(57)【要約】  ウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディター、ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターおよびこれらの組み合わせから選択される２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む、溶原ウイルスを処理するための組成物。ウイルスＤＮＡを標的とする少なくとも１つの遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む、溶菌ウイルスを処理するための組成物。ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡおよびこれらの組み合わせから選択されるウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための組成物。ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む、溶菌ウイルスを処理するための組成物。上記の組成物を、ウイルスを有する個体に投与することと、ウイルスを不活化することとにより溶原ウイルスまたは溶菌ウイルスを処理する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶原ウイルスを処理するための組成物において、ウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディター、ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、ウイルスＤＮＡを標的とする前記遺伝子エディターは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、ウイルスＲＮＡを標的とする前記遺伝子エディターは、Ｃ２ｃ２およびＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物は、前記ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物は、前記溶原ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物において、前記溶原ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ＨＰＶウイルス、黄熱病、ジカ、デング、ウエストナイル、日本脳炎、リッサウイルス、ベシクロウイルス、サイトハブドウイルス、ハンタンウイルス、リフトバレーウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、フレキサルウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、エボラ、マールブルグウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項９】
溶菌ウイルスを処理するための組成物において、ウイルスＤＮＡを標的とする少なくとも１つの遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物において、ウイルスＤＮＡを標的とする前記遺伝子エディターは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項９に記載の組成物において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２およびＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の組成物において、前記組成物は、前記ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の組成物において、前記組成物は、前記溶菌ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項９に記載の組成物において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項９に記載の組成物において、前記溶菌ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、コクサッキーウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ロタ、セアドルンウイルス、コルチウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための組成物において、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組成物において、前記組成物は、前記ウイルスＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１７に記載の組成物において、前記組成物は、前記溶原および溶菌ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１７に記載の組成物において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項１７に記載の組成物において、前記溶原および溶菌ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
溶菌ウイルスを処理するための組成物において、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組成物において、ウイルスＲＮＡを標的とする前記遺伝子エディターは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２３に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項２３に記載の組成物において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、Ｃ２ｃ２およびＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の組成物において、前記組成物は、前記ウイルスＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くことを特徴とする組成物。
【請求項２８】
請求項２３に記載の組成物において、前記組成物は、前記溶菌ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すことを特徴とする組成物。
【請求項２９】
請求項２３に記載の組成物において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする組成物。
【請求項３０】
請求項２３に記載の組成物において、前記溶菌ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、コクサッキーウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ロタ、セアドルンウイルス、コルチウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
溶原ウイルスを処理する方法において、ウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディター、ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む組成物を、溶原ウイルスを有する個体に投与するステップ；および
前記溶原ウイルスを不活化するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、前記ウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディターは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法において、前記ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターは、Ｃ２ｃ２およびＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記溶原ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３１に記載の方法において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３１に記載の方法において、前記溶原ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ＨＰＶウイルス、黄熱病、ジカ、デング、ウエストナイル、日本脳炎、リッサウイルス、ベシクロウイルス、サイトハブドウイルス、ハンタンウイルス、リフトバレーウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、フレキサルウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、エボラ、マールブルグウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
溶菌ウイルスを処理するための方法において、ウイルスＤＮＡを標的とする少なくとも１つの遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む組成物を、溶菌ウイルスを有する個体に投与するステップ；および
前記溶菌ウイルスを不活化するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法において、ウイルスＤＮＡを標的とする前記遺伝子エディターは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３９に記載の方法において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２およびＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３９に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項３９に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記溶菌ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項３９に記載の方法において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項３９に記載の方法において、前記溶菌ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、コクサッキーウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ロタ、セアドルンウイルス、コルチウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４７】
溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための方法において、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む組成物を、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを有する個体に投与するステップ；および
前記溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを不活化するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記ウイルスＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記溶原および溶菌ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４７に記載の方法において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４７に記載の方法において、前記溶原および溶菌ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５３】
溶菌ウイルスを処理するための方法において、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む組成物を、溶菌ウイルスを有する個体に投与するステップ；および
前記溶菌ウイルスを不活化するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５３に記載の方法において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、Ｃ２ｃ２およびＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５３に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記ウイルスＲＮＡの複製重要セグメントを取り除くステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５３に記載の方法において、前記不活化ステップは、前記溶菌ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切り出すステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５３に記載の方法において、前記組成物は、ベクター内に含まれることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５３に記載の方法において、前記溶菌ウイルスは、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、コクサッキーウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ロタ、セアドルンウイルス、コルチウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの処理の組成物および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ウイルスを感染宿主細胞から切り出し、ウイルスを不活化するための組成物および処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、２つのサイクルの１つ、溶菌サイクルあるいは溶原サイクルのいずれかで複製する。溶菌サイクルでは、ウイルスは最初に宿主細胞に侵入し、それ自身の核酸を放出する。次に、宿主細胞の代謝機構を使用してウイルス核酸を複製し、ウイルスを宿主細胞内に蓄積する。宿主細胞内に十分なビリオンが産生されたなら、宿主細胞は破裂（溶解）し、ビリオンは、別の細胞に感染し続ける。溶菌ウイルスは、ウイルスＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むこともあるし、組み込まれずに細胞の感染期間にわたり溶解が起こらないこともある。
【０００３】
溶菌ウイルスとして、ジョン・カニンガム（Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ウイルス（ＪＣＶ）、Ａ型肝炎および様々なヘルペスウイルスが挙げられる。溶原サイクルでは、ビリオンＤＮＡが宿主細胞に組み込まれて、宿主細胞が繁殖すると、ビリオンＤＮＡは細胞分裂の結果生じる細胞にコピーされる。溶原サイクルの場合、宿主細胞は破裂しない。溶原ウイルスとして、Ｂ型肝炎、ジカウイルスおよびＨＩＶが挙げられる。ラムダファージなどのウイルスは、溶菌サイクルと溶原サイクルを切り替えることができる。
【０００４】
Ｋｈａｌｉｌｉらに対する米国特許出願第１４／８３８，０５７号明細書には、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ、および２つ以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（少なくとも２つのｇＲＮＡの各々が、プロウイルスＤＮＡの末端反復配列（ＬＴＲ）の異なる標的核酸配列と相補的である）を含む組成物を用いて宿主細胞を処理すること；およびプロウイルスＤＮＡを不活化することにより、レトロウイルスに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活化する方法が開示される。さらにプロウイルスＤＮＡを不活化するための組成物も提供されている。この方法および組成物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた溶原ウイルスを処理するのに有用である一方、遺伝子編集システムは、溶菌ウイルスを効率的に処理することができない。溶菌ウイルスの処理は、ＨＩＶの場合と同様に阻害剤がウイルス発現を抑制するのに役立たない限り、このシステムを単独で使用する場合、非効率的なウイルス排除となる。大部分のウイルスは現在、標的阻害剤がない。特に、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ビリオン内に含まれる（すなわち、たとえばカプシドまたはエンベロープタンパク質により保護されている）ウイルス核酸に接近できない。
【０００５】
ブロード研究所（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＭＩＴ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ）、マサチューセッツ工科大学（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、ラトガース大学ニューブランズウィック（Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）およびスコルコボ科学技術大学（Ｓｋｏｌｋｏｖｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の研究者らは、ＤＮＡでなくＲＮＡを標的とする新規なＣＲＩＳＰＲシステムの特徴付けを行った。このアプローチは、ＲＮＡ編集に関する細胞操作において、さらなる道を開く可能性を有する。ＤＮＡ編集は、細胞のゲノムを永続的に変化させるのに対し、ＣＲＩＳＰＲを用いたＲＮＡ標的化アプローチは、上下に調整できる一時的変化を可能にし、既にあるＲＮＡ干渉法より特異性および機能性を高め得る。具体的には、ＣＲＩＳＰＲを用いたＲＮＡ標的化アプローチは、ＲＮＡ組み込みウイルスの感染およびその結果生じる疾患に対応することができる。この研究は、ＲＮＡを標的として分解することができるＲＮＡ誘導型酵素Ｃ２ｃ２の同定および機能の特徴付けを報告している。
【０００６】
この知見から、Ｃ２ｃ２（ＲＮＡのみを標的とすることが特定された最初の天然のＣＲＩＳＰＲシステム、２０１５年１０月にこの共同研究グループにより発見された）は、ウイルス感染から細菌を保護するのを助けることが明らかにされている。知見からは、Ｃ２ｃ２が、細菌細胞の特定のＲＮＡ配列を切断するようにプログラムできることが立証されており、これによりＣ２ｃ２は分子生物学のツールボックスの重要な追加要素になると考えられる。Ｃ２ｃ２のＲＮＡに的を絞った作用は、細胞の同一性および機能の青写真であるＤＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを補完する。ゲノムの指令の実行を手助けするＲＮＡのみを標的とし得ることで、ハイスループットでＲＮＡを特異的に操作し、そして遺伝子機能をより広く操作する能力が得られる。これは、疾患の理解、処置および予防の進歩を加速する可能性を有する。
【０００７】
したがって、溶原ウイルスのみならず溶菌ウイルスを標的とする処置剤が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディター、ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む、溶原ウイルスを処理するための組成物を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、ウイルスＤＮＡを標的とする少なくとも１つの遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む、溶菌ウイルスを処理するための組成物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターおよびＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む、溶菌ウイルスを処理するための組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、ウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディター、ウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む組成物を、溶原ウイルスを有する個体に投与することと、溶原ウイルスを不活化することとにより、溶原ウイルスを処理する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、ウイルスＤＮＡを標的とする少なくとも１つの遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む組成物を、溶菌ウイルスを有する個体に投与することと、溶菌ウイルスを不活化することとを含む、溶菌ウイルスを処理するための方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターをコードする単離された核酸を含む組成物を、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを有する個体に投与することと、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを不活化することとにより、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ウイルスＲＮＡを標的とする２つ以上の遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡ標的化組成物をコードする単離された核酸を含む組成物を、溶菌ウイルスを有する個体に投与することと、溶菌ウイルスを不活化することとにより、溶菌ウイルスを処理するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を添付図面と共に検討すると本発明の理解が深まるため、容易に理解される。
【００１７】
【図１】図１は、細胞内の溶菌および溶原ウイルスと、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９を使用してもよい時点およびＲＮＡ標的化システムを使用してもよい時点との図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は一般に、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを処理するための組成物および方法を対象とする。本組成物は、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを処理することも、あるいは任意選択的に両方の複製方法を使用するウイルスを処理することもできる。
【００１９】
「溶原ウイルス」は、本明細書で使用する場合、溶原サイクルにより複製する（すなわち宿主細胞を破裂させずに宿主細胞ＤＮＡにウイルス核酸を組み込む）ウイルスをいう。溶原ウイルスは、主に溶原サイクルにより複製するが、場合によっては溶菌サイクルにより複製することもできる。
【００２０】
「溶菌ウイルス」は、本明細書で使用する場合、溶菌サイクルにより複製する（すなわち細胞内ウイルスの蓄積後に宿主細胞を破裂させる）ウイルスをいう。溶菌ウイルスは、主に溶菌サイクルにより複製するが、場合によっては溶原サイクルにより複製することもできる。
【００２１】
「ｇＲＮＡ」は、本明細書で使用する場合、ガイドＲＮＡをいう。本明細書のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡは、ウイルスのゲノムセグメントを切り出し、ひいてはウイルスのタンパク質を複製／生成する能力を壊滅的に破壊するために使用される。これは、２つ以上の特別に設計されたｇＲＮＡを使用して、ウイルスエスケープまたは変異などの単一のｇＲＮＡで見られる問題を回避することにより達成される。ｇＲＮＡは、コードまたは非コード配列と相補的な配列であってもよく、標的とされる特定のウイルスに合わせることもできる。ｇＲＮＡは、タンパク質コード配列、たとえば、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質（たとえば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｔａｔ）をコードする配列と相補的な配列であってもよい。ｇＲＮＡ配列は、センス配列またはアンチセンス配列であってもよい。
【００２２】
「アルゴノートタンパク質」は、本明細書で使用する場合、ＰＩＷＩ（Ｐ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｍｐｙ  ｔｅｓｔｉｓ）ドメイン、ＭＩＤ（ｍｉｄｄｌｅ）ドメイン、ＰＡＺ（Ｐｉｗｉ−Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−Ｚｗｉｌｌｅ）ドメインおよびＮ末端ドメインを含む、ＰＩＷＩタンパク質スーパーファミリーのタンパク質をいう。アルゴノートタンパク質は、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびＰｉｗｉ相互作用（Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）ＲＮＡなどの小分子ＲＮＡに結合することができる。アルゴノートタンパク質は、標的配列のｍＲＮＡを切断する、翻訳を阻害するまたはｍＲＮＡ分解を誘導するため、これらのＲＮＡと共に標的配列に導くことができる。小分子ＲＮＡと結合するＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３およびＡＧＯ４を含め、いくつかの異なるヒトアルゴノートタンパク質がある。ＡＧＯ２は、スライサー能力を有する、すなわちエンドヌクレアーゼとして働く。アルゴノートタンパク質は、遺伝子編集に使用することができる。アルゴノートタンパク質ファミリーの（ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノートの）エンドヌクレアーゼも、ガイドとしてオリゴヌクレオチドを使用して侵入ゲノムを分解する。Ｇａｏらによる研究から、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）は、ヒト細胞におけるゲノム編集に好適なＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであることが示されている。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を添加すると、ｇＤＮＡと結合し、部位特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ｂｒｅａｋ）を効率的に引き起こす。ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡシステムは、Ｃａｓ９が必要とするプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とせず、予備的な特性評価では、ガイド−標的ミスマッチに対する許容性が低く、Ｇ＋Ｃリッチなゲノム標的の編集における効率が高いことが示唆される。本発明に使用されるアルゴノートタンパク質エンドヌクレアーゼはさらに、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）アルゴノート（ＲｓＡｒｇｏ）であってもよい。ＲｓＡｒｇｏは、Ｎ末端ドメインとＰＩＷＩドメインの間のガイドＲＮＡの３’−領域において塩基対合を維持することができるため、標的ＤＮＡ鎖およびガイドＲＮＡとの安定な相互作用を与えることができる。ＲｓＡｒｇｏはさらに、ガイドＲＮＡの５’塩基Ｕを特異的に認識し、ガイドＲＮＡとＰＡＺドメインの二重鎖認識ループが、ＤＮＡサイレンシング活性において重要である可能性がある。他の原核生物のアルゴノートタンパク質（ｐＡｇｏ）も、ＤＮＡ干渉および切断に使用することができる。アルゴノートタンパク質は、シロイスナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕ���ｉｏｓｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＪＬ−１８、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＨＢ２７、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）株ＶＦ５、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、ハロゲオメトリクム・ボリンクェンス（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ  ｂｏｒｉｎｑｕｅｎｓｅ）、ミクロシスティス・エルギノーザ（Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロストリジウム・バルトレッチイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ）、ハロルブルム・ラクスプロフンジ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）およびシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来であってもよい。さらに、エンドヌクレアーゼ的に不活性であるが、エンドヌクレアーゼとして活性化するため、保存された触媒残基に翻訳後修飾を行うことができるアルゴノートタンパク質を使用してもよい。
【００２３】
ヒトＷＲＮは、ウェルナー症候群遺伝子によりコードされるＲｅｃＱヘリカーゼである。ヒトＷＲＮは、複製、組換え、除去修復およびＤＮＡ損傷応答を含むゲノム維持に関係していると考えられている。これらの遺伝プロセスおよびＷＲＮの発現は、多くのタイプの癌において同時に上方制御される。したがって、このヘリカーゼの標的破壊が癌細胞の除去に有用であり得ると提唱されている。複数の報告では、ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡを方向付けるのに外部ガイド配列（ＥＧＳ）アプローチを使用して、培養ヒト細胞株のＷＲＮ  ｍＲＮＡを効率的に切断し、もってこの特有の３’−５’ＤＮＡヘリカーゼ−ヌクレアーゼの翻訳および活性を破壊している。ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡは、本発明に使用するのに有望なもう１つのエンドヌクレアーゼである。
【００２４】
「Ｃ２ｃ２」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ誘導型ＲＮａｓｅ機能を示すクラス２  ＶＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターをいう。Ｃ２ｃ２は、ＲＮＡのみを標的とする最初の天然のＣＲＩＳＰＲシステムである。Ｃ２ｃ２は、細菌レプトトリキア・シャヒー（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ）由来であり、ＲＮＡファージに干渉する。インビトロでの生化学的解析では、Ｃ２ｃ２は、単独のｃｒＲＮＡにより導かれ、相補的プロトスペーサーを有するｓｓＲＮＡ標的を切断するようにプログラムすることができることが示される。細菌では、Ｃ２ｃ２は、特定のｍＲＮＡをノックダウンするようにプログラムすることができる。切断は、２つの保存されたＨＥＰＮドメインの触媒残基により誘発され、その変異は、触媒的に不活性なＲＮＡ−結合タンパク質を作出する。これらの結果から、新たなＲＮＡ標的化ツールとしてのＣ２ｃ２の能力が立証される。Ｃ２ｃ２のＲＮＡに的を絞った作用は、細胞の同一性および機能の青写真であるＤＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを補完する。ゲノムの指令の実行を手助けするＲＮＡのみを標的とし得ることで、ハイスループットでＲＮＡを特異的に操作し、そして遺伝子機能をより広く操作する能力が得られる。したがって、Ｃ２ｃ２は、本明細書に記載の組成物に使用することができる。
【００２５】
「核酸」は、本明細書で使用する場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含む核酸アナログを含め、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方をいい、そのいずれも本発明のポリペプチドをコードしてもよく、そのすべてが本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、本質的に任意の三次元構造を有してもよい。核酸は、二本鎖でもあるいは一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）でもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびその一部、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーのほか、核酸アナログが挙げられる。本発明の文脈では、核酸は、天然のＣａｓ９またはその生物活性変異体のフラグメント、およびウイルスの配列と相補的である少なくとも２つのｇＲＮＡをコードすることができる。
【００２６】
「単離された」核酸は、たとえば、天然のＤＮＡ分子またはそのフラグメントであればよく、ただし通常天然ゲノムにおいてそのＤＮＡ分子に直接隣接することが分かっている核酸配列の少なくとも１つが取り除かれているかまたは存在しないものとする。よって、単離された核酸としては、以下に限定されるものではないが、他の配列（たとえば、化学合成された核酸、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）に関係なく、切り離された分子として存在するＤＮＡ分子が挙げられる。単離された核酸はさらに、ベクター、自律複製プラスミド、ウイルスまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているＤＮＡ分子もいう。さらに、単離された核酸は、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの人工核酸を含んでもよい。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライス内の多くの（たとえば、数十または数百から数百万）の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸ではない。
【００２７】
単離された核酸分子は、標準的な技術により作製することができる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含め、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸を得ることができる。ＰＣＲを使用して、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含め、ＤＮＡのほかＲＮＡ由来の特定の配列を増幅することができる。様々なＰＣＲ法は、たとえば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。一般に、目的の領域の両端またはそれ以外の配列情報を利用して、増幅される鋳型の逆鎖と配列が同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。さらに、部位特異的なヌクレオチド配列修飾を鋳型核酸に導入できる様々なＰＣＲ戦略も利用可能である。
【００２８】
単離された核酸はさらに、（たとえば、ホスホラミダイト技術を用いて３’から５’方向に自動ＤＮＡ合成により）単一の核酸分子としてあるいは一連のオリゴヌクレオチドとして化学合成することもできる。たとえば、所望の配列を含む長いオリゴヌクレオチド（たとえば、＞５０〜１００ヌクレオチド）の１つまたは複数の対を合成し、各対は、オリゴヌクレオチド対がアニーリングしたときに二重鎖が形成されるように、相補性の短いセグメント（たとえば、約１５ヌクレオチド）を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長させ、その結果オリゴヌクレオチド対あたり１つの二本鎖核酸分子が得られ、次いでこれをベクターにライゲートしてもよい。本発明の単離された核酸はさらに、たとえば、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡの天然部分の変異誘発によって得ることもできる（たとえば、上記の式に従って）。
【００２９】
「ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９」は、本明細書で使用する場合、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９をいう。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位は、可動性遺伝因子（ウイルス、転位因子および接合性プラスミド）に対するＲＮＡ誘導型適応免疫系をコードする。３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行可動性因子と相補的な配列、スペーサーを含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写され、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、標的ＤＮＡをカットする強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０塩基対（ｂｐ）の独特の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含む成熟ｃｒＲＮＡと、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ支援プロセシングのガイドとして働くトランス活性化小分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とにより導かれる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに方向付ける。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識してカット部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現させても、あるいは天然のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するため合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工融合小分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として遺伝子工学的に作製してもよい。こうしたｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡのように、ＲＮＡの直接トランスフェクションのため合成またはインビトロ転写しても、あるいはＵ６またはＨ１プロモーターを使用したＲＮＡ発現ベクターから発現させてもよいが、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、別々に発現させたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用いたシステムのそれより低い。本発明に使用することができるｃａｓ９のいくつかの変異体を下記表１に示す。
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【００３０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムと類似のＤＮＡ編集技術であり、ブロード研究所（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびＭＩＴのＦｅｎｇ  Ｚｈａｎｇのグループにより２０１５年に特徴付けが行われた。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。この獲得免疫メカニズムは、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）菌およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）菌に見られる。それは、ウイルスによる遺伝子損傷が起こらないようにする。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ座位と連鎖しており、ガイドＲＮＡを使用してウイルスＤＮＡを見つけて切断するエンドヌクレアーゼをコードする。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９より小さくて単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの制約の一部を克服している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、遺伝疾病および変性状態の処置を含め、複数の用途を有し得る。
【００３１】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型ストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種、たとえばサーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの他のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、もしくは他の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核生物の微生物由来の配列であってもよい。あるいは、野生型ストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列は、改変してもよい。核酸配列は、哺乳動物細胞において効率的に発現するようにコドンを最適化、すなわち、「ヒト化」してもよい。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５に列記された発現ベクターのいずれかによりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であってもよい。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、たとえば、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製のＰＸ３３０またはＰＸ２６０などの市販されているベクター内に含まれる配列であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列のいずれかの変異体またはフラグメントであるアミノ酸配列を有して、あるいはＰＸ３３０もしくはＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のＣａｓ９アミノ酸配列を有してもよい。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物活性変異体をコードするように改変してもよく、これらの変異体は、たとえば、１つまたは複数の変異（たとえば、付加変異、欠失変異もしくは置換変異またはそうした変異の組み合わせ）を含むため、野生型Ｃａｓ９と異なるアミノ酸配列を有してもよいし、あるいは含んでもよい。１つまたは複数の置換変異は、置換（たとえば、保存的アミノ酸置換）であってもよい。たとえば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物活性変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して少なくともまたは約５０％の配列同一性（たとえば、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性）を持つアミノ酸配列を有してもよい。保存的アミノ酸置換は典型的には、以下：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの群内の置換を含む。Ｃａｓ９アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、非天然のア���ノ酸残基であってもよい。天然のアミノ酸残基は、遺伝コードにより天然にコードされたもののほか、非標準的なアミノ酸（たとえば、Ｌ型でなくＤ型を有するアミノ酸）を含む。本ペプチドは、標準的なアミノ酸残基の修飾体であるアミノ酸残基をさらに含んでもよい（たとえばリジンの代わりにピロリシンを使用してもよく、システインの代わりにセレノシステインを使用してもよい）。非天然のアミノ酸残基は、自然界に見出されていないものの、アミノ酸の基本式に一致し、ペプチドに組み込むことができるものである。これらとして、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸およびＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸が挙げられる。他の例については、指導書またはワールドワイドウェブを参考にしてもよい（カリフォルニア工科大学（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が現在維持しているサイトでは、機能タンパク質への組み込みに成功した非天然アミノ酸の構造を表示している）。
【００３２】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、多用途ゲノム編集プラットフォームとして登場したが、一般に用いられるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の大きさにより、非常に万能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達ビヒクルを使用する基礎研究および治療用途に対する、その有用性が限定されるという報告も一部なされている。そこで、６つのより小さなＣａｓ９オルソログが使用されており、報告では、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）は、１キロベース超短いながらＳｐＣａｓ９と同様の効率でゲノムを編集できることが示されている。
【００３３】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、変異配列であってもよい。たとえばＣａｓ９ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する保存されたＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインで変異していてもよい。たとえば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパルテートからアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変異により、Ｃａｓ９ニッカーゼミュータント（Ｃａｓ９ｎ）は、ＤＮＡを切断するのではなくニックを入れて一本鎖切断（ｂｒｅａｋ）を生じることができ、その後のＨＤＲによる優先的修復により、オフターゲット二本鎖切断（ｂｒｅａｋ）による望ましくないインデル変異の頻度を潜在的に減少させることができる。
【００３４】
本発明は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよび他のウイルスＤＮＡを標的とする遺伝子エディター、ならびにＣ２ｃ２またはＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡなどのウイルスＲＮＡを標的とする遺伝子エディターを含む、溶原ウイルス（出芽ウイルス）を処理するための組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、および溶原ウイルスにおける標的配列と相補的な２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離された核酸を含む。各ｇＲＮＡは、溶原ウイルス内の異なる配列と相補的であってもよい。本組成物は、ゲノム自身内のウイルスゲノム（ＤＮＡ）（またはＣ２ｃ２などのＲＮＡエディターを用いてＲＮＡ）の複製重要セグメント、およびＣ２ｃ２などのＲＮＡエディターを用いて翻訳産物を取り除くことによりウイルスを不活化する。最も好ましくは、全ウイルスゲノムは、ウイルスを不活化するため、ウイルスに感染した宿主細胞から切り出してもよい。あるいは、ウイルスのゲノム内に付加、欠失または変異を作ってもよい。本組成物は任意選択的に、ＤＮＡを標的とする他のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムを含んでもよい。ｇＲＮＡは、安全性の点でオフターゲット効果およびウイルスエスケープを排除するのに最も最適であるように設計される。本組成物は、溶原複製サイクルを有すると記載された下記表の任意のウイルスを処理することができ、レトロウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ＨＰＶウイルス、黄熱病、ジカ、デング、ウエストナイル、日本脳炎、リッサウイルス、ベシクロウイルス、サイトハブドウイルス（ｃｙｔｏｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ハンタンウイルス、リフトバレーウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、フレキサルウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、エボラ、マールブルグウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルス）に特に有用である。本組成物は、ベクターまたは下記のような他の任意の方法により送達することができる。
【００３５】
本発明はさらに、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、および溶原性であるウイルスのウイルス遺伝子の切り出しのためウイルスＤＮＡゲノムを標的とするための他の遺伝子エディター、ならびに１）ウイルスタンパク質および／またはビリオンの形成に関与する（非コードまたはコード）ウイルスタンパク質を翻訳する決定的に重要なＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）／マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（ＲＮＡ干渉のため）、あるいは２）Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡまたはビリオンの形成に関与する（非コードまたはコード）ウイルスタンパク質を翻訳するＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を標的とするＣ２ｃ２などの他の遺伝子エディターのいずれかのウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む、溶菌ウイルスを処理するための組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、ウイルスにおける標的ＤＮＡ配列と相補的な２つ以上のｇＲＮＡ、ならびにｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉあるいはＣａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよびウイルスにおける標的ＲＮＡ配列と相補的な他の遺伝子エディターのいずれか、をコードする単離された核酸を含む。各ｇＲＮＡは、ウイルス内の異なる配列と相補的であってもよい。本組成物は、ウイルスＤＮＡゲノムを標的とし、それらのゲノムセグメントを切り出す他の任意のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムをさらに含んでもよい。この共治療薬は、Ｃａｓ９システム単独で処理できない溶菌ウイルスに感染した個体を処置するのに有用である。図１に示すように、溶菌ウイルスと溶原ウイルスは、異なるやり方で処理する必要がある。ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９は通常ＤＮＡを標的とするのに使用されるのに対し、この遺伝子編集システムは、溶菌ウイルスを標的とするため、代わりにウイルス内のＲＮＡを標的とするように設計することができる。たとえば、Ｎｅｌｌｅｓら（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６５，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐ．４８８−４９６，Ａｐｒｉｌ  ７，２０１６）では、ＲＮＡ標的Ｃａｓ９がｍＲＮＡに結合できたことが示される。下記表に列記された溶菌ウイルス（Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、コクサッキーウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ロタ、セアドルンウイルス、コルチウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルス）のいずれも、この組成物を用いて標的とすることができる。本組成物は、ベクターまたは下記のような他の任意の方法により送達することができる。
【００３６】
ｓｉＲＮＡおよびＣ２ｃ２は、本明細書の組成物において、ウイルスの特定の遺伝子または遺伝子ｍＲＮＡを標的とする。ｓｉＲＮＡは、ウイルス遺伝子配列または遺伝子ｍＲＮＡ配列の一部のヌクレオチド配列と実質的に同一の二重鎖の一方の鎖を有してもよい。ｓｉＲＮＡ二重鎖のもう一方の鎖は、ｓｉＲＮＡ二重鎖の一方の鎖およびウイルス遺伝子ｍＲＮＡの同じ部分の両方と相補的である。単離されたｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを標的とする長さが約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド、好ましくは長さが約１９〜約２５ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡを含んでもよい。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用により共にアニールするセンスＲＮＡ鎖および相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と実質的に同一の核酸配列を含む。本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に知られたいくつかの技術を用いて得ることができる。たとえば、ｓｉＲＮＡは、化学合成しても、あるいは開示内容全体を本明細書に援用するＴｕｓｃｈｌらの公開された出願米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号明細書に記載されたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系などの当該技術分野において公知の方法を用いて組換えで作製してもよい。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として合成しても、あるいは２つの相補領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成してもよい。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的供給業者としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）が挙げられる。あるいは、ｓｉＲＮＡはさらに、任意の好適なプロモーターを用いて組換え環状または直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現させてもよい。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現させるのに好適なプロモーターは、たとえば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の好適なプロモーターの選択は、当該技術分野の技術の範囲内にある。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現させるための誘導性または調節可能なプロモーターをさらに含んでもよい。組換えプラスミドから発現させるｓｉＲＮＡは、標準的な技術により培養細胞発現系から単離してもよいし、あるいは細胞内に発現させてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、組換えプラスミドから２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として発現させても、あるいは２つの相補領域を有する  単一のＲＮＡ分子として発現させてもよい。本明細書に記載するように、様々なベクターまたはプラスミドを使用することが���きる。たとえば、ｓｉＲＮＡは、ＪＣウイルス、ＢＫＶまたはＳＶ４０ポリオーマウイルスを標的とするのに有用であり得（Ｋｈａｌｉｌｉらに対する米国特許出願公開第２００７／０２４９５５２号明細書）、この場合、ＪＣＶアグノタンパク質（ａｇｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを使用し、かつセンスＲＮＡ鎖が、アグノタンパク質遺伝子またはラージＴ抗原遺伝子のｍＲＮＡの約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
本発明はさらに、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２およびウイルスＲＮＡを標的とする他の遺伝子エディター（Ｃ２ｃ２またはＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ）を含む、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、およびウイルスにおける標的ＲＮＡ配列と相補的な２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離された核酸を含む。各ｇＲＮＡは、ウイルス内の異なる配列と相補的であってもよい。本組成物は、ウイルスＲＮＡゲノムを標的とし、それらのゲノムセグメントを切り出す他の任意のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムをさらに含んでもよい。この組成物は、下記表に列記された溶原複製および溶菌複製の両方を有するウイルス（Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルス）を標的としてもよい。本組成物は、ベクターまたは下記のような他の任意の方法により送達することができる。
【００３８】
本発明は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよび他の遺伝子エディター、ならびにウイルスタンパク質および／またはビリオンの形成に関与する（非コードまたはコード）ウイルスタンパク質を翻訳する決定的に重要なＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を標的とするｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を含む、溶菌ウイルスを処理するための組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、および溶菌ウイルスにおける標的ＲＮＡ配列と相補的な２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離された核酸を含む。各ｇＲＮＡは、溶菌ウイルス内の異なる配列と相補的であってもよい。本組成物は任意選択的に、ウイルスＲＮＡゲノムを標的とし溶菌ウイルスを破壊するため、それらのゲノムセグメントを切り出す他のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムを含んでもよい。本組成物は、ベクターまたは下記のような他の任意の方法により送達することができる。
【００３９】
本発明の組成物および方法により様々なウイルスを標的とすることができる。ウイルスが溶菌性かそれとも溶原性かによって、異なる組成物および方法を必要に応じて使用してもよい。
【００４０】
表２は、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）／ヘペウイルス科（ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）／フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
2019517465.tif 000004
【００４１】
Ｄ型肝炎は、Ｂ型肝炎の存在下でのみ伝播する、したがって、Ｄ型肝炎の処理に特に有用な組成物は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよび溶原ウイルスを処理するための他の遺伝子エディター、ならびに溶菌ウイルスを処理するためのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉなど、Ｂ型肝炎も同様に標的とするものである点に留意されたい。
【００４２】
表３は、ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
2019517465.tif 000005
【００４３】
表４は、オルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
2019517465.tif 000006
【００４４】
表５は、レトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００４５】
表６は、パピローマウイルス科（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００４６】
表７は、フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
2019517465.tif 000009
【００４７】
表８は、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００４８】
表９は、ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００４９】
表１０は、ブニヤンウイルス科（ｂｕｎｙａｎｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００５０】
表１１は、アレナウイルス科（ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００５１】
表１２は、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００５２】
表１３は、ポリオーマウイルス科（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスおよびそれらの複製方法を列挙する。
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【００５３】
本発明の組成物は、活性ウイルスあるいは潜在ウイルスのいずれの処理に使用してもよい。本発明の組成物は、潜在ウイルスは存在しているが、ウイルスの症状をまだ示していない個体の処置に使用してもよい。本組成物は、以下に限定されるものではないが、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ランゲルハンス細胞および濾胞樹状細胞などの樹状細胞、造血幹細胞、内皮細胞、脳ミクログリア細胞、ならびに消化管上皮細胞など、個体におけるいずれの細胞のウイルスを標的としてもよい。
【００５４】
本発明では、本組成物のいずれかが核酸として投与されるかまたは発現ベクター内に含まれる場合、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ配列と同じ核酸またはベクターによりコードコードされていてもよい。その代わりにまたはそれに加えて、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ配列から物理的に切り離された核酸または切り離されたベクターにコードされていてもよい。
【００５５】
さらに、本明細書に記載の核酸などの核酸を含むベクターも提供される。「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンであり、別のＤＮＡセグメントを挿入して挿入したセグメントの複製を起こすことができる。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントと結合すると複製することができる。好適なベクター骨格としては、たとえば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはＰＡＣなど当該技術分野において日常的に使用されるものが挙げられる。「ベクター」という用語は、クローニングベクターおよび発現ベクターのほか、ウイルスベクターおよび組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。本明細書に記載の核酸配列を発現させるため、多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを使用してもよい。好適な発現ベクターとして、以下に限定されるものではないが、たとえば、バクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルス由来のプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。多数のベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような会社から市販されている。
【００５６】
本明細書で提供されるベクターは、たとえば、複製起点、足場付着領域（ＳＡＲ）および／またはマーカーをさらに含んでもよい。マーカー遺伝子は、宿主細胞上で選択可能な表現型を与えることができる。たとえば、マーカーは、抗生物質（たとえば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン）に対する耐性などバイオサイド耐性を与えることができる。上述のように、発現ベクターは、発現したポリペプチドの操作または検出（たとえば、精製または位置特定）を促進するように設計されたタグ配列を含んでもよい。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、ポリヒスチジン配列、ｃ−ｍｙｃ配列、ヘマグルチニン配列またはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列などのタグ配列は典型的には、コードされたポリペプチドとの融合物として発現される。こうしたタグは、カルボキシル末端あるいはアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこに挿入してもよい。
【００５７】
別の発現ベクターは、たとえば、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントをさらに含んでもよい。好適なベクターとして、ＳＶ４０の誘導体ならびに既知の細菌プラスミド、たとえば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、たとえば、ファージ１の多数の誘導体、たとえば、ＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、たとえば、Ｍ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドまたはその誘導体、真核細胞に有用なベクター、たとえば昆虫細胞または哺乳動物細胞に有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから得られたベクター、たとえばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するように改変されているプラスミドが挙げられる。
【００５８】
さらに酵母発現系を使用してもよい。２つだけ例を挙げると、本発明によれば、たとえば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩクローニングサイト、ＳｐｈＩクローニングサイト、ＳｈｏＩクローニングサイト、ＮｏｔＩクローニングサイト、ＧｓｔＸＩクローニングサイト、ＥｃｏＲＩクローニングサイト、ＢｓｔＸＩクローニングサイト、ＢａｍＨ１クローニングサイト、ＳａｃＩクローニングサイト、Ｋｐｎ１クローニングサイトおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイト；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩクローニングサイト、ＳｐｈＩクローニングサイト、ＳｈｏＩクローニングサイト、ＮｏｔＩクローニングサイト、ＢｓｔＸＩクローニングサイト、ＥｃｏＲＩクローニングサイト、ＢａｍＨ１クローニングサイト、ＳａｃＩクローニングサイト、ＫｐｎＩクローニングサイトおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイト、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してもよい。本発明では、さらに酵母ツーハイブリッド発現系を調製してもよい。
【００５９】
ベクターは、調節領域をさらに含んでもよい。「調節領域」という用語は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写産物または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。調節領域としては、以下に限定されるものではないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、核移行シグナルおよびイントロンが挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、核酸の調節領域および転写される配列を、そうした配列の転写または翻訳に影響を与えるように配置することをいう。たとえば、コード配列をプロモーターの制御下に置くには、ポリペプチドの転写リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的にはプロモーターの１ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド下流に配置される。一方、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドも上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチドも上流に配置してもよい。プロモーターは典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターは、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの制御エレメントをさらに含んでもよい。含ませるプロモーターの選択は、以下に限定されるものではないが、効率、選択性、誘導能、所望の発現レベルおよび細胞または組織優先的発現などいくつかの要因に左右される。当業者が、コード配列に対してプロモーターおよび他の調節領域を適切に選択および配置することにより、コード配列の発現を調節することは、日常的なことである。
【００６１】
ベクターは、たとえば、ウイルスベクター（アデノウイルス（「Ａｄ」）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ならびにレトロウイルス）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびにポリヌクレオチドの宿主細胞への送達を媒介できる他の巨大分子複合体を含む。ベクターは、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節するあるいは他の方法で標的細胞に有利な特性を与える、他の要素または機能性をさらに含んでもよい。下記により詳細に記載および説明されるように、そうした他の要素は、たとえば、細胞への結合または標的化に影響を与える要素（細胞型または組織特異的結合を媒介する要素を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える要素；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在に影響を与える要素（核局在化を媒介する作用物質）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える要素を含む。こうした要素は、ベクターにより送達された核酸を取り込んで発現している細胞の検出または選択に使用できる検出可能なおよび／または選択可能なマーカーなどのマーカーをさらに含んでもよい。こうした要素は、ベクターの天然の特徴として得てもよいし（結合および取り込みを媒介する要素または機能性を有する特定のウイルスベクターの使用など）、あるいはそうした機能性を備えるようにベクターを改変してもよい。他のベクターとして、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７−１７１（２００３）により記載されたものが挙げられる。多種類のそうしたベクターが当該技術分野において公知であり、一般に入手可能である。
【００６２】
「組換えウイルスベクター」は、１つまたは複数の異種の遺伝子産物または配列を含むウイルスベクターをいう。多くのウイルスベクターにはパッケージングに伴うサイズ制限があるため、異種の遺伝子産物または配列は典型的には、ウイルスゲノムの１つまたは複数の部分を置き換えることにより導入される。こうしたウイルスは複製欠損になることがあり、（たとえば、複製および／またはカプシド形成に必要な遺伝子産物を有するヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を使用することにより）ウイルスの複製およびカプシド形成中に、その欠失した機能（単数または複数）がトランスで提供される必要がある。さらに、ウイルス粒子の外側に送達されるポリヌクレオチドを有する改変ウイルスベクターも記載されている（たとえば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８８：８８５０−８８５４，１９９１を参照されたい）。
【００６３】
好適な核酸送達システムは、組換えウイルスベクター、典型的にはアデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存型アデノウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも１つに由来する配列を含む。そうした場合、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強力な真核生物プロモーター、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、その中に１つまたは複数のポリヌクレオチド、好ましくは約１つのポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるウイルスベクターは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕのｐｆｕ（プラーク形成単位）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターを用いて投与される実施形態では、約０．１ナノグラム〜約４０００マイクログラム、たとえば、約１ナノグラム〜約１００マイクログラムの使用が有用であることが多い。
【００６４】
別のベクターとして、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的コンジュゲートが挙げられる。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶ系ウイルスを含む。ＨＩＶ系ウイルスベクターの１つは、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子がもう１つのウイルス由来である少なくとも２つのベクターを含む。ＤＮＡウイルスベクターは、オルソポックまたはトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．：９０  ７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８７：１１４９（１９９０）］、アデノウイルスベクター［ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）］およびアデノ随伴ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）］を含む。
【００６５】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期発現のみを引き起こす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、一部の発明実施形態に適用してもよい。アデノウイルスベクターは、いくつかの実施形態で、非常に長期の発現を示すことがあるアデノ随伴ウイルスより短期の発現（たとえば約１ヶ月未満）を引き起こす。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存する。プロモーターの適切な選択は、容易に達成することができる。好適なプロモーターの例として、７６３塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターがある。遺伝子発現に使用してもよい他の好適なプロモーターとしては、以下に限定されるものではないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：１５１（１９９３））、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ＭＭＴ）遺伝子の調節配列、β−ラクタマーゼプロモーター、ｔａｃプロモーターなどの原核生物発現ベクター、Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリンキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；ならびに組織特異的性を示しトランスジェニック動物に利用されてきた動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域、肝臓において活性であるαフェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性であるα１アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域、脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域および視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域が挙げられる。ある種のタンパク質は、それらのネイティブプロモーターを用いて発現させてもよい。エンハンサー、またはｔａｔ遺伝子およびｔａｒエレメントなど高レベルの発現を引き起こすシステムなど発現を増強できる他のエレメントをさらに含めてもよい。次いでこのカセットは、ベクター、たとえば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクター、またはたとえば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点を含む他の既知のプラスミドベクターに挿入してもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，（１９８９）を参照されたい。プラスミドベクターは、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子など選択可能なマーカーをさらに含んでもよい、ただしマーカーポリペプチドは、処置されている生物の代謝に悪影響を与えないものとする。カセットはさらに、国際公開第９５／２２６１８号パンフレットに開示されたシステムなどの合成送達システムの核酸結合部分に結合してもよい。
【００６６】
必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドはさらに、カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなどの微小送達ビヒクルと共に使用してもよい。リポソームの調製、標的化および内容物の送達に関する手順の概説については、Ｍａｎｎｉｎｏ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照されたい。さらに、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２１（１９８９）およびＭａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２５（１９８９）も参照されたい。
【００６７】
既知の技術に従って、複製欠損組換えアデノウイルスベクターを作製してもよい。Ｑｕａｎｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０（１９９２）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５（１９９２）を参照されたい。
【００６８】
もう１つの送達方法は、細胞内に発現産物を産生できる一本鎖ＤＮＡ産生ベクターを使用することである。たとえば、その全体を本明細書に援用するＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７−１７１（２００３）を参照されたい。
【００６９】
上記のように、本発明の組成物は、当業者に知られた種々のやり方で調製することができる。それらの原料またはそれらを得る方法にかかわらず、本発明の組成物は、それらの使用に応じて製剤化してもよい。たとえば、上述の核酸およびベクターは、組織培養における細胞への使用のため、あるいは患者または被検体への投与のため組成物内で製剤化してもよい。本発明の医薬組成物のいずれも、薬物の調製に使用するため製剤化してもよく、処置、たとえば、ウイルスを有するまたはウイルスに感染するリスクがある被検体の処置の状況における特定の使用を下記に示す。医薬品として利用される場合、核酸およびベクターのいずれも、医薬組成物の形態で投与してもよい。これらの組成物は、医薬品技術分野でよく知られた方法で調製することができ、局所処置それとも全身処置が所望されるか、および処置される場所に応じて、種々の経路により投与することができる。投与は、局所（眼ならびに鼻腔内送達、経膣送達および直腸送達を含む粘膜）、経肺（たとえば、ネブライザーなどによる散剤またはエアロゾルの吸入もしくは吹入による；気管内、鼻腔内、上皮および経皮）、眼内、経口または非経口であってもよい。眼内送達の方法は、局所投与（点眼薬）、結膜下注射、眼周囲注射もしくは硝子体内注射あるいは結膜嚢に外科的に留置されたバルーンカテーテルまたは眼科用インサートによる導入を含んでもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射または注入；あるいは頭蓋内投与、たとえば、髄腔内投与または脳室内投与を含む。非経口投与は、単回ボーラス投与の形態でもよいし、あるいは、たとえば、持続灌流ポンプによるものであってもよい。局所投与用の医薬組成物および製剤として、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、散剤および同種のものを挙げることができる。従来の医薬キャリア、水性、粉末または油性基剤、増粘剤および同種のものが、必要であるかあるいは望ましいことがある。
【００７０】
本発明は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、本明細書に記載の核酸およびベクターを含む医薬組成物を活性成分としてさらに含む。「薬学的に許容される」（または「薬理学的に許容される」）という用語は、必要に応じて動物またはヒトに投与されたとき、副作用、アレルギー反応または他の有害反応を起こさない分子的実体および組成物をいう。本明細書に開示された方法および組成物は、広範囲に及ぶ種、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類（たとえば、サル）、ウマもしくは他の家畜類、イヌ、ネコ、フェレットもしくはペットとして飼育される他の哺乳動物、ラット、マウスもしくは他の実験動物に適用することができる。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書で使用する場合、薬学的に許容される物質の媒体として使用してもよい、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング薬、抗菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、バインダー、滑沢剤、ゲル剤、界面活性剤ならびに同種のものを含む。本発明の組成物を製造する場合、活性成分は典型的には、賦形剤と混合される、賦形剤により希釈される、あるいは、たとえば、カプセル、錠剤、サッシェ、紙または他の容器の形態のようなキャリア内に入れられる。賦形剤は、希釈薬として働く場合、固体材料でも、半固体材料でもあるいは液体材料（たとえば、生理食塩水）でもよく、活性成分のビヒクル、キャリアまたは媒体の役割を果たす。よって、本組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてのまたは液体媒体中の）、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、軟質および硬質ゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌の注射用溶液剤、ならびに無菌包装された散剤の形態であってもよい。当該技術分野において公知のように、希釈薬の種類は、所期の投与経路に応じて異なってもよい。得られた組成物は、防腐剤などの追加の作用物質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キャリアは、脂質またはポリマーのコロイドであってもよいし、あるいはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キャリア材料は、リポソーム、ヒドロゲル、微小粒子、ナノ粒子またはブロックコポリマーミセルとして製剤化されたコロイドであってもよい。上述のように、キャリア材料は、カプセルを形成してもよく、その材料は、ポリマーのコロイドであってもよい。
【００７１】
本発明の核酸配列は、被検体の適切な細胞に送達することができる。これは、たとえば、マクロファージなどの食細胞による食作用を最大限に高めるような大きさにした、高分子の生分解性微小粒子またはマイクロカプセル送達ビヒクルの使用により達成することができる。たとえば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微小粒子を使用してもよい。これらの微小粒子にポリヌクレオチドを封入し、それらがマクロファージにより取り込まれ、細胞内で徐々に生分解されることで、ポリヌクレオチドを放出する。放出されたならば、細胞内でＤＮＡが発現される。第２のタイプの微小粒子は、細胞により直接取り込まれるではなく、むしろ生分解による微小粒子からの放出時にのみ細胞により取り込まれる核酸の徐放性リザーバーとして主に役立つことを意図している。したがって、これらのポリマー粒子は、食作用を排除するのに十分大きくすべきである（すなわち、５μｍより大きく、好ましくは２０μｍより大きい）。核酸の取り込みを達成するためのもう１つのやり方は、標準的な方法により調製されたリポソームを使用することである。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で組み込んでも、あるいは組織特異抗体、たとえばＨＩＶ感染に共通の潜伏感染リザーバーである細胞型、たとえば、脳マクロファージ、ミクログリア、アストロサイトおよび腸関連リンパ系細胞を標的とする抗体、と同時に組み込んでもよい。あるいは、静電力または共有結合力によりポリ−Ｌ−リジンに結合したプラスミドまたは他のベクターからなる分子複合体を調製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合できるリガンドに結合する。インビボ発現を達成するためのもう１つの手段として、「裸のＤＮＡ」（すなわち、送達ビヒクルなしの）の筋肉内部位、皮内部位または皮下部位への送達がある。関連するポリヌクレオチド（たとえば、発現ベクター）においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードする配列を含む単離された核酸配列をコードする核酸配列が、プロモーターまたはエンハンサー−プロモーターの組み合わせに作動的に連結される。プロモーターおよびエンハンサーは、上述されている。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ナノ粒子として、たとえば、高分子量直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）とＤＮＡの複合体のコアからなり、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量ＬＰＥＩのシェルに囲まれたナノ粒子として、製剤化してもよい。
【００７３】
核酸およびベクターはさらに、装置（たとえば、カテーテル）の表面に適用しても、あるいはポンプ、パッチまたは他の薬剤送達装置内に含ませてもよい。本発明の核酸およびベクターは、薬学的に許容される賦形剤またはキャリア（たとえば、生理食塩水）の存在下で単独、あるいは混合物で投与してもよい。賦形剤またはキャリアは、投与のモードおよび経路に基づき選択される。好適な医薬キャリアのほか、医薬製剤に使用される製薬上不可欠なものは、本分野のよく知られた参考図書Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）、およびＵＳＰ／ＮＦ（米国薬局方および国民医薬品集（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ））に記載されている。
【００７４】
本発明は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよびウイルスＤＮＡを標的とする他の遺伝子エディターを含む組成物を、溶原ウイルスを有する個体に投与することと、溶原ウイルスを不活化することとにより、溶原ウイルスを処理する方法を提供する。溶原ウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込められており、本組成物は、宿主細胞からウイルスＤＮＡを切り出すことにより溶原ウイルスを不活化する。本組成物は、単離された核酸の状態である、ベクター送達システムにパッケージングされている、あるいは、ＤＮＡを標的とする他のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムを含むなど、上記のような特性のいずれを含んでもよい。溶原ウイルスは、上記表に列挙されたもののいずれでもよい。
【００７５】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、処置は、インビボ（組成物を直接投与する）でも、あるいはエキソビボ（たとえば、ウイルス感染を有する被検体から１つの細胞もしくは複数の細胞または組織外植片を取り除き、培養液に入れ、次いで本組成物で処理する）でもよい。有用なベクターシステムおよび製剤は、上述されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。しかしながら、本発明は、そのように限定されるものではなく、たとえばリン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤およびペルフルオロ化合物液を用いた化学的トランスフェクションなど他のＤＮＡ送達方法も意図しており、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、弾道粒子および「遺伝子銃」システムなどの物理的送達方法も同様である。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、投与される組成物の量は、個体に存在するすべてのウイルスを不活化するのに十分な量である。個体は、臨床上有益な結果が得られるときはいつでも、効果的に処置されている。これは、たとえば、疾患の症状の完全な消散、疾患の症状の重症度の低下、または疾患の進行の遅延を意味してもよい。本方法は、投薬およびスケジュールのほか、予後の予測の最適化に資するモニタリングステップをさらに含んでもよい。
【００７６】
本明細書に記載のいずれの組成物も、宿主の本体の任意の部分に投与し、その後標的細胞に送達することができる。組成物は、以下に限定されるものではないが、哺乳動物の脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋肉組織、皮膚または腹膜腔に送達することができる。送達経路で見ると、組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、膣内、髄腔内、気管内、皮内または経皮の注射により、経口もしくは鼻腔投与により、または時間をかけた緩やかな灌流により投与してもよい。さらなる例では、組成物のエアロゾル調製物を吸入により宿主に投与してもよい。
【００７７】
必要とされる投与量は、投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、患者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別、投与されている他の薬剤および担当臨床医の判断に依存する。細胞標的の多様性および様々な投与経路における効率の相違から鑑みて、必要な投与量の広範な変動が予想される。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野において十分に理解されているような最適化のための経験に基づく標準的な手順を用いて調節することができる。投与は、単回でもあるいは複数回（たとえば、２倍または３倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍またはそれを超える）でもよい。好適な送達ビヒクル（たとえば、ポリマー微小粒子または埋め込み型装置）に化合物を封入すると、送達の効率が高まることがある。
【００７８】
本明細書で提供される任意の組成物を用いた処置の期間は、１日という短い時間から宿主の寿命という長い時間（たとえば、長年）まで、どのような時間の長さであってもよい。たとえば、化合物は、週１回（たとえば、４週間から何ヶ月もの間または何年もの間）；月に１回（たとえば、３ヶ月から１２ヶ月または何年もの間）；あるいは５年、１０年またはそれを超える期間に年１回投与してもよい。さらに、処置の頻度も変動し得ることに注意されたい。たとえば、本化合物は、毎日、毎週、毎月または毎年１回（または２回、３回等）投与してもよい。
【００７９】
本明細書で提供されるいずれの組成物も、処置を必要とする個体に有効量で投与してもよい。「有効」という用語は、本明細書で使用する場合、患者に所望の応答をもたらす一方、著しい毒性を引き起こさない任意の量をいう。こうした量は、既知量の特定の組成物の投与後に患者の応答を評価することにより決定することができる。さらに、何らかの毒性がある場合、毒性のレベルは、既知量の特定の組成物を投与した前後の患者の臨床症状を評価することにより決定することができる。患者に投与される特定の組成物の有効量は、所望の結果のほか、患者の応答および毒性のレベルに従って調節してもよいことに注意されたい。著しい毒性は、個々の患者毎に異なることがあり、以下に限定されるものではないが、患者の病状、年齢および副作用に対する忍容性を含め、複数の要因に依存する。
【００８０】
本発明はさらに、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよびウイルスＤＮＡを標的とする他の遺伝子エディターと、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉならびにＣａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよびウイルスＲＮＡを標的とする他の遺伝子エディターから選択される組成物とを、溶菌ウイルスを有する個体に投与すること、および溶菌ウイルスを不活化することを含む、溶菌ウイルスを処理するための方法を提供する。本組成物は、ウイルスＤＮＡおよびＲＮＡを宿主細胞から切り出すことにより溶菌ウイルスを不活化する。本組成物は、単離された核酸の状態である、ベクター送達システムにパッケージングされている、あるいはＤＮＡを標的とする他のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムを含むなど上記のような特性のいずれを含んでもよい。溶菌ウイルスは、上記表に列挙されたもののいずれでもよい。
【００８１】
本発明はさらに、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡおよびウイルスＲＮＡを標的とする他の遺伝子エディターを含む組成物を、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを有する個体に投与することと、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスを不活化することとを含む、溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスの両方を処理するための方法を提供する。本組成物は、ウイルスＲＮＡを宿主細胞から切り出すことによりウイルスを不活化する。本組成物は、単離された核酸の状態である、ベクター送達システムにパッケージングされている、あるいはＲＮＡを標的とする他のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムを含むなど上記のような特性のいずれを含んでもよい。溶原ウイルスおよび溶菌ウイルスは、上記表に列挙されたもののいずれでもよい。
【００８２】
感染の時点でまたはウイルスが細胞質に侵入したときに、ウイルスは、組み込まれていない（ＤＮＡに変換されていない）が、それでも溶原型複製サイクルに寄与する、ＲＮＡのゲノムを有し得る。この上流点で、ウイルスゲノムを除去してもよい。一方、本アプローチはさらに、下流で生じる（ゲノムが翻訳されるため）ウイルスｍＲＮＡを標的とするのに利用してもよい。当該技術分野全体を通してアルゴノートが引用されているけれども、アルゴノートは今日まで、ＲＮＡ分子を認識するように修飾されていない。
【００８３】
本発明は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１  ｇＲＮＡなどの２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡならびにウイルスＲＮＡを標的とする他の遺伝子エディターおよびウイルスＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉを含む組成物を、溶菌ウイルスを有する個体に投与することと、溶菌ウイルスを不活化することとにより溶菌ウイルスを処理するための方法を提供する。本組成物は、ウイルスＲＮＡを宿主細胞から切り出すことにより溶菌ウイルスを不活化する。本組成物は、単離された核酸の状態である、ベクター送達システムにパッケージングされている、あるいはＲＮＡを標的とする他のＣＲＩＳＰＲシステムまたは遺伝子編集システムを含むなど上記のような特性のいずれを含んでもよい。ＲＮＡを標的としてＲＮＡのウイルスゲノムおよび／または下流で生じるウイルスｍＲＮＡを切り出すことができる、２つ以上の遺伝子エディターが利用される。ヌクレアーゼを用いたメカニズムを使用しないｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉの場合、１つまたは複数が、ウイルスＲＮＡ転写物（非コードまたはコード）の分解によるサイレンシングに利用される溶菌ウイルスは、上記表に列挙されたもののいずれでもよい。
【００８４】
本出願を通じて、米国特許を含め様々な刊行物は、著者および年ならびに特許番号により参照される。刊行物の書誌情報は、下記に列挙される。本発明が属する技術分野の現状をより詳細に説明するため、これらの刊行物および特許の開示内容全体を本出願に援用する。
【００８５】
本発明について例示的に説明してきたが、使用されている用語は、限定の語ではなく説明の語の性質を帯びていることを意図していることが理解されよう。
【００８６】
もちろん、上記の教示内容に照らして、本発明の多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内において、本発明は、具体的に説明した以外の方法で実施できることが理解されよう。
【図１】
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【国際調査報告】
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