(57)【要約】本発明は、ＨＭＢと少なくとも１種のプロバイオティックとを含む組成物を提供する。ＨＭＢおよび少なくとも１種のプロバイオティックを動物に投与する方法も記載される。ＨＭＢおよびプロバイオティックは、炎症性サイトカインマーカーを減弱する、および／または筋肉の完全性を維持するために投与される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．５ｇ〜約３０ｇのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）と、少なくとも１種のプロバイオティックとを含む組成物。
【請求項２】
前記ＨＭＢが、その遊離酸の形態、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＨＭＢが、カルシウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＭＢが、遊離酸の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記プロバイオティックが、バチルス・コアグランスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
必要とする動物に相乗的組成物を投与することを含む、該動物における炎症性サイトカインマーカーを減弱するための方法であって、
前記組成物は、サイトカインマーカーの減弱が必要な対象当たり約０．５ｇ〜約３０ｇのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）と、少なくとも１種のプロバイオティックとを含む、上記方法。
【請求項７】
前記ＨＭＢが、その遊離酸の形態、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＭＢが、カルシウム塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＭＢが、前記遊離酸の形態である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロバイオティックが、バチルス・コアグランスである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
必要とする動物に相乗的組成物を投与することを含む、該動物における筋肉の完全性を維持するための方法であって、
前記組成物は、筋肉の完全性の維持が必要な対象当たり約０．５ｇ〜約３０ｇのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）と、少なくとも１種のプロバイオティックとを含む、上記方法。
【請求項１２】
前記ＨＭＢが、カルシウム塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＭＢが、前記遊離酸の形態である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロバイオティックが、バチルス・コアグランスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
栄養サプリメント中のＨＭＢの効能を改善するための方法であって、
前記サプリメントに、ＨＭＢと少なくとも１種のプロバイオティックとを、相乗効果的な量で添加することを含む、上記方法。
【請求項１６】
前記ＨＭＢが、カルシウム塩である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＭＢが、遊離酸の形態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロバイオティックが、バチルス・コアグランスである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２０１６年１０月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６２／４１１，２００号の優先権を主張し、この仮出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）およびプロバイオティックを含む組成物、ならびに炎症性サイトカインマーカーを減弱するおよび／または筋肉の完全性を維持するための該組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＭＢ
アルファ−ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）は、ロイシンの第１の主要で活性な代謝産物である。ＫＩＣ代謝の少ない方の生成物は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）である。ＨＭＢは、様々な用途に関して有用であることが見出されている。具体的には、米国特許第５，３６０，６１３号（Nissen）において、ＨＭＢは、総コレステロールおよび低密度リポタンパク質コレステロールの血中レベルを低下させることに関して有用であるとして記載されている。米国特許第５，３４８，９７９号（Nissenら）において、ＨＭＢは、ヒトにおける窒素保持を促進することに関して有用であるとして記載されている。米国特許第５，０２８，４４０号（Nissen）は、動物における除脂肪組織の発達を増加させるためのＨＭＢの実用性を論じている。また米国特許第４，９９２，４７０号（Nissen）において、ＨＭＢは、哺乳動物の免疫応答の強化においても有効であると記載されている。米国特許第６，０３１，０００号（Nissenら）は、疾患関連の衰弱を処置するためのＨＭＢおよび少なくとも１種のアミノ酸の使用を記載している。
【０００４】
タンパク質分解を抑制するためのＨＭＢの使用は、ロイシンがタンパク質を節約する特徴を有するという観察に端を発する。必須アミノ酸であるロイシンは、タンパク質合成に使用されるか、またはα−ケト酸（α−ケトイソカプロエート、ＫＩＣ）にアミノ基転移されるかのいずれかであり得る。１つの経路では、ＫＩＣをＨＭＢに酸化することができ、この酸化は、ロイシン酸化のおよそ５％を占める。ＨＭＢは、筋肉の量と強度の強化においてロイシンより優れている。ＨＭＢの最適な作用は、ＨＭＢのカルシウム塩として与えられる場合、３．０グラム／日、または０．０３８ｇ／ｋｇ体重／日で達成することができるが、ロイシンの最適な作用は３０．０グラム／日より多くを必要とする。
【０００５】
ＨＭＢは、一旦生産または摂取されたら、２つの運命をたどると考えられる。第１の運命は、単純な尿への排出である。ＨＭＢが供給された後、尿中濃度が増加し、その結果として尿へのおよそ２０〜５０％のＨＭＢ損失が生じる。別の運命は、ＨＭＢのＨＭＢ−ＣｏＡへの活性化に関する。一旦ＨＭＢ−ＣｏＡに変換されたら、さらなる代謝により、ＨＭＢ−ＣｏＡが脱水されてＭＣ−ＣｏＡになるか、またはＨＭＢ−ＣｏＡがＨＭＧ−ＣｏＡに直接変換されるかのいずれかが起こる可能性があり、それにより細胞内コレステロール合成の基質が生じる。数々の研究から、ＨＭＢは、コレステロール合成経路に取り込まれ、傷害を負った細胞膜の再生に使用される新しい細胞膜のための源になり得ることが示されている。ヒトでの研究によれば、激しい運動後の筋肉の傷害が、上昇した血漿ＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）で測定した場合、４８時間以内の最初のＨＭＢ補給により低減されることが示されている。ＨＭＢの保護的作用は、毎日の使用を続ける場合、３週間まで続く。多数の研究から、ＨＭＢの有効量は、ＣａＨＭＢ（カルシウムＨＭＢ）として３．０グラム／日（約３８ｍｇ／ｋｇ体重／日）であることが示されている。ＨＭＢは、安全性に関して試験されており、健康な若いまたは年配の成人において副作用はないことが示されている。またＨＭＢとＬ−アルギニンおよびＬ−グルタミンとの組合せは、ＡＩＤＳおよびがん患者に補給した場合、安全であることも示されている。
【０００６】
近年、ＨＭＢの新しい送達形態であるＨＭＢ遊離酸が開発された。この新しい送達形態は、ＣａＨＭＢより迅速に吸収され、ＣａＨＭＢより大きい組織クリアランスを有することが示されている。新しい送達形態は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許公報第２０１２００５３２４０号に記載されている。
【０００７】
ＨＭＢは、高い強度の運動からの回復を強化し、それによる筋肉の傷害を減弱することが実証されている。ＨＭＢは、ＴＮＦ−アルファとのタンパク質合成の低下を減弱させ、ＴＮＦに関連するタンパク質分解を減少させる。
【０００８】
例えば長期の戦闘作戦の間に兵士が遭遇するものなどの、回復が最小限の激しい身体活動を調査する研究によれば、ＨＭＢ補給の使用は、この身体的ストレスに関連する有害な作用を和らげることができる。長期の軍事作戦中の兵士において、体重、体の強度および体力の著しい減少が報告されている。これらのストレスは、炎症性サイトカインマーカーの著しい上昇にも関連する。近年の現地調査から、模擬戦闘を含む激しい訓練中の３週間にわたり、兵士にＨＭＢを補給したところ、炎症性応答は減弱され、それに伴って、拡散テンソル画像化により決定したところ、筋肉の完全性を維持したことが実証された。これらの結果は、短い（例えば４日）および長い（例えば１２週）持続時間のＨＭＢ補給は、筋肉に傷害を与えるプロトコールに対するサイトカイン応答を減弱できることを報告する他の調査と一致した。
【０００９】
プロバイオティック
食事サプリメントとしてのプロバイオティックの使用は、過去数年にわたり、様々な疾患の予防および処置のために非常に人気が高まりつつある。プロバイオティックとは、炎症を減少させながら消化器系の健康および免疫機能を改善することに関して有益であることが示唆されている生細菌のことである。バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）などのプロバイオティックは、消化管中での食物の酵素消化を強化することができ、その結果として、より多くの栄養素が吸収されるようになると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，３６０，６１３号
【特許文献２】米国特許第５，３４８，９７９号
【特許文献３】米国特許第５，０２８，４４０号
【特許文献４】米国特許第４，９９２，４７０号
【特許文献５】米国特許第６，０３１，０００号
【特許文献６】米国特許公報第２０１２００５３２４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚くべきことに、かつ意外なことに、ＨＭＢとプロバイオティックとの組合せは、炎症性サイトカインマーカーを減弱し、筋肉の完全性を維持することが発見された。激しい訓練に対するサイトカイン応答の低減は、高い強度の訓練からのより好都合な回復を示すのに使用されることが多い。ＨＭＢとプロバイオティックとの組合せは、ＨＭＢの吸収を強化し、循環中のＨＭＢがＨＭＢ単独の投与と比較して増加することから、このような組合せは相乗的である。このＨＭＢとプロバイオティックとの相乗作用は、単独で投与した場合のＨＭＢの作用と比較して改善された炎症性サイトカインマーカーの減弱および筋肉の完全性によって実証される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの目的は、筋肉の完全性を維持するのに使用するための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、炎症性サイトカインマーカーの減弱において使用するための組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、筋肉の完全性を維持するのに使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
本発明の追加の目的は、炎症性サイトカインマーカーの減弱で使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＨＭＢを含有する組成物にプロバイオティックを添加することによってＨＭＢの吸収を改善する方法を提供することである。
本発明の追加の目的は、ＨＭＢを含有する組成物にプロバイオティックを添加することによって、ＨＭＢが血流中に存在する時間を増加させる方法を提供することである。
【００１５】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の明細書、図面、および特許請求の範囲を参照すれば当業者には明らかになると予想される。
本発明は、これまでに遭遇した困難を克服することを目的とする。その目的のために、ＨＭＢとプロバイオティックとを含む組成物が提供される。本組成物は、それらを必要とする対象に投与される。全ての方法は、ＨＭＢおよびプロバイオティックを動物に投与することを含む。本発明に包含される対象としては、ヒト、およびヒト以外の哺乳動物が挙げられる。本組成物は、それを必要とする対象によって消費される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、４０日の補給後の、激しい軍事訓練に対する炎症性サイトカイン応答の変化を示す。
【図２】図２は、４０日の補給後のＤＴＩ測定値の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
驚くべきことに、かつ意外なことに、プロバイオティックおよびＨＭＢは、相乗的な関係を有することが発見された。ＨＭＢとプロバイオティックとを含有する組成物の使用は、炎症性サイトカインマーカーの減弱および筋肉の完全性の維持をもたらし、これらの作用は、ＨＭＢ単独の投与より多くの量で見られる。ＨＭＢとプロバイオティックとの組合せは、ＨＭＢの吸収を強化し、循環中のＨＭＢがＨＭＢ単独の投与と比較して増加することから、このような組合せは相乗的である。
【００１８】
ＨＭＢ
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸、またはβ−ヒドロキシ−イソ吉草酸は、その遊離酸の形態で、（ＣＨ３）２（ＯＨ）ＣＣＨ２ＣＯＯＨとして表すことができる。用語「ＨＭＢ」は、その遊離酸および塩の形態の両方での前述の化学式を有する化合物、ならびにそれらの誘導体を指す。本発明に関してＨＭＢのあらゆる形態を使用できるが、好ましくは、ＨＭＢは、遊離酸、塩、エステル、およびラクトンを含む群から選択される。ＨＭＢエステルとしては、メチルおよびエチルエステルが挙げられる。ＨＭＢラクトンとしては、イソバレリルラクトン（isovalaryl lactone）が挙げられる。ＨＭＢ塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、クロム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルカリ金属塩、および土類金属塩が挙げられる。
【００１９】
ＨＭＢおよびその誘導体を生産するための方法は、当業界において周知である。例えば、ＨＭＢは、ジアセトンアルコールの酸化によって合成することができる。１つの好適な手順は、Coffmanら、J. Am. Chem. Soc. 80：2882〜2887（1958）によって記載されている。そこに記載されるように、ＨＭＢは、ジアセトンアルコールのアルカリ性次亜塩素酸ナトリウムの酸化によって合成される。生成物は遊離酸の形態で回収され、これは、塩に変換することができる。例えば、ＨＭＢは、Coffmanら（1958）の手順に類似した手順によって、そのカルシウム塩として調製することができ、その手順において、ＨＭＢの遊離酸は、水酸化カルシウムで中和され、エタノール水溶液からの結晶化により回収される。ＨＭＢのカルシウム塩は、メタボリックテクノロジー（Metabolic Technologies、アイオワ州エームズ）から市販されている。
【００２０】
カルシウムβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）の補給
２０年以上前、ＨＭＢのカルシウム塩は、ヒトのための栄養サプリメントとして開発された。研究から、体重１ｋｇ当たり３８ｍｇのＣａＨＭＢが、平均的な人の有効な投薬量であると考えられることが示された。
【００２１】
ＨＭＢがタンパク質の破壊を減少させタンパク質合成を増加させる分子メカニズムが報告されている。Eleyらが行ったインビトロでの研究では、ＨＭＢがｍＴＯＲリン酸化を介してタンパク質合成を刺激することが示された。他の研究から、タンパク質分解誘導因子（proteolysis inducing factor：ＰＩＦ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、およびアンギオテンシンＩＩによって筋肉のタンパク質異化が刺激されるとき、ＨＭＢが、ユビキチン−プロテオソームのタンパク質分解経路誘導の減弱を介してタンパク質分解を減少させることが示された。さらに他の研究から、ＨＭＢが、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−８プロテアーゼの活性化も減弱することが実証された。
【００２２】
ＨＭＢの遊離酸の形態
ほとんどの場合、臨床研究で利用され、筋力増強促進物質として販売されるＨＭＢは、カルシウム塩の形態であった。近年の進歩により、ＨＭＢを、栄養サプリメントとして使用するために遊離酸の形態で製造することが可能になっている。近年、ＨＭＢの新しい遊離酸の形態が開発され、これは、ＣａＨＭＢより迅速に吸収され、その結果として、より迅速でより高いピークの血清ＨＭＢレベルおよび改善された組織への血清クリアランスがもたらされることが示された。
【００２３】
それゆえにＨＭＢの遊離酸は、特に激しい運動の前に直接投与される場合、カルシウム塩の形態より有効なＨＭＢ投与方法であり得る。しかしながら当業者は、この本発明は、あらゆる形態でＨＭＢを包含することを認識しているものと予想される。
【００２４】
あらゆる形態のＨＭＢが、約０．５グラムのＨＭＢから約３０グラムのＨＭＢの典型的な投薬量範囲がもたらされるような様式で、送達および／または投与形態に取り込ませることができる。
【００２５】
ＨＭＢのあらゆる好適な用量を、本発明に関して使用することができる。適した用量を計算する方法は当業界において周知である。ＨＭＢの投薬量は、対応するＣａ−ＨＭＢのモル量を単位として表すことができる。ＨＭＢを経口的または静脈内に投与できる投薬量範囲は、２４時間につき体重１キログラム当たり０．０１〜０．２グラムのＨＭＢ（Ｃａ−ＨＭＢ）の範囲内である。成人の場合、約１００〜２００ポンド（約４５〜９１ｋｇ）の体重と仮定すると、ＨＭＢ（Ｃａ−ＨＭＢベース）の経口または静脈内の投薬量は、０．５〜３０グラム／対象／２４時間の範囲であってもよい。
【００２６】
プロバイオティック
プロバイオティック、例えばバチルス・コアグランス（ＢＣ３０）は、消化器系の健康および免疫機能を改善すること、ならびに炎症を減少させることなどの多くの健康上の利益を有する。加えて、以前の研究から、ＢＣ３０はタンパク質吸収を強化できることが示唆されている。あらゆるプロバイオティックが、本明細書に記載される組成物で使用するのに好適である。バチルス・コアグランスの適切な量は、当業者によって理解されていると予想される。本発明の典型的な組成物は、１グラムの投薬製剤中に、２×１０５〜１０１０コロニー形成単位の生存可能な細菌または細菌胞子（バチルス・コアグランスの場合）を含有する。他の実施態様において、細菌の量は、約１×１０４〜約１×１０１２個の生存可能な細菌の濃度でプロバイオティックを包含する。バチルス・コアグランス細菌は、胞子、栄養細胞、またはそれらの組合せの形態である。実験の実施例ではバチルス・コアグランスを使用したが、本発明は、この特定のバチルス種に限定されない。あらゆる種のプロバイオティック細菌を本発明の組成物および方法で使用することができる。
【００２７】
本組成物が食用の形態で経口投与される場合、本組成物は、好ましくは、食事サプリメント、食料品または医薬品の媒体の形態であり、より好ましくは食事サプリメントまたは食料品の形態である。本組成物を含むあらゆる好適な食事サプリメントまたは食料品が、本発明に関して利用することができる。当業者であれば、本組成物は、形態（例えば食事サプリメント、食料品または医薬品の媒体）に関係なく、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂肪、糖、無機物質および／または微量元素を包含していてもよいことを理解しているものとする。
【００２８】
本組成物を食事サプリメントまたは食料品として調製するために、本組成物は、一般的に、本組成物が食事サプリメントまたは食料品中に実質的に均一に分散するような方法で合わせたりまたは混合したりすると予想される。代替として、本組成物は、液体中に、例えば水中に溶解させることができる。
【００２９】
食事サプリメントの組成物は、粉末、ゲル、液体であってもよいし、または平板状であってもよいし、もしくはカプセル化されていてもよい。
本組成物を含むあらゆる好適な医薬品媒体を本発明に関して利用できるが、好ましくは、本組成物は、好適な医薬担体、例えばデキストロースまたはスクロースと組み合わされる。
【００３０】
さらに、医薬品媒体の組成物は、あらゆる好適な方式で静脈内投与することができる。静脈内注入を介した投与の場合、本組成物は、好ましくは水溶性の非毒性の形態である。静脈内投与は、静脈内（ＩＶ）療法を受けている入院患者に特に好適である。例えば、本組成物は、患者に投与されるＩＶ溶液（例えば、生理食塩水またはグルコース溶液）中に溶解させることができる。また本組成物は、栄養ＩＶ溶液に添加することもでき、このような栄養ＩＶ溶液は、アミノ酸、グルコース、ペプチド、タンパク質および／または脂質を包含していてもよい。静脈内投与される本組成物の量は、経口投与で使用されるレベルに類似していてもよい。静脈内注入は、経口投与より高度に制御され、正確であり得る。
【００３１】
本組成物が投与される頻度を計算する方法は当業界において周知であり、本発明に関してあらゆる好適な投与頻度（例えば、１回の６ｇ用量／日または２回の３ｇ用量／日）を、あらゆる好適な期間にわたり使用することができる（例えば、単回用量を、５分の期間または１時間の期間にわたり投与してもよいし、または代替として、複数回用量を長期にわたり投与してもよい）。本組成物は、長期にわたり、例えば数週間、数ヶ月または数年にわたり投与することができる。
【００３２】
本発明に関して、ＨＭＢおよびプロバイオティックのあらゆる好適な用量を使用することができる。適した用量を計算する方法は当業界において周知である。
特許請求された方法を実行するために、ＨＭＢとプロバイオティックとは、同じ組成物中で投与されないことが当業者には理解されるものと予想される。別の言い方をすれば、特許請求された方法を行うために、プロバイオティックとＨＭＢとの別々のカプセル、丸剤、混合物などが対象に投与されてもよい。
【００３３】
投与すること、または投与という用語は、哺乳動物に組成物を提供すること、組成物を消費すること、およびそれらの組合せを包含する。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例で、本発明をさらに詳細に例示する。本発明の組成物は、一般的に本明細書の実施例で記載および例示されているように、様々な製剤および剤形で合成できることが容易に理解されると予想される。したがって、以下に記載される本発明の方法、製剤および組成物の目下好ましい実施態様のより詳細な説明は、特許請求された本発明の範囲を限定することを意図しているのではなく、単に本発明の目下好ましい実施態様の代表を示したに過ぎない。
【００３５】
方法
参加者
イスラエル国防軍（ＩＤＦ）の精鋭戦闘部隊からの２６人の男性兵士が、この二重盲検並列設計研究への参加を志願した。全ての手順、リスクおよび利益を説明した後、各参加者は、研究に参加するための自身のインフォームドコンセントを提供した。ＩＤＦ医療隊（IDF Medical Corp）の、および医療倫理委員会によるヘルシンキ委員会、ならびにソロカメディカルセンター（Soroka Medical Center）のヘルシンキ委員会が、この調査研究を承認した。参加者は、いかなる追加の食事補給の使用も許可されず、さらに、いかなるアンドロゲンまたは他の運動能力向上薬も消費しなかった。運動能力向上薬の使用および追加の補給に関するスクリーニングは、参加者の補給中に記入された健康調査票を介して達成された。兵士は同じ部隊に属しており、２つのグループ：ＢＣ３０使用のＣａＨＭＢ（ＣａＨＭＢＢＣ３０；ｎ＝９；２０．５±０．８ｙ；１．７５±０．０９ｍ；７５．４±９．６ｋｇ）またはプラセボ使用のＣａＨＭＢ（ＣａＨＭＢＰＬ、ｎ＝９；１９．１±３．４ｙ；１．７３±０．０５ｍ；７１．４±６．４ｋｇ）のうち一方にランダムに振り分けられた。同じ部隊からの、研究への参加に関心を示したがサプリメントの消費に関心がない参加者の第３のグループは、対照グループとして協力することに同意した（ＣＴＬ；ｎ＝８；２０．４±０．７ｙ；１．７３±０．０５ｍ；６８．６±５．３ｋｇ）。
【００３６】
研究プロトコール
４０日の介入期間中、全ての参加者に同じ毎日のプロトコールを施した。
最初の２８日間、兵士を基地に駐留させ、
戦闘技術の開発と週５回の９０分の激しい接近戦（クラヴマガ）訓練を含む調整を含む同じ高度な軍事訓練の職務に参加させた。身体訓練は、１週間当たり平均して２回の５ｋｍ走を包含していた。５週目および６週目に、兵士は、野外で、およそ３５ｋｇ（参加者の体重のおよそ４０％に等しい）の装備を背負って難しい地形を一晩当たり２５ｋｍ〜３０ｋｍを行軍した。この行軍訓練の持続時間は、一晩当たり５〜８時間であった。訓練の最後の夜間に（４０日目）、兵士はまた、行軍訓練後に追加の５ｋｍのストレッチャー運搬も実行した。訓練の最後の２週間中、兵士の睡眠時間は、一晩当たり５〜８時間であった。全ての評価（採血および磁気共鳴映像法［ＭＲＩ］）は、最後のサプリメント消費（４０日目）の前（ＰＲＥ）およびそのおよそ１２時間後（ＰＯＳＴ）の１日で実行された。全ての評価は、ＰＲＥおよびＰＯＳＴの両方で、同じ順番で実行された。
【００３７】
補給プロトコール
ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬ両方における参加者は、１．０ｇのＣａＨＭＢを、３ｇの１日の合計消費量で、３回／日で摂取した。各一回分は、４個のカプセル（２５０ｍｇのＣａＨＭＢ）からなっており、朝食、昼食および夕食中に消費された。ＣａＨＭＢを、メタボリックテクノロジー社（米国アイオワ州エームズ）から得た。プロバイオティックサプリメント（バチルス・コアグランスＧＢＩ−３０、６０８６）は、ガネデンバイオテック社（Ganeden Biotech, Inc、米国オハイオ州メイフィールドハイツ）によって提供された。各一回分は、２．０×１０１０コロニー形成単位を含有していた。参加者は、１日当たり一回分（朝食）を１つ消費した。プラセボは、製造元によって提供され、その外観、重量および味を、被験製品と一致させた。プラセボと被験製品はどちらも粉末形態で提供され、摂取前に、水（約２５０ｍｌ）中に混合した。ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬの参加者に、ＨＭＢおよびＰＬの２回の２０日の供給が提供された。２０日の期間それぞれの最後に、参加者は、全ての使用済みおよび未使用の小袋を返却することが求められた。
【００３８】
血液測定
各試験セッションの前に、安静時の血液サンプルを得た。全ての血液サンプルを、１５分の平衡期間後に得た。これらの血液サンプルを、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブホルダー（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を備えた２０ゲージの使い捨ての針を使用して肘前の腕の静脈から得た。一晩断食後の各セッション中の日の同じ時に各参加者の血液サンプルを得た。全ての血液サンプルを、２つのＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブに収集した。ここで１つのチューブは、抗凝固剤非含有であり、第２のチューブはＫ２ＥＤＴＡ含有であった。最初のチューブ中の血液を室温で３０分凝固させ、その後、第２のチューブからの残存する全血と共に３，０００×ｇで１５分遠心分離した。得られた血漿および血清を、別個の１．８ｍｌのマイクロ遠沈管に入れ、後の分析のために−８０℃で凍結した。
【００３９】
生化学的分析
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の血清濃度を、市販の反応速度アッセイ（セキスイダイアグノスティックス（Sekisui Diagnostics、シャーロットタウン、ＰＥ、カナダ；シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、米国ミズーリ州セントルイス）を製造元の説明書に従って使用して分析した。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、フラクタルキン（ＣＸ３ＣＬ１）、インターフェロン−ガンマ（ＩＮＦ−γ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）を包含するサイトカインおよびケモカインの血漿濃度を、ヒトサイトカイン／ケモカインパネルの一つ（ＥＭＤミリポア（EMD Millipore）、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を使用したマルチプレックスアッセイを介して分析した。加えて、血漿ＨＭＢ濃度を、ガスクロマトグラフィー質量分析によって分析した。これは、メタボリックテクノロジー社によってこれまでに記載された方法を使用して実行された。全てのサンプルを一旦融解させ、ＣＫおよびＬＤＨ濃度についてはＢｉｏＴｅｋ  Ｅｏｎ分光光度計（BioTek、米国バーモント州ウィヌースキ）、およびサイトカインおよびケモカイン濃度についてはＭａｇＰｉｘ（ＥＭＤミリポア）を使用して、同じ技術者によって２連で分析した。全てのアッセイの平均のアッセイ間変動は１０％未満であった。
【００４０】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）
大腿直筋（ＲＦ）および外側広筋（ＶＬ）の筋肉の完全性における変化をＭＲＩを使用して評価した。ロジスティックな考察（時間の要素）により、事前に、研究の主な焦点は、ＣａＨＭＢと共に投与されるＢＣ３０の作用をＣａＨＭＢ単独と比較することであることが決定されたことから、ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬの兵士のみをＭＲＩで評価した。筋肉の完全性を拡散テンソル画像化（densor tensor imaging：ＤＴＩ）を介して決定した。ＤＴＩは、筋肉損傷の無症状の徴候を評価するための高感度のＭＲＩ技術である。ＤＴＩ評価は、細胞膜および他の水の拡散を制約する構造に基づく。水の動きは、固有ベクトルと呼ばれる水拡散の３つの直交方向と、固有値と呼ばれるそれらの強度を決定することによって評価することができる。３つの固有値（λ１、λ２およびλ３）から、異方性度（ＦＡ）および見かけの拡散係数（ＡＤＣ）などのパラメーターを計算して、ボクセルにおける水拡散の特徴を評価することができる。これらの測定は、骨格筋の完全性に関する情報を提供することが実証されている。
【００４１】
３．０テスラの全身撮像装置（Ingenia、フィリップス・メディカル・システムズ（Philips Medical Systems）、ベスト、オランダ）を使用してＭＲＩデータを得た。各測定中、参加者をスキャナー中であおむけにし、フェーズドアレイ表面コイルを使用して画像化した。膝蓋骨より２０ｃｍ上の位置を画像の中心として選び、オイルカプセルを使用してマークした。全てのスキャンを、軸方向に計画し、足から頭にかけて１６０ｍｍごとの幅４ｍｍの４０の断面、および２９０×２８０ｍｍ（ＲＬ×ＡＰ）の視野で構成した。３回の画像獲得を実行した。Ｔ１ｗ  ＤＩＸＯＮを解剖学的な参照として使用し、Ｔ２ｗターボスピン−エコー（T2w Turbo spin-echo）を筋肉に対するあらゆる構造的な傷害を評価するために使用し、拡散テンソル画像化（ＤＴＩ）シーケンスを筋線維を追跡するために使用した。使用したシーケンスパラメーターは、これまでに公開された通りである。
【００４２】
Ｔ２−ＴＳＥおよびＤＴＩスキャンのために、脂肪抑制（ＳＰＡＩＲ−スペクトル選択的な断熱反転回復（spectrally selective adiabatic inversion recovery））を使用した。ＤＴＩシーケンスは、２つのパッケージで画像化された２Ｄ−ＥＰＩシーケンスであった。ｂ値は４００秒／ｍｍ２であり、１５の固有な方向で画像化された。筋線維の追跡分析を、フィリップス（Philips）の「ＦｉｂｅｒＴｒａｋ」ソフトウェアを使用して計算した。断面１５および２５においてＲＦおよびＶＬのＲＯＩ（関心領域）を手描きした。次いでソフトウェアにより、ＦＡが０．１未満の場合、角度の変化が２７°より大きい場合、または線維の長さが１０ｍｍ未満の場合にトラックを消去するアルゴリズムを使用して、筋線維を描いた。全ての評価を同じ研究員が実行した。
【００４３】
統計分析
共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を使用して、全てのＭＲＩおよび血液の従属変数（筋肉傷害のマーカーおよびサイトカイン）を分析した。ＰＲＥおよびＰＯＳＴ値を、それぞれ共変量および従属変数として使用した。ｆ比が有意の場合、ＬＳＤ事後ペアワイズ比較を使用して、グループ間の差を調査した。またＡＮＣＯＶＡの結果も、ＰＲＥからの変化に変換した。全ての比較につき、ｐ≦０．０５のアルファレベルを統計学的に有意とみなした。全てのデータは、別段の規定がない限り平均±ＳＤとして報告される。ＳＰＳＳ（ウィンドウズ（登録商標）用のＩＢＭ統計、バージョン２３．０；ニューヨーク州アーモンク：ＩＢＭ社）を用いて統計的分析を実行した。
【００４４】
結果
この試験に参加した２６人の兵士のうち、２５人が介入を完了した。研究から離脱したのは、訓練中にけがをした参加者のみであった。研究中に報告された補給に関連する副作用はなかった。ＣａＨＭＢおよびＢＣ３０消費（返却されたカプセルおよびＢＣ−３０の小袋の数によって決定した）に基づいて、補給に関するコンプライアンスは２つのＣａＨＭＢグループ間で９５．０±３．０％であった。両方のサプリメントグループにおける参加者のＰＲＥおよびＰＯＳＴにおける血漿ＨＭＢ濃度を分析することによって、研究のコンプライアンスのための追加の測定を実行した。ＰＲＥ（３．２８±０．７３ｎｍｏｌ・Ｌ−１）からＰＯＳＴ（３４．１±４３．９ｎｍｏｌ・Ｌ−１）の評価にかけて血漿ＨＭＢ濃度の有意な上昇（ｐ＝０．０１０）を記録した。
【００４５】
血液データ
炎症性サイトカインの循環中の濃度は、表１で観察することができる。加えて、グループ間のＰＲＥからの変化の比較を図１に示す。循環中のＴＮＦ−α濃度における変化に関して有意な相互作用が観察された（Ｆ＝６．４８、ｐ＝０．００６）。ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬに関して、ＰＯＳＴにおける血漿ＴＮＦ−α濃度はＣＴＬより有意に低かった（それぞれｐ＝０．０１９およびｐ＝０．００２）。しかしながら、ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間に差は記録されなかった（ｐ＝０．２９０）。血漿ＣＸ３ＣＬ１濃度における変化に関しても、グループ間に有意な相互作用は記録されなかった（Ｆ＝４．７０、ｐ＝０．０２５）。ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬに関して、ＣＸ３ＣＬ１濃度の変化はＣＴＬより有意に低かった（それぞれｐ＝０．０４４およびｐ＝０．０１１）。ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間にＣＸ３ＣＬ１濃度における差は記録されなかった（Ｐ＝０．６８７）。血漿ＩＬ−１β濃度における変化に関して、有意な相互作用を記録した（Ｆ＝６．９３、ｐ＝０．００６）。ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬの両方に関して、ＩＬ−１β濃度がＣＴＬと比較して有意に減弱した（それぞれｐ＝０．００５およびｐ＝０．００４）。ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間に差は観察されなかった（ｐ＝０．８７８）。血漿ＩＬ−２濃度に関して、有意な相互作用も見出された（Ｆ＝４．９６、ｐ＝０．０１９）。ＰＯＳＴにおけるＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬに関する循環中のＩＬ−２濃度がＣＴＬと比較して有意に減弱した（それぞれｐ＝０．００７およびｐ＝０．０２９）。ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間に差は記録されなかった（ｐ＝０．５８４）。血漿ＩＬ−６濃度における変化でも、有意な相互作用が観察された（Ｆ＝７．９９、ｐ＝０．００５）。ＣａＨＭＢＢＣ３０およびＣａＨＭＢＰＬにおいて、血漿ＩＬ−６濃度がＣＴＬと比較して有意に減弱した（それぞれｐ＝０．００２およびｐ＝０．０１８）。ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間に、ＰＯＳＴでのＩＬ−６応答における差は記録されなかった（ｐ＝０．４６７）。血漿ＩＬ−１０濃度における変化でも、有意な相互作用が観察された（Ｆ＝３．７２、ｐ＝０．０４１）。ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣＴＬとの間で有意差が見られた（ｐ＝０．０１３）。他の有意差は記録されなかった。ＩＮＦ−γ（Ｆ＝１．２５、ｐ＝０．３１）、ＩＬ−８（Ｆ＝１．４９、ｐ＝０．２５）またはＧＭ−ＣＳＦ（Ｆ＝０．７１、ｐ＝０．５０）濃度における変化に関して、有意な相互作用は観察されなかった。
【００４６】
【表１】
2019531748.tif 000002
【００４７】
ＣａＨＭＢＢＣ３０＝カルシウムＨＭＢおよびバチルス・コアグランス；ＣａＨＭＢＰＬ＝カルシウムＨＭＢおよびプラセボ；ＣＴＬ＝対照。全てのデータは、平均±ＳＤとして報告される。ＡＮＣＯＶＡ試験を使用して、グループ間の差を評価した。
【００４８】
筋肉傷害のマーカーの分析から、血漿ＬＤＨ（Ｆ＝０．１５、ｐ＝０．８６）またはＣＫ濃度（Ｆ＝０．１７、ｐ＝０．８４）に関してグループ間に有意な相互作用がないことが解明された。合わせたグループにおいて、ＰＲＥ（５３７．７±８６．１ＩＵ・Ｌ−１）からＰＯＳＴ（５６７．５±８７．４ＩＵ・Ｌ−１）までのＬＤＨ濃度における変化は記録されなかった。加えて、合わせたグループにおいて、ＰＲＥ（２２５．４±７９．８ＩＵ・Ｌ−１）からＰＯＳＴ（３７７．６±２３０．２ＩＵ・Ｌ−１）までのＣＫ濃度において変化は記録されなかった。
【００４９】
ＤＴＩ
ＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間のＦＡおよびＡＤＣ評価の比較は、表２で観察することができる。
【００５０】
【表２】
2019531748.tif 000003
【００５１】
加えて、図２に、グループ間のＰＲＥからの変化の比較を示す。ＲＦにおいてＣａＨＭＢＢＣ３０とＣａＨＭＢＰＬとの間にＦＡの有意差は観察されなかったが（Ｆ＝０．３１５、ｐ＝０．５８７）、グループ間で急落している場合、ＰＲＥからＰＯＳＴにかけて有意な減少を記録した。ＲＦにおいて、グループ間でＡＤＣの有意差（Ｆ＝７．１９８、ｐ＝０．０２３）を記録した。ＣａＨＭＢＢＣ３０の参加者は、ＡＤＣの減少を経験したが、ＣａＨＭＢＰＬの参加者は増加を経験した。ＦＡ（Ｆ＝２．９５、ｐ＝０．１１７）またはＡＤＣ（Ｆ＝１．８８６、ｐ＝０．２００）のいずれに関しても、グループ間でＶＬの有意差は記録されかった。
【００５２】
この研究の結果は、４０日のバチルス・コアグランス有りおよび無しのＨＭＢ補給が、極めて激しい軍事訓練中に炎症性サイトカインマーカーを減弱できることを示す。この組合せは、対照と比較してＩＬ−１０応答を減弱するようであった。加えて、ＣａＨＭＢおよびＢＣ３０の組合せは、大腿直筋（ＲＦ）に関する見かけの拡散係数（ＡＤＣ）の減少で示されたように、筋肉の完全性の維持において、ＣａＨＭＢ単独と比較して有意な利益をもたらした。
【００５３】
ＣａＨＭＢＰＣ３０、ＣａＨＭＢＰＬおよびＣＴＬの血漿ＨＭＢは、それぞれ５０．６±１５．６ｎｍｏｌ・Ｌ−１、１５．６±２８．０ｎｍｏｌ・Ｌ−１および３．３±０．９ｎｍｏｌ・Ｌ−１であった。ＣａＨＭＢＢＣ３０に関して観察されたＨＭＢ濃度がより大きいことは、ＢＣ３０が強化された吸収能力を有することを示す。
【００５４】
筋肉の完全性の測定をＤＴＩによって実行した。ここでＤＴＩは、筋肉損傷の無症状の徴候を評価する高感度方法とみなされる。ＤＴＩは、３次元の筋肉微細構造における水分子の拡散およびその動きの方向を測定する。健康な組織では、構造の完全性が、拡散に対するバリアとなる。異方性度（ＦＡ）は、外傷後の組織への拡散率の増加を表し、一方で見かけの拡散係数（ＡＤＣ）は、筋肉の各方向における拡散の程度をその軸の長さによって反映する。ＦＡの減少およびＡＤＣの増加は、筋肉の完全性の崩壊を表し、これはすなわち、より大きい拡散を示す。これまでに本発明者らが報告した、プラセボグループのみにおけるＲＦと半腱様筋の両方におけるＦＡの有意な減少、および補給グループにおけるＶＬのＡＤＣ増加の可能性から、遊離酸の形態で提供されたＨＭＢは、激しい軍事訓練中に筋肉の完全性を強化できることが示される。しかしながら、ＣａＨＭＢへのＢＣ３０の添加は、筋肉の完全性の維持に関して相乗効果をもたらし、結果として、ＣａＨＭＢ単独によって提供されるものより大きい程度の筋肉保護をもたらすことがデータから示される。
【００５５】
前述の説明および図面は、本発明の例示的な実施態様を含む。前述の実施態様および本明細書に記載される方法は、当業者の能力、経験、および選択に基づき変更することができる。単に方法の工程を特定の順番で列挙しているが、方法の工程に対するいかなる限定ともみなされない。前述の説明および図面は単に本発明を説明および例示するものであり、特許請求の範囲によってそのように限定される場合を除いて、本発明はそれらに限定されない。当業者は、事前に本開示を知ることで、そこに本発明の範囲から逸脱することなく改変およびバリエーションをなすことができると予想される。
【００５６】
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【図１】
2019531748.tif 000004
【図２】
2019531748.tif 000005
【国際調査報告】
2019531748.tif 000006