(57)【要約】本発明は、自動化された化学的移動のためのサンドイッチ注入法に基づくキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）システムを提供する。このシステムは、質量分析計への動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーインターフェースに結合された。ナノエレクトロスプレーエミッタは、酸性シース電解質を使用した。自動化された集束及び移動を実現するために、まず水酸化アンモニウムのプラグがキャピラリ内に注入され、続いて混合試料及び両性電解質のセクションが注入された。集束が進行するにつれて、ＮＨ３Ｈ２Ｏセクションが、酸性シース緩衝液によってより低いｐＨの緩衝液まで滴定された。水酸化アンモニウムが酸性シース流動電解質により消費されると、化学的移動が自動的に開始した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一段階のキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）及び化学的移動のための方法であって、
（ａ）アノード端及びカソード端を有する分離キャピラリで分離を行うステップであって、前記分離キャピラリの前記カソード端は、質量分析計における動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーエミッタに連結されている、ステップと；
（ｂ）前記分離キャピラリの前記アノード端に、まずある長さのカソード電解質溶液を、次に両性電解質及び検体を含む混合物を部分的に充填するステップと；
（ｃ）前記ナノエレクトロスプレーエミッタに、酸性シース電解質溶液及びアノード電解質溶液を供給するステップであって、前記アノード電解質溶液は、前記分離キャピラリの前記カソード端から流出することにより前記ナノエレクトロスプレーエミッタ内に供給される、ステップと；
（ｄ）前記分離キャピラリの前記アノード及びカソード端に電圧を印加するステップと；
（ｅ）前記検体の等電集束、及びそれに付随する前記分離キャピラリの前記カソード端に向けた前記検体の化学的移動を誘発するステップと；
（ｆ）ナノエレクトロスプレーを形成するステップであって、前記酸性シース電解質溶液は、前記分離キャピラリの前記カソード端から流出する前記混合物を包み込む、ステップと
を含み、前記カソード電解質溶液及び前記アノード電解質溶液によりｐＨ勾配が確立されて、前記検体の等電集束を誘発し、前記酸性シース電解質溶液によってより低いｐＨに前記カソード電解質溶液が滴定されるにつれて、前記検体は化学的に移動され、次いで前記酸性シース電解質溶液により前記質量分析計に向けて動電学的にポンピングされ、それによって、電圧が印加された際にナノエレクトロスプレーを形成する、方法。
【請求項２】
前記カソード電解質溶液が、最初の充填後に、少なくとも１ｃｍの前記分離キャピラリ内の長さを有し、前記キャピラリの内径が、３００μｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カソード電解質溶液が、水酸化アンモニウムを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
両性電解質及び検体を含む前記混合物が、最初の充填後に、少なくとも１ｃｍの前記分離キャピラリ内の長さを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アノード電解質溶液が、ギ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記両性電解質が、ｐＨ単位当たりの高い緩衝能力、直線ｐＨ勾配、及び両性電解質にわたる均一な導電性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記両性電解質のｐＨ単位当たりの前記高い緩衝能力が、ｐＨ３〜１０、ｐＨ３〜６、ｐＨ５〜８、又はｐＨ７〜１０の範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酸性シース電解質溶液が、化学的移動剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酸性シース電解質溶液が、ギ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性シース電解質溶液が、アルコール又はアセトニトリルをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
等電集束及び化学的移動のために印加される前記電圧が、約５０Ｖ／ｃｍ〜約５００Ｖ／ｃｍの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
等電集束の後に、前記分離キャピラリの手動による物理的操作なしに化学的移動が自動的に続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離キャピラリが、ポリマーでコーティングされた内側表面を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが、直鎖ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離キャピラリが、少なくとも１０ｃｍの長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離キャピラリの前記カソード端の先端の外径が、前記分離キャピラリの残りの外径に対して低減されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離キャピラリの前記カソード端の先端の外径が、前記分離キャピラリの内径より２０％〜５０％大きい、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検体が、タンパク質、又は薬物−タンパク質複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記質量分析計により検出されたタンパク質、又は薬物−タンパク質複合体の電気泳動図のピークが、実質的に分解される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記電気泳動図が、実質的に再現可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
一段階のキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）及び化学的移動のためのキットであって、（ａ）カソード電解質溶液と、（ｂ）アノード電解質溶液と、（ｃ）酸性シース電解質溶液と、（ｄ）両性電解質と、任意選択で（ｅ）使用説明書とを備えるキット。
【請求項２２】
前記カソード電解質溶液が、水酸化アンモニウムを含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）の下で、２０１６年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３９９，２６７号に対する優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［政府支援］
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｒ０１ＧＭ０９６７６７の下で政府援助によりなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
［発明の背景］
Ｈｊｅｒｔｅｎ及びＺｈｕ（Ｊ．  Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．  １９８５、３４６、２６５）により初めて示されたキャピラリ等電集束法（ｃＩＥＦ）は、タンパク質及びペプチド分析のための強力な方法であることが証明されている。ｃＩＥＦは、典型的には、二段階プロセスとして行われ、集束（分離）段階の後に移動段階が続く。集束中、タンパク質又はペプチドは、その等電点（ｐＩ）に基づいて分離される。分離キャピラリ内で集束されたバンドを画像化するために、光学的検出が使用され得る。
【０００４】
あるいは、集束された試料は、キャピラリの遠位端に配置された検出器まで移動される。２種類の移動手法が典型的に使用される。流体圧式移動は、圧力、真空又はサイフォンを使用して生成される。あるいは、Ｈｊｅｒｔｅｎ（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  １９８７、３８７、１２７〜１３８）により初めて提案されたような化学的移動が、カソード電解質をより低いｐＨの緩衝液に変更することにより行われる。化学的移動は、圧力移動中の層流に起因するＴａｙｌｏｒ分散を回避する。
【０００５】
ｃＩＥＦは、ＵＶ吸光度、レーザ誘起蛍光、及び質量分析を含む一連の検出器に結合されている。質量分析は、正確な分子量及び断片化情報等の情報に富んだ同定を提供する。ｃＩＥＦを質量分析にオンラインで結合するにはいくつかの課題があるが、いくつかの報告では、タンパク質又はペプチドの複雑な混合物が分析されている。
【０００６】
しかしながら、初期のｃＩＥＦ−ＭＳ実験法は、キャピラリの大掛かりな手動操作を必要とする化学的移動を使用していた。集束は、専用貯蔵部内の適切な緩衝液を使用して、オフラインで行われた。集束後、キャピラリは、酸性シース電解質が移動緩衝液として機能し、試料を質量分析計まで付勢するための化学的移動を生成するエミッタ内に、手動で挿入された。この手動操作は、時間を要し、煩雑であり、自動化を妨げ、この技術の実際の適用を制限する。
【０００７】
したがって、オフライン集束及び化学的移動のためのキャピラリの面倒で大掛かりな手動操作を必要としないｃＩＥＦ−ＭＳ実験を行う必要がある。
【０００８】
［概要］
自動化された化学的移動のためのサンドイッチ注入法に基づくキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）システムが、本明細書において説明される。このシステムは、質量分析計（例えばイオントラップ又は飛行時間型質量分析計）への動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーインターフェースに結合された。ナノエレクトロスプレーエミッタは、酸性シース電解質を使用した。自動化された集束及び移動を実現するために、まず水酸化アンモニウムのプラグがキャピラリ内に注入され、続いて混合試料及び両性電解質のセクションが注入された。集束中、ＮＨ３Ｈ２Ｏセクションは、カソード電解質として機能した。集束が進行するにつれて、ＮＨ３Ｈ２Ｏセクションが、酸性シース緩衝液によってより低いｐＨの緩衝液まで滴定された。水酸化アンモニウムが酸性シース流動電解質により消費されると、化学的移動が自動的に開始し、次いで電解質は移動溶液として機能した。本開示において、ＮＨ３Ｈ２Ｏセクション及び試料の長さが最適化された。長さ１メートルのキャピラリにおいて、ＮＨ３Ｈ２Ｏセクションの比較的短いプラグ（３ｃｍ）は、急速な泳動及び妥当な分離分解能の両方をもたらした。自動化ＣＩＥＦ−ＭＳシステムは、ミオグロビン及びシトクロムＣに対して、３回の分離で８．５％のベースピーク強度相対標準偏差、及び０．６％以下の泳動時間相対標準偏差を生じた。
【０００９】
したがって、本開示は、一段階のキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）及び化学的移動のための方法であって、
（ａ）アノード端及びカソード端を有する分離キャピラリで分離を行うステップであって、分離キャピラリのカソード端は、質量分析計における動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーエミッタに連結されている、ステップと；
（ｂ）分離キャピラリのアノード端に、まずある長さのカソード電解質溶液を、次に両性電解質及び検体を含む混合物を部分的に充填するステップと；
（ｃ）ナノエレクトロスプレーエミッタに、酸性シース電解質溶液及びアノード電解質溶液を供給するステップであって、アノード電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出することによりナノエレクトロスプレーエミッタ内に供給される、ステップと；
（ｄ）分離キャピラリのアノード及びカソード端に電圧を印加するステップと；
（ｅ）検体の等電集束、及びそれに付随する分離キャピラリのカソード端に向けた検体の化学的移動を誘発するステップと；
（ｆ）ナノエレクトロスプレーを形成するステップであって、酸性シース電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出する混合物を包み込む、ステップと
を含み、カソード電解質溶液及びアノード電解質溶液によりｐＨ勾配が確立されて、検体の等電集束を誘発し、酸性シース電解質溶液によってより低いｐＨにカソード電解質溶液が滴定されるにつれて、検体は化学的に移動され、次いで酸性シース電解質溶液により質量分析計に向けて動電学的にポンピングされ、それによって、電圧が印加された際にナノエレクトロスプレーを形成する、方法を提供する。
【００１０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の実施形態又は様々な態様をさらに示すために含まれる。いくつかの場合において、本発明の実施形態は、本明細書に示される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することにより、最も良く理解され得る。説明及び添付の図面は、本発明のある特定の具体例、又はある特定の態様を強調し得る。しかしながら、当業者には、例又は態様の一部が、本発明の他の例又は態様と組み合わせて使用されてもよいことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】動電学的にポンピングされたエレクトロスプレーインターフェースに基づく自動化ＣＩＥＦ−ＭＳの図である。
【図２】［図２Ａ〜２Ｄ］６０ｃｍの試料注入、並びに１ｃｍ（Ａ）、３ｃｍ（Ｂ）、５ｃｍ（Ｃ）、及び１０ｃｍ（Ｄ）の０．３％  ＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長さでの自動化ＣＩＥＦ−ＭＳ／ＭＳからの、ミオグロビン及びシトクロムＣの混合物のベースピーク電気泳動図である。
【図３】［図３Ａ〜３Ｃ］長さ３ｃｍの０．３％  ＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長さ、並びに５０ｃｍ（Ａ）、６０ｃｍ（Ｂ）及び８０ｃｍ（Ｃ）の試料プラグ長さで自動化ｃＩＥＦ−ＭＳ／ＭＳシステムを使用した、シトクロムＣ（１）、ミオグロビン（２）、ベータ−ラクトグルブリン（ｌａｃｔｏｇｌｕｂｌｉｎ）（３）、及び炭酸脱水酵素（４）の混合物のベースピーク電気泳動図である。
【図４】５０ｃｍの試料プラグ長さ及び３ｃｍの０．３％  ＮＨ３Ｈ２Ｏ注入での、ミオグロビン及びシトクロムＣの３回のｃＩＥＦ−ＭＳ／ＭＳ分離のベースピーク電気泳動図である。
【００１２】
［詳細な説明］
キャピラリ等電集束法において、検体は、集束段階中に分離される。検出及び単離されるには、検体は、検出点を通過して移動しなければならない。この分離プロセスは、集束段階に従う。キャピラリ電気泳動機器における検出点は、分離キャピラリの出口端部に向けて配置される。タンパク質又はペプチド混合物が、ｃＩＥＦプロセスにおいてそのｐＩに従って分類されたら、個々の検体ゾーンは、検出点の前にキャピラリに沿って最低ｐＩから最高ｐＩまで分布する。したがって、検体ゾーンは、キャピラリ出口に向かって移動し、検出点を通過しなければならない（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｐｒｉｍｅｒ、５９９１−１６６０ＥＮ、Ｔ．  Ｋｒｉｓｔｌらによる、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ２０１４を参照されたい）。この目的のために確立された手法が、化学的移動である。実際には、これは面倒な手動の二段階プロセスであった。
【００１３】
化学的移動において、アノード電解質（ａｎｏｌｙｔｅ）又はカソード電解質（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）は、高いイオン強度又は異なるｐＨを有する別の電解質溶液で置き換えられる。試料検体及び担体両性電解質は、正味電荷を獲得し、出口に向けて移動し始め、それにより検出点を通過する。例えば、弱酸の溶液が、カソード電解質を置き換えるために使用され得る。化学的移動剤（弱酸）からの陰イオンは、カソード側からキャピラリに進入し、一方アノード電解質からのヒドロニウムイオンは、アノード側からキャピラリに進入する。ｐＨ勾配は、弱酸及び担体両性電解質により乱され、検体には、正味正電荷が付与され、これがカソードに、すなわち検出点が位置するキャピラリ側に向かうその移動をもたらす。したがって、上述の手動の二段階プロセスは、開示されるサンドウィッチ注入法によって一段階に低減されている。
【００１４】
さらに、我々のグループは、以前に、極めて安定で低いシース流速を提供するキャピラリ電気泳動ＭＳのための動電学的に付勢されるシース流動ナノスプレーインターフェースを開発した。我々は、生成物枯渇組み換え治療試料の分析のためにｃＩＥＦをＥＳＩ−ＭＳに結合し、迅速分析において、３７の宿主細胞タンパク質に対応する５３のペプチドを同定した。我々はまた、等電集束においてｐＨ勾配を生成するためのアミノ酸の使用を開発し、ＲＡＷ２６４．７トリプシン消化物から１００を超えるタンパク質及び３００を超えるペプチドを同定した。我々はまた、神経成長因子による処置後のｉＴＲＡＱ標識化ＰＣ１２細胞分化の定量的プロテオーム解析に、アミノ酸両性電解質によるｃＩＥＦを使用した。そして、合計で２，３２９のペプチド及び８３５のタンパク質群が定量された。９６の差次的発現タンパク質が同定された。
【００１５】
本開示では、動電学的に付勢されるシース流動ＣＥ−ＭＳナノスプレーインターフェースに基づくｃＩＥＦ−ＭＳを自動化するためのサンドイッチ注入法が説明される。
【００１６】
［定義］
以下の定義は、本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために含まれる。本明細書において使用される場合、列挙された用語は、以下の意味を有する。本明細書において使用される全ての他の用語及び語句は、当業者により理解されているようなその通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  第１４版、Ｒ．Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１等の専門用語辞典を参照することにより得ることができる。
【００１７】
本明細書における「一実施形態」、「実施形態」等への言及は、説明される実施形態が、特定の態様、特徴、構造、部分、又は特性を含み得るが、全ての実施形態がその態様、特徴、構造、部分、又は特性を含むとは限らないことを示す。さらに、そのような語句は、必ずではないが、本明細書の他の部分において参照された同じ実施形態を示し得る。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分、又は特性がある実施形態と関連して説明されている場合、明示的に説明されているか否かを問わず、そのような態様、特徴、構造、部分、又は特性を、他の実施形態と関連させる、又は結び付けることは、当業者の知識の範囲内である。
【００１８】
文脈上異なる定義が明示されていない限り、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形の言及も含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、複数のそのような化合物を含み、したがって、化合物Ｘは、複数の化合物Ｘを含む。さらに、請求項は、いかなる任意選択の要素も除外するように作成され得ることが留意される。したがって、この陳述は、本明細書に記載の任意の要素、及び／若しくは請求要素の列挙に関連する排他的用語、例えば「唯一」、「〜のみ」等の使用、又は「否定的」限定の使用の先行記述としての役割を果たすことを意図する。
【００１９】
「及び／又は」という用語は、この用語が関連する項目の任意の１つ、項目の任意の組合せ、又は項目の全てを意味する。「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」という語句は、特にその使用の文脈に照らして読めば、当業者に容易に理解される。例えば、この語句は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、１０個、１００個、又は列挙された下限値よりおよそ１０倍、１００倍若しくは１０００倍高い任意の上限値を意味し得る。
【００２０】
当業者に理解されるように、成分の量、分子量等の特性、反応条件等を表すものを含む全ての数字は、近似値であり、全ての場合において「約」という用語により任意選択で修飾されるものとして理解される。これらの値は、本明細書における説明の教示を利用して当業者が得ようとしている所望の特性に依存して変動し得る。また、そのような値は、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差から必然的に生じる変動性を本来含有することが理解される。先行詞「約」の使用により値が近似値として表される場合、修飾語「約」のない特定の値もまた、さらなる態様を形成することが理解される。
【００２１】
「約」及び「およそ」という用語は、同義的に使用される。これらの用語は共に、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％の変動を示し得る。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５〜５５パーセントの、又は特定の請求項により別様に定義されるような変動を有し得る。整数範囲の場合、「約」という用語は、範囲の各端で列挙された整数より大きい、及び／又は小さい１つ又は２つの整数を含み得る。本明細書において別様に示されない限り、「約」及び「およそ」という用語は、個々の成分、組成物、又は実施形態の機能性の点で等価である、列挙された範囲に近い値、例えば重量パーセンテージを含むことを意図する。「約」及び「およそ」という用語はまた、本段落において上述されたように、列挙された範囲の端点を修飾し得る。
【００２２】
当業者に理解されるように、ありとあらゆる目的において、特に文章による説明の提供に関して、本明細書において列挙された全ての範囲は、そのありとあらゆる可能な部分範囲及び部分範囲の組合せ、並びにその範囲を構成する個々の値、特に整数値もまた包含する。したがって、２つの特定の単位の間の各単位もまた開示されることが理解される。例えば、１０〜１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４もまた、個々に、及び範囲の一部として開示される。列挙された範囲（例えば重量パーセンテージ又は炭素群）は、範囲内のそれぞれの特定の値、整数、小数、又は同一性を含む。任意の列挙された範囲は、少なくとも等価な２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、又は１０分の１に分割された同じ範囲についても十分に説明するものであり有効であることが、容易に理解され得る。非限定的な例として、本明細書において議論される各範囲は、下限側の３分の１、中間の３分の１、及び上限側の３分の１等に容易に分割され得る。同じく当業者に理解されるように、「〜まで」、「少なくとも」、「〜を超える」、「未満」、「超」、「以上」等の用語は全て、列挙された数を含み、そのような用語は、その後上述のような部分範囲に分割され得る範囲を示す。同様にして、本明細書において列挙された全ての比率もまた、より広い比率に含まれる全ての部分比率を含む。したがって、基、置換基、及び範囲に対して列挙された特定の値は、例示のみを目的とし、それらは、基及び置換基に対する他の定義された値、又は定義された範囲内の他の値を除外しない。さらに、範囲のそれぞれの端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立して共に有意であることが理解される。
【００２３】
また、メンバーが一般的な様式で、例えばマーカッシュ群内に一緒にグループ化されている場合、本発明は、列挙された群全体をまとめて包含するだけでなく、群の各メンバーを個々に、及び主要群の全ての可能な部分群を包含することが、当業者に容易に理解される。さらに、全ての目的において、本発明は、主要群だけでなく、群のメンバーの１つ又は複数を含まない主要群もまた包含する。したがって、本発明は、列挙された群のメンバーの任意の１つ又は複数の明示的な除外を想定している。したがって、開示されたカテゴリー又は実施形態のいずれにも、例えば明示的な否定的限定における使用のために、列挙された要素、種、又は実施形態の任意の１つ又は複数がそのようなカテゴリー又は実施形態から除外され得る条件が適用され得る。
【００２４】
「接触させる」という用語は、細胞又は分子レベルを含め、触れさせる、接触を生じさせる、又は密接若しくは近接させる行為、例えば、溶液中、反応混合物中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏ等で、生理的反応、化学反応、又は物理的変化をもたらすことを指す。
【００２５】
「実質的に」という用語は、本明細書において使用される場合、広義の用語であり、ほぼ指定されたものであるが必ずしも完全ではないことを含む（但しそれに限定されない）、その通常の意味で使用される。例えば、この用語は、完全な数値の１００％ではない可能性がある数値を示し得る。完全な数値は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、又は約２０％少なくてもよい。
【００２６】
「分離キャピラリ」という用語は、一般に、その内側表面内及びその長さにわたって検体を精製された物質に分離することができる、狭い口径を有する管状デバイスを示す。分離キャピラリは、作製されてもよい、又は様々な物質であってもよい。分離キャピラリは、コーティング、固定相、移動相、又はそれらの組合せを備えてもよい。
【００２７】
「電気泳動」という用語は、電場内の荷電種の示差的移動速度に基づく検体の分離を示す。
【００２８】
「電気浸透流」という用語は、電気泳動の特性を示す。例えば分離キャピラリの軸に沿って電解質溶液に電場が印加された場合、キャピラリの壁に近い移動性の過剰のカチオンは、その溶媒和殻を引きずりながら反対電荷の電極に引かれる。電気浸透流現象はまた、シース電解質の貯蔵部に印加された電位がインターフェースを通してシース流体を動電学的に付勢（又はポンピング）し、エレクトロスプレーを生成する際に、エレクトロスプレーインターフェースのガラスエミッタ内で生じる。
【００２９】
「両性電解質」という用語は、酸性及び塩基性基の両方を含有し、ある特定のｐＨ範囲においてほとんどの場合両性イオンとして存在する両性分子を示す（例えばタンパク質及びポリペプチド）。平均電荷がゼロであるｐＨは、分子の等電点（ｐＩ）として知られている。両性電解質は、等電集束における使用のための安定なｐＨ勾配を確立するために使用される。
【００３０】
「アノード電解質」及び「カソード電解質」という用語は、溶液中の異なる電解質種を示し、アノード電解質はアノードの近くに位置し、カソード電解質はカソードの近くに位置する。
【００３１】
「長さ」という用語は、本明細書において使用される場合、ある特定の内径を有する分離キャピラリ内の長さを有する溶液、例えば両性電解質及び検体の混合物を含む試料の量を示す。「長さ」という用語はまた、本明細書において使用される場合、「プラグ」という用語と同義である。例えば、試料のプラグ、又はカソード電解質のプラグは、例えば、キャピラリ内に注入又は何らかの形で導入された試料の溶液、又はカソード電解質の溶液を示し、導入された試料又はカソード電解質の溶液の量は、キャピラリの全長の割合（又はパーセンテージ）であるキャピラリ内の長さを有する。
【００３２】
［発明の実施形態］
様々な実施形態において、一段階のキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）及び化学的移動のための方法が開示され、方法は、
（ａ）アノード端及びカソード端を有する分離キャピラリで分離を行うステップであって、分離キャピラリのカソード端は、質量分析計における動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーエミッタに連結されている、ステップと；
（ｂ）分離キャピラリのアノード端に、まずある長さのカソード電解質溶液を、次に両性電解質及び検体を含む混合物を部分的に充填するステップと；
（ｃ）ナノエレクトロスプレーエミッタに、酸性シース電解質溶液及びアノード電解質溶液を供給するステップであって、アノード電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出することによりナノエレクトロスプレーエミッタ内に供給される、ステップと；
（ｄ）分離キャピラリのアノード及びカソード端に電圧を印加するステップと；
（ｅ）検体の等電集束、及びそれに付随する分離キャピラリのカソード端に向けた検体の化学的移動を誘発するステップと；
（ｆ）ナノエレクトロスプレーを形成するステップであって、酸性シース電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出する混合物を包み込む、ステップと
を含み、カソード電解質溶液及びアノード電解質溶液によりｐＨ勾配が確立されて、検体の等電集束を誘発し、酸性シース電解質溶液によってより低いｐＨにカソード電解質溶液が滴定されるにつれて、検体は化学的に移動され、次いで酸性シース電解質溶液により質量分析計に向けて動電学的にポンピングされ、それによって、電圧が印加された際にナノエレクトロスプレーを形成する。上記要素（ａ）〜（ｆ）の１つ又は複数は、様々な実施形態において、任意選択で方法から省略されてもよい。
【００３３】
追加的実施形態において、分離キャピラリは、シリカキャピラリ、溶融シリカキャピラリ、又は検体を分離するために使用されるキャピラリである。他の実施形態において、分離キャピラリは、ガラス又はポリマーである。さらに他の実施形態において、分離キャピラリは、コーティングされている、又はコーティングされていない。
【００３４】
追加的実施形態において、カソード電解質溶液は、最初の充填後に、約又は少なくとも１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、４０ｃｍ、５０ｃｍ、７５ｃｍ、又は１００ｃｍの分離キャピラリ内の長さを有する。さらに他の実施形態において、カソード電解質溶液は、分離キャピラリ内のある長さを有し、キャピラリの長さは、分離キャピラリの長さの割合又はパーセンテージ（％）として表される。例えば、様々な実施形態において、シリカキャピラリの長さのパーセントとしてのキャピラリ溶液の長さは、約１％〜約９９％、約２％〜約８０％、約４％〜約６０％、約５％〜約５０％、約５％〜約４０％、約５％〜約３０％、約５％〜約２０％、約５％〜約１０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、又は２５％である。
【００３５】
様々な実施形態において、分離キャピラリの内径は、約１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０１ｍｍ若しくは０．００５ｍｍ、又はそれら未満である。
【００３６】
本開示は、本明細書に記載の方法に適合され得る質量分析計（ＭＳ）の様々な実施形態を含む。例えば、質量分析計の種類は、これらに限定されないが、イオントラップ質量分析計、飛行時間型質量分析計、誘導結合プラズマＭＳ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化ＭＳ、表面増強レーザ脱離イオン化ＭＳ、タンデムＭＳ、又はそれらの上述の質量分析計の種類の組合せであってもよい。
【００３７】
他の実施形態において、カソード電解質溶液は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、又は任意のアルカリ溶液を含む。アルカリカソード電解質溶液は、０．０１Ｍ〜１５Ｍ、又は０．１％ｖ／ｖ〜９９％ｖ／ｖの塩基であってもよい。様々な他の実施形態において、両性電解質及び検体を含む混合物は、最初の充填後に、少なくとも１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、４０ｃｍ、５０ｃｍ、７５ｃｍ、又は１００ｃｍの分離キャピラリ内の長さを有する。様々な追加的実施形態において、シリカキャピラリの長さのパーセントとしての混合物の長さは、約１％〜約９９％、約２％〜約８０％、約４％〜約６０％、約５％〜約５０％、約５％〜約４０％、約５％〜約３０％、約５％〜約２０％、約５％〜約１０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、又は２５％である。
【００３８】
追加的実施形態において、混合物は、１種又は複数種の両性電解質及び１種又は複数種の検体を含む。
【００３９】
さらに他の実施形態において、アノード電解質溶液は、（Ｃ１〜Ｃ８）カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、若しくは酪酸、及び／又は鉱酸、例えば硫酸、リン酸、若しくは塩酸を含む。アノード電解質溶液は、０．０１Ｍ〜１５Ｍ、又は０．１％ｖ／ｖ〜９９％ｖ／ｖの酸であってもよい。
【００４０】
様々な他の実施形態において、両性電解質は、ｐＨ単位当たりの高い緩衝能力、直線ｐＨ勾配、及び両性電解質にわたる均一な導電性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、両性電解質は、ファーマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）（登録商標）３−１０を含む。他の実施形態において、両性電解質のｐＨ単位当たりの高い緩衝能力は、ｐＨ３〜１０、ｐＨ３〜４、ｐＨ３〜５、ｐＨ３〜６、ｐＨ３〜７、ｐＨ３〜８、ｐＨ４〜７、ｐＨ４〜８、ｐＨ５〜８、ｐＨ５〜９、ｐＨ５〜１０、ｐＨ６〜８、ｐＨ６〜９、ｐＨ６〜１０、ｐＨ７〜９、ｐＨ７〜１０、又はｐＨ８〜１０の範囲である。
【００４１】
追加的実施形態において、酸性シース電解質溶液は、化学的移動剤である。他の実施形態において、酸性シース電解質溶液は、ギ酸、酢酸、（Ｃ３〜Ｃ８）カルボン酸、硫酸、リン酸、塩酸、又は別の鉱酸を含む。いくつかの実施形態において、酸性シース電解質溶液は、０．０１Ｍ〜１５Ｍ、又は０．１％ｖ／ｖ〜９９％ｖ／ｖの酸であってもよい。
【００４２】
様々な実施形態において、酸性シース電解質溶液は、有機溶媒、アルコール、又はアセトニトリルをさらに含む。いくつかの実施形態において、アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又は任意の（Ｃ１〜Ｃ８）アルコールであってもよい。さらに他の様々な実施形態において、酸性シース電解質溶液は、約０．１％〜約５０％のアルコール、又は約１％〜約２０％のアルコールを含んでもよい。いくつかの追加的実施形態において、酸性シース電解質溶液は、約０．１％〜約５０％のアセトニトリル、又は約１％〜約２０％のアセトニトリルを含んでもよい。
【００４３】
追加的実施形態において、等電集束及び化学的移動のために印加される電圧は、約５０Ｖ／ｃｍ〜約５００Ｖ／ｃｍ、約１００Ｖ／ｃｍ〜約４００Ｖ／ｃｍ、又は約１５０Ｖ／ｃｍ〜約３５０Ｖ／ｃｍの範囲である。他の実施形態において、化学的移動は、分離キャピラリの手動の物理的操作なしに、等電集束に続いて自動的に行われる。
【００４４】
さらに他の実施形態において、分離キャピラリは、ポリマーでコーティングされた内側表面を有する。様々な他の実施形態において、ポリマーは、直鎖ポリアクリルアミド、直鎖ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）、又はｃＩＥＦに好適な任意のポリマーを含む。追加的実施形態において、分離キャピラリは、少なくとも１０ｃｍ、２０ｃｍ、５０ｃｍ、１００ｃｍ、５００ｃｍ、１ｍ、２ｍ、５ｍ、１０ｍ、又は１００ｍの長さを有する。
【００４５】
他の実施形態において、分離キャピラリのカソード端の先端の外径は、分離キャピラリの残りの外径に対して低減されている。追加的実施形態において、キャピラリの遠位端の低減された外径を有する先端は、５ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０５ｍｍ、又は０．０２ｍｍ未満の長さを有する。様々な実施形態において、先端の外径は、約１％〜約８０％、約５％〜約５０％、又は約１０％〜約３０％だけ低減され得る。
【００４６】
様々な他の実施形態において、分離キャピラリのカソード端の先端の外径は、分離キャピラリの内径より２０％〜５０％大きい。他の実施形態において、分離キャピラリのカソード端の先端の外径は、分離キャピラリの内径より約１０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、又は８０％大きい。
【００４７】
さらなる追加的実施形態において、両性電解質及び検体を含む混合物は、２つ以上の異なる検体を含む。他の実施形態において、検体は、ペプチド、タンパク質、又は薬物−タンパク質複合体を含む。様々な実施形態において、質量分析計により検出されたタンパク質又は薬物−タンパク質複合体の電気泳動図のピークは、実質的に分解、部分的に分解、又は完全に分解される。他の実施形態において、電気泳動図は、実質的に再現性がある、又は完全に再現性がある。
【００４８】
上記開示の様々な実施形態は、一段階のキャピラリ等電集束（ｃＩＥＦ）及び化学的移動のためのキットであって、（ａ）カソード電解質溶液と、（ｂ）アノード電解質溶液と、（ｃ）酸性シース電解質溶液と、（ｄ）両性電解質と、任意選択で（ｅ）使用説明書とを備えるキットを含む。キットの他の実施形態において、カソード電解質溶液は、水酸化アンモニウムを含み、アノード電解質溶液は、ギ酸を含み、酸性シース電解質溶液は、ギ酸及び有機溶媒、例えばメタノール又はアセトニトリル、及び両性電解質、例えばファーマライト（登録商標）３−１０を含む。いくつかの実施形態において、説明書が含まれ、説明書は、本明細書に開示される意図される使用方法を説明している。
【００４９】
［結果及び考察］
（実験計画）
動電学的に付勢されるシース流動ナノスプレーに基づく自動化ｃＩＥＦ−ＭＳは、集束及び移動を自動化するためにサンドイッチ注入法を使用した。図１に示されるように、キャピラリのカソード端は、ｃＩＥＦ−ＭＳプロセス全体にわたりエレクトロスプレーエミッタに保持され、アノード端キャピラリは、ＰｒｉｎＣＥオートサンプラに固定された。手順の第１段階において、ＮＨ３Ｈ２Ｏのプラグをキャピラリ内に注入し、続いて試料及び両性電解質の混合物のプラグを注入した。次いで、キャピラリのアノード端を、ｃＩＥＦのアノード電解質（０．１％ギ酸）のバイアル内に配置した。高電圧の印加により集束が開始され、ＮＨ３Ｈ２ＯプラグはｃＩＥＦのカソード電解質として機能した。集束後、アノード電解質とＮＨ３Ｈ２Ｏセクションとの間でｐＨ勾配が確立された。ＮＨ３Ｈ２Ｏの量は制限されているため、このセクションは、酸性シース電解質によって、より低いｐＨ値に滴定される。ＮＨ３Ｈ２Ｏプラグの消費後に、化学的移動が自動的に開始した。
【００５０】
（ＮＨ３Ｈ２Ｏプラグの長さ）
シトクロムＣ及びミオグロビンの混合物を使用して、タンパク質分離に対する異なる長さのＮＨ３Ｈ２Ｏプラグの効果を調査した。図２は、同じ試料プラグ長さ（６０ｃｍ）及び異なるＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長さ（１ｃｍ、３ｃｍ、５ｃｍ、及び１０ｃｍ）でのｃＩＥＦ−ＭＳにより生成された、シトクロムＣ及びミオグロビンのベースピーク電気泳動図を示す。長さ１０ｃｍのＮＨ３Ｈ２Ｏプラグでは、構成成分は８０分後に泳動し、分離は低い分解能を有し、信号強度は低かった。一方、長さ５ｃｍ、３ｃｍ、及び１ｃｍのＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長さで生成された電気泳動図は、同様の分離分解能をもたらし、泳動時間は、ＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長さに比例して減少した。長さ３ｃｍのＮＨ３Ｈ２Ｏプラグは、最高の信号強度を生成した。許容される泳動時間、良好な分離分解能、及び高い信号強度に起因して、長さ３ｃｍのＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長がその後の実験に選択された。
【００５１】
（試料プラグの長さ）
シトクロムＣ（ｐＩ１０）、ミオグロビン（ｐＩ７）、ベータ−ラクトグロブリン（ｐＩ５．１）、及び炭酸脱水酵素（ｐＩ５．４）の混合物を使用して、タンパク質分離に対する試料プラグ長さの効果を調査した。図３は、３ｃｍのＮＨ３Ｈ２Ｏプラグ長さ並びに異なる試料プラグ長さ（５０ｃｍ、６０ｃｍ、及び８０ｃｍ）でのｃＩＥＦ−ＭＳによる、４つのタンパク質のベースピーク電気泳動図を示す。より長い試料プラグは、より長い泳動時間及びより良好な分離分解能をもたらす傾向がある。我々はまた、より低いｐＩ（５．１）値を有するベータ−ラクトグロブリンが、若干より高いｐＩ値（５．４）を有する炭酸脱水酵素より速く泳動することに気付いた。このシフトは、ゾーン電気泳動の構成成分の分離を増大させる比較的長い化学的移動によりもたらされ得る。ベータ−ラクトグロブリンの分子量は１８ｋＤａであり、これは、炭酸脱水酵素の分子量（２９ｋＤａ）よりはるかに小さい。より小さい分子量及び同様のｐＩ値に起因して、ベータ−ラクトグロブリンは、おそらくはより小さいサイズ対電荷比を有し、炭酸脱水酵素より速く移動し、これによってこれらの２つのタンパク質の泳動順序が切り替わり得る。この混合モード分離は、ｃＩＥＦにおけるこの形態の化学的移動の限界である。
【００５２】
（自動化ＣＩＥＦ−ＭＳの再現性）
シトクロムＣ及びミオグロビンの分離により、自動化ｃＩＥＦ−ＭＳの再現性を調査した。図４は、自動化ＣＩＥＦ−ＭＳによるシトクロムＣ及びミオグロビンの３回の分離のベースピーク電気泳動図を示す。ベースピーク強度のＲＳＤは、８．５％である。泳動時間のＲＳＤは、シトクロムＣに対して０．３％、及びミオグロビンに対して０．６％である。これらの結果は、この自動化されたｃＩＥＦ−ＭＳの優れた再現性を十分に示している。
【００５３】
以下の実施例は、上記の発明を例示することを意図し、その範囲を狭めるように解釈されるべきではない。実施例は本発明が実践され得る多くの他の様式を示唆するものであることが、当業者には容易に認識される。本発明の範囲内であることを維持しながら、数々の変形及び修正を行うことができることが理解されるべきである。
【実施例】
【００５４】
［実施例１］
実験の項
（略語）
ＡＰＳ、過硫酸アンモニウム；ｃＩＥＦ、キャピラリ等電集束；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＦＡ、ギ酸；ＩＡＡ、ヨードアセトアミド；ＬＰＡ、直鎖ポリアクリルアミド；ＭＳ、質量分析。
【００５５】
（試薬）
アクリルアミド、過硫酸アンモニウム、ウシ心臓由来シトクロムｃ、ウマ骨格筋由来ミオグロビン、牛乳由来ベータ−ラクトグロブリン、ウシ赤血球由来炭酸脱水酵素、尿素、重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、及び３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ギ酸（ＦＡ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。メタノール及び水は、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド）から購入した。両性電解質（ファーマライト３−１０）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）から購入した。コーティングされていない溶融シリカキャピラリ（内径５０μｍ／外径３６５μｍ）は、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）から購入した。
【００５６】
（直鎖ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）コーティングキャピラリの調製）
我々は、ＬＰＡコーティングキャピラリの調製のための単純で再現性のある方法を報告した（Ｚｈｕら、Ｔａｌａｎｔａ  ２０１６、１４６、８３９）。２μＬ／分の流速でシリンジポンプを使用することにより、キャピラリを１Ｍ塩酸で３０分間、水で１０分間、１Ｍ水酸化ナトリウムで３０分間、水で１０分間洗浄し、最後にメタノールで３０分間洗い流した。次いで、キャピラリを、窒素流下で、室温で４時間乾燥させた。次に、メタノール中５０％（ｖ／ｖ）の３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートをキャピラリに１０分間流して洗浄した。キャピラリの両端を封止し、充填されたキャピラリを室温で２４時間インキュベートした。次いで、キャピラリをメタノールで２０分間濯ぎ、窒素下で乾燥させた。４０ｍｇのアクリルアミドを１ｍＬの水に溶解し、２μＬの５％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を５００μＬのアクリルアミド溶液に添加した。混合物を３０秒間ボルテックスし、窒素を使用して５分間脱気した。次いで、混合物を長さ１００ｃｍの前処理されたキャピラリ内に真空により導入した。両端を封止し、キャピラリを５０℃の水浴中で３０分間インキュベートした。次いで、キャピラリを水で洗浄して過剰な試薬を除去し、使用まで室温で保存した。長さ約１ｍｍのキャピラリの遠位端の外側を、ＨＦで９０分間エッチングし、エッチングされた部分の外径を約７０μｍまで低減したが、ＨＦエッチングの詳細なプロトコルは、Ｓｕｎら（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ２０１３、５２、１３６６１）により説明されている。
【００５７】
（試料の調製）
２ｍＭ酢酸アンモニウム（約ｐＨ６）緩衝液中に溶解したシトクロムｃ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、ｐＩ１０）、ミオグロビン（０．１５ｍｇ／ｍＬ、ｐＩ７）、ベータ−ラクトグロブリン（０．４ｍｇ／ｍＬ、ｐＩ５．１）及び炭酸脱水酵素（０．１５ｍｇ／ｍＬ、ｐＩ５．４）を含有する標準タンパク質の混合物を、ダイナミックｐＨジャンクションに基づくＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳ分析のために調製した。タンパク質の同じ混合物を、ｃＩＥＦ分析のためにｘｘ  ｇ／ｍＬの両性電解質と混合した。
【００５８】
（ｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）
上述のように調製されたポリアクリルアミドコーティングキャピラリ（内径５０μｍ、長さ５０ｃｍ）を、ｃＩＥＦ分離に使用した。ＰｒｉｎＣＥオートサンプラ（Ｐｒｉｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂ．Ｖ．、オランダ）を自動注入及び分離電圧制御に使用した。第三世代の動電学的に付勢されるシース流動ＣＥ−ＭＳナノスプレーインターフェースを使用して、分離をＬＴＱ−ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計に結合した。６００〜２０００ｍ／ｚにわたり完全ＭＳ走査が取得された。
【００５９】
ｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの前に、キャピラリを、１，５００ｍｂａｒの圧力で１０分間、水で洗浄した。ｃＩＥＦ−ＭＳ／ＭＳの間、キャピラリのアノード端をギ酸（０．１％、ｐＨ２．５）中に配置し、カソード端をシース電解質（１０％メタノールを含む０．１％ギ酸）で充填されたエレクトロスプレーエミッタ（２０μｍ）内に挿入した。２００ｍｂａｒで０．１分、０．３分、０．５分、又は１分での加圧注入を使用して、０．３％ＮＨ３Ｈ２Ｏのプラグをキャピラリ内に注入し、続いて、２００ｍｂａｒで５分、６分、又は８分での加圧注入を使用することにより、試料／両性電解質のプラグを注入した。集束／移動電圧は、２５０Ｖ／ｃｍであった。
【００６０】
開示された実施形態及び例を参照しながら特定の実施形態を上で説明したが、そのような実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。以下の特許請求の範囲において定義されるようなより広い態様において、本発明から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術に従って変更及び修正を行うことができる。
【００６１】
全ての出版物、特許、及び特許文献は、参照することにより個々に組み込まれるのと同等に、参照することにより本明細書に組み込まれる。本開示からは、本開示に矛盾する限定は理解されない。本発明は、様々な特定及び好ましい実施形態及び技術を参照して説明されている。しかしながら、本発明の精神及び範囲内であることを維持しながら、多くの変形及び修正を行うことができることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
2019531459.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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