(57)【要約】  本明細書では、セリル−ｔＲＮＡシンターゼ（ＳｅｒＲＳ）のリン酸化を調節することによって血管新生を調整し、腫瘍進行を軽減するための方法および組成物が開示される。また、癌などの疾患を処置するための関連の組成物および方法も開示される。
2019531269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において腫瘍進行を軽減する方法であって、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質がリン酸化欠損突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質であり、それにより前記対象において腫瘍進行が軽減される、方法。
【請求項２】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、または両方により低減されたリン酸化レベルを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルが、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの５０％未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルが、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの１０％未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｓ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３の１以上にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、残基Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質がヒトＳｅｒＲＳタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６の残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方もしくは両方にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換がセリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、およびセリンからフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、前記アミノ酸置換はセリンからアラニンまたはセリンからグリシンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍進行の軽減が、対象において血管新生を軽減することによって達成される、請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
前記血管新生が低酸素誘導性血管新生である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍進行が転移である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記固形腫瘍が肉腫、癌腫、リンパ腫、またはそれらの組合せである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍が血液系悪性腫瘍である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、神経鞘腫、中皮腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組合せである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記リン酸化欠損突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が対象において血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写を抑制する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象における腫瘍進行が処置を受けなかった対象と比較して少なくとも５０％軽減される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
リン酸化欠損型である、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質。
【請求項２８】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項２９】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３０】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項２９に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３１】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３２】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、セリン１０１、セリン２４１、または両方にアミノ酸欠失を含んでなる、請求項２６に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３３】
脊椎動物タンパク質である、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３４】
ヒトタンパク質である、請求項３３に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３５】
配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換がセリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、およびセリンからフェニルアラニンから選択される、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換がセリンからアラニンまたはセリンからグリシンである、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３８】
配列番号２、配列番号３、または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２７に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項３９】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較してＶＥＧＦ転写の抑制を欠くか、またはＶＥＧＦ転写の刺激に効果的である、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質。
【請求項４０】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上のアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである、請求項３９に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４１】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項４０に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４２】
対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ｄ、Ｓ２４１Ｄ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項４１に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４３】
脊椎動物タンパク質である、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４４】
ヒトタンパク質である、請求項４３に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４５】
配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６のアミノ酸残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンであり、前記アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸、セリンからグルタミン酸、トレオニンからアスパラギン酸またはトレオニンからグルタミン酸である、請求項３９に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４６】
配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３９に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４７】
ＶＥＧＦ転写を抑制しない、請求項３９に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４８】
ＶＥＧＦ転写を刺激する、請求項３９に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質。
【請求項４９】
請求項２７〜４８のいずれか一項に記載の突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質と
薬学上許容される賦形剤と
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項５０】
対象において血管新生を促進する方法であって、
突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含み、前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較してＶＥＧＦ転写の抑制を欠くか、またはＶＥＧＦ転写の刺激に効果的であり、
それにより、前記対象において血管新生が促進される、方法。
【請求項５１】
前記組成物が医薬組成物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象が虚血性心疾患、心血管疾患、および神経疾患のうち１以上に罹患している、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制の５０％未満である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質がＶＥＧＦ転写を抑制しない、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳがＶＥＧＦ転写を刺激する、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ｄ、Ｓ２４１Ｄ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が脊椎動物タンパク質である、請求項５０〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質がヒトタンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６の残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンであり、前記アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸、セリンからグルタミン酸、トレオニンからアスパラギン酸またはトレオニンからグルタミン酸である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
対象において血管新生を軽減する方法であって、
セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）リン酸化阻害剤を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、
それにより、前記対象において血管新生が軽減される、方法。
【請求項６４】
前記組成物が医薬組成物である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤が、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、または両方に対する阻害剤である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤がＡＴＭ阻害剤である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤がＡＴＲ阻害剤である、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＲ０１  ＧＭ０８８２７８およびＮＳ０８５０９２の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
配列表に関して
本願は、電子形式で配列表とともに出願されている。配列表は２０１７年８月９日に作成された５６ＫｂのサイズのPCTSEQLISTING.TXTという名称のファイルで提供される。この配列表の電子形式の情報は、その全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００３】
背景技術
本開示は、分子生物学および医学の分野に関する。本明細書に開示されるものとして、セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ(seryl-tRNA synthetase)（ＳｅｒＲＳ）のリン酸化を調節することによって対象において血管新生および腫瘍進行を調節するための組成物および方法、ならびに癌などの疾患を処置するための関連の組成物および方法が含まれる。
【０００４】
ＳｅｒＲＳは、タンパク質生合成の基質を作製するためにそのコグネイトｔＲＮＡへのセリンの供与を担うアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼファミリーのメンバーである。研究によれば、そのアミノアシル化活性に非依存的な血管発生におけるＳｅｒＲＳの役割が示唆された。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、対象において腫瘍進行を軽減する方法が開示され、その方法は、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、リン酸化欠損突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質であり、それにより、前記対象において腫瘍進行が軽減される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、前記組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、前記突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ(ataxia telangiectasia mutated kinase)（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase)（ＡＴＲ）、または両方によるリン酸化のレベルが低減されている。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルは、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの５０％未満である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルは、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの１０％未満である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘは、セリン、チロシン、またはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｓ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、残基Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６の残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、およびセリンからフェニルアラニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニンまたはセリンからグリシンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、腫瘍進行の軽減は、対象において血管新生を軽減することによって達成される。いくつかの実施形態では、血管新生は、低酸素誘導性血管新生である。いくつかの実施形態では、腫瘍進行は、転移である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、肉腫、癌腫、リンパ腫、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、血液系悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、神経鞘腫、中皮腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対象において血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写を抑制する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＡである。いくつかの実施形態では、対象における腫瘍進行は、処置を受けなかった対象と比較して少なくとも５０％軽減される。
【００１０】
本明細書ではまた、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質も開示され、ここで、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、リン酸化欠損型である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘは、セリン、チロシン、またはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳは、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、セリン１０１、セリン２４１、または両方にアミノ酸欠失を含んでなる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトタンパク質である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸欠失を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、およびセリンからフェニルアラニンから選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニンまたはセリンからグリシンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００１５】
本明細書ではまた、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質も開示され、ここで、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較してＶＥＧＦ転写の抑制を欠くか、またはＶＥＧＦ転写の刺激に効果的である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３の１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ｄ、Ｓ２４１Ｄ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトタンパク質である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６のアミノ酸残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンであり、アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸、セリンからグルタミン酸、トレオニンからアスパラギン酸またはトレオニンからグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を抑制しない。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を刺激する。
【００２０】
本明細書ではまた、医薬組成物も開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質の１以上と薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる。
【００２１】
本明細書ではまた、対象において血管新生を促進する方法も開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、突然変異型セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）タンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質が、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較してＶＥＧＦ転写の抑制を欠くか、またはＶＥＧＦ転写の刺激に効果的であり、それにより、対象において血管新生が促進される。いくつかの実施形態では、この組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、対象は、虚血性心疾患、心血管疾患、および神経疾患のうち１以上に罹患している。
【００２２】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制の５０％未満である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を抑制しない。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳは、ＶＥＧＦ転写を刺激する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｘ７９、Ｓ８６、Ｘ１０１、Ｘ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｘ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリン、チロシンまたはトレオニンである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、Ｘ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｘ１０１Ｄ、Ｓ２４１Ｄ、または両方を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトタンパク質である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６の残基Ｘ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、Ｘはセリンまたはトレオニンであり、アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸、セリンからグルタミン酸、トレオニンからアスパラギン酸またはトレオニンからグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる。
【００２６】
本明細書ではまた、対象において血管新生を軽減する方法も開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ）リン酸化阻害剤を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、それにより、対象において血管新生が軽減される。いくつかの実施形態では、この組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、または両方の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＡＴＭ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＡＴＲ阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ〜Ｇは、ＳｅｒＲＳが低酸素により誘導されるＶＥＧＦＡ発現に重要であり、低酸素下でセリン１０１およびセリン２４１残基においてＡＴＭおよびＡＴＲキナーゼによってリン酸化されることを示す。図１Ａでは、ＨＥＫ２９３細胞を、ＳｅｒＲＳ（ｓｈ−ＳｅｒＲＳ）もしくはＧｌｙＲＳ（ｓｈ−ＧｌｙＲＳ）を標的とするｓｈＲＮＡ、または非特異的対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−対照）でトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を低酸素下または酸素正常条件下で１２時間培養した。抗ＳｅｒＲＳ、抗ＧｌｙＲＳおよび抗β−アクチン抗体を用いた細胞溶解液の免疫ブロット（左）。ＶＥＧＦＡ発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し（右）、低酸素下でのＶＥＧＦＡ転写の相対的誘導をプロットした（右、挿入部）（４回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１Ｂは、ヒトＳｅｒＲＳのセリン１０１およびセリン２４１（影付き）に隣接する配列と、他の無脊椎動物および脊椎動物ＳｅｒＲＳ配列の同じ領域とのアラインメントを示す。保存されているＡＴＭ／ＡＴＲ基質モチーフ残基が下線で示される。図１Ｃ、組換えｈｉｓ６タグを有するヒトＳｅｒＲＳまたはＧｌｙＲＳを、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、およびＡＴＭ／ＡＴＲ／ＤＮＡ−ＰＫキナーゼを活性化するためにＤＮＡ損傷刺激を模倣する二本鎖ＤＮＡオリゴで処理したまたは処理しないＨＥＫ２９３細胞核抽出物とともにインキュベートした。次に、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡビーズによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行った。図１Ｄでは、組換えｈｉｓ６タグを有する２つのヒトアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＡＡＲＳ）：ＴｙｒＲＳおよびＧｌｙＲＳ、野生型ＳｅｒＲＳ、またはセリン１０１およびセリン２４１のアラニンによる単一もしくは二重置換（Ｓ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、およびＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ）を有するＳｅｒＲＳ突然変異体を図１Ｃに記載されるように処理し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズによる精製の後に、リン酸化された組換えタンパク質を、示されるような抗体で免疫ブロットを行った。図１Ｅで、ＨＥＫ２９３細胞を低酸素下で３、６、および１２時間培養した。ＳｅｒＲＳタンパク質を免疫沈降（ＩＰ）された後に、リン酸化されたＳｅｒＲＳを特異的な抗ｐ−ＳＱ抗体で免疫ブロットを行った。細胞溶解液を既知のＡＴＭおよびＡＴＲ基質（Ｃｈｋ１およびＰ５３）に対する示された抗体で免疫ブロットを行った。図１Ｆでは、Ｆｌａｇタグを有する野生型および突然変異型ＳｅｒＲＳ構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に、細胞を低酸素ストレスで１２時間処理し、次に、異所発現されたＳｅｒＲＳを、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）および抗Ｐ−ＳＱ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫ブロット（ＩＢ）によって精製した。図１Ｇでは、ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＴＭ（ｓｉ−ＡＴＭ）またはＡＴＲ（ｓｉ−ＡＴＲ）に対してｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、低酸素ストレスで１２時間処理した。リン酸化されたＳｅｒＲＳを図１Ｅに記載されるように免疫ブロットを行った。細胞溶解液は、抗ＡＴＭおよび抗ＡＴＲ抗体で免疫ブロットを行った。
【図２】図２Ａ〜Ｇは、セリン１０１およびセリン２４１におけるＳｅｒＲＳのリン酸化がＶＥＧＦＡ発現および血管発生の抑制におけるその機能を阻害することを示す。図２Ａでは、野生型ＳｅｒＲＳ（ＳｅｒＲＳＷＴ）、セリン１０１および２４１のアラニンまたはアスパラギン酸残基による二重置換を有するその突然変異体（ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１ＡおよびＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ）、またはエンプティーベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＳｅｒＲＳタンパク質の発現レベルを免疫ブロット（下）により評価し、ＶＥＧＦＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した（３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図２Ｂ〜Ｄでは、ゼブラフィッシュのイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での血管発生の調節におけるＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１ＡおよびＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄの役割を、Ｖｅｇｆａの異常な高発現および血管過多（図２Ｃにおいて短い太矢印で示される）をもたらすアンチセンスモルホリノ（ＳｅｒＲＳ−ＭＯ）の注射によって内因性ＳｅｒＲＳがノックアウトされた１細胞期胚にＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ  ｍＲＮＡおよびＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ  ｍＲＮＡを同時注射することによって調べた。受精後(day post fertilization)（ｄｐｆ）３日に、胚を採取し、Ｖｅｇｆａ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２５−２１１；＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１）（Ｂ）。３ｄｐｆにおける体節間血管(intersegmental vessel)（ＩＳＶ）の発生を調べ（Ｃ）、ＳｅｒＲＳＷＴ  ｍＲＮＡまたは突然変異型ＳｅｒＲＳ  ｍＲＮＡ注射によって救済されたＩＳＶの異常分岐の統計量を分析した（Ｄ；χ２検定、＊Ｐ＞０．０５  ＳｅｒＲＳＷＴに対する、＊＊Ｐ＞０．１  ＳｅｒＲＳ−ＭＯに対する、＊＊＊Ｐ＜１×１０−２８  対照−ＭＯに対する）。図２Ｅでは、ＳｅｒＲＳＷＴまたはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄと、ヒトＶＥＧＦＡプロモーター上のＳｅｒＲＳ結合部位に相当する３２Ｐ標識ＤＮＡ断片との結合親和性をＥＭＳＡによって調べた。図２Ｆでは、ＨＥＫ２９３細胞内のＶＥＧＦＡプロモーターへのＳｅｒＲＳＷＴ、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ、またはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄの結合を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびｑＰＣＲ（２回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊＊＊Ｐ＜０．０００１）によって調べた。図２Ｇでは、低酸素経過中のＶＥＧＦＡプロモーターへの内因性ＳｅｒＲＳの結合を、ＣｈＩＰによって監視した（３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５  正常に対する）。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ＡＴＭ／ＡＴＲによるＳｅｒＲＳのリン酸化は、低酸素下でＶＥＧＦＡ誘導を調節する重要な経路であることを示す。図３Ａでは、ＨＥＫ２９３細胞を、さらに１２時間低酸素下でストレスに曝す前に、特異的ＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３（５μＭ）または特異的ＡＴＲ阻害剤ＶＥ−８２１（５μＭ）で前処理した。次に、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（２回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０００１）。図３Ｂでは、ＨＥＫ２９３細胞をＳｅｒＲＳＷＴもしくはＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ構築物またはエンプティー対照ベクターで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、１２時間の低酸素処理によるＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ誘導をｑＲＴ−ＰＣＲによって監視した（４回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。図３Ｃでは、ＨＥＫ２９３細胞を示された構築物で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション３６時間後、１２時間の低酸素処理によるＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡ誘導をｑＲＴ−ＰＣＲによって監視した（４回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。ＳｅｒＲＳ、ＨＩＦ−１α、およびβ−アクチンのタンパク質レベルをウエスタンブロットによって調べた（下）。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、セリン１０１およびセリン２４１におけるリン酸化によるＳｅｒＲＳの不活性化は低酸素下での血管新生に重要であることを示す。図４Ａでは、マウス３Ｂ１１内皮細胞をマウス野生型ＳｅｒＲＳまたは突然変異型ＳｅｒＲＳで安定にトランスフェクトし、ＳｅｒＲＳの発現を、抗ＳｅｒＲＳ抗体を用いた免疫ブロットによって調べ、バンドの濃さを定量した。図４Ｂ〜Ｃでは、マトリゲルプラグ血管新生アッセイを、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいて安定にトランスフェクトされた３Ｂ１１細胞を用いて行った。移植１４日後にマトリゲルプラグ（破線で囲まれた領域）をＣＤ３１に対する免疫組織化学的手法によって分析し（図４Ｂ）、微細血管密度を定量した（図４Ｃ）（ｎ＝１０〜１５）。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、リン酸化欠損ＳｅｒＲＳが腫瘍血管新生および腫瘍成長を強く抑制することを示す。図５Ａでは、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をヒト野生型（ＳｅｒＲＳＷＴ）および突然変異型ＳｅｒＲＳ（ＳｅｒＲＳＡＡ、ＳｅｒＲＳＤＤ）で安定にトランスフェクトした。ＳｅｒＲＳの発現を免疫ブロットによって監視した。図５Ｂ〜Ｃでは、操作したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１０６／マウス）をマウス乳腺の脂肪体に移植して腫瘍異種移植片を形成させた。１４日後に腫瘍異種移植片を切り出し、ＣＤ３１に対する免疫組織化学的手法（図５Ｂ）とその後の血管定量（図５Ｃ）を行った（ｎ＝５〜６）。図５Ｄ〜Ｆでは、ＳｅｒＲＳＷＴ、ＳｅｒＲＳＡＡ、ＨＩＦ１特異的ｓｈＲＮＡ（ＨＩＦＫＤ）、ＳｅｒＲＳＡＡとＨＩＦＫＤの両方またはエンプティーベクターで安定にトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１０６／マウス）をマウス乳腺の脂肪体に移植した。これらの腫瘍異種移植片の大きさを３５日目にマウスを屠殺するまで測定し（図５Ｄ）、腫瘍血管新生をＣＤ３１（図５Ｅ）およびＶＥＧＦＡ（図５Ｆ）に対する免疫組織化学的手法によって測定した（ｎ＝４〜１０）。スケールバーは１００μｍを表す。
【図６】図６は、低酸素誘導性血管新生におけるＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳ経路の例示的概略図を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、図１Ａ〜Ｇに関連して、ＳｅｒＲＳが低酸素およびＵＶ照射下でＡＴＭ／ＡＴＲキナーゼによってリン酸化されることを示す。図７Ａは、ＳｅｒＲＳタンパク質レベルがＨＥＫ２９３において１２時間低酸素ストレス下で変化しなかったことが示される免疫ブロットである。図７Ｂでは、組換え野生型および突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰとＡＴＭ／ＡＴＲ／ＤＮＡ−ＰＫキナーゼを活性化した二本鎖ＤＮＡオリゴとを含有するバッファー中で、ＨＥＫ２９３核抽出物とともにインキュベートした。次に、Ｈｉｓ６タグを有するＳｅｒＲＳタンパク質をＮｉ−ＮＴＡにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行った。図７Ｃでは、ＨＥＫ２９３細胞を特異的なＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３およびＡＴＲ阻害剤ＶＥ−８２１で１時間前処理し、次に、低酸素条件下で１２時間培養した。細胞溶解液を、抗ＳｅｒＲＳ抗体を用いてＩＰに付し、次いで、リン酸化されたＳｅｒＲＳ（Ｐ−ＳｅｒＲＳ）を検出するために抗Ｐ−ＳＱ抗体を用いた免疫ブロット（ＩＢ）を行った。既知のＡＴＭ／ＡＴＲ基質（Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２）のリン酸化に対しても免疫ブロットを行った。図７Ｄでは、ＨＥＫ２９３細胞を５０Ｊ／ｃｍ２のＵＶ光に曝し、細胞溶解液に図７Ｃに記載されるようにＩＰおよびＩＢを行った。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、図２Ａ〜Ｇに関連して、セリン１０１およびセリン２４１におけるＳｅｒＲＳのリン酸化がその核局在およびそのＳＩＲＴ２との相互作用に影響を及ぼさないことを示す。図８Ａでは、ＨＥＫ２９３細胞を低酸素下で１２時間培養し、細胞分画を行った。細胞質画分（Ｃｙ）、核画分（Ｎｕ）、および全細胞溶解液（ＷＣＬ）を、ＳｅｒＲＳ、核タンパク質ラミンＡ／Ｃ、および細胞質タンパク質α−チューブリンに対する抗体を用いた免疫ブロットによって調べた。図８Ｂでは、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｌａｇタグを有するＳｅｒＲＳＷＴ、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ、またはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄでトランスフェクトし、細胞分画ならびに抗Ｆｌａｇ、抗ラミンＡ／Ｃ、および抗α−チューブリン抗体を用いたＩＢを行った。図８Ｃでは、ＨＥＫ２９３細胞を低酸素下で６時間および１２時間培養した。次に、細胞を溶解させ、抗ＳｅｒＲＳ抗体を用いたＩＰおよび抗ＳｅｒＲＳと抗ＳＩＲＴ２抗体の両方を用いたＩＢを行った。図８Ｄでは、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｖ５タグを有するＳＩＲＴ２とＦｌａｇタグを有する野生型または突然変異型ＳｅｒＲＳとで共トランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞溶解液に、抗Ｆｌａｇ抗体を用いたＩＰおよび抗Ｖ５抗体を用いたＩＢを行った。
【図９】図９は、図４Ａ〜Ｆに関連して、マウス３Ｂ１１細胞を用いたマトリゲルプラグ血管新生アッセイから得られた画像を示す。マトリゲルプラグ内の低酸素環境（破線で囲まれた）を、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いた免疫組織化学的手法によって調べた。
【図１０】図１０は、ＳｅｒＲＳ上の潜在的リン酸化部位に対する修飾がどのようにＶＥＧＦＡ発現に影響を及ぼしたかを示す。
【図１１】図１１は、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、およびカエルＳｅｒＲＳタンパク質の配列アラインメントを示す。ヒトＳｅｒＲＳ上の種々のリン酸化部位（例えば、Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｔ２１４、Ｓ２１７、Ｙ２２０、Ｙ２４８、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｙ２６３、Ｔ５０１、およびＳ２４１）ならびにマウス、ゼブラフィッシュおよびカエルＳｅｒＲＳタンパク質におけるそれらの対応するアミノ酸残基を太字で強調して示す。
【図１２】図１２は、クロマチンＩＰ（ＣｈＩＰ）によって監視した低酸素経過中のＨＥＫ２９３細胞内のＶＥＧＦＡプロモーターに対する内因性ＳｅｒＲＳ、ｃ−Ｍｙｃ、およびＨｉｆ１αの結合を示す（３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ；＊＊Ｐ＜０．００５  ０時間に対する）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
以下の詳細な説明では、添付の図面が参照され、それらはその一部をなす。これらの図面では、文脈がそうではないことを示さない限り、同じ記号は一般に同じ成分を示す。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的実施形態は、限定を意味しない。本明細書で提供される対象の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が使用されてもよく、他の変更が行われてもよい。本明細書に全般的に記載され、図面で示されるような本開示の態様は、多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離および設計することができ、それらは総て本明細書で明示的に企図されることが容易に理解されるであろう。
【００２９】
一般技術
本明細書に記載される技術の実施には、特に断りのない限り、当業者の技術の範囲内にある有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、シークエンシング技術、ならびにマイクロ加工およびナノ加工の従来の技術および記載を用い得る。このような従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドのライゲーション、および標識を用いたハイブリダイゼーション検出が含まれる。好適な技術の具体的な説明は、本明細書の実施例を参照して行うことができる。しかしながら、当然のことながら他の等価な従来法も使用可能である。このような従来の技術および記載は、Green, et al.編, Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, Gabriel, Stephens編, Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler編, PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006);およびSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (総てCold Spring Harbor Laboratory Pressから); Stryer, Biochemistry (第4版) (1995) W.H. Freeman, New York N.Y.; Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (2002) IRL Press, London; Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry (2000) 第3版, W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.; Berg, et al., Biochemistry (2002) 第5版, W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.,  Jaeger, Introduction to Microelectronic  Fabrication (2002) 第2版, Prentice Hall, and Madou, Fundamentals of Microfabrication (2002)などの標準的な実験マニュアルに見出すことができ、これらはそれらの全内容が総てあらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３０】
いくつかの定義
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)参照。本明細書に記載される刊行物は総て、本明細書に記載される方法および開示に関して使用され得る装置、処方物および方法論を記載および開示する目的で、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３１】
本開示の目的で、下記の用語を以下に定義する。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００またはそれを超えるアミノ酸のポリマーを指して互換的に使用される。ポリマーは直鎖または分岐型であってよく、それは例えば修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸が挿入されてもよい。これらの用語はまた、自然にまたは介入によって；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義には、例えば、アミノ酸の１以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸を含む）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドが含まれる。
【００３３】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書では、任意の長さ、例えば、少なくとも８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００またはそれを超えるヌクレオチドの、ポリマー形態のヌクレオチドを指して互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含み得る。この用語は、分子の一次構造のみを指す。よって、この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。この用語はまた、例えば、アルキル化、および／またはキャッピングにより修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドも含む。より詳しくは、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」には、スプライシング型であれ非スプライシング型であれｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、およびｍＲＮＡを含む、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グルコシドである他のいずれかのタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ,  Ｉｎｃ．、コーヴァリス、ＯＲ．からＮｅｕｇｅｎｅとして市販）ポリマー、およびポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構造にある核酸塩基を含む場合の他の合成配列特異的核酸ポリマーが含まれる。よって、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミダート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの間のまたはＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡの間のハイブリッドを含み、また、既知のタイプの修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、ヌクレオチドの１以上の類似体による置換、非電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバメートなど）によるもの、負電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるもの、および正電荷結合（例えば、アミノアルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル）によるもの、例えば、タンパク質（酵素（例えば、ヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分によるもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン／プソラレンなど）によるもの、キレート（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）によるものなどのヌクレオチド間、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。
【００３４】
本明細書で使用する場合、２つのタンパク質配列または２つのヌクレオチド配列に関して「配列同一性」または「同一性」または「相同性」は、指定された比較ウインドウで最大一致を得るためにアラインした場合に２つの配列で同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを指すことを含む。比較ウインドウ内のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の部分は、それらの２配列の最適アラインメントのために参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでなり得る。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認識され、この場合、アミノ酸は類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されているので、その分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセンテージは、それらの置換の保存的性質に関して適正な方向へ補正することができる。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。これらの補正を行うための手段は当業者に周知である。このパーセンテージは、両配列で同一のアミノ酸残基または核酸塩基が見られる位置の数を求めてマッチした位置の数を出し、その比較ウインドウの位置の総数で割り、その商に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことによって計算される。一般に、これには、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコア化し、それによって配列同一性パーセンテージを引き上げることが含まれる。よって、例えば、同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にスコア０が与えられる場合、保存的置換には０〜１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、Meyers and Miller (Computer Applic. Biol. Sci., 1998, 4, 11-17)のアルゴリズムに従って計算される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「相同体」は、天然型の基本的ヌクレオチドまたはタンパク質構造を維持しつつ、天然の核酸（すなわち、「原型」または「野生型」核酸）とは異なる核酸もしくはタンパク質、または天然の核酸またはアミノ酸に対する微修飾によるタンパク質を指して使用される。このような変化には、限定されるものではないが、欠失（例えば、核酸の末端切断型）、挿入および／または置換を含む１または数個のヌクレオチドの変化が含まれる。相同体は、天然の核酸と比較して、増強された、低減された、または実質的に類似の特性を有し得る。相同体は、天然の核酸と相補的であってもマッチしていてもよい。相同体は、限定されるものではないが、組換えＤＮＡ技術、化学合成、またはそれらの任意の組合せを含む核酸の生産のための当技術分野で公知の技術を用いて生産することができる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「相補的またはマッチした」とは、２つの核酸配列が少なくとも５０％の配列同一性を有することを意味する。例えば、２つの核酸配列は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することができる。「相補的またはマッチした」とはまた、２つの核酸配列が低、中等度および／または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「実質的に相補的または実質的にマッチした」とは、２つの核酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。例えば、２つの核酸配列は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することができる。あるいは、「実質的に相補的または実質的にマッチした」とは、２つの核酸配列が高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、脊椎動物（例えば、ゼブラフィッシュ）、好ましくは、哺乳動物などの動物である。用語「哺乳動物」は、哺乳綱に属する個体と定義され、限定されるものではないが、ヒト、飼育動物および農用動物、ならびに動物園動物、競技用動物、またはペット動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコまたはウシが含まれる。いくつかの実施形態では、対象はマウスまたはラットである。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「処置」は、患者、特に、１以上の血管新生関連疾患、および／もしくは癌に罹患している患者が呈する疾患、障害、または生理学的状態に応じてなされる介入を指す。処置の目的としては、限定されるものではないが、症状の緩和または予防、疾患、障害、または病態の進行または増悪の緩徐化または停止、および疾患、障害または病態の寛解のうち１以上を含み得る。いくつかの実施形態では、「処置」は、治療的処置および／または予防的手段を指す。処置を必要とする対象としては、疾患または障害または望ましくない生理学的状態によってすでに影響を受けている対象ならびに疾患または障害または望ましくない生理学的状態が予防されるべき対象が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「予防」は、その後に病的症状を発現する個体の負担を軽減するいずれの活性も指す。これは一次、二次および／または三次予防レベルで起こり得るものであり、ａ）一次予防は、症状／障害／病態の発生を回避し；ｂ）二次予防の活性は、病態／障害／症状処置の初期段階に照準を合わせ、それによって、病態／障害／症状の進行および症状の出現を予防するための介入の機会を増やし；およびｃ）三次予防は、例えば、機能を回復させること、および／または任意の病態／障害／症状または関連の合併症を軽減することによってすでに確立された病態／障害／症状の悪影響を軽減する。
【００４０】
「薬学上許容される」担体は、使用される用量および濃度でそれに曝される細胞または哺乳動物に無毒なものである。「薬学上許容される」担体は、限定されるものではないが、経口適用または注射などの選択された適用様式に好適であり、かつ、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固体、および例えば、溶液、エマルション、懸濁液などの液体といった従来の医薬製剤の形態で投与される、有機または無機、固体または液体賦形剤であり得る。多くの場合、生理学的に許容される担体は、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーなどのｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体はまた、以下のものの１以上を含んでなってもよい：アスコルビン酸を含む酸化防止剤、低分子量（約１０  残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、ならびにツィーン（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニック（商標）などの非イオン性界面活性剤。補助剤、安定剤、乳化剤、滑沢剤、結合剤、ｐＨ調整剤、等張剤および他の従来の添加剤もこれらの担体に添加可能である。
【００４１】
薬学上許容可能されるまたは適当な担体は、損傷を受けた消化管に有益であることが知られている他の化合物（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、セレンもしくは亜鉛などの酸化防止剤）；または食品組成物を含んでよい。食品組成物は、限定されるものではないが、牛乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、牛乳に基づく発酵製品、アイスクリーム、発酵穀物に基づく製品、牛乳に基づく粉末、乳児用調製粉乳、錠剤、液体細菌懸濁液、乾燥経口サプリメント、または湿潤経口サプリメントであり得る。
【００４２】
治療薬または保護剤は、「薬物」を含んでなり得る。本明細書で使用する場合、「薬物」は、治療薬または診断薬を指し、疾患の予防、診断、緩和、治療、または治癒に使用される、食品以外のいずれの物質も含む。ステッドマン医学大辞典第２５版（１９９０）。薬物には、メルク・インデックス第１２版（１９９６）；Pei-Show Juo, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, (1996）；U.S. Pharmacopeia Dictionary, 2000版；およびPhysician’s Desk Reference, 2001版のうち少なくとも１つに開示されているいずれの物質も含み得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、本明細書に記載の組成物の一実施形態である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、治療システムに使用される薬物は、多くの場合、送達マトリックス上に置かれるか、その中に包埋、封入またはそうでなければ組み込まれる。送達マトリックスは、第１の骨格構造もしくは第２の緩衝構造のいずれか、または両方の中または上に含まれてよい。次に、送達マトリックスは、生分解性または非生分解性材料のいずれかを含んでなる。送達マトリックスは、限定されるものではないが、ポリマーに含まれてよい。生分解性ポリマーの例としては、タンパク質、ヒドロゲル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｌ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコリド、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、ポリ（アミノ酸）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリグルコネート、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシドコポリマー、修飾セルロース、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチレート、ポリ無水物、ポリホスホエステル、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、およびそれらの組合せが含まれる。非生分解性ポリマーは、シリコーン、アクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリウレタン、ヒドロゲル、ポリエステル（例えば、Ｅ．  Ｉ．  Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ウィルミントン、Ｄｅｌ．からのＤＡＣＲＯＮ（登録商標））、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ナイロン、押出コラーゲン、ポリマーフォーム、シリコーンゴム、ポリエチレンテレフタレート、超高分子量ポリエチレン、ポリカーボネートウレタン、ポリウレタン、ポリイミド、ステンレス鋼、ニッケル−チタン合金（例えば、ニチノール）、チタン、ステンレス鋼、コバルト−クロム合金（例えば、Ｅｌｇｉｎ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｔａｌｓ、エルギン、Ｉｌｌ．からのＥＬＧＩＬＯＹ（登録商標）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｍｅｔａｌｓ  Ｃｏｒｐ．、ワイオミッシング、Ｐａ．からのＣＯＮＩＣＨＲＯＭＥ（登録商標））を含んでなってよい。一実施形態では、ヒドロゲルは、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧとしても知られるポリ（アルキレンオキシド）、例えば、ポリ（エチレンオキシド）を含んでなってよい。
【００４４】
用語「を含んでなる(comprising)」は、本明細書で使用する場合、「を含む(including)」、「を含有する(containing)」、または「を特徴とする」と同義であり、包含または非限定的(open-ended)であり、列挙されていない付加的な要素または方法工程を排除しない。
【００４５】
腫瘍は、新生物としても知られ、一般に、例えば、固形または非固形であり得る異常な組織塊を指す。腫瘍は、例えば、良性（すなわち、非癌性）、前悪性（すなわち、前癌性）、または悪性（すなわち、癌性）であり得る。用語「固形腫瘍」は、本明細書で使用する場合、通常嚢腫または液体領域を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性、前悪性、または悪性であり得る。種々のタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプに関して呼称される場合がある。固形腫瘍は、様々な場所、例えば、骨、筋肉、および器官に生じ得る。固形腫瘍の例としては、限定されるものではないが、肉腫、癌腫、リンパ腫、およびそれらの組合せが含まれる。肉腫は一般に、血管、骨、脂肪組織、靱帯、リンパ管、筋肉または腱の腫瘍として知られ、例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、および  横紋筋肉腫がある。癌腫は一般に、上皮細胞、例えば、皮膚、腺および器官（限定されるものではないが、膀胱、尿管、および腎臓を含む）の内面に見られる上皮細胞に形成する腫瘍として知られる。癌腫の限定されない例としては、副腎皮質癌が含まれる。非固形腫瘍は、分散腫瘍、例えば、血液の腫瘍（白血病として知られる）と呼ばれることがある。非固形腫瘍の限定されない例としては、血液系悪性腫瘍、白血病、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）が含まれる。腫瘍の例としては、限定されるものではないが、子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、神経鞘腫、中皮腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組合せが含まれる。
【００４６】
本開示を通して、種々の態様が範囲の形式で示される。範囲の形式での記載は単に便利で簡潔であるために過ぎないと理解されるべきであり、開示の範囲の柔軟性のない限定と解釈されるべきでない。よって、ある範囲の記載は、そのあり得る部分範囲の総てならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したものと見なされるべきである。このことはその範囲の幅に関わらずに当てはまる。
【００４７】
本開示のその他の目的、利点および特徴は、添付の図面ととともに以下の明細書を理解することから明らかとなる。
【００４８】
以下の記載において、多くの具体的詳細が、本開示のより詳細な理解を提供するために示される。しかしながら、本開示の方法はこれらの具体的詳細のうちの１以上を用いずに実施され得ることは当業者に明らかである。他の例では、当業者に周知の特徴および周知の手順は、開示を不明確にすることを避けるために記載しなかった。
【００４９】
ＳｅｒＲＳタンパク質およびポリヌクレオチド
セリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＳｅｒＲＳ；セリン−ｔＲＮＡリガーゼとしても知られる）は、クラスＩＩアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ａａＲＳ）ファミリーに属する酵素である。ａａＲＳは、そのｔＲＮＡに適当なアミノ酸を付与する酵素である。ａａＲＳは、特定のコグネイトアミノ酸またはその前駆体を、その総ての適合するコグネイトｔＲＮＡの１つへとエステル化してアミノアシル−ｔＲＮＡを形成することを触媒することによってこれを行う。ＳｅｒＲＳは、タンパク質合成のためにセリンをそのコグネイトｔＲＮＡに供与するアミノアシル化反応を触媒する。この進化的に保存された必須の反応は次の二段階で起こる：（１）セリンがＡＴＰにより活性化されて、酵素結合型の反応中間体としてのセリン−アデニレート（Ｓｅｒ−ＡＭＰ）を形成する；（２）Ｓｅｒ−ＡＭＰ上のセリル部分がコグネイトｔＲＮＡの３’に移され、リボソームに送達される最終生成物Ｓｅｒ−ｔＲＮＡＳｅｒを生成する。本明細書に記載されるように、ＳｅｒＲＳが癌発生の特徴的所見である血管新生の転写抑制因子として同定されたことは驚くべきことである。
【００５０】
脊椎動物ＳｅｒＲＳ酵素は、ＳＡＲＳ遺伝子によってコードされ、この遺伝子は細菌および酵母対応物と進化的に関連している。脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質の限定されない例としては、ヒトＳｅｒＲＳ、マウスＳｅｒＲＳ、ゼブラフィッシュＳｅｒＲＳ、およびカエルＳｅｒＲＳが含まれる。ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、およびカエルＳＡＲＳ遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）は、それぞれ配列番号３９、４１、４３、および４５に示される。本明細書にはまた、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＳｅｒＲＳヌクレオチド配列を含んでなる、またはからなるヌクレオチド配列も開示される。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳヌクレオチド配列は、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５であるか、またはそれと約１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳヌクレオチド配列は、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａタンパク質をコードする配列番号４０のヌクレオチド配列を含んでなる、またはからなる。
【００５１】
野生型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質のアミノ酸配列は以下に示される（配列番号１）。野生型マウス、ゼブラフィッシュおよびカエルＳｅｒＲＳタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４２、４４、および４６に示される。本発明ではまた、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＳｅｒＲＳタンパク質配列を含んでなる、またはからなるタンパク質も開示される。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳタンパク質配列は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６であるか、またはそれと約１００％同一である。
【００５２】
【化１】
2019531269.tif 000003
【００５３】
リン酸化能が改変されたＳｅｒＲＳタンパク質およびそれらのポリヌクレオチド
ＳｅｒＲＳタンパク質には様々なリン酸化部位が見出されている。例えば、野生型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質（配列番号１）の限定されないリン酸化部位としては、Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、および  Ｙ２６３が含まれる。これらのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびチロシン（Ｙ）リン酸化部位は、脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質では保存性が高いことが見出されているが、非ヒトＳｅｒＲＳタンパク質では変動があり得る。例えば、図１１に例示されるように、いくつかの脊椎動物では、ＳｅｒＲＳタンパク質において、これらのリン酸化部位のセリンの１以上が、トレオニン、チロシン、アラニン、またはバリンである場合があり；ＳｅｒＲＳタンパク質において、これらのリン酸化部位のトレオニンの１以上が、セリン、チロシン、アラニン、またはバリンである場合があり；また、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質におけるこれらのリン酸化部位のチロシンの１以上が、ＳｅｒＲＳタンパク質においてトレオニン、セリン、アラニン、またはバリンである場合がある。例えば、カエルおよびゼブラフィッシュＳｅｒＲＳタンパク質では、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質でＳ１０１に対応する残基は、カエルＳｅｒＲＳタンパク質ではＴであり、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質でＳ１４２に対応する残基はＴである（図１１参照）。本開示において、ＳｅｒＲＳタンパク質のアミノ酸の位置は、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質での対応するアミノ酸の位置として参照される。例えば、１以上の対象ＳｅｒＲＳタンパク質と野生型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質の配列アラインメント（例えば、図１１に示されているもの）が、対象ＳｅｒＲＳタンパク質における１以上のアミノ酸の位置を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＳｅｒＲＳタンパク質は、例えば、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、または両方によってリン酸化され得る。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の程度は、ＳｅｒＲＳタンパク質上のリン酸化部位の１以上においてまたはその付近にアミノ酸置換、欠失、付加、またはそれらの組合せを作出することによって調整（modulate）（例えば、低減または増強）することができると考えられる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質）は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）上のリン酸化部位の１以上においてまたはその付近にアミノ酸置換、欠失、付加、またはそれらの組合せを作出することによって作製することができる。
【００５４】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較してリン酸化欠損型である変異体ＳｅｒＲＳｓタンパク質（例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質）を提供する。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルが、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）のそれまたはヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％  ５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であれば、リン酸化欠損型であると見なされる。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルは、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、６５％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルは、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、６５％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、リン酸化を受けることができない。また、本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の平均レベルが、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）のそれまたはヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であれば、リン酸化欠損型であると見なされる。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の平均レベルは、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、６５％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の平均レベルは、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、６５％、６０％、５０％、４５％、���０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。
【００５５】
いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２（またはＴ２６２）、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。アミノ酸置換は、例えば、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニン、トレオニンからアラニン、トレオニンからグリシン、トレオニンからリシン、トレオニンからアルギニン、トレオニンからアスパラギン、トレオニンからグルタミン、トレオニンからヒスチジン、トレオニンからシステイン、トレオニンからバリン、トレオニンからロイシン、トレオニンからイソロイシン、トレオニンからプロリン、トレオニンからメチオニン、トレオニンからトリプトファン、トレオニンからフェニルアラニン、チロシンからアラニン、チロシンからグリシン、チロシンからリシン、チロシンからアルギニン、チロシンからアスパラギン、チロシンからグルタミン、チロシンからヒスチジン、チロシンからシステイン、チロシンからバリン、チロシンからロイシン、チロシンからイソロイシン、チロシンからプロリン、チロシンからメチオニン、チロシンからトリプトファン、およびチロシンからフェニルアラニンであり得る。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸置換を含んでなることができる。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、配列が７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であり得るか、またはそれに近い。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）、およびヒト変異体ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、セリン１０１（Ｓ１０１）、セリン２４１（Ｓ２４１）、または両方にアミノ酸置換を含んでなる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質））と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸欠失を含んでなることができる。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、配列が約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であり得る。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（配列番号１））と比較して、セリン１０１（Ｓ１０１）、トレオニン１０１（Ｔ１０１）またはセリン２４１（Ｓ２４１）、または両方にアミノ酸欠失を含んでなる。
【００５７】
本明細書に開示されるように、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質、例えば、哺乳動物タンパク質（限定されるものではないが、ヒトタンパク質を含む）であり得る。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質、例えば、ヒトタンパク質である。
【００５８】
限定されない例として、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）は、その被リン酸化能を低減するように修飾することができる。例えば、配列番号１の残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上に対して置換、欠失、または両方を行って、リン酸化の最大レベルまたは平均レベルが親ヒトＳｅｒＲＳタンパク質（限定されるものではないが、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質を含む）と比較して低減された突然変異型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質を作出することができる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、配列番号１の残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。いくつかの実施形態では、アミノ酸欠失は、Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方におけるものである。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、配列番号１の残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方におけるものである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニン、トレオニンからアラニン、トレオニンからグリシン、トレオニンからリシン、トレオニンからアルギニン、トレオニンからアスパラギン、トレオニンからグルタミン、トレオニンからヒスチジン、トレオニンからシステイン、トレオニンからバリン、トレオニンからロイシン、トレオニンからイソロイシン、トレオニンからプロリン、トレオニンからメチオニン、トレオニンからトリプトファン、トレオニンからフェニルアラニン、チロシンからアラニン、チロシンからグリシン、チロシンからリシン、チロシンからアルギニン、チロシンからアスパラギン、チロシンからグルタミン、チロシンからヒスチジン、チロシンからシステイン、チロシンからバリン、チロシンからロイシン、チロシンからイソロイシン、チロシンからプロリン、チロシンからメチオニン、チロシンからトリプトファン、およびチロシンからフェニルアラニンの１以上である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニンまたはセリンからグリシンである。突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質の限定されない例としては、配列番号２（ヒトＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ突然変異体）、配列番号３（ヒトＳｅｒＲＳＳ２４１Ａ突然変異体）または配列番号４（ヒトＳｅｒＲＳＳ１０１／Ｓ２４１Ａ突然変異体）に示されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号２、配列番号３または配列番号４に示される配列と比較して、配列が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸置換を、また、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸置換を、また、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に少なくとも１つのアミノ酸欠失および少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）またはその変異体と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に少なくとも１つのアミノ酸欠失および少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。
【００６０】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、構成的にリン酸化されたまたはリン酸化されたＳｅｒＲＳタンパク質を模倣する変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質）を提供する。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は脱リン酸化を受けることができない。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、ＶＥＧＦ転写の抑制を欠いている。例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）またはその変異体と比較して、ＶＥＧＦ転写の抑制を欠き得る。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質がＶＥＧＦ転写を抑制する程度は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％であり得るか、またはその付近であり得るか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にあり得る。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質がＶＥＧＦ転写を抑制し得る程度は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質がＶＥＧＦ転写を抑制し得る程度は、野生型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）またはその変異体のそれの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を抑制しない。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％以下に抑制する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸置換を含んでなり得る。本明細書に開示されるように、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、配列が約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であり得る。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）またはその変異体である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質  （例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（配列番号１）またはその変異体）と比較して、セリン１０１（Ｓ１０１）、セリン２４１（Ｓ２４１）、または両方にアミノ酸置換を含んでなる。
【００６２】
本明細書に開示されるように、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質、例えば、哺乳動物タンパク質（限定されるものではないが、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、またはカエルタンパク質を含む）であり得る。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物タンパク質、例えば、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、またはカエルタンパク質である。
【００６３】
限定されない例として、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）は、そのリン酸化の程度を増強するように修飾することができる。例えば、配列番号１の残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上を置換して、被リン酸化能が低減されたヒト突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を作出することができる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、配列番号１の残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸またはセリンからグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸またはセリンからグルタミン酸である。突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質の限定されない例としては、配列番号５（ヒトＳｅｒＲＳＳ２４１Ｄ突然変異体）または配列番号６（ヒトＳｅｒＲＳＳ２４１Ｅ突然変異体）で示されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号５または配列番号６で示される配列と比較して、配列が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、天然のタンパク質ではない。例えば、親ＳｅｒＲＳは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれを超える異なるＳｅｒＲＳタンパク質に由来する配列を含んでなるキメラタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳは、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質と１以上の他の哺乳動物ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、マウスＳｅｒＲＳタンパク質およびラットＳｅｒＲＳタンパク質）に由来する配列を含んでなるキメラタンパク質である。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳは、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質と１以上の脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、マウスＳｅｒＲＳタンパク質、ラットＳｅｒＲＳタンパク質、ゼブラフィッシュＳｅｒＲＳタンパク質、またはカエルＳｅｒＲＳタンパク質）に由来する配列を含んでなるキメラタンパク質である。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳは、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質と１以上の無脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、酵母ＳｅｒＲＳタンパク質および大腸菌(E. coli)ＳｅｒＲＳタンパク質）に由来する配列を含んでなるキメラタンパク質である。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳは、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質と１以上の植物ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ＳｅｒＲＳタンパク質）に由来する配列を含んでなるキメラタンパク質である。ＳｅｒＲＳタンパク質に関しては、タンパク質配列が進化的に保存されていることが示されている。いくつかの実施形態では、親ＳｅｒＲＳタンパク質は、２つ以上の異なるＳｅｒＲＳタンパク質の部分または全配列をアラインすることによって得られる１以上のコンセンサス配列を含んでなる。例えば、コンセンサス配列は、ヒト、酵母および大腸菌ＳｅｒＲＳ配列をアラインすることによって構築することができる。別の例として、コンセンサス配列は、２つ以上の脊椎動物ＳｅｒＲＳ配列（限定されるものではないが、マウス、ヒト、カエル、および／またはゼブラフィッシュＳｅｒＲＳ配列を含む）をアラインすることによって構築することができる。このコンセンサス配列の１以上の部分（例えば、同定された保存領域）を、野生型ヒトＳｅｒＲＳの対応する配列を置換して親ＳｅｒＲＳタンパク質を作出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列を含んでなる、またはからなるタンパク質は、親ＳｅｒＲＳタンパク質として使用される。
【００６５】
本明細書に開示される変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、参照ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、それらの配列に沿った１以上の場所に保存的アミノ酸置換を含み得る。参照ＳｅｒＲＳタンパク質の限定されない例としては、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）またはその変異体が含まれる。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；また、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。いくつかの実施形態では、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、トレオニンのセリンによる置換、またはアミノ酸の、構造的に関連するアミノ酸による同様の置換は、結果として得られる変異体ポリペプチドの特性に大きな影響を持つとは思われない。アミノ酸変化が機能的ポリペプチドをもたらすかどうかは、本明細書に記載されるように、その活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。例示的な保存的アミノ酸置換を表１に示す。本開示の範囲内にあるアミノ酸置換は一般に、（ａ）置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、（ｃ）側鎖の嵩、または（ｄ）生物学的機能、の維持に対するそれらの影響が有意に異ならない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、変異体は生物活性に関してスクリーニングされる。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
本発明ではまた、本明細書に開示されるＳｅｒＲＳタンパク質（野生型および変異体ＳｅｒＲＳタンパク質を含む）のいずれかのコード配列を含んでなる、またはからなるポリヌクレオチド配列も開示される。
【００６８】
ＳｅｒＲＳタンパク質の発現
本開示の実施形態に好適なＳｅｒＲＳタンパク質は、例えば、様々な宿主細胞における組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、真核生物のタンパク質を発現することができる発現ベクター（例えば、ウイルスベクター、シャトルベクター、および細菌プラスミド）を、組換えＳｅｒＲＳタンパク質を発現させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌、真菌、植物、酵母、昆虫または脊椎動物細胞（限定されるものではないが、哺乳動物細胞）であり得る。用語「宿主細胞」には、本開示に従ってＳｅｒＲＳタンパク質を生産するために使用された細胞、それらの細胞の後代の両方、それらの細胞から作製したプロトプラストが含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌宿主細胞である。
【００６９】
限定されない例として、組換えＤＮＡ技術を用いてＳｅｒＲＳタンパク質を生産するために、ＳｅｒＲＳタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるＤＮＡ構築物を構築し、例えば、大腸菌宿主細胞に移入することができる。ベクターは、大腸菌宿主細胞に導入された際に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、複製され得るいずれのベクターであってもよい。ＳｅｒＲＳをコードする核酸は、大腸菌宿主細胞内で転写活性を示す好適なプロモーターに機能的に連結させることができる。プロモーターは、宿主細胞と同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。本明細書で使用する場合、「誘導プロモーター」は、環境的または発達的調節下で活性のあるプロモーターを指し得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳコード配列は、シグナル配列に機能的に連結させることができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターはまた、終結配列も含み得る。いくつかの実施形態では、終結配列およびプロモーター配列は、同じ供給源に由来し得る。別の実施形態では、終結配列は、宿主細胞と同種であり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、１以上の選択マーカーを含む。代表的選択マーカーの例としては、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシンおよびフレオマイシン）耐性を付与するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、およびｐｙｒ４として当技術分野で公知のマーカーを含む栄養選択マーカーが選択マーカーとして使用可能である。
【００７２】
ＳｅｒＲＳをコードするポリヌクレオチドを有するＤＮＡ構築物を含んでなる発現ベクターは、所与の宿主生物で自律的に複製し得るか、または宿主ＤＮＡに組み込まれ得るいずれのベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルス構築物であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子の発現を得るために２種類の発現ベクターが企図される。例えば、第１の発現ベクターは、プロモーター、ＳｅｒＲＳ−コード領域、およびターミネーターが総て発現される遺伝子に起源するＤＮＡ配列を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、発現されるドメインをその固有の転写および翻訳調節配列の制御下に残して望まれていないＤＮＡ配列（例えば、望まないドメインをコードするＤＮＡ）を欠失させることによって遺伝子の末端切断を得ることができる。第２のタイプの発現ベクターは、組み立て済みであってよく、高レベルの転写および選択マーカーに必要とされる配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ遺伝子またはその一部のコード領域をこの多目的発現ベクターに、それが発現構築物プロモーターおよびターミネーター配列の転写制御下にあるように挿入することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子またはその一部を強力なプロモーターの下流に挿入することができる。
【００７４】
ＳｅｒＲＳをコードするポリヌクレオチド、プロモーター、ターミネーターおよびその他の配列を含んでなるＤＮＡ構築物を連結し、それらを好適なベクターに挿入するために使用される方法は、当技術分野で周知である。連結は、一般に、都合の良い制限部位でライゲーションによって達成することができる。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドリンカーを従来の実施(Bennett & Lasure, More Gene Manipulations In Fungi, Academic Press, San Diego (1991) pp 70-76)に従って使用する。加えて、ベクターは、既知の組換え技術（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて構築することもできる。
【００７５】
ＤＮＡ構築物またはベクターの宿主細胞への挿入には、形質転換；エレクトロポレーション；核マイクロインジェクション；形質導入；トランスフェクション、（例えば、リポフェクション媒介およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介トランスフェクション）；リン酸カルシウムとのインキュベーションによるＤＮＡ沈降；ＤＮＡコーティング微粒子を用いた高速衝突；およびプロトプラスト融合などの技術が含まれる。一般的な形質転換技術は当技術分野で公知である（例えば、Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56参照）。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ベクター系を用いて遺伝的に安定な形質転換体を構築することができ、これにより、ＳｅｒＲＳをコードする核酸は宿主株の染色体に安定に挿入される。次に、形質転換体を既知の技術によって精製することができる。
【００７７】
腫瘍進行を軽減するための方法および組成物
本明細書では、腫瘍進行を軽減するための方法および組成物が開示される。この方法は、いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、ここで、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、リン酸化欠損突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質であり、それによって、対象において腫瘍進行が軽減される。例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルおよび／または平均レベルは、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質のそれまたは対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、１％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルおよび／または平均レベルは、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質のそれまたは対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルおよび／または平均レベルは、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満である。
【００７８】
この組成物は、例えば、医薬組成物であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、低酸素誘導因子(hypoxia-inducible factor)（ＨＩＦ）の１以上の阻害剤、例えば、ＨＩＦ−１の１以上の阻害剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＨＩＦの阻害剤、例えば、ＨＩＦ−１阻害剤を含んでならない。いくつかの実施形態では、腫瘍進行は、処置を受けなかった対象と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲で軽減される。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、リン酸化されたＳｅｒＲＳタンパク質は対象において血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写を抑制することができ、これが血管新生の軽減をもたらし得ると考えられる。いくつかの実施形態では、腫瘍進行の軽減は、対象において血管新生を軽減することによって達成される。例えば、対象の血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲で軽減され得る。いくつかの実施形態では、対象の血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％軽減される。いくつかの実施形態では、対象の血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して、１０％を超え、２０％を超えて、３０％を超えて、４０％を超えて、５０％を超えて、６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、９８％を超えて、または９９％を超えて軽減される。いくつかの実施形態では、血管新生は、低酸素誘導性血管新生である。いくつかの実施形態では、腫瘍進行は転移である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、肉腫、癌腫、リンパ腫、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、血液系悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、神経鞘腫、中皮腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍進行は、処置を受けなかった対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％軽減される。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍進行は、処置を受けなかった対象と比較して、１０％を超えて、２０％を超えて、３０％を超えて、４０％を超えて、５０％を超えて、６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、９８％を超えて、または９９％を超えて軽減される。
【００７９】
本明細書に開示される方法は、固形腫瘍または血液系悪性腫瘍、例えば、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、神経鞘腫、中皮腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、およびそれらの組合せからなる群から選択される癌を治療または改善するために使用することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、または両方によるリン酸化のレベルが低減されている。
【００８１】
本明細書に開示されるリン酸化欠損ＳｅｒＲＳタンパク質はいずれも、腫瘍進行を軽減するためにこれらの方法および組成物で使用することができる。例えば、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質、または対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニン、トレオニンからアラニン、トレオニンからグリシン、トレオニンからリシン、トレオニンからアルギニン、トレオニンからアスパラギン、トレオニンからグルタミン、トレオニンからヒスチジン、トレオニンからシステイン、トレオニンからバリン、トレオニンからロイシン、トレオニンからイソロイシン、トレオニンからプロリン、トレオニンからメチオニン、トレオニンからトリプトファン、トレオニンからフェニルアラニン、チロシンからアラニン、チロシンからグリシン、チロシンからリシン、チロシンからアルギニン、チロシンからアスパラギン、チロシンからグルタミン、チロシンからヒスチジン、チロシンからシステイン、チロシンからバリン、チロシンからロイシン、チロシンからイソロイシン、チロシンからプロリン、チロシンからメチオニン、チロシンからトリプトファン、およびチロシンからフェニルアラニンのうち１以上である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、残基Ｓ１０１およびＳ２４１のうち１以上におけるものである。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｓ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、アミノ酸置換Ｓ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニンのうち１以上である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質または対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなり得る。すなわち、これらの実施形態では、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質の１以上のアミノ酸残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３が、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質では不在であり得る。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１；Ｙ２２０、Ｙ２４８、Ｙ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。いくつかの実施形態では、アミノ酸欠失は、残基Ｓ１０１およびＳ２４１の１以上におけるものである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質または対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３に少なくとも１つのアミノ酸欠失と少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に少なくとも１つのアミノ酸欠失と少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸欠失を含んでなる。  いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなる。アミノ酸置換は、例えば、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニン、またはそれらの組合せであり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニンまたはセリンからグリシンである。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号２、配列番号３または配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト変異体ＳｅｒＲＳタンパク質）である。
【００８６】
血管新生を調節するための方法および組成物
本明細書では、血管新生を調節するための方法および組成物が提供される。これらの方法および組成物は、例えば、１以上の血管新生関連疾患に罹患しているか、またはそれを発症するリスクのある対象において使用することができる。血管新生関連疾患の例としては、限定されるものではないが、癌、関節炎、皮膚障害（例えば、皮膚老化、日焼け、創傷治癒、乾癬、湿疹、血管腫、血管線維腫およびカポジ肉腫）、眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、黄斑変性、角膜血管形成、および血管新生緑内障）、および心血管疾患が含まれる。
【００８７】
血管新生を促進するための方法および組成物
いくつかの実施形態では、これらの方法および組成物は血管新生を促進するためのものである。例えば、対象において血管新生を促進する方法は、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり得、ここで、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較してＶＥＧＦ転写の抑制を欠くか、またはＶＥＧＦ転写の刺激に効果的である。いくつかの実施形態では、対象において血管新生を促進する方法は、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり得、ここで、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較してＶＥＧＦ転写の抑制を欠き、それによって、対象において血管新生が促進される。いくつかの実施形態では、対象において血管新生を促進する方法は、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり得、ここで、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質はＶＥＧＦ転写を刺激し、それによって、対象において血管新生が促進される。この組成物は、例えば医薬組成物であり得る。これらの方法および組成物は、例えば、不十分な血管形成または異常な血管系を伴う１以上の疾患または障害に罹患している対象において使用することができる。いくつかの実施形態では、対象は、虚血性心疾患、心血管疾患、および神経疾患のうち１以上に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある。
【００８８】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制の７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制の７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、１％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＶＥＧＦ転写の抑制の７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＶＥＧＦ転写の抑制の７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、１％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）によるＶＥＧＦ転写の抑制の７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満である。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質によるＶＥＧＦ転写の抑制は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）によるＶＥＧＦ転写の抑制の７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、１％であるか、またはその付近であるか、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲にある。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を抑制しない。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ＶＥＧＦ転写を刺激する。
【００８９】
ＶＥＧＦ転写の抑制を欠く、本明細書に開示される変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のいずれも、またはＶＥＧＦ転写を刺激し得る、本明細書に開示される変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のいずれもが血管新生を促進するための方法および組成物において使用可能である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１；Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり得る。アミノ酸置換の限定されない例は、セリンからアスパラギン酸、セリンからグルタミン酸、トレオニンからアスパラギン酸、およびトレオニンからグルタミン酸を含んでなる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質または対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、Ｓ１０１、Ｓ２４１、または両方にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｓ１０１Ｄ（またはＴ１０１Ｄ）、Ｓ２４１Ｄ、または両方を含んでなる。いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、アミノ酸置換Ｓ１０１Ｄ、Ｓ２４１Ｄ、または両方を含んでなる。突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、例えば、脊椎動物タンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質（限定されるものではないが、突然変異型ヒトタンパク質を含む））、キメラＳｅｒＲＳタンパク質、またはコンセンサスＳｅｒＲＳ配列を有する親ＳｅｒＲＳの変異体であり得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ転写の抑制を欠く変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸またはセリンからグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ転写の抑制を欠く変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号５または配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ転写を刺激し得る変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアスパラギン酸またはセリンからグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ転写を刺激し得る変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号５または配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
【００９１】
血管新生を軽減するための方法および組成物
本明細書では、血管新生を軽減するための方法および組成物が開示される。例えば、対象において血管新生を軽減する方法は、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質）を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり得、ここで、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質はリン酸化欠損型であり、それによって、対象において血管新生が軽減される。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルおよび／または平均レベルは、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のそれまたは親ＳｅｒＲＳタンパク質のそれの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質のリン酸化の最大レベルおよび／または平均レベルは、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）のそれの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満である。
【００９２】
この組成物は、例えば、医薬組成物であり得る。いくつかの実施形態では、血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて軽減される。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、リン酸化されたＳｅｒＲＳタンパク質は対象において血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写を抑制することができ、これが血管新生の軽減をもたらし得ると考えられる。いくつかの実施形態では、血管新生の軽減は、腫瘍を有する対象において腫瘍進行の軽減をもたらすことができる。対象における血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲で軽減され得る。いくつかの実施形態では、血管新生は、低酸素誘導性血管新生である。いくつかの実施形態では、対象の血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して、１０％を超えて、２０％を超えて、３０％を超えて、４０％を超えて、５０％を超えて、６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、９８％を超えて、または９９％を超えて軽減される。いくつかの実施形態では、対象の血管新生は、処置を受けなかった対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％軽減される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質は、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、または両方によるリン酸化のレベルが低減されている。
【００９４】
本明細書に開示されるリン酸化欠損ＳｅｒＲＳタンパク質はいずれも、血管新生を軽減するための方法および組成物に使用することができる。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質または親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸置換を含んでなる。アミノ酸置換の例としては、限定されるものではないが、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニン、トレオニンからアラニン、トレオニンからグリシン、トレオニンからリシン、トレオニンからアルギニン、トレオニンからアスパラギン、トレオニンからグルタミン、トレオニンからヒスチジン、トレオニンからシステイン、トレオニンからバリン、トレオニンからロイシン、トレオニンからイソロイシン、トレオニンからプロリン、トレオニンからメチオニン、トレオニンからトリプトファン、トレオニンからフェニルアラニン、チロシンからアラニン、チロシンからグリシン、チロシンからリシン、チロシンからアルギニン、チロシンからアスパラギン、チロシンからグルタミン、チロシンからヒスチジン、チロシンからシステイン、チロシンからバリン、チロシンからロイシン、チロシンからイソロイシン、チロシンからプロリン、チロシンからメチオニン、チロシンからトリプトファン、およびチロシンからフェニルアラニンが含まれる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、残基Ｓ１０１（またはＴ１０１）およびＳ２４１の１以上におけるものである。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質または親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、アミノ酸置換Ｓ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、アミノ酸置換Ｓ１０１Ａ、Ｓ２４１Ａ、または両方を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、セリンからフェニルアラニン、またはそれらの組合せである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質または親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなり得る。言い換えれば、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質または親ＳｅｒＲＳタンパク質の１以上のアミノ酸残基Ｔ２２、Ｓ７９（またはＴ７９）、Ｓ８６、Ｓ１０１（またはＴ１０１）、Ｓ１４２（またはＴ１４２）、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０（またはＴ２２０）、Ｙ２４８、およびＹ２６３は、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質では不在である。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３のうち１以上にアミノ酸欠失を含んでなる。いくつかの実施形態では、アミノ酸欠失は、残基Ｓ１０１およびＳ２４１の１以上におけるものである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、比較親ＳｅｒＲＳタンパク質または野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）に対応する残基位置２２、７９、８６、１０１、１４２、２１７、２４１、２５５、２５８、２６２、３６８、３９４、３９６、２１４、５０１、２２０、２４８、および２６３に１以上のアミノ酸欠失と１以上のアミノ酸置換を含んでなる。例えば、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質のＴ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に対応する残基に１以上のアミノ酸欠失と１以上のアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、対応する野生型ＳｅｒＲＳタンパク質または親ＳｅｒＲＳタンパク質と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６；Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に１以上のアミノ酸欠失と１以上のアミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、ヒト野生型ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、残基Ｔ２２、Ｓ７９、Ｓ８６、Ｓ１０１、Ｓ１４２、Ｓ２１７、Ｓ２４１、Ｓ２５５、Ｓ２５８、Ｓ２６２、Ｓ３６８、Ｓ３９４、Ｓ３９６、Ｔ２１４、Ｔ５０１、Ｙ２２０、Ｙ２４８、およびＹ２６３に１以上のアミノ酸欠失と１以上のアミノ酸置換を含んでなる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸欠失を含んでなる。  いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなる。  いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアラニン、セリンからグリシン、セリンからリシン、セリンからアルギニン、セリンからアスパラギン、セリンからグルタミン、セリンからヒスチジン、セリンからシステイン、セリンからバリン、セリンからロイシン、セリンからイソロイシン、セリンからプロリン、セリンからメチオニン、セリンからトリプトファン、およびセリンからフェニルアラニンからなる群から選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、配列番号１の残基Ｓ１０１およびＳ２４１の一方または両方にアミノ酸置換を含んでなり、ここで、アミノ酸置換は、セリンからアラニンまたはセリンからグリシンである。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。いくつかの実施形態では、リン酸化欠損変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、脊椎動物変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、哺乳動物変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（ヒト変異体ＳｅｒＲＳタンパク質を含むが、これに限定されない））である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、対象において血管新生を軽減するための方法は、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤を含んでなる組成物を、必要とする対象に投与することを含んでなり、それによって、対象において血管新生が軽減される。この方法は、必要とする対象を特定することをさらに含んでなり得、ここで、対象は、異常に高い血管形成を有する疾患もしくは障害に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある。この組成物は、いくつかの実施形態では、医薬組成物であり得る。
【０１００】
用語「ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤」は、本明細書では広義で使用され、ＳｅｒＲＳのリン酸化を部分的または完全に遮断、阻害または中和するいずれの分子も含む。いくつかの実施形態では、前記阻害剤は、ＳｅｒＲＳのリン酸化を低減、防止、または無効にし得る。ＳｅｒＲＳのリン酸化が阻害される方法／機構は何ら限定されない。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、例えばＳｅｒＲＳに結合することによって、ＳｅｒＲＳに直接、ＳｅｒＲＳのリン酸化を防止または低減するように働き得る。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、例えばホスホリラーゼに結合することによって、ＳｅｒＲＳをリン酸化するホスホリラーゼに直接、ＳｅｒＲＳのリン酸化を防止または低減するように働き得る。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＳｅｒＲＳの、ＳｅｒＲＳをリン酸化し得るホスホリラーゼとの相互作用に干渉する、好ましくは、その相互作用を無効にするまたは低減することができる。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＳｅｒＲＳをリン酸化することができるホスホリラーゼをコードする遺伝子の発現レベルを、例えば、そのホスホリラーゼ遺伝子の転写を阻害または低減することによって調整することができる。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、細胞におけるホスホリラーゼのレベルを、例えば、ホスホリラーゼｍＲＮＡの翻訳を、阻害もしくは低減すること、またはホスホリラーゼｍＲＮＡもしくはホスホリラーゼタンパク質の分解を増大させることによって調整することができる。
【０１０１】
ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤の種類は何ら限定されない。例えば、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、小分子、核酸、抗体、ペプチド、またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＳｅｒＲＳと結合する小分子、ＳｅｒＲＳをリン酸化するホスホリラーゼ、または両方であり得る。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＳｅｒＲＳの相互作用を遮断する分子およびＳｅｒＲＳをリン酸化する１以上のホスホリラーゼであり得る。ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤の限定されない例には、毛細血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）、毛細血管拡張性失調症およびＲａｄ３関連キナーゼ（ＡＴＲ）、またはそれらの組合せの阻害剤が含まれる。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＡＴＭ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＡＴＲ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、核酸、例えば、抗ＡＴＭ小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＡＴＭアンチセンスＲＮＡ、抗ＡＴＲ小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＡＴＲアンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＡＴＲ阻害剤ＶＥ−８２１である。いくつかの実施形態では、ＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤は、ＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３である。
【０１０２】
実際の合成およびコンピューターモデリング技術の使用による試験に先立ち、ＳｅｒＲＳリン酸化に対する化学化合物の潜在的阻害または結合効果を分析することができる。所与の化合物の理論的構造がホスホリラーゼとＳｅｒＲＳの間の不十分な相互作用および関連を示唆する場合には、化合物の合成および試験は回避される。しかしながら、コンピューターモデリングが強い相互作用を示す場合には、その分子は合成され、好適なアッセイを用いてＳｅｒＲＳと結合してそれを阻害するその能力に関して試験することができる。このように、効力の無い化合物の合成を避けることができる。ＳｅｒＲＳの阻害化合物またはその他の結合化合物は、化学実体またはフラグメントがＳｅｒＲＳの各結合ポケットまたはその他の領域と会合するそれらの能力に関してスクリーニングおよび選択される一連の工程の手段によって、コンピューターにより評価および設計されてよい。当業者は、化学実体またはフラグメントを、ＳｅｒＲＳと、より詳しくはＳｅｒＲＳのリン酸化部位と会合するそれらの能力に関して試験するために様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＡＴＲ阻害剤ＶＥ−８２１およびＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３などの既知のＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤を、ＳｅｒＲＳリン酸化を阻害する化合物を設計するための開始点として使用することができる。
【０１０３】
医薬組成物
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、１以上の変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質）を含んでなる医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質は、リン酸化欠損型である。いくつかの実施形態では、変異体ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質）は、例えば、対応する親ＳｅｒＲＳタンパク質（例えば、野生型ＳｅｒＲＳタンパク質）と比較して、ＶＥＧＦ転写の抑制を欠いている。本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、１以上のＳｅｒＲＳリン酸化阻害剤（例えば、ＡＴＭ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、または両方）を含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物は、１以上の薬学上許容される賦形剤を含んでなり得る。医薬組成物は、限定されるものではないが、血管新生関連障害／疾患、腫瘍、および癌を含む様々な障害／疾患の処置のために使用可能である。
【０１０４】
また、医薬組成物の薬学上許容されるプロドラッグ、およびそのような薬学上許容されるプロドラッグを使用する処置方法も提供される。用語「プロドラッグ」は、対象に投与された後にイン・ビボにおいて加溶媒分解もしくは酵素的切断などの化学的もしくは生理学的過程を介して、または生理学的条件下で化合物を生じる（例えば、プロドラッグは、生理学的ｐＨとなった際に薬剤に変換される）指定の化合物の前駆体を意味する。「薬学上許容されるプロドラッグ」は、非毒性で、生物学的に忍容性があり、その他の点でも対象への投与に生物学的に好適であるプロドラッグである。好適なプロドラッグ誘導体の選択および調製の例示的手段は、例えば、Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press, 1985)に記載されている。
【０１０５】
また、医薬組成物の薬学上活性な代謝物、および本発明の方法におけるそのような代謝産物の使用も提供される。「薬学上活性な代謝物」は、化合物またはその塩の、身体における代謝の薬理学的に活性な産物を意味する。化合物のプロドラッグおよび活性代謝物は、当技術分野で既知または利用可能な慣用技術を用いて決定することができる。例えば、Bertolini et al., J. Med. Chem. 1997, 40, 2011-2016; Shan et al., J. Pharm. Sci. 1997, 86 (7), 765-767; Bagshawe, Drug Dev. Res. 1995, 34, 220-230; Bodor, Adv. Drug Res. 1984, 13, 255-331; Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press, 1985);およびLarsen, Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen et al.編, Harwood Academic Publishers, 1991)参照。
【０１０６】
本明細書に記載の化合物のいずれの好適な処方物も調製可能である。一般に、Remington's Pharmaceutical Sciences, (2000) Hoover, J. E.編, 第20版, Lippincott Williams and Wilkins Publishing Company, Easton, Pa., 780-857頁参照。処方物は適当な投与経路に好適であるように選択される。いくつかの投与方法として、経口投与、非経口投与、吸入による投与、局所投与、直腸投与、鼻腔投与、口内投与、膣投与、移植リザーバーを介する投与、またはその他の薬物投与法がある。化合物が安定な非毒性の酸塩または塩基塩を形成するために十分塩基性または酸性である場合には、塩としての化合物の投与が適当であり得る。薬学上許容される塩の例は、生理学的に許容される陰イオン、例えば、トシル酸イオン、メタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、マロン酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン、安息香酸イオン、アスコルビン酸イオン、α−ケトグルタル酸イオン、およびα−グリセロリン酸イオンを形成する酸を形成された有機酸付加塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸、および炭酸塩を含む好適な無機塩も形成され得る。薬学上許容される塩は、当技術分野で周知の標準法を用い、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物に、生理学的に許容される陰イオンを提供する好適な酸を伴うことで得られる。また、カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩も作製される。
【０１０７】
企図される化合物が薬理学的組成物中で投与される場合、それらの化合物は薬学上許容される賦形剤および／または担体と混合して処方され得ると考えられる。例えば、企図される化合物は、中性化合物または薬学上許容される塩として経口投与することもできるし、または生理食塩水中で静脈内に投与することもできる。この目的でリン酸バッファー、重炭酸バッファーまたはクエン酸バッファーなどの従来のバッファーを使用することができる。当然のことながら、当業者ならば、特定の投与経路に関して多くの処方物を提供するために、本明細書の教示内で処方物を改変することができる。特に、企図される化合物は、それらの水または他のビヒクル中での可溶性を高めるために改変することができ、これは例えば、十分に当業者の範囲内にある微修正（塩形成、エステル化など）で容易に達成することができる。また、本化合物の薬物動態が患者において最大有益効果となるように管理するために、特定の化合物の投与経路および投与計画を改変することも、十分に当業者の範囲内にある。
【０１０８】
本明細書に記載されるような医薬組成物は、一般に、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、グリセロール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、またはそれらの任意の組合せなどの有機溶媒に可溶である。一実施形態では、本発明は、薬剤を薬学上許容される担体と混合することによって調製される処方物を提供する。一態様において、処方物は、ａ）記載の薬剤を水溶性有機溶媒、非イオン性溶媒、水溶性脂質、シクロデキストリン、トコフェロールなどのビタミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、またはそれらの組合せ中に溶かして溶液を提供すること；およびｂ）１〜１０％炭水化物溶液を含有する生理食塩水またはバッファーを加えることを含んでなる方法を用いて調製することができる。一例では、炭水化物は、デキストロースを含んでなる。本方法を用いて得られる医薬組成物は、安定であり、動物および臨床適用に有用である。
【０１０９】
本方法で使用するための水可溶性有機溶媒の実例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、またはそれらの組合せが含まれる。アルコールの例としては、限定されるものではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、またはプロピレングリコールが含まれる。
【０１１０】
本方法で使用するための水可溶性非イオン性界面活性剤の実例としては、限定されるものではないが、クレモフォール(CREMOPHOR)（登録商標）ＥＬ、ポリエチレングリコール修飾クレモフォール（登録商標）（ポリオキシエチレングリセロールトリリシノールエート３５）、水素化クレモフォール（登録商標）ＲＨ４０、水素化クレモフォール（登録商標）ＲＨ６０、ＰＥＧ−スクシネート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルトール(SOLUTOL)（登録商標）ＨＳ（ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート）、モノオレイン酸ソルビタン、ポロキサマー、ラブラフィル(LABRAFIL) （登録商標）（エトキシル化杏仁油）、ラブラゾル(LABRASOL)（登録商標）（カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド）、ゲルシア(GELUCIRE)（登録商標）（グリセロールエステル）、ソフチゲン(SOFTIGEN）（登録商標）（ＰＥＧ  ６カプリルグリセリド）、グリセリン、グリコール−ポリソルベート、またはそれらの組合せが含まれる。
【０１１１】
本方法で使用するための水可溶性脂質の実例としては、限定されるものではないが、植物油(vegetable oils)、トリグリセリド、植物油(plant oils)、またはそれらの組合せが含まれる。脂質油の例としては、限定されるものではないが、ヒマシ油、ポリオキシルヒマシ油、コーン油、オリーブ油、綿実油、落花生油、ペパーミント油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油、水素化植物油、水素化ダイズ油、ココナッツ油のトリグリセリド、パーム種子油、およびその水素化形態、またはそれらの組合せが含まれる。
【０１１２】
本方法で使用するための脂肪酸および脂肪酸エステルの実例としては、限定されるものではないが、オレイン酸、モノグリセリド、ジグリセリド、ＰＥＧのモノもしくはジ脂肪酸エステル、またはそれらの組合せが含まれる。
【０１１３】
本方法で使用するためのシクロデキストリンの実例としては、限定されるものではないが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、またはスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンが含まれる。
【０１１４】
本方法で使用するためのリン脂質の実例としては、限定されるものではないが、大豆ホスファチジルコリン、もしくはジステアロイルホスファチジルグリセロール、およびその水素化形態、またはそれらの組合せが含まれる。
【０１１５】
当業者ならば、特定の投与経路に関して多くの処方物を提供するために、本明細書の教示内で処方物を改変することができる。例えば、これらの化合物は、それらの水または他のビヒクル中での可溶性を高めるために改変することができる。また、本化合物の薬物動態が患者において最大有益効果となるように管理するために、特定の化合物の投与経路および投与計画を改変することも、十分に当業者の範囲内にある。
【０１１６】
本明細書に開示される医薬組成物、例えば、リン酸化を欠く突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物、ＶＥＧＦ転写の抑制を欠く突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物、およびＶＥＧＦ転写を刺激し得る突然変異型ＳｅｒＲＳタンパク質を含んでなる組成物は、経口投与、非経口投与、吸入による投与、局所投与、直腸投与、鼻腔投与、口内投与、膣投与、移植リザーバーを介する投与、またはその他の薬物投与法により投与することができる。用語「非経口」には、本明細書で使用する場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。
【０１１７】
無菌注射用水性または油性懸濁液などの無菌注射用組成物は、当技術分野で公知の技術に従い、好適な分散剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用いて処方することができる。この無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。好適な担体およびその他の医薬組成物成分は一般に無菌である。
【０１１８】
加えて、無菌の不揮発性油も、溶媒または懸濁媒として従来から使用されている（例えば、合成モノまたはジグリセリド）。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸も、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型などの薬学上許容される油と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤も含み得る。薬学上許容される固体、液体、またはその他の投与形の製造に慣用される様々な乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤も処方の目的に合わせて使用することができる。
【０１１９】
経口投与用の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、エマルションおよび水性懸濁液、分散液および溶液を含め、経口的に許容されるいずれの投与形であってもよい。経口用錠剤の場合、慣用担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた添加可能である。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが含まれる。水性懸濁液またはエマルションが経口投与される場合には、乳化剤または沈殿防止剤と合わせた油相に有効成分を懸濁または溶解させることができる。必要であれば、ある種の甘味剤、香味剤、または着色剤を添加することができる。鼻腔エアロゾルまたは吸入組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製することができ、当技術分野で公知の好適な保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、および／または他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、例えば、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【実施例】
【０１２０】
上記の実施形態のいくつかの態様を以下の実施例でさらに詳細に開示するが、これらの実施例は本開示の範囲を何ら限定するものではない。
【０１２１】
実験材料および方法
以下の実験材料および方法を、下記の実施例１〜８に関して使用した。
【０１２２】
細胞株
ＨＥＫ２９３細胞、３Ｂ１１細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、終濃度１０％まで熱失活ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ターザナ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、グランドアイランド、ＮＹ、ＵＳＡ）で培養した。リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一過性トランスフェクションを行った。本発明者らは、ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ケンブリッジ、ＭＡ、ＵＳＡ）レトロビル感染およびピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いた選択によって、マウスまたはヒトＳｅｒＲＳ突然変異体を発現する安定な３Ｂ１１細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株樹立した。低酸素状態は、低血清（１％）培地中で密閉低酸素チャンバー（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）を用いて達成した。
【０１２３】
プラスミド構築物
ヒトおよびマウス全長ＳｅｒＲＳ遺伝子をｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−２ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）、およびヒトＳＩＲＴ２遺伝子をｐＣＤＮＡ６−Ｖ５／Ｈｉｓ−Ｃベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。ＳｅｒＲＳの突然変異のために、本発明者らは部位特異的突然変異誘発ＰＣＲを行ってＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ構築物およびＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ構築物を得た。
【０１２４】
ヒトＳｅｒＲＳ突然変異型構築物のプライマー配列は、以下の通りである。
【化２】
2019531269.tif 000005
【０１２５】
マウスＳｅｒＲＳ突然変異型構築物のプライマー配列は、以下の通りである。
【化３】
2019531269.tif 000006
上記段落の配列に太字で示されるヌクレオチドは、置換残基をコードする。
【０１２６】
タンパク質精製については、ヒトＳｅｒＲＳおよびその突然変異型遺伝子を、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）にサブクローニングし、大腸菌(E.coli)で過剰発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、ヴァレンシア、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、組換えＣ末端Ｈｉｓ６タグを有するタンパク質を精製した。組換えタンパク質の純度は、４〜１２％ミニゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）電気泳動後にクーマシーブルー染色によって評価した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて決定した。
【０１２７】
ＲＮＡｉ
ヒトＳｅｒＲＳに対して設計した短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡオリゴ（３’−ＵＴＲ内の5’ GGC ATA GGG ACC CAT CAT TGA 3’（配列番号２３））、ＧｌｙＲＳに対して設計した短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡオリゴ（オープンリーディングフレーム内の5’ GCA TGG AGT ATC TCA CAA AGT 3’（配列番号２４））を、ｓｈＲＮＡ発現を駆動するために、ｐＬｅｎｔｉＬｏｘ  ３．７プラスミドから、Ｈ１プロモーター（Ｘｂａ  Ｉ部位とＸｈｏ  Ｉ部位の間）を含むように改変したｐＬｅｎｔｉＬｏｘ−ｈＨ１プラスミドに挿入した。非標的化対照ｓｈＲＮＡとして、本発明者らは、配列5’ TAA GGC TAT GAA GAG ATA C 3’（配列番号２５）を用いた。ＡＴＭおよびＡＴＲに対するＳｉＲＮＡ二重鎖は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンヴァーズ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１２８】
リアルタイムＰＣＲアッセイ
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって細胞およびゼブラフィッシュ胚から単離した。各サンプルからの全ＲＮＡ  １グラムをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）によってｃＤＮＡに逆転写した。総てのリアルタイムＰＣＲ反応は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに用いて行った。ＰＣＲ反応のためのプライマー対は、ヒトＶＥＧＦＡについては、5’ GAG GGC AGA ATC ATC ACG AAG 3’（配列番号２６）および5’ TGT GCT GTA GGA AGC TCA TCT CTC 3’（配列番号２７）であり；ヒトβ−アクチンについては、5’ CGT CAC CAA CTG GGA CGA 3’（配列番号２８）および5’ ATG GGG GAG GGC ATA CC 3’（配列番号２９）であり；ゼブラフィッシュｖｅｇｆａについては、5’ GGC TCT CCT CCA TCT GTC TGC 3’（配列番号３０）および5’ CAG TGG TTT TCT TTC TTT GCT TTG 3’（配列番号３１）であり；ゼブラフィッシュβ−アクチンについては、5’ TCA CCA CCA CAG CCG AAA GAG 3’（配列番号３２）および5’ GTC AGC AAT GCC AGG GTA CAT 3’（配列番号３３）である。ＰＣＲ反応プログラムは、９５℃、１０分で始め、次に、９５℃、２０秒および６０℃、１分の４５サイクルを行った。各試験を３回行った。ＶＥＧＦＡ遺伝子発現をβ−アクチンの遺伝子発現で正規化した。統計分析は、ソフトウエアＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン１０．０）を用いて行った。スチューデントのｔ検定を用いて、異なる群間の変化を分析した。
【０１２９】
ゼブラフィッシュにおけるイン・ビボ研究
トランスジェニックＴｇ（Ｆｌｉ１ａ：ＥＧＦＰ）魚は、本発明者らが従前に記載したように（Ｒｅｆ）維持した。魚胚をマイクロインジェクションの前後で２８．５℃に保持した。ＳｅｒＲＳを標的とするアンチセンスモルホリノ（ＭＯ）を１細胞期胚の卵黄に、胚当たり４〜５ｎｇの用量で注入した。ＳｅｒＲＳ−ＭＯの配列は（Ｒｅｆ）である。ＳｅｒＲＳ−ＭＯ（5’ AGG AGA ATG TGA ACA AAC CTG ACA C 3’（配列番号３４））および標準対照ＭＯ（5’ CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT A 3’（配列番号３５））は、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ、ＵＳＡ）から購入した。注入後、色素の形成を防ぐために、胚を０．００３％１−フェニル−２−チオ尿素（ＰＴＵ）を添加したＥ３胚培地中、２８．５℃でインキュベートした。胚を０．１６８ｍｇ  ｍＬ−１トリカイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔し、２％メチルセルロース中に包埋し、ニコンＣＣＤカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ  ２０００Ｒ）を備えたニコン蛍光顕微鏡（ＡＺ１００）で写真を撮影した。ゼブラフィッシュを含む実験は総て、スクリプス研究所の所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee）（ＩＡＣＵＣ）によって確立されたガイドラインＩＡＣＵＣ承認番号０９−０００９に従って行った。統計分析は、ソフトウエアＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １９を用いて行った。ＩＳＶ発生に対する種々のＳｅｒＲＳ突然変異体の救済効果を、χ２検定を用いて分析した。
【０１３０】
免疫ブロット法および免疫沈降
細胞を氷上で、溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  β−グリセロホスフェート、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁させた。上清を示された抗体とインキュベートし、Ｇタンパク質結合アガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を少なくとも２時間インキュベートした。これらのビーズを洗浄バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が１％から０．１％に減らされたこと以外は溶解バッファーと同じ）で５回洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび示された抗体を用いる免疫ブロット分析を行った。ゼブラフィッシュからのタンパク質サンプルを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて調製した。免疫沈降用のモノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。特注のウサギ抗ヒトＳｅｒＲＳ抗体は、精製ヒト組換えＳｅｒＲＳに対して作製され、アフィニティー精製されたものであった。抗ＡＴＭ／ＡＴＲ基質ｐ−ＳＱ、抗ＡＴＭ、抗ｐ−ＡＴＭ（セリン１９８１）、抗ＡＴＲ、抗ＳＩＲＴ２、抗α−チューブリン、抗β−アクチン、抗ラミンＡ／Ｃ、抗Ｐ５３、抗ｐ−Ｐ５３（セリン１５）、抗ＲＰＡ３２、抗ｐ−ＲＰＡ３２（セリン３３）、抗ＣＨＫ１、抗ｐ−ＣＨＫ１（セリン３４５）、抗ＣＨＫ２、抗ｐ−ＣＨＫ２（トレオニン６８）、および抗ＨＩＦ１β（ＡＲＮＴ）抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ＨＩＦ１α抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）から購入した。抗Ｖ５抗体および抗ＧｌｙＲＳ抗体は、それぞれＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＡｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１３１】
マトリゲルプラグ血管新生アッセイ
合計１０６の安定にトランスフェクトされた３Ｂ１１細胞を、１０％ＦＢＳを添加した１００μｌのＤＭＥＭ培地に再懸濁させた後、氷上で２００μｌの氷冷マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）液と混合した。３００μｌの細胞およびマトリゲルの混合物をＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの側腹部に皮下注射した（マウス当たり２か所の注射部位および各群５〜６個体のマウス）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。１４日間の植込みの後、マトリゲルプラグを切り出し、クリオスタット切片作製のためにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）コンパウンド中で凍結させた。マウス試験は総て、スクリプス研究所の所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって確立されたガイドラインＩＡＣＵＣ承認プロトコール番号１３−０００３に従って行った。
【０１３２】
異種移植腫瘍モデル
野生型ヒトＳｅｒＲＳ、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ、またはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄを発現するベクターで安定にトランスフェクトされた１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６〜８週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ マウス（各群６個体のマウス）の乳腺に皮下注射した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。注射１４日後に、腫瘍異種移植片をマウスから分離し、クリオスタット切片作製のためにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）コンパウンド中で凍結させた。
【０１３３】
免疫組織化学
新鮮な凍結腫瘍異種移植片およびマトリゲルプラグからの５μｍ切片をアセトンおよび３％Ｈ２Ｏ２で処理して内因性ペルオキシダーゼを遮断した。３〜５回の洗浄およびヤギ血清遮断の後に、これらの切片を抗ＣＤ３１抗体（１：３０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに一晩４℃でインキュベートした。腫瘍異種移植片サンプルで血管を５〜１０のランダムな視野（１２０×）で数え、マトリゲルプラグの微細血管密度を、ＣＤ３１染色濃度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて測定することによって定量した。低酸素を検出するために、本発明者らは、これらのスライドを抗ＨＩＦ１α抗体（１：１００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とともにインキュベートした。
【０１３４】
ＥＭＳＡ
ＶＥＧＦＡプロモーター上のＳｅｒＲＳ結合部位に相当する２７ｂｐのＤＮＡオリゴヌクレオチド（5’ GGC GGG GCG GAG CCA TGC GCC CCC CCC 3’（配列番号３６））を合成し、アニーリングし、５’末端でＴ４  ＤＮＡキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ、ＵＳＡ）により［３２Ｐ］標識した後、セファデックスＧ−２５スピンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピッツバーグ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて脱塩した。標識されたオリゴヌクレオチド（０．０８ｐｍｏｌ）を室温で３０分間、結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ  ｍｌ−１  ＢＳＡ、１０ｎｇ  μｌ−１ポリ（ｄＧ−ｄＣ）、１ｍＭ  ＤＴＴ）中、示された濃度の組換えＳｅｒＲＳとともにインキュベートした。これらのサンプルを５％非変性ポリアクリルアミドゲル（１７．５ｃｍ長）に載せ、ランニングバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、１９０ｍＭグリシン）中、２５０Ｖで電気泳動を行った。その後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーによって調べた。
【０１３５】
細胞分画
細胞質画分および核画分を分離し、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて抽出した。外因的に発現されたまたは内因性のＳｅｒＲＳタンパク質を、ウエスタンブロット解析により、抗ｆｌａｇポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはポリクローナル抗ＳｅｒＲＳ抗体を用いて検出した。
【０１３６】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
細胞を、室温で１０分間、ホルムアルデヒド（１％終濃度）で固定した。１２５ｍＭのグリシンを添加することによって反応を停止させた。ＣｈＩＰアッセイは、ＣｈＩＰ−ＩＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）のプロトコールに従い、アフィニティー精製されたポリクローナル抗ＳｅｒＲＳ抗体を用いて行った。３回の洗浄の後、ＣｈＩＰｅｄ  ＤＮＡは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムにて、ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。ＶＥＧＦＡプロモーターを標的とするプライマーセット（５’−ＧＧＧＣＧＧＡＴＧＧＧＴＡＡＴＴＴＴＣＡ−３’（配列番号３７）および５’−ＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＣＣＡＧＴＧＡＡ−３’（配列番号３８））を使用した。
【０１３７】
実施例１
ＳｅｒＲＳは低酸素応答に関与してＶＥＧＦＡを調節する
この実施例は、ＳｅｒＲＳが低酸素応答に関与してＶＥＧＦＡ発現を調節することを示す。
【０１３８】
ＳｅｒＲＳ発現は、ＨＥＫ２９３細胞において、ＳｅｒＲＳ遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）でノックダウンした（図１Ａ）。正常酸素濃度（酸素正常状態）では、従前に見られたように（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＶＥＧＦＡ発現は、非特異的対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−対照）または別のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＧｌｙＲＳ）でトランスフェクトされた対照細胞と比較して、ＳｅｒＲＳのノックダウン時に上方調節された（図１Ａ）。しかしながら、低酸素下では、ＶＥＧＦＡ発現は、予想されたように対照細胞で有意に増強され、ＳｅｒＲＳノックダウン細胞での低酸素応答は大幅に低減され（図１Ａおよび挿入部）、このことはＳｅｒＲＳが低酸素応答に関与してＶＥＧＦＡを調節することを示唆する。
【０１３９】
実施例２
ＳｅｒＲＳは低酸素応答に関与してＶＥＧＦＡを調節する
この実施例は、ＳｅｒＲＳノックダウン細胞における低いＶＥＧＦＡ刺激が低酸素によるＶＥＧＦＡの抑制におけるＳｅｒＲＳの役割の不活性化によって引き起こされるかどうかを調べる実験を記載する。
【０１４０】
図７Ａに示されるように、低酸素は、ＳｅｒＲＳの発現に影響を及ぼさない。ＳｅｒＲＳを潜在的翻訳後修飾に関して調べた。Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載されている大規模質量分析研究では、ＳｅｒＲＳは、ＤＮＡ損傷により活性化されたＡＴＭ／ＡＴＲキナーゼによってセリン２４１（Ｓ２４１）でリン酸化されることが見出された。ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓデータベース（Ｈｏｒｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）では、別の潜在的ＳｅｒＲＳリン酸化部位セリン１０１（Ｓ１０１）も見出された。両部位とも、２つの疎水性残基が先行する（セリン／トレオニンに対してａｔ−１および−３の位置）セリンまたはトレオニンとその後にグルタミンを有する保存されたＡＴＭ／ＡＴＲ基質モチーフを有する（図１Ｂ）。多重配列アラインメントが、脊椎動物ＳｅｒＲＳにおけるＳ／Ｔ１０１およびＳ／Ｔ２４１および隣接するＡＴＭ／ＡＴＲ基質モチーフ残基の厳格な保存（図１Ｂ）を、血管発生および血管新生の調節におけるＳｅｒＲＳの役割とともに明らかにした。
【０１４１】
ＤＮＡ断片により誘導されるＳｅｒＲＳリン酸化は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において３２Ｐ標識によって確認された。ＡＴＭ／ＡＴＲを活性化するようにＤＮＡ損傷を模倣するために、ＨＥＫ２９３細胞の核抽出物に二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを加えた。「活性化された」核抽出物は、精製組換えＳｅｒＲＳのロバストなリン酸化を特異的に誘導したが、ＧｌｙＲＳはそうではなかった（図１Ｃ）。ＳｅｒＲＳのリン酸化は、特異的蛍光体−ＡＴＭ／ＡＴＲ基質（ｐ−ＳＱ）抗体を使用することによってさらに確認した（図１Ｄ）。ＳｅｒＲＳ上のリン酸化部位を確認するために、本発明者らは、Ｓ１０１およびＳ２４１を別個にアラニンで置換し、ＳｅｒＲＳＳ１０１ＡおよびＳｅｒＲＳＳ２４１Ａを作出すると同時にＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａを作出した。ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａは、リン酸化レベルの低下を示したが、ＳｅｒＲＳＳ２４１ＡおよびＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａは、ｐ−ＳＱ抗体（図１Ｄ）および３２Ｐ標識（図７Ｂ）の両方によって調べた場合、イン・ビトロにおいてリン酸化はほとんど無く、このことは、ＳｅｒＲＳはＳ１０１およびＳ２４１の両方でＡＴＭ／ＡＴＲキナーゼによってリン酸化され得ること、およびＳ２４１はＳｅｒＲＳ上の主要なリン酸化部位であることを示唆した。
【０１４２】
細胞におけるＳｅｒＲＳのリン酸化を確認するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＴＭ／ＡＴＲを活性化することができるストレス誘導低酸素およびＵＶ照射によって刺激した。低酸素下で、ＨＥＫ２９３細胞の内因性ＳｅｒＲＳのリン酸化が１２時間内に検出された（図１Ｅ）。低酸素ＨＥＫ２９３細胞では、外因的に発現されたＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａは、野生型ＳｅｒＲＳ（ＳｅｒＲＳＷＴ）よりもはるかに弱いリン酸化を示し（図１Ｆ）、Ｓ２４１および／またはＳ１０１は低酸素ストレス下の主要なリン酸化部位であることが確認された。
【０１４３】
ＡＴＭおよびＡＴＲが低酸素下でＳｅｒＲＳのリン酸化を担うことをさらに確認するために、ＡＴＭおよびＡＴＲをｓｉＲＮＡによって別個にまたは同時にノックダウンした。低酸素により誘導されるＳｅｒＲＳのリン酸化は、ＡＴＭまたはＡＴＲのいずれかがノックダウンされた場合に大幅に阻害され、両方のキナーゼが同時にノックダウンされた場合に完全に遮断された（図１Ｇ）。これらの結果と一致して、低酸素下でのＳｅｒＲＳのリン酸化は、それぞれ特異的なＡＴＭおよびＡＴＲ阻害剤ＫＵ−５５９３３およびＶＥ−８２１によっても遮断することができた（図７Ｃ）。ＳｅｒＲＳのリン酸化はまたＵＶ照射下でも検出された（図７Ｄ）。
【０１４４】
実施例３
リン酸化はヒト細胞およびゼブラフィッシュにおいてＶＥＧＦＡの転写リプレッサーとしてのＳｅｒＲＳを不活化する
この実施例は、ＳｅｒＲＳのリン酸化はＳｅｒＲＳの転写リプレッサー活性の低下をもたらすことを示す。
【０１４５】
ＳｅｒＲＳのリン酸化がＶＥＧＦＡの転写リプレッサーとしてのその役割に影響を及ぼすかどうかを理解するために、リン酸化されたＳｅｒＲＳを模倣するべくＳ１０１およびＳ２４１のアスパラギン酸残基での二重置換を有する突然変異型のＳｅｒＲＳ（ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１ＤまたはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ）を作出した。ＨＥＫ２９３細胞では、ＳｅｒＲＳＷＴおよびＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａとは対照的に、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１ＤはもはやＶＥＧＦＡ転写を抑制することができず（図２Ａ）、リン酸化がＳｅｒＲＳの転写リプレッサー活性を完全に阻害できることを示唆する。
【０１４６】
イン・ビボにおけるＳｅｒＲＳリン酸化の影響を検討するために、Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２に記載されている従前に確立されたゼブラフィッシュ系を使用した。ゼブラフィッシュ胚では、内因性ＳｅｒＲＳ発現はアンチセンスモルホリノ（ＳｅｒＲＳ−ＭＯ）によってノックダウンされ、ＶｅｇｆａのｍＲＮＡレベルに４倍の増加をもたらした（図２Ｂ）。この影響は、ヒトＳｅｒＲＳＷＴ  ｍＲＮＡまたはＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ  ｍＲＮＡをＳｅｒＲＳ−ＭＯと同時注射することによって救済または大幅に救済することができる。しかしながら、図２Ｂに示されるように、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ  ｍＲＮＡの同時注射には救済効果が全く無く、Ｓ１０１およびＳ２４１におけるリン酸化がイン・ビボにおけるＳｅｒＲＳの転写リプレッサー活性を完全に遮断することが確認される。
【０１４７】
実施例４
リン酸化はゼブラフィッシュにおいてＳｅｒＲＳの抗血管新生活性を無効にする
この実施例では、ゼブラフィッシュにおける血管発生に対するＳｅｒＲＳのリン酸化の効果を検討した。
【０１４８】
図２Ｃおよび２は、ＳｅｒＲＳ−ＭＯの注射によるＳｅｒＲＳのノックダウンが、予想されたように、ゼブラフィッシュ胚の６９．７％（ｎ＝２１１中１４７）において異常な過剰体節間血管（ＩＳＶ）分岐の表現型をもたらしたことを示す。これに対して、対照モルホリノ（対照−ＭＯ）を注射したゼブラフィッシュ胚は９．２％（ｎ＝１４２中１３）だけが、過剰ＩＳＶの表現型を示した。ヒトＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ  ｍＲＮＡの同時注射は、異常なＩＳＶ分岐を大幅に救済し（２６．４％、ｎ＝１２５中３３）、これはＳｅｒＲＳＷＴ  ｍＲＮＡの救済効果に匹敵する（１７．９％、ｎ＝１６２中２９）（図２Ｃおよび２Ｄ）。これに対して、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄは、異常なＩＳＶ分岐を救済することができず（６２．７％、ｎ＝１３４中８４）（図２Ｃおよび２Ｄ）、ＳｅｒＲＳのリン酸化はイン・ビボにおいてその抗血管新生活性を遮断することが確認される。
【０１４９】
実施例５
リン酸化はそのＤＮＡ結合能を減弱することによってＳｅｒＲＳを不活化する
この実施例は、リン酸化されたＳｅｒＲＳはＤＮＡ結合能を低減したことを示す。
【０１５０】
ＳｅｒＲＳのリン酸化が転写リプレッサーとしてどのようにその機能を不活化するかという分子機構を説明するために、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳｅｒＲＳ核局在に対する低酸素の影響を調べた。この結果は負であった（図８Ａ）。これに一致して、ＨＥＫ２９３細胞で、外因的に発現されたＳｅｒＲＳＷＴ、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ、およびＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａタンパク質の同様の細胞質／核分布も見られた（図８Ｂ）。
【０１５１】
ＳＩＲＴ２は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４に、ＳｅｒＲＳがＶＥＧＦＡ発現をエピジェネティック的にサイレンシングするために必要な補因子として記載されている。低酸素下でのＳｅｒＲＳとＳＩＲＴ２の間の相互作用を検討した。ＨＥＫ２９３細胞において、細胞を低酸素下で６時間または１２時間培養する前後に同量のＳＩＲＴ２がＳｅｒＲＳと共免疫沈降された（図８Ｃ）。これに一致して、ＳＩＲＴ２は、ＳｅｒＲＳＷＴと同様に強くＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１ＡおよびＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄと相互作用し（図８Ｄ）、低酸素がＳｅｒＲＳ−ＳＩＲＴ２相互作用に影響を及ぼさないことを示す。
【０１５２】
ＳｅｒＲＳとＶＥＧＦＡプロモーターとの相互作用に対する低酸素の影響も調べた。電気泳動移動度シフトアッセイ(electrophoresis mobility shift assay)（ＥＭＳＡ）により検出されるように、ＳｅｒＲＳと、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４においてＶＥＧＦＡプロモーター由来のＳｅｒＲＳ結合部位として従前に同定されている３２Ｐ標識２７ｂｐ  ＤＮＡ断片との間の直接結合は、蛍光体模倣突然変異型ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ（図２Ｅ）によって減弱された。ＨＥＫ２９３細胞で、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄはまた、クロマチン免疫沈降アッセイで決定した場合、ＶＥＧＦＡプロモーターに対する結合の低下も示した（図２Ｆ）。このアッセイをまた低酸素中のＨＥＫ２９３細胞でも行ったところ、ＶＥＧＦＡプロモーターに結合した内因性ＳｅｒＲＳのレベルの段階的低下を示した（図２Ｇ）。これらのデータは、低酸素誘導性のリン酸化は、そのＤＮＡ結合能を減弱することによりＳｅｒＲＳの転写リプレッサー活性を遮断することを示す。
【０１５３】
実施例６
ＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳは低酸素誘導性血管新生を調節する重要経路である
この実施例は、どの程度までＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳ経路が低酸素誘導性ＶＥＧＦＡ発現に寄与するかを検討する実験を記載する。
【０１５４】
ＡＴＭまたはＡＴＲは、ＨＥＫ２９３細胞において、特異的阻害剤によって遮断された。図３Ａに示されるように、ＡＴＲ阻害剤ＶＥ−８２１は、低酸素下でＶＥＧＦＡ誘導を劇的に阻害したが、ＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３の効果は、低いがなお統計的に有意であり、ＡＴＭおよびＡＴＲは低酸素中にＶＥＧＦＡ発現の刺激における重要な役者であることを示唆する。
【０１５５】
ＡＴＭおよびＡＴＲは多くの基質を有し、それらのほとんどはＤＮＡ損傷応答に関与する。ＳｅｒＲＳが、低酸素下でＶＥＧＦＡ発現を刺激するＡＴＭ／ＡＴＲの役割を媒介する主要な基質であるかどうかを調べるために、ＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳ経路を遮断するべくリン酸化欠損ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１ＡをＨＥＫ２９３細胞に導入した。ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａの過剰発現はＶＥＧＦＡ誘導を有意に抑制したが、ＳｅｒＲＳＷＴの過剰発現には効果は無かった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＳｅｒＲＳの転写リプレッサーを不活化するためのＡＴＭ／ＡＴＲにより媒介されるＳｅｒＲＳリン酸化は、低酸素下でＶＥＧＦＡ誘導に重要な役割を果たすことを示す。
【０１５６】
実施例７
ＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳ経路の遮断はＨＩＦノックダウンと共働して低酸素誘導性ＶＥＧＦＡ発現の完全な阻害を達成することができる
ＨＩＦはＶＥＧＦＡ発現および血管新生を促進するための主要な低酸素誘導性転写因子と考えられるが、ＨＩＦ単独の阻害は血管新生を完全に遮断することができなった。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、それはＨＩＦ非依存的経路の関与のためであると考えられる。例えば、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  ２０１３、Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４参照。低酸素応答におけるＡＴＭ／ＡＴＲにより媒介されるＳｅｒＲＳのリン酸化の重要な役割を考慮して、この実施例は、ＶＥＧＦＡ誘導の実質的または完全な阻害がＨＩＦを阻害することにより、また同時に、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａの発現によりＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳ経路を遮断することにより達成できるかどうかを調べる。
【０１５７】
ＨＥＫ２９３細胞をｓｈＨＩＦ−１α構築物およびｓｈＨＩＦ−２α構築物の両方で一緒にトランスフェクトしたが、その組織特異的発現パターンと一致して、ＨＩＦ−２αは細胞に検出できなかった。図３Ｃに示されるように、ＨＥＫ２９３細胞においてｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＩＦ）によってＨＩＦをノックダウンすると、低酸素によるＶＥＧＦＡ誘導を完全には遮断できなかった。しかしながら、ＨＩＦがノックダウンされた場合に構成的に活性なＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａを同時に発現させると、本発明者らは、低酸素下でＶＥＧＦＡ誘導を完全に阻害した（図３Ｃ）。この結果は、ＡＴＭ／ＡＴＲ−ＳｅｒＲＳ経路がＨＩＦ非依存的であることを実証しただけでなく、低酸素誘導性血管新生の完全な抑制を達成するためにＨＩＦ阻害と組み合わせてＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａを使用することの可能性も示唆した。さらなる結果は、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａの過剰発現の上にＨＩＦのノックダウンは付加的な有効性を何ら提供しないことを示し、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１ＡがＨＩＦ−１阻害の効果に完全に取って代わり、それを打ち破り得ることができることを示唆する。
【０１５８】
実施例８
ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａはマウスにおいて低酸素応答を迂回し、血管新生を強く阻害する
この実施例は、哺乳動物においてＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａの活性および低酸素誘導性血管新生におけるＳｅｒＲＳのリン酸化の効果を検討する実験を記載する。それはトリプルネガティブヒト乳癌のマウスモデルで、リン酸化欠損型のＳｅｒＲＳ（ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ）の過剰発現がＨＩＦ−１のノックダウンよりもはるかにロバストに血管新生および腫瘍成長を抑制し得ることを示し、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１ＡがＨＩＦ依存的とＨＩＦ非依存的両方の低酸素応答経路を阻害することを指摘する。
【０１５９】
マトリゲルプラグ血管新生アッセイを用いた。内因性マウスＳｅｒＲＳの発現レベレと同等の発現レベルを達成するために、マウス内皮３Ｂ１１細胞をマウスＳｅｒＲＳＷＴ、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ、またはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ遺伝子で安定にトランスフェクトした（図４Ａ）。操作した３Ｂ１１細胞をイン・ビトロにおいて低温でマトリゲルと混合した。各混合物をマウスに皮下注射し、固化させてプラグとし、そこに血管系の誘導に先立って低酸素環境が形成する。注射の２週間後に、Ｈｉｆ−１αタンパク質レベルの上昇により、マトリゲルプラグ内に低酸素環境が生じたことが確認された（図９）。同時に、プラグ内の微小血管系をＣＤ３１免疫染色によって評価した。ＳｅｒＲＳＷＴの発現は、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄと同様に、微小血管の形成を抑制しなかったが（図４Ｂおよび４Ｃ）、このことは、ＳｅｒＲＳＷＴの抗血管新生活性が低酸素下で不活化されたことを示唆する。しかしながら、図４Ｂおよび４Ｃに示されるように、リン酸化欠損ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａの発現は、マトリゲルプラグ内の微小血管形成を強く抑制し、ＳｅｒＲＳのリン酸化／不活性化がイン・ビボにおける低酸素誘導性血管新生に重要であることを実証する。
【０１６０】
低酸素誘導性血管新生は固形腫瘍の成長に重要であることから、低酸素により誘導されるＳｅｒＲＳのリン酸化／不活性化が腫瘍の血管新生に重要であるかどうかを判定するために実験を行った。ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、内因性タンパク質に比べて高レベルの過剰発現（約１０倍）を得るために、ヒトＳｅｒＲＳＷＴ、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａ、またはＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄ遺伝子で安定にトランスフェクトした（図４Ｄ）。操作した細胞を免疫不全ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスの乳腺に皮下移植した。２週間後、腫瘍異種移植片内の血管系をＣＤ３１染色によって調べた（図４Ｅおよび４Ｆ）。この系で、おそらくは高発現レベルのＳｅｒＲＳがＡＴＭ／ＡＴＲのリン酸化能を飽和したために、ＳｅｒＲＳＷＴは腫瘍血管新生を抑制した。しかしながらやはり、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ａ／Ｓ２４１Ａは、ＳｅｒＲＳＷＴと比較してはるかに強い血管新生の阻害を示した（図４Ｅおよび４Ｆ）。興味深いことに、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄは、腫瘍の血管新生の促進において強い活性を有した。おそらく、ＳｅｒＲＳＳ１０１Ｄ／Ｓ２４１Ｄの過剰発現は、抗血管新生機能を有することが知られている（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）ＳＩＲＴ２を封鎖した。これらの結果は、低酸素誘導性腫瘍血管新生におけるＳｅｒＲＳのリン酸化の重要な役割を実証した。
【０１６１】
実施例９
ＳｅｒＲＳにおけるリン酸化部位の同定
ヒトＳｅｒＲＳタンパク質を翻訳後修飾に関して調べた。ＳｅｒＲＳの大きさに相当するゲルバンドを脱染し、還元し（１０ｍＭ  ＤＴＴ）、アルキル化し（５５ｍＭヨードアセトアミド）、トリプシンで一晩消化した後、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。未処理データを提供される配列を含むカスタム配列データベースに対して検索し、対象タンパク質を３１のユニークなペプチドおよび６２％の配列包括度を有するものと同定した。ＭＳ／ＭＳデータを、所与の配列に対して、セリンにおける潜在的リン酸化に関して検索した。リン酸化部位は、ヒトＳｅｒＲＳタンパク質のＳ７９、Ｓ８６、Ｓ３９４、およびＳ３９６に見出された。
【０１６２】
実施例１０
ＶＥＧＦＡ発現に及ぼす、ＳｅｒＲＳ上のリン酸化部位に対する修飾による効果
この実施例では、野生型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質およびいつくかの突然変異型ヒトＳｅｒＲＳタンパク質をＶＥＧＦＡ発現に影響を及ぼすそれらの能力に関して調べた。
【０１６３】
ＨＥＫ２９３細胞を野生型（ＷＴ）ＳｅｒＲＳまたはＳｅｒＲＳ突然変異体でトランスフェクトした。それぞれ非リン酸化状態およびリン酸化状態を模倣するために、潜在的リン酸化可能残基（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはチロシン（Ｙ））をアラニン（Ａ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換した。トランスフェクション２４時間後に、細胞を採取し、ＥＧＦＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し、相対的ＶＥＧＦＡ転写を、β−アクチンに対して正規化した後にプロットした（平均±ＳＥＭ）。これらの結果を図１０に示す。図１０に示されるように、ＳｅｒＲＳ上のリン酸化部位の修飾は、ＶＥＧＦＡ発現を調節するＳｅｒＲＳの能力を変化させることができる。
【０１６４】
実施例１１
低酸素中のＶＥＧＦＡプロモーターへの内因性ＳｅｒＲＳの結合
ＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦＡプロモーターに対するＳｅｒＲＳ、ｃ−Ｍｙｃ、およびＨｉｆ１αの結合に及ぼす低酸素の効果をクロマチンＩＰ（ＣｈＩＰ）によって調べた。図１２に示されるように、低酸素中にＳｅｒＲＳのＤＮＡ結合は低下し、これにはｃ−ＭｙｃおよびＨｉｆ１αのＤＮＡ結合の増加が伴った。
【０１６５】
ＳｅｒＲＳのＤＮＡ結合の低下は、低酸素中にＳｅｒＲＳのリン酸化によって引き起こされると考えられる。Ｈｉｆ１αおよびｃ−ＭｙｃのＤＮＡ結合の同時増加は、ＭｙｃおよびＨｉｆ１αの両方の活性化にＳｅｒＲＳの不活性化が必要とされる可能性があることを示す。
【０１６６】
従前に記載した実施形態の少なくとも一部で、実施形態で使用される１以上の要素は、そのような置換が技術的に実現可能でないという場合以外は、別の実施形態で互換的に使用可能である。上記の方法および構造に対して、特許請求される対象の範囲から逸脱することなく様々な他の省略、付加および修飾が行われ得ることが当業者に認識されるであろう。このような総ての修飾および変更が添付の特許請求の範囲により定義されるように、対象の範囲内に入ることが意図される。
【０１６７】
本明細書における実質的にいずれの複数形および／または単数形の用語の使用についても、当業者は、文脈および／または適用に適当であれば、複数から単数へおよび／または単数から複数へ言い換えることができる。様々な単数／複数の入れ替えは、明瞭とするために本明細書では明示的に示され得る。
【０１６８】
一般に、本明細書で、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は全般的に「非限定(open)」の用語として意図される（例えば、用語「含む(including)」は、「限定されるものではないが含む」と解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む(includes)」は、「限定されるものではないが含む」と解釈されるべきであるなど）ことが当業者に理解されるであろう。さらに、提示された請求項記載の特定の数が意図される場合には、そのような意図は請求項に明示的に記載され、そのような記載がない場合には、そのような意図は存在しないということも当業者に理解されるであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項記載を提示するために導入節「少なくとも１つの」および「１以上の」の使用を含むことがある。しかしながら、このような節の使用は、不定冠詞「１つの(a)」または「１つの(an)」による請求項記載の提示は、同じ請求項が導入節「１以上の」または「少なくとも１つの」および「１つの(a)」または「１つの(an)」などの不定冠詞を含んでいる場合でさえ、そのような提示された請求項記載を含む任意の特定の請求項を、そのような記載１つだけを含む実施形態に限定することを暗示するものと解釈されるべきではなく（例えば、「１つの(a)」および／または「１つの(an)」は、「少なくとも１つの」または「１以上の」を意味することが意図されるべきである）、同じことが請求項記載を提示するために使用される定冠詞の使用についても言える。加えて、提示される請求項記載の特定の数が明示的に記載されているとしても、当業者は、このような記載は少なくとも記載の数を意味すると解釈されるべきである（例えば、他の修飾句なく「２つの記載」という無冠詞の記載は、少なくとも２つの記載、または２以上の記載を意味する）ことを認識するであろう。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣなどのうち少なくとも１つ」と同様の慣例が使用される場合、一般にこのような構文は、当業者がこの慣例を理解するという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有する系」には、限定されるものではないが、Ａ単独を、Ｂ単独を、Ｃ単独を、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、および／またはＡとＢとＣを一緒に有する系などが含まれる）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどのうち少なくとも１つ」と同様の慣例が使用される場合、一般にこのような構文は、当業者がこの慣例を理解するという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうち少なくとも１つを有する系」は、限定されるものではないが、Ａ単独を、Ｂ単独を、Ｃ単独を、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、および／またはＡとＢとＣを一緒に有する系などが含まれる）。さらに、事実上いずれの離接語および／または２以上の選択的用語を提示する節は、明細書であれ特許請求の範囲であれ図面であれ、これらの用語の１つ、これらの用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図することが理解されるべきであることが当業者に理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という節は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
【０１６９】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群の用語で記載される場合には、当業者は本開示がまたそれによりマーカッシュ群の任意の個々の要素または要素のサブグループに関して記載されることを認識するであろう。
【０１７０】
当業者に理解されているように、書面による説明を提供するということなど、任意のおよびあらゆる目的で、本明細書に開示される総ての範囲がまた、任意のおよびあらゆる可能性のある部分範囲およびそれらの部分範囲の組合せを包含する。挙げられているいずれの範囲も、同じ範囲が少なくとも等しく２分１、３分１、４分１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に記載し、それが可能であると容易に認識することができる。限定されない例として、本明細書に述べられる各範囲は、下３分１、中３分１および上３分１などに容易に分割できる。これもまた当業者に理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などの総ての用語が記載された数を含み、上述のように後に部分範囲に分割可能な範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は各個の要素を含む。従って、例えば、１〜３項を有する群は、１、２、または３項を有する群を指す。同様に、１〜５項を有する群は、１、２、３、４、または５項を有する群を指すなどである。
【０１７１】
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態も当業者には自明であろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は説明のためのものであり、限定を意図したものではなく、真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲に示される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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