(57)【要約】  配列番号４〜７の１１位に対応する位置の少なくともアスパラギンまたはセリン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２２、配列番号５１または配列番号５２によって定義される、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含む、改善されたアルカリ安定性をもつＦｃ結合ポリペプチド。【選択図】図１
2019517789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５３
ＫＥＸ１Ｑ  Ｘ２ＡＦＹＥＩＬＸ３ＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＸ４Ｘ５Ｆ  ＩＸ６Ｘ７ＬＫＤＸ８ＰＳＸ９  ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＬＡＥＡＫＸ１３  Ｘ１４ＮＸ１５ＡＱＡＰＫ  （配列番号５３）
によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％または少なくとも９５％または９８％の同一性を有する配列を含む、Ｆｃ結合ポリペプチドであって、
上式で、互いに個別に：
Ｘ１＝ＡまたはＱまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、ＨまたはＲ
Ｘ３＝ＨまたはＫ
Ｘ４＝ＡまたはＮ
Ｘ５＝Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ
Ｘ６＝ＱまたはＥ
Ｘ７＝ＳまたはＫ
Ｘ８＝ＥまたはＤ
Ｘ９＝ＱまたはＶまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋ、ＲまたはＡまたは欠失
Ｘ１１＝Ａ、ＥまたはＮまたは欠失
Ｘ１２＝ＩまたはＬ
Ｘ１３＝ＫまたはＲ
Ｘ１４＝ＬまたはＹ
Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲ
であるＦｃ結合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１＝Ａまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ
Ｘ３＝Ｈ
Ｘ４＝Ｎ
Ｘ６＝Ｑ
Ｘ７＝Ｓ
Ｘ８＝Ｄ
Ｘ９＝Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋまたは欠失
Ｘ１１＝Ａまたは欠失
Ｘ１２＝Ｉ
Ｘ１３＝Ｋ
Ｘ１４＝Ｌ
である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ｉ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄであり、
ｉｉ）Ｘ１は欠失、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄであり、
ｉｉｉ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９は欠失、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄであり、
ｉｖ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０は欠失、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄであり、
ｖ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１は欠失、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄであり、または
ｖｉ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
以下からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはその配列から本質的になる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド：
ｉ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０；
ｉｉ）配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５；
ｉｉｉ）配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９；または
ｉｖ）配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４および配列番号９５。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記アルカリ安定性が、２２＋／−２℃の０．５Ｍまたは１．０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中、２４または２５時間のインキュベーションの後に残存ＩｇＧ結合容量によって測定して改善されているように、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７によって、例えば配列番号７などによって定義されるポリペプチドまたは親ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドを含むかまたはそれから本質的になる多量体であって、任意選択で前記ポリペプチドが、１５個までのアミノ酸を含むリンカーによって連結されている多量体。
【請求項７】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５によって定義される配列の群から選択される配列を含むか、あるいはそれから本質的になる、請求項６に記載の多量体。
【請求項８】
前記Ｃ末端またはＮ末端に、または、前記Ｃ末端またはＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基の範囲内に、１または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される１または複数のカップリングエレメントをさらに含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは多量体。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは多量体をコードする核酸またはベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドまたは多量体が、例えばチオエーテル結合によって、固相支持体に結合されている分離マトリックス。
【請求項１１】
２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での２４時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記ＩｇＧ容量が、前記インキュベーションの前の前記ＩｇＧ容量の少なくとも８０、例えば少なくとも８５、少なくとも９０または少なくとも９５％であり、および／または、２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ中での２４時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記ＩｇＧ容量が、前記インキュベーションの前の前記ＩｇＧ容量の少なくとも７０、例えば少なくとも８０または少なくとも９０％である、請求項１０に記載の分離マトリックス。
【請求項１２】
免疫グロブリンを単離する方法であって、請求項１０または１１に記載の分離マトリックスを使用する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と、請求項１０または１１に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
ｂ）前記分離マトリックスを洗液で洗う工程と、
ｃ）溶出液を用いて前記分離マトリックスから前記免疫グロブリンを溶出する工程と、
ｄ）前記分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と
を含む、方法。
【請求項１４】
前記洗浄液が、アルカリ性、例えばｐＨが１３〜１４であり、および／または、前記清浄液が０．１〜１．０Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨ、例えば０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）〜ｄ）が少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回または５０〜２００回繰り返される、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には、免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用なプロテインＡの変異した免疫グロブリン結合ドメインに関する。また、本発明は変異ドメインの多量体に、さらに、変異ドメインまたは多量体を含む分離マトリックスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中で製造または開発のいずれにおいても最も普及しているバイオ医薬品を代表する。この特別な治療市場に対する商業的需要が高いことと、そのために価値が高いことにより、製薬会社は、付随するコストを制御する一方で各社のそれぞれのｍＡｂ製造プロセスの生産性を最大化することに重点を置いてきた。
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーは、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの精製の重要なステップの１つとして、大部分の例で使用される。特に興味深い種類のアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変部分と特異的結合することの可能なタンパク質であり、そのような相互作用は、抗体の抗原結合特異性とは独立している。そのような試薬は、限定されるものではないが血清または血漿調製物または細胞培養由来の供給原料などの異なる試料から、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用されることができる。そのようなタンパク質の一例は、異なる種由来のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分およびＦａｂ部分と結合することのできるドメインを含む、ブドウ球菌のプロテインＡである。これらのドメインは、一般にＥ−、Ｄ−、Ａ−、Ｂ−およびＣ−ドメインと表示される。
【０００４】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）に基づく試薬は、その高い親和性および選択性に起因して、バイオテクノロジーの分野、特に抗体の捕捉および精製のための、ならびに検出または定量化のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて広範な用途が見出されている。現在、ＳｐＡに基づくアフィニティー媒体は、おそらく、工業用の細胞培養上清を含む、異なる試料からモノクローナル抗体およびその断片を単離するための最も広く使用されるアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡ−リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインＡ（例えば、プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）の形態で市販されており、組換えプロテインＡからなるものもある（例えばｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。より具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で実施した遺伝子操作は、その支持体との付着を促進し、リガンドの生産性を増加することを目的とする。
【０００５】
これらの用途は、その他のアフィニティークロマトグラフィー用途のように、夾雑物を確実に除去することに総合的な注意を必要とする。そのような夾雑物は、例えば、クロマトグラフィー法において固定相またはマトリックスに吸着される、溶出しなかった分子、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌およびウイルスをはじめとする望ましくない生体分子または微生物などであり得る。マトリックスからのこのような夾雑物の除去は、通常、その後の使用の前にマトリックスを再生するために、所望の生成物の最初の溶出の後に行われる。そのような除去は通常、固定相から夾雑物を溶出することのできる薬剤を使用する、定置洗浄（ＣＩＰ）として公知の方法を伴う。多くの場合使用されるそのような薬剤の種類の１つは、固定相に通すアルカリ溶液である。現在最も広く使用される洗浄および消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は、汚染の程度および性質に応じて０．１から例えば１Ｍまでの範囲であり得る。この戦略は、１３を上回るｐＨ値をもつ溶液にマトリックスを曝露することに関連する。タンパク質性アフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関して、そのようなアルカリ環境は非常に厳しい条件であり、結果的に、関与する高いｐＨに対するリガンドの不安定性による能力の低下をもたらす。
【０００６】
そのため、広範な研究がアルカリ性ｐＨ値に耐える容量の改善を示す、操作されたタンパク質リガンドの開発に着目してきした。例えば、Ｇｕｌｉｃｈら（Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ  Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ  Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ  Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０（２０００），１６９−１７８）は、アルカリ性環境での連鎖球菌アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためにタンパク質工学を提案した。Ｇｕｌｉｃｈらは、４つ全てのアスパラギン残基がロイシン（１つの残基）、アスパラギン酸（２つの残基）およびリジン（１つの残基）に置き換えられている、ＡＢＤの変異体を作製した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈらは、作製した変異体が天然のタンパク質に似た標的タンパク質結合挙動を示すこと、および操作されたリガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ条件に繰り返し曝露した後に、操作されていない親リガンドを用いて調製したカラムよりも高い結合容量を示すことを報告している。よって、４つ全てのアスパラギン残基は、構造および機能に重大な影響を及ぼすことなく置き換えられることができることがその中で結論付けられる。
【０００７】
最近の研究は、その変更をプロテインＡ（ＳｐＡ）にも行って類似した性質をもたらすことができることを示す。参照によりその全文が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号明細書は、少なくとも１つのアスパラギン残基をグルタミン酸またはアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させると、その変異が、約１３〜１４までのｐＨ値で親ＳｐＡ、例えばＳｐＡのＢドメイン、または、ＳｐＡのＢドメインから誘導した合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５，１４３，８４４号明細書、参照によりその全文が援用される）などと比較して、増加した化学安定性を付与することを開示する。著者らは、これらの変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用する場合、予想通り分離媒体がアルカリ化剤を用いる洗浄方法により良く耐えることができることを示す。アルカリ安定性を向上させる目的をもつプロテインＡドメインのさらなる変異は、米国特許第８，３２９，８６０号、特開２００６−３０４６３３Ａ号、米国特許第８，６７４，０７３号、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８４４号、米国特許出願公開第２０１２／０２０８２３４号、米国特許第９，０５１，３７５号、米国特許出願公開第２０１４／００３１５２２号、米国特許出願公開第２０１３／０２７４４５１号および国際公開第２０１４／１４６３５０号にも公開されており、その全ては参照によりその全文が本明細書に援用される。しかし、現在利用可能な変異体はなおアルカリ性のｐＨに対して感受性があり洗浄中のＮａＯＨ濃度は通常０．１Ｍに制限され、これは完全な洗浄を実現することが困難であることを意味する。高いＮａＯＨ濃度は、洗浄を向上させるかもしれないが、容認できない容量損失を招く。
【０００８】
よって、この分野では、アルカリ洗浄方法に対してさらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性がなおある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第２７２８０００号明細書
【発明の概要】
【００１０】
本発明の一態様は、改善されたアルカリ安定性を有するポリペプチドを提供することである。これは、請求項１に記載のポリペプチドによって実現される。
【００１１】
１つの利点は、アルカリ安定性が親ポリペプチドよりも改善され、免疫グロブリンおよびその他のＦｃ含有タンパク質に対する選択性の高い結合が維持されていることである。
【００１２】
本発明の第２の態様は、複数のポリペプチドを含む、アルカリ安定性の改善された多量体を提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される多量体によって実現される。
【００１３】
本発明の第３の態様は、アルカリ安定性の改善されたポリペプチドまたは多量体をコードする核酸またはベクターを提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される核酸またはベクターによって実現される。
【００１４】
本発明の第４の態様は、アルカリ安定性の改善されたポリペプチドまたは多量体を発現することのできる発現系を提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される発現系によって実現される。
【００１５】
本発明の第５の態様は、免疫グロブリンおよびその他のＦｃ含有タンパク質に選択的に結合し、改善されたアルカリ安定性を示すことのできる分離マトリックスを提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される分離マトリックスによって実現される。
【００１６】
本発明の第６の態様は、免疫グロブリンまたはその他のＦｃ含有タンパク質を単離する効率的かつ経済的な方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される方法によって実現される。
【００１７】
本発明のさらなる適切な実施形態は、従属請求項に記載される。同時継続出願ＰＣＴ欧州特許出願第２０１５／０７６６３９号およびＰＣＴ欧州特許出願第２０１５／０７６６４２号は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【００１８】
定義
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質および抗体または抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
【００１９】
用語「Ｆｃ結合ポリペプチド」および「Ｆｃ結合タンパク質」とは、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）と結合することのできるポリペプチドまたはタンパク質をそれぞれ意味し、それには、例えばプロテインＡおよびプロテインＧ、または結合特性が維持されたその任意のフラグメントまたは融合タンパク質が挙げられる。
【００２０】
用語「リンカー」は、本明細書において、多量体の２つのポリペプチド単位、単量体またはドメインを互いに連結する要素を意味する。
【００２１】
用語「スペーサー」は、本明細書において、ポリペプチドまたはポリペプチド多量体を支持体に結合する要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】配列番号１〜７および５１〜５２によって定義されるＦｃ結合ドメインのアライメントを示す図である。
【図２】ＳＰＲバイオセンサーチップと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性について実施例２から得た結果を示す図である。
【図３】アガロースビーズと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【図４】アガロースビーズと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一態様では、本発明は、図１に図示される配列番号１（Ｅドメイン）、配列番号２（Ｄドメイン）、配列番号３（Ａドメイン）、配列番号２２（バリアントＡドメイン）、配列番号４（Ｂドメイン）、配列番号５（Ｃドメイン）、配列番号６（プロテインＺ）、配列番号７（Ｚｖａｒ）、配列番号５１（リンカー領域アミノ酸１〜６を含まないＺｖａｒ）または配列番号５２（リンカー領域アミノ酸１〜６を含まないＣドメイン）によって定義される（あるいはそれとの少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する）、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含むかまたはそれから本質的になり、該変異体では配列番号４〜７の１１位に対応する位置＊の少なくともアスパラギン（または配列番号２の例ではセリン）残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、Ｆｃ結合ポリペプチドを開示する。プロテインＺ（配列番号６）は、米国特許第５１４３８４４号明細書に開示されるように変異Ｂドメインであり、一方配列番号７は、変異Ｎ３Ａ，Ｎ６Ｄ，Ｎ２３Ｔを含む、本明細書においてＺｖａｒと呼ばれるプロテインＺのさらに変異したバリアントを示す。配列番号２２は、図１の位置用語を用いる、Ａ４６Ｓ変異を有する黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株由来のプロテインＡのＡドメインの天然バリアントである。これらのドメインのＮ１１の変異は、免疫グロブリン結合性を損なうことなく親ドメイン／ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。そのため、このポリペプチドは、Ｆｃまたは免疫グロブリン結合ポリペプチド、あるいはＦｃまたは免疫グロブリン結合ポリペプチド単位としても記載され得る。
【００２４】
＊この説明を通じて、図１のアミノ酸残基位置番号付けの慣習が使用され、位置番号は、配列番号４〜７の位置番号に対応するように指定される。これは多量体にもあてはまり、位置番号は、図１の慣習に従ってポリペプチド単位または単量体中の位置を指定する。
【００２５】
代わりの言い方では、本発明は、配列番号５３によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、Ｆｃ結合ポリペプチドを開示する。
【００２６】
配列番号５３
ＫＥＸ１Ｑ  Ｘ２ＡＦＹＥＩＬＸ３ＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＸ４Ｘ５Ｆ  ＩＸ６Ｘ７ＬＫＤＸ８ＰＳＸ９  ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＬＡＥＡＫＸ１３  Ｘ１４ＮＸ１５ＡＱＡＰＫ
ここで、互いに個別に：
Ｘ１＝ＡまたはＱまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、ＨまたはＲ
Ｘ３＝ＨまたはＫ
Ｘ４＝ＡまたはＮ
Ｘ５＝Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、例えばＳ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫなど
Ｘ６＝ＱまたはＥ
Ｘ７＝ＳまたはＫ
Ｘ８＝ＥまたはＤ
Ｘ９＝ＱまたはＶまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋ、ＲまたはＡまたは欠失
Ｘ１１＝Ａ、ＥまたはＮまたは欠失
Ｘ１２＝ＩまたはＬ
Ｘ１３＝ＫまたはＲ
Ｘ１４＝ＬまたはＹ
Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲ
である。
【００２７】
具体的には、配列番号５３中のアミノ酸残基は、互いに個別に：
Ｘ１＝Ａまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ
Ｘ３＝Ｈ
Ｘ４＝Ｎ
Ｘ６＝Ｑ
Ｘ７＝Ｓ
Ｘ８＝Ｄ
Ｘ９＝Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋまたは欠失
Ｘ１１＝Ａまたは欠失
Ｘ１２＝Ｉ
Ｘ１３＝Ｋ
Ｘ１４＝Ｌ
であってよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである。
【００２９】
ある種の実施形態では、Ｘ１は欠失、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９は欠失、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである。
【００３１】
ある種の実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０は欠失、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１は欠失、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである。
【００３３】
ある種の実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｆ，Ｙ，Ｗ，ＫまたはＲである。
【００３４】
上に考察される実施形態では、ポリペプチドは、いくつかの例では配列番号１〜１６、１７〜３４および３６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるいずれの配列もさらに含まないことがある。
【００３５】
Ｎ１１（Ｘ２）変異（例えばＮ１１ＥまたはＮ１１Ｋ変異）は、唯一の変異であってよく、あるいは、ポリペプチドは、さらなる変異、例えば配列番号４〜７の３、６、９、１０、１５、１８、２３、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４２、４３、４４、４７、５０、５１、５５および５７位に対応する位置の少なくとも１つでの置換などを含んでもよい。これらの位置の１または複数で、最初のアミノ酸残基は、例えばアスパラギン、プロリンまたはシステインでないアミノ酸で置換されていてよい。最初のアミノ酸残基は、例えばアラニン、バリン、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されていてよい。さらに、１または複数のアミノ酸残基が、例えば１〜６位および／または５６〜５８位から欠失されていてよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の９位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１）は、グルタミン、アスパラギン、プロリンまたはシステイン以外のアミノ酸、例えばアラニンなどであるか、またはその残基を欠失させることができる。９位および１１位の変異の組合せは、例によって示されるように、特に良好なアルカリ安定性をもたらす。具体的な実施形態では、配列番号７において９位のアミノ酸残基はアラニンであり、１１位のアミノ酸残基はリジンまたはグルタミン酸、例えばリジンなどである。９位の変異は、参照によりその全文が本明細書に援用される同時係属出願ＰＣＴ／ＳＥ２０１４／０５０８７２号明細書においても考察されている。
【００３７】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の５０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１３）は、アルギニンまたはグルタミン酸である。
【００３８】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の３位に対応する位置のアミノ酸残基は、アラニンであり、かつ／または配列番号４〜７の６位に対応する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸である。３位および６位のアミノ酸残基の１つはアスパラギンであってよく、代替実施形態では、３位および６位の両方のアミノ酸残基がアスパラギンであってよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１１）は、アラニンまたはグルタミン酸、例えばアラニンなどであるか、またはその残基を欠失させることができる。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびリジン／グルタミン酸であり、一方、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸である。
【００４０】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の２８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ５）は、アラニンまたはアスパラギン、例えばアラニンなどである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ９）は、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸およびバリンからなる群から、またはグルタミン酸およびバリンからなる群から選択されるか、あるいはその残基を欠失させることができる。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびグルタミン酸であり、一方、４０位のアミノ酸残基は、バリンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸であってよい。
【００４２】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の４２位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１０）は、アラニン、リジンまたはアルギニンであるか、またはその残基を欠失させることができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の１８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ３）は、リジンまたはヒスチジン、例えばリジンなどである。
【００４４】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の３３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ７）は、リジンまたはセリン、例えばリジンなどである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の３７位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ８）は、グルタミン酸またはアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである。
【００４６】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の５１位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１４）は、チロシンまたはロイシン、例えばチロシンなどである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４４位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１２）は、ロイシンまたはイソロイシンである。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびリジン／グルタミン酸であり、一方、４４位のアミノ酸残基はイソロイシンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸であってよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の１、２、３および４位、または３、４、５および６位に対応する位置のアミノ酸残基は欠失している。これらの実施形態の特定のバリアントでは、親ポリペプチドは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号５）である。これらの欠失の天然のＣドメインへの影響は、参照によりその全文が本明細書に援用される米国特許第９０１８３０５号明細書および米国特許第８３２９８６０号明細書に記載されている。
【００４９】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７、例えば配列番号７中の変異は：Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｅ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｔ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４ＩおよびＱ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉからなる群から選択される。これらの変異は、特に高いアルカリ安定性をもたらす。配列番号４〜７、例えば配列番号７中の変異はまた、Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４ＩおよびＱ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒからなる群から選択されることもできる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むか、あるいはその配列から本質的になる：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０。それは、例えば、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むか、あるいはそれから本質的になってよい：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９。また、それは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むか、あるいはそれから本質的になることもできる：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８。
【００５１】
ある種の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５４〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかあるいはそれから本質的になり、配列番号７１〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかあるいはそれから本質的になり、あるいは、それは、配列番号７６〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかあるいはそれから本質的になってよい。それは、さらに、配列番号８９〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むか、あるいはそれから本質的になってよい。上に考察される実施形態では、ポリペプチドは、いくつかの例では配列番号１〜１６、１７〜３４および３６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるいずれの配列もさらに含まないことがある。
【００５２】
ポリペプチドは、例えば上記の群から、またはこれらの群の部分集合から選択される配列によって定義されてよいが、それはまた、Ｎおよび／またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基、例えばＮ末端のリーダー配列および／またはＣ末端のテール配列を含んでもよい。
【００５３】
配列番号８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ｅ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１２  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＡＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１４  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ｅ，Ｑ４０Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＥ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１５  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ｅ，Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＲ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３６  Ｂ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３７  Ｃ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｅ４３Ａ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３８  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＹＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３９  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＴＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４０  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＦＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４１  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＬＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４２  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＷＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＩＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４４  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＭＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４５  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＶＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４７  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＨＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４８  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＲＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｇ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｓ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＳＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５６  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｙ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＹＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｑ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＱＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｔ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＴＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｎ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＮＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｆ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＦＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｌ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＬＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｗ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＷＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｉ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＩＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｍ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＭＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｖ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＶＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６６  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｄ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＤＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＥＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｈ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＨＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｒ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＲＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｋ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＫＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＦＡＱＡＰＫ
配列番号７２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＹＡＱＡＰＫ
配列番号７３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＷＡＱＡＰＫ
配列番号７４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＫＡＱＡＰＫ
配列番号７５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＲＡＱＡＰＫ
配列番号７６  Ｚｖａｒ（Ｑ９ｄｅｌ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥ＿Ｑ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０ｄｅｌ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳ＿  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２ｄｅｌ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  Ｓ＿ＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３ｄｅｌ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫ＿ＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号８９  Ｚｖａｒ（Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｋ４ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
Ｖ＿＿＿ＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９０  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５８ｄｅｌ）
＿＿ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ＿
配列番号９１  Ｚｖａｒ（Ｋ４ｄｅｌ，Ｆ５ｄｅｌ，Ｄ６ｄｅｌ，Ｋ７ｄｅｌ，Ｅ８ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡ＿＿＿＿＿ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ａ５６ｄｅｌ，Ｐ５７ｄｅｌ，Ｋ５８ｄｅｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ＿＿＿
配列番号９３  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
＿＿＿ＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９４  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｋ４ｄｅｌ，Ｆ５ｄｅｌ，Ｄ６ｄｅｌ，Ｋ７ｄｅｌ，Ｅ８ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
＿＿＿＿＿＿＿＿ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５８＿ｉｎｓＹＥＤＧ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＹＥ  ＤＧ
第２の態様では、本発明は、上に開示されるいずれかの実施形態によって定義される複数のポリペプチド単位を含むか、またはそれから本質的になる多量体を開示する。多量体の使用は、免疫グロブリン結合容量を増加させることがあり、また、多量体は単量体よりも高いアルカリ安定性を有することがある。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体であり得る。それは、多量体中の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、少なくとも１つの単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例えば上に開示される変異を含むことによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。あるいは、多量体中の２以上の単位は、オリゴマー種またはポリマー種、例えば最大１５または３０アミノ酸、例えば１〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸などを含む要素などを含むリンカーによって結合することができる。これは特に配列番号５１および５２の変異ならびに配列番号５３のポリペプチドの例であり、リンカーの具体例は、例えば、ＶＤＡＫＦＤまたはＡＤＮＫＦＮ、例えばＶＤＡＫＦＤなどであり得る。そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにＮ末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、または切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば１５以下、例えば１０以下または５以下などであってよい。具体例として、多量体は、ＡＱ配列をＮ末端に含むことがある。
【００５４】
ある種の実施形態では、多量体は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５からなる群から選択される配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。これらの配列は下の表に記載され、親（変異）ｎと命名される。ここでｎは多量体中の単量体単位の数である。
【００５５】
配列番号１７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ｅ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３０  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）６
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８０  リンカーのＤ２、Ａ３およびＫ４が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８１  リンカーのＫ５８、Ｖ１およびＤ２が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ  ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８２  リンカーのＰ５７、Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２およびＡ３が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ  ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８３  リンカーのＫ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７およびＥ８が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８４  リンカーのＡ５６、Ｐ５７およびＫ５８が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８５  リンカーのＶ１、Ｄ２およびＡ３が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８６  リンカーのＶ１、Ｄ２、Ａ３、Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７およびＥ８が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８７  リンカーのＫ５８とＶ１の間にＹＥＤＧが挿入された、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＹＥＤＧ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８８  Ｚｖａｒ２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
いくつかの実施形態では、上に開示されるポリペプチドおよび／または多量体は、Ｃ末端またはＮ末端に、１または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、１または複数のカップリングエレメントをさらに含む。１または複数のカップリングエレメントはまた、Ｃ末端またはＮ末端から１〜５アミノ酸残基の範囲内、例えば１〜３または１〜２アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。カップリングエレメントは、例えばＣ末端の単一のシステインであることがある。１または複数のカップリングエレメントは、Ｃ末端またはＮ末端に直接に結合してもよいし、あるいはカップリングエレメントは、最大１５アミノ酸、例えば１〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のために、ストレッチがアスパラギンを含まない場合に有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。Ｃ末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと支持体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。このことは、結合容量に重要である、結合したタンパク質の優れた移動度をもたらす。
【００５６】
ポリペプチドまたは多量体のアルカリ安定性は、例えばＮＨＳ−またはマレイミドカップリング化学を使用して、ＳＰＲチップ、例えば実施例に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップとそれをカップリングさせ、指定された温度、例えば２２＋／−２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを用いてチップの免疫グロブリン結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で何回かの１０分サイクル、例えば１００、２００または３００サイクルなどで実施することができる。２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で１００回の１０分インキュベーションサイクルの後のマトリックスのＩｇＧ容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも５５、例えば少なくとも６０、少なくとも８０または少なくとも９０％などであり得る。あるいは、上記のように測定される特定の変異体の１００サイクル後の残存ＩｇＧ容量は、親ポリペプチド／多量体の残存ＩｇＧ容量と比較することができる。この例では、変異体の残存ＩｇＧ容量は、親ポリペプチド／多量体の少なくとも１０５％、例えば少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％などであることがある。
【００５７】
第３の態様では、本発明は、上に開示される任意の実施形態によるポリペプチドまたは多量体をコードする核酸を開示する。よって、本発明は、ポリペプチドまたは多量体をコードするＲＮＡおよびＤＮＡなどの本発明の核酸配列の全ての形態を包含する。本発明は、コード配列に加えて、本発明によるポリペプチドまたは多量体の発現に必要なシグナル配列を含む、プラスミドなどのベクターを包含する。一実施形態では、ベクターは、本発明による多量体をコードする核酸を含み、この際、各々の単位をコードする別々の核酸は、相同または異種のＤＮＡ配列を有することがある。
【００５８】
第４の態様では、本発明は発現系を開示し、発現系は上に開示されるような核酸またはベクターを含む。発現系は、例えばグラム陽性またはグラム陰性の原核生物宿主細胞系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）であってよく、本発明のポリペプチドまたは多量体を発現するよう改変されている。代替実施形態では、発現系は、真核生物宿主細胞系、例えば酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。
【００５９】
第５の態様では、本発明は、上に開示される任意の実施形態による複数のポリペプチドまたは多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックスを開示する。そのようなマトリックスは、免疫グロブリンまたはその他のＦｃ含有タンパク質の分離に有用である。そして、ポリペプチド／多量体のアルカリ安定性が改善されたために、マトリックスは洗浄中の高アルカリ条件に耐え、それはバイオプロセス分離の状況において長期の反復使用に不可欠である。マトリックスのアルカリ安定性は、指定された温度、例えば２２＋／−２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを使用して、免疫グロブリン結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば、０．５Ｍまたは１．０Ｍ  ＮａＯＨ中で何回かの１５分サイクル、例えば２５、５０または７５時間の総インキュベーション時間に相当する１００、２００または３００サイクルなどで実施することができる。２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で９６〜１００回の１５分インキュベーションサイクルあるいは２４または２５時間の総インキュベーション時間の後のマトリックスのＩｇＧ容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも８０、例えば少なくとも８５、少なくとも９０または少なくとも９５％などであり得る。２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ中で合計２４時間のインキュベーションの後のマトリックスの容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも７０、例えば少なくとも８０または少なくとも９０％などであり得る。
【００６０】
当業者の理解するように、発現したポリペプチドまたは多量体は、支持体に固定される前に適切な程度まで精製されるべきである。そのような精製方法は当分野で周知であり、タンパク質に基づくリガンドの支持体への固定は標準法を用いて容易に実行される。適切な方法および支持体は、以下により詳細に述べる。
【００６１】
本発明によるマトリックスの固相支持体は、任意の適切な周知の種類であってよい。従来のアフィニティー分離マトリックスは、多くの場合有機性であり、親水性表面を使用する水性媒体に曝露している、すなわちヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（−ＣＯＮＨ２、Ｎ−置換型であってもよい）、アミノ（−ＮＨ２、置換されていてもよい）、オリゴ−またはポリエチレンオキシ基をそれらの外部に曝露し、存在する場合にはその内部にも曝露しているポリマーに基づく。固相支持体は、適切には多孔質であり得る。空隙率は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載の方法による逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたＫａｖまたはＫｄ値（特定のサイズのプローブ分子に利用可能な細孔容積の割合）として表すことができる。定義上、ＫｄおよびＫａｖ値は両方とも常に０〜１の範囲内にある。有利には、分子量１１０ｋＤａのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、Ｋａｖ値は０．６〜０．９５、例えば、０．７〜０．９０または０．６〜０．８であり得る。この有利性は、支持体が、本発明のポリペプチド／多量体および該ポリペプチド／多量体に結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、結合部位への、および結合部位からの免疫グロブリンの質量輸送を提供することができる細孔を大きな割合で有することである。
【００６２】
ポリペプチドまたは多量体は、例えばリガンドに存在するチオール、アミノおよび／またはカルボキシ基を利用する従来のカップリング技法によって支持体と結合させることができる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等は周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド／多量体との間には、ポリペプチド／多量体の有効性を改善し、ポリペプチド／多量体と支持体との化学カップリングを促進する、スペーサーとして公知の分子を導入することができる。ポリペプチド／多量体の性質およびカップリング条件に応じて、カップリングは、マルチポイントカップリング（例えば複数のリジンを介するもの）であってもよいし、シングルポイントカップリング（例えば単一のシステインを介するもの）であってもよい。あるいは、ポリペプチド／多量体は、非共有結合、例えば物理的吸着または生体分子特異的吸着などによって支持体と結合させてよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、マトリックスは、５〜２５、例えば５〜２０ｍｇ／ｍｌ、５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜１１ｍｇ／ｍｌまたは６〜１１ｍｇ／ｍｌの、支持体と結合したポリペプチドまたは多量体を含む。結合したポリペプチド／多量体の量は、カップリングプロセスで使用したポリペプチド／多量体の濃度、使用した活性化およびカップリング条件、および／または使用した支持体の多孔構造によって制御することができる。概して、マトリックスの絶対結合容量は、結合したポリペプチド／多量体の量とともに、少なくとも細孔が結合したポリペプチド／多量体によって著しく狭窄されるようになる時点まで増加する。結合したポリペプチド／多量体１ｍｇ当たりの相対結合容量は、高いカップリングレベルで低下し、上に指定される範囲内で最適の費用便益をもたらす。
【００６４】
ある種の実施形態ではポリペプチドまたは多量体は、チオエーテル結合を介して支持体と結合する。このようなカップリングを実施する方法は、この分野において周知であり、標準的な技術および装置を使用して当業者によって容易に実施される。チオエーテル結合は、柔軟で安定であり、一般的にアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適している。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチドまたは多量体上の末端または近末端のシステイン残基を介している場合、結合したポリペプチド／多量体の可動性が向上し、結合容量および結合反応速度が改善される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド／多量体は、上記のタンパク質に提供されるＣ末端システインを介して結合される。このことは、システインチオールと支持体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基等との効率的なカップリングを可能にし、その結果チオエーテル架橋カップリングとなる。
【００６５】
特定の実施形態において、支持体は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類を含む。多糖類の例としては、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどが挙げられる。多糖類は本質的に親水性であり、非特異的相互作用の程度は低く、反応性（活性化可能な）ヒドロキシル基含量が高く、バイオプロセスに使用されるアルカリ洗浄溶液に対して一般に安定である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、支持体は、寒天またはアガロースを含む。本発明で使用する支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））により容易に調製することができる。または、塩基性マトリクッスは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で販売されている架橋アガロースビーズなどの市販品である。大規模分離に特に有利な一実施形態において、支持体は、米国特許第６６０２９９０号または米国特許第７３９６４６７号（当該特許は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている方法を使用して、その剛性を増加させるように適合されており、そのためにマトリックスは高い流量に、より適したものとなる。
【００６７】
特定の実施形態において、多糖類またはアガロース支持体などの支持体は、ヒドロキシアルキルエーテル架橋などで架橋される。このような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えば、エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライドまたはアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であってよい。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定性であり、著しい非特異的吸着を引き起こさない。
【００６８】
または、固相支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどに基づく。ジビニルおよびモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックス表面は、多くの場合親水化されて、上で定義した親水性基を周囲の水性液体に曝露する。このようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造され、例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。あるいは、市販製品、例えばＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用される。別の代替としては、本発明による固相支持体は、無機性の支持体、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。
【００６９】
さらに別の実施形態において、固相支持体は、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルター（例えば、膜または深層フィルターマトリックス）などの別の形態である。
【００７０】
本発明によるマトリックスの形状に関して、一実施形態において、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。別の実施形態において、マトリックスは、多孔質または非多孔質であり得るビーズまたは粒子の形態である。ビーズまたは粒子の形態のマトリックスは、充填床として、または懸濁形態で使用することができる。懸濁形態には、粒子またはビーズが自由に移動する膨張床および純粋な懸濁液として知られている形態が含まれる。モノリス、充填床および膨張床の場合、分離手順は一般に、濃度勾配を用いた従来のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の例では、バッチ式モードが使用される。
【００７１】
第６の態様では、本発明は、上に開示されるような分離マトリックスを使用する、免疫グロブリンを単離する方法を開示する。
【００７２】
ある種の実施形態では、この方法は、
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と上に開示される分離マトリックスとを接触させる工程、
ｂ）分離マトリックスを洗液で洗う工程、
ｃ）溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、および
ｄ）分離マトリックスを洗浄液（あるいは定置洗浄（ＣＩＰ）液と呼ぶこともできる）で、例えば少なくとも１０分の接触（インキュベーション）時間で洗浄する工程
を含む。
【００７３】
この方法はまた、工程ａ）の前に、上記の実施形態のいずれかによるアフィニティー分離マトリックスを準備する工程と、免疫グロブリンおよび液体試料として少なくとも１つのその他の物質を含む溶液を準備する工程と、工程ｃ）の後に、溶出液を回収する工程と、任意選択で溶出液を、例えば陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、さらなる分離工程に供する工程を含んでもよい。液体試料、洗液および溶出液の適した組成、ならびに分離を実施するための一般条件は、アフィニティークロマトグラフィーの技術分野、特にプロテインＡクロマトグラフィーの技術分野で周知である。Ｆｃ含有タンパク質および少なくとも１つのその他の物質を含む液体試料は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えばＣＨＯ細胞、大腸菌または酵母タンパク質などを含んでよい。ＣＨＯ細胞および大腸菌タンパク質の内容物は、これらのタンパク質に対するイムノアッセイ、例えばＣｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣＨＯ  ＨＣＰまたは大腸菌ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキットによって簡便に求めることができる。宿主細胞タンパク質またはＣＨＯ細胞／大腸菌タンパク質は、工程ｂ）の間に離脱させることができる。
【００７４】
溶出は、プロテインＡ媒体からの溶出に使用される任意の適した溶液を使用することによって実施することができる。これは、例えばｐＨ５以下、例えばｐＨ２．５〜５または３〜５などの溶液またはバッファーであり得る。また、いくつかの例では、それはｐＨ１１以上、例えばｐＨ１１〜１４またはｐＨ１１〜１３などの溶液またはバッファーであり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液または溶出緩衝液勾配は、少なくとも１つの単官能性、二官能性または三官能性カルボン酸またはそのようなカルボン酸の塩を含む。ある種の実施形態では、溶出緩衝液または溶出緩衝液勾配は、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、コハク酸塩、リン酸塩、およびギ酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの陰イオン種を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、洗浄液は、アルカリ性、例えばｐＨが１３〜１４である。このような溶液は、特に間隔の上端において、マトリックスの効率的な洗浄を提供する
ある種の実施形態では、洗浄液は０．１〜２．０Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨ、例えば０．５〜２．０または０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨなどを含む。これらは効率的な洗浄溶液であり、特にＮａＯＨまたはＫＯＨ濃度が０．１Ｍまたは少なくとも０．５Ｍを上回る場合にそうである。本発明のポリペプチドの高い安定性は、そのような強アルカリ溶液の使用を可能にする。
【００７６】
この方法はまた、消毒液でマトリックスを消毒する工程を含んでもよく、消毒液は例えば過酸化物、例えば過酸化水素および／または過酸、例えば過酢酸または過ギ酸などを含んでよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、工程ａ）〜ｄ）は少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回、５０〜２００、５０〜３００または５０〜５００回繰り返される。このことは、マトリックスを何度も再使用することができるという点でプロセスの経済に重要である。
【００７８】
工程ａ）〜ｃ）はまた、少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回、５０〜２００、５０〜３００または５０〜５００回繰り返すことができ、工程ｄ）は、複数回の工程ｃ）の後に実施され、その結果工程ｄ）は少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回実施される。工程ｄ）は、例えば２〜２０回目の工程ｃ）ごとに実施することができる。
【実施例】
【００７９】
タンパク質の変異誘発
部位特異的変異誘発を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて２工程のＰＣＲによって実施した。鋳型として、Ｚ、ＢまたはＣのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を大腸菌発現ベクターに連結した。ＤＮＡ塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
【００８０】
変異体の多量体を形成するために、アミノ酸ＶＤに対応する、Ｂ、ＣまたはＺドメインの出発コドン（ＧＴＡ  ＧＡＣ）に位置するＡｃｃ  Ｉ部位を使用した。単量体ドメインのベクターをＡｃｃ  Ｉで消化し、ホスファターゼ処理した。各々のバリアントに特異的なＡｃｃ  Ｉ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を各々の鋳型から作製した。ＰＣＲ産物を精製し、２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を比較することによって濃度を推定した。等量の対のＰＣＲ産物をライゲーション緩衝液中でハイブリダイズした（４５分で９０℃→２５℃）。結果として得られる産物は、Ａｃｃ  Ｉ部位（正しいＰＣＲ断片および／または消化ベクター）に連結される可能性の高い断片の約１／４からなる。ライゲーションおよび形質転換の後、コロニーをＰＣＲスクリーニングして所望の変異体を含む構築物を同定した。陽性クローンは、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
【００８１】
構築物の発現および精製
構築物を、標準培地中の大腸菌Ｋ１２の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径０．２μｍの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
【００８２】
各々の構築物（ここでは濾過工程からの透過液中にある）を、アフィニティーによって精製した。透過液を、固定化ＩｇＧ（ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するクロマトグラフィー培地に添加した。添加した産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗い、ｐＨを低下させることによって溶出した。
【００８３】
溶出プールを中性ｐＨ（ｐＨ８）に調節し、ジチオトレイトールの添加によって還元した。次に、試料を陰イオン交換体に添加した。洗い工程の後、構築物をＮａＣｌ勾配に溶出し、それを夾雑物から分離した。溶出プールを限外濾過によって４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。固定化ＩｇＧ培地での構築物のアフィニティー精製の成功は、問題の構築物がＩｇＧに対して高い親和性を有することを意味することに留意する必要がある。
【００８４】
精製したリガンドをＲＰＣ  ＬＣ−ＭＳで分析して、純度を求め、分子量が（アミノ酸配列に基づく）予測値と一致することを確かめた。
【実施例１】
【００８５】
配列番号８〜１６、２３〜２８および３６〜４８についてＮ末端のＡＱＧＴリーダー配列およびＣ末端のシステインをさらに含む、表１に記載の精製単量体リガンドを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００〜１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合容量を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２＋／−２℃）１０分間、５００ｍＭ  ＮａＯＨを流した。これを９６〜１００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合容量（シグナル強度）として追跡した。結果は表１に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ１）、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）１およびＺｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）１、ならびに２９位にＧ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫを有するＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種、５３位にＦ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲを有するＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種およびＱ９、Ｑ４０、Ａ４２またはＮ４３が欠失しているＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種は、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ１と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、リガンドＢ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１��、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１およびＣ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）１は、基準として使用した親ＢドメインおよびＣドメインと比較して安定性が改善された。
【００８６】
表１．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した単量体リガンド
【００８７】
【表１−１】
2019517789.tif 000003
【表１−２】
2019517789.tif 000004
【実施例２】
【００８８】
表２に記載の精製二量体、四量体および六量体リガンドを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００〜１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合容量を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２＋／−２℃）１０分間、５００ｍＭ  ＮａＯＨを流した。これを３００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合容量（シグナル強度）として追跡した。結果は表２および図２に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）４およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。六量体リガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）６も、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ６と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、２つの単量体単位間のリンカー領域のａ）Ｄ２、Ａ３、Ｋ４；ｂ）Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２；ｃ）Ｐ５７、Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２、Ａ３；ｄ）Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７、Ｅ８；ｅ）Ａ５６、Ｐ５７、Ｋ５８；Ｖ１、Ｄ２、Ａ３またはｆ）Ｖ１、Ｄ２、Ａ３、Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７、Ｅ８が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）二量体は、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ２と比較してアルカリ安定性を改善させた。また、リンカー領域のＫ５８とＶ１の間にＹＥＤＧが挿入された、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）二量体は、Ｚｖａｒ２と比較してアルカリ安定性を改善させた。
【００８９】
表２．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した二量体、四量体および六量体リガンド。
【００９０】
【表２−１】
2019517789.tif 000005
【表２−２】
2019517789.tif 000006
【実施例３】
【００９１】
実施例２のような５００ｍＭの代わりに１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、３つのリガンドの１００回のＣＩＰサイクルを用いて実施例２を繰り返した。結果は表３に示され、３つ全てのリガンドが、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較して１Ｍ  ＮａＯＨ中でも安定性を改善したことを示す。
【００９２】
表３．Ｂｉａｃｏｒｅ（１Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した四量体リガンド
【００９３】
【表３】
2019517789.tif 000007
【実施例４】
【００９４】
表２の精製四量体リガンド（全てＮ末端にさらなるシステインを含む）を、下に記載される方法を用いてアガロースビーズに上に固定化し、容量および安定性について評価した。結果を表４および図３に示す。
【００９５】
表４．カラム（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【００９６】
【表４】
2019517789.tif 000008
活性化
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号明細書に記載の方法に従って調製し、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ  ６−１３に記載の方法に従う、分子量１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫａｖ値０．７０に相当する孔径をもつ、８５マイクロメートル（体積加重、ｄ５０Ｖ）のメジアン径の硬質架橋アガロースビーズであった。
【００９７】
２５ｍＬ（ｇ）のドレインしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水および２．０２ｇのＮａＯＨを、１００ｍＬフラスコ中２５℃で１０分間の機械撹拌によって混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを加え、反応を２時間進行させた。活性化されたゲルを、１０ゲル沈殿物体積（ＧＶ）の水で洗った。
【００９８】
カップリング
５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ３、２１ｍｇのＮａ２ＣＯ３、１７５ｍｇのＮａＣｌおよび７ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５〜１０分間載せた後、７７ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【００９９】
活性化したゲルを３〜５ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗い、次に米国特許第６３９９７５０号明細書に記載の方法に従ってリガンドを結合させた。この実験で使用した全ての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱気した。ゲルのリガンド含有量は、リガンド溶液の量および濃度を変化させることによって制御することができた。
【０１００】
固定化の後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗った。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍ  リン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に置いた。次に、ゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝および０．５Ｍ  ＨＡｃで、その後８〜１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗った。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
【０１０１】
タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ  １６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、平衡化緩衝液中２ｍｇ／ｍｌに希釈。
【０１０２】
平衡化緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
吸着緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
溶出緩衝液
１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ２．９
動的結合容量
２ｍｌの樹脂を、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５  １００カラムに充填した。貫流容量を、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ１０システムで滞留時間６分（流量０．３３ｍｌ／分）で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは自動ゼロ化の前に行った。１００％ＵＶシグナルが得られるまで試料をカラムに適用した。その後、安定したベースラインが得られるまで、平衡バッファーを再度適用した。
【０１０３】
ＵＶシグナルが最大吸光度の８５％に達するまで試料をカラムに添加した。その後、流量０．５ｍｌ／分の５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液でカラムを洗った。タンパク質を５ＣＶの溶出緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で溶出した。次に、カラムを流量０．２ｍｌ／分の０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、平衡化緩衝液で再び平衡化させた。
【０１０４】
１０％の貫流容量の計算には、下の式を使用した。それは、カラム流出液中のＩｇＧの濃度が供給液中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラムに添加されるＩｇＧの量である。
【０１０５】
【数１】
2019517789.tif 000009
Ａ１００％＝１００％ＵＶシグナル；
Ａｓｕｂ＝非結合ＩｇＧサブクラスによる吸光度への寄与；
Ａ（Ｖ）＝所与添加容量での吸光度；
Ｖｃ＝カラム容量；
Ｖａｐｐ＝１０％貫流までの添加量；
Ｖｓｙｓ＝システムのデッドボリューム；
Ｃ０＝供給濃度。
【０１０６】
１０％貫流での動的結合容量（ＤＢＣ）を計算した。動的結合容量（ＤＢＣ）は、１０および８０％貫流について計算した。
【０１０７】
ＣＩＰ−０．５Ｍ  ＮａＯＨ
１０％貫流のＤＢＣ（Ｑｂ１０）は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、０．５Ｍ  ＮａＯＨを０．５／分の速度で２０分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを４時間静置するＣＩＰ工程が含まれた。曝露は室温（２２＋／−２℃）で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で２０分間洗った。表４は、６回の４時間サイクル後の残存容量（すなわち、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの累積曝露時間は２４時間）を、絶対数で、そして初期容量と比較して表す。
【実施例５】
【０１０８】
実施例４を、表５に示される四量体リガンドを用いて、但しＣＩＰ工程で０．５Ｍの代わりに１．０Ｍ  ＮａＯＨを使用して繰り返した。結果を表５および図４に示す。
【０１０９】
表５．カラム−１．０Ｍ  ＮａＯＨで評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【０１１０】
【表５】
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本明細書は、最良の様式を含む本発明を開示するために、さらに当業者が誰でも、任意のデバイスまたはシステムを作製および使用することならびに任意の組み込まれた方法を実行することを含む、本発明を実践することを可能にするために、実施例を使用している。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が想到する他の実施例を含むことができる。このような他の実施例は、請求項の文言と異ならない構造要素を有する場合、または、請求項の文言と実質的な差のない等価の構造要素を含む場合に、請求項の範囲内にあることが意図されている。本文に述べられた全ての特許および特許出願は、それらが個別に援用されたかのように、それらの全文が参照により本明細書に援用される。
［実施態様１］
配列番号４〜７の１１位に対応する位置の少なくともアスパラギンまたはセリン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２２、配列番号５１または配列番号５２によって定義される、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含む、Ｆｃ結合ポリペプチド。
［実施態様２］
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号５１または配列番号５２によって定義される、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含む、実施態様１に記載のポリペプチド。
［実施態様３］
配列番号４〜７の１１位に対応する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施態様１または２に記載のポリペプチド。
［実施態様４］
前記配列番号４〜７の１１位に対応する位置の前記アミノ酸残基がリジンである、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様５］
配列番号４〜７の２９位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、グリシン、セリン、チロシン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン、フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様６］
配列番号４〜７の９位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンである、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様７］
配列番号４〜７の９位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様８］
配列番号４〜７の５０位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、アルギニンまたはグルタミン酸、例えばアルギニンなどである、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様９］
配列番号４〜７の３位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンであり、かつ／または配列番号４〜７の６位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアスパラギン酸である、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１０］
配列番号４〜７の３位および６位に対応する位置の前記アミノ酸残基の少なくとも１つ、例えば両方がアスパラギンである、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１１］
配列番号４〜７の４３位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンまたはグルタミン酸、例えばアラニンなどである、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１２］
配列番号４〜７の４３位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様１乃至１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１３］
配列番号４〜７の２８位に対応する位置の前記アミノ酸残基がアラニンまたはアスパラギンである、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１４］
配列番号４〜７の４０位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸およびバリンからなる群から選択される、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１５］
配列番号４〜７の４０位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１６］
配列番号４〜７の４２位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、アラニン、リジンまたはアルギニン、例えばアルギニンなどである、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１７］
配列番号４〜７の４２位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様１乃至１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１８］
配列番号４〜７の４４位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、ロイシンまたはイソロイシン、例えばイソロイシンなどである、実施態様１乃至１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１９］
配列番号４〜７の４４位に対応する位置の前記アミノ酸残基を欠失している、実施態様１乃至１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２０］
配列番号４〜７の５３位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アルギニンまたはリジンである、実施態様１乃至１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２１］
配列番号４〜７の１８位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、リジンまたはヒスチジン、例えばリジンなどである、実施態様１乃至２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２２］
配列番号４〜７の３３位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、リジンまたはセリン、例えばリジンなどである、実施態様１乃至２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２３］
配列番号４〜７の３７位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである、実施態様１乃至２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２４］
配列番号４〜７の５１位に対応する位置の前記アミノ酸残基が、チロシンまたはロイシン、例えばチロシンなどである、実施態様１乃至２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２５］
配列番号４〜７の１、２、３、４、５、６、７、８、５６、５７または５８位に対応する位置の前記アミノ酸残基の１以上が欠失している、実施態様１乃至２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２６］
配列番号７によって定義されるＺｖａｒの変異体である実施態様１乃至２５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記９位のアミノ酸残基がアラニンであるか、または欠失しており、前記１１位のアミノ酸残基がリジンまたはグルタミン酸、例えばリジンなどである、ポリペプチド。
［実施態様２７］
前記４３位のアミノ酸残基がアラニンまたはグルタミン酸であるか、あるいは欠失している、実施態様２６に記載のポリペプチド。
［実施態様２８］
前記４０位のアミノ酸残基がバリンであるか、または欠失している、実施態様２６または２７に記載のポリペプチド。
［実施態様２９］
前記４４位のアミノ酸残基がイソロイシンでありか、または欠失している、実施態様２６乃至２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３０］
前記変異が、
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｇ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｓ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｙ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｑ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｔ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｎ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｆ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｌ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｗ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｉ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｍ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｖ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｄ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｈ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｒ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；および
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ａ２９Ｋ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ
からなる群から選択される、実施態様１乃至２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３１］
前記変異が、
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｄ５３Ｆ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｄ５３Ｙ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｄ５３Ｗ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｄ５３Ｋ；および
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｄ５３Ｒ
からなる群から選択される、実施態様１乃至３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３２］
前記変異が、
Ｑ９ｄｅｌ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０ｄｅｌ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２ｄｅｌ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；および
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３ｄｅｌ、Ｌ４４Ｉ
からなる群から選択される、実施態様１乃至３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３３］
前記変異が、
Ｄ２ｄｅｌ、Ａ３ｄｅｌ、Ｋ４ｄｅｌ、Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｖ１ｄｅｌ、Ｄ２ｄｅｌ、Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５８ｄｅｌ；
Ｖ１ｄｅｌ、Ｄ２ｄｅｌ、Ａ３ｄｅｌ、Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｐ５７ｄｅｌ、Ｋ５８ｄｅｌ；
Ｋ４ｄｅｌ、Ｆ５ｄｅｌ、Ｄ６ｄｅｌ、Ｋ７ｄｅｌ、Ｅ８ｄｅｌ、Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ａ５６ｄｅｌ、Ｐ５７ｄｅｌ、Ｋ５８ｄｅｌ；
Ｖ１ｄｅｌ、Ｄ２ｄｅｌ、Ａ３ｄｅｌ、Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；
Ｖ１ｄｅｌ、Ｄ２ｄｅｌ、Ａ３ｄｅｌ、Ｋ４ｄｅｌ、Ｆ５ｄｅｌ、Ｄ６ｄｅｌ、Ｋ７ｄｅｌ、Ｅ８ｄｅｌ、Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；および
Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５８＿ｉｎｓＹＥＤＧ
からなる群から選択される、実施態様１乃至３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３４］
配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５％または９８％などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様１乃至２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３５］
配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５％または９８％などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様１乃至２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３６］
配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５％または９８％などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様１乃至２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３７］
配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４および配列番号９５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５％または９８％などの同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる、実施態様１乃至２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３８］
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１６、１７〜３４および３６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるいずれの配列も含まない、実施態様３４乃至３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３９］
実施態様１乃至３８のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７によって、例えば配列番号７などによって定義されるポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、ポリペプチド。
［実施態様４０］
実施態様１乃至３９のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７によって、例えば配列番号７などによって定義される親ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、ポリペプチド。
［実施態様４１］
前記アルカリ安定性が、２２＋／−２℃の０．５Ｍまたは１．０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中、２４または２５時間のインキュベーションの後に残存ＩｇＧ結合容量によって測定して改善されている、実施態様３８または３９に記載のポリペプチド。
［実施態様４２］
配列番号５３
ＫＥＸ１Ｑ  Ｘ２ＡＦＹＥＩＬＸ３ＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＸ４Ｘ５Ｆ  ＩＸ６Ｘ７ＬＫＤＸ８ＰＳＸ９  ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＬＡＥＡＫＸ１３  Ｘ１４ＮＸ１５ＡＱＡＰＫ  （配列番号５３）
によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％または少なくとも９５％または９８％の同一性を有する配列を含む、Ｆｃ結合ポリペプチドであって、
上式で、互いに個別に：
Ｘ１＝ＡまたはＱまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、ＨまたはＲ
Ｘ３＝ＨまたはＫ
Ｘ４＝ＡまたはＮ
Ｘ５＝Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ
Ｘ６＝ＱまたはＥ
Ｘ７＝ＳまたはＫ
Ｘ８＝ＥまたはＤ
Ｘ９＝ＱまたはＶまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋ、ＲまたはＡまたは欠失
Ｘ１１＝Ａ、ＥまたはＮまたは欠失
Ｘ１２＝ＩまたはＬ
Ｘ１３＝ＫまたはＲ
Ｘ１４＝ＬまたはＹ
Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲ
であるＦｃ結合ポリペプチド。
［実施態様４２］
Ｘ１＝Ａまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ
Ｘ３＝Ｈ
Ｘ４＝Ｎ
Ｘ６＝Ｑ
Ｘ７＝Ｓ
Ｘ８＝Ｄ
Ｘ９＝Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋまたは欠失
Ｘ１１＝Ａまたは欠失
Ｘ１２＝Ｉ
Ｘ１３＝Ｋ
Ｘ１４＝Ｌ
である、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４３］
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４４］
Ｘ１は欠失、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４５］
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９は欠失、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４６］
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０は欠失、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４７］
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１は欠失、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｄである、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４８］
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ、Ｘ１５＝Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲである、実施態様４１に記載のポリペプチド。
［実施態様４９］
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１６、１７〜３４および３６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるいずれの配列も含まない、実施態様４１乃至４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様５０］
実施態様１乃至４９のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドを含むかまたはそれから本質的になる多量体。
［実施態様５１］
前記ポリペプチドが、１５個までのアミノ酸を含むリンカーによって連結されている、実施態様５０に記載の多量体。
［実施態様５２］
二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体である、実施態様５０または５１に記載の多量体。
［実施態様５３］
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５によって定義される配列の群から選択される配列を含むか、あるいはそれから本質的になる、実施態様５０乃至５２のいずれか１項に記載の多量体。
［実施態様５４］
前記Ｃ末端またはＮ末端に、または、前記Ｃ末端またはＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基の範囲内に、１または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される１または複数のカップリングエレメントをさらに含む、実施態様１乃至５３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは多量体。
［実施態様５５］
実施態様１乃至５４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは多量体をコードする核酸またはベクター。
［実施態様５６］
実施態様５５に記載の核酸またはベクターを含む発現系。
［実施態様５７］
実施態様１乃至５４のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドまたは多量体が固相支持体に結合されている分離マトリックス。
［実施態様５８］
前記ポリペプチドまたは多量体が、チオエーテル結合によって前記固相支持体に結合されている、実施態様５７に記載の分離マトリックス。
［実施態様５９］
前記固相支持体が多糖類である、実施態様５７または５８に記載の分離マトリックス。
［実施態様６０］
２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での２４時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記ＩｇＧ容量が、前記インキュベーションの前の前記ＩｇＧ容量の少なくとも８０、例えば少なくとも８５、少なくとも９０または少なくとも９５％である、実施態様５７乃至５９のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様６１］
２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ中での２４時間のインキュベーションの後の前記マトリックスの前記ＩｇＧ容量が、前記インキュベーションの前の前記ＩｇＧ容量の少なくとも７０、例えば少なくとも８０または少なくとも９０％である、実施態様５７乃至６０のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様６２］
免疫グロブリンを単離する方法であって、実施態様５７乃至６１のいずれか１項に記載の分離マトリックスを使用する方法。
［実施態様６３］
実施態様６２に記載の方法であって、
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と、実施態様５７乃至６１のいずれか１項に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
ｂ）前記分離マトリックスを洗液で洗う工程と、
ｃ）溶出液を用いて前記分離マトリックスから前記免疫グロブリンを溶出する工程と、
ｄ）前記分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と
を含む、方法。
［実施態様６４］
前記洗浄液が、アルカリ性、例えばｐＨが１３〜１４である、実施態様６３に記載の方法。
［実施態様６５］
前記清浄液が０．１〜１．０Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨ、例えば０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む、実施態様６３または６４に記載の方法。
［実施態様６６］
工程ａ）〜ｄ）が少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回または５０〜２００回繰り返される、実施態様６３乃至６５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様６７］
工程ａ）〜ｃ）が少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回または５０〜２００回繰り返され、工程ｄ）が複数回の工程ｃ）の後に、例えば少なくとも１０回または少なくとも５０回実施される、実施態様６３乃至６６のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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