(57)【要約】  ジストロフィン発現を回復させるためにジストロフィン遺伝子内に内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を有する細胞内でジストロフィン遺伝子を改変する方法が開示される。この方法は、ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはイントロン内に第一の切断を導入して第一のエクソン末端またはイントロン末端を生じさせ、前記第一の切断が内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置すること；およびジストロフィン遺伝子のエクソンまたはイントロン内に第二の切断を導入して第二のエクソン末端またはイントロン末端を生じさせ、前記第二の切断がフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置することを含む。前記第一のエクソン末端と前記第二のエクソン末端または前記第一のイントロン末端と前記第二のイントロン末端が連結／ライゲートすると、ハイブリッドエクソンまたはイントロン連結部が生じ、正確なリーディングフレームが回復するため、ジストロフィン発現が回復する。例えば筋ジストロフィーに罹患している対象を治療するための方法の試薬および使用も開示される。【選択図】図１０
2019533440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストロフィン（ＤＹＳ）遺伝子内に内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を有する細胞内で前記ジストロフィン遺伝子を改変し、ジストロフィン発現のための正確なリーディングフレームを回復させる方法であって、
ａ）前記ＤＹＳ遺伝子のエクソンまたはイントロン内に第一の切断を導入して第一のエクソン末端またはイントロン末端を生じさせ、前記第一の切断が前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置することと、
ｂ）前記ＤＹＳ遺伝子のエクソンまたはイントロン内に第二の切断を導入して第二のエクソン末端または第二のイントロン末端を生じさせ、前記第二の切断が前記フレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置することと、
を含み、
前記第一のエクソン末端と前記第二のエクソン末端または前記第一のイントロン末端と前記第二のイントロン末端のライゲーション後に、ハイブリッドエクソンまたはハイブリッドイントロンを含む改変ジストロフィン遺伝子が生じ、ジストロフィン発現が回復する、
方法。
【請求項２】
細胞にｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ；およびｉｉ）ａ）前記第一の切断を導入する前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置する前記ＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列と結合する第一のｇＲＮＡ；ｂ）前記第二の切断を導入する内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置する前記ＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列と結合する第二のｇＲＮＡからなるｇＲＮＡの対を供給することにより、前記第一の切断および前記第二の切断を導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異が、前記ジストロフィン遺伝子のエクソン４５〜５８を含む前記ジストロフィン遺伝子の領域内に位置する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記第一の切断が、前記ジストロフィン遺伝子のエクソン４６、４７、４８、４９もしくは５０内にあり、前記第二の切断が、前記ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７もしくは５８内にあるか、または（ｉｉ）前記第一の切断が、前記ジストロフィン遺伝子のイントロン２２内にあり、前記第二の切断が、前記ジストロフィン遺伝子のイントロン２３内にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の切断がエクソン４７内にあり、前記第二の切断がエクソン５８内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記改変ジストロフィン遺伝子が、第一のＳＬＲの一部分と第二のＳＬＲの一部分とを含み、それによりハイブリッドＳＬＲ連結部を含むハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）含む、改変ジストロフィンタンパク質をコードし、７つ組モチーフの「ａ」および「ｄ」の位置に疎水性アミノ酸がある前記ハイブリッドＳＬＲの野生型立体配置が維持される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記改変ジストロフィン遺伝子が、以下のハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）：（ｉ）ＳＬＲ１７の一部分とＳＬＲ１９の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１７−１９）；（ｉｉ）ＳＬＲ１７の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１７−２０）；（ｉｉｉ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２０）；（ｉｖ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２１の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２１）；（ｖ）ＳＬＲ１９の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ；または（ｖｉ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２３の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２３）を含む改変ジストロフィンタンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ハイブリッドＳＬＲが、図５ａ、図５ｂおよび図１６ｂに記載されるハイブリッドＳＬＲ連結部から選択されるハイブリッドＳＬＲ連結部を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ハイブリッドエクソンが得られ、前記ハイブリッドエクソンが図１９（ａ）（ｉｉ）または図１７に記載される核酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のｇＲＮＡおよび前記第二のｇＲＮＡがそれぞれ、表６、表８、図１または図１１に記載されるＰＡＭ配列に隣接する標的配列を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｇＲＮＡの対が、図４、図１３、図１５、図１７、図２１もしくは図２２または表４もしくは表７に記載されるｇＲＮＡ対から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一のｇＲＮＡおよび前記第二のｇＲＮＡが、表３、表６または表８に挙げられるｇＲＮＡから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のｇＲＮＡが、ＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１０８）である標的配列を有し、前記第二のｇＲＮＡが、ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡ（配列番号１２１）である標的配列を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一のｇＲＮＡが、ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣ（配列番号１１０）である標的配列を有し、前記第二のｇＲＮＡが、ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号１２３）である標的配列を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｇＲＮＡ対が、ＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号２０８）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｇＲＮＡ対が、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号２１１）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｇＲＮＡ対が、ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号２１１）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｇＲＮＡ対が、ＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号２０８）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて前記第一のｇＲＮＡ、前記第二のｇＲＮＡおよび／または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを前記細胞内に送達する、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数のポリペプチドベースのシャトル（例えば、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ）を用いて前記第一のｇＲＮＡ、前記第二のｇＲＮＡおよび／または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを前記細胞内に送達する、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のポリペプチドベースのシャトルが、
（ｉ）アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡを有するポリペプチドベースのシャトル（ＦＳＡ）、
（ｉｉ）アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＨＨＨＨＨＨを有するポリペプチドベースのシャトル（ＦＳＢ）、
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＬＬＫＬＷＳＲＬＬＫＬＷＴＱＧＲＲＬＫＡＫＲＡＫＡＨＨＨＨＨＨを有するポリペプチドベースのシャトル（ＦＳＣ）；または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つの任意の組合せ
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ジストロフィン（ＤＹＳ）遺伝子内に内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を含む細胞のジストロフィン発現を回復させるためのｇＲＮＡ対であって、前記対が、第一のｇＲＮＡと第二のｇＲＮＡとからなり、前記第一のｇＲＮＡが、前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流にある第一の標的配列を含み、ヌクレアーゼ媒介性の第一の切断を前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置する前記ＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列内に指向させることができ、前記第二のｇＲＮＡが、前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流にある第二の標的配列を含み、ヌクレアーゼ媒介性の第二の切断を前記内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置する前記ＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列内に指向させることができる、ｇＲＮＡ対。
【請求項２３】
前記第一の切断が、（ｉ）前記ジストロフィン遺伝子のエクソン４６、４７、４８、４９もしくは５０内にあり、前記第二の切断が、前記ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７もしくは５８内にあるか、または（ｉｉ）前記第一の切断が、（ｉ）前記ジストロフィン遺伝子のイントロン２２内にあり、前記第二の切断が前記ジストロフィン遺伝子のイントロン２３内にある、請求項２２に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項２４】
第一のＳＬＲの一部分と第二のＳＬＲの一部分とハイブリッドＳＬＲ連結部とを含むハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）を含む改変ジストロフィンタンパク質をコードする改変ジストロフィン遺伝子を生じさせ、前記ハイブリッドＳＬＲが、前記７つ組モチーフの「ａ」および「ｄ」の位置に疎水性アミノ酸がある野生型立体配置を有する、請求項２２または２３に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項２５】
前記改変ジストロフィンタンパク質が、以下のハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）：（ｉ）ＳＬＲ１７の一部分とＳＬＲ１９の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１７−１９）；（ｉｉ）ＳＬＲ１７の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１７−２０）；（ｉｉｉ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２０）；（ｉｖ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２１の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２１）；（ｖ）ＳＬＲ１９の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１９−２０）；または（ｖｉ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２３の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２３）を含む、請求項２４に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項２６】
前記ハイブリッドＳＬＲが、図５ａ、図５ｂおよび図１６ｂに記載されるハイブリッドＳＬＲ連結部から選択されるハイブリッドＳＬＲ連結部を有する、請求項２４または２５に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項２７】
エクソン４６とエクソン５１（ハイブリッドエクソン４６−５１）；（ｉｉ）エクソン４６とエクソン５３（ハイブリッドエクソン４６−５３）；（ｉｉｉ）エクソン４７とエクソン５２（ハイブリッドエクソン４７−５２）；（ｉｖ）エクソン４９とエクソン５２（ハイブリッドエクソン４９−５２）；（ｖ）エクソン４９とエクソン５３（ハイブリッドエクソン４９−５３）；または（ｖｉ）エクソン４７とエクソン５８（ハイブリッドエクソン４７−５８）からハイブリッドエクソンを生じさせる、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項２８】
前記ＤＹＳ遺伝子内に図１９（ａ）（ｉｉ）または図１７に記載される核酸配列を有するハイブリッドエクソンを生じさせる、請求項２７に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項２９】
前記第一のｇＲＮＡおよび前記第二のｇＲＮＡの前記第一の標的配列および前記第二の標的配列がそれぞれ、前記ＤＹＳ遺伝子内で表６、表８、図１または図１１に記載されるＰＡＭ配列に隣接している、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３０】
図４、図１３、図１５、図１７、図２１もしくは図２２または表４もしくは表７に記載されるｇＲＮＡ対から選択される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３１】
前記第一のｇＲＮＡおよび前記第二のｇＲＮＡが、表３、表６もしくは表８または図１１に挙げられるｇＲＮＡから選択される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３２】
前記第一のｇＲＮＡの前記第一の標的配列がＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１０８）であり、前記第二のｇＲＮＡの前記第二の標的配列がＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡ（配列番号１２１）である、請求項３１に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３３】
前記第一のｇＲＮＡの前記第一の標的配列がＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣ（配列番号１１０）であり、前記第二のｇＲＮＡの前記第二の標的配列がＣＡＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号１２３）である、請求項３１に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３４】
ＡＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＴ（配列番号２０７）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項３１に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３５】
ＡＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＴ（配列番号２０７）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項３１に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３６】
ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号２１１）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項３１に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３７】
ＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号２０８）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる、請求項３１に記載のｇＲＮＡ対。
【請求項３８】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対の一方または両方のメンバーをコードする１つまたは複数の配列を含む、核酸。
【請求項３９】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
ライゲートされた請求項１〜２１のいずれか１項で定められる第一のエクソン末端と第二のエクソン末端または第一のイントロン末端と第二のイントロン末端とを含む改変ジストロフィン遺伝子を含む、核酸。
【請求項４１】
前記改変ジストロフィン遺伝子が、ライゲートされた表３もしくは表６または図１１ｂ、図１１ｃ、図１１ｄ、図１１ｅ、図１１ｆ、図１１ｇもしくは図１１ｈに示される切断部位によって定められる第一のエクソン末端と第二のエクソン末端とを含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
第一の切断部位が、前記ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド６７６９と６７７０の間にあり、第二の切断部位が、前記ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド８５５４と８５５５の間にある、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
前記第一の切断部位が、前記ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド６８３３と６８３４の間にあり、前記第二の切断部位が、前記ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド８６５７と８６５８の間にある、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４４】
前記改変ジストロフィン遺伝子が、ライゲートされた表８または図１１ｉもしくは図１１ｊに示される切断部位によって定められる第一のイントロン末端と第二のイントロン末端とを含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４５】
改変ジストロフィン遺伝子が、図５ａ、図９ａ（ｉ）または図１７に記載されるハイブリッドエクソン配列を含む、核酸。
【請求項４６】
図１６ｂに記載されるポリペプチド配列を有するハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む改変ジストロフィン遺伝子を含む、核酸。
【請求項４７】
請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる、改変ジストロフィンポリペプチド。
【請求項４８】
請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４９】
ウイルスベクターである、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
ＡＡＶまたはセンダイウイルスに由来するベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対の一方もしくは両方のメンバー、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の核酸、請求項４７に記載のポリペプチドおよび／または請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５２】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対の一方もしくは両方のメンバー、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の核酸、請求項４７に記載のポリペプチド、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項４７に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項５３】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５２または５３に記載の組成物。
【請求項５５】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対の一方もしくは両方のメンバー、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の核酸、請求項４７に記載のポリペプチド、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１に記載の細胞、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸を含む、キット。
【請求項５６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書をさらに含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
必要とする対象の筋ジストロフィーの治療に使用する、請求項５５または５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
対象の筋ジストロフィーを治療する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法に従って、前記対象の細胞内でジストロフィン遺伝子を改変し、ジストロフィン発現のための正確なリーディングフレームを回復させることを含む、方法。
【請求項６０】
対象の筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記対象の細胞と、（ｉ）（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）請求項５３に記載の組成物とを接触させることを含む、方法。
【請求項６１】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象の筋ジストロフィーの治療への（ｉ）（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）請求項５３に記載の組成物の使用。
【請求項６３】
対象の筋ジストロフィーを治療する薬物の調製への（ｉ）（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）請求項５３に記載の組成物の使用。
【請求項６４】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項６２または６３に記載の使用。
【請求項６５】
対象の筋ジストロフィーの治療に使用する、（ｉ）（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）請求項５３に記載の組成物。
【請求項６６】
対象の筋ジストロフィーを治療する薬物の調製に使用する、（ｉ）（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）請求項５３に記載の組成物。
【請求項６７】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項６５または６６に記載の使用のための（ｉ）（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）請求項５３に記載の組成物。
【請求項６８】
（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸と、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸とを含む、反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１６年９月２３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１６／０５１１１７号および２０１７年３月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／４７４，８２７号の優先権を主張するものであり、上記出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本願には、２０１７年９月１９日に作成され、大きさが約１５５ＫＢである「１１２２９＿３７５＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するコンピュータ可読形式の配列表が含まれる。このコンピュータ可読形式は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、変異細胞、例えば、デュシェンヌ型ＭＤ（ＤＭＤ）およびベッカー型ＭＤ（ＢＭＤ）などの筋ジストロフィー（ＭＤ）に罹患している対象の細胞などにジストロフィン発現を回復させるための内在性変異ジストロフィン遺伝子の標的化改変に関する。より具体的には、本発明は、内在性変異に近い位置にあるエクソン配列またはイントロン配列を標的とすることにより変異ジストロフィン遺伝子のリーディングフレームを修正することに関する。本発明は、このような改変型のジストロフィンにも関する。
【背景技術】
【０００４】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、Ｘ染色体と連鎖した一遺伝子性の遺伝性疾患であり、新生男児の約３５００人に１人が罹患する［１］。この疾患の原因は、身体が筋線維膜の完全性を維持するのに根本的な役割を果たしているジストロフィン（ＤＹＳ）タンパク質を合成することができないことである［２、３］。このタンパク質の欠如はＤＹＳ遺伝子の変異に続発するものである［４］。ＤＭＤ患者の６０％超に認められ、最も頻繁にみられる変異が、ＤＹＳ遺伝子のエクソン４５と５５の間のホット領域と呼ばれる領域にある１つまたは複数のエクソンの欠失である［５］。これらの欠失の大部分がｍＲＮＡ転写物のコドンフレームシフトを誘発し、短縮型のＤＹＳタンパク質の産生を引き起こす。後者は迅速に分解されるため、筋線維膜にＤＹＳが欠如することによってその脆弱性が高まり、ＤＭＤに特徴的な筋力低下が起こる。場合によっては、欠損がＤＭＤよりも軽度のベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）表現型が生じる［６］。ただ、ＢＭＤ患者の一部は平均余命が正常なこともある［６］が、ＤＭＤ患者では骨格筋の脆弱性によって１８〜３０歳で死に至る［７、８］。現時点でＤＭＤおよびＢＭＤの治療法はない。
【０００５】
ＤＭＤおよびＢＭＤの表現型の基礎となる分子が特定されたことによって、ＤＭＤの遺伝子治療の土台が確立された［９〜１３］。ＤＭＤの遺伝子治療に関する様々な戦略が開発段階にある。２．４ＭｂのＤＹＳ遺伝子には７９のエクソンが含まれ、１４ｋｂのｍＲＮＡをコードしている［１４、１５］ため、完全長遺伝子またはそのｃＤＮＡでさえ筋前駆細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または筋線維内にｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に送達する遺伝子治療を開発するのは困難である。
【０００６】
遺伝子置換の代替法として、ＤＹＳ  ｍＲＮＡまたはＤＹＳ遺伝子自体を直接細胞内で改変するというものがある。患者の欠失の前または後に、エクソンのスプライスドナーまたはスパイスアクセプター（ｓｐｉｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）を有する一次転写産物と相互作用する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いてエクソンをスキップすることにより、ｍＲＮＡのリーディングフレームを修正することができる［２０〜２８］。ただ、この治療方法は、ＡＯＮを生涯にわたって使用することに伴う多数の困難に直面している［２９］。さらに、ＡＯＮはｍＲＮＡにのみ作用することから、この方法で治療するＤＭＤ患者は生涯にわたってこの治療を受ける必要があり、それには極めて多額の費用がかかり、合併症のリスクも高くなる。
【０００７】
このため、細胞のジストロフィン発現を回復させる新規な治療方法が必要とされている。
【０００８】
本記載では多数の文献を取り上げるが、その内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、筋ジストロフィー（ＭＤ）（例えば、ＤＭＤ）を治療する新規な治療方法として用い得る変異ＤＹＳ遺伝子の正確なリーディングフレームを回復させることに関する。これは、ＭＤに罹患している対象の細胞に直接実施することができる。この方法は、内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流および下流にさらなる変異（例えば、欠失）を生じさせることによってＤＹＳリーディングフレームを恒久的に回復させることに基づくものである。これらの操作した上流および下流の変異は、内在性のフレームシフト変異もしくはナンセンス変異を含むエクソン内にあり得、かつ／または内在性のフレームシフト変異もしくはナンセンス変異に隣接するエクソンもしくはイントロン（例えば、フレームシフト変異もしくはナンセンス変異の上流および下流のエクソンもしくはイントロン）内にあり得る。第一の態様では、これらの操作された変異を導入する部位として（イントロンではなく）エクソンを標的とすることにより、細胞のＤＹＳ遺伝子のリーディングフレームを回復させて、欠失の可能性が最も少なく、同時に依然として十分なジストロフィンタンパク質機能を保持している改変ジストロフィンタンパク質を産生させることが可能である。あるいは、内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を含むエクソン全体を欠失させてジストロフィンリーディングフレームを回復させ得る。注目すべきことに、本出願者らは、内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を含むジストロフィン遺伝子内に導入する欠失を特異的に選択することにより、７つ組モチーフの「ａ」および「ｄ」の位置に疎水性アミノ酸がある改変ジストロフィンタンパク質の正常なスペクトリン様反復配列の立体配置を維持し、それにより（短くなったが）機能的なジストロフィンタンパク質を生じさせることができた。
【００１０】
ＤＭＤなどのＭＤの治療では、治療を効率的なものにするため、遺伝子改変を導入する薬剤を細胞内に効率的に送達する必要がある。現在、細胞内に遺伝子改変構成要素の送達にはＡＡＶベクターが最適な輸送媒体である。ただし、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）が持続的に発現すると、オフターゲット変異が増加することがある。効果的な代替的送達法を明らかにするべく、本出願者らは細胞内にｓｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの組合せを運搬する様々な方法／薬剤を検討した。リボ核タンパク質ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ（ＦＳ）と呼ばれる新しい細胞透過性ペプチドを含めた様々な送達薬剤を用いて筋芽細胞内にｖｉｔｒｏで、また筋線維内にｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に形質導入することが可能であることがわかった。この送達方法によって、細胞内でのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの寿命が短縮され、したがって、オフターゲット変異が抑えられ、治療の安全性が高くなり得る。さらに、試験したポリペプチドベースのシャトルのなかには、他のものより驚異的に効果の高い運搬体があることがわかった。
【００１１】
したがって、本発明では、ジストロフィン（ＤＹＳ）遺伝子内に内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を有する細胞内でジストロフィン遺伝子を改変し、ジストロフィン発現のための正確なリーディングフレームを回復させる方法であって、
ａ）ＤＹＳ遺伝子のエクソンまたはイントロン内に第一の切断を導入して第一のエクソン末端またはイントロン末端を生じさせ、前記第一の切断が内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置することと；
ｂ）ＤＹＳ遺伝子のエクソンまたはイントロン内に第二の切断を導入して第二のエクソン末端またはイントロン末端を生じさせ、前記第二の切断がフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置することと；
を含み、
前記第一のエクソン末端と前記第二のエクソン末端または前記第一のイントロン末端と前記第二のイントロン末端のライゲーション後に、ハイブリッドエクソンまたはハイブリッドイントロンを含む改変ジストロフィン遺伝子が生じ、ジストロフィン発現が回復する、
方法が提供される。
【００１２】
一実施形態では、第一および第二の切断は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソン内にあり、イントロン内にはない（ただし、生じる切断がエクソン内にある限り、ｇＲＮＡまたはその一部分が特にエクソンに隣接するイントロン領域内でイントロンと結合していてもよい）。その結果、第一および第二の切断が導入されると、第一のエクソン末端が最終的には第二のエクソン末端と連結またはライゲートし、ハイブリッド融合エクソンが生じ、それと同時に正確なリーディングフレームが回復し、ジストロフィン遺伝子の末端までの転写が可能になり、第一および第二の切断（例えば、内在性変異の上流にある第一のエクソン内の第一の切断および内在性変異の下流にある第二のエクソ内の第二の切断）によって遺伝子の一部分が除去されたことにより短縮されたジストロフィンタンパク質（少なくとも内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を含む部分を欠く）が産生される。第一および第二の切断の部位によっては、エクソン末端のライゲーションがジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列内に新たなコドンの導入を引き起こし得る。好ましくは、改変ジストロフィンタンパク質内のスペクトリン様反復配列の立体配置が維持される（すなわち、スペクトリン様反復配列内の疎水性アミノ酸が、当該技術分野で公知のように７つ組モチーフ「ａ」および「ｄ」の位置にある；例えば、図１６を参照されたい）ように、導入する切断の位置を特異的に選択する。
【００１３】
別の実施形態では、第一および第二の切断は、ジストロフィン遺伝子の内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異に隣接するイントロン内にある（ただし、生じる切断がイントロン内にある限り、ｇＲＮＡまたはその一部分が特にイントロンに隣接するエクソン領域内でエクソンと結合していてもよい）。その結果、第一および第二の切断が導入されると、第一のイントロン末端が最終的には第二のイントロン末端と連結またはライゲートし、ハイブリッド融合イントロンが生じ、イントロンの間に位置するエクソン（１つまたは複数）が欠失し、それと同時に正確なリーディングフレームが回復し、ジストロフィン遺伝子の末端までの転写が可能になり、第一および第二の切断（例えば、内在性変異の上流にある第一のイントロン内の第一の切断および内在性変異の下流にある第二のイントロン内の第二の切断）によって遺伝子の一部分が除去されたことにより短縮されたジストロフィンタンパク質（少なくとも内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異を含む部分を欠く）が産生される。好ましくは、改変ジストロフィンタンパク質内のスペクトリン様反復配列の立体配置が維持される（すなわち、スペクトリン様反復配列内の疎水性アミノ酸が、当該技術分野で公知のように７つ組モチーフ「ａ」および「ｄ」の位置にある；例えば、図１６を参照されたい）ように、導入する切断の位置を特異的に選択する。諸実施形態では、１つまたは複数のエクソンの欠失により１つまたは複数の完全なスペクトリン様反復配列（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４．．．．Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７’Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４またはその任意の組合せ）が除去される。
【００１４】
一実施形態では、細胞にｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）；およびｉｉ）ａ）第一の切断を導入する内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置するＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列と結合する第一のｇＲＮＡ；ｂ）第二の切断を導入する内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置するＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列と結合する第二のｇＲＮＡからなるｇＲＮＡの対を供給することにより、前記第一および第二の切断を導入する。
【００１５】
一実施形態では、内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５〜５８から選択される１つまたは複数のエクソン内に位置する。
【００１６】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８、４９または５０内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００１７】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００１８】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４６内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００１９】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４７内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００２０】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４８内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００２１】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４９内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００２２】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２３】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５２内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２４】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２５】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５４内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２６】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５５内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２７】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５６内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２８】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５７内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００２９】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５８内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００３０】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５４内にある。
【００３１】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４６内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１内にある。
【００３２】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４６内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３内にある。
【００３３】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４７内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５２内にある。
【００３４】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４９内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５２内にある。
【００３５】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４９内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３内にある。
【００３６】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４７内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５８内にある。
【００３７】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５〜５８内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４６〜５９内にある。
【００３８】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８、４９または５０内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９内にある。
【００３９】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００４０】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４６内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００４１】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４７内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００４２】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４８内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００４３】
諸実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４９内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８内にある。
【００４４】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５１内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００４５】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５２内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００４６】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５３内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００４７】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５４内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００４８】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００４９】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５６内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００５０】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５７内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００５１】
諸実施形態では、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン５８内にあり、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン４５、４６、４７、４８または４９内にある。
【００５２】
一実施形態では、第一の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン２２内にあり、第二の切断は、ジストロフィン遺伝子のイントロン２３内にある。
【００５３】
諸実施形態では、第一の切断と第二の切断によってハイブリッドエクソンが生じる。諸実施形態では、第一の切断と第二の切断によってハイブリッドイントロンが生じる。
【００５４】
一実施形態では、本発明の方法によって生じるハイブリッドエクソンは、図５ａ、図９ａ（ｉｉ）または図１７に記載される核酸配列を有する。一実施形態では、第一および第二のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ対）は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、ＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９）とともに、（ｉ）エクソン４６とエクソン５１（ハイブリッドエクソン４６−５１）；（ｉｉ）エクソン４６とエクソン５３（ハイブリッドエクソン４６−５３）；（ｉｉｉ）エクソン４７とエクソン５２（ハイブリッドエクソン４７−５２）；（ｉｖ）エクソン４９とエクソン５２（ハイブリッドエクソン４９−５２）；（ｖ）エクソン４９とエクソン５３（ハイブリッドエクソン４９−５３）；または（ｖｉ）エクソン４７とエクソン５８（ハイブリッドエクソン４７−５８）からハイブリッドエクソンを生じさせる。
【００５５】
一実施形態では、上記の方法によって、第一のＳＬＲの一部分と第二のＳＬＲの一部分とハイブリッドＳＬＲ連結部とを含むハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）を含む改変ジストロフィンタンパク質をコードする、改変ジストロフィン遺伝子が生じる。ハイブリッドＳＬＲでは、７つ組モチーフの「ａ」および「ｄ」の位置に疎水性アミノ酸があるＳＬＲの正常な（野生型）立体配置が維持される。
【００５６】
一実施形態では、本発明の方法によって生じる改変ジストロフィンタンパク質は、以下のハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）：（ｉ）ＳＬＲ１７の一部分とＳＬＲ１９の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１７−１９）；（ｉｉ）ＳＬＲ１７の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１７−２０）；（ｉｉｉ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２０）；（ｉｖ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２１の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２１）；（ｖ）ＳＬＲ１９の一部分とＳＬＲ２０の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１９−２０）；または（ｖｉ）ＳＬＲ１８の一部分とＳＬＲ２３の一部分とを含むハイブリッドＳＬＲ（ＳＬＲ１８−２３）を含む。
【００５７】
一実施形態では、ハイブリッドＳＬＲは、図５ａ、５ｂおよび１６ｂに記載されるハイブリッドＳＬＲ連結部から選択されるハイブリッドＳＬＲ連結部を有する。
【００５８】
当該技術分野で公知の任意の有用な方法を用いて、本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびｇＲＮＡを細胞内に導入し得る。
【００５９】
一実施形態では、１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、第一のｇＲＮＡ、第二のｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを細胞内に送達する。
【００６０】
別の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドベースのシャトル（例えば、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ）を用いて、第一のｇＲＮＡ、第二のｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを細胞内に送達する。
【００６１】
一実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドベースのシャトルは、（ｉ）アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡを有するポリペプチドベースのシャトル（ＦＳＡ、配列番号１９６）；（ｉｉ）アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＨＨＨＨＨＨを有するポリペプチドベースのシャトル（ＦＳＢ、配列番号１９７）；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＬＬＫＬＷＳＲＬＬＫＬＷＴＱＧＲＲＬＫＡＫＲＡＫＡＨＨＨＨＨＨを有するポリペプチドベースのシャトル（ＦＳＣ、配列番号１９８）；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つの任意の組合せを含む。
【００６２】
一実施形態では、本発明に従って使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ｓａＣａｓ９）または化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００６３】
また、本発明の方法（例えば、ジストロフィン（ＤＹＳ）遺伝子内に内在性のフレームシフト変異もしくはナンセンス変異を含む細胞のジストロフィン発現を回復させる方法、または筋ジストロフィーを治療する方法）に使用するｇＲＮＡ対も提供される。一実施形態では、この対は第一のｇＲＮＡと第二のｇＲＮＡとからなり、第一のｇＲＮＡは、内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流にある第一の標的配列を含み（すなわち、ｇＲＮＡは第一の標的配列の相補鎖（反対側の鎖）と結合し）、ヌクレアーゼ媒介性の第一の切断を内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流に位置するＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列内に指向させることができ、第二のｇＲＮＡは、内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流にある第二の標的配列を含み（すなわち、第二の標的配列の相補配列（反対側の鎖）と結合し）、ヌクレアーゼ媒介性の第二の切断を内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の下流に位置するＤＹＳ遺伝子のエクソン配列またはイントロン配列内に指向させることができる。
【００６４】
一実施形態では、第一および第二のｇＲＮＡの第一の標的配列および第二の標的配列は、それぞれが表３、表６、表８、図１または図１１に記載されるＤＹＳ遺伝子のＰＡＭ配列に隣接している。諸実施形態では、標的配列は、表８に記載されるｇＲＮＡ２０、２２、２３または２６の標的配列からなるものではない。
【００６５】
諸実施形態では、第一のｇＲＮＡおよび／または第二のｇＲＮＡの標的配列はイントロン−エクソン連結部に及ぶものである（すなわち、標的配列はイントロン配列およびエクソン配列をともに含む）。
【００６６】
一実施形態では、第一および第二のｇＲＮＡの第一の標的配列および第二の標的配列は、それぞれが表３、６もしくは８に挙げられる、または図１１に示される標的配列から選択される標的配列を含むか、これよりなるものである。
【００６７】
一実施形態では、第一および第二の標的配列はそれぞれ独立に、長さが１０〜４０ヌクレオチドである。
【００６８】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、図４、１３、１５、１７、２１もしくは２２または表４もしくは７に記載されるｇＲＮＡ対から選択される。諸実施形態では、ｇＲＮＡ対は、表８に記載されるｇＲＮＡ２０と２３または２０と２２から選択されるものではない。
【００６９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡおよび第二のｇＲＮＡは、表３、６もしくは８に挙げられる、または図１１に示されるｇＲＮＡから選択される。一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡおよび第二のｇＲＮＡは、表８に記載されるｇＲＮＡ２０、２２、２３または２６の標的配列からなる標的配列を有するものではない。一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡは、配列ＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡ（配列番号８３）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７０】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡは、配列ＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１０８）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７１】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡは、配列ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣ（配列番号１１０）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７２】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第二のｇＲＮＡは、配列ＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＡＧＡＴＧ（配列番号９３）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７３】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第二のｇＲＮＡは、配列ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡ（配列番号１２１）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７４】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第二のｇＲＮＡは、配列ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号１２３）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７５】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１０８）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡ（配列番号１２１）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００７６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣ（配列番号１１０）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号１２３）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００７７】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡは、配列ＡＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＴ（配列番号２０７）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７８】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第一のｇＲＮＡは、配列ＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号２０８）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００７９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第二のｇＲＮＡは、配列ＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号２１１）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００８０】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第二のｇＲＮＡは、配列ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００８１】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対の第二のｇＲＮＡは、配列ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）を含むかこれよりなる標的配列を有する。
【００８２】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＡＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＴ（配列番号２０７）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００８３】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＡＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＴ（配列番号２０７）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００８４】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号２０８）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００８５】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号２１１）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００８６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号２１０）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号２１１）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００８７】
一実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号２０８）である第一の標的配列を有する第一のｇＲＮＡと、ＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡ（配列番号２０９）である第二の標的配列を有する第二のｇＲＮＡとからなる。
【００８８】
また、本明細書に記載されるｇＲＮＡ対の一方または両方のメンバーをコードする１つまたは複数の配列を含む、核酸も提供される。一実施形態では、核酸は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。
【００８９】
また、本明細書に記載されるようにライゲートされた第一および第二のエクソン末端またはイントロン末端を含む改変ジストロフィン遺伝子を含む、核酸も提供される。一実施形態では、核酸は、図５ａ、９ａ（ｉｉ）または１７に記載されるハイブリッドエクソン配列を含む。一実施形態では、核酸は、図１６ｂに記載されるポリペプチド配列を有するハイブリッドスペクトリン様反復配列（ＳＬＲ）をコードする、ポリヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
諸実施形態では、改変ジストロフィン遺伝子は、表３または６に明記される切断部位によって定められるライゲートされた第一のエクソン末端と第二のエクソン末端とを含む。諸実施形態では、改変ジストロフィン遺伝子は、表８に明記される切断部位によって定められるライゲートされた第一のイントロン末端と第二のイントロン末端とを含む。さらなる実施形態では、第一の切断部位は、ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド６７６９と６７７０の間にあり、第二の切断部位は、ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド８５５４と８５５５の間にある。さらなる実施形態では、第一の切断部位は、ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド６８３３と６８３４の間にあり、第二の切断部位は、ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド８６５７と８６５８の間にある。さらなる実施形態では、第一の切断部位は、ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド７２２８と７２２９の間にあり、第二の切断部位は、ＤＹＳ遺伝子のヌクレオチド７９１２と７９１３の間にある。
【００９１】
また、上記の核酸によってコードされる改変ジストロフィンポリペプチドも提供される。
【００９２】
また、本明細書に記載される核酸を含むベクターも提供される。一実施形態では、ベクターはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはセンダイウイルス由来のベクター）である。
【００９３】
また、本明細書に記載されるｇＲＮＡ対の一方もしくは両方のメンバー、核酸、ポリペプチドおよび／またはベクターを含む、細胞（例えば、宿主細胞）も提供される。諸実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞であり、さらなる実施形態ではヒト細胞である。一実施形態では、細胞は筋肉細胞（例えば、筋芽細胞または筋細胞）である。一実施形態では、細胞は、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤ）に罹患している対象の細胞である。
【００９４】
また、本明細書に記載されるｇＲＮＡ対の一方もしくは両方のメンバー、核酸、ポリペプチド、ベクターおよび／または細胞を含む、組成物も提供される。一実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む。一実施形態では、組成物は、生物学的または薬学的に許容される担体をさらに含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される使用のためのものである。
【００９５】
また、本明細書に記載されるｇＲＮＡ対の一方もしくは両方のメンバー、核酸、ポリペプチド、ベクター、細胞、組成物、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸を含む、キットも提供される。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施するための指示書をさらに含むか、または本明細書に記載される使用のためのものである。
【００９６】
一実施形態では、キットは、必要とする対象の筋ジストロフィーの治療に使用するものである。
【００９７】
また、対象の筋ジストロフィーを治療する方法であって、本明細書に記載される方法に従って、前記対象の細胞内でジストロフィン遺伝子を改変し、ジストロフィン発現のための正確なリーディングフレームを回復させることを含む、方法も提供される。
【００９８】
また、対象の筋ジストロフィーを治療する方法であって、対象の細胞と、（ｉ）（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）本明細書に記載される組成物とを接触させることを含む、方法も提供される。
【００９９】
また、対象の筋ジストロフィーの治療への（ｉ）（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）本明細書に記載される組成物の使用も提供される。
【０１００】
また、対象の筋ジストロフィーを治療する薬物の調製への（ｉ）（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）本明細書に記載される組成物の使用も提供される。
【０１０１】
また、対象の筋ジストロフィーの治療に使用する（ｉ）（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）本明細書に記載される組成物も提供される。
【０１０２】
また、対象の筋ジストロフィーを治療する薬物の調製に使用する（ｉ）（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸あるいは（ｉｉ）本明細書に記載される組成物も提供される。
【０１０３】
一実施形態では、筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
【０１０４】
また、（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ対または前記ｇＲＮＡ対をコードする１つもしくは複数の核酸と、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸とを含む、反応混合物も提供される。
【０１０５】
本発明のその他の目的、利点および特徴については、添付図面を参照しながら、単なる例として記載される以下の好ましい実施形態の非限定的な説明を読めばさらに明らかになるであろう。
【０１０６】
添付図面については以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本試験に使用したプラスミドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す図である。（ａ）発現ベクターｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰには、プロトスペーサー配列を挿入するためＢｂｓＩ部位が２つ含まれている。ガイドＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。ガイドＲＮＡは、ＤＹＳ遺伝子のエクソン５０（ｂ）および５４（ｃ）のＰＡＭ（すなわち、ＮＧＧ配列）を特定してから設計したものである。図には、ヒトＤＹＳ遺伝子のエクソン５０（ｂ）および５４（ｃ）の配列が示されている。エクソン５０では１０の異なるＰＡＭ（１〜１０の番号が付されている）が特定され、そのうち６つはセンス鎖内にあり、４つはアンチセンス鎖内にある。エクソン５４では１４のＰＡＭが特定され、そのうち５つはセンス鎖内にあり、９つはアンチセンス鎖内にある。センス鎖（上）およびアンチセンス鎖（下）のＰＡＭのＧＧには陰影が施されている。両鎖ともＰＡＭの３つ目のヌクレオチド（すなわち、ＧＧに隣接するもの）にも陰影が施されている。これらのＰＡＭに隣接する配列を標的とする例示的ｇＲＮＡについては表３、６および８を参照されたい。
【図２】本発明の一実施形態に従って調製した構築物のトランスフェクション効率を示す図である。２９３Ｔ（ａ）およびＤＭＤ筋芽細胞（ｂおよびｃ）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００でｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰをトランスフェクトした後、ｅＧＦＰ発現をモニターした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いたトランスフェクションプロトコルに修正を施したところ、ＤＭＤ筋芽細胞のトランスフェクション効率が増大した（ｃ対ｂ）。
【図３】２９３Ｔ細胞および筋芽細胞でｇＲＮＡをスクリーニングするためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す図である。エクソン５０および５４を標的とする異なるｇＲＮＡを個別にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ａおよびｂ）または筋芽細胞（ｃおよびｄ）から抽出したゲノムＤＮＡでアッセイを実施した。エクソン５０（ａおよびｃ）およびエクソン５４（ｂおよびｄ）について別個にスクリーニングを実施した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの陰性対照（ＮＣ）には未トランスフェクト細胞のゲノムＤＮＡを用いた。ｇＲＮＡの番号は標的化配列（表１）に対応する。ＭＷ：分子量マーカー。
【図４】ＣｉｎＤｅｌ法により、考え得る４種類のＤＹＳ遺伝子改変を生じさせることが可能であることを示す図である。（ａ）Ｃａｓ９および様々なｇＲＮＡ対によって生じる二本鎖切断は、理論的には４つの異なる方法でＤＹＳ遺伝子を改変し得る：１）明灰色（１列目および５列目の影を付けたセル）は、エクソン５０および５４の正常なコドンの正確な連結である；２）濃灰色（２〜４列目、６〜９列目、１１列目、１３列目および１４列目の影を付けたセルならびに１０列目および１２列目の３行目および４行目の影を付けたセル）では、エクソン５０および５４のヌクレオチドの連結によって連結部位に新たなアミノ酸のコドンが発生するが、エクソン５４の残りのコドンは正常である；３）白色（影を付けていないセル）では、エクソン５０および５４のヌクレオチドの連結によって不正確なリーディングフレームが生じ、それがエクソン５４の残りのコドンを変化させる；４）黒色（１０列目および１２列目の２行目の濃く影を付けたセル）では、エクソン５０および５４のヌクレオチドの連結によって連結部位に新たな終止コドンが発生する。（ｂ）様々なｇＲＮＡの組合せを２９３Ｔ細胞および筋芽細胞で実験的に試験し、ＰＣＲ増幅により、予測された大きさのアンプリコンを得た。これらのハイブリッドエクソンのアンプリコンのシーケンシングにより、予測された改変が示された（１行目は上の「明灰色」に対応し；２行目は上の「濃灰色」に対応し；３行目は上の「白色」に対応し；４行目は上の「黒色」に対応する）。ＭＷ：分子量マーカー。
【図５】ｇＲＮＡ対が、ＤＭＤ筋芽細胞のＤＹＳ遺伝子のリーディングフレームを回復させる欠失を誘導し得ることを示す図である。ｇＲＮＡ２−５０とｇＲＮＡ２−５４の対のトランスフェクション後にハイブリッドエクソン５０−５４の増幅から得られた配列（ａ）には、連結部位に新たに形成されたコドンＴＡＴ（チロシンをコードする）がみられる。この新たなコドンは、残りのエクソン５０のヌクレオチドＴおよび残りのエクソン５４のヌクレオチドＡＴによって形成されている。これ以外のインフレーム配列およびアウトオブフレーム配列もみられた（ｂ）。
【図６】ＣｉｎＤｅｌ修正がｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスモデルにｉｎ  ｖｉｖｏで効果があることを示す図である。ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）にＲＮＡ２−５０およびｇＲＮＡ２−５４をコードする２つのプラスミドをエレクトロポレートした。７日後、マウスを屠殺した。エクソン５０および５４のアンプリコンにＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ａ）を実施した。ｇＲＮＡをエレクトロポレートした筋肉のアンプリコンにはＳｕｒｖｅｙｏｒ酵素による切断に起因する追加の２本のバンドが観察されたが、ｇＲＮＡをエレクトロポレートしなかった対照筋肉（ＣＴＬ）には観察されなかった。ｇＲＮＡ対をエレクトロポレートしたｈＤＭＤ／ｍｄｘの筋肉から抽出したＤＮＡのエクソン５０、エクソン５４およびハイブリッドエクソン５０−５４のＰＣＲ増幅（ｂ）。ＭＷ：分子量マーカー。
【図７】筋芽細胞のＣｉｎＤｅｌ修正によって筋管のＤＹＳタンパク質発現が回復したことを示す図である。（ａ）正常な野生型筋芽細胞（ＣＴＬ＋）、エクソン５１〜５３が欠失した未修正ＤＭＤ筋芽細胞（ＣＴＬ−）およびＣｉｎＤｅｌ修正ＤＭＤ筋芽細胞（ＣｉｎＤｅｌ）を融合させて、複数の核を含む筋管を多数形成させた。これらの３つのタイプの筋管からタンパク質を抽出した。ＤＭＤ筋芽細胞（Δ５１〜５３）に（ｂ）ｇＲＮＡ２−５０とｇＲＮＡ２−５４および（ｃ）ｇＲＮＡ１−５０とｇＲＮＡ５−５４で遺伝子修正を実施した。ｂおよびｃでは、ウエスタンブロットにより、未修正ＤＭＤ筋管（ＣＴＬ−）にはＤＹＳタンパク質が検出されず、野生型筋管（ＣＴＬ＋）には４２７ｋＤａのＤＹＳタンパク質が検出され、ＣｉｎＤｅｌ修正ＤＭＤ筋管（ＣｉｎＤｅｌ）には短縮されたＤＹＳタンパク質（約４００ｋＤａ）が検出された。
【図８】リボ核タンパク質−核酸複合体ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの活性を示す図である。（Ａ）ｃｒＲＮＡ（５’ＣＡＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｅｄｉｔ−Ｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）およびＳｐＣａｓ９タンパク質の複合体によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのジストロフィンエクソン５４アンプリコンの切断。（Ｂ）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡまたはエクソン５４を標的とするｓｇＲＮＡ５−５４をＳｐＣａｓ９タンパク質との複合体にしてＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＡ（ＨＨＨＨＨＨＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ、配列番号１９６）で送達しＨｅｌａ細胞に形質導入して得られたＤＭＤエクソン５４のアンプリコンに対するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。予測された追加のバンドが存在することから、エクソン５４のアンプリコンには複合体によるエクソン５４内のＤＳＢによって導入されたインデルが含まれていたことが裏付けられる。（Ｃ）様々な形質導入技術（エレクトロポレーション、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＲＮＡｉＭａｘ（商標）ならびにＦｅｌｄａｎ  ｓｈｕｔｔｌｅ  Ａ（配列番号１９６）およびＢ（ＨＨＨＨＨＨＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＨＨＨＨＨＨ、配列番号１９７）を用いたｈＤＭＤマウス筋肉内へのＳｐＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ対の送達。各形質導入法について筋肉を縦方向に４つの断片に分け、各断片の結果が示されている。ハイブリッドエクソン５０−５４のＰＣＲ増幅により約６００ｂｐの位置にバンドが得られた。
【図９】Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｂを用いてエクソン５０および５４を標的とする２種類のｓｇＲＮＡ：ＳｐＣａｓ９複合体を筋肉内に送達した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで得られたハイブリッドエクソン５０−５４のポリヌクレオチド配列を示す図である。（Ａ）ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスモデルに２種類のリボ核酸複合体ｓｇＲＮＡ：ＳｐＣａｓ９（ｇＲＮＡ１−５０および５−５４）を用いたゲノム編集によって形成されたハイブリッドエクソン５０−５４の（ｉ）予測された配列（配列番号１９９）および（ｉｉ）得られた配列（配列番号２００）。この図では、ＰＣＲ増幅に使用した順方向プライマーおよび逆方向プライマーが灰色で強調されている。エクソン５０のＣａｓ９による切断後に残ったセクションが太字およびイタリック体で示されている。連結部位には下線が施されており、エクソン５４の残りの部分が太字で示されている。（Ｂ）予測された配列（Ｑｕｅｒｙ）と得られた配列（Ｓｂｊｃｔ）との間の相同性の解析から、クローンの６０％では２つの配列が完全にマッチしていることがわかる。このことはハイブリッドエクソン５０−５４の形成を裏付けている。
【図１０】本発明の諸実施形態によるＣｉｎＤｅｌ治療法のまとめを示す図である。ＤＭＤ患者のＤＹＳ遺伝子には、野生型ジストロフィンと比較してエクソン５１、５２および５３の欠失がある。これにより、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際にリーディングフレームシフトが起こってエクソン５４内に終止コドンが生じ、それにより転写が中断される。ＣｉｎＤｅｌ治療によりエクソン５０および５４を切断すると、ハイブリッドエクソン５０／５４が形成されてリーディングフレームが回復し、ｍＲＮＡの正常な転写が可能になる。
【図１１】本試験に使用したプラスミドならびに表６および８に示される例示的ｇＲＮＡのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す図である。（ａ）本発明者らの試験には、Ｕ６プロモーターの制御下にプロトスペーサーの挿入に必要な２つのＢｓａＩ制限部位を含む（下を参照されたい）プラスミドｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡ（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６１５９１；配列番号１６７）を用いた。ｐＸ６０１プラスミドは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）も含む。あるいは、ＳｐＣａｓ９用に設計したｇＲＮＡに化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９を含むｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏプラスミドも用いた（詳細については実施例１９を参照されたい）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９（すなわち、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（Ｎ）、（ｂ）〜（ｈ）を参照されたい）または化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＮＧＧ、（ｉ）および（ｊ）を参照されたい）のＰＡＭと特定してからガイドＲＮＡを設計した。パネル（ｂ）〜（ｊ）は、ヒトＤＹＳ遺伝子の（ｂ）エクソン４６（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４７の１４０７２３６〜１４０７３８３）、（ｃ）エクソン４７（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４７の１４０９７１８〜１４０９８６７）、（ｄ）エクソン４９（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４７の１５０２６６５〜１５０２７６６）、（ｅ）エクソン５１（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４７の１５６５２９２〜１５６５５２４）、（ｆ）エクソン５２（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４の１６０９７３６〜１６０９８５３）、（ｇ）エクソン５３（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４７の１６５９８９８〜１６６０１０９）、（ｈ）エクソン５８（位置：ＥＮＳ０００００１９８９４７の１８６０３９１〜１８６０５０１）；（ｉ）イントロン２２の一部；および（ｊ）イントロン２３の一部の核酸配列を示している。ｇＲＮＡが標的とする配列は太字が示されており、対応するＰＡＭには下線が施されている。エクソン４６では、２つのＰＡＭ（１および２の番号が付されている）が特定され、そのうち１つがセンス鎖内にあり、１つがアンチセンス鎖内にある。エクソン４７では、３つのＰＡＭ（３〜５の番号が付されている）が特定され、そのうち１つがセンス鎖内にあり、２つがアンチセンス鎖内にある。エクソン４９では、アンチセンス鎖内に１つのＰＡＭ（６の番号が付されている）が特定された。エクソン５１では、アンチセンス鎖内に２つのＰＡＭ（７および８の番号が付されている）が特定された。エクソン５２では、２つのＰＡＭ（９および１０の番号が付されている）が特定され、そのうち１つがセンス鎖内にあり、１つがアンチセンス鎖内にある。エクソン５３では、５つのＰＡＭ（１１〜１５の番号が付されている）が特定され、そのうち３つがセンス鎖内にあり、２つがアンチセンス鎖内にある。エクソン５８では、３つのＰＡＭ（１６〜１８の番号が付されている）が特定され、そのうち１���がセンス鎖内にあり、２つがアンチセンス鎖内にある。イントロン２２（配列番号２２８）では、４つのＰＡＭ（１９、２１、２２および２３）を選択し、そのうち２つがセンス鎖内にあり、２つがアンチセンス鎖内にある。イントロン２３（配列番号２２９）では、４つのＰＡＭ（２０、２４、２５および２６の番号が付されている）を選択し、そのうち２つがセンス鎖内にあり、２つがアンチセンス鎖内にある。エクソン２３のうちイントロン２２の下流、イントロン２３の上流にある部分が灰色で強調されている。これらのＰＡＭに隣接する配列を標的とするｇＲＮＡについては表６および８を参照されたい。
【図１２】２９３Ｔ細胞でｇＲＮＡをスクリーニング（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す図である。様々なｇＲＮＡを個別にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ａ〜ｇ）から抽出したゲノムＤＮＡでアッセイを実施した。エクソン４６（ａ）、エクソン４７（ｂ）、エクソン４９（ｃ）、エクソン５１（ｄ）、エクソン５２（ｅ）、エクソン５３（ｆ）、エクソン５８（ｇ）についてスクリーニングを別個に実施した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの対照（Ｃｔ）として未トランスフェクト細胞のゲノムＤＮＡを用いた。ｇＲＮＡの番号は標的化配列（表６）に対応する。ＭＷ：分子量マーカー。本発明者らが試験したｇＲＮＡのうち、ｇＲＮＡ９，１１および１５は、試験条件下では検出可能な活性を示さなかったが、ｇＲＮＡ１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７および１８は、ｓｕｒｖｅｙｏｒ酵素アッセイによって示されるように、優れた効率を示した。
【図１３】ＰＣＲ増幅により予測された大きさのアンプリコンが得られた様々なｇＲＮＡの組合せ（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）の２９３Ｔ細胞における活性を示す図である。（ａ）ｇＲＮＡ１と７の組合せおよびｇＲＮＡ１と８の組合せではハイブリッドエクソン４６−５１が得られた。（ｂ）ｇＲＮＡ１と１２の組合せ、ｇＲＮＡ１と１３の組合せ、ｇＲＮＡ２と１４の組合せおよびｇＲＮＡ２と１５の組合せではハイブリッドエクソン４６−５３が得られた。（ｃ）ｇＲＮＡ５と９の組合せによりハイブリッドエクソン４７−５２が得られる。（ｄ）ｇＲＮＡ６と１０の組合せによりハイブリッドエクソン４９−５２が得られる。（ｅ）ｇＲＮＡ６と１１の組合せによりハイブリッドエクソン４９−５３が得られる。ｇＲＮＡ３と１６の組合せ、ｇＲＮＡ４と１７の組合せおよびｇＲＮＡ５と１８の組合せではハイブリッドエクソン４７−５８が得られる。
【図１４】完全なスペクトリン様反復配列Ｒ１９および様々なハイブリッドスペクトリン様反復配列の構造を示す図である。（ａ）スペクトリン様反復配列Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１の一次構造のアライメント。これらのスペクトリン反復配列に関連するエクソンが灰色で識別されている（配列の下）。配列の上にはスペクトリン反復配列の二次構造が示されており、Ｈがアルファヘリックスであり、Ｃがループセグメントである。得られたハイブリッドスペクトリン様反復配列Ｒ１９〜Ｒ２１では、同じ色の矢印の対の間にある残基が欠失している。エクソン５１〜５３が欠失している患者では、エクソン５０をスキップし、それによりエクソン４９〜５４を直接連結することによってリーディングフレームが回復し得る。エクソン４９〜５４の欠失の連結点が赤色で強調されている。ハイブリッドエクソン２〜５０／２〜５４の連結点が青色で強調されており、ハイブリッドエクソン１〜５０／４〜５４の連結点が緑色で強調されている。（ｂ）ｅＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  Ｗｅｂｓｉｔｅから完全なスペクトリン反復配列Ｒ１９の相同性モデルを入手した。（ｃ）エクソン５０〜５３の欠失の相同性モデル（エクソン５１〜５３が欠失している患者のエクソン５０をスキップすることによって得られた）。（ｄ）ハイブリッドエクソン２〜５０／２〜５４および（ｅ）ハイブリッドエクソン１〜５０／４〜５４の相同性モデルも図示されている。一次配列アライメントで特定される構造モチーフが以下のように着色されている：へリックスＡが緑色であり、へリックスＢがオレンジ色であり、へリックスＣが青色である。ループＡＢおよびＢＣは明灰色である。スペクトリン反復配列Ｒ１９は色が濃く、スペクトリン反復配列Ｒ２１は色が薄い。
【図１５】ＳａＣａｓ９と組み合わせて使用した様々なｇＲＮＡの組合せの活性を示す図である。アウトオブフレーム欠失（デルタ４９〜５０、デルタ５１〜５３およびデルタ５１〜５６）の異なるＤＭＤ患者に由来し、ＰＣＲ増幅により予測された大きさのアンプリコンが得られた３種類の異なる筋芽細胞でこれらの組合せを実験的に試験した。ｓｇＲＮＡ３と１６の組合せおよびｓｇＲＮＡ５と１８の組合せでは、順方向プライマーであるセンス４７’（５’−ＣＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＡＧＴＴＧ）（配列番号１９４）および逆方向プライマーであるアンチセンス５８’（５’−ＧＣＡＣＡＡＡＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＧＧＴＡＧ）（配列番号１９５）を用いてＰＣＲにより増幅されたハイブリッドエクソン４７−５８が得られた。
【図１６】スペクトリン様反復配列内で特定され試験した１８種類の例示的ｓｇＲＮＡ（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ）の切断部位の局在（Ａ）ならびに様々なｇＲＮＡの組合せを用いて得られたハイブリッドスペクトリン様反復配列１７−１９、１７−２０、１８−２０、１８−２１、１９−２０および１８−２３（Ｂ）および（Ｃ）を示す図である。ハイブリッドスペクトリン様反復配列１７−１９はｇＲＮＡ１［ＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡ］（配列番号１０６）と７［ＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴ］（配列番号１１２）の組合せおよびｇＲＮＡ１［ＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡ］（配列番号１０６）と８［ＡＧＴＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣ］（配列番号１１３）の組合せから得られた。ハイブリッドスペクトリン様反復配列１７−２０はｓｇＲＮＡ１［ＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡ］（配列番号１０６）と１２［ＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＧ］（配列番号１１７）の組合せおよびｇＲＮＡ１［ＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡ］（配列番号１０６）と１３［ＣＡＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＡ］（配列番号１１８）の組合せから得られた。ハイブリッドスペクトリン様反復配列１８−２０はｓｇＲＮＡ５［ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣ］（配列番号１１０）と９［ＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡ］（配列番号１１４）の組合せから得られた。ハイブリッドスペクトリン様反復配列１８−２１はｓｇＲＮＡ２［ＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＧ］（配列番号１０７）と１４［ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＧ］（配列番号１１９）の組合せおよびｇＲＮＡ２［ＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＧ］（配列番号１０７）と１５［ＣＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴ］（配列番号１２０）の組合せから得られた。ハイブリッドスペクトリン様反復配列１９−２０はｓｇＲＮＡ６［ＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧ］（配列番号１１１）と１０［ＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴ］（配列番号１１５）の組合せおよびｇＲＮＡ６［ＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧ］（配列番号１１１）と１１［ＴＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＣＴＧＡＴＴ］（配列番号１１６）の組合せから得られた。ハイブリッドスペクトリン様反復配列１８−２３はｇＲＮＡ３［ＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ］（配列番号１０８）と１６［ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡ］（配列番号１２１）および５［ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣ］（配列番号１１０）と１８［ＣＡＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧ］（配列番号１２３）の組合せから得られた。（Ａ）矢印は、ｇＲＮＡによって誘導され得る切断部位を示している。（Ｂ）矢印は、列挙したｓｇＲＮＡの組合せで得られるハイブリッド連結部を示している。
【図１７】ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムとともに使用するための様々なｇＲＮＡの組合せから得られた８種類のハイブリッドエクソンのＤＮＡ配列を示す図である。第一のｇＲＮＡが標的とするエクソン（上流エクソン）に対応するハイブリッドエクソンの最初の部分が明灰色で示され、第二のｇＲＮＡが標的とするエクソンに対応するハイブリッドエクソンの最後の部分が太字で示されている。スラッシュ（／）は連結の位置を示している。
【図１８】ＰＣＲ産物をｐＭｉｎｉＴプラスミドベクターにクローニングした後、数種類のｇＲＮＡの組合せ（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）から得られたハイブリッドエクソンのシーケンシングの結果を示す図である。（ａ）２９３Ｔ細胞で得られシーケンシングを実施したクローンの総数に対する予測されたハイブリッドエクソンの正確なヌクレオチド配列（図１７に示されている）を示すクローンの総数。（ｂ）は、エクソン４９〜５０の欠失、エクソン５１〜５３の欠失またはエクソン５１〜５６の欠失を保有する３種類の異なるＤＭＤ患者の筋芽細胞でｇＲＮＡ３と１６の組合せおよびｇＲＮＡ５と１８の組合せから得られたハイブリッドエクソン４７−５８のシーケンシングの結果を示している。ｇＲＮＡ３と１６の組合せを用いて、欠失４９〜５０、５１〜５３および５１〜５６を保有する筋芽細胞で得られたハイブリッドエクソンのそれぞれ７０％（７／１０）、４０％（４／１０）および８８．８％（８／９）の正確なリーディングフレームを回復させた。ｇＲＮＡ５と１８の組合せを用いて、欠失４９〜５０、５１〜５３および５１〜５６を保有する筋芽細胞で得られたハイブリッドエクソンのそれぞれ７０％（７／１０），５０％（５／１０）および６３．６％（７／１１）の正確なリーディングフレームを回復させた。
【図１９】ヒトＤＹＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号１）およびコードされるヒトジストロフィンのアミノ酸配列（配列番号２）（ＥＮＳＧ０００００１９８９４７の転写物ＤＭＤ−００１（ＥＮＳＴ０００００３５７０３３．８））を示す図である。１行目に大文字の配列領域と小文字の配列領域を交互に記載することによりエクソンが示されている。
【図２０】ヒトＤＹＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列（ＥＮＳＧ０００００１９８９４７の転写物ＤＭＤ−００１（ＥＮＳＴ０００００３５７０３３．８））を示す図である。ｃＤＮＡ配列（配列番号１）は大文字で示され、エクソンによりグループ分けされている。隣接イントロン配列（所与のエクソンの両側にある２５塩基）は太字でない小文字で示されている。５’ＵＴＲの２５ｎｔの先頭が太字の小文字で示されており；３’ＵＴＲの２５ｎｔの末端が太字の小文字で示されている。５’ＵＴＲの２５ｎｔ＋エクソン１のｃＤＮＡ配列＋３’側のイントロン配列の２５ｎｔが配列番号３に対応し；両側（５’側および３’側）に隣接するイントロン配列の２５ｎｔを有するエクソン２〜７８のｃＤＮＡ配列がそれぞれ配列番号４〜８０に対応し；３’側のイントロン配列の２５ｎｔ＋エクソン７９のｃＤＮＡ配列＋３’ＵＴＲの２５ｎｔが配列番号８１に対応する。
【図２１】マウスモデルｈＤＭＤ／ｍｄｘに２種類のＡＡＶ９ベクターを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで実験的に試験した様々なｇＲＮＡの組合せ（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）を示す図である。（ａ）は、ＳａＣａｓ９をコードするＡＡＶ９  ７．５×１０１１ｖｇと、ｇＲＮＡ３とｇＲＮＡ１６またはｇＲＮＡ５とｇＲＮＡ１８をコードするＡＡＶ９  ７．５×１０１１ｖｇとの組合せを静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）に注射することにより、予測された大きさのＰＣＲアンプリコンの生成によって示されるように、マウスモデルの心臓にｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリッドエクソン４７−５８が生じることを示している。（ｂ）は、ＳａＣａｓ９をコードするＡＡＶ９  ７．５×１０１１ｖｇと、ｇＲＮＡ３とｇＲＮＡ１６またはｇＲＮＡ５とｇＲＮＡ１８をコードするＡＡＶ９  ７．５×１０１１ｖｇとの組合せを静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）に注射することにより、予測された大きさのＰＣＲアンプリコンの生成によって示されるように、マウスモデルの横隔膜にｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリッドエクソン４７−５８が生じることを示している。（ｃ）は、ＳａＣａｓ９をコードするＡＡＶ９  ７．５×１０１１ｖｇと、ｇＲＮＡ３とｇＲＮＡ１６をコードするＡＡＶ９  ７．５×１０１１ｖｇとの組合せを静脈内（ＩＶ）に注射することにより、予測された大きさのＰＣＲアンプリコンの生成によって示されるように、マウスモデルの前脛骨筋にｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリッドエクソン４７−５８が生じることを示している。しかし、腹腔内注射した場合の前脛骨筋およびｇＲＮＡ５とｇＲＮＡ１８をコードするＡＡＶ９を静脈内注射した場合には、ハイブリッドエクソンを検出することができなかった。
【図２２】イントロン２２またはイントロン２３を標的とするｇＲＮＡのＣ２Ｃ１２筋芽細胞での活性を示す図である。（ａ）は、エクソン２３の周辺イントロンを標的とする選択された８種類のｇＲＮＡのｓｕｒｖｅｙｏｒ酵素アッセイを示している。ｇＲＮＡ１９、ｇＲＮＡ２１、ｇＲＮＡ２２およびｇＲＮＡ２３はイントロン２２を標的とし、ｇＲＮＡ２０、ｇＲＮＡ２４、ｇＲＮＡ２５およびｇＲＮＡ２６はイントロン２３を標的とする。これらのｇＲＮＡ標的配列を表８に示す。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの対照（ＮＴ）として、未トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞および選択されなかったＣ２Ｃ１２細胞のゲノムＤＮＡを用いた。（ｂ）は、実験的に試験し、ＰＣＲ増幅により２種類の産物が得られた様々なｇＲＮＡの組合せ（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）を示しており：上段のＰＣＲ増幅産物は野生型ゲノムＤＮＡに対応し、大きさの小さい２段目の増幅産物はエクソン２３の欠失に対応する。
【図２３】ＦＳＡ、ＦＳＢおよびＦＳＣと複合体を形成したＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを４か月齢のマウスに筋肉内注射した後、抗ジストロフィン抗体で標識した筋肉切片の免疫組織化学解析を示す図である。ｇＲＮＡ２０と２２の組合せおよびｇＲＮＡ２０と２３の組合せをＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼとともにＦＳＡ（配列番号１９６）、ＦＳＢ（配列番号１９７）およびＦＳＣ（ＨＨＨＨＨＨＬＬＫＬＷＳＲＬＬＫＬＷＴＱＧＲＲＬＫＡＫＲＡＫＡＨＨＨＨＨＨ、配列番号１９８）と複合体を形成させ筋肉内注射して試験した。筋肉内注射から３週間後、マウスを屠殺した。前脛骨筋を回収した後、一次マウスＮＣＬ−Ｄｙｓ２抗ジストロフィン抗体および二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６ヤギ抗マウス抗体（Ｈ＋Ｌ）を用いて試料にジストロフィン染色を実施した。（ａ）は未処理マウスでのジストロフィン発現を示している。このように、ジストロフィン陽性線維によりジストロフィン復帰変異体線維が確認される。（ｂ）は、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２２の組合せと複合体を形成したＦＳＡを注射したマウスでのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｃ）は、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２２の組合せと複合体を形成したＦＳＢを注射したマウスでのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｄ）は、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２２の組合せと複合体を形成したＦＳＣを注射したマウスでのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｅ）は、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２３の組合せと複合体を形成したＦＳＡを注射したマウスでのジストロフィンタンパク質の発現を示している。（ｆ）は、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２３の組合せと複合体を形成したＦＳＢを注射したマウスでのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｇ）は、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２３の組合せと複合体を形成したＦＳＣを注射したマウスでのジストロフィンタンパク質発現を示している。
【図２４】Ｒａｇ／ｍｄｘマウスに様々なポリペプチドベースのシャトル（Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ）と複合体を形成したｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９を筋肉内注射した後、免疫組織化学によって確認された陽性ジストロフィン線維の数を示す図である。ｇＲＮＡ２２と２０の組合せまたはｇＲＮＡ２３と２０の組合せと複合体を形成したＳｐＣａｓ９タンパク質の送達にはＦＳＡ、ＦＳＢおよびＦＳＣ  Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅを用いた。対照筋肉（ＮＴ）には、復帰変異体線維に対応するジストロフィン陽性線維が約３７本（ＳＤ±４．６８）認められた。ｇＲＮＡ４と２の組合せについては、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＡ、ＦＳＢおよびＦＳＣでジストロフィン陽性線維がそれぞれ８３本（ＳＤ±１８．８）、４９．５本（ＳＤ±８．６）および１８６本（ＳＤ±５２）カウントされた。ｇＲＮＡ５と２の組合せについては、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＡ、ＦＳＢおよびＦＳＣでジストロフィン陽性線維がそれぞれ３９本（ＳＤ±１６．０）、９９本（ＳＤ±１５．６）および１９９本（ＳＤ±３７．２）カウントされた。
【図２５】様々なポリペプチドベースのシャトル（Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ）と複合体を形成したｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９を筋肉内注射した後のＲａｇ／ｍｄｘマウスのゲノムＤＮＡからハイブリッドイントロン（すなわち、エクソン２３の欠失）を検出するＰＣＲ増幅の結果を示す図である。（ａ）は、プライマーＦｗ１−ｉ２２およびＲｅｖ１−ｉ２３をポイズンプライマーＦｗ−Ｐとともに用いた１回目のＰＣＲから得られたアンプリコンを示している。検出されたアンプリコンは、エクソン２３の欠失が検出されない野生型ゲノムＤＮＡのＦｗ−ＰおよびＲｅｖ１−ｉ２２からの増幅に対応する。（ｂ）は、前のＰＣＲ反応物に内側プライマーＦｗ２−ｉ２２およびＲｅｖ２−ｉ２２を加えたもの１μＬで実施したネステッドＰＣＲ増幅の結果を示している。ＮＴには、予測された通り、野生型配列の増幅のみがみられた。Ｃａｓ９ならびにＦＳＡ、ＦＳＢおよびＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２２と２０の組合せの送達により、エクソン２３の欠失に予測された大きさの短縮されたＰＣＲ産物の増幅が得られた。さらに、ＳｐＣａｓ９およびＦＳＡ、ＦＳＢまたはＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２３と２０の組合せの送達により、エクソン２３の欠失に予測された大きさの短縮されたＰＣＲ産物の増幅が得られた。しかし、ｇＲＮＡ２３と２０の組合せおよびＦＳＡ  ｓｈｕｔｔｌｅでは、短縮されたＰＣＲ産物は検出されなかった。エクソン２３の欠失を裏付ける短縮されたＰＣＲ産物のシーケンシングについては現時点で進行中である。
【図２６】６週齢マウスにＦＳＣと複合体を形成したＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡまたは複合体を形成していないＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを筋肉内注射した後、抗ジストロフィン抗体で標識した筋肉切片の免疫組織化学解析を示す図である。この実験では、ｇＲＮＡ２０と２２の組合せおよびｇＲＮＡ２０と２３の組合せをＦＳＣと複合体を形成したタンパク質ＳｐＣａｓ９または複合体を形成していないＳｐＣａｓ９とともに筋肉内注射して試験した。６週齢のマウスに注射を実施し、注射から３週間後、前脛骨筋を採取した。一次マウスＮＣＬ−Ｄｙｓ２抗ジストロフィン抗体および二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ヤギ抗マウス抗体（Ｈ＋Ｌ）を用いて試料にジストロフィン染色を実施した。（ａ）および（ｂ）は、ＳｐＣａｓ９タンパク質と複合体を形成しシャトルとは複合体を形成していないｇＲＮＡ２０と２３を注射した筋肉でのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｃ）は、ＳｐＣａｓ９タンパク質およびＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２０と２３を注射した筋肉でのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｄ）および（ｅ）は、ＳｐＣａｓ９タンパク質と複合体を形成しシャトルとは複合体を形成していないｇＲＮＡ２０と２２を注射した筋肉でのジストロフィンタンパク質発現を示している。（ｆ）および（ｇ）は、ＳｐＣａｓ９タンパク質およびＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２０と２２を注射した筋肉でのジストロフィンタンパク質発現を示している。
【図２７】６週齢のＲａｇ／ｍｄｘマウスにＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡとＳｐＣａｓ９または複合体を形成していないｇＲＮＡとＳｐＣａｓ９を筋肉内注射した後、免疫組織化学によって確認された陽性ジストロフィン線維の数を示す図である。ここでは、ｇＲＮＡ２０および２２またはｇＲＮＡ２０および２３と複合体を形成したＳｐＣａｓ９タンパク質の送達を、前回最も有望な結果を示したＦＳＣを加えた場合と加えない場合とで比較した。ｇＲＮＡ２０および２２またはｇＲＮＡ２０および２３と複合体を形成したＳｐＣａｓ９にシャトルを加えずに注射した筋肉では、ジストロフィン陽性線維がそれぞれ１０１本（ＳＤ±６．２）および１２０本（ＳＤ±３８．９）カウントされた。ＦＳＣをＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２２またはｇＲＮＡ２０と２３と組み合わせて使用した場合、これより多数のジストロフィン陽性線維が検出され、それぞれ１５１本（ＳＤ±９３．３）および１６６本（ＳＤ±２５．６）認められた。
【図２８】６週齢のマウスにＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＣを用いたハイブリッドイントロン（すなわち、エクソン２３の欠失）のＰＣＲ検出を示す図である。（ａ）は、プライマーＦｗ１−ｉ２２およびＲｅｖ１−ｉ２３をポイズンプライマーＦｗ−Ｐとともに用いた１回目のＰＣＲから得られたアンプリコンを示している。検出されたアンプリコンは、エクソン２３の欠失が検出されない野生型ゲノムＤＮＡのＦｗ−ＰおよびＲｅｖ１−ｉ２２からの増幅に対応する。（ｂ）は、前のＰＣＲ反応物に内側プライマーＦｗ２−ｉ２２およびＲｅｖ２−ｉ２２を加えたもの１μＬで実施したネステッドＰＣＲ増幅の結果を示している。ＮＴには、予測された通り、野生型配列の増幅のみがみられた。Ｃａｓ９と複合体を形成したｇＲＮＡ２２と２０の組合せをシャトルＦＳＣを用いて、またはシャトルＦＳＣを用いずに送達したところ、エクソン２３の欠失に予測された大きさの短縮されたＰＣＲ産物の増幅が得られた。さらに、ＳｐＣａｓ９と複合体を形成したｇＲＮＡ２３と２０の組合せをＦＳＣを用いて、またはＦＳＣを用いずに送達したところ、注射の失敗に対応するｇＲＮＡ２０と２３およびＦＳＣに関する最初のレーンを除いて、エクソン２３の欠失に予測された大きさの短縮されたＰＣＲ産物の増幅が得られた。エクソン２３の欠失を裏付ける短縮されたＰＣＲ産物のシーケンシングについては現時点で進行中である。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
（例示的実施形態の説明）
第一の態様では、本発明は、細胞のＤＹＳ遺伝子内の内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異の上流および下流に位置するエクソン配列内に変異を導入することにより、細胞内で正確なリーディングフレームを回復させ、ひいてはジストロフィン発現を回復させることが可能であるという本出願者らの発見に基づくものである。リーディングフレームを修正する変異は、エクソン内で内在性のフレームシフト変異またはナンセンス変異にできる限り近くに導入するのが好ましい。操作した変異の部位が１つまたは複数のエクソン内にあることから、修正された遺伝子は、２つのエクソン部分（すなわち、通常は互いに隣接していないエクソン部分）の融合物を有し、それと同時にＤＹＳ遺伝子の正確なリーディングフレームを回復させる。本出願者らはこの方法を用いて、細胞内でジストロフィン発現を回復させて、欠失が少なく機能的に野生型ジストロフィンタンパク質に近いジストロフィンタンパク質を産生させることが可能であることを発見した。
【０１０９】
ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソン内に１つまたは複数の変異を導入し、ジストロフィン発現を回復させるには、複数の方法を用いることができる。例えば、配列特異的ヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどを用いて、ＤＹＳ遺伝子の１つまたは複数のエクソン内に１つまたは複数の標的化変異を導入し、ジストロフィン発現を回復させることができる。細胞内のＤＹＳ遺伝子に既に存在する内在性変異によっては、本発明の方法が野生型ジストロフィンタンパク質の発現を引き起こすことも、引き起こさないこともある。しかし、内在性変異（１つまたは複数）に近い位置にある（イントロンではなく）エクソン配列を標的とすることにより、細胞は野生型ジストロフィンタンパク質のものに近い機能を有するジストロフィンタンパク質を有利に発現することがわかった。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて細胞内の変異ジストロフィン遺伝子のエクソン内にさらなる変異を導入する。ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌種で確認された防御機序の１つである［３７〜４２］。これは、哺乳動物細胞の遺伝子編集ができるように改変されている。この改変されたシステムでは依然として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いて特異的ＤＮＡ標的配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせる［４３、４４］。切断部位の認識は、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡの塩基対形成および標的ＤＮＡ配列と並列するＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれるトリヌクレオチドの存在によって決まる［４５］。このＰＡＭは、最もよく用いられる酵素である化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９ではＮＧＧである［４６、４７］。このＰＡＭは、アデノ随伴ウイルス送達およびペアニッカーゼ（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体の場合）適用において有利に使用することができる小型のＣａｓ９であり効率の高い黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９では、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（Ｎ）である。
【０１１１】
さらなる態様では、本発明は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の組合せを細胞内に送達するにはポリペプチドベースのシャトル（Ｆｅｌｄａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ）を用いるのが特に効果的であるという本出願者らの発見に基づくものである。
【０１１２】
シャトルはタンパク質または核酸（例えば、ｇＲＮＡｓ）を細胞内に直接送達する。送達後、それらのタンパク質／ｇＲＮＡは担体から遊離し、自由に遺伝子改変を誘導する。シャトルは１００％タンパク質をベースとするものであり、細胞内で迅速に分解され、毒性の残基を一切残さない。シャトルは、複数の細胞型に細胞生存能を変化させずにタンパク質／核酸を送達することができる。シャトルは無ウイルス、無ＤＮＡおよび無ＲＮＡであり、このため、変異を誘発するリスクがなくなる。
【０１１３】
有用なポリペプチドベースのシャトルならびにポリペプチドベースの（Ｆｅｌｄａｎ）シャトルの調製方法および使用方法については、２０１６年４月８日に出願された米国特許出願第１５／０９４，３６５号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｓａｍｅ）；２０１６年４月８日に出願された国際（ＰＣＴ）出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１６／０５０４０３号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｓａｍｅ）；２０１６年４月８日に出願された米国特許仮出願第６２／３２０，０６５号（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）；および２０１６年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４０７，２３２号（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ａｎｄ／ｏｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ，ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｓａｍｅ）に記載されており、上記出願はその全体が参照により組み込まれる。
【０１１４】
定義
本願の用語に関して明確で一貫した理解がもたらされるように、以下の定義を記載する。
【０１１５】
本明細書で特に明記されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法ならびに上記のものに関する技術は、当該技術分野でよく知られ一般的に使用されるものである。用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、潜在的に何らかの曖昧性がある場合、本明細書に記載される定義がいかなる辞書的定義または付帯的定義に対しても先例となる。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語には複数形が包含されるものとし、複数形の用語には単数形が包含されるものとする。
【０１１６】
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の文法的対象を指すのに使用される。
【０１１７】
本明細書および請求項（１つまたは複数）で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む）（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などの任意の形のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「ｈａｖｉｎｇ」（有する）（ならびに「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などの任意の形のｈａｖｉｎｇ）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（含む）（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」などの任意の形のｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（含む）（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などの任意の形のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という単語は包括的またはオープンエンドものであって、記載されていないほかの要素も方法の段階も除外するものではなく、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ」（特に限定されないが、〜を含む）および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ」（特に限定されないが、〜を含む）という語句と互換的に使用される。
【０１１８】
本明細書に数値範囲が記載される場合、同じ精度でその間に存在する数値が明示的に企図される。例えば、１８〜２０という範囲の場合、数値１８、１９および２０が明示的に企図され、範囲６．０〜７．０の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に企図される。「ｓｕｃｈ  ａｓ」（〜などの）という用語は、本明細書では「ｓｕｃｈ  ａｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ」（特に限定されないが、〜などの）という語句を意味し、これと互換的に使用される。
【０１１９】
本明細書に開示される方法ならびに産物および組成物の調製および使用の実施には、特に明示されない限り、当業者の技能範囲内にある分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびにそれに関連する分野の従来の技術を用いる。これらの技術については文献で十分に説明されている。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  第３版，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的改訂版；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【０１２０】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、直鎖状または環状の立体構造であり、一本鎖または二本鎖の形態であるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的には、これらの用語はポリマーの長さに関して制限がないものと理解されるべきである。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体ならびに塩基、糖および／またリン酸部分（例えば、ホスホロチオアート主鎖）が修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、ある特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対形成特異性を有する、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。
【０１２１】
本発明の様々な遺伝子および核酸配列は組換え配列であり得る。「組換え」という用語は、何かが組み換えられていることを意味し、したがって、核酸構築物に言及する場合、この用語は、分子生物学的技術によって連結または産生された核酸配列を含む分子を指す。タンパク質またはポリペプチドに言及する場合、「組換え」という用語は、分子生物学的技術によって作出した組換え核酸構築物を用いて発現させるタンパク質またはポリペプチド分子を指す。遺伝的構成物に言及する場合、「組換え」という用語は、親ゲノムにはみられなかった新たな対立遺伝子の組合せを有する配偶子、子孫、細胞またはゲノムを指す。組換え核酸構築物は、天然ではライゲートされることのない核酸配列、または天然では異なる位置でライゲートされる核酸配列とライゲートされているか、またはこれとライゲートするよう操作されたヌクレオチド配列を含み得る。したがって、「組換え」の核酸構築物に言及する場合、それは、核酸分子が遺伝子工学を用いて、すなわち、ヒトの介入によって操作されたものであることを表す。組換え核酸構築物は、例えば形質転換によって宿主細胞内に導入され得る。このような組換え核酸構築物は、それを単離し再導入した宿主種と同じ宿主細胞種または異なる宿主細胞種に由来する配列を含み得る。組換え核酸構築物の配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果として、あるいはそれに続く組換えおよび／または修復事象の結果として宿主細胞ゲノム内に組み込まれ得る。
【０１２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然のアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【０１２３】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質またはｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸を投与する個人または哺乳動物の細胞での発現を指令することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントと作動可能に連結された開始シグナルおよび終止シグナルをさらに含み得る。コード配列はコドン最適化されたものであり得る。
【０１２４】
本明細書で使用される「相補体」または「相補的な」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック型塩基対形成（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対形成を指す。「相補性」は、２つの核酸配列を互いに逆平行に並べたとき、各位置にあるヌクレオチド塩基が相補的になるよう両者の間で共有される特性を指す。
【０１２５】
本明細書で使用される「対象」および「患者」は、特に限定されないが、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含めた任意の脊椎動物を指すのに互換的に使用される。いくつかの実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。一実施形態では、対象または患者はＤＭＡに罹患しており、変異ジストロフィン遺伝子を有するものであり得る。対象または患者は他の形態の治療を受けているものであり得る。
【０１２６】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。本明細書に記載される「ベクター」は、核酸配列を運搬する輸送媒体を指し、宿主細胞内に核酸配列を導入する役割を果たす。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ヌクレアーゼまたはポリペプチドをコードすることが可能な配列を含む核酸と作動可能に連結された転写調節配列またはプロモーターを含む。諸実施形態では、プロモーターはＵ６またはＣＢｈプロモーターである。第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係にあるとき、第一の核酸配列は第二の核酸配列と「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合はリーディングフレーム内で、隣接している。ただし、例えば、エンハンサーは一般にプロモーターと数キロベース離れている場合に機能し、イントロン配列は長さを変化させ得るものであるため、一部のポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されているが、隣接はしてない場合がある。「転写調節エレメント」は、作動可能に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列、例えば開始シグナルおよび終止シグナル、エンハンサーおよびプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルなどを指す総称である。ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製する染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、本明細書に記載される少なくとも１つのｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸配列（１つまたは複数）を含み得る。あるいは、ベクターは、本発明の１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）のｇＲＮＡヌクレオチド配列をコードする核酸配列（１つまたは複数）を含み得る。１つまたは複数のｇＲＮＡを発現させるベクターは、ｇＲＮＡの「ＤＮＡ」配列を含む。
【０１２７】
本明細書で互換的に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、パルボウイルス科デペンドウイルス属に属し、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小型のウイルスを指す。ＡＡＶが疾患を引き起こすことは明らかにされておらず、このため、同ウイルスは極めて軽度の免疫応答を引き起こす。
【０１２８】
配列類似性
「相同性」および「相同」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、整列させた配列の各位置を比較することによって求めることができる。核酸配列間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、その配列に共通する位置にある同一であるかマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。この用語を本明細書で使用する場合、ある核酸配列と別の核酸配列が実質的に同一であり、その機能的活性が保存されていれば、その２つの配列は互いに「実質的に相同」である（本明細書で使用される「相同」という用語は、進化的関連性を示すものではなく、むしろ実質的な配列同一性を指すものであり、したがって、「同一性」／「同一」という用語と互換性がある）。２つの核酸配列を（ギャップを許容して）最適に整列させたとき、それらが少なくとも約５０％の配列類似性または同一性を共有しているか、定められた機能的モチーフを共有している場合、その２つの核酸配列は実質的に同一であると見なされる。別の実施形態では、最適に整列させた実質的に同一の配列の配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であり得る。簡潔にするため、単位（例えば、６６、６７．．．８１、８２、．．．９１、９２％．．．．）は体系的に記載されていないが、それでも本発明の範囲内に含まれるものと見なされる。
【０１２９】
実質的に相補的な核酸とは、一方の分子の相補体が他方の分子と実質的に同一である核酸のことである。２つの核酸またはタンパク質配列を最適に整列させたとき、それらが少なくとも約７０％の配列同一性を共有している場合、その２つの核酸またはタンパク質配列は実質的に同一であると見なされる。別の実施形態では、配列同一性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。同一性の比較に最適な配列の整列は、様々なアルゴリズム、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８）の類似性検索法ならびにコンピュータによる上記アルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなど）などを用いて実施し得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）１９９０（公開されている初期設定を用いる）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて配列同一性を求めてもよい。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアは、米国立生物工学情報センターから（インターネットでｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から）入手し得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは最初に、データベース配列内の同じ長さのワードと整列させたときに何らかの正の値の閾値スコアＴにマッチするか、これを満たす短いワード長Ｗをクエリ配列の中で特定することによりスコアの高い配列ペア（ＨＳＰ）を特定する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれるものである。最初の隣接ワードヒットが、さらに長いＨＳＰを見つける最初の検索のシードとしての役割を果たす。累積アライメントスコアを増加させることができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。以下のパラメータが満たされたとき、すなわち、累積アライメントスコアが、得られた最大値から量Ｘだけ減少したとき；１つもしくは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積により累積スコアがゼロ以下になったとき；またはいずれかの配列の末端に到達したとき、各方向へのワードヒットの延長を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、ＴおよびＸがアライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる２つの配列間の統計的類似性の尺度の１つに最小総確率（Ｐ（Ｎ））があり、これは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こる確率を示すものである。本発明の別の実施形態では、試験配列と比較した最小総確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が実質的に同一であると見なされる。
【０１３０】
２つの核酸配列が実質的に相補的であることを示す別の指標として、２つの配列が中程度にストリンジェントな条件下、または好ましくはストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることが挙げられる。中程度にストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションを、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃で実施し、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ，２０１０）。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションを、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃で実施し、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で洗浄し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ，２０１０）。目的とする配列に応じて、既知の方法に従いハイブリダイゼーション条件を修正し得る（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３）。ストリンジェントな条件は一般に、特定の配列の定められたイオン強度およびｐＨでの熱融解点より約５℃低くなるよう選択する。
【０１３１】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間、ｇＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとの間、またはｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の構成要素がすべて配列特異的なものである必要はない（例えば、ＤＮＡ主鎖のリン酸残基との接触）。「親和性」は結合の強さを指し、高い結合親和性と小さいＫｄは相関する。「結合タンパク質」とは、別の分子と非共有結合により結合することができるタンパク質のことである。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体と結合する（それによりホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができ、かつ／または１種類または複数種類の異なるタンパク質の１つまたは複数の分子と結合することができる。結合タンパク質は２種類以上の結合活性を有し得る。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【０１３２】
本明細書で使用される「標的遺伝子」、「標的化遺伝子」、「標的化ポリヌクレオチド」または「標的化遺伝子配列」は、一実施形態ではｇＲＮＡ対およびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入によって、改変する細胞内のポリヌクレオチドに対応する。それは細胞内に天然に存在する内在遺伝子に対応する。一実施形態では、標的化遺伝子は、ＭＤ（例えば、ＤＭＤまたはＢＭＤ）の発症に関連する１つまたは複数のフレームシフト変異またはナンセンス変異を含むＤＹＳ遺伝子である。本発明では、標的化遺伝子の対立遺伝子の一方または両方を細胞内で改変し得る。
【０１３３】
「フレームシフト変異」とは、ＤＮＡ配列の３で割り切れない数のヌクレオチドのインデル（挿入または欠失）を原因とするポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ遺伝子配列）内の変異のことである。コドンによる遺伝子のトリプレット性により、１つまたは複数の挿入または欠失を原因とするフレームシフト変異がリーディングフレーム（コドンの集まり）を変化させ、それにより元のもの（野生型ポリペプチド）とは異なる翻訳産物（変異ポリペプチド）が生じる。フレームシフト変異によって、（未成熟終止コドンの生成により）短縮したポリペプチド、（終止コドンの除去により）通常より大きいポリペプチドおよび／または全部または一部が異なるアミノ酸配列が生じ得る。野生型ポリヌクレオチド（遺伝子）配列の１つまたは複数のフレームシフト変異を原因とする変異ポリペプチドは、ＭＤ（例えば、ＤＭＤまたはＢＭＤ）の原因となるＤＹＳ遺伝子の変異の場合のように非機能性であることが多い。
【０１３４】
「ナンセンス変異」とは、ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ遺伝子配列）内にあり、転写されたｍＲＮＡの未成熟終止コドンもしくはナンセンスコドンおよび短く不完全で通常は非機能性であるタンパク質産物を生じる点変異のことである。本発明との関連における「ナンセンス変異」は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）配列内の少なくとも１つのナンセンス変異の存在を包含し、したがって、複数のこのような変異の存在を含む。
【０１３５】
本明細書で使用される「内在性フレームシフト変異」または「内在性ナンセンス変異」とは、対象の遺伝子内に天然に存在する変異のことである。例えば、筋ジストロフィー（ＤＭＤまたはＢＭＤ）との関連で言えば、内在性フレームシフト変異または内在性ナンセンス変異とは、筋ジストロフィーに罹患している対象の細胞のジストロフィン遺伝子（対立遺伝子の一方または両方）にみられる変異のことである。このような内在性変異（フレームシフトまたはナンセンス）の存在は疾患の発症の原因となる。このような変異の存在によって、ジストロフィンタンパク質の発現レベルの低下、（半減期が短い）不安定なタンパク質の産生、短いタンパク質の産生および／または不活性なタンパク質（または野生型の内在性タンパク質に比して活性の低いタンパク質）がもたらされる。
【０１３６】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞での核酸の発現をもたらす、調節する、または制御する（例えば、活性化、増強および／または抑制する）ことが可能な合成核酸分子または天然由来核酸分子を意味する。プロモーターは、その発現をさらに増強もしくは抑制し、かつ／あるいはその空間的発現および／または一過性発現を変化させる１つまたは複数の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位にエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントも含むことがあり、それらは転写開始部位から数千塩基対もの位置にあり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含めた入手源に由来するものであり得る。プロモーターは、遺伝子構成要素の発現を発現が起こる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現が起こる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオンもしくは誘導薬剤などの外部刺激に応答して恒常的または差次的に調節し得る。プロモーターの代表的例としては、Ｕ６プロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。諸実施形態では、Ｕ６プロモーターを用いて細胞に１つまたは複数のｇＲＮＡを発現させる。
【０１３７】
ＣＲＩＳＰＲシステム
ＣＲＩＳＰＲ技術はゲノム編集、例えば、特定の遺伝子の発現の改変のためのシステムである。
【０１３８】
このシステムは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと呼ばれ、ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびＣａｓタンパク質を標的とするＣＲＩＳＰＲを用いて、侵入してくるウイルスおよびプラスミドＤＮＡに存在する相補的配列を分解する適応免疫防御を発達させた細菌および古細菌での知見に端を発するものである。Ｊｉｎｅｋら（４７）およびＭａｌｉら（４１）は、特注のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いてＤＮＡに二本鎖切断（１つまたは複数）を誘導するＩＩ型細菌ＣＲＩＳＰＲシステムを設計した。あるシステムでは、別個にまたは融合して使用することができ、一般にＲＮアーゼＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性をなくすｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに対応する合成的に再構築した「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」）によりＣａｓ９タンパク質をゲノム標的部位に指向させた。このシステムは、「ｇＲＮＡガイド配列」または「ｇＲＮＡ標的配列」と、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）が標的化遺伝子に結合するのに必要なＲＮＡ配列（Ｃａｓ９認識配列）とを含む。ｇＲＮＡガイド配列は特異性を付与する配列である。この配列は標的配列の反対側の鎖（すなわち、ＤＮＡ標的配列のＲＮＡ配列に対応するもの）とハイブリダイズする（すなわち、相補的である）。ほかにも様々なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いるＣＲＩＳＰＲシステムが開発されており、当該技術分野では公知である（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの代わりにＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いるもの）。
【０１３９】
あるいは本発明に従い、特異的に設計したｇＲＮＡの対をＣａｓ９ニッカーゼと組み合わせて、またはｄＣａｓ９−ＦｏｌｋＩヌクレアーゼと組み合わせて使用してＤＮＡの両方の鎖を切断し得る。
【０１４０】
諸実施形態では、ＤＹＳ遺伝子を修正しその正確なリーディングフレームを回復させるのに使用するため操作したＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムが本明細書に提供される。本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムは、少なくとも１つのヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ヌクレアーゼ）と、標的細胞の内在性ＤＹＳ遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡとを含む。
【０１４１】
したがって、一態様では、本発明は、ＤＹＳ遺伝子にＤＳＢ（またはニッカーゼの場合は２つの一本鎖切断（ＳＳＢ））を誘導する１つまたは複数のｇＲＮＡの設計および調製を含む。次いで、ｇＲＮＡ（ＤＹＳ遺伝子を標的とする）とヌクレアーゼを一緒に用いて、例えばＮＨＥＪまたはＨＤＲにより、１つまたは複数の標的細胞のゲノム内に所望の改変（１つまたは複数）を導入する（すなわち、遺伝子編集事象）。
【０１４２】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ヌクレアーゼ）と、標的細胞の内在性ＤＹＳ遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡとを含む。
【０１４３】
ｇＲＮＡ
ＤＮＡを特異的部位で切断するためには、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはｇＲＮＡおよび標的化遺伝子上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とする。ＰＡＭは標的化ポリヌクレオチド遺伝子配列内のｇＲＮＡ標的配列の直後にある（すなわち、隣接している）。ＰＡＭは、（使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて）ｓｇＲＮＡ標的配列の３’末端または５’末端に位置するが、ｓｇＲＮＡガイド配列には含まれていない。例えば、Ｃａｓ９  ＣＲＳＩＰＲヌクレアーゼに対するＰＡＭは標的遺伝子上のｓｇＲＮＡ標的配列の３’末端に位置し、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼに対するＰＡＭは標的遺伝子上のｓｇＲＮＡ標的配列の５’末端に位置する。これと異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼも異なるＰＡＭを必要とする。したがって、（例えば、ＤＹＳ遺伝子核酸配列内の）特異的ポリヌクレオチドｇＲＮＡ標的配列の選択は一般に、使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づく。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステムに対するＰＡＭは５’−ＮＲＧ−３’であり、この場合、ＲはＡまたはＧであり、このシステムのヒト細胞での特異性を特徴付ける。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭはＮＮＧＲＲ（Ｔ）である。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型システムは、天然では「ＮＧＧ」配列を好んで用い、この場合、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得るが、操作したシステムでは「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も許容する。これと同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴという天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ  ＰＡＭを含めた様々なＰＡＭに対して活性を有する。ＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対するＰＡＭはＴＴＴＮである。好ましい実施形態では、本発明に従って使用するＣａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質に対するＰＡＭは、ＮＧＧトリヌクレオチド配列（Ｃａｓ９）またはＴＴＴＮ（ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１）である。下の表１に、ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムの非限定的な例をそれぞれのＰＡＭ配列とともに列挙する。
【０１４４】
【表１】
2019533440.tif 000003
【０１４５】
本明細書で使用される「ｇＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という表現は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとともに作用してＤＮＡ内に切断を導入するガイドＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡガイド配列（標的配列に対応する）と「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」とを含む。
【０１４６】
本明細書で使用される「ｇＲＮＡガイド配列」という表現は、「ｇＲＮＡ標的配列」の対応するＲＮＡ配列（スペーサー配列としても知られる）を指す。したがって、これは標的ポリヌクレオチド遺伝子配列上のプロトスペーサーと同じＲＮＡ配列である。ゲノムＤＮＡの対応するＰＡＭ配列はこれに含まれない。これは標的特異性を付与する配列である。諸実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１）と結合するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列と連結されている。ｓｇＲＮＡガイド配列は、目的とする標的化遺伝子を認識し、これと結合する。この配列は、ＰＡＭを含む標的遺伝子配列の反対側の鎖とハイブリダイズする（すなわち、これと相補的である）（すなわち、ＰＡＭの反対側にあるＤＮＡ鎖とハイブリダイズする）。上記にように、「ＰＡＭ」は、ＤＹＳ遺伝子上の標的配列または標的ポリヌクレオチドの直後にある（標的配列に隣接する）核酸配列であるが、ｇＲＮＡ内にはない。
【０１４７】
諸実施形態では、ｇＲＮＡはｇＲＮＡガイド配列とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列（ＣＲＩＳＰＲ反復配列および任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｇＲＮＡによって本発明のＣＲＳＩＰＲヌクレアーゼに標的化特異性およびスキャフォールディング／結合能の両方がもたらされる。本発明のｇＲＮＡは天然に存在しないものである、すなわち、非天然の核酸（１つまたは複数）である。
【０１４８】
本発明のｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲシステムと関連する「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書では互換的に使用され、ＰＡＭがなくてもＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムの標的となる標的遺伝子の領域を指す。それは、ゲノムＤＮＡ内のＰＡＭの前にある（すなわち、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じてＰＡＭの５’側または３’側にある）ヌクレオチドに対応する配列を指す。それは、ｇＲＮＡ発現構築物（例えば、ベクター／プラスミド／ＡＶＶ）内に含ませる配列である。ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムは、それぞれが標的遺伝子上の異なるＤＮＡ配列を標的とする少なくとも１つ（すなわち、１つまたは複数、好ましくは２つ）のｇＲＮＡを含み得る。標的ＤＮＡ配列は重複していてよい。標的配列またはプロトスペーサーの後または前には、プロトスペーサー末端（使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて３’末端または５’末端）のＰＡＭ配列がある。一般に、標的配列はＰＡＭ配列のすぐ隣にある（すなわち、隣接している）（ＳｐＣａｓ９様ヌクレアーゼではＰＡＭの５’末端、Ｃｐｆ１様ヌクレアーゼでは３’末端に位置する）。
【０１４９】
本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」は、標的遺伝子上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの結合および／または活性（活性化を含む）に必要な１つまたは複数のＲＮＡ配列（またはＲＮＡモチーフ）（Ｃｐｆ１ヌクレアーゼに対する５’の「ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣ  ＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ」（配列番号１６８）など）を広く指す。これには、通常ｔｒａｃｒＲＮＡを補完する構造的断片（反復配列）およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列が包含される。一部のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、機能するために他のものより長いＲＮＡ配列を必要とする。また、機能するために複数のＲＮＡ配列（モチーフ）を必要とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもあれば、単一の短いＲＮＡ配列／モチーフのみを必要とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもある。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、機能するためにｃｒＲＮＡ配列（反復配列）に加えてｔｒａｃｒＲＮＡ配列を必要とし、Ｃｐｆ１はｃｒＲＮＡ配列のみを必要とする。このため、干渉を媒介するのにｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合物もしくは両方）の両方を必要とするＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡとは無関係にｃｒＲＮＡアレイをプロセシングし、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体はほかのＲＮＡ種を一切必要とせず単独で標的ＤＮＡ分子を切断する（Ｚｅｔｓｃｈｅら，ＰＭＩＤ：２６４２２２２７を参照されたい）。
【０１５０】
したがって、本明細書に記載されるｓｇＲＮＡに含まれる「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」は、使用する特異的ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づいて選択される。これには、直接反復配列ならびに選択したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの結合および／または活性に必要であることがわかっている他の任意のＲＮＡ配列が含まれる。ＲＮＡガイド配列と融合してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを適切に機能させることができる様々なＲＮＡ配列（本明細書ではＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列と呼ぶ）は当該技術分野で周知であり、本発明に従って使用することができる。したがって、「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」は、ｃｒＲＮＡ配列のみ（例えば、Ｃｐｆ１の活性には、配列番号１６８で示されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣ  ＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵなど）を含み得るか、または追加の配列（例えば、Ｃａｓ９の活性に必要なｔｒａｃｒＲＮＡ配列、例えばｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含み配列番号１６６で示されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列など）を含み得る。さらに、本発明では、当該技術分野で周知のように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの結合および活性に必要なＲＮＡモチーフを別個に（例えば、（ｉ）１つのＲＮＡ分子にＲＮＡガイド配列−ｃｒＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ認識配列（ｃｒＲＮＡとしても知られる）を、（ｉｉ）別のＲＮＡ分子にｔｒａｃｒＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ認識配列を）与え得る。あるいは、必要なＲＮＡ配列（モチーフ）をすべて単一のＲＮＡガイドに融合し得る。ＣＲＩＳＰＲ認識配列は、ｇＲＮＡガイド配列と（使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて３’（例えば、Ｃａｓ９）または５’（Ｃｐｆ１）で）直接融合するのが好ましいが、２つのＲＮＡモチーフを隔てるスペーサー配列が含まれていてもよい。
【０１５１】
諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、少なくとも６５ヌクレオチドを有するＣａｓ９認識配列である。諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、少なくとも８５ヌクレオチドを有するＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列である。諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、約１９ヌクレオチドを有するＣｐｆ１認識配列（５’直接反復配列）である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９認識配列は配列番号１６６で示される配列を含む（またはこれよりなる）。特定の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１認識配列は配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣ  ＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１６８）を含む（またはこれよりなる）。本発明のｇＲＮＡは、それが選択したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを適切に機能させる（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質とＤＹＳ遺伝子および／または標的ポリヌクレオチド配列（１つまたは複数）と結合させる）限り、上記の配列の任意のバリアントを含み得る。
【０１５２】
ＲＮＡガイド配列とＣＲＳＩＰＲヌクレアーゼ認識配列（１つまたは複数）が合わさって、本発明のＣＲＳＩＰＲヌクレアーゼに標的化特異性およびスキャフォールディング／結合能の両方もたらす。本発明のｓｇＲＮＡは天然に存在しないものである、すなわち、非天然の核酸（１つまたは複数）である。
【０１５３】
諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）認識配列は、少なくとも６５ヌクレオチドを有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列である。諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、少なくとも８５ヌクレオチドを有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列である。
【０１５４】
上記のように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがすべて、機能するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするわけではない。Ｃｐｆ１は単一のｃｒＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。干渉を媒介するのにＲＮＡガイド配列（ｃｒＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合物もしくは両方）の両方を必要とするＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡとは無関係にｃｒＲＮＡアレイをプロセシングし、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体はほかのＲＮＡ種を一切必要とせず単独で標的ＤＮＡ分子を切断する（Ｚｅｔｓｃｈｅら（６２）を参照されたい）。
【０１５５】
諸実施形態では、ｇＲＮＡは、そのポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含み得る。５’に「Ｇ」が存在するのは、ｇＲＮＡをＵ６プロモーターの制御下で発現させる場合に好ましい（Ｋｏｏ  Ｔ．ら（６５））。本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムでは様々な長さのｇＲＮＡを使用し得る。ｇＲＮＡは、ＤＹＳ遺伝子の標的配列（このような標的配列にはＤＹＳ遺伝子内で後ろまたは前にＰＡＭがあるが、ｇＲＮＡの一部ではない）の少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１１ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２１ｎｔ、少なくとも２２ｎｔ、少なくとも２３ｎｔ、少なくとも２４ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔまたは少なくとも３５ｎｔのｇＲＮＡガイド配列を含み得る。諸実施形態では、「ｇＲＮＡガイド配列」または「ｇＲＮＡ標的配列」は、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ｎｔ長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ｎｔ長）、より好ましくは１７〜３０ｎｔ長、より好ましくは１７〜２２ヌクレオチド長であり得る。諸実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、１０〜４０、１０〜３０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜３０または１０〜２２ヌクレオチド長である。諸実施形態では、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であり、この場合、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る。諸実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（Ｎ）であり、この場合、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得、ＲはＡまたはＧである。諸実施形態では、ＰＡＭ配列は「ＴＴＴＮ」であり、この場合、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る。ｇＲＮＡは、ＰＡＭ（例えば、反対鎖に位置するＰＡＭではＮＧＧ／ＴＴＴＮまたはＣＣＮ／ＮＡＡＡ）配列のすぐ隣にある（５’または３’側で隣接する）標的遺伝子（例えば、ＤＹＳ）の任意の領域を標的とし得る。諸実施形態では、本発明のｇＲＮＡはエクソン内に位置する標的配列を有する（ｇＲＮＡガイド配列はエクソン内に位置する標的（ＤＮＡ）配列のＲＮＡ配列からなる）。諸実施形態では、本発明のｇＲＮＡはイントロン内に位置する標的配列を有する（ｇＲＮＡガイド配列はイントロン内に位置する標的（ＤＮＡ）配列のＲＮＡ配列からなる）。諸実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＹＳ遺伝子内でＰＡＭが後ろにあり（または使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによっては前にあり）、同遺伝子の正確なリーディングフレームを回復させるのに使用され得る任意の領域（配列）を標的とし得る。
【０１５６】
本発明の方法に従って標的細胞に投与する、または標的細胞に発現させるｓｇＲＮＡの数は、少なくとも１つのｇＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つのｇＲＮＡであり得る。
【０１５７】
ｇＲＮＡガイド配列と標的化遺伝子上のＤＮＡ配列が完全にマッチするのが好ましいが、ｇＲＮＡと、標的化遺伝子上のｇＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列の相補鎖とのハイブリダイゼーションが依然として可能である限り、ｇＲＮＡガイド配列と目的とする遺伝子配列上の標的配列との間のミスマッチが許容される。標的配列の適切な認識には、ｇＲＮＡ内の８〜１２個の連続するヌクレオチドからなりｇＲＮＡ標的配列の対応する部分と完全にマッチするシード配列が好ましい。ガイド配列の残りの部分は１つまたは複数のミスマッチを含み得る。一般に、ｇＲＮＡの活性はミスマッチの数と逆の相関関係がある。好ましくは、本発明のｇＲＮＡは、対応するｇＲＮＡ標的遺伝子配列との間で（ＰＡＭを差し引いて）７つのミスマッチ、６つのミスマッチ、５つのミスマッチ、４つのミスマッチ、３つのミスマッチ、より好ましくは２つのミスマッチまたはそれより少ないミスマッチを含み、さらにより好ましくはミスマッチがない。好ましくは、ｇＲＮＡ核酸配列は、目的とする遺伝子（例えば、ＤＹＳ）内のｇＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一である。当然のことながら、ｇＲＮＡガイド配列のヌクレオチド数が少ないほど許容されるミスマッチ数は少なくなる。結合親和性は、マッチするｇＲＮＡ−ＤＮＡの組合せの合計に左右されるものと考えられる。
【０１５８】
適切な位置に所望の改変（１つまたは複数）（例えば、挿入／欠失または選択した標的改変（１つまたは複数））を導入することができる限り、標的遺伝子内の任意のｇＲＮＡガイド配列を選択することができる。したがって、本発明のｇＲＮＡガイド配列または標的配列は、ＤＹＳ遺伝子のコード領域または非コード領域（すなわち、エクソンまたはイントロン）内にあり得る。当然のことながら、配列の相補鎖を別法として同じように用いて、適切なＰＡＭおよびｇＲＮＡ標的／ガイド配列を特定し得る。
【０１５９】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
最近、Ｔｓａｉら（６４）が、ヒト細胞内で長い配列を認識し高い効率で内在遺伝子を編集することができる組換えｄＣａｓ９−ＦｏＫＩ二量体ヌクレアーゼ（ＲＦＮ）を設計した。このヌクレアーゼは、触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質と融合した二量体化依存性の野生型ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含む。この融合タンパク質の二量体は、間にスペーサー配列のある２つの半分の部位（それぞれｄＣａｓ９（すなわち、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９ヌクレアーゼ）モノマードメインと結合する）からなる標的部位と結合すると配列特異的ＤＮＡ切断を媒介する。ｄＣａｓ９−ＦｏＫＩ二量体ヌクレアーゼは効率的なゲノム編集活性に二量体化を必要とし、このため、ＤＮＡ内に切断を導入するのにｇＲＮＡを２つ用いる。
【０１６０】
本発明に従って使用し得る組換えＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ｉ）天然のヌクレアーゼ（例えば、ＣａｓまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼ）に由来し；かつｉｉ）適切なｇＲＮＡ（１つまたは複数）の存在下で細胞内ＤＮＡにＤＳＢを導入するヌクレアーゼ（またはニッカーゼ）活性を有するものである。したがって、本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」という用語は、ヌクレアーゼ活性を有する天然のヌクレアーゼに由来し、本発明のｇＲＮＡとともに機能して目的とする標的、例えばＤＹＳ遺伝子にＤＳＢを導入する、組換えタンパク質を指す。諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはｓｐＣａｓ９である。諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＳａＣａｓ９である。諸実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１である。本発明に従って使用し得る例示的ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが上の表１に記載されている。Ｃａｓ９のバリアントは、タンパク質工学またはランダムな変異誘発によって得られる（すなわち、天然に存在しない）Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。このようなＣａｓ９バリアントは依然として機能性であり、天然のＣａｓ９、例えば化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の変異（欠失、挿入および／または置換）によって得ることができる。
【０１６１】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＰＡＭ配列の３〜４ｂｐ上流を切断する。一方、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは５’オーバーハングを生じる。切断は、標的化（＋）鎖ではＰＡＭの１９ｂｐ後ろ、反対鎖では２３ｂｐ後ろで起こる（６２）。野生型Ｃａｓ９を用いるとオフターゲットＤＳＢがいくつか生じる。オフターゲット作用の程度は、オン標的部位に対するオフ標的部位の相同性の程度、特異的部位の配列およびヌクレアーゼとガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の濃度を含めたいくつかの因子に左右される。これらの考慮事項は、ＰＡＭ配列がほぼ相同な標的部位のすぐ隣にある場合にのみ問題となる。追加のＰＡＭ配列が存在するだけではオフターゲットＤＳＢが生じるのに十分ではないはずであり、後ろまたは前にＰＡＭがあるプロトスペーサーの相同性が高い必要がある。
【０１６２】
コドン縮重の最適化
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質は、通常は細菌に発現するタンパク質である（またはそれに由来するものである）ため、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ組換えタンパク質を設計し調製する際には、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）で最適な発現が得られるようにその核酸配列を修正するのが有利であり得る。
【０１６３】
したがって、以下のコドン表（表２）を部位特異的変異誘発スキームに用いて、所与の核酸と同じである、またはわずかに異なるアミノ酸配列をコードする核酸を作製し得る：
【表２】
2019533440.tif 000004
【０１６４】
ジストロフィン
本明細書で使用される「ジストロフィン遺伝子」という用語は、ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子を指す（内容が参照により本明細書に組み込まれるアクセッション番号ＨＧＮＣ：２９２８，Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：１７５６；ＯＭＩＭ：３００３７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９８９４７；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１１５３２およびＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００００２３．１１を参照されたい）。「ジストロフィン遺伝子」という用語は、天然に（すなわち、通常ジストロフィンタンパク質を発現する対象内に）みられる遺伝子の対立遺伝子バリアントを包含する。ジストロフィン遺伝子には、少なくとも８つの独立した組織特異的プロモーターおよび２つのポリＡ付加部位が含まれている。さらに、ジストロフィンＲＮＡは、様々な方法でスプライスされて、一連の多数のタンパク質アイソフォームをコードする様々な転写物を生じる。「ジストロフィンタンパク質」、「ジストロフィンポリペプチド」、「ジストロフィンＲＮＡ」および「ジストロフィン転写物」という用語は、対象の細胞内のジストロフィン遺伝子（任意の対立遺伝子バリアントを含む）が発現するあらゆるアイソフォームを指す。
【０１６５】
ヒトジストロフィン遺伝子は大きさが約２．４Ｍｂであり、デュシェンヌ型（ＤＭＤ）およびベッカー型（ＢＭＤ）筋ジストロフィーの原因遺伝子の単離に基づきポジショナルクローニング法により同定された。一般に、ＤＭＤ患者は翻訳の中途終止の原因となる変異（ナンセンス変異またはフレームシフト変異）を保有し、ＢＭＤ患者は大きさ（インフレーム欠失による）または発現レベルが減少したジストロフィンを生じる変異を保有する。
【０１６６】
ＤＹＳ遺伝子の変異はＸ連鎖拡張型心筋症および家族性拡張型心筋症とも関係があるとされている。ＤＭＤ遺伝子の３０を超える変異がＸ連鎖型の家族性拡張型心筋症を引き起こすことがある。この心臓病態があると、心筋が肥大して脆弱化し、心臓が血液を効率的に送り出すことができない。拡張型心筋症はデュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー（上記）の徴候の１つであるが、Ｘ連鎖拡張型心筋症では通常、骨格筋の脆弱化および萎縮が起こらない。Ｘ連鎖拡張型心筋症の原因となる変異は、心筋細胞のジストロフィンの活性に選択的に影響を及ぼす。これらの変異の結果、罹患者には通常、心臓に機能性ジストロフィンがほとんどまたは全くみられない。このタンパク質が十分にないと、心筋が繰り返し収縮し弛緩するごとに心筋細胞が損傷を受ける。損傷を受けた筋細胞は時間の経過とともに脆弱化し、Ｘ連鎖拡張型心筋症に特徴的な心臓の問題を引き起こす。Ｘ連鎖拡張型心筋症では一般に、このタンパク質が骨格筋の脆弱化および萎縮を防ぐ程度には存在する。
【０１６７】
家族性拡張型心筋症は、少なくとも一方の心房の心筋が薄くなって脆弱化し、心房の開放領域が大きくなる（拡張する）ことを特徴とする。その結果、心臓が通常通りに効率的に血液を送り出すことができなくなる。それを補うため、心臓はそこを通って送り出される血液の量を増加させようとし、心筋がさらに薄くなって脆弱化する。時間の経過とともに、この状態が心不全を引き起こす。通常、家族性拡張型心筋症の症状が健康上の問題を引き起こすまでには何年間も要する。それは成人中期に起こるのが通常であるが、乳児期から成人後期までのどの時期にも起こり得る。家族性拡張型心筋症の徴候および症状には、不規則な心拍（不整脈）、息切れ（呼吸困難）、極度の疲労（倦怠感）、失神発作（失神）および下肢の腫脹が含まれ得る。場合によっては、障害の最初の徴候が突然心臓死となる。病状の重症度は、同じ家族のメンバーであっても罹患者によって異なる。
【０１６８】
上記のように、特定の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて細胞内で変異ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはイントロン内にさらなる変異を導入するものである。ＣＲＩＳＰＲシステムは細菌種で確認された防御機序の１つである［３７〜４２］。これは、哺乳動物細胞の遺伝子編集ができるように改変されている。この改変されたシステムでは依然として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いて特異的ＤＮＡ標的配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせる［４３、４４］。切断部位の認識は、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡの塩基対形成および標的ＤＮＡ配列と並列するＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれるトリヌクレオチドの存在によって決まる［４５］。このＰＡＭは、最もよく用いられる酵素である化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９ではＮＧＧである［４６、４７］。
【０１６９】
特定の実施形態では、本出願者らは、ＤＹＳ遺伝子のエクソン４６と５１、４６と５３、４９と５２、４９と５３、４７と５８と５０と５４およびイントロン２２と２３を標的とする２つのｇＲＮＡの様々な組合せをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験は、２９３Ｔ細胞または内在性のレームシフト変異もしくはナンセンス変異（例えば、終止コドンもしくはフレームシフトを生じるエクソン４９−５０、５１−５３もしくは５１−５６の欠失）を有するＤＭＤ患者の筋芽細胞で実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏの実験は、完全長ヒトＤＹＳ遺伝子を含むｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスまたはエクソン２３の変異を含むＲａｇ／ｍｄｘマウスモデルで実施した。結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、ｇＲＮＡの組合せがＰＡＭの３ヌクレオチド上流で正確なＤＳＢを可能にし、大きな欠失を誘導したことを示している。残りのＤＮＡ配列間の連結は予測通りに正確に得られた。特異的に選択したｇＲＮＡの対を用いてリーディングフレームを回復させ、その結果、アウトオブフレーム欠失を有するＤＭＤ患者の修正された筋芽細胞によって形成された筋管により、内部で欠失したＤＹＳタンパク質を合成させることができた。このようなＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失（ＣｉｎＤｅｌ）治療法を用いて、ＤＭＤ患者にみられる大部分の欠失のリーディングフレームを直接ｉｎ  ｖｉｖｏで回復させることができる。この方法をハイブリッドエクソン５０−５４の図１０にまとめる。重要なのは、本発明の方法によって生じたジストロフィン遺伝子の欠失が、内在性に変異したＤＹＳ遺伝子内にあるタンパク質の正確なリーディングフレームを回復させ、短いが機能性のジストロフィンタンパク質を生じさせることである。この欠失は、７つ組モチーフの「ａ」および「ｄ」の位置に疎水性アミノ酸がある正常なスペクトリン様反復配列の立体配置を維持することができるものである。
【０１７０】
上記のように、本発明のポリペプチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）ならびにｇＲＮＡおよびヌクレアーゼまたはニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）をコードする核酸は、様々な方法を用いて細胞内に送達され得る。これらの方法では、１つまたは複数の様々なウイルスベクターまたは送達剤、例えばペプチドベースのシャトル（上記のＦｅｌｄａｎ  ｓｈｕｌｌｔｌｅ）を使用し得る。
【０１７１】
したがって、上記のベクターは、本発明のｇＲＮＡおよび／またはヌクレアーゼを標的細胞に導入するウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターの非限定的な例としては、当該技術分野で周知のレトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【０１７２】
好ましくはＤＭＤ対象の１つまたは複数の罹患細胞型を標的とする改変ＡＡＶベクターを本発明に従って使用するのが好ましい。一実施形態では細胞型は筋細胞であり、さらなる実施形態では筋芽細胞である。したがって、改変ＡＡＶベクターは、心臓組織、骨格筋組織、神経組織、肝臓組織および／または膵臓組織（ランゲルハンス細胞）に対する指向性が強化されたものであり得る。改変ＡＡＶベクターは、少なくとも１つの本発明のｇＲＮＡおよびヌクレアーゼを哺乳動物の細胞に送達し発現させることが可能なものであり得る。例えば、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクター（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏら（２０１２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：６３５−６４６）であり得る。改変ＡＡＶベクターは、ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼをｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン、骨格筋および心筋ならびに／あるいは膵臓（ランゲルハンス細胞）に送達するものであり得る。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含めたいくつかのカプシド型のうちの１つまたは複数のものに基づくものであり得る。改変ＡＡＶベクターは、代替的筋肉指向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型、例えば全身送達および局所送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入するＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどに基づくものであり得る。一実施形態では、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＤＪである。一実施形態では、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＤＪ８ベクターである。一実施形態では、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ２−ＤＪ８ベクターである。
【０１７３】
さらに別の態様では、本発明は、上記の核酸および／またはベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。本発明はさらに、例えば当該技術分野で周知の培地、作製方法、単離方法および精製方法を用いて組換えタンパク質を発現／産生させる上記のような組換え発現システム、ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【０１７４】
別の態様では、本発明は、上記のｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）あるいはそれをコードする核酸（１つまたは複数）またはこのような核酸（１つまたは複数）を含むベクター（１つまたは複数）を含む、組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一実施形態では、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、添加剤および／または希釈剤をさらに含む。
【０１７５】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」（または「生物学的に許容される」）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで有毒または有害な生物学的作用を全く（またはわずかしか）示さないことを特徴とする物質を指す。それは、妥当な医学的判断の範囲内で、対象（例えば、ヒト、動物）に過剰な中毒、刺激、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を引き起こさずに体液および／または組織および／または器官に接触させて使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、組成物および／または剤形を指す。
【０１７６】
本発明はさらに、上記のｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、ベクター、細胞、標的化システム、組合せまたは組成物のうちの少なくとも１つのものが、対象のＤＭＤを治療する、または細胞のＤＹＳ遺伝子の正確なリーディングフレームを回復させるための指示書とともに配置された少なくとも１つの容器手段を含む、キットまたはパッケージを提供する。
【０１７７】
以下の非限定的な実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【０１７８】
実施例１
実施例１〜７の材料および方法
標的の特定およびｇＲＮＡのクローニング。Ｕ６プロモーターの制御下にプロトスペーサーの挿入に必要な２つのＢｂｓＩ制限部位を含む（下を参照されたい）プラスミドｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ（ｐＸ４５８）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４８１３８）（図１ａ）［５８］を図１〜８に示す実験に使用した。ｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰプラスミドは、ＣＢｈプロモーターの制御下に化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９遺伝子およびｅＧＦＰ遺伝子も含み、両遺伝子はペプチドＴ２Ａをコードする配列によって隔てられている。
【０１７９】
Ｌｅｉｄｅｎ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙのウェブサイトを利用して各エクソン配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスクリーニングすることにより、エクソン５０および５４内でｇＲＮＡの標的となるヌクレオチド配列を特定した（図１ｂ）。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＧＧである。Ａｄｄｇｅｎｅ社の指示通りに、標的配列をコードするオリゴヌクレオチドおよびその相補配列をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ、コーラルビル、アイオワ州）で合成し、プロトスペーサーとしてＢｂｓＩ部位にクローニングして、エクソン５０を標的とするｇＲＮＡ  １０種類およびエクソン５４を標的とするｇＲＮＡ  １４種類を個別に作製した。簡潔に述べれば、Ｔ４  ＰＮＫ（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）を用いてオリゴヌクレオチドをリン酸化し、次いで、Ｑｕｉｃｋｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）を用いてプラスミドｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰのＢｂｓＩ部位にアニールさせクローニングした。クローンを単離しＤＮＡを増幅させた後、プライマーＵ６Ｆ（５’−ＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧ）（配列番号１７３）を用いて試料のシーケンシングを実施し、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いてシーケンシングの結果を解析した。
【０１８０】
細胞培養。２９３Ｔ細胞およびＤＭＤ患者筋芽細胞への発現プラスミドのトランスフェクション。
【０１８１】
２９３Ｔ細胞およびエクソン５１〜５３の欠失を有するＤＭＤ筋芽細胞を用いて、各ｇＲＮＡをコードするｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡプラスミドのトランスフェクションによりｇＲＮＡ活性を個別に、または対で試験した。２９３Ｔ細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）とを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）で増殖させた。ＤＭＤ患者筋芽細胞は１５％ＦＢＳを含有し抗生物質を含まないＭＢ−１培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローガン、ユタ州）で増殖させた。２４ウェルプレートまたは６ウェルプレートに入れた細胞にそれぞれＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）で予め希釈した１μｇまたは５μｇのプラスミドＤＮＡおよび２μｌまたは１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州）を用いて、集密度７０〜８０％でトランスフェクトした。ｇＲＮＡ対のトランスフェクションには、ＤＮＡ混合物の半分をｇＲＮＡ−５０をコードするプラスミドのものとし、半分をｇＲＮＡ−５４のものとした。細胞を５％ＣＯ２の存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。Ｎｉｋｏｎ  ＴＳ１００（Ｅｃｌｉｐｓｅ社、日本）を用いた顕微鏡観察下、トランスフェクションの成否をトランスフェクト細胞でのＧＦＰ発現により評価した。
【０１８２】
前の標準的プロトコルに従って筋芽細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００でトランスフェクトしても十分な効果が得られず、以下の通りに改善した。トランスフェクションの前にＭＢ−１培地を吸引し、筋芽細胞を１×ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）５００μｌで１回洗浄した。次いで、（上記の通りにＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（商標）で希釈した）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００プラスミドＤＮＡ複合体を培地に入れる代わりに細胞上に直接注ぎ、細胞／ＤＮＡ複合体を３７℃で１５分間インキュベートした。そののち、無抗生物質培地を細胞に加え、プレートを１８〜２４時間、恒温器に戻した。そののち、培地を目指し、新鮮な培地に入れ替えた。プレートをさらに２４時間インキュベートした。
【０１８３】
筋芽細胞の筋管への分化およびジストロフィン発現。（ｇＲＮＡ２−５０およびｇＲＮＡ２−５４をトランスフェクトした）ＤＭＤ筋芽細胞を融合させて筋管にし、ジストロフィンの発現を誘導した。このように筋芽細胞を融合させるため、筋芽細胞培養物からＭＢ−１培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローガン、ユタ州）を吸引し、２％ＦＢＳを含有する最小ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）に入れ替えた。筋芽細胞を５％ＣＯ２、３７℃で７日間インキュベートした。ＤＭＤ患者の未トランスフェクト筋芽細胞（陰性対照）および健常ドナーの不死化野生型筋芽細胞（陽性対照）も同じ条件下で増殖させて、その筋管への分化を誘導した。
【０１８４】
ゲノムＤＮＡの抽出および解析。ｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡプラスミド（１つまたは複数）をトランスフェクトしてから４８時間後、標準的なフェノール−クロロホルム法を用いて２９３Ｔ細胞または筋芽細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。簡潔に述べれば、細胞ペレットを１０％のサルコシルと０．５Ｍ、ｐＨ８のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とを含有する溶解緩衝液１００μｌに再懸濁させた。プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた。懸濁液を上下にかき混ぜ、５５℃で１０分間インキュベートした。次いで、これを１３２００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を新たな微量遠心管に収集した。１体積のフェノール−クロロホルムを加え、遠心分離した後、水相を新たな微量遠心管に回収し、体積比１：１０の５Ｍ  ＮａＣｌおよび２体積の１００％エタノールでエタノール沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離し、ＤＮＡを再蒸留水５０μｌに再懸濁させた。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローガン、ユタ州）でゲノムＤＮＡ濃度をアッセイした。
【０１８５】
個々の切断または欠失が成功を収めたことを確認するため、次いでエクソン５０および５４ならびにハイブリッドエクソン５０−５４をＰＣＲにより増幅した。エクソン５０では、センスプライマーはイントロン４９の末端を標的とし（センス４９  ５’−ＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＡＴＧＴＴＣと呼ぶ）（配列番号１７４）、アンチセンスプライマーはイントロン５０の開始点を標的とする（アンチセンス５０  ５’−ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＣＣＧＴＴＧＴＣと呼ぶ）（配列番号１７５）ものとした。エクソン５４では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン５３の末端（センス５３  ５’−ＧＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＧＴと呼ぶ）（配列番号１７６）およびイントロン５４の開始点（アンチセンス５４  ５’−ＴＡＴＣＡＧＡＴＡＡＣＡＧＧＴＡＡＧＧＣＡＧＴＧと呼ぶ）（配列番号１７７）を標的とするものとした。ハイブリッドエクソン５０−５４では、順方向センス４９および逆方向アンチセンス５４を用いた。ＰＣＲ増幅はいずれもＢＩＯ  ＲＡＤ社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のサーマルサイクラーＣ１０００  ＴｏｕｃｈにＰｈｕｓｉｏｎ高忠実度ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）を使用し、エクソン５０、エクソン５４およびハイブリッドエクソン５０−５４に以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、５８℃／２０秒、７２℃／１分で３５サイクルを用いて実施した。
【０１８６】
エクソン５０および５４それぞれのアンプリコンを用いてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実施した。試験の最初の部分は、ＢＩＯ  ＲＡＤ社のサーマルサイクラーＣ１０００  Ｔｏｕｃｈ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に緩徐なハイブリダイゼーションプログラム（９５℃で変性させた後、アンプリコンを徐々に冷却する）を用いたアンプリコンのハイブリダイゼーションとした。次いで、サーマルサイクラー内でアンプリコンを４２℃で２５分間、ヌクレアーゼＣｅｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、コーラルビル、アイオワ州）で消化した。消化産物を１．５％アガロースゲル上で可視化した。
【０１８７】
ハイブリッドエクソンのクローニングおよびシーケンシング。２種類の異なるｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞または筋芽細胞から抽出したゲノムＤＮＡの増幅によって得たハイブリッドエクソンのアンプリコンをゲル抽出（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）により精製した。約４８０〜６５５ｂｐのバンドを直線状クローニングベクターｐＭｉｎｉＴ（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）にクローニングした。３日目に、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）でプラスミドＤＮＡを抽出し、クローニングベクターをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで同時に消化してアンプリコンの挿入を確認した。クローニングベクターｐＭｉｎｉＴ内では、インサートに２つのＥｃｏＲＩ制限部位が隣接していた。ＥｃｏＲＩで消化することにより、２５００ｂｐ（インサートを含まないプラスミド）および４８０〜６５５ｂｐ（挿入されたアンプリコン）の２種類のフラグメントが生じた。エクソン５４の残りの部分にはＰｓｔＩ制限部位が存在していたことに留意するべきである。ＰｓｔＩ消化により２種類のフラグメントが生じた。ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌでの二重消化によってこれらの２種類のフラグメントを生じたクローンを製造業者（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）が提供するプライマーを用いたシーケンシングに供した。シーケンシングの結果をＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）およびＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥｘＰＡＳｙ）プラットフォーム（ｈｔｔ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）で解析した。このソフトウェアにより、ハイブリッドエクソン５０−５４およびそれに対応するアミノ酸配列のヌクレオチド配列の両方を可視化することができた。
【０１８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏのマウスアッセイ。完全長ヒトジストロフィン遺伝子を発現するトランスジェニックｈＤＭＤマウスの精子を受精させた［５９］。ｈＤＭＤマウスをｍｄｘマウスと交配してｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスを得た。
【０１８９】
ｐＳｐＣａｓ−２Ａ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡ  ４０μｇ（ｇＲＮＡ２−５０  ２０μｇおよびｇＲＮＡ２−５４  ２０μｇ）を再蒸留水２０μｌに懸濁させ、タイロード緩衝液（１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭ  ＣａＣｌ２  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｇ／Ｌグルコース、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）２０μｌと混合した。ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）にｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰプラスミドを縦方向に単回経皮注射した後、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、サンローラン、カナダ）で電気泳動転写を実施した。２つの電極プレートの間を電場が通りやすくするため皮膚に電極電解質クリーム（Ｔｅｃａ社、プレザントビル、ニューヨーク州）を塗布した。筋肉に電場をかけた（持続時間２０ｍｓを１ｓ間隔で８パルス）。マウスの脚の幅に合わせて電圧を１００ボルト／ｃｍに調整した。７日後、エレクトロポレートしたマウスおよび対照マウスを屠殺した。上記のフェノール−クロロホルム法でゲノムＤＮＡを抽出し、既に記載されている通りにＤＮＡ解析を実施した。
【０１９０】
タンパク質解析。筋管を回収し、メタノール−クロロホルム法でタンパク質を抽出した。簡潔に述べれば、７５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する溶解緩衝液に細胞ペレットを再懸濁させた。タンパク質抽出物を急速真空装置Ｕｎｉｖａｐｏ  １００  ＥＣＨ（Ｕｎｉｅｑｕｉｐ社、マルティンスリート、ドイツ）で乾燥させてメタノールを完全に除去した。次いで、０．５％メルカプトエタノールを含有する緩衝液で試料を希釈し、９５℃で５分間加熱した。Ｉｍａｇｅｒ２２００  ＡｌｐｈａＤｉｇｉＤｏｃ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、スワニー、ジョージア州）を用いてアミドブラックによりタンパク質濃度をアッセイした。
【０１９１】
各試料のタンパク質７５μｇを７％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に４℃で１６時間転写した。膜上のジストロフィンを検出するため、ヒトジストロフィンのＣ末端を認識する一次マウスモノクローナル抗体（カタログ番号ＮＣＬ−ＤＹＳ２、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ニューカッスル、イギリス）を用いた。抗体を５％ミルクと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有する０．１×ＰＢＳで１：２５に希釈し、４℃で１６時間インキュベートした。
【０１９２】
実施例２
ＳｐＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤ筋芽細胞のジストロフィンエクソン標的化
２４種類の異なるｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡプラスミド（図１ａ）を作製し、そのうち１０種類はＤＹＳ遺伝子のエクソン５０の異なる配列を標的とするｇＲＮＡを含むものとし、１４種類はエクソン５４を標的とするｇＲＮＡを含むものとした（表３および図１ｂ〜１ｃ）。これらのｇＲＮＡの活性を試験するため、最初にこれらのプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。標準的なトランスフェクション条件下で、細胞の８０％がトランスフェクションの効果を確認するＧＦＰの発現を示した（図２ａ）。トランスフェクションから４８時間後、それらの細胞のＤＮＡを抽出した。プライマーであるセンス４９およびアンチセンス５０を用いてＤＹＳのエクソン５０をＰＣＲにより増幅し、エクソン５４をプライマーであるセンス５３およびアンチセンス５４で増幅した（プライマー配列の詳細については実施例１を参照されたい）。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９によって生じたＤＳＢの後に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によりもたらされたインデルの存在をＳｕｒｖｅｙｏｒ／Ｃｅｌ  Ｉ酵素アッセイを用いて検出した（図３ａ〜３ｂ）。大部分のｇＲＮＡに予想された３つのバンドからなるパターンが検出され、上のバンドは未切断ＰＣＲ産物を表し、下の２つのバンドはＤＳＢの誘導に使用したガイドと関係がある長さのＣｅｌ  Ｉ産物を表している。
【０１９３】
【表３】
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【０１９４】
次いで、エクソン５１から５３までの欠失を有するＤＭＤ患者の不死化筋芽細胞でもｇＲＮＡを個別に試験した。ただ、標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション［１４］では筋芽細胞のトランスフェクション効率が極めて低いものとなった（図２ｂ）。しかし、プロトコルを改善したところ、ＧＦＰを発現する筋芽細胞を約２０〜２５％確認することができた（図２ｃ）。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイでは、これらの筋芽細胞から得たエクソン５０（図３ｃ）および５４（図３ｄ）のアンプリコンにインデルが存在することが明らかになった。
【０１９５】
実施例３
ＳｐＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたｇＲＮＡ対の試験
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９はＰＡＭから５’方向にちょうど３ｂｐの位置にＤＳＢを誘導することから、様々なｇＲＮＡの対でエクソン５０および５４を切断した結果を予測することが可能であった。この解析では、図４ａに示し、表４に詳細に記載するように、以下の４つの可能性が予測された：１）欠失するコードヌクレオチドの総数（すなわち、欠失するエクソン５１、５２および５３ならびにエクソン５０および５４の一部分のヌクレオチドの合計）は３の倍数になり、エクソン５０および５４の残りの部分の連結部から新たなコドンが発生することはないという可能性、２）欠失するＤＹＳをコードするヌクレオチド数は３の倍数になるが、エクソン５０および５４の残りの部分の連結部から発生する新たなコドンが新たなアミノ酸をコードする可能性、３）欠失するコードヌクレオチドの数は３の倍数にならないため、ＤＹＳ遺伝子の不正確なリーディングフレームが発生する可能性；ならびに４）欠失するＤＹＳをコードするヌクレオチドの数の合計は３の倍数になるが、エクソン５０および５４の残りの部分の連結部により形成される新たなコドンが終止コドンになる可能性。
【０１９６】
【表４】
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2019533440.tif 000009
【０１９７】
２９３Ｔ細胞およびヒト筋芽細胞にｇＲＮＡをコードするプラスミドの様々な対、すなわち、一方がエクソン５０を標的とし、他方がエクソン５４を標的とする対（図４ｂおよび４ｃ）をトランスフェクトすることによりＤＹＳ遺伝子の一部の欠失を検討した。成功を収めた欠失を検出するため、４８時間後にこれらのトランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーであるセンス４９およびアンチセンス５４を用いてＰＣＲにより増幅した（プライマー配列の詳細については実施例１を参照されたい）。野生型ＤＹＳ遺伝子（すなわち、エクソン５０〜エクソン５４）のアンプリコンに予測された大きさ（約１６０Ｋｂｐ）が大き過ぎるため、未トランスフェクト細胞から抽出したＤＮＡからは増幅が得られなかった（図４ｃ、レーン１および６）。しかし、ｇＲＮＡの対を用いた場合、予測された大きさのハイブリッドエクソンという名称のアンプリコンが得られ（図４ｂ、レーン２〜５およびレーン７〜１０）、２９３Ｔ細胞での１６０Ｋｂｐ配列の切出しが確認された。
【０１９８】
図４ｂに示されるように、複数の異なるｇＲＮＡ対（エクソン５０および５４を標的とする）を試験し、いずれも上で説明した４つの可能性の通りに予測されたＤＹＳ遺伝子の改変が正確に得られた。
【０１９９】
実施例４
２９３Ｔ細胞を用いたハイブリッドエクソン５０−５４の特徴付け（ＳｐＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）
ｇＲＮＡ対のトランスフェクション後に得られたアンプリコンをゲル精製し、ｐＭｉｎｉＴプラスミドにクローニングし、細菌に形質転換し、挿入に成功に関してクローンをスクリーニングした。消化パターンに従い陽性クローンをシーケンシングに供して、エクソン５０の一部とエクソン５４の一部分との融合によって形成されたハイブリッドエクソンの存在を明らかにした。例えば、ｇＲＮＡ５−５０とｇＲＮＡ１−５４の対で得られた配列の１００％（７／７）で、ＤＹＳ遺伝子が両エクソンのＰＡＭから５’方向にちょうど３ヌクレオチドの位置で切断された（データ不掲載）。この作業を様々なｇＲＮＡの対を用いてそれぞれの機能的ｇＲＮＡ対に関して繰り返したところ、ＣｉｎＤｅｌ技術により２９３Ｔ細胞のＤＹＳ遺伝子の約１６０１００ｂｐの一部分が良好に除去された。
【０２００】
実施例５
筋芽細胞を用いたハイブリッドエクソン５０−５４の特徴付け（ＳｐＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）
本発明者らは、自身の発現プラスミド由来のＣａｓ９によって生じる切断の精度を既にエクソン５１〜５３の欠失を有するＤＭＤ患者の筋芽細胞でも確認したいと思った。そこで、ＤＹＳ遺伝子に欠失を生じさせてリーディングフレームを回復させることが既に特徴付けられているｇＲＮＡ２−５０とｇＲＮＡ２−５４の対をトランスフェクトした。また、対照として、リーディングフレームを回復させることのない別のｇＲＮＡ対（すなわち、ｇＲＮＡ５−５０とｇＲＮＡ１−５４）も用いた。２９３Ｔの場合と同じように、４８時間後にこれらの筋芽細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーであるセンス４９およびアンチセンス５４を用いて増幅し、アンプリコンをプラスミドｐＭｉｎｉＴにクローニングした。細菌クローンからプラスミドを抽出し、その消化パターンに従ってスクリーニングし、陽性クローンをシーケンシングに供した。ｇＲＮＡ２−５０とｇＲＮＡ２−５４の対に関して４５クローンの配列を解析したところ、最も大量に存在した（２５／４５、すなわち、５６％）産物にはエクソン５０および５４の残りの部分の間に予測された連結部が正確に含まれ、１４１ｂｐのハイブリッドエクソンが得られた（図５ａおよび５ｂ）。６０％（２７／４５）には新たなコドン（Ｙ）が生じた（図５ａおよび５ｂ）。６２％（２８／３５）の割合のものがインフレームのハイブリッドエクソンとして検出され（図５ｂ）、３８％（１７／４５）のものがアウトオブフレームのハイブリッドエクソンとして検出された（図５ｂ）。
【０２０１】
第二のｇＲＮＡ対（ｇＲＮＡ５−５０とｇＲＮＡ１−５４）では、８つの細菌クローンからプラスミドを抽出し、シーケンシングに供した。これらのクローンの配列からも、これらのハイブリッドエクソン５０−５４（アンプリコン６５５ｂｐ）の７５％（８つのうち６つ）に予測されたリーディングフレームシフトが含まれていることが明らかになった。残りの２つのクローンのうち一方のクローンには、予測された欠失に加えて１ｂｐの挿入がみられ、これによりＤＹＳリーディングフレームが回復した。他方のクローンには、リーディングフレームを回復させない１１ｂｐの追加の欠失がみられた。
【０２０２】
実施例６
ｈＤＭＤ／ＭＤＸマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの修正（ＳｐＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）
ＣｉｎＤｅｌ法が培養した２９３Ｔ細胞およびＤＭＤ筋芽細胞に効果を示したため、ｇＲＮＡの対をコードするプラスミドをｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）にエレクトロポレートしてｉｎ  ｖｉｖｏでのＣｉｎＤｅｌ効果を確認した。７日後、ｇＲＮＡ２−５０／２−５４をエレクトロポレートしたＴＡおよびエレクトロポレートしていないＴＡからゲノムＤＮＡを抽出した。ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０および５４をＰＣＲで増幅した。これらのエクソンのアンプリコンをＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイのＣｅｌＩ酵素により消化したところ、追加のバンドを検出することができた（図６ａ、ＣｉｎＤｅｌのレーン）。これらの結果から、両ｇＲＮＡともその標的とするエクソンにｉｎ  ｖｉｖｏで変異を誘導することが可能であることが確認された。さらに、ハイブリッドエクソン５０−５４もＰＣＲで増幅し（図６ｂ、レーン３）、両ｇＲＮＡともｉｎ  ｖｉｖｏで同時に切断し１６０ｋｂ超の欠失を生じさせることが可能であることが明らかになった。ハイブリッドエクソン５０−５４のアンプリコンを細菌にクローニングし、１１クローンをシーケンシングに供した。これらのクローンのうち７クローンの配列が、同じｇＲＮＡ対を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で得られたものと同じであり（図５ｂ）、したがって、配列の６４％（１１クローンのうち７クローン）がｉｎ  ｖｉｖｏでのリーディングフレームの正確な回復を示した。
【０２０３】
実施例７
遺伝子修正筋芽細胞によって形成された筋管でのＤＹＳ発現（ＳｐＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）
ＣｉｎＤｅｌ遺伝子治療法がＤＹＳタンパク質の発現を回復させるのに有効であるかどうかを検証するため、ｇＲＮＡ２−５０およびｇＲＮＡ２−５４をトランスフェクトしたＤＭＤ筋芽細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋管に分化させた。融合培地に入れてから７日後、生じた筋管のタンパク質（図７ａ）を抽出した。ウエスタンブロットにより分子量が約４００ｋＤａの短縮された（Ｔｒｕｎｃ．）ＤＹＳタンパク質の存在が確認された（図７ｂ、レーン３）。このタンパク質の大きさは、エクソン５１〜５３ならびにエクソン５０および５４の一部分がない場合に予測される分子量に相当するものであり、正常な筋管では完全長（ＦＬ）ＤＹＳタンパク質の分子量は４２７ｋＤａである（図７ｂ、レーン２）。遺伝子を修正していないＤＭＤ筋管から抽出したタンパク質にはＤＹＳタンパク質は検出されなかった（図７ｂ、レーン１）。この結果から、ＣｉｎＤｅｌによってリーディングフレームを回復させたＤＭＤ患者の筋芽細胞によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された筋管は、内側が短縮されたＤＹＳタンパク質を発現することが可能であることがわかる。
【０２０４】
実施例８
実施例９〜２３の材料および方法
標的の特定およびｇＲＮＡクローニング。Ｕ６プロモーターの制御下にプロトスペーサーの挿入に必要な２つのＢｓａＩ制限部位を含む（下を参照されたい）プラスミドｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６１５９１；配列番号１６７）を本発明者らの研究に使用した。ｐＸ６０１プラスミドは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９も含む。
【０２０５】
Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ社のソフトウェアウェブサイトを利用して各エクソン配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスクリーニングすることにより、エクソン４６および５８に沿ってｇＲＮＡの標的となるヌクレオチド配列を特定した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴである。Ａｄｄｇｅｎｅ社の指示通りに、標的配列をコードするオリゴヌクレオチドおよびその相補配列をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ、コーラルビル、アイオワ州）で合成し、プロトスペーサーとしてＢｓａＩ部位にクローニングして、エクソン４６を標的とするｇＲＮＡ  ２種類およびエクソン４７を標的とするｇＲＮＡ  ３種類、エクソン４９を標的とするｇＲＮＡ  １種類、エクソン５１を標的とするｇＲＮＡ  ２種類、エクソン５２を標的とするｇＲＮＡ  ２種類、エクソン５３を標的とするｇＲＮＡ  ５種類およびエクソン５８を標的とするｇＲＮＡ  ３種類（配列については下の表６を参照されたい）を個別に作製した。簡潔に述べれば、Ｔ４  ＰＮＫ（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）を用いてオリゴヌクレオチドをリン酸化し、次いで、Ｑｕｉｃｋｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）を用いてプラスミドｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡのＢｓａＩ部位にアニールさせクローニングした。クローンを単離しＤＮＡを増幅させた後、プライマーＵ６Ｆ２（５’ＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴ  ３’）（配列番号１７８）を用いて試料のシーケンシングを実施し、ＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（ＣＬＣ  Ｂｉｏ社）を用いてシーケンシングの結果を解析した。
【０２０６】
細胞培養。２９３Ｔ細胞およびＤＭＤ患者筋芽細胞への発現プラスミドのトランスフェクション。
２９３Ｔ細胞およびエクソン４９〜５０の欠失、エクソン５１〜５３の欠失またはエクソン５１〜５６の欠失を有するＤＭＤ筋芽細胞を用いて、各ｇＲＮＡをコードするｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡプラスミドのトランスフェクションによりｇＲＮＡ活性を個別に、または対で試験した。２９３Ｔ細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）とを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）で増殖させた。ＤＭＤ患者筋芽細胞は１５％ＦＢＳを含有し抗生物質を含まないＭＢ−１培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローガン、ユタ州）で増殖させた。
【０２０７】
２４ウェルに入れた２９３Ｔにそれぞれ予めＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）で希釈した１μｇのプラスミドＤＮＡおよび３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州）を用いて、７０〜８０％の集密度でトランスフェクトした。ｇＲＮＡ対のトランスフェクションには、ＤＮＡ混合物の半分をエクソン５０上流の標的配列を有するｇＲＮＡをコードするプラスミドのものとし、半分をエクソン５０下流の標的配列を有するｇＲＮＡのものとした。細胞を５％ＣＯ２の存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。
【０２０８】
筋芽細胞に予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）で希釈した５μｇのプラスミドＤＮＡおよび２μＬのＴｒａｎｓｆｅＸ（商標）トランスフェクション試薬（ＡＴＣＣ（登録商標）ＡＣＳ−４００５（商標））を６ウェルプレート中、６０〜７０％の集密度でトランスフェクトした。トランスフェクションの前にＭＢ−１培地を新鮮な培地に入れ替えた。次いで、（上記の通りにＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（商標）で希釈した）ＴｒａｎｓｆｅＸプラスミドＤＮＡ複合体を細胞上に注ぎ、細胞／ＤＮＡ複合体を３７℃で一晩インキュベートした後、培地を新鮮なＭＢ−１に入れ替えた。細胞を５％ＣＯ２の存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。
【０２０９】
ゲノムＤＮＡの抽出および解析。ｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡプラスミド（１つまたは複数）をトランスフェクトしてから４８時間後、標準的なフェノール−クロロホルム法を用いて２９３Ｔ細胞または筋芽細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。簡潔に述べれば、細胞ペレットを１０％サルコシルと０．５Ｍ、ｐＨ８のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とを含有する溶解緩衝液１００μｌに再懸濁させた。プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた。懸濁液を上下にかき混ぜ、５５℃で１０〜１５分間インキュベートした。次いで、懸濁液を１３２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を新たな微量遠心管に収集した。１体積のフェノール−クロロホルムを加え、遠心分離した後、水相を新たな微量遠心管に回収した。次いで、１０分の１体積の５Ｍ  ＮａＣｌおよび２体積の１００％エタノールを用いてＤＮＡを沈殿させた後、１３２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離し、ＤＮＡを再蒸留水に再懸濁させた。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローガン、ユタ州）でゲノムＤＮＡ濃度をアッセイした。
【０２１０】
個々の切断または欠失が成功を収めたことを確認するため、次いでエクソン４６、４７、４９、５１、５２、５３、５８およびハイブリッドエクソン４６−５１、４６−５３、４９−５２、４９−５３、４７−５８をＰＣＲにより増幅した。エクソン４６では、センスプライマーはイントロン４５の末端を標的とし（センス４６  ５’−ＣＣＴＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＧＧＧＴＴＡＣＡＧＧと呼ぶ）（配列番号１７９）、アンチセンスプライマーはイントロン４６の開始点を標的とする（アンチセンス４６  ５’−ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＣＣＧＴＴＧＴＣと呼ぶ）（配列番号１８０）ものとした。エクソン４７では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン４６の末端（４７  ５’−ＧＴＡＴＴＴＧＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣと呼ぶ）（配列番号１８１）およびイントロン４７の開始点（アンチセンス４７  ５’−ＧＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＧＡＡＡＴＧと呼ぶ）（配列番号１８２）を標的とするものとした。エクソン４９では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン４８の末端（センス４９  ５’−ＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣと呼ぶ）（配列番号１８３）およびイントロン４９の開始点（アンチセンス４９  ５’−ＧＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣと呼ぶ）（配列番号１８４）を標的とするものとした。エクソン５１では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン５０の末端（センス５１  ５’−ＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＴＣＣＡＧＣと呼ぶ）（配列番号１８５）およびイントロン５１の開始点（アンチセンス５１  ５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡと呼ぶ）（配列番号１８６）を標的とするものとした。エクソン５２では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン５１の末端（センス５２  ５’−ＧＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＧＡＡＴＧＴＣと呼ぶ）（配列番号１８７）およびイントロン５２の開始点（アンチセンス５２  ５’−ＧＴＴＴＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣＴＧＴＣと呼ぶ）（配列番号１８８）を標的とするものとした。エクソン５３では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン５２の末端（センス５３  ５’−ＣＡＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧと呼ぶ）（配列番号１８９）およびイントロン５３の開始点（アンチセンス５３  ５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＧＧと呼ぶ）（配列番号１９０）を標的とするものとした。エクソン５８では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれイントロン５７の末端（センス５８  ５’−ＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＡＴＡＣＣＴＣＡＣＧＡＴＣＣと呼ぶ）（配列番号１９１）およびイントロン５８の開始点（アンチセンス５８  ５’−ＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＣＣＴＴＴＧと呼ぶ）（配列番号１９２）を標的とするものとした。ハイブリッドエクソン４６−５１では、順方向センス４６および逆方向アンチセンス５１を用いた。ハイブリッドエクソン４６−５３では、順方向センス４６’（５−’ＣＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＴ��ＴＧＣ）（配列番号１９３）および逆方向アンチセンス５１を用いた。ハイブリッドエクソン４７−５２では、順方向センス４７および逆方向アンチセンス５２を用いた。ハイブリッドエクソン４９−５２では、順方向センス４９および逆方向アンチセンス５２を用いた。ハイブリッドエクソン４９−５３では、順方向センス４９および逆方向アンチセンス５３を用いた。２９３Ｔ細胞のハイブリッドエクソン４７−５８では、プライマー順方向センス４７（配列番号１８１）およびプライマー逆方向アンチセンス５８（配列番号１９２）を用いた。筋芽細胞のハイブリッドエクソン４７−５８には、順方向センス４７’（５’−ＣＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＡＧＴＴＧ）（配列番号１９４）および逆方向アンチセンス５８’（５’−ＧＣＡＣＡＡＡＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＧＧＴＡＧ）（配列番号１９５）を用いた。ＡＡＶを注射したマウスのゲノムＤＮＡからハイブリッドエクソン４７−５８の形成を最適に検出するため、本発明者らはネステッドＰＣＲを実施した。１回目のＰＣＲはプライマー順方向センス４７（配列番号１８１）およびプライマー逆方向アンチセンス５８（配列番号１９２）を用いて実施した。２回目のＰＣＲはプライマー順方向センス４７’（配列番号１９４）およびプライマー逆方向アンチセンス５８’（配列番号１９５）を用いて実施した。ＰＣＲ増幅はいずれもＢＩＯ  ＲＡＤ社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のサーマルサイクラーＣ１０００  ＴｏｕｃｈでＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）を用いて実施した。エクソン４６は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６４．５℃／３０秒、７２℃／４０秒で３５サイクルを用いて増幅した。エクソン４７、４９、５１および５３は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６１．２℃／３０秒、７２℃／４５秒で３５サイクルを用いて増幅した。エクソン５２および５８は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６３℃／３０秒、７２℃／４０秒で３５サイクルを用いて増幅した。ハイブリッドエクソン４６−５１は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６６℃／３０秒、７２℃／３０秒で３５サイクルを用いて増幅した。ハイブリッドエクソン４６−５３は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６５．５℃／３０秒、７２℃／４０秒で３５サイクルを用いて増幅した。ハイブリッドエクソン４７−５２は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６１．２℃／３０秒、７２℃／３０秒で３５サイクルを用いて増幅した。ハイブリッドエクソン４９−５２は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６６℃／３０秒、７２℃／４５秒で３５サイクルを用いて増幅した。ハイブリッドエクソン４９−５３は以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６３℃／３０秒、７２℃／４５秒で３５サイクルを用いて増幅した。２９３Ｔ細胞では、ハイブリッドエクソン４７−５８を以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６１．２℃／３０秒、７２℃／３０秒で３５サイクルを用いて増幅した。筋芽細胞では、ハイブリッドエクソン４７−５８を以下のプログラム、すなわち��９８℃／１０秒、６３℃／３０秒、７２℃／３０秒で３５サイクルを用いて増幅した。個々のエクソン４６、４７、４９、５１、５２、５３および５８のアンプリコンを用いてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実施した。最初に、ＢＩＯ  ＲＡＤ社のサーマルサイクラーＣ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に緩徐なハイブリダイゼーションプログラム（９５℃で５分間変性させた後、アンプリコンを徐々に冷却する）を用いてアンプリコンのハイブリダイゼーション段階を実施した。次いで、サーマルサイクラー内でアンプリコンを４２℃で１時間、ヌクレアーゼＣｅｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、コーラルビル、アイオワ州）で消化した。消化産物を２％アガロースゲル上で可視化した。
【０２１１】
ハイブリッドエクソンのクローニングおよびシーケンシング。２種類の異なるｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞または筋芽細胞から抽出したゲノムＤＮＡの増幅によって得たハイブリッドエクソンのアンプリコンをＧｅｎｅＪＥＴ（商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を直線状クローニングベクターｐＭｉｎｉＴ（商標）（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）にクローニングした。次いで、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）でプラスミドＤＮＡを抽出した。クローンを製造業者（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）が提供するプライマーを用いたシーケンシングに供した。シーケンシングの結果をＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（ＣＬＣＢｉｏ社）で解析した。
【０２１２】
ｓｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写。Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈサーモサイクラー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いて、Ｉｙｏｍｂｅら（２０１６）に記載されているプラスミドからｓｇＲＮＡ１−５０および５−５４をＰＣＲにより増幅した。順方向プライマーは５’にＴ７プロモーター配列を付加するものとした（プライマーＦｗ−ＩＶＴ−１−５０およびＦｗ−ＩＶＴ−５−５４、表１）。逆方向プライマーはｔｒａｃｒＲＮＡの末端に対応するものである（Ｒｖ−ＩＶＴ−ｔｒａｃｒ、表５）。ｓｇＲＮＡをコードするアンプリコン配列をカラム（ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＧｅｎｅＪＥＴ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適量に分けた。キットＨｉＳｃｒｉｂｅ  Ｑｕｉｃｋ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）にアンプリコン５００ｎｇを用い、３７℃で１６時間インキュベートすることにより転写を実施した。次いで、ＤＮアーゼＩで処理した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、冷エタノールで沈殿させた。遠心分離後、ペレットを０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＲＮＡ濃度を評価した。得られたｓｇＲＮＡを−８０℃で保管した。
【０２１３】
【表５】
2019533440.tif 000010
【０２１４】
ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＳｐＣａｓ９リボ核酸複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの活性解析。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＳｐＣａｓ９複合体の活性を解析するため、Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈサーモサイクラーを用いてジストロフィン遺伝子のエクソン５４をＰＣＲにより増幅した。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入し、Ｃａｓ９タンパク質をＦｅｌｄａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社から入手した。次いで、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＳｐＣａｓ９とエクソン５４のアンプリコンとを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮアーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）で反応を停止させ、５６℃で５分間加熱した。１×ＴＢＥ緩衝液中１．５％のアガロースゲル上で泳動させることにより切断解析を実施した。
【０２１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質送達。実験には、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり細胞１００００個のコンフルエンスで播き、１０％ウシ胎児血清および５％のペニシリンとストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）で一晩インキュベートした。細胞を５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃でインキュベートした。次いで、これらの細胞にＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ技術（Ｆｅｌｄａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）を用いてｓｇＲＮＡの特異性および効率の解析を実施した。ＳｐＣａｓ９タンパク質２．５μＭおよび各ｓｇＲＮＡを別個に２μＭ用いてリボ核酸複合体を作製し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。複合体を濃度５０μＭのＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ａとインキュベートし、ＰＢＳ  １×を用いて体積を満たした。混合物を細胞に直接加え、ＲＴで正確に１分間インキュベートした。次いで細胞を培地で１回洗浄した後、ＰＢＳ  １×での洗浄段階を実施した。新鮮な培地を加え、細胞を４８時間インキュベートした後、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【０２１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質送達
エレクトロポレーション。ｈＤＭＤマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に２つのｓｇＲＮＡおよび１つのタンパク質送達剤と複合体を形成したタンパク質ＳｐＣａｓ９を含有する溶液４０μＬを縦方向に注射した。２．５μＭのＳｐＣａｓ９タンパク質と２μＭのｓｇＲＮＡ（使用した両ｓｇＲＮＡの総量）とで形成された複合体を５分間インキュベートし、エレクトロポレートした（エレクトロポレーターＥｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ、Ｍｏｄｅｌ  ＥＣＭ６３０、ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ホリストン、マサチューセッツ州、米国）。電気パルスの通過を促進するため、マウスの脚に電解質クリーム（Ｔｅｃａ社、ルイビル、ケベック州、カナダ）を塗布した。マウスの筋肉に２０ｍｓのパルスを１ｓ間隔で８回かけた。処理したマウスの脚の幅に合わせて電圧を１００Ｖ／ｃｍに調整した。７２時間後、マウスを屠殺した。次いでマウスにイソフルランで麻酔を施し、ＣＯ２吸入により安楽死させた。筋肉を採取し、縦方向に４片に分けた。
【０２１７】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍａｘ。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２μＬ用いて、１μＭのＳｐＣａｓ９タンパク質および０．７μＭのｓｇＲＮＡ（使用した両ｓｇＲＮＡの総量）を送達した。最初にリボ核酸複合体を５分間インキュベートし、次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉｍａｘと混合した後、さらに２０分間インキュベートし、そののち、ｈＤＭＤマウスのＴＡ筋に最終体積４０μＬで縦方向に注射した。７２時間後、マウスを屠殺した。エレクトロポレーションの場合と同じ方法で筋肉を採取した。
【０２１８】
Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ。２．５μＭのＳｐＣａｓ９タンパク質と２μＭのｓｇＲＮＡ（使用した両ｓｇＲＮＡの総量）とで複合体を形成させ、次いでＲＴで５分間インキュベートした。得られた複合体を２種類の異なるＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ、すなわち、５０μＭのＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ａ（ＦＳＡ、配列番号１９６）または３５μＭのＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｂ（ＦＳＢ、配列番号１９７）と混合した。いずれの場合も、反応物の最終体積を４０μＬに維持した。この溶液をＴＡ筋に縦方向に注射した。７２時間後、マウスを屠殺した。エレクトロポレーションの場合と同じ方法で筋肉を採取した。
【０２１９】
筋肉からのゲノムＤＮＡ抽出。処理したＴＡ筋を採取し、縦方向に４片に分けた。次いで、プロテイナーゼＫ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する溶解緩衝液でその断片を処理した。次いで、５５℃で１６時間インキュベートした。溶解後、フェノール／クロロホルムで抽出して精製ゲノムＤＮＡを得た。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＤＮＡ濃度を評価した。
【０２２０】
組織切断片からのゲノムＤＮＡ抽出。最初に、組織切断片をＰＢＳ  １×で１回洗浄することによりＯＣＴ（最適切削温度）コンパウンドを除去した。次いで、溶解緩衝液４００μＬを試料上に加えた。この混合物を１．５ｍＬエッペンドルフ管に入れ、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加した後、５６℃で１時間インキュベートした。蒸留水を用いて懸濁液を５００μＬにした。次いで、１体積のフェノール−クロロホルムを加え、遠心分離後、水相を新たな微量遠心管に回収した。次いで、１０分の１体積のＮａＣｌ  ５Ｍおよび２体積の１００％エタノールを用いてＤＮＡを沈殿させた後、１３２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離し、ＤＮＡを再蒸留水に再懸濁させた。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ローガン、ユタ州）でゲノムＤＮＡ濃度をアッセイした。
【０２２１】
筋線維でのジストロフィン発現を確認するための免疫組織化学。最初に、ＯＣＴコンパウンドを除去するため、ＰＢＳ  １×を用いてスライドを５分間、３回洗浄してＯＣＴコンパウンドをすべて除去した。次いで、ＰＢＳ  １×および１０％のＦＢＳを用いて筋肉切片を１時間ブロックした。直ちにブロッキング溶液をＰＢＳ  １×および１０％ＦＢＳで１：５０に希釈した一次抗体のマウス抗ジストロフィン（ＮＣＬ−Ｄｙｓ２、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社）を含有する溶液に置き換えた。一次抗体を１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ  １×を用いてスライドを１０分間、３回洗浄した。二次抗体のヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６。試料が乾燥するのを防ぐため、ＰＢＳ中５０％のグリセロールでスライドを覆い、次いでカバースライドをかけた。用いて蛍光を観察した。Ｎｉｋｏｎ  ＩＳＯ  ３２００を用い、露出時間４分の１秒で写真を撮影した。
【０２２２】
ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスモデルで形成されたハイブリッドエクソンのＰＣＲ解析。ｈＤＭＤの筋肉から抽出したゲノムＤＮＡを使用し、Ｃ１０００  ＴｏｕｃｈサーモサイクラーならびにプライマーＦｗ−Ｉｎｔ５０（５’−ＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’、配列番号２２２）およびＲｖ−Ｅｘ５４（５’−ＴＡＴＣＡＧＡＴＡＡＣＡＧＧＴＡＡＧＧＣＡＧＴＧ−３’、配列番号１７７）を用いてハイブリッドエクソンを増幅した。次いで、Ｒｅｄ  Ｓａｆｅ  １×色素（Ｃｈｅｍｂｉｏ社）を含有する１×ＴＢＥ緩衝液中１．５％のアガロースゲル上で泳動させることにより解析を実施した。
【０２２３】
ハイブリッドエクソンのクローニングおよびシーケンシング。ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＧｅｎｅＪＥＴ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてハイブリッドエクソンのアンプリコンを精製した。次いで、得られたＰＣＲ精製フラグメントをＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて適量に分けた。ＰＣＲ産物１５ｎｇをＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）のプラスミドベクターｐＭｉｎｉＴにクローニングした。次いで、ライゲーション産物を製造業者により提供された形質転換受容性細菌に形質転換し、次いで、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ  Ａｇａｒプレートに播いた。３７℃で１６時間インキュベートした後、クローンを採取し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（溶原性ブロス）５ｍＬに接種した。試料を３７℃で１６時間インキュベートした。この細菌培養物をＭｉｎｉｐｒｅｐキット（ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたプラスミドＤＮＡ抽出に使用した。プラスミドをＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適量に分け、次いでＣＨＵＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＨＵＱ）のシーケンシングプラットフォームに送った。得られた配列をＢＬＡＳＴ相同性プラットフォーム（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて解析した。
【０２２４】
実施例９
ＳｐＣａｓ９／ＲＮＡ複合体によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断の解析
ｓｇＲＮＡ１−５０および５−５０（上の表３を参照されたい）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により作製した。一部の実験には商用に生産されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡも使用した。ｓｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、疾患の原因となる欠失の前にあるエクソン５０および欠失の後にあるエクソン５４を標的とするものであった。リーディングフレームのみならずジストロフィンタンパク質の構造も修正するようｇＲＮＡ標的化配列を選択した。最初に、Ｃａｓ９タンパク質との複合体中のｇＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの切断効果をエクソン５４の標的化領域のＰＣＲアンプリコンで試験した。結果は、３７℃でインキュベートしてわずか３０分で完全に消化されたことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断効率が高いことを示していた（図８Ａ）。
【０２２５】
実施例１０
Ｆｅｌｄａｎ  ＳｈｕｔｔｌｅでＨｅｌａ細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを形質導入した場合のＤＭＤ遺伝子のエクソン５４に関するＳｕｒｖｅｙｏｒ試験。
次いで、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ技術を用いてＳｐＣａｓ９：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体またはＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体をＨｅｌａ細胞に形質導入した（図８Ｂ）。Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ａ（ＦＳＡ）およびＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｂ（ＦＳＢ）はポリペプチドベースのシャトル剤であり、Ｆｅｌｄａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の厚意により提供されたものである。本発明者らの実験ではゲノム抽出ＤＮＡにＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用い、ＳｐＣａｓ９タンパク質をｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体としてＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅで細胞に送達した場合にのみジストロフィン遺伝子が効率的に切断されることが明らかになった（図８Ｂ）。ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを用いて得られた切断効率に差はみられなかった。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡの使用がＣａｓ９タンパク質の活性に干渉することはないことを示している。
【０２２６】
実施例１１
ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスモデルへのＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の送達
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの良好な結果を受けて、この遺伝子編集方法をｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスモデルを用いｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。このマウスモデルには、そのゲノムに組み込まれた完全なヒトＤＭＤ遺伝子が含まれている（’ｔ  Ｈｏｅｎら，２００８）。これにより、ヒトＤＭＤエクソン５０および５４を標的とするｓｇＲＮＡを様々な方法で送達した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的欠失を誘導することも可能であるかどうかを検証することが可能になる、すなわち、ＳｐＣａｓ９タンパク質を２つのｓｇＲＮＡとの複合体としてマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に単回注射した。この複合体をエレクトロポレーション、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍａｘ）または２種類の異なるＦｅｌｄａｎ  ＳｈｕｔｔｌｅによりＴＡの筋線維に形質導入した。７２時間後、マウスを屠殺し、処理した筋肉を摘出し、４つの等しい部分に分けて、遺伝子編集の分布を解析した。ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅およびシーケンシング用に抽出した。エクソン５０と５４の間の領域は約１６０ｋｂであり、このため従来のＰＣＲにより増幅することはできない。しかし、２つの標的化エクソンにＤＳＢが生じた後にハイブリッドエクソンが形成されれば、約６００ｂｐのＰＣＲフラグメントを観察することができる（図８Ｃ）。ｓｇＲＮＡ対をＳｐＣａｓ９タンパク質との複合体として形質導入して得られたアンプリコンをゲル精製し、ｐＭｉｎｉＴプラスミドにクローニングし、細菌に形質転換し、クローンを挿入の成否に関してスクリーニングした。消化パターンに従って陽性クローン（データ不掲載）をシーケンシングに供し、エクソン５０の一部とエクソン５４の一部分の融合によって形成されたハイブリッドエクソンの存在を明らかにした（図９Ａ（ｉ））。観察された配列と予測配列との間の完全なアライメントによって示されるように（図９ｂ）、予測されたハイブリッドエクソン５０−５４がみられた（図９Ａ（ｉｉ）、配列番号２００）。このような結果がクローン配列の約６０％で得られた。配列の他の４０％では連結部位にインデルが含まれていた。このインデルはＮＨＥＪによる遺伝子の修正の際に生じるものであり、本発明者らのグループでも、ＳｐＣａｓ９遺伝子と本発明者らの実験で使用したものと同じｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを用いて同じハイブリッドエクソンを形成した際に観察される。
【０２２７】
実施例１２
ヒトジストロフィン遺伝子を標的とする目的ｇＲＮＡを特定するための戦略
本発明者らの主な目標は、エクソン５０の欠失があるＤＭＤ患者の場合にジストロフィン遺伝子リーディングフレームの修正を可能にするハイブリッドエクソンの作出に基づく戦略を確立することであった。このため、本発明者らは、エクソン５０周辺で考え得るあらゆるｇＲＮＡ標的部位をスクリーニングした。エクソン４６〜エクソン５８の全部位が特定された。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質とともに使用することができる約５０のｇＲＮＡが特定された。ＳａＣａｓ９ヌクレアーゼはＰＡＭ（ＮＮＧＲＲＴ）の上流３ヌクレオチドに正確に二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することから、ジストロフィン遺伝子の正常なリーディングフレームを回復させる新たなハイブリッドエクソンを作出するのに組み合わせることができるｇＲＮＡを選択することができた。このハイブリッド連結部により、内側が短縮されたジストロフィンを産生させることができた。本発明者らは、ハイブリッド連結部によって、疎水性アミノ酸が７つ組モチーフの「ａ」および「ｄ」の位置にある（スペクトリン様反復配列はそれぞれ７個のアミノ酸（ａ〜ｆ）を含むαへリックスで構成されており、疎水性アミノ酸が「ａ」および「ｄ」の位置にある；例えば、図１６を参照されたい）正常なスペクトリン様反復配列の立体配置が維持されるｇＲＮＡの組合せに主眼を置いた。これらのアミノ酸の正確な局在を評価するため、本発明者らはジストロフィンタンパク質の構造ドメインに関する情報を提供しているｅＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｅｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．ｇｅｎｏｕｅｓｔ．ｏｒｇ／）を参照した。本発明者らは予備解析の結果を受けて、ジストロフィン遺伝子のリーディングフレームを修正するのみならずスペクトリン様反復配列の構造も維持する１２種類のハイブリッドエクソンが得られる１８種類のｇＲＮＡ（表６を参照されたい）に研究の主眼を置いた。
【０２２８】
実施例１３
ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムに対する個々のｇＲＮＡの試験
本発明者らは、ＰＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ番号６１５９１）にクローニングした１８種類のｇＲＮＡを設計した（表６）。これらのｇＲＮＡの活性を評価するため２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ゲノムＤＮＡを抽出した。標的化エクソン４６、４７、４９、５１、５２、５３、５８をＰＣＲにより増幅した後、インデルを検出する「Ｓｕｒｖｅｙｏｒ」酵素アッセイに供した（図１２）。１８種類のｇＲＮＡのうち、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ４、ｇＲＮＡ９、ｇＲＮＡ１１、ｇＲＮＡ１５が活性をほとんどまたは全く示さないのに対し、残りのｇＲＮＡはいずれも、予測された大きさの切断バンドが生じたため、切断効率および特異性に優れていることがわかった。
【０２２９】
実施例１４
２９３Ｔ細胞にＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたｇＲＮＡ対の試験
大きなゲノム欠失を生じさせ、エクソン５０の欠失の周辺にあるエクソンを正確に連結させて正しいヌクレオチドにすると考えられるｇＲＮＡの組合せ（表７を参照されたい）を２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。このようにして、本発明者らが特定したｇＲＮＡの１２種類の組合せを試験した。一方の標的化エクソンにｇＲＮＡを個々に試験したときに既に使用した順方向プライマーを、他方の標的化エクソンに同様の逆方向プライマーを用いて、ハイブリッドエクソンをＰＣＲにより特定した（図１３）。このように、イントロンによって隔てられた部分が極めて多数存在するため、２つの標的化エクソンの間に欠失が起こった場合にのみＰＣＲ増幅が可能である。
【０２３０】
実施例１５
２９３Ｔ細胞を用いたハイブリッドエクソンの特徴付け（ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム）
ハイブリッドエクソンの増幅によるＰＣＲ産物を精製した後、ｐＭｉｎｉＴベクターにクローニングし、エクソン５０欠失周辺のＳａＣａｓ９と２種類のｇＲＮＡによる大きなゲノム欠失から生じたハイブリッドエクソンのシーケンシングを実施した（図１８ａ）。最終的に、ｇＲＮＡ３とｇＲＮＡ１６の組合せおよびｇＲＮＡ５とｇＲＮＡ１８の組合せが最も大きなゲノム欠失を生じさせ、ＤＭＤ患者に確認された変異の最大４０％をカバーすることが可能であることから、最も有望であるように思われた。さらに、４５０ｋｂｐの欠失を生じさせたｇＲＮＡ３とｇＲＮＡ１６の組合せは、連結部が被験クローンの７５％で予測されたものであるため、最も精度の高い組合せである。
【０２３１】
実施例１６
ＳａＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤ筋芽細胞のジストロフィンエクソン標的化
大きなゲノム欠失を生じさせ、エクソン４７と５８を正確に連結することが可能であると考えられる２種類のｇＲＮＡの組合せ、すなわち、ｇＲＮＡ３とｇＲＮＡ１６の組合せおよびｇＲＮＡ５とｇＲＮＡ１８の組合せをＤＭＤ患者の筋芽細胞に共トランスフェクトした。これらの組合せは、正確なリーディングフレームを有するハイブリッドエクソンを生じさせて、ハイブリッドスペクトリン様反復配列を有するジストロフィンタンパク質の産生を引き起こすことが可能であるはずである。プライマーである順方向センス４７’（配列番号１９４）および逆方向アンチセンス５８’（配列番号１９５）用いて、ハイブリッドエクソン４７−５８をＰＣＲにより特定した（図１５）。このように、イントロンによって隔てられた部分が極めて多数存在するため、２つの標的化エクソンの間に欠失が起こった場合にのみＰＣＲ増幅が可能である。
【０２３２】
実施例１７
筋芽細胞を用いたハイブリッドエクソン４７−５８の特徴付け（ＳａＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム）
ハイブリッドエクソン４７−５８の増幅によるＰＣＲ産物を精製した後、ｐＭｉｎｉＴベクターにクローニングし、エクソン５０欠失周辺のＳａＣａｓ９と２種類のｇＲＮＡによる大きな欠失から生じたハイブリッドエクソンのシーケンシングを実施した（図１８ｂ）。
【０２３３】
実施例１８
ＨＤＭＤ／ＭＤＸマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの修正（ＳａＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム）
２９３Ｔ、次いで様々なＤＭＤ患者の筋芽細胞を用いてｇＲＮＡの対を特定し特徴付けた後、本発明者らは、ＡＡＶ血清型９を用いて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣＲＩＳＰＲシステムならびにｇＲＮＡ３と１６の対およびｇＲＮＡ５と１８の対のウイルスＡＡＶ媒介性送達を試験した。１つのＡＡＶ９は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＳａＣａｓ９ヌクレアーゼを発現させるものであり、２つ目のＡＡＶ９はｇＲＮＡの対（ｇＲＮＡ３と１６またはｇＲＮＡ５と１８）をコードするものであった。６週齢のｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスへのウイルス粒子の投与を腹腔内注射経路と静脈内注射経路とで比較した。注射から６週間後にマウスを屠殺した。組織、すなわち、心臓、横隔膜、前脛骨筋（ＴＡ）、脳／小脳、肝臓を採取し、３０％スクロース中で一晩インキュベートした。ＯＣＴ媒体に回収し液体窒素で凍結させた後、組織を処理してスライドガラスに載せ、ゲノムＤＮＡを抽出し精製した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのハイブリッドエクソン４７−５８の形成の成功を最適に検出するため、ネステッドＰＣＲを実施した。１回目のＰＣＲは順方向プライマーセンス４７および逆方向プライマーアンチセンス５８を用いて実施した。２回目のＰＣＲは順方向センス４７’（配列番号１９４）および逆方向アンチセンス５８’（配列番号１９５）とした。図２１に、心臓（ａ）、横隔膜（ｂ）、ＴＡ（ｃ）のゲノムＤＮＡを用いたネステッドＰＣＲ後のハイブリッドエクソン４７−５８の形成の検出を示す。心臓では横隔膜と同じく、未処理マウス（ＮＴ）と比較して、ＳａＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ対、すなわち、ｇＲＮＡ３と１６およびｇＲＮＡ５と１８のウイルス送達によってハイブリッドエクソン４７−５８が形成されるのが観察された。さらに、ＴＡでは、ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡ３と１６の対またはｇＲＮＡ５と１８の対を静脈内注射で送達した場合に限りハイブリッドエクソン４７−５８の増幅が検出された。
【０２３４】
実施例１９
ＲＡＧ／ＭＤＸジストロフィーマウスモデルにＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体を送達する方法（実施例２０〜２３）
プラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＰｕｒｏへのｇＲＮＡクローニング。標的配列およびその相補配列をコードするオリゴヌクレオチドをＩＤＴ社に注文し、Ｕ６プロモーターの制御下にプロトスペーサーの挿入に必要な２つのＢｂｓＩ制限部位を含むプラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ｐＸ４５９）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４８１３９）にクローニングした。実施例８に既に記載した通りにクローニングを実施した。ｐＳｐＣａｓ（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏプラスミドには、ＣＢｈプロモーターの制御下に化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９およびピューロマイシン耐性遺伝子が含まれており、両遺伝子は、自己切断ペプチドＴ２Ａをコードする配列によって隔てられている。ピューロマイシン耐性遺伝子は、トランスフェクトが困難な細胞系であるトランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１７７２）の選択を可能にするものであり、この遺伝子により同細胞を富化させた。
【０２３５】
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞）を用いて、各ｇＲＮＡをコードするｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ピューロマイシンプラスミドのトランスフェクションによりｇＲＮＡ活性を個別に、または対で試験した。Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）とを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）で増殖させた。トランスフェクションから２４時間後、細胞を２μｇ／ｍＬのピューロマイシンに４８時間供して、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞を選択した。ピューロマイシン選択の後、細胞をピューロマイシンの不在下で４８時間増殖させた。
【０２３６】
実施例８に記載した通りにゲノムＤＮＡを抽出した。
【０２３７】
改変ＤＹＳ遺伝子のＰＣＲ増幅。正確な切断および欠失を評価するため、イントロン２２内に位置する順方向プライマーＦｗ２−ｉ２２（５’−ＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＴＡＡＡＧＡＣ  ３’）（配列番号２０４）およびイントロン２３内に位置する逆方向プライマーＲｅｖ１−ｉ２３（５’−ＴＣＡＡＴＧＴＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡ  ３’）（配列番号２０５）を用いて、標的化領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅はＢＩＯ  ＲＡＤ社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）のサーマルサイクラーＣ１０００  ＴｏｕｃｈでＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）を用いて実施した。エクソン２３を以下のプログラム、すなわち、９８℃／１０秒、６１．２℃／３０秒、７２℃／４５秒で３５サイクルを用いて増幅した。個々のｇＲＮＡ活性の解析には、ＰＣＲ産物をＳｕｒｖｅｙｏｒ酵素アッセイに供した。ｇＲＮＡの対の解析には、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に負荷した。ｇＲＮＡの対がエクソン２３を欠失させる場合、ＰＣＲ増幅により、野生型のバンドがイントロン２２およびイントロン２３の欠失後に残った部分に対応する短くなったバンドとともに検出される。
【０２３８】
エクソン２３に対して生成したアンプリコンを用いてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実施した。最初に、ＢＩＯ  ＲＡＤ社のサーマルサイクラーＣ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に緩徐なハイブリダイゼーションプログラム（９５℃で５分間変性させた後、アンプリコンを徐々に冷却する）を用いてアンプリコンのハイブリダイゼーション段階を実施した。次いで、サーマルサイクラー内でアンプリコンを４２℃で１時間、ヌクレアーゼＣｅｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、コーラルビル、アイオワ州）で消化した。消化産物を２％アガロース上で可視化した。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏの実験には、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社（レッドウッドシティ、カリフォルニア州）に注文したｓｇＲＮＡ２０、ｓｇＲＮＡ２２およびｓｇＲＮＡ２３を用いた。ヌクレアーゼもＲＮアーゼも含まない水に再懸濁させて５０μＭのストック濃度とし−８０℃で回収した１ｎｍｏｌの各ｓｇＲＮＡを受け取った。希釈標準溶液として、ｓｇＲＮＡを１０μＭに希釈し、−２０℃で保管した。
【０２４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質送達。２．５μＭのＳｐＣａｓ９タンパク質と２μＭのｓｇＲＮＡとの複合体を形成させた後、ＲＴで５〜１０分間インキュベートした。ｓｇＲＮＡ混合物は、エクソン２３上流の領域を標的とする１μＭのｓｇＲＮＡ  １つと、エクソン２３下流の領域を標的とする１μＭのｓｇＲＮＡ  １つとで構成されるものである。得られた複合体を３種類の異なるＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ、すなわち、５０μＭのＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ａ（ＦＳＡ）、３５μＭのＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｂ（ＦＳＢ）または５０μＭのＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｃ（ＦＳＣ）と混合した。各条件とも、反応物の最終体積を４０μＬに維持した。陰性対照には、ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＳｐＣａｓ９をＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ無しで注射した。被験溶液を前脛骨筋の縦方向に注射した。３週間後、マウスを屠殺し、筋肉を採取した。筋肉を３０％スクロース、４℃で一晩インキュベートした。次いで、筋肉をＯＣＴ媒体に包埋し、液体窒素中で急速冷凍した。次いで、クリオスタット（Ｌｅｉｃａシステム）を用いて組織を処理し、グリシン処理スライドガラス上に１６μｍの横断面切片を作製した。
【０２４１】
ハイブリッドイントロンのＰＣＲ増幅のための戦略。エクソン２３の欠失を検出するため本発明者らは、最適化したネステッドＰＣＲ法を実施した。１回目のＰＣＲ反応では、外側順方向プライマーＦ１−ｉ２２（５’−ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣ）（配列番号２２３）および外側逆方向プライマーＲｅｖ１−ｉ２３（５’−ＴＣＡＡＴＧＴＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡ）（配列番号２２４）と、エクソン２３を標的とする順方向「ポイズン」プライマーＦｗ−Ｐ（５’−ＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＧ）（配列番号２２５）とを用いた。この戦略では主として、順方向「ポイズン」プライマーおよび外側逆方向プライマーから生成し野生型領域を増幅することができる。しかし、エクソン２３が欠失すると、順方向ポイズンプライマーＦｗ−Ｐは増幅産物を生成することができなくなる。したがって、ゲノムＤＮＡからは、２つの外側プライマーによりエクソン２３が欠失したゲノムＤＮＡが増幅されて富化し、それによりイントロン２２の残りの部分およびイントロン２３の一部によって形成されるハイブリッドイントロンが増幅される。１回目のＰＣＲの後、内側順方向プライマーＦ２−ｉ２２（５’−ＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＴＡＡＡＧＡＣ）（配列番号２２６）および内側逆方向プライマーＲｅｖ２−ｉ２３（５’−ＣＡＧＡＣＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＣＡＣ）（配列番号２２７）を用いてネステッドＰＣＲを実施する。この１つの内側プライマーは、外部プライマーのみで生成した前のアンプリコン、すなわち、エクソン２３を欠くアンプリコンから増幅させる。この内側プライマーのみの組合せは、２つの外側プライマー、Ｆ１−ｉ２２およびＲｅｖ１−ｉ２３で得られたアンプリコンからの増幅を可能にする。
【０２４２】
ハイブリッドイントロンの解析。ＴＡ筋から抽出したゲノムＤＮＡの増幅により得られたハイブリッドイントロンのアンプリコンを直線状クローニングベクターｐＭｉｎｉＴ（商標）（ＮＥＢ社、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）にクローニングした。次いで、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（商標）Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＥＵ、リトアニア）でプラスミドＤＮＡを抽出した。クローンを製造業者（ＮＥＢ、イプウィッシュ、マサチューセッツ州）が提供するプライマーを用いたシーケンシングに供した。シーケンシングの結果をＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（ＣＬＣＢｉｏ社）で解析した。
【０２４３】
ジストロフィン陽性線維のカウント。陽性の数値が最も高い３つの連続筋肉片のジストロフィン陽性線維の数をカウントし、平均値および標準偏差を明らかにした。
【０２４４】
実施例２０
マウスモデルＲａｇ／ｍｄｘの変異エクソン２３を除去するためのイントロン２２およびイントロン２３を標的とするｇＲＮＡ
マウスモデルＲａｇ／ｍｄｘは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に変異がある。そのため、このナンセンス点変異Ｃ５７２Ｔによって未成熟終止コドンが生じ、４２７ｋＤａの野生型ジストロフィンタンパク質が合成されなくなる。エクソン２３のヌクレオチド数は３の倍数であるため、その欠失によりジストロフィン遺伝子のリーディングフレームを修正することが可能であるはずである。したがって、本発明者らは、その周辺のイントロンを標的とするｇＲＮＡの対を設計することによってエクソン２３を欠失させることを目的とした。このため、本発明者らは、イントロン２２内のエクソン２３の上流にあるｇＲＮＡ標的部位４つと、イントロン２３内のエクソン２３の下流にあるｇＲＮＡ標的部位４つを特定した（表８を参照されたい）。２つの標的部位はエクソン２３／イントロン２３連結部に及ぶものであるが、遺伝子内に導入される切断はイントロン配列内に位置している（表８のｇＲＮＡ番号２０および２６を参照されたい）。
【０２４５】
本発明者らはこのようにして、ＰＸ４５９にクローニングしたイントロン２２またはイントロン２３を標的とする８種類のｇＲＮＡ発現構築物を調製した。この８種類のｇＲＮＡの活性を評価するため、Ｃ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いてトランスフェクト細胞の選択を４８時間実施した。無選択培地でさらに４８時間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。エクソン２３およびその周辺のイントロンをＰＣＲにより増幅し、試料を「Ｓｕｒｖｅｙｏｒ」検出アッセイに供してインデルの形成を評価した（図２２ａ）。試験条件下では、試験した８種類のｇＲＮＡのうちｇＲＮＡ１９、ｇＲＮＡ２０、ｇＲＮＡ２１、ｇＲＮＡ２２、ｇＲＮＡ２３およびｇＲＮＡ２４が良好な切断効率を示したのに対し、ｇＲＮＡ２５およびｇＲＮＡ２６には活性が全く検出されなかった。
【０２４６】
実施例２１
Ｃ２Ｃ１２細胞を用いたエクソン２３の欠失に関するｇＲＮＡ対の試験
実施例２０で特定したｇＲＮＡに基づき、本発明者らは、エクソン２３を欠失させることが可能なｇＲＮＡの組合せを試験した。したがって、本発明者らは、ｇＲＮＡ２２と２０、ｇＲＮＡ２２と２１、ｇＲＮＡ２２と２４、ｇＲＮＡ２３と２０、ｇＲＮＡ２３と２１およびｇＲＮＡ２３と２４の組合せを試験した。エクソン２３の欠失をアッセイするため、プライマーＦｗ２−ｉ２２およびＲｅｖ１−ｉ２３を用いて精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅し、アガロースゲル上に負荷した（図２２ｂ）。それぞれの条件で、完全なイントロン２２、エクソン２３およびイントロン２３によって形成された野生型バンドがＰＣＲ反応により検出された。さらに、試験したｇＲＮＡの各組合せでは、増幅により大きさが野生型産物より小さい第二の産物が検出される。これらの短縮された産物は、エクソン２３の欠失によって生じた大きさに相当する。のちのｉｎ  ｖｉｖｏの実験では、ｇＲＮＡ２０と２２の組合せおよびｇＲＮＡ２０と２３の組合せに焦点を当てることにした。
【０２４７】
実施例２２
マウスモデルＲａｇ／ｍｄｘを用いた変異エクソン２３の欠失に関するｇＲＮＡ対の試験
ｉｎ  ｖｉｖｏの実験では、本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質と、ジストロフィーマウスモデルＲａｇ／ｍｄｘの変異エクソン２３の上流および下流のＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡの対とのペプチドによる送達に基づく非ウイルス送達法を用いた。Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ（ＦＳ）として知られるこの非ウイルス送達ツールは、非共有結合を介してリボ核タンパク質複合体Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを結合させるものである。細胞内に移行すると、ｐＨの変化によってＦＳとリボ核タンパク質複合体との間の相互作用が崩壊する。Ｆｅｌｄａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の３種類のシャトル、すなわち、ＦＳＡ、ＦＳＢおよびＦＳＣを試験した。
【０２４８】
最初のｉｎ  ｖｉｖｏの実験では、４か月齢のマウスの前脛骨筋の下部から上部に向かって縦方向に単回注射により注射した。注射から３週間後、実施した筋肉を採取するためマウスを屠殺した。これまでの結果から、注射の３日後に所望のゲノム欠失を検出することが可能であることがわかっていたが、筋管内に回復したジストロフィン発現を蓄積させるため、３週間待った。筋肉を採取し、回収し、厚さ１６μｍの横断切片に処理した後、ＮＣＬ−Ｄｙｓ２抗体を用いてジストロフィンに対する免疫組織化学を実施し（図２３）、ジストロフィン陽性線維を解析した。
【０２４９】
未処理筋肉には約３７本のジストロフィン陽性線維が含まれているのが観察された。これらの天然にみられる線維は復帰変異体線維と呼ばれ、エクソン２３内への別の変異に起因するか、またはエクソン２３がスプライシングを受けたためジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修正されたことに起因するのではないかと思われる。未処理筋肉との比較では、ＦＳＢと複合体を形成したＣａｓ９およびｇＲＮＡ２２と２０で、またはＦＳＡと複合体を形成したＣａｓ９およびｇＲＮＡ２３と２０の送達で処理した筋肉では、ジストロフィン陽性線維の数が増大し、それぞれ４９本および３９本のジストロフィン陽性線維がみられた。一方、ｇＲＮＡ２２および２０とＦＳＡの組合せならびにｇＲＮＡ２３および２０とＦＳＢの組合せでは、ジストロフィン陽性線維がそれぞれ８３本および９９本みられた。最後に、ｇＲＮＡ２２と２０またはｇＲＮＡ２３と２０を送達するリボ核タンパク質と複合体を形成したＦＳＣがジストロフィン陽性線維の数が最も多く、線維はそれぞれ１８６本および１９９本であった。したがって、のちの実験では、筋肉へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ送達、ひいてはジストロフィン遺伝子のリーディングフレームの修正に最も適した非ウイルス送達システムであると思われるＦＳＣの使用に焦点を当てた。
【０２５０】
観察されたジストロフィン陽性線維がエクソン２３を欠失させるようプログラムしたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの作用に由来するものであることを裏付けるため、本発明者らは標的化ゲノム領域のＰＣＲ増幅を実施した。プライマーＦｗ２−ｉ２２およびＲｅｖ１−ｉ２３を用いたＰＣＲ増幅の予備結果ではエクソン２３の欠失が検出されないため、実施例１９に記載したように、小さな欠失が検出できる最適化したネステッドＰＣＲ法を用いた。ここでは、プライマーＦｗ１−ｉ２２およびＲｅｖ１−ｉ２３を用いて１回目のＰＣＲを実施し、ポイズンプライマーＦｗ−Ｐ（図２５ａ）でのみ野生型配列に対応する産物を可視化が可能である。次いで、内側プライマーＦｗ２−ｉ２２およびＲｅｖ２−ｉ２３を用いてネステッドＰＣＲを実施した（図２５ｂ）。ＦＳＡと複合体を形成したｇＲＮＡ２３および２０とＳｐＣａｓ９の組合せではエクソン２３の欠失が検出されない。一方、ｇＲＮＡとＦＳＢまたはＦＳＣの組合せを含む他の組合せでは、エクソン２３の欠失に対応するＰＣＲ産物が検出された。
【０２５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏの実験の２ラウンド目では、６週齢のマウスの前脛骨筋の縦方向に単回注射により注射した。注射から３週間後、注射を実施した筋肉を採取するためマウスを屠殺した。筋肉を採取し、回収し、厚さ１６μｍの横断切片に処理した後、ＮＣＬ−Ｄｙｓ２抗体を用いてジストロフィンに対する免疫組織化学を実施し（図２６）、ジストロフィン陽性線維を解析した。これらの実験では、ＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡ単独、または１回目の実験でジストロフィンタンパク質の回復効率が最も高かったＦｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  ＦＳＣと複合体を形成したＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを注射した。
【０２５２】
これらの２ラウンド目の実験では、ｇＲＮＡの対、すなわち、ＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２０と２２もしくはｇＲＮＡ２０と２３、またはＦＳＣと複合体を形成していないｇＲＮＡ２０と２２もしくはｇＲＮＡ２０と２３とのＳｐＣａｓ９の送達を比較することを目的とした。シャトルＦＳＣを用いて検出された回復したジストロフィン陽性線維の数が増大したことからわかるように、このシャトルが最も高い送達効率を示したため、本発明者らは同シャトルに焦点を絞った。ｇＲＮＡ２０と２２の対およびｇＲＮＡ２０と２３の対と複合体を形成したＳｐＣａｓ９の筋肉内注射では、ジストロフィン陽性線維がそれぞれ１０１本および１２０本みられた。さらに、ＳｐＣａｓ９をｇＲＮＡの対とともに送達するのにＦＳＣを使用すると、ジストロフィン陽性線維の数が増大する。実際、送達にＦＳＣを使用したところ、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２２では１５１本のジストロフィン陽性線維がみられ、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ２０と２３では１６６本のジストロフィン陽性線維がみられた。
【０２５３】
観察されたジストロフィン陽性線維がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびエクソン２３の欠失に特異的なｇＲＮＡの対の作用に由来するものであることを裏付けるため、本発明者らは標的化ゲノム領域のＰＣＲ増幅を実施した。プライマーＦｗ１−ｉ２２、Ｒｅｖ１−ｉ２３およびポイズンプライマーＦｗ−Ｐを用いて実施した１回目のＰＣＲ（図２８ａ）でのみ野生型ＤＹＳ配列に対応する産物が増幅した。次いで、内側プライマーＦｗ２−ｉ２２およびＲｅｖ２−ｉ２３（図２８ｂ）を用いてネステッドＰＣＲを実施した。単独の、またはＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２２および２０とＳｐＣａｓ９の組合せではエクソン２３の欠失が検出された。ｇＲＮＡ２３と２０の組合せで同じ観察を実施した。しかし、ＦＳＣと複合体を形成したｇＲＮＡ２３と２０およびＳｐＣａｓ９の１回の注射ではエクソン２３の欠失に対応するＰＣＲ産物は検出されず、これは注射に失敗したことに起因するのではないかと思われる。
【０２５４】
【表６】
2019533440.tif 000011
2019533440.tif 000012
2019533440.tif 000013
＊太字で示される配列はイントロン配列（すなわち、示されるエクソン隣接する部分）である。
＊＊ＤＹＳ  ｃＤＮＡ配列に関する番号付けはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｍｄ．ｎｌ／ｓｅｑｓ／ｍｕｒｅｆＤＭＤ．ｈｔｍｌ（Ｌｅｉｄｅｎ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙページ、ＤＭＤ  ｃＤＮＡ参照配列）に記載されている。参照配列はジストロフィンのＤｐ４２７ｍアイソフォーム（筋肉）を含むＧｅｎＢａｎｋファイルＮＭ＿００４００６．１に基づくものである（１２５０５Ｇ＞Ａの１箇所が異なる）。
【０２５５】
【表７】
2019533440.tif 000014
【０２５６】
【表８】
2019533440.tif 000015
＊太字で示される配列はエクソン配列（すなわち、示されるイントロンに隣接する部分）である。
【０２５７】
【表９】
2019533440.tif 000016
2019533440.tif 000017
【０２５８】
ここまで、本発明についてその好ましい実施形態により説明してきたが、添付の請求項で定められる本発明の趣旨および性質を逸脱することなく本発明に修正を施すことができる。
【０２５９】
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２３．Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍｄｘ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１０８３−１０９０．
２４．Ｌｕ，ＱＬ，Ｍａｎｎ，ＣＪ，Ｌｏｕ，Ｆ，Ｂｏｕ−Ｇｈａｒｉｏｓ，Ｇ，Ｍｏｒｒｉｓ，ＧＥ，Ｘｕｅ，ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｅｘｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：１００９−１０１４．
２５．Ｍａｎｎ，ＣＪ，Ｈｏｎｅｙｍａｎ，Ｋ，ＭｃＣｌｏｒｅｙ，Ｇ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｔｏｎ，ＳＤ（２００２）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ４：６４４−６５４．
２６．Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｙ，Ｙａｇｉ，Ｍ，Ｗａｄａ，Ｈ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｋ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ，Ｋａｋｕｍｏｔｏ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍＲＮＡ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ５９：６９０−６９４．
２７．ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，ＪＣ，Ｊａｎｓｏｎ，ＡＡ，Ｇｉｎｊａａｒ，ＩＢ，Ｆｒａｎｋｈｕｉｚｅｎ，ＷＳ，Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ，Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｌｏｃａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＰＲＯ０５１．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５７：２６７７−２６８６．
２８．Ｋｉｎａｌｉ，Ｍ，Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ，Ｖ，Ｆｅｎｇ，Ｌ，Ｃｉｒａｋ，Ｓ，Ｈｕｎｔ，Ｄ，Ａｄｋｉｎ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｌｏｃａｌ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ＡＶＩ−４６５８  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ８：９１８−９２８．
２９．Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ（２０１０）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＲＮＡ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４５３−４６１．
３０．Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，ＤＧ，Ｋａｂａｄｉ，ＡＭ，Ｔｈａｋｏｒｅ，ＰＩ，Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ，Ｂｒｏｗｎ，ＭＴ，Ｍａｊｏｒｏｓ，ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ５１  ｂｙ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２３：５２３−５３２．
３１．Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ，Ｃｈａｐｄｅｌａｉｎｅ，Ｐ，Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｓ，Ａｌｍｅｉｄａ，ＬＰ，Ｃｏｒｂｅｉｌ，Ｊ，Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １３：５２２−５３７．
３２．Ｌｉ，ＨＬ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｎ，Ｓａｓａｋａｗａ，Ｎ，Ｓｈｉｒａｉ，Ｓ，Ｏｈｋａｍｅ，Ｔ，Ｓａｋｕｍａ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：１４３−１５４．
３３．Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，ＤＧ，Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ，Ｔｈａｋｏｒｅ，ＰＩ，Ｋａｂａｄｉ，ＡＭ，Ｂｒｏｗｎ，ＭＴ，Ｑｉｎ，Ｘ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１：１７１８−１７２６．
３４．Ｌｏｎｇ，Ｃ，ＭｃＡｎａｌｌｙ，ＪＲ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＪＭ，Ｍｉｒｅａｕｌｔ，ＡＡ，Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ，Ｒ，ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，ＥＮ（２０１４）．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５：１１８４−１１８８．
３５．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ，Ｆｕｊｉｉ，Ｗ，Ｔｓｕｂｏｉ，Ｍ，Ｔａｎｉｈａｔａ，Ｊ，Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｎ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｏｄｅｌ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：５６３５．
３６．Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，ＤＧ，Ｋａｂａｄｉ，ＡＭ，Ｔｈａｋｏｒｅ，ＰＩ，Ｍａｊｏｒｏｓ，ＷＨ，Ｒｅｄｄｙ，ＴＥ，ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ，ＣＡ（２０１５）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ６：６２４４．
３７．Ｒａｎ，ＦＡ，Ｃｏｎｇ，Ｌ，Ｙａｎ，ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ，Ｋｒｉｚ，ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ  ５２０：１８６−１９１．
３８．Ｃｏｎｇ，Ｌ，Ｒａｎ，ＦＡ，Ｃｏｘ，Ｄ，Ｌｉｎ，Ｓ，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ，Ｈａｂｉｂ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３．
３９．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ，Ｅａｓｔ，Ａ，Ｃｈｅｎｇ，Ａ，Ｌｉｎ，Ｓ，Ｍａ，Ｅ，ａｎｄ  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ（２０１３）．ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１．
４０．Ｓａｎｄｅｒ，ＪＤ，ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，ＪＫ（２０１４）．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：３４７−３５５．
４１．Ｍａｌｉ，Ｐ，Ｙａｎｇ，Ｌ，Ｅｓｖｅｌｔ，ＫＭ，Ａａｃｈ，Ｊ，Ｇｕｅｌｌ，Ｍ，ＤｉＣａｒｌｏ，ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６．
４２．Ｃｈｏ，ＳＷ，Ｋｉｍ，Ｓ，Ｋｉｍ，ＪＭ，ａｎｄ  Ｋｉｍ，ＪＳ（２０１３）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
４３．Ｄｏｕｄｎａ，ＪＡ，ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６：１２５８０９６．
４４．Ｚｈｅｎｇ，Ｑ，Ｃａｉ，Ｘ，Ｔａｎ，ＭＨ，Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ，Ｓ，Ａｒｎｏｌｄ，ＣＰ，Ｇｏｎｇ，Ｘ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５７：１１５−１２４．
４５．Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｅ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ，Ｓｈａｒｍａ，ＣＭ，Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｋ，Ｃｈａｏ，Ｙ，Ｐｉｒｚａｄａ，ＺＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７．
４６．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ，ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，ＥＪ（２０１０）．ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１：１８１−１９０．
４７．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ，Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ，Ｈａｕｅｒ，Ｍ，Ｄｏｕｄｎａ，ＪＡ，ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ（２０１２）．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１．
４８．Ｃａｎｖｅｒ，ＭＣ，Ｂａｕｅｒ，ＤＥ，Ｄａｓｓ，Ａ，Ｙｉｅｎ，ＹＹ，Ｃｈｕｎｇ，Ｊ，Ｍａｓｕｄａ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９：２１３１２−２１３２４．
４９．Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ，Ｋａｍａｎ，ＷＥ，Ｗｅｉｊ，Ｒ，ｄｅｎ  Ｄｕｎｎｅｎ，ＪＴ，ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ，ＧＪ，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，ＪＣ（２００６）．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｘｏｎｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４０１−４０７．
５０．Ｂｅｒｏｕｄ，Ｃ，Ｔｕｆｆｅｒｙ−Ｇｉｒａｕｄ，Ｓ，Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ，Ｈａｍｒｏｕｎ，Ｄ，Ｈｕｍｂｅｒｔｃｌａｕｄｅ，Ｖ，Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＭＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｏｎｓ  ４５  ｔｈｒｏｕｇｈ  ５５  ｃｏｕｌｄ  ｒｅｓｃｕｅ  ｕｐ  ｔｏ  ６３％  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２８：１９６−２０２．
５１．Ｓｋｕｋ，Ｄ，ａｎｄ  Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ＪＰ（２０１４）．Ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｍｉｓｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｓ  ａｂｏｕｔ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｙｏｌｏｇｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２：８９７−８９８．
５２．Ｓｋｕｋ，Ｄ，ａｎｄ  Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ＪＰ（２０１１）．Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｄａｔａ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１：３５９−３７４．
５３．Ｂｒｕｕｓｇａａｒｄ，ＪＣ，Ｌｉｅｓｔｏｌ，Ｋ，Ｅｋｍａｒｋ，Ｍ，Ｋｏｌｌｓｔａｄ，Ｋ，ａｎｄ  Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ（２００３）．Ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｒｅｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｉｃｅ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５５１：４６７−４７８．
５４．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｉ，Ｖｉｌｑｕｉｎ，ＪＴ，Ａｓｓｅｌｉｎ，Ｉ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ，ａｎｄ  Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ＪＰ（１９９８）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｐｒｄｕｃｅｄ  ｏｎｌｙ  ａ  ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ２１：９１−１０３．
５５．Ｐａｖｌａｔｈ，ＧＫ，Ｒｉｃｈ，Ｋ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＳＧ，ａｎｄ  Ｂｌａｕ，ＨＭ（１９８９）．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５７０−５７３．
５６．Ｎｉｃｏｌａｓ，Ａ，Ｒａｇｕｅｎｅｓ−Ｎｉｃｏｌ，Ｃ，Ｂｅｎ  Ｙａｏｕ，Ｒ，Ａｍｅｚｉａｎｅ−Ｌｅ  Ｈｉｒ，Ｓ，Ｃｈｅｒｏｎ，Ａ，Ｖｉｅ，Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２４：１２６７−１２７９．
５７．Ｋａｓｐａｒ，ＲＷ，Ａｌｌｅｎ，ＨＤ，Ｒａｙ，ＷＣ，Ａｌｖａｒｅｚ，ＣＥ，Ｋｉｓｓｅｌ，ＪＴ，Ｐｅｓｔｒｏｎｋ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ａｇｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｉｒｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｇｅｎｅｔ  ２：５４４−５５１．
５８．Ｒａｎ，ＦＡ，Ｈｓｕ，ＰＤ，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｆ（２０１３）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ８：２２８１−２３０８．
５９．ｔ  Ｈｏｅｎ，ＰＡ，ｄｅ  Ｍｅｉｊｅｒ，ＥＪ，Ｂｏｅｒ，ＪＭ，Ｖｏｓｓｅｎ，ＲＨ，Ｔｕｒｋ，Ｒ，Ｍａａｔｍａｎ，ＲＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｕｍａｎ  ＤＭＤ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：５８９９−５９０７．
６０．Ｍｏｈａｎｒａｊｕ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｏｏｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３（６２９９：ａａｄ５１４７．
６１．Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６０（３）：３８５−９７．
６２．Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｃｐｆ１  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７１．
６３．Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，ＢＰ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ＰＡＭ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３（１２）：１２９３−１２９８．
６４．Ｔｓａｉ  ＳＱ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２，５６９−５７６．
６５．Ｋｏｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  ３８（６）：４７５−４８１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図１９Ｊ】
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【図１９Ｋ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２３ｄ】
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【図２３ｅ】
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【図２３ｆ】
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【図２３ｇ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２６ｄ】
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【図２６ｅ】
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【図２６ｆ】
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【図２６ｇ】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月10日(2019.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2019533440.tif 000085
2019533440.tif 000086
2019533440.tif 000087
2019533440.tif 000088
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2019533440.tif 000090
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