(57)【要約】  本開示は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ−融合タンパク質およびＰＤ−１抗体断片−Ｆｃ融合タンパク質を含む二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性ヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）第１のタンパク質ドメイン、第２のタンパク質ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、前記第１のタンパク質ドメインが、第１のドメインリンカーを用いて前記第２のタンパク質ドメインのＮ末端に共有結合し、前記第２のタンパク質ドメインが、第２のドメインリンカーを用いて前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含む、融合タンパク質、ならびに
ｂ）ＰＤ−１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）および第２のＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質であって、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインが前記第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である、抗体融合タンパク質を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２】
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する、請求項１に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３】
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する、請求項１または２に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４】
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮化ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５】
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６】
前記ＰＤ−１抗原結合ドメインが、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７】
前記第１の融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１６４７８）のポリペプチド配列を有し、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインの前記ｓｃＦｖが、配列番号ＸＸ（１５１１０）のポリペプチド配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８】
前記第１の融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１６４７８）のポリペプチド配列を有し、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインの前記Ｆａｂが、配列番号ＸＸ（１４８３３）および配列番号ＸＸ（１４８１２）のポリペプチド配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項９】
前記ヘテロ二量体タンパク質が、ＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、ＸＥＮＰ２５８５０、またはＸＥＮＰ２５９３７である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体融合タンパク質をコードする核酸組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１０に記載の核酸組成物をさらに含む、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の１つまたは２つの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
二重特異性ヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、前記第１のタンパク質ドメインが、ドメインリンカーを用いて前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含む、融合タンパク質、
ｂ）前記第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインであって、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含む、第２のタンパク質ドメイン、ならびに
ｃ）ＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第２のＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質であって、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインが前記第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である、抗体融合タンパク質を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１７】
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する、請求項１６に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１８】
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する、請求項１６または１７に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１９】
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮化ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２０】
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２１】
前記ＰＤ−１抗原結合ドメインが抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１６４８１）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、前記第２のタンパク質ドメインが配列番号ＸＸ（１６４８４）のポリペプチド配列を有し、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインの前記Ｆａｂが配列番号ＸＸ（１４８３３）および配列番号ＸＸ（１４８１２）のポリペプチド配列を有する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２３】
前記融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１７５８４）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、前記第２の融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１７０７４）のポリペプチド配列を有し、前記ＰＤ−１抗原結合ドメインの前記Ｆａｂが配列番号ＸＸ（１４８３３）および配列番号ＸＸ（１４８１２）のポリペプチド配列を有する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２４】
前記ヘテロ二量体タンパク質が、ＸＥＮＰ２２１１２およびＸＥＮＰ２２６４１からなる群から選択される、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２５】
請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸組成物。
【請求項２６】
請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の抗体融合タンパク質をコードする核酸組成物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２５に記載の核酸組成物をさらに含む、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記第２のタンパク質ドメインをコードする核酸組成物をさらに含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
二重特異性ヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）第１のＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の抗体融合タンパク質であって、前記第１のＰＤ−１抗原結合ドメインが第１のドメインリンカーを介して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記第１のＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である、第１の抗体融合タンパク質、
ｂ）第２のＰＤ−１抗原結合ドメイン、第２のＦｃドメイン、および第１のタンパク質ドメインを含む、第２の抗体融合タンパク質であって、前記第２のＰＤ−１抗原結合ドメインが第２のドメインリンカーを介して前記第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記第１のタンパク質ドメインが第３のドメインリンカーを介して前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合し、前記第２のＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片であり、前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含む、第２の抗体融合タンパク質、ならびに
（ｃ）前記第２の抗体融合タンパク質の前記第１のタンパク質ドメインに非共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質を含む、第２のタンパク質ドメイン、を含み、 
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３３】
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する、請求項３２に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３４】
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する、請求項３２または３３に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３５】
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮化ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３６】
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３７】
前記第１のＰＤ−１抗原結合ドメインが抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３８】
前記第２のＰＤ−１抗原結合ドメインが抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３９】
前記第１の抗体融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１７５９９）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有し、前記第２の抗体融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１６４７８）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有し、前記第２のタンパク質ドメインが配列番号ＸＸ（１６４８４）のポリペプチド配列を有する、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４０】
前記第１の抗体融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１７６０１）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有し、前記第２の抗体融合タンパク質が配列番号ＸＸ（９０１８）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有し、前記第２のタンパク質ドメインが配列番号ＸＸ（１７０７４）のポリペプチド配列を有する、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４１】
前記ヘテロ二量体タンパク質が、ＸＥＮＰ２２６４２またはＸＥＮＰ２２６４４である、請求項請求項３２〜４０のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４２】
請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の第１の抗体融合タンパク質をコードする核酸組成物。
【請求項４３】
請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の第２の抗体融合タンパク質をコードする核酸組成物。
【請求項４４】
請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の第２のタンパク質ドメインをコードする核酸組成物。
【請求項４５】
請求項４２に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項４６】
請求項４３に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項４７】
請求項４４に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
【請求項４８】
請求項４３および／または４４に記載の核酸組成物をさらに含む、請求項４５に記載の発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１〜９、１６〜２４、および３２〜４１のいずれか１項に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５１】
ＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、ＸＥＮＰ２２１１２、ＸＥＮＰ２２６４１、ＸＥＮＰ２２６４２、ＸＥＮＰ２２６４４、ＸＥＮＰ２５８５０、およびＸＥＮＰ２５９３７からなる群から選択される二重特異性ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５２】
ＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、ＸＥＮＰ２２１１２、ＸＥＮＰ２２６４１、ＸＥＮＰ２２６４２、ＸＥＮＰ２２６４４、ＸＥＮＰ２５８５０、およびＸＥＮＰ２５９３７からなる群から選択される二重特異性ヘテロ二量体タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、核酸組成物。
【請求項５３】
１つ以上の発現ベクターを含み、各々が、前記１つ以上の発現ベクターがＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、ＸＥＮＰ２２１１２、ＸＥＮＰ２２６４１、ＸＥＮＰ２２６４２、ＸＥＮＰ２２６４４、ＸＥＮＰ２５８５０、およびＸＥＮＰ２５９３７からなる群から選択される二重特異性ヘテロ二量体タンパク質をコードする、ように、核酸を含む、発現ベクター組成物。
【請求項５４】
請求項５２に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
【請求項５５】
請求項５３に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項５６】
前記二重特異性ヘテロ二量体タンパク質が発現される適切な条件下で、請求項５４または５５に記載の宿主細胞を培養することと、前記タンパク質を回収することと、を含む、請求項５１に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を製造する方法。
【請求項５７】
癌を治療することを必要とする患者において癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項５１に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を前記患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１６年１０月１４日に出願された米国特許出願第６２／４０８，６５５号、２０１６年１１月１日に出願された同第６２／４１６，０８７号、２０１７年１月６日に出願された同第６２／４４３，４６５号、および２０１７年３月２８日に出願された同第６２／４７７，９２６号の優先権を主張し、これらは、その中の図面、説明文、および特許請求の範囲を特に参照して、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の増殖および分化を助けるように機能する。ＩＬ−２はまた、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能および生存に必須である。両方のサイトカインは、２つの共有の受容体、共通のガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）、およびＩＬ−２受容体Ｂ鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）、ならびに各々のサイトカインに固有のアルファ鎖、すなわちＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５）またはＩＬ−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα、ＣＤ２１５）からなる三量体複合体への結合を通してそれらの細胞シグナル伝達機能を発揮する。両方のサイトカインは腫瘍学において潜在的に価値のある治療薬と考えられており、ＩＬ−２は転移性腎細胞癌および悪性黒色腫の患者に使用することが承認されている。現在、いくつかの臨床試験が進行中であるが、組換えＩＬ−１５の承認された使用はない。
【０００３】
ＩＬ−２は治療薬としていくつかの課題を提示する。第１に、ＩＬ−２は、ＣＤ２５発現に依存する高親和性受容体複合体を発現するＴ細胞を優先的に活性化する。Ｔｒｅｇ細胞は構成的にＣＤ２５を発現するので、それらはＩＬ−２についてエフェクターＴ細胞と競合し、その活性化は腫瘍学的治療にとって好ましい。この不均衡は、高用量ＩＬ−２の概念を導く。しかしながら、このアプローチは血管漏出症候群のようなＩＬ−２媒介性の毒性のためにさらなる問題を引き起こす。
【０００４】
ＩＬ−２は主に活性化Ｔ細胞から分泌され、その受容体は活性化Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、およびＢ細胞に存在する。対照的に、ＩＬ−１５は単球および樹状細胞で産生され、そして主に同じ細胞上に存在するＩＬ−１５Ｒαとの膜結合ヘテロ二量体複合体として提示される。その効果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体を、ＩＬ−２Ｒβおよび共通のガンマ鎖を発現するＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞にトランス提示することによって実現される。
【０００５】
有望な薬物として、両方のサイトカインは、数分単位で測定される半減期で、非常に速いクリアランスに悩まされている。さらに、ＩＬ−１５それ自体は、ＩＬ−１５Ｒα関連複合体に対するその選好性のために安定性が低い。組換え的に産生されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロ二量体はＴ細胞を強力に活性化し得ることもまた示されている。それにもかかわらず、短い半減期は好ましい投薬を妨げる。
【０００６】
ＰＤ−１（プログラム細胞死１）などのチェックポイント受容体は、Ｔ細胞および他の細胞型の活性化、増殖、および／またはエフェクター活性を阻害する。チェックポイント受容体が腫瘍細胞に対する内因性Ｔ細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレメリムマブを含む抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体の前臨床および臨床試験は、免疫チェックポイント遮断が優れた抗腫瘍応答をもたらし、内因性Ｔ細胞を刺激して腫瘍細胞を攻撃し、さまざまな悪性腫瘍を有する一部の患者に長期の癌寛解をもたらすことを実証した。残念なことに、これらの治療法に応答するのは一部の患者だけであり、適応症および他の要因により異なるが、奏効率は一般に１０〜３０％の範囲で、場合によっては単剤療法についてより高くなる。これらの剤の治療的組み合わせ、例えばイピリムマブ＋ニボルマブはさらに高い奏効率をもたらし、場合によっては６０％に近づく。前臨床試験は、抗ＰＤ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ４抗体の間のさらなる相乗作用を示した。多重チェックポイント遮断の可能性は非常に有望であるが、そのような薬剤との併用療法は高い経済的負担を伴うと予想される。さらに、併用療法、例えばニボルマブ＋イピリムマブの自己免疫毒性は、単独療法と比較して顕著に上昇し、多くの患者に療法を中止させる。
【０００７】
したがって、本発明は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体−Ｆｃ融合体およびＰＤ−１抗原に結合する抗体断片を含む二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質に関する。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本発明は、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質であって、（ａ）第１のタンパク質ドメイン、第２のタンパク質ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、第１のタンパク質ドメインが、第１のドメインリンカーを用いて第２のタンパク質ドメインのＮ末端に共有結合し、第２のタンパク質ドメインが、第２のドメインリンカーを用いて第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含む融合タンパク質、ならびに（ｂ）ＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第２のＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質であって、ＰＤ−１抗原結合ドメインが第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、ＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である、抗体融合タンパク質、を含む、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を提供する。第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する。任意選択で、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【０００９】
本発明の他の態様では、本明細書で提供されるのは、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質であって、（ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、第１のタンパク質ドメインが、ドメインリンカーを用いて第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含む、融合タンパク質、（ｂ）第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインであって、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含む、第２のタンパク質ドメイン、ならびに（ｃ）ＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第２のＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質であって、ＰＤ−１抗原結合ドメインが第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、上記該ＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である、抗体融合タンパク質、を含む二重特異性ヘテロ二量体タンパク質である。第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する。他の場合には、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【００１０】
本発明のいくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質であって、（ａ）第１のＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の抗体融合タンパク質であって、第１のＰＤ−１抗原結合ドメインが第１のドメインリンカーを介して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第１のＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である、第１の抗体融合タンパク質、（ｂ）第２のＰＤ−１抗原結合ドメイン、第２のＦｃドメイン、および第１のタンパク質ドメインを含む第２の抗体融合タンパク質であって、第２のＰＤ−１抗原結合ドメインが第２のＦｃのＮ末端に共有結合し、第１のタンパク質ドメインが第３のドメインリンカーを介して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合し、第２のＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片であり、第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含む、第２の抗体融合タンパク質、ならびに（ｃ）第２の抗体融合タンパク質の第１のタンパク質ドメインに非共有結合し、かつＩＬ−１５タンパク質を含む第２のタンパク質ドメイン、を含む二重特異性ヘテロ二量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する。他の場合には、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【００１１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質のＩＬ１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００１２】
他の態様では、本明細書で提供されるのは、ＸＥＮＰ２５８５０、ＸＥＮＰ２５９３７、ＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、ＸＥＮＰ２２１１２、ＸＥＮＰ２２６４１、ＸＥＮＰ２２６４２、およびＸＥＮＰ２２６４４からなる群から選択される二重特異性ヘテロ二量体タンパク質である。
【００１３】
これらのタンパク質を作製する方法および本タンパク質を用いて患者を治療する方法に加えて、核酸、発現ベクター、および宿主細胞も全て同様に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＩＬ−１５とその受容体であるＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）、ＩＬ−１５Ｒβ（ＣＤ１２２）、および共通のガンマ鎖（ＣＤ１３２）との複合体の構造を示す。
【図２】ＩＬ−１５とその受容体の配列を示す。
【図３】（スキューおよびＰＩ変異を含む）Ｆｃヘテロ二量体変異セットの有用な対を示す。対応する「単量体２」の変異が存在しない変異体があり、これらはいずれの単量体でも単独で使用できるｐＩ変異体である。さらに、図８８を参照する。
【図４】等価変異型抗体定常領域とそれらの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は低ｐＩ変異を示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩ変異を示す。これらは、任意選択でかつ独立して、本発明の他のヘテロ二量体化変異（および本明細書に概説されているように他の変異の種類）と組み合わせることができる。
【図５】ＦｃγＲ結合を除去した有用な除去変異を示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」変異と呼ばれる）。一般に、除去変異は両方の単量体に見られるが、場合によってはそれらは一方の単量体のみにあってもよい。
【図６】特にその中で概説されている配列について、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月１６日に本件と同時に出願された、「ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」とう名称のもの、２０１６年１０月１４日に出願された米国特許出願第６２／４０８，６５５号、２０１７年１月６日に出願された同第６２／４４３，４６５号、および２０１７年３月２８日に出願された同第６２／４７７，９２６号のような、本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の「非サイトカイン」構成要素の特に有用な実施形態を示す。
【図７】本発明のＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の「非サイトカイン」／「非Ｆｖ」構成要素の特に有用な実施形態を示す。それぞれについて、４２８Ｌ／４３４ＳのＦｃＲｎ半減期延長変異を含めることができる。
【図８】ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に使用するためのいくつかの例示的な可変長リンカーを示す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結するのに使用される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合するのに使用される。
【図９】構成要素として、１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体融合タンパク質のｐＩを増加または減少するのに使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは、本明細書において特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６（８）：９８９−９９５（１９９３）からの「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。
【図１０】サイトカイン配列（例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット骨格の配列を示す。これらの骨格はまた、ＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の特定の実施形態において使用することができることに留意することが重要である。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＤ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキュー変異およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有し、さらに両方の鎖にＮ２９７Ａ変異を有する。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格６および７の代替フォーマットは、両方の鎖において除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変���、鎖にＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異およびＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番によるもので、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）変異を有し、これは当該技術分野で既知なように、Ｆａｂアーム交換を除去する。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異を有する。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキュー変異、およびＳ２６７Ｋの変異を含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、そして両方の同一の鎖にＣ２２０Ｓ、両方の同一の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を含む。骨格１３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキュー変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。  当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、図６４Ａ〜６４Ｋに概略的に示されるように、ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα、およびｓｃＩＬ−１５／Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対と共に用いられ得る。さらに、任意のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）変異を、任意の組み合わせでこれらの図１０の骨格に組み込むことができる。  これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一であり、および／または（当業者には理解されるように、親のヒトＩｇＧ１（または骨格に基づいてＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾を既に含む図の「親」と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む配列である。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩおよび除去変異に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。
【図１１】サイトカイン配列（例えば、Ｉｌ−１５および／もしくはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））またはＶＨを含まず、図１０Ａ〜図１０Ｄに示されている軽鎖主鎖をさらに除外する、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性フォーマット骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｃ２２０Ｓ、およびＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｃ２２０Ｓ、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑの変異、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含み、鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩ変異を有し、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑの変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去変異を有する。  ある特定の実施形態において、これらの配列は、３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプのものであり得る。他の実施形態において、これらの配列は、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｓ置換のいずれかを含み得る。いくつかの他の実施形態において、これらの配列はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含み得る。さらに他の実施形態では、これらの配列は代わりにヒトＩｇＧ４に基づくことができ、当技術分野で既知のように両方の鎖にＦａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）変異を含む。なおさらなる実施形態において、これらの配列は代わりにヒトＩｇＧ２に基づき得る。さらに、これらの配列は、代わりに、図３に示される他のスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を利用し得る。  当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、図６４Ａ〜６４Ｋに概略的に示されるように、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα、およびｄｓＩＬ−１５Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対と共に用いられ得る。さらに当業者には理解されそして以下に概説されるように、任意のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）変異がこれらの骨格に組み込まれ得る。さらに、当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかを含む、本明細書に概説された任意のＶＨおよびＶＬ対と共に使用することができる。  こ��らの骨格の各々内に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一であり、および／または（当業者には理解されるように、親のヒトＩｇＧ１（または骨格に基づいてＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾を既に含む図の「親」と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む配列である。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩおよび除去変異に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。
【図１２】本発明のＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質に使用される軽鎖の「非Ｆｖ」骨格（すなわち、定常軽鎖）を示す。
【図１３】選択した数の抗ＰＤ−１抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１に基づいて生成されたことに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１４】配列番号ＸＸＸとして記載されている追加の抗ＰＤ−１ＡＢＤと共に選択された数のＰＤ−１ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図９Ａ〜９Ｃに示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、そしてスラッシュは可変ドメイン＞の境界（単数または複数）を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの向きを示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）の向きとされ、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）の向きとされるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の向きで使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。
【図１５】重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する、ハイブリドーマクローン１Ｃ１１およびヒトＩｇＧ１の可変領域に基づくキメラ抗ＰＤ−１抗体、ＸＥＮＰ２１５７５の配列を示す。ＣＤＲは太字であり、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１６】ＰＤ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の、抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１による遮断を示す。
【図１７】ＳＥＢ刺激Ｔ細胞への、抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の結合を示す。
【図１８】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１による処理後のサイトカイン放出アッセイ（Ａ：ＩＬ−２、Ｂ：ＩＦＮγ）を示す。
【図１９】重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する、ヒトＩｇＧ１フォーマットの二価抗体（ＸＥＮＰ２２５５３）中の抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の例示的ヒト化変異の配列を示す。ＣＤＲは太字であり、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１のさらなるヒト化変異の配列は、配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹ（ＸＥＮＰ２２５４３、ＸＥＮＰ２２５４４、ＸＥＮＰ２２５４５、ＸＥＮＰ２２５４６、ＸＥＮＰ２２５４７、ＸＥＮＰ２２５４８、ＸＥＮＰ２２５４９、ＸＥＮＰ２２５５０、ＸＥＮＰ２２５５１、ＸＥＮＰ２２５５２、およびＸＥＮＰ２２５５４を含む）として表される。当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、本発明のＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質において使用するために、ＦａｂまたはｓｃＦｖとしてフォーマットすることができる。
【図２０】Ｏｃｔｅｔ（および関連するセンサーグラム）によって決定されたＰＤ−１に対するＸＥＮＰ２２５５３の親和性を示す。
【図２１Ａ−Ｇ】は、本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかのフォーマットを示す。ＩＬ−１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合体または「ＩＬ−１５／Ｒα−ｈｅｔｅｒｏＦｃ」（図Ａ）は、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側に組換によって融合されたＩＬ−１５およびヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に組換によって融合されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含む。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、Ｆｃ領域のＣ末端とＮ末端との間に可変長Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有し得る。単鎖ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図Ｂ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「単鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、分子の反対側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃまたは「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図Ｃ）はヘテロ二量体Ｆｃ領域に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされて、「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である分子の反対側と非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。二価非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図Ｄ）はホモ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、一方ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされて非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。二価単鎖ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図Ｅ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合されたＩＬ−１５を含み（「単鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、次いでこれをホモ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合させる。Ｆｃ−非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」（図Ｆ）はヘテロ二量体Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、一方ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされて、「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である分子の反対側と非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。Ｆｃ−単鎖ＩＬ−１５／Ｒα融合または「Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」（図Ｇ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ−１５を含み（「単鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロ二量体Ｆｃ領域のＣ末端に融合され、分子の反対側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。
【図２２】「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質であるＸＥＮＰ２０８１８およびＸＥＮＰ２１４７５の配列を示し、さらなる配列はＸＥＮＰ２０８１９、ＸＥＮＰ２１４７１、ＸＥＮＰ２１４７２、ＸＥＮＰ２１４７３、ＸＥＮＰ２１４７４、ＸＥＮＰ２１４７６、およびＸＥＮＰ２１４７７として図中に列挙されている。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図７に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２３】「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質であるＸＥＮＰ２１４７８の配列を示し、さらなる配列は配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹとして列挙されている（ＸＥＮＰ２１９９３、ＸＥＮＰ２１９９４、ＸＥＮＰ２１９９５、ＸＥＮＰ２３１７４、ＸＥＮＰ２３１７５、ＸＥＮＰ２４４７７、およびＸＥＮＰ２４４８０を含む）。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２４】「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１４７９、ＸＥＮＰ２２３６６、およびＸＥＮＰ２４３４８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２５】「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質であるＸＥＮＰ２１９７８の配列を示し、さらなる配列は配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹとして列挙されている（ＸＥＮＰ２１９７９を含む）。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図７に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２６】「二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図７に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２７】「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質であるＸＥＮＰ２２６３７の配列を示し、さらなる配列は配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹとして列挙されている（ＸＥＮＰ２２６３８を含む）。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２８】「Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図２９】種々のリンカー長を有するフォーマットＡの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＡ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ８＋細胞の、ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく増殖の誘導を示す。
【図３０】ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７８）およびｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７９）の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＡ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ８＋細胞の、ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく増殖の誘導を示す。
【図３１】操作されたジスルフィド結合対の位置を示すＩＬ−１５／Ｒαヘテロ二量体の構造モデルを示す。
【図３２】システイン残基を操作するための足場として役立つようにＣ末端におけるさらなる残基によって操作された例示的なＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）変異体の配列を示す。
【図３３】システインによって操作されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）変異体と共有ジスルフィド結合を形成するためにシステインによって操作された例示的なＩＬ−１５変異体の配列を示す。
【図３４】システインによって操作されたＩＬ−１５変異体と共有ジスルフィド結合を形成するためにシステインによって操作された例示的なＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）変異体の配列を示す。
【図３５】操作されたジスルフィド結合を有する本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のさらなるフォーマットを示す。ジスルフィド結合したＩＬ−１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合体または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」（図Ａ）は「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」と同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果としてさらに共有結合している。ジスルフィド結合したＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図Ｂ）は「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」と同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果としてさらに共有結合している。二価のジスルフィド結合したＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃまたは「二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図Ｃ）は「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」と同一であるが、操作されたシステインの結果としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５はさらに共有結合している。Ｆｃ−ジスルフィド結合ＩＬ−１５／Ｒα融合または「Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」（図Ｄ）は「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と同一であるが、操作されたシステインの結果としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５がさらに共有結合している。
【図３６】「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２０１３、ＸＥＮＰ２２０１４、ＸＥＮＰ２２０１５、およびＸＥＮＰ２２０１７の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図３７】「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２３５７、ＸＥＮＰ２２３５８、ＸＥＮＰ２２３５９、ＸＥＮＰ２２６８４、およびＸＥＮＰ２２３６１の配列を示す。さらなる配列は、ＸＥＮＰ２２３６０、ＸＥＮＰ２２３６２、ＸＥＮＰ２２３６３、ＸＥＮＰ２２３６４、ＸＥＮＰ２２３６５、およびＸＥＮＰ２２３６６に示されている。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図３８】「二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３４、ＸＥＮＰ２２６３５、およびＸＥＮＰ２２６３６の配列を示す。さらなる配列は、配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹ（ＸＥＮＰ２２６８７を含む）として表される。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図３９】「Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３９およびＸＥＮＰ２２６４０の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図４０】ＣＥＦによって決定されるときの、操作されたジスルフィド結合を有するかまたは有さない例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の純度および均一性を示す。
【図４１】操作されたジスルフィド結合を有するかまたは有さない例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＡ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の、ＦＡＣＳにより測定されるＫｉ６７発現に基づく増殖の誘導を示す。
【図４２】ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、および共通のγ鎖と複合体を形成したＩＬ−１５の構造を示す。効力を低減するために設計された置換の位置が示されている。
【図４３】効力を低減するために操作された例示的なＩＬ−１５変異体の配列を示す。列挙された配列と（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８および９９％同一である、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のさらなるアミノ酸置換を含む配列がこれらの変異型ＩＬ−１５配列の各々に含まれる。非限定的な例において、列挙された配列は、実施例３Ｂに記載されるように共有ジスルフィド結合の形成に寄与するものなどのさらなるアミノ酸修飾を含み得る。
【図４４】効力を低減するために操作された「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２８２１、ＸＥＮＰ２２８２２、ＸＥＮＰ２３５５４、ＸＥＮＰ２３５５７、ＸＥＮＰ２３５６１、ＸＥＮＰ２４０１８、ＸＥＮＰ２４０１９、ＸＥＮＰ２４０４５、ＸＥＮＰ２４０５１、およびＸＥＮＰ２４０５２の配列を示す。さらなる配列は、配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹ（ＸＥＮＰ２２８１５、ＸＥＮＰ２２８１６、ＸＥＮＰ２２８１７、ＸＥＮＰ２２８１８、ＸＥＮＰ２２８１９、ＸＥＮＰ２２８２０、ＸＥＮＰ２２８２３、ＸＥＮＰ２２８２４、ＸＥＮＰ２２８２５、ＸＥＮＰ２２８２６、ＸＥＮＰ２２８２７、ＸＥＮＰ２２８２８、ＸＥＮＰ２２８２９、ＸＥＮＰ２２８３０、ＸＥＮＰ２２８３１、ＸＥＮＰ２２８３２、ＸＥＮＰ２２８３３、ＸＥＮＰ２２８３４、ＸＥＮＰ２３５５５、ＸＥＮＰ２３５５９、ＸＥＮＰ２３５６０、ＸＥＮＰ２４０１７、ＸＥＮＰ２４０２０、ＸＥＮＰ２４０４３、およびＸＥＮＰ２４０４８を含む）として示される。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図４５】効力を低減するために操作された「ＳＣＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４０１５、ＸＥＮＰ２４０５０、ＸＥＮＰ２４４７５、ＸＥＮＰ２４４７６、ＸＥＮＰ２４４７８、ＸＥＮＰ２４４７９、およびＸＥＮＰ２４４８１の配列を示す。さらなる配列は、配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹ（ＸＥＮＰ２４０１３、ＸＥＮＰ２４０１４、およびＸＥＮＰ２４０１６を含む）として表される。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図４６】効力を低減するために操作された「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４３４９、ＸＥＮＰ２４８９０、およびＸＥＮＰ２５１３８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図４７】効力を低減するために操作された例示的なｎｃＩＬ−１５／Ｒαヘテロ二量体である、ＸＥＮＰ２２８０１およびＸＥＮＰ２２８０２の配列を示す。さらなる配列は、配列番号ＸＸＸ−ＹＹＹ（ＸＥＮＰ２２７９１、ＸＥＮＰ２２７９２、ＸＥＮＰ２２７９３、ＸＥＮＰ２２７９４、ＸＥＮＰ２２７９５、ＸＥＮＰ２２７９６、ＸＥＮＰ２２８０３、ＸＥＮＰ２２８０４、ＸＥＮＰ２２８０５、ＸＥＮＰ２２８０６、ＸＥＮＰ２２８０７、ＸＥＮＰ２２８０８、ＸＥＮＰ２２８０９、ＸＥＮＰ２２８１０、ＸＥＮＰ２２８１１、ＸＥＮＰ２２８１２、ＸＥＮＰ２２８１３、およびＸＥＮＰ２２８１４）として示される。これらの配列は、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端におけるポリヒスチジン（Ｈｉｓ×６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。
【図４８】効力を低減するために操作された「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４３４２の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図４９】効力を低減するために操作された「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの、例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２３４７２およびＸＥＮＰ２３４７３の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界を示す。
【図５０】変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＡ）ＮＫ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞の、ＦＡＣＳにより測定されるＫｉ６７発現に基づく増殖の誘導を示す。
【図５１】変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導のＥＣ５０、およびＸＥＮＰ２０８１８と比較したＥＣ５０の減少の倍率を示す。
【図５２】図に示されている実験におけるリンパ球と亜集団のゲーティングを示す。図Ａはゲートされたリンパ球集団を示す。図ＢはＣＤ３陰性およびＣＤ３陽性亜集団を示す。図Ｃは、ＣＤ３陰性細胞のＣＤ１６陰性およびＣＤ１６陽性の亜集団を示す。
【図５３】図に示されている実験におけるＣＤ３＋リンパ球亜集団のゲーティングを示す図ＡはＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびγδＴ細胞の亜集団を示す。図ＢはＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ（−）およびＣＤ４５ＲＡ（＋）の亜集団を示す。図Ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ（−）およびＣＤ４５ＲＡ（＋）の亜集団を示す。
【図５４Ａ．Ｂ】ＸＥＮＰ２２８２１とのヒトＰＢＭＣのインキュベーション前（図Ａ）および後（図Ｂ）のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す。
【図５５】示された変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質と共に４日間インキュベートしたヒトＰＢＭＣにおける細胞増殖を示す。図Ａ〜Ｃは、増殖しているＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）（図Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）、（図Ｂ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）（図Ｃ）の割合を示す。図Ｄは、対照（ＸＥＮＰ２０８１８）と比較した、様々なＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα  Ｆｃヘテロ二量体のＥＣ５０の変化倍率を示す。
【図５６】示された変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質と共に３日間インキュベートしたヒトＰＢＭＣにおける細胞増殖を示す。図Ａ〜Ｃは、増殖しているＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞（図Ａ）、ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞（図Ｂ）、γδＴ細胞（図Ｃ）、およびＮＫ細胞（図Ｄ）の割合を示す。
【図５７】さらなるＩＬ−１５／Ｒα変異体による処理後の、（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（Ｃ）ＮＫ細胞におけるＫｉ６７発現の割合を示す。
【図５８】ＩＬ−１５／Ｒα変異体による処理後の、（Ａ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（Ｃ）γδＴ細胞、（Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋ＣＤ８α−）、および（Ｅ）ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ８α−）細胞におけるＫｉ６７発現の割合を示す。
【図５９】ＩＬ−１５／Ｒα変異体による処理後の、（Ａ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（Ｃ）γδＴ細胞、（Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋ＣＤ８α−）細胞、および（Ｅ）ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ８α−）細胞におけるＫｉ６７発現の割合を示す。
【図６０】さらなるＩＬ−１５／Ｒα変異体で処理した後の、（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（Ｃ）γδＴ細胞、および（Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞におけるＫｉ６７発現の割合を示す。
【図６１】さらなるＩＬ−１５／Ｒα変異体で処理した後の、（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（Ｃ）γδＴ細胞、および（Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞におけるＫｉ６７発現の割合を示す。
【図６２】０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与でのＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるさまざまなＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合タンパク質または対照のＩＶ−ＴＶ投与時のＰＫを示す。
【図６３】低効力のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による治療後の半減期とＮＫ細胞の効力の相関を示す。
【図６４】本発明のＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質に関するいくつかのフォーマットを示す。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマット（図Ａ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、ヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合したｓｃＦｖを有する。「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｂ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合し、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされ、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｃ）は「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図Ｄ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、ヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合した可変重鎖（ＶＨ）を有し、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図Ｅ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合し、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成され、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされ、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図Ｆ）は「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｇ）は、第１および第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合し、次いでこれはさらにヘテロ二量体Ｆｃ領域の一方のＣ末端に融合し、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｈ）は、第１および第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の一方のＣ末端に融合し、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成され、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされ、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。「ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｉ）は「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「中央−ＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｊ）は、次いでヘテロ二量体Ｆｃの一方にさらに融合されたＩＬ−���５のＮ末端に組換え融合されたＶＨと、次いでヘテロ二量体Ｆｃの他方にさらに融合されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に組換え融合されたＶＨとを含み、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。「中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図Ｋ）は、次いでヘテロ二量体Ｆｃの一方の側にさらに融合したＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合したＶＨと、ヘテロ二量体Ｆｃの他方に融合したＶＨとを含み、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。
【図６５】「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質である、ＸＥＮＰ２１４８０の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図６６】「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図６７】「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図６８】「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図６９】「Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質である、ＸＥＮＰ２２１１２の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７０】「Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６４１の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７１】「ｍＡｂ×ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃの図中に示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７２】「ｍＡｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６４２およびＸＥＮＰ２２６４３の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７３】「ｍＡｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６４４およびＸＥＮＰ２２６４５の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７４】「中央−ＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７５】「中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８および９Ａ〜９Ｃに示される他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界を示す。
【図７６】Ａ）例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２１４８０のフォーマット、Ｂ）ＳＥＣおよびＣ）ＣＥＦによって決定されるＸＥＮＰ２１４８０の純度、ならびにＯｃｔｅｔによって決定されたＤ）ＩＬ−２ＲβおよびＥ）ＰＤ−１に対するＸＥＮＰ２１４８０の親和性、ならびにＦ）ＤＳＦによって決定されたＸＥＮＰ２１４８０の安定性を示す。
【図７７】Ａ）ＩＬ−２Ｒβ：共通ガンマ鎖複合体およびＢ）ＰＤ−１への２バッチのＸＥＮＰ２５８５０の結合を確認するためのＯｃｔｅｔ実験によるセンサーグラムを示す。
【図７８】例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質および対照によるＡ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導を示す。
【図７９】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質およびＰＢＳに対する対照によるＩＬ−２分泌の増強を示す。
【図８０】例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０および対照による処理後のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの血清中の４、７および１１日目のＩＦＮγレベルを示す。
【図８１】例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０および対照による処理後のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血におけるＡ）４日目、Ｂ）７日目、およびＣ）１１日目のＣＤ８＋Ｔ細胞数を示す。
【図８２】例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０および対照による処理後のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血におけるＡ）４日目、Ｂ）７日目、およびＣ）１１日目のＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。
【図８３】例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０および対照による処理後のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血におけるＡ）４日目、Ｂ）７日目、およびＣ）１１日目のＣＤ４５＋細胞数を示す。
【図８４】例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０および対照による処理後の、Ａ）４日目、Ｂ）７日目、およびＣ）１１日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの初期体重の割合としての体重を示す。各点は単一のＮＳＧマウスを表す。体重が初期体重の７０％を下回ったマウスを安楽死させた。死亡したマウスは７０％として表される。
【図８５】本発明の配列を示す。ＣＤＲは太字で示され、ＩＬ−１５およびＩＬ１５−Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は下線が付され、リンカーは二重下線が付され、そしてスラッシュ（／）はＩＬ−１５、ＩＬ１５−Ｒα（ｓｕｓｈｉ）、リンカー、およびＦｃドメインの間にある。
【図８６】ｓｃＦｖコンストラクト（ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌまたはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈのいずれかの向きで）またはＦａｂのいずれかとしてであり、本明細書に概説されるように、任意選択のドメインリンカーを使用してＦｃドメインに連結される、本発明において使用することができる他の源からの追加の抗ＰＤ−１のＦｖ配列を示す。本明細書中に示される配列の大部分に関して、ＣＤＲに下線が付されている。
【図８７】本発明において特に使用される配列を示し、ｓｃＦｖ  ＩＬ−１５／Ｒα（ｓｕｓｈｉ）コンストラクトを示す図８７Ａ、操作されたシステインを有するＩＬ−１５およびＩＬ−１５／Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を示す図８７ｂを含む。
【図８８】ヘテロ二量体の収量（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）および熱安定性（ＤＳＣにより決定）を有する操作されたヘテロ二量体スキュー（例えば「立体ヘテロ二量体化」）Ｆｃ変異の一覧を示す。決定されていない熱安定性は「ｎ．ｄ．」によって示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。かかる定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
【００１６】
本明細書において「除去」とは、活性の低下または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を除去する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸変異が、その特定の変異を含まないＦｃ領域と比較して５０％未満の出発結合を有することを意味し、７０−８０−９０−９５−９８％未満の活性喪失が好ましく、一般に、活性はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な活性のレベル未満である。ＦｃγＲ結合の除去において特に有用なものを、図３に示す。しかしながら、他に断らない限り、本発明のＦｃ単量体はＦｃＲｎ受容体への結合を保持している。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書で論じるように、本発明の多くの実施形態はＡＤＣＣ活性を完全に除去する。
【００１８】
本明細書で用いられるとき、「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。
【００１９】
本明細書において「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書で考察されるような標的抗原に特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。したがって、「チェックポイント抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説されるようにチェックポイント抗原に結合する。当該技術分野で知られているように、これらのＣＤＲは、可変重鎖ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）の第１のセットおよび可変軽鎖ＣＤＲの第２のセット（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）として一般に存在し、各々が３つのＣＤＲ、すなわち重鎖についてｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、軽鎖についてｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、可変重鎖および可変軽鎖ドメインにそれぞれ存在し、一緒になってＦｖ領域を形成する。したがって、場合によっては、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲには、可変重鎖および可変軽鎖が寄与する。「Ｆａｂ」フォーマットにおいて、６つのＣＤＲのセットには、２つの異なるポリペプチド配列、すなわち可変重鎖ドメイン（ｖｈまたはＶＨ、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む）および可変軽鎖ドメイン（ｖｌまたはＶＬ、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与し、このうちｖｈドメインのＣ末端が重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合し、ｖｌドメインのＣ末端が定常軽鎖ドメインのＮ末端に結合している（したがって、軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖフォーマットでは、ｖｈおよびｖｌドメインは、一般に本明細書に概説されているようなリンカーの使用によって、単一のポリペプチド配列に共有結合され、それは（Ｎ末端から開始して）ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈのいずれかであり得、前者が一般的に好まれる（使用されるフォーマット（例えば、ＵＳ６２／３５３，５１１の図１からのもの）に応じて、両側の任意選択のドメインリンカーを含む）。
【００２０】
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
【００２１】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されている変異体ポリペプチド、この場合はＦｃ変異体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（なおもアルギニンをコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、すなわち、同一のタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同一のアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００２２】
「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で使用されるとき、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、および２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、および２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
【００２３】
「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で使用されるとき、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
【００２４】
本明細書で使用される「変異型タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、変異を有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」としての役割を果たすことができ、例えば、ＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。本明細書のタンパク質変異体の配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。変異型タンパク質は、変異型タンパク質それ自体、タンパク質変異を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。
【００２５】
したがって、本明細書で使用される「抗体変異体」または「変異型抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧ変異体」または「変異型ＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧに由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリン変異体」または「変異型免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃ変異であり、ここで付番はＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述の変異は４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、例えば４２８Ｌ／４３４ＳはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異などである。抗体に関連する本発明において論じられる全ての位置について、別段の記載がない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームと同様のＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。置換には、天然に存在するアミノ酸および場合によっては合成アミノ酸が含まれ得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４、およびＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、全て参照により全体が組み込まれる。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわち、ペプトイド（全体が参照により組み込まれるＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡ  Ｓ  ＵＳＡ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照）などの「類似体」を含んでもよい。アミノ酸は、当業者には理解されようが、天然に存在するものか合成物（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではないもの）かのいずれかでもよい。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、およびノレオロイシンは、本発明の目的では合成アミノ酸と考えられ、Ｄ−とＬ−（ＲまたはＳ）の立体配置のアミノ酸の両方を利用することができる。本発明の変異体は、Ｃｒｏｐｐ＆Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ  ｉ  ＵＳＡ１０１（２）：７５６６−７１、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、およびＣｈｉｎｅｔａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１（５６３５）：９６４−７（全体が参照により組み込まれる）によって説明されている方法が挙げられるがこれらに限定されない、Ｓｃｈｕｌｔｚおよび共同研究者らによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む修飾を含み得る。さらに、ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
【００２７】
「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離におけるこの領域、または、全長抗体に関連するこの領域、抗体断片、またはＦａｂ融合タンパク質を指し得る。
【００２９】
「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、本明細書で使用されるとき、単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理解されるように、これらは一般に、２つの鎖で構成されているか、または組み合わさって（一般に、本明細書で論じられるようなリンカーによって）、ｓｃＦｖを形成することができる。
【００３０】
本明細書における「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、一般に本明細書で論じられるようなｓｃＦｖリンカーを使用して可変軽鎖ドメインに共有結合し、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重鎖ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれの向きにもあり得る。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に存在しない修飾であるとみなされる。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと同種であるＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６、参照により全体が組み込まれる）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用されるとき、「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）、ならびに任意の発見されていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ−１（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の発見されていないマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当該技術分野において既知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされている。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるために、そしていくつかの場合には血清半減期を増加させるために使用される様々なＦｃＲｎ変異が使用できる。一般に、別段の記載がない限り、本発明のＦｃ単量体は、ＦｃＲｎ受容体への結合を保持する（そして、下記のように、ＦｃＲｎ受容体への結合を増大させるためのアミノ酸変異を含み得る）。
【００３８】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、変異体を生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」は、変異体を生成するように修飾される非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」は、変異型抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説されるように、既知の市販の組換え産生抗体が含まれることに留意すべきである。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）を除く抗体の定常領域、および場合によってはヒンジの一部を含む、ポリペプチドを意味する。このため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ２とＣＨ３）、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むものと定義され、ここでの付番はＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、以下でより詳細に説明されるように、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
【００４０】
本明細書における「重鎖定常領域」とは、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。
【００４１】
本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」とは、一般に（任意選択で本明細書に記載されるようなリンカー部分を介して）異なるタンパク質、例えば本明細書に記載されるようなＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒに連結したＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。いくつかの場合では、２つのＦｃ融合タンパク質がホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質またはヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を形成することができ、後者が好ましい。いくつかの場合では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の一方の単量体は、Ｆｃドメインのみ（例えば、空のＦｃドメイン）を含み、他方の単量体は、変異型Ｆｃドメインおよび受容体、リガンド、または他の結合パートナーなどのタンパク質ドメインを含むＦｃ融合体である。
【００４２】
本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立されているフォーマット、例えば、抗体付番のためのＥＵインデックスに従って、付番されてもよい。
【００４３】
本明細書中の本発明のヘテロ二量体抗体の単量体に関連して「撚り度（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロ二量体を形成する能力を保持するようにヘテロ二量体化変異を各単量体に組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異が単量体Ａへと操作される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体変異はｐＩ変異を妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷変異が同一の「鎖」または「単量体」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー」変異について、当業者は、対の１つのセットを組み入れる鎖または単量体がどちらに入るかを決定する際にｐＩを考慮し、同様にスキューのｐＩを使用してｐＩ分離を最大化するようにする。
【００４４】
「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所与の抗体の可変領域が特異的に結合する分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。多数の適切な標的抗原が以下に記載されている。
【００４５】
「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００４６】
「可変領域」は、本明細書で使用されるとき、実質的にＶκまたはＶλのいずれかでコードされる１つ以上のＩｇドメイン、ならびに／または、それぞれ、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＨ遺伝子を含む、免疫グロブリンの領域を意味する。
【００４７】
本明細書における「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００４８】
本発明の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は一般に、単離されているか、または組換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用されるとき、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「単離されたタンパク質」とは、異なる結合特異性を有する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。「組換え体」は、外来性宿主細胞において組換え核酸技術を用いてタンパク質が生成されることを意味する。
【００４９】
タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列を整合し、必要ならギャップを導入した後の、特定の（親）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整合は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整合を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整合を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２４４５２５号明細書の段落番号［０２７９］〜［０２８０］に概説されているＡＬＩＧＮ−２プログラムである。
【００５０】
本発明のアミノ酸配列（「本発明の配列」）と親アミノ酸配列との間の同一性の程度は、「本発明の配列」の長さまたは親配列の長さのうちの長さが短い方で割った、２つの配列の整合における正確な一致の数として計算される。結果は同一性パーセントで表される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％まで同一である。
【００５２】
特定の抗原またはエピトープへの「特異的結合」もしくはそれら「に特異的に結合する」またはそれら「に対して特異的である」とは、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない類似の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と類似の対照分子との競合によって決定することができる。
【００５３】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【００５４】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般に、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて測定される。
【００５５】
ＩＩ．導入
本発明は、チェックポイント阻害剤ＰＤ−１抗原に結合することができ、そして共通のガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）および／またはＩｌ−２受容体β鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）と複合体形成することができるヘテロ二量体融合タンパク質を提供する。一般に、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、３つの機能的構成要素：本明細書で一般に「ＩＬ−１５複合体」と呼ばれるＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）構成要素、抗ＰＤ−１構成要素、およびＦｃ構成要素を有し、各々が異なる形態をとることができ、各々が任意の構成で他の構成要素と組み合わせることができる。
【００５６】
Ａ．ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメイン
図に示すように、ＩＬ−１５複合体はいくつかの形態をとることができる。上述のように、ＩＬ−１５タンパク質それ自体は、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質と複合体を形成するときよりも安定性が低い。当該技術分野において既知であるように、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は「ｓｕｓｈｉドメイン」を含み、これはＩＬ−１５結合活性を保持する受容体の最も短い領域である。したがって、全ＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含むヘテロ二量体融合タンパク質を作製することができるが、本明細書における好ましい実施形態は、ｓｕｓｈｉドメインのみを使用する複合体を含み、その配列を図に示す。
【００５７】
したがって、ＩＬ−１５複合体は一般に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ  ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン（全長配列が使用されるという別段の記載がない限り、「ＩＬ−１５Ｒα」、「ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）」および「ｓｕｓｈｉ」は全体を通じて交換可能に使用される）を含む。この複合体は３つの異なるフォーマットで使用できる。図６４Ｂに示されるように、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、共有結合しているのではなく、むしろ通常のリガンド−リガンド相互作用によって自己集合している。本明細書でより十分に説明されるように、Ｆｃドメインに共有結合的に連結されるのはＩＬ−１５ドメインまたはｓｕｓｈｉドメインのいずれかであり得る（一般に任意選択のドメインリンカーを使用する）。代替的に、それらは、概して図６４Ａに示されるように、ドメインリンカーを使用して共有結合することができる。図６４Ａは、ｓｕｓｈｉドメインをＮ末端ドメインとして示すが、これは逆にすることもできる。最後に、ＩＬ−１５ドメインまたはｓｕｓｈｉドメインの各々は、システインアミノ酸を含むように操作でき、同様に、概して図６４Ｃに示されるように、Ｆｃドメインに（任意選択のドメインリンカーを用いて）共有結合しているＩＬ−１５ドメインまたはｓｕｓｈｉドメインのいずれかと共に複合体を形成するようにできる。
【００５８】
Ｂ．抗ＰＤ−１構成要素
本発明の抗ＰＤ−１構成要素（抗ＰＤ−１抗原結合ドメインまたはＡＢＤ）は、概して、ヒトＰＤ−１に結合することができる、Ｆｖドメインを形成する６個のＣＤＲのセットおよび／または可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインである。本明細書に示されるように、抗ＰＤ−１ＡＢＤはｓｃＦｖの形態であり得、ここでｖｈドメインおよびｖｌドメインはｓｃＦｖリンカーを使用して結合され、これは任意選択で荷電されたｓｃＦｖリンカーであり得る。当業者には理解されるように、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、Ｎ−ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−Ｃとして、またはＮ−ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−Ｃとして、組み立てることができ、ｓｃＦｖドメインのＣ末端は概してヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃドメインに連結する。適切なＦｖ（ＣＤＲセットおよび可変重鎖／可変軽鎖ドメインを含む）は、ｓｃＦｖフォーマットで使用することができ、またはＦａｂフォーマットは、ＵＳ６２／３５３，５１１に開示されており、その内容は、その全体が全ての目的のために、そして特に図１１および１２の配列について、本明細書に組み込まれる。
【００５９】
当業者にはさらに理解されるように、ヒンジ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４由来の野生型ヒンジ、またはＩｇＧ４ヒンジポリペプチドに対して２２８位に置換プロリンを有するＩｇＧ４Ｓ２４１ＰもしくはＳ２２８Ｐヒンジ変異体などのそれらの変異体でもあり得る（付番Ｓ２２８ＰはＥＵインデックスに従い、Ｓ２４１ＰはＫａｂａｔ付番である））の全部または一部が、ｓｃＦｖドメインとＣＨ２−ＣＨ３ドメインとの間のドメインリンカーとして使用することができ、または、図に示すようなドメインリンカーを使用することができる。
【００６０】
Ｃ．Ｆｃドメイン
本発明のＦｃドメイン構成要素は本明細書に記載の通りであり、それは概して、スキュー変異および／または任意選択のｐＩ変異を含み、および／または除去変異が本明細書において概説される。
【００６１】
ＩＩＩ．二重特異性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合体×ＰＤ−１ＡＢＤヘテロ二量体タンパク質
本明細書において提供されるものは、チェックポイント阻害剤ＰＤ−１抗原に結合することができ、そして共通のガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）および／またはＩｌ−２受容体β鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）と複合体形成することができるヘテロ二量体融合タンパク質である。ヘテロ二量体融合タンパク質は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質および抗体融合タンパク質を含み得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒαに共有結合したＩＬ−１５タンパク質、およびＦｃドメインを含み得る。任意選択で、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。
【００６２】
Ｆｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃドメインから誘導することができ、ＩｇＧ１Ｆｃドメインが本発明において特に使用される。以下は、本発明の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合単量体およびチェックポイント抗体断片に有用なＦｃドメインを記載する。
【００６３】
各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し、Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上述（１９９１）を参照）。
【００６４】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧと関連して「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って３４１〜４４７位を指す。本明細書において示され、以下に記載されるように、ｐＩ変異は、ＣＨ領域、および以下に論じられるように、ヒンジ領域のうちの１つ以上に存在し得る。
【００６５】
重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１および第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３７で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、位置２２１（ＩｇＧ１中のＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含むように本明細書で定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に関連して、下側ヒンジが含まれ、「下側ヒンジ」は一般に位置２２６または２３０を指す。本明細書に記載のように、ｐＩ変異はヒンジ領域にも同様に作製することができる。
【００６６】
したがって、本発明は、異なる抗体ドメイン、例えば異なるＦｃドメイン、例えば異なるＦｃドメインを提供する。本明細書中に記載され、そして当該技術分野において既知であるように、本発明のヘテロ二量体タンパク質は異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、および任意選択でヒンジドメインを含み、ＩｇＧ１由来のＦｃドメインと共に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来であり得る。本明細書のいくつかの実施形態では、タンパク質断片、例えばＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαがＦｃドメインに結合しているとき、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαコンストラクトのＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。他の実施形態では、タンパク質断片、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαがＦｃドメインに結合しているとき、それは、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαコンストラクトのＣ末端であり、ＦｃドメインのＣＨ１ドメインに結合している。
【００６８】
本明細書に概説したＦｃドメインタンパク質のコンストラクトおよび配列のいくつかにおいて、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαのＣ末端はドメインリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は定常ＦｃドメインのＮ末端に結合している（Ｎ−ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質断片−リンカー−Ｆｃドメイン−Ｃ）が、これは切り替えることができる（Ｎ−Ｆｃドメイン−リンカー−ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質ドメイン−Ｃ）。本明細書に概説される他のコンストラクトおよび配列において、第１のタンパク質断片のＣ末端は、任意選択でドメインリンカーを介して、第２のタンパク質断片のＮ末端に結合し、第２のタンパク質断片のＣ末端は、任意選択でドメインリンカーを介して定常ＦｃドメインのＮ末端に結合する。本明細書に概説されるさらに他のコンストラクトおよび配列において、第１のタンパク質断片または第２のタンパク質断片に結合していない定常Ｆｃドメインが提供される。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載の２つ以上の例示的な単量体Ｆｃドメインタンパク質を含み得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを共に連結するために使用される「ドメインリンカー」であり、そのいくつかは図８に示されている。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（および一般に１〜２〜３〜４〜５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。いくつかの場合において、以下に概説するように、「撚り度」に注意を払って、荷電ドメインリンカーである。
【００７０】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、それがｐＩ工学などのヘテロ二量体を生成するように操作することができる少なくとも２つの定常ドメインを含む。使用され得る他のＦｃドメインは、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジドメインのうちの１つ以上を含む断片を含む。特に、図２１および図６４に示すフォーマットは、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であり、これは、以下により完全に記載されるように、このタンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己集合した２つの結合したＦｃ配列および少なくとも１つのタンパク質断片（例えば、１つ、２つまたはそれ以上のタンパク質断片）を有することを意味する。いくつかの場合において、第１のタンパク質断片は第１のＦｃ配列に連結し、そして第２のタンパク質断片は第２のＦｃ配列に連結する。他の場合では、第１のタンパク質断片は第１のＦｃ配列に連結しており、第１のタンパク質断片はＦｃ配列に連結していない第２のタンパク質断片に非共有結合している。いくつかの場合では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１のＦｃ配列に連結している第２のタンパク質断片に連結している第１のタンパク質断片、および第１または第２のタンパク質断片のいずれにも連結していない第２のＦｃ配列を含む。
【００７１】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己集合してヘテロ二量体Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを形成する、２つの異なる重鎖変異型Ｆｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００７２】
本発明は、１つ以上の結合パートナー、リガンド、または受容体への結合を可能にするヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するための新規コンストラクトに関する。ヘテロ二量体Ｆｃ融合コンストラクトは、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組み立てられる２つの「単量体」の自己集合の性質に基づく。ヘテロ二量体Ｆｃ融合体は、以下により完全に論じられるように各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、ヘテロ二量体形成を促進するためにおよび／またはホモ二量体よりもヘテロ二量体の精製を容易にするために、各鎖上で異なる定常領域中のアミノ酸変異に依存して、結合パートナーまたはリガンドまたは受容体をいくつかの方法で共結合することができるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の作製に関する。
【００７３】
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる多くの機構が存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらの機構を組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸変異は、「ヘテロ二量体化変異」と呼ばれる。後述するように、ヘテロ二量体化変異は、ヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする立体変異（例えば、後述の「ノブアンドホール」または「スキュー」変異および「電荷対」変異）ならびに「ｐＩ変異」を含み得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には以下で「ヘテロ二量体化変異」の議論について本明細書に組み込まれるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、本明細書においてしばしば「スキュー」変異として（ＷＯ２０１４／１４５８０６中の議論を参照）、「ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されているような「静電ステアリング」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるようなｐＩ変異、およびＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説されているような一般的なさらなるＦｃ変異が含まれる。
【００７４】
本発明において、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基本的な機構が存在し、その１つは、各単量体が異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−ＢおよびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製が可能になるｐＩ変異の使用に依存する。代替的に、いくつかのフォーマットはまた、サイズに基づいて分離することも可能にする。以下にさらに概説するように、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を「スキュー」することも可能である。したがって、立体的ヘテロ二量体化変異とｐＩまたは電荷対変異の組み合わせは、本発明において特に使用される。
【００７５】
一般に、本発明において特に使用される実施形態は、２つの単量体間のｐＩ差を増加させる、ｐＩ変異と組み合わせた、ホモ二量体形成に対するヘテロ二量体形成を促進するスキュー変異を含む変異のセットに依存する。
【００７６】
さらに、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のフォーマットに応じて、ｐＩ変異は単量体の定常および／またはＦｃドメイン内に含まれるか、またはドメインリンカーのいずれかが使用され得る。すなわち、本発明は、一方または両方の単量体上にあるｐＩ変異体、および／または荷電ドメインリンカーも提供する。さらに、代替の機能性のためのさらなるアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯ変異などのｐＩ変化を付与し得る。
【００７７】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異を一方または両方の単量体のポリペプチドに導入することができ、すなわち、単量体の一方（本明細書では簡単のために「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを単量体Ｂと異なるように操作でき、または、単量体ＡとＢの両方の変化を、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させるように変更できる。論じられるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらの変異を図に示す。
【００７８】
したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができるように、少なくとも１つの単量体に十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解されるように、そして以下にさらに論じるように、これは、「野生型」重鎖定常領域およびそのｐＩ（ｗｔＡ−＋ＢまたはｗｔＡ−−Ｂ）を増加または減少させるように操作された変異領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）実施できる。
【００７９】
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩ変異」または「ｐＩ置換」）を単量体の一方または両方に組み込むことによって変化させることを目的とする定常領域におけるアミノ酸変異である。本明細書中に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものが全て本発明において使用される。
【００８０】
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体または両方の単量体に含まれるべきｐＩ変異の数は、構成要素の出発ｐＩに部分的に依存するであろう。当該技術分野において知られているように、異なるＦｃは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩの差異を生じるように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。
【００８１】
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体または両方の単量体に含まれるべきｐＩ変異の数は、構成要素の出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より陽性またはより陰性）かを決定するために、Ｆｃドメインの配列、およびいくつかの場合において、Ｆｃドメインに連結するタンパク質ドメインが計算され、そしてそこから決定がなされる。当該技術分野において知られているように、異なるＦｃドメインおよび／またはタンパク質ドメインは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩの差異を生じるように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。
【００８２】
さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体はサイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。図に示すように、例えば、フォーマットのいくつかは、サイズに基づいてヘテロ二量体およびホモ二量体の分離を可能にする。
【００８３】
Ｆｃドメインの定常領域を使用することによって、ｐＩ変異を使用してヘテロ二量体化を達成する場合、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を設計および精製するためのよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体化変異（スキューおよび精製ヘテロ二量体化変異を含む）を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態において、ｐＩ変異から生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩ変異を移入することによって顕著に低下する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低ｐＩの定常ドメインの解明、例えば、任意の特定の位置における非ヒト残基の最小化または回避である。
【００８４】
このｐＩ工学で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加である。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩ変異はまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。
【００８５】
さらに、ヘテロ二量体化変異のｐＩ変異は、ホモ二量体が存在するときを排除、最小化、および区別するいずれかの能力が顕著であるので、Ｆｃ融合タンパク質の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与える。同様に、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質産生の再現性を確実に試験する能力は重要である。
【００８６】
Ａ．ヘテロ二量体化変異
本発明は、ヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体からの精製を可能にするためにヘテロ二量体化変異を利用する、様々なフォーマットのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。ヘテロ二量体融合コンストラクトは、２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組み立てられる２つの「単量体」の自己集合の性質に基づく。＊＊Ｒｏｂｉｎ
【００８７】
ヘテロ二量体化スキュー変異のセットのいくつかの適切な対がある。これらの変異は、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１の単量体に組み込まれ、他のセットの対が第２の単量体に組み込まれる。注目すべきは、これらのセットは、一方の単量体上の残基と他方の単量体上の残基との間で一対一の対応関係を有する「ノブインホール」変異として必ずしも振舞わないことであり、すなわち、これらのセットの対は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げる２つの単量体間の界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合を予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％以上にする。
【００８８】
Ｂ．立体変異
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の形成は、立体変異の付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖中のアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が会合して同一のＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりもヘテロ二量体構造を形成する可能性が高い。適切な立体変異は、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図２９に含まれており、それらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、同様に図１Ａ〜１Ｅにも含まれる。
【００８９】
１つの機構は、当該技術分野において一般的に「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸工学を指し、任意選択で使用することもできる、これはしばしば、「ノブアンドホール」と呼ばれ、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載されるようなものであり、それらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ヘテロ二量体化に対するスキュー形成のためのジスルフィド結合と組み合わせることができる。
【００９０】
ヘテロ二量体の生成に使用されるさらなる機構は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらはまた、ｐＩ、したがって精製に影響を及ぼす可能性を有し、したがって場合によってはｐＩ変異と見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体変異」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。
【００９１】
さらなる単量体Ａおよび単量体Ｂの変異は、本明細書に概説されるｐＩ変異またはそれらの全ては参照により本明細書に明示的に組み込まれるＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体変異などの他の変異と、任意の量で任意選択で独立して組み合わせることができる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本明細書に概説される立体変異は、任意選択で独立していずれかのｐＩ変異（またはＦｃ変異、ＦｃＲｎ変異などの他の変異）を一方または両方の単量体に組み込むことができ、独立して任意選択で本発明のタンパク質に含めるかまたは除外することができる。
【００９３】
適切なスキューバリアントの一覧を図３に示す。多くの実施形態において特に有用であるのは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択で架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）を含むがこれらに限定されないセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方の単量体が二重変異セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重変異セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、上述のように、これらの対の「撚り度」は出発ｐＩに依存する。
【００９４】
Ｃ．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）変異
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩ変異には２つの一般的なカテゴリーがある：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）。本明細書中に記載されるように、これらの変異の全ての組み合わせがなされ得る：一方の単量体は野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異であり得、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各単量体は、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
【００９５】
ｐＩ変異体の好ましい組み合わせはＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図３０に示されており、それらの全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、全てのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
【００９６】
一実施形態では、Ｆｃ単量体の１つがＣＨ１ドメインを含む場合、ｐＩ変異の好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異（ヒトＩｇＧ１と比較するときＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体を有する。いくつかの場合では、第２の単量体は、（ＧＫＰＧＳ）４を含む、正に荷電したドメインリンカーを含む。いくつかの場合では、第１の単量体は２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まないコンストラクト（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の場合）において、好ましい負のｐＩ変異Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異（ヒトＩｇＧ１と比較するときＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、変異は、位置２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２３３、２３４、２３５、および２３６を含む、Ｆｃドマン（ｄｏｍａｎ）のヒンジドメインでなされる。２３３〜２３６における変化は、ＩｇＧ２骨格における（３２７Ａと共に）エフェクター機能を増加させるためになされ得ることに留意されたい。したがって、ｐＩ変異、特に置換は、本発明で使用されている１、２、３、４または５個の変異によって位置２２１〜２２５の１つ以上で行うことができる。同様に、全ての可能な組み合わせが、単独で、または他のドメイン中の他のｐＩ変異と共に企図されている。
【００９８】
ヒンジドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはトレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、および２３６位の欠失または非天然アラニンが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの場合では、ヒンジドメインにおいてはｐＩ置換のみが行われ、他の場合では、これらの置換は他のドメイン内の他のｐＩ変異に任意の組み合わせで加えられる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、位置２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４、および３３９を含む変異をＣＨ２領域内に生じさせることができる。同様に、これら１０個の位置の全ての可能な組み合わせを作ることができ、例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＣＨ２のｐＩ置換を有していてもよい。
【０１００】
ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の天然グルタミン酸、３３９位の非天然トレオニン、およびＣＨ２内および他のドメインとの全ての可能な組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０１】
この実施形態では、変異は位置３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４および４４７から独立してかつ任意選択で選択され得る。ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、３５９位の非天然グルタミン酸、３６２位の非天然グルタミン酸、３８９位の非天然グルタミン酸、４１８位の非天然グルタミン酸、４４４位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸が含まれるがこれらに限定されない。ｐＩ変異の例示的な実施形態は図２に提示されている。
【０１０２】
Ｄ．アイソタイプ変異
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、変異体に望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、変異型Ｆｃ融合タンパク質のｐＩに顕著な影響を与えるためには、一般にいくつかのアミノ酸置換が必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。
【０１０３】
他の実施形態では、得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるため（例えば、より高いｐＩアミノ酸からより低いｐＩアミノ酸へと変化させることによる）、または以下でより詳細に説明するように、安定性などのための構造調整を可能にするためのいずれかで、非アイソタイプのアミノ酸変化をなす。
【０１０４】
さらに、重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各単量体における顕著な変化を見ることができる。本明細書で論じるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。
【０１０５】
Ｅ．ｐＩの計算
各単量体のｐＩは、変異型重鎖定常ドメインのｐＩならびに変異型重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含む単量体全体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、変異型重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どの単量体を操作するかは、一般に、各単量体の固有のｐＩによって決定される。
【０１０６】
Ｆ．ｐＩ変異もまたインビボ結合により良好なＦｃＲｎを付与する。
ｐＩ変異が単量体のｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。
【０１０７】
まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、参照により全体が組み込まれる）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異は実際に低下した血清濃度および野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、参照により全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中へのＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。それ故、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。
【０１０８】
Ｇ．追加の機能性のための追加のＦｃ変異
ｐＩアミノ酸変異に加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合の改変、ＦｃＲｎ受容体への結合の改変などを含むがこれらに限定されない、様々な理由で実施することができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾が存在する。
【０１０９】
したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩ変異および立体変異を含む、本明細書に概説したヘテロ二量体化変異を含むアミノ酸修飾を含むことができる。各セットの変異は独立してそして任意選択で特定のヘテロ二量体タンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。
【０１１０】
Ｈ．ＦｃγＲ変異
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明で有用なアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものが含まれ、それらの全ては参照によりそれらの全体が、特にその中に開示される変異が明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定の変異には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１１】
さらに、ＦｃγＲＩＩｃに対する親和性を増加させるアミノ酸置換もまた、本明細書に概説されるＦｃドメイン変異に含まれ得る。例えば、ＵＳＳＮｓ１１／１２４，６２０および第１４／５７８，３０５に記載されている置換は有用である。
【０１１２】
さらに、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。
【０１１３】
Ｉ．除去変異
同様に、機能的変異の別のカテゴリーは「ＦｃγＲ除去変異」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）変異である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、さらなる作用機構を回避するために、１つ以上または全てのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去することが望ましい。これは、例えば、多くの実施形態において、特に、Ｆｃドメインのうちの１つが１つ以上のＦｃγ受容体除去変異を含むように、ＦＣγＲＩＩＩａ結合を除去してＡＤＣＣ活性を除去または顕著に減少させることが望ましい二重特異性免疫調節抗体の使用においてである。これらの除去変異は、それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図３１に示されており、ＥＵインデックスに従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される除去変異を用いる好ましい態様で、各々が独立して任意選択で含まれるか除外することができる。本明細書で言及される除去変異は、ＦｃγＲ結合を除去するが、一般にはＦｃＲｎ結合を除去しないことに留意されたい。
【０１１４】
ｐＩ変異の例示的な実施形態は図３に提示されている。
【０１１５】
Ｊ．ヘテロ二量体とＦｃ変異の組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化変異（スキューおよび／またはｐＩ変異を含む）は全て、それらの「撚り度」または「単量体分配」を保持する限り任意の方法で任意選択で独立して組み合わせることができる。さらに、これらの変異は全て、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
【０１１６】
ｐＩ変異の場合、特に使用される実施形態が図面に示されているが、精製を促進するために２つの単量体間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
【０１１７】
さらに、ヘテロ二量体化変異、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で一般的に概説されるように、Ｆｃ除去変異、Ｆｃ変異、ＦｃＲｎ変異と独立して任意選択で組み合わせることができる。
【０１１８】
さらに、単量体Ｆｃドメインは、Ｃ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳまたはＣ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むアミノ酸置換のセットを含み得る。
【０１１９】
さらに、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、スキュー変異（例えば、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０号の図１Ａ〜１Ｃに示されるアミノ酸置換のセット、それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むことができ、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意選択で除去変異、任意選択で荷電されたドメインリンカーを含むことができ、重鎖はｐＩ変異を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、２３６Ｒ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２４３Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｖ２５９Ｉ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２９８Ａ、Ｖ３０８Ｆ、３２８Ｆ、３２８Ｒ、３３０Ｌ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｆ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｙ４３６Ｉ／Ｍ４２８Ｌ、Ｙ４３６Ｖ／Ｍ４２８Ｌ、Ｙ４３６Ｉ／Ｎ４３４Ｓ、Ｙ４３６Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、およびＰＶＡ／Ｓ２６７Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの場合では、Ｆｃドメインはアミノ酸置換２３９Ｄ／３３２Ｅを含む。他の場合において、Ｆｃドメインはアミノ酸置換Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８ＲまたはＰＶＡ／Ｓ２６７Ｋを含む。
【０１２１】
一実施形態では、本発明で使用されるスキューおよびｐＩ変異の特定の組み合わせは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択で、架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）であり、一方の単量体がＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み他方が正に荷電したドメインリンカーである。当該技術分野において理解されるように、「ノブインホール」変異はｐＩを変化させず、したがっていずれの単量体にも使用することができる。
【０１２２】
ＩＶ．本発明の有用なフォーマット
図６４に示すように、本発明の二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質のいくつかの有用なフォーマットが存在する。一般に、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、３つの機能的構成要素：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）構成要素、抗ＰＤ−１構成要素、およびＦｃ構成要素を有し、本明細書で概説されるように各々が異なる形態をとることができ、各々が任意の構成で他の構成要素と組み合わせることができる。
【０１２３】
第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、ａ）Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、ｂ）Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｃ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、ｄ）Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、ｅ）Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、ｆ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびｇ）Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【０１２５】
任意選択で、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【０１２６】
任意選択で、第１および／または第２のＦｃドメインは、半減期延長のために４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を有する。
【０１２７】
Ａ．ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ
一実施形態が図６４Ａに示されており、２つの単量体を含む。第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカーＩｌ−１５ードメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の単量体は、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジを含み、いずれの方向でもよく、ドメインリンカーをヒンジの代わりに使用することができる。これは一般に「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表し、共有結合リンカーを用いたＩＬ−１５およびｓｕｃｈｉドメインの結合を指す。この実施形態のための変形の好ましい組み合わせは、図７ＡおよびＢに見られる。
【０１２８】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるように、配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１２９】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１３０】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１３１】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示される配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用し、例えば、スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体において）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合単量体において）、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側において）、両方の単量体除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋに、および任意選択で両側に４２８Ｌ／４３４Ｓ変異を利用する。
【０１３２】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｂのフォーマットで利用する。
【０１３３】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３からの可変重鎖および可変軽鎖配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１３４】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用する。
【０１３５】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｂのフォーマットで利用する。
【０１３６】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１３７】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８７Ａに示されるようにＩＬ−１５複合体（ｓｕｓｈｉドメイン−リンカー−ＩＬ−１５）を利用する。
【０１３８】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよび図８７Ａに示されるようなＩＬ−１５複合体（ｓｕｓｈｉドメイン−リンカー−ＩＬ−１５）を利用する。
【０１３９】
Ｂ．ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｂに示されており、そして３つの単量体を含む。第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の単量体は、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジを含み、いずれの方向でもよく、ドメインリンカーをヒンジの代わりに使用することができる。第３の単量体はＩＬ−１５ドメインである。これは一般に「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」はＩＬ−１５とｓｕｃｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「非共有」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７ＡおよびＢに見られる。
【０１４０】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１４１】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１４２】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１４３】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用し、例えばスキュー変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体において）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合単量体において）、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側において）、両方の単量体において除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択で両側に４２８Ｌ／４３４Ｓ変異を利用する。
【０１４４】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｂのフォーマットで利用する。
【０１４５】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３からの可変重鎖および軽鎖配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１４６】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用する。
【０１４７】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｂのフォーマットで利用する。
【０１４８】
ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１４９】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよび図８７Ｂに示されるようなＩＬ−１５複合体（ｓｕｓｈｉドメインおよびＩＬ−１５）を利用する。
【０１５０】
Ｃ．ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｃに示されており、そして３つの単量体を含む。第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ｓｕｓｈｉドメインが操作されたシステイン残基を有し、第２の単量体は、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジを含み、いずれの方向でもよく、ドメインリンカーをヒンジの代わりに使用することができる。第３の単量体は、システイン変異アミノ酸を有するように操作されたＩＬ−１５ドメインであり、それにより、ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ−１５ドメインとの間にジスルフィド架橋を形成することが可能になる。これは一般に「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｄｓ」は「ジスルフィド」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７ＡおよびＢに見られる。
【０１５１】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１５２】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１５３】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、および図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１５４】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用し、例えばスキュー変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体において）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合単量体において）、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側において）、両方の単量体において除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択で両側に４２８Ｌ／４３４Ｓ変異を利用する。
【０１５５】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｂのフォーマットで利用する。
【０１５６】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１５７】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用する。
【０１５８】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｂのフォーマットで利用する。
【０１５９】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１６０】
Ｄ．ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ
この実施形態は図６４Ｄに示されており、そして３つの単量体を含む。第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の単量体は、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３の単量体は軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７Ｃに見られる。
【０１６１】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１６２】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるように、配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１６３】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用し、例えばスキュー変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体において）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合単量体において）、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側において）、両方の単量体において除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択で両側に４２８Ｌ／４３４Ｓ変異を利用する。
【０１６４】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｃのフォーマットで利用する。
【０１６５】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１６６】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１６７】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｃのフォーマットで利用する。
【０１６８】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｃのフォーマットで利用する。
【０１６９】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１７０】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８７Ａに示されるＩＬ−１５複合体の配列を利用する。
【０１７１】
ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよび図８７Ａに示されるようなＩＬ−１５複合体（ｓｕｓｈｉドメイン−リンカー−ＩＬ−１５）を利用する。
【０１７２】
Ｅ．Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｅに示されており、そして３つの単量体を含む。第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の単量体は、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３の単量体はＩＬ−１５ドメインである。これは一般に「Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」はＩＬ−１５とｓｕｃｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「非共有」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７Ｄに見られる。
【０１７３】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１７４】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１７５】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１７６】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１７７】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１７８】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１７９】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１８０】
Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１８１】
Ｆ．Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｆに示されており、そして３つの単量体を含む。第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ｓｕｓｈｉドメインがシステイン残基を含むよう操作されており、第２の単量体は、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３の単量体は、天然の細胞条件下でジスルフィド架橋が形成されるようにシステイン残基を有するように操作されたＩＬ−１５ドメインである。これは一般に「Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｄｓ」はＩＬ−１５とｓｕｃｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「ジスルフィド」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７に見られる。
【０１８２】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１８３】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１８４】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１８５】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１８６】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１８７】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１８８】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１８９】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｄのフォーマットで利用する。
【０１９０】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１９１】
Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８７Ｂに示されるＩＬ−１５複合体の配列を利用する。
【０１９２】
Ｇ．ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｇに示されており、そして３つの単量体を含む（融合タンパク質は四量体であるが）。第１の単量体は、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２の単量体は、ｓｃＩＬ−１５複合体を有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５を含む。第３（および第４）単量体は軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７に見られる。
【０１９３】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１９４】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１９５】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ａのフォーマットで利用する。
【０１９６】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｃのフォーマットで利用する。
【０１９７】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０１９８】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０１９９】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｃのフォーマットで利用する。
【０２００】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７Ｃのフォーマットで利用する。
【０２０１】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２０２】
ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８７Ａに示されるＩＬ−１５複合体の配列を利用する。
【０２０３】
Ｈ．ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｈに示されており、そして４つの単量体を含む（ヘテロ二量体融合タンパク質は五量体であるが）。第１の単量体は、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２の単量体は、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメインを有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメインを含む。第３の単量体はＩＬ−１５ドメインである。第４（および第５）単量体は軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７に見られる。
【０２０４】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２０５】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２０６】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２０７】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２０８】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２０９】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２１０】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２１１】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２１２】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２１３】
Ｉ．ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｉに示されており、そして４つの単量体を含む（ヘテロ二量体融合タンパク質は五量体であるが）。第１の単量体は、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２の単量体は、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメインを有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメインを含み、ｓｕｓｈｉドメインがシステイン残基を含むように操作されている。第３の単量体は、ＩＬ−１５複合体が生理学的条件下で形成されるようにシステイン残基を含むように操作されたＩＬ−１５ドメインである。第４（および第５）単量体は軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７に見られる。
【０２１４】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２１５】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２１６】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２１７】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２１８】
ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２１９】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用し、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２２０】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２２１】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２２２】
ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２２３】
Ｊ．中央−ＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｊに示されており、そして四量体を形成する４つの単量体を含む。第１の単量体は、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＩＬ−１５−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第２の単量体は、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｓｕｓｈｉドメイン−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第３（および第４）単量体は軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「中央−ＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７に見られる。
【０２２４】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２２５】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２２６】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２２７】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２２８】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２２９】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２３０】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２３１】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１  ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２３２】
中央−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい態様は、図８６に示されるようにＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２３３】
Ｋ．中央ｓｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図６４Ｋに示されており、そして四量体を形成する４つの単量体を含む。第１の単量体は、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第２の単量体は、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３（および第４）単量体は軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。この実施形態のための変異の好ましい組み合わせは、図７に見られる。
【０２３４】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキュー変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２３５】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２３６】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２３７】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示すような配列１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２３８】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２３９】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１  ＡＢＤおよびスキューバ変異対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。
【０２４０】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２４１】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１４に示されるような配列１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３Ｌ３を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを図７のフォーマットで利用する。
【０２４２】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８６に示されるようなＦｖ配列を有する抗ＰＤ−１ＡＢＤを利用する。
【０２４３】
中央−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図８７ＡのｓｃＩＬ−１５複合体の配列を利用する。
【０２４４】
Ｖ．ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合単量体
本発明の二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）−Ｆｃ融合単量体を含み、本出願と同時に２０１７年１０月１６日に出願された、「ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα  ＨＥＴＥＲＯＤＩＭＥＲＩＣ  ＦＣ−ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」という名称の米国特許出願、ならびに２０１６年１０月１４日出願の米国特許出願第６２／４０８，６５５号、２０１７年１月６日出願の同第６２／４４３，４６５号、および２０１７年３月２８日出願の同第６２／４７７，９２６号を参照し、それらの全ては、特にそれらに概説された配列について、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの場合では、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）タンパク質ドメインは異なる向きにある。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合単量体の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２１４８０（鎖１、図６４Ａ）、ＸＥＮＰ２２０２２（鎖１、図６４Ｄ）、ＸＥＮＰ２２１１２（鎖１および３、図６４Ｅ）、ＸＥＮＰ２２６４１（鎖２および４、図６４Ｆ）、ＸＥＮＰ２２６４２（鎖１および４、図６４Ｈ）、ならびにＸＥＮＰ２２６４４（鎖１および４、図６４Ｉ）に提示される。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ−１５タンパク質は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０００５７６．１または配列番号１で記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの場合では、ヒトＩＬ−１５のコード配列は、ＮＣＢＩ基準配列番号Ｎｏ．ＮＭ＿０００５８５に示される。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロ二量体タンパク質の例示的なＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸４９〜１６２を有し得る。いくつかの態様において、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９０％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびアミノ酸置換Ｎ７２Ｄを有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列ならびにＣ４２Ｓ、Ｌ４５Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ｖ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｅ５３Ｃ、Ｅ８７Ｃ、およびＥ８９Ｃからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、ＩＬ１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、アミノ酸置換はＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換はＱ１０８Ｅである。特定の実施形態では、アミノ酸置換はＮ６５Ｄである。他の実施形態では、アミノ酸置換はＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄである。特定の実施形態では、アミノ酸置換はＮ６５Ｄである。いくつかの事例においては、アミノ酸置換はＮ１Ｄ／Ｎ６５Ｄである。任意選択で、ＩＬ−１５タンパク質はまたＮ７２Ｄ置換を有する。Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ−１５タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を有することができる。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）タンパク質は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿００２１８０．１または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの場合では、ヒトＩＬ−１５Ｒαのコード配列は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿００２１８９．３に示される。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロ二量体タンパク質の例示的なＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３のｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号３のアミノ酸３１〜９５）、換言すると配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列ならびにＤ９６、Ｐ９７、Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７、Ｄ９６／Ｃ９７、Ｄ９６／Ｐ９７／Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、およびＤ９６／Ｃ９７／Ａ９８からなる群から選択されるアミノ酸挿入を有し、ここで、アミノ酸位置は全長ヒトＩＬ−１５Ｒαタンパク質または配列番号３に対するものである。例えば、Ｄ（例えばＡｓｐ）、Ｐ（例えばＰｒｏ）、Ａ（例えばＡｌａ）、ＤＰ（例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ）、ＤＣ（例えばＡｓｐ−Ｃｙｓ）、ＤＰＡ（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ＤＰＣ（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ）、またはＤＣＡ（例えば、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ）のようなアミノ酸は、配列番号４のＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＣ末端に付加され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列ならびにＫ３４Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｇ３８Ｃ、Ｓ４０Ｃ、およびＬ４２Ｃからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、ここでアミノ酸位置は配列番号４に対するものである。ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入および／または欠失）を有することができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に結合している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質に非共有結合している。さらに他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＦｃドメインのＣ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質に非共有結合している。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質はリンカーを介して共に結合している（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」）。任意選択で、タンパク質はリンカーを介して結合せず、本明細書に概説されるように天然の自己集合またはジスルフィド結合のいずれかを利用する。他の態様において、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。いくつかの態様において、ＩＬ−１５タンパク質はリンカーを介してＦｃドメインに結合している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はリンカーを介してＦｃドメインに結合している。任意選択で、リンカーは、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質をＦｃドメインに結合するためには使用されない。
【０２４９】
いくつかの場合では、ＰＤ−１ＡＢＤはドメインリンカーなどのリンカーを介してＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを共に連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（および一般に１〜２〜３〜４〜５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。いくつかの場合において、以下に概説するように「撚り度」に注意が払われて、荷電ドメインリンカーは、本明細書において論議されそして図４Ａ〜４Ｂに示されるように使用され得る。
【０２５１】
ＶＩ．ＰＤ−１抗体単量体
ＰＤ−１のような免疫のチェックポイント阻害剤に対する治療用抗体は、癌治療のための診療所における限られた状況で非常に有望である。癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力がないものと考えることができる。多くの場合、これらの形質転換した（例えば、癌性）細胞は、免疫監視に反作用する。体内でのＴ細胞活性化を制限して無制限なＴ細胞活性を予防する天然の制御機構が存在し、これを、癌性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免疫療法」と称されることがある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、およびＯｐｄｉｖｏなどのＴ細胞チェックポイント阻害抗体が、いくつかの最近承認されたものである。これらの抗体は、それらがＴ細胞性免疫の通常は負の調節因子を遮断するため、一般に「チェックポイント阻害剤」と称される。共刺激性と共抑制性の両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合することができると一般に理解されている。
【０２５２】
一般的に、これらのモノクローナル抗体は、通常の状況下では細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を予防または抑制する、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１のようなチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する。チェックポイントタンパク質を、例えば、これらのタンパク質に結合する抗体の使用を介して、阻害することにより、腫瘍に対する増加したＴ細胞応答を達成することができる。つまり、これらの癌チェックポイントタンパク質は免疫応答を抑制し、このタンパク質が、例えばチェックポイントタンパク質に対する抗体を使用して遮断されるとき、免疫系が活性化され、免疫刺激を誘導し、その結果、癌および感染性疾患などの状態の治療をもたらす。
【０２５３】
本発明は、ＰＤ−１およびＩＬ−２Ｒβおよび共通のガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）を発現する細胞に結合する二重特異性ヘテロ二量体タンパク質の生成に関する。二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、免疫チェックポイント抗原に結合することができる任意の有用な抗体フォーマットの抗体単量体を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体単量体は、Ｆｃドメインに連結したＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。いくつかの場合において、ＰＤ−１抗体単量体は抗ＰＤ１（ＶＨ）−ＣＨ１−Ｆｃおよび抗ＰＤ−１ＶＬ−Ｃκを含む。いくつかの場合において、ＰＤ−１抗体単量体は抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。そのような抗体断片の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２１４８０（鎖２、図６４Ａ）、ＸＥＮＰ２２０２２（鎖２および３、図６４Ｄ）、ＸＥＮＰ２２１１２（鎖１および４、図６４Ｅ）、ＸＥＮＰ２２６４１（鎖１および３、図６４Ｆ）、ＸＥＮＰ２２６４２（鎖１〜３、図６４Ｈ）、およびＸＥＮＰ２２６４４（鎖１〜３、図６４Ｉ）に提示される。
【０２５４】
ＡＢＤは、ＦａｂフォーマットまたはｓｃＦｖフォーマットなどの様々なフォーマットであり得る。本発明で使用するための例示的なＡＢＤはＵＳ６２／３５３，５１１に開示されており、その内容は全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
ＰＤ−１に結合する適切なＡＢＤは、ＵＳ６２／３５３，５１１の図１１および１２、ならびに本明細書の図１３および１４に概説されているものに示されている。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、上述されるような、異なる付番スキームが使用される場合、ＵＳ６２／３５３，５１１の図１１および１２のｖｈおよびｖｌの配列内の他の整合を使用して同定されるＣＤＲかのいずれかとして、これらの図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。特定のｓｃＦｖ配列は、特定の荷電リンカーと共に、ＵＳ６２／３５３，５１１の図１１に示されているが、図７に示されているものなどの他のリンカーも使用することができる。ＰＤ−１に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＰＤ−１に結合するのはｓｃＦｖ単量体である。ＵＳ６２／３５３，５１１では、図１１は好ましいｓｃＦｖ配列を示し、図１２は適切なＦａｂ配列を示すが、本明細書で論じるように、ｖｈおよびｖｌはいずれかの構成でも使用できる。
【０２５６】
さらに、本発明の抗体は、本明細書に概説した抗原結合ドメインと同一のエピトープに結合するか、または本明細書に概説した抗原結合ドメインとの結合について競合するかのいずれかのものを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイント抗体は、本明細書で概説したＡＢＤのうちの１つと、本明細書で概説したＡＢＤのうちの１つと結合について競合する第２のＡＢＤを含み得る。いくつかの実施形態では、両方のＡＢＤが、本明細書で概説した対応するＡＢＤとの結合について競合する。結合の競合は一般に、本明細書に概説されるようにＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて決定される。
【０２５７】
Ｂ．抗体
以下で考察するように、「抗体」という用語は全般的に使用される。本発明で使用される抗体は、本明細書に記載されているようにいくつかのフォーマットをとることができ、本明細書に記載され図に示される従来の抗体、および抗体誘導体、断片および模倣物を含む。本発明は、チェックポイント抗原結合ドメインおよびＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、抗体融合タンパク質は、本明細書に記載のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合タンパク質と二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を形成する。他の実施形態では、抗体融合タンパク質は、チェックポイント抗原結合ドメインおよびＦｃドメインを含む別の抗体融合タンパク質と二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を形成する。そのような二重特異性ヘテロ二量体タンパク質の例示的な実施形態には、ＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、ＸＥＮＰ２２１１２、ＸＥＮＰ２２６４１、ＸＥＮＰ２２６４２、およびＸＥＮＰ２２６４４が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５８】
従来の抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。各四量体は、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量）と、１本の「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量）とを有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。本発明は、一般にＩｇＧクラスに基づく抗体または抗体断片（抗体単量体）を対象とし、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に図示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。
【０２５９】
さらに、本明細書中の配列の多くは、位置２２０の少なくとも１つのシステインをセリンで置換したものであり、これは一般に、本明細書に記載の配列の大部分について「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂ単量体」側、またはその両方にすることもできる。本明細書中の配列内に具体的に含まれるのは、これらのシステインの一方または両方が置換されたもの（Ｃ２２０Ｓ）である。
【０２６０】
したがって、本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。たとえば、米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ工学を包含し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６１】
各鎖のアミノ末端部分は、「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」として当該技術分野および本明細書では一般に称される、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖および軽鎖のＶドメインの各々について３つのループが集約されて、抗原結合部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域（これ以降「ＣＤＲ」と称される）と称され、ここではアミノ酸配列における変形が最も顕著である。「可変」は、可変領域のある特定のセグメントが抗体間で配列において大きく異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。その代わり、Ｖ領域は、各々が９〜１５アミノ酸長またはそれ以上長い「超可変領域」と称される極可変性のより短い領域によって隔てられた１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の区間からなる。
【０２６２】
各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で配列された３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）および４つのＦＲで構成される。
【０２６３】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそ、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を包含する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。
【０２６４】
当業者には理解されようが、ＣＤＲの正確な付番および配置は、異なる付番系間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重鎖領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽鎖領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。
【０２６５】
ＣＤＲ付番の有用な比較は以下の通りであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。
【表１】
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【０２６６】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上述（１９９１））。
【０２６７】
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖および３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽または可変重鎖ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重鎖および可変軽鎖のドメインは、重鎖および軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【０２６８】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。
【０２６９】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。
【０２７０】
エピトープは、立体配座または直線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。
【０２７１】
エピトープは、典型的には、固有の空間立体配座内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された抗原結合ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。
【０２７２】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定める。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【０２７３】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧと関連して「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って３４１〜４４７位を指す。本明細書において示され、以下に記載されるように、ｐＩ変異は、ＣＨ領域、および以下に論じられるように、ヒンジ領域のうちの１つ以上に存在し得る。
【０２７４】
重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１および第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３７で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、位置２２１（ＩｇＧ１中のＤ２２１）から２３６（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含むように本明細書で定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に関連して、下側ヒンジが含まれ、「下側ヒンジ」は一般に位置２２６または２３０を指す。本明細書に記載のように、ｐＩ変異はヒンジ領域にも同様に作製することができる。
【０２７５】
軽鎖は、一般に、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重鎖ドメインと一緒にＦｖ領域を形成する）、および定常軽鎖領域（しばしばＣＬまたはＣκと称される）の２つのドメインを含む。
【０２７６】
上に概説される追加の置換のための別の目的とする領域は、Ｆｃ領域である。
【０２７７】
したがって、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書中に記載され、そして当該技術分野において既知であるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。
【０２７８】
したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、および任意選択でヒンジドメインを含む。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合しているとき、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはｓｃＦｖコンストラクトのＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。重鎖は、可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含み、これは、ＣＨ１−任意選択のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むＦｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽鎖定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽鎖ドメインを含む。本明細書に概説したコンストラクトおよび配列のほとんどにおいて、可変軽鎖のＣ末端はｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は可変重鎖のＮ末端に結合している（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、これは切り替えることができる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。
【０２７９】
本発明のいくつかの実施形態は、天然には存在しないが、ｓｃＦｖリンカーによって共に結合した可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを一般に含む、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含む。本明細書に概説されるように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬとしてＮ末端からＣ末端に向かう向きとされているが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のＶＨおよびＶＬ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、フォーマットに応じて一方または両方の端部に任意選択のリンカーを用いて、ＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨへと逆転させることができる（全体的にＵＳ６２／３５３，５１１の図４Ａ〜４Ｂを参照）。
【０２８０】
本明細書に示されるように、組換え技術によって生成される従来のペプチド結合を含めて、使用され得る好適なｓｃＦｖリンカーは、ある数存在する。リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５〜約１０アミノ酸が有用である。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１（および一般に３〜４）の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得、すなわちリンカーとして有用であり得る。
【０２８１】
他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含まない場合があり、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを共に連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（および一般に３〜４〜５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。いくつかの場合において、以下に概説するように、「撚り度」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるような荷電ドメインリンカーを使用することができる。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかはＵＳ６２／３５３，５１１の図４Ａに示されている。したがって、本発明はさらに、第１の単量体と第２の単量体（例えば、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα単量体とＰＤ−１ＡＢＤ単量体）との間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーを提供する。すなわち、正または負のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカー（または異なる単量体上にｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、これは、Ｆｃドメインをさらに変化させることなく、荷電リンカーを含む単量体のｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者には理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書中で論じられるように、トリプルＦフォーマットヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインの各々についてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。
【０２８４】
荷電ドメインリンカーも同様に、本発明の単量体のｐＩ分離を増加させるために使用することができ、したがって、図４Ａに含まれるものは、リンカーが利用される、本明細書の任意の実施形態で使用することができる。
【０２８５】
一実施形態では、抗体は、それがｐＩ工学などのヘテロ二量体を生成するように操作することができる少なくとも１つの定常ドメインを含む限り、抗体断片である。使用され得る他の抗体断片は、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジおよびＣＬドメインのうちの１つ以上を含む断片を含む。特に、図８Ａ〜８Ｃおよび１６Ａ〜１６Ｃに示すフォーマットは、「ヘテロ二量体抗体」または「二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己集合した少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、およびＦａｂとしてまたはｓｃＦｖとしてであれ少なくとも１つのＦｖ領域を有することを意味する。
【０２８６】
Ｃ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、異なる種由来の混合物、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体に由来し得る。一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は伝統的に、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に見出される配列でスワップされた、非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてかかる抗体と同一である。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部または全てがコードされるＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークにグラフティングして、その特異性がグラフティングされたＣＤＲによって決定される抗体を作製する。かかる抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載され、全て参照により全体が組み込まれる。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「逆変異」が、最初の移植されたコンストラクトにおいて失われた親和性を回復するためにしばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３、全て参照により全体が組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、通常は全部を含み、したがって典型的にはヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて生成され得る。Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４、参照により全体が本明細書に組み込まれる。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技法および方法は、当該技術分野で周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそこで引用される参考文献を参照されたく、全て参照により全体が組み込まれる）。ヒト化方法には、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；  Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３；  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：  １０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１���９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９、Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１−８に記載される方法が含まれ、全て参照により全体が組み込まれる。ヒト化、または非ヒト抗体の可変領域の免疫原性を低下させる他の方法には、例えば、参照により全体が組み込まれるＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３に記載されているような表面再構成法が含まれ得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、かかる抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（すなわち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって、そのようなものとして特定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０アミノ酸以下の相違しか示さない（本明細書中の任意のスキュー、ｐＩおよび除去変異の導入前、すなわち、本発明の変異の導入前は、変異の数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５アミノ酸以下、またはさらには４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の相違しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキュー、ｐＩ、および除去変異の導入前、すなわち、本発明の変異の導入前は、変異の数は一般に少ない）。一実���形態では、親抗体は、当該技術分野で知られているように、親和性成熟されたものである。構造に基づく方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載される方法を含むがこれらに限定されない選択に基づく方法が抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟のために使用でき、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみを移植することを含み得、これには、参照により全ての内容が組み込まれる、ＵＳＳＮ  ０９／８１０，５１０；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；  Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法が含まれるがこれらに限定されない。
【０２８７】
ＶＩＩ．本発明の有用な実施形態
本発明は、融合タンパク質と抗体融合タンパク質とを含む二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を提供する。融合タンパク質は、第１のタンパク質ドメイン、第２のタンパク質ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む。いくつかの場合では、第１のタンパク質ドメインが第１のドメインリンカーを用いて第２タンパク質ドメインのＮ末端に共有結合し、第２のタンパク質ドメインが第２のドメインリンカーを用いて第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含む。抗体融合タンパク質はＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第２のＦｃドメインを含み、ＰＤ−１抗原結合ドメインが第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、ＰＤ−１抗原結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である。いくつかの実施形態において、第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの例では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むさらなるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの場合では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮化ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する。ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し得る。
【０２８９】
いくつかの実施形態において、上記ＰＤ−１抗原結合ドメインは抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質が配列番号ＸＸ（１６４７８）のポリペプチド配列を有し、上記ＰＤ−１抗原結合ドメインの上記Ｆａｂが配列番号ＸＸ（１４８３３）および配列番号ＸＸ（１４８１２）のポリペプチド配列を有する。他の実施形態において、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、ＸＥＮＰ２１４８０、ＸＥＮＰ２２０２２、または図８Ａ、８Ｂ、１３、および１４に示されるものであり得る。
【０２９１】
本明細書に記載の融合タンパク質または抗体融合タンパク質をコードする核酸組成物も提供される。いくつかの例において、発現ベクターは本明細書に記載の１つ以上の核酸組成物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で概説した１つまたは２つの発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０２９２】
本発明はまた、融合タンパク質、融合タンパク質の第１のタンパク質ドメインに非共有結合している第２のタンパク質、抗体融合タンパク質を含む二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む。第１のタンパク質ドメインは、ドメインリンカーを用いて第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合させることができ、第１のタンパク質ドメインは、配列番号３または４のものなどのＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含むことができる。いくつかの場合では、上記第１のタンパク質ドメインに非共有結合している第２のタンパク質ドメインは、ＩＬ−１５タンパク質（配列番号１）またはＩＬ−１５タンパク質の断片（配列番号２）を含む。ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、抗体融合タンパク質はＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第２のＦｃドメインを含む。いくつかの例において、ＰＤ−１抗原結合ドメインは第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。ＰＤ−１抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片であり得る。いくつかの場合において、ＰＤ−１抗原結合ドメインは抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含む。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの例では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むさらなるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの場合では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１６４８１）のポリペプチド配列を有する融合タンパク質、配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１６４８４）のポリペプチド配列を有する第２のタンパク質ドメイン、ならびに配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１４８３３）および配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１４８１２）のポリペプチド配列を有するＰＤ−１抗原結合ドメインのＦａｂを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１７５８４）のポリペプチド配列を有する融合タンパク質、配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１７０７４）のポリペプチド配列を有する第２のタンパク質ドメイン、ならびに配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１４８３３）および配列番号ＸＸ（ＸＥＮＰ１４８１２）のポリペプチド配列を有するＰＤ−１抗原結合ドメインのＦａｂを含む。いくつかの場合では、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、ＸＥＮＰ２２１１２、ＸＥＮＰ２２６４１、および図６４Ａ〜６４Ｋに示されているものからなる群から選択される。
【０２９６】
本明細書に記載の融合タンパク質、第２のタンパク質ドメイン、および／または抗体融合タンパク質をコードする核酸組成物も提供される。いくつかの例において、発現ベクターは本明細書に記載の１つまたは２つまたは３つの核酸組成物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で概説した１つまたは２つまたは３つの発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０２９７】
本発明はまた、第１の抗体融合タンパク質、第２の抗体融合タンパク質、および第２の抗体融合タンパク質の第１のタンパク質ドメインに非共有結合している第２のタンパク質ドメインを含む二重特異性ヘテロ二量体タンパク質を提供する。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、第１の抗体融合タンパク質は、第１のＰＤ−１抗原結合ドメインが第１のドメインリンカーを介して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合するようにされている第１のＰＤ−１抗原結合ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む。第１のＰＤ−１抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片であり得る。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、第２の抗体融合タンパク質は、第２のＰＤ−１抗原結合ドメインが第２のドメインリンカーを介して第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合するようにされている第２のＰＤ−１抗原結合ドメイン第２のＦｃドメイン、および第１のタンパク質ドメインを含む。第１タンパク質ドメインは、第３ドメインリンカーを介して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合することができる。いくつかの例において、第２のＰＤ−１抗原結合ドメインは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片である。第１のタンパク質ドメインは、配列番号３または４に記載のタンパク質などのＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み得る。
【０３００】
いくつかの実施形態では、第２のタンパク質ドメインは第２の抗体融合タンパク質の第１のタンパク質ドメインに非共有結合しており、そのような第２のタンパク質ドメインはＩＬ−１５タンパク質、例えば配列番号１または２に記載のタンパク質を含む。
【０３０１】
ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し得る。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、二重特異性ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／ＬＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの例では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むさらなるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの場合では、第１および／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番に従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。
【０３０３】
第１の抗体融合タンパク質の第１のＰＤ−１抗原結合ドメインは、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含み得る。第２の抗体融合タンパク質の第２のＰＤ−１抗原結合ドメインは、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたは抗ＰＤ−１Ｆａｂを含み得る。
【０３０４】
いくつかの場合では、本発明の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、配列番号ＸＸ（１７５９９）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有する第１の抗体融合タンパク質、配列番号ＸＸ（１６４７８）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有する第２の抗体融合タンパク質、ならびに配列番号ＸＸ（１６４８４）のポリペプチド配列を有する第２のタンパク質ドメインを含む。他の例において、本発明の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、配列番号ＸＸ（１７６０１）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有する第１の抗体融合タンパク質、配列番号ＸＸ（９０１８）および配列番号ＸＸ（９０１６）のポリペプチド配列を有する第２の抗体融合タンパク質、ならびに配列番号ＸＸ（１７０７４）のポリペプチド配列を有する第２のタンパク質ドメインを含む。二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、ＸＥＮＰ２２６４２またはＸＥＮＰ２２６４４、または図１６Ｂ、１６Ｃ、１８、および１９に示すものであり得る。
【０３０５】
ＶＩＩＩ．本発明の核酸
本発明はさらに、本発明の二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質をコードする核酸組成物（または、単量体Ｆｃドメインタンパク質の場合はそれらをコードする核酸）も提供する。
【０３０６】
当業者には理解されるように、核酸組成物は二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質のフォーマットに依存するだろう。したがって、例えば、フォーマットが３つのアミノ酸配列を必要とするとき、３つの核酸配列を発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかのフォーマットは２つの核酸のみを必要とし、同様に、それらを１つまたは２つの発現ベクターに組み込むことができる。
【０３０７】
当該技術分野において既知であるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、当該技術分野において既知であるように、そして本発明の二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞に応じた発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。
【０３０８】
次いで、本発明の核酸および／または発現ベクターを、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または真菌細胞を含む当該技術分野で周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に形質転換するが、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）が、多くの実施形態において使用される。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、各単量体をコードする核酸は、フォーマットに応じて適用可能なように、各々一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸の各々は異なる発現ベクターに含まれる。
【０３１０】
本発明の二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質は、当該技術分野において周知のように、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦製造されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の融合タンパク質または抗体精製工程が実施される。本明細書で論じるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）が異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するようになるように各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含むことによって、ヘテロ二量体の等電点精製（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）を促進する。これらの置換はまた、精製後の任意の混入したホモ二量体の特定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。
【０３１１】
ＩＸ．二重特異性免疫チェックポイント抗体×ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロ二量体免疫調節融合タンパク質の生物学的および生化学的機能性
一般に、本発明の二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質は、癌を有する患者に投与され、そして有効性は、本明細書中に記載されるようないくつかの方法で評価される。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価などの、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて同様に評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で実施することができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、ＬＮ関与、転移などといった「古典的な」測定と併せて、免疫状態（例えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を実施することができる。このため、以下のいずれかまたは全てを評価することができる：ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性活性および／もしくはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介性細胞枯渇に対するＰＶＲＩＧの抑制効果、Ｔｒｅｇ細胞分化および増殖ならびにＴｒｅｇ細胞もしくは骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するＰＶＲＩＧの増強効果、ならびに／または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−α産生に対するＰＶＲＩＧの影響。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン取り込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価することによって実施される。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパク質レベルを評価することによって実施される。
【０３１４】
一般に、遺伝子発現アッセイは、当該技術分野で知られているように実施される。
【０３１５】
一般に、タンパク質発現測定も同様に、当該技術分野で知られているように実施される。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性などの多数の細胞パラメーターを推測することを通した標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性活性を評価することによって実施される。これらのアッセイの具体的な例としては、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、細胞内、培養上清液中のいずれかで測定する。
【０３１８】
したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる：（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβおよび／またはγδのＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性を減少させるかまたは排除すること。
【０３１９】
Ａ．有効性を測定するためのアッセイ
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、当該技術分野において既知のように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、標的細胞、例えば癌細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、標的細胞、例えば癌細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、ＣＤ１０７ａなどのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＮＫおよび／またはＮＫＴの細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδのＴ細胞の抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定される炎症促進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるインターフェロンγ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３２９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ２応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３３０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３３１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるＭ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３３２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＭ２マクロファージ腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３３３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるＮ２好中球増加の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３３４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３３５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３３６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、標的細胞、例えば癌細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＣＴＬ活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３３７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例として活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβおよび／またはγδのＴ細胞枯渇の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３３８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδのＴ細胞の応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３３９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。。
【０３４０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、癌細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３４１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、癌細胞の細胞傷害性または細胞増殖抑制性の効果の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３４２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、癌細胞の直接的な殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３４３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３４４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、補体依存性細胞傷害性および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３４５】
一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、標的細胞、例えば癌細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。Ｔ細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）の増加が、癌細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となり得る。
【０３４６】
一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、標的細胞、例えば癌細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばＣＤ１０７ａなどのような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞については、増殖、細胞傷害性（標的細胞を殺傷し、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現を増加させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加が、癌細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となり得る。
【０３４７】
一実施形態では、γδのＴ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０３４８】
一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０３４９】
活性または応答の適切な増加（または減少、上で概説したように適切なもの）は、基準試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体を含まない試験試料におけるシグナルと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様に、基準対象または対照試料と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍または５倍の増加が有効性を示す。
【０３５０】
Ｘ．治療
一旦製造されると、本発明の組成物は、一般に本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の結合によって、一般にＴ細胞活性化を促進すること（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）によって癌を治療することによって、いくつかの腫瘍学用途に使用される。
【０３５１】
したがって、本発明の二重特異性ヘテロ二量体組成物はこれらの癌の治療に使用される。
【０３５２】
Ａ．インビボ投与のための二重特異性ヘテロ二量体タンパク質組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度の抗体を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に一般に概説されるような）と混合することによって、保存のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に概説されるように）。許容される担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０３５３】
Ｂ．投与様式
本発明の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈内投与またはある期間にわたる持続注入などの既知の方法に従って対象に投与される。
【０３５４】
Ｃ．治療法
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。
【０３５５】
任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評定され得る。
【０３５６】
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
【０３５７】
本発明に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量および期間で有効な量をいう。
【０３５８】
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれの毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
【０３５９】
腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。
【０３６０】
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、化合物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を検査することによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０３６１】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０３６２】
本発明の単位剤形形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。
【０３６３】
本発明で使用される二重特異性抗体の効率的な投薬量および投薬レジメンは、治療される疾患または病状に依存し、当業者によって決定され得る。
【０３６４】
本発明で使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的かつ非限定的な範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０３６５】
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。
【０３６６】
本発明の特定の実施形態を例示の目的で上述のように説明したが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく詳細の多数の変形をなし得ることが当業者には理解されよう。
【実施例】
【０３６７】
本発明を説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作理論に限定することを意味するものではない。本発明で論じられる全ての定常領域位置について、付番は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照により全体が組み込まれる）と同様のＥＵインデックスに従う。抗体の技術分野の当業者は、この規則が免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的な付番からなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置への標準的な基準を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は必ずしもその連続配列に対応しない。
【０３６８】
一般的および具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、およびＷＯ２０１４／１４５８０６に概説されており、それらの全ては、特にその中に概説されている技術に関して、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。２０１６年１１月１日に出願された米国特許出願第６２，４１６，０８７号の実施例１および２は、対応する図も含めて、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。
【０３６９】
ＸＩ．実施例１：抗ＰＤ−１ＡＢＤ
Ａ．１Ａ：例示的な抗ＰＤ−１ＡＢＤ
ＰＤ−１に結合する抗体の例は、その例示的な配列が図１３Ａ〜１３Ｅに示されるＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価のＩｇＧ１フォーマットで生成された。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣκ定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。追加のＰＤ−１ＡＢＤ（上記の抗体由来のものを含む）を本発明のＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質に使用するためにＦａｂおよびｓｃＦｖとしてフォーマットし、その例示的な配列をそれぞれ図１４Ａ〜１４Ｅおよび配列表に示す。
【０３７０】
Ｂ．１Ｂ：抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の生成
１．１Ｂ（ａ）：抗ＰＤ−１ハイブリドーマの生成とスクリーニング
本発明のＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質のためのさらなるＰＤ−１標的化アームを開発するために、モノクローナル抗体を、それらの標準法およびラピッドプライム法によって、ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅを介してハイブリドーマ技術によって最初に作成した。標準法では、抗原を３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。ハイブリドーマ生成のために犠牲にされる７〜１０日前に、免疫されたマウスは抗原追加免疫を受けた。抗体力価を抗原に対するＥＬＩＳＡによって評価し、そして最も応答のよいマウスを融合のために選択する。最後の抗原追加免疫は融合の４日前に与えられる。マウス由来のリンパ球をプールし、精製し、次いでＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。融合細胞をＨＡＴ選択的シングルステップクローニング培地上で１０〜１２日間増殖させ、その時点でハイブリドーマはスクリーニングの準備ができていた。ラピッドプライム法では、抗原を３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。１９日後、全てのマウス由来のリンパ球をプールし、精製し、次いでＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。融合細胞をＨＡＴ選択的シングルステップクローニング培地上で１０〜１２日間増殖させ、その時点でハイブリドーマはスクリーニングの準備ができていた。使用した抗原は、ヒトＰＤ−１のマウスＦｃ融合体（ｈｕＰＤ−１−ｍＦｃ）、カニクイザルＰＤ−１のマウスＦｃ融合体（ｃｙｎｏＰＤ−１−ｍＦｃ）、Ｈｉｓタグ付きヒトＰＤ−１（ｈｕＰＤ−１−Ｈｉｓ）、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＰＤ−１（ｃｙｎｏＰＤ−１−Ｈｉｓ）またはそれらの混合物であった。
【０３７１】
上述のようにして生成した抗ＰＤ−１ハイブリドーマクローンを、Ｏｃｔｅｔ、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法を用いて２回のスクリーニングにかけた。Ｏｃｔｅｔの実験工程は、一般的に以下を含んでいた：固定化（バイオセンサー上へのリガンドまたは試験試料の捕捉）、会合（対応する試験試料またはリガンドの連続希釈物を含むウェルへのリガンドまたは試験試料をコーティングしたバイオセンサーの浸漬）、試験試料の親和性を決定するための解離（緩衝液を含むウェルにバイオセンサーを戻すこと）。緩衝液のみを含む基準ウェルもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。
【０３７２】
１回目のラウンドでは、抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）バイオセンサーを用いてクローンを５００ｎＭの二価ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１−Ｆｃ−Ｈｉｓに浸漬して捕捉した。２回目のラウンドでは、１回目のラウンドで同定された、ヒトとカニクイザルのＰＤ−１の両方に陽性のクローンをＡＭＣバイオセンサーに捕捉し、５００ｎＭの一価ヒトとカニクイザルのＰＤ−１−Ｈｉｓに浸した。
【０３７３】
２．１Ｂ（ｂ）：クローン１Ｃ１１の分析
実施例１Ｂ（ａ）で同定された１つのハイブリドーマクローンはクローン１Ｃ１１であった。ハイブリドーマクローン１Ｃ１１のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターｐＴＴ５に標準的な分子生物学技術を用いてサブクローニングしてＸＥＮＰ２１５７５を生成し、その配列を図１５に示す。
【０３７４】
ａ．１Ｂ（ｂ）（ｉ）：クローン１Ｃ１１によるＰＤ−Ｌ１遮断
チェックポイント受容体／リガンド相互作用の遮断はＴ細胞活性化に必要である。細胞結合アッセイにおいてＸＥＮＰ２１５７５の遮断能力を調べた。ＰＤ−１を発現するようにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＸＥＮＰ２１５７５、および対照抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、ＰＤ−Ｌ１のマウスＦｃ融合体を添加してインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの結合を抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出し、そのデータを図１６に示す。
【０３７５】
ｂ．１Ｂ（ｂ）（ｉｉ）：クローン１Ｃ１１のＴ細胞表面結合
Ｔ細胞への抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の結合をＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで測定した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、ＰＤ−１などのチェックポイント受容体の発現を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化によって達成されるのと同様にＴ細胞の活性化および増殖を引き起こす超抗原である。ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬで３日間刺激した。刺激後、ＰＢＭＣを示された濃度の指示された試験試料と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１）およびヒト免疫グロブリンκ軽鎖に対するＡＰＣ標識抗体で染色した。ＦＩＴＣ＋細胞上のＡＰＣ  ＭＦＩによって示されるような試験試料のＴ細胞への結合を図１７に示す。
【０３７６】
ｃ．１Ｂ（ｂ）（ｉｉｉ）：クローン１Ｃ１１によるＴ細胞活性化
サイトカイン分泌によって示されるように、クローン１Ｃ１１によるＴ細胞活性化を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて調べた。ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで細胞を培地中で２回洗浄し、示された試験試料の示された量と組み合わせた５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２４時間刺激した。次いで上清を細胞によってＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイし、そのデータを図１８に示す。
【０３７７】
３．１Ｂ（ｃ）：クローン１Ｃ１１のヒト化
クローン１Ｃ１１は、ストリング含有量最適化を用いてヒト化した（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号を参照）。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。二価抗体フォーマットのクローン１Ｃ１１の例示的ヒト化変異体の配列を図１９に示す。クローン１Ｃ１１のさらなるヒト化変異体の配列は、図および配列表においてＸＥＮＰ２２５４３、ＸＥＮＰ２２５４４、ＸＥＮＰ２２５４５、ＸＥＮＰ２２５４６、ＸＥＮＰ２２５４７、ＸＥＮＰ２２５４８、ＸＥＮＰ２２５４９、ＸＥＮＰ２２５５０、ＸＥＮＰ２２５５１、ＸＥＮＰ２２５５２、およびＸＥＮＰ２２５５４として列挙されている。
【０３７８】
ＸＥＮＰ２２５５３の親和性は、概して実施例１Ｂ（ａ）に記載されているように、Ｏｃｔｅｔを用いて決定した。特に、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用して、試験試料を複数濃度のヒスチジンタグ付きＰＤ−１に浸漬して捕捉した。親和性の結果および対応するセンサーグラムを図２０に示す。
【０３７９】
ＸＩＩ．実施例２：ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ
Ａ．２Ａ：ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の操作
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロ二量体の短い半減期に対処するために、本発明者らは、産生の促進および複合体のＦｃＲｎ媒介リサイクルの促進および半減期の延長を目的として、Ｆｃ融合体としてＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体（以下、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体と呼ぶ）を生成した。
【０３８０】
ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインをコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナーを含むｐＴＴ５発現ベクター（例えば、図１０Ａ〜１０Ｄに示す定常領域）へのサブクローニングによって構築した。例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質フォーマットの漫画の概略図を図２１Ａ〜２１Ｇに示す。
【０３８１】
ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃフォーマット（図２１Ａ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２０８１８およびＸＥＮＰ２１４７５が含まれ、それらの配列は図２２に示されており、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列は、図に示されるＸＥＮＰ２０８１９、ＸＥＮＰ２１４７１、ＸＥＮＰ２１４７２、ＸＥＮＰ２１４７３、ＸＥＮＰ２１４７４、ＸＥＮＰ２１４７６、ＸＥＮＰ２１４７７である。ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図２１Ｂ）の例示的タンパク質はＸＥＮＰ２１４７８であり、その配列を図２３に示し、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列を図中のＸＥＮＰ２１９９３、ＸＥＮＰ２１９９４、ＸＥＮＰ２１９９５、ＸＥＮＰ２３１７４、ＸＥＮＰ２３１７５、ＸＥＮＰ２４４７７、ＸＥＮＰ２４４８０として示す。ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマットの例示的タンパク質（図２１Ｃ）には、図２４に示されているＸＥＮＰ２１４７９、ＸＥＮＰ２２３６６、およびＸＥＮＰ２４３４８の配列が含まれる。二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマットの（図２１Ｄ）例示的タンパク質はＸＥＮＰ２１９７８であり、その配列は図２５に示されており、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列はＸＥＮＰ２１９７９として示されている。二価のｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図２１Ｅ）の例示的タンパク質の配列を図２６に示す。Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図２１Ｆ）の例示的タンパク質はＸＥＮＰ２２６３７であり、その配列を図２７に示し、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列を図中にＸＥＮＰ２２６３８として示す。Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図２１Ｇ）の例示的タンパク質の配列を図２８に示す。
【０３８２】
タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５と１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。
【０３８３】
上述のような様々なフォーマットのＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを示された濃度で試験試料で処理した。処理の４日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｍ−Ｔ２７１）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、および抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ６０５（Ｈｉ１００）で染色し、以下の細胞型についてゲートした：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。Ｋｉ６７は細胞増殖と厳密に関連するタンパク質であり、そして細胞内Ｋｉ６７についての染色は抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）およびＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用して実施された。上述の細胞型に対するＫｉ６７の割合は、ＦＡＣＳを使用して測定された（図２９Ａ〜２９Ｃおよび図３０Ａ〜３０Ｃに示す）。様々なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の強い増殖を誘導した。特に、増殖活性の差異は、ＩＬ−１５−Ｆｃ側のリンカーの長さに依存していた。特に、ＸＥＮＰ２１４７１、ＸＥＮＰ２１４７４、およびＸＥＮＰ２１４７５を含む、リンカーを有さない（ヒンジのみ）コンストラクトは、より弱い増殖活性を示した。
【０３８４】
Ｂ．２Ｂ：操作されたジスルフィド結合を有するＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質
ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の安定性をさらに向上させ、半減期を延ばすために、ＩＬ−１５／Ｒα界面においてジスルフィド結合を操作した。ＩＬ−１５／Ｒα複合体の結晶構造を調べることによって、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）ソフトウェアを用いてモデリングすることによって、図３１に示されるように、共有ジスルフィド結合を形成するためにシステインで置換し得るＩＬ−１５／Ｒα界面の残基を予測した。さらに、ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに続く３個までのアミノ酸を、操作するシステインの足場としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端に付加した（その例示的な配列を図３２に示す）。システインで操作された例示的なＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）変異体の配列をそれぞれ図３３および３４に示す。
【０３８５】
ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナーを含むｐＴＴ５発現ベクター（例えば、図１０Ａ〜１０Ｄに示す定常領域）へのサブクローニングによって構築した。上述のように同定された残基を、標準的な変異導入技術によってシステインで置換した。操作されたジスルフィド結合を有するＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の漫画の概略図を図３５Ａ〜３５Ｄに示す。
【０３８６】
ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃフォーマット（図３５Ａ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２０１３、ＸＥＮＰ２２０１４、ＸＥＮＰ２２０１５、およびＸＥＮＰ２２０１７が含まれ、それらの配列を図３６に示す。ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図３５Ｂ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２３５７、ＸＥＮＰ２２３５８、ＸＥＮＰ２２３５９、ＸＥＮＰ２２６８４、およびＸＥＮＰ２２３６１が含まれ、それらの配列は図３７に示され、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列を図中のＸＥＮＰ２２３６０、ＸＥＮＰ２２３６２、ＸＥＮＰ２２３６３、ＸＥＮＰ２２３６４、ＸＥＮＰ２２３６５、ＸＥＮＰ２２３６６として示す。二価のｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図３５Ｃ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３４、ＸＥＮＰ２２６３５、およびＸＥＮＰ２２６３６が含まれ、これらの配列は図３８に示され、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列の図を図中にＸＥＮＰ２２６８７として示す。Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図３５Ｄ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３９およびＸＥＮＰ２２６４０が含まれ、その配列を図３９に示す。
【０３８７】
タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５と１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。
【０３８８】
タンパク質が精製された後、それらは純度および均質性についてキャピラリー等電点電気泳動（ＣＥＦ）によって分析された。製造者の使用説明書を使用して実施したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙ  ＬａｂＣｈｉｐおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用してＣＥＦを実施した。試料は、一方を還元下（ジチオトレイトールを用いて）、他方を非還元条件下で二重に試験した。変性非還元ＣＥＦによって示されるように、多くのジスルフィド結合が正しく形成され、ここで、操作されたジスルフィド結合を含まない対照と比較したとき、共有結合複合体のより大きい分子量が観察され得る（図４０）。
【０３８９】
次いでタンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作されたジスルフィド結合を有するかまたは有さない）または対照をＰＢＭＣと共に４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｏ３２３）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して様々な細胞集団をマークし、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を図４１Ａ〜４１Ｃに示す。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＬ−１５対照は各々、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。
【０３９０】
２Ｃ：より低い効力ならびにＰＫおよび半減期の増加のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質
ＰＫをさらに改善しそして半減期を延長するために、我々はＩＬ−１５の効力を減少させることが抗原シンクを減少させ、そしてそれ故、半減期を増加させるであろうと推論した。ＩＬ−１５：ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−１５：共通のガンマ鎖界面の結晶構造を調べることによって、ならびにＭＯＥソフトウェアを使用してモデリングすることによって、効力を低減するために置換され得るこれらの界面における残基を予測した。図４２は、（免疫原性のリスクを低減するために）等価置換を操作した予測された残基の位置を示すＩＬ−１５：受容体複合体の構造モデルを示す。効力を低減するために操作された例示的なＩＬ−１５変異体の配列を図４３に示す。
【０３９１】
ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナーを含むｐＴＴ５発現ベクター（例えば、図１０Ａ〜１０Ｄに示す定常領域）へのサブクローニングによって構築した。上述のように同定された置換を、標準的な変異導入技術によって組み込んだ。効力を低減するために操作された「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４４に示し、追加の配列を、図および配列表中の、ＸＥＮＰ２２８１５、ＸＥＮＰ２２８１６、ＸＥＮＰ２２８１７、ＸＥＮＰ２２８１８、ＸＥＮＰ２２８１９、ＸＥＮＰ２２８２０、ＸＥＮＰ２２８２３、ＸＥＮＰ２２８２４、ＸＥＮＰ２２８２５、ＸＥＮＰ２２８２６、ＸＥＮＰ２２８２７、ＸＥＮＰ２２８２８、ＸＥＮＰ２２８２９、ＸＥＮＰ２２８３０、ＸＥＮＰ２２８３１、ＸＥＮＰ２２８３２、ＸＥＮＰ２２８３３、ＸＥＮＰ２２８３４、ＸＥＮＰ２３５５５、ＸＥＮＰ２３５５９、ＸＥＮＰ２３５６０、ＸＥＮＰ２４０１７、ＸＥＮＰ２４０２０、およびＸＥＮＰ２４０４３、およびＸＥＮＰ２４０４８として示す。効力を低減するために操作された「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４５に示し、さらなる配列を図中のＸＥＮＰ２４０１３、ＸＥＮＰ２４０１４、およびＸＥＮＰ２４０１６として示す。効力を低減するために操作された「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４６に示す。効力を低減するために操作された例示的なｎｃＩＬ−１５／Ｒαヘテロ二量体の配列を図４７に示し、追加の配列を図中のＸＥＮＰ２２７９１、ＸＥＮＰ２２７９２、ＸＥＮＰ２２７９３、ＸＥＮＰ２２７９４、ＸＥＮＰ２２７９５、ＸＥＮＰ２２７９６、ＸＥＮＰ２２８０３、ＸＥＮＰ２２８０４、ＸＥＮＰ２２８０５、ＸＥＮＰ２２８０６、ＸＥＮＰ２２８０７、ＸＥＮＰ２２８０８、ＸＥＮＰ２２８０９、ＸＥＮＰ２２８１０、ＸＥＮＰ２２８１１、ＸＥＮＰ２２８１２、ＸＥＮＰ２２８１３、およびＸＥＮＰ２２８１４として示す。効力を低減するために操作された「二価のｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４８に示す。効力を低減するために操作された「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４９に示す。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５と１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。
【０３９２】
１．図２Ｃ（ａ）：効力を低減するために操作された変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性
変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をいくつかの細胞増殖アッセイで試験した。
【０３９３】
最初の細胞増殖アッセイでは、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（置換を有するかまたは有さない）または対照をＰＢＭＣと共に４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４−Ｅｖｏｌｖｅ６０５（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＴＵＬＹ５６）、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して様々な細胞集団をマークし、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を図５０Ａ〜５０Ｃおよび５１に示す。ほとんどのＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は各細胞集団の増殖を誘導したが、活性は特定の操作された置換に依存して変化した。
【０３９４】
第２の細胞増殖アッセイでは、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（置換を有するかまたは有さない）をＰＢＭＣと共に３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−Ｅｖｏｌｖｅ６０４（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＴＵＬＹ５６）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｏ３２３）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（２０Ｒａｊ１）抗体で染色して様々な細胞集団をマークした。図５２Ａ〜５２Ｃおよび５３Ａ〜５３Ｃは、ＦＡＣＳによるＸＥＮＰ２２８２１とのインキュベーション後の様々な細胞集団の選択を表す。リンパ球を最初に側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした（図５２Ａ）。次にリンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートした（図５２Ｂ）。ＣＤ３発現について陰性の細胞をさらにＣＤ１６発現に基づいてゲートしてＮＫ細胞（ＣＤ１６＋）を同定した（図５２Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）を同定するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８発現に基づいてさらにゲートした（図５３Ａ）。図５３Ｂ〜５３Ｃにそれぞれ示すように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＡ発現についてゲートした。最後に、様々な細胞集団の増殖を、Ｋｉ６７発現の割合に基づいて決定し、データを図５５Ａ〜５５Ｄに示す。ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に対してＣＤ４＋Ｔ細胞よりも感受性であり、そして上述のように、増殖活性は特定の操作された置換に応じて変化した。図５５Ｄは、対照ＸＥＮＰ２０８１８と比較した様々なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のＥＣ５０の変化倍率を示す。図５４Ａおよび５４Ｂは、ＰＢＭＣとＸＥＮＰ２２８２１とのインキュベーション前後のＣＤ６９およびＣＤ２５（Ｔ細胞活性化マーカー）の発現についてゲートすることによって、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による処理後のリンパ球の活性化をさらに示す。
【０３９５】
第３の実験において、追加の変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣと共に３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＳＢ６００（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して様々な細胞集団をマークし、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞の増殖を図５６Ａ〜Ｄに示す。
【０３９６】
第４の実験において、ヒトＰＢＭＣを示された濃度の追加のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ変異体と共に３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４（ＳＢ６００）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ６７）で染色し、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。処理後のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５７に示す。
【０３９７】
第５の実験において、変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣと共に３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ（２ＳＴ８．５Ｈ７）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５８Ａ〜５８Ｅに示す。
【０３９８】
第６の実験において、変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣと共に３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５９Ａ〜５９Ｅに示す。
【０３９９】
第７の実験において、変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を示された濃度でヒトＰＢＭＣと共に３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞に対するＫｉ６７の割合を図６０Ａ〜６０Ｄに示す。データは、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２１４７９がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞、およびγδＴ細胞の増殖の最も強力な誘導因子であることを示している。各ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は、増殖を誘導することにおいてＸＥＮＰ２１４７９よりも効力が弱かったが、差異はリンカーの長さと特定の操作された置換の両方に依存していた。
【０４００】
第８の実験において、変異型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を示された濃度でヒトＰＢＭＣと共に３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、概して実施例２Ａに記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞に対するＫｉ６７の割合を、それぞれ図６１Ａ〜６１Ｄに示す。上述のように、データは、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２１４７９がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞、およびγδＴ細胞の増殖の最も強力な誘導因子であることを示している。特に、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２４３４９）へのＱ１０８Ｅ置換の導入は、野生型（ＸＥＮＰ２１４７９）と比較してその増殖活性を劇的に減少させる。
【０４０１】
２．図２Ｃ（ｂ）：効力を低減するために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のＰＫ
効力を低減するために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質が半減期およびＰＫを改善したかどうかを調べるために、我々はＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＫ研究においてこれらの変異体を調べた。０日目に、２コホートのマウス（１コホートあたり試験試料あたり５匹のマウス）にＩＶ−ＴＶによって０．１ｍｇ／ｋｇの示された試験試料を投与した。投与６０分後に、次いでコホート１では２、４、および７日目、そしてコホート２では１、３、および８日目に血清を採取した。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の血清レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗ＩＬ−１５および抗ＩＬ−１５Ｒα抗体を用いて決定した。結果を図６２に示す。図６３は、試験試料の効力と半減期の間の相関関係を示す。予想通り、効力が低下した変異体は実質的により長い半減期を示した。特に、半減期は、野生型対照ＸＥＮＰ２０８１８の０．５日間と比較して、約９日間まで改善された（ＸＥＮＰ２２８２１およびＸＥＮＰ２２８２２を参照）。
【０４０２】
ＸＩＩＩ．実施例３：ＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性
Ａ．３Ａ：ＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性の生成および物理的分析
ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン、または抗ＰＤ−１可変領域をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナーを含むｐＴＴ５発現ベクター（例えば、図１１に示す定常領域）へのサブクローニングによって構築した。例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性の漫画の概略図を図６４に示す。
【０４０３】
「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマット（図６４Ａ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、ヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合したｓｃＦｖを有する。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図６５に示す。
【０４０４】
「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｂ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合し、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされ、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図６６に示す。
【０４０５】
「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｃ）は「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図６７に示す。
【０４０６】
「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図６４Ｄ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、ヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合した可変重鎖（ＶＨ）を有し、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図６８に示す。
【０４０７】
「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図６４Ｅ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの反対側に融合し、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成され、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされ、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図６９に示す。
【０４０８】
「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図６４Ｆ）は、「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図７０に示す。
【０４０９】
「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｇ）は、第１および第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合し、次いでこれはさらにヘテロ二量体Ｆｃ領域の一方のＣ末端に融合し、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図７１に示す。
【０４１０】
「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｈ）は、第１および第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の一方のＣ末端に融合し、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成され、一方、ＩＬ−１５は別々にトランスフェクトされ、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図７２に示す。
【０４１１】
「ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｉ）は、「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図７３に示す。
【０４１２】
「中央ＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｊ）は、次いでヘテロ二量体Ｆｃの一方にさらに融合されたＩＬ−１５のＮ末端に組換え融合されたＶＨと、次いでヘテロ二量体Ｆｃの他方にさらに融合されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に組換え融合されたＶＨとを含み、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図７４に示す。
【０４１３】
「中央ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図６４Ｋ）は、次いでヘテロ二量体Ｆｃの一方の側にさらに融合したＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合したＶＨと、ヘテロ二量体Ｆｃの他方に融合したＶＨとを含み、一方、対応する軽鎖は別々にトランスフェクトされ、ＶＨを有するＦａｂが形成される。このフォーマットの例示的な二機能性タンパク質の配列を図７５に示す。
【０４１４】
ＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質を、純度および均一性についてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびキャピラリー等電点電気泳動（ＣＥＦ）によって分析した。
【０４１５】
タンパク質をＳＥＣを用いて分析してそれらのサイズ（すなわち流体力学的容積）を測定し、精製サンプルの非変性の挙動を決定した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで実施した。４℃で２５分間、移動相として１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を１．０ｍＬ／分で用いて、２８０ｎＭのＵＶ検出波長で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に試料を注入した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯｐｅｎＬａｂクロマトグラフィーデータシステム（ＣＤＳ）ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＩＣバージョンＣ．０１．０７を使用して分析を実施した。ＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおける例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性ＸＥＮＰ２１４８０のクロマトグラムを図７６Ｂに示す。
【０４１６】
製造者の使用説明書を使用して実施したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙ  ＬａｂＣｈｉｐおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用するＣＥＦによってタンパク質を電気泳動的に分析した。試料は、一方を還元下（ジチオトレイトールを用いて）、他方を非還元条件下で二重に試験した。ＸＥＮＰ２１４８０のゲル画像を図７６Ｃに示す。
【０４１７】
ＩＬ−２ＲβおよびＰＤ−１に対する二機能性タンパク質の親和性スクリーニングは、概して実施例１Ｂ（ａ）に記載されているようにＯｃｔｅｔを用いて実施した。最初のスクリーニングでは、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用して試験試料を捕捉し、次いでＫＤ決定のために複数濃度のＩＬ−２Ｒβ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ）またはヒスチジンタグ付きＰＤ−１に浸漬した。ＸＥＮＰ２１４８０についての親和性の結果および対応するセンサーグラムを図７６Ｄ〜７６Ｅに示す。２番目のスクリーニングでは、ＨＩＳ１Ｋバイオセンサーを使用して、ヒスチジンタグ付きＩＬ−２Ｒβ：共通のガンマ鎖複合体−Ｆｃ融合体またはヒスチジンタグ付きＰＤ−１−Ｆｃ融合体のいずれかを捕捉し、次いで２つの異なるバッチのＸＥＮＰ２５８５０に浸漬し、それらのセンサーグラムを図７７に示す。
【０４１８】
二機能性タンパク質の安定性は、示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）を用いて評価した。ＤＳＦ実験は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。タンパク質をＳＹＰＲＯオレンジ蛍光色素と混合し、ＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＳＹＰＲＯオレンジの最終濃度は１０倍であった。２５℃で最初の１０分間のインキュベーション期間の後、タンパク質を１℃／分の加熱速度で２５℃〜９５℃に加熱した溶融温度（Ｔｍ）は機器のソフトウェアを用いて計算した。ＸＥＮＰ２１４８０についての安定性の結果および対応する融解曲線を図７６Ｆに示す。
【０４１９】
Ｂ．３Ｂ：細胞増殖アッセイにおけるＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性の活性
例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質ＸＥＮＰ２１４８０および対照を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを示された濃度で試験試料で処理した。処理の４日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｍ−Ｔ２７１）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、および抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ６０５（Ｈｉ１００）で染色し、以下の細胞型についてゲートした：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。Ｋｉ６７は細胞増殖と厳密に関連するタンパク質であり、そして細胞内Ｋｉ６７についての染色は抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）およびＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用して実施された。上述の細胞型に対するＫｉ６７の割合は、ＦＡＣＳを使用して測定された（図７８Ａ〜７８Ｃに示す）。
【０４２０】
Ｃ．３Ｃ：ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性の活性
複数のドナー由来のヒトＰＢＭＣを、２０μｇ／ｍＬの例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性タンパク質または対照と組み合わせた１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで７２時間刺激した。処理後、上清を回収してＩＬ−２についてアッセイし、そのデータを図７９に示す。
【０４２１】
Ｄ．３Ｄ：ＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１二機能性はヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける移植および疾患活動性を増強する
例示的なＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１を、ＮＳＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ）免疫不全マウスにおいて実施された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおいて評価した。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射すると、ヒトＰＢＭＣはマウス細胞に対して自己免疫応答を引き起こす。ヒトＰＢＭＣを注射したＮＳＧマウスに続くＩＬ−１５／Ｒα×抗ＰＤ−１の処理は、移植されたＴ細胞を脱抑制して増殖させ、そして移植を促進する。
【０４２２】
８日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に示された濃度で示された試験試料を投与した。ＩＦＮγレベルならびにヒトＣＤ４５＋リンパ球、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞数を４、７および１１日目に測定した。図８０は、４、７、および１１日目のマウス血清中のＩＦＮγレベルを示す。図８１Ａ〜８１Ｃはそれぞれ、４、７、および１１日目のＣＤ８＋Ｔ細胞数を示す。図８２Ａ〜８２Ｃはそれぞれ、４、７、および１１日目のＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。図８３Ａ〜８３Ｃはそれぞれ、４、７、および１１日目のＣＤ４５＋細胞数を示す。マウスの体重も４、７、および１１日目に測定し、図８４に初期体重の割合として示した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５５Ｄ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５６Ｄ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ａ−２】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５８Ｅ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図５９Ｅ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６０Ｄ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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【図６１Ｄ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６４Ｄ】
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【図６４Ｅ】
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【図６４Ｆ】
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【図６４Ｇ】
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【図６４Ｈ】
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【図６４Ｉ】
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【図６４Ｊ】
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【図６４Ｋ】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７６Ｃ】
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【図７６Ｄ】
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【図７６Ｅ】
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【図７６Ｆ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７８Ｃ】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８１Ｃ】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８２Ｃ】
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【図８３Ａ】
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【図８３Ｂ】
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【図８３Ｃ】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｂ】
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【図８４Ｃ】
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【図８５Ａ】
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【図８５Ｂ】
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【図８５Ｃ】
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【図８５Ｄ】
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【図８５Ｅ】
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【図８５Ｆ】
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【図８５Ｇ】
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【図８５Ｈ】
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【図８５Ｉ】
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【図８５Ｊ】
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【図８５Ｋ】
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【図８５Ｌ】
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【図８５Ｍ】
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【図８５Ｎ】
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【図８６Ａ】
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【図８６Ｂ】
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【図８６Ｃ】
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【図８６Ｄ】
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【図８６Ｅ】
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【図８６Ｆ】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
2019533444.tif 000221
【図８８】
2019533444.tif 000222
【配列表】
2019533444000001.app
【国際調査報告】
2019533444.tif 000223
2019533444.tif 000224
2019533444.tif 000225
2019533444.tif 000226