(57)【要約】  本発明は、セレクチン結合ドメインおよび非共有結合の二量体化ドメインを含む、組み換えタンパク質（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１および神経網膜特異的なロイシンジッパー）ＰＳＧＬ−１−ＮＲＬキメラタンパク質を開示し、それは、ロイシンジッパーであり、より好ましくは、ヒトまたはマウス神経網膜特異的なロイシンジッパーのロイシンジッパードメインである。キメラタンパク質は、別のキメラタンパク質とジスルフィド架橋を形成してホモ二量体を形成するのに適切な少なくとも１つのシステインを有する共有結合の二量体化ドメインをさらに含む。キメラタンパク質において、ＰＳＧＬ−１ドメインは、ヒトＰＳＧＬ−１の細胞外領域に対応し、より好ましくは、成熟タンパク質のセレクチン結合領域である。キメラタンパク質は、正しく翻訳後修飾されて、哺乳類系において効率的に発現される。それは、硫酸化、Ｏ−結合型グリコシル化およびシアル酸付加されて、Ｐ、ＥおよびＬセレクチンに結合して、診断的または治療的目的のためのインビボおよびインビトロの標的化を可能にする。
2019513344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えキメラＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）タンパク質であって、
少なくとも：配列番号１１（成熟ＰＳＧＬ−１配列）の少なくともａａ５〜１６を含むセレクチン結合ドメイン、配列番号１２（神経網膜特異的なロイシンジッパー）のａａ１８７〜２０８と少なくとも９０％相同または同一のアミノ酸配列を含むロイシンジッパードメイン、および、ジスルフィド結合促進領域を含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記セレクチン結合ドメインは、配列番号１１（ＰＳＧＬ−１配列）の少なくともａａ１〜４７を含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記ロイシンジッパーは、配列番号１２のａａ１８１〜２１５と少なくとも９０％相同または同一のアミノ酸配列を含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記ジスルフィド結合促進領域は、以下の一般式：
（Ｘ１）ｎ−Ｃ（Ｘ２）ｍ−（Ｘ３）
によって定義されるアミノ酸配列を含み、
ここで：
−Ｘ１、Ｘ２は、システイン（Ｃｙｓ）を除く任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を表わし、
−Ｃは、Ｃｙｓであり、
−Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、および
−ｎ、ｍは、１〜６からなる整数である、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
−Ｘ１は、好ましくは、プロリン、ヒスチジンまたはトレオニンを含み；
−ｎは、最大で５であり、および
−Ｘ２は、少なくとも１つのプロリンを含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
−Ｘ２は、Ｐｒｏ−Ｐｒｏであり；
−Ｘ３は、システインおよび少なくともプロリンを含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記ジスルフィド結合促進領域は、ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号２０）である、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
少なくともリジン（ＬｙｓまたはＫ）またはシステイン（ＣｙｓまたはＣ）を含むポリグリシンスペーサーをさらに含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記スペーサーは、配列番号１７である、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項１０】
少なくともジスルフィド結合によって互いに共有結合された請求項１から９のいずれか一項に記載の２つの組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質を含む、
二量体タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載の二量体タンパク質であって、
ホモ二量体である、
二量体タンパク質。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
分泌するのに、および、分泌前に切断されるのに、適切なシグナルペプチド配列をさらに含む、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項１３】
請求項１４に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記シグナルペプチドは、配列番号１８および配列番号２１〜３４からなる群より選択される、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項１４】
請求項１２から１３のいずれか一項に記載の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質であって、
前記シグナルペプチドは、マウスＩｇＨシグナルペプチド（配列番号１８）である、
組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質。
【請求項１５】
請求項１から９および１２から１４のいずれか一項に記載の組み換えキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、
配列番号１１（成熟ＰＳＧＬ−１配列）の少なくともａａ５〜１６を含むセレクチン結合ドメイン、配列番号１２（神経網膜特異的なロイシンジッパー）のａａ１８７〜２０８と少なくとも９０％相同または同一のアミノ酸配列を含むロイシンジッパードメイン、および、ジスルフィド結合促進領域を含む、
ＤＮＡ配列。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡ配列であって、
前記ジスルフィド結合促進領域は、以下の一般式：
（Ｘ１）ｎ−Ｃ（Ｘ２）ｍ−（Ｘ３）
によって定義されるアミノ酸配列を含み、
ここで：
−Ｘ１、Ｘ２は、システイン（Ｃｙｓ）を除く任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を表わし、
−Ｃは、Ｃｙｓであり、
−Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、および
−ｎ、ｍは、１〜６からなる整数である、
ＤＮＡ配列。
【請求項１７】
請求項１５から１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含む、
真核生物発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターであって、
グリコシル化酵素β１，６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）およびフコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴＶＩＩ）をそれぞれコードする、配列番号１３および／または１５のいずれか１つまたは両方をさらに含む、
ベクター。
【請求項１９】
請求項１５から１８のいずれか一項に記載のベクターまたはＤＮＡで形質転換された、
哺乳類細胞。
【請求項２０】
請求項１７から１８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクターおよびグリコシル化酵素Ｃ２ＧｎＴおよびＦＴＶＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む真核生物発現ベクターで形質転換された、
哺乳類細胞。
【請求項２１】
請求項１９から２０のいずれか一項に記載の哺乳類細胞であって、
安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞である、
哺乳類細胞。
【請求項２２】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の、
単離されたタンパク質。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離されたタンパク質であって、
配列番号１１の少なくとも１６位のＴｈｒがＯ−結合型グリコシル化されて、少なくとも５位、７位および１０位のＴｙｒが硫酸化された、ホモ二量体である、
単離されたタンパク質。
【請求項２４】
請求項１から１４または２２から２３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質、および、診断的または治療的部分を含む、
コンジュゲート化合物。
【請求項２５】
請求項２４に記載のコンジュゲートであって、
前記の診断的に有用な部分は、放射ラベル、酵素、蛍光ラベル、発光ラベル、金属キレート化合物、ガス充填脂質微小胞、および、前記の診断的に活性の部分の組み合わせからなる群より選択される、
コンジュゲート。
【請求項２６】
請求項２５に記載のコンジュゲートであって、
前記金属キレート化合物は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、４−カルボキシ−５，８，１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−オイック酸（ＢＯＰＴＡ）、ＡＡＺＴＡ、ＤＴＰＡ−Ｇｌｕ、ＤＴＰＡ−Ｌｙｓからなる群より選択される、
コンジュゲート。
【請求項２７】
請求項２５に記載のコンジュゲートであって、
前記のガス充填微小胞の脂質は、リン脂質である、
コンジュゲート。
【請求項２８】
請求項２４に記載のコンジュゲートであって、
前記の治療的に活性の部分は、サイトカイン、細胞増殖抑制剤、毒素、抗炎症剤、免疫調節剤、抗凝集剤、コルチコステロイド、モノクローナル抗体、増殖因子、または、放射性核種を保持するための金属キレート部分を含む放射線治療剤からなる群において選択される、
コンジュゲート。
【請求項２９】
請求項２４から２７のいずれか一項に記載のコンジュゲートであって、
超音波、磁気共鳴、光音響、シンチグラフィー、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、Ｘ線、無線周波聴覚および視覚からなる群において選択されるイメージング方法での使用のための、
コンジュゲート。
【請求項３０】
請求項１から１４または２２から２３のいずれか一項に記載の組み換えキメラタンパク質または請求項２４から２９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、
医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１から１４または２２から２３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質を調製する方法であって、
前記キメラタンパク質を安定して発現する組み換え系を達成するために、請求項１５から１６のいずれか一項のＤＮＡ配列または請求項１７から１８のいずれか一項のベクターによって真核生物細胞を形質転換するステップ、前記培養培地を採取するステップ、および、前記培養培地から前記組み換えタンパク質を精製するステップを含む、
方法。
【請求項３２】
請求項１から１４または２２から２３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質を調製する方法であって、
請求項１９から２１に記載の哺乳類細胞を増殖させるステップ、および、前記の組み換え可溶性キメラＰＳＧＬ−１タンパク質を含む培養培地を採取するステップを含む、
方法。
【請求項３３】
請求項１から１４または２２から２３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質を精製する方法であって、
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、
方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、
前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、強力なアニオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーの後に続く、
方法。
【請求項３５】
セレクチンの過剰発現によって特徴付けられる病理学的状態の診断イメージングのための方法であって、
請求項２４から２９のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項３０に記載の医薬組成物を対象に事前投与するステップ、および、超音波、磁気共鳴、光音響、シンチグラフィー、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、Ｘ線、無線周波聴覚および視覚からなる群において選択されるイメージング方法により画像を記録するステップを含む、
方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
前記病理学的状態は、急性冠症候群（ＡＣＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腫瘍と関連する血管新生、関節リウマチ、虚血再灌流障害および移植片拒絶からなる群において選択される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断的および治療的使用のための新規のセレクチン標的化タンパク質の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
［技術水準］
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は、生理学的血流下で活性化された内皮細胞上の細胞テザリングおよびローリングを仲介する白血球接着分子である。この活性は、白血球溢出における重要な最初のステップである。ＰＳＧＬ−１は、Ｐ−セレクチンに関するリガンドとして初めに同定されて、後の研究により、ＰＳＧＬ−１は、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンに関するリガンドでもあることが明らかにされた（例えば、米国特許第６，２７７，９７５号を参照）。
【０００３】
セレクチンファミリーの２つのメンバー：Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、分子イメージングの関連における特定の関連性を有する。血管内皮上のＰ−およびＥ−セレクチンの上方制御または発現は、炎症の条件下で生じることが知られていて、一方で、休止条件下の内皮セレクチンの存在は、一般に、低〜無（ｌｏｗ  ｔｏ  ｎｉｌ）である。セレクチンが有用な分子イメージング標的である病状は、虚血後損傷、急性冠症候群、関節炎、回腸炎および大腸炎を含む炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化、心筋炎、血栓および多発性硬化症を含む。しかしながら、セレクチン分子イメージングは、皮膚微小血管系のような通常の条件下でセレクチン発現が生じる組織を線引きおよび同定するのに有用であり得る。
【０００４】
Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐとも呼ばれる）の上方制御は、非常に急速に生じることが知られ（数分以内）、Ｐ−セレクチンを、炎症性疾患の初期段階の潜在的マーカーにさせる。Ｐ−セレクチンは、活性化された血小板の表面上にも見られて、それを血栓のマーカーにさせる。Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）は、炎症を起こした血管系上にも発現されるが、一般に、炎症性応答がＰ−セレクチンよりも遅い。Ｅ−セレクチンは、したがって、疾患の後期段階における炎症の有用なマーカーである。
【０００５】
セレクチンのリガンドうち、ＰＳＧＬ−１は、炎症組織への白血球の動員において重要な役割を果たす。白血球は、通常、血管の内皮と相互作用しない。しかしながら、炎症は、血管壁の表面上に、Ｐ−セレクチンのような細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現を引き起こす。血流中に存在する白血球は、ＣＡＭと相互作用することができる。この相互作用プロセスにおける最初のステップは、内皮細胞上のＰ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンと相互作用するＰＳＧＬ−１および付着性血小板によって行われる。この相互作用は、内皮細胞表面上での白血球の「ローリング」をもたらし、炎症組織への白血球の遊出および安定した接着が後に続く。
【０００６】
ヒトＰＳＧＬ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ１４２４２．１；ＧＩ  ２４９８９０４）は、例えば、好中球、単球、リンパ球、樹状細胞、および血小板を含むほとんどの造血細胞の表面上に発現される、ムチン様のホモ二量体のジスルフィド結合した糖タンパク質である。
【０００７】
ヒトＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列は、塩基性アミノ酸対変換酵素（ＰＡＣＥ）に関するコンセンサス切断部位を有するプロペプチド（アミノ酸残基１８〜４１）およびアミノ末端シグナルペプチド（アミノ酸残基１〜１７）を示す。成熟タンパク質のＮ末端細胞外領域は、残基４２で始まる。ＰＳＧＬ−１分子の細胞外ドメインは、多数のＯ−グリコシル化結合部位およびいくつかのＮ−グリコシル化結合部位も含む、いくつかのセリン／トレオニンリッチの十量体リピートを含む。分子のこの領域は、棒状構造に折り畳み、ＰＳＧＬ−１のムチン様特性を担う。好中球に対して、この棒状構造および微絨毛の先端上のＰＳＧＬ−１の局在は、セレクチン発現細胞へのＰＳＧＬ−１の結合を促進する。ＰＳＧＬ−１の十量体リピート領域は、膜貫通領域（残基２６８〜２９２）および細胞質ドメイン（残基２９３〜３６１）が後に続く、
【０００８】
Ｓａｋｏら（Ｃｅｌｌ，１９９３，７５（６），１１７９−１１８６）によって最初に達成された組み換えＰＳＧＬ−１の発現は、セレクチン結合に関連のある領域および修飾を定義することを可能にして、それは、たとえば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，１２：７０７８−７０８７，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，３２：５１９−５２８，Ｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１９９５，８３：３２３−３３１、等において引用され、報告されている。ＰＳＧＬ−１に対する研究全体から、セレクチン結合に重要な領域は、成熟ＰＳＧＬ−１のＮ末端部分にマップされていて、Ｔｈｒ１６に位置するｓＬｅｘを保有するＯ結合型オリゴ糖および３つのチロシン硫酸化部位を有する残基５〜１６を包含する。
【０００９】
ＰＳＧＬ−１の複雑な翻訳後修飾パターンは（タンパク質は、Ｐ−セレクチンのレクチンドメインによるＣａ２＋依存性の認識：フコースおよびシアル酸による特異的なコア２Ｏ−結合型グリコシル化およびチロシン硫酸化のために、２つの別個の翻訳後修飾を必要とする）、この分子が、組み換え真核生物系において発現されるのを必要とする。Ｆｕｇａｎｇ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：３２５５−３２６４は、ｒＰＳＧＬ−１の正しくグリコシル化された形態の組み換え発現に関する必要性を記載する。ＵＳ５，８２７，８１７およびＵＳ６，２７７，９７５は、ＰＳＧＬ−１タンパク質のいくつかの変異体、その中でも、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質、および、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＴ）と組み合わせた、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞におけるそれらの発現を記載する。したがって、免疫グロブリンＦｃフラグメントの部分を有するＰＳＧＬ−１キメラは、正しいグリコシル化のために適切な酵素（単数または複数）を保有しているＣＨＯまたはＣＯＳのいずれかにおいて既に発現されている。
【００１０】
同一出願人は、超音波イメージング微小胞のリン脂質に共有結合した、そのようなＰＳＧＬ−１  ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のより短い変異体は、標的への改善された結合を示して、微小気泡の安定性を増大させることを既に見いだしている。これらの知見は、本発明の同一出願人によって、ＷＯ２０１２／０２００３０に開示される。
【００１１】
本出願は、ＰＳＧＬ−１融合タンパク質のホモ二量体形態の生産のための、非共有結合の二量体化ドメインに依存するＰＳＧＬ−１キメラタンパク質の組み換え発現を開示し、それにより、抗体Ｆｃフラグメントの使用およびそのようなフラグメントの存在の欠点が避けられる。実際に、本発明の組み換え構築物は、ＤＮＡ調節タンパク質、「ロイシンジッパー」の機能性フラグメントの使用を活用し、それは、タンパク質−タンパク質相互作用および転写因子として作用するホモ−またはヘテロ−二量体／多量体形成を促進し、ＤＮＡと相互作用してその発現を調節することが可能である。
【００１２】
ロイシンジッパーは、７番目ごとの（４番目のこともある）アミノ酸位置にロイシン反復を有するタンパク質ドメインであり、右巻きαへリックスを形成することが可能であり、それによって、同一または異なる対部分（単数または複数）とのオリゴマー化を促進して、したがって、ホモ−またはヘテロ−二量体／多量体およびＤＮＡ発現調節特性を生じる。
【００１３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける二量体化ドメインとしてのロイシンジッパーの使用は、二量体抗体またはそれらの機能性フラグメント、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２を生産するために活用されている。Ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６、２７１：７６３０−７６３４における、Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＳｃＦｖ。
【００１４】
酵母ロイシンジッパーであるＧＣＮ４は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭ１３システムでのＦ（ａｂ’）２フラグメントのファージディスプレイに関して、Ｃｈｉｎｇｗｅｉ  Ｖ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，２８４：１１９−１３２において用いられている。
【００１５】
組み換えＣＤ４０を扱っているＷＯ２００５／１０５８４０は、真核生物細胞におけるＣＤ４０変異のオリゴマー化を誘導する、いわゆる「融合パートナー」の使用を提案する。マンノース結合タンパク質、テトラネクチンおよび神経網膜特異的なロイシンジッパーＮＲＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８１８４０）を含むロイシンジッパーのコラーゲン結合ドメインは、あり得る融合パートナーとして挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本出願人は、ここで、ＰＳＧＬ−１機能性フラグメントがＮＲＬ配列の上流にクローニングされると、それらは、正しくプロセッシングされて機能性ホモ二量体として発現されるだけでなく、発現および分泌が、ＰＳＧＬ−１ホモ二量体発現の参照標準となっている、一般に二量体タンパク質発現に用いられるヒンジ領域およびＦｃを保有する標準的なＩｇＧ主鎖を有するＰＳＧＬ−１  Ｆｃ由来の構築物に関して観察されるものよりも、いっそう非常に効率的に生じることを見いだした。
【００１７】
本発明は、ここで、治療的または診断的適用のいずれかでのインビボ使用に適切な量および標準的な質で、Ｐ／Ｅセレクチン特異的な試薬の調製を可能にする。
【００１８】
キメラタンパク質は、組み換えタンパク質の製造に関する安全な使用特性で認識されるＣＨＯ細胞系において高レベルで発現され得て、それは、セレクチン結合に必要とされるグリコシル化および翻訳後プロセッシングを提供することができる。高い発現レベルおよび機能的な翻訳後プロセッシングは、ここで、この試薬の産業上スケールアップを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、少なくともセレクチン結合ドメイン、ロイシンジッパードメインおよびジスルフィド結合促進領域を含む、組み換えキメラＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）タンパク質を開示し、ここで、セレクチン結合領域は、好ましくは、配列番号１１の少なくともａａ５〜１６を含む。
【００２０】
ロイシンジッパードメインは、配列番号１２（神経網膜特異的なロイシンジッパー）のａａ１８７〜２０８と少なくとも９０％相同または同一の、またはより好ましくは、配列番号１２のａａ１８１〜２１５と少なくとも９０％相同または同一の、アミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明の組み換えキメラＰＳＧＬ−１タンパク質では、ジスルフィド結合促進領域（共有結合二量体化ドメイン）は、以下の一般式：
（Ｘ１）ｎ−Ｃ（Ｘ２）ｍ−（Ｘ３）
によって定義されるアミノ酸配列を含み、ここで：
−Ｘ１、Ｘ２は、システイン（Ｃｙｓ）を除く任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を表わし、
−Ｃは、Ｃｙｓであり、
−Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、および
−ｎ、ｍは、１〜６からなる整数である、
または、好ましくは（配列番号２０）である。
【００２２】
組み換えキメラタンパク質は、少なくともジスルフィド結合によって互いに共有結合された上記に定義される２つの組み換えキメラＰＳＧＬ−１モノマーを含む二量体タンパク質であり、好ましくはホモ二量体である。
【００２３】
それは、哺乳類系において発現されて、正確に翻訳後修飾されて、可溶性二量体として高レベルで培養培地中に分泌される。
【００２４】
本発明は、上記に定義される組み換えキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および、哺乳類系（好ましくはＣＨＯ細胞）においてその発現を駆動する真核生物発現ベクターをさらに含む。哺乳類の発現系は、適切なグリコシル化のために、異なるまたは同一の発現ベクター上にグリコシル化酵素β１，６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）およびフコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴＶＩＩ）をさらに含む。
【００２５】
したがって、本発明は、キメラ組み換えＰＳＧＬ−１タンパク質をコードするＤＮＡまたは上記に定義されるベクターによって形質転換された哺乳類細胞、および、哺乳類細胞によって分泌された単離されて精製されたタンパク質をさらに含む。
【００２６】
単離されたキメラタンパク質は、配列番号１１の少なくとも１６位のＴｈｒがＯ−結合型グリコシル化されて、少なくとも５位、７位および１０位のＴｙｒが硫酸化された、ホモ二量体である。
【００２７】
タンパク質は、診断的または治療的部分に関する有用な標的化剤であり、それに対して、好ましくはＣ末端に存在および配置されたアミノ酸Ｃｙｓまたはリジンを含むリンカーまたはスペーサーによってコンジュゲートされ得る。
【００２８】
診断的に有用な部分は、好ましくは、放射ラベル、酵素、蛍光ラベル  発光ラベル、金属キレート化合物、ガス充填脂質微小胞、および、診断的に活性の部分の組み合わせからなる群より選択されて、より好ましくは、金属キレート化合物またはガス充填微小胞である。これらのコンジュゲートは、超音波、磁気共鳴、光音響、シンチグラフィー、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、Ｘ線、無線周波聴覚および視覚によるイメージング、および、セレクチンの過剰発現によって特徴付けられる病理学的状態、例えば：急性冠症候群（ＡＣＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腫瘍と関連する血管新生、関節リウマチ、虚血再灌流障害、移植片拒絶または、より一般的には、生理学的レベルよりも高くＰ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンを発現している任意の臓器または組織で有用である。より好ましくは、病理学的状態は、ＩＢＤ、ＡＣＳ、癌検出または移植片拒絶である。
【００２９】
より好ましくは、本発明のキメラタンパク質は、ＩＢＤ、ＡＣＳ、癌検出および移植片拒絶のための有用な標的化剤である。
【００３０】
治療的に活性の部分は、好ましくは、サイトカイン、細胞増殖抑制剤、毒素、抗炎症剤、免疫調節剤、抗凝集剤、コルチコステロイド、モノクローナル抗体、増殖因子、または、放射性核種を保持するための金属キレート部分を含む放射線治療剤からなる群において選択される。
【００３１】
本発明にさらに含まれるものは、上記に定義される診断的または治療的目的のための組み換えキメラタンパク質またはそのコンジュゲートを含む医薬組成物である。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様は、本発明の組み換えキメラタンパク質を調製する方法であり、キメラタンパク質を安定して発現する組み換え系を達成するために、それをコードするＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列を含む真核生物発現ベクターを用いて真核生物細胞を形質転換するステップ、培養培地を採取するステップ、および、前記培養培地から組み換えタンパク質を精製するステップを含む。
【００３３】
本発明は、さらに、組み換え可溶性タンパク質の精製プロセスに関し、最終のクロマトグラフィーステップとしてヒドロキシアパタイトを含む。ヒドロキシアパタイト、好ましくは、セラミックヒドロキシアパタイトは、好ましくは、強力なアニオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーの後に行なわれる。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様は、本発明に係る組み換え可溶性キメラタンパク質を含む標的化コンジュゲートを用いた、セレクチンの過剰発現によって特徴付けられる病理学的状態の治療的治療のための方法、および、セレクチンの過剰発現によって特徴付けられる病理学的状態の診断イメージングであり、それは、診断的コンジュゲートまたは医薬組成物を対象に事前投与するステップ、および、イメージング方法による画像を記録するステップを含む。そのようなイメージング方法は、好ましくは、超音波、磁気共鳴、光音響、シンチグラフィー、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、Ｘ線、無線周波聴覚および視覚からなる群において選択される。
【００３５】
セレクチンの過剰発現によって特徴付けられる病理学的状態は、好ましくは、急性冠症候群（ＡＣＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腫瘍と関連する血管新生、関節リウマチ、虚血再灌流障害、移植片拒絶、または、より一般的には、生理学的レベルよりも高くＰ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンを発現している任意の臓器または組織からなる群において選択される。より好ましくは、病理学的状態は、ＩＢＤ、ＡＣＳ、癌または移植片拒絶である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】還元および非還元条件下での変異体１〜５由来の馴化培地のウェスタンブロット。レーン１および６：変異体５、それぞれ還元および非還元条件下；レーン２および７：変異体１、それぞれ還元および非還元条件下；レーン３および８：変異体２、それぞれ還元および非還元条件下；レーン４および９：変異体３、それぞれ還元および非還元条件下；レーン５および１０：変異体２、それぞれ還元および非還元条件下。ＭＷマーカーは左である。
【図２】フラグメント１（Ｆｒ−１、実線）および本発明のキメラタンパク質（変異体１Ａ、斜線）の間の、それぞれ１２５ｎＭでのＳＰＲ  Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｐ−セレクチンに対するタンパク質結合応答）比較。Ｙ軸：Ｘ軸上の時間（秒）の関数としての関連／解離／再生を含む、共振ユニット（ＲＵ）応答。
【図３】ラット炎症性後肢の超音波イメージング。画像は、フラグメント−１または変異体１Ａの微小気泡注入の１０分後に、固定された泡イメージング（ＦＢＩ）によって得られた。
【図４】変異体１Ａ−リポソーム−ＤＩＲ（マウス１〜６）またはＦｒ−１−リポソーム−ＤＩＲ（マウス７〜１２）のいずれかを充填したリポソームの注入後の、マウス後肢炎症性ＬＰＳモデルの光学イメージング。  蛍光画像は、リポソーム注入の２時間後に得られた（左足：炎症を起こした足；右足：対側足）。
【図５】実施例１３（ネガティブ）に記載のＨＡ精製後の画分の最終プールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。標的タンパク質の保持時間（Ｒｔ）は、約９．７分である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
別段の提示がない限り、本発明が言及するヒトＰＳＧＬ−１のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ１４２４２．１によって同定される。このアクセッション番号は、機能性ドメイン、例えば、ａａ１〜１７からなるＰＳＧＬ−１のシグナルペプチド領域、ａａ１８〜４１からなるプロ−ペプチド領域も同定し、それは、ａａ４２の成熟タンパク質のスタート（配列番号１１のａａ１に対応）、Ｎ−およびＯ−グリコシル化部位および硫酸化部位を同定する。
【００３８】
神経網膜特異的なロイシンジッパー（ＮＲＬ）アミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６１６８．１（ＧＩ：１７０９３４８、ヒト）によって同定される。本発明において、神経網膜特異的なロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）に対する言及は、ＮＲＬのロイシンジッパー領域において少なくとも９０％相同の全てのアミノ酸配列を含み、マウスＮＲＬ（Ｐ５４８４６）を含む。
【００３９】
ＮＲＬは、Ｓｗａｒｏｏｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２、８９：２６６−２７０によって最初に単離されて特徴付けられて、一塩基多型が同定されている：それらは、機能性であるならば、本発明において；ＮＰ＿００６１６８．１配列内に含まれて、ロイシンジッパードメインは、アミノ酸１８７〜２０８の間に同定されている。ＮＲＬ配列由来のこの領域のＮ末端またはＣ末端域における隣接アミノ酸も、機能性ドメイン（非共有結合二量体化モチーフ）の一部であり得る。
【００４０】
本明細書において用いられる用語「組み換え」は、単離されたＤＮＡの操作および宿主細胞の形質転換を通して、非天然に変更または操作された核酸、外因性核酸によってトランスフェクトされた宿主細胞、または、非天然に発現されたポリペプチドを説明するために用いられる。組み換えは、遺伝子操作技術を用いてインビトロで構築されたＤＮＡ分子を明確に包含する用語であり、分子、構築物、ベクター、トランスフェクトされた細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するための形容詞としての用語「組み換え」の使用は、たとえそれらが天然起源分子と同一の部分的配列を有するとしても、そのような分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
【００４１】
用語「ポリペプチド」は、ペプチドアミド結合（−Ｃ（：Ｏ）ＮＨ−）によって主鎖（側鎖と対照的）を通して結合された２以上のアミノ酸の化合物を指すために用いられる。用語「ペプチド」は、本明細書において、「ポリペプチド」と相互交換可能に用いられるが、一般に、４０よりも少ない、好ましくは２５よりも少ないアミノ酸を有するポリペプチドを指すために用いられる。
【００４２】
用語「タンパク質」は、ペプチドアミド結合（−Ｃ（：Ｏ）ＮＨ−）によって主鎖（側鎖と対照的）を通して結合された４０よりも多いアミノ酸の化合物を指すために用いられる。
【００４３】
本発明において用いられる用語「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」または「キメラ」は、少なくとも１つの非ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに作動可能に結合しているＰＳＧＬ−１ポリペプチドを含む。「ＰＳＧＬ−１ポリペプチド」は、ＰＳＧＬ−１（好ましくはヒト）のアミノ酸配列を共有し、一方で、「非ＰＳＧＬ−１ポリペプチド」は、ＰＳＧＬ−１と実質的に相同でないアミノ酸配列を有し、それは、同一または異なる生物に由来する。好ましい実施態様では、「ＰＳＧＬ−１ポリペプチド」は、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分、または、セレクチン結合領域を定義するａａ５〜１６、領域を包含するＰＳＧＬ−１（配列番号１１）の１〜４７フラグメントのような、なおもセレクチン（特にＰおよびＥセレクチン）に結合する、より短いそのフラグメントを含む。セレクチン結合領域は、任意選択で、ＰＳＧＬ−１配列に由来するａａ５〜１６のＮ末端またはＣ末端において、隣接アミノ酸（単数または複数）を含んでよい。
【００４４】
「融合」または「キメラタンパク質」は、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、プロモーターまたはポリアデニル化部位のような真核生物発現の調節領域の制御下で互いにインフレームで融合された非ＰＳＧＬ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、作動可能に連結することによって、組み換え系において発現および生産される。
【００４５】
用語「結合」は、結合ポリペプチドが、所定の標的を認識して可逆的に結合する、本明細書に記載のものを含む標準的なアッセイによる決定を指す。そのような標準的なアッセイは、限定されないが、平衡透析、ゲル濾過、表面プラズモン共鳴、免疫親和性アッセイ（競合免疫測定法、および、結合に起因する分光学的変化のモニタリングを含む）を含む。
【００４６】
本明細書において用いられる「ラベル基」または「検出可能なラベル」は、検出可能なシグナルを生じることが可能な基または部分である。特に好ましいのは、診断イメージングに有用なラベル、すなわち、磁気共鳴、放射性検出、超音波、Ｘ線、光（ＵＶ、赤外線、蛍光など）によって検出可能な、または、放射性金属、または放射線療法または他の治療形態において用いられ得る他の物質のような、部分を保有するラベルである。特定のラベルは、以下に詳述される。
【００４７】
用語「特異性」は、一方の標的に関して他方よりも高い結合親和性を有する結合ポリペプチドを指す。結合特異性は、２つの試験される標的材料に関する解離平衡定数（ＫＤ）または結合平衡定数（Ｋａ）によって特徴付けられ得る。好ましい実施態様では、本発明の結合ポリペプチドは、約１０μＭ未満、より好ましくは約１μＭ未満、最も好ましくは約０．５μＭ未満、またはさらにいっそう低い、所望の標的に関する解離定数を有する。用語「セレクチン特異性」は、Ｐ、Ｌ、Ｅセレクチンの中で少なくとも１つのセレクチンに関して、無関係の標的よりも高い親和性を有するＰＳＧＬ−１結合部分を指す。
【００４８】
本明細書において用いられる用語「患者」は、任意の哺乳類、特にヒトを指す。
【００４９】
用語「薬学的に許容できる」担体または賦形剤は、本発明の化合物と一緒に患者に投与され得て、その薬理学的活性を破壊しない、非毒性の担体または賦形剤を指す。
【００５０】
用語「標的」または「標的分子」は、結合部分または結合ポリペプチドが、例えば、タンパク質またはポリペプチド、細胞、受容体、炭水化物、脂質などに結合することのできる、任意の物質を指す。本明細書において用いられる「標的」は、単離された形態の、または、細胞、組織または臓器内または表面上に発現された、セレクチンのファミリーを含む。したがって、本明細書において用いられる「標的化」部分は、異なる特定がされないならば、セレクチン、好ましくはＰおよびＥ−セレクチンに結合することが可能な、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはその機能性フラグメントを指す。
【００５１】
用語「治療的薬剤」または「治療的」は、すなわち悪性細胞にインビボで、有益な、治療的または細胞傷害性の効果を有する化合物または薬剤を指す。治療的薬剤は、例えば、生物活性剤、細胞傷害薬、薬物、化学療法薬、放射線療法薬、遺伝物質などと呼ばれる組成物を含む。
【００５２】
用語「正電荷の」アミノ酸は、以下のグループ内：アルギニン、ヒスチジン、リジンのアミノ酸を指す。これらのアミノ酸は、通常、「相互交換可能な」意味として、残基がタンパク質の決定的ドメイン内（例えば、αへリックス、結合ポケット、立体的依存性の制約など）に含まれる場合にたとえこれが適用し得ないとしても、同一グループ内の別のものとの残基の置換は、通常、タンパク質またはポリペプチド内で良好に許容されると考えられる。
【００５３】
用語「負に帯電した」アミノ酸は、以下のグループ内：アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸を指す。これらのアミノ酸は、通常、「相互交換可能な」意味として、残基がタンパク質の決定的ドメイン内（例えば、結合ポケットまたは立体的依存性の制約など）に含まれる場合にたとえこれが適用し得ないとしても、同一グループ内の別のものとの残基の置換は、通常、タンパク質またはポリペプチド内で良好に許容されると考えられる。
【００５４】
用語「極性非帯電側鎖」を有するアミノ酸は、以下のグループ内：セリン、トレオニン、アスパラギンおよびグルタミンのアミノ酸を指す。これらのアミノ酸は、通常、「相互交換可能な」意味として、同一グループ内の別のものとの残基の置換は、通常、上述した例示的な例外を有して、タンパク質またはポリペプチド内で良好に許容されると考えられる。
【００５５】
用語「疎水性側鎖」を有するアミノ酸は、以下のグループ内：アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンのアミノ酸を指す。これらのアミノ酸は、通常、「相互交換可能な」意味として、残基がタンパク質の決定的ドメイン内（例えば、αへリックス、結合ポケット、立体的依存性の制約など）に含まれる場合にたとえこれが適用し得ないとしても、同一グループ内の別のものとの残基の置換は、通常、タンパク質またはポリペプチド内で良好に許容されると考えられる。
【００５６】
タンパク質内で特定の機能を有するアミノ酸は、以下のグループ：システイン、グリシンおよびプロリンに含まれるものである。機能が残基のサイズに起因して行なわれるかどうかに応じて、グリシンは、セリンまたはアラニンのような他の小さなサイズの残基によって置換され得る。矛盾して、システインは、ジスルフィド架橋に関与する場合、置換され得ない。
【００５７】
共有結合二量体化ドメインによって、本出願人は、細胞外環境において安定して、異なるポリペプチド鎖上の他のシステインとジスルフィド架橋（鎖外ジスルフィド架橋）で係合することができるシステインを含むアミノ酸の配列を指す。
【００５８】
非共有結合二量体化ドメインによって、本出願人は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定および／または選択する（ｆａｖｏｒ）ことが可能なアミノ酸の配列を指す。好ましい非共有結合二量体化ドメインは、ロイシン残基の周期的な反復によって決定される構造上αへリックスであり、通常、当該分野において「ロイシンジッパー」と呼ばれる。
【００５９】
本発明によって用いられ得るロイシンジッパーアミノ酸領域は、好ましくは、任意のリジン（ＫまたはＬｙｓ）が欠失している。ロイシンジッパードメインは、通常、ａａロイシンの周期的な反復によって、真核生物「調節」タンパク質内で容易に同定される。それらのうち、すなわち、Ｑ９Ｙ２Ｄ１のロイシンジッパーは、ａａ２３６〜２５０、または活性化転写因子５のロイシンジッパー（ＧＩ：１１４６７８５４６）に対応する。
【００６０】
しかしながら、本発明に係る好ましいロイシンジッパーは：
−哺乳類から単離されて、ヒトＮＲＬタンパク質のフラグメント１８７〜２０８と≧９０％の相同性の程度を共有する、神経網膜特異的なロイシンジッパータンパク質フラグメント、さらにより好ましくは、マウスＮＲＬ（Ｑ５４３Ｙ０）またはヒトＮＲＬのロイシンジッパードメイン、アイソフォーム（ｉｓｏｐｈｏｒｍ）２（Ｐ５４８４５−２）またはウシタンパク質Ｆ１Ｎ４Ｊ１
からなる群において選択される。
【００６１】
詳細な説明
本発明は、セレクチン結合ドメインおよび非共有結合の二量体化ドメインを含む組み換えＰＳＧＬ−１キメラタンパク質を言及し、それはロイシンジッパーであり、より好ましくは、ヒトまたはマウス神経網膜特異的なロイシンジッパーのロイシンジッパードメインであり、好ましくは、ＮＰ＿００６１６８．１（配列番号１２）の少なくとも領域１８７〜２０８、または、より好ましくは、配列番号１２の少なくとも領域１８１〜２１５に対応する。あるいは、非共有結合二量体化ドメインは、ヒトＮＲＬタンパク質のフラグメント１８７〜２０８と≧９０％のホモロジーの程度を共有し、さらにより好ましくは、マウスＮＲＬ（Ｑ５４３Ｙ０）またはヒトＮＲＬのロイシンジッパードメイン、アイソフォーム２（Ｐ５４８４５−２）またはウシタンパク質Ｆ１Ｎ４Ｊ１である。
【００６２】
Ｐ−セレクチン結合ドメインによって、我々は本明細書において、セレクチン、特にＰ−セレクチンに関して結合親和性を有するアミノ酸配列（「活性の配列」）を含むペプチドまたはポリペプチドを指し；前記の活性の配列は、少なくともアミノ酸５〜１６を含み（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９，３２：５１９−５２８）、または、好ましくは、配列番号１１のフラグメント１〜１９、５〜４１および１〜４７の中で選択されて、ここで、アミノ酸１は、成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質の最初のアミノ酸を示し、ＧｅｎＢａｎｋ記録アクセッション番号Ｑ１４２４２．１のａａ４２に対応する。
【００６３】
ＰＳＧＬ−１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ記録において定義される膜貫通ドメインの近くのＣｙｓ３２０でジスルフィド結合によって連結された、膜貫通ホモ二量体である。
【００６４】
現在までに、組み換えＰＳＧＬ−１の二量体化は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを、ＰＳＧＬ−１セレクチン結合ドメインの下流に導入することによって達成されている。Ｆｃドメインは、ジスルフィド架橋で係合された少なくとも２つのシステインを有するヒンジ領域を含み、ホモ二量体でキメラタンパク質を共有結合する。免疫グロブリンＦｃ領域は、セレクチン結合に必須の二量体化を改善または促進するために、いくつかの組み換え系で用いられている。
【００６５】
しかしながら、Ｆｃドメインの存在は、いくつかの欠点を示す。第一に、Ｆｃドメインに融合されてガス微小胞の表面に結合されたＰＳＧＬ−１は、凝集体の形成を引き起こすことが示された（ＷＯ２０１２／０２００３０）。さらに、Ｆｃドメインは、マクロファージによって発現されるＦｃ受容体の特異的な認識を通して免疫反応もトリガーし得る。これは、Ｆｃタンパク質フラグメントを保有する分子の、血液循環からのクリアランスもたらし得て、または、アレルギー反応のような免疫応答をトリガーし得る。
【００６６】
実際のところ、本発明の同一出願人は、より短いＦｃ領域は、微小気泡製剤に用いられる誘導体に、改善された特性を提供することを見いだした。そのような欠点は、本発明によって克服されて、ここで、ヒトＮＲＬのロイシンジッパードメインは、Ｆｃ領域を置換する。この領域は、配列ＮＰ＿００６１６８．１（配列番号１２）の領域１８１〜２１５由来の、好ましくは、少なくとも、ＮＰ＿００６１６８．１のａａ１８７〜２０８または好ましくはａａ１８６〜２０９、１８５〜２１０、１８４〜２１１、１８３〜２１２、１８２〜２１３、１８１〜２１４、１８１〜２１５、１８６〜２０８、１８６〜２１０、１８７〜２０８、または、少なくともａａ１８７〜２０８プラスさらなる１、２、３、４、５、６または７個の隣接アミノ酸をＮ末端またはＣ末端または両方に含む任意のフラグメントを含む、神経網膜特異的なロイシンジッパーのロイシンジッパードメインである。
【００６７】
本出願人は、ＤＮＡ調節タンパク質ＮＲＬのロイシンジッパードメインは、ジスルフィド架橋の形成を選択すること（ｆａｖｏｕｒｉｎｇ）によってキメラ単量体の効率的な共有結合二量体化を可能にするだけでなく、哺乳類の組み換え系において二量体機能性タンパク質の非常に効率的な発現および分泌も提供することを見いだした。
【００６８】
さらにいっそう驚くべきことに、この新規のキメラタンパク質は、正しく翻訳後修飾されて、すなわち、予期されるＰＳＧＬ−１領域内のＴｙｒで正しくＯ−グリコシル化および硫酸化されて、二量体であり、ジスルフィド架橋（単数または複数）によって共有結合して、ＷＯ２０１２／０２００３０に記載の最適化されたフラグメント１（Ｆｒ−１）よりも優れた、または少なくとも同等の親和性でセレクチン標的に結合する。これらの結論は、実験部分により詳述されている多くのデータによって得られている。
【００６９】
上記の知見は、本発明のキメラタンパク質（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１および神経網膜特異的なロイシンジッパー）（本明細書においてｓＰＳＧＬ−１−ＮＲＬと呼ばれる）は、関係のないタンパク質由来のドメインの組み合わせであり、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントのような当該分野で一般に用いられる他の二量体化ドメインとインフレームで融合されたＮ末端領域としてＰＳＧＬ−１セレクチン結合ドメインを保有するように改変された他のキメラタンパク質の発現レベルと比較した場合、よりいっそう独特であるので、かなり驚くことである。
【００７０】
特に、本発明の好ましい実施態様の１つにおいて、配列番号１１のＰＳＧＬ−１ドメイン１〜４７は、
−以下に定義される少なくともシステインを含む共有結合の二量体化ドメイン（好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃまたはＣＨ３ドメインの代わりに、ＮＲＬロイシンジッパーのような非共有結合の二量体化ドメイン（または安定化ドメイン）が後に続き、またはあるいは先行し、およびインフレームで融合される）；
−任意選択でおよび好ましくは、Ｃ末端において連結される基または部分との任意の立体障害を避けるための、Ｃ末端におけるスペーサー、および
−成熟キメラタンパク質において切断されるのに適切であり、好ましくは内因性ＰＳＧＬ−１シグナルおよびプロ−ペプチド配列ではない、キメラタンパク質のＮ末端における分泌のためのシグナルペプチド
と、インフレームで融合されている。
【００７１】
哺乳類系における発現に関して生産および試験されているいくつかの変異体のうち：変異体１および１Ａは、本発明のＰＳＧＬ−１−ＮＲＬキメラタンパク質（配列番号２および配列番号３７）の好ましい実施態様を示し、変異体２（配列番号４）は、共有結合および非共有結合二量体化（または安定化）ドメインとしてそれぞれ用いられるヒトＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ３ドメインとインフレームで融合したＰＳＧＬ−１に対応し、または、変異体５（配列番号１０）は、比較目的のために調製されたＷＯ２０１２／０２００３０に記載の最適化されたフラグメント１の同一の機能性ドメインを含む。注目すべきことに、目的のタンパク質変異において、上述した配列リストは、発現された成熟型において切断されるシグナルペプチドを同定する。
【００７２】
特に、変異体１を含むＮＲＬロイシンジッパーのみが、医薬品の生産に適切な発現レベルを提供することが観察されている。同一の細胞系において発現された変異体１〜５の相対的発現の比較データが図１に提供されて、ここで、タグ化キメラタンパク質の発現レベルは、一過性発現、変性および非変性条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、Ｃ末端に配置された共通タグ（すなわちＦＬＡＧオクタペプチド）に向けられた抗体を用いたウェスタンブロットによって評価された。
【００７３】
したがって、特定の理論に関連付けられずに、非共有結合の二量体化ドメイン、例えば、ロイシンジッパーおよびより好ましくは、生理的に二量体であるタンパク質（ＰＳＧＬ−１）におけるタンパク質−タンパク質相互作用を選択する（ｆａｖｏｕｒ）ＮＲＬのロイシンジッパーの存在は、本発明の最終的なキメラタンパク質の好ましい折り畳みまたは安定化効果のいずれかによって、改善された発現レベルをもたらし、それは、培地中の単一のクローン単離および安定化によってさらに最適化され得ると考えられる。予備クローン選択後に与えられる力価は、０．１ｇ／Ｌより十分高い。
【００７４】
本発明のキメラタンパク質では、共有結合二量体化ドメイン（代替的にジスルフィド結合（単数または複数）促進領域と呼ばれる）は、２つのキメラタンパク質単量体が、少なくとも１つのジスルフィド架橋を通して共有結合されるように、単量体キメラタンパク質の対部分における別のＣｙｓとジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのＣｙｓ残基を含む。
【００７５】
共有結合二量体化ドメインを包含する一般式は：
（Ｘ１）ｎ−Ｃ（Ｘ２）ｍ−（Ｘ３）
であり、
ここで、Ｘ１およびＸ２は、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を表わし；Ｃは、システインであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、ｎおよびｍは１〜６からなる整数である。Ｘ１は、好ましくは、プロリン、ヒスチジンまたはトレオニンを含み；さらにより好ましくは、プロリンおよびヒスチジンまたはヒスチジンおよびトレオニンまたはプロリンおよびトレオニンを含む。好ましい実施態様によれば、Ｘ１は、プロリン、ヒスチジンおよびトレオニンを、好ましくはこの順序で含み、ｎは、最大で５である。Ｘ２は、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸またはアミノ酸配列であり、好ましくはプロリンを含む。好ましくは、Ｘ２は、Ｐｒｏ−Ｐｒｏであり；Ｘ３は、好ましくはシステインであり、少なくともプロリンを含む。より好ましくは、システインを保有する領域は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、またはその機能性フラグメントである。好ましいジスルフィド結合促進領域は、ＰＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２０）である。
【００７６】
好ましい実施態様によれば、キメラタンパク質は、Ｃ末端にスペーサーをさらに含み、それは、他のペプチドまたはイメージングおよび／または治療的部分のような化学的部分との共有結合の生体共役反応に適切な残基を含む。生体共役反応のための例示的なアミノ酸は、システインおよびリジンである。スペーサーは、約４〜２０アミノ酸の長さであり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕからなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸を含み；それは、そのＣ末端、好ましくは最後から２番目の位置に、システインまたはリジンを保有する。スペーサーは、好ましくは、アラニンまたは他の中性アミノ酸、例えばバリンまたは同様のものを埋め込んだポリ−グリシンであり、それは、システインまたはリジン、好ましくはリジンを保有し、ここで、前記のコンジュゲートアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、好ましくは少なくとも１つのＧｌｙが後に続く。スペーサーは、好ましくは配列Ｇ４ＡＧ４ＫＧ（配列番号１７）を有する。あるいは、キメラタンパク質は、そのＣ末端に、すなわち、認識および精製目的のために、Ｆｌａｇ配列を含む。Ｆｌａｇ配列は、一般に当業者によって用いられて、当該分野において知られている。１つの例は、ＤＹＤＤＤＤＫ配列（配列番号３５）であり、適切な抗体を用いた免疫親和性によってタンパク質の認識および／または精製を可能にする。
【００７７】
好ましい実施態様によれば、単量体タンパク質は、シグナルペプチドとともに前駆体として翻訳されて、その結果、プロセッシングされて、シグナルペプチドの切断後にホモ二量体として培養培地（馴化培地）中に最終的に分泌される。
【００７８】
分泌のためのシグナルペプチドは、キメラタンパク質の前駆体のＮ末端に存在する。好ましくは、シグナルペプチドは、マウスＩｇＨシグナルペプチドであり、配列：ＭＥＷＳＷＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１８）を有する。ＰＳＧＬ−１内因性シグナルペプチド配列または組み換えタンパク質発現の分野で一般に用いられる他の異種シグナルペプチド配列のような、他のシグナルペプチド（またはリーダーペプチド）が用いられ得て、翻訳後にプロセッシングされた組み換えタンパク質の分泌を可能にする。当該分野において公知の一部のシグナル（またはリーダー）ペプチドの例が、表１に提供されている。
【００７９】
【表１】
2019513344.tif 000003
2019513344.tif 000004
【００８０】
配列番号１８に対する代替として、配列番号２４から配列番号３４までの任意の上記のシグナルペプチドが、組み換えタンパク質の分泌を達成するために用いられ得る。
【００８１】
本発明のＰＳＧＬ−１−ＮＲＬキメラ組み換えタンパク質は、それぞれの単量体が上記に定義される組み換えＰＳＧＬ−１であり正しくグリコシル化および硫酸化された形態で生産された場合、効率的にＰ／Ｅセレクチンに二量体形態で結合する。いくつかの研究がこれまでに公表されて、Ｐ／Ｅ／Ｌセレクチン結合のためのＰＳＧＬ−１翻訳後動員、すなわち、グリコシル化、硫酸化をレビューして、このプロセッシングおよびセレクチン結合に重要な残基をマッピングした（Ｒ．Ｄ  Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９９、３２（５）：５２０−５２８、および、Ｄ．Ｓａｋｏ  Ｃｅｌｌ，１９９５，８３：３２３−３３１）。
【００８２】
本発明に係るキメラタンパク質の好ましい実施態様では、シアリル化（シアル酸の存在）は、弱酸性処理後の質量分析（ＬＣ−ＭＳ）と組み合わせた液体クロマトグラフィーによって評価された。本発明の組み換えタンパク質のシアリル残基の含有量は、約５％〜３０％ｗ／ｗ、１０％〜２８％ｗ／ｗ、１５％〜２５％ｗ／ｗ、より好ましくは１５％〜２５％を含んでよい。
【００８３】
組み換えキメラタンパク質を特徴付けるために、Ａｓｐ−Ｎおよびキモトリプシン酵素消化によってペプチドマッピングを行なった。
【００８４】
ピログルタミン（ｐＧｌｕ）に対するＮ末端グルタミン（Ｇｌｎ）環化、Ｔｙｒ硫酸化、Ｔｈｒ  Ｏ−グリコシル化（Ｃｏｒｅ  ２  ＳＬｅＸの存在）および二量体構造も評価されて、実験部分により詳述される。
【００８５】
タンパク質の二量体構造は、組み換えタンパク質の好ましい実施態様に従って（ＴＣＰＰＣＰＬ）２フラグメントを提供する、キモトリプシン切断によって確認された。
【００８６】
Ｎ末端チロシン（Ｙ）残基５、７および１０の硫酸化は、Ａｓｐ−Ｎ消化によって確認された。ＳＬｅＸ四糖モチーフによるＯ−グリコシル化は、キモトリプシン切断によってトレオニン１６上に確認された。
【００８７】
上記の全てから、キメラタンパク質において、セレクチン結合に重要なＰＳＧＬ−１のＮ末端ドメインは、成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質の５位、７位および１０位に対応するＴｙｒ残基で正しく硫酸化されて、および、１６位のトレオニン残基でグリコシル化、特にＯ−結合型グリコシル化されて；Ｏ−結合型グリカンは、典型的に、糖残基、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース、グルコース、ガラクトース、マンノース（Ｍａｎ）、ヘキソース、キシロース、シアル酸またはそれらの混合物を含むと結論付けることができる。
【００８８】
これらの翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、配列番号３８に要約されている。
【００８９】
好ましくは本発明のキメラタンパク質のＰＳＧＬ−１部分に存在するＯ−結合型グリカンは、好ましくはＧａｌＮａｃ、ＧｌｃＮＡｃ、フコース、シアル酸およびガラクトースである。ＰＳＧＬ−１上のＯ−結合型グリカンは、好ましくは、シアル酸付加およびフコシル化されて、および好ましくはトレオニン残基に結合したシアリル・ルイスＸグリカン構造（ｓＬｅｘ、シアル酸−ガラクトピラノシル−フコース−Ｎ−アセチルグルコサミン）からなる。
【００９０】
このタイプの翻訳後修飾は、Ｐ−セレクチン結合に必須であると説明されている（Ｒ．Ｄ  Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９９，３２（５）：５２０−５２８、および、Ｄ．Ｓａｋｏ  Ｃｅｌｌ，１９９５，８３：３２３−３３１）。
【００９１】
二量体が形成されてそれぞれの単量体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって互いに共有結合される。
【００９２】
キメラタンパク質の正しい翻訳後プロセッシングは、過去にＰＳＧＬ−１発現に用いられているＨＥＫ−２９３、ＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞内での発現によって達成されている。いずれに場合においても、ＰＳＧＬ−１は、好ましくは、Ｃ２ＧｎＴ（ｃｏｒｅ  ２  β１−６−Ｎアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）および、以下：Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ（Ｆｕｃ−Ｔ：フコシルトランスフェラーゼ）、Ｆｕｃ−ＩＶまたはＦｕｃＴＶＩＩ（Ｆｕｇａｎｇ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：３２５５−３２６４）またはそれらの機能性フラグメントの１つのようなフコシルトランスフェラーゼ酵素とともに、哺乳類細胞内で同時発現される。好ましくは、ＦｕｃＴＶＩＩまたはその機能性フラグメントが用いられる。細胞、好ましくは懸濁液増殖に適合されたＣＨＯは、ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地（他の血清フリーの化学的に規定された培地、例えば、ＡｃｔｉＣＨＯ（商標）（ＧＥ／ＰＡＡによる）、ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）、ＣｅｌｌＶｅｎｔｏ（商標）  ＣＨＯ  ２００およびＣｅｌｌＶｅｎｔｏ（商標）  ＣＨＯ２２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅによる）、８３８３６Ｃ（ＳＡＦＣによる）、ＢａｌａｎＣＤ（商標）（Ｉｒｖｉｎｅによる）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによる）などが成功的に用いられ得る）を用いて、選択圧の不存在下で、少なくとも７日、通常は１４日まで、増殖が可能にされる。グルタミン（またはアナログＧｌｕｔＭａｘ（商標））を、１〜１０ｍＭ、好ましくは４〜８ｍＭで補充した。ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）およびＡｃｔｉＣＨＯ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、発現目的に好ましい。
【００９３】
キメラタンパク質は、アニオン交換、疎水性相互作用およびサイズ排除またはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを含む、３ステップクロマトグラフィーによって、必要とされる純度レベルに精製され得る。最終の精製ステップとしてＨＡカラムを含む精製が好ましく、治療的グレードの純粋なキメラタンパク質を提供する。
【００９４】
したがって、さらなる実施態様によれば、本発明は、上記に定義されるキメラタンパク質のための精製プロセスを含み、最終ステップとしてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを含む。より好ましくは、精製プロセスは、強力なアニオン交換（ＡＥ）上で行なわれる第一のクロマトグラフィー、疎水性相互作用（ＨＩ）固相上で行なわれる第二のクロマトグラフィー、および、ＨＡ、好ましくはセラミックヒドロキシアパタイト上で行なわれる第三のステップを含む。
【００９５】
より一般には、本発明は、任意の可溶性ＰＳＧＬ−１を含む融合またはキメラタンパク質の精製のためのプロセスを指し、ここで、前記ＰＳＧＬ−１は、成熟ＰＳＧＬ−１（配列番号１１）の少なくともａａ５〜１６を含み、さらに、そのような５〜１６フラグメントのＮ末端またはＣ末端に１つまたは複数の隣接アミノ酸を含む。
【００９６】
より好ましくは、キメラタンパク質中のＰＳＧＬ−１フラグメントは、成熟ＰＳＧＬ−１の少なくともａａ１〜４７までの全ての隣接アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、キメラタンパク質は、さらに、配列番号１２（神経網膜特異的なロイシンジッパー）の少なくともａａ１８７〜２０８または前記１８７〜２０８領域と少なくとも９０％相同または同一のアミノ酸配列および一般式によって上記に定義した共有結合の二量体化ドメインを含む。キメラタンパク質に関する一般の実施態様は、配列番号３９を有する。
【００９７】
しかしながら、最終ステップとしてＨＡを含む本発明の精製プロセスは、Ｎ末端に保有している任意のキメラまたは組み換えタンパク質に対して成功的に適用され得て、成熟ＰＳＧＬ−１のＮ末端領域は、ＰＳＧＬ−１の少なくともａａ５〜１６または１〜４７を含む。
【００９８】
最終の精製ステップとしてＨＡを含むプロセスは、他のタンパク質から９５％、好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％よりも高いＰＳＧＬ−１の純度を達成することを可能にし、測定されると、すなわち、ＤＮＡ定量キット、蛍光アッセイ（Ｓｉｇｍａ）のような市販のＤＮＡ定量アッセイにより、汚染ＤＮＡから実質的にフリーである。
【００９９】
最終収率に関して、標的タンパク質は、合計キメラ標的タンパク質含有量の５０％よりも高い、典型的には６０％よりも高い、一般に、約７０％またはそれよりも高い収率で、上述のプロセスによって回収される。これらの収率は良好な結果を表わし、工業プロセスに関して最も重要なことに、それらはかなり標準化されて、非常に低い変動で再現可能である。
【０１００】
これらの特性を有する標準的な工業用樹脂またはカラムは、製造元の説明書に従って用いられ得る。セラミックＨＡは、市販され、すなわち、ＢＩＯＲＡＤ由来である。精製および溶出条件は、当業者に公知であるように調整され得る。
【０１０１】
スケールアップしやすさのために、グラジエント溶出は、工程内分析の数を制限および全体的なプロセス時間を低減するために、別々のステップ溶出で有利に置換され得る。以下に説明される変異体１および１Ａの好ましい実施態様では、精製されたタンパク質（純度≧９０％）が特徴付けられて、および：
・リーダーペプチドの正確な除去が確認される；
・ＰＳＧＬ変異体１Ａ糖タンパク質のＮ末端構造は、主にピログルタミン酸形状のｐＱＡＴＥＹＥＹＬである。実際に、Ａｓｐ  Ｎ消化酵素の使用は、Ｎ末端Ｇｌｎ環化の検出を可能にして、そのプロセスによって、Ｇｌｎ残基はＮ末端に存在し、自然に起こる環化を受けてピログルタミン酸を形成する傾向がある；
・ＰＳＧＬ変異体１Ａの二量体特性は、還元および非還元条件下でのゲル電気泳動および酵素消化後のＬＣ−ＭＳを用いたフラグメント特性化によって確認されている。実験的データは、ＰＳＧＬ変異体−１Ａは、完全にその二量体形態であり得ることを示す；
・Ｔｈｒ１６上のＯ−グリカン部分の存在が確認されて、その構造が同定されている。予測されたシアリル−ルイス−Ｘモチーフ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコースおよびシアル酸を含むＣｏｒｅ２構造は、実験的部分により詳述されるように、示されている；
・Ｌ−およびＰ−セレクチンの両方への結合に重要な成熟タンパク質の残基Ｙ５、Ｙ７およびＹ１０の硫酸化も確認されている。糖タンパク質硫酸化のモニタリングは、質量分析によって行われた。当業者に知られているように、この標的キメラタンパク質において示されたチロシン５、７および１０の硫酸化は、ＰＳＧＬ−１および変異体１Ａ生物活性に極めて重要である。
【０１０２】
さらなるタンパク質特性化データは、本出願において報告されていて、実験部分により詳述されている。
【０１０３】
したがって、主な態様によれば、本発明は、Ｐ、ＬおよびＥセレクチン、好ましくはＰセレクチンに結合することが可能な、上記に定義される単離されて精製されたＰＳＧＬ−１キメラタンパク質を指す。
【０１０４】
単離された組み換えタンパク質は、ホモ二量体であり、ここで、それぞれのホモ二量体は、以下のアミノ酸配列を、より好ましくはこの順序で、含むまたは好ましくはからなる、一次配列を有する：
−成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質（配列番号１１）のＮ末端におけるアミノ酸１〜４７；
−上記に定義される、式：（Ｘ１）ｎ−Ｃ（Ｘ２）ｍ−（Ｘ３）、より好ましくは配列番号２０とのジスルフィド架橋に適切なシステインを含むまたはからなる、少なくともアミノ酸配列；
−ＮＲＬ（配列番号１２）の少なくともａａ１８１−２１５；
−任意選択で、少なくとも１つまたは複数のＧｌｙおよび／またはＡｌａ、および、好ましくは、Ｃ末端またはより好ましくは最後から２番目の位置におけるＬｙｓまたはＣｙｓのようなアミノ酸を保有する、１５ａａまでの長さのアミノ酸スペーサー。より好ましくは、そのようなスペーサーは、４、５、６、７、８、９または１０グリシンで構成されるポリ−グリシンであり、好ましくは、少なくともアラニンを含んで埋め込んでいて、より好ましくは、さらなる化学的コンジュゲーションのために最後から２番目の位置にリジンをさらに含む。さらにより好ましくは、アミノ酸スペーサーは、配列番号１７である。したがって、特に好ましい実施態様では、キメラタンパク質は、配列番号３７を有し、ここで、成熟タンパク質において切断されるシグナルペプチドは、まだ表わされている。翻訳後に修飾されて、キメラ標的タンパク質単量体は、好ましい実施態様として配列番号３８に示される。
【０１０５】
以下：
−上記に十分に定義される、セレクチン結合、
−共有結合二量体化（すなわち、Ｃｙｓは、隣接領域を有するモチーフを含む）、
−好ましくは最後または最後から２番目の位置（すなわちＬｙｓまたはＣｙｓ）において、キメラタンパク質をコンジュゲートするための残基（単数または複数）を好ましくは含む、非共有結合二量体化（すなわち、モチーフは、少なくともＮＲＬ  ａａ１８７〜２０８を含む）
に必須のモチーフまたは領域を有するキメラ変異タンパク質の一般式も、配列番号３９に報告されている。
【０１０６】
単離されて精製されたＰＳＧＬ−１キメラタンパク質の純度は、すなわち、実験部分により詳述されるビアコア機器で、ＵＰＬＣ−ＵＶまたは表面プラズモン共鳴によって決定され得る。
【０１０７】
また、本発明は、上記のタンパク質を単量体の形態でコードする任意のＤＮＡ配列も指し、好ましくは、上記に定義されるキメラタンパク質の配列番号２のアミノ酸１〜１１８をコードするヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施態様によれば、ヌクレオチド配列は、配列番号３６のｎｔ１〜３５４を包含し、好ましくは、ヌクレオチド１〜３６０からなる。
【０１０８】
あるいは、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、少なくともＰＳＧＬ−１のＰ−セレクチン結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号１１のａａ１〜４７、および、神経網膜特異的なロイシンジッパードメイン（配列番号１２）の少なくともａａ１８７〜２０８をコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択で、Ｎ末端またはＣ末端に１、２、３、４、５、６個の隣接アミノ酸を含み、または、より好ましくは、ＮＲＬ（配列番号１２）の少なくともａａ１８１〜２１５をコードする。
【０１０９】
遺伝コードの余剰は、異なるコドンが単一アミノ酸に用いられることを可能にして、したがってコドンの異なる組み合わせ、すなわち異なるＤＮＡ配列は、同一の一次アミノ酸配列を有するタンパク質を発現すること、および、同一の組み換えタンパク質を生産することを可能にする。そのような異なるＤＮＡ配列は、それぞれの生物に関する好適なコドンを用いることによって選択された組み換え系において発現を最適化するように設計され得て、したがって、全て、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１０】
特に好ましい組み換えキメラタンパク質は、配列番号１のｎｔ１〜３５４によってコードされる配列番号２のａａ１〜１１８を包含する。配列番号２のアミノ酸１〜１１８は、任意選択で、少なくとも、標識化または治療的部分の反応基との化学的コンジュゲートに適切なアミノ酸をＣ末端にさらに含み、ここで、前記アミノ酸は、リジンまたはシステインである。より好ましくは、そのような反応性アミノ酸は、少なくとも別の非帯電アミノ酸、好ましくはグリシンが後に続く。さらにより好ましくは、コンジュゲートに適切なアミノ酸は、１５ａａまでのアミノ酸配列のＣ末端に位置し、少なくとも１つの中性または非帯電アミノ酸、例えばグリシンが後に続く。
【０１１１】
本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む発現ベクター、および、組み換え配列を保有するトランスフェクトされた細胞クローンをさらに含み、一時的または安定的にゲノム内に組み込まれる。好ましい細胞クローンは、ベクターの安定的に組み込まれたＤＮＡコピーを保有するもの、例えば、哺乳類細胞発現に標準的に用いられる発現ベクターとともに、ＣＨＯ細胞で、より好ましくは、すなわち、ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅによるＦｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ（商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において入手可能な、懸濁液増殖に適合されたＣＨＯ細胞で得られるものである。
【０１１２】
懸濁液に適合されたＣＨＯ細胞は、組み換えタンパク質の高効率分泌を達成するために、約２．１０７細胞／Ｌの密度に増幅および増殖され得る。
【０１１３】
さらなる態様によれば、本発明は、上記に定義される組み換えキメラタンパク質を調製するためのプロセスを含み、それをコードするＤＮＡ配列またはそれをコードするＤＮＡ配列を含むベクターで真核生物細胞を形質転換して、キメラタンパク質を安定して発現する組み換え真核生物系、好ましくはＣＨＯ細胞系を得るステップ（ここで、前記キメラタンパク質は、好ましくは培地中に分泌される）、培養培地を採取するステップ、および、精製によって前記培養培地から組み換えタンパク質を回収するステップを含む。
【０１１４】
精製された組み換えキメラタンパク質は、それから、Ｃ末端残基を通して診断的および／または治療的部分に成功的にコンジュゲートされ得て、または、そのようにして、すなわち、医薬組成物において適切な成分または賦形剤と組み合わせて、用いられる。
【０１１５】
診断的および治療的適用のためのキメラタンパク質のコンジュゲート
本発明のキメラタンパク質は、それに連結された診断的および治療的に活性の部分を、セレクチンを発現している組織、細胞または臓器に標的化するために用いられる。ＰＳＧＬ−１領域またはそのフラグメントによって提供されるキメラタンパク質の特異性は、正しく翻訳後修飾された場合、セレクチンを標的化する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３：７０７８−７０８７）。この発現系において、標的に対する結合強度は、非常に独特な二次構造によって与えられるロイシンジッパーのような非共有結合二量体化ドメインの存在によって変更されないことが確認されている。
【０１１６】
したがって、主な実施態様の１つによれば、本発明は、セレクチンを発現している細胞、組織、臓器などに対するイメージング部分の標的化剤としてキメラタンパク質を含むコンジュゲートに関する。
【０１１７】
「イメージング部分」によって、我々は、診断イメージング手順によって検出可能な任意の部分、すなわち、超音波（ＵＳ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、Ｘ線イメージング、光音響イメージング、蛍光および光学イメージング（本発明においては、術中イメージング、すなわち、診断的に有用な、好ましくは対比される画像の登録を可能にする任意の技術を含む）を含む、現在使用されているイメージング診断技術によって検出されるシグナルを、提供し、改善し、または、いずれにせよ有利に改変することが可能な、任意の診断的に効果的な部分を指す。複合型イメージング方法も本発明において検討されて、ここで、キメラタンパク質は、異なるイメージング方法によって検出可能な少なくとも２つの部分に連結される。複合型イメージングの例は、ＰＥＴ／ＣＴ、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ、ＭＲ／ＰＥＴ、ＭＲ／ＳＰＥＣＴ；超音波およびＭＲ、超音波およびＣＴ；ＭＲおよびＣＴである。
【０１１８】
イメージング部分は、デュアル検出のために、イメージング部分の任意の可能な組み合わせを含んでよく、例えばＭＲＩ／ＰＥＴについては、常磁性金属キレートユニットおよび放射性核種キレートユニットを含んでよい。本発明に係る診断的に効果的な部分の例は、例えば、キレートされたγ線または陽電子放出放射性核種；キレート化またはポリキレート化錯体の形態での常磁性金属イオン、２０よりも高い原子数を有する原子を含むＸ線吸収剤；色素分子；蛍光分子；燐光分子；ＵＶスペクトル内で吸収する分子；量子ドット；近または遠赤外線放射線内で吸収が可能な分子、および、一般に、検出可能なシグナルを産生または検出系と特異的に相互作用する全ての部分を含む。上記の全てから、用いられるイメージングモダリティは、本発明の診断化合物が結合されるイメージング検出可能部分に従って選択されなければならないことが、当業者に知られている。したがって、例えば、キメラタンパク質に連結されたＣｙＣ５のような蛍光イメージング部分については、蛍光の光検出系が適切である。
【０１１９】
以下の表は、一部の例示的なコントラスト生成剤および好ましいイメージングモダリティを提供する。
【０１２０】
【表２】
2019513344.tif 000005
【０１２１】
分子標的化のための、診断的および治療的部分に対するキメラタンパク質のコンジュゲート
本発明のキメラタンパク質のコンジュゲートの調製は、通常、化学的手段によって行なわれる。
【０１２２】
コンジュゲートパートナー、すなわちキメラタンパク質の反応基、および、それにコンジュゲートされる基（単数または複数）は、「保護された」形態で存在または調製される。この説明において、別段の指示がない限り、用語「保護基」は、それが結合される官能基の特徴的な化学的機能を保つように適合された保護基を指示する。特に、この文脈において、保護基は、アミノまたはカルボキシル官能基を保つために用いられる。適切な保護基は、したがって、例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはアルキルエステルまたはそのような官能基の保護を一般に意図しておよび当業者に公知の他の基を含んでよい。
【０１２３】
ポリペプチドユニット、例えば、本発明のキメラタンパク質のＮ末端（−ＮＨ２）またはＣ末端（−ＣＯＯＨ）基と化学的に反応して、化学的反応を通してそのような基を、対応するポリペプチド／タンパク質のセレクチンに向かう特異性を維持する適切な誘導体に形質転換することが可能であるが、異なる部分上の、それぞれ、カルボキシルまたはアミノ官能基と化学的に反応することができない他の化学基は、「非活性化基」と呼ばれる。非活性化基は、カルボキシアミド架橋反応に関与すべきものでない。１つの例は、対応する非反応性アセチル化ＡｃＨＮ基に変換することによって、ペプチド鎖のアミノ末端を非活性化するために用いられる、アセチル基［ＣＨ３（ＣＯ）−またはＡｃとも呼ばれる］によって表される。
【０１２４】
一方で、アミノ基自体およびその誘導体、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ３）またはＨ２ＮＯＣ−ＣＨ２−ＮＨ−は、それぞれ、対応する−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（ＣＨ３）または−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２非反応性アミドを与えることによって、フリーのカルボキシル基のための「非活性化基」として用いられ得る。
【０１２５】
例えば、キメラタンパク質が活性アミノ基（例えば、リジンの一次アミノ基）を含む場合、それは、適切な対応する反応性部分、例えばイソチオシアネート基（チオカルバミド結合を形成する）、反応性エステル（アミド結合を形成する）、カルボニル基（アミン結合に還元され得るイミン結合を形成する）、活性化されたヒドロキシル基（例えば、トシレート、トレシル化またはシアネート、ビニルスルホンまたはエポキシドの形態）を含む、微小胞の構成要素のような診断的部分と反応され得る。
【０１２６】
あるいは、本発明の標的化リガンドが反応性チオール基を含む場合、診断的または治療的部分、すなわち微小胞の構成要素上の適切な相補反応性部分は、ハロアセチル誘導体、マレイミド（チオエーテル結合を形成する）、または、２−ピリジルチオ（ＰＤＴ）基の形態のスルフィド（標的化リガンドに由来するチオールとの反応の際に、安定したジスルフィド結合の形成を生じる）、活性化されたヒドロキシル基（例えば、トシレート、トレシル化またはシアネート、ビニルスルホンまたはエポキシドの形態）を含む、混合ジスルフィドを含んでよい。
【０１２７】
あるいは、本発明の実施態様によれば、アミノ反応性部分（例えば一次アミノ基、特に、末端−ＮＨ２基）を含む標的化リガンドは、硫黄含有化合物と最初に反応され得て、標的化リガンド内に反応性チオール部分を導入して、それから、上記に説明した診断的構成要素、すなわち微小胞の構成要素上の対応する相補部分と反応される。反応性アミノ部分を含む標的化リガンド内に反応性チオール部分を導入するのに有用な適切な硫黄含有化合物の例は、例えば：チオイミダート（例えばＴｒａｕｔ’ｓ試薬）Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）またはＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を含む。Ｓ含有試薬およびそれぞれのチオール化反応の詳細な説明は、例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ：「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｅｄ．，第２版（２００８年４月）、第１章、第４−１節による本に見ることができる。例えば、マレイミド誘導体化リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ−またはペグ化ＰＥ）を調製し得て、一次アミノ基（例えば、リジン側鎖の−ＮＨ２）が硫黄含有化合物（以前に説明されたものなど）と以前に反応されている場合に、それを標的化リガンド（例えば配列番号３）と反応させて、反応性チオール部分を導入して；得られた化合物は、それから、標的化されたガス充填微小胞の調製で用いられ得る。
【０１２８】
さらなる代替によれば、標的化リガンドが反応性カルボン酸基を含む場合、診断的または治療的基、すなわち微小胞の構成要素上の適切な反応性部分は、アミンおよびヒドラジドであってよい（アミドまたはＮ−アシル、Ｎ’−アルキルヒドラジド官能基を形成する）。
【０１２９】
上記の好ましい実施態様によれば、アミノ反応性部分を（例えばリジン残基上に）含む標的化リガンドは、マレイミド含有化合物と最初に反応され得て、標的化リガンド内に反応性マレイミド部分を導入して、それから、微小胞の構成要素上の対応する相補部分と反応される。反応性アミノ部分を含む標的リガンド内に反応性マレイミド部分を導入するのに有用なマレイミド含有試薬、および、マレイミド基の付加のそれぞれの反応は、当技術分野でよく知られている。適切なマレイミド含有化合物の例は、例えば：ＡＭＡＳ（Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ｎ−（β−マレイミドプロポキシル）スクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸））、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ試薬（スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−エチレングリコール）エステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸））、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）−スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル（酪酸））を含む。
【０１３０】
他の類似の試薬は、マレイミドとは異なるスルフヒドリル反応基、例えば、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３−２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサン酸、ＮＨＳ−ブロモ酢酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモ酢酸）、ＮＨＳ−ヨード酢酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨード酢酸）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサン酸）を含んでよい。
【０１３１】
超音波診断イメージングのための微小胞実施態様によれば、一次アミノ基（例えばリジン側鎖のＮＨ２）がチオール反応性化合物（例えば、以前に説明されたもののようなマレイミド）と以前に反応されている場合は、チオール含有リン脂質（例えばチオール化ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ−またはペグ化ＰＥ）を、標的化リガンドと反応させて、チオール反応性部分をその中に導入してよく；得られた化合物は、それから、微小胞または他の診断的または治療的コンジュゲートの調製で用いられ得る。
【０１３２】
本発明のキメラタンパク質では、コンジュゲートは、好ましくは、キメラタンパク質のＣ末端で調製されて、Ｎ末端をセレクチン標的との結合に利用可能にさせる。
【０１３３】
超音波のために診断上効果的な部分
微小胞
特に超音波造影に有用な造影剤のクラスは、水性媒体中に分散されたナノ−および／またはマイクロ−メートルサイズの気泡の懸濁液を含む。特定の興味は、例えば、乳化剤、油、増粘剤または糖類を用いることによって、または、ガスまたはその前駆体を様々な系で捕捉または封入することによって、気泡が安定化される調製である。これらの安定化された気泡は、当該分野において様々な専門用語によって一般に言及されて、典型的に、それらの調製に用いられる安定化材料に依存して；これらの用語は、例えば、「マイクロスフェア」、「微小気泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」を含む。本明細書において用いられる用語「ガス充填微小胞」、または短く「微小胞」は、任意の上記の専門用語を含む。
【０１３４】
ガス充填微小胞
本発明の好ましい実施態様によれば、ガス充填微小胞は、セレクチン標的化リガンドとして、本発明のキメラタンパク質と共有結合された脂質またはリン脂質によって調製されて、好ましくは微小気泡である。微小気泡によって、我々は、水性担体内に懸濁された気泡を指し、それは、気体−液体界面において、安定した両親媒性材料による薄膜（フィルム）を保有する。ガス微小気泡の水性懸濁液の例は、例えば、ＵＳ５，２７１，９２８、ＵＳ５，４４５，８１３、ＵＳ５，４１３，７７４、ＵＳ５，５５６，６１０、５，５９７，５４９、ＵＳ５，８２７，５０４およびＷＯ０４／０６９２８４に開示される。また、用語は、凍結乾燥または噴霧乾燥された構成要素（好ましくはリン脂質含む）分散の形態での微小気泡の前駆体を含む。
【０１３５】
上記定義による微小気泡と相違して、用語「マイクロバルーン」または「マイクロカプセル」は、脂質または天然または合成ポリマーの固形膜によって気泡が囲まれている懸濁液を含む。マイクロバルーンおよびその調製の例は、例えば、ＵＳ５，７１１，９３３およびＵＳ６，３３３，０２１に開示される。
【０１３６】
微小気泡の安定化膜を形成するのに適切な構成要素は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸；脂質保有ポリマー、例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、「ペグ化脂質」とも呼ばれる；脂質を保有するスルホン化単糖、二糖、オリゴ糖または多糖；コレステロール、コレステロール硫酸またはコレステロールヘミコハク酸；トコフェロールヘミコハク酸；エーテルまたはエステル結合脂肪酸を有する脂質；重合脂質；ジアセチルリン酸；ジセチルリン酸；セラミド類；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪族アルコール類、ポリオキシエチレン脂肪族アルコールエーテル類、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセロールポリエチレングリコールリシノール、エトキシ化大豆ステロール類、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロックコポリマー類；コレステロール酪酸、コレステロールイソ−酪酸、コレステロールパルミチン酸、コレステロールステアリン酸、ラノステロール酢酸、エルゴステロールパルミチン酸、または植物ステロールｎ−酪酸を含む、ステロール脂肪酸エステル類；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルコロニド（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄｅ）、７−デヒドロコレステロールグルコロニド、エルゴステロールグルコロニド、コレステロールグルコン酸、ラノステロールグルコン酸、またはエルゴステロールグルコン酸を含む、糖酸のステロールエステル類；ラウリルグルコロニド、ステアロイルグルコロニド、ミリストイルグルコロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、糖酸およびアルコール類のエステル類；スクロースラウリン酸、フルクトースラウリン酸、スクロースパルミチン酸、スクロースステアリン酸、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、脂肪酸と糖類のエステル類；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸またはジギトキシゲニンを含む、サポニン類；グリセロール、または、グリセロールトリパルミチン酸、グリセロールジステアリン酸、グリセロールトリステアリン酸、グリセロールジミリスチン酸、グリセロールトリミリスチン酸、グリセロールジラウリン酸、グリセロールトリラウリン酸、グリセロールジパルミチン酸を含む、グリセロールエステル類；ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール類；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシル−ジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカンオイック酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；Ｎ−スクシニル−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；少なくとも１つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）、アルキル鎖、例えば、Ｎ−ステアリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアミン、Ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、Ｎ−ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ−ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタエシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）を含む、アルキルアミンまたはアルキルアンモニウム塩類；（Ｃ３−Ｃ６）アルキレン架橋を通してＮ原子に連結された、１つまたは好ましくは２つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）、アシル鎖、例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）を含む、第３級または第４級アンモニウム塩類；および、それらの混合物または組み合わせを含む。
【０１３７】
構成要素の組み合わせおよび微小気泡の製造プロセスに応じて、上記に挙げた例示的な化合物は、微小気泡の膜を形成するための主な化合物として、または、単純な添加剤として用いられ得て、したがって、ほんの少量で存在する。
【０１３８】
好ましい実施態様によれば、微小気泡の膜を形成する化合物の少なくとも１つは、両親媒性化合物（すなわち、親水性および親油性部分の両方を含む有機分子）、好ましくはリン脂質であり、任意選択で、任意の他の上記の材料と混合される。この説明によれば、用語「リン脂質」は、任意の両親媒性リン脂質化合物を包含することが意図されて、その分子は、最終的な微小気泡懸濁液中の気体−水の境界の界面において、材料の安定化フィルムを（典型的にモノ−分子層の形態で）形成することが可能である。したがって、これらの材料は、当該分野において「フィルム形成」リン脂質とも呼ばれる。
【０１３９】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的に、少なくとも１つのリン酸基、および、少なくとも１つ、好ましくは２つの、親油性長鎖炭化水素基を含む。
【０１４０】
適切なリン脂質の例は、脂肪酸の１つまたは好ましくは２つの（同一または異なる）残基およびリン酸とグリセロールのエステルを含み、ここで、リン酸残基は、次々に、親水性基、例えば、コリン（ホスファチジルコリン−ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン−ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジル¬グリセロール−ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール−ＰＩ）に結合される。脂肪酸のたった１つの残基とリン脂質のエステルは、当該分野において、一般に、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質内に存在する脂肪酸残基は、一般に、典型的に、１２〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２２個を含む長鎖脂肪酸であり；脂肪族鎖は、１つまたは複数の不飽和を含んでよく、または、好ましくは完全に飽和である。リン脂質内に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような、飽和脂肪酸が例示される。
【０１４１】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸、すなわち、脂肪酸とグリセロール−リン酸のジエステル；スフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリン、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換される場合、これらのホスファチジルコリンアナログ；カルジオリピン、すなわち、脂肪酸と１，３−ジホスファチジルグリセロールのエステル；ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシドのような糖脂質；糖脂質；スルファチドおよびグリコスフィンゴリピドである。
【０１４２】
本明細書において用いられる用語「リン脂質」は、単独または混合物として用いられ得る、天然起源、半合成または合成的に調製された産物を含む。
【０１４３】
天然起源リン脂質の例は、典型的に、大豆または卵黄レシチンのような、天然レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）である。
【０１４４】
半合成リン脂質の例は、天然起源レシチンの部分的または完全に水素化された誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジ−エステルである。
【０１４５】
好ましいリン脂質の例は、例えば、ジラウロイル−ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジル−グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。
【０１４６】
適切なリン脂質は、親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を、それに連結することによって修飾されたリン脂質をさらに含む。好ましいポリマー修飾リン脂質は、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合されたリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（略して「ＰＥ−ＰＥＧ」）、すなわち、親水性エタノールアミン部分が可変の分子量（例えば３００〜２００００ダルトン、好ましくは５００〜５０００ダルトン）のＰＥＧ分子、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ（またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＥ−ＰＥＧまたはＤＯＰＥ−ＰＥＧ）に連結される場合、ホスファチジルエタノールアミン類である。例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００は、約２０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーが付いたＤＰＰＥを指す。
【０１４７】
特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびエチル−ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＳＰＧまたはＤＳＰＣである。
【０１４８】
ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣと、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣの混合物のような、リン脂質の混合物も用いられ得る。
【０１４９】
好ましい実施態様では、リン脂質は、ガス充填微小気泡の膜を形成している構成要素の合計量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）に及ぶ、微小気泡の安定化膜の主な構成要素である。一部の好ましい実施態様では、膜の実質的に全体（すなわち、少なくとも８０重量％および１００重量％まで）が、リン脂質を形成し得る。
【０１５０】
リン脂質は、任意の上記に挙げた化合物と混合で好適に用いられ得る。したがって、例えば、コレステロール、エルゴステロール、植物ステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルまたはアスコルビン酸パルミチン酸のような物質、脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびそれらの誘導体またはブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または他の非リン脂質化合物は、０〜５０重量％の範囲、好ましくは２５％までの割合で、前述のリン脂質の１つまたは複数に任意選択で添加され得る。特に好ましいのは、両親媒性化合物、例えば、Ｃ１０〜Ｃ２０カルボン酸、好ましくはパルミチン酸である。
【０１５１】
好ましい実施態様によれば、本発明に係る微小気泡の膜は、全体的な（正または負）正味荷電を保有する化合物を含む。前記化合物は、荷電した両親媒性材料、好ましくは脂質またはリン脂質であってよい。
【０１５２】
全体的な負電荷を保有するリン脂質の例は、誘導体、特に、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳのようなホスファチジルセリンの；ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡのようなホスファチジン酸の；ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧおよびＤＳＰＧのようなホスファチジルグリセロールの、または、ＤＭＰＩ、ＤＰＰＩまたはＤＰＰＩのようなホスファチジルイノシトールの、脂肪酸ジ−エステル誘導体である。また、修飾リン脂質、特にＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧは、負に帯電した分子として用いられ得る。また、上記のリン脂質のリゾ形態、例えば、リゾホスファチジルセリン誘導体（例えばリゾ−ＤＭＰＳ、−ＤＰＰＳまたは−ＤＳＰＳ）、リゾホスファチジン酸誘導体（例えばリゾ−ＤＭＰＡ、−ＤＰＰＡまたは−ＤＳＰＡ）およびリゾホスファチジルグリセロール誘導体（例えばリゾ−ＤＭＰＧ、−ＤＰＰＧまたは−ＤＳＰＧ）は、負に帯電した化合物として有利に用いられ得る。負に帯電した化合物の他の例は、コール酸塩、デオキシコール酸塩またはグリココール酸塩のような、胆汁酸塩；および、（Ｃ１２〜Ｃ２４）、好ましくは（Ｃ１４〜Ｃ２２）脂肪酸塩、例えば、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール塩または１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール塩である。
【０１５３】
好ましくは、負に帯電した化合物は、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００またはそれらの混合物の中から選択される。
【０１５４】
負に帯電した構成要素は、典型的に、一価（例えばアルカリ金属またはアンモニウム）、二価（例えばアルカリ土類金属）または三価（例えばアルミニウム）であってよい対応する正の対イオンと関連する。好ましくは、対イオンは、アルカリ金属カチオン、例えば、Ｎａ＋またはＫ＋、より好ましくはＮａ＋の中から選択される。
【０１５５】
全体的な正電荷を保有するリン脂質の例は、エチルホスファチジルコリンの誘導体、特に、脂肪酸とエチルホスファチジルコリンのジ−エステル、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣまたはＤＳＥＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＰＰＣまたはＤＰＥＰＣ）である。負の対イオンは、好ましくは、ハロゲン化合物イオン、特に、塩素または臭素イオンである。微小気泡の膜内に取り込まれ得る正電荷の化合物の例は、ハロゲン化合物対イオン（例えば塩素または臭素）との、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−アルキルアンモニウム塩であり、少なくとも１つの（Ｃ１０〜Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４〜Ｃ１８）、アルキル鎖、例えば、モノ−またはジ−ステアリルアンモニウム塩化物、モノまたはジ−ヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタエシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）またはヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）を含む。微小気泡の膜内に取り込まれ得る正電荷の化合物のさらなる例は、ハロゲン化合物対イオン（例えば、塩素または臭素）との第３級または第４級アンモニウム塩であり、（Ｃ３〜Ｃ６）アルキレン架橋を通してＮ原子に連結された、１つまたは好ましくは２つの（Ｃ１０〜Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４〜Ｃ１８）、アシル鎖、例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）または１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）を含む。
【０１５６】
ＤＳＥＰＣ、ＤＰＥＰＣおよび／またはＤＳＴＡＰは、好ましくは、微小気泡膜において正電荷の化合物として用いられる。
【０１５７】
正電荷の構成要素は、典型的に、一価（例えばハロゲン化合物）、二価（例えば硫酸）または三価（例えばリン酸）であってよい対応する負の対イオンと関連する。好ましくは、対イオンは、Ｆ−（フッ素）、Ｃｌ−（塩素）またはＢｒ−（臭素）のようなハロゲン化合物イオンの中から選択される。
【０１５８】
中性および荷電した化合物、特にリン脂質および／または脂質の混合物は、微小気泡膜を形成するために満足に用いられ得る。荷電した脂質またはリン脂質の量は、脂質およびリン脂質の合計量に対して約９５ｍｏｌ％〜約０．１ｍｏｌ％、好ましくは８０ｍｏｌ％〜０．５ｍｏｌ％で変化し得る。
【０１５９】
中性リン脂質および荷電した脂質またはリン脂質の好ましい混合物は、例えば、ＤＰＰＧ／ＤＳＰＣ、ＤＳＴＡＰ／ＤＡＰＣ、ＤＰＰＳ／ＤＳＰＣ、ＤＰＰＳ／ＤＡＰＣ、ＤＰＰＥ／ＤＰＰＧ、ＤＳＰＡ／ＤＡＰＣ、ＤＳＰＡ／ＤＳＰＣ、ＤＳＰＣ／ＰＡ（ジステアロイルホスファチジルコリン／パルミチン酸）およびＤＳＰＧ／ＤＳＰＣである。
【０１６０】
ガス充填微小胞の安定化膜の形成に有用な任意の上記に説明された構成要素、特にリン脂質、好ましくは、ペグ化リン脂質は、配列番号１に示される配列、またはより好ましくは、配列番号１のアミノ酸１〜１１８を含む配列を含む、標的化リガンドのような適切な化合物に結合するのを可能にするために、その中に適切な反応性部分を挿入することによって修飾され得る。例えば、ペグ化リン脂質（例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）は、上記配列を含む化合物上の対応する反応性部分と（共有結合で）反応することが可能な末端の反応性部分（例えばマレイミド、省略して「ｍａｌ」、したがって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｍａｌ構成要素を形成する）を含んでよい。さらなる適切な反応性部分の例は、本明細書の以下に説明される。
【０１６１】
代替の実施態様によれば、標的化リガンド構成要素は、ガス充填マイクロカプセルと関連され得る。マイクロカプセルの好ましい例は、ポリマー、好ましくは生分解性ポリマー、または、生分解性水不溶性脂質（例えばトリパルミチン）を含む安定化膜を、任意選択で生分解性ポリマーとの混合で有するものである。適切なマイクロカプセルおよびその調製の例は、例えば、ＵＳ５，７１１，９３３およびＵＳ６，３３３，０２１に開示されて、それらの全体で参照により本明細書中に援用される。タンパク質性の膜を有する、すなわち、ＵＳ−Ａ−４，２７６，８８５またはＥＰ−Ａ−０３２４９３８（参照により本明細書中に援用される）に記載されるもののような天然のタンパク質（アルブミン、ヘモグロビン）で作られる、マイクロカプセルもまた用いられ得る。標的化リガンドは、例えば、マイクロカプセルの膜を形成している構成要素にそれを結合することによって、上記に説明した調製方法に従って、または、以前に説明した標的化リガンドに共有結合されたもののようにマイクロカプセル膜を形成している構成要素に両親媒性構成要素を混合することによって、マイクロカプセル中に取り込まれ得る。
【０１６２】
他の賦形剤または添加剤が、微小胞の乾燥製剤中に存在してよく、または、微小胞の安定化膜の形成において必ずしも含まれずに（または部分的にのみ含まれて）その再構成のために用いられる水性担体と一緒に添加されてよい。これらは、ｐＨ調整剤（例えばヒスチジン）、浸透圧調節剤、粘性強化剤、乳化剤、充填剤などを含み、従来の量で用いられてよい。例えば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールならびにそれらの共重合体のような化合物が用いられ得る。粘性増強剤または安定剤の例は、直鎖および架橋ポリ−およびオリゴ−糖類、糖類、および親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコールから選択される化合物である。
【０１６３】
ガス充填微小胞の調製は、凍結乾燥または噴霧乾燥ステップを伴い得るので、凍結乾燥添加剤、例えば、凍結保護および／または溶解保護効果を有する薬剤および／または充填剤、例えば、グリシンのようなアミノ酸；炭水化物、例えば、スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトースまたはシクロデキストリンのような糖、または、デキストランのような多糖類；または、ポリエチレングリコールのようなポリオキシアルキレングリコールを、製剤中に含むことが有利であり得る。典型的に、凍結乾燥添加剤の量は、微小胞を形成している構成要素の量の約１０〜約１０００倍（ｗ／ｗ）の範囲であってよい。
【０１６４】
任意の生体適合性ガス、ガス前駆体またはそれらの混合物は、上記の微小胞を充填するために用いられ得る（以降、「微小胞形成ガス」とも特定される）。
【０１６５】
ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトンのような希ガスまたは不活性ガス；Ｘｅ１３３またはＫｒ８１のような放射性ガス；過分極ヘリウム、過分極キセノンまたは過分極ネオンのような過分極希ガス；低分子量炭化水素（例えば、７個までの炭素原子を含む）、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンまたはイソペンタンのようなアルカン、シクロブタンまたはシクロペンタンのようなシクロアルカン、プロペン、ブテンまたはイソブテンのようなアルケン、または、アセチレンのようなアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化ガス、好ましくはフッ素化ガス、例えば、または、ハロゲン化、フッ素化またはパーフルオロ化低分子量炭化水素（例えば、７個までの炭素原子を含む）；または、前述のいずれかの混合物を含んでよい。ハロゲン化炭化水素が用いられる場合、前記化合物中のハロゲン原子の好ましくは少なくとも一部、より好ましくは全て、フッ素原子である。
【０１６６】
フッ素化ガス、特に超音波イメージングの分野では、特にパーフルオロ化ガスが、好ましい。フッ素化ガスは、少なくとも１つのフッ素原子、例えば、フッ素化炭化水素（１つまたは複数の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくはパーフルオロ化、ケトン、例えば、ペルフルオロアセトン；および、フッ素化、好ましくはパーフルオロ化、エーテル、例えば、ペルフルオロジエチルエーテルを含む材料を含む。好ましい化合物は、パーフルオロ化ガス、例えば、ＳＦ６またはペルフルオロカーボン（パーフルオロ化炭化水素）であり、すなわち、全ての水素原子がフッ素原子によって置換される炭化水素であり、それは、例えばＥＰ０５５４２１３に開示されるように、特に安定した微小気泡懸濁液を形成することが知られていて、参照により本明細書中に援用される。
【０１６７】
用語「ペルフルオロカーボン」は、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンを含む。生体適合性で、生理的に許容できるペルフルオロカーボンの例は：ペルフルオロアルカン類、例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン類、ペルフルオロブタン類（例えばペルフルオロ−ｎ−ブタン、任意選択で、ペルフルオロ−イソブタンのような他の異性体との混合）、ペルフルオロペンタン類、ペルフルオロヘキサン類またはペルフルオロヘプタン類；ペルフルオロアルケン類、例えば、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン類（例えばペルフルオロブト−２エン）またはペルフルオロブタジエン；ペルフルオロアルキン類（例えばペルフルオロブト−２−イン）；およびペルフルオロシクロアルカン類（例えばペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン類、ペルフルオロトリメチルシクロブタン類、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン類、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサンおよびペルフルオロシクロヘプタン）である。好ましい飽和ペルフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２およびＣ６Ｆ１２を含む。
【０１６８】
任意の比率で上記のガスのいずれかの混合物を用いることも好都合であり得る。例えば、混合物は、窒素、空気または二酸化炭素のような従来型のガス、および、六フッ化硫黄または前述したペルフルオロカーボンのような、安定したマイクロバブル懸濁液を形成するガスを含んでよい。適切なガス混合物の例は、例えばＷＯ９４／０９８２９に見られることができ、参照により本明細書中に援用される。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス（Ａ）と（Ｂ）の混合物であって、ガス（Ｂ）は前述したものの中から選択されるフッ素化ガスであり、それらの混合物を含み、そして（Ａ）は空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。ガス（Ｂ）の量は、混合物全体の約０．５％〜約９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約５％〜８０％を示すことができる。
【０１６９】
特に好ましいガスは、ＳＦ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０またはそれらの混合物であり、場合により、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物との混合である。
【０１７０】
特定の状況では、ガス状の物質の前駆体（すなわち、インビボでガスに変換されることが可能な材料）を含むことが望ましくあり得る。好ましくは、ガス状の前駆体およびそれから得られるガスは、生理的に許容できる。ガス状の前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化などであってよい。例えば、特定のペルフルオロカーボンは、温度活性化のガス状の前駆体として用いてよい。ペルフルオロペンタンまたはペルフルオロヘキサンのような、これらのペルフルオロカーボンは、室温（または薬剤が生産および／または保管される温度）よりも高いが体温よりも低い液体／ガス相転移温度を有し；したがって、それらは、液体／ガス相転移を受けて、ヒト体内でガスに転換される。
【０１７１】
ＭＲＩでの使用のために、微小胞は、好ましくは、過分極ネオン、過分極ヘリウム、過分極キセノン、またはそれらの混合物のような過分極希ガスを、任意選択で、空気、二酸化炭素、酸素、窒素、ヘリウム、キセノン、または上記に定義される任意のハロゲン化炭化水素との混合で含む。
【０１７２】
シンチグラフィーでの使用のために、微小胞は、好ましくは、Ｘｅ１３３またはＫｒ８１またはそれらの混合物のような放射性ガスを、任意選択で、空気、二酸化炭素、酸素、窒素、ヘリウム、クリプトンまたは上記に定義される任意のハロゲン化炭化水素との混合で含む。
【０１７３】
ＮＭＲイメージングおよび治療のための、金属キレート剤
イメージングプローブまたは放射性治療エフェクターのいずれかであってよい金属イオンを本発明のキメラタンパク質のような生体分子に連結する最も信頼性があり最も頻繁に適用される方法は、生体分子に共有結合するために金属キレートケージおよび反応基を保有する二官能性キレート剤を用いる。
【０１７４】
金属配位ケージは、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）またはＴＥＴＡ（１，４，８，１１テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸）のような環状、または、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）のような線状に分けられ得る。
【０１７５】
最も適切な金属キレートケージ、または「キレートリガンド」が選択された時点で、反応基を介した目的の生体分子へのコンジュゲートは、固相合成によって、または溶液中で行なわれ得る。ＬａｔｔｕａｄａＬ．らは、Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｒｅｖ，２０１１，４０，３０１９−３０４９において、金属キレートリガンドを他の部分、特に生体分子にコンジュゲートして、標的化された金属キレート剤を調製する合成手法を概説する。
【０１７６】
この段落に開示される実施態様によれば、金属は、治療に有用である放射性核種またはイメージング技術によって検出可能である。イメージングに適切な金属は、特に、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって検出可能な常磁性金属イオン、または、シンチグラフィー、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のようなイメージング技術によって検出可能な放射性核種を含む。
【０１７７】
この文脈において、用語「キレーター」、「キレートリガンド」または「キレート剤」は、遷移金属または別の金属との１つよりも多い座標結合を含む錯体を形成することが可能な極性基の存在によって特徴付けられる、化学的部分、薬剤、化合物、または分子を含む。本発明の好ましい態様では、前記キレートリガンドは、環状または線状ポリアミノポリカルボン酸またはポリホスホン酸を含み、フリーまたは任意選択で適切な二官能性リンカーまたは標的化タンパク質の官能基をコンジュゲートするのに適切な活性化された官能性として存在する、少なくとも１つのアミノ、チオールまたはカルボキシル基を含む。
【０１７８】
リンカーは、スペーサーとして、または、分子全体の薬物動態特性を改善するために用いられ得る。最も頻繁に用いられるリンカーの一部は、ＬｉｕＳ．  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００１，１２：７−３４に要約されていて、ならびに、ペプチドコンジュゲートに関してＷＯ２００８／０７１６７９に開示されている。
【０１７９】
本明細書において用いられる用語「標識」または「錯体形成」によって、すなわち、「金属によって標識されたキレートリガンド」の関連において、我々は、金属と錯体形成されるリガンド、すなわち、金属エレメントとのキレートの形態または座標錯体であるリガンドを指す。
【０１８０】
用語「金属体」または「金属エレメント」によって、我々は、イメージングまたは治療のいずれかのための放射性核種またはイメージング技術によって検出可能である金属イオンを指す。その用語は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって検出可能な常磁性金属イオン、および、シンチグラフィーイメージング、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によって検出可能な、または、以下に定義される放射線療法に適切な、放射性核種のような放射線放射金属を含む。
【０１８１】
適切なキレートリガンドは、以下からなる群より選択される：ポリアミノポリカルボン酸およびその誘導体、例えば以下を含む、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびその誘導体、以下を含む、ベンゾＤＴＰＡ、ジベンゾＤＴＰＡ、フェニルＤＴＰＡ、ジフェニルＤＴＰＡ、ベンジルＤＴＰＡおよびジベンジルＤＴＰＡ、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［（カルボキシメチル）［（メチルカルバモイル）メチル］エチル］−グリシン（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）、Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル）］−Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］グリシン（ＥＯＢ−ＤＴＰＡ）、４−カルボキシ−５，８，１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−オイック酸（ＢＯＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］Ｌ−グルタミン酸（ＤＴＰＡ−ＧＬＵ）；ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ（図３ａの化合物１を参照）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；１，４，７，１０−テトラアザ（ｔｅｒａａｚａ）シクロドデカン  １，４，７，−トリ酢酸（ＤＯ３Ａ）およびその誘導体、例えば以下を含む、［１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン  １，４，７，−トリ酢酸（ＨＰＤＯ３Ａ）；１，４，７−トリアザシクロノナン  Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）；６−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］テトラヒドロ−６−メチル−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１，４（５Ｈ）−二酢酸（ＡＡＺＴＡ）およびその誘導体、例えばＷＯ０３／００８３９０に開示されて参照により本明細書中に援用される、１，４，７，１０テトラ−アザシクロテトラデカン  １，４，７，１０四酢酸（ＤＯＴＡ）およびその誘導体、例えば以下を含む、ベンゾ−ＤＯＴＡ、ジベンゾ−ＤＯＴＡ、（α、α’、α’’、α’’’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０四酢酸（ＤＯＴＭＡ）；または１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）；または対応する化合物、ここで、カルボン酸基の１つまたは複数は、ホスホン酸および／またはホスフィン酸基によって置換され、例えば以下を含む、Ｎ、Ｎ’−ビス−（ピリドキサール−５−リン酸）エチレンジアミン−Ｎ．Ｎ’−二酢酸（ＤＰＤＰ）；エチレンジニトリロテトラキス（メチルホスホン）酸（ＥＤＴＰ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン）酸（ＤＯＴＰ）、例えばＵＳ５，３６２，４７６およびＵＳ５，４０９，６８９に開示されるホスホノアルキル−ポリアザ大環状化合物、および、ＵＳ６，５０９，３２４に開示される線状ホスホノアルキル誘導体；または、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｉｒｉｎｅ）、ポルフィリン、フタロシアニンのような大環状キレート剤。
【０１８２】
上記の中で、特に好ましいのは：ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−Ｇｌｕ、ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ、ＤＯＴＡおよびＤＯＴＡ誘導体、例えば、Ｐｒｉｃｅ  ＥＷ  ａｎｄ  Ｏｒｖｉｇ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１４，４３：２６０に開示されるもの、および、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．，２００８，３０２７−３０４７に開示されるｐｙｒｉｄｉｌ−ＤＯ３Ａ、または、多座配位性リガンドＡＡＺＴＡおよびその誘導体であり、すなわちＷＯ０３／００８３９４およびＷＯ２０１３／１３５７５０に説明される。
【０１８３】
ＭＲＩに好ましい常磁性金属エレメントは、２０〜３１、３９、４２、４３、４４、４９、および、５７〜８３の範囲の原子数を有するものである。
【０１８４】
さらにより好ましい常磁性金属イオンは、以下：Ｆｅ（２＋）、Ｆｅ（３＋）、Ｃｕ（２＋）、Ｎｉ（２＋）、Ｒｈ（２＋）、Ｃｏ（２＋）、Ｃｒ（３＋）、Ｇｄ（３＋）、Ｅｕ（３＋）、Ｄｙ（３＋）、Ｔｂ（３＋）、Ｐｍ（３＋）、Ｎｄ（３＋）、Ｔｍ（３＋）、Ｃｅ（３＋）、Ｙ（３＋）、Ｈｏ（３＋）、Ｅｒ（３＋）、Ｌａ（３＋）、Ｙｂ（３＋）、Ｍｎ（３＋）、Ｍｎ（２＋から選択されて；Ｇｄ（３＋）が最も好ましい。
【０１８５】
核イメージング（放射性核種イメージング）および放射線療法
本発明の別の実施態様では、本発明のセレクチン標的化キメラタンパク質が連結される部分は、放射性イメージング（診断的）または放射線療法（治療的適用）のための、放射性核種である。
【０１８６】
放射性金属キレート部分の主な特性は、極めて希釈された状態、すなわちｎＭ〜ｐＭの濃度でのインビボでのその使用に関するが；キレート部分と放射性金属との間の一部の最も適切な一致は知られていて、Ｐｒｉｃｅ  ＥＷ  ａｎｄ  Ｏｒｖｉｇ  Ｃ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ，２０１４，４３，２６０に要約されている。
【０１８７】
放射性イメージングのために、標的化剤は、「放射性イメージング検出可能部分」、すなわち、シンチグラフィーイメージング、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のようなイメージング技術によって検出可能な部分に連結され得る。
【０１８８】
好ましくは、前記の放射性イメージングの検出可能な部分は、通常は二官能性であって金属錯体特性を有するキレート部分を含むキレート剤にキレートされた放射性核種、および、本発明のセレクチン標的化剤のような生体分子への付着のための官能基を含み、または、あるいは、生体分子に直接的に連結される（すなわちヨウ素）。
【０１８９】
タンパク質上のアミンまたはチオール基とアミド、チオ尿素、尿素、シッフ塩基またはチオエーテル結合を形成する官能基は、前記のシンチグラフィー、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージング技術によって検出可能な放射性核種によって標識されたキレート剤を保有して調製され得る。
【０１９０】
いずれの場合においても、最も好ましいキレートリガンドは、線状またはより好ましくは大環状のキレートリガンドであり、および、上記に述べたものであり、例えば、ＤＴＰＡまたは、より好ましくはＤＯＴＡであり、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、８６／９０Ｙ、２２５Ａｃおよび４４／４７Ｓｃを含む多くの同位体に標準的な金をなおも表わし、および、最近では、より安定したＮＯＴＡおよびそのＤＯＴＡ誘導体によって置き換えられてはいるが、６７／６８Ｇａとともに広く用いられている。
【０１９１】
放射性核種のためのキレートリガンドのさらに適切な例は、線状、大環状、ターピリジン、および、例えば、ＵＳ５，３６７，０８０、ＵＳ５，３６４，６１３、ＵＳ５，０２１，５５６、ＵＳ５，０７５，０９９およびＵＳ５，８８６，１４２に開示されるリガンドを含むＮ３Ｓ、Ｎ２Ｓ２、Ｎ２Ｓ３、Ｎ２Ｓ４、Ｎ３Ｓ３またはＮ４キレート剤、および、制限されないが、６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）、または１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）を含む、当技術分野で知られている他のキレートリガンド；および、例えばＵＳ５，７２０，９３４に開示されるもののようなビス−アミノビス−チオール（ＢＡＴ）キレート剤、または、ＷＯ２００５／０６２８２８に記載のもののようなポリアザ大環状化合物のホスホ−誘導体から選択され得る。
【０１９２】
Ｎ４キレートリガンドは、例えば、ＵＳ５，６０８，１１０、ＵＳ５，６６５，３２９、ＵＳ５，６５６，２５４およびＵＳ５，６８８，４８７にも記載される。特定のＮ３ＳまたはＮ２Ｓ２キレート剤は、例えば、ＵＳ５，６５９，０４１、ＵＳ５，５７４，１４０、ＵＳ５，７８０，００６、ＵＳ５，６６２，８８５およびＵＳ５，９７６，４９５に記載される。また、キレート剤は、キレートリガンドメルカプト−アセチル−アセチル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体を含んでもよく、それは、Ｎ３ＳおよびＮ２Ｓ２系、例えば、ＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール類）、ＤＡＤＳ（Ｎ２Ｓジアミンジチオール類）、ＣＯＤＡＤＳなどを含む。これらのリガンド系および様々な他のものは、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ，１９９９，９９，２２３５−２２６８およびその中の引用文献に記載される。
【０１９３】
キレートは、テトラデンテートアレイ中の金属に供与されないリガンド原子を含む錯体を含んでもよい。これらは、例えばＵＳ５，１８３，６５３、ＵＳ５，３８７，４０９およびＵＳ５，１１８，７９７に記載のテクネチウムおよびレニウムジオキシムのボロン酸付加物を含む。
【０１９４】
別の実施態様では、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドのジスルフィド結合は、９９ｍＴｃのような放射性核種のキレートのためのリガンドとして用いられる。このようにして、ペプチドループは、Ｔｃの導入によって拡張される（ペプチド−Ｓ−Ｓ−ペプチドは、ペプチド−Ｓ−Ｔｃ−Ｓ−ペプチドに変化する）。
【０１９５】
本発明に係る好ましい放射性核種は、例えば：９９ｍＴｃ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４７Ｓｃ、１６７Ｔｍ、１４１Ｃｅ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１６８Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１４０Ｌａ、９０Ｙ、８８Ｙ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１９８Ａｕ、１１１Ａｇ、１９９Ａｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、６０Ｃｕ、７２Ａｓ、９４ｍＴｃ、または１１０Ｉｎ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄを含む。
【０１９６】
放射性核種の選択は、所望の治療的または診断的適用に基づく。例えば、治療的目的のためには（例えば、原発性腫瘍および転移のための放射線療法を提供するため）、好ましい放射性核種は、６４Ｃｕ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６／１８８Ｒｅ、および１９９Ａｕを含んでよく、１８６／１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕおよび９０Ｙが特に好ましい。診断的目的のためには（例えば、炎症の場所を示すため、および、治療後のその進行をモニターするため）、好ましい放射性核種は、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、および１１１Ｉｎを含んでよい。９９ｍＴｃが、その低いコスト、アベイラビリティ、イメージング特性、および高い比活性のため診断的適用に特に好ましい。特に、９９ｍＴｃの核および放射性特性は、この同位体を理想的なシンチグラフィーイメージング剤にさせる。この同位体は、実際に、１４０ｋｅＶの単一の光子エネルギーおよび約６時間の放射性半減期を有し、９９Ｍｏ−９９ｍＴｃ発生器から容易に利用可能である。
【０１９７】
ＰＥＴイメージングでの使用のための好ましい金属放射性核種は、陽電子放出金属イオン、例えば：５１Ｍｎ、５２Ｆｅ、６０Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、９４ｍＴｃまたは１１０Ｉｎである。
【０１９８】
好ましいキレートリガンドは、１１１Ｉｎおよび放射性ランタニド、例えば、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、および１６６Ｈｏに関し、または：
【化１】
2019513344.tif 000006
からなる群より選択される、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕまたは６７Ｃｕ）に関する。
【０１９９】
特に、１１１Ｉｎを含む金属体および放射性ランタニド、例えば、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、および１６６Ｈｏに関して、特に好ましいのは、以下のリガンド残基：
【化２】
2019513344.tif 000007
であり、
ここで、上記の式ａ）およびｂ）において、Ｒは、アルキル、好ましくはメチルである。
【０２００】
放射性９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅに関して、特に好ましいのは、以下のｄ）〜ｌ）の以下のキレート部分である：
【化３】
2019513344.tif 000008
2019513344.tif 000009
【０２０１】
これらおよび他の金属キレート基は、例えば、ＵＳ５，６０８，１１０、ＵＳ６，１４３，２７４、ＵＳ５，６２７，２８６、ＵＳ５，６６２，８８５、ＵＳ５，７８０，００６およびＵＳ５，９７６，４９５に記載される。
【０２０２】
加えて、式ｃ）の上記のキレート基は、ＵＳ６，１４３，２７４に記載されて；上記の式ｈ）およびｉ）のキレート基は、ＵＳ５，６２７，２８６およびＵＳ６，０９３，３８２に記載されて；式ｌ）のキレート基は、ＵＳ５，６６２，８８５、ＵＳ５，７８０，００６およびＵＳ５，９７６，４９５に記載される。
【０２０３】
式ｈ）およびｉ）において、Ｘは、ＣＨ２またはＯのいずれかであり、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ１０の分岐または非分岐アルキルのいずれかであり；Ｙは、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルであり；Ｙは、アリールキル（ａｒｙｌｋｙｌ）であり、ここで、アリール部分に付いたアルキル基（単数または複数）は、Ｃ１〜Ｃ１０分岐または非分岐アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０分岐または非分岐ヒドロキシ、または、ポリヒドロキシアルキル基またはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシ−ポリアルコキシアルキル基であり、Ｊは、＞Ｃ（＝Ｏ）、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、＞ＮＣ（＝Ｏ）−、＞ＮＣ（＝Ｓ）−、−Ｎ（Ｙ）−、−ＮＣ（＝ＮＣＨ３）−、−ＮＣ（＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、合成または天然起源アミノ酸から得られるヘテロポリアミン類またはホモポリアミド類であり；全て、ｎは１〜１００である。これらの構造の葉酸誘導体は、例えばＵＳ６，０９３，３８２に記載される。
【０２０４】
シンチグラフィーにより好ましいのは、イメージング検出可能部分として９９ｍＴｃによって標識された上記のリガンド残基ａ）〜ｌ）の１つを含む放射性イメージング造影剤である。
【０２０５】
標識糖類によるＰＥＴイメージング
本発明のさらなる実施態様では、融合タンパク質は、ＰＥＴイメージングでの使用のために、標識糖部分に連結される。
【０２０６】
好ましくは、糖部分は、例えば：１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、７７Ｂｒ、７６Ｂｒおよび１８Ｆのような放射性核種によるハロゲン化によって標識されて；１８Ｆが特に好ましい。
【０２０７】
光学イメージング
一部の実施態様では、光学イメージング剤は、本発明のキメラタンパク質にコンジュゲートされる。光学イメージング剤の中で、インビボ、エクスビボでおよびインビトロでのイメージング適用のための蛍光色素が当業者によく知られていて、インビボ蛍光イメージングに最適な広範な蛍光色素が開発されていて、市販もされている。これらの試薬は、異なる程度まで、蛍光発色団の組織透過性の深さ、光散乱および蛍光放射特性を最大化して、最適な信号−ノイズ比を提供する。一般に、光の吸収および散乱は、波長；約７００ｎｍよりも下、が増大するにつれて低減して、これらの効果は、数ミリメートルの浅い透過性の深さをもたらし、一方で、９００ｎｍよりも上では、水の吸収は、信号−ノイズ比に干渉し得る。したがって、近赤外線（ＮＩＲ）領域（７００〜９００ｎｍ）に励起／放射を有する蛍光色素は、これまで主に、小動物および潜在的にヒトにおけるインビボイメージングに活用されている。
【０２０８】
これらの中で最も使用されているものは：インドシアニングリーン、シアニン誘導体Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５およびＣｙ５．５、Ｃｙ７（シアニン色素および誘導体は、すなわちＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって入手可能である）、ＬＳ−２８７、ＬＳ−２８８、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲ−８２０、ＩＲ（登録商標）−８０６、ＩＲ−７８６、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７５０、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６５０（ＩＲＤｙｅ（登録商標）は、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能である）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素は、すなわち、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、それらの組み合わせおよび他のものであり、それらの化学構造は、例えばＷＯ２０１４／１９１４６７に報告されている。
【０２０９】
画像支援の外科的処置のための大部分の化合物の構造およびそれらの商業的入手性は、すなわち、Ｇｉｂｂｓ  Ｓ．Ｌ．Ｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅｄ  Ｓｕｒｇ２０１２，２（３）：１７７−１８７に記載されている。特に好ましいのは、シアニン色素およびＮＩＲイメージングのために開発されたそれらの化学的誘導体、例えば：Ｃｙ５．５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳおよびＩＲＤｙｅ（登録商標）７５０である。
【０２１０】
使用
上述の標的化診断薬は、インビボおよびエクスビボでのイメージングに特に有用である。本発明のキメラ標的化タンパク質は、本発明のキメラ標的化タンパク質が任意選択でイメージング剤と関連して用いられて、エクスビボおよび／またはインビボで、治療的化合物、すなわち、セレクチンを発現している細胞、組織または臓器に対して生物学的効果を発揮することが可能または発揮する要因となる分子を送達する、患者における疾患の治療のための任意の方法を含む、治療的目的のためにさらに用いられ得る。
【０２１１】
典型的に、この使用は、生物学的活性が与えられた薬剤／部分／分子、例えば、サイトカイン、細胞増殖抑制剤（例えば、ドキソルビシン、メトトレキサート、シスプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）毒素、抗炎症剤、免疫調節剤、例えば、サイトカイン阻害剤、抗凝集剤、コルチコステロイド、モノクローナル抗体、増殖因子、および、放射性核種を保有する金属キレート部分を含む上述の放射線治療剤と、本発明のキメラタンパク質のコンジュゲートを含み、炎症が観察または検出される場合に、生物学的に活性の部分を、セレクチンを発現している組織／細胞／臓器に標的化するように作用される。
【０２１２】
病理学的炎症状態は、診断的および／または治療的目的のために、生理学的よりも上のセレクチン発現レベルによって特徴付けられるべきであり；セレクチンは、好ましくはＥ−セレクチンおよび／またはＰ−セレクチン、より好ましくはＰ−セレクチンである。特に、本発明のイメージング剤は、以下に挙げたもののような血管内皮の炎症状態を検出するのに有用である。
【０２１３】
より好ましくは、病理学的炎症状態は、以下の、生理学的よりも高いセレクチン発現レベルについて特徴付けられるもの：急性冠症候群（ＡＣＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腫瘍と関連する血管新生、関節リウマチ、虚血再灌流障害、移植片拒絶または、より一般には、生理学的レベルよりも高くＰ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンを発現している任意の臓器または組織の中から選択される。
【０２１４】
より好ましくは、本発明のキメラタンパク質は、ＩＢＤ、ＡＣＳ、癌検出および移植片拒絶に関する有用な標的化剤である。
【０２１５】
さらに、本発明に係る標的化イメージング剤は、炎症性疾患または病理を患っている患者の（治療的）治療中（ｄｕｒｉｎｇ）の効率的な診断ツールとして用いられて、ここで、「中（ｄｕｒｉｎｇ）」は、それを監視および評価するための、治療の開始前、前記治療の途中、および／または、前記治療の終わりの任意の時を含む。例えば、本発明の標的化イメージング剤は、例えば、抗炎症性または炎症性阻害剤薬物の投与の、疾患または病理に対する効果を判定または評価するために、（例えば、任意の上記に挙げた疾患または病理の）抗炎症性治療の監視および／またはフォローアップにおいて有利に用いられ得る。
【０２１６】
例えば、ＩＢＤでは、本発明の標的化イメージング剤は、すなわち、メサラミン、コルチコステロイド、メトトレキサート、または、インフリキシマブを用いた治療的治療に対する応答をフォローアップするため、および、治療的治療に対するそれらの応答に従って患者を階層化するため、または、寛解維持治療を監視するために、用いられ得る。好ましくは、イメージング技術は、超音波検出のためのキメラ可溶性タンパク質を標的化した微小気泡に基づく。
【０２１７】
好ましい実施態様では、治療の間、患者の関心領域は、例えば、一定の時間間隔で、それぞれの薬物投与または治療的介入後および／または選択された数の薬物投与または治療の後の所定の時間間隔で、本発明の標的化イメージング剤の投与の際に選択のイメージング検出システムに供せられて；関心領域の最終的なイメージングは、それから、好ましくは、治療の最後または終局において行なわれる。
【０２１８】
本発明の標的化イメージング剤は、超音波関連技術において、すなわち治療的に関係があるイメージングにおいてさらに用いられ得て、それらは、例えば高い音響圧の超音波（非破壊的な診断イメージング方法で一般に用いられるものよりも典型的に高い）を用いて、ガス充填微小胞の制御された局所化破壊と有利に関連する。この制御された破壊は、任意選択で、造影剤と関連する適切な治療的化合物の放出と組み合わせて、例えば、血栓の治療のために用いられ得る（超音波血栓溶解（ｓｏｎｏｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）としても知られる技術）。あるいは、前記の治療的に関係があるイメージングは、微小胞の局所化された破裂または活性化によって誘導される細胞レベルでの一時的な膜透過性の結果として、細胞内への治療的薬剤の送達を含んでよい。この技術は、例えば、細胞内への遺伝物質の効果的な送達のために用いられ得て；あるいは、薬物は、任意選択で遺伝物質と組み合わせて、局所的に送達され得て、したがって、患者の組み合わせた製剤／遺伝子治療を可能にする（例えば腫瘍治療の場合）。治療的薬剤は、従来の方法に係るガス充填微小胞と関連し得て、または、組成物の別個の化合物として投与され得る。加えて、標的化剤は、超音波への曝露後の血液脳関門の一時的な開放により、脳組織への治療的薬剤の送達を促進するために用いられ得る。
【０２１９】
典型的に、有効量の標的化診断薬は、それを必要とする患者に（例えば注入によって）投与されて、イメージングまたは治療されるべき患者の体の部分または組織（「関心領域」）は、所望のイメージング方法に供される。好ましくは、造影剤は、静脈内に投与される。用語「患者」は、診断的／治療的目的または実験的目的のために（例えば実験的な治療的治療をフォローするための実験動物における造影剤の使用などを含む）、造影剤の投与を受けている任意の対象（ヒトまたは動物）を含む。
【０２２０】
好ましい実施態様によれば、有効量の標的化微小胞は、典型的にその懸濁液の注入によって、患者に投与される。関心領域のイメージングは、したがって、関心領域内の標的に結合された微小胞の存在によって高められる。
【０２２１】
様々なイメージング技術が、超音波適用において用いられ得て、例えば、ファンダメンタルおよび非線形（例えばハーモニック）Ｂ−モードイメージング、パルスまたは転相イメージング、および、ファンダメンタルおよび非線形ドップラーイメージングを含み；必要に応じて、三次元または四次元イメージング技術が用いられ得る。さらに、ガス充填微小胞の破壊（例えば、高音響圧での超音波を用いる）を必然的に伴う、高感度の検出方法である診断技術も検討される。
【０２２２】
本発明に係る微小胞は、例えば、それらのそれぞれの組成物、イメージングされる組織または臓器、および／または、選択されたイメージング技術に応じて、典型的に、患者のｋｇあたり約０．０１〜約５．０μｌのガスの濃度で投与され得る（微小胞の内側に封入される）。この一般的な濃度範囲は、もちろん、カラードップラーまたはパワーパルス反転のような非常に低い線量でシグナルが観察され得る場合など、特定のイメージング適用に応じて変化し得る。あり得る他の診断イメージング適用は、シンチグラフィー、光学イメージング、光音響イメージング、磁気共鳴イメージングおよびＸ線位相造影を含むＸ線イメージングを含む。
【０２２３】
また、超音波イメージング方法は、影響を受けた病変のより良好なマッピングを得るために、組み合わせ−（または融合−）イメージング方法に関して上述したように、ＭＲＩと関連して好適に用いられ得る。
【０２２４】
医薬組成物
本発明は、予想される使用に従ってコンジュゲートまたは改変された、上記に開示したキメラタンパク質を含む医薬組成物をさらに含み、それは、局所的に、または非経口的に投与され得て、鼻腔内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、または病巣内投与を含む。通常、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内、関節内、心臓内投与が好ましい。
【０２２５】
本発明の分子は、有効成分として、当技術分野で知られている薬学的に許容できて有効成分と適合する希釈剤または賦形剤中に、溶解、分散、または混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。他の適切な担体は、当業者によく知られている。加えて、必要に応じて、組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、安定化剤および／またはｐＨ緩衝剤を含んでよい。
【０２２６】
本発明に係る医薬組成物は、すなわち、従来の混合、溶解、粉状化、研削、粉砕、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥処理を用いて製造され得る。
【０２２７】
本発明に係る使用のための医薬組成物は、したがって、活性化合物を薬学的に用いられ得る製剤に処理するのを促進する補助剤および賦形剤を含む１つまたは複数の生理的に許容できる担体を用いて製剤化され得る。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２２８】
注入のために、本発明の化合物は、水溶液中に、好ましくは、生理的に適合するバッファー、例えば、ハンクス溶液、リンガー液、または、適切な賦形剤または安定化化合物をさらに含む生理食塩水バッファー中に、製剤化され得る。
【０２２９】
経口投与は、液体または固体組成物によって達成され得る。後者のうち、糖衣錠コアは、適切なコーティングによって提供される。この目的のために、濃縮された糖溶液が用いられてよく、任意選択で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでよい。識別のために、または、活性化合物の投与の異なる組み合わせを特徴付けるために、塗料または色素が錠剤または糖衣錠コーティングに加えられてよい。
【０２３０】
経口で投与される固体組成物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびに、ゼラチン製の密封された軟カプセル、および、グリセロールまたはソルビトールのような可塑剤を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのようなバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および任意選択で安定剤との混合で、有効成分を含んでよい。軟カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁されてよい。さらに、安定剤が加えられてよい。経口投与のための製剤は全て、選択された投与経路に適切な用量でなければならない。口腔投与のためには、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはトローチの形態を取り得る。
【０２３１】
本発明に係る一実施態様では、ペプチドは、経口で（例えば、シロップ、カプセル、または錠剤として）投与される。特定の実施態様では、ペプチド送達は、保護賦形剤の使用によって高められ得る。これは典型的に、酸性および酵素による加水分解に対する耐性を与えるためにペプチドを組成物と複合することによって、または、リポソームのような適切に耐性の担体内にペプチドをパッケージすることによって達成される。経口送達のためにペプチドを保護する方法は、当技術分野でよく知られている。
【０２３２】
圧縮錠剤は、任意選択でバインダー、（例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコレートナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性または分散剤と混合された、粉末または顆粒のようなサラサラした形態の活性ペプチド（単数または複数）を、適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、不活性の液体希釈剤によって湿潤化された粉末状ペプチド（単数または複数）の混合物を、適切な機械で成形することによって製造され得る。錠剤は、任意選択で、コーティングまたは刻印（ｓｃｏｒｅｄ）され得て、および、所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、異なる比率でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その中の有効成分の遅延または制御放出を与えるように製剤化され得る。
【０２３３】
シロップは、糖（例えばスクロース）の濃縮された水溶液に活性ペプチド（単数または複数）を添加することによって作られ得て、任意の必要な成分が添加されてもよい。そのような副成分は、香料、糖の結晶化を阻止するための薬剤、または、任意の他の成分、例えば、グリセロールまたはソルビトールのような多価アルコールの溶解度を増大させるための薬剤を含んでよい。
【０２３４】
吸入による投与のために、本発明に係る使用のための変形は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素のような適切な噴霧剤の使用による噴霧器または加圧パックからのエアロゾルスプレーの提供の形態で好適に送達される。加圧エアロゾルの場合には、用量単位は、測定された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。例えば、吸入器または注入器での使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、ペプチドの粉末混合および適切な粉末ベース（例えばラクトースまたはデンプン）を含んで製剤化され得る。
【０２３５】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態での有効成分の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注入懸濁液として調製され得る。適切な天然または合成の担体は当技術分野でよく知られている。また、懸濁液は、濃縮溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤、または、キメラタンパク質またはコンジュゲート基の安定性または化合物の溶解度を増大させる薬剤を含んでもよい。あるいは、有効成分は、使用の前に、滅菌された発熱物質フリーの水のような適切なビヒクルによって再構成するための、粉末形状であってよい。
【０２３６】
本発明の化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐薬ベースを用いた、坐薬または滞留浣腸剤のような直腸組成物で製剤化されてもよい。
【０２３７】
血清半減期の増大は、「パッケージング」システムとして、徐放性タンパク質または脂質の使用によって維持され得る。そのような徐放システムは、当業者によく知られていて、キメラタンパク質の製剤を、それ自体として、または、ナノ粒子、ナノ小胞、またはリポソームにコンジュゲートされた形態で含んでよい。
【０２３８】
前述の製剤および投与方法は、例示であることが意図されて、制限しない。本明細書において提供される教示を用いて、他の適切な製剤および投与モードが容易に考案され得ることが理解されよう。
【０２３９】
本発明のコンテキストにおける使用に適切な医薬組成物は、組成物を含み、ここで、有効成分は、使用目的を達成するのに効果的な量で含まれる。より具体的には、治療的に効果的な量は、治療される対象の疾患の症候を、予防、遅延、緩和、または寛解させるのに効果的な化合物の量を意味する。治療的に効果的な量の決定因子は、すなわち、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ，第９版，ＪＧ  Ｈａｒｄｍａｎ，Ａ．Ｇｉｌｍａｎ，ＬＥ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，第Ｉ章「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」３〜２７頁により、当業者の能力の十分に範囲内である。
【０２４０】
したがって、本発明は、治療的または好ましくは診断的目的のために、それを必要とする人々に、上記に開示したキメラタンパク質を、それ自体として、または好ましくはコンジュゲートとして、投与するための方法をさらに含む。
【０２４１】
診断的目的のために、本発明の医薬組成物は、投与経路および診断方法の感度に応じて適切な用量で事前投与されてよく、それから、最も適した技術によってイメージングが行なわれる。
【実施例】
【０２４２】
実験的部分
実施例１：フラグ付き組み換え融合タンパク質の調製および発現
多くのＤＮＡ構築物が調製された：
ＰＳＧＬ変異体１：配列は、成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質のアミノ酸１〜４７、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＮＲＬのロイシンジッパードメイン、グリシン（Ｇ４ＳＧ４）スペーサー、および、親和性認識のためのＦＬＡＧ配列をコードする。マウスＩｇＨシグナルペプチドを、分泌のために用いた。変異体１キメラタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【０２４３】
ＰＳＧＬ変異体２、成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質のアミノ酸１〜４７、ＩｇＧ１ヒンジ領域、Ｋ−＞Ａ配列の置換を有するＩｇＧ１ＣＨ３領域をコードする。マウスＩｇＨシグナルペプチドを、分泌のために用いた。Ｃ末端のＦＬＡＧ配列（配列番号３５）を、精製目的のために用いた。キメラタンパク質は、配列番号４を有する。
【０２４４】
ＰＳＧＬ変異体３：成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質の領域２７５〜２９０に、ＩｇＧ１ヒンジ領域に共有結合した成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質のアミノ酸１〜４７、および、同定および精製目的に用いられるＣ末端のＦＬＡＧ配列（配列番号３５）をコードする。マウスＩｇＨシグナルペプチドを、分泌のために用いた。キメラタンパク質は、配列番号を有する。
【０２４５】
ＰＳＧＬ変異体４は、ＩｇＧ１ヒンジ領域に共有結合した成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質のアミノ酸１〜４７、および、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のａａ１〜１５をコードする。マウスＩｇＨシグナルペプチドを、分泌のために用いた。Ｃ末端のＦＬＡＧ配列（配列番号３５）を、精製目的のために用いた。キメラタンパク質は、配列番号８を有する。
【０２４６】
ＰＳＧＬ変異体５は、ＩｇＧ１ヒンジ領域に共有結合したプロペプチド配列および内因性シグナルを有するＰＳＧＬ−１タンパク質のアミノ酸１〜８８（ＧＩ：２４９８９０４による）、および、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のａａ１〜１５をコードする。親和性認識のためのＣ末端のＦＬＡＧ配列（配列番号３５）を、精製目的のために用いた。キメラタンパク質は、配列番号１０を有する。
【０２４７】
小規模の一時的なトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｓ、懸濁液に適合されたチャイニーズハムスター卵巣株（Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ（商標）Ｋｉｔ，ＧＩＢＣＯ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔａｌｏｇ＃６１−０３０−ＲＯ，Ｌｏｔ＃６１０３０１５８）で補充された、化学的に規定された培地ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ，Ｃａｔａｌｏｇ＃１２４９０−０２５，Ｌｏｔ＃１１４９７７１）において、３７℃にて、湿潤化された５％ＣＯ２インキュベーター中で、製造元の指示書（２０１５年７月）に従って培養した。血清または他の動物由来産物は、ＣＨＯ−Ｓ細胞の培養において用いられなかった。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を振とうフラスコ内に蒔いて、血清フリーの化学的に規定された培地を用いて増殖させた。変異体１〜５発現構築物（各プラスミドの２５０μｇ）を、０．０５リットルの懸濁液ＣＨＯ細胞中に、エレクトロポレーションによって一時的にトランスフェクトした。手短には：５０％ＥＰバッファーおよびＱＣ４００キュベットで、Ｍａｘｃｙｔｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２５０×１０６のＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。採取する前に７日間、血清フリーの培地を用いて細胞を増殖させた。
【０２４８】
採取において行なわれたウェスタンブロットは、ＰＳＧＬ−１変異体の相対的発現を示した。非還元条件での馴化培地上のＦＬＡＧタグに特異的なウェスタンブロット分析は、タンパク質二量体化を確認した。馴化培地における変異体１は、還元条件下で、約２２ｋＤａの予測された分子量を示した（図１、レーン２）。非還元条件下では、正しく二量体を形成した（図１、レーン７）。バンド１〜５に見られる高い分子バンドは、抗ＦＬＡＧ抗体（抗ＦＬＡＧ抗体、モノクローナルマウスＩｇＧ１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ１８０４）に非特異的に結合した分子である可能性が最も高い。
【０２４９】
レーン３の場合は（変異体２）、最も小さな分子量バンドは、分解産物かもしれない。
【０２５０】
馴化培地上のウェスタンブロットを、全ての変異体のＣ末端にあるＦｌａｇエピトープを認識する抗体を用いて行なった（したがって、培地中に分泌されたキメラタンパク質の異なる構築物の相対量を示す）。
【０２５１】
ＦＬＡＧ付き変異体の精製
イオン交換および抗ＦＬＡＧ親和性精製によって精製を行なった。５つの変異体のそれぞれに関して、０．２μＭ濾過による浄化に続いて、１Ｍ  ＨＣｌの添加によって馴化培地をｐＨ６に調節して、蒸留水を用いて容量を倍にした。それから、１ｍＬアニオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ）上にＣＭをロードして、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１Ｍ  ＨＣｌ中で溶出した。溶出画分を、０．５ｍＬの抗ＦＬＡＧ親和性Ｍ２樹脂にアプライして、室温で５時間振動させた。１０ｍＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で樹脂を洗浄した。タンパク質を、５カラムボリュームのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中１００μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧペプチドで溶出した。ＰＳＧＬ変異体１については、通過画分を４℃で一晩、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２樹脂を用いて再インキュベートして、０．２５％酢酸（ｐＨ３．５）を用いて溶出を達成した。
【０２５２】
精製されたＰＳＧＬ変異体１〜５の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＯＤ２２０分析は、変異体１が５つの構築物の中で最も高い純度および発現レベルを有することを示唆する。
【０２５３】
ウシ血清アルブミンの希釈段階を用いて検量線を作成して、ＰＳＧＬ変異体からのデータをその曲線に合わせることによって計算されたＯＤ２２０でのタンパク質濃度を、以下の表３に提供する。
【０２５４】
【表３】
2019513344.tif 000010
【０２５５】
５つの構築物のうち、ＰＳＧＬ変異体１が、より良好な収量：最も高い発現レベルを有し、他の変異体と比較して少なくとも１のｌｏｇで純度を生じた。還元および非還元条件下でのウェスタンブロットおよび銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方とも、ＰＳＧＬ変異体１が、正しく二量体化することを示唆した。
【０２５６】
実施例２：変異体１Ａの発現および精製（ＦＬＡＧなし）。
コア２  β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、ＦＴＶＩＩ（フコシルトランスフェラーゼＶＩＩ）（Ｆｕｇａｎｇ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：３２５５−３２６４）、および、ＦＬＡＧ配列なしで配列番号１のａａ１〜１１８を含むキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を共発現している、安定したＣＨＯ−Ｓ細胞の安定した形質転換体を、それから、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ（商標）キットマニュアル（Ｃａｔ．ＮＡ１３６９６−０１  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２０１５年７月）に従って生産した。
【０２５７】
ＣＨＯ−Ｓクローンは、少なくとも７日間、通常は１４日まで、選択圧の不存在下で、ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地を用いて増殖するのが可能であった（他の血清フリーの化学的に規定された培地、例えば、ＡｃｔｉＣＨＯ（商標）、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）などが、成功的に用いられた）。グルタミン（または類似のＧｌｕｔＭａｘ）を、１〜１０ｍＭ、好ましくは４〜８ｍＭで補充した。
【０２５８】
６個の安定したＣＨＯクローンのプール由来の上清１００ｍＬを集めて、０．２μｍ  ＰＥＳ膜上で濾過して、そして、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で以前に平衡化された強力なアニオン交換Ｃａｐｔｏ  Ｑカラム（ＧＥ  １７−５３１６−０２，１．６×６ｃｍ，１２ｍＬ）上にロードした。
【０２５９】
結合されたタンパク質は、８カラムボリュームにわたって１Ｍ  ＮａＣｌまでの線形勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示される標的タンパク質を含んだ溶出画分を、第二のフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー精製ステップに用いた。
【０２６０】
カラムを１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄して、それから、平衡化して２０％  ＥｔＯＨ中で４℃にて保管した。
【０２６１】
ＮａＣｌを、プール画分中で４Ｍの濃度に溶解した。それから、このプールを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに関して、製造元の説明書に従って、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４Ｍ  ＮａＣｌで以前に平衡化された１ｍＬ  ＨＩＣカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ（商標），ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃１７−１３５１−０１）上にロードした。１０カラムボリュームでゼロまで塩化ナトリウム濃度を線形に減少させることによって、溶出を達成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示される標的タンパク質を含む画分を、第三のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ステップのために一緒にプールした。ＳＥＣカラム（ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）ｐｇ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃２８−９８９３−３５）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌによって事前に平衡化して、それを移動相として用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されるキメラＰＳＧＬ変異体１を含む画分をプールして濃縮した（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
【０２６２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対する、より感度の高い代替として、ウェスタンブロット分析を、取扱説明書に説明されるとおりにＰｈａｓｔ−Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）を用いて行なった。ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで飽和させた（室温で１時間）。膜を、抗−Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１抗体１：１０００（抗−Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１抗体、クローンＫＰＬ−１、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｃｏｄ．ＭＡＢ４０９２）を含む、ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１％  ＢＳＡを用いて、室温で１時間インキュベートした。
【０２６３】
ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３回洗浄した後に、二次抗体として抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰとともに膜をインキュベートした。
【０２６４】
３回洗浄した後に、ＨＲＰシグナルをＥＣＬで展開して、ポジティブの抗ＰＳＧＬ−１抗体の認識を示した。
【０２６５】
異なるサブクローン由来のキメラＰＳＧＬ変異体１Ａは、およそ６０ｋＤａに単一バンドとして現れて、それは、予期したとおり、還元条件下で約３０ｋＤａシフトした。さらなるバンドも分解産物も、精製された産物のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて見ることができなかった。
【０２６６】
さらなるサブクローニング、培地スケールの増殖、および、２Ｌ培養培地スケールでの精製のために、１つのクローンを選択した。
【０２６７】
実施例３：精製された変異体１Ａの特性化
ＰＳＧＬ変異体１Ａ組み換えタンパク質は、硫酸化、および、Ｎ−およびＯ−グリコシル化の両方を含む異なる翻訳後修飾に起因して、非常に異質である。その完全な特性化および正しい定量化のために、特定の酵素による、ＵＰＬＣ、ＭＳおよびペプチドマッピングの手順を含む分析方法のセットを用いた。その生物活性に本質的なＰＳＧＬ変異体１Ａの構造的特性も、注意深く監視した。
【０２６８】
３．１．ＵＰＬＣ−ＵＶ
逆相クロマトグラフィーを用いて、標的タンパク質の含有量を決定して、あり得る不純物または分解産物を定量化した。逆相クロマトグラフィーの実験のために、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ３００カラム（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ）を、勾配モードで５０℃にて用いた。移動相は、（Ａ）水中、０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中、０．１％ＴＦＡであった。ＵＶ検出を２１６ｎｍで行なった。専用のｓｕｂ  ２μｍカラムと組み合わせたＵＰＬＣ技術の使用は、改善された解像度、より高い感度、優れたピーク形状、および、分析時間の有意な減少を可能にした。ＵＰＬＣ−ＵＶ方法は、精製プロセスによって達成されたＰＳＧＬ変異体１Ａ純度が、９０％よりも高いことを示した。
【０２６９】
３．２．ＳＥＣ−ＵＶ
タンパク質の分離をそれらの効果的なサイズまたは形状（流体力学的半径）に基づき可能にする、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）とも呼ばれるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＵＶ検出と合わせて用いた。この場合において、方法は、あり得る凝集および他のサイズ変動を測定するために用いた。サイズ排除クロマトグラフィー実験のために、ＴＳＫゲルスーパー  ＳＷ  ｍＡｂ  ＨＴＰ  ４．６×１５０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ）、４μｍカラムを、３０℃にてアイソクラチックモードで用いた。移動相は、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４であり、ＵＶ検出を２１６ｎｍで行なった。エキストラ−カラムバンドの広がりを低減するように最適化されたＵＰＬＣ機器の使用は、高いカラム効率を可能にして、感度を増大させた。ＳＥＣ−ＵＶ方法を、ＰＳＧＬ変異体Ａ−１の分析に適用した：凝集は観察されなかった。
【０２７０】
３．３．シアル酸含有量
シアリル化は、バイオ医薬品のバイオアベイラビリティー、安定性、代謝および免疫原性に対する重大な特徴としてよく知られている。この目的に対して、キメラタンパク質変異体１Ａのシアル酸決定のためにＨＰＬＣ  ＭＳ方法が開発された。
【０２７１】
分析は、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）とインターフェース接続された誘導体化フリーの液体クロマトグラフィーと合わせた、化学的加水分解方法の組み合わせに基づいた。シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸ＮＡＮＡ）は、弱酸性条件下で酸加水分解によってＰＳＧＬ変異体１Ａから最初に放出された。シアル酸が放出された時点で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法の使用のおかげでその定量化が行なわれた。シアル酸量は、サンプルにおける応答を参照標準検量線と比較することによって決定された。他のＣＨＯサブクローンから精製されたタンパク質を用いて行なわれた実験では、シアリル化は、典型的に９．６〜１７．９％ｗ／ｗ含むことが分かった。
【０２７２】
３．４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）、分析も、ＰＳＧＬ変異体１Ａ分子量を決定するために行なわれた。この技術は、サンプルをマトリックスと混合するステップを含み、それから、プレートまたはプローブ上にコーティングされて、コリメート集束光ビームに曝されて、イオン化および脱離を引き起こす。ＭＡＬＤＩは、高感度および少ない断片化で、大質量イオンを産生する利点を有する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験は、無傷かつ還元形態でＰＳＧＬ変異体１Ａに対して行なわれた。ＭＡＬＤＩ実験によって決定されるように、ＰＳＧＬ変異体１Ａの平均分子量は、約３５．４ｋＤａで測定された。ＤＴＴによる還元は、ＰＳＧＬ変異体１Ａ質量の２倍低減をもたらし、精製されたタンパク質の二量体特性を示した。
【０２７３】
３．５．ペプチドマッピング（酵素消化）
ペプチドマッピング（ＰＭＡＰ）を用いて、硫酸化およびＮ−およびＯ−グリコシル化を含むキメラ糖タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を解明した。この目的に対して、キモトリプシンおよびＡｓｐ−Ｎの両方を、タンパク質消化に適用して、ＬＣ−ＭＳ液体クロマトグラフィー質量分析を続けた。
【０２７４】
３．５．１．キモトリプシンによる断片化
キモトリプシン断片化を、製造元（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ＭＳ  Ｇｒａｄｅ，Ｃａｔ．Ｎ．９００５６，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって提供されるプロトコルに従って行なった。乾燥キモトリプシンの１バイアルを、２５μＬのＨＣｌ  ０．１Ｍ中に再構成して、使用前に５００μＬエッペンドルフチューブ内に２μＬアリコートとして−１８℃で保管した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ（８，１０  ｍＭ  ＣａＣｌ２からなる消化バッファーを調製するために、３．０３ｇのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ（Ｍ  １２１．４ｇ／ｍｏｌ）および３６８ｍｇ  ＣａＣｌ２（Ｍ  １４７．０２ｇ／ｍｏｌ）を水に溶解させた。１．２Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨを８．０に調節して、容量を２５０ｍＬに満たした。
【０２７５】
５０（５０）μＬのＰＳＧＬ−１変異体１Ａストック溶液（０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬ）を、２μＬのキモトリプシンおよび４８μＬの消化バッファーに加えた。溶液を、ＬＣ−ＭＳにおいて注入前に３７℃で１８時間インキュベートした。
【０２７６】
３．５．２．エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎを用いた断片化
エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ断片化を、製造元（Ａｓｐ  Ｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｇｒａｄｅ  Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎ．１１０５４５８９００１）によって提供されるプロトコルに従って行なった。乾燥Ａｓｐ−Ｎの１バイアルを、５０μＬの水中に再構成して、使用前に５００μＬエッペンドルフチューブ内に５μＬアリコートとして−１８℃で保管した。５０ｍＭリン酸ナトリウムからなる消化バッファーを調製するために、１．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４（Ｍ  １１９．９８ｇ／ｍｏｌ）を水に溶解させた。１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に調節して、容量を２５０ｍＬに満たした。
【０２７７】
１０（１０）μＬのＰＳＧＬ−１変異体１Ａストック溶液（０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬ）を、５μＬのキモトリプシンおよび３５μＬの消化バッファーに加えた。溶液を、ＬＣ−ＭＳにおいて注入前に３７℃で１８時間インキュベートした。
【０２７８】
同様のＬＣ−ＭＳ分析を、Ａｓｐ−Ｎおよびキモトリプシン消化の特性化のために用いた。これらの実験は、温度制御されたサンプルマネジャー、バイナリ―溶媒マネジャーおよび加熱されたカラムコンパートメントからなるＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（登録商標）ＵＰＬＣシステムを用いて行なわれた。カラム出口は、質量分析計に直接接続された。分析カラムは、４０℃にて、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）由来の、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ（登録商標）１２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．１×１５０ｍｍ  ｉ．ｄ．，粒子サイズ２．７μｍであった。カラムからの化合物の溶出は、０．１％ＴＦＡを含む超純水および０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリルからなる移動相を用いた勾配モードで行なわれた。流速および注入容量は、それぞれ、０．３ｍＬ／分および１０μＬに設定した。検出は、化合物によって正および負のイオン化モードでエレクトロスプレーイオン化源を具備したＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱＳタンデム四重極質量分析計上で行なわれた。窒素およびアルゴンは、それぞれ、噴霧ガスおよび衝突ガスとして用いた。分析は、スキャンモードで行なわれた。データの取得および処理は、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアパッケージの支援で行なわれた。
【０２７９】
上記の分析は全て、以下の結論を可能にした：
・ＰＳＧＬ−１変異体１Ａ糖タンパク質のＮ末端構造は、ピログルタミン酸形態ｐＱＡＴＥＹＥＹＬが優勢である。
・ＰＳＧＬ変異体１Ａの二量体特性は、（５０ＴＣＰＰＣＰＬ５６）２配列に起因する（Ｍ＋２Ｈ）＋２＝７２８．５の存在によって確認された。このペプチドの単量体形態に対応するイオンは検出されず、ＰＳＧＬ変異体１Ａは完全に二量体形態であることを示唆した。
・Ｔｈｒ１６上のＯ−グリカン残基の構造が確認された：実際に、予期されたシアリル−ルイス−Ｘモチーフ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコースおよびシアル酸を含むコア２構造が同定された。
・チロシン５、７および１０の硫酸化は、負のスキャンモードでの質量分析によっても示された。
【０２８０】
翻訳後修飾（ＰＴＭ）の大部分は、配列番号３８において報告されている。
【０２８１】
実施例４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＰ−セレクチン上の親和性結合
実験は、ＷＯ２０１２／０２００３０の実施例２に記載の精製されたタンパク質Ｆｒ１および上記の実施例２に記載の変異体１Ａを用いて行なわれた。
【０２８２】
ＰＳＧＬ変異体１Ａの結合強度を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）由来のＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。ＳＰＲ技術は、生体分子間の結合のプロセスをリアルタイムでラベルを用いずにモニタリングするのを可能にする。Ｐ−セレクチン（標的リガンド）は、センサーチップ表面に付着されたが、目的のタンパク質は、マイクロ流体システムを用いて表面の上に溶液で流れて、再生可能なサンプル送達および低いサンプル消費が確認された。ＳＰＲは、結合イベントを、チップ表面における質量の変化として検出する。結果として、センソグラムが、時間に対してＳＰＲ応答をプロットすることによって生産される。
【０２８３】
第一に、Ｐ−セレクチン／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ）のビオチン化を、インハウスで行なった。それから、ＳＡチップ（ストレプトアビジンチップ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のワーキングセンサー（Ｆｃ２）上のＰ−セレクチン／Ｆｃの固定化を、以下のとおりに行なった：１容量の１０×ＨＢＳ−Ｎバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）（５０ｍＬ）を、９容量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水（４５０ｍＬ）で希釈した。５００マイクロリットルのＣａＣｌ２  １．５Ｍ（Ｆｌｕｋａ）、ｐＨ約５．６を、希釈されたバッファー（最終１．５ｍＭ）に添加して、０．２μｍＰＥＳフィルターを通して濾過した。ランニングバッファーを、４８．７５ｍＬのＨＢＳ−Ｎ、ＣａＣｌ２  １．５ｍＭバッファーおよび１．２５０ｍＬの界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を用いて、５０ｍＬファルコンチューブ中で調製した。直ちに使用しないＨＢＳ−ＮバッファーおよびＣａＣｌ２  １．５ｍＭは、＋４℃で保管した。
【０２８４】
試験するためのそれぞれのサンプルを、ランニングバッファー中に希釈して、１２５ｎＭの指示された濃度を得た。手動ランを、３０μＬ／分の流速で、参照センサー（Ｆｃ１）およびＦｃ２に対して開始した。参照の引き算２−１を選択した。ベースラインが安定したらすぐに、分析物を３０秒間、または、結合平衡が到達されない場合はそれよりも長く注入した。異なる分析物または異なる濃度の同一の分析物の結合を直接比較するために、それぞれのサンプルに関して、同一のサイクルパラメーター、例えば：
待機    １２０秒
注入    ３０秒
待機    ３００秒
をプログラムする必要があった。
【０２８５】
手動ランが終了したら、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．０を開いて、それぞれのサイクルのオーバーレイを作成した。
【０２８６】
ＳＰＲ実験に基づいて、Ｐ−セレクチンに向かう結合親和性が測定されて、標的に対するキメラタンパク質の結合強度は、Ｆｒ１結合と同等またはそれよりも良いことが分かった。図２は、Ｂｉａｃｏｒｅランの結果を示し、ここで、本発明のキメラタンパク質（斜線）は、Ｆｒ．１に対して、Ｐ−セレクチンリガンドへの改善された結合を示した。
【０２８７】
また、ＳＰＲは、Ｃｈｏｕ  Ｔ−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５１，２０１０，１０７−１１１に記載の方法による、細胞上清における変異体１Ａ滴定のためにも用いた。センサーチップを、Ｂｒａｃｃｏでビオチン化されたマウスα−ＰＳＧＬ−１抗体（ＫＰＬ−１，Ａｂｃａｍ，ｃａｔ．Ｎ．ａｂ７８１８８）およびストレプトアビジンによってオーバーレイして、上清における変異体１Ａを定量化するために用いた。
【０２８８】
実施例５：リン脂質コンジュゲーションに関する変異体１Ａ−ＳＭＣＣの調製
当該プロセスは、ＷＯ２０１２／０２００３０の実施例９に従って行われた。
手短には、実施例２による変異体１（６５ｎｍｏｌｅ）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１ｍＬのリン酸バッファー０．２Ｍ（ｐＨ７．５）中に溶解させた。スルホ−ＳＭＣＣ（スルホ−ＳＭＣＣ：スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（Ｐｉｅｒｃｅ）（５５ｍｇ／ｍＬ−１２５ｍＭ）の溶液を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｆｌｕｋａ）中に調製して、および５２μＬの溶液を、変異体１溶液に添加した。溶液を、室温で４５’インキュベートした。それから、リン酸バッファー２０ｍＭ（ｐＨ６）中で平衡化されたスピンカラム（Ｚｅｂａスピンカラム５ｍＬ，Ｐｉｅｒｃｅ＃８９８９０）を通して溶液をスピンさせた。イソプロパノールを溶液に添加して、３５％イソプロパノールを含む溶液を得た。
【０２８９】
実施例６：コンジュゲートＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＨの調製
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＳＨ（ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００で修飾されたジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン）を、ＷＯ２０１２／０２００３０の実施例１０に従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＰＤＰ（１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ポリエチレングリコール）−２０００］アンモニウム塩）から調製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＳＨの最終溶液をイソプロパノールで希釈して、３５％イソプロパノールを含む溶液を得た。
【０２９０】
実施例７：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＨ／変異体１Ａ−ＳＭＣＣコンジュゲートの調製
実施例５で得られた１．７ｍＬの変異体１Ａ−ＳＭＣＣ（６５ｎｍｏｌｅ）溶液を、実施例６で得られたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＳＨ（３２５ｎｍｏｌｅ−５当量）の溶液に添加した。溶液を、撹拌（回転輪）して室温で３時間インキュベートした。
【０２９１】
それから、ＡＮＸセファロースゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアニオン交換クロマトグラフィーによって溶液を精製した。精製された変異体１コンジュゲートを含む溶液を、ＴＲＩＳバッファー２０ｍＭ  ｐＨ７．５中で平衡化されたスピンカラム（Ｚｅｂａスピンカラム１０ｍＬ，Ｐｉｅｒｃｅ＃８９８９３）を通してスピンさせた。
【０２９２】
実施例８：実施例７のコンジュゲートを含む微小胞の調製。
ＤＳＰＣ（ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン）およびパルミチン酸（８０／２０モル比）の混合物１０ｍｇを、７０℃でシクロオクタン（０．８ｍＬ）中に溶解させた。
【０２９３】
別個に、実施例７に従って調製されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＨ／変異体１−ＳＭＣＣコンジュゲート溶液（２８ｎｍｏｌｅ−１．３ｍＬ）を、８．７ｍＬのＰＥＧ４０００  １０％溶液（蒸留水中）に添加した。ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、（８５μＬの水中、０．８５ｍｇ）の溶液を、この水相に添加した。
【０２９４】
上記の調製された有機溶液および水溶液を、高速ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ３０００）を用いて混合してエマルションを得た。生じたエマルションを、６０℃で１時間、撹拌下で加熱して、それから、室温（約２２℃）に冷却した。
【０２９５】
得られたエマルションを、ＰＥＧ４０００  １０％（蒸留水中）の溶液で２回希釈して、ＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（０．５ｍＬエマルション／バイアル）。バイアルを−５０℃で１時間冷凍して（Ｌｙｏｂｅｔａ  ３５凍結乾燥器−ＴＥＬＳＴＡＲ）、それから、−２０℃および０．２ｍｂａｒで１２時間、凍結乾燥させた。凍結乾燥された産物を、それから、ペルフルオロ−ｎ−ブタンおよび窒素（３５／６５ｖ／ｖ）混合物の雰囲気に曝して、バイアルを密封した。
【０２９６】
産物を、穏やかに手で混合することによって生理食塩水１５０ｍＭ（１ｍＬ／バイアル）の容量中に分散させた。
【０２９７】
実施例９：フローチャンバー設定における、標的化された微小胞のインビトロ結合活性
効果的な結合を試験するために、ＷＯ２０１２／０２００３０（実施例６）に記載のとおりに調製された標的化された微小胞、および、本発明（実施例８）に従って調製されたものを、マウスＦｃ  Ｐ−セレクチン（カタログ番号７３７−ＰＳ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）またはヒトＦｃ  ＰおよびＥセレクチン（Ｒ＆Ｄカタログ番号１３７−ＰＳ  ５０および７２４  ＥＳ  １００）のコーティングを含むフローチャンバー設定において、４μｇ／ｍＬで注入した。微小胞（８０×１０６／４００μＬ  ＴＢＳ＋＋の同等数）を、ボーラス様式でフローチャンバー（ＦＣＳ２，Ｂｉｏｐｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を通して注入して、マウスＰ−セレクチン（またはヒトＰ−またはＥ−セレクチン）コーティング層上へのそれらの接着を、ＴＢＳ中５０％（ｖ：ｖ）ヒト血漿（Ｓｔｅｈｅｌｉｎ  ＆  Ｃｉｅ  ＡＧ）の存在下で、１０分の期間にわたって１．０ｍＬ／分の流速（７１４ｓ−１のせん断速度）で評価した。微小胞蓄積の定量分析を、画像処理プログラムＡｎａｌｙｓｉｓ  ＦＩＶＥ（ＳＩＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、合計１０分のインフュージョンにわたって２分間隔で、観察された領域内に付着する微小胞の数をカウントすることによって行なった。１０分後に、５つの写真をランダムに撮って、結合した微小胞の数を測定して、１０分で結合した泡の数（ＮＢＢ）として表した。それぞれの観察された領域は、対物ミクロメーターの補助により測定して１８３×１３７μｍであった。測定は、チャンバーの中央と出口の間で行なった。
【０２９８】
同様に、実施例８に従って調製された標的化された微小胞の懸濁液（標的化リガンドとしての変異体１Ａ）を、上述のようにフローチャンバー内に注入して、それらの結合活性を上記の手順に従って決定した。
【０２９９】
実験を、上記と同一の濃度（４μｇ／ｍｌ）でヒトＥ−セレクチンおよびマウスＰ−セレクチンのコーティングに対して繰り返した。結果を表４に示す。
【０３００】
【表４】
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【０３０１】
上記の結果から推論できるように、新たに調製されたＭＢ−ＰＳＧＬ−１変異体１Ａの結合挙動は、Ｆｒ１を保有する微小気泡と同様であり：それらは、血漿内で凝集することなくフィルム結合を示し、ヒトおよびマウスＰ−セレクチンの両方ならびにヒトＥ−セレクチンに結合する。
【０３０２】
実施例１０：フラグメント１を有する微小胞（比較例）および変異体１Ａのインビボ実験
上記の実施例８に従って調製された変異体１Ａを有する微小胞、および、ＷＯ２０１２／０２００３０、実施例６に従って調製されたフラグメント１（Ｆｒ−１）を保有するものを、炎症性ラットモデルにおいて比較した。炎症を、リポ多糖（ＬＰＳ，０．２６：Ｂ６  Ｓｉｇｍａ  Ｌ−８２７４，２．１ｍｇ／ｋｇ）の注入によってラット後肢において誘導した。標的化された微小胞の効果的な結合を、炎症プロセスの誘導の２４時間後に、超音波造影によって評価した。コントラストモードを運転する９Ｌ線形変換器（送信周波数、４．０ＭＨｚ（Ｒｅｓ）；ダイナミックレンジ、４８ｄＢ；深さ、２０ｍｍ；Ｔｉｍｅ−Ｇａｉｎ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ（ＴＧＣ）、線形）を具備した、Ｌｏｇｉｑ  Ｅ９超音波スキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）を用いて、コントラスト増強超音波イメージングを行なった。３０秒間、毎秒１画像を低メカニカルインデックス（ＭＩ＝０．０６）で記録し、それから、１５秒毎に１画像を、１０分まで記録した。単回投与注入の１０分後に、コントラスト増強シグナルを、４Ｈｚのフレームレートで１０秒間獲得した。コントラスト増強画像は、Ｄｉｃｏｍファイルとして記録されて、インハウス（ＶｕｅＢｏｘ，Ｂｒａｃｃｏ  Ｓｕｉｓｓｅ  ＳＡ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で開発された専用ソフトウェアを用いて解析された。このソフトウェアは、画素レベルで、ログ圧縮されたビデオシーケンスの線形化後に超音波検査シグナルの定量分析を可能にして、目的領域（ＡＯＩ）内のコントラストエコパワー振幅（任意単位、Ａ．Ｕ．と表わされる）を提供する。Ｂｒａｃｃｏにおいて開発されたソフトウェア（ＶｕｅＢｏｘ市販キット）に統合されて、そして、結合された泡を検出するのを助ける、固定された泡イメージング（ＦＢＩ）アルゴリズムを、１０分で記録されたフレーム上に適用した。ＦＢＩ処理は、イメージのサブセットに適用される最小強度の投射機能に依拠し、それは、ウインドウ長（４０フレーム）に依存する。生じたイメージ（図３）は、変異体１Ａを保有する微小気泡が、炎症を起こしたラットの足における炎症を可視化することが可能であり、観察されたシグナルが、Ｆｒ−１を保有する微小気泡で観察されたものと非常に似ていることを示した。
【０３０３】
実施例１１：実施例７のコンジュゲートを含む蛍光リポソームの調製。
コレステロール（２８．２５ｍｇ−Ｍｅｒｃｋ＃３６７２）を、１ｍＬのクロロホルム中に溶解させた。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（１３．９ｍｇ−Ｇｅｎｚｙｍｅ＃ＬＰ−Ｒ４−０３９）を、１ｍＬのクロロホルム中に溶解させた。ＤｉＲ（１，１’−ジオクタエシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＃Ｄ１２７３１）をエタノール中に溶解させて、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０４】
ＤＳＰＣ（７９．７ｍｇ−１０１μｍｏｌｅｓ−Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＃ＬＰ−０４−０１３）を、１００ｍＬ−ラウンドバルーン内で量り、３０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物（２／１  ｖ／ｖ）中に溶解させた。コレステロール溶液のサンプル（５７５μＬ−４２μｍｏｌｅｓ）、ＤＳＰＥＰＥＧ２０００溶液のサンプル（２９０μＬ−１．５μｍｏｌｅ）、および、ＤｉＲ溶液のサンプル（１００μＬ−１μｍｏｌｅ）を、ＤＳＰＣ溶液に添加した。得られた溶液を、６５℃で１０分間撹拌して、減圧下で溶媒を除去して脂質ブレンドを得た。このブレンドを、２０ｍｍＨｇ下で６５℃にて、それから、０．２ｍＢａｒ下で２５℃にて一晩、乾燥させた。
【０３０５】
乾燥された脂質ブレンドを、７０℃にて撹拌下（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で２０分間、１０ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）中に再分散させた。得られた懸濁液を、それから、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅフィルター上（１×１μｍ，１×０．６μｍおよび４×０．４μｍ）で数回、７０℃にて押し出した。この押し出しステップは、様々なリポソームサイズを得るのに適合され得る。それから、リポソーム懸濁液を室温に冷却して、暗所で４℃にて保管した。
【０３０６】
変異体コンジュゲートの取り込みは、ポストインサーション手順によって行なった。手短には、室温にて１６時間、暗所で、５００μＬのリポソーム懸濁液を、実施例７で調製された１ｍＬの変異体１Ａコンジュゲート溶液（２２ｎｍｏｌｅ）と混合した。得られたリポソーム懸濁液を、精製せずにインビボ実験に用いた。
【０３０７】
Ｆｒ−１リポソームは、変異体１ＡコンジュゲートをＦｒ−１コンジュゲートによって置き換えて、上述と同じ手順を用いて得られた（ＷＯ２０１２／０２００３０、実施例６に記載のように調製した）。２つのリポソーム懸濁液の特性を、表６において比較した。
【０３０８】
リポソームのサイズおよびゼータ電位を、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ  ＺｅｔａＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて決定した。リポソームあたりのリガンドの密度を、リポソーム洗浄後（遠心分離２００００ｇ／３０分）に、シアル酸決定（実施例３．３による）によって決定した。
【０３０９】
【表５】
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【０３１０】
実施例１２．マウスＬＰＳモデルにおける変異体１Ａおよびフラグメント１（比較例）を有するリポソームを用いた光学イメージング実験
後肢炎症を有する動物の２群において、変異体１Ａを保有するリポソームを、フラグメント１を有するリポソームと比較した。炎症は、リポ多糖（ＬＰＳ，０．２６：Ｂ６  Ｓｉｇｍａ  Ｌ−８２７４）の筋肉内注入によって、マウス後肢内に誘導された。光学イメージングは、前臨床のＦｌｕｏｂｅａｍ  ７００システムを用いて行なわれた。光学ヘッドは、その後肢がカメラの視野の中央に置かれるように動物の上に置かれた（マウスおよびカメラの間の距離、１５ｃｍ）。炎症プロセスの誘導の２４時間後、標的化されたリポソームを注入して、蛍光シグナルを経時的に（２４時間まで）追跡した。注入および初期を、１６分の間に５秒ごとに１画像でのシーケンスとして記録して（固定された露出時間）、２０、３０、４５分、１、２、および４時間に個々の画像が続けられた。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて画像を解析した。全てのキャプチャーフレームにおいて、同一の目的領域（ＡＯＩ）を描いて、炎症を起こした対側足の輪郭を描いた。ミリ秒あたりの平均蛍光強度を、それぞれの画像のＡＯＩにおいて計算した。蛍光画像を図４に示し、比率（炎症を起こした足を、対側足で割る）として表された定量化結果を表７に示す。変異体１Ａ−リポソーム−ＤＩＲ注入の２時間後に記録された蛍光画像は、対側足におけるシグナルと比較して、炎症を起こした足においてより高いシグナルを示した。動物３の場合では、炎症を起こした足において観察されたシグナルは、おそらく、このマウスにおいてＬＰＳにより誘導された低い炎症に起因して低い。対照的に、動物６は、高い炎症の指標である高いシグナルを示す。炎症を起こした足／対側足の比の計算は、フラグメント−１（Ｆｒ−１）と比較して変異体１Ａに関してより高く、薬剤の良好な特性を示す。
【０３１１】
【表６】
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【０３１２】
実施例１３．ＨＡクロマトグラフィー（負または正）による精製条件の最適化。
ＡＥ／ＨＩおよびＨＡ（負）による精製
６００ｍＬの馴化培地を０．２２μｍ膜上で濾過して、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５で平衡化されたＡＥＸカラム上にロードした（Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標），ＧＥ，２．６×７ｃｍ，３７ｍＬ）。結合されたタンパク質を、３０％および１００％の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５での２ステップ溶出によって溶出した。標的タンパク質は、１００％画分において溶出された。カラムを１Ｍ  ＮａＯＨで浄化して、２０％．ＥｔＯＨ中で４℃にて保管した。馴化培地の導電率は、１０ｍＳ／ｃｍより下であった。
【０３１３】
固体ＮａＣｌを、ＡＥＸ精製の１００％溶出ステップ由来のプールに、４Ｍの最終濃度まで添加した。カラムをオーバーロードしないようにサンプルを二部に分けた。それから、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で以前に平衡化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（フェニルセファロース（商標），ＧＥ，１．６×９ｃｍ，１８ｍＬ容量）上にロードした。結合されたタンパク質を、５０％および１００％の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５において２ステップで溶出した。標的タンパク質は、５０％画分において溶出された。
【０３１４】
２回目のランの後に、０．２Ｍ  ＮａＯＨでカラムを浄化して、２０％ＥｔＯＨ中で４℃にて保管した。
【０３１５】
２つのＨＩＣランにおける最初の溶出ステップからのプールを組み合わせて、リン酸／ＣａＣｌ２濃度を、５００ｍＭリン酸ｐＨ６．８および１Ｍ  ＣａＣｌ２の添加により、それぞれ、１０および０．３ｍＭに調整した。それから、プールを、Ａｍｉｃｏｎ（商標）限外濾過撹拌セル（Ｍｅｒｃｋ，１０ｋＤａ公称分子量カットオフで、膜ＹＭ１０とともに組み立てられる）内で、１０ｍＭリン酸、０．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．８に対して透析濾過した。それから、透析濾過されたプールを、１０ｍＭリン酸、０．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．８で以前に平衡化されたヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ，２．２×５ｃｍ，１９ｍＬ容量）上にロードした。ＰＳＧＬ変異体１Ａは、ＦＴ画分において溶出された（負のクロマトグラフィー）。
【０３１６】
ＦＴ画分を、製造元の説明書に従ってＡｍｉｃｏｎ（商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔを用いて濃縮した。精製されたタンパク質を、−４０℃で凍結させた。最終濃度は、３８．７ｍｇの合計収量に関して０．８９ｍｇ／ｍＬであり（７３％）、９９．７％の純度であった（図５）。
【０３１７】
残余ＤＮＡおよびタンパク質汚染物質を、それぞれのクロマトグラフィーステップ後に、それぞれ、ＤＮＡ定量アッセイ（ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ，Ｓｉｇｍａ、検出限界２ｍｇ／Ｌ）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（他のタンパク質に対する純度）によって測定した。
【０３１８】
値を、以下の表に要約する。
【０３１９】
【表７】
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【０３２０】
ＡＥ／ＨＩおよびＨＡによる精製（正）
１０００ｍＬの馴化培地を、０．２２μｍ膜上で濾過して、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５で平衡化されたＡＥカラム（Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標），ＧＥ，２．６×７ｃｍ，３７ｍＬ）上にロードした。結合されたタンパク質を、３０％および１００％の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５での２ステップ溶出により溶出させた。標的タンパク質は、１００％画分において溶出された。カラムを１Ｍ  ＮａＯＨで浄化して、２０％ＥｔＯＨ中で４℃にて保管した。
【０３２１】
固体ＮａＣｌを、４Ｍの最終濃度まで、ＡＥ精製の１００％溶出ステップからプールに添加した。カラムをオーバーロードしないようにサンプルを二部に分けた。それから、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で以前に平衡化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（フェニルセファロース（商標），ＧＥ，１．６×９ｃｍ，１８ｍＬ容量）上にロードした。結合されたタンパク質を、５０％および１００％の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５での２ステップにより溶出させた。標的タンパク質は、５０％画分において溶出された。
【０３２２】
３回目のランの後に、カラムを０．２Ｍ  ＮａＯＨで浄化して、２０％ＥｔＯＨ中で４℃にて保管した。
【０３２３】
それぞれのＨＩＣランの最初の溶出ステップからのプールを合わせて、水で４倍に希釈した。それから、希釈されたプールを、５ｍＭリン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．８で以前に平衡化されたヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ，２．２×５ｃｍ，１９ｍＬ容量）上にロードした。結合されたタンパク質を、０〜１２．５％の５００ｍＭリン酸バッファーからの勾配で溶出させた。ＰＳＧＬ変異体１Ａは、最初のピークとして溶出された。
【０３２４】
標的タンパク質を含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０膜，１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を製造元の説明書に従って用いて濃縮した
【０３２５】
精製されたタンパク質を−４０℃で凍結させた。最終濃度は、２５ｍｇの合計収量に関して１．０９ｍｇ／ｍＬであり、合計の標的タンパク質含有量の約７０％および９８．７％の純度に対応した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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