(57)【要約】  本発明は一般に、ヒト耳前駆細胞の同定および単離に関する。より具体的には、本発明が細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を同定および単離するために細胞マーカーを使用する方法、ヒト耳前駆細胞の富化および産生の方法、ならびに同定および／または単離に使用するための関連キットに関し、細胞マーカーがＳＳＥＡ１(ＣＤ１５）、ジシアロガングリオシドＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（肝臓／骨／腎臓アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ガングリオシドＧＤ２、およびＣＤ１４１である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞がＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを有するかどうかを決定することを含む、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法。
【請求項２】
細胞マーカーＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２が陽性細胞マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞マーカーＣＤ１４１がネガティブ細胞マーカーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも２つの陽性細胞マーカーを組み合わせて用いて、ヒト耳前駆細胞を同定する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも３、４または５個の陽性細胞マーカーが、ヒト耳前駆細胞を同定するために組み合わせて使用される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
陽性細胞マーカー、または少なくとも２つの陽性細胞マーカーが、陰性細胞マーカーＣＤ１４１と組み合わせて使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の混合集団が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などのインビトロ多能性幹細胞分化プロトコールから、もしくはインビトロ多能性幹細胞分化プロトコール中に提供される；または
前記細胞の混合集団が、ヒト耳細胞系列への脱分化、トランス分化または直接再プログラミング手順から、もしくは脱分化、トランス分化または直接再プログラミング手順中に提供される；または
前記細胞の混合集団が、発達中の胎児内耳組織などの組織から、または成体内耳からの外科的介入により得られる蝸牛もしくは前庭サンプルから提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ヒト耳前駆細胞がインビボで同定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞の混合集団が、細胞マーカーに結合するように配列された１つ以上の結合メンバーと接触される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
結合メンバーが、抗体、抗体断片、またはその模倣物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞マーカーが、細胞または細胞群に存在するかまたは存在しないとして検出される、検出工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
同定のために結合メンバーが標識されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標識がフルオロフォアを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出が、ＦＡＣＳの使用および／またはＭＡＣＳの使用を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを使用して、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法であって：
−少なくとも２つの異なる細胞マーカーに特異的な結合メンバーを提供すること；
−前記細胞の混合集団を前記結合メンバーと接触させること；および
−前記細胞の混合集団における細胞に対する結合メンバーの結合または非結合を検出すること、を含む、方法。
【請求項１６】
ａ）陽性細胞マーカーに結合するように構成された結合メンバーが、細胞上の少なくとも２つの異なる陽性細胞マーカーに結合する場合；または、
ｂ）陽性細胞マーカーの１つに結合するように構成された結合メンバーが、細胞上の陽性細胞マーカーの少なくとも１つに結合し、陰性細胞マーカーＣＤ１４１に結合するように構成された結合マーカーが細胞に結合しない場合
、のいずれかであれば、細胞がヒト耳前駆細胞であると決定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）陽性細胞マーカーに結合するように構成された結合メンバーが細胞上の少なくとも３つの異なる陽性細胞マーカーに結合する場合；または
ｂ）少なくとも２つの異なる陽性細胞マーカーに結合するように構成された結合メンバーが細胞上の少なくとも２つの異なる陽性細胞マーカーに結合し、かつ陰性細胞マーカーＣＤ１４１に結合するように構成された結合マーカーが細胞に結合しない場合のいずれかであれば、細胞がヒト耳前駆細胞であると決定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を富化する方法であって：
−請求項１〜１７のいずれか一項の方法に従って、ヒト耳前駆細胞を同定すること；および
−非耳前駆細胞から単離されるヒト耳前駆細胞を、集団内に富化されるように細胞を選別すること、を含む、方法。
【請求項１９】
前記選別がＦＡＣＳおよび／またはＭＡＣＳを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト耳前駆細胞の集団を産生する方法であって、
−非耳前駆細胞をヒト耳前駆細胞に分化させ、それによって一部の非耳前駆細胞が集団中に残存して細胞の混合集団を形成することができること；および
−請求項１８または１９の方法に従って、細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を富化すること、を含む、方法。
【請求項２１】
少なくとも２つの異なる結合メンバーを含むキットであって、結合メンバーが、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置されるキット。
【請求項２２】
前記キットが少なくとも３つの異なる結合メンバーを含み、前記結合メンバーが、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記キットが結合メンバーのパネルを含み、前記結合メンバーのパネルが、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１の細胞マーカーの各々に特異的な結合メンバーを含む、請求項２１または２２に記載のキット。
【請求項２４】
結合メンバーが抗体であり、場合により抗体が標識される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
混合細胞集団中の非耳前駆細胞を同定するための陰性細胞マーカーとしてのＣＤ１４１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ヒト耳前駆細胞の同定および単離に関する。より詳細には、本発明が細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を同定および単離するために細胞マーカーを使用する方法、ヒト耳前駆細胞の富化および産生の方法、ならびに同定および／または単離に使用するための関連キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
難聴は、感覚有毛細胞およびそれに関連するらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）の喪失によって主に産生される、世界中で高い有病率を有する状態である。難聴の全ての形態のうち、聴性ニューロパシーが特に関心事である。この状態は、主に有毛細胞の相対的保存によるＳＧＮの損傷によって定義され、聴覚障害を有する患者のかなりの割合の原因である。有毛細胞の喪失は蝸牛インプラントによって部分的に回避され得るが、神経支配が乏しいため、インプラントの将来の性能が制限されるため、感覚ニューロンの喪失に対して日常的な処置は利用可能ではない。損傷した感覚回路を回復するために幹細胞を使用することは、潜在的な治療戦略である。
【０００３】
耳プラコードの最初の仕様に関与するＦＧＦ３およびＦＧＦ１０などのシグナルを使用して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からの分化を誘導するためのプロトコールが開発されている（Chen et al. 2012. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature, 490(7419):278-82. doi: 10.1038/nature11415）。誘導された耳前駆細胞は、インビトロで、期待される電気生理学的特性を示す有毛細胞様細胞および聴覚ニューロンに分化することができる。さらに、聴性ニューロパシーモデルに移植される場合、耳の神経前駆細胞は生着し、分化し、そして聴性誘発応答閾値を有意に改善する。しかし、使用したＦＧＦ３／１０誘導法は非効率的であり、必要とされる細胞型の約２０％しか得られない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する耳前駆細胞（ｏｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を臨床環境で使用する場合、分化プロセス中に誤って産生される他の細胞型からこれらの細胞を単離できることが必須である。異種培養物から成分細胞集団を分離するための確立された方法は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）であるが、この方法を使用するためには重要な細胞型（例えば、耳前駆細胞）に結合する特異的な細胞表面マーカーを同定しなければならない。一般的な神経前駆細胞を単離するための種々のマーカーが記載されているが、ヒト耳前駆細胞（神経または上皮のいずれか）を単離するためのマーカーは同定されていない。
【０００５】
本発明の目的は細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を同定し、潜在的に単離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、ＳＳＥＡ１（ＣＤ１５またはＬｅｗｉｓ  ｘとしても知られる）、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを使用して、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される。
【０００７】
本発明の別の態様によれば、細胞がＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを有するかどうかを決定することを含む、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、細胞がＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを有するかどうかを決定することを含む、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される：
ａ）ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、またはＧＤ２のうち少なくとも２つ；または
ｂ）ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２のうち少なくとも１つがヒト耳前駆細胞として同定され、ＣＤ１４１は同定されない。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ＳＳＥＡ１（ＣＤ１５としても知られる）、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを使用して、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される：
−少なくとも２つの異なる細胞マーカー（すなわち、少なくとも２つの異なる細胞マーカーは、ＳＳＥＡ１（ＣＤ１５としても知られる）、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される）に特異的な結合メンバーを提供する；
−細胞の混合集団を結合メンバーと接触させる工程；および
−細胞の混合集団中の細胞に対する結合メンバーの結合または非結合を検出する工程。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を富化する方法が提供される：
−本発明に従ってヒト耳前駆細胞を同定し；
−非耳前駆細胞から単離されるヒト耳前駆細胞を、集団に富化されるように選別する。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ヒト耳前駆細胞の集団を産生する方法が提供される：
−非耳前駆細胞をヒト耳前駆細胞に分化させ、それによっていくつかの非耳前駆細胞が集団中に残存して細胞の混合集団を形成し得；そして
−本明細書中の本発明の方法に従って、細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を富化する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、少なくとも２つの異なる結合メンバーを含むキットが提供され、ここで、結合メンバーは、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置される。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、混合細胞集団中の非耳前駆細胞を同定するための陰性細胞マーカーとしてのＣＤ１４１の使用が提供される。
【００１４】
有利には細胞マーカーＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１は２つの異なる方法を用いて耳前駆細胞に分化した２つの異なるヒト胚性幹細胞株上の細胞表面抗体のパネルを用いた複数回のスクリーニングによって同定された。発現の客観的、定量的閾値および耳前駆細胞の形態の定性的、形態学的分析を用いて、正しい細胞型を標識した以下のマーカーを選択した。さらに、ＣＤ１４１はネガティブマーカーとして同定された、すなわち、耳の前駆細胞ではない細胞を標識した。ヒト多能性幹細胞由来耳前駆細胞の細胞表面プロテオームは分化多能性幹細胞から生成されるヘテロな集団からそれらを精製するために、フローサイトメトリーおよび蛍光自動化細胞選別（ＦＡＣＳ）において使用され得る抗体を用いて特徴付けられた。この単離および精製はａ）適切な細胞型をより良好に規定し、潜在的に有害な細胞を除去することによって、細胞治療の直接適用を改善し得、そしてｂ）交絡効果を有し得る細胞を除去することによって、薬物スクリーニングおよび毒性についてのインビトロアッセイを改善し得る。さらに、これらのマーカーは、耳の前駆細胞を精製するために非常に有用であるはずである：
１）それらをさらに感覚有毛細胞またはニューロンのいずれかに分化させる。これは、分化プロトコールをより効率的にし、ハイスループット薬物スクリーニングのための調製物のスケールアップを容易にし；そして
２）細胞移植治療のための適切な細胞型を選択し、望ましくない細胞型での汚染を最小にし、そして副作用を発現する治療の潜在的なリスクを低減する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】耳の前駆細胞運命に対するｈＥＳ細胞の誘導は、ＦＧＦ３およびＦＧＦ１０によるＦＧＦシグナル伝達の誘導によって達成される。前駆細胞の改善された収率は、最初の９日間のＷＮＴ不活性化、続いて３日間のＷＮＴ活性化の添加、ＦＧＦ３およびＦＧＦ１０濃度の同時減少によって達成された。
【図２】個々の細胞の蛍光強度（プレート１データ）から作成されたドットプロットである。ｘ軸上の内因性レポーターからのＧＦＰレベルおよびｙ軸上の細胞表面マーカー抗体を標的とする二次からのＡｌｅｘａ  ５６８から得られる。
【図３】ＧＤ３（赤）、ＰＡＸ２（緑）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青）像の重ね合わせ。矢印は以下を示す：耳ニューロン前駆細胞の形態のＰＡＸ２＋／ＧＤ３コロニー、耳上皮前駆細胞のＰＡＸ２＋／ＧＤ３＋コロニー、および形態に基づいて耳前駆細胞であると予測されないＰＡＸ２−／ＧＤ３＋細胞。
【図４−ａ】強調表示されたウェルは、潜在的なヒット、すなわち閾値未満とはみなされない。
【図４−ｂ】強調表示されたウェルは潜在的なヒット、すなわち、閾値を上回るとはみなされない。
【図４−ｃ】ウェルＦ−３に対応する抗体は、ＩＷＲ−１およびＢＩＯで処理されたＨ１４ｓ９株の細胞にのみ結合した。株・プロトコールの両方で共通しないものは、調査対象としてさらに考慮されない。
【図５】ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅスクリーニングで検出された選択マーカーのパーセンテージ。ＳＳＥＡ１は２回出現した（ＨＩ９８抗体はＣＤ１５−として標識され、ＭＣ４８０抗体はＳＳＥＡ１として標識された）。ＧＤ３およびＴＲＡ−２−４９／６Ｅは、ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅには現れず、当初の小パネルから選択されたのみであった。
【図６】ＣＤ１４１について染色した１３週齢のヒト蝸牛管の切片。ＣＤ１４１陽性細胞（矢印）は、耳の前駆細胞を含む上皮の外側に位置する（矢印）。
【図７】ＣＤ１４１およびニューロフィラメント（ＮＦ２００）の染色を示す、８週齢蝸牛管の切片。ＣＤ１４１は蝸牛上皮を取り囲む細胞を標識するが、ＮＦ２００陽性神経芽細胞（ＮＦ２００染色切片の矢印、ＣＤ１４１染色切片の矢印）を除外する。
【図８】８ａおよび８ｂ−ｈＥＳＣは耳の前駆細胞に分化し、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−２−４９およびＣＤ１４１について染色した。（Ａ）そして（Ｂ）は２つの独立した実験を示す。ＳＳＥＡ４とＴＲＡ−２−４９は同じ細胞集団（左欄）に共局在する（（Ａ）Ｐ３−Ｑ２  ５５．８６％；（Ｂ）Ｐ３−Ｑ２  ６５．１５％）が、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ−２−４９陽性細胞の大半はＣＤ１４１陰性である（（Ａ）Ｐ４−Ｑ３  ４８．９７％、Ｐ５−Ｑ１  ５２．８７％；（Ｂ）Ｐ４−Ｑ３  ６５．８２％、Ｐ５−Ｑ１  ６６．７９％）。（Ａ）および（Ｂ）はより極端な例を示し、ＣＤ１４１陽性細胞は約０．３〜約８％の範囲である（（Ａ）Ｐ４−Ｑ２  ８．１７％、Ｐ５−Ｑ２  ８．２５％；（Ｂ）Ｐ４−Ｑ２  ０．３９％、Ｐ５−Ｑ２  ０．４９％）。
【図９】ｈＥＳＣを１４日間耳前駆細胞に分化させ、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ２−４９について選別した。次に、我々の研究室で開発したオルガノイド（３Ｄ）培養システムを用いて、二重陽性細胞を有毛細胞様細胞に１７、２０および２６日間分化させた。有毛細胞様細胞への分化はまた、公開された方法（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２０１７）を用いて達成され得る。未選別細胞も比較のために分化させ、試料をｑＰＣＲによって分析した。毛髪細胞マーカーＭｙｏ７ａおよびＡｔｏｈ１は３Ｄ培養の２６日後に、選別された集団においてアップレギュレートされた。ＬＧＲ５、幹細胞および支持細胞マーカーは、選別前の未成熟前駆細胞において、および主に未選別細胞サンプルにおける分化の初期段階の間にアップレギュレートされた。支持細胞マーカーであるＪＡＧ１はアップレギュレートされなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、ＳＳＥＡ１（ＣＤ１５またはＬｅｗｉｓ  ｘとしても知られる）、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを使用して、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、細胞がＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを有するかどうかを決定することを含む、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、細胞がＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを有するかどうかを決定することを含む、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される：
ａ）ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、またはＧＤ２のうち少なくとも２つ；または
ｂ）ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２のうち少なくとも１つがヒト耳前駆細胞として同定され、ＣＤ１４１は同定されない。
【００１９】
一実施形態では、細胞マーカーＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２は陽性細胞マーカーであり、ＣＤ１４１は陰性細胞マーカーである。適切には、本方法が陽性細胞マーカーの測定を含む。適切には、方法がネガティブ細胞マーカーを測定することを含む。この方法はまた、陽性細胞マーカーおよび陰性細胞マーカーの測定を含み得る。
【００２０】
本明細書に記載される細胞表面マーカーを使用することは、同定／決定ステップにおいてそれらを使用することを含み得る。特に、細胞表面マーカーが細胞上に存在するか否か、または細胞群上に存在するか否かの決定。陽性細胞マーカーは互いに組み合わせて、例えば、少なくとも陽性マーカーの対（すなわち、陽性マーカーの２つ以上）において、ヒト耳前駆細胞を同定するために使用され得る。別の実施形態では、陽性細胞マーカーの少なくとも３つを組み合わせて使用する。別の実施形態では、陽性細胞マーカーの少なくとも４つを組み合わせて使用する。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２の５つすべての陽性細胞マーカーを使用して、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する。
【００２１】
陽性細胞マーカーはまた、陰性細胞マーカーＣＤ１４１と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２から選択される少なくとも１つの陽性細胞マーカーを、ＣＤ１４１陰性細胞マーカーと組み合わせて使用する。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２から選択される少なくとも２つの（すなわち、２つの）陽性細胞マーカーを、ＣＤ１４１陰性細胞マーカーと組み合わせて使用する。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２から選択される少なくとも３つの（すなわち、３つの）陽性細胞マーカーを、ＣＤ１４１陰性細胞マーカーと組み合わせて使用する。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２から選択される少なくとも４つの陽性細胞マーカーを、ＣＤ１４１陰性細胞マーカーと組み合わせて使用する。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、およびＧＤ２の５つすべての陽性細胞マーカーを、ＣＤ１４１陰性細胞マーカーと組み合わせて使用する。
【００２２】
この方法は、少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得、少なくとも２つの細胞マーカーはＳＳＥＡ１およびＧＤ３を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＳＳＥＡ１およびＧＤ３を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含んでもよく、少なくとも２つの細胞マーカーはＳＳＥＡ１およびＴＲＡ−２−４９を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＳＳＥＡ１およびＴＲＡ−２−４９を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得、少なくとも２つの細胞マーカーはＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得、少なくとも２つの細胞マーカーはＳＳＥＡ１およびＧＤ２を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＳＳＥＡ１およびＧＤ２を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得、少なくとも２つの細胞マーカーはＧＤ３およびＴＲＡ−２−４９を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＧＤ３およびＴＲＡ−２−４９を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、ＧＤ３およびＳＳＥＡ４を含む少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＧＤ３およびＳＳＥＡ４を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得、少なくとも２つの細胞マーカーはＧＤ３およびＧＤ２を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＧＤ３およびＧＤ２を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。
【００２３】
この方法は、ＴＲＡ−２−４９およびＳＳＥＡ４を含む少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＴＲＡ−２−４９およびＳＳＥＡ４を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、および陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、ＴＲＡ−２−４９およびＧＤ２を含む少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＴＲＡ−２−４９およびＧＤ２を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、および陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。この方法は、少なくとも２つの細胞マーカーの使用を含み得、少なくとも２つの細胞マーカーはＳＳＥＡ４およびＧＤ２を含む。この方法は、少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ＳＳＥＡ４およびＧＤ２を含む少なくとも２つの陽性細胞マーカー、ならびに陰性細胞マーカーＣＤ１４１の使用を含み得る。
【００２４】
組み合わせた細胞マーカーの使用は、同定において同時に（実質的に同時に）、または連続的に（異なる時間／ステップで）であり得る。一実施形態では、組み合わせた細胞マーカーの使用が例えば、ＦＡＣＳおよび／またはＭＡＣＳにおいて同時である。
【００２５】
そうでない場合、細胞の混合集団は、異種細胞集団と称され得る。細胞の混合集団は、インビトロであり得る。本発明の方法は、インビトロであり得る。一実施形態では、細胞の混合集団がインビトロ幹細胞（ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの任意の他の多能性幹細胞など）分化プロトコールから、またはインビトロ幹細胞分化プロトコール中に提供することができる。別の実施形態では、細胞の混合集団がヒト耳細胞系列への脱分化、トランス分化または直接再プログラミング手順から、または脱分化、トランス分化または直接再プログラミング手順の間に提供され得る。
【００２６】
別の実施形態では、細胞の混合集団が組織から、例えば生検から提供され得る。ヒト耳前駆細胞の供給源は発生中の胎児内耳組織、ならびに成体内耳からの外科的介入から得られる蝸牛および前庭サンプルを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の組織であり得る。
【００２７】
細胞の混合集団は哺乳動物であってもよい。一実施形態では、細胞の混合集団の細胞はヒトである。
【００２８】
さらなる実施態様では、この方法がインビボで、例えば細胞移植処置中または処置後に手術後に、ヒト耳前駆細胞の同定のために使用することができる。
【００２９】
同定方法は検出可能な結合メンバーで細胞マーカーを標的化することを含んでもよく、例えば、細胞マーカーへの結合メンバーの結合が検出可能であってもよい。細胞の混合集団は、細胞マーカーに結合する（あるいは結合するように構成される）ことができる１つ以上の結合メンバーと接触され得る。
【００３０】
結合メンバーは本明細書中に記載される細胞マーカーに優先的に結合し得るか、またはそうでなければ、本明細書中に記載される細胞マーカーに特異的であり得る。結合メンバーは、抗体、抗体断片、またはその模倣物を含んでもよい。
【００３１】
一実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１を含む。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含み得る。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１と同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００３２】
一実施形態では、ＳＳＥＡ４を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＭＣ−８１３−７０を含む。別の実施形態では、ＳＳＥＡ４を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＭＣ−８１３−７０との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＳＳＥＡ４を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＭＣ−８１３−７０と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態において、ＳＳＥＡ４を同定／結合するための結合メンバーは、抗体ＭＣ−８１３−７０と同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態において、ＳＳＥＡ４を同定／結合するための結合メンバーは、抗体ＭＣ−８１３−７０と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００３３】
一実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅを含む。別の実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅとの結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅと同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅと同じＶＬおよびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態において、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するための結合メンバーは、抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅと同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００３４】
一実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するための結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つを含む。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するための結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つとの結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含み得る。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するための結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つと同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態において、ＧＤ２を同定／結合するための結合メンバーは、抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つと同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するための結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つと同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００３５】
一実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６を含む。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６と同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するための結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００３６】
一実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するための結合メンバーが抗体１Ａ４を含む。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するための結合メンバーが抗体１Ａ４との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するための結合メンバーが抗体１Ａ４と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するための結合メンバーが抗体１Ａ４と同じＶＬおよびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態において、ＣＤ１４１を同定／結合するための結合メンバーは、抗体１Ａ４と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００３７】
細胞マーカーおよび細胞マーカーに結合するように構成された抗体は以下の刊行物にさらに記載され、同定され得、これらの刊行物は本明細書中で参考として援用される。
【００３８】
SSEA4 (Kannagi R, Cochran NA, Ishigami F, Hakomori S-i, Andrews PW, Knowles BB, Solter D. Stage-specific embryonic antigens (SSEA-3 and -4) are epitopes of a unique globo-series ganglioside isolated from human teratocarcinoma cells. EMBO J. 1983;2:2355-2361.)
GD2 (Andrews PW, Nudelman E, Hakomori S-i, Fenderson BA. Different patterns of glycolipid antigens are expressed following differentiation of TERA-2 human embryonal carcinoma cells induced by retinoic acid, hexamtehylene bisacetamide (HMBA) or bromodeoxyuridine (BUdR) Differentiation. 1990;43:131-138) and (Durbas M, Horwacik I, Boratyn E, Kamycka E, Rokita H, GD2 ganglioside specific antibody treatment downregulates PI3K/Akt/mTOR signaling network in human neuroblastoma cell lines. Int J Oncol. 2015 Sep;47(3):1143-59. doi: 10.3892/ijo.2015.3070. )
SSEA1 (Solter D, Knowles BB. Monoclonal antibody defining a stage specific mouse embryonic antigen (SSEA1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978;75:5565-5569.)
GD3 (Andrews PW, Nudelman E, Hakomori S-i, Fenderson BA. Different patterns of glycolipid antigens are expressed following differentiation of TERA-2 human embryonal carcinoma cells induced by retinoic acid, hexamtehylene bisacetamide (HMBA) or bromodeoxyuridine (BUdR) Differentiation. 1990;43:131-138) and (Stuhlmiller GM1, Roberson KM, Seigler HF., Serological response of non-human primates to human melanoma disialoganglioside GD3. Cancer Immunol Immunother. 1989;29(3):205-10)
TRA-2-49 (Andrews PW1, Casper J, Damjanov I, Duggan-Keen M, Giwercman A, Hata J, von Keitz A, Looijenga LH, Millan JL, Oosterhuis JW, Pera M, Sawada M, Schmoll HJ, Skakkebaek NE, van Putten W, Stern P, Comparative analysis of cell surface antigens expressed by cell lines derived from human germ cell tumours. Int J Cancer. 1996 Jun 11;66(6):806-16.)
CD141 (Mutin M, Dignat-George F, Sampol J.Immunologic phenotype of cultured endothelial cells: quantitative analysis of cell surface molecules. Tissue Antigens. 1997 Nov;50(5):449-58.)
【００３９】
本明細書中で使用される用語「抗体」は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、天然または部分的もしくは全体的に合成的に産生されるか否かにかかわらず、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、または抗体結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含する。これらは天然の供給源に由来し得るか、またはこれらは部分的もしくは全体的に合成的に産生され得る。抗体の例は免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそれらのアイソタイプサブクラス；抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ）を含むフラグメント；ならびにダイアボディーである。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体は、「ｍＡｂ」と称され得る。
【００４０】
抗体は多くの方法で修飾され得るので、用語「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を包含するものと解釈されるべきである。従って、この用語は抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物、模倣物および抗体、ヒト化抗体のホモログを包含し、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含み、天然であろうと、全合成であろうと、部分合成であろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインまたは等価物を含むキメラ分子が含まれる。抗体模倣物は、アフィボディを含み得る。
【００４１】
全抗体のフラグメントが抗原に結合する機能を果たし得ることが示されている。結合フラグメントの例は（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；および（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であり、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結される。
【００４２】
本発明の方法は、細胞マーカーが細胞または細胞群に存在するかまたは存在しないとして検出される検出工程を含んでもよい。
【００４３】
当業者は細胞表面マーカーへの結合メンバー（例えば、抗体）の結合を検出するための多数の方法があることを理解する。そのような方法は、検出可能な標識／タグで結合メンバーを標識すること、または標識またはタグ付けされ、細胞マーカーに結合した「一次」結合メンバーに特異的に結合することができる抗体などの二次結合メンバーを使用することを含むことができる。
【００４４】
１つの実施形態において、結合メンバーは、同定のために標識される（または他の方法でタグ付けされる）。いったん標識された結合メンバーが細胞マーカーに結合されると、細胞は「標識細胞」と呼ぶことができる。異なる標識を使用して、細胞マーカーに結合するように配置された結合メンバーの各種を標識し得る。標識は放射標識、酵素標識、磁気標識、親和性標識（例えば、ビオチンまたはアビジン）、または発光検出可能標識（例えば、フルオロフォアまたは発色団）、またはそれらの組み合わせのいずれかを含み得る。標識は、共有結合などによって結合メンバーにコンジュゲートすることができる。
【００４５】
フルオロフォアは、ＧＦＰ（緑色）、ＹＦＰ（黄色）またはＲＦＰ（赤色）などの蛍光タンパク質の形態であってもよい。あるいは、フルオロフォアが非タンパク質有機フルオロフォアであってもよい。標識として提供され得るフルオロフォアは、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、およびテキサスレッドなどのキサンテン誘導体；シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、およびメロシアニンなどのシアニン誘導体；Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ、およびＳｑｕａｒｅ染料などのスクアレイン誘導体および環置換スクアライン；ナフタレン誘導体（ダンシル、プロダン誘導体）；クマリン誘導体；ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾジアゾール、およびベンゾオキサゾールなどのオキサゾール誘導体；アントラキノン、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、ＣｙＴＲＡＫオレンジなどのアントラゾール誘導体；カスケードブルーなどのピレン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０などのオキサジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなどのアクリジン誘導体、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体などのアクリジン誘導体、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなどのポルフィンが挙げられる。
【００４６】
異なるフルオロフォアを使用して、細胞マーカーに結合するように配列された結合メンバーの各種を標識し得る。各フルオロフォアは、検出され得る特徴的なピーク励起および発光波長を有する。量子ドットは、従来のフルオロフォアの代わりに使用することができる。
【００４７】
抗体に対する代替の結合メンバーは、特定のタンパク質ドメインを認識し得る短いヌクレオチド配列であるアプタマーによって提供され得る。アプタマーは小さく、その標的の結合により立体構造を変化させるので、特異的結合がクエンチャーを放出するか、または検出できるＦＲＥＴ対を生成するように操作することができる。
【００４８】
標識細胞の検出は、イムノアッセイ、分光分析、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロットまたはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗体マイクロアレイ免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ、アビジン−ビオチンまたはストレプトアビジン−ビオチン系を使用するイムノアッセイ、またはそれらの組み合わせを含む群のいずれかの使用を含み得る任意の適切なアッセイによるものであり得る。これらの方法は、当業者に周知である。検出のいくつかの方法は、細胞の破壊を必要とし得る。いくつかの実施形態では、検出方法が細胞にとって破壊的でなくてもよい。例えば、検出は標識された細胞を同定するために、共焦点顕微鏡および／または蛍光顕微鏡などの顕微鏡を含み得る。検出は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）またはＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）の使用を含み得る。一実施形態では、検出がＦＡＣＳの使用を含む。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、ＳＳＥＡ１（ＣＤ１５としても知られる）、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される少なくとも２つの細胞表面マーカーを使用して、細胞の混合集団中のヒト耳前駆細胞を同定する方法が提供される：
−少なくとも２つの異なる細胞マーカー（すなわち、細胞マーカーはＳＳＥＡ１（ＣＤ１５としても知られる）、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９（アルカリホスファターゼ）、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される）に特異的な結合メンバーを提供すること；
−細胞の混合集団を結合メンバーと接触させること；および
−細胞の混合集団中の細胞に対する結合メンバーの結合または非結合を検出すること。
【００５０】
この方法は、細胞がヒト耳前駆細胞であるという決定をさらに含み得る：
ａ）陽性細胞マーカーに結合するように構成された結合メンバーは細胞上の少なくとも２つの異なる陽性細胞マーカーに結合するか、または
ｂ）陽性細胞マーカーの１つに結合するように構成された結合メンバーは細胞上の少なくとも１つの陽性細胞マーカーに結合し、陰性細胞マーカーＣＤ１４１に結合するように構成された結合マーカーは細胞に結合しない。
【００５１】
別の実施形態では、この方法が、
ａ）陽性細胞マーカーに結合するように構成された結合メンバーが細胞上の少なくとも３つの異なる陽性細胞マーカーに結合する場合；または
ｂ）少なくとも２つの異なる陽性細胞マーカーに結合するように構成された結合メンバーが細胞上の少なくとも２つの異なる陽性細胞マーカーに結合し、陰性細胞マーカーＣＤ１４１に結合するように構成された結合マーカーが細胞に結合しない場合、細胞がヒト耳前駆細胞であるという決定をさらに含んでもよい。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を富化する方法が提供される：
−本発明に従ってヒト耳前駆細胞を同定し；
−ヒト耳前駆細胞が集団に富化されるように、ヒト耳前駆細胞が非耳前駆細胞から単離されるように細胞を選別する。
【００５３】
一つの態様において、ヒト耳前駆細胞の単離は完全であり得る（すなわち、非耳前駆細胞からの１００％単離）。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に２０％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に１５％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に１０％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に８％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に５％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に３％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に２％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に１％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に０．１％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。別の実施形態において、ヒト耳前駆細胞は、集団中に０．０１％未満の非耳前駆細胞が存在するように富化され得る。
【００５４】
富化は、１回の選別後に行ってもよい。あるいは、例えば、集団中のヒト耳前駆細胞のより高いパーセンテージをさらに富化または確実にするために、複数回の選別が提供され得る。
【００５５】
非耳前駆細胞は、廃棄、破壊、隔離、またはヒト耳前駆細胞とは別個に含有され得る。
【００５６】
一実施形態では、富化プロセスがヒト耳前駆細胞の生存率を維持する。
【００５７】
一実施形態では、分類はＦＡＣＳによる。別の実施形態では、ヒト耳前駆細胞の富化および選別が少なくとも１つのアフィニティーカラムの使用による。あるいは、この方法がヒト耳前駆細胞に選択的に結合する磁気ビーズの使用を伴うことができる。別の実施形態では、ヒト耳前駆細胞の富化および選別がＭＡＣＳの使用による。
【００５８】
有利なことに、ＦＡＣＳの使用は高精度での富化および細胞選別を提供し、ＦＡＣＳが複数の異なるフルオロフォア標識の使用、したがって複数の細胞マーカー選択を同時に可能にするので、複数の選別パスの必要性を低減する。
【００５９】
本発明の別の態様によれば、ヒト耳前駆細胞の集団を産生する方法が提供される：
−非耳前駆細胞の集団をヒト耳前駆細胞に分化、脱分化、トランス分化、または指向性再プログラミングし、それによっていくつかの非耳前駆細胞が集団中に残存して細胞の混合集団を形成し得；および
−本明細書中の本発明の方法に従って、細胞の混合集団からヒト耳前駆細胞を富化する。
【００６０】
非耳前駆細胞の集団を分化することは、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの幹細胞の集団を分化することを含み得る。例えば、非耳前駆細胞は、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの幹細胞を含むことができる。非耳前駆細胞の集団の脱分化は、より成熟した細胞の集団の脱分化を含み得る。例えば、非耳前駆細胞は、成熟（完全分化）細胞を含み得る。非耳前駆細胞集団のトランス分化または指向性再プログラミングは異なる系統（すなわち、非耳系統）由来の細胞集団のトランス分化または指向性再プログラミングを含み得る。
【００６１】
幹細胞を特定のタイプの細胞、例えば耳前駆細胞に分化させることができる多くの分化剤が当業者に知られている。従って、幹細胞は、当業者に公知の任意の手段によって耳前駆細胞に分化し得ることが想定される。分化剤のいくつかの例としてはＦＧＦリガンド、ＷＮＴ阻害および活性化、ＩＧＦ１、ＴＧＦ阻害および活性化、ウシ胎児血清、神経成長因子、ＥＧＦの除去、ｂＦＧＦ（またはその両方）の除去、ＢＤＮＦ、甲状腺ホルモン、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ソニックヘッジホッグ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、インターロイキン、インターフェロン、ＳＣＦ、アクチビン、インヒビン、ケモカイン、レチノイン酸およびＣＮＴＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
分化はＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（2012. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature, 490(7419) 278-82. doi: 10.1038/Nature11415)）またはＲｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ（2014. Stem Cells Dev,23(11),1275-1284）によって記載されるプロトコールに従い得るが、これらに限定されない。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、分化は、耳プラコードの最初の仕様に関与するシグナルを使用して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から耳前駆細胞を誘導することを含み得る。特に、分化はＦＧＦ３およびＦＧＦ１０によるＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）誘導を含んでもよく、場合によってはＦＧＦ３およびＦＧＦ１０濃度はそれぞれ約５０ｎｇ／ｍｌである。この区別は、本明細書中の図１ａまたはＣｈｅｎら２０１２に記載されるステップを含み得る。あるいは、分化がＦＧＦ３およびＦＧＦ１０によるＦＧＦ誘導、ならびにＷＮＴ阻害に続くＷＮＴ誘導によるＷＮＴシグナル伝達の操作を含み得る（本明細書中の図１ｂを参照のこと）。区別は、本明細書の図１ｂに記載されたステップを含むことができる。
【００６３】
非耳前駆細胞は、任意の公知の供給源、胚（胎児）組織または胚後組織由来の幹細胞であり得ることが想定される。一実施形態では、分化のための非耳前駆細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞を含むか、またはそれらからなる。非耳前駆細胞は、胎児細胞を含み得る。別の実施形態では、非耳前駆細胞が間葉組織、脂肪組織、または他の組織などの他の組織由来の幹細胞を含むことができる。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、少なくとも２つの異なる結合メンバーを含むキットが提供され、ここで、結合メンバーは、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置される。
【００６５】
一実施形態ではキットが少なくとも３つの異なる結合メンバーを含んでもよく、結合メンバーはＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置される。
【００６６】
別の実施形態ではキットが少なくとも４つの異なる結合メンバーを含んでもよく、結合メンバーはＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置される。
【００６７】
別の実施形態において、キットは少なくとも５つの異なる結合メンバーを含み得、ここで、結合メンバーはＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１から選択される異なる細胞マーカーに結合するように配置される。
【００６８】
別の実施形態ではキットが結合メンバーのパネルを含んでもよく、ここで、結合メンバーのパネルはＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２およびＣＤ１４１の細胞マーカーの各々に特異的な結合メンバーを含む。
【００６９】
キットの結合メンバーは、本明細書中に記載される抗体を含み得る。キットの結合メンバーは、本明細書中に記載されるように標識され得る。
【００７０】
一実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１を含む。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含み得る。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１と同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＳＳＥＡ１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＨＩ９８または４８０−１−１と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００７１】
一実施形態では、ＳＳＥＡ４を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＭＣ−８１３−７０を含む。別の実施形態では、ＳＳＥＡ４を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＭＣ−８１３−７０との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含み得る。別の実施形態では、ＳＳＥＡ４を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＭＣ−８１３−７０と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態において、ＳＳＥＡ４を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーは、抗体ＭＣ−８１３−７０と同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態において、ＳＳＥＡ４を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーは、抗体ＭＣ−８１３−７０と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００７２】
一実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅを含む。別の実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するために使用するキットの結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅとの結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅと同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅと同じＶＬおよびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態において、ＴＲＡ−２−４９を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーは、抗体ＴＲＡ−２−４９／６Ｅと同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００７３】
一実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つを含む。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つとの結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含み得る。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するために使用するキットの結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つと同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つと同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＧＤ２を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１４．１８、ＤＭａｂ−２０、１４Ｇ２ａ、ＶＩＮ２またはＰＢ２２のいずれか１つと同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００７４】
一実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６を含む。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するために使用するキットの結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するために使用するキットの結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６と同じＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＧＤ３を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体ＤＭａｂ−７またはＶＩＮＩＳ５６と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００７５】
一実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１Ａ４を含む。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１Ａ４との結合について競合することができる抗体などの結合メンバーを含み得る。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１Ａ４と同じエピトープに結合することができる抗体などの結合メンバーを含むことができる。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１Ａ４と同じＶＬおよびＶＨ鎖を有する抗体を含み得る。別の実施形態では、ＣＤ１４１を同定／結合するために使用されるキットの結合メンバーが抗体１Ａ４と同じＣＤＲを有する抗体を含み得る。
【００７６】
キットは、標識の検出に適切な試薬または結合メンバーをさらに含み得る。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、混合細胞集団中の非耳前駆細胞を同定するための陰性細胞マーカーとしてのＣＤ１４１の使用が提供される。
【００７８】
この使用は、細胞上のＣＤ１４１の存在または非存在の決定を含み得る。
【００７９】
さらなる実施形態は、発生中および成熟中の幹細胞およびヒト耳前駆細胞の挙動を研究するための、陽性および陰性の両方のヒト耳前駆細胞表面マーカーの使用である。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態は、ヒト耳前駆細胞特異的細胞マーカーを、ヒト耳前駆細胞の薬理学的操作のための標的として、インビボで、および単離または分化後のインビトロで使用することである。
【００８１】
本明細書中で使用される「耳前駆細胞」は幹細胞のように、特定の型の細胞に分化する傾向を有するが、幹細胞よりも既により特異的であり、有毛細胞様細胞または聴覚ニューロンなどの聴覚関連細胞に分化するように押し進められる生物学的細胞である。幹細胞と前駆細胞の違いは、幹細胞は無期限に複製できるのに対し、前駆細胞は限られた回数しか分裂できないことである。現在の同定方法は分子マーカーとして使用される一連の転写因子（例えば、いくつか挙げると、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２）を含み得る。耳前駆細胞はインビボで、胎児の発育中に、耳プラコード、耳嚢胞、および予想される感覚上皮の前感覚領域に見出される。成人の成熟した耳におけるそれらの存在は、まだ議論中である。しかし、いくつかの支持細胞は、前駆細胞様特性を有し得る。本明細書中で使用される場合、本出願は、ヒト耳前駆細胞に関連する局面を記載する。しかし、ヒト耳前駆細胞に関して本明細書に記載される全ての局面は、より一般的に哺乳動物を指すと理解され得る。
【００８２】
本明細書で使用される「陽性細胞表面マーカー」という用語は、耳前駆細胞の表面上にある分子などのマーカーを意味すると理解され、おそらく他のマーカーと共に使用して、耳前駆細胞の同一性を陽性的に検証することができる。本明細書中の「陽性細胞表面マーカー」または「陽性細胞マーカー」への言及は、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３、ＴＲＡ−２−４９、ＳＳＥＡ４、またはＧＤ２のうちの１つを指すことを意図する。
【００８３】
本明細書で使用される「陰性細胞表面マーカー」という用語は耳前駆細胞上では見出されない、細胞の表面上の分子などのマーカーを意味すると理解される。従って、このようなネガティブマーカーを有する細胞は、非耳前駆細胞として検証され得る。本明細書中の「ネガティブ細胞表面マーカー」または「ネガティブ細胞マーカー」への言及は、ＣＤ１４１を指すことを意図する。
【００８４】
本明細書で使用される「富化する」または「富化された」という用語は、耳前駆細胞の割合が非耳前駆細胞と比較して細胞集団において増加することを意味することを意図する。あるいは、富化は、非耳前駆細胞から耳前駆細胞を選別することとみなすことができる。富化において、耳前駆細胞は、非耳前駆細胞から単離されてもよく、またはその逆であってもよい。
【００８５】
本発明は、他の既知または将来同定される細胞マーカーと組み合わせた、本明細書に記載される細胞マーカーの使用を排除しない。
【００８６】
「特異的」または「特異的結合」は一般的に、特異的結合対の１つのメンバーがその特異的結合パートナー以外の分子に対していかなる有意な結合も示さず、そして例えば、任意の他の分子との約３０％未満の交差反応性を有する状況を指すために使用される。他の実施形態において、それは、任意の他の分子との２０％、１０％、または１％未満の交差反応性を有する。この文脈において、特定の細胞マーカーに「結合するように構成される」結合メンバーは細胞マーカーに特異的に結合することができる結合メンバーであり、すなわち、他の分子の有意な結合なしに前記マーカーに結合するように構成される。文脈が許す限り、「結合するように構成される」および「特異的に結合する」という用語は、互換的に使用することができる。
【００８７】
当業者は、本発明の一実施形態または態様の任意の特徴が適切な場合、本発明の他の実施形態または態様に適用可能であり得ることを理解するであろう。
【００８８】
本発明を概説してきたが、以下の実施例は特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではなく、例示するために提供される。
【実施例】
【００８９】
本発明に至る作業は、付与契約番号６０３０２９に基づく欧州連合第７次枠組みプログラムＦＰ７／ＨＥＡＬＴＨ−２０１３−ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ−１から資金提供を受けた。
【００９０】
［異種細胞集団からの耳前駆細胞の精製］
（イントロダクション）
（耳前駆細胞の有望な精製の必要性）
プロトコールは幹細胞を制御する能力における多くの重要な制限のために、ｈＰＳＣが（せいぜい）所望の細胞型の高い表現を有する細胞の集団を産生するように最適化された。不均一な開始培養、増殖因子のバッチごとの変動、培地および他の消耗品、細胞株の変動性および細胞播種密度などの問題はすべて、分化の効率に影響を及ぼし得る。ｈＰＳＣから耳前駆細胞を生成するための多数のプロトコールが開発されているが［１，２］、全てが混合培養物を生じ、サブセットのみが前駆細胞自体である。現在、耳の分化実験は前駆細胞を精製するために手動で洗浄され、これは形態学および／またはレポーター遺伝子の発現に基づいて、望ましくない細胞型を掻き取ることを包含する。このアプローチは下流のニューロン／有毛細胞の分化を促進するのに有効であるが、労働集約的であり、非前駆細胞型の少数の割合をキャリーオーバーする傾向がある。したがって、幹細胞療法が臨床応用に向かって進歩するためには、大きな細胞数までスケールアップすることができるより正確な客観的方法が必要である。
【００９１】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）は、細胞表面マーカーの差次的発現に基づいて集団内の細胞のサブグループを分離するために一般に使用される技術である。この方法は、それらのタンパク質に対する適切な抗体の利用可能性と合わせて、異種集団から選別されるべき細胞における独特の細胞表面タンパク質発現プロフィールを同定することを必要とする。本発明者らは耳前駆細胞を精製するためのＦＡＣＳにおける使用のための候補を同定するために、耳分化を受けたｈＥＳＣの培養物中の細胞表面抗原に付着することが知られている抗体をスクリーニングしてきた。
【００９２】
「耳前駆細胞」と呼ばれる中間状態を介して、ｈＰＳＣを耳の分化系統に沿って、感覚ニューロンおよび有毛細胞の表現型に向かって進めるためのプロトコールが開発されている。耳前駆細胞を誘導するために使用されるプロトコールはＦＧＦ３およびＦＧＦ１０によるＦＧＦ誘導（図１ａおよびＣｈｅｎら、２０１２）、ならびにＷＮＴシグナル伝達の操作を組み込み、ＷＮＴ阻害段階（ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏを使用する）を追加し、続いてＷＮＴ誘導（ＢＩＯを使用する）を組み込む、より最近の方法を含む（図１ｂ）。
【００９３】
ＦＡＣＳを介して耳前駆細胞集団を精製するために使用され得る適切な細胞表面マーカーを見出すために、上記の２つのプロトコールから生じる異種細胞集団に対して抗体スクリーニングが行われた。
【００９４】
（方法および結果）
Ｓｈｅｆ３．２、Ｈ１４−ＮＯＰ−ＳＯＸ２レポーターおよびＨ１４ｓ９培養物由来のｈＥＳＣを、「ＦＧＦプロトコール」（図１ａ）または「ＷＮＴプロトコール」（図１ｂ）のいずれかを用いて９６ウェルプレートで分化させた。得られた培養物を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ２２００における固定および画像化の前に、細胞表面抗体のパネルで生染色した。スクリーニングには３つの段階があった：
１．ＣＳＣＢ抗体を用いたパイロットスクリーニング。Ｈ１４−ＮＯＰ−ＳＯＸ２レポーター株およびＷＮＴプロトコールを使用した。
２．ＢＤ  ｌｙｏｐｌａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐａｎｅｌ  ｗｉｔｈ  ２４２抗体を用いたメインスクリーニング。Ｈ１４ｓ９ラインおよびＷＮＴプロトコールを使用した。（３プレート複製）
３．ＢＤ  ｌｙｏｐｌａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐａｎｅｌ  ｗｉｔｈ  ２４２抗体を用いたメインスクリーニング。Ｓｈｅｆ３．２株およびＦＧＦプロトコールを使用した。（２プレート複製）
イメージング後、データをＤｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェアを用いて処理し、ＥｘｃｅｌおよびＳＰＳＳでさらに分析した。
【００９５】
３つの実験を表１に要約する。
【００９６】
【表１】
2019533138.tif 000002
【００９７】
［１．１  ＣＳＣＢ−Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ抗体パネルを用いたパイロットスクリーニング］
スクリーニングの最初の段階は、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ（表２）で入手可能な抗体の比較的小さなパネルを利用した。
【００９８】
【表２】
2019533138.tif 000003
【００９９】
鼻および耳のプラコード特異的ＳＯＸ２エンハンサーによって駆動されるＥＧＦＰを発現するｈＥＳＣレポーター株を、「ＷＮＴ」プロトコールを用いて識別した（図１ｂ）。生染色を、耳誘導の終わり（〜１２日）に抗体パネルを用いて実施し、次いで、細胞を固定し、その後、全てをＨｏｅｃｈｓｔでプローブし、自動顕微鏡システム（ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ２２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化した。Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウェアを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔ発現に基づいて個々の細胞を同定し、次いで、ＧＦＰ（細胞内のＳＯＸ２レポーター）およびＡｌｅｘａ５６８（細胞表面マーカー抗体に対して使用される二次抗体に付着した蛍光色素）の両方の蛍光強度を記録し、そして各細胞における陽性発現を定義するために使用した。陽性は、非反応性ＩｇＧ、陰性対照ウェル（親骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株によって産生されたＩｇＧ）で見られるよりも高い蛍光強度として定義した。
【０１００】
２枚の９６ウェルプレートをこの一次スクリーニングにおいて使用し、染色法はごくわずかだけ変えている。つまり、プレート１はＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅバイオイメージングプロトコールに従って、増殖培地としてＤＭＥＭ中の５％  ＦＢＳを用い、抗体を添加した。プレート２はプレート１に対して、増殖培地の代わりにＰＢＳ（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を用いたもの）中の５％ＦＢＳを用いて染色した。
【０１０１】
多数の潜在的なヒットがＣＳＣＢ抗体パネルにおいて明らかにされた。図２はこの実験からのデータを、別々のペインにおける各抗体について示し、ｘ軸はＳＯＸ２レポーター（ＧＦＰ）の蛍光強度を示し、ｙ軸は細胞表面マーカーの蛍光強度を示す。枠は細胞表面マーカーに対して陽性の細胞の割合に基づいて上から下に配列され、左上が最も陽性であり、右下が最も陽性でない。ＴＲＡ−１−８５は陽性対照抗体、Ｐ３Ｘは陰性対照抗体である。トップヒットは、最初の列から最後の最も少ない候補までで見つけられる。
【０１０２】
各ウェルにおける陽性細胞のパーセンテージに基づく異なる分析方法、および２５％を超えるまたは１０％を超える閾値のいずれかで陽性とスコア付けされた抗体あたりの反復ウェルの数により、ＳＳＥＡ１、ＧＤ３およびＴＲＡ−２−４９として上位３ヒットが確認され、それに次いでＳＳＥＡ４（８１３−７０）であることが確認された。
【０１０３】
ＰＢＳまたはＤＭＥＭ中で行われる抗体インキュベーションの間にはほとんど差異がないため、その後の実験において、ＤＭＥＭが耳誘導の間に増殖する細胞の分化培地の成分を構成するものとして選択された。生染色はいかなる明らかな方法でも細胞に有害な影響を及ぼさないことが分かった（すなわち、プロトコール中に細胞の余分な剥離がない）。生染色は、ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅ法では以前の固定によって誤った結果が生じる可能性があることから、推奨される。生きた前駆細胞がさらなる操作に必要とされる場合にも、生染色は適するであろう。
【０１０４】
［１．２  ＣＳＣＢパネルからのヒットの初期検証］
ＳＳＥＡ−１およびＧＤ３抗体が、耳前駆細胞亜集団に有効に結合することを確認するために選択された。顕微鏡上でＧＦＰチャネルを遊離させるために、本発明者らは、レポーターが生成されたＨ１４ｓ９から親ｈＥＳＣ株に戻した。一次スクリーニングにおけるのと同じ方法で細胞を分化させ、次いで、ＳＳＥＡ−１抗体およびＧＤ３抗体で生染色した（複数の別個のウェル、すなわち、表面タンパク質の共発現を見ていない）。次いで、細胞は核（転写）の耳のマーカーである、ＰＡＸ２、ＳＯＸ２およびＦＯＸＧ１についてプローブされ得るように固定され、透過処理された。Ｈｏｅｃｈｓｔを再び用いて、個々の細胞の核を同定した。一次スクリーニングと同じデータ収集および分析方法を使用した。これらのデータは、ＳＳＥＡ１陽性集団が３つの転写因子のそれぞれについて陽性の細胞のサブセットであることを示す（表３ｉ）。ＧＤ３陽性である細胞の割合（３．４％）がＰＡＸ２陽性でないことを除いて、ＧＤ３のデータは類似している（表３ｉｉ）。これは、いくつかのＧＤ３染色を示す細胞が耳の前駆細胞の形態と関連しないことを示す形態学的データと合わせれば、ＧＤ３がＳＳＥＡ１よりも所望の細胞サブセットを識別しにくいことを示唆する。図３を参照のこと。
【０１０５】
【表３−１】
2019533138.tif 000004
【０１０６】
【表３−２】
2019533138.tif 000005
【０１０７】
［２．１  ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅ抗体パネルのスクリーニング］
ＣＳＣＢ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐａｎｅｌでの研究は細胞表面マーカーをスクリーニングするために自動化バイオイメージング法を使用する可能性を証明し、ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に基づくより包括的なスクリーニングを行う前に、システムの完全な最適化を可能にした。このパネルは２４２個の抗体の結合をアッセイし、同定されたマーカーの数を増加させることが期待された。
【０１０８】
ＢＤ  ｌｙｏｐｌａｔｅスクリーニングにより、５つの複製を９６ウェルプレートで実行することができる。実験を２つに分けた。ＷＮＴプロトコールを用いて分化したＨ１４ｓ９細胞株を用いて３回の反復を行ったが、残りの２回はＦＧＦプロトコールと共にＳｈｅｆ３．２細胞株を用いた。したがって、この実験デザインは、２つの独立した細胞株および２つの異なる分化プロトコールをカバーする全部で５つの複製を含んでいた。本発明者らはこれが、耳前駆細胞表面マーカーの非常に最良の候補を引き出す機会を最大化するのであろうと信じた。
【０１０９】
データを処理した後、分析を行って、ウェル中の細胞の総数および陽性であるとみなされる細胞を同定した。陽性閾値は、各プレート上の対照（一次抗体を含まない）として定義されるウェルＡ１の分析を通してプレートごとに計算した。次いで、陽性細胞のパーセンテージを各ウェルについて計算した。次いで、このデータを、３ＢＤ抗体プレートの各々について、すなわち、各プレートについて５反復、Ｈ１４ｓ９について３反復、およびＳＨｅｆ３．２について２反復について照合した。
【０１１０】
次に、２つの異なるタイプの分析を採用した。最初に強度ベースの客観的基準を使用し、後に形態ベースの主観的基準を使用した。
【０１１１】
（標識閾値の客観的分析）
１．本発明者らは、各ウェルにパーセンテージ陽性値を与え、比較のために５つ全ての反復を並べて列挙した。
２．１０％未満の陽性細胞は陰性と分類され、１０％以上は陽性と分類された。
３．３個以上の複製ウェルが陰性であった場合、ウェルおよび対応する抗体を非候補に分類し、将来の検討から除外した。
４．４または５ウェルすべてが８０％を超える陽性である場合、抗体は十分に区別できない（すなわち、あまりに多く細胞型に結合する）と考えられ、したがって非候補を分類し、将来の考察から除外する。
５．本発明者らは残りのウェルが２つの細胞株にまたがる最低３つの陽性複製を有することを調べた、すなわち、複製１〜３が陽性（Ｈ１４ｓ９複製）であるが、４および５が両方とも陰性（Ｓｈｅｆ３．２複製）である場合、抗体が１つの系統に特異的に結合していること（またはＦＧＦプロトコールとは対照的にＷＮＴプロトコールを介して分化を受けた細胞のみに特異的に結合している可能性があること）を示唆するので、ウェルは除外されるべきである。
【０１１２】
図４は、上述の基準がどのように実施されたかを示すために使用されるプレート１のデータの一部の切り抜きを示す。ウェルＦ５〜Ｇ６についてのデータが表示され、パーセンテージデータはパーセンテージが高いほど、陰影が暗くなり、差異を見やすくするようにフォーマットされている。複製１〜３は、Ｈ１４ｓ９／ＷＮＴプロトコール複製である。複製４および５は、Ｓｈｅｆ３．２／ＦＧＦプロトコール複製である。
【０１１３】
図４ａでは、枠線が描かれたウェルが３以上の負の複製（上記ポイント３）に入り、従って、非候補として除去される。図４ｂにおいて、枠線が描かれたウェルは不十分な識別（上記ポイント４）カテゴリーに入り、それ故、非候補として取り除かれる。図４ｃにおいて、概説されたウェルは、ライン／プロトコール特異的結合カテゴリー（上記ポイント５）に入るため、非候補として除去される。
【０１１４】
（形態学に基づく主観的分析）
一旦、全ての非候補ウェルが除去してから、我々は画像データに戻り、そして残りのウェルをチェックして、抗体が実際に、我々が形態学のみによって耳前駆細胞として分類する集団に結合しているかどうかを調べた。Ｈ１４ｓ９はコンフルエントすぎて目で形態を測ることができなかったため、この分析はＳｈｅｆ３．２反復試験でのみ行った。
【０１１５】
全体として、これらの分析は、最初のパイロットスクリーニングで同定された最良の候補のうちの３つ（ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４およびＧＤ２）を確認する。ＧＤ３とＴＲＡ２‐４９（アルカリホスファターゼ）はＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅでは示されなかった。いくつかの「第２段階」の陽性マーカーが同定されたが、それらは本研究の最初の試験で設定された厳格な基準に合格しなかったため、これら５つのみ（ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、ＧＤ２、ＧＤ３およびＴＲＡ２−４９）を追うことにした。
【０１１６】
さらに、本発明者らはＣＤ１４１がほとんどの他の細胞型を標識するが、前駆細胞を標識しないので、排除マーカーとしてＣＤ１４１を同定した。
【０１１７】
（図６および７の方法）
異なる妊娠期間のヒト胎児を、４℃のＰＢＳ中の４％  ＰＦＡ中で２時間固定した。次いで、サンプルを、ＰＢＳ中の５％〜３０％スクロースの上昇系列で凍結保護し、Ｃｒｙｏ−Ｍ−Ｂｅｄ（Ｂｒｉｇｈｔ）中に包埋し、その後、液体窒素で冷却した液体イソペンタン中で凍結した。厚さ１０μｍの連続切片をクライオスタットで切断し、ゼラチン被覆スライド上に集めた。切片をＰＢＳで簡単に洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  ５％  Ｎｏｒｍａｌ  Ｄｏｎｋｅｙ  Ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ＰＢＳ）中、室温で１５〜３０分間インキュベートした。使用した抗体は以下の通りであった：  抗ＣＤ１４１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ニューロフィラメント２００（Ｓｉｇｍａ）。シグナルは、Ａｌｅｘａ結合二次抗体を用いて可視化した。核対比染色をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で行った。
【０１１８】
（図８および図９の方法）
Ｓｈｅｆ３．２系統由来のｈＥＳＣを、［１］に記載されるように、「ＦＧＦプロトコール」を用いて１４日間耳前駆細胞に分化するように誘導した。この段階で、未固定細胞を、それぞれＡｌｅｘａ  ６４７、Ａｌｅｘａ  ４８８またはＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１蛍光色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に直接コンジュゲートしたＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−２−４９およびＣＤ１４１抗体で標識した。細胞を分離し、ＢＤ  ＦＡＣＳＪａｚｚを用いて分析した。
【０１１９】
図９について、選別された細胞および選別されていない細胞を、本発明者らの実験室で開発されたオルガノイド（３Ｄ）培養システムを使用して、１７、２０および２６日間、有毛細胞様細胞にさらに分化させた。有毛細胞様細胞への分化はまた、公表された方法（例えば［２］）を用いて達成され得る。ＲＮＡを抽出し、ＤＤ−Ｃｔ法を用いてｑＰＣＲにより遺伝子発現を分析した。
【０１２０】
これらの結果は、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ２‐４９＋二重陽性集団が非ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ２‐４９二重陽性画分（単一陽性または−／細胞）から単離されたときでさえ、有毛細胞系統に分化し得る前駆細胞を含有することを示唆する。ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ２−４９＋細胞の割合が比較的大きい（５４．８±５．６％、平均±  ｓ．ｅ．ｍ．）ことを考えると、ソートされていない集団は依然として分化することができた。
【０１２１】
（参照）
[1] Chen, W., Jongkamonwiwat, N., Abbas, L., Eshtan, S.J., Johnson, S.L., Kuhn, S., Milo, M., Thurlow, J.K., Andrews, P.W., Marcotti, W., Moore, H.D., Rivolta, M.N. “Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors.” Nature, 490, 278-282, 2012.
[2] Ronaghi, M., Nasr, M., Ealy, M., Durruthy-Durruthy, R., Waldhaus, J., Diaz, G.H., Joubert, L.M., Oshima, K., Heller, S. “Inner ear hair cell-like cells from human embryonic stem cells.” Stem Cells Dev, 23(11), 1275-1284, 2014.
【図１】
2019533138.tif 000006
【図２−１】
2019533138.tif 000007
【図２−２】
2019533138.tif 000008
【図２−３】
2019533138.tif 000009
【図３】
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【図４−ａ】
2019533138.tif 000011
【図４−ｂ】
2019533138.tif 000012
【図４−ｃ】
2019533138.tif 000013
【図５】
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【図６】
2019533138.tif 000015
【図７】
2019533138.tif 000016
【図８】
2019533138.tif 000017
【図９】
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【国際調査報告】
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2019533138.tif 000020
2019533138.tif 000021
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