(57)【要約】  本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系における使用のための変異Ｃａｓ９核酸及びタンパク質並びにこれらの使用方法に関する。特に、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性である単離された変異Ｃａｓ９タンパク質であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す、単離された変異Ｃａｓ９タンパク質に関する。本発明はまた、変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸、リボ核タンパク質複合体並びに野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す変異Ｃａｓ９タンパク質を有するＣＲＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系も含む。
2019533996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性である単離された変異Ｃａｓ９タンパク質であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す、単離された変異Ｃａｓ９タンパク質。
【請求項２】
（ａ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置から選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された単一置換変異、又は
（ｂ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異
からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１に記載の単離された変異Ｃａｓ９タンパク質。
【請求項３】
Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ｓ又はＲ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａの位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１に記載の単離された変異Ｃａｓ９タンパク質。
【請求項４】
配列番号７〜３８からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された変異Ｃａｓ９タンパク質。
【請求項５】
配列番号３９〜８８からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された変異Ｃａｓ９タンパク質。
【請求項６】
変異Ｃａｓ９タンパク質、及び
ｇＲＮＡ複合体
を含む、単離されたリボ核タンパク質複合体であって、
前記単離されたリボ核タンパク質複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系として活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す、単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項７】
ｇＲＮＡが、化学量論（１：１）比のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項８】
ｇＲＮＡが、
所与の遺伝子座についての特定の編集標的部位に対するＡｌｔ−Ｒ（商標）ｃｒＲＮＡを含む単離されたｃｒＲＮＡ、及び
Ａｌｔ−Ｒ（商標）ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｔｒａｃｒＲＮＡ
を含む、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項９】
ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡを含む、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項１０】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、
（ａ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置から選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された単一置換変異、又は
（ｂ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異
からなる群から選択される置換変異を含む、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項１１】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ｓ又はＲ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａの位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異からなる群から選択される置換変異を含む、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項１２】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号７〜３８からなる群から選択される、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項１３】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号３９〜８８からなる群から選択される、請求項６に記載の単離されたリボ核タンパク質複合体。
【請求項１４】
変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸であって、変異Ｃａｓ９タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す、核酸。
【請求項１５】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、
（ａ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置から選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された単一置換変異、又は
（ｂ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１４に記載の変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１６】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ｓ又はＲ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａの位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１４に記載の変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１７】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号７〜３８からなる群から選択される、請求項１４に記載の変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１８】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号３９〜８８からなる群から選択される、請求項１４に記載の変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１９】
変異Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系であって、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２０】
ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２１】
ＤＮＡ発現ベクターが、プラスミドによるベクターを含む、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２２】
ＤＮＡ発現ベクターが、細菌発現ベクター及び真核細胞発現ベクターから選択される、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２３】
ｇＲＮＡが、化学量論（１：１）比のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２４】
ｃｒＲＮＡが、所与の遺伝子座についての特定の編集標的部位に対するＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡが、Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２５】
ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡを含む、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２６】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、
（ａ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置から選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された単一置換変異、又は
（ｂ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異
からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２７】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ｓ又はＲ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａの位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異からなる群から選択される置換変異を含む、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２８】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号７〜３８からなる群から選択される、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項２９】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号３９〜８８からなる群から選択される、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系。
【請求項３０】
オフターゲット編集活性を減少させる及び／又はオンターゲット編集活性を増加させる遺伝子編集を実施する方法であって、
候補編集標的部位遺伝子座を、変異Ｃａｓ９タンパク質を有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と接触させるステップを含み、前記活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す、方法。
【請求項３１】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、
（ａ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置から選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された単一置換変異又は
（ｂ）Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５の位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質に導入された二重置換変異
からなる群から選択される置換変異を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａの位置のうちの２つから選択される、ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質
に導入された二重置換変異からなる群から選択される置換変異を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号７〜３８からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
変異Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号３９〜８８からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条の下、２０１６年１０月７日に出願した「ＮＯＶＥＬ  Ｓ．ＰＹＯＧＥＮＥＳ  ＣＡＳ９  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＴＨＡＴ  ＲＥＤＵＣＥ  ＯＦＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＧＥＮＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ  ＷＨＩＬＥ  ＭＡＩＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＯＮ  ＴＡＲＧＥＴ  ＰＯＴＥＮＣＹ」と題する米国仮特許出願第６２／４０５，６０１号に対する優先権の利益を主張するものであり、参照によりその内容全体を本明細書に組み込む。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出された配列表を含み、参照によりその全体を本明細書に組み込む。２０１５年１２月１８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＩＤＴ０１−００９−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、＿＿＿バイトサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、Ｃａｓ９変異遺伝子、これによってコードされるポリペプチド及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の組成物におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
部位特異的ＤＮＡ切断のための、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）及び関連Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）の使用は、多くの生物学的用途に対する優れた潜在性を示してきた。ＣＲＩＳＰＲは、ゲノム編集、内在性遺伝子に対する転写抑制因子（ＣＲＩＳＰＲｉ）及び活性化因子（ＣＲＩＳＰＲａ）のゲノムスケール特異的ターゲティング並びにＣａｓ酵素によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡターゲティングの他の用途に使用されている。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌及び古細菌に天然であり、ウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を提供する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の３つのクラスが研究及び治療試薬に潜在的に適応され得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、単一ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ（具体的に、Ｃａｓ９）を、適切なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との複合体中で利用する際に望ましい特徴を有する。細菌又は古細菌において、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは２つの別々のＲＮＡ種を含む。標的特異的ＣＲＩＳＰＲ活性化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特異的ＤＮＡ配列に結合し、これを標的とするようにＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を導く。ｃｒＲＮＡは、２つの機能ドメインである、標的特異的である５’ドメイン及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とのｃｒＲＮＡの結合を導く３’ドメインを有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに結合し、ｇＲＮＡ複合体のＣａｓ９との結合を媒介する、より長いユニバーサルＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡの結合は、Ｃａｓ９構造の変化を誘導し、不活性なコンフォメーションから活性なコンフォメーションにシフトする。ｇＲＮＡ機能はまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが単一種に融合されている、人工単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）としても提供され得る（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７、８１６〜２１頁、２０１２年を参照のこと。）。ｓｇＲＮＡフォーマットは、転写プロモーター及びｓｇＲＮＡ配列を含有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）カセットによって提供され得る単一の転写単位からの機能的ｇＲＮＡの転写を可能にする。哺乳動物系において、これらのＲＮＡは、ＲＮＡ転写を駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（Ｕ６又はＨ１のような）、ウイルスベクター及びインビトロ転写後の一本鎖ＲＮＡを含有するＤＮＡカセットのトランスフェクションによって導入されてきた（Ｘｕ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０１４年．８０（５）：１５４４〜５２頁を参照のこと。）。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、一例として、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ｐｙ．又はＳｐｙ）に存在する系を使用すると、天然ｃｒＲＮＡは、約４２塩基長であり、標的配列に相補的である約２０塩基長の５’領域（ｃｒＲＮＡのプロトスペーサー配列又はプロトスペーサードメインとも称されている。）及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の領域に相補的であり、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡとの結合を媒介する、典型的に約２２塩基長の３’領域を含有する。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、相補的標的ＤＮＡのＣａｓ９切断を導くことができる機能的ｇＲＮＡを含む。天然ｔｒａｃｒＲＮＡは、約８５〜９０塩基長であり、ｃｒＲＮＡに相補的な領域を含有する５’領域を有する。ｔｒａｃｒＲＮＡの残りの３’領域は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体のＣａｓ９との結合を媒介する二次構造モチーフ（本明細書において「ｔｒａｃｒＲＮＡ  ３’テール」と称されている。）を含む。
【０００７】
Ｊｉｎｅｋらは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の適切な機能化に必要とされるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの物理的ドメインを広範囲に調査した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、３３７（６０９６）：８１６〜２１頁）。彼らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓにおいて依然として機能することができる切断されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ断片を考案し、ｃｒＲＮＡは、野生型の４２個のヌクレオチドであり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、７５個のヌクレオチドに切断されていた。彼らはまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、リンカーループと連結され、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する実施形態を開発し、これは、異なる実施形態において、９９〜１２３個のヌクレオチドの間で異なる。
【０００８】
少なくとも３つのグループが、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）の結晶構造を解明した。Ｊｉｎｅｋ，Ｍらにおいて、この構造は、ガイドＲＮＡ又は標的ＤＮＡのいずれかとの複合体においてヌクレアーゼを示さなかった。彼らは、分子モデリング実験を実施して、ＲＮＡ及びＤＮＡの複合体におけるタンパク質間の予測的相互作用を明らかにした（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年、３４３、１２１５頁、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ／１２４７９９７）。
【０００９】
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈらにおいて、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９の結晶構造は、ｓｇＲＮＡ及びこの標的ＤＮＡの複合体において２．５オングストローム解像度にて示されている（Ｃｅｌｌ、２０１４年、１５６（５）：９３５〜４９頁、その全体を本明細書に組み込む。）。この結晶構造は、Ｃａｓ９酵素に対する２つのローブ：認識ローブ（ＲＥＣ）及びヌクレアーゼローブ（ＮＵＣ）を同定した。ｓｇＲＮＡ：標的ＤＮＡヘテロ二重鎖（負の電荷を持つ。）は、２つのローブ間の正の電荷を持つ溝にある。既知のタンパク質との構造的類似性を示さず、したがってＣａｓ９特異的機能ドメインのようなＲＥＣローブは、互いに相補的であるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分と相互作用する。
【００１０】
別のグループである、Ｂｒｉｎｅｒら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１４年、５６（２）：３３３〜９頁、その全体を本明細書に組み込む。）は、天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖及びｓｇＲＮＡ内の６つの保存モジュールを同定し、特徴付けた。Ａｎｄｅｒｓら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、５１３（７５１９）、５６９〜７３頁）は、ｓｇＲＮＡガイドと関連するＣａｓ９によるプロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）配列のＤＮＡ配列認識についての構造的基盤を解明した。
【００１１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、以下のようにゲノム工学において利用されている：ｇＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体又はｓｇＲＮＡのいずれか）はＣａｓ９と結合し、Ｃａｓ９を活性化し、ＤＮＡ結合クレフトを開くコンフォメーション変化を誘導し、ｃｒＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）のプロトスペーサードメインは相補的標的ＤＮＡと整列し、Ｃａｓ９はＰＡＭ配列に結合し、標的ＤＮＡの巻き戻しを開始し、続いて標的に対するプロトスペーサードメインのアニーリングが起こり、この後、標的ＤＮＡの切断が生じる。Ｃａｓ９は、エンドヌクレアーゼＨＮＨ及びＲｕｖＣのそれぞれに相同的な２つのドメインを含有し、ＨＮＨドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインは、非相補鎖を切断する。これは、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断をもたらす。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復された場合、切断は、典型的に不正確な様式において修復され、１つ以上の塩基だけシフトされているＤＮＡ配列をもたらし、天然ＤＮＡ配列の崩壊につながり、多くの場合、この事象がタンパク質をコードする遺伝子のコーディングエキソン内で起こる場合、フレームシフト変異につながる。切断はまた、相同性により導かれる組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）によって修復され得、これにより、Ｃａｓ９切断によって作り出された切断部位に導入される、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を有する細胞に導入された外因性ＤＮＡに基づく新たな遺伝物質の挿入が可能となる。
【００１２】
野生型（ＷＴ）Ｃａｓ９タンパク質は、高い効率でほとんどのＤＮＡ標的を切断するが、研究用途を複雑にし、医療用途に大きな懸念をもたらすのに十分なレベルの望ましくないオフターゲット編集を示す。この文脈において、オフターゲット切断は、ゲノムＤＮＡ標的部位がｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのプロトスペーサードメインに対する完全な相補性とは異なる部位において生じるＤＮＡ切断事象として定義される。このようなオフターゲット切断経路を介して非標的化部位に切断事象を導入することは望ましくない。典型的に、切断は、ｇＲＮＡに対して完全な相補性を有するゲノム内の部位でのみ望まれる。いくつかのグループが、減少したオフターゲット切断活性を示す新規変異Ｃａｓ９酵素を公開している（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、３５１、８４〜８８頁；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１６年、５２９、４９０〜４９５頁；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１７年、ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４２６８（２０１７年）を参照のこと。）。これらの３つの刊行物に記載されている変異体は、Ｃａｓ９タンパク質の結晶構造に基づいてタンパク質とＲＮＡガイド及び／又はＤＮＡ基質との間の接触部位として同定された、Ｃａｓ９タンパク質における特定のアミノ酸残基の選択的変異によって設計された。作用機構の知見はこれらの発明を実施するために（すなわち、改善された特異性でゲノム編集を実施するために）必要とされないが、改善された忠実度の変異体は、ＷＴ酵素と比較して、基質ＤＮＡに対する変異Ｃａｓ９ヌクレアーゼの相対的親和性を減少させることによって作用し、ガイドＲＮＡと基質ＤＮＡとの間のミスマッチが不安定化する可能性をより高くすると最初は考えられた。より最近、変異が、不活性コンフォメーションから活性コンフォメーションへのＣａｓ９構造の転移を制限すること、及びこの転移が、ＲＮＡガイドとＤＮＡ標的との間のミスマッチの存在下で比較的効果的に発生しないことが提案された。機構にかかわらず、これらの変異Ｃａｓ９酵素は、必要に応じて、ガイドＲＮＡに対して不完全な相補性を有する標的ＤＮＡの減少した切断を示す。しかしながら、この改善された特異性は、オンターゲット活性も減少させるという犠牲を払い、このことは望ましくない。改善された特異性のＣａｓ９変異体を開示した３つの従来技術の例の全てにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用したゲノム編集が、プラスミド又は他の発現に基づく手法、すなわち、２０１３年に最初に記載された方法を使用して行われた（Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３３９、８１９〜８２３頁；Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３３９、８２３〜８２６頁を参照のこと。）。しかしながら、プラスミド系はゲノム編集に複雑さをもたらすことが現在理解されている。例えば、プラスミドは宿主ゲノムに組み込まれ得、それによって、望まれない他のゲノム変化を導き得る又はこれは先天性免疫応答を誘発し得、細胞死をもたらし得る。これら及び他の理由のために、プラスミド系は、正確な編集が望まれる研究用途には理想的ではなく、このような副作用が許容され得ない医療用途には実用的ではない。より最近、組換えＣａｓ９タンパク質が合成ｇＲＮＡと予め複合体化されているリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を使用する方法が、ＤＮＡに基づく発現構築物を使用するより好ましいことが示されている。ＲＮＰ法は、副作用が低減した高活性ゲノム編集をもたらす（Ｃｈｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４年、２４、１３２〜１４１頁；Ａｉｄａら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５年、１６、８７〜９８頁を参照のこと。）。したがって、ＲＮＰプロトコールと適合性がある高忠実度のゲノム編集法を開発することが望まれる。改善された特異性のＣａｓ９変異体を記載している以前に引用された公開された例は全て、ゲノム編集結果を実施及び研究するために、プラスミドに基づくＤＮＡ発現カセットを利用していた。この方法は、長期間の間、変異Ｃａｓ９タンパク質の高レベルの過剰発現をもたらし、変異体の見かけの酵素活性を増加させる。本発明者らは、これらの改善された特異性のＣａｓ９変異体（ｅＳｐＣａｓ９（１．１）及びＣａｓ９−ＨＦ１）が、ゲノム編集を実施するためにＲＮＰ法を使用する場合、酵素活性を減少させ、その結果、標的ＤＮＡ部位の切断が、ＷＴ  Ｃａｓ９タンパク質による切断と比較して顕著に損なわれ、多くの場合、ＷＴ  Ｃａｓ９タンパク質を使用すると高い効率で作用する標的部位が、変異バリアントを使用すると切断についてのいかなる証拠も示さないほどであることを本明細書に記載している。したがって、公開された変異Ｃａｓ９タンパク質は、特に、より医学的に関連するＲＮＰ法が利用される場合、正確なゲノム編集のための有用性が限られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７、８１６〜２１頁、２０１２年
【非特許文献２】Ｘｕ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０１４年．８０（５）：１５４４〜５２頁
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、３３７（６０９６）：８１６〜２１頁
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年、３４３、１２１５頁、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ／１２４７９９７
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ、２０１４年、１５６（５）：９３５〜４９頁
【非特許文献６】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１４年、５６（２）：３３３〜９頁
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、５１３（７５１９）、５６９〜７３頁
【非特許文献８】Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、３５１、８４〜８８頁
【非特許文献９】Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１６年、５２９、４９０〜４９５頁
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１７年、ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４２６８（２０１７年）
【非特許文献１１】Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３３９、８１９〜８２３頁
【非特許文献１２】Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３３９、８２３〜８２６頁
【非特許文献１３】Ｃｈｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４年、２４、１３２〜１４１頁
【非特許文献１４】Ａｉｄａら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５年、１６、８７〜９８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、Ｃａｓ９ゲノム編集の特異性を改善する方法に対する必要性が依然として存在している。特に、ＲＮＰフォーマットにおいて利用される場合、ＷＴ  Ｃａｓ９酵素と同様の高い酵素活性を保持しながら、改善された特異性を示すＣａｓ９の変異体に対する必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのＣａｓ９変異遺伝子及びポリペプチド並びにこれらの使用方法に関する。
【００１６】
第１の態様において、単離された変異Ｃａｓ９タンパク質が提供されている。単離された変異Ｃａｓ９タンパク質は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼ系（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」）において活性である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す。
【００１７】
第２の態様において、単離されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が提供されている。ＲＮＰ複合体は変異Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体を含む。単離されたリボ核タンパク質複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系として活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す。
【００１８】
第３の態様において、変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸が提供されている。変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す。
【００１９】
第４の態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が提供されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、変異Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す。
【００２０】
第５の態様において、オフターゲット編集活性を減少させる及びオンターゲット編集活性を維持する遺伝子編集を実施する方法が提供されている。この方法は、候補編集ＤＮＡ標的部位遺伝子座を、適切なｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体又はｓｇＲＮＡ）と複合体化された変異Ｃａｓ９タンパク質を有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と接触させるステップを含む。前記相互作用は、いずれかの環境、例えば、生きている動物、生細胞又はインビトロで単離されたＤＮＡにおいて生じ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】高いオンターゲット切断活性及び低いオフターゲット切断活性を有する変異Ｃａｓ９配列を選択するために利用された細菌遺伝子スクリーニングの概略図である。
【図２】Ｃａｓ９ヌクレアーゼがプラスミドによって送達される場合（実施例３に記載されている。）、オフターゲット編集を減少させるＳ．ピオゲネスＣａｓ９における例示的な単一アミノ酸変異を示す図であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集実験は、ヒトＥＭＸ１遺伝子を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を共トランスフェクトした一連の変異Ｃａｓ９プラスミド発現カセット（ＷＴ  Ｃａｓ９又は示した変異Ｃａｓ９を発現する。）を使用した。ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションの４８時間後に相対的編集効率を測定した。相対的オンターゲット編集効率は、Ｙ軸において左側にある黒いバーで示され（オンターゲット配列５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１３３））、既知のオフターゲット部位における編集は、Ｙ軸において右側にある白いバーで示され（オフターゲット配列５’−ＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１３４）、下線を引いたヌクレオチドはゲノムＤＮＡ標的におけるＰＡＭ部位を明瞭にし、太字で強調された塩基は、オンターゲット部位に対するオフターゲット部位の塩基ミスマッチを示す。）。オフターゲット部位はＴｓａｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７〜１９７頁、２０１５年）によって同定された。実験条件は、１つのウェル当たり０．５マイクロリットルのＴｒａｎｓｉｔ  Ｘ−２を用いてリポフェクションによって導入された３０ｎＭのＥＭＸ１  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ及び１００ｎｇのＣａｓ９プラスミドを含む。エラーバーは平均値の標準誤差を表す（ｎ＝３）。
【図３】Ｃａｓ９ヌクレアーゼがプラスミドによって送達される場合（実施例３に記載されている。）、オフターゲット編集を減少させるＳ．ピオゲネスＣａｓ９における例示的な単一アミノ酸変異を示す図であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集実験は、ヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を共トランスフェクトした一連の変異Ｃａｓ９プラスミド発現カセット（ＷＴ  Ｃａｓ９又は示した変異Ｃａｓ９を発現する。）を使用した。ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションの４８時間後に相対的編集効率を測定した。相対的オンターゲット編集効率は、Ｙ軸において左側にある黒いバーで示され（５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１３５））、既知のオフターゲット部位における編集は、Ｙ軸において右側にある白いバーで示され（オフターゲット配列５’−ＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１３６）、下線を引いたヌクレオチドはゲノムＤＮＡ標的におけるＰＡＭ部位を明瞭にし、太字で強調された塩基は、オンターゲット部位に対するオフターゲット部位の塩基ミスマッチを示す。）。オフターゲット部位はＴｓａｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７〜１９７頁、２０１５年）によって同定された。実験条件は、１つのウェル当たり０．５マイクロリットルのＴｒａｎｓｉｔ  Ｘ−２を用いてリポフェクションによって導入された３０ｎＭのＥＭＸ１  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ及び１００ｎｇのＣａｓ９プラスミドを含む。エラーバーは平均値の標準誤差を表す（ｎ＝３）。
【図４】細菌スクリーニングにより選択された変異アミノ酸がアラニンにより代替的に置換されている場合、同一又はさらに減少したオフターゲット編集を生じるＣａｓ９によってオフターゲット編集を減少させるＳ．ピオゲネスＣａｓ９における例示的なアミノ酸変異を示す図である。Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ複合体は、ＥＭＸ１遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を用いて図２に示されているように送達される。相対的オンターゲット編集効率は、Ｙ軸において左側にある黒いバーで示され（オンターゲット配列５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１３３））、既知のオフターゲット部位における編集は、Ｙ軸において右側にある白いバーで示され（オフターゲット配列５’−ＧＡＧＴＴＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１３４）、下線を引いたヌクレオチドはゲノムＤＮＡ標的におけるＰＡＭ部位を明瞭にし、太字で強調された塩基は、オンターゲット部位に対するオフターゲット部位の塩基ミスマッチを示す。）。各場合、細菌により選択された変異体及びこのアラニン置換対応物は並んでいる。実験条件及びエラー分析は図２に示されているものと同一である。
【図５】細菌スクリーニングにより選択された変異アミノ酸がアラニンにより代替的に置換されている場合、同一又はさらに減少したオフターゲット編集を生じるＣａｓ９によってオフターゲット編集を減少させるＳ．ピオゲネスＣａｓ９における例示的なアミノ酸変異を示す図である。Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ複合体は、ＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を用いて図３に示されているように送達される。相対的オンターゲット編集効率は、Ｙ軸において左側にある黒いバーで示され（５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１３５））、既知のオフターゲット部位における編集は、Ｙ軸において右側にある白いバーで示され（オフターゲット配列５’−ＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１３６）、下線を引いたヌクレオチドはゲノムＤＮＡ標的におけるＰＡＭ部位を明瞭にし、太字で強調された塩基は、オンターゲット部位に対するオフターゲット部位の塩基ミスマッチを示す。）。各場合、細菌により選択された変異体及びこのアラニン置換対応物は並んでいる。実験条件及びエラー分析は図３に示されているものと同一である。
【図６】Ｃａｓ９タンパク質における異なる単一及び二重アミノ酸変異を比較している相対的オンターゲット及びオフターゲット編集効率を示す例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集実験を示す図であり、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ複合体は、ＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を用いて図３に示されているように送達される。相対的オンターゲット編集効率は、Ｙ軸において左側にある黒いバーで示され（５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１３５））、既知のオフターゲット部位における編集は、Ｙ軸において右側にある白いバーで示され（オフターゲット配列５’−ＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧ（配列番号１３６）、下線を引いたヌクレオチドはゲノムＤＮＡ標的におけるＰＡＭ部位を明瞭にし、太字で強調された塩基は、オンターゲット部位に対するオフターゲット部位の塩基ミスマッチを示す。）。実験条件及びエラー分析は図２及び３並びに図４及び５に示されているものと同一である。
【図７】精製された組換えＲ６９１Ａ  Ｃａｓ９変異タンパク質が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として送達される場合、既知のｅＳｐＣａｓ９（１．１）又はＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質より優れたオンターゲット編集活性を示すことを実証している図である。ＲＮＰ複合体は、ＷＴ（黒）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）（白）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（灰色）又はＲ６９１Ａ（斜線ハッチ）Ｃａｓ９タンパク質及びＨＲＰＴ遺伝子座内の異なる部位を標的とするＡｌｔ−Ｒ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ  配列番号８９〜１００）を用いて形成された（１μＭ）。細胞へのＲＮＰ送達は、分析の４８時間前に、ＨＥＫ２９３細胞において１．２マイクロリットルのＲＮＡｉＭＡＸリポフェクションと共に１０ｎＭのＲＮＰ（１：１：１の比のＣａｓ９：ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ（Ａｌｔ−Ｒ  ｃｒＲＮＡ）を含んだ。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図８】精製された組換えＲ６９１Ａ  Ｃａｓ９変異タンパク質が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として送達される場合、既知のｅＳｐＣａｓ９（１．１）又はＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質より優れたオンターゲット編集活性を示すことを実証している図である。ＲＮＰ複合体は、ＷＴ（黒）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）（白）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（灰色）又はＲ６９１Ａ（斜線ハッチ）Ｃａｓ９タンパク質及びＣＴＬＡ４遺伝子座内の異なる部位を標的とするＡｌｔ−Ｒ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ  配列番号１０１〜１１２）を用いて形成された（１μＭ）。実験の詳細及びエラー分析は、図７に記載されているものと同様である。
【図９】３つの異なるｃｒＲＮＡについて３つの独立した、検証されたオフターゲット部位においてＲＮＰ複合体として送達される場合、Ｒ６９１Ａ変異Ｃａｓ９を用いたＴ７ＥＩ分析によってオフターゲット編集活性が検出不能であることを示す実験の例示的な結果を示す図である。ＲＮＰ複合体は、ＷＴ（黒）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）（白）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（灰色）又はＲ６９１Ａ（斜線ハッチ）Ｃａｓ９タンパク質及びヒトＥＭＸ１（左）（配列番号１１３）、ＨＥＫＳｉｔｅ４（中央）（配列番号１１４）又はＶＥＧＦＡ３（右）（配列番号１１６）遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体を用いて形成された（１μＭ）。ＥＭＸ１及びＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座に対するオンターゲット及びオフターゲット部位は、それぞれ図２及び図３に記載されている通りである。ＶＥＧＦＡ３遺伝子座（５’−ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１３７））及びこのガイドについての問題のある既知のオフターゲット部位についてのオンターゲット編集が示されている（５’−ＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１３８）、下線を引いたヌクレオチドはＰＡＭ部位を示し、オフターゲット部位とオンターゲット部位との間の塩基の差異は太字フォントで強調されている（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７〜１９７頁、２０１５年）。
【図１０】Ｒ６９１Ａ変異体が、低い効率の編集を慣例的に実証し、したがってオンターゲット編集効率における差異を区別するのに有用である高いオンターゲット編集活性ガイド部位を維持する一方で、この変異を、二重又は三重変異体として細菌スクリーニングにおいて同定された他のアミノ酸変化と組み合わせること（すなわち、Ｃａｓ９によってオフターゲット編集活性を減少させる選択された変異を組み合わせること）もまた、オンターゲット編集活性を顕著に減少させることを示す実験の例示的な結果を示す図である。ＲＮＰ複合体は、ＨＲＰＴ  ３８５０９遺伝子座（配列番号９２）を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を用いてＷＴ、Ｒ６９１Ａ、Ｎ６９２Ａ、Ｔ７４０Ａ、Ｓ８４５Ａ、Ｓ８７２Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｔ７４０Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｓ８４５Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｓ８７２Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｔ７４０Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｓ８４５Ａ又はＲ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｓ８７２Ａ  Ｃａｓ９タンパク質と形成された（１μＭ）。ＲＮＰ複合体（１０ｎＭ）は、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して逆トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内へ送達され、ＤＮＡは４８時間後に抽出された。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図１１】Ｒ６９１Ａ変異体が、課題のあるオンターゲット部位において高いオンターゲット編集活性を維持する一方で、この変異を、二重又は三重変異体として細菌スクリーニングにおいて同定された他のアミノ酸変化と組み合わせること（すなわち、Ｃａｓ９によってオフターゲット編集活性を減少させる選択された変異を組み合わせること）が、オンターゲット編集活性を顕著に減少させることを示す実験の例示的な結果を示す図である。ＲＮＰ複合体は、ＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体（配列番号１１４）を用いてＷＴ、Ｒ６９１Ａ、Ｎ６９２Ａ、Ｔ７４０Ａ、Ｓ８４５Ａ、Ｓ８７２Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｔ７４０Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｓ８４５Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｓ８７２Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｔ７４０Ａ、Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｓ８４５Ａ又はＲ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｓ８７２Ａ  Ｃａｓ９タンパク質と形成された（１μＭ）。ＲＮＰ複合体（１０ｎＭ）は、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して逆トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内へ送達され、ＤＮＡは４８時間後に抽出された。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座についてのオンターゲット及びオフターゲット部位は図３に記載されている通りである。実験の詳細及びエラー分析は、図９に記載されているものと同様である。
【図１２】多くの置換がオンターゲット編集活性を維持し、他が編集効率を損なう、ＨＰＲＴ  ３８５０９部位での編集に対する、Ｒ６９１位置でのあらゆる可能なアミノ酸置換変異の導入の効果を示す例示的な実験結果を示す図である。Ｃａｓ９タンパク質はプラスミドによって送達され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集実験は、プラスミド媒介Ｃａｓ９（ＷＴ「Ｒ６９１」Ｃａｓ９（配列番号５）又は示した変異Ｃａｓ９（配列番号７、７１〜８８）を発現する。）を使用し、ＨＰＲＴ３８５０９遺伝子座（配列番号９２）を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を共トランスフェクトした。実験条件は、１つのウェル当たり０．５マイクロリットルのＴｒａｎｓｉｔ  Ｘ−２を用いてリポフェクションによって導入された３０ｎＭのＨＰＲＴ  ３８５０９  ｃｒＲＮＡ及び１００ｎｇのＣａｓ９プラスミドを含み、細胞を分析の４８時間前にインキュベートした。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図１３】オンターゲット活性の保持も示しながら、変異の大部分がオフターゲット編集を劇的に減少させる、ＨＥＫＳｉｔｅ４部位での編集に対する、Ｒ６９１位置でのあらゆる可能なアミノ酸置換変異の導入の効果を示す例示的な実験結果を示す図である。Ｃａｓ９タンパク質はプラスミドによって送達され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集実験は、プラスミド媒介Ｃａｓ９（ＷＴ「Ｒ６９１」Ｃａｓ９（配列番号５）又は示した変異Ｃａｓ９（配列番号７、７１〜８８）を発現する。）を使用し、ＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座（配列番号１１４）を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を共トランスフェクトした。実験条件は、１つのウェル当たり０．５マイクロリットルのＴｒａｎｓｉｔ  Ｘ−２を用いてリポフェクションによって導入された３０ｎＭのＨＥＫＳｉｔｅ４  ｃｒＲＮＡ及び１００ｎｇのＣａｓ９プラスミドを含み、細胞を分析の４８時間前にインキュベートした。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座についてのオンターゲット及びオフターゲット部位は、図３に記載されている通りである。実験の詳細及びエラー分析は、図９に記載されているものと同様である。
【図１４】Ｒ６９１位置において異なるアミノ酸置換を有する選択されたＣａｓ９変異タンパク質が、ヒトＨＰＲＴ遺伝子内の異なるガイド部位におけるオンターゲット編集活性を維持することを示す実験の例示的な結果を示す図である。ＲＮＰ複合体は、ＨＲＰＴ  ３８５０９又はＨＰＲＴ  ３８０８７遺伝子座（配列番号９２及び９４）のいずれかを標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体を用いてＷＴ（Ｒ６９１）、Ｒ６９１Ａ、Ｒ６９１Ｄ、Ｒ６９１Ｇ、Ｒ６９１Ｈ、Ｒ６９１Ｙ又はＲ６９１Ｗ  Ｃａｓ９タンパク質（それぞれ配列番号５、７、７３、７７、７８、８７及び８６）と形成された（１μＭ）。ＲＮＰ複合体（１０ｎＭ）は、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して逆トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内へ送達され、ＤＮＡは４８時間後に抽出された。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。実験の詳細及びエラー分析は、図９に記載されているものと同様である。
【図１５】Ｒ６９１位置において異なるアミノ酸置換を有する選択されたＣａｓ９変異タンパク質が、オンターゲット編集活性を維持し、複数のガイドによりオフターゲット編集活性を減少させることを示す実験の例示的な結果を示す図である。ＲＮＰ複合体は、ＨＥＫＳｉｔｅ４（配列番号１１４）又はＥＭＸ１（配列番号１１３）遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体を用いてＷＴ（Ｒ６９１）、Ｒ６９１Ａ、Ｒ６９１Ｄ、Ｒ６９１Ｇ、Ｒ６９１Ｈ、Ｒ６９１Ｙ又はＲ６９１Ｗ  Ｃａｓ９タンパク質（それぞれ配列番号５、７、７３、７７、７８、８７及び８６）と形成された（１μＭ）。ＲＮＰ複合体（１０ｎＭ）は、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して逆トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞内へ送達され、ＤＮＡは４８時間後に抽出された。ＥＭＸ１及びＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座についてのオンターゲット及びオフターゲット部位は、それぞれ図２及び図３に記載されている。実験の詳細及びエラー分析は、図９に記載されているものと同様である。
【図１６】生細胞において、以前に記載されているＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ手順（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７〜１９７頁、２０１５年）を使用した偏りのない及びゲノムワイド設定におけるオフターゲット編集活性の例示的な減少を示す図である。ＲＮＰ複合体は、ＥＭＸ１（配列番号１１３）、ＶＥＧＦＡ３（配列番号１１６）又はＡＲ（配列番号１１５）遺伝子ガイド部位のいずれかを標的とするＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ｇＲＮＡ複合体を用いてＷＴ（配列番号６）又はＲ６９１Ａ（配列番号８）Ｃａｓ９タンパク質と形成された（１μＭ）。ＲＮＰ複合体（４μＭ）は、Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用したエレクトロポレーションによって０．５μＭのｄｓＤＮＡ  ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑタグ（配列番号１３９及び１４０）と共にＨＥＫ２９３細胞内へ送達され、ＤＮＡは４８時間後に抽出された。ＮＧＳライブラリー構築、シークエンシング及びデータ分析は、以前に記載されているように（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７〜１９７頁、２０１５年）実施した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書に記載されている本発明の方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系における使用のための変異ＳｐｙＣａｓ９核酸及びポリペプチドを提供する。本発明は、ＲＮＰ複合体として送達される場合でさえ、野生型タンパク質と比較して高いオンターゲット編集活性を維持しながら、オフターゲット編集活性を低レベルに減少させる新規Ｃａｓ９変異体を記載している。本発明のこれら及び他の利点並びにさらなる本発明の特徴は、本明細書に提供されている本発明の説明から明らかになる。
【００２３】
「野生型Ｃａｓ９タンパク質」（「ＷＴ−Ｃａｓ９」又は「ＷＴ−Ｃａｓ９タンパク質」）という用語は、天然に存在するストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９の同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号５）を有し、活性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を形成するために適切なガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又は二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ組成物）と組み合わされた場合、生化学的及び生物学的活性を有するタンパク質を包含する。
【００２４】
「野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」という用語は、野生型Ｃａｓ９タンパク質及び適切なｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を指す。
【００２５】
「活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す」という語句は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の両方が所与の標的配列について同一のｇＲＮＡを含む場合、野生型Ｃａｓ９タンパク質を含む野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の対応するオフターゲット及びオンターゲット編集活性と比較して、典型的にオンターゲット編集活性の減少より大きいオフターゲット編集活性の減少を示す変異Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の活性を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の好ましいオフターゲット及びオンターゲット編集活性は目的のｇＲＮＡ及び標的配列に依存し、変異Ｃａｓ９タンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系のこのような好ましいオフターゲット及びオンターゲット編集活性は、実施例において例示されている。
【００２６】
「変異Ｃａｓ９タンパク質」という用語は、野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９と異なるアミノ酸配列を有し、活性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を形成するために適切なガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又は二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ組成物）と組み合わされた場合、生化学的及び生物学的活性を有するタンパク質形態を包含する。これは、野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９と異なるアミノ酸配列を有するオルソログ及びＣａｓ９バリアントを含む。
【００２７】
本明細書に言及されている変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列は、本開示及び配列表に提示されているように、全長アミノ酸配列として発現されているものを含む。しかしながら、簡潔さのために、短縮された変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸コード命名が本明細書に提供され、所与の置換変異の位置及び同一性は、野生型Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列（例えば、配列番号５）のアミノ酸の位置及び同一性に対して提供されている。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列のＲ６９１に導入された単一置換変異とは、野生型Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列内の残基６９１位におけるアルギニンを置き換えている置換変異を指す。例えば、特定の単一置換変異Ｒ６９１Ａとは、野生型Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列の残基６９１位におけるアルギニンの代わりにアラニンを含む変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列（例えば、配列番号７を参照のこと。）を指す。
【００２８】
本発明の変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す。本明細書に使用されている場合、「変異Ｃａｓ９タンパク質」は、特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系に含まれる場合、これらの変異Ｃａｓ９タンパク質が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す程度まで、並びに本明細書に開示されている変異Ｃａｓ９タンパク質が、本出願及び米国仮特許出願第６２／４０５，６０１号に関して法定の「従来技術」とみなされる程度まで、Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、３５１、８４〜８８頁；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１６年、５２９、４９０〜４９５頁；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１７年、ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４２６８（２０１７年））に開示されている変異Ｃａｓ９タンパク質を除外する。例えば、本明細書に使用されている場合、及び上記の条件に従う場合、「変異Ｃａｓ９タンパク質」は、特に、Ｋ７７５Ａ、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｒ８３２Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｋ８６２Ａ、Ｋ９６１Ａ、Ｋ９６８Ａ、Ｋ９７４Ａ、Ｒ９７６Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｋ１０１４Ａ、Ｋ１０４７Ａ、Ｋ１０５９Ａ、Ｒ１０６０Ａ、Ｈ１２４１Ａ、Ｋ１２８９Ａ、Ｋ１２９６Ａ、Ｈ１２９７Ａ、Ｋ１３００Ａ、Ｈ１３１１Ａ、Ｋ１３２５Ａ、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）及びＨｙｐａ−Ｃａｓ９（Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；「クラスター１」）、クラスター２（Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ）、クラスター３（Ｔ６５７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ）、クラスター４（Ｎ４９７Ａ／Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ）、クラスター５（Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ）からなる群から選択される変異Ｃａｓ９タンパク質を除外する。
【００２９】
「ポリペプチド」という用語は、１つより多いアミノ酸を含む任意の直鎖又は分枝ペプチドを指す。ポリペプチドは、このようなタンパク質、断片又は融合物が有用な生化学的又は生物学的活性を保持するという条件で、タンパク質又はこの断片又はこの融合物を含む。
【００３０】
融合タンパク質は、典型的に、タンパク質に対して天然ではない追加のアミノ酸情報を含み、この追加のアミノ酸情報はそのタンパク質に共有結合している。このような追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質の精製又は同定を可能にするタグを含み得る。このような追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質が細胞内に輸送されること及び／又は細胞内の特定の位置に輸送されることを可能にするペプチドを含み得る。これらの目的のためのタグの例には以下が含まれる：タンパク質がストレプトアビジンによって単離され得るように酵素ＢｉｒＡによるビオチン化を可能にするペプチドであるＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）；タンパク質カルモジュリンが結合しているペプチドであるカルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；Ｍｏｎｏ−Ｑのようなアニオン交換樹脂と効果的に結合しているペプチドであるポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；抗体によって認識されているペプチドであるＥタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；抗体によって認識されているペプチドであるＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）；抗体によって認識されているヘマグルチニン由来のペプチドであるＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；典型的にニッケル又はコバルトキレートが結合している５〜１０個のヒスチジンであるＨｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）；抗体によって認識されているｃ−ｍｙｃに由来するペプチドであるＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降及び組換えタンパク質の親和性精製を含む広範囲の用途に有用である、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識されている新規の１８個のアミノ酸合成ペプチドであるＮＥタグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；リボヌクレアーゼＡに由来するペプチドであるＳタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ストレプトアビジンと結合しているペプチドであるＳＢＰタグ；（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；哺乳動物発現を意図するＳｏｆｔａｇ１（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；原核生物発現を意図するＳｏｆｔａｇ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；ストレプトアビジン又はストレプトアクチン（ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）と呼ばれる修飾ストレプトアビジンと結合しているペプチドであるＳｔｒｅｐタグ（ＳｔｒｅｐタグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；抗体によって認識されているペプチドである、ＦｌＡｓＨ及びＲｅＡｓＨ二ヒ素（ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ）化合物（ＣＣＰＧＣＣ）Ｖ５タグによって認識されているテトラシステインタグであるＴＣタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；抗体によって認識されているペプチドであるＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）；ピリン−Ｃタンパク質と共有結合しているペプチドであるＩｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ）；ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と共有結合しているペプチドであるＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ）；ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質と共有結合しているペプチドであるＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ）；ストレプトアビジンによる認識を可能にするためにＢｉｒＡによってビオチン化されているタンパク質ドメインであるＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）；固定化グルタチオンと結合しているタンパク質であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ；自然蛍光性であり、抗体が結合することができるタンパク質である緑色蛍光タンパク質タグ；多種多様な基質との付着を可能にするために反応性ハロアルカン基質と共有結合により付着している変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼであるＨａｌｏＴａｇ；アミロースアガロースと結合しているタンパク質であるマルトース結合タンパク質タグ；Ｎｕｓタグ；チオレドキシンタグ；並びに二量化及び可溶化を可能にし、プロテインＡセファロース上での精製のために使用され得る免疫グロブリンＦｃドメインに由来するＦｃタグ。ＳＶ４０から得られるもののような核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、タンパク質が細胞に入るとすぐに核に輸送されることを可能にする。天然のＣａｓ９タンパク質が細菌起源であり、したがってＮＬＳモチーフを天然に含まないと仮定すると、組換えＣａｓ９タンパク質への１つ以上のＮＬＳモチーフの付加は、標的ゲノムＤＮＡ基質が核に存在する真核細胞において使用される場合、改善されたゲノム編集活性を示すことが予想される。当業者は、これらの種々の融合タグ技術並びにこれらを含む融合タンパク質をどのように作製し、使用するかを理解している。
【００３１】
「単離された核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びこれらをコードするベクターを含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びベクターは、細胞成分のような、これらが由来し得る又は関連し得る他の生物学的物質を含まない。典型的に、単離された核酸は、細胞成分のような、これらが由来し得る又は関連し得る他の生物学的物質から精製される。
【００３２】
「単離された野生型Ｃａｓ９核酸」という用語は、野生型Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸である。単離された野生型Ｃａｓ９核酸の例には、配列番号１及び２が含まれる。
【００３３】
「単離された変異Ｃａｓ９核酸」という用語は、変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸である。単離された変異Ｃａｓ９核酸の例には、配列番号３及び４が含まれる。
【００３４】
「長さが修飾された」という用語は、この用語がＲＮＡを修飾する場合、ヌクレオチド配列を欠いている参照ＲＮＡの短縮された若しくは切断された形態又はさらなるヌクレオチド配列を含む参照ＲＮＡの伸長された形態を指す。
【００３５】
「化学的に修飾された」という用語は、この用語がＲＮＡを修飾する場合、ＲＮＡと共有結合により連結している化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化学基を含有する参照ＲＮＡの形態を指す。化学的に修飾されたＲＮＡは、本明細書に記載されている場合、一般に、修飾されたヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成の間に組み込まれるオリゴヌクレオチド合成手順を使用して調製された合成ＲＮＡを指す。しかしながら、化学的に修飾されたＲＮＡはまた、合成後に適切な修飾剤により修飾された合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドも含む。
【００３６】
コンピテントなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、単離されたＣａｓ９タンパク質及び二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの組合せ又はキメラ単一分子ｓｇＲＮＡのうちの１つから選択される単離されたガイドＲＮＡと形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの単離された長さが修飾された及び／又は化学的に修飾された形態は、精製されたＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離されたｍＲＮＡ又は発現ベクターにおいてＣａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と組み合わされる。ある特定のアッセイにおいて、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの単離された長さが修飾された及び／又は化学的に修飾された形態は、Ｃａｓ９遺伝子をコードする内在性発現カセットからＣａｓ９タンパク質を安定に発現する細胞株に導入され得る。他のアッセイにおいて、変異Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ又は変異Ｃａｓ９タンパク質のいずれかと組み合わされたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの長さが修飾された及び／又は化学的に修飾された形態の混合物が細胞に導入され得る。
【００３７】
出願人は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において強力な活性を示す、新規ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド組成物を以前に提示している。オリゴヌクレオチド組成物は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの長さが修飾された形態並びにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの化学的に修飾された形態を含む。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの長さが修飾された形態は、慣例的に利用可能なコスト効率が良く、効果的なオリゴヌクレオチド合成プロトコールを用いてこれらのＲＮＡの活性形態を調製することを可能にする。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの化学的に修飾された形態は、細胞及びインビボでの環境における改善された安定性又は哺乳動物細胞における先天性免疫応答を誘発するリスクの低減のような、ある特定の固有の特性に調整可能な活性剤を提供する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの長さが修飾された形態はまた、修飾を含んでもよく、これによってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の環境において活性を有する広範囲の組成物に対する利用を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系におけるこれらのオリゴヌクレオチド組成物及びこれらの特性は、本明細書に開示されている変異Ｃａｓ９核酸及びタンパク質と共に使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系におけるこれらのオリゴヌクレオチド組成物及びこれらの特性は、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら（出願者：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ（ＵＳ））、米国特許公開番号、ＵＳ２０１６−０１７７３０４  Ａ１として２０１６年６月２３日に公開され、現在、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿に米国特許＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿号として発行されている、「ＣＲＩＳＰＲ−ＢＡＳＥＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ」と題する２０１５年１２月１８日に出願した米国特許出願第１４／９７５，７０９号に開示されており、これらの内容はそれらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【００３８】
オフターゲット遺伝子編集活性を減少させた変異Ｃａｓ９タンパク質
第１の態様において、単離された変異Ｃａｓ９タンパク質が提供されている。単離された変異Ｃａｓ９タンパク質は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼ系（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」）において活性である。得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示す。
【００３９】
好ましい単一変異Ｃａｓ９タンパク質は、以下の位置：Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５のうちの１つに導入されたＷＴ−Ｃａｓ９における置換変異を含む。例示的な単一変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＷＴ−Ｃａｓ９に導入された以下の特定の変異：Ｒ４９４Ｃ、Ｒ４９４Ａ、Ｎ５２２Ｋ、Ｎ５２２Ａ、Ｎ５８８Ｄ、Ｎ５８８Ａ、Ｎ６１２Ａ、Ｔ６５７Ａ、Ｓ６６３Ａ、Ｒ６９１Ｓ、Ｒ６９１Ａ、Ｎ６９２Ｄ、Ｎ６９２Ａ、Ｓ７３０Ｇ、Ｓ７３０Ａ、Ｔ７４０Ａ、Ｒ７６５Ｇ、Ｒ７６５Ａ、Ｔ７７０Ｋ、Ｔ７７０Ａ、Ｎ７７６Ａ、Ｒ７７８Ａ、Ｒ７８３Ａ、Ｓ７９３Ａ、Ｎ８０３Ｄ、Ｎ８０３Ａ、Ｓ８４５Ａ、Ｎ８５４Ｋ、Ｎ８５４Ａ、Ｓ８７２Ａ、Ｒ９２５Ｃ及びＲ９２５Ａを含む。例示的な単一変異Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号７〜３８からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。得られた変異Ｃａｓ９タンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系として活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示すという条件で、さらなる置換変異が単一変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含まれ得る。
【００４０】
好ましい二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、以下の位置：Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５のうちの２つに導入されたＷＴ−Ｃａｓ９における変異を含む。極めて好ましい二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、以下の位置：Ｒ６９１／Ｎ６９２、Ｒ６９１／Ｒ４９４、Ｒ６９１／Ｎ５２２、Ｒ６９１／Ｎ５８８、Ｒ６９１／Ｎ６１２、Ｒ６９１／Ｓ６６３、Ｒ６９１／Ｔ７３０、Ｒ６９１／Ｔ７４０、Ｒ６９１／Ｒ７６５、Ｒ６９１／Ｔ７７０、Ｎ６９２／Ｔ７４０、Ｒ６９１／Ｓ８４５、Ｎ６９２／Ｓ８４５、Ｒ６９１／Ｓ８７２、及びＮ６９２／Ｓ８７２に導入されたＷＴ−Ｃａｓ９における変異を含む。例示的な二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、以下のアミノ酸変異：Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ｓ又はＲ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａから選択されるＷＴ−Ｃａｓ９に導入された２つの異なる特定の変異を含む。例示的な二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３９〜８８からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。得られた変異Ｃａｓ９タンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系として活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示すという条件で、さらなる置換変異が二重変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含まれ得る。
【００４１】
第２の態様において、単離されたリボ核タンパク質複合体が提供されている。ＲＮＰは変異Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体を含む。第１の点において、ｇＲＮＡは化学量論（１：１）比のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。第２の点において、ｃｒＲＮＡは所与の遺伝子座についての特定の編集標的部位に対するＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ（ＵＳ））を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡはＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ（ＵＳ））を含む。別の点において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡを含む。好ましい変異Ｃａｓ９タンパク質は上記のものを含む。
【００４２】
第３の態様において、変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸が提供されている。好ましい単離された核酸は、上記の変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする。変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする例示的な単離された核酸は、組換えＤＮＡ手順又は化学合成法を使用して、野生型Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸から容易に生成され得る。この目的のための好ましい核酸には、細菌（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるＣａｓ９タンパク質の発現のために最適化された核酸が含まれる。Ｅ．コリ及びヒト細胞においてＷＴ−Ｃａｓ９（配列番号５）を発現するための例示的なコドン最適化核酸には、それぞれ配列番号１及び２が含まれる。Ｅ．コリ及びヒト細胞において変異Ｃａｓ９タンパク質（例えば、Ｒ６９１Ａ変異Ｃａｓ９タンパク質；配列番号７）を発現するための例示的なコドン最適化核酸には、それぞれ配列番号３及び４が含まれる。さらに、本発明はＷＴ−Ｃａｓ９及び変異Ｃａｓ９の融合タンパク質を意図し、ＷＴ−Ｃａｓ９及び変異Ｃａｓ９のコード配列は、真核細胞における融合タンパク質の核局在化（「ＮＬＳ」）をコードするアミノ酸配列又はタンパク質の精製を容易にするアミノ酸配列と融合される。ＷＴ−Ｃａｓ９アミノ酸配列又は変異Ｃａｓ９アミノ酸配列（例えば、Ｒ６９１Ａ変異Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかを含む例示的な融合タンパク質には、それぞれ配列番号６及び８が含まれる。
【００４３】
第１の点において、単離された核酸は、前述の変異Ｃａｓ９タンパク質のうちの１つをコードするｍＲＮＡを含む。第２の点において、単離された核酸は、前述の変異Ｃａｓ９タンパク質のうちの１つについての遺伝子をコードするＤＮＡを含む。好ましいＤＮＡは、変異Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子をコードするベクターを含む。このような送達法には、当業者に周知であるようなプラスミド及び種々のウイルス送達ベクターが含まれる。変異Ｃａｓ９タンパク質はまた、変異Ｃａｓ９を構成的又は誘導的に発現する細胞株を産生するために適切な発現ベクターを使用して細胞に安定に形質転換され得る。前述の方法はまた、変異Ｃａｓ９を構成的又は誘導的に発現する子孫動物を産生するために胚に適用され得る。
【００４４】
第４の態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が提供されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は変異Ｃａｓ９タンパク質を含む。好ましい変異Ｃａｓ９タンパク質は上記のものを含む。第１の点において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる。一実施形態において、ＤＮＡ発現ベクターは、プラスミドによるベクター（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ）である。第２の実施形態において、ＤＮＡ発現ベクターは細菌発現ベクター及び真核細胞発現ベクターから選択される。第３の点において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、変異Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体を含むリボ核タンパク質複合体を含む。第１の点において、ｇＲＮＡは化学量論（１：１）比のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。第２の点において、ｃｒＲＮＡは所与の遺伝子座についての特定の編集標的部位に対するＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ（ＵＳ））を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡはＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ（ＵＳ））を含む。別の点において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡを含む。
【００４５】
第５の態様において、オフターゲット編集活性を減少させる及び／又はオンターゲット編集活性を増加させる遺伝子編集を実施する方法が提供されている。この方法は、候補編集標的部位遺伝子座を、変異Ｃａｓ９タンパク質を有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と接触させるステップを含む。第１の点において、この方法は、以下の位置：Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５のうちの１つに導入されたＷＴ−Ｃａｓ９における変異を有する単一変異Ｃａｓ９タンパク質を含む。例示的な単一変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＷＴ−Ｃａｓ９に導入された以下の特定の変異：Ｒ４９４Ｃ、Ｒ４９４Ａ、Ｎ５２２Ｋ、Ｎ５２２Ａ、Ｎ５８８Ｄ、Ｎ５８８Ａ、Ｎ６１２Ａ、Ｔ６５７Ａ、Ｓ６６３Ａ、Ｒ６９１Ｓ、Ｒ６９１Ｓ、Ｒ６９１Ａ、Ｎ６９２Ｄ、Ｎ６９２Ａ、Ｓ７３０Ｇ、Ｓ７３０Ａ、Ｔ７４０Ａ、Ｒ７６５Ｇ、Ｒ７６５Ａ、Ｔ７７０Ｋ、Ｔ７７０Ａ、Ｎ７７６Ａ、Ｒ７７８Ａ、Ｒ７８３Ａ、Ｓ７９３Ａ、Ｎ８０３Ｄ、Ｎ８０３Ａ、Ｓ８４５Ａ、Ｎ８５４Ｋ、Ｎ８５４Ａ、Ｓ８７２Ａ、Ｒ９２５Ｃ及びＲ９２５Ａを含む。例示的な単一変異Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号７〜３８からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。得られた変異Ｃａｓ９タンパク質が、この方法においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系として活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示すという条件で、さらなる置換変異が単一変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含まれ得る。
【００４６】
別の点において、この方法は、以下の位置：Ｒ４９４、Ｎ５２２、Ｎ５８８、Ｎ６１２、Ｔ６５７、Ｓ６６３、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｓ７３０、Ｔ７４０、Ｒ７６５、Ｔ７７０、Ｎ７７６、Ｒ７７８、Ｒ７８３、Ｓ７９３、Ｎ８０３、Ｓ８４５、Ｎ８５４、Ｓ８７２及びＲ９２５のうちの２つに導入されたＷＴ−Ｃａｓ９における変異を有する二重変異Ｃａｓ９タンパク質を含む。極めて好ましい二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、以下の位置：Ｒ６９１／Ｎ６９２、Ｒ６９１／Ｒ４９４、Ｒ６９１／Ｎ５２２、Ｒ６９１／Ｎ５８８、Ｒ６９１／Ｎ６１２、Ｒ６９１／Ｓ６６３、Ｒ６９１／Ｔ７３０、Ｒ６９１／Ｔ７４０、Ｒ６９１／Ｒ７６５、Ｒ６９１／Ｔ７７０、Ｎ６９２／Ｔ７４０、Ｒ６９１／Ｓ８４５、Ｎ６９２／Ｓ８４５、Ｒ６９１／Ｓ８７２、及びＮ６９２／Ｓ８７２に導入されたＷＴ−Ｃａｓ９における変異を含む。例示的な二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、以下のアミノ酸変異：Ｒ４９４Ｃ又はＲ４９４Ａ；Ｎ５２２Ｋ又はＮ５２２Ａ；Ｎ５８８Ｄ又はＮ５８８Ａ；Ｎ６１２Ａ；Ｔ６５７Ａ；Ｓ６６３Ａ；Ｒ６９１Ｓ又はＲ６９１Ａ；Ｎ６９２Ｄ又はＮ６９２Ａ；Ｓ７３０Ｇ又はＳ７３０Ａ；Ｔ７４０Ａ；Ｒ７６５Ｇ又はＲ７６５Ａ；Ｔ７７０Ｋ又はＴ７７０Ａ；Ｎ７７６Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８３Ａ；Ｓ７９３Ａ；Ｎ８０３Ｄ又はＮ８０３Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｎ８５４Ｋ又はＮ８５４Ａ；Ｓ８７２Ａ；及びＲ９２５Ｃ又はＲ９２５Ａから選択されるＷＴ−Ｃａｓ９に導入された２つの異なる特定の変異を含む。例示的な二重変異Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３９〜８８からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。得られた変異Ｃａｓ９タンパク質が、この方法においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系として活性であり、得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系が、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系と比較して、減少したオフターゲット編集活性及び維持されたオンターゲット編集活性を示すという条件で、さらなる置換変異が二重変異Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸バックグラウンドに含まれ得る。
【００４７】
Ｃａｓ９に基づく手段の適用は多く、様々である。これらには、限定されないが、植物遺伝子編集、酵母遺伝子編集、哺乳動物遺伝子編集、生きている動物の器官における細胞の編集、胚の編集、ノックアウト／ノックイン動物系の迅速な生成、疾患状態の動物モデルの生成、疾患状態の矯正、レポーター遺伝子の挿入及び全ゲノム機能的スクリーニングが含まれる。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
野生型及び変異Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ及びアミノ酸配列。
以下のリストでは、本発明に記載されている異なる野生型（ＷＴ）及び変異Ｃａｓ９ヌクレアーゼを示す。多くの場合、１つより多いコドンが同一のアミノ酸をコードし得るので、多くの異なるＤＮＡ配列が同一のアミノ酸（ＡＡ）配列をコード／発現し得ることが、当業者によって理解される。以下に示されているＤＮＡ配列は例としてのみ与えられ、同一のタンパク質（例えば、同一のアミノ酸配列）をコードする他のＤＮＡ配列が意図されている。ＮＬＳドメインなどのようなさらなる特徴、要素又はタグが、前記配列に付加されてもよいことがさらに理解される。Ｃａｓ９単独並びにＣ末端及びＮ末端の両方のＳＶ４０ＮＬＳドメイン及びＨＩＳタグと融合されたＣａｓ９としてこれらのタンパク質についてのアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す、ＷＴ  Ｃａｓ９及び変異Ｒ６９１Ａ  Ｃａｓ９についての例を示す。他のＣａｓ９変異体について、アミノ酸配列のみが提供されているが、ＮＬＳ及びＨｉｓタグドメインの類似の付加が、哺乳動物細胞における使用のための組換えタンパク質を産生する際の使用を容易にするために付加されてもよいことが意図されている。ＷＴ配列と異なる変異は、下線付きの太字フォントを使用して明瞭に示されている。
【００４９】
配列番号１
Ｅ．コリにおける発現のためにコドン最適化されたＷＴ  ＳｐｙＣａｓ９  ＤＮＡ配列。
【００５０】
【化１】
2019533996.tif 000003
2019533996.tif 000004
【００５１】
配列番号２
Ｈ．サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）における発現のためにコドン最適化されたＷＴ  ＳｐｙＣａｓ９  ＤＮＡ配列。
【００５２】
【化２】
2019533996.tif 000005
2019533996.tif 000006
【００５３】
配列番号３
Ｅ．コリにおける発現のためにコドン最適化されたＲ６９１Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＤＮＡ配列。
【００５４】
【化３】
2019533996.tif 000007
2019533996.tif 000008
【００５５】
配列番号４
Ｈ．サピエンスにおける発現のためにコドン最適化されたＲ６９１Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＤＮＡ配列。
【００５６】
【化４】
2019533996.tif 000009
2019533996.tif 000010
【００５７】
配列番号５
ＷＴ  ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００５８】
【化５】
2019533996.tif 000011
【００５９】
配列番号６
ＮＬＳドメイン及びＨＩＳ−Ｔａｇ精製ドメインが付加されたＷＴ  ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００６０】
【化６】
2019533996.tif 000012
【００６１】
配列番号７
Ｒ６９１Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００６２】
【化７】
2019533996.tif 000013
【００６３】
配列番号８
ＮＬＳドメイン及びＨＩＳ−Ｔａｇ精製ドメインが付加されたＲ６９１Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００６４】
【化８】
2019533996.tif 000014
【００６５】
配列番号９
Ｒ４９４Ｃ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００６６】
【化９】
2019533996.tif 000015
【００６７】
配列番号１０
Ｒ４９４Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００６８】
【化１０】
2019533996.tif 000016
【００６９】
配列番号１１
Ｎ５２２Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００７０】
【化１１】
2019533996.tif 000017
【００７１】
配列番号１２
Ｎ５２２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００７２】
【化１２】
2019533996.tif 000018
【００７３】
配列番号１３
Ｎ５８８Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００７４】
【化１３】
2019533996.tif 000019
【００７５】
配列番号１４
Ｎ５８８Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００７６】
【化１４】
2019533996.tif 000020
【００７７】
配列番号１５
Ｎ６１２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００７８】
【化１５】
2019533996.tif 000021
【００７９】
配列番号１６
Ｔ６５７Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００８０】
【化１６】
2019533996.tif 000022
【００８１】
配列番号１７
Ｓ６６３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００８２】
【化１７】
2019533996.tif 000023
【００８３】
配列番号１８
Ｎ６９２Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００８４】
【化１８】
2019533996.tif 000024
【００８５】
配列番号１９
Ｎ６９２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００８６】
【化１９】
2019533996.tif 000025
【００８７】
配列番号２０
Ｓ７３０Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００８８】
【化２０】
2019533996.tif 000026
【００８９】
配列番号２１
Ｓ７３０Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００９０】
【化２１】
2019533996.tif 000027
【００９１】
配列番号２２
Ｔ７４０Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００９２】
【化２２】
2019533996.tif 000028
【００９３】
配列番号２３
Ｒ７６５Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００９４】
【化２３】
2019533996.tif 000029
【００９５】
配列番号２４
Ｒ７６５Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００９６】
【化２４】
2019533996.tif 000030
【００９７】
配列番号２５
Ｔ７７０Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００９８】
【化２５】
2019533996.tif 000031
配列番号２６
Ｔ７７０Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【００９９】
【化２６】
2019533996.tif 000032
【０１００】
配列番号２７
Ｎ７７６Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１０１】
【化２７】
2019533996.tif 000033
【０１０２】
配列番号２８
Ｒ７７８Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１０３】
【化２８】
2019533996.tif 000034
【０１０４】
配列番号２９
Ｒ７８３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１０５】
【化２９】
2019533996.tif 000035
【０１０６】
配列番号３０
Ｓ７９３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１０７】
【化３０】
2019533996.tif 000036
【０１０８】
配列番号３１
Ｎ８０３Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１０９】
【化３１】
2019533996.tif 000037
【０１１０】
配列番号３２
Ｎ８０３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１１１】
【化３２】
2019533996.tif 000038
【０１１２】
配列番号３３
Ｓ８４５Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１１３】
【化３３】
2019533996.tif 000039
【０１１４】
配列番号３４
Ｎ８５４Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１１５】
【化３４】
2019533996.tif 000040
【０１１６】
配列番号３５
Ｎ８５４Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１１７】
【化３５】
2019533996.tif 000041
【０１１８】
配列番号３６
Ｓ８７２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１１９】
【化３６】
2019533996.tif 000042
【０１２０】
配列番号３７
Ｒ９２５Ｃ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１２１】
【化３７】
2019533996.tif 000043
【０１２２】
配列番号３８
Ｒ９２５Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１２３】
【化３８】
2019533996.tif 000044
【０１２４】
配列番号３９
Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１２５】
【化３９】
2019533996.tif 000045
【０１２６】
配列番号４０
Ｒ６９１Ａ／Ｒ４９４Ｃ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１２７】
【化４０】
2019533996.tif 000046
【０１２８】
配列番号４１
Ｎ６９２Ａ／Ｒ４９４Ｃ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１２９】
【化４１】
2019533996.tif 000047
【０１３０】
配列番号４２
Ｒ６９１Ａ／Ｎ５２２Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１３１】
【化４２】
2019533996.tif 000048
【０１３２】
配列番号４３
Ｎ６９２Ａ／Ｎ５２２Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１３３】
【化４３】
2019533996.tif 000049
【０１３４】
配列番号４４
Ｒ６９１Ａ／Ｎ５８８Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１３５】
【化４４】
2019533996.tif 000050
【０１３６】
配列番号４５
Ｎ６９２Ａ／Ｎ５８８Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１３７】
【化４５】
2019533996.tif 000051
【０１３８】
配列番号４６
Ｒ６９１Ａ／Ｎ６１２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１３９】
【化４６】
2019533996.tif 000052
【０１４０】
配列番号４７
Ｎ６９２Ａ／Ｎ６１２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１４１】
【化４７】
2019533996.tif 000053
【０１４２】
配列番号４８
Ｒ６９１Ａ／Ｓ６６３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１４３】
【化４８】
2019533996.tif 000054
【０１４４】
配列番号４９
Ｎ６９２Ａ／Ｓ６６３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１４５】
【化４９】
2019533996.tif 000055
【０１４６】
配列番号５０
Ｒ６９１Ａ／Ｓ７３０Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１４７】
【化５０】
2019533996.tif 000056
【０１４８】
配列番号５１
Ｎ６９２Ａ／Ｓ７３０Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１４９】
【化５１】
2019533996.tif 000057
【０１５０】
配列番号５２
Ｒ６９１Ａ／Ｔ７４０Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１５１】
【化５２】
2019533996.tif 000058
【０１５２】
配列番号５３
Ｎ６９２Ａ／Ｔ７４０Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１５３】
【化５３】
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【０１５４】
配列番号５４
Ｒ６９１Ａ／Ｒ７６５Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１５５】
【化５４】
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【０１５６】
配列番号５５
Ｎ６９２Ａ／Ｒ７６５Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１５７】
【化５５】
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【０１５８】
配列番号５６
Ｒ６９１Ａ／Ｔ７７０Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１５９】
【化５６】
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【０１６０】
配列番号５７
Ｎ９６２Ａ／Ｔ７７０Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１６１】
【化５７】
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【０１６２】
配列番号５８
Ｒ６９１Ａ／Ｓ７９３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１６３】
【化５８】
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【０１６４】
配列番号５９
Ｎ６９２Ａ／Ｓ７９３Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１６５】
【化５９】
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【０１６６】
配列番号６０
Ｒ６９１Ａ／Ｎ８０３Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
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【化６０】
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配列番号６１
Ｎ６９２Ａ／Ｎ８０３Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１６９】
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【０１７０】
配列番号６２
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【０１７１】
【化６２】
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【０１７２】
配列番号６３
Ｎ６９２Ａ／Ｓ８４５Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１７３】
【化６３】
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【０１７４】
配列番号６４
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【０１７５】
【化６４】
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【０１７６】
配列番号６５
Ｎ６９２Ａ／Ｎ８５４Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１７７】
【化６５】
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【０１７８】
配列番号６６
Ｒ６９１Ａ／Ｓ８７２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１７９】
【化６６】
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【０１８０】
配列番号６７
Ｎ６９２Ａ／Ｓ８７２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１８１】
【化６７】
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【０１８２】
配列番号６８
Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｔ７４０Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１８３】
【化６８】
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【０１８４】
配列番号６９
Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｓ８４５Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１８５】
【化６９】
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【０１８６】
配列番号７０
Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ／Ｓ８７２Ａ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１８７】
【化７０】
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【０１８８】
配列番号７１
Ｒ６９１Ｓ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１８９】
【化７１】
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【０１９０】
配列番号７２
Ｒ６９１Ｎ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１９１】
【化７２】
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【０１９２】
配列番号７３
Ｒ６９１Ｄ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１９３】
【化７３】
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【０１９４】
配列番号７４
Ｒ６９１Ｃ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１９５】
【化７４】
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【０１９６】
配列番号７５
Ｒ６９１Ｑ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１９７】
【化７５】
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【０１９８】
配列番号７６
Ｒ６９１Ｅ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０１９９】
【化７６】
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【０２００】
配列番号７７
Ｒ６９１Ｇ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２０１】
【化７７】
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【０２０２】
配列番号７８
Ｒ６９１Ｈ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２０３】
【化７８】
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【０２０４】
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Ｒ６９１Ｉ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２０５】
【化７９】
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【０２０６】
配列番号８０
Ｒ６９１Ｌ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２０７】
【化８０】
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【０２０８】
配列番号８１
Ｒ６９１Ｋ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２０９】
【化８１】
2019533996.tif 000087
【０２１０】
配列番号８２
Ｒ６９１Ｍ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２１１】
【化８２】
2019533996.tif 000088
【０２１２】
配列番号８３
Ｒ６９１Ｆ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２１３】
【化８３】
2019533996.tif 000089
【０２１４】
配列番号８４
Ｒ６９１Ｐ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２１５】
【化８４】
2019533996.tif 000090
【０２１６】
配列番号８５
Ｒ６９１Ｔ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２１７】
【化８５】
2019533996.tif 000091
【０２１８】
配列番号８６
Ｒ６９１Ｗ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２１９】
【化８６】
2019533996.tif 000092
【０２２０】
配列番号８７
Ｒ６９１Ｙ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２２１】
【化８７】
2019533996.tif 000093
【０２２２】
配列番号８８
Ｒ６９１Ｖ変異ＳｐｙＣａｓ９  ＡＡ配列。
【０２２３】
【化８８】
2019533996.tif 000094
【０２２４】
［実施例２］
高いオンターゲット活性を保持しながら、オフターゲット切断を減少させた変異Ｃａｓ９ペプチドを富化するための細菌遺伝子スクリーニング。
以下の実施例は、約２５０，０００個の変異体クローンのライブラリーから、後のより詳細な特徴付けのために、目的の候補Ｃａｓ９変異酵素を同定するためにＥ．コリにおいて行った遺伝子スクリーニングを詳述する。
【０２２５】
従来技術において明らかにされたオフターゲット効果を減少させたＣａｓ９変異体の全ては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ及びＣａｓ９−ｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の以前に公開されている結晶及び共結晶構造に基づいて、Ｃａｓ９核酸結合ポケットに近接した荷電アミノ酸のアラニン置換を作製することによる合理的な設計手法を使用して開発された。これは、変異のために利用可能な配列空間を、極めて限定された数のアミノ酸残基に制限する。本発明は、有用な変異について調査された潜在的な配列空間を大幅に拡大させる、Ｃａｓ９発現カセットの低忠実度ＰＣＲによって生成された多数のランダム変異体の偏りのないスクリーニングを上記に代わり使用して、新規の有用なＣａｓ９変異体を同定した。
【０２２６】
本発明において、本発明者らは、細菌スクリーニング手法を使用してオンターゲット切断を容易にするが、オフターゲット切断を回避する、Ｃａｓ９における任意のアミノ酸置換を選択した。スクリーニング手法は、他の適用のために以前に実施されていたスクリーニングから適合させた。Ｃｈｅｎ及びＺｈａｏ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３（１８）ｐｅ１５４、２００５年）並びにＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、５２３、４８１〜４８５頁、２０１５年）を参照のこと。本スクリーニングは、２つのプラスミドを用いたＥ．コリ細胞の共形質転換に基づいた：ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オンターゲット切断部位（ＶＥＧＦＡ３、ＨＥＫＳｉｔｅ４又はＥＭＸ１、配列番号１３３、１３５、１３７）と連結されているアラビノース誘導性細胞増殖毒素をコードする毒素プラスミドであって、オンターゲット切断が毒素産生を取り除く、毒素プラスミド（すなわち、オンターゲット部位が切断されない場合、細胞は死滅する。）及びｉｉ）ランダムに変異誘発された（１キロベース当たり約６個の変異）ｃａｓ９配列、各オンターゲット部位に特異的な単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及び各ガイドＲＮＡについての既知のオフターゲット切断部位（配列番号１３４、１３６、１３８）を含有するクロラムフェニコール耐性プラスミド（切断が生じる場合、耐性遺伝子は発現されず、細胞は、選択マーカーであるクロラムフェニコールに曝露される場合に死滅するようにクロラムフェニコール発現と連動している。）。スクリーニングの設計は、適切なオフターゲット部位（クロラムフェニコール）と対になった異なるオンターゲット部位（毒素）の連続使用を可能にし、それによってスクリーニングは、単離物が単一ｇＲＮＡ標的部位に対する性能のみに基づいて選択されなかったことを確実にするために、繰り返し行うことができる。
【０２２７】
スクリーニング手法は以下の通りであった：Ｅ．コリＫ１２株ＭＧ１６５５を、アラビノースの非存在下でＶＥＧＦ  Ａ３標的部位を含有する毒素プラスミドで形質転換した。この場合、毒素は産生されず、細胞生存は可能である。次いで安定に複製する毒素プラスミドを有する細胞を、クロラムフェニコールＣａｓ９−ｓｇＲＮＡオフターゲットプラスミドで形質転換し、３７℃にて１時間非選択的に増殖させて回収し、次いで形質転換に供した菌を、クロラムフェニコール及びアラビノースの両方を含有する選択培地上に播種した。増殖した細菌は、ｉ）Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡオフターゲットプラスミドで形質転換するのに成功した細菌、ｉｉ）毒素オンターゲットプラスミドを切断するのに十分なＣａｓ９及びＶＥＧＦＡ３  ｓｇＲＮＡを発現した細菌並びにｉｉｉ）選択下で生存するために十分なクロラムフェニコール耐性を可能にするのに十分な、クロラムフェニコールＣａｓ９−ｓｇＲＮＡオフターゲットプラスミドの切断を回避した細菌であった。３つの全ての試験したガイド（ＶＥＧＦＡ３、ＨＥＫＳｉｔｅ４及びＥＭＸ１）により生存が可能になった候補変異のプールを生成した。このプール内で、スクリーニングプロセスを通して複数回単離した変異（合計で９４個のクローン）を、哺乳動物細胞へのさらなる分析に進ませた。本スクリーニング法の概略を図１に示す。
【０２２８】
［実施例３］
新規Ｃａｓ９変異体のプラスミド送達は、オンターゲット活性を維持しながら、オフターゲット遺伝子を減少させる。
【０２２９】
以下の実施例は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのプラスミド送達によってオフターゲット遺伝子編集活性を減少させる本発明の能力を実証している。一次スクリーニングにおいて同定した単一点突然変異（実施例２）を出発点として与え、この出発点から、選択した二重又は三重変異バリアントを部位特異的突然変異誘発法によって作製した。Ｃａｓ９酵素が過剰発現されるプラスミド発現の設定において、複数の変異の組合せを有するクローンは、オンターゲット編集活性の効果を制限して、オフターゲット編集活性の改善された減少を示すことができた。
【０２３０】
Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９発現プラスミド（ＷＴ）を部位特異的突然変異誘発法により改変し、ＤＮＡシークエンシングによって、示された変異を有することを確認した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験を、変異体である、異なるＷＴ及び変異Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９発現プラスミドと同時に共トランスフェクトした２部のＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ系を使用して実施した。ＥＭＸ１及びＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座におけるＮＧＧ  ＰＡＭ含有配列（表１、配列番号１１３及び１１４）を標的とするＡｌｔ−Ｒ（商標）ｃｒＲＮＡを、９５℃に５分間加熱し、続いて２５℃にゆっくり冷却することによって１：１のモル比（３μＭ）にてＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡに二重鎖にした。０．５μｌのＴｒａｎｓｉｔ−Ｘ２（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）、３０ｎＭのＥＭＸ１又はＨＥＫＳｉｔｅ４  Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ｇＲＮＡ複合体及び０．１μｇのＡｌｔ−Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９プラスミド（ＷＴ又は示した変異体を含有する。）を用いて３連で逆トランスフェクションを実施した。製造業者の説明書に従ってトランスフェクション脂質複合体を室温にて２０分間形成させ、４０，０００個のＨＥＫ２９３細胞を各トランスフェクションに添加した。３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後、付着細胞を０．１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、０．０５ｍｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液を用いて溶解した。細胞溶解物を６５℃にて１５分間インキュベートし、続いて９８℃にて３分間、熱不活性化した。次いで粗ＤＮＡ試料を０．１ｍｌのｄｄＨ２Ｏで３倍希釈し、ＰＣＲテンプレートとして使用した。ＰＣＲプライマー及び予想されるＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）消化パターンを表１（配列番号１２１〜１２８）に示す。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ及び以下のサイクルパラメーター：９５５：００、（９８０：２０、６４０：１５、７２０：３０）２９回反復、７２２：００を使用してＥＭＸ１又はＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座のいずれかの≦１ｋｂの断片を増幅させるためにＰＣＲを使用した。以下のサイクルパラメーター：１分かけて８５に冷却した９５１０：００、１分かけて７５に冷却した８５１：００、１分かけて６５に冷却した７５１：００、１分かけて５５に冷却した６５１：００、１分かけて４５に冷却した５５１：００、１分かけて３５に冷却した４５１：００、１分かけて２５に冷却した３５１：００、２５１：００を使用してヘテロ二重鎖を形成した。ＸＹとして記載した前述の数は、Ｘを定温（カ氏温度）として表し、Ｙを時間周期として表す（「ｎ：００」として表す場合、分、又は「０：ｎｎ」として表す場合、秒（ｎは整数である。））。ヘテロ二重鎖を、２Ｕ  Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を３７℃にて添加して１時間置くことによって切断し、切断産物をキャピラリー電気泳動（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）によって分析した。Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイを利用して、この及び後の実施例におけるＤＮＡ編集効率を評価した。完全なプロトコールは記載されてい��（Ｊａｃｏｂｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２１〜１２２、１６〜２８頁、２０１７年を参照のこと。）。
【０２３１】
これらの結果は、示したＣａｓ９アミノ酸位置における点突然変異（配列番号９、１１、１３、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３６、３７及び７１）が、ＥＭＸ１（図２）又はＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座（図３）を標的とするｃｒＲＮＡについてのオフターゲット遺伝子編集活性を減少させることを示す。本発明者らのスクリーニングから単離された点突然変異の多くは、アラニン以外のアミノ酸への置換をもたらした。非アラニン置換であった最初のスクリーニングからのこれらの変異体について、本発明者らは部位特異的突然変異誘発法を実施し、これらの変異をこれらの位置におけるアラニン置換に変更し、これらをＷＴ  Ｃａｓ９及び元のアミノ酸置換の両方と比較した（新たなアラニン変異体は、配列番号７、１０、１２、１４、１９、２１、２４、２６、３２、３５及び３８を含む。）。本発明者らは、一次スクリーニングから単離された元の変異体と新たなアラニン変異体との間で類似の表現型を観察した（図４及び５）。一部の場合、アラニン置換は、より高いオンターゲット編集活性及びより低いオフターゲット編集活性をもたらした。一般に、アラニン変異体は、単離された元の変異体と同様に機能し又はこれより良好に機能し、したがって前進変異の組合せを、アラニン置換を使用してのみ試験した。位置Ｒ６９１及びＮ６９２における変異は、ＥＭＸ１及びＨＥＫＳｉｔｅ４  ｃｒＲＮＡの両方について、オフターゲット遺伝子編集活性の最大の減少を示した。Ｒ６９１における変異はＷＴ  Ｃａｓ９レベルのオンターゲット編集活性を実証する一方、Ｎ６９２における変異は、両方のｃｒＲＮＡについてオンターゲット編集活性のわずかな減少を示す。この理由のために、本発明者らは、出発点として、Ｒ６９１Ａ又はＮ６９２Ａ変異のいずれかに基づいて二重及び三重変異体の組合せを作製することを選択した。本発明者らはまた、Ｒ６９１Ａ／Ｎ６９２Ａ二重変異体を作製し、試験した。新たな二重変異Ｃａｓ９配列は配列番号３９〜７０を含む。これらの変異の全ての組合せは、検出可能なオフターゲット編集活性が検出されなかったという点で相加効果を有した（図６）。２つの公開された従来技術の高忠実度Ｃａｓ９タンパク質、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）（Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ及びＲ１０６０Ａ）（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５１、８４〜８８頁、２０１６年）及びＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４９０〜４９５頁、２０１６年）もまた、プラスミドによって送達された場合、検出不能なオフターゲット編集活性を有したが、野生型タンパク質と比較して、減少したオンターゲット編集活性を有した。本発明の変異体は、従来技術からのこれらの変異体と比較して、プラスミドとして送達された場合、優れた全体的な編集活性プロファイルを有する。実施例において利用した全てのＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡの標的特異的プロトスペーサードメインの配列を表１に提供する。これらのＲＮＡ配列は、標的部位と共に変化するｇＲＮＡの可変ドメインを表す。実際には、プロトスペーサードメインは、完全な機���的Ｃａｓ９  ｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡを含むようにさらなるユニバーサルＲＮＡ配列と隣接している（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、３３７（６０９６）：８１６〜２１頁及びＪａｃｏｂｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１７年、１２１〜１２２、１６〜２８頁を参照のこと。）。実施例において研究したＤＮＡオンターゲット及びオフターゲットドメイン並びにｄｓＤＮＡ  ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑタグの配列を表２に示す。
【０２３２】
【表１】
2019533996.tif 000095
2019533996.tif 000096
2019533996.tif 000097
【０２３３】
【表２】
2019533996.tif 000098
【０２３４】
［実施例４］
新規Ｃａｓ９変異体のＲＮＰ送達は、オンターゲット編集活性を維持しながら、オフターゲット編集活性を減少させる。
【０２３５】
以下の実施例は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体がＲＮＰ複合体として哺乳動物細胞に送達される場合、オフターゲット遺伝子編集活性を減少させ、オンターゲット編集活性を維持する、本発明のＣａｓ９変異体の能力を実証している。
【０２３６】
本発明に記載されているＣａｓ９アミノ酸変異を、Ｅ．コリにおける組換えタンパク質の発現を可能にするＣａｓ９タンパク質発現／精製プラスミドの環境に移し、得られたタンパク質は、哺乳動物細胞における核送達を容易にするＮＬＳドメイン並びに精製を単純化するためのＨＩＳタグを含有する（ＷＴ  Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列、配列番号１及びＲ６９１Ａ変異体、配列番号３を参照のこと。）。ドメイン付加を伴うアミノ酸配列は、例示的なモデルとして示されている（ＷＴ  配列番号６、Ｒ６９１Ａ変異体  配列番号８）。野生型及び変異Ｃａｓ９タンパク質を、固定化金属アフィニティー及びヘパリンクロマトグラフィー法により精製した。公開されている高忠実度Ｃａｓ９タンパク質、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）及びＳｐＣａｓ９−ＨＦ１もまた、この方法を使用して精製した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験を、２５℃にて５分間、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の精製したＣａｓ９タンパク質及び２部のＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体）との１μＭのＲＮＰ複合体を最初に形成することによって実施した。Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡはＨＰＲＴ遺伝子（配列番号８９〜１００）及びＣＴＬＡ４遺伝子（配列番号１０１〜１１２）を標的化し、１．２μｌのＲＮＡｉＭＡＸを使用した予め形成したＲＮＰ複合体の逆トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞（４０，０００個の細胞／ウェル）へ送達された。実験を生物学的三連において実施し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後に溶解した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅及びＴ７Ｅ１消化を、実施例３におけるプラスミドに基づく実験について記載されているように実施した。ＰＣＲ増幅プライマーは表１（配列番号１１７〜１２２）に列挙されている。
【０２３７】
図７は、ＷＴ、変異Ｒ６９１Ａ、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）及びＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質を比較した、ヒトＨＰＲＴ遺伝子の１２個の部位にて哺乳動物細胞においてＲＮＰ法を使用したゲノム編集効率を示し、ヒトＣＴＬＡ４遺伝子の１２個の部位については図８に示す。本発明のＲ６９１Ａ  Ｃａｓ９変異体は、試験した部位の９５％にて野生型Ｃａｓ９と同等のオンターゲット編集活性を示したが、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１及びｅＳｐＣａｓ９（１．１）はそれぞれ、部位の２９％及び５７％においてのみ有用な機能を示した。
【０２３８】
同一の系を、３つの異なる遺伝子（ＥＭＸ１  配列番号１１３、ＨＥＫＳｉｔｅ４  配列番号１１４及びＶＥＧＦＡ３  配列番号１１６）におけるｃｒＲＮＡ部位について以前に同定された部位でのオフターゲット編集活性を研究するために使用した。オンターゲット部位は、図９におけるオフターゲット部位（配列番号１２１〜１２６、１２９及び１３０）と並べて示されている。有意なオフターゲット編集活性が、ＷＴ  Ｃａｓ９酵素について３つの全ての部位において見られたが、３つの変異Ｃａｓ９酵素の全ては、このアッセイを使用して検出可能なオフターゲット活性を示さなかった。しかしながら、本発明の新規Ｒ６９１Ａ変異体は、これらの３つの部位において同一のオンターゲット活性を示す一方、従来技術の変異体ｅＳｐＣａｓ９（１．１）及びＣａｓ９−ＨＦ１のみが、ＥＭＸ１部位において完全な活性を示し、有意に減少した活性がＨＥＫＳｉｔｅ４及びＶＥＧＦ３Ａ遺伝子座において見られた。このことは本発明の有用性を実証している：Ｒ６９１Ａ  Ｃａｓ９変異体については、オンターゲット活性を高く維持しながら、オフターゲット活性を減少させ、従来技術からの既存の変異体の性能を超える有意な改善を提供する。
【０２３９】
さらなるＣａｓ９変異体（単一、二重及び三重変異体を含む。）を、精製組換えタンパク質として調製し、部位ＨＰＲＴ−３８５０９（配列番号９２）でのオンターゲット活性について（図１０）及びＨＥＫＳｉｔｅ４（配列番号１１４）でのオンターゲット対オフターゲット活性について、上記のように哺乳動物細胞におけるＲＮＰ送達を使用して研究した。研究したＣａｓ９酵素は、ＷＴ（配列番号５）及び変異体、配列番号７、１９、２２、３３、３６、５２、６２、６６、６８、６９及び７０）を含んだ。ＨＰＲＴ  ３８５０９は、典型的に高レベルの編集活性を示さず、Ｃａｓ９活性の変化に感受性であるｇＲＮＡ部位である。
【０２４０】
図１０は、試験したＣａｓ９単一変異体の全てが、高レベルのオンターゲット活性を示し、一方で、二重及び三重変異体の全てが、ＲＮＰ法と共に哺乳動物細胞において使用した場合、活性の有意な喪失を示したことを示す。これらの同一の二重変異体は、プラスミドテンプレートから過剰発現した場合、良好な活性を示したことに留意されたい（図６）。
【０２４１】
これらの変異体をまた、オフターゲット活性及びＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座について試験するためにＲＮＰとして送達した。全体として、Ｎ６９２Ａ変異体はＲ６９１Ａと同様に機能し、オンターゲット編集活性をわずかにだけ減少させ（図１０）、オフターゲット編集活性は検出不能であった（図１１）。単離物における他の単一変異体は、優れたオンターゲット編集活性を示したが（図１０）、この困難な部位においてオフターゲット編集活性の減少はわずかであった又は全くなかった（図１１）。Ｒ６９１Ａ又はＮ６９２Ａを含有する変異の複数の組合せは、プラスミド送達を使用して、検出不能なオフターゲット編集活性と相まって優れたオンターゲット編集活性を示したが、これらの変異体は、ＲＮＰ送達を使用すると、減少したオンターゲット編集活性を示した（図１０及び１１）。Ｒ６９１Ａ変異体は、試験した複数の部位において、オフターゲット編集活性の減少とオンターゲット編集活性の維持との最良の全体的な組合せを示したので、この部位をより深く研究した。
【０２４２】
［実施例５］
プラスミド及びＲＮＰ送達法を使用した、位置Ｒ６９１におけるさらなるアミノ酸変異の試験。
これまで、部位Ｒ６９１は、ＷＴ並びに変異体Ｒ６９１Ａ及びＲ６９１Ｓとして特徴付けられてきた。本実施例は、Ｃａｓ９におけるこの位置での１７個の他の可能なアミノ酸置換の活性を実証している。
【０２４３】
この位置での１７個の新しいアミノ酸置換を、部位特異的突然変異誘発法を使用して哺乳動物Ｃａｓ９発現プラスミドに導入し、プラスミド送達を使用してＨＥＫ２９３細胞における機能について試験した（実施例３に記載されている方法）。オンターゲット編集活性を、ｃｒＲＮＡ  ＨＰＲＴ  ３８５０９（配列番号９２）を使用して研究し、この部位における全ての２０個の可能なアミノ酸（配列番号５、７及び７１〜８８）についての結果を図１２に示す。変異体Ｒ６９１Ｎ、Ｒ６９１Ｃ、Ｒ６９１Ｔ、Ｒ６９１Ｉ、Ｒ６９１Ｌ及びＲ６９１Ｖは、減少したオンターゲット活性を示したが、この位置において１４個の他のアミノ酸を利用するＷＴ及び変異体は全て高い活性を示した。
【０２４４】
この組の２０個のＣａｓ９バリアントについてのオンターゲット及びオフターゲット活性の組合せを、ＷＴ  Ｃａｓ９でのオンターゲット及びオフターゲットの両方についての高活性部位であるｃｒＲＮＡ  ＨＥＫＳｉｔｅ４（配列番号１１４）において研究した。図１３は、ＷＴ  Ｃａｓ９並びに変異体Ｒ６９１Ｋ及びＲ６９１Ｐが、この部位において高いオフターゲット活性を示したが、他の１７個全てのＣａｓ９変異体は、有意に減少したオフターゲット活性を示したことを実証している。このことは、部位Ｒ６９１が、Ｃａｓ９機能を改善するために変異させるための理想的な部位であり、種々の異なるアミノ酸置換がこの環境において十分に機能することを実証している。
【０２４５】
これらの変異体、Ｒ６９１Ｄ、Ｒ６９１Ｇ、Ｒ６９１Ｈ、Ｒ６９１Ｙ及びＲ６９１Ｗの最良の性能を組換えタンパク質として調製し、ＲＮＰ送達（実施例４に記載されている方法）を使用してオンターゲット及びオフターゲット編集活性についてＷＴ  Ｃａｓ９及び変異体Ｒ６９１Ａと比較して試験した。図１４及び１５に示されているように、これら変異体の全ては、ｃｒＲＮＡ部位ＨＰＲＴ  ３８５０９（配列番号９２）、ＨＰＲＴ  ３８０８７（配列番号９４）、ＥＭＸ１（配列番号１１３）及びＨＥＫＳｉｔｅ４（配列番号１１４）において極めて類似したレベルのオンターゲット編集活性を示した。全ての変異体はまた、部位ＥＭＸ１及びＨＥＫＳｉｔｅ４についてオフターゲット活性の有意な減少を示したが（図１５）、低いが検出可能なオフターゲット編集活性が、Ｒ６９１Ｇ、Ｒ６９１Ｈ及びＲ６９１Ｙ変異体について観察された。Ｒ６９１Ａ、Ｒ６９１Ｄ及びＲ６９１Ｗ変異体は、プラスミド及びＲＮＰ送達法の両方が考慮される場合、オンターゲット編集活性及びオフターゲット編集活性減少の最良の組合せを提供した。
【０２４６】
Ｒ６９１Ａ変異体を、Ｇｕｉｄｅ−Ｓｅｑ（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３、１８７〜１９７頁、２０１５年）と呼ばれている公開されている偏りのないゲノムワイド次世代シークエンシング（ＮＧＳ）アッセイを使用して全体的なオフターゲット効果について試験した。これは、上記の実施例において研究したＥＭＸ１、ＨＥＫＳｉｔｅ４及びＶＥＧＦ３Ａ  ｃＲＮＡについての検証されたオフターゲット部位のための供給源であった。Ｇｕｉｄｅ−Ｓｅｑプロトコールを、ＲＮＰ送達と共にＷＴ  Ｃａｓ９又はＲ６９１Ａ変異体Ｃａｓ９のいずれかを使用して、ｃｒＲＮＡガイドＥＭＸ１（配列番号１１３）、ＶＥＧＦＡ３（配列番号１１６）及びＡＲ（配列番号１１５）を使用して推奨されているように実施した。ＮＧＳライブラリー構築及びデータ処理を、以前に記載されているように実施し（Ｔｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７〜１９７頁、２０１５年）、結果（図１６）は、Ｒ６９１Ａ変異体が、ＷＴ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較して、オンターゲット編集活性を維持しながら全体的なオフターゲット編集活性を有意に減少させることを実証している。
【０２４７】
本明細書において引用されている刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、個々にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込む。
【０２４８】
本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「一つの（ａ）」及び「一つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」という用語並びに同様の指示語の使用は、本明細書において別途指示されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途記載されない限り、オープンエンドの用語として解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途指示されない限り、その範囲内に含まれる各別個の値を個々に言及することの簡易方法として役立つことが意図されるにすぎず、各別個の値は、これが本明細書において個々に列挙された場合と同様に、本明細書に組み込む。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において別途指示されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書において提供されるいかなる実施例又は例示的な語（例えば、「のような」）の使用も、本発明をより良く例示することが意図されているにすぎず、別途要求されない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる語も、請求されていないいかなる要素も本発明の実施に必須であるとして示すものと解釈されるべきではない。
【０２４９】
本発明を実施するために本発明者らに公知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことで当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形形態を適切に用いることを期待し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている方法とは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法により許可される通り、本明細書に添付されている特許請求の範囲内に列挙される主題の全ての修飾及び均等物を含む。さらに、上記要素の、これらの全ての可能な変形形態におけるいかなる組合せも、本明細書において別途指示されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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