(57)【要約】  本発明は認知症関連神経性疾患、より具体的にはアルツハイマー病に関連する。本願では、ＢＭＩ１欠損性であり、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す霊長類の皮質神経細胞について説明する。このような細胞を含む細胞モデル、このような細胞を使用して抗アルツハイマー薬をスクリーニングする方法、抗アルツハイマー薬を設計する方法、及び／又は抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補を特定する方法も説明する。また、ＢＭＩ１活性を評価すること、及び／又はＢＭＩ１のエピジェネティックサイレンシングを検出することを含む、アルツハイマー病を診断する方法についても説明する。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＩ１欠損性である霊長類の皮質神経細胞であり、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す単離細胞。
【請求項２】
前記１つ以上のフェノタイプ特徴が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＢＭＩ１が欠失しているか、あるいはＢＭＩ１遺伝的活性、ＢＭＩ遺伝子発現、ＢＭＩ１タンパク質機能、及び／又はＢＭＩ１タンパク質発現が低下及び／又は不活化している、請求項１又は請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ＢＭＩ１遺伝子に対するマイクロＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ、ＣＲＥ−ｌｏｘｐを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＴＡＬＥＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＺＦＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、及びこれらの組合せのうちの１つ以上を用いる遺伝的不活化を介してＢＭＩ１が不活化されている、請求項１又は請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
前記霊長類がヒトである、請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞又はヒト胚性幹細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記アルツハイマー病が孤発性アルツハイマー病である、請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の細胞。
【請求項８】
複数の請求項１に記載の皮質神経細胞のインビトロ培養物を含む、認知症関連神経性疾患の細胞モデル。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞が３次元的に培養される、請求項８に記載の細胞モデル。
【請求項１０】
前記細胞モデルが、アミロイドプラーク及びＴａｕ濃縮物を生じる、請求項８又は請求項９に記載の細胞モデル。
【請求項１１】
前記神経細胞が３Ｄマトリゲル（商標）マトリックス中で培養される、請求項８〜請求項１０の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１２】
星状細胞との共培養物をさらに含む、請求項８〜請求項１１の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１３】
前記皮質神経細胞及び前記星状細胞がヒト細胞である、１２。
【請求項１４】
前記認知症関連神経性疾患がアルツハイマー病である、請求項８〜請求項１３の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１５】
前記認知症関連神経性疾患が、前頭側頭型認知症又はレビー小体型認知症である、請求項８〜請求項１４の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１６】
（ｉ）霊長類の皮質神経細胞を提供する工程、及び
（ｉｉ）ＢＭＩ１の発現又は生物活性を不活化又は抑制する工程
を含む、請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の細胞を調製する方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の神経細胞又は請求項８〜請求項１５の何れか一項に記載の細胞モデルと、
アッセイ緩衝液、対照、基質、標準物質、検出材料、実験室用品、及び使用者向けマニュアル又は指示書からなる群より選択される１つ以上の追加構成要素と、
を含む、抗アルツハイマー薬スクリーニング用キット。
【請求項１８】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の細胞を、被験抗アルツハイマー化合物に曝露することと、
前記被験化合物が存在する状態で、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について前記細胞を評価することと、
アルツハイマー病の前記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択することと、
を含む、抗アルツハイマー薬をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
（ｉ）ＢＭＩ１欠損を有する細胞又は動物を、試験される被験化合物と接触させることと、
（ｉｉ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴に対する前記被験化合物の活性を評価することと、
を含む、抗アルツハイマー薬候補を特定するためのスクリーニング方法。
【請求項２０】
前記１つ以上のフェノタイプ特徴が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験化合物との接触の存在下で、又は前記被験化合物との接触若しくは曝露の後で前記評価が実施される、請求項１８又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択が、以下の生物学的効果のうちの１つ以上を有する被験化合物を選択することを含む、請求項１８〜請求項２１の何れか一項に記載の方法：
軸索膨張の防止又は阻害；
軸索セグメントの切断の防止又は阻害；
β−アミロイド蓄積の防止又は阻害；
Ｃ９９断片蓄積の防止又は阻害；
ｐ−Ｔａｕ蓄積の防止又は阻害；
シナプス萎縮の防止又は阻害；
神経細胞アポトーシスの防止又は阻害；
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮の防止又は阻害；
ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成の防止又は阻害；及び
核膜異常の防止又は阻害。
【請求項２３】
前記評価が、前記１つ以上のフェノタイプ特徴を、前記被験化合物に曝露された、又は曝露されていない野生型皮質ニューロンと比較することを含む、請求項１８〜請求項２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記評価が、前記１つ以上のフェノタイプ特徴を、前記被験化合物に曝露されていない対照の細胞又は動物と比較することを含む、請求項１８〜請求項２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＢＭＩ１欠損を有する非ヒト動物の、アルツハイマー病の動物モデルとしての使用。
【請求項２６】
前記動物が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択されるアルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記動物がＢＭＩ１についてヘミ接合である、請求項２５又は請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記動物がマウスである、請求項１８〜請求項２７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２９】
アルツハイマー病の研究のための、及び／又は抗アルツハイマー化合物候補の特定、検査、スクリーニング、及び／又は設計のための請求項１８〜請求項２８の何れか一項に記載の使用。
【請求項３０】
（ａ）請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の細胞を被験抗アルツハイマー化合物に曝露する工程、
（ｂ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について前記細胞を評価する工程、
（ｃ）アルツハイマー病の前記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択する工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）の被験化合物の化学構造を改変して抗アルツハイマー活性が改善した改変化合物を得る工程
を含む、抗アルツハイマー薬を設計する方法。
【請求項３１】
前記改変化合物を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を再度繰り返すこと、及び所望により工程（ｄ）を再度繰り返すことをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の細胞を野生型皮質ニューロンと定量的プロテオーム比較解析又はゲノムワイド発現比較解析する工程、及び
（ｂ）発現又は翻訳後修飾が異なる遺伝子又はタンパク質を特定する工程、
を含み、
工程（ｂ）において特定された遺伝子又はタンパク質は抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補である、抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補を特定する方法。
【請求項３３】
（ｃ）請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の細胞及び／又は前記野生型皮質ニューロンを抗アルツハイマー薬に曝露する工程、及び
（ｄ）曝露細胞及び／又は曝露皮質ニューロンを、工程（ａ）の定量的プロテオーム解析と比較定量的プロテオーム解析又は比較遺伝子発現解析する工程
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象の脳細胞におけるＢＭＩ１活性を評価することを含み、
ＢＭＩ１活性の低下又は不在がアルツハイマー病の徴候である、対象におけるアルツハイマー病を診断する方法。
【請求項３５】
前記脳細胞が、海馬由来の細胞、前頭皮質由来の細胞、及び嗅内皮質由来の細胞からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記評価が、ＢＭＩ１に対する親和性を有する放射性及び／又は蛍光性血液脳関門透過性分子を前記対象に投与することを含む、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記評価が、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）脳走査の使用を含む、請求項３４〜請求項３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記評価が、組織生検の取得を含む、請求項３４〜請求項３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記評価が、死後に実施される、請求項３４〜請求項３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記評価が、ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出を含む、請求項３４〜請求項３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出が、ｑＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ−シーケンシング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、及び／又はこれらの組合せのうちのいずれか１つによって実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象の海馬、前頭皮質、及び／又は嗅内皮質におけるＢＭＩ１のエピジェネティックサイレンシングを検出することを含む、ヒト対象における孤発性アルツハイマー病を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は認知症関連神経性疾患の分野に関し、より具体的にはアルツハイマー病の治療法を開発するための細胞及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
孤発性ＡＤ（ｓＡＤ）は最も一般的な認知症であり、２０１４年ではアメリカ人の推定有病数が５２０万人である｛Ｈｅｂｅｒｔ，２０１３｝。ｓＡＤ及び他の認知症の個人全員に対する２０１４年の総支出はアメリカ国内で２１４０億ドルと推定されている（アメリカアルツハイマー協会２０１４年レポート）。多数の治験にもかかわらず、ｓＡＤ疾患を停止又は遅延させる治療は現実には存在しない｛Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，２０１４｝。ｓＡＤにおける脳の変化は症状が現れる２０年以上前に始まる｛Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ，２０１３｝。６５歳以上の人々の１１％がｓＡＤである。８５歳以上の人々の３２％がｓＡＤである。このように、ｓＡＤの最大のリスク因子は年齢の進行である｛Ｓａｖｖａ，２００９｝。ＡＰＯＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮのＥ４アレル又はＳＯＲＬ１のアレル多型の保有者はＡＤ発症のリスクが高くなる｛Ｋａｎｅｋｉｙｏ，２０１４｝。対照的に、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）は３０〜５０歳の間の年齢で発症し、常染色体優性であり、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、又はＰＳＥＮ２の突然変異に連鎖しており、ＡＤ症例の５％未満である｛Ｂｌｅｎｎｏｗ，２００６｝。ＡＤは一般的に、脳の辺縁領域及び皮質領域の変性に起因する進行性の記憶障害及び行動障害を特徴とする。ＡＤの病理学的特徴としては、アミロイドプラーク、神経原線維リン酸化ＴＡＵ濃縮体、及びシナプス機能障害の存在が含まれる｛Ｂｌｅｎｎｏｗ，２００６｝。特筆すべきことに、ｓＡＤの病因は解明されておらず、未だに不明である。
【０００３】
ｓＡＤ患者の皮膚線維芽細胞から、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が作製されている。この方法で作製された細胞株の中には、皮質ニューロンに分化させるとＡＤの病態をインビトロで示すものもある｛Ｉｓｒａｅｌ，２０１２｝。これらの細胞を薬品スクリーニング法に使用することもできるが、これらの細胞株では上記疾患の遺伝的又はエピジェネティックな原因が不明のままであることから、新規ＡＤ媒介経路に対してこのスクリーニング法を適用することはできない。
【０００４】
したがって、アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患の遺伝的病因をさらに理解する必要があり、アルツハイマー病及びｓＡＤを診断するためのより正確な方法が必要である。
【０００５】
また、アルツハイマー病及びｓＡＤを含む認知症関連神経性疾患の有効な実験モデルも必要である。実際に非常に再現性に富み、且つ、堅固なインビトロヒトアルツハイマー病及び／又はｓＡＤモデルがあれば、製薬業界に対して数百万ドルを節約することができるだろう。
【０００６】
より具体的には、新しいｓＡＤの治療薬を正確に検査、スクリーニング、及び／又は設計するために、非常に再現性に富み、且つ、堅固であり、上記疾患の遺伝的原因が明らかなインビトロヒトｓＡＤモデルが必要である。
【０００７】
また、第Ｉ相〜第ＩＩＩ相治験において治験中の有望なＡＤ治療薬の有効性（又は無効性）を確認するために、非常に再現性に富み、且つ、堅固であり、上記疾患の遺伝的原因が明らかなインビトロヒト皮質神経細胞ｓＡＤモデルも必要である。
【０００８】
本発明はこれらの要求、及び以下の本開示の概要と本発明の特徴の説明から明らかになるような他の要求に関する。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様によると、本発明は、ＢＭＩ１欠損性である霊長類の皮質神経細胞であり、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す単離細胞に関する。
【００１０】
本発明の関連する態様は、本明細書において規定される複数の皮質神経細胞のインビトロ培養物を含む、認知症関連神経性疾患の細胞モデルに関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、
本明細書において規定される皮質神経細胞を、被験抗アルツハイマー化合物に曝露することと、
上記被験化合物が存在する状態で、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について上記細胞を評価することと、
アルツハイマー病の上記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択することと、
を含む、抗アルツハイマー薬をスクリーニングする方法に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、
（ｉ）ＢＭＩ１欠損を有する細胞又は動物を試験される被験化合物と接触させることと、
（ｉｉ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴に対する上記化合物の活性を評価することと、
を含む、抗アルツハイマー薬候補を特定するためのスクリーニング方法に関する。
【００１３】
別の態様によると、本発明は、アルツハイマー病の動物モデルとしてのＢＭＩ１欠損を有する非ヒト動物の使用に関する。
【００１４】
また、本発明は、抗アルツハイマー薬を設計する方法、及び抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補を特定する方法にも関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、対象の脳細胞におけるＢＭＩ１活性を評価することを含み、ＢＭＩ１活性の低下又は不在がアルツハイマー病の徴候である、対象におけるアルツハイマー病を診断する方法に関する。
【００１６】
関連する態様は、対象の海馬、前頭皮質、及び／又は嗅内皮質におけるＢＭＩ１のエピジェネティックサイレンシングを検出することを含む、ヒト対象における孤発性アルツハイマー病を診断する方法に関する。
【００１７】
本発明の利点は、本発明によってヒトにおける認知症（例えばアルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及びレビー小体型認知症）の最も可能性の高い遺伝的病因、特にアルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）の遺伝的病因についての強力な証拠が提供されることである。
【００１８】
本発明の別の利点は、本発明が単一の遺伝的引き金、すなわちＢＭＩ１の不活化を介して、ヒト皮質ニューロン（インビトロ）におけるｓＡＤの急速かつ強力な誘導のために使用可能であることである。
【００１９】
本発明に係るｓＡＤの生物モデルは、アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対する薬品候補の小スループット、中スループット、及び／又は高スループットの薬品スクリーニング並びに有効性確認（又は無効性確認）に使用可能である点で有利である。例えば、ｓＡＤに対する薬品候補の有効性の確認を非常に高価な治験に移行する前に、信頼でき、且つ、適切なインビトロヒトｓＡＤモデルを可能にすることで、製薬業界に対して数百万ドルを節約する可能性が高い。
【００２０】
本発明の更なる態様、利点、及び特徴については、例示に過ぎず、且つ、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない好ましい実施形態に関する以下の非限定的な説明を読むことで明らかになる。
【００２１】
本発明が容易に理解可能となるように、実施例と添付図面により本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ａ：１５か月齢のＷＴ（ｎ＝３）マウス及びＢｍｉ１＋／−マウス（ｎ＝３）由来の皮質抽出物のウエスタンブロットを示す図である。
【図１Ｂ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｂ：２０か月齢のＷＴマウス及びＢｍｉ１＋／−マウスの皮質切片に対するｐ−Ｔａｕ免疫反応性を示す図である。（ｉ）低倍率。スケールバーは２０μｍである。（ｉｉ）高倍率。矢頭はゴースト様ニューロン上のｐ−ＴＡＵ沈積物を示す。（ｉｉｉ）Ｂｍｉ１＋／−マウスの皮層白質の神経線維内のｐ−ＴＡＵ沈積物（矢頭）を示す。スケールバーは８μｍである。
【図１Ｃ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｃ：ＤＥ２Ｂ４抗体を使用した１５か月齢のＷＴマウス及びＢｍｉ１＋／−マウスの皮質（可溶性画分）のアミロイド（Ｃ９９）の免疫沈殿であって、ＦＣＡ３５４２抗体によって視覚化された免疫沈殿を示す図である。
【図１Ｄ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｄ：２０か月齢のＷＴマウス及びＢｍｉ１＋／−マウスの皮質切片に対するβ−アミロイド（ＤＥ２Ｂ４）免疫反応性を示す図である。（上部）低倍率。スケールバーは２０μｍである。（下部）高倍率。スケールバーは８μｍである。
【図１Ｅ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｅ：１５か月齢のＢｍｉ１＋／−マウスでは上昇するが、２４か月齢のＷＴマウスでは上昇しなかった皮質抽出物におけるアミロイド（Ｃ９９）、ｐ−Ｔａｕ（ＡＴ８）、及びｐ−ＪＮＫの免疫反応性を示す図である。
【図１Ｆ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｆ：ＩＨＣを使用した１５か月齢のＷＴ（ｎ＝５）及びＢｍｉ１＋／−（ｎ＝５）の前頭皮質における減少したＮｅｕＮ＋皮質ニューロン数と増加した活性型カスパーゼ−３皮質ニューロン数を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１である。
【図１Ｇ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｇ：アミロイドプラーク（ＭＯＡＢ２）の検出が老齢ＷＴマウスには無いが２４か月齢のＢｍｉ１＋／−マウスの皮質（Ｃｔｘ）と海馬（Ｈｉｐ）には有ることを示す図である。Ｃｂは小脳である。
【図１Ｈ】Ｂｍｉ１＋／−マウスがＡＤに類似の神経病態を提示することを示す写真とグラフを含む図である。図１Ｈ：図１Ｇにおいて観察されたアミロイド陽性領域の高倍率図である。
【図２Ａ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ａ：ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の皮質ニューロンへの分化とＢＭＩ１ノックダウンのプロトコルを示す図である。
【図２Ｂ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｂ：分析の７日前にｓｈＳｃｒａｍｂｌｅウイルス（ｓｈＣＴＬ）又はｓｈＢＭＩ１ウイルス（ｓｈＢＭＩ１）と感染した分化済みニューロンのＢＭＩ１とｂＩＩＩ−チューブリンの共焦点免疫蛍光を示す図である。スケールバーは４０ｍｍである。
【図２Ｃ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｃ：イムノブロットにより、ｓｈＣＴＬニューロンと比較して、ｓｈＢＭＩ１ニューロンにおけるＢＭＩ１及びＨ２Ａｕｂのレベルが減少したことを示す図である。
【図２Ｄ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｄ：（上部）ｓｈＣＴＬ皮質ニューロン及びｓｈＢＭＩ１皮質ニューロンの位相差像である。白色の矢印はジストロフィー性神経突起を示す。（下部）神経細胞マーカーであるＧＡＢＡ及びｖＧＬＵＴ１の発現（１４日目）を示す図である。スケールバーは４０ｍｍである。
【図２Ｅ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｅ：神経細胞マーカーであるＧＡＢＡ及びＭＡＰ２のｓｈＣＴＬニューロン及びｓｈＢＭＩ１ニューロンにおける発現（１４日目）を示す図である。白色の矢印は遠位軸索萎縮を示す。スケールバーは４０ｍｍである。
【図２Ｆ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｆ：神経細胞マーカーであるｖＧＬＵＴ１、ｂＩＩＩ−チューブリン、及びＮｅｕＮのｓｈＣＴＬニューロン及びｓｈＢＭＩ１ニューロンにおける発現（１４日目）を示す図である。白色の矢印は軸索膨張と軸索セグメントに沿ったシグナル切断を示す。スケールバーは４０ｕｍである。
【図２Ｇ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｇ：ｓｈＣＴＬ培養物（ｎ＝４）及びｓｈＢＭＩ１（ｎ＝４）培養物におけるＧＡＢＡ陽性ニューロン及びｖＧＬＵＴ１陽性ニューロンの定量を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５である。
【図２Ｈ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｈ：前記培養物における錐体ニューロンの割合（３８日目）を示す図である。
【図２Ｉ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｉ：神経細胞マーカー、中胚葉／内胚葉マーカー、及び多能性マーカーについてのｈＥＳＣニューロン（ｎ＝３）、ｓｈＣＴＬニューロン（ｎ＝３）、及びｓｈＢＭＩ１ニューロン（ｎ＝３）の正規化済み遺伝子発現ヒートマップを示す図である。（上部）発現レベルについてのカラーコードレジェンド。
【図２Ｊ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャが誘導されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図２Ｊ：（左）ｓｈＢＭＩ１ニューロンとｓｈＣＴＬニューロンとの間でのＡＮＯＶＡ統計分析からのボルカノプロットを示す図である。ｓｈＢＭＩ１ニューロンにおいて有意に上方制御される遺伝子が右上隅に示される。（右）上方制御された遺伝子の遺伝子オントロジー（ＰＡＮＴＨＥＲ）分析。
【図３Ａ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ａ：ｐ−Ｔａｕ（ＰＨＦ１）の蓄積が（１４日目の）ｓｈＣＴＬニューロンには無いがｓｈＢＭＩ１ニューロンには有ることを示す図である。スケールバーは４０ｍｍである。
【図３Ｂ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｂ：グルタミン酸作動性ｓｈＢＭＩ１ニューロンの切断された軸索セグメントにおけるｐ−Ｔａｕ（ＰＨＦ１）の蓄積（矢印）と軸索膨張部におけるｐ−ＴａｕのｖＧＬＵＴ１との共局在（差込図中の矢印）を示す図である。スケールバーは４０ｍｍである。
【図３Ｃ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｃ：ｓｈＣＴＬ培養物（ｎ＝３）及びｓｈＢＭＩ１培養物（ｎ＝３）におけるＰＨＦ１陽性ニューロンの定量及び軸索当たりのｐ−Ｔａｕ輝点（ｆｏｃｉ）の定量を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１である。
【図３Ｄ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｄ：アポトーシスマーカーである活性型カスパーゼ−３のｓｈＣＴＬ培養物及びｓｈＢＭＩ１培養物における共焦点免疫蛍光を示す図である。スケールバーは４０ｍｍである。
【図３Ｅ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｅ：ＧＡＢＡ＋神経集団及びＧＡＢＡ−神経集団における活性型カスパーゼ−３陽性細胞の定量を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５である。
【図３Ｆ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｆ：ＭＯＡＢ２抗体又はＰＡ３抗体を使用してｓｈＣＴＬニューロンと比較したｓｈＢＭＩ１ニューロンにおけるアミロイド蓄積を示す図である。スケールバーは４０ｍｍである。
【図３Ｇ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｇ：β−セクレターゼ阻害剤（ＢＳＩ）又はベヒクル対照で処理されたｓｈＣＴＬニューロン及びｓｈＢＭＩ１ニューロンのアミロイドオリゴマー（ＮＵ１）及びＡｂ４２（ＰＡ３）の共焦点免疫蛍光を示す図である。
【図３Ｈ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が生じることを示す写真とグラフを有する図である。図３Ｈ：ＥＬＩＳＡによるｓｈＣＴＬニューロン（ｎ＝３）及びｓｈＢＭＩ１ニューロン（ｎ＝３）における細胞内及び細胞外のＡｂ４２レベルを示す図である。（右）ＢＳＩ又はベヒクル対照で処理されたｓｈＣＴＬニューロン（ｎ＝３）及びｓｈＢＭＩ１ニューロン（ｎ＝３）におけるＡｂ４２レベル。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０１である。
【図４Ａ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ａ：３次元での皮質ニューロンの長期培養の実験スキームを示す図である。
【図４Ｂ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ｂ：シナプスマーカーであるシナプトフィジン（ＳＹＮ）及びＰＳＤ９５のｓｈＢＭＩ１ニューロンにおける低下した免疫反応性を示す図である。スケールバーは４０μｍである。
【図４Ｃ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ｃ：ＭＯＡＢ２又は自家蛍光性化合物Ｋ１１４を使用してｓｈＢＭＩ１ニューロンにおけるアミロイドプラーク形成を示す図である。ＮＵ１抗体を使用してｓｈＢＭＩ１ニューロン細胞質におけるアミロイドオリゴマー沈積を示す。スケールバーは４０μｍである。
【図４Ｄ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ｄ：ｓｈＣＴＬニューロンと対照的に、ｓｈＢＭＩ１ニューロンにおいてｐ−Ｔａｕ（ＰＨＦ１及び７６４Ｇ）の蓄積を広がった細胞外凝集体（ｉ）又は濃縮体（ｉｉ）として示す図である。コリン作動性ニューロンマーカーであるＣｈＡＴとの共染色によって大きなｐ−Ｔａｕ濃縮体を含む変性中のＣｈＡＴ陽性ｓｈＢＭＩ１ニューロンが示されている。スケールバーは４０μｍである。
【図４Ｅ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ｅ：ｓｈＢＭＩ１ニューロンの細胞体に局在するｐ−Ｔａｕ濃縮体の３次元ｚスタック再構成を示す図である。
【図４Ｆ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ｆ：ｓｈＢＭＩ１ニューロン溶解物中の凝集型アミロイド（３０ｋＤａ）、Ｃ９９断片（１４ｋＤａ）、及びＡb４２ペプチド（４ｋＤａ）の蓄積を示す図である。
【図４Ｇ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってｐ−Ｔａｕ濃縮体及びアミロイドプラークが形成されることを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図４Ｇ：ＥＬＩＳＡによりｓｈＣＴＬニューロン（ｎ＝４）及びｓｈＢＭＩ１ニューロン（ｎ＝４）における細胞外Ａｂ４２レベルを示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊＊＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．００１である。
【図５Ａ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＭＡＰＴ、ＧＳＫ３ｂ及びｐ５３が活性化されることを示す写真とグラフを有する図である。図５Ａ：ｓｈＣＴＬニューロン、ｓｈＢＭＩ１ニューロン、及びＢＭＩ１過剰発現（ＢＭＩ１  ＯＥ）ニューロンにおけるＡＤ関連タンパク質のイムノブロットを示す図である。ポンソー染色を使用し、且つ、ｓｈＣＴＬニューロンにおける発現を１としてタンパク質発現比率を確定した。
【図５Ｂ】ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＭＡＰＴ、ＧＳＫ３ｂ及びｐ５３が活性化されることを示す写真とグラフを有する図である。図５Ｂ：ＤＭＳＯ、β−セクレターゼ阻害剤（ＢＳＩ）、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、又はγ−セクレターゼモジュレーター（ＧＳＭ）で処理されたｓｈＢＭＩ１ニューロンにおけるＦ−アクチン（ファロイジン）、アミロイド（ＰＡ３）、ｐ−Ｔａｕ（ＰＨＦ１）、及び活性型カスパーゼ−３（Ｃａｓｐ３ａ）の共焦点分析を示す図である。ｓｈＣＴＬニューロンを１として定量を確定した。スケールバーは４０μｍである。
【表１】
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【図６Ａ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ａ：ＣＴＬ患者（ｎ＝２）及びＡＤ患者（ｎ＝３）の海馬におけるＧＡＰＤＨ、ＦＯＸＧ１、ＡＳＣＬ１、及びＮＥＵＲＯＤ１に対して正規化されたｑＰＣＲでのＢＭＩ１遺伝子発現レベルを示す図である。（上部）ＣＴＬ脳に対してＡＤ脳で減少したＢＭＩ１のパーセンテージ。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１である。
【図６Ｂ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｂ：ＣＴＬ患者（ｎ＝２）及びＡＤ患者（ｎ＝３）の海馬における４対の非重複性プライマーペアを使用するＧＡＰＤＨに対して正規化されたｑＰＣＲでのＢＭＩ１遺伝子発現レベルを示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１である。
【図６Ｃ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｃ：２つの独立した起源（ダグラス病院とバナー衛生研究所）に由来するＣＴＬ患者（ｎ＝５）及びＡＤ患者（ｎ＝６）の海馬におけるＧＡＰＤＨに対して正規化されたｑＰＣＲでのＢＭＩ１遺伝子発現レベルを示す図である。（＊＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０１である。
【図６Ｄ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｄ：２つの独立した起源（ダグラス病院とバナー衛生研究所）に由来するＣＴＬ患者（ｎ＝５）及びＡＤ患者（ｎ＝６）の海馬におけるＧＡＰＤＨに対して正規化されたｑＰＣＲでのＥＺＨ２遺伝子発現レベルを示す図である。
【図６Ｅ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｅ：同年齢の対照患者とＡＤ患者に由来する前頭皮質切片上でのＢＭＩ１（黒色の矢印）及びＮｅｕＮ（小さい黒色の正方形）の免疫染色を示す図である。リポフスチン沈積（小さい星印）に注目されたい。スケールバーは８μｍである。
【図６Ｆ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｆ：ＢＭＩ１に対するクローンＦ６を使用した若齢対照患者（ｎ＝３）、ＦＡＤ患者（ｎ＝４）、及びＡＤ患者（ｎ＝２）に由来する海馬抽出物に対するイムノブロットを示す図である。
【図６Ｇ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｇ：ＢＭＩ１に対するクローンＦ６を使用した対照患者（ｎ＝６）及びＡＤ患者（ｎ＝６）に由来する前頭皮質に対するイムノブロットを示す図である。
【図６Ｈ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｈ：対照患者、ＡＤ患者、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）患者、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）患者、ピック病（ＰＳＰ）患者、コルサコフ症候群（ＫＳ）患者、及び含シヌクレイン型ＤＬＢ患者におけるＢＭＩ１タンパク質レベルの定量を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊＊）は一元配置ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０１である。
【図６Ｉ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｉ：ＩｇＧ抗体、Ｈ２Ａｕｂ抗体、及びＢｍｉ１クローン１．Ｔ．２１抗体（ａｂ１４３８９）を使用した対照（４２８番、８９歳）及びＡＤ（１１２７番、８８歳）の前頭皮質試料に対するＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを示す図である。
【図６Ｊ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｊ：対照患者（ｎ＝２）及びＡＤ患者（ｎ＝２）に由来する海馬抽出物に対するイムノブロットを示す図である。
【図６Ｋ】脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す模式図、写真、及びグラフを有する図である。図６Ｋ：対照患者、ＦＡＤ患者、及びＡＤ患者に由来する海馬抽出物（Ｈｉｐｐｏ）及び前頭皮質抽出物（Ｆｃｔ）におけるＢＭＩ１タンパク質レベル及びＨ２Ａｕｂタンパク質レベルの定量を示す図である。海馬は３人分の若齢対照、４人分のＦＡＤ脳、３人分の老齢対照脳、及び５人分のＡＤ脳に由来する。前頭皮質は６人分の老齢対照脳と６人分のＡＤ脳に由来する。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１であり、（＊＊＊）はＰ＜０．００１である。
【図７Ａ】独立した抗体を使用して、脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す写真を含む図である。図７Ａ：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社のＢＭＩ１抗体クローンＤ４２Ｂ３を使用したＷＴ皮質抽出物及びＢｍｉ１皮質抽出物に対するイムノブロットを示す図である。
【図７Ｂ】独立した抗体を使用して、脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す写真を含む図である。図７Ｂ：クローンＤ４２Ｂ３  ＢＭＩ１抗体を使用した対照患者（ｎ＝４）及びＡＤ（ｎ＝５）患者に由来する前頭皮質に対するイムノブロットを示す図である。
【図７Ｃ】独立した抗体を使用して、脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す写真を含む図である。図７Ｃ：クローンＤ４２Ｂ３  ＢＭＩ１抗体を使用した対照患者、ＡＤ患者、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）患者、ピック病（ＰＳＰ）患者、及びコルサコフ症候群患者（ＫＳ）に由来する前頭皮質に対するイムノブロットを示す図である。
【図７Ｄ】独立した抗体を使用して、脳でのＢＭＩ１の発現がｓＡＤでは低下するが、他の関連の認知症では低下しないことを示す写真を含む図である。図７Ｄ：クローンＤ４２Ｂ３  ＢＭＩ１抗体を使用した対照患者、ＡＤ患者、及びレビー小体型認知症（ＤＬＢ）患者に由来する前頭皮質に対するイムノブロットを示す図である。
【図８Ａ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ａ：１５か月齢のＷＴマウス（ｎ＝３）及びＢｍｉ１＋／−マウス（ｎ＝３）に由来する皮質抽出物のウエスタンブロットを示す図である。
【図８Ｂ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ｂ：１５か月齢のＷＴマウス及びＢｍｉ１＋／−マウスに由来する皮質抽出物のＨ３Ｋ９ｍｅ３についての免疫蛍光を示す図である。
【図８Ｃ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ｃ：ｓｈＣＴＬヒト皮質ニューロン及びｓｈＢＭＩ１ヒト皮質ニューロンのＨ３Ｋ９ｍｅ３についての免疫蛍光を示す図である。
【図８Ｄ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ｄ：Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を使用した対照患者（ｎ＝６）及びＡＤ患者（ｎ＝６）に由来する前頭皮質に対するイムノブロットを示す図である。
【図８Ｅ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ｅ：同年齢の対照患者及びＡＤ患者に由来する前頭皮質切片上でのＨ３Ｋ９ｍｅ３の免疫染色を示す図である。
【図８Ｆ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ｆ：図Ｅの写真の定量を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１である。
【図８Ｇ】ＡＤ脳において見られるクロマチン異常がＢＭＩ１の欠損によっても誘導されることを示す写真を含む図である。図８Ｇ：図Ｅの写真の定量を示す図である。全ての値は平均値±ＳＥＭである。（＊）はスチューデントの対応の無いｔ検定でＰ＜０．０５であり、（＊＊）はＰ＜０．０１である。
【図９Ａ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ａ：有糸分裂後のニューロンにおけるＢＭＩ１の不活化のための実験法の模式図である。
【図９Ｂ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｂ〜図９Ｆにおいては、１か月の成熟後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、合成スクランブルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）、又はＢＭＩ１のエクソン１に対して相補的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）の発現用のプラスミドを３回にわたって皮質ニューロンに形質移入した。形質移入されたニューロンを２週間培養した後に分析した。図９Ｂ：ＢＭＩ１座位の４か所の異なる場所についての野生型（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）ニューロン及びＢＭＩ１ヌル（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）ニューロンに対するゲノムＰＣＲの写真を示す図である。エクソン３、エクソン４、又は遺伝子の３’末端ではなくエクソン１（白色の矢印）上に欠失があることに注目されたい。
【図９Ｃ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｂ〜図９Ｆにおいては、１か月の成熟後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、合成スクランブルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）、又はＢＭＩ１のエクソン１に対して相補的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）の発現用のプラスミドを３回にわたって皮質ニューロンに形質移入した。形質移入されたニューロンを２週間培養した後に分析した。図９Ｃ：ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌニューロン及びｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンに対するＢＭＩ１及びＨ２Ａｕｂについてのイムノブロットの写真を示す図である。
【図９Ｄ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｂ〜図９Ｆにおいては、１か月の成熟後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、合成スクランブルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）、又はＢＭＩ１のエクソン１に対して相補的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）の発現用のプラスミドを３回にわたって皮質ニューロンに形質移入した。形質移入されたニューロンを２週間培養した後に分析した。図９Ｄ：ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌニューロン及びｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンに対するＭＡＰ２及びＨ２Ａｕｂについての免疫蛍光の写真を示す図である。ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンにおいてＨ２Ａｕｂ陽性細胞核が減少していることに注目されたい。スケールバーは１００μｍである。
【図９Ｅ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｂ〜図９Ｆにおいては、１か月の成熟後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、合成スクランブルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）、又はＢＭＩ１のエクソン１に対して相補的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）の発現用のプラスミドを３回にわたって皮質ニューロンに形質移入した。形質移入されたニューロンを２週間培養した後に分析した。図９Ｅ：ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌニューロンには無いがｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンにはあるｐ−Ｔａｕ（ＰＨＦ１）の蓄積の写真を示す図である。ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１における濃縮核の存在（白色の矢印）及び特にＢＭＩ１ノックアウトニューロンにおけるｐ−Ｔａｕの蓄積（赤色の矢印）に注目されたい。二次抗体だけを使用して染色されたｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンを使用して非特異的バックグランド蛍光の可能性についてアッセイした。図９Ｅ〜図９Ｈにおいて、スケールバーは４０μｍである。
【図９Ｆ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｂ〜図９Ｆにおいては、１か月の成熟後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、合成スクランブルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）、又はＢＭＩ１のエクソン１に対して相補的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）の発現用のプラスミドを３回にわたって皮質ニューロンに形質移入した。形質移入されたニューロンを２週間培養した後に分析した。図９Ｆ：ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌニューロンには無いがｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１には有るアミロイド（Ｄ９Ａ３Ａ）蓄積の写真を示す図である。二次抗体だけを使用して染色されたｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンを使用して非特異的バックグランド蛍光の可能性についてアッセイした。図９Ｅ〜図９Ｈにおいて、スケールバーは４０μｍである。
【図９Ｇ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｇ〜図９Ｈにおいては２か月の成熟後に皮質ニューロンに３回形質移入し、１週間培養した後に分析した。図９Ｇ：シナプス後マーカーであるＰＳＤ９５に対する免疫反応性がｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌニューロンでは低下していないがｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１では低下している写真を示す図である。二次抗体だけを使用して染色されたｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンを使用して非特異的バックグランド蛍光の可能性についてアッセイした。図９Ｅ〜図９Ｈにおいて、スケールバーは４０μｍである。
【図９Ｈ】ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１ノックアウトによってＡＤ病態が生じることを示す一連の図である。図９Ｇ〜図９Ｈにおいては２か月の成熟後に皮質ニューロンに３回形質移入し、１週間培養した後に分析した。図９Ｈ：シナプス前マーカーであるシナプトフィジン（ＳＹＮ）に対する免疫反応性がｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌニューロンでは低下していないがｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１では低下している写真を示す図である。二次抗体だけを使用して染色されたｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１ニューロンを使用して非特異的バックグランド蛍光の可能性についてアッセイした。（Ｅ〜Ｈ）スケールバーは４０μｍである。図９Ｅ〜図９Ｈにおいて、スケールバーは４０μｍである。
【図１０】ＢＭＩ１（配列番号１）の遺伝子配列を提示する図である。コード配列は５０７〜１４８７にわたる。
【図１１】ＢＭＩ１のアミノ酸配列（配列番号２）を提示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の更なる詳細及びその利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００２４】
以下の実施形態の説明において、本発明の実施の基になり得る実施例を例示することにより添付図面を参照する。本発明の開示範囲から逸脱しない限り、他の実施形態が実施可能であることは理解され得る。
【００２５】
（概要）
現在まで、ｓＡＤの遺伝的病因は不明であり、したがってｓＡＤの有効な実験モデルは存在していない。本発明者らは、単一の遺伝的引き金、すなわちＢＭＩ１の不活化が、ヒトにおける認知症（例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及びレビー小体型認知症）、特にアルツハイマー病、より具体的にはｓＡＤの最も可能性の高い遺伝的病因である、という強力な証拠を提供する。
【００２６】
本発明者らは、ヒト皮質ニューロンにおける遅発型孤発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）の誘導性遺伝的モデルを得た。一実施形態によれば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞を使用して、大量のヒト皮質ニューロンを生成することが可能である。次に、有糸分裂後のニューロン又はそれらの前駆細胞に、ＢＭＩ１（ｓｈＢＭＩ１）に対して短ヘアピンＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させる。ｓｈＢＭＩ１コンストラクトのプラスミドＤＮＡ形質移入を複数回用いて同様の結果を得ることが可能である。ＢＭＩ１ノックダウンのわずか２週間後に、ｓＡＤの特徴、すなわち軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド及びｐ−Ｔａｕ蓄積と、神経細胞アポトーシスを示す神経細胞のフェノタイプを見ることが可能である。
【００２７】
本願は、ヒト胚性幹細胞の分化により作製されたヒト皮質前駆細胞／ニューロンにおいてＢＭＩ１を不活化する方法を説明する。ＢＭＩ１が欠損すると、ヒト皮質ニューロンは軸索膨張、軸索セグメントの切断、並びにカドヘリン／Ｗｎｔ及びアルツハイマー病／プレセニリンシグナリングに関連度が高い遺伝子発現シグネチャなどの幾つかの異常を示すことが結果より明らかにされる。
【００２８】
また、本発明者らは、ファロイジン染色を使用してｓｈＢＭＩ１処理ニューロンにおけるＦ−アクチン束の形成も観察した。このフェノタイプは、ｐ−Ｔａｕ蓄積又は総Ｔａｕ蓄積の副産物と考えられる。同様に、本発明者らは、マトリゲル（商標）中の長期（６〜８週間）神経細胞培養物（すなわち、３Ｄ培養物）に、細胞外アミロイドプラークの形成、細胞内ｐ−Ｔａｕ濃縮体、並びにシナプス前及びシナプス後の萎縮及び／又は変性が生じることを観察した。本発明に係る細胞モデルは、このようにｓＡＤの特徴を再現している。このことは、ｓｈＢＭＩ１ニューロンの遺伝子発現プロファイルについても言え、その遺伝子発現プロファイルはｓＡＤのシグネチャを提示している。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、ｓＡＤモデリングを（おそらくあらゆる起源の）ヒト皮質ニューロンにおいて誘導することを可能とする方法であって、単一の因子、すなわちＢＭＩ１の遺伝的不活化を介すること（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び全ての同等物による遺伝子編集法又はＣＲＥ／ｌｏｘｐ介在性遺伝的組換え）又は遺伝子ノックダウンを介すること（ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）を特徴とする。
【００３０】
さらに、複数の実施形態において、本発明は、１５日間で非常に急速に生じ、且つ、堅固な（したがって容易に測定可能な）疾患フェノタイプを誘導することを可能とする（図２〜３）方法であって、ＢＭＩ１が制御する分子経路の指向性薬物ターゲティングをそれによって可能にする（図２Ｉ〜図２Ｊ及び図５Ｉ）方法を特徴とする。また、今日までに分析されたほぼ全てのｓＡＤ脳試料でＢＭＩ１発現が欠損していることから（図６）、インビトロでのｓＡＤフェノタイプをレスキューすることが可能な薬品が、大半のｓＡＤ患者で効率的に作用するであろうことが示唆される。
【００３１】
本発明によれば、ＢＭＩ１遺伝子の遺伝的「機能欠損」によって、コリン作動性ニューロンを含むヒト皮質ニューロンにおいてｓＡＤ特徴が再現される。したがって、本発明は、薬品スクリーニング法及び薬品効果検証法に適したユニークな手段を提供する。また、本発明は、新しい認知症関連治療法の論理的設計のための、ｓＡＤに至る分子経路及びカスケードを理解するためのユニークな細胞モデルも提供する。
【００３２】
（単離ＢＭＩ欠損細胞）
一態様によれば、本発明は、ＢＭＩ１欠損性であり、且つ、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す単離細胞に関する。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「ＢＭＩ１」という用語は、概して、ＰｏｌｙｃｏｍｂグループＲＩＮＧフィンガータンパク質４（ＰＣＧＦ４）又はＲＩＮＧフィンガータンパク質５１（ＲＮＦ５１）としても知られるＰｏｌｙｃｏｍｂ複合体タンパク質ＢＭＩ−１を指し、ヒトではＢＭＩ１遺伝子（Ｂ細胞特異的モロニーマウス白血病ウイルス組み込み部位１）によってコードされるタンパク質である
【００３４】
知られているように、ＢＭＩ１は約３７〜４２ｋＤａのタンパク質である。ＢＭＩ１のヒトｃＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号は、ＮＭ＿００５１８０．８であり、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６４８の番号で引用される。図９は、ＢＭＩ１の遺伝子配列（配列番号１）を示している。コード配列は５０７〜１４８７にわたる。図１０は、ＢＭＩ１のアミノ酸配列（配列番号２）を示している。ヒトでは、上流遺伝子プロモーター配列によって生成される未だに特徴不明のアイソフォームが存在し、そのアイソフォームは約７０ｋＤａのタンパク質（ＣＯＭＭＤ３−ＢＭＩ１）を生成する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「ＢＭＩ１欠損性」という用語又は「ＢＭＩ１欠損」などの関連する用語は、ＢＭＩの抑制、不活化、阻害等を指す。上記用語は、例えば、ＢＭＩ１遺伝子発現、ＢＭＩ１タンパク質発現及び／又はＢＭＩ生物活性の抑制、不活化及び／又は阻害を指す場合がある。複数の実施形態において、上記用語は、ＢＭＩ１が不活化されているか、欠失しているか、又はその発現が遺伝的レベルでノックダウンされている状況を指す。幾つかの実施形態では、上記用語は、ＢＭＩ１生物活性が医薬阻害剤によって抑制されている状況を包含する。ある実施形態では、上記用語は、ＢＭＩの活性型アイソフォームの抑制、不活化、阻害等を包含する場合がある。
【００３６】
好ましい実施形態では、上記細胞は霊長類の皮質神経細胞である。本明細書において使用される場合、「霊長類」という用語は、ヒト、並びにチンパンジー、サル、マカク及びゴリラを含むがこれらに限定されない非ヒト霊長類を包含する。霊長類は、ヒトであることが好ましい。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「アルツハイマー病」又は「ＡＤ」という用語は、孤発性及び遺伝性（すなわち家族性）の両方のアルツハイマー病を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、孤発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）に向けられたものであり、すなわち有効、且つ、堅固なｓＡＤモデルである細胞を対象とする。
【００３８】
複数の実施形態において、本発明の細胞は、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せから選択されるアルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す。
【００３９】
任意の適切な方法又は技術を用いて、本発明のＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞を入手することが可能である。例えば、様々な細胞でＢＭＩを不活化することが可能であり得る。例えば、ヒト胎児由来の初代神経組織、死後ヒト脳組織、ヒト神経幹細胞、又はヒト体細胞由来の人工神経細胞などの様々な起源から、ＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞を獲得及び／又は誘導することが可能である。好ましい実施形態では、本発明に係るＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞は、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞又はヒト胚性幹細胞である。
【００４０】
また、任意の適切な方法又は技術を用いて、ＢＭＩ１遺伝子発現、ＢＭＩ１タンパク質発現及び／又はＢＭＩ生物活性の抑制、不活化及び／又は阻害を達成することが可能である。例えば、ＢＭＩ１遺伝子に対するマイクロＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ、ＣＲＥ−ｌｏｘｐを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化（例えば、実施例９を参照されたい）、ＴＡＬＥＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＺＦＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、又は他の任意の適切な遺伝子編集法若しくは相同組換え法、並びにこれらの組合せのうちの１つ以上を用いる遺伝的不活化を介して、ＢＭＩ１を不活化することが可能である。好ましい実施形態では、ヒト皮質ニューロンにおけるＢＭＩ１のノックダウン又は遺伝的欠失によって、ＢＭＩ欠損皮質神経細胞が得られる。複数の実施形態において、ＢＭＩ１の医薬阻害剤（例えばＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＢＭＩ１阻害剤であるＰＴＣ−２０９（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号ＳＭＬ１１４３から入手可能）及びＰＴＣ−５９６（癌治療について治験中。ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のウェッブページを参照されたい））を使用して、ＢＭＩ生物活性が抑制、不活化及び／又は阻害される。
【００４１】
したがって、本発明の関連態様は、本発明の細胞を調製する方法に関する。一実施形態では、上記方法は、（ｉ）霊長類の皮質神経細胞を提供する工程、及び（ｉｉ）ＢＭＩ１の発現又は生物活性を不活化又は抑制する工程を含む。
【００４２】
（認知症関連神経性疾患の細胞モデル）
本発明の別の態様は、認知症関連神経性疾患の細胞モデルであって、本明細書において規定される複数のＢＭＩ欠損皮質神経細胞のインビトロ培養物を含む細胞モデルに関する。
【００４３】
一実施形態では、３Ｄマトリゲル（商標）マトリックスを含むがこれに限定されない、任意の適切なマトリックスを使用して、ＢＭＩ欠損皮質神経細胞が３次元的に培養される。
【００４４】
細胞モデルは、ＢＭＩ欠損皮質神経細胞と共培養物される他の細胞を含んでもよい。このような他の細胞の例としては、例えば星状細胞が挙げられる。一実施形態では、ＢＭＩ欠損皮質神経細胞は、支持細胞としての星状細胞と共培養される。複数の実施形態において、皮質神経細胞はヒト細胞であり、星状細胞は哺乳類細胞（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット等）である。好ましい実施形態では、皮質神経細胞と星状細胞は両方ともヒト細胞である。
【００４５】
上記細胞モデルは、あらゆる認知症関連神経性疾患（アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない）との関連で有用であり得る。好ましい実施形態では、認知症関連神経性疾患は、アルツハイマー病（例えば、遺伝性又は孤発性）であり、より好ましくはｓＡＤである。
【００４６】
（スクリーニング方法）
本発明に係る細胞及び細胞モデルは、薬品スクリーニング法及び薬品効果検証法に特に有用であり得る。これら細胞及び細胞モデルは、ｓＡＤを含む認知症に至る分子経路及びカスケードの理解、及び新しい認知症関連治療法の論理的設計に適したユニークなモデルでもあり得る。
【００４７】
したがって、本発明の関連態様は、認知症関連疾患（例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及びレビー小体型認知症）の治療用の薬品及び分子をスクリーニングするための方法に関する。
【００４８】
本明細書において使用される場合、特定の疾患の「治療用分子」又は特定の疾患用の「薬品」などの用語（及び／又はあらゆる類似の表現）に対する言及は、疾患若しくは状態、疾患若しくは状態の症状、又は疾患若しくは状態のリスク（罹病性）を安定化させる、治療する、癒す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、悪化を抑える、回復させる、改善する、又は影響を与える必要がある対象に投与され得るあらゆる分子又は化合物（天然物又は化学合成物）を包含する。
【００４９】
１つの特定の態様によれば、本発明は抗アルツハイマー薬をスクリーニングするための方法に関する。一実施形態では、この方法は下記を含む：
・本明細書において規定されるＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞を、被験抗アルツハイマー化合物に曝露すること；
・上記被験化合物が存在する状態で、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について上記細胞を評価すること；
・アルツハイマー病の上記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択すること。
【００５０】
別の特定の態様によれば、本発明は、抗アルツハイマー薬候補を特定するためのスクリーニング方法に関する。一実施形態では、この方法は、（ｉ）ＢＭＩ１欠損を有する細胞又は動物を、試験される被験化合物と接触させること、及び（ｉｉ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴に対する上記化合物の活性を評価すること、を含む。上記細胞は、本明細書において規定されるＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞であることが好ましい。上記動物は、ＢＭＩ１欠損を有するか、又はヒトアルツハイマー病に相当する認知症関連疾患（以下参照）を有する可能性がある、任意の動物であり得る。
【００５１】
フェノタイプ特徴は、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せから選択され得る。
【００５２】
複数の実施形態において、上記評価は、被験化合物との接触の存在下で、又は被験化合物との接触若しくは曝露の後で実施される。
【００５３】
複数の実施形態において、上記選択工程は、下記の生物学的効果のうちの１つ以上を有する被験化合物を選択することを含む：
・軸索膨張の防止又は阻害；
・軸索セグメントの切断の防止又は阻害；
・β−アミロイド蓄積の防止又は阻害；
・Ｃ９９断片蓄積の防止又は阻害；
・ｐ−Ｔａｕ蓄積の防止又は阻害；
・シナプス萎縮の防止又は阻害；
・神経細胞アポトーシスの防止又は阻害；
・Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮の防止又は阻害；
・ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成の防止又は阻害；及び
・例えばラミンＡ／Ｃ抗体、又はラミンＡ／Ｃ−ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質、又はいずれかの蛍光ラミンＡ／Ｃ融合タンパク質を使用することによる、核膜異常の防止又は阻害。
【００５４】
複数の実施形態において、評価工程は、被験化合物に曝露された、又は曝露されていない野生型皮質ニューロンを、１つ以上のフェノタイプ特徴と比較することを含む。複数の実施形態において、評価工程は、被験化合物に曝露されていない対照の細胞又は動物を、１つ以上のフェノタイプ特徴と比較することを含む。
【００５５】
本発明の別の態様は、認知症関連疾患の治療のための薬品及び分子（例えば、抗アルツハイマー薬）をスクリーニングするためのキットに関する。一実施形態によれば、このキットは、本明細書において規定されるＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞及び／又は本明細書において規定される細胞モデルと、１つ以上の追加構成要素と、を含む。あり得る追加構成要素の例としては、アッセイ緩衝液、対照、基質、標準物質、検出材料（例えば、抗体、フルオレセイン標識誘導体、発光性基質、検出溶液、シンチレーション測定用液等）、実験室用品（例えば、脱塩カラム、反応チューブ又はマイクロプレート（例えば、９６ウェル又は３８４ウェルプレート））、使用者向けマニュアル又は指示書等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
したがって、本発明の関連態様は、認知症関連疾患（例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及びレビー小体型認知症）の動物モデルとしての、ＢＭＩ１欠損を有する非ヒト動物の使用に関する。このような動物は既に存在する可能性があるが、これら動物は決してそのような目的のために使用されていない。
【００５７】
本使用によると、上記動物は、ＢＭＩ１欠損を有するか、又はヒトアルツハイマー病に相当する認知症関連疾患を有する可能性がある、あらゆる非ヒト動物であり得る。例えば、上記動物は、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシスファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されないアルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示し得る。
【００５８】
複数の実施形態において、上記非ヒト動物は、ＢＭＩ１についてヘミ接合である非ヒト哺乳類（好ましくは非ヒト霊長類）である。複数の実施形態において、上記動物は、げっ歯類、例えばＢＭＩ１についてヘミ接合であるＢＭＩ欠損マウス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｕｇｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４，  Ｃｈａｔｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）である。
【００５９】
本発明に係るアルツハイマー病の非ヒト動物モデルは、様々なレベルで有用であり得る。例えば、この非ヒト動物モデルは、アルツハイマー病の研究に、及び／又は有望な抗アルツハイマー化合物の特定、検査、スクリーニング及び／又は設計（例えば、論理的薬品設計の実施）に有用であり得る。
【００６０】
したがって、本発明に係る細胞、細胞モデル、キット及び非ヒト動物は、例えば下記のような様々な有用な用途に適用可能である：（１）アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対する新規薬品を特定するための小スループット、中スループット及び／又は高スループットの薬品スクリーニング法；（２）アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対する候補薬品の有効性又は無効性を確認するための小スループット、中スループット及び／又は高スループットの薬品スクリーニング法；（３）ゲノム技法、エピゲノム技法及び／又はプロテオーム技法の使用による、ＢＭＩ１が制御する経路及び／又はＢＭＩ１欠損の誘導後に脱制御される経路の分子解剖を介したアルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対する論理的薬品設計；（４）正常ヒト皮質ニューロン及びＢＭＩ１欠損性ヒト皮質ニューロンに対する、アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対する候補薬品の毒性アッセイ及び薬物動態アッセイ；（５）アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対する遺伝子療法系（例えば、ＢＭＩ１又は他の候補遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＭＡＰＴ、ＡＰＰ、ｐ５３、又はＧＳＫ３ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、マイクロＲＮＡ等）を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検査するための細胞性プラットフォーム。
【００６１】
したがって、本発明の追加態様は、アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対して使用される薬品を設計するための方法に関する。１つの特定の態様によれば、本発明は、抗アルツハイマー薬を設計するための方法であって、下記の工程を含む：
（ａ）本明細書において規定されるＢＭＩ１欠損性霊長類皮質神経細胞を、被験抗アルツハイマー化合物に曝露する工程；
（ｂ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について、上記細胞を評価する工程；
（ｃ）アルツハイマー病の上記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制する及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の被験化合物の化学構造を改変して、抗アルツハイマー活性が改善した（例えば、生物活性、安定性、吸収、血液脳関門移行等のうちの１つ以上が改善された）改変化合物を得る工程。
【００６２】
一実施形態では、上記方法は、工程（ｄ）の改変化合物を用いて、工程（ａ）〜（ｃ）を再度繰り返すこと、及び所望により工程（ｄ）も再度繰り返すこと、をさらに含む。したがって、好ましい実施形態では、上記方法を繰り返すたびに上記化合物が改善され、所望の抗アルツハイマー活性を有する化合物が得られるまで工程（ａ）〜（ｃ）（及び所望により工程（ｄ））が繰り返される。
【００６３】
さらに、本発明の追加態様は、アルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患に対して使用される薬品の生物学的標的候補を特定するための方法に関する。１つの特定の態様によれば、本発明は、抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補を特定するための方法であって、
（ａ）本明細書において規定されるＢＭＩ１欠損性霊長類の皮質神経細胞を、野生型皮質ニューロンと、定量的プロテオーム比較解析又はゲノムワイド発現比較解析する工程；
（ｂ）発現又は翻訳後修飾が異なる遺伝子又はタンパク質を（すなわち、ＢＭＩ１欠損性霊長類の皮質神経細胞と野生型皮質ニューロンとの間で）特定する工程；
を含み、
工程（ｂ）において特定された遺伝子又はタンパク質は、抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補である、上記方法に関する。
【００６４】
上記方法は、追加工程、例えば：
（ｃ）ＢＭＩ１欠損性霊長類の皮質神経細胞及び／又は野生型皮質ニューロンを抗アルツハイマー薬に曝露する工程；
（ｄ）工程（ａ）の定量的プロテオーム解析との、曝露細胞及び／又は曝露皮質ニューロンの比較定量的プロテオーム解析又は比較遺伝子発現解析を実施する工程
をさらに含んでよい。
【００６５】
（診断応用）
ヒトにおける認知症（例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及びレビー小体型認知症）の遺伝的病因、より具体的にはアルツハイマー病及びｓＡＤの遺伝的病因の特定によって、これら疾患の診断に新しい道が開かれる。
【００６６】
したがって、本発明の別の態様は、対象におけるアルツハイマー病（より具体的にはｓＡＤ）を含む認知症関連神経性疾患の診断方法に関する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語には、アルツハイマー病が発症し得る生物が含まれる。「対象」という用語には、動物（例えば、哺乳類（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、ウサギ、リス、クマ、霊長類（例えば、チンパンジー、サル、ゴリラ及びヒト））、及び鳥類（例えば、ニワトリ、カモ、アヒル、ガチョウ）、並びにこれらの遺伝子導入種が含まれる。対象は、ヒト又は非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、サル、マカク、ゴリラ）であることが好ましい。対象はヒトであることがより好ましい。
【００６８】
１つの特定の態様によれば、本発明は、対象におけるアルツハイマー病を診断するための方法に関する。一実施形態では、この方法は、対象の脳細胞におけるＢＭＩ１活性を評価することを含み、ここで、ＢＭＩ１活性の低下又は不在がアルツハイマー病の徴候である。複数の実施形態において、脳細胞は、海馬由来の細胞、前頭皮質由来の細胞、嗅内皮質由来の細胞及び／又はこれらの混合物である。
【００６９】
本発明の追加関連態様は、ヒト対象における孤発性アルツハイマー病を診断する方法に関する。一実施形態では、この方法は、対象の海馬、前頭皮質及び／若しくは嗅内皮質において、並びに／又はこれらから単離された細胞におけるＢＭＩ１のエピジェネティックサイレンシングを検出することを含む。
【００７０】
任意の適切な方法又は技術が、対象の脳及び／又は単離脳細胞におけるＢＭＩ１活性の評価及び／又はＢＭＩ１のサイレンシングに使用可能である。例えば、上記評価は、ＢＭＩ１に対する親和性を有する放射性及び／又は蛍光性血液脳関門透過性分子を、対象に投与することを含み得る。ＢＭＩ１に対する親和性を有する分子の例としては、ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＢＭＩ１阻害剤であるＰＴＣ−５９６及びＰＴＣ−２０９（上記参照）が挙げられる。脳細胞におけるＢＭＩ１活性及び／又はＢＭＩ１サイレンシングの評価は、例えばＢＭＩ１に対する親和性を有する放射性及び／又は蛍光性血液脳関門透過性分子を検出するための、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）脳走査の使用を含み得る。
【００７１】
代替法として、脳細胞におけるＢＭＩ１活性及び／又はＢＭＩ１サイレンシングの評価は、生きている対象からの組織生検の取得を含んでもよいし、又は死後に実施されてもよい。
【００７２】
また、脳細胞におけるＢＭＩ１活性及び／又はＢＭＩ１サイレンシングの評価は、ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出を含んでもよい。例えば、ＢＭＩ１の発現レベルの検出、ＢＭＩ１生物活性の検出、及び／又はＢＭＩ１サイレンシングの検出は、ｑＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ−シーケンシング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング及び／又はこれらの組合せなどの方法及び技術を伴い得る。
【実施例】
【００７３】
（実施例１：ヒト胚性幹細胞の皮質ニューロンへの分化）
ヒト胚性幹細胞を皮質ニューロンに分化させた。その分化プロトコルは、以前の研究（Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ７７，  ４４０−４５６，  （２０１３））に基づくものであった。しかし、組換え体ノギンの濃度を低下させるために、ノギンアゴニストＬＤＮ１９３１８９を使用した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社番号ＡＴ−１０４）を使用して、Ｈ９細胞株（ＷｉＣｅｌｌ（商標））及びＨＵＥＳ９細胞株（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を解離し、ＲＯＣＫ（商標）阻害剤（Ｙ−２７６３２；１０μＭ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社番号１０００５５８３）を添加したＰｅｐｒｏＧｒｏｗ（商標）ｈＥＳ細胞培地（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社番号ＢＭ−ｈＥＳＣ）中の増殖因子低減マトリゲル（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社番号３５６２３１）にこれら細胞株を播種した。７０％の集密度になったところで、培地を、Ｂ２７（最終１×）、ノギン（１０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社番号１２０−１０Ｃ）及びＬＤＮ１９３１８９（０．５μＭ、Ｓｉｇｍａ社番号ＳＭＬ０５５９）を添加したＤＤＭに変更した。培地は毎日交換した。１６日間の分化の後に、培地をＤＤＭ／Ｂ２７に交換し、毎日補充した。２４日の時点で、神経前駆細胞を手作業でプレートから解離し、レンチウイルス上清と３７℃で３０分間にわたって混合した。その後、感染済み神経前駆細胞を、ＲＯＣＫ（商標）阻害剤（Ｙ−２７６３２、１０μＭ）添加したＤＤＭ／Ｂ２７の中に混合し、そして増殖因子低減マトリゲル（商標）被覆プレート又はチャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ（商標）社番号１５４５３４）上に播種した。解離／感染から５日後に、培地の半分を、Ｂ２７（最終１×）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）Ａ培地に交換し、３日毎に培地を交換した。３Ｄ培養物のために、２４日目の神経前駆細胞を氷冷増殖因子低減マトリゲル（商標）（１：２０希釈）と混合し、そして８ウェルチャンバースライドに播種した。３７℃で３０分間培養した後、新しいＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）Ａ／Ｂ２７を添加した。
【００７４】
ＢＭＩ１のＯＲＦ（受託番号ＢＣ０１１６５２）を標的とするように設計された配列特異的オリゴヌクレオチド伸長物ｓｈＲＮＡを合成した。Ｏｌｉｇｏ＃１（ヌクレオチド番号１０６１〜１０８１）５’−ＣＣＴＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３）及びｏｌｉｇｏＳｃｒａｍｂｌｅ（ヌクレオチド番号５７３〜５９１）５’−ＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号４）を本試験に使用した。これらの配列にはループ配列（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）（配列番号５）が続き、最終的に標的配列の逆相補鎖が続く。ＡｇｅＩ、ＳｍａＩ、及びＸｂａＩクローニング部位を使用して、Ｈ１Ｐ−ＵｂｑＣ−ＨｙｇｒｏＥＧＦＰプラスミドのＨ１Ｐプロモーターの下流に二重鎖ｓｈＲＮＡ配列をクローニングした。製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、これらｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスプラスミドをｐＣＭＶｄＲ８．９プラスミド及びｐＨＣＭＶ−Ｇプラスミドと共に２９３ＦＴパッケージング細胞に形質移入した。ウイルス含有培地を収集し、濾過し、そして超遠心分離により濃縮した。２９３Ｔ細胞に対してウイルスタイターを段階希釈とそれに続く４８時間後の顕微鏡観察分析により測定した。ウイルス形質導入のために、播種する前に解離細胞にレンチウイルスベクターを添加した。ハイグロマイシン選択（１５０μｇ／ｍｌ）を４８時間後に加えた。
【００７５】
皮質ニューロンを作製するためにヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用する場合にも、同様の結果を得ることが可能である。また、ＢＭＩ１ノックダウンのためにヒトＢＭＩ１  ｃＤＮＡに対して異なるｓｈＲＮＡ配列を使用する場合でも、同様の結果を得ることが可能である。
【００７６】
（実施例２：ＢＭＩ１についてヘミ接合であるマウスが老化と共にＡＤの病態を発症する）
１５〜２４か月齢のＢｍｉ１＋／−マウスのＡＤ様脳（皮質）病態を、ＷＴの同腹兄弟に対して比較した。図１は、Ｂｍｉ１＋／−マウスにおけるｐ−Ｔａｕ、Ｃ９９断片及びアミロイドプラークの蓄積、神経細胞の欠損、並びにシナプス萎縮を示している。これらは認識されているＡＤの特徴である。
【００７７】
（実施例３：ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１の不活化がＡＤに関連する遺伝子発現シグネチャを誘導する）
ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１欠損により、類似の神経病態が生じるかどうかを試験するため、本発明者らは、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の分化から作製された皮質ニューロン｛Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏ，  ２０１３｝においてＢＭＩ１活性を阻害した。２４日間の神経誘導の後に、前駆細胞を解離し、有糸分裂後のニューロンに分化させる前に、スクランブル配列を含む短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するレンチウイルス（ｓｈＣＴＬ＋Ｈｙｇｒｏ−／ＧＦＰ）か、又はＢＭＩ１指向性ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス（ｓｈＢＭＩ１＋Ｈｙｇｒｏ／ＧＦＰ）に感染させた（図２Ａ〜図２Ｃ）｛Ａｂｄｏｕｈ，  ２００９｝。１４日後に、前方神経／皮質マーカーであるＦＯＸＧ１、総合神経マーカーであるｂ−ＩＩＩ−チューブリン、ＭＡＰ２及びＮｅｕＮ、並びにグルタミン酸作動性及びＧＡＢＡ作動性神経マーカーであるｖＧＬＵＴ１及びＧＡＢＡのそれぞれについて、大多数の細胞が陽性であった（図２Ｄ〜図２Ｇ）。ＰＭＩインデックスを使用する形態計測分析により、ｂＩＩＩ−チューブリンニューロンの約６０％が皮質錐体ニューロンであることが明らかになった（図２Ｈ）｛Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏ，  ２０１３；  Ｈａｎｄ，  ２００５｝。ｖＧＬＵＴ１陽性及びＧＡＢＡ陽性のニューロンの割合は、精製済み神経細胞培養物について報告された割合｛Ｉｓｒａｅｌ，  ２０１２｝と同等であった（図２Ｇ）｛ｄｅ  Ｓｉｌｖａ，  ２００３｝。ＡＤの最も初期の段階に軸索膨張部が存在する｛Ｓｔｏｋｉｎ，  ２００５｝。特筆すべきことに、ＢＭＩ１ノックダウンから７〜１５日後にジストロフィー性神経突起及び軸索膨張を容易に観察することができた（図２Ｄ）。また、本発明者らは、ジストロフィー性神経突起と軸索膨張部を有するＧＡＢＡ陽性ニューロン、及び軸索セグメントに沿った分断されているｖＧＬＵＴ１又はｂＩＩＩ−チューブリンの標識も観察した（図２Ｅ〜図２Ｆ）。比較遺伝子発現プロファイル分析により、これらの培養物の効率的な神経細胞分化が確認された（図２Ｉ）。ＢＭＩ１は転写抑制因子として作用するので、ｓｈＢＭＩ１ニューロンにおいて対照と比較して上方制御されている遺伝子の大半を抽出した。バイアス無し遺伝子オントロジー分析により、これらの遺伝子は主にＡＤ関連シグナル伝達経路、すなわちカドヘリン、ＷＮＴ及びＡＤプレセニリン｛Ｊａｃｋｓｏｎ，  ２００２；  Ａｎｄｏ，  ２０１１；  Ｆｒａｓｅｒ，  ２００１｝、並びにハンチントン病及びニコチン性アセチルコリン受容体経路と関連付けられることが明らかになった（図２Ｊ）。本発明者らは、上位１４の最も有意な上方制御遺伝子にアノテーションを付けた。トランスサイレチン（ＴＴＲ）はＡｂ４２凝集を阻害し、神経細胞ストレス応答タンパク質として挙動する｛Ｗａｎｇ，  ２０１４｝。ＤＮＡＪＡ４（ＨＳＰ４０としても知られる）は、タンパク質ミスフォールティング及びアミロイド凝集を防止する分子シャペロンである｛Ｔｏｒｒｅｎｔｅ，  ２０１３｝。ＵＢＲ１は、ポリユビキチン化及びプロテアソーム分解のための正常タンパク質とミスフォールドタンパク質の認識とターゲティングに関与するユビキチンリガーゼである｛Ｋｉｍ，  ２０１４��。これらの結果より、ＢＭＩ１の不活化によって、ＡＤに関連度が高い遺伝子発現シグネチャが生じ、この遺伝子発現シグネチャにはタンパク質ミスフォールティングに対する細胞応答の早期活性化も含まれることが明らかになった。
【００７８】
まとめると、ＢＭＩ１が欠損すると、ヒト皮質ニューロンが、軸索膨張、軸索セグメントの切断、並びにカドヘリン／Ｗｎｔ及びアルツハイマー病／プレセニリンシグナリングに関連度が高い遺伝子発現シグネチャなどの幾つかの異常を示すことがこれらの結果から示される。
【００７９】
（実施例４：ヒト皮質ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤの病理学的特徴、すなわちｐ−Ｔａｕ及びアミロイドの蓄積が再現される）
ＡＤ関連のｐ−Ｔａｕは正常型Ｔａｕを捕捉し、且つ、濃縮体形成及び微小管分解を引き起こすことができる｛Ａｌｏｎｓｏ，  １９９６｝。本発明者らは、ＰＨＦ１とＳ４２２を使用して、ｓｈＢＭＩ１ニューロンにおけるｐ−Ｔａｕ免疫反応性を観察し（図３Ａ〜図３Ｃ）、軸索セグメント及び細胞体部分の両方にこれを認めた（データを示さず）。これと一致するように、ｖＧＬＵＴ１又はｂＩＩＩ−チューブリンの分布が乱れている軸索セグメントにもｐ−Ｔａｕ輝点の蓄積が提示された（図３Ｂ）。広がったＰＨＦ１免疫反応物も軸索膨張部内に認められた（図３Ｂ差込図）。対照的に、幾つかの対照ニューロンの軸索はＰＨＦ１によって弱く色づけられた（図３Ａ〜図３Ｃ）。アポトーシス核の頻度もｓｈＢＭＩ１ニューロンにおいて有意に高かった（図３Ｄ〜図３Ｅ）。Ａｂ４２に対する抗体を使用して、ｓｈＢＭＩ１ニューロンの細胞体及び神経突起において対照と比較して堅固な免疫反応性が観察され（図３Ｆ）、ＢＡＣＥ阻害剤（ＢＳＩ）に曝露するとアミロイド免疫反応体が著しく減少した（図３Ｇ）。アミロイドオリゴマーを認識するＮＵ１を使用して同様の観察を行った（図３Ｇ）｛Ｌａｍｂｅｒｔ，  ２００７；  Ｋｏｎｄｏ，  ２０１３｝。ＥＬＩＳＡを用いて、Ａｂ４２を対照ニューロン抽出物及び培地の中に検出したが、対応するＢＭＩ１ノックダウン試料において相対的アミロイド濃度が７日目と１４日目に上昇し、ＢＳＩ処理されるとアミロイド濃度が正常化した（図３Ｈ）。ＢＭＩ１がノックダウンされた非神経細胞ではアミロイド免疫反応物が観察されなかった（データを示さず）。別の抗ＢＭＩ１ｎ性ｓｈＲＮＡ配列を使用したとき（データを示さず）、又はＫｉ６７陰性、Ｎｅｓｔｉｎ陰性及びＰＣＮＡ陰性の有糸分裂後のニューロンにｓｈＢＭＩ１  ＤＮＡコンストラクトを導入したとき（データを示さず）にも神経病態が観察された。
【００８０】
（実施例５：ヒト皮質ニューロンにおけるＢＭＩ１欠損によってＡＤの病理学的特徴、すなわちｐ−Ｔａｕ濃縮体の形成及びアミロイドプラーク形成が再現される）
３次元で培養されたＦＡＤ遺伝子発現性神経細胞培養物は、アミロイドプラーク及びＴａｕ濃縮物を生成し得ることが示された｛Ｃｈｏｉ，  ２０１４｝。この方法（図４Ａ）を適用することにより、シナプス前成熟（シナプトフィジン）とシナプス後成熟（ＰＳＤ−９５）を経た対照培養物と対照的に、ＢＭＩ１欠損神経細胞培養物では顕著な量のシナプトフィジン及びＰＳＤ−９５が発現しなかったことを発見した（図４Ｂ）。アミロイド線維及びアミロイドプラークに結合する特異的抗体又は自家蛍光性化合物Ｋ１１４を使用して明らかにされるように、ＢＭＩ１ノックダウンによって細胞外アミロイドプラークも形成された（図４Ｃ）。これらの条件によって、広がった細胞外ｐ−ＴＡＵ沈積物及びニューロンの細胞体中に局在する大きなｐ−Ｔａｕ濃縮体も形成された（図４Ｄ〜図４Ｅ）。ＡＤにおいて影響を受ける神経細胞種であるＣｈＡＴ陽性コリン作動性ニューロンの変性しているものに、ｐ−Ｔａｕ凝集体の存在が認められた（図４Ｄ）｛Ｂａｓｋｉｎ，  １９９９｝。細胞抽出物を使用するイムノブロット、又は細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡによって明らかにされるように、ＢＭＩ１欠損培養物は約３０ｋＤａ、約１４ｋＤａ、及び約４ｋＤａのアミロイド種の蓄積も特徴とした（図４Ｆ〜図４Ｇ）。このことから、ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１の不活化がＡＤの病理学的特徴を再現することが明らかになった。
【００８１】
（実施例６：ＢＭＩ１欠損によりＭＡＰＴ、ＧＳＫ３ｂ及びｐ５３の病態関連活性化が生じる）
疾患機序を洞察するために、神経細胞培養物におけるＡＤ関連遺伝子の発現を分析した。ＢＭＩ１が欠損すると上方制御される対照遺伝子として、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）及びＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）を使用した｛Ａｂｄｏｕｈ，  ２００９；  Ｃｈａｔｏｏ，  ２００９｝。ＢＭＩ１が欠損すると、ＭＡＰＴ（Ｔａｕをコードする）及びＬＲＰ２だけが増加した一方、ＡＰＰの発現が低下した（データを示さず）。ＭＡＰＴの二倍化は病原性である｛Ｒｏｖｅｌｅｔ−Ｌｅｃｒｕｘ，  ２０１０｝ので、ＢＭＩ１によるＭＡＰＴの制御が可能か調査した。それによると、未処理の（ｎａｉｖｅ）ニューロンにおいてＢＭＩ１が過剰発現すると、ＭＡＰＴ発現が低下し（データを示さず）、特異的ＢＭＩ１抗体を使用するクロマチン免疫沈殿（ＣｈＩＰ）によって測定したところ、対照ニューロンのプロモーター領域を含むＭＡＰＴ座位の幾つかの部分にＢＭＩ１が濃縮され（データを示さず）、このことから直接的な転写抑制が示唆された。ＢＭＩ１はＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を調節することが可能である｛Ｆａｃｃｈｉｎｏ，  ２０１０；  Ｉｓｍａｉｌ，  ２０１０｝。ＢＭＩ１／ＲＩＮＧ１ａ／ｂはｐ１４ＡＲＦ（ＣＤＫＮ２Ａにコードされる第２の転写物）の転写抑制を介してＭＤＭ２ユビキチンリガーゼの活性の抑制を解除し、ｐ５３の分解を促進し｛Ｓｈｅｒｒ，  ２００１｝、且つ、ｐ５３との相互作用を介してｐ５３のモノユビキチン化を引き起こすことも可能である｛Ｃａｌａｏ，  ２０１３｝。このことを考慮して、本発明者らは、観察された病態の幾つかは転写非依存性機構によって説明可能であると推測した。同様に、ＧＳＫ３ｂは（ＰＨＦ１で検出されるように）Ｓｅｒ３９６／４０４においてＴａｕをリン酸化することができ、ＧＳＫ３ｂの発現と活性は転写機構及び翻訳後機構によって制御される｛Ｍｅｄｉｎａ，  ２０１４｝。
【００８２】
本発明者らは、イムノブロットによって、ＢＭＩ１欠損性ニューロンにおいてＴａｕレベル、ｐ−Ｔａｕレベル、ＧＳＫ３ｂレベル、ｐ−ＧＳＫ３ｂ（Ｓｅｒ９）レベル、及びｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）レベルの劇的な上昇を検出した（図５Ａ）。逆に、未処理ニューロンにおけるＢＭＩ１過剰発現によって、Ｔａｕ、ｐ−Ｔａｕ、ＧＳＫ３ｂ、ｐ−ＧＳＫ３ｂ、及びｐ−ｐ５３の基線レベルを低下させることができた（図５Ａ）。また、ＢＭＩ１ノックダウンによって、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、及びβ−アクチンの発現も対照と比較して上昇した一方、ＢＭＩ１過剰発現では反対の傾向が生じた（図５Ａ）。このように、ＢＭＩ１ノックダウンニューロンにおいて、Ｃ９９の蓄積及び２種類の大型アミロイド関連断片の蓄積が観察された（図５Ａ）。特筆すべきことに、ファロイジンを使用するＩＦによって可視化されるように、β−アクチン単量体レベルの上昇はＢＭＩ１ノックダウンニューロンにおけるＦ−アクチン束形成と相関した（図５Ｂ）。Ｆ−アクチン束の形成はＡＤ及びタウオパチーにおいて存在し、且つ、Ｔａｕが持つＦ−アクチン及びチューブリン二量体との架橋活性に大いに依存する｛Ｅｌｉｅ，  ２０１５｝。本発明者らは次に、ＢＳＩ、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、及びγ−セクレターゼモジュレーター（ＧＳＭ）のＢＭＩ１欠損性ニューロンに対する影響を分析した｛Ｃｈｏｉ，  ２０１４｝。ＢＳＩによってアポトーシス及びアミロイド免疫反応体が減少したが、ｐ−Ｔａｕ及びＦ−アクチンの免疫反応体は部分的にしか減少しなかった（図５Ｂ）。このことから、Ｃ９９の生産及び毒性を、ｐ−Ｔａｕの蓄積から部分的に切り離すことが可能であることが示唆された。他方、大半の病態パラメーターはＧＳＩとＧＳＭによって改善されなかった（図５Ｂ）。ＧＳＩはｐ−Ｔａｕの強度を低下させたが、ニューロンの細胞体へのｐ−Ｔａｕの再局在からは濃縮体形成が示唆された（図５Ｂ）。さらに、ＧＳＩで処理されると、おそらくＣ９９の蓄積に起因して、アミロイド免疫反応性が飽和レベルに達した（図５Ｂ）｛Ｍｏｏｒｅ，  ２０１５｝。
【００８３】
（実施例７：ＢＭＩ１はＡＤ脳においてサイレンシングを受け、正常な脳ではＭＡＰＴ座位に濃縮される）
本発明者らは、ヒトの脳におけるＢＭＩ１発現を調査するために、ＡＤ試料及び対照試料の海馬を比較するときに使用される最適な正規化遺伝子を確定した。本発明者らは、同量の総ＲＮＡについて、全ての試料の間でＣｔ値の最も強い変動を示すＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＡＣＴＢ、ＮＧＮ２、ＮｅｕＮ、及びＲＰＬ１３（データを示さず）と比較すると、ＧＡＰＤＨとＦＯＸＧ１は変動を示さないことを発見した。ＧＡＰＤＨ、ＦＯＸＧ１、ＡＳＣＬ１、又はＮＥＵＲＯＤ１に対して正規化されると、ＢＭＩ１の発現はＡＤ試料において著しく低下し、ＢＭＩ１  ｃＤＮＡを範囲とする別々のプライマーペアを使用したときに同等の結果が得られた（図６Ａ〜図６Ｃ）。対照的に、別のＰｏｌｙｃｏｍｂグループ遺伝子であるＥＺＨ２の発現は、ＡＤ試料で変化しなかった（図６Ｄ）。ＢＭＩ１の発現はＡＤ試料の前頭皮質でも低下したが、ＦＡＤ試料の前頭皮質では低下しなかった（データを示さず）。前頭皮質切片については、ＢＭＩ１発現が対照試料のＮｅｕＮ陽性錐体ニューロンにおいて認められ、ＡＤ試料では低下した（図６Ｅ）。遺伝子発現の結果と一致して、ＢＭＩ１タンパク質の発現（Ｆ６抗体を使用した）は対照（ｎ＝３、５９歳の年齢中央値）と比較するとＦＡＤ患者（ｎ＝４、６１歳の年齢中央値）の海馬において影響を受けなかった（図６Ｆ及び図６Ｋ）。対照的に、ＢＭＩ１は対照（ｎ＝３、８７歳の年齢中央値）と比較するとＡＤ患者（ｎ＝５、８２歳の年齢中央値）の海馬において著しく減少した（図６Ｆ及び図６Ｊ〜図６Ｋ）。対照試料（ｎ＝６、８７歳の年齢中央値）において異なるリン酸化型のＢＭＩ１であるＢＭＩ１トリプレットの存在が前頭皮質で観察された（図６Ｇ）｛Ｖｏｎｃｋｅｎ，  １９９９｝。対照的に、ＢＭＩ１発現はＡＤ試料（ｎ＝６、８７歳の年齢中央値）では存在しないに近かった（図６Ｇ及び図６Ｋ）。ヒストンＨ２ＡはＢＭＩ１／ＲＩＮＧ１ａ／ｂ活性の主要な標的である｛Ｂｕｃｈｗａｌｄ，  ２００６；  Ｌｉ，  ２００６｝。Ｈ２ＡｕｂレベルはＡＤ脳では著しく低下したが、ＦＡＤ脳では低下しなかった（図６Ｆ〜図６Ｇ及び図６Ｋ）。第２の特異的ＢＭＩ１抗体（Ｄ４２Ｂ３）を使用すると同等の結果が得られた（図７Ａ〜図７Ｂ）。ＢＭＩ１レベルは、他の認知症を有する患者に由来する前頭皮質試料では少数の例外を除いてあまり低下しなかった（図６Ｈ及び図７Ａ〜図７Ｂ）。本発明者らは、第３のＢＭＩ１抗体（１．Ｔ．２１）を使用して、ＢＭＩ１及びＨ２Ａｕｂが認知症ではないヒトの皮質のＭＡＰＴ座位及びＩＮＫ４Ａ座位に濃縮され、ＡＤ皮質では激減する（図６Ｉ）ことを確認することができた。
【００８４】
（実施例８：ＢＭＩ１サイレンシングによって神経変性の特徴であるヘテロクロマチン異常が引き起こされる）
ＢＭＩ１の欠損が、神経変性障害に見られるようなヘテロクロマチン異常を引き起こし得るか判定するために、本発明者らは老齢（２４か月齢）のＢｍｉ１＋／−マウスとＢＭＩ１がノックダウンされたｈＥＳ細胞由来皮質ニューロン（ｓｈＢＭＩ１）を分析した。ヒストンＨ３のリシン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）は、ヘテロクロマチンのマーカーである。ＷＴの同腹兄弟と比較して、Ｂｍｉ１＋／−マウスの皮質ではＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルが低下した（図８Ａ）。特筆すべきことに、凝縮したクロマチンからＨ３Ｋ９ｍｅ３輝点が解離した（図８Ｂ）。ｓｈＣＴＬニューロンと比較すると、ｓｈＢＭＩ１ヒト皮質ニューロンにおいて同様の結果が得られた（図８Ｃ）。同様にｓＡＤヒト皮質試料も低下したＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルを有する（図８Ｄ〜図８Ｇ）。
【００８５】
（実施例９：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する皮質ニューロンにおけるＢＭＩ１の不活化）
本発明者らは、本発明者らの発見をさらに検証するために、クラスター化規則的間隔配置短鎖回文性反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ；ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）という遺伝的アプローチを使用して、ＢＭＩ１座位の両アレルにヌル欠失を導入した（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。製造業者の指示に従ってＭｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ−Ｘ２（商標）（カタログ番号ＭＩＲ６００３）を使用したＣａｓ９発現プラスミド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社番号ＣＡＳ１０１４０）、合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）スクランブル（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社番号Ｕ−００７５０１）又はＢＭＩ１に相補的な合成ガイドＲＮＡ（標的：ＡＡＣＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＧＴＴＡＣＣ；配列番号６）、及び合成トランス活性化ｃｒＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社番号Ｕ−００２００５）の多重送達によってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用するＢＭＩ１の不活化を実施した。
【００８６】
簡単に説明すると、多重送達薬剤を使用して、対照ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−Ｃｔｒｌ）又はＢＭＩ１エクソン１を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１）と共にＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミドを３０日齢の未処理ヒト有糸分裂後ニューロンに形質移入した（図９Ａ）。１０日後に、ゲノムＰＣＲによってニューロンを分析した。これにより、ｓｇＲＮＡ−ＢＭＩ１に曝露されたニューロンだけにＢＭＩ１のエクソン１内の約４００ｂｐの欠失（ＢＭＩ１ＫＯ）の存在が示された（図９Ｂ）。特筆すべきことに、ＢＭＩ１及びＨ２Ａｕｂに対する抗体を使用して明らかにされるように、ＢＭＩ１活性の欠損がＢＭＩ１ＫＯ培養物の細胞の９０％超において認められた（図９Ｃ〜図９Ｄ）。他の方法と対照的に、このアプローチはウイルス感染、薬剤選択及び／又は細胞選別を必要としなかった（Ｒｕｂｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。特筆すべきことに、ＢＭＩ１ＫＯ神経細胞培養物は濃縮核の存在とｐ−Ｔａｕ及びβ−アミロイドの蓄積を特徴とした（図９Ｅ〜図９Ｆ）。ｐ−Ｔａｕ免疫反応性が低Ｈ２Ａｕｂ（ＢＭＩ１ＫＯ）ニューロンにおいて単一細胞レベルでさらに可視化されたが、高Ｈ２Ａｕｂ（野生型）ニューロンでは可視化されなかった。このことから、細胞自律的効果が示唆された（図９Ｅ）。シナプス維持におけるＢＭＩ１の役割を試験するために、ＢＭＩ１ノックアウトを６０日齢のニューロンに導入し、７日後にそれらのニューロンを分析した。ＰＳＤ−９５及びシナプトフィジンに対する免疫反応性が対照ニューロンで認められたが、ＢＭＩ１ＫＯニューロンでは大きく減少した（図９Ｇ〜図９Ｈ）。このことから、ＢＭＩ１はシナプスの完全性に必要であることが明らかになった。
【００８７】
（結論）
本データは、ＢＭＩ１遺伝子の機能欠損によって、老齢のマウス及びヒトの皮質ニューロンにおけるアルツハイマー病の全ての神経病理学的特徴を再現することができたことを証明している。ヒトニューロンにおけるＢＭＩ１の阻害には、軸索セグメントに沿ったｐ−Ｔａｕの蓄積、細胞外アミロイドプラーク及び神経細胞内ｐ−Ｔａｕ濃縮体の形成、シナプス変性、並びに神経細胞死が付随した。非常に類似した神経病態が老齢のＢｍｉ１＋／−マウスに見られた。本分子分析により、ＢＭＩ１はＭＡＰＴを抑制し得ることも明らかになり、ＢＭＩ１欠損によって、ＡＰＰ／アミロイド経路と無関係にタウオパチーを引き起こし得ることが示唆された。したがって、ＢＳＩによって、ＢＭＩ１欠損性ニューロンにおけるアポトーシス及びＣ９９／アミロイド蓄積が防止されたが、ｐ−Ｔａｕレベル及びＦ−アクチンレベルについては部分的にしかレスキューされなかった。このことから、２つの並行疾患媒介経路が存在することが示唆された。しかし、Ｃ９９蓄積を生じるγ−セクレターゼ活性の阻害によって、未だ不明な機序によるＴａｕ蓄積を促進することができるので、特定の状況ではこれらの経路は相互に関連し得る｛Ｍｏｏｒｅ，  ２０１５｝。
【００８８】
ｓＡＤに対する薬品候補の効果確認のために本発明を使用する原理の証拠として、本発明者らはすでに試験されたものの、ｓＡＤ患者における高い神経毒性のために２０１４年に放棄されたγ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）を試験している｛Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，  ２０１４｝。このＧＳＩは、ＡＰＰのＣ９９断片の蓄積の誘導を介してＢＭＩ１ノックダウンヒト皮質ニューロンにも有毒であることが本研究の結果から示されている（図５Ｂ）。
【００８９】
本発明者らは、ＢＭＩ１（ＰＣＧＦ４とも呼ばれる）がｓＡＤ脳において優先的にサイレンシングを受けること、及びマウスと培養ヒト皮質ニューロンにおいてＢＭＩ１欠損によってＡＤが生じることも発見した。このことは、エピジェネティックＢＭＩ１サイレンシングが可能性の高いｓＡＤの原因であることを示している。得られた結果により、ＢＭＩ１がシナプスの完全性の維持に必要であることがさらに確認された。したがって、本発明は、ｓＡＤの有効な実験モデルが存在しないことに関連したｓＡＤの広大な知識ギャップと治療についての空白部分を埋めるのに役立ち得る。
【００９０】
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【００９１】
見出しは参照のため、及びある特定の節の場所の提示に役立たせるために本明細書に含まれている。これらの見出しは、それらの節の中で説明される考えの範囲を限定する意図を持っておらず、これらの考えは本明細書全体の中の他の節でも適用可能性を有する場合がある。したがって、本発明は、本明細書において示された実施形態に限定されるように意図されておらず、本明細書において開示された原理と新規特徴と一致する最も広い範囲と一致するものとする。
【００９２】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈から別段の指示が無い限り対応する複数の指示物を含む。したがって、例えば「（単数の）化合物」の参照はそのような化合物のうちの１つ以上を含み、「上記方法」の参照は本明細書に記載される方法に対して改変可能又は置換可能である当業者に知られている同等の工程及び方法への参照を含む。
【００９３】
特段の指示が無い限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、反応条件、濃度、特性等の量を表す全ての数は全ての例で「約」という用語によって修飾されているものと理解されたい。少なくとも各数値パラメーターは少なくとも報告されている有効桁数を考慮し、且つ、通常の切り上げ法を適用して解釈されるべきである。したがって、反対のことを指示されない限り本明細書及び添付されている特許請求の範囲において示されている数値パラメーターは獲得することが求められている特性に応じて変化し得る近似値である。本実施形態の広い範囲を表している数値範囲及び数値パラメーターは近似値であるのだが、特定の例において示されている数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながらどの数値も実験、検査測定値、統計分析等の変動から生じるある特定の誤差を本質的に含む。
【００９４】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示だけを目的としており、当業者はそれらの実施例及び実施形態を考慮した様々な改変又は変更を思いつき、それらの様々な改変又は変更が本発明及び添付されている特許請求の範囲内に含まれることが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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