(57)【要約】  内部を固定した脂質小胞を生成する方法は、架橋剤に対して不透過性の脂質膜によって包み込まれた水性内部を有する前駆脂質小胞を用意し、前記脂質膜を一時的に透過性化処理して透過性小胞を生成し、不活性状態にある活性化可能架橋剤が前記透過性小胞内に入るように前記透過性小胞を前記不活性状態にある活性化可能架橋剤と接触させ、前記透過性小胞を非透過性小胞へと戻し、小胞外の架橋剤を除去し、前記不活性状態にある活性化可能架橋剤を活性化することで前記非透過性小胞の内部で架橋を生じさせて内部を固定した脂質小胞を生成することを備える。
2019524119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部を固定した脂質小胞を生成する方法であって、
架橋剤に対して不透過性の脂質膜によって包み込まれた水性内部を有する前駆脂質小胞を用意し、
前記脂質膜を一時的に透過性化処理して透過性小胞を生成し、
不活性状態にある活性化可能架橋剤が前記透過性小胞内に入るように前記透過性小胞を前記不活性状態にある活性化可能架橋剤と接触させ、
前記透過性小胞を非透過性小胞へと戻し、
小胞外の架橋剤を除去し、
前記不活性状態にある活性化可能架橋剤を活性化することで前記非透過性小胞の内部で架橋を生じさせて内部を固定した脂質小胞を生成すること
を備える、前記方法。
【請求項２】
前記前駆脂質小胞は細胞またはウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、細菌細胞、真菌細胞、不死化細胞、設計された細胞、人工細胞、免疫細胞、上皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、血球、骨細胞、分泌細胞、幹細胞、耳有毛細胞、脳細胞、神経細胞、肺細胞、または癌細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記不活性状態にある活性化可能架橋剤は、光反応性、熱反応性、または化学反応性の架橋剤である請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記透過性化処理は、前記前駆脂質小胞を、凍結融解、浸透圧衝撃、音響穿孔、電気穿孔、レーザー、界面活性剤に基づく透過性化処理、または剪断にかけることによって行われる請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
以下の方法によって生成された内部を固定した脂質小胞であって、前記方法が、
（ｉ）架橋剤に対して不透過性の前駆脂質膜によって包み込まれた水性内部を有する前駆脂質小胞を用意し、
（ｉｉ）前記前駆脂質小胞を一時的に透過性化処理して透過性小胞を生成し、
（ｉｉｉ）不活性状態にある活性化可能架橋剤が前記透過性小胞内に入るように前記透過性小胞を前記不活性状態にある活性化可能架橋剤と接触させ、
（ｉｖ）前記透過性小胞を非透過性小胞へと戻し、
（ｖ）小胞外の架橋剤を除去し、
（ｖｉ）前記不活性状態にある活性化可能架橋剤を活性化することで前記非透過性小胞の内部で架橋を生じさせて内部を固定した脂質小胞を生成すること
を備え、
前記内部を固定した脂質小胞が１つ以上の特性の点で前記前駆脂質膜と実質的に同一である脂質膜を有している、
前記内部を固定した脂質小胞。
【請求項８】
前記１つ以上の特性は、界面活性剤に対する感受性、膜流動性、膜タンパク質移動性、膜透過性、膜含有量、表面電荷、および生物学的機能からなる群から選択される請求項７に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項９】
前記前駆脂質小胞は細胞である請求項７または８に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１０】
前記細胞は、内因性、外因性、または設計された細胞表面タンパク質またはグリカンを有する請求項９に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１１】
前記細胞は抗原提示細胞である請求項９に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１２】
前記細胞は癌細胞または樹状細胞である請求項１１に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１３】
前記細胞は培養フィーダー細胞である請求項９に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１４】
前記細胞はマウス胚性線維芽細胞、ＪＫ１フィーダー細胞、またはＳＮＬ７６／７フィーダー細胞である請求項１３に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１５】
前記細胞は薬剤にまたは薬剤候補に対する細胞表面レセプタを有する請求項９に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１６】
前記細胞は病原体に対する細胞表面レセプタを有する請求項９に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１７】
前記細胞は赤血球、免疫細胞、または血小板である請求項１６に記載の内部を固定した脂質小胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載の内部を固定した脂質小胞を用意し、
前記内部を固定した脂質小胞を抗原反応性細胞と接触させること
を備える、免疫応答を調節する方法。
【請求項１９】
請求項１３の内部を固定した脂質小胞の単層を用意し、
前記単層を標的細胞と共培養すること
を備える、標的細胞を培養する方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の内部を固定した脂質小胞を用意し、
前記内部を固定した脂質小胞を薬剤または薬剤候補と接触させ、
こうして接触させた前記内部を固定した脂質小胞の分析を行うこと
を備える、薬剤または薬剤候補を分析する方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の内部を固定した脂質小胞を用意し、
前記内部を固定した脂質小胞を、病原体を含むかまたは含むと疑われる試料と接触させること
を備える、病原体をバインドする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は内部を固定した脂質小胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は脂質二重層、タンパク質、及びグリカンで構成されており、これらが一体となって物質輸送や、シグナル伝達、細胞接着といった細胞の独自性及び機能を左右する複雑な界面を形成する。脂質二重層はかなりの流動性を有しており、細胞膜に見られる様々な部位の並進移動性（ｌａｔｅｒａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）が得られる。多くの生物学的研究および生物医学的応用はこの複雑な界面に依存しており、実用的用途の目的で堅牢な基材上にこの界面を再現するために多くの方法が考案されている。細胞は本来壊れやすく、表面生化学を変化させ得るさまざまな生物学的プロセス（例えば、アポトーシスおよび小胞の出芽）を受ける。
【０００３】
膜組成を失うことなく保存するための従来の取り組みは、精製した原形質膜を平面状または球状の基材上で再構成すること、およびホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのような化学架橋剤を用いてそれら細胞全体を固定化することを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、こうした技術は、その複合体と流体細胞膜との界面を複製することについて依然不十分である。例えば、精製された原形質膜を合成基材上で再構成することには、膜不純物や、膜破壊、基材上の不完全な膜被覆といった問題がある。化学的固定化技術は、膜タンパク質の元来の状態を変化させ、タンパク質移動性を損ない、生物医学的応用において毒性効果を示すことがある。堅牢で流動性のある細胞膜界面の製造が困難であるため、膜界面での分子相互作用に依存する生物学的応用ならびに生物医学的応用が著しく制限されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一局面では、内部を固定した脂質小胞（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ−ｆｉｘｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を生成する方法が提供される。この方法は、架橋剤に対して不透過性の脂質膜によって包み込まれた水性内部を有する前駆脂質小胞を用意し、前記脂質膜を一時的に透過性化処理して透過性小胞を生成し、不活性状態にある活性化可能架橋剤が前記透過性小胞内に入るように前記透過性小胞を前記不活性状態にある活性化可能架橋剤と接触させ、前記透過性小胞を非透過性小胞へと戻し、小胞外の架橋剤を除去し、前記不活性状態にある活性化可能架橋剤を活性化することで前記非透過性小胞の内部で架橋を生じさせて内部を固定した脂質小胞を生成することを備える。
【０００６】
いくつかの実施形態では、前駆脂質小胞は細胞またはウイルスである。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、細菌細胞、真菌細胞、不死化細胞、設計された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）細胞、人工細胞、免疫細胞、上皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、血球、骨細胞、分泌細胞、幹細胞、耳有毛細胞、脳細胞、神経細胞、肺細胞、または癌細胞といった、哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、不活性状態にある活性化可能架橋剤は、光反応性、熱反応性、または化学反応性の架橋剤である。例えば、架橋剤は、エポキシド、ウレタン、ポリエーテル、任意の分子量のポリエステル、疎水性ペンダント基を含有するポリアクリルアミド誘導体、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧトリブロックコポリマー、ヒドロキシエチルメタクリレートメチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、ポリアクリロニトリルポリ塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ポリＮＩＰＡＭ）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、セルロース誘導体、エチレンオキシド−プロピレン、またはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）であってよい。透過性小胞は、例えば１〜７０重量％（例えば、２、４、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０重量％）の架橋剤を含む溶液と接触されてよい。いくつかの実施形態では、光開始剤が光反応性架橋剤と一緒に使用される。例えば、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）架橋剤を、光開始剤としての２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉ−２９５９）と共に使用することができる。
【０００８】
透過性化処理は、前駆脂質小胞を、凍結融解、浸透圧衝撃、音響穿孔（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、レーザー、界面活性剤に基づく透過性化処理、または剪断にかけることによって実施してよい。いくつかの実施形態では、この処理は、架橋剤の存在下で行われ、任意選択で光開始剤の存在下で行われる。
【０００９】
他の態様では、本明細書に記載の方法によって生成される内部を固定した脂質小胞が開示される。この内部を固定した脂質小胞は、１つ以上の特性の点で、例えば界面活性剤に対する感受性、膜流動性、膜タンパク質移動性、膜透過性、膜含有量、表面電荷、および生物学的機能の点で、前駆脂質膜と実質的に同一の脂質膜を有する。内部を固定した脂質小胞は、任意の前駆脂質小胞から、本明細書に記載したような、光反応性、熱反応性、または化学反応性の架橋剤をな様々な濃度で用いて調製することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前駆脂質小胞は細胞である。この細胞は、内因性、外因性、または設計された細胞表面タンパク質またはグリカンを有することができる。例えば、この細胞は、抗原提示細胞（例えば、癌細胞または樹状細胞）、培養フィーダー細胞（例えば、マウス胚性線維芽細胞、ＪＫ１フィーダー細胞、またはＳＮＬ７６／７フィーダー細胞）、薬剤または薬剤候補に対する表面レセプタを有する細胞、病原体に対する細胞表面レセプタを有する細胞（例えば、赤血球、免疫細胞、または血小板）であり得る。
【００１１】
さらに別の態様では、免疫応答を調節する方法が記載されており、その方法は、本明細書に記載の方法を用いて抗原提示細胞（例えば癌細胞または樹状細胞）から調製される内部を固定した脂質小胞を用意し、内部を固定した脂質小胞を抗原反応性細胞と接触させることを備える。
【００１２】
さらに、本明細書には標的細胞を培養する方法が記載されており、その方法は、本明細書に記載の方法を用いて培養フィーダー細胞（例えば、マウス胚性線維芽細胞、ＪＫ１フィーダー細胞、またはＳＮＬ７６／７フィーダー細胞）から調製された複数の脂質小胞の内部固定単層を用意し、その内部固定単層を標的細胞と共培養することを含む。
【００１３】
また、一態様では、薬剤または薬剤候補の分析方法が提供され、その方法は、薬剤または薬剤候補に対する表面レセプタを有する前駆細胞から本明細書に記載の方法を使用して調製された内部を固定した脂質小胞を用意し、内部を固定した脂質小胞を薬剤または薬剤候補と接触させ、こうして接触した内部を固定した脂質小胞の分析を実施することを備える。
【００１４】
他の局面において、病原体をバインド（ｂｉｎｄ）する方法が記載されており、この方法は、病原体に対する細胞表面レセプタを有する細胞から本明細書に記載の方法を用いて調製された内部を固定した脂質小胞を用意し、内部を固定した脂質小胞を病原体を含むまたは含むと疑われる試料と接触させることを備える。この方法は、バインドを検出する工程をさらに含み得る。
【００１５】
１つまたは複数の実施形態についての詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。実施形態の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、正常細胞と、８％ＳＤＳの存在下において細胞密度が同程度である内部をゲル化した細胞とを比較した顕微鏡写真であり、正常細胞は界面活性剤の存在下で溶解したが、内部をゲル化した細胞は脂質膜可溶化後にヒドロゲルマトリックスを示した。
【図２】図２は、正常細胞（上段）、内部をゲル化した細胞（中段）、および８％ＳＤＳ溶液中でインキュベートした後の内部をゲル化した細胞（下段）のＴＥＭ図であり、矢印は脂質膜の存在を示す。
【図３】図３は、異なる濃度の架橋剤で内部を固定したＨｅＬａ細胞の光退色後の蛍光回復を示す一連のグラフであり、内部をゲル化した細胞は、光退色後の蛍光回復のシグナル（上）および光退色後の蛍光回復の半分の時間（下）によって示されるように、正常細胞と同様の膜流動性を有した。
【図４】図４は、原子間力顕微鏡法によって特徴付けられ４、１０、２０、または４０ｗｔ％のＰＥＧＤＡで固定された、内部がゲル化された細胞の調整可能なヤング率を示すグラフ。
【図５】図５は、３０日間４℃の水中に保存し、内部を固定化処理したＨｅＬａ細胞を示す顕微鏡図であり、０日目（左）、１０日目（中央）、および３０日目（右）の固定化処理した細胞には、細胞構造および形態についての識別可能な変化は見られなかった。
【図６】図６は、内部を固定した樹状細胞（ＤＣ）の表面でのＣＤ８０（上）の発現およびＭＨＣクラスＩ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体（下）の発現を示すグラフ。
【図７】図７は、ゲル化活性化骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）（上）およびＪＡＷＳＩＩ細胞（下）がインビトロでＴ細胞増殖を誘発したことを示すグラフ。
【図８】図８は、内部ゲル化活性化ＤＣがインビボでＴ細胞増殖を誘発したことを示すグラフ。
【図９】図９は、接着性ＨｅＬａ細胞（上段）と内部を固定化処理した接着性ＨｅＬａ細胞（下段）とを様々な条件下で比較した図であり、それら２つの試料は、ＰＢＳ中では同様の密集度および形態を示したが水中では内部を固定化処理した細胞は浸透膨潤に対してより高い耐性を示し、水中で７２時間インキュベートした後では、内部を固定化処理した細胞は培養皿上でより良好な保持を示した。
【図１０】図１０は、内部をゲル化したニワトリ赤血球は溶液中によく分散する（左）が、インフルエンザウイルスＰＲ８の存在下では赤血球凝集する（右）ことを示す図。
【図１１】図１１は、インフルエンザウイルスの非存在下（上段）と存在下（下段）での内部がゲル化したニワトリ赤血球を示すＴＥＭ図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（詳細な説明）
脂質小胞（例えば細胞）を、その流体外膜表面および関連する内容物を破壊することなく固定できることが、予期せずに発見した。得られる、内部を固定化処理した脂質小胞はその元来の外面を失うことなく保存しており、環境ストレスに影響を受けにくい。膜脂質および膜タンパク質は、内部固定化処理の際にそれらの移動性を保持する。
【００１８】
この方法によって製造される内部を固定した脂質小胞は、その前駆体である未固定脂質小胞の脂質膜と実質的に同一である脂質膜によって包み込まれた、固定またはゲル化した内部を有する。界面活性剤に対する感受性、膜流動性、膜タンパク質移動性、膜透過性、膜含有量、表面電荷、および膜の生物学的機能などの前駆脂質小胞の特性は、失われずに保存される。
【００１９】
内部を固定した脂質小胞は、液膜界面を保持しているので、化合物、生体分子、病原体、細胞などの実体とのバイオミメティック相互作用の目的に使用できる。本明細書に記載の内部固定化方法は、エクスビボまたはインビトロで維持するのが困難な希少な細胞を含め、生物医学的分析用の細胞を失うことなく保存するために一般的に適用できる。例えば、生物学的細胞を有する単離された臨床試料は、例えば治療効能が見込まれる特定のリガンドを同定するためといった後続の分析のために、内部が固定され得る。内部を固定した小胞はまた、生体膜研究用の一般的なツールとして使用できる。それは、レセプタリガンド結合および細胞接着といった界面力（ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ｆｏｒｃｅｓ）を探求するための頑強で多目的なモデルを提供する。内部を固定した小胞は、細胞様生体機能性を持つバイオセンサーといったより複雑な装置を開発するのに適用できる。内部を固定した小胞を、薬剤の治療効果を増強するために薬剤や薬剤送達システムに付着させることもできる。
【００２０】
内部を固定した脂質小胞の他の応用としては、免疫調節、薬剤スクリーニング、組織工学、凝集アッセイシステム、および病原体を除去するための濾過システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
用途に応じて、内部を固定した小胞は、懸濁液中、培養皿上の単層中、または固体基材（例えば、皿、ポリマー、または粒子）または他の実体に付着させて使用することができる。
【００２２】
（内部を固定した脂質小胞の生成方法）
本明細書に記載した内部を固定した脂質小胞を生成する方法は、不活性状態にある活性化可能架橋剤を脂質小胞に導入するために、前駆脂質小胞の脂質膜を一時的に透過性化処理することを含む。架橋剤が透過性化処理された脂質小胞に入った後、その小胞はその非透過性状態に戻されてもよく、それにより架橋剤はその小胞の内側に密封される。その後、例えば小胞を洗浄することによって、残留している小胞外の架橋剤を除去する。内部の架橋剤は続いて活性化され、膜を乱すことなく脂質小胞内部の固定化を達成する。透過性化処理は、架橋剤の存在下で実施され得る。
【００２３】
内部を固定した脂質小胞は、脂質膜からなる任意の前駆脂質小胞を用いて調製することができる。例えば、脂質小胞は細胞またはウイルスであり得る。細胞は原核細胞（例えば細菌細胞）または真核細胞（例えば哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞）であり得る。細胞はまた、設計された細胞または人工細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、真菌細胞、免疫細胞、上皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、血球、骨細胞、分泌細胞、幹細胞、耳有毛細胞、脳細胞、神経細胞、肺細胞、または癌細胞であり得る。前駆細胞は、内因性膜タンパク質を過剰発現するように、または外因性、突然変異型もしくは融合膜タンパク質を発現するように、または内因性膜タンパク質を除去するように設計され得る。
【００２４】
前駆脂質小胞に一時的な膜穿孔または透過性化をもたらすための当該技術分野において既知の様々な技術を適用することができる。その技術には、凍結融解、浸透圧衝撃、音響穿孔、電気穿孔、レーザー誘導膜穿孔、剪断誘導膜穿孔、および、機械的手段に基づく他の技術が含まれるが、これらに限定されない。例えば、音響穿孔は、脂質膜のすぐ近くでキャビテーション現象が起こるときに起こる。マイクロバブルと膜との間の相互作用は、脂質膜を突き刺す、音響マイクロストリーミング、バブル振動、衝撃波、およびマイクロジェット形成によって、一時的な孔を形成する。当業者であれば、膜を恒久的に破壊することなく膜に一時的な孔を形成するためにどのように技術を適用するかを決定することができるであろう。典型的には、一時的膜穿孔技術の適用を中止すると、生成した孔は自発的に閉じる。
【００２５】
透過性化された脂質膜に入ることができ、脂質小胞内で活性化されて固定された内部を作り出すことができる任意の架橋剤を本方法に利用することができる。いくつかの実施形態では、架橋剤は、活性化されて架橋形成してゲルを形成することができるモノマーまたはポリマーである。熱応答性ヒドロゲル架橋、光応答性ヒドロゲル架橋、ｐＨ感受性ヒドロゲル架橋、化学物質応答性ヒドロゲル架橋、およびゾルゲルシリカ架橋は、例示的な活性化可能な架橋技術である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、光重合または光反応性架橋が使用される。光重合は、多くの場合電磁スペクトルの紫外領域または可視領域の光の露光時にその特性を変化させるポリマーの架橋であり、材料の硬化（ｃｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｈａｒｄｅｎｉｎｇ）をもたらす。この処理は光開始剤の存在下でまたは非存在下で行うことができる。光開始剤の例としては、カチオン性光開始剤（例えば、オニウム塩、有機金属塩、およびピリジニウム塩）、およびフリーラジカル光開始剤（例えば、ベンゾフェノン、キサントン、キノン、ベンゾインエーテル、アセトフェノン、ベンゾイルオキシム、およびアシルホスフィン）が挙げられる。光反応性架橋剤の例としては、任意の分子量の、エポキシド、ウレタン、ポリエーテル、およびポリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。光反応性架橋剤は典型的には架橋のためにアクリレートで官能化されている。例えば、分子量７００のポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を、光開始剤としての２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉ−２９５９）と併用することができる。
【００２７】
熱応答性ポリマーは通常、疎水性基かまたは臨界温度で鎖凝集しやすい基を含む。熱応答性ポリマーは、特定の温度（例えば、非反応性温度）で透過性化脂質小胞内に導入され、続いて温度を臨界温度に変えることによって架橋することができる。本明細書に記載の内部固定化方法に適用可能な感熱性ポリマーの例には、疎水性ペンダント基を含有するポリアクリルアミド誘導体、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧトリブロックコポリマー、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、ポリアクリロニトリルポリ塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ポリＮＩＰＡＭ）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、セルロース誘導体、エチレンオキシド−プロピレン、およびマトリゲルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
例えば、前駆脂質小胞を、光反応性架橋剤および光開始剤（例えば、２０重量％のＰＥＧＤＡおよび１重量％のＩ−２９５９）を含有する溶液中に懸濁し、−２０℃で凍結することができる。この凍結処理は、脂質小胞の膜を穿孔する氷の結晶を生じ、架橋剤および光開始剤が脂質小胞内に入ることを可能にする。解凍して膜の孔を自発的に再封止すると、小胞は等張圧の溶液中で洗浄されて、小胞外のＰＥＧＤＡおよびＩ−２９５９含有量が希釈される。洗浄された小胞は次に、小胞内のＩ−２９５９の存在下でのＰＥＧＤＡモノマーの架橋をもたらす紫外線照射にかけられる。
【００２９】
さらに、この方法は、懸濁液中ではなく培養皿上の単層中の脂質小胞（例えば細胞）に直接適用され得る。例えば、細胞を組織培養皿上に播種して培養皿に接着させることができる。次いで、培養物を、架橋剤、および任意に開始剤の存在下で、透過性化処理、例えば凍結融解にかけることができる。細胞膜の一時的な孔を再封止した後、細胞外架橋剤および開始剤は洗い流される。次いで内部の架橋剤を活性化すると、内部を固定した細胞を単層で生成することができる。
【００３０】
内部を固定した脂質小胞の機械的性質（例えば、弾性または剛性）は、小胞に、架橋の程度を制御するために異なる濃度の架橋剤を導入することによって調節することができる。例えば、より高濃度の架橋剤を使用すると、より硬質な内部を固定した脂質小胞を製造することができる。脂質小胞、架橋剤、および所望の機械的性質に応じて、当業者は、適用するのに適切な架橋剤濃度を決定できるであろう。
【００３１】
（免疫調節用の内部を固定した脂質小胞）
疾患治療のための細胞性免疫を促進または削除できる免疫調節材料に大きな関心が寄せられている。例えば、人工抗原提示細胞は、インビボで腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させるために調製されている。耐性誘導粒子（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、自己免疫疾患の治療のためや同種異系移植を容易にするためにも適用されている。商業的には、抗原提示細胞を模倣して免疫細胞の増殖を刺激するために合成材料が作られてきており、これは研究および臨床の両方の場面で用途がある。しかしながら、合成材料の性能は、それらの免疫調節効果において細胞系より劣ったままである。特に、免疫刺激の主な特徴として示される、生きた抗原提示細胞の流体表面タンパク質を忠実に表示する合成系を作り出すことは困難であった。一方、細胞系は、生存能が低く、表現型の変化を受け、ウイルス感染のための貯蔵庫として作用する可能性があるので、細胞系には限界がある。
【００３２】
本明細書に記載の内部固定化方法は、抗原提示能を破壊することなく、抗原提示細胞の増殖活性を奪うために適用することができ、Ｔ細胞刺激のための流体表面タンパク質を有する新規なプラットフォームを提供する。内部を固定した細胞は、腫瘍形成性の危険性なくそれらの免疫増強能を保持する。したがって、内部を固定した抗原提示細胞は、免疫応答を刺激するために被験体に投与され得る。例えば、癌細胞は内部で固定され、癌細胞に特異的なＴ細胞を増殖させるためにエクスビボまたはインビボで適用され得る。本明細書に記載の内部固定化方法は、黒色腫細胞、白血病細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、および卵巣癌細胞を含むがこれらに限定されない任意の癌細胞に適用可能である。Ｔ細胞共刺激因子（例えば、ＣＤ８０）でトランスフェクトした癌細胞が強い抗癌Ｔ細胞応答を誘導できることが示されている。したがって、いくつかの実施形態では、内部固定される癌細胞は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−１、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ５８タンパク質を含むがこれらに限定されない１つ以上の免疫調節分子を発現するように設計することができる。本明細書中に記載される方法はまた、抗原提示のための所望の抗原でパルスされ得る樹状細胞などの他の抗原提示細胞を内部固定するために適用され得る。
【００３３】
（組織工学用の内部を固定した脂質小胞）
細胞および組織の培養システムの市場は拡大している。細胞の元々の環境的ニッチを厳密に模倣するバイオミメティックシステムは、組織培養の増殖と生存率を促進することができる。例えば、幹細胞の維持には、しばしば線維芽細胞、サイトカイン、細胞外マトリックス成分などの特定の成分が必要である。幹細胞培養の場合、培養基質はしばしば幹細胞の多能性を維持するのに必要な微小環境を提供するのに役立つフィーダー細胞の層を必要とする。そのようなフィーダー細胞層は、しばしばマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＪＫ１フィーダー細胞、またはＳＮＬ７６／７フィーダー細胞を用いて調製される。しかしながら、生きたフィーダー細胞の使用は面倒でありそして細胞汚染を引き起こす可能性がある。幹細胞培養において生きたフィーダー細胞の代替となるようないくつかの方法が考案されている。そうした合成系には、幹細胞の維持に必要な生体分子の手がかりを保持するように設計された、タンパク質で被覆した培養皿および化学的に固定化処理したフィーダー細胞層が含まれる。
【００３４】
本明細書に記載の方法によって生成される内部を固定した細胞は、他の化学的固定化技術によって調製されたタンパク質被覆基材およびフィーダー細胞と比べて、多くの利点を提供する。細胞の細胞質のみを架橋することによって、細胞はそれらの形態、膜流動性、および膜タンパク質動態を保持する。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞が、調製されてその後の幹細胞継代のために内部固定され得る。ＭＥＦの内部固定単層は、幹細胞維持のために必要な刺激を提供するためにそれらの形態および流体膜タンパク質を保持している。内部固定されたフィーダー細胞は生きていないので、安定的に貯蔵および輸送することができる。特定の組織培養の需要に合うように異なる弾性を有する固定フィーダー細胞を、例えば架橋の程度を変えることによって、設計することができる。組織培養用の内部で固定され得る細胞単層の例には、マウス胚性線維芽細胞、ＪＫ１フィーダー細胞、ＳＮＬ７６／７フィーダー細胞、およびヒト起源の線維芽細胞が含まれるが、これらに限定されない。内部固定フィーダー細胞は、免疫細胞、癌細胞、初代細胞株、および異なる起源の幹細胞などの異なる種類の細胞を培養および維持するために適用することができる。
【００３５】
（薬剤および分子スクリーニング用の内部を固定した脂質小胞）
膜透過性とタンパク質結合が薬剤の吸収と分布に影響を与えるので、より面倒なインビボ試験に先立って細胞膜との分子相互作用を調べるインビトロ試験によって早期スクリーニングを提供することができる。リポソームおよび粒子支持脂質膜は、それらが細胞とどのように相互作用し得るかを分析するために化合物の存在下で適用され得る。それでも、これらの装置は実際の細胞の複雑な表面組成を再現することができない。一方、生細胞は化学的ストレスに耐えることができず、したがって分子の輸送速度論を調べるために直接使用することはできない。
【００３６】
本明細書に記載の内部固定化方法は、薬剤および分子のスクリーニングのための洗練された解決策を提供する。内部を固定した細胞は、細胞の元々のリン脂質二重層と表面タンパク質を失うことなく保存しており、化学的ストレスに耐性がある。したがって、内部を固定した細胞は、異なる化合物（例えば薬剤候補）と混合され、続いてそれら化合物の膜結合および／または輸送動態を理解するために分析され得る。薬剤透過性および吸収を分析するために、任意の種類の細胞が内部固定され得る。分子スクリーニング用に内部固定され得る細胞の例には、腸上皮細胞（例えば経口吸収を分析するため）、脳細胞（例えば脳内の血漿分布を分析するため）、癌細胞（例えばがん細胞標的化を分析するため）、免疫細胞、および赤血球があるが、それらに限定されない。内部固定化方法は、小分子の化合物、炭水化物、ポリマー、ペプチド、タンパク質、および核酸などの分子のスクリーニングに適用することができる。
【００３７】
（病原体検出および分離用の内部を固定した脂質小胞）
毒素、ウイルス、バクテリア、寄生虫、真菌などの病原体は、宿主の侵入、栄養素の誘導、および免疫回避のために特定の細胞や組織を標的にすることができるようにしばしば細胞膜に対して高い親和性を持つことがある。こうした特性を考慮すると、病原体相互作用のための細胞類似外部を有するように装置を設計されてよく、そうした装置は病原体を検出または単離するために適用することができる。本明細書に記載の方法によって製造された内部固定した脂質小胞は、元々の生体膜を模倣する脂質膜を有しており、細胞接着性病原体との生体模倣相互作用を実施するのに使用できる。例えば、内部を固定した小胞は、試料中の病原体をバインドまたは検出するために使用され得る。内部を固定した小胞はまた、試料から病原体を単離または濾過（例えば除去）するためにも使用され得る。
【００３８】
病原体に親和性のある膜を有する任意の前駆脂質小胞（例えば細胞）を使用して、病原体を検出またはバインド用の内部を固定した小胞を調製することができる。特定の病原体検出用の内部を固定され得る細胞の例には、赤血球（インフルエンザウイルス、大腸菌、およびマラリア原虫に結合する）、免疫細胞（ヒト免疫不全ウイルスに結合する）、血小板（黄色ブドウ球菌および循環腫瘍細胞に結合する）が含まれるがこれらに限定されない。前駆細胞はまた、病原体に対する細胞表面レセプタを発現するように設計され得る。内部を固定した細胞は、病原体の検出、単離および／または濾過のための、懸濁液中で使用されるかまたは固体基材上に固定化されることができる。検出される病原性実体に応じて、当業者は、病原性実体をバインドしそのバインドを検出するための内部を固定した細胞を製造するための適切な前駆細胞を選択することができるであろう。
【００３９】
例えば、内部を固定した赤血球を調製し、それをインフルエンザウイルスのバインドと検出に使用することができる。赤血球はそれらの細胞膜上に、ウイルスの表面上に発現された赤血球凝集素糖タンパク質と結合するシアル酸レセプタを有する。この結合は赤血球の凝集を引き起こし、これはウイルスの存在の指標として物理的に観察することができる。様々な動物由来の赤血球がウイルス定量のためのツールとして市販されている。しかしながら、天然赤血球の脆弱性によってそれらの貯蔵期間が制限される。一方、本明細書に記載の方法によって調製された内部を固定した赤血球は、ウイルス相互作用のために天然赤血球膜の形態、機能、および含有量を保持するが、天然赤血球よりも環境ストレスおよび崩壊に対して感受性が低い。
【００４０】
下記の特定の例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味においても残りの開示を限定するものではない。さらなる詳述なしでも、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて本開示を最大限に利用することができると考えられる。
【００４１】
（実施例１：内部を固定したＨｅＬａ細胞）
懸濁液中のＨｅＬａ細胞、架橋剤モノマーポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、および光開始剤２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉ−２９５９）を用いて内部を固定した細胞を調製した。
【００４２】
凍結融解法による一過性膜穿孔により、ＰＥＧＤＡおよびＩ−２９５９をＨｅＬａ細胞の内部に導入した。細胞を、２０重量％のＰＥＧＤＡおよび１重量％のＩ−２９５９を含有する溶液に懸濁し、続いて−２０℃で凍結した。凍結処理によって、架橋剤および光開始剤が細胞内部に入れるように細胞膜が穿孔された。解凍により膜孔を自発的再封止させると、細胞を等張圧の溶液中で洗浄して、細胞外ＰＥＧＤＡおよびＩ−２９５９含有量を希釈した。次いで、得られた細胞をＵＶ照射に供し、これによりＩ−２９５９の存在下でＰＥＧＤＡモノマーを架橋した。細胞の外部は著しく希釈された量のＰＥＧＤＡおよびＩ−２９５９を含有していたので、細胞の内部のみが架橋された。固定化技術に続いて、架橋ヒドロゲルは、動的膜二重層を支持するための合成細胞骨格として機能する。
【００４３】
紫外線活性化ヒドロゲル形成による細胞標的の内部固定化処理の成功を実証するために、我々は最初に、ヒドロゲル架橋による細胞内マトリックスの形成を確認すべく、内部を固定した細胞を８％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液に入れた。内部固定化処理していない正常細胞を対照として使用した。細胞を８％ＳＤＳ溶液に移した後、界面活性剤によって脂質膜成分が可溶化するにつれて正常細胞は急速に溶解し、結果として細胞破片となったのを光学顕微鏡下で観察した（図１左を参照）。一方、内部を固定した細胞は、元の細胞基質のサイズに似た球状マトリックスを示した（図１右を参照）。この結果は、表面膜の包み込み体の内側で起きたヒドロゲル架橋の成功を示す。ヒドロゲルは界面活性剤による可溶化に対して耐性があるので、脂質膜成分を除去するＳＤＳの存在にもかかわらず、細胞サイズのマトリックスが観察された。
【００４４】
内部固定化技術によって膜界面が失われずに保存できるかどうかを判定するために、内部を固定した細胞の表面を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で調べた。ＴＥＭの視野下で、正常細胞（図２上段）と内部を固定した細胞（図２中段）との間を比較したところ、表面に識別可能な差は見られなかった。両方の試料で脂質二重層膜を明確に識別できており（図２の矢印）、内部固定化処理後に細胞膜界面が良好に保存されたことを示している。８％ＳＤＳを用いて細胞膜を溶解すると、内部を固定した細胞の周りの脂質膜が除去され、細胞内部からヒドロゲルマトリックスが残った（図２下段を参照）。この結果はさらに、内部固定化技術によって外側膜界面が損なわれず、界面活性剤によって溶解可能なままの無傷の膜二重層が残ることも示した。
【００４５】
内部固定化処理した細胞に対し、親油性染料である１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）による膜染色を行い、表面脂質膜の存在を可視化した。共焦点顕微鏡を使用して、親油性色素が内部ゲル化細胞の外側に局在化していることを観察し、表面膜が無傷かつ親油性のままであることを実証した（データは示さず）。
【００４６】
内部を固定化処理した細胞の細胞膜の流動性は、光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）として知られる技術を用いて確認された。この技術では、蛍光標識化した細胞膜の一セグメントを高強度励起レーザーで衝撃してその領域で発蛍光団を光退色させる。次にレーザーをオフにし、関心領域で蛍光の回復を観察した。この研究では、内部を固定したＨｅＬａ細胞を、異なる重量％、例えば４％、１０％、２０％、および４０％のＰＥＧＤＡを用いて調製した。異なる架橋度に対応する異なるレベルのヒドロゲル含有量にもかかわらず、蛍光回復の全体的なパターンはほぼ類似しており、光退色後の蛍光回復を示していることを我々は観察した（図３上段を参照）。内部を固定した細胞に比べて、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの処理を経る従来の固定化技術で調製された細胞は、著しく低い膜流動性を示した（図３上段を参照）。光退色領域がその末端蛍光の５０％を回復するのにかかる時間量によって定義される蛍光回復のための半減期の評価は、内部固定化方法が従来の化学固定化技術と比べて、蛍光回復に対して最小の効果を有することを示した。パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用する（図３下段を参照）。結果は、内部固定化処理後に細胞膜が流動性を維持したことを証明した。
【００４７】
内部を固定した細胞の原形質膜脂質移動性に加えて、全反射顕微鏡（ＴＩＲＦ）を用いて膜貫通タンパク質の移動度をさらに調べた。蛍光顕微鏡下で膜貫通タンパク質の移動度を視覚化するために、最初に緑色蛍光タンパク質タグ付きＣＤ８０タンパク質（ＣＤ８０−ＧＦＰ）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＣＤ８０−ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞を２．５％グルタルアルデヒドを使用して固定化処理するか、または２０重量％のＰＥＧＤＡおよびＩ−２９５９で内部固定した。次いで、処理した細胞を、未処理のＣＤ８０−ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞とＴＩＲＦを用いて比較した。顕微鏡観察下で、正常な未処理の細胞は、経時的に位置が変化する移動性緑色蛍光点を示したが、これは、膜貫通タンパク質が脂質膜内で動き回れることを示している（データは示さず）。内部を固定した細胞も、蛍光点の移動において同様のパターンを示し（データは示さず）、細胞内で行われた固定化にもかかわらず、外膜の脂質およびタンパク質の流動性の両方が失われずに保存された。対照的に、従来の架橋剤であるグルタルアルデヒドを用いて固定化処理された細胞は、緑色点が経時的に固定されたままで不動であることを示した（データは示さず）。この研究は、原形質膜の動的な性質とそれに関連した内容物の保存における内部固定化方法のユニークな能力を強調した。
【００４８】
異なる濃度の架橋剤を内部固定化処理のために細胞に導入することができるので、内部を固定化処理した細胞の機械的性質は架橋の程度に基づいて制御することができる。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して、我々は内部を固定した細胞のヤング率がより高いｗｔ％のＰＥＧＤＡと共に増加することを実証した。内部を固定した細胞は、ＡＦＭ下でそれらの細胞様形態を保持している（データは示さず）。一方、内部固定化処理中のＰＥＧＤＡモノマーの濃度が４から４０ｗｔ％に増加するにつれて、ヤング率は平均３３．７９ｋＰａから１０１．８ｋＰａまで変化した（図４を参照）。
【００４９】
内部を固定化処理した細胞の主な特徴は、細胞内部を満たす架橋ヒドロゲルマトリックスが細胞の構造的完全性を安定化し失うことなく保存するのに役立つので、細胞が通常の未固定細胞と比べて、より頑強で崩壊しにくいことである。内部を固定化処理した細胞を水中に静置し、４℃で３０日間保存した。固定化処理した細胞は貯蔵期間を通してそれらの細胞様構造および形態を保持することが観察された（図５を参照）。固定処理化していない細胞はアポトーシスを起こし、不適切な細胞培養条件で急速に崩壊する。対照的に、結果は、内部を固定化処理した細胞はストリンジェントな条件に対して耐性があることを示した。したがって、内部固定された細胞は、細胞膜界面を含む様々な生物医学的利用のための信頼性がありかつ用途の広いプラットフォームを提供することができる。
【００５０】
（実施例２：内部を固定した免疫細胞）
その表面にＣＤ８０およびＭＨＣ−Ｉ分子を発現するように遺伝子操作され刺激されたＢ１６メラノーマ癌細胞が内部で固定されたことを我々は示した。内部を固定したＢ１６細胞は、フローサイトメトリーによって分析したところ、これらの免疫調節分子の表面表示を保持していた（データは示さず）。
【００５１】
さらに、我々は、活性化樹状細胞（ＤＣ）上で発現されたリンパ球活性化シグナル１および２が、ＤＣが内部固定後に適切に表示され得るかどうかを判定した。ＪＡＷＳＩＩマウス樹状細胞株をモデル細胞として使用し、ＯＴＩペプチドを用いたパルス化およびＬＰＳを用いたプライミングを介して活性化を達成した。フローサイトメトリーを用いて、我々はＣＤ８０発現が活性化ＤＣにおいて高レベル（〜８０．６％）で観察されたが、ＣＤ８０は非活性化ＤＣにおいて低レベル（〜５３．６％）で発現されたことを見出した。興味深いことに、ＣＤ８０の発現パターンは依然として内部固定ＤＣで維持されており（活性化細胞で約５９．１％対非活性化細胞で３２．８％）（図６上段）、固定化処理がシグナル２の発現を制限しなかったことを示唆する。さらに、細胞をＯＶＡでパルスした後、未固定細胞および固定細胞におけるＭＨＣクラスＩ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の発現（シグナル１）がそれぞれ９９．１％および９２．２％で見られた（図６下を参照）。ごくわずかなシグナルが、ＯＶＡパルスなしで、正常ＤＣおよび固定ＤＣについて検出された。これらの結果は、内部固定化処理が活性化ＡＰＣに見られる膜結合リンパ球活性化シグナルを損なわないことを示す。
【００５２】
内部固定ＤＣが生細胞の生物学的機能を保持することができるかどうかを調べるために、我々はインビトロＴ細胞増殖アッセイで内部固定ＤＣを試験した。最初にＣＤ８Ｔ細胞をＯＴ−１マウスから単離し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識化した。次いで、その細胞を、内部を固定した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）または正常ＢＭＤＣと共に培養した。７２時間の共培養の後、全ての細胞を採取し、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ３抗体で染色した。全ての試料をフローサイトメトリーによって分析した。ＯＴＩパルス化を伴う正常および固定ＢＭＤＣの両方が、ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の数の増加をもたらし（図７上段）、固定化処理がＢＭＤＣの機能を保持し得ることを示した。マウスＤＣ株、ＪＡＷＳＩＩを用いてインビトロ増殖アッセイを行った。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、正常または内部ゲル化ＪＡＷＳＩＩ細胞と共培養した。興味深いことに、インビトロアッセイは、ＯＶＡパルス内部固定のおよび未固定のＪＡＷＳＩＩ  ＤＣの両方が抗原特異的ＣＤ８  ＯＴ−１  Ｔ細胞増殖を誘導することを示した（図７下段を参照）。通常のＯＶＡパルスＤＣは、固定ＯＶＡパルスＤＣと比べて、より高いＴ細胞増殖をもたらした（８４．４％対６４．１％）。
図７下段を参照。この相違は、生細胞によって容易に分泌されるが固定細胞には存在しない３番目のリンパ球活性化シグナル（サイトカイン）におそらく起因し得る。
【００５３】
内部固定されたＤＣがインビボ適用のためにそれらの生物学的機能を保持することができるかどうかも調べるために、我々はインビボＴ細胞増殖アッセイにおいて内部的固定ＤＣを適用した。ＣＤ８  Ｔ細胞を最初にＯＴ−Ｉトランスジェニックマウスから単離しＣＦＳＥで標識化した。次いで細胞をマウスに静脈内注射した。注射から２４時間後、４つの異なる群のマウスに、ＯＴ−Ｉパルス化を伴う生ＤＣ（活性化されたもの）、ＯＴ−１パルス化を伴わない生ＤＣ（活性化されていないもの）、内部固定され活性化されたＤＣ、または内部固定され活性化されていないＤＣをそれぞれ静脈内投与した。さらに３日後、マウスを屠殺し、それらの脾細胞を抽出して分析した。生の活性化されたＤＣおよび内部固定され活性化されたＤＣの両方が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大において同等の能力を有することがフローサイトメトリー分析によって示された。これは内部固定化処理が細胞表面抗原の生物学的機能を保持したことを示す。図８を参照。非活性化細胞については、生ＤＣも固定ＤＣもＣＤ８  Ｔ細胞を増殖させる能力を示さず、それによって活性化固定ＤＣによって引き起こされるＴ細胞増殖が抗原提示の結果であることをさらに確認した。図８を参照。
【００５４】
（実施例３：内部を固定した培養フィーダー細胞）
内部固定化方法を付着性ＨｅＬａ細胞の単層に適用した。ＨｅＬａ細胞を組織培養皿上に約７０％の密集度で播種し、培養皿に接着させた。播種後、１つの培養試料を、２０％ＰＥＧＤＡおよび１％Ｉ−２９５９を用いた凍結融解膜穿孔法を用いて内部固定化処理した。ＵＶ活性化架橋後、内部固定（ゲル化）細胞単層を正常細胞と様々な環境下で比較した。図９左欄を参照。内部を固定化処理した細胞はＰＢＳ中の正常細胞と同様にそれらの細長い形態を保持することが観察され、これは内部固定方法が接着細胞の細胞様特徴を保持することができることを示す。内部ゲル化細胞単層の頑健性を実証するために、水中で７２時間インキュベートした細胞単層を観察した。図９右欄を参照。正常細胞の大部分は、細胞片が溶液中に浮遊しているように見えた。分離した細胞を除去すると、培養皿上に細胞の残骸はほとんど見られなかった。正常細胞は細胞剥離を通して有意な細胞喪失を示したが、内部を固定した細胞は細胞形態の変化をほとんど伴わずに同様の密集度を保持した。内部を固定化処理した細胞の安定性は、架橋ヒドロゲルマトリックスによる強固な固定に起因し得る。結果は、接着細胞試料への内部固定化方法の適用が成功したことを実証した。内部的にゲル化された細胞単層の頑強性は、製品を商業化用の長期保存の実現を可能にする。
【００５５】
さらに、内部固定されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）単層を製造した。この単層が胚性幹細胞の増殖を維持できることが示された。最初にＭＥＦの単層を内部固定化方法により固定化処理した。次いで、生きたマウス胚性幹細胞を固定単層上で培養した。幹細胞の播種から２４時間後、顕微鏡観察は明確な幹細胞スフェロイドを示し、幹細胞が適切に維持され、すなわちそれらの非分化状態のままであることを示した（データは示さず）。
【００５６】
（実施例４：病原体検出用の内部を固定した赤血球）
チキンとマウス由来の内部固定した赤血球（ＲＢＣ）を調製した。凍結融解法を適用して、２０％のＰＥＧＤＡおよび１％のＩ−２９５９をＲＢＣの内部に導入し、架橋剤をＵＶ活性化によって重合させた。ＤｉＩ色素を用いた膜染色および蛍光顕微鏡検査を通して、内部固定化後に細胞形態および膜成分の保持が成功したことを観察し（データは示さず）、この技術が異なる細胞標的に広く適用可能であることを実証した。
【００５７】
さらに、赤血球の凝集を引き起こすことが知られているインフルエンザウイルス（ＰＲ８）と、内部でゲル化したニワトリ赤血球を混合する赤血球凝集アッセイを実施した。内部ゲル化ニワトリＲＢＣはインフルエンザウイルスの非存在下では十分に分散していたが、ウイルスの存在下では特徴的な凝集体が視認された。図１０を参照。インフルエンザウイルスによる内部ゲル化ニワトリＲＢＣの首尾よい凝集は、細胞表面上の生体分子の保存を実証した。というのは、そのような凝集事象がＲＢＣ表面上のシアル酸とインフルエンザウイルス上の血球凝集素との間の相互作用に依存するからである。
【００５８】
インフルエンザウイルスと内部でゲル化したニワトリ赤血球とのバインドを透過型電子顕微鏡を用いてさらに調べた。試料を綿密に検査すると、ゲル化ニワトリ赤血球がそれらの二層脂質膜を保持していることがはっきりと観察できた。図１１上段を参照。インフルエンザウイルスの存在下で、ウイルスとゲル化細胞との間の強い相互作用は、天然ニワトリ赤血球とのウイルスの相互作用に類似した、豊富なウイルス結合および細胞凝集を生じた。図１１下段を参照。ゲル化赤血球の凝集は、ウイルスを検出するための指標として使用することができる。さらに、ゲル化赤血球はその後、ウイルス単離のために混合物から単離され得る。
【００５９】
（実施例５：内部を固定した細胞で被覆された微粒子）
ダブルエマルジョン法を用いてＰＬＧＡとスルホ−Ｃｙ５（赤）を混合してＰＬＧＡをベースとしたマイクロパーティクル（ＭＰ）を合成した。親水性スルホ−Ｃｙ５染料をモデルカーゴとして使用してカーゴカプセル化の成功を実証した。ＭＰをポリ−Ｌ−リジンでコーティングした後、コーティングしたＭＰを内部を固定した細胞と混合し、次いでカルボシアニン膜色素ＤｉＯ（緑）で染色した。得られた混合物を共焦点顕微鏡を用いて撮像した。内部を固定した細胞がＭＰにうまく付着したことが示された（データは示さず）。まとめると、結果は、内部を固定した小胞を別の化合物または薬剤送達製剤と組み合わせる能力を強調した。
【００６０】
（その他の実施形態）
この明細書に開示したすべての機能は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、等価、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。上記した説明から、当業者は記載された実施形態の本質的な特徴を容易に確認することができ、その技術的思想および範囲から逸脱することなく、それを様々な用途および条件に適合させるために様々な変更および修正を加えることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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