(57)【要約】  本発明は、アルカリ耐性が向上した変異型免疫グロブリン結合タンパク質に関する、より詳細にはスタフィロコッカスのプロテインＡのドメインA又はその機能的変異体において、特定の位置におけるアミノ酸が突然変異して、親分子に比べてアルカリpH値において向上した化学的安定性を示す免疫グロブリン結合タンパク質に関するものである。本発明は、耐アルカリ性が向上されて多数のアルカリ洗浄に対する安定性が向上された抗体精製用免疫グロブリン結合タンパク質リガンド及びマトリックスを提供することができる。
2019524088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異したことを特徴とする免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項２】
前記突然変異は、N18H、D36V、N43Y/L及びN52Sからなる群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質又はその機能的変異体において、23番目及び28番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基突然変異を追加して含むことを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項４】
前記23番目の位置における突然変異は、N23T、N23A、N23E、N23H、N23K、N23L、N23P、N23S及びN23Yからなる群から選ばれ、前記28番目の位置における突然変異は、N28W、N28G、N28R、N28F及びN28Iからなる群から選ばれることを特徴とする請求項３記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項５】
前記免疫グロブリン結合タンパク質は、配列番号9で定義されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１記載の突然変異タンパク質単位を含み、反復単位を二つ以上含む多量体。
【請求項７】
ブドウ球菌プロテインＡのE、D、A、B及びCドメインのうち、一つ以上を追加して含むことを特徴とする請求項６記載の多量体。
【請求項８】
請求項１記載の免疫グロブリン結合タンパク質又は請求項６記載の多量体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１記載の免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが、固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックス。
【請求項１２】
請求項１記載の突然変異タンパク質又は請求項６記載の多量体又は請求項１１記載のマトリックスが使用される免疫グロブリンの単離方法。
【請求項１３】
請求項１記載の突然変異タンパク質又は請求項６記載の多量体又は請求項１１記載のマトリックスの吸着によって液体から一つ以上の標的化合物が分離されるクロマトグラフィー法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法で単離された免疫グロブリンタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３記載の方法で分離された標的化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2016年7月6日に出願された韓国特許出願第10-2016-0085721号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。
【０００２】
本発明は、アルカリ耐性が向上した変異型免疫グロブリン結合タンパク質に関するもので、より詳細には、ブドウ球菌(スタフィロコッカス)プロテインＡのドメインA又はその機能的変異体において、特定の位置でアミノ酸が突然変異して、親分子に比べてアルカリpH値において向上した化学的安定性を示す免疫グロブリン結合タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体(monoclonal antibody)は、遺伝子操作された動物細胞の培養時、培地中に分泌され、細胞自体で分泌される複数のタンパク質及び培地内のタンパク質と混ざって、極めて低い濃度で存在するようになる。従って、目的のモノクローナル抗体以外の不純物の除去が、抗体の生産では重要な段階である。モノクローナル抗体分離精製工程は、培地からモノクローナル抗体のみを選択的に回収できる、抗体の親和性リガンド(antibody affinity ligand)であるプロテインＡを利用した親和性クロマトグラフィー(affinity chromatography)が主に使用されている。
【０００４】
抗体精製後には、レジンに残っている核酸、脂質、タンパク質、微生物のような多様な汚染物質を除去するための洗浄(cleaning-in-place、CIP)を実施する。一般的に、レジンの洗浄剤の内で最も広く使用されている物質がNaOHである。しかし、タンパク質ベースの精製用レジンは、アルカリに脆弱なため、NaOHを使用し難い。プロテインＡは、比較的アルカリの条件でも安定であるため、NaOHで洗浄されるが、より洗浄率を高めるために、アルカリ条件でも安定したプロテインＡを開発するためのタンパク質改良研究等が進められてきた。
【０００５】
プロテインＡは、ブドウ球菌の細胞表面タンパク質として、高い相同性を有している５個のドメイン（E、D、A、B、Cドメイン）で構成されている。ドメインは、３個の逆平行ヘリックスと、ヘリックスの中間に位置している２個のループからなる構造を有し、約58個のアミノ酸残基で構成されている。Gulichは、レンサ球菌(ストレプトコッカス菌)株由来のアルブミン結合ドメイン(streptococcal albumin-binding domain)をモデルにして、Asn残基がアルカリに敏感であるとの情報を基に、全てのAsn残基を他のアミノ酸に置換した。その結果、0.5N NaOHに対する安定性と熱安定性が高いタンパク質を得ることができた(非特許文献１)。Linhultは、バイパス突然変異法(bypass mutagenesis approach)を利用して、反復的なアルカリ処理にも構造的安定性が維持されるプロテインＡを開発した。詳細に説明すると、Zドメイン(BドメインのG29A変異体)のF30は、３番目のヘリックス位置に存在していて、抗体結合には干渉しないが、構造的安定性には影響を与える残基である。実際には、F30をAlaに置換した場合、IgGの親和力は野生型と似ているが、構造的な安定性が減少して、アルカリに対する耐性が弱まった。Z（F30A）を鋳型にして、Asn残基を、他のドメイン(E、D、A、Cドメイン)と同じ位置に存在するAsn以外の他の残基に置換したときに、つまりN23T、N28A、N6A、N11Sに置換したときに、アルカリ条件で安定性が向上することを確認した。しかし、N21A、N43E、N52Aの場合には、野生型よりアルカリ耐性が落ちることから、単にAsnを他の残基に置換することに加えて、何の残基に置換したのかも重要である(非特許文献２)。
【０００６】
特許文献１は、Bドメイン又はZドメインのN3A/N23T又はN3A/N6D/N23Tに替わった変異型免疫グロブリン結合タンパク質を記載しており、親分子に比べて、アルカリ条件のpHにおいて、化学的安定性が向上した。特許文献２は、ZドメインのN3、N6、N23の三つの位置をヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、トレオニンに置換して、アルカリ耐性が向上した突然変異配列等を記載した。
【０００７】
他の発明では、特許文献３は、N末端から3番目の残基から6番目の残基までを除いたCドメインと野生型Cドメインを含むクロマトグラフィーマトリックスを記載しており、このマトリックスは、アルカリに対する安定性が向上した。特許文献４は、N末端から1番目のアミノ酸から始めて3又は4個の連続的アミノ酸欠失を含む2個乃至5個のCドメイン、Bドメイン又はZドメインの親和性クロマトグラフィーリガンド及びマトリックスを記載しており、このマトリックスは、アルカリ条件で野生型リガンドに比べてリガンド分解が少ない特徴がある。
【０００８】
前記の通り、個別のプロテインＡリガンドとしては、アスパラギン残基に対して幾つかの特定のアミノ酸への置換を行うか又はN末端の残基を取り除くことにより、アルカリ耐性の向上を確認したが、置換残基がアルカリ耐性に影響を与えることを考慮すると、その効果は限定的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１３０７６５１号
【特許文献２】米国特許第９０５１３７５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／００４８８７６号明細書
【特許文献４】韓国登録特許第１０−１４６４０４０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gulich et. al., J Biotechnol, 28(2), 169-178(2000)
【非特許文献２】Linhult et. al., Proteins, 55(2), 407-416(2004)
【発明の概要】
【００１１】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
そこで、本発明者らは、無作為突然変異法を利用して、アスパラギンの他に別の残基についても無作為に多様なアミノ酸に置換させることで、アルカリ耐性が向上したプロテインＡリガンドを発明するために鋭意努力を傾けた結果、プロテインＡのドメインA又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異すると、アルカリ耐性が向上した免疫グロブリン結合タンパク質を得られることを発見して、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、配列番号2で定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異したことを特徴とする、免疫グロブリン結合タンパク質を提供する。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記突然変異したタンパク質単位を含めて、反復単位を二つ以上含む多量体を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記免疫グロブリン結合タンパク質又は前記多量体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することある。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、前記免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックスを提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、請求項1による突然変異タンパク質又は請求項6による多量体又は請求項11によるマトリックスが使用されている免疫グロブリンの単離方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、請求項1による突然変異タンパク質又は請求項6による多量体又は請求項11によるマトリックスの吸着によって、液体から一つ以上の標的化合物が分離されるクロマトグラフィー法を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、前記の方法で単離された免疫グロブリンタンパク質を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、前記の方法で分離された標的化合物を提供することである。
【００２２】
［技術的解決方法］
前記の本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号2で定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目になされた群から選ばれた、一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異したことを特徴とする免疫グロブリンタンパク質を提供する。
【００２３】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記突然変異したタンパク質単位を含めて、反復単位を二つ以上含む多量体を提供する。
【００２４】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記免疫グロブリン結合タンパク質又は前記多量体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２６】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２７】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックスを提供する。
【００２８】
本発明の他の目的を達成するために、請求項1による突然変異タンパク質又は請求項6による多量体又は請求項11によるマトリックスが使用される免疫グロブリンの単離方法を提供する。
【００２９】
本発明の他の目的を達成するために、第1項による突然変異タンパク質又は第6項による多量体又は第11項によるマトリックスの吸着によって液体から一つ以上の標的化合物が分離されるクロマトグラフィー方法を提供する。
【００３０】
本発明の他の目的を達成するために、前記の方法で単離された免疫グロブリンタンパク質を提供する。
【００３１】
本発明の他の目的を達成するために、前記の方法で分離された標的化合物を提供する。
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
本発明は、配列番号2に定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異したことを特徴とする免疫グロブリン結合タンパク質を提供する。
【００３４】
本発明者らは、プロテインＡのAドメインのアミノ酸を他のアミノ酸に置換させた組換えタンパク質変異体を分子設計して、タンパク質工学的方法及び遺伝子工学的方法を使用して、前記変異体を形質転換細胞から取得し、前記変異体のアルカリ条件下での抗体結合活性を比較検討することにより、本発明を完成した。
【００３５】
本明細書で用語“タンパク質”とは、“ポリペプチド(polypeptide)”又は“ペプチド(peptide)”と互換性をもって使用され、例えば、天然状態のタンパク質から一般的に発見されるように、アミノ酸残基の重合体を意味する。
【００３６】
本発明で“核酸”又は“ポリヌクレオチド”とは、単一又は二重鎖の形態からなるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを意味する。別に制限がない限り、天然に生成されるヌクレオチドと類似した方法で核酸に混成化される天然ヌクレオチドの公知されたアナログも含まれる。
【００３７】
本明細書で用語“発現(expression)”とは、細胞からのタンパク質又は核酸の生成を意味する。
【００３８】
本明細書に使用されたアミノ酸の一文字（３文字）は、生化学分野での標準略語規定により、次のアミノ酸を意味する：
A（Ala)：アラニン；C（Cys)：システイン；D（Asp)：アスパラギン酸；E（Glu)：グルタミン酸；F（Phe)：フェニルアラニン；G（Gly)：グリシン；H（His)：ヒスチジン；I（IIe)：イソロイシン；K（Lys)：リジン；L（Leu)：ロイシン；M（Met)：メチオニン；N（Asn)：アスパラギン；O（Ply)ピロリシン；P（Pro)：プロリン；Q（Gln)；グルタミン；R（Arg)：アルギニン；S（Ser)：セリン；T（Thr)：トレオニン；U（Sec)：セレノシステイン；V(Val）：バリン；W（Trp)：トリプトファン；Y（Tyr)：チロシン。
【００３９】
本明細書に表記される“（アミノ酸１文字）（アミノ酸位置）（アミノ酸１文字）”は、天然型ポリペプチドの該当アミノ酸位置から、先に表記されたアミノ酸が、後に表記されたアミノ酸に置換されることを意味する。例えば、N23Rは、天然型ポリペプチドの23番目に該当するアスパラギンが、アルギニンに置換されることを意味する。また、末尾に表記されたアミノ酸において“斜線（/)”表示は、“又は”を意味する。
【００４０】
本発明は、プロテインＡのA、B、C又はZドメインから選ばれる少なくとも一つのドメインに由来するアミノ酸配列において、18、36、43及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置でのアミノ酸残基が置換された突然変異タンパク質であり、変異導入前のタンパク質と比較して、アルカリ条件で化学的安定性が向上したことを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質に関するものある。
【００４１】
変異導入前のドメインに由来するアミノ酸配列が、配列番号1に記載されたプロテインＡのAドメインの塩基配列、又は配列番号2に記載されたプロテインＡのAドメインに由来するアミノ酸配列であることが望ましい。
【００４２】
本発明で前記突然変異タンパク質は、配列番号2に定義されたアミノ酸配列を含むか又はその機能的変異体である。“機能的変異体”とは、高pH値の環境で突然変異タンパク質の向上した化学的安定性又は免疫グロブリンに対する親和性には影響を与えないアミノ酸位置から、一つ以上の追加変異を含む全ての類似した配列を含む。
【００４３】
変異導入前のアミノ酸残基において、各ドメインにおけるAドメインの18番目の位置に対応するアミノ酸残基がAsn、各ドメインにおけるAドメインの23番目の位置に対応するアミノ酸残基がAsn、各ドメインにおけるAドメインの28番目の位置に対応するアミノ酸残基がAsn、各ドメインにおけるAドメインの36番目の位置に対応するアミノ酸残基がAsp、各ドメインにおけるAドメインの43番目の位置に対応するアミノ酸残基がAsn、又は各ドメインにおけるAドメインの52番目の位置に対応するアミノ酸残基がAsnであることが望ましい。
【００４４】
本発明でブドウ球菌プロテインＡの各ドメインに導入されるアミノ酸置換変異が、Aドメインの18番目の位置に対応するAsnをHisに置換する変異（N18H）、Aドメインの36番目の位置に対応するAspをValに置換する変異（D36V）、Aドメインの43番目の位置に対応するAsnをTyr又はLeuに置換する変異（N43Y/L）及びAドメインの52番目の位置に対応するAsnをSerに置換する変異（N52S）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることが望ましい。
【００４５】
最も好ましくは、本発明の前記変異型Aドメインは、前記配列番号2で表示されるポリペプチドにおいて、18番目のアスパラギンがヒスチジンで置換されたポリペプチド(本明細書において、AEP1、配列番号3、N18Hと呼ぶ)、36番目のアスパラギン酸がバリンで置換されたポリペプチド(本明細書において、AEP4、配列番号4、D36Vと呼ぶ)、43番目のアスパラギンがチロシンで置換されたポリペプチド(本明細書において、AEP5、配列番号5、N43Y/Lと呼ぶ)、52番目のアスパラギンがセリンで置換されたポリペプチド(本明細書において、AEP6、配列番号6、N53Sと呼ぶ)が好ましい。
【００４６】
本発明は、また、前記18番目、36番目、43番目及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸変異の他に、23番目及び／又は28番目の位置におけるアミノ酸残基の突然変異をさらに含むことを特徴的する免疫グロブリン結合タンパク質を提供する。
【００４７】
好ましくは、前記23番目の位置における突然変異は、N23T、N23A、N23E、N23H、N23K、N23L、N23P、N23S及びN23Yからなる群から選ばれて、前記28番目の位置における突然変異は、N28W、N28G、N28R、N28F及びN28Iからなる群から選ばれることを特徴とすることができ、より好ましくは、23番目のアスパラギンがロイシンで置換されたポリペプチド(本明細書において、AEP2、配列番号7、N23Lと呼ぶ)、28番目のアスパラギンがトリプトファンで置換されたポリペプチド(本明細書AES3、配列番号8、N28Wと呼ぶ)でもある。
【００４８】
本発明は、また、配列番号2に定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、18番目、23番目、28番目、36番目、43番目及び52番目位置のアミノ酸が全て置換された突然変異タンパク質を提供する。
【００４９】
前記タンパク質は、好ましくは配列番号2に定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、N18H、N23L、N28W、D36V、N43Y及びN52S変異を含む配列番号9に定義されるタンパク質でもある。
【００５０】
本発明の前記突然変異タンパク質は、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgMのような免疫グロブリンのFc断片に特異的に結合するタンパク質リガンドであり、親分子より、アルカリ条件でより長期間親和性が維持される。
【００５１】
本発明による前記突然変異タンパク質の向上したアルカリ耐性は、明細書実施例に示されている。
【００５２】
本発明の実施例では、野生型Aドメインの1次、2次改良を通じて、アルカリ耐性が向上した変異体を発明し、最終的に各残基において最もアルカリ耐性が高い残基を集めて、アルカリ耐性が野生型Aドメインに比べてかなり向上した変異体を開発した。
【００５３】
具体的には、1次改良は、野生型Aドメイン塩基(配列番号1)を、エラー誘発性重合酵素連鎖反応法(error prone PCR)を利用して突然変異ライブラリを製造して、野生型対比アルカリ耐性が向上した変異を探索して、野生型Aドメインポリペプチド(配列番号2)のN18、N23、N28、D36、N43、N52の位置において他のアミノ酸に置換された突然変異を選別することができた。具体的には、前記突然変異は、N18がヒスチジンに置換、N23がロイシンに置換、N28がトリプトファンに置換、D36がバリンに置換、N43がチロシンに置換、N52がセリンに置換される突然変異体が選別された。
【００５４】
2次改良は、前記1次改良で選定された6個のアミノ酸残基(N18H、N23L、N28W、D36V、N43Y、N52S)に対する追加的な改良のために、部位飽和突然変異ライブラリを製造してアルカリ耐性が向上した変異体を探索した結果、野生型Aドメインポリペプチド(配列番号2)のN23、N28、N43の位置が追加的に他のアミノ酸に置換された突然変異を選別することができた。具体的には前記突然変異は、N23がアラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、ロイシン、プロリン、セリン、チロシンに置換、N28がグリシン、アルギニン、フェニルアラニン、イソロイシンに置換、N43がロイシンに置換されている突然変異が選別された。
【００５５】
本発明の実施例で製造した前記変異体のアルカリ耐性を分析して、各位置において最も耐性が高かった置換残基をすべて導入したmAF(配列番号9)を発明し、これは野生型に比べてアルカリ耐性が格段に向上したことを確認した。
【００５６】
本発明は、また、前記説明した突然変異したタンパク質単位を含めて反復単位を二つ以上含む多量体を提供する。すなわち、前記のタンパク質単量体が結合された二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体タンパク質を提供する。
【００５７】
本発明の前記多量体は、さらに、スタフィロコッカスプロテインＡのE、D、A、B、Cドメインの内で一つ以上を含む。
【００５８】
本発明の一実施例によると、前記の配列番号9のタンパク質が結合された四量体(4mAFと称する、配列番号11)を作製してレジンに固定化した後、市販のレジン(Mabselect Sure、GE Healthcare)とアルカリ耐性を比較した時、市販のレジンに比べてアルカリ耐性が優れていることを確認した。
【００５９】
一方、本発明は、前記免疫グロブリン結合タンパク質又は前記多量体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００６０】
本発明の用語“組換え発現ベクター”とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質又は目的核酸(RNA)を発現することができる発現ベクターであり、ポリヌクレオチド(遺伝子)挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物を意味する。
【００６１】
本発明で用語“作動可能に連結された(operably linked)”とは、一般的な機能を遂行するように、核酸発現調節配列と、目的とするタンパク質又はRNAをコードする核酸配列が、機能的に連結(functional linkage)されていることを意味する。つまり、タンパク質又はRNAをコードする核酸配列(例えば、本発明の変異型Aドメインをコードするポリヌクレオチド配列)が、発現調節配列により遺伝子発現が可能になる方法で連結されたことを意味するもので、例えばプロモーターとタンパク質又はRNAをコードする核酸配列が作動可能に連結されて、コードする核酸配列の発現に影響を与えることができる。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位特異的DNA切断及び連結は、当該技術分野で一般的に知られている酵素などを使用する。
【００６２】
本発明の組換え発現ベクターは、前記変異型Aドメインをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明より、ベクター内にクローニングされた前記ポリヌクレオチド配列は、適切な発現調節配列に作動可能に連結することができ、前記作動可能に連結された遺伝子配列と発現調節配列は、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカー及び／又は複製開始点(replication origin)を一緒に含む一つの発現ベクター内に含まれることができる。また、前記発現ベクターは、発現調節配列及び必要によって膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含めて、目的により多様に製造することができる。前記“発現調節配列(expression control sequence)”とは、特定の宿主細胞から作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するDNA配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどを含む。前記ベクターのプロモーターは、構成的又は誘導性でもある。
【００６３】
シグナル配列には、宿主がエスケリキア属菌の場合には、PhoAシグナル配列、OmpAシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌の場合には、α-アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母の場合には、MFαシグナル配列、SUC2シグナル配列などが、宿主が動物細胞の場合にはインスリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用することができるが、これに制限されない。
【００６４】
本発明の発現ベクターは、クローニングの分野で通常的に使用されるベクターであればその種類が特に制限されず、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。具体的には前記プラスミドには、大腸菌由来のプラスミド(pBR322、pBR325、pUC118及びpUC119、pET-22b(+))、バチルスサブチリス由来のプラスミド(pUB110及びpTP5)及び酵母由来プラスミド(YEp13、YEp24及びYCp50)などがあり、前記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスのような動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルスなどが使用されており、これに制限されない。
【００６５】
本発明は、前記発現ベクターによって形質転換された形質転換体を提供する。
【００６６】
前記形質転換は、核酸(本発明の変異型Aドメインをコードするポリヌクレオチド)を、有機体、細胞、組織又は器官に導入する如何なる方法も含まれて、当分野で公知の通り、宿主細胞によって適切な標準技術を選択して遂行できる。このような方法は、電気穿孔法(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、シリコン炭化物ウィスカー(silicon carbide whisckers)、超音波処理(sonication)、アグロバクテリア媒介された形質転換、PEG(polyethylenglycol)による沈殿法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン、熱衝撃法(heat shock)、粒子銃衝撃法(particle gun bombardment)などが含まれるが、これに制限されない。
【００６７】
前記宿主細胞(host cell)は、任意の手段（例：電気衝撃法、カルシウムホスファターゼ侵入法、微小注入法、形質転換法、ウイルス感染等）によって細胞内導入された異種性DNAを含む原核又は真核細胞を意味する。
【００６８】
本発明で前記宿主細胞は、クローニング分野で通常的に使用されている全ての種類の単細胞有機体、例えば各種のバクテリア(例えば、Clostridia属、大腸菌など)などの原核細胞微生物、酵母などの下等真核細胞微生物と、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞に使用することができ、これに制限されない。宿主細胞によってタンパク質の発現量と式などが異なって示されるので、当業者が目的とすることに最も適切な宿主細胞を選択して使用することができる。
【００６９】
本発明で前記宿主細胞は、クロストリジウム属（Clostridia spp. 例えば、Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、又はClostridium saccharobutylicumなど）、エスケリキア属（Escherichia spp.）、アセトバクター属（Acetobacter spp.、例えばAcetobacter turbidans、Acetobacter pasteurianus等）、アエロモナス属（Aeromonas spp.）、アルカリジェネス属（Alcaligenes spp.）、アファノクラジウム属（Aphanocladium spp.）、バチルス属（Bacillus spp.）、セファロスポリウム属（Cephalosporium spp.）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium spp.）、クルイベラ属（Kluyvera spp.）、ミコプラナ属（Mycoplana spp.）、プロタミノバクター属（Protaminobacter spp.）、シュードモナス属（Pseudomonas spp.）及びキサントモナス属（Xanthomonas spp.、例えばXanthomonas citri等）からなる群から選ばれたいずれか一つの属（genus）の微生物であることができるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明による変異型Aドメインポリペプチド(タンパク質)は、天然から抽出するか、又は遺伝子工学的方法によって作製することもできる。例えば、通常の方法により、前記変異型Aドメインポリペプチドをコードする核酸を作製する。前記核酸は、適切なプライマーを使用してPCR増幅することにより作製することができる。他の方法では、当業界に公知の標準方法により、例えば、自動DNA合成器(Biosearch又はApplied Biosystems社で販売されている)を使用してDNA配列を合成することもできる。作製された核酸は、これに作動可能に連結されて(operatively linked)、核酸の発現を調節する一つ以上の発現調節配列(expression control sequence)(例:プロモーター、エンハンサーなど)を含むベクターに挿入して、そこから形成された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる。生成された形質転換体を培養してその培養物から回収することにより、取得することができる。培養物とは、培養上澄み液、培養細胞、培養菌体、又は、細胞もしくは菌体の破砕物を意味することもある。培養後、本発明の改良型タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結溶解反復処理などを利用して、菌体又は細胞を破砕することにより、タンパク質を採取する。また、そのタンパク質が菌体の外又は細胞の外に生産された場合には、培養液をそのまま使用するか、又は遠心分離などによって菌体又は細胞を除去する。その後、変異型Aドメインのタンパク質の分離精製は、従来明らかにされたAドメインの性質を利用して多様なクロマトグラフィー法によるタンパク質分離方法をそのまま使用するか又は実験目的に合わせて少し変形して使用可能である。また、ヒスチジンペプチドとニッケルカラム成分との結合力又はセルロース結合部位(cellulose-binding domain、CBD)とセルロースとの結合力などのような、特定の結合力性質を利用した親和性クロマトグラフィー(affinity chromatography)法によって、変異型Aドメインを精製することも可能である。
【００７１】
分離精製した本発明の改良型タンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するために、そのタンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる。
【００７２】
前記で“実質的に純粋なポリペプチド(substantially pure polypeptide)”とは、本発明によるポリペプチドが、宿主細胞から由来した如何なる他のタンパク質も実質的に含まないことを意味する。本発明のポリペプチド合成のための遺伝子工学的方法は、次の文献を参考にすることができる：Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second (1998) and Third (2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
【００７３】
本発明の変異型Aドメインは遊離(free)状態だけでなく、固定化させた状態で使用することが可能である。変異型Aドメインの固定化は、当業界に公知の通常の方法によって製造が可能であるが、担体としては、セルロース、デンプン、デキストラン、アガロース(agarose)等の天然ポリマー；ポリアクリルアミド(polyacrylamide)、ポリアクリレート(polyacrylate)、ポリメタクリレート(polymethacylate)、ユーペルギットC（Eupergit C）などの合成ポリマー；又はシリカ(silica)、ベントナイト(bentonite)、金属のようなミネラルなどが使用可能である。また、これらの担体に、共有結合、イオン結合、疎水性結合、物理的吸着、マイクロカプセル化(microencapsulation)などによって変異型Aドメインを結合させることが可能である。併せて、これらの担体-酵素結合体がグルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、臭化シアン(cyanogen bromide)などの作用によって共有結合を形成することにより、変異型Aドメインを固定化させることも可能である。また、変異型Aドメインを別に精製する必要がなく、変異型Aドメインを含有した微生物細胞をそのまま固定化して使用することも可能である。このような全細胞固定化(whole cell immobilization)時に微生物含有された変異型Aドメインの反応性を高めるために、細胞に孔を開けたり、表面発現させたりするなどの技術を適用することもできる。
【００７４】
本発明はまた、前記免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックスを提供する。
【００７５】
本発明によるマトリックスは、リガンドとして前記のどのような形態の突然変異タンパク質も含むことができ、好ましくは、固体支持体上に存在するリガンドが前記多量体でもある。
【００７６】
本発明によるマトリックスの固体支持体は、全て適切な公知された種類のものでもある。通常的な親和性分離マトリックスは、通常、有機性であり、使用された水性媒質で親水性表面を露出させる、つまり、自分の外部に、そして存在すれば内部表面上にも同様に、ヒドロキシ(-OH)、カルボキシ(-COOH)、カルボキサミド(-CONH2、おそらく、N-置換された形で)、アミノ(-NH2、おそらく、N-置換された形で)、オリゴ又はポリエチレンオキシ基を露出させる重合体を基剤とする。前記重合体は例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖類、有利には例えば、ビスエポキシドエピハロヒドリン、1,2,3-トリハロ置換された低級炭化水素と一緒に架橋結合された多糖類を基剤として、適切な多孔性及び強度を提供することができる。好ましくは、前記固体支持体が多孔質アガロースビーズである。本発明に使用された支持体は、逆(inverse)懸濁ゼラチン化など標準的な方法によって容易に製造することができる(S Hjerten: Biochem Biophys Acta 79(2), 393-398(1964))。これとは別に、基剤マトリックスが市販されている製品、例えばセファロース（商標）FF(Amersham Biosciences, ウプサラ、スウェーデン)である。大規模な分離に特に有利な支持体は、その強度を増加させるように適応しており、マトリックスを高い流速に対して、より適合させる。
【００７７】
一方、本発明の前記固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基剤とすることができる。ジビニル及びモノビニル置換されたベンゼンを基剤としたマトリックスのような疎水性ポリマーの場合には、通常、マトリックス表面が親水性化されて、周囲の水性液体で前記のような親水性基を露出させる。これらのポリマーは、標準的な方法により容易に製造し、例えば文献("Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization", R. Arshady:Chimica eL'Industria 70(9), 70-75(1988))を参照する。これとは別に、市販されている製品、例えばSOURCE(商標)(Amersham Biosciences, ウサプラ、スウェーデン)が使用される。
【００７８】
また、本発明による前記固体支持体は、シリカ、酸化ジルコニウムなどの無機性の支持体を含み、又は固体支持体が表面、チップ、毛細管又はフィルターなどの他の形態でもある。
【００７９】
本発明によるマトリックスの外観と関連して、マトリックスは多孔質モノリス(monolith)の形態でもある。又はマトリックスが多孔性又は非多孔性でもあるビーズ型又は粒子型である。ビーズ又は粒子型マトリックスが充填されたベッドとして又は懸濁された形態で使用することができる。懸濁された形態は、拡張されたベッド及び純粋な懸濁液として公知のもの等を含み、その中で粒子又はビーズは自在に動く。モノリス、充填されたベッド及び拡張されたベッドの場合、分離過程は、濃度勾配を通じた通常的なクロマトグラフィー以後にすることが普通である。
【００８０】
リガンドは、例えばリガンドに存在するアミノ基及び(又は)カルボキシル基を使用する通常的なカップリング技術を通じて支持体に付着することがある。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシコハク酸イミドなどは、よく知られているカップリング剤である。支持体とリガンド間に、スペーサーとして知られている分子を導入することができ、これはリガンドの活用度を向上させて、リガンドの支持体への化学的カップリングを容易にすることができる。これとは別の方法で、リガンドは物理的吸着又は生物特異的吸着などの非共有結合によって支持体に付着することができる。
【００８１】
本発明は、本発明による突然変異タンパク質、多量体又はマトリックスが使用されるIgG、IgA、及び(又は)IgMなどの免疫グロブリンを単離する方法を提供する。好ましくはマトリックスを使用して、免疫グロブリンを単離する方法でもある。
【００８２】
より具体的に、本発明の免疫グロブリン単離方法は、
a)免疫グロブリンを含む溶液を試料として提供する段階;
b)前記試料を前記の突然変異タンパク質又は多量体又はマトリックスと吸着させる段階;
c)前記クロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、未結合の汚染物質を除去する段階;及び
d)前記マトリックスから標的分子を回収する段階を含むことができる。
【００８３】
各段階に対して詳細に説明する。
【００８４】
前記a）段階は、免疫グロブリンを含む溶液を試料として提供することを特徴とする。
【００８５】
本発明で“免疫グロブリン(immunoglobulin)”とは、血清成分中、免疫に重要な役割を果たし、抗体の作用をするタンパク質の総称を意味する。基本構造は、分子量約2万3000のL鎖（軽鎖）一対と5万〜7万のH鎖（重鎖）一対がＳ−Ｓ架橋により結合されたもので、H鎖の種類によってIgG、IgA、IgM、IgD、IgEに分類される
【００８６】
前記b）段階は、a）段階の試料を前記の変異タンパク質又は多量体又はマトリックスと吸着させることを特徴とする。
好ましくは、試料に含まれている免疫グロブリンが、マトリックス上に存在するリガンドに吸着できる条件(例えば、pH、塩濃度等)を設定した後、試料の流れを十分に緩くしてマトリックスを通過させて、免疫グロブリンがマトリックスに十分に吸着されるようにする。
【００８７】
本発明で先に説明した通り、突然変異タンパク質は、配列番号2に定義されたアミノ酸配列を含むか、又はその機能的変異体であり、多量体は突然変異したタンパク質単位を含めて反復単位を二つ以上含むタンパク質であり、マトリックスは、免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが、固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックスであることを意味する。
【００８８】
前記c）段階は、b）段階のクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、未結合の汚染物質を除去することを特徴的とする。
好ましくは、マトリックスの試料に使用された水溶液又はアルカリ製剤などを利用してマトリックスを洗浄して、未結合物質又は汚染物質を除去することを特徴とする。
【００８９】
前記d）段階は、c）段階のマトリックスから標的分子を回収することを特徴とする。
【００９０】
好ましくは、未結合物質又は汚染物質が除去されたマトリックスに、溶出剤又は標的分子と親和性が高い溶液を通過させ、標的分子を単離させることを特徴とする。より好ましくは、免疫グロブリン(immunoglobulin)を単離させることでもある。
【００９１】
従って、本発明は、一つ以上の標的化合物が前記の突然変異タンパク質又は多量体又はマトリックスに吸着されることにより、液体から分離されるクロマトグラフィー法を含む。望む生成物が分離された化合物又は液体でもある。従って、本発明のこのような態様は、広く使用されてよく知られている分離技術の親和性クロマトグラフィーに関する。簡単に説明すると、第1段階で標的化合物、好ましくは、上述したような抗体を含む溶液を、標的化合物が分離マトリックス上に存在するリガンドに吸着できる条件の下で分離マトリックスに通過させる。これらの条件は、例えばpH及び(又は)塩濃度、すなわち溶液中のイオンの強度により調節される。マトリックスの容量を超えないように注意すべきであるが、満足な吸着が可能なように十分流れを緩くしなければない。この段階でその溶液の他の成分は、原則として塞がれず通過するであろう。必須的なことではないが、保有された物質及び(又は)緩く結合された物質を除去するために、その後マトリックスは、水溶液を使用することなどによって洗浄する。本マトリックスは、上述した通り、アルカリ製剤を使用する洗浄段階を通じて最も有利に使用される。次の段階で溶出剤と称する第2溶液を標的化合物の脱着、すなわち放出を可能にする条件の下でマトリックス上に通過させる。これらの条件は、pH、塩濃度、すなわちイオンの強度、疎水性などの変化により通常提供される。勾配溶出及び段階式溶出など多様な溶出方法が知られている。溶出は、マトリックス上で望む抗体を代替する競争物質を含む第2溶液によっても可能である。親和性クロマトグラフィーの原理の一般的概観は例えば文献（Wilchek、M.、and Chaiken、I.2000、An overview of affinity chromatography、MethodsMol．Biol．147：1-6)を参照する。
【００９２】
本発明は、
a)標的化合物を含む溶液を試料として提供する段階;
b)前記試料を、前記の突然変異タンパク質又は多量体又はマトリックスを通過させて、標的化合物をマトリックス上のリガンドに吸着させる段階;
c)前記クロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、緩く結合される物質及び未結合物質を除去する段階;及び
d)溶出剤を前記マトリックス上に通過させて標的化合物を溶出させる段階、を含む一つ以上の標的化合物が分離される方法、すなわち、クロマトグラフィー法を提供する。
【００９３】
各段階に対して詳細に説明する。
【００９４】
前記a）段階は、標的化合物を含む溶液を試料として提供することを特徴とする。
本発明の“標的化合物”とは、アルカリ耐性が向上した変異型免疫グロブリン結合タンパク質によって精製されるタンパク質を意味し、好ましくは免疫グロブリンでもある。
【００９５】
前記b）段階は、a）段階の試料を前記の突然変異タンパク質又は多量体又はマトリックスを通過させて、標的化合物をマトリックス上のリガンドに吸着させることを特徴とする。
【００９６】
前記にて説明した通り、好ましくは、試料に含まれている標的化合物がマトリックス上に存在するリガンドに吸着できる条件(例えば、pH、塩濃度等)を設定した後、試料の流れを十分に緩くしてマトリックスを通過させて、免疫グロブリンがマトリックスに十分に吸着するようにする。
【００９７】
前記c）段階は、b）段階のクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して緩く結合された物質及び未結合物質を除去することを特徴とする。
【００９８】
好ましくは、マトリックスに試料として使用された水溶液又はアルカリ製剤などを利用してマトリックスを洗浄して、緩く結合した物質、未結合物質又は汚染物質を除去することを特徴とする。
【００９９】
前記d）段階は、溶出剤をc）段階のマトリックスの上に通過させて標的化合物を溶出させることを特徴とする。
【０１００】
好ましくは、未結合物質又は汚染物質が除去されたマトリックスに溶出剤又は標的化合物と親和性が高い溶液を通過させて、標的化合物を分離させることを特徴的する。より好ましくは、免疫グロブリンタンパク質を分離させることでもある。
【０１０１】
本発明は、前記の免疫グロブリン単離法で単離された免疫グロブリンタンパク質を提供する。
【０１０２】
また、本発明は前記のクロマトグラフィー法で分離された標的化合物を提供する。
【０１０３】
前記免疫グロブリン結合タンパク質は、前記説明と同一である。
【０１０４】
［有利な効果］
本発明は、耐アルカリ性が向上され、多数のアルカリ洗浄に対する安定性が向上した抗体精製用免疫グロブリン結合タンパク質リガンド及びマトリックスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図1は、アルカリ耐性向上のための改良実験を通じて選別された残基の情報である。
【図２】図2は、改良を通じて選別された変異型Aドメインのアルカリ耐性の向上を示すグラフである。
【図３】図3は、アルカリ耐性に寄与する残基を全て反映した変異型Aドメイン(mAF)と野生型Aドメイン(wAD)のアルカリ耐性を比較したグラフである。
【図４】図4は、アルカリ耐性に寄与する残基を全て反映した変異型Aドメイン四量体(4mAF)をレジンで製作した後、市販のレジン(Mabselect sure)とアルカリ耐性を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０１０７】
ただし、下記実施例は、本発明を例示するのみで、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【０１０８】
＜実施例１＞
改良のための組換え免疫グロブリンGのFcタンパク質製造
【０１０９】
＜１ー１＞免疫グロブリンGのFcドメイン遺伝子の合成
ヒトのIgG1からのFcポリペプチドをコードする配列は、NCBIサイトのBlastを通じて探して(GenBank accession no. Y14735)、コスモジンテック社（大田、韓国）に依頼して合成した。
【０１１０】
＜１−２＞pET-Fcプラスミドの製造
pET-Fcプラスミドは、前記実施例＜２−１＞で収得したFc遺伝子を、pET29a(+)ベクター(Stratagene社、米国)のNdeIとXhoI制限酵素認識部位に挿入して製造した。詳しくは下記の通りである。
【０１１１】
前記実施例＜１−１＞で合成を通じて得られたFc遺伝子DNA産物を、制限酵素NdeIとXhoIで切断した後、精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen社、ドイツ)で精製して、これを挿入DNAに使用した。また、pET29a(+）ベクターDNAを制限酵素NdeIとXhoIで切断して、CIPで脱リン酸化したDNA断片をベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(Roche社、ドイツ)を利用して、16℃で12〜16時間接合(ligation)させた後、前記接合液を利用して、電気穿孔法(electroporation)で発現用大腸菌BL21(DE3)菌株に形質転換を行った。前記菌株を40μg/mL濃度のカナマイシン抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩、静置培養することにより、形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを分離して、挿入DNAの塩基配列を決定することにより、配列番号12の塩基配列を有するFc遺伝子を含むpET-Fcプラスミドを製造した。前記pET-Fcプラスミドは、配列番号13で表示される野生型Fcタンパク質を発現する。
【０１１２】
＜１−３＞ニッケル親和性レジンを利用したタンパク質の精製
大腸菌BL21(DE3)の形質転換体を種菌培養するために、カナマイシン抗生物質が含有されたLB液体培地5mLが分注された50mLのコニカルチューブに接種した後、37℃、200rpmの条件で16時間振盪培養した。前記培養液を、LB液体培地200mLが分注された500mLの三角フラスコに、種菌培養液の1％(v/v)を接種した後、37℃、200rpmで振盪培養して、OD600=約0.6で、最終濃度が1mMになるようにIPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)を添加して、37℃、200rpm、18時間の追加振盪培養をした。このフラスコ培養液を遠心分離(4℃、1,000rpm、30分)して菌体を回収した後、PBSバッファー(pH7.4)(イントロンバイオテクノロジー、韓国)10mLの溶液に懸濁して、4℃で、超音波破砕機で15分間破砕し、4℃、10,000rpmの条件で30分間遠心分離して、上澄み液だけを取った。ニッケル親和性レジンのNi-NTA Chelating AgaroseCL-6B(Incospharm社、韓国)1mLを充填したカラムに5mLの結合バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、10mM Imidazole pH 7.4)を流して、前記の上澄み液2.5mLと結合バッファー5mLを混合した後、カラムに流した。洗浄バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、20mM Imidazole pH 7.4) 5mLを流した後、溶出バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、300mM Imidazole pH 7.4) 2.5mLを15mLのコニカルチューブに受けた。精製されたタンパク質は、PD10カラムを利用して脱塩を行った。
【０１１３】
＜実施例２＞
スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus)由来のプロテインＡのAドメイン発現ベクター製作
【０１１４】
＜２−１＞Aドメイン遺伝子合成
スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインＡの三番目のドメインのAドメイン遺伝子に、後に続くタンパク質精製を考慮してHQ tagを含めた遺伝子を、コスモジンテック社(大田、韓国)に依頼して合成した。
【０１１５】
＜２−２＞pBC-wAdプラスミドの製造
pBC-wAdプラスミドは、前記実施例＜１−１＞で収得したAドメイン遺伝子を、pBCKS(+）ベクター(Stratagene社、アメリカ)のNdeIとNotI制限酵素認識部位に挿入して製造した。詳しくは下記のように行った。前記実施例＜２−１＞で合成を通じて得たwAd遺伝子DNA産物を、制限酵素NdeIとNotIで切断した後、精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen社、ドイツ)で精製して、これを挿入DNAに使用した。また、pBCKS（+)ベクターDNAを制限酵素NdeIとNotIで切断し、CIPで脱リン酸化したDNA断片をベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(Roche社、ドイツ)を利用して、16℃で12〜16時間かけて接合(ligation)させた後、前記接合液を利用して、電気穿孔法(electroporation)で大腸菌DH5α菌株に形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩静置培養することにより、形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを分離して、挿入DNAの塩基配列を決定することにより、配列番号1の塩基配列を有する野生型Aドメイン遺伝子を含むpBC-wAdプラスミドを製造した。前記pBC-wAdプラスミドは、配列番号2で表示される野生型Aドメインタンパク質を発現する。
【０１１６】
＜実施例３＞
エラー誘発性重合酵素連鎖反応(error prone PCR)方法を利用したwAd改良
【０１１７】
＜３−１＞エラー誘発性重合酵素連鎖反応によるwAd変異体ライブラリの製作
合成したwAd遺伝子の塩基配列に人為的に無作為で突然変異を誘発するために、エラー誘発性重合酵素連鎖反応を行うことにより、突然変異ライブラリを製造した。具体的な突然変異ライブラリの製造過程は次の通りである。エラー誘発性重合酵素連鎖反応は、Diversity Random Mutagenesis kit(クローンテック、アメリカ)を使用して、1000bp当たり1〜2個の突然変異が起こるように誘導し、PCR反応液の組成は、鋳型DNAとして1ngのpBC-wAdプラスミド、各10pmolのEP-Fプライマー(配列番号14)とT7プライマー(配列番号15)、40μM dGTP、Diversity dNTP mix、TITANIUM Taq polymeraseで、最終嵩は100μLに調製して行った。PCRはTakara PCR Thermal Cycler(タカラ、日本)を使用し、反応条件は、反応混合液を94℃で30秒間、前変性させ、変性を94℃で30秒、アニーリングを55℃で30秒、及び重合を68℃で3分間遂行する反応を16回繰り返した後、68℃で1分間、後重合させた。前記条件のエラー誘発性重合酵素連鎖反応を通じて得られたそれぞれの各変異wAd遺伝子のPCR産物を、制限酵素NdeIとNotIで切断し、QIAEX Gel Extraction Kit(キアゲン、ドイツ)を使用して精製した後、挿入DNAとして使用し、pBC-KS（+)プラスミドを制限酵素NdeIとNotIで切断して回収した3.4kbの大きさのDNA断片を、ベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、スウェーデン)を利用して16℃で16時間かけて接合させた後、前記接合液を利用して、電気穿孔法で大腸菌DH5α菌株の形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩、静置培養をすることにより、無作為突然変異ライブラリを製造した。
【０１１８】
＜３−２＞アルカリ耐性が向上した変異体の選抜
前記突然変異が誘発された変異wAd遺伝子が含まれている大腸菌DH5α形質転換体をクロラムフェニコール抗生物質が含有されたLB液体培地に600μLずつ分注した96ディープウェルプレート(バイオニア、韓国)に接種した後、37℃、280rpmの条件で18時間振盪培養した。具体的なタンパク質精製過程は、Promega HisLink（商標） 96 Protein Purification System(Promega社、アメリカ)を使用して行った。600μLの培養液に60μLのFastBreak（商標） Cell Lysis Reagent, 10X及びDNase I solutionを入れて45μLのHisLink（商標） Resinを各ウェルに装着させた後、100rpmの条件で30分かけて混合した。反応液と樹脂は、Filtrationプレートに移し、Vac-Man Vacuum Manifold(Promega社、アメリカ)を利用して、10秒間真空を加えてフィルタリングした。次に、250μLの洗浄バッファーを96ウェルに添加した後、10秒間真空を加えた。同じ方法で3回洗浄した。プレートに溶出バッファー(100mM HEPES、50mM Imidazole、pH7.5)を200μL添加して、10分間反応させた後、1分間真空を与えて、新たな96ウェルプレートに精製されたタンパク質を得た。
【０１１９】
精製したwAd変異体を、96ウェルプレートでNHS(N-hydroxysuccinimide)-activated Sepharose 4 Fast flow (GE Healthcare社、スウェーデン)にカップリングした。実施例＜１−３＞で精製したFc150μL(59.5μg/mL)を、前記NHS-activatedセファローズビーズにカップリングされたwAd変異体が含まれているFiltrationプレートに移して、常温で、100rpmで1時間反応させた。結合しなかったFcタンパク質は、真空を与えて除去し、PBSバッファー150μLを分注して真空を加えて洗浄した。この洗浄過程を3回繰り返した。溶出バッファー(0.1M Glycine-HCl、pH3.0)を150μL入れて、常温で30秒の間反応させた後、1分間真空を与えて新たな96ウェルプレートにタンパク質を受けた。溶出バッファーを処理したFiltrationプレートは、PBSバッファー150μLを分注して真空を加えて洗浄した。この洗浄過程を3回繰り返した。前記上澄み液を移した新たな96ウェルプレートは、Synergy HTX multi-mode reader(BioTek、アメリカ)を使用して、OD280でFcタンパク質の量を測定した。wAd変異体のアルカリ耐性を確認するために、Filtrationプレートに含まれいるwAd変異体レジンに0.5NNaOHを150μL添加して、常温で、100rpmで6時間反応させた。その後、PBSバッファーで3回洗浄して、前記と同じ方法で残存するFc結合活性を分析した。
【０１２０】
前記実施例＜３−３＞のmAEP変異体の、0.5N NaOH処理する前と後の吸光度の値を比較して、wAdよりアルカリ耐性が向上したwAd改良タンパク質を選抜した。6個の変異体は、遺伝子の塩基配列の決定を通じてAEP1(N18H)(配列番号3)、AEP4(D36V)(配列番号4)、AEP5(N43Y)(配列番号5)、AEP6(N52S)(配列番号6)、AEP2(N23T)(配列番号7)、AEP3(N28W)(配列番号8)で突然変異したことを確認した。
【０１２１】
＜実施例４＞
部位飽和突然変異(site-saturation mutagenesis)法を利用したwAd改良
【０１２２】
＜４−１＞部位飽和突然変異によるwAd変異体ライブラリの製作
追加的にアルカリ耐性を付与するために、実施例＜３−２＞で選ばれた6個のアミノ酸残基(N18、N23、N28、D36、N43、N52)に対して、部位飽和突然変異ライブラリを製造した。具体的には、18番目のアミノ酸が変異したライブラリを製造するために、pBC KS（+)ベクターに挿入されているAEP1(配列番号3)を鋳型として、18-Fプライマー(配列番号16)と18-Rプライマー(配列番号17)、pFU-x Reactionバッファー、10mM dNTP、pFU-x polymeraseで最終嵩は50μLに調製して行った。反応条件は、反応混合液を95℃で1分間、前変性させ、変性を95℃で50秒、アニーリングを53℃で50秒、及び重合を68℃で3分間行う反応を18回繰り返した後、68℃で10分間、後重合させた。前記条件のPCR産物を獲得して制限酵素DpnIで18時間処理し、精製キット(PCR purification Kit;コスモジンテック、韓国)で精製して、これを直ぐに電気穿孔法(electroporation)で大腸菌DH5α菌株に形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩、静置培養することにより、部位飽和突然変異ライブラリを製造した。
【０１２３】
その後、前述した方法と同じ方法で、pBC KS(+)ベクターに挿入されている、AEP4(配列番号4)、AEP5(配列番号5)、AEP6(配列番号6)、AEP2(配列番号7)、AEP3(配列番号8)を鋳型に、それぞれ36-Fプライマー(配列番号20)と36-Rプライマー(配列番号21)、43-Fプライマー(配列番号22)と43-Rプライマー(配列番号23)、52-Fプライマー(配列番号24)と52-Rプライマー(配列番号25)、23-Fプライマー(配列番号26)と23-Rプライマー(配列番号27)、28-Fプライマー(配列番号28)と28-Rプライマー(配列番号29)を使用してライブリーを製作した。
【０１２４】
＜４−２＞アルカリ耐性が向上した変異体の選抜
＜３−２＞で行われた同じ方法を利用してライブラリを探索した結果、wAd対比アルカリ耐性が向上した変異体に、AES(N23A)、AES(N23E)、AES(N23H)、AES(N23K)、AES(N23L)、AES(N23P)、AES(N23S)、AES(N23Y)、AES(N28G)、AES(N28R)、AES(N28F)、AES(N28I)、AES(N43L)が追加的に選抜された(図2)。
【０１２５】
＜実施例５＞
最終アルカリ耐性が向上したmAd変異体開発
＜５−１＞mAF遺伝子合成
前記実施例4で選抜された置換残基を参考にして、突然変異残基の位置に、最も残存活性が高かった残基をwAdに導入することを試みた。変異体でN18H/N23L/N28W/D36V/N43Y/N52S変異体をデザインして、mAF(配列番号9)と命名して、HQ tagを含む遺伝子をコスモジンテック社(大田、韓国)に依頼して合成した。
【０１２６】
＜５−２＞pBC-mAFプラスミドの製造
前記実施例＜５−１＞で収得したmAF遺伝子を、前記実施例＜１−２＞の方法と同じくpBC KS（+)ベクター(Stratagene社、アメリカ)にクローニングして、pBC-mAFプラスミドを製造した。前記pBC-mAFプラスミドは、配列番号10で表示されるmAFタンパク質を発現する。
【０１２７】
＜５−３＞変異タンパク質mAF多量体のアルカリ耐性比較
前記実施例＜１−４＞と同じ方法でタンパク質精製をして、＜実施例３＞と同じ方法で時間によるアルカリ耐性を比較した(図3)。
【０１２８】
その結果、図3に示した通り、本発明のmAFタンパク質は、0.5N NaOHで24時間処理後に活性を比較したとき、野生型アミノ酸配列を有するwAdタンパク質に比べて、約7倍以上アルカリ耐性が向上したことを確認した。
【０１２９】
＜実施例６＞
mAF四量体のアルカリ耐性調査
【０１３０】
＜６−１＞pET-4mAFプラスミドの製造
実施例＜５−３＞の正確なアルカリ耐性の結果を確認するために、重合酵素連鎖反応を行うことにより、mAF遺伝子四量体を製造した。詳しくは下記のように行った。
【０１３１】
mAF遺伝子四量体を製造するために、mAFを鋳型にして、mAF2-Fプライマー(配列番号28)とmAF2-Rプライマー(配列番号29)を使用して、遺伝子をランダムに、引き続き四量体を作るPCRを行った。PCR反応液の組成は、それぞれの鋳型DNA、プライマー、pfu-xバッファー、dNTPs mix、pfu-x polymeraseで最終嵩は100μlに調製して行った。PCR反応条件は、反応混合液を96℃で2分間、前変性させ、変性を96℃で30秒、アニーリングを54℃で30秒、及び重合を72℃で1分間行う反応を25回繰り返した後、72℃で5分間、後重合させた。得られたPCR産物は、精製キットQIAEX Gel Extraction Kit(キアゲン、ドイツ)を使用して精製した。前記mAF遺伝子は、T4 DNAリガーゼ(Roche社、ドイツ)を利用して、16℃で12〜16時間接合(ligation)させた後、精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen社、ドイツ)で、0.72kbの大きさの四量体mAF遺伝子産物を回収した。前記回収した四量体mAF遺伝子を鋳型にして、4mAF-Fプライマー(配列番号30)と4mAF-Rプライマー(配列番号31)を使用して前記方法と同じくPCRを行った。得られたPCR産物は、精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit;Qiagen社、ドイツ)で0.72kbの大きさの四量体mAF遺伝子DNA産物を回収し、制限酵素NdeIとXhoIで切断した後、0.72kbの大きさの四量体mAF遺伝子DNAを精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen社、ドイツ)で精製して、これを挿入DNAに使用した。また、pET29a（+)ベクターDNAを制限酵素NdeIとXhoIで切断し、CIPで脱リン酸化したDNA断片をベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(Roche社、ドイツ)を利用して、16℃で12〜16時間接合させた後、前記接合(ligation)液を利用して、電気穿孔法(electroporation)で大腸菌BL21(DE3)菌株の形質転換を行った。前記菌株を、40μg/mLの濃度のカナマイシン抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩、静置培養することにより、形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを分離して、挿入DNAの塩基配列を決定することにより、配列番号11の塩基配列を有する4mAF遺伝子を含むpET-4mAFプラスミドを製造した。前記pET-4mAFプラスミドは、配列番号32に表示される変異タンパク質4mAFを発現する。
【０１３２】
＜６−２＞ニッケル親和性レジンを利用した変異タンパク質mAF四量体の精製
大腸菌BL21(DE3)形質転換体を種菌培養するために、カナマイシン抗生物質が含有されたTB液体培地5mLが分注された50mLのテストチューブに接種した後、37℃、200rpmの条件で16時間振盪培養した。前記培養液を、TB液体培地500mLが分注された2000mLの三角フラスコに、種菌培養液の1％(v/v)を接種した後、37℃、200rpmで振盪培養し、OD600=約0.6で、最終濃度が1mMになるようにIPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)を添加して、37℃、200rpm、18時間振盪培養した。このフラスコ培養液を遠心分離(4℃、10000rpm、30分)して、菌体を回収した後、PBSバッファー(pH7.4)(イントロンバイオテクノロジー、韓国)20mLの溶液に懸濁して、4℃で、超音波破砕機で30分破砕し、4℃、10,000rpmの条件で30分間遠心分離して上澄み液だけをとった。Ni NTA Chelating Agarose CL-6B(インコースパーム社、韓国)5mLを充填させたカラムに、25mLの結合バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、10mM Imidazole pH7.4)を流して、前記の上澄み液20mLと結合バッファー40mLを混合した後、カラムに流した。洗浄バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、20mM Imidazole pH7.4)25mLを流した後、溶出バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、300mM Imidazole pH7.4)40mLを50mLのコニカルチューブに受けた。精製されたタンパク質は、PD10カラムを利用して脱塩を行った。
【０１３３】
＜６−３＞変異タンパク質mAF四量体のアルカリ耐性比較
実施例＜６−２＞で精製した4mAFをNHS(N-hydroxysuccinimide)-activated sepharose 4 Fast flow(GE Healthcare社、スウェーデン)にカップリングした。製作された4mAFレジンを、アルカリ耐性が高いと知られた市販のレジンMabSelect Sure (GE Healthcare Life Scicences社、アメリカ)と、アルカリ耐性を比較した。Disposable columns(ThermoFisher社、アメリカ)にレジン100μlと5mLの0.5N NaOHを入れて密封した後、徐々に揺さぶりながらアルカリ処理を行った。一定時間後には、密封をなくし、NaOHを重力で流して除去した後、PBSバッファー(pH 7.4)(イントロンバイオテクノロジー、韓国)でレジンを5回洗浄した。2mg/mLのウサギ由来の精剤抗体(ヤングインフロンティア、韓国)5mLをレジンと混ぜて再び密封した後、徐々に揺さぶりながら3時間室温で結合反応させた。結合しなかった抗体タンパク質は重力で流して除去し、PBSバッファーで3回洗浄した。溶出バッファー(0.1M GlycineHCl、pH3.0)3mLを流して結合された抗体を分離した。分離された抗体は、中性化バッファー(1M Tris-HCl、pH8.5)300μlが含まれたチューブに全量を受けて、回収されたタンパク質の量を測定した。結合分析が終わった後には、溶出バッファーとPBSバッファーで交互に洗浄し、再び5mLの0.5N NaOHと混合して、追加的にアルカリ処理した。
【０１３４】
その結果、図4に示した通り、本願発明の4mAF樹脂は、産業用に広く使用されているMabSelectSureに比べて、アルカリ耐性が優れたことを確認した。100時間のアルカリ処理時に、4mAFの残存活性は33％で、MabSelect Sureに比べ1.4倍高かった。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明は、耐アルカリ性が向上され、多数のアルカリ洗浄に対する安定性が改善された抗体精剤用免疫グロブリン結合タンパク質リガンド及びマトリックスを提供することができ、産業上の利用可能性が極めて優れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月18日(2019.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の他の目的は、本発明による突然変異タンパク質又は本発明による多量体又は本発明によるマトリックスが使用されている免疫グロブリンの単離方法を提供することである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の他の目的は、本発明による突然変異タンパク質又は本発明による多量体又は本発明によるマトリックスの吸着によって、液体から一つ以上の標的化合物が分離されるクロマトグラフィー法を提供することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の他の目的を達成するために、本発明による突然変異タンパク質又は本発明による多量体又は本発明によるマトリックスが使用される免疫グロブリンの単離方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の他の目的を達成するために、本発明による突然変異タンパク質又は本発明による多量体又は本発明によるマトリックスの吸着によって液体から一つ以上の標的化合物が分離されるクロマトグラフィー方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
＜１−２＞pET-Fcプラスミドの製造
pET-Fcプラスミドは、前記実施例＜１−１＞で収得したFc遺伝子を、pET29a(+)ベクター(Stratagene社、米国)のNdeIとXhoI制限酵素認識部位に挿入して製造した。詳しくは下記の通りである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
＜２−２＞pBC-wAdプラスミドの製造
pBC-wAdプラスミドは、前記実施例＜２−１＞で収得したAドメイン遺伝子を、pBCKS(+）ベクター(Stratagene社、アメリカ)のNdeIとNotI制限酵素認識部位に挿入して製造した。詳しくは下記のように行った。前記実施例＜２−１＞で合成を通じて得たwAd遺伝子DNA産物を、制限酵素NdeIとNotIで切断した後、精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen社、ドイツ)で精製して、これを挿入DNAに使用した。また、pBCKS（+)ベクターDNAを制限酵素NdeIとNotIで切断し、CIPで脱リン酸化したDNA断片をベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(Roche社、ドイツ)を利用して、16℃で12〜16時間かけて接合(ligation)させた後、前記接合液を利用して、電気穿孔法(electroporation)で大腸菌DH5α菌株に形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩静置培養することにより、形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを分離して、挿入DNAの塩基配列を決定することにより、配列番号1の塩基配列を有する野生型Aドメイン遺伝子を含むpBC-wAdプラスミドを製造した。前記pBC-wAdプラスミドは、配列番号2で表示される野生型Aドメインタンパク質を発現する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
前記実施例＜３−２＞のmAEP変異体の、0.5N NaOH処理する前と後の吸光度の値を比較して、wAdよりアルカリ耐性が向上したwAd改良タンパク質を選抜した。6個の変異体は、遺伝子の塩基配列の決定を通じてAEP1(N18H)(配列番号3)、AEP4(D36V)(配列番号4)、AEP5(N43Y)(配列番号5)、AEP6(N52S)(配列番号6)、AEP2(N23T)(配列番号7)、AEP3(N28W)(配列番号8)で突然変異したことを確認した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
＜５−３＞変異タンパク質mAF多量体のアルカリ耐性比較
前記実施例＜１−３＞と同じ方法でタンパク質精製をして、＜実施例３＞と同じ方法で時間によるアルカリ耐性を比較した(図3)。
【国際調査報告】
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