(57)【要約】  本発明では、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法が開示されている。当該方法では、胚盤胞における少量の栄養膜細胞のＤＮＡメチル化プロファイルを検出し、ガードナー分類における形態良好な胚のメチル化レベルの平均値とパターンを、発育良好な胚盤胞のスクリーニング基準とし、検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のメチル化レベルが、良好な胚のメチル化レベルまたは状態に近ければ近いほど、胚の発育が良好になり、より母体への移植に適する。それと同時に、メチル化シーケンシングの結果の分析により、染色体が異常であるかを判断し、染色体異常胚を直接に除去することができる。【選択図】図１
2019513417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のゲノムに対してメチル化検出を行い、そのメチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベルに近いまたは等しい場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞であることを特徴とする、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法。
【請求項２】
更に、ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化パターンを基準とすることを特徴とする、請求項１に記載の非侵襲的な検出方法。
【請求項３】
更に、メチル化シーケンシングの結果により、胚盤胞の各染色体の倍数が正常であるかどうかを判断し、標準の二倍体である場合、検出待ちの胚盤胞の染色体が正常であることを特徴とする、請求項１または２に記載の非侵襲的な検出方法。
【請求項４】
妊娠率の向上における請求項１〜３のいずれか一項に記載の非侵襲的な検出方法の応用。
【請求項５】
栄養膜細胞のメチル化レベルが、ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベル値および／またはメチル化パターンに近いまたは等しい胚盤胞をスクリーニングして移植し、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞であることを特徴とする、試験管ベビーの出生率を向上させる方法。
【請求項６】
さらに、栄養膜細胞のメチル化シーケンシングの結果に基づき、全ての染色体の数が標準二倍体である胚盤胞をスクリーニングして移植を行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
胚盤胞のメチル化シーケンシングのキットであって、メチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベルに近いまたは等しい場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞であることを特徴とする、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキット。
【請求項８】
胚盤胞のメチル化シーケンシングのキットであって、検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシングの結果が、すべての染色体が標準二倍体であることを示す場合、検出待ちの胚盤胞が発育良好な胚盤胞であることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
検出対象が胚盤胞の栄養膜細胞である、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
ガードナー分類における形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、前記ガードナー分類における形態良好な胚のメチル化レベル値の、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットの製造における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全ゲノムレベルのエピジェネティクス分野に関するもので、具体的には、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
体外受精及び胚移植（ＩＶＦ−ＥＴ）は、俗に「試験管ベビー」と称され、特殊な臨床生殖補助技術であり、卵子と精子を体外に取り出し、体外の人工制御の環境でそれらの受精の過程を完成させ、初期胚を女性の子宮に移植し、子宮内で胎児に育成することが必要である。このように、体外受精技術で生まれたベビーは試験管ベビーとも呼ばれる。移植する前に、体外で得られた胚をスクリーニングする必要があり、現在臨床上、下記の二つの方法がある。
【０００３】
（１）ガードナー分類システム（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）による方法。試験管ベビーの過程において、胚盤胞の育成と移植がとても重要な工程である。試験管ベビーの胚盤胞の品質の優劣は、成功を決定する重要な要素である。現在の臨床では、ガードナー分類システムにより、胚盤胞腔の大きさ及び孵化するか否かに基づき、胚盤胞の発育を下記の六つの段階に分けている。即ち、初期胚盤胞であって、胚盤胞腔が胚の総体積の１／２より小さい第１段階；胚盤胞腔の体積が胚の総体積の１／２、またはそれ以上である第２段階；完全胚盤胞であって、胚盤胞腔が完全に胚の総体積を占めている第３段階；拡張胚盤胞であって、胚盤胞腔が完全に胚を満たし、胚の総体積が大きくなり、透明帯が薄くなる第４段階；孵化中胚盤胞であって、胚盤胞の一部が透明帯から脱出した第５段階；孵化後胚盤胞であって、胚盤胞全体が透明帯から脱出した第６段階。第３〜６段階の胚盤胞では、それらの内部細胞塊及び栄養膜細胞に対して、品質のグレード分類を行う必要がある。細胞塊のグレード分類には、細胞数が多く、緊密に配列するグレードＡ；細胞数が少なく、疎に配列するグレードＢ；細胞数がかなり少ないグレードＣがある。栄養膜細胞のグレード分類には、上皮細胞層が比較的に多くの細胞からなり、構造が緻密であるグレードＡ；上皮細胞層が少ない細胞からなり、構造が稀疎であるグレードＢ；上皮細胞層が稀疎な細胞からなるグレードＣがある。このような分類法によれば、評価の最も良好な胚盤胞は５日目の胚盤胞３ＡＡと、６、７日目の胚盤胞４ＡＡである。ＡＲＴ治療において、グレードＡＡの胚が最も理想的な選択であるが、臨床上では、３３％の夫婦しかグレードＡＡの胚を得て移植に用いることができず、５２％の患者はグレードＢ*の胚盤胞（ＡＢ、ＢＡ、ＢＢを含む）しか得られない。グレードＡＡの胚の出生率が３９％で、グレードＢ*の胚の出生率が約２８％で、グレードＣ*（ＢＣ、ＣＢを含む）の胚の出生率が４％で、そのうち、グレードＣＣの出生率はほぼ０である。
【０００４】
ガードナー分類システム（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）は顕微鏡に依頼する伝統的な技術であり、形態学的なグレードの高い胚を選んで移植する胚形態学であり、精度が劣る。臨床試験のデータによれば、形態学的検出だけに頼る生殖補助治療の反復流産者の流産率は３３．５％であり、臨床妊娠率が４５．８％である。試験管ベビーの平均成功率が２０〜３０％であるため、一回の移植の成功率を向上させるためには、通常、２〜３個の胚を同時に移植する。このため、多胎現象が現れることは多々にある。多胎のリスクは単一胎より高く、このような危険は母にとっても胎児にとっても存在する。従って、母子の安全を守るために、三つ子以上の場合、原則的には、減数手術を行う必要があるが、減数手術を行う場合、すべての胚が流産する可能性が１０％である。
【０００５】
よって、妊娠の成功率を向上させるために複数の胚を盲目的に移植して多胎妊娠になり、妊娠期間中に減数手術を行わざるを得ないことによる危害及び論理的な衝突を避け、試験管ベビーの成功率を向上させる新たな方法が望まれている。
【０００６】
（２）胚移植前の遺伝子スクリーニング、即ち、第三世代試験管ベビー（ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＰＧＳ／ＰＧＤ）による方法。１９９０年に、英国のＨａｎｄｙｓｉｄｅはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による卵割球の分析に成功し、性連鎖劣性遺伝病の持病者に対して、胚の性別のスクリーニング後の妊娠分娩を行い、世界初のＰＧＳを完成させ、出産前のスクリーニングの新紀元を画した。１９９０年以後、移植前のスクリーニング技術は急速に発展している。１９９４年に、Ｍｏｎｎｅは蛍光 ｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＦＩＳＨ）技術を用いて、移植する前の染色体異数体及び胚の性別のスクリーニングに成功した。それ以来、マルチプレックスＰＣＲ、蛍光ＰＣＲ、多色ＦＩＳＨなどの技術が次々と発展してきた。１９９８年、ＦＩＳＨは染色体が均衡転座したＰＧＳに応用され始めた。ＰＧＳは、正常で均衡な配偶子または胚を選択することで、染色体転座による反復自然流産率を著しく降下させた。同年、商業的に提供された、１３、１８、２１、Ｘ及びＹの５つの染色体を同時にスクリーニングできる５色プローブもＰＧＳに使用され始め、それによって高齢女性の卵子及び胚の異数体のスクリーニングを行っていた。１９９９年以来、次々と開発された分裂間期核転換（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｎｕｃｌｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）技術、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｄｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＣＧＨ）、全ゲノム増幅（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＷＧＡ）技術が相次いでＰＧＳに用いられ、当該技術の研究及び応用をさらに促進させた。２０１０年以来、ハイスループットシーケンシング技術（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が急速に発展し、１回に数十万〜数百万のＤＮＡ分子をシーケンシングし、１つの胚のゲノムを精密且つ全面的に分析することが可能になり、ＰＧＳを新たな分野に取り込んだ。国内外のＰＧＳ技術に対する研究の熱意は一時でも止まることなく、現在では、ＰＧＳは主に、ａ. 染色体数の異常；ｂ. 胚の性別の診断；ｃ. 遺伝子欠失型遺伝病；ｄ. 胚の単一遺伝子疾患の検査といった遺伝病の診断に応用されている。
【０００７】
現在、アメリカでは、約１２％の生殖期の女性は生殖補助技術ＡＲＴによって子を出産するニーズがある。自然に受胎した者の中にも、胚発育の異常のため流産してしまう者がかなりいる。ＡＲＴ術後に、大部分の胚は発育の異常のため流産してしまう。ゲノム不安定性、例えば、各種の遺伝子の突然変異、染色体構造や数の異常などは流産を招く重要な原因の１つである。遺伝子の欠陥を有する初期胚を排除するために、臨床上では着床前診断技術（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉａｎｏｓｉｓ、ＰＧＤ）が用いられている。このような技術はマイクロマニピュレーションの方法で、移植前の胚の栄養膜から複数の細胞を分離し、これらの細胞に対してゲノム検出を行うものである。現在、ＰＧＤ技術は臨床に広く使用され、「第三世代試験管ベビー」と呼ばれ、生殖補助治療を受ける反復流産者の流産率を大幅に低下させ、臨床妊娠率を向上させている。
【０００８】
ＰＧＳ胚移植前の遺伝子スクリーニングは、染色体の数やＤＮＡ配列が変化した遺伝性疾患だけに対してスクリーニング作用を有する。臨床における大部分の不妊症や流産は、ＤＮＡ配列の変化によるものではなく、大部分の胚の流産には未だに何らかの既知の原因がない。
【０００９】
動物発育の過程において、エピジェネティック情報が重要な役割を果たしている。有機体内のすべての細胞が同じＤＮＡ配列を用いるが、エピゲノムの制御により、細胞が異なる種類に分化し、異なる器官が形成される。つまり、胚の初期の発育過程において、発育段階の異なる細胞は特定のエピゲノムパターンを従わなければならず、このパターンによって胚の多能性が確保され、正確な方向に分化・発育するように導かれていく。哺乳動物の初期胚の発育過程において、全ゲノムレベルのＤＮＡ脱メチル化が現れる。メチルトランスフェラーゼＤＮＭＴｓまたはＴｅｔ３の遺伝子配列を人工的にノックアウトし、ＤＮＡメチル化のリプログラミングを止める場合、胚発育の異常が発生してしまう。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、胚移植前のエピゲノムスクリーニング技術（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ、ＰＥＧＥ）に基づく、世界で初めてエピジェネティック情報による方法を用いて胚の状態を鑑定する方法であって、体外培養段階の胚盤胞から複数の栄養膜細胞を分離し、これらの複数の細胞を取ることが胚全体にとって非侵襲的であるが、胚全体のメチル化状態及び各染色体の倍数状態を代表することができる、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
胚が桑実胚に発育した後、桑実胚がさらに分裂し、それと同時に、子宮腔中の分泌液が透明帯を通じて細胞内に浸み込んで、１つの▲のう▼腔が形成され、胚盤胞腔となる。胚盤胞腔外を包囲するものが扁平細胞層であり、当該層におけるサイズが比較的に小さい細胞は、胎盤の一部となり、栄養膜細胞と呼ばれる。胚の一端に集まる、サイズが比較的に大きい細胞は、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ、ＩＣＭ）と呼ばれる。内部細胞塊の細胞は胚性幹細胞であり、未分化の細胞でもあって、発育多能性を有し、将来的には胎児の各種の組織に発育する。将来、栄養膜細胞が胎膜と胎盤に発育するため、遺伝子診断を行う場合、一般的には少量の栄養膜細胞を取リ出して検出を行う。このような操作は、正常な胎盤の形成に影響を与えず、胎児の発育を影響することもない。
【００１２】
本発明は「ｏｎｅ−ｔｕｂｅ」法で微量の細胞の全ゲノムメチル化ライブラリーを構築し、その後、サンプルに対して全ゲノムのメチル化シーケンシングを行う。グレードＡＡの胚の平均メチル化レベルを判定基準とし、即ち、臨床移植前における胚の非侵襲的な検出の定量基準とする。被検胚のメチル化状態が基準値に近ければ近いほど、その発育状態が良好で、正常の胎児に発育する可能性が大きく、より移植に適すると証明される。同時に、測定したメチル化結果を分析することで、各胚のゲノムにおける染色体倍数が異常であるかどうかを判断できる。染色体異常胚は胚移植に使用できない。従って、本発明の方法によれば、臨床医師は、染色体の倍数が正常で、かつより良好なエピジェネティックプロファイルを示す胚を選択して胚移植を行うことができる。
【００１３】
本発明の研究では、ガードナー分類における形態良好なグレードＡＡの胚の全ゲノムメチル化レベルが非常に一致していること（図１）、形態学的に普通であるＢ*胚における一部の胚の全ゲノムメチル化レベルがグレードＡＡの胚のレベルと一致し、一部の胚のメチル化レベルとグレードＡＡの胚のレベルとの差が大きいこと（図２）、形態学的に劣るＣ*胚における大部分の胚の全ゲノムメチル化レベルがグレードＡＡの胚のメチル化レベルとの差が顕著であること（図１）が見出された。つまり、形態学的な分類が劣るほど、グレードＡＡと比べてメチル化レベルにおいて差がある胚の割合がより大きくなることが見出された。
【００１４】
それと同時に、本発明では、すべてのグレードＡＡの胚のメチル化パターン（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）がよく似ていること（図３、図４）（即ち、異なる胚が同じゲノム領域において同じ高メチル化または低メチル化の状態を呈する。）、品質の低い胚がそれぞれ異なる状態を呈すること（図３、図４）が見出された。
【００１５】
本発明は、人類の初期胚の発育過程において、全ゲノムレベルのエピジェネティック情報の不安定が現れ、これが出生率の低下の重要な要素の１つであり、ゲノムＤＮＡメチル化プロファイルが胚の発育過程において重要な役割を果たし、メチル化に問題がある胚では、一部の重要な遺伝子の制御領域においてメチル化に問題が生じたことを証明した（図５、図６）。メチル化レベルが基準に合致するまたは近い胚盤胞は、胚移植の最も理想的な選択である。ＰＥＧＥ検出により、メチル化レベルがよりグレードＡＡに近い胚をスクリーニングして移植し、直接に胚のエピジェネティック物質を分析し、胚の発育が異常であるかどうかを判断し、より移植に適する胚をスクリーニングすることができる。生殖補助技術の精度を潜在的に大幅に向上させ、「試験管ベビー」の妊娠成功率を向上させ、自然流産率を低下させ、妊娠の品質、試験管ベビーの出生率を向上させることができる（図７）。
【００１６】
また、複数の栄養膜細胞を非侵襲的に獲得して測定したメチル化レベルは、胚全体のＤＮＡメチル化レベルを代表できる（図８）。そのため、本検出方法では、栄養膜における複数の細胞を非侵襲的に獲得し、これら複数の栄養膜細胞のメチル化プロファイルを測定することが最も望ましい。ガードナー分類におけるグレードＡＡの胚のメチル化レベルの平均値である０．３±０．０２を、発育良好な胚盤胞のスクリーニング基準とする。同じ親に由来する複数の胚について、メチル化レベルが０．３に近いほど、より胚移植に適する。
【００１７】
従来から、胚を移植できるかどうかを判断する１つの重要な指標は、胚の染色体が異常であるか否かである。測定したメチル化プロファイルによって、胚の各染色体の倍数が正常であるか否かをも同時に判定できる。例えば、メチル化プロファイルのデータにより、多くの胚の染色体にエラーが発生したこと（表２）、例えば、サンプルｓ−２５−４ＣＣに対する染色体の分析（図９）では、５番目の一つの大きなフラグメントにコピーが１つ多く、９番目の染色体の一つの大きなフラグメントにコピーが１つ少ないことが発見されたため、当該胚は胚移植に使用できないと証明されている。
【００１８】
つまり、栄養膜における複数の細胞を非侵襲的に獲得し、メチル化プロファイルを測定することで、メチル化レベル指標、メチル化パターン、及び染色体の状態を獲得できる。これにより、臨床医師は、染色体の倍数が正常で、かつより良好なエピジェネティックプロファイルを示す胚を選択して胚移植を行うことができる。
【００１９】
具体的には、本発明は、検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のゲノムに対してメチル化検出を行い、そのメチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベルに近いまたは等しい場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化パターン（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）を基準とする、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、メチル化シーケンシングの結果により、胚盤胞の各染色体の倍数が正常であるかどうかを判断し、標準の二倍体である場合、検出待ちの胚盤胞の染色体が正常である、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供する。
【００２２】
本発明は妊娠率の向上における上記非侵襲的な検出方法の応用を提供する。
【００２３】
本発明は、栄養膜細胞のメチル化レベルが、ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベル値に近いまたは等しい胚盤胞をスクリーニングして移植し、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、試験管ベビーの出生率を向上させる方法を提供する。
【００２４】
本発明は、栄養膜細胞のメチル化シーケンシングの結果により、検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシング結果が、すべての染色体が標準二倍体であることを示す胚盤胞をスクリーニングして移植する、試験管ベビーの出生率を向上させる方法を提供する。
【００２５】
本発明は、胚盤胞のメチル化シーケンシングのキットであって、メチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベルに近いまたは等しい場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットを提供する。
【００２６】
更に、本発明は、胚盤胞のメチル化シーケンシングのキットであって、検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシングの結果が、すべての染色体が標準二倍体であることを示す場合、検出待ちの胚盤胞が発育良好な胚盤胞である、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットを提供する。
【００２７】
本発明のキットの検出対象が胚盤胞の栄養膜細胞であることが好ましい。
【００２８】
本発明は、ガードナー分類における形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、前記ガードナー分類における形態良好な胚のメチル化レベル値の、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットの製造における応用を提供する。
【００２９】
具体的には、本発明の実施例のメチル化シーケンシング法で、検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のゲノムに対してメチル化シーケンシングを行い、検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のメチル化レベルを検出し、メチル化レベルが０．３±０．２の範囲内にある場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好である。
【００３０】
検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のメチル化レベルが０．３±０．０２の範囲内にある場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であることが好ましい。
【００３１】
検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のメチル化パターン（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）がグレードＡＡの胚盤胞のパターンに近い場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であることがより好ましい。
【００３２】
本発明では、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法が、メチル化シーケンシングにより得られたデータにより、胚盤胞の各染色体の倍数が正常であるかどうかを判断することをも含み、標準二倍体である場合、検出待ちの胚盤胞の染色体が正常であることがより好ましい。
【００３３】
更に、本発明は、本発明の実施例のメチル化シーケンシング法で、栄養膜細胞のメチル化レベルが０．３±０．２である胚盤胞をスクリーニングして移植する、試験管ベビーの出生率を向上させる方法を提供する。
【００３４】
栄養膜細胞のメチル化レベルが０．３±０．０２である胚盤胞をスクリーニングして移植することが好ましい。
【００３５】
栄養膜細胞のメチル化シーケンシングの結果により、すべての染色体が標準二倍体である胚盤胞をスクリーニングして移植することを更に含むことがより好ましい。
【００３６】
本発明は、本発明の実施例のメチル化シーケンシング法を使用し、検出待ちの胚盤胞のメチル化レベルの平均値が０．３±０．２であり、メチル化パターンがグレードＡＡの胚盤胞のパターンに近いおよび／または検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシングの結果がすべての染色体が標準二倍体であることを示す場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好である、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットを提供する。
【００３７】
本発明のキットでは、検出待ちの胚盤胞のメチル化レベルの平均値が０．３±０．０２であり、メチル化パターンがグレードＡＡの胚盤胞のパターンに近いおよび／または検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシングの結果がすべての染色体が標準二倍体であることを示す場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であることが好ましい。
【００３８】
本発明のキットの検出対象は胚盤胞の栄養膜細胞である。
【００３９】
更に、本発明は、ガードナー分類におけるグレードＡＡの胚のメチル化レベル値の、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットの製造における応用を提供する。本発明の実施例のメチル化検出方法で検出されたグレードＡＡの胚のメチル化レベル値が０．３±０．０２である。検出待ちの胚盤胞は、栄養膜細胞のメチル化レベルが０．３に近いほど、より胚移植に適する。
【００４０】
本方法は胚における各染色体の状態をも同時に検出できる。染色体においてコピー数が変化しない胚だけを胚移植に用いることができ、即ち、すべでが標準二倍体である胚だけを移植に用いることができる。
【００４１】
本発明では、一種のメチル化シーケンシングにより、胚ＤＮＡメチル化のプロファイル（ＤＮＡメチル化レベルを含む）及び胚の各染色体の状態という二つの指標が同時に得られる。この二つの指標を合わせて胚をスクリーニングすることで、胚の生殖補助に用いる。本発明は、従来の方法に比べて、大きな利点を有する。
【００４２】
本発明の方法は、移植前の胚の発育状態及び発育の潜在能力を定量的にスクリーニングするものである。本発明の方法と伝統的な形態学的スクリーニングとは同じ応用範囲を有し、すべての形態学的な分類の胚（グレードＡＡ、Ｂ*またはＣ*を含む）に適するが、本発明の方法はより客観的で、正確である。また、当該技術はすべての胚のスクリーニングに応用でき、当該技術は生殖補助技術の精度を大幅に向上させ、手術のリスクを低下させ、患者の苦しみを軽減し、試験管ベビーの成功率をより向上させることができる。本発明の有益な效果として、具体的には、下記の通りである。
【００４３】
１、本発明の方法は、伝統的な形態学及びＰＧＳに基づき、さらに発育良好な胚を定量的にスクリーニングし、試験管ベビーの成功率を向上させ、流産率を低下させるものである。
【００４４】
従来の顕微鏡技術に頼る、形態学的なグレードの高い胚をスクリーニングして移植する胚形態学に比べて、本発明の方法はより客観的であり、形態学的な分類における人為的な不確定性（多くの形態学的検出が医療担当者の個人的な経験に頼る。）を避けている。また、形態学的な優劣はゲノム及びエピゲノムの状態を完全に代表することができず、それによって、胚盤胞の発育状態及び潜在能力を正確に予想することができない。一方、本発明の方法は、胚のエピジェネティック情報を直接に測定・分析することができ、胚が標準のＤＮＡメチル化プロファイルを有するかどうか、胎児に正常に発育する潜在能力を有するかどうかを正確的に判断でき、それと同時に、染色体が正常であるかどうかをも検出し、発育が良好で、染色体が正常である胚をスクリーニングできる。本ＰＥＧＥ法は、世界で初めて、エピジェネティック情報により胚をスクリーニングし、移植前の検出を行うという概念を提出した。
【００４５】
２、本発明のＰＥＧＥ法は、今現在使用されているＰＧＳ法より優れるものである。
【００４６】
ＰＧＤ／ＰＧＳは国際的に、胚の染色体に異常があるかどうかを判断する、胚のＤＮＡ配列及び染色体の構造を分析する一般的な方法である。しかし、正常な、染色体の異常や遺伝性疾患を有しない大多数の人にとって作用がなく、大多数の人のＡＲＴ術後の妊娠率及び出生率を向上できない。一方、本発明の発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法は、すべての人に適するとともに、染色体の異常も検出できる。従って、本ＰＥＧＥ法は、既存のＰＧＳ法による、染色体の異数性問題の有無の検出を完成するとともに、より良好な胚の発育のエピジェネティック状態を示す胚をもスクリーニングするため、本方法は明らかに既存のＰＧＳ法より優れている。従って、将来、本ＰＥＧＥ法を臨床に応用することが、移植前における最も一般的で、基礎的且つ精確な、胚のスクリーニング手段になるのが有望である。
【００４７】
３、多胎妊娠を避け、減数手術の実施を減らす。
【００４８】
試験管ベビーの平均成功率が２０％〜３０％であるため、一回の移植の成功率を向上させるためには、通常、２〜３個の胚を同時に移植する。それにより多胎現象が現れることは多々にある。多胎のリスクは単一胎より高く、このような危険は母にとっても胎児にとっても存在する。権威的な調査によれば、双生児の帝王切開率が７８．４５％であり、早産が４７．０７％を占め、合併症及び併発症が３９．７％を占める。双生児及び多子出産の母は妊娠期間に糖尿病、高血圧などの妊娠期総合症をより罹りやすく、出産後に出血する概率も高く、それと同時に早産も比較的に発生しやすくなる。早産児の大部分は先天性の肺部疾患を患い、このような疾患は終生的なものである。母子の安全を守るために、三つ子以上の場合、原則的には、減数手術を行う必要があるが、減数手術の場合、すべての胚が流産する可能性が１０％である。本発明の方法は、一回で複数の胚を移植することによる多胎妊娠の現象を回避でき、受胎中の母の苦しみを減少し、胚の成活率及び妊娠の成功率を保証するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】形態学的な分類におけるグレードが最も高いグレードＡＡの胚と、グレードが劣るグレードＣＣまたはＣＢの胚のメチル化レベルの図である。ＡＡ−１とＣＢ−１の胚は同じ夫婦に由来し、ＡＡ−３とＣＣ−６も同じ夫婦に由来するものである。結果によると、ＡＡのメチル化レベルが０．３０±０．０２の間にあるのに対し、ＣＣまたはＣＢのメチル化レベルはＡＡに比べて、全体的に非常に大きな差がある。
【図２】６個のグレードＢＢまたはＢＡの胚のメチル化レベルの図である。２つの破線は５個のグレードＡＡの胚のメチル化レベルのＳＤ誤差を示す。結果によると、３個のメチル化レベルがＡＡと近似していて（ＢＢ−３、ＢＢ−４、ＢＢ−５）、他の３個のメチル化レベルがＡＡに比べて非常に大きな差がある（ＢＡ−１、ＢＢ−２、ＢＢ−６）。
【図３】各胚のＣｐＧメチル化パターンによる主成分の分析図である（ＰＣＡ分析）。グレードＡＡの胚のメチル化パターンが非常に似ているのに対し、ＣＣまたはＣＢのメチル化パターンとＡＡのメチル化パターンとの差は比較的に大きく、且つ各胚同士の状態の差も比較的に大きい。
【図４】５個のグレードＡＡの胚と７個のグレードＣＢまたはＣＣの胚における、異なるゲノムの機能要素の平均メチル化レベルを示す図である。５個のグレードＡＡの胚の各機能要素のメチル化レベルは近似しているが、７個のグレードＣＣまたはＣＢの胚の各機能要素のメチル化レベルの差は非常に大きく、且つ複数の胚がＡＡと比べて比較的に大きな差がある。
【図５】異なる形態学的な分類の胚のメチル化リプログラミングの機能分析図である。形態学的な分類によるグレードの高い胚とグレードの低い胚とのメチル化可変領域に対して、機能エンリッチメント解析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行う。プロモーターがＤＭＲｓ領域にある遺伝子にはＤＡＶＩＤ  ＧＯエンリッチメント解析を用い、遺伝子内部のＤＭＲｓ領域のシスエレメントはＧＲＥＡＴ  ｔｏｏｌｓにより解析する。ＧＯ解析によるｐ値が０．０５より小さいものは、統計学的な意義を有する。結果によると、メチル化のエラーが発生する領域が、細胞の生存にとって非常に重要な基礎代謝遺伝子、または発育、特に神経の発育に係わる遺伝子によく発生し、正常のメチル化プロファイルが胚の発育にとって極めて重要であることが証明されている。
【図６】異なる胚におけるＩＤＨ２遺伝子附近のエンハンサーが異なるメチル化状態を呈することを示す図である。図には、グレードの高い胚とグレードの低い胚の平滑なメチル化レベルが延伸する遺伝子領域の上下５ｋｂの領域が示されている。サンプルＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３のエンハンサーの周囲のメチル化状態が近似していて、サンプルＣＣ５とＣＣ６のエンハンサーのメチル化状態に問題が生じている。黒い短柵はＣｐＧサイトを表す。
【図７】各グレードの胚における、メチル化レベルが０．３±０．０２の範囲内にある割合、及び異なるグレードの胚の出生率を示す図である。ＣＣとＣ*の出生率の代わりにＣ*の出生率を使用したため、図中のＣ*胚の出生率がＣＣとＣ*の合計出生率より高くなっている。当該図によると、メチル化状態が良好な胚は良好な出生率を得る傾向にもあることが証明されている。
【図８】非侵襲的に得られた複数の栄養膜細胞のメチル化レベルが全胚のメチル化レベルに近似していることを示す図である。ＢＢ−７−ＴＥとＣＣ−８−ＴＥはそれぞれ胚ＢＢ−７とＣＣ−８から取り出した複数の栄養膜細胞である。
【図９】メチル化プロファイルの結果により染色体のコピー数を分析することを示す図である。サンプルｓ−２５の５番目の染色体の１つのフラグメントにコピーが１つ多く、９番目の染色体の１つのフラグメントにコピーが１つ少なくなっている。これにより、当該胚の染色体に異常が生じ、胚移植に使用できないことが証明されている。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。本発明の主旨と実質から逸脱しない限り、本発明の方法、工程、または条件に対する補正または代替は、全て本発明の範囲に属すものである。
【００５１】
特に断りがない限り、実施例で用いる化学試薬はいずれも通常の市販の試薬であり、実施例で用いる技術手段は当業者が熟知している通常の手段である。
【００５２】
実施例１
【００５３】
人類胚盤胞における全ゲノムレベルのＤＮＡメチル化の不安定に関する発見
本発明では、ガードナー分類システムにより分類されたグレードが最も高いグレードＡＡの胚盤胞と、グレードが劣るグレードＣＣ、ＢＣまたはＣＢの胚盤胞とを収集した。これらの胚盤胞は協力部門である北京大学第三医院及び広州医科大学付属第三医院から提供されるもので、患者に生殖補助手術を行う際に、体外で複数の胚盤胞を同時に培養した後、形態が最も良好な胚盤胞を選択して移植し、患者本人の許可を得て、同意書にサインして頂いた後、寄付していただいた残りの胚盤胞を当該課題の科学研究に使用した。各胚盤胞に対して、単一塩基解像度にて全ゲノムのメチル化シーケンシングを行った。本発明の「ｏｎｅ−ｔｕｂｅ」実験方法の詳細は下記の通りである。
【００５４】
１、サンプルの準備
【００５５】
栄養膜細胞を胚から分離した後、５μｌ以下の胚専用培養液またはＰＢＳにて２００μｌのチューブに保存し、−８０℃まで急速に冷凍させて保存した。
【００５６】
２、細胞の溶解
【００５７】
【表１】
2019513417.tif 000003
【００５８】
冷凍保存したサンプルを取り出し、室温まで融化させた後、直接に４℃で３０００ｇを５ｍｉｎ遠心分離させた。５６℃で１．５ｈタンパクを消化させた後、７５℃で３０ｍｉｎプロテアーゼを失活させた。
【００５９】
３、ＤＮＡの切断
【００６０】
サンプルＤＮＡ  １０００ｐｇ当たりにＬａｍｄａ  ＤＮＡ  ５ｐｇを加える割合で、メチル化されていないＬａｍｄａ  ＤＮＡを加えた。サンプルの量が５０μｌとなるように超純水を加えた。切断の条件：Ｓ２、５０μｌ、４００ｂｐ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ。体積が３０μｌになるまで濃縮させた。
【００６１】
４、Ｅｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ末端修復
【００６２】
準備した反応緩衝液が下記の通りである
【００６３】
2019513417.tif 000004
【００６４】
２０℃で３０ｍｉｎ反応させ、さらに７５℃で２０ｍｉｎ反応させ、酵素を失活させた。次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００６５】
５、ｄＡ−Ｔａｉｌｉｎｇ  ３’末端に対するＡの付加
【００６６】
一歩前の工程の反応系に下記の試薬を追加した。
【００６７】
2019513417.tif 000005
【００６８】
３７℃で３０ｍｉｎ反応させ、さらに７５℃で２０ｍｉｎ反応させ、酵素を失活させた。次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００６９】
６、アダプタの付加
【００７０】
一歩前の工程の反応系に下記の試薬を追加した。
【００７１】
2019513417.tif 000006
【００７２】
十分に混合させ、１６℃で一晩反応させた（少なくとも８ｈ）。次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００７３】
７、メチル化ライブラリー構築キットの使用
【００７４】
説明書に従い、５０μｌのサンプルに適用するＣＴ  ＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔを調製した。準備したＢｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅは下記のとおりであった。
【００７５】
2019513417.tif 000007
【００７６】
十分に混合させ、各サンプルを２つのチューブに平均的に配分し（１つのチューブに７５μｌ）、下記のような工程を起動させた。９８℃で１０ｍｉｎ；６４℃で２ｈ；４℃で最大２ｈ放置した。キットのスピンカラムを採集チューブに入れ、ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ６００μｌ及びＣａｒｒｉｅｒ  ＲＮＡ  ０．５μｌを加えた。１５０μｌのサンプルを一歩前の工程のｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに加えた。ピペットチップで軽く吹き、均一になるようにかき混ぜ、チューブの蓋を閉めて５ｍｉｎ放置した。少なくとも１００００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心させた。採集チューブ中の試薬を改めてスピンカラムに入れ、再度１ｍｉｎ遠心させた。遠心された試薬を除去した。スピンカラムにＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μｌを加え、少なくとも１００００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心させた。スピンカラムにＤｅ−ｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌを加え、室温で１５〜２０ｍｉｎ放置した。少なくとも１００００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心させた。遠心された試薬を除去した。スピンカラムにＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μｌを加え、少なくとも１００００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心させた。一歩前の工程を繰り返し、採集チューブ中の試薬を除去し、スピンカラムを新たな１．５ｍＬの遠心チューブに入れた。超純水１１μｌを加え、室温で１０ｍｉｎ放置し、少なくとも１００００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心させ、この工程を繰り返した。遠心後に得られたサンプルがバイサルファイト処理されたＤＮＡである。次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００７７】
８、一回目のＰＣＲ増幅
【００７８】
ＰＣＲ増幅キットを使用した。下記の増幅緩衝液を準備した。
【００７９】
2019513417.tif 000008
【００８０】
下記の循環工程に従って増幅を行った：９８℃で４５ｓ；９８℃で１５ｓ、６５℃で３０ｓ、７２℃で３０ｓ、計６サイクル；７２℃で１ｍｉｎ。４℃に維持した。
【００８１】
次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００８２】
９、一歩前の工程のＤＮＡサンプルに同体積（５０μｌ）のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓを加え、均一になるまで十分に混合させ、遠心させた。３７℃で１０ｍｉｎ静置した。チューブをマグネティックラックにセットし、５ｍｉｎ静置した。７５％エタノール２００μｌで磁気ビーズを洗浄し、上清を吸い捨てた。磁気ビーズを空気に２ｍｉｎ晒し、エタノールを揮発させた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８.５）２５μｌで磁気ビーズを再懸濁させ、簡単に遠心させた後、５ｍｉｎ静置した。その後、マグネティックラックにセットし、５ｍｉｎ静置した。上清を収集して新たな２００μｌ遠心チューブに入れ、次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００８３】
１０、二回目のＰＣＲ増幅
【００８４】
ＰＣＲ増幅キットを使用した。下記の増幅緩衝液を準備した。
【００８５】
2019513417.tif 000009
【００８６】
下記の循環工程に従って増幅を行った：９８℃で４５ｓ；９８℃で１５ｓ、６５℃で３０ｓ、７２℃で３０ｓ、計１３〜１６サイクル；７２℃で１ｍｉｎ；４℃に維持した。次いで、次の工程に移るか、あるいは−２０℃またはそれ以下の温度まで冷凍させて保存した。
【００８７】
１１、ゲルの回収
【００８８】
ＤＮＡサンプルに対して、ゲルの濃度が２％で、電圧が９０Ｖに制御されたアガロースゲル電気泳動を行った。シーケンシングの要求に応じて、適宜な大きさのＤＮＡフラグメントを切り取って、ゲルの回収を行った。最後の工程でＤＮＡを溶離させる際に、計５０μｌの無菌超純水を使用し、３回に分けて、溶離した。
【００８９】
１２、アダプタの除去
【００９０】
一歩前の工程のＤＮＡサンプルに０.８ｘ（４０μｌ）ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓを加え、均一になるまで十分に混合させ、遠心させた。３７℃で１０ｍｉｎ静置した。チューブをマグネティックラックにセットし、５ｍｉｎ静置し、磁気ビーズが吸着されるまでに待っていた。磁気ビーズを吸い取らないように上清を吸い捨てた。７５％エタノール２００μｌで磁気ビーズを洗浄し、上清を吸い捨てた。磁気ビーズを空気に２ｍｉｎ晒し、エタノールを揮発させた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８.５）１５μｌで磁気ビーズを再懸濁させ、簡単に遠心させた後、５ｍｉｎ静置した。その後、マグネティックラックにセットし、５ｍｉｎ静置した。上清を収集して新たな１．５μｌの遠心チューブに入れ、−２０℃まで冷凍させて保存した。このサンプルがシーケンシング待ちのＤＮＡサンプルである。
【００９１】
上記の工程によりＤＮＡメチル化ライブラリーが得られ、ライブラリーが品質検査に合格した後、シーケンシングを行うことができる。まず、Ｂｉｓｍａｒｋ対照ソフトで、得られた胚盤胞の全ゲノムのメチル化シーケンシングデータをヒトリファレンスゲノム配列（ｈｇ１９）と比較した。比較情報によれば、ＰＣＲ反復配列及び両端の配列が重なる領域を除去した後、唯一に比較されたヒトリファレンスゲノム配列上のシーケンシング配列（ｒｅａｄ）がＷａｓｔｏｎ鎖配列とＣｒｉｃｋ鎖配列に分けられる。Ｓａｍｔｏｏｌｓソフトにより、Ｗａｓｔｏｎ鎖配列のシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）及びＣｒｉｃｋ鎖配列のアデニンに由来するメチル化情報をそれぞれ引き出し、２つの鎖の情報を合わせて、各ＣｐＧサイトのメチル化レベルを得た。全ゲノムのメチル化レベルは各ＣｐＧサイトのメチル化レベルの平均値である。
【００９２】
検討した結果、検出された５個のグレードＡＡの胚盤胞のメチル化レベルは全て近似している一方、検出された７個のグレードの低い胚では、６個の胚の全ゲノムのメチル化レベルがグレードＡＡの胚の平均値から大きく離れ、これらの６個の胚の間の差も明らかであった。グレードの高い胚に比べて、これらのグレードの低い胚において、一部の胚は過度に脱メチル化され、他の一部の胚は脱メチル化が不十分であった（図１をご参照）。６個のグレードＢＢまたはＢＡの胚では、３個の胚のメチル化レベルがＡＡと近似していて、移植胚の良好な候補であるが、他の３個の胚のメチル化レベルは胚移植に適しないものであった（図２）。
【００９３】
さらに、生物情報学のＤＮＡメチル化パターンの主成分分析（ＰＣＡ）法によると、５個のグレードＡＡの胚のメチル化パターンが近似していて、同じ類別に分類できるが（図３において、丸で示される）、７個のグレードの低い胚は丸の外に分散し、それらのメチル化パターンとグレードＡＡの胚との差は大きかった。
【００９４】
異なる胚の同じ機能エレメント領域のメチル化状態の比較分析により、同じ機能領域における５個のグレードＡＡの胚のメチル化パターンが類似しているが、グレードの低い胚において、同じ機能領域のメチル化状態はそれぞれ異なっていることが見出された（図４）。これで分かるように、人類の胚の初期発育の過程において、全ゲノムレベルのエピゲノムの不安定が現れた。グレードＡＡの胚の全ゲノムのメチル化レベルが非常に一致（即ち、異なる胚が同じゲノム領域において同じ高メチル化または低メチル化の状態を呈する。）しているが、形態学的な分類の低いＢ*とＣ*の胚の全ゲノムのメチル化レベルには異なる程度のばらつきが現れた。グレードＡＡと比べて形態学的な分類グレードが低いほど、そのメチル化レベルの差がより大きくなる。臨床上では、グレードＡＡの胚の出生率が最も高く、メチル化レベルも一致しているため、グレードＡＡの胚のメチル化パターンが最も正確なものであり、初期胚の正常な発育を導くことができると考えられる。
【００９５】
実施例２  不正確なメチル化リプログラミングの、胚の初期発育を調節するシグナル経路への影響
【００９６】
高グレードの胚及び低グレードの胚のメチル化状態が異なる領域に対して、遺伝子機能の分析（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ）を行った。
【００９７】
分析結果により、遺伝子プロモーターがメチル化可変領域（ＤＭＲ）にある遺伝子は、主に胚の発育、例えば、細胞周期、ＤＮＡ新陳代謝、ＤＮＡ修飾、染色体定位、ＲＮＡエディティング、ＤＮＡ修復、細胞周期などに関する多くの経路に富化することや（図５）、メチル化可変領域が遺伝子の内部にある遺伝子は、主に特定の組織の発育、例えば、神経の発育、ニューロンの分化と運命決定、脊髄の構造、ｍＲＮＡのホメオスタシスなどを影響すること（図５）が見出された。
【００９８】
結果によれば、グレードが最も低いグレードＣＣの胚において、エンハンサーのメチル化には時々誤ったリプログラミングが発生する。メチル化可変領域がエンハンサーにある遺伝子は、発育と代謝に関する経路に富化する。図６は、ＩＤＨ２遺伝子のエンハンサー及び附近領域の、異なる胚におけるメチル化状態を示すものである。グレードＡＡの胚は当該領域においていずれも低メチル化状態を示すが、グレードＣＣの胚は高メチル化状態を示した。エンハンサー領域の高メチル化により、ＩＤＨ２遺伝子の発現量が大幅に低下した。
【００９９】
実施例３  移植前の胚盤胞のメチル化レベルとＡＲＴ術後の胎児出生率との関係
【０１００】
本実施例では、グレードＡＡの胚盤胞の平均メチル化レベルである０.３±０.０２を比較基準とし、即ち、臨床移植前の胚盤胞の非侵襲的な検出の定量基準とする。当該基準は形態学的検出に基づき、正常に発育した胚盤胞をより精確にスクリーニングする新たな臨床指標である。
【０１０１】
当該指標の精度をさらに検証するため、本発明では別途で６個のグレードＢ*の胚盤胞（図２）を収集した。結果によれば、グレードＢ*のサンプルにおける３個のサンプルのメチル化レベルが、グレードＡＡの胚盤胞の平均メチル化レベルの標準である０.３から顕著に離れた。図１は、５個のグレードＡＡのサンプルにおいても、１個のサンプルが基準から離れ、検出した７個のグレードＣ*の胚における６個の胚が基準から離れたため、各グレードの胚盤胞のメチル化レベルが基準に合致する割合はそれぞれ、グレードＡＡでは約８０％、グレードＢ*では約５０％、グレードＣ*では約１４％であることを示した（図７）。図７の結果は、各グレードの胚盤胞におけるメチル化レベルが基準に合致するサンプルの割合と、当該グレードの臨床上の胎児の出生率とが顕著な正の相関関係であることを示した。
【０１０２】
本実施例の結果により、ゲノムＤＮＡメチル化プロファイルが胚の発育の過程において重要な役割を果たし、メチル化レベルが基準に合致するまたは近い胚盤胞が胚移植の最も理想的な選択であることが証明された。
【０１０３】
実施例４  移植前のエピゲノムの検査は、マイクロマニピュレーションにより胚盤胞から複数の栄養膜細胞を分離することで実現できる
【０１０４】
臨床において、移植前の遺伝学診断（ＰＧＤ）技術は２０年以上の応用歴史を有し、当該技術は生活組織検出法で胚盤胞から複数の細胞を剥離し、遺伝子の突然変異と染色体の異常などの疾患の診断に用いるものである。本実施例では、各被検胚盤胞の栄養膜細胞（ＴＥ）から複数の細胞を分離し、実施例１に記載の「Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ」、即ち、極少量の細胞の全ゲノムのメチル化ライブラリーの構築方法により、異なる胚盤胞のＴＥメチル化ライブラリーをそれぞれ構築するとともに、異なる胚盤胞の残りの細胞で平行のメチル化ライブラリーに作った。そして、Ｈｉｓｅｑシーケンスプラットホームで検出を行い、図８は、ＴＥ由来の少量の細胞のメチル化レベルが、当該胚盤胞のメチル化レベル全体と類似し、全胚盤胞のメチル化プロファイルを代表できることを示した。よって、このような非侵襲的な生活組織検出法により、より良好な移植前の胚のメチル化プロファイルを示す胚盤胞をスクリーニングすることができる。
【０１０５】
実施例５ 胚染色体の異数性の検出
【０１０６】
現在広く使用されているＰＧＤ／ＰＧＳは、胚のＤＮＡ配列及び染色体の構造を分析することで、胚に染色体の異常が存在するかどうかを判断するものである。本発明のＤＮＡメチル化全ゲノムシーケンシングの結果によりも、染色体の倍数を判断でき、染色体の異常に関する計算方法は、染色体のフラグメントに対するシーケンシングの深さに基づいて検出するものである。その後の胚盤胞の全ゲノムメチル化のシーケンシングデータを比較し、ＧＣの含有量及び比較の偏好性などの要素を除いた後、一兆の塩基（１Ｍｂ）を単位としてシーケンシングの深さを計算した。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）により、シーケンシングの深さの類似性に基づき、染色体を分割した。シーケンシングの深さが極高または極低となる領域が現れる場合、このフラグメントに染色体の倍加または欠失が存在することを意味する。表２の結果は、３６個の胚における１７個の胚に染色体の異常があり、胚移植に適しないことを示した。サンプルｓ−２５を例として、その５番目の染色体の１つのフラグメントにはコピーが１つ多く、９番目の染色体の１つのフラグメントにはコピーが１つ少なかった（図９）。
【０１０７】
従って、本発明のＰＥＧＥ法は、既存のＰＧＳ法による、染色体の異数性問題の有無の検出を完成するとともに、より良好な胚の発育のエピジェネティック状態を示す胚をもスクリーニングするため、本方法は明らかに既存のＰＧＳ法より優れている。従って、将来、本ＰＥＧＥ法を臨床に応用することが、移植前における最も一般的で、基礎的且つ精確な、胚のスクリーニング手段になるのが有望である。本発明のＰＥＧＥ法を用いると、染色体異常の問題も同時に検出できる。その結果、１７個の胚の染色体に倍数の異常が発生し、これらの胚は胚移植に使用できないことが見出された。
【０１０８】
【表２】
2019513417.tif 000010
【０１０９】
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【０１１０】
上記では、一般的な説明および本発明を実施するための形態を用いて本発明を詳細に説明したが、当業者にとって、本発明に基づいていくつかの修正または改善を行い得るのは明らかなことである。従って、本発明の精神から逸脱しない上で行われたこれらの修正または改善は、全て本発明の保護範囲に属すものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明は発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供する。胚盤胞における少量の栄養膜細胞のＤＮＡメチル化プロファイルを検出し、ガードナー分類における形態良好な胚のメチル化レベルの平均値及びパターンを発育良好な胚盤胞のスクリーニング基準とし、検出待ちの胚盤胞の栄養膜細胞のメチル化レベルが良好な胚のメチル化レベルまたは状態に近ければ近いほど、胚の発育が良好で、より母体への移植に適する。それと同時に、メチル化シーケンシングの結果の分析により、染色体が異常であるかどうかを判断し、染色体異常胚を直接に除去することができる。本発明が提供する発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法により、臨床医師は、染色体の倍数が正常で、且つより良好なエピジェネティックプロファイルを示す胚を選択して胚移植を行うことができ、生殖補助技術の精度を大幅に向上させ、自然流産率の低下、妊娠の品質及び試験管ベビーの出生率の向上に有益であり、良好な経済価値及び応用前景を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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