(57)【要約】  本発明は、二本鎖クロストリジウム神経毒の組換え製造に適している、活性化工程の必要性を回避する方法、細胞及びキット並びに療法における使用に適している、それによって得られる二本鎖クロストリジウム神経毒を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖クロストリジウム神経毒を製造する方法であって、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を、異種宿主細胞において別個に発現させることを含み、前記の第1及び第2の遺伝子が、前記宿主細胞の酸化環境において発現される、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化環境が、前記宿主原核細胞の細胞質である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記原核細胞が、ジスルフィド結合形成に関与している少なくとも1つの遺伝子が、その他の点においては同一の野生型細胞と比較して、細胞質において過剰発現される、及び/又はジスルフィド結合還元に関与している少なくとも1つの遺伝子が、その他の点においては同一の野生型細胞と比較して、抑制される原核細胞である、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項５】
前記原核細胞が、AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami及びSHuffle株から選択される株に由来する大腸菌(E.coli)細胞である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記クロストリジウム神経毒軽鎖が、BoNT A型、B型、C型、D型、E型、F型又はG型又はTeNT軽鎖から選択され、前記クロストリジウム神経毒重鎖が、BoNT A型、B型、C型、D型、E型、F型又はG型又はTeNT重鎖から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記クロストリジウム神経毒軽鎖及び前記クロストリジウム神経毒重鎖が、同一BoNT血清型又は亜型に由来する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記クロストリジウム神経毒軽鎖及び前記クロストリジウム神経毒重鎖が、異なるBoNT血清型又は亜型に由来する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする前記の第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする前記の第2の遺伝子が、同一ベクター上に存在する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする前記の第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする前記の第2の遺伝子が、異なるベクター上に存在する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
二本鎖クロストリジウム神経毒を前記宿主細胞から回収する工程をさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を含む細胞であって、前記の第1及び第2の遺伝子が、前記細胞の酸化環境において発現される、細胞。
【請求項１３】
a.酸化環境を含む細胞、
b.クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子、及び
c.クロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子
を含み、
前記の第1及び第2の遺伝子は、前記細胞の前記酸化環境において、クロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖を別個に発現するのに適している、キット。
【請求項１４】
請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって得られる二本鎖クロストリジウム神経毒。
【請求項１５】
請求項14に記載の二本鎖クロストリジウム神経毒を含む医薬組成物。
【請求項１６】
二本鎖クロストリジウム神経毒を製造するための酸化的細胞質を有する宿主細胞の使用であって、前記宿主細胞が、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を含み、前記の第1及び第2の遺伝子が、前記宿主細胞の酸化的細胞質において発現される、宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化工程の必要性を免れる、二本鎖クロストリジウム神経毒の組換え製造のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム属(Clostridia)の細菌は、高度に強力な特異的なタンパク質毒素を産生し、これは、送達される神経細胞及びその他の細胞を毒することができる。このようなクロストリジウム毒素の例として、C.テタニ(tetani)によって産生される神経毒(TeNT)、及びC.ボツリヌム(botulinum)血清型A〜Gによって産生される神経毒(BoNT)並びにC.バラティ(baratii)及びC.ブチリカム(butyricum)によって産生される神経毒が挙げられる。
【０００３】
クロストリジウム神経毒のうちいくつかは、公知の毒素の中で最も強力な毒素である。例として、ボツリヌス神経毒は、血清型に応じて0.5〜5ng/kgの範囲のマウスの半致死量(LD50)値を有する。テタヌス及びボツリヌス毒素の両方とも、冒されたニューロンの機能、具体的には、神経伝達物質の放出を阻害することによって作用する。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部で作用し、末梢神経系においてコリン作動性伝達を阻害するが、破傷風菌毒素は、中枢神経系において作用する。
【０００４】
クロストリジウム神経毒は、SNAREタンパク質として知られる細胞内輸送タンパク質(例えば、SNAP-25、VAMP又はシンタキシン)をタンパク分解性に切断することによって作用する-Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons、Inc.を参照のこと。頭字語SNAREは、可溶性NSF付着受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)に由来し、ここで、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子を意味する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞融合にとって、したがって、細胞からの小胞輸送を介した分子の分泌にとって不可欠である。プロテアーゼ機能は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質の高基質特異性を示す。したがって、ひとたび、所望の標的細胞に送達されると、非細胞傷害性プロテアーゼは、標的細胞からの細胞性分泌を阻害可能である。
【０００５】
天然では、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、これがタンパク質切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に連結された2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置する、活性化部位と呼ばれることが多い特定の切断部位で起こる。クロストリジウム神経毒の完全な効力が達成されるのは、この活性化事象を通じてのみである。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)及びおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。H鎖は、N末端側転位置構成成分(HNドメイン)及びC末端側標的化構成成分(HCドメイン)を含む。切断部位は、L鎖及び転位置ドメイン構成成分の間に位置する。HCドメインのその標的神経細胞との結合及びエンドソームによる結合された毒素の細胞への内部移行後、HNドメインは、L鎖をエンドソーム膜を横断してサイトゾル中に転位置し、L鎖は、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
【０００６】
ボツリヌス神経毒は、弛緩性筋肉麻痺を引き起こし、コリン作動性分泌を阻害するその能力についてよく知られている。これらの特性が、ボツリヌス神経毒を、眉間の皴又は多動性の顔面の皴、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の活動亢進、発汗過多、鼻腔口唇の皴、頸部ジストニア、眼瞼痙攣、痙縮及び発汗過多の治療を含む種々の医学的手順及び美容的手順において使用されるようにしてきた。
【０００７】
BoNTを含む現在承認されているすべての薬物/美容用調製物は、クロストリジウム株から精製された天然に存在する神経毒を含有している(DYSPORT(登録商標)、BOTOX(登録商標)又はXEOMIN(登録商標)の場合にはBoNT/A及びMYOBLOC(登録商標)の場合にはBoNT/B)。BoNT製剤の伝統的な製造は、C.ボツリヌム(botulinum)の培養と、それに続く、ボツリヌス神経毒複合体又は複合遊離神経毒の単離及び精製によって実施される。C.ボツリヌム(botulinum)は、芽胞形成性細菌であり、したがって、厄介である、特別な培養装置及び施設を必要とする。したがって、大腸菌(E.coli)などの異種宿主におけるBoNTの組換え製造は、有利であろう。しかし、クロストリジウム神経毒の組換え製造の制限段階は、活性化工程である。
【０００８】
実際、組換えクロストリジウム神経毒製造の現在の実施は、大腸菌(E.coli)などの適した異種宿主において単一ポリペプチド鎖としてクロストリジウム神経毒を発現することである(上流プロセス)。この初期工程に、普通、一連の精製工程(例えば、クロマトグラフィーによる)、及び、単鎖不活性(又はほとんど活性ではない)クロストリジウム神経毒を二本鎖の十分に活性な形態に変換する適したプロテアーゼの添加を必要とする活性化工程が続く(下流プロセス)。活性化工程は、クロストリジウム神経毒活性化ループの特異的、かつ、制御された切断を必要とする。この切断は、適したプロテアーゼを使用することによって達成されて、ジスルフィド結合によって連結される軽鎖及び重鎖を含む所望の二本鎖クロストリジウム神経毒を生成する。この活性化工程は、クロストリジウム神経毒製造の極めて困難な段階とわかっている。特に、切断事象は、活性化ループの外側で起こることもあり、末端切断型クロストリジウム神経毒の生成につながることもあり、次いで、これを全長二本鎖クロストリジウム神経毒から分離しなくてはならない。さらに、インキュベーション期間後、最終医薬製剤を汚染することを避けるために、活性化プロテアーゼが、活性化された毒素から除去されなくてはならない。
【０００９】
活性化段階で遭遇され得る問題として:
- 他の部位での不要な切断(短縮化及び効力の低減/喪失につながる)を避けながら活性化ループを切断するプロテアーゼの同定における難しさ、
- 最終製剤からの活性化プロテアーゼの除去における難しさ、
- 開発及び商業化製剤の製造のためのGMP等級活性化プロテアーゼの調達における難しさ、
- 最良の活性化条件(温度、時間、活性化酵素/神経毒比…)を調べるための時間のかかるアプローチ
が挙げられる。
【００１０】
したがって、活性化工程の必要性を回避するであろうクロストリジウム神経毒の組換え製造のための方法は、大きな利益となるであろう。
【００１１】
Maisey et al. 1988 (MAISEY、E. Anne、et al. "Involvement of the constituent chains of botulinum neurotoxins A and B in the blockade of neurotransmitter release." European Journal of Biochemistry 177.3 (1988): 683-691.)では、アンフォールディングされている予め精製された毒素を使用して二本鎖BoNT/A及びBを形成しようと試み、得られたドメインを別個に再フォールディングした。別個のドメインが組み合わされると、彼らは、毒素の>70％が二本鎖毒素を形成するが、効力は大幅に低減されることがわかった。その考察では、彼らは、この効力の低減は、遊離ドメイン、非共有結合会合又は不正確なジスルフィド形成の存在による可能性が高いことを示唆している。
【００１２】
US2006/0024794 A1では、バキュロウイルス(baclovirus)発現系を使用して昆虫細胞において、BoNTドメインを共発現させて、二本鎖毒素を製造する可能性に取り組んでいる。しかし、特に、US2006/0024794 A1の図10及び11に示されるデータは、少ない割合の二本鎖神経毒が形成されるが、クロストリジウム神経毒の大部分は、遊離軽鎖及び重鎖として残存することを示す。
【００１３】
したがって、当技術分野では、二本鎖クロストリジウム神経毒の組換え製造のための改善された方法が必要である。
【発明の概要】
【００１４】
第1の態様において、本発明は、二本鎖クロストリジウム神経毒を製造する方法であって、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を、異種宿主細胞において別個に発現させることを含み、前記の第1及び第2の遺伝子が、前記宿主細胞の酸化環境において発現される方法を提供する。
【００１５】
第2の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を含む細胞であって、前記の第1及び第2の遺伝子が、前記宿主細胞の酸化環境において発現される細胞を提供する。
【００１６】
第3の態様では、本発明は、
a.酸化環境を含む細胞、
b.クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子、及び
c.クロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子
を含むキットであって、
前記の第1及び第2の遺伝子が、前記細胞の前記酸化環境においてクロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖を別個に発現するのに適しているキットを提供する。
【００１７】
第4の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られた二本鎖クロストリジウム神経毒を提供する。
【００１８】
第5の態様では、本発明は、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
第6の態様では、本発明は、二本鎖クロストリジウム神経毒を生成するための酸化的細胞質を有する宿主細胞の使用を提供し、ここで、前記宿主細胞は、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を含み、前記の第1及び第2の遺伝子は、前記宿主細胞の酸化的細胞質において発現される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、異種宿主細胞の酸化環境内でクロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖を別個に共発現させることによって、2つのドメインが一緒にフォールディングして、著しく増大した効率で二本鎖クロストリジウム神経毒を形成することが可能になるという本発明者らによる発見に基づく。
【００２１】
第1の態様において、本発明は、二本鎖クロストリジウム神経毒を製造する方法であって、異種宿主細胞において、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を別個に発現させることを含み、第1及び第2の遺伝子が、前記宿主細胞の酸化環境において発現される方法を提供する。
【００２２】
用語「酸化環境」とは、本明細書において、シスチン形成(システインの酸化二量体)を促進する細胞環境を意味する。これは、一般に、それだけには限らないが、チオレドキシンベースのタンパク質(例えば、DsbA)及びグルタチオンなどのさまざまな酸化還元タンパク質のバランスによって達成される。酸化環境の限定されない例は、グラム陰性菌のペリプラズム又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)、昆虫又は酵母細胞などの真核細胞の発現系の小胞体がある。
【００２３】
多数の原核生物及び真核生物発現系が、技術水準において公知である。宿主細胞は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)及びバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)などの原核細胞から、又はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの真核細胞から選択できる。昆虫細胞又は哺乳動物細胞などの高等真核細胞も同様に使用してもよいが、それでも、C.ボツリヌム(botulinum)のような、グリコシル化装置を有さない宿主細胞が好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。より好ましい実施形態では、酸化環境は、原核細胞の細胞質である。
【００２５】
ジスルフィド結合は、共有結合をもたらす2つのシステイン側鎖の間のスルフヒドリル基の酸化によって形成される。天然では、細胞は、その細胞質中にジスルフィド結合を還元するように特化された酵素を有し(還元性細胞質)、ジスルフィド結合の形成は、グラム陰性菌中のペリプラズム又は真核生物における小胞体(ER)などの細胞質外環境において生じる。したがって、大腸菌(E.coli)などの細胞の細胞質におけるジスルフィド結合を必要とする組換えタンパク質の製造は、困難である。
【００２６】
細菌細胞の細胞質を、遺伝子工学を介して、例えば、細胞質において、ジスルフィド結合形成に関与する遺伝子を発現させること及び/又はジスルフィド結合還元に関与する遺伝子を抑制すること及び/又はこのような遺伝子を修飾することによって酸化性にすることができる。例えば、チオレドキシン(trxB)及び/もしくはグルタチオン(gor又はgshA)経路の遺伝子中に突然変異を導入すること並びに/又はDsbCを細胞質的に過剰発現させることによって、細胞質環境を酸化性にすることができ、ジスルフィド結合の形成を可能にする(Bessette、Paul H.、et al. "Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm." Proceedings of the National Academy of Sciences 96.24 (1999): 13703-13708; Lobstein、Julie、et al. "SHuffle、a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm." Microbial cell factories 11.1 (2012): 1)。
【００２７】
酸化環境を有する市販の大腸菌(E.coli)株の例として、
- Novagenから入手可能であり、trxB遺伝子が突然変異されているAD494及びBL21trxB株、
- Novagenから入手可能であり、gor及びtrxB遺伝子が突然変異されているOrigami(商標)株(Origami、Origami2、Origami B)、
- Novagenから入手可能であり、gor及びtrxB遺伝子が突然変異されているRosetta-gami(商標)株(Rosetta-gami、Rosetta-gami2及びRosetta-gami B)、
- New England Biolabsから入手可能であり、gor及びtrxB遺伝子が突然変異されており、そのシグナル配列を欠くDsbC遺伝子が細胞質において発現される、SHuffle(登録商標)株(SHuffle T7、SHuffle T7 express)。
【００２８】
好ましい実施形態では、細胞は、ジスルフィド結合形成に関与している少なくとも1つの遺伝子が、その他の点においては同一の野生型細胞と比較して細胞質において過剰発現される、及び/又はジスルフィド結合還元に関与している少なくとも1つの遺伝子が、その他の点においては同一の野生型細胞と比較して抑制される原核細胞である。一実施形態では、原核細胞は、AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami及びSHuffle株から選択される株に由来する大腸菌(E.coli)細胞である。好ましい実施形態では、原核細胞は、Origami又はSHuffle株に由来する大腸菌(E.coli)細胞である。
【００２９】
用語「神経毒」とは、本明細書において、神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する任意のポリペプチドを意味する。このプロセスは、神経毒の低又は高親和性受容体との結合、神経毒の内部移行、神経毒のエンドペプチダーゼ部分の細胞質への転位置及び神経毒基質の酵素的修飾を包含する。より詳しくは、用語「神経毒」は、神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害するクロストリジウム属(Clostridium)の細菌によって産生された任意のポリペプチド及び組換え技術又は化学技術によって製造されたこのようなポリペプチドを包含する。毒素の活性形態は、二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)及びおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。L鎖は、エンドペプチダーゼ活性を含む。H鎖は、各々およそ50kDaの分子量を有する2つの機能的に別個のドメイン: 即ち、神経毒が標的細胞の表面に位置する受容体との結合するのを可能にする「HCドメイン」、及び、軽鎖(エンドペプチダーゼ)が細胞質へ転位置するのを可能にする「HNドメイン」を含む。HCドメインは、2つの構造的に別個のサブドメイン、各々およそ25kDaの分子量を有する「HCNサブドメイン」(HCドメインのN末端側部分)及び「HCCサブドメイン」(HCドメインのC末端側部分)からなる。用語「二本鎖クロストリジウム神経毒」とは、本明細書において、ジスルフィド結合によって連結されるクロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖からなる活性神経毒を意味する。本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒は、標的細胞と結合可能であり、軽鎖を、標的細胞の細胞質中に転位置させることが可能であり、SNAREタンパク質を切断し、それによって、標的の細胞の分泌能力を損なうことが可能であることは理解される。
【００３０】
異なるボツリヌス神経毒(BoNT)血清型は、特定の中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、血清型によるこのような分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性百分率と相関する。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸配列同一性百分率に基づいて異なる亜型にさらに分けられる。BoNT/Aアミノ酸配列の一例が、配列番号1(UniProt受託番号A5HZZ9)として提供される。BoNT/Bアミノ酸配列の一例は、配列番号2(UniProt受託番号B1INP5)として提供される。BoNT/Cアミノ酸配列の一例は、配列番号3(UniProt受託番号P18640)として提供される。BoNT/Dアミノ酸配列の一例は、配列番号4(UniProt受託番号P19321)として提供される。BoNT/Eアミノ酸配列の一例は、配列番号5(受託番号WP_003372387)として提供される。BoNT/Fアミノ酸配列の一例は、配列番号6(UniProt受託番号Q57236)として提供される。BoNT/Gアミノ酸配列の一例は、配列番号7(受託番号WP_039635782)として提供される。テタヌス神経毒(TeNT)アミノ酸配列の一例は、配列番号8(UniProt受託番号P04958)として提供される。
【００３１】
BoNT/Aをコードする核酸配列の一例は、配列番号9として提供される。BoNT/Bをコードする核酸配列は、配列番号10として提供される。BoNT/Cをコードする核酸配列は、配列番号11として提供される。BoNT/Dをコードする核酸配列は、配列番号12として提供される。BoNT/Eをコードする核酸配列は、配列番号13として提供される。BoNT/Fをコードする核酸配列は、配列番号14として提供される。BoNT/Gをコードする核酸配列は、配列番号15として提供される。テタヌス神経毒(TeNT)配列をコードする核酸配列は、配列番号16として提供される。
【００３２】
例示的L、HN、HCN及びHCCアミノ酸ドメインは、表1に示されている。
【表１】
2019531721.tif 000002
【００３３】
L、HN、HCN及びHCCドメインをコードする例示的核酸配列は、表2に示されている。
【表２】
2019531721.tif 000003
【００３４】
亜血清型に応じてわずかな変動が起こり得るので、上記で同定された参照配列は、ガイドと考えられるべきである。例として、US2007/0166332(出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする)には、わずかに異なるクロストリジウム配列が引用されている。
【００３５】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖は、BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型又はG型又はTeNTに由来する。
【００３６】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒重鎖は、BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型又はG型又はTeNTに由来する。
【００３７】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖は、BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型又はG型又はTeNTに由来し、クロストリジウム神経毒重鎖は、BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型又はG型又はTeNTに由来する。
【００３８】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖は、同一血清型又は亜型に由来する。
【００３９】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖は、異なる血清型又は亜型に由来する。
【００４０】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖は、以下から選択される配列を含む:
- 配列番号1のアミノ酸残基1〜448又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号2のアミノ酸残基1〜441又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号3のアミノ酸残基1〜449又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号4のアミノ酸残基1〜442又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号5のアミノ酸残基1〜423又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号6のアミノ酸残基1〜439又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号7のアミノ酸残基1〜446又はG対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号8のアミノ酸残基1〜456又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号9のヌクレオチド1〜1344によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号10のヌクレオチド1〜1323によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号11のヌクレオチド1〜1347によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号12のヌクレオチド1〜1326によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号13のヌクレオチド1〜1269によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号14のヌクレオチド1〜1317によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号15のヌクレオチド1〜1338によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、並びに
- 配列番号16のヌクレオチド1〜1368によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列。
【００４１】
クロストリジウム神経毒軽鎖は、SNAREタンパク質を切断可能であるということは理解される。
【００４２】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒重鎖は、以下から選択される配列を含む:
- 配列番号1のアミノ酸残基449〜1296又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号2のアミノ酸残基442〜1291又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号3のアミノ酸残基450〜1291又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号4のアミノ酸残基443〜1276又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号5のアミノ酸残基424〜1252又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号6のアミノ酸残基440〜1278又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号7のアミノ酸残基447〜1297又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号8のアミノ酸残基457〜1315又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号9のヌクレオチド1345〜3888によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号10のヌクレオチド1324〜3873によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号11のヌクレオチド1348〜3873によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号12のヌクレオチド1327〜3828によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号13のヌクレオチド1270〜3756によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号14のヌクレオチド1318〜3834によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号15のヌクレオチド1339〜3891によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、並びに
- 配列番号16のヌクレオチド1369〜3945によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列。
【００４３】
クロストリジウム神経毒重鎖は、標的細胞と結合可能であり、軽鎖を、標的細胞の細胞質中に転位置可能であるということは理解される。
【００４４】
本発明のクロストリジウム神経毒重鎖のHN、HCN及びHCCドメインは、同一又は異なるクロストリジウム血清型又は亜型に由来し得るということも理解される。
【００４５】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒重鎖は、HN、HCN及びHCCドメインを含み、ここで、
・HNドメインは、
- 配列番号1のアミノ酸残基449〜872又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号2のアミノ酸残基442〜859又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号3のアミノ酸残基450〜867又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号4のアミノ酸残基443〜863又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号5のアミノ酸残基424〜846又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号6のアミノ酸残基440〜865又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号7のアミノ酸残基447〜864又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号8のアミノ酸残基457〜880又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号9のヌクレオチド1345〜2616によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号10のヌクレオチド1324〜2577によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号11のヌクレオチド1348〜2601によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号12のヌクレオチド1327〜2589によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号13のヌクレオチド1270〜2538によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号14のヌクレオチド1318〜2595によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号15のヌクレオチド1339〜2592によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、並びに
- 配列番号16のヌクレオチド1369〜2640によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
から選択される配列を含み、
・HCNドメインは、
- 配列番号1のアミノ酸残基873〜1094又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号2のアミノ酸残基860〜1081又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号3のアミノ酸残基868〜1095又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号4のアミノ酸残基884〜1082又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号5のアミノ酸残基847〜1069又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号6のアミノ酸残基866〜1087又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号7のアミノ酸残基865〜1089又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号8のアミノ酸残基881〜1111又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号9のヌクレオチド2617〜3282によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号10のヌクレオチド2578〜3243によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号11のヌクレオチド2602〜3285によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号12のヌクレオチド2590〜3246によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号13のヌクレオチド2539〜3207によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号14のヌクレオチド2596〜3261によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号15のヌクレオチド2593〜3267によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、並びに
- 配列番号16のヌクレオチド2641〜3333によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
から選択される配列を含み、
・HCCドメインは、
- 配列番号1のアミノ酸残基1095〜1296又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号2のアミノ酸残基1082〜1291又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号3のアミノ酸残基1096〜1291又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号4のアミノ酸残基1083〜1276又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号5のアミノ酸残基1070〜1252又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号6のアミノ酸残基1088〜1278又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号7のアミノ酸残基1090〜1297又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
配列番号8のアミノ酸残基1112〜1315又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列、
- 配列番号9のヌクレオチド3283〜3888によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号10のヌクレオチド3244〜3873によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号11のヌクレオチド3286〜3873によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号12のヌクレオチド3247〜3828によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号13のヌクレオチド3208〜3756によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号14のヌクレオチド3262〜3834によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
- 配列番号15のヌクレオチド3268〜3891によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、並びに
- 配列番号16のヌクレオチド3334〜3945によって、又はそれに対して少なくとも70％、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
から選択される配列を含む。
【００４６】
2つ以上の核酸又はアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、アラインされた配列によって共有される同一位置の同一ヌクレオチド/アミノ酸の数の関数である。したがって、同一性％は、アラインされた配列中のヌクレオチド/アミノ酸の総数によって除され、100が乗じられた、アラインメント中の各位置の同一ヌクレオチド/アミノ酸の数として算出され得る。配列同一性％の算出はまた、2つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要があるキャップの数及び各ギャップの長さも考慮し得る。2つ以上の配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、当業者によく知られる特定の数学的アルゴリズム、例えば、BLASTを使用して実施できる。
【００４７】
軽鎖及び/又は重鎖は、モザイク神経毒に由来し得る。この文脈において使用される「モザイク神経毒」という用語は、別の型のクロストリジウム毒素(例えば、異なる血清型のクロストリジウム神経毒)に由来する、通常は含まれないような少なくとも1つの機能ドメインを含む天然発生のクロストリジウム神経毒を意味する。モザイク神経毒の例として、天然に存在するBoNT/DC及びBoNT/CDがある。BoNT/DCは、血清型DのL鎖及びHNドメイン並びに血清型CのHCドメインを含むが、BoNT/CDは、血清型CのL鎖及びHNドメイン並びに血清型DのHCドメインからなる。
【００４８】
軽鎖及び/又は重鎖は、改変神経毒又はその誘導体に由来し得るが、それは、以下に記載されるものを含み、それに限定されない。改変神経毒又は誘導体は、天然(非修飾)形態の神経毒と比較して修飾されている1個以上のアミノ酸を含有し得る、又は天然(非修飾)形態の毒素中には存在しない1個以上の挿入されたアミノ酸を含有し得る。例として、改変クロストリジウム神経毒は、天然(非修飾)クロストリジウム神経毒配列に対して、1つ以上のドメイン中に修飾されたアミノ酸配列を有し得る。このような修飾は、神経毒の機能的側面、例えば、生物活性又は持続性を修飾し得る。したがって、一実施形態では、第1の神経毒及び/又は第2の神経毒は、改変神経毒又は改変神経毒誘導体である。
【００４９】
改変神経毒は、標的細胞上の低又は高親和性神経毒受容体と結合する能力、神経毒のエンドペプチダーゼ部分(軽鎖)を細胞の細胞質中に転位置する能力及びSNAREタンパク質を切断する能力から選択される、神経毒の少なくとも1つの機能を保持する。好ましくは、改変神経毒は、これらの機能のうち少なくとも2つを保持する。より好ましくは、改変神経毒は、これらの3つの機能を保持する。
【００５０】
改変神経毒は、重鎖のアミノ酸配列中に1以上の修飾を有してもよく(改変HCドメインなど)、前記の改変重鎖は、天然(非修飾)神経毒よりも高い又は低い親和性で標的神経細胞と結合する。HCドメイン中のこのような修飾は、標的神経細胞のガングリオシド受容体及び/又はタンパク質受容体との結合を変更するHCドメインのガングリオシド結合部位中又はタンパク質(SV2又はシナプトタグミン)結合部位中の修飾残基を含み得る。このような改変神経毒の例は、WO2006/027207及びWO2006/114308に記載されており、その両方ともその全文が参照により本明細書に取り込まれる。
【００５１】
改変神経毒は、軽鎖のアミノ酸配列中に1以上の修飾、例えば、改変LCのSNAREタンパク質特異性を変更又は修飾し得る、基質結合ドメイン又は触媒ドメインにおける修飾を有し得る。このような改変神経毒の例は、WO2010/120766及びUS2011/0318385に記載されており、その両方ともその全文が参照により本明細書に取り込まれる。
【００５２】
改変神経毒は、改変神経毒の生物活性及び/又は生物学的持続性を増大又は減少させる1以上の修飾を含み得る。例えば、改変神経毒は、ロイシン-又はチロシン-ベースのモチーフを含んでもよく、前記モチーフは、改変神経毒の生物活性及び/又は生物学的持続性を増大又は減少させる。適したロイシン-ベースのモチーフとして、xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL及びxExxxLM(式中、xは任意のアミノ酸である)が挙げられる。適したチロシン-ベースのモチーフとして、Y-x-x-Hy(式中、Hyは疎水性アミノ酸である)が挙げられる。ロイシン-及びチロシン-ベースのモチーフを含む改変神経毒の例は、その全文が参照により本明細書に取り込まれるWO2002/08268に記載されている。
【００５３】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、再標的化される神経毒である。用語「再標的化される神経毒」(「標的化される分泌阻害剤」、「TSI」、「TVEMP」又は「TEM」とも呼ばれる)とは、本明細書において、非クロストリジウム受容体と結合するターゲティング部分(TM)を含むクロストリジウム神経毒を意味する。TMは、クロストリジウム神経毒重鎖のHC又はHCCドメインの一部又はすべてと置き換わり得る。再標的化される神経毒の例は、WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO01/53336、WO02/07759 WO2005/023309、WO2006/026780、WO2006/099590、WO2006/056093、WO2006/059105、WO2006/059113、WO2007/138339、WO2007/106115、WO2007/106799、WO2009/150469、WO2009/150470、WO2010/055358、WO2010/020811、WO2010/138379、WO2010/138395、WO2010/138382、WO2011/020052、WO2011/020056、WO2011/020114、WO2011/020117、WO2011/20119、WO2012/156743、WO2012/134900、WO2012/134897、WO2012/134904、WO2012/134902、WO2012/135343、WO2012/135448、WO2012/135304、WO2012/134902、WO2014/033441、WO2014/128497、WO2014/053651、WO2015/004464に開示されており、それらのすべては、参照により本明細書に取り込まれる。
【００５４】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする遺伝子は、同一のベクター上に存在する。
【００５５】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする遺伝子は、異なるベクター上に存在する。
【００５６】
特に、大腸菌(E.coli)において共発現を達成するために、任意の発現ベクター、例えば、pK7、pJ401、pBAD又はpETベクターを使用できる。各ドメインを発現させるために別個のベクターを使用する場合には、プラスミド安定性を補助するために、異なる抗生物質耐性マーカー及び複製の起点を使用することが好ましい。単一ベクターアプローチを用いる場合には、一般に、別個のプロモーター及びリボソーム結合部位の制御下に遺伝子を有することが有益であるが、これは必須ではない。最後に、両戦略とも同種のプロモーターによって両遺伝子を制御できる、又は各々のために異なるもの、例えば、T7-lac、T5-lac、rhaBAD及びaraBADプロモーターを利用できる。
【００５７】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする遺伝子は、単数又は複数のDNA又はRNAベクター、好ましくは、プロモーター及びターミネーターを含む単数又は複数のDNAベクターの一部として調製される。適したプロモーター及びターミネーター配列は、当技術分野で周知である。
【００５８】
プロモーターの選択は、この場合には、発現に使用される発現系に応じて変わる。一般に、構成プロモーターが好ましいが、誘導プロモーターも同様に使用され得る。この方法で生成される構築物は、ベクターの少なくとも1つの部分、特に、調節エレメントを含み、ベクターは、例えば、A-誘導体、アデノウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、SV40ウイルス及びレトロウイルスから選択される。ベクターは、所与の宿主細胞において遺伝子を発現可能であることが好ましい。
【００５９】
一実施形態では、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する:
【表Ａ】
2019531721.tif 000004
【００６０】
本発明の遺伝子は、当技術分野で公知の任意の適したプロセスを使用して作製できる。したがって、遺伝子は、化学合成技術を使用して作製できる。あるいは、本発明の遺伝子は、分子生物学技術を使用して作製できる。
【００６１】
本発明の遺伝子は、好ましくは、コンピュータ内で設計され、次いで、従来の遺伝子合成技術によって合成される。
【００６２】
上記の遺伝子は、使用されるべき最終宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli))発現系に応じたコドンバイアス化のために随意により修飾される。
【００６３】
一実施形態では、本発明の方法は、二本鎖クロストリジウム神経毒を宿主細胞から回収する工程をさらに含む。特に、方法は、宿主細胞を溶解して、宿主細胞ホモジネートを提供する工程及び二本鎖クロストリジウム毒素タンパク質を単離する工程を含み得る。一実施形態では、本発明の方法は、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする遺伝子を、宿主細胞中に導入する工程をさらに含み得る。例えば、本発明の遺伝子は、細胞中に、本明細書において記載される単数又は複数の発現ベクターの形態で導入され得る。
【００６４】
通常、二本鎖クロストリジウム神経毒は、宿主細胞からの回収後に精製及び/又は濃縮される。二本鎖クロストリジウム神経毒の回収、精製及び/又は濃縮のために、任意の適した単数又は複数の方法を使用してもよい。回収、精製及び/又は濃縮のための標準技術は、当技術分野で公知である、例えば、クロマトグラフィー法及び/又は電気泳動。
【００６５】
二本鎖クロストリジウム神経毒は、ポリペプチドの精製を補助するための1以上のN末端及び/又はC末端に位置する精製タグを含み得る。任意の精製タグを使用してもよいが、以下が好ましい: 好ましくは、C末端及び/又はN末端タグとしてのHis-タグ(例えば、6×ヒスチジン)、好ましくは、N末端タグとしてのMBP-タグ(マルトース結合タンパク質)、好ましくは、N末端タグとしてのGST-タグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、好ましくは、N末端タグとしてのHis-MBP-タグ、好ましくは、N末端タグとしてのGST-MBP-タグ、好ましくは、N末端タグとしてのチオレドキシンタグ及び/又は好ましくは、N末端タグとしてのCBD-タグ(キチン結合ドメイン)。
【００６６】
二本鎖クロストリジウム神経毒中に、1以上のペプチドスペーサー/リンカー分子が含まれてもよい。例えば、精製タグとポリペプチド分子の残りの間にペプチドスペーサーが使用されてもよい。
【００６７】
さらなる態様では、本発明は、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を含む細胞を提供し、ここで、第1及び第2の遺伝子は、細胞の酸化環境において発現される。
【００６８】
好ましい実施形態では、前記細胞は、原核細胞である。より好ましい実施形態では、酸化環境は、原核細胞の細胞質である。
【００６９】
好ましい実施形態では、細胞は、ジスルフィド結合形成に関与する少なくとも1つの遺伝子が、その他の点においては同一の野生型細胞と比較して、細胞質において過剰発現される、及び/又はジスルフィド結合還元に関与している少なくとも1つの遺伝子が、その他の点においては同一の野生型細胞と比較して、抑制される原核細胞である。
【００７０】
一実施形態では、原核細胞は、AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami及びSHuffle株から選択される株に由来する大腸菌(E.coli)細胞である。好ましい実施形態では、原核細胞は、Origami又はSHuffle株に由来する大腸菌(E.coli)細胞である。
【００７１】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子は、同一ベクター上に存在する。
【００７２】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子は、異なるベクター上に存在する。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は、
a.酸化環境を含む細胞、
b.クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子、及び
c.クロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子
を含むキットを提供し、
ここで、前記の第1及び第2の遺伝子は、前記細胞の前記酸化環境において、クロストリジウム神経毒軽鎖及び重鎖を別個に発現するのに適している。
【００７４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる二本鎖クロストリジウム神経毒を提供する。
【００７５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒を、医薬上許容される担体、賦形剤、アジュバント、噴射剤及び/又は塩から選択される少なくとも1つの成分と一緒に含む。
【００７６】
別の態様では、本発明は、療法において使用するための、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒又は本発明の医薬組成物を提供する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒又は本発明の医薬組成物の適した用量を、それを必要とする患者へ投与することを含む治療の方法を提供する。
【００７８】
本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒は、望まれないニューロン活性と関連している状態、例えば、痙攣性発声障害、痙性斜頚、喉頭ジストニア、顎口腔発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、手掌ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、限局性痙縮及びその他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、チック、振戦、ブラキシズム、肛門裂傷、アカラシア、嚥下障害及びその他の筋緊張障害並びに筋肉群の不随意運動を特徴とするその他の障害、流涙、発汗過多、過剰流涎、過剰胃腸分泌、分泌障害、筋痙攣に由来する疼痛、頭痛疼痛、片頭痛及び皮膚科状態からなる群から選択される状態の治療において使用するのに適している。
【００７９】
別の態様では、本発明は、審美的又は美容的状態を処置するための、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒の非治療的使用を提供する。
【００８０】
本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒は、経口、非経口、連続注入、吸入又は局所適用用に製剤化され得る。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液又はエマルジョン又は使用前に適したビヒクルに溶解もしくは懸濁される乾燥散剤の形態であり得る。
【００８１】
局所送達される予定の本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒の場合には、キメラ神経毒は、クリーム(例えば、局所適用用)として、又は皮下注射用に製剤化され得る。
【００８２】
局所送達手段として、エアゾール又はその他のスプレー(例えば、ネブライザー)を挙げることができる。この関連で、キメラ神経毒のエアゾール製剤は、肺及び/又はその他の鼻腔及び/又は気管支もしくは気道経路への送達を可能にする。
【００８３】
本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒は、くも膜下腔内注射又は罹患臓器の神経支配に関与している脊髄分節のレベルでの脊柱における硬膜外注射によって患者に投与され得る。
【００８４】
好ましい投与経路は、腹腔鏡下及び/又は局在化された、特に筋肉内の注射によるものである。
【００８５】
本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒の投与の投与量範囲は、所望の治療効果をもたらすものである。必要とされる投与量範囲は、二本鎖クロストリジウム神経毒又は組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、広がり又は重症度、あるとすれば禁忌症及び主治医の判断に応じて変わることは認められよう。これらの投与量レベルの変動は、最適化のために標準的な経験的ルーチンを使用して調整することができる。
【００８６】
流体剤形は、通常、本発明の二本鎖クロストリジウム神経毒及び発熱物質不含滅菌ビヒクルを利用して調製する。二本鎖クロストリジウム神経毒を、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクルに溶解又は懸濁できる。溶液の調製では、二本鎖クロストリジウム神経毒を、ビヒクルに溶解し、溶液を、必要に応じて塩化ナトリウムの添加によって等張性にし、無菌技術を使用して滅菌フィルターを通す濾過によって滅菌し、その後、適した滅菌バイアル又はアンプルに充填し、密閉できる。あるいは、溶液安定性が適当である場合には、その密閉容器中の溶液をオートクレーブ処理することによって滅菌してもよい。有利なことに、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤又は殺菌剤、懸濁剤又は乳化剤及び又は局所麻酔剤などの添加物を、ビヒクルに溶解してもよい。
【００８７】
使用前に適したビヒクルに溶解もしくは懸濁される乾燥散剤は、滅菌領域において無菌技術を使用して予め滅菌した成分を滅菌容器中に充填することによって調製してもよい。あるいは、滅菌領域において無菌技術を使用して、成分を適した容器中に溶解してもよい。次いで、製剤を凍結乾燥し、容器を無菌的に密閉する。
【００８８】
筋肉内、皮下又は皮内注射に適した非経口懸濁液は、滅菌構成成分を、溶解する代わりに滅菌ビヒクルに懸濁することを除いて、実質的に同一法で調製し、滅菌は濾過によっては達成され得ない。構成成分は、滅菌状態で単離してもよく、あるいは、単離後に、例えば、γ照射によって滅菌してもよい。
【００８９】
本発明に従う投与は、微粒子カプセル封入、ウイルス送達システム又は高圧エアロゾルインピンジメントを含む種々の送達技術を利用してもよい。
【００９０】
さらなる態様では、本発明は、二本鎖クロストリジウム神経毒を製造するための酸化的細胞質を有する宿主細胞の使用を提供し、ここで、宿主細胞は、クロストリジウム神経毒軽鎖をコードする第1の遺伝子及びクロストリジウム神経毒重鎖をコードする第2の遺伝子を含み、第1及び第2の遺伝子は、宿主細胞の細胞質において発現される。
【００９１】
本開示は、本明細書において開示される例示的方法及び材料によって制限されず、本明細書において記載されるものと同様の又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用できる。数的範囲は、範囲を規定する数字を含めたものである。特に断りのない限り、それぞれ、任意の核酸配列は、左から右に5’から3’配向に書かれており、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向に書かれている。
【００９２】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の介在する値は各々、文脈が明確に別のものを示さない限り、下限の単位の小数第1位までも具体的に開示されることは理解される。記述された範囲中の任意の述べられた値又は介在する値と、その述べられた範囲中の任意のその他の述べられた又は介在する値の間のより小さい範囲は各々、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、その範囲に独立に含まれることも、排除されることもあり、各範囲はまた、両限界のいずれかが、より小さい範囲中に含まれる、又は両方とも含まれない、又は両方とも含まれる場合も本開示内に包含され、述べられた範囲中の任意の具体的に排除される限界の影響下にある。述べられた範囲が、限界の一方又は両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を排除する範囲も、本開示中に含まれる。
【００９３】
本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用されるような、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈が明確に別のものを示さない限り、複数の言及を含むということは注記されなければならない。したがって、例えば、「クロストリジウム神経毒」への言及は、複数のこのような候補物質を含み、「クロストリジウム神経毒」への言及は、1つ以上のクロストリジウム神経毒及び当業者に公知のその同等物などへの言及を含む。
【００９４】
本発明をここで、単に例として、以下の図面及び実施例を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図1は、BoNT/AのLC(図1A)対して作製されたポリクローナル社内抗体、又は、全長BoNT/A1(HCに対して優先)(図1B)に対して作製されたポリクローナル社内抗体のいずれかを用いるウエスタンブロットを示す図である。MK: Magic Mark、サンプル1: 対照、Shuffle T7可溶化液-IPTGなし、サンプル2: Origami 2可溶化液±DTT、サンプル3: Shuffle T7可溶化液±DTT、サンプル4: Shuffle T7 Express可溶化液±DTT、サンプル5: BL21(DE3)±DTT。
【図２】図2は、共発現されたBoNT/A1(0)及び単鎖発現されたBoNT/A1(0)の精製後のSDS PAGEを示す図である。MK: Bench Mark、サンプル1: 共発現されたBoNT/A1(0)、サンプル2: 単鎖発現されたBoNT/A1(0)、サンプル3: 還元された共発現されたBoNT/A1(0)、サンプル4: 還元された単鎖発現されたBoNT/A1(0)。
【図３】図3は、Optim読み出し情報を示す図である。すべての図において、レーン1は、精製された単鎖発現されたBoNT/A1(0)であり、レーン2は、精製された共発現されたBoNT/A1(0)である。図3Aは、蛍光発光重心平均(barycentric mean, BCM)における温度依存性シフトの尺度(measure)である。図3Bは、266nmでの静的光散乱(static light scatter, SLS)における温度依存性シフトの尺度であり、図3Cは、473nmでの(SLS)における温度依存性シフトの尺度である。各分子の4回の反復読み出しから得た平均及び標準偏差が示されている。
【図４】図4は、280nmでのSEC読み出し情報を示す図であり、図4は、280nmでの尺度いっぱいのクロマトグラムを示す。精製された共発現されたBoNT/A1(0)及び精製された単鎖発現されたBoNT/A1(0)は、注釈がつけられている。
【図５】図5は、グルタミン酸放出アッセイを示す図である。図は、共発現されたBoNT/A1(SXN104279-DK170710)を、ラット大脳皮質神経細胞においてグルタミン酸放出を阻害するその能力に関して、天然のクロストリジウムBoNT/A1(LIST Biological Laboratories)に対して比較する。
【実施例】
【００９６】
[実施例1] 単一ベクター(二重プロモーター)アプローチを使用するBoNT/A1(0)軽鎖及び重鎖の共発現
【００９７】
エンドネガティブ(endonegative)BoNT/A1(0)の軽鎖(表3-プライマー1及び2)及び重鎖(表3-プライマー3及び4)を別個に増幅し、停止コドンが軽鎖(LC)の最後に、開始コドンが重鎖(HC)の始まりに組み込まれることを確実にするようにプライマーを設計した。更に、LCをpETDuetベクター(Millipore 71146番)のMCS1中にライゲートできるように制限部位NcoI(fwrd)及びBamHI(rev)を含め、HCをMCS2中にライゲートできるようにNdeI(fwrd)及びXhoI(rev)を使用した。遺伝子を、表4に示されるBoNT/A1(0)鋳型DNAを使用してQ5 Hot start HFマスターミックス(NEB M0494S番)を用いて増幅した。増幅されたLC及びpETDuetベクターをNcoI(NEB R3193番)及びBamHI(NEB R3136番)を用いて消化し、NEB T4 DNAリガーゼ(M0202S番)を使用してライゲートした。
【表３】
2019531721.tif 000005
【表４】
2019531721.tif 000006
【００９８】
次いで、得られたpETDuet/LCベクター及び増幅されたHC遺伝子を、Xho1(NEB R0146S番)及びNde(NEB R0111S番)を用いて消化し、一緒にライゲーションして所望の最終構築物を得た。
【００９９】
BoNT/A1(0)の共発現を試験するために、ベクターを、指示されるようにShuffle T7((NEB C3026H番)、Shuffle T7 Express細胞(NEB C3029番)、BL21(DE3)(C2527I)及びOrigami 2細胞(Merks 714083番)中に形質転換し、得られたコロニーをマイクロバンクビーズとして-80℃で保存した。すべてのクローニング及び形質転換工程は、製造業者の使用説明書に従ったことは留意されたい。
【０１００】
発現のために、250mlのバッフル付きフラスコ中の、50μg/mlのアンピシリンを含有する100mlの改変TB(mTB)(Melford T1703番)を、各オーバーナイト培養物のために準備した。これらに、各細胞株について1つのマイクロバンクビーズを播種し、225rpmで振盪しながら、30℃で20時間、一晩成長させた。翌日、10mlのオーバーナイト培養物を用いて播種された、2.5Lのバッフル付きフラスコ中の900mlのmTB+50μg/mlのアンピシリンを使用して主培養物を準備した。225rpmで振盪しながら30℃で成長させることによって、細胞密度を、1のOD600に到達させた。所望のODが到達されると、温度を16℃に(1時間)低下させ、その後、1mM IPTG(Sigma I6758番)を用いて誘導した。発現培養物を、16℃でさらに20時間インキュベートし、その後、6000rpm、30分間で回収した。
【０１０１】
発現後に回収した細胞を、6ml/gで、25mM Tris、150mM NaCl pH8を使用して再懸濁し、次いで、20Kpsiでコンスタントシステムズ(constant systems)ホモジナイザー(homogenisior)を1回通すことによって可溶性タンパク質を抽出した。12000rpmで30分の遠心分離によって細胞片を除去し、次いで、清澄化した可溶化液をウエスタンブロットによって評価した(図1)。
【０１０２】
手短には、還元サンプルのためのThermoFishers NuPAGE(登録商標)LDSサンプルバッファー(4X)NP0007番+0.1M DTT(Sigma)又は非還元サンプルのためのNovex(登録商標)Tris-グリシンSDSサンプルバッファー(2x)LC2676番のいずれかを用いて清澄化された可溶化液を1:10希釈した。95℃で10分間加熱した後、4〜12％ Bis Trisアクリルアミドゲルを使用して、これらのサンプルでSDS PAGE電気泳動を実施した。タンパク質を0.2μMニトロセルロースメンブランにトランスファーし、その後、BoNT/A1のLCに対して作製されたポリクローナル社内抗体、又は、全長BoNT/A1(HCに対して優先)に対して作製されたポリクローナル社内抗体のいずれかを用いてブロットした。抗ウサギIgG-ペルオキシダーゼ抗体(Sigma A0545-1ML番)を使用して抗体結合を検出し、Super Signal West Dura拡張持続時間基質(extended duration substrate)を使用して可視化した。
【０１０３】
図1に示される結果は、全長BoNT/A1(0)に等しい150kDaのバンドがサンプル2、3及び5(サンプル4も、より少ない程度に)中に存在するが、陰性対照では見られないことを示す。DTTの存在下では150kDaのタンパク質は、もはやみえないという事実によって、これは、還元されているジスルフィド結合として確認され、ここで、LCは、図1Aにおいて50kDaで見ることができ、HCは、図1Bにおいて100kDaで見ることができる。
【０１０４】
これらの結果から、軽鎖及び重鎖の共発現後のBoNT/A1(0)ジスルフィド架橋の細胞内形成が、すべての株において実現可能であること並びに還元性細胞質を有する株が使用される場合(BL21(DE3))と比較して、酸化的細胞質を含有する発現株を使用する場合に、最少量の遊離LCが存在することが確認される。
【０１０５】
[実施例2] Shuffle T7細胞における軽鎖及び重鎖の共発現後のBoNT/A1(0)の精製
【０１０６】
3リットルのBoNT/A1(0)培養物をShuffle T7細胞において再度共発現させ、実施例1において詳述されたように溶解した。以下のとおりである3つのクロマトグラフィー工程を使用して、清澄化した可溶化液から得られた全長BoNT/A1(0)を精製した:
【０１０７】
工程1: ブチルHP
【０１０８】
清澄化された可溶化液を、25mM Tris、2M (NH4)2SO4 pH8の添加によって半分に希釈して、(NH4)2SO4濃度を、最大1Mにした。次いで、サンプルを、事前に平衡化させた10mlのブチルHPカラム(2x5ml HiTrapブチルHP、GE Healthcare 28-4110-05番)に150cm/時間でロードした。25mM Tris、1M (NH4)2SO4 pH8を使用する10カラム容積(column volume, CV)の洗浄後、25mM Tris、35mM NaCl pH8へと低下する25CVの直線勾配により、全ての結合したタンパク質を溶出し、5mlずつの画分を集めた。次いで、SDS PAGEによって画分を解析し、標的毒素を含んでいたものをプールした。
【０１０９】
工程2: Q HP
【０１１０】
ブチルHPプールを、Q HPカラムにロードできるように低塩バッファーにバッファー交換した。HiPrep26/10脱塩カラム(GE healthcare、17-5087-01番)を使用し、製造業者の使用説明書に従って、25mM Tris、20mM NaCl pH8へのバッファー交換を数回実施することによってこれを達成した。
【０１１１】
次いで、サンプルを、事前に平衡化した4.7mlのHiScreen Q HPカラム(GE healthcare、28-9505-11番)に75cm/時間でロードした。25mM Tris、20mM NaCl pH8を用いて5CVで洗浄した後、最大25mM Tris、300mM NaCl pH8への25CVの直線勾配により、結合したタンパク質を溶出し、2.5mlずつの画分を集めた。SDS PAGEによる解析後、標的タンパク質を含有する画分をプールした。
【０１１２】
工程3: フェニルHP
【０１１３】
25mM Tris、2M (NH4)2SO4 pH8を用いてサンプルを半分に希釈して、(NH4)2SO4を最大1Mにすることによって、Q HPプールをフェニルHPカラムのために調整した。サンプルを、事前に平衡化した1mlのフェニルHP(GE Healthcare 17-1351-01番)カラムに150cm/時間でロードし、次いで、3CVの25mM Tris、1M (NH4)2SO4 pH8を用いてカラムを洗浄した。結合したタンパク質の溶出は、25mM Tris、35mM NaCl pH8へと低下する25CVの直線勾配を使用し、0.5mlずつの画分を集めた。SDS PAGEによる解析後、標的タンパク質を含有する画分をプールし、図2に示されるように最終産物を得た。
【０１１４】
対照として使用されるために、単鎖組換えBoNT/A1(0)も発現させ、精製した。これを達成するために、BLR(DE3)大腸菌(E.coli)発現株(Novagen 69053番)を使用して単鎖産物として発現され得るように、BoNT/A1(0)(表4-LC+活性化ループ+HC)をpJ401中に挿入した。
【０１１５】
発現のために、30μg/mlのカナマイシンを含有する100mlの改変TB(mTB)(Melford T1703番)を、250mlのバッフル付きフラスコ中に、オーバーナイト培養物のために準備した。これに、1つのマイクロバンクビーズを播種し、225rpmで振盪しながら37℃で20時間成長させた。翌日、2.5Lのバッフル付きフラスコ中の15×1LのmTB+30μg/mlのカナマイシンを使用して主培養物を準備し、10mlのオーバーナイト培養物を用いて各々播種した。225rpmで振盪しながら37℃で成長させることによって、細胞密度を、0.5のOD600に到達させた。所望のODが到達されると、温度を16℃(1時間)に低下させ、その後、1mM IPTG(Sigma I6758番)を用いて誘導した。発現培養物を、16℃でさらに20時間インキュベートし、その後、5000rpmで20分間回収した。
【０１１６】
共発現されたBoNT/A1(0)と同様に、回収した細胞を溶解し、毒素を精製した。ただ2つの相違点は、精製をより大規模で実施したこと並びに第2及び第3のカラムの間に活性化工程を必要としたことであった:
200ml ブチルHP→53ml Q HP→活性化(以下を参照のこと)→10ml フェニルHP
【０１１７】
活性化段階 - Q HPプール(A280により0.46mg/ml)を92μg(0.8μg Lys-C/mlサンプル)のLys-C(Sigma P2289番)とともに、4℃で20時間インキュベートした。活性化後、フェニルHPにロードできるように、サンプルを25mM Tris pH8、2M (NH4)2SO4を用いて直ちに半分に希釈し、次いで、実施例1と同様に精製を継続した。
【０１１８】
フェニルHPカラムから得られた2つの最終産物を、SDS-PAGEによって評価した(図2)。手短には、共発現された、単鎖発現されたBoNT/A1(0)を含有するフェニルHPプールを、還元サンプルのためのThermoFishers NuPAGE(登録商標)LDSサンプルバッファー(4X)NP0007番+0.1M DTT(Sigma)又は非還元サンプルのためのNovex(登録商標)Tris-グリシンSDSサンプルバッファー(2x)LC2676番のいずれかを用いて0.1mg/mlに希釈した。単鎖発現され、さらなる活性化段階を含む同一方法を使用して精製されたBoNT/A1(0)を、対照として使用した。調製されたSDSサンプルを、95℃で10分間加熱し、4〜12％ Bis Trisアクリルアミドゲルを使用して、これらのサンプルについてSDS PAGE電気泳動を実施した。染色は、SimplyBlue SafeStain(Thermo fisher LC6065番)を1時間使用し、次いで、一晩脱染した。
【０１１９】
図2に示される結果から、精製は成功であり、共発現されたBoNT/A1(0)は、単鎖発現されたBoNT/A1(0)と同様に挙動し、正しくフォールディングしていることを示唆することが確認される。
【０１２０】
また、精製されたサンプルについて、自家発光及び光散乱を測定することでフォールディング及び安定性に関する示唆を与えるデバイスであるoptim(図3)で比較し、大きさ及び凝集プロフィールについてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(図4)で比較した。
【０１２１】
Optimの結果は、共発現されたBoNT A1(0)及び単鎖発現されたBoNT/A1(0)が、それぞれ、融解温度並びに小さい及び大きい粒子凝集についての読み出し情報である、BCM、266及び473nmでのSLSにおいて、極めて類似した移行点(transition points)を有することを示す。
【０１２２】
SECの結果は、共発現されたBoNT A1(0)及び単鎖発現されたBoNT/A1(0)が、同一のモノマーピークを有し、両方において最小の凝集を伴うことを示す。
【０１２３】
[実施例3] BoNT/A1の共発現及び活性を確認するためのグルタミン酸放出アッセイ
【０１２４】
LCドメインのタンパク質分解活性に必須である亜鉛結合を回復させるために、BoNT/A1(0) pETDUET共発現ベクターのLCドメイン(配列番号17)内の2つの残基(Q224E/Y227H)を突然変異させるようにプライマーを設計した。得られたpETDUETベクターは、活性BoNT/A1 LC及びHCを共発現し、したがって、細胞ベースの系における効力の確認を可能にする。quick change lightning mutagenesis (210514番-Agilent technologies)を、製造業者の使用説明書に従って使用して突然変異を導入した。
【０１２５】
得られたベクターをShuffle T7細胞に形質転換し、発現/精製を実施例1-BoNT/A1(0)の共発現及び実施例2-共発現されたBoNT/A1(0)の精製に記載されるように実施した。この分子は、活性化工程を必要としないので、第1の2つのクロマトグラフィーカラム、ブチルHP及びQ HPのみを必要としたということは留意されたい。
【０１２６】
次いで、共発現された全長BoNT/A1を、BoNT活性の結果としてのグルタミン酸放出の阻害によって転位置及びsnare切断を確認するラットCtxグルタミン酸放出アッセイで試験した。市販の天然BoNT/A1(LIST biological laboratories)を、共発現されたBoNT/A1に対する対照として使用した。
【０１２７】
グルタミン酸放出アッセイは、共発現されたBoNT/A1は、グルタミン酸放出を天然BoNT/Aのものに匹敵する効力で阻害することを示した。したがって、これは、共発現が、中毒のすべての必要な工程(神経細胞終板(neuronal endplate)での結合及び内部移行、エンドソームから細胞質への軽鎖の転位置及び標的SNAREタンパク質のタンパク質切断)を実施可能である十分に活性な二本鎖クロストリジウム神経毒の産生のための実行可能な方法であることを実証している。
【０１２８】
配列
【０１２９】
・ 配列番号1. BoNT/A1, 受入番号 A5HZZ9, アミノ酸配列.
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
・ 配列番号2. BoNT/B1, 受入番号 B1INP5, アミノ酸配列.
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
・ 配列番号3. BoNT/C1, 受入番号 P18640, アミノ酸配列.
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
・ 配列番号4. BoNT/D, 受入番号 P19321, アミノ酸配列.
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
・ 配列番号5. BoNT/E1, 受入番号 WP_003372387, アミノ酸配列.
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
・ 配列番号6. BoNT/F1, 受入番号 Q57236, アミノ酸配列.
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
・ 配列番号7. BoNT/G, 受入番号 WP_039635782, アミノ酸配列.
MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
・ 配列番号8. TeNT, 受入番号 P04958, アミノ酸配列.
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND
・ 配列番号9. BoNT/A1, DNA.
ATGCCATTTG TTAATAAACA ATTTAATTAT AAAGATCCTG TAAATGGTGT TGATATTGCT 60
TATATAAAAA TTCCAAATGC AGGACAAATG CAACCAGTAA AAGCTTTTAA AATTCATAAT 120
AAAATATGGG TTATTCCAGA AAGAGATACA TTTACAAATC CTGAAGAAGG AGATTTAAAT 180
CCACCACCAG AAGCAAAACA AGTTCCAGTT TCATATTATG ATTCAACATA TTTAAGTACA 240
GATAATGAAA AAGATAATTA TTTAAAGGGA GTTACAAAAT TATTTGAGAG AATTTATTCA 300
ACTGATCTTG GAAGAATGTT GTTAACATCA ATAGTAAGGG GAATACCATT TTGGGGTGGA 360
AGTACAATAG ATACAGAATT AAAAGTTATT GATACTAATT GTATTAATGT GATACAACCA 420
GATGGTAGTT ATAGATCAGA AGAACTTAAT CTAGTAATAA TAGGACCCTC AGCTGATATT 480
ATACAGTTTG AATGTAAAAG CTTTGGACAT GAAGTTTTGA ATCTTACGCG AAATGGTTAT 540
GGCTCTACTC AATACATTAG ATTTAGCCCA GATTTTACAT TTGGTTTTGA GGAGTCACTT 600
GAAGTTGATA CAAATCCTCT TTTAGGTGCA GGCAAATTTG CTACAGATCC AGCAGTAACA 660
TTAGCACATG AACTTATACA TGCTGGACAT AGATTATATG GAATAGCAAT TAATCCAAAT 720
AGGGTTTTTA AAGTAAATAC TAATGCCTAT TATGAAATGA GTGGGTTAGA AGTAAGCTTT 780
GAGGAACTTA GAACATTTGG GGGACATGAT GCAAAGTTTA TAGATAGTTT ACAGGAAAAC 840
GAATTTCGTC TATATTATTA TAATAAGTTT AAAGATATAG CAAGTACACT TAATAAAGCT 900
AAATCAATAG TAGGTACTAC TGCTTCATTA CAGTATATGA AAAATGTTTT TAAAGAGAAA 960
TATCTCCTAT CTGAAGATAC ATCTGGAAAA TTTTCGGTAG ATAAATTAAA ATTTGATAAG 1020
TTATACAAAA TGTTAACAGA GATTTACACA GAGGATAATT TTGTTAAGTT TTTTAAAGTA 1080
CTTAACAGAA AAACATATTT GAATTTTGAT AAAGCCGTAT TTAAGATAAA TATAGTACCT 1140
AAGGTAAATT ACACAATATA TGATGGATTT AATTTAAGAA ATACAAATTT AGCAGCAAAC 1200
TTTAATGGTC AAAATACAGA AATTAATAAT ATGAATTTTA CTAAACTAAA AAATTTTACT 1260
GGATTGTTTG AATTTTATAA GTTGCTATGT GTAAGAGGGA TAATAACTTC TAAAACTAAA 1320
TCATTAGATA AAGGATACAA TAAGGCATTA AATGATTTAT GTATCAAAGT TAATAATTGG 1380
GACTTGTTTT TTAGTCCTTC AGAAGATAAT TTTACTAATG ATCTAAATAA AGGAGAAGAA 1440
ATTACATCTG ATACTAATAT AGAAGCAGCA GAAGAAAATA TTAGTTTAGA TTTAATACAA 1500
CAATATTATT TAACCTTTAA TTTTGATAAT GAACCTGAAA ATATTTCAAT AGAAAATCTT 1560
TCAAGTGACA TTATAGGCCA ATTAGAACTT ATGCCTAATA TAGAAAGATT TCCTAATGGA 1620
AAAAAGTATG AGTTAGATAA ATATACTATG TTCCATTATC TTCGTGCTCA AGAATTTGAA 1680
CATGGTAAAT CTAGGATTGC TTTAACAAAT TCTGTTAACG AAGCATTATT AAATCCTAGT 1740
CGTGTTTATA CATTTTTTTC TTCAGACTAT GTAAAGAAAG TTAATAAAGC TACGGAGGCA 1800
GCTATGTTTT TAGGCTGGGT AGAACAATTA GTATATGATT TTACCGATGA AACTAGCGAA 1860
GTAAGTACTA CGGATAAAAT TGCGGATATA ACTATAATTA TTCCATATAT AGGACCTGCT 1920
TTAAATATAG GTAATATGTT ATATAAAGAT GATTTTGTAG GTGCTTTAAT ATTTTCAGGA 1980
GCTGTTATTC TGTTAGAATT TATACCAGAG ATTGCAATAC CTGTATTAGG TACTTTTGCA 2040
CTTGTATCAT ATATTGCGAA TAAGGTTCTA ACCGTTCAAA CAATAGATAA TGCTTTAAGT 2100
AAAAGAAATG AAAAATGGGA TGAGGTCTAT AAATATATAG TAACAAATTG GTTAGCAAAG 2160
GTTAATACAC AGATTGATCT AATAAGAAAA AAAATGAAAG AAGCTTTAGA AAATCAAGCA 2220
GAAGCAACAA AGGCTATAAT AAACTATCAG TATAATCAAT ATACTGAGGA AGAGAAAAAT 2280
AATATTAATT TTAATATTGA TGATTTAAGT TCGAAACTTA ATGAGTCTAT AAATAAAGCT 2340
ATGATTAATA TAAATAAATT TTTGAATCAA TGCTCTGTTT CATATTTAAT GAATTCTATG 2400
ATCCCTTATG GTGTTAAACG GTTAGAAGAT TTTGATGCTA GTCTTAAAGA TGCATTATTA 2460
AAGTATATAT ATGATAATAG AGGAACTTTA ATTGGTCAAG TAGATAGATT AAAAGATAAA 2520
GTTAATAATA CACTTAGTAC AGATATACCT TTTCAGCTTT CCAAATACGT AGATAATCAA 2580
AGATTATTAT CTACATTTAC TGAATATATT AAGAATATTA TTAATACTTC TATATTGAAT 2640
TTAAGATATG AAAGTAATCA TTTAATAGAC TTATCTAGGT ATGCATCAAA AATAAATATT 2700
GGTAGTAAAG TAAATTTTGA TCCAATAGAT AAAAATCAAA TTCAATTATT TAATTTAGAA 2760
AGTAGTAAAA TTGAGGTAAT TTTAAAAAAT GCTATTGTAT ATAATAGTAT GTATGAAAAT 2820
TTTAGTACTA GCTTTTGGAT AAGAATTCCT AAGTATTTTA ACAGTATAAG TCTAAATAAT 2880
GAATATACAA TAATAAATTG TATGGAAAAT AATTCAGGAT GGAAAGTATC ACTTAATTAT 2940
GGTGAAATAA TCTGGACTTT ACAGGATACT CAGGAAATAA AACAAAGAGT AGTTTTTAAA 3000
TACAGTCAAA TGATTAATAT ATCAGATTAT ATAAACAGAT GGATTTTTGT AACTATCACT 3060
AATAATAGAT TAAATAACTC TAAAATTTAT ATAAATGGAA GATTAATAGA TCAAAAACCA 3120
ATTTCAAATT TAGGTAATAT TCATGCTAGT AATAATATAA TGTTTAAATT AGATGGTTGT 3180
AGAGATACAC ATAGATATAT TTGGATAAAA TATTTTAATC TTTTTGATAA GGAATTAAAT 3240
GAAAAAGAAA TCAAAGATTT ATATGATAAT CAATCAAATT CAGGTATTTT AAAAGACTTT 3300
TGGGGTGATT ATTTACAATA TGATAAACCA TACTATATGT TAAATTTATA TGATCCAAAT 3360
AAATATGTCG ATGTAAATAA TGTAGGTATT AGAGGTTATA TGTATCTTAA AGGGCCTAGA 3420
GGTAGCGTAA TGACTACAAA CATTTATTTA AATTCAAGTT TGTATAGGGG GACAAAATTT 3480
ATTATAAAAA AATATGCTTC TGGAAATAAA GATAATATTG TTAGAAATAA TGATCGTGTA 3540
TATATTAATG TAGTAGTTAA AAATAAAGAA TATAGGTTAG CTACTAATGC ATCACAGGCA 3600
GGCGTAGAAA AAATACTAAG TGCATTAGAA ATACCTGATG TAGGAAATCT AAGTCAAGTA 3660
GTAGTAATGA AGTCAAAAAA TGATCAAGGA ATAACAAATA AATGCAAAAT GAATTTACAA 3720
GATAATAATG GGAATGATAT AGGCTTTATA GGATTTCATC AGTTTAATAA TATAGCTAAA 3780
CTAGTAGCAA GTAATTGGTA TAATAGACAA ATAGAAAGAT CTAGTAGGAC TTTGGGTTGC 3840
TCATGGGAAT TTATTCCTGT AGATGATGGA TGGGGAGAAA GGCCACTGTA A 3891
・ 配列番号10. BoNT/B1, DNA.
ATGCCAGTTA CAATAAATAA TTTTAATTAT AATGATCCTA TTGATAATAA TAATATTATT 60
ATGATGGAGC CTCCATTTGC GAGAGGTACG GGGAGATATT ATAAAGCTTT TAAAATCACA 120
GATCGTATTT GGATAATACC GGAAAGATAT ACTTTTGGAT ATAAACCTGA GGATTTTAAT 180
AAAAGTTCCG GTATTTTTAA TAGAGATGTT TGTGAATATT ATGATCCAGA TTACTTAAAT 240
ACTAATGATA AAAAGAATAT ATTTTTACAA ACAATGATCA AGTTATTTAA TAGAATCAAA 300
TCAAAACCAT TGGGTGAAAA GTTATTAGAG ATGATTATAA ATGGTATACC TTATCTTGGA 360
GATAGACGTG TTCCACTCGA AGAGTTTAAC ACAAACATTG CTAGTGTAAC TGTTAATAAA 420
TTAATCAGTA ATCCAGGAGA AGTGGAGCGA AAAAAAGGTA TTTTCGCAAA TTTAATAATA 480
TTTGGACCTG GGCCAGTTTT AAATGAAAAT GAGACTATAG ATATAGGTAT ACAAAATCAT 540
TTTGCATCAA GGGAAGGCTT CGGGGGTATA ATGCAAATGA AGTTTTGCCC AGAATATGTA 600
AGCGTATTTA ATAATGTTCA AGAAAACAAA GGCGCAAGTA TATTTAATAG ACGTGGATAT 660
TTTTCAGATC CAGCCTTGAT ATTAATGCAT GAACTTATAC ATGTTTTACA TGGATTATAT 720
GGCATTAAAG TAGATGATTT ACCAATTGTA CCAAATGAAA AAAAATTTTT TATGCAATCT 780
ACAGATGCTA TACAGGCAGA AGAACTATAT ACATTTGGAG GACAAGATCC CAGCATCATA 840
ACTCCTTCTA CGGATAAAAG TATCTATGAT AAAGTTTTGC AAAATTTTAG AGGGATAGTT 900
GATAGACTTA ACAAGGTTTT AGTTTGCATA TCAGATCCTA ACATTAATAT TAATATATAT 960
AAAAATAAAT TTAAAGATAA ATATAAATTC GTTGAAGATT CTGAGGGAAA ATATAGTATA 1020
GATGTAGAAA GTTTTGATAA ATTATATAAA AGCTTAATGT TTGGTTTTAC AGAAACTAAT 1080
ATAGCAGAAA ATTATAAAAT AAAAACTAGA GCTTCTTATT TTAGTGATTC CTTACCACCA 1140
GTAAAAATAA AAAATTTATT AGATAATGAA ATCTATACTA TAGAGGAAGG GTTTAATATA 1200
TCTGATAAAG ATATGGAAAA AGAATATAGA GGTCAGAATA AAGCTATAAA TAAACAAGCT 1260
TATGAAGAAA TTAGCAAGGA GCATTTGGCT GTATATAAGA TACAAATGTG TAAAAGTGTT 1320
AAAGCTCCAG GAATATGTAT TGATGTTGAT AATGAAGATT TGTTCTTTAT AGCTGATAAA 1380
AATAGTTTTT CAGATGATTT ATCTAAAAAC GAAAGAATAG AATATAATAC ACAGAGTAAT 1440
TATATAGAAA ATGACTTCCC TATAAATGAA TTAATTTTAG ATACTGATTT AATAAGTAAA 1500
ATAGAATTAC CAAGTGAAAA TACAGAATCA CTTACTGATT TTAATGTAGA TGTTCCAGTA 1560
TATGAAAAAC AACCCGCTAT AAAAAAAATT TTTACAGATG AAAATACCAT CTTTCAATAT 1620
TTATACTCTC AGACATTTCC TCTAGATATA AGAGATATAA GTTTAACATC TTCATTTGAT 1680
GATGCATTAT TATTTTCTAA CAAAGTTTAT TCATTTTTTT CTATGGATTA TATTAAAACT 1740
GCTAATAAAG TGGTAGAAGC AGGATTATTT GCAGGTTGGG TGAAACAGAT AGTAAATGAT 1800
TTTGTAATCG AAGCTAATAA AAGCAATACT ATGGATAAAA TTGCAGATAT ATCTCTAATT 1860
GTTCCTTATA TAGGATTAGC TTTAAATGTA GGAAATGAAA CAGCTAAAGG AAATTTTGAA 1920
AATGCTTTTG AGATTGCAGG AGCCAGTATT CTACTAGAAT TTATACCAGA ACTTTTAATA 1980
CCTGTAGTTG GAGCCTTTTT ATTAGAATCA TATATTGACA ATAAAAATAA AATTATTAAA 2040
ACAATAGATA ATGCTTTAAC TAAAAGAAAT GAAAAATGGA GTGATATGTA CGGATTAATA 2100
GTAGCGCAAT GGCTCTCAAC AGTTAATACT CAATTTTATA CAATAAAAGA GGGAATGTAT 2160
AAGGCTTTAA ATTATCAAGC ACAAGCATTG GAAGAAATAA TAAAATACAG ATATAATATA 2220
TATTCTGAAA AAGAAAAGTC AAATATTAAC ATCGATTTTA ATGATATAAA TTCTAAACTT 2280
AATGAGGGTA TTAACCAAGC TATAGATAAT ATAAATAATT TTATAAATGG ATGTTCTGTA 2340
TCATATTTAA TGAAAAAAAT GATTCCATTA GCTGTAGAAA AATTACTAGA CTTTGATAAT 2400
ACTCTCAAAA AAAATTTGTT AAATTATATA GATGAAAATA AATTATATTT GATTGGAAGT 2460
GCAGAATATG AAAAATCAAA AGTAAATAAA TACTTGAAAA CCATTATGCC GTTTGATCTT 2520
TCAATATATA CCAATGATAC AATACTAATA GAAATGTTTA ATAAATATAA TAGCGAAATT 2580
TTAAATAATA TTATCTTAAA TTTAAGATAT AAGGATAATA ATTTAATAGA TTTATCAGGA 2640
TATGGGGCAA AGGTAGAGGT ATATGATGGA GTCGAGCTTA ATGATAAAAA TCAATTTAAA 2700
TTAACTAGTT CAGCAAATAG TAAGATTAGA GTGACTCAAA ATCAGAATAT CATATTTAAT 2760
AGTGTGTTCC TTGATTTTAG CGTTAGCTTT TGGATAAGAA TACCTAAATA TAAGAATGAT 2820
GGTATACAAA ATTATATTCA TAATGAATAT ACAATAATTA ATTGTATGAA AAATAATTCG 2880
GGCTGGAAAA TATCTATTAG GGGTAATAGG ATAATATGGA CTTTAATTGA TATAAATGGA 2940
AAAACCAAAT CGGTATTTTT TGAATATAAC ATAAGAGAAG ATATATCAGA GTATATAAAT 3000
AGATGGTTTT TTGTAACTAT TACTAATAAT TTGAATAACG CTAAAATTTA TATTAATGGT 3060
AAGCTAGAAT CAAATACAGA TATTAAAGAT ATAAGAGAAG TTATTGCTAA TGGTGAAATA 3120
ATATTTAAAT TAGATGGTGA TATAGATAGA ACACAATTTA TTTGGATGAA ATATTTCAGT 3180
ATTTTTAATA CGGAATTAAG TCAATCAAAT ATTGAAGAAA GATATAAAAT TCAATCATAT 3240
AGCGAATATT TAAAAGATTT TTGGGGAAAT CCTTTAATGT ACAATAAAGA ATATTATATG 3300
TTTAATGCGG GGAATAAAAA TTCATATATT AAACTAAAGA AAGATTCACC TGTAGGTGAA 3360
ATTTTAACAC GTAGCAAATA TAATCAAAAT TCTAAATATA TAAATTATAG AGATTTATAT 3420
ATTGGAGAAA AATTTATTAT AAGAAGAAAG TCAAATTCTC AATCTATAAA TGATGATATA 3480
GTTAGAAAAG AAGATTATAT ATATCTAGAT TTTTTTAATT TAAATCAAGA GTGGAGAGTA 3540
TATACCTATA AATATTTTAA GAAAGAGGAA GAAAAATTGT TTTTAGCTCC TATAAGTGAT 3600
TCTGATGAGT TTTACAATAC TATACAAATA AAAGAATATG ATGAACAGCC AACATATAGT 3660
TGTCAGTTGC TTTTTAAAAA AGATGAAGAA AGTACTGATG AGATAGGATT GATTGGTATT 3720
CATCGTTTCT ACGAATCTGG AATTGTATTT GAAGAGTATA AAGATTATTT TTGTATAAGT 3780
AAATGGTACT TAAAAGAGGT AAAAAGGAAA CCATATAATT TAAAATTGGG ATGTAATTGG 3840
CAGTTTATTC CTAAAGATGA AGGGTGGACT GAATAA 3876
・ 配列番号11. BoNT/C1, DNA.
ATGCCAATAA CAATTAACAA CTTTAATTAT TCAGATCCTG TTGATAATAA AAATATTTTA 60
TATTTAGATA CTCATTTAAA TACACTAGCT AATGAGCCTG AAAAAGCCTT TCGCATTACA 120
GGAAATATAT GGGTAATACC TGATAGATTT TCAAGAAATT CTAATCCAAA TTTAAATAAA 180
CCTCCTCGAG TTACAAGCCC TAAAAGTGGT TATTATGATC CTAATTATTT GAGTACTGAT 240
TCTGACAAAG ATACATTTTT AAAAGAAATT ATAAAGTTAT TTAAAAGAAT TAATTCTAGA 300
GAAATAGGAG AAGAATTAAT ATATAGACTT TCGACAGATA TACCCTTTCC TGGGAATAAC 360
AATACTCCAA TTAATACTTT TGATTTTGAT GTAGATTTTA ACAGTGTTGA TGTTAAAACT 420
AGACAAGGTA ACAACTGGGT TAAAACTGGT AGCATAAATC CTAGTGTTAT AATAACTGGA 480
CCTAGAGAAA ACATTATAGA TCCAGAAACT TCTACGTTTA AATTAACTAA CAATACTTTT 540
GCGGCACAAG AAGGATTTGG TGCTTTATCA ATAATTTCAA TATCACCTAG ATTTATGCTA 600
ACATATAGTA ATGCAACTAA TGATGTAGGA GAGGGTAGAT TTTCTAAGTC TGAATTTTGC 660
ATGGATCCAA TACTAATTTT AATGCATGAA CTTAATCATG CAATGCATAA TTTATATGGA 720
ATAGCTATAC CAAATGATCA AACAATTTCA TCTGTAACTA GTAATATTTT TTATTCTCAA 780
TATAATGTGA AATTAGAGTA TGCAGAAATA TATGCATTTG GAGGTCCAAC TATAGACCTT 840
ATTCCTAAAA GTGCAAGGAA ATATTTTGAG GAAAAGGCAT TGGATTATTA TAGATCTATA 900
GCTAAAAGAC TTAATAGTAT AACTACTGCA AATCCTTCAA GCTTTAATAA ATATATAGGG 960
GAATATAAAC AGAAACTTAT TAGAAAGTAT AGATTCGTAG TAGAATCTTC AGGTGAAGTT 1020
ACAGTAAATC GTAATAAGTT TGTTGAGTTA TATAATGAAC TTACACAAAT ATTTACAGAA 1080
TTTAACTACG CTAAAATATA TAATGTACAA AATAGGAAAA TATATCTTTC AAATGTATAT 1140
ACTCCGGTTA CGGCGAATAT ATTAGACGAT AATGTTTATG ATATACAAAA TGGATTTAAT 1200
ATACCTAAAA GTAATTTAAA TGTACTATTT ATGGGTCAAA ATTTATCTCG AAATCCAGCA 1260
TTAAGAAAAG TCAATCCTGA AAATATGCTT TATTTATTTA CAAAATTTTG TCATAAAGCA 1320
ATAGATGGTA GATCATTATA TAATAAAACA TTAGATTGTA GAGAGCTTTT AGTTAAAAAT 1380
ACTGACTTAC CCTTTATAGG TGATATTAGT GATGTTAAAA CTGATATATT TTTAAGAAAA 1440
GATATTAATG AAGAAACTGA AGTTATATAC TATCCGGACA ATGTTTCAGT AGATCAAGTT 1500
ATTCTCAGTA AGAATACCTC AGAACATGGA CAACTAGATT TATTATACCC TAGTATTGAC 1560
AGTGAGAGTG AAATATTACC AGGGGAGAAT CAAGTCTTTT ATGATAATAG AACTCAAAAT 1620
GTTGATTATT TGAATTCTTA TTATTACCTA GAATCTCAAA AACTAAGTGA TAATGTTGAA 1680
GATTTTACTT TTACGAGATC AATTGAGGAG GCTTTGGATA ATAGTGCAAA AGTATATACT 1740
TACTTTCCTA CACTAGCTAA TAAAGTAAAT GCGGGTGTTC AAGGTGGTTT ATTTTTAATG 1800
TGGGCAAATG ATGTAGTTGA AGATTTTACT ACAAATATTC TAAGAAAAGA TACATTAGAT 1860
AAAATATCAG ATGTATCAGC TATTATTCCC TATATAGGAC CCGCATTAAA TATAAGTAAT 1920
TCTGTAAGAA GAGGAAATTT TACTGAAGCA TTTGCAGTTA CTGGTGTAAC TATTTTATTA 1980
GAAGCATTTC CTGAATTTAC AATACCTGCA CTTGGTGCAT TTGTGATTTA TAGTAAGGTT 2040
CAAGAAAGAA ACGAGATTAT TAAAACTATA GATAATTGTT TAGAACAAAG GATTAAGAGA 2100
TGGAAAGATT CATATGAATG GATGATGGGA ACGTGGTTAT CCAGGATTAT TACTCAATTT 2160
AATAATATAA GTTATCAAAT GTATGATTCT TTAAATTATC AGGCAGGTGC AATCAAAGCT 2220
AAAATAGATT TAGAATATAA AAAATATTCA GGAAGTGATA AAGAAAATAT AAAAAGTCAA 2280
GTTGAAAATT TAAAAAATAG TTTAGATGTA AAAATTTCGG AAGCAATGAA TAATATAAAT 2340
AAATTTATAC GAGAATGTTC CGTAACATAT TTATTTAAAA ATATGTTACC TAAAGTAATT 2400
GATGAATTAA ATGAGTTTGA TCGAAATACT AAAGCAAAAT TAATTAATCT TATAGATAGT 2460
CATAATATTA TTCTAGTTGG TGAAGTAGAT AAATTAAAAG CAAAAGTAAA TAATAGCTTT 2520
CAAAATACAA TACCCTTTAA TATTTTTTCA TATACTAATA ATTCTTTATT AAAAGATATA 2580
ATTAATGAAT ATTTCAATAA TATTAATGAT TCAAAAATTT TGAGCCTACA AAACAGAAAA 2640
AATACTTTAG TGGATACATC AGGATATAAT GCAGAAGTGA GTGAAGAAGG CGATGTTCAG 2700
CTTAATCCAA TATTTCCATT TGACTTTAAA TTAGGTAGTT CAGGGGAGGA TAGAGGTAAA 2760
GTTATAGTAA CCCAGAATGA AAATATTGTA TATAATTCTA TGTATGAAAG TTTTAGCATT 2820
AGTTTTTGGA TTAGAATAAA TAAATGGGTA AGTAATTTAC CTGGATATAC TATAATTGAT 2880
AGTGTTAAAA ATAACTCAGG TTGGAGTATA GGTATTATTA GTAATTTTTT AGTATTTACT 2940
TTAAAACAAA ATGAAGATAG TGAACAAAGT ATAAATTTTA GTTATGATAT ATCAAATAAT 3000
GCTCCTGGAT ACAATAAATG GTTTTTTGTA ACTGTTACTA ACAATATGAT GGGAAATATG 3060
AAGATTTATA TAAATGGAAA ATTAATAGAT ACTATAAAAG TTAAAGAACT AACTGGAATT 3120
AATTTTAGCA AAACTATAAC ATTTGAAATA AATAAAATTC CAGATACCGG TTTGATTACT 3180
TCAGATTCTG ATAACATCAA TATGTGGATA AGAGATTTTT ATATATTTGC TAAAGAATTA 3240
GATGGTAAAG ATATTAATAT ATTATTTAAT AGCTTGCAAT ATACTAATGT TGTAAAAGAT 3300
TATTGGGGAA ATGATTTAAG ATATAATAAA GAATATTATA TGGTTAATAT AGATTATTTA 3360
AATAGATATA TGTATGCGAA CTCACGACAA ATTGTTTTTA ATACACGTAG AAATAATAAT 3420
GACTTCAATG AAGGATATAA AATTATAATA AAAAGAATCA GAGGAAATAC AAATGATACT 3480
AGAGTACGAG GAGGAGATAT TTTATATTTT GATATGACAA TTAATAACAA AGCATATAAT 3540
TTGTTTATGA AGAATGAAAC TATGTATGCA GATAATCATA GTACTGAAGA TATATATGCT 3600
ATAGGTTTAA GAGAACAAAC AAAGGATATA AATGATAATA TTATATTTCA AATACAACCA 3660
ATGAATAATA CTTATTATTA CGCATCTCAA ATATTTAAAT CAAATTTTAA TGGAGAAAAT 3720
ATTTCTGGAA TATGTTCAAT AGGTACTTAT CGTTTTAGAC TTGGAGGTGA TTGGTATAGA 3780
CACAATTATT TGGTGCCTAC TGTGAAGCAA GGAAATTATG CTTCATTATT AGAATCAACA 3840
TCAACTCATT GGGGTTTTGT ACCTGTAAGT GAATAA 3876
・ 配列番号12. BoNT/D, DNA.
ATGACATGGC CAGTAAAAGA TTTTAATTAT AGTGATCCTG TTAATGACAA TGATATATTA 60
TATTTAAGAA TACCACAAAA TAAGTTAATT ACTACACCTG TAAAAGCTTT TATGATTACT 120
CAAAATATTT GGGTAATACC AGAAAGATTT TCATCAGATA CTAATCCAAG TTTAAGTAAA 180
CCGCCCAGAC CTACTTCAAA GTATCAAAGT TATTATGATC CTAGTTATTT ATCTACTGAT 240
GAACAAAAAG ATACATTTTT AAAAGGGATT ATAAAATTAT TTAAAAGAAT TAATGAAAGA 300
GATATAGGAA AAAAATTAAT AAATTATTTA GTAGTTGGTT CACCTTTTAT GGGAGATTCA 360
AGTACGCCTG AAGATACATT TGATTTTACA CGTCATACTA CTAATATTGC AGTTGAAAAG 420
TTTGAAAATG GTAGTTGGAA AGTAACAAAT ATTATAACAC CAAGTGTATT GATATTTGGA 480
CCACTTCCTA ATATATTAGA CTATACAGCA TCCCTTACAT TGCAAGGACA ACAATCAAAT 540
CCATCATTTG AAGGGTTTGG AACATTATCT ATACTAAAAG TAGCACCTGA ATTTTTGTTA 600
ACATTTAGTG ATGTAACATC TAATCAAAGT TCAGCTGTAT TAGGCAAATC TATATTTTGT 660
ATGGATCCAG TAATAGCTTT AATGCATGAG TTAACACATT CTTTGCATCA ATTATATGGA 720
ATAAATATAC CATCTGATAA AAGGATTCGT CCACAAGTTA GCGAGGGATT TTTCTCTCAA 780
GATGGACCCA ACGTACAATT TGAGGAATTA TATACATTTG GAGGATTAGA TGTTGAAATA 840
ATACCTCAAA TTGAAAGATC ACAATTAAGA GAAAAAGCAT TAGGTCACTA TAAAGATATA 900
GCGAAAAGAC TTAATAATAT TAATAAAACT ATTCCTTCTA GTTGGATTAG TAATATAGAT 960
AAATATAAAA AAATATTTTC TGAAAAGTAT AATTTTGATA AAGATAATAC AGGAAATTTT 1020
GTTGTAAATA TTGATAAATT CAATAGCTTA TATTCAGACT TGACTAATGT TATGTCAGAA 1080
GTTGTTTATT CTTCGCAATA TAATGTTAAA AACAGGACTC ATTATTTTTC AAGGCATTAT 1140
CTACCTGTAT TTGCAAATAT ATTAGATGAT AATATTTATA CTATAAGAGA TGGTTTTAAT 1200
TTAACAAATA AAGGTTTTAA TATAGAAAAT TCGGGTCAGA ATATAGAAAG GAATCCTGCA 1260
CTACAAAAGC TTAGTTCAGA AAGTGTAGTA GATTTATTTA CAAAAGTATG TTTAAGATTA 1320
ACAAAAAATA GTAGAGATGA TTCAACATGT ATTAAAGTTA AAAATAATAG ATTACCTTAT 1380
GTAGCTGATA AAGATAGCAT TTCACAAGAA ATATTTGAAA ATAAAATTAT TACAGATGAG 1440
ACTAATGTAC AAAATTATTC AGATAAATTT TCATTAGATG AATCTATTTT AGATGGGCAA 1500
GTTCCTATTA ATCCTGAAAT AGTAGATCCA CTATTACCCA ATGTTAATAT GGAACCTTTA 1560
AATCTTCCAG GTGAAGAAAT AGTATTTTAT GATGATATTA CTAAATATGT TGATTATTTA 1620
AATTCTTATT ATTATTTGGA ATCTCAAAAA TTAAGTAATA ATGTTGAAAA TATTACTCTT 1680
ACAACTTCAG TTGAAGAAGC ATTAGGTTAT AGCAATAAGA TATACACATT TTTACCTAGC 1740
TTAGCTGAAA AAGTGAATAA AGGTGTTCAA GCAGGTTTAT TCTTAAATTG GGCGAATGAA 1800
GTAGTTGAGG ATTTTACTAC AAATATTATG AAGAAAGATA CATTGGATAA AATATCAGAT 1860
GTATCAGTAA TAATTCCATA TATAGGACCT GCCTTAAATA TAGGAAATTC AGCATTAAGG 1920
GGAAATTTTA ATCAAGCATT TGCAACAGCT GGTGTAGCTT TTTTATTAGA GGGATTTCCA 1980
GAGTTTACTA TACCTGCACT CGGTGTATTT ACCTTTTATA GTTCTATTCA AGAAAGAGAG 2040
AAAATTATTA AAACTATAGA AAATTGTTTG GAACAAAGAG TTAAGAGATG GAAAGATTCA 2100
TATCAATGGA TGGTATCAAA TTGGTTGTCA AGAATTACTA CTCAATTTAA TCATATAAAT 2160
TATCAAATGT ATGATTCTTT AAGTTATCAG GCAGATGCAA TCAAAGCTAA AATAGATTTA 2220
GAATATAAAA AATACTCAGG AAGTGATAAA GAAAATATAA AAAGTCAAGT TGAAAATTTA 2280
AAAAATAGTT TAGATGTAAA AATTTCGGAA GCAATGAATA ATATAAATAA ATTTATACGA 2340
GAATGTTCTG TAACATACTT ATTTAAAAAT ATGCTCCCTA AAGTAATTGA CGAATTAAAT 2400
AAGTTTGATT TAAGAACTAA AACAGAATTA ATTAATCTTA TAGATAGTCA TAATATTATT 2460
CTAGTTGGTG AAGTAGATAG ATTAAAAGCA AAAGTAAATG AGAGTTTTGA AAATACAATG 2520
CCTTTTAATA TTTTTTCATA TACTAATAAT TCTTTATTAA AAGATATAAT TAATGAATAT 2580
TTCAATAGTA TTAATGATTC AAAAATTTTG AGCTTACAAA ACAAAAAAAA TGCTTTAGTG 2640
GATACATCAG GATATAATGC AGAAGTGAGG GTAGGAGATA ATGTTCAACT TAATACGATA 2700
TATACAAATG ACTTTAAATT AAGTAGTTCA GGAGATAAAA TTATAGTAAA TTTAAATAAT 2760
AATATTTTAT ATAGCGCTAT TTATGAGAAC TCTAGTGTTA GTTTTTGGAT TAAGATATCT 2820
AAAGATTTAA CTAATTCTCA TAATGAATAT ACAATAATTA ACAGTATAGA ACAAAATTCT 2880
GGGTGGAAAT TATGTATTAG GAATGGCAAT ATAGAATGGA TTTTACAAGA TGTTAATAGA 2940
AAGTATAAAA GTTTAATTTT TGATTATAGT GAATCATTAA GTCATACAGG ATATACAAAT 3000
AAATGGTTTT TTGTTACTAT AACTAATAAT ATAATGGGGT ATATGAAACT TTATATAAAT 3060
GGAGAATTAA AGCAGAGTCA AAAAATTGAA GATTTAGATG AGGTTAAGTT AGATAAAACC 3120
ATAGTATTTG GAATAGATGA GAATATAGAT GAGAATCAGA TGCTTTGGAT TAGAGATTTT 3180
AATATTTTTT CTAAAGAATT AAGTAATGAA GATATTAATA TTGTATATGA GGGACAAATA 3240
TTAAGAAATG TTATTAAAGA TTATTGGGGA AATCCTTTGA AGTTTGATAC AGAATATTAT 3300
ATTATTAATG ATAATTATAT AGATAGGTAT ATAGCACCTG AAAGTAATGT ACTTGTACTT 3360
GTTCAGTATC CAGATAGATC TAAATTATAT ACTGGAAATC CTATTACTAT TAAATCAGTA 3420
TCTGATAAGA ATCCTTATAG TAGAATTTTA AATGGAGATA ATATAATTCT TCATATGTTA 3480
TATAATAGTA GGAAATATAT GATAATAAGA GATACTGATA CAATATATGC AACACAAGGA 3540
GGAGAGTGTT CACAAAATTG TGTATATGCA TTAAAATTAC AGAGTAATTT AGGTAATTAT 3600
GGTATAGGTA TATTTAGTAT AAAAAATATT GTATCTAAAA ATAAATATTG TAGTCAAATT 3660
TTCTCTAGTT TTAGGGAAAA TACAATGCTT CTAGCAGATA TATATAAACC TTGGAGATTT 3720
TCTTTTAAAA ATGCATACAC GCCAGTTGCA GTAACTAATT ATGAAACAAA ACTATTATCA 3780
ACTTCATCTT TTTGGAAATT TATTTCTAGG GATCCAGGAT GGGTAGAGTA A 3831
・ 配列番号13. BoNT/E1, DNA.
ATGCCAAAAA TTAATAGTTT TAATTATAAT GATCCTGTTA ATGATAGAAC AATTTTATAT 60
ATTAAACCAG GCGGTTGTCA AGAATTTTAT AAATCATTTA ATATTATGAA AAATATTTGG 120
ATAATTCCAG AGAGAAATGT AATTGGTACA ACCCCCCAAG ATTTTCATCC GCCTACTTCA 180
TTAAAAAATG GAGATAGTAG TTATTATGAC CCTAATTATT TACAAAGTGA TGAAGAAAAG 240
GATAGATTTT TAAAAATAGT CACAAAAATA TTTAATAGAA TAAATAATAA TCTTTCAGGA 300
GGGATTTTAT TAGAAGAACT GTCAAAAGCT AATCCATATT TAGGGAATGA TAATACTCCA 360
GATAATCAAT TCCATATTGG TGATGCATCA GCAGTTGAGA TTAAATTCTC AAATGGTAGC 420
CAAGACATAC TATTACCTAA TGTTATTATA ATGGGAGCAG AGCCTGATTT ATTTGAAACT 480
AACAGTTCCA ATATTTCTCT AAGAAATAAT TATATGCCAA GCAATCACCG TTTTGGATCA 540
ATAGCTATAG TAACATTCTC ACCTGAATAT TCTTTTAGAT TTAATGATAA TTGTATGAAT 600
GAATTTATTC AAGATCCTGC TCTTACATTA ATGCATGAAT TAATACATTC ATTACATGGA 660
CTATATGGGG CTAAAGGGAT TACTACAAAG TATACTATAA CACAAAAACA AAATCCCCTA 720
ATAACAAATA TAAGAGGTAC AAATATTGAA GAATTCTTAA CTTTTGGAGG TACTGATTTA 780
AACATTATTA CTAGTGCTCA GTCCAATGAT ATCTATACTA ATCTTCTAGC TGATTATAAA 840
AAAATAGCGT CTAAACTTAG CAAAGTACAA GTATCTAATC CACTACTTAA TCCTTATAAA 900
GATGTTTTTG AAGCAAAGTA TGGATTAGAT AAAGATGCTA GCGGAATTTA TTCGGTAAAT 960
ATAAACAAAT TTAATGATAT TTTTAAAAAA TTATACAGCT TTACGGAATT TGATTTACGA 1020
ACTAAATTTC AAGTTAAATG TAGGCAAACT TATATTGGAC AGTATAAATA CTTCAAACTT 1080
TCAAACTTGT TAAATGATTC TATTTATAAT ATATCAGAAG GCTATAATAT AAATAATTTA 1140
AAGGTAAATT TTAGAGGACA GAATGCAAAT TTAAATCCTA GAATTATTAC ACCAATTACA 1200
GGTAGAGGAC TAGTAAAAAA AATCATTAGA TTTTGTAAAA ATATTGTTTC TGTAAAAGGC 1260
ATAAGGAAAT CAATATGTAT CGAAATAAAT AATGGTGAGT TATTTTTTGT GGCTTCCGAG 1320
AATAGTTATA ATGATGATAA TATAAATACT CCTAAAGAAA TTGACGATAC AGTAACTTCA 1380
AATAATAATT ATGAAAATGA TTTAGATCAG GTTATTTTAA ATTTTAATAG TGAATCAGCA 1440
CCTGGACTTT CAGATGAAAA ATTAAATTTA ACTATCCAAA ATGATGCTTA TATACCAAAA 1500
TATGATTCTA ATGGAACAAG TGATATAGAA CAACATGATG TTAATGAACT TAATGTATTT 1560
TTCTATTTAG ATGCACAGAA AGTGCCCGAA GGTGAAAATA ATGTCAATCT CACCTCTTCA 1620
ATTGATACAG CATTATTAGA ACAACCTAAA ATATATACAT TTTTTTCATC AGAATTTATT 1680
AATAATGTCA ATAAACCTGT GCAAGCAGCA TTATTTGTAA GCTGGATACA ACAAGTGTTA 1740
GTAGATTTTA CTACTGAAGC TAACCAAAAA AGTACTGTTG ATAAAATTGC AGATATTTCT 1800
ATAGTTGTTC CATATATAGG TCTTGCTTTA AATATAGGAA ATGAAGCACA AAAAGGAAAT 1860
TTTAAAGATG CACTTGAATT ATTAGGAGCA GGTATTTTAT TAGAATTTGA ACCCGAGCTT 1920
TTAATTCCTA CAATTTTAGT ATTCACGATA AAATCTTTTT TAGGTTCATC TGATAATAAA 1980
AATAAAGTTA TTAAAGCAAT AAATAATGCA TTGAAAGAAA GAGATGAAAA ATGGAAAGAA 2040
GTATATAGTT TTATAGTATC GAATTGGATG ACTAAAATTA ATACACAATT TAATAAAAGA 2100
AAAGAACAAA TGTATCAAGC TTTACAAAAT CAAGTAAATG CAATTAAAAC AATAATAGAA 2160
TCTAAGTATA ATAGTTATAC TTTAGAGGAA AAAAATGAGC TTACAAATAA ATATGATATT 2220
AAGCAAATAG AAAATGAACT TAATCAAAAG GTTTCTATAG CAATGAATAA TATAGACAGG 2280
TTCTTAACTG AAAGTTCTAT ATCCTATTTA ATGAAAATAA TAAATGAAGT AAAAATTAAT 2340
AAATTAAGAG AATATGATGA GAATGTCAAA ACGTATTTAT TGAATTATAT TATACAACAT 2400
GGATCAATCT TGGGAGAGAG TCAGCAAGAA CTAAATTCTA TGGTAACTGA TACCCTAAAT 2460
AATAGTATTC CTTTTAAGCT TTCTTCTTAT ACAGATGATA AAATTTTAAT TTCATATTTT 2520
AATAAATTCT TTAAGAGAAT TAAAAGTAGT TCAGTTTTAA ATATGAGATA TAAAAATGAT 2580
AAATACGTAG ATACTTCAGG ATATGATTCA AATATAAATA TTAATGGAGA TGTATATAAA 2640
TATCCAACTA ATAAAAATCA ATTTGGAATA TATAATGATA AACTTAGTGA AGTTAATATA 2700
TCTCAAAATG ATTACATTAT ATATGATAAT AAATATAAAA ATTTTAGTAT TAGTTTTTGG 2760
GTAAGAATTC CTAACTATGA TAATAAGATA GTAAATGTTA ATAATGAATA CACTATAATA 2820
AATTGTATGA GAGATAATAA TTCAGGATGG AAAGTATCTC TTAATCATAA TGAAATAATT 2880
TGGACATTCG AAGATAATCG AGGAATTAAT CAAAAATTAG CATTTAACTA TGGTAACGCA 2940
AATGGTATTT CTGATTATAT AAATAAGTGG ATTTTTGTAA CTATAACTAA TGATAGATTA 3000
GGAGATTCTA AACTTTATAT TAATGGAAAT TTAATAGATC AAAAATCAAT TTTAAATTTA 3060
GGTAATATTC ATGTTAGTGA CAATATATTA TTTAAAATAG TTAATTGTAG TTATACAAGA 3120
TATATTGGTA TTAGATATTT TAATATTTTT GATAAAGAAT TAGATGAAAC AGAAATTCAA 3180
ACTTTATATA GCAATGAACC TAATACAAAT ATTTTGAAGG ATTTTTGGGG AAATTATTTG 3240
CTTTATGACA AAGAATACTA TTTATTAAAT GTGTTAAAAC CAAATAACTT TATTGATAGG 3300
AGAAAAGATT CTACTTTAAG CATTAATAAT ATAAGAAGCA CTATTCTTTT AGCTAATAGA 3360
TTATATAGTG GAATAAAAGT TAAAATACAA AGAGTTAATA ATAGTAGTAC TAACGATAAT 3420
CTTGTTAGAA AGAATGATCA GGTATATATT AATTTTGTAG CCAGCAAAAC TCACTTATTT 3480
CCATTATATG CTGATACAGC TACCACAAAT AAAGAGAAAA CAATAAAAAT ATCATCATCT 3540
GGCAATAGAT TTAATCAAGT AGTAGTTATG AATTCAGTAG GAAATTGTAC AATGAATTTT 3600
AAAAATAATA ATGGAAATAA TATTGGGTTG TTAGGTTTCA AGGCAGATAC TGTCGTTGCT 3660
AGTACTTGGT ATTATACACA TATGAGAGAT CATACAAACA GCAATGGATG TTTTTGGAAC 3720
TTTATTTCTG AAGAACATGG ATGGCAAGAA AAATAA 3756
・ 配列番号14. BoNT/F1, DNA.
ATGCCAGTTG TAATAAATAG TTTTAATTAT AATGACCCTG TTAATGATGA TACAATTTTA 60
TACATGCAGA TACCATATGA AGAAAAAAGT AAAAAATATT ATAAAGCTTT TGAGATTATG 120
CGTAATGTTT GGATAATTCC TGAGAGAAAT ACAATAGGAA CGGATCCTAG TGATTTTGAT 180
CCACCGGCTT CATTAGAGAA CGGAAGCAGT GCTTATTATG ATCCTAATTA TTTAACCACT 240
GATGCTGAAA AAGATAGATA TTTAAAAACA ACGATAAAAT TATTTAAGAG AATTAATAGT 300
AATCCTGCAG GGGAAGTTTT GTTACAAGAA ATATCATATG CTAAACCATA TTTAGGAAAT 360
GAACACACGC CAATTAATGA ATTCCATCCA GTTACTAGAA CTACAAGTGT TAATATAAAA 420
TCATCAACTA ATGTTAAAAG TTCAATAATA TTGAATCTTC TTGTATTGGG AGCAGGACCT 480
GATATATTTG AAAATTCTTC TTACCCCGTT AGAAAACTAA TGGATTCAGG TGGAGTTTAT 540
GACCCAAGTA ATGATGGTTT TGGATCAATT AATATCGTGA CATTTTCACC TGAATATGAA 600
TATACTTTTA ATGATATTAG TGGAGGGTAT AACAGTAGTA CAGAATCATT TATTGCAGAT 660
CCTGCAATTT CACTAGCTCA TGAATTGATA CATGCACTGC ATGGATTATA CGGGGCTAGG 720
GGAGTTACTT ATAAAGAGAC TATAAAAGTA AAGCAAGCAC CTCTTATGAT AGCCGAAAAA 780
CCCATAAGGC TAGAAGAATT TTTAACCTTT GGAGGTCAGG ATTTAAATAT TATTACTAGT 840
GCTATGAAGG AAAAAATATA TAACAATCTT TTAGCTAACT ATGAAAAAAT AGCTACTAGA 900
CTTAGTAGAG TTAATAGTGC TCCTCCTGAA TATGATATTA ATGAATATAA AGATTATTTT 960
CAATGGAAGT ATGGGCTAGA TAAAAATGCT GATGGAAGTT ATACTGTAAA TGAAAATAAA 1020
TTTAATGAAA TTTATAAAAA ATTATATAGC TTTACAGAGA TTGACTTAGC AAATAAATTT 1080
AAAGTAAAAT GTAGAAATAC TTATTTTATT AAATATGGAT TTTTAAAAGT TCCAAATTTG 1140
TTAGATGATG ATATTTATAC TGTATCAGAG GGGTTTAATA TAGGTAATTT AGCAGTAAAC 1200
AATCGCGGAC AAAATATAAA GTTAAATCCT AAAATTATTG ATTCCATTCC AGATAAAGGT 1260
CTAGTGGAAA AGATCGTTAA ATTTTGTAAG AGCGTTATTC CTAGAAAAGG TACAAAGGCG 1320
CCACCGCGAC TATGCATTAG AGTAAATAAT AGGGAGTTAT TTTTTGTAGC TTCAGAAAGT 1380
AGCTATAATG AAAATGATAT TAATACACCT AAAGAAATTG ACGATACAAC AAATCTAAAT 1440
AATAATTATA GAAATAATTT AGATGAAGTT ATTTTAGATT ATAATAGTGA GACAATACCT 1500
CAAATATCAA ATCAAACATT AAATACACTT GTACAAGACG ATAGTTATGT GCCAAGATAT 1560
GATTCTAATG GAACAAGTGA AATAGAGGAA CATAATGTTG TTGACCTTAA TGTATTTTTC 1620
TATTTACATG CACAAAAAGT ACCAGAAGGT GAAACTAATA TAAGTTTAAC TTCTTCAATT 1680
GATACGGCAT TATCAGAAGA ATCGCAAGTA TATACATTCT TTTCTTCAGA GTTTATTAAT 1740
ACTATCAATA AACCTGTACA CGCAGCACTA TTTATAAGTT GGATAAATCA AGTAATAAGA 1800
GATTTTACTA CTGAAGCTAC ACAAAAAAGT ACTTTTGATA AGATTGCAGA CATATCTTTA 1860
GTTGTACCAT ATGTAGGTCT TGCTTTAAAT ATAGGTAATG AGGTACAAAA AGAAAATTTT 1920
AAGGAGGCAT TTGAATTATT AGGAGCGGGT ATTTTATTAG AATTTGTGCC AGAGCTTTTA 1980
ATTCCTACAA TTTTAGTGTT TACAATAAAA TCCTTTATAG GTTCATCTGA GAATAAAAAT 2040
AAAATCATTA AAGCAATAAA TAATTCATTA ATGGAAAGAG AAACAAAGTG GAAAGAAATA 2100
TATAGTTGGA TAGTATCAAA TTGGCTTACT AGAATTAATA CACAATTTAA TAAAAGAAAA 2160
GAACAAATGT ATCAAGCTTT GCAAAATCAA GTAGATGCAA TAAAAACAGT AATAGAATAT 2220
AAATATAATA ATTATACTTC AGATGAGAGA AATAGACTTG AATCTGAATA TAATATCAAT 2280
AATATAAGAG AAGAATTGAA CAAAAAAGTT TCTTTAGCAA TGGAAAATAT AGAGAGATTT 2340
ATAACAGAGA GTTCTATATT TTATTTAATG AAGTTAATAA ATGAAGCCAA AGTTAGTAAA 2400
TTAAGAGAAT ATGATGAAGG CGTTAAGGAA TATTTGCTAG ACTATATTTC AGAACATAGA 2460
TCAATTTTAG GAAATAGTGT ACAAGAATTA AATGATTTAG TGACTAGTAC TCTGAATAAT 2520
AGTATTCCAT TTGAACTTTC TTCATATACT AATGATAAAA TTCTAATTTT ATATTTTAAT 2580
AAATTATATA AAAAAATTAA AGATAACTCT ATTTTAGATA TGCGATATGA AAATAATAAA 2640
TTTATAGATA TCTCTGGATA TGGTTCAAAT ATAAGCATTA ATGGAGATGT ATATATTTAT 2700
TCAACAAATA GAAATCAATT TGGAATATAT AGTAGTAAGC CTAGTGAAGT TAATATAGCT 2760
CAAAATAATG ATATTATATA CAATGGTAGA TATCAAAATT TTAGTATTAG TTTCTGGGTA 2820
AGGATTCCTA AATACTTCAA TAAAGTGAAT CTTAATAATG AATATACTAT AATAGATTGT 2880
ATAAGGAATA ATAATTCAGG ATGGAAAATA TCACTTAATT ATAATAAAAT AATTTGGACT 2940
TTACAAGATA CTGCTGGAAA TAATCAAAAA CTAGTTTTTA ATTATACACA AATGATTAGT 3000
ATATCTGATT ATATAAATAA ATGGATTTTT GTAACTATTA CTAATAATAG ATTAGGCAAT 3060
TCTAGAATTT ACATCAATGG AAATTTAATA GATGAAAAAT CAATTTCGAA TTTAGGTGAT 3120
ATTCATGTTA GTGATAATAT ATTATTTAAA ATTGTTGGTT GTAATGATAC AAGATATGTT 3180
GGTATAAGAT ATTTTAAAGT TTTTGATACG GAATTAGGTA AAACAGAAAT TGAGACTTTA 3240
TATAGTGATG AGCCAGATCC AAGTATCTTA AAAGACTTTT GGGGAAATTA TTTGTTATAT 3300
AATAAAAGAT ATTATTTATT GAATTTACTA AGAACAGATA AGTCTATTAC TCAGAATTCA 3360
AACTTTCTAA ATATTAATCA ACAAAGAGGT GTTTATCAGA AACCAAATAT TTTTTCCAAC 3420
ACTAGATTAT ATACAGGAGT AGAAGTTATT ATAAGAAAAA ATGGATCTAC AGATATATCT 3480
AATACAGATA ATTTTGTTAG AAAAAATGAT CTGGCATATA TTAATGTAGT AGATCGTGAT 3540
GTAGAATATC GGCTATATGC TGATATATCA ATTGCAAAAC CAGAGAAAAT AATAAAATTA 3600
ATAAGAACAT CTAATTCAAA CAATAGCTTA GGTCAAATTA TAGTTATGGA TTCAATAGGA 3660
AATAATTGCA CAATGAATTT TCAAAACAAT AATGGGGGCA ATATAGGATT ACTAGGTTTT 3720
CATTCAAATA ATTTGGTTGC TAGTAGTTGG TATTATAACA ATATACGAAA AAATACTAGC 3780
AGTAATGGAT GCTTTTGGAG TTTTATTTCT AAAGAGCATG GATGGCAAGA AAACTAA 3837
・ 配列番号15. BoNT/G, DNA.
ATGCCAGTTA ATATAAAAAN CTTTAATTAT AATGACCCTA TTAATAATGA TGACATTATT 60
ATGATGGAAC CATTCAATGA CCCAGGGCCA GGAACATATT ATAAAGCTTT TAGGATTATA 120
GATCGTATTT GGATAGTACC AGAAAGGTTT ACTTATGGAT TTCAACCTGA CCAATTTAAT 180
GCCAGTACAG GAGTTTTTAG TAAAGATGTC TACGAATATT ACGATCCAAC TTATTTAAAA 240
ACCGATGCTG AAAAAGATAA ATTTTTAAAA ACAATGATTA AATTATTTAA TAGAATTAAT 300
TCAAAACCAT CAGGACAGAG ATTACTGGAT ATGATAGTAG ATGCTATACC TTATCTTGGA 360
AATGCATCTA CACCGCCCGA CAAATTTGCA GCAAATGTTG CAAATGTATC TATTAATAAA 420
AAAATTATCC AACCTGGAGC TGAAGATCAA ATAAAAGGTT TAATGACAAA TTTAATAATA 480
TTTGGACCAG GACCAGTTCT AAGTGATAAT TTTACTGATA GTATGATTAT GAATGGCCAT 540
TCCCCAATAT CAGAAGGATT TGGTGCAAGA ATGATGATAA GATTTTGTCC TAGTTGTTTA 600
AATGTATTTA ATAATGTTCA GGAAAATAAA GATACATCTA TATTTAGTAG ACGCGCGTAT 660
TTTGCAGATC CAGCTCTAAC GTTAATGCAT GAACTTATAC ATGTGTTACA TGGATTATAT 720
GGAATTAAGA TAAGTAATTT ACCAATTACT CCAAATACAA AAGAATTTTT CATGCAACAT 780
AGCGATCCTG TACAAGCAGA AGAACTATAT ACATTCGGAG GACATGATCC TAGTGTTATA 840
AGTCCTTCTA CGGATATGAA TATTTATAAT AAAGCGTTAC AAAATTTTCA AGATATAGCT 900
AATAGGCTTA ATATTGTTTC AAGTGCCCAA GGGAGTGGAA TTGATATTTC CTTATATAAA 960
CAAATATATA AAAATAAATA TGATTTTGTT GAAGATCCTA ATGGAAAATA TAGTGTAGAT 1020
AAGGATAAGT TTGATAAATT ATATAAGGCC TTAATGTTTG GCTTTACTGA AACTAATCTA 1080
GCTGGTGAAT ATGGAATAAA AACTAGGTAT TCTTATTTTA GTGAATATTT GCCACCGATA 1140
AAAACTGAAA AATTGTTAGA CAATACAATT TATACTCAAA ATGAAGGCTT TAACATAGCT 1200
AGTAAAAATC TCAAAACGGA ATTTAATGGT CAGAATAAGG CGGTAAATAA AGAGGCTTAT 1260
GAAGAAATCA GCCTAGAACA TCTCGTTATA TATAGAATAG CAATGTGCAA GCCTGTAATG 1320
TACAAAAATA CCGGTAAATC TGAACAGTGT ATTATTGTTA ATAATGAGGA TTTATTTTTC 1380
ATAGCTAATA AAGATAGTTT TTCAAAAGAT TTAGCTAAAG CAGAAACTAT AGCATATAAT 1440
ACACAAAATA ATACTATAGA AAATAATTTT TCTATAGATC AGTTGATTTT AGATAATGAT 1500
TTAAGCAGTG GCATAGACTT ACCAAATGAA AACACAGAAC CATTTACAAA TTTTGACGAC 1560
ATAGATATCC CTGTGTATAT TAAACAATCT GCTTTAAAAA AAATTTTTGT GGATGGAGAT 1620
AGCCTTTTTG AATATTTACA TGCTCAAACA TTTCCTTCTA ATATAGAAAA TCTACAACTA 1680
ACGAATTCAT TAAATGATGC TTTAAGAAAT AATAATAAAG TCTATACTTT TTTTTCTACA 1740
AACCTTGTTG AAAAAGCTAA TACAGTTGTA GGTGCTTCAC TTTTTGTAAA CTGGGTAAAA 1800
GGAGTAATAG ATGATTTTAC ATCTGAATCC ACACAAAAAA GTACTATAGA TAAAGTTTCA 1860
GATGTATCCA TAATTATTCC CTATATAGGA CCTGCTTTGA ATGTAGGAAA TGAAACAGCT 1920
AAAGAAAATT TTAAAAATGC TTTTGAAATA GGTGGAGCCG CTATCTTAAT GGAGTTTATT 1980
CCAGAACTTA TTGTACCTAT AGTTGGATTT TTTACATTAG AATCATATGT AGGAAATAAA 2040
GGGCATATTA TTATGACGAT ATCCAATGCT TTAAAGAAAA GGGATCAAAA ATGGACAGAT 2100
ATGTATGGTT TGATAGTATC GCAGTGGCTC TCAACGGTTA ATACTCAATT TTATACAATA 2160
AAAGAAAGAA TGTACAATGC TTTAAATAAT CAATCACAAG CAATAGAAAA AATAATAGAA 2220
GATCAATATA ATAGATATAG TGAAGAAGAT AAAATGAATA TTAACATTGA TTTTAATGAT 2280
ATAGATTTTA AACTTAATCA AAGTATAAAT TTAGCAATAA ACAATATAGA TGATTTTATA 2340
AACCAATGTT CTATATCATA TCTAATGAAT AGAATGATTC CATTAGCTGT AAAAAAGTTA 2400
AAAGACTTTG ATGATAATCT TAAGAGAGAT TTATTGGAGT ATATAGATAC AAATGAACTA 2460
TATTTACTTG ATGAAGTAAA TATTCTAAAA TCAAAAGTAA ATAGACACCT AAAAGACAGT 2520
ATACCATTTG ATCTTTCACT ATATACCAAG GACACAATTT TAATACAAGT TTTTAATAAT 2580
TATATTAGTA ATATTAGTAG TAATGCTATT TTAAGTTTAA GTTATAGAGG TGGGCGTTTA 2640
ATAGATTCAT CTGGATATGG TGCAACTATG AATGTAGGTT CAGATGTTAT CTTTAATGAT 2700
ATAGGAAATG GTCAATTTAA ATTAAATAAT TCTGAAAATA GTAATATTAC GGCACATCAA 2760
AGTAAATTCG TTGTATATGA TAGTATGTTT GATAATTTTA GCATTAACTT TTGGGTAAGG 2820
ACTCCTAAAT ATAATAATAA TGATATACAA ACTTATCTTC AAAATGAGTA TACAATAATT 2880
AGTTGTATAA AAAATGACTC AGGATGGAAA GTATCTATTA AGGGAAATAG AATAATATGG 2940
ACATTAATAG ATGTTAATGC AAAATCTAAA TCAATATTTT TCGAATATAG TATAAAAGAT 3000
AATATATCAG ATTATATAAA TAAATGGTTT TCCATAACTA TTACTAATGA TAGATTAGGT 3060
AACGCAAATA TTTATATAAA TGGAAGTTTG AAAAAAAGTG AAAAAATTTT AAACTTAGAT 3120
AGAATTAATT CTAGTAATGA TATAGACTTC AAATTAATTA ATTGTACAGA TACTACTAAA 3180
TTTGTTTGGA TTAAGGATTT TAATATTTTT GGTAGAGAAT TAAATGCTAC AGAAGTATCT 3240
TCACTATATT GGATTCAATC ATCTACAAAT ACTTTAAAAG ATTTTTGGGG GAATCCTTTA 3300
AGATACGATA CACAATACTA TCTGTTTAAT CAAGGTATGC AAAATATCTA TATAAAGTAT 3360
TTTAGTAAAG CTTCTATGGG GGAAACTGCA CCACGTACAA ACTTTAATAA TGCAGCAATA 3420
AATTATCAAA ATTTATATCT TGGTTTACGA TTTATTATAA AAAAAGCATC AAATTCTCGG 3480
AATATAAATA ATGATAATAT AGTCAGAGAA GGAGATTATA TATATCTTAA TATTGATAAT 3540
ATTTCTGATG AATCTTACAG AGTATATGTT TTGGTGAATT CTAAAGAAAT TCAAACTCAA 3600
TTATTTTTAG CACCCATAAA TGATGATCCT ACGTTCTATG ATGTACTACA AATAAAAAAA 3660
TATTATGAAA AAACAACATA TAATTGTCAG ATACTTTGCG AAAAAGATAC TAAAACATTT 3720
GGGCTGTTTG GAATTGGTAA ATTTGTTAAA GATTATGGAT ATGTTTGGGA TACCTATGAT 3780
AATTATTTTT GCATAAGTCA GTGGTATCTC AGAAGAATAT CTGAAAATAT AAATAAATTA 3840
AGGTTGGGAT GTAATTGGCA ATTCATTCCC GTGGATGAAG GATGGACAGA ATAA 3894
・ 配列番号16. TeNT, DNA.
ATGCCAATAA CCATAAATAA TTTTAGATAT AGTGATCCTG TTAATAATGA TACAATTATT 60
ATGATGGAGC CACCATACTG TAAGGGTCTA GATATCTATT ATAAGGCTTT CAAAATAACA 120
GATCGTATTT GGATAGTGCC GGAAAGGTAT GAATTTGGGA CAAAACCTGA AGATTTTAAC 180
CCACCATCTT CATTAATAGA AGGTGCATCT GAGTATTACG ATCCAAATTA TTTAAGGACT 240
GATTCTGATA AAGATAGATT TTTACAAACC ATGGTAAAAC TGTTTAACAG AATTAAAAAC 300
AATGTAGCAG GTGAAGCCTT ATTAGATAAG ATAATAAATG CCATACCTTA CCTTGGAAAT 360
TCATATTCCT TACTAGACAA GTTTGATACA AACTCTAATT CAGTATCTTT TAATTTATTA 420
GAACAAGACC CCAGTGGAGC AACTACAAAA TCAGCAATGC TGACAAATTT AATAATATTT 480
GGACCTGGGC CTGTTTTAAA TAAAAATGAG GTTAGAGGTA TTGTATTGAG GGTAGATAAT 540
AAAAATTACT TCCCATGTAG AGATGGTTTT GGCTCAATAA TGCAAATGGC ATTTTGCCCA 600
GAATATGTAC CTACCTTTGA TAATGTAATA GAAAATATTA CGTCACTCAC TATTGGCAAA 660
AGCAAATATT TTCAAGATCC AGCATTACTA TTAATGCACG AACTTATACA TGTACTACAT 720
GGTTTATACG GAATGCAGGT ATCAAGCCAT GAAATTATTC CATCCAAACA AGAAATTTAT 780
ATGCAGCATA CATATCCAAT AAGTGCTGAA GAACTATTCA CTTTTGGCGG ACAGGATGCT 840
AATCTTATAA GTATTGATAT AAAAAACGAT TTATATGAAA AAACTTTAAA TGATTATAAA 900
GCTATAGCTA ACAAACTTAG TCAAGTCACT AGCTGCAATG ATCCCAACAT TGATATTGAT 960
AGCTACAAAC AAATATATCA ACAAAAATAT CAATTCGATA AAGATAGCAA TGGACAATAT 1020
ATTGTAAATG AGGATAAATT TCAGATACTA TATAATAGCA TAATGTATGG TTTTACAGAG 1080
ATTGAATTGG GAAAAAAATT TAATATAAAA ACTAGACTTT CTTATTTTAG TATGAATCAT 1140
GACCCTGTAA AAATTCCAAA TTTATTAGAT GATACAATTT ACAATGATAC AGAAGGATTT 1200
AATATAGAAA GCAAAGATCT GAAATCTGAA TATAAAGGAC AAAATATGAG GGTAAATACA 1260
AATGCTTTTA GAAATGTTGA TGGATCAGGC CTAGTTTCAA AACTTATTGG CTTATGTAAA 1320
AAAATTATAC CACCAACAAA TATAAGAGAA AATTTATATA ATAGAACTGC ATCATTAACA 1380
GATTTAGGAG GAGAATTATG TATAAAAATT AAAAATGAAG ATTTAACTTT TATAGCTGAA 1440
AAAAATAGCT TTTCAGAAGA ACCATTTCAA GATGAAATAG TTAGTTATAA TACAAAAAAT 1500
AAACCATTAA ATTTTAATTA TTCGCTAGAT AAAATTATTG TAGATTATAA TCTACAAAGT 1560
AAAATTACAT TACCTAATGA TAGGACAACC CCAGTTACAA AAGGAATTCC ATATGCTCCA 1620
GAATATAAAA GTAATGCTGC AAGTACAATA GAAATACATA ATATTGATGA CAATACAATA 1680
TATCAATATT TGTATGCTCA AAAATCTCCT ACAACTCTAC AAAGAATAAC TATGACTAAT 1740
TCTGTTGATG ACGCATTAAT AAATTCCACC AAAATATATT CATATTTTCC ATCTGTAATC 1800
AGTAAAGTTA ACCAAGGTGC ACAAGGAATT TTATTCTTAC AGTGGGTGAG AGATATAATT 1860
GATGATTTTA CCAATGAATC TTCACAAAAA ACTACTATTG ATAAAATTTC AGATGTATCC 1920
ACTATTGTTC CTTATATAGG ACCCGCATTA AACATTGTAA AACAAGGCTA TGAGGGAAAC 1980
TTTATAGGCG CTTTAGAAAC TACCGGAGTG GTTTTATTAT TAGAATATAT TCCAGAAATT 2040
ACTTTACCAG TAATTGCAGC TTTATCTATA GCAGAAAGTA GCACACAAAA AGAAAAGATA 2100
ATAAAAACAA TAGATAACTT TTTAGAAAAA AGATATGAAA AATGGATTGA AGTATATAAA 2160
CTAGTAAAAG CAAAATGGTT AGGCACAGTT AATACGCAAT TCCAAAAAAG AAGTTATCAA 2220
ATGTATAGAT CTTTAGAATA TCAAGTAGAT GCAATAAAAA AAATAATAGA CTATGAATAT 2280
AAAATATATT CAGGACCTGA TAAGGAACAA ATTGCCGACG AAATTAATAA TCTGAAAAAC 2340
AAACTTGAAG AAAAGGCTAA TAAAGCAATG ATAAACATAA ATATATTTAT GAGGGAAAGT 2400
TCTAGATCAT TTTTAGTTAA TCAAATGATT AACGAAGCTA AAAAGCAGTT ATTAGAGTTT 2460
GATACTCAAA GCAAAAATAT TTTAATGCAG TATATAAAAG CAAATTCTAA ATTTATAGGT 2520
ATAACTGAAC TAAAAAAATT AGAATCAAAA ATAAACAAAG TTTTTTCAAC ACCAATTCCA 2580
TTTTCTTATT CTAAAAATCT GGATTGTTGG GTTGATAATG AAGAAGATAT AGATGTTATA 2640
TTAAAAAAGA GTACAATTTT AAATTTAGAT ATTAATAATG ATATTATATC AGATATATCT 2700
GGGTTTAATT CATCTGTAAT AACATATCCA GATGCTCAAT TGGTGCCCGG AATAAATGGC 2760
AAAGCAATAC ATTTAGTAAA CAATGAATCT TCTGAAGTTA TAGTGCATAA AGCTATGGAT 2820
ATTGAATATA ATGATATGTT TAATAATTTT ACCGTTAGCT TTTGGTTGAG GGTTCCTAAA 2880
GTATCTGCTA GTCATTTAGA ACAATATGGC ACAAATGAGT ATTCAATAAT TAGCTCTATG 2940
AAAAAACATA GTCTATCAAT AGGATCTGGT TGGAGTGTAT CACTTAAAGG TAATAACTTA 3000
ATATGGACTT TAAAAGATTC CGCGGGAGAA GTTAGACAAA TAACTTTTAG GGATTTACCT 3060
GATAAATTTA ATGCTTATTT AGCAAATAAA TGGGTTTTTA TAACTATTAC TAATGATAGA 3120
TTATCTTCTG CTAATTTGTA TATAAATGGA GTACTTATGG GAAGTGCAGA AATTACTGGT 3180
TTAGGAGCTA TTAGAGAGGA TAATAATATA ACATTAAAAC TAGATAGATG TAATAATAAT 3240
AATCAATACG TTTCTATTGA TAAATTTAGG ATATTTTGCA AAGCATTAAA TCCAAAAGAG 3300
ATTGAAAAAT TATACACAAG TTATTTATCT ATAACCTTTT TAAGAGACTT CTGGGGAAAC 3360
CCTTTACGAT ATGATACAGA ATATTATTTA ATACCAGTAG CTTCTAGTTC TAAAGATGTT 3420
CAATTGAAAA ATATAACAGA TTATATGTAT TTGACAAATG CGCCATCGTA TACTAACGGA 3480
AAATTGAATA TATATTATAG AAGGTTATAT AATGGACTAA AATTTATTAT AAAAAGATAT 3540
ACACCTAATA ATGAAATAGA TTCTTTTGTT AAATCAGGTG ATTTTATTAA ATTATATGTA 3600
TCATATAACA ATAATGAGCA CATTGTAGGT TATCCGAAAG ATGGAAATGC CTTTAATAAT 3660
CTTGATAGAA TTCTAAGAGT AGGTTATAAT GCCCCAGGTA TCCCTCTTTA TAAAAAAATG 3720
GAAGCAGTAA AATTGCGTGA TTTAAAAACC TATTCTGTAC AACTTAAATT ATATGATGAT 3780
AAAAATGCAT CTTTAGGACT AGTAGGTACC CATAATGGTC AAATAGGCAA CGATCCAAAT 3840
AGGGATATAT TAATTGCAAG CAACTGGTAC TTTAATCATT TAAAAGATAA AATTTTAGGA 3900
TGTGATTGGT ACTTTGTACC TACAGATGAA GGATGGACAA ATGATTAA 3948
・ 配列番号17, DNA, BoNT/A1(0) LC
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATcAACTGATCtACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAA
・ 配列番号18, DNA, BoNT/A1(0) 活性化ループ
ACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAG
・ 配列番号19, DNA, BoNT/A1(0) HC
GCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGTAA
・ 配列番号20, DNA, プライマー
ATACACCATGGTATGCCATTCGTCAACAAGCAATT
・ 配列番号21, DNA, プライマー
GCTTTTGGATCCGGTTTATTTGCTGGTGATGATACCGCGC
・ 配列番号22, DNA, プライマー
ACAAGCATATGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAG
・ 配列番号23, DNA, プライマー
AAGCTTCTCGAGTCATTACAGCGGACGTTCGCCCC
【符号の説明】
【０１３０】
[図1]
Full length BoNT/A1(0): 全長BoNT/A1(0)
[図2]
Full length BoNT/A1(0): 全長BoNT/A1(0)
HC of BoNT/A1(0): BoNT/A1(0)のHC
LC of BoNT/A1(0): BoNT/A1(0)のLC
[図4]
Co-expressed BoNT/A1(0): 共発現されたBoNT/A1(0)
[図5]
Glutamate Release ％ Control: グルタミン酸放出、対照の百分率
Co expressed BoNT/A1: 共発現されたBoNT/A1
【図１】
2019531721.tif 000007
【図２】
2019531721.tif 000008
【図３】
2019531721.tif 000009
【図４】
2019531721.tif 000010
【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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