(57)【要約】  本発明は、a)二官能又は多官能の架橋剤を使用して、グリコサミノグリカンを共有結合により架橋させて、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを形成する工程と、b)二価の亜鉛カチオンを含む溶液中で、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを膨潤させて、ヒドロゲル組成物を形成する工程と、c)オートクレーブによってヒドロゲル組成物を滅菌して、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を形成する工程とを含む、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を調製する方法、及びこのような方法によって得ることができる滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物に関する。
2019532708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)二官能又は多官能の架橋剤を使用して、グリコサミノグリカンを共有結合により架橋させて、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを形成する工程であって、グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である工程と、
b)二価のカチオンを含む溶液中で、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを膨潤させて、ヒドロゲル組成物を形成する工程であって、二価のカチオンはZn2+であり、溶液中のZn2+の濃度は、0.5から4mmの範囲である工程と、
c)オートクレーブによってヒドロゲル組成物を滅菌して、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を形成する工程
とを含む、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を調製する方法。
【請求項２】
溶液中のZn2+の濃度が、0.8から2mMの範囲である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
溶液中のZn2+の濃度が、0.8から1.5mMの範囲、好ましくは0.8から1.2mMの範囲である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
溶液中のZn2+の濃度が、約1.0mMである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
溶液が、リドカイン及びロピバカインからなる群から選択される、治療上適切な濃度の局所麻酔薬を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
形成した滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が、二価のカチオンを有さない同一の組成物と比較して安定性の増加を示す、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
i)共有結合により架橋した、ヒアルロン酸であるグリコサミノグリカンと、
ii)Zn2+である二価のカチオンであって、溶液中のZn2+の濃度が、0.5から4mMの範囲である、二価のカチオン
とを含む滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物であって、オートクレーブによる滅菌に供されたヒドロゲル組成物。
【請求項８】
組成物中の二価のカチオンの濃度が、0.8から2mMの範囲である、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
溶液中のZn2+の濃度が、0.8から1.5mMの範囲、好ましくは0.8から1.2mMの範囲である、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
溶液中のZn2+の濃度が、約1.0mMである、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
リドカイン及びロピバカインからなる群から選択される、治療上適切な濃度の局所麻酔薬を更に含む、請求項7から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
二価のカチオンを有さない同一の組成物と比較して安定性の増加を示す、請求項7から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
二価のカチオンによる処置に感受性の状態の処置において使用するための、請求項7から12のいずれか一項に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【請求項１４】
請求項7から12のいずれか一項に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を皮膚に投与することを含む、皮膚を美容的に処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び/又は美容適用における、注射可能なヒドロゲル組成物とこのような組成物の使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学的用途で最も広く使用される生体適合性ポリマーのうちの1つはヒアルロン酸(HA)である。ヒアルロン酸は、グリコサミノグリカン(GAG)の群に属する天然に存在する多糖である。ヒアルロン酸と他のGAGは、多量の水を吸収する能力を有する負に荷電したヘテロ多糖鎖である。ヒアルロン酸及びヒアルロン酸から誘導される生成物は、生化学及び美容の分野で、例えば、粘弾性物質手術(viscosurgery)の間に、及び皮膚充填剤として、広く使用される。
【０００３】
水吸収ゲル、又はヒドロゲルは、生化学の分野で広く使用される。これらは、一般的に、ポリマーを無限ネットワークへと化学的に架橋させることによって調製される。天然のヒアルロン酸及びある特定の架橋したヒアルロン酸生成物は、これらが完全に溶解するまで水を吸収し、架橋したヒアルロン酸ゲルは、典型的には、これらが飽和するまで、ある特定量の水を吸収する、すなわち、これらは、有限の液体保持能、又は膨潤度を有する。
【０００４】
ヒアルロン酸は、ほとんどの生物において、分子量を除いて同一の化学構造で存在するため、最小限の反応しかもたらさず、高度な医学的利用を可能とする。ヒアルロン酸分子の架橋及び/又は他の修飾は、in vivoでのその持続期間を改善するのに必要である。更に、このような修飾は、ヒアルロン酸分子の液体保持能に影響を及ぼす。その結果として、ヒアルロン酸は、多くの修飾の試みの対象となってきた。
【０００５】
二価のカチオンを有するヒアルロン塩、例えば、ヒアルロン酸亜鉛及びヒアルロン酸カルシウムがこの分野で、例えば、パテントファミリーWO9010020A1によって知られており、ヒアルロナン亜鉛は、生理的創傷治癒を促進し、創傷感染を予防するために、名称Curiosin(登録商標)により販売されている。
【０００６】
仏国特許出願公開第2979539号は、ヒアルロン酸、麻酔薬、α-リポ酸及び銅塩を含む組成物を開示する。1つの可能な組成物は、架橋したヒアルロン酸と、更に、0.006mg/mL(0.027mM)の酢酸亜鉛二水和物を含んでいる。この組成物は、オートクレーブによって滅菌される。
【０００７】
仏国特許出願公開第3032617号は、架橋剤1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)を使用して、架橋したヒアルロン酸又はその塩を調製するための方法を開示する。この塩は、ナトリウム、カルシウム、亜鉛又はカリウム塩であってもよい。この方法は、架橋工程の後、残留BDDEを求核剤と反応させる工程と、その後の洗浄工程とを伴っている。この方法は、明示されていない水性環境でのオートクレーブによる滅菌を伴い得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO9010020A1
【特許文献２】仏国特許出願公開第2979539号
【特許文献３】仏国特許出願公開第3032617号
【特許文献４】国際特許出願WO9704012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、対象における皮膚充填剤としての使用のため及び/又は二価のカチオンの徐放性のための、二価のカチオン、好ましくはZn2+を含む改良された注射可能なヒドロゲル組成物、好ましくは、ヒアルロン酸系ヒドロゲル組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、オートクレーブ中の組成物の分解が少ない、二価のカチオン、好ましくはZn2+を含む改良された注射可能なヒドロゲル組成物、好ましくは、ヒアルロン酸系ヒドロゲル組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、オートクレーブ後の安定性が増加する、二価のカチオン、好ましくはZn2+を含む改良された注射可能なヒドロゲル組成物、好ましくは、ヒアルロン酸系ヒドロゲル組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、対象に組成物を注射した際に、対象に二価のカチオンの徐放と安全な放出をもたらす、二価のカチオン、好ましくはZn2+を含む、改良された注射可能なヒドロゲル組成物、好ましくは、ヒアルロン酸系ヒドロゲル組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
注射において使用するための、ヒドロゲル組成物、例えば、ヒアルロン酸系ヒドロゲル組成物は、使用前に滅菌される必要がある。滅菌は、一般的に、熱処理、例えば、オートクレーブによって実施される。熱処理は、一般的に、組成物の剛性又は粘度の低減を導く。
【００１４】
先行技術の亜鉛を含むヒアルロン酸組成物に関して観察された1つの問題は、組成物が、対イオンとしてナトリウムを含む同一の組成物と比較して、オートクレーブ中のヒアルロン酸分解の増加とオートクレーブ後の組成物の安定性の低下を示すことである。したがって、組成物の初期安定化(すなわち、粘度又はG'の増加)は、正に荷電したZn2+と負に荷電したヒアルロン酸イオンの間の静電相互作用によって達成されるが、この安定化は、オートクレーブ中のヒアルロン酸イオンの分解によって低下又は排除される。次に、このことにより、in vivoでの組成物の寿命が低下する。
【００１５】
本明細書で例証される態様によれば、
a)二官能又は多官能の架橋剤を使用して、グリコサミノグリカンを共有結合により架橋させて、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを形成する工程と、
b)二価のカチオンを含む溶液中で、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを膨潤させて、ヒドロゲル組成物を形成する工程と、
c)オートクレーブによってヒドロゲル組成物を滅菌して、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を形成する工程
とを含む、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を調製する方法が提供される。
【００１６】
用語「注射可能な」は、組成物が、例えば、対象又は患者の軟組織、例えば、皮膚への非経口注射に適する形態で提供されることを意味する。注射可能な組成物は滅菌されているべきであり、対象又は患者の軟組織、例えば、皮膚に導入される際に有害反応を引き起こす可能性のある成分を含むべきではない。このことは、処置された個体において、免疫応答が起こらないか又は非常に穏やかにしか起こらないことを示す。すなわち、処置された対象では、望ましくない局所又は全身作用は起こらないか又は非常に穏やかにしか起こらない。
【００１７】
一部の実施形態によれば、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸、並びにこれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸である。
【００１８】
二価のカチオンは、好ましくは、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びZn2+からなる群から選択される。好ましい実施形態では、二価のカチオンは、Zn2+である。
【００１９】
一部の実施形態では、溶液中のZn2+は、ZnCl2、グルコン酸Zn及びクエン酸Znからなる群から選択されるZn塩によって提供される。
【００２０】
本発明者らは、ヒアルロン酸ゲル組成物中で、0.05から4mMの範囲の、好ましくは、0.05から2mMの範囲の濃度のZn2+が、組成物を安定化させるように作用し、一方、より高濃度のZn2+は、代わりに、組成物の分解を引き起こすことを特定した。したがって、一部の実施形態では、溶液中の二価のカチオンの濃度は、0.05から4mMの範囲、好ましくは0.05から2mMの範囲である。更に好ましい実施形態では、Zn2+の濃度は、0.5から4mMの範囲、好ましくは0.5から2mMの範囲、より好ましくは0.8から4mM、例えば0.8から2mMの範囲である。代わりの好ましい実施形態では、Zn2+の濃度は、0.8から1.5mMの範囲、好ましくは0.8から1.2mMの範囲、より好ましくは約1.0mMである。
【００２１】
ヒドロゲル組成物の粘度及び/又は弾性率G'は、当業者に周知の種々の方法に従って測定することができる。粘度は、例えば、Bohlin VORレオメーター(測定システムC14又はPP 30、ギャップ1.00mm)を使用する回転粘度法によって、「ゼロせん断粘度、η0」として測定することができる。粘度を測定する他の方法も適用することができる。弾性率G'は、例えば、ひずみ掃引を実施して線形粘弾性領域(LVR)を見出し、次いで、LVR内の粘弾特性を測定することによって、Bohlin VORレオメーター(測定システムPP 30、ギャップ1.00mm)を使用して測定することができる。弾性率G'を測定する他の方法も適用することができる。
【００２２】
組成物は、水性形態で存在してもよいが、乾燥又は、例えば、エタノール中での沈殿形態で存在してもよい。
【００２３】
組成物のグリコサミノグリカンは、好ましくは、ヒアルロン酸である。特段提供されていなければ、用語「ヒアルロン酸」は、種々の鎖長及び荷電状態の、並びに架橋を含む種々の化学的修飾を有する種々のヒアルロン酸、ヒアルロネート又はヒアルロナンのすべてのバリアント及びバリアントの組合せを包含する。すなわち、この用語は、種々の対イオンを有するヒアルロン酸の種々のヒアルロン酸塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムも包含する。この用語によって、ヒアルロン酸の種々の修飾、例えば、酸化、例えば、-CHO及び/又は-COOHへの-CH2OH基の酸化;ビシナルヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化、場合によっては、続いて、還元、例えば、-CH2OHへの-CHOの還元、又はアミンとカップリングしてイミンを形成し、続いて、第二級アミンへの還元;硫酸化;脱アミド、場合によって、続いて、脱アミノ又は新たな酸とのアミド生成;エステル化;架橋;例えば、架橋剤の使用又はカルボジイミドに補助されるカップリング(例えば、タンパク質、ペプチド及び活性薬物成分のような異なる分子の、ヒアルロン酸へのカップリングを含む)を使用する、種々の化合物による置換;並びに、脱アセチル;もまた包含される。修飾の他の例は、イソウレア、ヒドラジド、ブロモシアン、モノエポキシド及びモノスルホンのカップリングである。
【００２４】
一部の実施形態では、方法の工程a)のグリコサミノグリカンは、一価のカチオン、例えば、Na+との塩の形態で提供される。
【００２５】
ヒアルロン酸は、動物及び非動物起源の種々の供給源から得ることができる。非動物起源の供給源として、酵母、好ましくは、細菌が挙げられる。単一のヒアルロン酸分子の分子量は、典型的には、0.1〜10MDaの範囲であるが、他の分子量もあり得る。
【００２６】
ある特定の実施形態では、グリコサミノグリカンの濃度は、1から100mg/mlの範囲である。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンの濃度は、2から50mg/mlの範囲である。特定の実施形態では、グリコサミノグリカンの濃度は、5から30mg/mlの範囲又は10から30mg/mlの範囲である。
【００２７】
グリコサミノグリカンは共有結合により架橋される。グリコサミノグリカンの架橋は、架橋剤による修飾によって達成することができる。架橋剤は、例えば、ジビニルスルホン、マルチエポキシド及びジエポキシドからなる群から選択することができる。実施形態によれば、架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)、1,2-エタンジオールジグリシジルエーテル(EDDE)及びジエポキシオクタンからなる群から選択される。好ましい実施形態によれば、架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)である。
【００２８】
本発明の方法を使用して形成した滅菌した注射可能な組成物は、ヒドロゲルである。すなわち、これは、水不溶性とみなすことができるが、液体、典型的には、水性の液体にさらされると、グリコサミノグリカン分子の架橋系を実質的に希釈することができる。
【００２９】
滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物は、質量で、主に、液体を含有し、例えば、90〜99.9%の水を含有することができるが、液体内の三次元架橋ヒアルロン酸ネットワークにより、固体のように挙動する。そのかなりの液体含量により、ゲルは、構造的に可撓性であり、天然の組織に類似し、それによって、組織工学におけるスキャホールドとして、及び組織増強のために非常に有用となる。
【００３０】
ヒドロゲル組成物は、好ましくは、生体適合性である。このことは、処置された個体において、免疫応答が起こらないか又は非常に穏やかにしか起こらないことを意味する。すなわち、処置された個体では、望ましくない局所又は全身作用は起こらないか又は非常に穏やかにしか起こらない。
【００３１】
上述のように、架橋したグリコサミノグリカンを形成するための、ヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンの架橋は、例えば、架橋剤、例えば、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)を用いる修飾によって達成することができる。グリコサミノグリカンの濃度と架橋の程度は、ヒドロゲルの機械的特性、例えば、弾性率G'、及び安定性特性に影響を及ぼす。架橋したグリコサミノグリカンゲルは、「修飾度」に関して特徴付けられることが多い。
【００３２】
ヒアルロン酸ゲルの修飾度は、一般的に、0.1から15モル%の間の範囲である。
【００３３】
一部の実施形態では、ヒアルロン酸ゲルは、12モル%以下、例えば、12モル%以下、例えば、10モル%以下、例えば、0.1から12モル%の範囲、例えば、0.2から10モル%の範囲、例えば、0.3から8モル%の範囲の修飾度を有する。
【００３４】
一部の実施形態では、ヒアルロン酸ゲルは、2モル%以下、例えば、1.5モル%以下、例えば、1.25モル%以下、例えば、0.1から2モル%の範囲、例えば、0.2から1.5モル%の範囲、例えば、0.3から1.25モル%の範囲の修飾度を有する。
【００３５】
修飾度(モル%)は、グリコサミノグリカンに結合する架橋剤の量、すなわち、グリコサミノグリカン二糖の繰り返し単位の総モル量に対する結合した架橋剤のモル量について記載する。修飾度は、どの程度のグリコサミノグリカンが架橋剤によって化学的に修飾されたかを反映する。架橋に関する反応条件及び修飾度を決定するのに適切な分析技術はすべて当業者に周知であり、当業者は、これらの及び他の関連因子を容易に調整することができ、それによって、0.1〜15%の範囲の修飾度を得るために適切な条件を提供し、修飾度について、得られる生成物の特徴を検証することができる。BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルは、例えば、公開された国際特許出願WO9704012の実施例1及び2に記載された方法に従って調製されてもよい。
【００３６】
好ましい実施形態では、組成物の架橋したグリコサミノグリカンは、架橋剤によって架橋した、架橋したヒアルロン酸の形態で存在し、前記ヒアルロン酸の濃度は、2から50mg/mlの範囲であり、前記架橋剤との修飾度は、0.1から2モル%の範囲である。
【００３７】
一部の実施形態では、溶液は、緩衝化合物を更に含む。緩衝化合物の目的は、組成物のpHを適切な値、典型的には、5から8の範囲、好ましくは6から7.5の範囲で維持することである。したがって、溶液のpH値は、5から8の範囲、好ましくは6から7.5の範囲である。
【００３８】
注射可能なヒドロゲル組成物は、治療上適切な濃度の局所麻酔薬を更に含んでもよい。局所麻酔薬は、可逆的局所麻酔と痛覚の喪失を引き起こす薬物である。局所麻酔薬が特定の神経経路(神経ブロック)に使用され、痛覚脱失症(痛みの感覚の喪失)及び麻痺(筋力の喪失)等の効果を達成することができる。局所麻酔薬は、注射手順により、患者が経験する痛み又は不快感を低減するために、組成物に添加されてもよい。
【００３９】
ある特定の実施形態によれば、局所麻酔薬は、アミド型及びエステル型の局所麻酔薬、例えば、ブピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、シンコカイン(ジブカイン)、クリブカイン、エチルパラピペリジノアセチルアミノベンゾエート、エチドカイン、リグノカイン(リドカイン)、メピバカイン、オキセサゼイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリカイン、トリメカイン、バボカイン、アルチカイン、レボブピバカイン、アミロカイン、コカイン、プロパノカイン、クロルメカイン、シクロメチカイン、プロキシメタカイン、アメソカイン(テトラカイン)、ベンゾカイン、ブタカイン、ブトキシカイン、アミノ安息香酸ブチル、クロロプロパカイン、ジメソカイン(ラロカイン)、オキシブプロカイン、ピペロカイン、パレソキシカイン、プロカイン(ノボカイン)、プロポキシカイン、トリカイン又はこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態によれば、局所麻酔薬は、リドカイン及びロピバカイン、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４０】
特定の実施形態によれば、局所麻酔薬はリドカインである。リドカインは、ヒアルロン酸組成物等の注射可能な製剤における局所麻酔薬として広範に使用されている周知の物質である。アミド型又はエステル型の局所麻酔薬の濃度は、それぞれ特定の局所麻酔薬又はこれらの組合せの治療上適切な濃度範囲内で当業者によって選択されてもよい。
【００４１】
一部の実施形態では、前記局所麻酔薬の濃度は、0.1から30mg/mlの範囲である。ある特定の実施形態では、前記局所麻酔薬の濃度は、0.5から10 mg/mlの範囲である。
【００４２】
リドカインを局所麻酔薬として使用する場合、リドカインは、好ましくは、1から5mg/mlの範囲、より好ましくは2から4mg/mlの範囲の濃度で、例えば、約3mg/mlの濃度で存在してもよい。
【００４３】
ロピバカインを局所麻酔薬として使用する場合、ロピバカインは、好ましくは、0.1から3mg/mlの範囲、より好ましくは0.5から2mg/mlの範囲の濃度で、例えば、約1mg/mlの濃度で存在してもよい。
【００４４】
本明細書に記載の方法は、オートクレーブによる組成物の滅菌、すなわち、飽和水蒸気を使用する滅菌を伴う。オートクレーブは、F0値>4で実施することができる。オートクレーブは、好ましくは、10から50の範囲のF0値で実施することができる。飽和水蒸気滅菌プロセスのF0値は、Z値10を有する微生物に関して、最終容器中の生成物に対するプロセスによって121℃の温度に到達する等価時間(分)に関して表される致死性である。
【００４５】
好ましい実施形態では、グリコサミノグリカンは、2〜50mg/mlの範囲の濃度のヒアルロン酸であり、二価のカチオンは、0.05から4mMの範囲の、好ましくは0.05から2mMの範囲の濃度のZn2+であり、滅菌は、F0値>4でのオートクレーブによって実施される。
【００４６】
本発明者によって提供される実験データは、本発明の方法に従って形成した滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が、二価のカチオンを有さない同一の組成物と比較して安定性の増加を示すことを示す。
【００４７】
本明細書で使用する場合、安定性という用語は、使用前の貯蔵及び操作中の分解に耐性となる滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物の能力を示すために使用される。ヒアルロン酸又はヒアルロン酸ゲル等のグリコサミノグリカンへの構成物の添加が、前記グリコサミノグリカンの安定性に影響を及ぼし得ることが知られている。グリコサミノグリカンを含むヒドロゲル組成物の安定性は、一定範囲の様々な方法によって決定することができる。安定性を決定するための方法としては、これらに限定されないが、組成物の均質性、色、透明度、pH、ゲル含量及びレオロジー特性を評価することが挙げられる。グリコサミノグリカンを含むヒドロゲル組成物の安定性は、多くの場合、経時的に前記パラメータの1つ又は複数を観察又は測定することによって決定される。安定性は、例えば、経時的に組成物の粘度及び/又は弾性率G'を測定することによって決定することができる。粘度は、例えば、Bohlin VORレオメーター(測定システムC14又はPP30、ギャップ1.00mm)を使用する回転粘度法によって、「ゼロせん断粘度η0」として測定することができる。粘度を測定する他の方法も適用することができる。弾性率G'は、例えば、ひずみ掃引を実施して線形粘弾性領域(LVR)を見出し、次いで、LVR内の粘弾特性を測定することによって、Bohlin VORレオメーター(測定システムPP 30、ギャップ1.00mm)を使用して測定することができる。弾性率G'を測定する他の方法も適用することができる。
【００４８】
本明細書で例証される態様によれば、上記の方法によって得ることができる滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が提供される。
【００４９】
本明細書で例証される態様によれば、
i)共有結合により架橋したグリコサミノグリカンと、
ii)二価のカチオン
とを含む滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が提供される。
【００５０】
一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸、並びにこれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸である。
【００５１】
架橋剤は、ジビニルスルホン、マルチエポキシド及びジエポキシドからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)、1,2-エタンジオールジグリシジルエーテル(EDDE)及びジエポキシオクタンからなる群から選択される。好ましい実施形態では、架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)である。
【００５２】
一部の実施形態では、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンは、2モル%以下、例えば、1.5モル%以下、例えば、1.25モル%以下の修飾度を有する。
【００５３】
一部の実施形態では、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンは、0.1から2モル%の範囲の、例えば、0.2から1.5モル%の範囲の、例えば、0.3から1.25モル%の範囲の修飾度を有する。
【００５４】
一部の実施形態では、組成物中のグリコサミノグリカンの濃度は、1から100mg/mlの範囲である。
【００５５】
一部の実施形態では、組成物中のグリコサミノグリカンの濃度は、2から50mg/mlの範囲である。
【００５６】
一部の実施形態では、組成物中のグリコサミノグリカンの濃度は、10から30mg/mlの範囲である。
【００５７】
一部の実施形態では、二価のカチオンは、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びZn2+からなる群から選択される。好ましい実施形態では、二価のカチオンは、Zn2+である。
【００５８】
組成物中の二価のカチオンの濃度は、好ましくは、0.05から4mMの範囲、より好ましくは0.05から2mMの範囲である。
【００５９】
組成物中の二価のカチオン亜鉛の濃度は、好ましくは0.05から4mMの範囲、好ましくは0.05から2mMの範囲である。更に好ましい実施形態では、Zn2+の濃度は、0.5から4mMの範囲、好ましくは0.5から2mMの範囲、より好ましくは0.8から4mM、例えば、0.8から2mMの範囲である。代わりの好ましい実施形態では、Zn2+の濃度は、0.8から1.5mMの範囲、好ましくは0.8から1.2mMの範囲、より好ましくは約1.0mMである。本発明者らは、ヒアルロン酸ゲル組成物中で、これらの範囲の濃度のZn2+が、組成物を安定化させるように作用し、一方、より高濃度のZn2+は、代わりに、組成物の分解を引き起こすことを特定した。
【００６０】
一部の実施形態では、組成物は、緩衝化合物を更に含む。緩衝化合物の目的は、組成物のpHを適切な値、典型的には、5から8の範囲、好ましくは6から7.5の範囲で維持することである。したがって、溶液のpH値は、5から8の範囲、好ましくは6から7.5の範囲である。
【００６１】
一部の実施形態では、組成物は、治療上適切な濃度の局所麻酔薬を更に含む。
【００６２】
局所麻酔薬は、好ましくは、リドカイン及びロピバカインからなる群から選択される。
【００６３】
本明細書に記載の組成物は、好ましくは、オートクレーブによる滅菌、すなわち、飽和水蒸気を使用する滅菌に供されてきた。オートクレーブは、F0値>4で実施することができる。飽和水蒸気滅菌プロセスのF0値は、Z値10を有する微生物に関して、最終容器中の生成物に対するプロセスによって121℃の温度に到達する等価時間(分)に関して表される致死性である。
【００６４】
本発明の組成物は、好ましくは、二価のカチオンを有さない同一の組成物と比較して安定性の増加を示す。
【００６５】
組成物の成分、特徴、効果及び利点は、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を調製する方法に関して上述のように更に定義することができる。
【００６６】
本発明による滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物は、予め充填されたシリンジ、すなわち、注射可能なヒドロゲル組成物で予め充填され、オートクレーブされたシリンジの形態で提供されてもよい。
【００６７】
本明細書に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物は、種々の医薬物質又は美容物質の輸送又は投与及び徐放又は制御放出のために使用されるのが有利であり得る。
【００６８】
本明細書に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物は、患者又は対象の軟組織への組成物の注射によって、医学的及び非医学的、例えば、純粋に美容の手順で用いられてもよい。
この組成物は、例えば、軟組織の増強、例えば、ヒアルロン酸ゲルの注射によってしわを埋めるのに有用であることが見出された。この組成物は、それによって、少量のヒアルロン酸組成物が、処置される皮膚の面積に対して分布したいくつかの注射部位の真皮に注射され、肌の調子及び肌の弾性に改善を生じる皮膚の再活性化のような、本明細書で言及される美容処置法においても有用であることが見出された。皮膚の再活性化は単純な手順であり、この手順に関連する健康についてのリスクは非常に低い。
【００６９】
組成物は、例えば、種々の皮膚科学条件の処置において有用である。特に、創傷治癒、乾燥肌の状態又は日焼けで損傷した肌の処置、色素沈着過剰症の処置、脱毛の処置及び予防、並びに疾患プロセスの構成成分として炎症を有する状態、例えば、乾癬及び皮脂欠乏性湿疹の処置からなる群から選択される皮膚科学的処置において使用するための、上記の注射可能なヒアルロン酸組成物が提供される。言い換えれば、創傷治癒、乾燥肌の状態又は日焼けで損傷した肌の処置、色素沈着過剰症の処置、脱毛の処置及び予防、並びに疾患プロセスの構成成分として炎症を有する状態、例えば、乾癬及び皮脂欠乏性湿疹の処置からなる群から選択される皮膚科学的処置において使用するための医薬の製造において使用するための、上記注射可能なヒアルロン酸組成物が提供される。
【００７０】
本明細書で例証される他の態様によれば、対象の皮膚への組成物の注射による対象の美容、非医学的処置のための、上記の注射可能なヒアルロン酸組成物の使用が提供される。美容、非医学的処置の目的は、皮膚の外観を改善する、脱毛を予防及び/若しくは処置する、しわを埋める、又は対象の顔若しくは身体の輪郭を描くためであり得る。美容、非医学的使用は、疾患又は医学的状態のいかなる形態の処置も伴わない。皮膚の外観を改善することの例として、これらに限定されないが、日焼けで損傷したか又は老化した皮膚の処置、皮膚の再活性化、美白及び老人性色素斑、黒皮症及びそばかす等の色素沈着過剰症の処置が挙げられる。
【００７１】
本明細書で例証される態様によれば、医薬として使用するための、本明細書に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が提供される。
【００７２】
本明細書で例証される態様によれば、二価のカチオンによる処置に感受性の状態の処置において使用するための、本明細書に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が提供される。
【００７３】
一部の実施形態では、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物は、対象の皮膚に注射される。組成物は、好ましくは、注射の際の対象の皮膚における二価のカチオンの徐放をもたらす。対象の皮膚における二価のカチオンの放出は、二価のカチオンの中毒量を十分に下回るべきである。例として、Zn2+を有する組成物に関して、注射の際の対象の皮膚における放出は、好ましくは、1日当たり0.1mmol未満である。
【００７４】
本明細書で例証される態様によれば、二価のカチオンによる処置に感受性の状態の処置のための医薬の製造が提供される。
【００７５】
本明細書で例証される態様によれば、本明細書の記載に従って、治療有効量の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を患者に投与することによって、二価のカチオンによる処置に感受性の状態に罹患している患者を処置する方法が提供される。
【００７６】
本明細書で例証される態様によれば、本明細書に記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を皮膚に投与する工程を含む、皮膚を美容的に処置する方法が提供される。
【００７７】
本発明の方法及び組成物は、特に、グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であり、二価のカチオンがZn2+である好ましい実施形態に関して、本明細書に記載されている。しかし、本発明は、この特定の実施形態に制限されるものではない。他のグリコサミノグリカン及び他の二価のカチオンも本発明の範囲内であることが企図される。
【００７８】
当業者は、本発明が、本明細書に記載の好ましい実施形態に決して限定されるものではないことを理解する。対照的に、多くの修正及び変形が添付の特許請求の範囲の範囲内で可能である。更に、開示した実施形態に対する変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲についての研究から、特許請求した発明を実践する際に、当業者によって理解され、実行され得る。特許請求の範囲において、「含む(comprising)」という語は、他の要素又は工程を除外するものではなく、不定冠詞「1つの(a)」又は「1つの(an)」は、複数を除外するものではない。ある特定の測定値が、相互に異なる独立請求項に記載されているという単なる事実は、これらの測定値の組合せが有利となるように使用できないということを示すものではない。
【００７９】
実施形態の項目別リスト
以下は、本発明によって提供される種々の特徴及び組合せを、その態様の一部において記載する目的で表した、本発明の開示の実施形態の非限定的な項目別リストである。
【００８０】
1. 
a)二官能又は多官能の架橋剤を使用して、グリコサミノグリカンを共有結合により架橋させて、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを形成する工程と、
b)二価のカチオンを含む溶液中で、共有結合により架橋したグリコサミノグリカンを膨潤させて、ヒドロゲル組成物を形成する工程と、
c)オートクレーブによってヒドロゲル組成物を滅菌して、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を形成する工程
とを含む、滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を調製する方法。
【００８１】
2. グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
【００８２】
3. グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸である、項目2に記載の方法。
【００８３】
4. 工程a)のグリコサミノグリカンが、一価のカチオン、例えば、Na+を有する塩の形態で提供される、項目1から3のいずれか1つに記載の方法。
【００８４】
5. 架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド及びジエポキシドからなる群から選択される、項目1から4のいずれか1つに記載の方法。
【００８５】
6. 架橋剤が、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)、1,2-エタンジオールジグリシジルエーテル(EDDE)及びジエポキシオクタンからなる群から選択される、項目5に記載の方法。
【００８６】
7. 架橋剤が、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)である、項目6に記載の方法。
【００８７】
8. 共有結合により架橋したグリコサミノグリカンが、2モル%以下、例えば、1.5モル%以下、例えば、1.25モル%以下の修飾度を有する、項目1から7のいずれか1つに記載の方法。
【００８８】
9. 共有結合により架橋したグリコサミノグリカンが、0.1から2モル%の範囲の、例えば、0.2から1.5モル%の範囲の、例えば、0.3から1.25モル%の範囲の修飾度を有する、項目1から8のいずれか1つに記載の方法。
【００８９】
10. 前記グリコサミノグリカンの濃度が、1から100mg/mlの範囲、例えば、2から50mg/mlの範囲、例えば、10から30mg/mlの範囲である、項目1から9のいずれか1つに記載の方法。
【００９０】
11. 二価のカチオンが、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びZn2+からなる群から選択される、項目1から10のいずれか1つに記載の方法。
【００９１】
12. 二価のカチオンが、Zn2+である、項目1から11のいずれか1つに記載の方法。
【００９２】
13. 溶液中のZn2+が、ZnCl2、グルコン酸Zn及びクエン酸Znからなる群から選択されるZn塩によって提供される、項目12に記載の方法。
【００９３】
14. 溶液中の二価のカチオンの濃度が、0.05から4mMの範囲、好ましくは0.05から2mMの範囲である、項目1から13のいずれか1つに記載の方法。
【００９４】
15. 二価のカチオンが、Zn2+であり、溶液中のZn2+の濃度が、0.5から4mMの範囲、好ましくは0.5から2mMの範囲、より好ましくは0.8から4mM、例えば0.8から2mMの範囲である、項目1から14のいずれか1つに記載の方法。
【００９５】
16. 溶液中のZn2+の濃度が、0.8から1.5mMの範囲、好ましくは0.8から1.2mMの範囲、より好ましくは約1.0mMである、項目15に記載の方法。
【００９６】
17. 溶液が、緩衝化合物を更に含む、項目1から16のいずれか1つに記載の方法。
【００９７】
18. 溶液のpH値が、5から8の範囲、好ましくは6から7.5の範囲である、項目1から17のいずれか1つに記載の方法。
【００９８】
19. 溶液が、治療上適切な濃度の局所麻酔薬を更に含む、項目1から18のいずれか1つに記載の方法。
【００９９】
20. 局所麻酔薬が、リドカイン及びロピバカインからなる群から選択される、項目19に記載の方法。
【０１００】
21. オートクレーブが、F0値>4で実施される、項目1から20のいずれか1つに記載の方法。
【０１０１】
22. 形成した滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物が、二価のカチオンを有さない同一の組成物と比較して安定性の増加を示す、項目1から21のいずれか1つに記載の方法。
【０１０２】
23. 項目1から22のいずれか1つに記載の方法によって得ることができる滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【０１０３】
24. 
i)共有結合により架橋したグリコサミノグリカンと、
ii)二価のカチオン
とを含む滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
25. グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、項目24に記載の組成物。
【０１０４】
26. グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸である、項目25に記載の組成物。
【０１０５】
27. 架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド及びジエポキシドからなる群から選択される、項目24から26のいずれか1つに記載の組成物。
【０１０６】
28. 架橋剤が、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)、1,2-エタンジオールジグリシジルエーテル(EDDE)及びジエポキシオクタンからなる群から選択される、項目27に記載の組成物。
【０１０７】
29. 架橋剤が、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)である、項目28に記載の組成物。
【０１０８】
30. 共有結合により架橋したグリコサミノグリカンが、2モル%以下、例えば、1.5モル%以下、例えば、1.25モル%以下の修飾度を有する、項目24から29のいずれか1つに記載の組成物。
【０１０９】
31. 共有結合により架橋したグリコサミノグリカンが、0.1から2モル%の範囲の、例えば、0.2から1.5モル%の範囲の、例えば、0.3から1.25モル%の範囲の修飾度を有する、項目24から29のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１０】
32. 前記グリコサミノグリカンの濃度が、1から100mg/mlの範囲、例えば、2から50mg/mlの範囲、例えば、10から30mg/mlの範囲である、項目24から31のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１１】
33. 二価のカチオンが、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びZn2+からなる群から選択される、項目24から32のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１２】
34. 二価のカチオンが、Zn2+である、項目24から33のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１３】
35. 組成物中の二価のカチオンの濃度が、0.05から4mMの範囲、好ましくは0.05から2mMの範囲である、項目24から34のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１４】
36.  二価のカチオンが、Zn2+であり、溶液中のZn2+の濃度が、0.5から4mMの範囲、好ましくは0.5から2mMの範囲、より好ましくは0.8から4mM、例えば0.8から2mMの範囲である、項目24から35のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１５】
37. 溶液中のZn2+の濃度が、0.8から1.5mMの範囲、好ましくは0.8から1.2mMの範囲、より好ましくは約1.0mMである、項目36に記載の組成物。
【０１１６】
38. 緩衝化合物を更に含む、項目24から37のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１７】
39. 組成物のpH値が、5から8の範囲、好ましくは6から7.5の範囲である、項目24から38のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１８】
40. 治療上適切な濃度の局所麻酔薬を更に含む、項目24から39のいずれか1つに記載の組成物。
【０１１９】
41. 局所麻酔薬が、リドカイン及びロピバカインからなる群から選択される、項目40に記載の組成物。
【０１２０】
42. オートクレーブによる滅菌に供された、項目24から41のいずれか1つに記載の組成物。
【０１２１】
43. F0値>4でのオートクレーブによる滅菌に供された、項目24から42のいずれか1つに記載の組成物。
【０１２２】
44. 二価のカチオンを有さない同一の組成物と比較して安定性の増加を示す、項目24から43のいずれか1つに記載の組成物。
【０１２３】
45. 医薬として使用するための、項目23から44のいずれか1つに記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【０１２４】
46. 二価のカチオンによる処置に感受性の状態の処置において使用するための、項目23から44のいずれか1つに記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【０１２５】
47. 対象の皮膚に注射される、項目45又は46に記載の使用のための滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【０１２６】
48. 注射の際の対象の皮膚における二価のカチオンの徐放をもたらす、項目47に記載の使用のための滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【０１２７】
49.  注射の際の対象の皮膚における二価のカチオンの放出は、1日当たり0.1mmol未満である、項目47又は48に記載の使用のための滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物。
【０１２８】
50. 二価のカチオンによる処置に感受性の状態の処置のための医薬の製造のための、項目23から44のいずれか1つに記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物の使用。
【０１２９】
51. 項目23から44のいずれか1つに記載の、治療有効量の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を患者に投与することによって、二価のカチオンによる処置に感受性の状態に罹患している患者を処置する方法。
【０１３０】
52. 項目23から44のいずれか1つに記載の滅菌した注射可能なヒドロゲル組成物を皮膚に投与する工程を含む、皮膚を美容的に処置する方法。
【０１３１】
本発明は、図1〜図6によって更に例証される。図1〜図6は、例示的実施形態のみを表す。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図1aは、1モル%の修飾度を有するヒアルロン酸ゲルにおけるZnの安定化効果を示す図である。図1bは、5モル%の修飾度を有するヒアルロン酸ゲルにおけるZnの安定化効果を示す図である。
【図２】図2aは、Znの安定化効果が、リドカイン又はロピバカインが組成物に添加される際にも存在することを示す図である。図2bは、Znの安定化効果が、リドカイン又はロピバカインが組成物に添加される際にも存在することを示す図である。
【図３】緩衝液としてtrisが使用された場合に、Znの安定化効果も存在することを示す図である。
【図４】様々なZn塩が、同様の安定化効果を有することを示す図である。
【図５】図5aは、Znの安定化効果の濃度依存性を示す図である。図5bは、組成物の貯蔵安定性に関するZnの効果を示す図である。
【図６】時間関数として、1mMの塩化亜鉛を含有するゲルから放出されたZnの割合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３３】
これらに限定されることを望むものではないが、本発明は、以下において、実施例として例証される。
【０１３４】
（実施例１）
MoD 1%を有するヒアルロン酸ゲル
1mol%の修飾度と20mg/mLのヒアルロン酸含量を有する、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルを、最初に、ヒアルロン酸(Mw 1MDa)をプラスチックジャーに移すことによって調製した。1%のNaOH及び0.3%のBDDEの溶液を添加し、混合物をホモジナイズした。ジャーをインキュベーターに移し、架橋工程を実施した。得られたゲルを2つの部分に分割した。第1の部分を、pHが約7.4のリン酸ナトリウム、HCl及びNaClを含有する緩衝溶液中に、約20mg/mLのHA濃度まで膨潤させた(基準)。第2の部分は、リン酸ナトリウム、HCl及び1mMのZnCl2を含有する緩衝溶液中に、約20mg/mLのHA濃度まで膨潤させた。製剤のpHを7.4に調整し、製剤をガラスシリンジに充填し、Getinge 6610 ERC-1オートクレーブ中でオートクレーブした(F0  約19)。
【０１３５】
製剤のレオロジー特性をAhres G2レオメーター(測定システムPP 40、ギャップ1.00mm)を使用して分析した。最初に、ひずみ掃引を行って、線形粘弾性領域(LVR)を見出し、次いで、LVR内の粘弾特性を測定した。
【０１３６】
図1aは、ZnCl2を含む緩衝液中で膨潤したHAゲルサンプルと緩衝液のみで膨潤した基準サンプルとの間のG'の差を示す。ゲルに関する安定化効果は、1mMのZnCl2が製剤中で使用される場合に見られ得る。
【０１３７】
（実施例２）
MoD 5%を有するヒアルロン酸ゲル
5mol%の修飾度を有する、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルを、3gのヒアルロネート(Mw 2MDa)を1%のNaOH中のBDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)の混合物と混合することによって調製した。1%のNaOH中のBDDEを希釈することによって、BDDE/NaOH溶液を調製し、1/100まで希釈した塩基性BDDE溶液を得ることとなった。次いで、19gの調製したBDDE溶液を、ヒアルロネートに添加し、ホモジナイズした。混合物を、50℃の水浴中に2時間置いた。
【０１３８】
得られた架橋したヒアルロン酸をリン酸緩衝食塩水(1mMのPBS)中で膨潤させ、pHを7に調整した。次いで、透析  (MWCO 15000)によって2日間ゲルを精製した。次いで、ゲルを2つの部分に分割し、ゲルの一方に、1MのZnCl2を添加し、最終ゲル中1mMのZnCl2の濃度を得て、PBS緩衝液を添加して20mg/mLの最終ヒアルロン酸濃度を得た。ゲルの第2の部分に、PBS緩衝液を添加し、20mg/mLの最終ヒアルロン酸濃度を得た。製剤のpHを7.4に調整し、製剤をガラスシリンジに充填し、Getinge 6610 ERC-1オートクレーブ中でオートクレーブした(F0  約19)。
【０１３９】
製剤のレオロジー特性をAhres G2レオメーター(測定システムPP 40、ギャップ1.00mm)を使用して分析した。最初に、ひずみ掃引を行って、線形粘弾性領域(LVR)を見出し、次いで、LVR内の粘弾特性を測定した。
【０１４０】
図1bは、ZnCl2を含む緩衝液中で膨潤したHAゲルサンプルと緩衝液のみで膨潤した基準サンプルとの間のG'の差を示す。ゲルに関する安定化効果は、1mMのZnCl2が製剤中で使用される場合に見られ得る。したがって、ZnCl2の添加に由来するゲルに関する安定化効果は、修飾度が1%のゲルと5%のゲルの場合の両方で存在する。
【０１４１】
（実施例３）
異なるZnCl2濃度を有するヒアルロン酸ゲル
1mol%の修飾度と20mg/mLのヒアルロン酸含量を有する、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルを、架橋工程後にゲルを8つの部分に分割する点は異なるが、実施例1に従って調製した。ゲルの部分は、それぞれ、0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4及び8mMのZnCl2を含有するPBS緩衝液で、約20mg/mLまで膨潤させた。製剤のpHを7.4に調整し、製剤をガラスシリンジに充填し、Getinge 6610 ERC-1オートクレーブ中でオートクレーブした(F0  約19)。
【０１４２】
図5aは、ZnCl2の濃度が異なるゲルのオートクレーブ後のレオロジー特性に関する効果を示す。
【０１４３】
ゲルに関して、安定性の研究も実施した。オートクレーブしたシリンジをインキュベーター内に1及び2週間置き、次いで、レオロジー特性を分析した。
【０１４４】
図5bは、ゲルを1及び2週間60℃に供した際に、時間関数として、ZnCl2の濃度が異なるゲルのレオロジー特性を示す。
【０１４５】
ゲルの分解が4mM及びそれを超える濃度のZnCl2で観察される一方、ゲルの安定化効果は、0.05〜2mMのZnCl2で見られた。より高濃度のZnCl2が使用された場合に、ゲルの分解速度もより高かった。
【０１４６】
（実施例４）
様々なZn塩を有するヒアルロン酸ゲル
1mol%の修飾度と20mg/mLのヒアルロン酸含量を有する、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルを、架橋工程後にゲルを4つの部分に分割する点は異なるが、実施例1に従って調製した。Table 1(表1)に示すように、1つの部分は、PBS緩衝液(1mMのホスフェート)中で膨潤させ、1つの部分は、1mMのZnCl2を有するPBS緩衝液中で膨潤させ、1つの部分は、1mMのグルコン酸Znを有するPBS緩衝液中で膨潤させ、1つの部分は、1mMのクエン酸Znを有するPBS緩衝液で膨潤させ、1つの部分は、1mMのクエン酸Znを有するPBS緩衝液で膨潤させた。すべてのゲルを約20mg/mLのHA濃度まで膨潤させた。製剤のpHを7.4に調整し、製剤をガラスシリンジに充填し、Getinge 6610 ERC-1オートクレーブ中でオートクレーブした(F0  約19)。
【０１４７】
製剤のレオロジー特性をAhres G2レオメーター(測定システムPP 40、ギャップ1.00mm)を使用して分析した。最初に、ひずみ掃引を行って、線形粘弾性領域(LVR)を見出し、次いで、LVR内の粘弾特性を測定した。
【０１４８】
【表１】
2019532708.tif 000003
【０１４９】
図4は、1mMのZnCl2、1mMのグルコン酸Zn及び1mMのクエン酸Znを含むPBS中で膨潤したサンプルとPBSのみで膨潤した基準サンプルとの間のG'の差を示す。安定化効果は、Znが、ZnCl2、グルコン酸Zn又はクエン酸Znのいずれかとして添加される場合に見られ得る。
【０１５０】
（実施例５）
ZnCl2と異なる緩衝液を有するヒアルロン酸ゲル
1mol%の修飾度と20mg/mLのヒアルロン酸含量を有する、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルを、ゲルの膨潤の間に、PBSの代わりに、生理食塩水中のTris緩衝液(50mM)を使用した点は異なるが、実施例1に従って調製し、分析した。
【０１５１】
図3に示すように、オートクレーブ後の1mMのZnCl2の安定化効果は、生理食塩水中のTris緩衝液(50mM)が製剤中で使用される場合にも存在する。
【０１５２】
（実施例６）
Znと局所麻酔薬を有するHAゲル
1mol%の修飾度と20mg/mLのヒアルロン酸含量を有する、BDDE(1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)により架橋したヒアルロン酸ゲルを、架橋工程後に、ゲルを8つの部分に分割する点は異なるが、実施例1に従って調製した。ゲルは、Table 2(表2)に従って、1mMのZnCl2の有無にかかわらず、10mMのPBS緩衝液中で膨潤させた。
【０１５３】
塩酸リドカイン一水和物と塩酸ロピバカイン一水和物の保存液を、それぞれ、リドカインとロピバカインを水中に溶解することによって調製した。保存液を、1mMのZnCl2と10mMのリン酸緩衝食塩水とを有するヒアルロン酸ゲルに添加し、ロピバカインの最終濃度を1mg/mL及びリドカインの最終濃度を3mg/mLとした。撹拌することによってゲルをホモジナイズし、製剤のpHを、Table 2(表2)に従って、6.5又は7.3に調整し、製剤をガラスシリンジに充填し、Getinge 6610 ERC-1オートクレーブ中でオートクレーブした(F0  約19)。
【０１５４】
製剤のレオロジー特性をAhres G2レオメーター(測定システムPP 40、ギャップ1.00mm)を使用して分析した。最初に、ひずみ掃引を行って、線形粘弾性領域(LVR)を見出し、次いで、LVR内の粘弾特性を測定した。
【０１５５】
【表２】
2019532708.tif 000004
【０１５６】
Table 2(表2)並びに図2a及び図2bに示すように、ゲルに関する1mMのZnCl2の安定化効果は、製剤中にカインが存在する場合にも見られる。
【０１５７】
（実施例７）
ZnCl2を含有するゲルからのZnの放出
ゲルからの亜鉛放出は、ゲルを置く特定のゲル容器を使用するUSP-パドル装置によって測定した。1mMのZnCl2を含有するゲルを、実施例1に従って製造した。固定容積が1mlの7つのゲル容器にゲルを充填した。充填したゲルの幾何学的形状は、直径1cm及び深さ3mmの円筒であった。ゲルを、メッシュサイズのプラスチックネット(PA80m = 200メッシュ、AB Derma)と粗いステンレス鋼ネットとで覆い、ゲルとプラスチックネットの間に空気がトラップされなかったことを確認するように注意を払った。
【０１５８】
各ゲル容器を、Distek Evolution 6100(North Brunswick、New Jersey)を使用して、600mlのサーモスタットで温度管理した離型剤中に浸漬し、30rpmで撹拌し、37℃で維持した。所定の時点で、ゲル容器を取り出し、容器内のZn含量を、ICPを使用して決定した。
【０１５９】
結果を図6に示す。ゲルからのZnの放出は非常に遅い。この実験設定では、ゲルと分子の間にいかなる相互作用も有さずに、同様のゲルにおいて自由に拡散する小分子は、通常、6時間後には完全に放出されている。
【０１６０】
8日後に、ゲル中のZnの50%未満しか放出されなかった。これは、1日当たり約0.06μmolの放出をもたらす。これらの結果により、in vivoでゲルを安全に使用して、患者に対して、Znの徐放を行うことができる。
【０１６１】
（実施例８）
様々な亜鉛塩を含有するゲルからのZnの放出。
塩化亜鉛(1mM)、グルコン酸亜鉛(1mM)及びクエン酸亜鉛(1mM)を含有する実施例4に従って調製したゲルを、それぞれ、実施例7に記載されているように分析した。Table 3(表3)は、様々な亜鉛塩に対する相対的放出速度を示す。
【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
解離した亜鉛(遊離したZn2+)の割合が大きい程、おそらくはゲル中のZnとヒアルロナンの間の相互作用の結果、より遅い放出がもたらされる。その対イオンと複合体を形成した亜鉛はゲルと相互作用せず、その対イオンと複合体を形成した亜鉛の割合が大きい程、放出もより急速である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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