(57)【要約】  本発明は、ガンの処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、ガンの処置レジメンの一環として被験体に投与された免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強するための方法であって、該免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて薬学的有効量のＴＮＦα遮断剤を被験体に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンの処置レジメンの一環として被験体に投与された免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強するための方法であって、該免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて薬学的有効量のＴＮＦα遮断剤を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤とＴＮＦα遮断剤との治療的に有効な組み合わせを該被験体に投与することを含み、該組み合わせの投与が、該免疫チェックポイント阻害剤のみの投与と比べて増強された治療有効性をもたらす、方法。
【請求項３】
被験体が、棘細胞腫、腺房細胞ガン、聴神経腫、末端性黒子性黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺ガン、腺様嚢胞ガン、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質ガン、成人Ｔ細胞白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連ガン、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、肛門ガン、未分化大細胞リンパ腫、甲状腺未分化ガン、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂ガン、神経膠星状細胞腫、非定型奇形腫様横紋筋様腫瘍、基底細胞ガン、基底細胞型ガン腫、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリニ管ガン、胆道ガン、膀胱ガン、芽細胞腫、骨ガン、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳ガン、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞上皮ガン、褐色腫、バーキットリンパ腫、未知の原発部位のガン、カルチノイド腫瘍、ガン腫、上皮内ガン、陰茎ガン、未知の原発部位のガン腫、ガン肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸ガン、胆管ガン、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛腫、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、透明細胞腫瘍、結腸ガン、大腸ガン（Colorectal cancer）、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、皮様嚢腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎生期ガン、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜ガン、子宮内膜子宮ガン、子宮内膜性腫瘍、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽細胞腫、上衣細胞腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道ガン、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング腫瘍ファミリー、ユーイング肉腫ファミリー、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管ガン、乳房外ページェット病、卵管ガン、封入奇形、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺ガン、胆嚢ガン、胆嚢ガン、神経節膠腫、神経節細胞腫、胃ガン、胃リンパ腫、消化管ガン、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛ガン、妊娠性絨毛腫瘍、骨巨細胞腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、大脳膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、頭頸部ガン、頭頸部ガン、心臓ガン、血管芽細胞腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液学的悪性腫瘍、肝細胞ガン、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳−卵巣ガン症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭ガン、視床下部膠腫、炎症性乳ガン、眼内黒色腫、島細胞ガン、島細胞腫、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎臓ガン、クラッキン腫瘍、クルッケンベルグ腫瘍、喉頭ガン、喉頭ガン、悪性黒子型黒色腫、白血病、白血病、口唇ガン及び口腔ガン、脂肪肉腫、肺ガン、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪���中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性横紋筋様腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様ガン、髄芽細胞腫、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、黒色腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞ガン、中皮腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部ガン、転移性尿路上皮ガン、ミュラー管混合腫瘍、単球性白血病、口腔ガン、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔ガン、上咽頭ガン、鼻咽腔ガン、新生物、神経線維腫症、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫、神経腫、結節型黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚ガン、非小細胞肺ガン、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と共存する非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、眼ガン、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、好酸性顆粒細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔ガン、口腔ガン、口腔咽頭ガン、骨肉腫、骨肉腫、卵巣ガン、卵巣ガン、上皮性卵巣ガン、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳房パジェット病、パンコースト腫瘍、膵臓ガン、膵臓ガン、甲状腺乳頭ガン、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔ガン、副甲状腺ガン、陰茎ガン、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭ガン、褐色細胞腫、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、胸膜肺芽腫（Pleuropulmonary blastema）、多胎芽腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性肝細胞ガン、原発性肝臓ガン、原発性腹膜ガン、原始神経外胚葉腫瘍、前立腺ガン、腹膜偽粘液腫、直腸ガン、腎細胞ガン、第１５染色体上のＮＵＴ遺伝子に関連する気道ガン、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒタートランスフォーメーション、仙尾部奇形腫、唾液腺ガン、肉腫、シュワン細胞腫、脂腺ガン、二次腫瘍、精上皮腫、漿液性腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫瘍、性索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞ガン、皮膚ガン、小青色円形細胞腫瘍、小細胞ガン腫、小細胞肺ガン、小細胞リンパ腫、小腸ガン、軟部組織肉腫、ソマトスタチン産生腫瘍、煤煙性疣贅、脊髄腫瘍、脊髄腫瘍、脾性辺縁帯リンパ腫、扁平上皮細胞ガン、胃ガン、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、表層上皮性間質性腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ腺ガン、睾丸ガン、莢膜細胞腫、咽喉ガン、胸腺ガン、胸腺腫、甲状腺ガン、腎盂及び尿管の移行上皮ガン、移行上皮ガン、尿膜管ガン、尿道ガン、泌尿生殖器腫瘍、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣ガン、ヴァーナーモリソン症候群、疣状ガン、視経路神経膠腫、外陰ガン、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるガンを患っている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験体が黒色腫を患っている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
被験体が、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性の黒色腫を患っている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
ＴＮＦα遮断剤が可溶性ＴＮＦαレセプターであるか、又はＴＮＦα若しくはＴＮＦαレセプター１に対する特異性を有する抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
ＴＮＦα遮断剤が、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））、インフリキシマブ（Remicade（登録商標））、アダリムマブ（Humira（登録商標））、セルトリズマブペゴル（Cimzia（登録商標））及びゴリムマブ（Simponi（登録商標））からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１阻害剤である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択される抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤ−１阻害剤で処置された被験体における腫瘍回避を予防する方法であって、治療有効量のＴＮＦα遮断剤を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
腫瘍回避が、ＴＩＭ−３の発現によって誘導される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍回避が、ＴＩＭ−３及びＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の発現によって誘導される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ｉ）被験体から得られた腫瘍組織サンプルにおけるＴＩＭ−３の発現レベルを決定すること、ｉｉｉ）工程ｉ）において決定した発現レベルと所定の基準値とを比較すること、並びにｉｖ）治療有効量のＰＤ−１阻害剤及びＴＮＦα遮断剤を該被験体に同時投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−１分子）に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位と、ＴＮＦα又はＴＮＦαレセプター（例えば、ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２）に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む多重特異性抗体の治療的に有効な組み合わせを該被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ガンの処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）及びプログラム細胞死１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントは、抗ガン免疫応答の重要なネガティブレギュレーターであり、リンパ球活性化を制限し、腫瘍細胞の免疫回避及びガン進行を促進する。ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ、トレメリムマブ）又はＰＤ−１（ニボルマブ、ペンブロリズマブ）を阻害するモノクローナル抗体は、転移性黒色腫の処置において有意な有効性を示し、高い応答率及び長期の腫瘍コントロールを促進した(Marquez-Rodas I, Ann Transl Med. 2015; 3(18):267)。有望な結果にもかかわらず、患者の約４０％は治療反応を示さず、応答者の相当割合が、処置誘導後２年間に腫瘍再発を経験する。最近、宿主ＴＮＦ−Ｒ１依存性ＴＮＦシグナリングは、黒色腫に対するＣＤ８＋Ｔ細胞依存性免疫応答を損なうことが実証された(Bertrand et al., Cancer Research, 2015;75(13):2619-28)。ＴＮＦの遮断（エタネルセプトを使用）又は欠損（ＴＮＦノックアウトマウス）は、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の蓄積を促し、それにより、高レベルで主要組織適合性クラスＩ分子（ＭＨＣ−Ｉ）を発現するマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｋ１及びＹｕｍｍ）の成長を制限する。ＴＮＦ−Ｒ１を欠くマウスでは同様の所見が観察されたが、ＴＮＦ−Ｒ２を欠くマウスでは観察されず、これは、本発明者らの実験条件下では、宿主ＴＮＦ−Ｒ１が、黒色腫に対するこのようなＣＤ８＋Ｔ細胞依存性免疫応答の確立の制限において重要な役割を果たすことを示している。分子機構の点では、ＴＮＦ−Ｒ１は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞死をトリガーすることによって、新規免疫チェックポイントとして作用する可能性が高い。この結論は、以下の知見（ｉ）ＴＮＦ−Ｒ２を発現するがＴＮＦ−Ｒ１を発現しないナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＮＦ誘導性細胞死に耐性であったこと；（ｉｉ）ＴＮＦ−Ｒ１を有意に発現する活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、外因性ＴＮＦに感受性であったこと；及び（ｉｉｉ）ＴＮＦ−Ｒ１欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＮＦ誘導性細胞死に完全に耐性であったことによって裏付けられる。ＣＤ８欠損宿主において実施した養子移入実験では、ＴＮＦ−Ｒ１欠損によって黒色腫への活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積が促されたことを示す本発明者らのデータによって示されているように、黒色腫における免疫チェックポイントとしてのＴＮＦ−Ｒ１の役割は、さらなる信憑性を獲得している(Bertrand et al., Cancer Research, 2015;75(13):2619-28)。したがって、欧州特許出願公開第１４３０５６８７号には、抗ＴＮＦ又は抗ＴＮＦ−Ｒ１中和分子は、進行性黒色腫を処置するためにヒトにおいて使用され得ることが開示されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ガンの処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００４】
発明の詳細な説明
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）はガン免疫において二重の役割を果たし１，２、抗ガン因子として作用するか３，４、又は免疫抑制サイトカインとして行動し５−１０、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を制限する１，２，１１。抗ＰＤ−１のような免疫チェックポイントをターゲティングする新たな免疫療法は、黒色腫と戦う戦略を根本的に変化させた１２。しかしながら、患者の６０〜６７％が抗ＰＤ−１に反応せず１３，１４、良好な応答者は、１１．７〜１３．３％の頻度で、抗ＴＮＦによって治癒され得る１５重度の免疫関連有害事象を発症する１３，１４。抗ＰＤ−１によってトリガーされる抗ガン免疫応答に対するＴＮＦ遮断の影響は、依然として不明である。本明細書では、本発明者らは、実験的黒色腫の処置において、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１の欠損又は遮断が抗ＰＤ−１と相乗作用して、しばしば完全腫瘍退縮をもたらし、全生存を大きく改善することを示す。ＴＮＦ又はＴＮＦＲ１の欠損はまた、ルイス肺ガンを抗ＰＤ−１に感受性にした。機構的には、抗ＰＤ−１で産生されたＴＮＦは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬにおけるＴＩＭ−３（これは、Ｔ細胞枯渇の重要なレギュレーターであり、黒色腫の抗ＰＤ−１耐性又は回避性に関与する免疫チェックポイントである１６）の発現を強力に誘導した。その結果として、ＴＮＦ遮断はＴＩＭ−３アップレギュレーションを防止し、ＩＦＮ−γ産生及びＣＤ８＋ＴＩＬ含有量を劇的に増強した。この前臨床研究は、抗ＴＮＦ及び抗ＰＤ−１が抗ガン免疫応答において相乗作用することを実証している。本発明では、腸炎、大腸炎の処置のために、又は、ＣＤ４０活性化抗体と組み合わせたＰＤ−Ｌ１抗体の忍容性の改善若しくは有効性の維持のために、ＴＮＦα遮断剤を投与することはない。
【０００５】
したがって、本発明は、ガンの処置レジメンの一環として被験体に投与された免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強するための方法であって、該免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて薬学的有効量のＴＮＦα遮断剤を被験体に投与することを含む方法に関する。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤とＴＮＦα遮断剤との治療的に有効な組み合わせを該被験体に投与することを含み、該組み合わせの投与が、該免疫チェックポイント阻害剤のみの投与と比べて増強された治療有効性をもたらす方法に関する。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤とＴＮＦα遮断剤との治療的に有効な組み合わせを該被験体に投与することを含む方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ＴＮＦα遮断剤と抗ＣＴＬＡ−４抗体及びＰＤ−１阻害剤、例えば抗ＰＤ１抗体及び抗ＰＤＬ１抗体との治療的に有効な組み合わせを被験体に投与することを含む。
【０００９】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ＴＮＦα遮断剤と、ＰＤ−Ｌ１抗体と、ＣＤ４０（ＴＮＦＲ）を活性化する抗体との組み合わせを投与することを含まない。
【００１０】
「ＣＤ４０」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、Ｂリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）及び単球を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるその発現を介した抗腫瘍免疫応答のレギュレーターであるＣＤ４０を指す(Grewal IS et al, Ann Rev Immunol, 1998;16: 111-35; Van Kooten C et al, Leukoc. Biol, 2000;67:2-17; O’Sullivan B et al, Crit Rev Immunol. 2003;23(1 2):83-107)。「ＣＤ４０活性化抗体」という用語は、国際公開公報第２０１６／０２３８７５号に記載されているＣＤ４０を活性化する抗体を指す。いくつかの実施態様では、被験体は、ガンを患っている。本明細書で使用される場合、「ガン」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、限定されないが、固形腫瘍及び血液由来の腫瘍を含む。ガンという用語は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液及び血管の疾患を含む。「ガン」という用語は、原発性ガン及び転移性ガンの両方をさらに包含する。本発明の方法及び組成物によって処置され得るガンの例としては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮由来のガン細胞が挙げられる。いくつかの実施態様では、被験体は、棘細胞腫、腺房細胞ガン、聴神経腫、末端性黒子性黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟急性骨髄芽球性白血病（Acute myeloblastic leukemia with maturation）、急性骨髄性樹状細胞白血病（Acute myeloid dendritic cell leukemia）、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺ガン、腺様嚢胞ガン、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質ガン、成人Ｔ細胞白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連ガン、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、肛門ガン、未分化大細胞リンパ腫、甲状腺未分化ガン、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂ガン、神経膠星状細胞腫、非定型奇形腫様横紋筋様腫瘍、基底細胞ガン、基底細胞型ガン腫、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリニ管ガン、胆道ガン、膀胱ガン、芽細胞腫、骨ガン、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳ガン、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞上皮ガン、褐色腫、バーキットリンパ腫、未知の原発部位のガン、カルチノイド腫瘍、ガン腫、上皮内ガン、陰茎ガン、未知の原発部位のガン腫、ガン肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸ガン、胆管ガン、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛腫、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、透明細胞腫瘍、結腸ガン、大腸ガン（Colorectal cancer）、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、皮様嚢腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎生期ガン、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜ガン、子宮内膜子宮ガン、子宮内膜性腫瘍、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽細胞腫、上衣細胞腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道ガン、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング���瘍ファミリー、ユーイング肉腫ファミリー、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管ガン、乳房外ページェット病、卵管ガン、封入奇形、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺ガン、胆嚢ガン、胆嚢ガン、神経節膠腫、神経節細胞腫、胃ガン、胃リンパ腫、消化管ガン、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛ガン、妊娠性絨毛腫瘍、骨巨細胞腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、大脳膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、頭頸部ガン、頭頸部ガン、心臓ガン、血管芽細胞腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液学的悪性腫瘍、肝細胞ガン、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳−卵巣ガン症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭ガン、視床下部膠腫、炎症性乳ガン、眼内黒色腫、島細胞ガン、島細胞腫、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎臓ガン、クラッキン腫瘍、クルッケンベルグ腫瘍、喉頭ガン、喉頭ガン、悪性黒子型黒色腫、白血病、白血病、口唇ガン及び口腔ガン、脂肪肉腫、肺ガン、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性横紋筋様腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様ガン、髄芽細胞腫、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、黒色腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞ガン、中皮腫、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮ガン、転移性尿路上皮ガン、ミュラー管混合腫瘍、単球性白血病、口腔ガン、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔ガン、上咽頭ガン、鼻咽腔ガン、新生物、神経線維腫症、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫、神経腫、結節型黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚ガン、非小細胞肺ガン、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と共存する非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、眼ガン（Ocular oncology）、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、好酸性顆粒細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔ガン、口腔ガン、口腔咽頭ガン、骨肉腫、骨肉腫、卵巣ガン、卵巣ガン、上皮性卵巣ガン、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳房ページェット病、パンコースト腫瘍、膵臓ガン、膵臓ガン、甲状腺乳頭ガン、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔ガン、副甲状腺ガン、陰茎ガン、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭ガン、褐色細胞腫、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、胸膜肺芽腫（Pleuropulmonary blastema）、多胎芽腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性肝細胞ガン、原発性肝臓ガン、原発性腹膜ガン、原始神経外胚葉腫瘍、前立腺ガン、腹膜偽粘液腫、直腸ガン、腎細胞ガン、第１５染色体上のＮＵＴ遺伝子に関連する気道ガン、網膜芽細胞腫、横紋筋腫���横紋筋肉腫、リヒタートランスフォーメーション、仙尾部奇形腫、唾液腺ガン、肉腫、シュワン細胞腫、脂腺ガン、二次腫瘍、精上皮腫、漿液性腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫瘍、性索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞ガン、皮膚ガン、小青色円形細胞腫瘍（Small blue round cell tumor）、小細胞ガン腫、小細胞肺ガン、小細胞リンパ腫、小腸ガン、軟部組織肉腫、ソマトスタチン産生腫瘍、煤煙性疣贅、脊髄腫瘍、脊髄腫瘍、脾性辺縁帯リンパ腫、扁平上皮細胞ガン、胃ガン、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、表層上皮性間質性腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ腺ガン、睾丸ガン、莢膜細胞腫、咽喉ガン、胸腺ガン、胸腺腫、甲状腺ガン、腎盂及び尿管の移行上皮ガン、移行上皮ガン、尿膜管ガン、尿道ガン、泌尿生殖器腫瘍、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣ガン、ヴァーナーモリソン症候群、疣状ガン、視経路神経膠腫、外陰ガン、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるガンを患っている。
【００１１】
いくつかの実施態様では、被験体は、黒色腫を患っている。本明細書で使用される場合、「黒色腫」は、皮膚及び他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍の成長を特徴とする症状を指す。ほとんどのメラノサイトは皮膚に存在するが、髄膜、消化管、リンパ節及び眼においても見られる。皮膚において黒色腫が発生した場合、それは、皮膚黒色腫と称される。黒色腫は眼においても発生し得、眼黒色腫又は眼内黒色腫と称される。髄膜、消化管、リンパ節又はメラノサイトが見られる他の領域では、黒色腫はほとんど発生しない。いくつかの実施態様では、黒色腫は、転移性黒色腫である。黒色腫の４０〜６０％は、セリン−トレオニンプロテインキナーゼＢ−ＲＡＦ（ＢＲＡＦ）をコードする遺伝子において活性化突然変異を有する。黒色腫において観察されるＢＲＡＦ突然変異のうち、９０％超がコドン６００にあり、これらのうちの９０％超は、バリンのグルタミン酸への置換をもたらす単一ヌクレオチド突然変異（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）である。いくつかの実施態様では、被験体は、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性の黒色腫を患っている。本明細書で使用される場合、「耐性」という用語は、黒色腫の発生又は黒色腫の進行の前に疾患が治癒したかにかかわらず、黒色腫の発生が繰り返され又は黒色腫が進行することを指す。本明細書で使用される場合、「ＢＲＡＦ阻害剤」という用語は、ＢＲＡＦキナーゼ又は突然変異ＢＲＡＦキナーゼ活性（１つ以上の突然変異型セリン−トレオニンプロテインキナーゼＢ−ＲＡＦ（ＢＲＡＦ））（例えば、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）を阻害することができる薬剤を指す。したがって、「ＢＲＡＦ阻害剤」という用語は、その範囲内に、ＢＲＡＦ若しくはその突然変異型を阻害することができる化合物；又はＶ６００突然変異型ＢＲＡＦを阻害することができる化合物を包含する。ＢＲＡＦ阻害剤の例としては、限定されないが、BAY43-9006 (ソラフェニブ、Bayer)、ベムラフェニブ(PLX4032、Plexxikon; RG7204、RO5185426、Hofmann-LaRoche)、GDC-0879 (GlaxoSmithKline)、ダブラフェニブ(GSK21 18436、GlaxoSmithKline)、PLX4720 (Hofmann-LaRoche)、BMS-908662 (XL281 、Bristol-Myers Squibb)、LGX818 (Novartis)、PLX3603 (RO5212054、Hofmann-LaRoche)、ARQ-736 (ArQule)、DP-4978 (Deciphera)又はRAF265 (Novartis)が挙げられる。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患するリスクがある患者又は疾患に罹患していると疑われる患者、及び病気である患者又は疾患若しくは医学的症状を患っていると診断された患者の処置を含む防止的若しくは予防的処置及び治癒的又は疾患改善処置を指し、臨床的再発の抑制を含む。障害若しくは再発障害の１つ以上の症候を予防し、治癒し、その発症を遅延させ、その重症度を軽減し、若しくは寛解させるために、又はこのような処置の非存在下で予測されるよりも被験体の生存を延長させるために、処置は、医学的障害を有する被験体又は最終的に障害を獲得し得る被験体に施行され得る。「治療レジメン」は、病気の処置のパターン、例えば、治療中に使用される投与のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間に高レベルの薬物を患者に提供することである。導入レジメンは、維持レジメン中に医師が用いるよりも多い用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が薬物を投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る「ローディングレジメン」を（部分的に又は全体的に）用い得る。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、例えば、患者を長期間（数カ月間又は数年間）寛解に保つために、病気の処置中に患者の維持に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、持続的治療（例えば、一定間隔（例えば毎週、毎月、毎年など）で薬物を投与すること、）又は間欠的治療（例えば、断続的処置、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の所定基準［例えば、疼痛、疾患徴候など］を満たした際の処置）を用い得る。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞によって発現される分子であって、シグナルを上昇させる（刺激性チェックポイント分子）か、又はシグナルを低下させる（阻害性チェックポイント分子）分子を指す。免疫チェックポイント分子は、当技術分野では、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１依存性経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成すると認識されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264; Mellman et al., 2011. Nature 480:480- 489を参照のこと）。阻害性チェックポイント分子の例としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７７、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３及びＶＩＳＴＡが挙げられる。アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ２ＡＲ）は、ガン治療における重要なチェックポイントとみなされる。これは、腫瘍微小環境は比較的高レベルのアデノシンを有し、これが、Ａ２ＡＲの活性化を介したネガティブ免疫フィードバックループにつながることによる。当初、Ｂ７−Ｈ３又はＣＤ２７６は共刺激分子であると理解されていたが、現在では、共阻害性であるとみなされている。腫瘍細胞及び腫瘍関連マクロファージによって発現されるＢ７−Ｈ４又はＶＴＣＮ１は、腫瘍回避において役割を果たす。ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター）又はＣＤ２７２は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー１４又はＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター）のリガンドである。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がナイーブからエフェクター細胞表現型に分化する間に、ＢＴＬＡの細胞表面発現は徐々にダウンレギュレーションされるのに対して、腫瘍特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は高レベルのＢＴＬＡを発現する。Ｔｒｅｇ細胞上で発現されるＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）又はＣＤ１５２は、Ｔ細胞増殖をレギュレーションする。ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）はトリプトファン異化酵素であり、関連免疫阻害性タンパク質である。ＩＤＯは、Ｔ及びＮＫ細胞を抑制し、Ｔｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞を生成及び活性化し、腫瘍血管新生を促進することが公知である。別の重要な分子はまた、ＴＤＯ（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）である。ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様レセプター）は、ＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子のレセプターである。ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子−３）は、Ｔｒｅｇに対するその効果と、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するその直接効果とを介して、免疫応答を抑制する。２つのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を有するＰＤ−１（プログラム死１）レセプターは、Merck&Co.の黒色腫薬Keytrudaのターゲットである。それは、２０１４年９月にＦＤＡの承認を得た。ＰＤ−１のターゲティングは、腫瘍微小環境における免疫機能を回復させ得る。ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現され、Ｔｈ１及びＴｈ１７サイトカインをレギュレーションする。ＴＩＭ−３は、そのリガンド（ガレクチン−９）との相互作用により細胞死をトリガーすることによって、Ｔｈ１／Ｔｃ１機能のネガテ��ブレギュレーターとして作用する。ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー）は、造血細胞上で主に発現されるので、腫瘍内の白血球におけるＶＩＳＴＡの一貫した発現は、広範囲の固形腫瘍に対してＶＩＳＴＡ遮断が有効であることを可能にし得る。本明細書で使用される場合、「ＴＩＭ−３」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３を指す。ＴＩＭ−３の天然リガンドは、ガレクチン９（Ｇａｌ９）である。本明細書で使用される場合、「ＰＤ−１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プログラム細胞死タンパク質１（ＣＤ２７９としても公知である）を指す。ＰＤ−１は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の一方の結合により、Ｔ細胞の活性化を阻害する免疫チェックポイントとして作用する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、免疫阻害性チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物を指す。阻害は、機能の低下及び完全な遮断を含む。好ましい免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。多くの免疫チェックポイント阻害剤が公知であり、これらの公知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤と同様に、（近い）将来、代替的な免疫チェックポイント阻害剤が開発され得る。免疫チェックポイント阻害剤としては、ペプチド、抗体、核酸分子及び小分子が挙げられる。特に、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、被験体におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、遊走、持続性及び／又は細胞傷害活性、特に被験体のＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増強するために投与される。本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、それらの表面上でＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを指す。それらはＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する。「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞又はキラーＴ細胞とも称される。ＣＤ８抗原は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、主要組織適合複合体クラスＩ拘束性相互作用における会合認識エレメントである。ＣＤ８＋Ｔ細胞殺傷活性を増強する免疫チェックポイント阻害剤の能力は、当技術分野で周知の任意のアッセイによって決定され得る。典型的には、前記アッセイは、ＣＤ８＋Ｔ細胞をターゲット細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識及び／又は溶解されるターゲット細胞）と接触させるin vitroアッセイである。例えば、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による特異的溶解を、本発明の免疫チェックポイント阻害剤によって接触されるＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞株と同じエフェクター：ターゲット細胞比で得られる特異的溶解の約２０％超、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又はそれ以上増加させる能力について選択され得る。古典的な細胞傷害性アッセイのプロトコールの例は、従来のものである。いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である。本明細書で使用される場合、「ＰＤ−１阻害剤」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＤ−１の機能を阻害し得る化合物、物質又は組成物を指す。例えば、阻害剤は、ＰＤ−１の発現若しくは活性を阻害し、ＰＤ−１シグナル伝達経路をモデュレーション若しくは遮断し、及び／又はＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２に対するＰＤ−１の結合を遮断し得る。いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤＬ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択される抗体である。
【００１５】
したがって、「免疫チェックポイントの効力を増強する」という表現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、遊走、持続性及び／又は細胞傷害活性を増強する免疫チェックポイント阻害剤の能力を増加させるＴＮＦα遮断剤の能力を指す。本明細書で使用される場合、ガンに対する「増強された治療有効性」という表現は、ガン細胞若しくは固形腫瘍の成長の減速若しくは減退、又はガン細胞の総数若しくは全腫瘍量の減少を指す。したがって、「改善された治療転帰」又は「強化された治療有効性」は、任意の臨床的に許容し得る基準による患者の症状の改善、例えば腫瘍サイズの減少、腫瘍進行までの時間の増加、無増悪生存の増加、全生存期間の延長、平均余命の増加、免疫有害効果の減少又は生活の質の改善があることを意味する。特に、「改善された」又は「増強された」は、治療転帰又は有効性の任意の臨床的に許容し得る指標の１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又は１００％超の改善又は増強を指す。本明細書で使用される場合、「と比べて」という表現は、免疫チェックポイント阻害剤とＴＮＦα遮断剤とを含む組み合わせ組成物の活性及び／又は有効性を、免疫チェックポイントのみの活性及び／又は有効性と比較する文脈で使用される場合、当業者により比較可能であることが公知の量を使用した比較を指す。
【００１６】
したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、抗原結合ドメインを含む抗体フラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ、トリボディ（それぞれ二重特異性又は三重特異性ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合物）；ｓｃ−ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞を引き付けるためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（小型免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小型モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃダイマー；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性再ターゲティング」）；１つ以上のＣＤＲを含む小型抗体模倣物などを含む。様々な抗体ベースの構築物及びフラグメントを調製及び使用するための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Kabat et al., 1991（これは、参照により本明細書に具体的に組み入れられる）を参照のこと）。特に、ダイアボディは、欧州特許出願公開第４０４，０９７号及び国際公開公報第９３／１１１６１号にさらに記載されているのに対して、線状抗体は、Zapata et al. (1995)にさらに記載されている。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ペプシンで抗体を処理することによって生成され得る。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’フラグメントを生産し得る。ペプシン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント及び他のフラグメントもまた、リコンビナント技術によって合成され得るか、又は化学的に合成され得る。抗体フラグメントを生産するための技術は周知であり、当技術分野で記載されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001 ; Reiter et al., 1996;及びYoung et al., 1995はそれぞれ、有効な抗体フラグメントの生産をさらに記載しており、それを可能にする。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、一本鎖抗体である。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、軽鎖を天然に欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体も「nanobody（登録商標）」である。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明については、上記先行技術並びに欧州特許出願公開第０３６８６８４号、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490;及び国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号も参照のこと。
【００１７】
いくつかの実施態様では、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を表す。ヒト化の方法としては、限定されないが、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号及び米国特許第５，８５９，２０５号（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施態様では、抗体は、完全ヒト抗体である。完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫化することによって調製され得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５９８，３６９号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第６，１５０，５８４号及びそこで引用されている参考文献（これらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生において機能的欠損があるように遺伝子改変されている。これらの動物の免疫化が目的の抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすように、動物は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するようにさらに改変される。これらのマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm)）の免疫化後、モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって調製され得る。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトに投与した場合、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しない。ヒト抗体を生産するためのin vitro方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のin vitro刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び米国特許第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様では、抗体はヒト重鎖定常領域配列を含むが、それらが結合するＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させず、好ましくは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない。本明細書で使用される場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞に関して「枯渇」という用語は、サンプル又は被験体中に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞の数に悪影響を与えるように、殺傷し、排除し、溶解し又はこのような殺傷、排除若しくは溶解を誘導し得るプロセス、方法又は化合物を意味する。「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣ末端フラグメント、例えばヒトγ重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０、又は他の種類の抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合にはα、δ、ε及びμ）におけるその同等物、又はそれらの天然に存在するアロタイプを指す。特に指定がない限り、本開示を通して、免疫グロブリンに関する一般的に認められているKabatアミノ酸ナンバリングが使用される（Kabat et al. (1991). Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MDを参照のこと）。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を直接的又は間接的にもたらさない（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の１０％、２０％、５０％、６０％又はそれ以上の排除又は減少をもたらさない）。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することができるＦｃドメインを含まない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを欠くか（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを欠く）、又はＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体フラグメント、又は複数の異なる抗体フラグメントを含む多重特異性抗体からなるか、又はそれを含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、毒性部分に連結されていない。いくつかの実施態様では、抗体が、変化したＣ２ｑ結合及び／又は減少若しくは消失した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基で置換され得る。このアプローチは、ldusogieらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００１８】
抗ＣＴＬＡ−４抗体の例は、米国特許第５，８１１，０９７号；米国特許第５，８１１，０９７号；米国特許第５，８５５，８８７号；米国特許第６，０５１，２２７号；米国特許第６，２０７，１５７号；米国特許第６，６８２，７３６号；米国特許第６，９８４，７２０号；及び米国特許第７，６０５，２３８号に記載されている。１つの抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）である。いくつかの実施態様では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合する完全ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体であるイピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−Ｄ０１０としても公知である）である。ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１抗体の例は、米国特許第７，４８８，８０２号；米国特許第７，９４３，７４３号；米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第８，１６８，７５７号；米国特許第８，２１７，１４９号並びに国際公開公報第０３０４２４０２号、国際公開公報第２００８１５６７１２号、国際公開公報第２０１００８９４１１号、国際公開公報第２０１００３６９５９号、国際公開公報第２０１１０６６３４２号、国際公開公報第２０１１１５９８７７号、国際公開公報第２０１１０８２４００号及び国際公開公報第２０１１１６１６９９号に記載されている。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１遮断薬としては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が挙げられる。特定の他の実施態様では、ＰＤ−１遮断薬としては、抗ＰＤ−１抗体及び類似の結合タンパク質、例えばニボルマブ（ＭＤＸ１１０６、ＢＭＳ９３６５５８、ＯＮＯ４５３８）、ＰＤ−１に結合してそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によるその活性化を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体；ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＳＣＨ９００４７５）、ＰＤ−１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体；ＣＴ−０１１（ＰＤ−１に結合するヒト化抗体）；ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣの融合タンパク質である）；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１）が挙げられる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）阻害剤、例えばＩＭＰ３２１（可溶性Ｉｇ融合タンパク質）(Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211)が挙げられる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、Ｂ７阻害剤、例えばＢ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４阻害剤が挙げられる。特に、抗Ｂ７−Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１(Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834)。ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）阻害剤(Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86及びSakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94)も挙げられる。ＴＩＭ−３に対する特異性を有する抗体は当技術分野で周知であり、典型的には、国際公開公報第２０１１１５５６０７号、国際公開公報第２０１３００６４９０号及び国際公開公報第２０１０１１７０５７号に記載されているものである。いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤である。ＩＤＯ阻害剤の例は、国際公開公報第２０１４１５０６７７号に記載されている。ＩＤＯ阻害剤の例としては、限定されないが、１−メチル−トリプトファン（ＩＭＴ）、β−（３−ベンゾフラニル）−アラニン、β−（３−��ンゾ（ｂ）チエニル）−アラニン）、６−ニトロ−トリプトファン、６−フルオロ−トリプトファン、４−メチル−トリプトファン、５−メチルトリプトファン、６−メチル−トリプトファン、５−メトキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ−トリプトファン、インドール３−カルビノール、３，３’−ジインドリルメタン、エピガロカテキンガレート、５−Ｂｒ−４−Ｃｌ−インドキシル１，３−ジアセタート、９−ビニルカルバゾール、アセメタシン、５−ブロモ−トリプトファン、５−ブロモインドキシルジアセタート、３−アミノ−ナフトエ酸、ピロリジンジチオカルバメート、４−フェニルイミダゾール、ブラシニン誘導体、チオヒダントイン誘導体、β−カルボリン誘導体又はブラシレキシン誘導体が挙げられる。好ましくは、ＩＤＯ阻害剤は、１−メチル−トリプトファン、β−（３−ベンゾフラニル）−アラニン、６−ニトロ−Ｌ−トリプトファン、３−アミノ−ナフトエ酸及びβ−［３−ベンゾ（ｂ）チエニル］−アラニン又はそれらの誘導体若しくはプロドラッグから選択される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ＴＮＦα」又は「ＴＮＦ−アルファ」という用語は、腫瘍壊死因子−アルファを示す。ヒトＴＮＦ−アルファは、ＴＮＦ−アルファ遺伝子によってコードされるヒトサイトカインである。本明細書で使用される場合、「ＴＮＦα遮断剤」又は「ＴＢＡ」という用語は、本明細書では、ＴＮＦαの効果を中和することができる生物学的薬剤を意味する。前記薬剤は、優先的には、可溶性ＴＮＦαレセプターなどのタンパク質、例えばペグスネルセプト又は抗体である。いくつかの実施態様では、ＴＢＡは、ＴＮＦα又はＴＮＦαレセプターに対する特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、ＴＢＡは、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））、インフリキシマブ（Remicade（登録商標））、アダリムマブ（Humira（登録商標））、セルトリズマブペゴル（Cimzia（登録商標））及びゴリムマブ（Simponi（登録商標））からなる群より選択される。リコンビナントＴＮＦレセプターベースのタンパク質も開発されている（例えば、エタネルセプト、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃフラグメントによって接続された可溶性ＴＮＦαレセプター２（ｐ７５）の２つの細胞外部分からなるリコンビナント融合タンパク質）。ペグ化可溶性ＴＮＦ１型レセプターもまた、ＴＮＦ遮断剤として使用され得る。加えて、サリドマイドは、ＴＮＦ産生の強力な阻害剤であることが実証されている。したがって、ＴＮＦα遮断剤としてはさらに、ホスホジエステラーゼ４（ＩＶ）阻害剤、サリドマイド類似体及び他のホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤が挙げられる。本明細書で使用される場合、「エタネルセプト」又は「ＥＴＡ」という用語は、関節リウマチの処置に使用される腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニストを示す。「エタネルセプト」（ＥＴＡ、ＥＴＮ、Ｅｎｂｒｅｌ）という用語は、ＩｇＧ１のＦｃドメインに遺伝的に融合されたｐ７５  ＴＮＦレセプターから構成されるリコンビナントＴＮＦレセプターＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質である。エタネルセプトは、炎症促進性サイトカイン腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）及びリンホトキシン−αを中和する(Batycka-Baran et al., 2012)。
【００２０】
さらなる目的は、ＰＤ−１阻害剤で処置された被験体における腫瘍回避を予防する方法であって、治療有効量のＴＮＦα遮断剤を該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「腫瘍回避」という用語は、腫瘍が宿主の免疫系を逃れる任意の機構を指す。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＴＩＭ−３の発現によって誘導される腫瘍回避を予防するために特に適切である。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＴＩＭ−３及びＰＤ−１の発現によって誘導される腫瘍回避を予防するために特に適切である。いくつかの実施態様では、前記方法は、ＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１の発現によって誘導される腫瘍回避を予防するために特に適切である。いくつかの実施態様では、前記方法は、ｉ）被験体から得られた腫瘍組織サンプルにおけるＴＩＭ−３の発現レベルを決定すること、ｉｉｉ）工程ｉ）において決定した発現レベルと所定の基準値とを比較すること、並びにｉｖ）治療有効量のＰＤ−１阻害剤及びＴＮＦα遮断剤を該被験体に同時投与することを含む。本明細書で使用される場合、「腫瘍組織サンプル」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、摘出された組織片又は組織切片（外科的腫瘍切除後を含む）を包含する。腫瘍細胞サンプルは、細胞密度の決定前に、様々な周知の採取後調製及び保存技術（例えば、固定、保存、凍結など）に供され得る。腫瘍組織サンプルは、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）と称されるマイクロアレイにおいて使用され得る。ＴＩＭ−３の発現は、典型的には、免疫組織化学、免疫蛍光、又はＴＩＭ−３をコードするｍＲＮＡの発現レベルを決定することができる任意の方法によって決定される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「同時投与」という用語は、本明細書で使用される場合、ＴＮＦα遮断剤と免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせを同じ患者に投与するプロセスを意味する。ＴＮＦα遮断剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、本質的に同時に又は逐次的に投与され得る。ＴＮＦα遮断剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同じビヒクルによって投与される必要はない。ＴＮＦα遮断剤及び免疫チェックポイント阻害剤は１回以上投与され得、組み合わせの各成分の投与回数は同じものでもよいし、又は異なるものでもよい。加えて、ＴＮＦα遮断剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同じ部位に投与される必要はない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「治療的に有効な組み合わせ」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患（すなわち、ガン）を処置するために十分なＴＮＦα遮断剤の量又は用量及び免疫チェックポイント阻害剤の量又は用量を指す。所定の治療的に有効な組み合わせにおけるＴＮＦα遮断剤の量は、異なる個体及び異なる腫瘍型で異なり得、組み合わせに含まれる１つ以上のさらなる薬剤又は処置に依存するであろう。「治療有効量」は、「改善された治療転帰」が生じるように、当業者によってルーチンに用いられる手順を使用して決定される。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の被験体のための特定の治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路及び排出速度；処置の継続時間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当技術分野の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日投与量は、０．０１〜１０００mg／成人／日の広範囲で変動し得る。典型的には、処置すべき被験体への投与量の対症的調整のために、組成物は、有効成分 ０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分 約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは有効成分１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−１分子）に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位と、ＴＮＦα又はＴＮＦαレセプター（ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２）に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む多重特異性抗体の治療的に有効な組み合わせを該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００２５】
本発明の多重特異性抗体分子の例示的なフォーマットとしては、限定されないが、（ｉ）化学的ヘテロコンジュゲーションによって架橋された２つの抗体（一方は、免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−１）に対する特異性を有し、他方は、ＴＮＦα又はＴＮＦαレセプター（ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２）に対する特異性を有する）；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む一本鎖抗体、例えば、追加の（extra）ペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖ；（ｉｖ）各軽鎖及び重鎖が、短いペプチド結合を介してタンデムに２つの可変ドメインを含有する二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig（商標）) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；（ｖ）化学的に連結された二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント；（ｖｉ）Ｔａｎａｄａｂ（これは、各ターゲット抗原に対する２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合物である）；（ｖｉｉ）フレキシボディ（これは、多価分子をもたらすｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせである）；（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼＡ中の「二量化及びドッキングドメイン」に基づくいわゆる「ドックアンドロック」分子（これは、Ｆａｂに適用した場合、異なるＦａｂフラグメントに連結された２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質を生成し得る）；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂ−アームの両端に融合された２つのｓｃＦｖを含むいわゆるスコーピオン分子、及び（ｘ）ダイアボディが挙げられる。二重特異性抗体の別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。このような分子は、公知の技術、例えばトリオマブ／クアドローマ(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、ノブ−イントゥ−ホール(Genentech)、CrossMAb (Roche)及び静電マッチ(Amgen)、ＬＵＺ−Ｙ(Genentech)、鎖交換操作ドメインボディ(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic (Merus)及びDuoBody (Genmab A/S)技術として知られるものを使用して調製され得る。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、典型的にはデュオボディ技術を使用して、制御されたＦａｂ−アーム交換によって得られる又は得られ得る。制御されたＦａｂ−アーム交換によって二重特異性抗体を生産するためのin vitro方法は、国際公開公報第２００８１１９３５３号及び国際公開公報第２０１１１３１７４６号（両方ともGenmab A/Sによる）に記載されている。国際公開公報第２００８１１９３５３号に記載されている１つの例示的な方法では、二重特異性抗体は、還元条件下におけるインキュベーションによる２つの単一特異性抗体（両方ともＩｇＧ４様ＣＨ３領域を含む）間の「Ｆａｂ−アーム」又は「半分子」交換（重鎖及び結合軽鎖のスワッピング）によって形成される。得られる生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。国際公開公報第２０１１１３１７４６号に記載されている別の例示的な方法では、第１及び第２の抗体の少なくとも１つが本発明の抗体である本発明の二重特異性抗体は、ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供する工程であって、前記Ｆｃ領域が第１のＣＨ３領域を含む工程、ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供する工程であって、前記Ｆｃ領域が第２のＣＨ３領域を含み、前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が異なるものであり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第１及び第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強力であるようなものである工程、ｃ）還元条件下で、前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒にインキュベーションする工程、並びにｄ）前記二重特異性抗体を得る工程であって、第１の抗体が本発明の抗体であり、第２の抗体が異なる結合特異性を有するか、又はその逆である工程を含む方法によって調製される。還元条件は、例えば、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンから選択される還元剤を追加することによって提供され得る。工程ｄ）は、例えば還元剤の除去（例えば脱塩による）によって、非還元性又は低還元性になるように条件を回復させることをさらに含み得る。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なるものであり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強力であるように、ごくわずかな極めて保存的な非対称突然変異を含む。これらの相互作用及びそれらの達成方法のさらなる詳細は、国際公開公報第２０１１１３１７４６号（これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に提供されている。
【００２６】
本発明によれば、活性剤（例えば、ＴＮＦα遮断剤、免疫チェックポイント阻害剤又は多重特異性抗体）は、医薬組成物の形態で被験体に投与される。典型的には、治療用組成物を形成するために、活性剤は、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により徐放性マトリックス（例えば、生分解性ポリマー）と組み合わされる。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の不適切な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤化助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は単独で、又は別の有効成分と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物として単位投与形態で動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液又は溶液、舌下及び口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下（subcutaneous）、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下（subdermal）、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。典型的には、医薬組成物は、注射され得る製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は場合により滅菌水若しくは生理食塩水を追加すると注射溶液の構成を可能にする乾燥組成物（特に、凍結乾燥組成物）であり得る。注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、注射容易性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保存されていなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために保存剤を含有する。活性剤は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデルなどで形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄など及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例���ば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物で使用することによってもたらされ得る。滅菌注射溶液は、必要に応じて上記に列挙されている他の成分のいくつかと共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本分散媒及び上記に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、典型的な調製方法は、有効成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過されたその溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥技術である。直接注射のためのより濃縮された又は高濃縮された溶液の調製も企図され、非常に迅速な浸透をもたらして高濃度の活性剤を小さい腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。製剤化されると、溶液は、投与製剤と適合するように、また治療に有効な量で投与される。製剤は、上記注射溶液の種類などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いられ得る。水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要な場合には溶液を適切に緩衝し、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースで液体希釈剤を等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、本開示を考慮して、当業者であれば、用いられ得る滅菌水性媒体を把握しているであろう。処置される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与担当者は、個々の被験体のための適切な用量を決定するであろう。
【００２７】
以下の図及び実施例によって、本発明をさらに例証する。しかしながら、これらの実施例及び図は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】黒色腫が定着している抗ＰＤ−１注射野生型及びＴＮＦ欠損マウスにおける腫瘍形成。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 ３×１０５個をＣ５７ＢＬ／６野生型及びＴＮＦ  ＫＯマウスに両側的に皮内移植した後、示されている日に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）又は関連アイソタイプ対照を腹腔内注射した（ｎ＝マウス １１匹／群）。ａ、実験プロトコールを表すスキーム。ｂ及びｃ、示されている日に、キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。各腫瘍について、個々の曲線が示されている（ｂ）。数字は、全腫瘍のうちの腫瘍退縮を示す（ｂ、挿入図）。個々の腫瘍について２７日目に決定した値が示されている。バーは、平均値±ｓｅｍを表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）（ｃ）。ｄ、累積生存曲線（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２】黒色腫が定着している抗ＰＤ−１注射野生型及びＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスにおける腫瘍形成。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 ３×１０５個をＣ５７ＢＬ／６野生型及びＴＮＦ−Ｒ１  ＫＯマウスに両側的に皮内移植した後、示されている日に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）又は関連アイソタイプ対照を腹腔内注射した（ｎ＝マウス ６匹／群）。Ａ、実験プロトコールを表すスキーム。Ｂ及びＣ、示されている日に、キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。各腫瘍について、個々の曲線が示されている（Ｂ）。数字は、全腫瘍のうちの腫瘍退縮を示す（Ｂ、挿入図）。個々の腫瘍について２７日目に決定した値が示されている。バーは、平均値±ｓｅｍを表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）（Ｃ）。Ｄ、累積生存曲線（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３】黒色腫が定着しているＷＴマウスにおける抗ＰＤ−１及び抗ＴＮＦ注射。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 ３×１０５個をＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに両側的に皮内移植した後、示されている日に、抗ＰＤ−１及び／若しくは抗ＴＮＦ抗体又は関連アイソタイプ対照（各抗体について１０mg/Kg）を腹腔内注射した（ｎ＝マウス １２匹／群）。Ａ、実験プロトコールを表すスキーム。Ｂ及びＣ、示されている日に、キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。各腫瘍について、個々の曲線が示されている（Ｂ）。数字は、全腫瘍のうちの腫瘍退縮を示す（Ｂ、挿入図）。個々の腫瘍について２７日目に決定した値が示されている。バーは、平均値±ｓｅｍを表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）（Ｃ）。Ｄ、累積生存曲線（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ  ｐ＞０．５）。
【図４】黒色腫が定着している抗ＰＤ−１注射野生型及びＴＮＦ欠損マウス由来の腫瘍における免疫細胞浸潤。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６野生型及びＴＮＦ−ＫＯマウスに両側的に皮内移植した後、７日目に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）又はビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。Ａ、実験プロトコールを表すスキーム。Ｂ、１０日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を計量した。データは、腫瘍 少なくとも２２個／群の平均±ｓｅｍである。（ｎｓ：ｐ＞０．５、＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｃ、腫瘍を解離し、フローサイトメトリーを使用することによってＴＩＬ含有量分析を実施した。全ＣＤ４５＋、Ｔｈｙ１＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの割合を決定した。データは、腫瘍 少なくとも１１個／群の平均±ｓｅｍである。（ｎｓ：ｐ＞０．０５、＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｄ、ＣＤ８＋ＴＩＬ及びＣＤ４＋ＴＩＬに対するＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって決定した。データは、腫瘍 少なくとも１１個／群の平均±ｓｅｍである。Ｅ、野生型脾臓からＣＤ８  Ｔ細胞を精製し後、インキュベーション前に、６ng/mL ＴＮＦで３日間活性化した。次に、フローサイトメトリーによって、ＴＩＭ−３発現を分析した。値は、ＴＩＭ−３陽性細胞の％及びＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度を示す（ｎｓ：ｐ＞０．０５、＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図５】黒色腫が定着している野生型マウスにおける、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１と組み合わせたエタネルセプト注射。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 ３×１０５個をＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに両側的に皮内移植した後、示されている日に、抗ＰＤ−１（αＰＤ−１、５mg/Kg）及び抗ＣＴＬＡ−４（αＣＴＬＡ−４、初回注射は５mg/Kg、次いで２．５mg/Kg）抗体の組み合わせと共に、又はそれなしで、ビヒクル（ＰＢＳ）又はエタネルセプト（Ｅｔａ、３mg/Kg）を腹腔内注射した（ｎ＝マウス ５匹／群）。Ａ、実験プロトコールを表すスキーム。Ｂ及びＣ、示されている日に、キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。各腫瘍について、個々の曲線が示されている（Ｂ）。バーは、２４日目に決定した平均値を表す。Ｐ値は、ビヒクル（ＰＢＳ）注射マウスと比較して、各条件についてスチューデントｔ検定を使用することによって計算されている（Ｃ）。
【図６】黒色腫が定着している抗ＰＤ−１処置野生型及びＴＮＦ欠損マウス由来の腫瘍の免疫細胞浸潤。ａ〜ｅ、Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＴＮＦ欠損マウス（ＴＮＦ−／−）に両側的に皮内移植した後、７日目に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）又はビヒクル（ＰＢＳ；Ｃｔｒｌ）を腹腔内注射した。ａ、１０日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を計量した。データは、腫瘍 少なくとも２２個／群の平均±ｓｅｍである。ｂ及びｃ、腫瘍から精製した全ｍＲＮＡを使用してＲＴ−ｑＰＣＲによって、ＴＮＦ及びＩＦＮ転写レベルを定量した。データは、腫瘍 少なくとも４個／群の平均±ｓｅｍである。ｄ及びｅ、腫瘍を解離し、フローサイトメトリーを使用することによってＴＩＬ含有量を分析した。全細胞のうちの全ＣＤ４５＋、Ｔｈｙ１＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの割合を決定した。データは、腫瘍 少なくとも１１個／群の平均±ｓｅｍである。ｆ、Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに両側的に皮内移植した後、５日目及び７日目に、抗ＴＮＦ（αＴＮＦ、１０mg/Kg）又はビヒクル（Ｃｔｒｌ）を腹腔内注射し、７日目に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）又はビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。１０日目に、フローサイトメトリーによって、ＴＩＬを分析した。データは、腫瘍 少なくとも５個／群の平均±ｓｅｍである。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図７】ヒト黒色腫サンプルでは、ＴＮＦ発現は、ＴＩＭ−３発現と正に相関する。ＴＣＧＡコホートの転移性黒色腫患者由来の黒色腫サンプルにおける、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ−３をコードする）発現とＴＮＦＡ（ＴＮＦをコードする）発現の間の相関分析（ｎ＝３４２）。（ｐ＜０．０００１）。
【図８】ＴＮＦ欠損は、ＴＩＬ  ＰＤ−１＋含有量を増強する。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＴＮＦ欠損マウスに両側的に皮内移植した。１０日目に、腫瘍を採取し、解離し、フローサイトメトリーを使用することによって、腫瘍含有量分析を実施した。全細胞のうち、ＰＤ−１を発現するＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬの割合を決定した。データは、腫瘍 少なくとも２１個／群の平均±ｓｅｍである（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９】ＴＮＦ又はＴＮＦＲ１の欠損は、定着したルイス肺ガン（ＬＬＣ）における抗ＰＤ−１治療を増強する。ＬＬＣ細胞 ４×１０５個をＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＴＮＦ欠損及びＴＮＦＲ１欠損マウスに両側的に皮内移植した後、６日目、９日目及び１３日目に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）又は関連アイソタイプ対照（Ｃｔｒｌ、１０mg/Kg）を腹腔内注射した。ａ、示されている日に、キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。データは、マウス 少なくとも４匹／群の平均±ｓｅｍである。ｂ、個々の腫瘍について２０日目に決定した値が示されている。バーは、平均値±ｓｅｍを表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】抗ＴＮＦＲ１は、実験的黒色腫において抗ＰＤ−１と相乗作用する。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 ３×１０５個をＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに両側的に皮内移植した。６日目及び９日目に、抗ＴＮＦ−Ｒ１及び抗ＰＤ−１抗体（１０mg/Kg）を単独で又は組み合わせてマウスに２回注射した。あるいは、アイソタイプ対照（Ｃｔｒｌ）をマウスに注射した。示されている日に、キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。データは、マウス 少なくとも４匹／群の平均±ｓｅｍである。バーは、平均値±ｓｅｍを表す。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】ＴＩＬにおけるＴＩＭ−３及びＰＤ−１発現の分析。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＴＮＦ欠損マウスに両側的に皮内移植した。１０日目に、腫瘍を採取し、解離し、フローサイトメトリーを使用することによって、腫瘍含有量分析を実施した。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ＰＤ−１及びＴＩＭ−３を共発現するＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の割合をそれぞれ決定した。データは、腫瘍 少なくとも１０個／群の平均±ｓｅｍである（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１２】ＴＮＦは、抗ＰＤ−１治療でＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬにおける細胞死をトリガーする。Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＴＮＦ欠損マウス（ＴＮＦ−／−）に両側的に皮内移植した後、７日目に、抗ＰＤ−１抗体（αＰＤ−１、１０mg/Kg）を腹腔内注射した。１０日目に、フローサイトメトリーによって、死んだＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬの割合を分析した。２回の独立した実験からの腫瘍 １２個／群において測定した値は、テューキーの箱ひげ図として表されている（スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１３】ＴＮＦは、ＴＩＬ及びＤＣにおけるＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２発現を誘導する。図１３の凡例に記載されているように、ＷＴ及びＴＮＦ欠損（ＴＮＦ−／−）マウスに注射した。１０日目に、発生した腫瘍に対するフローサイトメトリーによって、ＴＩＬを分析した。ａ、ＣＤ８＋ＴＩＬ（左のパネル）及びＣＤ４＋ＴＩＬ（右のパネル）に対するＰＤ−Ｌ１染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。ｂ、全細胞のうちの腫瘍ＤＣの割合。ｃ〜ｄ、ＤＣに対するＰＤ−Ｌ１（ｃ）又はＰＤ−Ｌ２（ｄ）染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。ａ〜ｄ、（２回のうちの）１回の代表的な実験からの腫瘍 少なくとも６個／群において測定した値は、テューキーの箱ひげ図として表されている（マン・ホイットニーＵ検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１４】抗ＴＮＦ及び抗ＴＮＦＲ１抗体は、実験的乳ガンにおける抗ＰＤ−１治療に対する耐性を克服する。４Ｔ１乳ガン細胞 １×１０５個をＷＴ  Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注射した。次に、アイソタイプ対照、抗ＴＮＦ、抗ＴＮＦＲ１、抗ＰＤ−１（各抗体 １０mg/Kg）又は抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとの組み合わせ又は抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦＲ１との組み合わせをマウスに注射した。マン・ホイットニーＵ検定を使用したところ、差異は、アイソタイプ対照群と比較して統計的に有意であった（＊ｐ＜０．０５）。データは、１回の実験からのマウス ６匹／群の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図１５】ＴＮＦ遮断は、抗ＰＤ−１に応じたＴＩＬにおけるＴＩＭ−３アップレギュレーションを防止する。ａ及びｂ、Ｂ１６Ｋ１移植に続く、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＰＤ−１（αＰＤ−１）、抗ＴＮＦ（αＴＮＦ）又は両方の組み合わせの注射後１０日目に、ＷＴマウス由来の腫瘍に対するフローサイトメトリーによって、ＣＤ８＋ＴＩＬ（ａ）及びＣＤ４＋ＴＩＬ（ｂ）におけるＴＩＭ−３発現レベルを決定した。１回の実験からの腫瘍 少なくとも５個／群において測定したＣＤ８＋（ｂ）及びＣＤ４＋ＴＩＬ（ｃ）における平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、テューキーの箱ひげ図として表されている。ｃ及びｄ、Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞 １×１０６個をＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスに両側的に皮内移植した後、１３日目、１７日目及び２０日目に、アイソタイプ対照、又は抗ＴＮＦ及び／又は抗ＴＩＭ−３と組み合わせた抗ＰＤ−１（各抗体 １０mg/Kg）を注射した（ｎ＝マウス ５〜６匹／群）。データは、１回の実験からのものである。キャリパーを用いて腫瘍体積を決定した。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍである（ｃ）。個々の腫瘍について２４日目に決定した腫瘍体積が示されている。バーは、平均値±ｓｅｍを表す（ｄ）。（ａ〜ｄ：マン・ホイットニーＵ検定：ｎｓ：非有意；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【実施例】
【００２９】
実施例１：
材料及び方法：
試薬及び抗体：抗ＰＤ−１（クローン：ＲＭＰ１−１４）、抗ＣＴＬＡ−４（クローン：９Ｈ１０）、抗ＴＮＦ（クローン：ＸＴ３．１１）、アイソタイプ対照抗体はBioXcellから購入し、抗ＴＮＦＲ１（クローン：５５Ｒ−１７０）はOzymeから購入した。この研究において使用したさらなる抗体は、抗マウスＣＤ４５（BD Biosciences、ＢＵＶ３９５）、抗マウスＴｈｙ１（Biolegend、ＡＰＣ−Ｃｙ７）、抗マウスＣＤ８（BD Biosciences、ＢＶ６０５）、抗マウスＣＤ４（eBioscience、ＦＩＴＣ）、抗ＴＩＭ３（Biolegend、ＰＥ−Ｃｙ７）、抗ＣＤ１１ｃ（eBioscience、ＰＥ−Ｃｙ７）、抗ＣＤ３（Biolegend、ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ１９（Biolegend、ＦＩＴＣ）、抗ＮＫ１．１（BD Biosciences、ＦＩＴＣ）、抗ＰＤ−Ｌ１（BD Biosciences、ＰＥ）及び抗ＰＤ−Ｌ２（BD Biosciences、ＡＰＣ）であった。エタネルセプトは、Dr. Astudillo (CHU, Toulouse, France)によって提供された。
【００３０】
細胞株：Ｂ１６Ｋ１は、Ｂ１６Ｆ１０細胞から得られた遺伝子改変Ｃ５７ＢＬ／６マウス黒色腫細胞株であり、ＭＨＣ−Ｉ分子Ｈ−２Ｋｂを安定に発現し、ＣＤ８  Ｔ細胞依存性免疫応答を刺激する１，２。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地中で、細胞を培養した。培地を２〜３日ごとに交換した。ルイス肺ガン細胞（ＬＬＣ）及び４Ｔ１乳ガン細胞は、ＡＴＣＣからのものであった。１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中で、限られた継代数にわたって細胞を培養し、マイコプラズマ汚染の非存在についてＰＣＲによって試験した。
【００３１】
マウス：ＴＮＦ欠損（＃５５４０）及びＴＮＦＲ１欠損（＃２８１８）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Jackson laboratoriesから購入した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Janvierからものであった。特定病原体除去動物施設(Anexplo platform, Toulouse, France)の温度管理室においてマウスを飼育し、１２時間の明／暗周期を維持し、飼料及び水の利用は無制限であった。全ての動物実験は、国内の及び国際的な方針にしたがって行われ、動物実験について地方委員会によって承認された。
【００３２】
in vivo腫瘍形成：Ｂ１６Ｋ１ ３×１０５個又はＬＬＣ細胞 ４×１０５個を野生型、ＴＮＦ欠損及びＴＮＦＲ１欠損マウスに両側的に皮内注射した。次に、Ｂ１６Ｋ１移植後６日目、１０日目及び１３日目に、抗ＰＤ−１（１０mg/Kg）又はアイソタイプ対照（１０mg/Kg）を腹腔内注射した。６日目、１０日目、１３日目及び１６日目に抗ＴＮＦ３（１０mg/Kg）を接種し、６日目及び１０日目に抗ＴＮＦＲ１３（１０mg/Kg）を接種した。あるいは、関連アイソタイプ対照抗体（１０mg/Kg）をマウスに注射した。あるいは、本発明者らは、野生型マウスにおいて、抗ＴＮＦ（エタネルセプト）とαＰＤ−１及びαＣＴＬＡ−４遮断抗体とを組み合わせたプロトコールを確立した。Ｂ１６Ｋ１細胞 ３×１０５個を野生型マウスに両側的に皮内注射した（ｎ＝マウス ５匹／条件）。Ｂ１６Ｋ１移植の７日後、実験を通してそれぞれビヒクル（ＰＢＳ）及びエタネルセプト（３mg/Kg）を週２回腹腔内注射することによって、対照及びエタネルセプト処置群を実施した。αＰＤ−１及びαＣＴＬＡ−４でマウスを腹腔内処置した（７日目、１３日目及び１７日目にαＰＤ−１（５mg/Kg）、並びに２０日目、２４日目及び２７日目にαＣＴＬＡ−４（初回注射は５mg/Kg、次いで２．５mg/Kg））。示されている日に、キャリパーを使用して腫瘍体積を計算した。式：腫瘍体積＝０．５２×長さ×幅２を用いて、示されている日に、キャリパーを使用して腫瘍体積を計算した。
【００３３】
全生存：国内の及び国際的な方針にしたがって、動物の自然死の時期又はあるいは屠殺の時期（これは、腫瘍が体重の１０％（すなわち、２，０００mm3）の総腫瘍体積）に達した時点である）を考慮して、全生存を推定した。
【００３４】
腫瘍のリンパ球含有量の分析：Ｂ１６Ｋ１細胞 １０６個をＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスに皮内注射した。次に、７日目に、抗ＰＤ−１（１０mg/Kg）、抗ＴＮＦ（１０mg/Kg）又はビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。１０日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を採取し、計量し、Tumor Dissociation Kit, mouse (miltenyi)を用いて消化した。フローサイトメトリー分析の前に、抗体及びlive-dead試薬(Invitrogen)で細胞を染色した。
【００３５】
腫瘍転写産物の分析：Ｂ１６Ｋ１細胞 １０６個をＷＴ、ＴＮＦ欠損及びＣＤ８欠損マウスに皮内注射した。次に、７日目に、抗ＰＤ−１（１０mg/Kg）又はビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。１０日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を採取し、セラミックボールを含有するバイアル中で、組織ホモジナイザーevolution (Precellys, Bertin technologies)を使用する（８，０００rpmで３０秒間、２サイクル）ことによって解離した。RNeasy Midi Kit (Qiagen)を使用して、ＲＮＡを精製した。各サンプル由来のＲＮＡ １μgを使用することによって、SuperScript II逆転写酵素(Thermofischer)を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。SYBR Green Master Mix (Takara)と、マウスβ−アクチン、ＨＰＲＴ、ＴＮＦα及びＩＦＮγ（Qiagen）をコードする転写産物に対するプライマーとを使用して、ｑＰＣＲを実施した。
【００３６】
精製リンパ球におけるＴＩＭ−３誘導の分析：マウスナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞精製キット(Miltenyi Biotec)を使用して、ナイーブＷＴ又はＴＮＦＲ１欠損マウスの脾臓から、マウスナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。ヒトナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞精製キット(Miltenyi Biotec)を使用して、健常ドナーの全血から、ヒトナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＩＬ−２（Invitrogen；２００U/mL）の存在下で、それぞれ抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コーティングビーズ(Life Technologies)並びに抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２コーティングビーズ(Miltenyi)を用いて、マウス及びヒトＴ細胞を活性化した。リコンビナントマウス又はヒトＴＮＦ(Peprotec)の存在下で、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を４８時間インキュベーションし、次いで、フローサイトメトリーによってＴＩＭ−３発現を評価した。
【００３７】
マウスにおける４Ｔ１乳ガン細胞成長。４Ｔ１細胞 １×１０５個をＢａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注射した。次に、６日目、９日目及び１３日目に、アイソタイプ対照、抗ＰＤ−１、抗ＴＮＦ、又は抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとの組み合わせ（各抗体 １０mg/Kg）をマウスに注射した。示されている日に、式：腫瘍体積＝０．５２×長さ×幅２を用いて、キャリパーを使用して腫瘍体積を計算した。
【００３８】
ヒト黒色腫におけるＴＮＦ、ＴＩＭ３、ＰＤＬ１／２発現の分析。ＴＣＧＡ黒色腫コホートを使用して、ＴＮＦ発現を分析した。ＵＣＳＣガンゲノムブラウザプロジェクト(https://genomecancer.ucsc.edu)から、ＴＣＧＡゲノム及び臨床データをダウンロードした。分析集団は、遠隔転移を有する患者であって、ＲＮＡｓｅｑ及び臨床データが重複する患者 ３４２人から構成されていた。ＴＣＧＡ分析に関して、正式なサンプルサイズの計算は実施しなかった。組み入れ及び非組み入れ基準を満たす患者は全て、この分析に含まれていた。Illumina HiSeq 2000 RNA Sequencing platformを使用して遺伝子発現を実験的に測定し、log2(x+1)変換した。あるいは、抗ＰＤ−１で処置した患者由来の黒色腫生検において、ＴＮＦ発現を分析した（Chen et al., Cancer Discov 6, 827-837 (2016)によって発表されたデータの本発明者らの分析）。スピアマン順位相関係数を使用して、ＴＮＦ及びＴＩＭ−３をコードする遺伝子間の関係の強さを評価した。
【００３９】
統計的分析：Graph-Pad Prismソフトウェアを使用することによって、群間の差異の統計的有意性を評価した。簡潔に言えば、本発明者らは、ダゴスティーノ・ピアソンオムニバス正規性検定を用いて、これらの値がガウス分布から得られるかを試験した。正規性検定を通過した場合、スチューデントｔ検定を使用した。そうでなければ、マン・ホイットニーＵ検定を使用した。ｐ＜０．０５の場合に、差異を統計的に有意であるとみなした（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。生存に関する統計的有意性については、ゲーハン・ブレスロー・ウィルコクソン検定を使用した。
【００４０】
実施例２：
ＴＮＦ又はＴＮＦ−Ｒ１阻害は、黒色腫に対する抗ＰＤ−１治療を改善する。
最近、本発明者らは、宿主ＴＮＦ−Ｒ１依存性ＴＮＦシグナリングが、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞死をトリガーし、高内皮細静脈（これは、リンパ球組織浸潤に関与する血管である）の腫瘍内密度を制限することによって、マウス黒色腫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍含有量を損なうことを実証した。その結果として、マウスＴＮＦを効率的に中和するエタネルセプトの注射は、免疫不全（すなわち、ヌード、ＩＦＮγ及びＣＤ８  ＫＯ）マウスではなく免疫正常マウスにおいて、ＭＨＣ−Ｉｈｉｇｈ黒色腫（Ｂ１６Ｋ１）成長を有意に減少させる。αＰＤ−１遮断抗体を含む新たな免疫療法は、転移性黒色腫に罹患した患者の処置について、臨床的有効性を証明している。本明細書では、本発明者らは、αＰＤ−１免疫療法と組み合わせた黒色腫発生に対するＴＮＦ又はＴＮＦ−Ｒ１遮断戦略の効果を評価した。本発明者らは、高レベルでＭＨＣ−Ｉを発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存性免疫応答を研究するための適切なモデルであるＢ１６Ｋ１マウス黒色腫細胞株を選択した。図１ａに示されているように、Ｂ１６Ｋ１を野生型及びＴＮＦ欠損マウスの両方に同所的に注射し、次に、αＰＤ−１又は適切なアイソタイプ対照をマウスに腹腔内注射した。本発明者らの以前の観察結果と一致して、Ｂ１６Ｋ１腫瘍成長は、ＴＮＦ  ＫＯマウスでは、それらの野生型等価体と比較して有意に低減した（図１ｂ及びｃ）。また、対照マウスと比較して、ＴＮＦ−ＫＯマウスの死亡の有意な遅延があった。野生型マウスでは、抗ＰＤ−１遮断抗体注射はＢ１６Ｋ１腫瘍成長を有意に遅延させ、ＴＮＦ欠損動物では、この現象が大きく増強された（図１ｂ及び１ｃ）。ＷＴマウスでは、抗ＰＤ１注射は、腫瘍 ２２例のうちの８例の完全退縮をもたらしたのに対して、ＴＮＦ  ＫＯマウスでは、それは、２２例のうちの２０例の腫瘍退縮をトリガーした。加えて、抗ＰＤ−１注射により、生存率は、ＴＮＦ欠損マウス（マウス １１匹のうちの９匹）では、野生型マウス（マウス １１匹のうちの０匹）と比較して劇的に改善した（図１ｄ）。初回Ｂ１６Ｋ１細胞注射の２カ月後、Ｂ１６Ｋ１細胞を生存ＴＮＦ  ＫＯマウスに再注射した。事前にＢ１６Ｋ１細胞を経験しなかった野生型対照マウスとは対照的に、いずれのマウスも腫瘍を発症しなかった（図１ｄ）。後者の観察結果は、全ての生存ＴＮＦ  ＫＯマウスが、Ｂ１６Ｋ１細胞に対して完全にワクチン接種されたことを示している。したがって、ＴＮＦシグナリングは、黒色腫に対する効率的な記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の確立に必要である可能性が低い。
【００４１】
次に、本発明者らは、抗ＰＤ−１遮断抗体の治療活性に対するＴＮＦ−Ｒ１欠損の転帰を評価した。図２ａに示されているように、Ｂ１６Ｋ１細胞をＷＴ及びＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスに同所的に注射し、次に、αＰＤ−１又はアイソタイプ対照をマウスに腹腔内注射した。本発明者らの以前の観察結果と一致して、Ｂ１６Ｋ１腫瘍成長は、ＴＮＦ−Ｒ１  ＫＯマウスでは、それらの野生型等価体と比較して有意に低減した（図２ｂ及びｃ）。また、対照マウスと比較して、ＴＮＦ−Ｒ１  ＫＯマウスの死亡の有意な遅延があった。抗ＰＤ−１は、野生型マウスにおける腫瘍成長（図２ｂ及びｃ）及び死亡（図２ｄ）を有意に遅延させたが、腫瘍の大部分は再発し、腫瘍細胞注射後６０日以内に全てのマウスが死亡した。対照的に、抗ＰＤ−１抗体を注射したＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスでは、全ての腫瘍が完全に退縮した（図２ｂ、右のパネル）。２６日目以降、抗ＰＤ−１抗体で処置したＴＮＦ−Ｒ１  ＫＯ動物ではいずれも、腫瘍を検出することができなかった（図２ｃ）。また、Ｂ１６Ｋ１細胞注射後４０日以内に全てのマウスが死亡したアイソタイプ注射群とは対照的に、全てのマウスが生存した（図２ｄ）。初回Ｂ１６Ｋ１細胞注射の２カ月後、Ｂ１６Ｋ１細胞を生存ＴＮＦ−Ｒ１  ＫＯマウスに再注射したところ、いずれのマウスも腫瘍を発症しなかった（図２）。後者の観察結果は、抗ＰＤ−１を注射したＴＮＦ  ＫＯマウスのように、全ての生存ＴＮＦ−Ｒ１  ＫＯマウスが、Ｂ１６Ｋ１細胞に対して完全にワクチン接種されたことを示している。
【００４２】
まとめると、本発明者らのデータは、ＴＮＦ−Ｒ１依存性ＴＮＦシグナリングが、抗ＰＤ−１抗体によってトリガーされる抗黒色腫免疫応答に必要ではなく、むしろ、黒色腫におけるＰＤ−１遮断の治療利益を阻害することを示している。したがって、ＴＮＦ又はＴＮＦ−Ｒ１の阻害は、黒色腫と闘う抗ＰＤ−１有効性を促進し得る。
【００４３】
実施例３：
黒色腫が定着している野生型マウスにおける抗ＰＤ−１遮断抗体と組み合わせた抗ＴＮＦ注射。
臨床試験の結果は、転移性黒色腫では、抗ＰＤ−１遮断抗体による治療が有望な戦略であることを示している。しかしながら、一部の患者は処置の利益を受けず、それらの一部は、自己免疫及び炎症反応を含む重度の免疫関連有害効果を示す。（ｉ）ＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒ１阻害が、マウス黒色腫における抗ＰＤ−１治療有効性を改善することを示す本発明者らの上記観察結果、（ｉｉ）抗ＴＮＦ注射が、黒色腫に対するＣＤ８＋Ｔ細胞依存性免疫応答を増強することを示す本発明者らの最近の知見、及び（ｉｉｉ）臨床における自己免疫及び炎症性症候群を阻害するいくつかの抗ＴＮＦ遮断分子の有効性を考慮して、本発明者らは、マウス黒色腫において、抗ＰＤ−１遮断抗体と組み合わせた抗ＴＮＦを評価するためのプロトコールを設計した（図３Ａ）。アイソタイプ注射対照マウスと比較して、抗ＴＮＦのみでは、Ｂ１６Ｋ１黒色腫成長がわずかに阻害された（図３Ｂ及びＣ）。抗ＰＤ−１遮断抗体のみの注射は、腫瘍成長のより大きい遅延を伴っており、完全退縮は、対照マウスにおいて腫瘍 ２４例のうちの７例であった。興味深いことに、抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとの組み合わせはこの現象を増加させ、完全退縮は、腫瘍 ２４例のうちの１８例であった（図３Ｂ及びＣ）。また、抗ＴＮＦと組み合わせた抗ＰＤ−１注射は、抗ＰＤ−１のみを注射した群におけるマウス １２匹のうちの２匹と比較して、マウス １２匹のうちの９匹の生存をもたらした。
【００４４】
まとめると、本発明者らのデータは、抗ＴＮＦが、黒色腫における抗ＰＤ−１の治療効果を損なわず、むしろ少なくともある程度増強することを示している。
【００４５】
実施例４：
抗ＰＤ−１遮断抗体を注射したＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスにおいて発生した黒色腫における免疫細胞の腫瘍浸潤
以前、本発明者らは、宿主ＴＮＦ−Ｒ１依存性ＴＮＦシグナリングが、マウス黒色腫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍含有量を損なうことを示したので、次に、本発明者らは、ＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスにおいてＴＩＬに対する抗ＰＤ−１の効果を調査した。この目的のために、Ｂ１６Ｋ１細胞 １００万個をマウスに同所的に注射した。７日目に、抗ＰＤ−１抗体又はビヒクルをマウスに注射し、１０日目に屠殺した（図４Ａ）。これらの条件下において、Ｂ１６Ｋ１腫瘍重量は、ＴＮＦ欠損マウスでは、ＷＴマウスと比較して有意に減少し、この現象は、抗ＰＤ−１注射により増幅された（図４Ｂ）。フローサイトメトリーによる白血球腫瘍含有量の分析により、ＷＴマウスにおける抗ＰＤ−１注射は、対照ＷＴマウスと比較して、ＣＤ４５＋細胞並びにＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球のわずかだが有意な増加を誘導したことが示された（図４Ｃ）。本発明者らの発表されたデータとよく一致して、ＴＮＦ欠損マウスでは、ＣＤ４５＋細胞並びにＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬは劇的に増加し、この現象は、抗ＰＤ−１注射によりさらに増強されなかった（図４Ｃ）。マウス及び患者の両方における抗ＰＤ−１耐性に関連する免疫回避機構におけるＴＩＭ−３の主な役割を考慮して、次いで、本発明者らは、ＴＩＬにおけるＴＩＭ−３発現を評価した。注目すべきことに、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬの約７０％は、ＴＮＦの状態とは無関係にＰＤ−１及びＴＩＭ−３を共発現した（図１１）。ＷＴマウスでは、抗ＰＤ−１注射後に、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度は増加した（図４Ｄ）。対照的に、ＴＮＦ  ＫＯマウスでは、この現象は完全に無効化されたが（図４Ｄ）、これは、抗ＰＤ１によってトリガーされるＴＩＭ−３発現がＴＮＦ依存的に起こったことを示唆している。ＴＮＦがＴＩＭ−３発現の強力な誘導因子であるかを評価するために、本発明者らは、精製及び活性化マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を、毒性用量未満の外因性マウスＴＮＦと共にインキュベーションした。ＴＮＦは、ＴＩＭ−３＋細胞の割合及びＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度の増加を誘導した（図４Ｅ）。
【００４６】
要するに、本発明者らのデータは、ＴＮＦ欠損がＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬ含有量を増強するだけではなく、黒色腫において抗ＰＤ−１によってトリガーされるＴＩＭ−３のアップレギュレーションも妨げることを示している。
【００４７】
実施例５：
黒色腫が定着している野生型マウスにおける抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１遮断抗体と組み合わせたエタネルセプト注射。
最近の臨床試験は、抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体を併せた併用療法が、転移性黒色腫において有望な戦略であることを示している。しかしながら、患者の大部分は、抗ＴＮＦで治癒され得る自己免疫及び炎症反応を含む重度の免疫関連有害効果を示す。本発明者らは、マウス黒色腫において、抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体と組み合わせたエタネルセプトを評価するためのプロトコールを設計した（図５Ａ）。ビヒクル（ＰＢＳ）注射対照マウスと比較して、エタネルセプトのみでは、Ｂ１６Ｋ１黒色腫成長が有意に阻害された（図５Ｂ及びＣ）。抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体の注射は、腫瘍成長のより大きい遅延を伴っており、この現象は、エタネルセプト注射によってより顕著であった（図５Ｂ及びＣ）。
【００４８】
まとめると、本発明者らのデータは、エタネルセプトが、黒色腫における抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４との組み合わせの治療効果を損なわず、むしろ少なくともある程度増強することを示している。
【００４９】
実施例６：
ＰＤ−１経路によってネガティブにレギュレーションされる既存のＣＤ８＋ＴＩＬは、黒色腫患者における抗ＰＤ−１に対する応答を予測させるものであるので２９、本発明者らは、最初に、野生型（ＷＴ）及びＴＮＦ欠損マウス由来のＢ１６Ｋ１腫瘍におけるＰＤ−１及びそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）の発現を評価した。ＴＮＦ欠損マウス由来の黒色腫腫瘍では、ＣＤ８＋ＰＤ−１＋ＴＩＬ（図８ａ）及びＣＤ４＋ＰＤ−１＋ＴＩＬ（図８ｂ）の割合が増加した。したがって、ＴＮＦ欠損は、ＰＤ−１を発現する重要なエフェクターリンパ球の腫瘍含有量を増強する。
【００５０】
次に、本発明者らは、黒色腫発症に対する、αＰＤ−１と組み合わせたＴＮＦ欠損又は遮断の効果を調査した。この目的のために、黒色腫細胞をＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスに注射し、６日目に腫瘍が検出可能になったら、抗ＰＤ−１遮断抗体又はアイソタイプ対照の３回の注射のうちの１回目をマウスに行った。本発明者らの以前の報告１１と一致して、Ｂ１６Ｋ１腫瘍成長（図１ａ及び１ｂ）及び動物の死亡（図１ｃ）は、ＴＮＦ欠損マウスでは、それらのＷＴ等価体と比較して有意に遅延した。ＷＴマウスでは、抗ＰＤ−１遮断抗体注射は、Ｂ１６Ｋ１腫瘍成長を有意に抑制した。しかしながら、腫瘍の大部分は再発し、腫瘍細胞注射後６０日以内に全てのマウスが死亡した（図１ａ、１ｂ及び１ｃ）。興味深いことに、ＴＮＦ欠損マウスでは、抗ＰＤ−１治療は、腫瘍の９０％の腫瘍拒絶を誘導した（図１ａ及び図１ｂ）。また、ＴＮＦ欠損マウスの８０％超が最大１２０日間生存した（図１ｃ）。抗ＰＤ−１治療によりＢ１６Ｋ１黒色腫細胞を強力に拒絶したＴＮＦＲ１欠損マウスにおいて、同様のデータが得られた（図２ａ及び２ｂ）。初回Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞接種の２カ月後、生存ＴＮＦ−及びＴＮＦＲ１欠損マウスへのＢ１６Ｋ１黒色腫細胞の再注射は、全生存を損なわなかったが、これは、それらが、Ｂ１６Ｋ１黒色腫細胞に対して完全にワクチン接種されたことを実証している（図１ｃ及び図２ｃ）。
【００５１】
本発明者らの観察結果を他のガン細胞モデルに拡大するために、本発明者らは、ルイス肺ガン細胞（ＬＬＣ）を注射したＷＴ、ＴＮＦ−及びＴＮＦＲ１欠損マウスにおいて抗ＰＤ１遮断抗体の効果を試験した（図９）。ＴＮＦ及びＴＮＦＲ１欠損はいずれも、ＬＬＣ成長を損なわなかった（図９ａ）。また、ＷＴマウスでは、抗ＰＤ−１は腫瘍成長に対して効果を有していなかったが、これは、本発明者らの実験条件下では、ＬＬＣがこの治療に完全に耐性であることを示している（図９ａ及び９ｂ）。興味深いことに、ＴＮＦ又はＴＮＦＲ１欠損は、抗ＰＤ−１に対するＬＬＣの耐性を部分的に克服した（図９ａ及び９ｂ）。したがって、第２相及び第３相臨床試験３０，３１によれば、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１欠損及び抗ＰＤ−１の相乗作用は、黒色腫に限定される可能性が低く、抗ＰＤ−１から利益を受け得る肺ガンなどの他のガン型に拡大され得る。本発明者らの前臨床データによれば、抗ＰＤ−１に対する臨床応答は、肺ガンを有する患者では、黒色腫患者よりも弱い。
【００５２】
上記観察結果の治療関連性を評価するために、次に、本発明者らは、マウス黒色腫において抗ＴＮＦと抗ＰＤ−１遮断抗体との組み合わせを調査した（図３）。対照マウスと比較して、抗ＴＮＦのみでは、Ｂ１６Ｋ１黒色腫成長をわずかだが有意に阻害した（図３）。抗ＰＤ−１遮断抗体のみの注射は、腫瘍成長の遅延を伴っており、完全退縮は、対照マウスにおいて腫瘍の３０％未満であった（図３）。興味深いことに、抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとを組み合わせると、腫瘍の７５％の完全退縮がもたらされ（図３）、抗ＰＤ−１のみを注射したマウス群における２０％未満と比較してマウスの７５％の生存がもたらされた。生存マウスは、Ｂ１６Ｋ１に対して完全にワクチン接種された（データは示さず）。抗ＴＮＦＲ１抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせで、同様のデータが得られた（図１０）。まとめると、本発明者らのデータは、ＴＮＦＲ１依存性ＴＮＦシグナリングがＰＤ−１遮断の治療利益を損なうことを示している。
【００５３】
抗ＰＤ−１治療に対するＴＮＦ遮断の有益な治療効果に関与する分子及び細胞機構を理解するために、本発明者らは、Ｂ１６Ｋ１注射の７日後のＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスにおける抗ＰＤ−１単独注射に基づくプロトコールを作成した。１０日目に、マウスを屠殺した。本発明者らは、腫瘍重量が、ＴＮＦ欠損マウスでは、ＷＴマウスと比較して有意に減少し、この現象が、抗ＰＤ−１注射によりさらに増幅されたことを観察した（図６ａ）。興味深いことに、ＷＴマウスでは、１回の抗ＰＤ−１単独注射は腫瘍拒絶を促進することができなかったのに対して、ＴＮＦ欠損マウスでは、それは３０％超の腫瘍拒絶をトリガーした（図６ａ）。次に、本発明者らは、ＴＮＦ及びＩＦＮγをコードする転写産物の腫瘍内含有量をモニタリングした。ＷＴマウスでは、抗ＰＤ−１注射は、ＴＮＦ及びＩＦＮγ転写産物の両方の発現の増加を誘導した（図６ｂ及びｃ）。興味深いことに、ＴＮＦ欠損マウス由来の腫瘍では、対照条件においてＩＦＮγ転写産物は増加し、抗ＰＤ−１注射によりさらに増強された（図６ｃ）。ＣＤ８欠損マウスでは、対照及び抗ＰＤ−１条件の両方の下においてＴＮＦ及びＩＦＮγ  ｍＲＮＡ腫瘍レベルは低かったが、これは、この黒色腫モデルでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＮＦ及びＩＦＮγの強力な産生に必要であることを実証している（図６ｂ及びｃ）。
【００５４】
次に、本発明者らは、抗ＰＤ−１を注射した又は注射していないＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスにおいてＴＩＬ蓄積に対する抗ＰＤ−１の効果を調査した。フローサイトメトリーによる白血球腫瘍含有量の分析により、ＷＴマウスにおける抗ＰＤ−１注射は、ＣＤ４５＋及びＴ細胞（図６ｄ）（ＣＤ８＋及び比較的程度は低いがＣＤ４＋ＴＩＬの両方を含む（図６ｅ））のわずかだが有意な増加を誘導したことが示された。本発明者らの以前の知見１１と一致して、ＴＮＦ欠損マウス（図６ｄ及びｅ）及び抗ＴＮＦを注射したＷＴマウス（図６ｆ）では、ＣＤ４５＋細胞並びにＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬは劇的に増加し、抗ＰＤ−１処置によりさらに増大しなかった（図６ｄ〜ｆ）。したがって、ＴＮＦ遮断は、マウス黒色腫においてＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬを強く増強する（黒色腫患者における抗ＰＤ−１に対する応答を予測する現象２９）。Ｔｈ１応答を阻害して末梢寛容をトリガーするＴＩＭ−３３２は、黒色腫における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を損ない３３、マウス及び患者の両方における黒色腫の抗ＰＤ−１耐性に関連する免疫回避機構において主な役割を果たす１６重要な免疫チェックポイントとして最近登場した。本発明者らは、ＴＩＬにおけるＴＩＭ−３発現を評価したところ、ＴＮＦの状態とは無関係に、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬの５０％超がＰＤ−１及びＴＩＭ−３を共発現することを見出した（図１１）。ＷＴマウスでは、ＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（これは、ＴＩＬにおけるその発現を反映する）は、抗ＰＤ−１投与後にＣＤ８＋ＴＩＬにおいて有意に増加した（図４Ｄ）。対照的に、ＴＮＦ欠損マウスでは、この現象は完全に無効化されたが（図４Ｄ）、これは、抗ＰＤ１によってトリガーされるＴＩＭ−３発現がＴＮＦ依存的に起こったことを示唆している。重要なことに、抗ＴＮＦは、ＷＴマウスにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬのＴＩＭ−３発現を損なった（データは示さず）。ＴＮＦがＴＩＭ−３発現を誘導し得るかを評価するために、本発明者らは、ナイーブマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を精製及び活性化した後、毒性用量未満の外因性マウスＴＮＦと共にインキュベーションした。ＴＮＦは、ＴＩＭ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合及びＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度の両方の増加を誘発した（図４Ｅ）。ＴＮＦＲ１欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞では、これは無効化されたが、これは、ＴＮＦがＴＮＦＲ１依存的にＴＩＭ−３発現を誘導したことを示している（データは示さず）。興味深いことに、ＴＮＦはまた、精製ナイーブヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ−３の発現を刺激した（データは示さず）。加えて、ＴＣＧＡコホートの転移性黒色腫患者由来の黒色腫サンプルでは、（ＴＮＦをコードする）ＴＮＦＡの発現は、（ＴＩＭ−３をコードする）ＨＡＶＣＲ２のものと正にかつ有意に相関していたが（ｒ＝０．７２３、ｐ＜０．０００１）（図７）、これは、黒色腫におけるＴＮＦシグナリングとＴＩＭ−３発現との間の密接な分子的関連性をさらに強固にしている。
【００５５】
まとめると、本発明者らのデータは初めて、ＴＮＦＲ１依存性ＴＮＦシグナリングが強力な免疫回避機構を構成し、おそらくはＣＤ−８＋ＴＩＬ含有量を制限してＴＩＭ−３発現を誘導することによって、抗ＰＤ−１耐性を付与することを強調している。本発明者らの研究は、抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとを組み合わせて、患者における黒色腫及び推定される他のガン、例えば肺ガンと闘うという概念の証明を提供する。
【００５６】
実施例７：
ＴＮＦ欠損は、抗ＰＤ−１治療によるＴＩＬの細胞死を減少させる。
抗ＰＤ−１治療におけるＴＮＦ遮断の有益な効果に関与する分子及び細胞機構を理解するために、本発明者らは、Ｂ１６Ｋ１細胞 １００万個をＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスに両側的に移植し、続いて７日後に、単回の抗ＰＤ−１注射を行った。
【００５７】
ＴＮＦ欠損がＴＩＬ増殖に対して影響を及ぼすかを評価するために、本発明者らは、Ｋｉ６７発現（増殖マーカー）をモニタリングした。抗ＰＤ−１で処置したＷＴ及びＴＮＦ欠損マウスでは、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋ＴＩＬ及びＫｉ６７＋ＣＤ４＋ＴＩＬの割合は同様であった（データは示さず）。したがって、抗ＰＤ−１治療下では、ＴＮＦは、ＴＩＬ増殖の主なレギュレーターではないと思われる。次に、本発明者らは、原形質膜透過性（LIVE/DEAD陽性細胞）の増加を評価することによって、ＴＩＬの細胞死をモニタリングした。重要なことに、抗ＰＤ−１処置動物では、ＴＮＦ欠損は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬの両方の細胞死を有意に減少させた（図１２）。注目すべきことに、ＴＮＦ欠損は、抗ＰＤ−１治療による腫瘍におけるケモカインｍＲＮＡレベルを損なわなかった（データは示さず）。まとめると、本発明者らのデータは、ＴＮＦ欠損マウスにおけるＴＩＬ蓄積が、抗ＰＤ−１治療下においてＴ細胞増殖又は走化性の増加ではなくＴＩＬ生存の増加に起因していたことを示している。
【００５８】
実施例８：
ＴＮＦ欠損はＩＦＮ−γ応答を増強し、ＰＤ−Ｌ１発現を減少させる。
ＷＴマウスでは、抗ＰＤ−１注射は、腫瘍におけるＴＮＦ及びＩＦＮ−γ転写産物の両方の発現の増加を誘発した（図６ｂ及びｃ）。興味深いことに、ＴＮＦ欠損マウス由来の腫瘍では、基礎条件下においてＩＦＮ−γ転写産物は増加し、抗ＰＤ−１処置によりさらに増強された（図６ｃ）。ＣＤ８欠損マウス由来の腫瘍では、対照及び抗ＰＤ−１の両方の条件下においてＴＮＦ及びＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡレベルは依然として低かったが、これは、この黒色腫モデルでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＮＦ及びＩＦＮγの強力な産生に必要であることを実証している（図６ｂ及びｃ）。
【００５９】
ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋ＴＩＬの割合は依然として、ＴＮＦ損失によって影響を受けなかったのに対して、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋ＴＩＬは有意に増加したが、これは、抗ＰＤ−１治療下では、ＴＮＦがＴｈ１応答を制限することを示している（データは示さず）。したがって、ＴＮＦ欠損マウス由来の腫瘍におけるＩＦＮ−γの発現の増加は、Ｔｈ１極性化の増強及びＣＤ８＋ＴＩＬの蓄積（これらは、ＩＦＮ−γの強力な産生者である）に関連していた。ＴＮＦ欠損マウスでは、グランザイムＢ＋ＣＤ８＋ＴＩＬの割合も有意に増加したが（データは示さず）、これは、ＴＮＦが細胞傷害性ＣＤ８＋ＴＩＬの蓄積を損なうことを示している。
【００６０】
ＴＮＦは、黒色腫１５を含む固形ガン１７におけるＰＤ−Ｌ１発現を促進することが公知である。次いで、本発明者らは、本発明者らの実験条件下においてＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２レベルを分析した。ＷＴマウスでは、抗ＰＤ−１による処置は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの両方においてＰＤ−Ｌ１発現を選択的に増強したが、ＰＤ−Ｌ２発現を増強しなかった（図１３ａ、データは示さず）。ＴＮＦ欠損は、抗ＰＤ−１治療によるＴＩＬにおけるＰＤ−Ｌ１アップレギュレーションを完全に無効化した（図１３ａ）。本発明者らはまた、樹状細胞（ＤＣ）（これは、Ｔ細胞のプライミングにおいて重要な役割を果たす）の腫瘍含有量をモニタリングした。抗ＰＤ−１で処置したＷＴマウス及び（抗ＰＤ−１注射の有無にかかわらず）ＴＮＦ欠損マウスでは、腫瘍浸潤ＤＣはわずかだが有意に増加した（図１３ｂ）。また、対照及び抗ＰＤ−１条件下において、ＴＮＦ欠損マウスのＤＣでは、ＰＤ−Ｌ１及び比較的程度は低いがＰＤ−Ｌ２の発現は減少した（図１３ｃ及び１３ｄ）。したがって、ＴＮＦ欠損は、腫瘍におけるＤＣ蓄積を促し、ＰＤ−１リガンドの発現を減少させるが無効化しない。
【００６１】
実施例９：
ＴＮＦは、腫瘍浸潤白血球におけるＴＩＭ−３発現を増強する。
ＴＩＭ−３はＴｈ１応答を阻害し、末梢寛容をトリガーする２８。この新たに認識された重要な免疫チェックポイント分子は、黒色腫における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を損ない２９、免疫回避機構において主な役割を果たす。これは、マウス及び患者の両方における黒色腫の抗ＰＤ−１耐性に関連していた２２。
【００６２】
本発明者らは、ＴＩＬにおけるＴＩＭ−３発現を評価したところ、ＴＮＦの状態とは無関係に、ＣＤ８＋ＴＩＬの７０％超及びＣＤ４＋ＴＩＬの５０％超がＰＤ−１及びＴＩＭ−３を共発現していたことを見出した（図１１）。ＷＴマウスでは、ＴＩＭ−３染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（これは、ＴＩＬにおけるその発現を反映する）は、抗ＰＤ−１投与後にＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬにおいて有意に増加した（図４Ｄ）。対照的に、ＴＮＦ欠損マウスでは、ＴＩＭ−３アップレギュレーションは完全に無効化されたが（図４Ｄ）、これは、抗ＰＤ１によってトリガーされるＴＩＭ−３発現がＴＮＦ依存的に起こったことを示唆している。注目すべきことに、ＴＮＦ欠損は、ＣＤ８＋ＴＩＬにおけるＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３及びＣＴＬＡ−４の発現を損なわなかったが（データは示さず）、これは、本発明者らの実験条件下では、ＴＮＦがこれらの免疫チェックポイントの強力な誘導因子である可能性が低いことを示している。
【００６３】
ＴＮＦがＴＩＭ−３発現を誘導し得るかを評価するために、本発明者らは、ナイーブマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を精製及び活性化した後、毒性用量未満のマウスＴＮＦと共にインキュベーションした。ＴＮＦは、ＴＩＭ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合及びＴＩＭ−３染色のＭＦＩの増加を誘発した（図４Ｅ）。ＴＮＦＲ１欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞では、これは抑制されたが、これは、ＴＮＦがＴＮＦＲ１依存的にＴＩＭ−３発現を誘導したことを示している（データは示さず）。したがって、ＴＮＦは、ＴＮＦＲ１を発現しない１４非活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ−３発現をトリガーすることができなかった（データは示さず）。ＴＮＦは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ−３発現を強力にアップレギュレーションしたのに対して、それは、ＴＩＧＩＴ及びＬＡＧ３発現に対して効果を有していなかったか、又は最小の効果を有していた（データは示さず）。興味深いことに、ＴＮＦはまた、精製ナイーブ及び活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ−３の発現を刺激した（データは示さず）。
【００６４】
次に、本発明者らは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＮＦ誘導性ＴＩＭ−３発現に関与する分子機構を調査した。本発明者らは、ＴＮＦによって活性化されて３０ＴＩＭ−３発現をもたらす３１，３２シグナル伝達経路（すなわち、ＭＥＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ）に、本発明者らの分析の焦点を合わせた。ＰＩ３Ｋ及びＭＥＫの薬理学的阻害は、基礎ＴＩＭ−３発現を有意に減少させたが、ｐ３８  ＭＡＰＫはそうではなかった。興味深いことに、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤のみが、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＮＦ誘導性ＴＩＭ−３発現を完全に妨げた（データは示さず）。したがって、ｐ３８  ＭＡＰＫは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＮＦに応じたＴＩＭ−３アップレギュレーションにおいて重要な役割を果たす可能性が高い。
【００６５】
実施例１０：
抗ＴＮＦ抗体は、抗ＰＤ−１治療と相乗作用する。
上記観察結果の治療関連性を評価するために、本発明者らは、マウス黒色腫において抗ＴＮＦと抗ＰＤ−１遮断抗体との組み合わせを試験した（図３ａ）。未処置マウスと比較して、抗ＴＮＦのみでは、Ｂ１６Ｋ１黒色腫成長がわずかに阻害された（図３Ｂ及びＣ）。興味深いことに、抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとを組み合わせると、腫瘍の７５％の完全退縮がもたらされ（図３Ｂ及びＣ）、抗ＰＤ−１のみを注射したマウス群における２０％未満と比較してマウスの７５％の生存がもたらされた（図３Ｄ）。生存マウスは、Ｂ１６Ｋ１に対して完全にワクチン接種された（データは示さず）。注目すべきことに、Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体への４Ｔ１細胞の同所移植に基づく乳ガンモデルにおいても、抗ＴＮＦ及び抗ＴＮＦＲ１は抗ＰＤ−１と相乗作用した。抗ＰＤ−１、抗ＴＮＦ又は抗ＴＮＦＲ１のみでは腫瘍成長を損なうことができなかったのに対して、抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとの組み合わせ又は抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦＲ１との組み合わせは、それを有意に減少させた（図１４）。
【００６６】
抗ＰＤ−１と抗ＴＮＦとの組み合わせの治療利益に関与する分子及び細胞機構をさらに調査するために、本発明者らは、Ｂ１６Ｋ１腫瘍におけるＣＤ８＋ＴＩＬを分析した。抗ＴＮＦはＣＤ８＋ＴＩＬの割合を増強し（図６ｆ）、抗ＰＤ−１処置に応じて、それらの死（データは示さず）だけではなくそれらのＴＩＭ−３アップレギュレーション（図１５ａ及び１５ｂ）も妨げた。これらの知見は、抗ＰＤ−１治療により産生されたＴＮＦが、ＣＤ８＋ＴＩＬのＡＩＣＤ及びＴＩＬにおけるＴＩＭ−３アップレギュレーションの両方をトリガーすることを示している。次に、本発明者らは、定着した腫瘍に対する中核として抗ＰＤ−１を含む治療の有効性を比較し、１３日目まで遅らせた初回抗体注射との様々な組み合わせを試験した。抗ＴＩＭ−３及び抗ＴＮＦの同時投与は、腫瘍成長の軽減において等しく有効であった（図１５ｃ及び１５ｄ）。最後に、抗ＴＩＭ−３を抗ＴＮＦ及び抗ＰＤ−１と一緒に同時注射すると、治療効果はさらに改善されなかった（図１５ｃ及び１５ｄ）。ＴＮＦ欠損マウスにおいても同様の所見が観察され、抗ＴＩＭ−３注射は、抗ＰＤ−１治療効果を増強しなかった（データは示さず）。要するに、このデータは、抗ＴＮＦと抗ＰＤ−１とを組み合わせる治療利益が、少なくとも部分的には、ＴＩＭ−３依存性経路の阻害によるものであることを示している。
【００６７】
実施例１１：
高ＴＮＦ発現は、ヒト黒色腫における免疫回避遺伝子シグネチャーに関連する。
【００６８】
本発明者らの知見が、患者における転移性黒色腫に応用される方法を評価するために、次に、本発明者らは、免疫回避及び最終的には抗ＰＤ−１治療耐性に関与するタンパク質をコードする一連の遺伝子の発現について、ＴＣＧＡ黒色腫データバンク３３を分析した。驚くべきことに、高ＴＮＦ発現を示す黒色腫サンプルでは、免疫回避遺伝子シグネチャーが豊富であり、これは、ＴＮＦが、ヒト黒色腫における免疫抑制につながる遺伝子ネットワークの一部であることを示唆している（データは示さず）。加えて、（ＴＮＦをコードする）ＴＮＦＡの発現は、（ＴＩＭ−３をコードする）ＨＡＶＣＲ２、（ＰＤ−Ｌ１をコードする）ＰＤＣＤ１ＬＧ１及び（ＰＤ−Ｌ２をコードする）ＰＤＣＤ１ＬＧ２のものと正にかつ有意に相関していた（図７、データは示さず）。また、別の公表されたデータセット２３の本発明者らの分析により、抗ＰＤ−１で処置した患者由来の黒色腫標本におけるＴＮＦＡ、ＨＡＶＣＲ２、ＰＤＣＤ１ＬＧ１及びＰＤＣＤ１ＬＧ２発現間に強い正の有意な相関があることが明らかになった（データは示さず）。
【００６９】
したがって、本発明者らの前臨床データと一緒に、ヒト黒色腫に関するこれらの観察結果は、ＴＮＦが、抗ＰＤ−１治療により黒色腫におけるＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２及びＴＩＭ−３の発現を強力に誘導することを示唆している。
【００７０】
参考文献：
本出願を通して、本発明が関係する技術水準が様々な参考文献に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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