(57)【要約】本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置するための、化合物２−［（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）カルバモイル］フェニル］エタノアート（ニタゾキサニド）又は２−ヒドロキシ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）ベンズアミド（チゾキサニド）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置する方法において使用するための、ニタゾキサニド（NTZ）、チゾキサニド（TZ）、及びチゾキサニドグルクロニド（TZG）、並びにNTZ、TZ、又はTZGの薬学的に許容し得る塩からなる群から選択される化合物。
【請求項２】
NTZ及びTZ、並びにNTZ又はTZの薬学的に許容し得る塩からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
医薬組成物に含まれる、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
前記線維性障害が、肝臓、腸、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆管、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節、眼、及び胃の線維症からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
前記線維性障害が、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟組織、骨髄、腸、及び関節の線維症からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
前記線維性障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肺線維症、特発性肺線維症、皮膚線維症、眼線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、増殖性線維症、新生物線維症、慢性炎症性気道疾患（COPD、喘息、肺気腫、喫煙者肺、結核）に続発する肺線維症、アルコール又は薬物誘発性の肝線維症、肝硬変、感染誘発性肝線維症、放射線又は化学療法誘発性の線維症、腎原性全身性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性強皮症、関節線維症、癒着性関節包炎の一部の形態、慢性線維化性胆管症、例えば、原発性硬化性胆管炎（PSC）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、胆道閉鎖症、家族性肝内胆汁うっ滞症３型（PFIC3）、インプラント周囲線維症、及び石綿肺からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
前記胆汁うっ滞性障害が、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、妊娠時肝内胆汁うっ滞症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、胆道閉鎖症、胆石症、感染性胆管炎、ランゲルハンス細胞組織球増殖症に付随する胆管炎、アラジール症候群、非症候性腺管低形成、薬物誘発性胆汁うっ滞症、及び完全非経口栄養関連胆汁うっ滞症からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
前記胆汁うっ滞性障害が、PBCである、請求項７に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
ピルフェニドン又は受容体チロシンキナーゼ阻害剤（RTKI）、例えば、ニンテダニブ、ソラフェニブ、及び他のRTKI、又はアンギオテンシンII（AT1）受容体ブロッカー、又はCTGF阻害剤、又はMMP2、MMP9、THBS1、若しくは細胞表面インテグリン等の潜在TGFβ複合体の活性化剤を含むTGFβ-及びBMP-活性化経路に干渉しやすい任意の抗線維化化合物、TGFβ受容体Ｉ型（TGFBRI）若しくはII型（TGFBRII）、及びこれらのリガンド、例えば、TGFβ、アクチビン、インヒビン、ノーダル、抗ミュラーホルモン、GDF、若しくはBMP、補助共受容体（III型受容体としても知られている）、又は制御性若しくは阻害性のSMADタンパク質を含むSMAD依存性古典的経路の構成要素、又はMAPKシグナル伝達、TAK1、Rho様GTPaseシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／AKT経路、TGFβ誘発性EMTプロセス、又はHhリガンド若しくは標的遺伝子を含む古典的及び非古典的なヘッジホッグシグナル伝達経路の様々なブランチを含むSMAD非依存性若しくは非古典的な経路のメンバー、又はTGFβシグナル伝達に影響を与えやすいWNT若しくはノッチの経路の任意のメンバーから選択される公知の抗線維化活性を有する少なくとも１つの処置活性剤と併用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
JAK/STAT阻害剤、他の抗炎症剤及び／又は免疫抑制剤から選択される少なくとも１つの処置活性剤と併用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
前記処置活性剤が、グルココルチコイド、NSAIDS、シクロホスファミド、ニトロソ尿素、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリン、ミリオシン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸誘導体、フィンゴリモド及び他のスフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子；炎症促進性サイトカイン及び炎症促進性サイトカイン受容体、Ｔ細胞受容体、インテグリン等の標的に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体から選択される、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野、具体的には胆汁うっ滞性又は線維性の疾患の処置に関する。
【０００２】
背景技術
細胞外マトリクスの異常かつ過度の沈着は、肝臓、肺、腎臓、又は心臓の線維症を含む全ての線維性疾患の特徴である。罹患器官のスペクトル、線維化過程の進行性の性質、多数の罹患者、及び有効な処置の欠如は、線維性疾患を処置するときに重大な問題となる。
【０００３】
線維性疾患を処置するための新規処置ストラテジを提案するための試みにおいて、本発明者らは、合成抗原虫剤である化合物２−［（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）カルバモイル］フェニル］エタノアート（ニタゾキサニド又はNTZ）が強力な抗線維化特性も示すことを見出した。更に、肝損傷モデルにおけるNTZの評価によって、その血中胆汁酸濃度を低下させる能力が明らかになり、したがって、これは胆汁うっ滞性（例えば、PBC及びPSC）及び線維性の疾患の両方を処置する可能性を反映している。
【０００４】
１９７５年に最初に報告された（Rossignol and Cavier, 1975）NTZは、嫌気性原虫、蠕虫、並びに嫌気性及び好気性の細菌の両方を含む広範な微生物に対して非常に有効であることが示された（Rossignol and Maisonneuve, 1984；Dubreuil, Houcke et al., 1996；Megraudd, Occhialini et al., 1998；Fox and Saravolatz, 2005；Pankuch and Appelbaum, 2006；Finegold, Molitoris et al., 2009）。NTZは、最初に腸に寄生する条虫を処置するためにヒトで研究され（Rossignol and Maisonneuve, 1984）、そして、現在、寄生原虫クリプトスポリジウム・パルバム（Crystosporidium parvum）及びランブル鞭毛虫（Giardia intestinalis）によって引き起こされる下痢の処置について米国で認可されている（Alinia（登録商標）、Romark laboratories）。また、NTZは、南米及びインドで広く市販されており、そこでは広範な腸内寄生虫感染症の処置に適応がある（Hemphill, Mueller et al., 2006）。提案されている、NTZがその抗寄生虫活性を発揮する作用機序は、嫌気的代謝に必須であるピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（PFOR）酵素依存性電子伝達反応の阻害を通じたものである（Hoffman, Sisson et al., 2007）。また、NTZは、PFORのホモログを有しないヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に対する活性も示し、したがって、これは別の作用機序を示唆する。実際、NTZは膜電位及び生物内pHホメオスタシスを乱すアンカップラーとしても作用し得ることが示された（de Carvalho, Darby et al., 2011）。
【０００５】
NTZの薬理学的効果はその抗寄生虫活性に限定されず、そして、近年、NTZが抗ウイルス活性を付与することもできることが幾つかの研究によって明らかになった（Di Santo and Ehrisman, 2014; Rossignol, 2014）。NTZは、赤血球凝集素（インフルエンザ）若しくはVP7（ロタウイルス）のタンパク質の成熟における遮断、又は自然免疫応答に関与するタンパク質PKRの活性化を含む多様な方法によってウイルスの複製に干渉する（概説については、（Rossignol, 2014）を参照）。また、NTZは、重要な代謝及び死促進のシグナル伝達経路に干渉することによって広い抗癌特性を有することも示された（Di Santo and Ehrisman, 2014）。
【０００６】
本発明では、潜在的抗線維化剤を同定するための表現型スクリーニングアッセイを使用して、NTZ又はその活性代謝物チゾキサニド（又はTZ）が、肝線維症の発現において重要な役割を果たす肝星細胞（HSC）の活性化に干渉することが見出された。この効果は、これら分子について既に報告されている特性に鑑みて全く予想外であった。更に、NTZ及びTZは、心臓、肺、及び腸等の他の器官に由来する、刺激された線維芽細胞の活性化に干渉することが示された。NTZの抗線維化特性は、有意に低下した肝臓のコラーゲン及び線維症のレベルを示すことによって肝疾患（CDAAc食餌誘発性NASH）の臨床前モデルにおいて更に確認された。その抗線維化活性に加えて、NTZは、CCl4誘発性肝損傷モデルにおいて血中胆汁酸濃度を低下させることも示された。したがって、NTZ及びTZは、胆汁うっ滞性疾患及び多様な種類の線維性疾患を処置するための関心対象の化合物であると考えられる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置する方法において使用するための、化合物２−［（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）カルバモイル］フェニル］エタノアート（ニタゾキサニド）、若しくはその活性代謝物２−ヒドロキシ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）ベンズアミド（チゾキサニド）、若しくはチゾキサニドグルクロニド（TZG）、又はこれらの薬学的に許容し得る塩に関する。
【０００８】
具体的な実施態様では、線維性障害は、肝臓、腸、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆管、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節、眼、及び胃の線維症からなる群から選択される。更に具体的な実施態様では、線維性障害は、肝臓、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆管、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節、及び胃の線維症からなる群から選択される。更に具体的な実施態様では、線維性障害は、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟組織、骨髄、腸、及び関節の線維症からなる群から選択される。更に別の実施態様では、線維性障害は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肺線維症、特発性肺線維症、皮膚線維症、眼線維症（例えば、莢膜線維症）、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭坑夫塵肺の合併症）、増殖性線維症、新生物線維症、慢性炎症性気道疾患（COPD、喘息、肺気腫、喫煙者肺、結核）に続発する肺線維症、アルコール又は薬物誘発性の肝線維症、肝硬変、感染誘発性肝線維症、放射線又は化学療法誘発性の線維症、腎原性全身性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性強皮症、関節線維症、癒着性関節包炎の一部の形態、慢性線維化性胆管症、例えば、原発性硬化性胆管炎（PSC）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、胆道閉鎖症、家族性肝内胆汁うっ滞症３型（PFIC3）、インプラント周囲線維症、及び石綿肺からなる群から選択される。
【０００９】
本発明の具体的な実施態様によれば、胆汁うっ滞性疾患は、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、妊娠時肝内胆汁うっ滞症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、胆道閉鎖症、胆石症、感染性胆管炎、ランゲルハンス細胞組織球増殖症に付随する胆管炎、アラジール症候群、非症候性腺管低形成、薬物誘発性胆汁うっ滞症、及び完全非経口栄養関連胆汁うっ滞症からなる群から選択される。具体的な実施態様では、胆汁うっ滞性疾患はPBCである。
【００１０】
別の態様によれば、本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置する方法において使用するための、NTZ若しくはTZ(G)から選択される化合物又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物であって、該化合物が、該組成物中において唯一の活性成分である医薬組成物に関する。
【００１１】
別の態様によれば、本発明は、ピルフェニドン又は受容体チロシンキナーゼ阻害剤（RTKI）、例えば、ニンテダニブ、ソラフェニブ、及び他のRTKI、又はアンギオテンシンII（AT1）受容体ブロッカー、又はCTGF阻害剤、又はMMP2、MMP9、THBS1、若しくは細胞表面インテグリン等の潜在TGFβ複合体の活性化剤を含むTGFβ-及びBMP-活性化経路に干渉しやすい任意の抗線維化化合物、TGFβ受容体Ｉ型（TGFBRI）若しくはII型（TGFBRII）、及びこれらのリガンド、例えば、TGFβ、アクチビン、インヒビン、ノーダル、抗ミュラーホルモン、GDF、若しくはBMP、補助共受容体（III型受容体としても知られている）、又は制御性若しくは阻害性のSMADタンパク質を含むSMAD依存性古典的経路の構成要素、又はMAPKシグナル伝達、TAK1、Rho様GTPaseシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／AKT経路、TGFβ誘発性EMTプロセス、又はHhリガンド若しくは標的遺伝子を含む古典的及び非古典的なヘッジホッグシグナル伝達経路の様々なブランチを含むSMAD非依存性若しくは非古典的な経路のメンバー、又はTGFβシグナル伝達に影響を与えやすいWNT若しくはノッチの経路の任意のメンバーから選択される公知の抗線維化活性を有する少なくとも１つの処置活性剤と組み合わせて線維性障害の処置において使用するための、上に定義された化合物又は医薬組成物に関する。
【００１２】
本発明は、更に、JAK/STAT阻害剤、他の抗炎症剤及び／又は免疫抑制剤から選択される少なくとも１つの処置活性剤と併用するための、上に定義された化合物又は医薬組成物に関する。
【００１３】
具体的な実施態様によれば、処置活性剤は、グルココルチコイド、NSAIDS、シクロホスファミド、ニトロソ尿素、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリン、ミリオシン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸誘導体、フィンゴリモド及び他のスフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子；炎症促進性サイトカイン及び炎症促進性サイトカイン受容体、Ｔ細胞受容体、インテグリン等の標的に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体から選択される。
【００１４】
本発明は、更に、
−  NTZ又はNTZの薬学的に許容し得る塩と、
−  TZ(G)又はTZ(G)の薬学的に許容し得る塩と
を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明は、また、
−  NTZ又はNTZの薬学的に許容し得る塩と、
−  TZ(G)又はTZ(G)の薬学的に許容し得る塩と
を含むキットオブパーツに関する。
【００１６】
具体的な実施態様によれば、本明細書に記載される各態様及び実施態様では、NTZ若しくはTZ、又はNTZ若しくはTZの薬学的に許容し得る塩が使用される。
【００１７】
図及び表の説明
図、表、及び文章において用いられる略語：
α-SMA：α平滑筋アクチン
BMP：骨形成タンパク質
cDNA：相補的デオキシリボヌクレオチド酸
COL1A1：１型コラーゲンアルファ１
CDAA：コリン欠乏Ｌアミノ酸制限飼料
CDAAc：コレステロール補給コリン欠乏Ｌアミノ酸制限飼料
CHOL：コレステロール
CSAA：コリン補給Ｌアミノ酸制限飼料
CYPA：シクロフィリンＡ
DDC：３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン
DMSO：ジメチルスルホキシド
ELISA：酵素結合免疫吸着測定法
EMT：上皮間葉転換
DTT：ジチオスレイトール
FBS：ウシ胎仔血清
FDA：食品医薬品局
GDF：増殖分化因子
Hh：ヘッジホッグ
hHSC：ヒト肝星細胞
HSC：肝星細胞
IC50：半数阻害濃度
InMyoFib：腸筋線維芽細胞
MMP2：マトリクスメタロペプチダーゼ２
MMP9：マトリクスメタロペプチダーゼ９
μL：マイクロリットル
NHLF：正常ヒト肺線維芽細胞
NTZ：ニタゾキサニド
PBC：原発性胆汁性胆管炎
PBS：リン酸緩衝生理食塩水
PSC：原発性硬化性胆管炎
qPCR：定量ポリメラーゼ連鎖反応
pMol：ピコモル
rhFGF：組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子
RNA：リボ核酸
RT：逆転写酵素
SmBM：平滑筋細胞基本培地
SteCGS：星細胞増殖補給剤
STeCM：星細胞培地
TBA：全胆汁酸
TGFβ1：腫瘍増殖因子ベータ１
TGFBRI：TGFb Ｉ型受容体
TGFBRII：TGFb II受容体
THBS1：トロンボスポンジン１
TMB：テトラメチルベンジジン
TZ：チゾキサニド
TZG：チゾキサニドグルクロニド
TZ(G)：TZ又はTZG
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ニタゾキサニド及びその代謝物チゾキサニドは、ヒトHSCにおいてα−SMAタンパク質のTGFβ1誘導性発現を阻害する  血清除去したHSCをNTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）と共に１時間プレインキュベートした後、線維化促進性サイトカインTGFβ1（１ng/mL）で活性化した。４８時間インキュベートした後、α−SMAの発現をELISAによって測定した。得られた値を、TGFβ1対照に対する阻害率に変換した。データを平均（３回分）±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いて、ボンフェローニ事後検定によって実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（１ng/mL TGFβ1群に対する比較）］。曲線当てはめ及び半値阻害濃度（IC50）の計算は、XLFitソフトウェア5.3.1.3で実施した。
【図２】ニタゾキサニド及びその代謝物チゾキサニドは、TGFβ1誘導性ヒトHSCにおいてCOL1A1転写物を低減する  血清除去したHSCをNTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）と共に１時間プレインキュベートした後、TGFβ1（１ng/mL）で活性化した。２４時間インキュベートした後、COL1A1の発現をRT-qPCRによって測定した。発現値を、TGFβ1対照に対する誘導倍数に変換した。データを平均（３回分）±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いて、ボンフェローニ事後検定によって実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（１ng/mL TGFβ1群に対する比較）］。
【図３】NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）は、ラットHSCにおいてα−SMAタンパク質のTFGβ1誘導性発現を阻害する。  NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）を血清除去したラットHSC（rHSC）に添加し、１時間後、TGFβ1（3ng/mL）で活性化した。４８時間インキュベートした後、α−SMAの発現をELISAによって測定した。得られた値を、TGFβ1対照に対する阻害率に変換した。データを平均（３回分）±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いて、ボンフェローニ事後検定によって実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（３ng/mL TGFβ1群に対する比較）］。
【図４】NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）は、ヒト肺線維芽細胞においてα−SMAタンパク質のTFGβ1誘導性発現を阻害する。  NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）を血清除去した肺線維芽細胞（NHLF）に添加し、１時間後、TGFβ1（１ng/mL）で活性化した。４８時間インキュベートした後、α−SMAの発現をELISAによって測定した。得られた値を、TGFβ1対照に対する阻害率に変換した。データを平均（３回分）±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いて、ボンフェローニ事後検定によって実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（１ng/mL TGFβ1群に対する比較）］。
【図５】NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）は、ヒト心臓線維芽細胞においてα−SMAタンパク質のTFGβ1誘導性発現を阻害する。  NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）を血清除去した心臓線維芽細胞（NHCF）に添加し、１時間後、TGFβ1（３ng/mL）で活性化した。４８時間インキュベートした後、α−SMAの発現をELISAによって測定した。得られた値を、TGFβ1対照に対する阻害率に変換した。データを平均（３回分）±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いて、ボンフェローニ事後検定によって実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（３ng/mL TGFβ1群に対する比較）］。
【図６】NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）は、ヒト腸線維芽細胞においてα−SMAタンパク質のTFGβ1誘導性発現を阻害する。  NTZ（Ａ）又はTZ（Ｂ）を血清除去した腸線維芽細胞（InMyoFib）に添加し、１時間後、TGFβ1（３ng/mL）で活性化した。４８時間インキュベートした後、α−SMAの発現をELISAによって測定した。得られた値を、TGFβ1対照に対する阻害率に変換した。データを平均（３回分）±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いて、ボンフェローニ事後検定によって実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（３ng/mL TGFβ1群に対する比較）］。
【図７】ニタゾキサニドの持続的経口投与（１０mg/kg/日）は、C57Bl/6Jマウスの肝臓においてCDAA誘発性コラーゲン貯蔵を抑制する。  ６週齢のC57BL/6マウスに、対照（CSAA）飼料、CDAA＋１％ CHOL(CDAAc）飼料、又は１０mg/kg/日 NTZを補給したCDAAc飼料を１２週間給餌した。屠殺後、肝臓のコラーゲン含量を決定した。データを平均±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、スチューデントｔ検定によって実施した：CSAA対CDAAc（#：ｐ＜０．０５；##：ｐ＜０．０１；###：ｐ＜０．００１）及びCDAAc対１０mg/kg/日 NTZ（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図８】ニタゾキサニドの持続的経口投与（１０mg/kg/日）は、C57Bl/6Jマウスの肝臓においてCDAAc飼料誘発性線維症を抑制する。  ６週齢のC57BL/6マウスに、対照（CSAA）飼料、CDAAc飼料、又は１０mg/kg/日NTZを補給したCDAAc飼料を１２週間給餌した。屠殺後、肝臓の線維症領域を決定した。データを平均±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、スチューデントｔ検定によって実施した：CSAA対CDAAc（#：ｐ＜０．０５；##：ｐ＜０．０１；###：ｐ＜０．００１）及びCDAAc対１０mg/kg/日 NTZ（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図９】ニタゾキサニドの持続的経口投与は、CCl4誘導性血中TBA濃度レベルを抑制する。  ２５０〜２７５ｇのラットにオリーブ油（対照群）又はオリーブ油に乳化させたCCl4（CCl4：オリーブ油 １：２v/v、最終CCl4濃度：２mL/kg）を３週間にわたって週２回腹腔内注射した。同時に、オリーブ油注射群を対照飼料で飼育し、一方、CCl4注射群を対照飼料又は１０mg/kg/日若しくは３０mg/kg/日 NTZを補給した飼料で飼育した。屠殺後、血中TBA濃度を決定した。データを平均±標準偏差（SD）として提示する。統計解析は、Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、スチューデントｔ検定によって実施した：オリーブ油対CCl4（#：ｐ＜０．０５；##：ｐ＜０．０１；###：ｐ＜０．００１）及びCCl4対NTZ（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【００１９】
発明を実施するための形態
本出願の実験部分では、化合物２−［（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）カルバモイル］フェニル］エタノアート（ニタゾキサニド）及び２−ヒドロキシ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）ベンズアミド（チゾキサニド）が幾つかの線維症モデルにおいて抗線維化特性を有することが示される。更に、NTZ又はその活性代謝物TZが、肝損傷モデルにおいて血中胆汁酸のレベル変化が生じるのを防ぐ能力を有することが示され、これは胆汁うっ滞性疾患を処置するNTZ及びTZの能力を示す。したがって、本発明は、化合物NTZ又はその活性代謝物、例えばTZ又はTZGの新規処置的使用に関する。
【００２０】
具体的には、本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置する方法において使用するための、化合物NTZ若しくはTZ(G)、又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩に関する。また、本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置する方法において使用するための、NTZ若しくはTZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物に関する。更に、本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の障害の処置に有用な医薬を製造するための、NTZ若しくはTZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩の使用に関する。また、本発明は、NTZ若しくはTZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物に関する。本発明に係る医薬組成物は、胆汁うっ滞性又は線維性の障害の処置に有用である。
【００２１】
線維性障害の原因物質又は起因事象はかなり多様であり、そして、その発症機序は可変であるが、罹患組織における共通の特徴は、筋線維芽細胞と呼ばれる多数の活性化線維芽細胞の存在である（（Rosenbloom, Mendoza et al., 2013））。TGFβ1等の線維化刺激は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を誘導することができる（Leask and Abraham, 2004；Leask, 2007）。筋線維芽細胞は、代謝的に及び形態的に特徴的な線維芽細胞であり、その活性化及び増殖が線維化応答の発現において重要な役割を果たす。更に、これら筋線維芽細胞は、例えば様々な形態のコラーゲン、フィブロネクチン、及び他のECMタンパク質等の細胞外マトリクスの形成に関与するタンパク質の発現を含む独特の生物学的機能を示す。α−平滑筋アクチン（α−SMA）の発現誘導は、休止状態の線維芽細胞の活性化筋線維芽細胞への分化の認識されている特徴であり、そして、線維化プロセスに干渉する薬物の効力を評価するために生理学的読み出し情報として使用することができる。腫瘍増殖β因子、そして、特に腫瘍増殖因子ベータ１（TGFβ1）は、線維芽細胞の線維化促進性筋線維芽細胞への形質転換を誘導する認識されている生理学的シグナルであり、当該線維化促進性筋線維芽細胞は、高レベルのα−SMA及び高レベルの細胞外マトリクスタンパク質を発現し、これらは後に分泌され、そして、線維性瘢痕組織を形成する。
【００２２】
更に、線維芽細胞の増殖及び活性化は、細胞外マトリクスを構成する幾つかの結合組織成分（例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、及びヒアルロナン）の産生に関与していることが知られている（Kendall and Feghali-Bostwick, 2014）。
【００２３】
予想外に、NTZだけでなくその活性代謝物TZも抗線維化特性が明らかになったが、その理由は、これら化合物が、TGFβ誘導性肝星細胞及び他の器官由来の初代線維芽細胞におけるα−SMAのレベルを用量依存的に低下させたためである。更に、NTZ又はTZによる処理は、TGFβ活性化ラットHSCにおけるコラーゲン（Col1a1）発現も抑制し、これは両分子の抗線維化特性を確認するものである。CDAAc誘発性肝線維症のモデルを使用してインビボにおいてもNTZ又はその代謝物TZの抗線維化活性が示され、ここでは肝臓のコラーゲン含量の低下及び線維症領域の減少が例証された。更に、CCl4誘発性肝損傷モデルにおいて、NTZ又はその活性代謝物TZが、胆汁うっ滞性疾患のマーカーを表す血中胆汁酸レベルの誘導を防ぐことができることが示された。
【００２４】
本発明に従って使用されるNTZ、TZ、及びTZGは、それぞれ、以下の式（Ｉ）、（II）、及び（III）を有する：
【化１】
2019513761.tif 000002
【００２５】
NTZ及びTZは、その抗寄生虫及び抗ウイルスの活性で知られているが、先行技術は、NTZ、TZ、及びTZGが抗胆汁うっ滞及び抗線維化の効果を有することを教示していない。
【００２６】
本発明者らは、これら化合物が胆汁うっ滞又は線維症の処置において処置効果を有することを新規かつ独創的な方法で証明した。
【００２７】
したがって、本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置する方法において使用するための、化合物NTZ若しくはTZ(G)、又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩に関する。
【００２８】
更なる態様では、本発明は、線維芽細胞の増殖及び／又は活性化の阻害において使用するための、NTZ若しくはTZ(G)、又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩に関する。当技術分野において公知であるように、線維芽細胞は、コラーゲン線維又は細胞外マトリクスの他の結合組織成分の産生に関与する。
【００２９】
本発明によれば、用語「線維症」、「線維性疾患」、「線維性障害」、及びこれらの語形変化（declinations）は、器官又は組織における線維性結合組織の過剰な沈着の病的状況を意味する。より具体的には、線維症は、組織損傷に対する応答として、持続的な線維性瘢痕形成及び結合組織による細胞外マトリクスの過剰産生を含む病理学的プロセスである。生理学的に、結合組織の沈着は、その下に存在する器官又は組織の構造及び機能を消し去り得る。
【００３０】
本発明によれば、線維症又は線維性障害は、任意の器官又は組織の線維症に関連したものであってよい。。具体的な器官線維症の例示的な非限定例は、肝臓、腸、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆管、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節、又は胃の線維症、特に、肝臓、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆管、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節、又は胃の線維症を含む。
【００３１】
本発明によれば、用語「胆汁うっ滞」、又は「胆汁うっ滞性疾患」、又は「胆汁うっ滞性障害」、及びこれらの語形変化は、肝細胞による分泌の障害又は肝内若しくは肝外の胆管を通る胆汁流の閉塞に起因する胆汁流の減少によって定義される病的状況を意味する。したがって、胆汁うっ滞の臨床的定義は、通常胆汁に排泄される物質が保持される任意の状況である。
【００３２】
具体的な実施態様では、線維性障害は、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、腸、及び関節（例えば、膝、肩、又は他の関節）の線維症からなる群から選択される。
【００３３】
好ましい実施態様では、線維性障害は、肝臓、肺、皮膚、腎臓、及び腸の線維症からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のより好ましい実施態様では、処置される線維性障害は、以下の線維性障害の非排他的なリストからなる群から選択される：非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肺線維症、特発性肺線維症、皮膚線維症、眼線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭坑夫塵肺の合併症）、増殖性線維症、新生物線維症、慢性炎症性気道疾患（COPD、喘息、肺気腫、喫煙者肺、結核）に続発する肺線維症、アルコール又は薬物誘発性の肝線維症、肝硬変、感染誘発性肝線維症、放射線又は化学療法誘発性の線維症、腎原性全身性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性強皮症、関節線維症、癒着性関節包炎の一部の形態、慢性線維化性胆管症、例えば、原発性硬化性胆管炎（PSC）及び原発性胆汁性胆管炎（PBC）、胆道閉鎖症、家族性肝内胆汁うっ滞症３型（PFIC3）、インプラント周囲線維症、及び石綿肺。
【００３５】
本発明の具体的な実施態様によれば、胆汁うっ滞性疾患は、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、妊娠時肝内胆汁うっ滞症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、胆道閉鎖症、胆石症、感染性胆管炎、ランゲルハンス細胞組織球増殖症に付随する胆管炎、アラジール症候群、非症候性腺管低形成、薬物誘発性胆汁うっ滞症、及び完全非経口栄養関連胆汁うっ滞症からなる群から選択される。好ましい実施態様では、胆汁うっ滞性疾患は、PBC又はPSC、特にPBCである。
【００３６】
用語「処置」又は「処置する」とは、それを必要としている被験体における胆汁うっ滞性又は線維性の障害の治癒的又は予防的な処置を指す。処置は、障害を治癒させるか、障害の進行を遅延、逆行、又は減速させることによって、被験体の状況を改善するために、指定の障害を有する被験体、すなわち、患者に、特に医薬組成物に含まれる化合物を投与することを含む。また、処置は、障害を予防又は遅延させるために、健常な又は胆汁うっ滞性若しくは線維性の障害を発現するリスクのある被験体に施してもよい。
【００３７】
したがって、本発明によれば、線維性障害の処置は、該障害を治癒させるか、該障害の進行を遅延、逆行、又は減速させることによって、患者の状況を改善するために、指定の障害を有する被験体に、又は、健常被験体、特に胆汁うっ滞性又は線維性の障害を発現するリスクのある被験体に、NTZ若しくはTZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩、又はそれを含有する医薬組成物を投与することを含む。
【００３８】
処置される被験体は、哺乳類、好ましくはヒトである。本発明に従って処置される被験体は、以前に行われた薬物処置、関連する病状、遺伝子型、リスク因子に対する曝露、ウイルス感染等の胆汁うっ滞性又は線維性の疾患に関連する幾つかの基準に基づいて、更に、画像診断方法、及び免疫学的、生化学的、酵素的、化学的、又は核酸検出の方法を用いて評価することができる任意の関連するバイオマーカーの検出に基づいて選択することができる。
【００３９】
NTZ又はTZの合成は、例えば、Rossignol and Cavier, 1975に記載されているようにして、又は当業者に公知の任意の他の合成方法によって、実施することができる。TZGは、当技術分野において公知の、例えばWadouachi 2011. S'agit-il de A Wadouachi, J Kovensky, Synthesis of Glycosides of Glucuronic, Galacturonic and Mannuronic Acids: An Overview, Molecules, 2011, 16(5), 3933-3968における合成方法に従って、合成することができる。
【００４０】
具体的な実施態様では、胆汁うっ滞性又は線維性の障害の処置は、NTZ及びTZ(G)の両方の組み合わせ、又はNTZ及びTZ(G)の薬学的に許容し得る塩を投与することを含み得る。この実施態様の変形例によれば、NTZ及びTZ(G)の両方が単一の組成物に共に含まれる。
【００４１】
この実施態様の別の変形例では、NTZ及びTZ(G)は、療法において同時、逐次、又は別々に投与するためのものであるので、異なる組成物に含まれていてもよい。逐次投与の場合、NTZをTZ(G)の投与前に投与してもよく、TZ(G)をNTZ投与の前に投与してもよい。したがって、本発明は、また、同時、逐次、又は別々に投与するための、（ｉ）NTZ若しくはその薬学的に許容し得る塩、又はNTZ若しくはその薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物と；（ii）TZ(G)若しくはその薬学的に許容し得る塩、又はTZ(G)若しくはその薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物とを含むキットオブパーツに関する。
【００４２】
NTZ又はTZ(G)は、薬学的に許容し得る塩、特に、薬学的使用に適合する酸又は塩基の塩として処方され得る。NTZ及びTZ(G)の塩は、薬学的に許容し得る酸付加塩、薬学的に許容し得る塩基付加塩、薬学的に許容し得る金属塩、アンモニウム及びアルキル化アンモニウムの塩を含む。これら塩は、化合物の最終精製工程中、又は事前に精製されている化合物に塩を組み込むことによって得ることができる。
【００４３】
別の態様では、本発明は、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置する方法において使用するための、NTZ若しくはTZ(G)から選択される化合物又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
特に胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置する方法において使用するための、NTZ又はTZ(G)を含む医薬組成物は、１つ又は幾つかの薬学的に許容し得る賦形剤又はビヒクル（例えば、薬学的用途に適合しかつ当業者に周知である生理食塩溶液、生理溶液、等張溶液等）を含んでいてもよい。
【００４５】
また、これら組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、保存剤等から選択される１つ又は幾つかの作用物質（agents）又はビヒクルを更に含んでいてもよい。これら製剤（液体及び／又は注射可能及び／又は固体）に有用な作用物質又はビヒクルは、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アラビアゴム、リポソーム等である。
【００４６】
これら組成物は、最終的にガレヌス形態又は持続放出及び／若しくは徐放を保証する装置を用いて、注射可能な懸濁液、シロップ、ゲル、オイル、軟膏、丸剤、錠剤、坐剤、粉剤、ゲルキャップ、カプセル、エアゾール等の形態で処方され得る。この種の製剤については、セルロース、カーボナート、又はデンプン等の作用物質を有利に使用することができる。
【００４７】
NTZ又はTZ(G)は、異なる経路によって、そして、異なる形態で投与してよい。例えば、化合物は、全身経路を介して、経口的に、非経口的に、吸入によって、鼻腔内噴霧によって、鼻腔内滴下によって、又は注射によって、例えば静脈内に、筋肉内経路によって、皮下経路によって、経皮経路によって、局所経路によって、動脈内経路によって投与してよい。
【００４８】
無論、投与経路を、当業者に周知の手順に従ってNTZ又はTZ(G)の形態に適応させる。
【００４９】
具体的な実施態様では、化合物は錠剤として処方される。別の具体的な実施態様では、化合物は経口投与される。
【００５０】
NTZ若しくはTZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩は、処置的に有効な量で投与される。本発明の文脈において、用語「有効な量」とは、所望の処置効果を生じさせるのに十分な化合物の量を指す。
【００５１】
投与に関連する頻度及び／又は投与量は、患者、病状、投与形態等に応じて当業者が適応させることができる。典型的には、NTZ又はTZ(G)は、０．０１mg/日〜４０００mg/日、例えば５０mg/日〜２０００mg/日、例えば１００mg/日〜２０００mg/日；そして、特に１００mg/日〜１０００mg/日を含む投与量で胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置するために投与され得る。具体的な実施態様では、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩は、約１０００mg/日の投与量（すなわち、９００〜１１００mg/日の投与量）、特に１０００mg/日で投与される。具体的な実施態様では、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩は、特に錠剤として、約１０００mg/日の投与量、特に１０００mg/日で経口投与される。投与は、必要に応じて、毎日、又は更には１日数回行ってよい。一実施態様では、化合物は、少なくとも１日１回、例えば、１日１回、１日２回、又は１日３回投与される。具体的な実施態様では、化合物は１日に１回又は２回投与される。特に、経口投与は、約１０００mgの投与量、特に１０００mgの投与量の化合物を含む錠剤を摂取することによって、食事中、例えば、朝食、昼食、又は夕食中に１日１回実施してよい。別の実施態様では、錠剤は、例えば、ある食事中に約５００mgの投与量（すなわち、４５０〜５５０mgの投与量）、特に５００mgの投与量の化合物を含む第１の錠剤を投与し、そして、同日の別の食事中に約５００mgの投与量、特に５００mgの投与量の化合物を含む第２の錠剤を投与することによって、１日２回経口投与される。
【００５２】
好適には、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩による処置過程は、少なくとも１週間、特に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは２４週間、又はそれ以上である。特に、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩による処置過程は、少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間、又は少なくとも５年間である。
【００５３】
具体的な実施態様では、本発明は、それを必要としている患者における、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患、具体的には肝線維症、より具体的にはNASHに続発する肝線維症の処置であって、処置的に有効な量のNTZ若しくはTZ(G)又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩を該患者に投与する、具体的には、特に、１日２回、特に２回の異なる食事中にNTZ ５００mgを含有する錠剤を投与することによって、１０００mg/日の投与量でNTZを投与することを含む処置に関する。
【００５４】
具体的な実施態様では、本発明は、公知の抗線維化活性を有する少なくとも１つの他の処置活性剤と組み合わせた、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置するためのNTZ若しくはTZ(G)又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩の使用に関する。この実施態様の変形例によれば、NTZ又はTZ(G)は、ピルフェニドン又は受容体チロシンキナーゼ阻害剤（RTKI）、例えば、ニンテダニブ、ソラフェニブ、及び他のRTKI、又はアンギオテンシンII（AT1）受容体ブロッカー、又はCTGF阻害剤、又はMMP2、MMP9、THBS1、若しくは細胞表面インテグリン等の潜在TGFβ複合体の活性化剤を含むTGFβ-及びBMP-活性化経路に干渉しやすい任意の抗線維化化合物、TGFβ受容体Ｉ型（TGFBRI）若しくはII型（TGFBRII）、及びこれらのリガンド、例えば、TGFβ、アクチビン、インヒビン、ノーダル、抗ミュラーホルモン、GDF、若しくはBMP、補助共受容体（III型受容体としても知られている）、又は制御性若しくは阻害性のSMADタンパク質を含むSMAD依存性古典的経路の構成要素、又はMAPKシグナル伝達、TAK1、Rho様GTPaseシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／AKT経路、TGFβ誘発性EMTプロセス、又はHhリガンド若しくは標的遺伝子を含む古典的及び非古典的なヘッジホッグシグナル伝達経路の様々なブランチを含むSMAD非依存性若しくは非古典的な経路のメンバー、又はTGFβシグナル伝達に影響を与えやすいWNT若しくはノッチの経路の任意のメンバー等の任意の抗線維化化合物と組み合わせることができる。
【００５５】
したがって、本発明は、また、線維性障害を処置する方法において使用するための、ピルフェニドン又は受容体チロシンキナーゼ阻害剤（RTKI）、例えば、ニンテダニブ、ソラフェニブ、及び他のRTKI、又はアンギオテンシンII（AT1）受容体ブロッカー、又はCTGF阻害剤、又はMMP2、MMP9、THBS1、若しくは細胞表面インテグリン等の潜在TGFβ複合体の活性化剤を含むTGFβ-及びBMP-活性化経路に干渉しやすい抗線維化化合物、TGFβ受容体Ｉ型（TGFBRI）若しくはII型（TGFBRII）、及びこれらのリガンド、例えば、TGFβ、アクチビン、インヒビン、ノーダル、抗ミュラーホルモン、GDF、若しくはBMP、補助共受容体（III型受容体としても知られている）、又は制御性若しくは阻害性のSMADタンパク質を含むSMAD依存性古典的経路の構成要素、又はMAPKシグナル伝達、TAK1、Rho様GTPaseシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／AKT経路、TGFβ誘発性EMTプロセス、又はHhリガンド若しくは標的遺伝子を含む古典的及び非古典的なヘッジホッグシグナル伝達経路の様々なブランチを含むSMAD非依存性若しくは非古典的な経路のメンバー、又はTGFβシグナル伝達に影響を与えやすいWNT若しくはノッチの経路の任意のメンバーから選択される公知の抗線維化活性を有する少なくとも１つの処置活性剤と組み合わせて、NTZ若しくはTZ(G)、又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩から選択される化合物を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
別の具体的な実施態様では、NTZ又はTZ(G)と組み合わせてもよい分子の他のクラスは、JAK/STAT阻害剤、又は他の抗炎症剤及び／若しくは免疫抑制剤を含む。これら作用物質の非排他的なリストは、グルココルチコイド、NSAIDS、シクロホスファミド、ニトロソ尿素、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリン、ミリオシン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸誘導体、フィンゴリモド及び他のスフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子；炎症促進性サイトカイン及び炎症促進性サイトカイン受容体、Ｔ細胞受容体、インテグリン等の標的に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。NTZ又はTZ(G)と組み合わせてもよい分子の他のクラスは、NTZ又はTZ(G)の曝露又は効果を潜在的に強化することができる分子を含む。
【００５７】
別の具体的な実施態様では、本発明は、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩と、公知の抗線維化活性を有する少なくとも１つの他の処置活性剤、又はJAK/STAT阻害剤、又は他の抗炎症剤及び／若しくは免疫抑制剤との組み合わせに関する。該組み合わせは、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩を含む様々な活性成分を含む単一の医薬組成物の形態であり得る。変形例では、該組み合わせは、NTZ、TZ(G)、又はこれらの薬学的に許容し得る塩と、別の抗線維化剤、JAK/STAT阻害剤、又は別の抗炎症剤及び／若しくは免疫抑制剤等の別の活性成分とを含むキットオブパーツである。該キットオブパーツは、胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置するために、同時、別々、又は逐次投与するためのものであり得る。
【００５８】
別の実施態様では、化合物NTZ若しくはTZ(G)、又はNTZとTZ(G)との組み合わせは、唯一の活性成分として投与される。したがって、本発明は、また、胆汁うっ滞性又は線維性の障害を処置する方法において使用するための、NTZ若しくはTZ(G)から選択される化合物、又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩、又はこれらの混合物を含む医薬組成物であって、該化合物が、該組成物において唯一の活性成分である医薬組成物に関する。
【００５９】
更なる実施態様では、本発明は、特にNTZ又はTZ(G)を含有する医薬組成物の形態の、NTZ若しくはTZ(G)、又はNTZ若しくはTZ(G)の薬学的に許容し得る塩を投与することを含む、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を処置する方法を提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、
−  ニタゾキサニド又はニタゾキサニドの薬学的に許容し得る塩と、
−  チゾキサニド又はチゾキサニドの薬学的に許容し得る塩と
を含むキットオブパーツに関する。
【００６１】
本発明のキットオブパーツの化合物は、線維性障害を処置するために同時に、別々に、又は逐次投与される。
【００６２】
別の実施態様では、本発明は、特に食事中（例えば、朝食、昼食、又は夕食中）に、NTZ ５００mgを含有する錠剤を、胆汁うっ滞性又は線維性の疾患を有するそれを必要としている患者（特に、NASH患者又は肝線維症を有する患者）に１日２回投与することを含む、胆汁うっ滞性及び／又は線維性の疾患を処置する方法を提供する。
【００６３】
本発明は、以下の非限定例を参照して更に説明される。
【００６４】
実施例
材料及び方法
化合物は、ジメチルスルホキシド（DMSO、Flukaカタログ番号41640）に溶解させた。ニタゾキサニド（INTERCHIMカタログ番号RQ550U）及びチゾキサニド(INTERCHIMカタログ番号RP253）は、商業的に入手した。
【００６５】
hHSC培養
ヒト初代肝星細胞（hHSC）（Innoprot）を、２％ ウシ胎仔血清（FBS、ScienCell カタログ番号0010）、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ScienCell カタログ番号0503）、及び星細胞増殖補給剤（SteCGS；ScienCell カタログ番号5352）を補給したSTeCM培地（ScienCell カタログ番号5301）中で培養した。よりよく接着させるために細胞培養フラスコをポリ−Ｌ−リジン（Sigma カタログ番号P4707）でコーティングした。
【００６６】
TGF-β1によるhHSCの活性化
ヒト初代肝星細胞（hHSC）（Innoprot）を、上記の通り標準的な条件下で培養した。続いて、該細胞を、遺伝子発現試験については７×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに、そして、ELISAによるα−SMAの測定については２×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。次の日、細胞培養培地を除去し、そして、細胞をPBS（Invitrogen カタログ番号14190）で洗浄した。hHSCを無血清かつSteCGS不含培地中で２４時間飢餓状態にした。NTZ又はTZによる処理については、血清欠乏hHSCを該化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、線維化促進性刺激TGFβ1（PeproTech カタログ番号100-21、１ng/mL）を添加し、無血清かつSteCGS不含培地中で更に２４又は４８時間インキュベートした（タイムポイントは図面の凡例に示す）。処理の最後に、細胞をPBS（Invitrogen、カタログ番号14190）で洗浄した後、溶解バッファ（CelLyticTM MT試薬；Sigma #C3228） ５０μLを添加した。次いで、プレートシェーカーを使用して氷上で３０分間プレートをインキュベートした後、−２０℃で保存した。
【００６７】
TGFβ1によるラットHSCの活性化：
ラット初代肝星細胞（rHSC）（Innoprot）を、２％ ウシ胎仔血清（FBS、ScienCell カタログ番号0010）、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ScienCell カタログ番号0503）、及び星細胞増殖補給剤（SteCGS; ScienCell カタログ番号5352）を補給したSTeCM培地（ScienCell カタログ番号5301）中で培養した。TGFβ1による活性化実験のために、rHSCを１０×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。次の日、細胞培養培地を除去し、そして、細胞をPBS（Invitrogen カタログ番号14190）で洗浄した。rHSCを無血清かつSteCGS不含培地中で２４時間飢餓状態にした。NTZ又はTZによる処理のため、血清欠乏rHSCを該化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、線維化促進性刺激TGFβ1（PeproTech カタログ番号100-21、３ng/mL）を添加し、無血清かつSteCGS不含培地中で更に４８時間インキュベートした。処理の最後に、細胞をPBS（Invitrogen、カタログ番号14190）で洗浄した後、溶解バッファ（CelLyticTM MT試薬；Sigma #C3228） ５０μLを添加した。次いで、プレートシェーカーを使用して氷上で３０分間プレートをインキュベートした後、−２０℃で保存した。
【００６８】
TGFβ1によるNHLFの活性化
正常ヒト肺線維芽細胞（NHLF）（Lonza）を、FGM-2 SingleQuots（商標）キット（Lonza カタログ番号CC-3132)を補給した線維芽細胞基本培地（FBM）（Lonza カタログ番号CC-3131）中で培養した。完全培地は、２％ ウシ胎仔血清を含有する。TGFβ1による活性化実験のために、NHLFを５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。次の日、細胞培養培地を除去し、そして、細胞をPBS（Invitrogen カタログ番号14190)で洗浄した。NHLFを無血清、インスリン不含、かつrhFGF-B不含培地中で２４時間飢餓状態にした。NTZ又はTZによる処理のため、血清欠乏NHLFを該化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、線維化促進性刺激TGFβ1（PeproTech カタログ番号100-21、１ng/mL）を添加し、無血清、インスリン不含、かつrhFGF-B不含培地中で更に４８時間インキュベートした。処理の最後に、細胞をPBS（Invitrogen、カタログ番号14190）で洗浄した後、溶解バッファ（CelLyticTM MT試薬；Sigma #C3228） ５０μLを添加した。次いで、プレートシェーカーを使用して氷上で３０分間プレートをインキュベートした後、−２０℃で保存した。
【００６９】
TGFβ1によるNHCF-Vの活性化：
正常ヒト心臓線維芽細胞(心室)（NHCF-V)（Lonza)を、正常成人心臓組織から単離した。細胞を、FGM（商標）-3 BulletKit（商標）キット（Lonza カタログ番号CC-4525）を補給した線維芽細胞基本培地（FBM)（Lonza カタログ番号CC-3131）中で培養した。完全培地は、１０％ ウシ胎仔血清を含有する。TGFβ1による活性化実験のために、NHCF-Vを６×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。次の日、細胞培養培地を除去し、そして、細胞をPBS（Invitrogen カタログ番号14190)で洗浄した。NHCFを無血清、インスリン不含、かつrhFGF-B不含培地中で２４時間飢餓状態にした。NTZ又はTZによる処理のため、血清欠乏NHCFを該化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、線維化促進性刺激TGFβ1（PeproTech カタログ番号100-21、３ng/mL）を添加し、無血清、インスリン不含、かつrhFGF-B不含培地中で更に４８時間インキュベートした。処理の最後に、細胞をPBS（Invitrogen、カタログ番号14190）で洗浄した後、溶解バッファ（CelLyticTM MT試薬；Sigma #C3228） ５０μLを添加した。次いで、プレートシェーカーを使用して氷上で３０分間プレートをインキュベートした後、−２０℃で保存した。
【００７０】
TGFβ1によるInMyoFibの活性化：
ヒト腸筋線維芽細胞（InMyoFib）（Lonza）を、SmGMTM-2 BulletKit（商標）（Lonza カタログ番号CC-4149）を補給した平滑筋細胞基本培地（SmBM-2TM）（Lonza カタログ番号CC-3181）中で培養した。完全培地は、５％ ウシ胎仔血清を含有する。TGFβ1による活性化実験のために、inMyoFibを１０×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。次の日、細胞培養培地を除去し、そして、細胞をPBS（Invitrogen カタログ番号14190）で洗浄した。InMyoFibを無血清、インスリン不含、かつrhFGF-B不含培地中で２４時間飢餓状態にした。NTZ又はTZによる処理のため、血清欠乏InMyoFibを該化合物と共に１時間プレインキュベートし、続いて、線維化促進性刺激TGFβ1（PeproTech カタログ番号100-21、３ng/mL）を添加し、無血清、インスリン不含、かつrhFGF-B不含培地中で更に４８時間インキュベートした。処理の最後に、細胞をPBS（Invitrogen、カタログ番号14190）で洗浄した後、溶解バッファ（CelLyticTM MT試薬；Sigma #C3228） ５０μLを添加した。次いで、プレートシェーカーを使用して氷上で３０分間プレートをインキュベートした後、−２０℃で保存した。
【００７１】
α-SMAのELISA
サンドイッチELISAを使用してα-SMAのレベルを測定した。簡潔に述べると、まず、ELISAプレートのウェルを４℃で一晩捕捉抗体（マウスモノクローナル抗ACTA2、Abnova）でコーティングした。PBS＋０，２％ Tween 20で３回洗浄した後、PBS＋０．２％ BSAからなるブロッキング溶液を１時間にわたって添加し、続いて、別の洗浄サイクルに供した。細胞溶解物をウェルに移し、室温で２時間捕捉抗体に結合させた。洗浄手順後、検出抗体（ビオチン化マウスモノクローナル抗ACTA2、Abnova）を室温で２時間にわたって添加し、続いて、３回洗浄した。検出するために、まず、HRP標識ストレプトアビジン（R&D Systems カタログ番号DY998）を室温で３０分間適用した。洗浄後、HRPの基質であるTMB（BD、#555214）を添加し、そして、暗条件下、室温で７分間インキュベートした。酸化すると、TMBは水溶性青色反応生成物を形成し、これは硫酸を添加すると黄色になる（溶液停止）ので、分光計を用いて４５０nmにおける強度を正確に測定することができる。発色は、溶解物中に存在するα-SMAの量と正比例する。
【００７２】
遺伝子発現
製造業者の指示書に従ってNucleospin（登録商標）96 RNA（Macherey Nagel）を使用して全RNAを単離した。１×RTバッファ（Invitrogen)、１mM DTT（Invitrogen)、０．１８mM dNTPs（Promega)、pdN6（Amersham） ２００ng、及びRNase阻害剤（Promega） ３０U中で、M-MLV RT（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素)（Invitrogen カタログ番号28025）を使用して全RNA（インビトロサンプルについては５００ng）をcDNAに逆転写した。
【００７３】
次いで、MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System（Biorad）を使用して定量PCRを実施した。簡潔に述べると、逆転写反応 １μL、リバース及びフォワードのプライマー（各１０pmol） ０．５μL、並びに２×iQ SYBR Green Supermix（BioRad, 1725006CUST） １２．５μLを含有する、総体積２５μLの96-WPフォーマットにおいてPCR反応を実施した。プライマーの配列を表１に示す。
【表１】
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【００７４】
ヒトサンプルにおけるレファレンスとして36B4遺伝子の発現を使用して発現レベルを正規化した。
【００７５】
各遺伝子につき、PCR反応効率を１００％に近づけ、かつ相関係数を１に近づけるために、最良点（少なくとも３点）を選択することによって標準曲線を描いた。（各標的遺伝子の特異的PCR効率を考慮して）ハウスキーピング遺伝子及び標的遺伝子の両方の標準曲線方程式を使用して、発現レベルを決定した。
【００７６】
慢性CDAAc飼料誘発性肝線維症モデルにおけるNTZの評価
CDAAc飼料誘発性実験的肝線維症のマウスモデルにおいてNTZの抗線維化効果を評価した。６週齢のC57BL/6マウスに１２週間、対照（CSAA）飼料、CDAAc飼料、又は１０mg/kg/日 NTZを補給したCDAAc飼料を１２週間給餌した。
【００７７】
体重及び飼料の摂取を週２回モニタリングした。処理の最後の日、６時間の絶食期間後にマウスを屠殺した。生化学的及び組織学的な試験のために、迅速に肝臓を摘出した。
【００７８】
標準的なプロトコールに従って、そして、実験動物の適切なケア及び使用のための標準的な勧告に従って全ての動物実験を実施した。
【００７９】
CCl4誘発性肝障害モデルにおけるNTZの評価
CCl4誘発性肝損傷のラットモデルにおいてNTZの抗線維化効果を評価した。
【００８０】
OFA S;Dawleyラット（初期体重２５０〜２７５ｇ）をその体重に従って無作為に４群に分け、そして、３週間処理した。ラットにオリーブ油（対照群）又はオリーブ油に乳化させたCCl4（CCl4：オリーブ油 １：２v/v、最終CCl4濃度：２mL/kg）を週２回腹腔内注射した。同時に、オリーブ油注射群を対照飼料で飼育し、一方、CCl4注射群を対照飼料又はNTZを補給した飼料で飼育した。１０又は３０mg/kg/日の曝露にそれぞれ対応する、NTZを含有する２つのレジメンを調製した。処理の最後の日、６時間の絶食期間後にラットを屠殺した。血液サンプルを回収し、そして、生化学的分析のために血清を単離した。
【００８１】
胆汁うっ滞のDDCモデルにおけるNTZの評価：
０，１％ DDC補給飼料、又は１００mg/kg/日 NTZを含有する０，１％ DDC補給飼料、又は標準的なマウス飼料（Ssniff）をC57BL/6マウスに８週間給餌する。処理の最後の日、６時間の絶食期間後にマウスを屠殺する。生化学的分析のために血液サンプルを採取し、そして、生化学的及び組織学的な試験のために迅速に肝臓を摘出する。
【００８２】
慢性CCl4誘発性肝線維症モデルにおけるNTZの評価
９週齢のC57BL/6マウスを対照飼料又はNTZを補給した飼料で６週間飼育する。３０又は１００mg/kg/日 NTZの曝露にそれぞれ対応する、NTZを含有する２つのレジメンを調製する。同時に、そして、合計６週間にわたって、強制経口飼養によってマウスをオリーブ油に溶解させたCCl4又はビヒクルで週３回処理する。CCl4の量は、０．８７５mL/kgから２．５mL/kgに次第に増加させる。処理の最後の日、６時間の絶食期間後にマウスを屠殺する。血清の生化学的分析のために血液サンプルを回収する。生化学的、組織学的、そして、発現の試験のために、迅速に肝臓を摘出する。
【００８３】
組織学
組織の包埋及び切片作製：:
まず、肝臓薄片を４％ ホルマリン溶液で１２時間固定した。次いで、肝臓片をPBSで３０分間洗浄し、そして、エタノール溶液（７０、８０、９５、及び１００％ エタノールの浴で連続して）で脱水した。肝臓片をキシレン（Sigma-Aldrich カタログ番号534056）の３つの異なる浴中で、続いて、流動パラフィン（５６℃）の２つの浴中でインキュベートした。次いで、肝臓片をラックに入れ、これに組織を完全に覆うようにHistowax（登録商標）を静かに充填した。
【００８４】
組織片を含有するパラフィンブロックをラックから取り出し、そして、室温で保存した。肝臓ブロックを３μmの薄片に切断した。
【００８５】
ピクロシリウスレッド染色
肝切片を脱パラフィンし、再水和し、そして、Fast Green FCF ０．１％（Sigma-Aldrich、カタログ番号F7258）の溶液中で１５分間インキュベートした後、０．５％ 酢酸（Panreac、カタログ番号131008.1611）の浴ですすいだ。肝切片を水ですすぎ、そして、飽和ピクリン酸水溶液（Sigma-Aldrich カタログ番号P6744）中０．１％ シリウスレッド（Direct Red 80、Fluka カタログ番号43665）の溶液中で３０分間インキュベートした。最後に、肝切片を脱水し、そして、CV Mount medium（Leica、カタログ番号14046430011）を使用して載せた。
【００８６】
組織学的試験
肝臓試料のアイデンティティは、試験者に分からないようにした。3D Histech製のPannoramic 250スキャナを使用してバーチャル切片を作成した。Quant Centerソフトウェア（3D Histech、Pattern Quant and Histo Quantモジュールを含む）を使用して、コラーゲンが染色された領域を定量した。簡潔に述べると、Pattern Quantを使用して関連する組織構造を検出し、そして、表面を測定した。次いで、Histo Quantを使用して、染色されたコラーゲン含量を検出し、また色閾値法に基づき総面積及び百分率を測定した。線維症領域を、組織全体に対するコラーゲン表面の百分率として表した。
【００８７】
肝臓のコラーゲン含量の測定
適切なQuickZymeキット（Total collagen assay、カタログ番号QZB-totcol2）を使用して肝臓のコラーゲン含量を決定した。このアッセイは、コラーゲンの三重らせんで主にみられる非タンパク質性アミノ酸であるヒドロキシプロリンの検出に基づく。したがって、（プロコラーゲン、成熟コラーゲン、及びコラーゲン分解産物を区別することなく）組織中に存在するコラーゲンの量の直接の尺度として、組織加水分解物中のヒドロキシプロリンを使用することができる。
【００８８】
ヒドロキシプロリンを添加する（dosing）前に、９５℃の６M HCl中で組織サンプルを完全に加水分解することが必要である。このアッセイの結果、最大吸収が５７０nmである色素原が生じる。結果を肝臓１ｇ当たりのコラーゲンのmgとして表す。
【００８９】
BDLモデルにおけるNTZの評価
肝外胆汁うっ滞及びそれに続く肝線維症を誘導するために、ラットに対して外科的胆管結紮を行う。２週間の回復期の後、動物を３０又は１００mg/kg/日 NTZで１又は２週間処理する。処理の最後の日、６時間の絶食期間後にマウスを屠殺する。血清の生化学的分析のために血液サンプルを回収する。生化学的、組織学的、そして、発現の試験のために、迅速に肝臓を摘出する。
【００９０】
血漿中の全胆汁酸濃度の測定
Daytona自動分析機（Randox、カタログ番号BI 3863）に適したRandoxキットを使用して血漿中の全胆汁酸（TBA）濃度を決定した。チオ−NADの存在下において、酵素３−αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３−αHSD）は、胆汁酸を３−ケトステロイド及びチオ−NADHに変換する。この反応は可逆性であり、そして、３−αHSDは、３−ケトステロイド及びチオ−NADFH−を胆汁酸及びチオ−NADに変換することができる。過剰のNADHの存在下では、酵素サイクリングが効率的に生じ、そして、４０５nmにおける吸光度の特異的変化を測定することによって、チオ−NADHの形成速度を決定する。結果をμmol/Lで表す。
【００９１】
結果及び結論：
分化した筋線維芽細胞の異常な存続は、多くの線維性疾患の特徴である。肝損傷後、休止状態のHSCは、（α−SMA）陽性筋線維芽細胞への分化を特徴とする活性化プロセスを受ける。新規抗線維化分子を見出す試みにおいて、線維化促進性サイトカインTGFβ1で活性化されたヒトHSCのモデルにおいて、FDAに承認されている薬物のライブラリを表現型で（phenotypically）スクリーニングした。線維性病変の特徴であるα−SMAのレベルを使用して、薬物の線維化プロセスに干渉する能力を評価した。組織的スクリーニング（screening campaign）によってニタゾキサニド（NTZ）が同定され、これはTGFβ誘導性HSCにおいてα−SMAのレベルを用量依存的に低下させた。全体的にみて、NTZは、０．１〜３μMを含むIC50を示した（図１Ａ）。NTZは活性代謝物チゾキサニド（TZ）に急速に加水分解されることが知られている（Broekhuysen, Stockis et al., 2000）ので、この代謝物についてもHSCにおけるその抗線維化活性について評価した。TZは、親薬物と同様のプロファイルを示し、IC50は０．１〜３μMを含んでいた（図１Ｂ）。細胞外マトリクスコラーゲン1A1（COL1A1）を含むTGFβ刺激の他のマーカーは、両化合物によって減少した（図２）。毒性アッセイによって、α−SMAのレベル低下は毒性又はHSCのアポトーシスに起因するものではないことが確認された（データ不図示）。
【００９２】
また、NTZ及びTZは、ラット由来のTGFβ活性化HSCにおけるα−SMAのレベルも低下させた（図３）。更に、NTZ及びTZの抗線維化能は、正常ヒト肺線維芽細胞（NHLF）（図４）、正常ヒト心臓線維芽細胞（図５）、及びヒト腸筋線維芽細胞（InMyoFib）（図６）を含む他の組織に由来する線維芽細胞にも及んだ。これら線維症モデルの全てにおいて、NTZ及びTZは、１μMの濃度で有意な抗線維化効果を示した。
【００９３】
CDAAコレステロール飼料誘発性実験的肝線維症モデルにおいてNTZのインビボにおける効力を評価した。１０mg/kg/日 ニタゾキサニドの持続的経口投与は、有意に低い肝臓のコラーゲン含量（図７）及び組織学的試験による肝線維症領域の減少（図８）によって反映される抗線維化特性を示した。
【００９４】
CCl4誘発性肝損傷のインビボモデルにおいて、NTZは、胆汁うっ滞に関連するマーカーである（Chang 2013）循環TBA濃度の病的な増加を妨げた（図９）。
【００９５】
結論として、出願人は、抗寄生虫剤NTZの予想外の抗線維化及び抗胆汁うっ滞の活性を見出した。これら結果は、NTZ及び／又はその活性代謝物TZが、胆汁うっ滞性疾患及び複数の種類の線維性疾患において処置上の利益を提供し得ることを示す。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019513761.tif 000013
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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