(57)【要約】抗ＣＴＬＡ４−抗ＰＤ−１二機能性抗体、その医薬組成物およびその使用。具体的に、前記の抗ＣＴＬＡ４−抗ＰＤ−１二機能性抗体は、ＰＤ−１を標的とする第１タンパク質機能領域と、ＣＴＬＡ４を標的とする第２タンパク質機能領域を含む。当該二機能性抗体は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１と特異的にうまく結合でき、特異的にＣＴＬＡ４およびＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除け、Ｔリンパ球を活性化させることができ、良好な応用の将来性がある。【選択図】図５２
2019533475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１を標的とする第１タンパク質機能領域と、
ＣＴＬＡ４を標的とする第２タンパク質機能領域と、を含む二重特異性抗体。
【請求項２】
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域は、直接に接続または接続断片によって接続され、好ましくは、前記接続断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは、正の整数、例えば１、２、３、４、５または６である、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域は、独立して免疫グロブリンまたはその抗原結合断片、例えば、半抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、または、一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記第１タンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第２タンパク質機能領域が一本鎖抗体であり、あるいは、
好ましくは、前記第１タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、前記第２タンパク質機能領域は免疫グロブリンである、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域は、独立して１個、２個または２個以上である、請求項１〜３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、または、ＩｇＭであり、好ましくはＩｇＧである、請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に接続されている、請求項３〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
本発明の一つの実施形態において、
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲを含み、および／または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲを含み、
あるいは、
本発明の別の実施形態において、
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲを含み、および／または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲを含む、
請求項３〜６の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
本発明の一つの実施形態において、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２からなる群から選択され、および／または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７からなる群から選択され、
あるいは、
本発明の別の実施形態において、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７からなる群から選択され、および／または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２からなる群から選択される、請求項３〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
前記の免疫グロブリンは非−ＣＤＲ領域を含み、かつ、前記非−ＣＤＲ領域は、鼠類以外の種由来、例えばヒト抗体由来である、請求項１〜８の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
前記の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４タンパク質および／またはＰＤ−１タンパク質に結合するＫＤが約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下である、請求項１〜９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の重鎖可変領域は、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲ、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲ、および、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲ、
を含む、単離核酸分子。
【請求項１２】
抗体の軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の軽鎖可変領域は、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲ、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲ、
を含む、単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項１１及び／または請求項１２に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１１及び／または請求項１２に記載の単離核酸分子、あるいは、請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を適切な条件で培養する工程、および、細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収する工程を含む、方法。
【請求項１６】
二重特異性抗体および複合部分を含む複合体であって、前記二重特異性抗体は請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体であり、前記複合部分は検出可能な標識であり、好ましくは、前記複合部分が放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素である、複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体、あるいは、請求項１６に記載の複合体を含む、キットであって、
好ましくは、前記キットが前記二重特異性抗体を特異的に認識する第２抗体をさらに含み、任意的に、前記第２抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素をさらに含む、キット。
【請求項１８】
試料中のＣＴＬＡ４および／ＰＤ−１の存在またはそのレベルを検出するために用いられるキットの製造における、請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項１６に記載の複合体を含み、
さらに、薬学的に許容されるベクター及び／または賦形剤を任意的に含む、医薬組成物。
【請求項２０】
腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断する薬剤の調製における、請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体もしくは請求項１６に記載の複合体の使用であって、好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、使用。
【請求項２１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項１６に記載の複合体の、
試料中のＣＴＬＡ４のレベルを検出する薬剤、
ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断する薬剤、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、
Ｔリンパ球を活性化する薬剤、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
の調製における使用、
および／または、
ＰＤ−１のＰＤＬ１への結合を遮断する薬剤、
ＰＤ−１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現を増加させる薬剤
の調製における使用。
【請求項２２】
有効量の請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項１６に記載の複合体を、細胞またはニーズがある被験者にインビボまたはインビトロで投与する工程を含む、
試料中のＣＴＬＡ４のレベルを検出する方法、
ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断する方法、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、
Ｔリンパ球を活性化する方法、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる方法、
および／または、
ＰＤ−１のＰＤＬ１への結合を遮断する方法、
ＰＤ−１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現を増加させる方法、
からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断するために用いられ、好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項１６に記載の複合体。
【請求項２４】
試料中のＣＴＬＡ４のレベルを検出すること、
ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断すること、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、
Ｔリンパ球を活性化する薬剤こと、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させること、
および／または、
ＰＤ−１のＰＤＬ１への結合を遮断すること、
ＰＤ−１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現を増加させること、
に用いられる、請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項１６に記載の複合体。
【請求項２５】
有効量の請求項１〜１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体あるいは請求項１６に記載の複合体を、ニーズがある被験者に投与する工程を含む、腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断するための方法であって、
好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療および分子免疫学の分野に属し、抗ＣＴＬＡ４−抗ＰＤ−１二機能性抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。具体的に、本発明は抗ＣＴＬＡ４−抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞傷害性Ｔリンパ球に関する抗原−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４、ＣＴＬＡ４とも略称される）は、遺伝子構造、染色体局在、配列同一性および遺伝子発現の面でＣＤ２８分子と非常に近接な関係を持ち、共に共刺激分子Ｂ７の受容体であり、主に活性化されるＴ細胞の表面に発現される。ＣＴＬＡ４は、Ｂ７に結合すると、マウスおよびヒトＴ細胞の活性化を阻害でき、Ｔ細胞の活性化において負的調節する役割を果たす。
ＣＴＬＡ４  ｍＡｂまたはＣＴＬＡ４リガンドは、ＣＴＬＡ４の天然的なリガンドとのＣＴＬＡ４の結合を阻止することができることによって、Ｔ細胞の負的調節したシグナルに対するＣＴＬＡ４の伝達をブロックし、種々の抗原に対するＴ細胞の反応性を高め、この点についてインビボおよびインビトロの研究結果は基本的に一致している。現在、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸癌、肝臓癌、悪性黒色腫などの治療のために用いられている臨床試験中にあるＣＴＬＡ４  ｍＡｂは存在する（Ｇｒｏｓｓｏ  ＪＦ．，  Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  ＭＮ．，  ＣＴＬＡ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  ２０１３；  １３：５．  Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊａｎ  ２２）。
【０００３】
インターロイキン２（ＩＬ−２）はＴ細胞から産生され、Ｔ細胞サブセットを調節する成長因子であり、また免疫応答を調節する重要な因子であり、かつ活性化Ｂ細胞の増殖を促進し、抗体反応、造血および腫瘍監視に関与することができる。組換えヒトＩＬ−２は悪性腫瘍（メラノーマ、腎臓腫瘍などを含む）の治療に用いられることが米国ＦＤＡによって承認され、かつ、慢性ウイルス感染症の治療の臨床研究を受けている（Ｃｈａｖｅｚ，  Ａ．Ｒ．ら、  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ２００９．  １１８２：ｐ．  １４−２７）。インビトロ試験において、ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を特異的に取り除け、Ｔ細胞を活性化させ、ＩＬ−２の産生を誘導し、抗腫瘍および寄生虫症などの疾患の遺伝子治療において広い応用見通しを有する。
【０００４】
ＣＴＬＡ４およびＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、Ｔ細胞の機能に影響を与える重要な因子として、生体の免疫微環境を介入することにより、病気に対して特異的な治療効果を生み出し、かつ高い治療効果を発揮し、伝統的な薬物の欠乏を補って、遺伝子治療の新しい方法を切り開く。ＣＴＬＡ４およびＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、試験およびさまざまな段階の臨床診療で使用され、例えば、自己免疫疾患について喘息動物モデルにおける気道の高反応性の効果的な抑制、リウマチ性疾患の発展の阻止、および、同種異系移植における生体の免疫寛容の介在などに用いられている。しかしながら、生物の遺伝子治療は短期的な臨床試験で副作用を見つけなかったが、ＣＴＬＡ４  ｍＡｂがＣＴＬＡ４−Ｂ７シグナルを必要以上に遮断することと自己免疫疾患の発生につながる可能性があるなど長期使用による潜在的な影響も注意すべきである。抗体はそのリガンドに特異的に結合でき、かつ標的細胞を溶解または病理学的プロセスを遮断ことができるため、抗体薬剤、特にヒト由来抗体薬剤の開発および利用は、ヒト悪性腫瘍および他の免疫疾患の臨床治療にとって非常に重要である。
【０００５】
膜貫通受容体ＰＤ−１（プログラム細胞死因子−１）はＣＤ２８遺伝子ファミリーの一員であり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および、骨髄系細胞のいずれにおいても発現される。ＰＤ−１の受容体であるＰＤＬ１およびＰＤＬ２はいずれもＢ７スーパーファミリーに属し、そのうち、ＰＤＬ１はＴ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞および上皮細胞を含む様々な細胞において発現され、ＰＤＬ２は樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞においてのみ発現される。
【０００６】
Ｔ細胞はウイルス感染の除去に非常に重要な役割を果たすが、Ｔ細胞の抗ウイルス反応は、通常、免疫病理学と関連している。ＰＤ−１はＴ細胞の活性化に対する負的調節に非常に重要な役割を果たし、Ｔ細胞に対するＰＤ−１を介した負的調節の作用は感染によって引き起こされる組織損傷を減らすことができるが、ＰＤ−１の負的調節作用を遮断または阻害すると、自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。例えば、ＰＤ−１ノックアウトマウスは膵臓ウイルス感染の除去により効果的であるが、より重篤な肝障害を引き起こす（Ｉｓａｉら、  ２００３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８：３９−５０）。また、ＰＤ−１を高度に発現する腫瘍は検出が困難な癌が伴う（Ｈａｍａｎｉｓｈｉら、  ２００７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：３３６０−５）。インビボで抗体を注射することによってＰＤ−１の発現をコントロールする方法は、有効的な方法である。
【０００７】
ＰＤ−１抗体は広範囲の抗腫瘍の予想および素晴らしい効果を有するため、ＰＤ−１経路を標的とする抗体が様々な腫瘍の治療において飛躍的な進歩をもたらすことは、業界で広く受け入れられており、例えば、非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がん、黒色腫の治療に用いられ（Ｈｏｍｅｔ  Ｍ．  Ｂ．，  Ｐａｒｉｓｉ  Ｇ．ら、  Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１５  Ｊｕｎ；４２（３）：４６６−４７３）、白血病および貧血の治療に用いられる（Ｈｅｌｄ  ＳＡ，  Ｈｅｉｎｅ  Ａら、  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＣＭＬ．  Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  ２０１３  Ｓｅｐ；１３（７）：７６８−７４）。２０１２年と２０１３年のアメリカ癌学会（ＡＡＣＲ）の年次総会及びアメリカ臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）の年次総会で、これまでにない臨床効果データが発表された後、ＰＤ−１抗体は世界の製薬業界で最も熱く研究される新薬になる。
【０００８】
また、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、主にナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）から自然に生成されるもの、および、ＣＤ４  Ｔｈ１細胞とＣＤ８細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のようなエフェクターＴ細胞から所定の抗原による刺激を経った後産生したものがある。ＩＦＮγは、重要な先天性および後天性免疫サイトカインとして、腫瘍、ウイルス、ある細菌感染および原虫感染との戦いまたは抑制において重要な役割を果たす。同時に、ＩＦＮγは、マクロファージを活性化し、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を誘導して免疫反応を活性化することによって腫瘍の発達を制御することができる（Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ  ＪＲ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＢ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７；  ９６：４１−１０１）。
モノクローナル抗体は、現在、癌、炎症、感染症及び他の疾患の治療に使用されてきたが、その多くは単一特異性である。しかし、いくつかの病気は、病気の原因と体内の影響因子が通常、異なるシグナル伝達経路において、異なるタンパク質、異なるサイトカイン、および受容体などの上方または下方制御、インビボ機能の阻害または促進などさまざまな面を含む。したがって、さまざまな異なる要因の遮断は、治療効果を向上させることができる。これは、異なる薬物の組み合わせ、異なる薬物の置き換え、例えば多重特異性抗体による複数のターゲティング戦略などで達成することができる。
二機能性抗体は、二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、２つの異なる抗原を同時に標的結合する特異的な薬物であり、免疫ソートによる精製で調製される。また、これは、遺伝子工学で得られ、遺伝子工学は、結合部位の最適化、合成形態の考慮、および、収率の点で柔軟性を有するので、一定の利点を有する。現在、その４５種類超えの存在形態が証明されている（Ｍuｌｌｅｒ  Ｄ，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０１０；  ２４：８９−９８）。現在、開発された複種類の二重特異性抗体は、ＩｇＧ−ＳｃＦｖ形態、すなわち、Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデルであり（１９９７  Ｃｏｌｏｍａ  ＭＪ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７；１５：１５９−１６３）、天然的に存在しているＩｇＧ形態と類似しているため、抗体工学、発現および精製に利点があり、二機能性抗体の理想的な存在形態であることが証明された（Ｍｉｌｌｅｒ  ＢＲ，  Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪら、  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｃＦｖｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０；  ２３：５４９−５７；  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｊ，  Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ．  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  ＭＡｂｓ  ２０１１；  ３：２９９−３０９）。
しかし、現在、世界には２つの異なる細胞表面分子に対する抗体が存在するが、市場には同じ細胞上の２つ以上の標的サイトを標的とする二機能性抗体はまた存在していない。同時に、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４の二重機能性抗体薬を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｒｏｓｓｏ  ＪＦ．，  Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  ＭＮ．，  ＣＴＬＡ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  ２０１３；  １３：５．  Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊａｎ  ２２
【非特許文献２】Ｃｈａｖｅｚ，  Ａ．Ｒ．ら、  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ２００９．  １１８２：ｐ．  １４−２７
【非特許文献３】Ｉｓａｉら、  ２００３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８：３９−５０
【非特許文献４】Ｈａｍａｎｉｓｈｉら、  ２００７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：３３６０−５
【非特許文献５】Ｈｏｍｅｔ  Ｍ．  Ｂ．，  Ｐａｒｉｓｉ  Ｇ．ら、  Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１５  Ｊｕｎ；４２（３）：４６６−４７３
【非特許文献６】Ｈｅｌｄ  ＳＡ，  Ｈｅｉｎｅ  Ａら、  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＣＭＬ．  Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  ２０１３  Ｓｅｐ；１３（７）：７６８−７４
【非特許文献７】Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ  ＪＲ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＢ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７；  ９６：４１−１０１
【非特許文献８】Ｍuｌｌｅｒ  Ｄ，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０１０；  ２４：８９−９８
【非特許文献９】１９９７  Ｃｏｌｏｍａ  ＭＪ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７；１５：１５９−１６３
【非特許文献１０】Ｍｉｌｌｅｒ  ＢＲ，  Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪら、  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｃＦｖｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０；  ２３：５４９−５７
【非特許文献１１】Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｊ，  Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ．  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  ＭＡｂｓ  ２０１１；  ３：２９９−３０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究および創造的な取り組みを施したところ、哺乳動物細胞発現系を用いて発現した組み換えＣＴＬＡ４およびＰＤ−１を、抗原としてマウスを免疫させ、マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマ細胞を得た。本発明者らは、多数の試料をスクリーニングすることによってそれぞれ下記のハイブリドーマ細胞株を得た。
【００１１】
２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５８７であるハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２（ＣＴＬＡ４−４Ｇ１０）、および、
２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５であるハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ−１−１４Ｃ１２）。
【００１２】
驚くべきことに、本発明者らは、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２がＣＴＬＡ４に特異的に結合する特異的モノクローナル抗体（４Ｇ１０と命名）を分泌することができ、そして当該モノクローナル抗体がＣＴＬＡ４のＢ７への結合を非常に有効的に遮断できること、および、
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３がＰＤ−１に特異的に結合する特異的モノクローナル抗体（１４Ｃ１２と命名）を分泌することができ、そして当該モノクローナル抗体がＰＤＬ１へのＰＤ−１の結合を非常に有効的に遮断できることを見出した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、創造的に抗ＣＴＬＡ４のヒト化抗体（それぞれ４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３及び８Ｄ２Ｈ１４Ｌ２と命名）および抗ＰＤ−１のヒト化抗体（１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と命名）を作製した。
【００１４】
さらに、本発明者らは、創造的に両種類のヒト化抗体をタンパク質と組換え、融合させて新型の抗体になり、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１と結合することができ、かつ、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合、ＰＤＬ１へのＰＤ−１の結合を遮断することができるヒト化二機能性抗体（それぞれＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７及びＢｉＡｂ０１０と命名）を得た。当該抗体は、ヒトＴ細胞に有効的に結合し、Ｔ細胞を活性化してヒトリンパ球によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を誘導でき、肺癌、黒色腫、腎臓腫瘍、卵巣癌、白血病などの癌を予防−治療する薬物を調製するために用いられる可能性を有する。
【００１５】
したがって、次の発明を提供する。
本発明のある態様は、ＰＤ−１を標的とする第１タンパク質機能領域と、ＣＴＬＡ４を標的とする第２タンパク質機能領域と、を含む二重特異性抗体である。
【００１６】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域は、直接に接続または接続セグメントによって接続され、好ましくは、前記接続断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは、正の整数、例えば１、２、３、４、５または６である。
【００１７】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域は、独立して免疫グロブリンまたはその抗原結合断片、例えば、半抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、または、一本鎖抗体であり、
好ましくは、前記第１タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第２タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、あるいは、
好ましくは、前記第１タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、前記第２タンパク質機能領域は免疫グロブリンである。
【００１８】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域は、独立して１個、２個または２個以上である。
【００１９】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり、好ましくは、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。
【００２０】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に接続されている。免疫グロブリンは二つの重鎖を有するため、一つの免疫グロブリン分子は、二つの一本鎖抗体分子に接続されている。好ましくは、二つの一本鎖抗体分子が同一である。
【００２１】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲを含み、および／または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲを含む。
【００２２】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記の免疫グロブリンの重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲを含み、および／または、
前記の一本鎖抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲを含む。
【００２３】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２からなる群から選択され、および／または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７からなる群から選択される。
【００２４】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５からなる群から選択され、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７からなる群から選択され、および／または、
前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０からなる群から選択され、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記の免疫グロブリンは非−ＣＤＲ領域を含み、かつ、前記非−ＣＤＲ領域は、鼠類以外の種由来、例えばヒト抗体由来である。
【００２６】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記免疫グロブリンの定常領域はヒト化定常領域であり、例えば、重鎖定常領域は、いずれもＩｇ  ｇａｍｍａ−１  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８５７を採用し、軽鎖定常領域は、いずれもＩｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８３４を採用した。
【００２７】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記の二重特異性抗体において、
前記の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４タンパク質および／またはＰＤ−１タンパク質に結合するＫＤが約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下である。
【００２８】
本発明は、さらに、重鎖可変領域が、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲ、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲ、および、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲ、
を含み、
かつ、
軽鎖可変領域が、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲ、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲ、
を含み、
好ましくは、軽鎖可変領域のＣＤＲが重鎖可変領域のＣＤＲと同一ではない、
二重特異性抗体に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の重鎖可変領域は、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９−３１であるＣＤＲ、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５−３７であるＣＤＲ、又はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２−４４であるＣＤＲ、および、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲ、又は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲ、
を含む、単離核酸分子に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、抗体の軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の軽鎖可変領域は、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２−３４であるＣＤＲ、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８−４０であるＣＤＲ、または、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５−４７であるＣＤＲ
を含む、単離核酸分子に関する。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、本発明の単離核酸分子を含むベクターに関する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、本発明の単離核酸分子または本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、本発明の二重特異性抗体を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件で培養する工程、および、細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収する工程を含む方法に関する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、二重特異性抗体および複合部分を含む複合体であって、前記二重特異性抗体は本発明の二重特異性抗体であり、前記複合部分は検出可能な標識であり、具体的に前記複合部分が放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素である、複合体に関する。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、本発明の二重特異性抗体、または本発明の複合体を含むキットであって、具体的に、前記キットが前記二重特異性抗体を特異的に認識する第２抗体をさらに含み、任意的に、前記第２抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素をさらに含むキットに関する。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、試料中のＣＴＬＡ４および／ＰＤ−１の存在またはそのレベルを検出するために用いられるキットの製造における、本発明の二重特異性抗体の使用に関する。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、本発明の二重特異性抗体あるいは本発明の複合体を含み、
さらに薬学的に許容されるベクター及び／または賦形剤を任意的に含む、医薬組成物に関する。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断する薬剤の調製における、本発明の二重特異性抗体または本発明の複合体の使用であって、具体的に、前記腫瘍が、、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、使用に関する。
【００３９】
発明者らは、動物試験で本発明の二重特異性抗体ＢｉＡｂ００４がＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウス（ヒトＰＤ−１遺伝子導入マウス）右側皮下で接種したＭＣ３８腫瘍細胞の成長を効果的に抑制できることを見出し、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭ  ＭＣ３８担癌マウスの腫瘍体積の増加を著しくに抑制すると示されていた。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、本発明の二重特異性抗体あるいは本発明の複合体の、
試料中のＣＴＬＡ４のレベルを検出する薬剤、
ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断する薬剤、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、
Ｔリンパ球を活性化する薬剤、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
の調製における使用、
および／または、
ＰＤ−１のＰＤＬ１への結合を遮断する薬剤、
ＰＤ−１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現を増加させる薬剤
の調製における使用に関する。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の二重特異性抗体あるいは本発明の複合体を、細胞またはニーズがある被験者にインビボまたはインビトロで投与する工程を含む、
試料中のＣＴＬＡ４のレベルを検出する方法、
ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断する方法、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、
Ｔリンパ球を活性化する方法、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる方法、
および／または、
ＰＤ−１のＰＤＬ１への結合を遮断する方法、
ＰＤ−１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現を増加させる方法、
からなる群から選択される方法に関する。
本発明のインビトロ試験において、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ４−抗ＰＤ−１二機能性抗体は、いずれもＩＦＮ−γの分泌を誘導して免疫反応を活性化することができる。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか１つによる二重特異性抗体あるいは本発明の複合体を、ニーズがある被験者に投与する工程を含む、腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断する方法であって、具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、方法に関する。
【００４３】
本発明の実施形態の何れか１つによる二重特異性抗体または複合体によれば、これらは、腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断することに用いられ、具体的に、前記腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである。
【００４４】
本発明の実施形態の何れか１つによる二重特異性抗体または複合体によれば、これらは、
ＣＴＬＡ４のＢ７への結合を遮断すること、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは
Ｔリンパ球を活性化する薬剤こと、または、Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させること、
および／または、
ＰＤ−１のＰＤＬ１への結合を遮断すること、
ＰＤ−１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＰＤ−１の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの発現を増加させること、
に用いられる。
【００４５】
抗体治療薬物、特にモノクローナル抗体（ＭＡＢ）は、様々な疾患の治療において良好な結果を達成した。これらの治療用抗体を得る伝統的な実験方法として、動物を抗原で免疫し、免疫された動物において抗原を標的とする抗体を得る方法、または、親和性成熟の方法によって抗原に対して低い親和性を有する抗体を改良する方法はある。しかしながら、これらの方法は多くの時間と労力を必要とし、そしてほとんどの場合それらは抗原上の所定のエピトープに特異的ではない。
【００４６】
軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原との結合を決定する。各鎖の可変領域は、いずれも相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含む（重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む；それらはＫａｂａｔらに命名され、詳しくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），  Ｖｏｌ．  １−３，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄを参照のこと）。
【００４７】
当業者によって周知の技術的手段によって、例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースによって、下記の（１）−（１３）項目のモノクローナル抗体配列におけるＣＤＲ領域のアミノ酸配列を分析した結果は、下記のとおりである。
【００４８】
（１）１４Ｃ１２
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示す。
【００４９】
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＦＡＦＳＳＹＤ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）
ＨＣＤＲ２：  ＩＳＧＧＧＲＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）
ＨＣＤＲ３：  ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＬＣＤＲ１：  ＱＤＩＮＴＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２）
ＬＣＤＲ２：  ＲＡＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３）
ＬＣＤＲ３：  ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３４）
【００５０】
（２）１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２に示す。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、１４Ｃ１２と同じである。
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、１４Ｃ１２と同じである。
【００５１】
（３）４Ｇ１０
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４に示す。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＹＳＦＴＧＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５）
ＨＣＤＲ２：  ＩＮＰＹＮＮＩＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６）
ＨＣＤＲ３：  ＡＲＬＤＹＲＳＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＬＣＤＲ１：  ＴＧＡＶＴＴＳＮＦ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８）
ＬＣＤＲ２：  ＧＴＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３９）
ＬＣＤＲ３：  ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４０）
【００５２】
（４）４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８に示す。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、４Ｇ１０と同じである。
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、４Ｇ１０と同じである。
【００５３】
（５）４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２に示す。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、４Ｇ１０と同じである。
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、４Ｇ１０と同じである。
【００５４】
（６）４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２に示す。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＹＳＦＴＧＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５）
ＨＣＤＲ２：  ＩＮＰＹＮＤＩＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１）
ＨＣＤＲ３：  ＡＲＬＤＹＲＳＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、４Ｇ１０と同じである。
【００５５】
（７）８Ｄ２Ｈ１４Ｌ２
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７に示す。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＤＮＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２）
ＨＣＤＲ２：  ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４３）
ＨＣＤＲ３：  ＴＡＱＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４４）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＬＣＤＲ１：  ＥＮＩＹＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５）
ＬＣＤＲ２：  ＧＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４６）
ＬＣＤＲ３：  ＱＮＶＬＲＳＰＦＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４７）
【００５６】
（８）ＢｉＡｂ００１
その重鎖可変領域の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＦＡＦＳＳＹＤ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）
ＨＣＤＲ２：  ＩＳＧＧＧＲＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）
ＨＣＤＲ３：  ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）
ＨＣＤＲ４：  ＧＹＳＦＴＧＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５）
ＨＣＤＲ５：  ＩＮＰＹＮＮＩＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６）
ＨＣＤＲ６：  ＡＲＬＤＹＲＳＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７）
ＨＣＤＲ７：  ＴＧＡＶＴＴＳＮＦ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８）
ＨＣＤＲ８：  ＧＴＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３９）
ＨＣＤＲ９：  ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４０）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＬＣＤＲ１：  ＱＤＩＮＴＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２）
ＬＣＤＲ２：  ＲＡＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３）
ＬＣＤＲ３：  ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３４）
【００５７】
（９）ＢｉＡｂ００２
その重鎖可変領域の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
【００５８】
（１０）ＢｉＡｂ００３
その重鎖可変領域の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
【００５９】
（１１）ＢｉＡｂ００４
その重鎖可変領域の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
【００６０】
（１２）ＢｉＡｂ００７
その重鎖可変領域の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＦＡＦＳＳＹＤ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）
ＨＣＤＲ２：  ＩＳＧＧＧＲＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）
ＨＣＤＲ３：  ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）
ＨＣＤＲ４：  ＧＹＳＦＴＧＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５）
ＨＣＤＲ５：  ＩＮＰＹＮＤＩＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１）
ＨＣＤＲ６：  ＡＲＬＤＹＲＳＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７）
ＨＣＤＲ７：  ＴＧＡＶＴＴＳＮＦ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８）
ＨＣＤＲ８：  ＧＴＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３９）
ＨＣＤＲ９：  ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４０）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
【００６１】
（１３）ＢｉＡｂ０１０
その重鎖可変領域の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＨＣＤＲ１：  ＧＦＡＦＳＳＹＤ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）
ＨＣＤＲ２：  ＩＳＧＧＧＲＹＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）
ＨＣＤＲ３：  ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）
ＨＣＤＲ４：  ＧＦＴＦＳＤＮＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２）
ＨＣＤＲ５：  ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４３）
ＨＣＤＲ６：  ＴＡＱＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４４）
ＨＣＤＲ７：  ＥＮＩＹＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５）
ＨＣＤＲ８：  ＧＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４６）
ＨＣＤＲ９：  ＱＮＶＬＲＳＰＦＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４７）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ＢｉＡｂ００１と同じである。
【００６２】
本発明において、別段の指定のない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、本明細書中で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学の試験手順は、いずれも関連技術分野で広く利用される一般的なものである。同時に、本発明をよりよく理解する目的のために、関連用語の定義および説明を以下で提供する。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、ＣＴＬＡ４タンパク質（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ４）のアミノ酸配列を言うと、ＣＴＬＡ４タンパク質の全長、ＣＴＬＡ４の細胞外断片ＣＴＬＡ４ＥＣＤ、または、ＣＴＬＡ４ＥＣＤを含有する断片を含み、さらにＣＴＬＡ４ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウスまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）と融合した断片を含む。しかし、当業者は、ＣＴＬＡ４タンパク質のアミノ酸配列において突然変異または変形（置換、欠失、および／または付加を含むがこれらに限定されない）が、それらの生物学機能に影響を及ぼすことなく、自然にまたは人工的に起こり得ると理解できる。したがって、本発明において、「ＣＴＬＡ４タンパク質」という用語には、そのような配列のすべて、ならびに、それらの天然または人工の変異体が含まれるべきである。また、ＣＴＬＡ４タンパク質の配列断片を記載するとき、それはその天然または人工の変異体における対応配列断片も含む。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、ＰＤ−１タンパク質（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，  ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ：  ＮＭ＿００５０１８）のアミノ酸配列を言うと、ＰＤ−１タンパク質の全長、ＰＤ−１の細胞外断片ＰＤ−１ＥＣＤ、または、ＰＤ−１ＥＣＤを含有する断片を含み、さらにＰＤ−１ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウスまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）と融合した断片を含む。しかし、当業者は、ＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列において突然変異または変形（置換、欠失、および／または付加を含むがこれらに限定されない）が、それらの生物学機能に影響を及ぼすことなく、自然にまたは人工的に起こり得ると理解できる。したがって、本発明において、「ＰＤ−１タンパク質」という用語には、そのような配列のすべて、ならびに、それらの天然または人工の変異体が含まれるべきである。また、ＰＤ−１タンパク質の配列断片を記載するとき、それはその天然または人工の変異体における対応配列断片も含む。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、特別な説明がない限り、前記Ｂ７は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２である。その具体的なタンパク質配列は、従来技術に知られている配列であり、従来文献またはＧｅｎＢａｎｋに開示された配列を参照することができる。例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０、  ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ９４１）；Ｂ７−２（ＣＤ８６、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ９４２）を参照する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、ＥＣ５０という用語は、最大効果の５０％に対する濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ５０％  ｏｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）、すなわち最大効果の５０％を引き起こす濃度を指す。
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、一般的に２対のポリペプチド鎖（各対は「軽」（Ｌ）鎖および「重」（Ｈ）鎖を有する。）からなる免疫グロブリン分子を指す。一般的な意味では、重鎖は、抗体における分子量の大きい方のポリペプチド鎖と理解され、軽鎖は抗体における分子量の小さい方のポリペプチド鎖を指す。軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類され得る。重鎖は通常μ、δ、γ、αまたはεとして分類され得、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２つ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結され、重鎖は約３つ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域はＣＬドメインからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第一の構成成分（Ｃ１ｑ）を含め、宿主組織また因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、比較的に保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に散在する高い可変性を有する領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。）にさらに細かく分けられ得る。各ＶＨまたはＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んでいる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖／軽鎖の各対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は抗体結合部位をそれぞれ形成する。各領域またはドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３で提供される定義に従う。特に、重鎖は、三つ以上、例えば６、９、１２つのＣＤＲを含んでもよい。例えば本発明の二機能性抗体において、重鎖は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ端がもう一つの抗体のＳｃＦｖと連接されていてもよく、この場合、重鎖が９つのＣＤＲを含む。「抗体」という用語は、抗体を産生させる何らかの具体的な方法に限定されない。例えば、これは、特に、組み換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体が結合する抗原と同じ抗原に特異的に結合する能力を保持する、および／または抗原への特異的な結合について全長抗体と競合する全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。これは、「抗原結合部分」とも呼ばれる。全般的には、全ての目的に対してその全体において引用により本明細書中に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．ｅｄ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。抗体の抗原結合断片は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。いくつかの場合において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）および、特異的抗原結合能を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「Ｆｄ断片」という用語は、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなる抗体断片を意味する。「Ｆｖ断片」という用語は、抗体のシングルアームのＶＬとＶＨドメインからなる抗体断片を意味する。「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨドメインからなる抗体断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６  （１９８９））を意味する。「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる抗体断片を意味する。「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を意味する。
【００６９】
いくつの場合において、抗体の抗原結合断片は一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、そのうち、ＶＬとＶＨドメインは、それらを単一のポリペプチド鎖に形成できるリンカーによって対にして一価分子を形成する（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６  （１９８８）、および、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８）を参照のこと）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨという一般的な構造を有する。従来技術における適切なリンカーは、繰り返しＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを使ってもよいが、そのバリアント（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８）も使える。また、本発明に用いられる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：７２５−７３１、Ｃｈｏｉら（２００１），Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：  ９４−１０６、Ｈｕら（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：３０５５−３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９），Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：４１−５６、および、Ｒｏｏｖｅｒｓら（２００１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記載されている。
【００７０】
また、いくつの場合において、抗体の抗原結合断片は、ダイアボディ、すなわち、２価抗体であり、ここでＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、利用されるリンカーは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインが互いに対形成できないので、別の鎖上の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３（１９９４）を参照のこと。）。
【００７１】
抗体の抗原結合断片（例えば、上記の抗体断片）は、当業者にとって公知の通常技術（例えば、組み換えＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的切断法）を用いて、所定の抗体から得ることができ、かつ、インタクト抗体の場合と同じように特異性についてスクリーニングし得る。
【００７２】
本明細書中で、文脈において明らかに指定されない限り、「抗体」という用語について申し述べる場合、インタクトな抗体を含むだけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書中で使用される場合、「単抗」または「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同性を有する抗体分子の集団からの抗体または抗体断片を指し、すなわち、可能性のある天然の突然変異を除き、完全に同一の抗体分子集団である。単抗は、抗原上の単一のエピトープに非常に高い特異性を有する。モノクローナル抗体とは対照的に、ポリクローナル抗体は、一般的には、抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般的に、最初にＫｏｈｌｅｒらにより報告されたハイブリドーマ技術を用いて得ることができる（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）が、組み換えＤＮＡ技術を使用して得ることもできる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。）。
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」とは、軽鎖または／および重鎖の一部が１つの抗体（それは所定のある種に由来するか、または所定の抗体クラスもしくはサブクラスに属してもよい。）に由来、かつ、軽鎖また／および重鎖の他の部分が別の抗体（それは同じがまたは異なる種に由来するが、同じかまたは異なる抗体クラスまたはサブクラスに属してもよい）に由来したものであるが、いずれにせよ、標的抗原に対する結合活性を保持する抗体を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ  ４，８１６，５６７，Ｃａｂｉｌｌｙら；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１  ６８５５  （１９８４））。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の全てのまたは一部のＣＤＲを非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置き換えた後に得られた抗体または抗体断片を指し、そのうち、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラットまたはウサギ）抗体であり得る。さらに、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基も、抗体の性能をさらに向上させるかまたは最適化するように、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基または他の抗体のアミノ酸残基で置き換えられ得る。ヒト化抗体に関するより詳細な説明については、例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；およびＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２（２０００）を参照のこと。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、抗原の免疫グロブリンまたは抗体と特異的に結合する部位を意味する。本分野において、「エピトープ」は、「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は、一般的に分子の化学的活性な表面基例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖からなり、かつ、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは、一般的に特別な立体配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５つの連続または非連続のアミノ酸を含み、「線状」または「立体配座」であってもよい。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。線状エピトープにおいて、タンパク質は、相互作用分子（例えば抗体）との間の相互作用のすべてのサイトがタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。配座エピトープにおいて、相互作用のサイトは、互いに分離したタンパク質アミノ酸残基を跨って存在する。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「単離されている」、または、「単離される」という用語は、人工的手段によってネイティブ状態から得られていることを意味する。自然界にある「単離されている」物質または構成成分が生じる場合、それが位置する天然の環境が変化しているか、または当該物質が天然の環境から単離されているか、またはその両方であると考えられる。例えば、ある単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある生きている動物の体に天然に存在し、このような天然の状態から単離される高純度の同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されている」ものとされる。「単離されている」、または、「単離される」という用語は、人工的または合成物質との混合物を排除せず、物質の活性に影響を与えない他の不純物の存在も排除しない。
【００７６】
本明細書中で使用される「Ｅ．ｃｏｌｉ発現系」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉ（株）およびベクターからなる発現系といい、ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ（株）は、市販の株に由来するものであるが、例えば、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）があるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターにより保有される遺伝物質構成要素が宿主細胞で発現されるように、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。ベクターは、当業者にとって周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；例えばλファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージならびに動物ウイルスなどが含まれるがこれらに限定されない。ベクターとして使用し得る動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む。）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）がふくまれるがこれらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択構成要素およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を調節するための複数の構成要素を含み得る。さらに、ベクターは、複製開始サイトも含み得る。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入のために使用し得る細胞を指し、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核細胞、例えば酵母細胞またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９などの昆虫細胞、または、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞などの動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間または２つの核酸間の配列の一致性に用いられる。比較される２つの配列中のある部位が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおけるあるサイトは共にアデニンによって占められるか、または２つのポリペプチドのそれぞれのあるサイトは共にリジンによって占められる場合）、各分子はそのサイトで同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」とは、２つの配列に共有される一致的なサイトの数を比較されるサイトの数で割ったもの×１００の関数である。例えば，２つの配列の１０個のサイトにおいて６個が一致している場合、この２つの配列が６０％の同一性を有すると言える。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは、合わせて５０％の同一性（６個のサイトにおいて、３個のサイトは一致している）を有する。通常、２つの配列が最大の同一性を生じるように整列されたときにアライメントは、行われる。このようなアライメントは、例えば、コンピュータープログラム、例えばＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）で簡単に行われるＮｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３の方法で実現される。また、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されたＥ．  ＭｅｙｅｒｓとＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ  （Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７  （１９８８））のアルゴリズムを使って、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅを使用し、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４で２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を測定する。また、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから取り得る）に統合されたＧＡＰプログラムにおけるＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ  （Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３  （１９７０））のアルゴリズムを使って、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および、１６、１４、１２、１０、８、６または４のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔと１、２、３、４、５または６の長加重で２個のアミノ酸配列の間のパーセント同一性を測定するができる。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「特異的な結合」という用語は、２つの分子間の非無作為結合反応、例えば抗体とその標的抗原との間の反応などを指す。いくつかの実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（またはある抗原に特異的な抗体）とは、抗体が約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。本発明のいくつか実施形態において、「標的」という用語は、特異的に結合することを指す。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、抗体と抗原との間の結合親和性を表現する特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。解離平衡定数が小さいほど、抗体−抗原結合が堅固であり、抗体と抗原との間の親和性が高くなる。一般的に、抗体は、約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原と結合する。例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）などを使ってＢＩＡＣＯＲＥ機で測定される。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」および「単抗」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリクローナル抗体」および「マルチ抗体」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。さらに、本発明において、アミノ酸は一般的に、本分野で周知の、１文字及び３文字略号により表される。例えば、アラニンはＡまたはＡｌａで表し得る。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞株」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、「ハイブリドーマ」または「ハイブリドーマ細胞株」という用語について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマのサブクローンおよび子孫細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２またはＬＴ００３について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２またはＬＴ００３のサブクローンおよび子孫細胞も指す。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能なベクターおよび／または賦形剤」という用語は、薬理学および／または生理学において被験者および活性成分と相容性を有するベクターおよび／または賦形剤を指し、これらは当技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編，１９ｔｈ  ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照のこと。）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度促進剤が含まれるがこれらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としてはリン酸緩衝液が含まれるがそれに限定されず；界面活性剤としては陽イオン性、陰イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０が含まれるがこれらに限定されず；イオン強度促進剤としては塩化ナトリウムが含まれるがこれらに限定されない。
【００８５】
本明細書中で使用される「アジュバント」という用語は、抗原と一緒にまたは予め体内に送達されると、抗原に対する体の免疫応答を増強するかまたは免疫応答の種類を変える非特異的免疫増強剤をいう。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウムパルブム、リポ多糖、サイトカインなどを含むがこれらに限定されない多くのアジュバントがある。フロイントアジュバントは、現在動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは臨床試験で使用される場合が多い。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するかまたは少なくとも一部達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍のようなＣＬＴＡ４のＢ７との結合、または、ＣＬＴＡ４の高すぎる活性に関する疾患）に対する予防有効量は、疾患（例えば、、腫瘍のようなＣＬＴＡ４のＢ７との結合、または、ＣＬＴＡ４の高すぎる活性に関する疾患）の発症を防ぐか、抑止するかまたは遅延させるのに十分である量を指し；疾患に対する治療有効量は、疾患に罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒させるか少なくとも部分的に抑止するのに十分な量を指す。このような有効量を測定することは十分に当業者の技術の範囲内である。例えば、治療用途の有効量は、治療しようとする疾患の重症度、患者の自己免疫系の全般的状況、患者の全般的状況、例えば年齢、体重および性別、薬剤の投与形式、同時に行われる他の治療などに依存する。
【発明の効果】
【００８７】
本発明におけるモノクローナル抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３は、ＣＴＬＡ４と特異的によく結合でき、かつ、ＣＬＴＡ４のＢ７との結合を非常に効果的に遮断でき、ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を特異的に取り除け、Ｔリンパ球を活性化させることができる。
【００８８】
本発明におけるモノクローナル抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、ＣＴＬＡ４と特異的によく結合でき、かつ、ＣＬＴＡ４のＢ７との結合を非常に効果的に遮断でき、ＣＴＬＡ４の生体に対する免疫抑制を特異的に取り除け、Ｔリンパ球を活性化させることができる。
【００８９】
本発明の二機能性抗体は、例えば抗黒色腫、腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌などの腫瘍または白血病を治療する薬剤を調製するために用いられる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】モノクローナルマウス抗体４Ｇ１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。試料およびそれらのローディング量は、左から右への４つのレーンで次のとおりであった：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；マーカー、５μｌ；ＢＳＡ、１μｇ。
【図２】モノクローナルヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。試料およびそれらのローディング量は、左から右への３つのレーンで次のとおりであった：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；マーカー、５μｌ。
【図３】モノクローナルヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。試料およびそれらのローディング量は、左から右への２つのレーンで次のとおりであった：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；マーカー、５μｌ。
【図４】モノクローナルヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。試料およびそれらのローディング量は、左から右への４つのレーンで次のとおりであった：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；マーカー、５μｌ；ＢＳＡ、１μｇ。
【図５】二機能性抗体ＢｉＡｂ００１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。レーンの試料およびそれらのローディング量は、マーカー、５  μｌ；１、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；２、Ｒｅｄｕｃｅｄ：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１μｇ；  ３、ＢＳＡ、１  μｇ。
【図６】二機能性抗体ＢｉＡｂ００２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。レーンの試料およびそれらのローディング量は、マーカー、５  μｌ；１、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；２、Ｒｅｄｕｃｅｄ：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；  ３、ＢＳＡ、１  μｇ。
【図７】二機能性抗体ＢｉＡｂ００３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。レーンの試料およびそれらのローディング量は、マーカー、５  μｌ；１、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；２、Ｒｅｄｕｃｅｄ：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；  ３、ＢＳＡ、１  μｇ。
【図８】二機能性抗体ＢｉＡｂ００４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。レーンの試料およびそれらのローディング量は、マーカー、５  μｌ；１、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；２、Ｒｅｄｕｃｅｄ：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；  ３、ＢＳＡ、１  μｇ。
【図９】二機能性抗体ＢｉＡｂ００７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。レーンの試料およびそれらのローディング量は、マーカー、５  μｌ；１、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；２、Ｒｅｄｕｃｅｄ：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；  ３、ＢＳＡ、１  μｇ。
【図１０】二機能性抗体ＢｉＡｂ００１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。レーンの試料およびそれらのローディング量は、マーカー、５  μｌ；１、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ：非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；２、Ｒｅｄｕｃｅｄ：還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル、１  μｇ；  ３、ＢＳＡ、１  μｇ
【図１１】抗体４Ｇ１０の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１２】抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１３】抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１４】抗体４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１５】抗体１４Ｃ１２の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１６】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１７】ＣＴＬＡ４と抗体ＢＩＡｂ００１の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１８】ＣＴＬＡ４と抗体ＢＩＡｂ００２の動的特性パラメーター検出結果である。
【図１９】ＣＴＬＡ４と抗体ＢＩＡｂ００３の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２０】ＣＴＬＡ４と抗体ＢＩＡｂ００４の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２１】ＣＴＬＡ４と抗体ＢＩＡｂ００７の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２２】ＰＤ−１と抗体ＢＩＡｂ００１の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２３】ＰＤ−１と抗体ＢＩＡｂ００２の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２４】ＰＤ−１と抗体ＢＩＡｂ００３の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２５】ＰＤ−１と抗体ＢＩＡｂ００４の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２６】ＰＤ−１と抗体ＢＩＡｂ００７の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２７】ＰＤ−１と抗体ＢＩＡｂ０１０の動的特性パラメーター検出結果である。
【図２８】抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１および４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の抗原ＣＴＬＡ４との結合を間接ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図２９】Ｂ７と競合する抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１および４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の抗原ＣＴＬＡ４との結合活性を競合ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３０】抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＤ−１との結合を間接ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３１】ＰＤＬ１と競合する抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＤ−１との結合を競合ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３２】抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＣＴＬＡ４との結合を間接ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３３】抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＰＤ−１との結合を間接ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３４】Ｂ７と競合する抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＣＴＬＡ４の結合を競合ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３５】ＰＤＬ１と競合する抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＰＤ−１との結合を競合ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３６】抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞表面タンパク質ＣＴＬＡ４との結合ＥＣ５０である。
【図３７】抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞表面タンパク質ＣＴＬＡ４との結合ＥＣ５０である。
【図３８】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞表面タンパク質ＰＤ−１との結合ＥＣ５０である。
【図３９】抗体ＢｉＡｂ００１の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞表面タンパク質ＣＴＬＡ４との結合ＥＣ５０である。
【図４０】抗体ＢｉＡｂ００２の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞表面タンパク質ＣＴＬＡ４との結合ＥＣ５０である。
【図４１】抗体ＢｉＡｂ００３の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞表面タンパク質ＣＴＬＡ４との結合ＥＣ５０である。
【図４２】抗体ＢｉＡｂ００４の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞表面タンパク質ＣＴＬＡ４との結合ＥＣ５０である。
【図４３】抗体ＢｉＡｂ００１の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞表面タンパク質ＰＤ−１との結合ＥＣ５０である。
【図４４】抗体ＢｉＡｂ００２の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞表面タンパク質ＰＤ−１との結合ＥＣ５０である。
【図４５】抗体ＢｉＡｂ００３の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞的表面タンパク質ＰＤ−１との結合ＥＣ５０である。
【図４６】抗体ＢｉＡｂ００４の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞表面タンパク質ＰＤ−１との結合ＥＣ５０である。
【図４７】抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３のＴ細胞表面抗原ＣＴＬＡ４との結合活性である。
【図４８】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＴ細胞表面抗原ＰＤ−１との結合活性である。
【図４９】抗体ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＴ細胞との結合活性、および抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３との比較である。
【図５０】抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の混合リンパ球のサイトカインＩＦＮ−γの分泌への影響である。
【図５１】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の混合リンパ球のサイトカインＩＦＮ−γの分泌への影響である。
【図５２】抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２の混合リンパ球のサイトカインＩＦＮ−γの分泌への影響、および、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１との比較である。
【図５３】抗体ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４の混合リンパ球のサイトカインＩＦＮ−γの分泌への影響、および、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３との比較である。
【図５４】抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の混合リンパ球のサイトカインＩＬ−２の分泌への影響である。
【図５５】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の混合リンパ球のＩＬ−２の分泌への影響である。
【図５６】抗体ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４の混合リンパ球のサイトカインＩＬ−２の分泌への影響、および、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３との比較である。
【図５７】抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の、ＰＢＭＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、および、Ｒａｊｉ細胞を混合し、共培養して誘導したサイトカインＩＬ−２の分泌への影響である。
【図５８】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の、ＰＢＭＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＲａｊｉ細胞を混合し、共培養して誘導したサイトカインＩＬ−２の分泌への影響である。
【図５９】抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４の、ＰＢＭＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＲａｊｉ細胞を混合し、共培養して誘導したサイトカインＩＬ−２の分泌への影響、および、抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１との比較である。
【図６０】抗体ＢｉＡｂ００４のＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭ  ＭＣ３８担癌マウスの腫瘍体積への影響である。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
生物材料寄託に関する表示：
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２（ＣＴＬＡ４−４Ｇ１０）は、２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５８７であり、アドレス  は：  中国  武漢、武漢大学で、郵便番号は、４３００７２である。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ−１−１４Ｃ１２）は、２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５であり、アドレス  は：  中国  武漢、武漢大学で、郵便番号は、４３００７２である。
【００９２】
以下で実施例を組み合わせて本発明の実施形態を詳述する。当業者は、次の実施例が単に本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではないことを理解できる。具体的な技術または条件が記載されていない実施例は、当技術分野の文献で開示される技術または条件（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｐｅｉｔａｎｇ  ＨＵＡＮＧら訳、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、または製品とともに提供される説明書に従い、行った。用いた供給者が示されていない試薬および機器は、いずれも市販の通常製品である。
【００９３】
本発明の次の実施例において、用いられたＴ細胞は、Ａｋｅｓｏ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎから入手した。用いられたＢＡＬＢ／Ｃマウスは、Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入されたものである。用いられたＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスは、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇａｌａｘｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｃｏ，Ｌｔｄから入手された。使用されたＭＣ３８細胞は、ＦｕＤａｎ  ＩＢＳ  Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒから入手された。
【実施例】
【００９４】
実施例１：抗ＣＴＬＡ４の抗体４Ｇ１０の調製
１．  ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２の調製
抗ＣＴＬＡ４抗体の調製に用いられる抗原ＣＴＬＡ４−ｍＦｃは、ヒトＣＴＬＡ４（ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：  ＮＰ＿００５２０５．２）細胞外ドメインとマウスＩｇＧ１Ｆｃの融合タンパク質である。免疫ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入）の脾臓細胞をマウス骨髓瘤細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、現在確立された方法（例えば，Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｓ．Ｊ．，  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，  ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  Ｇ．Ｃ．  Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｂｅｔｈｅｌｌ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００）に従った。
【００９５】
融合タンパク質ＣＴＬＡ４−ｍＦｃをＴＥＶ  タンパク質酵素で切断し、カラムに通して精製し、ＣＴＬＡ４タンパク質を得た。抗原としてＣＴＬＡ４タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、間接ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングしてＣＴＬＡ４と特異的に結合する新型の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得た。間接ＥＬＩＳＡによるスクリーニングによって得られたハイブリドーマ細胞に対して、競合ＥＬＩＳＡでリガンドＢ７−１（ＣＤ８０，  ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ９４１）、Ｂ７−２（ＣＤ８６，  ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ９４２）と競合してＣＴＬＡ４と結合するモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、かつ、限界希釈法で安定的なハイブリドーマ細胞株を得た。当該ハイブリドーマ細胞株を、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２（ＣＴＬＡ４−４Ｇ１０）と命名し、かつ、これによって分泌されたモノクローナル抗体を４Ｇ１０と命名した。
【００９６】
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００２（ＣＴＬＡ４−４Ｇ１０）は、２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５８７であり、アドレスは：中国  武漢、武漢大学で、郵便番号は、４３００７２である。
【００９７】
２．  抗ＣＴＬＡ４の抗体４Ｇ１０の調製
前記に得られたＬＴ００２細胞株を１０％の低ＩｇＧウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で培養し（１％ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地、５％ＣＯ２、３７°Ｃで細胞インキュベータに培養した）、７日後に細胞培養上清を集めて、高速遠心、細孔フィルター膜による真空ろ過、および、ＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムによる精製によって、抗体４Ｇ１０を調製した。精製した４Ｇ１０サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動測定した結果を図１に示す。
【００９８】
実施例２：抗ＣＴＬＡ４の抗体４Ｇ１０の配列解析
抗体４Ｇ１０の配列解析
培養細胞／細菌Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｉａｎｇｅｎ、カタログ番号ＤＰ４３０）の方法で、実施例１にて培養したＬＴ００２細胞株からｍＲＮＡを抽出した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲキット取扱説明書に従ってｃＤＮＡを合成し、かつ、ＰＣＲにより増幅させた。
ＰＣＲ増幅産物を直接にＴＡクローニングに供した。具体的な操作は、ｐＥＡＳＹ−Ｔ１  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  ＣＴ１０１）キット取扱説明書を参照して行う。
【００９９】
ＴＡクローニングの産物を直接に配列決定に供し、配列決定結果を以下に示す。
重鎖可変領域の核酸配列：（３７２  ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＴＣＧＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１２４  ａａ）
ＱＶＫＬＱＥＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＦＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＲＬＴＳＥＤＳＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）
軽鎖可変領域の核酸配列：（３７８  ｂｐ）
ＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１２６  ａａ）
ＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＳＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＱＧＱＦＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）
【０１００】
実施例３：抗ＣＴＬＡ４のヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３および４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３のデザインおよび調製
１．  抗ＣＴＬＡ４ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３および４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の軽鎖と重鎖配列のデザイン
ＣＴＬＡ４タンパク質の三次元結晶構造（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  （１９９７）  ４  ｐ．５２７）および実施例２に得られた抗体４Ｇ１０の配列に基づき、抗体モデルのコンピューターシミュレーションによって、モデルによって変異をデザインし、抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３および４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の可変領域配列（抗体定常領域配列、ＮＣＢＩのデータベースから、重鎖定常領域はＩｇ  ｇａｍｍａ−１  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８５７、軽鎖定常領域はＩｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８３４である）を得た。
【０１０１】
デザインした可変領域配列は以下の通りであった。
（１）ヒト化モノクローナル抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１の重鎖と軽鎖の配列
重鎖可変領域の核酸配列：（３４５  ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＣＧＧＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＧＣＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１１５  ａａ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＦＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＳＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
軽鎖可変領域の核酸配列：（３２７  ｂｐ）
ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１０９  ａａ）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＳＬＩＧＧＴＮＮＲＡＳＷＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）
【０１０２】
（２）ヒト化モノクローナル抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の重鎖と軽鎖の配列
重鎖可変領域の核酸配列：（３４５  ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１１５  ａａ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）
軽鎖可変領域の核酸配列：（３２７  ｂｐ）
ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１０９  ａａ）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＳＬＩＧＧＴＮＮＫＡＳＷＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）
（３）ヒト化モノクローナル抗体４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の重鎖と軽鎖の配列
重鎖可変領域の核酸配列：（３４５ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１１５  ａａ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＤＩＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）
軽鎖可変領域の核酸配列は、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の軽鎖可変領域配列と同じである。
【０１０３】
２．ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３および４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の調製
重鎖定常領域は、いずれもＩｇ  ｇａｍｍａ−１  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８５７を採用する。軽鎖定常領域は、いずれもＩｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８３４を採用する。
４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１の重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡ、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡ、および４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡを、別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．より提供）ベクターにクローニングし、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−４Ｇ１０Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−４Ｇ１０Ｌ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−４Ｇ１０Ｈ３、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−４Ｇ１０Ｌ３、および、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−４Ｇ１０Ｈ４、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−４Ｇ１０Ｌ３を得た。そして、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。組み換えプラスミドを２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした後、培養液を集めて精製し、ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３および４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３を得た。精製した４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１サンプルに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検出を行い、得られた結果を図２に示す。精製した４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３サンプルに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検出を行い、得られた結果を図３に示す。
【０１０４】
実施例４：抗ＰＤ−１の抗体１４Ｃ１２の調製
１．  ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３の調製
ＰＤ−１−ｍＦｃ融合タンパク質を抗原とし、免疫ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入）の脾臓細胞を、マウス骨髓瘤細胞と融合してハイブリドーマ細胞を合成し、現在、確立された方法（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ｊ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，  ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  Ｇ．Ｃ．  Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｂｅｔｈｅｌｌ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００）に従った。
ＰＤ−１−ｍＦｃを抗原としてマイクロタイタープレートに被覆し、間接ＥＬＩＳＡ法によってスクリーニングし、ＰＤ−１と特異的に結合する新規な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得た。
競合ＥＬＩＳＡでリガンドＰＤＬ１−ｈＦｃ（ＰＤＬ１  Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１）と競合してＰＤ−１と結合するモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、限界希釈法により安定的なハイブリドーマ細胞株を得、かつ、限界希釈法によりＬＴ００３安定細胞株（ＰＤ−１‐１４Ｃ１２）を得、これにより分泌されたモノクローナル抗体を１４Ｃ１２と命名した。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ−１−１４Ｃ１２）は、２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５であり、アドレス  は：  中国  武漢、武漢大学で、郵便番号は、４３００７２である。
【０１０５】
２．  抗ＰＤ−１の抗体１４Ｃ１２の調製
前記に得られたＬＴ００３細胞株を１０％の低ＩｇＧウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で培養し（１％ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地、５％ＣＯ２、３７°Ｃで細胞インキュベータに培養）、７日後に細胞培養上清を集めて精製し、抗体１４Ｃ１２を得た。
【０１０６】
実施例５：抗体１４Ｃ１２の配列の取得
抗体１４Ｃ１２の配列の取得
培養細胞／細菌Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｉａｎｇｅｎ、カタログ番号ＤＰ４３０）の方法で、実施例４で得られたハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３からｍＲＮＡを抽出した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲキット取扱説明書に従ってｃＤＮＡを合成し、かつ、ＰＣＲにより増幅させた。
ＰＣＲ増幅産物を直接にＴＡクローニングに供した。具体的な操作は、ｐＥＡＳＹ−Ｔ１  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  ＣＴ１０１）キット取扱説明書を参照する。
ＴＡクローニングの産物を直接に配列決定に供し、配列決定結果を以下に示す。
重鎖可変領域の核酸配列：（３５４  ｂｐ）
ＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＴＣＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１１８  ａａ）
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）
軽鎖可変領域の核酸配列：（３１８  ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１０６  ａａ）
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＦＴＣＫＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）
【０１０７】
実施例６：抗ＰＤ−１のヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のデザイン、調製および検出
１．  ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖および重鎖配列のデザイン
ＰＤ―１タンパク質の三次元結晶構造（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｔら、  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＰＤ―１  ｇｅｎｅ（ＰＤＣＤ１）．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９５，  ２３（３）：７０４−６）および実施例５にて得られた抗体１４Ｃ１２の配列に基づき、抗体モデルのコンピューターシミュレーションによって、モデルによって変異をデザインし、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の可変領域配列を得た。
デザインした可変領域配列は、以下の通りであった。
重鎖可変領域の核酸配列：（３５４  ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１１８  ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０）
軽鎖可変領域の核酸配列：（３２１  ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）
これによりコードされるアミノ酸配列：（１０７  ａａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２）
【０１０８】
２．  ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検出
重鎖定常領域は、Ｉｇ  ｇａｍｍａ−１  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８５７を採用し、軽鎖定常領域は、Ｉｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  Ｐ０１８３４を採用した。
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングし、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の組換え発現プラスミドを得た。組換えプラスミドを２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。２９３Ｆ細胞培養液を精製して測定した。測定した結果は図４に示すように、還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、約２４．５ｋＤと４９ＫＤにあったが、非還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、約１４７  ｋＤにあった。
【０１０９】
実施例７：二機能性抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の重鎖と軽鎖の配列デザイン、発現および測定
１．  配列デザイン
本発明における二機能性抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の構造モードは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎモード（ＩｇＧ−ｓｃＦｖ）に属し、すなわち、１つのＩｇＧ抗体の２本の重鎖のＣ端は、いずれも別の抗体のｓｃＦｖ断片に接続され、その重鎖と軽鎖の主な組成デザインが、下記の表１に示す。
【０１１０】
【表１】
2019533475.tif 000003
【０１１１】
上記の表１において、
（１）右下に「Ｖ」というマークを付いているのは、対応の重鎖の可変領域または対応の軽鎖の可変領域を意味する。「Ｖ」というマークを付いていないのは、対応の重鎖または軽鎖が定常領域の全長を含むことを意味する。これらの可変領域または全長のアミノ酸配列およびコードされる核酸配列は、いずれも前記の実施例に記載の対応の配列を参照する。
（２）Ｌｉｎｋｅｒ１のアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３）である。
Ｌｉｎｋｅｒ２のアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２４）である。
（３）８Ｄ２Ｈ１４Ｌ２の重鎖可変領域（８Ｄ２Ｈ１４Ｖ）のアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＳＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＮＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＡＱＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴＹＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＧＶＹＹＣＴＡＱＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５）である。
８Ｄ２Ｈ１４Ｖをコードする核酸配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴＧＴＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＴＡＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＡＴＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６）
（４）８Ｄ２Ｈ１４Ｌ２の軽鎖可変領域（８Ｄ２Ｌ２Ｖ）のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＩＹＧＧＬＮＷＹＱＲＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＳＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＮＶＬＲＳＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７）
８Ｄ２Ｌ２Ｖをコードする核酸配列：
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＧＧＧＡＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＴＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８）
【０１１２】
２．  抗体ＢｉＡｂ００１の発現および精製
ＢｉＡｂ００１の重鎖ｃＤＮＡ配列と軽鎖のｃＤＮＡ配列をそれぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．より提供）ベクターにクローニングし、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＢｉＡｂ００１Ｈ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−  ＢｉＡｂ００１Ｌプラスミドを得た。
【０１１３】
プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＢｉＡｂ００１Ｈ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−  ＢｉＡｂ００１Ｌを、酵素切断し（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＥｃｏＲＩ）、電気泳動によって得られた重鎖、軽鎖をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出し、２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクションした。細胞を７日間培養した後、培養液を高速遠心し、上澄みを濃縮した後、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ柱に供し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒでタンパク質を一歩で溶出させ、目的試様を回収し、かつ液をＰＢＳに変更した。
【０１１４】
精製した試料にそれぞれ還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液と非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液を加え、沸騰した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検出を行った。ＢｉＡｂ００１の電気泳動図は図５に示すように、還元型タンパク質試料の目的タンパク質は２３．６  ｋＤと７５．８  ｋＤにあったが、非還元型タンパク質試料（単一抗体）の目的タンパク質は１９９  ｋＤにあった。
【０１１５】
３．  抗体ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７とＢｉＡｂ０１０の発現および精製
前述したＢｉＡｂ００１の発現および精製方法で精製した抗体ＢｉＡｂ００２，ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７とＢｉＡｂ０１０を得た。
精製した試料にそれぞれ還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液、非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液を加え、沸騰した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検出を行った。ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の電気泳動図は、それぞれ図６、図７、図８、図９および図１０に示すように、還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、２３．６  ｋＤと７５．８  ｋＤにあったが、非還元型タンパク質試料（単一抗体）の目的タンパク質は、１９９  ｋＤにあった。
【０１１６】
実施例８：抗体の動的パラメータの測定
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機で抗体と抗原を結合する動的パラメータを測定した。
１．  抗体４Ｇ１０およびヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の抗原ＣＴＬＡ４との結合の動的パラメータの測定
１．１．  ＴＥＶ  タンパク質酵素でＣＴＬＡ４−ｍＦｃタンパク質を切断し、かつカラム精製してＣＴＬＡ４抗原を得た。
１．２．  抗体４Ｇ１０をアミノカップリングによりＡＲ２Ｇセンサーの表面に固定化し、エタノールアミンによりブロックし、ＰＢＳＴでバランスした後、抗原ＣＴＬＡ４と結合し、ＣＴＬＡ４をＰＢＳＴで２倍希釈し、濃度は２６８．１、１３４．１、６７、３３．５、１６．８、８．３８、４．１９、０ｎＭであり、ＰＢＳＴにて解離させた。ヒト化４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の検出方法は４Ｇ１０と類似し、抗原濃度は、１８０、９０、４５、２２．５、１１．２５、５．６２５、２．８１３、０ｎＭであった。
１．３  抗体４Ｇ１０およびそのヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、４Ｇ１０Ｈ４Ｌ３の抗原と結合する動的パラメータ測定結果は、下記の表１に示し、動的特性パラメーター測定結果は、それぞれ図１１、図１２、図１３および図１４に示す。
【０１１７】
２．抗体１４Ｃ１２およぼそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の抗原ＰＤ−１と結合する動的パラメータの測定
２．１．ＴＥＶタンパク質酵素でＰＤ−１−ｍＦｃタンパク質を切断し、カラム精製してＰＤ−１抗原を得た。
２．２．抗原ＰＤ−１（抗原濃度：１  μｇ／ｍｌ）をビオチンで標識してＳＡセンサー表面に固定化し、ＰＢＳＴでバランスした後、それぞれ抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と結合し、抗体をＰＢＳＴで２００ｎＭから３倍希釈してＰＢＳＴにて解離させた。
２．３  抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の抗原と結合する動的パラメータ検出結果を下記の表１に示し、動的特性パラメーター検出結果をそれぞれ図１５、図１６に示す。
【０１１８】
３．抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の、抗原ＣＴＬＡ４と結合する動的パラメータの測定
３．１  抗原ＣＴＬＡ４（抗原濃度：１  μｇ／ｍｌ）をビオチンで標識してＳＡセンサー表面に固定化し、ＰＢＳＴでバランスした後、それぞれ抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０と結合し、抗体をＰＢＳＴで２００ｎＭから３倍希釈してＰＢＳＴにて解離させた。
３．２  抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の抗原ＣＴＬＡ４と結合する動的パラメータ検出結果を下記の表１に示し、動的特性パラメーター検出結果を、それぞれ図１７−図２１に示す。
【０１１９】
４．抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の抗原ＰＤ−１と結合する動的パラメータの測定
４．１抗原ＰＤ−１（抗原濃度：１  μｇ／ｍｌ）をビオチンで標識してＳＡセンサー表面に固定化し、ＰＢＳＴでバランスした後、それぞれ抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０と結合し、抗体をＰＢＳＴで２００ｎＭから３倍希釈してＰＢＳＴにて解離させた。
４．２抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４、ＢｉＡｂ００７およびＢｉＡｂ０１０の抗原ＰＤ−１と結合する動的パラメータ検出結果を下記の表２に示し、動的特性パラメーター検出結果をそれぞれ図２２−図２７に示す。
【０１２０】
【表２】
2019533475.tif 000004
【０１２１】
前記の結果からわかるように、
抗体４Ｇ１０及びそのヒト化抗体は、いずれも抗原に対してよい親和性を有する。１４Ｃ１２と１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、いずれも抗原ＰＤ−１に対して良い親和性を有する。
二機能性抗体は、いずれも抗原ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１に対して良い親和性を有する。
【０１２２】
実施例９：ＥＬＩＳＡ法による抗体の抗原との結合活性の測定
１．  ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の抗原ＣＴＬＡ４との結合活性
１．１  間接ＥＬＩＳＡ法でヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３のＣＴＬＡ４との結合活性を測定した。
ＥＬＩＳＡプレートに抗原を加えてインキュベートし、４℃で一晩置き、１％のＢＳＡで３７℃、２時間ブロッキングした後、それぞれ、抗体に加え、３７℃で３０  ｍｉｎインキュベートし、ＨＲＰで標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，１０９−０３５−０８８）を添加し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，３０８１７７）で５  ｍｉｎ発色反応を行い、かつ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
測定結果を図２８に示す。図面からわかるように、ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３は、いずれも有効的にＣＴＬＡ４タンパク質と結合でき、かつその結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度を表３に示す。結合された抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションより計算した抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の結合效率ＥＣ５０は、それぞれ０．０４８、０．０６７ｎＭであった。
【０１２３】
【表３】
2019533475.tif 000005
【０１２４】
１．２．  競合ＥＬＩＳＡ法によるヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３のそれぞれのＢ７と競合して抗原ＣＴＬＡ４を結合する結合活性の測定
Ｂ７／１−ｈＦｃ（Ｂ７／１Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿００５１８２．１）でＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩被覆し、１％ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、抗体を加え、それぞれＣＴＬＡ４−ｍＦｃの抗原抗体混合液（希釈濃度は表４に示す）と３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、酵素標識二次抗体を添加して３７℃で１ｈインキュベートし、３７℃で３０  ｍｉｎインキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度値を測定した（表４に示す）。
抗体のＢ７−１と競合して抗原ＣＴＬＡ４を結合する測定結果を図２９に示す。図面からわかるように、抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３は、効果的にＢ７−１と競合してＣＴＬＡ４タンパク質と結合することができ、かつ、その結合効率が投与量に依頼し、各投与量の蛍光強度は、表４に示す。結合された抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる結合效率ＥＣ５０は、それぞれ１．２９７ｎＭ、１．２２９ｎＭであった。
【０１２５】
【表４】
2019533475.tif 000006
【０１２６】
２．  ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体１４Ｃ１２およびヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の抗原ＰＤ−１との結合活性の測定
２．１．  間接ＥＬＩＳＡ法でモノクローナル組換え抗体１４Ｃ１２および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＤ−１との結合活性をそれぞれ測定し、具体的な方法は、以下の通りであった。
ＥＬＩＳＡプレートにＰＤ−１−ｍＦｃを加えてインキュベートし、４℃で一晩置き、１％のＢＳＡで３７℃、２時間ブロッキングした後、それぞれ抗体に加え、３７℃で３０  ｍｉｎインキュベートし、ＨＲＰで標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，１０９−０３５−０８８）を添加し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，３０８１７７）で５  ｍｉｎ発色反応を行い、かつ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の抗原ＰＤ−１と結合した結果を図３０に示す。図面からわかるように、抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、いずれも効果的にＰＤ−１タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率が投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表５に示す。結合された抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体の結合效率ＥＣ５０は、それぞれ０．１７５ｎＭ、０．０４３ｎＭであった。
【０１２７】
【表５】
2019533475.tif 000007
【０１２８】
２．２．競合ＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマ細胞から産生したモノクローナル抗体１４Ｃ１２およびヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＤＬ１と競合して抗原ＰＤ−１を結合することを測定し、具体的な方法は、以下の通りであった。
ＰＤ−１−ｈＦｃまたはＰＤ−１−ｍＦｃでＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩被覆し、１％ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、異なる濃度の抗体１４Ｃ１２および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１をそれぞれＰＤＬ１−ｈＦｃおよびＰＤＬ１−ｍＦｃと１０ｍｉｎ混合し（希釈濃度は表６に示す。）、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、酵素標識二次抗体を添加して３７℃で３０  ｍｉｎインキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度値を測定した（表６に示す）。
抗体１４Ｃ１２およびヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の抗原ＰＤ−１と結合した結果を図３１に示す。図面からわかるように、１４Ｃ１２およびヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、いずれも効果的にＰＤＬ１と競合してＰＤ−１タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表６に示す。結合された抗体１４Ｃ１２およびヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体１４Ｃ１２および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の結合效率ＥＣ５０は、それぞれ０．８５３  ｎＭ、０．３７  ｎＭであった。
【０１２９】
【表６】
2019533475.tif 000008
【０１３０】
３．  ＥＬＩＳＡ法による抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の抗原との結合活性の測定
３．１．  間接ＥＬＩＳＡ法で抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の、抗原ＣＴＬＡ４との結合活性をそれぞれ測定し、測定方法は、本実施例における１．１を参照する。
抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の抗原ＰＤ−１との結合を測定した結果を図３２に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、  ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４は、いずれも効果的にＰＤ−１タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表７に示す。結合された抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体の結合效率ＥＣ５０は、下記の表７に示す。
【０１３１】
【表７】
2019533475.tif 000009
【０１３２】
３．２．  間接ＥＬＩＳＡ法で抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の抗原ＰＤ−１との結合活性をそれぞれ測定し、その方法は、本実施例における２．１を参照する。
抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の、抗原ＰＤ−１と結合した結果を図３３に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４は、いずれもＰＤ−１タンパク質と効果的に結合し、かつ、その結合效率が投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表７に示す。結合された抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる結合效率ＥＣ５０は下記の表８に示す。
【０１３３】
【表８】
2019533475.tif 000010
【０１３４】
３．３  競合ＥＬＩＳＡ法で抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＢ７／１−ｈＦｃと競合して抗原ＣＴＬＡ４と結合することを測定し、その方法は本実施例における１．２を参照する。
測定結果は図３４に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、  ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４は、いずれも効果的に抗原ＣＴＬＡ４と結合することができ、ＣＴＬＡ４のＢ７／１との結合を抑制し、かつ、ＣＴＬＡ４のＢ７／１との結合に対する抗体の抑制效率は、投与量に依存し、各投与量の吸光強度は、表９に示す。結合された抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４に対して吸光強度定量分析を行い、曲線シミュレーションによって結合ＥＣ５０を得った（表９）。
【０１３５】
【表９】
2019533475.tif 000011
【０１３６】
３．４．  競合ＥＬＩＳＡ法で抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＰＤＬ１と競合して抗原ＰＤ−１と結合することを測定し、方法が本実施例における２．２と同じである。
測定結果は、図３５に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４は、いずれも効果的に抗原ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤＬ１との結合を抑制することができ、かつ、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤＬ１の結合に対する抗体の抑制效率は、投与量に依存し、各投与量の吸光強度は、表１０に示す。結合された抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４に対して吸光強度定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体の結合效率ＥＣ５０を得った（表１０）。
【０１３７】
【表１０】
2019533475.tif 000012
【０１３８】
実施例１０：フローサイトメータ法による抗体の細胞表面抗原との結合活性の測定
まず、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１抗原を発現する宿主細胞２９３Ｔをそれぞれ構築し、本発明にて調製したヒト化抗体を用いて当該宿主細胞を標識した。そして、フローサイトメトリー法で細胞表面の天然立体配座抗原に対する抗体の特異的結合能を分析および検証する。
【０１３９】
１．ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１抗原をそれぞれ発現する宿主細胞２９３Ｔの構築
ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１のベクターｐＬｅｎｔｉ６．３−ＣＴＬＡ４、ｐＬｅｎｔｉ６．３−ＰＤ−１（ベクターｐＬｅｎｔｉ６．３は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したものである）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、スクリーニングによりＣＴＬＡ４を安定的に発現するクローン集団２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞およびＰＤ−１を安定的に発現するクローン集団２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞をそれぞれ得た。
【０１４０】
２．抗体の細胞表面抗原との結合を測定する方法
通常のトリプシン消化法で前記工程にて得られた抗原を発現する宿主細胞を消化し、かつ各回収チュープにおける細胞数を２×１０５とし、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ）で濃度が勾配した抗体希釈液をそれぞれ調製し、氷上で対応する抗原を発現する２９３Ｔ細胞と２時間インキュベートし、１００  μＬ  ＦＩＴＣヒツジ抗ヒトＩｇＧ（１：５００）を各チュープに加え、氷上で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗った後、３００  μＬ  ＰＢＳを添加し、細胞を再懸濁させ、フローサイトメータでＦＩＴＣチャンネルを用いて蛍光シグナルを測定した。
【０１４１】
２．１細胞表面抗原に対する抗体の結合の検出結果
ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の、２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞と結合する結果は、それぞれ図３６、図３７に示す。図面からわかるように、４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１および４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３抗体は、効果的に宿主細胞２９３Ｔ−  ＣＴＬＡ４表面のターゲットＣＴＬＡ４タンパク質と結合することができ、かつ、その結合效率は投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表１１に示す。結合された４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１および４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１および４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３抗体の結合效率ＥＣ５０は、それぞれ７．５８ｎＭ、１０．５４ｎＭであった。
【０１４２】
【表１１】
2019533475.tif 000013
【０１４３】
２．２  ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞との結合結果は、図３８に示す。図面からわかるように、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体は、宿主細胞２９３Ｔ−ＰＤ−１表面のターゲットＰＤ−１タンパク質と効果的に結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表１２に示す。結合された１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体の結合效率ＥＣ５０は１．８９  ｎＭであった。
【０１４４】
【表１２】
2019533475.tif 000014
【０１４５】
２．３  抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の、２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞との結合結果は、それぞれ図３９、図４０、図４１および図４２に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４は、いずれも宿主細胞２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４表面のターゲットＣＴＬＡ４タンパク質と効果的に結合し、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表１３に示す。結合された抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体の結合效率ＥＣ５０を得た（表１３）。
【０１４６】
【表１３】
2019533475.tif 000015
【０１４７】
２．４抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の、２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞との結合結果は、それぞれ図４３〜４６に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４は、いずれも宿主細胞２９３Ｔ−ＰＤ−１表面のターゲットＰＤ−１タンパク質と効果的に結合し、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表１４に示す。結合された抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体的結合效率ＥＣ５０を得た（表１４）。
【０１４８】
【表１４】
2019533475.tif 000016
【０１４９】
３．  抗体の、Ｔ細胞表面抗原ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１との結合活性
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＯＴ  Ｎｏ．：１７１４４０−０２）を採用してＰＢＭＣを分離させ、ＰＢＭＣからＣＤ４＋細胞を分離した。ＰＨＡ（５０  μｌ／ｍｌ）で３日間刺激した後ＰＢＳで１回洗い、異なる濃度を有する抗体を加え、氷上で１．５時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、ＰＢＳで１回洗い、ＦＩＴＣで標識された抗ヒト二次抗体ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌｏｔ．１０２１５５）を加えた。氷上でかつ遮光下で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗ってフローサイトメータで測定した。
ここで、用いられる対照抗体Ｎｉｖｏｌｕｍａｂは抗ＰＤ−１の抗体であり、市販されており、これについての情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０９０３５を参照してもよい。
対照抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂは、抗ＣＴＬＡ４の抗体であり、市販されており、これについての情報もｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６１８６を参照してもよい。
【０１５０】
３．１  ヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３のＴ細胞との結合結果は、図４７に示す。図面からわかるように、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３抗体は、Ｔ細胞表面のターゲットＣＴＬＡ４タンパク質と効果的に結合でき、かつ、その結合效率は、投与量に依存する。
【０１５１】
３．２  ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＴ細胞との結合は、図４８に示す。図面からわかるように、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体は、Ｔ細胞表面のターゲットＰＤ−１タンパク質と効果的に結合でき、かつ、その結合效率は、投与量に依存する。
【０１５２】
３．３  抗体ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４のＴ細胞との結合と、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３との比較結果を図４９に示す。図面からわかるように、抗体ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３抗体は、いずれも効果的にＴ細胞表面のターゲットＰＤ−１タンパク質と結合でき、かつ、その結合效率が投与量に依存する。そして、抗体ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、Ｔ細胞との結合が抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂより強かった。蛍光強度測定結果は、表１５に示す。
【０１５３】
【表１５】
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【０１５４】
実施例１１：混合リンパ球反応：サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の分泌
１．  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＯＴ  Ｎｏ．：１７１４４０−０２）を採用してＰＢＭＣを分離させ、分離されたＰＢＭＣにＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｋ２５１３、１０００Ｕ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｈ１５１３、１０００Ｕ／ｍｌ）を添加して６日間誘導した後、ＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｇ１５１３、２００Ｕ／ｍｌ）を添加して３日間誘導し、ＤＣ細胞を得た。
【０１５５】
ＰＢＭＣからＴ細胞を分離し、得られたＤＣ細胞とＴ細胞を、１：１０の比率で混合して培養し、かつ、異なる比率の抗体（ｈＩｇＧを対照とする）を加えて５〜６日間培養した後、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＦＮ−γ（Ｄａｋｅｗｅ  Ｇｒｏｕｐから購入）とＩＬ−２（Ｄａｋｅｗｅ  Ｇｒｏｕｐから購入）の分泌量を測定した。
ＤＣ細胞とＴ細胞を混合して培養した後のＩＦＮ−γの分泌検出結果は、ぞれぞれ図５０−図５３に示す。ＤＣ細胞とＴ細胞を混合して培養した後のＩＬ−２の分泌検出結果はそれぞれ図５４−図５６に示す。
【０１５６】
図面からわかるように、４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および二機能性抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４は、いずれも効果的に混合リンパ球のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を誘導することができる。そのうち、抗ＰＤ−１抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、濃度が１  ｎＭおよび１０  ｎＭである場合、ＩＦＮ−γ分泌に対する誘導効果は、１００  ｎＭの対照抗体Ｎｉｖｏｌｕｍａｂと相当する。ＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１及び４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３は、濃度が１００  ｎＭである場合、ＩＦＮ−γ分泌に対する誘導効果が対照抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂより強かった（図５２）。
【０１５７】
実施例１２：ＩＬ−２の分泌
（実施例１０と同じ方法で）分離して得たＰＢＭＣをＰＨＡ（上海疾控生物科技有限公司、５０  μｌ／ｍＬ）で３日間刺激した後、９６ウェルプレートに刺激によって成熟したＰＢＭＣ（ボランティア血液ドナーから、５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ウェル）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ由来、５×１０４  ｃｅｌｌｓ／孔）、および、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ由来）（１×１０４  ｃｅｌｌｓ／孔）を加えると共に、抗体（１００ｎｍ）を添加して均一になるように混合して共培養した。３日間後、ＥＬＩＳＡキットを採用してＩＬ−２（Ｄａｋｅｗｅ  Ｇｒｏｕｐから購入）の分泌量を測定し、具体的な手順は、キットの取扱説明書に従って行った。
【０１５８】
細胞を混合して培養した後のＩＬ−２の分泌検出結果はそれぞれ図５７、図５８および図５９に示す。図面からわかるように、４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１、４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、および二機能性抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３、ＢｉＡｂ００４は、いずれも効果的にＰＢＭＣのＩＬ−２の分泌を誘導できる。そのうち、抗ＰＤ−１抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＩＬ−２の分泌に対する誘導効果は、対照抗体Ｎｉｖｏｌｕｍａｂより強く（図５８）、二機能性抗体ＢｉＡｂ００１、ＢｉＡｂ００２、ＢｉＡｂ００３およびＢｉＡｂ００４の、ＩＬ−２の分泌の誘導効果は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１＋４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１または１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１＋４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の効果と相当する（図５９）。
【０１５９】
実施例１３：抗体ＢｉＡｂ００４の、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおける腫瘍生長への影響
ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウス（ヒトＰＤ−１遺伝子導入マウス）右側皮下にＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０６／匹）を接種し、平均腫瘍体積が約１４４ｍｍ３に達すると、腫瘍体積によってマウスをランダムに４つの実験群に分け、腹腔内投与した。各群は、いずれも８匹のマウスであった。具体的な分類と投与量は以下の通りであった。
Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ群（投与量２．６７ｍｇ／ｋｇ），
ＢｉＡｂ００４高投与量群（投与量２．６７ｍｇ／ｋｇ），
ＢｉＡｂ００４低投与量群（投与量０．２６７ｍｇ／ｋｇ），
前記の３つの群は、いずれも周２回、合計５回で投与した。各群に投与した後、腫瘍のサイズを周２回で測定した。
結果は図６０に示す。
結果からわかるように、
ＢｉＡｂ００４高投与量群およびＢｉＡｂ００４低投与量群の腫瘍体積は、いずれも統計的にＩｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ群（Ｐ＜０．００１、＜０．０５）より有意に小さい。ＢｉＡｂ００４低投与量群は、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、統計的に有意な抗腫瘍効果を示す。
【０１６０】
本発明の具体的な実施形態を詳細に記載してきたが、当業者は、本明細書で開示される教示に照らして、本発明の構成に対して様々な改変および変更がなされ得、これらが全て本発明の保護範囲に包含されることを理解できる。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびその何らかの同等物において定められる。
【図１】
2019533475.tif 000018
【図２】
2019533475.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019533475.tif 000023
【図７】
2019533475.tif 000024
【図８】
2019533475.tif 000025
【図９】
2019533475.tif 000026
【図１０】
2019533475.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
2019533475.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2019533475.tif 000033
【図１７】
2019533475.tif 000034
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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