(57)【要約】【課題】マイクロ流体デバイスにおいてＴリンパ球を増殖させる方法が提供される。【解決手段】本方法は、１個以上のＴリンパ球をマイクロ流体デバイスに導入することと、１個以上のＴリンパ球と活性化剤とを接触させることと、１個以上のＴリンパ球が少なくとも１ラウンドの有糸細胞分裂を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、マイクロ流体デバイスを通して培養培地をかん流させることとを含み得る。増殖は、非特異的又は抗原特異的であり得る。開示された方法に従って産生されたＴリンパ球も、対象における癌を治療する方法と共に提供される。癌を治療する方法は、対象から得られた組織サンプルからＴリンパ球を分離することと、分離されたＴリンパ球をマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、増殖されたＴリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、増殖されたＴリンパ球を対象に再導入することとを含み得る。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路と、前記流路に流体接続された隔離ペンとを有するマイクロ流体デバイスにおいてＴリンパ球を増殖させる方法であって、
１個以上のＴリンパ球を前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンに導入することと、
前記１個以上のＴリンパ球と活性化剤とを接触させることと、
前記隔離ペンに導入された前記１個以上のＴリンパ球が増殖を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、前記マイクロ流体デバイスの前記流路を通して培養培地をかん流させることと
を含む方法。
【請求項２】
前記隔離ペンは、約５×１０５から約５×１０６立方ミクロンの体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記隔離ペンの少なくとも１つの内面は、コーティング材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コーティング材料は、前記隔離ペンの前記少なくとも１つの内面に共有結合で結合され、前記コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、糖部分、アミノ酸部分又はそれらの組合せを含むポリマーを含み、任意選択的に、前記コーティング材料は、デキストラン又はポリエチレングリコール部分を含み、任意選択的に、前記コーティング材料は、１種以上のタンパク質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記コーティング材料は、それぞれ結合基とアルキル部分とを含む分子を含み、前記結合基は、前記隔離ペンの前記少なくとも１つの内面に共有結合で結合され、任意選択的に、前記結合基は、シロキシ結合基である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アルキル部分は、少なくとも１０個の炭素原子を含む炭素の直鎖を含み、及び／又は前記アルキル部分は、フルオロアルキル部分若しくはペルフロウロアルキル部分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コーティング材料の前記分子は、前記内側基板表面に共有結合で結合された密充填単層構造を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記コーティング材料は、結合基とカチオン部分及び／又はアニオン部分とを有する分子を含み、前記結合基は、前記内側基板表面に共有結合で結合される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン部分は、第４級アンモニウム基を含み、又は前記アニオン部分は、ホスホン酸、カルボン酸若しくはスルホン酸を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コーティング材料は、結合基と双性イオン部分とを有する分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記双性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸及びアミノ酸から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化剤は、前記コーティング材料に共有結合で結合されるか又は安定に結合され、任意選択的に、前記活性化剤は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して前記コーティング材料に安定に結合される、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記１個以上のＴリンパ球は、対象から採取された末梢血サンプル又は対象の固形腫瘍サンプルから分離され、任意選択的に、固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固形腫瘍サンプルは、細針吸引物（ＦＮＡ）又は生検物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記１個以上のＴリンパ球は、前記末梢血サンプル又は前記固形腫瘍サンプルから分離されたＴリンパ球の集団に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記集団は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球が富化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記集団は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球が富化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記集団は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球が富化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔリンパ球が富化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記集団は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球が富化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記集団は、ＣＣＲ７＋Ｔリンパ球又はＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が富化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記集団は、ＣＤ６９＋Ｔリンパ球又はＰＤ−１＋及び／若しくはＰＤ−Ｌ１＋Ｔリンパ球が枯渇される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔリンパ球と、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６９、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１に対する抗体とを接触させることにより、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球、ＣＤ６９＋Ｔリンパ球、ＰＤ−１＋Ｔリンパ球及びＰＤ−Ｌ１＋Ｔリンパ球の１つ、２つ、３つ又は４つを枯渇させることと、前記抗体に結合されたＴリンパ球を前記集団から除去することとを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体は、固体担体を伴い、任意選択的に、前記固体担体は、磁気ビーズの集団である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、前記１個以上のＴリンパ球を含有する流体を前記マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させることを含み、前記マイクロ流体チャネルは、前記マイクロ流体デバイスの前記流路の一部であり、前記隔離ペンは、前記マイクロ流体チャネルから離れて開口し、任意選択的に、前記１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて、前記マイクロ流体チャネルに位置する少なくとも１個のＴリンパ球を選択し、且つそれを前記隔離ペン内に移動させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はそれらの任意の組合せを含むために選択され、任意選択的に、（ｉ）前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面が前記マーカーＣＤ３＋及びＣＤ４＋を含むために選択され、又は（ｉｉ）前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面が前記マーカーＣＤ３＋及びＣＤ８＋を含むために選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋又はそれらの任意の組合せを含むために選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１個のＴリンパ球を選択することは、前記少なくとも１個のＴリンパ球を含むＴリンパ球の集団を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７又はＣＤ６２Ｌに特異的に結合する抗体で標識することと、前記少なくとも１個のＴリンパ球を、それが前記抗体を伴うことに基づいて前記隔離ペン内に移動させることとを含み、任意選択的に、前記抗体は、フルオロフォアを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＯ＋でないために選択され、任意選択的に、１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＤ４５ＲＯの指標となる標識を伴わない１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することとを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＡ＋でないために選択され、任意選択的に、１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＤ４５ＲＡの指標となる標識を伴わない１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することとを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＣＲ７＋及びＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＣＲ７の指標となる標識を伴う及び／又はＣＤ６２Ｌの指標となる標識を伴う１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペン内に移動させることとを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＣＲ７＋及びＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＣＲ７の指標となる標識を伴わない及び／又はＣＤ６２Ｌの指標となる標識を伴わない１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペン内に移動させることとを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ６９＋でなく、ＰＤ−１＋でなく、且つ／又はＰＤ−Ｌ１＋でないために選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う抗原で標識されるために選択され、任意選択的に、前記抗原は、ＭＨＣタンパク質で複合体化されるペプチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う１種以上の抗体で標識されるために選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記１種以上の抗体は、ＣＤ４５ＲＡ若しくはＣＤ４５ＲＯに対する抗体、ＣＣＲ７に対する抗体、ＣＤ６２Ｌに対する抗体又はそれらの任意の組合せを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１種以上の抗体は、ＣＤ４又はＣＤ８に対する抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記１個以上のＴリンパ球は、前記隔離ペンに導入される前に活性化剤に接触され、任意選択的に、前記１個以上のＴリンパ球は、前記マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも１時間の期間にわたり、又は前記マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも５時間の期間にわたり前記活性化剤と共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記１個以上のＴリンパ球を前記隔離ペンに導入することは、前記活性化剤を前記隔離ペンに導入することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１個以上のＴリンパ球は、前記隔離ペンに導入された後に前記活性化剤に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
（ｉ）前記活性化剤は、抗ＣＤ３及び／若しくは抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を含み、任意選択的に、前記活性化剤は、固体担体にコンジュゲートされる抗ＣＤ３アゴニスト抗体、固体担体にコンジュゲートされる抗ＣＤ２８アゴニスト抗体若しくは可溶性抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を含み、又は（ｉｉ）前記活性化剤は、樹状細胞（ＤＣ）を含み、任意選択的に、前記ＤＣは、前記１個以上のＴリンパ球を接触させる前に腫瘍抗原でパルスされ、さらに任意選択的に、前記腫瘍抗原は、前記１個以上のＴリンパ球と同系の腫瘍細胞から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍抗原は、腫瘍細胞のゲノム解析を通して同定され、任意選択的に、前記解析される腫瘍細胞は、前記１個以上のＴリンパ球と同系である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＣ及び前記１個以上のＴリンパ球は、自己細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記培養培地は、前記マイクロ流体デバイスの前記流路を通して少なくとも２４時間、少なくとも４８時間又は少なくとも９６時間の期間にわたってかん流される、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養培地は、ヒト血清とＩＬ２とを含み、及び／又は前記培養培地は、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１若しくはそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
２０個以下、１０個以下、６〜１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球は、前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンに導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記増殖は、少なくとも３ラウンドの有糸細胞分裂を含み、及び／又は前記方法は、前記増殖されたＴリンパ球を前記マイクロ流体デバイスから搬出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、１個以上のＴリンパ球は、前記複数のそれぞれの隔離ペンに導入され、且つ前記活性化剤に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたＴリンパ球。
【請求項５１】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたＴリンパ球を含むマイクロ流体デバイスであって、任意選択的に、隔離ペンを含み、及び前記Ｔリンパ球は、前記隔離ペン内に位置する、マイクロ流体デバイス。
【請求項５２】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたＴリンパ球と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５３】
対象における癌を治療する方法であって、Ｔリンパ球を前記対象に導入することを含み、前記Ｔリンパ球は、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法によって調製される、方法。
【請求項５４】
対象における癌を治療する方法であって、
前記対象から得られた組織サンプルからＴリンパ球を分離することと、
前記分離されたＴリンパ球を、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法に従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、
前記増殖されたＴリンパ球を前記マイクロ流体デバイスから搬出することと、
前記増殖されたＴリンパ球を前記対象に再導入することと
を含む方法。
【請求項５５】
前記対象は、哺乳動物であり、任意選択的に、前記対象は、ヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記組織サンプルは、末梢血のサンプルであるか又は固形腫瘍に由来し、任意選択的に、前記組織サンプルは、前記固形腫瘍に由来するＦＮＡ又は生検物であり、任意選択的に、前記固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組織サンプルからＴリンパ球を分離することは、前記組織サンプル中のＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞又はそれらの任意の組合せの選択を行うことを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記分離されたＴリンパ球を増殖させることは、前記分離されたＴリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト及び／又はＣＤ２８アゴニストを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記マイクロ流体デバイスは、前記分離されたＴリンパ球の増殖を支援するように構成された少なくとも１つの隔離ペンを含み、前記少なくとも１つの隔離ペンのそれぞれの少なくとも１つの表面は、コーティング材料を含み、前記活性化剤は、前記コーティング材料に共有結合で結合される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記活性化剤は、樹状細胞（ＤＣ）を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＣは、癌について治療される前記対象から得られ、及び／又は前記ＤＣは、前記分離されたＴリンパ球と前記活性化剤とを接触させる前に腫瘍抗原でパルスされ、任意選択的に、前記腫瘍抗原は、前記対象から得られた癌細胞から分離され、又は前記腫瘍抗原は、合成品である、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国法典第３５編第１１９条の下、２０１６年３月１７日出願の米国特許出願第６２／３０９，４５４号、２０１６年４月２２日出願の米国特許出願第６２／３２６，６６７号、２０１６年１０月２４日出願の米国特許出願第６２／４１２，２１２号及び２０１７年３月１３日出願の米国特許出願第６２／４７０，７４４号（それらのそれぞれの開示全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
分野
本分野は、概して、マイクロ流体環境内でＴリンパ球を選択し且つ増殖させるための方法、システム及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫療法は、患者の免疫系を用いて疾患への対処を支援する急成長中の分野である。患者自身の免疫系の刺激による癌細胞の攻撃及び外部源からの免疫系成分の投与をはじめとする様々な免疫療法ストラテジーが、癌に対処するために評価されてきた。例えば、生体内で癌細胞を攻撃するように設計されたモノクローナル抗体は、単独で又は遺伝子工学操作構築物として投与されてきた。加えて、種々のＴ細胞療法が研究されてきた。自己Ｔ細胞療法は、対象からＴ細胞を得ることと、エクスビボでＴ細胞を増殖させることと、増殖されたＴ細胞を対象に再導入することとを含む。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法は、対象の癌を標的とするキメラ抗体含有融合タンパク質をその表面上に発現させて、Ｔ細胞によって癌細胞を死滅させるようにＴ細胞を遺伝子工学操作することを含む。いずれのタイプのＴ細胞療法も利点を提供する。しかし、これらの療法は、依然として更なる改良を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
自己Ｔ細胞療法及びＣＡＲ−Ｔ療法の両方の主要な問題の１つは、最も高い腫瘍死滅能を有するＴ細胞を選択的に増殖させるようにＴ細胞をエクスビボで増殖させる方法が欠如していることである。本開示は、Ｔ細胞をエクスビボで選択的に増殖させるための解決策を提供する。本開示はまた、本明細書に開示される方法に従ってエクスビボで増殖されたＴ細胞を用いて、癌に罹患している対象を治療するための改善された方法を提供する。
【０００５】
概要
マイクロ流体デバイス（又は「チップ」）においてＴリンパ球を増殖させる方法が開示される。マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルと、チャネルに流体接続された隔離ペンとを含み得、隔離ペンは、Ｔリンパ球の培養及び増殖を支援するように構成される。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、ナノ流体デバイスであり得る。隔離ペンは、例えば、約０．５×１０６から約５．０×１０６立方ミクロン又は約０．５×１０６から約２．０×１０６立方ミクロンの体積を有し得る。さらに、マイクロ流体デバイスは、２つ以上のマイクロ流体チャネルと、各マイクロ流体チャネルに流体接続された複数の隔離ペンとを有し得、複数のそれぞれの隔離ペンは、Ｔリンパ球の培養及び増殖を支援するように構成される。隔離ペンの表面の１つ以上は調整され得る。
【０００６】
Ｔリンパ球を増殖させる方法は、１個以上のＴリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することと、１個以上のＴリンパ球と活性化剤とを接触させることとを含み得る。幾つかの実施形態では、２０個以下、１０個以下、６から１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球が隔離ペンに導入される。マイクロ流体デバイスが複数の隔離ペンを含む場合、１つ以上の隔離ペンのそれぞれに１個以上のＴリンパ球（例えば、２０個以下、１０個以下、６から１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球）を導入し得る。Ｔリンパ球を増殖させる方法は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通して培養培地をかん流させることをさらに含み得る。かん流は、連続的また間欠的であり得、且つ１つの隔離ペン（又は複数の隔離ペン）に導入された１個以上のＴリンパ球が少なくとも１ラウンドの有糸細胞分裂を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたって継続し得る。
【０００７】
特定の実施形態では、１個以上のＴリンパ球は、対象の末梢血から分離されたＴリンパ球の集団に由来する。他の実施形態では、１個以上のＴリンパ球は、対象の固形腫瘍サンプルから分離されたＴリンパ球の集団に由来する。固形腫瘍サンプルは、細針吸引物（ＦＮＡ）又は腫瘍生検物（例えば、コア生検物）であり得る。固形腫瘍は、乳癌、泌尿生殖器癌（例えば、腎臓（例えば、腎細胞癌）、尿管、膀胱、尿道等の尿路に発生する癌、男性生殖管の癌（例えば、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌）、又は女性生殖管の癌（例えば、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌若しくは卵管癌））、神経系癌（例えば、神経芽腫、網膜芽腫）、腸癌（例えば、結腸直腸癌）、肺癌、黒色腫、或いは他のタイプの癌であり得る。具体的な実施形態では、固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫であり得る。
【０００８】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＣＲ７＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＰＤ−１＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ１３７＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＰＤ−１＋／ＣＤ１３７＋Ｔリンパ球が富化される。
【０００９】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＣＲ７＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＰＤ−１＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＣＤ１３７＋Ｔリンパ球が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団は、ＰＤ−１＋／ＣＤ１３７＋Ｔリンパ球が枯渇される。
【００１０】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球の集団の主な細胞型は、ナイーブＴ細胞（Ｔｎａｉｖｅ）、セントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）若しくはエフェクタメモリＴ細胞（ＴＥＭ）等のメモリＴ細胞又はエフェクタＴ細胞（ＴＥＦＦ）である。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本方法は、Ｔリンパ球を含有するサンプルを前処理して、ナイーブＴリンパ球、メモリＴリンパ球（例えば、ＴＣＭ細胞及び／又はＴＥＭ細胞）、ＴＥＦＦリンパ球又はそれらの任意の組合せを富化することを含む。処理は、デブリ及び／又は非リンパ球細胞型をサンプルから除去することを含み得る。代替的又は追加的に、ナイーブＴリンパ球、メモリＴリンパ球（例えば、ＴＣＭ及び／又はＴＥＭリンパ球）、ＴＥＦＦリンパ球又はそれらの組合せをサンプルから枯渇させる処理を含み得る。
【００１２】
サンプルは、癌（例えば、本明細書に記載の又は当技術分野で公知の任意のタイプの癌）に罹患している対象等の対象に由来し得る。サンプルは、末梢血サンプル又はその派生物（例えば、ＰＢＭＣサンプル）であり得る。代替的に、サンプルは、固形腫瘍生検物又はＦＮＡであり得る。幾つかの実施形態では、末梢血サンプルは、ナイーブＴリンパ球を富化するように処理される。他の実施形態では、腫瘍サンプルは、メモリＴリンパ球、特にＴＣＭリンパ球を富化するように処理されるが、ＴＥＦリンパ球を富化してもよい。さらに他の実施形態では、腫瘍サンプルは、ＴＥＦＦリンパ球を富化するように処理される。所望のＴリンパ球細胞型を富化するために、１つ以上の細胞表面抗原に特異的に結合する結合剤（例えば、抗体等）が利用され得る。結合剤が結合する細胞表面抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＰＤ−１及びＣＤ１３７Ｔをはじめとする本明細書に記載の細胞表面抗原のいずれか１つ又はそれらの組合せであり得る。処理は、サンプルと１つ以上の蛍光標識結合剤とを接触させることと、標識細胞を選択するために（例えば、１つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて富化する場合）又は標識細胞を除去するために（例えば、１つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて枯渇させる場合）ＦＡＣＳを行うこととを含み得る。代替的又は追加的に、処理は、サンプルと、固体担体に結合された１つ以上の結合剤とを接触させることと、固体担体に結合された細胞を除去することと（例えば、１つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて枯渇させる場合）又は固体担体に結合されなかった細胞を除去することと（例えば、１つ以上の結合剤が特異的に結合した細胞表面抗原に基づいて富化する場合）を含み得る。固体担体は、例えば、１つ以上のビーズ（例えば、磁気を有し得るビーズの集団）であり得る。磁気ビーズを使用する場合、磁気ビーズがペレットを形成するようにサンプルに磁力を適用し、得られた上澄み液がペレットから分離されることを可能にする。
【００１３】
特定の実施形態では、１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、１個以上のＴリンパ球を含有する流体をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させることを含む。１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて、マイクロ流体チャネルに位置する少なくとも１個のＴリンパ球を選択し、且つそれを隔離ペン内に移動させることをさらに含み得る。少なくとも１個のＴリンパ球は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＰＤ−１、ＣＤ１３７Ｔ等のマーカー又はそれらの任意の組合せの細胞表面発現に基づいて選択され得る。代替的に、１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、重力によって少なくとも１個のＴリンパ球を隔離ペンに引き入れるようにマイクロ流体チップを傾斜させることをさらに含み得る。他の代替形態では、１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、遠心力によって少なくとも１個のＴリンパ球を隔離ペンに引き入れるようにマイクロ流体デバイスを遠心することをさらに含み得る。
【００１４】
幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４＋又はＣＤ３＋ＣＤ４＋であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ８＋又はＣＤ３＋ＣＤ８＋であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＡ＋（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＡ−（例えば、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋）であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＣＲ７＋及び／又はＣＤ６２Ｌ＋であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＣＲ７−及び／又はＣＤ６２Ｌ−であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ６９−であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＰＤ−１＋及び／又はＣＤ１３７＋であるために選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＰＤ−１−及び／又はＣＤ１３７−であるために選択される。
【００１５】
幾つかの実施形態では、選択するステップは、少なくとも１個のＴリンパ球と、１つ以上の結合剤（例えば、抗体、ペプチド結合ＭＨＣ複合体テトラマー等）とを接触させることと、１つ以上の結合剤と少なくとも１個のＴリンパ球との間の結合の存在（又は不在）に基づいて少なくとも１個のＴリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の結合剤のそれぞれは、フルオロフォア等の標識を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、活性化剤を隔離ペンに導入することをさらに含む。１個以上のＴリンパ球は、隔離ペンに導入される前に活性化剤と接触され得る。例えば、Ｔリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも１時間（例えば、少なくとも２、３、４、５時間又はそれを超える時間）の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされ得る。代替的に、１個以上のＴリンパ球は、隔離ペンに導入された後に活性化剤に接触され得る。
【００１７】
特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストを含み得る。ＣＤ３及び／又はＣＤ２８アゴニストは、抗体であり得る。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ３アゴニスト（例えば、抗体）は、固体担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗体）は、固体担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗体）は、水性溶液中の溶質である。そのため、例えば、活性化剤は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８アゴニスト抗体にコンジュゲートされた１個以上のビーズを含み得る。代替的に、活性化剤は、抗ＣＤ３アゴニスト抗体にコンジュゲートされた１個以上のビーズと、可溶性抗ＣＤ２８アゴニスト抗体の溶液とを含み得る。さらに他の代替形態では、ＣＤ３及び／又はＣＤ２８アゴニストは、隔離ペンの１つ以上の表面に（共有結合又は非共有結合で）結合され得る。隔離ペンの表面は、表面へのＣＤ３及び／又はＣＤ２８アゴニストの結合を促進するように調整され得る。
【００１８】
特定の実施形態では、活性化剤は、樹状細胞（ＤＣ）を含み得る。樹状細胞は、１個以上のＴリンパ球を接触させる前に対象の抗原（例えば、癌関連抗原、感染性疾患関連抗原又は幾つかの他のタイプの病態に関連する抗原）でパルスされ得る。周知の抗原又は新抗原であり得る癌関連抗原は、腫瘍生検物から得られる腫瘍細胞のゲノム解析を通して同定され得る。
【００１９】
特定の実施形態では、活性化剤は、ペプチド抗原とＭＨＣ分子との間の複合体を含み得る。かかる複合体は、ペプチド−ＭＨＣテトラマー複合体の場合のように結合され得る。ペプチド−ＭＨＣ複合体は、固体担体にコンジュゲートされ得る。幾つかの実施形態では、固体担体は、１個以上のビーズであり得る。他の実施形態では、固体担体は、隔離ペンの１つ以上の表面であり得る。そのため、隔離ペンの表面は、表面へのペプチド−ＭＨＣ複合体の結合を促進するように調整され得る。
【００２０】
特定の実施形態では、培養培地は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通して少なくとも２４時間（例えば、少なくとも４８、７２、９６、１１０時間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間）の期間にわたってかん流される。特定の実施形態では、培養培地は、ウシ血清（例えば、ウシ胎児血清又は仔ウシ血清）と任意選択的に組み合わせたヒト血清（例えば、ヒトＡＢ血清）であり得る哺乳動物血清を含む。特定の実施形態では、培養培地は、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）又はそれらの任意の組合せをさらに含む。幾つかの実施形態では、培養培地は、約５０Ｕ／ｍｌのＩＬ２（例えば、約１Ｕ／ｍｌから約１０Ｕ／ｍｌのＩＬ２）を含む。幾つかの実施形態では、培養培地は、約５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７（例えば、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７）を含む。幾つかの実施形態では、培養培地は、約３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１）を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本方法は、１個以上のＴリンパ球のペン内増殖速度をアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、隔離ペン内の１個以上のＴリンパ球による１種以上のサイトカイン、例えばＩＮＦγ、ＴＮＦα、ＩＬ２又はそれらの組合せの発現をアッセイすることを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、隔離ペン内の１個以上のＴリンパ球によるＣＴＬＡ４等の１種以上の調節性Ｔ細胞マーカーの発現をアッセイすることを含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、例えば、増殖後、マイクロ流体デバイスから搬出される。搬出は、例えば、増殖速度、サイトカイン発現、調節性Ｔ細胞マーカー発現又はそれらの組合せに少なくとも部分的に基づいて選択的であり得る。幾つかの実施形態では、搬出されたＴリンパ球のサンプルは、ゲノムプロファイリングされる。
【００２３】
特定の実施形態では、対象において癌を治療する方法が開示される。対象は、ヒト等の哺乳動物であり得る。癌は、乳癌、泌尿生殖器癌（例えば、腎臓（例えば、腎細胞癌）、尿管、膀胱、尿道等の尿路に発生する癌、男性生殖管の癌（例えば、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌）、又は女性生殖管の癌（例えば、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌若しくは卵管癌））、神経系癌（例えば、神経芽腫）、腸癌（例えば、結腸直腸癌）、肺癌、黒色腫、或いは他のタイプの癌であり得る。特定の実施形態では、癌は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫であり得る。
【００２４】
癌を治療する方法は、対象から得られた組織サンプルからＴリンパ球を分離することと、分離されたＴリンパ球を、本明細書に開示される方法のいずれかに従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、増殖されたＴリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、増殖されたＴリンパ球を対象に再導入することとを含み得る。
【００２５】
特定の実施形態では、組織サンプルは、末梢血サンプルである。特定の実施形態では、組織サンプルは、固形腫瘍に由来する。組織サンプルは、例えば、固形腫瘍に由来するＦＮＡ又は生検物（例えば、コア生検物）であり得る。固形腫瘍サンプルは、以上で考察した癌のいずれかに由来し得る。
【００２６】
特定の実施形態では、組織サンプルからＴリンパ球を分離することは、組織サンプルでＣＤ３＋細胞の選択を行うことを含む。幾つかの実施形態では、選択は、以上に及び本明細書の他の箇所に記載されるマーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の１つ以上に基づき得る。選択は、ＣＤ３結合剤（又は他のマーカー結合剤）が結合された磁気ビーズ等のビーズを使用することを含み得る。特定の実施形態では、組織サンプルからＴリンパ球を分離することは、腫瘍サンプルでＣＤ３＋（又は他のマーカー陽性）細胞の選択を行う前に組織サンプルを解離させることをさらに含む。
【００２７】
特定の実施形態では、分離されたＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される。マイクロ流体デバイスは、ナノ流体デバイスであり得る。特定の実施形態では、分離されたＴリンパ球を増殖させることは、マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスの隔離ペンに１個以上の分離されたＴリンパ球を導入することを含む。隔離ペンは、例えば、約０．５×１０６から約５×１０６立方ミクロン又は約０．５×１０６から約２．０×１０６立方ミクロンの体積を有し得る。
【００２８】
特定の実施形態では、分離されたＴリンパ球を増殖させることは、分離されたＴリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む。幾つかの実施形態では、活性化剤は、ＣＤ３及び／又はＣＤ２８アゴニストを含む。ＣＤ３及び／又はＣＤ２８アゴニストは、抗体であり得る。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ３アゴニストは、固体担体にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２８アゴニストは、固体担体にコンジュゲートされる。そのため、活性化剤は、例えば、それぞれ抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８アゴニスト抗体にコンジュゲートされ得る１つ以上の固体担体（例えば、１個以上のビーズ）を含み得る。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗体）は、溶質として水性溶液中に提供される。他の実施形態では、活性化剤は、樹状細胞（ＤＣ）を含む。ＤＣは、治療される対象から得られ得、及び／又は分離されたＴリンパ球を接触させる前に腫瘍抗原でパルスされ得る。腫瘍抗原は、対象から得られた癌細胞に由来する核酸分子（例えば、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ等）のシーケンシングによって同定され得る。さらに他の実施形態では、活性化剤は、１個以上のビーズ又は隔離ペンの１つ以上の表面（例えば、調整された表面）等の固体担体に結合され得るペプチド−ＭＨＣ複合体又は複合体クラスター（例えば、ペプチド−ＭＨＣテトラマー複合体）であり得る。
【００２９】
特定の実施形態では、Ｔリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも１時間（例えば、少なくとも２、３、４、５時間又はそれを超える時間）の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされる。特定の実施形態では、分離されたＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、活性化剤を隔離ペンに導入することをさらに含む。
【００３０】
特定の実施形態では、活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたＴリンパ球は、少なくとも１００倍（例えば、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍等）の増殖を呈する。特定の実施形態では、増殖されたＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスから搬出された後であるが、対象に再導入される前に「オフチップ」でさらに増殖される。
【００３１】
本明細書に記載の方法はいずれも、マイクロ流体デバイスと、その中で成長されるＴ細胞との間の主要なインターフェースを提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又はコーティングされた１つ以上の内面（例えば、基板表面、カバー表面及び／又は回路材料表面）を有するマイクロ流体デバイスを用いて行われ得る。例えば、流路及び隔離ペンは、１つ以上の内面に結合し、且つ分子の有機層及び／又は親水性層を提示するコーティング溶液で処理され得る。そのため、コーティング溶液は、１つ以上の内面に結合するコーティング剤、例えば血清、血清中アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、ポリマー、界面活性剤、酵素又はそれらの任意の組合せを含み得る。
【００３２】
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、コーティング材料を含む内側基板表面（及び／又は内側カバー表面、及び／又は内側回路材料表面）を含み得る。幾つかの実施形態では、コーティング材料は、結合基とアルキル部分とを有する分子を含む。結合基は、内側基板表面に共有結合で結合され得、且つ例えばシロキシ結合基であり得る。アルキル部分は、例えば、非置換アルキル部分又は置換アルキル部分、例えばフルオロアルキル部分又はペルフロウロアルキル部分であり得る。アルキル部分は、少なくとも１０個の炭素原子（例えば、少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２個又はそれを超える炭素原子）を含む炭素直鎖を含み得る。コーティング材料の分子は、内側基板表面（及び／又は内側カバー表面、及び／又は内側回路材料表面）に共有結合で結合された密充填単層構造を形成し得る。
【００３３】
幾つかの実施形態では、コーティング材料は、結合基とカチオン部分及び／又はアニオン部分とを有する分子を含み、結合基は、内側基板表面（及び／又は内側カバー表面、及び／又は内側回路材料表面）に共有結合で結合される。カチオン部分は、第４級アンモニウム基を含み得る。アニオン部分は、ホスホン酸、カルボン酸又はスルホン酸を含み得る。幾つかの関連する実施形態では、コーティング材料は、結合基と双性イオン部分とを有する分子を含み得、結合基は、内側基板表面（及び／又は内側カバー表面及び／又は内側回路材料表面）に共有結合で結合される。双性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸及びアミノ酸から選択される。幾つかの実施形態では、カチオン部分、アニオン部分又は双性イオン部分は、ブロック剤とイオン結合可能である。
【００３４】
幾つかの実施形態では、コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、糖部分又はアミノ酸部分を含むポリマーを含む。例えば、コーティング材料は、デキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。代替的又は追加的に、コーティング材料は、タンパク質ポリマー（例えば、Ｔ細胞活性化を促進するタンパク質）を含み得る。
【００３５】
また、本明細書に開示される方法に従って生成されたＴリンパ球も提供される。また、本明細書に開示される方法に従って、例えば、マイクロ流体デバイスの１つ以上の隔離ペン内で生成された１個以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれを超えるＴリンパ球を含むマイクロ流体デバイスも提供される。また、本明細書に開示される方法に従って生成されたＴリンパ球と、任意選択的に薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
【００３６】
追加的な目的及び利点は、部分的に以下の説明に示され且つ部分的にその説明から明らかになり、又は実施することで分かり得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指定された要素及び組合せによって実現及び達成されるであろう。
【００３７】
以上の概要及び以下の詳細な説明の両方は、例示的且つ解説的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定しないことを理解すべきである。
【００３８】
本明細書に組み込まれ且つその一部を構成する添付の図面は、１つ（幾つか）の実施形態を例示し、本記載内容と合わせて本明細書に記載の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器で用いられるシステムの例を例示する。
【図１Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。
【図１Ｃ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。
【図２Ａ】本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを例示する。
【図２Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを例示する。
【図２Ｃ】本開示の幾つかの実施形態による詳細な隔離ペンを例示する。
【図２Ｄ】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。
【図２Ｅ】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。
【図２Ｆ】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。
【図２Ｇ】本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。
【図２Ｈ】本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスのコーティング表面を例示する。
【図３Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器で用いられるシステムの例を例示する。
【図３Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による撮像デバイスを例示する。
【図４】抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｔ細胞活性化ビーズと共に培養したヒトＴリンパ球を含有するナノ流体チップ内の単一ナノウェルの一連のタイムラプス画像を提供する。画像は、０、２４、４８、７２及び９６時間の培養におけるナノウェルを示す。
【図５Ａ】同種異系樹状細胞（ＤＣ）と共に培養したヒトＴリンパ球を含有するナノ流体チップ内の単一ナノウェルの一連のタイムラプス画像を提供する。画像は、０、２４、４８、７２及び９６時間の培養におけるナノウェルを示す。
【図５Ｂ】破傷風毒素及びエプスタインバーウイルス抗原でパルスされた樹状細胞（ＤＣ）と共に培養されたヒトＴリンパ球を含有するナノ流体チップ内の単一ナノウェルの一連のタイムラプス画像を提供する。画像は、０、２４、４８、７２、９６及び１１０時間の培養におけるナノウェルを示す。
【図６Ａ】図６Ａのナノウェル内のＴ細胞へのＥｄＵ（蛍光シグナル）の取込みを示す画像を提供する。ＥｄＵ取込みは、９６時間培養時点で示されており（赤）、選択的に増殖されたＴ細胞の明視野画像にオーバーレイされている。
【図６Ｂ】図６Ｂのナノウェル内のＴ細胞へのＥｄＵ（蛍光シグナル）の取込みを示す画像を提供する。ＥｄＵ取込みは、１１０時間培養時点で示されており（赤）、選択的に増殖されたＴ細胞の明視野画像にオーバーレイされている。
【図７Ａ】少なくとも１つの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスでＴ細胞を培養する実施形態の写真図である。
【図７Ｂ】少なくとも１つの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスでＴ細胞を培養する実施形態の写真図である。
【図８Ａ】サンプルからＴリンパ球を得、それをマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することにより、閉じ込められた細胞を提供する例示的なワークフローを例示する。
【図８Ｂ】図８Ａに例示されるワークフローに従って閉じ込められたＴリンパ球等の閉じ込められたＴリンパ球を増殖させる例示的なワークフローを例示する。
【図８Ｃ】図８Ｂに例示されるワークフローに従って増殖されたＴリンパ球等の増殖されたＴリンパ球を搬出する例示的なワークフローを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
実施形態の詳細な説明
本明細書には、本開示の例示的な実施形態及び適用が記載されている。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用、例示的な実施形態及び適用を行う方式、又はそれについて本明細書に記載される方式に限定されない。さらに、図は、簡略図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、誇張されるか又は他に比例していないことがあり得る。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」という用語又は類似語が本明細書で使用される場合、一方の要素が直接他方の要素上にあるか、それに付着されるか、それに接続されるか、若しくはそれに結合されるか、又は一方の要素と他方の要素との間に１つ以上の介在要素があるかにかかわらず、一方の要素（例えば、材料、層、基板等）は、他方の要素「上」にあるか、それに「付着される」か、それに「接続される」か、又はそれに「結合される」。また、文脈上特に規定されない限り、方向（例えば、上、下、頂、底、側、上向き、下向き、下方、上方、上側、下側、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供された場合、相対的なものであり、単なる例として説明及び考察が容易になるように提供され、限定を目的としたものではない。加えて、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、かかる参照は、列挙された要素のいずれか１つのみ、列挙された要素の全てに満たない任意の組合せ、及び／又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的とし、考察される要素のいずれの組合せにも限定されない。
【００４１】
マイクロ流体フィーチャの寸法が幅又は面積を有するものとして記載されている場合、寸法は、典型的には、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行な平面内にいずれも位置するｘ軸方向及び／又はｙ軸方向の寸法に対して記載されている。マイクロ流体フィーチャの高さは、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行な平面に垂直なｚ軸方向に対して記載されている。幾つかの場合、チャネル又は通路等のマイクロ流体フィーチャの断面積は、ｘ軸方向／ｚ軸方向、ｙ軸方向／ｚ軸方向、又はｘ軸方向／ｙ軸方向の面積に対するものである。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図された目的で機能するのに十分であることを意味する。そのため、「実質的に」という用語は、当業者によって予想されるような、ただし全体性能にそれほど影響を及ぼさない、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からのわずかな有意でない変動を許容する。数値又は数値として表現され得るパラメータ若しくは特性に対して用いられる場合、「実質的に」は、１０パーセント以内を意味する。
【００４３】
「１つ」という用語は、２つ以上を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超え得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内において「位置する」を包含する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成された１つ以上の離散マイクロ流体回路（各マイクロ流体回路は、限定されるものではないが、領域、流路、チャネル、チャンバ及び／又はペンをはじめとする流体相互接続回路要素を含む）と、マイクロ流体デバイスに対して流体（及び任意選択的に流体中に懸濁された微小物体）の流入及び／又は流出を可能にするように構成された少なくとも１つのポートとを含むデバイスである。典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルと少なくとも１つチャンバとを含み、約１ｍＬ未満、例えば約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満又は約２μＬ未満の体積の流体を保持するであろう。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１〜２μＬ、約１〜３μＬ、約１〜４μＬ、約１〜５μＬ、約２〜５μＬ、約２〜８μＬ、約２〜１０μＬ、約２〜１２μＬ、約２〜１５μＬ、約２〜２０μＬ、約５〜２０μＬ、約５〜３０μＬ、約５〜４０μＬ、約５〜５０μＬ、約１０〜５０μＬ、約１０〜７５μＬ、約１０〜１００μＬ、約２０〜１００μＬ、約２０〜１５０μＬ、約２０〜２００μＬ、約５０〜２００μＬ、約５０〜２５０μＬ又は約５０〜３００μＬを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第１のポート（例えば、流入口）に流体接続された第１の端と、マイクロ流体デバイスの第２のポート（例えば、流流出口）に流体接続された第２の端とを有するように構成され得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１μＬ未満、例えば約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ以下の体積の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路要素を含有するマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個又はそれを超える）を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００ｐＬから１ｎＬ、約１００ｐＬから２ｎＬ、約１００ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから２ｎＬ、約２５０ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから５ｎＬ、約５００ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから１０ｎＬ、約７５０ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから２０ｎＬ、約１から１０ｎＬ、約１から１５ｎＬ、約１から２０ｎＬ、約１から２５ｎＬ又は約１から５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約２０ｎＬから２００ｎＬ、約１００から２００ｎＬ、約１００から３００ｎＬ、約１００から４００ｎＬ、約１００から５００ｎＬ、約２００から３００ｎＬ、約２００から４００ｎＬ、約２００から５００ｎＬ、約２００から６００ｎＬ、約２００から７００ｎＬ、約２５０から４００ｎＬ、約２５０から５００ｎＬ、約２５０から６００ｎＬ又は約２５０から７５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。
【００４８】
本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、水平寸法及び垂直寸法の両寸法よりも有意に長い長さを有するマイクロ流体デバイスの流路を意味する。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えばその長さの少なくとも１０倍、その長さの少なくとも２５倍、その長さの少なくとも１００倍、その長さの少なくとも２００倍、その長さの少なくとも５００倍、その長さの少なくとも１，０００倍、その長さの少なくとも５，０００倍であり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、介在する任意の範囲を含めて約１００，０００ミクロンから約５００，０００ミクロンの範囲内である。幾つかの実施形態では、水平寸法は、約１００ミクロンから約１０００ミクロン（例えば、約１５０から約５００ミクロン）の範囲内であり、及び垂直寸法は、約２５ミクロンから約２００ミクロン、例えば約４０から約１５０ミクロンの範囲内である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多様な空間構成を有し得るため、完全に線状の要素に制限されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、以下の構成：カーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク（例えば、複数の異なる流路）及びそれらの任意の組合せを有する１つ以上のセクションであり得るか又はそれらを含み得る。加えて、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅及び狭窄を有し得る。フローチャネルは、バルブを含み得、バルブは、マイクロフルイディクス技術分野で公知の任意のタイプであり得る。バルブを含むマイクロ流体チャネルの例は、米国特許第６，４０８，８７８号及び同第９，２２７，２００号（それぞれその全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの２つの異なる領域間又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分な大きさのバンプ又は類似のタイプの構造物を意味する。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの回路要素（又は２つの回路要素間のインターフェース）の幅の狭小化を意味する。狭窄は、例えば、本開示のマイクロ流体隔離ペンの分離領域と接続領域との間のインターフェースに位置し得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、光が通過する際に光を実質的に変化させることなく可視光を透過させる材料を意味する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本開示に従って分離及び／又は操作され得る任意の微視的物体を意味する。限定されるものではないが、微小物体の例としては、無生物微小物体、例えばマイクロ粒子、マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）、磁気ビーズ、マイクロロッド、マイクロワイヤ、量子ドット等、生物学的微小物体、例えば細胞、生物オルガネラ、ベシクル又は複合体、合成ベシクル、リポソーム（例えば、合成又は膜調製物由来）、脂質ナノラフト等、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞付着マイクロビーズ、リポソームコーティングマイクロビーズ、リポソームコーティング磁気ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、共有結合又は非共有結合で結合された部分／分子、例えば蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、低分子シグナリング部分又はアッセイで使用可能な他の化学的／生物学的種を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al.(2009) “Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,” Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、「生体細胞」という用語と同義的に使用される。限定されるものではないが、生体細胞の例としては、真核細胞、植物細胞、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、爬虫動物細胞、トリ細胞、サカナ細胞等、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞等、組織、例えば筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経の組織等から解離させた細胞、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等、胚（例えば、接合体）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞系細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又はトランスフォーム細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長動物等に由来し得る。
【００５４】
コロニー中の複製可能な生細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞である場合、生体細胞のコロニーは、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、１０回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、１４回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、１７回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、２０回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。「クローン細胞」という用語は、同一のクローンコロニーの細胞を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２細胞以上（例えば、約２から約２０、約４から約４０、約６から約６０、約８から約８０、約１０から約１００、約２０から約２００、約４０から約４００、約６０から約６００、約８０から約８００、約１００から約１０００細胞又は１０００細胞超）を意味する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞の生存及び／又は増殖を続けるのに必要な条件を提供する、流体及び気体の両方の成分と任意選択的に表面とを含む環境を提供することを意味する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、細胞を参照するときの「増殖させる」という用語は、細胞数が増加することを意味する。
【００５８】
流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、低分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物等をはじめとする培地中に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、微小物体に対する認識部位を提供する化学的若しくは生物学的種、官能基又はモチーフである。所定のクラスの微小物体は、インサイチューで生成された捕捉部分を認識し得、インサイチューで生成された捕捉部分に結合し得るか又はそれに対して親和性を有し得る。限定されるものではないが、例としては、抗原、抗体及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「流動性ポリマー」は、流体培地（例えば、プレポリマー溶液）に溶解可能又は分散可能なポリマーモノマー又はマクロマーである。流動性ポリマーは、マイクロ流体流路に進入し得、その中の流体培地の他の成分と共に流動し得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「光開始ポリマー」は、光に暴露されると、共有結合による架橋、特異的共有結合の形成、剛性化化学モチーフの周りの位置化学の変化又は物理的状態の変化を引き起こすイオン対の形成が可能であり、それによりポリマーネットワークを形成するポリマー（又はポリマーを生成するために使用され得るモノマー分子）を意味する。幾つかの場合、光開始ポリマーは、共有結合による架橋、特異的共有結合の形成、剛性化化学モチーフの周りの位置化学の変化又は物理的状態の変化を引き起こすイオン対の形成が可能な１つ以上の化学部分に結合されたポリマーセグメントを含み得る。幾つかの場合、光開始ポリマーは、ポリマーネットワークの形成を開始（例えば、ポリマーの重合により）するために光活性ラジカル開始剤を必要とし得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を意味し、これは、霊長動物化（例えば、ヒト化）、ネズミ、マウス−ヒト、マウス−霊長動物、並びにキメラのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含み、且つインタクト分子、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ファブ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメント）、或いはインタクト分子及び／又はフラグメントのマルチマー若しくはアグリゲートであり得、天然に存在し得るか、又は免疫化、合成、遺伝子工学等によって生成され得る。「抗体フラグメント」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、且つ幾つかの実施形態ではガラクトース残基の導入等によってクリアランス及び取込みを促進する構造特徴部を呈するように誘導体化され得る、抗体に由来する又は関連するフラグメントを意味する。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及びそれらの組合せを含む。
【００６３】
流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」又は「拡散」は、流体培地の成分が濃度勾配の下方に熱力学的に移動することを意味する。
【００６４】
「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、点間の圧力差に起因する一方の点から他方の点への流体培地の移動を含み得る。かかるフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期フロー、ランダムフロー、間欠フロー若しくは往復フロー又はそれらの任意の組合せを含み得る。一方の流体培地が他方の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合を生じ得る。
【００６５】
「実質的にフローなし」という語句は、時間平均で流体培地中への又は流体培地中での材料の成分（例えば、対象のアナライト）の拡散速度未満の流体培地の流速を意味する。かかる材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に依存し得る。
【００６６】
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填されたときに各領域内の流体が単一体の流体を形成するように接続されることを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも同一の組成であることを意味するものではない。より正確には、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、溶質がそのそれぞれの濃度勾配の下方に移動するとき及び／又はマイクロ流体デバイスを貫流するときに流束内で異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、他の分子等の溶質の濃度が異なる）を有し得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「流路」又は「フロー領域」は、培地のフローのトラジェクトリーを規定し且つその対象となる１つ以上の流体接続回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を意味する。そのため、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路の培地のフローの対象とならない流路を含む回路要素に流体接続され得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「微小物体を分離する」は、マイクロ流体デバイス内の画定領域に微小物体を閉じ込めることである。微小物体は、インサイチューで生成された捕捉構造内で依然として運動が可能であり得る。
【００６９】
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域と「非掃引」領域とを含み得る。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに培地のフローにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全部又は一部を含み得る。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに実質的に流体のフラックスなしにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。拡散を可能とするが、掃引領域と非掃引領域との間で培地が実質的にフローなしとなるように流体接続が構造化される限り、非掃引領域は、掃引領域に流体接続され得る。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ、掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化され得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下にさらに詳細に記載される）は、非掃引領域の例である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「富化する」は、組成物又は集団で対象の細胞型等の成分の濃度を他の細胞型等の他の成分と比べて増加させることを意味する。富化は、組成物又は集団で他の成分（例えば、他の細胞型）の濃度を低減させた結果であり得る。例えば、本明細書で使用される場合、サンプル中のＴリンパ球の特定のサブ集団を「富化する」は、サンプル中の全細胞数と比べてサブ集団の割合を増加させることを意味する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「枯渇させる」は、組成物又は集団で望ましくない細胞型等の成分の濃度を１つ以上の所望の細胞型等の他の成分と比べて減少させることを意味する。枯渇は、１つ以上の他の成分の濃度を増加させた結果であり得る。例えば、本明細書で使用される場合、Ｔリンパ球の特定のサブ集団をサンプルから「枯渇させる」は、サンプル中の全細胞数と比べてサブ集団の割合を減少させることを意味する。
【００７２】
特定の生体物質（例えば、抗体等のタンパク質）を産生する生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の能力は、かかるマイクロ流体デバイスでアッセイされ得る。アッセイの具体的な実施形態では、対象のアナライトを産生するためにアッセイされる生物学的微小物体（例えば、細胞）を含むサンプル材料は、マイクロ流体デバイスの掃引領域に装填され得る。生物学的微小物体（例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞）のうち、特定の特徴のものを選択して非掃引領域に配置することができる。次いで、残留サンプル材料を掃引領域から流出させ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることができる。選択された生物学的微小物体は、非掃引領域内にあるため、選択された生物学的微小物体は、残留サンプル材料の流出又はアッセイ材料の流入の影響を実質的に受けない。選択された生物学的微小物体は、対象のアナライトの産生を可能にし得る。この場合、対象のアナライトは、非掃引領域から掃引領域内に拡散し得、掃引領域では、対象のアナライトは、アッセイ材料と反応して、局在化された検出可能な反応を引き起こすことができ、各反応は、特定の非掃引領域に関連付けられ得る。検出された反応に関連付けられる任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域内のいずれの生物学的微小物体（存在する場合）が対象のアナライトの十分なプロデューサーであるかを決定することができる。
【００７３】
マイクロ流体／ナノ流体デバイスにおけるＴリンパ球の培養、選択及び増殖。
Ｔリンパ球は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス及びナノ流体デバイスにおいて培養、選択及び増殖され得る。この節での考察に加えて、培養、選択及び増殖の方法は、発明の概要（以上）、実施例（以下）及び本明細書に添付された特許請求の範囲に記載されている。例示的なワークフローは、図８Ａ〜Ｃに例示される。本開示のマイクロ流体デバイス内でＴ細胞をはじめとする生体細胞を増殖させる方法は、２０１６年４月２２日出願の米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号（その全内容が参照により本明細書に援用される）にも記載されている。
【００７４】
Ｔリンパ球の集団は、公知の方法によって得ることができる。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が全血サンプル等の血液サンプルから分離される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、細針吸引物又は生検物等の固形腫瘍サンプルから分離される。分離されたＴリンパ球の集団は、所望の細胞型を富化され得るか又は望ましくない細胞型を枯渇され得る。富化及び枯渇は、例えば、フローサイトメトリー、Ｔ細胞富化カラム、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、磁気ビーズ）等を用いて行われ得、所望の細胞を集団から分離すること又は望ましくない細胞を集団から除去すること等のポジティブ選択又はネガティブ選択をそれぞれ使用し得る。例えば、ＣＤ４５ＲＯに対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、集団からＣＤ４５ＲＯ＋細胞を枯渇させることができる。他の例として、ＣＤ４５ＲＡに対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、集団からＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させることができる。
【００７５】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球が富化される。幾つかの実施形態では、１個以上のＴリンパ球は、末梢血サンプル又は固形腫瘍サンプルから分離されたＣＤ３＋Ｔリンパ球の集団に由来する。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞）が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の両方が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＣＲ７＋細胞、例えばＣＤ３＋ＣＣＲ７＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＣＲ７＋細胞又はＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＣＲ７＋細胞が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞又はＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞が富化される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞又はＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞が富化される。
【００７６】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞又はＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞が枯渇される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞又はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞が枯渇される。
【００７７】
マイクロ流体デバイス内のＴリンパ球はまた、以上で考察した富化又は枯渇の代わりに又はそれに加えて、所望の又は望ましくないマーカーの存在又は不在に基づいて選択され得る。マイクロ流体チャネルに位置するＴリンパ球を隔離ペン内に移動させるために誘電泳動を使用することができる。例えば、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はそれらの任意の組合せ（例えば、ＣＤ３＋ＣＤ４＋又はＣＤ３＋ＣＤ８＋）であるために選択され得る。選択は、抗体（例えば、蛍光抗体）で標識することと、抗体を伴うＴリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含み得る。
【００７８】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋及び／若しくはＣＤ６２Ｌ＋又はそれらの全部であるために選択され得る。ＣＤ４５ＲＡ＋は、ナイーブＴリンパ球（Ｔｎａｉｖｅ細胞）のマーカーとみなされ、一方、ＣＣＲ７＋及びＣＤ６２Ｌ＋は、Ｔｎａｉｖｅ状態（ＣＤ４５ＲＡ＋も存在するかどうかに依存する）に合致するマーカーとみなされる。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、Ｔｎａｉｖｅ状態に合致しない少なくとも１つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＰＤ−１＋、ＰＤ−Ｌ１＋、ＣＤ１３７＋若しくはＣＤ６９＋の細胞表面又はそれらの任意の組合せを欠いているＴリンパ球を選択することができる。幾つかの実施形態では、ＣＤ４＋細胞表面を有するＴリンパ球も選択される。幾つかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞表面を有するＴリンパ球も選択される。
【００７９】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋及び／若しくはＣＤ６２Ｌ＋又はそれらの全部であるために選択され得る。ＣＤ４５ＲＯ＋マーカーとＣＣＲ７＋及び／又はＣＤ６２Ｌ＋マーカーとの組合せは、メモリＴリンパ球（例えば、ＴＣＭ細胞）に合致するとみなされる。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、メモリＴリンパ球状態に合致しない少なくとも１つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＰＤ−１＋、ＰＤ−Ｌ１＋、ＣＤ１３７＋若しくはＣＤ６９＋の細胞表面又はそれらの任意の組合せを欠いているＴリンパ球を選択することができる。幾つかの実施形態では、ＣＤ４＋細胞表面を有するＴリンパ球も選択される。幾つかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞表面を有するＴリンパ球も選択される。
【００８０】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面がＣＤ４５ＲＯ＋、ＰＤ−１＋及び／若しくはＰＤ−Ｌ１＋、ＣＤ１３７＋又はそれらの組合せであるために選択され得る。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＣＤ１３７マーカーと組み合わされたＣＤ４５ＲＯの存在は、エフェクタＴリンパ球（ＴＥＦＦ細胞）に合致するとみなされる。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、ＴＥＦＦ状態に合致しない少なくとも１つのマーカーを欠いているために選択され得る。例えば、Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ又はそれらの任意の組合せに対する抗体で標識され得、及びＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ又はそれらの組合せに対する抗体を伴わないＴリンパ球を（例えば、マイクロ流体チャネルから）マイクロ流体デバイスの隔離ペンに（例えば、誘電泳動を用いて）移動させることができる。
【００８１】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、Ｔｎａｉｖｅに合致しない少なくとも１つ、少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーを欠いているために選択され得る。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、メモリＴリンパ球（例えば、ＴＣＭ又はＴＥＭ）状態に合致しない少なくとも１つ、少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーを欠いているために選択され得る。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、少なくとも部分的には、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置するために、細胞表面が、ＴＥＦＦ状態に合致しない少なくとも１つ、少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーを欠いているために選択され得る。
【００８２】
したがって、本明細書に開示される方法は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は全て、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ−であるＴリンパ球を隔離ペンにさせることを含み得る。上記のタイプのＴリンパ球はいずれも、さらに、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋及び／又はＣＤ６９−ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−の少なくとも１つ、２つ、３つ若しくは全て、例えばＣＤ６９−ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１−、ＣＤ６９−ＰＤ−１−ＣＤ１３７−、ＣＤ６９−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−、ＣＤ６９−ＰＤ−１−、ＣＤ６９−ＰＤ−Ｌ１−、ＣＤ６９−ＣＤ１３７−、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１−、ＰＤ−１−ＣＤ１３７−、ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−、ＣＤ６９−、ＰＤ−１−、ＰＤ−Ｌ１−若しくはＣＤ１３７−であり得る。
【００８３】
本明細書に開示される方法は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は全て、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋であるＴリンパ球を隔離ペン内に移動させることを含み得る。上記のタイプのＴリンパ球はいずれも、さらに、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋及び／又はＣＤ６９−ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−の少なくとも１つ、２つ、３つ若しくは全て、例えばＣＤ６９−ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１−、ＣＤ６９−ＰＤ−１−ＣＤ１３７−、ＣＤ６９−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−、ＣＤ６９−ＰＤ−１−、ＣＤ６９−ＰＤ−Ｌ１−、ＣＤ６９−ＣＤ１３７−、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１−、ＰＤ−１−ＣＤ１３７−、ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７−、ＣＤ６９−、ＰＤ−１−、ＰＤ−Ｌ１−若しくはＣＤ１３７−であり得る。
【００８４】
本明細書に開示される方法は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は全て、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１３７＋、ＣＤ３＋ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＰＤ−１＋ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ−１＋、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１３７＋、ＣＤ１３７＋ＣＤ４５ＲＯ＋又はＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＯ＋であるＴリンパ球を隔離ペン内に移動させることを含み得る。上記のタイプのＴリンパ球はいずれも、さらに、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋及び／又はＣＤ６９＋ＰＤ−Ｌ１＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−の少なくとも１つ、２つ、３つ若しくは全て、例えばＣＤ６９＋ＰＤ−Ｌ１＋ＣＣＲ７−、ＣＤ６９＋ＰＤ−Ｌ１＋ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６９＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、ＰＤ−Ｌ１＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６９＋ＰＤ−Ｌ１＋、ＣＤ６９＋ＣＣＲ７−、ＰＤ−Ｌ１＋ＣＣＲ７−、ＣＤ６９＋ＣＤ６２Ｌ−、ＰＤ−Ｌ１＋ＣＤ６２Ｌ−、ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６９＋、ＰＤ−Ｌ１＋、ＣＣＲ７−又はＣＤ６２Ｌ−であり得る。
【００８５】
本明細書に開示される方法は、例えば、誘電泳動により、重力により（例えば、重力によって１個以上のＴリンパ球が隔離ペンに引き込まれるようにマイクロ流体デバイスを傾斜させることにより）、遠心力により、又は局在化フローにより、Ｔリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することを含み得る。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本方法は、１個以上のＴリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む。かかる接触は、例えば、Ｔリンパ球をマイクロ流体デバイスに導入する前に、例えばデバイスへの導入の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０時間前に又は０．５から２、２から４、４から６、６から８又は８から１０時間の期間わたって行われ得る。活性化剤は、Ｔリンパ球と共に隔離ペンに導入され得る。代替的又は追加的に、接触（例えば、活性化剤の添加）は、Ｔリンパ球が隔離ペン内にあるときに行われ得る。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又はアゴニストがリンパ球との接触に使用される。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２８抗体又はアゴニストは、例えば、抗ＣＤ３抗体又はアゴニストと組み合わせてリンパ球との接触に使用される。活性化剤は、溶解可能な形態で提供され得るか、又はビーズに付着され得る。例えば、抗ＣＤ３抗体又はアゴニストが付着されたビーズは、可溶性抗ＣＤ２８抗体又はアゴニストと組み合わせて使用され得る。代替的に、抗ＣＤ３抗体又はアゴニスト及び抗ＣＤ２８抗体又はアゴニストは、両方ともビーズに付着して使用され得る（例えば、両方の抗体を同一のビーズに付着させるか、又は幾つかのビーズを抗ＣＤ３抗体に付着可させ、且つ他のビーズを抗ＣＤ２８抗体に付着させることができる）。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの活性化剤（例えば、抗体）、例えば抗ＣＤ３抗体は、Ｔリンパ球がペン内にあるときに刺激が行われるように隔離ペンの表面に付着される。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の両方は、隔離ペンの表面に付着される。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、隔離ペンの表面に付着され、及び少なくとも１つのＴリンパ球は、隔離ペン内にあるときに可溶性抗ＣＤ２８抗体にも接触される。典型的には、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、活性化剤として使用する場合、アゴニスト抗体であろう。
【００８７】
幾つかの実施形態では、活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたＴリンパ球は、少なくとも１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍又はそれを超える増殖を呈する。
【００８８】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、樹状細胞、例えば自己樹状細胞で刺激される。幾つかの実施形態では、樹状細胞は、１つ以上の抗原、例えば癌由来ペプチド、例えばＴリンパ球と同系の癌細胞から分離された抗原又はペプチドで装填（例えば、パルス）される。例えば、以下の実施例３を参照されたい。樹状細胞はまた、Ｔリンパ球と同系であり得る。代替的に、樹状細胞は、合成抗原で装填（例えば、パルス）され得る。
【００８９】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＭＨＣ分子に結合されてペプチド−ＭＨＣ複合体を形成し得る抗原で刺激される。ペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＭＨＣテトラマー構造のように一体に連結され得る。抗原（又は抗原複合体）は、固体担体、例えば１個以上のビーズに付着され得る。代替的に、固体担体は、隔離ペンの少なくとも１つの表面であり得、抗原は、共有結合又は非共有結合で少なくとも１つの表面に結合され得る（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合相互作用により）。
【００９０】
幾つかの実施形態では、培養培地は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルを通してかん流される。かん流は、例えば、様々なかん流速度における２相又は３相を含むサイクルで間欠的であり得る。幾つかの実施形態では、かん流は、約０．００２〜０．１μｌ／ｓｅｃのかん流速度の第１の相と、約０．５〜１０μｌ／ｓｅｃのかん流の第２の相との１サイクル以上を含む。サイクルは、例えば、かん流が約０．０１μｌ／ｓｅｃ未満の速度であり、例えば、実質的に停止される第３の相をさらに含み得る。より高いかん流速度の相の長さは、例えば、約１〜１０分間、例えば１〜２分間であり得る。より低いかん流速度の相の長さは、例えば、約０．５分間から約３時間、例えば約１分間から約２時間であり得る。存在する場合、かん流が約０．０１μｌ／ｓｅｃ未満の速度である相の長さは、例えば、約２〜３０若しくは２〜２０分間又は約５〜１０分間であり得る。培養培地は、少なくとも２４、４８、７２、９６、１２０時間若しくはそれを超える時間の期間、又は０．５から１０日間、例えば０．５から１、１から２、２から３、３から４、４から５、５から７、６から８、７から９若しくは８から１０日間の時間長さにわたってマイクロ流体デバイスの流路を通してかん流され得る。
【００９１】
幾つかの実施形態では、培養培地は、サイトカイン、例えばＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１又はそれらの組合せ、例えばＩＬ１５及びＩＬ２１が追加される。幾つかの実施形態では、培養培地は、ＩＬ２を含む。かん流（培地が隔離ペンに導入されるアクティブかん流に続くインキュベーションの時間を含み得る）は、例えば、少なくとも１、２、３ラウンド又はそれを超える有糸細胞分裂で１個以上のＴリンパ球の増殖を行うのに十分な時間の期間であり得る。幾つかの実施形態では、培養培地は、ＦＢＳ又は仔ウシ血清と任意選択的に組み合わせたヒトＡＢ血清等の血清を含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、２０個以下、１０個以下、６〜１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球がマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入される。幾つかの実施形態では、２０個以下、１０個以下、６〜１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球がマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンに導入される。
【００９３】
隔離ペンは、ペン内のＴリンパ球が硬質表面に直接接触しないように例えばコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、ペン表面は、デキストラン又はポリエチレングリコールでコーティングされる。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約５×１０５から約５×１０６立方ミクロンの体積を有する。
【００９４】
幾つかの実施形態では、１個以上のＴリンパ球の増殖速度が監視される。例えば、これは、所与の隔離ペン内の細胞分裂の頻度を観測することにより、例えばペン内の細胞数を周期的に観測することにより、かん流中に行われ得る。
【００９５】
幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球による１種以上のサイトカイン（例えば、ＩＮＦγ、ＴＮＦα、ＩＬ２又はそれらの組合せ）の発現が監視される。幾つかの実施形態では、１種以上の調節性Ｔ細胞マーカー、例えばＣＴＬＡ４の発現が監視される。
【００９６】
以上に記載の監視は、例えば、隔離ペン内のＴリンパ球の増殖後に行われ得る。例えば、増殖されたＴリンパ球のサンプルは、オンチップ発現アッセイを用いて調節性Ｔ細胞マーカー及び／又はサイトカインの発現に関して特徴付けられ得、これについては、例えば米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号及び同第２０１５／０１６５４３６号並びに米国特許出願公開第１５／３７２，０９４号（２０１６年１２月７日出願）（そのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００９７】
幾つかの実施形態では、増殖後、Ｔリンパ球は、マイクロ流体デバイスから搬出される。幾つかの実施形態では、増殖されたＴリンパ球のサンプルは、ゲノムプロファイリング、例えばゲノムシーケンス解析及び／又は発現解析（例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ）のためにマイクロ流体デバイスから搬出される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ゲノムプロファイリング結果、例えば機能喪失突然変異の不在、サイトカイン発現等に基づいて、癌治療等の下流使用のために選択される。幾つかの実施形態では、Ｔリンパ球は、所定の閾値以上の増殖速度を有すること、例えば少なくとも閾値レベルの増殖を示したこと、例えば約１週間以下の期間にわたって少なくとも１００倍の増殖を起こしたことに少なくとも部分的に基づいて選択的に搬出される。選択的搬出は、代替的又は追加的に、１種以上のサイトカイン、例えばＩＮＦγ、ＴＮＦα、ＩＬ２又はそれらの組合せの発現に少なくとも部分的に基づき得る。選択的搬出は、代替的又は追加的に、１種以上の調節性Ｔ細胞マーカー、例えばＣＴＬＡ４等の発現に少なくとも部分的に基づき得る。
【００９８】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスから搬出されたＴリンパ球は、例えば、それをＴリンパ球が得られた対象等の対象に導入することにより、癌を治療するために使用される。対象は、哺乳動物、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
【００９９】
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを操作し観測するシステム
図１Ａは、Ｔリンパ球の選択、活性化、拡大、及び／又はクローニングに使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示す。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路１０６に流体接続する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路１０６と流通する１つのみの開口部を有し得る。さらに以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
【０１００】
図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
【０１０１】
図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
【０１０２】
支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）をさらに含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
【０１０３】
マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、流路（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
【０１０４】
マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料  −  したがって、マイクロ流体回路材料１１６  −  は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
【０１０５】
カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極をさらに含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
【０１０７】
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１Ａに示されていない）を含む。
【０１０８】
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器をさらに含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）をさらに含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【０１０９】
システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）をさらに含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
【０１１０】
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
【０１１１】
幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。さらに、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。さらに他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
【０１１２】
システム１５０は培地源１７８をさらに含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
【０１１３】
図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２をさらに含むことができる。
【０１１４】
マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
【０１１５】
培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
【０１１６】
原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
【０１１７】
撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度をさらに計算することができる。
【０１１８】
傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
【０１１９】
図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、重力、及び／又は遠心力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
【０１２０】
マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、生物学的微小物体を維持、単離、アッセイ、刺激（例えば、活性化）又は培養するために有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
【０１２１】
図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７をさらに含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
【０１２２】
幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２をさらに含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
【０１２４】
トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
【０１２６】
他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。さらに他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
【０１２８】
図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ〜図２Ｈは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスのさらに別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
【０１２９】
生物学的微小物体を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスをさらに記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
【０１３０】
原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
【０１３１】
ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、流路、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。さらに、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることをさらに理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
【０１３２】
図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
【０１３３】
特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、流路１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
【０１３４】
電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
【０１３５】
図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１３７】
他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
【０１３８】
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ｏｈｔａら）（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、及び米国特許出願公開第２０１６／０１８４８２１号明細書（Ｈｏｂｂｓら）（例えば、図面にわたって描かれているｄｅｖｉｃｅｓ  ２００，  ５０２，  ５０４，  ６００，  及び７００、及びその記述を参照されたい）に記載されており、それぞれの内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１３９】
ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。さらに、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
【０１４０】
ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
【０１４１】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１４２】
更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
【０１４３】
誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）を有する。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。さらに、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
【０１４７】
したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
【０１４８】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１４９】
マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
【０１５０】
隔離ペン。
一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ〜図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
【０１５１】
図２Ａ〜図２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する、隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれ流路）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、流路）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又は流路）及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００にも当てはまる。
【０１５２】
したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ〜図２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
【０１５３】
図２Ｃは、本開示による隔離ペン２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
【０１５４】
既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
【０１５５】
さらに、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離ペン２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄの隔離ペン２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
【０１５６】
マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域と流路との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。さらに、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
【０１５７】
マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
【０１５９】
図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
【０１６０】
図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。さらに、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。さらに、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
【０１６１】
図２Ｄ〜図２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ〜図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離ペン２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００での上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
【０１６２】
図２Ｄ〜図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離ペン２６６が流体接続される。
【０１６３】
各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
【０１６４】
図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
【０１６５】
図２Ｅに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む：約３０°〜約９０°、約４５°〜約９０°、約６０°〜約９０°等。
【０１６６】
隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも２×１０５立方μｍ、少なくとも４×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
【０１６７】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：約５０〜１０００μｍ、約５０〜５００μｍ、約５０〜４００μｍ、約５０〜３００μｍ、約５０〜２５０μｍ、約５０〜２００μｍ、約５０〜１５０μｍ、約５０〜１００μｍ、約７０〜５００μｍ、約７０〜４００μｍ、約７０〜３００μｍ、約７０〜２５０μｍ、約７０〜２００μｍ、約７０〜１５０μｍ、約９０〜４００μｍ、９０〜３００μｍ、約９０〜２５０μｍ、約９０〜２００μｍ、約９０〜１５０μｍ、約１００〜３００μｍ、約１００〜２５０μｍ、約１００〜２００μｍ、約１００〜１５０μｍ、及び約１００〜１２０μｍ。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００〜８００μｍ、約２００〜７００μｍ、又は約２００〜６００μｍの範囲であり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。さらに、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０〜約２００μｍ又は約５０〜約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０４〜約３×１０６平方μｍ、約２×１０４〜約２×１０６平方μｍ、約４×１０４〜約１×１０６平方μｍ、約２×１０４〜約５×１０５平方μｍ、約２×１０４〜約１×１０５平方μｍ、又は約２×１０５〜約２×１０６平方μｍの断面積を有する。
【０１６９】
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜１００μｍ、２０〜９０μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜７０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜９０μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜７０μｍ、３０〜６０μｍ、３０〜５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜９０μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜７０μｍ、４０〜６０μｍ、又は４０〜５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
【０１７０】
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００〜５０，０００平方μｍ、５００〜４０，０００平方μｍ、５００〜３０，０００平方μｍ、５００〜２５，０００平方μｍ、５００〜２０，０００平方μｍ、５００〜１５，０００平方μｍ、５００〜１０，０００平方μｍ、５００〜７，５００平方μｍ、５００〜５，０００平方μｍ、１，０００〜２５，０００平方μｍ、１，０００〜２０，０００平方μｍ、１，０００〜１５，０００平方μｍ、１，０００〜１０，０００平方μｍ、１，０００〜７，５００平方μｍ、１，０００〜５，０００平方μｍ、２，０００〜２０，０００平方μｍ、２，０００〜１５，０００平方μｍ、２，０００〜１０，０００平方μｍ、２，０００〜７，５００平方μｍ、２，０００〜６，０００平方μｍ、３，０００〜２０，０００平方μｍ、３，０００〜１５，０００平方μｍ、３，０００〜１０，０００平方μｍ、３，０００〜７，５００平方μｍ、又は３，０００〜６，０００平方μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。
【０１７１】
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約１〜６００μｍ、５〜５５０μｍ、１０〜５００μｍ、１５〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜５００μｍ、４０〜４００μｍ、６０〜３００μｍ、８０〜２００μｍ、又は約１００〜１５０μｍ。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。
【０１７２】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜５００μｍ、２０〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜２００μｍ、２０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、３０〜４００μｍ、３０〜３００μｍ、３０〜２００μｍ、３０〜１５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜６０μｍ、４０〜３００μｍ、４０〜２００μｍ、４０〜１５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜６０μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、５０〜８０μｍ、６０〜２００μｍ、６０〜１５０μｍ、６０〜１００μｍ、６０〜８０μｍ、７０〜１５０μｍ、７０〜１００μｍ、及び８０〜１００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。
【０１７３】
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、活性化されたＴ細胞のような生体細胞）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なってもよい（例えば、上記列挙される任意の端点により定義される範囲）。
【０１７４】
隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なってもよい。
【０１７５】
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３００において、Ｖｍａｘは、約０．１マイクロリッター／秒、約０．２マイクロリッター／秒、約０．３マイクロリッター／秒、約０．４マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．６マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約０．８マイクロリッター／秒、約０．９マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．１マイクロリッター／秒、約１．２マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．５マイクロリッター／秒、約２．０マイクロリッター／秒、約２．５マイクロリッター／秒、約３．０マイクロリッター／秒、約３．５マイクロリッター／秒、約４．０マイクロリッター／秒、約４．５マイクロリッター／秒、約５．０マイクロリッター／秒、約５．５マイクロリッター／秒、約６．０マイクロリッター／秒、約６．７マイクロリッター／秒、約７．０マイクロリッター／秒、約７．５マイクロリッター／秒、約８．０マイクロリッター／秒、約８．５マイクロリッター／秒、約９．０マイクロリッター／秒、約１０マイクロリッター／秒、約１１マイクロリッター／秒、約１２マイクロリッター／秒、約１３マイクロリッター／秒、約１４マイクロリッター／秒、約１５マイクロリッター／秒、又はそれ以上に設定することができる。
【０１７６】
隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも１×１０５立方μｍ、少なくとも２×１０５立方μｍ、少なくとも４×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも５×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、少なくとも５×１０８立方μｍ、少なくとも８×１０８立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの容積は、約２×１０５立方μｍ、約５×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、又は約８×１０７立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約０．１ナノリットル〜約５０ナノリットル、０．２ナノリットル〜約２５ナノリットル、０．５ナノリットル〜約２０ナノリットル、約０．８ナノリットル〜約１５ナノリットル、又は約１ナノリットル〜約１０ナノリットルであり得る。
【０１７７】
様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離ペンを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約５〜約１０個の隔離ペン、約１０〜約５０個の隔離ペン、約１００〜約５００個の隔離ペン、約２００〜約１０００個の隔離ペン、約５００〜約１５００個の隔離ペン、約１０００〜約２０００個の隔離ペン、約１５００〜約３０００個の隔離ペン、約２０００〜約４０００個の隔離ペン、約２５００〜約５０００個の隔離ペン、約３０００〜約６０００個の隔離ペン、約３５００〜約７０００個の隔離ペン、約４０００〜約８０００個の隔離ペン、約４５００〜約９０００個の隔離ペン、又は約５０００〜約１００００個の隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴）を含み得る。
【０１７８】
図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。マイクロ流体デバイス２８０は図２Ｇに示され、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離ペンをさらに含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
【０１７９】
図３Ａ〜図３Ｂは、本開示によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４をさらに含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
【０１８０】
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
【０１８１】
通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）をさらに含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
【０１８２】
特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８をさらに含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロ
プロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ−ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
【０１８４】
図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６をさらに含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
【０１８６】
ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
【０１８７】
上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム３３０（図３Ｂ参照）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
【０１８８】
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡３５０をさらに含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
【０１８９】
特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。さらに、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
【０１９０】
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は構造化光の生成（例えば、光変調サブシステム３３０を介した）に使用することができ、第２の光源３３４は非構造化光の提供に使用することができる。第１の光源３３２は、光学的に作動される動電学的及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成することができ、第２の光源３３４は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して第１の光源３３２を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム３３０から受け取り、構造化光を光学作動式動電学的デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域で結像し、（２）マイクロ流体デバイスから反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を検出器３４８上に結像するように構成され得る。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されているとき、非構造化光を第２の光源から受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域で結像するようにさらに構成され得る。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は重複領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、光の任意の適切な波長を有し得るレーザーを追加で又は代替として含み得る。図３Ｂに示した光学系の描写は、単なる模式的な描写であり、光学系は、追加のフィルター、ノッチフィルター、レンズ等を含み得る。第２の光源３３４が一又は複数の明視野及び／又は蛍光励起用の光源を含むとき、レーザー照明のみならず、光源の物理的な配置も図３Ｂから変化し得るし、レーザー照明は、光学系内で任意の適切な物理的位置に誘導される。光源４３２及び光源４０２／光モジュールサブシステム４０４の模式的な配置は、相互に交換可能でもあり得る。
【０１９１】
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
【０１９２】
幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
【０１９３】
被覆溶液及び被覆剤
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
【０１９４】
被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
【０１９５】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、流路（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数の流路又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。
【０１９６】
被覆剤／溶液
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
【０１９７】
ポリマーベースの被覆材料
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
【０１９８】
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
【０１９９】
他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。さらに他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
【０２００】
他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
【０２０１】
他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
【０２０２】
さらに他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びに／或いはアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％ｖ／ｖの範囲で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。さらに他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
【０２０３】
幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
【０２０４】
共有結合される被覆材料
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
【０２０５】
共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
【０２０６】
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
【０２０７】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。
【０２０８】
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得、ここで、アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
【０２０９】
他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
【０２１０】
他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、又は約２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
【０２１１】
共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
【０２１２】
共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び／又は流路（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。
【０２１３】
調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は２つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子をさらに含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第１の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。
【０２１４】
調整面特性
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がＤＥＰ力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式（例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング）等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７ｎｍ、約１ｎｍ〜約５ｎｍ、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成基板表面）に共有結合した場合、単層を形成し得、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５ｎｍ〜３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、典型的には約３０ｎｍの範囲の厚さを有し得るスピンコーティングで用意された表面の厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
【０２１５】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場）を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造（例えば、高密度単層構造）を有することができる。
【０２１６】
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
【０２１７】
単一又は複数パートの調整面
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、２部シーケンスで形成し得る。
【０２１８】
共有結合された被覆材料を準備する方法
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又は流路の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合した被覆材料は、式１又は式２の構造を有する。被覆材料は、表面に１ステップで導入される場合、式１の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式２の構造を有する。
【化１】
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【０２１９】
被覆材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。ＤＥＰ又はＥＷ構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。
【０２２０】
被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に結合し得、ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基からなる群から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０〜２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子〜約２００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
【０２２１】
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式２の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。
【０２２２】
幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘとペアとなる反応部分Ｒｐｘ（すなわち、反応部分Ｒｘと反応するように構成される部分）との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な１つの結合基ＣＧはカルボキサミジル（carboxamidyl）基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）基、カルボキサミジル（carboxamidyl）、チオアミジル、オキシム、メルカプチル（mercaptyl）、二硫化物、エーテル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部）に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。結合基ＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、さらに置換し得る（例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン（triazolylene）基）。
【０２２３】
幾つかの実施形態では、被覆材料（又は表面修飾リガンド）は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電層）を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る）を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１〜約７：１であり得るピラニア溶液）等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。
【０２２４】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス２００の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路１２０に堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６の誘電層及び／又はカバー１１０との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。２ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。
【０２２５】
図２Ｈは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、ＤＥＰ基板であり得る基板２８６の内面２９４と、マイクロ流体デバイス２９０のカバー２８８の内面２９２と、の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近くエンクロージャ２８４に向かって内側に面する略全ての内面２９４、２９２に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかに配置することができる。
【０２２６】
図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。上記の被覆材料２９８のいずれかを使用することができ（例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分）、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される（すなわち、内面２９２、２９４に結合されず、エンクロージャ２８４に近い被覆材料２９８の単層の部分）。
【０２２７】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は両性イオン部分をマイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）中に存在する非共有結合被覆剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とイオン結合を形成することができる。
【０２２８】
さらに他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分（例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分）のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。
【０２２９】
適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、米国特許出願公開第２０１６／０３１２１６５号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
【０２３０】
マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。これらのタイプの追加の構成要素は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３１２１６５号に記載されている。
【実施例】
【０２３１】
実施例
実施例１：OptoSelect（商標）チップによるヒトＴ細胞の増殖
Ｔ細胞増殖は、Berkeley Lights, Inc.によって製造され、且つ同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたナノ流体デバイスOptoSelectチップ内で達成された。この装置は、温度コントローラに結合されたチップ用の取付けステージと、ポンプ及び流体培地調整コンポーネントと、カメラとチップ内のフォトトランジスターをアクティブにするのに好適な構造化光源とを含む光学縦列とを含んだ。OptoSelect（商標）チップは、フォトトランジスター誘起ＯＥＴ力を提供するOptoElectroPositioning（OEP（商標））技術を用いて構成された基板を含んだ。チップはまた、複数のNanoPen（商標）チャンバ（又は隔離ペン）がそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含んだ。各隔離ペンの容積は、約１×１０６立方ミクロンであった。
【０２３２】
末梢血から分離されたＣＤ３＋ヒトＴリンパ球と、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズ（DYNABEADS（商標）、Thermo Fisher Scientific, Inc.）とを１ビーズ／１細胞の比で混合した。混合物を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで５時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｔ細胞／ビーズ混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でＴ細胞／ビーズをペンに引き入れることにより、Ｔ細胞／ビーズを隔離ペンにランダムに装填した。
【０２３３】
Ｔ細胞及びビーズを隔離ペンに装填した後、チップのマイクロ流体チャネルを通してＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２、R&D Systems）を４日間にわたってかん流させた。４日間の全培養期間にわたり、３０分ごとに隔離ペン及びその中に入っている任意のＴ細胞及びビーズの撮像を行った。
【０２３４】
図４は、上記の方法に従ってオンチップでＣＤ３＋ヒトＴリンパ球の増殖に成功した０、２４、４８、７２及び９６時間の培養における単一ペンの一連のタイムラプス画像である。分かるように、時間ｔ＝０における少数のＴ細胞は、９６時間のオンチップ培養後にＴ細胞のオリゴクローン集団になった。
【０２３５】
代替形態１：上記の実験は、動物成分フリーＴ細胞培養培地を用いて繰り返され得る。例えば、上記のＴ細胞培養培地中のＦＢＳを除去することができ、ＲＰＭＩを改良ＲＰＭＩ（又は高レベルのホスフェートを有し且つインスリン及びフェリチンのサプリメントを含む類似の基本培地）で置き換えることができる。また、こうして得られるＴ細胞増殖は、実質的に同一であろう。加えて、Ｔ細胞培養培地にＩＬ７（例えば、５ｎｇ／ｍｌのＬ７）を追加することができる。
【０２３６】
代替形態２：上記の実験は、Ｔ細胞及びビーズの５時間オフチッププレインキュベーションを行うことなく繰り返され得る。代わりに、Ｔ細胞を隔離ペンに装填する前又は装填した後のいずれかで１個以上のビーズを各隔離ペンに配置することができる。また、こうして得られるＴ細胞増殖は、実質的に同一であろう。
【０２３７】
実施例２：OptoSelect（商標）チップによるヒトＴ細胞の選択的増殖
Ｔ細胞増殖は、実施例１に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ（Berkeley Lights, Inc.）内で達成された。
【０２３８】
最初に、末梢血から分離されたヒトＣＤ１４＋単球をＤＣ培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、R&D Systems）で７日間培養して樹状細胞（ＤＣ）の分化を促進した。培養の最後の２日間に２５０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（R&D Systems）を培養培地に添加してＤＣ活性化を促進した。
【０２３９】
同種異系ドナーＴリンパ球と上記の培養からのＤＣとを約１０Ｔ細胞／１ＤＣの比で混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで５時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｔ細胞／ＤＣ混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でＴ細胞／ＤＣをペンに引き入れることにより、Ｔ細胞／ＤＣを隔離ペンにランダムに装填した。
【０２４０】
Ｔ細胞／ＤＣを隔離ペンに装填した後、チップのマイクロ流体チャネルを通してＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２、R&D Systems）を４日間にわたってかん流させた。４日間の全培養期間にわたり、３０分ごとに隔離ペン及びその中に入っている任意のＴ細胞及びＤＣの撮像を行った。
【０２４１】
図５Ａは、上記の方法に従ってオンチップでＣＤ３＋ヒトＴリンパ球を選択的に増殖させた０、２４、４８、７２及び９６時間の培養における単一隔離ペンの一連のタイムラプス画像である。分かるように、ＤＣは、９６時間のオンチップ培養後、Ｔ細胞の有意な増殖を刺激した。しかし、少なくとも１個のＴ細胞及び少なくとも１個のＤＣが最初に播種された隔離ペンのわずか１％〜２％がＴ細胞増殖を呈したことから、図５Ａで観測された増殖が選択的であったことが実証される。
【０２４２】
４日間の培養期間の最後の１６時間中、チップをかん流させるために使用した培養培地にClick-It EdU試薬（Thermo Fisher Scientific, Inc.）を追加することにより、Ｔ細胞が試薬を取り込んでそれをそのＤＮＡに組み込むことを可能にした。培養期間後、細胞を洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％Triton-Xで透過化した。ＥｄＵ導入は、テキサスレッドチャネルの蛍光を監視することによって検出した。図６Ａは、選択的に増殖されたＴ細胞の明視野画像にオーバーレイされたＥｄＵ蛍光シグナルを示す画像を提供する。最初に閉じ込められたＴ細胞がＤＣによって活性化されたという結論に合致して、細胞の成長及び分裂によってペン内のＴ細胞数の増加を生じたことがＥｄＵデータから示される。
【０２４３】
代替形態：上記の実験は、動物成分フリーＴ細胞培養培地を用いて繰り返され得る。例えば、上記のＴ細胞培養培地中のＦＢＳを除去することができ、ＲＰＭＩを改良ＲＰＭＩ（又は高レベルのホスフェートを有し且つインスリン及びフェリチンのサプリメントを含む類似の基本培地）で置き換えることができる。また、こうして得られるＴ細胞増殖は、実質的に同一であろう。加えて、Ｔ細胞培養培地にＩＬ７（例えば、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７）を追加することができる。
【０２４４】
実施例３：OptoSelect（商標）チップによるヒトＴ細胞の抗原特異的増殖
Ｔ細胞増殖は、実施例１に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ（Berkeley Lights, Inc.）内で達成された。
【０２４５】
最初に、末梢血から分離されたヒトＣＤ１４＋単球をＤＣ培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清、１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、R&D Systems）で７日間培養して樹状細胞（ＤＣ）の分化を促進した。培養の最後の２日間に２５０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（R&D Systems）を培養培地に添加してＤＣ活性化を促進した。ＬＰＳの添加と同時に、ＤＣはまた、１０μＭ破傷風毒素（ＴＴ）抗原（Sigma-Aldrich Co.）及び１０μＭエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）抗原（EastCoast Bio, Inc.）でパルスされた。
【０２４６】
自己ドナーＴリンパ球と上記の培養からのＥＢＶパルスＤＣとを約１０Ｔ細胞／１ＤＣの比で混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで５時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｔ細胞／ＤＣ混合物を再懸濁させ、次いで流体流入口を通してチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させた。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でＴ細胞／ＤＣをペンに引き入れることにより、Ｔ細胞／ＤＣを隔離ペンにランダムに装填した。
【０２４７】
Ｔ細胞／ＤＣを隔離ペンに装填した後、チップのマイクロ流体チャネルを通してＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２、R&D Systems）を５日間にわたってかん流させた。５日間の全培養期間にわたり、３０分ごとに隔離ペン及びその中に入っている任意のＴ細胞及びビーズの撮像を行った。
【０２４８】
図５Ｂは、上記の方法に従ってオンチップでＣＤ３＋ヒトＴリンパ球を選択的に増殖させた０、２４、４８、７２、９６及び１１０時間の培養における単一隔離ペンの一連のタイムラプス画像である。分かるように、ＤＣは、１１０時間のオンチップ培養後、Ｔ細胞の有意な増殖を刺激した。しかし、少なくとも１個のＴ細胞及び少なくとも１個のＤＣが最初に播種されたペンのわずか１％〜２％がＴ細胞増殖を呈したことから、図５Ｂで観測された増殖が抗原特異的であったことが実証される。
【０２４９】
５日間の培養期間の最後の１６時間中、チップをかん流させるために使用した培養培地にClick-It EdU試薬（Thermo Fisher Scientific, Inc.）を追加することにより、Ｔ細胞が試薬を取り込んでそれをそのＤＮＡに組み込むことを可能にした。培養期間後、細胞を洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％Triton-Xで透過化した。ＥｄＵ導入は、テキサスレッドチャネルの蛍光を監視することによって検出した。図６Ｂは、選択的に増殖されたＴ細胞の明視野画像にオーバーレイされたＥｄＵ蛍光シグナルを示す画像を提供する。最初に閉じ込められたＴ細胞がＤＣによって活性化されたという結論に合致して、細胞の成長及び分裂によってペン内のＴ細胞数の増加を生じたことがＥｄＵデータから示される。
【０２５０】
代替形態：上記の実験は、動物成分フリーＴ細胞培養培地を用いて繰り返され得る。例えば、上記のＴ細胞培養培地中のＦＢＳを除去することができ、ＲＰＭＩを改良ＲＰＭＩ（又は高レベルのホスフェートを有し且つインスリン及びフェリチンのサプリメントを含む類似の基本培地）で置き換えることができる。また、こうして得られるＴ細胞増殖は、実質的に同一であろう。加えて、Ｔ細胞培養培地にＩＬ７（例えば、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７）を追加することができる。
【０２５１】
実施例４：調整された表面を有するOptoSelect（商標）チップによるＴリンパ球の培養及び搬出
材料。ＣＤ３＋細胞は、AllCells Inc.製であった。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、磁気ビーズ（Dynabeads（登録商標）、Thermofisher Scientific、カタログ番号１１４５３Ｄ）に結合させた。培養培地は、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清及び５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２（R&D Systems）が追加されたＲＰＭＩ−１６４０（GIBCO（登録商標）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１８７５−１２７）であった。
【０２５２】
システム及びマイクロ流体デバイス。Ｔ細胞増殖は、実質的に実施例１に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ（Berkeley Lights, Inc.）内で達成された。しかし、この実施例では、OptoSelectチップの内面を共有結合デキストランで調整した。
【０２５３】
マイクロ流体デバイスのプライミング。２５０マイクロリットルの１００％二酸化炭素を１２マイクロリットル／秒の速度で流動させ、続いて０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有する２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流動させ、最後に２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流動させた。続いて培養培地の導入を行う。
【０２５４】
培地かん流。培地は、以下の２つの方法のいずれかによってマイクロ流体デバイスを通してかん流させた。
１．０．０１マイクロリットル／秒で２時間かん流させ、２マイクロリットル／秒で６４秒間かん流させ、繰り返す。
２．０．０２マイクロリットル／秒で１００秒間かん流させ、フローを５００秒間停止し、２マイクロリットル／秒で６４秒間かん流させ、繰り返す。
【０２５５】
実験：ＣＤ３＋細胞と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズとを１ビーズ／細胞の比で混合した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターによって培養培地で混合物を５時間インキュベートし、その後、使用のためにＴ細胞／ビーズ混合物を再懸濁させた。
【０２５６】
流体流入口を通して再懸濁液をマイクロ流体チャネルに流入させることにより、Ｔ細胞懸濁液（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを含む）をマイクロ流体デバイスに導入した。フローを停止し、チップを傾斜させて重力でＴ細胞／ビーズをチャンバに引き入れることにより、Ｔ細胞／ビーズを隔離チャンバにランダムに装填した。
【０２５７】
Ｔ細胞／ビーズを隔離チャンバに装填した後、ナノ流体チップのマイクロ流体チャネルを通して培養培地を４日間かん流させた。図７Ａは、マイクロ流体デバイスの隔離チャンバのデキストランで調整された表面上におけるＴ細胞の成長を示した。デキストランで調整された表面上におけるＴ細胞の成長は、類似のマイクロ流体デバイスの調整されていない表面と比べて改善された（データは示されていない）。
【０２５８】
次いで、マイクロ流体デバイスを傾斜させて重力でチャンバからＴ細胞を引き出すことにより、Ｔ細胞を隔離チャンバから取り出した。図７Ｂは、２０分間の重力アンローディング後で隔離チャンバから取り出されたＴ細胞の代表的な画像を示す。増殖されたＴ細胞が、デキストランで調整された隔離ペンから容易に搬出されたことは、デキストランで調整された表面が欠如したOptoSelectチップを用いて達成されたＴ細胞搬出の度合いよりも優れた改善であった（データは示されていない）。
【０２５９】
実施例５：調整された表面を有するOptoSelect（商標）チップによるＴリンパ球の活性化及び増殖
Ｔ細胞増殖は、実質的に実施例１に記載されるように、同様にBerkeley Lights, Inc.によって製造された光学機器によって制御されたOptoSelectチップ（Berkeley Lights, Inc.）内で達成された。実施例４と同様に、OptoSelectチップは、調整された表面を特徴とした。この実施例では、調整された表面は、ビオチン化抗ＣＤ３アゴニスト抗体に結合されたストレプトアビジン結合ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、約１ｋＤ）含有ポリマーを含んだ。
【０２６０】
OptoSelectチップを遊離ストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍＬ、流出口ポートへの注入によって装填した）でフラッシュし、ＲＴで１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ（注入により）×１で濯いだ。次いで、ビオチン化抗ＣＤ３抗体（５マイクログラム／ｍＬ、Miltenyi  １３０−０９３−３７７）をチップに流入させ、フローを停止し、加湿しながらチップを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、培養培地をデバイスに流入させることによってチップを濯いだ。
【０２６１】
流入口を通してＴ細胞の培養物をチップ内のマイクロ流体チャネルに流入させることによってＴ細胞をチップ（以上に記載されるように準備した）に装填し、次いでフローを停止した。チップを傾斜させて重力でＴ細胞をチップ内の隔離ペンに装填した。重力ローディング後、チップの隔離ペン内でＴ細胞を３から４日間培養した。Ｔ細胞培養に使用した培地は、２μｇ／ｍＬの可溶性機能グレード抗ＣＤ２８抗体（クローン１５Ｅ８、Miltenyi  １３０−０９３−３７５）を含有していた。
【０２６２】
以上に記載のマイクロ流体デバイスで培養されたＴ細胞をタイムラプス撮像によって監視した。得られた画像から、Ｔ細胞が動き回り分裂したことが明らかにされたため、Ｔ細胞活性化の特徴が実証された。
【０２６３】
上記の実験の変形形態は、結合される抗ＣＤ３アゴニスト抗体の表面密度を変化させること、ＰＥＧポリマーの長さを変化させること、抗ＣＤ２８抗体を調整された表面に結合させること、抗ＣＤ３アゴニスト抗体と抗ＣＤ２８抗体との比を変化させること、及び／又は抗ＣＤ３抗体をペプチド−ＭＨＣ複合体で置き換えることを含み得る。この最後の変更は、Ｔ細胞の抗原特異的な活性化及び増殖を達成するために使用され得る。
【０２６４】
実施例６：マイクロ流体デバイス内へのＴ細胞活性化表面の導入
ベースを形成する第１のシリコン電極活性化基板と、カバーを形成する第２のＩＴＯ基板と、２つの基板を分離する壁を形成する光パターン化シリコーンマイクロ流体回路材料とを含むOptoSelect（商標）チップ（Berkeley Lights, Inc.）の内面は、米国特許出願公開第２０１６０３１２１６５号に記載されるように、アジド部分を含むように共有結合で改質した。基本的に、１００Ｗの電力と、２４０ｍＴｏｒｒの圧力と、４４０ｓｃｃｍの酸素流量とを用いて、OptoSelectチップを酸素プラズマクリーナ（Nordson Asymtek）で１分間処理した。真空反応器の底部の箔ボート中において、真空反応器の底部の個別箔ボート中の水反応剤源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４−９９−８）の存在下において、プラズマ処理チップを３−アジドウンデシル）トリメトキシシラン（アジ化ナトリウムとの反応によって１１−ブロモウンデシルトリメトキシシラン（Gelestカタログ番号ＳＩＢ１９０８．０）から合成、３００マイクロリットル）で真空反応器内において処理した。次いで、真空ポンプを用いてチャンバを７５０ｍＴｏｒｒまでポンプ吸引し、シールした。１１０℃に加熱されたオーブン内に真空反応器を２４〜４８時間配置した。これにより、改質表面が、構造：
【化２】
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を有するようにチップの内面の改質が行われた。室温に冷却し、減圧チャンバにアルゴンを導入した後、マイクロ流体デバイスを反応器から取り出したところ、更なる反応に好適なものであった。
【０２６５】
次いで、ストレプトアビジンで表面を官能基化するために、最初にOptoSelectチップを１００％二酸化炭素で繰り返しフラッシュし、次いでＤＢＣＯ−ストレプトアビジン溶液を装填した。ＤＢＣＯ−ストレプトアビジン溶液は、ＤＢＣＯ部分に共有結合で結合されたストレプトアビジンの凍結乾燥粉末（NANOCSカタログ番号ＳＶ１−ＤＢ−１）を１．０マイクロモルの濃度になるように１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁させることによって作製した。ＤＢＣＯとアジドとをカップリングさせた１５〜３０分間のインキュベーション後、OptoSelectチップを１×ＰＢＳで繰り返し洗浄して非結合ＤＢＣＯ−ストレプトアビジンを洗い流した。ＤＢＣＯ修飾ストレプトアビジン溶液を１マイクロモルの濃度で調製したが、約０．５から約２マイクロモルの範囲内の濃度は、アジド部分を有するOptoSelectチップの内面の改質に有効である。
【０２６６】
このストレプトアビジン官能基化表面をビオチン化抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３クローン、機能グレード、Miltenyiカタログ番号１３０−０９３−３７７）及びビオチン化抗ＣＤ２８抗体（１５Ｅ８クローン、機能グレード、Miltenyiカタログ番号１３０−０９３−３８６）でさらに改質した。これらの抗体を１：１の比で約１〜１０マイクログラム／ｍＬの濃度においてＰＢＳ＋２％ウシ血清アルブミン中に懸濁させた。この抗体溶液を、ストレプトアビジン官能基化表面を備えたOptoSelectチップに通してかん流させ、ビオチン−ストレプトアビジン結合相互作用によってチップの内面への抗体のコンジュゲーションを促進した。１時間のインキュベーション後、OptoSelectチップをＰＢＳで、次いで細胞培養培地でフラッシュした。この時点で、チップは、細胞ローディングが可能な状態であった。
【０２６７】
上記の例は、抗体によるOptoSelectチップの内面の官能基化に重点を置いているが、対象の他のバイオ分子も同様にコンジュゲートされ得る（すなわち、バイオ分子のビオチン修飾及びストレプトアビジン官能基化表面へのビオチン−ストレプトアビジン媒介結合を介して）。さらに、OptoSelectチップのアジド改質表面との反応前にビオチン化抗体（又は他のバイオ分子）とストレプトアビジンとを反応させることができる。ＤＢＣＯ−ストレプトアビジン及びビオチン化バイオ分子は、以下に記載されるように、０．５〜２マイクロモルの範囲内の濃度でＰＢＳ溶液中に個別に調製してから任意の所望の比で混合され得る。ビオチン化バイオ分子をストレプトアビジンに少なくとも１５分間コンジュゲートした後、以上に記載したように、得られた複合体を用いてアジド改質OptoSelectチップの表面を改質することができる。
【０２６８】
２タイプ以上の抗体／バイオ分子を用いてOptoSelectチップの表面を改質する場合、ＤＢＣＯ−ストレプトアビジンとのコンジュゲーションステップ前に２タイプ（若しくはそれを超える）の抗体／バイオ分子の混合を行い得るか、又は幾つかの個別タイプのバイオ分子のＤＢＣＯ−ストレプトアビジンコンジュゲートを調製して表面官能基化前に混合し得る。そのため、以上の実施例のバイオ分子改質表面は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体との比が１：１であったが、比は、約１：５〜約５：１（例えば、約２：１〜約１：２）であり得る。より一般的には、Ｔ細胞の活性化に有用なバイオ分子改質表面は、２種のＴ細胞活性化バイオ分子を含み得る。そのいずれかは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト又はＭＨＣタンパク質（例えば、MBL Internationalカタログ番号ＭＲ０１００８）であり得、２種のバイオ分子は、互いに約１：１０〜約１０：１の範囲内で存在し得る。さらに、バイオ分子改質表面は、３、４、５種又はそれを超えるＴ細胞活性化バイオ分子の混合物を含み得る。
【０２６９】
上記の実験の更なる変形形態は、結合される抗ＣＤ３アゴニスト抗体及び／又は結合される抗ＣＤ２８アゴニスト抗体の表面密度を変化させること、最初に内部チップ表面を官能基化するために使用されるアジド部分含有分子の炭化水素鎖の長さを変化させること、可溶形の抗ＣＤ２８抗体を提供すること、及び／又は抗ＣＤ３抗体をペプチド−ＭＨＣ複合体で置き換えることを含み得る。この最後の変更は、Ｔ細胞の抗原特異的な活性化及び増殖を達成するために使用され得る。
【０２７０】
実施例７：実施形態
以下の番号付き項目は、本明細書に記載の実施形態の詳細をさらに提供するが、これらに限定されるものではない。
【０２７１】
項目１．流路と、流路に流体接続された隔離ペンとを有するマイクロ流体デバイスにおいてＴリンパ球を増殖させる方法であって、
１個以上のＴリンパ球をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することと、
１個以上のＴリンパ球と活性化剤とを接触させることと、
隔離ペンに導入された１個以上のＴリンパ球が増殖を行うことを可能にするのに十分な時間の期間にわたり、マイクロ流体デバイスの流路を通して培養培地をかん流させることと
を含む方法。
【０２７２】
項目２．隔離ペンは、約５×１０５から約５×１０６立方ミクロンの体積を有する、項目１に記載の方法。
【０２７３】
項目３．隔離ペンの少なくとも１つの内面は、コーティング材料を含む、項目１又は２に記載の方法。
【０２７４】
項目４．コーティング材料は、隔離ペンの少なくとも１つの内面に共有結合で結合され、コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、糖部分、アミノ酸部分又はそれらの組合せを含むポリマーを含む、項目３に記載の方法。
【０２７５】
項目５．コーティング材料は、デキストランを含む、項目４に記載の方法。
【０２７６】
項目６．コーティング材料は、ポリエチレングリコール部分を含む、項目４に記載の方法。
【０２７７】
項目７．コーティング材料は、１種以上のタンパク質を含む、項目４〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
項目８．コーティング材料は、それぞれ結合基とアルキル部分とを含む分子を含み、結合基は、隔離ペンの少なくとも１つの内面に共有結合で結合される、項目３に記載の方法。
【０２７９】
項目９．結合基は、シロキシ結合基である、項目８に記載の方法。
【０２８０】
項目１０．アルキル部分は、少なくとも１０個の炭素原子を含む炭素の直鎖を含む、項目８又は９に記載の方法。
【０２８１】
項目１１．アルキル部分は、フルオロアルキル部分である、項目８〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
項目１２．アルキル部分は、ペルフロウロアルキル部分である、項目８〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
項目１３．コーティング材料の分子は、内側基板表面に共有結合で結合された密充填単層構造を形成する、項目８〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８４】
項目１４．コーティング材料は、結合基とカチオン部分及び／又はアニオン部分とを有する分子を含み、結合基は、内側基板表面に共有結合で結合される、項目３に記載の方法。
【０２８５】
項目１５．カチオン部分は、第４級アンモニウム基を含む、項目１４に記載の方法。
【０２８６】
項目１６．アニオン部分は、ホスホン酸、カルボン酸又はスルホン酸を含む、項目１４又は１５に記載の方法。
【０２８７】
項目１７．コーティング材料は、結合基と双性イオン部分とを有する分子を含む、項目１４〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０２８８】
項目１８．双性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸及びアミノ酸から選択される、項目１７に記載の方法。
【０２８９】
項目１９．活性化剤は、コーティング材料に共有結合で結合される、項目３〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２９０】
項目２０．活性化剤は、コーティング材料に安定に結合される、項目３〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２９１】
項目２１．活性化剤は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してコーティング材料に安定に結合される、項目２０に記載の方法。
【０２９２】
項目２２．１個以上のＴリンパ球は、対象から採取された末梢血サンプルから分離される、項目１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２９３】
項目２３．１個以上のＴリンパ球は、対象の固形腫瘍サンプルから分離される、項目１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２９４】
項目２４．固形腫瘍サンプルは、細針吸引物（ＦＮＡ）である、項目２３に記載の方法。
【０２９５】
項目２５．固形腫瘍サンプルは、生検物である、項目２３に記載の方法。
【０２９６】
項目２６．固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、項目２３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２９７】
項目２７．固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、項目２３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２９８】
項目２８．１個以上のＴリンパ球は、末梢血サンプル又は固形腫瘍サンプルから分離されたＴリンパ球の集団に由来する、項目２２〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２９９】
項目２９．集団は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球が富化される、項目２８に記載の方法。
【０３００】
項目３０．集団は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球が富化される、項目２８に記載の方法。
【０３０１】
項目３１．集団は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球が富化される、項目２８に記載の方法。
【０３０２】
項目３２．集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔリンパ球が富化される、項目２８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０３０３】
項目３３．集団は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球が富化される、項目２８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０３０４】
項目３４．集団は、ＣＣＲ７＋Ｔリンパ球が富化される、項目２８〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０３０５】
項目３５．集団は、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球が富化される、項目２８〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０３０６】
項目３６．集団は、ＣＤ６９＋Ｔリンパ球が枯渇される、項目２８〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０３０７】
項目３７．集団は、ＰＤ１＋及び／又はＰＤ−Ｌ１＋Ｔリンパ球が枯渇される、項目２８〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０３０８】
項目３８．Ｔリンパ球と、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６９、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１に対する抗体とを接触させることにより、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球、ＣＤ６９＋Ｔリンパ球、ＰＤ−１＋Ｔリンパ球及びＰＤ−Ｌ１＋Ｔリンパ球の１つ、２つ、３つ又は４つを枯渇させることと、抗体に結合されたＴリンパ球を集団から除去することとを含む、項目２８〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０３０９】
項目３９．抗体は、固体担体を伴う、項目３８に記載の方法。
【０３１０】
項目４０．固体担体は、磁気ビーズの集団である、項目３９に記載の方法。
【０３１１】
項目４１．１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、１個以上のＴリンパ球を含有する流体をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させることを含み、マイクロ流体チャネルは、マイクロ流体デバイスの流路の一部であり、隔離ペンは、マイクロ流体チャネルから離れて開口する、項目１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０３１２】
項目４２．１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて、マイクロ流体チャネルに位置する少なくとも１個のＴリンパ球を選択し、且つそれを隔離ペン内に移動させることをさらに含む、項目４１に記載の方法。
【０３１３】
項目４３．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はそれらの任意の組合せを含むために選択される、項目４２に記載の方法。
【０３１４】
項目４４．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーＣＤ３＋及びＣＤ４＋を含むために選択される、項目４２に記載の方法。
【０３１５】
項目４５．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーＣＤ３＋及びＣＤ８＋を含むために選択される、項目４２に記載の方法。
【０３１６】
項目４６．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がマーカーＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋又はそれらの任意の組合せを含むために選択される、項目４２〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０３１７】
項目４７．少なくとも１個のＴリンパ球を選択することは、少なくとも１個のＴリンパ球を含むＴリンパ球の集団を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７又はＣＤ６２Ｌに特異的に結合する抗体で標識することと、少なくとも１個のＴリンパ球を、それが抗体を伴うことに基づいて隔離ペン内に移動させることとを含む、項目４２〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【０３１８】
項目４８．抗体は、フルオロフォアを含む、項目４７に記載の方法。
【０３１９】
項目４９．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＯ＋でないために選択される、項目４２〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０３２０】
項目５０．１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＤ４５ＲＯの指標となる標識を伴わない１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することとを含む、項目４２〜４８に記載の方法。
【０３２１】
項目５１．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ４５ＲＡ＋でないために選択される、項目４２〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０３２２】
項目５２．１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＤ４５ＲＡの指標となる標識を伴わない１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することとを含む、項目４２〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０３２３】
項目５３．ＣＣＲ７＋及びＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＣＲ７の指標となる標識を伴う及び／又はＣＤ６２Ｌの指標となる標識を伴う１個以上のＴリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含む、項目４２〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０３２４】
項目５４．ＣＣＲ７＋及びＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球を標識することと、ＣＣＲ７の指標となる標識を伴わない及び／又はＣＤ６２Ｌの指標となる標識を伴わない１個以上のＴリンパ球を隔離ペン内に移動させることとを含む、項目４２〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０３２５】
項目５５．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＣＤ６９＋でないために選択される、項目４２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０３２６】
項目５６．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＰＤ−１＋でないために選択される、項目４２〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０３２７】
項目５７．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、その細胞表面がＰＤ−Ｌ１＋でないために選択される、項目４２〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０３２８】
項目５８．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う抗原で標識されるために選択される、項目４２〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０３２９】
項目５９．抗原は、ＭＨＣタンパク質で複合体化されたペプチドを含む、項目５８に記載の方法。
【０３３０】
項目６０．少なくとも１個の選択されるＴリンパ球は、少なくとも部分的には、それが蛍光標識を伴う１種以上の抗体で標識されるために選択される、項目４２〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０３３１】
項目６１．１種以上の抗体は、ＣＤ４５ＲＡ若しくはＣＤ４５ＲＯに対する抗体、ＣＣＲ７に対する抗体、ＣＤ６２Ｌに対する抗体又はそれらの任意の組合せを含む、項目６０に記載の方法。
【０３３２】
項目６２．１種以上の抗体は、ＣＤ４に対する抗体を含む、項目６０又は６１に記載の方法。
【０３３３】
項目６３．１種以上の抗体は、ＣＤ８に対する抗体を含む、項目６０又は６１の方法。
【０３３４】
項目６４．１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、重力で１個以上のＴリンパ球が隔離ペンに引き込まれるようにマイクロ流体デバイスを傾斜させることをさらに含む、項目４１に記載の方法。
【０３３５】
項目６５．１個以上のＴリンパ球は、隔離ペンに導入される前に活性化剤に接触される、項目１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０３３６】
項目６６．１個以上のＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも１時間の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされる、項目６５に記載の方法。
【０３３７】
項目６７．１個以上のＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスに導入される前に少なくとも５時間の期間にわたり活性化剤と共にインキュベートされる、項目６５に記載の方法。
【０３３８】
項目６８．１個以上のＴリンパ球を隔離ペンに導入することは、活性化剤を隔離ペンに導入することをさらに含む、項目６５〜６７のいずれか１つに記載の方法。
【０３３９】
項目６９．１個以上のＴリンパ球は、隔離ペンに導入された後に活性化剤に接触される、項目１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０３４０】
項目７０．活性化剤は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を含む、項目１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０３４１】
項目７１．活性化剤は、固体担体にコンジュゲートされる抗ＣＤ３アゴニスト抗体を含む、項目７０に記載の方法。
【０３４２】
項目７２．活性化剤は、固体担体にコンジュゲートされる抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を含む、項目７０又は７１に記載の方法。
【０３４３】
項目７３．活性化剤は、可溶性抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を含む、項目７０又は７１に記載の方法。
【０３４４】
項目７４．活性化剤は、樹状細胞（ＤＣ）を含む、項目１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０３４５】
項目７５．ＤＣは、１個以上のＴリンパ球を接触させる前に腫瘍抗原でパルスされる、項目７４に記載の方法。
【０３４６】
項目７６．腫瘍抗原は、１個以上のＴリンパ球と同系の腫瘍細胞から分離される、項目７５に記載の方法。
【０３４７】
項目７７．腫瘍抗原は、腫瘍細胞のゲノム解析を通して同定される、項目７５に記載の方法。
【０３４８】
項目７８．分析される腫瘍細胞は、１個以上のＴリンパ球と同系である、項目７７に記載の方法。
【０３４９】
項目７９．ＤＣ及び１個以上のＴリンパ球は、自己細胞である、項目７４〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０３５０】
項目８０．培養培地は、マイクロ流体デバイスの流路を通して少なくとも２４時間の期間にわたってかん流される、項目１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０３５１】
項目８１．培養培地は、マイクロ流体デバイスの流路を通して少なくとも４８時間の期間にわたってかん流される、項目１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０３５２】
項目８２．培養培地は、マイクロ流体デバイスの流路を通して少なくとも９６時間の期間にわたってかん流される、項目１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０３５３】
項目８３．培養培地は、ヒト血清とＩＬ２とを含む、項目１〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０３５４】
項目８４．培養培地は、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１又はそれらの任意の組合せを含む、項目１〜６７のいずれか１つに記載の方法。
【０３５５】
項目８５．２０個以下、１０個以下、６〜１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入される、項目１〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０３５６】
項目８６．増殖は、少なくとも３ラウンドの有糸細胞分裂を含む、項目１〜８５のいずれか１つに記載の方法。
【０３５７】
項目８７．増殖されたＴリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することを含む、項目１〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０３５８】
項目８８．マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、１個以上のＴリンパ球は、複数のそれぞれの隔離ペンに導入され且つ活性化剤に接触される、項目１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０３５９】
項目８９．２０個以下、１０個以下、６〜１０個、５個以下、約５個、約４個、約３個、約２個又は１個のＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入される、項目８８に記載の方法。
【０３６０】
項目９０．項目１〜８９のいずれか１つに記載の方法に従って産生されたＴリンパ球。
【０３６１】
項目９１．項目１〜８９のいずれか１つに記載の方法に従って産生されたＴリンパ球を含むマイクロ流体デバイス。
【０３６２】
項目９２．マイクロ流体デバイスは、隔離ペンを含み、Ｔリンパ球は、隔離ペン内に位置する、項目９１に記載のマイクロ流体デバイス。
【０３６３】
項目９３．項目１〜８９のいずれか１つに記載の方法に従って産生されたＴリンパ球と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【０３６４】
項目９４．対象における癌を治療する方法であって、Ｔリンパ球を対象に導入することを含み、Ｔリンパ球は、項目１〜８９のいずれか１つに記載の方法によって調製される、方法。
【０３６５】
項目９５．対象における癌を治療する方法であって、
対象から得られた組織サンプルからＴリンパ球を分離することと、
分離されたＴリンパ球を、項目１〜８９のいずれか１つに記載の方法に従ってマイクロ流体デバイスにおいて増殖させることと、
増殖されたＴリンパ球をマイクロ流体デバイスから搬出することと、
増殖されたＴリンパ球を対象に再導入することと
を含む方法。
【０３６６】
項目９６．対象は、哺乳動物である、項目９４又は９５に記載の方法。
【０３６７】
項目９７．対象は、ヒトである、項目９６に記載の方法。
【０３６８】
項目９８．組織サンプルは、末梢血のサンプルである、項目９５〜９７のいずれか１つに記載の方法。
【０３６９】
項目９９．組織サンプルは、固形腫瘍に由来する、項目９５〜９７のいずれか１つに記載の方法。
【０３７０】
項目１００．組織サンプルは、固形腫瘍に由来するＦＮＡ又は生検物である、項目９９に記載の方法。
【０３７１】
項目１０１．固形腫瘍は、乳癌、尿路、尿管、膀胱若しくは尿道に発生する癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管若しくは陰茎の癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌、神経系癌、神経芽腫、網膜芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、或いは黒色腫である、項目９９又は１００に記載の方法。
【０３７２】
項目１０２．固形腫瘍は、髄様乳癌、中皮腫又は黒色腫である、項目９９又は１００に記載の方法。
【０３７３】
項目１０３．組織サンプルからＴリンパ球を分離することは、組織サンプル中のＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞又はそれらの任意の組合せの選択を行うことを含む、項目９５〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
【０３７４】
項目１０４．組織サンプルからＴリンパ球を分離することは、組織サンプル中のＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞又はそれらの任意の組合せの選択を行う前に組織サンプルを解離することをさらに含む、項目１０３に記載の方法。
【０３７５】
項目１０５．分離されたＴリンパ球を増殖させることは、分離されたＴリンパ球と活性化剤とを接触させることを含む、項目９５〜１０４のいずれか１つに記載の方法。
【０３７６】
項目１０６．活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト及び／又はＣＤ２８アゴニストを含む、項目１０５に記載の方法。
【０３７７】
項目１０７．活性化剤は、抗ＣＤ３アゴニスト抗体を含む、項目１０６に記載の方法。
【０３７８】
項目１０８．活性化剤は、抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を含む、項目１０６又は１０７に記載の方法。
【０３７９】
項目１０９．活性化剤は、１個以上のビーズにコンジュゲートされる、項目１０５〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０３８０】
項目１１０．マイクロ流体デバイスは、分離されたＴリンパ球の増殖を支援するように構成された少なくとも１つの隔離ペンを含み、少なくとも１つの隔離ペンのそれぞれの少なくとも１つの表面は、コーティング材料を含み、活性化剤は、コーティング材料に共有結合で結合される、項目１０５〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
項目１１１．活性化剤は、コーティング材料に安定に結合される、項目１１０に記載の方法。
【０３８２】
項目１１２．活性化剤は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してコーティング材料に安定に結合される、項目１１０に記載の方法。
【０３８３】
項目１１３．活性化剤は、樹状細胞（ＤＣ）を含む、項目９５〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
【０３８４】
項目１１４．ＤＣは、癌について治療される対象から得られる、項目１１３に記載の方法。
【０３８５】
項目１１５．ＤＣは、分離されたＴリンパ球と活性化剤とを接触させる前に腫瘍抗原でパルスされる、項目１１３又は１１４の方法。
【０３８６】
項目１１６．腫瘍抗原は、対象から得られた癌細胞から分離される、項目１１５に記載の方法。
【０３８７】
項目１１７．腫瘍抗原は、合成品である、項目１１５に記載の方法。
【０３８８】
項目１１８．腫瘍抗原は、少なくとも部分的には、対象から得られた癌細胞に由来する核酸分子のシーケンシングによって同定される、項目１１５〜１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３８９】
項目１１９．活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたＴリンパ球は、少なくとも１００倍の増殖を呈する、項目９５〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３９０】
項目１２０．活性化剤との接触に反応して増殖を行う分離されたＴリンパ球は、少なくとも１０００倍の増殖を呈する、項目９５〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３９１】
項目１２１．増殖されたＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスから選択的に搬出される、項目９５〜１２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９２】
項目１２２．１つ以上のペンで１個以上のＴリンパ球の増殖速度をアッセイすることと、所定の閾値以上の増殖速度のＴリンパ球を選択的に搬出することとを含む、項目１２１に記載の方法。
【０３９３】
項目１２３．１つ以上のペンで１個以上のＴリンパ球による１種以上のサイトカインの発現をアッセイすることと、１種以上のサイトカインを発現するＴリンパ球を選択的に搬出することとを含む、項目１２１又は１２２に記載の方法。
【０３９４】
項目１２４．１種以上のサイトカインは、ＩＮＦγ、ＴＮＦα、ＩＬ２又はそれらの任意の組合せを含む、項目１２３に記載の方法。
【０３９５】
項目１２５．１つ以上のペンで１個以上のＴリンパ球による１種以上の調節性Ｔ細胞マーカーの発現をアッセイすることと、１種以上の調節性Ｔ細胞マーカーを発現するＴリンパ球を選択的に搬出することとを含む、項目１２１に記載の方法。
【０３９６】
項目１２６．１種以上の調節性Ｔ細胞マーカーは、ＣＴＬＡ４を含む、項目１２５に記載の方法。
【０３９７】
項目１２７．搬出されたＴリンパ球のサンプルをゲノムプロファイリングすることをさらに含む、項目９５〜１２６のいずれか１つに記載の方法。
【０３９８】
項目１２８．増殖されたＴリンパ球は、マイクロ流体デバイスから搬出された後であるが、対象に再導入される前にさらに増殖される、項目９５〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
【０３９９】
項目１２９．増殖されたＴリンパ球を搬出することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて、増殖されたＴリンパ球をその対応する隔離ペンから搬出することを含む、項目９５〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
【０４００】
均等物
上記の本明細書は、当業者による実施形態の実施を可能にするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、企図される最良の形態を記述する。しかし、以上の内容が本文でいかに詳細に見えても、実施形態は、多くの方法で実施され得るため、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが分かるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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