(57)【要約】  微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）によるタンパク質の部位特異的修飾は、生理学的条件下でのタンパク質の制御された修飾のための強力で多用途な戦略である。本発明者らは、固相マイクロビーズ固定化を使用して、さらに下流での適用に重要なさまざまな機能性分子を、ｓｃＦＶ、Ｆａｂフラグメントおよび抗体を含む治療に関連するタンパク質に部位特異的かつ効率的に結合できることを証明する。本発明者らは、ＭＴＧが検出可能なカラムブリードなしにしっかりと固定化されたままであり、かつ酵素活性が連続操作の間持続し、このことによって酵素の便利な再循環が可能になり、したがって液相ＭＴＧコンジュゲーションを超えていくことを証明する。加えて、固定化ＭＴＧは、コンジュゲーションが溶液で行われた場合、すべて標的とされるいくつかの反応性残基の存在下で、特定の残基に対して高い選択性を示すことが示される。また、有効なグルタミン含有ペプチドを用いる固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧによる抗体の部位特異的リジンコンジュゲーションについても報告されている。さらに、固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧを用いる二重部位特異的コンジュゲートＩｇＧ１の生成、すなわち、ＩｇＧ１抗体のグルタミン残基およびリジン残基への部位特異的コンジュゲーションが報告されている。リジン残基および機能性部分を含む小さなペプチドとの部位特異的グルタミンコンジュゲーションも記載されている。
2019531050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化および／または非固定化形態のＭＴＧ（微生物トランスグルタミナーゼ）を使用して、有機分子を標的タンパク質にコンジュゲートし、融合タンパク質を作製するための方法であって、
ａ）前記ＭＴＧを、ポリマーの交差反応性基を露出させることによって前記ポリマーに結合させて、ＭＴＧを固定化する工程；
ｂ）ＭＴＧポリマーコンジュゲートをマイクロビーズに吸着させるか、またはＭＴＧポリマーコンジュゲートを溶液に入れる工程；
ｃ）ＭＴＧポリマーコンジュゲート吸着マイクロビーズおよび／またはＭＴＧポリマーコンジュゲートを含む溶液および／またはＭＴＧを含む溶液をアクティブフローリアクターカラムに充填する工程；
ｄ）標的タンパク質および有機分子を流体内に供給し、前記流体を、所定の条件下で、前記充填されたアクティブフローリアクターカラムに通すか、またはＭＴＧポリマーコンジュゲートを含む溶液および／またはＭＴＧを含む溶液と混合し、それによって前記有機分子を、ＭＴＧの触媒作用下で前記タンパク質にコンジュゲートする工程；
ｅ）前記流体からタンパク質有機分子コンジュゲートを抽出する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ポリマーは、前記マイクロビーズにイオン結合および／または共有結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマーは、第二世代の樹状ポリマー（ｄｅ−ＰＧ２）である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記標的タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡもしくはＩｇＥフォーマットの抗体またはそのフラグメントからなる群から選択され、かつ好ましくはモノクローナルであって、任意で残基Ｎ２９７にて変異（例えば、Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａ）（ＥＵ番号付けスキーム）を含むキメラ、ヒト化、ヒトまたは二重特異性、脱グリコシル化または非グリコシル化であるように選択されるモノクローナルであり、かつ好ましくはＭＴＧを介したコンジュゲーションを可能にする抗体骨格中に他の反応性グルタミン残基変異も含む、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記標的タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｄａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ）２などのペプチドであり、ここで、さらに可能性のあるタンパク質および／またはペプチドは、他のタンパク質およびペプチドの認識に関与するタンパク質およびペプチドを含み、該タンパク質およびペプチドは、これらに限定されないが、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ、ならびにＭＡＰキナーゼ、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫＩ）およびサイクリン依存性キナーゼを直接的または間接的にリン酸化するキナーゼなどのタンパク質キナーゼ、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、線維芽細胞由来成長因子（ＦＧＦ）受容体、インスリン受容体およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ダルピン、アフィボディ／ナノボディもしくはフィブロネクチンフラグメントのような人工タンパク質、または免疫応答を誘発し、したがってワクチン接種にとって重要であるＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素の変異体もしくはＧＢＳ６７（ＰＩ−２ａの補助タンパク質）などのキャリアタンパク質もしくはハプテンを含み；さらに、前記標的タンパク質は、好ましくは、非タンパク質構造、例えば、グルカンのような単量体または多量体デキストランへのコンジュゲーションも含む、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
酵素が、１つ以上の反応性グルタミン残基（例えば、抗体のＱ２９５およびＮ２９７Ｑ）または標的タンパク質上の１つ以上の反応性リジン残基（例えば、抗体のＫ２８８またはＫ２９０、Ｋ３４０）のいずれかを有機分子で修飾し、その際、前記残基が、遺伝的手段またはその組み合わせによって内因的または人工的に導入される、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記有機分子が、蛍光色素／標識（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７）、毒素などの細胞傷害性または影響を及ぼす部分（例えば、ＭＭＡＥ、ＰＢＤ−二量体）または細胞調節剤、免疫細胞免疫調節／刺激化合物、ＳＰＥＣＴ／ＰＥＴまたはＭＲＩに適した金属キレート剤（例えばＮＯＤＡ−ＧＡ）、機能性ペプチド（例えば、アルファデフェンシンＮＰ−１）、歪み促進型アジド−アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）またはテトラジン−アルケンライゲーションのようなクリック反応に適した化学的部分、例えば、アジドおよびシクロオクチン誘導体（例：ＤＩＦＯ、ＢＣＮ、ＤＩＢＡＣ、ＤＩＢＯ、ＡＤＩＢＯ）、ならびにＭＴＧを介したコンジュゲーションのための第一級アミンおよびＣｎ＞２０のスペーサー部分を有するテトラジンおよびトランス−シクロオクテン誘導体からなる群から選択され、ここで、（Ｃ）ｎは、好ましくは置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル鎖およびそれらの誘導体であり（例えば、前記鎖のすべての炭素は、任意でアルコキシ、ヒドロキシルもしくはアミド、またはアルキルアミドで置換される）、かつｎは、＞２０の範囲の中から選択される整数である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記有機分子は、任意の位置にリジンを含むペプチド（例えば、ＫＮＡＡＧＧＧもしくはＫＤＡＡＧＧＧもしくはＫＡＹＡＧＧＧもしくはＡＫＥＴＡＡ）または任意の位置にグルタミン残基を含むペプチド（例えば、ＦＧＬＱＰＲＹ、ＳＬＬＱＧＲ）からなる群から選択され、かつＭＴＧにより標的化され（すなわち、ＭＴＧのための基質である）、任意で酵素的に切断可能なペプチド配列（例えば、バリン−シトルリン（ＶＣ）、ＫＮＡＡＧＧＧ−ＶＣ）を含み、前記リジンペプチドは、（Ｃ＋Ｎ）ｎ＞２０のサイズ（長さ）を有し、前記グルタミンペプチドは、１＜（Ｃ＋Ｎ）ｎ＜２００のサイズ（長さ）を有する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、機能性部分、例えば、細胞傷害性部分（ＭＭＡＥ）、蛍光色素、金属キレート剤、またはＳＰＡＡＣクリック反応に適した化学的部分（例えば、アジド基またはＤＢＣＯ基、例えば、ＦＧＬＱＰＲＹＧＫ（アジド））またはテトラジンおよびトランス−シクロオクテン基またはその誘導体（例えば、ＫＮＡＡＧＧＧ−ＰＥＧ５−ＴＣＯ）を含み、任意で前記ペプチドと前記機能性部分（例えば、ＫＮＡＡＧＫ（ＰＥＧ３−ＮＯＤＡＧＡ））との間にスペーサー部分（例えば、ポリ−エチレングリコール、アルキル基）を含みかつ／または任意でさらに自壊型基（例えば、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ））を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロビーズは、ガラス、ニッケル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＣＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、および類似物からなる群から選択され；前記群はさらに、ゼラチン、ガラス、セファロースマクロビーズ、セファデックスビーズまたはデキストランマイクロキャリア、例えば、ＣＹＴＯＤＥＳ（登録商標）（ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）、多糖、例えば、アガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、キチン、セルロース、デキストランまたはデンプン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、ペルフルオロカーボン、無機化合物、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、アルミナ、金、酸化鉄、グラフェンおよびグラフェン酸化物もしくは他の金属酸化物、または２種以上の天然に存在するポリマー、合成ポリマーもしくは無機化合物の任意の組み合わせからなるコポリマーを含み；前記マイクロビーズの大きさは、１〜１００ｎｍ、または１００〜１０００ｎｍ、または１μｍ〜１０μｍ、または１０μｍ〜１０００μｍの範囲にある、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記流体は、適切な緩衝剤（例えば、トリス）および塩添加剤（例えば、ＮａＣｌ）を含有する水からなる群から選択され、前記緩衝水溶液はさらに、グリセロールおよび他の有機溶媒、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−プロパノール、ＤＭＳＯ、メタノール、アセトニトリルを６０％まで含有し得る、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリビニルピロリドン、ポリリジンおよびポリグルタメート、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリメタクリル酸およびポリプロパクリル酸、あるいはそれらの混合物およびデンドリマー構造からなる群から選択され；さらに糖残基をベースとするポリマー、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ポリＮＩＰＡＭ）、ポリ（グリシジルメタクリレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびポリ（エチレン−ａｌｔ−テトラフルオロエチレン）（ＥＴＦＥ）、ポリ（オリゴエチレングリコール）メタ−アクリレート（ＰＯＥＧＭＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）およびポリ（エチレンイミン）およびそれらの誘導体も含まれる、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーＭＴＧコンジュゲートは、ポリマーとＭＴＧとの間にリンカー（スペーサー）を含み、前記リンカーは、二官能性リンカー系Ｓ−ＨｙＮｉｃ（スクシンイミジル−６−ヒドラジノ−ニコチンアミド）、Ｓ−４ＦＢ（４−ホルミルベンゾエート）もしくはそれらの誘導体、またはＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）またはその誘導体、Ｙ−Ｓ−Ｚ（ＹはＺでもあり得、その逆もあり得る）のような構造を有するホモ二官能性またはヘテロ二官能性スペーサーであり、ここでＹおよびＺは、以下の群またはそれらの誘導体：テトラジン、トランス−シクロオクテン、アジド、シクロオクテン（例えば、ジベンジルシクロオクチンまたはビシクロノニン）、ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、イソチオシアネート、アルデヒド、エポキシド、アルコール、アミン、チオール、ホスホネート、アルキン、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、α−ケト酸−ヒドロキシルアミン、Ｏ−アシルヒドロキシルアミン、カルボン酸、ヒドラジン、イミン、ノルボルネン、ニトリルおよびシクロプロペンのものであり、かつＳは、ポリマーまたはその誘導体、例えば、オリゴまたはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、アルキル部分で作られたデキストラン、アミノ酸またはペプチド誘導体であるスペーサー単位である、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記所定の条件は、以下の詳細：０℃〜５０℃の温度範囲、数秒〜１６８時間（または７日）の接触時間、アクティブフローリアクターカラムにおいて１μＬ／分を下回るかまたは１μＬ／分〜１０ｍｌ／分の流速／速度、１μＭ〜１ｍＭのタンパク質濃度を含み、ここで、標的タンパク質に対する有機分子のモル比は、０．５〜５０倍、５０〜５００倍、および５００〜１０，０００倍であり、かつＭＴＧ濃度は、樹脂もしくはマイクロビーズまたはコンジュゲーション溶液１ｍｌあたり０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．０１ｍｇ／ｍｌおよび０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは少なくとも３０％かつ１００％までの転化率の有機分子を用いた標的タンパク質へのコンジュゲーション効率および０．１バール〜２０バールの流圧も含み；さらに、機能化マイクロビーズを、好ましくはスピンカラムに適したデバイスに配置し、ここで、反応混合物を、ビーズと共に１秒〜６０秒、１分〜６０分、１時間〜１６８時間の一定時間インキュベートし；次いで、遠心分離し、上清を除去することにより前記混合物を再びマイクロビーズから除去するか、または遠心分離の間に、マイクロビーズを保持するが、反応に必要な混合物は保持せずに、前記溶液を、適切なフィルターデバイスを通して押し出す、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロビーズ固定化ＭＴＧ（微生物トランスグルタミナーゼＭＴＧ）および／または溶液でのＭＴＧポリマーコンジュゲートおよび／または溶液での遊離ＭＴＧを用いる、有機分子のタンパク質へのコンジュゲーション方法および融合タンパク質の作製方法に関する。
【０００２】
近年、酵素によるタンパク質の部位特異的機能化は、バイオコンジュゲーション分野においてかなりの関心を集めている。酵素によって行われるバイオコンジュゲーション反応は、通常、低い試薬濃度（サブミリモル）での速い反応速度、高い変換効率を示し、そしてこれは生理学的条件下で行われ得る。
【０００３】
これらの利点にもかかわらず、酵素は、その後に、あらゆる下流での干渉を避けるために混合物から除去されなければならず、したがって、酵素は、失われてしまう。これは、固相の固定化を通して、酵素の簡単な回収で回避することができた。酵素の固定化は、これまで、ほぼ小化合物の変換のみに適用されており、そして酵素の安定性を高め、さらには高められた活性、選択性または選択度につながることが報告された。様々なタンパク質フォーマットを数回コンジュゲーションするための連続操作下でタンパク質のような高分子量基質を部位特異的に修飾するための固定化酵素の調整可能な性質（すなわち、特定の残基に対して高められた選択性）はまだ報告されていない。
【０００４】
Policarpoらは、近年、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ上への酵素のコンジュゲーションを示した。残念ながら、このコンジュゲーションは、非共有結合的な性質を有し、カラムブリードの危険性が高い。
【０００５】
したがって、本発明の課題は、酵素のあらゆるカラムブリードを大幅に避けながら、有機分子のタンパク質への望ましいコンジュゲーションのために、高い速度に達するアクティブフローリアクターカラムまたはスピンカラムで使用するためのしっかりと固定化された酵素および／または溶液で酵素をもたらす方法を提供することである。
【０００６】
この課題は、本発明に従って、固定化および／または非固定化形態のＭＴＧ（微生物トランスグルタミナーゼ）を使用して、有機分子を標的タンパク質にコンジュゲートし、融合タンパク質を作製するための方法であって、以下の工程：
ａ）ＭＴＧを、ポリマーの交差反応性基を露出させることによって上記ポリマーに結合させて、ＭＴＧを固定化する工程；
ｂ）ＭＴＧポリマーコンジュゲートをマイクロビーズに吸着させるか、またはＭＴＧポリマーコンジュゲートを溶液に入れる工程；
ｃ）ＭＴＧポリマーコンジュゲート吸着マイクロビーズおよび／またはＭＴＧポリマーコンジュゲートを含む溶液および／またはＭＴＧを含む溶液をアクティブフローリアクターカラムに充填する工程；
ｄ）標的タンパク質および有機分子を流体内に供給し、前記流体を、所定の条件下で、前記充填されたアクティブフローリアクターカラムに通すか、またはＭＴＧポリマーコンジュゲートを含む溶液および／またはＭＴＧを含む溶液と混合し、それによって前記有機分子を、ＭＴＧの触媒作用下で前記タンパク質にコンジュゲートする工程；
ｅ）前記流体からタンパク質有機分子コンジュゲートを抽出する工程
を含む方法によって達成される。
【０００７】
この方法は、遊離体の高い転化率でタンパク質に有機分子をコンジュゲートして、タンパク質有機分子コンジュゲートを効率的に形成するための機会を初めて提供する。ＭＴＧのポリマーへの共有結合のために、ＭＴＧのブリーディングは、有利な程度まで抑制され得る。この方法は驚くべきことに、コンジュゲーションが溶液での非固定化酵素を用いて行われた場合にすべて標的化されることになる複数の反応性残基の存在下でコンジュゲートされるべきタンパク質、ペプチドまたは他の生体分子上の１つの（またはそれ以上の所望の）酵素反応性残基に対して高められた選択性を酵素の固定化によってもたらす。このことは、様々な程度までコンジュゲートされた分子の望ましくない混合物、またはすべての残基の完全なコンジュゲーションをもたらすであろう。このように固定化形態のＭＴＧを使用する場合、たった１つの（またはそれ以上の所望の）残基が、それぞれ、標的化され、かつコンジュゲートされる。当然ながら、ＭＴＧは、溶液中でその遊離形態でかつ／または溶液に入れられるＭＴＧポリマーコンジュゲートとしても使用され得る。ＭＴＧに関して、当業者は、ＭＴＧが、好ましくは、生物ストレプトマイセス・モバラエンシス（streptomyces mobaraensis）に由来することを理解している。
【０００８】
ポリマーのマイクロビーズへの結合は、ポリマーがマイクロビーズにイオン結合および／または共有結合する際に安定な方式でもたらされ得る。ポリマーの好ましい例は、第二世代の樹状ポリマー（ｄｅ−ＰＧ２）であり得る。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態によれば、標的タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡもしくはＩｇＥフォーマットの抗体またはそのフラグメントからなる群から選択することができ、好ましくはモノクローナルであって、任意で、Ｎ２９７にて変異（例えば、Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａ）（ＥＵ番号付けスキーム）を含む、キメラ、ヒト化または二重特異性、脱グリコシル化または非グリコシル化であるように選択されるモノクローナルであり、また、好ましくはさらにＭＴＧを介したコンジュゲーションを可能にする抗体骨格中に他の反応性グルタミン残基変異も含む。
【００１０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、標的タンパク質は、ペプチド、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｄａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ）２であり、ここで、さらに可能性のあるタンパク質および／またはペプチドは、他のタンパク質およびペプチドの認識に関与するタンパク質およびペプチド、例えば、これらに限定されないが、タンパク質キナーゼ、例えば、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ、ならびにＭＡＰキナーゼ、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫＩ）およびサイクリン依存性キナーゼを直接的または間接的にリン酸化するキナーゼ、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、線維芽細胞由来成長因子（ＦＧＦ）受容体、インスリン受容体およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、人工タンパク質、例えば、ダルピン（darpin）、アフィボディ／ナノボディもしくはフィブロネクチンフラグメント、または免疫応答を誘発し、したがってワクチン接種にとって重要であるＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素の変異体もしくはＧＢＳ６７（ＰＩ−２ａの補助タンパク質）などのキャリアタンパク質もしくはハプテンを含み；さらに、標的タンパク質は、好ましくは非タンパク質構造、例えば、グルカンのような単量体または多量体デキストランへのコンジュゲーションも含む。
【００１１】
酵素に関して、酵素は、１つ以上の反応性グルタミン残基（例えば抗体のＱ２９５およびＮ２９７Ｑ）または標的タンパク質上の１つ以上の反応性リジン残基（例えば抗体のＫ２８８またはＫ２９０、Ｋ３４０）のいずれかを有機分子で修飾してもよく；ここで、残基は、遺伝的手段またはその組み合わせによって内因的または人工的に導入される。
【００１２】
標的タンパク質にコンジュゲートされるべき有機分子の好ましい実施形態は、蛍光色素／標識（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７）、毒素などの細胞傷害性または影響を及ぼす部分または細胞調節剤、免疫細胞免疫調節／刺激化合物、ＳＰＥＣＴ／ＰＥＴまたはＭＲＩに適した金属キレート剤（例えばＮＯＤＡ−ＧＡ）、機能性ペプチド（例えば、アルファデフェンシンＮＰ−１）、歪み促進型アジド−アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）またはテトラジン−アルケンライゲーションのようなクリック反応に適した化学的部分、例えば、アジドおよびシクロオクチン誘導体（例えば、ＤＩＦＯ、ＢＣＮ、ＤＩＢＡＣ、ＤＩＢＯ、ＡＤＩＢＯ）、ならびにＭＴＧを介したコンジュゲーションのための第一級アミンおよびＣｎ＞２０のスペーサー部分を有するテトラジンおよびトランス−シクロオクテン誘導体からなる群から選択され得る。
【００１３】
さらに、有機分子は、細胞傷害性部分のような機能性部分にコンジュゲートされた（Ｃ＋Ｎ）ｎ＞２０のペプチド、蛍光色素、金属キレート剤、またはＳＰＡＡＣクリック反応に適した化学的部分（例えば、アジド基またはＤＢＣＯ基）またはテトラジンおよびトランス−シクロオクテン基またはその誘導体からなる群から選択され得る。特に、ペプチドは、リジン（例えば、ＫＮＡＡまたはＫＡＹＡ）またはグルタミン残基（例えば、ＦＧＬＱＰＲＹ）を含んでいてよく、これはＭＴＧにより標的化され（すなわち、ＭＴＧのための基質である）、任意でＣｎ＞２０のスペーサー部分（例えば、ポリエチレングリコール、アルキル基）を含みかつ／または第一級アミンを介してコンジュゲートされている。
【００１４】
さらに、有機分子は、任意の位置にリジンを含むペプチド（例えば、ＫＮＡＡＧＧＧもしくはＫＤＡＡＧＧＧもしくはＫＡＹＡＧＧＧもしくはＡＫＥＴＡＡ）または任意の位置にグルタミン残基を含むペプチド（例えば、ＦＧＬＱＰＲＹ、ＳＬＬＱＧＲ）からなる群から選択することができ、これはＭＴＧにより標的化され（すなわち、ＭＴＧのための基質である）、任意で酵素的に切断可能なペプチド配列（例えば、バリン−シトルリン（ＶＣ）、ＫＮＡＡＧＧＧ−ＶＣ）を含み；前記リジンペプチドは、（Ｃ＋Ｎ）ｎ＞２０のサイズ（長さ）を有し、前記グルタミンペプチドは、１＜（Ｃ＋Ｎ）ｎ＜２００のサイズ（長さ）を有する。
【００１５】
マイクロビーズまたはマイクロビーズ樹脂の好ましい実施形態は、ガラス、ニッケル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＣＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、および類似物からなる群から選択され得る。他の固体支持体としては、ゼラチン、ガラス、セファロースマクロビーズ、セファデックスビーズまたはデキストランマイクロキャリア、例えば、ＣＹＴＯＤＥＳ（登録商標）（ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）、多糖、例えば、アガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、キチン、セルロース、デキストランまたはデンプン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、ペルフルオロカーボン、無機化合物、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、アルミナ、金、酸化鉄、グラフェンおよびグラフェン酸化物もしくは他の金属酸化物、または２種以上の天然に存在するポリマー、合成ポリマーもしくは無機化合物の任意の組み合わせからなるコポリマーが挙げられる。ビーズの大きさは、１〜１００ｎｍ、または１００〜１０００ｎｍ、または１μｍ〜１０μｍ、または１０μｍ〜１０００μｍであり得る。
【００１６】
流体の適切な例は、適切な緩衝剤（例えば、トリス）および塩添加剤（例えば、ＮａＣｌ）を含有する水からなる群から選択することができ、前記緩衝水溶液はさらに、グリセロールおよび他の有機溶媒、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−プロパノール、ＤＭＳＯ、メタノール、アセトニトリルを６０％まで含有し得る。
【００１７】
第一世代および第二世代およびそれ以上の世代の樹状ポリマー（ｄｅ−ＰＧ２）の他に、適切なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリビニルピロリドン、ポリリジンおよびポリグルタメート、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリメタクリル酸およびポリプロパクリル酸、あるいはそれらの混合物およびデンドリマー構造からなる群から選択され得る。また、糖残基をベースとしたポリマーとしては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ポリＮＩＰＡＭ）、ポリ（グリシジルメタクリレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、およびポリ（エチレン−ａｌｔ−テトラフルオロエチレン）（ＥＴＦＥ）、ポリ（オリゴエチレングリコール）メタ−アクリレート（ＰＯＥＧＭＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）およびポリ（エチレンイミン）ならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＭＴＧとポリマーとのコンジュゲーションは、ポリマーとＭＴＧとの間にリンカー（スペーサー）を含み、前記リンカーは、二官能性リンカー系Ｓ−ＨｙＮｉｃ（スクシンイミジル−６−ヒドラジノ−ニコチンアミド）、Ｓ−４ＦＢ（４−ホルミルベンゾエート）もしくはそれらの誘導体、またはＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）もしくはその誘導体、Ｙ−Ｓ−Ｚ（ＹはＺでもあり得、その逆もあり得る）のような構造を有するホモ二官能性またはヘテロ二官能性スペーサーからなる群から選択することができ、ここでＹおよびＺは、以下の群またはそれらの誘導体：テトラジン、トランス−シクロオクテン、アジド、シクロオクテン（例えば、ジベンジルシクロオクチンまたはビシクロノニン）、ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、イソチオシアネート、アルデヒド、エポキシド、アルコール、アミン、チオール、ホスホネート、アルキン、アシルトリフルオロホウ酸カリウム、α−ケト酸−ヒドロキシルアミン、Ｏ−アシルヒドロキシルアミン、カルボン酸、ヒドラジン、イミン、ノルボルネン、ニトリルおよびシクロプロペンのものであり、かつＳは、ポリマーまたはその誘導体、例えば、オリゴまたはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、アルキル部分で作られたデキストラン、アミノ酸またはペプチド誘導体であるスペーサー単位である。
【００１９】
コンジュゲーションの進行に適した条件は、所定の条件が、以下の詳細を含む場合にもたらされ得る：０℃〜５０℃の温度範囲、数秒〜１６８時間（または７日）の接触時間、アクティブフローリアクターカラムにおいて１μＬ／分を下回るかまたは１μＬ／分〜１０ｍｌ／分の流速／速度、１μＭ〜１ｍＭのタンパク質濃度、ここで、標的タンパク質に対する有機分子のモル比は、０．５〜５０倍または５０〜５００倍または５００〜１０，０００倍であり、かつＭＴＧ濃度は、樹脂もしくはマイクロビーズまたはコンジュゲーション溶液１ｍｌあたり０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．０１ｍｇ／ｍｌまたは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは少なくとも３０％かつ１００％までの転化率の有機分子を用いた標的タンパク質へのコンジュゲーション効率および０．１バール〜２０バールの流圧も含む。
【００２０】
さらに、機能化マイクロビーズは、スピンカラムに適したデバイスに配置することもでき、ここで、反応混合物は、マイクロビーズと共に１秒〜６０秒、１分〜６０分、１時間〜１６８時間の一定時間インキュベートされる。次いで、遠心分離し、上清を除去することにより混合物が再びマイクロビーズから除去されるか、または遠心分離の間に、マイクロビーズを保持するが、反応に必要な混合物／コンジュゲートを保持せずに、溶液が適切なフィルターデバイスを通して押し出される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態は、添付の図面を参照して以下により詳細に説明される：
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｄｅ−ＰＧ２ポリマーへの微生物トランスグルタミナーゼＭＴＧの固定化プロセスおよびその後のマイクロビーズへの吸着を概略的に示す。
【図２】図２は、ｄｅ−ＰＧ２ポリマーへのＭＴＧのコンジュゲーションおよびＭＴＧの特性および定量化、ならびに、１μＭのＭＴＧに規準化したＭＴＧ−ポリマーコンジュゲート活性を示す。
【図３】図３は、マイクロビーズ固定化ＭＴＧを用いたｓｃＦＶおよびＦａｂフラグメントのような抗体様足場への機能性分子のコンジュゲーションを概略的に示す。
【図４】図４は、マイクロビーズ固定化ＭＴＧを用いた（非グリコシル化）抗体（Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑ変異体）への機能性分子のコンジュゲーション；さらには抗ＭＴＧ抗体によって検出されたポリマーに結合したＭＴＧを概略的に示す。
【図５】図５は、コンジュゲーションが溶液の形で行われる場合と比較した、いくつかの反応性アミノ酸の存在下で固定化ＭＴＧによって高められた選択性を示す。
【図６】図６は、異なるｐＨ条件を用いた脱グリコシル化ＩｇＧ１（ハーセプチン）についてのグルタミン含有ペプチド（配列を右側の表に示す）のスクリーニングを示す。ペプチド２は、５０％以上のコンジュゲーションが生じるｐＨ７．６で最も有効であることが分かった。
【図７】図７は、ペプチド２の構造（左）およびそのアジド誘導体（右）を示す。
【図８】図８は、固相固定化ＭＴＧを用いた、ペプチドＦＧＬＱＲＰＹ（ペプチド２）と脱グリコシル化ＩｇＧ１とのコンジュゲーションを示す。
【図９】図９は、７０％を上回るコンジュゲーションをもたらす、固定化ＭＴＧ（左）および溶液のＭＴＧ（右）を用いた、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｓ変異を含む）へのペプチド２のコンジュゲーションを示す。
【図１０】図１０は、７０％を上回るコンジュゲーションをもたらす、固定化ＭＴＧ（左）および溶液のＭＴＧ（右）を用いた、ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｓ抗体のリジン３４０およびリジン２８８／２９０へのペプチド２−アジド誘導体のコンジュゲーションを示す。
【図１１】図１１は、約４０％の二重部位特異的修飾ＩｇＧ１をもたらす、固定化ＭＴＧ（左）および溶液のＭＴＧ（右）を用いたＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｓ抗体への二重部位特異的コンジュゲーションを示す。グルタミンＱ２９５コンジュゲーション用の基質ＴＣＯ−ＰＥＧ３−ＮＨ２およびリジン３４０（および２８８／２９０）コンジュゲーション用のペプチド２アジド誘導体を使用した。
【図１２】図１２は、リジンコンジュゲート抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー分析および蛍光分析を示す。軽鎖ではなく、重鎖のみが選択的にコンジュゲートされる。
【００２３】
ＭＴＧ−ポリマー−コンジュゲートの形成および特性決定
微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）へのＮ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（４ＦＢ）のコンジュゲーション（図１）について、ＭＴＧ１つあたり１つのリンカーを目標に、様々なリンカー過剰を調査した。リンカー比をＬＣ−ＭＳおよびＵＶ−ＶＩＳによる分光光度法で定量すると、双方の方法がよく相関していることが分かった（図２ａ）。４ＦＢに対して等しいＭＴＧのリンカー量では、約０．４のコンジュゲーション比が得られ、２を超えるとこの比は約０．８に増加した（図２ａ）。０．８の比が望ましいように思われたが、本発明者らは、約０．５のリンカー比をもたらす１．５当量の４ＦＢを使用することを選択した。なぜならば、実験の過程で、リンカー比が０．８であり高すぎる場合には、酵素−ポリマーコンジュゲートが生成されるものの、サンプルが沈殿するためこれを超遠心処理では精製できないことが観察されたためである。これは、２当量の場合には二重に結合したＭＴＧ（ＭＴＧ−（４ＦＢ）２）の量が２０％を上回り、対照的に１．５当量の場合にはこの量が１０％を下回ったままであったことに起因し得る（図２ｂ）。ＭＴＧ−（４ＦＢ）２の量が多すぎると、同一または別のポリマーストランドでの望ましくない過剰架橋、ＭＴＧ活性の低下、および酵素−ポリマーコンジュゲートの溶解度の低下を招き得る。これらの理由から、ＭＴＧを過剰にコンジュゲートさせずに、ＭＴＧに対して１．５当量の過剰の４ＦＢを選択し、単一結合したＭＴＧを９０％を上回る純度で生成させることが特に強調された。
【００２４】
Ｎ−スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチネート（Ｓ−ＨｙＮｉｃ）−リンカーにコンジュゲートしたポリマーｄｅ−ＰＧ２５００（図１）を、次いでＭＴＧ−４ＦＢと共にインキュベートした。これら２種の結合した化合物を混合すると、ＵＶ−ＶＩＳから分かるように３５４ｎｍで特徴的なピークが形成され、吸収が増加した（図２ｃ）。このことは、ビス−アリール−ヒドラゾン（ＢＡＨ）結合が形成され、かつ酵素−ポリマーコンジュゲートがうまく生成したことを表す。
【００２５】
ポリマー−酵素コンジュゲートの活性を、比色ヒドロキシルアミン−アミンアッセイを用いて溶液中でアッセイしたところ、ＭＴＧは、天然型ＭＴＧと比較して明らかに低下してはいるものの、まだ触媒活性を有することが分かった（図２ｄ）。この活性の低下は、固定化されていない天然型ＭＴＧと比較してポリマー固定化ＭＴＧの回転自由度および配置の可能性が低下し、これによりヒドロキシルアミンが酵素の活性部位により入りにくくなったことで説明することができるだろう。溶液中の同一のポリマーに固定化されたプロテイナーゼＫについても、同様の活性低下が見られたことが報告された。そうとはいえ、最も重要なのは、ＭＴＧは、固定化後もまだ触媒活性を示したことであった。
【００２６】
マイクロビーズガラス表面に吸着したＭＴＧ−ポリマーコンジュゲートの量の計算
３５４ｎｍ（２９，０００Ｍ−１ｃｍ−１）にてＵＶ−ＶＩＳで定量化可能なビス−アリール−ヒドラゾン結合によって、ビーズ固定化ＭＴＧ量を、溶出容量から推定することができた。１時間のインキュベーション後、溶出容量中の濃度を求めると１．６±０．１５μＭであり、開始濃度が５μＭの場合には約７０％のコンジュゲートがビーズに吸着した。ＭＴＧは、ほとんどがポリマーに単一架橋しているので、吸着質量は、約３００ｎｇ／ｃｍ２または約７．８ｐｍｏｌＭＴＧ／ｃｍ２と推定され得る。これらの値は、樹状化ポリマー（denpol-polymer）に固定化されたプロテイナーゼＫまたはホースラディッシュペルオキシダーゼおよびシリカポリマー表面に共有結合的に固定化された他の酵素を用いるすでに公表された結果と一致する。
【００２７】
機能性分子のタンパク質への部位特異的コンジュゲーションのためのマイクロビーズ固定化ＭＴＧ
ＭＴＧ−ポリマーコンジュゲートの安定した固定化のために、ガラスマイクロビーズの使用を選択した。これは、正電荷を帯びた樹状化アミン（denpol-amine）が、負電荷を帯びたガラス表面に対して強い親和性を示し、ビーズをフローベースのマイクロリアクターに容易に取り付けることができるためである。このようなセットアップによって、十分に制御可能な方法でサンプルビーズを繰り返しオーバーフローさせることが可能となり、したがって反応を完了に向かわせるためにこれを使用することができる。さらに、マイクロビーズをコンジュゲーションプロセス後に容易に洗浄することができ、それにより、次のコンジュゲーションに向けて固定化ＭＴＧを回収することができる。
【００２８】
ｓｃＦＶ、ナノボディまたはＦａｂフラグメントを含む、比較的小さな抗体様足場の治療関連タンパク質は、より大きな抗体と比較して、それらの腫瘍浸透能力の増大、それらの容易な産生およびより迅速なクリアランスのためにかなり興味深い。タンパク質を機能化する最初の試みでは、このように、ＦａｂフラグメントとｓｃＦＶとをコンジュゲートすることが目的とされており、その双方とも、それらのＣ末端ｍｙｃ−タグにおいてグルタミン２（‘Ｑ２’）を介して、ストレプトアビジン被覆表面への固定化を含むさらに下流の用途に理想的な基質であるビオチン−カダベリンをアミンとして使用して、溶液でのＭＴＧによって効率的にコンジュゲートされることがすでに示されている。グルタミンを含むタンパク質上の可動性ループおよび末端タグは、ＭＴＧによって優先的に標的とされることが知られているが、球状構造および接近可能な末端タグの存在は、表面固定化ＭＴＧのコンジュゲーションを可能にし、酵素の活性部位に入るのは、嵩高い抗体上のグルタミン２９５のようなループ構造と比較してそれほど難しくない。したがって、ビオチン−カダベリンとＣ末端にｍｙｃタグ付けしたＦａｂフラグメントおよびｓｃＦＶとを混合し、マイクロリアクター内のマイクロビーズ固定化ＭＴＧ上に溶液を流した（図１および３ａ）。この溶液をマイクロリアクターに３０分間ポンプで送り、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。所望のビオチンコンジュゲートＦａｂフラグメントへの９５％以上の完全な転化が生じたことが判明し、非コンジュゲート材料は、検出されなかった（図３ｂ）。また、ｃ−ｍｙｃタグ付きｓｃＦＶは、同一の条件下でわずか３０分以内に効率的にコンジュゲートして、９５％以上の所望のコンジュゲートをもたらした（図３ｂ）。
【００２９】
ＭＴＧ用の蛍光アミン供与体であるダンシルカダベリンもまた、ＦａｂおよびｓｃＦＶに対してわずか８等モルの過剰量でコンジュゲートされ（図３ａ）、３０分以内に９５％以上のダンシル標識化Ｆａｂフラグメントおよび９０％以上のｓｃＦＶをもたらした（図３ｂ）。
【００３０】
場合によっては、嵩高い第一級アミン含有基質を、ＭＴＧ反応性グルタミンに直接コンジュゲートさせると、残留非コンジュゲート材料との不完全な生成物転化をもたらすことがある。これは特に、金属キレート剤上のカルボキシ基のような親水性の高い基を含むそれらの基質で起こる。最初に「クリック可能」な部分をタンパク質上に設け、続いて所望分子のクリックコンジュゲーションを行う２段階手法を使用すると、この問題を回避して、定量的コンジュゲーションをもたらすことができる。したがって、ＳＰＡＡＣ（歪み促進型アルキン−アジド環状付加）クリックケミストリー（図３ｃ）に適したアミン−ＰＥＧ３−アジドを用いてｍｙｃタグ付きｓｃＦＶにコンジュゲートできるかどうかが検討された。ｍｙｃタグ付きｓｃＦＶをカラムに流し、３０分後にサンプルを取り出し、ＬＣ−ＭＳ分析にかけたところ、すでに８２％までの所望のｓｃＦＶ−Ｎ３転化が生じていた（図３ｃ）。９０分間ビーズをオーバーフローさせ続けると９７％の転化が得られ、一晩連続して（１４時間）流した後、非コンジュゲート材料は、もはや検出されなかった（図３ｃ）。これらの結果は、マイクロビーズ固定化ＭＴＧが、少量の試薬過剰でも、９０分未満で様々な基質をｍｙｃタグ付きタンパク質に定量的にコンジュゲートすることが可能であったことを明確に実証する。
【００３１】
これらの結果に基づいて、完全抗体もビーズ固定化ＭＴＧによってコンジュゲートできるかどうかが検討された。予め、脱グリコシル化抗体の１つの特定されたグルタミン２９５（Ｑ２９５）は、抗体骨格内の唯一のＭＴＧ標的部位としてＦｃドメインの可動性Ｃ’Ｅループ上にあり、したがって、グリコシル化部位を切除するＮ２９７Ｑ点変異を導入すると、２つまたは４つの結合部位を有する規定の抗体コンジュゲートが生成される。表面上での抗体コンジュゲーションは、その配向の可能性を制限する抗体の嵩高さゆえ、溶液の形でよりも困難な場合があり、したがって、ループへのＱ２９５およびＱ２９７それぞれへのＭＴＧの到達は、おそらくより困難になる。
【００３２】
したがって、脱グリコシル化およびビオチン−カダベリンを回避するために、Ｎ２９７Ｓ点変異を含むＩｇＧ１抗体に固定化ＭＴＧを供した（図４ａ）。３０分後、還元抗体のＬＣ−ＭＳ分析は、すでに３７％の重鎖転化率を示し、室温で１時間後には７２％を示し、これは一晩のインキュベーションの間に９５％以上に増加した（図４ａ）。４〜６の高い薬物抗体比（ＤＡＲ）を有する部位特異的に修飾された抗体は、同一の薬物量を有する従来の非特異的コンジュゲート抗体と比較して、コンジュゲート薬物を効果的に腫瘍標的部位に送達されると考えられ、これによって、このようなＡＤＣは、改善された癌治療として非常に魅力的なものとなる。したがって、固定化ＭＴＧが、Ｎ２９７Ｑ抗体に非常に近接して２つのＳＰＡＡＣ感受性二官能性リンカーをコンジュゲートするその能力を維持するであろうかどうかが調査された（図４ｂ）。ビーズ固定化ＭＴＧが実際に双方のリンカーを定量的かつ効率的にコンジュゲートすることができ、抗体１つあたり４つのリンカーの比でＮ２９７Ｑ抗体をもたらすることが分かった（図４ｂ）。
【００３３】
これらの研究により、ＭＴＧの特異的でかつ効率的なコンジュゲーション能力は固定化時に維持され、さらにタンパク質の残基特異性を調整することさえできることが明らかになった。
【００３４】
マイクロビーズ上でのＭＴＧ−ポリマーコンジュゲートおよびＭＴＧ活性の安定性調査
樹状化ポリマーのポリカチオン性が、数週間にわたりアニオン性ガラス表面での安定な表面固定をもたらすことはすでに示されていた。固体酵素固定化は、特に有望な治療用タンパク質の下流の用途にとって重要であるため、スロットブロットアッセイおよび抗ＭＴＧ抗体を用いた酵素漏出への対処がなされている。大量のサンプルの適用が可能であり、またその感度ゆえ、スロットブロットが選択されている。陽性対照としてのＭＴＧ−ポリマーコンジュゲートは、強いシグナルを示し（図４ｃ、レーン１、ｉ）、また非コンジュゲートＭＴＧを検出することができたが（レーン１、ｉｉ）、ＨｙＮｉｃポリマーは、シグナルを生成しなかった（レーン１、ｉｉｉ）。このことは、ＭＴＧがポリマーにコンジュゲートした場合であっても、抗体がＭＴＧを特異的に認識したことを実証している。１４時間の連続操作の後、ＭＴＧはしっかりと結合したままであり（レーン２、ｉおよびｉｉ）、また複数のコンジュゲーションを実施した４０時間の操作後も、ＭＴＧは、ポリマーにしっかりと結合したままで、酵素は検出されなかった（レーン２、ｉｉｉ）。後者の条件下では、固定化ＭＴＧは、３時間後にも９０％を上回るまでＢＣをＮ２９７Ｓ  ＩｇＧ１にコンジュゲートすることができた。これらのデータから、ＭＴＧは、ガラスマイクロビーズにしっかりと結合したままであるだけでなく、長期間および数回のコンジュゲーションの間、それぞれ、活性があり、したがって、ＭＴＧと同程度のサイズ範囲のタンパク質をコンジュゲートするための非常に有望なツールであると結論づけられた。
【００３５】
固定化ＭＴＧの複数のＭＴＧ反応性アミノ酸の存在下での残基選択性の増加
固定化酵素は、基質に対して高められた選択性を示すことが報告されているので、これは固定化ＭＴＧにも適用できると考えられた。ＭＴＧを用いた、いくつかの反応性リジン残基を有する、アビジン（モデルタンパク質として機能）へのＺＱＧ−Ｔａｍｒａ−カダベリン（ＺＱＧ−ＴＣ）の溶液の形でのコンジュゲーションは、デコンボリューションしたＬＣ−ＭＳスペクトルにおいて２つの主要なピークを示した。これらのピークは、１つのＺＱＧ−ＴＣを有するアビジンおよび２つのコンジュゲートしたＺＱＧ−ＴＣを有するアビジンに対応するだけでなく、いくつかの未修飾アビジンにも対応する（図５、左パネル）。同一の実験を行ったが、ただし固定化ＭＴＧを使用したところ、驚くべきことに、おそらくＭＴＧの回転自由度の低下ゆえに、ＭＴＧは、アビジンの１つのリジン残基をほぼ独占的に標的とし、第２残基へのコンジュゲーションは限られていたことが分かった（図５、右パネル）。これらのデータは、固定化ＭＴＧが、２つの残基を主にコンジュゲートする液相コンジュゲーションでは手の届かない残基選択性を調整するために実際に使用され得ることを示す。
【００３６】
脱グリコシル化および非グリコシル化ＩｇＧ１のリジン残基への小さなグルタミン含有ペプチドの部位特異的コンジュゲーション
ＺＱＧ誘導体を用いるリジン側鎖を介した抗体のＭＴＧを介した機能化が報告されているが、そのコンジュゲーション収率は満足できるものではなく（すなわち＜２０％）、かつ修飾リジン部位は報告されていなかった。したがって、さらなる研究は、溶液の形でおよび固定化ＭＴＧを用いて、非グリコシル化および脱グリコシル化ＩｇＧ１のリジン残基を標的とすることを目的としている。様々なグルタミンペプチドが、一般的に適用されているＺＱＧまたはその誘導体よりもＩｇＧ１上のリジン残基に対してより効率的にコンジュゲートされる可能性があると推論された。したがって、様々なｐＨ条件下にて、溶液で高いＭＴＧ活性が報告されているグルタミン含有ペプチドの小さなライブラリーが最初にスクリーニングされ、これはその後、固定化ＭＴＧに適用されることが望まれる。実際に、室温で１６時間インキュベートした後に脱グリコシル化ＩｇＧ１に対して好ましいコンジュゲーション比を有する配列を同定することができ、これは分析にＬＣ−ＭＳを使用してＺＱＧより高い反応性を示した（図６）。特に、ペプチド配列ＮＨ２−ＦＧＬＱＲＰＹ−ＣＯＯＨは、脱グリコシル化ＩｇＧ１に対してｐＨ７．６の溶液中のＺＱＧよりもほぼ２倍高いほぼ５０％のコンジュゲーション効率を示した（図６）。脱グリコシル化ＩｇＧ１およびペプチドＦＧＬＱＲＰＹ（ペプチド２、ペプチドの構造については図７の左）を、室温で一晩、固定化ＭＴＧに供すると、３０％のコンジュゲーションが見出された（図８）。驚くべきことに、ＩｇＧ１非グリコシル化Ｎ２９７Ｓ変異体およびＦＧＬＱＲＰＹを使用すると、コンジュゲーション率は、固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧにより７１％に増加した（図９の左右、それぞれ）。固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧとともにＦＧＬＱＲＰＹアジド誘導体（ペプチド構造については図７の右）を使用し、分析にＬＣ−ＭＳを使用しても同じ結果が得られた（図１０の左右、それぞれ）。分析にＬＣ−ＭＳを使用すると、主に、単一の修飾種と、ほんのわずかな第２のコンジュゲーションとが見出され、双方とも専ら重鎖上にあった。ペプチドマッピングにより、Ｌｙｓ２８８またはＬｙｓ２９０に、およびＬｙｓ３４０に２つの修飾部位が確認された。
【００３７】
固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧを用いる非グリコシル化ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｓ変異体）への部位特異的二重コンジュゲーション
固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧを用いてグルタミンおよびリジンのコンジュゲーションを確立したことから、Ｎ２９７Ｓ  ＩｇＧ１のＱ２９５およびＫ３４０、Ｋ２８８／Ｋ２９０を修飾することによって固定化ＭＴＧおよび溶液のＭＴＧを用いて部位特異的二重修飾が実現可能であるかどうかが推論された。このような二重修飾抗体、例えば、２つのイメージングプローブを有する二重修飾抗体は、例えば、非侵襲的および／または作業中／作業後の組織イメージングに非常に適しているであろう。また、相乗効果を示す２つの異なる毒性ペイロード（toxic payload）を結合させることができた。Ｑ２９５を、最初にＮＨ２−ＰＥＧ３−ＴＣＯで９５％以上修飾し、続いてペプチド−２アジド誘導体で修飾すると、３８％のわずかに低い収率の二重部位特異的修飾ＩｇＧ１が得られ（図１１、左）、溶液のＭＴＧを用いる二重部位特異的コンジュゲーションでも同様の結果が得られた（図１１、右）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、リジン残基への重鎖特異的コンジュゲーションが確認され、二重コンジュゲート抗体についてもＬＣ−ＭＳ結果が確認された（図１２）。
【００３８】
機能性リジンペプチドの脱グリコシル化抗体へのコンジュゲーション
リジン残基を含むペプチドが、溶液のＭＴＧを用いてグルタミン２９５位で脱グリコシル化抗体を部位特異的に修飾するのにも使用できるかどうかも調査されたが、これはこれまで文献には記載されていなかった。このようなＮ３−基（ＫＡＹＡ−ＧＧＧ−Ｎ３）などの官能基を有するペプチドまたは金属キレート剤（例えば、ＮＯＤＡＧＡ）を備えることで、第１の場合、例えば、低モル当量でのＳＰＡＡＣ−クリックケミストリーによって別の部分を後で結合させることができるだろう。第２の場合、機能性部分を直接コンジュゲートさせることができるので、第２の工程を必要とせず、このことは、さらなる下流の処理を容易にする。さらに、親水性アミノ酸をペプチドに組み込むことで、機能性部分（「前記ペイロード」）の溶解度を高めることができ、このことは疎水性ペイロードにとって非常に有益である。本研究では、ＫＡＹＡ−ＧＧＧ−Ｎ３は、ＫＮＡＡ−ＧＫ−ＰＥＧ３−ＮＯＤＡＧＡおよびＫＡＹＡ−ＧＫ−ＰＥＧ３−ＮＯＤＡＧＡと同様に高い効率（＞９５％）で脱グリコシル化抗体にコンジュゲートされ得ることが示された。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2019531050.tif 000017
2019531050.tif 000018
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