(57)【要約】  本発明は、一側面において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含む毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防及び治療用組成物に関し、本発明の一側面により毛髪関連産業の発展を図り且つ関連消費者の福祉を増進させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含む毛髪の黒化用又は毛髪の白化防止用組成物。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含むメラニン低下性疾患の予防及び治療用組成物。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡは、メラニンの生成又は沈着を増進させるものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、チロシナーゼ及びＴＲＰ１のうち一つ以上の発現を増進させるものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物中のｓｉＲＮＡの含量は、前記組成物の総質量に対し、０．００００００００１質量％〜２０質量％の範囲である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡの投与量は、０．０００００１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記メラニン低下性疾患は、白化症、白斑、脱色素性母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後色素脱失症、斑状強皮症、部分白皮症、特発性滴状低メラニン症及び点状白皮症からなる群より選ばれた一つ以上である、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
当該組成物は薬学組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項９】
当該組成物は、毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防及び改善用化粧料組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、特定のｓｉＲＮＡを含む毛髪の黒化用、メラニン低下性疾患の予防用、又はメラニン低下性疾患の改善用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）は、黒い色素とタンパク質との複合体形態を持つフェノール類の生体高分子物質であって、リンゴ、じゃがいも、バナナの切断された表面が空気中に露出したときに発生する褐変又は動物の外皮毛、皮膚、毛髪、眼部などで観察される。メラニンが過剰生成して皮膚に沈着すると、しみやそばかすなどができ且つ毛髪の黒化などとも直結し、メラニンによって皮膚又は毛髪老化も促進され、皮膚癌を誘発することもある。
【０００３】
紫外線、炎症、ホルモンなどによってメラニン細胞刺激ホルモン（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＭＳＨ）が分泌され、該ＭＳＨは受容体と反応してメラニン形成細胞内においてｃＡＭＰを向上させてメラニンを合成し、合成されたメラニンは、メラニン形成細胞の外部へ分泌され、紫外線などから皮膚又は毛髪を保護する役割をするようになる。メラニンの合成は、主にα−ＭＳＨによって調節され、メラニンの合成に関与するタンパク質としては、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２などが知られている。
【０００４】
毛髪におけるメラニンは、毛髪の色相を決める重要な因子であって、毛嚢に存在するメラニン形成細胞内で生成されたメラニンは毛髪皮質細胞のケラチノサイトに伝達された後、毛髪の成長とともに上方へ移動する。生理的老化の一現象として認識される毛髪の白化は、毛髪メラニン形成細胞の数的減少及びメラニン形成細胞の機能低下などによるメラニン生成の減少によって誘発される。現在、毛髪の白化の解決方案として染髪施術が用いられているが、染髪は一時的な方法であって白髪の成長に伴い再度染髪を施す必要があり、また、染毛剤中に含まれている成分が刺激成分となって接触性皮膚炎や皮膚アレルギーを起こして問題となっている。
【０００５】
また、メラニン生合成に異常が生じると、異常な着色によって皮膚の異常な白化などが現われ、これにより、白化症（白色症、ａｌｂｉｎｉｓｍ）、白斑などの疾病が発病したりもする。
【０００６】
一方、１０〜６０個程度の核酸から構成された干渉ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、細胞内でＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）などと結合して、細胞内の相補的な塩基配列を持つｍＲＮＡなどに特異的に作用して標的ｍＲＮＡなどを抑制するＲＮＡ干渉作用をするものとして周知されている。ｓｉＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて４〜１０倍程度少ない量でも遺伝子発現を阻害することができ、細胞毒性が少なく且つ遺伝子の選択的発現阻害に優れ、これを用いて癌や遺伝的疾病を誘導する遺伝子がタンパク質を発現させることを阻害すると、疾病の原因を無くすことができるようになるため、新しい有効な疾病治療剤として多くの関心を集めている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１６−００６６９８６号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１１−０１３０２８２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ALLOUCHE, J. et al., “In Vitro Modeling of Hyperpigmentation Associated to Neurofibromatosis Type 1 Using Melanocytes Derived from Human Embryonic Stem Cells”, Preceedings of the National Academy of Sciences, 2015, vol. 112, no. 29, pages 9034-9039
【非特許文献２】ROY, R. et al., “Association between Risk of Oral Precancer and Genetic Variations in MicroRNA and Related Processing Genes”, Journal of Biomedical Science, 2014, vol. 21, thesis no. 48, internal pages 1-7
【非特許文献３】LI, Y. et al., “VIT1/FBOX11 Knockdown Induces Morphological Alterations and Apoptosis in B10BR Mouse Melanocytes”, International Journal of Melecular Medicine, 2009, Vol. 23, pages 673-678
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、一側面において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含む毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防用、メラニン低下性疾患の治療用、又はメラニン低下性疾患の改善用組成物を提供して、白髪ケア分野及びメラニン低下性疾患関連分野の発展を図り、且つ関連消費者及び患者の福祉を増進させることをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために本発明は、一側面において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含む毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防用、メラニン低下性疾患の治療用、又はメラニン低下性疾患の改善用組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、他の側面において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを含む組成物を個体に投与することを含む毛髪の黒化方法、毛髪の白化防止方法、メラニン低下性疾患の予防方法、メラニン低下性疾患の治療方法、又はメラニン低下性疾患の改善方法を提供する。
【００１２】
本発明は、他の側面において、毛髪の黒化用途、毛髪の白化防止用途、メラニン低下性疾患の予防用途、メラニン低下性疾患の治療用途、又はメラニン低下性疾患の改善用途に用いるための有効成分として配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ及びこれを含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、また他の側面において、毛髪の黒化、毛髪の白化防止、メラニン低下性疾患の予防、メラニン低下性疾患の治療、又はメラニン低下性疾患の改善のための有効成分として配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ及びこれを含む組成物の非治療的美容用途を提供する。本発明は、他の側面において、毛髪の黒化用組成物、毛髪の白化防止用組成物、メラニン低下性疾患の予防用組成物、メラニン低下性疾患の治療用組成物、又はメラニン低下性疾患の改善用組成物の製造に用いるための配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡの用途を提供する。
【００１４】
本発明の他の側面において、前記組成物は、薬学組成物又は化粧料組成物であってよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の一側面に係る、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含む組成物を用いる場合、毛髪の黒化、毛髪の白化防止、メラニン低下性疾患の予防、又はメラニン低下性疾患の治療及び改善を有効に図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】メラン−ａ細胞において配列番号１又は２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡによってメラニンの含量が顕著に増加することを示す図である。
【図２】メラン−ａ細胞において配列番号１又は２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡによってチロシナーゼ、ＴＲＰ１が顕著に増加することを示したウエスタンブロット資料である。
【図３】Ｂ１６Ｆ１細胞において配列番号１又は２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡによってメラニンの含量が顕著に増加することを示した図である。
【図４】Ｂ１６Ｆ１細胞において配列番号１又は２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡによってチロシナーゼ、ＴＲＰ１が顕著に増加することを示したウエスタンブロット資料である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本明細書について詳しく説明する。
【００１８】
本明細書において「毛髪」とは、角化した上皮細胞からなり皮膚の表面に出る糸状の構造物のことをいい、具体的には身体の毛のことを意味し、髪の毛及び体毛を含む最広義の概念である。
【００１９】
本明細書において「皮膚」とは、動物の体表を覆う組織のことを意味し、顔またはボディーなどの体表を覆う組織だけではなく、頭皮や毛髪を含む最広義の概念である。
【００２０】
本明細書において「黒化」とは、皮膚又は毛髪の有色の色素が増加することを意味し、特に、メラニン色素の量が増加して皮膚又は毛髪が濃い色を呈するようになる現象のことを意味し得る。例えば、毛髪の黒化は、髪の毛が黒く変わる現象を含み、毛髪の白化や白髪を予防及び防止することも含む。
【００２１】
本明細書において「白化」とは、皮膚又は毛髪の有色の色素が減少することを意味し、特に、メラニン色素の量が減少して皮膚又は毛髪が薄い色を呈するようになる現象のことを意味し得る。例えば、毛髪の白化又は白髪は髪の毛が白く変わる現象を含む。
【００２２】
本明細書において「毛髪の黒化効能物質」又は「毛髪の白化防止効能物質」は、毛髪の明るさを暗くしたり、毛髪の白化がさらに進行したりしないようにする物質を総称するものであってよい。また、有色の色素、特にメラニンの沈着を誘導、改善及び増進させるなどの作用をする物質を総称するものであってよく、単一の化合物、重合体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質などを含むものであってよいが、これらに制限されない。
【００２３】
本明細書において「メラニン低下性疾患」は、メラニン色素の合成又は分解の異常によって異常にメラニンの沈着が抑制されたり、メラニンの生成が低下する疾患、又はメラニンが過度に除去されたりする疾患を含む。例えば、白化症（白色症、Ａｌｂｉｎｉｓｍ）、白皮症（ｌｅｕｋｏｄｅｒｍａ）、部分白皮症、白癜、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、四色白斑（ｑｕａｄｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、点状白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ  ｐｏｎｃｔｕｅ）、特発性滴状低メラニン症、点状白皮症、白色症症侯群（ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ  Ａｌｂｉｎｉｓｍ）（例えば、アレサンドリニ症候群（Ａｌｅｚｚａｎｄｒｉｎｉｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ヘルマンスキー・パドラック症侯群（Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、チェディアック・ヒガシ症侯群（Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、グリセリ症候群（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（エレジャルデ症侯群（Ｅｌｅｊａｌｄｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、グリセリ症候群２型（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ２）及びグリセリ症候群３型（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ３））、ワールデンブルグ症侯群（Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、タイツ症侯群（Ｔｉｅｔｚ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｃｒｏｓｓ−ＭｕＫｕｓｉｃｋ−Ｂｒｅｅｎ症侯群（Ｃｒｏｓｓ−ＭｕＫｕｓｉｃｋ−Ｂｒｅｅｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＡＢＣＤ症侯群（ＡＢＣＤ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白色症−難聴症候群（Ａｌｂｉｎｉｓｍ−ｄｅａｆｎｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及びフォークト・小柳・原田症侯群（Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、眼皮膚白皮症（ｏｃｕｌｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｂｉｎｉｓｍ）、低メラニン症（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ）（特発性滴状低メラニン症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｇｕｔｔａｔｅ  ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ）、葉状低メラニン症（ｐｈｙｌｌｏｉｄ  ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ）、進行性斑状低メラニン症（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍａｃｕｌａｒ  ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ））、斑状強皮症、まだら症（ｐｉｅｂａｌｄｉｓｍ）、脱色素性母斑（ｎｅｖｕｓ  ｄｅｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｓ）、炎症後色素沈着減少症（炎症後色素脱失症、ｐｏｓｔｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｈｙｐｏｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、白色粃糠疹（ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ  ａｌｂａ）、バガボンド白斑黒皮症（Ｖａｇａｂｏｎｄ’ｓ  ｌｅｕｋｏｍｅｌａｎｏｄｅｒｍａ）、イエメン盲ろう色素脱失症候群（Ｙｅｍｅｎｉｔｅ  ｄｅａｆ−ｂｌｉｎｄ  ｈｙｐｏｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウェンデ・バックス症候群（Ｗｅｎｄｅ−Ｂａｕｃｋｕｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウォロノフ環（Ｗｏｒｏｎｏｆｆ’ｓ  ｒｉｎｇ）、メラニン欠乏症（ａｍｅｌａｎｉｓｍ）、及び白変種（Ｌｅｕｃｉｓｍ）を含む。
【００２４】
本明細書において「メラニン低下性疾患予防、改善及び治療効能物質」は、メラニン低下性疾患への罹患を事前に防止又は抑制する物質、罹患したメラニン低下性疾患の症状を軽減又は緩和させる物質、メラニン低下性疾患の原因を解消させる物質、メラニン合成を増進させる物質、メラニン合成の抑制を防止する物質、メラニンの分解を抑制させる物質を含むものであって、皮膚全体、毛髪全体、特定の毛髪又は特定の皮膚部位の明るさを暗くしたり、メラニン色素の沈着を誘導、改善及び増進させたりするなどの作用をする物質のことを総称し、単一の化合物、重合体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質などを含むものであってよいが、これらに制限されない。
【００２５】
本発明は、一側面において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含む毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防用、メラニン低下性疾患の治療用、又はメラニン低下性疾患の改善用組成物を提供する。
【００２６】
一具現例によると、前記配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡは「#１」で表されてよく、前記配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡは「#２」で表されてよく、それぞれのｓｉＲＮＡの配列は、下記のような塩基配列を含むものであってよい。
#１の塩基配列（配列番号１）：５’−ＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＡ−３’
#２の塩基配列（配列番号２）：５’−ＧＡＡＣＡＣＧＡＡＧＧＣＵＧＵＡＡＣＡＡＡ−３’
【００２７】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは、１００％の相同性を持つ塩基配列を含んでいてよい。
【００２８】
前記ｓｉＲＮＡは、前記配列又は前記配列と８０〜１００％の相同性を持つ配列を含む独立の一本鎖ＲＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよい。前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖ＲＮＡ及びこれに相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡを含むか、前記センス鎖ＲＮＡ及びアンチセンス鎖ＲＮＡがループによって連結されたステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造の単一鎖ＲＮＡであってもよい。なお、前記二本鎖又はステム部位はミスマッチ（対応する塩基が相補的ではない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などによって対をなしていない部分が含まれていてもよい。前記ｓｉＲＮＡの全長は１０〜６０塩基、好ましくは、１５〜４０塩基、より好ましくは、１８〜３０塩基である。また、前記ループ領域は配列に特別な意味がなく、単に配列を適当な間隔で連結するために３〜１０程度の塩基を有していて十分である。ｓｉＲＮＡ末端の構造はブラント（ｂｌｕｎｔ）末端或いは粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のいずれも可能である。粘着末端の構造は３’末端が突出した構造（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）及び／又は５’末端側が突出した構造のいずれも可能であり、突出する塩基数は限定されない。また、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制効果を保ち得る範囲で、例えば、一方の末端の突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子又は人工のＲＮＡ分子）を含んでいてよい。ｓｉＲＮＡ末端の構造は、両側とも切断構造を持つ必要はなく、ｓｉＲＮＡの一方の末端部位がリンカーＲＮＡによって接続された構造であってもよい。リンカーの長さはステム部分の対をなすうえで差し支えのない長さであれば特に限定されない。
【００２９】
さらに、本発明の一側面に係る前記ｓｉＲＮＡにおいて、ＲＮＡ鎖は、その糖部分、ヌクレオベース部分又はインターヌクレオチド構造内に少なくとも１個の化学的変形を含むことが可能である。このような変形は、生体内でヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡの破壊を阻害することを可能にすることができる。本発明の一側面に係るｓｉＲＮＡの安定性と生体適合性を生体内で向上させることができるあらゆる化学的変形が本発明の範囲に含まれる。糖部分に係る好ましい変形のうち、言及され得るものは、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−チオ、又は２’−Ｏ-アルキルといったようなリボースの２’位、そして、好ましくは、リボヌクレオチド上の正常２’−ＯＨ基を代替する２’−Ｏ−メチル又はＬＮＡの２’位及び４’位との間にあるメチレンブリッジの存在で起きる変形である。ヌクレオベースの場合、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ３−メチル−ウリジン、２,６−ジアミノプリン（ＤＡＰ、５−メチル−２’−デオキシシチジン、５−（１−プロピニル）−２’−デオキシ−ウリジン（ｐｄＵ）、５−（１−プロピニル）−２’−デオキシシチジン（ｐｄＣ）のような変形された塩基又はコレステロールと結合した塩基を用いることが可能である。インターヌクレオチド骨格の好ましい変形は、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホネート、ホスホロジアミデート基による骨格にあるホスホジエステル基を置換するものを含むか、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン（ＰＮＡ、ペプチド核酸）から構成される骨格を用いるものを含む。多様に変形された塩基、糖、骨格は、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）タイプの変形された核酸（モルフォリン環に固定され且つホスホロジアミデート基によって連結された塩基）又はＰＮＡ（ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位に固定された塩基）に結合されていてよい。
【００３０】
本発明に係るｓｉＲＮＡは、「分離されたもの」や、他の伝達及び運搬手段などに「結合されたもの」をも含み、これは自然状態のものではないことを意味するが、自然状態で求められるものも含み、ヒトの介入に関連したあらゆる手段によって得られるものであってもよいことを意味する。特に、本発明に係るｓｉＲＮＡは、化学的合成、酵素的方法、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて製造することができ、特定のヌクレオチド配列の増幅、又は組換え合成によって既に存在する多様な核酸構造やｓｉＲＮＡを精製することで得られるものであってよい。
【００３１】
他の具現例によると、前記ｓｉＲＮＡは、メラニンの生成又は沈着を増進させるものであってよい。
【００３２】
他の具現例によると、前記ｓｉＲＮＡは、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）及びＴＲＰ１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）の一以上の発現を増進させるものであってよい。
【００３３】
本発明の一側面に係る前記ｓｉＲＮＡは、メラニン形成細胞であるメラン−ａ細胞及びＢ１６Ｆ１細胞においてメラニンの生成又は沈着を促進し、メラニンを生成する酵素であるチロシナーゼとメラニンの形成に関与するＴＲＰ１タンパク質の発現を増進させるものと確認された。また、前記ｓｉＲＮＡを処理すると、チロシナーゼ又はＴＲＰ１が発現される細胞数が増加されたりもする。チロシナーゼはメラニンの形成などに関与する酵素であって、チロシナーゼの発現が増進されると、メラニンの生成又は沈着が増加する。また、ＴＲＰ１はメラニンの合成に関与するタンパク質であって、チロシナーゼと同様、ＴＲＰ１の発現が増進されると、メラニンの生成又は沈着が増加する。毛髪におけるメラニンは毛髪の色相を決める重要な因子であって、毛嚢に存在するメラニン形成細胞内で生成されたメラニンは毛髪皮質細胞のケラチノサイトに伝達された後、毛髪の成長とともに上方へ移動するので、毛髪の白化は毛髪メラニン形成細胞の数的減少及びメラニン形成細胞の機能低下などによるメラニンの生成の減少によって誘発される。前記ｓｉＲＮＡを介してメラニンの生成促進及びこれに関与する酵素及びタンパク質の発現増進を実現することができるため、これにより、皮膚及び毛髪を黒化させることができ、且つ皮膚及び毛髪の白化を防止することができる。
【００３４】
また、本発明は、一側面において、前記ｓｉＲＮＡを介してメラニンの生成促進及びこれに関与する酵素及びタンパク質の発現増進を実現することができるため、メラニン低下性疾患及び症状に対しても予防、治療、及び改善することができることを究明したものでもある。
【００３５】
本発明の他の側面によると、前記組成物は、本発明に係るｓｉＲＮＡの生体適合性と伝達性の向上を可能にするあらゆる運搬体を更に含んでいてよい。特に、ｓｉＲＮＡとともに用いられ得る運搬体は、リポソーム、エクソソーム、ペプチド（例えば、細胞−透過性ペプチド）及び多様なナノ粒子を含む。また、前記ｓｉＲＮＡを含む組換えベクター、プラスミドなどを伝達又は運搬手段として用いることもできる。前記伝達又は運搬手段は、当該分野において公知の種々の技術と方法を適用することができ、剤形に応じて変形、改善などを施すこともできる。
【００３６】
前記ｓｉＲＮＡは、伝達された細胞における適切な転写のため少なくともプロモーターに作動可能に連結されることが好ましいが、これに制限されるものではない。前記プロモーターとしては、細胞で機能し得るプロモーターであればその種類は問わない。本発明の一側面に係る前記ｓｉＲＮＡは、効率よい作用のために、必要に応じてリーダー配列、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサー、アップストリーム活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終決因子をはじめとした調節配列をさらに含むものであってもよい。
【００３７】
本発明の他の側面によると、前記組成物中のｓｉＲＮＡの含量は、前記組成物の総質量に対し、０．００００００００１質量％〜２０質量％の範囲であってよい。また、前記含量は、前記組成物の総質量に対し、０．００００００００１質量％以上、０．００００００００５質量％以上、０．０００００００１質量％以上、０．０００００００５質量％以上、０．００００００１質量％以上、０．００００００５質量％以上、０．０００００１質量％以上、０．０００００５質量％以上、０．００００１質量％以上、０．００００５質量％以上、０．０００１質量％以上、０．０００５質量％以上、０．００１質量％以上、０．００５質量％以上、０．０１質量％以上、０．０５質量％以上、０．１質量％以上、０．３質量％以上、０．５質量％以上、０．８質量％以上、１質量％以上、３質量％以上、５質量％以上、８質量％以上、１０質量％以上、１２質量％以上、１５質量％以上、又は１８質量％以上であってよい。また、前記含量は、前記組成物の総質量に対し、２０質量％以下、１８質量％以下、１５質量％以下、１２質量％以下、１０質量％以下、８質量％以下、５質量％以下、３質量％以下、１質量％以下、０．８質量％以下、０．５質量％以下、０．３質量％以下、０．１質量％以下、０．０５質量％以下、０．０１質量％以下、０．００５質量％以下、０．００１質量％以下、０．０００５質量％以下、０．０００１質量％以下、０．００００５質量％以下、０．００００１質量％以下、０．０００００５質量％以下、０．０００００１質量％以下、０．００００００５質量％以下、０．００００００１質量％以下、０．０００００００５質量％以下、０．０００００００１質量％以下、又は０．００００００００５質量％以下であってよい。
【００３８】
本発明のまた他の側面によると、前記ｓｉＲＮＡの投与量は、０．０００００１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。また、前記投与量は、０．０００００１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０００００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００００１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００００１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．８ｍｇ／ｋｇ／日以上、１ｍｇ／ｋｇ／日以上、２ｍｇ／ｋｇ／日以上、３ｍｇ／ｋｇ／日以上、５ｍｇ／ｋｇ／日以上、８ｍｇ／ｋｇ／日以上、１０ｍｇ／ｋｇ／日以上、１２ｍｇ／ｋｇ／日以上、１５ｍｇ／ｋｇ／日以上、又は１８ｍｇ／ｋｇ／日以上であってよい。また、前記投与量は、２０ｍｇ／ｋｇ／日以下、１８ｍｇ／ｋｇ／日以下、１５ｍｇ／ｋｇ／日以下、１２ｍｇ／ｋｇ／日以下、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下、８ｍｇ／ｋｇ／日以下、５ｍｇ／ｋｇ／日以下、３ｍｇ／ｋｇ／日以下、２ｍｇ／ｋｇ／日以下、１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．８ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．０００５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００００１ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００００５ｍｇ／ｋｇ／日以下、０．００００１ｍｇ／ｋｇ／日以下、又は０．０００００５ｍｇ／ｋｇ／日以下であってよい。前記有効成分の投与量の決定は、通常の技術者の水準内にあり、薬物の１日投与用量は、投与しようとする対象の進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの多様な要因に応じて異なり得る。
【００３９】
本発明は、他の側面において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有効成分として含むメラニン低下性疾患の予防、治療及び改善用組成物であってよい。
【００４０】
一具現例によると、前記メラニン低下性疾患は、白斑、脱色素性母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後色素脱失症、斑状強皮症、部分白皮症、特発性滴状低メラニン症及び点状白皮症からなる群より選ばれた一つ以上であってよい。メラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）は動物の外皮毛、毛、皮膚、頭部、眼部などから観察され、メラニンの産生が不足したり沈着が抑制され、又は過度な分解が起きると、メラニン低下性疾患が発病することがある。本発明は、一側面において、メラニンの生成又は沈着を増進させたり、チロシナーゼ及びＴＲＰ１の発現を増進させたりもするため、前記メラニン低下性疾患の予防、改善、及び治療に用いられ得る。
【００４１】
本発明の一側面によると、前記組成物は薬学組成物であってよい。
【００４２】
前記薬学組成物は、担体、賦形剤、保存剤、防腐剤、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、並びにその他治療的に有用な物質をさらに含んでいてよく、通常的な方法によって多様な経口投与剤又は非経口投与剤の形態で剤形化していてよい。
【００４３】
前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などがあり、これらの剤形は、有効成分の他、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有していてよい。錠剤は、さらに、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリジンといった結合剤を含有していてよく、場合によって、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有していてよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されていてよい。
【００４４】
また、前記非経口投与の形態としては、経皮投与型剤形であってよく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってよいが、これらに制限されるものではない。
【００４５】
前記薬学組成物は、経口又は非経口で投与されてよく、非経口投与のとき、皮膚外用、腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、皮内、胸部内又は脳血管内注射注入方式を選択していてよい。
【００４６】
前記薬学組成物は皮膚外用剤であってよく、前記皮膚外用剤は、外皮に塗布されるものであればいずれも含み得る組成物の総称であって、多様な剤形の医薬品又は医薬外品がこれに含まれ得る。
【００４７】
本発明の他の側面によると、前記組成物は、毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防及び改善用化粧料組成物であってよい。
【００４８】
前記化粧料組成物には、機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれていてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選ばれた成分を含んでいてよい。その他含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００４９】
前記化粧料組成物は、その剤形が特に限定されず、目的とするところに応じて適宜選択すればよい。例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、及びボディークレンザーからなる群より選ばれたいずれか一つ以上の剤形で製造されていてよいが、これらに制限されるものではない。
【００５０】
本発明の一側面に係る剤形がペースト、クリーム、又はゲルの場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられていてよい。
【００５１】
本発明の一側面に係る剤形がパウダー又はスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられていてよく、特にスプレーである場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【００５２】
本発明の一側面に係る剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５３】
本発明の一側面に係る剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノール、又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラガカントなどが用いられていてよい。
【００５４】
本発明の一側面に係る剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられていてよい。
【００５５】
本発明の他の側面によると、前記組成物は、食品又は健康食品組成物であってよい。
【００５６】
前記食品又は健康食品組成物は、液状又は固体状態の剤形であってよく、例えば、各種の食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能食品類、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、又は飲料の形態で用いられていてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他、当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が困難なく適宜選定して配合していてもよく、他の原料と同時に適用した場合に相乗効果が奏されることがある。
【００５７】
本明細書に開示された有効成分の他に含有し得る液体成分には特に制限点がなく、通常の飲料と同様に種々の香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでいてよい。前記天然炭水化物の例としては、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類及びデキストリン、シクロデキストリンなどの通常的な糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールがある。前記香味剤としては、天然香味剤(ソーマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど))及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテームなど)を有利に使用していてよい。前記天然炭水化物の割合は、本明細書に開示された組成物１００ｍｌ当たり一般的に約１〜２０ｇ、一側面において、約５〜１２ｇであってよい。
【００５８】
前記食品組成物は、一側面において、多様な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでいてよい。他の側面において、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでいてよい。これらの成分は、独立的に又は組み合わせて用いていてよい。前記添加剤の割合は種々であってよいが、本明細書に開示された組成物１００質量部当たり０．００１〜約２０質量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００５９】
以下、実施例、実験例を通じて、本発明の一側面の構成及び効果をより具体的に説明する。なお、下記の例は本発明に関する理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がそれらによって制限されるものではない。
【００６０】
［実施例１］
細胞及び皮膚モデルの準備
正常ヒト表皮メラニン形成細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、ＮＨＥＭｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を入手し、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｊ（ｂｌａｃｋ、ａ／ａ）マウス由来のメラニン形成細胞であるメラン−Ａ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）細胞株をＤｏｒｏｔｈｙ  Ｃ. Ｂｅｎｎｅｔｔ博士（Ｓｔ. Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）から入手した。Ｂ１６Ｆ１マウス黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞株はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した。
【００６１】
正常ヒト表皮メラニン形成細胞は、Ｍ−２５４培地でヒトメラニン形成細胞増殖サプリメント（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ＨＭＧＳ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ.、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）下で維持させた。Ｍｅｌａｎ−Ａ細胞はＲＰＭＩ  １６４０培地で１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン、及び０．２μＭ  ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）下で維持させた。Ｂ１６Ｆ１マウス黒色腫細胞株は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで培養した。
【００６２】
試薬及びｓｉＲＮＡトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
α−ＭＳＨ、アルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ）、及びコウジ酸（ｋｏｊｉｃ  ａｃｉｄ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。ｓｉＲＮＡである#１（５’−ＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＡ−３’）、#２（５’−ＧＡＡＣＡＣＧＡＡＧＧＣＵＧＵＡＡＣＡＡＡ−３’）、及び陰性対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＣ）（５’−ＣＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＵＵＵＣＧＵ−３’）はジェノリューション社（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ、ソウル、大韓民国）から入手した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登録商標)  ＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳA）を用いて６０ｍｍディッシュで培養したメラン−ａ（Ｍｅｌａｎ−ａ）及びＢ１６Ｆ１細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた。ｓｉＲＮＡとともに２４時間培養した後、細胞に対してそれぞれの化合物（試薬）で処理を施し、４８時間維持した。
【００６３】
メラニンアッセイ
細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで処理後、１０００ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。チューブ内の最終細胞ペレットを写真に撮り、細胞ペレットは１Ｎ  ＮａＯＨに溶解させた。均質化させた細胞抽出物を９６−ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに移載し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを利用して吸光度４０５ｎｍにおける相対的メラニン量を測定した。
【００６４】
ウエスタンブロット分析
すべての溶解物は２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（２×Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２５％［ｖ／ｖ］ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ、５％［ｖ／ｖ］β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び０．０１％［ｗ／ｖ］ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて準備した。すべての細胞タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。その後、前記試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移転した。ＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．０５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ(登録商標)  ２０）中の４％（ｗ／ｖ）スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）でブロッキングした後、メンブレインを特定の１次抗体とともにオーバーナイト（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養させた。
【００６５】
抗アクチン抗体（ａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＭＡＢ１５０１、１：１０,０００）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手し、抗αＰＥＰ７（チロシナーゼ）抗体（ａｎｔｉ−αＰＥＰ７（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）ａｎｔｉｂｏｄｙ、１：１０００）と抗αＰＥＰ１（ＴＲＰ１）抗体（ａｎｔｉ−αＰＥＰ１（ＴＲＰ１）ａｎｔｉｂｏｄｙ、１：１０００）は、Ｖ. Ｊ. Ｈｅａｒｉｎｇ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から入手した。タンパク質の検出のために、前記メンブレインはＨＲＰ−コンジュゲーティッド二次抗体を用いて培養し、シグナルはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ(登録商標)  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  ＨＲＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を利用して測定した。
【００６６】
統計分析
各データは少なくとも３回の独立した実験を施して得たものとし、平均±ＳＥ（標準誤差）で表した。結果の統計的評価は一元分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて行った（*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１）。
【００６７】
［実験例１］ｓｉＲＮＡによるメラニンの生成、関連酵素及びタンパク質の調節
メラン−ａ（Ｍｅｌａｎ−ａ）細胞をｓｉＲＮＡ（#１、#２）、スクランブル対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＣ）にそれぞれトランスフェクションさせ、４８時間後に、メラニンの生成を抑制させる特定の物質Ｄ（０．５μＭ）の処理又は無血清血清条件下で２日間培養した後、メラニンの含量を測定した。図１から分かるように、メラニンの生成を抑制させる特定の物質Ｄの処理又は無血清条件下におけるメラン−ａ細胞培養は、対照群（ｓｉＮＣ）においてメラニンの生成を抑制したが、刺激（特定の物質Ｄ又は血清飢餓）で抑制されたメラニンの生成はｓｉＲＮＡ（#１、#２）によって顕著に増進した（図１）。
【００６８】
また、メラニン形成酵素の発現についても実験を実施した。ウエスタンブロット分析結果、メラン−ａ細胞ｓｉＲＮＡ（#１、#２）をトランスフェクションさせた場合、野生型細胞に比べ、チロシナーゼ及びＴＲＰ１タンパク質の水準が顕著に増加した（図２）。
【００６９】
Ｂ１６Ｆ１細胞に対してもｓｉＮＣ、ｓｉＲＮＡ（#１、#２）をトランスフェクションさせ、１日後に、メラニン形成を抑制させる特定の物質Ｄ（０．５μＭ）の処理又は無血清培地処理を施し、２日後にメラニンの生成程度を確認し、チロシナーゼ、ＴＲＰ１に対してウエスタンブロットで分析を行った。
【００７０】
その結果、Ｂ１６Ｆ１細胞において特定の物質Ｄ又は血清飢餓で抑制されたメラニンの生成が、メラン−ａ細胞と同様、ｓｉＲＮＡ（#１、#２）トランスフェクションによって顕著に増加した（図３）。また、特定の物質Ｄ又は血清飢餓で抑制されたチロシナーゼ及びＴＲＰ１の発現がｓｉＲＮＡ（#１、#２）トランスフェクションによって顕著に増加した（図４）。
【００７１】
このような結果を総合すると、前記ｓｉＲＮＡ（#１、#２）によってメラニンの合成を増進させることができるとともに、メラニンの生成酵素及びメラニンの生成関与タンパク質の発現を増進させることができ、これにより、毛髪の黒化及び毛髪の白化防止を図ることができることから、本発明は、一側面において、毛髪の黒化及び白髪のケアに用いられ得る。また、本発明の一側面に係るこのような特徴を用いて皮膚の特定の部位や皮膚全体に対してメラニンの生成を増進させることができることから、本発明の一側面を用いてメラニン低下性疾患や症状の予防、治療、及び改善を図ることができる。
【００７２】
以下、本発明の一側面に係る組成物の剤形例について説明するが、他の様々な剤形への応用も可能であり、且つ、これらは本発明を限定するためのものではない、単に具体的に説明するためのものである。
【００７３】
［剤形例１］軟質カプセル剤
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  ２ｍｇを含有するリポソーム１０ｍｇ、Ｌ−カルニチン８０〜１４０ｍｇ、大豆油１８０ｍｇ、パーム油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ及びレシチン６ｍｇを混合し、通常の方法に従って１カプセルに充填して軟質カプセル剤を製造した。
【００７４】
［剤形例２］錠剤
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  ２ｍｇを含むリポソーム１０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を利用して顆粒した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ  ｅｓｔｅｒ）を６ｍｇを添加して、打錠機で打錠して錠剤を製造した。
【００７５】
［剤形例３］顆粒剤
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  ２ｍｇを含むリポソーム１０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、包に充填して顆粒剤を製造した。
【００７６】
［剤形例４］ドリンク剤
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  ２ｍｇを含むリポソーム１０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつ充填する。瓶に充填した後、１３０℃で４〜５秒間殺菌してドリンク剤を製造した。
【００７７】
［剤形例５］注射剤
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  ５ｍｇを含むリポソーム２０ｍｇ、適量の注射用滅菌蒸留水、適量のｐＨ調節剤を用いて通常の方法に従い注射剤を製造した。
【００７８】
［剤形例６］柔軟化粧水（スキンローション）
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  １．０質量％を含有するリポソーム１０質量％、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩１．００質量％、水溶性コラーゲン（１％水溶液）１．００質量％、クエン酸ナトリウム０．１０質量％、クエン酸０．０５質量％、甘草エキス０．２０質量％、１,３−ブチレングリコール３．００質量％、残量として精製水を用いて柔軟化粧水（スキンローション）を製造した。
【００７９】
［剤形例７］クリーム
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  １．００質量％を含有するリポソーム１０質量％、ポリエチレングリコールモノステアレート２．００質量％、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５．００質量％、プロピレングリコール４．００質量％、スクアレン６．００質量％、トリ２−エチルヘキサングリセリル６．００質量％、スフィンゴ糖脂質１．００質量％、１,３−ブチレングリコール７．００質量％、蜜蝋５．００質量％、残量として精製水を用いてクリーム状製剤を製造した。
【００８０】
［剤形例８］パック
配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ  １．００質量％を含有するリポソーム１０質量％、ポリビニルアルコール１３．００質量％、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩１．００質量％、ラウロイルヒドロキシプロリン１．００質量％、水溶性コラーゲン（１％水溶液）２．００質量％、１,３−ブチレングリコール３．００質量％、エタノール５．００質量％、残量として精製水を用いてパックを製造した。
【００８１】
［剤形例９］健康食品
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い健康食品を製造した。
【００８２】
【表１】
2019531264.tif 000003
【００８３】
前記ビタミン及び無機質混合物の組成比は、比較的に健康食品に適合した成分を例にして混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても構わなく、通常の健康食品の製造方法に従い前記成分を混合した後、通常の方法に従い健康食品の組成物の製造に用いてもよい。
【００８４】
［剤形例１０］健康飲料
【００８５】
【表２】
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【００８６】
前記表２のように総体積９００ｍｌになるように残量の精製水を添加して通常の健康飲料の製造方法に従い前記成分を混合してから約１時間８５℃で撹拌加熱し、これにより調製された溶液をろ過して得られたろ液を滅菌された２リットルの容器に入れて密封滅菌した後に冷蔵保管して健康飲料を製造した。
【００８７】
以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好適な実施態様であるに過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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