(57)【要約】  移植組織を含有するデバイスは、対象の身体内への挿入のために構成されており、移植組織を対象の免疫系から保護する、チャンバーを有するハウジングを含む。ハウジングは、酸素供給容器、ヒドロゲル層、ポート、およびアクセスポートを含む。酸素供給容器は、上面および底面ならびに側面により画定されているチャンバーを有し、ハウジングのチャンバー内に配置されている。酸素供給容器の上面および底面は、ガス透過膜を含む。ヒドロゲル層は、内表面および外表面を有する。ヒドロゲル層の内表面は、酸素供給容器の上面または酸素供給容器の底面と接触する。少なくとも１つのポートは、酸素を酸素供給容器に送達するよう構成されている。少なくとも１つのアクセスポートは、ガスの外部供給を受け取るよう構成されている。
2019503828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、対象の身体内への挿入のために構成されているハウジングであって、
ａ．上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、ハウジングのチャンバー内に配置されており、上面および底面が少なくとも１つのガス透過膜を含む、酸素供給容器、
ｂ．酸素供給容器の上面および酸素供給容器の底面からなる群から選択される少なくとも１つの表面と接触する内表面、ならびに外表面を有し、移植細胞を含有する、少なくとも１つのヒドロゲル層、
ｃ．酸素を酸素供給容器に送達するよう構成されており、酸素供給容器のチャンバーと流体連通した、少なくとも１つのポート、ならびに
ｄ．外部からのガスの供給を受け取るよう構成されており、少なくとも１つのポートと流体連通した、少なくとも１つのアクセスポート
を含むハウジングを含み、
デバイスが、移植細胞の生存および／または機能を促進するよう構成されており、
酸素供給容器が、２０〜６００ｍｍＨｇの間の値の最低ｐＯ２を少なくとも２４時間提供するよう、酸素を供給するようさらに構成されており、
酸素供給容器が、酸素が定期的に補充されるようさらに構成されている、
移植細胞を含有するデバイス。
【請求項２】
少なくとも１つのヒドロゲル層が、グルロン酸アルギネートを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
移植細胞が、ランゲルハンス島、幹細胞、副腎細胞、インスリン分泌細胞、ベータ細胞、幹細胞由来インスリン産生細胞、幹細胞由来ベータ細胞、幹細胞由来アルファ細胞および遺伝子組換え細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
移植細胞がヒトである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
移植細胞が、同種異系細胞、異種細胞、同種同系細胞および自己細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
対象の免疫系から移植細胞を保護する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
少なくとも１つのヒドロゲル層の外表面が、免疫保護膜を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
免疫保護膜が、多孔質ポリテトラフルオロエチレンまたはコラーゲンを含む、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
対象の身体内に、皮下位置、筋内位置、腹腔内位置、腹膜前位置、および大網位置からなる群から選択される位置において移植される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
酸素供給容器のチャンバーに送達される酸素が、２１％から９５％の間の濃度を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
酸素が、酸素供給容器のチャンバーに、２００から９５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞が、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の値の密度を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞が、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１５，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の値の密度を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
少なくとも１つのヒドロゲル層が、１００から８００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
少なくとも１つのアクセスポートが、機器から離れて移植される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
少なくとも１つのアクセスポートが、対象の身体内に、皮下位置、筋内位置、腹腔内位置、腹膜前位置、および大網位置からなる群から選択される位置において移植される、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
酸素が、酸素供給容器のチャンバーからヒドロゲル層内に含有された移植細胞へと、酸素供給容器の少なくとも１つのガス透過膜を通じて通過する、請求項１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２９２，６２３号に基づく優先権を主張し、ここにその内容全体が参照により完全に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、医療デバイス、細胞療法および細胞を含有する医療デバイスに関する。特に、本発明は、移植細胞の生存および機能を促進するための機器を提供する。
【背景技術】
【０００３】
臓器移植は、ホルモン障害、たとえば糖尿病にとって、実行可能な治療法ではないことが多い。多くの場合、移植組織または移植細胞が不足し、レシピエントに拒絶される可能性がある。単離組織または細胞は、たとえば免疫抑制、照射またはカプセル化による拒絶反応を予防する処置の後に、身体に移植することができる。
【０００４】
移植片はまた、移植片に対する酸素供給が不十分であることによりもたらされる虚血状態によっても損なわれる場合がある。たとえば、例示として、ドナー膵島は酵素および機械処理により膵臓組織から単離される。これらの処理は、膵島の血液供給を破壊するため、膵島への酸素の拡散を制限する。
【０００５】
酸素は、移植細胞の生理学的プロセス、生存および機能性にとって不可欠である。移植細胞に対する酸素の不十分な供給は、多くの場合、移植細胞の機能性の喪失および／または細胞死をもたらす。
【０００６】
たとえば、例示として膵島を移植機能細胞の一例として使用すると、最初に、移植膵島はレシピエントの血液供給から拡散により酸素を受け取る。いくつかの場合では、たとえば酸素拡散の効率または速度を増加させうる血管新生因子、たとえばＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの助けにより、脈管構造が移植膵島の周囲に最終的には形成されうる。移植膵島を免疫系から保護するため、移植膵島は多くの場合、カプセル化により保護され、移植膵島はレシピエントの免疫系から隔離される。
【０００７】
しかしながら、移植細胞がカプセル化される場合、移植細胞への酸素の拡散が低減しうる。加えて、移植細胞による需要は、移植細胞の量により影響を受けうる。たとえば、高密度移植細胞の酸素需要は拡散能力よりも高く、移植細胞に対する酸素の欠乏（ｌａｋｅ）をもたらす場合がある。さらに、高代謝活性細胞、たとえばインスリン産生細胞は、移植組織に対するより多量の酸素供給を要することが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態では、本発明は、
上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、対象の身体内への挿入のために構成されているハウジングであって、
ａ．上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、ハウジングのチャンバー内に配置されており、上面および底面が少なくとも１つのガス透過膜を含む、酸素供給容器、
ｂ．酸素供給容器の上面および酸素供給容器の底面からなる群から選択される少なくとも１つの表面と接触する内表面、ならびに外表面を有し、移植細胞を含有する、少なくとも１つのヒドロゲル層、
ｃ．酸素を酸素供給容器に送達するよう構成されており、酸素供給容器のチャンバーと流体連通した、少なくとも１つのポート、ならびに
ｄ．外部からのガスの供給を受け取るよう構成されており、少なくとも１つのポートと流体連通した、少なくとも１つのアクセスポート
を含むハウジングを含み、
デバイスが、移植細胞の生存および／または機能を促進するよう構成されており、
酸素供給容器が、５０〜６００ｍｍＨｇからの間の値の最低ｐＯ２を少なくとも２４時間提供するよう、酸素を供給するようさらに構成されており、
酸素供給容器が、酸素が定期的に補充されるようさらに構成されている、
移植細胞を含有するデバイスを提供する。
【０００９】
一実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、グルロン酸アルギネートを含む。
【００１０】
一実施形態では、移植細胞は、ランゲルハンス島、幹細胞、副腎細胞、インスリン分泌細胞、ベータ細胞、幹細胞由来インスリン産生細胞、幹細胞由来ベータ細胞、幹細胞由来アルファ細胞および遺伝子組換え細胞からなる群から選択される。
【００１１】
一実施形態では、移植細胞はヒトである。
【００１２】
一実施形態では、移植細胞は同種異系である。一実施形態では、移植細胞は異種である。一実施形態では、移植細胞は同種同系である。一実施形態では、移植細胞は自己由来である。
【００１３】
一実施形態では、デバイスは、対象の免疫系から移植細胞を保護する。
【００１４】
一実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層の外表面は、免疫保護膜を含む。
【００１５】
一実施形態では、免疫保護膜は、ポリテトラフルオロエチレンまたはコラーゲンを含む。一実施形態では、少なくとも１つのガス透過膜は、シリコーンゴム−テフロンを含む。
【００１６】
一実施形態では、デバイスは、対象の身体内に、皮下位置、筋内位置、腹腔内位置、腹膜前位置、および大網位置からなる群から選択される位置において移植される。
【００１７】
一実施形態では、酸素供給容器のチャンバーに送達される酸素は、２１％から９５％の間の濃度を有する。
【００１８】
一実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、２００から９５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。
【００１９】
一実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の値の密度を有する。
【００２０】
一実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１５，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の値の密度を有する。
【００２１】
一実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、１００から８００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。
【００２２】
一実施形態では、少なくとも１つのアクセスポートは、機器から離れて移植される。一実施形態では、少なくとも１つのアクセスポートは、対象の身体内に、皮下位置、筋内位置、腹腔内位置、腹膜前位置、腹膜前位置、および大網位置からなる群から選択される位置において移植される。
【００２３】
一実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーからヒドロゲル層内に含有された移植細胞へと、酸素供給容器の少なくとも１つのガス透過膜を通じて通過する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態は、あくまで例として、添付の図面を参照して本明細書に記載される。ここで詳細に特定の図面を参照することについて、事項は例として、本発明の実施形態の例示的議論を目的として示されることを強調する。この点に関して、図面とともに解釈される本明細書の記載は、本発明の実施形態をどのようにして実施できるかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明のデバイスの一実施形態を示し、移植可能デバイスを示す。Ａ：断面概略図。Ｂ：本発明のデバイスの一実施形態の写真。Ｃ：異なる膵島密度（それぞれ２，４００ＩＥＱ／ｃｍ２、３，６００ＩＥＱ／ｃｍ２、４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２）を有する３つのデバイスの上面の顕微鏡写真。少なくとも１つのヒドロゲル層内にカプセル化された個々の膵島は、上面金属グリッド（ｇｉｒｄ）の下に視認可能である。バーは１．８ｍｍである。
【図２】図２は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイス上でのＯ２測定のために利用される、円錐状セルの断面の図を示す。図面はスケールどおりではない。寸法単位はｍｍである。
【図３】図３は、移植組織を含有する少なくとも１つのヒドロゲル層内の酸素プロファイルを測定するシステムの概略図を示す。示された実施形態では、膵島は、デバイス内に少なくとも１つのヒドロゲル層において固定化されるが、デバイスはＢｉｏｐｏｒｅ膜および上面金属グリッドを有しない。様々なＯ２レベルを有するガス混合物を用いて酸素供給容器をパージし（出口ポートは図示せず）、移植組織を含有する領域内にＯ２電極を徐々に挿入する。少なくとも１つのヒドロゲル層の厚さは、Ｏ２電極機構を示すため、比率どおりではない。
【図４】図４は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおける、移植組織を含有する少なくとも１つのヒドロゲル層内の酸素プロファイルを示す。３．５ｐｍｏｌ／ＩＥＱ／ｍｉｎのＯＣＲを有する２，４００ＩＥＱを、６００μｍ厚のヒドロゲル層において、４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度で固定化した。Ｏ２電極は、固定化した膵島と培地との境界面またはそれらの間に挿入し、１００μｍの増分でガス透過膜の境界面まで逐次的に移動させた。Ａ：代表生データ。Ｂ：パネルＡのデータから計算されるＯ２分圧プロファイル。
【図５】図５Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの、糖尿病ラット内に移植されるときに血糖を低下させる能力を示す。パネルは、異なる酸素濃度（表２を参照のこと）を用いて酸素供給された、パネルの右上に示す様々な密度のドナー膵島を含有するデバイスから得られたデータを示す。矢印は、デバイスが除去されたときを示す。トレースは、平均観察血糖値である。図５Ｂは、移植６週間後に実施した、約１８０分間にわたる静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）の結果を示す。正常非糖尿病ラット（黒ひし形印）。以下の平均密度の膵島を含有するデバイスを移植された糖尿病動物。すなわち、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２、２，４００ＩＥＱ／ｃｍ２、３，６００ＩＥＱ／ｃｍ２および４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２（黒三角印）。
【図６】図６は、記載の密度における、本発明のいくつかの実施形態によるデバイス内の２，４００ＩＥＱの平均観察酸素消費速度を示す。暗色バーは、移植前の酸素消費速度を示す。明色バーは、移植から最低でも９０日後にデバイスを除去した後の酸素消費速度を示す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、膵島単離前の膵島内の密な脈管構造の、未処理の顕微鏡写真を示す。
【図８】図８Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおける、移植組織を含有する少なくとも１つのヒドロゲル層の断面の顕微鏡写真を示す。矢印は、少なくとも１つのヒドロゲル層を通じて酸素が拡散する方向を示す。図８Ｂは、少なくとも１つのヒドロゲル層を通じた理論上の酸素勾配（破線）を示し、少なくとも１つのヒドロゲル層の内表面（８０１）から少なくとも１つのヒドロゲル層の外表面（８０２）への、最大溶解酸素および最少溶解酸素濃度を示す。異なる破線は、異なる膵島密度における理論上の酸素勾配を示す。少なくとも１つのヒドロゲル層の外表面（８０２）は、レシピエントの血液供給と隣接する。
【図９】図９は、皮下移植された本発明の一実施形態によるデバイスを有するラットの写真を示す。
【図１０】図１０は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの、糖尿病ラット内に移植されるときに血糖を低下させる能力を示す。図１０Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの移植前（−１０〜０）および移植後の血糖を示すが、付加酸素を伴わない。図１０Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの移植前（−１０〜０）および移植後の血糖を示し、本発明のいくつかの実施形態に記載の方法により、デバイスに酸素を供給した。矢印は、酸素を窒素と置き換えたときを示す。
【図１１】図１１は、１４０日間の期間移植された後にラットから除去されたデバイスの周囲の線維性ポケット（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｐｏｃｋｅｔ）の顕微鏡写真を示す。
【図１２】図１２は、別のＩＶＧＴＴからの結果を示し、同種同系（三角印）または同種異系（丸印）膵島を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植されたラットから観察された血糖値を示す。非糖尿病動物（四角印）および未処置糖尿病動物（ひし形印）から観察された血糖値もまた示す。
【図１３】図１３は、本発明のデバイスの一実施形態を示す。示された実施形態では、デバイスは、大型動物、たとえばブタまたはヒトのための大型デバイスである。
【図１４】図１４は、図１３に示すデバイスの断面である。
【図１５】図１５Ａは、ラット膵島を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植された４頭のブタの平均体重（四角印）および血糖値（丸印）を示す。図１５Ｂは、移植８９日後にデバイスから回収した膵島におけるインスリン染色を示す。
【図１６】図１６Ａは、ブタ内に移植されたラット膵島を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスから除去された組織からの、示されたプライマーを使用したＰＣＲ反応の検証を示す。図１６Ｂは、移植組織試料を除去するために使用された手法の図を示す。図１６Ｃは、ブタ内に移植されたラット膵島を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスから除去された組織からの、示されたプライマーを使用したＰＣＲ反応の結果を示す。
【図１７】図１７Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおいて利用された高マンヌロン酸アルギネートヒドロゲル（Ｈｉｇｈ  ｍａｎｕｒｏｎｉｃ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）（ＨＭ−ＤＭ）を含浸させた親水化テフロン膜（四角印）および非含浸テフロン膜対照（ひし形印）全体にわたるインスリン拡散速度を示す。              図１７Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおいて利用された高マンヌロン酸アルギネートを含浸させた親水性テフロン膜（四角印）および非含浸テフロン膜対照（ひし形印）全体にわたるＩｇＧの拡散を示す。
【図１８】図１８Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの、移植組織とレシピエントとの間でのウイルスの移動を遮断する能力を試験するための実験系の図を示す。図１８Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおいて利用されたヒドロゲルＨＭ  ＤＭを含浸させたテフロン膜（図の最下部のひし形印）および非含浸テフロン膜対照（丸印）全体にわたるウイルスの通過を示す。
【図１９】図１９Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスのための、ヒト対象における移植部位を示す。図１９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスのヒト対象内への移植を示す。図１９Ｃは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスのヒト対象内への移植を別の視点で示す。図１９Ｄは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスのヒト対象内への移植を別の視点で示す。
【図２０】図２０Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植される前の、インスリン注射を受けている糖尿病ヒト患者の血糖値を示す。個々のトレースは、単一の２４時間の期間の血糖値を示す。図２０Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植された糖尿病ヒト患者の血糖値を示す。データは、移植１カ月後に得られた。個々のトレースは、単一の２４時間の期間の血糖値を示す。
【図２１】図２１Ａは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植されたヒト対象における、移植前および移植後のフルクトサミンレベルを示す。図２１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植されたヒト対象における、移植前および移植後のヘモグロビンＡ１ｃレベルを示す。図２１Ｃは、移植３、６、および９カ月後の、本発明のいくつかの実施形態による移植デバイスからのグルコース刺激性ｃ−ペプチド分泌を示す。
【図２２】図２２は、示された時点での、本発明のいくつかの実施形態による移植デバイスからのグルコース刺激性インスリン、プロインスリン、およびｃ−ペプチド分泌を示す。
【図２３】図２３Ａは、１０カ月間移植されていた後にヒト対象から除去された後の、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの顕微鏡写真を示す。図２３Ｂは、１０カ月間移植されていた後にヒト対象から除去された後の、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおける、ジチゾンを用いて染色した膵島の顕微鏡写真を示す。
【図２４】図２４Ａは、１０カ月間移植されていた後にヒト対象から除去された後の、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおける膵島からのグルコース刺激性インスリン分泌を示す。図２４Ｂは、１０カ月間移植されていた後にヒト対象から除去された後の、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおける膵島からのグルコース刺激性ｃ−ペプチド産生を示す。
【図２５】図２５は、本発明のいくつかの実施形態による円筒状または楕円体状デバイスの断面の概略図を示す。
【図２６】図２６は、本発明のいくつかの実施形態による複合膜を製造するための方法の概略図を示す。
【図２７】図２７は、図２６に示す方法により製造される複合膜の概略図を示す。
【図２８】図２８は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを製造するための方法の概略図を示す。
【図２９】図２９は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを製造するための方法の概略図を示す。
【図３０】図３０は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの断面の概略図を示す。
【図３１】図３１は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるヒト膵島を示す。図３１Ａ：ラットにおける移植前の、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるヒト膵島の顕微鏡写真。図３１Ｂ：１カ月間移植されていた後にラットから除去されたデバイスにおける、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるヒト膵島の顕微鏡写真。
【図３２】図３２Ａは、副腎摘出ラット（ＡＤＸ）、ウシ副腎細胞を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植された副腎摘出ラット（ＤＥＶＩＣＥ）、およびウシ副腎細胞を含有するアルギネートヒドロゲルを移植された副腎摘出ラット（ＳＬＡＢＳ）における基底およびＡＣＴＨ刺激性血漿コルチゾールレベルを示す。図３２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるウシ副腎細胞の生存を示す。データは、移植２０日後に得られた。
【図３３】図３３は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植された糖尿病ラットおよびステージ４ヒト幹細胞におけるＣ−ペプチドレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
開示されてきた利益および改良点のなかで、本発明の他の目的および利点が、添付の図面と併せて解釈される以下の記載から明らかになると考えられる。本発明の詳細な実施形態が、本明細書に開示される。しかしながら、本開示の実施形態は、様々な形態で実施できる本発明を例示するものでしかないことが理解されるべきである。加えて、本発明の様々な実施形態との関連で提示される例のそれぞれが、例示的であって、限定的ではないことが意図される。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、以下の用語は、特に文脈上明示されない限り、本明細書において明確に関連づけられる意味を持つ。本明細書で使用する「一実施形態では」および「いくつかの実施形態では」は、必ずしも同じ実施形態（複数可）を指さないが、同じ実施形態（複数可）を指していてもよい。さらに、本明細書で使用する「別の一実施形態では」および「いくつかの他の実施形態では」という文言は、必ずしも異なる実施形態を指さないが、異なる実施形態を指していてもよい。したがって、下に説明するように、本発明の様々な実施形態が、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなしに、容易に組み合わされてもよい。
【００２８】
加えて、本明細書で使用する「または」という用語は、両立的「または」演算子であり、特に文脈上明示されない限り、「および／または」という用語と同義である。「ベースの（ｂａｓｅｄ  ｏｎ）」という用語は、排他的でなく、特に文脈上明示されない限り、記述されていない追加の要素をベースにすることを可能にする。加えて、本明細書を通じて、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、複数の指示内容を含む。「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。
【００２９】
本明細書で使用する「膵島当量」または「ＩＥＱ」は、１５０ミクロン（μｍ）の直径を有する球形膵島の体積を指す。各膵島は、細胞１，０００個から４，０００個を含有し、これは移植細胞（たとえば、これに限定されないが、ベータ細胞）を含む。
【００３０】
本明細書で使用する「ＩＥＱ／ｃｍ３」は、膵島の密度を指す。臨床診療では、密度は、およそ１，０００〜１０，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の範囲でありうる。各膵島は、非限定的な一例として、１，０００〜４，０００個の間の移植細胞を含有しうるので、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２は、３，０００，０００〜４，０００，０００個の移植細胞を含有しうる。
【００３１】
本明細書で使用する「機能性」は、移植組織の生物学的活性、たとえばグルコース応答性インスリン分泌を指す。
【００３２】
本明細書で使用する「同種異系」は、同種内の異なる遺伝子構成を指し、したがって抗原的に区別される。
【００３３】
本明細書で使用する「異種」は、たとえばドナーおよびレシピエントが異種に属するとき、組織移植片に関して異種であることを指す。
【００３４】
本明細書で使用する「同種同系」は、同一の遺伝子構成を指し、したがって抗原的に同一である。
【００３５】
本明細書で使用する「自己由来」は、ドナーおよびレシピエントが同じ個体である移植片を指す。
【００３６】
特定の理論により限定を受けることを意図しないが、酸素は、移植細胞の生理学的プロセスおよび機能性にとって不可欠である。移植細胞に対する酸素の不十分な供給は、多くの場合、細胞の機能性の喪失または細胞死をもたらす。したがって、酸素供給は、移植細胞の生存および機能性を維持するのに不可欠の要素である。いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、デバイス内に含有される移植細胞に酸素を供給し、移植細胞の生存および／または機能性を維持するよう構成されている。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、
上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、対象の身体内への挿入のために構成されているハウジングであって、
ａ．上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、ハウジングのチャンバー内に配置されており、上面および底面が少なくとも１つのガス透過膜を含む、酸素供給容器、
ｂ．酸素供給容器の上面および酸素供給容器の底面からなる群から選択される少なくとも１つの表面と接触する内表面、ならびに外表面を有し、移植細胞を含有する、少なくとも１つのヒドロゲル層、
ｃ．酸素を酸素供給容器に送達するよう構成されており、酸素供給容器のチャンバーと流体連通した、少なくとも１つのポート、ならびに
ｄ．外部からのガスの供給を受け取るよう構成されており、少なくとも１つのポートと流体連通した、少なくとも１つのアクセスポート
を含むハウジングを含み、
デバイスが、移植細胞の生存および／または機能を促進するよう構成されており、
酸素供給容器が、２０〜６００ｍｍＨｇからの間の値の最低ｐＯ２を少なくとも２４時間提供するよう、酸素を供給するようさらに構成されており、
酸素供給容器が、酸素が定期的に補充されるようさらに構成されている、
移植細胞を含有するデバイスを提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、図１に開示のデバイスである。代替的には、本発明のデバイスは、図１３に開示のデバイスである。代替的には、本発明のデバイスは、図１４に開示のデバイスである。
【００３９】
図１３を参照すると、デバイスは、６８ｍｍの直径および１７ｍｍの厚さを有する。
【００４０】
図１４を参照すると、酸素はポートを介して、２４時間ごとに酸素供給容器内に補充され、ガスは、５％のＣＯ２および９５％のＯ２を、周囲Ｏ２ａｔｍを０．４ａｔｍ超える圧力で含む（タンク１４２０）。１４１０は、移植細胞を収容し、デバイス内の領域（外側領域と隣接）を示し、酸素供給容器内にガスが補充されてから２４時間が経過した後に、４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度で、約３０５ｍｇ  Ｈｇで、Ｏ２レベルを測定する。いくつかの実施形態では、３０５ｍｇ  Ｈｇが、デバイスに収容した移植細胞の必要性を満たすのに要する最低限の酸素レベルである。酸素供給容器（タンク１４２０）は、外側領域（１４３０）内への酸素の拡散を可能にする。移植細胞を含有する少なくとも１つのヒドロゲル層（１４４０）の遠端部は、２４時間後に３０〜６５ｍｇ  Ｈｇの間のＯ２レベルを有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、臨床グレードポリエーテルエーテルケトンでできた外側円盤状ハウジングを含む。代替的には、いくつかの実施形態では、ハウジングは、米国特許第８，８２１，４３１号（Ｂ２）に記載の材料から形成される。代替的には、いくつかの実施形態では、ハウジングは、米国特許第８，７８４，３８９号（Ｂ２）に記載の材料から形成される。代替的には、いくつかの実施形態では、ハウジングは、米国特許第８，４４４，６３０号（Ｂ２）に記載の材料から形成される。代替的には、いくつかの実施形態では、ハウジングは、米国特許第８，０１２，５００号（Ｂ２）に記載の材料から形成される。代替的には、いくつかの実施形態では、ハウジングは、米国特許出願公開第２０１１０３００１９１号（Ａ１）に記載の材料から形成される。代替的には、いくつかの実施形態では、ハウジングは、米国特許出願公開第２０１５０２７３２００号（Ａ１）に記載の材料から形成される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、米国特許第８，８２１，４３１号（Ｂ２）に記載の方法により組み立てられる。代替的には、いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、米国特許第８，７８４，３８９号（Ｂ２）に記載の方法により組み立てられる。代替的には、いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、米国特許第８，４４４，６３０号（Ｂ２）に記載の方法により組み立てられる。代替的には、いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、米国特許第８，０１２，５００号（Ｂ２）に記載の方法により組み立てられる。代替的には、いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、米国特許出願公開第２０１１０３００１９１号（Ａ１）に記載の方法により組み立てられる。代替的には、いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、米国特許出願公開第２０１５０２７３２００号（Ａ１）に記載の方法により組み立てられる。代替的には、本発明のデバイスは、下の実施例１に記載の方法により組み立てられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、デバイスは、対象の免疫系から移植細胞を保護する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層の外表面は、免疫保護膜を含む。いくつかの実施形態では、移植細胞は、免疫保護膜を介して対象の免疫系から保護される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、多孔質ポリテトラフルオロエチレンまたはコラーゲンを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、米国特許出願公開第２０１１０３００１９１号（Ａ１）に開示の免疫保護膜を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は複合膜を含み、多孔質親水化ＰＴＦＥ膜が骨格として使用され、ヒドロゲル（たとえばＨＭアルギネート）がフィラーとして使用される。アルギネートは、すべての細孔容量を満たす。この膜の細孔容量は小さい（典型的な最大孔径は０．４μｍ）が、表面積は大きいので、細孔内に含有されるゲルは、親水性相互作用により容易に安定化される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、移植細胞への酸素および／または栄養の拡散に影響を与えることなしに、免疫細胞、ウイルスおよび分子が少なくとも１つのヒドロゲル層へと逃れるのを防止する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、デバイスからの老廃物および／または代謝産物の拡散に影響を与えることなしに、免疫細胞、ウイルスおよび分子が少なくとも１つのヒドロゲル層へと逃れるのを防止する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、移植細胞の生存および／または機能性に影響を与えることなしに、免疫細胞、ウイルスおよび分子が少なくとも１つのヒドロゲル層へと逃れるのを防止する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、インスリンまたはグルコースの拡散に影響を与えることなしに、免疫細胞、ウイルスおよび分子が少なくとも１つのヒドロゲル層へと逃れるのを防止する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、凍結乾燥により乾燥させて貯蔵できる。貯蔵温度は、摂氏４度から２５度であってもよい。いくつかの実施形態では、免疫保護膜は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイス内への組入れ前に再水和できる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、デバイスは、上面、底面、および側面により画定されているチャンバーを有し、ハウジングのチャンバー内に配置されており、上面および底面が少なくとも１つのガス透過膜を含む酸素供給容器を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガス透過膜は、シリコーンゴム−テフロンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガス透過膜は、米国特許第８，８２１，４３１号（Ｂ２）に開示の膜である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、酸素を酸素供給容器のチャンバーに送達するよう構成されており、酸素供給容器のチャンバーと流体連通した、少なくとも１つのポート、ならびに、外部からのガスの供給を受け取るよう構成されており、少なくとも１つのポートと流体連通した、少なくとも１つのアクセスポートをさらに含む。一例を、図１３および図１９Ｃに示す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、デバイスは、対象の身体内に、皮下位置、筋内位置、腹腔内位置、腹膜前位置、および大網位置からなる群から選択される位置において移植される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアクセスポートは、機器から離れて移植される。一実施形態では、少なくとも１つのアクセスポートは、対象の身体内に、皮下位置、筋内位置、腹腔内位置、腹膜前位置、および大網位置からなる群から選択される位置において移植される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、デバイスは、Barkai et al., PLoSONEに開示の方法により対象の身体内に移植される。いくつかの実施形態では、デバイスは、Ludwig et al., PNASに開示の方法により対象の身体内に移植される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、酸素は、移植細胞の生存および／または機能性を維持するのに十分な量で、酸素供給容器のチャンバーに送達される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアクセスポートは、皮下移植され、経皮針を使用して、酸素供給容器への外部からの酸素のデリバリーを可能にする。いくつかの実施形態では、酸素は、米国特許第８，７８４，３８９号（Ｂ２）に記載の方法により送達される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４００〜６５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４５０〜６５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、５００〜６５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、５５０〜６５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、６００〜６５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４００〜６００ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４００〜５５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４００〜５００ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４００〜４５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、４５０〜６００ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、酸素供給容器のチャンバーに、５００〜５５０ｍｍＨｇの間の初期分圧で送達される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態では、デバイスは、４０％から９５％の間（たとえば、これらに限定されないが、４０％、４５％、５０％、５５％等）の濃度の酸素およびバランスの窒素を含むガス混合物を含む。いくつかの実施形態では、酸素混合物は、５％の二酸化炭素を含む。いくつかの実施形態では、酸素供給容器内のガス混合物の圧力は、１．０ａｔｍ（環境気圧）から１０ａｔｍの間である。いくつかの実施形態では、酸素供給容器内のガス混合物の圧力は、５．０ａｔｍ（環境気圧）から１０ａｔｍの間である。いくつかの実施形態では、酸素供給容器内のガス混合物の圧力は、１．０気圧（ａｔｍ）（環境気圧）から５ａｔｍの間である。いくつかの実施形態では、酸素のソースは、ハウジングの内部と本体部との間のｐＨ７．４の酸性度のバランスを維持するために、およそ５％の二酸化炭素を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、酸素は、２４時間に１回送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、２４時間に少なくとも１回送達される。いくつかの実施形態では、酸素は、７日または１４日に少なくとも１回送達される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、５０ｍｍ  Ｈｇから５００ｍｍ  Ｈｇの間の酸素、５３ｍｍ  ＨｇのＣＯ２およびバランスの窒素を含有するガス混合物は、少なくとも１つのアクセスポートを通じて酸素供給容器内に送達される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアクセスポートを通じて酸素供給容器内に送達されるガス混合物は、約５％のＣＯ２（４０ｍｍ  Ｈｇ）を含有する。ガス相におけるＣＯ２のこのレベルは、組織における重炭酸イオンと均衡状態にあり、ｐＨ７．４の酸性度レベルをもたらす。したがって、酸素供給容器と周囲のレシピエント組織との間で勾配は生じず、したがって、正常組織の酸性度レベルを乱さない。
【００６４】
特定の理論により限定を受けることを意図しないが、酸素供給容器から移植細胞へと酸素を供給するため、少なくとも１つのガス透過膜を通じて酸素が拡散し、移植細胞の周囲の少なくとも１つのヒドロゲル層内に溶解するか、または細胞の周囲のマトリックス（たとえば細胞外マトリックス、ＥＣＭ）内に溶解し、移植細胞へと拡散することが仮定される。酸素は、ヒドロゲルまたはＥＣＭ内に拡散するにつれて、その濃度を減少させる。したがって、酸素における酸素濃度は、細胞による消費および周囲の組織への消失を補うのに十分なほど高くなければならない。
【００６５】
図８Ｂを参照すると、少なくとも１つのヒドロゲル層（図８Ａ）を通じた理論上の酸素勾配を示し、低いＯ２需要（たとえば、より低い細胞密度、上側の破線）またはより高いＯ２需要（たとえば、より高い細胞密度、下側の破線）を示す。最大限の細胞機能性を達成するために、より低いＯ２濃度は、およそ５０〜６０ｍｍＨｇに維持されなければならない。したがって、８０２における最も低いＯ２は、５０〜６０ｍｍＨｇであるべきである。最低でも５０〜６０ｍｍＨｇを達成するために、入口（８０１）は、より高いＯ２濃度を有していなければならない。（８０１）は、酸素供給容器と隣接する表面である一方で、（８０２）は、対象の身体と隣接する表面である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、移植細胞に少なくとも５％の酸素を、少なくとも１つのヒドロゲル層の外表面（図８Ｂ、８０２）において提供するよう構成されている。
【００６７】
いくつかの実施形態では、デバイスは、恒久的に移植されうる。代替的には、デバイスは、一定期間後に除去できる。一定期間は、１年を超えても、１年でも、１年未満でもよい。一定期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１カ月であってもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、図２５〜図３０に示すデバイスである。図２５を参照すると、本発明のデバイスの一実施形態全体の断面の概略図を示す。デバイスは、内部空洞を組織または細胞コンパートメント（２）から隔てるガス透過膜（１）により形成される中心空洞である、内部ガス混合物供給容器を含む。一実施形態では、ガス透過膜の厚さは、１０〜４００μｍである。内部供給容器は軟質であり、ガス混合物を保持するに足るよう設計されている。一実施形態では、ガス透過膜は、シリコンゴム膜である。一実施形態では、ガス混合物は、酸素、５％のＣＯ２、およびバランスの窒素を含有する。ガスは、ガス透過膜を介して、移植細胞（３）の周囲のヒドロゲル（２）を含む細胞コンパートメント内に拡散する。硬質メッシュ（４）は、バイオ人工移植デバイスを強化し、移植細胞（３）を保持するゲル（２）の一定の厚さを維持する、機械的骨格として作用するよう設計される。デバイスは、架橋ゲルにより満たされた／それを含浸させた骨格としての親水性多孔膜から構成される複合膜（５）をさらに含む。
【００６９】
図２６を参照すると、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの含浸ゲル膜［複合膜（５）］を製造するための第１の実施形態の第１の工程の概略図を示す。親水化多孔膜（１１）、たとえば、親水化０．４μｍ多孔質ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜（Ｂｉｏｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、硬質多孔質材（１２）、たとえば焼結ガラスまたは多孔質ステンレス鋼管上を通り、ゲル溶液（１３）、たとえば高マンヌロン酸（ＨＭ）アルギネート中に位置する。多孔質硬質管（１２）内部で真空を作動させるか、または、ゲル（１３）の上面上で圧力を作動させ、ゲル（１３）が多孔親水化膜（１１）内の空隙容量内に貫入する。過剰なゲルを穏やかに除去する。ゲルを含む多孔親水化膜（１１）を有する多孔質硬質管（１２）を、架橋剤、たとえばバリウム、カルシウム、またはストロンチウムを含有する溶液中に浸漬させ、凍結乾燥により乾燥させ、低温エチレンオキシド（ＥＴＯ）により滅菌する。いくつかの実施形態では、溶媒はヒスチジン−トリプトファンケトグルタレート（ＨＴＫ）であり、溶液は、約６％（ｗ／ｖ）のＨＭアルギネートの最終濃度を有する。
【００７０】
図２７は、骨格としての親水化多孔膜およびフィラーとしてのヒドロゲルから構成される、図２６に概要を示した工程により製造される乾燥させた複合膜（５）全体の断面の概略図を示す。いくつかの実施形態では、複合膜は、Neufeld et al. "The Efficacy of an Immunoisolating Membrane System for Islet Xenotransplantation in Minipigs", PLOS ONE, August 2013, Vol. 8, Issue 8の「材料および方法」の部分に記載の工程の一部または全部を使用して製造される。
【００７１】
図２８を参照すると、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを製造するための第１の実施形態の第２の工程の概略図が示され、硬質メッシュ（６）は、ガス透過管（７）上を通る。硬質メッシュ（６）の厚さは、約１０μｍから約２，０００μｍの間で変化する。いくつかの実施形態では、硬質メッシュ（６）は、約１００μｍから約１，０００μｍの間の厚さを有する。いくつかの実施形態では、硬質メッシュ（６）は、長期移植に好適な硬質材でできている。
【００７２】
本開示の硬質メッシュとしての使用に好適な硬質材の例には、ステンレス鋼、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、およびニチノールが含まれるが、これらに限定されない。硬質メッシュ（６）の空隙容量は、組織を伴うゲルの最大ローディングを可能にし、１０：１（メッシュ体積に対する空隙容量）から１００：１（メッシュ体積に対する空隙容量）の間で変化する。
【００７３】
図２９を参照すると、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを製造するための第１の実施形態の第３の工程の概略図が示され、一定の厚さの量の細胞を、ガス透過管（７）／硬質メッシュ（４）コンストラクト上に固定化する。硬質メッシュ（４）により被覆されたガス透過管（７）を、多孔質管（９）（たとえば焼結ガラス）に接続された円錐状漏斗から構成される押出しツール（８）内に挿入する。ゲル（２）と混合された細胞（３）を、ガス透過管（７）および硬質メッシュ（４）の周囲に注ぎ、管（７）およびメッシュ（４）を硬質多孔質管（９）（たとえば焼結ガラス）内に引き下げる。いくつかの実施形態では、ゲルは、アガロース、アルギネートおよびセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ゲルは、０．５％の濃度まで滅菌水中に溶解され、膜を通じて濾過滅菌され、凍結乾燥法により凍結乾燥された高グルロン酸（ＨＧ）アルギネートである。凍結乾燥ＨＧアルギネートを、ヒスチジン−トリプトファンケトグルタレート（ＨＴＫ）を用いて、約０．５％から約５％の間の濃度まで再水和した。いくつかの実施形態では、移植細胞を含むゲルの厚さは、硬質メッシュ（４）により決定され、厚さは約１０μｍから約１，０００μｍの間である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、細胞（３）およびゲル（２）を混合し、押出しツール（８）と硬質メッシュ（４）における間隙との間に適用する。ガス透過管（７）および硬質メッシュ（４）を引き下げ、均等な厚さの細胞（３）およびゲル（７）をもたらす。架橋剤（１０）、たとえばバリウム、カルシウム、またはストロンチウムを含有する溶液を、注入硬質管（９）の周囲に導入し、ゲルの固化をもたらす。細胞（３）およびゲル（２）が、硬質メッシュ（４）間の空間（空隙容量）を満たす。
【００７５】
図３０を参照すると、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを製造するための第１の実施形態の第４の工程の概略図が示され、複合膜（１４）は、ガス透過膜（１）、組織または細胞（３）および硬質メッシュ（４）でできたデバイス上を通る。デバイス上に乾燥複合膜（１４）を適用するプロセス中、複合膜は湿った状態になる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、デバイスは、軟質酸素供給容器の周囲の円筒状または楕円体状ヒドロゲル中に埋め込まれた移植細胞の薄層を含み、小さい水溶性分子、たとえばグルコースおよびインスリンの移動を可能にして、免疫応答を実行する大きい水溶性分子、たとえば免疫グロブリンおよび補体成分の移動を防止する複合膜により、体液から隔てられる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、デバイスは、酸素ガスが軟質酸素供給容器の内部から通過し、ヒドロゲル中に溶解し、移植細胞内に拡散するのに十分なよう設計される。一実施形態では、酸素供給容器は、ガス透過材でできた軟質ガス透過管を含む。いくつかの実施形態では、ガス透過材は、シリコンゴムである。いくつかの実施形態では、軟質ガス透過管は、約１．０μｍから約２，０００μｍの間の厚さを有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、含有ガス中の酸素濃度は、４０ｍｍＨｇから２，０００ｍｍＨｇの間である（ガスの圧力は、１ＡＴＭを超えていてもよい）。いくつかの実施形態では、軟質酸素供給容器のチャンバー内のＣＯ２濃度は、４０ｍｍＨｇである。いくつかの実施形態では、アルギネート、たとえばＨＭアルギネートを二価イオン、たとえばバリウム、ストロンチウムおよびカルシウムを用いて架橋されたフィラーとして含む空隙容量を有する、骨格としての多孔親水性膜、たとえばＰＴＦＥ親水性膜で、複合膜はできている。一実施形態では、複合膜を、デバイス上に統合する前に乾燥させる。一実施形態では、複合膜は、含浸ＨＭアルギネートに対するダメージを防止するため、たとえば３２℃から３６℃の間の低温エチレンオキシドにより滅菌される。
【００７９】
少なくとも１つのヒドロゲル層
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、１００〜７００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、１００〜６００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、３００〜５００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのグルロン酸アルギネート層は、３００〜４００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、４００〜８００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、５００〜８００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、６００〜８００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、７００〜８００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、４００〜７００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、５００〜６００マイクロメートルの間の均等な厚さを有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、グルロン酸アルギネートを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層が、米国特許出願公開第２０１１０１６５２１９号（Ａ１）に開示の方法により生成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層が、Neufeld et al., PLoSONEに開示の方法により生成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層が、Ludwig et al., PNASに開示の方法により生成される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層は、メッシュにより支持される。
【００８３】
移植組織
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、米国特許出願公開第２０１１０１６５２１９号（Ａ１）に記載の方法により少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される。いくつかの実施形態では、移植細胞は、Neufeld et al., PLoSONEに記載の方法により少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される。いくつかの実施形態では、移植細胞は、Ludwig et al., PNASに記載の方法により少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、ランゲルハンス島、幹細胞、副腎細胞、インスリン分泌細胞、ベータ細胞、アルファ細胞、幹細胞由来インスリン産生細胞、幹細胞由来ベータ細胞、幹細胞由来アルファ細胞および遺伝子組換え細胞からなる群から選択される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、移植細胞は同種異系である。いくつかの実施形態では、移植細胞は異種である。いくつかの実施形態では、移植細胞は同種同系である。いくつかの実施形態では、移植細胞は自己由来である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、単離膵島を含む。膵島の単離は、たとえばMatsumoto et al., Proc (Bayl. Univ. Med. Cent.). 2007 Oct; 20(4): 357-362に記載の方法による、ドナー膵臓の酵素消化を介して実施できる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１５，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１４，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１３，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１２，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から１１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から９，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から８，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から７，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から６，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から５，０００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、２，４００ＩＥＱ／ｃｍ２から４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、３，６００ＩＥＱ／ｃｍ２から４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から３，６００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、１，０００ＩＥＱ／ｃｍ２から２，４００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、２，４００ＩＥＱ／ｃｍ２から３，６００ＩＥＱ／ｃｍ２の間の密度を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、幹細胞由来インスリン産生細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞由来インスリン産生細胞は、米国特許第８，３３８，１７０号に開示の細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞由来インスリン産生細胞は、米国特許第８，８５９，２８６号に開示の細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞由来インスリン産生細胞は、米国特許第９，１０９，２４５号に開示の細胞である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞２，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞３，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞４，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞５，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞６，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞７，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞８，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞９，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，８００，０００個／ｃｍ２から細胞１００，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞９０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞８０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞７０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞６０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞５０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞４０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞３０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞２０，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１９，２００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，８００，０００個／ｃｍ２から細胞１９，２００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１２，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１９，２００，０００個／ｃｍ２の間の値の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１４，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１９，２００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１６，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１９，２００，０００個／ｃｍ２の間の値の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１８，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１９，２００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，８００，０００個／ｃｍ２から細胞１８，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，８００，０００個／ｃｍ２から細胞１６，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，８００，０００個／ｃｍ２から細胞１４，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１０，８００，０００個／ｃｍ２から細胞１２，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１２，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１８，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒドロゲル層内に含有される移植細胞は、細胞１４，０００，０００個／ｃｍ２から細胞１６，０００，０００個／ｃｍ２の間の密度を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、本発明のいくつかの実施形態による移植可能医療デバイス内で、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月または１年もしくはそれを超えて生存できる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、それらの初期生存率の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を保持する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、それらの初期密度の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を保持する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、それらの初期機能性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を保持する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、本発明のいくつかの実施形態による移植可能医療デバイス内への導入後にさらに分化または成熟できる。例には、機能細胞へとさらに発生または成熟する前駆細胞の移植が含まれるが、これに限定されない。さらなる分化は、本発明のいくつかの実施形態による移植可能医療デバイスの、レシピエント内への移植前に生じてもよい。代替的には、さらなる分化は、本発明のいくつかの実施形態による移植可能医療デバイスの、レシピエント内への移植後に生じてもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態では、移植細胞の密度または代替的には量は、増加（たとえば、細胞分裂を介して）してもよい。密度または量は、本発明のいくつかの実施形態による移植可能医療デバイスの、レシピエント内への移植前に増加してもよい。代替的には、密度または量は、本発明のいくつかの実施形態による移植可能医療デバイスの、レシピエント内への移植後に増加してもよい。いくつかの実施形態では、レシピエントは、治療を必要とする対象である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、移植細胞は、細胞分裂を介して自己再生（すなわち、細胞死により失われた移植細胞を置換）してもよい。
【０１０１】
数多くの本発明の実施形態が記載された一方で、これらの実施形態は例示的なものでしかなく、限定的ではなく、多くの変更が当業者にとって明らかとなりうることが理解される。さらに、任意の所望の順序で様々な工程を実施できる（かつ、任意の所望の工程を追加できるかかつ／または任意の所望の工程を除外できる）。
【０１０２】
ここで以下の実施例を参照し、これらは、上の記載と合わせて、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な仕方で例示する。
（実施例）
【実施例１】
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを用いた糖尿病ラットの治療
材料および方法
動物、糖尿病の誘発、および前治療：Ｌｅｗｉｓラット（２６０〜２８０ｇ）をＨａｒｌａｎ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入し、８５ｍｇ／Ｋｇ体重のストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）の単回の静脈内注入により糖尿病を誘導した。動物は、常時食餌に自由にアクセスでき、４日間連続またはそれを超えて非空腹時血糖が４５０ｍｇ／ｄｌを超えるとき、糖尿病とみなされた。
【０１０４】
非ストレス状態の正常血糖環境におけるデバイス移植のための糖尿病動物を調製するため、３日間連続またはそれを超えて非空腹時血糖が２５０ｍｇ／ｄＬ未満であるときにデバイスの移植準備ができているとみなされた糖尿病動物の皮下に、１．５カプセルの徐放インスリンインプラント（Ｌｉｎｐｌａｎｔ，ＬｉｎＳｈｉｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を挿入した。徐放インスリンカプセルを移植４８時間後に除去し、下に記載の方法による移植後に、カプセル化デバイスをインスリンの唯一のソースとして残した。１日２度の非空腹時血糖濃度測定を通じてデバイス内の膵島の機能性を評価することにより、血糖管理の有効性を移植後６０日間追跡した。動物を鎮静させ、血液試料を尾部から回収し、市販のグルコメーター（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋセンサー、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）によりグルコースレベルを測定した。静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を移植６週後に以下のとおり実施した：動物を一晩絶食させた。翌朝に、１ｍｌの０．７Ｍグルコース溶液を１０〜１５秒以内に注入し（５００ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの用量）、注入前ならびにグルコース注入１０、３０、６０、１２０および１８０分後の測定のために、血糖試料を収集した。
【０１０５】
膵島単離および培養：２６０〜２８０ｇの体重の９から１０週齢のオスのＬｅｗｉｓラットから膵臓を得て、ドナー膵臓のコラゲナーゼ消化を行った。簡潔に述べると、各膵臓に、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｔ  ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中に１５  ＰＺ単位コラゲナーゼＮＢ８（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１ｍｇ／ｍｌウシＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ、カタログｎｏ．１５９００１）を含有する１０ｍｌの酵素消化ブレンドを１４分間注入した。低温（６℃）中１，７５０ｇ／ｍａｘで２０分間走らせた非連続的なＨｉｓｔｏｐａｑｕｅの勾配［１．１１９／１．１００／１．０７７／ＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）］で膵島を精製した。次に、膵島を２度洗浄し、完全ＣＲ培地［Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＭＲＬ）：１０％ウシ胎児血清（Ｂｅｔ−ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（１：１）］中で、移植可能デバイス内に統合する前に１週間培養した。
【０１０６】
ラット膵島当量（ＩＥＱ）中の細胞数を決定するため、それぞれ５０〜６０の標準的な膵島を含有する２１個の異なるロットを選択した。膵島は、ｘ軸およびｙ軸両方の直径が１５０μｍと推定されるときに「標準的」と定義した。細胞の計数のため、本明細書に記載のＤＴＺ染色の方法を使用し、細胞１，５５６±１４５個／ＩＥＱの値が得られた。単離直後にラット膵島を、同じ計数プロトコルに供し、細胞１，４３０±１８５個／膵島（ｎ＝１０）を含有することを見出した。デバイス組立ての時点（単離６〜８日後）で、細胞１，２７０±２８０個／ＩＥＱ（ｎ＝１０７）が計数された。培養期間中、平均的膵島における細胞数は＜２０％減少し、そしてそれゆえ、移植の時点で、膵島粒子は０．８ＩＥＱに相当すると推定された。膵島粒子は、同種同系（すなわち、Ｌｅｗｉｓラットに由来し、糖尿病Ｌｅｗｉｓラット内に移植）または同種異系（すなわち、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに由来し、糖尿病Ｌｅｗｉｓラット内に移植）のいずれかであった。
【０１０７】
ＤＴＺ染色を用いた従来の計数法による膵島計数：最終膵島調製物にそれぞれ由来する１００μｌの２つの代表的アリコートを、ＤＴＺ染色による体積分率決定のための記載のとおり、ＤＴＺ希釈標準溶液とともにインキュベートした。一辺５０μｍの四角のグリッドを含有するＢａｕｓｃｈ  ａｎｄ  Ｌｏｍｂマイクロメートルディスク（３１−１６−０８）接眼レンズレチクルを伴う光学顕微鏡を使用して、各染色膵島により占められる四角の数および面積を決定し、概ね同じ表面積を有する円の直径を各膵島について推定した。２人の独立した観察者により、５０μｍの増分（範囲：５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、および＞３５０μｍ）で、膵島のサイズ分布を定量した。膵島が球形であることを仮定することにより、各５０μｍ増分における膵島の数を総膵島体積に変換するため、ある式を使用した。総膵島体積をＩＥＱ（１．７７×１０６  μｍ３）の体積により除算したものとしてＩＥの数を算出した。
【０１０８】
皮下移植可能デバイス：皮下移植可能デバイスは、臨床グレードのポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ  Ｏｐｔｉｍａ  ＬＴ１Ｒ４０；Ｉｎｖｉｂｉｏ，Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，ＵＫ）でできた、３１．３ｍｍの直径および７ｍｍの厚さを有する外側円盤状ハウジングを有していた。
【０１０９】
図１を参照すると、デバイスは、３つの主要構成部からなる：１．膵島チャンバーは、医療用エポキシ接着剤（Ｅｐｏｔｅｋ  ３０１−２  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＥＥＫハウジングに接着された、約８０％の分画開放領域（上面グリッド、図１Ａ、挿入図、Ｓｕｒｏｎ，Ｍａ’ａｇａｎ  Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｉｓｒａｅｌ）を有する１００μｍの厚さのステンレス鋼グリッドを用いて強化された５００〜６００μｍの厚さの超高純度高グルロン酸アルギネート層に埋め込まれた、約２，４００膵島当量（ＩＥＱ）を含有していた。ガス透過膜の下に配置されており、ＰＥＥＫ機械的支持体により強化された、上面グリッドと同一の底面グリッドにより、機械的支持が提供された（図１Ａを参照のこと）。膵島密度を変化させるため、２，４００の膵島を１８、１１．３、９．８、または８．０ｍｍの直径を有するヒドロゲル層に固定し、１，０００、２，４００、３，６００、または４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度をそれぞれ、酸素供給のための表面領域の反対側にもたらした（図１Ｂを参照のこと）。２．酸素供給容器（３ｍｌの容量）は、以前に記述されたとおり（Barkai at. al., 2013）、２５μｍガス透過性シリコーンゴム−テフロン膜（Ｓｉｌｏｎ、ＢＭＳ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）により膵島モジュールから隔てられ、皮下のデバイスから離れた部位に移植された皮下アクセスポート（カタログＮｏ．ＰＭＩＮＯ−ＰＵ−Ｃ７０、Ｉｎｓｔｅｃｈ  Ｓｏｌｏｍｏｎ，ＰＡ）へと２つのポリウレタン管により接続された、入口および出口酸素供給容器ポートを含有していた。３．２５μｍの０．４μｍ孔径親水化ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜（Ｂｉｏｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）が、膵島モジュールを体液から隔て、膵島を免疫系の細胞部分から保護した。
【０１１０】
デバイスアセンブリー：５分間の沈降により、２，４００±２００ＩＥＱの用量を収集した。沈降物を２．２％（ｗ／ｖ）超高純度高グルロン酸（６８％）アルギネート（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰＭＶＧ、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ；Ｓａｎｄｖｉｋａ，Ｎｏｒｗａｙ）と穏やかに混合し、混合物を膵島モジュールコンパートメントに置き、上面グリッドの開口部に入るよう広げた（図１Ａを参照のこと）。次に、Ｖｉｔｏｎ  Ｏ−Ｒｉｎｇ（硬度７５ショアおよび外径２７ｍｍ）（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒｒ；Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を使用して、ＰＴＦＥ（Ｂｉｏｐｏｒｅ）膜をデバイス上に固定し、医療用シリコーン接着剤（ＭＥＤ  ２０００、Ｐｏｌｙｔｅｋ  Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を用いてプラスチックハウジングにシールした。７０ｍＭの最終濃度となるようＲＰＭＩ培地中に溶解させた塩化ストロンチウムを用いて飽和させた平らな焼結ガラス（Ｐｙｒｅｘ，ＵＫ）を適用することにより、アルギネートを架橋した。デバイスおよび焼結ガラスを、ＲＰＭＩ−ストロンチウム培地中に１６分間浸漬させ、５００から６００μｍの厚さの硬貨様ヒドロゲル層をもたらした。厚さの変動は、接着剤の厚さの変動に起因した。デバイスを、さらに５分間３７℃で、完全ＣＲ培地（Ｂｅｉｔ  ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中で洗浄した。完成したデバイスを移植前に、完全ＣＲ培地中３７℃で、撹拌しながら２時間洗浄した。
【０１１１】
デバイス移植：すべての動物実験を、Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓにより確立されたガイドラインに従い実施した。９０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／Ｋｇのキシラジンの腹腔内注射によりラットを麻酔し、続いてイソフルランを吸入させた。デバイスのために背面皮膚を３ｃｍ切開し、筋肉を皮下組織から分離した。肩甲骨の間の皮膚において第２の切開を行い、３ｍｍ幅のステンレス鋼針を皮下に通すことにより、この部位をデバイス移植部位と接続する２つのチャネルを創出した。背面皮膚切開部の下に、膵島モジュールが筋膜に面するようデバイスを挿入し、酸素供給容器ポートを、離れた皮下アクセスポートに接続した。組織接着剤（Ｈｉｓｔｏａｃｒｙｌ、Ｔｕｆｆｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて皮膚を縫合および固定した。
【０１１２】
ガス混合物置換：２４時間ごとに、イソフルラン吸入を用いて動物を鎮静させた。２つの移植されたアクセスポートのそれぞれに２７Ｇ針を挿入し、特定の酸素濃度、４０ｍｍＨｇのＣＯ２およびバランスのＮ２を含有する２０ｍｌ（約６．７チャンバー容量）のガス混合物を用いて、酸素供給容器をパージした。酸素供給容器内の最終全圧は、周囲大気圧と等しかった。異なる酸素混合物を得るため、事前に充填されたシリンダーを使用した（Ｍａｘｉｍａ、Ｉｓｒａｅｌ）。
【０１１３】
酸素消費速度：移植後の膵島の酸素消費速度（ＯＣＲ）を、２００膵島以上の用量を使用して、デバイスの摘出、デバイスからのヒドロゲル層の取外しおよびマニュアルでの膵島の計数後に決定した。
【０１１４】
膵島ＯＣＲ：３０μＬの高グルロン酸アルギネート中に固定された移植前の２５０ＩＥＱを、５００μｍの厚さで硬貨状に造形した。スライドガラス上に、直径５ｍｍの電磁撹拌器を上面上に伴うヒドロゲル層を配置し、円錐状のＯＣＲ測定チャンバーで覆った（図２）。円錐状チャンバーに、１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を伴う１：１ＣＭＲＬ：ＲＰＭＩ培地を、６２０μｌの最終容量となるよう充填した。チャンバーは、ピコアンペア制御装置（カタログＮｏ．ＰＡ２０００、Ｕｎｉｓｅｎｓｅ，Ａｒｈａｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に接続された、５００μｍの直径のＣｌａｒｋ型酸素電極を備えていた。Ｏ２測定チャンバーはＰｅｒｓｐｅｘ箱内に配置され、気温は、温度制御ユニット（Ｅｕｒｏｔｈｅｒｍ  ８０８；Ｅｕｒｏｔｈｅｒｍ  Ｗｏｒｔｈｉｎｇ，ＵＫ）を使用して、３７±１℃に維持された。ＯＣＲが変化しなくなるまで撹拌速度を増加させ（約７０ｒｐｍ）、膵島およびＯ２電極の周囲の物質輸送境界層と関連する効果を最小とするよう保証した。膵島およびヒドロゲル層形態ならびに安定的なＯＣＲ読取りにより評価する限り、ヒドロゲル層または膵島に対するダメージは観察されなかった。ゼロ酸素濃度または周囲酸素濃度を含有するガスを用いて平衡化した培地を使用して、電極を較正した。両方の相におけるＯ２濃度をここで、関係式ｃ＝αｐにより酸素濃度ｃに対して関係づけられる、ｍｍＨｇの単位の酸素分圧ｐとして報告し、式中、αはＢｕｎｓｅｎ溶解係数であり、３７℃の培地中の酸素について、１．３４×１０−９モル／（ｃｍ３ｍｍＨｇ）である。したがって、たとえば、１６０ｍｍＨｇの定常状態周囲Ｏ２分圧（２１％のＯ２、１ａｔｍ）で、溶解Ｏ２濃度は、３７℃の培地中で２１５μＭである。膵島によるＯ２消費の結果として、円錐状測定チャンバー内の培地中のＯ２濃度は、経時的に減少した。経時的なＯ２濃度のデータを、線形回帰によりフィッティングし、傾きを膵島のＯＣＲを推定するために使用した。ＯＣＲを下式から算出した：
【０１１５】
【数１】
2019503828.tif 000003
式中、Ｖｃｈは、チャンバー容量であり、αは、Ｂｕｎｓｅｎ溶解係数であり、３７℃で１．２７ｎｍｏｌ／ｃｍ３・ｍｍＨｇと考えられる。ｐＯ２対時間の最も急な傾きをもたらす領域で６０ｍｍＨｇを超えるデータを、線形回帰を使用して直線にフィッティングした。式（１）の両辺をチャンバー内のＩＥＱの数（ｎＣ）で除算することにより、１ＩＥＱ当たりのＯＣＲを下式のとおり得た。
【０１１６】
【数２】
2019503828.tif 000004
式中、量ｎＣ／Ｖｃｈは、たとえば核の計数により測定された細胞濃度である。量ＯＣＲ／ＤＮＡは、分母をチャンバー内のＤＮＡ濃度により置き換える場合、式（２）から算出できる。
【０１１７】
デバイスの除去後のＯＣＲ測定：デバイスの選択的除去の際、膵島を含有するヒドロゲル層を注意深く除去した。顕微鏡下で膵島を計数し、ヒドロゲル層をＯＣＲチャンバー（図２に示す）内に配置し、ＯＣＲを上述のとおり試験した。
【０１１８】
酸素ガス測定：移植されたデバイス内の酸素供給容器におけるＯ２濃度を測定するため、１．０ｍｌのシリンジと接続された２７Ｇ針を、移植された皮下アクセスポートのうちの１つに挿入し、２５０μｌの試料を、最後のＯ２補充の２４時間後に酸素供給容器から採取し、円錐状測定チャンバー内に注入した。酸素供給容器からの試料における酸素濃度を算出するため、電極測定の変化を使用した。ゼロＯ２濃度（純粋なＮ２）および１６０ｍｍＨｇ（周囲空気）を含有するガスを用いて、Ｏ２電極を較正した。
【０１１９】
移植膵島間の酸素プロファイル：ＰＴＦＥ（Ｂｉｏｐｏｒｅ）膜および上面の金属グリッドがないことを除き、皮下移植可能デバイスアセンブリーについて記載のとおり、様々な密度で約２，４００ＩＥＱを固定化した。デバイスの上に最小限の深さの層を創出するため、ＲＰＭＩＩ培地を伴うカバーされた９０ｍｍペトリ皿にデバイスを置き、皮下組織におけるガス組成をシミュレートした４０ｍｍＨｇのＯ２、４０ｍｍＨｇのＣＯ２および６８０ｍｍＨｇのＮ２を有するガス流（図３）を用いて、ヒドロゲル層の上の空間をパージした。１５２から３０４ｍｍＨｇの間を変化する酸素濃度を用いて、酸素供給容器をパージした。マイクロマニピュレーターに取り付けられた５００μｍの直径を有するＯ２電極を膵島含有ヒドロゲル層内に挿入し、１００μｍの増分で、膵島含有ヒドロゲル層の遠位側から下方向に、ガス透過膜に向かって進めた。各工程で、Ｏ２電極読取値は、次の工程に移行する前に定常状態レベルに到達した。測定システム全体を３７℃のチャンバー内に配置した。データは、平均±標準偏差として表される。統計的有意性（ｐ＜０．０５）をステューデントのＴ検定により決定した。
【０１２０】
結果：典型的には、酸素が膵島表面から半径方向内向きに拡散するにつれて、酸素はそれと接触する細胞により消費される。したがって、酸素濃度は、膵島の中心に向かって進行するにつれて減少する。平均で細胞１，５６０個を含有し、１５０μｍの直径を有するヒト由来の球状膵島等価物（ＩＥＱ）について、膵島外表面は、全細胞の十分な機能性の維持を可能にするために、約４５〜５０ｍｍＨｇの酸素分圧を要する。膵島の密度が増加するにつれて、少なくとも１つのヒドロゲル層全体にわたる酸素勾配は増加した。たとえば、図８Ｂを参照のこと。
【０１２１】
デバイス内で、５００〜６００μｍの間の厚さを有するアルギネートヒドロゲル層において膵島を固定化した。酸素を含有するガス混合物を膵島に、隣接する酸素供給容器から拡散により、２５μｍのガス透過膜を通じて供給した。チャンバー内のガス混合物を２４時間ごとに補充した。４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度の膵島を支持すると考えられる、チャンバー内にロードされるガス混合物における最低初期Ｏ２濃度を決定するため、インビトロ実験を使用した。支持できる機能膵島の密度は、チャンバー内のＯ２濃度が増加するとともに増加した。様々な膵島密度および十分な酸素供給容器酸素レベルを含有するデバイスを、ストレプトゾトシン誘発（「ＳＴＺ誘発」）糖尿病ラットに２５０日間まで移植した。図５Ａを参照のこと。ラットは、全期間で正常血糖を達成し、静脈内グルコース負荷試験に対して正常に近い反応を示した。図５Ｂを参照のこと。移植膵島に酸素を供給し、高い膵島固定化密度（たとえば、これに限定されないが、４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２）において膵島の生存および機能性を維持するデバイスの能力をデータは実証する。したがって、本明細書に記載の技術を使用して、ヒトにおける使用に好適な移植デバイスに必要なサイズを実質的に低減できる。
【０１２２】
移植膵島におけるｐＯ２：デバイス内の膵島を、ヒドロゲル層全体を通じてランダムに分散させた。いくつかの膵島がＯ２ソース（すなわち、酸素供給容器と隣接する２５μｍのシリコーンゴム−テフロンガス透過膜、たとえば、図１Ａの挿入図を参照のこと）に近接する一方で、他の膵島は、ソースから離れて（すなわち、デバイス−組織境界面に近接して）位置していた。１５０μｍの膵島の機能を十分に維持するには、膵島の表面上での最低Ｏ２濃度は、５０ｍｍＨｇを超えていなくてはならない。
【０１２３】
すべての膵島が必要なＯ２濃度に曝露されることを保証する条件を決定するため、図３に示すインビトロ試験系を使用して、移植膵島内の様々な深さまでＯ２電極を導入することにより、移植膵島間にわたるｐＯ２プロファイルを測定した。
【０１２４】
図４は、３０４ｍｍＨｇのｐＯ２を有するガス混合物を用いて酸素供給容器をパージする一方で、移植膵島の上方の培地は、両方とも４０ｍｍＨｇの濃度のＯ２およびＣＯ２ならびにバランスのＮ２を用いて連続的にパージした後の、移植膵島内の代表的なｐＯ２プロファイルを示す。図４Ａは、ｐＯ２の各増分増加後に、３０秒未満で定常状態が達成されたことを示す。図４Ｂは、酸素ソースからの距離が増加するとき、膵島生存にｐＯ２の増加が必要であったことを示す。Ｏ２透過膜の近傍で測定された最大値は、約２６０ｍｍＨｇであった。ｐＯ２は、酸素供給容器の最遠位部（すなわち、酸素ソースから最も遠い位置）において最低で約５０ｍｍＨｇまで減少した。
【０１２５】
様々な膵島密度における酸素供給容器において必要な最低酸素濃度：膵島の密度の増加は、必要な酸素透過表面積の減少をもたらし（膵島のすべてが生存および機能し続けた場合）、そのことにより最終的には、より小さな移植用デバイスをもたらすと考えられる。本研究では、固定量の膵島を、直径、面積および容量が逐次低減する（すなわち、１８、１１．３、９．８、または８．０ｍｍであり、１，３００、２，４００、３，６００、または４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度をもたらす）円形ヒドロゲル層に詰め、これは、デバイスの膵島モジュールを含んでいた。ヒドロゲル層全体にわたるＯ２勾配は増加し、膵島含有ヒドロゲル層−組織境界面において、より低いＯ２濃度をもたらした。膵島密度の増加を補うため、酸素供給容器における酸素のレベルを増加させた（たとえば、表１を参照のこと）。
【０１２６】
ヒドロゲル層の最遠位部における酸素分圧を５０ｍｍＨｇ超に維持するために酸素供給容器において必要とされる最低限のレベルのｐＯ２に対する膵島密度の効果を、インビトロ系を用いて測定した。異なる密度（２，４００、３，６００、または４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２）の膵島を、５００〜６００μｍの厚さを有するヒドロゲル層内に固定化した。ヒドロゲル層の最外部（すなわち、酸素供給容器から最も遠い表面）における酸素分圧が約５０ｍｍＨｇの値に到達するまで、増加させたＯ２レベルを用いて酸素供給容器をパージした。酸素供給容器における対応するｐＯ２レベルを、最低ｐＯ２として示した（表１）。高密度（たとえば４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２）膵島含有ヒドロゲル層に、ヒドロゲル層厚さ全体にわたって適切な酸素を供給するのに、酸素供給容器において３０５ｍｍＨｇのｐＯ２が必要であった。細胞（たとえば幹細胞）についての最低酸素濃度は、１．０〜６７マイクロモルの間である。
【０１２７】
表1:機能固定化膵島に必要な酸素供給容器における最低酸素濃度。表1は、3.4から3.8pmol/IEQ/minの間のOCRを有する約2,400IEQを、様々な密度[すなわち、48IEQ/cm3(2,400IEQ/cm2)、72IEQ/cm3(3,600IEQ/cm2)、および96IEQ/cm3(4,800IEQ/cm2)]で固定化したことを示す。最低pO2は、膵島含有アルギネートヒドロゲル層と皮下組織との間の境界面において50mmHgを達成するために必要な、酸素供給容器における最低酸素濃度である。(N=3の実験である。)
【表１】
2019503828.tif 000005
【０１２８】
酸素濃度は、膵島を支持するのに十分であった。Ｏ２補充が２４時間ごとに実施されるよう移植可能デバイスを設計した。この期間中、酸素供給容器におけるＯ２濃度は、膵島による酸素消費およびカプセル化するアルギネートを通じた拡散を介する漏れの結果として減少すると考えられた。したがって、補充ガス混合物における初期Ｏ２濃度は、表１に要約される測定された最低ｐＯ２値よりも高い必要があった。 必要な初期ｐＯ２を決定するため、２，４００ＩＥＱを様々な密度でロードしたデバイスを、酸素供給容器における異なる初期酸素濃度を用いて、糖尿病ラットに移植した。各チャンバー内のガス混合物を、その初期レベルまで毎日補充した。２４時間後、Ｏ２補充の直前に、酸素供給容器におけるＯ２濃度を測定した（表２の初期ｐＯ２を参照のこと）。
【０１２９】
移植後の膵島生存および機能：様々な密度の膵島をデバイスに固定化し、糖尿病ラット内に移植した。初期に必要なｐＯ２（表２）を含有するガス混合物を用いて酸素供給容器をパージし、移植前および摘出後のラットにおける血糖パラメータおよび固定化膵島のＯＣＲを測定した。膵島のＯＣＲは、初期値と最終値との間に有意差がなく、比較的一定のままに留まった（たとえば、図６を参照のこと）。９０日間の正常血糖を達成し（たとえば、図５Ａを参照のこと）、４２日後に試験したときは、ＩＶＧＴＴは正常に近く、正常ラットと移植デバイスを有する糖尿病ラットとの間に差はほとんどまたはまったくなかった（たとえば、図５Ｂを参照のこと）。データは、酸素供給容器における初期Ｏ２濃度が十分に高い場合に高密度の機能膵島を支持する、デバイスの能力を実証する（たとえば、図５Ｂを参照のこと）。４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の高い膵島密度において、非定常グルコースレベルが得られ（たとえば、図５Ａを参照のこと）、これが、この設定で達成できる最大密度であることが示唆される。本研究では、すべてのデバイスが選択的に除去され、血糖値の疾患状態への回帰をもたらす。最低移植期間は、９０日間であった。多くのラットにおいて、２２０日間までのより長い期間ののちに、デバイスを除去した。これらのデータは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスが、移植組織の生存および機能性を少なくとも９０日間維持可能であることを示す。
【０１３０】
表2:酸素供給容器における初期および最終酸素濃度:表2は、初期pO2および24時間後の平均最終pO2を要約する。各膵島密度の24時間後の酸素供給容器における平均O2濃度は、必要な最低O2レベルと等しいかまたはそれを超えており、そのことによって、使用された初期pO2レベルが、膵島の機能性を維持するのに十分であることを示した。
【表２】
2019503828.tif 000006
【０１３１】
様々な密度の膵島を含有するデバイスを、糖尿病ラット内に移植した。様々な酸素濃度、４０ｍｍＨｇのＣＯ２、およびバランスの窒素を含有する２０ｍｌのガス混合物を用いて、酸素供給容器を毎日フラッシュした。２４時間後、新鮮なガス混合物をフラッシュする直前に、酸素供給容器におけるｐＯ２を測定した。（各膵島密度について、Ｎ＝２００の異なる試料。）
【０１３２】
ネイティブの膵島はよく血管形成し（図７Ａ、図７Ｂ）、これは、膵島全体にわたって３８〜４０ｍｍＨｇのほぼ均等な酸素濃度をもたらす。単離膵島では、Ｏ２は表面から膵島の中心部へと拡散しなければならず、したがって、より高いＯ２の濃度が膵島の表面上に供給されなければならない。皮下（ＳＣ）が移植部位である。しかしながら、ＳＣのＯ２レベルは約４０ｍｍＨｇでしかなく、これは、直径約１００μｍを超える膵島を十分に支持するには不十分であり、典型的には平均約１５０μｍであるヒト膵島からのインスリン分泌に悪影響をもたらすと考えられる。
【０１３３】
図７は、高度に血管形成され、膵島全体にわたって約４５ｍｍＨｇをもたらす、未処理の膵島の写真を示す。図７Ｂは、推定される膵島の外周を示す破線の丸を組み込む。破線内の染色された管は、血液を膵島に供給する膵島内の細動脈である。単離膵島は、血液供給が破壊されており、すべての栄養素および生成物（たとえばインスリン、グルカゴン）が、拡散を介して移動しなければならない。酸素が、まず限定される分子として挙げられる。
【０１３４】
本明細書における結果は、カプセル化膵島のより高い密度と、膵島の生存および機能を十分に維持するために必要な酸素供給容器における初期酸素レベルとの間の関係性を示す。本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおける所定の膵島密度について、酸素供給容器において必要な酸素レベルを決定する方法。この酸素レベルは、ガス混合物補充後の２４時間の期間の終了時、酸素供給容器に初期に必要なｐＯ２を含有するガス混合物を補充する直前に、最低ｐＯ２が、宿主−デバイス境界面に最も近い膵島の表面（図８Ｂ、８０２）において、約５０ｍｍＨｇ以上であることを保証すると考えられる。
【０１３５】
移植組織においてｐＯ２プロファイルについてなされるインビトロ測定（図３および図４を参照のこと）を、異なる膵島密度においてガス混合物中におおよそ必要とされるｐＯ２を決定するために使用した（表１）。
【０１３６】
たとえば、試験された最高密度である４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２を支持するために、約３０５ｍｍＨｇの最低ｐＯ２が必要である。移植されるとき、５７０ｍｍＨｇであった初期の酸素供給容器のｐＯ２は、２４時間後に約３５０ｍｍＨｇまで下がった。したがって、５７０ｍｍＨｇは、４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度において、すべての膵島の機能性を保証するのに十分である。この発見の重要な帰結の一つは、ヒトにおける移植のためのデバイスのサイズを、実質的に低減できることである。結果として、たとえば、２５０，０００ＩＥＱの用量は、これらの条件下で、酸素供給容器からのＯ２の供給のための約５０ｃｍ２の表面積を有するデバイスにおいて支持できる。２つのデバイスを酸素供給容器を間に挟んで連続して組み合わせることによって、膵島支持に必要な表面積をさらに２５ｃｍ２まで低減でき、これは、６ｃｍ未満の直径を有する硬貨様デバイスに等しい。かかるサイズ低減は、ヒトにおける移植の可能性をより高めると考えられる。酸素供給容器における初期酸素レベルのさらなる増加とともに、さらに高い密度を支持でき、そのことにより、さらに小さなサイズのデバイスを容易にすることが可能である。
【０１３７】
デバイスに初期に移植された事実上すべての生存可能な膵島が、摘出までのＯＣＲの維持により実証されたとおり、４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の最高密度であっても、これらの実験の存続期間全体を通じて、それらの生存を保持する（図５Ａおよび図６を参照のこと）。微小血管系におけるｐＯ２は約４０ｍｍ  Ｈｇであるので、この結果は、たとえ移植片の周囲の広範な新血管新生が達成されていたとしても、血流を通じた局所的な酸素供給に依存する任意の他の方法によっては達成できなかった。さらに、糖尿病ラット内に移植された１，０００から４，８００ＩＥＱ／ｃｍ２の密度の２，４００ＩＥＱを含有するデバイスは、２５６日後までの実験の選択的終了まで正常な空腹時血糖を維持し、ＩＶＧＴＴの検出可能な遅延は観察されず（図５Ｂを参照のこと）、ラットの皮下組織におけるデバイス移植片の迅速な応答を実証した。したがって、アルギネートヒドロゲル層内に非常に高い密度で固定化された膵島は、皮下移植可能デバイスにおいて長期間、明らかな機能劣化もなく生存した。
【０１３８】
典型的には、臨床膵島移植は、ほとんどのレシピエントがインスリン非依存性となるためには、通常は２人以上の死体ドナーから供給される約１０，０００ＩＥＱ／ｋｇ  ＢＷ（７０ｋｇの患者について約７００，０００の膵島）を必要とする一方で、正常なヒトでは、正常血糖を維持するために、１００万の内因性膵島のうち約１０から２０％しか必要とされない。マウスおよび臨床膵島移植における研究は、典型的には、膵島用量のうち約３分の１しか、移植および初期生着期間を生き延びないことを示す。
【０１３９】
本例において提示された方法は、高密度でカプセル化された膵島に対し直接的に、外因性酸素のインサイチュー供給を増強することにより、初期状態の膵島の生存および機能を、有意な損失なしに長期間にわたって維持できることを実証する。現在経験されている生存および機能の実質的な損失を排除することにより、供給が限定されている膵島をはるかに効率的に使用でき、不十分な膵島数ゆえに通常は無視されているヒト調製物を有意義に使用できる。
【０１４０】
十分な酸素供給を保証することによる膵島細胞死の防止は、カプセル化同種異系または異種膵島の真の免疫隔離の達成を増強し、そのことにより、免疫抑制の必要性を排除するという、さらなる利点を提供できる。同種異系移植片拒絶反応は、ドナー由来抗原提示細胞（ＡＰＣ）と宿主由来Ｔ細胞との間の直接的接触を必要とする直接経路により主に媒介される。直接的細胞接触は、マイクロ多孔膜またはポリマーカプセル化により防止され、これらの両方が本明細書において研究されるデバイスにおいて使用される。結果的に、カプセル化膵島における瀕死の細胞の存在は、とりわけ異種移植片について、大きな免疫原性刺激を生成しうるのであり、これは間接経路を励起し、最終的には、移植片の周囲の全面的な応答を形成する活性化免疫細胞から放出された物質による攻撃をもたらす。デバイスにおいてカプセル化された事実上すべての膵島の生存を維持することにより、この免疫原性刺激の発生が防止され、免疫隔離を達成できる。
【０１４１】
下の表３は、本発明のデバイスの要約を示す。
【０１４２】
【表３】
2019503828.tif 000007
【０１４３】
表３は、酸素分圧ｐの単位の変換を示す。たとえば、１６０ｍｍＨｇの定常状態周囲Ｏ２分圧（２１％のＯ２、１ａｔｍ）で、溶解Ｏ２濃度は、３７℃の培地中で２１５μＭである。
【０１４４】
図９は、本発明のデバイスの実施形態を示し、ラットに移植されたデバイスを示す。
【０１４５】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、本発明のデバイスの実施形態を示し、移植後（図１０Ａの第０日、すなわち移植の日；図１０Ｂの移植後５９日）に酸素供給を阻害された、デバイス内に固定化されたラットの膵島を示す。図１０Ａは、酸素供給を有しない移植を示す。図１０Ｂは、移植５９日後に酸素を窒素に置き換え、血糖値の疾患状態への回帰をもたらした時点を（矢印で）示す。したがって、これらのデータは、酸素が連続的に供給されなければならないことを示す。とりわけ、細胞によりどれだけのグルコースが使用されたかを同定するために、血糖を測定した。すなわち、より低量のグルコースは、より少ない細胞が生存しているかおよび／または健全であることを意味する。
【０１４６】
図１１および図１２は、本発明のデバイスの実施形態を示し、図１１は、デバイスを１４０日間の期間移植されたラットから摘出されたデバイスの周囲の線維性ポケットを示す。デバイスの周囲の線維性組織はよく血管形成されており、図１２に示すとおり、おおよそ正常なＩＶＧＴＴ（静脈内グルコース負荷試験）の結果をもたらした。デバイス内の移植細胞は、同種同系（三角印）または同種異系（丸印）でありうる。正常な非糖尿病ラット（四角印）および同種同系または同種異系移植細胞のいずれかを収容するデバイスを移植された糖尿病ラットから、類似する血糖の結果が得られた。陰性対照として、移植されたデバイスを有しない糖尿病ラット（ひし形印）は、非糖尿病ラットまたはデバイスを有する糖尿病ラット（同種異系または同種同系細胞を有する）と比較して、有意に高い血糖値を有していた。糖尿病ラットは、非糖尿病（正常）ラットおよび移植デバイスを有するラット（同種異系または同種同系細胞を有する）のおよそ４倍の血糖量を有していた。これらのデータは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスが、インビボで長期間機能可能であることを示唆する。
【実施例２】
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを用いた糖尿病ブタの治療
大型動物（たとえば約１０Ｋｇのミニブタ）を支持するため、大型デバイスを構築した（実際の外観は図１３、断面図は図１４）。糖尿病ブタは、約６，５００ＩＥＱ／ｋｇ体重の初期ラット膵島用量を含有する本発明のデバイスを受け入れた（Ｎ＝４頭のミニブタ）。実施例１に記載の方法によりデバイスを組み立てた。
【０１４８】
図１５Ａは、移植後の糖尿病ブタにおける平均血糖値および体重を示す。データは、初期には、血糖値が正常近くに調整されることを示した。四角印は体重（初期の％）を示し、丸印は血糖（ｍｇ／ｄｌ）を表す。移植期間中、ブタの体重は増加した。これらのデータは、デバイスに移植された低用量のラット膵島（６，５００ＩＥＱ／ｋｇ体重）が、ＳＴＺミニブタを治癒できることを示す。驚くべきことに、デバイスは、移植後８０日までブタを支持できた。しかしながら、８０日を過ぎた後、おそらくはブタの体重が移植された膵島の用量にとって大きくなりすぎたがゆえに、移植デバイスはもはや正常血糖値を維持できなくなった。８９日後、デバイスを除去し、膵島を回収し、インスリンについて染色した。図１５Ｂを参照すると、インスリン染色が回収した膵島において観察された。
【０１４９】
図１６を参照すると、ラットまたはブタ細胞がこれらの試料に一切見出されなかったことがわかり、移植細胞がデバイスの外部の環境に入るのをデバイスの膜が制限することが示されたことを示す。さらに、デバイスにおいてラットまたはブタ由来のＤＮＡも一切見出されなかった。したがって、これらの実験（図１６Ｃ）は、移植された哺乳動物の免疫系からデバイスが保護されることを示す。
【実施例３】
【０１５０】
ＩｇＧおよびインスリンに対する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの透過性
図１７Ａおよび図１７Ｂは、本発明のデバイスの実施形態の膜を介した分子移動のグラフを示す。図１７Ａの結果は、膜（テフロン、０．４ミクロン）を通じたインスリン拡散を示す。膜がＨＭ  ＤＭを使用して遮断されていたとはいえ、依然としてインスリンは膜を通過可能であった。これらのデータは、インスリンの移動率が膜の影響を受けず、ＩｇＧの移動率が有意に阻害されることを示す。図１７Ｂは、インスリンがデバイスの含浸された膜（膵島／膜／アルギネートを含む）を通過可能である一方で、ＩｇＧ抗体（丸印）を遮断することをさらに示す。含浸されていない（四角印−ＤＭ）、すなわちアルギネートなしの膜では、ＩｇＧは膜を通過すると考えられる。
【０１５１】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、本発明のデバイスの実施形態を示し、ウイルス保護を示す。異なるウイルスロードを有する細胞を、含浸Ｂｉｏｐｏｒｅ膜の上に播種し、下の線維芽細胞におけるウイルスの存在を試験した。含浸されたアルギネートは、ウイルスの透過を完全に遮断した。図１８Ａは、ＩｇＧおよび約７０Ｋのウイルスが膜を通過するのを阻止する、アルギネートを含浸させた膜の図を示す。図１８Ｂは、ウイルスが、含浸されていない膜を通過可能であった一方で、含浸された膜にはウイルスが存在せず、したがって通過がなかったことを示す。
【実施例４】
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを用いた糖尿病ヒトの治療
２つの動物モデルにおける前臨床的結果は、以下のデバイスの能力を証明した。すなわち、（１）ドナーの酸素需要量を支持する能力、（２）同種同系、同種異系、および異種移植細胞を、宿主免疫系から保護する能力、（３）糖尿病動物において正常に近いグルコース制御を達成する能力、ならびに（４）糖尿病動物（ラットおよびブタ）において、健常動物パターンと類似するグルコース薬物動態パターンを達成する能力。
【０１５３】
臨床研究
対象は６３歳の男性であり、１９５７年以来Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）患者と診断されてきた。彼は関連合併症を有しておらず、ＣＳＩＩ下で許容可能な血糖管理を受けていた。治験デザインは以下のとおりである。すなわち、マクロカプセル化ヒト膵島（２，１００ＩＥＱ／ｋｇ  ＢＷの限界質量を有する）を皮下に移植した。免疫抑制は提供しなかった。一次エンドポイントは、安全性および実施可能性（酸素補給を含む）を評価することであり、二次エンドポイントは、代謝制御（たとえばＨｂＡ１ｃのモニタリング）、インスリン必要量の決定、および陽性Ｃ−ペプチドの評価を研究することであった。
【０１５４】
図１９Ａは、対象の手術前の写真であり、移植されるデバイスおよびポートのマークがある。図１９Ｂは、移植されているデバイスの写真である。図１９Ｃは、移植されているポートの写真である。図１９Ｄは、皮下移植されたデバイスの写真である。
【０１５５】
図２０Ａは、最低限の量のインスリンを使用する患者（デバイスの移植前）に、約２４時間の期間にわたって血糖値の大きな逸脱があったことを示す。しかしながら、この同じ対象は、デバイスの移植後に、約２４時間の期間にわたって、より逸脱の小さい血糖平均値を有していた（図２０Ｂを参照のこと）。図２０Ｂで得られた測定値は、対象がデバイスを移植する手術を受けた１カ月後に得られた。
【０１５６】
図２１Ａ〜図２１Ｃは、本発明のデバイスの実施形態を示し、グラフを介して臨床治験の代謝所見を示す。図２１Ａは、一人の患者の治療後の日数にわたって測定された代謝結果を示し、デバイスの移植後にフルクトサミンのレベルが実質的に線形であり、約２５０から３００μｍｏｌ／Ｌの間の測定値であったことを示す。図２１Ｂは、対象において１６０，０００個の機能膵島（４，５００ＩＥＱ／ｃｍ２）を維持するために、酸素を注入できること、そして、デバイスの一部が破損し、したがって膵島のうち２分の１のみが機能するとわかったことを示す。図２１Ｂは、移植デバイスが、ＨｂＡ１ｃ（％）を１〜２％の間減少させたことを示す。図２１Ｃは、局所的にグルコースを注入した結果を示す。移植３、６、または９カ月後にＣ−ペプチドの分泌を実証し、グルコース注入後３０〜２４０分の間、ｃ−ペプチド濃度を試験した。３，６、および９カ月の試料のそれぞれが類似の結果および経時的なｃ−ペプチド増加の進行を示した（たとえば、６０または９０分後、３、６、および９カ月の試料は、０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満しか逸脱しなかった）。このデータは、９カ月の期間にわたるデバイスの安定した機能性を示す。
【０１５７】
高グルコース（１５ｍＭ）溶液を対象のデバイスの周囲に局所的に注入し、インスリン、プロインスリン、およびｃ−ペプチドの局所ホルモン濃度を１８０分間の期間評価した。図２２の結果は、生存可能で機能する膵島移植片を示す。機能デバイスを、不適切な侵襲なしに、好ましい可能性のある部位に再配置した。
【０１５８】
図２３Ａおよび図２３Ｂは、臨床研究からの回収後の本発明のデバイスの実施形態を示す、２つの顕微鏡写真を示す。図２３Ａは、以前に対象に１０カ月前に移植されたデバイスから除去された後の無傷の膵島構造を示す明視野顕微鏡検査である。図２３Ｂは、インスリンについての、膵島含有ヒドロゲル層の底部側において均質で強いジチゾン染色を示し、膵島含有ヒドロゲル層の上部側においては不均質で減弱な染色である（データは示さず）。したがって、図２３Ｂは、免疫抑制なしの患者への移植１０カ月後に、移植細胞が活性であることを示す。
【０１５９】
図２４Ａおよび図２４Ｂは、本発明のデバイスの実施形態のグラフを示す。移植１０カ月後にヒト対象からデバイスを回収した後にグラフを生成し、デバイスを２０ｍＭのグルコース溶液中でインキュベートし、タンパク質レベルを試験した。移植組織を含有するアルギネート層をデバイスから除去し、ＨＧアルギネート含有量は、移植前の４．２３±０．８６マイクログラム／ｍＬと比較して、５．５マイクログラム／ｍＬであった。移植組織を含有する層におけるＨＭアルギネート含有量は、移植前の２５±２．６と比較して、それぞれ２４±４および１８±５マイクログラム／ｍＬであった。したがって、ＨＭおよびＨＧアルギネートの含有量は、移植前と同等のままであり、安定的なゲル系であることが示唆される。対象に１０カ月間移植された後に、対象からデバイスを除去し、デバイスの移植細胞が試験され、正常に機能することが見出された。
【０１６０】
したがって、マクロカプセル化同種異系膵島移植の第１のヒト治験（１０カ月の追跡）は、移植および酸素補給処置の実施可能性および安全性、デバイスの生体適合性、酸素の連続供給による免疫抑制なしでの同種異系膵島の生存、ならびにグルコース応答性の保存を実証した。膵島移植片機能は、初期Ｃ−ペプチド陰性患者における刺激後のヒトＣ−ペプチドの検出（非常に限界に近い膵島質量とはいえ）により直接的に証明した。
【実施例５】
【０１６１】
異種移植：本発明のいくつかの実施形態によるヒト膵島を含有するデバイスを用いた糖尿病ラットの治療
Ｐｒｏｄｏ（ＣＡ）からヒト膵島を購入した。到着時に約５００個の膵島を９０ｍｍのペトリ皿に配置し、１０％のウシ血清を添加した１０ｍｌのＲＭＰＩ／ＣＭＲＬ（５０／５０％）（Ｂｅｔ−Ｈｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）とともに培養した。
【０１６２】
５分間の沈降により、２，４００±２００ヒトＩＥＱの用量を収集した。沈降物を２．２％（ｗ／ｖ）超高純度高グルロン酸（６８％）アルギネート（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰＭＶＧ、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ；Ｓａｎｄｖｉｋａ，Ｎｏｒｗａｙ）と穏やかに混合した。混合物を、実施例１に記載の方法により、本発明のいくつかの実施形態によるデバイス内に置いた。
【０１６３】
９０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／Ｋｇのキシラジンの腹腔内注射によりラットを麻酔し、続いてイソフルランを吸入させた。デバイスのために背面皮膚を３ｃｍ切開し、筋肉を皮下組織から分離した。肩甲骨の間の皮膚において第２の切開を行い、３ｍｍ幅のステンレス鋼針を皮下に通すことにより、この部位をデバイス移植部位と接続する２つのチャネルを創出した。背面皮膚切開部の下に、膵島モジュールが筋膜に面するようデバイスを挿入し、ガスチャンバーポートを、離れた皮下アクセスポートに接続した。組織接着剤（Ｈｉｓｔｏａｃｒｙｌ、Ｔｕｆｆｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて皮膚を縫合および固定した。
【０１６４】
２４時間ごとに、イソフルラン吸入を用いて動物を鎮静させた。２つの移植されたアクセスポートのそれぞれに２７Ｇ針を挿入し、４５６ｍｍＨｇのＯ２、４０ｍｍＨｇのＣＯ２およびバランスのＮ２（Ｍａｘｉｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）を含有する２０ｍｌ（約６．７チャンバー容量）のガス混合物を用いて、ガスチャンバーをパージした。ガスチャンバー内の最終全圧は、周囲大気圧と等しかった。
【０１６５】
図３１は、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるヒト膵島を示す。図３１Ａ：ラットにおける移植前の、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるヒト膵島の顕微鏡写真。図３１Ｂ：１カ月間移植されていた後にラットから除去されたデバイスにおける、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるヒト膵島の顕微鏡写真。これらのデータは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスが、ヒト膵島の生存を維持可能であることを実証する。
【実施例６】
【０１６６】
副腎細胞を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの、副腎摘出ラット内への移植
ＢＡＣ（ウシ副腎細胞）を、屠殺されたばかりの１〜３歳のウシのウシ副腎から、Haidan A, et al., 1998、Vukicevic V, et al., 2012、Chung KF, et al., 2009に記載の方法に従い、コラゲナーゼ消化により単離した。
【０１６７】
沈降したＢＡＣを、Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ−ＨＴＫ溶液（Ｈ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａ）中に溶解させた３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の滅菌高グルロン酸（ＨＧ）アルギネートと穏やかに混合した。次に、アルギネート−細胞混合物を、ガラス（スラブとして）上に置くか、またはチャンバーデバイスの細胞コンパートメントに広げた。７０ｍＭの塩化ストロンチウムに２０ｍＭのＨｅｐｅｓを加えたものを用いて飽和させた平らな焼結ガラス（Ｐｙｒｅｘ）を適用することにより、アルギネートを架橋した。アルギネート／細胞スラブの厚さは、約５５０μｍであった。
【０１６８】
雌のＲＮＵ（８週齢）およびＷｉｓｔａｒラット（２００ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。両側副腎摘出を細胞移植処置と同時に実施した。裸細胞移植について、５×１０６個のウシ副腎皮質細胞を、各腎臓の被膜下に形成されたパウチ内に注入した。カプセル化細胞移植について、２つの同一のスラブを移植し、１つを各腎臓被膜の下に移植した。副腎摘出Ｗｉｓｔａｒラットにおけるｉ．ｐ．移植について、細胞５×１０６個をそれぞれ含有する２つのスラブを、後腹膜腔内に慎重に置いた。マクロチャンバーを背面皮膚の下に置いた。２０ｍｌの酸素富化ガス混合物（６０％の酸素、３５％の窒素、５％のＣＯ２）を、毎日のガス交換のために使用した。
【０１６９】
図３２Ａは、副腎摘出ラット（ＡＤＸ）、ウシ副腎細胞を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを移植された副腎摘出ラット（ＤＥＶＩＣＥ）、およびウシ副腎細胞を含有するアルギネートヒドロゲルを移植された副腎摘出ラット（ＳＬＡＢＳ）における基底およびＡＣＴＨ刺激性血漿コルチゾールレベルを示す。図３２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスにおけるウシ副腎細胞の生存を示す。データは、移植２０日後に得られた。これらのデータは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスが、ウシ副腎細胞の生存を維持可能であることを実証する。
【実施例７】
【０１７０】
ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞を含有する本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを用いた糖尿病ラットの治療
ヒト胚性幹細胞株ＷＡ０１（Ｈ１）の多能性維持を、放射線照射マウス胚性フィーダーとの共培養を通じて達成した。増殖因子枯渇マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３５４２３０）上への継代と、それに続く、分化プロトコルを開始する前のＭＥＦ馴化培地における３日間の増殖により、多能性細胞の分化が生じた。
【０１７１】
使用された分化プロトコルのステージごとの記述は、米国特許第８，３３８，１７０号に開示されており、特定の添加剤濃度とともに簡潔に記載する。ステージ１は、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  １２０−１４）、８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １３２５６０２９）および２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  ５０３６−ＷＮ／ＣＦ）を含有するＲＰＭＩにおける３日間のインキュベーションからなっていた。Ｗｎｔ３ａは、ステージ１の第１日にのみ適用され、胚体内胚葉細胞の形成を補助した。ステージ２は、２μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｒ２６２５）、１００ｎｇ／ｍｌのノギン（Ｒ＆Ｄ  ３３４４−ＮＧ）、２５０ｎＭのシクロパミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ２３９８０４）、１００ｎｇ／ｍｌのＦｇｆ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  １００−２６）および１％のＨｙｃｌｏｎｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＨ３００７００，０２）を前半の４日間、１％のＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ０８−００８５５Ａ）を後半の４日間含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２における、８日間のインキュベーションからなっていた。ステージ３は、２μＭのレチノイン酸、１００ｎｇ／ｍｌのノギン、２５０ｎＭのシクロパミン、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡおよび１％のＢ２７を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２における３日間のインキュベーションからなっていた。ステージ４は、５０μＭのＤＡＰＴ、（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄ５９４２）、０．５μＭの１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ６７９１０１）、１μＭのＡＬＫ５阻害剤（Ａ−８３−０１、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ６１６４５２）、１ｍＭのプロピオン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ１８８０）および５０μＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ７８８０）を添加した１２ｍＭのグルコースを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２における１２日間のインキュベーションからなっていた。
【０１７２】
本研究において対照として使用したヒト膵島は、Ｕ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ＣｈｉｃａｇｏのＩｓｌｅｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄｒ．Ｊ．Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ）から得た。２．５％のヒト血清アルブミン（Ｇｒｉｆｏｌｓ  ＮＤＣ  ６８５１６−５２１６−２，ＣＡ）、０．２４４％の炭酸ナトリウム（Ｈｏｓｐｉｒａ  ０４０９−６６２５−０２，ＣＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ−Ｃｅｌｌｇｒｏ  ２５−０６０，ＶＡ）、シプロフロキサシン（Ｈｏｓｐｉｒａ  ０４０９−４７７８−８６，ＣＡ）および０．２％のインスリン−トランスフェリン−セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４１４００−０４５）を添加したＦｉｎａｌ  Ｗａｓｈ／Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ９９−７８５−ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＶＡ）から構成される完全膵島培地においてヒト膵島を維持した。１日おきに培地を補充した。
【０１７３】
ステージ４の細胞を、コラゲナーゼとの５分間のインキュベーションと、それに続く穏やかなピペッティングにより、フラスコ培養物から分離した。次に、フラスコをプールし、アリコートをトリプシンを用いて処理し、細胞数を推定した。次に、培養物を懸濁液中で一晩、細胞凝集体として増殖させた。
【０１７４】
３×１０６個のｈＥＳＣ細胞（ｎ＝３）、または３，０００個のヒト膵島を、各βＡｉｒデバイスにロードされた２．５％のＨＧ（Ｇ＝０．６８）アルギネートと混合した。デバイスを、ストロンチウム溶液（７０ｍＭのＳｒＣｌ２、１２．５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４）中で１６分間インキュベートさせ、アルギネートの架橋を確立した。過量のストロンチウム溶液を、完全膵島培地中のアルギネート／細胞スラブから洗い落とした。含浸Ｂｉｏｐｏｒｅ膜を、シリコーン接着剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＧＳＭ３３ＳＳ）によりデバイスの本体部と接着し、Ｏリングを膜上に取り付けた。デバイスを移植した。
【０１７５】
Ｌｅｗｉｓラット（移植時在胎８週齢、１９０〜２１６グラムの間の範囲）を高脂肪食で維持し、体重増加を補助した。デバイスに、５５％の窒素、４０％の酸素および５％の二酸化炭素から構成されるガス混合物（Ｐｒａｘａｉｒ特別注文）を毎日補給した。簡潔に述べると、イソフルランチャンバーを使用して、ラットを麻酔した。補給ポートを覆う皮膚をエタノールを用いて洗浄し、２７ゲージ針（ＢＤ  ３０５１０９）を各ポート内に挿入した。２０ｍｌのガス混合物を含有する濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＦＧ０２５ＬＳ）シリンジ（ＢＤ  ３０２８３２）を、針のうちの１つ（ガス混合物が注入される側は毎日交換された）に付加する一方で、他方はデバイスに存在する置換される使用済みガスの排気に供した。血液の収集のため、２週ごとに尾静脈を通じてラットに出血させた。血液試料を沈降させ、上清をＥＬＩＳＡ解析に供し、循環中の供給されるｈＣ−ペプチドレベルを決定した。
【０１７６】
デバイスをラットに移植し、血中のヒトＣ−ペプチドのレベルを追跡した。ステージ４の細胞は、移植後９週まで、持続的なＣ−ペプチド分泌を示した（淡褐色のカラム、図３３を参照のこと）。
【０１７７】
これらのデータは、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスが、デバイス内に移植されたヒト胚性幹細胞に由来するインスリン産生細胞の生存を、ラット異種系において維持可能であることを実証する。
【０１７８】
本書面全体を通じて、引用された刊行物は、ここにそれらの全体が参照により組み込まれる。実施例および好ましい実施形態を参照することにより、本開示の実施形態の様々な態様が上に例示されたとはいえ、本開示の実施形態の範囲は、上の記載によってではなく、特許法の原理の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲により定義されることが認められると考えられる。
【０１７９】
加えて、本出願における任意の参考文献の引用または同定は、かかる参考文献が本開示の実施形態に対する先行技術として利用可能であることの認容と解釈されるべきではない。項目名が使用された限りにおいて、それらが必然的に限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
2019503828.tif 000008
【図２】
2019503828.tif 000009
【図３】
2019503828.tif 000010
【図４】
2019503828.tif 000011
【図５】
2019503828.tif 000012
【図６】
2019503828.tif 000013
【図７】
2019503828.tif 000014
【図８】
2019503828.tif 000015
【図９】
2019503828.tif 000016
【図１０−１】
2019503828.tif 000017
【図１０−２】
2019503828.tif 000018
【図１１】
2019503828.tif 000019
【図１２】
2019503828.tif 000020
【図１３】
2019503828.tif 000021
【図１４】
2019503828.tif 000022
【図１５】
2019503828.tif 000023
【図１６】
2019503828.tif 000024
【図１７】
2019503828.tif 000025
【図１８】
2019503828.tif 000026
【図１９−１】
2019503828.tif 000027
【図１９−２】
2019503828.tif 000028
【図２０−１】
2019503828.tif 000029
【図２０−２】
2019503828.tif 000030
【図２１−１】
2019503828.tif 000031
【図２１−２】
2019503828.tif 000032
【図２２】
2019503828.tif 000033
【図２３−１】
2019503828.tif 000034
【図２３−２】
2019503828.tif 000035
【図２４】
2019503828.tif 000036
【図２５】
2019503828.tif 000037
【図２６】
2019503828.tif 000038
【図２７】
2019503828.tif 000039
【図２８】
2019503828.tif 000040
【図２９】
2019503828.tif 000041
【図３０】
2019503828.tif 000042
【図３１】
2019503828.tif 000043
【図３２】
2019503828.tif 000044
【図３３】
2019503828.tif 000045
【国際調査報告】
2019503828.tif 000046