(57)【要約】  本発明は、植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を増加させる方法であって、植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ, ethylene-dependent gravitropism-deficient and yellow green protein）の活性又は発現を増加させることにより、前記植物を改変するステップを含む前記方法を提供する。
2019524074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を増加させる方法であって、前記植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ, ethylene-dependent gravitropism-deficient and yellow green protein）の活性又は発現を増加させることにより、前記植物を改変するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を増加させるための、植物中のＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現増加、又はＥＧＹタンパク質の活性増加の使用。
【請求項３】
ＥＧＹタンパク質が、前記植物の葉において過剰発現している、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＥＧＹポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）を、植物内で発現させるステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５】
ポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）が、植物内で核酸配列の転写を指示するために、異種プロモーターと作動可能に連結したＥＧＹポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項４に記載の方法又は使用。
【請求項６】
プロモーターが、葉特異的又は葉選好性プロモーターである、請求項５に記載の方法又は使用。
【請求項７】
植物が、作物植物、例えば、果実作物、種子作物、マメ科植物、又はナッツ作物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項８】
タバコ植物において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はその前駆体（例えば、葉中硝酸塩）のレベルを低下させるための、請求項１〜７のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項９】
少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはその前駆体が低下しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ収穫されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法であって、前記植物において、ＥＧＹ遺伝子の発現が増加するように、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加するように、前記タバコ植物を改変するステップを含む、前記方法。
【請求項１０】
植物において、ＥＧＹ遺伝子の発現が増加するように、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加するように改変されなかったタバコ植物と比較したときに、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低下している、請求項８又は９に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
ＴＳＮＡが、ニコチン由来のニトロソアミンケトン（ＮＮＫ）、ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、又はＮ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）である、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１２】
植物が、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）種、又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）種に由来する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１３】
ＥＧＹポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
ａ．下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１１を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４１、Ｘ−４４２、Ｘ−４４３、Ｐｒｏ−４４４、Ｘ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｌｅｕ−４４８、Ａｓｐ−４４９、及びＧｌｙ−４５０を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを有するＥＧＹポリペプチドをコードし、式中Ｘは、任意のアミノ酸であり、前記保存された残基のナンバリングは、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質と有効同等な位置を意味するか、或いは
ｂ．配列番号２又は３として示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列若しくはその機能的断片、又は配列番号２若しくは３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列若しくはその機能的断片を含むか、或いは
ｃ．配列番号４、５、２１、若しくは２２として示されるポリヌクレオチド配列、又は配列番号４、５、２１、若しくは２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、或いは
ｄ．上記ａ．、ｂ．、又はｃ．に定義するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１４】
ＥＧＹ遺伝子又は前記ＥＧＹポリペプチドをコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドが、配列番号２若しくは３として示される配列、又はその機能的断片、或いは配列番号２又は３に対して少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の配列同一性を有する配列、又はその機能的断片を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１５】
請求項１３又は１４で定義するＥＧＹタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクター。
【請求項１６】
葉特異的又は葉選好性プロモーターと作動可能に連結した、請求項１３又は１４で定義するＥＧＹタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクター。
【請求項１７】
ｉ）外来性ＥＧＹポリヌクレオチドを含む、
ii）請求項１５若しくは１６に記載のコンストラクト若しくはベクターを含む、及び／又は
iii）請求項１〜１４のいずれかに記載の方法若しくは使用により得られる（例えば、得られた）
植物細胞（例えば、タバコ植物細胞）。
【請求項１８】
ｉ）外来性ＥＧＹポリヌクレオチドを含む、
ii）非改変植物との比較において、窒素の使用効率及び／若しくは窒素利用効率の増加を実現するように改変されており、前記改変が、前記改変された植物におけるＥＧＹポリペプチドの活性若しくは発現の増加である、
iii）請求項１〜１４のいずれかに記載の方法若しくは使用により得られる、
iv）請求項１５又は１６に記載のコンストラクト若しくはベクターを含む、並びに／又は
ｖ）請求項１７に記載の細胞を含む
植物（例えば、タバコ植物）。
【請求項１９】
請求項１８に記載の植物から得られる植物繁殖材料（例えば、植物の種子）。
【請求項２０】
請求項１８に記載の植物（例えば、タバコ植物）の収穫された葉、又は請求項１９に記載の繁殖材料から得られる収穫された葉、若しくは請求項１〜１４のいずれかに記載の方法から得られる収穫された葉。
【請求項２１】
カットされ収穫された葉である、請求項１６に記載の植物（例えば、タバコ植物）の収穫された葉。
【請求項２２】
ａ．請求項１７に記載の植物細胞を含む、
ｂ．請求項１〜１４のいずれかに記載の方法から得られる植物から得られる、
ｃ．請求項１８に記載の植物を加工するステップから得られる、
ｄ．請求項１９に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物から得られる、及び／又は
ｅ．請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉を加工するステップにより得られる
加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉、好ましくは非生存の加工されたタバコ葉）。
【請求項２３】
植物又は葉が、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せにより加工される、請求項２２に記載の加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）。
【請求項２４】
カットされ加工された葉である、請求項２２又は２３に記載の加工された葉。
【請求項２５】
植物が、作物植物、例えば、果実作物、種子作物、マメ科植物、又はナッツ作物である、請求項１７に記載の植物細胞、請求項１８に記載の植物、請求項１９に記載の植物繁殖材料、請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉、又は請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工された葉。
【請求項２６】
植物が、ニコチアナ・タバカム種又はニコチアナ・ルスティカ種に由来する、請求項１７に記載の植物細胞、請求項１８に記載の植物、請求項１９に記載の植物繁殖材料、請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉、又は請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工された葉。
【請求項２７】
ａ．請求項１〜１４のいずれかに記載の方法により得られた若しくは得られる植物から調製された、
ｂ．請求項１８に記載の植物から調製された、
ｃ．請求項１９に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物から調製された、
ｄ．請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉から調製された、
ｅ．請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工葉から調製された、及び／又は
ｆ．請求項１８に記載の改変された植物から得られた若しくは得られる植物抽出物から調製される、又は前記植物抽出物を含む
植物製品。
【請求項２８】
消費可能な植物製品である、請求項２７に記載の植物製品。
【請求項２９】
タバコ製品である、請求項２８に記載の消費可能な植物製品。
【請求項３０】
喫煙物品である、請求項２９に記載のタバコ製品。
【請求項３１】
無煙タバコ製品である、請求項３０に記載のタバコ製品。
【請求項３２】
タバコ加熱デバイス、例えば、エアゾール発生デバイスである、請求項３０又は３１に記載のタバコ製品。
【請求項３３】
請求項１８に記載の植物の植物抽出物（例えば、タバコ抽出物）、又は前記植物の一部分の植物抽出物（例えば、タバコ抽出物）。
【請求項３４】
請求項１２に記載の方法により、又は請求項１８に記載の植物から得られた若しくは得られるニコチアナ・タバカム種又はニコチアナ・ルスティカ種に由来する植物若しくはその一部分を含む、喫煙物品、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイス。
【請求項３５】
請求項２７〜３２のいずれかで定義する製品を製造するための、
ａ．請求項１８に記載の植物若しくはその一部、
ｂ．請求項１９に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物（好ましくは葉）、
ｃ．請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉、
ｄ．請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工された葉、及び／又は
ｅ．請求項１８に記載の植物から得られた植物抽出物
の使用。
【請求項３６】
植物を育種するための、請求項１８に記載の植物の使用。
【請求項３７】
作物を成長させるための、請求項１８に記載の植物の使用。
【請求項３８】
葉（例えば、加工された（好ましくは乾燥させた）葉）を製造するための、請求項１８に記載の植物の使用。
【請求項３９】
植物（例えば、タバコ植物）をＥＧＹバリアントについてスクリーニングする方法であって、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列と比較して、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントの存在を識別するステップと、前記野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列を含む植物と比較して、前記ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントがＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを増加させることをさらに決定する任意のステップとを含む、前記方法。
【請求項４０】
ＮＵＥの増加傾向及び／又はＮＵＴＬの増加傾向を有する植物（例えば、タバコ植物）を同定する方法であって、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列と比較して、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントの存在を識別するステップと、前記野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列を含む植物と比較して、前記ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントがＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを増加させることをさらに決定する任意のステップとを含む、前記方法。
【請求項４１】
植物が、タバコ植物であり、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列が、配列番号４、５、２１、又は２２として示される配列である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントが、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列を含む植物と比較して、植物中のＴＳＮＡレベルの低下と関連することを決定するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ａ．請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法により、ＮＵＥが増加している、及び／又はＮＵＴＬが増加していると同定されたドナー植物を、ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントを有さず、及び商業的に望ましい特性を有するレシピエント植物と交配させるステップと、
ｂ．前記レシピエント植物と交配させた前記ドナー植物の子孫に由来する遺伝物質を単離する任意のステップと、
ｃ．ＮＵＥの増加及び／又はＮＵＴＬの増加と関連する前記ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントを含む遺伝子移入領域を識別するステップを含む、分子マーカーを用いた分子マーカー支援式の選択を実施する任意のステップと
を含む、ＮＵＥが増加している、及び／又はＮＵＴＬが増加している植物を製造する方法。
【請求項４４】
実質的に、説明及び図面と参照しながら本明細書に記載するとおりの、方法、葉、植物、植物繁殖材料、収穫された葉、製品、使用、又はそれらの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を改善する方法、及び、特に、タバコ植物中のタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を低下させる方法に関する。本発明は、本方法により得られる植物、及びその下流製品（例えば、繁殖材料、収穫された（harvested）葉、加工された葉、及び消費可能な製品）にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口の増加に伴い、食物の増産が求められる。国連食糧農業機関（United Nations Food and Agricultural Organization）の予測（FAO, 2006, “World Agriculture: towards 2030/2050”. Interim Report. FAO, Rome, Italy）によれば、穀類の生産量は、２０００〜２０５０年にかけて６０％増加する必要がある。より多くの作物を生産するには、より多量の植物栄養分を必要とする。その結果として、作物の増産に対する要求に伴い、肥料消費量が顕著に増加する。肥料は、作物の収穫に伴う栄養分の田畑からの永続的な外部流出と、土壌より供給される栄養分の間のギャップを均衡させるために適用される。但し、適用された肥料のすべてが作物に行き着くわけではない。肥料栄養分の一部は、より広い環境に失われ、また環境問題を引き起こすおそれもある。
【０００３】
したがって、農業におけるより効率的な植物栄養分の使用に対する社会的及び政治的要求が存在する。
【０００４】
窒素（Ｎ）及び硝酸塩（ＮＯ３−）の利用能は、植物の代謝、成長、及び発育の多くの側面を制御する。窒素の使用効率（ＮＵＥ, nitrogen use efficiency）及び窒素利用効率（ＮＵＴＬ, nitrogen utilization efficiency）は、農業生産性を維持しつつ、窒素（Ｎ）の喪失を減少させる手段の有効性を評価するための重要な指標である。ＮＵＥは、適用された窒素１単位当たりの収穫された植物の物質重量として一般的に定義される。ＮＵＴＬは、植物に蓄積した窒素１単位当たりの収穫された物質重量として一般的に定義される。
【０００５】
ＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬの改善を目指すことが、したがって、農業業界にとって望ましい。
【０００６】
タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ, tobacco-specific nitrosamine）は、図１に示すように、ニコチン及び関連化合物から、タバコの乾燥工程及び加工工程期間中に生ずるニトロソ化反応により形成される。空気乾燥されたタバコ内のニトロソ化物質として、乾燥期間中の微生物の作用による葉中硝酸塩の還元に由来する亜硝酸塩が通常挙げられ、またニトロソアミンの生成は、高レベルの硝酸塩／亜硝酸塩及び一酸化窒素と相関することが明らかにされている（Liang S., Yang J., Zhou J., Yu J., Ma Y., Bai R., Xu F., Yang C; Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036）。外来物質を適用すれば、バーレイ種タバコにおいてアルカロイド及び亜硝酸塩の生合成が制御され、それによりタバコ特異的ニトロソアミンレベルを低下させることができる（Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036）。ＴＳＮＡの低減を目指すことがタバコ業界にとって望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】FAO, 2006, “World Agriculture: towards 2030/2050”. Interim Report. FAO, Rome, Italy
【非特許文献２】Liang S., Yang J., Zhou J., Yu J., Ma Y., Bai R., Xu F., Yang C; Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036
【非特許文献３】Acta Physiol. Plant. (2013) 35: 3027-3036
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、植物における窒素の使用効率（ＮＵＥ）及び／又は窒素利用効率（ＮＵＴＬ）を増加させる方法であって、植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ, ethylene-dependent gravitropism-deficient and yellow green protein）の活性又は発現を増加させることにより、前記植物を改変するステップを含む前記方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を増加させるための、植物中のＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現増加、又はＥＧＹタンパク質の活性増加の使用を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、タバコ植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ）の活性又は発現を増加させることにより、前記植物中の少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はその前駆体のレベルを低下させる方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはその前駆体が低下しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ収穫されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法を提供し、該方法は、前記植物において、ＥＧＹ遺伝子の発現が増加するように、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加するように、前記タバコ植物を改変するステップを含む。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、ＥＧＹタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターを提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、
ｉ）外来性ＥＧＹポリヌクレオチドを含む、
ii）本発明によるコンストラクト若しくはベクターを含む、及び／又は
iii）本発明の方法若しくは使用により得られる（例えば、得られた）
植物細胞（例えば、タバコ植物細胞）を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、
ｉ）外来性ＥＧＹポリヌクレオチドを含む、
ii）非改変植物との比較において、窒素の使用効率及び／若しくは窒素利用効率の増加を実現するように改変されており、前記改変が、前記改変された植物におけるＥＧＹポリペプチドの活性若しくは発現の増加である、
iii）本発明の方法若しくは使用により得られる、
iv）本発明のコンストラクト若しくはベクターを含む、並びに／又は
ｖ）本発明の細胞を含む
植物（例えば、タバコ植物）を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の植物から得られる植物繁殖材料（例えば、植物の種子）を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本発明による植物（例えば、タバコ植物）の、又は本発明による繁殖材料から得られる、又は本発明による方法から得られる収穫された葉を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、
ａ．本発明による植物細胞を含む、
ｂ．本発明による方法から得られる植物から得られる、
ｃ．本発明による植物を加工するステップから得られる、
ｄ．本発明による植物繁殖材料から繁殖させた植物から得られる、及び／又は
ｅ．本発明による収穫された葉を加工するステップにより得られる、
加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉、好ましくは非生存の加工されたタバコ葉）を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、
ａ．本発明による方法により得られた又は得られる植物から調製された、
ｂ．本発明による植物から調製された、
ｃ．本発明による植物繁殖材料から繁殖させた植物から調製された、
ｄ．本発明による収穫された葉から調製された、
ｅ．本発明による加工された葉から調製された、及び／又は
ｆ．本発明による改変された植物から得られた、若しくは得られる植物抽出物から調製される、若しくはそれを含む
植物製品を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本発明による方法又は本発明によるタバコ植物に基づくことにより得られた、又は得られるニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）の種に由来する植物又はその一部分を含む喫煙物品、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイスを提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の製品を製造するための
ａ．本発明による植物若しくはその一部、
ｂ．本発明による植物繁殖材料から繁殖させた植物（好ましくは葉）、
ｃ．本発明による収穫された葉、及び／又は
ｄ．本発明による加工された葉、
ｅ．本発明による植物から得られた植物抽出物
の使用を提供する。
【００２１】
本発明は、植物の育種のための本発明による植物の使用をさらに提供する。
【００２２】
本発明は、作物を成長させるための本発明による植物の使用をさらに提供する。
【００２３】
本発明は、葉（例えば、加工された（好ましくは乾燥させた（cured））葉）を製造するための本発明による植物の使用をさらに提供する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、植物（例えば、タバコ植物）をＥＧＹバリアントについてスクリーニングする方法であって、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列と比較して、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントの存在を識別するステップと、前記ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントがＮＵＥの増加及び／又はＮＵＴＬの増加と関連することをさらに決定する任意のステップとを含む、前記方法を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＮＵＥの増加傾向及び／又はＮＵＴＬの増加傾向を有する植物（例えば、タバコ植物）を同定する方法であって、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列と比較して、前記植物中のＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントの存在を識別するステップと、前記ＥＧＹポリヌクレオチド配列バリアントがＮＵＥの増加及び／又はＮＵＴＬの増加と関連することをさらに決定する任意のステップとを含む、前記方法を提供する。
【００２６】
本発明は、説明及び図面を参照しながら、本明細書に実質的に記載される方法、葉、植物、植物繁殖材料、収穫された葉、製品、使用、又はそれらの組合せをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】タバコ喫煙における、ニトロソ化反応による前駆体、例えばニコチン及びノルニコチン等からのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の形成を示す図である。
【図２】（Ａ）Ｙｂ１遺伝子及び（Ｂ）Ｙｂ２遺伝子のポジショナルクローニングを示す図である。暗線は、遺伝マーカーの相対的な位置を表すように引かれている。これらのマーカーの間の遺伝的距離をｃＭで示す。灰色長方形はエクソンを表す。（Ｃ）Ｙｂ突然変異の結果。Ｙｂ２のエクソン２内で８ｂｐ欠損すると、未成熟終止コドンにおいて終了する前に８個の擬アミノ酸の組込みを引き起こすフレームシフトが生ずる。Ｙｂ１のエクソン９内にＴが挿入されると、未成熟終止コドンにおいて終了する前に２１個の擬アミノ酸の組込みを引き起こすフレームシフトが生ずる。
【図３】シロイヌナズナ属（Arabidopsis）のＥＧＹ１（ＮＰ＿１９８３７２）、並びにニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）のＥＧＹ１（ＮｔＥＧＹ１）及びＥＧＹ２（ＮｔＥＧＹ２）に関するポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】Ｙｂ関連タンパク質のアミノ酸アラインメントを示す図である。ＭＵＳＣＬＥを使用してアラインメントを生成した。保存されたヌクレオチドを影付きの四角形で示す。３つの保存されたドメイン、ＧＮＬＲ、ＨＥＸＸＨ、及びＮＰＤＧに黒色の線で下線を付す。受託番号は以下の通り：シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＥＧＹ１（ＮＰ＿１９８３７２）、ゴシピウム・レモンディ（Gossypium raimondii）の予測されたＥＧＹ１（ＸＰ＿０１２４９２４８０）、ヴィティス・ヴィニフェラ種（Vitis vinifera）の予測されたＥＧＹ１（ＸＰ＿００２２６９４４７）、トマト（S. lycopersicum）Ｌ２（ＮＰ＿００１２９９８１６）、バレイショ（S. tuberosum）の予測されたＥＧＹ１（ＸＰ＿００６３３９２０２）。
【図５】非形質転換バーレイ種タバコの栽培品種ＴＮ９０ＬＣ、並びに３５Ｓ：ＮｔＹｂ１で形質転換したＲ０ＴＮ９０ＬＣ植物の遺伝子導入（緑色の茎）及び非遺伝子導入（白色の茎）Ｒ１子孫に関する収量、窒素の使用効率（Ｎ−ＵＳＥ, nitrogen use efficiency）、窒素利用効率（Ｎ−ＵＴＬ, nitrogen utilization efficiency）、及び硝酸塩レベルの平均値を示す図である。Ｒ１子孫の平均値は、３回の遺伝子導入イベントについて平均化した（遺伝子導入イベント１回につき、遺伝子型クラス毎にそれぞれ２０回測定した）。
【図６】バーレイ種タバコ栽培品種ＴＮ９０ＬＣにおいてＮｔＹｂ１が過剰発現したときに、空気乾燥された葉内でのＴＳＮＡ蓄積に与える効果を示す図である。総ＴＳＮＡは、ＮＮＮ、ＮＡＴ、ＮＡＢ、及びＮＮＫの合計として計算する。「ｎ」＝サンプリングされた植物の数に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
窒素の使用効率（ＮＵＥ又はＮ−ＵＳＥ）／窒素利用効率（ＮＵＴＬ又はＮ−ＵＴＬ）
窒素は、植物の成長に必要とされる主要な栄養素の１つであり、また一般的に植物の成長における律速要素である。窒素は、生存細胞に見出される非常に多くの重要な化合物、例えばアミノ酸、タンパク質（例えば、酵素）、核酸、及びクロロフィル等の一部をなす。植物乾燥物の１.５％〜２％が窒素であり、また植物タンパク質全体の約１６％を占める。したがって、窒素の利用能は、アミノ酸合成の他、アミノ酸組成、アミノ酸の蓄積に対して、タンパク質の合成及びその蓄積に対して重大な影響を有し、それに基づけば、窒素の利用能は植物の成長及び収量に対する重大な制限因子である（Frink et al.; Proc. Natl. Acad Sci. USA96, 1175 (1999)、参照として本明細書に組み込まれている）。
【００２９】
植物は、揮発性のアンモニア（ＮＨ３）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、硝酸塩（ＮＯ３−）やアンモニウム塩（ＮＨ４＋）等の無機窒素、尿素、及び尿素誘導体、並びに有機窒素（アミノ酸、ペプチド等）を含む、広範囲の窒素種を利用することができる。いくつかの植物は、共生細菌又は特定の菌類により大気中の窒素を利用することができる。しかし、ほとんどの農業土壌において、硝酸塩（ＮＯ３−）が窒素の最も重要な供給源である（Crawford N. M., Glass A. D. M., Trends in Plant Science, 3 389 (1998); Hirsch R. E. Sussman M. R., TIBTech 17, 356 (1999)、参照として本明細書に組み込まれている）。それにもかかわらず、両方の形態が存在するとき、ほとんどの植物は、たとえＮＨ４＋がＮＯ３−よりも低濃度で存在する場合であっても、ＮＨ４＋を優先的に取り込むので、アンモニウムＮＨ４＋もまた、過小評価されているかもしれないが重要な役割を演じている（von Wiren N. et al; Curr. Opin. Plant Bioi. 3, 254 (2000)、参照として本明細書に組み込まれている）。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明の方法及び／又は使用を実施すれば、その結果、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかった植物と比較して、改変された植物においてＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬが増加する。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明の方法及び／又は使用を実施すれば、その結果、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかった植物と比較して、改変された植物においてＮＵＥが増加する。
【００３２】
１つの実施形態では、本発明の方法及び／又は使用を実施すれば、その結果、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかった植物と比較して、改変された植物においてＮＵＴＬが増加する。
【００３３】
ＮＵＥは、適用された窒素１単位当たりの、収穫された植物の物質重量として一般的に定義される。ＮＵＴＬは、植物に蓄積された窒素１単位当たりの収穫された物質重量として一般的に定義される。
【００３４】
ＮＵＥを計算するための適する様々な方法が当技術分野において公知である（例えば、参照として本明細書に組み込まれているCarranca et al.; Farming for Food and Water Security; 2012; pp. 57-82; Weih et al.; Plant Soil 2011, 339, 513-520; Weih; Agronomy 2014, 4 (4), 470-477）。
【００３５】
したがって、ＮＵＥ及びＮＵＴＬは、当技術分野において公知の任意の適する方法を使用して計算され得る。
【００３６】
好適には、ＮＵＥは、下記の方法に基づき計算され得る（そのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれるLewis et al.; J. Agric. Food Chem. 60:6454-6461 (2012); Moll et al.; Agron. J.; 74, 562-564; (1982)の記載に従い）：
N-使用効率(N-USE(kg)kg-1)=(乾燥した葉の収量(kg)ha-1/単位Ｎ肥料(kg)ha-1)，
【００３７】
好適には、ＮＵＥは、下記の方法に基づきやはり計算され得る：
N-使用効率(N-USE(g)g-1)=(植物バイオマス(グラム)植物-1/単位N肥料(グラム)植物-1)
【００３８】
好適には、ＮＵＴＬは、下記の方法に基づき計算され得る（そのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれるLewis et al.; J. Agric. Food Chem. 60:6454-6461 (2012); Moll et al.; Agron. J.; 74, 562-564; (1982) の記載に従い）：
N利用効率(N-UTL(kg)kg-1)=(乾燥した葉の収量(kg)ha-1/N-ACC(kg)ha-1)、式中、N-ACC=(乾燥した葉の収量(kg)ha-1×総N濃度(g)kg-1)
【００３９】
好適には、ＮＵＴＬは、下記の方法に基づきやはり計算され得る：
N利用効率(N-UTL(g)g-1)=(植物バイオマス(g)植物-1/N-ACC(g)植物-1)
式中、N-ACC=(植物バイオマス(g)植物-1×%N*10)/1000
【００４０】
好適には、総窒素は、Ｎｅｌｓｏｎ及びＳｏｍｍｅｒｓに記載の方法に基づき計算され得るが（Agron. J. 65:109-112;1973 -参照として本明細書に組み込まれる）、また硝酸塩の蓄積（ＮＯ３−Ｎ）は、参照として本明細書に組み込まれるＣＯＲＥＳＴＡの推奨法Ｎｏ．３６（２０１１）に基づき計算され得る。
【００４１】
ＮＵＴＬを計算するための上記方法は、植物のすべての部分に関する総窒素ではなく、葉内のみの総窒素に基づく。好適には、１つの実施形態では、葉柄、主脈、及び根の組織窒素濃度は、葉窒素濃度に比例する。１つの実施形態では、ＮＵＥは、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％増加し得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＮＵＥは約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、１％〜約１０％、２％〜約１０％、又は約２％〜５％増加し得る。
【００４３】
１つの実施形態では、ＮＵＴＬは、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％増加し得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＮＵＴＬは、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、１％〜約１０％、２％〜約１０％、又は約２％〜５％増加し得る。
【００４５】
１つの実施形態では、用語「ＮＵＥを増加させる」及び／又は「ＮＵＴＬを増加させる」とは、改変された植物が正常条件下又は窒素欠乏条件下で収量の一般的な増強を示すことを意味する。
【００４６】
用語「収量」とは、本明細書で用いる場合、一般的に植物、特に作物から生み出される測定指標を意味する。収量及び収量増加（非改変植物との比較において）は、いくつかの方法で測定可能であり、また当業者は、特定の実施形態、特定の関係する作物、及び特定の目的又は関係する用途を考慮して正しい手段を適用することができるものと理解される。本明細書に記載する本発明の好ましい実施形態では、収量の増加とは、バイオマスの収量増加、種子の収量増加、及び／又は植物全体若しくはその一部の１若しくは２以上の特定の含有物（複数可）、若しくは植物の種子（複数可）に関する収量の増加を意味する。好適には、「収量」とは、特定の状況（試験条件、対象とする特定の作物、対象とする用途等）に応じて、植物の地上部分及び／又は地下部分のそれぞれに関して、乾燥重量のバイオマス収量及び／又は新鮮重量のバイオマス収量を含むバイオマス収量を意味する。いずれの場合にも、バイオマス収量は、新鮮重量、乾燥重量として、又は水分補正後を基準として、また一方、１つの植物を基準として、又は特定の面積（例えば、１エーカー／１平方メートル当たりのバイオマス収量等）に関連して計算され得る。好適には、「収量」とは、下記のパラメーターのうちの１又は２以上により測定可能である種子の収量を意味する：種子の数又は充実種子の数（１植物当たり、又は面積当たり（１エーカー／１平方メートル等））；種子充実率（充実種子数と総種子数の間の比）；１植物当たりの花の数；種子バイオマス又は総種子重量（１植物当たり、又は面積当たり（１エーカー／１平方メートル等）；千粒重（ＴＫＷ, thousand kernel weight；計測された充実種子の数及びその総重量から外挿）；ＴＫＷの増加は、種子サイズの増加、種子重量の増加により引き起こされ得る；又は種子収量の測定を可能にするその他のパラメーター。種子収量は、乾燥重量又は新鮮重量を基準として、又は一般的に、例えば１５．５パーセントの湿度における水分補正後を基準に決定され得る。
【００４７】
好ましい実施形態では、収量とは、収穫可能な産物のバイオマスを意味する。
【００４８】
好適には、バイオマスは、乾燥バイオマスであり得る。
【００４９】
好適には、バイオマスは、地上部のバイオマス、好ましくは地上部の乾燥バイオマスであり得る。
【００５０】
好適には、バイオマスは、新鮮重量バイオマス、例えば、地上部の新鮮重量バイオマスであり得る。
【００５１】
好適には、バイオマスは、植物の収穫可能な部分を意味し得る。
【００５２】
用語「地上部」とは、本明細書で用いる場合、地上にある植物の一部（複数可）を意味し、葉、果物、種子、及び茎を含み得る。１つの実施形態では、植物の地上部分という用語は、本明細書で用いる場合、葉のみ、又は植物の葉及び／若しくは茎を意味する。好ましくは、「地上部」という用語は、植物の葉を指すのに使用される。
【００５３】
１つの実施形態では、用語「バイオマスの増強」とは、野生型の光合成が活発な対応する生物と比較して、植物が、窒素供給が制限された条件下でも成長速度の増加を示すことを意味する。成長速度の増加は、全植物のバイオマス産生量の増加により、又は植物の地上部分のバイオマス産生量の増加により、又は植物の地下部分のバイオマス産生量の増加により、又は植物の一部、例えば茎、葉、花、果物、種子等のバイオマス産生量の増加により特に反映され得る。
【００５４】
その一実施形態では、バイオマス産生量の増加には、より高い果実収量、より高い種子収量、より高い新鮮物の生産、及び／又はより高い乾燥物の生産が含まれる。
【００５５】
１つの実施形態では、バイオマスは、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％増加し得る。いくつかの実施形態では、バイオマスは、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、１％〜約１０％、２％〜約１０％、又は約２％〜５％増加し得る。
【００５６】
エチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ）
エチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ）は、葉緑体中のチラコイド・グラナ及び十分に組織化されたラメラの両方の発達に必要とされる、膜会合型のＡＴＰ非依存性メタロプロテアーゼである。ＥＧＹは、葉緑体膜におけるクロロフィル及びクロロフィルａ／ｂ結合（ＣＡＢ, chlorophyll a/b binding）タンパク質の蓄積、並びにグラナ形成及び正常な葉緑体の発達に必要とされる。ＥＧＹは、アンモニウムストレスに応答する核の遺伝子発現の制御に関与し、及びＡＢＡシグナル伝達と相互作用し、及びインビトロにおいてＡＴＰ非依存様式でベータ−カゼインを分解する。
【００５７】
用語「ＥＧＹタンパク質」及び「ＥＧＹポリペプチド」は、保存されたＧＮＬＲ、ＨＥＸＸＨ、及びＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを含むタンパク質を指すのに本明細書で使用される。１つの実施形態では、用語「ＥＧＹタンパク質」及び「ＥＧＹポリペプチド」は、ＧＮＬＲ、ＨＥＸＸＨ、及びＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを含み、並びにＡＴＰ非依存性のメタロプロテアーゼ活性を提供するタンパク質を指すのに使用される。
【００５８】
用語「ＥＧＹタンパク質の活性又は発現を増加させる」とは、植物中のＥＧＹタンパク質の発現又は活性が全体として、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかった植物と比較して、改変された植物において増加することを意味する。
【００５９】
１つの実施形態では、改変された植物におけるＥＧＹタンパク質の活性又は発現の増加は、非改変植物と比較したとき、約５％を超え得る。好適には、ＥＧＹタンパク質の発現又は活性の増加は、約１０％を超え、好適には約１５％を超え得る。いくつかの実施形態では、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現の増加は、約２０％を超え、より好適には約３０％を超え得る。いくつかの実施形態では、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現の増加は、約４０％、例えば約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％等を超え得る。
【００６０】
１つの実施形態では、本方法及び／又は使用は、２つ以上のＥＧＹポリヌクレオチド、遺伝子、又はタンパク質の発現又は活性を増加させるステップを含み得る。
【００６１】
１又は２以上のＥＧＹポリヌクレオチド、遺伝子、又はタンパク質は、本明細書に記載するような任意のＥＧＹポリヌクレオチド、遺伝子、又はタンパク質であり得る。
【００６２】
好適には、本方法及び／又は使用は、ＮｔＥＧＹ１及び／又はｎｔＥＧＹ２の発現を増加させるステップを含み得る。
【００６３】
１つの実施形態では、ＥＧＹバリアントは、野生型ＥＧＹポリペプチドと比較して、増加した活性を有するＥＧＹポリペプチドであり得る。
【００６４】
好適には、野生型ＥＧＹポリペプチドは、例えば、例えば配列番号２又は３として示される配列の１つを含むニコチアナＥＧＹ１又はＥＧＹ２配列として示されるＥＧＹポリペプチド、シロイヌナズナ属ＥＧＹ１（ＡｔＥＧＹ, Arabidopsis EGY1）（ＮＰ＿１９８３７２）、ゴシピウム・レモンディＥＧＹ１（ＧｒＥＧＹ１, Gossypium raimondii EGY1）（ＸＰ＿０１２４９２４８０）、ヴィティス・ヴィニフェラ種ＥＧＹ１（ＶｖＥＧＹ１, Vitis vinifera EGY1）（ＸＰ＿００２２６９４４７）、トマトＬ２（Ｓｌ  Ｌ２, S. lycopersicum L2）（ＮＰ＿００１２９９８１６）、又はバレイショＥＧＹ１（Ｓｔ  ＥＧＹ１, S. tuberosum EGY1）（ＸＰ＿００６３３９２０２）であり得る。
【００６５】
好適には、野生型ＥＧＹポリペプチドは、配列番号１、２、３、１７、１８、１９、又は２０として示される配列を含み得る。１つの実施形態では、野生型ＥＧＹポリペプチドは、配列番号２又は３として示される配列を含み得る。
【００６６】
ＥＧＹポリペプチドバリアントは、野生型ＥＧＹポリペプチドと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％増加した活性レベルを有し得る。
【００６７】
野生型ＥＧＹポリペプチドと比較して増加した活性を有するＥＧＹポリペプチドバリアントは、植物内で発現したとき、野生型ＥＧＹタンパク質よりもＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを増加させ得る。
【００６８】
好適には、ＥＧＹポリペプチドバリアントは、植物内で発現したとき、野生型ＥＧＹポリペプチドよりもＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％多く増加させ得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現を増加させる植物の改変は、遺伝子編集を使用して実施され得る。
【００７０】
遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実施され得る。いくつかの非限定的な例を、CRISPR-Cas9システムの使用を含め、ここに提示する。CRISPR/Cas9ゲノム編集ツール、例えばClontech社製（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye、France）の「Guide-it」等が市販されている。遺伝子編集の別の方法として、市販キット（例えば、Addgene社製、1Kendall Sq. Ste. B7102、Cambridge、MA 02139、USA）によるTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）技術の使用が挙げられる。さらなる方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えばSigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術等の使用を含む。別の方法は、Silva et al Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット及び国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレット（その教示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているメガヌクレアーゼの使用（又はさらなる方法）を含む。なおもさらなる方法として、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ＯＤＭ，oligonucleotide-directed mutagenesis）、例えばKeygene社 (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)から入手可能なKeyBase（登録商標）等が挙げられる。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明に基づき使用されるＥＧＹタンパク質、及び／又はＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＥＧＹ遺伝子）は、植物（例えば、タバコ植物）に対して内在性であり得る。
【００７２】
本明細書で「内在性」遺伝子と呼ぶ場合、それは、その天然の形態（すなわち、何らかのヒトによる介入が存在しない）で植物に見出される対象遺伝子を意味するだけでなく、単離された形態の同一遺伝子（又は実質的に相同的な核酸／遺伝子）であって、その後、植物に（再）導入された遺伝子（導入遺伝子）をも意味する。例えば、そのような導入遺伝子を含有する遺伝子導入植物では、導入遺伝子発現が実質的に低減する、及び／又は内在性遺伝子の発現が実質的に低減することとなり得る。単離される遺伝子は、生物から単離され得る、又は例えば化学合成による人工物であり得る。
【００７３】
別の実施形態では、本発明に基づき使用されるＥＧＹタンパク質は、植物（例えば、タバコ植物）に対して外来性であり得る。
【００７４】
ＥＧＹタンパク質の例として、ニコチアナＥＧＹ１又はＥＧＹ２（例えば、配列番号２及び３をそれぞれ含む）、シロイヌナズナ属ＥＧＹ１（ＡｔＥＧＹ）（ＮＰ＿１９８３７２）、ゴシピウム・レモンディＥＧＹ１（ＧｒＥＧＹ１）（ＸＰ＿０１２４９２４８０）、ヴィティス・ヴィニフェラ種ＥＧＹ１（ＶｖＥＧＹ１）（ＸＰ＿００２２６９４４７）、トマトＬ２（Ｓｌ  Ｌ２）（ＮＰ＿００１２９９８１６）、バレイショＥＧＹ１（Ｓｔ  ＥＧＹ１）（ＸＰ＿００６３３９２０２）が挙げられる。
【００７５】
１つの実施形態では、ＥＧＹポリペプチドは、下記のアミノ酸配列を含む：
ｉ）ＧＮＬＲ（配列番号６）
ii）ＨＥＸＸＨ、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である（配列番号７）
iii）ＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧ、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である（配列番号８）
【００７６】
１つの実施形態では、ＥＧＹポリペプチドは、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１１を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４１、Ｘ−４４２、Ｘ−４４３、Ｐｒｏ−４４４、Ｘ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｌｅｕ−４４８、Ａｓｐ−４４９、及びＧｌｙ−４５０を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、保存された残基のナンバリングは、ＥＧＹタンパク質が配列番号１を有するシロイヌナズナＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされた有効同等な位置を意味する。
【００７７】
１つの実施形態では、ＥＧＹポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３として示されるポリペプチド又はその機能的断片、或いは配列番号２若しくは３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列又はその機能的断片を含む。
【００７８】
好適には、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも８０％の同一性を有し得る。
【００７９】
より好適には、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【００８０】
より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００８１】
用語「機能的断片」とは、本明細書で用いる場合、ＥＧＹタンパク質をコードする能力を有し、その活性を保持するポリペプチドの一部分を意味する。１つの実施形態では、機能的断片は、本明細書に記載するＥＧＹポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、又は少なくとも５００個のアミノ酸を含む本発明のポリペプチドの一部分であり得る。
【００８２】
１つの実施形態では、ＥＧＹポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３、又は配列番号２若しくは３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列として示されるポリペプチドを含む。好適には、ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有し得る。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００８３】
１つの実施形態では、ＥＧＹポリヌクレオチドは、ＮｔＥＧＹ１、ＮｔＥＧＹ２、ＡｔＥＧＹ（ＮＭ＿１２２９１３．３）、ＧｒＥＧＹ１（ＸＭ＿０１２６３７０２６）、ＶｖＥＧＹ１（ＸＭ＿００２２６９４１１．２）、Ｓｌ  Ｌ２（ＮＭ＿００１３１２８８７．１）、又はＳｔＥＧＹ１（ＸＭ＿００６３３９１４０．２）であり得る。
【００８４】
好適には、ＥＧＹ遺伝子又はポリヌクレオチドは、ＮｔＥＧＹ１及び／又はＮｔＥＧＹ２である。
【００８５】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号４、又は配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。好適には、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有し得る。より好ましくは、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号４と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００８６】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号４を含む又はそれからなる。
【００８７】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ１遺伝子は、ＮｔＥＧＹ１として本明細書で定義するポリヌクレオチド配列に転写されるゲノムポリヌクレオチド配列である。１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ１のゲノムポリヌクレオチド配列は、配列番号２１、又は配列番号２１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。好適には、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号２１と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号２１と少なくとも９５％の同一性を有し得る。より好ましくは、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号２１と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００８８】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ１は、配列番号２１を含む又はそれからなる。
【００８９】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号５、又は配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。好適にはＮｔＥＧＹ２は、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有し得る。より好ましくは、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号５と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００９０】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号５を含む又はそれからなる。
【００９１】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ２遺伝子は、ＮｔＥＧＹ２として本明細書で定義するポリヌクレオチド配列に転写されるゲノムポリヌクレオチド配列である。１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ２ポリヌクレオチド配列は、配列番号２２、又は配列番号２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。好適には、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号２２と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好ましくは、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号２２と少なくとも９５％の同一性を有し得る。より好ましくは、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号２２と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００９２】
１つの実施形態では、ＮｔＥＧＹ２は、配列番号２２を含む又はそれからなる。
【００９３】
１つの実施形態では、ＥＧＹ遺伝子又はポリヌクレオチドは、配列番号４、５、２１、若しくは２２、又はその機能的断片；或いは配列番号４、５、２１、若しくは２２、又はその機能的断片に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列番号４、５、２１、若しくは２２のバリアント、又はその機能的断片を含む。好適には、バリアントは、配列番号４、５、２１、若しくは２２、又はその機能的断片に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。好適には、バリアントは、配列番号４、５、２１、若しくは２２、又はその機能的断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。好適には、バリアントは、配列番号４、５、２１、若しくは２２、又はその機能的断片に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。好適には、バリアントは、配列番号４、５、２１、若しくは２２、又はその機能的断片に対して、少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
【００９４】
さらなる実施形態では、本発明に基づき用いられるＥＧＹポリペプチドは、
ｉ）配列番号４、配列番号５、配列番号２１、若しくは配列番号２２として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、
ii）ＥＧＹポリペプチドをコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号２、若しくは配列番号３として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度にストリンジェントな条件下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に教示するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列、
を含むポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９５】
用語「遺伝子コードの縮重」とは、本明細書で用いる場合、ポリペプチド配列をコードするコドンにおける冗長性を意味し、アミノ酸を規定する３コドンの組合せの多様性として顕在化する。例えば、イソロイシンアミノ酸を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子では、イソロイシンは、ＡＵＵ、ＡＵＣ、又はＡＵＡによりコードされ得る。これは、得られたポリペプチドは同一の配列を有するものの、ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は複数の配列を有し得ることを意味する。換言すれば、ヌクレオチド配列が多型であっても、同一のポリペプチド生成物をコードすることができる。これは、同一のポリペプチド配列をコードするにもかかわらず、１つの核酸配列は、第２の配列に対して配列の同一性が非常に低い配列を含み得ることを意味する。
【００９６】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号２１、又は配列番号２２と、少なくとも８０％の同一性を有し得る。好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号２１、又は配列番号２２と、少なくとも９０％の同一性を有し得る。好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号２１、又は配列番号２２と、少なくとも９５％の同一性（より好適には、少なくとも９９％の同一性）を有し得る。より好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号２１、又は配列番号２２と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００９７】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し得る。好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号５と少なくとも９５％の同一性（より好適には少なくとも９９％の同一性）を有し得る。より好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は配列番号５と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００９８】
１つの実施形態では、ＥＧＹバリアントは、野生型ＥＧＹポリペプチドと比較して活性が低下したＥＧＹポリペプチドであり得る。
【００９９】
好適には、野生型ＥＧＹポリペプチドは、例えば、例えば配列番号２又は３として示される配列の１つを含むニコチアナＥＧＹ１又はＥＧＹ２配列、シロイヌナズナ属ＥＧＹ１（ＡｔＥＧＹ）（ＮＰ＿１９８３７２）、ゴシピウム・レモンディＥＧＹ１（ＧｒＥＧＹ１）（ＸＰ＿０１２４９２４８０）、ヴィティス・ヴィニフェラ種ＥＧＹ１（ＶｖＥＧＹ１）（ＸＰ＿００２２６９４４７）、トマトＬ２（Ｓｌ  Ｌ２）（ＮＰ＿００１２９９８１６）、又はバレイショＥＧＹ１（Ｓｔ  ＥＧＹ１）（ＸＰ＿００６３３９２０２）として示されるＥＧＹポリペプチドであり得る。
【０１００】
好適には、野生型ＥＧＹポリペプチドは、配列番号１、２、３、１７、１８、１９、又は２０として示される配列を含み得る。１つの実施形態では、野生型ＥＧＹポリペプチドは、配列番号２又は３として示される配列を含み得る。
【０１０１】
活性が低下しているＥＧＹバリアントは、当技術分野において公知である様々な方法を使用して生成され得る。一例として、野生型ＥＧＹポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子編集によりＥＧＹタンパク質の活性が低下するように改変され得る。遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して実施され得る。いくつかの非限定的な例を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の使用を含めここに提示する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ツール、例えばClontech社製（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France）の「Guide-it」等が市販されている。遺伝子編集の別の方法として、市販キット（例えば、Addgene社製, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA）によるTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）技術の使用が挙げられる。さらなる方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えばSigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術等の使用を含む。別の方法は、Silva et al Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27、国際公開第２００７／０４７８５９号、及び国際公開第２００９／０５９１９５号（その教示は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているメガヌクレアーゼ（又はさらなる方法）の使用を含む。なおもさらなる方法として、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ODM, oligonucleotide-directed mutagenesis）、例えばKeygene社（Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands）から入手可能なKeyBase（登録商標）等が挙げられる。
【０１０２】
ＥＧＹポリペプチドバリアントは、野生型ＥＧＹポリペプチドと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％低下した活性レベルを有し得る。
【０１０３】
野生型ＥＧＹポリペプチドと比較して活性が低下しているＥＧＹポリペプチドバリアントは、植物内で発現したとき、ＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬ増加量が野生型ＥＧＹタンパク質よりも少ない可能性がある。
【０１０４】
好適には、ＥＧＹポリペプチドのバリアントは、植物内で発現したとき、ＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬ増加が野生型ＥＧＹポリペプチドよりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％少ない可能性がある。
【０１０５】
好適には、タバコ品種（例えば、イエローバーレイ品種）の官能的特徴を保持しつつ、ＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを増加させるために、活性が低下しているＥＧＹバリアントが、タバコ品種、例えばイエローバーレイ種等においてＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを増加させるのに使用され得る。
【０１０６】
ＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬは、本明細書に記載する任意の適する方法により決定され得る。
【０１０７】
タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）
図１に示すように、タバコ葉内の残留窒素が、ニトロソ化反応を通じて、ニトロソアミンの形成に寄与することは周知されている。特に、硝酸塩及び亜硝酸塩及び一酸化窒素（ＮＯ）は、乾燥葉内で、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）形成に対する前駆体として作用する。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、ＥＧＹタンパク質の発現を調節することにより、硝酸同化を修正すれば、亜硝酸塩及び一酸化窒素（ＮＯ, nitric oxide）の生成を調節する、したがってタバコ葉の乾燥及び加工期間中に形成されるＴＳＮＡのレベルを調節する能力がもたらされると考える。特に、発現及び／又は活性、ＥＧＹタンパク質の発現を増加させることにより、植物硝酸レダクターゼ酵素又は微生物活性による亜硝酸塩への還元に利用可能なフリーのＮＯ３−Ｎのプール（空気乾燥タバコにおいてＴＳＮＡを形成するための一次ニトロソ化物質）が低下し、したがってＴＳＮＡレベルも低下する。
【０１０８】
したがって、１つの態様では、本発明は、タバコ植物（例えば、タバコ植物の葉）中の少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はその前駆体のレベルを低下させる方法であって、前記植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質（ＥＧＹ）の活性又は発現を増加させることにより植物を改変するステップを含む、前記方法を提供する。
【０１０９】
本発明は、タバコ植物において、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減のための、ＥＧＹ遺伝子の発現増加、又はＥＧＹタンパク質の活性増加の使用も提供する。
【０１１０】
ＥＧＹ遺伝子の発現が増加している、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加しているタバコ植物から調製されるタバコ製品中のＴＳＮＡ含有量又は濃度を低減することは、極めて有利な技術的効果となる。
【０１１１】
１つの実施形態では、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低減しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、加工されたタバコ葉、カットされたタバコ葉又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法が提供され、該方法は、ＥＧＹ遺伝子の発現が増加、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加するように、前記タバコ植物を改変するステップを含む。
【０１１２】
用語「タバコ特異的ニトロソアミン」又は「ＴＳＮＡ」は、本明細書で用いる場合、当技術分野におけるその通常の意味を有する、すなわちタバコ製品又はその他のニコチン含有製品にのみ見出されるニトロソアミンを指す。好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ，4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ，N'-nitrosonornicotine）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ，N'-nitrosoanatabine）、又はＮ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ，N-nitrosoanabasine）であり得る。
【０１１３】
より好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、ＮＮＫ又はＮＮＮであり得る。
【０１１４】
用語「その前駆体」とは、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンと関連して使用される場合、タバコ特異的ニトロソアミンの形成を誘発する、又はニトロソ化反応に関与し、タバコ特異的ニトロソアミンの生成を引き起こすタバコ植物の１又は２以上の化学物質又は化合物を意味する。好適には、用語「その前駆体」とは、硝酸塩、亜硝酸塩、又は一酸化窒素を指し得る。好適には、用語「その前駆体」は硝酸塩を意味し得る。
【０１１５】
１つの実施形態では、本発明の方法及び／又は使用を実行すれば、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物と比較して、改変されたタバコ植物において少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減が引き起こされる。
【０１１６】
用語「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体を低減する」又は「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減」は、本発明の製品、方法、又は使用における少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量が、同等の製品、方法、又は使用に関連して低いことを意味するように、本明細書では使用される。例えば、同等のタバコ製品は、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性（例えば植物種、成長条件、タバコ加工方法等）は同一であったタバコ植物に由来する。
【０１１７】
少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための、当技術分野において公知のあらゆる方法が利用可能である。特に、本明細書の実施例４に詳記するような方法が利用可能である。例えば、タバコ特異的ニトロソアミンの前駆体の濃度及び／又はレベルを決定する際には、例えば国際公開第２００９／０２２１８３号パンフレット、Morot-Gaudry-Talarmain et al., 2002, Planta, 215:708-715、又はMur et al., Plant Science 181 (2011) 509-519に詳記する方法等（本明細書に参照として組み込まれる）が利用可能である。
【０１１８】
好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、本発明の方法及び／又は使用を実施することにより低減され得る。好適には、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物内の少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（複数可）若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルと比較して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルは、本発明のタバコ植物（例えば、本発明の方法及び／又は使用により得られる若しくは得られた）において低減され得る。
【０１１９】
少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（複数可）若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されなかったタバコ植物から得られる若しくは得られたタバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉、タバコ製品、若しくはそれらの組合せと比較して、本発明のタバコ植物から得られる若しくは得られたタバコ葉、収穫された葉、加工されたタバコ葉、タバコ製品、若しくはそれらの組合せにおいて低減され得る。
【０１２０】
好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、タバコ植物葉において低減され得る。好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又は総含有量は、加工されたタバコ葉において低減され得る。
【０１２１】
好適には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体の濃度及び／又はレベルは、タバコ製品において低減され得る。
【０１２２】
１つの実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、３０％〜約７０％、又は約４０％〜６０％低減され得る。
【０１２３】
加工された（例えば、乾燥させた）タバコ葉に関連して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、約５０００ｎｇ／ｇ〜約５０ｎｇ／ｇ、約４０００ｎｇ／ｇ〜約１００ｎｇ／ｇ、約３０００ｎｇ／ｇ〜５００ｎｇ／ｇ、又は２０００ｎｇ／ｇ〜１０００ｎｇ／ｇ低減され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはその前駆体は、少なくとも約５０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約５００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１００ｎｇ／ｇ、又は少なくとも約５０ｎｇ／ｇ低減され得る。
【０１２４】
発現の増加
本発明の方法及び使用は、少なくとも１つのＥＧＹタンパク質について、その発現の増加を含む。発現の増加は、当業者にとって公知の任意の手段により達成され得る。
【０１２５】
用語「発現の増加」又は「過剰発現」とは、本明細書で用いる場合、オリジナルの野生型発現レベルに付加する任意の発現形態を意味する。
【０１２６】
「発現の増加」とは、ある植物が、同一品種の親植物の発現レベルと比較して、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルにおいて増加していることを意味する。発現レベルは、同一条件下で培養される同一品種の親植物内の対応する部分と比較される。発現レベルが、親植物の発現レベルを少なくとも１．１倍上回り増加するケースが、発現レベルが増加するケースとして好ましくはみなされる。この場合、発現レベルの増加が認められるとみなされるためには、植物の発現レベルが、親植物の発現レベルと比較して、ｔ−検定により５％の有意差を有するのがより好ましい。植物及び親植物の発現レベルが、同一の方法により同時に測定されるのが好ましい。但し、バックグラウンドデータとして保管されたデータも利用可能である。
【０１２７】
遺伝子の発現又は遺伝子産物を増加させる方法は、当技術分野において十分に実証されており、また、例えば適するプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用を含む。プロモーター又はエンハンサーエレメントとして機能する単離された核酸は、所望のポリペプチドをコードする核酸の発現を上方制御するために、異種ではない形態（non-heterologous form）のポリヌクレオチドのしかるべき位置（一般的に上流）に導入され得る。例えば、内在性プロモーターが、インビボでの突然変異、欠損、及び／若しくは置換により変更され得る（参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，５６５，３５０号明細書；国際公開第９３２２４４３号パンフレットを参照）、又は遺伝子の発現を制御するために、単離されたプロモーターが、適切な向きで、本発明の遺伝子から距離を置いて植物細胞に導入され得る。
【０１２８】
ポリペプチドの発現が望ましい場合には、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端に、ポリアデニル化領域を含むのが一般的に望ましい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、その他の様々な植物遺伝子、又はＴ−ＤＮＡに由来し得る。付加される３１末端配列は、例えばノパリンシンターゼ又はオクトピンシンターゼ遺伝子に、又は代替的に別の植物遺伝子に、又はそれほど好ましくないが任意のその他の真核生物遺伝子に由来し得る。
【０１２９】
サイトゾル内に蓄積する成熟したメッセージの量を増やすために、イントロン配列も、コーディング配列又は部分的コーディング配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に付加され得る。転写ユニット内にスプライス可能なイントロンを組み込むと、植物発現コンストラクト及び動物発現コンストラクトのいずれにおいても、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において、最大１０００倍、遺伝子発現が増加することが明らかにされている（参照として本明細書に組み込まれているBuchman and Berg (1988) MoI. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200）。そのようなイントロンによる遺伝子発現の増強は、転写ユニットの５’末端近傍に配置したときに、一般的に最大となる。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、及び６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は、当技術分野において公知である。一般情報については、参照として本明細書に組み込まれるThe Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994)を参照すること。
【０１３０】
１つの実施形態では、発現の増加は、遺伝子編集又は標的を定めた突然変異誘発の使用により達成され得る。
【０１３１】
遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実施され得る。いくつかの非限定的な例を、CRISPR-Cas9システムの使用を含め、ここに提示する。CRISPR/Cas9ゲノム編集ツール、例えばClontech社製（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France）の「Guide-it」等が市販されている。遺伝子編集の別の方法として、市販キット（例えば、Addgene社製, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA）によるTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）技術の使用が挙げられる。さらなる方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えばSigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術等の使用を含む。別の方法は、Silva et al Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット及び国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレット（その教示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているメガヌクレアーゼの使用（又はさらなる方法）を含む。なおもさらなる方法として、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ＯＤＭ）、例えばKeygene社（Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands）から入手可能なKeyBase（登録商標）等が挙げられる。
【０１３２】
好適には、遺伝子編集は、ＥＧＹ遺伝子プロモーターの配列をインビボで変化させるのに利用可能である。
【０１３３】
本発明の別の実施形態では、ＥＧＹポリペプチドの発現増加は、ＥＧＹポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）を、植物内で発現させることにより達成され得る。１つの実施形態では、前記ポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）は、前記植物内で前記核酸配列の転写を指示するために、異種プロモーターと作動可能に連結したＥＧＹポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、老化特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生制御型プロモーター（developmentally-regulated promoter）、及び誘導性プロモーターからなる群から選択され得る。
【０１３５】
１つの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
【０１３６】
遺伝子はすべての細胞型において同一レベルで発現されない可能性はあるものの、構成的プロモーターは、植物の発育期間中に植物の様々な部分全体にわたり、連続的に遺伝子の発現を指示する。公知の構成的プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物（参照として本明細書に組み込まれているOdell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature. 313 810-2）、ライスアクチン１遺伝子（参照として本明細書に組み込まれているZhang W, McElroy D, Wu R. (1991). Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3 1155-65）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（参照として本明細書に組み込まれているCornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）と関連したものが挙げられる。構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ，carnation etched ring virus）プロモーター等（参照として本明細書に組み込まれているHull R, Sadler J, LongstaffM (1986) The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses. EMBO Journal, 5(2):3083-3090）。
【０１３７】
構成的プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、ライスアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来のプロモーターから選択され得る。
【０１３８】
好適には、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーターであり得る。
【０１３９】
１つの実施形態では、プロモーターは、老化特異的プロモーターであり得る。
【０１４０】
「老化特異的プロモーター」（ＳＡＧ，senescence-specific promoter）は、老化関連遺伝子の発現制御と関連するプロモーターであり得る。したがって、プロモーターはコーディング配列（すなわち、遺伝子）の発現を制限し得るが、該プロモーターは、実質的にもっぱら老化組織においてコーディング配列と作動可能に連結している。したがって、老化特異的プロモーターは、実質的に植物組織が老化を経た場合に限り、３’タンパク質コード領域の発現が生ずるように発生学的に制御された様式で、植物組織内において遺伝子発現を選択的に促進する能力を有するプロモーターであり得る。老化は、植物のより古い部分、例えばより古い葉等で生ずる傾向を有し、一方植物のより若い部分、例えば種子等では生じないものと認識される。
【０１４１】
非常に多くの老化関連遺伝子を発現することが公知である植物の一例として、シロイヌナズナが挙げられる。したがって、老化特異的プロモーターは、シロイヌナズナの老化関連遺伝子から単離され得る。Gepsteinら（参照として本明細書に組み込まれているThe Plant Journal, 2003, 36, 629-642）は、シロイヌナズナをモデルとして用いて、ＳＡＧ及びそのプロモーターについて詳細な試験を実施した。遺伝的コンストラクトは、本書に開示するＳＡＧのいずれかに由来するプロモーターを含み得る。例えば、適するプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１、若しくはＳＡＧ１８、及びその機能的バリアント若しくは機能的断片からなる群から選択され得る。
【０１４２】
１つの実施形態では、プロモーターは、当業者にとって公知のＳＡＧ１２プロモーター又はその機能的バリアント若しくは断片であり得る（参照として本明細書に組み込まれているGan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319）。
【０１４３】
適するプロモーター及びその配列は、本明細書に参照として組み込まれる国際公開第２０１０／０９７６２３号パンフレットに見出され得る。
【０１４４】
別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。
【０１４５】
組織特異的プロモーターは、植物の１つの（又はいくつかの）部分内にある遺伝子の発現を、通常そのような植物の部分の寿命全体にわたり指示するプロモーターである。組織特異的プロモーターのカテゴリーには、特異性が絶対的ではないプロモーターも一般的に含まれる、すなわち、該プロモーターは、好ましい組織以外の組織内においても低レベルの発現を指示し得る。
【０１４６】
いくつかの組織特異的プロモーターは、当技術分野において公知であり、またジャガイモの塊茎内で発現するパタチン遺伝子、及び小麦、大麦、又はトウモロコシの胚乳内で発現する高分子量グルテニン遺伝子と関連するプロモーターを含む。これらのプロモーターのいずれも、本発明で利用可能である。
【０１４７】
好適には、組織特異的プロモーターは、葉特異的プロモーターであり得る。適する葉特異的プロモーターは、アシンメトリックリーフ１（ＡＳ１，ASYMMETRIC LEAVES 1）を含み得る。
【０１４８】
別の実施形態では、プロモーターは、発生制御型プロモーターであり得る。
【０１４９】
発生制御型プロモーターは、植物の発育期間中の特定の時期において、１又は２以上の植物の部分に存在する遺伝子の発現変化を指示する。遺伝子は、その他の時期に、異なる（通常より低い）レベルで当該植物の部分内で発現し得るが、またその他の植物の部分においても発現し得る。
【０１５０】
１つの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０１５１】
誘導性プロモーターは、インデューサーに反応して遺伝子の発現を指示する能力を有する。インデューサーが存在しない場合には、遺伝子は発現しない。インデューサーは、プロモーター配列に直接作用し得る、又はリプレッサー分子の効果を和らげることにより作用し得る。インデューサーは、化学物質、例えば代謝物、タンパク質、増殖制御因子、又は毒性元素等、生理学的ストレス、例えば熱、傷害、若しくは浸透圧等、又は病原体若しくは害虫がもたらす作用の間接的結果であり得る。発生制御型プロモーターは、植物の生活環の特定の時点において、植物により産生される内在性インデューサー、又は環境上の刺激に応答する誘導性プロモーターの特定のタイプとして記載される場合もある。誘導性プロモーターの公知の例として、例えばWarner SA、Scott R、Draper J.（1993）が記載する傷害応答と関連するプロモーター（参照として本明細書に組み込まれているIsolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.）、Benfey及びChua (1989)が開示する温度応答と関連するプロモーター（参照として本明細書に組み込まれているBenfey, P.N., and Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181）、及びGatz (1995)が記載するような化学的に誘発されたプロモーター（参照として本明細書に組み込まれているGatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424）等が挙げられる。
【０１５２】
したがって、１つの実施形態では、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（完全型又はトランケーション型）、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α、β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、及びパタチンプロモーターからなる群から選択され得る。
【０１５３】
本発明は、葉特異的プロモーターと作動可能に連結したＥＧＹポリペプチドをコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターをさらに提供する。
【０１５４】
本発明は、老化特異的プロモーターと作動可能に連結したＥＧＹポリペプチドをコードする核酸を含むコンストラクト又はベクターも提供する。
【０１５５】
コンストラクトは、ベクターに含まれ得る。好適には、ベクターは、プラスミドであり得る。
【０１５６】
植物
本発明による植物（若しくはその一部）、又は植物細胞、又は植物繁殖材料は、作物植物、例えば、果実作物、種子作物、マメ科植物、又はナッツ作物であり得る。
【０１５７】
本発明に基づく作物植物は、タバコ、トマト、イチゴ、サクランボ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、グーズベリー、ラズベリー、クワの実、コショウ（カプシクム属）、コショウ（コショウ属）、スイカ、メロン、カボチャ、ウリ科植物又はオーバジーン（ナス）、オリーブ、ダイコン、西洋ワサビ、バナナ、リンゴ、洋ナシ、モモ、ブドウ、柑橘類、小麦、エンバク、大麦、ライコムギ、米、キノア（Chenopodium quinoa）、フォニオ（ジギタリア属（Digitaria））、トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、タマネギ、セイヨウネギ、キビ、ソバ、サトウキビ、ヒマワリ、油料種子のナタネ（キャノーラを含む）、オクラ、コーヒー、及びココア（Theobroma cacao）、パーム、綿、ココナッツ、ゴマ、ベニバナ、アマ、カポック、マスタード、ナツメグ、ホホバ、エンドウ豆、マメ、アルファルファ、レンズマメ、大豆、ピーナッツ、アーモンド、ペカン、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、カシューナッツ、ドングリ、ビーチナッツ、フィルバートナッツ、及びチェスナッツからなる群から選択され得る。
【０１５８】
本発明による植物（若しくはその一部）、又は植物細胞、又は植物繁殖材料は、果実作物であり得る。本発明に基づく果実作物は、トマト、イチゴ、サクランボ、アカフサスグリ、クロフサスグリ、グーズベリー、ラズベリー、クワの実、コショウ（カプシクム属）、コショウ（コショウ属）、スイカ、メロン、カボチャ、ウリ科植物、オーバジーン（ナス）、オリーブ、ダイコン、西洋ワサビ、バナナ、リンゴ、洋ナシ、モモ、ブドウ、及び柑橘類からなる群から選択され得る。
【０１５９】
本発明による植物（若しくはその一部）、又は植物細胞、又は植物繁殖材料は、種子作物であり得る。本発明に基づく種子作物は、穀類又は穀類作物、例えば、小麦、エンバク、大麦、ライコムギ、米、キノア（Chenopodium quinoa）、フォニオ（ジギタリア属）、トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、タマネギ、セイヨウネギ、キビ、ソバ、サトウキビからなる群から選択されるものであり得る。別の実施形態では、本発明に基づく種子作物は、ヒマワリ、油料種子のナタネ（キャノーラを含む）、オクラ、コーヒー、ココア（Theobroma cacao）、パーム、綿、ココナッツ、ゴマ、ベニバナ、アマ、カポック、マスタード、ナツメグ、及びホホバからなる群から選択され得る。
【０１６０】
本発明による植物（若しくはその一部）、又は植物細胞、又は植物繁殖材料は、マメ科植物であり得る。本発明に基づくマメ科植物は、エンドウ豆、マメ、アルファルファ、レンズマメ、大豆、及びピーナッツからなる群から選択され得る。
【０１６１】
本発明による植物（若しくはその一部）、又は植物細胞、又は植物繁殖材料は、果実作物又はナッツ作物である種子作物であり得る。本発明に基づくナッツ作物は、アーモンド、ペカン、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、カシューナッツ、ドングリ、ビーチナッツ、フィルバートナッツ、及びチェスナッツからなる群から選択され得る。
【０１６２】
好ましくは、植物、植物細胞、又は植物組織、又は宿主植物は、作物植物である。作物植物とは、ヒト若しくは動物の消費又は動物飼料用途のために、市販スケールで成長する任意の植物を意味する。
【０１６３】
本明細書で用いる場合、用語「植物」とは、そのライフサイクル又は発育の任意の段階にある任意の植物及びその子孫を意味する。一般的に、別途規定しない限り、「植物」と呼ぶ場合、単細胞及び種子を含む、任意の発達段階にある植物を包含するように意図されている。したがって、特定の実施形態では、本発明は、植物細胞、例えば、本明細書で定義するような「改変された植物」の１又は２以上の特徴を有する単離された植物細胞を提供する。
【０１６４】
１つの実施形態では、本発明は、
ｉ）本明細書で定義するＥＧＹタンパク質をコードする外来性ＥＧＹ遺伝子（例えば、外来性ポリヌクレオチド）を含む、
ii）本明細書で定義するコンストラクト若しくはベクターを含む、及び／又は
iii）本明細書に記載する方法若しくは使用により得られる（例えば、得られた）
植物細胞（例えば、タバコ植物細胞）を提供する。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明は、
ｉ）本明細書で定義するＥＧＹタンパク質をコードする外来性ＥＧＹ遺伝子（例えば、外来性ポリヌクレオチド）を含む、
ii）非改変植物との比較において、窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率の増加を実現するように改変された植物であって、前記改変が、前記改変された植物におけるＥＧＹポリペプチドの活性若しくは発現の増加である、
iii）本明細書に記載する方法若しくは使用により得られる、
iv）本明細書で定義するコンストラクト若しくはベクターを含む、及び／又は
ｖ）本明細書で定義する細胞を含む
植物（例えば、タバコ植物）を提供する。
【０１６６】
１つの実施形態では、植物繁殖材料は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。
【０１６７】
用語「植物繁殖材料」とは、本明細書で用いる場合、さらなる植物を生み出し得る、植物から得られるあらゆる植物由来物質を意味する。好適には、植物繁殖材料は、種子であり得る。
【０１６８】
１つの実施形態では、改変された植物は遺伝子導入植物である。
【０１６９】
用語「消費される」とは、本明細書で用いる場合、ヒト又は動物（好ましくはヒト）により摂取されることを意味する。用語「消費可能な」とは、本明細書で用いる場合、ヒト又は動物（好ましくはヒト）により摂取可能であることを意味する。摂取とは、食べる、例えば、消化及び吸収するために経口で身体内に取り入れる形態であり得るが、この場合、植物は食用植物である。その他の実施形態では、植物は、植物の物質又はその抽出物（例えば、タバコ抽出物）を焼灼又は加熱すること、及びこうして生成した蒸気又は煙を吸入することにより消費され得る、又は消費可能である。吸入の場合、消費は、口及び肺経由であり得る。
【０１７０】
本発明は、本発明に基づく植物の収穫された葉をさらに提供する。好適には、収穫された葉は、収穫されたタバコ葉であり得る。
【０１７１】
収穫される、という用語は、植物の１つの葉又は複数の葉が植物の根から取り除かれることを意味する。収穫された葉は、葉及び茎の物質から構成され得る。
【０１７２】
好適には、収穫された葉（例えば、タバコ葉）は、下流の加工ステップの対象となり得る。したがって、１つの実施形態では、収穫された葉は、加工された葉を製造するために加工され得る。
【０１７３】
特に好ましい実施形態では、本発明による植物（若しくはその一部）、又は植物細胞、又は植物繁殖材料は、タバコ植物である。
【０１７４】
タバコ植物
本発明は、タバコ植物、並びにタバコ細胞、タバコ植物及び植物繁殖材料と関連する方法、使用を提供する。
【０１７５】
用語「タバコ植物」とは、本明細書で用いる場合、タバコ製品の製造で使用されるニコチアナ属内の植物を意味する。適するタバコ植物の非限定的な例として、Ｎ．タバカム及びＮ．ルスチカ（例えば、ＴＮ９０、Ｋ３２６、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、Ｔｌ  １４０６、バスマ、ガルパオ、ペリケ、ベインハルト１０００−１、及びペチコ）が挙げられる。用語「タバコ」を、タバコ製品の製造に役立たないニコチアナ種にまで拡張する意図はない。
【０１７６】
したがって、１つの実施形態では、タバコ植物には、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）が含まれる。
【０１７７】
タバコ材料は、バーレイ品種として一般的に知られているニコチアナ・タバカム種の品種、フルー又はブライト品種、ダーク品種、及びオリエンタル／トルコ品種に由来し得る。いくつかの実施形態では、タバコ材料は、バーレイ、バージニア、熱風乾燥式、空気乾燥式、火力乾燥式、オリエンタル、又はダークタバコ植物に由来する。タバコ植物は、メリーランドタバコ、レアタバコ、スペシャリティタバコ、膨化タバコ等から選択され得る。
【０１７８】
１つの実施形態では、タバコ植物はバーレイタイプではない。
【０１７９】
タバコ栽培品種及びエリートタバコ栽培品種の使用も、本明細書において検討される。本明細書で使用されるタバコ植物は、したがってタバコ品種又はエリートタバコ栽培品種であり得る。
【０１８０】
特に有用なニコチアナ・タバカム品種として、ダークタイプ、熱風乾燥タイプ、及びオリエンタルタイプのタバコが挙げられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、タバコ植物は、例えば下記の品種のうちの１又は２以上から選択され得る：Ｎ．タバカムＡＡ３７−１、Ｎ．タバカムＢ１３Ｐ、Ｎ．タバカム・クサンシ（N.tabacum Xanthi）（ミッチェル-モール(Mitchell-Mor))、Ｎ．タバカムＫＴ  Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｎ．タバカムＢｅｌ−Ｗ３、Ｎ．タバカム７９−６１５、Ｎ．タバカム・サムスンホルムズ（Samsun Holmes）ＮＮ、Ｎ．タバカムＢＵ２１×Ｎ．タバカム・ホジャパラド（Hoja Parado）の交配に由来するＦ４、ライン９７、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１  １０、Ｎ．タバカム・バーレイ２１、Ｎ．タバカムＰＭ０１６、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃５ＫＹ１６０ＳＩ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃７ＦＣＡ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃６ＴＮ８６ＳＩ、Ｎ．タバカムＰＭ０２１、Ｎ．タバカムＫ１４９、Ｎ．タバカムＫ３２６、Ｎ．タバカムＫ３４６、Ｎ．タバカムＫ３５８、Ｎ．タバカムＫ３９４、Ｎ．タバカムＫ３９９、Ｎ．タバカムＫ７３０、Ｎ．タバカムＫＹ１０、Ｎ．タバカムＫＹ１４、Ｎ．タバカムＫＹ１６０、Ｎ．タバカムＫＹ１７、Ｎ．タバカムＫＹ８９５９、Ｎ．タバカムＫＹ９、Ｎ．タバカムＫＹ９０７、Ｎ．タバカムＭＤ６０９、Ｎ．タバカム・マクネイル（McNair）３７３、Ｎ．タバカムＮＣ２０００、Ｎ．タバカムＰＧ０１、Ｎ．タバカムＰＧ０４、Ｎ．タバカムＰ０１、Ｎ．タバカムＰ０２、Ｎ．タバカムＰ０３、Ｎ．タバカムＲＧ１  １、Ｎ．タバカムＲＧ１７、Ｎ．タバカムＲＧ８、Ｎ．タバカム・スペイト（Speight）Ｇ−２８、Ｎ．タバカムＴＮ８６、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＶＡ５０９、Ｎ．タバカムＡＳ４４、Ｎ．タバカム・バンケット（Banket）Ａ１、Ｎ．タバカム・バスマドラマ（Basma Drama）Ｂ８４／３１、Ｎ．タバカム・バスマＩジクナ（Basma I Zichna）ＺＰ４／Ｂ、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ（Basma Xanthi）ＢＸ２Ａ、Ｎ．タバカム・バテク（Batek）、Ｎ．タバカム・ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｎ．タバカムＣ１０４、Ｎ．タバカム・コーカー（Coker）３１９、Ｎ．タバカム・コーカー３４７、Ｎ．タバカム・クリオロミシオネロ（Criollo Misionero）、Ｎ．タバカムＰＭ０９２、Ｎ．タバカム・デルクレスト（Delcrest）、Ｎ．タバカム・ジェベル（Djebel）８１、Ｎ．タバカムＤＶＨ４０５、Ｎ．タバカム・ガルパオコマム（Galpao Comum）、Ｎ．タバカムＨＢ０４Ｐ、Ｎ．タバカム・ヒックスブロードリーフ（Hicks Broadleaf）、Ｎ．タバカム・カバクラクエラッソナ（Kabakulak Elassona）、Ｎ．タバカムＰＭ１０２、Ｎ．タバカム・クツァゲ（Kutsage）Ｅ１、Ｎ．タバカムＫＹ１４×Ｌ８、Ｎ．タバカムＫＹ１７１、Ｎ．タバカムＬＡ  ＢＵ２１、Ｎ．タバカム・マクネイル９４４、Ｎ．タバカムＮＣ２３２６、Ｎ．タバカムＮＣ７１、Ｎ．タバカムＮＣ２９７、Ｎ．タバカムＮＣ３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０９、Ｎ．タバカムＰＶＨ１９、Ｎ．タバカムＰＶＨ２１  １０、Ｎ．タバカム・レッドロシアン（Red Russian）、Ｎ．タバカム・サムスン（Samsun）、N.タバカム・サプラク（Saplak）、Ｎ．タバカム・シンマバ（Simmaba）、Ｎ．タバカム・タルガー（Talgar）２８、Ｎ．タバカムＰＭ１３２、Ｎ．タバカム・ウィスリカ（Wislica）、Ｎ．��バカム・ヤヤルダグ（Yayaldag）、Ｎ．タバカムＮＣ４、Ｎ．タバカムＴＲマドーレ（Madole）、Ｎ．タバカム・プリレップ（Prilep）ＨＣ−７２、Ｎ．タバカム・プリレップＰ２３、Ｎ．タバカム・プリレップＰＢ１５６／１、Ｎ．タバカム・プリレップＰ１２−２／１、Ｎ．タバカム・ヤカ（Yaka）ＪＫ−４８、Ｎ．タバカム・ヤカＪＢ１２５／３、Ｎ．タバカムＴＩ−１０６８、Ｎ．タバカムＫＤＨ−９６０、Ｎ．タバカムＴＩ−１０７０、Ｎ．タバカムＴＷ１３６、Ｎ．タバカムＰＭ２０４、Ｎ．タバカムＰＭ２０５、Ｎ．タバカム・バスマ（Basma）、Ｎ．タバカムＴＫＦ４０２８、Ｎ．タバカムＬ８、Ｎ．タバカムＴＫＦ２００２、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＧＲ１４１、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ、Ｎ．タバカムＧＲ１４９、Ｎ．タバカムＧＲ１５３、及びＮ．タバカム・ペティットハバナ（Petit Havana）。
【０１８２】
品種又は栽培品種の非限定的な例は、ＢＤ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＤ２６３、ＤＦ９１  １、ＤＴ５３８ＬＣガルパオタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、ＨＢ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド４０３ＬＣ、ハイブリッド４０４ＬＣ、ハイブリッド５０１ＬＣ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ＬＣ、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、マクネイル３７３、マクネイル９４４、ｍｓＫＹ１４×Ｌ８、ナロウリーフマドーレ（Narrow Leaf Madole）、ナロウリーフマドーレＬＣ、ＮＢＨ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１ＬＣ、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣ  ＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニールスミスマドーレ（Neal Smith Madole）、ＯＸＦＯＲＤ２０７、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ’Periq’e’タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１１、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ１４０６、ＴＩ１２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（トムロッソン（Tom Rosson））マドーレ、ＶＡ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、クサンシ（ミッチェル-モール）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、サムスンホルムズＮＮ、ＫＴＲＤＣナンバー２ハイブリッド４９、バーレイ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ１  １、ＲＧ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケットＡ１、バスマドラマＢ８４／３１、バスマＩジクナＺＰ４／Ｂ、バスマクサンシＢＸ２Ａ、バテク、ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｃ１０４、コーカー３４７、クリオロミシオネロ、デルクレスト、ジェベル８１、ＤＶＨ４０５、ガルパオコマム、ＨＢ０４Ｐ、ヒックスブロードリーフ、カバクラクエラッソナ、クツァゲＥ１、ＬＡ  ＢＵ２１、ＮＣ２３２６、ＮＣ２９７、ＰＶＨ２１  １０、レッドロシアン、サムスン、サプラク、シンマバ、タルガー２８、ウィスリカ、ヤヤルダグ、プリレップＨＣ−７２、プリレップＰ２３、プリレップＰＢ１５６／１、プリレップＰ１２−２／１、ヤカＪＫ−４８、ヤカＪＢ１２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、バスマ、ＴＫＦ４０２８、���８、ＴＫＦ２００２、ＧＲ１４１、バスマクサンシ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、ペティットハバナである。上記これらの低コンバーター亜品種も、たとえ本明細書で特に特定されないとしても検討される。
【０１８３】
１つの実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から得ることができる。
【０１８４】
「植物繁殖材料」とは、本明細書で用いる場合、さらなる植物を生み出し得る、植物から得られるあらゆる植物由来物質を意味する。
【０１８５】
好適には、植物繁殖材料は、種子であり得る。
【０１８６】
１つの実施形態では、本発明のタバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、外来性ＥＧＹタンパク質を含み得る。別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明によるコンストラクト又はベクターを含み得る。別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明による方法により得ることができる（例えば、得られた）。
【０１８７】
好適には、本発明によるタバコ植物は、非改変タバコ植物と比較して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（複数可）について低減した量を含み得るが、その場合、改変は、前記改変された植物におけるＥＧＹタンパク質の活性又は発現の増加である。
【０１８８】
１つの実施形態では、本発明に基づくタバコ植物は、本発明のタバコ細胞を含む。
【０１８９】
別の実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から得ることができる（例えば、得られた）。
【０１９０】
別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本明細書で定義するＥＧＹポリヌクレオチド、又は遺伝子、又はＥＧＹポリペプチドを含み得る。
【０１９１】
好適には、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、
ｉ）配列番号４、５、２１、若しくは２２として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は配列番号４、５、２１、若しくは２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、或いは
ii）配列番号２若しくは配列番号３として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、若しくはその機能的断片、又は配列番号２若しくは３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、若しくはその機能的断片、
iii）高度に厳密な条件下で、上記ｉ）又はii）に教示するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、或いは
iv）上記ｉ）、ii）、又はiii）に示すポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、或いは
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、又はiii）に示すポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含み得る。
【０１９２】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、５、２１、又は２２と少なくとも８０％の同一性を有し得る。１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は５と少なくとも８０％の同一性を有し得る。
【０１９３】
好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、５、２１、又は２２と少なくとも９０％の同一性を有し得る。１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は５と少なくとも９０％の同一性を有し得る。
【０１９４】
好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、５、２１、又は２２と少なくとも９５％の同一性（より好適には、少なくとも９９％の同一性）を有し得る。１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４又は５と少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【０１９５】
別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１１を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４１、Ｘ−４４２、Ｘ−４４３、Ｐｒｏ−４４４、Ｘ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｌｅｕ−４４８、Ａｓｐ−４４９、及びＧｌｙ−４５０を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを有するポリペプチド配列を含むＥＧＹタンパク質を含み得るが、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、保存された残基のナンバリングは、ＥＧＹタンパク質が配列番号１を有するシロイヌナズナＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされた有効同等な位置を意味する。
【０１９６】
好適には、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３として示されるポリペプチド又はその機能的断片、或いは配列番号２若しくは配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列又はその機能的断片を含み得る。
【０１９７】
好適には、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも９０％の同一性を有し得る。特に、ポリペプチドは、配列番号２若しくは配列番号３又はその機能的断片と少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【０１９８】
好適には、ポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有し得る。より好適には、ポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有し得る。特に、ポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【０１９９】
最も好適には、ポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号３と少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【０２００】
１つの実施形態では、タバコ製品の製造のための上記実施形態において提供されるようなタバコ細胞の使用が提供される。
【０２０１】
さらに、タバコ植物を育成するための、本明細書に記載するタバコ植物の使用が提供される。
【０２０２】
本発明は、別の実施形態では、タバコ製品の製造のための、上記実施形態のタバコ植物の使用も提供する。
【０２０３】
別の実施形態では、作物を成長させるための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
【０２０４】
商業的に望ましい特性
用語「商業的に望ましい特性」には、収量及び／又は品質等の特性が含まれる。
【０２０５】
分子マーカー利用選抜
分子マーカー利用選抜は、所望の天然の遺伝的バリアント、又はＥＧＹタンパク質の発現若しくは活性が変化しているＥＧＹヌクレオチド配列のバリアントを含む遺伝子移入された核酸配列を同定するために、ＰＣＲを実施するステップを含み得る。
【０２０６】
１つの実施形態では、ＥＧＹヌクレオチド配列バリアントは、ＥＧＹタンパク質の発現又は活性を増加させ得る。
【０２０７】
製品
本発明は、本発明による植物（例えば、タバコ植物）から得られる、又は得られた製品も提供する。
【０２０８】
１つの実施形態では、タバコ葉を製造するための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
【０２０９】
好適には、タバコ葉は、加工工程等の下流の用途に供され得る。したがって、１つの実施形態では、上記実施形態の使用は、加工されたタバコ葉を提供し得る。好適には、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せの対象となり得る。
【０２１０】
別の実施形態では、タバコ葉はカットされ得る。いくつかの実施形態では、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せに供される前又は後においてカットされ得る。
【０２１１】
１つの実施形態では、本発明は収穫された本発明のタバコ植物の葉を提供する。
【０２１２】
さらなる実施形態では、収穫された葉は、本発明の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得ることができる（例えば、得られた）。
【０２１３】
別の実施形態では、本発明の方法又は使用から得られる収穫された葉が提供される。
【０２１４】
好適には、収穫された葉は、カットされ収穫された葉であり得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、収穫された葉は生存タバコ細胞を含み得る。その他の実施形態では、収穫された葉はさらなる加工の対象となり得る。
【０２１６】
加工されたタバコ葉も提供される。
【０２１７】
加工されたタバコ葉は、本発明のタバコ植物から得ることができる。好適には、加工されたタバコ葉は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかに基づき得られたタバコ植物から得ることができる。
【０２１８】
別の実施形態では、加工されたタバコ葉は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から得ることができる。
【０２１９】
本発明の加工されたタバコ葉は、収穫された本発明の葉を加工することにより得ることができる。
【０２２０】
用語「加工されたタバコ葉」とは、本明細書で用いる場合、当技術分野においてタバコが供される１又は２以上の加工ステップを経たタバコ葉を意味する。「加工されたタバコ葉」は、生存細胞を含まない又は実質的に含まない。
【０２２１】
用語「生存細胞」とは、増殖することができ、及び／又は代謝的に活性である細胞を意味する。したがって、細胞が生存していないと言われる場合には、「非生存」とも呼ばれ、その場合、細胞は生存細胞の特徴を示さない。
【０２２２】
用語「実質的に生存しない細胞」とは、全細胞のうち約５％未満が生存していることを意味する。全細胞のうち、好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満、なおいっそうより好ましくは約０．１％未満が生存している。
【０２２３】
１つの実施形態では、加工されたタバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程のうちの１又は２以上により加工され得る。
【０２２４】
好適には、加工されたタバコ葉は乾燥工程により加工され得る。
【０２２５】
タバコ葉は、当技術分野において公知の任意の方法により乾燥され得る。１つの実施形態では、タバコ葉は、空気乾燥、火力乾燥、熱風乾燥、及び天日乾燥からなる群から選択される乾燥法のうちの１又は２以上により乾燥され得る。
【０２２６】
好適には、タバコ葉は空気乾燥され得る。
【０２２７】
一般的に、空気乾燥は、十分に換気された収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、そして放置乾燥することにより達成される。これは、４〜８週間にわたり通常実施される。空気乾燥は、バーレイ種のタバコに特に適する。
【０２２８】
好適には、タバコ葉は火力乾燥され得る。火力乾燥は、大型の収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、その収蔵室内で、連続的又は間欠的に弱く煙らせながら広葉樹の炎を継続することにより一般的に達成され、その乾燥は、プロセス及びタバコに応じて３日間〜１０週間を通常要する。
【０２２９】
別の実施形態では、タバコ葉は熱風乾燥され得る。熱風乾燥は、タバコ葉をタバコスティック上に糸で吊るし、そしてそれを乾燥収蔵室内のタイアーポールから吊り下げる工程を含み得る。収蔵室は、外部供給式の火室から通ずる煙道を通常有する。これにより、一般的に、煙に曝露されないで加熱乾燥させたタバコが得られる。通常、温度は乾燥工程の過程全体にわたりゆっくりと上昇し、全プロセスに約１週間を要する。
【０２３０】
好適には、タバコ葉は天日乾燥され得る。この方法は、むき出しのタバコの天日への曝露を一般的に含む。
【０２３１】
好適には、加工されたタバコ葉は発酵工程により加工され得る。
【０２３２】
発酵は、当技術分野において公知の任意の方式で実施可能である。一般的に、発酵期間中に、タバコ葉は、湿気を保持するために、例えば黄麻布でくるまれたスタック状（バルク状）の乾燥タバコに積層される。葉内に残留する水とタバコの重量が組み合わさって自然の熱が生成し、タバコを熟成させる。バルク中心部の温度は毎日モニタリングされる。いくつかの方法では、毎週、バルク全体が開放される。次に葉を取り出して振動及び湿度を与え、そして内側の葉が外側に来るように、また底部にあった葉がバルクの最上部に配置されるようにバルクを回転させる。これにより、バルク全体を通じて均等な発酵が保証される。葉の上のさらなる湿気に加え、葉それ自体が実際に回転することで熱が生成し、タバコに本来含まれるアンモニアが放出され、そしてニコチンが低減する一方、色の深みも増し、またタバコのアロマも良化する。一般的に、発酵プロセスは、タバコの品種、葉上の葉柄の位置、厚さ、及び葉の使用目的に応じて最長６カ月継続する。
【０２３３】
好適には、加工されたタバコ葉は、加熱殺菌により加工され得る。加熱殺菌工程は、タバコ葉が、無煙タバコ製品、最も好ましくはスヌースを製造するのに用いられる場合、特に好ましい可能性がある。
【０２３４】
タバコ葉の加熱殺菌は、当技術分野において公知の任意の方法により実施され得る。例えば、加熱殺菌は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、J Fould, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden（参照として本明細書に組み込まれている）。
【０２３５】
Tobacco Control (2003) 12: 349-359に詳記するように実施され得る。
【０２３６】
スヌースの製造期間中、加熱殺菌は、タバコが蒸気で２４〜３６時間加熱処理
されるプロセス（約１００℃の温度に達する）により一般的に実施される。これにより、ほぼ無菌の製品がもたらされ、また理論に束縛されるものではないが、この結果の１つとして、さらなるＴＳＮＡ形成が制限されるものと考えられている。
【０２３７】
１つの実施形態では、加熱殺菌は蒸気式加熱殺菌であり得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、加工されたタバコ葉はカットされ得る。加工されたタバコ葉は、加工前又は後でカットされ得る。好適には、加工されたタバコ葉は、加工後にカットされ得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、タバコ植物、収穫されたタバコ植物の葉、及び／又は加工されたタバコ葉は、ニコチンを抽出するのに利用可能である。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実現され得る。例えば、タバコからニコチンを抽出する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２，１６２，７３８号明細書に教示されている。
【０２４０】
別の態様では、本発明はタバコ製品を提供する。
【０２４１】
１つの実施形態では、タバコ製品は、本発明のタバコ植物又はその一部分から調製され得る。
【０２４２】
好適には、タバコ植物又はその一部分は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖され得る。
【０２４３】
用語「その一部分」とは、タバコ植物の文脈において本明細書で用いる場合、タバコ植物の一部分を意味する。好ましくは、「その一部分」とはタバコ植物の葉である。
【０２４４】
別の実施形態では、タバコ製品は、収穫された本発明の葉から調製され得る。
【０２４５】
さらなる実施形態では、タバコ製品は、加工された本発明のタバコ葉から調製され得る。
【０２４６】
好適には、タバコ製品は、乾燥工程、発酵工程、及び／又は加熱殺菌工程のうちの１又は２以上により加工されたタバコ葉から調製され得る。
【０２４７】
好適には、タバコ製品はカットされたタバコ葉を含み得るが、上記実施形態に従って加工されてもよい。
【０２４８】
１つの実施形態では、タバコ製品は喫煙物品であり得る。
【０２４９】
本明細書で用いる場合、用語「喫煙物品」は、タバコ、タバコ派生品、膨化タバコ、再構成タバコ、又はタバコ代用品に基づき、喫煙可能な製品、例えば巻きタバコ、シガレット、シガー、及びシガリロ等を含み得る。
【０２５０】
別の実施形態では、タバコ製品は無煙タバコ製品であり得る。
【０２５１】
用語「無煙タバコ製品」とは、本明細書で用いる場合、喫煙する及び／又は燃焼させるように意図されないタバコ製品を意味する。１つの実施形態では、無煙タバコ製品として、スヌース、嗅ぎ煙草、噛みタバコ等を挙げることができる。
【０２５２】
さらなる実施形態では、タバコ製品はタバコ加熱デバイスであり得る。
【０２５３】
一般的に、加熱式喫煙物品では、熱源から、熱源の内部、近傍、又は下流に位置し得る物理的に分離したエアゾール形成基材又は材料に熱を移動させることにより、エアゾールが生成する。喫煙期間中、熱源からの熱移動により揮発性化合物がエアゾール形成基材から放出され、そして喫煙物品を通じて吸引された空気中に取り込まれる。放出された化合物が冷やされると、凝縮してエアゾールを形成し、ユーザーにより吸入される。
【０２５４】
消費用のエアゾール発生物品及びデバイス、又はタバコ喫煙用の加熱デバイスは、当技術分野において公知である。そのようなデバイスとして、例えば、電気加熱式エアゾール発生デバイスを挙げることができ、同デバイス内では、エアゾール発生デバイスの１又は２以上の電気発熱要素からタバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材に熱を移動させることにより、エアゾールが発生する。
【０２５５】
好適には、タバコ加熱デバイスは、エアゾール発生デバイスであり得る。
【０２５６】
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、非燃焼加熱式デバイスであり得る。非燃焼加熱式デバイスは、当技術分野において公知であり、またタバコを燃焼させるのではなく、加熱することにより化合物を放出させる。
【０２５７】
非燃焼加熱式デバイスの適する例として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット、又は英国特許第２５１５５０２号明細書に教示するものが該当し得る。
【０２５８】
１つの実施形態では、タバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材は、本発明に基づくタバコ製品であり得る。
【０２５９】
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／コンストラクト／方法
本発明の特定の実施形態では、所望のタンパク質（例えば、ＥＧＹタンパク質）をコードするキメラ遺伝子は、植物細胞に形質転換可能であり、プロモーターの指示に基づき、所望のタンパク質について制御された発現を実現する。プロモーターは、動物、植物、菌類、細菌、及びウイルスを含む異なるソースから取得され得る。また、プロモーターは合成によっても構築され得る。
【０２６０】
外来性遺伝子は、適するベクター、例えば植物形質転換ベクターによって、本発明による植物に導入され得る。植物形質転換ベクターは、５’→３’の転写方向で、プロモーター配列、所望の遺伝子（例えば、調節解除された硝酸レダクターゼ）コーディング配列を含む発現カセットを含み得るが、但しイントロンを含んでもよく、並びにＲＮＡポリメラーゼに対する終止シグナル、及びポリアデニラーゼに対するポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳、転写終結コドン配列を含んでもよい。プロモーター配列は、１又は２以上のコピー内に存在し得るが、またそのようなコピーは、上述のように当該プロモーター配列と同一、又はそのバリアントであり得る。転写終結コドン配列は、植物、細菌、又はウイルスの遺伝子から取得され得る。適する転写終結コドン配列は、例えば、エンドウマメｒｂｃＳ  Ｅ９転写終結コドン配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓ転写終結コドン配列、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓ転写終結コドン配列である。当業者は、その他の適する転写終結コドン配列を容易に認識する。
【０２６１】
発現カセットは、プロモーターの強度を高める遺伝子発現強化機構も含み得る。そのようなエンハンサーエレメントの例として、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモーターの一部分に由来するものが挙げられ、それは、国際特許出願番号ＷＯ第９７／２００５６号（参照として本明細書に組み込まれている）の主題である。適するエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。このような制御領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同一の遺伝子に由来し得る、或いはニコチアナ・タバカム、又はその他の生物、例えばナス科の植物若しくはヤコウカ亜科から得られる異なる遺伝子に由来し得る。すべての制御領域は、形質転換される組織の細胞で作動する能力を有するべきである。
【０２６２】
プロモーターＤＮＡ配列は、本発明で使用される配列をコーディングする所望の遺伝子（例えば、プロモーターが指示する遺伝子、例えばＬＢＤ窒素応答性転写因子の活性又は発現が増加するように植物の改変をコードする遺伝子）と同一の遺伝子に由来し得る、或いはニコチアナ・タバカム、又は別の生物、例えばナス科の植物から若しくはヤコウカ亜科から得られる異なる遺伝子に由来し得る。「キメラ遺伝子」と呼ぶ場合、それは、所望の遺伝子をコードする核酸配列（例えば、調節解除された硝酸レダクターゼをコードする遺伝子）は、その発現を指示するプロモーター配列とは異なる起源に由来する（例えば、異なる遺伝子に由来、又は異なる種に由来する）ことを意味する。
【０２６３】
発現カセットは、基本的植物形質転換ベクター、例えばpBIN19プラス、pBI101等、又は当技術分野において公知のその他の適する植物形質転換ベクターに組み込まれ得る。発現カセットに付加して、植物形質転換ベクターは、形質転換プロセスに必要な配列を含む。そのような配列は、アグロバクテリウム属ｖｉｒ遺伝子、１若しくは２以上のＴ−ＤＮＡ境界配列、及び選択マーカー、又は遺伝子導入植物細胞を確認するその他の手段を含み得る。
【０２６４】
用語「植物形質転換ベクター」とは、インビボ又はインビトロで発現する能力を有するコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくはゲノムへの安定な組込みを含む。
【０２６５】
植物を形質転換する技術は当技術分野において周知されており、また例えば、アグロバクテリウム媒介型の形質転換を含む。遺伝子改変植物の構築における基本原則は、挿入された遺伝物質の安定的維持が得られるように、植物ゲノム内に遺伝情報を挿入することである。一般的技術のレビューは、そのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれているPotrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）、及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）による文献に見出され得る。
【０２６６】
一般的に、アグロバクテリウム媒介型形質転換では、外来の所望のＤＮＡ、すなわちキメラ遺伝子を担持するバイナリーベクターを、アグロバクテリウムと標的植物から得た外植片との同時培養により、適するアグロバクテリウム系統から標的植物に移動させる。形質転換植物の組織は、次に選択培地上で再生されるが、同選択培地は、選択マーカー及び植物成長ホルモンを含む。代替法として、フローラルディップ法（Clough & Bent, 1998）が挙げられ、同法により、インタクトな植物の花芽がキメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム系統の懸濁液と接触することとなり、結実後、形質転換された個々の植物を発芽させ、そして選択的培地上で成長させることにより確認される。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は単純な技法であり、幅広く採用されているが、同法は、参照として本明細書に組み込まれているButcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208.に記載されている。
【０２６７】
さらに適する形質転換方法として、例えばポリエチレングリコール、又はエレクトロポレーション技術、粒子衝突（particle bombardment）、マイクロインジェクション、及びシリコンカーバイドファイバーの使用等を用いたプロトプラストへの直接遺伝子移入法が挙げられる。
【０２６８】
シリコンカーバイドホイスカー技術を含むバリスティック形質転換法を用いた植物の形質転換は、Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)で教示されている。シリコンカーバイドホイスカー媒介式形質転換による、結実能力のある遺伝子導入トウモロコシ植物の製造は、The Plant Journal 6: 941-948に教示されており、またウイルス形質転換技術は、例えばMeyer P, Heidmmm I & Niedenhof I (1992)に教示されている。植物用のベクター系としてのキャッサバモザイクウイルスの使用は、Gene 110: 213-217.に教示されている。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号明細書（そのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれている）に見出され得る。
【０２６９】
さらなる態様では、本発明は、所望の遺伝子（例えば、ＥＧＹタンパク質をコードする遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を担持するベクター系、及び植物等の生物のゲノムに該ベクター系を導入するステップに関する。ベクター系は、１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含んでもよい。２ベクターの場合、ベクター系は、バイナリーベクター系と通常呼ばれる。バイナリーベクター系は、参照として本明細書に組み込まれているGynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.においてさらに詳細に記載されている。
【０２７０】
植物細胞を形質転換するために広範に採用されている１つの系は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴｉプラスミド、又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）に由来するＲｉプラスミドを使用する（Anetal., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208.）（そのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれている）。植物を対象とした本発明による望ましい外来性遺伝子導入法をそれぞれ実施した後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となり得る。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用について集中的に試験されており、欧州特許第Ａ−１２０５１６号明細書、Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V; Fraley, etal., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284.（そのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている。
【０２７１】
所望のタンパク質（例えば、ＥＧＹタンパク質）をコードする外来性遺伝子で形質転換された植物細胞は、周知された組織培養法に基づき、例えばアミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の必要な成長因子が供給された好適な培養培地内で細胞を培養すること等により成長及び維持可能である。
【０２７２】
本発明に関連する用語「遺伝子導入植物」には、所望の遺伝子をコードする外来性遺伝子、例えば本発明によるＥＧＹタンパク質をコードする遺伝子を含むあらゆる植物が含まれる。好ましくは、外来性遺伝子は、植物のゲノムに組み込まれる。
【０２７３】
「遺伝子導入植物」及び「キメラ遺伝子」が、その本来のプロモーターの制御下に置かれており、該プロモーターもその天然の環境にあるとき、用語「遺伝子導入植物」及び「キメラ遺伝子」は、その天然の環境内に天然のヌクレオチドコーディング配列を含まない。
【０２７４】
１つの態様では、核酸配列、キメラ遺伝子、植物形質転換ベクター、又は本発明による植物細胞は、単離された状態にある。用語「単離された」とは、自然状態において配列が本質的に関連し、また自然において見出されるようなその他の構成要素について、配列は、その少なくとも１つを少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０２７５】
１つの態様では、核酸配列、キメラ遺伝子、植物形質転換ベクター、又は本発明による植物細胞は、精製された状態にある。用語「精製された」とは、比較的純粋な状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋を意味する。
【０２７６】
用語「ヌクレオチド配列」とは、本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにそのバリアント、ホモログ、断片及び誘導体（例えば、その一部分等）を意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来、又は合成由来、又は組換え体由来であり得るが、二本鎖であっても、また一本鎖であってもよく、センスストランド又はアンチセンスストランドのいずれを示すかを問わない。
【０２７７】
本発明に関連する用語「ヌクレオチド配列」には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくは、該用語は、ＤＮＡ、より好ましくは本発明を目的としてコーディングするｃＤＮＡ配列を意味する。
【０２７８】
好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列が本発明に関係し、そして本発明の範囲そのものに含まれるとき、当該ヌクレオチド配列は、その天然の環境に置かれたときの本発明による天然のヌクレオチド配列、及び同様にその天然の環境に置かれた天然において関連する配列（複数可）と連結したときの本発明による天然のヌクレオチド配列を含まない。呼びやすくするために、この好ましい実施形態を「非天然のヌクレオチド配列」と呼ぶこととする。こうしたことから、用語「天然のヌクレオチド配列」とは、その天然の環境に置かれているヌクレオチド配列全体、及び同様にその天然の環境に置かれた天然において関連するプロモーター全体と作動的に連結しているヌクレオチド配列全体を意味する。但し、本発明の範囲に含まれるアミノ酸配列は、その天然の生物内でヌクレオチド配列により発現した後に単離及び／又は精製され得る。但し、好ましくは、本発明の範囲に含まれるアミノ酸配列は、その天然の生物内でヌクレオチド配列により発現し得るが、但しその場合、ヌクレオチド配列は、当該生物内において、上記ヌクレオチド配列が本質的に関連するプロモーターの制御を受けない。
【０２７９】
一般的に、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。但し、本発明の代替的実施形態では、ヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の化学的方法を用いて、その全部又は一部において合成され得る（Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232-参照として本明細書に組み込まれている  を参照）。
【０２８０】
本明細書で定義するような特別な特性を有するタンパク質、又は改変に適するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞若しくは生物から同定及び／又は単離及び／又は精製され得る。様々な方法が、ヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製について、当技術分野において周知されている。例として、適する配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されたら、より多くの配列を調製するために、ＰＣＲ増幅技術が利用可能である。
【０２８１】
さらなる例として、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーが、酵素を産生する生物に由来する染色体ＤＮＡ、又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築され得る。酵素のアミノ酸配列が公知の場合には、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成することが可能であり、そして生物から調製されるゲノムライブラリーから、酵素をコードするクローンを同定するのに利用可能である。或いは、別の公知の酵素遺伝子と相同の配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、酵素をコードするクローンを同定するのに利用可能である。後者の場合では、ストリンジェンシーが低いハイブリダイゼーション及び洗浄条件が使用される。
【０２８２】
なおもさらなる代替法では、酵素をコードするヌクレオチド配列が、確立された標準法、例えば、参照として本明細書に組み込まれている、Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869.に記載されているホスホロアミダイト法、又はMatthes et al.,  (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載されている方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＤＮＡ合成装置内で合成され、精製、アニーリング、ライゲートされ、及びしかるべきベクター内にクローン化される。
【０２８３】
ヌクレオチド配列は、標準技法に基づき、合成由来、ゲノム由来、又はｃＤＮＡ由来（適宜）の断片をライゲートすることにより調製されたゲノム由来と合成由来の混合物、及び合成由来とｃＤＮＡ由来の混合物、又はゲノム由来とｃＤＮＡ由来の混合物であり得る。各ライゲートされた断片は、ヌクレオチド配列全体のうちの様々な部分に対応する。また、ＤＮＡ配列は、例えば、参照として本明細書に組み込まれている、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、又はSaiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491)の記載に従い、特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）によっても調製され得る。
【０２８４】
本発明の範囲には、本明細書で定義するような特別な特性を有する酵素のアミノ酸配列も含まれる。
【０２８５】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０２８６】
アミノ酸配列は、適するソースから調製及び／若しくは単離され得る、又はアミノ酸配列は合成により作製され得る、又はアミノ酸配列は組換えＤＮＡ技術の使用により調製され得る。
【０２８７】
好ましくは、アミノ酸配列が、本発明に関係するとき、及び本発明の範囲そのものに含まれるとき、当該アミノ酸配列は、天然型酵素ではない。こうしたことから、用語「天然型酵素」とは、その天然の環境に置かれた酵素全体を意味し、その場合、当該天然型酵素は、その天然のヌクレオチド配列により発現される。
【０２８８】
本発明は、本明細書で定義する特別な特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列（複数可）、又はそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列とある程度の配列同一性若しくは配列相同性を有する配列（以後、「相同的配列（複数可）」と呼ぶ）の使用も含む。ここで、用語「ホモログ」とは、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列と所定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」に等しいとみなすことができる。
【０２８９】
相同的アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列及び／又は断片は、機能的活性を保持する及び／又は酵素の活性を増強するポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
【０２９０】
一般的に、相同的配列は、例えば対象アミノ酸配列と同一の活性部位等を含む、又は同一の活性部位をコードする。また相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）についても検討され得るが、本発明の文脈において、配列同一性に関して相同性と表現するのが好ましい。
【０２９１】
１つの実施形態では、相同的配列は、対象配列と比較して１又は複数の付加、欠損、及び／又は置換を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むものと理解される。
【０２９２】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が本明細書で提示されるタンパク質に関する、或いはこの（親）タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸等、又はそれより多くのアミノ酸、例えば１０若しくは１０個を超えるアミノ酸等が置換、欠損、若しくは付加することにより、親タンパク質に由来するタンパク質であって、かつ親タンパク質の活性を有するタンパク質に関する。
【０２９３】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が本明細書で提示されるタンパク質をコードする、又はこの（親）タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸等、若しくはそれより多くのアミノ酸、例えば１０若しくは１０個を超えるアミノ酸等が置換、欠損、若しくは付加することにより、親タンパク質に由来し、また親タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（又は遺伝子）に関する。
【０２９４】
相同性、又は同一性の比較は、目視により、又はより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。このような市販のコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性の割合（％）を計算することができる。
【０２９５】
相同性の割合（％）、又は同一性の割合（％）は、連続した配列について計算され得る、すなわち一方の配列が他方の配列と位置合わせされ、そして一方の配列内の各アミノ酸が他方の配列内の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較される。これは「非ギャップ」アラインメントと呼ばれる。一般的に、そのような非ギャップアラインメントは、残基数が比較的短い場合にのみ実施される。
【０２９６】
これは、非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば１つの挿入又は欠損以外は同一である配列の対において、それ以降のアミノ酸残基がアラインメントから排除される原因となり、したがってグローバルアラインメントを実施したときに、相同性の割合（％）の著しい低減を引き起こす可能性があるという点が考慮されない。したがって、ほとんどの配列比較法は、挿入及び欠損の可能性を考慮して、全体的な相同性スコアに対して不当にペナルティーを科さない最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所的相同性を最大化させるように、配列アラインメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０２９７】
但し、このようなより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸について、ギャップができる限り少なくなるように配列アラインメントを行い、２つの比較される配列間においてより高い関連性を反映させることにより、多くのギャップを有するスコアよりも高いスコアを実現するように、アラインメント内に生ずる各ギャップに対して「ギャップペナルティー」を割り振る。ギャップの存在に対して比較的高いコスト、及びギャップ内の後続する各残基に対してより小さいペナルティーを科す「アフィンギャップコスト」が一般的に用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーにより、もちろん、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーの修正を可能にする。但し、配列比較にそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。
【０２９８】
相同性の割合（％）が最大となる計算法は、したがってギャップペナルティーを考慮しつつ、最適なアラインメントの生成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実施するのに適するコンピュータープログラムは、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を実施することができるソフトウェアの例として、例えばBLASTパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照）、BLAST2（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8、及びtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照）、FASTA（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、及びAlignXが挙げられるが、但しこれらに限定されない。少なくともBLAST、BLAST2、及びFASTAが、オフライン及びオンラインサーチに利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58〜7-60を参照）。
【０２９９】
最終的な相同性の割合（％）は、同一性に関して測定可能であるが、アラインメントプロセスそのものは、一般的にオールオアナッシングの対比較に基づかない。むしろ、化学的類似性、又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較に対してスコアを割り振る、スケール化類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックス−BLASTパッケージプログラムのデフォルトマトリックスである。Vector NTIプログラムは、パブリックデフォルト値、又は供給される場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを一般的に使用する（さらに詳しくは、ユーザーマニュアルを参照）。いくつかの用途では、Vector NTIパッケージ用のデフォルト値を使用するのが好ましい。
【０３００】
或いは、相同性の割合（％）は、CLUSTALに類似したアルゴリズムに基づき、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）内の複数のアラインメント特性を用いて計算され得る（参照として本明細書に組み込まれているHiggins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）。
【０３０１】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、相同性の割合（％）、好ましくは配列同一性の割合（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、一般的に配列比較の一環としてこれを行い、そして数値結果を生成する。
【０３０２】
配列同一性を決定するときに、ギャップペナルティーを使用する場合、好ましくはペアワイズアラインメント用として、下記のパラメーターが使用される：
【０３０３】
【表１】
2019524074.tif 000003
【０３０４】
１つの実施形態では、CLUSTALは、上記で定義されたギャップペナルティー及びギャップエクステンションセットと共に利用可能である。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、BLAST又はCLUSTALアラインメントで用いられるギャップペナルティーは、これまでに詳記したギャップペナルティーとは異なる可能性がある。当業者は、BLAST及びCLUSTALアラインメントを実施するための標準パラメーターは定期的に変化し得るが、またBLAST又はCLUSTALアラインメントアルゴリズムについて詳記された標準パラメーターに基づきしかるべきパラメーターを、その時に選択することができるものと認識する。
【０３０６】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも４０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも６０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドについて決定される。
【０３０７】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定され得る。
【０３０８】
配列は、サイレント変化を引き起こし、機能的に同等の物質を生み出すアミノ酸残基の欠損、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいてなし得る。例えば、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる；正電荷を有するアミノ酸として、リジン及びアルギニンが挙げられる；並びに類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を備えたアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【０３０９】
保存的置換は、例えば下記の表に基づきなし得る。第２の列の同一ブロック内、及び好ましくは第３の列の同一行内のアミノ酸は、相互に置換され得る：
【０３１０】
【表２】
2019524074.tif 000004
【０３１１】
本発明は、生じる可能性がある相同的置換（置換及び交換は、いずれも既存のアミノ酸残基と代替残基とが相互に交換することを意味するために本明細書で用いられる）、すなわち似た者同士の置換、例えば塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性等の置換も含む。１つのクラスの残基から別のクラスに、また或いは非天然のアミノ酸、例えばオルニチン（以後Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシン等の組込みを含め、相同的ではない置換も生じる可能性がある。
【０３１２】
交換は、非天然のアミノ酸によってもなされる可能性があり、アルファ＊及びアルファ−二置換型＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化合物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊等、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊等、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が含まれる。＊の表記は、上記考察のために（相同的又は相同的ではない置換に関連して）利用されており、誘導体の疎水的性質を表し、一方＃は、誘導体の親水的性質を表し、＃＊は両親媒性の特徴を表すのに利用されている。
【０３１３】
バリアントのアミノ酸配列は、アミノ酸スペーサー、例えばグリシン又はβ−アラニン残基等に付加して、アルキル基、例えば、メチル、エチル、又はプロピル基等を含む、配列内の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。さらなる変化形態は、ペプトイド形態内の１又は２以上のアミノ酸残基の存在と関係し、当業者には十分に理解される。誤解を回避するために、α炭素置換基がα炭素ではなく残基の窒素原子上にあるようなバリアントのアミノ酸残基を指すのに、「ペプトイド形態」が用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は、当技術分野、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371、及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134 -参照として本明細書に組み込まれている、において公知である。
【０３１４】
本発明で用いられるヌクレオチド配列は、その中に合成又は修飾されたヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の修飾が、当技術分野において公知である。これには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、並びに／或いは分子の３’及び／又は５’末端部におけるアクリジン若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的に照らせば、本明細書に記載するヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法により修飾され得るものと理解される。そのような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボでの活性又は寿命を増強するために実施され得る。
【０３１５】
本発明は、本発明の核酸配列に対して相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれと相補的な配列とハイブリダイズする能力を有する配列も含む。
【０３１６】
用語「ハイブリダイゼーション」には、本明細書で用いる場合、「核酸のストランドが、塩基対形成を通じて、相補鎖と結合するプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスが含まれるものとする。
【０３１７】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列とも関連する（本明細書に提示する配列の相補的な配列を含む）。
【０３１８】
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で決定される（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０３１９】
より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件下で決定される（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０３２０】
１つの態様では、本発明で用いられる配列は、合成配列−すなわち、インビトロでの化学合成、又は酵素的合成により調製された配列である。そのような配列として、宿主生物にとってコドン利用が最適となるように作製された配列が挙げられるが、但しこれに限定されない。
【０３２１】
用語「発現ベクター」とは、インビボ又はインビトロでの発現能力を有するコンストラクトを意味する。
【０３２２】
好ましくは、発現ベクターは、適する宿主生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」には、好ましくはゲノムへの安定な組込みが含まれる。
【０３２３】
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、適する宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を実現する能力を有する制御配列と作動可能に連結したベクター内に存在し得る。
【０３２４】
本発明で用いられるベクターは、本発明のポリペプチドの発現を実現するために、本明細書に記載するような好適な宿主細胞に形質転換され得る。
【０３２５】
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択は、多くの場合、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。
【０３２６】
ベクターは、例えばＲＮＡを生成するために、インビトロで利用可能である、又は宿主細胞に対してトランスフェクト、形質転換、形質導入し、又は感染させるのに利用可能である。
【０３２７】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入し、該ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、そして該ベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させることにより本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０３２８】
ベクターは、ベクターが対象とする宿主細胞内で複製するのを可能にするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのような配列の例として、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、及びpIJ702の複製起点が挙げられる。
【０３２９】
いくつかの用途では、本発明で用いられるヌクレオチド配列は、例えば選択された宿主細胞等によりヌクレオチド配列の発現を実現する能力を有する制御配列と作動可能に連結している。例として、本発明には、そのような制御配列と作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターが含まれる、すなわちベクターは発現ベクターである。
【０３３０】
用語「作動可能に連結している」とは、記載する構成要素が、その意図した方式で機能するのを可能にする関係にある並列配置を意味する。コーディング配列に「作動可能に連結している」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング配列の発現が実現するようにライゲートされる。
【０３３１】
用語「制御配列」には、プロモーター、及びエンハンサー、及びその他の発現制御シグナルが含まれる。
【０３３２】
用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味で用いられ、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０３３３】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現強化は、異種制御領域、例えばプロモーター、分泌リーダー、及び転写終結コドン領域の選択によっても達成され得る。
【０３３４】
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターと作動可能に連結している。
【０３３５】
用語「コンストラクト」は、用語「コンジュゲート」、「カセット」、及び「ハイブリッド」等と同義であるが、プロモーターに直接又は間接的に結合した、本発明に基づき使用されるヌクレオチド配列を含む。
【０３３６】
間接的な結合の例は、適するスペーサー群、例えばＳｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロン等のイントロン配列、中間のプロモーター、及び本発明のヌクレオチド配列等の提供である。同じことは、本発明に関連して、用語「融合した」にも当てはまり、同用語には直接又は間接的な結合が含まれる。場合によっては、野生型遺伝子プロモーターと通常関連したタンパク質をコーディングするヌクレオチド配列の天然の組合せが、いずれもその天然の環境に置かれている場合、これらの用語には当該組合せは含まれない。
【０３３７】
コンストラクトは、遺伝的コンストラクトの選択を可能にするマーカーを含み得る、又は発現し得る。
【０３３８】
植物の形質転換で用いられる一般的技術のレビューは、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）による文献に見出すことができ、そのそれぞれは参照として本明細書に組み込まれる。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号に見出され得る。
【０３３９】
アミノ酸は、本明細書ではアミノ酸の名称、３文字略号、又は１文字略号を用いて表される。
【０３４０】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられる。本開示及び特許請求の範囲では、アミノ酸残基について、従来方式の１文字及び３文字コードが使用され得る。アミノ酸の３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ生化学命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ，Joint Commission on Biochemical Nomenclature）に準拠して規定される通りである。またポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して、１を超えるヌクレオチド配列によりコードされ得るものとやはり理解される。
【０３４１】
用語のその他の定義も、本明細書全体を通じて提示され得る。例示的な実施形態がより詳細に記載する前に、本開示は、記載されている特定の実施形態に限定されない、したがって、当然ながら変化する可能性もあると理解される。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、そして本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限するようには意図されないものとやはり理解される。
【０３４２】
植物の形質転換で用いられる一般的技術のレビューは、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)、及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の文献に見出され得る。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号明細書に見出され得る。
【０３４３】
別途規定しない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示で使用される用語の多くについて、当業者に一般的なディクショナリーを提供する。
【０３４４】
本開示は、本明細書に開示する例示的な方法及び材料に限定されず、また本明細書に記載するものと類似した又は同等のあらゆる方法及び材料は、本開示の実施形態を実践又は試験するのに利用可能である。数値の範囲には、範囲を規定する数字も含まれる。別途明示しない限り、核酸配列はいずれも、左から右に５’→３’の向きで記載されており、アミノ酸配列は、左から右にアミノ基→カルボキシ基の向きでそれぞれ記載されている。
【０３４５】
ある範囲の値が提示される場合、その内容について別途明確な指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、当該範囲の上限及び下限の間の中間的な値それぞれも特に開示されるものと理解される。記載された任意の値の間のより狭い範囲のそれぞれ、又は記載された範囲内の中間的な値、及び当該記載された範囲内の任意のその他の記載された値、又は中間的な値は本開示に含まれる。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、該範囲に独立して含まれる又はそれから除外され得る、並びにいずれか一方若しくは両方の限界がより狭い範囲に含まれる、又はそのいずれも含まれない場合の各範囲も本開示に含まれ、記載された範囲内において、特に除外された任意の限界が設けられる。一方又は両方の限界が、記載された範囲に含まれる場合、そのような含まれる限界の一方又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。
【０３４６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、その内容について別途明確な指示がない限り、複数形の指示物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「an enzyme（酵素）」と記載する場合、それには複数のそのような候補薬剤及び当業者にとって公知のその同等物等が含まれる。
【０３４７】
用語「含むこと（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」は、本明細書で用いる場合、「含むこと（including）」、「含む（includes）」、又は「含有すること（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又は非制限的であり、追加の列挙されていないメンバー、要素、又は方法ステップを除外しない。用語「含むこと（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」は、用語「からなる（consisting of）」も含む。
【０３４８】
本明細書で議論される公開資料は、本出願の出願日に先立つそれらの開示のためにもっぱら提供される。本明細書内のいずれも、そのような公開資料が、本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術に該当するとした承認として解釈されない。
【０３４９】
利点
本発明と関連した重要な利点として、ＥＧＹタンパク質の発現又は活性が増加するように改変された植物におけるＮＵＥ及びＮＵＴＬの改善が挙げられる。そのような利点は、窒素欠乏条件において収穫可能な産物のバイオマスの増加、又は改変された植物の成長の改善を可能にし得る。
【０３５０】
本発明と関連したさらなる特定の利点として、ＥＧＹタンパク質の活性又は発現が増加するように改変されたタバコ植物から調製されるタバコ製品中のタバコ特異的ニトロソアミン濃度（例えば、ＮＮＫ及び／又はＮＮＮ）の低下が挙げられる。
【０３５１】
本発明は、下記の図及び実施例を参照しながら、例示目的に限定して以下に記載される。
［実施例］
【実施例１】
【０３５２】
イエローバーレイ種１（Ｙｂ１）及びイエローバーレイ種２（Ｙｂ２）遺伝子座の同定
その他の市場クラスのタバコ栽培品種と比較して、バーレイ種のタバコは高度にクロロフィル欠損性であり、それはバーレイ種のタバコ植物の茎、葉柄、及び葉の中央脈において最も明白であり、また植物の齢と共により顕著となる。さらに、バーレイ種のタバコは、特に熱風乾燥タバコと比較して、アルカロイドレベルが増加し、窒素の使用効率が低下し、窒素利用効率が低下し、葉中硝酸塩窒素（ＮＯ３−Ｎ）が増加しており、そしてタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）が増加している。バーレイ種のタバコのクロロフィル欠損表現型は、イエローバーレイ種１（Ｙｂ１）及びイエローバーレイ種２（Ｙｂ２）遺伝子座における二重ホモ接合性劣性遺伝子型（double homozygous recessive genotype）（ｙｂ１ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２）により付与されるが、それは染色体Ｂ及び染色体Ｏ上にそれぞれ存在することが報告されている。２つの遺伝子座のいずれかにおける１つの優性対立遺伝子のみが、正常でより緑色の表現型を確立するのに必要とされる。
【０３５３】
Ｙｂ１及びＹｂ２の精密マッピング
Ｙｂ１及びＹｂ２遺伝子座における対立遺伝子について同質遺伝子的な３組の系統の遺伝子型を、30 K Infinium SNPチップを使用して判定した。２つのゲノム領域が、近同質遺伝子系統の３組すべてにおいて多形性を示すことを見出した。Bindlerら（2011; Theor Appl Genet; 123: 219-230 -参照として本明細書に組み込まれる）の高密度マイクロサテライトマーカー連鎖マップ上の、マイクロサテライトマーカーによる共分離分析（co-segregation analyses）を通じて、これらのＳＮＰマーカーが、祖先種であるＮ．シルベストリス（N. sylvestris）及びＮ．トメントシホルミス（N. tomentosiformis）それぞれより付与されたＮ．タバカム（N. tabacum）連鎖群（ＬＧ, linkage group）５及び２４上に存在することを見出した。ＬＧ５上の１．３３ｃＭの領域に広がることが推定された２つのＳＮＰマーカー、及びＬＧ２４上の１７．１６ｃＭの領域をカバーすることが推定された６つのＳＮＰマーカーを、一方のＹｂ遺伝子座における野生型対立遺伝子について分離しており、他方のＹｂ遺伝子座における劣性の対立遺伝子について固定化されていると予想されるＢＷＤＨ８／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７及びＢＷＤＨ１６／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７ＢＣ１Ｆ１集団を使用して、Ｙｂ１及びＹｂ２遺伝子座の精密マッピング用としてＫＡＳＰマーカー（図２）に変換した。２つのマッピング集団（ＢＷＤＨ８、ＢＷＤＨ１６、及びＮＣ１４２６−７）について、その親系統の遺伝子型を、８つのＫＡＳＰマーカーを用いて判定し、その判定を使用して、ＢＷＤＨ８に由来する集団がＬＧ５上のマーカーについて分離しており、またＢＷＤＨ１６に由来する集団がＬＧ２４上のマーカーについて分離していることを推測した。
【０３５４】
２つの選択されたＬＧ５ＫＡＳＰマーカーを用いて、ＢＷＤＨ８／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７ＢＣ１Ｆ１集団内の３８４個のＢＣ１Ｆ１個体についてスクリーニングを行い、一方のＹｂ遺伝子座の位置を、ＳＮＰマーカーＹｂ５−１から０．２６ｃＭに精密化した（図２）。６つの選択されたＬＧ２４ＫＡＳＰマーカーを用いて、ＢＷＤＨ１６／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７ＢＣ１Ｆ１集団内の３８４個のＢＣ１Ｆ１個体についてスクリーニングを行い、他方のＹｂマーカーの位置を、間隔が４．３７であるＳＮＰマーカーＹｂ２４−４及びＹｂ２４−５の間、及びマーカーＹｂ２４−４から１．０７ｃＭの距離に精密化した（図２）。潜在的候補遺伝子を有するスキャフォールドを同定するために、Ｙｂ遺伝子座のいずれかと最も密接に関連するＳＮＰマーカー配列を、Ｎ．タバカムゲノム配列案に由来するスキャフォールドに対してアラインメントした。合計７９個の予測された遺伝子を有する３つのスキャフォールド（３，８７６，６４０ｂｐ）が、ＬＧ５について同定され、また合計２２３個の予測された遺伝子を有する３つのスキャフォールド（８，４５８，８０２ｂｐ）が、ＬＧ２４について同定された。
【０３５５】
予測された遺伝子の潜在的機能を決定するために、シロイヌナズナ属ゲノムアセンブリ（The arabidopsis Information Resource, TAIR）（www.arabidopsis.org）に対する配列類似性サーチを実施した。窒素同化、窒素使用生理学、又は葉緑体活性と関連すると予測された遺伝子は、イエローバーレイ種表現型の基礎をなす潜在的候補遺伝子とみなした。そのような候補を、ＬＧ５上のゲノム対象領域において２つ、及びＬＧ２４上の対象領域において４つ同定した。対象とする６つの遺伝子に対応する完全長シロイヌナズナ属ｃＤＮＡ配列をＴＡＩＲから得、そしてＫ３２６（Ｙｂ１Ｙｂ１  Ｙｂ２Ｙｂ２）及びＴＮ９０（ｙｂ１ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２）についてゲノム配列データに対してＢＬＡＳＴサーチした（それぞれＧＣＡ＿００７１５０７５．１及びＧＣＡ＿００７１５１３５．１；www.ncbi.nlm.nih.gov）。シロイヌナズナ属遺伝子ＣＪＤ１、ＦｔｓＺ２−１、ＣｈｌＡＫＲ、又はＲＣＡのＮ．タバカムホモログについて、Ｋ３２６及びＴＮ９０配列案の間で相違は見出されなかった。ＣＲＴＩＳＯホモログでは、８０ｂｐの欠損が第７及び第８エクソンの間のＴＮ９０について同定されたが、これは予測されるようなアミノ酸配列変化を引き起こさなかった。ＥＧＹ１ホモログでは、しかし、８ｂｐ及び１１１ｂｐの欠損が、Ｋ３２６と比較してＴＮ９０において同定され、前者はオルタナティブスプライシング及び予測されるような余分なエクソンをもたらすと予測された。
【０３５６】
ＴＮ９０及びＫ３２６の間の、予測されたアミノ酸配列の劇的な相違のために、ＥＧＹ１（エチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーンタンパク質１）ホモログ（以後、ＮｔＥＧＹ１と呼ぶ）についてさらに調査した。Ｓ及びＴゲノムがＮ．シルベストリス及びＮ．トメントシホルミスにそれぞれ起因する場合、Ｎ．タバカムの異質四倍体の性質を考慮して、ＮｔＥＧＹ１配列をＮ．タバカムゲノム配列に対してＢＬＡＳＴサーチして、きわめて類似した潜在的配列を同定した。８９パーセントのヌクレオチド同一性を有する予測された遺伝子が潜在的ホモログとして同定され、そして暫定的にＮｔＥＧＹ２と命名された。Ｋ３２６及びＴＮ９０ＬＣに由来するＮｔＥＧＹ２配列のＢＬＡＳＴ比較から、Ｋ３２６と比較してＴＮ９０ＬＣにおける１７５ｂｐの欠損と、後続する５〜１０ｂｐの多数のその他の欠損、及びＴヌクレオチドの単一挿入が明らかとなった。
【０３５７】
ＮｔＥＧＹ１のセグメントのみを増幅し、及びＴＮ９０ＬＣ内の８ｂｐの欠損を検出するように設計されたＰＣＲプライマーＥＧＹ１−Ｆ及びＥＧＹ１−Ｒを、Ｋ３２６、ＴＮ９０ＬＣ、及び２つのマッピング集団の親において試験した（ＢＷＤＨ８、ＢＷＤＨ１６、ＮＣ１４２６−１７）。８ｂｐの欠損が、ＴＮ９０ＬＣ内及びＢＷＤＨ８内にも存在することが見出されたが、ＢＷＤＨ１６には存在しなかった。ＢＷＤＨ８／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７ＢＣ１Ｆ１集団（正常な表現型：クロロフィル欠損表現型について１：１で分離する）に由来する１０５６ＢＣ１Ｆ１植物を、この欠損について遺伝子型の判定を行い、クロロフィル欠損と８ｂｐの欠損との間の完全な共分離が明らかとなり、したがってＮｔＥＧＹ１が２つのＹｂ遺伝子座のうちの１つにおける遺伝子であることが強く示唆された。
【０３５８】
野生型対立遺伝子と突然変異体ＮｔＹｂ２（ＮｔＥＧＹ１）対立遺伝子との間で予測されるアミノ酸配列の相違を決定するために、対応するｃＤＮＡストランドをＫ３２６及びＴＮ９０ＬＣから単離し、そして配列決定した。ＮｔＥＧＹ１とＮｔＥＧＹ２の間の高度の配列類似性のために、両者のｃＤＮＡが同時に増幅されたものと推測された。ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動を使用して分離し、そして断片をクローン化及び配列決定した。ＮｔＥＧＹ１に対応するｃＤＮＡとＮｔＥＧＹ２に対応するｃＤＮＡとは、前者内には９ｂｐの挿入が存在することに基づき区別可能であったが、それはＧｅｎＢａｎｋ内のゲノムの配列に基づきやはり予測された。
【０３５９】
ＮｔＹｂ２  ｃＤＮＡ配列の分析より、ＴＮ９０において、塩基６１８におけるＴ→Ｃ置換、塩基６２１におけるＡ→Ｔ置換、並びにフレームシフト及び未成熟終止コドン形成を引き起こし、その結果、Ｃ末端の３３０アミノ酸領域が失われた短縮型のタンパク質をもたらす塩基６２３〜６３０（エクソン２）の８ｂｐ欠損が明らかにされた（図２）。
【０３６０】
ＴＮ９０ＬＣ及びＫ３２６に由来するＮｔＥＧＹ２  ｃＤＮＡ配列を比較したとき、見出された唯一の相違は、ＴＮ９０ＬＣ内のｃＤＮＡ（エクソン９）の塩基１４４８におけるＴヌクレオチドの挿入であった。この挿入は、フレームシフトを引き起こし未成熟終止コドンを形成し、その結果、Ｃ末端の４２アミノ酸領域が失われた短縮型のタンパク質をもたらす。野生型ＮｔＥＧＹ１及びＮｔＥＧＹ２  ｃＤＮＡは、９７％のアミノ酸類似性を有する翻訳されたタンパク質を生み出すものと予測される（図２）。
【０３６１】
予測された短縮型のＮｔＥＧＹ２タンパク質をもたらす１ｂｐの挿入が同定されたので、ＮｔＥＧＹ２はＮｔＹｂ１に対応するものと仮定された。Ｔ挿入を検出するように、ＫＡＳＰプライマーのＥＧＹ２＿ｋａｓｐを設計した。１ｂｐ挿入の近傍のＮｔＥＧＹ１とＮｔＥＧＹ２との間の極めて高度の配列類似性のために、ＮｔＥＧＹ２ホモログに特異的なプライマーを設計するのは困難であった。したがって、ネステッドＰＣＲを、ＫＡＳＰマーカーの遺伝子型を判定する前に、プライマーＥＧＹ２−ｎＦ及びＥＧＹ２−ｎＲを用いて実施した。Ｋ３２６、ＴＮ９０ＬＣ、及び２つのマッピング集団の親（ＢＷＤＨ８、ＢＷＤＨ１６、ＮＣ１４２６−１７）上でマーカーを試験した後、ＴＮ９０ＬＣ及びＢＷＤＨ１６が突然変異を担持することが決定された。したがって、ＢＷＤＨ１６／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７ＢＣ１Ｆ１集団に由来する合計１０４０個体の遺伝子型が、該マーカーを有するものと判定され、そして完全な共分離が１ｂｐ挿入の存在とイエローバーレイ種表現型との間で認められた。これは、ＮｔＥＧＹ２はＹｂ遺伝子座の一方の遺伝子もコードするという極めて強いエビデンスを提供する。
【実施例２】
【０３６２】
イエローバーレイ種遺伝子座に潜在する遺伝子の確認
ＮｔＥＧＹ１及びＮｔＥＧＹ２がイエローバーレイ種表現型を制御する遺伝子をコードすることをさらに確認するために、標的突然変異法及び相補性アプローチの両方を実施した。標的突然変異誘発では、ＢＷＤＨ８及びＢＷＤＨ１６をＴＮ９０ＬＣとハイブリダイズさせることにより、Ｙｂ１ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２又はｙｂ１ｙｂ１  Ｙｂ２ｙｂ２遺伝子型を最初に確立した。突然変異標的遺伝子が、まさにＹｂ遺伝子座に位置する遺伝子である場合、単一のＹｂ遺伝子コピーのみが中断されて予測された表現型が観察されるように、これらの遺伝子型を使用した。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓが媒介する突然変異誘発では、突然変異の誘発により通常の緑色表現型がクロロフィル欠損表現型に変換された合計３０の植物の再生をもたらした。これらの改変された植物におけるＹｂ遺伝子座の標的突然変異を検証するために、標的領域を配列破壊について検証した。ＮｔＹｂ１標的部位では、再生された１５の植物すべてがクロロフィル欠損表現型も示したが、それにはフレームシフトを引き起こす小さなインデル又は挿入が含まれた。ＮｔＹｂ２標的部位では、再生された１５の植物すべてがクロロフィル欠損表現型も示したが、それにもやはりフレームシフトを引き起こす小さなインデル又は挿入が含まれた。
【０３６３】
相補性の実験では、完全長ＮｔＹｂ１及び完全長ＮｔＹｂ２野生型ｃＤＮＡを、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下で、バーレイ種栽培品種ＴＮ９０ＬＣ、及び熱風乾燥したタバコ栽培品種ＳＣ５８の「イエローバーレイ種」近同質遺伝子バージョン（ＳＣ５８  ｙｂ１ｙｂ１ｙｂ２ｙｂ２）において個別に発現させた。３０の独立した一次３５Ｓ：ＮｔＹｂ１形質転換体のうちの２０、及び３０の独立した一次３５Ｓ：ＮｔＹｂ２形質転換体のうちの２０が、イエローバーレイ種表現型について相補性を示した。
【実施例３】
【０３６４】
ＥＧＹ１及びＥＧＹ２はタバコ内ＴＳＮＡ産生レベルに寄与する
ａ）ＮｔＹｂ１が窒素の使用効率及び窒素利用効率に与える効果の決定
クロロフィル欠損表現型について遺伝子導入相補性を示す３つのＴＮ９０ＬＣ３５Ｓ：ＮｔＹｂ１Ｒ０形質転換体を自家受粉させて、組み込まれた導入遺伝子（複数可）及びクロロフィル欠損表現型の存在について分離した３つのＲ１ファミリーを生み出した（表１）。各Ｒ１ファミリーに由来する白色の茎及び緑色の茎の分離個体を、米国、ＮＣのＯｘｆｏｒｄ近郊で実施した反復野外実験において、収量、Ｎ−ＵＳＥ、Ｎ−ＵＴＬ、及びＮＯ３−Ｎについて、相互に比較し、また非遺伝子導入対照植物と比較した。２０回反復したランダム化完全ブロックデザインを使用した。
【０３６５】
結果は、ＴＮ９０ＬＣでＮｔＹｂ１が過剰発現すると、非遺伝子導入ＴＮ９０ＬＣ対照と比較して、植物の収量が増加し、Ｎ−ＵＳＥが増加し、Ｎ−ＵＴＬが増加し、及びＮＯ３−Ｎが減少することを示唆した（図５）。
【０３６６】
ｂ）ＮｔＹｂ１がタバコ内ＴＳＮＡ蓄積に与える効果の決定
緑色の茎ＴＮ９０ＬＣ３５Ｓ：ＮｔＹｂ１の温室栽培したＲ０形質転換体１０例を、温室栽培したＴＮ９０ＬＣの非遺伝子導入対照植物１４例と比較した。遺伝子導入３５Ｓ：ＮｔＹｂ１の遺伝子型群では、非遺伝子導入対照群と比較して、Ｎ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）及び総ＴＳＮＡの蓄積レベルが低下することが見出された（図６）。
【０３６７】
材料及び方法
Ｙｂ１及びＹｂ２のマッピング
ｙｂ１及びｙｂ２対立遺伝子についてホモ接合性を確立してクロロフィル欠損表現型を付与するために、劣性のｙｂ１及びｙｂ２対立遺伝子を、８サイクルの戻し交配とその後の複数世代にわたる自家受粉を使用して、バーレイ種タバコ栽培品種Ｋｙ１６から熱風乾燥タバコ（Ｙｂ１Ｙｂ１Ｙｂ２Ｙｂ２）栽培品種ＳＣ５８、ＮＣ９５、及びＣｏｋｅｒ１３９に移動させた。改変された臭化セチルトリメチルアンモニウム手順（Afandor et al., 1993, Annu Rep Bean Improv Coop 36: 10-11）を使用して、６つの遺伝子型からＤＮＡを単離し、そして30K Infinium iSelect HD BeadChip SNPチップを用いて遺伝子型の判定を行った。近同質遺伝子系統を判別する多形性を含有するゲノム領域を同定し、そして対象とする対応するＳＮＰマーカーをＫｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ａｌｌｅ特異的ＰＣＲ（ＫＡＳＰ, Kompetitive Alle Specific PCR）マーカーに変換した（Semagn et al., 2014, Mol Breeding 33: 1-14）。
【０３６８】
ｙｂ１及びｙｂ２の両方を精密マッピングするためのマッピング集団を開発するために、バーレイ種タバコ栽培品種Ｋｙ１４を熱風乾燥タバコ栽培品種Ｋ３４６とハイブリダイズさせ、Ｎ．アフリカナ（N. africana）でＦ１ハイブリッドを受粉させてハプロイド植物を単離し、そして得られたハプロイド植物の染色体数を２倍に増加させることにより、イエローバーレイ種表現型について分離する一連の二重ハプロイド（ＤＨ, Doubled haploid）系統を生成した。二重ハプロイド系統ＢＷＤＨ６及びＢＷＤＨ８は、その後一方の遺伝子座においてのみ優性Ｙｂ対立遺伝子についてホモ接合性であることが見出されたが、一方、系統ＢＷＤＨ１６は、反対側のＹｂ遺伝子座において優性対立遺伝子についてホモ接合性であることが見出された。
【０３６９】
Ｙｂ１及びＹｂ２を精密マッピングするのに適する子孫を最終的に開発するために、ＢＷＤＨ８及びＢＷＤＨ１６（Ｙｂ１Ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２又はｙｂ１ｙｂ１  Ｙｂ２Ｙｂ２遺伝子型のいずれか）を、バーレイ種タバコ育成系統ＮＣ１４２６−１７（ｙｂ１ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２）と両方ハイブリダイズさせた。対応するＦ１ハイブリッドを、次にＮＣ１４２６−１７に戻し交配して、イエローバーレイ種表現型について１：１分離するものと予想される子孫を開発した。各ファミリーに由来する約１０００のＢＣ１Ｆ１子孫を圃場で成長させ、クロロフィル欠損表現型についてスコア化し、そしてＳＮＰに対応するＫＡＳＰマーカーを用いて遺伝子型の判定を行い、Ｙｂ１又はＹｂ２のいずれかと密接に関連していることが見出された。
【０３７０】
Ｙｂ１又はＹｂ２候補遺伝子を含有すると考えられるスキャフォールドを同定するために、Ｙｂ１又はＹｂ２のいずれかと密接に関連していることが見出されたＳＮＰマーカーを、Ｎ．タバカム配列案に対してアラインメントした。窒素同化、窒素使用生理学、又はクロロフィルメンテナンスと関係していると予測される遺伝子を、イエローバーレイ種表現型の基礎をなす潜在的候補遺伝子とみなした。熱風乾燥栽培品種Ｋ３２６（Ｙｂ１Ｙｂ１  Ｙｂ２Ｙｂ２）及びバーレイ種タバコ栽培品種（ｙｂ１ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２）に関するＧｅｎＢａｎｋ配列を、これらの候補遺伝子における多形性について調査した。対象とする多形性について遺伝子型の判定が可能となるようにプライマーを設計し、そして対象とする多形性とイエローバーレイ種表現型を制御する遺伝子の間の関連性の程度を決定するために、そのプライマーを使用して、ＢＷＤＨ８／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７及びＢＷＤＨ１６／ＮＣ１４２６−１７／／ＮＣ１４２６−１７ＢＣ１Ｆ１集団に由来する約１２００の植物について、それらの遺伝子型を判定した。
【０３７１】
ｙｂ１及びｙｂ２ｃＤＮＡの単離及びクローニング
RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen社）を使用して、ＲＮＡを、Ｋ３２６（Ｙｂ１Ｙｂ１  Ｙｂ２Ｙｂ２）及びＴＮ９０（ｙｂ１ｙｂ１  ｙｂ２ｙｂ２）植物の６週齢植物の葉組織から抽出した。オリゴ（ｄＴ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ用として、SuperScript first-Strand Synthesis System（Invitrogen社）を使用してｃＤＮＡを合成した。Ｎ．タバカムゲノム配列案情報を使用して、Ｙｂ１及びＹｂ２の予測された配列に基づき、プライマーｃＹｂ−Ｆ及びｃＹｂ−Ｒを設計し、そのプライマーを使用して、Ｋ３２６及びＴＮ９０に由来するファーストストランドｃＤＮＡから、ＰＣＲによりＹｂ候補遺伝子のコード領域を増幅した。Ｙｂ１候補とＹｂ２候補の間で、５’又は３’末端部にいくつかのヌクレオチド相違が存在したので、いずれかのホモログに特異的なプライマーを設計するのは可能ではなかった。したがって、アガロースゲルからバンドを切り出し、そしてMonarch DNA Gel Extraction Kit （New England Biolabs社）を用いて精製した。Zero Blunt PCR Cloning Kit（Invitrogen社）を使用して、断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローン化し、そしてＮＥＢ５−アルファコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（New England Biolabs社）に形質転換した。各栽培品種に由来する個々のクローンの配列決定を、ベクタープライマーを使用して実施したが、その後の分析から、Ｙｂ１候補断片及びＹｂ２候補断片の両方が増幅されたことが明らかになった。
【０３７２】
Ｙｂ１及びＹｂ２ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡを、改変された臭化セチルトリメチルアンモニウム手順を使用してＫ３２６及びＴＮ９０の植物から単離した。Q5 High-Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs社）を用いたＰＣＲを使用して、各候補遺伝子のゲノムＤＮＡを、それぞれ約１２５０ｂｐの６つの断片において増幅した。所望の遺伝子の特異的増幅を確実にするために、３’末端の最後の塩基対がＹｂ１とＹｂ２の間のＳＮＰであるようにプライマーを設計した。断片を切り出して精製し、そしてＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローン化した。ベクタープライマー、及びより長い配列については内部遺伝子配列プライマーを使用して配列決定を実施した。
【０３７３】
配列分析及びバイオインフォマティクスリソース
Vector NTI- AlignX（Thermo Fisher Scienfific社、Walthmam、MA）を使用してＤＮＡ配列をアラインメントした。Vector NTI-ContigExpressを使用して、個々のゲノムＤＮＡ断片を全ゲノム配列につなぎ込んだ。ゲノムＤＮＡ配列内の遺伝子予測を、ＦＧＥＮＥＳＨ隠れマルコフモデルに基づく遺伝子構造予測プログラムを用いて実施した（www.softberry.com）。Spidey （www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey）を用いてｃＤＮＡ配列をゲノム配列に対してアラインメントした。ＭＵＳＣＬＥを使用してアミノ酸のアラインメントを実施した（Edgar, 2004, Nucl Acids Res 32: 1792-97）。Ｙｂ１又はＹｂ２の完全長アミノ酸配列を使用して、ＮＣＢＩデータベース又はファイトザイム（Phytozyme）データベースをサーチするＢＬＡＳＴにより、Ｙｂオルソログを異なる生物から同定した。選択された結果の多重配列アラインメントを、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａを使用して構築した。ＰＨＹＬＩＰ（Felsenstein、2005、著者より配布されているPHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.6、Department of Genome Sciences、University of Washington、Seattle）を使用して系統樹を再構築し、そしてＲ／ａｐｅにより可視化した（Paradis et al., Bioinformatics (2004) 20 (2): 289-290）。
【０３７４】
Ｙｂ野生型ｃＤＮＡの過剰発現による遺伝子機能の検証
ＸｂａＩ及びＳａｃＩクローニングリンカーを有するＹｂ１及びＹｂ２の完全野生型ｃＤＮＡを、上記のように決定されたＫ３２６ｃＤＮＡ配列に基づき合成した。野生型Ｙｂ候補遺伝子の合成ｃＤＮＡを、構成的なＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で遺伝子を過剰発現することを目的としてｐＢＩ１２１にライゲートした。標準的なアグロバクテリウム属に基づく形質転換を使用して、３５Ｓ：ＮｔＹｂ１又は３５Ｓ：ＮｔＹｂ２を、バーレイ種タバコ栽培品種ＴＮ９０ＬＣ、及び熱風乾燥したタバコ栽培品種ＳＣ５８のイエローバーレイ種近同質遺伝子バージョン（ＳＣ５８ｙｂ１ｙｂ１ｙｂ２ｙｂ２）に導入した。形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２００ｍｇ／Ｌのチメンチンを含有するMSメディア上で選択し、そしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域に特異的なＰＣＲプライマーを使用してスクリーニングした。得られた遺伝子導入植物を、正常なクロロフィル産生表現型の回復について観察した。
【０３７５】
ＮｔＹｂ１が窒素の使用効率及び窒素利用効率に及ぼす効果の決定
クロロフィル欠損表現型の遺伝子導入相補性を示す３つの選択されたＴＮ９０ＬＣ３５Ｓ：ＮｔＹｂ１Ｒ０形質転換体を自家受粉させて、組み込まれた導入遺伝子（複数可）及びクロロフィル欠損表現型の存在について分離した３つのＲ１ファミリーを生み出した。各Ｒ１ファミリーに由来する白色の茎及び緑色の茎の分離個体を、米国、ＮＣのＯｘｆｏｒｄ近郊で実施した反復野外実験において、１植物当たりの収量、ＮＯ３−Ｎ、Ｎ−ＵＳＥ、及びＮ−ＵＴＬについて、相互に比較し、及び非遺伝子導入対照植物と比較した。２０回反復するランダム化完全ブロックデザインを使用した。実験ユニットは、７つの実験エントリーのそれぞれを代表する単一の植物から構成された（表１）。列と列内の植物の間隔は、それぞれ１１７．８ｃｍ及び４５．７ｃｍであり、また実験は、境界植物により取り囲まれた。１エーカー当たり６−６−１８肥料７００ポンドを、移植から１週間以内に適用した。第１回目のＮの適用から２０日後、１エーカー当たり液体２１−０−０−２４Ｓ、７５ガロンを適用した。生産実践法は、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａでの市販空気乾燥タバコ製造で使用される方法と同一であった。
【０３７６】
【表３】
2019524074.tif 000005
【０３７７】
移植から６０日後、個々の植物を地面のレベルでカットし、そして地上部のバイオマスを記録した。植物をオーブン乾燥し、１ｍｍの篩を通過するまですり潰し、そしてNelson及びSommers（Agron. J. 65:109-112; 1973）に基づき総Ｎについて、及びＣＯＲＥＳＴＡ推奨法Ｎｏ．３６（２０１１）に基づきＮＯ３−Ｎについて分析した。Ｎ−ＵＳＥ及びＮ−ＵＴＬを、下記の式を使用して、Mollら（Agron. J. 74:562-564, 1982）、及びSissonら（Crop Sci. 31: 1615-1620, 1991）に基づき計算した：
Nの使用効率(N-USE、(g)g-1)=(植物バイオマス(グラム)植物-1/N肥料単位(g)植物-1)、及び
N利用効率(N-UTL、(g)g-1)=(植物バイオマス(g)植物-1/N-ACC(g)植物-1)
式中、N-ACC=(植物バイオマス(g)植物-1×%N*10)/1000
【０３７８】
エントリーの平均値を比較するために、データを標準的な分散分析法を使用して分析し、そしてSAS社のPROC GLMを使用して、該当するシングルデグリー・オブ・コントラストステートメント（single degree of contrast statements）を実施した（SAS Institute社, Cary, NC）。誤差分散の不均一性を低下させるために、分析前に、ＮＯ３−Ｎデータについて対数変換を実施した。
【０３７９】
ＮｔＹｂ１がタバコ内ＴＳＮＡ蓄積に与える効果の決定
緑色の茎のＴＮ９０ＬＣ３５Ｓ：ＮｔＹｂ１Ｒ０形質転換体１０例を、ＴＮ９０ＬＣの非遺伝子導入対照植物１４例と共に温室内で栽培した。ポッティングから約７０日後に、すべての植物を剪定してアルカロイドの蓄積を増強した。剪定から１０日後に、最頂部の２葉を、各植物から収集し、そしてタグ表示し、そして空気乾燥した。空気乾燥から５週間後、葉を１ｍｍの篩を通過するまですり潰し、そしてガスクロマトグラフィーを使用してニコチン、ノルニコチン、アナタビン、及びアナバシンについて、並びにＬＣ−ＭＳを使用してＴＳＮＡ、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＢ、及びＮＡＴについて、試料を定量した。総ＴＳＮＡを、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＴ、及びＮＡＢの合計として計算した。遺伝子導入３５Ｓ：：ｔＹｂ１ＴＮ９０ＬＣ群及び非遺伝子導入ＴＮ９０ＬＣ群のＴＳＮＡの平均値を、単純なｔ−検定を使用して比較した（Steele et al., Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach; McGraw-Hill: NewYork, NY, 1997）。
【０３８０】
上記明細書に記載するすべての公開資料は、本明細書に参照として組み込まれる。記載されている本発明の方法及びシステムについて、本発明の範囲及び精神から逸脱しないその様々な修飾形態及び変更形態は、当業者にとって明白である。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、主張されるような本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解すべきである。確かに、本発明を実施するに当たり、生化学及びバイオテクノロジー、又は関連分野の当業者にとって、記載するモードの様々な改変は明らかであるが、そのような改変も下記の特許請求の範囲内であるように意図される。
【図１】
2019524074.tif 000006
【図２】
2019524074.tif 000007
【図３−１】
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【図３−２】
2019524074.tif 000009
【図３−３】
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【図３−４】
2019524074.tif 000011
【図３−５】
2019524074.tif 000012
【図３−６】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を増加させる方法であって、
前記植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）タンパク質の活性又は発現を増加させることにより、前記植物を改変するステップを含み、
前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘが任意のアミノ酸であり、
前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、
前記方法。
【請求項２】
植物における窒素の使用効率及び／又は窒素利用効率を増加させるための、植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現増加、又はＥＧＹタンパク質の活性増加の使用であって、
前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘが任意のアミノ酸であり、
前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、
前記使用。
【請求項３】
ＥＧＹタンパク質が、植物の葉において過剰発現している、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＥＧＹタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）を、植物内で発現させるステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５】
ポリヌクレオチド（例えば、外来性ポリヌクレオチド）が、植物内で核酸配列の転写を指示するために、異種プロモーターと作動可能に連結したＥＧＹタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項４に記載の方法又は使用。
【請求項６】
プロモーターが、葉特異的又は葉選好性プロモーターである、請求項５に記載の方法又は使用。
【請求項７】
植物が、作物植物、例えば、果実作物、種子作物、マメ科植物、又はナッツ作物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項８】
タバコ植物において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はその前駆体（例えば、葉中硝酸塩）のレベルを低下させるための、請求項１〜７のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項９】
少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはその前駆体が低下しているタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ収穫されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカット及び加工されたタバコ葉を製造する方法であって、
前記植物において、エチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）遺伝子の発現が増加するように、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加するように前記タバコ植物を改変するステップを含み、
前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、
前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、
前記方法。
【請求項１０】
植物において、ＥＧＹ遺伝子の発現が増加するように、又はＥＧＹタンパク質の活性が増加するように改変されなかったタバコ植物と比較したときに、少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体が低下している、請求項８又は９に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
ＴＳＮＡが、ニコチン由来のニトロソアミンケトン（ＮＮＫ）、ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、又はＮ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）である、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１２】
植物が、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）種、又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）種に由来する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１３】
ＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、
ａ．配列番号２若しくは３として示されるポリペプチド、又はその機能的断片、或いは配列番号２若しくは３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列若しくはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、或いは
ｂ．配列番号４、５、２１、若しくは２２として示されるポリヌクレオチド配列、又は配列番号４、５、２１、若しくは２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、或いは
ｃ．上記ａ．又はｂ．に定義するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１４】
ＥＧＹ遺伝子；又はＥＧＹタンパク質をコードする核酸配列；によりコードされるポリペプチドが、配列番号２若しくは３として示されるアミノ酸配列、又はその機能的断片、或いは配列番号２又は３に対して少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的断片を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１５】
請求項１３又は１４で定義するＥＧＹタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクター。
【請求項１６】
葉特異的又は葉選好性プロモーターと作動可能に連結した、請求項１３又は１４で定義するＥＧＹタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクター。
【請求項１７】
ｉ）エチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）タンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドであって、前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、前記外来性ポリヌクレオチドを含む、
ii）請求項１５若しくは１６に記載のコンストラクト若しくはベクターを含む、並びに／又は
iii）請求項１〜１４のいずれかに記載の方法若しくは使用により得られる（例えば、得られた）
植物細胞（例えば、タバコ植物細胞）。
【請求項１８】
ｉ）エチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）タンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドであって、前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、前記外来性ポリヌクレオチドを含む、
ii）非改変植物との比較において、窒素の使用効率及び／若しくは窒素利用効率の増加を実現するように改変されており、前記改変が、前記改変された植物におけるＥＧＹタンパク質の活性若しくは発現の増加である、
iii）請求項１〜１４のいずれかに記載の方法若しくは使用により得られる、
iv）請求項１５若しくは１６に記載のコンストラクト若しくはベクターを含む、並びに／又は
ｖ）請求項１７に記載の細胞を含む
植物（例えば、タバコ植物）。
【請求項１９】
請求項１８に記載の植物から得られる植物繁殖材料（例えば、植物の種子）。
【請求項２０】
請求項１８に記載の植物（例えば、タバコ植物）の収穫された葉、又は請求項１９に記載の繁殖材料から得られる収穫された葉、若しくは請求項１〜１４のいずれかに記載の方法から得られる収穫された葉。
【請求項２１】
カットされ収穫された葉である、請求項１６に記載の植物（例えば、タバコ植物）の収穫された葉。
【請求項２２】
ａ．請求項１７に記載の植物細胞を含む、
ｂ．請求項１〜１４のいずれかに記載の方法から得られる植物から得られる、
ｃ．請求項１８に記載の植物を加工するステップから得られる、
ｄ．請求項１９に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物から得られる、及び／又は
ｅ．請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉を加工するステップにより得られる、
加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉、好ましくは非生存の加工されたタバコ葉）。
【請求項２３】
植物又は葉が、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せにより加工される、請求項２２に記載の加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）。
【請求項２４】
カットされ加工された葉である、請求項２２又は２３に記載の加工された葉。
【請求項２５】
植物が、作物植物、例えば、果実作物、種子作物、マメ科植物、又はナッツ作物である、請求項１７に記載の植物細胞、請求項１８に記載の植物、請求項１９に記載の植物繁殖材料、請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉、又は請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工された葉。
【請求項２６】
植物が、ニコチアナ・タバカム種又はニコチアナ・ルスティカ種に由来する、請求項１７に記載の植物細胞、請求項１８に記載の植物、請求項１９に記載の植物繁殖材料、請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉、又は請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工された葉。
【請求項２７】
ａ．請求項１〜１４のいずれかに記載の方法により得られた若しくは得られる植物から調製された、
ｂ．請求項１８に記載の植物から調製された、
ｃ．請求項１９に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物から調製された、
ｄ．請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉から調製された、
ｅ．請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工葉から調製された、及び／又は
ｆ．請求項１８に記載の改変された植物から得られた若しくは得られる植物抽出物から調製される、又は前記植物抽出を含む
植物製品。
【請求項２８】
消費可能な植物製品である、請求項２７に記載の植物製品。
【請求項２９】
タバコ製品である、請求項２８に記載の消費可能な植物製品。
【請求項３０】
喫煙物品である、請求項２９に記載のタバコ製品。
【請求項３１】
無煙タバコ製品である、請求項３０に記載のタバコ製品。
【請求項３２】
タバコ加熱デバイス、例えば、エアゾール発生デバイスである、請求項３０又は３１に記載のタバコ製品。
【請求項３３】
請求項１８に記載の植物の植物抽出物（例えば、タバコ抽出物）、又は前記植物の一部分の植物抽出物（例えば、タバコ抽出物）。
【請求項３４】
請求項１２に記載の方法により、又は請求項１８に記載の植物から得られた若しくは得られるニコチアナ・タバカム種又はニコチアナ・ルスティカ種に由来する植物若しくはその一部分を含む喫煙物品、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイス。
【請求項３５】
請求項２７〜３２のいずれかで定義する製品を製造するための、
ａ．請求項１８に記載の植物若しくはその一部、
ｂ．請求項１９に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物（好ましくは葉）、
ｃ．請求項２０若しくは２１に記載の収穫された葉、
ｄ．請求項２２〜２４のいずれかに記載の加工された葉、及び／又は
ｅ．請求項１８に記載の植物から得られた植物抽出物
の使用。
【請求項３６】
植物を育種するための、請求項１８に記載の植物の使用。
【請求項３７】
作物を成長させるための、請求項１８に記載の植物の使用。
【請求項３８】
葉（例えば、加工された（好ましくは乾燥させた）葉）を製造するための、請求項１８に記載の植物の使用。
【請求項３９】
植物（例えば、タバコ植物）をエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）バリアントについてスクリーニングする方法であって、
前記植物中のＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を、野生型ＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、前記植物中のＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列の存在を識別するステップと、前記野生型ＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む植物と比較して、前記ＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列が窒素の使用効率（ＮＵＥ）及び／又は窒素利用効率（ＮＵＴＬ）を増加させることをさらに決定する任意のステップとを含み、
前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、
前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、
前記方法。
【請求項４０】
窒素の使用効率（ＮＵＥ）の増加傾向及び／又は窒素利用効率（ＮＵＴＬ）の増加傾向を有する植物（例えば、タバコ植物）を同定する方法であって、前記植物中のエチレン依存性重力屈性欠損型のイエローグリーン（ＥＧＹ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を、野生型ＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、前記植物中のＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列の存在を識別するステップと、前記野生型ＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む植物と比較して、前記ＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列がＮＵＥ及び／又はＮＵＴＬを増加させることをさらに決定する任意のステップとを含み、前記ＥＧＹタンパク質が、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフ；を有し、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、前記保存された残基のナンバリングが、配列番号１を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされたＥＧＹタンパク質の有効同等な位置を意味する、前記方法。
【請求項４１】
植物が、タバコ植物であり、野生型ＥＧＹタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号４、５、２１、又は２２として示される配列である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列が、野生型ＥＧＹポリヌクレオチド配列を含む植物と比較して、植物中のタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）レベルの低下と関連することを決定するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ａ．請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法により、ＮＵＥが増加している、及び／又はＮＵＴＬが増加していると同定されたドナー植物を、ＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を有さず、かつ商業的に望ましい特性を有するレシピエント植物と交配させるステップと、
ｂ．前記レシピエント植物と交配させた前記ドナー植物の子孫に由来する遺伝物質を単離する任意のステップと、
ｃ．ＮＵＥの増加及び／又はＮＵＴＬの増加と関連する前記ＥＧＹバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子移入領域を識別するステップを含む、分子マーカーを用いた分子マーカー支援式の選択を実施する任意のステップと
を含む、ＮＵＥが増加している、及び／又はＮＵＴＬが増加している植物を製造する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
１つの実施形態では、ＥＧＹポリペプチドは、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、保存された残基のナンバリングは、ＥＧＹタンパク質が配列番号１を有するシロイヌナズナＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされた有効同等な位置を意味する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、下記の保存された残基、すなわちＧｌｙ−１７６、Ａｓｎ−１７７、Ｌｅｕ−１７８、及びＡｒｇ−１７９を含むＧＮＬＲモチーフ；Ｈｉｓ−３１１、Ｇｌｕ−３１２、Ｘ−３１３、Ｘ−３１４、及びＨｉｓ−３１５を含むＨＥＸＸＨモチーフ；及びＡｓｎ−４４２、Ｘ−４４３、Ｘ−４４４、Ｐｒｏ−４４５、Ｘ−４４６、Ｘ−４４７、Ｘ−４４８、Ｌｅｕ−４４９、Ａｓｐ−４５０、及びＧｌｙ−４５１を含むＮＸＸＰＸＸＸＬＤＧモチーフを有するポリペプチド配列を含むＥＧＹタンパク質を含み得るが、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、保存された残基のナンバリングは、ＥＧＹタンパク質が配列番号１を有するシロイヌナズナＥＧＹ１タンパク質とアラインメントされた有効同等な位置を意味する。
【国際調査報告】
2019524074.tif 000017
2019524074.tif 000018
2019524074.tif 000019
2019524074.tif 000020