(57)【要約】本発明は、患者の微生物叢を変更することによって、患者の免疫細胞を調節する方法に関する。本発明はまた、対象の微生物叢を変更することによって、対象生物における処置または治療を調節する方法に関する。本発明はまた、細胞集団、システム、アレイ、細胞、ＲＮＡ、キットおよび、これをもたらす他の手段にも関する。一例では、誘導型核酸改変を用いたヒト腸内微生物叢中の特定の種の有利な選択的標的化が、該変更をもたらすために実行される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病または症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌクレアーゼシステム。
【請求項２】
該方法が、該微生物叢中の第１の種の細胞のゲノムを誘導型ヌクレアーゼを用いて選択的に標的化して該変更をもたらすことを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
該選択的標的化が、（ｉ）前記第１の種と同じ門の種、または（ｉｉ）前記第１の種の異なる株を標的とすることを回避する、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ｉ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｉｉ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されないか、または、前記第１の細胞の増殖が、第２の細胞の少なくとも５倍の増殖阻害で阻害される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
（ａ）患者がヒト患者であり；
（ｂ）微生物叢が腸内微生物叢であり；
（ｃ）該方法が、誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢において第１の種のゲノムを選択的に標的化して該変更をもたらすことを含み；および
（ｄ）該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌または抗古細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
【請求項７】
第１の細胞が、細菌または古細菌の細胞であり、例えばファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、請求項２〜６のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項８】
該方法が、第１の種の細胞の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、切断および／または変異）することを含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項９】
第１の細胞が宿主細胞の集団を含み、該方法が宿主細胞において標的配列を改変することを含み、標的配列の改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ−システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、請求項２〜８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１０】
調節された免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞を含む、請求項１〜５および７〜９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１２】
システムが、操作されたＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはジンクフィンガーシステムである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１３】
該方法が、患者において、（ｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団をアップレギュレートするか、または、（ｉｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団をダウンレギュレートする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１４】
該方法が、患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
（ａ）患者において治療を実行すること；および
（ｂ）誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢の前記変更を実行することにより、患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオシスが、患者において免疫細胞の前記調節をおこなうことにより、患者において治療を調節すること、
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１５】
該方法が、
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強すること、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること、場合により、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、サイトカイン放出症候群）を弱めるために調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ−ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；または
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させること、
を目的とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１６】
疾病または症状が、がん、自己免疫性の疾病または症状、炎症性の疾病または症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、アレルギー性の疾病または症状、または、ウイルス感染症により媒介されるか、または、引き起こされる疾病または症状である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１７】
第１の細胞集団の増殖が、少なくとも５倍低下する、請求項２〜１６のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１８】
微生物叢が、患者の腸内微生物叢である、請求項２〜５および７〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
該方法を実行して微生物叢を変更し、それにより患者においてパネート細胞を刺激し、それにより免疫細胞が調節され、疾病または症状が処置または低減されることを目的とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項２０】
請求項1〜１９のいずれか一項に記載の方法を実行するための該請求項に記載のシステムにおいて用いるための、誘導型ヌクレアーゼ；または、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ−アレイもしくはＨＭ−ｃｒＲＮＡ；または、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を実行するために前記請求項のＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いるための、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡもしくはＨＭ−ｃｒＲＮＡ；または、該システム、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、第１の細胞に感染することができるか、または第１の細胞を形質転換することができる、ベクター、例えば、バクテリオファージ、接合性プラスミドもしくはトランスポゾン；または、該システム、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、医薬；ここで、場合により、ｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡである。
【請求項２１】
患者において疾病または症状を処置または軽減する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、患者の微生物叢を変更することにより患者の免疫細胞（患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞）を調節する方法に関する。本発明はまた、対象の微生物叢を変更することにより対象において処置または治療を調節する方法に関する。本発明はまた、細胞集団、システム、キット、および、これをもたらす他の手段に関する。一例では、誘導型核酸改変を用いたヒト腸内微生物叢中の特定の種の有利な選択的標的化が、該変更をもたらすために実行される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
免疫療法の１つのアプローチは、腫瘍を認識して攻撃する細胞表面抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、患者自身の（またはドナーの）免疫細胞を操作することを包含する。養子細胞移入（ＡＣＴ）と呼ばれる、本アプローチは、今までのところ小規模な臨床試験に限られていたが、これらの操作された免疫細胞を用いた処置は、進行がんの患者においていくつかの顕著な反応をもたらしている。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと融合した、抗体由来の標的化ドメインから成り、Ｔ細胞により発現された場合に、ＣＡＲの標的化ドメインにより決定される抗原特異性をＴ細胞に付与する。ＣＡＲは、抗体ベースの標的化ドメインが利用可能である限り、Ｔ細胞のエフェクター機能を、細胞表面上に発現される任意のタンパク質および非タンパク質標的に方向転換させることができる可能性がある。それによって、本戦略は、標的細胞による抗原プロセシングおよび提示の必要性を回避し、炭水化物などの非古典的Ｔ細胞標的に適用可能である。このＨＬＡ拘束性の回避は、ＣＡＲ  Ｔ細胞のアプローチが、養子Ｔ細胞療法の適用可能性を広げる一般的なツールとして使用できることを意味する。例えば、Methods Mol Biol. 2012;907:645−66. doi: 10.1007/978−1−61779−974−7_36, “Chimeric antigen receptors for T−cell based therapy”, Cheadle EJ et al.を参照されたい。
【０００４】
最初のＣＡＲ−Ｔ構築物は、ＰＮＡＳにおいて、免疫療法のパイオニアであるＺｅｌｉｇ  Ｅｓｈｈａｒにより、１９８９年の論文に記載された。ＣＡＲの構造には、今や、異なる細胞タンパク質由来の異なるドメインのキメラである、膜貫通ポリペプチド鎖を含む。例えば、ＣＡＲは、細胞内部分に（多くの場合、リンカーおよび／またはヒンジ領域によって）連結された細胞外部分を有し、免疫細胞、通常はＴ細胞の膜に該受容体を埋め込むＣＡＲの膜貫通部分を有する。細胞外部分は、一般にはがん細胞の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である標的抗原を認識する抗体結合部位（通常、例えばマウスｍＡｂに由来する、ｓｃＦｖの形態である）を含む。このようにして抗原認識は、ＭＨＣ拘束性の抗原提示を必要とするＴＣＲに頼る必要性をなくし、結合親和性が比較的低い可能性がある。ＣＡＲの細胞内部分は、典型的に、抗原が細胞外結合部位に結合した際の細胞内シグナル伝達のための、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）ドメインを含む。後の世代のＣＡＲはまた、しばしば４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）またはＣＤ２８細胞内ドメインである、Ｔ細胞媒介応答を増強するさらなるドメインを含む。ＣＡＲ結合部位のコグネイトの抗原リガンドに遭遇すると、ＣＡＲは細胞内シグナリング伝達を活性化し、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化により腫瘍細胞の死滅を促進することができる。
【０００５】
大部分のＣＡＲ−Ｔはインビボで増殖するので、従来の意味での用量漸増（dose titration）は困難であり、多くの場合、操作されたＴ細胞は「永遠に」活性であると考えられる−すなわち、ほとんどのこれまでのＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ臨床試験において、進行中のＢ細胞無形成が見られた。このことは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のアプローチに重大な問題を提起する。いくつかの観察されたリスクが、Discov Med. 2014 Nov;18(100):265−71, “Challenges to chimeric antigen receptor (CAR)−T cell therapy for がん”, Magee MS & Snook AEで議論されており、本文献は、ＣＡＲ−Ｔ細胞処置後の最初の重大な有害事象は、肺および肝臓へ転移性の結腸直腸がんの患者で生じたこと(Morgan et al., 2010)を説明している。この患者は、上皮増殖因子受容体２（ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２）を標的とする第三世代ＣＡＲを発現するＴ細胞で処置された。該ＣＡＲは、ＨＥＲ２陽性乳がんの処置のためにＦＤＡで承認された４Ｄ５抗体由来のｓｃＦｖ（トラスツズマブ）を含有していた（Zhao et al., 2009）。この患者は、１０１０  ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回投与を受けてから１５分以内に呼吸促迫を発症し、その後５日間にわたって複数回の心停止が起こり、最終的に死に至った。処置４時間後の血清解析では、サイトカインＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の顕著な増加が明らかとなった。ＣＡＲ−Ｔ細胞は肺および腹部および縦隔リンパ節に見られたが、腫瘍転移には見られなかった。研究者らは、毒性は、肺上皮におけるＨＥＲ２の認識に起因し、炎症性サイトカインを放出して肺毒性を生みだし、および、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらして多臓器不全を引き起こすと考えた（Morgan et al.,2010）。保守的な用量漸増（ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）戦略の後に異なる抗体（ＦＲＰ５）由来の第二世代のＨＥＲ２を標的とするＣＡＲを利用する試験が、他の研究者によって様々なＨＥＲ２＋悪性腫瘍に対して現在進行中である（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖの識別番号ＮＣＴ０１１０９０９５、ＮＣＴ００８８９９５４、およびＮＣＴ００９０２０４４）。
【０００６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞のテーマの一種は、抗体共役型Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）療法であり、腫瘍特異的ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＣＤ１６Ａ（ＦＣγＲＩＩＩＡ）を使用する（例えば、ＷＯ２０１５／０５８０１８、ＵＳ２０１５１３９９４３を参照）。目的は、患者に投与されるＩｇＧを用量設定することによって、インビボでのＣＡＲ  Ｔ細胞活性のより多くの制御を可能にすることである。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ１６結合部位は、患者の内因性ＩｇＧにも自由に結合し得、このことは、該アプローチの魅力を低下させる。該アプローチはまた、体内のＩｇＧの本質的に長い半減期（ヒトＩｇＧではおよそ２０日間）を考慮する必要があり、ＣＡＲ細胞活性の制御を制限する可能性がある。進行中の研究はこのリスクを評価し得る。
【０００７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞アプローチおよび他の細胞ベースのアプローチのような、免疫細胞ベースの治療を調節（ダウンレギュレートまたはアップレギュレート）する代替方法を提供することが望ましいであろう。自己免疫性の、炎症性の、および感染性の疾病および症状などの、内因性免疫細胞により媒介される疾病および症状に対処する方法を提供することもまた、望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の記載
本発明は、本明細書の特許請求の範囲に記載される、誘導型ヌクレアーゼ（guided nuclease）、宿主細胞改変型（ＨＭ）−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ−アレイ、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ、ＨＭ−Ｃａｓ、ＨＭ−ＴＡＬＥＮ、ＨＭ−メガヌクレアーゼ、ＨＭ−ジンクフィンガー、および方法を提供する。
【０００９】
医療行為は、しばしば、患者に抗生物質を投与することを包含する。これらの処置は、典型的には、多くのグラム陽性菌種または多くのグラム陰性種を、区別することなく標的とする抗生物質、すなわち、広域スペクトル抗生物質の投与を包含し得る。同様に、農業（ｆａｒｍｉｎｇ）や農耕（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における広域スペクトル抗生物質の使用は、健康に有害であり、微生物耐性を発展させる可能性のある、これらの抗生物質のヒトおよび動物の食物連鎖への侵入を含む、環境問題を提起する。むしろ、本発明は、第１の微生物叢種または株の選択的標的化を包含する。本明細書の実施例に示されるように、選択された種のゲノムを標的とし、一方で、同時に系統学的に関連する種および株を温存する、誘導型ヌクレアーゼを用いて、特定の細菌種の選択的標的化が達成された。さらに、本発明は、以下でさらに論じるように、ヒトおよび動物における免疫機能を形成する際に微生物叢の細菌および古細菌が果たす役割を実証している。
【００１０】
従って、本発明は、患者の微生物叢を変更することにより患者の免疫細胞（患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞）を調節する方法に関する。一例では、微生物叢（例えば、腸内微生物叢）中の種の有利な選択的標的化が、該変更をもたらすために実行される。選択的標的化は、例えば、同じ門の種など、または同じ種の異なる株などの、関連する種または株の標的化を避けることができる。
【００１１】
例えば、本発明は、微生物叢を変更することによって、患者および対象における、疾病および症状の免疫細胞ベースまたは他の治療を調節すること、並びに、これをもたらすためのシステム、キット、および他の手段を提供する。
【００１２】
例えば、本発明は、微生物叢を変更することによって、患者において疾病および症状を処置または軽減することを提供し、ここで、該疾病および症状は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者の免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより対処される疾病および症状である。実施形態は、がん、自己免疫性の疾病もしくは症状、炎症性の疾病もしくは症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、または、ウイルス感染症により媒介されるか、あるいは、引き起こされる疾病もしくは症状である。
【００１３】
本発明はまた、対象の微生物叢を変更することにより対象生物（例えば、植物、酵母、ヒト、または動物患者）における処置または治療を調節する方法に関する。治療の例は、例えば、患者における疾病または症状の処置または予防のための、養子細胞療法、抗体療法(例えば、免疫チェックポイント阻害)、放射線療法、化学療法である。
【００１４】
第１の構成において、本発明は、
患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが、患者において免疫細胞を調節することにより、患者において治療を調節すること、
を含む方法を提供する。
【００１５】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが、患者において免疫細胞を調節することにより、患者において治療を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は養子免疫細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法、例えば、患者へのＣＡＲ−Ｔ細胞の投与）を含む、
を含む方法を提供する。
【００１６】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが患者において治療を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、患者に免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４または抗ＴＩＭ３阻害剤、例えば、抗体）を投与することを含む。
【００１７】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが患者において治療を調節すること;
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、患者に抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＴＩＭ３抗体；または、抗ＴＮＦａスーパーファミリーメンバー抗体、例えば、抗ＴＮＦａ、ＴＮＦＲ１もしくはＢＡＦＦ抗体；または、抗ＩＬ６Ｒもしくは抗ＩＬ−４Ｒａ抗体；または、抗ＰＣＳＫ９抗体）を投与することを含む。
【００１８】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
対象において処置を調節する方法であって、
ａ．対象において処置を実行すること；および
ｂ．対象において微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが対象において処置を調節すること、
を含む方法を提供する。
【００１９】
一例では、対象または患者はヒトである。一例では、対象または患者は非ヒトである。一例では、対象は植物であり、場合により、処置は、植物生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。一例では、対象は酵母であり、場合により、処置は、酵母の増殖促進処置または増殖抑制処置である。
【００２０】
一例では、調節は、対象または患者の、処置または治療を、増大、アップレギュレート、ダウンレギュレート、阻害、増強、または、強化する。一例では、処置または治療は、対象または患者において有効であり、処置または治療は、対象、患者、または、調節を受けていないコントロール対象もしくは患者において、有効でないか、有効性が低下または増加している。コントロールは、対象または患者と同じ種であり、場合により、同じ年齢および／または性別である。一例では、細菌または古細菌の宿主細胞は、本発明の方法を用いて、対象または患者において死滅させるか、またはその増殖が阻害され、コントロールは、同じ細菌または古細菌の種の細胞を含み、該細胞は本発明の方法により死滅しないか、または、増殖が阻害されない。
【００２１】
一例では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実行される。一例では、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の前に実行される。一例では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前に実行され、場合により、ステップ（ｂ）は（ａ）の後に再度実施される。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は、
植物または酵母において処置を調節する方法であって、
ａ．植物または酵母において処置を実行すること；および
ｂ．植物または酵母において細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが対象において処置を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、該処置は、生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。
【００２３】
対象、患者、植物または酵母において、微生物のディスバイオシスを引き起こすことは、一例では、対象、患者、植物または酵母の表面上に、例えば、葉の表面上（対象が植物の場合）、または、皮膚、肺、眼または粘膜の表面上（対象または患者がヒトまたは動物の場合）に、微生物のディスバイオシスを引き起こすことを含む。
【００２４】
本発明は、細菌のディスバイオシスを引き起こすことに代えて、または、加えて、ステップ（ｂ）において、対象、患者、植物または酵母において、古細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こすことを含む。
【００２５】
例えば、疾病または症状は、自己免疫性の疾病または症状（例えば、ＳＬＥ）であり、治療は、それらのための処置、例えば、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバーアンタゴニスト（例えば、ＢＥＮＬＹＳＴＡ（商標）またはそのジェネリック薬などの抗Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）抗体）の投与である。例えば、疾病または症状は、炎症性の疾病または症状（例えば、関節リウマチ、ＩＢＤ、クローン病、大腸炎、または乾癬）であり、治療は、それらのための処置、例えば、サリルマブ、デュピルマブ、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバーアンタゴニスト（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、ＳＹＭＰＯＮＩ（商標）またはＥＮＢＲＥＬ（商標）またはそのジェネリック薬などの、抗ＴＮＦα抗体またはトラップ）の投与である。例えば、疾病または症状は、ウイルス感染症であるか、または、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）により媒介され、治療は、それらのための処置、例えば、レトロウイルス薬または抗ＨＩＶワクチンの投与である。例えば、疾病または症状はがん（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、乳がんまたは膵臓がん）であり、治療はそれらのための処置、例えば、化学療法薬（例えば、抗ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴまたはＳＩＲＰａ抗体などの、チェックポイント阻害剤またはアゴニスト抗体）の投与である。一例では、抗体は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴおよびＳＩＲＰａから選択される第１および第２の標的に特異的に結合する二重特異性抗体であり、例えば、第１の標的がＣＴＬＡ４であり、第２の標的がＬＡＧ３またはＰＤ−１である。場合により、抗体は、ヒトγ１抗体であり、および／または、ＡＤＣＣまたはＣＤＣについて増強されてよい。例えば、治療はワクチン療法であり、例えば、がんワクチン療法、または、マラリア、ＨＩＶ感染症、結核感染症、コレラ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ）感染症、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）感染症もしくは、クラミジア感染症などの、感染症または感染性の疾病の処置または予防のためのワクチン療法である。
【００２６】
第１の構成のある実施形態は、
患者において疾病または症状の細胞療法を調節する方法であって、
ａ．細胞集団を患者に投与することを含み、該細胞の投与は、患者の疾病または症状を治療することができる、患者において細胞療法を実行すること；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが患者において細胞療法を調節すること
を含む方法を提供する。
【００２７】
一例では、細胞療法は、がんの処置のための、ＣＡＲ−ＴまたはＴＩＬ療法などの、養子免疫細胞療法である。
【００２８】
第２の構成において、本発明は、
疾病または症状が患者において免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって媒介されている患者の疾患または状態のリスクを処置または軽減する方法であって、該方法は、該患者に腸内細菌微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが、患者において免疫細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）を調節し、それにより患者における該疾病または症状のリスクを処置または軽減することを含む方法を、提供する。
【００２９】
例えば、疾病または症状は、自己免疫性の疾病または症状（例えば、ＳＬＥ）、炎症性の疾病または症状（例えば、関節リウマチ、ＩＢＤ、クローン病、大腸炎または乾癬）、ウイルス感染症であるか、あるいは、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）により媒介される。
【００３０】
一例では、微生物叢ディスバイオシスは、微生物叢において１つ以上の標的細菌種を死滅させることによって、あるいは、微生物叢において該古細菌の集団の増殖を阻害することによって、もたらされる。一例では、微生物叢ディスバイオシスは、微生物叢において１つ以上の標的古細菌種を死滅させることによって、あるいは、微生物叢において該細菌の集団の増殖を阻害することによって、もたらされる。
【００３１】
第３の構成では、本発明は、
患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および、
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された微生物叢を産生すること、
を含む方法を提供する。
【００３２】
第３の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において治療を調節する、変更された微生物叢を産生すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４または抗ＴＩＭ３阻害剤、例えば、抗体）を投与することを含む。
【００３３】
第３の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において治療を調節する、変更された微生物叢を産生すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＴＩＭ３抗体；または、抗ＴＮＦａスーパーファミリーメンバー抗体、例えば、抗ＴＮＦａ、ＴＮＦＲ１もしくはＢＡＦＦ抗体；または、抗ＩＬ６Ｒもしくは抗ＩＬ−４Ｒａ抗体；または、抗ＰＣＳＫ９抗体）を患者に投与することを含む。
【００３４】
第３の構成の別の局面では、本発明は、
対象において処置を調節する方法であって、
ａ．対象において処置を実行すること；および
ｂ．対象の微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより該ディスバイオシスが対象において処置を調節すること、
を含む方法を提供する。
【００３５】
一例では、対象または患者はヒトである。一例では、対象または患者は非ヒト動物である。一例では、対象は植物であり、場合により、処置は、植物生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。一例では、対象は酵母であり、場合により、処置は、酵母の増殖促進処置、または増殖抑制処置である。
【００３６】
一例では、調節は、対象または患者の、処置または治療を、増大、アップレギュレート、ダウンレギュレート、阻害、増強、または、強化する。一例では、一例では、処置または治療は、対象または患者において有効であり、処置または治療は、調節を受けていない対象、患者、または、コントロール対象もしくは患者において、有効でないか、有効性が低下または増加している。コントロールは、対象または患者と同じ種であり、場合により、同じ年齢および／または性別である。一例では、細菌または古細菌の宿主細胞は、本発明の方法を用いて、対象または患者において死滅させるか、またはその増殖が阻害され、コントロールは、同じ細菌または古細菌の種の細胞を含み、該細胞は本発明の方法により死滅しないか、または、増殖が阻害されない。
【００３７】
一例では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実行される。一例では、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の前に実行される。一例では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前に実行され、場合により、ステップ（ｂ）は（ａ）の後に再度実施される。
【００３８】
ある実施形態では、本発明は、
植物または酵母において処置を調節する方法であって、
ａ．植物または酵母において処置を実行すること；および
ｂ．植物または酵母の微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、植物または酵母において処置を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、該処置は、生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。
【００３９】
対象、患者、植物または酵母において、細胞の亜集団の相対的割合を前記の通り変更することは、一例では、対象、患者、植物または酵母の表面上に、例えば、葉の表面上（対象が植物の場合）、または、皮膚、肺、眼または粘膜の表面上（対象または患者がヒトまたは動物の場合）に、微生物のディスバイオシスを引き起こすことである。
【００４０】
第１の細菌または古細菌の亜集団の割合は、増加または減少される。一例では、第１の細菌種または株と、第２の細菌種または株との相対的比率が変更される（例えば、増加または減少される）；あるいは、第１の古細菌種または株と、第２の古細菌種または株との相対的比率が変更される（例えば、増加または減少される）。
【００４１】
一例では、養子免疫細胞療法は、がんの処置のためのＣＡＲ−Ｔ療法である。一例では、養子免疫細胞療法は、がんの処置のためのＴＩＬ療法である。
【００４２】
第１または第３の構成の一例では、ステップ（ａ）の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞からなる群から選択される第１のタイプの細胞であり、ステップ（ｂ）は患者においてそのタイプの細胞をアップレギュレートする。これは、細胞ベースの治療を増強するのに有用である。別の例では、ステップ（ａ）の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞からなる群から選択される第１のタイプの細胞であり、ステップ（ｂ）は患者においてそのタイプの細胞をダウンレギュレートする。これは、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、ＣＲＳ）を弱めるのに有用である。
【００４３】
ある実施形態では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢（例えば、腸内微生物叢）細菌および／または古細菌を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いた、細菌または古細菌の微生物叢亜集団の選択的標的化を用いて、実行される。一例では、本方法は、宿主細胞においてそれぞれの標的配列を切断して、標的配列を改変する、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ)を用い、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割合を低減させることを含む。誘導型ヌクレアーゼ切断を実行するための好適なシステムは、例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーシステムである。
【００４４】
この目的のために、発明者らは、以下の特徴の１つ以上を伴った、腸内微生物叢において天然に共生する細菌の混合共同体における、特定の細菌株の集団増殖阻害を初めて証明したと信じている：
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた集団増殖阻害が、
・野生型細胞を標的とすること；
・野生型内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を利用すること；
・必須および抗生物質耐性遺伝子を標的とすること；
・ここで、標的が野生型配列であること、
によること。
【００４５】
発明者らは、以下の特徴を伴った、ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、このことを証明した：
・ヒト腸内微生物叢種の混合集団における、細菌増殖阻害を標的とすること；
・ここで、該集団が３つの異なる種を含むこと；
・これらの種の１つを選択的に死滅させ、他の種の細胞を温存すること；
・系統発生学的に近い他のヒト腸内細菌叢種の存在下での細胞増殖阻害を標的とし、該種はこの阻害を免れる；
・ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種および非ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種を含む、ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、細胞増殖阻害を標的とすること；
・ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、特定のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種の細胞増殖阻害を標的とし、一方で、異なるファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種を温存すること；
・ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、特定のグラム陽性細菌株の細胞増殖阻害を標的とし、一方で、異なるグラム陽性細菌種を温存すること；
・あるヒト腸内微生物叢細菌種を標的とし、一方で、片利共生のヒト腸内細菌種を温存すること；
・ヒト腸内微生物叢細菌種を標的とし、一方で、プロバイオティックヒト腸内細菌種を温存すること；
・表面上のヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において細胞増殖阻害を標的とすること；
・特定の細菌種単独で、または、ヒト腸内微生物叢細菌の共同体において、複数の他の細菌種と混合された場合に、少なくとも１０倍の増殖阻害を達成すること；および
・特定のヒト腸内微生物叢細菌種の２つの異なる株の、少なくとも１０倍の増殖阻害を達成すること。
【００４６】
本発明は、患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団を提供し、該方法は、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが、患者において免疫細胞療法を調節し、該疾病または症状が処置または予防されること：
を含む。
【００４７】
本発明は、患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団を提供し、該方法は、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である;および
ｂ．患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること、
を提供する。
本発明はまたは、本発明の方法を実行するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、アレイ、ｃＲＮＡおよびキットを提供する。
【００４８】
本発明はまた、本方法を実施するためのシステム、キットおよび他の手段に関する。
【００４９】
一例では、本明細書中の１つの構成上の任意の特徴は、本発明の異なる構成と組み合わされて、本明細書の１つ以上の特許請求の範囲においてこれらの組合せを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、キシロース誘導性システムを示す。
【００５１】
【図２】図２は、ＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲアレイを示す。
【００５２】
【図３】図３は、本研究で用いた株のＴＨ寒天培地上のスポットアッセイを示す。全ての株を、３７℃で２０時間、ＴＨ寒天培地上で増殖させた。それぞれのコロニー数をカウントするために、一晩培養した培養液の段階希釈を、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌ  ＬａｃｔｉｓおよびＳ．ｍｕｔａｎｓについて２回、そしてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの両方の株について３回行った。
【００５３】
【図４】図４は、異なる培養条件下での、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉの選択的増殖を示す。テトラサイクリンは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９の選択的増殖には使用できない。しかしながら、３ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９を選択的に増殖させることが証明された。
【００５４】
【図５】図５は、２つのキシロース誘導カセットの構築を図示している。
【００５５】
【図６】図６は、プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａを有するＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＬＭＤ−９におけるキシロース誘導性カセットの特徴を実証した。キシロース量の増加に伴い、蛍光における明らかな応答を観察することができた。
【００５６】
【図７】図７は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの設計を図示している。該アレイは、誘導性キシロースプロモーターの支配下にＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子を標的とする２つのスペーサー配列を含有し、強力な構成的プロモーターＰ３Ａの支配下にｔｒａｃｒＲＮＡを含有している。
【００５７】
【図８】図８は、プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｐｌｄｈ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰＸｙｌＡによる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＬＭＤ−９の形質転換効率を示す。
【００５８】
【図９】図９は、キシロース誘導性ＣＲＩＳＰＲ装置の模式図を示している。キシロースの誘導により、ＣＲＩＳＰＲアレイが標的とするＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  ＬＭＤ−９ゲノム上のｐｏｌＩＩＩおよびｔｅｔＡの両方が発現される。恒常的に発現されるｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に、Ｃａｓ９と複合体が形成される。この複合体が、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９ゲノムにおけるｔｅｔＡおよびｐｏｌＩＩにおいて、二重鎖切断を誘導し、細胞生存率の制限をもたらすであろう。
【００５９】
【図１０】図１０は、プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰＸｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡを有するＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  ２０６１７（Ｔ）の、非誘導および誘導における、増殖阻害を示す。写真は６３時間のインキュベーション後に撮影した。コロニー数は左下の角に記載した（上の行：＞１０００、＞１０００、下の行：３３６、１１３）。
【００６０】
【図１１】図１１は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ由来の１６Ｓ配列の最尤系統樹を示す。
【００６１】
【図１２】図１２は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかを有するＥ．ｃｏｌｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの共培養物におけるＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５ − ＸｙｌＲ − ＣＲＩＳＰＲ − ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５ − ＸｙｌＲ − ＣＲＩＳＰＲ − ＰｌｄｈＡ ＋ ＸｙｌＡプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ（中央の列）の間で増殖の違いは観察されない。しかしながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（２．５μｌ／１  ＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上で選択的に増殖させた）は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡ（強い）またはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ（弱い）プラスミドの間で、予想通り形質転換効率の低下を示す。従って、細胞の混合集団における標的とするＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ亜集団の選択的増殖阻害を実証した。コロニー数は左下の角に記載した（上の行：＞１０００、＞１０００、６８：下の行：＞１０００、＞１０００、３２）。
【００６２】
【図１３】図１３はｌ、ｓｐＣａｓ９およびリボソームＲＮＡサブユニット１６ｓを標的とする自己標的化ｓｇＲＮＡの発現を制御する調節因子を示す。
【００６３】
【図１４】図１４は、外因性のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムによるＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的化を示す。ｓｇＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０などのＫ−１２由来Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを標的とするが、試験した他の株は影響を受けなかった。
【００６４】
【図１５】図１５は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの誘導なしの、ＴＨ寒天培地における、本研究で用いた個々の細菌種および混合培養液の段階希釈によるスポットアッセイを示す。
【００６５】
【図１６】図１６は、異なる選択培地上の、１０００倍希釈のスポットアッセイを示す。２．５ｇ／ｌのＰＥＡを有するＴＨは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ単独のための選択的培地である。マルトースを添加したマッコンキーは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的かつ差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）培養培地である。従って、ＴＯＰ１０ΔｍａｌＫ変異体は、プレート上に白いコロニーを形成し、一方Ｎｉｓｓｌｅは、ピンクのコロニーを形成する；ＡはＥ  ｃｏｌｉ  ΔｍａｌＫ、ＢはＥ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｉｌｅ、ＣはＢ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＤはＬ  ｌａｃｔｉｓ、Ｅは混合培養液である；マッコンキー−のＢとＥの画像はピンクに見える；マッコンキー＋のＢとＥの画像はピンクに見える。
【００６６】
【図１７】図１７は、異なる培地および選択プレート上の、本研究で用いられる細菌の選択的増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な説明
以下の実施例において、増殖阻害を、ヒト腸内微生物叢細菌種の混合集団において、調べた。共同体において、選択的に標的化された種（グラム陽性ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）集団）の、１０倍を超える集団増殖阻害が達成され、非標的化共生細菌が温存された。発明者らは、腸内微生物叢などの微生物叢を患者のin situで改変し、それにより、微生物叢の変化に応答して患者において免疫細胞調節を可能にするための、これの有用な適用を実現した。発明者らはまた、変化され得る微生物叢を含む、植物および酵母などの対象において、処置を調節することに対する適用を実現した。発明者らは、さらに、自己免疫性の疾病、炎症性の疾病およびウイルス感染症（例えば、ヒトのＨＩＶ感染症）などの、患者において免疫細胞ベースの治療を調節するため、または患者において免疫細胞媒介性の疾病または症状を治療または予防するための、実用化を実現した。発明者らは、ヒトまたは動物の対象または患者において該調節をもたらすための、腸、皮膚、膣、鼻、眼、肺、消化管、直腸、陰嚢、耳、皮膚または毛髪のディスバイオシスを引き起こすことの実用化を実現した。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「ディスバイオシス」は、微生物叢（例えば、腸内微生物叢）の、細菌および／または古細菌のバランスの変化を指す。該変化は、該方法を実行する前の（例えば、実行する直前、または、実行する前の１日未満の）バランスとの相対的なものである。該変化は、（ｉ）微生物叢（例えば、腸内微生物叢）（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓまたはｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）における、第１の種（細菌または古細菌の種）または株の割合の増加；（ｉｉ）第１の種と第２の種（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓ対Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、または、Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ対Ｅ  ｃｏｌｉもしくはＬ  ｌａｃｔｉｓ）、同じ種の第１の株と第２の株、または、互いに異なる第１の門と第２の門（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）対ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の相対的割合の増加；（ｉｉｉ）処置方法の前には、微生物叢に含まれなかった種または株の添加；（ｉｖ）微生物叢における、第１の種（細菌または古細菌の種）または株（例えば、  Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の割合の減少；（ｖ）第１の種と第２の種（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓ対Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、または、Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ対Ｅ  ｃｏｌｉ  もしくはＬ  ｌａｃｔｉｓ）、同じ種の第１の株と第２の株、または、互いに異なる第１の門と第２の門（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）対ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の相対的割合の減少；および（ｖｉ）処置方法の前には、微生物叢に含まれなかった種または株の除去のうちの１つ以上であり得る。
【００６９】
免疫システムが微生物叢の組成に及ぼす影響は、病気にかかりやすいように微生物群を変えるいくつかの免疫不全によって示唆されている。例えば、Garrett et al．は、自然免疫系と適応免疫系の両方の細胞における炎症性の応答を支配する転写因子T−bet（Tbx21によってコードされる）を欠くマウスを研究した(Cell. 2007 Oct 5;131(1):33−45, “Communicable ulcerative colitis induced by T−bet deficiency in the innate immune system”, Garrett WS et al.)。適応免疫を欠くＲａｇ２−／−マウスにＴｂｘ２１−／−マウスを交配させると、Ｔｂｘ２１−／−／Ｒａｇ２−／−子孫は微生物叢依存的に潰瘍性大腸炎を発症した。驚くべきことに、この大腸炎の表現型は、Ｔｂｘ２１−／−／Ｒａｇ２−／−微生物叢の養子移入により、野生型マウスに伝達可能であった。このことは、変化した微生物叢が、疾病を誘導するのに十分であることを実証した。免疫由来のディスバイオシスの別の例は、インフラマソーム成分ＮＬＲＰ６の上皮細胞発現が欠損しているマウスにおいて見られる。これらのマウスは、腸炎症性細胞の動員および化学的に誘発される大腸炎への感受性の増加に関連するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）のメンバーの存在量の増加を伴う変化した微生物叢を発生させる。
【００７０】
個々の共生種が、異なるエフェクター機能を有する粘膜固有層Ｔリンパ球サブセットの構成に影響を及ぼすことは明らかにされている。腸粘膜におけるホメオスタシスは、インターフェロンγを生産するＴｈ１細胞、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｆおよびＩＬ−２２を産生するＴｈ１７細胞、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞に似たサイトカインエフェクター特徴を有する多様な天然のリンパ系細胞、並びに抗炎症性Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む、潜在的に炎症促進性である細胞間の、チェックおよびバランスのシステムによって維持されている。
【００７１】
本発明の特定の適用は、患者におけるＴｈ１７細胞集団の形成において見出される。これらの細胞は、自己免疫性の、および、炎症性の疾患に関係づけられている。これらの細胞は、Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al., “Interleukin 17−producing CD41 effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages”, Nat Immunol. 2005;6(11): 1123−1132、および、Park H, Li Z, Yang XO, et al., “A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17”, Nat Immunol. 2005; 6(11):1133−1141に記載された。自己免疫性の疾患の場合、Ｔｈ１７細胞の過剰活性化は、多発性硬化症、関節リウマチおよび乾癬の場合のように、不適切な量の炎症を引き起こし得る。Ｔｈ１７細胞はまた、粘膜免疫の維持に必要であることが示されている。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｒｅｇ細胞と比較した遺伝子発現の増加に起因する遅発型喘息反応の発症に寄与し得る。
【００７２】
ＨＩＶでは、Ｔｈ１７細胞集団の喪失が慢性感染の一因となり得る。腸内のＴｈ１７細胞集団の枯渇は、腸管バリアを破壊し、微生物移行により腸から出る細菌の移動レベルを増加させ、慢性ＨＩＶ感染症およびＡＩＤＳへの進行に寄与する。微生物移行は、細菌の、腸管内腔の外からの、粘膜固有層内へ、リンパ節へ、およびさらに非リンパ組織への移動をもたらす。それは、ＨＩＶの後期段階に全身で見られる一定の免疫活性化を引き起こし得る。腸内のＴｈ１７細胞集団の増加は、効果的な処置であり、かつ、おそらく予防的でもあることが示されている。腸内の、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞はＨＩＶによって重度に枯渇されるが、特に腸内のＴＨ１７細胞の喪失は慢性の病原性ＨＩＶおよびＳＩＶ感染症の徴候に関連している。微生物移行は、ＨＩＶの文脈において、慢性炎症および免疫活性化に寄与する主要な因子である。ＳＩＶの非病原性の場合には、微生物移行は観察されない。Ｔｈ１７細胞は、腸におけるＨＩＶ感染症の間に、腸内上皮バリアを維持することによって、重度ＨＩＶ感染症を予防する。それらの、高レベルのＣＣＲ５発現（ＨＩＶの共受容体）のために、それらは優先的に感染して、枯渇する。従って、微生物移行は、Ｔｈ１７細胞の枯渇を通して生じる。さらに、腸内のＴｈ１７細胞の喪失は、炎症性Ｔｈ１７細胞とそれらの抗炎症性対応物であるＴｒｅｇ細胞との間のバランスの喪失につながる。Ｔｒｅｇ細胞は、その免疫抑制特性のため、ＨＩＶに対する抗ウイルス応答を減少させ、病因に寄与していると考えられている。Ｔｈ１７活性と比較してより高いＴｒｅｇ活性があり、ウイルスに対する免疫応答はあまり積極的および効果的ではない。Ｔｈ１７細胞の活性を高めること（ｒｅｖｉｔａｌｉｚｉｎｇ）は、炎症の減少を含む、慢性感染症の徴候を減少させることが示されており、高活性抗レトロウイルス処置（ＨＡＡＲＴ）に対する応答が改善される。これは、重要な発見であり、微生物移行は一般的に、ＨＡＡＲＴへの不応答をもたらす。患者は継続して徴候を示し、予想されるウイルス量の低減は示さない。ＳＩＶ−アカゲザルモデルにおいて、、Ｔｈ１７分化および増殖を促進することが示されたサイトカインであるＩＬ−２１を投与すると、Ｔｈ１７細胞集団を増加させることによって微生物移行が減少することが見出された。
【００７３】
本方法の一例では、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２は、細胞集団と共に、患者に、順次または同時に投与される。このことは、患者において免疫細胞集団をさらに調製するのに、有用である。
【００７４】
Yang et al.は、マウスにおけるＴｈ１７細胞の存在は、微生物叢を有するマウスにおける定着を必要とすることを発見した。セグメント細菌（ＳＦＢ）は、動物モデルにおいて、Ｔｈ１７細胞を誘導し、Ｔｈ１７依存性の自己免疫性の疾病を促進するのに十分であった(Nature, 2014 Jun 5;510(7503):152−6. doi: 10.1038/nature13279. Epub 2014 Apr 13, “Focused specificity of intestinal Th17 cells towards commensal bacterial antigens”, Yang Y et al.)。ＳＦＢは、回腸末端の腸上皮細胞を覆う粘液層に浸透できるようであり、それらは上皮細胞と密接に相互作用し、相互作用の部位で宿主細胞アクチン重合を誘導し、おそらく、粘膜固有層内のＴｈ１７極性化環境をもたらすシグナル伝達事象を誘導する。
【００７５】
一例では、第１の細菌は、セグメント細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡに、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または、９９％同一である、１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む種または株の細菌である。ある実施形態では、本方法は第１の細菌の割合を増加させ、ここで、患者におけるＴｈ１７細胞はアップレギュレートされ、例えば、疾病は、がんまたはウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ）である。ある実施形態では、本方法は、第１の細菌の割合を減少させ、患者におけるＴｈ１７細胞はダウンレギュレートされ、例えば、疾病または症状は自己免疫性または炎症性の疾病または症状であるか、あるいは、ＡＣＴを受けているがん患者においてＣＲＳのリスクを減少させるためである。
【００７６】
一例では、本方法は、アレルギー性の疾病または症状、例えば喘息を、処置または予防する。一例では、本方法は、ＩｇＥ媒介性の疾病または症状、例えば喘息を、処置または予防する。
【００７７】
一例では、本方法は、Ｔｈ２細胞のサイトカイン放出によって媒介される、患者の自己中毒（ａｕｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を低減させる。
【００７８】
Lopez et al.は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）／バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の比率の低減により特徴づけられる、腸のディスバイオシスが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者において報告されることを発見した。彼らの研究において、インビトロ培養物により、ＳＬＥ患者便サンプル（ＳＬＥ−Ｍ）から単離された微生物叢が、健常なコントロール微生物叢よりも、リンパ球活性化およびナイーブＣＤ４＋リンパ球からのＴｈ１７分化を、より大きく促進することを明らかにした。Ｔｒｅｇ誘導細菌によるＳＬＥ−Ｍの濃縮は、２つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌株の混合物がＴｈ１７／Ｔｈ１バランスを有意に低減させたが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍの補充はＣＤ４＋リンパ球過剰活性化を妨げたことを示した。患者サンプルのエスビボ解析は、Ｔｈ１７およびＦｏｘｐ３＊ＩＬ−１７＋集団が増幅したこを示し、Ｔｒｅｇ−Ｔｈ１７分化転換が可能であることが示唆された。さらに、糞便微生物叢の分析は、健常なコントロールにおけるＩＬ−１７＋集団とファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）との間に負の相関を明らかにしたが、ＳＬＥでは、この門は患者においてわずかに低減されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮγの血清レベルと直接相関した（Sci Rep. 2016 Apr 5;6:24072. doi: 10.1038/srep24072, “Th17 responses and natural IgM antibodies are related to gut microbiota composition in systemic lupus erythematosus patients”, Lopez P et al.）。
【００７９】
他の細菌が、Ｔｒｅｇの分化を指示することによって、またはＩＬ−１０発現を誘導することによって、適応免疫システムの抗炎症性分枝（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｒａｎｃｈ）を増強することが示されている。例えば、最初はマウス糞便から単離され、主にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属する、４６のマウスクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ）株の複雑なカクテルによるノトバイオートマウスの定着は、粘膜固有層および全身のＴｒｅｇの増幅をもたらす。
【００８０】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓポリサッカライドＡ（ＰＳＡ）は、全身のＴ細胞応答の発達に影響を与える。ＰＳＡを生産するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓによる無菌マウスでの定着は、ＰＳＡを欠くＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓを定着させたマウスと比較して、より多くの循環ＣＤ４＋Ｔ細胞を生じる。ＰＳＡを生産するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓはまた、血液循環中のより高頻度のＴｈ１細胞を誘発する。これらの知見は共に、共生細菌が、粘膜組織をはるかに越える、全体的な免疫への影響を有することを示している。
【００８１】
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは酪酸を生産し、その経口投与はマウスのＴＮＢＳ誘導大腸炎の重症度を低減させるめ、ＩＢＤ患者において見られるこの細菌の減少は興味深い。一例では、第１の種は、酪酸生産細菌種（例えば、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）であり、微生物叢において、第１の種の割合は低減され、該方法は、患者においてエフェクターＴ細胞、および／または、ヘルパーＴ細胞をダウンレギュレートし、それにより、前記疾病または症状（例えば、自己免疫性または炎症性の疾病または症状、またはＣＲＳ）を治療または予防する。
【００８２】
古細菌は、伝統的に５つの門に分かれており、すなわち、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ、ＮａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａおよびＴｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａである。豊富な全ゲノムデータの増加に基づいて（主に、環境分離菌由来）、古細菌の系統発生は最近見直されている。Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａおよび新たに提案されたＡｉｇａｒｃｈａｅｏｔａの４つのグループが、１つの上門（いわゆる、ＴＡＣＫ上門）に含まれ、ＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａおよびＮａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａは除外されている。本発明の方法の第１の種は、本段落で述べた古細菌のいずれかであり得る。
【００８３】
Ｔ細胞は胸腺で成熟し、ＴＣＲ受容体（Ｔ細胞受容体）を発現し、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性）と呼ばれるか、またはＣＤ４糖タンパク質を発現することができ、そのためＣＤ４細胞（ヘルパーＴ細胞）と呼ばれるかのいずれかである。ＣＤ４＋細胞は、異なるサブセット、ＴＨ（Ｔヘルパー）１、ＴＨ２、ＴＨ、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞ｓ）およびＴｆｈ（濾胞性ヘルパーＴ細胞ｓ）に分化し、これらは異なるサイトカインプロファイルにより特徴づけられる。これらの異なるＣＤ４＋サブセットは、Ｔ細胞の免疫およびエフェクター応答機能において、重要な役割を果たす。全てのＣＤ４＋ＴＨサブセットは、特定のサイトカインにより、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から分化し、ＴＨ１は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ（炎症誘発性のサイトカインであり、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）の増加、サイトカイン分泌の誘導、またはマクロファージの活性化などの、複数の役割を有する）により分化し、Ｔｈ２はＩＬ−４により分化し、ＴｒｅｇはＩＬ−２およびＴＧＦ−βにより分化する。ＴＨサブセットはそれぞれ、特定のサイトカインを放出する、炎症誘発性または抗炎症性の機能、生存または保護機能のいずれかを有し得る、特定のサイトカインを放出する。例えば、ＴＨ１はＩＦＮ−γおよびＴＮＦを放出し、Ｔｈ２はＩＬ−４（Ｂ型リンパ球の重要な生存因子）、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を放出し、ＴＨ９はＩＬ−９を生産し、ＴｒｅｇはＩＬ−１０（免疫抑制機能を有するサイトカインであり、Ｔｒｅｇの抑制機能に必要なＦＯＸ３転写因子の発現を他の細胞上で維持する）およびＴＧＦ−βを分泌し、Ｔｈ１７はＩＬ−１７（細菌および真菌に対する宿主防御において重要な役割を果たすサイトカイン）を生産する。
【００８４】
本発明のある実施形態は、ＣＡＲ−Ｔおよび他の養子免疫療法（養子ＴＩＬ療法など）を調節するための適用を見出した。いくつかの報告が、ＣＡＲ−Ｔおよび他の免疫細胞ベースの治療を評価する際の重要な考慮事項である、ＣＤ４＋サブセットによって放出される異なるタイプのサイトカインの異なる役割を実証している。ＴＨ１およびＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットサイトカインは、第２世代のＣＤ２８含有ＣＡＲ−Ｔによって生成される異なるタイプの細胞傷害性を促進することが示された。高レベルのＴＨ１サイトカインでは短期毒性が観察され、第２世代のＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔを受けた動物では高用量のＴＨ２型サイトカインが慢性自己細胞傷害性を生じた。誘導性ＩＬ−１２を送達するように操作したＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍間質を調節してがんを破壊した。操作されたCAR−T細胞によるＩＬ−１２放出は、マクロファージを動員することによって、抗がん活性を上昇させた。ＣＡＲ−Ｔにより放出されたＩＬ−１２はまた、抑制細胞の再プログラミングを誘導し、その阻害機能を逆転させ、臨床試験におけるその評価を示唆した。ＣＡＲ−Ｔ療法の存続は、注入産物中のＣＤ４＋細胞の数およびセントラルメモリー細胞の数に依存することが示された。ＣＤ８＋エフェクター細胞からではなく、セントラルメモリーＴ細胞から単離されたＣＤ８＋クローンが、非ヒト霊長類モデルにおいて、養子Ｔ細胞移入の間インビボで長期間存続し、このことは、効果的な養子免疫療法のための、特定のＴ細胞サブセットの機能の重要性を示した。ＣＤ８＋サブセットとＣＤ４＋サブセットとの組み合わせが、Ｔ細胞養子移入を顕著に増強したこともまた、示されている。ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋記憶機能の発達を支持することが示され、免疫療法の治験におけるサブセットおよび組み合わせの両方の重要性を実証した。いくつかの前臨床モデルは、効果的なＣＡＲ−Ｔ療法ための、異なるＴ細胞サブセットの利点を実証した：Ｔ記憶幹細胞表現型細胞に最も近いＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＡＲ−Ｔ細胞は、より大きなＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を生じた。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋サブセットは共に、相乗的な抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ活性を発現した。
【００８５】
一例では、投与される細胞集団は、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔサブセットと、ＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔサブセットとの組み合わせを含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団である。
【００８６】
本発明の一例では細胞療法は、養子Ｔ細胞療法であり、場合により、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびTh17細胞からなる群から選択される細胞が、患者に投与される。一例では、細胞療法は、本発明の方法により増強され、例えば、がん細胞の免疫細胞細胞傷害性が患者において増強されるか、または、疾病または症状の処置が増強される。一例では、細胞療法は、本発明の方法により低減され、例えば、例えば、がん細胞の免疫細胞細胞傷害性が患者において低減されるか、または、（例えば、がん患者において）ＣＲＳのリスクが低減される。従って、ある実施形態では、本方法は、患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する。ある実施形態では、本方法は、細胞療法の望まれない副作用（例えば、ＣＲＳなどの、ヒト患者におけるＣＡＲ−Ｔ療法の副作用）を低減または予防する。
【００８７】
一例では、免疫細胞集団は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、および／または、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、および／または、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、操作されたＴＩＬ）を含む。ＷＯ２０１３０６３３６１、ＵＳ９１１３６１６、ＵＳ２０１３０１０９０５３、ＵＳ２０１６００８１３１４およびＷＯ２０１６０４４７４５（これらの開示は、本明細書に参照により組み込まれる）は、本発明において使用するための細胞を生成するのに使用するための、ＣＡＲおよびＴＣＲを生成するための好適な遺伝子導入のインビボのプラットフォームを記載する。免疫細胞集団は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および／またはＴＩＬなどの、操作された自家の、または同種の免疫細胞（移植片）を含んでよく、例えば、ここで細胞および患者はヒトである。自家細胞の利点は、内因性システムの調節が、自家細胞を移植した細胞の調節と同様に調整される可能性があることである。ある実施形態では、投与された細胞および患者は、同じ種または株の細胞または患者であり、例えば、ヒトまたはげっ歯類（例えば、マウス）であり、例えば、ＨＬＡまたはＭＨＣ適合のドナー移植片およびレシピエント患者である。
【００８８】
一例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である。例えば、投与されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を含み、場合により、該細胞は、Ｔｈ１７細胞である。ある実施形態では、投与されるＴ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【００８９】
マウスにおける養子移入実験は、Ｔｈ１７細胞が、Ｔｈ１極性細胞よりも高いインビボの生存率および自己再生能を有することを示している。それゆえ、一例では、Ｔｈ１７細胞が、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性Ｔ細胞、および／または、患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。ある実施形態では、ＲＯＲγｔ発現Ｔｈ１７細胞がアップレギュレートされ、例えば、患者において増殖している。ある実施形態では、１つ以上のＴｈ１７関連遺伝子、例えば、Ｒｏｒｃ、Ｉｌ２２およびＩｌ２６の１つ以上の発現が、増加している。ある実施形態では、１つ以上のＴｈ１関連遺伝子、例えば、Ｉｆｎｇ、ＴｎｆａおよびＴｂｘ２１（Ｔ−ｂｅｔ）の１つ以上の発現が、増加している。ある実施形態では、この場合、疾病または症状はがんである。
【００９０】
一例では、Ｔｒｅｇ細胞は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性Ｔ細胞であってよく、および／または、患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。ある実施形態では、この場合、疾病または症状は、Ｔｒｅｇ細胞がアップレギュレートされたときの自己免疫性の、炎症性の、または感染性の疾病または症状である。
【００９１】
一例では、ＣＤ４＋細胞は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
【００９２】
一例では、ＣＤ８＋細胞は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
【００９３】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
【００９４】
一例では、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ以上などのメモリー細胞が、微生物叢または患者においてアップレギュレートされ、場合により、該細胞は、患者に投与される免疫細胞集団に含まれ、および／または、その子孫である。ある実施形態では、メモリー細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋である。
【００９５】
ある細胞集団のアップレギュレーションは、例えば、微生物叢または患者または対象における、そのタイプ（例えば、種または株）の細胞の集団の大きさまたは割合の増加であってよく、および／または、微生物叢または患者または対象における、そのタイプの細胞の活性（例えば、細胞傷害性、エフェクター機能またはサプレッサー機能）の増加であってよい。ある細胞集団のダウンレギュレーションは、例えば、微生物叢または患者または対象における、そのタイプ（例えば、種または株）の細胞の集団の大きさまたは割合の減少であってよく、および／または、微生物叢または患者または対象における、そのタイプの細胞の活性（例えば、細胞傷害性、エフェクター機能またはサプレッサー機能）の減少であってよい。
【００９６】
一例では、細胞療法集団は、ＣＡＲ−Ｔ細胞（すなわち、それぞれが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を表面発現するように操作されたＴ細胞）を含む。あるいは、該細胞は、ＣＡＲ−ＴＩＬまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞である。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍細胞抗原）に結合するための細胞外受容体ドメイン、膜貫通部分、および、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）においてシグナル伝達するための、１つ以上の（例えば、第１および第２の）シグナル伝達ドメインを含む細胞内部分を含む。好適な細胞内ドメインの例はよく知られており、例えば、ＣＤ３ζドメインと、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインの１つ以上との組み合わせであって、例えば、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８、またはＩＣＯＳおよび４１−ＢＢ、ＣＤ２８および４１−ＢＢシグナル伝達ドメインの組み合わせである。
【００９７】
場合により、細胞集団は、疾病（例えば、がん、自己免疫性の疾病、移植片拒絶、または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ））の治療または予防のために患者に投与される移植片に含まれ、あるいは、細胞または移植片は、該使用のためのものである。
【００９８】
一例では、患者はヒトであり、例えば、女性または男性である。
【００９９】
一例では、患者またはヒトは、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の投与の前に、リンパ球枯渇を受けている。
【０１００】
ＣＡＲおよびＣＡＲＴ細胞を生産する技術は、当業界で知られていて通例であり、本発明において使用するための細胞を生産するために、一般的に適用することができる（例えば、本発明に適用可能な一般的方法として、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１；ＵＳ８９０６６８２、ＵＳ８９１１９９３、ＵＳ８９１６３８１、ＵＳ８９７５０７１、ＵＳ９１０１５８４、ＵＳ９１０２７６０、ＵＳ９１０２７６１、ＵＳ９３２８１５６、ＵＳ９４６４１４０、ＵＳ９４８１７２８、ＵＳ９４９９６２９、ＵＳ９５１８１２３、ＵＳ９５４０４４５、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＵＳ２０１３０２８８３６８、ＵＳ２０１３０３０９２５８、ＵＳ２０１４０１０６４４９、ＵＳ２０１４０３７００１７、ＵＳ２０１５００５０７２９、ＵＳ２０１５００９３８２２、ＵＳ２０１５００９９２９９、ＵＳ２０１５０１１８２０２、ＵＳ２０１６０１３０３５５、ＵＳ２０１６０１５９９０７、ＵＳ２０１６０１９４４０４、ＵＳ２０１６０２０８０１２； J Immunother. 2009 Sep; 32(7): 689―702, doi:  10.1097/CJI.0b013e3181ac6138, “Construction and Pre−clinical Evaluation of an Anti−CD19 Chimeric Antigen Receptor”, James N. Kochenderfer et al；またＷＯ２０１４０１２００１およびＵＳ２０１５０２９０２４４を参照されたい）。例えば、エレクトロポレーション、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの使用は、当業者は知るところであろうが、ＣＡＲのエレメントをコードするヌクレオチド配列を、Ｔ−細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬまたは他の免疫細胞に導入して、ＣＡＲ−細胞を生産するために用いることができる。患者から単離された細胞（自家細胞サンプル）、または、同種の別のドナーから単離された細胞（同種サンプル）は、遺伝子操作されてＣＡＲをコードする配列を含む祖先細胞を提供するために、用いることができる。細胞の増幅は、当業界で知られることであるが、該プロセスで用いることができる。例えば、ＣＡＲ細胞を操作した後、通例の技術を用いて細胞集団を大量に増幅して、患者に投与（例えば、注入（ｔｒａｎｓｆｕｓｅ））される移植片を生産することができる。患者は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。１つ以上のＣＡＲエレメントに対する（例えば、１つ以上のシグナル伝達ドメインに対する）ヌクレオチド配列を、患者または別のドナーから得た細胞を用いて、クローニングまたはシーケンシングすることができる。
【０１０１】
例えば、ＣＡＲは、ヒトＣＤ３ζドメインである、第一の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、患者に投与される細胞は、該ヒトＣＤ３ζドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、ヒト細胞である。一例では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号２４のアミノ酸配列を含み、該配列は、本発明における使用のために本明細書に明示的に組み込まれ、本明細書の１つ以上の特許請求の範囲に含めることができる。一例では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１８の核酸配列によりコードされ、該配列は、本発明における使用のために本明細書に明示的に組み込まれ、本明細書の1つ以上の特許請求の範囲に含めることができる。
【０１０２】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８ドメインであり、本発明の細胞集団は、ヒトＣＤ２８ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒト細胞の集団である。
【０１０３】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢドメインであり、本発明の細胞集団は、ヒト４−１ＢＢドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒト細胞の集団である。
【０１０４】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインは、ヒトＯＸ４０ドメインであり、本発明の細胞集団は、ヒトＯＸ４０ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒト細胞の集団である。
【０１０５】
一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインであり、第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の細胞（例えば、ヒト野生型細胞、または患者から単離された細胞）に天然に共生せず、例えば、第２のドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０または４−１ＢＢドメインである。
【０１０６】
一例では、第１の細胞内ドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインまたは４−１ＢＢドメインである。
【０１０７】
一例では、ＣＡＲは、抗原結合部位（例えば、ヒトであってよい抗体ｓｃＦｖ）；場合によりヒンジ（例えば、ヒトＣＤ８αヒンジ）；膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ８αまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン）；およびヒトＣＤ３ζドメインを含む、操作された単一ポリペプチドである。一例では、ＣＡＲは、２つ以上の前記ポリペプチドの複合体である。場合により、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζドメインとの間に、さらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉ）を含む。場合により、ＣＡＲは、さらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ３ζドメインは、さらなるシグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインとの間にある。一例では、さらなるシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメインまたはＣＤ１６ドメインである。代替としては、単一ポリペプチドの代わりに、ＣＡＲは、該ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチドの、操作された複合体を含む。
【０１０８】
免疫細胞は、単独で、または、希釈剤と、および／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインまたは細胞集団などの他の成分と組み合わせて、医薬組成物として投与されてよい。
【０１０９】
ある実施形態では、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ細胞またはＴＣＲを有する細胞）は、ＴＡＡに結合する細胞表面結合部位（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲにより提供される）を含む。腫瘍抗原（ＴＡＡ）は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって生産されるタンパク質である。抗原結合特異性の選択は、治療される特定のがんのタイプに依存するであろう。腫瘍抗原は当業界でよく知られており、本発明のある実施形態の文脈において、例えば、グリオーマ関連抗原, がん胎児抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｍ）、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｒｂｏｘｙｉ  ｅｓｔｅｒａｓｅ）、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ，好中球エラスターゼ，エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメンテリンが含まれる。
【０１１０】
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する、１つ以上の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として働くことができる多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、メラノーマ中のＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、並びに、前立腺がん中の前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの、組織特異的抗原が含まれるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ−２／ＮｅｕＥｒｂＢ−２などの、形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の、真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤＩ９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ種における標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体による受動免疫療法のための標的として用いられているが、効果は限られる。１つ目の抗原または４つ目の結合部分は、これらのＴＡＡのいずれかであり得るか、またはこれらのＴＡＡのいずれかの抗原性配列であり得る。
【０１１１】
本発明のある実施形態では、ＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：ＭＡＲＴ−ｌ／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｌＯＯ（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原、および、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ５などの腫瘍特異的多系列の抗原；ＣＥＡなどの過剰発現の胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどの過剰発現したがん遺伝子および変異した腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、１ＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ）；および、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ並びにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７が含まれる。他の、大きな、タンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂｒＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４（７９１Ｔｇｐ７２｝αフェトプロテイン（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｍ）、ｂｅｔａ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｉ、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質Ａ、シクロフィリンＣ関連タンパク質、、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが含まれる。
【０１１２】
一実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲは、ヒトＣＤ１９のための結合部位を含み、例えば、ＣＡＲについては、これは、抗体ＣＤ１９ｓｃＦＶにより提供され得、場合により、抗ＣＤ１９ｓｃＦＶは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１４によりコードされる。一実施形態では、抗ＣＤ１９ｓｃＦＶは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１１３】
一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つと天然に結合する膜貫通ドメインが用いられる。いくつかの例では、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換によっては改変して、これらのドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。
【０１１４】
膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来してよい。起源が天然の場合、該ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来してよい（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってよく、その場合、該ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含むであろう。場合により、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端で見出されるであろう。
【０１１５】
場合により、短いオリゴペプチドの、またはポリペプチドのリンカー、好ましくは２か〜１０のアミノ酸長のリンカーが、ＣＡＲなどの免疫細胞膜貫通タンパク質の、膜貫通ドメインと、細胞内部分との間の連結を形成する。グリシン−セリンダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）は、特に好適なリンカー（例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー）を提供する。
【０１１６】
場合により、膜貫通ドメインは、配列番号１６の核酸配列によりコードされるＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１１７】
いくつかの例では、膜貫通ドメインは、配列番号１５の核酸配列によりコードされる、ＣＤ８ヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１１８】
患者に投与された細胞集団の細胞により発現される、膜貫通タンパク質の細胞内部分、言い換えれば細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通タンパク質を発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能（例えば、（例えば、Ｔエフェクター細胞に対して）細胞傷害性または、（Ｔ制御性細胞に対して）抑制を導くなどの、Ｔ細胞機能）のうち、少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解溶解活性またはヘルパー活性であってよく、サイトカインの分泌を含む。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部が使用される範囲においては、この切断された一部は、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、完全な鎖の代わりに使用されてよい。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部を含むことを意味する。投薬された細胞の膜貫通タンパク質に用いる細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および、協調して作用して抗原受容体の結合に続くシグナル伝達を開始する共受容の、細胞質側の配列、ならびにこれらの配列の任意の派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）または変異体、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。
【０１１９】
ＴＣＲ単独で生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次または共刺激シグナルも必要であることが、知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により媒介されると言える。すなわち、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列（一次細胞質シグナル伝達ドメイン）と、抗原非依存的に作用して、二次または共刺激シグナルを提供する細胞質シグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達ドメイン）である。一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的方法、または、阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち、ＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでよい。
【０１２０】
一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζドメイン）である。一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、二次細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢドメイン）である。
【０１２１】
一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭを含む。
【０１２２】
本発明において特に有用な、好適なＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達ドメインの例には、ＴＣＲζ、ＦｃＲｇａｍｍａ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するシグナル伝達ドメインが含まれる。本発明の膜貫通タンパク質における細胞質シグナル伝達分子が、ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達配列を含むことが、特に好ましい。
【０１２３】
細胞内部分は、場合により、（例えば、第１のシグナル伝達ドメイン、またはさらなる細胞内ドメインとして）共刺激分子のドメインを含む。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。従って、これらおよび他の共刺激エレメントは、膜貫通タンパク質の細胞内部分における使用のための本発明の範囲内である。
【０１２４】
細胞内部分ドメインは、１つ以上のリンカー、例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーにより、共に連結されていてよい。
【０１２５】
一実施形態では、細胞内部分は、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含む。別の実施形態では、細胞内部分は、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインと、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含む。さらに別の実施形態では、細胞内部分は、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含む。
【０１２６】
一実施形態では、細胞内部分は、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインとを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号１７に記載される核酸配列によりコードされ、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインは配列番号１８に記載される核酸配列によりコードされる。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１２７】
一実施形態では、細胞内部分は、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインとを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１２８】
一実施形態では、細胞内部分は、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインとを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１２９】
Ｔ細胞および他の免疫細胞の起源は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１、ＵＳ８９０６６８２、ＵＳ８９１１９９３、ＵＳ８９１６３８１、ＵＳ８９７５０７１、ＵＳ９１０１５８４、ＵＳ９１０２７６０、ＵＳ９１０２７６１、ＵＳ９３２８１５６、ＵＳ９４６４１４０、ＵＳ９４８１７２８、ＵＳ９４９９６２９、ＵＳ９５１８１２３、ＵＳ９５４０４４５、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＵＳ２０１３０２８８３６８、ＵＳ２０１３０３０９２５８、ＵＳ２０１４０１０６４４９、ＵＳ２０１４０３７００１７、ＵＳ２０１５００５０７２９、ＵＳ２０１５００９３８２２、ＵＳ２０１５００９９２９９、ＵＳ２０１５０１１８２０２、ＵＳ２０１６０１３０３５５、ＵＳ２０１６０１５９９０７、ＵＳ２０１６０１９４４０４、ＵＳ２０１６０２０８０１２に開示されており、並びに、これらを生成、活性化、および増幅する方法も開示されている。これらの開示は、本発明を実施する際の可能性のある使用のために参照される。
【０１３０】
本方法による処置または予防のためのがん
【０１３１】
治療され得るがんには、血管新生されないか、実質的に血管新生されない腫瘍、並びに、血管新生された腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫などの血液系腫瘍）を含むか、または固形腫瘍を含み得る。本発明で処置されるがんのタイプには、細胞種（細胞腫）、芽細胞腫、および肉腫（肉腫）、およびある種の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、悪性腫瘍（例えば、肉腫、細胞腫およびメラノーマ）が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。
【０１３２】
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液性（または血行性）のがんの例には、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄白血病、および、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｉｏｃｙｔｉｃ）白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の）、多発性骨髄腫，ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および骨髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
【０１３３】
固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含有しない、組織の異常な腫瘤である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、細胞腫、およびリンパ腫など）について、名前が付けられている。肉腫および細胞種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫，軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん，リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺癌、汗腺がん，甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫皮脂腺細胞腫、乳頭がん，乳頭状腺がん、髄様がん，気管支原性肺癌、腎細胞がん、肝細胞がん，胆管細胞腫、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、メラノーマ、および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、星細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫，胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、脳室上衣腫、松果体腫（ｐｉｎｅａｉｏｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。
【０１３４】
一実施形態では、投与された細胞は、特定の癌を処置するように設計された第１の抗原結合部位（例えば、ＣＡＲによって含まれる）を発現する。例えば、第１の抗原結合部位は、ＣＤ１９に特異的に結合して、がんおよび疾患、例えば、前駆Ｂリンパ芽球性白血病リンパ腫（ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ）（小児適応症）、成人の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または同種骨髄移植後のサルベージを処置するために用いられ得る。別の実施形態では、第１の部分または第１の結合部位は、ＣＤ２２に特異的に結合して、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を処置する。
【０１３５】
一実施形態では、がんおよび疾患には、ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ（小児適応症）、成人の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後のサルベージなどが含まれるがこれらに限定されず、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＲＯＲ１のうち２つまたは３つを標的とする複数の架橋剤（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（または、単一の剤に含まれる複数の結合部分もしくは結合部位）の組み合わせを用いて処置することができる。
【０１３６】
一例では、細胞は、異なる（例えば、その標的抗原において異なる（かつ、場合により他の点では同一である））、第１および第２の膜貫通タンパク質（例えば、Ｔ細胞により発現された、２つのＣＡＲまたは、１つのＣＡＲおよび操作されたＴＣＲ）を含む。同様に、本発明は、例えば同一の移植片に含まれる、免疫細胞の混合物（例えば、ＣＡＲ細胞の混合物）を用いてよく、ここで、混合物は、異なる（例えば、その標的抗原において異なる（かつ、場合により他の点では同一である））膜貫通タンパク質（例えば、Ｔ細胞により発現された、２つのＣＡＲまたは、１つのＣＡＲおよび操作されたＴＣＲ）を含む細胞を含む。これは、例えば、がんによる処置に対する抵抗を低下させるため、あるいは、複数の標的抗原を表面発現するがん細胞などの細胞集団をより効果的に標的とするために、有用であり得る。
【０１３７】
一実施形態では、抗原結合部位は、メンテリンに特異的に結合して、中皮腫、膵臓がん、卵巣がんを、処置または予防する。
【０１３８】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａに特異的に結合して、急性骨髄白血病を、処置または予防する。
【０１３９】
一実施形態では、抗原結合部位は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、トリプルネガティブ乳がんまたは非小細胞肺がんを、処置または予防する。
【０１４０】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＰＳＭＡに特異的に結合して、前立腺がんを、処置または予防する。
【０１４１】
一実施形態では、抗原結合部位は、糖脂質Ｆ７７に特異的に結合して、前立腺がんを、処置または予防する。
【０１４２】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＥＧＦＲｖＩｌＩに特異的に結合して、膠芽腫（ｇｌｉｏｂａｓｔｏｍａ）を、処置または予防する。
【０１４３】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＧＤ−２に特異的に結合して、神経芽腫またはメラノーマを、処置または予防する。
【０１４４】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲに特異的に結合して、骨髄種、肉種、またはメラノーマを処置する。
【０１４５】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲに結合して、骨髄腫、肉腫およびメラノーマを処置する。
【０１４６】
特異的抗原結合は、インビトロで、２５℃または室温で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定される、１ｍＭ以下（例えば、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下）のＫＤによる結合である。
【０１４７】
１つの例では、本方法を用いた前記処置は、疾病または症状、またはその徴候の進行を低減させる。１つの例では、本方法を用いた前記処置は、例えば、少なくとも、１、２、３、４または５年間、疾病または症状、またはその徴候の発生率を低減させる。例えば、少なくとも、１、２、３、４または５年間、
【０１４８】
一例では、本方法は、哺乳動物、例えばヒト、男性または女性、または男児または女児、またはヒト乳児（例えば、１、２、３または４歳未満）で、インビボで行われる。一例では、患者は成人または小児のヒト患者である。
【０１４９】
ＣＡＲまたはＴＣＲは操作されている、すなわち、天然に存在しない部分とドメインの組み合わせを含む。一例では、細胞療法は、標的細胞を標的とし、標的細胞はがん細胞であり、例えば、白血病細胞、リンパ腫細胞、腺がん細胞、または、がん幹細胞である。場合により、投与される免疫細胞のＣＡＲまたはＴＣＲは、ヒトＣＤ１９（場合により、標的細胞は、白血病細胞またはリンパ腫細胞である）、ＥｐＣＡＭ（場合により、標的細胞は、肺がん細胞、胃腸がん細胞、腺癌、がん幹細胞である）、ＣＤ２０（場合により、標的細胞は白血病細胞である）、ＭＣＳＰ（場合により、標的細胞はメラノーマ細胞である）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、シアリルＴｎ、ＣＤ１３３、ＣＤ３３（場合により、標的細胞は、白血病細胞であり、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である）、ＰＭＳＡ、ＷＴ１、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ−１、ＭＵＣ−１６、ＣＤ３０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ＴＡＧ−７２、ムチン、ＣＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＣＤ６６ｅ、ＥｐｈＡ２，ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、アンジオポエチン、メンテリン、糖脂質Ｆ７７またはテネイシンに、特異的に結合する。
【０１５０】
場合により、ＣＡＲは、ブリナツモマブまたは抗体ＨＤ３７のＣＤ１９結合部位、カツマキソマブのＥｐＣＡＭ結合部位、ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位、ＬｙｍｐｈｏｍｕｎのＣＤ２０結合部位、ＥｒｔｕｍａｘｏｍａｂのＨｅｒ２結合部位、ＡＭＧ２１１（ＭＥＤＩ−５６５，ＭＴ１１１）のＣＥＡ結合部位、ＰａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂのＰＳＭＡ結合部位、ｓｏｌｉｔｏｍａｂのＥｐＣＡＭ結合部位、ＲＧ７２２１またはＲＧ７７１６のＶＥＧＦまたはアンジオポエチン２結合部位、ＲＧ７５９７のＨｅｒ１またはＨｅｒ３結合部位、ＭＭ１１１のＨｅｒ２またはＨｅｒ３結合部位、ＭＭ１４１のＩＧＦ１ＲまたはＨｅｒ３結合部位、ＭＧＤ００６のＣＤ１２３結合部位、ＭＧＤ００７のｇｐａ３３結合部位、ＴＦ２のＣＥＡ結合部位、ＡＦＭ１３のＣＤ３０結合部位、ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位、および、ＬＹ３１６４５３０のＨｅｒ１またはｃＭｅｔ結合部位からなる群から選択される、抗体の可変ドメインを含む。
【０１５１】
場合により、ＣＡＲは、ＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、リツキシマブ、Ｚｅｎａｐａｘ（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、トラスツズマブ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズマブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキムマブ、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）、イピリムマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アドトラスツズマブ、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の可変ドメインを含む。
【０１５２】
一例では、標的細胞は血液細胞、例えば、ヒトまたは動物の、幹細胞または骨髄細胞である。場合により、標的細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。
【０１５３】
一例では、ＣＡＲまたはＴＣＲは、自己免疫性の疾病の標的のための抗原結合部位を含み、シグナル伝達は免疫細胞の細胞傷害活性または増殖をダウンレギュレートする。本明細書で用いられる場合、「自己免疫性の疾病」という用語は、自己免疫応答の結果生じる疾患として規定される。自己免疫性の疾病は、自己抗原に対する、不適切および過度な応答の結果である。自己免疫性の疾病の例には、とりわけ、、アジソン病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ｇｒｅａｔａ  ａｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、自己免疫性の肝炎、自己免疫性の耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。メモリーＴ細胞集団全体の範囲内で、いくつかの異なる亜集団が記載されており、ケモカイン受容体ＣＣＲ７およびＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の示差的発現によって認識され得る。ステムメモリーＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ−７Ｒα＋であるが、大量のＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３およびＬＦＡ−１も発現し、メモリー細胞特有の多数の機能的属性を示す。セントラルメモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を発現し、ＩＬ−２を分泌するが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は分泌しない。しかしながら、エフェクターメモリーＴＥＭ細胞は、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７は発現しないが、エフェクターサイトカイン様ＩＦＮγおよびＩＬ−４を生産する。ＴＳＣＭなどのメモリーＴ細胞は、ヒトにおいて、操作された免疫細胞の持続する集団を確立するために、特に有用であり得る。
【０１５４】
本明細書の免疫細胞、標的細胞、または幹細胞は、一例では、ＴＳＣＭ、ＴＣＭまたはＴＥＭ細胞、例えば、ヒトＴＳＣＭ、ＴＣＭまたはＴＥＭ細胞であり得る。一例では、細胞療法の免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）はそれぞれ、自己免疫性の疾病、炎症性の疾病、ウイルス感染症、またはがんを患っているヒトの細胞の子孫であり、例えば、該ヒトは、リンパ性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）または非ホジキンリンパ腫を患っている。該ヒトは、例えば、該患者またはその親戚（例えば、兄弟または親）であってよい。
【０１５５】
一例では、投与される免疫細胞は、シグナル伝達が増強されるように、操作されており、ここで、シグナル伝達は、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ４０シグナル伝達から選択される。
【０１５６】
場合により、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）は死滅する。一例では、各標的細胞は、腫瘍細胞であり、本方法は、ヒトにおいて、がんのリスクを処置または低減し、あるいは、がん進行のリスクを処置または低減する。
【０１５７】
場合により、ヒトはがんを有する。一例では、がんは血液がんである。一例では、ヒトは、Ｂ細胞起源のがんを有する。一例では、ヒトは、Ｔ細胞起源のがんを有する。例えば、がんは肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫である。本発明に使用するのに好ましいがんの標的は、Ｂ細胞起源のがんであり、特に急性リンパ性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む。一例では、がんはＴ細胞またはＢ細胞起源のがんであり、例えば、リンパ性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）、または非ホジキンリンパ腫である。場合により、投与される免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−細胞）はそれぞれ、前記ヒトの免疫細胞の子孫であり、例えば、該ヒトは、リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬまたはＢ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）または非ホジキンリンパ腫を患っている。場合により、投与される免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）はそれぞれ、前記ヒトの自家細胞（例えば、Ｔ細胞）であるか、該自家細胞の子孫である。本明細書で用いられる場合、用語「自家の」は、後に再導入される個体と同一の個体に由来する任意の物質を指すことが意図されている。「同種の」は、同じ種の異なる動物に由来するグラフトを指す。
【０１５８】
場合により、投与される細胞（例えば、ＣＡＲ−細胞）はそれぞれ、ヒトの血液または腫瘍サンプルに由来し、ステップ（ｃ）の前に、インビトロで活性化および増殖される。「活性化」は、本明細書で用いられる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞または他の免疫細胞の状態をいう。活性化はまた、誘導されたサイトカイン生産、および、検出可能なエフェクター機能とも、関連し得る。用語「活性化されたＴ細胞」は、とりわけ、細胞分裂をしているＴ細胞を指す。
【０１５９】
ある実施形態では、ヒトは、自己免疫性の疾病を有し、投与される免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−細胞）は、アネルギー性であり、または、標的細胞と結合した場合の増殖および／または細胞傷害活性が低下しており、それにより、細胞移植片細胞（および／またはその子孫）は、前記自己免疫性の疾病をアップレギュレートする、前記ヒトの内因性免疫細胞と競合する。
【０１６０】
本方法における免疫細胞の投与は、患者の血液への細胞注入によってよい。免疫細胞は、患者に投与される増幅免疫細胞集団を生産するように、増幅されてよい。免疫細胞は、患者に投与される活性化免疫細胞集団を生産するように、活性化されてよい。本明細書における方法では、有効量の免疫細胞が投与される。本明細書で使用される「有効量」は、疾病または症状を処置または予防するための治療的または予防的利益を提供する量を意味する。
【０１６１】
本発明の方法のある実施形態において、方法は、患者への免疫細胞の投与の前に、リンパ球枯渇を受けている患者（例えば、ヒト）のがんのリスクを処置または低減する。
【０１６２】
一実施形態では、ヒトは、少なくとも１つの化学療法薬に耐性である。
【０１６３】
一実施形態では、慢性リンパ性白血病は、難治性のＣＤ１９＋白血病およびリンパ腫である。
【０１６４】
本発明はまた、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団を生成する方法を含み、ここで、投与される細胞はＴ細胞を含み、存続する集団はその子孫を含む。一実施形態では、本方法は、ヒトにＴ細胞集団（例えば、ＣＡＲＴ細胞集団）を投与することを含み、ここで、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少なくとも１ヵ月間、ヒト中に存続する。一実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団は、メモリーＴ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少なくとも３週間は、ヒト中に存続する。別の実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少なくとも４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、２年、または３年の間、ヒト中に存続する。
【０１６５】
一実施形態では、慢性リンパ性白血病が処置される。本発明はまた、がんと診断されたヒトにおいて、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を増幅させる方法であって、投与される細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、増幅された集団がその子孫を含む方法を提供する。
【０１６６】
場合により、自家のリンパ球の注入が、処置において用いられる。例えば、自家のＰＢＭＣを、処置が必要な患者から回収し、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＡＲ膜貫通タンパク質を発現するように操作し、当業界で知られる方法を用いて活性化および増幅して、その後、ステップ（ａ）において患者に注入して戻す。一例では、投与される細胞は、多能性または多分化能である。該幹細胞は、ヒトの細胞に発達することができない。ある実施形態では、該幹細胞は、ヒトの胚または接合子に発達することができない。
【０１６７】
一例では、投与される細胞集団は、例えば、ヒトの自家細胞または同種細胞である、骨髄幹細胞を含む。
【０１６８】
一例では、投与される細胞集団は、例えば、ヒトの自家細胞または同種細胞である、造血幹細胞を含む。
【０１６９】
微生物叢の調節
医療行為は、しばしば、患者に抗生物質を投与することを包含する。 これらの処置は、典型的には、多くのグラム陽性菌種または多くのグラム陰性種を、区別することなく標的とする抗生物質、すなわち、広域スペクトル抗生物質の投与を包含し得る。同様に、農業（ｆａｒｍｉｎｇ）や農耕（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における広域スペクトル抗生物質の使用は、健康に有害であり、微生物耐性を発展させる可能性のある、これらの抗生物質のヒトおよび動物の食物連鎖への侵入を含む、環境問題を提起する。むしろ、一例では、本発明は、微生物叢の第１の微生物の（例えば、細菌または古細菌の）種または株の、選択的標的化を包含する。本明細書の実施例に示されるように、特定の細菌種の選択的標的化は、選択された種のゲノムを標的とするの誘導型ヌクレアーゼを用いて達成されているが、同時に、関連する種および株、並びに、共存する種（実施例においては、ヒト腸内微生物叢に共存する種）を温存する。従って、１つの例では、ディスバイオシスを引き起こすステップ、または、ステップ（ｂ）は、微生物叢亜集団の第１の細胞を死滅すること、または、微生物叢亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）を用いることにより前記亜集団の増殖を阻害することを含む。誘導型ヌクレアーゼ標的化を実行するための好適なシステムは、例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーシステムである。例として、共同体における、選択されたヒト腸内微生物叢細菌種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ガイド標的化が、本明細書の実施例において実証されている。該標的化は、標的の種または株のＤＮＡのヌクレアーゼ切断を生みだし、例えば、微生物叢における標的の種の相対的割合を低減させ、あるいは、微生物叢における前記種の亜集団の増殖を阻害する。本方法における種の選択的標的化は、一般に、微生物叢における、細菌および/または古細菌種の相対的割合の変化の、より細かい制御を可能にするのに有利である。このように、本発明は、ＴＨ１、ＴＨ１７および／またはＴｒｅｇ細胞などの特定の免疫細胞集団のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、または本明細書に記載される微生物叢を調節する他の結果に影響を及ぼすことを目的として、微生物叢を改変する能力を提供する。
【０１７０】
一例では、第１の細胞集団増殖は、該ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）より前の増殖と比較して、少なくとも５倍低下している。本方法は、腸表面での、第１の細胞集団増殖を阻害することを含んでよい。本方法は、植物（例えば、葉および／または茎）表面での、第１の細胞集団増殖を阻害することを含んでよい。
【０１７１】
あるいは、対象に適用される代わりに、処置は、環境または土壌に適用され（例えば、処置は、肥料、植物生長促進または阻害、除草剤、または、農薬の処置である）、ここで、処置は本発明によって調節される。
【０１７２】
腸内微生物叢または他の微生物叢において、細菌および古細菌の変化をいかにして決定するかは、当業者には、明らかであろう。例えば、これは、処置前および処置後に、患者の糞便サンプルを解析することにより、行われ得る。各サンプルにおける異なる種または株のタイプ、および、処置前および処置後の種または株の割合を決定してよい。１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６ｓ  ｒＤＮＡ）の従来の分析を用いて、例えば種を同定することが可能である。これに加えて、または、これに代えて、標準的な生化学テストを、株または種を同定するために用いることができ、例えば、染色、運動性試験、血清学的試験、ファージ分類、（例えば、Ｋｉｒｂｙ  Ｂａｕｒディスク拡散法を用いた）識別ディスク試験（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ）の１つ以上もまた包含する。生化学テストは、（ａ）カタラーゼテスト、（ｂ）コアグラーゼテスト、（ｃ）オキシダーゼテスト、（ｄ）糖発酵テスト、（ｅ）インドールテスト、（ｆ）クエン酸テスト、および（ｇ）ウレアーゼテストの１つ以上を包含してよい。相対的割合は、各サンプルから（本明細書の実施例のように）寒天プレート上のコロニーを増殖させ、コロニー数を計測することにより、決定してよい。
【０１７３】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢における、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加させる。
【０１７４】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢における、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を減少させる。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢における、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の割合を増加させる。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢における、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の割合を減少させる。
【０１７５】
蓄積した証拠は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導においてクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．の共生株の役割を支持する。例えば、Lopez et al.を参照されたい。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、一例では、それぞれの種はクラスターＩＶまたはＸＩＶａＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である）の割合を低減する。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、一例では、それぞれの種はクラスターＩＶまたはＸＩＶａ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である）の割合を増加させる。
【０１７６】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、腸内微生物叢においての割合を増加させる。
【０１７７】
例えば、ヒト腸内微生物叢を選択的に変更することによって、本発明は、ＣＡＲ−Ｔまたは他のＡＣＴ処置のアップレギュレーションを提供する（例えば、変化した微生物叢は、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ投与を受けた患者においてＴｒｅｇ細胞をダウンレギュレートし、および／または、該患者においてＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞をアップレギュレートし、これらの細胞は、例えば、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ移植片に含まれている）。Ｔｒｅｇ細胞のダウンレギュレーションは、患者においてエフェクターＴ細胞および／またはヘルパーＴ細胞の抑制を低減させ、それによって、がんまたは他の疾患を媒介する細胞に対する、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ細胞傷害性、または他の望ましい活性を増強し得る。ＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞のアップレギュレーションは、エフェクターＴ細胞の活性を増加させ、それによって、がんまたは他の疾患を媒介する細胞に対する、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ細胞傷害性、または他の望ましい活性を増強し得る。
【０１７８】
別の例では、微生物叢の変更は、ＣＡＲ−Ｔまたは他のＡＣＴ処置を弱めるためのスイッチとして用いられ得る（例えば、変化した微生物叢は、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ投与を受けた患者においてＴｒｅｇ細胞をアップレギュレートし、および／または、該患者においてＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞をダウンレギュレートし、これらの細胞は、例えば、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ移植片に含まれている）。Ｔｒｅｇ細胞のアップレギュレーションは、患者においてエフェクターＴ細胞および／またはヘルパーＴ細胞の抑制を増加させ、それによって、サイトカイン放出を促進するＣＡＲ−ＴもしくはＡＣＴの能力、または他の望ましくない活性を低減し得る。ＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞のダウンレギュレーションは、エフェクターＴ細胞活性を減少させ、それにより、サイトカイン放出を促進するＣＡＲ−ＴもしくはＡＣＴの能力、または他の望ましくない活性を低減し得る。これは、患者における、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを制限するのに有用であり得る。本発明の方法を用いた患者の腸内微生物叢のその後のさらなる改変は、目の前の疾病または症状（例えば、血液がんなどの、がん）に対処するためにこれをもう一度使用することが望ましい場合に、ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ処置をアップレギュレートするために行うことができる。この例では、メモリーＴ細胞ＣＡＲ−ＴまたはＡＣＴ集団は、より初期の治療から、患者に存在し得、本発明による微生物叢の変更を用いたアップレギュレーションは、メモリーＴ細胞をアップレギュレートして、エフェクター細胞および／またはヘルパー細胞に分化させ、疾病または症状に対処し得る。従って、１つの例では、本発明の細胞療法は、免疫メモリー細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）および／またはステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）などの、メモリーＴ細胞）を含む免疫細胞集団を投与することを含み、および／または、投与される集団は、最初の微生物叢の変更の後にこれらのメモリー細胞を産生する細胞を含む。
【０１７９】
本発明の１つの局面は、患者における細胞ベースの治療を調節することに対する有用性を認識するが、別の局面は、例えば患者のＴ細胞または他の免疫細胞によって媒介される、自己免疫疾患および炎症性の疾病および症状などの、患者における細胞媒介性の疾患および症状を調節（すなわち、処置または予防）することに対する有用性を認識する。さらなる局面では、本発明は、疾病または症状の別の治療を調節（例えば、増強）するための手段として有用性を認識する。例えば、疾病または症状を治療または予防するために、抗体または抗ウイルス薬による治療を増強する、または、実施するための手段として有用性を認識する。例えば、薬は、（例えば、メラノーマまたはＮＳＣＬＣなどのがんを処置または予防するための）免疫チェックポイントのアンタゴニストまたはアゴニストであることができる。「治療を実施する」ことによって、患者が薬に応答しないか、応答が不十分であり、本発明による微生物叢の変更（例えば、本明細書に記載される、細菌または古細菌の種の選択的誘導型ヌクレアーゼ標的化を用いた微生物叢の変更）が患者による薬への応答（または改善された応答）をもたらすことが、企図される。例えば、本発明の方法は、ＨＩＶ感染症を患う患者において、Ｔｈ１７細胞をアップレギュレートする。一局面では、これは、患者の抗レトロウイルス、または抗ＨＩＶワクチン療法を増強する。Ｔｈ１７細胞は、患者の内因性細胞であるか、または、患者のＡＣＴにより提供された細胞であってよい。別の例では、本発明の方法は、がん（例えば、メラノーマまたはＮＳＣＬＣなどの肺癌）を患う患者において、Ｔｈ１７細胞をアップレギュレートする。一局面では、これは、患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強する。Ｔｈ１７細胞は、患者の内因性細胞であるか、または、患者のＡＣＴにより提供された細胞であってよい。例えば、治療は、イピリムマブ（すなわち、ＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわち、ＯＰＤＩＶＯ商標）、ペンブロリズマブ（すなわち、ＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択した抗体を用いた抗体療法である。
【０１８０】
本発明は、植物、酵母、環境、土壌、ヒトまたは動物の微生物叢において、第１の細胞を標的化するか、または、細菌または古細菌の細胞集団の増殖を阻害することにより前記ディスバイオシスを引き起こすか、または、細胞の１つ以上の亜集団の相対的割合を変更するために（例えば、ヒトの腸内微生物叢における、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）および／またはグラム陽性またはグラム陰性細菌の割合の変更のために）、本発明の方法において用いられる、誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーシステム）、アレイ（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ）、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびベクター（例えば、前記システムの成分を含むファージ）に関する。本発明は、例えば、宿主細菌細胞（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細胞、または、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）細胞、または宿主古細菌細胞）の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、切断および／または変異）することを包含する。一例では、第１の細菌は、病原性腸内細菌である。
【０１８１】
２つの主な腸内微生物の門、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）およびファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のそれぞれのレベルが、ヒトおよび無菌マウスの両方において、肥満症と関連していることを指摘した多数の研究がある。これらの研究の著者等は、糖代謝が重要な因子であると推測している。彼らは、肥満症患者の微生物叢は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細菌がより豊富であり、バクテロテデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の細菌がより少ないことを観察し、彼らは、この細菌混合物が、（反対の割合を有する）痩身個体の微生物叢よりも、所与の食餌からエネルギーを抽出することに、より効率的であり得ると推論する。いくつかの研究において、彼らは、肥満症患者の体重が減少するにつれて、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の相対的存在量が増加すること、さらに、肥満マウスの微生物が無菌マウスに移されると、これらのマウスは、痩せたマウスからの微生物叢を受け取ったコントロール群よりも脂肪が多くなるこが見出した。例えば、Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, " An obesity−associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest ", Nature 444:1027―1131を参照されたい。さらなる局面において、本発明は、例えば、微生物叢においてバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する比率を増加させることによって、患者の抗肥満症の治療を増強するための手段としての有用性を認識する。
【０１８２】
場合により、第１の細胞は、異なる株または種の細胞の存在下にあり、該異なる細胞は、エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、または、ヒトに対して（例えばヒトの腸内で）プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）、片利共生（ｃｏｍｍｅｎｓａｌ）、もしくは相利共生（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）の細菌である。一例では、第１の細胞はそれぞれ、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）であり、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの細胞である。
【０１８３】
一例では、本発明は、同じ種、または、異なる種にもかかわらず系統学的に関連する種（１６ｓ  ｒＤＮＡによって示される）の第２の関連株を標的としないが、微生物叢の標的微生物を選択的に死滅させるか、ダウンレギュレートすることができる。例えば、微生物叢は、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第２の種または株は、第１の細胞種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖は、前記方法によって阻害されない。ある実施形態では、第２の株または種の増殖は阻害されないか、あるいは、前記第１の細胞の増殖は、第２の細胞の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍の増殖阻害によって、阻害される。
【０１８４】
本方法の一局面において、ディスバイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）は、患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において第１の細胞（宿主細胞）の亜集団の割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含み、本方法は、宿主細胞においてそれぞれの標的配列を切断して、標的配列を改変する、誘導型ヌクレアーゼ (例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ)を用い、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割合を低減させることを含む。誘導型ヌクレアーゼ切断を実行するための好適なシステムは、例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーシステムである例として、共同体における、選択されたヒト腸内微生物叢細菌種の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ガイド切断が、本明細書の実施例で実証されている
【０１８５】
一例では、標的配列の改変は、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現させること、
によって実行され、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ−システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させる。
【０１８６】
あるいは、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に含まれる。操作された各核酸配列は、それぞれのベクターに含まれており、各ベクターは、場合により、プラスミド（例えば、宿主細胞に移行できる接合性プラスミド）、ファージ、ファージミド、またはプロファージである。ファージは、前記宿主細胞に感染することができる。
【０１８７】
一例では、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼが、標的ヌクレオチド配列の改変のために用いられる。ある実施形態では、それゆえ、各ベクターは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをコードする配列を欠いている。内因性Ｃａｓヌクレアーゼを利用することによって、本発明の実施形態は、内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を使用する（すなわち、ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するために、あらかじめ宿主細胞の遺伝子改変を行う必要がない）。従って、一例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型遺伝子にコードされている。一例では、ヌクレアーゼは活性であり、宿主細胞における内因性Ｃａｓヌクレアーゼ（または、Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子）リプレッサーを阻害することなく、細胞の死滅または増殖低下を達成する。従って、本発明は、あらかじめ操作する必要なく、野生型細菌集団に対処して、効果的なＣａｓ媒介性の細胞の死滅または増殖低下をもたらすことができる。従って、該集団は、その野生型環境にある場合（例えば、植物、酵母、環境、土壌、ヒト、または動物のマイクロバイオームに含まれる場合）、ｃＲＮＡにさらすことができる。
【０１８８】
一例では、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、粘膜、腸内、経口、鼻腔内、直腸内、または頬側投与により、ヒトまたは非ヒト動物患者へ投与するためのものである（あるいは、投与される）。
【０１８９】
場合により、前駆Ｃａｓヌクレアーゼは、各第１の細胞の、内因性タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって提供される。場合により、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列は、各宿主細胞に内因性である。場合により、各標的配列は、それぞれの宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子 または必須遺伝子に含まれ、例えば、標的配列は、宿主細胞間で同一である。場合により、操作された核酸配列は抗生物質組成物に含まれ、該配列は、抗生物質製剤（第１の抗生剤）と組み合わせられ、また、一例では、標的配列は抗生物質耐性遺伝子に含まれ、抗生物質は前記第１の抗生剤である。抗生物質組成物は、患者または対象に投与され、前記ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）をもたらす。
【０１９０】
場合により、各宿主細胞は、目的のＨＭ配列をコードする遊離末端を有するデオキシリボ核酸鎖（ＨＭ−ＤＮＡ）を含み、および／または、ここで、該方法は、ＨＭ−ＤＮＡをコードする当該配列を宿主細胞に含み、ＨＭ−ＤＮＡは、ＨＭ−ＤＮＡを宿主ゲノムに（例えば、染色体の部位またはエピソームの部位に）挿入するための標的配列の内部または隣接する配列にそれぞれ相同な１つまたは複数の配列を含む。
【０１９１】
本発明はまた、本発明の処置または予防方法を実行するために第１の細胞（宿主細胞）に導入するためのベクターを提供し、各ベクターは、内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌または古細菌宿主細胞を改変するための操作された核酸ベクターであって、該ベクターは、ディスバイオシスを引き起こすのに用いるための、または、本方法のステップ（ｂ）において用いるための、複数の異なるｃｒＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を発現するための核酸配列を含み、場合により、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、第１の前記ｃｒＲＮＡは、前記宿主細胞において第１の核酸配列にハイブリダイズすることができ、第２の前記ｃｒＲＮＡは、前記宿主細胞において第２の核酸配列にハイブリダイズすることができ、ここで、前記第２の配列は前記第１の配列と異なり；かつ
ａ．第１の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、場合により、これらの遺伝子は異なり、
ｂ．第１の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は必須遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、
ｃ．第１の配列は必須遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は、必須遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、あるいは、
ｄ．第１の配列は病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は必須遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれている。
【０１９２】
各ベクターは、上述の通り、例えば、宿主細胞に感染することができるファージ、または、宿主細胞に導入することができる接合性プラスミドであってよい。一例では、ベクターは、抗生物質製剤（例えば、βラクタム抗生剤）と組み合わせられる。
【０１９３】
第１の細胞（宿主細胞）はそれぞれ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ  ｃｏｌｉ、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ宿主細胞であってよい。一例では、第１の細胞（宿主細胞）はそれぞれ、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）細胞であり、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である。
【０１９４】
一例では、操作された各核酸配列は、宿主細胞におけるそれぞれのｃｒＲＮＡの発現または生産のための配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み（例えば、シングルガイドＲＮＡに含まれる）、（ｉ）式中、Ｒ１は第１のＣＲＩＳＰＲリピートであり、Ｒ１’は第２のＣＲＩＳＰＲであり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり；かつ（ｉｉ）Ｓ１は、前記標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれから成る第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーである。
【０１９５】
一例では、Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ、宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第１および第２のリピート配列に、少なくとも９５％同一である。一例では、Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ、前記種、例えば前記種の前記宿主細胞の、のＣＲＩＳＰＲアレイの、第１（最も５’側）および第２（第１のリピートの３’側すぐ）のリピート配列に、少なくとも９５％（例えば、９６、９７、９８、９９または１００％）同一である。一例では、Ｒ１およびＲ１’は、タイプＩＩＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ  ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９）またはタイプＩＣａｓ３と共に機能して、前記宿主細胞において標的を改変する。
【０１９６】
一局面では、実施例の実験例により実証されているように、本方法は以下の使用を包含する。
【０１９７】
第１の細胞（宿主細胞）集団の野生型内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の、前記集団の増殖を阻害するための使用であって、各宿主細胞は、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、該使用は該集団の宿主細胞を形質転換することを含み、ここで、各形質転換宿主細胞は、宿主細胞において宿主改変（ＨＭ）ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するために遺伝子操作されたヌクレオチド配列で形質転換され、ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内因性Ｃａｓを標的に誘導するために宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼとコグネイトであり、宿主細胞の形質転換後、集団の増殖が阻害される、使用を包含する。
【０１９８】
「コグネイトの」とは、内因性Ｃａｓが、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと作動可能であり、宿主細胞の標的へと誘導されることを意図している。当業者であれば、このＣａｓ誘導が、一般的に、細菌および古細菌細胞における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特徴であり、例えば、内因性の活性野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有する細菌または古細菌の細胞における、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特徴であることは、理解するであろう。
【０１９９】
「野生型」Ｃａｓ活性とは、当業者には明らかであろうが、内因性Ｃａｓが操作されたＣａｓではないこと、または、細胞が内因性Ｃａｓ活性を抑制解除するように操作されてはいないことを意図している。これは、Ｃａｓヌクレアーゼ活性が天然に抑制されている特定の細菌とは対照的である（すなわち、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性は存在しないか、または本発明に有用な野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性は存在せず、反対に、in situで野生型宿主細胞に対処することに適用可能であり、例えば、内因性Ｃａｓ活性が細胞集団増殖阻害をもたらすために利用できる場合が挙げられる）。
【０２００】
以下の実施例では、固体表面上の細菌集団（グラム陽性ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））において、阻害を調べた。宿主細胞集団の増殖の、１０倍を超える阻害が達成された。標的化は、抗生物質耐性遺伝子および必須遺伝子を対象とした。表面上の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の実証は、実施形態において、重要かつ望ましく、ここで、本発明はヒトまたは動物対象において本明細書に開示される微生物叢によって媒介または引き起こされる疾病または症状を処置または予防するためのものである。該微生物叢は、典型的には、対象の組織（例えば、腸組織）と接触しており、従って、表面上の微生物叢の細菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが例示される）の増殖を阻害する活性の実証は、この有用性を支持すると我々は信じている。 植物表面の微生物叢の標的化もまた、望ましい適用である。
【０２０１】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）集団の増殖の阻害は、前記の操作されたヌクレオチド配列にさらされていない同じ種または株の細胞の増殖と比較して、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍である。例えば、増殖阻害は、宿主細胞の第１のサンプル（単独、または混合細菌集団であって、例えば、処置後の患者の微生物叢または糞便サンプル）の細菌のコロニー数が、宿主細胞の第２のサンプル（単独、または混合細菌集団であって、例えば、処置前の患者の微生物叢または糞便サンプル）のコロニー数と比較して、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍低いことにより示され、ここで、第１の細胞は、前記操作されたヌクレオチド配列により形質転換されているが、第２のサンプルは、前記操作されたヌクレオチド配列に曝されていない。
ある実施形態では、コロニー数は、第１のサンプルが操作された配列にさらされてから、１２、２４、３６、または４８時間後に決定される。ある実施形態では、コロニーは、インビトロで（例えば、ペトリ皿にて）固体寒天上で増殖する。それゆえ、増殖阻害は、第１の細胞または集団（宿主細胞または集団）の増殖の低下（処置なし、すなわち、コントロールサンプルの増殖と比較して１００％を下回る増殖）により示され得ること、または、該増殖の完全な消失であり得ることは、理解されるであろう。一例では、宿主細胞集団の増殖は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％低下し、すなわち、所定の期間にわたって（例えば、宿主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーなどの組み合わせ後の２４時間または４８時間）、宿主細胞集団の増殖が、前記ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ等に曝されていないが、前記所定の期間継続して同じ条件に置かれたコントロール宿主細胞集団の増殖と比較して、少なくとも当該パーセント低い。一例では、増殖の低下率は、前記期間の終わり（例えば、コントロールサンプルの対数増殖期中期の時点）に各集団のサンプルのコロニー数を比較することによって決定される。例えば、テスト集団を、Ｏ時間にｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ等に曝した後、テスト集団およびコントロール集団のサンプルを採取して、各サンプルを寒天プレート上にプレーティングし、前記所定の期間、同一条件下でインキュベートする。所定の期間の終わりに、各サンプルのコロニー数をカウントして、増減率を計算する（すなわち、テストコロニー数をコントロールコロニー数で除して、１００を掛け、その結果を１００から引いて増殖低下率を求める）。倍数差は、コントロールコロニー数を、テストコロニー数で除して、計算する。
【０２０２】
集団の増殖阻害は、集団における第１の細胞（宿主細胞）の増殖数における低下により示され得る。これは、ヌクレアーゼによる細胞の死滅および／または標的プロトスペーサー配列に対するヌクレアーゼの作用による宿主細胞増殖（分裂および／または細胞増殖）のダウンレギュレーションによる可能性がある。本明細書に開示される処置または予防のある実施形態では、ヒトまたは動物対象の宿主細胞負荷が減少し、それによって疾病または症状が処置される（例えば、軽減または除去される）か、または予防される（すなわち、対象が疾病または症状を発症するリスクが軽減または除去される。）
【０２０３】
一例では、野生型宿主細胞内因性Ｃａｓ９またはｃｆｐ１活性が用いられる。一例では、野生型宿主細胞内因性Ｃａｓ３および／またはＣＡＳＣＡＤＥ活性が用いられる。操作されたヌクレオチド配列は、外因性のＣａｓヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせてはならない。場合により、前記Cas ヌクレアーゼはニッカーゼである。
【０２０４】
一例では、前記宿主細胞の細菌コロニーの形成は、前記ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）に続いて阻害される。一例では、宿主細胞の増殖は、前記ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）に続いて阻害される。一例では、宿主細胞は、前記ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）に続いて死滅する。
【０２０５】
別の局面において、本方法は、疾病または症状を処置または予防するための前記ディスバイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）のための、患者へ投与するための医薬をエクスビボで生産することを含み、該医薬は改変された混合細菌集団（例えば、１つ以上のヒトドナーまたは前記患者の糞便または腸内微生物叢から得られる）を含み、該改変された集団は、患者に投与され、前記ディスバイオシスを引き起こすか、または、ステップ（ｂ）において患者の腸内微生物叢における種または株のバランスを変更し、それにより、腸内微生物叢における第１の細胞の割合を変更する。改変された混合集団は、本明細書に記載される誘導型ヌクレアーゼ改変技術を用いて、エクスビボで生産され得る。従って、例えば、本方法は、例えば、本明細書に開示される代謝性の、またはＧＩの症状または疾病の処置または予防のための医薬の生産のために、混合集団において、特定のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）亜集団の割合を低減し、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）を温存するために用いられ得る。このように、本発明は、ヒトまたは動物における、これらの使用または、当該処置または予防のための、改変された細菌移植片（例えば、改変された糞便移植片）の医薬を使用するとができる。例えば、本方法は、医薬的使用（例えば、代謝性の症状（肥満症または糖尿病）または、消化管の症状（例えば、本明細書に記載の任意の当該症状）、またはがん（例えば、消化管がん）の処置または予防）のためにヒトまたは動物に投与するための、改変された細菌コレクションを生産するために、１つ以上の微生物叢をインビトロで改変するのに用いられ得る。一例では、本明細書に記載される操作された各核酸配列を含むファージまたはプラスミドベクターによる細菌細胞の形質転換が、インビトロで実行されるか、または、操作されたヌクレオチド配列が、宿主細胞にエレクトロポレーションされる核酸に含まれる。一例では、核酸はＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡのコピー）である。別の例では、核酸は、宿主細胞において発現するための、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡである。
【０２０６】
従って、一例では、本発明は、本発明の方法において用いられる植物、酵母、環境、土壌、ヒトまたは動物対象に含まれる野生型細菌宿主細胞の集団において、宿主細胞改変（ＨＭ）ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するための操作されたヌクレオチド配列提供し、該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、Ｃａｓを標的に誘導するための宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含み、該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、野生型ヌクレアーゼ活性を有する内因性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼにコグネイトであり、宿主細胞の形質転換後に、集団の増殖が阻害され、かつ、疾病または症状が処置または予防されるか、あるいは、治療または処置が調節される。
【０２０７】
一例では、操作されたヌクレオチド配列は、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、シングルガイドＲＮＡをコードする。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）、または、ｃｒＲＮＡである。一例では、操作された配列は宿主細胞に感染することができるバクテリオファージに含まれており、ここで、形質転換は、バクテリオファージによる宿主細胞の形質導入を含む。バクテリオファージは、本明細書に記載されるファージであり得る。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞を形質転換することができるプラスミド（例えば、接合性プラスミド）に含まれる。該プラスミドは、本明細書に記載されるプラスミドであり得る。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞に、および／または、宿主細胞間を、移行することができるトランスポゾンに含まれる。トランスポゾンは、本明細書に記載されるトランスポゾンであり得る。
【０２０８】
本発明の方法はいずれも、細胞においてｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを生産するために、宿主細胞を核酸で形質転換することを含む。例えば、操作されたヌクレオチド配列を含むベクターまたは核酸は、経口的に、静脈内に、局所的に、眼に、鼻腔内に、吸入により、直腸投与により、または本明細書で開示される任意の他の投与経路により、または他の方法で、患者に投与され、ここで、投与は、第１の細胞（宿主細胞）を、ベクターまたは核酸で形質転換する。
【０２０９】
一例では、第１の細胞は、患者または対象の微生物叢において、第２の細菌と混合される。場合により、第２の細菌種は、以下の実施例に示されるように、Ｅ  ｃｏｌｉ、Ｌ  ｌａｃｔｉｓまたはＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであり、ヒトおよび動物の腸内微生物叢において、相利共生的に共存する株である。実施例はまた、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の混合集団における標的化に対処している。さらに、実施例は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の集団（Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、および、エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の集団（Ｅ  ｃｏｌｉ）に対処しており、これらは共に、ヒトの微生物叢に見られる。エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の他の例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒである。
【０２１０】
一例では、症状または疾病は、代謝性の、または胃腸の疾病または症状であり、例えば、肥満症、ＩＢＤ、ＩＢＳ、クローン病または潰瘍性大腸炎である。一例では、症状または疾病は、がんであり、例えば、固形腫瘍、すなわち、ＧＩがん（例えば、胃がん）、肝臓がん、または膵臓がんである。一例では、症状は、抗生物質（例えば、本明細書に開示される任意の抗生物質）に耐性であるか、応答性が低下している。
【０２１１】
一例では、各第１の細胞（宿主細胞）は、細胞における前記ＨＭ−ｃｒＲＮＡの生産において、操作された配列で作動可能な内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを含む。代替としては、１つ以上のベクターが、宿主細胞におけるＲＮａｓｅＩＩＩの発現のために、該ＲＮａｓｅＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２１２】
一例では、必須遺伝子（標的を含む）は、細胞のＤＮＡポリメラーゼを含む。これは、以下に例示されている。
【０２１３】
一例では、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＧＮＧ、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＡＧＡＡＷプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、ＡＡＡＧＡＡＡまたはＴＡＡＧＡＡＡ  ＰＡＭ（これらの配列は、５’から３’の方向で記載されている）に隣接する、宿主細胞の標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含む。ある実施形態では、ＰＡＭは、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接している。一例では、ＣａｓはＳ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ  ｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＳ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓである。一例では、Ｃａｓは、Ｃｐｆ１であり、および／または、ＰＡＭは、ＴＴＮまたはＣＴＡである。
【０２１４】
一例では、操作されたヌクレオチド配列またはベクターはそれぞれ、前記ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする前記ＣＲＩＳＰＲアレイまたは配列を含み、さらに、抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性）を含み、ここで、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは、抗生物質耐性遺伝子を標的としない。一例では、標的配列は、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれており、該抗生物質は、第１の抗生物質（例えば、カナマイシン）とは異なる。このように、操作された配列またはベクターは、それ自身を標的とせずに、宿主を標的とすることができる。宿主細胞を、第１の抗生物質にさらすことによって（例えば、患者に対して、経口的に、または、静脈内に投与することによって）、ポジティブ選択圧によって操作された配列またはベクターの保持を促進することができる。なぜなら、第１の抗生物質耐性遺伝子を含む細胞は、第１の抗生物質の存在下で生存に有利になるであろうからである（操作された配列またはベクターによって形質転換されていない宿主細胞が、第１の抗生物質に耐性でない場合）。従って、ある例では、以下を提供する：宿主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列の維持を促進するための、第１の（宿主）細胞集団を前記抗生物質（例えば、カナマイシン）および前記操作された配列またはベクターに曝露することを含む本発明の方法；あるいは、本発明の操作された配列、アレイまたはベクターは前記抗生物質と組み合わされている。
【０２１５】
一例では、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列は、宿主細胞の種において作動可能な構成的プロモーター（例えば、強力なプロモーター）、または、誘導性プロモーターの下にある。
【０２１６】
一例では、当該またはそれぞれの第一の（宿主）細胞はグラム陽性細胞である。別の例では、当該またはそれぞれの第一の（宿主）細胞はグラム陽性細胞である。
【０２１７】
本発明はまた、本方法を実行した後に患者から腸内微生物叢を単離することによって、または、本方法を実行した後に患者から糞便サンプルを単離することによって、本方法により得られる微生物叢細菌のエクスビボ混合集団を提供する。一例では、混合集団は、医薬的使用または栄養的使用のための容器に入っている。例えば、容器は滅菌容器であり、例えば、吸入器、鼻腔内送達装置であり、または、シリンジまたは静脈注射用針に連結されている。一例では、混合集団は、疾病または症状（例えば、本明細書中に開示される疾病または症状）を処置するために、そのマイクロバイオームを生息させるための、ヒトまたは動物への投与に有用である。
【０２１８】
本明細書において、一例では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、ｃａｃｃａｅ、ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｌａ、ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ、ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ｄｏｒｅｉ、ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ、ｆａｅｃｉｓ、ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ，ｆｌｕｘｕｓ、ｆｒａｇａｌｉｓ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、ｎｏｒｄｉｉ、ｏｌｅｉｃｉｐｌｅｎｕｓ、ｏｒａｌｉｓ、ｏｖａｔｕｓ、ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、ｐｌｅｂｅｉｕｓ、ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、ｖｕｌｇａｔｕｓおよびｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓから選択される種である。例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである。一例では、第１の（宿主細胞）集団または第２の細菌は、複数の異なるバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の種、または、複数のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎおよびＢ  ｆｒａｇａｌｉｓ）、または、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を含む。本明細書において、一例では、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａは、ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、ｂｉｖｉａ、ｂｕｃｃａｅ、頬側ｉｓ、ｃｏｐｒｉ、ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、ｏｒｉｓ、ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、ｔａｎｎｅｒａｅ、ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ  およびｖｅｒｏｒａｌｉｓから選択される種である。あるいは、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞であり、例えば、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｉｎｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃａｐｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｓｐｉｒａ，Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｅｉｎｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＴｕｒｉｂａｃｔｅｒおよびＷｅｉｓｅｌｌａから選択される１つ以上のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）を含むか、これらから成る。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅ）細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の亜集団はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞から成る）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。例えば、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ（例えば、Ａ２−１６５、Ｌ２−６、Ｍ２１／２またはＳＬ３／３）である。
【０２１９】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞（場合によりＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはｐｙｏｇｅｎｅｓ細胞）からなり、第２の細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）および／またはエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、Ｅ  ｃｏｌｉ）細胞からなる。
【０２２０】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、ヒト、動物（例えば、非ヒト動物）、または植物の、感染性の疾病の病原体である。
【０２２１】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７またはＯ１０４：Ｈ４）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例えば、ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば、ＤＴ  １０４）、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（例えば、ｐｅｓｔｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、ｐｅｒｔｕｓｓｕｓ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＭＲＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、結核）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｊｅｊｕｎｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、コレラ、例えば、Ｏ１３９、またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｌｉｃｈｉａ（例えば、ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ｆａｅｃａｌｉｓまたはｆａｃｅｉｍ、例えば、リネゾイド耐性）、ＯｅｎｏｃｏｃｃｕｓおよびＡｃｉｎｅｔｏｅｂａｃｔｅｒ（例えば、ｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば、多剤耐性の）の種から選択される。
【０２２２】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性およびテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞である。
【０２２３】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｕｒｏｇｉｎｏｓａ細胞であり、例えばセファロスポリン（例えば、セフタジジム）、カルバペネム（例えばイミペネムまたはメロペネム）、フルオロキノロン、アミノグリコシド（例えばゲンタマイシンまたはトブラマイシン）およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２２４】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞であり、例えば、カルバペネムに耐性である。
【０２２５】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはｐｙｏｇｅｎｅｓ）細胞であり、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、βラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２２６】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｔｙｐｈｉ）細胞であり、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２２７】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）はＳｈｉｇｅｌｌａ細胞であり、例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２２８】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞であり、例えば、イソニアシド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＭＰ）、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンに対する耐性から選択される抗生物質に耐性である。
【０２２９】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞であり、例えば、バンコマイシン耐性である。
【０２３０】
全ての宿主細胞がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細胞であり、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性である、請求項１３に記載の方法。
【０２３１】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）はＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン（ｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、セファレキシンおよびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２３２】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅ）細胞であり、例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性である。
【０２３３】
一例では、第１細胞（宿主細胞）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａ細胞であり、例えば、セフィキシム（例えば、経口セファロスポリン）、セフトリアキソン（注射用セファロスポリン）、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２３４】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ａｃｉｎｅｔｏｅｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  細胞であり、例えば、βラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性である。
【０２３５】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ細胞であり、例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性である。
【０２３６】
一例では、第２の種または株は、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プロバイオティック種または株である。
【０２３７】
一例では、第２の種または株は、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。
【０２３８】
一例では、第１の細胞は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である。
【０２３９】
一例では、前記ディスバイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌剤または抗古細菌剤を投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる。
【０２４０】
一例では、本方法は、第１の（宿主）細胞集団の増殖を、前記誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ）の改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少なくとも５、１０、２０、５０、または１００倍低下させる。
【０２４１】
一例では、本方法は、腸表面における宿主細胞集団の増殖を阻害する。
【０２４２】
一例では、各宿主細胞について、本システムは、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の成分を含む：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサーおよびリピート配列を含む操作されたＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ − ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記ＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ−ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢における前記亜集団の割合を変更する。
【０２４３】
一例では、成分（ｉ）は、各宿主細胞に内因性である。
【０２４４】
一例では、各ベクターは、ウイルスまたはファージである。
【０２４５】
一例では、各標的配列は、ＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接している。
【０２４６】
一例では、あるいは、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に含まれ、本方法は、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む。
【０２４７】
一例では、微生物叢は、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、第２の細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されないか；または、微生物叢が第２の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されない。
【０２４８】
一例では、微生物叢は、第２の細菌種を含み、第１および第２の種はそれぞれグラム陽性種であり、第２の細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されない。
【０２４９】
一例では、各標的配列は、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子、または必須遺伝子に含まれる。
【０２５０】
一例では、各第１の細胞は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ  ｃｏｌｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である。
【０２５１】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）により産生された変化した微生物叢は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）の前の微生物叢と比較して、増加した割合のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が刺激され、細胞療法が調節される。
【０２５２】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、パネート細胞タンパク質の発現に影響を及ぼし得る。小腸陰窩には、死滅して絨毛から失われる上皮細胞を絶えず補充する働きをする幹細胞がある。パネート細胞（好中球に類似する免疫系細胞）は、これらの幹細胞に隣接しており、多くの抗菌分子（デフェンシン）を陰窩の内腔に分泌することにより、微生物から幹細胞を保護しており、これらの保護効果が、絨毛に移動した成熟細胞にまで及ぶことも可能である。動物モデルにおいて、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、特定の病原性生物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を死滅することができる抗菌性のパネート細胞タンパク質（Ａｎｇ４）の生産を刺激することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは強力なＴＨ１細胞誘導因子であり、したがって、これは、本発明の特定の局面においてパネート細胞を刺激することによって、ＴＨ１からＴＨ１７などの他の細胞型へ免疫を歪めるために有用であり得る。これは、本発明の免疫細胞療法を増加または増強させるために有用であり得る。例えば、これは、本発明は、Ｔｈ１７ベースの細胞療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔｈ１７細胞）を患者に投与することを含む場合に、有用であり得る。
【０２５３】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、患者において腸Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）により産生された変化した微生物叢は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）の前の微生物叢と比較して、増加した割合のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの第１の細菌を含み、それにより、細胞療法が調節される。
【０２５４】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、患者の腸内微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生することを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させるか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む。
【０２５５】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片を提供する。場合により、移植片は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第２の種の細胞を含む（かつ、例えば、第１の種の細胞を含まない）。
【０２５６】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、それらの処置を調節するために、対象（例えば、植物または酵母）または土壌もしくは環境に投与するための、細菌または古細菌の移植片を提供する。場合により、移植片は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第２の種の細胞を含む（かつ、例えば、第１の種の細胞を含まない）。
【０２５７】
一例では、酵母は、同じ種または株の酵母細胞の集団を含む。例えば、酵母は、微生物叢に含まれ、例えば、酵母は、微生物叢の細胞の亜集団を含み、例えば、標的細胞は、微生物叢にまた含まれる、細菌または古細菌細胞である。ある実施形態では、本方法は、標的細胞（例えば、細菌）を死滅させるか、微生物叢に含まれる標的細胞亜集団の増殖を低下させ、ここでは、微生物叢における標的細胞による１つ以上の化学物質またはメッセンジャーの放出（または濃度）が低下する。例えば、微生物叢の微生物（例えば、細菌）において、クオラムセンシングを媒介する、１つ以上の化学物質またはメッセンジャーが低下する。このことは、微生物叢における、標的細胞および／または他の微生物細胞集団の増殖を形成するのに有用であり得る。一例では、１つ以上の化学物質またはメッセンジャーは、酵母の増殖を阻害するか、酵母を死滅させ、従って、微生物叢における化学物質またはメッセンジャーの放出または濃度の低下は、微生物叢における酵母の増殖および／または維持の促進に有利である。これらの例のある実施形態では、処置は、酵母の栄養法、または増殖促進物質による酵母の処置である（例えば、ここで、酵母は食糧または飲料製造用であり、あるいは、例えば抗体などのバイオテクノロジー製品または医薬品の製造用であり、例えば、酵母はＳａｃｃｈａｒａｏｍｙｃｅｓである）。別の例では、化学物質またはメッセンジャーが酵母の増殖を促進し、ここで、酵母の処置は、酵母殺菌剤（例えば、殺真菌薬）による処置である。これは、酵母が望ましくない場合（例えば、望ましくないカビである場合）に、死滅処置の有効性を促進する。一例では、対象が植物の場合、１つ以上の化学物質またはメッセンジャーが植物の生長を阻害するか、植物を死滅させるため、微生物叢における化学物質またはメッセンジャーの放出または濃度の低減が、植物の生長の促進、および／または、植物の死滅の阻害に有利である。これらの例のある実施形態では、処置は、植物の栄養法であるか、または、肥料または窒素固定剤による酵母の処置である。ある実施形態では、処置は、植物の農薬処置であり、例えば、標的の微生物叢細胞の存在下で阻害または低減される処置である。
【０２５８】
一例では、植物は、農作物（例えば、小麦、大麦、禾穀類または家畜用飼料植物）、果樹（例えば、リンゴ、オレンジ、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、ライム、レモン、ラズベリー、イチゴ、ベリーまたはバナナの植物）、サトウキビの植物、香辛料の植物、庭の植物、野菜の植物、草、木または顕花植物である。例えば、植物は、塊茎植物、例えば、ジャガイモまたはサツマイモである（例えば、かつ、第１の、宿主、または標的細菌はＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ細胞であり、場合により、処置はその収穫物（例えば、ジャガイモ収穫物）の植物の保管（例えば、冷蔵）、洗浄、殺虫剤もしくは除草剤処置、施肥、または水分補給である）。例えば、植物はタバコ植物である（例えば、かつ、第１の、宿主、または標的細菌はＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ細胞であり、場合により、処置ははその収穫物（例えば、タバコ葉収穫物）の植物の保管（例えば、冷蔵）、洗浄、殺虫剤もしくは除草剤処置、施肥、または水分補給である）。
【０２５９】
一例では、対象は、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）である。一例では、対象または患者は魚類である。一例では、対象または患者は鳥類である。一例では、対象または患者は爬虫類である。一例では、対象または患者はクモである。一例では、対象は酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞）である。一例では、対象または患者は動物（例えば、げっ歯類、マウスまたはラット）である。一例では、対象または患者は（例えば、胎児である、または胎児でない）ヒトである。一例では、対象または患者は、ペットの動物（例えば、トリ、ウマ、イヌ、ネコまたはウサギ）である。一例では、対象または患者は昆虫（例えば、卵、幼虫、または蛹などのライフサイクルの任意の段階の昆虫、例えば、飛ぶ虫、這う虫、または甲虫）である。一例では、対象または患者は、頭足類または線形動物である。一例では、対象または患者は、植物または動物の害虫である。一例では、動物またはヒトの処置は、栄養処置、疾病または症状の治療、疾病または症状の予防、眼の処置、農薬処置、場の処置、局所的処置、または消化の処置であってよい。一例では、本方法は、病原体（例えば、病原性の寄生虫、原生動物、ウイルスまたは細菌）に対する対象または患者の免疫を増強する。一例では、処置または治療は、ヒトまたは動物に実施される併用処置または併用治療であり、ここで、ヒトまたは動物には、第１の医薬が、第２の医薬または放射線と組み合わせて投与される。第１および／または第２の医薬は、抗体療法または免疫細胞移植片（例えば、ＣＡＲ−ＴまたはＴＩＬ移植片）療法であってよい（また、本発明の免疫調節の局面は、これらの治療を調節するのに有利であってよい）。一例では、それぞれの医薬または処置は、表２から選択される。
【０２６０】
一例では、疾病または症状は、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病（例えば、インスリン抵抗性ＩＩ型糖尿病））、糖尿病患者または前糖尿病患者におけるインスリン抵抗性の発症、または糖尿病患者または前糖尿病患者におけるインスリン応答性の低下である。場合により、さらにこの例では、標的とされる第１の細胞または宿主細胞は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ細胞またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ細胞である。ある実施形態では、患者においてＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ細胞の両方が標的とされ（すなわち、本明細書に記載されるように、死滅し、および／または、集団の増殖が低下し、または移植片投与後に微生物叢において低下し）、ここで前記疾病または症状は、処置または予防される。
【０２６１】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−アレイ、またはＨＭ−ｃｒＲＮＡを提供する。
【０２６２】
本発明はまた、患者の養子細胞療法のための免疫細胞のエクスビボ集団を含むキットを提供し、ここで、キットはさらに、移植片、システム、アレイ、またはｃｒＲＮＡを含み、場合により、免疫細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される。
【０２６３】
可動遺伝因子（ＭＧＥ）
一例では、各ベクターは、可動遺伝因子（ＭＧＥ）を含む、または可動遺伝因子（ＭＧＥ）からなる核酸ベクターであり、ここで、ＭＧＥは、宿主細胞のゲノムまたは宿主細胞内のウイルス（例えば、プロファージ）のゲノムの標的配列を改変するための、伝達起点（ｏｒｉＴ）およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む。ＭＧＥの例は、ＩＣＥ、トランスポゾン、プラスミドおよびバクテリオファージである。伝達起点（ｏｒｉＴ）は、接合中にそれを含むＤＮＡを細菌宿主からレシピエントに伝達するのに必要な短い配列（例、最大５００ｂｐ）である。ｏｒｉＴはシス作用性であり、伝達されているＤＮＡと同じＤＮＡ上にあり、そのＤＮＡと共に伝達される。典型的な伝達起点は、機能的に規定された３つのドメイン：ニッキングドメイン、伝達ドメイン、および終結ドメインを含む。
【０２６４】
本発明のための好適なＩＣＥおよび、好適なｏｒｉＴのための起源を提供する、ＩＣＥｂｅｒｇデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｄｂ−ｍｍｌ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＩＣＥｂｅｒｇ／）が参照される。一例では、ＩＣＥはグループ１〜２８から選択されるＩＣＥを含むＩＣＥファミリーの一員であり、あるいは、ｏｒｉＴは当該ファミリーの一員のｏｒｉＴである：１＝ＳＸＴ／Ｒ３９１；２＝Ｔｎ９１６；３＝Ｔｎ４３７１；４＝ＣＴｎＤＯＴ／ＥＲＬ；５＝ＩＣＥｃｌｃ；６＝ＩＣＥＢｓ１；７＝ＩＣＥＨｉｎ１０５６；８＝ＰＡＰＩ−１；９＝ＩＣＥＭｌＳｙｍ（Ｒ７Ａ）；１０＝ＩＣＥＳｔ１；１１＝ＳＰＩ−７；１２＝ＩＣＥ６０１３；１３＝ＩＣＥＫｐ１；１４＝ＴｎＧＢＳ１；１５＝Ｔｎ５２５３；１６＝ＩＣＥＳａ２６０３；１７＝ＩＣＥＹｅ１；１８＝１０２７０−ＲＤ．２；１９＝Ｔｎ１２０７．３；２０＝Ｔｎ１８０６；２１＝ＩＣＥＡ５６３２；２２＝ＩＣＥＦ−Ｉ／ＩＩ；２３＝ＩＣＥＡＰＧ２；２４＝ＩＣＥＭ；２５＝１０２７０−ＲＤ．１；２６＝Ｔｎ５８０１；２７＝ＰＰＩ−１；２８＝ＩＣＥＦ−ＩＩＩ。ファミリーの説明は、ＩＣＥｂｅｒｇデータベースにある。例えば、Ｔｎ９１６ファミリーは、Roberts et al (2009)により規定された（Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251−8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; "A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements", Roberts A, Mullany P）。Ｔｎ９１６ファミリーに属する因子は、次の基準により規定されている：それらは、Roberts et alにより示された一般的な組織を有していなければならず、かつＤＮＡレベルで元のＴｎ９１６と配列および構造が類似しているコア領域（接合および調節モジュール）を有していなければならない。例外は、以前にこのファミリーに分類されていたＴｎ１５４９などの接合性トランスポゾンや、対応する参考文献に記載されているような高度のタンパク質類似性を有するトランスポゾンである。場合により、ＩＣＥはトランスポゾンであり、例えば、接合性トランスポゾンである。一例では、ＭＧＥは、機能性ヘルパーエレメントの存在下で可動性（ｍｏｂｉｌｉｓａｂｌｅ）である、可動性トランスポゾンであり、場合により、該トランスポゾンは、前記ヘルパーエレメントと組み合わせられる。
【０２６５】
場合により、ベクターはプラスミドであり、場合により、ここで、ＭＧＥはプラスミドに含まれるトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは接合性トランスポゾンである。一例では、トランスポゾンは、可動性トランスポゾンである（例えば、プラスミドがコードする１つ以上の因子を用いて、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の遺伝子により、可動性である）。場合により、トランスポゾンはＩ型トランスポゾンである。場合により、トランスポゾンは、ＩＩ型トランスポゾンである。場合により、ベクターｏｒｉＴは、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、ＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓもしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａトランスポゾンのｏｒｉＴである。これは、第１の細胞（宿主細胞）がそれぞれバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、ＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａである場合に有用である。場合により、ベクターｏｒｉＴは、ＣＴｎＤｏｔ、ＣＴｎＥＲＬ  ＳＸＴ／Ｒ３９１、Ｔｎ９１６またはＴｎ４３７１ファミリーのトランスポゾンｏｒｉＴである。
【０２６６】
場合により、本方法は、患者の微生物叢を、第２の細胞内で作動可能であるが、第１の（宿主）細胞内で作動できない、または、機能が低下する抗毒素遺伝子を含む、毒素−抗毒素モジュールを含むベクターまたはＭＧＥ（例えば、上述の）に曝すことを含む。従って、第１の細胞が死滅し、第２の細胞は温存され、それにより、患者の微生物叢において第１の細胞の割合を変更する。
【０２６７】
ＳＰＬＩＴ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステム
一局面では、第１の細胞（宿主細胞）の内因性Ｃａｓが利用され、宿主細胞に導入されたベクター（例えば、ファージ）に含まれる操作された配列と共に作動する。本局面は、外因性の配列を運搬する能力が限られているウイルスやファージなどのベクターにおいて、スペースを確保するのに有利である。スペースを確保することによって、より標的指向性の高いスペーサーまたはアレイを含むことができ、宿主の抵抗を回避するのに有用である。例えば、特にｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９などのかさ高いＣａｓ配列にとっては、内因性Ｃａｓエンドヌクレアーゼを利用することは、それをベクター内でコードするよりも有利である。さらに、非宿主起源由来のいくつかの外因性のＣａｓでみられるような、互換性が劣る可能性はない。ウイルス、例えばファージゲノムサイズを縮小させる能力はまた、宿主細胞の取り込み（宿主細胞におけるウイルスの感染および／または維持）を促進するのに有益であり得る。いくつかの例において、ベクター（例えばファージ）による宿主への侵入が、宿主が侵入する核酸と戦おうとして、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性をアップレギュレートし得る（宿主Ｃａｓヌクレアーゼの発現増加を含む）ことが利点である。しかしながら、これはまた、宿主Ｃａｓによって認識されるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを使用する場合、本発明と共に使用するための内因性Ｃａｓを提供するのにも有用である。本発明が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイを標的とするｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを包含する場合、これは、次いで、それ自身のＣＲＩＳＰＲシステムを不活性化するためにそれ自身のＣａｓヌクレアーゼを使用する「自殺」宿主細胞と同様に、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ自体の不活性化を促進する。
【０２６８】
従って、ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする配列を欠いていてよい。
【０２６９】
場合により、内因性の第１の細胞（宿主細胞）システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＣａｓヌクレアーゼである。場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＩＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＩＩＣａｓヌクレアーゼである。
【０２７０】
さらによりスペースを節約するために、場合により、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はベクターにより提供されないが、内因性宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡ配列であり、ここでｔｒａｃｒＲＮＡは、その後の宿主細胞内の標的へのＣａｓの誘導のための成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングのために、細胞内のＨＭ−ｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる。
【０２７１】
一般的に適用可能な特徴
以下の特徴は、本発明の任意の構成（例えば、任意のその局面、実施形態、コンセプト、段落、または実施例における）に適用される。
【０２７２】
一例では、標的配列は、染色体の配列、内因性宿主細胞の配列、野生型宿主細胞の配列、非ウイルス染色体宿主細胞の配列、および／または非ファージ配列であり（すなわち、これらの１つ以上またま全て）、例えば、標的配列は、宿主細胞染色体に含まれる抗生物質耐性遺伝子または必須遺伝子などの、野生型宿主染色体細胞配列である。一例では、標的配列は、宿主細胞プラスミド配列であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
【０２７３】
一例では、少なくとも２つの標的配列が、Ｃａｓにより改変され、例えば、抗生物質耐遺伝子および必須遺伝子である。このような複数の標的化は、エスケープ変異体宿主細胞の進化を低減させるのに有用であり得る。
【０２７４】
一例では、Ｃａｓは野生型内因性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼである。一例では、各宿主細胞は、恒常的Ｃａｓヌクレアーゼ活性、例えば、恒常的野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する。一例では、宿主細胞は細菌細胞である。別の例では、宿主細胞は古細菌細胞である。内因性Ｃａｓの使用は、ベクターのｃＲＮＡまたはｇＲＮＡにおいてスペースを確保することを可能にするために、有利である。例えば、タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが本発明において宿主細胞の改変のために用いられる場合において、タイプＩＩＣａｓ９ヌクレオチド配列は大きく宿主細胞の内因性Ｃａｓの代替の使用は、有利である。最も一般的に用いられるＣａｓ９は、４．２キロベース（ｋｂ）と測定され、Ｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。これは効率的なヌクレアーゼであるが、その分子の長さは、ベクターがどれだけの遺伝物質を収容することができるかという限界を押し上げ、生きている動物の組織および本明細書に記載の他の設定において、ＣＲＩＳＰＲを使用することに対する障壁を作り出す(F.A. Ran et al., “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,” Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015参照)。従って、ある実施形態では、本発明のベクターは、ＡＡＶベクターであるか、またはＡＡＶベクター以下の外因性ＤＮＡ挿入能力を有し、Ｃａｓは宿主細胞の内因性Ｃａｓであり、ここで細胞は細菌細胞または古細菌細胞である。Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ））ヌクレオチド配列は、１．４ｋｂのサイズを有する。
【０２７５】
一例では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、特に限られた外因性ＤＮＡ挿入能力を有するので、ウイルスパッケージング能力を考慮する必要がある。コートタンパク質およびポリメラーゼを発現させるためなどの、不可欠なウイルス機能をコードする配列のために余地を残す必要がある。一例では、ベクターはファージベクター、ＡＡＶ、またはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞である場合には有用である。
【０２７６】
「操作された」という用語の使用により、本発明の、アレイ、配列、ベクター、ｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ＭＧＥまたは他の構成、コンセプト、局面、実施形態、段落、または実施例などが、天然に生じるものではないことは、当業者にとって、容易に明らかとなるであろう。例えば、該ＭＧＥ、ベクター、配列またはアレイは、ＭＧＥ、ベクター、配列、またはアレイの、他の配列または成分と一緒に天然には見出されない１つ以上の配列または成分を含む。例えば、該アレイまたは配列は、宿主細胞に対して組み換え、人工、合成または外因性（すなわち、非内因性である、または野生型でない）である。
【０２７７】
一例では、本発明のアレイまたは配列は、単離された（例えば、宿主細胞から単離された）アレイまたは配列の操作されたバージョンである。一例では、操作されたアレイまたは配列は、細胞内で天然に見出されるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせられていない。
【０２７８】
研究により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌによる感染を予防する役割を有することが示唆されている。潜在的な病原体の侵入および増殖を制限する免疫応答の発達は、Ｂ  ｆｒａｇｉｌｉｓに大きく依存している。また、パネート細胞タンパク質は、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎによる刺激に応答して、抗菌ペプチドを生産し得、これらの分子は、病原体が腸に定着することを予防し得る。さらに、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎは、パネート細胞に殺菌性レクチン、ＲｅｇＩＩＩを生産させることができ、ＲｅｇＩＩＩはグラム陽性生物のペプチドグリカンに結合することによってその抗菌作用を発揮する。従って、患者の微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎおよび／またはｆｒａｇａｌｉｓ）の割合を増加させるための構成のいずれかにおける本発明の使用は、ヒトもしくは非ヒト動物の腸における集団の病原性細菌の定着を制限するのに有用である。
【０２７９】
Hooper et alは、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎがフコースリプレッサー遺伝子によって媒介される複雑な相互作用における腸内フコシル化と、シグナル伝達システムを改変できることを実証した。転写解析を用いて、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎが、栄養素の吸収、粘膜のバリア強化、および血管新生因子の生産に関わる遺伝子を含む、様々な宿主遺伝子の発現を調節できることが実証された。
【０２８０】
場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、グラム陰性細菌（例えば、ｓｐｉｒｉｌｌａまたは  ｖｉｂｒｉｏ）である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はグラム陽性細菌である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅまたはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＭＲＳＡ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｏ１５７：Ｈ７）宿主であり、例えば、ここで、Ｃａｓはベクターによりコードされるか、または、内因性宿主Ｃａｓヌクレアーゼ活性は抑制解除されている。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｖｉｂｒｏ（例えば、ｃｈｏｌｅｒａｅ（例えば、Ｏ１３９）またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＳｈｉｇｅｌｌａ（例えば、ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、ａｂｏｒｔｕｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＥｒｗｉｎｉａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｊｅｊｕｎｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＹｅｒｓｉｎｉａ（例えば、ｐｅｓｔｉｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、���１および／または第２の細菌）は、Ｂｏｒｅｌｉａ（例えば、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｅｒｌｉｃｈｉａ（例えば、ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例えば、ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば、ＤＴ  １０４）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ｆａｅｃａｌｉｓまたはｆａｅｃｉｍ、例えば、リネゾイド耐性）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば、多剤耐性）宿主である。
【０２８１】
例えばｔｒａｃｒＲＮＡを使用しないタイプのＣａｓシステムの場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を本発明のアレイまたはベクターから除くことができる。
【０２８２】
一例では、標的に誘導されるＣａｓはエキソヌクレアーゼである。場合により、本明細書で言及されるニッカーゼは、ダブルニッカーゼである。ニッカーゼの例は、Ｃａｓ９ニッカーゼであり、すなわち、２つのヌクレアーゼドメインのうちの一方（ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインのいずれか）が不活性化されているＣａｓ９である。
【０２８３】
本明細書におけるベクターＤＮＡの使用についての言及はまた、別の実施形態において、文脈が許す場合に、必要な変更を加えてベクターＲＮＡに適用することもできる。例えば、ベクターがＲＮＡベクターである場合である。したがって、本発明の全ての特徴は開示された代替形態であり、文脈が許す場合に、本明細書中でベクターＤＮＡを指す場合には「ＤＮＡ」の代わりに「ＲＮＡ」として読まれるべきである。一例では、当該またはそれぞれのベクターはまた、逆転写酵素をコードする。
【０２８４】
一例では、当該またはそれぞれのアレイまたは操作されたヌクレオチド配列は、ナノ粒子ベクターによって、または、リポソーム中で、提供される。
【０２８５】
一例では、Ｃａｓは切断用のＣａｓヌクレアーゼ、遮断用の不活性化型Ｃａｓ（ｄｅａｄ  Ｃａｓ）（ｄＣａｓ）、または標的を活性化するための転写活性化因子に結合したｄＣａｓである。
【０２８６】
一例では、当該またはそれぞれのアレイまたは操作された配列は、宿主におけるｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの転写に機能的である外因性プロモーターを含む。
【０２８７】
ある実施形態において、アレイまたは操作された配列は、ヴィロファージベクターに含まれ、宿主は、あるいは、細胞に感染することができるウイルスである。例えば、宿主は、アメーバ細胞に感染し得る大きなウイルスである。例えば、宿主は、スプートニクウイルス（Ｓｐｕｔｎｉｋ  ｖｉｒｕｓ）、ピソウイルス（Ｐｉｔｈｏｖｉｒｕｓ）、ミミウイルス（ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）、ママウイルス（ｍａｍａｖｉｒｕｓ）、メガウイルス（Ｍｅｇａｖｉｒｕｓ）、またはパンドラウイルス（Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｕｓ）であり、例えば、ここで、宿主ウイルスは水中に存在する。本実施形態の一例では、本発明は水処理または下水処理（例えば浄化処理、例えば水路、河川、湖、池または海の処理）のためのものである。
【０２８８】
ある実施形態において、当該またはそれぞれのベクターまたは操作された配列は、ΦΝΜ１ファージであるか、これに含まれ、例えば、ここで、宿主細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＲＳＡ）細胞である。
【０２８９】
例えば、本方法は、哺乳動物対象、例えば、ヒト、げっ歯類、マウスまたはラットに実施される。例えば、本方法は脊椎動物、爬虫類、鳥類または魚類に実施される。
【０２９０】
細胞集団は、１回以上の投与で、患者に投与することができる。例えば、本方法は、抗菌剤を投与して前記ディスバイオシスを引き起こすこと、または、細菌移植片を患者に投与して前記ディスバイオシスを引き起こすことを含む。
【０２９１】
本方法が細胞療法を軽減する場合、該療法を、例えば細胞療法の望まれない副作用（例えば、ＣＲＳなどの、ヒト患者におけるＣＡＲ−Ｔ療法の副作用）を軽減または予防するために、ダウンレギュレート、緩和または停止させることができる。本方法が細胞療法を上昇させる場合、該療法を、例えば標的細胞に対する細胞傷害性を増強させるために、アップレギュレート、増強、または開始させることができる。
【０２９２】
本方法は、疾病または症状を、処置または予防する（すなわち、そのリスクを低減する）。これは、完全なまたは部分的な、処置または予防であってよく、すなわち、疾病／症状またはその徴候の軽減であるが、完全な軽減でなくてよく；あるいは、疾病／症状またはその徴候のリスクの軽減であるが、完全な予防でなくてよい。同様に、本方法は、疾病もしくは症状または治療の望ましくない徴候（例えば、ＣＲＳ）を処置または予防する（すなわち、そのリスクを軽減する）。
【０２９３】
コンセプト
１．患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および、
ｂ．患者において細菌微生物叢（例えば、腸内微生物叢）ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオシスが患者において免疫細胞療法を調節すること
を含む方法。
２．患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および、
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された微生物叢を産生すること
を含む方法。
３．ステップ（ｂ）が、抗細菌剤または抗古細菌剤を、患者の微生物叢に、免疫細胞集団と同時に、または連続して投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することにより実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、コンセプト２の方法。
４．細胞療法が養子Ｔ細胞療法である、コンセプト１〜３のいずれかに記載の方法。
５．ステップ（ａ）において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞からなる群から選択される細胞が患者に投与される、コンセプト４に記載の方法。
６．患者においてＴｈ１７細胞が調節される、コンセプト４または５に記載の方法。
７．患者においてＴｒｅｇ細胞が調節される、コンセプト４、５または６に記載の方法。
８．細胞療法が増強される、コンセプト１〜７のいずれかに記載の方法。
９．患者においてＴｈ１７細胞がアップレギュレートされ、および／または、患者においてＴｒｅｇ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ以上がアップレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、コンセプト１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．細胞療法が低減される、コンセプト１〜７のいずれかに記載の方法。
１４．患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する、コンセプト１３に記載の方法。
１５．患者においてＴｈ１７細胞がダウンレギュレートされ、および／または、患者においてＴｒｅｇ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１〜７、１３および１４のいずれかに記載の方法。
１６．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１〜７、および、１３〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１〜７、および、１３〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ以上がダウンレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、コンセプト１〜７および１３〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．免疫細胞集団が、ＣＡＲ−Ｔ細胞、および／または、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、および／または、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、コンセプト１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．免疫細胞集団が、操作された自家の、または同種の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および／またはＴＩＬを含む、コンセプト１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である、コンセプト１９または２０に記載の方法。
２２．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加させる、コンセプト１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）  の割合を減少させる、コンセプト１〜２１のいずれかに記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を増加させる、コンセプト１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を減少させる、コンセプト１〜２３のいずれかに記載の方法。
２６．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である）の割合を低減させる、コンセプト１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である）の割合を増加させる、コンセプト１〜２５のいずれかに記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる、コンセプト１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を増加させる、コンセプト１〜２７のいずれかに記載の方法。
３０．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変化した微生物叢を産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含む方法であって、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現させること
を含む方法であって、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列が、
(iii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列;
(iv)宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ;
を含み、場合により、ＨＭ−システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割合を低減させる、コンセプト１〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．標的ヌクレオチド配列の改変のために、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼを用いることを含む、コンセプト３０の方法。
３２．前記Ｃａｓ改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少なくとも５倍、宿主細胞集団の増殖を低下させることを含む、コンセプト３０または３１に記載の方法。
３３．腸表面上の宿主細胞集団の増殖を阻害することを含む、コンセプト３０〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．微生物叢が、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第２の種または株が、宿主細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が前記ＨＭ−システムにより阻害されない、コンセプト３０〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．第２の種または株が、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プロバイオティック種または株である、コンセプト３４に記載の方法。
３６．第２の種または株が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞である、コンセプト３４または３５に記載の方法。
３７．第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、コンセプト３０〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．各宿主細胞について、該システムが、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の成分を含む、コンセプト３０〜３７のいずれかに記載の方法：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列およびリピートを含む操作されたＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ−ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記ＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ−ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢における前記亜集団の割合を変更する。
３９．成分（ｉ）が、各宿主細胞に対して内因性である、コンセプト３８に記載の方法。
４０．各ベクターが、ウイルスまたはファージである、コンセプト３８または３９に記載の方法。
４１．各標的配列が、隣接するＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）である、コンセプト３０〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．代わりに、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に含まれ、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む、コンセプト３０〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．微生物叢が、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、第２の細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されない；あるいは、微生物叢が、第２の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されない、コンセプト３０〜３５および３７〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．微生物叢が第２の細菌種を含み、第１および第２の種のぞれぞれが、グラム陽性種であり、第２の細菌の増殖がＨＭ−システムによって阻害されない、コンセプト３０〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．各標的配列が、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれる、コンセプト３０〜３３のいずれかに記載の方法。
４６．各第１の細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ  ｃｏｌｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である、コンセプト１〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．ステップ（ｂ）が、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ステップ（ｂ）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が刺激され、細胞療法が調節される、コンセプト１〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．ステップ（ｂ）が、患者において腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ステップ（ｂ）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、細胞療法が調節される、コンセプト１〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生することを含み、ステップ（ｂ）が、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させるか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む、コンセプト１〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．コンセプト１〜４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片であって、場合により前記第１の種の細胞を含む移植片。
５１．コンセプト１〜４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、コンセプト３０〜４５のいずれかに記載される、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−アレイまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡ。
５２．さらに、コンセプト５０または５１の移植片、システム、アレイまたはｃｒＲＮＡを含み、場合により免疫細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される、患者の養子細胞療法のための免疫細胞のエクスビボ集団を含むキット。
【０２９４】
局面
１．患者において疾病または症状を治療または予防するための、患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが患者において免疫細胞療法を調節し、該疾病または症状が処置または予防されること；
を含む、免疫細胞のエクスビボ集団。
２．患者において疾病または症状を治療または予防するための、以下を含む、患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団。
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
ｂ．患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること。
３．ステップ（ｂ）が、抗細菌剤または抗古細菌剤(例えば、誘導型ヌクレアーゼ)を、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することにより実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、局面２の免疫細胞集団。
４．細胞療法が養子Ｔ細胞療法である、局面１〜３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
５．ステップ（ａ）において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞からなる群から選択される細胞が患者に投与される、局面４の免疫細胞集団。
６．患者においてＴｈ１７細胞が調節される、局面４または５に記載の免疫細胞集団。
７．患者においてＴｒｅｇ細胞が調節される、局面４、５または６に記載の免疫細胞集団。
８．細胞療法が増強される、局面１〜７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
９．患者においてＴｈ１７細胞がアップレギュレートされ、および／または、患者においてＴｒｅｇ細胞がダウンレギュレートされる、局面１〜８のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１０．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、局面１〜９のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１１．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、局面１〜１０のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１２．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ以上がアップレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与されるる免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、局面１〜１１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１３．細胞療法が低減される、局面１〜７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１４．該方法が、患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する、局面１３に記載の免疫細胞集団。
１５．患者においてＴｈ１７細胞がダウンレギュレートされ、および／または、患者においてＴｒｅｇ細胞がアップレギュレートされる、局面１〜７、１３および１４のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１６．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、局面１〜７および１３〜１５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１７．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、局面１〜７および１３〜１６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１８．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ以上がダウンレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、局面１〜７および１３〜１７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１９．免疫細胞集団が、ＣＡＲ−Ｔ細胞および／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、または、これらから成る、局面１〜１８のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２０．免疫細胞集団が、操作された自家の、または同種の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および／またはＴＩＬを含む、またはこれらから成る、局面１〜１９のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２１．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である、局面１９または２０に記載の免疫細胞集団。
２２．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加させる、局面１〜２１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２３．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を減少させる、局面１〜２１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２４．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を増加させる、局面１〜２３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２５．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を減少させる、局面１〜２３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２６．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である）の割合を低減させる、局面１〜２５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２７．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種である）の割合を増加させる、局面１〜２５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２８．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる、局面１〜２７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２９．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を増加させる、局面１〜２７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３０．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変化した微生物叢を産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含む方法であって、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現させること
を含む方法であって、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列が、
(iii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列;
(iv)宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ; 
を含み、場合により、ＨＭ−システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、,それにより、微生物叢における該亜集団の割合を低減させる、局面１〜２９のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３１．標的ヌクレオチド配列の改変のために、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼを用いることを含む、局面３０の免疫細胞集団。
３２．前記Ｃａｓ改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少なくとも５倍、宿主細胞集団の増殖を低下させることを含む、局面３０または３１に記載の免疫細胞集団。
３３．腸表面上の宿主細胞集団の増殖を阻害することを含む、局面３０〜３２のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３４．微生物叢が、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第２の種または株が、宿主細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が前記ＨＭ−システムにより阻害されない、局面３０〜３３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３５．第２の種または株が、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プロバイオティック種または株である、局面３４に記載の免疫細胞集団。
３６．第２の種または株が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞である、局面３４または３５に記載の免疫細胞集団。
３７．第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、局面３０〜３６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３８．各宿主細胞について、該システムが、（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の成分を含む、局面３０〜３７のいずれかに記載の免疫細胞集団：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列およびリピートを含む操作されたＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ−ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記ＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ−ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢における前記亜集団の割合を変更する。
３９．成分（ｉ）が、各宿主細胞に対して内因性である、局面３８に記載の免疫細胞集団。
４０．各ベクターが、ウイルスまたはファージである、局面３８または３９に記載の免疫細胞集団。
４１．各標的配列が、隣接するＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）である、局面３０〜４０のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４２．代わりに、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に含まれ、本方法が、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む、局面３０〜４１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４３．微生物叢が、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、第２の細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されない；あるいは、微生物叢が、第２の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ−システムによって阻害されない、局面３０〜３５および３７〜４２のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４４．微生物叢が第２の細菌種を含み、第１および第２の種のぞれぞれが、グラム陽性種であり、第２の細菌の増殖がＨＭ−システムによって阻害されない、局面３０〜４３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４５．各標的配列が、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれる、局面３０〜４４のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４６．各第１の細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ  ｃｏｌｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である、局面１〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．ステップ（ｂ）が、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ステップ（ｂ）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が刺激され、細胞療法が調節される、局面１〜４６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４８．ステップ（ｂ）が、患者において腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ステップ（ｂ）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、細胞療法が調節される、局面１〜４７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４９．ステップ（ｂ）が、患者の腸内微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生することを含み、ステップ（ｂ）が、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させるか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む、局面１〜４８のいずれかに記載の免疫細胞集団。
５０．局面１〜４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片であって、場合により前記第１の種の細胞を含む移植片。
５１．局面１〜４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、局面３０〜４５のいずれかに記載される、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−アレイまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡ。
５２．さらに、局面５０または５１の移植片、システム、アレイまたはｃｒＲＮＡを含み、場合により免疫細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される、前記疾病または症状を処置するための患者の養子細胞療法のための、局面１〜４９のいずれかに記載の、免疫細胞のエクスビボ集団を含むキット。
【０２９５】
場合により、宿主細胞、第１の細胞、第２の細胞、または混合細菌集団は、ヒトまたは非ヒト動物対象に含まれ、例えば、該集団は、腸内の微生物叢、皮膚の微生物叢、口腔の微生物叢、喉の微生物叢、毛髪の微生物叢、腋窩の微生物叢、膣の微生物叢、直腸の微生物叢、肛門の微生物叢、眼の微生物叢、鼻の微生物叢、舌の微生物叢、肺の微生物叢、肝臓の微生物叢、腎臓の微生物叢、生殖器の微生物叢、陰茎の微生物叢、陰嚢の微生物叢、乳腺の微生物叢、耳の微生物叢、尿道の微生物叢、口唇の微生物叢、臓器の微生物叢または歯の微生物叢に含まれる。場合により、混合細菌集団は、植物に（例えば、タバコ、農作物、果樹、野菜、またはタバコに、例えば、植物の表面上に、または、植物内に含有されて）または環境に（例えば、土壌または水中または水路または水溶液（ａｃｑｕｅｏｕｓ  ｌｉｑｕｉｄ）に）含まれる。
【０２９６】
場合により、ヒトまたは動物の対象または患者の、疾病または症状は、以下から選択される。
（ａ）神経変性の疾病または症状；
（ｂ）脳の疾病または症状；
（ｃ）中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または症状；
（ｄ）記憶喪失または記憶障害；
（ｅ）心臓または循環器の疾病または症状、例えば、心臓発作、脳卒中または心房細動；
（ｆ）肝臓の疾病または症状；
（ｇ）腎臓の疾病または症状、例えば、慢性腎臓病（ＣＫＤ）；
（ｈ）膵臓の疾病または症状；
（ｉ）肺の疾病または症状、例えば、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ；
（ｊ）胃腸の疾病または症状；
（ｋ）喉または口腔の疾病または症状；
（ｌ）眼の疾病または症状；
（ｍ）生殖器の疾病または症状、例えば、陰唇、陰茎または陰嚢の疾病または症状；
（ｎ）性行為感染性疾病または症状、例えば、淋病、ＨＩＶ感染症、梅毒またはクラミジア感染症；
（ｏ）耳の疾病または症状；
（ｐ）皮膚の疾病または症状；
（ｑ）心臓の疾病または症状；
（ｒ）鼻の疾病または症状
（ｓ）血液性の疾病または症状、例えば、貧血、例えば、慢性病の貧血またはがん；
（ｔ）ウイルス感染症；
（ｕ）病原性細菌感染症；
（ｖ）がん；
（ｗ）自己免疫性の疾病または症状、例えば、ＳＬＥ；
（ｘ）炎症性の疾病または症状、例えば、関節リウマチ、乾癬、湿疹、喘息、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病またはＩＢＤ；
（ｙ）自閉症；
（ｚ）ＡＤＨＤ；
（ａａ）双極性障害；
（ｂｂ）ＡＬＳ［筋萎縮性側索硬化症］；
（ｃｃ）骨関節炎；
（ｄｄ）先天性または発達の欠損または症状；
（ｅｅ）流産；
（ｆｆ）血液凝固の症状；
（ｇｇ）気管支炎；
（ｈｈ）ドライ型またはウェット型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；
（ｉｉ）血管新生（例えば、腫瘍の、または眼の中の）；
（ｊｊ）かぜ；
（ｋｋ）てんかん；
（ｌｌ）線維症、例えば、肝臓または肺の線維症；
（ｍｍ）真菌症または症状、例えば、鵞口瘡；
（ｎｎ）代謝性の疾病または症状、例えば、肥満症、食欲不振、糖尿病、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病．
（ｏｏ）潰瘍、例えば、胃潰瘍または皮膚潰瘍；
（ｐｐ）皮膚乾燥；
（ｑｑ）シェーグレン症候群；
（ｒｒサイトカインストーム；
（ｓｓ）難聴、聴覚消失または聴覚障害；
（ｔｔ）代謝が遅いまたは速い（すなわち、対象の体重、性別および年齢の平均よりも遅いまたは速い）；
（ｕｕ）受胎障害、例えば、不妊症または低受胎能；
（ｖｖ）黄疸；
（ｗｗ）発疹；
（ｘｘ）川崎病；
（ｙｙ）ライム病；
（ｚｚ）アレルギー、例えば、ナッツ、草、花粉、イエダニ、ネコまたはイヌの毛またはフケのアレルギー；
（ａａａ）マラリア、腸チフス熱、結核またはコレラ；
（ｂｂｂ）鬱；
（ｃｃｃ）精神障害；
（ｄｄｄ）小頭症；
（ｅｅｅ）栄養失調；
（ｆｆｆ）結膜炎；
（ｇｇｇ）肺炎；
（ｈｈｈ）肺塞栓症；
（ｉｉｉ）肺高血圧症；
（ｊｊｊ）骨の疾患；
（ｋｋｋ）敗血症または敗血症性ショック；
（ｌｌｌ）副鼻腔炎（Ｓｉｎｕｓｉｔｕｓ）；
（ｍｍｍ）ストレス（例えば、職業ストレス）；
（ｎｎｎ）地中海貧血症、貧血、フォン・ヴィルブランド病、または血友病；
（ｏｏｏ）帯状疱疹または口唇ヘルペス；
（ｐｐｐ）月経；
（ｑｑｑ）精子数減少
【０２９７】
本方法により処置または予防する、神経変性または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または症状
【０２９８】
一例では、神経変性または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または症状は、ルツハイマー病、腰筋症（ｇｅｒｉｏｐｓｙｃｈｏｓｉｓ）、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性ニューロパチー、およびクロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択される。例えば、該疾病はアルツハイマー病である。例えば、該疾病は、パーキンソン症候群である。
【０２９９】
一例では、本発明の方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）または神経変性の疾病または症状の処置のために、ヒトまたは動物対象に実行され、本方法は、対象においてＴｒｅｇ細胞のダウンレギュレーションを引き起こし、それにより、全身性単球由来マクロファージおよび／Ｔｒｅｇ細胞の、脈絡叢を通った対象の脳への移行を促進し、それにより、疾病または症状（例えば、アルツハイマー病）が処置、予防され、あるいは、その進行が軽減される。ある実施形態では、本方法は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）システム（例えば、脳内および／またはＣＳＦの）において、ＩＦＮ−γの増加を引き起こす。一例では、本方法は、神経線維を回復させ、および／または、神経線維の損傷の進行を低減させる。一例では、本方法は、神経ミエリンを回復させ、および／または、神経ミエリン損傷の進行を低減させる。一例では、本発明の方法は、ＷＯ２０１５１３６５４１に開示された疾病または症状を、処置または予防し、および／または、本方法は、ＷＯ２０１５１３６５４１に開示された方法と共に用いられ得る（当該文書の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、例えば、当該方法、疾病、症状および中枢神経系（ＣＮＳ）および神経変性の疾病および症状の処置および／または予防をもたらすために対象に投与され得る潜在的治療薬（例えば、当該文書に開示される抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＴＩＭ３、または他の抗体などの、免疫チェックポイント阻害剤などの薬）の開示を提供することを目的とする）。
【０３００】
本方法により処置または予防するがん
【０３０１】
処置され得るがんには、血管形成されていない、または実質的に血管形成されていない腫瘍、ならびに、血管形成腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（血液系腫瘍など、例えば、白血病およびリンパ腫）を含んでよく、あるいは、固形腫瘍を含んでもよい。本発明で処置されるがんのタイプには、細胞腫、芽細胞腫、および肉腫、およびある種の白血病、またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、および悪性病変（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）（例えば、肉腫、細胞腫、およびメラノーマ）が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。
【０３０２】
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液性（または血行性）のがんの例には、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄白血病、および、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など（ｐｒｏｍｙｅｉｏｃｙｔｉｃ））、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の）、多発性骨髄腫，ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および骨髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
【０３０３】
固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含有しない、組織の異常な腫瘤である。固形腫瘍は良性または悪性であることができる。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、細胞腫、およびリンパ腫など）について、名前が付けられている。肉腫および細胞種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん，リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺癌、汗腺がん，甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫皮脂腺細胞腫、乳頭がん，乳頭状腺がん、髄様がん，気管支原性肺癌、腎細胞がん、肝細胞がん，胆管細胞腫、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、メラノーマ、および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、星細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫，胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、脳室上衣腫、松果体腫（ｐｉｎｅａｉｏｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。
【０３０４】
本方法により処置または予防する自己免疫性の疾病
・急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
・急性壊死性出血性白質脳炎
・アジソン病
・無ガンマグロブリン血症
・円形脱毛症
・アミロイドーシス
・強直性脊椎炎
・抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
・抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）
・自己免疫性の血管浮腫
・自己免疫性の再生不良性貧血
・自己免疫性の自律神経障害
・自己免疫性の肝炎
・自己免疫性の高脂血症
・自己免疫性の免疫不全
・自己免疫性の内耳疾病（ＡＩＥＤ）
・自己免疫性の心筋炎
・自己免疫性の卵巣炎
・自己免疫性の膵炎
・自己免疫性の網膜症
・自己免疫性の血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
・自己免疫性の甲状腺疾患
・自己免疫性のじんま疹
・軸索およびニューロンのニューロパシー
・バロ病
・ベーチェット病
・水疱性類天疱瘡
・心筋症
・キャッスルマン病
・セリアック病
・シャガス病
・慢性疲労症候群
・慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）
・慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）
・チャーグ・ストラウス症候群
・瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
・クローン病
・コーガン症候群
・寒冷凝集素症
・先天性心ブロック
・コクサッキー心筋炎
・ＣＲＥＳＴ症
・本態性混合型クリオグロブリン血症
・脱髄性ニューロパシー
・ヘルペス状皮膚炎
・皮膚筋炎
・デビック病（視神経脊髄炎）
・円盤状ループス
・ドレッスラー症候群
・子宮内膜症
・好酸球性食道炎
・好酸球性筋膜炎
・結節性紅斑
・実験的アレルギー性脳脊髄炎
・エバンス症候群
・線維筋痛症
・線維性肺胞炎
・巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
・巨細胞性心筋炎
・糸球体腎炎
・グッドパスチャー症候群
・多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）
・グレーブス病
・ギラン・バレー症候群
・橋本脳炎
・橋本甲状腺炎
・溶血性貧血
・ヘノッホ・シェーンライン紫斑病
・妊娠性疱疹
・低ガンマグロブリン血症
・特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
・ＩｇＡ腎症
・ＩｇＧ４関連硬化性疾病
・免疫調節性リポタンパク質
・封入体筋炎
・間質性膀胱炎
・若年性関節炎
・若年性糖尿病（１型糖尿病）
・若年性筋炎
・川崎症候群
・ランバート・イートン症候群
・白血球破砕性血管炎
・扁平苔癬
・硬化性苔癬
・木質性結膜炎
・線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）
・ループス（ＳＬＥ）
・ライム病、慢性
・メニエール病
・顕微鏡的多発血管炎
・混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）
・モーレン潰瘍
・ムッハ・ハーベルマン病
・多発性硬化症
・重症筋無力症
・筋炎
・ナルコレプシー
・視神経脊髄炎（デビック病）
・好中球減少症
・眼の瘢痕性類天疱瘡
・視神経炎
・回帰性リウマチ
・ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連する小児自己免疫性精神神経疾患）
・傍腫瘍性小脳変性症
・発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
・Ｐａｒｒｙ  Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群
・パーソネージ・ターナー症候群
・毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）
・天疱瘡
・末梢神経障害
・静脈周囲脳脊髄炎
・悪性貧血
・ＰＯＥＭＳ症候群
・結節性多発動脈炎
・多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型
・リウマチ性多発筋痛
・多発性筋炎
・心筋梗塞後症候群
・心膜切開後症候群
・プロゲステロン皮膚炎
・一次胆汁性肝硬変
・一次硬化性胆管炎
・乾癬
・乾癬性関節炎
・特発性肺線維症
・壊疽性膿皮症
・赤芽球癆
・レイノー現象
・反応性関節炎
・反射性交感神経性ジストロフィー
・ライター症候群
・再発性多発軟骨炎
・下肢静止不能症候群
・後腹膜線維症
・リウマチ熱
・関節リウマチ
・サルコイドーシス
・シュミット症候群
・強膜炎
・強皮症
・シェーグレン症候群
・精子および精巣の自己免疫性疾患（Ｓｐｅｍ＆ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）
・全身硬直症候群
・亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）
・スザック症候群
・交感性眼炎
・高安動脈炎
・側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎
・血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
・トロサ・ハント症候群
・横断性脊髄炎
・１型糖尿病
・潰瘍性大腸炎
・未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）
・ぶどう膜炎
・血管炎
・小水疱水疱性皮膚病
・白斑
・ウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）
【０３０５】
本方法により処置または予防する炎症性の疾病
・アルツハイマー病
・強直性脊椎炎
・関節炎（骨関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）
・喘息
・アテローム動脈硬化症
・クローン病
・大腸炎
・皮膚炎
・腸憩室炎
・線維筋痛症
・肝炎
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
・腎炎
・パーキンソン病
・潰瘍性大腸炎
【０３０６】
一例では（例えば、混合細菌集団を包含する本発明の方法において）、宿主細胞（または第１の細胞または第２の細胞）の属または種は、表１に列挙した属または種から選択される。本発明の実施例において、Ｃａｓ（例えば、タイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩなどのＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ３またはＣａｓ９）は、表１に列挙した属または種から選択された属または種の細菌に含まれるＣａｓであり、かつ、場合により、宿主細胞（または第１の細胞または第２の細胞）は、同一の属または種の細胞である。この一例では、Ｃａｓは前記宿主細胞（または第１または第２の細胞）に内因性であり、このことは、内因性Ｃａｓが標的配列の改変に用いられる本明細書の実施形態にとって有用である。この場合、ＨＭ−アレイは、前記細胞、属または種のリピート配列に少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一（または１００％同一）である、１つ以上のリピートヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を含み得、それにより、Ｃａｓは該細胞において１つ以上の標的配列を改変するためにＨＭ−アレイによってコードされるｃＲＮＡと作動可能である。一例では、ＣａｓはタイプＩＣａｓであり、タイプＩＣＡＳＣＡＤＥと共に用いられ、ここで、Ｃａｓ３およびＣＡＳＣＡＤＥの１つまたは両方が、宿主細胞または第１の細胞に内因性であるか、あるいは、ベクター媒介性である（すなわち、宿主細胞または第１の細胞に外因性である）。
【０３０７】
一例では、本発明の方法は、微生物叢において第１の細胞を選択的に死滅する一方で、第２の細胞は標的とせず、例えば、第２の細胞は、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する。ある実施形態では、第１の細胞は、表１から選択された第１の種の細胞であり、かつ、第２の細胞は、表１から選択された異なる種の細胞である。一例では、該種は、同じ属の種であり、または、異なる属の種である。
【０３０８】
本明細書に記載された特定の実施形態は例示として示されており、本発明の限定として示されていないことは理解されるであろう。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態に採用することができる。当業者であれが、本明細書に記載の特定の手順に対する多数の均等物を認識するか、または日常的な研究のみを用いて確認することができるであろう。これらの均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲により包含される。本明細書中で言及されている全ての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。すべての刊行物および特許出願ならびにすべての同等の米国特許出願および特許は、まるで各刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。特許請求の範囲および／または明細書中で「含む」という用語と一緒に使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも一つ」、および「１つまたはそれより多い」の意味とも一致する。請求項における用語「または」の使用は、本開示は、代替物および「および／または」のみを指す規定を支持するが、代替物のみを指すように明示的に示されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。本出願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使用されている装置、方法にとって固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用されている。
【０３０９】
本明細書および特許請求の範囲で使用されているように、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などの任意の形式のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「ｈａｖｉｎｇ」（および「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などの任意の形式のｈａｖｉｎｇ）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのあらゆる形式のｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などのあらゆる形式のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という単語は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる、記載されていないエレメントまたは方法のステップを除外するものではない。
【０３１０】
本明細書で使用される場合、「またはそれらの組み合わせ」または同様の用語は、その用語の前に列挙された項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、「A、B、C、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈で順序が重要な場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢもまた含むことを意図している。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１つ以上の項目または用語の繰り返しを含む組み合わせが明確に含まれる。当業者であれば、文脈から他に明らかでない限り、典型的には任意の組み合わせにおける項目または用語の数に制限がないことを、理解するであろう。
【０３１１】
文脈から明らかでない限り、本開示の任意の部分は、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
【０３１２】
本明細書に開示され特許請求されている全ての組成物および／または方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく製造および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、組成物および／または方法、ならびに本明細書に記載の方法の工程または方法の工程の順序において、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変形が適用され得ることは当業者に明らかであろう。当業者に明らかなこれらの類似の代替物および改変物はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。
【０３１３】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、さらに詳細に記載されている。
【実施例】
【０３１４】
実施例１：野生型内因性Ｃａｓを利用することによる、特定の微生物叢細菌集団の増殖阻害
１．材料および方法
１．１．株
【０３１５】
本実施例および実施例２および３の過程では、以下の株を用いた：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４９１、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  ２０６１７（Ｔ）（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３および  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  Ｃｌａｒｋｅ  １９２４  ＤＳＭ  ２０５２３（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０３１６】
培地選択および遺伝子構築物の試験の過程では、異なるＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｉ株を用いた。適合性のある増殖要件のために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４９１）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０が考えられた。全ての株は、他に示されない限り、好気的条件下および３７度で、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ  ｂｒｏｔｈ（ＴＨ）（Ｔ１４３８  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養した。株は、−８０度で、２５％グリセロール中で保存した。
【０３１７】
１．２．分化増殖培地（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ）
全ての株を、３７度で２０時間、ＴＨ培地上で増殖させた。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのための選択培地は、３ｇ／ｌの２−フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であった。ＰＥＡを培地に添加し、１５ｐｓｉで、１５分間１２１℃、オートクレーブ処理した。寒天プレートは、対応する培地に１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天を添加することにより調製した。選択またはプラスミド維持のために必要な場合、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株およびＥ．ｃｏｌｉの両方に使用し、５００μｇ／ｍｌをＳ．ｍｕｔａｎｓに使用した。
【０３１８】
いくつかの場合では、株およびプラスミドに応じて、ＰＥＡを添加して培地上での増殖を見るには、最大４８時間のより長い培養が、必要とされ得る。用いる生物の生存率を制御するためには、並行してコントロールＴＨ寒天培地を行わなければならない。
１．３．クローニング
【０３１９】
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント細胞）をすべてのサブクローニング手順に使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。製造元のプロトコールに従って、全てのＰＣＲ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐにより精製した。精製した断片を、総量３４μｌ中に１μｌの酵素を含む１×ＦＤ緩衝液において、制限酵素ＤｐｎＩで分解した。製造元のプロトコールに従って、分解反応物を再び、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐで精製した。製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）のプロトコールに従って、１０μｌの反応液中で、ギブソン・アセンブリを行った。
【０３２０】
製造元の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために０．５％グリシンおよびリゾチームを添加した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
【０３２１】
１．４．形質転換
１．４．１  エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  ＴＯＰ１０  ケミカルコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ）を、クローニングおよび実験に用いた。エレクトロポレーションは、標準設定を用いて行った：Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＥＣＭ６３０）を用いて１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで行った。パルスの後、１ｍｌのＬＢ−ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。
【０３２２】
１．４．２  エレクトロコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞の調製
エレクトロポレーションプロトコールは、Somkuti and Steinberg, 1988から改変した。４０ｍＭのＤＬ−スレオニン（Ｔ８３７５ Ｓｉｇｍａ − Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＴＨ  Ｂｒｏｔｈ中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一晩培養した培養液を、５ｍｌの同じ培地中で１００倍希釈し、０．３〜０．５の間のＯＤ６００まで増殖させた（播種後約２．５時間）。細胞を、１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することにより回収し、５ｍｌの氷冷洗浄バッファー（０．５Ｍショ糖＋１０％グリセロール）で３回洗浄した。細胞を洗浄後、エレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍショ糖、１０％グリセロールおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にＯＤ６００が１５〜３０になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は、使用するまで、４℃で保存され得るか（１時間以内）、あるいは、エッペンドルフチューブに５０μｌずつ分注し、液体窒素中で凍結し、後で使用するために−８０℃で保管され得る。
【０３２３】
１．４．３  Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞のエレクトロポレーション
１μｌの精製プラスミドＤＮＡを、５０μｌの細胞懸濁液に添加し、予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットでエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーションの設定は、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＥＣＭ６３０）を用いて、２５００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωであった。電気パルスの直後に、１ｍｌのＴＨ  ｂｒｏｔｈを細胞に添加し、懸濁液を氷上で１０分間保存し、続いて、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。耐性遺伝子が発現するのを待った後、細胞を３０μｇ／ｍのカナマイシンを含有するＴＨ−寒天プレート上にプレーティングした。構築物に応じて、コロニーは、３７℃で１２時間〜４８時間インキュベーションする間に出現した。
【０３２４】
１．５．ＸｙｌＳプラスミドの構築
本研究に使用したすべてのプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓの潜在プラスミドｐＷＶ０１に由来する広宿主域発現ベクターであるｐＢＡＶ１Ｋ − Ｔ５に基づいており（Ｂｒｙｋｓｉｎ＆Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、２０１０）、ギブソン法を使用して他のフラグメントとアセンブルするためのオーバーハングを含むものを用いて主鎖を増幅した。
【０３２５】
ＸｙｌＲリプレッサーの前にプロモーターｇｙｒＡをクローニングすることにより、キシロース誘導性システムを構築した（図１）。XylRリプレッサーは、ギブソン・アセンブリのためのオーバーハングを含むリバースプライマー、並びに、ｇｙｒＡプロモーター（Xie et al.2011）およびｐＢＡＶ１ＫＴ５主鎖にアセンブルするための対応するオーバーハングを導入するのに使用されるウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）であるフォワードプライマーで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＣＫ６ (Zhang et al. 2011)から増幅した。得られた断片を、ｐＣＬ００２から増幅されたｍＣｈｅｒｒｙ（未発表の研究）に、Ｐｌｄｈａ＋ＰｘｙｌＡハイブリッドプロモーターを含むウルトラマーで隣接させた（Xie et al.2013）。得られた３つのＰＣＲ産物は、製造元の説明書に従い、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（登録商標）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）中でアセンブルした。該産物を、最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。図１参照。
【０３２６】
１．６．  ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドの設計および構築
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは４つの異なるＣＲＩＳＰＲシステムを有し（Sapranauskas, et al. 2011）、本研究ではタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ１（ＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲ）システムを選択した。標的配列の設計は、ＬＭＤ−９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０００４１９．１）の入手可能なゲノム配列に基づいた。ＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲアレイは、キシロース誘導性プロモーター(Xie et al. 2013)の支配下に、ＣＲＩＳＰＲアレイリピートおよびスペーサーのみを含有し、その後ろに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐｅｃｉｅｓの強力な構成的プロモーター(Sorg et al. 2014)の支配下に対応するｔｒａｃｒＲＮＡを含有するように、設計した（図２、配列番号）。
【０３２７】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの成熟において役割を果たし、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ内因性ＲＮａｓｅＩＩＩによってプロセシングされ、ｃｒＲＮＡと複合体を形成する。本複合体は、エンドヌクレアーゼＳＴ１−Ｃａｓ９のためのガイドとして機能する(Horvath & Barrangou, 2010)。キシロース誘導性プロモーターからの合成アレイの転写後、内因性Ｃａｓ９およびＲＮＡｓｅはそれを機能的ｇＲＮＡにプロセシングするであろう。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、標的部分で、二重鎖切断を引き起こすであろう。
【０３２８】
該アレイの設計は、ＧＣ含有量が高い２つの特異的標的配列およびｔｒａｃｒＲＮＡの縮小された部分（すなわち、完全ではないｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を使用しており、該部分は、ｃｒＲＮＡの適切な成熟に必要ではないことが示唆されている(Horvath & Barrangou, 2010)。
【０３２９】
２つの標的は、必須遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットα）および抗生物質耐性遺伝子（ｔｅｔＡ様遺伝子）（配列番号）であった。
【０３３０】
プライマーを用いて、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＰｌｄｈＡ主鎖を増幅した。ＣＲＩＳＰＲアレイｇＢｌｏｃｋおよびオーバーハングを有する該主鎖を、製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の説明書に従い、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（登録商標）中でアセンブルした。該産物を、最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。
【０３３１】
１．７．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９におけるキシロース誘導性システムの特徴付け
一晩培養した定常期の培養液を、対応する抗生剤を含むＴＨｂｒｏｔｈに１：１００で希釈した。対数増殖期中期の細胞を、様々な濃度のＤ−（＋）−キシロース（０、０．００１、０．０１、０．１、０．５および１％ｗｔ／ｖｏｌ）で誘導して、細胞培養液を培地中で直接測定して、培地の自己蛍光の程度を、細胞懸濁液または懸濁バッファー（ＰＢＳバッファー）上で評価した。２０μｌの細胞培養液サンプルを、平底の９６ウェルプレート上のＰＢＳバッファーで１／１０に希釈した。細胞懸濁液または培地の蛍光を、プレートリーダーで読んだ。５５８ｎｍの励起波長および６１２ｎｍでの発光を用いてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定した。再懸濁した細胞の吸光度を、ＯＤ６００ｎｍで測定した。各実験について最低３回の独立した生物学的反復試験を行った。
【０３３２】
１．８．Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの活性化
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびをｔｅｔＡ標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含有するプラスミドおよびを共に有する、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９およびＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０を、プラスミド維持のための３０μg／ｍｌのカナマイシンを添加した３ｍｌの培養液中で一晩増殖させた。翌日、９６ウェルのディープウェルプレートに、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した新鮮なＴＨ培地中で一晩培養した培養液を１００倍希釈して、５００μｌ接種した。対数増殖期中期の細胞培養液を、１％キシロースで誘導した。死滅効果はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉ単独で試験した。試験した各株および条件について、ネガティブコントロールをキシロースなしで維持した。細胞をＯＤ約０．５まで増殖させ、次にＴＨ培地中で１０倍段階希釈し、９６ウェルレプリケーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｌｉｑｕｉｄａｔｏｒ（商標）９６）を使用して５μＬの体積の液滴を、ＴＨ寒天プレート上およびｇ／ｌのＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上にスポットした。プレートを、３７℃で２４時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。
【０３３３】
２．結果
２．１  増殖条件および選択培地
本発明者らは、最初に、共培養実験に使用することを計画した全ての菌株について増殖を支持するであろう細菌株および培養プロトコールを確立することに着手した。本発明者らは、３７℃のＴＨブロス中でＥ．ｃｏｌｉと同様の増殖を支持することができたＳ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＬＭＤ−９を使用した（図３）。
【０３３４】
混合培養液から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天培地を用いると、大腸菌を選択的に増殖させることが可能であるが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。ＰＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、本発明者らは、異なる濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。これにより、本研究で使用した他のグラム陽性菌の間の選択が可能になる（図４）。３ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９を選択的に増殖させることが証明された。３ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９を選択的に増殖させることが証明された。
【０３３５】
２．２．誘導システムの設計と検証
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種の誘導システムは、以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍキシロースオペロン（図５）に基づいて、異種のキシロース誘導カセット（Ｘｙｌ−Ｓ）を作成することによって開発されていた。ｘｙｌＲおよびｘｙｌＡプロモーターを、それぞれ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの恒常的に発現されるｇｙｒＡおよびｌｄｈプロモーターで置換した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種に対するこの発現カセットは、異なる種間で、感度および発現レベルに違いがあったが、該システムはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでは試験しなかった（Xie et al. 2013）。従って、発明者らは、最初に、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてキシロース誘導カセットを検証することに着手した。
【０３３６】
誘導カセットの代替バージョンを、ｘｙｌＲプロモーターをＳ．ｍｕｔａｎｓのｇｙｒＡプロモーターと置き換えるだけで、内因性Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのｘｙｌＡプロモーターをそのままにして構築した。キシロース誘導性システムの設計中に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに見いだされる天然型ＰＸｙｌＡプロモーターと、ＰＸｙｌＡプロモーターのリプレッサー結合部位と融合した高度に保存されたプロモーターＰｌｄｈａのハイブリッドプロモーターの、両方のバージョンの誘導性プロモーターを検討した（図５）。キシロースを代謝すると報告されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種はごくわずかであるため、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種におけるｘｙｌＡプロモーターを認識するための調節機構の存在はありそうもない。従って、我々は両方のキシロース誘導システムを構築したが、Ｐｌｄｈａ ＋ ＸｙｌＡシステムを用いたｍＣｈｅｒｒｙの誘導性のみを試験した。
【０３３７】
キシロースによるｍＣｈｅｒｒｙ誘導発現を決定するために、プラスミド（ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ）を有する細胞の対数増殖期中期の培養液を、異なる濃度のキシロースで誘導した。誘導の６時間後に、培養液中のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定し、プラスミドを保持している細胞において、全体的にかなり高い発現レベルが観察された（図６）。キシロースが添加されていない培養液においても、該システムが相当なレベルの基礎発現を示したことは注目に値する。これは、該システムが「リーキー（ｌｅａｋｙ）」であることを意味しており、死滅アレイ（ｋｉｌｌ−ａｒｒａｙ）の場合、該システムがキシロースで誘導される前であっても細胞死を招く可能性がある。しかしながら、本研究の後の過程において、我々はプラスミドバージョンの両方（ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰｘｙｌＡ）を用いた。
【０３３８】
２．３  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９アレイの設計
ＣＲＩＳＰＲアレイのゲノムを標的とするスペーサーがＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９の死を引き起こす可能性があるかどうかを決定するために、我々は既に構築した２つのキシロース誘導性システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰｘｙｌＡ）に、設計したＣＲＩＳＰＲアレイを挿入した。これらのプラスミドにおいて、ｍＣｈｅｒｒｙを、ＣＲＩＳＰＲアレイを含有するｇＢｌｏｃｋで置換した（図７）。Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡプロモーターを有する変異体は、ＰｘｙｌＡを有する変異体よりも強く、かつ、より高い基礎活性を有することが予想された（Xie et al.2013）。
【０３３９】
２．４．  内因性Ｃａｓ９を用いた細菌集団の増殖の阻害
Ｅ．ｃｏｌｉでプラスミドを構築した後、該プラスミドをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに形質転換した。これにより、特定の細菌種の細胞の死を引き起こす可能性があるかどうかを決定することができるであろう。興味深いことに、強いＰｌｄｈ＋ＸｙｌＡハイブリッドプロモーターを含有するプラスミドにさらされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの細菌宿主集団サイズ（寒天プレート上で細菌を増殖させて、コロニー数をカウントすることによって示される）は、弱い、正常なＰｘｙｌＡプロモーターを含有するプラスミドにさらされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと比較して１０倍小さかった（図８；強力なアレイ発現を有する５２個のコロニー対弱いアレイ発現を有する５５６個のコロニー、１０．７倍の差）。これら２つの株は、同じバッチのエレクトロコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞を用いて同時に形質転換された。これは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを保有するプラスミドが、内因性ＣａｓヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅＩＩＩを使用して細胞を死滅させることができ、それによって集団の増殖を１０倍阻害できることを示唆している。
【０３４０】
我々は、ＰｘｙｌＡプロモーターを含むプラスミドによって形質転換された宿主細胞における弱いアレイ発現が、強力なプロモータープラスミドを用いた場合よりはるかに少ないにもかかわらず、ある程度の細胞の死滅をもたらしたと予想する。我々は、強力なアレイ発現の活性が、いずれのアレイをコードするプラスミドにも曝露されていないＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（腸内微生物叢から直接分離された細菌など）と比較された場合、観察された１０倍阻害よりも大きい集団増殖阻害が決定されるであろうと我々は予想する。したがって、我々は、内因性Ｃａｓヌクレアーゼを利用するための宿主細胞におけるアレイ（またはシングルガイドＲＮＡ）発現は、本明細書に記載の環境的、医学的および他の状況において標的宿主細胞の効果的な増殖阻害を提供するために有用であろうと信じている。抗生物質の同時投与はまた、特に１つ以上の抗生物質耐性遺伝子を標的とする場合に、増殖阻害を増強するのに有用であろう。
【０３４１】
３．考察および展望
本研究において、内因性Ｃａｓ９システムを用いてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを特異的に死滅させるためのＣＲＩＳＰＲアレイの設計に着手した。死滅シグナルを制御するために、我々はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに適用することができる誘導システムを適用しようとした。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のキシロース誘導性ＸｙｌＲシステムは、既にＳ．ｍｕｔａｎｓにおいて適用されているが（Xie, 2013）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいては適用されていない。本研究では、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて、設計したＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）を用いてｘｙｌＲ誘導システムの機能性を検証した。我々は、０．１％ｗｔ／ｖｏｌが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてＸｙｌＲシステムを完全に誘導するのに十分であることを見出した（図６）。
【０３４２】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとＥ．ｃｏｌｉとを共培養する場合に存在量を観察するために、３ｇ／ｌのＰＥＡを培養培地に添加することにより、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながらＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを選択的に増殖させることを確立した（図４）。
【０３４３】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９ゲノムにおいてＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットおよびｔｅｔＡ様遺伝子を標的とするＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲアレイを、キシロース誘導性プロモーター（Xie et al. 2013）支配下に置いた。これらの領域を標的とすることは、二重鎖切断を引き起こし、それゆえにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生存率を制限するはずである（図９）。操作されたアレイは、コードされたＣＲＩＳＰＲアレイをプロセシングするための内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ装置を用いてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムを標的とするように設計されているので、該アレイは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの無関係な株の増殖に影響を及ぼさないと予想され、そのゲノム上に見出し得る同様の標的にさえ、影響を及ぼさないと予想される。実施例３で論じるように、このことは混合細菌集団（ヒト微生物叢の局面を模倣する）において試験することに成功した。
【０３４４】
表面上での宿主細胞増殖を阻害する能力の実証は、本発明がヒトまたは動物対象において本明細書中に開示される微生物叢によって媒介または引き起こされる疾病または症状を治療または予防することを目的とした実施形態において、重要かつ望ましい。これらの微生物叢は、典型的には対象の組織（例えば、腸組織）と接触しており、従って、表面上での微生物叢細菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにより例示される）の増殖を阻害する活性の実証が、この実用性を指示すると信じている。
【０３４５】
実施例２：異なる株における、特定の微生物叢細菌集団の増殖阻害
実施例１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＭＤ−９の特異的な増殖阻害を実証した。ここに、増殖阻害が、第二の株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  ２０６１７においても得られ得ることを実証する。実施例１に記載した方法を、それゆえ、後者の株に適用した（ただし、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  ２０６１７の選択培地は、２．５ｇ／ｌの２−フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であったことを除く）。
【０３４６】
ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドで形質転換したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７を、回復のために３７℃で３時間、液体培地中でインキュベートして、カナマイシン耐性の発現を可能にした。回復期間の後、細胞の死を誘導するために、細胞を１％キシロースの存在下で、およびコントロールとしてキシロースなしで、異なる選択培地中にプレーティングした（図１０）。（１）キシロース誘導によりＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの増殖を阻害することができ（「強い」プロモーターは、コントロールの約１０倍）、（２）「強い」システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ）は「弱い」システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡ）よりもより増殖低下をもたらすことが明らかである。
【０３４７】
実施例３：異なる微生物叢の種の混合共同体における、選択的細菌集団増殖阻害
次に、これらの種の混合集団における、特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証した。ヒトおよび動物の腸内微生物叢に見出される種を選択した（Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  ２０６１７（Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＥ  ｃｏｌｉ）。これがＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの種の選択的死滅の能力に影響を与えるかどうかを確かめるために２つのグラム陽性種（Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ  ｌａｃｔｉｓ）を含めた；さらに、複雑さを増すために（および、微生物叢の状況をより厳密に模倣するために）、Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに系統学的に関連する種（２つの種間の１６ｓリボソームＲＮＡの高い配列同一性によって示される）であるがゆえにＬ  ｌａｃｔｉｓを選択した。Ｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ  ｌａｃｔｉｓは共に、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）である。さらに、微生物叢を模倣するために、ヒト片利共生腸内種（Ｅ  ｃｏｌｉ）を含めた。
【０３４８】
１．材料および方法
実施例１で設定した方法を用いた（ただし、選択培地が、２．５ｇ／ｌの２−フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であることを除く）。
【０３４９】
１．１  エレクトロコンピテントＬ．ｌａｃｔｉｓ細胞の調製
０．５Ｍショ糖および１％グリシンを添加したＴＨ培地中のＬ．ｌａｃｔｉｓの一晩培養した培養液を、５ｍｌの同じ培地中で１００倍希釈し、０．２〜０．７の間のＯＤ６００まで３０℃で増殖させた（播種後約２時間）。
細胞を、７０００×ｇ、４℃、５分間で回収し、５ｍｌの氷冷洗浄バッファー（０．５Ｍショ糖＋１０％グリセロール）で３回洗浄した。細胞を洗浄後、エレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍショ糖、１０％グリセロールおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にＯＤ６００が１５〜３０になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は、使用するまで、４℃で保存されたか（１時間以内）、あるいは、エッペンドルフチューブに５０μｌずつ分注し、液体窒素中で凍結し、後で使用するために−８０℃で保管された。全ての種に対するエレクトロポレーションの条件は、実施例１に記載した通りであった。
【０３５０】
１．２  ＣＲＩＳＰＲアレイの活性化：共同体実験。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＳＭ  ２０６１７、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３およびＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびｔｅｔＡを標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含有するプラスミドで遺伝子形質転換した。形質転換の後、全ての細胞を単独で、および、共培養で、３７℃で３時間増殖させ、プラスミド中にコードされた抗生物質耐性を発現させるための回復を可能にした。ＣＲＩＳＰＲでコードされた増殖阻害の読み取りとして形質転換効率を使用することとした。それゆえ、細胞を回復させた後に、培養液をＴＨ培地にプレーティングした。ＴＨ培地にはＰＥＡを添加し、マッコンキー寒天培地には全てカナマイシンを添加し、１％キシロースで誘導した。
【０３５１】
２．結果
２．０  Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの間の系統発生的距離
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列における計算される配列類似性は８３．３％と決定された。以下の１６S配列を用いた：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＡＢ０３０９１８．１、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：ＡＹ１８８３５４．１、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ：ＡＢ０３０９１８。
配列はニードル（ｎｅｅｄｌｅ）(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)で、以下のパラメーターを用いてアライメントした：−ｇａｐｏｐｅｎ１０．０−ｇａｐｅｘｔｅｎｄ０．５−ｅｎｄｏｐｅｎ１０．０−ｅｎｄｅｘｔｅｎｄ０．５−ａｆｏｒｍａｔ３ｐａｉｒ−ｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１−ｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ２。図１１は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ由来の１６Ｓ配列の最尤系統樹を示している。
【０３５２】
２．１増殖条件および選択培地
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓは一般的に多くの発酵食品やヨーグルトに一緒に使用されている。これらは、宿主と密接な関係を形成する腸内微生物であることが一般的に知られていること、および、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓの１６ＳリボソームＲＮＡ領域の以前の特徴付けで、これらの生物が系統学的に密接に関連していることを示したこと（Ludwig et al。、1995）から、これらの株を選択した。同時に、Ｅ．ｃｏｌｉもまた、腸微生物群集においても一般的に見られるので、我々の混合集団共培養実験のためにＥ．ｃｏｌｉの増殖もまた評価した。最初に、我々が共培養実験に使用することを計画した全ての菌株の増殖を支持するであろう、細菌株および培養プロトコールを確立することに着手した。我々は、全ての株が３７℃でのＴＨブロス中での増殖を支持することができることを見出した（図３）。
【０３５３】
混合培養液から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天培地を用いると、大腸菌を選択的に増殖させることが可能であるが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。ＰＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、異なる濃度のＰＥＡが異なるグラム陽性菌および株の増殖を部分的に阻害し、これにより、本研究で使用した他のグラム陽性細菌の間の選択が可能になる。２．５ｇ／ｌのＰＥＡの使用は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを選択的に増殖させることが証明された。
【０３５４】
全ての株を、カナマイシン選択マーカーを有するｐＢＡＶ１ＫＴ５のベクター主鎖を用いたプラスミドで形質転換した；我々は、プラスミドを維持しながら細胞を増殖させるのに、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した培地を用いることは十分であることを見出した。
【０３５５】
２．３  混合集団における形質転換および選択的増殖阻害
我々は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、およびＥ．ｃｏｌｉを、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドで形質転換し、それら全ての細菌種を等分に組み合わせた共同体で培養した。これにより、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて細胞の死を特異的に引き起こす可能性があるかどうかを判断できるであろう。全ての種を、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰＸｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかで形質転換した。
【０３５６】
図１２は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかを有するＥ．ｃｏｌｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの共培養物におけるＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ（中央の列）の間で増殖の違いは観察されない。しかしながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（２．５μｌ／１ＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上で選択的に増殖させた、最後の列）は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡ（強い）またはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ（弱い）プラスミドの間で、予想通り形質転換効率の低下を示す。従って、細胞の混合集団における標的とするＳ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ亜集団の選択的増殖阻害を実証した。
【０３５７】
参考文献
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【０３５８】
実施例４：混合腸内微生物叢集団におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅの比率の変更
細菌の比率の変更は、混合腸内微生物叢サンプル中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ細菌のノックダウンを参照して記載されている本実施例に従って行われるであろう。該サンプルは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびメトロニダゾール（ＭＴＺ）耐性Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ株６３０亜集団を含有するであろう。エクスビボで、該混合集団を、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むように操作されているキャリア細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ − １４および／またはＬａ − ５）の集団と組み合わせる。
【０３５９】
各ＣＲＩＳＰＲアレイは、キャリア細菌およびＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞と互換性のあるプラスミドに含まれている。該アレイは、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列、ｔｅｔＱ−ｒｔｅＡ−ｒｔｅＢオペロン、ｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ−ｘｉｓ２ｄ−ｏｒｆ３−ｅｘｃもまた含むＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ  ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンに含まれる。ある実験では、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンは除かれる（その代わりに、トランスポゾンがキャリア細菌と組み合わされた混合物中で移送されるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの細胞によって供給されるオペロンに依存する）。別の実験では、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンがトランスポゾンに含まれている。
【０３６０】
細胞質膜を横切るタンパク質移行は、全ての細菌において必須の過程である。その中核にＡＴＰａｓｅであるＳｅｃＡ、および膜チャネルであるＳｅｃＹＥＧを含むＳｅｃシステムは、このタンパク質輸送の大部分を担っています。第２の並行するＳｅｃシステムが、多くのグラム陽性種において記載されている。この付属の（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）Ｓｅｃシステムは、活性化ＡＴＰａｓｅの第２のコピー、ＳｅｃＡ２の存在を特徴としており、研究されているところでは、ＳｅｃＡ２はＳｅｃ基質のサブセットの移行を担っている。多くの病原性のグラム陽性種と共通して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは２コピーのＳｅｃＡを持っている。表層タンパク質（ＳＬＰ）およびさらには細胞壁タンパク質（ＣｗｐＶ）の排出はＳｅｃＡ２に依存している。ＳＬＰの細胞質前駆体ＳｌｐＡおよび他の細胞壁タンパク質の蓄積は、細胞壁における成熟ＳＬＰのレベルの減少と同時に、ドミナントネガティブなｓｅｃＡ１またはｓｅｃＡ２対立遺伝子を発現する細胞において観察される。さらに、ＳｅｃＡ１またはＳｅｃＡ２のドミナントネガティブ対立遺伝子またはアンチセンスＲＮＡのいずれかのノックダウンの発現は、増殖を劇的に損ない、このことは両方のＳｅｃシステムがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに必須であることを示している。
【０３６１】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０（流行型Ｘ）は、４，２９０，２５２ｂｐ（Ｇ＋Ｃ含有量＝２９．０６％）の単一環状染色体および７，８８１ｂｐ（Ｇ＋Ｃ含有量＝２７．９％）の環状プラスミドを有する。全ゲノムの配列決定がなされ、ゲノムの１１％が接合性トランスポゾンなどの可動遺伝因子からなることが見出された。これらのエレメントは、その抗微生物剤耐性、病原性、宿主相互作用および表面構造の生産に関与する遺伝子をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに提供する。例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｃｄｅＡ遺伝子は多剤排出ポンプを生産し、これは多剤および毒性化合物排出（ＭＡＴＥ）ファミリーの既知の排出トランスポーターと相同であることが示された。このタンパク質は、細胞からの薬物のエネルギー依存性およびナトリウム結合型排出を促進する。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｃｍｅ遺伝子は、他の細菌において多剤耐性を与えることが示されている。
【０３６２】
該アレイは、Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞の必須遺伝子（ＳｅｃＡ２）において、ある配列を標的とするための、Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’ＣＲＩＳＰＲユニット（２つのＣＲＩＳＰＲリピートが隣接するスペーサー）を含む。別の実験では、標的化は、ＭＴＺおよび場合によっては１つ以上の他の抗Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ抗生物質の存在下での、ｃｄｅＡ遺伝子に対するものである。各スペーサー（Ｓ）は、ＳｅｃＡまたはｃｄＡ遺伝子の２０ｍｅｒのヌクレオチド配列を含み、ここで、該配列は、リピート配列にコグネイトなＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ株６３０ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＰＡＭを含む。各リピートは、Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ株５３０リピートに同一である。
【０３６３】
該リピートは、混合集団におけるＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞に内因性であるＣａｓと共に機能する。細菌の混合集団は、Ｃ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しているヒト患者の便サンプルから、エクスビボサンプルとして回収される。混合集団をインビトロでキャリア細菌と混合し、テトラサイクリンの存在下で腸の条件を模倣するために、好気的条件下で、３７℃でインキュベートする。ＣＲＩＳＰＲアレイを含有するトランスポゾンは、混合物中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞に移行すると予想される。さらに、さらに、後者の細胞中の標的部位はＣａｓヌクレアーゼ作用によって切断され、それによって混合集団中のＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅの割合を低減させる（そしてＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅに対するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの割合が増加する）と予想される。
【０３６４】
その後の実験では、キャリア細菌を含む飲料が生産され、これは、制酸剤の有無にかかわらず、数日間連続して１〜２回ヒト患者によって消費される。該患者にはまた、処置の期間にテトラサイクリンが投与される。便解析により、便サンプル中のＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅの割合が低減する（そしてＣ  ｄｉｆｉｃｉｌｅに対するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの比率が増加する）ことが明らかになるだろうと予想される。
【０３６５】
実施例５：ベクターにコードされた、混合細菌共同体における種および株の選択的増殖阻害のためのシステム
実施例３において、驚くべきことに、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻害のために宿主細菌における内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を利用する可能性を確立した。次に、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻害のために、代わりにベクターにコードされたＣａｓ活性を使用する可能性を探った。３つの異なる種の混合集団における特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証し、そしてさらに標的細菌とは別の株を含んだ選択的増殖阻害を実証した。驚くべきことに、所定の標的種のうちの標的株のみの選択的増殖阻害を示すことができた。さらに、該別の株は、ベクターにコードされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって標的とされず、ヒトまたは動物の腸内微生物叢エレメントを模倣した混合細菌共同体におけるこれらのベクター媒介性システムの細かな特異性を確立するのに望ましかった。
【０３６６】
ヒトおよび動物の腸内微生物叢で見出された種を選択した（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＥ  ｃｏｌｉ）。ヒト片利共生腸内種であるＥ．ｃｏｌｉの２つの株を含んだ。密接に関連した株ではあるが、一方の株では標的死滅に使用できるが、もう一方の株では標的死滅に使用できない配列の違いを有する株を、区別できるかどうかを確認することは興味深いと考えた。これは、微生物叢中のＥ  ｃｏｌｉのいくつかの株が望ましく、一方で他の株は望ましくなく（例えば、ヒトまたは動物に対して病原性である）、したがって、その株をノックダウンするＣａｓ改変の標的となり得るため、興味深かった。
【０３６７】
１．材料および方法
１．１．プラスミドおよび株
表７および表８を参照されたい。全ての株は、他に示されない限り、好気的条件下でＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ  ｂｒｏｔｈ（ＴＨ）（Ｔ１４３８  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において、３７℃で培養した。株は、−８０℃で、２５％グリセロールで保管した。
【０３６８】
自己標的化ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体は、テオフィリンリボスイッチおよびＡｒａＣ／ＰＢＡＤ発現システムによってそれぞれ厳密に調節された。Ｅ．ｃｏｌｉ内で安定に運ばれるためには、Ｃａｓ９の厳密な調節が望ましい。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉのＫ−１２株を標的とするシングルガイドＤＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の外因性のＣａｓ９を含んでいた。したがって、Ｋ−１２由来株ＴＯＰ１０は、システムが活性化されたときに二本鎖自己切断およびその結果としての死を受けやすかった。ＮｉｓｓｌｅなどのＥ．ｃｏｌｉ株は同じ標的配列を持っていないため、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９活性の影響を受けなかった。実施例９において用いた配列を示す、以下の表９〜１１を参照されたい。標的細胞に保存され、複数のコピー（７コピー）で存在する標的配列（リボソームＲＮＡをコードする配列）を選択した。これにより、宿主細胞ゲノムを複数の場所で切断する確率が増加し、シングルｇＲＮＡデザインを用いた死滅を促進した。
【０３６９】
図１３は、ｓｐＣａｓ９の発現およびリボソームＲＮＡサブユニット１６ｓを標的とする自己標的化ｓｇＲＮＡを制御する調節因子を示す。
【０３７０】
１．２．  分化増殖培地
全ての株は、３７度で２０時間、ＴＨ培地上で増殖させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのための選択培地は、２．５ｇ／ｌの２−フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であった。ＰＥＡを培地に添加し、１５ｐｓｉで、１５分間１２１℃、オートクレーブ処理した。寒天プレートは、対応する培地に１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天を添加することにより調製した。
【０３７１】
１．３．  クローニング
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント細胞）をすべてのサブクローニング手順に使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。製造元のプロトコールに従って、全てのＰＣＲ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（商標）のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐにより精製した。精製した断片を、総量３４μｌ中に１μｌの酵素を含む１×ＦＤ緩衝液において、制限酵素ＤｐｎＩで分解した。製造元のプロトコールに従って、分解反応物を再び、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐで精製した。製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）のプロトコールに従って、１０μｌの反応液中で、ギブソン・アセンブリを行った。製造元の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために０．５％グリシンおよびリゾチームを添加した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
【０３７２】
１．４．  形質転換
１．４．１  エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ）を、クローニングおよび実験に用いた。エレクトロポレーションは、標準設定を用いて行った: Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＥＣＭ６３０）を用いて１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで行った。パルスの後、１ｍｌのＬＢ−ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞を、対応する抗生物質を含有する、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。
【０３７３】
１．５．  Ｅ．ｃｏｌｉおよび共同体実験における、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９の活性化
Ｋ−１２由来株および他の細菌のリボソームＲＮＡコードする配列を標的とするｓｇＲＮＡを含むプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０およびＮｉｓｓｌｅをいずれも、３ｍｌのＴＨ  ｂｒｏｔｈ中で一晩増殖させた。翌日、細胞をＯＤ約０．５まで希釈し、次にＴＨ培地中で１０倍段階希釈し、９６ウェルレプリケーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｌｉｑｕｉｄａｔｏｒ（商標）９６）を使用して４μＬの体積の液滴を、ＴＨ寒天プレート上、誘導因子（１％アラビノースおよび２ｍＭテオフィリン）を添加したＴＨ寒天プレート上、２．５ｇ／ｌのＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上、および１％マルトースを添加したマッコンキー寒天培地上にスポットした。プレートを、３７℃で２４時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。プレートを２７℃で２０時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。
【０３７４】
２．結果
２．１  外因性のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いたＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的化
最初に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０とＮｉｓｓｌｅの両方に死滅システムを導入することにより、該システムが２つのＥ．ｃｏｌｉ株を区別できるかどうかを最初に試験した。
【０３７５】
２．１  混合培養液における外因性のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いたＥ．ｃｏｌｉの標的化
一晩培養した培養液の段階希釈を、両方のE．ｃｏｌｉ株、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓについて２回、そして混合培養液について３回行った。全ての株を、誘導因子の有無で、選択プレートにおいて、３７℃で２０時間増殖させた。該システムの誘導は、他の細菌は無傷のまま、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９のＫ−１２由来株の標的化を活性化する。
【０３７６】
混合培養液から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定しそして種の特異的除去を決定するために重要である。マッコンキー寒天培地はＥ．ｃｏｌｉを選択的に増殖させ、ＰＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、本発明者らは、異なる濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。２．５ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ラクティスの増殖を制限しながら、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを選択的に増殖させることがわかった。
【０３７７】
図１４は、誘導性の、外因性の、ベクター媒介性のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムによるＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的化を示す。ｓｇＲＮＡはＫ−１２由来のＥ．ｃｏｌｉ株、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０のゲノムを標的とし、一方試験した他のＥ．ｃｏｌｉ株は影響を受けなかった。
【０３７８】
図１５は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの誘導なしのＴＨ寒天培地中の本研究で用いた個々の細菌種および混合培養液の段階希釈によるスポットアッセイを示す。
【０３７９】
図１６、異なる選択培地上の１０００倍希釈のスポットアッセイを示す。２．５ｇ／ｌのＰＥＡを有するＴＨは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ単独のための選択的培地である。マルトースを添加したマッコンキーは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的かつ差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）培養培地である。従って、ＴＯＰ１０ΔｍａｌＫ変異体は、プレート上に白いコロニーを形成し、一方Ｎｉｓｓｌｅは、ピンクのコロニーを形成する；ＡはＥ  ｃｏｌｉ  ΔｍａｌＫ、ＢはＥ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｉｌｅ、ＣはＢ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＤはＬ  ｌａｃｔｉｓ、Ｅは混合培養液である；マッコンキー−のＢとＥの画像はピンクに見える；マッコンキー＋のＢとＥの画像はピンクに見える。図１７は、本研究で使用した細菌の異なる培地および選択プレート上での選択的増殖を示す。明らかに、混合集団において標的Ｅ  ｃｏｌｉ株（図１７のｘ軸上の「Ｅ  ｃｏｌｉ」）を選択的に死滅させたが、他の関連株（「Ｅ  ｃｏｌｉ−Ｎｉｓｓｌｅ」）は同じようには死滅しないことがわかった。混合集団における標的株の死滅は、本実験において１０００倍であった。
【０３８０】
参考文献
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【表１−１】
2019517529.tif 000002
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【表１−２】
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【０３８３】
【表１−３】
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【０３８４】
【表１−４】
2019517529.tif 000005
【０３８５】
【表１−５】
2019517529.tif 000006
【０３８６】
【表１−６】
2019517529.tif 000007
【０３８７】
【表１−７】
2019517529.tif 000008
【０３８８】
【表１−８】
2019517529.tif 000009
【０３８９】
【表１−９】
2019517529.tif 000010
【０３９０】
【表１−１０】
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【０３９１】
【表１−１１】
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【０３９２】
【表１−１２】
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【０３９３】
【表１−１３】
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【０３９４】
【表１−１４】
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【０３９５】
【表１−１５】
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【０３９６】
【表１−１６】
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【０３９７】
【表１−１７】
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【０３９８】
【表１−１８】
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【０３９９】
【表１−１９】
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【０４００】
【表１−２０】
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【０４０１】
【表１−２１】
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【０４０２】
【表１−２２】
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【０４０３】
【表１−２３】
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【０４０４】
【表２−１】
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【０４０５】
【表２−２】
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【０４０６】
【表２−３】
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【０４０７】
【表２−４】
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【０４０８】
【表２−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019517529.tif 000041
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月1日(2019.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の腸内微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病または症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防され、該方法が、微生物叢の第１の細菌種または株の細胞の選択的標的化を含み、選択的標的化が、該細胞のゲノムを標的化し、同時に、関連する種および株、並びにヒトの腸内微生物叢に共存する種を温存させる誘導型ヌクレアーゼを用いて達成される、誘導型ヌクレアーゼシステム。
【請求項２】
第１の細胞が異なる株または種の細胞の存在下にあり、該異なる細胞がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、または、ヒトの腸内でヒトとプロバイオティック、片利共生、もしくは相利共生の細菌である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
微生物叢が第２の細菌種または株の細胞を含み、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
前記第１の細胞の増殖が、第２の細胞の少なくとも１０倍の増殖阻害で阻害される、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
第２の株が、ヒト腸内片利共生株および／またはヒト腸内プロバイオティック株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
患者の養子細胞療法のための免疫細胞のエクスビボ集団を含むキットであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシステムをさらに含むキット。
【請求項８】
患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種または株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
【請求項９】
該方法が、第１の細胞の１つ以上の標的ゲノムのまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、切断および／または変異）することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１０】
第１の細胞が宿主細胞の集団を含み、該方法が宿主細胞において標的配列を改変することを含み、標的配列の改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ−システムはｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、または、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１１】
調節された免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１３】
システムが、操作されたＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはジンクフィンガーシステムである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１４】
免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＨ１細胞またはＴＨ１７細胞からなる群から選択され、該方法が、患者において該タイプの細胞をアップレギュレートする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１５】
免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＨ１細胞またはＴＨ１７細胞からなる群から選択され、該方法が、患者において該タイプの細胞をダウンレギュレートする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１６】
該方法が、
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強すること、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ−ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；または
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させること、
を目的とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１７】
疾病または症状が、がん、自己免疫性の疾病または症状、炎症性の疾病または症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、アレルギー性の疾病または症状、または、ウイルス感染症により媒介されるか、または、引き起こされる疾病または症状である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項１８】
請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法を実行するための該請求項に記載のシステムにおいて用いるための、誘導型ヌクレアーゼ；または、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ−アレイもしくはＨＭ−ｃｒＲＮＡ；または、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法を実行するために前記方法のＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いるための、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡもしくはＨＭ−ｃｒＲＮＡ；または、該システム、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、第１の細胞に感染することができるか、または第１の細胞を形質転換することができる、ベクター、例えば、バクテリオファージ、接合性プラスミドもしくはトランスポゾン；または、該システム、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、医薬；ここで、場合により、ｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡである。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載される方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者に投与するための組成物であって、
免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの抗体であって、場合により、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）、ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体；または、
ワクチン；または、
養子細胞療法のための免疫細胞（場合により、ＣＡＲ−ＴまたはＴＩＬ細胞）のエクスビボ集団
、を含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８０】
参考文献
１．Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology, 4(1), 98−105. http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x
２．Wegmann, U., O’Connell-Motherway, M., Zomer, A., Buist, G., Shearman, C., Canchaya, C., … Kok, J. (2007). Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Journal of Bacteriology, 189(8), 3256−70. http://doi.org/10.1128/JB.01768-06
本発明はまた、以下に関する。
１．  患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病または症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌクレアーゼシステム。
２．  該方法が、該微生物叢中の第１の種の細胞のゲノムを誘導型ヌクレアーゼを用いて選択的に標的化して該変更をもたらすことを含む、前記１に記載のシステム。
３．  該選択的標的化が、（ｉ）前記第１の種と同じ門の種、または（ｉｉ）前記第１の種の異なる株を標的とすることを回避する、前記２に記載のシステム。
４．  該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ｉ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｉｉ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されないか、または、前記第１の細胞の増殖が、第２の細胞の少なくとも５倍の増殖阻害で阻害される、前記１〜３のいずれかに記載のシステム。
５．  （ａ）患者がヒト患者であり；
（ｂ）微生物叢が腸内微生物叢であり；
（ｃ）該方法が、誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢において第１の種のゲノムを選択的に標的化して該変更をもたらすことを含み；および
（ｄ）該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する、
前記１〜３のいずれかに記載のシステム。
６．  患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌または抗古細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
７．  第１の細胞が、細菌または古細菌の細胞であり、例えばファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、前記２〜６のいずれかに記載のシステムまたは集団。
８．  該方法が、第１の種の細胞の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、切断および／または変異）することを含む、前記２〜７のいずれかに記載のシステムまたは集団。
９．  第１の細胞が宿主細胞の集団を含み、該方法が宿主細胞において標的配列を改変することを含み、標的配列の改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ−ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ−システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、前記２〜８のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１０．  調節された免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞を含む、前記１〜５および７〜９のいずれかに記載のシステム。
１１．  ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、前記１〜１０のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１２．  システムが、操作されたＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはジンクフィンガーシステムである、前記１〜１１のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１３．  該方法が、患者において、（ｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団をアップレギュレートするか、または、（ｉｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団をダウンレギュレートする、前記１〜１２のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１４．  該方法が、患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
（ａ）患者において治療を実行すること；および
（ｂ）誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢の前記変更を実行することにより、患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオシスが、患者において免疫細胞の前記調節をおこなうことにより、患者において治療を調節すること、
を含む、前記１〜１３のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１５．  該方法が、
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強すること、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること、場合により、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、サイトカイン放出症候群）を弱めるために調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ−ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；または
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させること、
を目的とする、前記１〜１４のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１６．  疾病または症状が、がん、自己免疫性の疾病または症状、炎症性の疾病または症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、アレルギー性の疾病または症状、または、ウイルス感染症により媒介されるか、または、引き起こされる疾病または症状である、前記１〜１５のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１７．  第１の細胞集団の増殖が、少なくとも５倍低下する、前記２〜１６のいずれかに記載のシステムまたは集団。
１８．  微生物叢が、患者の腸内微生物叢である、前記２〜５および７〜１０のいずれかに記載のシステム。
１９．  該方法を実行して微生物叢を変更し、それにより患者においてパネート細胞を刺激し、それにより免疫細胞が調節され、疾病または症状が処置または低減されることを目的とする、前記１〜１８のいずれかに記載のシステムまたは集団。
２０．  前記1〜１９のいずれかに記載の方法を実行するための該前記に記載のシステムにおいて用いるための、誘導型ヌクレアーゼ；または、前記１〜１９のいずれかに記載の方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、ＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ−アレイもしくはＨＭ−ｃｒＲＮＡ；または、前記１〜１９のいずれかに記載の方法を実行するために前記前記のＨＭ−ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いるための、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡもしくはＨＭ−ｃｒＲＮＡ；または、該システム、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、第１の細胞に感染することができるか、または第１の細胞を形質転換することができる、ベクター、例えば、バクテリオファージ、接合性プラスミドもしくはトランスポゾン；または、該システム、ＨＭ−アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、医薬；ここで、場合により、ｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡである。
２１．  患者において疾病または症状を処置または軽減する方法であって、前記１〜１９のいずれかに記載される、方法。
【国際調査報告】
2019517529.tif 000047
2019517529.tif 000048
2019517529.tif 000049
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