(57)【要約】  本発明は、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を用いて非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための方法を対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）から選択される疾患の治療に使用するための、ホスホジエステラーゼ４（phosphodiesterase 4：ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物であって、
前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、５−（（２Ｒ，４ａＲ，１０ｂＲ）−９−エトキシ−２−ヒドロキシ−８−メトキシ−１，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−フェナントリジン−６−イル）１−メチル−１Ｈ−ピリジン−２−オン（以下「化合物Ａ」と呼ぶ）及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、医薬組成物。
【請求項２】
前記疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
２型糖尿病（diabetes mellitus type 2）及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療（concomitant treatment）に使用するための、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物であって
前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、医薬組成物。
【請求項５】
２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療に使用するための、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物であって、
前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、医薬組成物。
【請求項６】
前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａである、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で一日１回投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日１回投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で一日２回投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日２回投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で一日３回投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日３回投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
化合物Ａの用量が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の用量が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、 ０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される化合物Ａの用量に相当する用量から選択される、請求項７、９、及び１１の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
化合物Ａの用量が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される、請求項８、１０、及び１２の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日１回投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日２回投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日３回投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
化合物Ａの用量が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の用量が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される化合物Ａの用量に相当する用量から選択される、請求項１５、１７、及び１９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
化合物Ａの用量が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される、請求項１６、１８、及び２０の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記医薬組成物が経口投与形態である、請求項１〜２２の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、前記方法は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
【請求項２５】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、前記方法は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
【請求項２６】
２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、前記方法は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、前記方法は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
【請求項２８】
前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａである、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日１回投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日２回投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日３回投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
化合物Ａの用量が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の用量が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される化合物Ａの用量に相当する、請求項２９、３１及び３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
化合物Ａの用量が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される、請求項３０、３２及び３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で一日１回投与される、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日１回投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で一日２回投与される、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日２回投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される、請求項２４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日３回投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
化合物Ａの用量が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の用量が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される化合物Ａの用量に相当する、請求項３７、３９及び４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
化合物Ａの用量が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される、請求項３８、４０及び４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
化合物Ａが経口投与形態で投与される、請求項２４〜４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
肝線維症の面積、肝性トリグリセリド濃度、血漿ＡＬＴレベル、ＨｂＡ１ｃレベル、又はＨｂＡ１ｃレベルの治療、軽減、又は予防を、それを必要とする哺乳類において行う方法であって、斯かる哺乳類に対して、治療有効量の化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩を投与することを含む方法。
【請求項４７】
肝脂肪代謝異常、過剰体重、又は除脂肪体重に影響しない体脂肪量（body fat mass without affecting lean mass）の治療又は軽減を、それを必要とする哺乳類において行う方法であって、斯かる哺乳類に対して、治療有効量の化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非アルコール性脂肪肝疾患の治療法を対象とする。より具体的には、本発明はホスホジエステラーゼ４阻害剤（phosphodi-esterase 4 inhibitor：本願明細書ではＰＤＥ４阻害剤と略称する場合がある。）による非アルコール性脂肪肝疾患の治療法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：本願明細書ではＮＡＦＬＤと略称する場合がある。）は、高カロリー摂取及びグルコース代謝障害に関連する、近年増加している疾病である。糖尿病患者の６０〜７５％がＮＡＦＬＤを有し、これらの患者の約１０％が非アルコール性脂肪性肝炎（nonalcoholic steato-hepatitis：本願明細書ではＮＡＳＨと略称する場合がある。）へと進行する。ＮＡＳＨと診断された患者の約２０％が肝硬変を発症し、これらの患者の４０〜６０％が５〜７年で肝不全を発症する。更に、約１０％が肝細胞がん（hepato-cellular carcinoma：ＨＣＣ）を発症し、約３０％が最終的に肝疾患の合併症で死亡する。現在のところ利用可能な既承認の治療法はない。
【０００３】
「非アルコール性脂肪肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）という語は、予後の異なる様々な形態及び重症度の病理学的肝脂肪変性のスペクトルの総称である。斯かるスペクトルには、一方で、良性且つ非進行型の非アルコール性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver：本願明細書ではＮＡＦＬと略称する場合がある。）が存在し、他方では肝炎を伴い、肝線維症及び肝硬変へと進行しうる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が存在する。
【０００４】
診断においては、ＮＡＳＨが通常最初に疑われるのは、定期血液検査項目に含まれる肝臓検査値に上昇が見られる対象である。斯かる肝臓検査値としては、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransaminase：ＡＬＴ）やアスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransaminase：ＡＳＴ）が挙げられる。更なる評価の結果、肝疾患の明らかな原因（例えば投薬、ウイルス性肝炎、アルコール過剰摂取等）が見出されず、Ｘ線等による肝臓の画像検査でも脂肪の存在が見られない場合には、ＮＡＳＨの疑いがある。ＮＡＳＨとの診断を確定し、単なる脂肪肝との診断を棄却するには、肝生検が必要となる。肝生検は、針を皮膚から挿入して肝臓の小さな試料を採取する。組織検査により、肝脂肪蓄積の存在と共に、肝炎及び肝細胞の風船化（ballooning）等の異常が見出されれば、ＮＡＳＨと診断される。組織に脂肪沈着のみが見られ、他の病理学的知見がない場合には、単なる脂肪肝又はＮＡＦＬと診断される。生検から得られる重要な情報の一つは、肝臓でＮＡＳＨが発症しているか否かである。
【０００５】
診断目的において、病理学者はＮＡＦＬＤを、ＮＡＦＬ（主に大滴性の脂肪症であって、非特異的炎症を伴う場合と伴わない場合とがある。）とＮＡＳＨとに分類する。ＮＡＳＨの組織学的特徴としては、大滴性脂肪症、肝細胞の風船様変化（ballooning degeneration）、散在性の（主に小葉性の）炎症、アポトーシス小体、及びマロリーデンク（Mallory-Denk）小体が挙げられる。なお、ある程度の線維症が存在する場合が多いが、診断には必須ではない。ＮＡＦＬとは異なり、ＮＡＳＨには、他の肝疾患と共存する場合でも識別可能な、肝損傷の特異的なパターンを有する。疾患の初期段階では、組織学的変化は独特の分布を示し、最も重篤な変化が見られる腺房ゾーン３は、解剖学的局在性によれば、酸素供給が最も乏しい領域である。本疾患固有の複雑さと広範な知見ゆえ、病理学者によるＮＡＦＬＤの重症度評価を補助するための評点系が開発されてきた。
【０００６】
ＮＡＦＬＤの特徴を評点するための独自の系である、通称ＮＡＦＬＤ活性スコア（NAFLD Activity Score：本願明細書ではＮＡＳと略称する場合がある。）は、治験時のＮＡＦＬＤの変化を測定するためのツールとして開発された。本スコアは、脂肪症（０〜３）、小葉性炎症（０〜３）、及び風船様変化（ballooning）（０〜２）の各スコアの非加重総計として定義される、０〜８のスコアである。線維症は、より不可逆性の高いパラメーターと考えられるため、ここには含まれていない。
【０００７】
ＮＡＦＬＤ活性スコアが４以上であれば、脂肪性肝炎の予測において最適な感度及び特異性が得られると考えられるため、ＮＡＳＨの介入試験を認めるための推奨値とされている。ＮＡＳを用いた診断では、ＮＡＳが３以下の場合にはＮＡＦＬＤと診断され、ＮＡＳが５以上の場合にはＮＡＳＨと診断される。ＮＡＳスコアが３よりも大きく、５よりも小さい場合（典型的には４の場合）には、一般に境界性ＮＡＳＨと診断される。
【０００８】
ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨは、先進工業国に共通の、臨床的に重要な型の慢性肝疾患となりつつある。ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨの管理法は極めて保守的であり、例えば食事や運動、更には減量薬や脂質降下剤の投与、幾つかの抗酸化剤等によるアプローチ（例えばビタミン、グルタチオン）等が用いられる。重篤になり得る障害であるにもかかわらず、今のところ確立された治療法は存在しない。
【０００９】
従って、ＮＡＦＬＤの治療、特にＮＡＳＨの治療のための有効な新規薬剤が、依然として強く求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の側面によれば、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療を、斯かる治療を必要とする哺乳類において行う方法であって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
第２の側面によれば、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療を、斯かる治療を必要とする哺乳類において行う方法であって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
第３の側面によれば、本発明は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療のための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
第４の側面によれば、本発明は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療のための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
前記のホスホジエステラーゼ４阻害剤は、５−（（２Ｒ，４ａＲ，１０ｂＲ）−９−エトキシ−２−ヒドロキシ−８−メトキシ−１，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−フェナントリジン−６−イル）１−メチル−１Ｈ−ピリジン−２−オン（以下「化合物Ａ」と呼ぶ）及び医薬的に許容可能なその塩から選択される。
【００１５】
本発明の１又は２以上の側面及びその実施態様を、添付の図面及び以下の説明において詳述する。他の特徴及び利点は、本明細書並びに添付の図面及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝線維症の面積に対する化合物Ａの予防作用。
【図２】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝ＴＧ蓄積に対する化合物Ａの予防作用。
【図３】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における血漿ＡＬＴレベルに対する化合物Ａの作用。
【図４】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における身体組成及び食物摂取に対する化合物Ａの作用。
【図５】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝線維症の面積に対する化合物Ａの治療効果。
【図６】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝ＴＧ蓄積に対する化合物Ａの治療効果。
【図７】化合物Ａによる２８日間の処置が雄ＤＩＯマウスの体重及び総食物摂取に与える作用。
【図８】化合物Ａによる２８日間の処置が雄ＤＩＯマウスの体脂肪量及び除脂肪体重に与える作用。
【図９】化合物Ａによる２８日間の経口治療後における雌ｄｂ／ｄｂマウスのＨｂＡ１ｃレベルへの作用。
【図１０】化合物Ａによる２９日間の処置後におけるｏｂ／ｏｂマウスのインシュリン感度への作用。
【図１１】５６日間の化合物Ａの一日１回投与の前後における、高カロリーの食餌又は標準的な食餌に対する雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝脂肪代謝異常。
【図１２】ヒト肝星細胞における化合物Ａの抗線維化活性。
【図１３】肝臓遺伝子発現に対する化合物Ａの予防作用 − ＴＩＭＰ−１。
【図１４】肝臓遺伝子発現に対する化合物Ａの予防作用 − ＴＮＦα。
【図１５】ヒトＴＨＰ−１細胞における化合物Ａの抗線維化活性。
【図１６】ＬＰＳ暴露Sprague Dawleyラットの血漿試料中のＴＮＦα濃度に対する化合物Ａの作用。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本発明において「治療有効量」（therapeutically effective amount）という句は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床従事者が、組織、系、動物、個人、又はヒトにおいて求める、生物学的又は医薬的な応答を惹起する活性化合物又は医薬品の量を指し、例えば以下の１又は２以上が含まれる。
【００１８】
疾患を改善し、又は疾患及びその進行を抑制すること。例えば、疾患、病態又は障害の病理又は症候を示している個人において、疾患、病態又は障害を改善／抑制すること（即ち、病理及び／又は症候の更なる進展を停止させ、或いは斯かる病理及び／又は症候を回復させること）。例えばＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨの場合、例えば（ａ）体重、（ｂ）体脂肪、（ｃ）肝脂肪量、（ｄ）アラニンアミノ基転移酵素の（ＡＬＴ）血清又は血清アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）のレベル、（ｅ）肝臓内の線維症の低減、並びに（ｆ）インシュリン抵抗性及び２型糖尿病の改善、のうち１又は２以上により、前記を達成すること。 
【００１９】
本明細書において「哺乳類」（mammal）とは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、及びサルを指すが、中でもヒトが好ましい。
【００２０】
本明細書において「医薬的に許容可能な塩」（pharmaceutically acceptable salt）とは、塩基との塩及び酸との塩を指す。
【００２１】
発明を実施するための形態
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療（ＮＡＦＤＬ）のための方法であって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＤＬ）を患う患者に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療のための方法であって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う患者に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
更に、本発明は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療のための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
同様に、本発明は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療のための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
ホスホジエステラーゼ４阻害剤は、５−（（２Ｒ，４ａＲ，１０ｂＲ）−９−エトキシ−２−ヒドロキシ−８−メトキシ−１，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−フェナントリジン−６−イル）１−メチル−１Ｈ−ピリジン−２−オン及び医薬的に許容可能なその塩から選択される。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、５−（（２Ｒ，４ａＲ，１０ｂＲ）−９−エトキシ−２−ヒドロキシ−８−メトキシ−１，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−フェナントリジン−６−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピリジン−２−オンという化学名の代わりに、簡便のために「化合物Ａ」という表現を用いる場合がある。
【００２７】
化合物Ａは米国特許第８,３２４,３９１号に開示されている。本特許は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２８】
化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の例は、米国特許第８，７５４，２１８号に開示されている。本特許も引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の例としては、化合物Ａの塩酸塩、フマル酸塩、Ｌ−酒石酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩（esilate）、臭化水素酸塩、及びトシル酸塩（tosylate）が挙げられる。化合物Ａは、医薬的に許容可能なその塩の形態よりも、遊離型として用いることが好ましい。
【００２９】
化合物Ａは、例えば米国特許第８，３２４，３９１号に開示の方法で合成することができる。
【００３０】
化合物Ａは極めて強力且つ選択性の高いＰＤＥ４阻害剤である。更に、化合物Ａは非常に好ましい薬物動態プロファイルを示す。
【００３１】
化合物Ａは、幾つかのインビトロ及びインビボ（動物）実験において、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に関連するパラメーター、例えば体重の減少、体脂肪量の減少、血清アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の減少、肝脂肪量の減少、肝臓の線維症の減少、及びインシュリン抵抗性の改善等に対し、強力な改善作用を有することが示されている。
【００３２】
化合物ＡがＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ治療の他の開発候補と比べて優れているのは、抗炎症、抗線維化、及び抗脂肪症的な作用機序を通じて作用を発揮する、という点である。化合物Ａは、他の（第二世代の？）ＰＤＥ４阻害剤と比較して、より優れた安全性／忍容性プロファイルを有すると考えられる。また、インビトロ及び動物実験で観察されたこれらの全作用に対応する作用が、臨床環境下のヒトでも見られるものと考えられる。実際に、化合物Ａは、第１相臨床試験［単回用量上昇（用量０．０５から０．８５ｍｇ）及び複数回用量上昇（７日間で０．０５から０．８ｍｇ；最長１４日間で用量０．３５及び０．８ｍｇ）］において、非常に好ましい安全性及び薬物動態プロファイルを示した。これらの臨床試験では、ＰＤＥ４阻害剤に特有の副作用、例えば下痢や悪心等は観察されていない。
【００３３】
第１の側面によれば、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療のための方法であって、それを必要とする哺乳類（患者）に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される方法に関する。
【００３４】
第２の側面によれば、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療のための方法のための方法であって、それを必要とする哺乳類（患者）に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される方法に関する。
【００３５】
第３の側面によれば、本発明は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療のための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患を患う哺乳類（患者）に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される方法に関する。
【００３６】
第４の側面によれば、本発明は、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療のための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類（患者）に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される方法に関する。
【００３７】
本発明の好ましい態様によれば、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤は、化合物Ａである。
【００３８】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の各々の治療のための方法であって、化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩を、治療の必要な哺乳類（患者）に投与することを含む方法に関する。化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、種々の投与経路で投与することができる。例えば、経肺、経口、非経口、又は経皮で投与可能である。投与経路としては経口が好ましい。
【００３９】
好ましい投与形態は経口投与形態である。適切な経口投与形態としては、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル、粉末、丸薬、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、及び顆粒が挙げられる。最も好ましい経口投与形態は錠剤である。
【００４０】
用量情報
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、例えば一日１回、一日２回、又は一日３回投与することができる。
【００４１】
化合物Ａは、化合物Ａを含む経口投与形態として、０．１ｍｇ〜６ｍｇの間の任意の量（好ましくは０．８〜３．２５ｍｇの間の任意の量）、例えば、これらに限定されるものではないが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２,７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、又は６ｍｇを投与することができる。中でも０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇが好ましい。
【００４２】
前述したように、化合物Ａを０．１〜６ｍｇの間の任意の量（好ましくは０．８〜３．２５ｍｇの間の任意の量）で含む経口投与形態は、例えば一日１回、一日２回、又は一日３回投与することができる。中でも一日２回及び一日３回投与が好ましく、一日２回投与が特に好ましい。
【００４３】
化合物Ａの医薬的に許容可能な塩の対応する量は、それぞれの塩の選択に応じて、当業者であれば容易に計算することができる。
【００４４】
本発明の第１の側面のある態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００４５】
本発明の第１の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００４６】
本発明の第１の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００４７】
本発明の第１の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００４８】
本発明の第１の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００４９】
本発明の第１の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００５０】
本発明の第１の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００５１】
本発明の第２の側面のある態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００５２】
本発明の第２の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００５３】
本発明の第２の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００５４】
本発明の第２の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、化合物Ａを０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの量で含む経口投与形態として、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩を、化合物Ａの０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの量に対応する量で含む経口投与形態として、一日１回投与される。
【００５５】
本発明の第２の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００５６】
本発明の第２の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００５７】
本発明の第２の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００５８】
本発明の第３の側面のある態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００５９】
本発明の第３の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００６０】
本発明の第３の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００６１】
本発明の第３の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００６２】
本発明の第３の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００６３】
本発明の第３の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００６４】
本発明の第３の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００６５】
本発明の第４の側面のある態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００６６】
本発明の第４の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００６７】
本発明の第４の側面の他の態様によれば、化合物Ａが、０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１ｍｇ〜６ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００６８】
本発明の第４の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００６９】
本発明の第４の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される。
【００７０】
本発明の第４の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８ｍｇ〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される。
【００７１】
本発明の第４の側面の他の態様によれば、化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される。
【００７２】
第５の側面において、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療法であって、
・過剰な体重の減量、
・バランスの取れた食事の導入、
・十分な運動、
・節酒、及び
・抗酸化剤、例えばビタミンＥによる治療
のうち１又は２以上にもかかわらず、症状が十分に改善せず、治療を必要とする患者に対して、治療有効量の化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩を投与することを含む、方法に関する。
【００７３】
本発明の第１、第２、第３、第４、又は第５の側面の好ましい態様によれば、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤は、化合物Ａである。
【００７４】
本発明の第１、第２、第３、第４、又は第５の側面の好ましい態様によれば、化合物Ａ又は化合物Ａの医薬的に許容可能な塩は、経口投与形態で投与される。
【００７５】
医薬製剤及び投与形態
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩（本願明細書では適宜「本発明の化合物」と総称する）は、医薬として用いる場合、医薬組成物の形態で投与することができる。これらの医薬組成物は、医薬分野では周知の方法で調製することができ、種々の経路で投与することができる。投与は、経肺（例えば吸引、或いは、ネブライザー等を用いた紛剤又はエアロゾルの吹送による）、気管内、鼻腔内、上皮若しくは経皮、経口、又は非経口で行うことができる。非経口投与としては、静脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、又は点滴が挙げられる。非経口投与は、単回ボーラス投与の形態でもよく、例えば灌流ポンプ等で連続的に行ってもよい。好ましい投与経路としては経口が挙げられる。
【００７６】
局所投与用の医薬組成物及び製剤は、必要又は所望に応じて、経皮パッチ、従来の医薬担体、水性、紛粉末、若しくは油性基材、増粘剤、及び／又は、その他の同様の成分を含むことができる。
【００７７】
また、本発明には、本発明の化合物を活性成分として、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物も含まれる。医薬的に許容可能な担体としては、本技術分野で公知のものを用いることができる。本発明の医薬組成物を製造するには、通常は活性成分を賦形剤と混合し、賦形剤で希釈し、又は例えばカプセル、サシェ、紙、若しくは他の容器の形態の担体に封入する。賦形剤が希釈剤である場合には、固体、半固体、又は液体材料の何れであってもよく、これらは活性成分のビヒクル、担体、又は媒体として機能する。即ち、医薬組成物は、例えば錠剤、丸剤、紛剤、ロゼンジ、サシェ、カシェ、エリキシル、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、又は液体媒体中）、ソフト若しくはハードゼラチンカプセル、坐薬、無菌注射溶液、及び無菌包装紛剤の形態とすることができる。
【００７８】
医薬組成物は、各用量が前述の量の活性成分を含む単位投与形態として処方することができる。ここで「単位投与形態」（unit dosage form）という語は、ヒト対象及び哺乳類のための単位用量として適切な、物理的に分離された単位であって、各単位が所望の治療効果を発揮するよう計算された所定の量の活性成分を、適切な医薬賦形剤との組み合わせで含むものを指す。
【００７９】
本発明の化合物は、通常は治療有効量で投与される。しかし、当然ながら、実際に投与される化合物の量は、例えば治療対象の病態、選択した投与経路、実際に投与する化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答性、並びに患者の症状の重症度等の関連する状況に応じて、通常は医師が決定すればよい。
【実施例】
【００８０】
前臨床試験
１）ＮＡＳＨのマウスモデルにおける化合物Ａの予防作用
ａ）肝線維症の形成、ｂ）肝性トリグリセリドの形成、及びｃ）血漿ＡＬＴの軽減等のパラメーターに対する化合物Ａの予防作用を、ＮＡＳＨの齧歯類モデルを用いて検討した。
【００８１】
ホモ接合性の低密度リポタンパク質受容体ノックアウト（low-density lipoprotein receptor knockout：ＬＤＬＲ−ＫＯ）マウスを、飼料又は加工コリン欠乏・Ｌ−アミノ酸調節（modified choline deficient, L-amino acid-defined：ｍＣＤＡＡ）食餌（A08111307, Research Diets, USA）で飼育した。飼料又はｍＣＤＡＡ食餌で１週間飼育した後、これらのマウスに化合物Ａ（１、３及び１０ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ、ＱＤ、ｎ＝１０；０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース懸濁液に懸濁）を７週間経口投与した。
【００８２】
化合物Ａ（１、３、及び１０ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ、ＱＤ、ｎ＝１０）で処置した結果、肝線維症の面積が用量依存的に縮小した（図１）。肝性トリグリセリド（ＴＧ）含量（図２）及び血漿ＡＬＴレベル（図３）も有意に低下した。
【００８３】
体重は僅かに減少したが、食物摂取量に変化は見られなかった。肝臓重量及び精巣上体白色脂肪組織（体脂肪量の代わりとなる）は用量依存的に減少した（図４）。
【００８４】
更に、肝臓遺伝子発現に対する化合物Ａの予防作用を評価した。肝臓から総ＲＮＡを抽出し、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ABI 4368813）を用いてｃＤＮＡを増幅し、標的遺伝子ｍＲＮＡをTaqman ＰＣＲにより測定した。標的遺伝子の発現レベルをＧＡＰＤＨにより正規化した。
【００８５】
化合物Ａによる処置の結果、肝線維症に関連する組織性メタロプロテアーゼ阻害剤１（tissue inhibitor of metalloproteases-1：ＴＩＭＰ−１）の遺伝子発現（図１３）及び肝炎ＴＮＦαの遺伝子発現（図１４）は用量依存的に減少した。
【００８６】
これらのデータを総合すると、化合物Ａは肝臓で抗炎症作用及び抗線維化作用を発揮することにより、ＮＡＳＨの進行を防止することが示唆されていると言える。
【００８７】
２）ＮＡＳＨのマウスモデルにおける化合物Ａの治療効果 
化合物Ａが有する治療可能性を評価するために、肝線維症の形成後における化合物Ａの作用を更に検討した。ホモ接合性のＬＤＬＲ−ＫＯマウスを、飼料又はｍＣＤＡＡ食餌（A08111307, Research Diets, USA）で飼育した。飼料又はｍＣＤＡＡ食餌で６週間飼育した後、これらのマウスに化合物Ａ（４及び８ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ、ＱＤ、ｎ＝１２；０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液に懸濁）を１０週間経口投与した。
【００８８】
化合物Ａによる処置を開始した６週目の時点で、肝線維症の形成及び肝性トリグリセリドの蓄積が見られた（図５及び６）。化合物Ａによる処置の結果、肝線維症の面積は縮小した（図５）。肝ＴＧ含量も当初の値から有意に低下した（図６）。これらのデータは、既存の線維症及び脂肪症を化合物Ａが治療できる可能性を示唆している。
【００８９】
３）体重及び脂肪量並びに除脂肪体重に対する化合物Ａの作用  〜  食餌性肥満（diet-induced obese：ＤＩＯ）マウスにおける４週間の処置
モデルの説明
日本クレア（株）から雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを入手した。これらのマウスを５週齢から５４週齢まで高脂肪食餌D12451（Research diets, Inc.）で飼育した。飲水は自由とした。
【００９０】
実験プロトコール
何れのマウスも個別の動物ケージに収容し、２週間の順応期間後に試験に使用した。各動物群（ｎ＝７）を５０週齢から、１回一日夕刻にビヒクル（０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース、ｐ．ｏ．）又は化合物Ａ（１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース溶液に懸濁）で、４週間に亘って処置した。体重を毎週２回又は３回測定した。身体組成については、体脂肪量及び除脂肪体重を測定した。
【００９１】
測定
身体組成（体脂肪量及び除脂肪体重）は、Echo-MRI-900（ALOKA Japan）を用いて測定した。
【００９２】
統計分析
データは全て平均±Ｓ．Ｄ．で示す。化合物Ａの作用を評価するために、ビヒクル（ｐ．ｏ．）群と化合物Ａ処置群との間の統計的有意性を、群内の分散が均一の場合は片側ウイリアム検定（Williams test）で、不均一の場合はシャーリー・ウイリアムズ検定（Shirley-Williams test）でそれぞれ分析した。ｐ値が０．０２５未満の場合、片側ウイリアム検定又はシャーリー・ウイリアムズ検定により統計的に有意であると判断した。処置前（０日目）からの体重変化を、式：［（ＢＷ−０日目のＢＷ）／０日目のＢＷ］×１００により計算した。
【００９３】
結果
化合物Ａ（１及び３ｍｇ／ｋｇ）により４週間処置したＤＩＯマウスの体重（１ｍｇ／ｋｇ；−４．９±３．５％、３ｍｇ／ｋｇ；−１７．２±４．０％）は、ビヒクル（ｐ．ｏ．）処置群（＋３．８％±２．４％）と比較して用量依存的且つ有意に減少した。化合物Ａは、４週間の試験期間に亘って持続的な体重減少作用を示した（図７）。ビヒクル（ｐ．ｏ．）処置時の体重変化に基づき修正した化合物Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）による体重減少は−８．７±３．５％であった。化合物Ａ（１及び３ｍｇ／ｋｇ）による処置の結果、体脂肪量は用量依存的且つ有意に減少したのに対し（図８Ａ）、除脂肪体重には影響がなかった（図８Ｂ）ことから、化合物Ａの体重減少作用は、体脂肪量の特異的軽減によるものであることが示唆された。
【００９４】
４．化合物Ａ  〜  ＨｂＡ１ｃに対する作用  −  ｄｂ／ｄｂマウスの４週間の処置
モデルの説明
５〜６週齢雌のｄｂ／ｄｂマウスをTaconic（Lille Skensved, Denmark）から購入し、標準的な条件（５動物／ケージ；１２ｈ明暗サイクル；室温２２±２℃；相対湿度６０±１５％）下で飼育した。何れのマウスも自由に飲水できるようにし、標準的な飼料（Provimi Kliba, Kaiseraugst, Switzerland）で飼育した。動物の到着から４日後、動物を体重及び糖化ヘモグロビン１ｃ（glycated hemoglobin 1c：ＨｂＡ１ｃ）レベルに基づき無作為化した。７週齢の時点から、動物に対して毎日、ビヒクル（４％メチルセルロース）、又は、化合物Ａ（４％メチルセルロース中水溶液）を１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｉ．ｄ．の用量（遊離塩基基準の用量）で、それぞれ強制経口投与することにより処置を行った。必要な用量を体重１ｋｇ当たり１０ｍＬの量となるように調製した。各用量群は動物１０頭とした。処置期間の終わりに血漿試料を単離し、ＨｂＡ１ｃレベルの測定に供した。実験操作は何れもドイツ動物保護法（German Animal Protection Law）に則って実施した。
【００９５】
ＨｂＡ１ｃ
ＨｂＡ１ｃの分析は、尾端血液（処置前のＨｂＡ１ｃ測定）又は眼窩後方静脈叢から採取した血液（４週間の処置後のＨｂＡ１ｃ測定）を用いて、ヘモグロビンＡ１ｃテスト（Siemens, Bad Nauheim, Germany）により行った。
【００９６】
統計分析：値は平均±ＳＥＭで示す。統計的差異は、一元配置分散分析（one-way-ANOVA）及びその後のダネット訂正（Dunnet's correction）による事後分析（GraphPad Prism）により決定した。
【数１】
2019524860.tif 000002
【００９７】
結果：化合物Ａによる処置の結果、試験した何れの用量でも、ＨｂＡ１ｃレベルが用量依存的に有意且つ顕著に低下した。用量１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａにより、ＨｂＡ１ｃレベルは９．０６％（対照）から、それぞれ７．２７（ｐ＜０．０５）、７．０６（ｐ＜０．０１）、及び６．１６％（ｐ＜０．００１）まで低下した（図９）。
【００９８】
【表１】
2019524860.tif 000003
【００９９】
５．化合物Ａ  −  ｏｂ／ｏｂマウスのインシュリン感度に対する２９日間の処置後の作用
【０１００】
モデルの説明
雄５週齢ｏｂ／ｏｂマウス（B6.Cg-Lepob/J、遺伝子型：Lepob/Lebob）及び週齢を適合させた雄痩身マウス（B6.Cg-Lepob/J、遺伝子型：Lepob/+又はLeb+/+）を、日本チャールス・リバー（株）から購入した。何れのマウスも、標準的な飼料（CE-2、日本クレア（株））で飼育し、水道水を自由に飲めるようにした。これらの動物は温度（２３±１℃）、湿度（５５±１０％）、及び照明（明期は０７：００から１９：００）が制御された部屋で飼育した。何れの実験も武田薬品工業（日本）湘南研究所の動物実験委員会による承認の下で行った。
【０１０１】
実験プロトコール／測定
何れのマウスも個別の動物ケージに収容し、２週間の順応期間後、７週齢で試験に使用した。血液試料は尾静脈から採取した。ヘパリン及び２％ＥＤＴＡを用いて血液の凝固を防止した。遠心分離により血漿を分離した。グルコースの血漿レベルは自動アナライザー7180（（株）日立製作所、日本）により測定した。ビヒクル（０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース、１０ｍＬ／ｋｇ）及び化合物Ａ（３及び１０ｍｇ／ｋｇを０．５％メチルセルロース溶液に懸濁）を一日１回経口投与した。２８日間の投与後、インシュリン耐性試験（insulin tolerance test：ＩＴＴ）を実施した。６時間の絶食後、マウスにインシュリン（Novolin R, NovoNordisk）を０．５単位／５ｍＬ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。インシュリン投与前及び投与から１５、３０、６０及び１２０分後に、尾静脈から血液試料を採取した。前述の方法により血漿グルコース（ＰＧ）レベル及びＩＴＴを測定した。インシュリン感度の評価のために、インシュリン投与から６０分後の血漿グルコースレベル、血漿グルコースレベルのＡＵＣ０-１２０分、及び、インシュリン投与から６０分後の血漿グルコースレベルの（初期値からの）変化を用いた。血漿グルコースレベルのＡＵＣ０-１２０分は、式； ［｛（０分ＰＧ）＋（１５分ＰＧ）｝×１５＋｛（１５分ＰＧ）＋（３０分ＰＧ）｝×１５＋｛（３０分ＰＧ）＋（６０分ＰＧ）｝×３０＋｛（６０分ＰＧ）＋（２０分ＰＧ）｝×６０］／２により算出した。
【０１０２】
統計分析
データは平均値及び標準偏差で示す（ｏｂ／ｏｂマウスのｎ＝８、痩身マウスのｎ＝５）。化合物Ａの用量反応の傾向は、片側ウイリアム検定又はシャーリー・ウイリアムズ検定により評価した。ｐ値が０．０２５未満の場合、片側ウイリアム検定又はシャーリー・ウイリアムズ検定により統計的に有意であると判断した。ピオグリタゾンの作用を評価するために、ビヒクル群とピオグリタゾン処置群との間の統計的差異を、スチューデントｔ−検定（Student's t-test）又はアスピン・ウェルチ検定（Aspin-Welsh test）により分析した。Ｐ値が０．０５未満の場合、スチューデントｔ−検定及びアスピン・ウェルチ検定により統計的に有意であると判断した。
【０１０３】
結果
インシュリン感度の評価のため、２９日間の処置後にＩＴＴを実施した。インシュリン（０．５単位／ｋｇ、ｉ．ｐ．）刺激による血漿グルコース（ＰＧ）の低減作用は、ビヒクル処置ｏｂ／ｏｂマウスでは痩身マウスと比べて弱められており（図１０）、ｏｂ／ｏｂマウスがインシュリン抵抗性を有することが示された。１０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａによる処置の結果、インシュリン刺激による６０分後のＰＧの低減作用は、ビヒクル群と比べて強化されていた（図１０Ａ）。更に、化合物Ａ（３及び１０ｍｇ／ｋｇ／日）による処置の結果、ＰＧレベルのＡＵＣは用量依存的に減少し、１０ｍｇ／ｋｇ／日では統計的有意性が見られた（図１０Ｂ）。更に、６０分時点での血漿グルコースレベルの初期値からの減少幅は、化合物Ａ（３及び１０ｍｇ／ｋｇ／日）処置群ではビヒクル群と比較して有意に大きかった（図１０Ｃ）。これらの結果は、化合物Ａによってｏｂ／ｏｂマウスのインシュリン感度が強化されたことを示している。
【０１０４】
６．化合物Ａ  −  肝脂肪代謝異常／肝臓重量に対する作用  −  食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの８週間の処置
モデルの説明
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Charles River, Germany；試験開始時６週齢、体重１９〜２０ｇ）を高カロリー食餌（６０％ｋｃａｌ％脂肪；No. 2127；Provimi-Kliba, Switzerland））で７週間飼育することにより、肥満を誘導した。動物を個別にマクロロン（Makrolon）ケージ・タイプII-Longに収容し、食餌及び水道水を自由に摂取可能とした。飼育開始時からの体重増加率が５０％を超えた時点で、動物を体重に基づいて無作為化し（４日目）、所定の一日用量の化合物Ａ（０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ／日、ｐ．ｏ．；４％（ｗ／ｖ）メトセル（methocel）（登録商標）水溶液に溶解させ、必要な用量を体重１ｋｇ当たり１０ｍＬの体積となるよう調製；各群ｎ＝１０）で８週間に亘って処置した。８週間の処置後に動物を屠殺した。肝臓を取り出し、秤量し、４％中性緩衝ホルマリンで２日間固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンエオシンで染色して組織学的評価に供した。組織学的読み取りに際してスライドを盲検化し、光学顕微鏡検査で肝脂肪代謝異常を評価した。
【０１０５】
肝脂肪代謝異常の程度は、以下の段階基準に基づき半定量的に評価した。
グレード１（最少）：肝細胞内に小型の球状細胞質内空胞が存在。
グレード２（軽度）：肝細胞内に小型〜中型の球状細胞質内空胞が存在。
グレード３（中度）：以上に加えて、球状細胞質内空胞により細胞核が細胞の外縁へと移動。
グレード４（高度）：以上に加えて、葉全体に影響あり。
局所的（focal）変化又は多巣性（multifocal）変化の場合は、それぞれ０．５又は０．２５を減算した。全グレード数（／群）の総和を動物数（／群）で除算することにより、平均重症度指数を算出した。
【０１０６】
結果
肝臓重量
高カロリー食餌を与えることで、一晩絶食させた雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓重量は僅かに増加した。標準食餌群及び高カロリー食餌群の動物の肝臓は、それぞれ０．９６ｇ及び１．０４ｇであった（ｐ＞０．０５）。肝臓重量の増加幅は、化合物Ａにより用量依存的に減少し、３及び１０ｍｇ／ｋｇではそれぞれ０．９６ｇ及び０．９５ｇと、完全に打ち消される結果となった。
【０１０７】
要すれば、高カロリー食餌を与えることにより、標準的な食餌の場合と比較して、肝臓重量は僅かに８％増加した。３及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによる処置の結果、肝臓重量の増加は完全に消失した。
【０１０８】
【表２】
2019524860.tif 000004
【０１０９】
肝脂肪代謝異常
５６日目に、標準的な食餌を与えた対照動物（ＳＤ）は、軽度の肝脂肪代謝異常（重症度２．２）を示し、高カロリー食餌を与えた対照動物（ＨＤ）は、軽度〜中度の肝脂肪代謝異常（重症度１．５）を示した。化合物Ａによる処置の結果、肝臓の形態は用量依存的に改善し、重症度は１．４、０．６、０．３及び０．２（それぞれ用量０．３、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇの場合）となった。要すれば、用量３及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによる処置の結果、肝脂肪代謝異常は殆ど消失した（図１１）。
【０１１０】
【表３】
2019524860.tif 000005
【０１１１】
７．化合物Ａ  −  ヒト肝星細胞における抗線維化活性
ヒト星細胞（human stellate cells：ＨＳＣ）の活性化に対する作用を、ＴＧＦ−βにより誘発されるα平滑筋アクチン（alfa smooth muscle actin：αＳＭＡ）の遺伝子発現により評価した。
【０１１２】
初代ＨＳＣ（ScienCell）を無血清SteCM培地（ScienCell）に懸濁させ、ポリ−Ｄ−リシン被覆９６ウェルプレートに２．５×１０３細胞／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。播種から６時間後、ＨＳＣを化合物Ａ（０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、及び１μＭ）、ＴＧＦ−β（０．２ｎｇ／ｍＬ）、及びホルスコリン（１μＭ）で２４時間処理した。２４時間のインキュベーション後、RNeasy 96キット（QIAGEN 74182）を用いて細胞溶解物から総ＲＮＡを抽出した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ABI 4368813）を用いてｃＤＮＡを増幅し、Taqman ＰＣＲを用いて標的遺伝子のｍＲＮＡを測定した。標的遺伝子の発現レベルをＧＡＰＤＨにより正規化した。実験は５回繰り返した。
【０１１３】
結果
ＨＳＣにおいてＴＧＦ−βにより誘発されたαＳＭＡの遺伝子発現は、ホルスコリンの存在下では、化合物Ａにより用量依存的に抑制された。結果を図１２に平均±ＳＤとして示す。
【０１１４】
８．化合物Ａ  −  インビトロ及びインビボでの全身性抗炎症作用 
ａ）ＴＨＰ−１細胞における化合物Ａの抗炎症作用（インビトロ）
ヒト単球細胞系列であるＴＨＰ−１細胞において、ＬＰＳにより誘発されるＴＮＦ−αの遺伝子発現に基づき、化合物Ａの抗炎症作用を評価した。
【０１１５】
１０％ ＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡを含むＲＰＭＩ培地にＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ）を懸濁させ（２．５×１０５細胞／ｍＬ）、９６ウェルプレートに播種した。播種から４８時間後、培地を無血清ＲＰＭＩ培地に変更した。培地変更から３時間後、化合物Ａ（０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１及び１μＭ）、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍＬ）、及びホルスコリン（０．１μＭ）をＴＨＰ−１細胞に加えた。５時間のインキュベーション後、RNeasy 96キット（QIAGEN 74182）を用いて細胞溶解物から総ＲＮＡを抽出した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ABI 4368813）を用いてｃＤＮＡを増幅し、Taqman ＰＣＲを用いて標的遺伝子のｍＲＮＡを測定した。標的遺伝子の発現レベルをＧＡＰＤＨにより正規化した。実験は５回繰り返した。
【０１１６】
結果
ＴＨＰ−１細胞においてＬＰＳにより誘導されたＴＮＦ-α遺伝子の発現は、ホルスコリンの存在下では、化合物Ａにより用量依存的に抑制された。結果を図１５に平均±ＳＤとして示す。
【０１１７】
b）化合物Ａの抗炎症作用（インビボ）  −  リポ多糖類（ＬＰＳ）に暴露したSpraque Dawley（ＳＤ）ラットの全身性腫瘍壊死因子α（tumor necrosis factor alpha：ＴＮＦα）放出に対する化合物Ａの作用 
【０１１８】
ＬＰＳ暴露の１時間前に、化合物Ａを０．１、０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した（各用量群ｎ＝８動物）。ＬＰＳ群及びビヒクル処置対照群のそれぞれにｎ＝８の動物を割り当てた。化合物Ａ又はビヒクルを経口で（ｐ．ｏ．）強制投与した（投与体積：１０ｍＬ／ｋｇ ｂ．ｗ．）。化合物又はビヒクルの投与から１時間後に、ＬＰＳを用量２０μg／ｋｇ（投与体積：１ｍＬ／ｋｇ ｂ．ｗ．）で静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。
【０１１９】
ＬＰＳ暴露の１時間後、吸入イソフルラン麻酔（５％；流速２〜３Ｌ／分）及び頸椎脱臼により動物を屠殺した。ヘパリンを加えた血液を心臓穿孔により採取した。血液を遠心分離し（２１,０００×g、４℃、１０分間）、血漿試料をＥＬＩＳＡによるＴＮＦαレベルの測定まで−２０℃で冷凍した。
【０１２０】
結果
化合物Ａ投与群では、ビヒクルで処置した対照群と比較して、血漿中の平均ＴＮＦα量が用量依存的に低減された。試験した何れの用量でも、ＴＮＦα濃度の低減は統計的に有意であった。結果を図１６に平均±ＳＤで示す（統計：一元配置分散分析（One-Way ANOVA）及びダネット事後検定（Dunnett's Post-Test）、ビヒクル対照に対して、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１）。
【０１２１】
８ａ）及び８ｂ）で得られた結果を、１）で得られた肝炎ＴＮＦα遺伝子発現の抑制の結果と考え合わせると、化合物Ａが全身性抗炎症作用及び肝臓の抗炎症作用を有することが明らかに示唆される。
【０１２２】
本発明の更なる側面：
ａ）非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される疾患の治療のための医薬組成物の製造におけるホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の使用であって、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、使用。
ｂ）前記疾患が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、ａ）に記載のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の使用。
ｃ）前記疾患が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、ａ）に記載のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の使用。
ｄ）２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療のための医薬組成物の製造におけるホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の使用であって、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、使用。
ｅ）２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療のための医薬組成物の製造におけるホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の使用であって、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、使用。
ｆ）前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が化合物Ａである、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｇ）化合物Ａが０．１〜６ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で一日１回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｈ）化合物Ａが０．１〜６ｍｇの用量で一日１回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｉ）化合物Ａが０．１〜６ｍｇの用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で一日２回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｊ）化合物Ａが０．１〜６ｍｇの用量で一日２回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｋ）化合物Ａが、０．１〜６ｍｇの用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．１〜６ｍｇの用量に相当する用量で一日３回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｌ）化合物Ａが０．１〜６ｍｇの用量で一日３回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｍ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される化合物Ａの一日１回用量に相当する用量で、一日１回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｎ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される用量で一日１回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｏ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される化合物Ａの一日２回用量に相当する用量で、一日２回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｐ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される用量で一日２回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｑ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される化合物Ａの一日３回用量に相当する用量で、一日３回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｒ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２，７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５及び６ｍｇから選択される用量で一日３回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｓ）化合物Ａが０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｔ）化合物Ａが０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日１回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｕ）化合物Ａが０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日２回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日２回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｖ）化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日２回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｗ）化合物Ａが、０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日３回０．８〜３．２５ｍｇの用量に相当する用量で、一日３回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｘ）化合物Ａが０．８〜３．２５ｍｇの用量で一日３回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｙ）化合物Ａが、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される用量で、一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される化合物Ａの一日１回用量に相当する用量で、一日１回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｚ）化合物Ａが、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される用量で、一日１回投与される、ｆ）に記載の使用。
【０１２３】
ａａ）化合物Ａが、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される用量で、一日２回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される化合物Ａの一日２回用量に相当する用量で、一日２回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｂｂ）化合物Ａが、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される用量で、一日２回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｃｃ）化合物Ａが、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される用量で、一日３回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される化合物Ａの一日３回用量に相当する用量で、一日３回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｄｄ）化合物Ａが、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３及び３．２５ｍｇから選択される用量で、一日３回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｅｅ）化合物Ａが０．１〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１ｍｇ〜２ｍｇの化合物Ａの一日１回用量に相当する用量で、一日１回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｆｆ）化合物Ａが、０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｇｇ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される化合物Ａの一日１回用量に相当する用量で、一日１回投与される、ａ）〜ｅ）に記載の使用。
ｈｈ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される一日用量で、一日１回投与される、ｆ）に記載の使用。
ｉｉ）非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される疾患の治療に使用するための、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群から選択される、医薬組成物。
ｊｊ）前記疾患が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、ｉｉ）に記載の医薬組成物。
ｋｋ）前記疾患が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、ｉｉ）に記載の医薬組成物。
ｌｌ）２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療に用いられる、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、医薬組成物。
ｍｍ）２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療に用いられる、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、医薬組成物。
ｎｎ）前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が化合物Ａである、ｉｉ）〜ｍｍ）の何れかに記載の医薬組成物。
ｏｏ）化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される、ｉｉ）〜ｍｍ）の何れかに記載の医薬組成物。
ｐｐ）化合物Ａが、０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与される、ｎｎ）に記載の医薬組成物。
ｑｑ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される化合物Ａの一日１回用量に相当する用量で、一日１回投与される、ｉｉ）〜ｍｍ）の何れかに記載の医薬組成物。
ｒｒ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される用量で一日１回投与される、ｎｎ）に記載の医薬組成物。
ｓｓ）非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
ｔｔ）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
ｕｕ）２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の同時治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
ｖｖ）２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の同時治療を、それを必要とする哺乳類において行うための方法であって、２型糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患う哺乳類に対して、治療有効量のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を投与することを含み、ここで前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、化合物Ａ及び医薬的に許容可能なその塩からなる群より選択される、方法。
ｗｗ）前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が化合物Ａである、ｓｓ）〜ｖｖ）の何れかに記載の方法。
ｘｘ）化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、化合物Ａの一日１回０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量に相当する用量で、一日１回投与される、ｓｓ）〜ｖｖ）の何れかに記載の方法。
ｙｙ）化合物Ａが０．１ｍｇ〜２ｍｇの用量で一日１回投与される、ｗｗ）に記載の方法。
ｚｚ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される用量で一日１回投与され、或いは、化合物Ａの医薬的に許容可能な塩が、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される化合物Ａの一日１回用量に相当する用量で、一日１回投与される、ｓｓ）〜ｖｖ）の何れかに記載の方法。
【０１２４】
ａａａ）化合物Ａが、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５及び２ｍｇから選択される用量で一日１回投与される、ｗｗ）に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図１】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝線維症の面積に対する化合物Ａの予防作用。
【図２】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝ＴＧ蓄積に対する化合物Ａの予防作用。
【図３】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における血漿ＡＬＴレベルに対する化合物Ａの作用。
【図４】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における身体組成及び食物摂取に対する化合物Ａの作用。
【図５】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝線維症の面積に対する化合物Ａの治療効果。
【図６】ＮＡＳＨのマウスモデル（ホモ接合性ＬＤＬＲ−ＫＯマウス）における肝ＴＧ蓄積に対する化合物Ａの治療効果。
【図７】化合物Ａによる２８日間の処置が雄ＤＩＯマウスの体重及び総食物摂取に与える作用。
【図８】化合物Ａによる２８日間の処置が雄ＤＩＯマウスの体脂肪量及び除脂肪体重に与える作用。
【図９】化合物Ａによる２８日間の経口治療後における雌ｄｂ／ｄｂマウスのＨｂＡ１ｃレベルへの作用。
【図１０】化合物Ａによる２９日間の処置後におけるｏｂ／ｏｂマウスのインシュリン感度への作用。
【図１１】５６日間の化合物Ａの一日１回投与の前後における、高カロリーの食餌又は標準的な食餌に対する雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝脂肪代謝異常。
【図１２】ヒト肝星細胞における化合物Ａの抗線維化活性。
【図１３】肝臓遺伝子発現に対する化合物Ａの予防作用 − ＴＩＭＰ−１。
【図１４】肝臓遺伝子発現に対する化合物Ａの予防作用 − ＴＮＦα。
【図１５】ヒトＴＨＰ−１細胞における化合物Ａの抗炎症活性。
【図１６】ＬＰＳ暴露Sprague Dawleyラットの血漿試料中のＴＮＦα濃度に対する化合物Ａの作用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５】
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【国際調査報告】
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