(57)【要約】  抗体および／またはその結合フラグメントであって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、前記重鎖可変領域がＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：  ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１２３、１２６〜１３０、１４２、１４８もしくは１４９のいずれか１つから選択される；  ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１もしくは１２４；  ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２もしくは１２５；および／または  ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択されるのうち１以上を含んでなる、抗体および／またはその結合フラグメント。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体および／またはその結合フラグメントであって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、前記重鎖可変領域がＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１２３、１２６〜１３０、１４２、１４８もしくは１４９のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１もしくは１２４；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２もしくは１２５；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される、
のうち１以上を含んでなる、抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項２】
ＣＤＲが、場合により、以下に示されるような配列番号１４２〜２２６から選択されるアミノ酸配列：
軽鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１４２〜１５６のいずれか１つから選択される；
重鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１５７〜１７４のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１７５〜１９５のいずれか１つから選択される；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される
を含んでなる、請求項１に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、以下に示されるアミノ酸配列：
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１４０；および／または
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１４１
を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２を含んでなる、請求項１または２に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項４】
抗体および／またはその結合フラグメントが、モノクローナル抗体、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、一本鎖ドメイン抗体、ｓｃＦａｂ、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項５】
αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、哺乳類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項６】
哺乳類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、ヒトαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項５に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項７】
哺乳動物αＫｌｏｔｈｏが、齧歯類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項５に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項８】
齧歯類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、マウスαＫｌｏｔｈｏポリペプチドまたはラットαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項７に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項９】
αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドおよび／または可溶性αＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項１０】
抗体および／またはその結合フラグメントが、尿、血漿、および／または血清中に見られる可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する、請求項９に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項１１】
抗体および／またはその結合フラグメントが、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを含んでなる複合体と結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項１２】
折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、場合によりＦＧＦＲ１ｃと複合体を形成する、請求項１１に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
【請求項１３】
抗体および／または結合フラグメントが、検出可能なタグで標識される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体および／または結合フラグメントである。
【請求項１４】
検出可能なタグが、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、またはＦＬＡＧタグである、請求項１３に記載の抗体および／または結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントとαＫｌｏｔｈｏポリペプチドとを含んでなり、場合によりＦＧＦＲ１ｃをさらに含んでなる、抗体複合体。
【請求項１６】
エピトープＡと結合する抗体をさらに含んでなる、請求項１５に記載の抗体複合体。
【請求項１７】
軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含んでなり、前記軽鎖可変領域がＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、前記重鎖可変領域がＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１２３、１２６〜１３０、１４２、１４８もしくは１４９のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１もしくは１２４；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２もしくは１２５；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される、
のうち１以上を含んでなる抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項１８】
配列番号２２９〜３１６：
（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２２９〜２４３のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２４４〜２６２のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２６３〜２８５のいずれか１つから選択される；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２８６〜３１６のいずれか１つから選択される）
から選択される核酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記軽鎖可変領域が、以下に示される核酸配列：
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２２７および／または
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２２８
を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２を含んでなる、請求項１７または１８に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１つの核酸を含んでなるベクター。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の核酸または請求項２０に記載のベクターを含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントを生産する組換え細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／もしくはその結合フラグメント、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の核酸、請求項２０に記載のベクター、または請求項２１に記載の組換え細胞を含んでなる、組成物。
【請求項２３】
抗体および／またはその結合フラグメントを生産する方法であって、
工程が
ａ．宿主細胞内で請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントのアミノ酸配列をコードする核酸を発現させること；
ｂ．前記宿主細胞を培養して抗体および／またはその結合フラグメントを生産すること；ならびに
ｃ．前記宿主細胞から抗体および／またはその結合フラグメントを単離および精製すること
を含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記核酸が、配列番号２２９〜３１６：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２２９〜２４３；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２４４〜２６２；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２６３〜２８５；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２８６〜３１６
から選択される核酸配列を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントを含んでなる、イムノアッセイ。
【請求項２６】
イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である、請求項２５に記載のイムノアッセイ。
【請求項２７】
ＥＬＩＳＡが、捕捉抗体および検出抗体を含んでなるサンドイッチＥＬＩＳＡであり、前記捕捉抗体および／または検出抗体が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントである、請求項２６に記載のイムノアッセイ。
【請求項２８】
前記捕捉抗体および検出抗体が、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント、ならびにそれぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体から選択される、請求項２７に記載のイムノアッセイ。
【請求項２９】
前記捕捉および検出抗体の一方が、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントであり、かつ、前記捕捉および検出抗体の他方が、それぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体である、請求項２７または２８に記載のイムノアッセイ。
【請求項３０】
イムノアッセイを作製する方法が、
ａ．固相支持体を捕捉抗体でコーティングすること；
ｂ．前記捕捉抗体をサンプルと、捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること；
ｃ．結合していないサンプルを除去すること；
ｄ．捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出抗体と接触させること；
ｅ．結合していない検出抗体を除去すること；および
ｆ．前記捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる、サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを検出および／または測定するための、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。
【請求項３１】
ＥＬＩＳＡが、競合的ＥＬＩＳＡである、請求項２６に記載のイムノアッセイ。
【請求項３２】
サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのレベルを検出および／または測定する方法であって、
ａ．サンプルを請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントと、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること；および
ｂ．抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる、方法。
【請求項３３】
可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出および／または測定するアッセイであって、
方法が、
ａ．体液であるサンプルを請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントと、抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること；ならびに
ｂ．前記抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる、アッセイ。
【請求項３４】
抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体が、免疫沈降、イムノブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により検出される、請求項３２または３３に記載のアッセイ。
【請求項３５】
対象において慢性腎臓病（ＣＫＤ）および急性腎障害（ＡＫＩ）から選択される腎臓病態を診断または検出するスクリーニング方法であって、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを、場合により、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、または請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のアッセイを用いて測定すること；ならびに
ｂ．前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、前記対象がＣＫＤまたはＡＫＩから選択される腎臓病態を有することを示す、方法。
【請求項３６】
前記ＣＫＤが、早期ＣＫＤ、場合により、病期１または病期２、または病期３、病期４、病期５または病期６である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、新鮮組織サンプル、冷凍サンプルおよび軽度固定サンプルなどの固定サンプルから選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
αＫｌｏｔｈｏのレベルが、免疫沈降により決定される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＡＫＩ後の回復の予後を診断する方法であって、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを、場合により、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、または請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のアッセイを用いて測定すること；ならびに
ｂ．前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象のＡＫＩ後の回復の見込みがより高いことを示す、方法。
【請求項４０】
ＡＫＩ後の長期合併症の予後を診断する方法であって、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを、場合により、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、または請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のアッセイを用いて測定すること；ならびに
ｂ．前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象のＡＫＩ後の長期合併症が少ない見込みがより高いことを示す、方法。
【請求項４１】
ＣＫＤの進行速度の予後を診断する方法であって、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを、場合により、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、または請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のアッセイを用いて測定すること；ならびに
ｂ．前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象のＣＫＤの進行速度がより遅い見込みがより高いことを示す、方法。
【請求項４２】
ＣＫＤにおける腎外合併症の予後を診断する方法であって、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを、場合により、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、または請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のアッセイを用いて測定すること；ならびに
ｂ．前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象のＣＫＤ関連の腎外合併症が少ない見込みがより高いことを示す、方法。
【請求項４３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント、参照薬剤ならびに場合によりその使用説明書を含んでなる、キット。
【請求項４４】
それぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体および／または結合フラグメントをさらに含んでなる、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／２９０，７７６号の優先権に基づき３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の利益を主張する特許協力条約出願であり、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
【０００２】
本発明は、一部にＮＩＨ許可第Ｒ０１ＤＫ０９１３９２号、第Ｒ０１ＤＫ０９２４６１号および第Ｒ０１ＤＥ１３６８６号として米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明において所定の権利を有し得る。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、折り畳まれた形態のαＫｌｏｔｈｏに特異的な抗体、ならびにＫｌｏｔｈｏを検出する方法およびアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイに関する。
【背景技術】
【０００４】
ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、最初に早期老化の抑制因子として同定された［１、２に総説］。Ｋｌｏｔｈｏは、主として腎臓、副甲状腺、および脈絡膜叢で発現する１回膜貫通タンパク質である［１、３、４］。βＫｌｏｔｈｏおよびγＫｌｏｔｈｏ［５、６］と呼ばれる機能および発現プロフィールが異なるパラロガスタンパク質も知られている。
【０００５】
αＫｌｏｔｈｏは、イオン輸送、Ｗｎｔおよびインスリンシグナル伝達、レニン−アンギオテンシン系、幹細胞の動員、抗発癌、抗線維症、ならびに抗酸化の調節を含む多様な作用を有する。αＫｌｏｔｈｏの最も高い発現レベルは腎臓におけるものである［１、７、８］。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）２３の共受容体であるその膜貫通型［９〜１１］に加え、αＫｌｏｔｈｏはまた、転写産物の末端切断型ペプチドへのスプライシング［２］またはセクレターゼによるタンパク質分解放出［１４、１５］によって生成される内分泌物質［７、１２、１３］として循環、尿、および脳脊髄液中にも放出される。循環αＫｌｏｔｈｏの実質的部分は腎起源である［１６］。遺伝的なαＫｌｏｔｈｏ除去と慢性腎臓病（ＣＫＤ）の間の表現型の類似は、αＫｌｏｔｈｏ腎発現の低下が病原であるという概念を裏付ける［１、１６］。
【０００６】
腎臓のαＫｌｏｔｈｏ転写産物またはタンパク質レベル［１２、１８〜２４］および血清αＫｌｏｔｈｏ濃度［１２、２０］の低下は、ネフロン縮小手術、虚血性再潅流傷害、免疫複合体糸球体腎炎、多遺伝子性またはホルモン性高血圧症、代謝症候群、および糖尿病からの齧歯類ＣＫＤで証明されている［１２、１８〜２４］。この収束は、αＫｌｏｔｈｏ欠乏がネフロン喪失の遺伝的帰結であり得ることを示唆する。αＫｌｏｔｈｏの低下は、ＣＫＤおよびまたＣＫＤ合併症の予後の高感度かつ早期のバイオマーカーである可能性がある［２２］。齧歯類での実験的ＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏの回復は、腎臓病および腎外合併症を改善する［１２、２２、２３］。αＫｌｏｔｈｏ欠乏はまた、齧歯類およびヒトの両方で急性腎障害（ＡＫＩ）においても報告されている［２５］。αＫｌｏｔｈｏは、ＡＫＩの現在知られているバイオマーカーの変化よりもずっと早期に低下するので、ＡＫＩの早期バイオマーカーとして役立つ可能性がある［２６］。
【０００７】
αＫｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２３に対する選択的親和性を付与するためにＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）と構成的二元複合体を形成する［１０、２７］。αＫｌｏｔｈｏ発現の欠損は、マウス［１、２８］およびヒト［２９］においてＦＧＦ２３耐性およびリン酸塩の保持をもたらす。よって、αＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２３は、リン酸代謝を調節する骨−腎内分泌軸の必須成分として浮上した［３０、３１］。
【０００８】
膜係留型のαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメインは、可溶性タンパク質として分泌され得る。可溶型は膜係留型から膜係留プロテアーゼによって生成され、血液および尿中に放出される［１３、１５］。上記のように、膜係留型αＫｌｏｔｈｏはＦＧＦ２３受容体複合体の一部として機能するが、分泌型αＫｌｏｔｈｏは、遠隔器官に作用を発揮して上述のように極めて多面発現的な作用（イオン輸送、Ｗｎｔおよびインスリンシグナル伝達、レニン−アンギオテンシン系、幹細胞の動員、抗発癌、抗線維症、および抗酸化の調節）を発揮する内分泌因子として働く［７］。
【０００９】
腎傷害と腎機能の低下を特徴とする進行性ＣＫＤ（病期４〜５）は人口の７％を超える推定２６０万人のカナダ人を侵している。国家人口動態統計報告書、国民健康栄養調査および米国腎臓データシステムの最近の分析では、白人男性、白人女性、黒人男性、および黒人女性の寿命リスクがそれぞれＣＫＤ病期３ａ＋、５３．６％、６４．９％、５１．８％、および６３．６％が示された［８４］。ＣＫＤおよびその関連合併症の人々の生活および医療制度への影響および負担は重大で、今後数年で悪化するであろう［３２〜３４］。ＣＫＤを治療するための現行のアプローチには、食餌および投薬による、また腎不全（end stage renal disease：ＥＳＲＤ）の場合には透析および臓器移植によるリスク因子の改善が含まれる。合併症が生じる前に早期段階でＣＫＤの進行を停止または遅延させるためのさらなる療法の差し迫った必要がある。ＣＫＤの合併症の大多数は、ミネラル代謝の障害に結びつけられている慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常(CKD-mineral bone disturbance：ＣＫＤ−ＭＢＤ）の実体を伴っている。リン酸塩の保持はＣＫＤ患者において普遍的に見られ、不良な転帰に関連している［３５、３６］。高ホスファターゼ血症は通常、疾患が末期への進行に運命付けられる場合の進行ステージのＣＫＤでのみ検出される［３７］。最近、腎臓のαＫｌｏｔｈｏ発現の低下がＣＫＤにおける最も初期のイベントの１つであることが発見された［１２］。
【００１０】
現在、市場で入手可能なαＫｌｏｔｈｏ抗体および診断キットがいくつかあるが、既存のαＫｌｏｔｈｏ抗体は十分な特異性がなく、ヒト血清からαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させるには効率的でなく、αＫｌｏｔｈｏに関する現行の免疫に基づくアッセイはコストが高く、感度および特異性が十分でない。
【００１１】
末期腎臓の腎摘サンプルからのヒト腎臓およびＣＫＤ患者からの生検においてαＫｌｏｔｈｏ転写産物およびタンパク質の低いレベルが記載されている［２１、３８］。免疫に基づくアッセイを用いた研究では、血清αＫｌｏｔｈｏ濃度の絶対値（異なる研究室からのレベルでは１００倍の範囲）および変ＣＫＤおよび年齢による化の方向（上昇、低下、または変化なし）に関して広く異なる結果が示された［２１、３９〜６０］。矛盾したデータベースは進行を妨げ、有望な齧歯類でのデータが有意義なヒト適用に変換され得るかどうかを決定する能力を無効にした。ＣＫＤに加えて、多様な原因からの急性腎障害（ＡＫＩ）もまた齧歯類の腎臓および血清、ならびにヒトの尿［２５］中のαＫｌｏｔｈｏの急速な低下に関連している［２５、６１〜６５］。現在のところ、ＡＫＩにおけるヒト血清αＫｌｏｔｈｏに関するデータは無い。ヒトにおける腎損傷の早期、高感度および／または特異的マーカーの必要がある［６６］。
【００１２】
保存されているタンパク質に対する抗体の作製は、抗体生成のための動物免疫誘導法が自己免疫から保護する機構を受けるので困難である。合成抗体技術は、定義されたイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）条件下で適用され、自己反応性抗体を除去する免疫寛容選択を受けていない抗体ライブラリーを使用し、かつ、高い親和性および特異性を有する抗体を生じることが証明されているので有力な代替法を提供する［６７〜７１］。最適化された抗体フレームワーク内で、コンビナトリアル突然変異誘発により相補性決定領域（ＣＤＲ）に配列多様性が導入される。これらのライブラリーをファージディスプレーと組合わせる。各ファージ粒子は、内部にコードＤＮＡを保持しつつその表面にユニークな抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を提示し、従って、表現型−遺伝子型の直接的関連が得られる。対象抗原と結合するＦａｂ提示ファージは、固相支持体上での精製抗原との結合選択を用いて濃縮される。結合ファージクローンのＣＤＲはＤＮＡシークエンシングによって同定され、細菌からＦａｂタンパク質が精製されるか、または哺乳動物細胞内で全長ＩｇＧに変換される。
【００１３】
Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５［８６］は、合成ヒトＦａｂファージディスプレーライブラリーの複数回のバイオパンニングの後に単離された、Ｋｌｏｔｈｏと特異的結合親和性を有する抗体ｓｂ１０６を記載している。このｓｂ１０６抗体は一桁ナノモル範囲でαＫｌｏｔｈｏと結合親和性を有し、下記のＣＤＲ配列を含んでなる（ＩＭＧＴ  ＣＤＲ残基に下線が施され、ＩＭＧＴフレームワーク領域残基には下線が施されず、選択ライブラリーにおいて無作為化されたＩＭＧＴ位の残基は太字で示される）：ＱＳＶＳＳＡ  ＣＤＲ−Ｌ１）、ＳＡＳ（ＣＤＲ−Ｌ２）、ＱＱＡＧＹＳＰＩＴ（ＣＤＲ−Ｌ３）、ＧＦＮＩＳＹＹＳＩ（ＣＤＲ−Ｈ１）、ＹＩＳＰＳＹＧＹＴＳ（ＣＤＲ−Ｈ２）およびＡＲＹＹＶＹＡＳＨＧＷＡＧＹＧＭＤＹ（ＣＤＲ−Ｈ３）。
【００１４】
ｓｂ１０６とは異なるエピトープに結合するさらなるαＫｌｏｔｈｏ特異的抗体も記載される。
【発明の概要】
【００１５】
本開示は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、前記重鎖可変領域がＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１２３、１２６〜１３０、１４２、１４８もしくは１４９のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１もしくは１２４；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２もしくは１２５；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される
のうち１以上を含んでなる抗体および／またはその結合フラグメントに関する。
【００１６】
別の態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、場合により、以下に示されるような配列番号１４２〜２２６から選択されるアミノ酸配列：
軽鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１４２〜１５６のいずれか１つから選択される；
重鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１５７〜１７４のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１７５〜１９５のいずれか１つから選択される；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される
を含んでなる。
【００１７】
さらなる態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４０および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。
【００１８】
１つの態様では、本抗体により特異的に結合されるαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである。
【００１９】
別の側面は、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸を含む。
【００２０】
さらなる側面は、本明細書に記載の核酸を含んでなるベクターである。
【００２１】
別の側面は、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメント、核酸またはベクターを生産する組換え細胞を含む。
【００２２】
別の側面は、１以上の本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントを含んでなるまたは用いるイムノアッセイである。
【００２３】
１つの態様において、イムノアッセイは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【００２４】
他の側面は、抗体および／またはその結合フラグメントを生産する方法、サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのレベルを測定するアッセイ、可溶性αＫｌｏｔｈｏポリペプチドを検出および／または測定するアッセイ、ならびに対象において慢性腎臓病（ＣＫＤ）および急性腎障害（ＡＫＩ）から選択される腎臓病態を診断または検出するスクリーニング方法、および疾患の進行および／または回復の予後を診断する方法を含む。
【００２５】
本開示の他の特徴および利点は下記の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本開示の趣旨および範囲の中で様々な変更および修正が明らかとなるので、詳細な説明および具体例は本開示の好ましい態様を示しつつ、単に例示として示されるに過ぎないと理解されるべきである。
【００２６】
以下、本開示の態様を図面に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ｓｂ１０６の配列、特異性および親和性を示す。（Ａ）ＩＭＧＴ（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース）ナンバリング法による、抗αＫｌｏｔｈｏ  ｓｂ１０６のライブラリーＦにおける可変のＣＤＲ配列およびＶＨドメインフレームワーク領域残基。ＩＭＧＴ  ＣＤＲ残基に下線が施され、ＩＭＧＴフレームワーク領域残基には下線が施されず、選択ライブラリーで無作為化を受けたＩＭＧＴ位の残基は太字である。（Ｂ）Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡによる抗αＫｌｏｔｈｏ  ｓｂ１０６の特異性の決定：ｓｂ１０６  Ｆａｂ−ファージを下記の固定化抗原とともにインキュベートした：ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ複合体（ａＫＬ−Ｒ１）、ＦＧＦＲ１ｃ単独（Ｒ１）、ヒトαＫｌｏｔｈｏ（Ｈｕ  ａＫＬ）およびマウスαＫｌｏｔｈｏ（Ｍｕ  ａＫＬ）、または陰性対照としてのニュートラアビジン（ＮＡ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。結合していないファージを洗い流した後、結合したファージを、ＨＲＰコンジュゲート抗ファージ抗体を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は４５０ｎｍで吸光度測定を可能とする。（Ｃ）競合Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡによる親和性の評価。ｓｂ１０６  Ｆａｂ−ファージは、５０、５、０．５、０．０５、０．００５および０．０００５ｎＭ可溶性ヒトαＫｌｏｔｈｏとともにプレインキュベートした。報告された固定化ヒトαＫｌｏｔｈｏに対する結合シグナルは、２つのデータセットの平均である。固定化αＫｌｏｔｈｏに対する結合の減少は可溶性αＫｌｏｔｈｏと結合した画分を示し、よって、可溶性αＫｌｏｔｈｏ濃度が相互作用のＫＤにほぼ等しい時にシグナルの５０％低下が起こる。
【図２】図２は、イムノブロット、免疫組織化学および免疫細胞化学によるｓｂ１０６−Ｆａｂの特性評価を示す。（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）、同型接合αＫｌｏｔｈｏ低次形態マウス（ｋｌ／ｋｌ）およびトランスジェニックαＫｌｏｔｈｏ過剰発現マウス（Ｔｇ−Ｋｌ）由来の腎溶解液の、モノクローナル抗体ＫＭ２０７６またはｓｂ１０６−Ｆａｂを用いたイムノブロット。ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ。（Ｂ）正常ラット腎（ＮＲＫ）細胞、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、およびαＫｌｏｔｈｏの過剰発現用のプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞由来の溶解液の、モノクローナル抗体ＫＭ２０７６またはｓｂ１０６−Ｆａｂを用いたイムノブロット。（Ｃ）β−アクチンまたはｓｂ１０６−ＩｇＧに関してファロイジンでプローブした新鮮または固定ラット副甲状腺組織。（Ｄ）ベクター対照、またはαＫｌｏｔｈｏもしくはβＫｌｏｔｈｏの過剰発現用のベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｓｂ１０６免疫染色。代表的な細胞を示す。ＤＡＰＩ核染色は「Ｎ」と表示する。（スケールバー、１０μｍ）。Ｆａｂ  ｓｂ１０６によるαＫｌｏｔｈｏ染色は、αＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされた細胞にのみ見られ、βＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされた細胞には見られなかった。
【図３】図３は、免疫沈降によるｓｂ１０６−Ｆａｂの特性評価を示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞をエンプティーベクターまたは種々の量の（μｇ／ディッシュ）、膜貫通全長αＫｌｏｔｈｏ（ＴＭ−αＫｌｏｔｈｏ）もしくはＣ末端ＦＬＡＧエピトープを有するαＫｌｏｔｈｏの可溶性細胞外ドメイン（ｓ−αＫｌｏｔｈｏ−ＦＬＡＧ）の発現用のベクターでトランスフェクトした。細胞溶解液または細胞培養培地をｓｂ１０６−Ｆａｂまたは抗ＦＬＡＧ  ＭＡｂのいずれかで免疫沈降（ＩＰ）させた。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、モノクローナル抗αＫｌｏｔｈｏ抗体ＫＭ２０７６でイムノブロットを行った（ＩＢ）。（Ｂ）ラット、マウス、またはヒトの尿をｓｂ１０６−Ｆａｂで免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ＫＭ２０７６でイムノブロットを行った（ＩＢ）（左の３つのレーン）。サイズを選択した尿（１００ｋＤカットオフ）に対して直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、イムノブロットを行った（右の３つのレーン）。（Ｃ）血清からの内因性αＫｌｏｔｈｏの免疫沈降。野生型（ＷＴ）マウス、ｋｌｏｔｈｏ−／−マウス、正常ヒト、および透析患者（ＥＳＲＤ）由来の血清サンプルをｓｂ１０６−Ｆａｂとともに４℃で一晩インキュベートした。次に、抗ＦＬＡＧ抗体とコンジュゲートしたセファロースビーズを加え、２時間４℃でインキュベートした。これらのビーズを洗浄し、結合したタンパク質を２×ＳＤＳサンプルローディングバッファーで溶出した。イムノブロットは、ＫＭ２０７６、次いで、可視化のための標準抗ラットＩｇＧ二次抗体で行った。
【図４】図４は、組換えαＫｌｏｔｈｏを添加したヒト血清を用いたＩＰ−ＩＢアッセイのバリデーションを示す。（Ａ）既知量の可溶性ヒトαＫｌｏｔｈｏエクトドメインを健常ボランティアまたは無腎透析患者（ＣＫＤ患者）由来の血清に加えた。ＩＰ−ＩＢアッセイを用いて血清中のαＫｌｏｔｈｏを測定した。（Ｂ）プロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ  ０．１ｍＭ、アプロチニン０．３μＭ、ベスタチン１０μＭ、Ｅ−６４  １μＭ、ロイペプチン５０μＭ、ペプスタチンＡ  １μＭ）を含む、またはＩＰから除いた場合で比較を行ったこと以外は（Ａ）と同様の実験。（Ｃ）ＩＰ−ＩＢにより決定されたαＫｌｏｔｈｏレベル（ｙ軸）を、上記の４つの条件で添加した組換えαＫｌｏｔｈｏ（ｘ軸）に対してプロットした。ゼロ添加への延長により、プロテアーゼ阻害剤で処理した血清中の内因性αＫｌｏｔｈｏのレベルが示される。結果が識別不能であった場合には、プロテアーゼ阻害剤を含むまたは含まない健常血清に関して直線が１つだけ示される。
【図５】図５は、慢性腎臓病を有するヒトの血清αＫｌｏｔｈｏのＩＰ−ＩＢアッセイを示す。（Ａ）正常な健常ボランティアおよび従来の数字による病期分類を用いたＣＫＤ診断所および透析ユニットからの患者由来のヒト血清において、検量線として組換えαＫｌｏｔｈｏを用い、ＩＰ−ＩＢアッセイによってαＫｌｏｔｈｏを測定した。バーおよびエラーバーは平均および標準偏差を表す。データはＡＮＯＶＡ、次いで、ペアワイズ多重比較のためのスチューデント−ニューマン−コイル検定によって分析した。間で統計的有意性に達したＰ値を括弧の上に示す。各群の対象の数は一番下に示す。（Ｂ）多様なヒト血清中のαＫｌｏｔｈｏの濃度は、同じサンプルでのＩＰ−ＩＢ（ｘ軸）または市販のＥＬＩＳＡ（ｙ軸）により測定した。点線は同一を表す。灰色の菱形は、１回以上の冷凍−解凍サイクルを経た血清（保存）を表し、黒い菱形は、１回だけ解凍した血清（新鮮）を表す。（Ｃ）ヒト対象由来の血清をＩＰ−ＩＢおよびＥＬＩＳＡによりアッセイした。同じ血清に対して示された回数の反復冷凍−解凍を行った後にアッセイした。各サンプルの結果は、１回だけ解凍した同じサンプルからの測定値に対するパーセンテージとして表した。黒い線は異なる対象の平均を表す。
【図６】図６は、ヒト尿αＫｌｏｔｈｏレベルを示す。健常ボランティアまたは慢性腎臓病病期５（ＣＫＤ５）を有する患者の尿でαＫｌｏｔｈｏを測定した。（Ａ）定常状態条件下で各群４名の対象を用いた、組換えマウスαＫｌｏｔｈｏ（ｒＭＫｌ）を較正として用いる代表的ＩＰ−ＩＢアッセイ。ＩＰ−ＩＢには等量の尿クレアチニンを使用した。（Ｂ）ＩＰ−ＩＢアッセイおよび市販のＥＬＩＳＡからのデータの概要。バーおよびエラーバーは、各群８名の対象からの平均および標準偏差を表す。健常ボランティアの平均を１００％の参照とした。
【図７】図７は、ｓｂ１０６−Ｆａｂを用いた場合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。（Ａ）ｓｂ１０６−Ｆａｂ（Ｆｓｂ１０６）とαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体との結合を示すＳＰＲセンサーグラム。マウスαＫｌｏｔｈｏエクトドメインとヒトＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインの二元複合体をバイオセンサーチップに固定化し、１００ｎＭのＦｓｂ１０６をそのチップ上に注入した。Ｆｓｂ１０６はαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体から極めてゆっくり脱離することに留意されたい。（Ｂ）ｓｂ１０６−ＦａｂがＦＧＦ２３、αＫｌｏｔｈｏ、およびＦＧＦＲ１ｃ間の三元合体の形成を阻害しないことを示すＳＰＲセンサーグラムの重畳。１０ｎＭのαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体単独および１０ｎＭのαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と１００ｎＭのＦｓｂ１０６の混合物を、固定化ＦＧＦ２３を含有するバイオセンサーチップ上に注入した。
【図８】図８は、ｓｂ１０６のアミノ酸配列の模式図である。（Ａ）ｓｂ１０６の軽鎖配列（配列番号１１）。（Ｂ）重鎖配列−Ｆａｂ（配列番号１２）。（Ｃ）重鎖配列−ＩｇＧ１（配列番号１３）。（Ｄ）重鎖配列−ＩｇＧ４（配列番号１４）。ＩＭＧＴ  ＣＤＲ残基に下線が施され、ＩＭＧＴフレームワーク領域残基には下線が施されず、選択ライブラリーで無作為化を受けたＩＭＧＴ位の残基は太字の大きめの書体であり、斜体のアミノ酸は定常ドメインである。
【図９】図９は、ｓｂ１０６  Ｆａｂの不在下または存在下でのＦａｂファージクローンとαＫｌｏｔｈｏの結合を示す、ＦａｂファージＥＬＩＳＡの吸光度値を示すグラフである。Ｆａｂファージクローンをｓｂ１０６  Ｆａｂ（２５ｕｇ／ｍｌ）、または陰性対照としてのニュートラアビジン（ＮＡ）の不在下または存在下で固定化αＫｌｏｔｈｏとともにインキュベートした。結合していないファージを洗い流した後、結合したファージを、ＨＲＰコンジュゲート抗ファージ抗体を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は４５０ｎｍでの吸光度測定を可能とする。
【図１０】図１０は、付加的αＫｌｏｔｈｏ抗体を用いたＦａｂ  ＥＬＩＳＡの吸光度値を示すグラフである。精製したＦａｂ［５ｕｇ／ｍｌ］を固定化αＫｌｏｔｈｏ  （１ｇ／ｍｌ）または陰性対照としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともにインキュベートした。結合していないＦａｂを洗い流した後、結合したＦａｂを、ＲＰコンジュゲート抗Ｆｌａｇ抗体（Ｆａｂは軽鎖上にＦｌａｇタグを有する）を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は４５０ｎｍでの吸光度測定を可能とする。
【図１１】図１１は、さらなるαＫｌｏｔｈｏ抗体のエピトープ分類試験の一連のグラフである。αＫｌｏｔｈｏ抗原をプレートにコーティングし、ブロッキングした後、１０ｕｇ／ｍｌのＦａｂ（ｘ軸に示す通り）とともに１時間インキュベートした。結合していないＦａｂを洗浄した後、Ｆａｂの結合した抗原を２０分間Ｆａｂ−ファージ（各グラフの上に示す）に曝す。結合していないファージを洗い流した後、結合したファージを、ＨＲＰコンジュゲート抗ファージ抗体を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は４５０ｎｍでの吸光度測定を可能とする。Ｆａｂは、干渉無しの対照、参照シグナルであり、ＢＳＡシグナルはバックグラウンド対照である。
【図１２】図１２は、αＫｌｏｔｈｏ  Ｆａｂを用いて表面プラズモン共鳴により測定した親和性推定値の一連のグラフである。Ｆａｂは、捕捉のための抗Ｈ＋Ｌ  ＩｇＧを用いて固定化した。αＫｌｏｔｈｏ注入液は、毎回２倍希釈で３回連続希釈した；５０ｕｇ／ｍｌ（最高曲線）を出発濃度とし、６．２５ｕｇ／ｍｌ（最低曲線）を終濃度とした。曲線はラングミュアモデルに当てはめる。
【図１３】図１３は、同定されたＦａｂを用いたαＫｌｏｔｈｏの免疫沈降を示す一連のイムノブロットである。
【図１４】図１４は、αＫｌｏｔｈｏの３つの異なるエピトープを呈するＩｇＧを用いた捕捉ＥＬＩＳＡの吸光度値を示すグラフである。
【図１５】図１５は、αＫｌｏｔｈｏの３つの異なるエピトープを呈するＩｇＧを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの吸光度値を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ヒトおよびマウスの両αＫｌｏｔｈｏを用いたＦａｂ  ＥＬＩＳＡの吸光度値を示すグラフである。
【図１７】図１７は、αＫｌｏｔｈｏ  Ｆａｂを選択するためのヒトおよびマウス抗原に対する表面プラズモン共鳴により測定された親和性推定値の一連のグラフである。Ｆａｂは抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて捕捉させ、αＫｌｏｔｈｏの希釈系を注入した。結合曲線はラングミュアモデルに当てはめた。図１７（Ａ）は、決定されたＫｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値を示す。図１７（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれヒトおよびマウス抗原に関する結合曲線を示す。
【発明の具体的説明】
【００２８】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「αＫｌｏｔｈｏ」または「アルファＫｌｏｔｈｏ」は、全長αＫｌｏｔｈｏタンパク質、エクトドメインフラグメントなどのそのフラグメントを含むあらゆる既知の天然αＫｌｏｔｈｏ分子、ならびに使用するコンテキストから決定可能なように前記タンパク質およびフラグメントをコードする核酸を意味する。可溶型のαＫｌｏｔｈｏ（血液またはその画分、尿または脳脊髄液などの体液中に存在し、かつ約１３０ｋＤａの分子量を有する場合には、「可溶性αＫｌｏｔｈｏ」と呼称される、タンパク質切断型ならびに選択的スプライシング型のαＫｌｏｔｈｏ）ならびに膜係留型のαＫｌｏｔｈｏが含まれ、限定されるものではないが、ヒトαＫｌｏｔｈｏ、または例えばマウスおよびラットαＫｌｏｔｈｏを含む齧歯類αＫｌｏｔｈｏといった哺乳動物αＫｌｏｔｈｏが含まれる。
【００２９】
用語「急性腎障害」または「ＡＫＩ」は、本明細書で使用する場合、例えば、尿素および血中の他の化学物質の蓄積をもたらし得、例えば発作の７日以内に発症する、急性の、また持続的な腎機能の損失を意味する。ＡＫＩは、骨格筋に対する圧挫損傷などの損傷および投薬により引き起こされ得る。ＡＫＩは、リスク（糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の２５％の低下）、損傷（ＧＦＲの５０％の低下）、不全（ＧＦＲの７５％の低下）、喪失（４週間を超える腎機能の完全な喪失）および腎不全（３か月を超える腎機能の完全な喪失）まで異なる病期に分類される。ＡＫＩは無症候性であり得る。
【００３０】
用語「早期急性腎障害」は、本明細書で使用する場合、血清クレアチニンの上昇前を意味する。
【００３１】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸ならびに修飾アミノ酸の総てを含む。
【００３２】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体および他のキメラ抗体を含むことが意図される。抗体は、組換え源由来であっても、および／またはトランスジェニック動物で生産されてもよい。１つの態様の抗体は、重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２および重鎖相補性決定領域３を含んでなる重鎖可変領域または重鎖、ならびに軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２および軽鎖相補性決定領域３を含んでなる軽鎖可変領域または軽鎖を含んでなる。
【００３３】
用語「結合フラグメント」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー（例えば、Ｆｃダイマー）、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらのマルチマー、多重特異性抗体フラグメントおよびドメイン抗体を含むことが意図される。抗体は従来技術を用いてフラグメント化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を減らす処理をするとＦａｂ’フラグメントが作製できる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよびその他のフラグメントは組換え技術によっても合成することができる。
【００３４】
用語「捕捉抗体」は、本明細書で使用する場合、固相支持体に結合され、かつ、サンプル中の標的抗原、例えば、αＫｌｏｔｈｏポリペプチド、場合により、可溶性αＫｌｏｔｈｏポリペプチドを、その標的抗原と複合体を形成することにより捕捉するために使用される抗体またはその結合フラグメントを意味する。
【００３５】
用語「検出抗体」は、本明細書で使用する場合、標的抗原、例えば、αＫｌｏｔｈｏポリペプチド、場合により、可溶性αＫｌｏｔｈｏポリペプチド、場合により、すでに捕捉抗体との複合体中にある標的抗原と結合する抗体またはその結合フラグメントを意味する。例えば、検出抗体は、捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体と、その捕捉抗体により認識されるものとは異なる、標的抗原上のエピトープで結合する。
【００３６】
「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で使用する場合、あるアミノ酸残基が、そのタンパク質の所望の特性を損なうことなく別のアミノ酸残基で置換されるものである。好適な保存的アミノ酸置換は、類似する疎水性、極性、およびＲ鎖長を有するアミノ酸で互いに置換することによりなし得る。保存的アミノ酸置換には以下のものが含まれる。
【００３７】
【表１】
2019513004.tif 000003
【００３８】
用語「慢性腎臓病」または「ＣＫＤ」は、腎機能に進行性の損失を引き起こす疾患を意味する。ＣＤＫは、定義された糸球体濾過速度（ＧＦＲ）に従って決定される５つの病期に従って分類される。病期１ＣＫＤは、≧９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２のＧＦＲにより定義され、病期２ＣＤＫは、６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ２の間のＧＦＲにより定義され、病期３ＣＫＤは、３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ２の間のＧＦＲにより定義され、病期４ＣＫＤは、１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ２の間のＧＦＲにより定義され、病期５ＣＫＤは、１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満のＧＦＲにより定義される。正常な腎臓機能は、１００〜１３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の間またはタンパク尿が無く９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２のＧＦＲにより定義される。
【００３９】
用語「対照」は、本明細書で使用する場合、腎臓病を有するもしくは有さないと知られる対象もしくは対象群に由来するサンプル、および／または前記対象群から決定された値（そのような値以下のαＫｌｏｔｈｏレベルを有する対象はその疾患を有する可能性がある）を意味する。その疾患は例えば慢性腎臓病（ＣＫＤ）または急性腎障害（ＡＫＩ）であり得る。その疾患は、例えば、病期１ＣＫＤ、病期２ＣＫＤ、病期３ＣＫＤ、病期４ＣＫＤまたは病期５ＣＫＤなどのＣＫＤの病期であり得、病期が高いほど重篤である。加えて、対照は、例えば、検査される対象のサンプルと同じタイプの組織に由来してもよい。モニタリングに向けられる方法では、対照は、異なる時点で採取された同じ対象由来の組織であってもよく、例えば、対照は、腎臓病に対する処置前に採取された同じ対象由来のサンプルであり得る。
【００４０】
用語「早期慢性腎臓病」は、ＣＫＤの早期の病期を指し、ある態様では、病期１および／または病期２ＣＫＤを意味する。多くの場合、ＦＧＦ２３、ＰＴＨ、およびリン酸塩の上昇はない。病期１ＣＫＤの対象には腎障害を示す症状はほとんど存在しない。病期２ＣＫＤの対象には、腎障害を示す症状は必ずしも存在しないが、存在する場合もある。
【００４１】
用語「変性した」は、本明細書で使用する場合、例えばＳＤＳサンプルローディングバッファー中での変性条件に曝された場合など、三次および／または二次構造を失ったポリペプチド（例えば、完全非折り畳みタンパク質）を意味する。
【００４２】
用語「検出可能なタグ」は、本明細書で使用する場合、組換えタンパク質に付加または導入され得るペプチド配列などの部分を意味する。
【００４３】
用語「サンドイッチＥＬＩＳＡ」は、本明細書で使用する場合、固相支持体と固相支持体に固定化された捕捉抗体またはその結合フラグメント（抗原に特異的）を含んでなるＥＬＩＳＡを意味する。このようなＥＬＩＳＡでは、サンプル中のある量の標的抗原に捕捉抗体（例えば、サンプル中に含まれるαＫｌｏｔｈｏポリペプチド）が結合する。結合した抗原は、二次抗体またはその結合フラグメント、すなわち、捕捉抗体により認識されるものとは異なるエピトープを認識する検出抗体またはその結合フラグメントによって検出される。捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体は、酵素に共有結合させることができる検出抗体により検出されるか、またはそれ自体、酵素に結合された二次抗体の添加により検出され得る。例えば、捕捉抗体および／または検出抗体は、本明細書に開示されるＣＤＲ領域を含んでなり得る。
【００４４】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、本明細書に開示される抗体または結合フラグメントにより認識される、抗原上の部位を意味する。
【００４５】
用語「重鎖相補性決定領域」は、本明細書で使用する場合、抗体分子の重鎖可変領域内の超可変領域を意味する。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へと、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｈ２）および重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）と呼称される３つの相補性決定領域を有する。本明細書に開示される総てのＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）、本明細書に開示されるＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列、ならびに本明細書に開示されるＣＤＲをコードするまたはＦＲをコードする核酸配列は、ＩＭＧＴナンバリングに従って定義されることが意図される（８５）。
【００４６】
用語「重鎖可変領域」は、本明細書で使用する場合、重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２および重鎖相補性決定領域３を含んでなる重鎖の可変ドメインを意味する。１以上のアミノ酸またはヌクレオチドが、例えばＣＤＲ配列の外側で、修飾、例えば、保存的置換で置換されてもよい。
【００４７】
用語「宿主細胞」は、組換え細胞を生産するために組換えＤＮＡ発現ベクターを導入できる細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞であり得るが、いずれのタイプの微生物、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物宿主細胞であってもよい。
【００４８】
用語「単離された抗体またはその結合フラグメント」または「単離かつ精製された抗体またはその結合フラグメント」は、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質、および／または例えば異なるエピトープに対する他の抗体を実質的に含まない抗体またはその結合フラグメントを意味する。
【００４９】
用語「ＫＤ」は、例えば特定の抗体−抗原相互作用の複合体の解離定数を意味する。
【００５０】
用語「軽鎖相補性決定領域」は、本明細書で使用する場合、抗体分子の軽鎖可変領域内の超可変領域を意味する。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へと、軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２および軽鎖相補性決定領域３と呼称される３つの相補性決定領域を有する。
【００５１】
用語「軽鎖可変領域」は、本明細書で使用する場合、軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２および軽鎖相補性決定領域３を含んでなる軽鎖の可変ドメインを意味する。
【００５２】
用語「天然」または「天然の折り畳みの」は、本明細書で使用する場合、その天然立体配座（例えば、３Ｄ立体配座）にあるか、または例えば、受容体またはリガンドと結合し得る部分的非折り畳みタンパク質を含む、機能の付与に十分な立体配座にあるタンパク質を意味する。例えば、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏタンパク質は、ＦＧＦＲ１ｃなどのＦＧＦ受容体と結合能があり、ＦＧＦＲ１ｃ：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成することができる。
【００５３】
用語「核酸配列」は、本明細書で使用する場合、天然の塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を意味する。この用語はまた、非天然モノマーまたはその一部を含んでなる修飾または置換配列も含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然塩基を含み得る。これらの配列はまた修飾塩基も含み得る。このような塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列ならびにコドン最適化等価物または同義コドン等価物も含む。用語「単離された核酸配列」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸はまた、その核酸が由来する核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列を実質的に含まない。
【００５４】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、鎖内でともに結合された多数のアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。ポリペプチドはタンパク質の一部または全体を形成し得る。ポリペプチドは、長い、連続でかつ非分岐ペプチド鎖として構成され得る。ポリペプチドはまた、生物学的に機能的な方法で構成され得る。ポリペプチドは、それに定義された活性を付与する特定の三次元構造に折り畳まれ得る。用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語と互換的に使用される。
【００５５】
用語「単離されたポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。
【００５６】
用語「参照薬剤」は、本明細書で使用する場合、アッセイで使用される得る、および例えば、慢性腎臓病および急性腎疾患などの腎臓病態を検出する、スクリーニングするまたは診断するために参照として使用される、標準量のαＫｌｏｔｈｏタンパク質であり得る薬剤を意味する。
【００５７】
用語「サンプル」は、本明細書で使用する場合、可溶性バイオマーカーなどのαＫｌｏｔｈｏに関してアッセイされ得る、対象由来のいずれの体液、細胞または組織サンプルも意味する。例えば、サンプルは尿、血清、血漿または脳脊髄液を含んでなり得る。サンプルは、例えば、「処置後」サンプル（サンプルは、１以上の処置後に得られる）、または「ベースラインサンプル」（例えば、疾患の進行を評価するためにベースラインとして使用される）であり得る。
【００５８】
用語「ｓｂ１０６」、「ｓｂ１０６抗体」または「クローンＩＤ４８」は、本明細書で使用する場合、以下に示される軽鎖および重鎖アミノ酸配列：
軽鎖可変領域配列（ＩＭＧＴ  ＣＤＲ配列に下線が施され、ＩＭＧＴフレームワーク領域残基には下線が施されず、選択ライブラリーで無作為化を受けたＩＭＧＴ位の残基は太字で示される）：
【００５９】
【化１】
2019513004.tif 000004
【００６０】
重鎖可変領域配列（ＩＭＧＴ  ＣＤＲ配列に下線が施され、ＩＭＧＴフレームワーク領域残基には下線が施されず、選択ライブラリーで無作為化を受けたＩＭＧＴ位の残基は太字で示される）：
【００６１】
【化２】
2019513004.tif 000005
【００６２】
を含んでなり、かつ、例えば、以下に示されるアミノ酸配列（ＩＭＧＴ  ＣＤＲ配列に下線が施され、ＩＭＧＴフレームワーク領域残基には下線が施されず、選択ライブラリーで無作為化を受けたＩＭＧＴ位の残基は太字で示される）：
【００６３】
軽鎖可変領域:
ＣＤＲ−Ｌ１：  ＱＳＶＳＳＡ（配列番号９）
ＣＤＲ−Ｌ２：  ＳＡＳ（配列番号１０）
ＣＤＲ−Ｌ３：  ＱＱＡＧＹＳＰＩＴ（配列番号５）
重鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｈ１：  ＧＦＮＩＳＹＹＳＩ（配列番号６）
ＣＤＲ−Ｈ２：  ＹＩＳＰＳＹＧＹＴＳ（配列番号７）
ＣＤＲ−Ｈ３：  ＡＲＹＹＶＹＡＳＨＧＷＡＧＹＧＭＤＹ（配列番号８）．
【００６４】
を有する、ＩＭＧＴナンバリングを用いて決定される相補性決定領域を含んでなる抗体を意味する。
【００６５】
ｓｂ１０６の対応するＣＤＲに取って代わる１以上のＣＤＲ（表２に示される通り）を有し、かつ、ｓｂ１０６と同一の非ライブラリーＦ可変フレームワーク領域（すなわち、ＩＭＧＴ  ＶＨドメイン３９、５５および６６番を除く総てのＩＭＧＴフレームワーク領域の位置）を有するｓｂ１０６のサブクローン（例えば、変異体）が同定された。
【００６６】
Ｓｂ１０６は、本明細書で開示される抗体および／または結合フラグメントにより認識されるエピトープ（例えば、エピトープＢおよびエピトープＣ）とは異なるαＫｌｏｔｈｏのエピトープを認識する。従って、ｓｂ１０６ならびにｓｂ１０６および／またはｓｂ１０６の変異体のＣＤＲを含んでなる抗体は、検出アッセイ、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡなどのＥＬＩＳＡで、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメント（例えば、エピトープＢおよび／またはエピトープＣに対するもの）と併用することができる。
【００６７】
用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを意味する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するためには、これらの配列を最適な比較のために整列させる（例えば、第１のアミノ酸または核酸配列の配列に、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのためにギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていれば、それらの分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の重複する位置の数／位置の総数×１００％）。１つの態様では、２配列は同じ長さである。２配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することもできる。２配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい限定されない例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877のように改変されたKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本出願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、例えば、スコア＝１００、ワードレングス＝１２のＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセットを用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、例えば、スコア−５０、ワードレングス＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセットを用いて行うことができる。比較のためにギャップのあるアラインメントを得るためには、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用することができる。あるいは、分子間の離れた関係を検出する反復検索行うために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用することもできる（同著）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用できる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト参照）。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい限定されない例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップ・レングス・ペナルティー１２、およびギャップ・ペナルティー４が使用できる。２配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容して、または許容せずに、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際、一般に正確な一致だけが計数される。
【００６８】
「少なくとも中等度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の２つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に見られ得る。ハイブリダイズ部分は一般に、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）のヌクレオチド長である。当業者ならば、核酸二重鎖、すなわちハイブリッドの安定性が、ナトリウムを含有するバッファー中でのナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または類似の式）により決定されることを認識するであろう。よって、ハイブリッド安定性を決定する洗浄条件のパラメーターは、ナトリウムイオン濃度と温度である。既知の核酸分子と類似であるが同一でない分子を同定するためには、１％のミスマッチがＴｍに約１℃の低下をもたらすと過程することができ、例えば、核酸分子が＞９５％の同一性を有することが求められるならば、最終洗浄温度は、約５℃下げられる。これらの考慮事項に基づき、当業者ならば、適当なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができる。好ましい態様では、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、ストリンジェントハイブリダイゼーションを達成するために以下の条件が使用できる：上式に基づき、Ｔｍ−５℃、５倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５倍デンハート液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、その後、６０℃、０．２倍ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄。中等度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件には、４２℃、３倍ＳＳＣでの洗浄工程が含まれる。しかしながら、等価なストリンジェンシーが別のバッファー、塩および温度を用いて達成され得ると理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002、およびSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に見出せる。
【００６９】
用語「対象」は、本明細書で使用する場合、動物界、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト、またはラットまたはマウスなどの齧歯類を意味する。１つの態様では、対象は、慢性腎臓病（ＣＫＤ）または急性腎障害（ＡＫＩ）などの腎臓病を有することが疑われる。
【００７０】
用語「変異体」は、本明細書で使用する場合、配列（それぞれポリペプチドまたは核酸）における１以上のアミノ酸および／またはヌクレオチド修飾、例えば、本明細書に開示される軽鎖および重鎖ＣＤＲと実質的に同じ機能を実質的に同様に遂行する、本明細書に開示される軽鎖または重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上の修飾を含む。例えば、本明細書に開示されるＣＤＲの変異体は、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏタンパク質上のエピトープと特異的に結合し得る同じ機能を有するか、またはヌクレオチド修飾の場合には、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏタンパク質上のエピトープと特異的に結合し得る同じ機能を有するＣＤＲをコードする。例えば、コドンが最適化された配列および縮重配列が含まれる。本明細書に開示されるＣＤＲの変異体は、限定されるものではないが、保存的アミノ酸置換ならびに本明細書に開示されるＣＤＲ配列への付加および欠失を含む。例えば、付加または欠失は、１、２、３または４個のアミノ酸、および／または対応する数のヌクレオチドであり得る。
【００７１】
用語「レベル」は、本明細書で使用する場合、サンプル中で検出可能なまたは測定可能なαＫｌｏｔｈｏタンパク質の量（例えば、相対的量または濃度）を意味する。例えば、可溶性αＫｌｏｔｈｏレベルは、ｐＭなどの濃度、または例えば対照レベルが健常対象の可溶性αＫｌｏｔｈｏのレベルである場合、対照レベルの１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０および／もしくは１０倍などの相対的量であり得る。
【００７２】
本開示の範囲を理解する上で、用語「含んでなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、示された特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を明示するが、示されていない他の特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を排除しないオープンエンドの用語であることが意図される。以上のことはまた、用語「含む」、「有する」およびそれらの派生語などの同様の意味を有する語にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、本明細書で使用する場合、最終結果が有意に変化しないようなこの修飾語の偏差の合理的な量を意味する。これらの程度の用語は、この偏差がそれが修飾する語の意味を否定しなければ、その修飾語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００７３】
本開示の範囲を理解する上で、用語「からなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、示された特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を明示し、かつ、示されていない他の特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を排除もするクローズエンドの用語であることが意図される。
【００７４】
本明細書における終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数字および分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、総ての数字およびその分数が用語「約」により修飾されると考えられることも理解されるべきである。さらに、分脈が明らかにそうではないことを示さない限り、「１つ(a)」、「１つ(an)」、および「その(the)」は複数の指示語を含むと理解されるべきである。用語「約」は、参照される数字のプラスまたはマイナス０．１〜１０％、１〜１０％、または好ましくは１〜５％を意味する。
【００７５】
さらに、特定の節で記載される定義および態様は、当業者に理解されるように、それらが適切である本明細書に記載の他の態様に適用可能であることが意図される。例えば、以下の下りでは、本発明の種々の側面がより詳細に定義される。そのように定義される各側面は、そではないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の側面と組合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの特徴も、好ましいまたは有利であるとして示される他のいずれの１または複数の特徴と組合わせてもよい。
【００７６】
ＩＩ．抗体および／またはその結合フラグメント
本開示は、例えば、腎臓病を診断する、および／または予後を診断する、抗体および／またはその結合フラグメントならびに作製方法および使用に関する。
【００７７】
引用することにより本明細書の一部とされる「α−Ｋｌｏｔｈｏに対する高親和性を有する抗体」という名称の国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０７２８号は、ｓｂ１０６抗体を開示している。本明細書には、異なるエピトープでαＫｌｏｔｈｏと特異的に結合するさらなる抗体が記載される。図１０に記載されるように、さらなる抗体は合成抗体ライブラリーから同定され、αＫｌｏｔｈｏと結合することが示された。実施例１１および図１１に示されるように、競合的ＥＬＩＳＡ法を用いたエピトープ分類試験により、ｓｂ１０６抗体は全く別のエピトープ（Ａと識別）と結合するが、今回記載される抗体はエピトープＢおよびＣと識別される少なくとも２つの異なるエピトープと結合することが明らかとなる。さらに図１４には、エピトープＡおよびＢがαＫｌｏｔｈｏのアミノ酸５５０〜９８１内に位置し、エピトープＣはαＫｌｏｔｈｏのアミノ酸１〜５４９内に位置することが記載される。これらの試験は、これらの抗体が結合する３つのエピトープが検出アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡで使用され得ることを示す。
【００７８】
よって、第１の側面は、それぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体により認識されるものとは異なるエピトープで、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントである。
【００７９】
ある態様では、「ＣＤＲ−Ｈ１」は、ＩＭＧＴ  ＣＤＲ−Ｈ１およびＩＭＧＴ  ＣＤＲ−Ｈ１のカルボキシ末端残基に隣接するＩＭＧＴ３９位のＶＨドメイン残基から構成され；「ＣＤＲ−Ｈ２」は、ＩＭＧＴ  ＣＤＲ−Ｈ２およびＩＭＧＴ  ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ末端残基に隣接するおよびカルボキシ末端残基に隣接するＩＭＧＴ５５および６６位のＶＨドメイン残基から構成される。
【００８０】
ある態様では、本抗体またはその結合フラグメントは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域と、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域を有し、ここで、ＣＤＲ領域はＩＭＧＴナンバリングを用いて決定される。
【００８１】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域を有する抗体またはその結合フラグメントにより認識されるものとは異なるエピトープで、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する。
【００８２】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、それぞれ配列番号９、１０および５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域を有する抗体またはその結合フラグメントにより認識されるものとは異なるエピトープで、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する。
【００８３】
１つの態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、αＫｌｏｔｈｏのアミノ酸５５０〜９８１内に位置するエピトープＢと結合するが、ｓｂ１０６抗体により認識されるエピトープとは結合しない。
【００８４】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドのアミノ酸１〜５４９内で特異的に結合する。
【００８５】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、場合により天然の立体配座で折り畳まれている（例えば、完全に折り畳まれている）。
【００８６】
よって、別の側面は、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープと特異的に結合し、かつ、それぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体により認識されるものとは異なるエピトープで、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントである。
【００８７】
さらなる側面は、非固定または軽度固定サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合し、かつ、それぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体により認識されるものとは異なるエピトープで、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントである。
【００８８】
ある態様では、非固定または軽度固定サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏである。
【００８９】
実施例１２に示されるように、本明細書で開示される抗体は、αＫｌｏｔｈｏに対して２４０ｐＭ〜８．７ｎＭの範囲の結合親和性を有する。ある態様では、本抗体  および／または結合フラグメントは、競合的ＥＬＩＳＡアッセイおよび／またはＳＰＲイムノアッセイにより測定した場合に、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドに対して約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１２ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約９ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００９０】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含んでなり、前記軽鎖可変領域は相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、前記重鎖可変領域は相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１２３、１２６〜１３０、１４２、１４８もしくは１４９のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１もしくは１２４；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２もしくは１２５；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される
のうち１以上を含んでなる。
【００９１】
ある態様では、ＣＤＲ−Ｈ１領域は、配列番号１３３または１３４の配列を含んでなる。
【００９２】
ある態様では、ＣＤＲ−Ｈ２領域は、配列番号１３５または１３６の配列を含んでなる。
【００９３】
ある態様では、相補性決定領域は、場合により、以下に示されるような配列番号１４２〜２２６：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１４２〜１５６いずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１５７〜１７４のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１７５〜１９５のいずれか１つから選択される；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００９４】
ある態様では、前記軽鎖可変領域は、以下に示されるアミノ酸配列：
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１４０および／または
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１４１
を含んでなる相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２をさらに含んでなる。
【００９５】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、表３Ａおよび３Ｄ〜３Ｉに示されるようなＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３アミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる。
【００９６】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、αＫｌｏｔｈｏのエピトープＢと結合し、かつ、表３Ａおよび／または３Ｄ〜３Ｆに示されるようなＣＤＲ領域を含んでなる。
【００９７】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントは、表３Ａに示されるようなエピトープＢに特異的として同定された抗体のＣＤＲ領域を含んでなる。
【００９８】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントのＣＤＲは、表３Ａに示されるようなクローン４８０４、４８０５、４８０７、４８０８、４８０９、４８１１、４８１２、４８１３、４８１５、４８１６、４８１８、４８２０、４８２１、４８２２、４８２３、４８２４、４８２５、４８２６、４８２７、４８２９、４８３２、４８３３および４８３４に関して示されるものから選択される。
【００９９】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントは、表３Ａおよび／または３Ｇ〜３Ｉに示されるようにエピトープＣに特異的として同定された抗体のＣＤＲ領域を含んでなる。
【０１００】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントは、表３Ａに示されるようにエピトープＣに特異的として同定された抗体のＣＤＲ領域を含んでなる。
【０１０１】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントのＣＤＲは、表３Ａに示されるようにクローン４８１４、４８１９、４８３０および４８３１に関して示されるものから選択される。
【０１０２】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗体および／または結合フラグメントのＣＤＲは、表３Ａに示されるようにクローン４８０６、４８１０、４８１７および４８２８に関して示されるものから選択される。
【０１０３】
一例として、全長軽鎖および重鎖可変領域のコンテキストにおける抗体ｓｂ１７３（クローンｉｄ  ４８０８）のＣＤＲ配列を表４に示す。ＣＤＲ領域を表す下線の残基は、例えば、表３Ａに示されるように、本明細書に記載の他のＣＤＲ配列で置換されてもよい。
【０１０４】
抗体、場合により、ヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含むいずれのクラスの免疫グロブリンでも；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいずれのアイソタイプでもよい。
【０１０５】
いずれのＦａｂクローンも、例えば、サブクローニングによって、例えば、全長免疫グロブリン分子に挿入可能である。ここで同定されたＦａｂクローンのＣＤＲは、ＣＤＲグラフト抗体を作製するために抗体にグラフトすることができる。
【０１０６】
ヒト化またはキメラ抗体は、１以上のアイソタイプまたはクラス由来の配列を含み得る。
【０１０７】
さらに、本明細書に記載の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’  Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよびシングルドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントとして、または重鎖および軽鎖がスペーサーにより連結された一本鎖抗体として生産されてもよい。また、ヒトまたはキメラ抗体は、モノマー型またはポリマー型で存在してもよい。
【０１０８】
キメラ抗体は、組換え技術を用いて作製することができる。実施例に記載されるように、スクリーニングで同定されたＦａｂは、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、例えば、実施例に示されるようにヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を用いてＩｇＧタンパク質を生産することによって、全長ＩｇＧに再構成した。他所に記載されるように、抗体を発現させるのに好適ないずれの細胞種も使用可能である。
【０１０９】
さらに別の態様では、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３および重鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ配列番号１４２〜１５６、配列番号１５７〜１７４、配列番号１７５〜１９５、および配列番号１９６〜２２６と少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【０１１０】
ある態様では、抗体、その結合フラグメント、場合により、ＣＤＲ配列は１以上の保存的置換を有する。
【０１１１】
１つの態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、フラグメントｓｃＦａｂを含む一本鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される。
【０１１２】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントは、合成することができるか、または組換え技術によって発現させることができる。
【０１１３】
抗体はまた、従来技術を用いてフラグメント化することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を減らす処理をするとＦａｂ’フラグメントが作製できる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらし得る。
【０１１４】
ある態様では、抗体はヒト抗体である。
【０１１５】
ヒト抗体は場合により、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号および同第５，７７０，４２９号）。このアプローチでは、キメラまたは生殖細胞系列突然変異マウスにおいて重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子が削除される。次に、このような突然変異マウスにヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移入する。その後、得られたトランスジェニックマウスは、抗原刺激時にヒト抗体の全レパートリーを生成する能力を有する。
【０１１６】
ある態様では、抗体は、配列番号１４０〜２２６から選択される１以上のＣＤＲを含んでなるキメラ抗体である。
【０１１７】
実施例１５に示されるように、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントは、いくつかの種と交差反応性がある。ある態様では、結合したαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、哺乳動物αＫｌｏｔｈｏポリペプチドであり、例えば、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、ヒトαＫｌｏｔｈｏポリペプチド、またはマウスαＫｌｏｔｈｏポリペプチドもしくはラットαＫｌｏｔｈｏポリペプチドなどの齧歯類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドから選択される。
【０１１８】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、マウスαＫｌｏｔｈｏよりもヒトαＫｌｏｔｈｏに優先的に結合する。
【０１１９】
別の態様では、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである。例えば、本抗体および／またはその結合フラグメントは、尿、血漿、および／または血清中に見られる可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する。
【０１２０】
実施例１６に示されるように、本明細書で開示されるＦａｂフラグメントは、αＫｌｏｔｈｏ単独および複合体（αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ）と結合することができた。さらに別の態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを含んでなる複合体と結合する。例えば、複合体は、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、場合により、ＦＧＦＲ１ｃとともに含んでなり得る。
【０１２１】
さらなる態様では、本抗体および／または結合フラグメントは、例えば、診断薬を生産するために、標識され、かつ／またはタグとコンジィゲートされる。例えば、検出可能なタグは、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ビオチンまたはＦＬＡＧタグなどの精製タグであり得る。
【０１２２】
標識は、好ましくは、直接または間接的に検出可能なシグナルを生成することができる。例えば、標識は、放射線不透過性もしくは３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンなどの蛍光（蛍光団）もしくは化学発光（発色団）化合物；アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素；造影剤；または金属イオンであり得る。
【０１２３】
本開示の別の側面は、抗体および／またはその結合フラグメントとαＫｌｏｔｈｏを含んでなる、場合により、ＦＧＦＲ１ｃをさらに含んでなる抗体複合体に関する。
【０１２４】
ある態様では、抗体複合体は、ＦＧＦＲ１ｃを含んでなり、場合により、ＦＧＦ２３をさらに含んでなる。
【０１２５】
ある態様では、本抗体および／またはその結合フラグメントは、単離された抗体および／またはその結合フラグメントである。
【０１２６】
さらに別の側面は、抗体および／またはその結合フラグメント、例えば、本明細書に記載のその結合フラグメントをコードする核酸である。ある態様では、核酸は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１２３、１２６〜１３０、１４２、１４８もしくは１４９のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１２１もしくは１２４；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１２２もしくは１２５；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１９６〜２２６のいずれか１つから選択される
のうち１以上を含んでなる抗体および／またはその結合フラグメントをコードする。
【０１２７】
ある態様では、抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸は、以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号２２９〜２４３のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号２４４〜２６２のいずれか１つから選択される；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号２６３〜２８５のいずれか１つから選択される；および／または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２８６〜３１６のいずれか１つから選択される
をさらに含んでなる。
【０１２８】
ある態様では、前記軽鎖可変領域は、以下に示される核酸配列：
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号２２７および／または
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号２２８
を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２を含んでなる。
【０１２９】
異なるエピトープと結合するＣＤＲの変異体が記載される。加えて、遺伝コードの縮重は、異なる核酸が同じアミノ酸配列をコードすることを可能とする。よって、少なくとも中等度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列とハイブリダイズし、かつ、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合もする抗体をコードするヌクレオチド配列も含まれる。
【０１３０】
また、別の態様では、コドン縮重またはコドン最適化配列も含まれる。別の態様では、核酸配列は、配列番号２２７〜３１６をコードする核酸配列と少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、いっそう最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する（表３Ｂおよび３Ｃに示される通り）。
【０１３１】
本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の特徴のうち１以上を含んでなり得る。
【０１３２】
ある態様では、核酸は単離された核酸である。
【０１３３】
別の側面は、本明細書に開示される核酸を含んでなるベクターである。ある態様では、ベクターは単離されたベクターである。
【０１３４】
ベクターは、例えば、本明細書に記載のベクターを含む、抗体および／またはその結合フラグメントを生産するために好適ないずれのベクターであってもよい。可能性のある発現ベクターとしては、限定されるものではないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
【０１３５】
さらなる側面は、本明細書に開示される抗体および／もしくはその結合フラグメントまたは本明細書に開示されるベクターを生産する組換え細胞である。
【０１３６】
組換え細胞は、ポリペプチドを生産するために好適な、例えば、抗体および／またはその結合フラグメントを生産するために好適ないずれの細胞を用いて作製してもよい。
【０１３７】
好適な宿主細胞としては、多様な原核生物および真核生物宿主細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞などの細菌細胞で発現させることができる。
【０１３８】
より詳しくは、組換え抗体生産細胞を生産するために好適な細菌宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌(B. subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびシュードモナス属(Pseudomonas)、放線菌属(Streptomyces)、およびブドウ状球菌属(Staphylococcus)内の様々な種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が含まれる。好適な細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞内で機能するプロモーター、１以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌複製起点を含んでなる。代表的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系、ｔｒｐプロモーターおよびｔａｃプロモーターが含まれる。代表的な選択マーカーとしては、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの種々の抗生物質耐性マーカーが含まれる。好適な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、λ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）などのプラスミドが含まれる。
【０１３９】
好適な酵母および真菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア属(Pichia)またはクルイベロミセス属(Kluyveromyces)およびアスペルギルス属(Aspergillus)の種々の種が含まれる。酵母Ｓ．セレビシエ内での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、ＣＡ）が含まれる。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコールは、当業者に周知である。
【０１４０】
好適な哺乳動物細胞としては、とりわけ、ＣＯＳ（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ６１）、ＨｅＬａ（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ２）、２９３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５７３）、ＮＳ−１細胞およびこれらの株のいずれの誘導体も含まれる。
【０１４１】
ある態様では、組換え抗体を生産するために使用される哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３細胞またはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から選択される。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞株は、２９３細胞株に由来し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ２９３発現系、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系または他の発現系とともに使用可能である。
【０１４２】
哺乳動物細胞内で発現を命令するために好適な発現ベクターは一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０などのウイルス材料に由来）、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。
【０１４３】
ある態様では、ベクターは、軽鎖またはＩｇＧ１重鎖の生産用に設計される。
【０１４４】
好適な昆虫細胞としては、カイコ(Bombyx)またはスポドプテラ(Spodotera)種に由来する細胞および細胞株が含まれる。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）内でのタンパク質発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ種およびｐＶＬ種が含まれる。
【０１４５】
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性の増強；組換えペプチドの溶解度の増強；および例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含め、アフィニティー精製においてリガンドとして働くことによる標的組換えペプチドの精製の補助を提供する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする遺伝子を含有し得る。さらに、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質の分離を可能とするために、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を付加してもよい。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを組換えタンパク質と融合するｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェイ、ＮＪ）が含まれる。
【０１４６】
「作動可能に連結」とは、核酸が調節配列と、その核酸の発現を可能とする様式で連結されることを意味するものとする。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む様々な供給源に由来し得る。適当な調節配列の選択は、選択される宿主細胞によって異なり、当業者ならば容易に達成することができる。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボゾーム結合配列が挙げられる。加えて、選択される宿主細胞および使用されるベクターによって、複製起点、付加的ＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列などの他の配列を発現ベクターに組み込んでもよい。
【０１４７】
ある態様では、抗体またはその結合フラグメントの発現は、誘導プロモーターの制御下にある。誘導性の非融合発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（２８）およびｐＥＴ  １１ｄが挙げられる。
【０１４８】
組換え発現ベクターはまた、本発明の換え分子で形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子も含有し得る。選択マーカー遺伝子の例は、Ｇ４１８などのタンパク質および特定の薬物に対して耐性を付与するハイグロマイシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタル・ルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン、好ましくは、ＩｇＧのＦｃ部分などのその一部をコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタル・ルシフェラーゼなどの選択マーカータンパク質の濃度の変化によってモニタリングされる。選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞はＧ４１８で選択することができる。選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存するが、その他の細胞を死滅する。これにより本発明の組換え発現ベクターの発現に関して可視化およびアッセイすること、特に、発現および表現型に対する突然変異の効果を決定することが可能となる。選択マーカーは対象とする核酸とは別のベクターで導入することもできることが認識されるであろう。他の選択マーカーとしては、対象とする核酸とともに形質導入され得るＧＦＰなどの蛍光タンパク質が含まれる。
【０１４９】
さらに別の側面は、抗体および／またはその結合フラグメント、本明細書に開示される核酸または本明細書に開示される組換え細胞を、場合により、好適な希釈剤または担体と組合わせて含んでなる組成物である。
【０１５０】
本組成物は、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性溶液または懸濁液であり得、抗酸化剤、バッファー、静菌剤および溶質をさらに含み得る。このような組成物中に存在し得る他の成分としては、例えば、水、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。
【０１５１】
核酸に好適な希釈剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。
【０１５２】
抗体もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドおよび／または細胞に好適な希釈剤としては、限定されるものではないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結させるのに好適な他の溶液が挙げられる。
【０１５３】
組成物は、生理学的バッファーに添加される分解防止剤、例えば、還元剤、疎水性添加剤、およびプロテアーゼ阻害剤をさらに含んでなり得る。
【０１５４】
ＩＩＩ．方法
本開示の別の側面は、αＫｌｏｔｈｏに対して特異的結合親和性を有し、かつ、ｓｂ１０６抗体により認識されるエピトープとは異なる、αＫｌｏｔｈｏのエピトープと結合する、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントを単離または生産する方法である。
【０１５５】
従前に述べたように、ｓｂ１０６抗体は、それぞれ配列番号９、１０および５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域とを含んでなる。
【０１５６】
異なるエピトープと結合するさらなるαＫｌｏｔｈｏ特異的抗体は、例えば、検出アッセイを確立するために望ましい。本明細書に記載されるように、αＫｌｏｔｈｏに対する抗体は、飽和レベルの元のｓｂ１０６  Ｆａｂの存在下でヒトαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で行った抗体−ファージディスプレー選択により想定した。この方法を用い、３１抗体が、αＫｌｏｔｈｏの全く別のエピトープを認識するとして、また、ｓｂ１０６の存在下および不在下でαＫｌｏｔｈｏと結合するとして同定された（実施例１０および図９）。これらの抗体は、表５に示されるように、１０ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を示す。１つの態様では、この方法は、可溶性αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する抗体に関して抗体ライブラリーをスクリーニングすること、および抗体ライブラリーから抗体を単離することを含んでなる。例えば、抗体ライブラリーは、抗体ファージディスプレーライブラリーであり得る。１つの態様では、抗体ファージディスプレーライブラリーは、ヒトＦａｂファージディスプレーライブラリーである。
【０１５７】
ある態様では、抗体ライブラリーからαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体を単離するために、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドを用いる。ある態様では、抗体ライブラリーからαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体を単離するために、エピトープＡ、ＢまたはＣに特異的なＣＤＲ領域を有する抗体または結合フラグメントと複合体を形成したαＫｌｏｔｈｏを用いる。
【０１５８】
別の態様では、単離および精製された抗体および／またはその結合フラグメントは親和性成熟される。親和性成熟は、例えば、ＣＤＲ配列の変異体を含んでなるファージライブラリーを用い、プラスチックプレートに吸着させた抗原で、初期選択に関して記載されるように行うことができる。
【０１５９】
当業者ならば、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏに対して特異的結合親和性を有する抗体および／またはその結合フラグメントを単離および生産するためにいくつかの方法が使用可能であることを認識するであろう。使用可能な方法はファージディスプレー法である。例えば、抗体および／またはその結合フラグメントを単離および特性評価するために、二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ１Ｒｃ複合体が生成される。ファージは、数回のパンニングの後にヒトＦａｂファージディスプレーライブラリーから選択される。ＥＬＩＳＡで決定した場合に、二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ１Ｒｃ複合体に対して特異的結合親和性を有するファージを配列決定し、軽鎖または重鎖の生産用に設計されたベクターにクローニングする。重鎖は、例えば、ＩｇＧ、またはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４などのＩｇＧアイソタイプであり得る。次に、抗原結合フラグメントおよびＩｇＧポリペプチドは、例えばプロテインＡアフィニティーカラムを使用することによってアフィニティー精製する。
【０１６０】
別の態様では、抗体および／またはその結合フラグメントを作製するために、本明細書に記載の抗体をコードする核酸を宿主細胞で発現させる。ある態様では、本方法は、
ａ．宿主細胞内で本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸を発現させること；
ｂ．抗体および／またはその結合フラグメントを生産するために前記宿主細胞を培養すること；ならびに
ｃ．前記抗体および／またはその結合フラグメントを前記宿主細胞から単離および／または精製すること
を含んでなる。
【０１６１】
いくつかの態様では、一本鎖抗体をコードする核酸が発現される。他の態様では、例えば、抗体軽鎖をコードする核酸および抗体重鎖をコードする核酸など、複数の核酸が発現される。
【０１６２】
好適な宿主細胞およびベクターは上記されている。本明細書に記載の抗体をコードするベクターおよび核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチンおよび他のリポソームに基づくトランスフェクション剤、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの従来技術によって哺乳動物細胞に導入され得る。
【０１６３】
本明細書に記載の抗体をコードする核酸は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターなどの送達ビヒクルを用いて哺乳動物細胞に直接導入され得る。
【０１６４】
実施例１３に記載されるように、これらの抗体が、ヒト尿サンプルにおいてＦａｂとして、免疫沈降−イムノブロットアッセイを用いて試験された。結果は、これらの抗体はαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させる能力を有することを示す（図１３）。これらの抗体を、Ｆａｂとしてヒト患者尿サンプルからαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させるそれらの能力に関してアッセイした。
【０１６５】
Ｖ．アッセイ
本明細書に開示されるαＫｌｏｔｈｏ特異的抗体は、異なるエピトープと結合し、サンプル中のαＫｌｏｔｈｏと結合し、それを検出および測定するための種々のアッセイで使用することができる。例えば、これらの抗体は、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）ならびに場合によりイムノブロット検出と組合わせた免疫沈降において使用することができる。抗体に基づく検出はまた、例えば、粒子に基づくフローサイトメトリーアッセイのように、質量分析アッセイと組合わせることもできる。
【０１６６】
本明細書に記載されるような免疫検出法は一般に、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントを用いた、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体の検出または測定を含む。このような複合体の検出は当技術分野で周知であり、種々の方法を介して、例えば、放射性タグ、蛍光タグまたは酵素タグなどの検出可能な標識またはマーカーを使用することによって達成され得る。これらの複合体の検出は、αＫｌｏｔｈｏに、または抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体に特異的な二次抗体および／またはその結合フラグメントなどのリガンドの使用も含み得る。
【０１６７】
それらはまた、検出アッセイ、例えば、１つの抗体がαＫｌｏｔｈｏを単離するための捕捉試薬として使用でき、全く別のエピトープと結合する別の抗体を検出試薬として使用できる場合にはサンドイッチＥＬＩＳＡを作製するために使用することもできる。
【０１６８】
エピトープＡおよびＢは、αＫｌｏｔｈｏのアミノ酸５５０〜９８１に位置し、エピトープＣは、αＫｌｏｔｈｏのアミノ酸１〜５４９に位置する。実施例１４、図１４に示されるように、異なるエピトープと結合する３つの抗体を、αＫｌｏｔｈｏの２つの異なる部分、すなわち、αＫｌｏｔｈｏのアミノ酸１〜５４９およびアミノ酸３４〜９８１とともにインキュベートした。エピトープＡと結合するクローン４８（ｓｂ１０６）およびエピトープＢと結合するクローン４８０８は両方ともαＫｌｏｔｈｏのアミノ酸５５０〜９８１内で結合し、一方、エピトープＣと結合するクローン４８３１はアミノ酸１〜５４９内で結合する。
【０１６９】
よって、別の側面は、１以上の本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメント（例えば、エピトープＢまたはＣに特異的）を含んでなるイムノアッセイである。
【０１７０】
ある態様では、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。抗体および／またはその結合フラグメントは、ＥＬＩＳＡ、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡなどの検出アッセイに関して使用可能である。実施例１４および図１５に示されるように、これらの抗体は、溶液中のαＫｌｏｔｈｏの検出のための捕捉および検出抗体として使用した。エピトープＡ（ｓｂ１０６）、Ｂ（ｓｂ１７７）またはＣ（ｓｂ２００）を認識する全長ＩｇＧを固定化し、αＫｌｏｔｈｏとともにインキュベートした。次に、これらのサンプルを、エピトープＡ、ＢまたはＣを認識するビオチン化ＩｇＧとともにインキュベートした。
【０１７１】
ある態様では、ＥＬＩＳＡは、捕捉抗体と検出抗体を含んでなるサンドイッチＥＬＩＳＡであり、前記捕捉抗体は、本明細書に特定されるＣＤＲを有しかつ、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する、例えば、エピトープＡ、ＢもしくはＣと特異的に結合する抗体もしくはその結合フラグメントであり、ならびに／または前記検出抗体は、本明細書に特定されるＣＤＲを有しかつ、αＫｌｏｔｈｏと特異的に結合する、例えば、エピトープＡ、ＢもしくはＣと特異的に結合する抗体もしくはその結合フラグメントであり、前記捕捉抗体および検出抗体は異なるエピトープと結合する。
【０１７２】
１つの態様では、前記捕捉抗体および検出抗体は、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメント、ならびに配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有するｓｂ１０６抗体から選択される。
【０１７３】
別の態様では、捕捉抗体および検出抗体の一方は、表３に特定されるＣＤＲを有する本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントであり、捕捉抗体および検出抗体の他方は、場合により、それぞれ配列番号１１および１２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖および重鎖可変領域を有するｓｂ１０６抗体またはその変異体に関して特定されるＣＤＲを有する抗体である。
【０１７４】
１つの態様では、本イムノアッセイは、αＫｌｏｔｈｏのエピトープＢまたはＣと結合する、本明細書に記載のＣＤＲを有する抗体および／またはその結合フラグメント、ならびにエピトープＡと結合すると同定されたｓｂ１０６抗体またはその変異体のＣＤＲを有する抗体を含んでなる。
【０１７５】
例えば、捕捉抗体はエピトープＡと結合し、検出抗体はエピトープＢと結合する。例えば、捕捉抗体はエピトープＡと結合し、検出抗体はエピトープＣと結合する。例えば、捕捉抗体はエピトープＢと結合し、検出抗体はエピトープＡと結合する。例えば、捕捉抗体はエピトープＢと結合し、検出抗体はエピトープＣと結合する。例えば、捕捉抗体はエピトープＣと結合し、検出抗体はエピトープＡと結合する。例えば、捕捉抗体はエピトープＣと結合し、検出抗体はエピトープＢと結合する。
【０１７６】
１つの態様では、抗体またはその変異体はｓｂ１０６−Ｆａｂ（Ｆｓｂ１０６）である。
【０１７７】
１つの態様では、本イムノアッセイは、サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを検出および／または測定するためのものであり、イムノアッセイの作製方法は、
ａ）固相支持体を捕捉抗体でコーティングすること；
ｂ）捕捉抗体をサンプルと、捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること；
ｃ）結合してないサンプル除去すること；
ｄ）捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出抗体と接触させること；
ｅ）結合してない検出抗体を除去すること；および
ｆ）捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる。
【０１７８】
ある態様では、ＥＬＩＳＡは競合的ＥＬＩＳＡ法である。ある態様では、ＥＬＩＳＡは直接的ＥＬＩＳＡである。ある態様では、ＥＬＩＳＡは間接的ＥＬＩＳＡである。
【０１７９】
本明細書で使用する場合、「固相支持体」には、本明細書に開示されるαＫｌｏｔｈｏポリペプチドおよび抗体および／またはその結合フラグメントが結合し得るいずれの材料も含まれる。例えば、固相支持体は、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および修飾セルロースおよびポリアクリルアミドを含み得る。例えば、固相支持体は、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、ラテックスビーズまたはアレイ表面である。
【０１８０】
例えば、サンプルは、抗体および／またはその結合フラグメントと、適当な条件下、例えば、所与の温度およびαＫｌｏｔｈｏの抗体への有効な結合を可能とする、従って、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体、例えば、捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体の形成を可能とするのに十分な期間接触させる。例えば、接触工程は、室温で約３０分間、約６０分間、約２時間または約４時間行われる。例えば、接触工程は、約４℃で一晩行われる。
【０１８１】
例えば、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントは、好適なバッファー中でαＫｌｏｔｈｏと複合体を形成する。例えば、バッファーは、約５．０〜約１０．０のｐＨを有する。例えば、バッファーは、４．５、６．５または７．４のｐＨを有する。例えば、バッファーは、ＨＢＳ−ＥＰバッファー、ＫＲＨバッファーまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水である。例えば、バッファーは、ＢＳＡおよび／またはＴｗｅｅｎ２０を含んでなる。
【０１８２】
例えば、形成された抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体だけが固相支持体上に残るように洗浄することにより、いずれの結合してないサンプルも除去することができる。例えば、結合してないサンプルを、場合によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んでなるリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１８３】
ある態様では、検出抗体は標識および／またはタグとコンジュゲートする。
【０１８４】
例えば、検出抗体は、直接標識および／またはコンジュゲートされる。例えば、検出抗体は、間接的に標識および／またはコンジュゲートされる。間接的標識としては、例えば、蛍光または化学発光タグ、抗体に結合された金属、色素または放射性核種が含まれる。間接的標識としては、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼおよびウレアーゼが含まれる。例えば、ＨＲＰは、発色基質、例えば、過酸化水素の存在下で、４５０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を産生するテトラメチルベンジジンと併用可能である。
【０１８５】
さらに別の側面は、サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを検出するおよび／またはレベルを測定するアッセイであり、このアッセイは、
ａ）サンプルを本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントと、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること；ならびに
ｂ）抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる。
【０１８６】
さらなる側面は、可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出および／または測定するアッセイであり、この方法は、
ａ）体液であるサンプルを本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントと、抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること；ならびに
ｂ）抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる。
【０１８７】
ある態様では、アッセイは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈを検出するためのものであり、アッセイは、非変性または軽度変性条件下で行われる。
【０１８８】
ある態様では、複合体は直接検出され、例えば、抗体は検出可能なタグまたは融合部分で標識される。ある態様では、複合体は、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体に特異的な二次抗体を用いて間接的に検出される。
【０１８９】
ある態様では、アッセイは、免疫沈降、イムノブロット、免疫組織化学または免疫細胞化学近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、質量分析に基づく技術と蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、および質量分析に基づく技術である。
【０１９０】
ある態様では、本方法は、可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出するためのものであり、例えば、サンプルは体液である。
【０１９１】
検出は、定量的方法を用いて、例えば標準または標準曲線と比較することによって定量または測定される方法を用いて行うことができる。
【０１９２】
ある態様では、体液サンプルは血液、または血清もしくは血漿などのその一部、または尿である。
【０１９３】
さらに別の側面は、対象において慢性腎臓病（ＣＫＤ）および急性腎障害（ＡＫＩ）から選択される腎不全をスクリーニング、診断または検出する方法に関し、この方法は、
ａ．場合により本明細書に開示される抗体またはアッセイを用いて、対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること；および
ｂ．サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、対象がＣＫＤまたはＡＫＩから選択される腎臓病態を有することを示す。
【０１９４】
ある態様では、対照は、ＣＫＤまたはＡＫＩの無い対象群から導かれた参照値、例えば、正常対照である。
【０１９５】
ある態様では、ＣＫＤは、早期ＣＫＤ、場合により、病期１、病期２、または病期３、病期４、病期５または病期６  ＣＫＤである。
【０１９６】
本開示のさらなる側面は、αＫｌｏｔｈｏ欠乏のレベルを測定することにより評価される、ＣＫＤの進行もしくはＡＫＩの進行もしくはそれが無いこと（例えば、疾患の回復または悪化）、またはＣＫＤにおける腎外合併症の予後を診断する方法である。
【０１９７】
よって、ある側面は、ＡＫＩ後の回復の見込みの予後を診断する方法であり、この方法は、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること；および
ｂ．サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照、例えば、回復しなかったまたは進行した対象群から導かれた対照と比較すること
を含んでなり、対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、対象のＡＫＩ後の回復の見込みが高いことを示す。
【０１９８】
ある態様では、対照は、回復しなかった対象群から導かれた対照値であり、対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、対象のＡＫＩ後の回復の見込みが低いこと、および／または疾病の進行の見込みが高いことを示す。
【０１９９】
別の側面は、ＡＫＩ後の長期合併症の見込みの予後を診断する方法であり、この方法は、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること；および
ｂ．サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照、長期合併症を有する、もしくは長期合併症の数が多い対象群から導かれた対照値と比較すること
を含んでなり、
対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、対象のＡＫＩ後の長期合併症が少ない見込みが高いことを示す。
【０２００】
ある態様では、対照は、長期合併症を有さないまたは長期合併症が少ない対象群から導かれた対照値であり、対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、対照の長期合併症を有する見込みが高い、またはＡＫＩ後の長期合併症の数が多いことを示す。
【０２０１】
さらなる側面は、ＣＫＤの進行の見込みの予後を診断する方法であり、この方法は、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること；および
ｂ．サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が（ここで、対照は、回復しなかった、または進行した対象群から導かれた対照値である）、前記対象のＣＫＤからの回復の見込みが高いことを示す。
【０２０２】
ある態様では、対照は、回復しなかった対象群から導かれた対照値であり、対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、対象のＣＫＤ後の回復の見込みが低いこと、および／または疾患進行の見込みが高いことを示す。
【０２０３】
さらに別の側面は、ＣＫＤにおける腎外合併症の予後を診断する方法であり、この方法は、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること；および
ｂ．サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、対象のＣＫＤ関連の腎外合併症が少ない見込みがより高いことを示す。
【０２０４】
ある態様では、対照は、腎外合併症を有さない、または腎外合併症が少ない対象群から導かれた対照値であり、対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、長期合併症またはＣＫＤ後の多数の腎外合併症を有する見込みが高いことを示す。
【０２０５】
さらなる側面は、ＣＫＤまたはＡＫＩなどの腎不全病態を有する対象を経過観察する方法であり、この方法は、
ａ．対象由来のサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること；および
ｂ．サンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルを他の従前の参照サンプルまたは他の対照と比較すること
を含んでなり、
従前の参照サンプルまたは他の対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、対象の腎臓病態が改善していること、および従前の参照サンプルまたは他の対照と比較したサンプル中のαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、対象の腎臓病態が悪化していることを示す。
【０２０６】
サンプルは例えば対象が処置を受けた後に採取され、例えば処置前のサンプルと比較することができる。あるいは、患者は、繰り返し間隔の後に、例えば処置または他の介入が必要であるかどうかを評価すえるために経過観察することもできる。ある態様では、検査を繰り返し、対象の進行を評価するためにプロットする。
【０２０７】
ある態様では、サンプルは、体液、例えば、血液、または血漿もしくは血清などのその画分であり、本方法は、例えば、可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出する。ある態様では、体液は尿である。
【０２０８】
別の態様では、サンプルは、新鮮体液サンプルまたは組織サンプルなどの新鮮サンプル（例えば、無冷凍または１回冷凍（例えば、サンプル取得時に１回の冷凍））および反復冷凍サンプル（例えば、冷凍および解凍および冷凍体液サンプルまたは反復冷凍組織サンプル）から選択される。ある態様では、サンプルは、軽度固定サンプルなどの固定サンプルであり、固定は限定された変性および／または脱折りたたみを誘導する。
【０２０９】
ある態様では、αＫｌｏｔｈｏのレベルが、本明細書に記載の抗体または結合フラグメントを用いて測定される。
【０２１０】
腎臓病を診断、検出もしくは経過観察する、または疾患合併症の予後を診断する本明細書に開示される方法は、腎臓病の従来の診断技術に加えて、またはそれらと組合せて使用することができる。
【０２１１】
本明細書または実施例に記載されるいずれの抗体または抗体の組合せも、前記アッセイで使用可能である。
【０２１２】
ＩＶ．キット
さらなる側面は、滅菌バイアルなどのバイアルまたは他のハウジングに含まれ本明細書に開示されるｉ）抗体および／もしくはその結合フラグメント、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）組成物、またはｉｖ）組換え細胞と場合により参照薬剤および／またはその使用説明書を含んでなるキットに関する。
【０２１３】
ある態様では、本キットは、それぞれ配列番号９、１０および５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変領域とを有する付加的抗体および／またはその結合フラグメントをさらに含んでなる。例えば、付加的抗体および／またはその結合フラグメントは、ｓｂ１０６抗体および／またはその結合フラグメントである。
【０２１４】
ある態様では、本キットは、成分を含んでなり、かつ／または本明細書に記載のアッセイの実施において使用するためのものである。
【０２１５】
例えば、本キットは、ＥＬＩＳＡキットであり、第１の抗体、例えば、捕捉抗体、例えば、固相支持体に結合されたもの、およびαＫｌｏｔｈｏおよび／または捕捉抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体と結合し、検出可能な標識とコンジュゲートされた第２の抗体、例えば、検出抗体を含んでなり得る。
【０２１６】
本明細書に記載の抗体のいずれの組合せも使用可能である。
【０２１７】
ある態様では、本キットは、診断キットであり、前記説明書は本明細書に記載の方法に向けられる。
【０２１８】
上記の開示は一般に、本出願を説明する。下記の具体例を参照すれば、より完全な理解が得られる。これらの実施例は単に例示のために記載されるものであり、本出願の半を限定することは意図されない。状況が好都合であることを示唆すれば、または表せば、形態の変化および当業者物の置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は、説明の意味であって限定を目的としないことが意図される。
【０２１９】
下記の限定されない例は、本開示の例示である。
【実施例】
【０２２０】
実施例１
合成抗体ライブラリーをスクリーニングし、ヒトおよび齧歯類αＫｌｏｔｈｏに対して高親和性を有する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を作製した。この新規な抗体ｓｂ１０６を、組換えタンパク質、培養細胞、ならびにヒトおよび齧歯類由来の体液および組織を用いて特性評価した。ヒトおよび齧歯類の血清および尿中のαＫｌｏｔｈｏレベルは正確に定量することができ、早期ヒトＣＫＤでは、血清および尿両方のαＫｌｏｔｈｏが劇的に低下していることが示される。ｓｂ１０６抗体は、Ｋｌｏｔｈｏのα型に特異的であり、現行の市販のαＫｌｏｔｈｏ検出試薬に比べて、明瞭かつ特異的な方法で患者血清サンプルからαＫｌｏｔｈｏを上手く捕捉することが最初に知られたものである。細胞において、この抗体はαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させ、それを免疫細胞化学により標識することができる。動物では、この抗体は、血漿からαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させるのに効果的である。ｓｂ１０６抗体の、体液から少量のαＫｌｏｔｈｏを検出する能力は、この抗体を、αＫｌｏｔｈｏのレベルが異常な疾患の診断のための有価な試薬とする。さらに、ｓｂ１０６抗体は、ＦＧＦ２３により媒介されるシグナル伝達経路を含む生理学的状態および病的状態の研究において研究試薬として有価である。この抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、および質量分析に基づく技術などの様々な技術を用いる、血清などのヒトおよび齧歯類サンプル中の可溶性αＫｌｏｔｈｏに関する特異的アッセイで使用可能である。
【０２２１】
実施例２：二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体の調製
ヒトＦＧＦＲ１ｃのリガンド結合ドメイン（Ｄ１４２〜Ｒ３６５）は、大腸菌(E.coli)で発現され、封入体からイン・ビトロで再折り畳みされ、公開されている方法［７２、７３］により精製した。マウスαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（Ａ３５〜Ｋ９８２）は、Ｃ末端ＦＬＡＧタグとともにＨＥＫ２９３細胞で発現させ、αＫｌｏｔｈｏエクトドメインとＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインの二元複合体は記載のように作製した［９］。
【０２２２】
ｓｂ１０６の単離および特性評価
Ｓｂ１０６は、合成ヒトＦａｂファージディスプレーライブラリー（ライブラリーＦ）から単離された［７４］。結合選択、ファージＥＬＩＳＡおよびＦａｂタンパク質精製  は記載のように行った［６７、７５、７６］。簡単に述べれば、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ネピアン、ＯＮ、カナダ）にて捕捉標的としてαＫｌｏｔｈｏ細胞外ドメインＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインの二元複合体で複数回パンニングすることによりライブラリーＦからのファージを循環させた。５回の選択後、９６ウェル形式で増殖させた個々のクローンからファージを生成し、特異的結合クローンを検出するためにファージＥＬＩＳＡを行った。結合を示したクローンに対してＤＮＡシークエンシングを行った。競合的結合ＥＬＩＳＡは、ｓｂ１０６−ファージを可溶性ヒトαＫｌｏｔｈｏの希釈系（５０〜０．０００５ｎＭ×１時間）とともにプレインキュベートした後、ヒトαＫｌｏｔｈｏでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合させることにより行った。ｓｂ１０６の重鎖可変および軽鎖ドメインをコードする遺伝子をそれぞれ軽鎖またはＩｇＧ１重鎖の生産用に設計されたベクターにクローニングし、ｓｂ１０６−ＩｇＧを２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ．ＵＳＡ）から発現させた。ＦａｂおよびＩｇＧタンパク質をプロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ミシサガ、ＯＮ、カナダ）でアフィニティー精製した。
【０２２３】
タンパク質の精製
ＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインとマウスαＫｌｏｔｈｏエクトドメインの二元複合体（αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と呼称）を公開されているプロトコール［９］によって作製した。Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを有する成熟型のヒトＦＧＦ２３（Ｙ２５〜Ｉ２５１）を公開されているプロトコール［７３、７４、７７］により、大腸菌で発現させ、精製した。
【０２２４】
ＳＰＲ分光法によるαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対するＦａｂ結合の分析
リアルタイムタンパク質−タンパク質相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光計（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０）中で測定した。タンパク質は、研究級のＣＭ５バイオセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシメチル（ＣＭ）デキストランに、それらの遊離アミノ基を介して共有結合させた。タンパク質をバイオセンサーチップ上に、流速５０μｌ  分−１で注入し、各タンパク質注入（１８０秒）の終了時に、解離をモニタリングするために１８０秒間、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（５０μｌ  分−１）をチップに流した。タンパク質注入間で、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、または１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム、ｐＨ６．５を注入してチップ表面を再生した。データはＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアバージョン４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理した。各タンパク質注入で、対照フローチャネルに関して記録された非特異的ＳＰＲ応答をサンプルフローチャネルに関して記録された応答から差し引いた。
【０２２５】
ＥＬＩＳＡにより選択されたＦａｂがαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と結合するかどうかを調べるために、二元受容体複合体をＣＭ５チップに固定化した（チップフローチャネル約４２ｆｍｏｌ  ｍｍ−２）。非特異的結合の対照とするために、αＫｌｏｔｈｏの２つの細胞外グリコシダーゼ様ドメインのそれぞれと構造上関連のあるウシβ−グルクロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をチップの対照フローチャネルに結合させた（フローチャネル約４５ｆｍｏｌ  ｍｍ−２）。１００ｎＭの各Ｆａｂをチップ上に注入した。対照として、ＧＦ２３の固定化αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体への結合を調べた。
【０２２６】
ＦａｂがＦＧＦ２３と競合し得るか、かつ／またはαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に結合し得るかを調べるために、ＦＧＦ２３をＣＭ５チップに固定化した（チップフローチャネル約１６ｆｍｏｌ  ｍｍ−２）。ＦＧＦと構造上類似するがｓＦＧＦＲ結合は示さないＦＨＦ１Ｂ［７７］を、非特異的結合の対照として使用した（対照フローチャネル約１５ｆｍｏｌ  ｍｍ−２）。１０ｎＭのαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体（ＨＢＳ−ＥＰバッファー）を混合した１００ｎＭのＦａｂをチップ上に注入した。対照として、溶液中で競合因子としてＦＧＦ２３を用い、結合競合を行った。
【０２２７】
細胞培養、動物およびヒト研究
細胞株：  天然にαＫｌｏｔｈｏを発現する正常ラット腎（ＮＲＫ）細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ、ＵＳＡ）、およびベクター単独、全長膜貫通マウスαＫｌｏｔｈｏ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有するマウスαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン、または全長マウスαＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞［７８］。細胞は３７℃、９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気で培養し、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した高グルコース（４５０ｍｇ／ｄｌ）ＤＭＥＭ中で継代培養した。
【０２２８】
動物試験は、テキサス大学サウスウェスタン医療センター施設内動物実験委員会により承認された。動物は総て動物資源センターで飼育し、実験は完全に承認を受けた実験室で行った。使用した種は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ．インディアナポリス、ＩＮ）、Ｋｌｏｔｈｏトランスジェニック過剰発現体（Ｔｇ−Ｋｌｏｔｈｏ；ＥＦｍＫＬ４６系統）［７９］、同型接合αＫｌｏｔｈｏ低次形態マウス（Ｋｌ／Ｋｌ）［８０］、およびそれらの野生型同腹子（１２９ｓｖバックグラウンド）を含む。
【０２２９】
臨床歴および慣例の検査データは電子カルテから取得した。前肘静脈穿刺からの血液サンプルを回転させ、血清を−８０℃で冷凍した。新鮮尿は、４，０００ｇで回転させ、上清を−８０℃で冷凍した。
【０２３０】
免疫細胞化学および免疫組織化学
ＨＥＫ２９３細胞をベクターまたは示されているαＫｌｏｔｈｏプラスミドでトランスフェクトし、ポリリシンで前処理した１２ウェルのカバーガラス上に播種し（１．８×１０５細胞／ｍｌ）、一晩増殖させた。細胞を洗浄し（４℃  ＰＢＳ×３）、３％パラホルムアルデヒドで固定し（４℃×１０分）、洗浄し（氷冷ＰＢＳ×３）、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ  ４４℃×１０分）でブロッキングし、ｓｂ１０６−Ｆａｂ（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中５ｕｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、洗浄し（ＰＢＳ  ４℃×５）、抗ＦＬＡＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：４００希釈；１時間；２０℃）とともにインキュベートし、洗浄し（ＰＢＳ；４℃×４）、次いで、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１滴の退色防止剤を含むスライドガラス上に逆さに置き、暗所、室温で乾燥させた。２４時間後、、これらのスライドを−２０℃で保存した。画像はＷａｖｅＦＸスピニングディスク型共焦顕微鏡で取得した。
【０２３１】
副甲状腺および甲状腺（気管と一体）を成体Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから得た。非固定新鮮副甲状腺の場合には、組織をＯＣＴ媒体に包埋し、すぐに液体Ｎ２中で予冷したイソペンタンを用いて冷凍した。固定副甲状腺サンプルの場合には、組織をＢＳ  ｐＨ７．４中４％パラホルムアルデヒド中に４℃で一晩浸漬し、ＰＢＳで洗浄し、ＯＣＴ媒体に包埋し、液体Ｎ２中で予冷したイソペンタンを用いて冷凍した。４μｍ厚のクリオスタット切片を作製し、ＰＢＳ中で洗浄し（１５分）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で透過処理を施した（１０分）。標識については、切片をブロッキングし（ＰＢＳ、１．５％ＢＳＡ、１０％ヤギ血清；４０分）、一次抗体ｓｂ１０６（ブロッキング溶液中２１μｇ／ｍｌ；４℃で一晩）とともにインキュベートした。洗浄後（ＰＢＳ）、切片をＡｌｅｘａ  ５４６ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：８００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでさらに洗浄した後、切片をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、マウントし、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０顕微鏡で可視化した。
【０２３２】
実施例３：αＫｌｏｔｈｏアッセイおよび詳細な方法
ＥＬＩＳＡは、製造者（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、日本）が説明しているように行った。ＩＰ−ＩＢアッセイについては、一般に、５０μｌの血清または尿をＫＲＨバッファー［２５  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４］で希釈して終容量０．５ｍｌとし、低結合シリコン処理チューブにて、２μｇのｓｂ１０６−Ｆａｂとともに一晩４℃でインキュベートした。ＫＲＨバッファーで３回予備洗浄した、抗ＦＬＡＧ抗体（５０％ｖ／ｖ）をコンジュゲートしたセファロースビーズ（５０μＬ）を加え、インキュベートし、（４℃×２時間）、洗浄した（ＫＲＨ−チューブ当たり５００μｌ  ３回；２２℃）。免疫複合体を２×ＳＤＳサンプルローディングバッファー（５０μｌ；１００℃×３分；４℃×３分；回転）で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＫＬ１抗体（ＫＭ２０７６、１：４０００または３．１ｍｇ／ｍＬ、１：１００００希釈）および希釈剤（Ｄａｋｏ＃Ｓ３０２２、カーピンテリア、ＣＡ、ＵＳＡ）で一晩（４℃、揺動器）でブロットした。膜を洗浄し（３回、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水；ＴＢＳ−Ｔ）、抗ラットＩｇＧ２Ａ（ＬＳＢｉｏ  ｃａｔ＃ＬＳ−Ｃ５９０５１、５％乳汁／２％  ヤギ血清／ＴＢＳ−Ｔ中１：２００００×１時間）に曝し、洗浄した（×３  ＴＢＳ−Ｔ）。化学発光については、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ）で覆い、３０〜９０秒間露光した。１３０ｋＤのバンドをスキャンし、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４を用い、既知量のＫｌｏｔｈｏの内部対照サンプルと比較した。
【０２３３】
実施例４：抗αＫｌｏｔｈｏ合成Ｆａｂの同定
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１ｃのリガンド結合ドメインとの組換えαＫｌｏｔｈｏエクトドメイン複合体に対するファージディスプレー合成Ｆａｂライブラリーの複数回のバイオパンニングの後、いくつかの結合ファージを同定した。クローンｓｂ１０６（図１Ａ）をさらなる特性評価のために選択した。ファージＥＬＩＳＡ（図１Ｂ）において、ｓｂ１０６−ファージはヒトおよびマウス両方のαＫｌｏｔｈｏと結合し、このことは種交差反応性を示し、また、αＫｌｏｔｈｏ単独またはＦＧＦＲ１ｃとの複合体いずれかと結合し、このことはそのエピトープが補助受容体複合体の形成によって隠されていないことを示す。ｓｂ１０６−ファージは、ＦＧＦＲ１ｃ単独、ニュートラアビジン（ＮＡＶ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とは結合しなかった。ｓｂ１０６は、ヒトαＫｌｏｔｈｏと一桁ナノモルの範囲の親和性で結合する（ＩＣ５０＝１．７ｎＭ、図１Ｃ）。ｓｂ１０６−Ｆａｂはまた、バイオセンサーチップ上に固定化されている二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体とも高い親和性で結合し（図７Ａ）、それはＦＧＦ２３、αＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃの間の三元複合体の形成に干渉しない（図７Ｂ）。
【０２３４】
実施例５：抗αＫｌｏｔｈｏＦａｂ  ｓｂ１０６の特性評価
ｓｂ１０６のユニークなＣＤＲ配列（図１Ａ）を用い、Ｆａｂおよび全長ＩｇＧタンパク質の両方を生産した（例えば、Ｆａｂは細菌細胞で、ＩｇＧタンパク質は２９３Ｆ細胞で生産した）。ｓｂ１０６は、天然条件下でαＫｌｏｔｈｏに対して反応性が高かった。変性条件下でのマウス、ラット、およびヒト腎組織に対するイムノブロットシグナルは弱かったが、αＫｌｏｔｈｏを過剰発現するトランスジェニックマウス由来のサンプル［７９］では、ｓｂ１０６−Ｆａｂは、αＫｌｏｔｈｏの全長細胞外ドメインに相当するバンドを検出した（図２Ａ）。培養細胞では、ｓｂ１０６−Ｆａｂは、天然αＫｌｏｔｈｏを発現するＮＲＫ細胞を用いた変性条件下でのイムノブロットではαＫｌｏｔｈｏを検出できなかったが、αＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの細胞溶解液では過剰発現抗原を検出できた（図２Ｂ）。新鮮冷凍非固定ラット副甲状腺組織（およびαＫｌｏｔｈｏを発現することが知られる他の組織Ｉを用いた免疫組織化学では、ｓｂ１０６−ＩｇＧはαＫｌｏｔｈｏを検出したが、同じす組織が固定された場合には陰性であり（図２Ｃ）、このことはｓｂ１０６が天然の折り畳みのＦＧＦＲ１−αＫｌｏｔｈｏ複合体と結合することを示唆する（図１Ｂ）。新鮮固定細胞を用いた免疫細胞化学染色では、αＫｌｏｔｈｏを異種過剰発現するＨＥＫ２９３細胞で明白な染色が得られたが、βＫｌｏｔｈｏを過剰発現する細胞では見られなかった（図２Ｄ）。細胞をポリリシンで処理した１２ウェルカバーガラス上に１．８×１０５／ｍｌで播種し、一晩増殖させた。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、氷上で１０分間固定し（３％パラホルムアルデヒド）、冷ＰＢＳで３回洗浄し、１０分間ブロッキングした（冷ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）。次に、細胞をｓｂ１０６−Ｆａｂ（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで５回洗浄し（各２分）、次いで、抗ＦＬＡＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｆａｂ軽鎖のＣ末端はＦｌａｇエピトープタグを含む）とともに光から保護しながら１時間インキュベートした（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中１：４００）。細胞を冷ＰＢＳで４回洗浄した（各５分）。次に、カバーガラスを、ＤＡＰＩとともに１滴の退色防止剤を含むスライドガラス上に逆さに置いた。画像はスピニングディスク型共焦顕微鏡で取得した。αＫｌｏｔｈｏを過剰発現する細胞であっても、固定の延長はｓｂ１０６による染色を著しく低下または無効にした。これらのデータは、ｓｂ１０６が天然の折り畳みのヒト、ラット、およびマウスαＫｌｏｔｈｏと特異的に反応し、変性したαＫｌｏｔｈｏタンパク質とは反応しないことを示す。
【０２３５】
実施例６：αＫｌｏｔｈｏの免疫沈降
ｓｂ１０６−Ｆａｂの可溶性αＫｌｏｔｈｏを沈降させる能力を、一連の免疫沈降−イムノブロット（ＩＰ−ＩＢ）アッセイを用いて試験した。ｓｂ１０６−Ｆａｂは、全細胞溶解液および馴化細胞培養培地およびαＫｌｏｔｈｏ過剰発現細胞からのαＫｌｏｔｈｏを捕捉した（図３Ａ）。捕捉されたｓｂ１０６−Ｆａｂを、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有する可溶性αＫｌｏｔｈｏを用い、抗ＦＬＡＧ抗体の場合と比較した。ｓｂ１０６−Ｆａｂおよび抗ＦＬＡＧは、正確に同じ電気泳動移動度のタンパク質を沈降させた。
【０２３６】
ｓｂ１０６−Ｆａｂは、ヒト、マウス、およびラット血清から、抗αＫｌｏｔｈｏ抗体ＫＭ２０７６と反応した約１３０ｋＤａのタンパク質を沈降させた（図３Ｂ）。尿由来のＩＰもまた１３０ｋＤａのバンドを示したが（図３Ｂ）、ＩＰ後の尿サンプルはイムノブロットにおいてそのようなバンドを示さなかった。ｓｂ１０６によるＩＰ−ＩＢバンドの真正性をさらに裏づけるために、このバンドの強度を正常者とＣＫＤ病期５の患者由来のヒト血清および野生型マウスと同型接合αＫｌｏｔｈｏ低次形態由来の血清で検討した（図３Ｃ）。ヒト進行性ＣＫＤでは約１３０ｋＤａのバンドのみが低下しており（図３Ｃ）、αＫｌｏｔｈｏ欠損マウス（ｋｌ／ｋｌ）には存在しなかった［８０］。
【０２３７】
実施例７：ヒトＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏレベル
ＩＰ−ＩＢ法がＣＫＤ患者の単一施設データベースから血清αＫｌｏｔｈｏレベルを相対的に決定できるかどうかを判定するために、この方法を試験した。アッセイの直線性ならびに延長されるｙ切片を調べるために、組換えヒトαＫｌｏｔｈｏを既知量で添加した。ＩＰ−ＩＢは、一定範囲の異なる濃度の組換えαＫｌｏｔｈｏを添加した正常健常ボランティアおよび病期５ＣＫＤの患者からの血清を用いて行った（図４Ａ）。漸増接種される外因性αＫｌｏｔｈｏとともにシグナルの段階的増強が見られた。ＣＫＤ患者由来の血清もまた外因性αＫｌｏｔｈｏの増加とともにシグナルの増強を示したが、任意の所与のαＫｌｏｔｈｏ濃度では、シグナル強度は正常血清より低かった。
【０２３８】
興味深いことに、健常ボランティア由来の血清は、プロテアーゼ阻害剤カクテルの不在下または存在下で同じシグナルを与えたが、ＣＫＤ患者由来の血清は、プロテアーゼ阻害剤の存在下で測定されたαＫｌｏｔｈｏレベルに顕著な上昇を示した（図４Ｂ）。これらの所見は、尿毒症の安定な定常状態では内因性αＫｌｏｔｈｏが存在し、一方、外から加えたαＫｌｏｔｈｏは毒症血清中ではタンパク質分解を受け得るが、正常血清では受けないことを示唆する。この添加実験の定量概要を図４Ｃに示す。健常およびＣＫＤ血清は両方とも、αＫｌｏｔｈｏ接種に対して直線的応答を示したが、ＣＫＤ血清からのシグナルは傾きがより低かった。プロテアーゼ阻害剤が含まれた場合、ＣＫＤ直線の傾きはその切片に影響を与えずに健常対照の傾きに近づいた。ゼロ接種への延長は、正常個体由来の血清が３１．１ｐＭのαＫｌｏｔｈｏを有し、ＣＫＤ患者由来の血清は８．５ｐＭのαＫｌｏｔｈｏを有していたことを示した。同様の推定が、正常腎機能を有するまたはＣＫＤを有する他の複数の対象から得られた。
【０２３９】
ＣＫＤ診療所から動員された患者の性質は、糖尿病および高血圧症が優勢であるＣＫＤの全国的プロフィールに類似している（表１）。分散しているにもかかわらず、ＣＫＤの病期とともにαＫｌｏｔｈｏの明瞭な段階的低下が見られる（図５Ａ）。血清αＫｌｏｔｈｏの低下はＣＫＤの早期に見られ、高いＦＧＦ２３、高いＰＴＨ、および高リン酸塩血に先立った（表１）。同じサンプルを用い、ＩＰ−ＩＢアッセイを市販のαＫｌｏｔｈｏ  ＥＬＩＳＡキットと直接比較した（図５Ｂ）。全体的に見れば、二者の間で相関が見られるが、一致ラインの両側に分離が見られる。新鮮サンプルでは、ＥＬＩＳＡは、ＩＰ−ＩＢより高い値を示すが（一致ラインの左側に灰色の菱形、図５Ｂ）、１回以上の冷凍−解凍を経たサンプルでは、ＥＬＩＳＡ値はずっと低い（致ラインの左側に黒い菱形、図５Ｂ）。全く同じサンプルを反復冷凍−解凍の前後に２つの方法により試験した場合、ＩＰ−ＩＢアッセイはより安定な結果を示したが、ＥＬＩＳＡ値は急速に落ち込んだ（図５Ｃ）。
【０２４０】
尿を直接免疫ブロットすることにより、ヒトＣＫＤ患者における低い尿αＫｌｏｔｈｏが従前に記載されている［１２］。ｓｂ１０６−Ｆａｂを用いたＩＰ−ＩＢアッセイは、ＣＫＤ患者における尿αＫｌｏｔｈｏの劇的な低下を示した（図６Ａ）。血清からの対比において、ＥＬＩＳＡでは尿でＩＰ−ＩＢアッセイにより匹敵する値が得られたが、αＫｌｏｔｈｏ濃度の低下の規模は、ＥＬＩＳＡよりもＩＰ−ＩＢアッセイにより検出した場合により劇的である（図６Ｂ）。これらの結果は、ヒトＣＫＤが血清および尿の両方においてαＫｌｏｔｈｏ欠乏の状態であることを示す。
【０２４１】
ゆえに、免疫沈降−イムノブロット（ＩＰ−ＩＢ）アッセイを用いて、全長可溶性αＫｌｏｔｈｏの血清および尿の両レベルをヒトで測定し、ヒトＣＫＤが血清および尿中のαＫｌｏｔｈｏ欠乏と関連することが確認された。αＫｌｏｔｈｏレベルは、ＣＫＤ病期とともに段階的低下するミネラル代謝およびレベルの他のパラメーターの障害に先立って早期ＣＫＤで検出可能に低下した。外から加えたαＫｌｏｔｈｏは、ＣＫＤ環境においては本質的に不安定である。
【０２４２】
抗体に基づく試薬は、研究および臨床現場の両方で、タンパク質の検出、タンパク質  単離および精製、および多くの下流適用のために有価なツールである。αＫｌｏｔｈｏ検出に利用可能な市販の試薬が限られており、例えば、天然の折り畳みのαＫｌｏｔｈｏタンパク質を特異的に検出するための抗体は存在しない。さらに、αＫｌｏｔｈｏ検出用の市販のＥＬＩＳＡキットでは価値の高い結果が得られる。
【０２４３】
設計された抗原結合部位を有する合成抗体は、標的の莫大なレパートリーの分子認識にために微調整および仕立てることができる。イン・ビトロファージディスプレーと組合わせ、自己反応性抗体を排除する免疫寛容機構の不在下で選択が行われる。抗体ライブラリーを用いた選択により、天然の折り畳みのヒト、マウスおよびラットαＫｌｏｔｈｏに特異性を有する抗体としてｓｂ１０６が得られた。
【０２４４】
ミネラル代謝におけるその役割に加え、可溶性αＫｌｏｔｈｏは、多くの体液中に循環し、体中で細胞の健全性を維持する複数の「ハウスキーピング」機能を有する。可溶性αＫｌｏｔｈｏの作用機序は不十分な理解に留まっているが、αＫｌｏｔｈｏ欠乏の生物学的影響は疑う余地無く示されている［８１］。αＫｌｏｔｈｏ転写産物は複数の臓器に存在するが、はるかに腎臓が最高の発現を示す［８０］。ＣＫＤは複数の代謝の混乱状態であり、排泄不足の内因性および外因性毒素の蓄積ならびに健康の維持を担う物質の欠乏からの複合症候群である。
【０２４５】
試験動物において、ＡＫＩおよびＣＫＤの両方が全身性のαＫｌｏｔｈｏ欠乏の状態であるという証拠がある。これは早期かつ高感度のバイオマーカーとなるだけでなく、αＫｌｏｔｈｏの回復は腎機能障害を改善することができる。その腎保護効果とは独立に、αＫｌｏｔｈｏはまたＣＫＤの腎外合併症も軽減することができる［１２、８２］。前臨床データに基づけば、抗αＫｌｏｔｈｏ抗体は、診断値と予後値の両方を持ち得る。
【０２４６】
ＩＰ−ＩＢアッセイのバリデーションおよび市販のＥＬＩＳＡとの比較
αＫｌｏｔｈｏに関して利用可能な市販のアッセイには、それらの間に一貫した相関がない［４６、８３］。ＥＬＩＳＡに基づく健常ヒトおよびＣＫＤ患者における研究［５８］からは矛盾した結果が得られている。正常およびＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏの絶対レベルは０．４［４７］〜２０００ｐｇ／ｍｌ超［４１］までの範囲であり、ほとんどの測定値は１００代の半ばから後半である［４８、５０、５５、５８〜６０、８３］。このアッセイに基づけば、αＫｌｏｔｈｏレベルは糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の低下とともに低くなる［４８、５２、５４、５７〜６０］、関連は無い［４０、４１、５０、５１、５３］または上昇すらする［４４、４７］ことが記載されている。同様に、αＫｌｏｔｈｏレベルは、年齢とともに変化しない、低下することも報告されている［４２、５３、５８、５９］。このことはヒトαＫｌｏｔｈｏデータの解釈をほぼ不能とし、異なる施設から得られた収集データには価値がない。
【０２４７】
天然の折り畳みの立体配座にあるαＫｌｏｔｈｏを認識する高親和性合成抗体（図１〜３）を作製した。ｓｂ１０６−ＦａｂまたはＩｇＧは、細胞溶解液、培養培地、血清、および尿からαＫｌｏｔｈｏを捕捉する。付加的なバンドはαＫｌｏｔｈｏのより短いフラグメントであり得るが、これらのバンドの強度はｋｌ／ｋｌマウスで低下せず、この可能性については議論がある。約１３０ｋＤａのバンドはどれが全長可溶性αＫｌｏｔｈｏであるか、時には、ＥＬＩＳＡが達成できないことについて分析された。
【０２４８】
添加実験の直線性は、接種されたαＫｌｏｔｈｏの総てが検出されることを示す（図４）。予期されなかった発見は、外から加えた組換えαＫｌｏｔｈｏは尿毒症血清中でタンパク質分解を受けるが、正常血清ではこのような現象は見られなかったということであった。このことは、腎臓病における低αＫｌｏｔｈｏが単に生産の低下によるものであって、さらなる機構および研究のための新たな道を拓くという見解に異議を投げかける。ＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏ欠乏の新たな機構を明らかにすることに加え、これは組換えαＫｌｏｔｈｏの置き換えに関して重要な遺伝子を持ち得る。
【０２４９】
ＣＫＤの進行とともに血清αＫｌｏｔｈｏには段階的な低下が見られる（図５Ａ）。ＩＰ−ＩＢアッセイの変動係数は、血清では４％、尿では７％であった。ＩＰ−ＩＢアッセイはまた、進行したＣＫＤでは極めて低い尿αＫｌｏｔｈｏを示した（図６）。実際に、この尿αＫｌｏｔｈｏの低下は血清におけるものよりも劇的であり、ＣＫＤのより高感度のマーカーと言える。
【０２５０】
ＩＰ−ＩＢおよび市販のＥＬＩＳＡは両方とも、ＣＫＤにおいて低い尿αＫｌｏｔｈｏを検出したが、αＫｌｏｔｈｏの絶対レベルはＥＬＩＳＡアッセイで悠に高く、低下パーセントはＩＰ−ＩＢアッセイの場合と同じではない。ＣＫＤにおける尿αＫｌｏｔｈｏレベルの激烈な低下では、これら２つのアッセイは、量的な違いはあるものの同じ結論を出した。血清中の状態は異なる。全体的として正の相関があるものの、これらの２つのアッセイの比較は完全に２群に分離した（図５Ｂ）。新鮮サンプルはＥＬＩＳＡでより高い測定値を示したが、保存サンプルはＥＬＩＳＡで極めて低い結果を出した。１つの可能性は、ＥＬＩＳＡがαＫｌｏｔｈｏおよび新鮮サンプル中で反応中の他のいくつかのアクチンを測定しているということである。ＩＰ−ＩＢアッセイは反復冷凍−解凍によっていくらか有効性を失っていたが、これはＥＬＩＳＡの場合にはるかに重大な問題となる。
【０２５１】
ＩＰ−ＩＢアッセイのもう１つの利点は、それがヒトおよび齧歯類の両方で等しく十分にαＫｌｏｔｈｏを測定できるということであるが、齧歯類において現在利用可能なＥＬＩＳＡの使用は、それは汎αＫｌｏｔｈｏ欠乏の状態であるＣＫＤを有するラットで極めて高い循環αＫｌｏｔｈｏレベルを検出するので、問題となる可能性がある［６８］。
【０２５２】
実施例８
付加的ＣＤＲ配列を表２に示す。相同な突然変異が各アミノ酸位置に導入されたが、これは、各位置に関して、元のアミノ酸が保持されたか、またはそのアミノ酸に最も近い「ホモログ」（例えば、保存的アミノ酸変化）が導入され、新たなＦａｂファージライブラリーが構築されたことを意味する。αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体を抗原として用い、新たなライブラリーを用いて選択を行った。抗原に結合したクローンを単離し、配列決定を行い、表２に示す。結合親和性はＳｂ１０６と同等またはそれより良好であると思われる。
【０２５３】
実施例９：ヒト試験
右心カテーテル法を受けた９名のヒト対象（４９．０６６．２歳）を本試験に登録した。右心カテーテル留置中に、腎上部および腎下部大静脈血液サンプルを得、４℃で遠心分離後すぐに血清を分離し、その後の試験のために−８０℃で保存した。血清αＫｌｏｔｈｏを、本明細書に記載の免疫沈降−イムノブロットアッセイにより決定した。簡単に述べれば、０．１ｍｌの血清を合成抗αＫｌｏｔｈｏ  Ｆａｂ（ｓｂ１０６）で免疫沈降させ、免疫複合体をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出させ、ＫＭ２０７６抗体でイムノブロットを行った。１３０ｋＤの移動度に基づくオートラジオグラム上の特異的シグナルを、ＩｍａｇｅＪプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）、ベテスダ、メリーランド州）で定量した。
【０２５４】
動物試験
αＫｌｏｔｈｏ低次形態（ｋｌ／ｋｌ）マウス、ｋｌ／ｋｌマウスおよびそれらの野生型（ＷＴ）同腹子をテキサス大学サウスウェスタン医療センターの動物研究センターで維持した。当時点で、総てのマウスが１２９  Ｓ１／ＳＶｌｍＪ（１２９  ＳＶ）バックグラウンドで、６〜８週間である。正常Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（体重２２０〜２５０ｇ）はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウェルミントン、ＭＡ）から購入した。αＫｌｏｔｈｏクリアランス試験では、ラットに両側腎摘（無腎ラット）または腎臓の手動操作を伴う開腹（シャムラット）を施した。ラットまたはマウスに、用量０．１ｍｇ／ｋｇ体重の組換えマウスαＫｌｏｔｈｏタンパク質（ｒＭＫｌ）の標識全長細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を静脈内または腹膜内に１回注射した。セクレターゼが血中αＫｌｏｔｈｏを調節するかどうかを調べるため、塩酸ドキシクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、２５ｍｇ／ｋｇ／日のα−セクレターゼ阻害剤、および／または２．５ｍｇ／ｋｇ／日のβ−セクレターゼ阻害剤ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ビレリカ、ＭＡ）を正常ＷＴマウスの腹膜内に、２日間毎日注射し、４８時間の時点で血液および腎臓を採取し、血清および腎のαＫｌｏｔｈｏを決定した。
【０２５５】
抗体
ラットモノクローナル抗ヒトＫｌｏｔｈｏ抗体ＫＭ２０７６１，２を免疫ブロット法および免疫電子顕微鏡に使用し、合成抗αＫｌｏｔｈｏ抗体ｓｂ１０６６３を血清Ｋｌｏｔｈｏの免疫沈降に用いた。
【０２５６】
ラットおよびマウスにおける標識αＫｌｏｔｈｏのクリアランス
正常Ｍｕｎｉｃｈ  Ｗｉｓｔａｒラット（ＢＷ２２０〜２５０ｇ）をイナクチン（１００ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）で麻酔し、標識αＫｌｏｔｈｏボーラスを頚静脈から注射した（０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）。１２５Ｉ標識αＫｌｏｔｈｏまたは１２５Ｉ標識アルブミンの注射試験では、ボーマン嚢のフリーフロー微小穿刺および近位尿細管による体液回収を、公開されている方法を用いて行った。簡単に述べれば、左腎を露出させ、左尿管に尿回収のためのカテーテル留置を行った。リサミングリーン色素注射後にそれらの特徴的な輪郭により近位尿細管を特定し、ガラスキャピラリーで穿刺した。体液の容量は較正済みの定孔径ガラスキャピラリーで測定した。体液の放射活性は、シンチレーション計数で決定さし、体液容量に対して正規化した。明示された時点で、眼窩後静脈洞から血液を採取し、スポット尿を採取した。採取した尿および血清中の１２５Ｉ標識αＫｌｏｔｈｏまたは１２５Ｉ標識アルブミンをシンチレーション計数により定量した。種々の臓器のホモジネートを作製し、臓器ホモジネート中の放射活性をシンチレーション計数により測定し、臓器ホモジネート中のタンパク質に対して正規化した。臓器切片（１０ｍｍ）に対してオートラジオグラフィーを行った。
【０２５７】
免疫電子顕微鏡
マウス組換えＫｌｏｔｈｏタンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）をｋｌ／ｋｌマウスの腹膜内に注射し、注射２４時間後にマウスを犠牲にした。腎臓を採取し、大動脈灌流により２．５％パラホルムアルデヒドで固定し、取り出し、４％パラホルムアルデヒド中で後固定した（４℃  ４時間）。超薄冷凍組織切片の免疫金標識を記載ように行った。２１の腎皮質に２．３Ｍスクロースを一晩潤させ、液体窒素中で冷凍し、７０〜８０ｎｍ厚の切片を作製し（Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェッツラー、ドイツ）、ホルムバールコーティングニッケルグリッドにマウントした。これらの切片をＫＭ２０７６抗体とともにインキュベートした後、金コンジュゲートプロテインＡ（１０ｎｍ金粒子、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに６０分間インキュベートした。酢酸ウラニル染色の後、切片をＪｅｏｌ  １２００  ＥＸ透過型電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ  Ｌｔｄ．、昭島、日本）で可視化した。
【０２５８】
結果
循環αＫｌｏｔｈｏの生産および運用における腎臓の役割を調べた。直接穿刺による正常ラットの腎上部および腎下部大静脈中の、および右心カテーテル法を受けたヒト対象のαＫｌｏｔｈｏタンパク質の血清レベル。総ての患者がｅＧＦＲ≧６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２を示した。ラットおよびヒト血清サンプルの両方で、同等の静脈洞αＫｌｏｔｈｏレベルの腎下部／腎上部増分が見られた。血清αＫｌｏｔｈｏレベルを周知の腎由来ホルモンである血清エリスロポエチンに対してプロットし、血清エリスロポエチンが上昇すると、および腎下部／腎上部下大静脈からの血清クレアチニン（ＳＣｒ）が低下し、一方。αＫｌｏｔｈｏは層化することが見出され、このことは臓が循環中にαＫｌｏｔｈｏを分泌することを示す。
【０２５９】
ラットから両腎臓を除去した場合、血清αＫｌｏｔｈｏレベルは、１日で正常レベルの約半分に著しく低下した。無腎状態は、試験を４０〜５０時間より長く継続することを許容しなかった。
【０２６０】
循環からのαＫｌｏｔｈｏクリアランスの方法を調べた。無腎ラットの循環外因性αＫｌｏｔｈｏタンパク質のレベルは、注射直後の正常ラットの場合と同等であったが、正常ラットにおける外因性αＫｌｏｔｈｏタンパク質の半減期は、無腎ラットの場合よりもはるかに短く、腎摘時の内因性αＫｌｏｔｈｏの半減期は、無腎ラットの外因性αＫｌｏｔｈｏの場合に極めて近似している。静注した外因性標識αＫｌｏｔｈｏの解剖学的運命を調べるさらなる試験は、αＫｌｏｔｈｏの取り込みならびにその排泄の主要な臓器であり得ることを裏づけた。
【０２６１】
注射された標識αＫｌｏｔｈｏタンパク質は、主として腎臓および脾臓、わずかながら心臓に分布し、大動脈、脳、および筋肉では検出できなった。血清および尿中の放射性標識された外因性αＫｌｏｔｈｏのクリアランスを追跡するさらなる試験は、αＫｌｏｔｈｏタンパク質が血液から腎臓を経て尿へ排除されることを裏づけた。
【０２６２】
これらの、またさらなる試験に基づき、（１）腎臓は可溶性αＫｌｏｔｈｏを生産し、αＫｌｏｔｈｏのエクトドメインの、セクレターゼを介した放出によって体循環へ放出すること、（２）腎臓は可溶性αＫｌｏｔｈｏを循環から排除するための重要な臓器であること、（３）αＫｌｏｔｈｏは、腎尿細管を通って基底外側から細胞内部へ移動し、その後、頂端膜を経て尿管腔内へ分泌されることが決定付けられた。
【０２６３】
実施例１０：αＫｌｏｔｈｏと結合するさらなる抗体の同定
αＫｌｏｔｈｏに対する元の抗体試薬ｓｂ１０６（クローン４８）、ならびにｓｂ１０６に由来するＣＤＲ変異体は総て、単一の共通エピトープに結合する。検出アッセイを確立するためには、１つの表面／エピトープはタンパク質を単離または捕捉するために使用されるが、検出試薬のためには第２の全く別のエピトープが必要とされるので、異なるエピトープを有する抗体が必要である。よって、ｓｂ１０６とは異なり、全く別のエピトープと結合する抗体を同定するための別の選択戦略を行った。αＫｌｏｔｈｏに対するこれらの抗体は、ヒトαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して、飽和レベルのｓｂ１０６  Ｆａｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で行われる抗体ファージディスプレー選択により同定した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（５３３４−ＫＬ）から購入したタンパク質はアミノ酸Ｅ３４〜Ｓ９８１をカバーし、Ｃ末端に結合された６−Ｈｉｓタグを有する。
【０２６４】
合成抗体ライブラリー(Persson et al, 2013 J Mol Biol)から合計３１の新たな抗体が同定され、最初のαＫｌｏｔｈｏ抗体であるｓｂ１０６の存在下および不在下でαＫｌｏｔｈｏと結合することが示された（図９）。これらのクローンのＣＤＲを表３に示し（３Ａにアミノ酸配列、および３Ｂおよび３Ｃにヌクレオチド配列）、全長配列の例を表４に示す。これらのクローンにまず名称を与え、次にＩＤ番号を与えた。ここでは両方を参照のために示す。
【０２６５】
総ての配列をＦａｂ発現ベクター（ＲＨ２．２）にサブクローニングし、発現させ、精製した。ファージの場合と同様に、総てのＦａｂクローンがＥＬＩＳＡにより標的抗原と結合する（図１０）。
【０２６６】
実施例１１：エピトープ分類
このさらなる抗体のセット内にαＫｌｏｔｈｏ上の少なくとも２つの新たなエピトープが存在する。競合ＥＬＩＳＡ戦略を用い、エピトープ分類試験を行った。このセット内に多数のクローンが得られたので、予備試験で、ｓｂ１０６（４８）が結合するものとは別の２つの全く別のエピトープが明らかになった。これらのエピトープの代表的なもの（４８０４および４８１９）を次に、セット内の各クローンの評価のためにｓｂ１０６（４８）とともに使用した（図１１）。ｓｂ１０６（４８）がエピトープＡを表す場合、新規クローンのうち２３がエピトープＢに分類され、エピトープＣに関しては４クローンが見出された（図１１および表５に要約）。３つのクローン（４８０６、４８１０および４８１７）については、ファージによる問題のために決定はされなかった。クローン４８２８は、提示された３つのエピトープのいずれとも競合を示さなかった。
【０２６７】
実施例１２：親和性評価
各抗体に関する親和性評価は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。Ｆａｂを、抗Ｈ＋Ｌ抗体を用いて固定化し、αＫｌｏｔｈｏの希釈系を注入した。結合曲線を図１２に示し、結合親和性（ＫＤ）を表５に要約する。親和性は２４０ｐＭ〜８．７ｎＭの範囲である。
【０２６８】
実施例１３：免疫沈降
抗体を、ヒト患者尿サンプルからＦａｂとしてαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させるそれらの能力に関してアッセイした（図１３）。正常ボランティアからの５０ｕｌのヒト尿サンプルを、４℃で一晩、１ｕｇ／ｍｌのＦａｂ（ｓｂ１７３−２０３、ｓｂ１０６）を含む４００ｕｌのＫＲＨバッファー内でインキュベートした。次に、５０ｕｌのＭ２抗ＦＬＡＧセファロースビーズを加え、４℃で２時間インキュベートした（Ｆａｂ軽鎖のＣ末端はＦＬＡＧエピトープタグを含む）。これらのビーズを５００ｕｌのＫＲＨバッファーで３回洗浄し、結合したタンパク質を１００ｍＭ  ＤＴＴを含有する２×ＬＤＳサンプルローディングバッファーで溶出させた。イムノブロットは、市販の一次ラット抗Ｋｌｏｔｈｏ抗体（ＫＭ２０７６）、次いで、可視化のための標準抗ラットＩｇＧ二次抗体で行った。Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ基質を化学発光基質として使用した。半数を超えるクローンがｓｂ１０６と同じかより良好に挙動した。
【０２６９】
実施例１４：ＥＬＩＳＡ
新規エピトープ（Ｂでは４８０８、およびＣでは４８３１）を呈する選択クローンを全長ＩｇＧにサブクローニングし、発現させ、精製し、さらにｓｂ１０６（４８）とともに特性評価を行った。全長ＩｇＧを１ｕｇ／ｍｌで固定化し（捕捉）、１％ＢＳＡを含有するバッファーでブロッキングした後、捕捉バッファー（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水  ｐＨ７．４＋０．１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中２０ｎｇのビオチン化αＫｌｏｔｈｏ（ａａ３４〜９８１）、２０ｎｇのビオチン化αＫｌｏｔｈｏ（ａａ１〜５４９）のいずれかとともに、または捕捉バッファー単独（ＢＳＡ）で、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、捕捉されたビオチン化αＫｌｏｔｈｏを、ＨＲＰ−ストレプトアビジン試薬を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は４５０ｎｍでの吸光度の測定を可能とする。３つのＩｇＧは総て、予想通り、溶液からαＫｌｏｔｈｏを捕捉したが（図１４）、４８３１だけがαＫｌｏｔｈｏの末端切断型のＥＣＤを検出でき、ｓｂ１０６とのエピトープ認識の違いをさらに特徴付けた。
【０２７０】
最後に、溶液中でのαＫｌｏｔｈｏの検出のために、３つの全く別のエピトープクローンのそれぞれを捕捉および検出抗体が互いに対として使用されるようにＥＬＩＳＡのマトリックスを実施した（図１５）。全長ＩｇＧを１ｕｇ／ｍｌで固定化し（捕捉）、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡでブロッキングし、次いで、５ｎＭのαＫｌｏｔｈｏとともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、次に、サンプルを同じＩｇＧのビオチン化調製物とともに室温で３０分間インキュベートした（検出、＊ｂ）。再び洗浄した後、結合したＩｇＧを、ＨＲＰ−ストレプトアビジン試薬を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は、４５０ｎｍでの吸光度の測定を可能とする。二反復のデータ点を示す。灰色は自己に対する自己を強調する。これらの試験は、抗体が結合する３つのエピトープが、好適には、診断キットにおける所望の使用目的に関して互いに適合することを示す。
【０２７１】
実施例１５：ヒトおよびマウスαＫｌｏｔｈｏに対する交差反応性
ヒトおよびマウスαＫｌｏｔｈｏに対する交差反応性を評価するために、ヒトおよびマウスαＫｌｏｔｈｏの両方を用いてＦａｂ  ＥＬＩＳＡを行った（図１６）。Ｆａｂ（５ｕｇ／ｍｌ）を、固定化したαＫｌｏｔｈｏヒト、マウス、または陰性対照としてのニュートラアビジン（ＮＡ）およびＳＢＡとともにインキュベートした。結合してないＦａｂを洗い流した後、結合したＦａｂを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｆｌａｇ抗体（Ｆａｂはそれらの軽鎖の末端にＦａｌｇタグを有する）を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬は、４５０ｎｍでの吸光度の測定を可能とする。
【０２７２】
αＫｌｏｔｈｏ  Ｆａｂを選択するための、ヒトおよびマウス抗原に対する推定親和性は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６に対する表面プラズモン共鳴によって得た（図１７）。Ｆａｂを、抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて捕捉し、αＫｌｏｔｈｏの希釈系を注入した。結合曲線はラングミュアモデルに当てはめた。（Ａ）決定されたＫｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値。（Ｂ）および（Ｃ）それぞれヒトおよびマウス抗原に関する結合曲線。
【０２７３】
実施例１６：αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対するＦａｂ結合
Ｆａｂタンパク質（クローン４８０４〜４８２４、４８２６〜４８３４）をＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）に１５ｕｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間吸着させた後、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。このプレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した後、２ｕｇ／ｍｌの以下のタンパク質：αＫｌｏｔｈｏ（Ｆｃダイマー）、ａＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体（Ｆｃ複合体）、Ｆｃ単独、またはＰＢＳとともに室温で１時間インキュベートした。結合してない抗原をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０の６回の洗浄洗い流した後、これらのウェルをヤギ抗マウス（ｍＧ２ａ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに室温で３０分間インキュベートした。結合してない抗マウス抗体をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０の６回の洗浄で洗い流した後、これらのウェルを抗ヤギＨＲＰ試薬とともに室温で３０分間インキュベートした。結合してない抗ヤギＨＲＰ抗体をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０の６回の洗浄で洗い流した後、比色定量ＨＲＰ試薬（ＴＭＢ基質および停止溶液）を用い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２７４】
これらの結果は、αＫｌｏｔｈｏ抗体（クローン４８０４〜４８２４、４８２６〜４８３４）がαＫｌｏｔｈｏ単独および複合体（αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ）に結合することを示す。ｓｂ１０６（クローン４８）を、αＫｌｏｔｈｏ単独および複合体（αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ）の両方に対して結合の対照として使用した。
【０２７５】
【表２】
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【０２７６】
【表３】
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【０２７７】
【表４】
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【０２７８】
【表５】
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【０２７９】
【表６】
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【０２８０】
【表７】
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【０２８１】
【表８】
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【０２８２】
【表９】
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【０２８３】
【表１０】
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【０２８４】
【表１１】
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【０２８５】
【表１２】
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【０２８６】
【表１３】
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【０２８７】
【表１４】
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【０２８８】
【表１５】
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【０２８９】
本出願をこれまでのところ好ましい例と考えられるものを参照して説明してきたが、本出願は開示されている例に限定されないと理解されるべきである。逆に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な改変および等価の配置を包含することが意図される。
【０２９０】
刊行物、特許および特許出願は総て、各個の刊行物、特許および特許出願が具体的かつ個々に引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされることが示される場合と同じ程度で、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。特に、例えば、表または他所に示される受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含め、本明細書に示される各受託番号に関連する配列は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【０２９１】
本明細書に引用される参照文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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