(57)【要約】本発明は、組換え微生物、ならびにステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体を産生するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞であって、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含み、前記組換え宿主細胞が、前記ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生することが可能な、前記組換え宿主細胞。
【請求項２】
（ａ）ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ステビオールまたはステビオールグリコシドを、Ｃ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｊ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／または
（ｋ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子;
のうちの１つ以上をさらに含み、
前記遺伝子の少なくとも１つが、組換え遺伝子である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
（ａ）ＧＧＰＰを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号１１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、または配列番号９２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｆ）ステビオールを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、または配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｇ）ステビオールまたはステビオールグリコシドを、それらのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能な前記ポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｉ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそれらのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｊ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能な前記ポリペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド；配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド；または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み；かつ、
（ｋ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な前記二機能性ポリペプチドが、配列番号５４、配列番号５６、または配列番号５８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
前記組換え宿主が、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞を含む、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記真菌細胞が、酵母細胞を含む、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、または  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ種由来の細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅである、請求項６または７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種由来の細胞である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生する方法であって、前記遺伝子が発現される条件下で、細胞培地中で請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を成長させることを含み、前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物が、前記組換え宿主細胞により産生される、前記方法。
【請求項１１】
ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生するための方法であって、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ請求項１〜９のいずれか１項に記載の前記組換え宿主細胞により産生される配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能な組換えポリペプチドを使用して、細胞培地中での植物由来または合成ステビオール及び／またはステビオールグリコシドの全細胞生物変換、ならびに、それにより前記ステビオールグリコシドを合成することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離ステップが、
（ａ）前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む前記細胞培地を提供すること、
（ｂ）前記細胞培地の液相を、前記細胞培養物の固相から分離して、前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む上清を得る；
（ｃ）充填カラム中の吸着樹脂を提供することを含む、１つ以上の吸着樹脂を提供すること；及び
（ｄ）前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の前記上清を、前記１つ以上の吸着樹脂と接触させ、それにより、前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離すること、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離ステップが、
（ａ）前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む前記細胞培養物を提供すること；
（ｂ）前記細胞培養物の液相を、前記細胞培養物の固相から分離して、前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ること；
（ｃ）１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供すること；及び
（ｄ）前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の前記上清を、前記１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させること、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離ステップが、
（ａ）前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む前記細胞培養物を提供すること；
（ｂ）前記細胞培養物の液相を、前記細胞培養物の固相から分離して、前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ること；
（ｃ）前記ステビオールグリコシドを結晶化または抽出し、それにより、前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離すること、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステビオールグリコシドを単独で、または前記ステビオールグリコシドを含む組成物として回収することをさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法
【請求項１７】
前記回収された組成物が、ステビア植物由来のグリコシド組成物と比較して、前記ステビオールグリコシドについて富化され、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記回収された組成物が、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞培地が、
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞または植物由来もしくは合成ステビオール及び／もしくはステビオールグリコシドの全細胞生物変換により産生される前記ステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、及び／またはスクロース；ならびに／あるいは
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素、
を含む、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステビオールグリコシドが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドをコードする前記遺伝子で形質転換されている透過処理された組換え宿主細胞内で産生される、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換え宿主が、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記真菌細胞が、酵母細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、または  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ種由来の細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種由来の細胞である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）を産生するためのインビトロの方法であって、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能な組換えポリペプチド、ならびに植物由来または合成ステビオールを、反応混合物に添加すること；ならびに、それにより１９−ＳＭＧを合成することを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記反応混合物が、
（ａ）１９−ＳＭＧ；
（ｂ）前記組換えポリペプチド；
（ｃ）グルコース、フルクトース、及び／もしくはスクロース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／もしくはＮ−アセチル−グルコサミン；ならびに／または
（ｄ）反応緩衝液及び／もしくは塩、
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、またはそれらの異性体を含む、請求項１０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞培地であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主；及び
（ｂ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド；
を含み、
１つ以上のステビオールグリコシドが、前記細胞培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在する、前記細胞培地。
【請求項３１】
細胞培地であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド、
を含み、
１つ以上のステビオールグリコシドが、前記培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、前記細胞培地が、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含む、前記細胞培地。
【請求項３２】
細胞培地であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド、
を含み、
１つ以上のステビオールグリコシドが、前記細胞培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、前記細胞培地が、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含み；
前記細胞培地が、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する、前記細胞培地。
【請求項３３】
細胞培地であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド、
を含み、
１つ以上のステビオールグリコシドが、前記細胞培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、前記細胞培地が、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含み；
前記細胞培地が、ステビア植物由来のステビオールグリコシド抽出物と比較して、１９−ＳＭＧについて富化され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する、前記細胞培地。
【請求項３４】
細胞溶解物であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシドを含み、前記細胞溶解物が、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含む、前記細胞溶解物。
【請求項３５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生されるステビオールグリコシド。
【請求項３６】
請求項１０〜２９のいずれか１項に記載の方法により産生されるステビオールグリコシド。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載のステビオールグリコシドを含む甘味料組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の甘味料組成物を含む食品。
【請求項３９】
請求項３８に記載の甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。
【請求項４０】
ステビオールグリコシドの組成物であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主、または請求項１０〜２９のいずれか１項に記載の方法により産生され、前記組成物中のステビオールグリコシドの前記相対的レベルが、前記組換え宿主内のステビオールグリコシドの前記相対的レベルに対応する、前記ステビオールグリコシドの組成物。
【請求項４１】
ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチドをコードする前記遺伝子を欠いている、対応する組換え宿主細胞により産生されるステビオールグリコシドの組成物と比較して、増加したレベルの１９−ＳＭＧをさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換え宿主内でのステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体の組換え産生に関する。特に、本開示は、組換え宿主内での、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド（Ｒｕｂｕ）、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、トリグルコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグルコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグルコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグルコシル化ステビオールグリコシド、またはそれらの異性体を含むステビオールグリコシドの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
甘味料は、食品、飲料、または菓子業界で最も一般に使用される成分として周知である。甘味料は、卓上甘味料またはベーキング時の砂糖の家庭用代替品として、適切に希釈された時に、製造中の最終食品中に組み込むことができるか、または独立の使用のためのものであるかのいずれかである。甘味料は、天然甘味料、例えば、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、及び蜂蜜、ならびに人工甘味料、例えば、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースを含む。ステビア抽出物は、多年草であるＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａから単離及び抽出することができる天然甘味料である。ステビアは、ステビア抽出物を商業的に製造するために、南米及びアジアで一般に栽培されている。種々の程度に精製されたステビア抽出物は、食品中の高強度甘味料として、かつブレンドで、または卓上甘味料として単独で、商業的に使用される。
【０００３】
ジテルペンステビオール及び種々のステビオールグリコシドを含む、いくつかのステビオールグリコシドの化学構造は図２に示される。ステビア植物の抽出物は一般に、甘味に寄与するステビオールグリコシドを含む。但し、各ステビオールグリコシドの量は多くの場合、とりわけ、異なる製造バッチ間で変動する。
【０００４】
ステビア植物由来のステビオールグリコシドの回収及び精製が、労働集約的及び非効率的であることが証明されているので、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭなどの所望のステビオールグリコシドを高収率で蓄積することができる組換え産生系は依然として必要とされている。商業的使用のための組換え宿主内でのステビオールグリコシドの産生の改善も依然として必要とされている。同様に、１つ以上のより特異的なステビオールグリコシドを産生するために、特定の基質に対して選択的な酵素を同定することは依然として必要とされている。一部の態様では、より高い収率のステビオールグリコシドを産生するために、１９−Ｏグリコシル化活性を有する酵素の触媒能力を増加させることは依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明が従来技術を超える特定の利点及び進歩を提供することは、上述の背景と反対である。
【０００６】
本明細書で開示されるような本発明は、具体的な利点または機能に限定されないが、本発明は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え宿主細胞を提供し、組換え宿主細胞は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生することが可能である。
【０００７】
一部の態様では、組換え宿主細胞は、
（ａ）ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び
（ｆ）ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｊ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／または
（ｋ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み、
遺伝子のうち少なくとも１つは、組換え遺伝子である。
【０００８】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一部の態様では、
（ａ）ＧＧＰＰを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号１１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドは、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）ステビオールを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、または配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｇ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそれらのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｉ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそれらのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｊ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド；配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド；または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み；かつ
（ｋ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドは、配列番号５４、配列番号５６、または配列番号５８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０００９】
一部の態様では、本明細書に開示の組換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞を含む。
【００１０】
一部の態様では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細菌細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞を含む。
【００１１】
一部の態様では、真菌細胞は、酵母細胞を含む。
【００１２】
一部の態様では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ種由来の細胞である。
【００１３】
一部の態様では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅである。
【００１４】
一部の態様では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種由来の細胞である。
【００１５】
本発明は、遺伝子が発現される条件下、細胞培地中で、本明細書に開示の組換え宿主細胞を成長させること含む、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生する方法をさらに提供し、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物は、組換え宿主細胞により産生される。
【００１６】
本発明は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生される配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能な組換えポリペプチドを使用して、細胞培地中での植物由来または合成ステビオール及び／またはステビオールグリコシドの全細胞生物変換、ならびに、それによりステビオールグリコシドを合成することを含む、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生するための方法をさらに提供する。
【００１７】
一部の態様では、本明細書に開示の方法は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離することをさらに含む。
【００１８】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、単離ステップは、
（ａ）ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む細胞培地を提供すること；
（ｂ）細胞培地の液相を、細胞培養物の固相から分離して、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ること；
（ｃ）充填カラム中の吸着樹脂を提供することを含む、１つ以上の吸着樹脂を提供すること；及び
（ｄ）ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の上清を、１つ以上の吸着樹脂と接触させ、それにより、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離すること、
を含む。
【００１９】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、単離ステップは、
（ａ）ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）細胞培養物の液相を、細胞培養物の固相から分離して、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ること；
（ｃ）１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供すること；及び
（ｄ）ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の上清を、１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させること、
を含む。
【００２０】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、単離ステップは、
（ａ）ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）細胞培養物の液相を、細胞培養物の固相から分離して、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ること；
（ｃ）ステビオールグリコシドを結晶化または抽出し、それにより、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離すること、
を含む。
【００２１】
一部の態様では、本明細書に開示の方法は、ステビオールグリコシドを単独で、またはステビオールグリコシドを含む組成物として回収することをさらに含む。
【００２２】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、回収された組成物は、ステビア植物由来のグリコシド組成物と比較して、ステビオールグリコシドについて富化され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する。
【００２３】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、回収された組成物は、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する。
【００２４】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、細胞培地は、
（ａ）本明細書に開示の組換え宿主細胞または植物由来もしくは合成ステビオール及び／もしくはステビオールグリコシドの全細胞生物変換により産生されるステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、及び／またはスクロース；ならびに／あるいは
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素、
を含む。
【００２５】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、ステビオールグリコシドは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換されている、透過処理された組換え宿主細胞内で産生される。
【００２６】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、組換え宿主は、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む。
【００２７】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞を含む。
【００２８】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、真菌細胞は、酵母細胞を含む。
【００２９】
本明細書に開示の方法一部の態様では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、または  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ種由来の細胞である。
【００３０】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅである。
【００３１】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種由来の細胞である。
【００３２】
本発明は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能な組換えポリペプチド、ならびに植物由来または合成ステビオールを、反応混合物に添加すること；ならびに、それにより１９−ＳＭＧを合成することを含む、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）を産生するためのインビトロの方法をさらに提供する。
【００３３】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、反応混合物は、
（ａ）１つ以上の１９−ＳＭＧ；
（ｂ）組換えポリペプチド；
（ｃ）グルコース、フルクトース、及び／もしくはスクロース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／もしくはＮ−アセチル−グルコサミン；ならびに／または
（ｄ）反応緩衝液及び／もしくは塩、
を含む。
【００３４】
本明細書に開示の方法の一部の態様では、ステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、またはそれらの異性体を含む。
【００３５】
本発明は、
（ａ）本明細書に開示の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド；
を含む細胞培地をさらに提供し、
１つ以上のステビオールグリコシドは、細胞培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在する。
【００３６】
本発明は、
（ａ）本明細書に開示の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド；
を含む細胞培地をさらに提供し、
１つ以上のステビオールグリコシドは、細胞培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、細胞培地は、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含む。
【００３７】
本発明は、
（ａ）本明細書に開示の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド；
を含む細胞培地をさらに提供し、
１つ以上のステビオールグリコシドは、培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、細胞培地は、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含み；
細胞培地は、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する。
【００３８】
本発明は、
（ａ）本明細書に開示の組換え宿主細胞；及び
（ｂ）本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシド；
を含む細胞培地をさらに提供し、
１つ以上のステビオールグリコシドは、細胞培地の少なくとも０．１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、細胞培地は、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含み；
細胞培地は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド抽出物と比較して、１９−ＳＭＧについて富化され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来構成成分を有する。
【００３９】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生される１つ以上のステビオールグリコシドを含む細胞溶解物をさらに提供し、細胞溶解物は、グルコース、スクロース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、及び／またはＹＮＢをさらに含む。
【００４０】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生されるステビオールグリコシドをさらに提供する。
【００４１】
本発明は、本明細書に開示の方法により産生されるステビオールグリコシドをさらに提供する。
【００４２】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主細胞または方法により産生されるステビオールグリコシドを含む甘味料組成物をさらに提供する。
【００４３】
本発明は、本明細書に開示の甘味料組成物を含む食品をさらに提供する。
【００４４】
本発明は、本明細書に開示の甘味料組成物を含む飲料または飲料濃度をさらに提供する。
【００４５】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主により産生されるステビオールグリコシドの組成物をさらに提供し、組成物中のステビオールグリコシドの相対レベルは、組換え宿主内のステビオールグリコシドの相対レベルに対応する、
【００４６】
一部の態様では、組成物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子を欠いている、対応する組換え宿主細胞により産生されるステビオールグリコシドの組成物と比較して、増加したレベルの１９−ＳＭＧをさらに含む。
【００４７】
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と共に、次の発明を実施するための形態からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲の範囲は、そこに列挙されるものにより規定され、本明細書に記載の特徴及び利点の具体的な検討により規定されないことに注意する。
【００４８】
本発明の実施形態の次の詳細な説明は、次の図面と共に読まれる時、最も良く理解することができ、類似の構造は、類似の参照番号で示される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチド（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））；ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ））（示さず）；及びステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））を使用して、ゲラニルゲラニルジホスファート由来の酵母内でステビオールを産生するための、操作された生合成経路の概略図を示す。
【図２】好適なウリジン５′−ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素により触媒される代表的なステビオールグリコシドグリコシル化反応及びいくつかのステビオールグリコシド化合物の化学構造を示す。
【図３】ＵＧＴ３３９４２（配列番号１、配列番号２）を発現するステビオール給餌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株による１９−ＳＭＧの蓄積（曲線下面積；ＡＵＣ）を示す。
【図４】ステビオール給餌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ対照株（上段）及びＵＧＴ３３７８６（配列番号１１８、配列番号１１９）を発現するステビオール給餌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（下段）由来の試料の１９−ＳＭＧの質量に対応する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）選択イオンレコーディング（ＳＩＲ）トレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明を詳細に説明する前に、多数の用語が定義されるであろう。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」についての言及は、１つ以上の核酸を意味する。
【００５１】
「好ましくは」、「一般に」、及び「通常」のような用語は、特許請求される発明の範囲を限定するために、または特定の特徴が特許請求される発明の構造もしくは機能に決定的、必須、またはさらに重要であることを意味するために、本明細書では利用されないことに注意する。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態で利用することができ、または利用することができない代替または追加の特徴を強調することが単に意図される。
【００５２】
本発明を説明及び記載する目的で、本明細書では、「実質的に」という用語は、定量的な比較、値、測定値、または他の表現に起因する可能性がある不確実性の固有の程度を表すために本明細書で利用されることに注意する。「実質的に」という用語も、本明細書では、問題となっている主題の基本機能に変化をもたらさずに、定量的表現が記載された基準と異なる可能性がある程度を表すために利用される。
【００５３】
当業者らに周知の方法は、本発明による遺伝子発現構築物及び組換え細胞を構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組換え技術、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載されるような技術を参照のこと。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、当業者に理解されるように、文脈に応じて、一本鎖または二本鎖のいずれかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む核酸を指すために互換的に使用することができる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「宿主」、及び「宿主細胞」という用語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、「組換え宿主」または「組換え微生物」という用語は、ゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列により増強されている宿主を指すものである。このようなＤＮＡ配列は、天然には存在しない遺伝子、ＲＮＡに正常に転写されないか、またはタンパク質に翻訳され（「発現され」）ないＤＮＡ配列、及び宿主に導入することが所望される他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。通常は、本明細書に記載の組換え宿主のゲノムは、１つ以上の組換え遺伝子の安定した導入により増強されることが理解されるであろう。一般に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡのレシピエントである宿主内に元々存在していないが、ＤＮＡセグメントを所与の宿主から単離すること、及び続く、そのＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを、同じ宿主に導入すること、例えば、遺伝子の産物の産生を増強させるか、または遺伝子の発現パターンを変更することは、本開示の範囲内である。一部の場合では、導入されたＤＮＡは、例えば、相同組換えまたは部位特異的変異導入により、内在性遺伝子またはＤＮＡ配列を改変または置換するであろう。好適な組換え宿主は、微生物を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「組換え遺伝子」という用語は、同じまたは類似の遺伝子またはＤＮＡ配列が、このような宿主内に既に存在し得るかどうかにかかわらず、レシピエント宿主に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。本文脈における「導入された」または「増強された」は、人間の手により導入または増強されることを意味することが当該技術分野で既知である。従って、組換え遺伝子は、別の種に由来するＤＮＡ配列とすることができ、または同じ種に由来するか、もしくは同じ種に存在するが組換え宿主を形成するために組換え方法により宿主に組み込まれているＤＮＡ配列とすることができる。宿主に導入される組換え遺伝子は、形質転換される宿主に通常存在するＤＮＡ配列と同一である可能性があり、ＤＮＡの１つ以上のさらなるコピーを提供し、それにより、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にするために導入されることが理解されるであろう。一部の態様では、該組換え遺伝子は、ｃＤＮＡによりコードされる。他の実施形態では、組換え遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での発現のために合成及び／またはコドン最適化される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「操作された生合成経路」という用語は、本明細書に記載されているように、組換え宿主内で生じる生合成経路を指す。一部の態様では、生合成経路の１つ以上のステップは、未改変宿主内で自然に生じない。一部の実施形態では、異種バージョンの遺伝子は、内在性バージョンの遺伝子を含む宿主に導入される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「内在性」遺伝子という用語は、特定の生体、組織、または細胞から生じ、かつ産生または合成される遺伝子を指す。一部の実施形態では、内在性遺伝子は、酵母遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子は、限定されないが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２８８Ｃを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して内在性である。一部の実施形態では、内在性酵母遺伝子は、過剰発現される。本明細書で使用される場合、「過剰発現」という用語は、野生型生体内での遺伝子発現のレベルよりも高いレベルで生体内の遺伝子の発現を指すために使用される。例えば、Ｐｒｅｌｉｃｈ，２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９０：８４１−５４を参照のこと。一部の実施形態では、内在性酵母遺伝子を欠失させる。例えば、Ｇｉａｅｖｅｒ  ＆  Ｎｉｓｌｏｗ，２０１４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９７（２）：４５１−６５を参照のこと。本明細書で使用される場合、「欠失」、「欠失した」、「ノックアウト」、及び「ノックアウトした」という用語は、限定されないが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む生体内で今後発現されないように操作されている内在性遺伝子を指すために互換的に使用することができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「異種配列」及び「異種コード配列」という用語は、組換え宿主以外の種に由来する配列を記載するために使用される。一部の実施形態では、組換え宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり、異種配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の生体に由来する。異種コード配列は、例えば、異種配列を発現する組換え宿主と異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫または真菌由来である可能性がある。一部の実施形態では、コード配列は、宿主に固有の配列である。
【００６０】
「選択マーカー」は、宿主細胞栄養要求性を補完し、抗生物質耐性を提供し、または色の変化をもたらす任意の数の遺伝子のうちの１つとすることができる。次に、遺伝子置換ベクターの線状化されたＤＮＡフラグメントは、当該技術分野で周知の方法を使用して、細胞に導入される（下記を参照のこと）。線状フラグメントのゲノムへの組み込み及び遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定することができ、例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット分析により確認することができる。選択に使用された後に、選択マーカーは、例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムにより、宿主細胞のゲノムから除去することができる（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６：１５３−１７３及びＵ．Ｓ．２００６／００１４２６４を参照のこと）。あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の部分を含むように構成することができ、部分は、任意の内在性遺伝子のプロモーター配列を欠いており、何もコードせず、または遺伝子のコード配列の不活性フラグメントをコードする。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「多様体」及び「変異体」という用語は、特定のタンパク質の野生型配列と比較して、１つ以上のアミノ酸で修飾されているタンパク質配列を記載するために使用される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「不活性フラグメント」という用語は、遺伝子の全長コード配列から産生されるタンパク質の活性の例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子フラグメントである。遺伝子のこのような一部分は、既知のプロモーター配列が遺伝子配列に作動可能に連結されていないが、終止コドン及び転写終結配列が遺伝子配列の部分に作動可能に連結されるようにベクターに挿入される。このベクターは、その後、遺伝子配列の部分で線状化し、細胞内に形質転換することができる。次に、単一の相同組換えにより、この線状化されたベクターは、それらが不活化された状態で遺伝子の内在性対応物に組み込まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド」という用語は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）（ＣＡＳ＃５８５４３−１６−１）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）（ＣＡＳ＃５８５４３−１７−２）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）（ＣＡＳ＃６３５５０−９９−２）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）（ＣＡＳ＃６３２７９−１３−０）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）（ＣＡＳ＃６３２７９−１４−１）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）（ＣＡＳ＃４３８０４５−８９−７）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）（ＣＡＳ＃１２２０６１６−４４−３）、ルブソシド（ＣＡＳ＃６３８４９−３９−４）、ズルコシドＡ（ＣＡＳ＃６４４３２−０６−０）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）（ＭａｓｓＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ：ＦＵ０００３３２）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、１，２−ステビオシド（ＣＡＳ＃５７８１７−８９−７）、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、１，２−ビオシド（ＭａｓｓＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ：ＦＵ０００２９９）、１，３−ビオシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ），ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、トリ−グルコシル化ステビオールグリコシド、テトラ−グリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタ−グリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサ−グルコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタ−グリコシル化ステビオールグリコシド、及びそれらの異性体を指す。図２を参照のこと：Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ６９ｔｈ  ＪＥＣＦＡ，２００７，ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｗａｌｌｉｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．Ｏｒｇも参照のこと。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド前駆体」及び「ステビオールグリコシド前駆体化合物」という用語は、ステビオールグリコシド生合成経路における中間体化合物を指すために使用される。ステビオールグリコシド前駆体は、ゲラニルゲラニルジホスファート（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリルジホスファート、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナル、ｅｎｔ−カウレン酸、及びステビオールを含むが、これらに限定されない。図１を参照のこと。一部の実施形態では、ステビオールグリコシド前駆体はそれ自体、ステビオールグリコシド化合物である。例えば、１９−ＳＭＧ、ルブソシド、ステビオシド、及びＲｅｂＥは、ＲｅｂＭのステビオールグリコシド前駆体である。図２を参照のこと。ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、インビボ（すなわち、組換え宿主内）、インビトロ（すなわち、酵素的に）、または全細胞生物変換により産生させることができる。本明細書で使用される場合、「産生する」及び「蓄積する」という用語は、インビボ、インビトロ、または全細胞生物変換によりステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体の合成について説明するために互換的に使用することができる。
【００６５】
組換えステビオールグリコシド産生Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８に記載される。全細胞生物変換による、かつインビトロでの、組換え宿主内でのステビオールグリコシドの産生方法は、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８にも記載されている。これらの刊行物の全ては、本明細書により、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドは、組換え宿主内のステビオールグリコシド生合成経路に関与する１つ以上の酵素の発現によりインビボで産生される。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチド（ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド）をコードする組換え遺伝子を発現するステビオール産生組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシドを産生することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）；例えば、限定されないが、テルペノイド生合成のための補因子として利用される、ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への変換中のＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０複合体への電子移動が可能なポリペプチド）；ならびにステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））；及び／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子を含む組換え宿主は、インビボでステビオールを産生することができる。例えば、図１を参照のこと。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００６８】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチドをコードする組換え遺伝子及び組換え宿主のステビオールグリコシドの生合成経路に関与する１つ以上の酵素の発現によりインビボで産生される。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化し、かつ配列番号２または１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／もしくはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２及びＥＵＧＴ１１ポリペプチド）をコードする遺伝子を含むステビオール産生組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体を産生することができる。例えば、図１及び２を参照のこと。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００６９】
一部の態様では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドは、配列番号２０（配列番号１９に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号２２（配列番号２１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２４（配列番号２３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２６（配列番号２５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２８（配列番号２７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３０（配列番号２９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３２（配列番号３１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１６（配列番号１１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７０】
一部の態様では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号３４（配列番号３３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号３６（配列番号３５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３８（配列番号３７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号４０（配列番号３９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号４２（配列番号４１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、葉緑体輸送ペプチドを欠いている。
【００７１】
一部の態様では、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号４４（配列番号４３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号４６（配列番号４５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号４８（配列番号４７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号５０（配列番号４９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号５２（配列番号５１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７２】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。一部の態様では、二機能性ポリペプチドは、配列番号５４（配列番号５３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号５６（配列番号５５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号５８（配列番号５７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７３】
一部の態様では、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号６０（配列番号５９に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号６２（配列番号６１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号６６（配列番号６５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号６８（配列番号６７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７０（配列番号６９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７２（配列番号７１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７４（配列番号７３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７６（配列番号７５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１７（配列番号６３もしくは配列番号６４に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７４】
一部の態様では、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドは、配列番号７８（配列番号７７に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号８０（配列番号７９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８２（配列番号８１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８４（配列番号８３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８６（配列番号８５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８８（配列番号８７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号９０（配列番号８９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号９２（配列番号９１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７５】
一部の態様では、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドは、配列番号９４（配列番号９３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号９７（配列番号９５もしくは配列番号９６に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１００（配列番号９８もしくは配列番号９９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６（配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１０８（配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１０（配列番号１０９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１２（配列番号１１１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１４（配列番号１１３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７６】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）（配列番号７）をコードする核酸；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）（配列番号９）をコードする核酸；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）（配列番号４）をコードする核酸；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチド）（配列番号１６）をコードする核酸；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチド）（配列番号２）をコードする核酸；ならびに／またはステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチド）（配列番号１１９）をコードする核酸を含む。一部の態様では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド）は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１１）またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号１３）とすることができる。
【００７７】
一部の態様では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号５または配列番号６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号１０、１２、１４、または１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチドは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドは、配列番号１１８に記載のヌクレオチド配列によりコードされる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子の発現が特定のステビオールグリコシドを産生するために必要であり得るが、これらの遺伝子のうちの１つ以上が宿主に内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００７８】
特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、または、ステビオールグリコシドポリペプチドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする外来核酸を含む。
【００７９】
別の特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする外来核酸を含む。
【００８０】
別の特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびに／またはＵＧＴ３３９４２ポリペプチドをコードする外来核酸を含む。
【００８１】
さらに別の特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびに／またはＵＧＴ３３７８６ポリペプチドをコードする外来核酸を含む。
【００８２】
さらに別の特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびに／またはＵＧＴ３３９４２ポリペプチド及びＵＧＴ３３７８６ポリペプチドをコードする外来核酸を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド生合成経路で見出される反応が可能な１つ以上の酵素の組換え宿主内での発現によりインビボで産生される。例えば、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの１つ以上；ならびにステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、またはステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドのうちの１つ以上を発現するステビオール産生組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体を産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８４】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）、ならびにステビオールグリコシドの生合成経路に見出される反応が可能な１つ以上の酵素をコードする組換え遺伝子の組換え宿主内での発現によりインビボで産生される。例えば、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）、ならびに、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの１つ以上、ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、またはステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドのうちの１つ以上を発現するステビオール産生組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシドを産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８５】
別の例では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組換え宿主は、インビボでステビオールを産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８６】
別の例では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）をコードする組換え遺伝子、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシドを産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８７】
別の例では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド、ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、またはステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドのうちの１つ以上を発現する組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシドを産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８８】
別の例では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）をコードする組換え遺伝子、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド、及び／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、またはステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドのうちの１つ以上を発現する組換え宿主は、インビボでステビオールグリコシドを産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８９】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、またはそれらの異性体を含む。
【００９０】
一部の態様では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドは、配列番号２０（配列番号１９に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号２２（配列番号２１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２４（配列番号２３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２６（配列番号２５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２８（配列番号２７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３０（配列番号２９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３２（配列番号３１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１６（配列番号１１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
一部の態様では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号３４（配列番号３３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号３６（配列番号３５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３８（配列番号３７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号４０（配列番号３９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号４２（配列番号４１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、葉緑体輸送ペプチドを欠いている。
【００９２】
一部の態様では、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号４４（配列番号４３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号４６（配列番号４５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号４８（配列番号４７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号５０（配列番号４９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号５２（配列番号５１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９３】
一部の態様では、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号６０（配列番号５９に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号６２（配列番号６１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号６６（配列番号６５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号６８（配列番号６７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７０（配列番号６９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７２（配列番号７１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７４（配列番号７３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７６（配列番号７５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１７（配列番号６３もしくは配列番号６４に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９４】
一部の態様では、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドは、配列番号７８（配列番号７７に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号８０（配列番号７９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８２（配列番号８１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８４（配列番号８３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８６（配列番号８５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８８（配列番号８７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号９０（配列番号８９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号９２（配列番号９１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９５】
一部の態様では、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドは、配列番号９４（配列番号９３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号９７（配列番号９５もしくは配列番号９６に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１００（配列番号９８もしくは配列番号９９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６（配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１０８（配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１０（配列番号１０９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１２（配列番号１１１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１４（配列番号１１３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９６】
一部の態様では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドは、配列番号５４、配列番号５６、または配列番号５８に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９７】
一部の態様では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号７（配列番号５または配列番号６に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の態様では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号９（配列番号８に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載の配列を有するポリペプチドを含む。一部の態様では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号１１９（配列番号１、配列番号３、または配列番号１１８に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載の配列を有するポリペプチドを含む。一部の態様では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１１、または配列番号１３（配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドは、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドは、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそれらのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドである。一部の実施形態では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドは、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチド、またはＵＧＴ３３７８６ポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅもしくはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂなどのＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド、またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドである。
【００９９】
特定の実施形態では、ステビオールグリコシドは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭである。ＲｅｂＡは、例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ｉｉ）ＵＧＴ３３９４２、及び／またはｉｉｉ）ＵＧＴ３３７８６を発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができる。ＲｅｂＢは、例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができる。ＲｅｂＤは、例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ｉｉ）ＵＧＴ３３９４２、及び／またはｉｉｉ）ＵＧＴ３３７８６を発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができる。ＲｅｂＭは、例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ｉｉ）ＵＧ��３３９４２、及び／またはｉｉｉ）ＵＧＴ３３７８６（図２を参照のこと）を発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができる。
【０１００】
特定の実施形態では、ステビオールグリコシドは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭである。ＲｅｂＡは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ｉｉ）ＵＧＴ３３９４２、及び／またはｉｉｉ）ＵＧＴ３３７８６を発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができ；ＲｅｂＢは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドを発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができ；ＲｅｂＤは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ｉｉ）ＵＧＴ３３９４２、及び／またはｉｉｉ）ＵＧＴ３３７８６を発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができ；ＲｅｂＭは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グ���コースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ｉｉ）ＵＧＴ３３９４２、及び／またはｉｉｉ）ＵＧＴ３３７８６を発現するステビオール産生組換え微生物内で合成することができ；ステビオール産生宿主は、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ））；及びステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））；ならびに／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子のうちの１つ以上、ならびにＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体をインビボで産生することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチド（配列番号１、配列番号２）をコードする遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ステビオールを１９−ＳＭＧに変換する。ＵＧＴ３３９４２は、ＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと高い構造類似性を有するＵＧＴポリペプチドであり、ステビオール及びステビオールグリコシドの１９−Ｏ位のグリコシル化を触媒する。例１及び図３を参照のこと。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３９４２は、ｉ）ステビオール−１，２−ビオシドからステビオシドへの変換、ｉｉ）ステビオール−１，３−ビオシドから１，３−ステビオシドへの変換、ｉｉｉ）１３−ＳＭＧからルブソシドへの変換、及び／またはｉｖ）ＲｅｂＢからＲｅｂＡへの変換を触媒する。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチド（配列番号１１８、配列番号１１９）をコードする遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ステビオールを１９−ＳＭＧに変換する。ＵＧＴ３３７８６は、ＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと高い構造類似性を有するＵＧＴポリペプチドであり、ステビオール及びステビオールグリコシドの１９−Ｏ位のグリコシル化を触媒する。例２及び図４を参照のこと。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３７８６は、ｉ）ステビオール−１，２−ビオシドからステビオシドへの変換、ｉｉ）ステビオール−１，３−ビオシドから１，３−ステビオシドへの変換、ｉｉｉ）１３−ＳＭＧからルブソシドへの変換、及び／またはｉｖ）ＲｅｂＢからＲｅｂＡへの変換を触媒する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド前駆体を、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素と接触させることにより、インビトロで産生される。例えば、ステビオールをＵＧＴポリペプチドと接触させると、ステビオールグリコシドのインビトロでの産生がもたらされる可能性がある。一部の実施形態では、ステビオールグリコシド前駆体は、上流のステビオールグリコシド前駆体を、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素と接触させることによりインビトロで産生される。例えば、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドと、ｅｎｔ−カウレン酸を接触させると、インビトロでのステビオールの産生がもたらされる可能性がある。
【０１０４】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドと、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体を接触させることによりインビトロで産生される。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドと、ステビオールを接触させると、インビトロでのステビオールグリコシドの産生がもたらされる可能性がある。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドは、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、産生されるステビオールグリコシドは、１９−ＳＭＧである。一部の実施形態では、１９−ＳＭＧ、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰ−キシロース、ならびに／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに／あるいは反応緩衝液及び／または塩を含む反応混合物中で、接触が生じる。
【０１０５】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、全細胞生物変換により産生される。全細胞生物変換が起こるためには、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞は、細胞内でステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を取り込んで修飾し；インビボでの修飾後に、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、細胞内に残り、かつ／または細胞培地に排出される。例えば、ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組換え宿主細胞は、細胞内にステビオールを取り込み、ステビオールをグリコシル化することができ；インビボでのグリコシル化後に、ステビオールグリコシドは、細胞培地に排出される可能性がある。一部の実施形態では、細胞は、修飾されるべき基質を取り込むために、または修飾された産物を排出するために透過処理される。別の例では、ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組換え宿主細胞は、細胞内にステビオールを取り込み、ステビオールをグリコシル化することができ；インビボでのグリコシル化後に、ステビオールグリコシドは、細胞培地に排出される可能性がある。次に、透過処理された組換え宿主細胞は、細胞培地に添加して、排出されたステビオールグリコシドをさらに修飾し、さらなる修飾産物を排出することができる。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチドは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；及び／またはｉｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）とすることができる。
【０１０７】
別の例では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ））；及びステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））；ならびに／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子のうちの１つ以上を発現するステビオール産生組換え宿主は、細胞内でステビオールを産生することができ；インビボでの産生後に、ステビオールは、細胞培地に排出される可能性がある。次に、インビボでステビオールまたはステビオールグリコシドをグリコシル化することが可能なＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する透過処理された組換え宿主細胞は、修飾されるべき排出されたステビオールを取り込むために、かつ修飾された産物を排出するために、細胞培地に添加することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチドは、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド；及び／またはｉｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）とすることができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、組換え宿主のステビオールグリコシド生合成経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞内での全細胞生物変換により産生される。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現する宿主細胞は、インビボでステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体を修飾することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、アンカーモチーフと融合させることにより、本明細書に開示の組換え宿主細胞の表面上に提示することができる。提示されるべきステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド−パッセンジャータンパク質は、Ｎ末端融合、Ｃ末端融合、またはサンドイッチ融合によりアンカーモチーフ−担体タンパク質に融合させることができる。このような細胞表面提示は、全細胞生物変換によるステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体の産生に使用することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドは、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、組換え宿主のステビオールグリコシド生合成経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞内での全細胞生物変換により産生される。例えば、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ））；及びステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））；ならびに／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子、及びＵＧＴをコードする遺伝子のうちの１つ以上を発現するステビオール産生組換え宿主は、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体をインビボで修飾することができる。例えば、図１及び２を参照のこと。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内在性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【０１１３】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）ならびに組換え宿主のステビオールグリコシド生合成経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞内での全細胞生物変換により産生される。例えば、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと構造的に類似するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ポリペプチド（例えば、ＵＧＴ３３９４２及びＵＧＴ３３７８６）、ならびに、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ））；及びステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））；ならびに／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子のうちの１つ以上、ならびにＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現するステビオール産生組換え宿主は、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体をインビボで修飾することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、またはそれらの異性体を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、ステビオール、１つ以上のステビオールグリコシド前駆体、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドは、２つ以上の宿主の共培養により産生される。一部の実施形態では、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素をそれぞれ発現する１つ以上の宿主は、ステビオール、１つ以上のステビオールグリコシド前駆体、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドを産生する。例えば、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチド、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド、ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチド、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド、ならびに／またはシトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドを含む宿主、ならびに１つ以上のＵＧＴを含む宿主は、１つ以上のステビオールグリコシドを産生する。
【０１１６】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、またはそれらの異性体を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、インビボで、インビトロで、または全細胞生物変換により産生されるステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物は、とりわけ、ステビア植物由来のステビア抽出物よりも低減した量または低減したレベルの植物由来構成成分を含まず、または含む。植物由来構成成分は、オフフレーバーの原因となる可能性があり、顔料、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパツレノール、及び他のセスキテルペン、ラブダンジテルペン、モノテルペン、デカン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、２−メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β−シトステロール、α−アミリン及びβ−アミリン、ルペオール、β−アミリンアセテート、五環性トリテルペン、センタレジン、ケルシチン、ｅｐｉ−αカジノール、カロフィレン（ｃａｒｏｐｈｙｌｌｅｎｅｓ）及び誘導体、β−ピネン、β−シトステロール、ならびにジベレリンを含む。一部の実施形態では、本明細書で言及される植物由来構成成分は、非グリコシド化合物である。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」、及び「測定可能な濃度」という用語は、ＡＵＣ、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭ、またはｍＭで測定されたステビオールグリコシドのレベルを指す。ステビオールグリコシド産生（すなわち、総量、上清、及び／または細胞内ステビオールグリコシドレベル）は、例えば、限定されないが、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外可視分光法／分光測光法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析法（ＭＳ）、及び核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）を含む、当業者に一般に利用可能な技術により検出及び／または分析することができる。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「検出不能な濃度」という用語は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術により測定及び／または分析するには低すぎる化合物のレベルを指す。一部の実施形態では、「検出不能な濃度」の化合物は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物中に存在しない。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「または」及び「及び／または」という用語は、複数の構成要素を組み合わせてまたは互いに排他的に記載するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、及び／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、及びｚ」、「（ｘ及びｙ）またはｚ」、「ｘまたは（Ｙ及びＺ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指す可能性がある。一部の実施形態では、「及び／または」は、組換え細胞が含む外来核酸を指すために使用され、組換え細胞は、群から選択される１つ以上の外来核酸を含む。一部の実施形態では、「及び／または」は、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体の産生を指すために使用される。一部の実施形態では、「及び／または」は、１つ以上のステビオールグリコシドが産生される、ステビオールグリコシドの産生を指すために使用される。一部の実施形態では、「及び／または」は、１つ以上のステビオールグリコシドが次のステップ：組換え微生物を培養すること、組換え微生物内で１つ以上のステビオールグリコシドを合成すること、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドを単離すること、のうちの１つ以上により産生される、ステビオールグリコシドの産生を指すために使用される。
【０１２１】
機能的ホモログ
上記ポリペプチドの機能的ホモログは、組換え宿主内でのステビオールグリコシドの産生における使用にも適する。機能的ホモログは、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、かつ参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（複数可）のうちの１つ以上を行うポリペプチドである。機能的ホモログ及び参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドとすることができ、配列類似性は、収斂または分岐進化事象に起因する可能性がある。そのようなものであるから、機能的ホモログは、ホモログ、またはオルソログ、またはパラログとして文献に示される場合がある。天然に存在する機能的ホモログの多様体、例えば、野生型コード配列の変異体によりコードされるポリペプチドは、それ自体機能的ホモログとすることができる。機能的ホモログはまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入により、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列由来のドメインを組み合わせること（「ドメイン交換」）により作製することができる。本明細書に記載の機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は、既知であり、とりわけ、指向性進化技術、部位特異的変異導入技術、及びランダム変異導入技術を含み、ポリペプチドの比活性を増加させるのに有用であり、基質特異性を変更し、発現レベルを変更し、細胞内の場所を変更し、または所望の仕方でポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変することができる。このような修飾されたポリペプチドは、機能的ホモログと考えられる。「機能的ホモログ」という用語は、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される場合がある。
【０１２２】
機能的ホモログは、ヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントの分析により同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対するクエリーを実行することにより、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列分析は、参照配列としてＵＧＴアミノ酸配列を使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ、相互ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を含むことができる。一部の場合では、アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有するデータベース中のポリペプチドは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適合性のさらなる評価に対する候補である。アミノ酸配列類似性は、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換または１つの極性残基の別の疎水性残基への置換などの保存的アミノ酸置換を可能にする。必要に応じて、このような候補の手動調査は、さらに評価されるべき候補の数を減らすために実行することができる。手動調査は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドに存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメイン、を有すると思われる候補を選択することにより実施することができる。一部の実施形態では、核酸及びポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ分析を使用する代わりに、発現レベルに基づいてトランスクリプトームデータから同定される。
【０１２３】
保存領域は、反復配列であるか、一部の２次構造（例えば、ヘリックス及びβシート）を形成するか、正もしくは負に荷電したドメインを確立するか、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表すステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの１次アミノ酸配列内に領域を配置させることにより同定することができる。例えば、ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／及びｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／のワールドワイドウェブ上の様々のタンパク質モチーフ及びドメインに対するコンセンサス配列について記載するＰｆａｍウェブサイトを参照のこと。Ｐｆａｍデータベースに含まれる情報は、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：３２０−３２２（１９９８）；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８：４０５−４２０（１９９７）；及びＢａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：２６０−２６２（１９９９）に記載される。保存領域はまた、密接に関連する種からの同じまたは関連するポリペプチドの配列をアラインすることにより決定することができる。密接に関連する種は、好ましくは、同じファミリーのものである。一部の実施形態では、２つの異なる種に由来する配列のアラインメントは、このようなホモログを同定するのに適切である。
【０１２４】
通常、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するために有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。一部の実施形態では、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１２５】
例えば、組換え宿主内でステビオールを産生するのに適するポリペプチドは、ＵＧＴの機能的ホモログを含む。
【０１２６】
例えば、ＵＧＴの基質特異性を改変する方法は、当業者らに既知であり、部位特異的／合理的変異導入アプローチ、ランダム指向性進化アプローチ、及びランダム変異導入／飽和技術が酵素の活性部位付近で実施される組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｏｓｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０：３２５−３４７を参照のこと。
【０１２７】
候補配列は通常は、参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは通常、参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、もしくは１２０％、または間の任意の範囲である長さを有する。次のように、参照核酸またはポリペプチドに対する任意の候補核酸またはポリペプチドの％同一性は、次の通り決定することができる。参照配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列またはアミノ酸配列）は、コンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメーター）を使用して、１つ以上の候補配列にアラインされ、これは、核酸配列またはポリペプチド配列をそれらの全長にわたって実施させる（グローバルアラインメント）。Ｃｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３４９７−５００。
【０１２８】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、参照及び１つ以上の候補配列間の最良の一致を計算し、同一性、類似性、及び相違性を決定することができるようにそれらをアラインする。１つ以上の残基のギャップは、配列アラインメントを最大化するために、参照配列、候補配列、またはその双方に挿入することができる。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、次のデフォルトパラメーター：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；採点方法：％年齢；上対角線の数：４；及びギャップペナルティー：５が使用される。核酸配列の複数のアラインメントのために、次のパラメーター：ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルティー：５．０；及び重み移動：有り、が使用される。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントでは、次のパラメーター：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；得点方法：％年齢；上対角線の数：５；ギャップペナルティー：３が使用される。タンパク質配列のマルチプルアラインメントでは、次のパラメーター：質量マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルティー：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；残基特異的なギャップペナルティー：オンが使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷ出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ワールドワイドウェブ上のＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒサイト（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）及びＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサイト（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）で実行することができる。
【０１２９】
参照配列に対する候補核酸またはアミノ酸配列の％同一性を決定するために、配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してアラインされ、アラインメントでの完全一致の数を参照配列の長さで除し、結果に１００を掛ける。％同一性値は、少数第２位で四捨五入することができることに注意する。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４は、７８．１に切り下げられる一方、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９は、７８．２に切り上げられる。
【０１３０】
機能的ＵＧＴタンパク質（例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド）は、酵素により実施される酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含むことができることが理解されるであろう。一部の実施形態では、ＵＧＴタンパク質は、融合タンパク質である。「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「融合構築物」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」、「キメラ構築物」、及び「キメラ酵素」という用語は、本明細書では、異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の連結により操作されるタンパク質を指すために使用することができる。一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチド（例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド）をコードする核酸配列は、その後のコードされたポリペプチドを操作（例えば、精製または検出を容易にするように）、分泌、または局在化を促進するように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コード配列がポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置するように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入することができる。コードされたタグの非限定例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、及びＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）を含む。タグの他の例としては、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグが挙げられる。
【０１３１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ドメインスワッピングにより変更されたタンパク質である。本明細書で使用される場合、「ドメインスワッピング」という用語は、第１のタンパク質のドメインを第２のタンパク質のドメインと置換するプロセスについて記載するために使用される。一部の実施形態では、第１のタンパク質のドメイン及び第２のタンパク質のドメインは、機能的に同一または機能的に類似している。一部の実施形態では、第２のタンパク質のドメインの構造及び／または配列は、第１のタンパク質のドメインの構造及び／または配列とは異なる。一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチド（例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド）は、ドメインスワッピングにより変更される。
【０１３２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、後に他の場所で開かれることになるタンパク質の末端の共有結合に存在する円順列により変更されたタンパク質である。従って、配列の順序は、タンパク質のアミノ酸の変化を引き起こすことなく変更される。一部の実施形態では、標的化円順列は、例えば、限定されないが、元のタンパク質の末端を連結するスペーサーを設計することにより、生成させることができる。スペーサーが規定されていると、一般に受け入れられている分子生物学技術により、例えば、限定されないが、ＰＣＲを用いるコンカテマーを産生することにより、かつ続くコンカテマー内の具体的な順列の増幅により、または異なる順序で連結するように交換するタンパク質の別個のフラグメントを増幅することにより、順列を生成するいくつかの可能性がある。順列を生成するステップに、フラグメント末端を結合させ、かつランダムに切断することにより環状遺伝子を作製し、それにより、順列の集合を独特の構築物から形成することが続く可能性がある。一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチド（例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチド）は、円順列により変更される。
【０１３３】
一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチドである。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３９４２ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＵＧＴ３３７８６ポリペプチドは、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
ステビオール及びステビオールグリコシド生合成核酸
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに適する１つ以上の制御領域にセンス方向で作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物が複数の遺伝子産物をポリシストロン性ｍＲＮＡから発現することが可能であるので、必要に応じて、それらの微生物に対する単一の制御領域のコントロール下で、複数のポリペプチドを発現させることができる。制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように、制御領域及びコード配列が配置される時、コード配列及び制御領域は、作動可能に連結されていると考えられる。通常、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、モノシストロン性遺伝子の制御領域の１〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。
【０１３５】
多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、組換え宿主以外の種、すなわち、異種核酸である。従って、組換え宿主が微生物である時、コード配列は、他の原核もしくは真核微生物由来、植物由来、または動物由来である可能性がある。しかし、一部の場合では、コード配列は、宿主に対してネイティブであり、かつその生体に再導入されている配列である。天然配列は多くの場合、外来核酸と連結される非天然配列、例えば、組換え核酸構築物の天然配列にフランキングする非天然制御配列の存在により、天然に存在する配列と区別することができる。加えて、安定して形質転換された外来核酸は通常、天然配列が見出される位置以外の位置に組み込まれる。「制御領域」は、転写または翻訳産物の転写または翻訳開始及び速度、ならびに安定性及び／または移動度に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を指す。制御領域は、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５′及び３′非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。制御領域は通常、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。制御領域は、エンハンサー配列、上流エレメント、または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの制御エレメントも含み得る。制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように制御領域及びコード配列を配置することにより、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列及びプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は通常、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド上流に位置する。しかし、制御領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流に、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に位置する可能性がある。
【０１３６】
含まれるべき制御領域の選択は、限定されないが、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、及び特定の培養期中の優先的発現を含むいくつかの因子に依存する。コード配列に対する制御領域を適切に選択及び配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者には日常的な事項である。複数の制御領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、及び誘導性エレメントが、存在し得ることが理解されるであろう。
【０１３７】
１つ以上の遺伝子は、別個の態様のステビオール及び／またはステビオールグリコシド産生に有用な「モジュール」の組換え核酸構築物内で組み合わせることができる。モジュール、特に、ポリシストロン性モジュール内で複数の遺伝子を組み合わせると、様々な種においてモジュールの使用が促進される。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスターまたはＵＧＴ遺伝子クラスターは、好適な制御領域の挿入後に、モジュールが多種多様な種に導入することができるように、ポリシストロン性モジュール内で組み合わせることができる。別の例として、ＵＧＴ遺伝子クラスターは、ＵＧＴモジュールを形成するために、各ＵＧＴコード配列が別々の制御領域に作動可能に連結されるように組み合わせることができる。このようなモジュールは、モノシストロン性発現が必要または望ましいそれらの種に使用することができる。ステビオールまたはステビオールグリコシド産生に有用である遺伝子に加えて、組換え構築物は通常、複製起点、及び適切な種において構築物を維持するための１つ以上の選択マーカーも含有する。
【０１３８】
遺伝コードの縮重のために、多くの核酸が特定のポリペプチドをコードすることができること；すなわち、多くのアミノ酸の場合、アミノ酸のコドンとして機能する複数のヌクレオチドトリプレットが存在することが理解されるであろう。従って、所与のポリペプチドのコード配列中のコドンは、その宿主（例えば、微生物）のための適切なコドンバイアス表を使用して、特定の宿主内での最適な発現が得られるように改変することができる。単離された核酸として、これらの改変配列は、精製された分子として存在することができ、組換え核酸構築物のためのモジュールの構築に使用されるベクターまたはウイルスに組み込むことができる。
【０１３９】
一部の場合では、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に転用するために、内在性ポリペプチドの１つ以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシド産生をさらに増加させるために、例えば、スクワレンエポキシダーゼを下方制御することにより、酵母株のステロールの合成を下方制御することが望ましいことがある。別の例として、特定の内在性遺伝子産物、例えば、本明細書で検討されるような、グルコース部分を２次代謝産物またはホスファターゼから除去するグリコヒドロラーゼ、の分解機能を阻害することが望ましいことがある。このような場合では、ポリペプチドまたは遺伝子産物を過剰発現する核酸は、株に形質転換される組換え構築物に含まれ得る。あるいは、変異導入は、機能を増加させるかまたは増強することが望ましい遺伝子に変異体を生じさせるために使用することができる。
【０１４０】
宿主微生物
組換え宿主は、哺乳類、昆虫、植物、及び藻類細胞を含むステビオールグリコシドを産生するためのポリペプチドを発現するために使用することができる。多数の原核生物及び真核生物もまた、本明細書に記載の組換え微生物、例えば、グラム陰性菌、酵母、及び真菌の構築における使用に適する。ステビオールグリコシド産生株として使用するために選択された種及び株は、どの産生遺伝子が株に対して内在性であるか、かつどの遺伝子が存在しないかを決定するために最初に分析される。内在性対応物が株に存在しない遺伝子は、１つ以上の組換え構築物に有利に組み立てられ、次に、これは、欠損機能（複数可）を補うために株に形質転換される。
【０１４１】
通常、組換え微生物は、温度（複数可）で一定期間、発酵槽中で成長し、温度及び期間は、ステビオールグリコシドの産生を促進する。本発明により提供される構築及び遺伝子操作された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、流加培養、取り出し及び充填などの半連続発酵、連続灌流発酵、ならびに連続灌流細胞培養を含む通常の発酵プロセスを使用して培養することができる。方法で使用される特定の微生物に応じて、イソペンテニル生合成遺伝子ならびにテルペンシンターゼ及びシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子も存在及び発現し得る。基質及び中間体、例えば、イソペンテニルジホスファート、ジメチルアリルジホスファート、ＧＧＰＰ、ｅｎｔ−カウレン、及びｅｎｔ−カウレン酸、のレベルは、公表された方法従って分析のために、試料を培地から抽出することにより決定することができる。
【０１４２】
本方法で使用される炭素源は、ステビオールグリコシドの成長及び／または産生を促進するために組換え宿主細胞により代謝される可能性がある任意の分子を含む。好適な炭素源の例としては、スクロース（例えば、糖蜜に見出されるような）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオース、または他のグルコース含有ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。酵母を宿主として用いる実施形態では、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、及びグルコースなどの炭素源が適する。炭素源は、培養期間を通じて宿主生体に提供することができ、または代わりに、生体は、別のエネルギー源、例えば、タンパク質、の存在下で一定期間成長させ、次に、流加段階中のみに、炭素源と共に提供することができる。
【０１４３】
温度及び期間がステビオールグリコシドの産生を促進する期間で培養中に組換え微生物が成長した後に、次に、ステビオール及び／または１つ以上のステビオールグリコシドは、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して培養物から回収することができる。一部の実施形態では、透過処理剤は、原材料が宿主に入るのを助け、かつ産物が出るのを助けることができる。例えば、培養された微生物の粗溶解物は、上清を得るために遠心分離することができる。次に、得られる上清は、クロマトグラフィーカラム、例えば、Ｃ−１８カラムに添加し、親水性化合物を除去するために水で洗浄し、続いて、目的の化合物（複数可）を、メタノールなどの溶媒で溶出させることができる。次に、化合物（複数可）は、分取ＨＰＬＣによりさらに精製することができる。ＷＯ２００９／１４０３９４も参照のこと。
【０１４４】
本明細書で検討される種々の遺伝子及びモジュールは、単一の宿主ではなく２つ以上の組換え宿主に存在することができることが理解されるであろう。複数の組換え宿主が使用される場合、それらは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドを蓄積するために混合培養で成長させることができる。
【０１４５】
あるいは、２つ以上の宿主はそれぞれ、別々の培地で成長させることができ、第１の培地の産物、例えば、ステビオールは、その後の中間体に、または、例えば、ＲｅｂＡなどの最終産物に変換されるために、第２の培地に導入することができる。次に、第２の、または最終の宿主により産生される産物が回収される。一部の実施形態では、組換え宿主は、培地以外の栄養源を使用し、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長することも理解されるであろう。
【０１４６】
例示的な原核生物種及び真核生物種は、以下により詳細に記載される。しかし、他の種が、好適である可能性があることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａなどの属のものとすることができる。このような属の例示的な種としては、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｔｉｇｒｉｎｕｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【０１４７】
本明細書に別途記載されるような組換え宿主の一部の実施形態では、微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂａｃｔｅｒｉａ細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ細胞；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ細胞；Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ細胞；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ細胞；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ細胞；またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞などの原核生物とすることができる。
【０１４８】
本明細書に別途記載されるような組換え宿主の一部の実施形態では、微生物は、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅとすることができる。
【０１４９】
本明細書に別途記載されるような組換え宿主の一部の実施形態では、微生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ種などの藻類細胞とすることができる。
【０１５０】
本明細書に別途記載されるような組換え宿主の一部の実施形態では、微生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓなどのシアノバクテリア細胞とすることができる。
【０１５１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、合成生物学で広く使用されるシャーシ生体であり、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。例えば、変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで利用可能な他の情報のライブラリーがあり、種々のモジュールの合理的設計が産物収率を向上させることを可能にする。組換え微生物を作製するための方法が知られている。
【０１５２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．
Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｓｏｊａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種は、食品製造に広く使用される微生物であり、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することもできる。ヌクレオチド配列は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｔｅｒｒｅｕｓのゲノムに利用可能であり、合理的設計及び内在性経路の改変が、フラックスを高め、かつ産物収率を増加させることを可能にする。代謝モデルは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓならびに転写学研究及びプロテオミクス研究のために開発されている。Ａ．ｎｉｇｅｒは、クエン酸及びグルコン酸などの多数の食品成分の工業生産のために培養され、それにより、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの種は一般に、ステビオールグリコシドを産生するのに適する。
【０１５３】
Ｅ．ｃｏｌｉ
合成生物学で広く使用される別のプラットフォーム生体であるＥ．ｃｏｌｉは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することもできる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと同様に、変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、及びＥ．ｃｏｌｉで利用可能な他の情報のライブラリーがあり、種々のモジュールを合理的設計が産物収率を向上させることを可能にする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓについて上記のものと類似した方法は、組換えＥ．ｃｏｌｉ微生物を作製するために使用することができる。
【０１５４】
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．は、培養中に大量のイソプレノイドを産生することが知られているので、有用である可能性がある。従って、大量のステビオールグリコシドを産生するためのテルペン前駆体は既に、内在性遺伝子により産生されている。従って、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組換え遺伝子を含むモジュールは、メバロナートまたはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要がなく、このような属に由来する種に導入することができる。従って、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．は、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１５５】
Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）
Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓは、二形性酵母であり、（それは、パン酵母のような出芽酵母として４２℃の温度まで成長し、この閾値を超えて、糸状形態で成長する）珍しい生化学的特徴を有する。それは、幅広い基質上で成長することができ、ニトラートを吸収することができる。それは、天然プラスチックを産生することができる株の生成、または環境試料中のエストロゲンに対するバイオセンサーの開発に効率よく適用されている。従って、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１５６】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、二形性酵母（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓを参照のこと）であり、Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓファミリーに属する。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの全ゲノムは、既知である。Ｙａｒｒｏｗｉａ種は、好気性であり、非病原性であると考えられる。Ｙａｒｒｏｗｉａは、疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用する際に有効であり、糖上で成長することができる。それは、工業用途のための高い可能性を有しており、油性微生物である。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｐｔｉｃａは、その乾燥細胞重量の約４０％の脂質含有量を蓄積することができ、脂質蓄積及び再流動化のためのモデル生体である。例えば、Ｎｉｃａｕｄ，２０１２，Ｙｅａｓｔ  ２９（１０）：４０９−１８；Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ９１（６）：６９２−６；Ｂａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８４（５）：８４７−６５を参照のこと。従って、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１５７】
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａは、単細胞性の着色酵母である。油性赤酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓは、脂質及びカロテノイドを粗製グリセロールから産生することが示されている（Ｓａｅｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（１）：２１０−８）。Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ株は、改良されたバイオマス及び脂質産生能のための効率的な流加発酵システムであることが示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４１：３１２−７）。従って、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１５８】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓは、油性酵母であり、脂質産生経路遺伝子操作によって作り変えるのに有用である（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ．３：１１１２；Ａｇｅｉｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９０（４）：１２１９−２７を参照のこと）。従って、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１５９】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉは、メチロトローフ酵母である（メタノール上で成長することができる）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの他のメチロトローフ種と同様に、それは、異種タンパク質を産生するための優れたプラットフォームを提供する。マルチグラム範囲の収率の分泌された外来タンパク質が報告されている。計算方法ＩＰＲＯにより、最近、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉキシロースレダクターゼの補因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨに実験的に切り替えた変異が予測された。例えば、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８２４：３２９−５８；Ｋｈｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１８（１０）：２１２５−３８を参照のこと。従って、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１６０】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、メチロトローフ酵母である（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉを参照のこと）。それは、幅広い他の基材上でさらに成長することができ；それは、耐熱性であり、ニトラートを資化することができる（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓも参照のこと）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、及びＣ型肝炎の処置のためインターフェロンα−２ａを産生することに適用されており、さらに、幅広い技術的酵素に適用されている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｖｉｒｏｌ  Ｓｉｎ．２９（６）：４０３−９を参照のこと。従って、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１６１】
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓは、ケフィアの製造に通常適用される酵母である。それは、いくつかの糖類で成長することができ、最も重要なことには、ミルク及び乳清に存在するラクトースで成長することができる。それは、とりわけ、チーズを製造するためのキモシン（通常は子ウシの胃に存在する酵素）を産生するために効率よく適用されている。産生は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。例えば、Ｏｏｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．６（３）：３８１−９２を参照のこと。従って、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１６２】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチロトローフ酵母である（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを参照のこと）。それは、外来タンパク質を産生するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素は、キットとして入手可能であり、それは、タンパク質を産生するために学界で世界的に使用される。複雑なヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは、類似しているがヒトに見られるものと同一ではない）を産生することができる株が操作されている。例えば、Ｐｉｉｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（６）：５３２−７を参照のこと。従って、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１６３】
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｍｏｓｓｅｓは、浮遊培養で成長させた時、酵母または他の真菌培養と類似の特徴を有する。この属は、植物の２次代謝産物を産生するために使用することができ、これは、他のタイプの細胞では産生することが困難である可能性がある。従って、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｍｏｓｓｅｓは、本明細書に別途記載されるように、組換え宿主の組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。
【０１６４】
ステビオールグリコシド組成物
ステビオールグリコシドは、必ずしも異なる食品システムにおいて同等の性能を有するとは限らない。それ故、選択すべきステビオールグリコシド組成物に合成を向ける能力を有することが望ましい。本明細書に記載の組換え宿主は、具体的なステビオールグリコシド（例えば、１９−ＳＭＧ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）について選択的に富化され、かつ一貫した味覚プロファイルを有する組成物を産生することができる。本明細書で使用される場合、「富化された」という用語は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物（抽出物）と比較して、特定のステビオールグリコシドの割合が増加したステビオールグリコシド組成物について記載するために使用される。従って、本明細書に記載の組換え宿主は、所与の食品に望ましいスイートニングプロファイルを満たすように調整され、かつ各ステビオールグリコシドの割合がバッチ間で均一である組成物の産生を促進することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の宿主は、ステビア抽出物に見出される望ましくない植物由来構成成分を産生しない、または、それを低減した量産生する。従って、本明細書に記載の組換え宿主により産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物由来の組成物と区別される。
【０１６５】
蓄積される個々のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の量は、約１〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、もしくは約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌとすることができる。一部の態様では、個々のステビオールグリコシドの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超えることができる。蓄積されたステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の組み合わせの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２００〜約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌとすることができる。一部の態様では、ステビオールグリコシドの組み合わせの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超えることができる。一般に、より長い培養時間は、より多くの量の産物をもたらすであろう。従って、組換え微生物は、１日間〜７日間、１日間〜５日間、３日間〜５日間、約３日間、約４日間、または約５日間培養することができる。
【０１６６】
本明細書で検討される種々の遺伝子及びモジュールは、単一の微生物ではなく２つ以上の組換え微生物に存在することができると理解されるであろう。複数の組換え微生物が使用される時、それらは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドを産生するために、混合培養で成長させることができる。例えば、第１の微生物は、ステビオールグリコシド前駆体を産生するための１つ以上の生合成遺伝子を含むことができる一方、第２の微生物は、ステビオールグリコシド生合成遺伝子を含む。次に、第２の、または最終の微生物により産生された産物が回収される。一部の実施形態では、組換え微生物は、培地以外の栄養源を使用し、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長することも理解されるであろう。
【０１６７】
あるいは、２つ以上の微生物はそれぞれ、別々の培地で成長させることができ、第１の培地の産物、例えば、ステビオールは、その後の中間体に、または、ＲｅｂＡなどの最終産物に変換されるために、第２の培地に導入することができる。次に、第２の、または最終の微生物により産生された産物が回収される。一部の実施形態では、組換え微生物は、培地以外の栄養源を使用し、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長することも理解されるであろう。
【０１６８】
本明細書に開示の方法により得られるステビオールグリコシド及び組成物は、食品、栄養補助食品、及び甘味料組成物の作製に使用することができる。例えば、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８を参照のこと。これらの刊行物は、本明細書により、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
例えば、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシド、例えば、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤは、食品、例えば、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、焼き菓子、チューインガム、ハードキャンディー及びソフトキャンディー、ならびにソース、に含まれる可能性がある。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、非食品、例えば、医薬製品、医薬品、栄養補助食品、及び栄養剤にも含まれる可能性がある。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、農業及びコンパニオンアニマル業界の双方のための動物飼料製品にも含まれ得る。あるいは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドの混合物は、組換え微生物を別々に培養すること、具体的なステビオールまたはステビオールグリコシドをそれぞれ産生すること、ステビオールまたはステビオールグリコシドを各微生物から実質的に純粋な形態で回収すること、次に、所望の割合で各化合物を含む混合物を得るために、化合物を組み合わせることにより作製することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、現在のステビア製品と比較してより正確で一貫した混合物が得られることを可能にする。
【０１７０】
別の代替案では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、他の甘味料、例えば、サッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムと共に食品中に組み込むことができる。ステビオールまたはステビオールグリコシドの、他の甘味料に対する重量比は、最終食品で満足な味を達成するために、要望通りに変動させることができる。例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０１２８３１１を参照のこと。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、風味調節剤として、風味（例えば、柑橘類）と共に提供されてもよい。
【０１７１】
本明細書に記載の組換え微生物により産生される組成物は、食品に組み込むことができる。例えば、組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシド及び食品のタイプに応じて、乾燥重量基準で約２０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品〜約１８００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品の範囲の量で食品に組み込むことができる。例えば、組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大５００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、デザート、冷菓子（例えば、アイスクリーム）、乳製品（例えば、ヨーグルト）、または飲料（例えば、炭酸飲料）に組み込むことができる。組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大３００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、焼き菓子（例えば、ビスケット）に組み込むことができる。組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ソース（例えば、チョコレートシロップ）または野菜製品（例えば、ピクルス）に組み込むことができる。組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１６０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、パンに組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１６００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ハードキャンディーまたはソフトキャンディーに組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、加工フルーツ製品（例えば、フルーツジュース、フルーツ充填物、ジャム、及びゼリー）に組み込むことができる。一部の実施形態では、本明細書で産生されるステビオールグリコシド組成物は、医薬組成物の構成成分である。例えば、Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ６９ｔｈ  ＪＥＣＦＡ，２００７，ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｗａｌｌｉｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．Ｏｒｇ．；ＥＦＳＡ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｄｄｅｄ  ｔｏ  Ｆｏｏｄ  （ＡＮＳ），“Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｕｓｅｓ  ａｓ  ａ  ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ，”  ２０１０，ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８（４）：１５３７；Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ  ３２３；Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ  ３２９；ＷＯ  ２０１１／０３７９５９；ＷＯ  ２０１０／１４６４６３；ＷＯ  ２０１１／０４６４２３；及びＷＯ２０１１／０５６��３４を参照のこと。
【０１７２】
例えば、このようなステビオールグリコシド組成物は、９０〜９９重量％のＲｅｂＡ及び植物由来のステビア抽出物と比較して検出不可能な量のステビア植物由来構成成分を有し、乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇで食品に組み込むことができる。
【０１７３】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＢを有する、ＲｅｂＢが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＢの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品に組み込むことができる。通常、ＲｅｂＢが富化された組成物は、植物由来のステビア抽出物と比較して検出不能な量のステビア植物由来の構成成分を有する。
【０１７４】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＤを有する、ＲｅｂＤが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＤの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品に組み込むことができる。通常、ＲｅｂＤが富化された組成物は、植物由来のステビア抽出物と比較して検出不能な量のステビア植物由来の構成成分を有する。
【０１７５】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＥを有する、ＲｅｂＥが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＥの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品に組み込むことができる。通常、ＲｅｂＥが富化された組成物は、植物由来のステビア抽出物と比較して検出不能な量のステビア植物由来の構成成分を有する。
【０１７６】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＭを有する、ＲｅｂＭが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＭの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品に組み込むことができる。通常、ＲｅｂＭが富化された組成物は、植物由来のステビア抽出物と比較して検出不能な量のステビア植物由来の構成成分を有する。
【０１７７】
一部の実施形態では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、卓上甘味料または「カップ用カップ」製品に組み込まれる。このような製品は通常、当業者らに既知の１つ以上の増量剤、例えば、マルトデキストリンで、適切な甘味レベルに希釈される。ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭについて富化されたステビオールグリコシド組成物は、卓上使用のために、例えば、乾燥重量基準で１０，０００〜３０，０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ製品で、サッシェにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、インビトロ、インビボ、または全細胞生物変換により産生されるステビオールグリコシド。
【０１７８】
本発明は、次の実施例にさらに記載されることになり、これは、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１７９】
続く実施例は、本発明の具体的な実施形態及びそれらの種々の使用を例示するものである。それらは、説明のためのみに記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１８０】
実施例１．ＵＧＴ３３９４２を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の操作
ＵＧＴ３３９４２をクローニングし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株で過剰発現させた。ＵＧＴ３３９４２発現プラスミドで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、３０℃でそこに存在するプラスミドを選択するために、ウラシルを欠いている合成完全培地（ＳＣ培地）中で２４時間成長させた。成長の２４時間後、ステビオールを、４０μＭの最終濃度まで培養物に添加した。１体積の培養物を１体積のＤＭＳＯと混合して、それらを８０℃で１０分間置き、最高速度のＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｄで遠心分離することにより、ＬＣ−ＭＳの試料を、ステビオールの添加の２４時間後に調製した。次に、得られた上清のアリコートを、新しいバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ分析にかけた。
【０１８１】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）−ＴＱＤトリプル四重極質量分析計に連結したＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）で実施した。２つの移動相の勾配：Ａ（０．１％のギ酸を含むＨ２Ｏ）及びＢ（０．１％のギ酸を含むアセトニトリル）を使用して、Ｂを０．３〜２．０分で２０％から５０％まで、２．０１分で１００％まで増加させ、０．６分間１００％で保持し、０．６分間再平衡させることにより、化合物の分離を、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ＶａｎＧｕａｒｄプレカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５ｍｍ）を装備したＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍの粒子、１３０Åの孔径）で達成した。流速は、０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は、５５℃であった。ＭＳの取得は、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）モードを使用する負イオンモードであった。ステビオールグリコシドの同定を、既知の標準と比較して行った。
【０１８２】
ステビオール及び１９−ＳＭＧに対応するピークに由来するＬＣ−ＭＳの曲線下面積（ＡＵＣ）値を、ＵＧＴ３３９４２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株及び空ベクターを含む対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について決定した。結果を図３に示す。ＵＧＴ３３９４２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に与えられたステビオールの大部分は、１９−ＳＭＧに変換された一方、対照酵母株は、与えられたステビオールを変換しなかった。従って、ＵＧＴ３３９４２は、ステビオールを１９−Ｏ位でグルコシル化し、１９−ＳＭＧの産生をもたらす。Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａでは、ＵＧＴ７４ＧファミリーのＵＧＴは、１９−Ｏグリコシル化を触媒する。しかし、ＵＧＴ３３９４２は、ＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと高い構造類似性を有するＵＧＴポリペプチドである。ＵＧＴ８５ファミリーのメンバーが、１９−Ｏグリコシル化活性を主に有するものとして予め特徴付けられていないので、ＵＧＴ３３９４２の活性は、驚くべきことであり、予想外である。
【０１８３】
実施例２．ＵＧＴ３３７８６を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の操作
ＵＧＴ３３７８６をクローニングし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株で過剰発現させた。ＵＧＴ３３７８６発現プラスミドで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、そこに存在するプラスミドを選択するために、かつ３０℃でのプラスミドを維持するために、ウラシルを欠いている合成完全培地（ＳＣ培地）中で２４時間成長させた。成長の２４時間後、ステビオールを、４０μＭの最終濃度まで培養物に添加した。１体積の培養物を１体積のＤＭＳＯと混合し、それらを８０℃で１０分間置き、最高速度のＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｄで遠心分離することにより、ステビオールの添加の２４時間後に調製した。次に、得られた上清のアリコートを、新しいバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ分析にかけた。
【０１８４】
ＬＣ−ＭＳ分析を、実施例１に記載の方法に従って実施した。ステビオール及び１９−ＳＭＧに対応するピークに由来するＬＣ−ＭＳの曲線下面積（ＡＵＣ）値を、ＵＧＴ３３７８６を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株及び空ベクターを含む対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について決定した。結果を図４に示す。ＵＧＴ３３７８６を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に与えられたステビオールの部分は、１９−ＳＭＧに変換された一方、対照酵母株は、与えられたステビオールを変換しなかった。従って、ＵＧＴ３３７８６は、ステビオールを１９−Ｏ位でグルコシル化し、１９−ＳＭＧの産生をもたらす。ＵＧＴ３３９４４に関して、ＵＧＴ３３７８６は、ＵＧＴ８５ファミリーのメンバーと高い構造類似性を有するＵＧＴポリペプチドである。従って、ＵＧＴ３３９４４の１９−Ｏグリコシル化活性も、驚くべきことであり、予想外である。
【０１８５】
詳細に、かつそれらの具体的な実施形態への言及により、本発明を説明するが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、修正及び変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明の一部の態様が、特に有利であると本明細書で確認されるが、本発明は、本発明のこれらの特定の態様に必ずしも限定されないことが企図される。
【表１−１】
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【表１−２】
2019503670.tif 000003
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2019503670.tif 000051
【配列表】
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【国際調査報告】
2019503670.tif 000052
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