(57)【要約】本開示は、チェックポイント受容体「プログラム死１」（ＰＤ−１）に対して強い親和性を有するペプチドを提供する。これらのペプチドは、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻止し、したがって、癌を含む、過剰増殖性障害の進行の阻害、感染性疾患の治療、ワクチン接種に対する応答の増強、及び敗血症の治療などの様々な治療目的のために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド
からなる群から選択される最高で４つのペプチド：並びに
（ｂ）薬学的に許容されるビヒクル
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記４つのペプチドのうちの１つのみを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記４つのペプチドのうちの２つのみを含み、該２つのペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；並びに
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド
からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記４つのペプチドのうちの３つのみを含み、該３つのペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペプチドの全４つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
過剰増殖性障害の進行を阻害して、感染性疾患を治療するため、又は敗血症を治療するための方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載の有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項７】
前記組成物が、過剰増殖性障害の進行を阻害するために投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記過剰増殖性障害が癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が黒色腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者に癌ワクチンを投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を施すことをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、感染性疾患を治療するために投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記感染性疾患がマラリアである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記感染性疾患がＢ型肝炎である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、前記感染性疾患に対するワクチンのワクチンアジュバントとして投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、敗血症を治療するために投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
過剰増殖性障害の進行を阻害するため、感染性疾患を治療するため、又は敗血症を治療するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
過剰増殖性障害の進行を阻害するため、感染性疾患を治療するため、又は敗血症を治療するために使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる２０１６年９月１５日出願の米国特許第６２／３９５，１９５号の優先権を主張するものである。本開示で引用される各参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、本出願の配列表である２０１７年９月１１日に作成され、「０００４７９００２４９ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と命名された１．３８ｋｂのテキストファイルの内容を参照により組み込む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、概して、免疫調節ペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の飽和可能な結合を示すグラフ。
【図２】Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの飽和可能な結合を示すグラフ。
【図３Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＱＰ２０の効果を示すグラフ。図３Ａ、ＭＦＩ；図３Ｂ、正規化された平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図３Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＱＰ２０の効果を示すグラフ。図３Ａ、ＭＦＩ；図３Ｂ、正規化された平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図４Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＨＤ２０の効果を示すグラフ。図４Ａ、ＭＦＩ；図４Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図４Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＨＤ２０の効果を示すグラフ。図４Ａ、ＭＦＩ；図４Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図５Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＷＱ２０の効果を示すグラフ。図５Ａ、ＭＦＩ；図５Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図５Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＷＱ２０の効果を示すグラフ。図５Ａ、ＭＦＩ；図５Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図６Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＳＱ２０の効果を示すグラフ。図６Ａ、ＭＦＩ；図６Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図６Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＳＱ２０の効果を示すグラフ。図６Ａ、ＭＦＩ；図６Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図７Ａ】ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、及びＮＦ−κＢ応答エレメントを含有するプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーターのＰＤ−１媒介性抑制の阻害をもたらすＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の効果を示すグラフ。
【図７Ｂ】ＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の効果を示すグラフ（図７Ａのデータは倍数阻害として表されている）。
【図８Ａ】ＰＤ−１ペプチド阻害剤が、ルシフェラーゼレポーター発現の増加をもたらす、ＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用を用量依存的に阻害することを示すグラフ。
【図８Ｂ】ＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の効果を示すグラフ（図８Ｂのデータは倍数阻害として表されている）。
【図９】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおける末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図１０】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−４産生を示すグラフ。
【図１１】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−６産生を示すグラフ。
【図１２】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−１０産生を示すグラフ。
【図１３】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図１４】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生を示すグラフ。
【図１５】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を示すグラフ。
【図１６】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図１７】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−４産生を示すグラフ。
【図１８】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−６産生を示すグラフ。
【図１９】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせでの刺激後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−１０産生を示すグラフ。
【図２０】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせでの刺激後のＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図２１】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後のＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生を示すグラフ。
【図２２】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後のＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を示すグラフ。
【図２３Ａ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後のドナーＡからのＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図２３Ｂ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、又はＳＱ２０及びこれらのペプチドの組み合わせとの培養後のドナーＢからのＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図２４Ａ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後のドナーＡからのＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図２４Ｂ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、又はＳＱ２０及びこれらのペプチドの組み合わせとの培養後のドナーＢからのＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図２５】Ｂ１６−Ｆ１０−ＬａｃＺの腫瘍細胞を有し、ペプチドの組み合わせで処置したマウスにおける表面転移の数を示すグラフ。
【図２６】実施例８で試験した各コホートの０．５×１０６個の脾細胞当たりのプラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｙＣＳ）特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞の平均数±標準偏差を示すグラフ。
【図２７】感染後２及び３週目に、血清ＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）の平均レベルに対するＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチドの組み合わせの効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
詳細な説明
本開示は、４つのペプチド：
【表Ａ】
2019531293.tif 000002
を提供する。これらのペプチドは、太字で上記に示されているＨＨ＿のコア配列を共有し、チェックポイント受容体「プログラム死１」（ＰＤ−１）に対して強い親和性を有する。これらのペプチドは、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻止し、したがって、癌を含む、過剰増殖性障害の進行を阻害するため、又は個体の免疫応答を増強、刺激、及び／若しくは増加させることによってＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及び熱帯熱マラリア原虫などの病原体による持続性感染症を含む、感染性疾患を治療するために使用することができる。
【０００６】
医薬組成物
医薬組成物は、最高で４つの本明細書に開示されるペプチド及び薬学的に許容されるビヒクルを含む。「薬学的に許容されるビヒクル」は、ペプチドの生物学的活性に影響しない１種または複数種の物質を含んでよく、患者に投与された場合、有害反応を引き起こさない。医薬組成物は、液体であってもよく、又は凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥組成物は、組成物の再構成に使用するのに適する液体、典型的には、注射用水（ＷＦＩ）と共にキットに提供され得る。医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下投与を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の開示されたペプチドをアルブミン及びトランスサイレチンなどの様々な部分にコンジュゲートして、ペプチドの血漿半減期を高めることができる。そのようなコンジュゲートを調製する方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｐｅｎｃｈａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１６；Ｚｏｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０００８】
治療的使用
本明細書に開示される医薬組成物は、いくつかの治療的用途を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、癌などの過剰増殖性障害の進行を阻害するために患者に投与することができる。そのような阻害は、例えば、新生物又は前新生物細胞の増殖を低減すること、新生物又は前新生物細胞を破壊すること；及び転移を阻害すること又は腫瘍のサイズを減少させることを含むことができる。
【０００９】
本明細書に開示される医薬組成物を用いて治療することができる癌の例としては、黒色腫、リンパ腫、肉腫、及び結腸の癌、腎臓の癌、胃の癌、膀胱の癌、脳の癌（例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、星細胞腫、髄芽腫）、前立腺の癌、膀胱の癌、直腸の癌、食道の癌、膵臓の癌、肝臓の癌、肺の癌、乳房の癌、子宮の癌、子宮頸部の癌、卵巣の癌、血液の癌（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ−誘導性Ｂ細胞リンパ腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、癌ワクチンと組み合わせて投与することができる。「癌ワクチン」は、癌ワクチンが投与される患者における特定の抗原に対する免疫応答を誘発することが意図される免疫原性組成物である。癌ワクチンは、典型的には、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導又は刺激することができる腫瘍抗原を含有する。「腫瘍抗原」は、標的腫瘍の表面上に存在する抗原である。腫瘍抗原は、非腫瘍細胞が発現しない分子であり得るか、又は例えば、非腫瘍細胞が発現する分子の改変バージョン（例えば、ミスフォールドされるか、切断されるか、又はそうでなければ変異したタンパク質）であり得る。医薬組成物の投与を含む「組み合わせて」は、癌ワクチンと共に、癌ワクチンの投与前、又は投与後であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、かかる治療の有効性を高めるために、癌を治療するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法と組み合わせて投与することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、例えば、ウイルス、真菌、細菌、及び原生動物、並びに蠕虫によって引き起こされる慢性感染症を含む感染性疾患を治療するために患者に投与することができる。
【００１３】
ウイルス病原体の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１及びＨＳＶ２を含むＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、並びにＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００１４】
真菌病原体の例としては、アスペルギルス、カンジダ、コクシジオイデス、クリプトコッカス、及びヒストプラスマカプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）が挙げられる。
【００１５】
細菌病原体の例としては、連鎖球菌細菌（例えば、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎連鎖球菌）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられる。
【００１６】
原生動物の例としては、肉質虫（例えば、エントアメーバ）、鞭毛虫（例えば、ジアルジア）、繊毛虫（例えば、バランチジウム）、及び胞子虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫、クリプトスポリジウム）が挙げられる。
【００１７】
蠕虫の例としては、扁形動物（Platyhelminths）（例えば、吸虫、条虫）、鉤頭動物（Acanthocephalins）、及び線虫が挙げられる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、（例えば、エフェクターＴ細胞の増加及び／又はＴ細胞の消耗の低減により）ワクチン接種に対する応答を高めるためのワクチンと組み合わせて、ワクチンアジュバントとして投与することができる。医薬組成物の投与を含む「組み合わせて」は、ワクチンと共に、ワクチンの投与の前、又は投与後であり得る。ワクチンは、例えば、ＲＮＡワクチン（例えば、ＵＳ  ２０１６／０１３０３４５、ＵＳ  ２０１７／０１８２１５０）、ＤＮＡワクチン、組換えベクター、タンパク質ワクチン、又はペプチドワクチンであり得る。当技術分野で周知のように、かかるワクチンは、例えば、ウイルス様粒子を用いて送達することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、敗血症を治療するために投与することができる。
【００２０】
実施例１．ペプチドライブラリーのスクリーニング
ＴｒｉＣｏ−２０（商標）（ＴＲＩＣＯ−２０（商標））及びＴｒｉＣｏ−１６（商標）（ＴＲＩＣＯ−１６（商標））ファージディスプレイペプチドライブラリー（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ，４５−１  Ｒａｍｓｅｙ  Ｒｏａｄ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ  １１９６７）を、可溶性組換えヒトＰＤ−１受容体の結合体を特定するためにスクリーニングした。パニングの第４ラウンド後、特異的結合体についての明白な濃縮が観察され、個々のペプチドは、クローンファージＥＬＩＳＡにおいて弱い特異的結合体として確認された。パニングの第５ラウンドにより、さらに濃縮した。表１に、クローンファージＥＬＩＳＡにおいて強い特異的結合を示した４つのペプチドを記載する。
表１
【表１】
2019531293.tif 000003
【００２１】
実施例２．競合ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１結合阻害アッセイ
簡単に説明すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞上の細胞表面ＰＤ−１の検出は、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質と細胞をインキュベートし、その後、蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体での組換え分子の検出によって達成した。フローサイトメトリーを、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質との間の結合を検出するために行った。次いで、定量的な結合測定値を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定した。
【００２２】
図１及び図２に示すように、ＰＤ１のＪｕｒｋａｔ細胞表面発現及びこれらの細胞へのＰＤ−Ｌ１の結合を確認した。その結果を図３Ａ〜Ｂ、図４Ａ〜Ｂ、図５Ａ〜Ｂ、及び図６Ａ〜Ｂに示す。
【００２３】
実施例３．細胞ベースのレポーターアッセイ
細胞ベースのレポーターアッセイを用いて、上記で特定した４つのペプチドの結合が、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻止するのに十分であったかどうかを評価した。該アッセイの成分には、該アッセイにおいて測定可能な効果をもたらすヒトＰＤ−１及びルシフェラーゼレポーターを安定に発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株、ヒトＰＤ−Ｌ１を安定に発現したＣＨＯ細胞株、及びＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻止する陽性対照抗ＰＤ−１抗体が含まれる。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株におけるルシフェラーゼレポーターは、プロモーター領域におけるＩＬ−１、ＮＦＡＴ、又はＮＦ−κＢ応答エレメントによって誘発される。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をＣＤ３で前処理し、該アッセイで使用するためにすぐに凍結保存する。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞株との相互作用は、ルシフェラーゼ構築物が活性化される細胞内メカニズムを阻害し、それによってルシフェラーゼ発現を防止する。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上のＰＤ−１又はＣＨＯ細胞上のＰＤ−Ｌ１のいずれかに結合してそれらの相互作用を十分に防止する分子は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞がルシフェラーゼを産生するのを可能にする。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ発現を測定した。
【００２４】
抗ＰＤ−１対照抗体を用いた陽性対照アッセイの結果を、図７Ａ〜Ｂに示す。これらの結果は、対照抗体が、２０μΜの抗体濃度で約８のピーク倍数阻害を有して、用量依存的にルシフェラーゼ発現を回復することを実証する。
【００２５】
上記で特定されたペプチドのアッセイの結果を図８Ａ〜Ｂに示す。これらの結果は、４つのペプチドの各々が、約２５μΜの濃度で約１．５のピーク倍数阻害を有して、用量依存的にルシフェラーゼ発現を回復することを実証する。
【００２６】
実施例４．個々のペプチドを用いた破傷風トキソイドリコールアッセイ
ペプチド１〜４を、ヒトＰＢＭＣベース破傷風抗原リコールアッセイで試験した。「ペプチドＣＱ−２２」を、陰性対照として使用した。
【００２７】
ＰＢＭＣを、ヒトのドナーの血漿から取得して、破傷風トキソイドのリコールについてインビトロで試験した。必要になるまで適切なＰＢＭＣを凍結保存し、次いで、解凍し、９６ウェルプレートで培養した。破傷風トキソイドをペプチド１〜４の存在下又は非存在下で培養物に添加し、サイトカインの産生及び細胞表面Ｔ細胞活性化マーカーを調べた。
【００２８】
これらのアッセイの結果を図９〜１５に示し、表２に定性的にまとめる。表中の「ｘ」は、全く効果がないことを示し、「−」は可能性のある低効果を示し、「＋」はある程度の効果を示し、「＋＋」は明確な効果を示す。
表２
【表２】
2019531293.tif 000004
【００２９】
結果は、最高濃度のペプチドで、ＩＬ−６、ＩＬ−１７α、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα産生の適度な増強に向かう傾向を実証した。ＩＬ−２産生の有意な増強は検出されなかった。
【００３０】
実施例５．ペプチドの組み合わせを用いた破傷風トキソイドリコールアッセイ
ペプチドの組み合わせを、異なるＰＢＭＣドナー及び破傷風トキソイドの異なるロット番号を用いて、上記の抗原リコールアッセイで試験した。結果を図１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２に示す。これらの結果は、４つのペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の４つのペプチド組み合わせの組み合わせがＩＬ−２産生の増加及びＩＬ−１７ａ産生の減少をもたらすことを実証した。
【００３１】
図２３Ａ〜Ｂ及び図２４Ａ〜Ｂに示すように、ＩＬ−２及びＩＬ−１７ａの産生に対するペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＱＰ２０の効果は、ドナー特異的であると考えられる。
【００３２】
実施例６．ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイを、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ−２００を用いて行った。該アッセイ及び再生緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＰ２０を含有していた。固定化緩衝液は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０であった。リガンドを固定化するために使用した流速は、５μｌ／分であった。動態分析のための流速は、３０μｌ／分であった。
【００３３】
スカウティング
ヒトＰＤ−１受容体の１２,０００応答単位（ＲＵ）及びマウスＰＤ−１受容体の６０００  ＲＵを、アミンカップリング法（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によってＣＭ５チップのフローセル２及びフローセル４上に直接固定化した。非占有部位を、１Ｍのエタノールアミンでブロックした。スカウティングを、結合の有無を確認するために、２５μΜの単一検体濃度で行った。フローセル１をブランクとして保持し、基準減算（reference  subtraction）に使用した。リガンドへの検体の結合をリアルタイムで監視した。
【００３４】
完全な動態
スカウティングの結果に基づいて、新しいチップへより高いＲＵのリガンドを固定し、２５μΜの検体濃度とそれに続いて１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２、０．７８及び０μΜ濃度に連続希釈して、又は示されるように完全な動態を行った。速いオン速度及びオフ速度により、定常状態の平衡動態によってＫＤを決定した。
【００３５】
カイ二乗（χ２）分析を、実際のセンサーグラム及びＢＩＡＮＡＬＹＳＩＳ（登録商標）ソフトウェア（黒線）から生成されたセンサーグラムの間で行い、分析の精度を決定した。１〜２内のχ２値は有意（正確）とみなされ、１を下回るχ２値は非常に有意（高精度）である。結果を表３にまとめる。
【００３６】
表３
【表３】
2019531293.tif 000005
【００３７】
これらの結果は、４つのペプチドの各々がヒトＰＤ−１とマウスＰＤ−１の両方に結合することを示している。ＱＰ２０及びＳＱ２０は、マウスＰＤ−１に対して最も高い親和性を示した。ＨＤ２０及びＳＱ２０は、ヒトＰＤ−１に対して最も高い親和性を示した。
【００３８】
実施例７．実験的転移モデル
ペプチドの有効性を、Ｂ１６−Ｆ１０−ＬａｃＺ実験的転移モデルで評価した。このモデルにおいて、細胞内酵素のβガラクトシドをコードするＬａｃＺ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１０−ＬａｃＺ細胞を、同系マウスの尾静脈に注射する。細胞は、循環を通って移動し、肺に定着し、腫瘍を形成する。マウスを移植後２週間で屠殺する。酵素がその基質Ｘ−ｇａｌを切断する場合、生成物は二量体化し、色を変え、エクスビボで検出することができる。その後、肺の表面上の転移性腫瘍の数を、解剖顕微鏡下で腫瘍の手動計数によって定量する。
【００３９】
簡単に説明すると、研究０日目に、マウス（Ｎ＝７）に、尾静脈への静脈内注射によってＢ１６−Ｆ１０−ＬａｃＺ腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５又は１×１０６個の細胞）を移植した。研究２、５、７、９及び１２日目に、尾静脈注射によってマウスの静脈内にペプチド組み合わせ（用量あたり２００μｇ、２０μｇ、又は２μｇの各ペプチド）を投与した。臨床試験の詳細及び体重を治療中に定期的に記録した。マウスを研究１４日目に屠殺し、その肺を摘出し、染色した。腫瘍転移数を数えた。処置群を表４に記載する。
表４
【表４】
2019531293.tif 000006
【００４０】
結果を図２５に示す。マウスに両方の細胞濃度で移植したときに、良好な用量応答が観察された。最高用量（２００μｇ）のペプチド混合物で処置したマウスは最も少ない腫瘍（平均９７）を有し、最低用量（２μｇ）のペプチド混合物で処置したマウスは最も多くの腫瘍（平均２０５）を有していた。同様に、高い腫瘍数を移植した２つの群において、未処置群は有意により多くの腫瘍を有していた。これは、組み合わせた４つのペプチドがインビボでのＢ１６−Ｆ１０−ＬａｃＺ腫瘍増殖に対して用量依存的効果を示したことを示す。さらに、該ペプチド組み合わせは、マウスに十分に許容され、動物の健康にいかなる急性の悪影響も及ぼさなかった。
【００４１】
実施例８．マラリアワクチンの免疫原性に対するペプチド組み合わせの効果
予防ワクチンアジュバントとしてのペプチド組み合わせの免疫原性を、マラリアのマウスモデルで評価した。プラスモジウム・ヨエリのスポロゾイト周囲タンパク質（ＡｄＰｙＣＳ）を発現するアデノウイルスに基づくマラリアワクチンで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスに、２００μｇのペプチド組み合わせ、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、抗ＰＤＬ１ｍＡｂ、又は陰性対照ペプチドオボアルブミン（ＯＶＡ）を、ＡｄＰｙＣＳによる免疫付与後１、３、５、及び７日目に与えた（表５）。追加のアジュバントをＡｄＰｙＣＳ抗原に添加しなかったことに留意されたい。免疫付与の１２日後に脾臓を回収し、脾臓ＰｙＣＳ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞数を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのために、脾細胞をＰｙＣＳのＨ−２Ｋｄ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであるＳＹＶＰＳＡＥＱＩペプチド（配列番号５）で刺激したことに留意されたい。
表５
【表５】
2019531293.tif 000007
【００４２】
図２６は、各コホートについて０．５×１０６個の脾細胞当たりのＣＳＰ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均数±標準偏差を示す。ＡｄＰｙＣＳ単独（コホート１）及びペプチド組み合わせ（コホート３）、抗ＰＤ−１抗体（コホート４）又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（コホート５）の間の有意差を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて検出した（＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、該ペプチド組み合わせ（コホート３）がインビボで機能的に活性があり、ＡｄＰｙＣＳ単独（コホート１）に対してＣＳＰ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を約１．６倍増加させ、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（コホート４及び５）での変化と類似していたことを実証する。
【００４３】
実施例９．敗血症のモデルにおける生存に対するペプチド組み合わせの効果
敗血症はＴ細胞機能及び生存を負に変化させ得るが、これは、ＰＤ−１：ＰＤＬ１相互作用が阻止された場合に逆になり得、生存率が改善される。したがって、ＣＤ１マウスを盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）に供して、腹腔内腹膜炎を誘導した敗血症の代表的な、臨床的に関連するモデルでペプチド組み合わせの有効性を評価した。この研究のために、ペプチド組み合わせ又は抗ＰＤ−１抗体のいずれか２００μｇを、手術の２、２４、４８、７２及び９６時間後に静脈内投与した。ビヒクル対照群も含めた。各群には６匹のマウスがいた。全てのマウスを、罹患率及び死亡率の兆候について毎日２回チェックした。該ペプチド組み合わせの投与により、該ペプチド組み合わせが２倍高い生存率を示し、ビヒクル対照群を上回って延命効果が増強された（表６）。さらに、該ペプチド組み合わせの群における生存率は、抗ＰＤ−１抗体での処置をわずかに上回った。
表６
【表６】
2019531293.tif 000008
【００４４】
実施例１０．ＨＢＶ感染マウスにおける血清ＨＢｓＡｇレベルに対するペプチド組み合わせの効果
Ｔ細胞の消耗及び免疫寛容におけるＰＤ−１の役割が実証されているＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）マウスモデルでＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチドの組み合わせを評価した（Ｔｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＰＤ−１は、持続的ＨＢＶ感染を有するマウスの肝臓Ｔ細胞において上昇しているが、感染をクリアした動物では上昇しない。このモデルにおいて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用の抗ＰＤ−１ｍＡｂによる阻害により、肝臓Ｔ細胞による抗原特異的ＩＦＮγ産生を増加させ、ＨＢＶの持続性を逆転することの両方が示された（Ｔｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。持続的ＨＢＶのこのマウスモデルは、ＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチド組み合わせが、インビボでのＴ細胞消耗を無くし、ウイルス感染を制御する際に免疫系を助けることができるかどうかを試験する機会を提供した。
【００４５】
ＨＢＶ感染マウスを、感染２日前、及び感染後１、３、６、９、１２、１４、１７及び２０日目の９時点で、生理食塩水（陰性対照）、２００μｇのＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチド組み合わせ、又は２００μｇの抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。血清ＨＢ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のレベルを、感染後７、１４、及び２１日目にＥＬＩＳＡにより監視し（血清ＨＢｓＡｇのより高いレベルは、より高いウイルス力価を反映している）、ＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチドの組み合わせの免疫増強活性を検出した。ＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチドの組み合わせで処置した群は、陰性対照生理食塩水と比較して、感染後２及び３週目に血清ＨＢｓＡｇの有意に低い平均レベルを示した（ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）（図２７）。
参考文献
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  “Ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６，  ９０３−１５，  ２０１６．
Ｐｅｎｃｈａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  ７９３−９８，  ２０１５．
Ｔｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＰＤ−１  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒａｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ，”  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（６）：ｅ３９１７９，  ２０１２．
Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，”  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．  Ｍａｒ  １９；６：ｅ１６９４，  ２０１５．
Ｚｏｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｃｙｌａｔｅｄ  ｈｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｓ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ｔａｇ  ｆｕｒｎｉｓｈｅｓ  ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８，  １６０９２，  ２０１７
【図１】
2019531293.tif 000009
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2019531293.tif 000012
【図４Ａ】
2019531293.tif 000013
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2019531293.tif 000017
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2019531293.tif 000020
【図８Ａ】
2019531293.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図９】
2019531293.tif 000023
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2019531293.tif 000030
【図１７】
2019531293.tif 000031
【図１８】
2019531293.tif 000032
【図１９】
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【図２０】
2019531293.tif 000034
【図２１】
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【図２２】
2019531293.tif 000036
【図２３Ａ】
2019531293.tif 000037
【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2019531293.tif 000040
【図２５】
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【配列表】
2019531293000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月15日(2019.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本開示は、概して、免疫調節ペプチドに関する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド
からなる群から選択される最高で４つのペプチド：並びに
（ｂ）薬学的に許容されるビヒクル
を含む、医薬組成物。
（項目２）
前記４つのペプチドのうちの１つのみを含む、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記４つのペプチドのうちの２つのみを含み、該２つのペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；並びに
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド
からなる群から選択される、項目１に記載の医薬組成物。
（項目４）
前記４つのペプチドのうちの３つのみを含み、該３つのペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
からなる群から選択される、項目１に記載の医薬組成物。
（項目５）
前記ペプチドの全４つを含む、項目１に記載の医薬組成物。
（項目６）
過剰増殖性障害の進行を阻害して、感染性疾患を治療するため、又は敗血症を治療するための方法であって、項目１〜５のいずれかに記載の有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目７）
前記組成物が、過剰増殖性障害の進行を阻害するために投与される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記過剰増殖性障害が癌である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記癌が黒色腫である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記患者に癌ワクチンを投与することをさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記患者にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を施すことをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記組成物が、感染性疾患を治療するために投与される、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記感染性疾患がマラリアである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記感染性疾患がＢ型肝炎である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物が、前記感染性疾患に対するワクチンのワクチンアジュバントとして投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物が、敗血症を治療するために投与される、項目６に記載の方法。
（項目１７）
過剰増殖性障害の進行を阻害するため、感染性疾患を治療するため、又は敗血症を治療するための医薬の製造における、項目１〜５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
（項目１８）
過剰増殖性障害の進行を阻害するため、感染性疾患を治療するため、又は敗血症を治療するために使用するための、項目１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の飽和可能な結合を示すグラフ。
【図２】Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの飽和可能な結合を示すグラフ。
【図３Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＱＰ２０の効果を示すグラフ。図３Ａ、ＭＦＩ；図３Ｂ、正規化された平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図３Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＱＰ２０の効果を示すグラフ。図３Ａ、ＭＦＩ；図３Ｂ、正規化された平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図４Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＨＤ２０の効果を示すグラフ。図４Ａ、ＭＦＩ；図４Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図４Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＨＤ２０の効果を示すグラフ。図４Ａ、ＭＦＩ；図４Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図５Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＷＱ２０の効果を示すグラフ。図５Ａ、ＭＦＩ；図５Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図５Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＷＱ２０の効果を示すグラフ。図５Ａ、ＭＦＩ；図５Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図６Ａ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＳＱ２０の効果を示すグラフ。図６Ａ、ＭＦＩ；図６Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図６Ｂ】ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合に対するペプチドＳＱ２０の効果を示すグラフ。図６Ａ、ＭＦＩ；図６Ｂ、正規化されたＭＦＩ。
【図７Ａ】ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、及びＮＦ−κＢ応答エレメントを含有するプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーターのＰＤ−１媒介性抑制の阻害をもたらすＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の効果を示すグラフ。
【図７Ｂ】ＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の効果を示すグラフ（図７Ａのデータは倍数阻害として表されている）。
【図８Ａ】ＰＤ−１ペプチド阻害剤が、ルシフェラーゼレポーター発現の増加をもたらす、ＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用を用量依存的に阻害することを示すグラフ。
【図８Ｂ】ＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞間の相互作用に対する抗ヒトＰＤ−１抗体の効果を示すグラフ（図８Ｂのデータは倍数阻害として表されている）。
【図９】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおける末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図１０】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−４産生を示すグラフ。
【図１１】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−６産生を示すグラフ。
【図１２】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−１０産生を示すグラフ。
【図１３】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図１４】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生を示すグラフ。
【図１５】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、ＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を示すグラフ。
【図１６】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図１７】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−４産生を示すグラフ。
【図１８】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−６産生を示すグラフ。
【図１９】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせでの刺激後の、破傷風トキソイドリコールアッセイにおけるＰＢＭＣによるＩＬ−１０産生を示すグラフ。
【図２０】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせでの刺激後のＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図２１】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後のＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生を示すグラフ。
【図２２】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０の様々な組み合わせとの培養後のＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を示すグラフ。
【図２３Ａ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後のドナーＡからのＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図２３Ｂ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、又はＳＱ２０及びこれらのペプチドの組み合わせとの培養後のドナーＢからのＰＢＭＣによるＩＬ−２産生を示すグラフ。
【図２４Ａ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０、又はＣＱ−２２との培養後のドナーＡからのＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図２４Ｂ】ペプチドＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、又はＳＱ２０及びこれらのペプチドの組み合わせとの培養後のドナーＢからのＰＢＭＣによるＩＬ−１７ａ産生を示すグラフ。
【図２５】Ｂ１６−Ｆ１０−ＬａｃＺの腫瘍細胞を有し、ペプチドの組み合わせで処置したマウスにおける表面転移の数を示すグラフ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ＡｄＰｙＣＳ単独（コホート１）及びペプチド組み合わせ（コホート３）、抗ＰＤ−１抗体（コホート４）又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（コホート５）の間の、０．５×１０６個の脾細胞当たりのＣＳＰ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均数±標準偏差における有意差を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて検出した（＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、該ペプチド組み合わせ（コホート３）がインビボで機能的に活性があり、ＡｄＰｙＣＳ単独（コホート１）に対してＣＳＰ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を約１．６倍増加させ、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（コホート４及び５）での変化と類似していたことを実証する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ＨＢＶ感染マウスを、感染２日前、及び感染後１、３、６、９、１２、１４、１７及び２０日目の９時点で、生理食塩水（陰性対照）、２００μｇのＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチド組み合わせ、又は２００μｇの抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。血清ＨＢ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のレベルを、感染後７、１４、及び２１日目にＥＬＩＳＡにより監視し（血清ＨＢｓＡｇのより高いレベルは、より高いウイルス力価を反映している）、ＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチドの組み合わせの免疫増強活性を検出した。ＱＰ２０、ＨＤ２０、ＷＱ２０、及びＳＱ２０ペプチドの組み合わせで処置した群は、陰性対照生理食塩水と比較して、感染後２及び３週目に血清ＨＢｓＡｇの有意に低い平均レベルを示した（ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）。
参考文献
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【国際調査報告】
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