(57)【要約】  タンパク質凝集体のホログラフィ特徴付けのためのシステム及び方法が開示されている。溶液中の個々の凝集体のサイズ及び屈折率を決定することができる。ホログラフィデータから形態及び多孔性に関する情報を抽出することができる。【選択図】      図２
2019513973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のタンパク質凝集体のサンプルを特徴付ける方法であって、
前記サンプルをホログラフィ顕微鏡の観察分量を通して流す工程と、
前記観察分量内の第１のセットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて、第１の時間に第１のセットのホログラムを生成する工程と、
前記第１のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各々を球体として特徴付ける工程と、
前記第１のセットのタンパク質凝集体の特徴付けられた球体に関する屈折率及び半径を決定する工程と、を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記観察分量内の第２のセットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて、第２の時間に第２のセットのホログラムを生成する工程と、
前記第２のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各々を球体として特徴付ける工程と、
前記第２のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各々に関する屈折率及び半径を決定する工程と、をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のセットのタンパク質凝集体及び前記第２のセットのタンパク質凝集体の各々の特徴付け工程は、前記第１のセットのタンパク質凝集体及び前記第２のセットのタンパク質凝集体の各々を、フラクタクル次元Ｄのフラクタルクラスタとしてモデル化する工程をさらに備え、
【数１】
2019513973.tif 000008
であり、式中φはタンパク質の分量分率であり、ａ0はタンパク質の半径であり、ａpは前記タンパク質凝集体の半径である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらにタンパク質の前記分量分率は反射率がｎ0であり、残りの分量は、屈折率がｎmの流体媒体であり前記タンパク質凝集体の見かけの屈折率ｎpをもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のセットのタンパク質凝集体及び前記第２のセットのタンパク質凝集体の形態を、アンサンブル平均のフラクタル次元を推定する工程に基づいて特徴付ける工程をさらに備える、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アンサンブル平均のフラクタル次元を推定する工程は、
【数２】
2019513973.tif 000009
を備え、式中
【数３】
2019513973.tif 000010
であり、
【数４】
2019513973.tif 000011
である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の粒子の屈折率及び半径と前記第２の粒子の屈折率及び半径との比較に基づいて複数の粒子の合成を監視する工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルを流す工程は、１００μｍｓ-1までの速度であることをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のセットのホログラムを生成する前に、塩を添加する工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記屈折率及び前記半径を決定する工程は、ローレンツ・ミー理論の適用を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の粒子の合成が完了したかどうかを判定する工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の前記屈折率及び前記半径を決定する工程、並びに前記第２のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の前記屈折率及び前記半径を決定する工程は、それぞれ前記第１のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の屈折率及び半径の確率密度を決定する工程、並びに前記第２のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の屈折率及び半径の確率密度を決定する工程を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のセットのタンパク質凝集体及び前記第２のセットのタンパク質凝集体の両方に少なくとも１つのタンパク質凝集体が存在し、さらに、前記少なくとも一方のタンパク質凝集体の軌道が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複数のタンパク質凝集体を特徴付ける方法であって、
前記複数のタンパク質凝集体のタンパク質凝集体のホログラムを生成し、各ホログラムは、前記複数のタンパク質凝集体のタンパク質凝集体ＰNのホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて時間ＴNに生成される工程と、
前記タンパク質凝集体を球体として特徴付ける工程と、
前記タンパク質凝集体ＰNの前記屈折率及び前記半径を時間ＴNに決定する工程と、
前記複数のタンパク質凝集体の経時的な変化を、前記粒子の前記決定された屈折率及び半径に基づいて特徴付ける工程と、を備えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記複数のタンパク質凝集体の凝集を、前記決定された屈折率間及び半径間の比較に基づき監視する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記屈折率及び前記半径を決定する工程は、ローレンツ・ミー理論の適用を備える、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のタンパク質凝集体を、ホログラフィビデオ顕微鏡検査システムを通して流す工程をさらに備える、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記モデル化する工程は、前記第１のセットのタンパク質凝集体及び前記第２のセットのタンパク質凝集体の各々を、フラクタル次元Ｄのフラクタルクラスタとしてモデル化する工程をさらに含み、
【数５】
2019513973.tif 000012
であり、式中φはタンパク質の分量分率であり、ａ0はタンパク質の半径であり、ａpは前記タンパク質凝集体の半径である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
さらに前記タンパク質の分量分率は屈折率がｎ0であり、残りの分量は屈折率がｎmの流体媒質であり前記タンパク質凝集体の見かけの屈折率ｎpをもたらし、方法は、前記第１のセットのタンパク質凝集体及び前記第２のセットのタンパク質凝集体の形態を、アンサンブル平均のフラクタル次元を推定する工程に基づいて特徴付ける工程をさらに備える、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アンサンブル平均のフラクタル次元を推定する工程は、
【数６】
2019513973.tif 000013
を備え、
【数７】
2019513973.tif 000014
であり、ローレンツ・ローレンツ因子は
【数８】
2019513973.tif 000015
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
複数のタンパク質凝集体を特徴付けるためのコンピュータ実行機械であって、
プロセッサと、
コヒーレント光と、観察分量を有する検査サンプル台と、対物レンズと、画像収集装置とを含み、前記プロセッサと通信するホログラフィ顕微鏡と、
前記プロセッサに動作可能に接続されかつコンピュータコードを有する有形のコンピュータ可読媒体と、を備え、前記コンピュータコードは、
前記ホログラフィ顕微鏡の観察分量を通るサンプルの流れを制御し、
前記観察分量内の第１のセットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて第１の時間に第１のセットのホログラムを受け取り、
前記第１のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各々を球体としてモデル化し、
前記第１のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各球体に関する前記屈折率及び前記半径を決定し、
前記観察分量内の第２のセットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて第２の時間に第２のセットのホログラムを受け取り、
前記第２のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各々を球体としてモデル化し、
前記第２のセットのタンパク質凝集体の前記タンパク質凝集体の各球体に関する前記屈折率及び前記半径を決定する、ように構成されていることを特徴とするコンピュータ実行機械。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]  タンパク質及びタンパク質凝集体は、商業的用途にとってますます重要になっている。タンパク質凝集体の特徴付けは、特に大規模な実施についてかつリアルタイム又はほぼリアルタイムの特徴付けに関して課題を提供する。タンパク質がクラスターに凝集する傾向は、タンパク質ベースの生物医薬品を製造し、それらの安全性を評価する際の大きな懸念事項である。治療有効性を低下させることに加えて、タンパク質凝集物は免疫応答を引き出し、免疫は臨床的な有害事象をもたらし、羅患者の健康を危うくする可能性がある。タンパク質凝集体に関与する決定経路を理解するためには、タンパク質凝集体を検出し、計数し及び特徴付けることが不可欠である。動的光散乱のような確立された粒子特性評価技術は、そのままでサブミクロン規模の凝集体の特性評価に適している。マイクロフロー画像化のようなそれ以外のものは、５マイクロメートル程度以上の肉眼で見える凝集体に適している。確立された技術により、１００ｎｍから１０μｍまでの肉眼で見えない範囲が証明されることは比較的少ない。肉眼で見えない凝集体をそれらの自然環境でリアルタイムに監視することを必要とする用途では、画質が高まった特徴付け技術の必要性が特に緊急である。
【０００２】
[0002]  タンパク質がクラスター化する傾向、及びそのように検出し及び特徴付ける能力は、重要な考慮事項である。タンパク質を正確かつ素早く特徴付けるためのシステム及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]  １つの実施形態は、複数のタンパク質凝集体のサンプルを特徴付ける方法に関する。方法は、サンプルをホログラフィ顕微鏡の観察分量に流す工程を含む。観察分量内の第１のセットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて、第１の時間に第１のセットのホログラムが生成される。第１のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体は、球体としてモデル化される。第１のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体に関する屈折率及び半径が決定される。観察分量内の第２セットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて、第２の時間に第２のセットのホログラムが生成される。第２のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体は、球体としてモデル化される。第２のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体に関する屈折率及び半径が決定される。
【０００４】
[0004]  別の実施形態は、複数のタンパク質凝集体を特徴付ける方法に関する。複数のタンパク質凝集体のタンパク質凝集体のホログラムが生成され、各ホログラムは、複数のタンパク質凝集体のタンパク質凝集体ＰNのホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて時間ＴNに生成される。タンパク質凝集体ＰNに関する屈折率及び半径が時間ＴNに決定される。時間経過に伴う複数のタンパク質凝集体の変化は、粒子の決定された屈折率及び半径に基づいて特徴付けられる。
【０００５】
[0005]  別の実施形態は、複数のタンパク質凝集体を特徴付けるためのコンピュータ実行機械に関し、プロセッサと、コヒーレント光、観察分量を有するサンプル台、対物レンズ及び画像収集装置を含むホログラフィ顕微鏡とを備える。ホログラフィ顕微鏡は、プロセッサと通信している。システムは、プロセッサに動作可能に接続されかつコンピュータコードを含む有形のコンピュータ可読媒体をさらに備える。コンピュータコードは、ホログラフィ顕微鏡の観察分量を通るサンプルの流れを制御し、観察分量内のタンパク質凝集体の第１のセットのホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて第１の時間に第１のセットのホログラムを受け取り、第１のタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体を球体としてモデル化し、第１のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体に関する屈折率及び半径を決定し、観察分量内第２のセットのタンパク質凝集体のホログラフィビデオ顕微鏡検査に基づいて第２の時間に第２のセットのホログラムを受け取り、第２のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体を球体としてモデル化し、第２のセットのタンパク質凝集体の各タンパク質凝集体に関する屈折率及び半径を決定するように構成されている。
【０００６】
[0006]  上記概要は例示的なものに過ぎず、決して限定することを意図しない。  上述した例示的な態様、実施形態及び特徴に加えて、以下の図面及び詳細な説明を参照することによってさらなる態様、実施形態及び特徴が明らかになる。
【０００７】
[0007]  本開示の上記特徴及びその他の特徴は、添付の図面と併せて以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになる。これらの図面は、本開示に従ったいくつかの実施形態のみを描き、従ってその範囲を限定するとみなすべきではないことを理解して、開示は、添付図面を用いて具体的にかつ詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】直径が１マイクロメートルであるＢＳＡ凝集体の測定されたホログラフィを示す。
【図１Ｂ】ローレンツ・ミー理論に基づく光散乱の適合を示す。
【図２】マイクロ流体チャネルを流れ落ちるタンパク質凝集体は、それらがレーザー光を通過する際にホログラムを形成することを示す。一般的な実験用ホログラムは、図中にグレースケール画像として再現されている。各ホログラムは、ビデオカメラで記録され、ローレンツ・ミー理論の予測と比較されて、各凝集体の半径ａp及び屈折率ｎpを測定する。はめ込み散布図は、ウシインスリンの肉眼で見えない３０００個の凝集物に関する実験データを示し、各データ点は、単一凝集物の特性を表し、色は、（ａp、ｎp）平面における観察に関する相対確立密度ρ（ｎp）を表す。
【図３Ａ】半径ａp及び屈折率ｎpの散布図を示し、それらは、４つの異なるタイプの粒子の混合物からなる、不均質なコロイド分散のホログラフィ特徴付けを用いて得られたものである。２０，０００粒子の結果がプロットされている。重ね合せた十字は、４つの母集団の各々に関する製造業者の仕様を示している。これらの結果により、粒子を組成及びサイズによって区別するホログラフィ特徴付け能力が形成される。
【図３Ｂ】水中で適合と一緒に測定されたコロイド状ポリスチレン球のホログラムを示し、ホログラフィ特徴付けに従って修正可能な粒径の範囲を例示している。これらの一般的な実施例は、半径ａp＝０．２３７ｍｍ（２２４ピクセル×２２４ピクセルの関心領域）、０．８００ｍｍ（３５６ピクセル×３５６ピクセル）、及び１０．４７ｍｍ（６０８ピクセル×６０８ピクセル）の球体で得られた。各ホログラムへの適合により、粒子の半径ａp及び屈折率ｎpのための値が生み出される。半径方向輪郭ｂ（ｒ）は、これらのホログラム及びそれらの適合から、各特徴の中心の周りの角度にわたって正規化された強度を平均化することによって得られ、特徴の中心からの距離ｒの関数としてプロットされている。実験データは、陰影が付けられた領域内のより暗い（青色の）曲線としてプロットされ、陰影が付けられた領域は、その半径における測定の不確実性を表す。適合は、明るい（オレンジ色の）曲線として重ね合わされ、実験データを密接に追跡する。
【図４Ａ−４Ｄ】ホログラフィ特徴付けに関する凝集体形態の影響を示す。一般的な凝集体のホログラムは、測定されたホログラムと適合したホログラムとの間の相違が大きくなる順に配置されている。図４Ａは、顕微鏡の視野からの１６０ピクセル×１６０ピクセルの関心がある領域を示し、顕微鏡の視野は、候補ＢＳＡ−ＰＡＨ錯体として自動的に識別された特徴を中心に置いている。図４Ｂは、球体によって形成されたホログラムのローレンツ・ミー理論への適合を示す。図４Ｃは、適合（赤い曲線）の半径方向の輪郭に重ね合わされた実験的なホログラム（黒色の曲線）の半径方向の輪郭を示す。陰影が付けられた領域は、推定された実験の不確実性を表す。図４Ｄは、実験的なホログラムから得られた凝集体の３次元構造におけるレイリー・ゾンマーフェルト再構成を示す。グレースケール画像は、再構成の投影であり、最適な焦点における等価な明視野画像に似ている。重ね合わせた円は、粒子サイズについての適合評価を示す。
【図５Ａ−５Ｆ】汚染物質がＢＳＡ−ＰＡＨ錯体の半径ａp及び屈折率ｎpの測定された分布に及ぼす影響を図示する。図５Ａ（屈折率）は、トリス緩衝液中のＰＡＨと錯体を形成した、ＢＳＡ（１１００個の凝集体）についての結果を図示する。図５Ｂ（サイズ分布）は、トリス緩衝液中のＰＡＨと錯体を形成した、ＢＳＡ（１１００個の凝集体）についての結果を図示する。図５Ｃ（屈折率）は、図５Ａと同じサンプルである、０．１ＭのＮａＣｌ（１２００凝集体）を用いた結果を図示する。図５Ｄ（サイズ分布）は、図５Ｂと同じサンプルである、０．１ＭのＮａＣｌ（１２００凝集体）を用いた結果を図示する。図５Ｅ（屈折率）は、図５Ｃと同じ条件下で調製され、シリコン球が添加されたサンプル（１６００個の特徴）の結果を図示する。図５Ｆ（サイズ分布）は、図５Ｄと同じ条件下で調製され、シリコン球が添加されたサンプル（１６００個の特徴）の結果を図示する。図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅは、散布図（図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅ）中の各点は、単一の凝集体の特性を表し、観察の相対密度ρ（ａp、ｎp）で着色されている。図５Ｂ、図５Ｄ及び図５Ｆは、装置誤差及び統計誤差を表す陰影が付けられた領域内における関連したサイズ分布ρ（ａp）を表す。
【図６Ａ】３つのＢＳＡサンプルの全てについての結合データを示す。
【図６Ｂ】式４に従って再スケーリングされたデータを示す。
【図７】所定の実施で使用するコンピュータシステムを示す。
【図８Ａ−８Ｂ】マイクロフロー画像化及びホログラフィ特徴付けで測定されたサイズ分布の比較を示す。各値域は、値域の中心半径の約±１００ｎｍの周辺にある溶液１ミリリットル当たりの粒子の数を表す。図８Ａは、塩を添加していないサンプル（図５Ａ〜５Ｂのサンプル）を示す。図８Ｂは、ＮａＣＬを添加したサンプル（図５Ｃ〜図５Ｄのサンプル）を示す。
【図９】動的光散乱（ＤＬＳ）によるＢＳＡ−ＰＡＨ錯体の特徴付けを示す。値は、所定の流体力学的半径ａｈの分散体に起因する、散乱光の強度の割合Ｐ（ａh）を表す。矢印は、ａｈ１／４２．８ｍｍの周囲の両方の分布における小さなピークを示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】脱イオン水に分散されたシリコン球についてのホログラフィ特徴付けデータを示す。灰色の部分は、これらの粒子についてそれらの組成に基づいて予想される屈折率の範囲を示し、図１０Ａは単分散サンプル（６００球）を示し、図１０Ｂは多分散サンプル（６００球）を示す。
【図１１Ａ−１１Ｄ】粒子半径及び屈折率の相対確率密度ｒ（ａp、ｎp）のホログラフィ測定を示し、これらは、添加されたシリコン球で突き出し部分がある懸濁液ＢＳＡ−ＰＡＨ錯体に関する。図１１Ａは、図５Ａ〜図５Ｂと同じ条件下で調製され、図１０Ａからの単分散球（２０００個の特徴）で突き出し部分があるサンプルを示す。図１１Ｂは、図５Ｃ〜図５Ｄと同じ条件下で調製され、図１０Ｂの多分散球（１６００個の特徴）で突き出し部分があるサンプルを示す。図１１Ｃは、図１１Ａ中のデータからの粒子半径に関する投影された相対確率密度ｒ（ａp）を示す。図１１Ｄは、図１１Ｂ中のデータからの粒子半径に関する投影された相対確率密度ｒ（ａp）を示す。
【図１２Ａ−１２Ｃ】タンパク質とシリコン油との区別を別々に示す結果を図示する。図１２Ａは、ＰＢＳ緩衝液の１ｍｇ／ｍＬヒトＩｇＧを示す。図１２Ｂは、ＰＢＳ緩衝液中の３ｍｇ／ｍＬシリコン油を示す。図１２Ｃは、これらのサンプルは、ＰＢＳ緩衝液中におけるヒトＩｇＧ０．５ｍｇ／ｍＬの及びシリコン油１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で一緒に混合されていることを示す。全ての測定は、４０倍対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ  ０．７５ＮＡ）、及び深さが１００μｍのマイクロ流体チャンネル（μ−スライド  ＶＩ  ０．１  被覆なし）を用いて行った。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
[0020]  以下の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付図面が参照される。図面において、類似の記号は、文脈に別段の定めがない限り、一般的に同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定を意味しない。本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更をなすことができる。本明細書に一般的に記載され、図に図示されている本開示の態様は、広範囲の異なる構成で配置され、置換され、結合され、設計されることができ、これらの全てが明示的に熟考され、この開示の一部をなす。
【００１０】
[0021]  フラクタルタンパク質凝集体のホログラフィ特徴付けにより、溶液中の個々の凝集体のサイズ及び屈折率に関する理解が深まる。単一凝集体の特徴付けデータは、分布の性質についての先験的な前提なしで、凝集体の分散におけるサイズ及び屈折率の結合分布に組み合わせることができる。タンパク質凝集体のアンサンブルについての測定されたサイズ・指数結合分布が、フラクタル凝集体による分散のための有効媒質モデルの観点から解釈され、これにより、凝集体の平均フラクタル次元、ひいてはそれらの形態の推定値が得られる。この解釈が凝集ウシ血清アルブミンの分散に適用されると、抽出されたフラクタル次元Ｄ＝１．２は、電子顕微鏡法及び原子間力顕微鏡法などの、現場測定技術に基づく以前の報告と一致する。この母集団平均化スケーリング解析の成功により、解析が基礎としている単一凝集体特性データに信頼性が与えられ、こうしてホログラフィ特徴付けを使用して、マイクロメーター規模のタンパク質凝集体のサイズ、構造及び形態を分析することができる新規な提案に信頼性が与えられる。
【００１１】
[0022]  タンパク質がクラスターに凝集する傾向は、疾患プロセスに関係があり、タンパク質ベースの医薬品の有効性にも影響する。ここで、個々のタンパク質凝集体を検出し、計数し及び特徴づけるためのホログラフィビデオ顕微鏡による検査に基づいた方法が導入され、個々のタンパク質凝集体は、肉眼で見えない凝集体に関する母集団統計を、溶液内にその自然状態で、希釈状態又は特殊な溶媒条件なしで、しかも化学標識又は光ラベルの必要性なしに素早く作り上げる。ローレンツ・ミー分析を含むホログラフィビデオ顕微鏡の使用は、球状の均質な粒子の特徴付けにとって公知である。タンパク質凝集体は、それらが均質ではなくしかも球形でないという点で特有の課題を提示する。タンパク質凝集体は、不規則な形になる傾向があり、大いに枝分かれした細長い構造であり得る。本明細書では、凝集体と周囲の及び格子間の間質性の液媒体を含む有効な球体の特性の決定を利用するシステム及び方法が記載されている。この定められた球体の半径及び屈折率の推定値は、次いでフラクタルモデルのようなモデリングを使用することによって、実際のタンパク質凝集体の半径及び屈折率の推定値に調整される。１つの用途では、システム及び方法は、材料の特徴付けなしで利用されるが、１つの実施形態では、タンパク質凝集体のその本来の環境における「計数」に関する情報をほぼリアルタイムで提供する。
【００１２】
[0023]  この方法の概念実施例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシインスリン（ＢＩ）の凝集体を、半径３００ｎｍから１０μｍの範囲にわたって測定することによって証明される。粒子解像測定値を凝集体のサイズ及び屈折率に関する結合分布に累積することにより、タンパク質凝集体のメカニズムに対する成長条件の影響に関する洞察が提供される。この結合分布のスケーリング分析は、以前の現場測定と一致する凝集体のフラクタル次元についての推定値をもたらすので、凝集体の形態への洞察を提供する。このスケーリング分析の成功は、単一クラスターのサイズ及び屈折率についての結果が、個々の凝集体の特性を正確に反映することを示唆している。
【００１３】
[0024]  図２の実施形態のような測定技術は、顕微鏡の視野内に個々のオブジェクトのホログラムを生成する技術である、インラインホログラフィビデオ顕微鏡による検査に基づいている。ホログラフィ顕微鏡は、そのサンプルを従来の非干渉性の光源ではなく平行なレーザー光で照明する。従って、タンパク質凝集体のような小さなオブジェクトによって散乱された光が、光学顕微鏡の焦点面内の残りの光線と干渉する。顕微鏡は、干渉パターンを拡大し、それをビデオカメラの面に投影し、ビデオカメラは、空間的に変化する強度パターンＩ（ｒ）を記録する。結果として生じるビデオストリームの各画像は、レーザー光を通過する散乱のホログラフィスナップショットであり、光散乱のローレンツ・ミー理論に基づく予測で分析されて、各凝集体の半径ａp、屈折率ｎp及び三次元位置ｒpを測定することができる。ホログラフィによる特徴付けは、もともと球状粒子を分析するために開発されたものである（例えば、Ｌｅｅ  ＳＨ、Ｒｏｉｃｈｍａｎ  Ｙ、Ｙｉ  ＧＲ、Ｋｉｍ  ＳＨ、Ｙａｎｇ  ＳＭ、ｖａｎ  Ｂｌａａｄｅｒｅｎ  Ａらによる、ビデオホログラフィ顕微鏡法による単一コロイド粒子の特徴付け及び追跡、Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、２００７年、１５、１８２７５−１８２８２参照。これは、本明細書に参照によって組み込まれる）。非球面及び非均質のオブジェクトの詳細な構造を説明するために分析を厳密に一般化することは、分析の複雑さ及びこれと関連する計算上の負担のために、非常に遅い。理想化された球形モデルを使用して、結果はタンパク質凝集体と有効球を満たす流体媒体との両方を含む有効球を指すとして解釈する必要があるという理解のもとで、タンパク質凝集体が特徴付けられる。
【００１４】
[0025]  図２は、マイクロ流体チャネルを流れ落ちるタンパク質凝集体は、それがレーザー光を通過するときにホログラムを形成することを示す。一般的な実験用ホログラムが、図中のグレースケール画像として再現される。各ホログラムはビデオカメラで記録され、ローレンツ・ミー理論の予測と比較され、各凝集体の半径ａp及び屈折率ｎpを測定する。散布図は、ウシインスリンの３０００個の肉眼で見えない凝集物に関する実験データを示し、各データ点は、単一の凝集物の特性を表し、色は、（ａp、ｎp）平面での観察に関する相対密度ρ（ｎp）を表す。
【００１５】
[0026]  １つの実施形態では、ホログラフィ特徴付けシステム及び方法は、タンパク質凝集体の検出を提供し、タンパク質凝集体の半径は、２００ｎｍ（３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ）から２０μｍ（１０μｍ、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ）の範囲内のような、許容可能なサイズ範囲内にある。さらに、実施形態により、サイズ範囲内にあるタンパク質凝集体を計数することが可能になり、タンパク質凝集体（サイズ範囲内にある）の数密度の決定が可能になる。さらに、このシステム及び方法により、許容可能なサイズ範囲の下位範囲内にあるタンパク質凝集体の識別が可能になる。動的光散乱（ＤＬＳ）などの一部の技術は、同じサイズ範囲の下端をカバーし、より小さい粒子を精査することができる。同じサイズ範囲の上端でマイクロフロー画像化（ＭＦＩ）のような他の技術が動作し、さらに大きい粒子を精査することができる。ホログラフィへの本アプローチは、これらの他の技術の動作領域を橋渡しする。特定された範囲は現行の実施を反映しており、光学ハードウェアの選択及びホログラムの分析に使用するソフトウェアの修正によって拡張することができる。範囲の下端は、光の波長によっても制限される。範囲の上端は、基本的にこのように制限されないが、実際には計算の複雑さを考慮して制限され得る。
【００１６】
[0027]  ホログラフィ特徴付けを達成するために、１つの実施形態では、システム及び方法は、許容されるサイズ範囲内で、タンパク質凝集体を特徴付ける。特徴付けは次の工程、即ちａ）ローレンツ・ミー分析で半径を測定する工程と、ｂ）ローレンツ・ミー分析で凝集体の有効屈折率を測定する工程と、ｃ）個々の凝集体の多孔率を、タンパク質自体の有効屈折率に対する個々の凝集体の有効屈折率に基づいて推定する工程と、ｄ）凝集体のアンサンブル平均の多孔率を、単粒子特徴付けデータの分布の形状に基づいて、凝集体はフラクタル幾何形状であるとしてモデル化できる仮定して推定する（下記の式（１）を用いて）工程と、ｅ）個々の凝集体の形態を、凝集体のホログラムの誤差逆伝搬に基づいて測定する工程とを含む。さらなる実施形態では、誤差逆伝搬工程は、同じデータを分析するための明確で平行なパスであり、１）フレネル誤差逆伝搬、２）レイリー・ゾンマーフェルト逆逆伝搬、及び／又は３）レイリー・ゾンマーフェルトコンピュータ解析を含むことができる。この有効屈折率という用語は、研究中の粒子とその粒子内に介在された媒体との両方を包含する球形分量内の材料の屈折率を指す。この「有効球」は、関心がある粒子の対応する特性を反映するサイズ及び屈折率とされている。この粒子は、コロイド球、非球状コロイド粒子、コロイド粒子の凝集体、又はタンパク質凝集体のような分子の凝集体とすることができる。測定された有効屈折率は、媒体の屈折率でも、純粋なタンパク質クラスターの屈折率でもなく、凝集体の全成分の錯体の屈折率である。凝集体中に包含される溶媒が多いとき有効屈折率は溶媒の屈折率に近く、溶媒が少ないときそれは溶媒の屈折率からさらに遠くなる。有効屈折率により、媒質で満たされた有効球の体積の割合に関する情報が提供され、従って粒子の形態に対する有用な洞察が得られる。
【００１７】
[0028]  図２の実施例を参照すると、ホログラフィ特徴付け装置は、従来の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ、１００×、開口数１．４５、油浸）を使用し、この対物レンズは、標準的な管レンズと組み合わせて、単色ビデオカメラ（ＮＥＣ  ＴＩ−３２４ＡＩＩ）の表面に、１３５ｎｍ／ピクセルのシステム倍率をもたらす。サンプルは、５３２ｎｍのサンプル真空波長に１０ｍＷの光を供給する、固体レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｖｅｒｄｉ）からの平行ビームで照明される。この光は、直径３ｍｍの光線に広がり、この例では、１．５ｍＷ／ｍｍ2のピーク放射照度をもたらす。マイクロメーター規模のコロイド球について、この器具は、個々の粒子の半径をナノメートルの精度で測定することができ、粒子の屈折率は千分の一以内であり、しかも粒子の位置を平面内のナノメートル内にかつ光軸に沿って３ナノメートルの範囲内で追跡することができる。各適合は、自動化された特徴検出及び画像認識アルゴリズムを用いて、ほんの一瞬、例えば数十ミリ秒で実行することができる。単一の適合は、単一のタンパク質凝集体を特徴づけるのに十分である。
【００１８】
[0029]  タンパク質分散中の凝集体の母集団を特徴付けるために、サンプルが顕微鏡の観察分量を通ってマイクロ流体チャネル中に流される。カメラの露出時間を０．１ｍｓとすれば、結果は、１００μｍ／秒までの流速をあいまいにする動きに影響されない。一般的な条件下では、１０個以下のタンパク質凝集体が、８６μｍ×６５μｍの視野を一度に通過する。これらの条件は、個々の粒子の分散パターン間の重なりを最小化することによって、ホログラフィ分析を単純化する。一般的に凝集体である各粒子は、それが視野を移動するとき、複数のビデオフレームに記録される。そのような測定シーケンスは、最尤アルゴリズムを使用して軌道にリンクされ、各軌道につき中央値が報告される。これらの考慮事項は、到達可能な凝集体濃度の範囲の上限１０8／ｍｌを形成する。他の極端な状態では、１０分のデータが低い濃度１０4凝集体／ｍｌで凝集体を検出し、計数し及び特徴付けるには十分である。この感度は、動的光散乱及びナノ粒子追跡分析の両方と良好に比較される。１つの実施形態では、５０００個の粒子からなるデータセットを約５分で取得することができる。
【００１９】
[0030]  図２にはめ込まれた散布図は、ウシインスリンの肉眼で見えない凝集体についての一般的な結果を示す。各点は、単一の凝集体の特性を表し、半径及び屈折率における推定誤差とサイズが同程度である。色は、カーネル密度推定器で計算された（ａp、ｎp）平面内の記録データ点の局所密度ρ（ａp、ｎp）を表し、赤が最も可能性の高い値を示す。
【００２０】
[0031]  ホログラフィによる特徴付けは、非球面でかつ不均一な粒子を収納するように一般化することができる。しかしながら、関連する光散乱計算は、計算に負担がかかる。タンパク質凝集体は、等方性及び均一性の球体のための光散乱理論を用いて、凝集体はこの理想化されたモデルから逸脱し得ることを理解した上で、特徴付けられる。しかしながら、図１の一般的な実施例から、球状モデルによればシステム内で観察された単一粒子の散乱パターンがうまく説明されることが分かる。
ホログラフィ特徴付け器具の較正
【００２１】
[0032]  ホログラフィ特徴付けは、４つの機器較正パラメータ、即ち、レーザー照明の真空波長、光学系の倍率、カメラの暗計数、及び動作照明レベルでの単一ピクセルの信号対雑音比である。これらの全ては、一度測定し、次にその後の全ての引き続く分析に使用することができる。
【００２２】
[0033]  レーザーの真空波長は、製造業者によって特定され、ファイバー分光計（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ、ＨＲ４０００）を用いて、独立して検証されて４つの有効数字になる。顕微鏡の系倍率は、精密マイクロメーター規模（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、カタログ番号２２８５−１６）を用いて測定されて、４つの有効数字になる。カメラの暗計数は、レーザー照射をブロックし、各画素における平均画像値を計算することによって測定される。画像ノイズは、中央値絶対偏差（ＭＡＤ）測定基準を有するホログラフィ画像から推定される。
【００２３】
[0034]  これらの器具の較正に加えて、正確な結果を得るには、レーザー波長及びサンプル温度における媒体の屈折率の正確な値も必要である。この研究における水性緩衝液について、この値は、アッベ屈折計（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて４つの有効数字が得られた。この値を、測定温度２１±１℃の純水の屈折率ｎｍ＝１．３３５で近似すると、推定された半径及び屈折率の系誤差が０．１％以下になる。
ホログラフィ特徴付けの動作範囲
【００２４】
[0035]  ホログラフィ特徴付けの動作範囲は、粒度標準としての使用を意図したコロイド球の水性分散液についての測定によって形成される。各粒子のホログラムにおける干渉縞は、顕微鏡の焦点面内の少なくとも１つのピクセルによって分離する必要がある。この要件は、焦点面をサンプルセル内のガラス−水界面の５μｍ下方に設定することによって調整される。アクセス可能な最大の軸方向変位は、複数の同心円状の縞をカメラの視野に適合させる必要性と、カメラのノイズレベルの下方の画像コントラストを低減することとの両方によって設定される。この上限は、この器具では約１００μｍである。好ましい実施形態では、サンプルは、チャネル内の高さにかかわらず、光路長３０μｍのマイクロ流体チャネルを通過して、全ての凝集体について良好な画像化条件を保証する。
【００２５】
[0036]  検出可能な粒径の範囲の下端は、媒体中の光の波長の半分に制限される。これよりも小さい粒子は検出可能なホログラムを生じ、それは、ローレンツ・ミー理論によって適合されることができる。しかしながら、これらの適合は、粒子サイズを屈折率からきれいに分離しない。粒子の屈折率が先験的に分かっていれば、これらの測定値は、粒子の半径について再び信頼できる推定値をもたらすことができる。例示的な実施形態では、実用的な下限は、カメラの８ビットのダイナミックレンジによってａｐ＞約２００ｎｍに設定されている。より小さい粒子の光散乱パターンは、信頼できる検出及び特徴付けに必要なコントラストを欠いている。
【００２６】
[0037]  例示的な実施形態では、上限サイズ限界は、チャネルの深さによってａp＜１０μｍに設定されている。記載された実施例配置では、１０μｍよりもはるかに大きい不規則な形状のタンパク質凝集体が確実に観察されかつ正確に特定されることは、期待されない。大きな一時的な凝集体は、チャネル内のポアズイユ流での流体力学的せん断によって壊れる可能性がある。光の波長よりも実質的に大きい非常に非対称な凝集体は、球体の自動ホログラフィ特徴付けのために開発された特徴識別アルゴリズムによって、２つ以上の区別可能な特徴として誤認される可能性がある。この人工産物を訂正する努力はなされていないが、その存在は、ホログラフィ特徴付けからの結果と、マイクロフロー画像化に関する同じデータを次の節に記載した方法を用いて再分析することによって得られた結果とを比較することによって確認することができる。
ホログラフィによる形態測定
【００２７】
[0038]  ローレンツ・ミー分析によるホログラフィ特徴付けに使用されたホログラムと同じホログラムはまた、レイリー・ゾマーフェルトの逆伝搬を通じて体積コンピュータ解析で個々の凝集体の三次元形態を視覚化するために使用することができる。この技術は、レイリー・ゾマーフェルト回折積分を使用して、観察された強度分布に関与する分量光照射野を再構成する。散乱パターンに関与するオブジェクトは、この再構成では、光照射野に作る場合は焼灼の形で現れる。サイズが光の波長と同等の特徴を有するオブジェクトでは、これらの焼灼は、これらの特徴の位置及び方向を３次元で正確に追跡することが示されている。得られた分量データセットをレイリー・ゾマーフェルト回折カーネル用の点広がり関数を用いてコンピュータで解析すると、二重像人工産物が除去され、散乱体の３次元表現が得られる。
【００２８】
[0039]  タンパク質凝集体の分量再構成は、最良焦点の平面に明視野画像の同等物を得るために、撮像面に投影することができる。これにより、従来の明視野顕微鏡と比較して、ホログラフィ顕微鏡の有効焦点深度が非常に大きいという利点が得られる。得られた画像は、タンパク質凝集体の形態の分析を含む、マイクロフロー画像分析に有用である。この情報は、次に、ローレンツ・ミー分析における誤った特徴の識別率を評価するために、従ってより大きい凝集体がより小さい凝集体のクラスターとして誤認される割合を評価するために使用することができる。
【００２９】
[0040]  ホログラフィコンピュータ解析顕微鏡による検査を用いて凝集体形態を調査することは、ローレンツ・ミー分析によるホログラフィ特徴付けの補完に有益である。しかしながら、ローレンツ・ミー適合は約数ミリ秒の間に進むが、レイリー・ゾマーフェルトの逆伝搬は数百倍も遅い。従って、この研究は、ローレンツ・ミー特徴付けによって素早く得られる情報に焦点を当てている。
実施例
材料の調製
【００３０】
[0041]  ウシ膵臓インスリン（Ｍｗ：５７３３．４９Ｄａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号：１１０７０−７３−８）のサンプルが、以前に公開された方法に従い、攪拌によって誘導されたインスリン凝集体を調べるための改変のみを行って調製された。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡＳ番号７７−８６−１）中に、インスリンが、濃度５ｍｇ／ｍｌにおいて、３７％塩酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号：７６４７−Ｃ）でペーハーを７．４に調整して、溶解された。次いで、溶液は、２５０ｒｐｍで１時間遠心分離されて凝集物を誘導し、その時点でサンプルは、依然として実質的に透明に見えた。
【００３１】
[0042]  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｍｗ：６６，５００Ｄａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号：９０４８−４６−８）の溶液が、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）（Ｍｗ：１７５００ｇ／ｍｏｌ、ＣＡＳ数：７１５５０−１２−４、平均重合度：１２０７）［３３，３４］との錯体形成によって凝集された。ＢＳＡ及びＰＡＨが、１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡＳ番号：７７−８６−１）に溶解され、それぞれ濃度１．２２ｍｇ／ｍｌ及び濃度０．０３ｍｇ／ｍｌを達成する。溶解を確実にするために試薬が渦により混合され、サンプルの後に形成された凝集物は１時間平衡することができる。
【００３２】
[0043]  追加のサンプルが、同等の条件下で、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号７６４７−１４−５）を添加して調製され、錯体形成を助長し、凝集を促進した。
【００３３】
[0044]  コロイド球サンプルの標準化学量論的混合物は、単分散コロイド球の４つの母集団の混合物であり、各母集団は、区別可能な平均サイズ及び組成を有する。単分散球は、１０％固形物での水性分散液としてＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ストック懸濁液が脱イオン水で１０００倍に希釈され、次いで等容積で混合されて、不均一混合物を生成した。この混合物中の４つの母集団は、直径２ａp＝０．７１±０．０９μｍ（カタログコードＰＳ０３Ｎ、ロット番号９４０２）及び２ａp＝１．５８±０．１４μｍ（カタログコードＰＳ０４Ｎ、ロット番号９２５８）のポリスチレン球、並びに直径２ａp＝０．６９±０．０７μｍ（カタログコードＳＳ０３Ｎ、ロット番号８９３３）及び２ａp＝１．５４±０．１６μｍ（カタログコードＳＳ０４Ｎ、ロット番号５３０５）のシリカ球である。粒子のサイズの引用範囲は、製造者が、より小さい球体には動的光散乱を用い、大きい球体はコールター原理によって推定する。
【００３４】
[0045]  ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から成るシリコン球が、二官能性ジエトキシジメチルシラン（ＤＥＤＭＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号７８−６２−６、３体積％）及び三官能性トリエトキシメチルシラン（ＴＥＭＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号２０３１−６７−６、２体積％）の塩基触媒加水分解及び共重合によって、標準的なプロトコル［Ｏｂｅｙらによる、Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ、１９９４年、１６３：４５４−４６３、及びＧｏｌｌｅｒらによる、コロイド表面、１９９７年、１２３−１２４、１８３−１９３］に従って合成された。ＤＥＤＭＳ及びＴＥＭＳを化学量論比６０：４０で混合した混合物が、脱イオン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｉｌｌｉＱ、９３体積％）に（２８−３０）重量％で、及び水酸化アンモニウム溶液（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  ２体積％）に添加され、合計分量１０ｍｌを得た。サンプルは、渦巻き器によって室温で４分間激しく振動されて核生成を開始し、次いで放置されて回転フレーム上において１０ｒｐｍで３時間重合させた。次いで、完全に成長したシリコン球は、タンパク質凝集体の懸濁液と分量分率１０-4で混合されて、球体の有効濃度４×１０6／ｍｌを得る。
【００３５】
[0046]  これらの重合球は、未重合シリコン油滴とほとんどの特性を共有する。それらの平均屈折率１．３８８±０．００２は、アッベ屈折計（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）で及びホログラフィ特徴付けによって決定される、ＤＥＤＭＳの屈折率１．３８１及びＴＥＭＳの屈折率１．３８３を超える。
正確さ及び精密性の証明
【００３６】
[0047]  図３のデータは、４つの区別できるタイプの単分散コロイド球の化学量論的混合物から成る、モデルコロイド分散体のホログラフィ特徴付けによって得られた。図３Ａの４つのピークの各々は、それらの母集団の１つの特性を表す。各場合において、ホログラフィで測定された特性の分布は、製造業者の仕様と一致する。この一致は、以前の刊行物の補完的なテストとともに、粒子解像ホログラフィ特徴付けの正確さ及び精密性を形成する。
【００３７】
[0048]  このデータセットは、異種コロイド分散を特徴付けるためのホログラフィ特徴付けの特有な能力も図示している。他の技術は、単分散コロイド成分の何れかのサイズ分布を個々に解像することができた。しかしながら、他の技術は、混合物内の４つの母集団を解像することはできなかった。
【００３８】
[0049]  図４Ａ〜図４Ｄは、ホログラフィ特徴付けが有用な結果をもたらす粒径の範囲の実験的証拠を提供する。ここに提示された３つのホログラムは、水中に分散された３つの異なるポリスチレン球について記録され、第１は技術の有効範囲の最小端においてａp１／４半径が０．２３７ｍｍであり、第２はａp１／４半径が０．８００ｍｍであり、第３はａp１／４半径が１０．４７ｍｍである。これらの測定されたホログラム（図４Ａ）は、各粒子の３次元位置、半径及び屈折率によってパラメータ化された、光散乱の理論の予測に対する対応する画素ごとの適合（図４Ｂ）と共に提示されている。適合の品質は、正規化された画像強度ｂ（ｒ）の半径方向輪郭（図４Ｃ）をプロットすることによって評価することができる。これは、２次元強度パターンを、散乱パターンの中心の周りの角度にわたって平均化することによって得られる。測定されたデータから得られた曲線は、図４Ｄ中において測定の不確かさを表す、陰影が付けられた領域内にプロットされている。適合から得られた曲線は、実験データに重ね合させて比較される。適合は、粒子サイズの全範囲にわたって、実験データを極めて良好に追跡する。
肉眼で見えないインスリン凝集物の特徴付け
【００３９】
[0050]  ウシインスリンサンプルは、目視検査でははっきりと見えたが、図２のデータは、１ミリリットル当たり（３．９±０．５）×１０7の肉眼で見えないウシインシュリン凝集物の濃度を示し、それは約１０-3の分量分率に相当する。この値の不確かさは、最大粒子に関する特徴識別誤差と、流速の不確かさとに起因する。半径が２００ｎｍよりも小さい母集団は、ホログラフィ特徴付けシステムによって検出されないため、これらの合計でカウントしなかった。粒子特性の分布は、半径１．６μｍでピークに達し、広範囲でかつ多様である。半径が４．２μｍを超える凝集体は記録されておらず、それは、このような大型の凝集体は１０4／ｍｌ未満の濃度で存在することを示唆する。
【００４０】
[0051]  凝集体の屈折率は、緩衝液の屈折率ｎｍ＝１．３３５のすぐ上から、１．４２よりも少し大きい値まで広範囲に変化する。この範囲は、完全に高密度のタンパク質結晶に期待される約１．５４の値よりもかなり小さい。しかしながら、この観察された上限は、タンパク質凝集物の屈折率の最近の屈折率マッチング測定値と一致している。これらの後者の測定値は、タンパク質凝集体を屈折率マッチング流体で灌流させることによって行われるため、タンパク質自体の屈折率の推定値をもたらす。対照的に、ホログラフィ特徴付けは、高屈折率タンパク質と、球体を満たす低屈折率緩衝液との両方からなる有効分散体を分析する。そのような有効球は、実際の粒子の多孔度に依存する比において、２つの媒体の有効屈折率の中間に有効屈折率を有することが示されている。より多孔性又は開放構造では、有効屈折率はより小さい。さらに、多孔性が有効屈折率に及ぼす影響は、半径がより大きい粒子の場合に比例して大きいことが分かる。
【００４１】
[0052]  有効球体モデルは、タンパク質凝集体が不規則な構造を有すると仮定して、ホログラフィ特徴付けデータの一般的傾向を説明する。この提案は、ウシインスリンがフィラメント状凝集体を形成することを実証した以前の現場外の研究と一致している。
【００４２】
[0053]  従って、個々のコロイド粒子のサイズ及び屈折率の両方を記録するためのホログラフィ特徴付けの特別な能力により、その場でかつ希釈せずに、しかも他の特別な調製なしでタンパク質凝集体の形態への洞察が提供される。この能力によりまた、ホログラフィによる特徴付けが、他の分析技術に支障を来すシリコン油滴及びゴム粒子などの共通の汚染物質から、タンパク質凝集体を区別することが可能になる。
肉眼で見えないＢＳＡ凝集体の特徴付け
【００４３】
[0054]  図５は、ウシ血清アルブミンの２つのサンプルについて同等のホログラフィ特徴付け結果を示す。図５Ａのデータは、追加の塩なしに調製されたサンプルについて得られた。インスリンサンプルに関して、ＢＳＡサンプルのホログラフィ特徴付けは、３００ｎｍから２．５μｍまでの半径範囲の及びピーク半径０．５μｍで±０．５×１０6／ｍｌの凝集体を示す。半径が２．８μｍを超える凝集体は観察されず、それは、より大きな凝集体が１０4／ｍｌ未満の濃度で存在することを示唆する。
【００４４】
[0055]  図５Ａの上側パネルは、凝集体サイズρ（ａp）の分布に対する結合分布ρ（ａp、ｎp）の投影である。この投影は、動的光散乱などの他のサイズ測定技術によってもたらされる結果により似ている。肉眼で見えないタンパク質凝集体の観察された濃度は、ＤＬＳに関する検出閾値未満であるが、ＤＬＳ測定値は、凝集体の濃度約１０9／ｍｌを明らかにし、凝集体の半径は、１００ｎｍよりも小さいので、ホログラフィ特徴付けには小さすぎる。ＢＩサンプルに関して、図５Ａ〜図５Ｆで明らかなａpとｎpとの間の相関関係は、ＢＳＡ−ＰＡＨ錯体が開放構造を有することを示唆している。これは、ＢＳＡが弱い分岐構造に凝集することを証明する以前の現場外研究と一致している。
【００４５】
[0056]  塩の添加により錯体形成が高まり、平均凝集体サイズがほぼ２倍に増大するとともに、凝集体サイズの分布が実質的に広がる。これらの傾向は図５Ｂに見ることができる。図５Ａ〜図５Ｆはまた、凝集体のサイズ分布が成長条件に伴ってどのように変化するかを強調する相対確率密度ρ（ａp）の予測を含む。これらの予測により、凝集体半径及び屈折率の結合分布における著しい変化が、図５Ａ及び図５Ｂから省略される。このシフトは、添加された塩の存在下で成長したより大きな凝集体が実質的により多孔性であることを示唆している。凝集体の形態に対するこの洞察は、サイズ分布だけでは得られない。
凝集体形態の役割
マイクロフロー画像化
【００４６】
[0057]  図４Ａ〜図４Ｄはホログラフィ特徴付けとＭＦＩとの間の直接の比較を示し、これは、ほぼ球形の小型のクラスターからの形態範囲が細長い構造に延びる、６つのＢＳＡ−ＰＡＨ錯体の代表的サンプルに関するものである。各凝集体のホログラムは、ローレンツ・ミー理論の予測への非線形最小二乗適合と比較される。これらの適合についての減少したＸ2統計値が使用され、上位にある最善の適合から下位にある最悪の適合への結果を配列するために使用される。測定されたホログラムの各々はまた、個々の凝集体の分量画像をレイリー・ゾマーフェルトコンピュータ解析顕微鏡検査によって再構成するために使用される。再構成されたクラスターのサイズは、ホログラフィ特徴付けから得た有効半径と比較することができる。
【００４７】
[0058]  図４Ａの２つの最も小型のクラスターでさえ、実質的に非球面であるように見える。それにもかかわらず、それらのホログラムは、非線形適合によって非常によく再現される。これらの適合に関するＸ2測定基準は、一つである状態に近く、モデルが光散乱プロセスを適切に記載し、単一ピクセルノイズが十分に推定されることを示唆している。凝集体半径の値は、レイリー・ゾマーフェルト再構成から推定されたサイズと一致している。半径がホログラフィにより決定された円が、図４Ｄの数値的に再合焦された明視野画像に重ね合わせて比較される。この成功は、コロイド球及びコロイド棒に関する以前のローレンツ・ミー及びレイリー・ゾマーフェルト分析の比較と一致する。
【００４８】
[0059]  凝集体がますます構造化されかつ非対称になるにつれて、誤差が増える。それでも、特徴的なサイズの推定値は、最悪の場合の明視野再構成の見かけのサイズと合理的に一致している。この堅牢性は、散乱体の有効サイズが、中心散乱ピークの大きさ及びコントラスト、並びに直近の強度最小値に強く影響するために生じる。従って、干渉パターンのこの領域に忠実に適合することにより、散乱体のサイズについて合理的な値が得られる。パターン全体の全体的なコントラストは、散乱体の屈折率を符号化するので、このような開放構造のクラスターでは非常に低い。
【００４９】
[0060]  これらの代表的な実施例は、ホログラフィ特徴付けが不完全な球体及び非球形粒子について有用な特徴付けデータをもたらす以前の実施例と一致する。特に、大きな凝集体の場合、屈折率の推定値は実効球を記載する。しかしながら、推定された半径は、凝集体サイズにとって合理的に堅牢な測定基準である。
【００５０】
[0061]  ホログラフィ特徴付けが形態に洞察を提供する能力から独立して、これらの結果は、ホログラフィ顕微鏡による検査が、溶液中の肉眼で見えないタンパク質凝集体を有用に検出し及び計数することを証明している。これらの検出それ自体は、タンパク質溶液の凝集状態をその場で特徴付けるのに有用な情報を、広範なサンプル調製を必要とすることなく提供する。ホログラフィ顕微鏡の大きな有効被写界深度は、次に分析速度を従来の粒子画像分析と比較して上昇させるのに役立つ。
【００５１】
[0062]  ホログラフィ特徴付けのように、ＭＦＩは、具体化されたサイズ値域内の粒子の濃度を計算するために使用できる粒子解像半径測定値をもたらす。これらの結果は、ホログラフィ特徴付けによって生成された投影サイズ分布と直接比較することができる。図８Ａ〜図８Ｂのデータは、図５Ｃ〜図５Ｄで特色付けられた、塩を添加した場合と添加しなかった場合のＢＳＡ−ＰＡＨ錯体についてそのような比較を示す。結果は、ａｐにある各値域の中心周りの±１００ｎｍのサイズ範囲における、ミリリットル当たりの凝集物の数Ｎ（ａp）として示される。図５Ｂ及び図５Ｄからのホログラフィ特徴付けデータが、比較のために、このプロットで再度スケール変更されている。独立した研究によれば、半径が１ｎｍよりも大きい凝集体について、ＭＦＩ分析により信頼できるサイズ推定値が得られることが証明されている。より小さい粒子の場合には、回折により実質的な測定誤差が生じる。従って、発明者は、図８Ａ及び８Ｂでは、小粒子のＭＦＩ結果を６００ｎｍ幅の値域に集め、対応する正規化を行う。この値域の範囲の下端は、ホログラフィ特徴付けによって報告された最小の半径に対応する。ホログラフィ特徴付けとＭＦＩとの間の一致は、プロットされた粒径の全範囲にわたって合理的に良好である。両方の技術は、１０7凝集物／ｍＬの全体濃度について一貫した値をもたらす。ＭＦＩは、サイズ範囲の大きな端に多くの集計を、小さな端に少ない集計を体系的に報告する。この差異は、最も細長くかつ不規則な凝集体に帰することがあり、その凝集体は、例えば図４Ａ〜図４Ｄの最後の例であり、そのサイズがホログラフィ特徴付けによって過小評価されている。形態がホログラフィによるサイズの特徴付けに及ぼすこの効果は以前に検討した。これらの場合でも、ホログラフィ特徴付けは、粒子の存在を正確に検出し、それらをマイクロメーター規模のオブジェクトとして識別する。ＭＦＩ及びホログラフィ特徴付けの両方とも、凝集体の総数密度について一貫した結果をもたらす。
【００５２】
[0063]  サイズ範囲の小さい端にある粒子の場合、ＭＦＩは、粒子数を提供するが有用な特性データを提供しない。対照的に、ホログラフィ特徴付けは、この事象において信頼できるサイズ推定値を提供する。考慮されるサイズの全範囲にわたって、ホログラフィ特徴付けはまた、粒子の屈折率の推定値を提供する。
動的光散乱
【００５３】
[0064]  サンプル中の肉眼で見えないタンパク質凝集体の存在を証明するために、発明者はＤＬＳ測定も行なった。ホログラム特徴付け及びＭＦＩは粒子解像測定値をもたらすが、ＤＬＳはバルク特徴付け技術である。ＤＬＳによって報告された値は、所定の流体力学的半径ａhのオブジェクトに帰することができる、散乱光の割合Ｐ（ａh）を反映する。従って、得られるサイズ分布は、オブジェクトの光散乱特性によって重み付けされる。散乱強度は、粒子が光の波長よりも小さい場合及び全ての粒子の屈折率が全て同じである場合、少なくともほぼ粒子濃度に変えることができる。直接的な比較は、例えばタンパク質凝集体の場合には、粒子の屈折率が大きさにつれて変化するとき不可能である。そのような場合、サイズのある範囲内にある散乱体の存在を確認するためには、ＤＬＳが有用である。図６は、図３に示したＢＳＡ−ＰＡＨ錯体の同じサンプルに関するＤＬＳデータを示す。両方のサンプルにおいて、ＤＬＳにより半径が１００ｎｍ未満である多数の散乱体の存在が明らかになる。このサイズの散乱体に関するＤＬＳの検出閾値は、独立した研究によって決定されるように、およそ１０8凝集体／ｍＬである。発明者は、両方のサンプルは少なくともこの濃度でかつ直径がサブミクロンの凝集体を有すると結論する。このようなオブジェクトは、発明者がホログラフィビデオ顕微鏡を実施するための検出限界よりも小さいので、図３では解像されなかった。
【００５４】
[0065]  分布は、塩が添加されたサンプルでは、ホログラフィ特徴付けの結果と一致して、より大きなサイズにシフトする。両方のサンプルとも、流体力学的半径が２．８ｎｍの肉眼で見えないオブジェクトにつき、図９の矢印で表される非常に小さな信号を示す。これにより、本発明者のサンプルは、そのような散乱体がそのオブジェクトに関するＤＬＳの検出閾値をわずかに上回る濃度で存在することが確認される。
【００５５】
[0066]  塩が添加されたサンプルはまた、ホログラフィ特徴付けの検出範囲にあるａh＝４００±２０ｎｍの周囲に明確なピークを有する。図５Ｃの対応するピークは、実質的により大きい半径ａp＝７７０±２０ｎｍに現れる。この不一致の考えられる原因の１つは、ホログラフィ特徴付けは有効な境界球の半径を報告するのに対して、開放構造の場合は実質的に小さくなり得るＤＬＳは、流体力学的半径を報告するためである。別の要因は、より大きな凝集体は、有効屈折率がより小さいので、比例して光をより小さい凝集体よりもより弱く散乱させることである。この効果はまた、ＤＬＳ測定値において、見かけのサイズ分布を下方にシフトさせる。しかしながら、サイズ分布のシフトは、ホログラフィ特徴付けには影響せず、各オブジェクトのサイズ及び屈折率の両方を個別に報告する。
タンパク質凝集体からのシリコン球のホログラフィによる差別化
【００５６】
[0067]  ＤＬＳは、懸濁液中でタンパク質凝集体を他の粒子母集団から区別することができない。ＭＦＩは、一部のそのような汚染物質を形態によって差別することができ、例えば、シリコン小滴は球形である傾向があるが、タンパク質凝集体は不規則な形状となる傾向がある。形態的な差別化は、光の波長よりも実質的に大きく、構造的特徴が回折によって不明瞭にならない粒子について最も効果がある。情報を通じて、形態的な差別化は、個々の粒子に屈折率を与え、ホログラフィ特徴付けは、マイクロメーター規模のオブジェクトを組成によって区別するための追加の手段を提供する。発明者は、シリコン球で品質を意図的に下げたＢＳＡサンプルにつきホログラフィ特徴付け測定を実行することによって、この能力を証明する。
シリコン球のホログラフィによる特徴付け
【００５７】
[0068]  図１０Ａから図１０Ｂは、脱イオン水中に分散されたシリコン球のホログラフィ特徴付けデータを示す。図１０Ａのサンプルは、比較的単分散であり、サンプル平均半径は０．７５±０．０９ｎｍである。図１０Ｂの粒子は、平均半径が０．８７±０．２８ｎｍであるより広範なサイズの分布から描いている。両方の球形サンプルの屈折率は、４０％の架橋を有するポリジメチルシロキサンにつき以前に報告された値ｎp＝１．３８８±０．００５と一致する。この範囲は、図１０Ａ〜図１０Ｂに陰影がつけられた領域で示されている。
【００５８】
[0069]  タンパク質凝集体とは異なり、これらの粒子の屈折率は、粒子の大きさと相関関係がない。このことは、図１０Ｂの多分散サンプルで最も容易に分かり、均一な密度を有しかつ多孔性でない小滴と一致する。発明者は、単一粒子特性の同じ分布を見ることを、これらのシリコン球がタンパク質凝集体と共分散しているとき期待する。
シリコン球の差別化による検出
【００５９】
[0070]  図１１Ａのデータは、図５Ａと同じ条件下であるが、単分散シリコン球を４×１０6粒子／ｍＬの濃度で添加して調製されたＢＳＡのサンプルから得た。粒子特性の得られた分布は明らかに二峰性であり、一方の母集団はタンパク質凝集体単独から得られたものに似ており、他方の母集団はシリコン球の分布と一致する屈折率ｎp＝１．３８８±０．００５を有する。図１１Ｂのサンプルは、図５Ｃの条件と同等の条件下で、図１０Ｂのサンプルから多分散性シリコン球を添加して同様に調製した。図５Ａ〜５Ｄ及び図１１Ａ〜１１Ｂにおいて、タンパク質凝集体に関連する特徴同士が一致しており、これは、サンプル調製プロトコル及びホログラフィ特徴付け技術の両方が、サンプル間で再現性のある結果をもたらすこと、及びタンパク質凝集物のホログラフィ特徴付けは、外来の不純物粒子の存在によって影響されないことによる。
【００６０】
[0071]  興味深いことに、両方の分布は、図９のＤＬＳデータのピークに対応するａp＝２．８ｎｍ付近の小さなピークを特徴としている。この特徴は、図３Ａ〜３Ｆには存在しない。より大きな凝集体のこの小さな母集団がそれらのサンプル中に存在するが、１０分間の測定では、検出の閾値をわずかに下回る濃度で存在する可能性が高い。
【００６１】
[0072]  図１１Ａ〜１１Ｂのシリコン小滴に関連する特徴の分布はまた、図１０Ａ〜１０Ｂからの小滴のみに基づくホログラフィ特徴付けデータとよく一致する。これらの結果は、ホログラフィ特徴付けからの屈折率データが、シリコン油滴からタンパク質凝集体を区別するのに有用であり得ることを証明する。このような差別化は、図１１Ａ〜図１１Ｄの投影データから分かるように、サイズ分布のみに基づいては不可能である。
【００６２】
[0073]  ホログラフィ特徴付けは、シリコンの小滴を、屈折率がシリコンと同じであるタンパク質クラスターから差別することができない。このようなあいまい性は、図１１Ａ〜１１Ｄで分析された最小の粒子につき生じる。球状シリコン小滴は、これらの条件下で不規則な形状とされたタンパク質凝集体から区別することができ、区別には同じホログラムのコンピュータ解析による分析によって得られた形態データを用いる。これらの場合の区別は、相対的な浮力の兆候によってシリコンをタンパク質から区別する、共鳴質量測定（ＲＭＭ）で得られるよりも依然として明らかではない。特定の粒子を明白に区別できない場合、シリコン小滴の存在は、ホログラフィ特徴付けデータから依然として推測することができ、その理由は、そのような粒子は、屈折率がサイズに依存しない（ａp、ｎp）面内にクラスターを生成するからである。２つの母集団の相対存在量は、次に、例えば、統計的クラスター方法によって推定することができる。
実施例の結果の考察
【００６３】
[0074]  タンパク質凝集物特性の光学プローブとして、ホログラフィ特徴付けは、コールター原理又は共鳴質量測定（ＲＭＭ）のような非光学技術と直交している。画像技術として、ホログラフィ特徴付けは、マイクロフロー画像化（ＭＦＩ）及びナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）に関連している。しかしながら、ホログラフィ特徴付けは、その有効実効深度が大きいこと及び屈折率を監視する能力並びにサイズから利益を得る。ＭＦＩ及びホログラフィ特徴付けは、１つのスナップショットで１つの粒子を分析できるため、両方とも、時系列解析に依存するＮＴＡよりも本質的に速い。
【００６４】
[0075]  ホログラフィ特徴付けはまた、動的光散乱（ＤＬＳ）及び光不明瞭化（ＬＯ）などの光散乱技術に関連する。ホログラフィ特徴付けは、マイクロメーター規模のオブジェクトにつき、動的光散乱よりも大きな計数感度を与え、光不明瞭化よりも小さな粒子へのアクセスを与え、希釈を必要としない。他の散乱技術とは異なり、ホログラフィの特徴付けは、むしろ粒子の屈折率を入力として必要とせず、屈折率を出力として提供する。
【００６５】
[0076]  これらの技術間の比較が表１に要約されており、表１は、肉眼で見えないタンパク質凝集体に関する高生産性特徴付け技術の比較である。サイズ範囲は、各方法によって検出される有効球の半径を指す。第４の列は、技術が凝集体の形態を測定できるかどうかを表す。参考事項は、タンパク質凝集体を特徴付けるための技術の能力における独立した評価を記載している。
【表１】
2019513973.tif 000003
表１
【００６６】
[0077]  ここに提示された測定値により、ホログラフィビデオ顕微鏡による検査はローレンツ・ミー分析と一緒に、肉眼で見えないタンパク質凝集体を検出し、計数し、特徴付けし得ることを証明している。データ収集は、素早く、一般に１５分を要するに過ぎず、しかも特別なサンプル調整が不要である。１つの実施は、半径が３００ｎｍから１０μｍの範囲にあり、しかも濃度が１０4凝集体／ｍｌから１０8凝集体／ｍｌの範囲にある凝集体に有効である。特徴付け測定値に使用されたホログラムと同じホログラムはまた、個々のタンパク質凝集体の形態を数値の逆伝搬を通じて推定するために解釈することもできる。較正は、簡単であり、レーザー波長、顕微鏡の倍率及び媒質の屈折率を必要とするのみである。タンパク質凝集物のそのようなホログラフィ特徴付けは、生物医薬品の安定性の評価、製造中のプロセス制御、並びに販売時点での及び潜在的な使用時点での品質保証に有用であると考えられる。
凝集体サイズと屈折率との間の反相関関係
【００６７】
[0078]  上述したように、図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅで明らかにした、凝集体サイズと屈折率との間に強い相関関係が観察された。そのような相関関係は、従来技術の粒子特徴付け技術では検出されなかった。さらに、単一粒子屈折率の値は、タンパク質につき画像波長で予想される約１．４５の値よりも実質的に小さい。実際、最大粒子の推定屈折率は、水の屈折率１．３３５よりもそれほど大きくない。
【００６８】
[0079]  サイズと屈折率との間の相関関係は、屈折率の低い値と一緒に、粒子多孔率の特徴として識別されている。しかしながら、均質に多孔質であるのではなく、タンパク質凝集体は、成長を通じて凝集によって自然に生じるフラクタル構造を有することになると考えられる。
【００６９】
[0080]  この考えを検査するために、タンパク質凝集体は、フラクタル次元Ｄのフラクタルクラスタとしてモデル化された。フラクタルモデルは、ランダムな凝集体の幾何学的形状との公知の関係のために、及び単一パラメータへの依存による簡単さのために、密度を予測するためのフラクタル次元Ｄのために選択された。当業者であれば、他の適切なモデルを使用して、密度を含むタンパク質凝集体の特性を予測し得ることを理解する。従って、凝集体半径ａp内にあるタンパク質半径ａ0の分量分率φは、
【数１】
2019513973.tif 000004
である。
【００７０】
[0081]  クラスターのこの比率は、屈折率ｎ0の材料からなる。分量の残部は、おそらく、より低い屈折率ｎmの流体媒体で満たされている。粒子全体の見かけの屈折率ｎpは、全体として有効媒質理論
【数２】
2019513973.tif 000005
によって与えられ、ローレンツ・ローレンツ因数は、
【数３】
2019513973.tif 000006
である。
これから
【数４】
2019513973.tif 000007
となる。
【００７１】
[0082]  たとえｎ0及びａ0が独立して公知でなくても、このスケーリング関係により凝集体の母集団の形態を特徴付ける手段が、アンサンブル平均のフラクタル次元を推定することによって提供される。
【００７２】
[0083]  図６のデータは、そのような分析の結果を示す。図６Ａは、図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅからの全てのデータを、成長条件の３つの全てのセットのもとで同じ形態が発生すると仮定して蓄積する。この仮定は、式（４）のスケーリング関係に従ってプロットされた同じデータを示す図６Ｂで裏付けされる。特に、図６Ｂの線形の傾向は、式（４）の根底にありかつ凝集体の３つの母集団が一貫した成長習性を有するという仮定を含む、仮定を支持している。
【００７３】
[0084]  図６Ｂのデータに重ね合わせた破線は、Ｄ＝１、１．２及び１．４と一致する勾配を示し、Ｄ＝１．２について最良の一致が得られた。この結果は、ＢＳＡ凝集体がフィラメント状であって分岐が殆どないことを示唆している。フラクタルモデルは、密度が高くぼんやりした形（Ｄ＝３）、線形チェーン（Ｄ＝１）、及びその間の構造（一般にＤ＞３＞１）に使用することができる。従って、ホログラムの見かけ上の球対称は、凝集体がフィラメントのクラスターで構成されていることを示唆する。これは、同等の条件のもとでのＢＳＡ凝集体の電子顕微鏡による研究と一致する。ホログラフィ特徴付けを通じてフラクタル次元を推定することにより、電子顕微鏡による検査が改善され、その理由は、検査は現場で実行することができ、サンプル調製に特有の構造変化を伴わないためである。ホログラフィ特徴付けはまた、モノマー屈折率に関する推定が不要であるので、従来の光散乱に優る利点ももたらす。測定に必要な全ての較正データは、単一粒子の特性データ及び器具の全体的な較正から得られる。
【００７４】
[0085]  このスケーリング解析の成功により、個々のタンパク質凝集体の半径及び屈折率についてのホログラフィにより推定した値は、凝集体の実際の特性を正確に反映するというさらなる証拠がもたらされる。この結果は、図１Ａの実施例のような単一凝集体ホログラムの観察された対称性と理想球体につきローレンツ・ミー結果との適合の修正可能性を仮定すると、不合理ではない。これらの観察は、次にホログラフィ特徴付けが、個々のタンパク質凝集体の特性を分析するために、従ってタンパク質凝集体の分散体の特性を評価するために有効であり得ることを示唆する。タンパク質凝集体のサイズ分布に関する情報をもたらす以外に、ホログラムの特徴付けは、屈折率による組成及び形態の洞察をもたらす。
【００７５】
[0086]  ホログラフィ特徴付けによって提供される情報は、タンパク質分散液を調合する必要があり、特に、凝集体のサイズを監視し制限する必要のある用途では、有用なフィードバックを提供する必要がある。ホログラフィ特徴付けのリアルタイム実施が、同様に、そのような用途でのプロセス制御及び品質保証に役立つ必要がある。
差別化
【００７６】
[0087]  図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅは、本明細書に記載されたシステム及び方法が１つの実施形態で差別をもたらす能力を図示する。これに関連して、「差別化」とは、懸濁液中のタンパク質凝集物などの所望の物質を他の物質から区別する能力である。ホログラフィ特徴付けによって与えられる屈折率データは、タンパク質凝集体をシリコン小滴のような汚染物質から区別するために使用することができる。これは重要であり、その理由は、シリコン小滴及びゴム粒子を含む汚染物質は、タンパク質溶液にたどり着くことが多く、他の特徴付け技術によってタンパク質凝集体と間違われることがあるからである。そのような誤認は、製品に問題がない場合に問題があることを示唆し、又は汚染された一群の製品を識別できないことがある。
【００７７】
[0088]  さらに、図１２Ａ〜図１２Ｃは、ヒトＩｇＧ、シリコン油、ひいては１つのサンプルでの２つの組み合わせを示す。分かるように、タンパク質凝集体（図１２Ａ）及びシリコン油（図１２Ｂ）は、非常に異なる痕跡を有し、それらが同じサンプル中にあれば、はっきりと識別可能である（図１２Ｃ）。シリコン油の痕跡は、オイルエマルジョンのホログラフィ特徴付けの典型例である一方、タンパク質は容易に区別することができる。
【００７８】
[0089]  本明細書に記載されたシステム及び方法を使用して、誰でもオブジェクト同士をそれらの特有の能力である屈折率によって区別することができる。従って、区別は、形態のような何か他の態様（それは、異なる材料について同じである可能性があるので、偽陽性又は偽陰性の何れかの間違った結果が与えられる）でなく、屈折率が直接関連する実際の組成物による。例えば、一般的な１つの技術は、形態を使用してシリコンをタンパク質から区別し、その際シリコン小滴は球形であり、タンパク質凝集体は存在しないと仮定する。しかしながら、この仮定は、小さなタンパク質凝集体を含みしかもタンパク質凝集体のサイズは技術が球体から凝集体を区別する能力を下回る、多くの重要なシナリオではうまくいかない。
コンピュータ実施
【００７９】
[0090]  図７に示すように、例えば、コンピュータがアクセス可能な媒体１２０（例えば、本明細書で説明するように、ハードディスク、フロッピーディスク、メモリスティック、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＲＯＭなどの記憶装置又はそれらの一群）を設けることができる（例えば、処理装置１１０と通信する）。コンピュータアクセス可能媒体１２０は、非一時的なコンピュータアクセス可能媒体とすることができる。コンピュータアクセス可能媒体１２０は、それに関する実行可能な命令１３０を含むことができる。これに加えて又は代えて、記憶装置１４０を、コンピュータアクセス可能媒体１２０と別個に設けることができ、記憶装置１４０は、処理装置１１０に命令を提供して、処理装置が、例えば本明細書に記載したような所定の典型的な手続き、プロセス及び方法を実施するように構成することができる。命令は、複数セットの命令を含むことができる。例えば、一部の実施では、命令は、複数のシーケンスブロック内の無線周波数エネルギーを分量に適用するための命令を含むことができ、シーケンスブロックの各々は、少なくとも第１のステージを含む。命令は、第１のステージを各シーケンスブロックの先頭の磁化が安定するまで連続的に繰り返す命令と、複数のシーケンスブロックに対応する複数の画像セグメントを連結して単一の連続画像セグメントに連結する命令と、少なくとも１つの緩和パラメータを単一の連続画像セグメントに符号化するための命令とをさらに含むことができる。
【００８０】
[0091]  システム１００はまた、ディスプレイ又は出力デバイスと、キーボード、マウス、タッチスクリーン又は他の入力装置などの入力装置とを含み、論理ネットワークを介して追加のシステムに接続することができる。本明細書で説明する実施形態の多くは、プロセッサを有する１つ又は複数のリモートコンピュータへの論理接続を使用してネットワーク化された環境で実施することができる。論理接続にはローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及びワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含むことができ、それらは、本明細書に限定でなくほんの一例として提示されている。このようなネットワーク環境は、オフィス全体又は企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネット及びインターネットでは一般的であり、多種多様な異なる通信プロトコルを使用することができる。当業者であれば、そのようなネットワークコンピュータ環境は、パーソナルコンピュータ、手持ち式装置、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベース又はプログラマブル消費家電製品、ネットワークＰＣ、小形コンピュータ、汎用コンピュータなどの多くのタイプのコンピュータシステム構成を一般に包含し得ることを理解することができる。本発明の実施形態は、分散コンピュータ環境でも実施することができ、そこでタスクは、リンクされたローカル及びリモート処理装置によって実行され（直接接続リンク、無線リンク、或いは直接接続リンク又は無線リンクの組み合わせの何れかよって）通信ネットワークを介して行う。分散コンピュータ環境では、プログラムモジュールは、ローカル及びリモートメモリ貯蔵装置の両方に配置することができる。
【００８１】
[0092]  様々な実施形態が方法工程の一般的な文脈で説明され、方法工程は、１つの実施形態では、プログラムコードのようなネットワーク環境内のコンピュータによって実施されるコンピュータ実行可能命令を含む、プログラム製品によって実施され得る。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実行し、又は特定の抽象データタイプを実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、構成部品、データ構造などを含む。コンピュータ実行可能命令、関連するデータ構造、及びプログラムモジュールは、本明細書で開示される方法の工程を実行するためのプログラムコードの例を提示する。そのような実行可能命令又は関連するデータ構造の特定のシーケンスは、そのような工程で説明された機能を実施するための対応する動作の例を示す。
【００８２】
[0093]  本発明のソフトウェア及びウェブ実施は、標準的なプログラミング技術で様々なデータベース検索工程、相互関係工程、比較工程及び決定工程を達成するためのルールベースの論理及び他の論理を用いて達成することができる。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「構成部品」及び「モジュール」という用語は、ソフトウェアコード及び／又はハードウェア実施の１つ又は複数のラインを使用する実施、並びに／或いはマニュアル入力を受信するための機器を含むことを意図することに留意されたい。
【００８３】
[0094]  本明細書における実質的に任意の複数形及び／又は単数形の用語の使用に関して、当業者であれば、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数形から単数形に及び／又は単数形から複数形に置き替えることができる。様々な単数／複数の置換は、明瞭化のために本明細書に明示的に記載することができる。
【００８４】
[0095]  例示的な実施形態の上記説明は、例示及び説明のために提示された。開示された厳密な形態に関して網羅的又は限定的であることを意図せず、修正又は変形が、上記の教示に照らして可能であり又は開示された実施形態の実施から取得することができる。従って、上記の実施形態は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。
【図１Ａ】
2019513973.tif 000016
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ−５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
2019513973.tif 000026
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｄ】
2019513973.tif 000030
【図１２Ａ−１２Ｃ】
2019513973.tif 000031
【国際調査報告】
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2019513973.tif 000033
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