(57)【要約】  本発明は、個体における炎症性胃腸疾患の処置及び／又は予防に使用するための、ＣＮＣＭに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３で寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）種の細菌株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における炎症性胃腸疾患の処置及び／又は予防に使用するための、ＣＮＣＭに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３で寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）種の細菌株。
【請求項２】
個体が哺乳動物である、請求項１に記載の細菌株。
【請求項３】
個体がヒトである、請求項１又は請求項２に記載の細菌株。
【請求項４】
炎症性胃腸疾患が炎症性腸疾患である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項５】
炎症性胃腸疾患が結腸炎症性腸疾患である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項６】
結腸炎症性腸疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎及び回腸嚢炎からなる群から選択される、請求項５に記載の細菌株。
【請求項７】
結腸炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項５又は請求項６に記載の細菌株。
【請求項８】
当該細菌株が、生理学的に許容される媒体を含む組成物中に含まれる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項９】
当該細菌株が経口組成物中に含まれる、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１０】
当該細菌株が栄養補助食品中に含まれる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１】
前記組成物が、薬剤として１０７〜１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）に相当する１日投与量、好ましくは１０９ｃｆｕの１日投与量の形態での投与に適している、請求項８乃至請求項１０のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１２】
前記組成物が経口投与用のものであり、食品、飲料、医薬品、機能性食品、食品添加物、栄養補助食品及び乳製品からなる群から選択される、請求項８乃至請求項１１のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１３】
前記組成物が経口投与用のものであり、栄養補助食品である、請求項１２に記載の細菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体における炎症性胃腸疾患（ＩＢＤ）、特に炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置及び予防に使用するためのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、損傷又は感染に対する正常な反応の一部をなし、生物を内的又は外的攻撃から防御するのに寄与する自然な生物学的プロセスである。
【０００３】
しかし、炎症メカニズムの機能不全、特に持続的又は過剰な炎症は、有痛性疾患を引き起こし、患者の生命を脅かしかねない。このような疾患としては、例えば、皮膚障害、腸障害、神経障害、関節炎及び自己免疫疾患が含まれる。これらの炎症性疾患の幾つかは、依然として、全く治療法がないか或いは適切な治療法がない。
【０００４】
従って、新しい抗炎症治療戦略の研究及び探索は、医学及び生物医学研究の主要テーマの一つである。
【０００５】
炎症性腸疾患は、胃腸管の慢性及び再発性炎症を特徴とする疾患群である。この群の最も一般的な形態はクローン病である。発病には、遺伝的素因のある患者の腸内細菌叢の存在によって引き起こされる粘膜免疫系の不適切で連続的な活性化が関与している。
【０００６】
個体における炎症性胃腸疾患、特に炎症性腸疾患の処置及び予防のための新規物質、特にプロバイオティクス又は組成物に対するニーズが常に存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、個体における炎症性胃腸疾患、特に個体における炎症性腸疾患の処置及び予防のための新規物質、特にプロバイオティクス及び組成物を提供することである。
【０００８】
本発明に関して、「予防」という用語は、所与の事象すなわち本発明では胃腸の炎症、特に腸の炎症の発生リスク又は発生確率を低減することをいう。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる、ＣＮＣＭに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３で寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ株の抗炎症特性の発見に基づくものである。
【００１０】
本発明者らの実験結果によると、２０１２年１月２１日付けでＣＮＣＭに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３で寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の特定の株は、個体における炎症性胃腸疾患、特に炎症性腸疾患を、インビトロ及びインビボで軽減するという予想外の能力を有していることが判明した。対照的に、本願明細書の実施例で例証し、以降で説明する通り、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株はこのような有益な性質を有していないことが本発明者らによって実証された。
【００１１】
本発明の細菌株は、さらに具体的には、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）及びγインターフェロン（ＩＮＦγ）のような炎症促進性分子の産生を低減し、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）のような抗炎症性分子の産生を増加させることができる。
【００１２】
第一の態様では、本発明は、個体における炎症性胃腸疾患、特に個体における炎症性腸疾患、とりわけ個体における結腸炎症性腸疾患の処置及び／又は予防に使用するための、ＣＮＣＭに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３で寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ種の細菌株に関する。
【００１３】
本発明者らによって同定されたこの株は、上記の用途に使用し得るプロバイオティクス株である。
【００１４】
本発明において、個体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物も含めた哺乳動物であり、特にヒトである。
【００１５】
炎症性胃腸疾患は、特に炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、とりわけ結腸炎症性腸疾患である。
【００１６】
結腸炎症性腸疾患は、特にクローン病、潰瘍性大腸炎及び回腸嚢炎からなる群、特にクローン病及び潰瘍性大腸炎から選択し得る。
【００１７】
別の実施形態では、本発明に係る使用のための細菌株は、生理学的に許容される媒体を含む組成物中、好ましくは経口組成物中、さらに好ましくは栄養補助食品中に含まれる。
【００１８】
「生理学的に許容される媒体」という用語は、本組成物を投与しなければならない個体の身体に適合する媒体をいう。これは例えば水のような無毒性の溶媒である。特に、上記媒体は経口投与に適合したものである。
【００１９】
本発明の組成物は、好ましくは経口投与用のものである。
【００２０】
本発明の経口投与用の組成物は、食品、飲料、医薬品、機能性食品、食品添加物、栄養補助食品及び乳製品からなる群から選択することができ、特に栄養補助食品の形態である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、（ａ）ＹＢＨＩ培地（対照）中、（ｂ）Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株で処理、（ｃ）本発明のＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株で処理、又は（ｄ）Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株で処理し、ＴＮＦαで刺激したＨＴ−２９細胞中のインターロイキン８（ＩＬ−８）の濃度（ｐｇ  ＩＬ−８／ｍｇタンパク質）を示す。試験は３回実施した。結果は、陰性対照としてのＰＢＳでの共誘導後に産生したＩＬ−８を基準値として用いて標準化した。＊ｐ＜０．０５。
【図２】図２は、（ａ）ＹＢＨＩ培地（対照）中、（ｂ）Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株で処理、（ｃ）本発明のＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株で処理、又は（ｄ）Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株で処理した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の濃度（ｐｇ  ＩＬ−１０／ｍｇタンパク質）を示す。試験は３回実施した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】図３は、マウス（ＤＮＢＳ）における慢性大腸炎モデルの実験プロトコルを示す。
【図４】図４は、（ａ）ＥｔＯＨのみを与えた対照マウス（大腸炎なし）、（ｂ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、ＰＢＳで処置した対照マウス、（ｃ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株で処置したマウス、（ｄ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株で処置したマウス、又は（ｅ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株で処置したマウスの結腸及び小腸の巨視的スコアを示す。巨視的評価基準（０（損傷なし）〜９の尺度で評価）は、粘膜の巨視的損傷（潰瘍、結腸壁の肥厚、結腸と他の腹腔内臓器との間の癒着の存在など）、便のコンシステンシー（下痢の指標として）及び充血の存在を含む。Ｎ＝８。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、（ａ）ＥｔＯＨのみを与えた対照マウス（大腸炎なし）、（ｂ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、ＰＢＳで処置した対照マウス、（ｃ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株で処置したマウス、（ｄ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株で処置したマウス、又は（ｅ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株で処置したマウスの遠位結腸におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（Ｕ／ｍｇ）を示す。Ｎ＝８。＊Ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、（ａ）ＥｔＯＨのみを与えた対照マウス（大腸炎なし）、（ｂ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、ＰＢＳで処置した対照マウス、（ｃ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株で処置したマウス、（ｄ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株で処置したマウス、又は（ｅ）ＤＮＢＳ大腸炎を有し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株で処置したマウスの結腸サイトカインの濃度（（図６Ａ）ＩＬ−２、（図６Ｂ）ＩＬ−４、（図６Ｃ）ＩＬ−６、（図６Ｄ）ＩＦＮｇ）（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者らは、個体における炎症性胃腸疾患、特に個体における炎症性腸疾患を処置及び／又は予防するためのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィの特定の株の能力を同定するための詳細な研究を行った。
【００２３】
実際、本発明者らは、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株が、個体における胃腸炎症、特に腸炎症を軽減する能力を有するという予想外の結論を得た。
【００２４】
本発明の細菌株が、特に、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターロイキン６（ＩＬ−６）のような炎症促進性分子の濃度を低減させることができることは本明細書で開示する。
【００２５】
本発明の細菌株が、特に、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）のような抗炎症性分子の濃度を増加させることができることも本明細書で開示する。
【００２６】
本発明のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ株
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門の主要メンバーであり、健康なヒトの大腸の細菌叢における最も豊富な常在細菌の一つである。
【００２７】
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは、極端に酸素に敏感な（ＥＯＳ）細菌であり、たとえ嫌気性条件下であっても培養するのが難しい（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５２（Ｐｔ  ６）：  ２１４１−６及びＬｏｐｅｚ−Ｓｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１２，  ７８（２）：  ４２０−８）。Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは、特に、ヒトの消化管における最も豊富な酪酸産生菌の一つとして知られているが、短鎖脂肪酸である酪酸は、腸の生理、全身機能、及びヒトの健康への有益な作用に非常に重要である（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  （２０１１），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ４５  Ｓｕｐｐｌ：  Ｓ１２０−７）。
【００２８】
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株も、急性及び慢性大腸炎、すなわち炎症性疾患のマウスモデルにおいて抗炎症及び防御作用を有することが知られている（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  Ｍａｒｃｈ  ２０１４；  ２０（３）：  ４１７−３０及びＳｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２８，  ２００８；  １０５（４３）：  １６７３１−６）。
【００２９】
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの所与の株について抗炎症特性の存在は予測できないことから、Ａ２−１６５株の抗炎症特性をＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ種全般に帰属させることはできない。実際、そうした特異的な抗炎症活性が実施例に例示されており、本発明の技術的範囲に属さないＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ株すなわちＣＮＣＭ  Ｉ−４５７５株で比較試験が実施されているが、この株は、本発明の株の抗炎症活性を有していない。
【００３０】
本発明に係る細菌株の適切な１日投与量は、薬剤として１０７〜１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）であり、例えば１０９ｃｆｕの１日投与量の形態である。
【００３１】
本発明のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ株は、個体における炎症性胃腸疾患、特に個体における炎症性腸疾患の処置及び／又は予防に使用するためのものである。
【００３２】
本発明の株は、その活性が腸内に局在するプロバイオティクスである。本発明に係るプロバイオティクス菌は、十分な量の生菌を摂取したときに、ヒトの健康に有益な作用を奏することのできる細菌をいう。
【００３３】
従って、この株は生菌のまま腸に投与しなければならない。
【００３４】
本発明の細菌株は、処置すべき個体の腸に様々な方法で投与、すなわち経口投与又は直腸内投与することができる。本発明の細菌は好ましくは経口投与される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の細菌株は、生理学的に許容される媒体を含む組成物中に含まれる。かかる組成物は、好ましくは経口投与用であり、特に栄養補助食品の形態である。
【００３６】
組成物
本発明は、生理学的に許容される媒体中に、本発明のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＩ−４５７３株を少なくとも含む組成物にも関する。
【００３７】
本発明に係る組成物は、消化管、特に腸のためのものである。
【００３８】
従って、本発明に係る組成物は、経口又は直腸用組成物から選択される。本発明の組成物は、好ましくは経口又は直腸用組成物であり、さらに好ましくは経口組成物である。
【００３９】
一実施形態では、本発明の組成物は経口組成物、すなわち被験体に経口投与するためのものである。
【００４０】
かかる組成物は、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤の形態とし得る。
【００４１】
本発明に係る経口投与用の組成物は、食品、飲料、医薬品、機能性食品、食品添加物、栄養補助食品又は乳製品からなる群から選択することができ、特に栄養補助食品とし得る。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明に係る組成物は栄養補助食品である。
【００４３】
経口投与用の栄養補助食品は、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、糖衣錠、丸剤、ペースト剤、トローチ剤、ガム剤、経口液剤又は懸濁剤、シロップ剤又はゲル剤中に存在し得る。
【００４４】
好適には、経口投与向けの本発明に係る組成物には、該組成物に含まれる本発明の細菌株が損傷した胃を通過できるように、耐胃液性コーティングを設けてもよい。こうして細菌株の放出は上部腸管で初めて起こるようにしてもよい。
【００４５】
本発明に係る栄養補助食品は、甘味料、安定剤、酸化防止剤、添加剤、香料及び／又は着色剤を含んでいてもよい。
【００４６】
その製剤化は、糖衣錠、ゼラチンカプセル剤、ゲル剤、徐放性ヒドロゲル剤、乳剤、錠剤又はカプセル剤を製造するための常法によって実施される。
【００４７】
本発明に係る組成物は栄養組成物の形態であってもよい。
【００４８】
本発明に係る栄養組成物は、ヨーグルト、シリアルバー、朝食用シリアル、デザート、冷凍食品、スープ、ペットフード、液体懸濁液、粉末、錠剤、ガム又はキャンディーの形態である。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、本発明の細菌株を含む組成物は直腸内投与される。
【００５０】
好ましくは、直腸内投与は座剤、注腸剤又はフォーム製剤の形態で実施される。
【００５１】
特に、本発明に係る組成物は、薬剤として１０７〜１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）に相当する１日投与量、好ましくは１０９ｃｆｕの１日投与量での投与に適している。
【００５２】
例えば、本発明に係る組成物は、該組成物を必要とする個体に、本発明の細菌株Ｉ−４５７３を１０７〜１０１１ｃｆｕ、好ましくは１０９ｃｆｕに相当する量で含有する１ｇの１日１回投与量で投与し得る。
【００５３】
別の例では、本発明に係る組成物は、該組成物を必要とする個体に、本発明の細菌株Ｉ−４５７３を１０７〜１０１１ｃｆｕ、好ましくは１０９ｃｆｕに相当する量で含有する０．２ｇの１日１回投与量で投与し得る。
【００５４】
別の例では、本発明に係る組成物は、該組成物を必要とする個体に、各投与量が、独立に、本発明の細菌株Ｉ−４５７３を５×１０６〜５×１０１０ｃｆｕ（乾燥重量基準）、好ましくは５×１０８ｃｆｕに相当する量で含有する、１ｇの２回投与量を１日２回投与して、個体に投与される本発明の細菌株Ｉ−４５７３の１日の合計投与量が前述の通りになるようにしてもよい。
【００５５】
本発明に係る組成物は、酸化防止剤、魚油、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ビタミン、ミネラル、植物栄養素、タンパク質、脂質、プロバイオティクス及びこれらの組合せの１種以上を含んでいてもよい。
【００５６】
以下の実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は例示にすぎない。
【００５７】
百分率は、別途記載しない限り、すべて重量百分率である。
【実施例】
【００５８】
インビボ及びインビトロでの免疫応答の調節能力及び腸炎症に対する直接的影響に関して、ＣＮＣＭに受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３で寄託されたＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ株を試験し、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの別の２つの株、Ａ２−１６５株及びＩ−４５７５株と比較した。
【００５９】
インビトロ試験では、ＨＴ−２９とＰＢＭＣの２種類の細胞モデルを使用する。
【００６０】
インビボ試験では、マウス大腸炎モデルを使用する。
【００６１】
インビトロ試験
Ｉ．細菌株及び培養条件
試験したＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ株の単離菌は、Ｎ２＝８５％、ＣＯ２＝１０％及びＨ２＝５％を満たした嫌気チャンバー内で、１ｍｇ／ｍｌのセロビオース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社（スイス、ブフス））、１ｍｇ／ｍｌのマルトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び０．５ｍｇ／ｍｌのシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＹＢＨＩ培地（０．５％酵母エキス添加ブレインハートインフュージョン培地）（Ｄｉｆｃｏ社（米国デトロイト））中３７℃で培養する。
【００６２】
株は、以下の通り健康な患者から単離されたものである。
・ＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３株及びＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３株は４０歳の男性から単離され、
・Ａ２−１６５（ＤＳＭＺ  １７６７７）株は３４歳の女性から単離されたものである（Ｄｕｎｃａｎ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＪＳＥＭ，  ２００２，  ５２（Ｐｔ  ６）：２１４１−２１４６）。
【００６３】
ＩＩ．ＨＴ−２９細胞による免疫調節特性
Ａ．細胞培養
ＨＴ−２９細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）（ＬＧＣ−Ｓｔａｎｄａｒｓ社）は、１０％（ｗ／ｖ）の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社（フランス、エラニー））をペニシリンＧ／ストレプトマイシン（５０００ＩＵ／ｍｌ，５０００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共に添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で培養される。培養物は、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ社（デンマーク、ロスキレ）中でコンフルエントに達するまで５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２含有雰囲気中３７℃でインキュベートされる。
【００６４】
Ｂ．抗炎症試験
ＨＴ−２９を用いた抗炎症試験は、Ｋｅｃｈａｏｕ他（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２，  ７９  （５）：  １４９１−１４９９）に記載された手順に従って行われる。
【００６５】
簡潔には、２４ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ社）にウェル当たり５００００個のＨＴ−２９細胞を播種する。細菌刺激の２４時間前に、培地を５％ＦＢＳ含有培地と交換する。
【００６６】
試験は播種後７日目に、細胞がコンフルエンス（１．８３×１０６細胞／ウェル）となったときに開始する。細菌共培養の２４時間前（６日目）に、培地を５％熱非働化ＦＢＳ及１％グルタミン含有培地と交換する。
【００６７】
共培養の日に、総体積５００μｌのＤＭＥＭに１０％の細菌上清を添加する。細胞を、１０％ＣＯ２中３７℃で６時間、ヒトＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社（米国ニュージャージー州））で同時に刺激する。
【００６８】
すべてのサンプルは３回重複して解析する。
【００６９】
共培養後、細胞上清を回収し、後でＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ））でインターロイキン８（ＩＬ−８）濃度を分析するまで−８０℃で保存する。
【００７０】
全タンパク質量はブラッドフォード試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）試験を用いて測定する。試験は少なくとも３回重複して行われる。
【００７１】
結果は、ＩＬ−８／タンパク質（ｐｇ／ｍｇ）として表され、陰性対照としてのＰＢＳとの共インキュベーション後に産生されたＩＬ−８を基準値として用いて標準化される。
【００７２】
Ｃ．統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（米国カリフォルニア州ラホヤ））によって実施される。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして表される。
【００７３】
比較は、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とその後のＤｕｎｎ多重比較検定によって行われる。
【００７４】
相関試験はスピアマン検定によって行われる。
【００７５】
０．０５未満のｐ値は有意であるとみなされる。
【００７６】
Ｄ．結果
得られた結果を図１に示す。
【００７７】
これらの試験から、ＨＴ−２９上皮細胞におけるＴＮＦ−α刺激によって誘導される炎症性サイトカインＩＬ−８の産生をＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３株が大幅に低減できることが観察される。
【００７８】
予想通り、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株もこのようなＩＬ−８産生の低減をもたらす。
【００７９】
対照的に、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株は、ＩＬ−８の統計的に有意な減少を惹起しない。
【００８０】
ＩＩＩ．ＰＢＭＣによる免疫調節特性
Ａ．細胞培養
５人の健康なドナーに由来する市販のＰＢＭＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（フランス））を使用する。
【００８１】
ドナーは以下の特徴を有する：男性、６５歳未満、ボディマス指数＜３０、非喫煙者、選択前１５日以内に既知の抗炎症作用を有する薬剤の摂取歴なし、並びにＨＩＶ、Ａ型肝炎及びＢ型肝炎ウィルスに陰性。
【００８２】
採取後、細胞は使用するまで液体窒素中に保存される。
【００８３】
Ｂ．抗炎症試験
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ菌との共培養アッセイ用のＰＢＭＣを調製するため、フラスコを水浴中３７℃で融解し、次いで１０％熱非働化ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン及び０．１％ペニシリン／ストレプトアビジンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（培地の成分はＬｏｎｚａ社（スイス）から購入）を含む培地に移す。細胞の凝集を防ぐため、ＤＮａｓｅ（１００μｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（フランス））を培地に加えた。
【００８４】
次いで、細胞を２００×ｇで１５分間遠心分離し、トリパンブルーを用いて計数し、２４ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルで播種する。上清を総体積１ｍｌ中１０％の割合で３回（ドナー当たり３ウェル）添加する。プレートは１０％ＣＯ２下３７℃で２４時間インキュベートする。
【００８５】
培養上清を回収し、製造業者の指示（ＥＤＴＡ−ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインビヒター（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社））に従って抗プロテアーゼカクテルと混合し、後でＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ社（スウェーデン））でインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）濃度を分析するまで−８０℃で保存する。
【００８６】
Ｃ．統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（米国カリフォルニア州ラホヤ））によって実施される。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして表される。
【００８７】
比較は、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とその後のＤｕｎｎ多重比較検定によって行われる。
【００８８】
相関試験はスピアマン検定によって行われる。
【００８９】
０．０５未満のｐ値は有意であるとみなされる。
【００９０】
Ｄ．結果
得られた結果を図２に示す。
【００９１】
これらの試験は、ＰＢＭＣにおける抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生をＣＮＣＭ  Ｉ−４５７３株が顕著に増加させることができることを実証している。
【００９２】
予想通り、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株もこのようなＩＬ−１０産生の増加をもたらす。
【００９３】
対照的に、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７５株は、ＩＬ−１０の統計的に有意な増加を惹起しない。
【００９４】
インビボ試験
Ａ．ＤＮＢＳ大腸炎の誘導及び菌投与
ＤＮＢＳ誘導大腸炎プロトコルは既報の通りである（Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｉａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  Ｍａｒｓ  ２０１４  ；  ２０（３）：４１７−３０）。
【００９５】
簡潔には、マウスをエンフルラン（Ａｂｂｏｔｔ社（米国イリノイ州アボットパーク））で麻酔し、ＰＥ−９０チューブ（ＣｌａｙＡｄａｍ社（米国ニュージャージー州パーシッパニー））の１０ｃｍ長セグメントをツベルクリン注射器に取り付けて、結腸内に３．５ｃｍ挿入する。
【００９６】
このチューブを介してエタノール（ＥｔＯＨ）中３０％ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）溶液２００ｍｇ／ｋｇを直腸内（ｉｒ）注入することによって大腸炎を誘導する。
【００９７】
対照マウス（大腸炎なし）にはＥｔＯＨだけを投与する。
【００９８】
脱水を防ぐため、ＤＮＢＳ注入後最初の３日間、飲料水中６％スクロースをマウスに給餌する（ＤＮＢＳ期間）。ＤＮＢＳ期間の１０日後に、１種類の細菌株１×１０９ＣＦＵを含む２００μｌを１０日間毎日胃内投与する（胃管栄養期間）（図３参照）。
【００９９】
研究群は以下の通りである：非大腸炎対照群（ＥｔＯＨ＋ＰＢＳ）、大腸炎対照群（ＤＮＢＳ＋ＰＢＳ）、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５株群（ＤＮＢＳ＋Ａ２−１６５）、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ＣＮＣＭ−Ｉ４５７３群（ＤＮＢＳ＋ＣＮＣＭ−Ｉ４５７３）及びＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ＣＮＣＭ−Ｉ４５７５群（ＤＮＢＳ＋ＣＮＣＭ−Ｉ４５７５）。
【０１００】
ＤＮＢＳの最初の注入後（回復期間）２１日目に１００ｍｇ／ｋｇのＤＮＢＳ溶液の２回目の注入によって、大腸炎を再活性化させる。
【０１０１】
次いで２回目の注入後３日間の体重減少（結果は示さず）をモニタリングして大腸炎の重篤度を判定する。
【０１０２】
Ｂ．巨視的スコア
マウスを頸椎脱臼により屠殺し、腹腔を開く。結腸及び小腸を取り出し、縦に開き、巨視的損傷について直ちに評価する。
【０１０３】
巨視的スコアは、ＤＮＢＳ大腸炎に関して既報の系を用いて記録される。
【０１０４】
簡潔には、巨視的基準（０〜９の尺度で評価）は、粘膜の巨視的損傷（潰瘍、結腸壁の肥厚、結腸と他の腹腔内臓器との間の癒着の存在など）、便のコンシステンシー（下痢の指標として）及び充血の存在を含む。
【０１０５】
得られた結果を図４に示す。
【０１０６】
Ｃ．ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）
好中球浸潤マーカーとして用いられるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、Ｂｒａｄｌｅｙ他（Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９８２，  ７８（３）：２０６−２０９）に記載された方法の変法によってアッセイする。
【０１０７】
１ｃｍ長の遠位結腸を回収して、５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する氷冷５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）中でホモジナイズ（５０ｍｇ／ｍｌ）する。
【０１０８】
分光光度計で吸光度を測定することによって比色反応をモニターする。
【０１０９】
得られた結果を図５に示す。
【０１１０】
Ｄ．サイトカインアッセイ
１ｃｍ長の遠位結腸を回収し、組織破砕装置（ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ）において、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液４００μｌ中でホモジナイズする。
【０１１１】
試料を２０分間遠心分離し、上清を分析時まで−８０℃で凍結する。
【０１１２】
屠殺前に、後眼窩静脈叢から血液サンプルを採取し、遠心分離して、血清を分析時まで−８０℃で保存する。
【０１１３】
炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−２）を、１以上のサイトメトリックビーズアレイシステム（ＢＤ社（米国ニュージャージー州））でアッセイする。
【０１１４】
得られた結果を図６ａ（ＩＬ−２）、図６ｂ（ＩＬ−４）、図６ｃ（ＩＦＮ−γ）及び図６ｄ（ＩＬ−６）に示す。
【０１１５】
Ｅ．統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（米国カリフォルニア州ラホヤ））によって実施される。
【０１１６】
結果は棒グラフ±ＳＥＭとして表される。
【０１１７】
比較は、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とその後のＤｕｎｎ多重比較検定によって行われる。相関試験はスピアマン検定によって行われる。
【０１１８】
０．０５未満のｐ値は有意であるとみなされる。
【０１１９】
Ｆ．結果
１．図４の巨視的スコアは、Ｉ−４５７３株で処置したＤＮＢＳマウスにおいて、大腸炎のない対照マウスで得られたものと同等の、非常に良好なスコアが得られたことを示す。
【０１２０】
対照的に、巨視的判定基準の尺度において、Ａ２−１６５株又はＩ−４５７５株で処置したＤＮＢＳマウスで得られたスコアは、大腸炎のない対照マウス及びＩ−４５７３株で処置したＤＮＢＳマウスで得られたスコアよりも高い。
【０１２１】
２．ミエロペルオキシダーゼ活性の測定値について、Ｉ−４５７３株又はＡ２−１６５株で処置したＤＮＢＳマウスで得られた活性は、大腸炎のない対照マウスで得られた活性と事実上同様である。
【０１２２】
対照的に、Ｉ−４５７５株で処置したＤＮＢＳマウスで得られた活性は、未処置の対照ＤＢＮＳマウスで得られた活性と同様である。
【０１２３】
３．最後に、Ｉ−４５７３株で処置したＤＮＢＳマウス及びＡ２−１６５株で処置したＤＮＢＳマウスで得られた炎症性サイトカインのプロファイルは、これら２つの株の抗炎症作用をはっきりと示している。
【０１２４】
実際、特にＩ−４５７３株で処置したＤＮＢＳマウスに関して、ＩＬ−２及びＩＬ−４の発現レベルは、大腸炎のない対照マウスで得られたものと同様である。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６の発現レベルは、未処置の対照ＤＮＢＳマウスで得られた発現レベルよりも低減している。
【０１２５】
対照的に、Ｉ−４５７５株は抗炎症特性を全く示さない。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γの発現レベルは、未処置の対照ＤＮＢＳマウスで観察されたものと同様であるか、もっと高いことさえある。
【０１２６】
以上、本実施例では、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ｉ−４５７３株が好適な抗炎症特性を示すこと、並びにＩ−４５７５株で実証されているように、このような特性をすべてのＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ株が有しているわけではないことが実証されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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