(57)【要約】本明細書で提供されるのは、マクロファージ遊走阻害因子（MIF）ヌクレアーゼ活性を阻害することによって、パーキンソン病等の、ポリ［ADP-リボース］ポリメラーゼ１（PARP-1）活性化の増加に起因する疾患を治療する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてポリ［ADP-リボース］ポリメラーゼ 1（PARP-1）活性化が増加することを特徴とする疾患の治療方法であって、前記被験体に、治療有効量のマクロファージ遊走阻害因子（MIF）ヌクレアーゼ活性の阻害剤を投与し、それによって病気を治療すること、を含む治療方法。
【請求項２】
前記疾患が、炎症性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性疾患が、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息アテローム性動脈硬化症（asthma atherosclerosis）、クローン病、大腸炎、皮膚炎憩室炎（dermatitis diverticulitis）、線維筋痛、肝炎、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス、腎炎、潰瘍性大腸炎又はパーキンソン病からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が、パーキンソン病である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤が、大環状ラパフシン・ライブラリーから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、12B3-11、17A5-1 及び 17A5-2 からなる群から選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
マクロファージ遊走阻害因子（MIF）阻害剤をスクリーニングする方法であって、以下：
一本鎖でアミン修飾をした MIF の標的 DNA を表面に固定化する；
大環状ラパフシン・ライブラリー由来の化合物が有り又は無しの状態で MIF をインキュベートする；
前記一本鎖でアミン修飾をした MIF の標的 DNA をビオチン化 DNA とハイブリダイズさせる、ここで前記ビオチン化 DNA は前記一本鎖でアミン修飾をした MIF の標的 DNA に相補的である；
ストレプトアビジン酵素コンジュゲート、続いて基質とインキュベートする（ここで前記基質にストレプトアビジン酵素コンジュゲートが作用する）；
前記大環状ラパフシン・ライブラリー由来の化合物が有る場合の MIF の吸光度と、前記大環状ラパフシン・ライブラリー由来の化合物が無い場合の MIF の吸光度とを比較する；及び、
吸光度の変化に基づいて、前記化合物が阻害剤であるかどうかを判定する；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許法第 119 条(e) の利益を、2016 年 9 月 2 日に出願された米国仮特許出願第 62/383,209 号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づき主張する。
【０００２】
＜助成金の情報＞
この発明は、米国国立衛生研究所の助成金 K99/R00 NS078049、DA000266、R01 NS067525、R37 NS067525、及び NS38377 の下で米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、広くマクロファージ遊走阻害因子（MIF）に関するものであり、より具体的には疾患の治療における MIF 阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリ（ADP-リボース）（PAR）ポリメラーゼ-1（PARP-1）は、DNA 損傷によって活性化される重要な核にある酵素であり、DNA 修復を促進する（1）。PARP-1 の過剰な活性化は、パータナトス（parthanatos）と呼ばれる内因性であるカスパーゼ非依存性細胞死プログラムを引き起こし（2、3）、これは脳梗塞及び心筋梗塞後の虚血‐再潅流傷害、炎症性傷害、活性酸素種による傷害、グルタミン酸興奮毒性、並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病等の神経変性疾患等（2、4、6）を含む多くの臓器系における多数の毒性傷害後に（4、5）、顕著な役割を果たす。PARP-1 が重要な細胞死メディエーターであるという考えと合致して、PARP 阻害剤又は PARP-1 の遺伝子欠失は、これら及び他の細胞傷害パラダイム及びヒト疾患のモデルに対して極めて防御的に働く（2、4、5、7）。
【０００５】
パータナトスの根底にある分子機構には、ミトコンドリアから PARP-依存性アポトーシス誘導因子（apoptosis-inducing factor（AIF））が放出されること、及び核へ移行して、その結果、DNA が 20-50 kb のフラグメントに断片化されること、が含まれる（2、8-11）。AIF 自体には明らかなヌクレアーゼ活性はない（2）。線虫（Cenorhabditis elegans（C. elegans））のエンドヌクレアーゼ G（EndoG）ホモログである CED-3 プロテアーゼ・サプレッサー（CED-3 Protease Suppressor（CPS））-6 が、ワーム AIF ホモログ（worm AIF Homolog（WAH-1））と協同して DNA 分解を促進することが示唆されてきている（12）。しかし、EndoG は、哺乳動物における一過性局所脳虚血後の PARP-依存性クロマチン分解及び細胞死において必須の役割を果たしてはいないようである（13）。パータナトスの際のクロマチン分解を担うヌクレアーゼは知られていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明は、PARP-1 依存性 AIF-関連ヌクレアーゼ（PARP-1 dependent AIF-associated nuclease（PAAN））として、マクロファージ遊走阻害因子（MIF）を同定したことに基づく。
【０００７】
ある実施形態では、本発明は、被験体においてポリ［ADP-リボース］ポリメラーゼ 1（PARP-1）活性化が増加することに関連した疾患の治療方法を提供する。前記方法は、前記被験体に、治療有効量のマクロファージ遊走阻害因子（MIF）ヌクレアーゼ活性の阻害剤を投与し、それによって疾患の症状を治療又は緩和することを含む。
【０００８】
ある態様では、前記疾患は炎症性疾患である。別の態様では、前記炎症性疾患は、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息アテローム性動脈硬化症（asthma atherosclerosis）、クローン病、大腸炎、皮膚炎憩室炎（dermatitis diverticulitis）、線維筋痛、肝炎、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス、腎炎、潰瘍性大腸炎又はパーキンソン病、である。
【０００９】
ある実施形態では、前記阻害剤は、大環状ラパフシン化合物であり、例えばハイブリッド大環状ラパフシン・ライブラリーに由来する。
【００１０】
本発明はまた、一本鎖でアミン修飾をした MIF の標的 DNA を表面に固定化し、その後、大環状ラパフシン・ライブラリー由来の化合物が有り又は無しの状態で MIF をインキュベートし；前記一本鎖でアミン修飾をした MIF の標的 DNA を、前記一本鎖でアミン修飾をした MIF の標的 DNA に相補的であるビオチン化 DNA とハイブリダイズさせ、その後ストレプトアビジン酵素コンジュゲート、続いて基質とインキュベートする（ここで前記基質にストレプトアビジン酵素コンジュゲートが作用する）、等の工程等を含む、マクロファージ遊走阻害因子（MIF）阻害剤をスクリーニングする方法、を提供する。吸光度の変化に基づいて、前記化合物が阻害剤であるかどうかを判定するために、前記大環状ラパフシン・ライブラリー由来の化合物が有る場合の MIF の吸光度を前記大環状ラパフシン・ライブラリー由来の化合物が無い場合の MIF の吸光度と比較する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】PARP-1 依存性細胞死を媒介する重要な細胞死エフェクターとしての MIF の同定。（A）PARP-1 依存性細胞死に関与する AIF 関連タンパク質を同定するための戦略。（B）MNNG 処理（50 μM、15 分）24 時間後の HeLa 細胞における、siRNA ベースの PARP-1 依存性細胞生存率ハイ‐スループット・スクリーニング（n=8）。この実験は、4 回の独立した試験として繰り返した。（C）MIF の PD-D/E(X)K ドメインの概略図。（Ｄ）ヒト MIF のヌクレアーゼ・ドメインと他のヌクレアーゼとのアライメント（alignment）。その配列の上の矢印はβ‐鎖を示し、長方形はα‐ヘリックスを表す。変異したアミノ酸残基を矢印と数字で示す（結果を参照）。ヌクレアーゼ及び CxxCxxHx(n)C ドメインを、それぞれ緑色及びピンク色で強調表示する。（Ｅ）MIF 三量体（pdb:1GD0）（左）及び三量体中の MIF PD-D/E(x)K モチーフ（右）の結晶構造。
【図２】MIF はゲノム DNA を切断する新規なヌクレアーゼである。（Ａ）pcDNA を基質として用いた in vitroMIF ヌクレアーゼ・アッセイ。（Ｂ）EDTA（50 mM）有り又は無しで Mg2+（10 mM）、又は EDTA（25 mM）有り又は無しで Ca2+（2 mM）を含有する緩衝液中、基質として、ヒト・ゲノム DNA を使用する in vitro パルス‐フィールド・ゲル電気泳動‐MIF ヌクレアーゼ・アッセイ。（Ｃ）DPQ（30 μM）又は ISO-1（100 μM）で処理した、又は処理していない MIF 欠損 HeLa 細胞及び野生型 HeLa 細胞における MNNG-誘導性 DNA 損傷のパルス‐フィールド・ゲル電気泳動アッセイ。（Ｄ）基質としてヒト・ゲノム DNA を用いた MIF WT 及び MIF 変異体のヌクレアーゼ・アッセイ。
【図３】MIF は一本鎖 DNA に結合して切断する。（Ａ）ChIP-seq により決定した MIF DNA 結合モチーフ。（Ｂ）MIF は ssDNA に結合するが、二本鎖 DNA には結合せず、構造特異性を有する。異なる構造又は異なる配列を有する 5’ ビオチン標識した小 DNA 基質を前記 EMSA アッセイにおいて使用した（基質の図示については図１９、配列については表１を参照）。（Ｃ）MIF はステム・ループ ssDNA の 3’ 末端の不対塩基を構造特異的に切断する。異なる構造又は異なる配列を有する 5’ 又は 3’ ビオチン標識した小 DNA 基質を前記ヌクレアーゼ・アッセイにおいて使用した（基質の図示については図１９、配列については表１を参照）。3 回、独立して調製し、精製した MIF タンパク質を用いて実験を 4 回繰り返した。（Ｄ）MIF は、非標識 PS30 及び 3F1 基質から 3’ 不対塩基を切断する。ラダー 1 と 2 を、PS30 とその 3’ ヌクレオチドを 1 つずつ除去することによる切断産物を使用して、カスタマイズした。ラダー 1 は PS30, PS28, PS26, PS24, PS22 及び PS20 を用いて調製した。ラダー 2 は PS29, PS27, PS25, PS23 及び PS21 を用いて調製した。（Ｅ）非標識 PS30及び 3F1 基質上の MIF 切断部位。
【図４】AIF は、NMDA  処理後に MIF を核に集めるのに必要である。（Ａ）AIF に結合した固定化 GST-MIF WT 及び GST-MIF 変異体の GST-プル‐ダウン・アッセイ。（B）MIF WT 及び MIF 変異体のヌクレアーゼ活性及び AIF-結合活性。（Ｃ‐Ｄ）生理学的及び NMDA 処理条件下での皮質神経細胞における MIF 及び AIF の免疫共沈降。星印は IgG を示す。（Ｅ-Ｇ）野生型、AIF ノックダウン及び MIF ノックダウン皮質神経細胞における NMDA 処理後の AIF 及び MIF の核内移行。核除去後画分（postnuclear fraction（PN））及び核画分（nuclear fraction（N））における AIF 及び MIF シグナルの強度をＧに示す。（Ｈ）WT 及び KO 神経細胞における MIF の発現。（Ｉ）NMDA 処理後の皮質神経細胞における Flag タグ付き MIF 変異体及び AIF の免疫共沈降。（Ｊ‐Ｌ）、MIF KO 皮質神経細胞における NMDA 処理後の AIF 並びに外因性 MIF WT 及び MIF 変異体の核内移行。スケール・バー、20 μm。核除去後画分（postnuclear fraction（PN））及び核画分（nuclear fraction（N））における AIF 及び MIF シグナルの強度をＬに示す。平均値±SEM を示す。実験は少なくとも 3 回繰り返した。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、スチューデントの t 検定（Ｄ）及び一元配置分散分析（Ｇ、Ｌ）。
【図５】MIF ヌクレアーゼ活性は、in vitro 及び in vivo での DNA 損傷及び虚血性神経細胞死に重要である。（Ａ）MIF WT、KO 及び MIF WT、E22Q 又は E22A を発現する KO 皮質神経細胞における、NMDA（500 μM、5 分）-誘導性細胞傷害。（Ｂ）MIF WT、KO 及び MIF WT、E22Q 又は E22A を発現する KO 神経細胞における、コメット・アッセイによって測定した、処理 6 時間後の NMDA-誘導性 DNA 損傷の代表的な画像。破線は頭とテール（tail）の中心を示す。スケール・バー、20 μm。（Ｃ）MIF WT 及び KO 神経細胞並びに MIF WT、E22Q 又は E22A を発現する KO 神経細胞における、処理 6 時間後の NMDA に起因する DNA 損傷のパルス‐フィールド・ゲル電気泳動アッセイ。（Ｄ）45 分の MCAO 後 24 時間での、MIF WT、KO 及び AAV2-MIF WT、E22Q 又は E22A を投与した KO マウスの TTC 染色の代表的な画像。（Ｅ）45 分の MCAO 後 1 日又は 7 日での皮質、線条体及び半球における梗塞体積の定量化。（Ｆ‐Ｇ）MCAO 手術後 1 日、3 日又は 7 日に、オープン・フィールドにより、0-5 のスケールで、神経学的欠損を評価した。WT MCAO (n = 29), KO MCAO (n= 20), KO-WT MCAO (n = 23). KO-E22Q MCAO (n = 22), KO-E22A MCAO (n = 19)。Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇにおいて、平均値±SEM を示す。* P <0.05（Ｅ，Ｆ）、*** P <0.001（Ａ，Ｅ）、一元配置分散分析。*** P <0.001（Ｇ）、異なる時点での WT 対 KO 、KO-WT 対 KO-E22Q/KO-E22A、二元配置分散分析。
【図６】大環状化合物ライブラリーを用いた MIF 阻害剤スクリーニングの確立。切断アッセイに基づく MIF 阻害剤の大環状スクリーニングの概略図。一本鎖でアミン修飾をしたオリゴヌクレオチド（MIF の標的 DNA）を DNA-BIND プレート上に固定化し、そして阻害剤が有り又は無しの状態で MIF タンパク質とインキュベートした。MIF が切断した後、そのフラグメントをビオチン標識相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そして 450 nm の吸光度をモニターして検出した。
【図７】大環状ラパフシン・ライブラリーの概略図。
【図８】MIF 阻害剤についてのスクリーニングの結果。38 枚のプレートの大環状化合物ライブラリーの MIF による切断の阻害率パーセントの散布図。青い線は MIF 無しでインキュベートした陽性対照であり、そして緑色の線は MIF と共にインキュベートした陰性対照である。右のグラフは試験した化合物のヒストグラムを表す。
【図９】MIF 阻害剤についてスクリーニングした個々の化合物の結果。MIF による切断の阻害率パーセント（Ｘ軸）及び MNNG-誘導性細胞死の阻害率（Ｙ軸）の散布図。
【図１０】4 つのヒット化合物の用量依存性についての確認。（Ａ）4 つの候補化合物を、MNNG で処理した HeLa 細胞における細胞保護について評価した。その候補化合物は用量依存的な細胞保護を示す。（Ｂ）4 つの候補化合物を TBE ゲル中での切断アッセイに供した。その候補化合物は、MIF による基質の切断を阻害しうる。
【図１１】初代皮質神経細胞を 14 日間、2 つのヒット化合物が有り又は無しの状態で PFF で処理した。画像は、2 つのヒット化合物で処理したときであり、 PFF-誘導性細胞死を示す（左）。スケール・バー、50 μm。2 つのヒット化合物による PFF-誘導性細胞死の定量化。バーは、3 回の実験での平均値±s.d. を表す。**P<0.005, ***P< 0.001（両側対応のない t 検定）。
【図１２】EndoG は、PARP-1 依存性細胞死には必要ではない。（Ａ）SH-SY5Y 細胞における CRISPR-Cas9 システムを用いたノックアウト endoG。EV は空のベクター（empty vector）。（Ｂ）ノックアウト endoG は、MNNG-誘導性細胞死に影響を及ぼさない。（Ｃ）ノックアウト endoG は MNNG によって引き起こされる DNA 損傷に影響を及ぼさない。
【図１３】MIF ノックダウンは MNNG 及び NMDA-誘導性細胞死から細胞を保護する。（Ａ）ヒト MIF shRNA1-3 IRES-GFP レンチウイルス又は非標的（NT）shRNA IRES-GFP レンチウイルスを形質導入した HeLa 細胞の代表的な画像。（Ｂ）shRNA 形質導入後の HeLa 細胞中の MIF タンパク質レベル。hMIF shRNA 1、2 及び 3 は、HeLa 細胞において MIF タンパク質を 83.3 ± 7.1%、71.6 ± 3.2 %、及び 82.7 ± 6.3% 減少させた。（Ｃ）MNNG（50 μM、15 分）-誘導性 HeLa 細胞死の定量化。平均値±SEM を示す。DMSO 対照に対して ***P < 0.001。MNNG 処理した WT に対して ###P < 0.001。（Ｄ）マウス MIF shRNA1-3 IRES-GFP 又は非標的（NT）shRNA IRES-GFP レンチウイルスで形質導入した皮質神経細胞の代表的な画像。（Ｅ）shRNA 形質導入後の皮質神経細胞中の MIF タンパク質レベル。（Ｆ）MIF ノックダウン神経細胞における NMDA（500 μM、5 分）-誘導性神経細胞死の定量化。mMIF shRNA 1、2 及び 3 は、皮質神経細胞において MIF タンパク質を 84.5 ± 8.2 %、90.1 ± 7.1 %、及び 92.2 ± 3.3 % 減少させた。平均値±SEM を示す。CSS 対照に対して ***P < 0.001。NMDA 処理した WT に対して ###P < 0.001。（Ｇ）皮質神経細胞における MIF ノックダウン及び MIF 変異体（これらは shRNA 1 及び 3 に耐性がある）の過剰発現での代表的な免疫ブロット。（Ｈ）MIF ノックダウン皮質神経細胞及び MIF 変異体（これらは shRNA 1 及び 3 に対して耐性がある）を過剰発現している細胞における NMDA-誘導性神経細胞死の定量。平均値±SEM を示す。CSS 対照に対して ***P < 0.001。NMDA 処理した WT に対して ###P < 0.001、一元配置分散分析。スケール・バー、100 μm。MIF シグナルの強度をＣ、Ｆ及びＨに示す。この実験は 3 回の独立した試験として繰り返した。
【図１４】MIF は PD-D/E(x)K ヌクレアーゼ・モチーフを含む。（Ａ）ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ及びトガリネズミ由来の MIF のヌクレアーゼ・ドメインのアラインメント。（Ｂ）ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、及びトガリネズミ由来の MIF の CxxCxxHx(n)C ドメインのアラインメント。（Ｃ）PD-D/E(x)K ヌクレアーゼにおける活性部位の保存されたトポロジー。Kosinski ら（18）のものを修正した画像。アルファ・ヘリックスを円として、そしてβ‐鎖を三角形として示す。β‐鎖の配向性は、平行又は逆平行を示す。（Ｄ）MIF 三量体（pdb:1GD0）の結晶構造。各単量体を異なる色で示す。（Ｅ）PD-D/E(x)K モチーフと類似する様々なドメインの配向性を示す MIF 三量体のトポロジー。（Ｆ）2 つの単量体を隠すことによって三量体から取り出した（Ｄ中の赤い破線）PD-D/E(x)K ドメインを含む MIF 単量体の結晶構造。（Ｇ）MIF 三量体中の MIF 単量体のトポロジー。（Ｈ）各単量体には PD-D/E(x)K ドメインがあることを図示する。前記PD-D/E(x)K モチーフは、1 つの単量体に由来する 2 本の平行β‐鎖（β4 及びβ5）と隣接する単量体に由来する 2 本の逆平行鎖（β6 及びβ7）とからなる。（Ｉ）MIF 三量体中の MIF 単量体と EcoRV のトポロジーにおける類似性の概略図であり、それらのヌクレアーゼ・ドメイン中の様々なドメインが類似の配向性であることを示す。アルファ・ヘリックスを円として、そしてβ‐鎖を三角形として示す。（Ｊ）EcoRV 単量体のトポロジー。（Ｋ）MIF 三量体中の MIF 単量体と EcoRV 単量体（赤）とのアライメント。（Ｌ‐Ｏ）MIF 並びに EcoRI（マゼンタ、pdb:1QC9）、EcoRV（水色、pdb:1SX8）、ExoIII（赤、pdb:1AK0）、及び PvuII（オレンジ、pdb:1PVU）等の他の周知のヌクレーアーゼにおけるPD-D/E(x)K モチーフのアラインメント。5 つのモチーフ全てが、典型的なPD-D/E(x)K モチーフ活性部位において観察されるように、アルファ・ヘリックスに向かって、ベータ‐シート中の 4 つのβ‐鎖の配向性は類似していることを示す。
【図１５】MIF は新規ヌクレアーゼである。（Ａ）10 mM MgCl2を含む pH 7.0 の Tris-HCl 緩衝液中で、ヒト・ゲノム DNA（hgDNA、200 ng）と、37 ℃ 4 時間、インキュベーションしたときの MIF の濃度依存性。（Ｂ）10 mM MgCl2を含む pH 7.0 の Tris-HCl 緩衝液中で、37 ℃で、hgDNA と、MIF をインキュベーション（4 μM）した時間経過。（Ｃ）Tris-HCl pH 7.0 緩衝液中で hgDNA と MIF（8 μM）とを異なるイオンと共に、37 ℃で 4 時間、インキュベーション。（Ｄ）ヒト・ゲノム DNA を基質として用いた、精製タンパク質（4 μM）の in vitroパルス‐フィールド・ゲル電気泳動‐ヌクレアーゼ・アッセイ。（Ｅ）異なる精製した MIF 変異体（MIF のアミノ酸配列の図示については図１Ｄを参照のこと）を、10 mM MgCl2を含む pH 7.0 の Tris-HCl 緩衝液中で hgDNA と、37 ℃で 4 時間、インキュベートした。精製した MIF WT タンパク質及び MIF 変異体タンパク質のクマシー・ブルー染色を示す（下パネル）。（Ｆ）グルタミン酸残基を、グルタミン、アスパラギン酸及びアラニンに変異させた。（Ｇ）精製した MIF WT タンパク質及び MIF 変異体タンパク質のクマシー・ブルー染色。（Ｈ）異なる精製した MIF 変異体（変異の図示については図１Ｄ参照）を、10 mM MgCl2 を含む pH 7.0 の Tris-HCl 緩衝液中で、37 ℃で 4 時間、hgDNA とインキュベートした。精製 MIF WT タンパク質及び MIF 変異体タンパク質のクマシー・ブルー染色を示す（下パネル）。3 つの独立した調製物中で精製された MIF タンパク質を用いて、この実験を繰り返した。
【図１６】タンパク質の折り畳み及び酵素活性に対する MIF 突然変異の影響。（Ａ）MIF タンパク質のオキシドレダクターゼ活性。（Ｂ）MIF タンパク質のトートメラーゼ活性。B 及び C では、平均値±SEM を示す。**P < 0.01、一元配置分散分析。（Ｃ）MIF タンパク質（野生型、E22Q 及び E22A）（実線）及びタンパク質標準（破線）の FPLC プロファイル。（Ｄ）FPLC 後の MIF 画分のクマシー・ブルー染色。（Ｅ‐Ｍ）塩化マグネシウム（Mg）及び／又は塩化亜鉛（Zn）の存在下及び非存在下での精製した MIF 組換えタンパク質の UV-CD 解析。3 つの独立した調製物から精製した MIF を用いて実験を 3 回繰り返した。
【図１７】ChIP-seq による MIF-DNA 結合の特徴付け。（Ａ）超音波処理したクロマチンの断片は、DMSO 及び MNNG 処理細胞において、ChIP-seq で 100-200 bp の範囲にある。（Ｂ）MIF ChIP の代表的な免疫ブロット画像。（Ｃ）DMSO 又は MNNG（50 μM）処理細胞から調製した DNA インプット（input）及び MIF の ChIP サンプル等の 4 つの異なるライブラリーからのリード（read）数及び範囲。（Ｄ）MNNG 処理細胞における異なるゲノム領域にわたる MIF の ChIP ピークの分布。円グラフは、MIF が遺伝子のプロモーターに結合する傾向があることを示している（ChIP 領域の約 36 ％がプロモーター内にある）。（Ｅ‐Ｆ）2 つの異なる染色体ウィンドウ・サイズで示される、ゲノム上で MIF が富化（enrichment）していることの代表的な IGV 可視化。上の 2 行は、DMSO と MNNG で処理した細胞からの ChIP-seq データの tdf ファイルを示す。3 行目と 4 行目は、DMSO と MNNG で処理したサンプルのベッド・ファイルを示す。ピークは、MNNG 処理サンプルでのみ観察され、DMSO 処理サンプルでは観察されなかった。最後の行は hg19 の対照となる遺伝子を示す。（Ｇ）DMSO 及び MNNG 処理細胞において MIF クロマチンが富化していることを、qPCR により、非 P（非ピーク領域）、P55101、P66005、P65892、P36229、P46426 及び P62750（ピーク領域）について検討した。
【図１８】MIF は一本鎖 DNA に結合する。（Ａ）MIF DNA 結合モチーフのアラインメント。（Ｂ）溝／結合ポケット（矢印）を示す MIF 三量体（PDB 登録 1FIM）表面の画像（上パネル）。溝内に dsDNA を有する MIF 三量体のモデル（中央パネル）。中央パネルの右の画像は、MIF-ssDNA（PDB 登録 2RPD）モデルと MIF-dsDNA（PDB 登録 1BNA）を重ね合わせた側面図を示す。i-iii、絵の画像は、残基 P16 及び D17 が dsDNA 及び ssDNA に近接しているのに対して、E22 は ssDNA に近接しているが dsDNA には近接していないことを示している。（Ｃ）Mg2+又は非標識 PS30 の存在下又は非存在下で、MIF がその一本鎖 5’ ビオチン標識した DNA 結合モチーフ（PS30）に結合することを示す EMSA。MIF がその DNA 基質に結合することは MIF 抗体によって破壊されるが、一方で、MIF 突然変異体 E22A、E22Q、P16A、D17A、D17Q は依然としてその DNA 基質に結合する。3 つの独立した調製物から精製した MIF タンパク質を用いて実験を 4 回繰り返した。
【図１９】結合アッセイ及び切断アッセイに使用した異なるビオチン標識した DNA 基質の二次構造。
【図２０】MIF は構造特異的ヌクレアーゼ活性でステム・ループ ssDNA を切断する。（Ａ）dsPS100 を基質として用いた MIF ヌクレアーゼ・アッセイ。（Ｂ）基質として ssPS100 及びその相補鎖 ssPS100Rを用いる MIF ヌクレアーゼ・アッセイ。（Ｃ）MIF（1-4 μM）は、dsPS30、その配列関連基質‐dsRF、及び非関連基質‐dsL3 を用いたところ、二本鎖 DNA に対する明らかなヌクレアーゼ活性を有さない。（Ｄ）MIF（0.5-4 μM）は濃度依存的に dsPS30、dsRF、dsL3 を切断することができない。（Ｅ）Mg2+は、ssPS30 を基質として用いたときに MIF ヌクレアーゼ活性に必要である。（Ｆ‐Ｈ）MIF（2 μM）は濃度依存的及び時間依存的に ssPS30を切断する。
【図２１】MIF は AIF と結合し、核へ一緒に移行する。（Ａ）結合アッセイにおいて使用した GST-AIF の部分欠損タンパク質の概略図。（Ｂ）抗 MIF 抗体を用いたウエスタン・ブロットにより可視化された GST プル‐ダウン・アッセイ（上のパネル）。そのプル‐ダウン実験で使用した GST 融合 AIF 部分欠損タンパク質のクマシー・ブルー染色（下のパネル）。（Ｃ）抗 MIF 抗体を用いたウエスタン・ブロットにより可視化した AIF 変異体のプル‐ダウン・アッセイ。（Ｄ）グルタチオン・ビーズ上の GST-MIF 及びその変異体は AIF タンパク質をプル‐ダウンした。この実験を 3 つの独立した試験で再現した。（Ｅ‐Ｇ）HeLa 細胞において、PARP 阻害剤 DPQ（30 μM）の存在下又は非存在下での、MNNG 処理後の AIF 及び MIF の核内移行。これは（Ｅ）免疫染色及び（Ｆ‐Ｇ）細胞内分画によって測定した。スケール・バー、20 μm。この実験は 3 つの独立した試験で再現した。*** P <0.001、一元配置分散分析。（Ｈ‐Ｊ）皮質神経細胞において、PARP 阻害剤 DPQ 又は nNOS 阻害剤ニトロ‐アルギニン（N-Arg、100 μM）の存在下又は非存在下での、NMDA 処理後の AIF 及び MIF の核内移行。これは細胞内分画によって測定した。MIF 及び AIF シグナルの強度をＩ及びＪに示す。この実験を 3 つの独立した試験で再現した。この実験を 3 つの独立した試験で再現した。*** P <0.001、一元配置分散分析。
【図２２】MIF ヌクレアーゼ活性は、皮質神経細胞における NMDA-誘導性 DNA 損傷及び PARP-1 依存性細胞死にとって重要である。（Ａ）MIF WT 皮質神経細胞、KO 皮質神経細胞、及び MIF WT、E22Q 又は E22A を発現するレンチウイルス形質導入 MIF KO 皮質神経細胞における NMDA-誘導性細胞傷害の代表的な画像。スケール・バー、200 μm。（Ｂ‐Ｄ）コメット・アッセイによって測定した処理 6 時間後の NMDA-誘導性 DNA 損傷の定量化。（Ｂ）テール（tail）陽性神経細胞の %、（Ｃ）テールの長さ、及び（Ｄ）テール中の DNA の %。
【図２３】MIF は、HeLa 細胞における MNNG-誘導性 DNA 損傷に重要である。（Ａ）WT HeLa 細胞、NT shRNA 又は MIF shRNA レンチウイルス形質導入 HeLa 細胞におけるコメット・アッセイによって測定した MNNG-誘導性 DNA 損傷の代表的な画像。破線は頭とテールの中心を示す。スケール・バー、20 μm。（Ｂ‐Ｄ）（Ｂ）テール陽性細胞の %、、（Ｃ）テールの長さ、及び（Ｄ）テール中の DNA の %。ｂ‐ｄでは、平均値±SEM を示す。*** P <0.001、### P <0.001、一元配置分散分析。この実験を 3 つの独立した試験で再現した。
【図２４】MIF ヌクレアーゼ活性は in vivoの脳梗塞におけるパータナトスに必要である。（Ａ）トリパン・ブルー染料の脳室内（ICV）投与。（Ｂ）投与の 79 日後の（ｉ）皮質、（ｉｉ）線条体及び（ｉｉｉ＆ｉｖ）海馬における AAV2-MIF WT の発現の代表的な免疫染色像。スケール・バー、50 μm。（Ｃ）WT（n=16）、MIF KO（n=12）、MIF KO-WT（n=11）、MIF KO-E22Q（n=11）及び MIF KO-E22A（n=11）マウスにおける、虚血領域の中心部の側頭頂皮質にわたって測定されたレーザー‐ドップラー血流。（Ｄ‐Ｅ）45 分の MCAO の 1 日後又は 7 日後の皮質、線条体及び半球における梗塞体積の定量化。（Ｆ）45 分の MCAO 手術の 1、3 及び 7 日後のコーナー・テストにおいて右ターン（turn）の % によって、神経学的欠損を評価した。WT MCAO（n=16）、KO MCAO（n=12）、KO-WT MCAO（n=16）。KO-E22Q MCAO（n=16）、KO-E22A MCAO（n=16）。平均値±SEM を示す。*P < 0.05、脳梗塞前を対照、一元配置分散分析。（Ｇ）MIF WT、KO 及び AAV2-MIF WT、E22Q 又は E22A を投与した KO マウスにおける、MCAO 後のペナンブラ（penumbra）での、MCAO 手術の 1 日後、3 日後又は 7 日後の、AIF（赤）及び MIF（緑）の核移行並びに（Ｈ）パルス・フィールド・ゲル電気泳動により測定される DNA 断片化。WT MCAO（n=29）、KO MCAO（n=20）、KO-WT MCAO（n=23）。KO-E22Q MCAO（n=22）、KO-E22A MCAO（n=19）。Ｄ‐Ｆでは、平均値±SEM を示す。*P < 0.05（Ｅ）、***P < 0.001（Ｄ、Ｆ）、対照又はベースライン、一元配置分散分析。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、PARP-1 依存性AIF-関連ヌクレアーゼ（PAAN）としてのマクロファージ遊走阻害因子（MIF）の同定に基づく。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、化合物の「治療有効量(therapeutically effective amount)」は、疾患又は障害の治療において使用される活性成分の量を適格化することを意図している。この量によって、前記疾患又は障害を軽減又は排除するという目的を達成するであろう。当業者にはよく知られているように、正確な投与量及び投与頻度は、使用する本発明の具体的な化合物、治療する具体的な症状、治療する症状の重症度、具体的な被験体の年齢、体重及び一般的な健康状態、並びにその患者が服用している可能性がある他の薬物に依存する。更に、前記「治療有効量(therapeutically effective amount)」は、治療を受ける被験体の反応に応じて及び／又は本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて増減されることがある。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、被験体の「治療すること（treating）」又は「治療（treatment）」に言及することは、予防を含むことを意図している。用語「被験体（subject）」は、ヒト等を含む全ての哺乳動物を意味する。被験体の例には、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、及びウサギが含まれる。好ましくは、前記被験体はヒトである。
【００１５】
本発明の化合物に加えて、化学療法剤、抗炎症剤、及び治療用抗体等を含む他の治療用化合物を、本発明の化合物による治療の前に、それと同時に又はその後に使用することがあることを当業者は認識するであろう。限定するものではないが、化学療法剤には、メトトレキサート等の代謝拮抗剤、シスプラチン／カルボプラチン等の DNA 架橋剤；カンブシル（canbusil）等のアルキル化剤；ダクチノマイシン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；タキソール（パクリタキソール）等の微小管阻害剤等、が含まれる。他の化学療法剤としては、例えば、ビンカアルカロイド、マイトマイシン系抗生物質、ブレオマイシン系抗生物質、抗葉酸剤、コルヒチン、デメコリン、エトポシド、タキサン、アントラサイクリン系抗生物質、ドキソルビシン、ダウノルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、4-ジメトキシ‐ダウノマイシン、11-デオキシダウノルビシン、13-デオキシダウノルビシン、アドリアマイシン-14-ベンゾエート、アドリアマイシン-14-オクタノエート、アドリアマイシン-14-ナフタレンアセテート、アムサクリン、カルムスチン、シクロホスファミド、シタラビン、エトポシド、ロバスタチン、メルファラン、トポテカン（topetecan）、オキサリプラチン（oxalaplatin）、クロラムブシル、メトトレキサート（methtrexate）、ロムスチン、チオグアニン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、又はメクロレタミン、が挙げられる。限定するものではないが、治療用抗体には、トラスツズマブ等の HER2 タンパク質に対する抗体；血管内皮増殖因子を標的とするベバシズマブ、及び上皮増殖因子を標的とする OSI-774 等の増殖因子又は増殖因子受容体を標的とする抗体；Vitaxin（MEDI-522 としても知られる）等のインテグリン受容体を標的とする抗体、等が挙げられる。本発明の組成物及び方法での使用に適した抗がん剤のクラスには、限定されるものではないが、以下が含まれる：１）微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビンデシン等）、微小管安定化剤（例えば、パクリタキセル［タキソール］、及びドセタキセル、タキソテール等）を含むアルカロイド、並びにエピポドフィロトキシン（例えばエトポシド［VP-16］及びテニポシド［VM-26］等）、トポイソメラーゼＩを標的とする薬剤（例えば、カンプトテシン及びイシリノテカン［CPT-11］等）等のトポイソメラーゼ阻害剤等を含む、クロマチン機能阻害剤；２）ナイトロジェン・マスタード（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、及びブスルファン［ミレラン］等）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、及びセムスチン等）、並びに他のアルキル化剤（例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、及びミトシシン等）等を含む、共有結合性 DNA 結合剤［アルキル化剤］；３）核酸阻害剤（例えばダクチノマイシン［アクチノマイシン D］等）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン［ダウノマイシン及びセルビジン］、ドキソルビシン［アドリアマイシン］、及びイダルビシン［イダマイシン］等）、アントラセンジオン（例えば、［ミトキサントロン］等のアントラサイクリン類似体）、ブレオマイシン（ブ��オキサン）等、並びにプリカマイシン（ミトラマイシン）等を含む、非共有結合性 DNA 結合剤［抗腫瘍抗生物質］；４）葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ホレックス（Folex）及びメキセート（Mexate）等）、プリン代謝拮抗剤（例えば、6-メルカプトプリン［6-MP、プリネトール］、6-チオグアニン［6-TG］、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、2-クロロデオキシアデノシン［CdA］、及び 2’-デオキシコホルマイシン［ペントスタチン］等）、ピリミジン拮抗薬（例、フルオロピリミジン［例、5-フルオロウラシル（アドルシル）、5-フルオロデオキシウリジン（FdUrd）（フロックスウリジン）］等）、並びにシトシン・アラビノシド（例えば、サイトサール［アラ-C］及びフルダラビン等）等を含む、代謝拮抗剤；５）L-アスパラギナーゼ等を含む、酵素；６）グルココルチコイド等を含み、例えば抗エストロゲン薬（例えばタモキシフェン等）、非ステロイド性抗アンドロゲン薬（例えばフルタミド等）、及びアロマターゼ阻害薬（例えばアナストロゾール［アリミデックス］等）等の、ホルモン；７）白金化合物（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン等）；８）抗がん剤、毒素、及び／又は放射性核種等と結合したモノクローナル抗体；９）生物学的応答調節剤（例えば、インターフェロン［例えば、IFN-α 等］及びインターロイキン［例えば、IL-2 等］等）；１０）養子免疫療法；１１）造血増殖因子；１２）腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オール‐トランス‐レチノイン酸等）；１３）遺伝子治療技術；１４）アンチセンス療法技術；１５）腫瘍ワクチン；１６）腫瘍転移に対する治療法（例えば、バチミスタット等）；並びに１７）血管新生阻害剤。
【００１６】
他の治療剤の例には、以下が含まれる：シクロスポリン（例えばシクロスポリン A）、CTLA4-Ig、ICAM-3、抗 IL-2 受容体（抗-Tac）、抗 CD45RB、抗 CD2、抗 CD3（OKT-3）、抗 CD4、抗 CD80、抗 CD86等の抗体、CD40 及び／又は gp39（即ち、CD154）に特異的な抗体、CD40 及び gp39 から構築される融合タンパク質（CD40Ig 及び CD8 gp39）等の CD40 と gp39 との間の結合を阻害する薬剤、デオキシスペルグアリン（DSG）等の核移行阻害剤等の NF-κB 機能の阻害剤、HMG CoA レダクターゼ阻害剤（ロバスタチン及びシンバスタチン）等のコレステロール生合成阻害剤、イブプロフェン、及びロフェコキシブ等のシクロオキシゲナーゼ阻害剤等の非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、プレドニゾン又はデキサメタゾン等のステロイド、金化合物、メトトレキセート、FK506（タクロリムス、プログラフ）、ミコフェノール酸モフェチル等の抗増殖剤、アザチオプリン及びシクロホスファミド等の細胞毒性薬、テニダップ、抗 TNF 抗体又は可溶性 TNF 受容体等の TNF-α阻害剤、並びにラパマイシン（シロリムス又はラパミューン）、或いはそれらの誘導体。
【００１７】
本発明の組成物及び方法と組み合わせて投与することがある他の薬剤には、サイトカイン、免疫調節剤及び抗体等のタンパク質治療剤等が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン（cytokine）」は、ケモカイン、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、及び受容体関連タンパク質、並びにそれらの機能的フラグメントを包含する。本明細書中で使用される場合、用語「機能的フラグメント（functional fragment）」とは、規定の機能的アッセイを通して同定される生物学的機能又は活性を有するポリペプチド又はペプチドをいう。
【００１８】
前記サイトカインには、内皮単球活性化ポリペプチド II（endothelial monocyte activating polypeptide II (EMAP-II)）、顆粒球‐マクロファージ‐CSF（GM-CSF）、顆粒球‐CSF（G-CSF）、マクロファージ‐CSF（M-CSF）、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12 及び IL-13、インターフェロン等、が含まれ、細胞又は細胞のメカニズムにおける特定の生物学的、形態学的、又は表現型の変化に関連する。
【００１９】
ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ-1（PARP-1）の阻害又は遺伝的欠失は、多くの臓器系におけるいくつかの毒性の傷害に対して極めて防御的である。PARP-1 依存性細胞死の根底にある分子メカニズムには、ミトコンドリアのアポトーシス誘導因子（AIF）が放出されて核へ移行し、その結果クロマチンが分解することが含まれる。AIF がどのようにクロマチン分解及び細胞死を誘導するのかはわかっていない。本発明は、マクロファージ遊走阻害因子（MIF）を、Mg2+/Ca2+-依存的ヌクレアーゼ活性を有するPARP-1  依存性 AIF 関連ヌクレアーゼ（PARP-1 dependent AIF-associated nuclease（PAAN））として同定する。AIF は、MIF がゲノム DNA を 20-50 kb のフラグメントに切断する場所である核へ、MIF を集めるのに必要とされる。MIF を欠損させること、AIF-MIF 結合を壊すこと、又は触媒性ヌクレアーゼ・ドメインにおいて E22 から Q22 へ変異させることは、MIF のヌクレアーゼ活性を遮断し、神経細胞培養におけるグルタミン酸興奮毒性、及びマウスにおける脳梗塞後のクロマチン分解及び細胞死を阻害する。MIF のヌクレアーゼ活性を阻害することは、過剰な PARP-1 活性化による疾患の重要な治療標的になる可能性がある。
【００２０】
MIF は、MNNG 又はNMDA 興奮毒性によって誘導される PARP-1 依存性の細胞死に必要であると考えられる。
【実施例】
【００２１】
以前の知見と合致して（13、14）、EndoG は、PARP-1 依存性の大きな DNA 断片化及び MNNG 誘導性の細胞死には重要ではない（図１２）。PARP-1  依存性 AIF 関連ヌクレアーゼ（PARP-1 dependent AIF-associated nuclease（PAAN））を同定するために、16K 及び 5K プロテイン・チップ（15）を組換え AIF をプローブとして調べた。HeLa 細胞培養において MNNG によって誘導されるパータナトス（パータナトスの研究がなされる、良く知られた方法（2、11、12））の修飾因子を同定するために、最も強い AIF との結合物質のうちの 160 個について、siRNA に基づくスクリーニングを進めた（図１、Ａ及びＢ）。これらの AIF 結合物質は、それらをノックダウンしたときに PARP-1 のノックダウンと同等の保護が提供されること、及びヌクレアーゼ活性がある可能性と合致する配列及び構造的な相同性をそれらが示すかどうかに基づいて更に分離した。AIF 結合物質 18 のノックダウンは、PARP-1 ノックダウンと同程度に防御的であることが見出された（図１Ｂ）。AIF 結合物質 18 は、以前から様々な同義語で知られており、マクロファージ遊走阻害因子（MIF 又は MMIF）として総称されている（16、17）。ヒト及びマウス MIF に対する 3 つの異なる shRNA 構築物を利用して、MIF のノックダウンが、HeLa 細胞における MNNG 毒性又はマウス初代皮質神経細胞における NMDA 興奮毒性によって誘導されるパータナトスから保護することを確認した（図１３、Ａ‐Ｆ）。shRNA に由来するオフ‐ターゲット効果を排除するために、shRNA 1（RshRNA 1）及び 3（RshRNA 3）に耐性のある MIF 構築物を作製し、ノックダウンに対して抵抗性であることを示した（図１３Ｇ）。これらの耐性 MIF 構築物によって、内因性 MIF をノックダウンさせた状況において NMDA 興奮毒性が再び表れるようになり（図１３Ｈ）、MIF が MNNG 又は NMDA によって誘導されるパータナトスに必要であることが確認される。
【００２２】
MIF は、多くのヌクレアーゼに見出され（18-20）（図１、Ｃ及びＤ）、哺乳動物種にわたって高度に保存されている（図１４Ａ）3 つの PD-D/E(X)K モチーフを含む。更に、それは CxxCxxHx(n)C ジンク・フィンガー・ドメイン（zinc finger domain）を含み（図１Ｃ及び図１４Ｂ）、これは DNA 損傷応答タンパク質に一般的に見られる（20）。MIF は三量体として存在することが知られている（21-23）。MIF 三量体中のコア PD-D/E(X)K トポロジー構造は、2 本のα−鎖に隣接する 4 本のβ−鎖からなる（図１Ｅ及び図１４、Ｃ‐Ｇ）。これは、EcoRI、EcoRV、ExoIII 及び PvuII 等を含む、よく知られているヌクレアーゼのものと類似している（図１４、ＨからＯ）。これらの配列解析及び 3D モデリングの結果は、MIF が PD-D/E(X)K ヌクレアーゼ様スーパーファミリーに属することを示している（24、25）。
【００２３】
MIF がヌクレアーゼ活性を有するかどうかを決定するために、pcDNA プラスミドを組換え MIF と共にインキュベートした。スーパーコイル状の pcDNA は MIF によって開環状型に切断され、更にそれを線状型に切断する（図２Ａ）。更に、MIF は濃度依存的及び時間依存的にヒト・ゲノム DNA を切断する（図１５、Ａ及びＢ）。他の類似のヌクレアーゼの in vitro 活性に必要な二価カチオン濃度と同じく、10 mM Mg2+、2 mM Ca2+、又は 1 mM Mn2+の添加が MIF ヌクレアーゼ活性に必要である（26）。EDTA は、ヒト・ゲノム DNA に対する MIF のヌクレアーゼ活性を遮断する（図２Ｂ）。二価カチオンが存在しないか、又は 2-10 μMのカチオンでは、MIF はヌクレアーゼ活性を有さない（図１５Ｃ）。200 μM の Zn2+ の添加は MIF の存在下でゲノム DNA を沈殿させ、一方で、2 μMの Zn2+ では効果が無い。更に、Na+ は MIF のヌクレアーゼ活性に影響を与えない（図１５Ｃ）。重要なことに、パルス・フィールド・ゲル電気泳動の結果は、MIF がヒト・ゲノム DNA を切断し、MNNG で処理した HeLa 細胞から精製された DNA に匹敵する大きな断片にすることを示している（図２Ｂ、レーン８）。MIF を shRNA でノックダウンすると、MNNG 誘導性 DNA 切断が妨げられ、これは、3,4-ジヒドロ-5[4-(1-ピペリジニル）ブトキシ)-1(2H)-イソキノリン（DPQ）による PARP 阻害の効果と同様である（図２Ｃ）。MIF はトートメラーゼ活性を有すると頻繁に言われてきているので、MIF トートメラーゼ阻害剤である ISO-1 を評価してみた（27）。ISO-1 は MNNG 誘導性の DNA 損傷を防ぐことができない（図２Ｃ）。更に、トートメラーゼ活性を欠く MIF P2G トートメラーゼ変異体（28）は、MIF のヌクレアーゼ活性への影響は無い（図１５Ｄ）。これらのデータを総合すると、MIF はヌクレアーゼであり、それは PARP-1 依存性の DNA 断片化において重要な役割を果たすことを示している。
【００２４】
MIF のヌクレアーゼ活性にとって重要なアミノ酸残基を同定するために、MIF の PD-D/E(X)K ドメイン内の重要なアスパラギン酸、グルタミン酸及びプロリン残基に変異を入れた。グルタミン酸 22 をアラニン（E22A）又はグルタミン（E22Q）で置換すると、明らかに MIF のヌクレアーゼ活性が阻害されるが、アスパラギン酸（E22D）での置換では阻害されない（図２Ｄ、図１５、ＥからＨ）。これらのデータは、MIF の最初のα‐ヘリックスにおけるこのグルタミン酸残基（E22）がそのヌクレアーゼ活性にとって重要であることを示唆しており、これは、多くのエキソヌクレアーゼ‐エンドヌクレアーゼ‐ホスファターゼ（EEP）ドメイン・スーパーファミリー・ヌクレアーゼの最初のα‐ヘリックスにおけるこのグルタミン酸が高度に保存されており、それはヌクレアーゼ活性の活性部位である、という報告と合致する（24、25）。
【００２５】
以前の研究から、MIF がオキシドレダクターゼ活性及びトートメラーゼ活性の両方を有することが示されている（27、29、30）。MIF 活性部位変異 E22Q 及び E22A は、MIF のオキシドレダクターゼ活性又はトートメラーゼ活性には、はっきりと分かるような影響を及ぼさず（図１６、Ａ及びＢ）、MIFヌクレアーゼ活性はそのオキシドレダクターゼ活性及びトートメラーゼ活性から独立していることを示唆している。更に、それぞれタンパク質の二次構造及び三次構造を研究するための一般的な方法である遠紫外（UV）円偏光二色性（CD）及び近紫外 CD 分光法によって決定されるMIF のタンパク質構造は、E22Q 及び E22A 変異によって影響されないことがわかった（図１６、ＣからＭ）。MIF タンパク質の純度は、クマシー・ブルー染色、FPLC 及び質量分析（MS）アッセイによって確認した（図１５Ｇ、１６Ｃ、１６Ｄ、材料及び方法）。偶発的なヌクレアーゼ汚染は観察されなかった。
【００２６】
DMSO 又は MNNG（50 μM、15 分）で処理した HeLa 細胞において、MIF が DNA と結合するかどうかを更に研究するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイとそれに続くディープ・シークエンシング（deep sequencing）を行った（図１７）。MEME-チップを用いて、2 つのクラスの MIF 結合モチーフ（図３Ａ）を同定した。第 1 のクラス（配列１‐３）は、配列が重なる高度に関連しあったファミリーを表す（図３Ａ及び図１８Ａ）。このファミリーの配列の特徴は、配列１において最もよく捉えられていて、30 個のヌクレオチドを有するものとして同定され、PS30 と命名された、最も統計的に有意なモチーフである。同定された第 2 のクラスはポリ（A）ストレッチである。
【００２７】
P16、D17 及び E22 は同じ PD-D/E(X)K モチーフ内にある。三次元コンピュータ・モデリングによれば、MIF 上の P16 及び D17 は二本鎖 DNA（dsDNA）に近いのに対して、E22 は ssDNA に近いことを示し、MIF が ssDNA 若しくは dsDNA 又はその両方に結合する可能性があることを示す（図１８Ｂ）。2 つのクラスの MIF DNA 結合モチーフの一本鎖及び二本鎖形態の両方について、MIF 結合性及び切断特異性を調べた。ssPS30 配列を 5’ ビオチン標識をして合成し、電気泳動移動度シフト・アッセイ（electrophoretic mobility shift assay（EMSA））に供した（図１８Ｃ）。MIF は 10 mM Mg2+の存在下でビオチン標識 ssPS30 に結合して 1 つの主要な複合体を形成し（図１８Ｃ）、これは過剰の非標識 DNA 基質（PS30）又は MIF に対するポリクローナル抗体を添加することにより完全に壊される（図１８Ｃ）。MIF E22Q、E22A、P16A、P17A 及び P17Q 変異体は依然として MIF/ssPS30 複合体を形成する（図１８Ｃ）。
【００２８】
ssPS30 は 5’ 及び 3’ 末端に不対塩基を持つステム‐ループ構造を形成する可能性があるので、MIF が配列又は構造特異的に ssDNA に結合するかどうかを測定することにした。5’ 末端、3’ 末端、5’ 末端及び 3’ 末端の両方の不対塩基を除去すること、又はステム・ループを排除することによって異なる構造の 5’ ビオチン標識した ssPS30 及びその配列に関連する基質を EMSA で使用した（図３Ｂ、図１９）。3’ 不対塩基（5’bLF）を完全に除去しても DNA/MIF 複合体の形成には明らかな影響はないことがわかった（図２Ｅ及び図１９）。対照的に、5’ 不対塩基（5’bRF）を除去すると、DNA-MIF の結合は減少し、MIF は依然として DNA と結合するが低い効率である。同様の結果が、5’ と 3’ の両方の不対塩基（5’bSL）を削除した場合に、観察される。これらのデータは、MIF が主に ssDNA 中の 5’ 不対塩基にステム・ループ構造で結合することを示唆している。ステム・ループを有さないポリ A 配列（5’bPA30）及びステム・ループ構造の 5’ 末端にある短いポリ A 配列（5’b3F1）もまた基質として使用し、そして MIF は 5’bPA30 に結合できないが、5’b3F1 にははっきりと結合することが見出された。これは、ステム・ループが MIF-ssDNA の結合に必要であることを示唆している（図３Ｂ及び図１９）。PS30 配列に関連する基質に加えて、ステム・ループ様構造を有する非配列関連基質（5’bL3）も試験したところ、MIF は 5’bL3 に弱く結合することがわかった。しかし、その結合効率は 5’bPS30 のそれよりはるかに低い。これらのデータは、MIF がステム・ループを有する ssDNA に選択的に結合し、そしてそれが配列特異性にあまり依存しないことを示唆する。
【００２９】
ssDNA 研究と並行して、PS30、ポリ A、PS30 配列関連基質（5’bPS30、5’bSL、5’bLF、5’bRF、5’bPA30 及び 5’bPA5E）、並びに非関連配列（PCS 及び 5’bL3）を使用して、MIF が dsDNA に結合するかどうかを調べるために MIF を試験した（図３Ｂ及び図１９）。MIF はこれらの二本鎖基質のいずれにも結合しないことが見出された（図３Ｂ）。
【００３０】
MIF が一本鎖又は二本鎖 DNA を切断するかどうかを判定するために、PS30 DNA 結合モチーフの 5’ 末端及び 3’ 末端の両方に 35 塩基のランダム・ヌクレオチドを付加して PS100と命名し、ssDNA（ssPS100）又は dsDNA（dsPS100）の切断をモニターした。MIF は ssPS100 及びその相補鎖 ssPS100R を実質的に切断するが、dsPS100 は切断しない（図２０、Ａ及びＢ）。ChIP Seqで同定された MIF DNA 結合モチーフ（PS30）は、MIF の濃度を増加させると ssPS30 が切断されるので、MIF による切断に十分である（図２０Ｃ）。しかしながら、MIF の濃度を上げても（1-4 μM）、dsPS30、その関連配列 dsRF 並びにその非関連配列 dsL3 は切断されない（図２０Ｃ）。ssPS30 の MIF による切断には Mg2+ が必要とされる（図２０Ｅ）。MIF の E22Q 及び E22A 変異によって ssPS30の切断は遮断される（図２０２２０Ｅ）。MIF は 12 分の t1/2 で時間依存的に ssPS30を切断し、そしてそれは 2 μM の Km 及び 41.7 nM/分 の Vmax で濃度依存的に ssPS30 を切断する（図２０、ＦからＨ）。これらの速度論的な性質は、EcoRI のような他のPD-D/E(X)K ヌクレアーゼと類似する（26、31）。一本鎖 DNA に対する MIF の選択性は、MIF の活性部位に一本鎖 DNA が結合している三次元モデル（図１８Ｂ）及び MIF-DNA 結合アッセイ（図３Ｂ）と合致する。
【００３１】
MIF が配列特異的又は構造特異的なエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ活性を有するかどうかを判定するために、DNA 基質 ssPS30 の二次構造に基づく一連の 5’ 及び 3’ ビオチン標識した変異体を合成し、MIF による切断を調べた（図３Ｃ及び図１９）。MIF は 3’ エキソヌクレアーゼ活性を有し、ssPS30 の 3’ 末端にある不対塩基を認識して分解する傾向があること、そしてこれは、3’ 末端のビオチン修飾によって阻害されることが見出された（図３Ｃレーン 2-5 及び図１９、表１）。MIF の 3’ エキソヌクレアーゼ活性は、5’bRF 基質、及び 5’b3E 基質を用いた切断アッセイによっても支持される（図３Ｃ及び図１９、表１）。更に、MIF の 3’ エキソヌクレアーゼ活性は、5’ ビオチン‐ポリ A（5’bPA30）を切断することはできるが、3’ ビオチン‐ポリ A（3’bPA30）を切断することはできず、MIF の 3’ エキソヌクレアーゼ活性はその二次構造から独立していることを示唆する（図３Ｃ及び図１９）。MIF は構造に特異的なエンドヌクレアーゼ活性も有する。MIF は、ステム・ループに隣接する 3’ 末端にある ssDNA の短い不対塩基（5’bPS40、3’bPS40、5’b3F1、3’b3F1 及び 5’bL3）を、ステム・ループに隣接する 3’ 末端にある 3’-OH/3’-ビオチン（3’bSL及び3’bLF）と同様に、切断する（図３Ｃ及び図１９）。そのエキソヌクレアーゼ活性とは対照的に、MIF のエンドヌクレアーゼ活性は、前記 3’ 末端でのビオチン修飾体（3’bSL、3’bLF、3’bPS40 及び 3’b3F1）によって遮断されることはない。5’bL3 は非関連の PS30 配列であるが、類似のステム・ループ構造（MIF によって切断されるが効率は低い）を有する（図３Ｃ及び図１９）。まとめると、これらの結果は、MIF が 3’ エキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性の両方を有し、3’ 末端でステム・ループ ssDNA の不対塩基を切断することを示している。
【００３２】
MIF が DNA をどこで切断するかを更に研究し、ビオチン標識による干渉の可能性を更に回避するために、ステム・ループ構造の 3’ 末端に 1 つの不対塩基のみを有する非標識 PS30 及び 3F1 を基質として使用し、PS30 に基づく 2 つの異なる DNA ラダーをカスタマイズした。MIF（2 μM）を PS30 と共に 2 時間インキュベートすることによって、20 及び 22 ヌクレオチドの 2 つの主要産物が検出される（図３Ｄ）。更に、かすかなより高分子量のバンドも観察される。これらのより高い分子量のバンドは、インキュベーション時間が 1 時間である、ビオチン標識した PS30 の MIF 切断実験において、より明白である（図３Ｄ）。3F1 基質を MIF による切断させると、ステム・ループ構造の 3’ 末端にある 1 つの不対塩基が切断されたことと一致する 29 nt のバンドのみを生じる（図３、Ｄ及びＥ）。これらのデータは、PS30が MIF によって、3’ エキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性の両方を使用して、まず最初に、「A23↓T24↓T25↓」の後で切断されることを示唆している（図３Ｅ左パネル）。そして、得られた産物はより安定な構造を形成し（図３Ｅ右パネル）、MIF はステム・ループ構造の 3’ 末端にある「G20↓G21↓G22↓」の後の新しい不対塩基を切断する。まとめると、MIF は、3’ エキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性の両方を使用して、ステム・ループに隣接する 3’ 末端の +1〜+3 位で不対塩基を切断する。
【００３３】
MIF が AIF 結合タンパク質であることを確認するために、GST プル・ダウン実験を行った。野生型 GST-AIF は内因性 MIF をプル・ダウンし、そして野生型 GST-MIF は内因性 AIF をプル‐ダウンする（図４Ａ及び図２１、ＡからＤ）。次に、前記 MIF-AIF 結合ドメインをマッピングした。MIF が AIF にアミノ酸 567-592 で結合することが見出された（図２１、ＡからＣ）。逆に、MIF E22A 変異体では、GST プル・ダウンにおいて、AIF への結合が実質的に減少したが、E22D 変異体及び E22Q 変異体は依然として AIF に結合する（図４、Ａ及びＢ、並びに図２１Ｄ）。更に、他の PD-D/E(X)K 及び C57A; C60A 変異体は依然として AIF に結合する（図２１Ｄ）。これらのデータは、MIF E22 が AIF 結合に重要であることを示唆している。GST プル・ダウン・データと合致して、AIF は、500 μM の NMDA で処理した皮質神経細胞において、MIF と免疫共沈降するが、これは未処理培養物ではほとんど検出されない（図４、Ｃ及びＤ）。
【００３４】
MIF は、HeLa 細胞（図２１Ｅ）及び皮質神経細胞（図４Ｅ）の両方の細胞質ゾルに主に局在している。HeLa 細胞での MNNG 刺激及び皮質神経細胞での NMDA 刺激によって、MIF 及び AIF の両方は、核に移行し、そして核内に共局在するようになる。AIF のノックダウンによって、MIF が核に移行することは減少するが、MIF のノックダウンによっては、NMDA 曝露後に AIF が核に移行することは妨げられない（図４Ｅ）。細胞内分画を核画分及び核除去後画分に分けることにより、皮質神経細胞培養を NMDA に暴露した後に MIF 及び AIF が核に移行すること、並びに MIF が移行するのに AIF を必要とすることが確認される（図４、Ｆ及びＧ）。DPQ は、皮質神経細胞に NMDA を投与した後、及び HeLa 細胞に MNNG 処理をした後で、MIF 及び AIF の両方が核に蓄積することを妨げる（図２１、ＥからＪ）。NMDA による興奮毒性は一酸化窒素の産生を含むという考えと合致して、一酸化窒素合成酵素の阻害剤であるニトロ‐アルギニン（N-Arg）は、MIF 及び AIF の両方が核に蓄積することを妨げる（図２１Ｈ‐Ｊ）。
【００３５】
MIF は脳全体に広く分布しており、MIF ノックアウト・マウスは以前に報告されている（図４Ｈ）（32）。MIF ノックアウト・マウス由来の初代皮質培養を、MIF-WT-FLAG、MIF-E22Q-FLAG、及び MIF-E22A-FLAG を担持するレンチウイルスで形質導入し、NMDA 投与後に MIF が核で蓄積するのには、AIF/MIF 結合が必要であることを確認した。GST プル・ダウン実験（図４Ａ）と合致して、野生型 MIF 及び E22Q は AIF と結合するが、MIF E22A は AIF に結合しない（図４Ｉ）。形質導入していない MIF ノックアウトの培養及び  MIF-WT-FLAG、MIF-E22Q-FLAG、及び MIF-E22A-FLAG を形質導入した MIF ノックアウトの培養では、NMDA 投与後に AIF は核に移行する（図４Ｊ）。MIF 野生型及び MIF E22Q もまた核に移行する；しかしながら、AIF 結合を欠損する変異体である MIF E22A は移行することができない（図４Ｊ）。細胞内分画を核画分及び核除去後画分に分けることにより、免疫蛍光法により観察されたことが確認される（図４、Ｋ及びＬ）。まとめると、これらの結果は、AIF との MIF の結合が MIF の核移行に必要であることを示している。
【００３６】
MIF のヌクレアーゼ活性及び AIF を介して MIF が集められることが、パータナトスに必要であるかどうかを判定するために、MIF ノックアウトの培養に、ヌクレアーゼを欠損する MIF E22Q 変異体及び AIF 結合を欠損する変異体である MIF E22A 変異体を形質導入した。shRNA ノックダウン実験と合致して、MIF ノックアウトの皮質培養は NMDA による興奮毒性に対して耐性がある（図５Ａ及び図２２Ａ）。野生型 MIF を形質導入すると、NMDA による興奮毒性が完全に再び見られるようになるが、逆に、MIF E22Q と MIF E22A のどちらも NMDA による興奮毒性を再び見られるようにすることはない（図５Ａ及び図２２Ａ）。コメット・アッセイを行うことにより、野生型皮質神経細胞に NMDA を投与すると、相当数の神経細胞で、コメット・テールを有するようになり、テール長及びテール中の DNA が増加したが、MIF ノックアウトの神経細胞には明らかなコメット・テール陽性神経細胞が無いことが、分かった（図５Ｂ及び図２２、ＢからＤ）。MIF E22Q 又は MIF E22A ではなく、野生型 MIF をノックアウト神経細胞に形質導入すると、NMDA 投与後のコメット・テールが再び見られるようになり、テール長及びテール中の DNA を増加させる（図５Ｂ及び図２２、ＢからＤ）。2  つの異なる shRNAs で HeLa 細胞において MIF を shRNA ノックダウンすると、MIF を標的としていない shRNA と比較して、MNNG 投与後、コメット・テールを有する細胞数が減少し、テール長及びテール中の DNA が減少する（図２３、ＡからＤ）。ゲノム DNA のパルス・フィールド・ゲル電気泳動アッセイを行うと、NMDA 投与によって、野生型皮質神経細胞における大きな DNA 断片化が引き起こされるが、MIF ノックアウト皮質神経細胞においては引き起こされないことが確認される（図５Ｃ）。MIF E22Q 又は MIF E22A で形質導入された MIF ノックアウト神経細胞においては、明らかな大規模な DNA 断片化は観察されない（図５Ｃ）。野生型 MIF を用いたノックアウト神経細胞の形質導入は、NMDA-誘導性の大きな DNA 断片化が再び観察されるようになる（図５Ｃ）。まとめると、これらの結果は、MIF が、MNNG 又は NMDA 誘導性のパータナトスによる大規模な DNA 断片化に関与する主要なヌクレアーゼであることを示している。
【００３７】
in vivo のパータナトスによる細胞死において、MIF ヌクレアーゼ活性及び AIF への MIF の結合が必要であるかを評価するために、新生児マウスの脳室内ゾーンに投与することによって、MIF ノックアウト・マウスに、ヌクレアーゼ欠損 MIF E22Q 変異体及び AIF 結合欠損変異体 MIF E22A 変異体を軽質導入した。2 ヶ月齢の雄マウスを、その中大脳動脈（MCAO）の 45 分間の一過性閉塞に供した。形質導入がうまくいっているかどうかは、成体マウスの皮質、線条体及び海馬で、MIF-FLAG についての免疫染色を行うことによって確認した（図２４、Ａ及びＢ）。虚血性傷害の強度が類似しているにもかかわらず（図２４Ｃ）、MIF ノックアウト・マウスでは、その野性型のマウスと比較して、皮質、線条体及び半球で梗塞体積が約 30 % 減少している（図５、Ｄ及びＥ、並びに図２４、Ｄ及びＥ）。更に、MIF ノックアウト・マウスにおける神経保護は少なくとも 7 日間持続する（図５Ｅ及び図２４Ｅ）。MIF ノックアウト・マウスにおいて、MIF E22Q 又は MIF E22A ではなく、野生型 MIF を発現させると、梗塞体積は野生型レベルに再び戻る（図５、Ｄ及びＥ、並びに図２４、Ｄ及びＥ）。MCAO の 1 日後、3 日後及び 7 日後でのオープン・フィールド・タスクにおける自発的活動によって、神経行動を評価した。梗塞体積データと合致して、MIF ノックアウト・マウスは野生型と比較して、神経行動学的スコアが改善した。野生型 MIF を発現する MIF ノックアウト・マウスは、野生型マウスと同等の神経行動学的スコアになるが、MIF E22Q 又は MIF E22A を発現させても、MIF ノックアウト・マウスと有意に異ならない（図５、Ｆ及びＧ）。3 日及び 7 日間にわたって、MIF ノックアウト・マウスの神経行動学的スコアは、野生型マウスと比較して、保護的な結果を示し続ける（図５、Ｆ及びＧ）。コーナー・テスト・データは、全てのマウスが、MCAO 手術の前には、横に曲がる傾向が無いことを示す。しかしながら、MCAO の1、3 及び 7 日後において、野生型マウス及び野生型 MIF を発現する MIF ノックアウト・マウスでは、障害を受けていない側へ曲がることが有意に増加しており（図２４Ｆ）、これらのマウスが、より重度の感覚障害及び運動障害を負っていることを示す。MIF ノックアウト・マウス及び MIF E22Q 又は MIF E22A を発現する MIF ノックアウト・マウスでは、何ら傾向は観察されなかった（図２４Ｆ）。脳梗塞のペナンブラ（penumbra）領域を共焦点顕微鏡観察することによって、AIF 及び MIF の局在を調べた（図２４Ｇ）。皮質神経細胞における観察と合致して、MIF 野生型、ノックアウト、並びに MIF 野生型、E22Q、及び E22A を投与した MIF ノックアウト・マウスで、MCAO の 1、3 及び 7 日後において、AIF は核に移行する（図２４Ｇ）。MIF 野生型及び MIF E22Q の両方ともまた、MCAO の1、3 及び 7 日後に核に移行する。しかしながら、AIF 結合欠損変異体 MIF E22A はそうすることができない（図２４Ｇ）。パルス・フィールド・ゲル電気泳動によって評価される DNA 損傷は、MCAO の1、3 及び 7 日後に観察され、3 日目に、野生型マウス又は野生型 MIF を発現する MIF KO マウスでは、DNA 損傷が最も重度である（図２４Ｈ）。MIF KO マウス及び E22Q 又は E22A MIF を発現する MIF KO マウスでは DNA 損傷が減少する（図２４Ｈ）。これらのデータは、MIF が AIF が介する神経毒性及び DNA 切断に必要で���ること、及び AIF が in vivo での MIF の移行に必要であることを示している。
【００３８】
本発明の重要な発見は、PAAN として MIF を同定したことである。分子モデリングを用いることで、MIF 三量体は、2 本のα-ヘリックスの隣に中央の 4 本のストランドが混合した β‐シートを有する PD-D/E(X)K ヌクレアーゼ・スーパーファミリーと同じトポロジー構造を含むことが示された（24、25）。MIF は 3’ エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方の活性を持つ。MIF は、ステム・ループ構造を持つ ssDNA の 5’ 不対塩基に結合し、その 3’ 不対塩基を切断する。AIF は MIF と結合して MIF を核に集め、そこで MIF はゲノム DNA に結合し、ゲノム DNA を、パータナトスを活性化するストレッサーによって誘導されるサイズと同様の大きな断片に切断する。MIF をノックアウトすると、PARP-1 依存性細胞死を活性化する刺激によって誘導される DNA 断片化が著しく減少する。PD-D/E(X)K モチーフの重要なアミノ酸残基を変異させると、MIF のヌクレアーゼ活性が消失し、in vitro と in vivo の両方でパータナトスから細胞が保護される。AIF 及び MIF のタンパク質‐タンパク質結合を壊すことは、MIF が細胞質から核へ移行することを妨げ、これは in vitro及び in vivoの両方で PARP-1 依存性細胞死からも保護する。MIF のチオール‐タンパク質酸化還元酵素活性又はトートメラーゼ活性は、ヌクレアーゼとしてのその作用には関与していない。MIF のノックアウト、MIF ヌクレアーゼ欠損変異体及び MIF AIF 結合欠損変異体はすべて、マウスの脳梗塞の局所性虚血モデルにおいて梗塞体積を減少させ、行動学的な保護が長く続くようにする。したがって、MIF は、PARP-1 の活性化及び AIF の放出のために細胞死において重要であり、長い間求められてきた PAAN である（2）。
【００３９】
PARP と同様に、MIF ヌクレアーゼ活性の阻害は急性神経障害の魅力的な標的である。しかしながら、MIF ヌクレアーゼ活性の阻害には、長期にわたり PARP 阻害をすると DNA 損傷応答及び修復が損なわれる可能性がある慢性神経変性疾患において、PARP 阻害を超える利点があり得る。MIF のヌクレアーゼ活性を阻害すれば、この潜在的な懸念を回避し、そして様々な疾患に対する重要な治療の機会を提供する可能性があるだろう。
【００４０】
MIF には、3’ エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方の活性と、そのヌクレアーゼ活性の DNA 配列に対して選択性があることがわかった。この配列を DNA-BIND プレート上に固定化し、大環状化合物ライブラリー由来のプールした化合物が有り又は無しの状態で、組換え MIF と共にインキュベートし、ビオチン化した相補的 DNA とハイブリダイズさせる。前記配列を、分光計で測定する比色変化によって、検出する。もし、プールした化合物に MIF 阻害剤が含まれていると、黄色い基質の色が維持される。MIF が活性化していると、前記 DNAが切断されて色が消える（図６）。
【００４１】
大環状天然物 FK506 及びラパマイシンは、重要な生物学的活性を有する承認済みの免疫抑制薬である。構造的には、FK506 とラパマイシンは類似する FKBP-結合ドメインを共有するが、それらのエフェクター・ドメインは異なる。FK506 のエフェクター・ドメインとラパマイシンのエフェクター・ドメインを取り替えると、カルシニューリンから mTOR へ、ターゲットを変更させることができる。従って、ヒト・プロテオーム中の標的タンパク質に、エフェクター・ドメインを機能的に移植することが可能である。ラパフシン（rapafucin）と命名した合成 FKBP-結合ドメイン及びテトラ‐ペプチジル・エフェクター・ドメインを含む新しい大環状化合物のライブラリーを、新しいタンパク質を標的とするように設計及び作製した（図７）。前記ライブラリーのスクリーニングで、MIF のヌクレアーゼ活性を強力に阻害するいくつかのヒットが同定されてきた。
【００４２】
そのハイブリッド大環状ライブラリーは、15 個の個々の化合物がプールになった 45,000 個の化合物からなる。38 枚のプレート（〜3000 プール）をスクリーニングし、プールしたライブラリーのスクリーニングについて、最後に切断アッセイした（図８）。陽性プール中の化合物は、個別に、切断アッセイにおいて試験し、パータナトスの誘導剤としての MNNG で処理した HeLa 細胞において、in vitro での神経保護作用を更に評価した（図９）。12 個の陽性候補化合物を最初に選択し、用量反応 DNA 切断アッセイ及び MNNG-誘導細胞死アッセイで試験し、その後、4 個の候補化合物（C7; 12B3-11, C8; 12B3-11, C11; 17A5-1, C12; 17A5-2）を最終的に選択した。
【００４３】
陽性候補化合物について、TBE ゲルにおける用量反応 DNA 切断アッセイ（図１０Ａ）及び MNNG で処理した HeLa 細胞における神経保護効果（図１０Ｂ）を次に行った。更に、陽性候補化合物を、α‐シヌクレインで予め形成させた原線維（a-Syn PFF）による神経毒性において試験した。組換えのミスフォールディングされたα-syn PFF で処理することは、in vitro 及び in vivo でのα-シヌクレインの伝播及び毒性の研究が可能なパーキンソン病のモデル系を提供する。初代皮質培養を 14 日間 PFF±MIF 阻害剤に曝露した。細胞生存率は、コンピュータを使って、ヘキスト／ヨウ化プロピジウム陽性細胞を数えることにより決定した。その結果、C8 及び C12 が PFF 誘発毒性試験において最も保護的な効果を示し、そしてこの 2 つのヒット化合物には PFF 毒性において用量反応性があることが確認された（図１１）。
【００４４】
材料及び方法
ヒト・プロテイン・チップ・ハイ‐スループット・スクリーニング
16,000 種又は 5,000 種の高度に精製されたタンパク質を、ニトロセルロースで被覆した特別なスライド（15）上にスポットすることによって作成された 16K 及び 5K ヒト・プロテイン・チップを、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM DTT、0.3 % Tween 20 を含む復元緩衝液（renaturation buffer）中で、4 ℃で 1 時間、インキュベートした。室温で 1 時間、5 % 脱脂粉乳でブロッキングした後、プロテイン・チップを 1 % ミルク中の精製マウス AIF タンパク質（50 nM、NP_036149）と共に 1 時間インキュベートした。次いで、ウサギ抗 AIF 抗体（9、11）及び Alexa Fluor登録商標 647 ロバ抗ウサギ IgG、又はネガティブコントロールとして Alexa Fluor（登録商標）647 ロバ抗ウサギ IgG のみ、で続けてインキュベートすることによって、タンパク質相互作用を測定した。タンパク質マイクロアレイを、Cy5 画像として GenePix 4000B Microscanner (Tecan) でスキャンし、各スポットの蛍光の中央値を計算した。相互作用するタンパク質を同定するために以前に報告されたのと同じ手順を使用した（15）。
【００４５】
PARP-1 依存性細胞死での生存に関する、逆トランスフェクション・フォーマット siRNA-ベースによるスクリーニング
ヒト・プロテイン・チップ・ハイ‐スループット・スクリーニングから得られた AIF 結合タンパク質を標的とする On-Target plus登録商標 SMARTpool登録商標 siRNAs を、ダーマコン社（Dharmacon）の 96-ウェル・プレートにカスタマイズした。前記プレートを DharmaFECT 1 トランスフェクション試薬を用いて室温で 30 分間、再水和した。次いで、HeLa 細胞を 1×104 /ウェルの細胞密度でプレートに播種した。トランスフェクションの 48 時間後、細胞を MNNG（50 μM）又は DMSO で 15 分間処理し、次いで通常の完全培地中で 24 時間インキュベートした。1-4 時間、アラマーブルーを添加した後、細胞生存率を励起波長 570 nm 及び放出波長 585 nm の蛍光により測定した。PARP-1 siRNA を陽性対照として使用し、そして非標的の  siRNAs を陰性対照として使用した。
【００４６】
ヌクレアーゼ・アッセイ
ヒト・ゲノム  DNA（200 ng/反応、Promega）、pcDNA（200 ng/反応）又は PS30及びその関連及び非関連基質（1 μM）を、10 mM MgCl2 及び 1 mM DTT を含む 10 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.0）又は指示されたとおりの特定の緩衝液中で、0.25-8 μM の記載する最終濃度の野生型 MIF 又はその変異体と共に、1 時間（pcDNA 及び小さい DNA 基質と共に）又は 4 時間（ヒト・ゲノム DNA と共に）37 ℃ でインキュベートした。10  mM EDTA を含有する緩衝液を添加すること、及び氷上でインキュベーションすることにより、前記反応を停止させた。前記ヒト・ゲノム DNA サンプルを、1.5 秒の初期スイッチ時間及び 3.5 秒の最終スイッチ時間、6 V/cm で 12 時間、0.5 Xの TBE 緩衝液中の 1.2 % パルス・フィールド用アガロースにて、直ちに分離した。pcDNA サンプルは、1 % アガロース・ゲルによって測定した。小さい DNA 基質を 15 % 又は 25 % TBE-尿素ポリアクリルアミド（PAGE）ゲル又は 20 % TBE PAGE ゲル上で分離した。次にゲルを 0.5 μg/ ml の臭化エチジウム（EtBr）で染色し、続いてナイロン膜へ電気的に転写した。次いで、ビオチン標識した DNA を、化学発光核酸検出モジュール（Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module（サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific）））を用いて化学発光によって更に検出する。
【００４７】
電気泳動移動度シフト・アッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA））
EMSAアッセイは、LightShift Chemiluminescent EMSA キット（サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific））を製造元の指示書に従って用いて行った。簡単に述べると、精製 MIF タンパク質（2 μM）を、10 mM MgCl2を含有する結合緩衝液中でビオチン標識した DNA 基質（10 nM）と共に氷上で 30 分間インキュベートした。次いで、サンプルを 6 % 移動抵抗ポリアクリルアミド（retardation polyacrylamide）で分離し、続いてナイロン膜に電気的に転写した。次いで、ビオチン標識した DNA を、化学発光核酸検出モジュール（Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module（サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific）））を用いて化学発光によって更に検出する。
【００４８】
コメット・アッセイ
コメット・アッセイは、トレビゲン社（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）（Trevigen（Gaithersburg、MD））によって提供されたプロトコルに従って実施した。簡単に述べると、MNNG 処理有り又は無しの HeLa 細胞、及び NMDA 処理有り又は無しの皮質神経細胞を、処理の 6 時間後に氷冷 PBS で洗浄し、720 g で 10 分間遠心分離することにより回収し、氷冷 PBS（Ca2+ 及び Mg2+ を含まない）に 1x105 細胞/ml で再懸濁した。次いで、細胞を 1:10（v/v）の比率で PBS 中 1 ％ 低融点アガロースと混合し（42 ℃）、50 μl の細胞‐アガロース混合物を直ちにコメットスライド（CometSlide）上にピペットで載せ、付着するのを促進するために 30 分間 4 ℃で暗所で平らに置いた。溶解緩衝液に溶解した後、スライドをアルカリ性巻き戻し溶液（alkaline unwinding solution）（200 mM NaOH、pH > 13、1 mM EDTA）に室温で 1 時間浸漬した。前記コメット・スライドを移し、水平電気泳動装置内で 21 ボルト、30 分間、1 リットルのアルカリ性巻き戻し溶液で、電気泳動した。過剰の電気泳動緩衝液を除いた後、スライドを dH2O で 2 回すすぎ、次いで 5 分間 70 % エタノールで固定し、4 ℃で 5 分間 SYBR Green で染色した。細胞画像をツァイス社（Zeiss）の落射蛍光顕微鏡（Axiovert 200M）を用いて取得し、画像解析を CASP ソフトウェア（バージョン 1.2.2）を用いて行った。各サンプルについて、核の端からコメットのテールの端までの長さとして呼ばれる「コメット・テール（comet tail）」の長さを測定した。
【００４９】
タンパク質の発現と精製
ヒト endoG（NM_004435）、シクロフィリン A（NM_021130）、マウス AIF（NM_012019）、ヒト MIF（NM_002415）の cDNA 及びそれらの変異体を、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）-タグ付き pGex-6P-1 ベクター（GE ヘルスケア社（GE Healthcare））の EcoRI 及び XhoI 制限酵素部位にサブクローニングし、シークエンシングをして確認した。このタンパク質を発現させ、大腸菌からグルタチオン・セファロースによって精製した。続いて、ヌクレアーゼ・アッセイのために前記 GST タグをタンパク質分解的に除去した。MIF 点突然変異体をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって構築し、そしてシークエンシングによって確認した。前記ヌクレアーゼ・アッセイに使用した MIF タンパク質の純度を、質量分析によって更に確認した。FPLC によって精製した MIF タンパク質を前記ヌクレアーゼ・アッセイにも使用したところ、FPLC MIF タンパク質と非 FPLC MIF タンパク質との間に明らかな違いは観察されなかった。GST タンパク質をヌクレアーゼ・アッセイにおける陰性対照として使用した。
【００５０】
中大脳動脈閉塞（MCAO）
以前に報告されているように（33）、45 分間の可逆的 MCAO によって脳虚血を誘導した。成体オスの MIF KO マウス（2 から 4 月齢、20-28 g）をイソフルランで麻酔し、そして体温をフィードバック制御加熱システムによって 36.5 ±  0.5 ℃に維持した。正中線腹側頸部切開を行い、外頸動脈の断端を介して内頸動脈／翼状動脈の動脈分岐部（internal carotid/pterygopalatine artery bifurcation）から 6-8 mm の右内頸動脈に、7.0 ナイロンのモノフィラメントを挿入することによって、片側 MCAO を行った。擬似手術（sham）をした動物としては、同じ外科的処置を施したが、前記糸は内頸動脈内に挿入しなかった。再灌流の 1 日、3 日又は 7 日後、MIF WT 及び KO マウスを PBS で灌流し、塩化トリフェニル・テトラゾリウム（TTC）で染色した。脳を 4 % PFA で更に固定し、免疫組織化学染色の用にスライスした（9、11、15、34）。
【００５１】
ChIP-Seq
ChIP-seq は、以前に記載されているようにして行った（35、36）。簡単に述べると、HeLa 細胞を最初に DMSO 又は MNNG で処理した（50 μM、15 分）。MNNG 処理の 5 時間後、細胞を 1 % ホルムアルデヒドで 37 ℃で 20 分間架橋し、そしてその反応を 0.125 M グリシン中で停止させた。超音波処理の前にクロマチン抽出を行った。抗 MIF 抗体（ab36146、Abcam）を使用し、そして DNA を超音波処理した細胞溶解物から免疫沈降させた。前記ライブラリーを、DNA Sample キットに付属しているイルミナ社の指示書に従って調製し、Illumina HiSeq2000 を使用して、50 bp シングル‐エンド・リードを生成するシークエンシングをした。
【００５２】
詳細な手順は以下の通りである。HeLa 細胞を DMSO 又は MNNG（50 μM）で 15 分間処理し、新しい培地中で更に 5 時間培養した。次いで細胞を 1 % ホルムアルデヒドで 37 ℃で 10 分間架橋し、そしてその反応を室温、20 分間、0.125 M グリシン中で停止させた。セル・シグナリング・テクノロジー社（Cell Signaling Technology）の SimpleChIP（登録商標） Enzymatic Chromatin IP キット（Cat#9003）を使用してクロマチンを抽出し、Bioruptor Twin（ダイアジェノード社（Diagenode））を使用して、30 秒間オン及び 30 秒間オフを 15 サイクル、超音波処理した。剪断されたクロマチン DNA の品質及び大きさを DNA 電気泳動によりアガロース・ゲルにて調べた。10 % クロマチンをインプットとして確保し、残りのクロマチンを希釈して、10 μl のマグネティック・プロテイン G アガロース・スラリー（Magnetic protein G agarose slurry）を用いて、4 ℃で 30 分間、前処理し、プロテイン G アガロース・ビーズへの直接的な非特異的結合を排除した。前記前処理をしたクロマチンを、抗 MIF 抗体（3 μg/ml、ab36146、アブカム社（Abcam））又は対照 IgG（3 μg/ml）と共に、マグネティック・プロテイン G アガロース・スラリー（30 μl）の存在下、4 ℃で一晩インキュベートした。前記プロテイン G アガロース・ビーズを 3 回洗浄した後、プロテイン G アガロース／抗体複合体の半分を免疫ブロットアッセイに供し、免疫沈降の質をチェックした。プロテイン G アガロース／抗体複合体のもう半分を、1 % SDS、0.1 M NaHCO3を含有する 170 μl の溶出緩衝液中に、65 ℃で溶出した。この溶出液及びクロマチン・インプットを 1 mg/ml の RNaseA で 37 ℃、30 分間処理し、3 μlの 5 M NaCl と 1 μl の 10 mg/ml プロテアーゼK を加えた後、65 ℃ で 4 時間インキュベートして脱架橋（reverse-crosslinked）した。最後にそのクロマチン DNA をフェノール／クロロホルム／イソアミル・アルコールを用いて精製し、そしてエタノールにより沈澱させた。前記 ChIP 及びインプット DNA ライブラリーを、指示書に従ってイルミナ社（Illumina）の Truseq DNA LT サンプル調製キットを使用して調製した。最終生成物を 15 サイクル増幅した。このインサートの質及びサイズはバイオアナライザーを用いて解析した。50 bp のシングル‐エンド・リードを生成する Illumina HiSeq2000 を使用して、ジョン・ホプキンスの次世代シークエンス・センター（Next Generation Sequencing Center）でシークエンシングを行った。前記 ChIP-seq の生データは GEO データベース受入番号：GSE65110 として寄託されている。
【００５３】
ChIP-Seq データ解析
HiSeq 2000 からの生データは、CASAVA v1.8 を使用して FASTQ に変換し、多重分離化（demultiplexed）した。デフォルトのパラメーターを用いる Bowtie2（v2.0.5）を用いてリードをヒト・ゲノム（hg19）にマッピングした。変換した SAM ファイルを、MACS（v1.4.1）に渡し、デフォルトのパラメータを使用するピーク・コーリングを行った。DMSO- 及び MNNG-処理ライブラリーからのピークはベッド・フォーマットで記録され、GEO で提供される。DMSO- 及び MNNG-処理群において違いとして同定されたピークは、カスタム R スクリプトによって解析した。デフォルトのパラメータを用いたモチーフ発見のために、MNNG-処理ライブラリーのみで同定されたがDMSO-処理ライブラリーでは同定されなかったピークに対応する配列をSeSiMCMC_4_36、Chipmunk v4.3 +、及び MEMEchip v4.9.0 に取り込ませた。
【００５４】
データ転送：CASAVAv1.8 ソフトウェアを使用して生ファイルを fastq ファイルに変換し、そのレーンを多重分離化した。
DMSO_MIF: JHUTD01001/JHUTD01001_001_DPAN1/raw
DMSO_Input: JHUTD01001/JHUTD01001_002_Dinput1/raw
MNNG_MIF: JHUTD01001/JHUTD01001_003_MPAN1/raw
MNNG_Input: JHUTD01001/JHUTD01001_004_Minput1/raw
【００５５】
解析：以下は、解析ステップとそのステップで使用されるパラメータのリストである。すべてのモチーフ検索ソフトウェアはデフォルト設定を使用して実行した。
【００５６】
１．アライメント・パイプライン
ａ．デフォルトのパラメータで hg19 ゲノムへのフラグメント・アラインメントを実行し、単一の SAM ファイルを生成する Bowtie2 -2.0.5
JHUTD01001 / JHUTD01001_001_DPAN1 / DPan1_hg19_alignment.sam
JHUTD01001 / JHUTD01001_002_Dinput1 / Dinput1_hg19_alignment.sam
JHUTD01001 / JHUTD01001_003_MPAN1 / MPan1_hg19_alignment.sam
JHUTD01001 / JHUTD01001_004_Minput1 / Minput1_hg19_alignment.sam
ｂ．samtools-0.1.18/ を使って SAM ファイルを BAM ファイルに分類して変換する
JHUTD01001 / JHUTD01001_001_DPAN1 / DPan1_hg19_alignment.bam
JHUTD01001 / JHUTD01001_002_Dinput1 / Dinput1_hg19_alignment.bam
JHUTD01001 / JHUTD01001_003_MPAN1 / MPan1_hg19_alignment.bam
JHUTD01001 / JHUTD01001_004_Minput1 / Minput1_hg19_alignment.bam
【００５７】
２．デフォルトのパラメータを使用する MACS-1.4.1 を使用してピークをコールする
ａ．ピーク・コール
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis/ MACS / DPan1_vs_Dinput_peaks.bed
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / MPan1_vs_Minput_peaks.bed
ｂ．アノテーション付きのピーク・コール（Annotated peak calls）
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / DPan1_vs_Dinput_annotation.txt
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / MPan1_vs_Minput_annotation.txt
ｃ．遺伝子に基づいてディファレンシャル・ピーク・コール（differential peak calls）を実行するためのカスタム R スクリプト
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / intersections.bothsamples.DPan1.MPan1.txt
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / intersectionsDPan1_not_MPan1.txt
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / intersectionsMPan1_not_DPan1.txt
ｄ．アノテーション付きのディファレンシャル・ピーク・コール（differential peak calls）
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / only_DPan1_annotation.txt
JHUTD01001 / JHUTD01001_000_analysis / MACS / only_MPan1_annotation.txt
【００５８】
３．IGVtools を通じて作成されたアライメントを表示するためのカバレッジ・トラック（coverage tracks）
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/DPan1.tdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/Dinput1.tdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/MPan1.tdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/Minput1.tdf
【００５９】
４．3 つの異なるソフトウェアを使ってモチーフを見つけた
ａ． SeSiMCMC_4_36
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_motif_Dpan1.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_DPan1_logo.png
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_MPan1_motif.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_MPan1_logo.pdf
ｂ． Chipmunk v4.3+
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/DPan1_ChiPMunk_motif.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/MPan1_ChipMunk_motif.txt
ｃ． MEMEchip v4.9.0
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/MEME ChIP_DPan1.webarchive
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/MEME ChIP_MPan1.webarchive
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/only_MPan1_MEME_ChIP.webarchive
【００６０】
５．領域のアノテーション、遺伝子中心のアノテーション（gene centered annotation）及びゲノムの特徴近くの平均シグナル・プロファイリングのプロットを作成するための CEAS ソフトウェア
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/CEAS/DPan1.pdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/CEAS/MPan1.pdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/CEAS/MPan1_only.pdf
【００６１】
MIF-DNA ドッキング方法
Hex-8.0（タンパク質-DNAドッキングプログラム（39、40））を用いて、DNA 二本鎖構造（37）（PDB 受入番号 1BNA）及び一本鎖 DNA 構造（PDB 受入番号 2RPD（38））を、MIF（PDB 受入番号 1FIM（23））の表面にドッキングした。前記 Hex プログラムは、タンパク質と DNA の間の接点を同定するために表面相補性アルゴリズム（surface complementarity algorithm）を使用する。MIF 表面は Pymol を用いて作製した。すべての画像は、pdb viewer（Pymol）で表示及びラベル付けされている。前記 MIF-DNA のドッキングさせたモデルは、HEX プログラムから得られたものとして示されている。
【００６２】
レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）の構築とウイルス産生
マウス MIF-WT-Flag（NM_010798）、MIF-E22Q-Flag 及び MIF-E22A-Flag を、AgeI 及び EcoRI 制限酵素部位でレンチウイルス cFugw ベクターにサブクローニングし、ヒト・ユビキチン C（hUBC）プロモーターにより発現させた。ヒト MIF 及びマウス MIF shRNA は、ウェブサイト<http://katahdin.cshl.org/siRNA / RNAi.cgi？type = shRNA>を使用して設計した。前記プログラムは、shRNAmirs を生成するための 97 nt のオリゴ配列を提供する。PacI SME2 フォワード・プライマー 5’ CAGAAGGTTAATTAAAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG 3’ 及び NheI SME2 リバース・プライマー 5’ CTAAAGTAGCCCCTTGCTAGCCGAGGCAGTAGGCA 3’ を使用する PCR を実施して第二鎖を生成し、PacI 及び NheI 制限酵素部位を付加して、pSME2（pSM2 ベクター中の空の shRNAmir 発現カセットを、制限酵素部位を修飾して cFUGw 骨格に挿入した構築物）にクローニングした。このベクターは GFP を発現する。前記組換え cFugw ベクターを、3 つのパッケージングベクター：pLP1、pLP2、及び pVSV- Gと共に（1.3:1.5:1:1.5）、293FT 細胞に一過性にトランスフェクションすることによって、前記レンチウイルスを作製した。前記ウイルス上清をトランスフェクションの 48 時間後及び 72 時間後に集め、そして 50,000 g で 2 時間の超遠心分離により濃縮した。
【００６３】
MIF-WT-Flag、MIF-E22Q-Flag 及び MIF-E22A-Flag を、BamHI 及び EcoRI 制限酵素部位で AAV-WPRE-bGH (044 AM/CBA-pI-WPRE-bGH) ベクターにサブクローニングし、そしてニワトリβ-アクチン（CBA）プロモーターによって発現させた。全ての AAV2 ウイルスは、ベクター・バイオラボ社（Vector BioLabs）が生産した。
【００６４】
MIF の基質、鋳型及びプライマーの配列
shRNA 構築物及び点変異構築物に使用した MIF の基質、鋳型及びプライマーの配列は以下の通りである。
【００６５】
PS100-5’ACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATGAG3’; 
【００６６】
PS100R-5’CTCATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGAGTCGAGGCTGATCAGCGAGCTCTAGCATTTAGGT3’; 
【００６７】
PR30 - 5’CTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGG3’; 
【００６８】
SL - 5’CCTGTAATCCCAAGTAGCTGGGATTACAGG3’; 
【００６９】
LF - 5’AAAAAAACTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGA3’; 
【００７０】
RF - 5’TCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGAAAAAAA3’; 
【００７１】
PA30 - 5’AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’; 
【００７２】
3E - 5’CTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGG3’;  5’TCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAG3’; 
【００７３】
PS40 - 5’CTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTAAACTTGGT3’; 
【００７４】
3F1 - 5’AAAAAAAAAACAAGTAGCTGGGATTACAGG3’; 
【００７５】
L3 - 5’ACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCT3’
【００７６】
hMIFshRNA1 -TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCATCGTAAACACCAACGTGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCACGTTGGTGTTTACGATGAATGCCTACTGCCTCGGA; 
【００７７】
hMIFshRNA2 -TGCTGTTGACAGTGAGCGACGCGCAGAACCGCTCCTACAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTGTAGGAGCGGTTCTGCGCGCTGCCTACTGCCTCGGA; 
【００７８】
hMIFshRNA3 -TGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGGTCTACATCAACTATTACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTAATAGTTGATGTAGACCCTGTGCCTACTGCCTCGGA; 
【００７９】
mMIFshRNA1 -TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCATCGTGAACACCAATGTTCTAGTGAAGCCACAGATGTAGAACATTGGTGTTCACGATGAATGCCTACTGCCTCGGA; 
【００８０】
mMIFshRNA2 -TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCAGTGCACGTGGTCCCGGACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTCCGGGACCACGTGCACTGCGTGCCTACTGCCTCGGA; 
【００８１】
mMIFshRNA3 -TGCTGTTGACAGTGAGCGACGGGTCTACATCAACTATTACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTAATAGTTGATGTAGACCCGGTGCCTACTGCCTCGGA; 
【００８２】
AIFshRNA1 -TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGAACCGGCTTCCAGCTACAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTGTAGCTGGAAGCCGGTTCCTTGCCTACTGCCTCGGA; 
【００８３】
WT-mMIF-fw2 -CGGGATCCGCCACCATGCCTATGTTCATCGTGAAC; 
【００８４】
WT-mMIF-re -CGGAATTCTCAAGCGAAGGTGGAACCGT; 
【００８５】
Rsh1-mMIF-fw -
CACCATGCCTATGTTTATTGTCAATACGAACGTACCCCGCGCCTCCGTG; 
【００８６】
Rsh1-mMIF-re -CACGGAGGCGCGGGGTACGTTCGTATTGACAATAAACATAGGCATGGTG; 
【００８７】
Rsh3-mMIF-fw -GCACATCAGCCCGGACCGCGTGTATATTAATTACTATGACATGAACGCTGCC; 
【００８８】
Rsh3-mMIF-re -GGCAGCGTTCATGTCATAGTAATTAATATACACGCGGTCCGGGCTGATGTGC; 
【００８９】
hMIF P2G Fw - GGGATCCCCGGAATTCggGATGTTCATCGTAAACACC; 
【００９０】
hMIF P2G Re - GGTGTTTACGATGAACATCCCGAATTCCGGGGATCCC; 
【００９１】
P16A-hMIF-fw - CCTCCGTGGCGGACGGGTTC;
【００９２】
P16A-hMIF-re - GAACCCGTCCGCCACGGAGG;
【００９３】
D17A-hMIF-fw - CGCGCCTCCGTGCCGGCCGGGTTCCTCTCC; 
【００９４】
D17A-hMIF-re - GGAGAGGAACCCGGCCGGCACGGAGGCGCG; 
【００９５】
D17Q-hMIF-fw - CCGTGCCGCAAGGGTTCCTC;
【００９６】
D17Q-hMIF-re - GAGGAACCCTTGCGGCACGG;
【００９７】
E22A-hMIF-fw - GGGTTCCTCTCCGCGCTCACCCAGCAGCTG; 
【００９８】
E22A-hMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGCGCGGAGAGGAACCC; 
【００９９】
E22Q-hMIF-fw - GGGTTCCTCTCCCAGCTCACCCAGCAGCTG; 
【０１００】
E22Q-hMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGCTGGGAGAGGAACCC; 
【０１０１】
E22D-hMIF-fw - GGGTTCCTCTCCGACCTCACCCAGCAGCTG; 
【０１０２】
E22D-hMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGGTCGGAGAGGAACCC; 
【０１０３】
P44A-hMIF-fw - GTGCACGTGGTCGCGGACCA;
【０１０４】
P44A-hMIF-re - CATGAGCTGGTCCGCGACCA;
【０１０５】
D45A-hMIF-fw - GCACGTGGTCCCGGCCCAGCTCATGGCCTTC; 
【０１０６】
D45A-hMIF-re - GAAGGCCATGAGCTGGGCCGGGACCACGTGC; 
【０１０７】
D45Q-hMIF-fw - GTGGTCCCGCAACAGCTCAT;
【０１０８】
D45Q-hMIF-re - CCATGAGCTGTTGCGGGACC;
【０１０９】
E55A-hMIF-fw2 - CTTCGGCGGCTCCAGCGCGCCGTGCGCGCTCTG; 
【０１１０】
E55A-hMIF-re2 - CAGAGCGCGCACGGCGCGCTGGAGCCGCCGAAG; 
【０１１１】
E55D-hMIF-fw - CTCCAGCCAGCCGTGCGCGC;
【０１１２】
E55D-hMIF-re - GCGCGCACGGCTGGCTGGAG;
【０１１３】
E86A-hMIF-fw - GGCCTGCTGGCCGCGCGCCTGCGCATCAGC; 
【０１１４】
E86A-hMIF-re - GCTGATGCGCAGGCGCGCGGCCAGCAGGCC; 
【０１１５】
R87Q-hMIF-fw - GCTGGCCGAGCAACTGCGCATCAG;
【０１１６】
R87Q-hMIF-re - CTGATGCGCAGTTGCTCGGCCAGC;
【０１１７】
R89Q-hMIF-fw - CCGAGCGCCTGCAAATCAGC;
【０１１８】
R89Q-hMIF-re - GCTGATGCGCAGTTGCTCGG;
【０１１９】
P92A-hMIF-fw - GCGCATCAGCGCGGACAGGG;
【０１２０】
P92A-hMIF-re - CCCTGTCCGCGCTGATGCGC;
【０１２１】
D93A-hMIF-fw2 - CTGCGCATCAGCCCGGCCAGGGTCTACATCAAC; 
【０１２２】
D93A-hMIF-re2 - GTTGATGTAGACCCTGGCCGGGCTGATGCGCAG; 
【０１２３】
D93Q-hMIF-fw - CAGCCCGCAAAGGGTCTACA; 
【０１２４】
D93Q-hMIF-re - TGTAGACCCTTTGCGGGCTG; 
【０１２５】
D101A-hMIF-fw - CATCAACTATTACGCCATGAACGCGGCC; 
【０１２６】
D101A-hMIF-re - GGCCGCGTTCATGGCGTAATAGTTGATG; 
【０１２７】
C57A;C60AhMIFfw -CGGCGGCTCCAGCGAGCCGGCCGCGCTCGCCAGCCTGCACAGCATCGGC;
【０１２８】
C57A;C60AhMIFre -GCCGATGCTGTGCAGGCTGGCGAGCGCGGCCGGCTCGCTGGAGCCGCCG; 
【０１２９】
E22D-mMIF-fw - GAGGGGTTTCTGTCGGACCTCACCCAGCAGCTG; 
【０１３０】
E22D-mMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGGTCCGACAGAAACCCCTC; 
【０１３１】
E22Q-mMIF-fw - GAGGGGTTTCTGTCGCAGCTCACCCAGCAGCTG; 
【０１３２】
E22Q-mMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGCTGCGACAGAAACCCCTC; 
【０１３３】
AAV2-mMIFfw - CGGATCCGCCACCATGCCTATGTTCATCGTG; 
【０１３４】
AAV2-mMIFre -CGGAATTCTCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCAGCGAAGGTGGAACCGT; 
【０１３５】
hEndoG-fw - CGGAATTCATGCGGGCGCTGCGGGCCGGCCT; 
【０１３６】
hEndoG-re - CCGCTCGAGTCACTTACTGCCCGCCGTGATG; 
【０１３７】
hCypA-fw - CGGAATTCATGGTCAACCCCACCGTGTTC; 
【０１３８】
hCypA-re - CCGCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAG
【０１３９】
EndoG gRNA1: CCGCCGCCGCCAACCACCGC(TGG)
【０１４０】
EndoG gRNA2: GGGCTGGGTGCGGTCGTCGA(GGG)
【０１４１】
括弧内の 3 文字は PAM 配列を示し、他の配列（20 塩基）は標的部位である。
【０１４２】
細胞培養、トランスフェクション、レンチウイルス形質導入、細胞毒性
HeLa細胞は、10 ％ ウシ胎児血清（ハイクローン社（HyClone））を添加したダルベッコ改変イーグル培地（インビトロゲン社（Invitrogen））で培養した。V5-タグ付き MIF をリポフェクトアミン・プラス（Lipofectamine Plus（インビトロゲン社（Invitrogen）））でトランスフェクトした。皮質からの初代神経細胞培養を以前に報告されているように調製した（9）。簡単に述べると、皮質を解剖し、0.027 % トリプシン／生理食塩水溶液（ギブコ-BRL 社（Gibco-BRL））中で 10 分間消化した後、改変イーグル培地（MEM）、20 % ウマ血清、30 mM グルコース、及び 2 mM L-グルタミン中で細胞をバラバラに解離させた。前記神経細胞を、ポリオルニチンでコーティングした 15 mm マルチウェル・プレート上、又はポリオルニチンでコーティングしたカバーガラス上に播いた。神経細胞を、MEM、10 % ウマ血清、30 mM グルコース、及び 2 mM L-グルタミン中に、7 % CO2 加湿 37 ℃インキュベーター内で、培養した。この増殖培地は週に 2 回交換した。培養が成熟すると、神経細胞は細胞の総数の 70 から 90 ％ を占めるようになる。in vitro での日数（DIV）7 から 9 日目に、神経細胞を、MIF-WT-Flag、MIF-E22Q-Flag、又は MIF-E22A-Flag を有するレンチウィルスに 72 時間感染させた [1X109ユニット(TU)/ml]。パータナトスを、HeLa 細胞では MNNG（シグマ社（Sigma））又は神経細胞では NMDA（シグマ社（Sigma））のいずれかによって誘導した。HeLa 細胞を MNNG（50 μM）に 15 分間曝露し、及び神経細胞（DIV 10 から 14）を対照塩溶液［control salt solution (CSS)、120 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2、25mM Tris-HCl 及び 20 mM グルコース（pH 7.4）を含有する CSS］で洗浄、500 μM NMDA＋10 μM グリシンの CSS 溶液に 5 分間暴露し、それから、様々な時間、10 % ウマ血清、30 mM グルコース及び 2 mM L-グルタミンを含む MEM に暴露した後に、固定、免疫細胞化学的染色、及び共焦点レーザー走査顕微鏡検査を行った。翌日、全核を 7 μM ヘキスト 33342（インビトロゲン社）で、そして死細胞核を 2 μM ヨウ化プロピジウム（インビトロゲン社）で染色した後、公平で客観的なコンピュータ支援細胞計数法によって細胞生存率を測定した。総細胞数及び死細胞数を、Axiovision 4.6 ソフトウェア（カール・ツァイス）を用いて計数した。少なくとも 6 つの別々のウェルを使用する少なくとも 3  つの別々の実験を、データ・ポイントあたり最小 15,000 から 20,000 個の神経細胞又は細胞を計数して実施した。神経毒性評価では、グリア核は神経核とは異なる強度で蛍光を発するが、これは除外した。細胞死のパーセンテージは、生細胞対死細胞の比として決定し、培養を機械的刺激することによって細胞死を示す対照ウェルにおける細胞死のパーセンテージと比較した。
【０１４３】
プル‐ダウン、免疫共沈降、及び免疫ブロッティング
プル‐ダウン・アッセイでは、GST-タグ付き MIF 又は AIF タンパク質を固定化したグルタチオン・セファロース・ビーズを 500 μgの HeLa 細胞溶解物と共にインキュベートし、溶解緩衝液中で洗浄し、そしてタンパク質ローディング緩衝液中に溶出した。免疫共沈降では、プロテインA/G セファロース（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology））の存在下で、1 mg の全細胞溶解物を AIF 抗体（1 μg/ml）と共に一晩インキュベートし、続いてマウス抗 Flag 抗体（クローン M1、シグマ社）、マウス抗 V5（V8012、シグマ社）又はヤギ抗 MIF（ab36146、アブカム社）で免疫ブロット解析をした。タンパク質を変性 SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。前記メンブレンをブロッキングし、一次抗体（50 ng/ml；マウス抗 Flag；ウサギ抗 AIF；又はヤギ抗 MIF）と 4 ℃でインキュベートした後、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（HRP）が結合したロバ抗マウス、抗ウサギ又は抗ヤギ抗体と室温で 1 時間、インキュベートした。洗浄後、この免疫複合体をスーパーシグナルウェスト・ピコ・ケミルミネッセント基質（SuperSignalWest Pico Chemiluminescent Substrate）（ピアス社（Pierce））によって検出した。
【０１４４】
細胞内分画
核抽出物（N）及び核除去後抽出物（PN）（核タンパク質を除去した後の全細胞溶解物から調製した画分）を低張緩衝液中に単離した（9、11）。核及び核除去後の細胞内画分の完全性（integrity）は、ヒストン H3 及び MnSOD 又は Tom20 の免疫反応性をモニターすることによって判定した（9、11）。
【０１４５】
免疫細胞化学、免疫組織化学、及び共焦点顕微鏡
免疫細胞化学では、MNNG 又は NMDA 処理の 4 時間後に 4 % パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、0.05 % Triton X-100 で透過処理し、そして 3 % BSA の PBS でブロッキングをした。AIF は、ロバ抗ウサギ Cy3 又はロバ抗ウサギ 647 によって可視化した。MIF は、ロバ抗マウス cy2（2 μg/ml）、ロバ抗ヤギ Cy2 又はロバ抗ヤギ 647 によって可視化した。免疫組織化学は、Flag に対する抗体を使って行った。免疫蛍光分析は、（9）に記載されているように、LSM710 共焦点レーザー走査顕微鏡（カール・ツァイス）を用いて行った。
【０１４６】
FPLC
精製組換え MIF の非変性状態（native state）及び純度は、Superdex 200 10/300GL カラム（GE ヘルスケア、ライフ・サイエンス（GE Healthcare, Life Sciences））を使用する Akta Basic FPLC（アマシャム‐ファルマシア社（Amersham-Pharmacia Limited））における、溶出体積と既知分子量非変性マーカー・タンパク質の分子量（kDa）との間で、標準較正曲線を用いて測定した。ゲル濾過カラムでは、標準 PBS 緩衝液中を 0.5 ml/分の流速で流した。以下の分子量標準を使用した：それぞれフェリチン（440 kDa）、アルドラーゼ（158 kDa）、コンアルブミン（75 kDa）、オボアルブミン（43 kDa）、炭酸脱水酵素（29 kDa）、及びリボヌクレアーゼ（13.7 kDa）（GE ヘルスケア、ライフ・サイエンス）。MIF を含有する溶出画分を 12 % SDS-PAGE で分離し、そしてクマシー・ブルーで染色してタンパク質の純度をチェックした。
【０１４７】
MIF タンパク質純度の質量分析
ヌクレアーゼ・アッセイに使用する MIF タンパク質はまた、他の既知のヌクレアーゼによる汚染のあらゆる可能性を除くために、質量分析法によっても試験した。ヌクレアーゼのごく僅かの存在可能性を捉えるために、95 % 以下の信頼水準にある異なる基準を用いた分析を行った。全ての種について NCBI データベースを解析及び検索すると、一本鎖又は二本鎖 DNA を消化することができる既知のヌクレアーゼが、ヌクレアーゼ・アッセイに使用した MIF タンパク質中に検出されなかったことが明らかになる。
【０１４８】
円二色性（CD）分光法
CD 分光法は、AVIV 420 CD 分光計（バイオメディカル社、レイクウッド、ニュージャージ州、米国（Biomedical Inc., Lakewood, NJ, USA））で行った。近紫外 CD スペクトルを、室温、2 mg/ml のタンパク質サンプル濃度、光路長 0.5  cm の石英キュベットを使用し、240-320  nm の間で記録した。遠紫外 CD スペクトルも、室温、0.2 mg/ml 濃度のタンパク質サンプル、光路長 0.1 cm の石英サンドイッチ・キュベットを使用し、190-260 nm の間で記録した（41）。前記タンパク質を、塩化マグネシウム（5.0 mM）及び／若しくは塩化亜鉛（0.2 mM）を含む又は含まない PBS 緩衝液に懸濁した。前記 CD スペクトルを、0.5 nm のデータ・ピッチ、1 nm/3 秒の走査速度で得て、及び記録のために 0.5 秒の応答時間を選択した。
【０１４９】
オキシド‐レダクターゼ活性アッセイ
MIF のチオール‐タンパク質オキシドレダクターゼ活性は、以前に報告されているように、インスリンを基質として使用して測定した（30）。簡単に述べると、インスリン・アッセイは、インスリンの減少及びそれに続くインスリンβ‐鎖の不溶化に基づいている。次いで濁度が時間依存的に増加することを 650 nm で分光光度的に測定する。この反応は、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）、及び 200 mM 還元型グルタチオン（GSH）に溶解した 5 μM MIF WT、E22A、E22Q、C57A;C60A 及び／又は P2G 変異体を、1 mg/ml インスリン、100 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）及び 2 mM EDTA 含む氷冷反応混合物に添加することによって開始させた。同じ実験において、対照溶液（GSH 含有）に対して、MIF インスリン減少を測定した。
【０１５０】
トートメラーゼ・アッセイ
以前に報告されているように（42）、基質として D-ドーパクロム・トートメラーゼを使用して、トートメラーゼ活性を測定した。簡単に述べると、2 mM の L-3,4 ジヒドロキシフェニルアラニン・メチル・エステルを 4 mM の過酸化ナトリウムと室温で 5 分間混合することで D-ドーパクロム・メチル・エステルの溶液を用時調製し、次いで使用前に直接氷上に置いた。その酵素反応は、20 μlのドーパクロム・メチル・エステル基質を200 μlの MIF WT、E22A、E22Q、C57A;C60A（最終濃度 5 μM）及び／又は P2G 変異体のトートメラーゼ・アッセイ緩衝液（50 mM リン酸カリウム、1 mM EDTA、pH 6.0）に添加することで開始させた。その活性は、分光光度計を使用して、OD 475 nm の半連続的な減少により測定した。
【０１５１】
脳室内（Intracerebroventricular（ICV））投与
3 μl の AAV2-MIF WT、E22Q 及び E22A（1x1013 GC/ml、ベクター・バイオラボ社（Vector BioLabs））を新生児 MIF-KO マウスの脳室内の両側に投与した（34）。MIF とその変異体の発現は、8-16 週齢での MCAO 手術後に免疫組織化学によって確認した。
【０１５２】
神経行動活動
自発運動活動を、MCAOの 1 日後、3 日後及び 7 日後に、動物をマウス・ケージに 5 分間入れて評価した。ケージ内のマウスの動きを記録するために、ビデオ・カメラをケージの上に取り付けた。神経学的欠損を、0-5 の尺度（0、神経学的欠損なし；5、重度の神経学的欠損）で動物の処置及び遺伝子型を知らされていない観察者によって評価した。以下の基準を用いて欠損をスコア付けした：0= マウスは正常に見え、ケージ環境を探索し、そしてケージ内を自由に動き回った；1= マウスは遠慮がちにケージ内を移動したが、時折ケージの壁に触れることができた、2= マウスは姿勢異常及び動作異常を示し、ケージの全ての側面に近づくわけではなかった、3= マウスは姿勢異常及び動作異常を示し、ケージの真ん中で中サイズの円を描いて動いた、4= マウスは姿勢異常を示し、所定の位置に非常に小さい円を描いて動いた、5= マウスはケージ内を動くことができずに真ん中に留まった。記録を、動物の処置及び遺伝子型を知らされていない観察者によって評価した。
【０１５３】
コーナー試験（corner test）をMCAOの 1 日後、3 日後及び 7 日後に行って、皮質及び線条体の損傷後の感覚及び運動の欠損を評価した。ビデオ・カメラをケージの上に取り付けて、ケージ内でのマウスの活動を 5 分間記録した。前記マウスを、それぞれ 30 cm × 20 cm × 0.5 mm の寸法を有し、端から 30 °の角度で互いに取り付けた 2  つの厚紙の間に置いた。コーナー（corner）に入ると、マウスは通常後ろ脚で立ってから左又は右に向きに回る（ターン（turn））。脳梗塞の前には、マウスは向きについての傾向を示さない。脳梗塞後に感覚及び運動の欠損を有するマウスは、非障害側（右）の向きに回るだろう。右ターンの % = 右ターン／総ターン×100 を計算し比較した。記録を、動物の処置及び遺伝子型を知らされていない観察者によって評価した。
【０１５４】
動物
ジョンズ・ホプキンス医学研究所（The Johns Hopkins Medical Institutions）は、米国実験動物飼育認定協会（American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC））によって完全に認定されている。本研究で実施されたすべての研究手順は、動物福祉法の規制及び公衆衛生局（Public Health Service（PHS））の方針に準拠して、ジョンズ・ホプキンス医学研究所の施設内動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC））で承認された。全ての動物実験は盲検様式で行われた。マウスの遺伝子型は K.N. によって決定された。脳梗塞手術は R.A. によって行われた。マウスの遺伝子型は、脳梗塞手術、マウス行動試験及びデータ解析の後に解析した。それらの遺伝子型に基づいて、マウスを WT、KO、KO-WT、KO-E22Q 及び KO-E22A として群分けした。各群内で、マウスを、擬似手術（sham）、梗塞 1 日後、梗塞 3 日後又は 7 日後等を含むサブグループに無作為に割り当てた。
【０１５５】
統計分析
特に明記しない限り、統計的評価は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して、2 群間のスチューデントの t 検定、及び多群間の一元配置分散分析（ANOVA）と続いてボンフェローニ検定による事後比較（post hoc comparisons）を行った。データは平均値±SEM として示す。P <0.05 が有意と見なされる。定量化のための実験は盲検様式で行った。効果を検出するのに十分な検出力を確保するために、すべての分子生化学研究について少なくとも 3 回の独立した試験を行い、3 つの異なる同腹仔からの少なくとも 5 匹のマウスを動物実験に用いた。
【０１５６】
EndoG、MIF タンパク質構造、MIF 変異、MIF タンパク質純度、ChIP シークエンシング・データ、及び MIF-AIF 結合の追加解析。
【０１５７】
EndoG は PARP-1 依存性細胞死には重要ではない
以前に報告されているように（13、14）、EndoG がパータナトスに重要ではないことを確認するために、CRISPR/Cas9 システムを使用して、ヒト SH-SY5Y 細胞から endoG をノックアウトした（図１２Ａ）。endoG をノックアウトすることによっては、MNNG 誘導性のパータナトス（図１２Ｂ）及び大きな DNA 断片化（図１２Ｃ）を阻止することができず、EndoG がパータナトスに必要とされないことが確認された（13、14）。
【０１５８】
MIF タンパク質構造の解析
ヌクレアーゼのコア PD-D/E(X)K トポロジー構造は、2 本のヘリックスに隣接する 4 本のβ‐ストランドからなる（18）。2 本のβ‐ストランドは互いに平行であり、他の 2 本は逆平行である（図１４Ｃ、（18）からの修正）。以前の MIF の 3-D 結晶構造は、それが三量体として存在することを示している（21-23）。MIF の三量体構造によって、各単量体のβ‐ストランドと他の単量体とが相互作用することが可能になり、2 本のα‐ストランドに隣接する 4 本のβ‐ストランドからなるPD-D/E(X)K 構造をもたらされる（図１Ｅ及び図１４、ＤからＧ）。2 本のβ‐ストランド（β-4 及びβ-5）は平行であるが、他の 2 本のストランド（β-6 及びβ-7）（隣接単量体から）は逆平行である（図１４、ＤからＧ）。MIF 三量体におけるアルファ・ヘリックスに対するベータ・ストランドの配向性がある PD-D/E(X)K モチーフのトポロジー構造は、よく分かっているエンドヌクレアーゼである EcoRV と非常に類似している（図１４、ＨからＫ）。重要なことに、MIF の三量体構造に基づくPD-D/E(X)K モチーフは、EcoRI 及び EcoRV 等の II 型 ATP 非依存性制限エンドヌクレアーゼ、並びに ExoIII 等の ExoIII ファミリー・プリン／アピリミジン（AP）エンドヌクレアーゼ（図１Ｅ及び図１４、ＬからＮ）、と構造的に類似している。更に、MIF は PvuII エンドヌクレアーゼとも同様のトポロジーを有し、そのβ-7 ストランドはその PD-D/E(x)K モチーフ内の同じ位置で PvuII エンドヌクレアーゼのβ‐ストランドと同様のサイズである（図１４Ｏ）。これらの 3-D モデリングの結果を総合すると、MIF は PD-D/E(X)K ヌクレアーゼ様スーパーファミリーに属することが示される（24、25）。
【０１５９】
MIF のヌクレアーゼ活性に重要な残基の同定
MIF のヌクレアーゼ活性に重要なアミノ酸残基を同定するために、MIF の PD-D/E(X)K ドメイン内の重要なアスパラギン酸及びグルタミン酸残基をアラニンに変異させた。グルタミン酸 22 をアラニンに置換すると（E22A）明らかに（しかし、完全にではない）、MIF のヌクレアーゼ活性が低下するのに対し、他のアスパラギン酸及びグルタミン酸をアラニンに置換しても（D17A、D45A、E55A、E86A、D93A 及び D101A 等を含む）実質的な効果は見られない（図１５Ｅ）。MIF の CxxCxxHx(n)C ジンク・フィンガー・ドメインの変異である C57A;C60A は、それほどの影響を及ぼさない（図１５Ｅ）。MIF E22A はヌクレアーゼ活性が低下しているので、E22 の周りで更に保存的な変異を作成した（図１５、Ｆ及びＧ）。MIF E22Q はヌクレアーゼ活性を有さず（図２Ｄ及び図１５、Ｄ及びＨ）、一方 E22D は野生型と同等のヌクレアーゼ活性を有する（図２Ｄ）。これらのデータは、MIF の最初のα‐ヘリックスにおけるこのグルタミン酸残基（E22）が、そのヌクレアーゼ活性にとって重要であることを示唆しており、これは多くのエキソヌクレアーゼ‐エンドヌクレアーゼ‐ホスファターゼ（Exonuclease-Endonuclease-Phosphatase（EEP））ドメイン・スーパーファミリー・ヌクレアーゼの最初のα‐ヘリックスにおけるこのグルタミン酸が高度に保存されており、それがヌクレアーゼ活性の活性部位であるという先行報告（24、25）と合致する。三次元構造モデリングに基づいて（図１Ｅ）、可能性のある MIF DNA 結合部位に変異：P16A、P44A、R87Q、R89Q、P92A、D45Q、D17Q、E55Q、及び D93Q 等を含む、を入れた（図１５Ｈ）。P16A 又は D17Q が MIF ヌクレアーゼ活性を妨げることが見出された（図１５Ｈ）。MIF の配列アラインメント及び三次元構造モデリングの両方に基づくと、そのデータにより、P16、D17 及び E22 が同じPD-D/E(X)K モチーフ内にあり、各単一残基の変異が MIF ヌクレアーゼ活性を遮断するのに十分であることが明らかになる。最初のα‐ヘリックスの E22 は種間で高度に保存されており、以前に PD-D/E(X)K ヌクレアーゼ様スーパーファミリー・ヌクレアーゼ活性の活性部位として報告されていたという事実を考慮して（24、25）、この後の研究では、前記 E22 変異体に焦点を当てた。
【０１６０】
EndoG とシクロフィリン A は PARP-1 依存性の大きな DNA 断片化に直接には関与しない
EndoG 及びシクロフィリン A は、AIF 関連ヌクレアーゼであることが以前に示唆されてきている（43-45）。パルス‐フィールド・ゲル電気泳動は、EndoG が DNA を小さな断片に切断することを示し、これはパータナトスで観察される、より大きな DNA 断片化のパターンとは一致しない（図１５Ｄ）。対照的に、MIF は、MNNG 誘導性の DNA 断片化と同様のパターンで DNA を大きな断片に切断する（図２Ｂ及び図１５Ｄ）（13、14）。シクロフィリン A 及び AIF には、陰性対照としての役割のグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）と同様に明白なヌクレアーゼ活性を有さない（図１５Ｄ）。
【０１６１】
MIF ヌクレアーゼ活性はそのオキシドレダクターゼ及びトートメラーゼ活性から独立している
以前の研究より、MIF はオキシドレダクターゼ及びトートメラーゼ活性の両方を有することが示されている（27、29、30）。野生型及び MIF 変異体のオキシドレダクターゼ活性を、基質としてインスリンを用いて測定した（還元型インスリンは野生型 MIF の存在下で 650 nm の吸光度を示す）（図１６Ａ）。E22Q、E22A、C57A;C60A MIF変異体及びトートメラーゼ P2G MIF 変異体は、MIF のオキシドレダクターゼ活性にはっきりと分かるような影響を及ぼさない（図１６Ａ）。MIF のトートメラーゼ活性も測定した。E22Q、E22A、C57A;C60A の MIF 変異は MIF のトートメラーゼ活性にはっきりと分かるような影響を与えないが、P2G MIF 変異体は MIF のトートメラーゼ活性を著しく低下させる（図１６Ｂ）。これらの結果を総合すると、MIF 活性部位変異体の E22Q 及び E22A は、MIF のオキシドレダクターゼ活性又はトートメラーゼ活性に、はっきりと分かるような影響を及ぼさないことを示している。
【０１６２】
精製した MIF タンパク質には、偶発的なヌクレアーゼ汚染はない
組換え MIF 調製物が、ヌクレアーゼを偶発的に含有していることがないことを確認するために、FPLC を実施した。FPLC によって、三量体として存在する MIF と一致する約 37 kD の分子量に、ただ 1 つのピークがあることが明らかになる。MIF E22Q 及び E22A もまた三量体構造と一致する 37 kD で溶出するが、これらの変異は 、MIF の存在を確認することに対して、はっきりと分かるような影響を及ぼさないことが示唆されている（図１６Ｃ）。クマシー・ブルー染色は、FPLC 精製後のタンパク質（図１６Ｄ）及び FPLC 精製無しのタンパク質（図１５Ｇ）中に単一のバンドのみがあることを明らかにする。FPLC 精製をした、及びしていない両方のタイプのタンパク質をヌクレアーゼ・アッセイにおいて使用したところ、明らかな差異は観察されなかった。ヌクレアーゼ・アッセイに使用した、これらのすべての組換え MIF タンパク質の純度も、2 つの独立した質量分析（MS）アッセイによって確認した。MS によって同定したペプチドの大多数は MIF である。一本鎖又は二本鎖 DNA を切断することができる、あらゆる種由来の既知のヌクレアーゼは同定されなかった。従って、MIF 調製物は非常に純粋であり、そして偶発的なヌクレアーゼは存在しない。
【０１６３】
MIF タンパク質の存在の確認は E22Q、E22A、C57A;C60A 変異の影響を受けない
タンパク質の二次構造を研究するための一般的な方法である遠紫外（UV）円二色性（CD）分光法は、野生型 MIF が、以前に報告された MIF の結晶構造（22）と合致して、α‐ヘリックス及びβ‐シートが混合して成ることを示す。MIF 変異体である E22Q、E22A 及び C57A; C60A は、野生型 MIF と同様の CD スペクトルを示し、これらの変異が MIF の立体配座に有意に影響を及ぼさないことを示唆している（図１６Ｅ）。野生型 MIF 又は MIF 変異体に Mg2+ を添加しても有意な変化は観察されない（図１６Ｆ‐Ｉ）。しかしながら、Zn2+の添加によりスペクトルが大きく変化し、Zn2+ が結合すると野生型 MIF タンパク質の構造が有意に変化することを示している（図１６Ｆ）。MIF E22Q 及び E22A は、Zn2+ の存在下で野生型 MIF と同様の CD スペクトルを示す（図１６、Ｇ及びＨ）。しかし、C57A;C60A 変異体に Zn2+ を添加しても、CD スペクトルに変化は生じず、これは、MIF の CxxCxxHx(n)C ジンク・フィンガー・ドメインで、MIF は Zn2+ と結合する、ということを示している（図１６Ｉ）。
【０１６４】
近紫外 CD 分光法を用いて、MIF 及び MIF 変異体の三次元構造を更に解析した。前記精製したタンパク質は、近紫外 CD スペクトルにおいてフェニルアラニン及びチロシンの明確なピークがあるので、適切に折り畳まれた三次構造を有する（図１６Ｊ）。MIF 変異体である E22Q、E22A 及び C57A;C60A は野生型と同様の近紫外 CD スペクトルを示し、これらの変異体が MIF の三次元構造に影響を有意に及ぼさないことを示唆している（図１６、ＪからＭ）。野生型 MIF 又は MIF 変異体 C57A;C60A への Mg2+の添加は、Mg2+ が結合したことの指標となる三次元構造に有意な変化を引き起こす（図１６、Ｊ及びＭ）。E22A は Mg2+ の存在下で小さな変化を示し、E22Q は近紫外 CD スペクトルにおいて有意な変化を示さず、これは Mg2+ が E22 に又はその近くに結合することを示唆する（図１６、Ｋ及びＬ）。これは、Mg2+が MIF のヌクレアーゼ活性に必要であり、E22Q 及び E22A 変異体が、そのヌクレアーゼ活性を完全に又は部分的に遮断することができる、という我々の発見と合致する。野生型 MIF 又は MIF 変異体である E22A 及び E22Q に Zn2+ を添加することによって、Zn2+ が結合したことの指標となる三次元構造に有意な変化が引き起こされるが、一方で、MIF C57A; C60A 変異体では、CxxCxxHx(n)C ジンク・フィンガー・ドメインに Zn2+が結合したことと一致する有意な変化は見られない（図１６、ＪからＭ）。
【０１６５】
MIF-DNA 結合特性の ChIP シークエンシング解析
前記データは MIF がヌクレアーゼ活性を有することを示しているので、次に MIF が DMSO 又は MNNG で処理した（50 μM、15分）HeLa 細胞中で DNA に結合しているかどうかを調べた。処理の 5 時間後、ChIP アッセイのために細胞を架橋して調製し、続いてディープ・シークエンシング（deep sequencing）を行った。剪断されたゲノム DNA の品質及び MIF 抗体を用いた ChIP の特異性を試験し確認した（図１７、Ａ及びＢ）。DMSO-処理サンプル中のピークと重なるものを除外した後では、全マッピング・リードの 0.1 % が MNNG 処理後の MIF ピークを示す（図１７Ｃ）。MNNG 処理後、MIF はプロモーター及び 5’ UTR 領域に選択的に結合する（図１７Ｄ）。ゲノム上に MIF が富化していることの代表的な IGV 可視化を、2 つの異なるウィンドウ・サイズ（250 kb（図１７Ｅ）及び 50 kb（図１７Ｆ））で示す。MIF ピーク間の平均距離間隔は、約 15 から 60 kb であり、パルス‐ゲル電気泳動で観察されたパータナトスの際の DNA 断片のサイズと一致する。ChIP-qPCR によって更に、MNNG 処理後、MIF は 55101、66005、65892、36229、46426 及び 62750 のピーク領域に結合しているが、非ピーク領域には結合していないことが確認される（図１７Ｇ）。
【０１６６】
AIF-MIF 結合のマッピング
MIF が AIF 結合タンパク質であることを確認するために、GST プル・ダウン実験を行った。野生型 GST-AIF は内因性 MIF をプル・ダウンし、そして野生型 GST-MIF は内因性 AIF をプル・ダウンする（図４Ａ及び図２１、ＡからＤ）。MIF に結合するドメインを、色々な GST-タグ付き AIF ドメインを用いた GST プル・ダウンによって更に決定した（図２１Ａ）。MIF は GST-C2b AIF（aa 551-590）及び GST C2e AIF（aa 571-612）に結合する（図２１、Ａ及びＢ）。MIF は GST-C2aAIF 、GST-C2cAIF 、GST-C2dAIF 又は GST には結合せず、これは使用した実験条件では非特異的に GST に結合しないことを示している（図２１、Ａ及びＢ）。aa567-592 をポリアラニンに変異させること（AIF m567-592）、又は全長から aa567-592 を欠失させる（AIFΔ567-592）と、MIF 及び AIF の結合は完全に無くなり（図２１Ｃ）、MIF が aa567-592 で AIF に結合することを示唆する。
【０１６７】
MIF の以前の結晶化研究は、MIF が PD-D/E(x)K ヌクレアーゼと構造的に類似していることを 3D モデリングによって示した。PD-D/E(X)K ドメインを含むタンパク質はヌクレアーゼ様スーパーファミリーに属し（総説については（24、25）を参照）、MIF がヌクレアーゼであるという更なる証拠を提供する。このヌクレアーゼ・スーパーファミリーには、生物界のあらゆるヌクレアーゼが含まれる。これらのタンパク質の大部分は原核生物に属するが、このドメインは様々な脊椎動物のヌクレアーゼにも含まれている（24、25）。MIF のPD-D/E(X)K ドメインは脊椎動物で高度に保存されている。MIF の最初のα‐ヘリックス中のグルタミン酸残基（E22）はそのヌクレアーゼ活性にとって重要であり、これは多くのエキソヌクレアーゼ‐エンドヌクレアーゼ‐ホスファターゼ（Exonuclease-Endonuclease-Phosphatase（EEP））ドメイン・スーパーファミリー・ヌクレアーゼの最初のα‐ヘリックスにおけるこのグルタミン酸は高度に保存されており、それはヌクレアーゼ活性の活性部位である（24、25）という以前の報告と合致する。
【０１６８】
コア PD-D/E(x)K 構造は、2 本のα‐ヘリックスに隣接する 4 本のβ‐鎖からなる。β‐鎖のうちの 2 本は互いに平行であり、他の 2 本は逆平行である（18、24）。興味深いことに、MIF単量体は、2 本のα‐ヘリックスに隣接する 4 本のβ‐鎖を有し、分離した単量体内のβ‐鎖の配向性は、PD-D/E(X)K トポロジーの要件（22）を満たしていないので、擬似 2-束の対称性を有する MIF 単量体はコアの PD-D/E(X)K 構造を含まない。しかしながら、3-束の対称性を有する MIF 三量体に基づく構造‐活性解析は、各単量体のβ‐鎖と他の単量体との相互作用によって、2 本のα‐ヘリックスに隣接する 4 本のβ‐鎖からなる MIF の PD-D/E(x)K 構造がもたらされることを示す。2 本のβ‐鎖（β-4とβ-5）は平行であるのに対し、他の 2 本の鎖（β-6とβ-7）（隣接単量体に由来する）は逆平行である。このトポロジーは、MIF のヌクレアーゼ活性は三量体を必要とし、単量体はその必要なトポロジーを備えていないという考えを見事に支持し、MIF が三量体として存在することと合致する。MIF 三量体のこのトポロジーは、活性残基であるグルタミン酸 22 を含有するα-1 ヘリックスをβ‐鎖の隣に配置するが、これは前例のないことではない（18、24）。例えば、よく知られているエンドヌクレアーゼである EcoRV は、古典的な PD-D/E(x)K モチーフとは異なり、MIF のPD-D/E(x)K モチーフと類似するαヘリックスに対するβ‐鎖の配向性を有する PD-D/E(x)K モチーフを有する。EcoRV に対する MIF のトポロジーにおける類似性は、MIF がよく知られている制限エンドヌクレアーゼと非常に類似していることを示唆する。確かに、コアα‐ヘリックスの保存された酸性残基（通常は第 1 α‐ヘリックスのグルタミン酸）は、少なくとも MIF について報告された（24）ものと類似する PD-D/E(x)K ファミリーのサブセットにおいては、しばしば活性部位を形成するのに寄与する。MIF の三量体構造に基づく PD-D/E(x)K モチーフはまた、ヌクレアーゼ Exo III、EcoRI、及び EcoRV と非常によく似た構造もしている。更に、MIF は PvuII エンドヌクレアーゼと類似のトポロジーを持ち、MIF のβ-7 鎖は、PvuIIエンドヌクレアーゼの、PD-D/E(X)K モチーフの同じ位置にあるβ‐鎖と似たサイズである（46）。その構造解析に基づけば、MIF はヌクレアーゼとして分類されるべきである。
【０１６９】
MIF には様々な多面的作用がある。MIF はがん生物学、免疫応答及び炎症において重要な役割を果たす可能性がある非古典的に分泌されるサイトカインとして機能する（16、17）。MIF は細胞ストレス及びアポトーシスにおいても重要な役割を果たしている（47、48）。MIF のノックアウトは局所性虚血において神経保護的であることも示されている（49）。前記結果は、MIF のノックアウトが、局所性虚血から保護すること、及び、MIF が AIF に結合すること、及び PAAN としての機能と合致する MIF のヌクレアーゼ活性を介して、MIF が局所性虚血における神経細胞損傷に寄与すること示すこと、を支持する。MIF はまた、チオール‐タンパク質オキシドレダクターゼ活性及びトートメラーゼ活性を有する。EMSA と ChIP はどちらも MIF が DNA に結合することを示す。MIF は高度に関連したファミリーの重なり合う配列に結合するが、前記構造‐活性実験は、MIF が ssDNA にその構造に基づいて選択的に結合し、そしてそれが配列特異性にあまり依存しないことを示す。MIFは、ステム・ループ構造を持つ ssDNA の 5’ 不対塩基に結合し、3’ エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方の活性を持ち、ステム・ループ ssDNA の 3’ 端で不対塩基を切断する。三次元計算モデリングは、触媒性の E22 がモデル化された ssDNA の結合ドメインの近くにあることを示す。本明細書で示すように、MIF のヌクレアーゼ活性は、オキシドレダクターゼ活性とトートメラーゼ活性から明確に区別することができる。
【０１７０】
AIF に結び付いたヌクレアーゼを同定しようとする以前の試みは、当初ミトコンドリア・マトリックス・タンパク質である EndoG に焦点を当てていた（43）。線虫では、哺乳動物の EndoG のホモログである CPS-6 が、WAH-1（AIF ホモログ）の細胞死誘導特性に必要である。しかしながら、哺乳動物では、EndoG は PARP-1 依存性虚血性細胞死等を含む多くの細胞死モデルでは重要ではない（13、14、50）。重要なことに、中大脳動脈閉塞後、野生型対照と比較して、EndoG ノックアウト・マウスにおいて同量のDNA断片化があった（13）。これらの観察と合致して、endoG をノックアウトしても MNNG 誘導性のパータナトス及び大きな DNA 断片化を阻止することができず、EndoG がパータナトスに必要ではないことを支持することが、裏付けられた（13、14）。対照的に、MIF のノックアウト、MIF のヌクレアーゼ欠損変異体及び MIF の AIF 結合欠損変異体は、PARP-1 の活性化後の in vitro 及び in vivo の両方で細胞死及び大きな DNA 断片化を妨げる。したがって、哺乳動物では EndoG は PAAN ではなく、一方で MIF がこの役割のすべての基準に適合する。最近、AIF がシクロフィリン A と共に活性のある DNA 分解複合体を生成することが示唆された（45）が、この複合体中のヌクレアーゼは同定されていなかった。
【０１７１】
【表１−１】
2019532038.tif 000002
【表１−２】
2019532038.tif 000003
【０１７２】
本発明を上記の実施例を参照して説明してきたが、変更及び変形が本発明の精神及び範囲内に包含されることが理解されるであろう。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１７３】
＜参考文献＞
以下の参考文献はそれぞれ信頼されているものであり、その全体が本明細書に組み込まれる。
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https://drive.google.com/folderview?id=0B5rxNsjjvI-
9fjJfS1FXbU9vMDFURlZBSC0yYkswZ3NjYzZMVVBiYUoySG5YOVRzQTZk W8&usp=sharing.
【図１】
2019532038.tif 000004
【図１Ｃ】
2019532038.tif 000005
【図１Ｄ】
2019532038.tif 000006
【図１Ｅ】
2019532038.tif 000007
【図２】
2019532038.tif 000008
【図３Ａ】
2019532038.tif 000009
【図３Ｂ】
2019532038.tif 000010
【図３Ｃ】
2019532038.tif 000011
【図３Ｄ】
2019532038.tif 000012
【図３Ｅ】
2019532038.tif 000013
【図４−１】
2019532038.tif 000014
【図４−２】
2019532038.tif 000015
【図４−３】
2019532038.tif 000016
【図４−４】
2019532038.tif 000017
【図５−１】
2019532038.tif 000018
【図５−２】
2019532038.tif 000019
【図５−３】
2019532038.tif 000020
【図６】
2019532038.tif 000021
【図７】
2019532038.tif 000022
【図８】
2019532038.tif 000023
【図９】
2019532038.tif 000024
【図１０Ａ】
2019532038.tif 000025
【図１０Ｂ】
2019532038.tif 000026
【図１１】
2019532038.tif 000027
【図１２】
2019532038.tif 000028
【図１３−１】
2019532038.tif 000029
【図１３−２】
2019532038.tif 000030
【図１３−３】
2019532038.tif 000031
【図１３−４】
2019532038.tif 000032
【図１４Ａ−Ｃ】
2019532038.tif 000033
【図１４Ｄ】
2019532038.tif 000034
【図１４Ｅ】
2019532038.tif 000035
【図１４Ｆ】
2019532038.tif 000036
【図１４Ｇ】
2019532038.tif 000037
【図１４Ｈ】
2019532038.tif 000038
【図１４Ｉ−Ｍ】
2019532038.tif 000039
【図１４Ｎ−Ｏ】
2019532038.tif 000040
【図１５−１】
2019532038.tif 000041
【図１５−２】
2019532038.tif 000042
【図１５−３】
2019532038.tif 000043
【図１６−１】
2019532038.tif 000044
【図１６−２】
2019532038.tif 000045
【図１６−３】
2019532038.tif 000046
【図１６−４】
2019532038.tif 000047
【図１７−１】
2019532038.tif 000048
【図１７−２】
2019532038.tif 000049
【図１７−３】
2019532038.tif 000050
【図１７−４】
2019532038.tif 000051
【図１７−５】
2019532038.tif 000052
【図１８−１】
2019532038.tif 000053
【図１８−２】
2019532038.tif 000054
【図１９−１】
2019532038.tif 000055
【図１９−２】
2019532038.tif 000056
【図１９−３】
2019532038.tif 000057
【図２０−１】
2019532038.tif 000058
【図２０−２】
2019532038.tif 000059
【図２１−１】
2019532038.tif 000060
【図２１−２】
2019532038.tif 000061
【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
2019532038.tif 000069
【図２３−３】
2019532038.tif 000070
【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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