(57)【要約】  対象における、肝線維症を検出するための、または非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の鑑別診断のための方法が提供される。方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在または非存在を検出する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、肝線維症を検出するための、または非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法であって、
対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャー（microbiome signature）を決定する工程、および
腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在もしくは非存在を検出する工程、または
腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するか、存在しないかを決定する工程であって、ｎが少なくとも２であり、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在もしくは非存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む、方法。
【請求項２】
分析する工程が、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種を検出する試験パネルに生物学的試料を適用することを含み、ｎが少なくとも２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析する工程が、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在または非存在により腸管マイクロバイオームシグネチャーを定義することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
参照腸管マイクロバイオームシグネチャーが、肝線維症を有さない対象の集団から得られる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
参照腸管マイクロバイオームシグネチャーが、肝線維症を有する対象の集団から得られる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対象の集団が進行性肝線維症を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に対する腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に基づいて決定される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生物学的試料を分析する工程が、糞便試料、腸管粘膜試料、および腸管内容物の試料からなる群から選択される試料を分析することを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
精査する工程に基づいて、肝線維症の病期が決定される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
精査する工程に基づいて、進行性線維症の病期が決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｎが、約１〜３０、約１〜２５、約５〜３０、約５〜２５、約１０〜３０、および約１０〜２５からなる群から選択される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｎが、二（２）より大きい、三（３）より大きい、四（４）より大きい、五（５）より大きい、六（６）より大きい、七（７）より大きい、八（８）より大きい、九（９）より大きい、十（１０）より大きい、十一（１１）より大きい、十二（１２）より大きい、十三（１３）より大きい、十四（１４）より大きい、十五（１５）より大きい、十六（１６）より大きい、十七（１７）より大きい、十八（１８）より大きい、十九（１９）より大きい、および二十（２０）より大きい数からなる群から選択される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｎが、少なくとも８であり、かつＡ群における細菌種（Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteae）で構成される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ａ群細菌種で構成された腸管マイクロバイオームシグネチャーが、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＡ群細菌種の相対存在量の少なくとも２倍のシグネチャーにおける各細菌種の相対存在量を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｎが、少なくとも９であり、追加として、Ｂ群における細菌種（Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2-50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformis）の１個または複数を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＢ群細菌種が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＢ群細菌種の相対存在量の多くとも２分の１の相対存在量を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｎが、Ｃ群における細菌種（gathobacter rectalis (Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter（属）、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8）で構成される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＣ群細菌種が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＣ群細菌種の相対存在量の多くとも２分の１の相対存在量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分析する工程が、表２に示された１個または複数の細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイを用いて、生物学的試料を分析すること含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｒＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
分析する工程が、核酸増幅技術を用いて生物学的試料を分析することを含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸増幅技術が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸増幅技術が等温核酸増幅技術である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
分析する工程が、核酸シーケンシングを用いて生物学的試料を分析することを含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
核酸シーケンシングが、メタゲノムＤＮＡシーケンシング、または１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸シーケンシングが、次世代シーケンシングまたはサンガーシーケンシングによるＤＮＡシーケンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
次世代シーケンシングが、ピロシーケンシング、合成によるシーケンシング、イオン半導体によるシーケンシング、またはライゲーションによるシーケンシングを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
分析する工程が、顕微鏡法、代謝物同定、グラム染色、フローサイトメトリー、免疫学的アッセイ、および培養に基づいたアッセイから選択される方法を用いて分析することを含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法であって、
対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期３〜４期線維症の診断が、以下の基準：
（ａ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｄｏｒｅａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３１７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ７＿３＿５４ＦＡＡ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅからなる群（A群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；
（ｂ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．  ４＿３＿５４Ａ２ＦＡＡ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  １＿１＿３０、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：８２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−５０、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：４３、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：５６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：１７、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：９０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＣＡＧ：２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：８３、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１２９、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＣＡＧ：３９、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３７、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１７６、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１１０、およびＨｏｌｄｅｍａｎｉａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓからなる群（B群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー； 
（ｃ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔａｌｉｓ（Eubacterium rectale）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ（属）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、およびＢｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＧＤ８からなる群（C群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；ならびに
（ｄ）（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、および（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、かつ（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量と（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きい、腸管マイクロバイオームシグネチャー
の１つまたは複数により示される、工程を含む、方法。
【請求項３０】
病期３〜４期線維症の診断が、（ａ）と（ｂ）の両方、（ａ）と（ｃ）の両方、（ａ）と（ｄ）の両方、（ｂ）と（ｃ）の両方、または（ｂ）と（ｄ）の両方により示される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
病期３〜４期線維症の診断が、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも２倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種の存在量を有する、（ａ）に列挙された細菌種の少なくとも２個により示される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
病期３〜４期線維症の診断が、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも２分の１である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、（ｂ）または（ｃ）に列挙された細菌種の少なくとも２個により示される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
病期３〜４期線維症の診断が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され、細菌種が、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ＿ｓｐ．＿ＣＡＧ．２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１２９、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１７０、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｏｂｅｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ＿ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ＿ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．８３からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
病期３〜４期線維症の診断が、参照マイクロバイオームに対する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＥ．  ｃｏｌｉの存在量の増加により追加して示される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法であって、
表２に同定された少なくともｎ個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、ｎが少なくとも２であり、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が肝硬変への進行のリスクを示す、工程；または
（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量より少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、および（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量より多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量および（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量を、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーから決定する工程であって、ジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きい場合には、肝硬変への進行のリスクが示される、工程
を含む、方法。
【請求項３６】
腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種の非存在が、非アルコール性脂肪肝（NAFL）を示す、請求項１または３５に記載の方法。
【請求項３７】
腸管マイクロバイオームシグネチャーが、腸管マイクロフローラからの細菌代謝産物または腸管マイクロフローラにおけるタンパク質に基づいており、細菌マイクロバイオームシグネチャーが、代謝産物またはタンパク質から決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
決定する工程または精査する工程が、ノンパラメトリック多変量解析、ランダムフォレスト解析、サポートベクターマシン、相関ネットワーク解析、相関差異ネットワーク解析、ベイズモデル、線形モデル、および教師あり機械学習ツールからなる群から選択される方法論の使用を含む、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  この出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられた、２０１６年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３２５，３３４の利益を主張する。
【０００２】
[0002]  本明細書に記載された主題は、対象由来の試料を分析して、細菌種の存在、非存在、または相対存在量（relative abundance）についてのそれのマイクロバイオームシグネチャー（signature）を決定することによる、肝線維症の検出、ならびに非アルコール性肝疾患の検出および／または鑑別のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ヒト腸管微生物叢（microbiota）は、ヒトゲノムに存在するものより１００倍を超える遺伝子を有する、１５０〜２００個のよく見られる細菌種および１０００個のあまり一般的ではない細菌種を含む、何兆個もの微生物からなる（Quigleyら、J. Hepatology、58:1020-1027（2013））。腸管微生物叢は、主に細菌で構成されるが、古細菌、原生動物、およびウイルスもまた含有する。微生物叢は、食物処理、複雑な不消化多糖の消化、およびビタミンの合成を含む、健康維持に必要不可欠な重要な機能を実施し、病原体の阻害、毒性化合物の代謝から宿主代謝の調節まで及ぶ多様な機能を有する生物活性代謝物を分泌する（Quigley、同上）。
【０００４】
[0004]  乱された微生物叢は、乳幼児における壊死性腸炎から、成人における肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、過敏性腸症候群、および炎症性腸疾患まで、ヒトにおける様々な障害に関与している。いくつかのヒト障害の発病における微生物叢の役割は認識されているが、肝疾患における腸マイクロバイオームについての役割に関する確固たる科学的根拠はまだ現れつつある段階である。例えば、腸微生物叢は、ある特定の肝疾患の発病または進行において役割を果たしているのではないかと疑われており、その肝疾患には、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）および非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、完全静脈栄養／腸管不全合併肝疾患、ならびに原発性硬化性胆管炎が挙げられる（Quigley、同上）。個体に存在する微生物叢を容易に、かつ正確にアセスメントするための方法、ならびに特定の微生物の存在、非存在、または相対存在量を、特定の疾患および状態、ならびに／またはそれを発症するリスクと関連づけるための方法が必要とされている。
【０００５】
[0005]  ＮＡＦＬＤに関して、およそ８千万〜１億人の米国人が、肥満およびインスリン抵抗性に一般的に関連した、メタボリックシンドロームの肝臓症状である、ＮＡＦＬＤを有すると推定される（Carding, S.ら、Microb. Ecol. Health Dis.、26:26191（2015）; Zhu, L.ら、Hepatology、57（2）:601-609（2013）; Kakiyama, G.ら、J. Hepatol.、58（5）:949-955（2013））。ＮＡＦＬＤは、ＮＡＦＬＤの非進行性サブタイプである、非アルコール性脂肪肝（NAFL）と呼ばれる良性脂肪症から、硬変、肝細胞癌、および肝臓関連死へ進行し得るＮＡＦＬＤの進行性サブタイプである、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）まで及ぶ一連の肝疾患である（Qin, N.ら、Nature、513（7516）:59-64（2014））。ＮＡＦＬおよびＮＡＳＨは、典型的には、肝生検により区別され、これらの障害の検出のための、およびそれらの区別のための代替の方法、好ましくは非侵襲性方法が望まれる。
【０００６】
[0006]  前述の、関連分野の例およびそれに関係した限界は、例証であって、排他的ではないことを意図される。関連分野の他の限界は、本明細書を読み、かつ本図面を研究すれば、当業者に明らかになるだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]  下に記載され、例証された以下の態様およびその実施形態は、例示的かつ例証的であることを意図され、範囲を限定することを意図するものではない。
【０００８】
[0008]  一態様において、対象において肝線維症を検出するための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して（inspect）、肝線維症の存在または非存在を検出する工程を含む。
【０００９】
[0009]  別の態様において、対象において、肝線維症を検出するための、または非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在もしくは非存在を検出する工程、および／または腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するか、存在しないかを決定する工程であって、ｎが少なくとも２であり、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在もしくは非存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む。
【００１０】
[0010]  一実施形態において、分析する工程は、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種を検出する試験パネルに生物学的試料を適用することを含む。一実施形態において、ｎは少なくとも２である。
【００１１】
[0011]  別の実施形態において、分析する工程は、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在もしくは非存在により、腸管マイクロバイオームシグネチャーを定義することをさらに含む。
【００１２】
[0012]  他の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有さない対象の集団から得られた参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比較される。
【００１３】
[0013]  一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有する対象の集団から得られた参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比較される。
【００１４】
[0014]  別の実施形態において、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、進行性肝線維症を有する対象の集団から得られる。
【００１５】
[0015]  さらに他の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量が、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に対する腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値から決定される。
【００１６】
[0016]  なお別の実施形態において、生物学的試料を分析する工程は、糞便試料、腸管粘膜試料、および腸管内容物の試料からなる群から選択される試料を含む。
【００１７】
[0017]  他の実施形態において、精査に基づいて、肝線維症の病期が決定される。
【００１８】
[0018]  一実施形態において、精査に基づいて、進行性線維症の病期が決定される。
【００１９】
[0019]  他の実施形態において、精査に基づいて、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断が決定される。
【００２０】
[0020]  いくつかの実施形態において、ｎは、一（１）、二（２）、三（３）、四（４）、五（５）、六（６）、七（７）、八（８）、九（９）、十（１０）、十一（１１）、十二（１２）、十三（１３）、十四（１４）、十五（１５）、十六（１６）、十七（１７）、十八（１８）、十九（１９）、および二十（２０）からなる群から選択される。
【００２１】
[0021]  さらに他の実施形態において、ｎは、約１〜３０、約１〜２５、約５〜３０、約５〜２５、約１０〜３０、および約１０〜２５からなる群から選択される。
【００２２】
[0022]  なお他の実施形態において、ｎは、一（１）より大きい、二（２）より大きい、三（３）より大きい、四（４）より大きい、五（５）より大きい、六（６）より大きい、七（７）より大きい、八（８）より大きい、九（９）より大きい、十（１０）より大きい、十一（１１）より大きい、十二（１２）より大きい、十三（１３）より大きい、十四（１４）より大きい、十五（１５）より大きい、十六（１６）より大きい、十七（１７）より大きい、十八（１８）より大きい、十九（１９）より大きい、および二十（２０）より大きい数からなる群から選択される。一実施形態において、ｎは、４０未満、または３７未満、または３５未満、または３０未満である。
【００２３】
[0023]  一実施形態において、ｎは、少なくとも８であり、かつＡ群における細菌種（Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteae）で構成される。
【００２４】
[0024]  別の実施形態において、Ａ群細菌種で構成された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＡ群細菌種の相対存在量の少なくとも２倍のシグネチャーにおける各細菌種の相対存在量を有する。
【００２５】
[0025]  別の実施形態において、ｎは少なくとも９であり、追加として、Ｂ群における細菌種（Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2-50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformis）の１個または複数を含む。
【００２６】
[0026]  一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＢ群細菌種は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＢ群細菌種の相対存在量の多くとも２分の１の相対存在量を有する。
【００２７】
[0027]  別の実施形態において、ｎは、Ｃ群における細菌種（gathobacter rectalis (Eubacterium rectale)、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter（属）、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8）で構成される。
【００２８】
[0028]  なお別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＣ群細菌種は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＣ群細菌種の相対存在量の多くとも２分の１の相対存在量を有する。
【００２９】
[0029]  いくつかの実施形態において、分析する工程は、表２、表３、表４、および／または表５に示された１個もしくは複数の細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイを用いて、生物学的試料を分析すること含む。
【００３０】
[0030]  一実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｒＲＮＡである。
【００３１】
[0031]  別の実施形態において、分析する工程は、核酸増幅技術を用いて生物学的試料を分析することを含む。
【００３２】
[0032]  さらに別の実施形態において、核酸増幅技術は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応から選択される。
【００３３】
[0033]  別の実施形態において、核酸増幅技術は、等温核酸増幅技術である。
【００３４】
[0034]  なお別の実施形態において、分析する工程は、核酸シーケンシングを用いて生物学的試料を分析することを含む。
【００３５】
[0035]  別の実施形態において、核酸シーケンシングは、全ＤＮＡシーケンシング、もしくは完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシング、または非限定的にＶ６領域を含む、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域のシーケンシングを含む。次世代シーケンシング（NGS）が、いくつかの実施形態において、生物学的試料を分析するために用いられる。
【００３６】
[0036]  一実施形態において、核酸シーケンシングは、ピロシーケンシングまたはサンガーシーケンシングによるＤＮＡシーケンシングを含む。一実施形態におけるピロシーケンシングは、マルチタグシーケンシングである。
【００３７】
[0037]  他の実施形態において、分析する工程は、顕微鏡法、代謝物同定、グラム染色、フローサイトメトリー、免疫学的アッセイ、および培養に基づいたアッセイから選択される方法を用いて分析することを含む。
【００３８】
[0038]  別の態様において、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種が、対象の腸管マイクロフローラにおいて存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロフローラにおける、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法。
【００３９】
[0039]  別の態様において、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法が、提供される。その方法は、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期３〜４期線維症の診断が、以下の基準：
（ａ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｄｏｒｅａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３１７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ７＿３＿５４ＦＡＡ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅからなる群（A群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；
（ｂ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．  ４＿３＿５４Ａ２ＦＡＡ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  １＿１＿３０、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：８２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−５０、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：４３、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：５６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：１７、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：９０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＣＡＧ：２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：８３、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１２９、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＣＡＧ：３９、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３７、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１７６、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１１０、およびＨｏｌｄｅｍａｎｉａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓからなる群（B群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；ならびに／または
（ｃ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約２分の１、もしくは多くとも約２．５分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔａｌｉｓ（Eubacterium rectale）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ（属）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、およびＢｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＧＤ８からなる群（C群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；ならびに／または
（ｄ）（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ（ｉｉｉ）（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量と（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きく、および／または０．５以上である
の１つまたは複数により示される、工程を含む。
【００４０】
[0040]  一実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、（ａ）と（ｂ）の両方、（ａ）と（ｃ）の両方、（ａ）と（ｄ）の両方、（ｂ）と（ｃ）の両方、または（ｂ）と（ｄ）の両方により示される。
【００４１】
[0041]  別の実施形態において、（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量と（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が０．７より大きく、および／または０．７以上である。
【００４２】
[0042]  別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも２倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、（ａ）に列挙された細菌種の少なくとも２個により示される。
【００４３】
[0043]  なお別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも２分の１である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、（ｂ）または（ｃ）に列挙された細菌種の少なくとも２個により示される。
【００４４】
[0044]  さらに別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され、細菌種が、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ＿ｓｐ．＿ＣＡＧ．２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１２９、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１７０、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｏｂｅｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ＿ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ＿ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．８３からなる群から選択される。
【００４５】
[0045]  別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、さらに、参照マイクロバイオームに対する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＥ．  ｃｏｌｉの存在量の増加により示される。
【００４６】
[0046]  別の態様において、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程を含む、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す。
【００４７】
[0047]  別の態様において、（Ｉ）表２、表３、表４、および／もしくは表５に同定された少なくともｎ個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２、表３、表４、および／もしくは表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が肝硬変への進行のリスクを示す、工程、または（ＩＩ）（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量より少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、および（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量より多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量および（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量を、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーから決定する工程であって、ジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きい場合には、肝硬変への進行のリスクが示される、工程を含む、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法。
【００４８】
[0048]  一実施形態において、ｎは少なくとも２である。
【００４９】
[0049]  さらに別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）を有する対象において非アルコール性脂肪肝（NAFL）を非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）から区別するためのアッセイ方法が提供される。その方法は、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種が前記シグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２で同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む。
【００５０】
[0050]  一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の非存在が、非アルコール性脂肪肝（NAFL）を示す。
【００５１】
[0051]  別の実施形態において、ｎは、一（１）、二（２）、三（３）、四（４）、五（５）、六（６）、七（７）、八（８）、九（９）、十（１０）、十一（１１）、十二（１２）、十三（１３）、十四（１４）、十五（１５）、十六（１６）、十七（１７）、十八（１８）、十九（１９）、および二十（２０）からなる群から選択される。
【００５２】
[0052]  別の実施形態において、ｎは、１より大きくかつ３０未満、１より大きくかつ２５未満、５より大きくかつ３０未満、５より大きくかつ２５未満、１０より大きくかつ３０未満、および１０より大きくかつ２５未満からなる群から選択される。
【００５３】
[0053]  さらに他の実施形態において、腸管マイクロフローラは、対象由来の生物学的試料から得られ、試料が、糞便試料、腸管粘膜試料、および腸管内容物の試料からなる群から選択される。
【００５４】
[0054]  一実施形態において、腸管マイクロフローラに存在する細菌種は、表２、表３、表４、および／または表５に示された細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイを用いて決定される。
【００５５】
[0055]  別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、腸管マイクロフローラからの細菌代謝産物または腸管マイクロフローラにおけるタンパク質に基づいており、細菌マイクロバイオームシグネチャーは、代謝産物またはタンパク質から決定される。
【００５６】
[0056]  別の実施形態において、決定することまたは精査することは、ノンパラメトリック多変量解析、ランダムフォレスト解析、サポートベクターマシン、相関ネットワーク解析、相関差異ネットワーク解析、ベイズモデル、線形モデル、および教師あり機械学習ツールからなる群から選択される方法論の使用を含む。
【００５７】
[0057]  本方法の追加の実施形態は、以下の説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかであろう。前述および以下の説明から認識できるように、本明細書に記載されたありとあらゆる特徴、およびそのような特徴の２つ以上のありとあらゆる組合せは、そのような組合せに含まれる特徴がお互いに矛盾しないという条件で、本開示の範囲内に含まれる。加えて、任意の特徴または特徴の組合せは、本発明の任意の実施形態から特定的に排除され得る。本発明の追加の態様および利点は、特に添付の実施例および図面と共に考慮されれば、以下の説明および特許請求の範囲に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】[0058]軽度／中等度群（Ｇ１、白色バー）における試料を進行性線維症群（Ｇ２、ダッシュで満たされている）における試料から区別するために用いられるランダムフォレストモデルのために選択された３７個の種の相対存在量の箱型図である。
【図１Ｂ】軽度／中等度群（Ｇ１、白色バー）における試料を進行性線維症群（Ｇ２、ダッシュで満たされたバー）における試料から区別するために用いられるランダムフォレストモデルのために選択された３７個の種の相対存在量の箱型図である。
【図２】[0059]生検診断によるＮＡＦＬＤ患者のメタボロミクス分析およびメタゲノム分析の概観を示す図である。８６人の患者のコホートからの血清および糞便試料を、それらの代謝性および機能性内容物について分析した。左：５６個の血清試料の代謝プロファイルが、多重検定補正後、いくつかの示差的に大量の（abundant）代謝物を検出した。これらは、Ｇ１で豊富なのは白色ボックスにより、Ｇ２で豊富なのはダッシュで満たされたボックスにより示されている。中央：８６個の糞便試料の全ゲノムシーケンシングから同定されたＯＲＦ配列を用いて、ＳＣＦＡ産生に関与した酵素の相対存在量をコンピュータで計算した。いくつかの酵素が、Ｇ１（白色）かまたはＧ２（ダッシュで満たされている）のいずれかにおいて豊富であったが、それらは、多重検定補正後、統計学的に有意ではなかった。右：代謝経路を、８６個の糞便試料の全ゲノムシーケンシングから再構築した。経路存在量を、経路が再構築された種の存在量を合計することにより計算した。いくつかの経路がＧ１（白色）かまたはＧ２（ダッシュで満たされている）において豊富であったが、これらは、多重検定補正後、統計学的に有意ではなかった。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
１．定義
[0060]  様々な態様が、ここで、以下により完全に記載される。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形で具体化され得、本明細書に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態は、この開示が、綿密で、完全であり、かつ当業者へそれの範囲を十分に伝えるように提供される。
【００６０】
[0061]  値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間にある各値、およびその提示された範囲における任意の他の、提示され、または間にある値が、本開示内に包含されることが意図される。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が提示されている場合には、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、および７μｍ、加えて、１μｍ以上の値の範囲および８μｍ以下の値の範囲もまた明確に開示されていることが意図される。
【００６１】
[0062]  単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに別なふうに規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、１つの「ポリマー」への言及は、単一のポリマー、加えて、２つ以上の同じ、または異なるポリマーを含み、１つの「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤、加えて、２つ以上の同じ、または異なる賦形剤、などを含む。
【００６２】
[0063]  数値の直前にある場合の語「約」は、その開示の文脈が別なふうに指示せず、または以下のような解釈と矛盾しない限り、その値のプラスまたはマイナス１０％の範囲を意味し、例えば、「約５０」は４５〜５５を意味し、「約２５，０００」は２２，５００〜２７，５００を意味するなどである。例えば、「約４９、約５０、約５５」などの数値のリストにおける、「約５０」は、その前の値と次の値の間の間隔の半分未満まで拡張される範囲、例えば、４９．５より大〜５２．５未満を意味する。さらに、句「約〜未満」または「約〜より大きい」（「〜」はある一つの値）は、本明細書に提供された用語「約」の定義を考慮して、理解されるべきである。
【００６３】
[0064]  「腸管（intestinal tract）」または形容詞として用いられる場合の「腸管の（intestinal）」は、個体の胃、結腸、小腸、大腸、盲腸、および直腸を指す。同義語には、腸（gut）および胃腸管（gastrointestinal tract）が挙げられる。
【００６４】
[0065]  「微生物叢」は、腸などのある特定の位置を占める微生物の集合的集団を記載するために用いられる。
【００６５】
[0066]  「マイクロバイオーム」は、微生物叢の集合的ゲノムを指す。
【００６６】
[0067]  範囲により、または任意の類似した様式で主張することができる、群内の任意の部分的範囲または部分的範囲の組合せを含む任意のそのような群の任意の個々のメンバーを排除または除外する権利を留保することにより、この開示の完全な基準に満たないものが、任意の理由によって主張することができる。さらに、任意の個々の置換体、類似体、化合物、リガンド、構造、もしくはそれらの群、または主張された群の任意のメンバーを排除または除外する権利を留保することにより、この開示の完全な基準に満たないものが、任意の理由によって主張することができる。
【００６７】
[0068]  この開示を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物が参照されている。これらの特許、特許出願、および刊行物の全体としての開示は、この開示の日付時点の状態としてその当業者に知られているような当技術分野の状態をより完全に記載するために、参照によりこの開示へ組み入れられている。引用された特許、特許出願、および刊行物とこの開示との間に何か矛盾がある場合、この開示が支配する。
【００６８】
[0069]  便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲に用いられるある特定の用語は、ここに集められている。他に規定がない限り、この開示に用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示の属する当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００６９】
ＩＩ．検出および診断のための方法
[0070]  肝線維症の検出、ならびに非アルコール性脂肪性肝疾患の検出および／または鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査する工程を含む。これらの方法の裏付けとして行われる研究は、実施例１を参照してここに記載される。
【００７０】
[0071]  実施例１に詳述された研究において、８６人の個体のコホートを選択した。そのコホートにおいて、１４人の個体が、肝生検で確認された進行性肝線維症を有した。個体のコホートからの糞便試料を取得し、ＤＮＡ分析および全ゲノムショットガンシーケンシングにより分析した。シーケンシングデータを、ＮＣＢＩからの細菌、古細菌、ウイルス、および真核生物のゲノムから構築されたデータベースにおけるマイクロバイオーム配列データへマッピングした。細菌の相対存在量を、種、属、科、目、綱、および門へ分類学的に分類して、訓練データセットを形成した。訓練データセットには、各対象の年齢、性別、人種、および体格指数（BMI）と共に、試料多様性および試料豊富度（richness）も含まれた。
【００７１】
[0072]  その研究における個体を、線維症の重症度に基づいて２つの群にカテゴリー化した。個体の第１の群（群１）は、線維症をもたず（病期０期）、または中等度の線維症（病期１期および２期）を有した。第２の群（群２）は、肝臓が生検によって線維症の進行期（病期３期および４期）を確認された患者からなった。大部分の患者（７２人）は、群１であり、１４人の患者は、群２に属した。表１．１（下記の実施例１内）は、進行性線維症状態により分類されたコホート全体の個体群統計学的、臨床的、生化学的、および代謝的プロファイルを示す。進行性線維症を有する患者は、進行性線維症をもたないものより、年齢が高く、ヒスパニックで、糖尿病患者であり、かつより高いＡＬＴ、より高いＡＳＴ、より低い血小板数、およびより高いＨｂＡ１ｃを有する可能性がより高かった。加えて、その２つの群は類似したＢＭＩを有したが、進行性線維症を有する患者はより高い胴囲を有した。表１．２（下記の実施例１内）は、進行性線維症状態により分類された研究コホートにおける詳細な組織学的差異を提供する。進行性線維症を有する患者は、進行性線維症をもたないものより、より重篤な小葉ならびに門脈の炎症および風船様膨化（ballooning）を有する可能性がより高かった。
【００７２】
[0073]  実施例１に詳述されているように、患者の腸マイクロバイオーム組成を、彼らの糞便試料から抽出されたＤＮＡの全ゲノムショットガンシーケンシングを用いて決定した。８６個の糞便試料は、（低品質の塩基を切り取り、ヒト配列を除去した後）試料あたり平均６．５８×１０９塩基を生じた。循環代謝物およびそれらの微生物機能への関連性もまた研究し、実施例１に記載されているように、コホートのサブセット（５６人の患者）から収集された血清試料から生化学的プロファイルを作成した。
【００７３】
[0074]  表１に示されているように、腸マイクロバイオーム組成の分析により、軽度／中等度ＮＡＦＬＤ対進行性線維症の間に、糞便由来のメタゲノムの分類学的組成の差があることが明らかにされた。
【００７４】
【表１】
2019517783.tif 000002
【００７５】
[0075]  表１に見られるように、門レベルにおいて、両方の群における腸マイクロバイオームは、ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのメンバー、続いて、よりずっと少ない存在量でＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのメンバーによって支配された。さらに、ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓとＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの両方は、２つの群に渡って示差的に大量であり（ｐ値＜０．０５）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓが軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（Ｇ１）においてより多く、一方、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａは進行性線維症（Ｇ２）においてより多かった。種レベルにおいて、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ（２．５％  相対存在量中央値）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ（１．７％）が軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（Ｇ１）において最も大量にある生物体であり、一方、Ｂ．  ｖｕｌｇａｔｕｓ（２．２％）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（１％）が進行性線維症（Ｇ２）において最も大量であった。Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＣＡＧ：３９、Ｒ．  ｏｂｅｕｍ、およびＥ．  ｒｅｃｔａｌｅは、軽度／中等度ＮＡＦＬＤより進行性線維症において有意に、より少なかった。
【００７６】
[0076]  進行性線維症の検出のための糞便由来のメタゲノムプロファイルを利用するモデルを開発した。軽度／中等度ＮＡＦＬＤおよび進行性線維症に属する試料を区別する能力があるモデルを構築するために、ランダムフォレスト（ＲＦ）を用いるカスタム機械学習プロセスを使用した。モデル構築のためのインプットフィーチャ（feature）のセットは、メタゲノムフィーチャおよび患者メタデータフィーチャからなった。メタゲノムデータからのフィーチャは、１５２個の構成種の数（豊富度）および相対存在量、ならびにマイクロバイオーム多様性（シャノン多様性）からなった。患者メタデータは、年齢、性別、人種、およびＢＭＩからなった。ＲＦモデルを構築することにおける第１のステップは、３００個のＲＦを訓練し、その後、最高性能モデルから上位フィーチャを選択することからなった。訓練されたＲＦの性能を最適化するためにフィーチャ削除ステップを行い、最も重要なフィーチャとしてシャノン多様性、年齢、およびＢＭＩと一緒に３７個の種を選択した。訓練段階におけるＲＦのほとんど全部において、年齢が最高予測子（predictor）であることが観察された。選択されたフィーチャの統計学的有意性を、４０個のランダムに選択されたフィーチャにおいてそれぞれ訓練された１０，０００個のモデルを用いるモンテカルロシミュレーションによりアセスメントした（ｐ値＜０．００６）。
【００７７】
[0077]  ４０個の選択されたフィーチャを用いて、５０個のＲＦを訓練し、最良性能モデルを最終モデルとして選択した。このモデルは、ＡＵＣ  ０．９３６のロバストかつ統計学的に有意な診断精度を有した。図１Ａ〜１Ｂは、軽度／中等度群（Ｇ１）における試料を進行性線維症群（Ｇ２）における試料から区別するために用いられるランダムフォレストモデルに選択された３７個の種の相対存在量の箱型図である。試料多様性ならびに患者年齢およびＢＭＩもまた、ランダムフォレストモデルによりフィーチャとして選択された（箱型図は未呈示）。（５０個のＲＦから導かれた）ＡＵＣ推定値についての範囲は０．７７９〜０．９３６の間であった。
【００７８】
[0078]  表２は、ＲＦモデルを用いて同定された３７個の種を要約する。表２はまた、Ｇ２およびＧ１におけるジニ指数の平均減少量および種存在量中央値のログ比を提供する。最適化されたモデルにより選択された３７個の種から、８個の種が、軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（Ｇ１）と比較して進行性線維症（Ｇ２）において２倍より多く大量であったが、２２個の種は、進行性線維症（Ｇ２）と比較して軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（Ｇ１）において２倍より多く大量であった。具体的には、８個の種（Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、Clostridium bolteae）の種存在量中央値は、群１試料においてより群２において２〜４倍、大量であった。これらの８個の種は、まとめてＡ群と呼ばれる。進行性線維症（Ｇ２）と比較して軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（Ｇ１）において２倍より多く大量であった２２個の種は、本明細書でまとめてＢ群と呼ばれる。表２はまた、ゲノムデータベースのキュレーションにより同定された６個の種を要約し、それらの種は、表２においてＣ群種により示されている。
【００７９】
【表２】
2019517783.tif 000003
【００８０】
[0079]  したがって、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法が提供される。その方法は、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期３〜４期線維症の診断が以下の基準：
（ａ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｄｏｒｅａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３１７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ７＿３＿５４ＦＡＡ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅからなる群（A群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；または
（ｂ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．  ４＿３＿５４Ａ２ＦＡＡ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  １＿１＿３０、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：８２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−５０、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：４３、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：５６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：１７、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：９０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＣＡＧ：２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：８３、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１２９、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＣＡＧ：３９、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３７、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１７６、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１１０、およびＨｏｌｄｅｍａｎｉａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓからなる群（B群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；または
（ｃ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約２分の１、もしくは多くとも約２．５分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔａｌｉｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ（属）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、およびＢｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＧＤ８からなる群（C群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；ならびに／または
（ｄ）（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量と（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きく、および／もしくは０．５以上である
の１つまたは複数により示される、工程を含む。
【００８１】
[0080]  病期３〜４期線維症の診断は、いくつかの実施形態において、（ａ）と（ｂ）の両方により示され、または代替として、病期３〜４期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも２倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有するＡ群の細菌種の少なくとも２個により示される。
【００８２】
[0081]  病期３〜４期線維症の診断はまた、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも２分の１である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有するＢ群の細菌種の少なくとも２個により示され得る。
【００８３】
[0082]  病期３〜４期線維症の診断はまた、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも２分の１、または多くとも２．５分の１である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有するＣ群の細菌種の少なくとも１個または少なくとも２個により示され得る。
【００８４】
[0083]  他の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、（ａ）と（ｂ）の両方、（ａ）と（ｃ）の両方、（ａ）と（ｄ）の両方、（ｂ）と（ｃ）の両方、もしくは（ｂ）と（ｄ）の両方、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のうちの３つ、または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の全部により示される。
【００８５】
[0084]  病期３〜４期線維症の診断はまた、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され得、細菌種が、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ＿ｓｐ．＿ＣＡＧ．２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１２９、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１７０、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｏｂｅｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ＿ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ＿ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．８３からなる群から選択される。
【００８６】
[0085]  病期３〜４期線維症の診断はまた、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１、または多くとも２．５分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され得、細菌種が、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔａｌｉｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ（属）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、およびＢｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＧＤ８（C群）からなる群から選択される。
【００８７】
[0086]  別の実施形態において、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法は、本明細書に記載されているように、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種がジニ係数の平均減少量を有し、かつ細菌種の少なくともｎ個についてのジニ係数の平均減少量の合計が０．５以上であることが、ＮＡＳＨを示す、工程を含む。
【００８８】
[0087]  別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断のための方法は、本明細書に記載されているように、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種がジニ係数の平均減少量を有し、かつ細菌種の少なくともｎ個についてのジニ係数の平均減少量の合計が０．５以上であることが、進行性（病期３〜４期）肝線維症を示す、工程を含む。
【００８９】
[0088]  別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法が企図され、提供される。その方法は、一実施形態において、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーから、（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量を決定する工程を含む。（ｉ）および（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種についてのジニ係数の平均減少量が得られ、または決定される。（ｉ）および（ｉｉ）における細菌種のそれぞれについてのジニ係数の平均減少量の合計が決定され、ジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きい場合には、肝硬変への進行のリスクが示されている。
【００９０】
[0089]  ジニ係数の平均減少量の総和が腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける１つまたは複数の種について決定される方法の実施形態において、総和値が、０．２５より大きく、０．３より大きく、０．４より大きく、０．５より大きく、０．６より大きく、０．７より大きく、０．８より大きく、０．９より大きく、もしくは１．０より大きくあり得、または０．２５以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、もしくは１．０以上であり得る。さらに、ジニ係数の平均減少量の総和が腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける１つまたは複数の種について決定される方法の実施形態において、１つもしくは複数の種、またはｎの値は、本明細書に示されたｎの範囲または値のいずれかであり得、ある特定の実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【００９１】
[0090]  軽度／中等度ＮＡＦＬＤの群（G1）と進行性線維症の群（G2）とを区別するためのシグネチャーの存在をさらに検証するために、線形サポートベクターマシン（SVM）に基づいた直交機械学習方法を用いて、同じインプットフィーチャセットから分類器を構築した；これは、最終フィーチャセットが、ＲＦに基づいたモデルにおけるフィーチャと高度の一致を有し、かつ同様に高いＡＵＣを有するモデルを生じた。実施例１は、モデルを詳細に記載する。訓練されたＳＶＭは予測子として１８個の種を選択し、それらは、表３に示されている。その種のうちの１２個は、ランダムフォレスト方法により選択された種と重複し、これらの重複する種は表３において太字で識別されている。
【００９２】
【表３】
2019517783.tif 000004
【００９３】
[0091]  線形ＳＶＭにより同定された種（表３）のうちの１２個は、ランダムフォレスト方法により選択された種（表２）と重複し、その１２個の共通の種は、下記の表４に列挙されている。表４に列挙された１２個の種のうち、４個の種（Bacteroides finegoldii、Clostridium sp. 7_3_54FAA、Clostridium symbiosum、およびStreptococcus parasanguinis）は、２つの群間のそれらの存在量中央値のログ倍数変化（表２の最後の列）に基づいて群２試料においてより大量であることが観察された。群２においてより群１において、２〜１６倍、大量であるおおよそ２０個の種がある。
【００９４】
【表４】
2019517783.tif 000005
【００９５】
[0092]進行性線維症を線維症なしまたは中等度線維症から区別する、データベースキュレーションにより同定された種は、表５に同定された。表５に見られるように、同定された種は、線維症なしまたは中等度線維症を有する患者に対して、進行性線維症を有する患者において多くとも約２分の１、または多くとも約２．５分の１である。表５におけるこれらの種は、細菌のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目に属する。
【００９６】
【表５】
2019517783.tif 000006
【００９７】
[0093]  データの２つの供給源を用いて、進行性線維症を進行性線維症なしから区別するための、メタゲノム導出モデル（metagenome derived model）の性能を検証した。（ｉ）年齢は、両方のマイクロバイオーム、加えて進行性線維症の主要な効果変更子（modifier）である。メタゲノム導出モデルが年齢によって偏っていなかったことを調べるために、ＲＦモデルを、以前に発表され、かつ十分表現型検査された双子コホートデータセット（Loomba, R.ら  Gastroenterology、149（7）:1784-1793（2015））に適用した。先験的に、６０歳以上で、かつＭＲＩ  ＰＤＦＦ＜５％により決定された場合の脂肪肝なしの正常な肝臓脂肪含量（NAFLDなし）およびＭＲＥ＜３  Ｋｐａにより決定された場合の線維症の非存在（線維症なし）に基づいて健康であったペアの双子から単一の双子（双子は、有意に共有されたマイクロバイオームを有することが知られているため）を選択した。これらの固有的に十分特徴づけられた２８人の健康で年齢の高い方の双子の個体からのデータへ、訓練されたＲＦによりなされた予測のＡＵＣは、一貫し、かつロバストのままであり、０．８９のＡＵＣ（ｐ値＜０．０００１、並べ替えクラス（permuted class）ラベルを用いるモンテカルロシミュレーション）を有した。
【００９８】
[0094]  患者の独立した群におけるフレームワークのさらなる検証を、ＮＡＦＬＤ硬変を有する患者の年齢均衡のとれた群および線維症をもたない患者の年齢均衡のとれた群を確立することにより行い、その検証において、全てがＮＡＦＬＤ硬変（Ｎ＝１４）かまたは線維症なし（Ｎ＝１６）のいずれかで、６０歳を超える、ほぼ同数の患者が研究された。このＮＡＳＨ硬変試料および対照試料からの患者データおよび種存在量を用いて、０．８０のＡＵＣを有する別のＲＦモデルを訓練した。表６に示された、このモデルにより選択された９個の微生物種から、７個が、最初のＲＦモデルにより選択された３７個の種と重複している（ｐ値＜０．０００８）。表６はまた、Ｇ２およびＧ１におけるジニ係数の平均減少量および種存在量中央値のログ比を示す。
【００９９】
【表６】
2019517783.tif 000007
【０１００】
[0095]  したがって、例えば、マイクロバイオーム由来のバイオマーカーのパネルの検出のための診断試験を用いて、患者試料においてマイクロバイオームシグネチャーを決定することにより、ＮＡＦＬＤによる進行性線維症を診断するための方法が企図される。その方法は、糞便試料などの胃腸管由来の試料を用いる、進行性線維症の非侵襲性検出、および進行性線維症または硬変のスクリーニングを提供する。ＮＡＦＬＤにおける腸マイクロバイオームは、ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのメンバー、続いて、より少ない存在量でＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのメンバーによって支配されている（上記の表１）。その疾患が、軽度／中等度ＮＡＦＬＤから進行性線維症へ進行するにつれて、ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａがＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓに取って代わり、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓが、進行性線維症への移行期において役割を果たし得、いったん進行性線維症が始まったならば、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが優位になることを示唆する。
【０１０１】
[0096]  種レベルにおいて、Ｅ．  ｒｅｃｔａｌｅ（２．５％相対存在量中央値）およびＢ．  ｖｕｌｇａｔｕｓ（１．７％）は軽度／中等度ＮＡＦＬＤにおいて大量の生物体であったが、Ｂ．  ｖｕｌｇａｔｕｓ（２．２％）およびＥ．  ｃｏｌｉ（１％）が進行性線維症において大量であった。進行性線維症を有する患者の誰も、腹水も肝臓代償不全のいかなる証拠ももたなかったが、高いＥ．  ｃｏｌｉ存在量をまだなお有した。進行性線維症におけるＥ．  ｃｏｌｉのこの存在量の増加は、臨床上の意義を有する可能性がある。これらのデータは、Ｅ．  ｃｏｌｉ優位が、線維症進行の病期のかなり早期に生じることを示唆し、かつ腸内毒素症が門脈圧亢進症の発生に先行し得るという仮説を支持する。
【０１０２】
[0097]  したがって、一実施形態において、対象において、肝線維症を検出するための方法、および非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、Ｅ．  ｃｏｌｉ、および表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種で構成されるマイクロバイオームシグネチャーが、肝線維症または非アルコール性脂肪性肝炎を示す、工程を含む。
【０１０３】
[0098]  本明細書に記載されたデータは、肝線維症の検出へのアプローチとして、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子シーケンシングよりむしろ、メタゲノミクスシーケンシングの使用を確立する。十分表現型検査されたＮＡＦＬＤコホートからの糞便メタゲノムの分析から、データは、その疾患の異なる病期に異なって存在する３７個の微生物種を明らかにする。微生物バイオマーカーは、代謝性および線維性疾患を診断するために用いることができ、肝疾患の病期を決定するためのツールを提供する。メタゲノミクスシグネチャーはまた、線維症、進行性線維症、および硬変を検出するために、他の非侵襲性の血清／血漿または画像診断に基づいた試験と共に用いられ得る。
【０１０４】
[0099]  したがって、対象において肝線維症を検出するための方法が提供される。その方法は、対象由来の生物学的試料を分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、および腸管マイクロバイオームシグネチャーを参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて精査して、肝線維症の存在または非存在を検出する工程を含む。
【０１０５】
[0100]  対象において非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法もまた提供される。一つの方法において、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種が、対象の腸管マイクロフローラに存在するかどうかが決定され、腸管マイクロフローラにおける表２、表３、表４、または表５に同定された前記少なくともｎ個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す。別の方法において、対象の腸管マイクロフローラが、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定するために分析され、腸管マイクロバイオームシグネチャーが、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定するために精査される。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す。
【０１０６】
[0101]  対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法であって、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種が対象の腸管マイクロフローラに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロフローラにおける表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む、方法。
【０１０７】
[0102]  一実施形態において、ｎは少なくとも８であり、Ａ群における細菌種（Dorea sp. CAG:317、Bacteroides cellulosilyticus、Bacteroides finegoldii、Bacteroides dorei、Streptococcus parasanguinis、Clostridium symbiosum、Clostridium sp. 7_3_54FAA、およびClostridium bolteae）で構成される。場合によっては、Ａ群細菌種で構成される腸管マイクロバイオームシグネチャーは、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＡ群細菌種の相対存在量の少なくとも２倍の、シグネチャーにおける各細菌種の相対存在量を有する。
【０１０８】
[0103]  別の実施形態において、ｎは少なくとも９であり、加えて、Ｂ群における細菌種（Subdoligranulum sp. 4_3_54A2FAA、Bacteroides sp. 1_1_30、Faecalibacterium sp. CAG:82、Clostridium sp. L2-50、Blautia sp. KLE 1732、Clostridium sp. CAG:43、Firmicutes bacterium CAG:56、Ruminococcus sp. CAG:17、Ruminococcus obeum、Alistipes putredinis、Roseburia inulinivorans、Ruminococcus sp. CAG:90、Bacteroides pectinophilus、Roseburia intestinalis、Coprococcus comes、Oscillibacter sp. CAG:241、Firmicutes bacterium CAG:83、Dorea longicatena、Firmicutes bacterium CAG:129、Ruminococcus obeum CAG:39、Blautia sp. CAG:37、Eubacterium rectale、Firmicutes bacterium CAG:176、Firmicutes bacterium CAG:110、およびHoldemania filiformis）の１つまたは複数を含む。場合によっては、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＢ群細菌種は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおけるＢ群細菌種の相対存在量の多くとも２分の１の相対存在量を有する。
【０１０９】
[0104]  別の実施形態において、ｎは少なくとも２であり、Ｃ群における細菌種（Agathobacter rectalis（Eubacterium rectale）、Blautia sp. KLE 1732、Roseburia inulinivorans、Oscillibacter（属）、Eubacterium ramulus、およびBlautia sp. GD8）の１つまたは複数を含む。
【０１１０】
[0105]  別の実施形態における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための本明細書に企図された方法は、対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程であって、病期３〜４期線維症の診断が以下の基準：
（ａ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｄｏｒｅａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３１７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ７＿３＿５４ＦＡＡ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅからなる群（A群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；または
（ｂ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．  ４＿３＿５４Ａ２ＦＡＡ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  １＿１＿３０、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：８２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−５０、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：４３、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：５６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：１７、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：９０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＣＡＧ：２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：８３、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１２９、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＣＡＧ：３９、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３７、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１７６、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１１０、およびＨｏｌｄｅｍａｎｉａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓからなる群（B群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；または
（ｃ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも約２分の１、もしくは多くとも約２．５分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであって、細菌種が、Ａｇａｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔａｌｉｓ（Eubacterium rectale）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＫＬＥ  １７３２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ（属）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、およびＢｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＧＤ８からなる群（C群）から選択される、腸管マイクロバイオームシグネチャー；ならびに／または
（ｄ）（ｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の少なくとも２倍である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量、（ｉｉ）参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２中の少なくとも２個の細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である同じ少なくとも２個の細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーであり、かつ（ｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量と（ｉｉ）における少なくとも２個の細菌種のジニ係数の平均減少量の合計が０．５より大きく、および／または０．５以上である
の１つまたは複数により示される、工程を含む。
【０１１１】
[0106]  病期３〜４期線維症の診断は、いくつかの実施形態において、（ａ）と（ｂ）の両方により示され、または代替として、病期３〜４期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより少なくとも２倍である対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、（ａ）に列挙された細菌種の少なくとも２個により示される。
【０１１２】
[0107]  なお別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも２分の１である、対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、（ｂ）に列挙された細菌種の少なくとも２個、および／または参照マイクロバイオームシグネチャーにおいてより多くとも２分の１もしくは２．５分の１である、対象マイクロバイオームシグネチャーにおける相対的な種存在量を有する、（ｃ）に列挙された細菌種の１個もしくは複数により示される。
【０１１３】
[0108]  さらに別の実施形態において、病期３〜４期線維症の診断は、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量の多くとも２分の１である細菌種の相対存在量を有する対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーにより示され、細菌種が、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ＿ｓｐ．＿ＣＡＧ．２４１、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１２９、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．１７０、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｏｂｅｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ＿ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ＿ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ＿ｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ＣＡＧ．８３からなる群から選択される。
【０１１４】
[0109]  別の態様において、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程を含む、対象における非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断のための方法。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す。
【０１１５】
[0110]  別の態様において、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、肝硬変への進行のリスクを示す、工程を含む、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法。
【０１１６】
[0111]  さらに別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）を有する対象において非アルコール性脂肪肝（NAFL）を非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）から区別するためのアッセイ方法が提供される。その方法は、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む。
【０１１７】
[0112]  分析される対象由来の試料は、糞便試料、腸管粘膜試料、または腸管内容物の試料であり得る。糞便試料の使用は、非侵襲性方法の利点を提供する。
【０１１８】
[0113]  試料は、Ｓｅｋｉｒｏｖ，  Ｉ．ら  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ、９０：８５９〜９０４（2010）に記載されたものなど、当業者に公知の様々な技術のいずれかにより、分析されて、それのマイクロバイオームシグネチャーが確認される。例えば、一実施形態において、生物学的試料を、細菌種を検出する試験パネルに適用し、一実施形態において、その試験パネルは、表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の検出のための試験パネルである。試験パネルは、培養に基づいたパネル、細菌１６ＳリボソームＲＮＡ同定を用いる分子に基づいたパネル、完全長１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングパネル（サンガーシーケンシングによる）、ＤＮＡマイクロアレイパネルなどの培養非依存的技術であり得る。例えば、合成によるシーケンシング（sequencing by synthesis）（SBS）ケミストリー、イオン半導体（ion torrent）シーケンシング、ピロシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、および当業者に公知の他の方法などの次世代シーケンシング技術を用いる、メタゲノムシーケンシングもまた、マイクロバイオームシグネチャーを決定するために用いることができる。ラージスケールショットガン型メタゲノムシーケンシングが用いられ得、標的化メタゲノムシーケンシングもまた適している。一実施形態において、マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種は、マルチタグピロシーケンシングなどのピロシーケンシングを用いて同定される。他の分析方法には、変性ゲル電気泳動、末端制限断片長多型、リボソーム遺伝子間スペーサー分析、ＦＩＳＨ、およびｑＰＣＲが挙げられる。ＦＩＳＨおよびｑＰＣＲは、標的とされる細菌種に固有の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列へハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる。分析技術は、組み合わせて、例えば、ＦＩＳＨとｑＰＣＲを、用いることができる。他の同定技術には、顕微鏡法、代謝物同定、グラム染色、フローサイトメトリー、および免疫学的アッセイが挙げられる。
【０１１９】
[0114]  試料の分析から決定されるマイクロバイオームシグネチャーは、同定された各種の絶対量、または同定された種の相対存在量に基づくことができる。一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける細菌種の相対存在量は、シグネチャーを定義するために用いられ、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける各細菌種の存在量中央値に対する、試料における各細菌種の存在量中央値が用いられる。
【０１２０】
[0115]  別の実施形態において、分析する工程は、表２、表３、表４、および／もしくは表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在または非存在により腸管マイクロバイオームシグネチャーを定義することをさらに含む。
【０１２１】
[0116]  マイクロバイオームシグネチャーを決定した後、それは、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーと比べて分析され、それと比べて精査され、またはそれと比較される。参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、診断されるべき障害によって異なり得、一実施形態において、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有さない対象の集団から得られる。別の実施形態において、参照腸管マイクロバイオームシグネチャーは、肝線維症を有する対象の集団から得られる。一実施形態において、対象の集団は、進行性肝線維症を有し、他の実施形態において、対象の集団は、非アルコール性脂肪肝（NAFL）または非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を有する。得られた腸管マイクロバイオームシグネチャーの参照シグネチャーとの比較は、例えば、進行性肝線維症などの肝線維症の病期の診断を可能にする。肝線維症が、独立した疾患ではなく、いくつかの疾患に存在する組織学的変化であることは認識されているだろう。例えば、慢性ウイルス性Ｂ型およびＣ型肝炎は、肝線維症の一般的な原因である。肝線維症の重症度は、典型的には、Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４と名付けられた５つの病期に分類される。Ｓ０は線維症なしである。Ｓ４は硬変である。中間において、Ｓ１は門脈域における軽度線維症である；Ｓ２は、小葉構造の破壊がない、門脈域間の線維症の中等度病期である。Ｓ３は、門脈域間および門脈域と中心静脈との間の線維性架橋により観察される、重度の線維症である。Ｓ４において、Ｓ２の所見に加えて、形成された偽小葉がある。
【０１２２】
[0117]  他の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーの精査に基づいて、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の型の鑑別診断が決定される。腸管マイクロバイオームシグネチャーが決定され、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを確認するように精査される。腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す。あるいは、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の非存在が非アルコール性脂肪肝（NAFL）を示す。
【０１２３】
[0118]  試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表２に同定されたｎ個の細菌種を含有し得、ｎが、一（１）、二（２）、三（３）、四（４）、五（５）、六（６）、七（７）、八（８）、九（９）、十（１０）、十一（１１）、十二（１２）、十三（１３）、十四（１４）、十五（１５）、十六（１６）、十七（１７）、十八（１８）、十九（１９）、および二十（２０）からなる群から選択される。あるいは、ｎは、約１〜３０、約１〜２５、約５〜３０、約５〜２５、約１０〜３０、および約１０〜２５からなる群から選択される。あるいは、ｎは、一（１）より大きい、二（２）より大きい、三（３）より大きい、四（４）より大きい、五（５）より大きい、六（６）より大きい、七（７）より大きい、八（８）より大きい、九（９）より大きい、十（１０）より大きい、十一（１１）より大きい、十二（１２）より大きい、十三（１３）より大きい、十四（１４）より大きい、十五（１５）より大きい、十六（１６）より大きい、十七（１７）より大きい、十八（１８）より大きい、十九（１９）より大きい、および二十（２０）より大きい数からなる群から選択される。あるいは、ｎは、少なくとも一（１）、少なくとも二（２）、少なくとも三（３）、少なくとも四（４）、少なくとも五（５）、少なくとも六（６）、少なくとも七（７）、少なくとも八（８）、少なくとも九（９）、少なくとも十（１０）、少なくとも十一（１１）、少なくとも十二（１２）、少なくとも十三（１３）、少なくとも十四（１４）、少なくとも十五（１５）、少なくとも十六（１６）、少なくとも十七（１７）、少なくとも十八（１８）、少なくとも十九（１９）、および少なくとも二十（２０）からなる群から選択される。あるいは、ｎは、表２のＡ群および／またはＢ群および／またはＣ群における種に対応する。
【０１２４】
[0119]  試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表３に同定されたｎ個の細菌種を含有し得、ｎが、一（１）、二（２）、三（３）、四（４）、五（５）、六（６）、七（７）、八（８）、九（９）、十（１０）、十一（１１）、十二（１２）、十三（１３）、十四（１４）、十五（１５）、十六（１６）、十七（１７）、十八（１８）、十九（１９）、および二十（２０）からなる群から選択される。あるいは、ｎは、約１〜３０、約１〜２５、約５〜３０、約５〜２５、約１０〜３０、および約１０〜２５からなる群から選択される。あるいは、ｎは、一（１）より大きい、二（２）より大きい、三（３）より大きい、四（４）より大きい、五（５）より大きい、六（６）より大きい、七（７）より大きい、八（８）より大きい、九（９）より大きい、十（１０）より大きい、十一（１１）より大きい、十二（１２）より大きい、十三（１３）より大きい、十四（１４）より大きい、十五（１５）より大きい、十六（１６）より大きい、十七（１７）より大きい、十八（１８）より大きい、十九（１９）より大きい、および二十（２０）より大きい数からなる群から選択される。
【０１２５】
試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表４に同定されたｎ個の細菌種を含有し得、ｎが、一（１）、二（２）、三（３）、四（４）、五（５）、六（６）、七（７）、八（８）、九（９）、十（１０）、十一（１１）、および十二（１２）からなる群から選択される。あるいは、ｎは、約１〜１２、約１〜１１、約１〜１０、約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４、約１〜３、および約１〜２からなる群から選択される。あるいは、ｎは、表４における種の５〜１２、５〜１１、５〜１０、および５〜９からなる群から選択される。
【０１２６】
[0120]  試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、表５に同定されたｎ個の細菌種を含有し得、ｎが、一（１）、二（２）、三（３）、四（４）、五（５）、および六（６）からなる群から選択される。あるいは、ｎは、約１〜６、約１〜５、約１〜４、約１〜３、および約１〜２からなる群から選択される。あるいは、ｎは、表５における種の６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、またはちょうど１個からなる群から選択される。
【０１２７】
[0121]  別の実施形態において、試料から決定された腸管マイクロバイオームシグネチャーは、（ｉ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  １＿１＿３０の少なくとも１個；（ｉｉ）Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐ．  ＣＡＧ：３７；（ｉｉｉ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ７＿３＿５４ＦＡＡ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＡＧ：４３、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍの少なくとも１個；（ｉｖ）Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ；（ｖ）Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＡＧ：１２９；（ｖｉ）Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＣＡＧ：２４１；（ｖｉｉ）Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＣＡＧ：３９およびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＡＧ：９０の少なくとも１個；および（ｖｉｉｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓを含む。
【０１２８】
[0122]  マイクロバイオームシグネチャーを決定するために用いられる試験パネルまたは技術は、そのｎ個の細菌種の検出のために、それに応じて、設計される。ｎ個の細菌種の検出のための試験パネルに適した技術は上記で言及されている。１つの例において、表２、表３、表４、または表５に示されたｎ個の細菌種に対する結合親和性を有する核酸配列を含むマイクロアレイが提供される。核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｒＲＮＡである。別の例において、その単位複製配列の検出のために、ｎ個の細菌種由来の核酸が単離され、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅などにより増幅される。別の例において、試験パネルは、サンガーシーケンシングまたはピロシーケンシングを含む核酸シーケンシングを用いて、ｎ個の細菌種の存在または非存在を同定する。核酸シーケンシングは、全ＤＮＡシーケンシング、または完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシング、またはＶ６領域などの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域のシーケンシングであり得る。
【０１２９】
[0123]  別の実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーは、腸管マイクロフローラからの細菌代謝産物、または腸管マイクロフローラ内のタンパク質に基づいており、細菌マイクロバイオームシグネチャーは、代謝産物またはタンパク質から決定される。
【０１３０】
[0124]  本明細書に記載された方法が、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種が対象の腸管マイクロバイオームシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける表２、表３、表４、および／または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、肝硬変への進行のリスクを示す、工程を含む、腸管マイクロバイオームシグネチャーを有し、かつ非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）と診断された対象において肝硬変への進行のリスクをアセスメントするための実質的に非侵襲性の方法を提供することは理解されるだろう。
【０１３１】
[0125]  記載された技術および方法はまた、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）を有する対象において非アルコール性脂肪肝（NAFL）を非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）から区別するためのアッセイ方法を提供する。その方法は、対象の腸管マイクロフローラを分析して、対象についての腸管マイクロバイオームシグネチャーを決定する工程、ならびに腸管マイクロバイオームシグネチャーを精査して、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種がシグネチャーに存在するかどうかを決定する工程であって、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の存在が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を示す、工程を含む。一実施形態において、腸管マイクロバイオームシグネチャーにおける、表２、表３、表４、または表５に同定された少なくともｎ個の細菌種の非存在が、非アルコール性脂肪肝（NAFL）を示す。
【０１３２】
メタボローム分析
[0126]  メタゲノムおよびメタボロームデータを用いる微生物機能の分析も行った。ＮＡＦＬＤにおける進行性線維症のメタゲノムから導かれた腸微生物叢プロファイルの妥当な機能を探索した。メタゲノムデータを用いて、２つの群に関連した微生物群集の機能的および代謝的潜在力を、試料におけるタンパク質ファミリーおよび酵素の相対存在量の定量化、ならびにアセンブルされたデータから生じた種のビンから再構築された経路の相対存在量によって、アセスメントした。これらのデータを、血清代謝物データと統合して、微生物代謝を評価した。
【０１３３】
[0127]  血清試料中に検出された代謝物は、内因性、または微生物起源であるものを含む（Guo, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、112（35）:E4901-E4910（2015））。微生物起源である可能性があるそれらの代謝物をさらに評価するために、５６個の血清試料から検出された代謝物の完全セットを、糞便メタゲノムデータから再構築された微生物経路から予想される代謝物のセットと交差させた。この比較により、８９個の代謝物が生じ、それは、宿主と微生物の両方により産生されることが知られた数個を含んだ。微分解析（differential analysis）により、存在量（ピーク強度）が、軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（G1）と進行性線維症（G2）との間で有意に異なる１１個の代謝物が同定され（FDRおよびα=０．０５について補正されたウィルコクソンの順位和）、これらの１１個の代謝物は、下記の実施例１において表１．４に示されている。このセットにおいて、（ヌクレオシド代謝に関連した）２個の代謝物が、軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（G1）において豊富であり、一方、（アミノ酸および炭素の代謝に関連した）９個の代謝物が、進行性線維症（G2）において豊富であった。それの存在量の差異は統計学的に有意ではなかったが、進行性線維症（G2）において最も高い倍数で増加した代謝物は、嫌気性細菌により産生される代謝物である、３−フェニルプロパノエート（Wikoff, W.R.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、106（10）:3698-3703（2009）; Moss, C.W.ら、Appl. Microbiol.、19（2）:375-8（1970））であった。
【０１３４】
[0128]  軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（G1）および進行性線維症（G2）に渡っての存在量の差異が統計学的に有意である、経路もタンパク質ファミリーも酵素も同定されなかった（多重検定補正後）。しかしながら、経路存在量の調査は、進行性線維症（G2）が、炭素代謝および解毒に関連した経路の存在量の増加があり、一方、軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（G1）は、ヌクレオチドおよびステロイド分解と関連した経路の存在量の増加があったことを示した。これらの所見は図２に示されている。短鎖脂肪酸（SCFA）産生に関連したタンパク質ファミリーおよび酵素の評価は、軽度／中等度ＮＡＦＬＤ（G1）が、乳酸、酢酸、およびギ酸に関連した酵素のより高い存在量を有し、一方、進行性線維症（G2）は、酪酸、Ｄ−乳酸、プロピオン酸、およびコハク酸についての酵素のより高い存在量を有することを示唆した（図２）。Ｇ１またはＧ２におけるエタノール代謝酵素の存在量についての傾向は、それほど明らかではなく、酵素ＥＣ  １．１．１．１（アルコールデヒドロゲナーゼ）がＧ２において増加し、一方、酵素ＥＣ  １．１．１．２（アルコールデヒドロゲナーゼＮＡＤＰ（＋））がＧ１において増加した。
【実施例】
【０１３５】
[0129]  以下の実施例は、本来、例証であり、決して、限定することを意図するものではない。
【０１３６】
実施例１
ヒト腸微生物叢の分析
[0130]  生検診断によるＮＡＦＬＤを有する８６人の個体（女性５６％）のコホートを以下の２つの群へ分類した：病期０〜２期線維症を有する７２人の患者を有する群１は軽度／中等度ＮＡＦＬＤとして分類され、病期３〜４期線維症を有する１４人の患者を有する群２は進行性ＮＡＦＬＤとして分類された。表１．１は、群１および群２における個体の概要を提供する。
【０１３７】
【表７】
2019517783.tif 000008
【０１３８】
[0131]  進行性線維症状態により分類された研究コホートにおける組織学的特徴および差異は、表１．２に示されている。進行性線維症を有する患者は、進行性線維症をもたない患者より重篤な小葉および門脈の炎症ならびに風船様膨化を有する可能性が高かった。
【０１３９】
【表８】
2019517783.tif 000009
【０１４０】
[0132]  群１および群２における個体由来の糞便試料を入手して、その試料の腸マイクロバイオーム組成を、以下のように、抽出されたＤＮＡの全ゲノムショットガンシーケンシングを用いて決定した。
【０１４１】
[0133]  ＤＮＡ抽出。溶解バッファー（２０ｍＭ  Tris-HCl  ｐＨ８．０、２ｍＭ  EDTAナトリウム、１．２％  Triton X-100）３ｍＬ体積を、糞便試料０．５グラムに加え、試料をホモジナイズされるまでボルテックスした。ホモジナイズされた試料１．２ｍＬ体積およびプロテイナーゼＫ（Sigma Aldrich、PN. P2308）酵素１５μＬを、ガーネットビーズを含む１．５ｍＬチューブ（Mo Bio PN. 12830-50-BT）へ分注した。その後、ビーズチューブを、６５℃で１０分間、その後、９５℃で１５分間、インキュベートした。その後、チューブをＶｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ  ２内に置いて、１５分間、ビーズビーティングを実施し、続いて、試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機５４２４において回転させた。その後、上清８００μＬをディープウェルブロックへ移し、ＤＮＡを抽出し、製造会社のプロトコールに従い、Ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＭＳＭ  Ｉ（Perkin Elmer）を用いて精製した。その後、製造会社の使用説明書（Zymo Research PN. D6035）に従い、Ｚｙｍｏ  Ｏｎｅｓｔｅｐ阻害剤除去キットを実施した。その後、ＤＮＡ試料を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＦ２２００プレートリーダーにおいてＱｕａｎｔ−ｉＴを用いて定量化した。
【０１４２】
[0134]  ライブラリー調製およびシーケンシング。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴライブラリーを、製造会社のプロトコール（Illumina、PN. 15031942）に従って、手作業で調製した。簡単に述べれば、試料を、ＡＦ２２００プレートリーダー（Eppendorf）上でＱｕａｎｔ−ｉＴ  ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイシステム（Life Technologies、PN. Q33120）を用いて、ライブラリーあたり０．２ｎｇ／μＬ  ＤＮＡ材料へ正規化し、その後、タグ付き断片化（tagmentation）により、断片化し、タグ付けした。Ｖｅｒｉｔｉ  ９６ウェルＰＣＲ（Applied Biosystems）により増幅を実施し、続いて、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズクリーンアップ（Beckman Coulter、PN. A63880）を行った。全てのライブラリーについての断片サイズを、Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  Ｈｉ  Ｓｅｎｓを用いて測定した。シーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００上でＳＢＳキットＶ４ケミストリーを用いて実施した。
【０１４３】
[0135]  メタゲノムデータアノテーション：マイクロバイオーム配列データを、Ｊｏｎｅｓ，  Ｍ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１１２（４５）：１４０２４〜１４０２９（２０１５）に以前に記載されているように、処理した。アノテーションパイプラインは、試料中の構成微生物の相対的ゲノム存在量推定値、およびタンパク質ファミリー（COGs、Pfams、TIGRFAMs、およびEC）の相対存在量を生じた。アノテーション処理の一部として、各メタゲノム試料からのデータをまたアセンブリして、コンティグアセンブリを作製した。コンティグを、生物分類学に割り当て、種のビンへ組織化した。その後、アノテーション情報を用いて、経路ツール（Pathway Tool）（Karp, P.D.ら、Bioinformatics、18 補遺1:S225-S232.（2002））を用いるアセンブリされた種の代謝の再構築を行った。ＯＲＦを、ＭｅｔａＧｅｎｅを用いて、アセンブリされたデータおよびシングルトンリードから作成した。タンパク質ファミリーの相対存在量は、ＯＲＦ存在量の合計である。経路の相対存在量は、その経路が再構築された全ての種の相対存在量の合計であると定義される。
【０１４４】
[0136]  ランダムフォレスト：ランダムフォレストアルゴリズムを以下の２つの目的のために用いた：１）肝線維症の微生物シグネチャーのモデルを作ること；および２）肝線維症の進行に最も大きく寄与し得る重要な種を選択すること。フィーチャとも呼ばれる、種の相対存在量および患者データを、Ｒ（Breiman, L. Machine learning 45、no. 1、5-32（2001）; Liaw, A.ら、R news 2、no. 3、18-22（2002））におけるランダムフォレストパッケージを用いて解析した。フォレストは、各試料の予測される結果が期待される結果と同じであるように、フォレストにおける各木が、１セットのランダムに選ばれたフィーチャについて理想的なスプリットを見出す、教師あり学習により訓練される。フォレストにおける木ごとにより見出されるデータ分割が、試料の予測される全体的な結果を票決するために用いられる。ランダムフォレストの投票戦略は、各木によるフィーチャのランダムサンプリングによりデータのオーバーフィッティングを回避すると文献で立証されている。結果を票決するためにあらゆる木を用いることは、データを記憶した可能性がある任意の単一の木が支配的な予測をするのを防ぐ。
【０１４５】
[0137]  結果は、疾患または疾患なしである。ＡＵＣ、または受診者動作特性曲線下面積は、訓練されたフォレストの精度を測定した。ＡＵＣは、真陽性予測率および偽陽性予測率の広く用いられている推定量である。最高ＡＵＣを有するそれらのフォレストからの変数または種重要度リストを、さらなる解析のために選択した。
【０１４６】
[0138]  訓練データ：データセットは、登録コホートにおける患者から収集された８６個の糞便試料中に検出された試料多様性、試料豊富度、および種の相対ゲノム存在量からなった。各患者の年齢、性別、人種、およびＢＭＩもまた訓練セットに含まれた。この研究について、個体を、線維症の重症度に基づいて２つの群へカテゴリー化した。個体の第１の群（群１）は、線維症をもたず（病期０期）、または軽度／中等度の線維症（病期１期および２期）を有した。第２の群（群２）は、肝臓が生検によってそれらの線維症の進行期（病期３期および４期）を確認された患者からなった。大部分の患者（７２人）は、群１であり、１４人の患者は、群２に属した。線維症の異なる病期に関しての患者プロフィール、年齢、人種、ＢＭＩ、および性別が表１．１に示されている。相対存在量データに存在する可能性があるノイズのレベルを低減させるために、１０−４未満である存在量はゼロに設定され、種は、患者糞便試料の７０％より多くにおいて存在しなければならない。
【０１４７】
[0139]  階層的クラスタリング：相関したデータが訓練に生じ得る効果を低減させるために、存在量データをさらに、階層的クラスタリングによりフィルタリングした。Ｒにおけるｃｏｒ関数を用いて、種存在量データからスピアマン相関係数を計算した。相関行列を非類似度行列へ変換し、その後、非類似度行列の完全連結クラスタリングについてｈｃｌｕｓｔ関数を用いた。ｃｏｒおよびｈｃｌｕｓｔ関数は、Ｒ  ＳＴＡＴＳパッケージの一部である。クラスタリングから生じた木を、０．１の高さでカットし、クラスター内の全ての他の種に最も近い種を、そのクラスターを代表する種として選んだ。この手順を、１５２個の種の最初のセットに適用した場合、それは、１３６個の代表種を生じ、それらを、その後、訓練段階に用いた。作成された種クラスターのリストは表１．３に示されている。
【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
[0140]  ランダムフォレストの最初の訓練：ＡＵＣとして報告される、分類の最良全体的精度を有するランダムフォレストを訓練する一連の工程が開発された。それぞれ１００１個の木を含有する３００個のフォレストが、前に記載されているように、存在量および普及率のフィルタリングを通過した種の相対ゲノム存在量を用いて訓練された。加えて、各試料のシャノン多様性指数および豊富度、ならびに各患者の年齢、ＢＭＩ、性別、および人種もまた、訓練セット内に含まれた。群１と比較して群２における患者の少ない数のため、各群由来の同数の試料からのフィーチャがランダムにサンプリングされ、各木を訓練するために用いられる、層化サンプリングで訓練を行った。訓練されたフォレストは、ジニ係数の平均減少量に基づいた変数重要度リストを生じる。データセットについて、変数重要度リストは、あらゆる試料の正しい分類もしくは正しい群割当に最も多く寄与した、種、試料指数、または患者測定値のリストである。最高ＡＵＣを有するフォレストからの種重要度リストが、（下に記載された）反復フィーチャ削除（Iterative Feature Elimination）のために選択された。この工程における訓練されたフォレストの性能の有意性を決定するために、並べ替えクラス値を用いた追加の１０，０００個のフォレストが訓練されるモンテカルロシミュレーションを用いた。
【０１５０】
[0141]  反復フィーチャ削除（IFE）およびフォレスト／フィーチャ選択：前のセクションに記載されたフィーチャ重要度リストからのフィーチャ（種、試料指数、および患者データ）を、試料分類の最高全体的精度を有するフォレストを訓練する１セットのフィーチャを見出すために反復的に削除した。フィーチャ重要度リストを、ジニ係数の平均減少量の最高から最低へ順序づけ、重要度の最も低い種を除去した。ランダムフォレストを、フィーチャ重要度リストにおける残りのフィーチャで訓練し、ＡＵＣを計算する。重要度の最も低いフィーチャを除去すること、フォレストを残りのフィーチャで訓練すること、およびＡＵＣを計算することを、重要度リストからフィーチャの全部が除去されるまで、続けた。最高ＡＵＣを有するフォレストを訓練するために用いられたフィーチャを、最終のフィーチャ重要度リストとして用いた。最高ＡＵＣを有する２つ以上のフォレストがある場合、フィーチャの数が最も多いフォレストを選んだ。フィーチャ削除工程後、最高ＡＵＣを有するフォレストを訓練した種が、最終モデルにおいて報告される。
【０１５１】
[0142]  種選択の有意性：最終の種重要度リストの有意性を決定するために、モンテカルロシミュレーションアプローチが用いられ、ランダムに選ばれたフィーチャにおいて訓練されたフォレストからのＡＵＣのゼロ分布が作成された。ランダムに選ばれたフィーチャの数は、前のセクションで記載されているような反復フィーチャ削除工程により見出されたフィーチャの数と同じである。ＡＵＣを、ランダムに選択されたフィーチャにおいて訓練された１０，０００個のフォレストについて計算し、それを用いて、ゼロ分布を形成し、反復フィーチャ削除により選択された上位フィーチャ（IFEフィーチャ）の有意性に対して比較した。ＩＦＥフィーチャに関連したｐ値は、ランダムに選択されたフィーチャのセットにおいて訓練されたフォレストのＡＵＣが、ＩＦＥフィーチャにより訓練されたフォレストのＡＵＣより高い、回数の率である。
【０１５２】
[0143]  線形サポートベクターマシン：線形サポートベクターマシン（線形SVM）が以下の２つの手順のために用いられる：（１）フィーチャ選択、すなわち、重要な患者データおよび微生物種の選択、ならびに（２）選択されたフィーチャでの分類器訓練。フィーチャ選択は、Ｌ１ノルム正則化を用いて行われ、分類器訓練は、Ｌ２ノルム正則化を用いて行われる。線形ＳＶＭのために用いられるデータセットは、ランダムフォレスト分類についてと同じである。軽度／中等度線維症を有する群１は、クラスラベル「−１」に割り当てられ、進行性線維症を有する群２は、クラスラベル「１」に割り当てられた。フィーチャセットは、性別、年齢、ＢＭＩ、人種（白人、アジア人、ヒスパニック）を含み、かつメタデータと呼ばれる患者データ、および登録コホートにおいて８６個の試料の７０％より多くに存在する微生物種からなる。線形ＳＶＭモジュールｓｋｌｅａｒｎ．ｓｖｍ。Ｐｙｔｈｏｎからの線形ＳＶＭが適用され、最良推定量パラメータを選び出すために、２−５〜２５の範囲でのペナルティパラメータＣについてのグリッド検索が実施された。層別２倍クロスバリデーションが用いられ、訓練および試験データセットが設定された。スコアリング方法としてＲＯＣ−ＡＵＣが用いられ、試験データセットに関する分類器の精度が評価された。
【０１５３】
[0144]  Ｌ１ノルムでのフィーチャ選択：Ｌ１ノルムペナルティを有する線形ＳＶＭを、数値メタデータ（年齢、BMI）、バイナリメタデータ（女性、ヒスパニック、アジア人、白人）、および１５２個の微生物種のログ変換相対存在量を含有するフィーチャセットにおけるフィーチャ選択のために用いた。Ｌ１正則化下で非ゼロ係数を有する２４個のフィーチャが選択され、４個のメタデータ（年齢、女性、アジア人、ヒスパニック）および２０個の微生物種を含む。これらの選択されたフィーチャを、線形ＳＶＭ分類器の次の工程の訓練のための新しいフィーチャセットとして用いた。
【０１５４】
[0145]  ＳＶＭ選択されたフィーチャセットの有意性：選択されたフィーチャのセットの有意性を決定するために、ＲＯＣ−ＡＵＣスコアのゼロ分布を、以下の手順で作成した：（１）１５２個の種のリストから２０個の微生物種をランダムに選ぶ、（２）４個のメタデータと２０個のランダムな微生物種を新しいフィーチャセットとして組み合わせる、（３）その新しいフィーチャセットを用いて、Ｌ２ノルムを有する線形ＳＶＭを訓練する、（４）層別２倍クロスバリデーションを用いてＡＵＣを計算する、（５）ランダムな種選択を１０，０００回、繰り返して、ゼロ分布を形成する。ｐ値は、選択されたフィーチャセットのＡＵＣをゼロ分布と比較することにより得られた（データ未呈示）。
【０１５５】
[0146]  生検診断によるＮＡＦＬＤコホートにおけるＲＦモデルとＳＶＭモデルの一致：訓練されたＳＶＭは予測子として１８個の種を選択し（表３）、それらの種のうち１２個が、ランダムフォレスト方法により選択された種と重複した（表３において太字フォントにより識別され、表４に示されている）。
【０１５６】
[0147]  相対存在量における差異についての統計学的検定：ウィルコクソン順位和検定を用いて、存在量の差異をアセスメントした。適切な場合、多重検定補正を用い、検定を、０．０５の有意レベルでのｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅについて制御した。
【０１５７】
[0148]  年齢均衡のとれたデータセット：生検診断による登録コホート（コホートＡ、８６人の患者）からの線維症の進行期（病期３期および４期）における全ての患者は、６０歳以上であった。年齢における歪みは、より幅広い範囲の年齢が病期０期、１期、または２期のいずれかである患者について観察されたように群１における患者についての極値ではなかった。進行性線維症を有する患者についての年齢の観察された歪みに対処するために、複数のコホートから全員が６０歳以上である患者の、コホートＢと呼ばれる、第２のコホートを作成した。コホートＢにおける４９人の患者は、コホートＡからの３１人の患者、双子のコホートからの１６人の健康な患者（各ペアからの単一の双子）、および家族性硬変研究からの２人の生検診断による硬変患者からなる。
【０１５８】
[0149]  代謝物プロファイル：血清試料のメタボロンの質量分析に基づいた代謝プロファイリングを用いて、代謝物を同定した（Guo, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、112（35）:E4901-E4910（2015））。５６人の個体（群１由来の５０人および群２由来の６人）由来の血清試料を用いて、代謝物プロファイルを作成した。有意な代謝物およびそれらのｐ値は表１．４に示されている。
【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
[0150]  いくつかの例示的な態様および実施形態は上記で論じられているが、当業者は、それらのある特定の改変、並べ替え、付加、およびサブコンビネーションを認識しているだろう。したがって、以下の添付された特許請求の範囲、および今後、導入される特許請求の範囲は、全てのそのような改変、並べ替え、付加、およびサブコンビネーションを、それらの真の精神および範囲内であるとして含まれると解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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