(57)【要約】遺伝子操作に関連して使用するための細胞を含めた、細胞を遺伝子操作するための方法が提供される。いくつかの態様では、提供される方法は、レトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスベクターと一緒のインキュベーションによる細胞の形質導入を含み、その際、インキュベーション前に、細胞は、活性化剤または刺激剤と一緒にインキュベーションされたことがなく、例えば抗CD3／抗CD28抗体および／または1種もしくは複数種の組換えサイトカインと一緒にインキュベーションされたことがない。いくつかの態様では、このような方法は、細胞を遺伝子操作するための工程を短縮または改良することに関係する特徴を結果として生じる。キメラ抗原受容体などのキメラ受容体またはトランスジェニックT細胞受容体などの他の組換え抗原受容体をコードする遺伝子などの組換え遺伝子または異種遺伝子を形質導入された、結果として生じた細胞およびその組成物も提供される。いくつかの態様では、提供される細胞および組成物は、養子免疫療法の方法に使用することができる。2019536461.tif 000009
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え核酸を含むウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られた複数のT細胞を含むインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、
インキュベーションする工程が、対象から試料を得た後24時間以内に開始される；かつ／あるいは
インキュベーションする工程の前に、T細胞が、15℃、18℃、22℃、もしくは25℃よりも高い、または約15℃、約18℃、約22℃、もしくは約25℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、または24時間よりも長い期間供されたことがない；かつ／あるいは
インキュベーションする工程の前に、T細胞が、37°±2.0℃、約37°±2.0℃、37°±2.0℃よりも高い、または約37°±2.0℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後15分、30分、1時間、または2時間よりも長い期間供されたことがない、
方法。
【請求項２】
インキュベーションする工程が、対象から試料を得た後1時間、3時間、6時間、12時間、もしくは18時間以内、または約1時間、3時間、6時間、12時間、もしくは18時間以内に開始される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーションの前に、細胞活性化を促進する条件でT細胞を刺激することを含まない、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
インキュベーションする工程の前に、インプット組成物が、
37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高いインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞を活性化することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、
TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤；CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7の存在下でのインキュベーション
を含むエクスビボ刺激に供されたことがない、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
インキュベーションする工程の前に、T細胞の5％、10％、20％、30％、もしくは40％以下が、活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、G1もしくはより後期の細胞周期である、かつ／または増殖することが可能である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
組換え核酸を含むウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られたT細胞を含むインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、
インキュベーションする工程の前に、
T細胞またはインプット組成物が、37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高いインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞を活性化することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、
TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤；CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7の存在下でのインキュベーション
を含むエクスビボ刺激に供されたことがない、方法。
【請求項７】
1種または複数種の剤が、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含む、請求項4または6記載の方法。
【請求項８】
組換え核酸を含むウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られたT細胞を含有するインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、
インキュベーションの前に、T細胞の5％、10％、20％、30％、もしくは40％以下が、活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、かつ／またはG1もしくはより後期の細胞周期である、方法。
【請求項９】
インプット組成物中のT細胞の10%以下が、インキュベーションの直前にHLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L、および4-1BBからなる群より選択されるT細胞活性化マーカーを含む、請求項5または請求項8記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーションする工程の前に、T細胞の5%、10％、20％、30％、または40％よりも多くが、低密度脂質受容体（LDL-R）を発現する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
対象が、ヒトである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
インキュベーションする工程の前に、T細胞が、2℃〜8℃の温度で48時間よりも長く維持されたことがない、かつ／または維持されていない、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
試料が、血液試料である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
試料が、白血球除去試料である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
T細胞が、未分画T細胞である、富化もしくは単離されたCD3+ T細胞である、富化もしくは単離されたCD4+ T細胞である、または富化もしくは単離されたCD8+ T細胞である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
T細胞が、対象からの試料から選択または富化されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベーションの前に、対象から試料を得る工程および任意で試料からT細胞を選択もしくは富化する工程をさらに含み、
そのことが、任意で富化された組成物を生成する、かつ／またはインプット組成物を生成する、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
インプット組成物中のT細胞のパーセンテージが、T細胞の75%、80%、85%、90%、もしくは95%、または約75%、80%、85%、90%、もしくは95%よりも大きい、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
T細胞が、CD4+またはCD8+細胞を含む、請求項3〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
T細胞が、CD4+およびCD8+細胞を含む、請求項3〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
CD4+細胞とCD8+細胞の比が、1：1、1：2、2：1、1：3、もしくは3：1、または約1：1、1：2、2：1、1：3、もしくは3：1である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
試料が、少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも33％（v/v）もしくは少なくとも約33％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度の血清または血漿を含む；かつ／あるいは
インキュベーションする工程の前に、試料が、少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも33％（v/v）もしくは少なくとも約33％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度の血清または血漿とエクスビボで接触されたことがある、
請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
試料が、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）の濃度の血清もしくは血漿を含む；かつ／または
インキュベーションする工程の前に、試料が、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）の濃度の血清もしくは血漿とエクスビボで接触されたことがある、
請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
血清または血漿が、ヒトの血清または血漿である、請求項22または請求項23記載の方法。
【請求項２５】
血清または血漿が、対象について自己の血清または血漿である、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
試料が、抗凝固薬を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
抗凝固薬が、遊離クエン酸イオンを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
インキュベーションする工程の前に、T細胞、任意で試料または富化された組成物のT細胞を凍結保護物質の存在下で凍結保存し、それにより、凍結保存組成物を産生する工程を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
インキュベーションする工程の前に、凍結保護物質を減少させるもしくは除去するおよび／またはインプット組成物を生成させる条件で凍結保存組成物を洗浄する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
インプット組成物が、N-アセチルシステイン（NAC）；血清、任意でヒト血清；組換えインターロイキン-2（IL-2）、組換えインターロイキン-15（IL-15）、および／または組換えインターロイキン-7（IL-7）を含む、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
インプット組成物が、0.4mg/mL〜4mg/mL、0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは1.6mg/mL〜2.4mg/mL、または約0.4mg/mL〜4mg/mL、約0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは約1.6mg/mL〜2.4mg/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度のN-アセチルシステインを含む；あるいは
インプット組成物が、少なくとも0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mL、または少なくとも約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mL、または約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mLの濃度のN-アセチルシステインを含む、
請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
インプット組成物が、0.5%〜25％（v/v）、1.0%〜10％（v/v）、もしくは2.5%〜5.0％（v/v）、または約0.5%〜25％（v/v）、1.0%〜10％（v/v）、もしくは2.5%〜5.0％（v/v）（それぞれ両端の値を含む）の濃度の血清、任意でヒト血清を含む；あるいは
インプット組成物が、少なくとも0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%、または少なくとも約0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%、または約0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%の濃度の血清、任意でヒト血清を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
インプット組成物が、10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL、または約10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、もしくは500IU/mL、または少なくとも約10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、もしくは500IU/mLの濃度の組換えIL-2、任意で組換えヒトIL-2を含む；かつ／あるいは
インプット組成物が、1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、もしくは5IU/mL〜10IU/mL、または約1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、もしくは5IU/mL〜10IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL、もしくは50IU/mL、または少なくとも約1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL、もしくは50IU/mLの濃度の組換えIL-15、任意で組換えヒトIL-15を含む；かつ／あるいは
インプット組成物が、50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは200IU/mL〜600IU/mL、または約50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは200IU/mL〜600IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、もしくは1000IU/mL、または少なくとも約50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、もしくは1000IU/mLの濃度の組換えIL-7、任意で組換えヒトIL-7を含む、
請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
インキュベーションする工程が、ウイルスベクター粒子をインプット組成物と一緒にスピン接種する（spinoculate）段階を含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
スピン接種する段階が、遠心チャンバーの内部キャビティー中でウイルスベクター粒子およびインプット組成物を回転させることを含み、
該回転が、該キャビティーの側壁内面で、
500g〜2500g、500g〜2000g、500g〜1600g、500g〜1000g、600g〜1600g、600g〜1000g、1000g〜2000g、もしくは1000g〜1600g、または約500g〜2500g、500g〜2000g、500g〜1600g、500g〜1000g、600g〜1600g、600g〜1000g、1000g〜2000g、もしくは1000g〜1600g（それぞれ両端の値を含む）；あるいは
少なくとも600g、800g、1000g、1200g、1600g、もしくは2000g、または少なくとも約600g、800g、1000g、1200g、1600g、もしくは2000g
である相対遠心力を及ぼす、
請求項34記載の方法。
【請求項３６】
スピン接種する段階が、
5分よりも長いもしくは約5分、10分よりも長いもしくは約10分、15分よりも長いもしくは約15分、20分よりも長いもしくは約20分、30分よりも長いもしくは約30分、45分よりも長いもしくは約45分、60分よりも長いもしくは約60分、90分よりも長いもしくは約90分、または120分よりも長いもしくは約120分；あるいは
5分〜60分、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分、または約5分〜60分、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分（それぞれ両端の値を含む）
である時間にわたる、
請求項34または35記載の方法。
【請求項３７】
インプット組成物および／またはウイルスベクター粒子を形質導入アジュバントと接触させる工程をさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
接触させる工程が、ウイルスベクター粒子をインプット組成物と一緒にスピン接種する前、それと同時、またはその後に実施される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記インキュベーションの少なくとも一部が、37℃±2℃または約37℃±2℃で実施される、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記インキュベーションの少なくとも一部が、スピン接種の後に実施される、請求項34〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
前記インキュベーションの少なくとも一部が、2時間、4時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以下、または約2時間、4時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以下にわたり実施される、請求項39または40記載の方法。
【請求項４２】
前記インキュベーションの少なくとも一部が、24時間または約24時間実施される、請求項39〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
前記インキュベーションの合計持続時間が、12時間、24時間、36時間、48時間または72時間以下である、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
ウイルスベクター粒子が、レンチウイルスベクター粒子である、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
レンチウイルスベクター粒子が、HIV-1に由来する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
ウイルスベクター粒子が、ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されている、請求項1〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
ウイルスエンベロープ糖タンパク質が、VSV-Gである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
ウイルスベクター粒子が、SAMHD1阻害活性を示すレンチウイルスタンパク質を含み、該タンパク質が、ウイルス粒子中にパッケージングされている、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
SAMHD1阻害タンパク質が、野生型Vpxタンパク質もしくは野生型Vprタンパク質である、または野生型VpxもしくはVprタンパク質の、SAMHD1阻害活性を示す変種もしくは部分である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
SAMHD1阻害タンパク質が、レトロウイルスベクター粒子に対して異種である、請求項48または49記載の方法。
【請求項５１】
SAMHD1阻害タンパク質が、野生型Vpxタンパク質である、または野生型Vpxタンパク質の、SAMHD1阻害活性を示す変種もしくは部分である、請求項48〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
ウイルスベクター粒子が、20.0未満もしくは約20.0未満、または10.0未満もしくは約10.0未満の感染多重度でインキュベーションされる、請求項1〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
ウイルスベクター粒子が、1.0IU/細胞〜10IU/細胞、もしくは2.0U/細胞〜5.0IU/細胞、または約1.0IU/細胞〜10IU/細胞、もしくは2.0U/細胞〜5.0IU/細胞の感染多重度でインキュベーションされる；あるいは
ウイルスベクター粒子が、少なくとも1.6
IU/細胞、1.8IU/細胞、2.0IU/細胞、2.4IU/細胞、2.8IU/細胞、3.2IU/細胞、3.6IU/細胞、4.0IU/細胞、5.0IU/細胞、6.0IU/細胞、7.0IU/細胞、8.0IU/細胞、9.0IU/細胞、もしくは10.0IU/細胞、または少なくとも約1.6IU/細胞、1.8IU/細胞、2.0IU/細胞、2.4IU/細胞、2.8IU/細胞、3.2IU/細胞、3.6IU/細胞、4.0IU/細胞、5.0IU/細胞、6.0IU/細胞、7.0IU/細胞、8.0IU/細胞、9.0IU/細胞、もしくは10.0IU/細胞の感染多重度でインキュベーションされる、
請求項1〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
インプット組成物が、少なくとも50×106個、100×106個、もしくは200×106個、または少なくとも約50×106個、100×106個、もしくは200×106個、または約50×106個、100×106個、もしくは200×106個の細胞を含む、請求項1〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
組換え核酸が、抗原受容体をコードする、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
抗原受容体が、トランスジェニックT細胞受容体（TCR）である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
抗原受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、請求項55または56記載の方法。
【請求項５８】
キメラ抗原受容体（CAR）が、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結している膜貫通ドメインをさらに含む、請求項58または59記載の方法。
【請求項６１】
膜貫通ドメインが、CD28の膜貫通部分を含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
細胞内シグナル伝達ドメインが、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項58〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
T細胞共刺激分子が、CD28および41BBからなる群より選択される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
抗原受容体が、疾患もしくは状態と関連する抗原と特異的に結合する、またはユニバーサルタグと特異的に結合する、請求項55〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
疾患または状態が、がん、および自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
組換え核酸を形質導入されたT細胞を含むアウトプット組成物を産生する、請求項1〜65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
アウトプット組成物中のT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%に組換え核酸が形質導入されている、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
請求項66または67記載の方法により産生された形質導入T細胞をアウトプット組成物から回収または単離する工程をさらに含む、請求項66または67記載の方法。
【請求項６９】
アウトプット組成物の細胞または請求項66または68記載の方法により形質導入された細胞を活性化または拡大する工程をさらに含む、請求項66または68記載の方法。
【請求項７０】
前記活性化および／または拡大が、エクスビボで行われる、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
前記インキュベーションに続いて、アウトプット組成物中の細胞が、T細胞を活性化すること、TCR複合体を経由するシグナルを誘導すること、および／またはT細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の刺激剤の存在下でさらにインキュベーションされる、請求項69または70記載の方法。
【請求項７２】
1種または複数種の刺激剤が、CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7からなる群より選択される、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
1種または複数種の刺激剤が、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含む、請求項71または72記載の方法。
【請求項７４】
活性化および／または拡大が、インビボで行われる、請求項69記載の方法。
【請求項７５】
活性化および／または拡大が、抗原受容体により特異的に結合された抗原の存在下で起こり、かつ／または導入遺伝子特異的である、請求項69または74記載の方法。
【請求項７６】
前記インキュベーションに続いて、アウトプット組成物中の細胞が、任意でCD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7からなる1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でエクスビボでさらにインキュベーションされず、かつ／またはアウトプット組成物中の細胞が、30℃よりも高い温度で24時間よりも長くさらにインキュベーションされない、請求項72または75記載の方法。
【請求項７７】
請求項1〜76のいずれか一項記載の方法により産生される、遺伝子操作T細胞。
【請求項７８】
請求項77記載の遺伝子操作T細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７９】
疾患または状態を有する対象に請求項78記載の組成物を投与する工程を含む、処置方法。
【請求項８０】
前記組成物が、対象から試料を得た後5日以内に対象に投与される、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物が、対象から試料を得た後1日、2日、3日または4日以内に対象に投与される、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
以下の工程を含む、養子細胞療法のための方法：
（a）疾患または状態を有する対象から得られた試料からT細胞を富化または単離する工程；
（b）請求項1〜71のいずれか一項記載の方法により、T細胞を含むインプット組成物にウイルスベクター粒子を形質導入し、それにより、形質導入細胞を含むアウトプット組成物を産生する工程であって、ウイルスベクター粒子が、疾患または障害と関連する抗原と特異的に結合する抗原受容体をコードする組換え核酸を含む、工程；
（c）疾患または状態を処置するために、形質導入細胞を含むアウトプット組成物を対象に投与する工程であって、アウトプット組成物が、対象から試料を得た後9日以内に該対象に投与される、工程。
【請求項８３】
疾患または状態を処置するために、組換え核酸を形質導入されたT細胞を含むアウトプット組成物を対象に投与する工程を含む、養子細胞療法の方法であって、アウトプット組成物が、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法により産生される、方法。
【請求項８４】
アウトプット組成物が、対象から試料を得た後1日、2日、3日、4日、または5日以内に対象に投与される、請求項82または83記載の方法。
【請求項８５】
前記組成物を投与する前に、アウトプット組成物の形質導入細胞または細胞が、薬学的に許容される緩衝液中で製剤化される、請求項82〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
形質導入細胞を含むアウトプット組成物を投与する前に、細胞が、形質導入後最大24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、または9日間エクスビボで培養され、該培養が、30℃よりも高い温度で行われる、請求項82〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
形質導入に続いて、形質導入細胞を含むアウトプット組成物または細胞が、T細胞を活性化すること、TCR複合体を経由するシグナルを誘導すること、および／またはT細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の刺激剤の存在下で培養され、それにより、形質導入細胞を含む組成物を産生する、請求項82〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
形質導入細胞を投与する前に、形質導入細胞を含むアウトプット組成物または細胞が、1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でエクスビボでさらにインキュベーションされず、かつ／または30℃よりも高い温度で24時間よりも長くさらにインキュベーションされない、請求項82〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
1種または複数種の刺激剤が、CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7、抗原受容体により特異的に認識される抗原を含むワクチン、ならびに抗原受容体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体からなる群より選択される、請求項87または88記載の方法。
【請求項９０】
1種または複数種の刺激剤が、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含む、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
アウトプット組成物の細胞または形質導入細胞が、最適以下の用量で投与される、請求項82〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
対象に1種または複数種の剤を投与する工程であって、形質導入T細胞のインビボ刺激および／または拡大を誘導または強化する、工程
をさらに含む、請求項82〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
1種または複数種の剤が、導入遺伝子に特異的であり、かつ／または任意で抗原受容体であるかもしくはそれを含む発現した導入遺伝子を介して細胞を刺激もしくは活性化する、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
1種または複数種の剤が、抗原受容体により特異的に認識される抗原を含むワクチン、抗原受容体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体、または抗原受容体の二量体化を化学的に誘導することが可能な剤の中より選択される、請求項92または93記載の方法。
【請求項９５】
1種または複数種の剤が、免疫調節剤；免疫チェックポイント阻害剤；細胞外アデノシンまたはアデノシン受容体、任意でA2aR受容体の阻害剤；キヌレニン経路モジュレーター、およびシグナル伝達経路のモジュレーター、例えばキナーゼ阻害剤である、請求項92記載の方法。
【請求項９６】
標的抗原と特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）またはトランスジェニックTCRを発現するように遺伝子操作された初代ヒトT細胞集団を含む組成物であって、
該集団が、複数の休止T細胞を含み；かつ
該複数の休止T細胞が、該組成物中の遺伝子操作細胞の少なくとも7.5％を構成する、
組成物。
【請求項９７】
遺伝子操作された休止T細胞が、前記組成物中の遺伝子操作細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%を構成する、請求項96記載の組成物。
【請求項９８】
休止T細胞が、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L（CD154）および4-1BB（CD137）からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーについて表面陰性であり；IL-2、IFN-ガンマおよびTNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を欠如し；G0もしくはG0G1a期の細胞周期であり；かつ／または活性SAMHD1を含有する、請求項96または97記載の組成物。
【請求項９９】
休止T細胞が、CD25およびCD69について表面陰性（CD25-/CD69-）である、請求項98記載の組成物。
【請求項１００】
休止T細胞が、CD4+および／またはCD8+ T細胞を含む、請求項96〜99のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０１】
標的抗原が、疾患または障害に関連する、請求項96〜100のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０２】
疾患または障害が、感染性疾患もしくは状態、自己免疫疾患、炎症疾患またはがんである、請求項100記載の組成物。
【請求項１０３】
標的抗原が、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水素酵素9（CAIX）、tEGFR、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、デュアル抗原（dual antigen）、がん精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児抗原、Gタンパク質共役受容体5D（GPCR5D）、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、病原体特異抗原およびユニバーサルタグに関連する抗原からなる群より選択される、請求項96〜102のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０４】
初代ヒトT細胞が、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARを発現するように遺伝子操作されている、請求項96〜103のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０５】
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、請求項104記載の組成物。
【請求項１０６】
CARが、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、請求項104または105記載の組成物。
【請求項１０７】
膜貫通ドメインが、CD28の膜貫通部分を含む、請求項106記載の組成物。
【請求項１０８】
CARの細胞内シグナル伝達ドメインが、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項104〜107のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０９】
T細胞共刺激分子が、CD28および41BBからなる群より選択される、請求項108記載の組成物。
【請求項１１０】
薬学的に許容される担体を含む、請求項96〜108のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年12月5日に出願された「Production of Engineered Cells for Adoptive Cell Therapy」という名称の米国仮出願第62/430,349号の優先権を主張するものであり、その内容はその全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組入れ
以下のASCIIテキストファイル：コンピュータ可読形態（CRF）の配列リスト（ファイル名：735042005040SeqList.txt、作成日：2017年11月28日、サイズ：50,233バイト）による提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、養子細胞療法に関連する使用のための細胞を含めた、細胞を遺伝子操作するための方法を提供する。いくつかの態様では、提供される方法は、レトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスベクターと一緒のインキュベーションによる細胞の形質導入を含み、その際、インキュベーション前に、細胞は、活性化剤または刺激剤と一緒にインキュベーションされたことがなく、例えば抗CD3／抗CD28抗体、および／または1種もしくは複数種の組換えサイトカインと一緒にインキュベーションされたことがない。いくつかの態様では、このような方法は、細胞を遺伝子操作するための工程を短縮または改良することに関係する特徴を結果として生じる。キメラ抗原受容体などのキメラ受容体またはトランスジェニックT細胞受容体などの他の組換え抗原受容体をコードする遺伝子などの組換え遺伝子または異種遺伝子を形質導入された、結果として生じる細胞およびその組成物も提供される。いくつかの態様では、提供される細胞および組成物は、養子免疫療法の方法に使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
背景
養子細胞免疫療法またはがん治療に使用するために抗原特異的T細胞にインビトロで形質導入するためを含めて、T細胞集団にインビトロで形質導入するために、様々な戦略が利用可能である。研究、診断および治療目的などで細胞集団にインビトロで形質導入するために、改良された戦略が必要である。このような必要性に応じる試薬、方法、製品およびキットが提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
組換え核酸を含有するウイルスベクター粒子と、対象由来の細胞を含有する試料から得られた複数のT細胞を含有するインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、インキュベーションする工程が、対象から試料を得た後24時間以内に開始される；かつ／あるいはインキュベーションする前に、T細胞が、15℃、18℃、22℃、もしくは25℃よりも高い、または約15℃、約18℃、約22℃、もしくは約25℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、もしくは24時間よりも長い期間供されたことがない；かつ／あるいはインキュベーションする前に、T細胞が、37°±2.0℃、約37°±2.0℃、37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後15分、30分、1時間、もしくは2時間よりも長い期間供されたことがない、方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、インキュベーションする工程は、対象から試料を得た後1時間、3時間、6時間、12時間、もしくは18時間以内、または約1時間、3時間、6時間、12時間、もしくは18時間以内に開始される。
【０００６】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションの前に、該方法は、細胞活性化を促進する条件でT細胞を刺激することを含まない。任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションする前に、インプット組成物は、37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高いインキュベーション、ならびに／またはT細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞を活性化することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、ならびに／またはT細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の剤；CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7の存在下でのインキュベーションを含めた、エクスビボ刺激に供されたことがない。
【０００７】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションする前に、T細胞の5％、10％、20％、30％、もしくは40％以下が、活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、およびTNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、G1もしくはより後期の細胞周期である、かつ／または増殖することが可能である。
【０００８】
任意のこのような態様のいくつかでは、方法は、組換え核酸を含有するウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られたT細胞を含有するインプット組成物とをインキュベーションする工程を含み、その際、インキュベーションする前に、T細胞またはインプット組成物が、37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高いインキュベーション、ならびに／またはT細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞を活性化することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、ならびに／またはT細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤；CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7の存在下でのインキュベーションを含めたエクスビボ刺激に供されたことがない。
【０００９】
任意のこのような態様のいくつかでは、1種または複数種の剤は、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含有する。
【００１０】
組換え核酸を含有するウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られたT細胞を含有するインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、インキュベーションの前に、T細胞の5％、10％、20％、30％、もしくは40％以下が活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、およびTNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、かつ／またはG1もしくはより後期の細胞周期である方法も提供される。
【００１１】
任意のこのような態様のいくつかでは、インプット組成物中のT細胞の10%以下が、インキュベーションの直前にHLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L、および4-1BBからなる群より選択されるT細胞活性化マーカーを含有する。任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションする前に、T細胞の5%、10％、20％、30％、または40％よりも多くが、低密度脂質受容体（LDL-R）を発現する。
【００１２】
任意のこのような態様のいくつかでは、対象は、ヒトである。
【００１３】
任意のこのような態様のいくつかでは、T細胞は、インキュベーションする前に、2℃〜8℃の温度で48時間よりも長く維持されたことがない、かつ／または維持されていない。
【００１４】
任意のこのような態様のいくつかでは、試料は、血液試料である。任意のこのような態様のいくつかでは、試料は、白血球除去試料である。
【００１５】
任意のこのような態様のいくつかでは、T細胞は、未分画T細胞である、富化もしくは単離されたCD3+ T細胞である、富化もしくは単離されたCD4+ T細胞である、または富化もしくは単離されたCD8+ T細胞である。任意のこのような態様のいくつかでは、T細胞は、対象からの試料から選択または富化されており、そのことが、いくつかの局面では、富化された組成物を生成する、かつ／またはインプット組成物を生成する。
【００１６】
任意のこのような態様のいくつかでは、方法は、インキュベーションの前に、対象から試料を得ることおよび任意で試料からT細胞を選択または富化する工程をさらに含み、そのことが、いくつかの局面では、富化された組成物を生成する、かつ／またはインプット組成物を生成する。場合によっては、インプット組成物中のT細胞のパーセンテージは、T細胞の75%、80%、85%、90%、もしくは95%、または約75%、80%、85%、90%、もしくは95%よりも大きい。
【００１７】
任意のこのような態様のいくつかでは、T細胞は、CD4+またはCD8+細胞を含有する。いくつかの態様では、T細胞は、CD4+およびCD8+細胞を含有する。場合によっては、CD4+細胞とCD8+細胞の比は、1：1、1：2、2：1、1：3、もしくは3：1、または約1：1、1：2、2：1、1：3、もしくは3：1である。
【００１８】
任意のこのような態様のいくつかでは、試料は、少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも33％（v/v）もしくは少なくとも約33％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度の血清または血漿を含有する；かつ／あるいは
インキュベーションする前に、試料が、少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも33％（v/v）もしくは少なくとも約33％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度の血清または血漿とエクスビボで接触されたことがある。
【００１９】
任意のこのような態様のいくつかでは、試料は、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）の濃度の血清もしくは血漿を含有する；かつ／またはインキュベーションする前に、試料が、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）の濃度の血清もしくは血漿とエクスビボで接触されたことがある。いくつかの局面では、血清または血漿は、ヒトの血清または血漿である。場合によっては、血清または血漿は、対象について自己の血清または血漿である。
【００２０】
任意のこのような態様のいくつかでは、試料は、抗凝固薬を含有する、かつ／またはインキュベーションする前に、抗凝固薬が、試料に添加されたことがある。いくつかの例では、抗凝固薬は、遊離クエン酸イオンを含有する。
【００２１】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションする前に、該方法は、T細胞、任意で試料または富化された組成物のT細胞を凍結保護物質の存在下で凍結保存し、それにより、凍結保存組成物を産生する工程を含む。いくつかの局面では、インキュベーションする前に、該方法は、凍結保護物質を減少させるもしくは除去するおよび／またはインプット組成物を生成させる条件で凍結保存組成物を洗浄することを含む。
【００２２】
任意のこのような態様のいくつかでは、インプット組成物は、N-アセチルシステイン（NAC）；血清、任意でヒト血清；組換えインターロイキン-2（IL-2）、組換えインターロイキン-15（IL-15）、および／または組換えインターロイキン-7（IL-7）を含有する。
【００２３】
任意のこのような態様のいくつかでは、インプット組成物は、0.4mg/mL〜4mg/mL、0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは1.6mg/mL〜2.4mg/mL、または約0.4mg/mL〜4mg/mL、0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは1.6mg/mL〜2.4mg/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度のN-アセチルシステインを含有する；あるいはインプット組成物は、少なくとも0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mL、または少なくとも約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mL、または約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mLの濃度のN-アセチルシステインを含有する。任意のこのような態様のいくつかでは、インプット組成物は、0.5%〜25％（v/v）、1.0%〜10％（v/v）、もしくは2.5%〜5.0％（v/v）、または約0.5%〜25％（v/v）、1.0%〜10％（v/v）、もしくは2.5%〜5.0％（v/v）（それぞれ両端の値を含む）の濃度の血清、任意でヒト血清を含有する；あるいはインプット組成物は、少なくとも0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%、または少なくとも約0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%、または約0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%の濃度の血清、任意でヒト血清を含有する。
【００２４】
任意のこのような態様のいくつかでは、インプット組成物は、10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL、または約10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、もしくは500IU/mL、または少なくとも約10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、もしくは500IU/mLの濃度の組換えIL-2、任意で組換えヒトIL-2を含有する；かつ／あるいはインプット組成物は、1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、もしくは5IU/mL〜10IU/mL、または約1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、もしくは5IU/mL〜10IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL、もしくは50IU/mL、または少なくとも約1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL、もしくは50IU/mLの濃度の組換えIL-15、任意で組換えヒトIL-15を含有する；かつ／あるいはインプット組成物は、50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは200IU/mL〜600IU/mL、または約50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL〜200IU/mL〜600IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、もしくは1000IU/mL、または少なくとも約50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、もしくは1000IU/mLの濃度の組換えIL-7、任意で組換えヒトIL-7を含有する。
【００２５】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションする工程は、ウイルスベクター粒子をインプット組成物と一緒にスピン接種する（spinoculate）段階を含む。いくつかの例では、スピン接種する工程は、遠心チャンバーの内部キャビティー中でウイルスベクター粒子およびインプット組成物を回転させることを含み、その際、回転は、キャビティーの側壁内面で、500g〜2500g、500g〜2000g、500g〜1600g、500g〜1000g、600g〜1600g、600g〜1000g、1000g〜2000g、または約500g〜2500g、500g〜2000g、500g〜1600g、500g〜1000g、600g〜1600g、600g〜1000g、1000g〜2000g、もしくは1000g〜1600g（それぞれ両端の値を含む）；あるいは少なくとも600g、800g、1000g、1200g、1600g、もしくは2000g、または少なくとも約600g、800g、1000g、1200g、1600g、もしくは2000gである相対遠心力を及ぼす回転である。
【００２６】
いくつかの態様では、スピン接種する工程は、5分よりも長いもしくは約5分、10分よりも長いもしくは約10分、15分よりも長いもしくは約15分、20分よりも長いもしくは約20分、30分よりも長いもしくは約30分、45分よりも長いもしくは約45分、60分よりも長いもしくは約60分、90分よりも長いもしくは約90分、または120分よりも長いもしくは約120分；あるいは
5分〜60分、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分、または約5分〜60分、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分（それぞれ両端の値を含む）である時間にわたる。
【００２７】
任意のこのような態様のいくつかでは、方法は、インプット組成物および／またはウイルスベクター粒子を形質導入アジュバントと接触させることをさらに含む。場合によっては、接触させることは、ウイルスベクター粒子をインプット組成物と一緒にスピン接種する前、それと同時、またはその後に実施される。
【００２８】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションの少なくとも一部は、37℃±2℃または約37℃±2℃で実施される。いくつかの局面では、インキュベーションの少なくとも一部は、スピン接種の後に実施される。場合によっては、インキュベーションの少なくとも一部は、2時間、4時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以下、または約2時間、4時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以下にわたり実施される。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は、24時間または約24時間実施される。任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションの合計持続時間は、12時間、24時間、36時間、48時間、または72時間以下である。
【００２９】
任意のこのような態様のいくつかでは、ウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子である。場合によっては、レンチウイルスベクター粒子は、HIV-1に由来する。任意のこのような態様のいくつかでは、ウイルスベクター粒子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されている。場合によっては、ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、VSV-Gである。
【００３０】
任意のこのような態様のいくつかでは、ウイルスベクター粒子は、SAMHD1阻害活性を示すレンチウイルスタンパク質を含有し、該タンパク質は、ウイルス粒子中にパッケージングされている。いくつかの例では、SAMHD1阻害タンパク質は、野生型Vpxタンパク質もしくは野生型Vprタンパク質である、または野生型VpxもしくはVprタンパク質の、SAMHD1阻害活性を示す変種もしくは部分である。場合によっては、SAMHD1阻害タンパク質は、レトロウイルスベクター粒子に対して異種である。いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、野生型Vpxタンパク質である、または野生型Vpxタンパク質の、SAMHD1阻害活性を示す変種もしくは部分である。
【００３１】
任意のこのような態様のいくつかでは、ウイルスベクター粒子は、20.0未満もしくは約20.0未満、または10.0未満もしくは約10.0未満の感染多重度でインキュベーションされる。任意のこのような態様のいくつかでは、ウイルスベクター粒子は、1.0IU/細胞〜10IU/細胞もしくは2.0U/細胞〜5.0IU/細胞、または約1.0IU/細胞〜10IU/細胞もしくは2.0U/細胞〜5.0IU/細胞の感染多重度でインキュベーションされる；あるいはウイルスベクター粒子は、少なくとも1.6IU/細胞、1.8IU/細胞、2.0IU/細胞、2.4IU/細胞、2.8IU/細胞、3.2IU/細胞、3.6IU/細胞、4.0IU/細胞、5.0IU/細胞、6.0IU/細胞、7.0IU/細胞、8.0IU/細胞、9.0IU/細胞、もしくは10.0IU/細胞、または少なくとも約1.6IU/細胞、1.8IU/細胞、2.0IU/細胞、2.4IU/細胞、2.8IU/細胞、3.2IU/細胞、3.6IU/細胞、4.0IU/細胞、5.0IU/細胞、6.0IU/細胞、7.0IU/細胞、8.0IU/細胞、9.0IU/細胞、もしくは10.0IU/細胞の感染多重度でインキュベーションされる。
【００３２】
任意のこのような態様のいくつかでは、インプット組成物は、少なくとも50×106個、100×106個、もしくは200×106個、または少なくとも約50×106個、100×106個、もしくは200×106個、または約50×106個、100×106個、もしくは200×106個の細胞を含有する。
【００３３】
任意のこのような態様のいくつかでは、組換え核酸は、抗原受容体をコードする。場合によっては、抗原受容体は、トランスジェニックT細胞受容体（TCR）である。いくつかの態様では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの例では、キメラ抗原受容体（CAR）は、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびITAMを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの局面では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含有する。任意のこのような態様のいくつかでは、CARは、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結している膜貫通ドメインをさらに含有する。場合によっては、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分を含有する。
【００３４】
任意のこのような態様のいくつかでは、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含有する。いくつかの例では、T細胞共刺激分子は、CD28および41BBからなる群より選択される。
【００３５】
任意のこのような態様のいくつかでは、抗原受容体は、疾患もしくは状態と関連する抗原と特異的に結合する、またはユニバーサルタグと特異的に結合する。場合によっては、疾患または状態は、がん、および自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である。
【００３６】
任意のこのような態様のいくつかでは、方法は、組換え核酸を形質導入されたT細胞を含有するアウトプット組成物を産生する。場合によっては、アウトプット組成物中のT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%に組換え核酸が形質導入されている。いくつかの局面では、該方法は、該方法により産生された形質導入T細胞をアウトプット組成物から回収または単離する工程をさらに含む。場合によっては、該方法は、アウトプット組成物の細胞または該方法により形質導入された細胞を活性化または拡大（expansion）する工程をさらに含む。いくつかの例では、活性化および／または拡大は、エクスビボで行われる。
【００３７】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションに続いて、アウトプット組成物中の細胞が、T細胞を活性化する、TCR複合体を経由するシグナルを誘導するおよび／またはT細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の刺激剤の存在下でさらにインキュベーションされる。いくつかの局面では、1種または複数種の刺激剤は、CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7からなる群より選択される。いくつかの態様では、1種または複数種の刺激剤は、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含有する。
【００３８】
場合によっては、活性化および／または拡大は、インビボで行われる。いくつかの態様では、活性化および／または拡大は、抗原受容体により特異的に結合された抗原の存在下で起こり、かつ／または導入遺伝子特異的である。
【００３９】
任意のこのような態様のいくつかでは、インキュベーションに続いて、アウトプット組成物中の細胞は、任意でCD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7からなる1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でエクスビボでさらにインキュベーションされず、かつ／またはアウトプット組成物中の細胞は、30℃よりも高い温度で24時間よりも長くさらにインキュベーションされない。
【００４０】
本明細書記載の方法のいずれかにより産生される遺伝子操作T細胞も提供される。本明細書記載の遺伝子操作T細胞および薬学的に許容される担体を含有する組成物も提供される。
【００４１】
疾患または状態を有する対象に上記組成物を投与する工程を含む処置方法も提供される。場合によっては、組成物は、対象に投与されるもしくはその用意ができており、かつ／または対象から試料を得た後9日以内、8日以内、7日以内、6日以内もしくは5日以内に検査に回される。いくつかの例では、組成物は、対象に投与されるもしくは投与される用意ができており、かつ／または対象から試料を得た後1日、2日、3日もしくは4日以内に検査に供される。場合によっては、組成物は、対象から試料を得た後21日以内、20日以内、19日以内、15日以内、14日以内、13日以内、12日以内、10日以内、9日以内、8日以内、7日以内、6日以内、または5日以内に、対象に投与する用意ができている。
【００４２】
疾患または状態を有する対象から得られた試料からT細胞を富化または単離する工程；上記の方法のいずれかにより、富化または単離されたT細胞を含有するインプット組成物にウイルスベクター粒子を形質導入し、それにより、形質導入細胞を含有するアウトプット組成物を産生する工程であって、その際、ウイルスベクター粒子が、疾患または障害と関連する抗原と特異的に結合する抗原受容体をコードする組換え核酸を含有する、工程；および疾患または状態を処置するために、形質導入細胞を含有するアウトプット組成物を対象に投与する工程を含む、養子細胞療法のための方法も提供される。
【００４３】
疾患または状態を処置するために、組換え核酸を形質導入されたT細胞を含むアウトプット組成物を対象に投与する工程を含む処置方法であって、アウトプット組成物が、提供される、細胞に形質導入する方法のいずれかにより産生される、処置方法も提供される。
【００４４】
任意のこのような方法の態様では、組成物は、対象に投与される、もしくは投与される用意ができている、または対象から試料を得た後11日以内、9日以内、8日以内、7日以内、6日以内、もしくは5日以内に検査に供される。いくつかの態様では、組成物は、対象から試料を得た後1日、2日、3日、4日、または5日以内に対象に投与される、もしくは投与される用意ができている。場合によっては、組成物を投与する前に、アウトプット組成物の形質導入細胞または細胞が、薬学的に許容される緩衝液中に製剤化される。
【００４５】
任意のこのような態様のいくつかでは、形質導入細胞を含有するアウトプット組成物を投与する前に、細胞は、形質導入後最大24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、または10日間エクスビボで培養され、培養は、30℃よりも高い温度で起こる。いくつかの態様では、形質導入に続いて、形質導入細胞を含有するアウトプット組成物または細胞は、T細胞を活性化する、TCR複合体を経由するシグナルを誘導するおよび／またはT細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の刺激剤の存在下で培養され、それにより、形質導入細胞を含有する組成物を産生する。
【００４６】
任意のこのような態様のいくつかでは、形質導入細胞を投与する前に、形質導入細胞を含有するアウトプット組成物または細胞は、1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でエクスビボでさらにインキュベーションされず、かつ／または30℃よりも高い温度で24時間よりも長くさらにインキュベーションされない。
【００４７】
任意のこのような態様のいくつかでは、1種または複数種の刺激剤は、CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7、抗原受容体により特異的に認識される抗原を含むワクチン、ならびに抗原受容体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体からなる群より選択される。
【００４８】
場合によっては、1種または複数種の刺激剤は、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含有する。いくつかの態様では、アウトプット組成物の細胞または形質導入細胞は、最適以下の用量で投与される。
【００４９】
任意のこのような態様のいくつかでは、該方法は、対象に1種または複数種の剤を投与する工程であって、形質導入T細胞のインビボ刺激および／または拡大を誘導または強化する工程をさらに含む。場合によっては、1種または複数種の剤は、導入遺伝子に特異的であり、かつ／または任意で抗原受容体であるもしくはそれを含有する、発現した導入遺伝子を介して細胞を刺激もしくは活性化する。いくつかの局面では、1種または複数種の剤は、抗原受容体により特異的に認識される抗原を含有するワクチン、抗原受容体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体、または抗原受容体の二量体化を化学的に誘導することが可能な剤の中より選択される。いくつかの態様では、1種または複数種の剤は、免疫調節剤；免疫チェックポイント阻害剤；細胞外アデノシンまたはアデノシン受容体、任意でA2aR受容体の阻害剤；キヌレニン経路モジュレーター、およびシグナル伝達経路のモジュレーター、例えばキナーゼ阻害剤である。
【００５０】
標的抗原と特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）またはトランスジェニックTCRを発現するように遺伝子操作された初代ヒトT細胞集団を含有する組成物であって、集団が、複数の休止T細胞を含有し；複数の休止T細胞が、組成物中の遺伝子操作細胞の少なくとも7.5％を含有する組成物も提供される。いくつかの例では、遺伝子操作された休止T細胞は、組成物中の遺伝子操作細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%を含有する。
【００５１】
いくつかの態様では、休止T細胞は、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L（CD154）および4-1BB（CD137）からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーについて表面陰性であり；IL-2、IFN-ガンマおよびTNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を欠如し；G0もしくはG0G1a期の細胞周期であり；かつ／または活性SAMHD1を含有する。いくつかの例では、休止T細胞は、CD25およびCD69について表面陰性（CD25-/CD69-）である。いくつかの局面では、休止T細胞は、CD4+および／またはCD8+ T細胞を含有する。
【００５２】
任意のこのような態様のいくつかでは、標的抗原は、疾患または障害に関連する。場合によっては、疾患または障害は、感染性疾患もしくは状態、自己免疫疾患、炎症疾患またはがんである。
【００５３】
任意のこのような態様のいくつかでは、標的抗原は、RORl、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソセリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児抗原、TAG72、VEGF-R2、がん胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）およびサイクリンA1（CCNA1）からなる群より選択される。本明細書記載の組成物のいくつかの態様では、初代ヒトT細胞は、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびITAMを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有するCARを発現するように遺伝子操作されている。場合によっては、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含有する。場合によっては、CARは、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインをさらに含有する。いくつかの局面では、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分を含有する。
【００５４】
任意のこのような態様のいくつかでは、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含有する。場合によっては、T細胞共刺激分子は、CD28および41BBからなる群より選択される。
【００５５】
任意のこのような態様のいくつかでは、組成物は、薬学的に許容される担体を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクター粒子で形質導入する前に活性化したまたは活性化しなかったT細胞の、側方散乱(SSC;y軸)およびEGFRt表面マーカー発現(x軸)(導入遺伝子発現の指標である)のドットプロットを示す。図1Aは、形質導入の前に抗CD3/抗CD28ビーズ試薬1または抗CD3/抗CD28ビーズ試薬2で活性化したCD4+およびCD8+T細胞をレンチウイルスベクター粒子で形質導入した後の、EGFRt発現のドットプロットを示す。
【図１Ｂ】導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクター粒子で形質導入する前に活性化したまたはしなかったT細胞の、側方散乱(SSC;y軸)およびEGFRt表面マーカー発現(x軸)(導入遺伝子発現の指標である)のドットプロットを示す。図1Bは、形質導入前に活性化しなかったCD4+およびCD8+T細胞を様々なウイルス濃度(初期濃度から2倍段階希釈)のレンチウイルスベクター粒子で形質導入した後の、EGFRt発現のドットプロットを示す。また、EGFRt+であった細胞の百分率を囲み図に示す。
【図２】様々な条件下で形質導入および処理した後の、選択後の指定日におけるCD4+およびCD8+T細胞についての代理マーカー表面発現の頻度(形質導入頻度の指標である)を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
I.  概要
免疫細胞、例えばT細胞などの細胞に形質導入することを含む、細胞（例えばT細胞）へのウイルスベクターの移入方法であって、形質導入が、細胞の事前活性化なしに、および／もしくは対象から細胞を得た後24時間以内に開始される期間内に行われ、かつ／または対象から細胞を得た後、形質導入の前に細胞が、15℃〜25℃よりも高い、例えば37°±2.0℃よりも高いまたは約37°±2.0℃よりも高い温度に数時間よりも長く（および24時間以下にわたり）供されたことがない、移入方法が提供される。いくつかの態様では、提供される方法は、細胞をウイルス粒子と一緒に接触させるまたはインキュベーションする前におよび／またはそれに関連して、最初に、すなわち形質導入の前に、エクスビボ刺激試薬（例えば抗CD3／抗CD28試薬）を用いてT細胞を活性化および／または刺激せずに、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター粒子を、免疫細胞、例えばT細胞などの細胞集団と一緒にインキュベーションすることおよび／または接触させることを含む。
【００５８】
いくつかの態様では、提供される方法は、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）またはトランスジェニックT細胞受容体（TCR）などの抗原受容体などの異種分子を用いてこのような細胞を遺伝子操作するために使用される。結果として生じた遺伝子操作細胞を養子免疫療法に使用することができる。いくつかのこのような態様では、T細胞を活性化および／または刺激する段階を含まない、提供される方法は、養子療法のためのT細胞などの免疫細胞を調製するために使用することができる。いくつかの局面では、細胞を活性化または刺激する必要性を排除することにより、提供される方法は、養子細胞療法用の細胞を操作および／または調製するための工程を短縮する。
【００５９】
一般に、レトロウイルスベースのベクターを使用して、関心対象の遺伝子を細胞内に安定的に組み込むことができる。水疱性口内炎ウイルスGタンパク質（VSV-g）でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターを非分裂細胞に形質導入することができるものの、休止T細胞を用いたときに形質導入が不十分であると報告されている。したがって、既存のレトロウイルスベクターに関して、レトロウイルスベクターを用いて細胞周期非進行（non-cycling）骨髄系細胞または休止T細胞などの静止および／または休止細胞を、下流の使用のために、例えば細胞療法への使用のために十分な量で効果的に安定遺伝子操作することは、必ずしも可能でない場合がある。場合によっては、T細胞に形質導入を起こすために、T細胞受容体（TCR）の結合またはサイトカイン刺激によるT細胞の活性化が必要な場合がある。時として、ある観察では、VSV-Gの結合パートナーであるLDL受容体の低レベル発現が休止T細胞に起こる。場合によっては、活性化がLDL受容体の発現を増加させ、それにより、レンチウイルスベクターの取込みを強化することが示されている。養子T細胞療法に使用するために、T細胞は、典型的には形質導入前に少なくとも1日間（最大3日間またはそれよりも長く）活性化される。例えば、T細胞のためのレンチウイルス形質導入プロトコールは、典型的には形質導入の少なくとも24時間前の活性化を必要とする（Amirache et al. (2014) Blood, 123:1422-1424）。
【００６０】
いくつかの例では、養子免疫療法用の遺伝子操作T細胞を調製するための利用可能な手順は、選択、活性化、形質導入および拡大の連続エクスビボ段階を必要とする可能性がある。しかし、T細胞などの免疫細胞のエクスビボ刺激または活性化は、ある特定の養子免疫療法の方法のための細胞調製に必ずしも望ましくない場合がある。例えば形質導入の前に、活性化および／または刺激段階を含めることで、養子細胞療法用の細胞を調製する上での時間、費用、試薬、および／またはユーザーの取扱いが増加する可能性がある。このような結果は、異なる工程の間のおよび／または異なる対象からの細胞に関するばらつきのリスクを増加させる可能性がある。したがって、いくつかの態様では、提供される方法は、他の方法と比較して、レトロウイルスベクター粒子に曝露する前の活性化および／または刺激段階を排除することにより、有利である。
【００６１】
追加的に、一部の状況では、養子T細胞療法後のT細胞の存続および／または消耗は、投与前、例えば遺伝子操作（例えば、抗原受容体、例えばCARなどの受容体などの遺伝子操作された分子をコードする核酸の導入）の前または途中のT細胞の刺激および／または活性化に関係づけることができる。例えば、形質導入を促進するためのT細胞の活性化は、T細胞の分化または活性化状態における変化を結果として招く可能性があり、その変化は、遺伝子操作細胞が対象に投与されたときのインビボ存続の減少を結果として招くおよび／または導く場合がある。起こりうる分化状態における変化の中に、場合によっては、ナイーブ表現型の喪失、メモリーT細胞表現型の喪失、および／または消耗したT細胞表現型を有するエフェクター細胞の生成が含まれる。T細胞の消耗は、T細胞機能の進行性の喪失および／または細胞枯渇へと導く場合がある（Yi et al. (2010) Immunology, 129:474-481）。
【００６２】
提供される方法は、対象からの細胞を選択および／または富化した直後に、T細胞集団などの細胞集団をレンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子と一緒にインキュベーションおよび／または接触させることにより、対象から得られた初代細胞の十分な形質導入を達成することができるという観察に基づいている。いくつかの態様では、提供される方法による形質導入工程は、CD3および／もしくはCD28タンパク質の結合を介して細胞に刺激を提供する、かつ／または最初に細胞を活性化することによりLDL受容体をアップレギュレーションするという必要性に縛られないらしいということが認められている。理論に縛られることを望むわけではないが、本明細書において、アフェレーシス収集を含めた、選択および／または富化された細胞の上流のプロセシング、ならびにT細胞選択および／または富化における工程が、それだけでLDL受容体の発現をアップレギュレーションする、かつ／または別のやり方でT細胞をウイルス侵入に感受性にする場合があると考えられている。したがって、細胞を少なくとも24時間活性化する必要なしに、選択直後にT細胞に形質導入し、それにより、より短い工程を可能にする可能性があることが判明している。提供される方法のいくつかの場合では、富化および／または選択された細胞が、インキュベーションするおよび／または接触させる前に1種または複数種の刺激剤を用いたエクスビボ刺激に供されないかぎり、富化および／または選択された細胞の凍結保存を、形質導入に先行させることができる。
【００６３】
いくつかの態様では、提供される方法は、形質導入されるべき細胞を含有するインプット組成物をインキュベーションするおよび／または接触させることを含み、その際、インプット組成物の細胞は、インキュベーションする前に、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞などのT細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを作動させるまたは開始する剤と一緒のインキュベーションを含むエクスビボ刺激に供されたことがない。このような剤は、例えばビーズなどの固体支持体と結合した、TCR成分および／もしくは共刺激受容体に特異的な結合分子もしくは抗体などの結合分子もしくは抗体、例えば抗CD3、抗CD28、ならびに／または1種もしくは複数種のサイトカイン、例えばIL-2および／もしくはIL-15および／もしくはIL-7などの組換えサイトカインを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、提供されるレトロウイルスベクターを導入する前に、抗CD3抗体、抗CD28抗体および／または組換えIL-2、IL-15もしくはIL-7サイトカインのうちの1種または複数種を用いて、T細胞を含有する細胞集団を活性化および／または刺激することを含まない。いくつかの態様では、組換えへの言及は、対象から得られた試料中に通常は得られないが、その代わりにタンパク質をコードする遺伝子配列が細胞内に人工的または外因的に導入されたDNAからの細胞における発現を含むような、組換えDNA技法を使用して産生されるサイトカインを表す。したがって、組換えサイトカインへの言及は、対象からの試料、例えばアフェレーシス試料中に存在する、かつ／またはこのような対象から得られた血清中に存在する場合があるサイトカインを含まない。いくつかの態様では、インプット組成物は、対象からの試料から得られ、かつ／または細胞、例えばT細胞の特定のサブセットについて富化された初代細胞集団を含む。
【００６４】
いくつかの態様では、細胞集団、例えばインプット組成物は、予め凍結保存に供された細胞集団であることができる。いくつかのこのような態様では、細胞の凍結保存の前に、細胞集団は、T細胞の細胞活性化または刺激などの、細胞の活性化または刺激を促進する任意の条件に供されたことがない、かつ／またはその存在下で曝露および／もしくはインキュベーションされたことがない。いくつかの態様では、細胞の凍結保存の前に、細胞集団は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な1種または複数種の剤、例えば抗CD3および／もしくは抗CD28抗体ならびに／または1種もしくは複数種のサイトカイン、例えばIL-2および／もしくはIL-15および／もしくはIL-7に供されたことがない、かつ／またはその存在下で曝露および／もしくはインキュベーションされたことがない。
【００６５】
いくつかの態様では、提供されるレトロウイルスベクターと一緒にインキュベーションされる細胞集団、例えばインプット組成物は、レトロウイルスベクター粒子と一緒のインキュベーションの前に、0℃よりも高い、例えば4℃、15℃、20℃よりも高いまたは25℃よりも高い温度に、約1時間、3時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、または72時間よりも長く曝露および／または供されたことがない細胞集団である。
【００６６】
いくつかの態様では、インキュベーションすることおよび／または接触させることは、初代細胞を含有する対象から試料、例えばアフェレーシス試料を得た後1時間、3時間、6時間、12時間、18時間、もしくは24時間以内、または約1時間、3時間、6時間、12時間、18時間、もしくは24時間以内に開始される。いくつかの態様では、インキュベーションする前に、T細胞は、15℃、18℃、22℃、もしくは25℃よりも高い、または約15℃、18℃、22℃、もしくは25℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、または24時間よりも長い期間にわたり供されたことがなく、例えば、37°±2.0℃よりも高い、または約37°±2.0℃よりも高い温度に対象から試料を得た後、15分、30分、1時間、または2時間よりも長い期間にわたり供されたことがない。
【００６７】
いくつかの態様では、提供される方法は、細胞のこのような活性化が形質導入に先行しなかった形質導入細胞を含有するアウトプット組成物を産生する。いくつかの態様では、この方法を使用して、集団中のT細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれよりも多くが、休止T細胞、例えば表面マーカーもしくは細胞内サイトカインもしくは他のマーカーなどのT細胞活性化マーカーを欠如するT細胞、および／または細胞周期のG0もしくはG0G1a期にあるT細胞であるT細胞集団に形質導入することができる。
【００６８】
いくつかの態様では、該方法は、アウトプット組成物中の総細胞（またはT細胞などの特定の標的細胞型）の少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、または少なくとも75％にウイルスベクターが形質導入されており、かつ／またはこれらの細胞が、それによりコードされる組換え遺伝子産物を発現する、アウトプット組成物を産生する。
【００６９】
いくつかの態様では、提供される方法は、非活性化または非刺激免疫細胞などの細胞周期非進行および／または休止細胞などの免疫細胞、例えば休止T細胞の相対的に高い形質導入を結果として招く。いくつかの態様では、細胞集団、例えばアウトプット組成物中の休止T細胞などの細胞周期非進行細胞または休止細胞の少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%にレトロウイルスベクター粒子が、提供される方法にしたがって形質導入される。
【００７０】
いくつかの態様では、インプット組成物および／またはアウトプット組成物中のT細胞の5％、10％、20％、30％、または40％以下は、活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、G1もしくはより後期の細胞周期である、かつ／または増殖することが可能である。例えば、いくつかの局面では、インプット組成物および／またはアウトプット組成物の細胞集団は、少なくとも40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%がCD25および／またはCD69について表面陰性である細胞集団であり、例えばCD25-およびCD69-である。
【００７１】
休止T細胞などの細胞の細胞周期進行状況を評価および／または判断するための方法および／または技法は、公知である（Tumeh et al. (2010) J Immunother., 33:759-768）。いくつかの態様では、休止T細胞は、活性化T細胞などの増殖中のT細胞よりも小さいサイズを示す。したがって、いくつかの局面では、自動細胞計数器を使用して、トリパンブルーなどの生存性色素を用いてまたは用いずに決定されるような細胞のサイズを採用することができる。いくつかの態様では、集団中の大部分の細胞および／またはT細胞の実質的にすべては、4μm未満、一般的に3μm未満、例えば1μm〜3μmまたは約1μm〜3μm、例えば一般的に約またはおよそ2μmである直径を有する細胞である。いくつかの態様では、代謝基質、例えば活性化細胞または刺激された細胞により取り込まれる各マーカーであるトリチウム（3H）標識2'-デオキシ-D-グルコース（[3H]-2'DDG）、3H標識3'-デオキシ-3'-フルオロチミジン（[3H]-3'FLT）および／または3H標識-2'-デオキシ-2'-フルオロアラビノフルラノシル（fluranosyl）シトシン（[3H]-FAC）の取込みを判断することができる。いくつかの態様では、集団中の大部分の細胞および／またはT細胞の実質的にすべては、代謝基質のマーカーを取り込むことができず、かつ／またはそれを蓄積しない。いくつかの態様では、細胞周期は、例えば、ヨウ化プロピジウム（PI）、7-アミノアクチノマイシン-D（7-AAD）、Hoechst 33342、33258およびS769121、TO-PRO-3,4'6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、DRAQ5（商標）またはDRAQ7（商標）を利用する、DNA含量の定量などにより、直接に判断またはモニタリングすることができる。
【００７２】
T細胞活性化マーカーの発現および／またはレベルを判断するための方法および技法は、当技術分野において公知である。このようなマーカーを検出するための抗体および試薬は、当技術分野において周知であり、容易に入手可能である。このようなマーカーを検出するためのアッセイおよび方法には、非限定的に、細胞内フローサイトメトリーを含めたフローサイトメトリー、ELISA、ELISPOT、サイトメトリービーズアレイまたは他のマルチプレックス法、ウエスタンブロットおよび他のイムノアフィニティーベースの方法が含まれる。
【００７３】
いくつかの態様では、方法は、ある特定の条件で少なくとも特定の形質導入効率を達成することが可能である。例えば、インプット組成物が細胞1つあたり1もしくは約1感染単位（IU）〜細胞1つあたり10もしくは約10IUの比で、例えば細胞1つあたり少なくとも1感染単位（IU）、もしくは1IU、もしくは約1IU、または細胞1つあたり少なくとも2IU、もしくは2IU、もしくは約2IU、細胞1つあたり少なくとも5IU、もしくは5IU、もしくは約5IU、または細胞1つあたり少なくとも10IU、もしくは10IU、もしくは約10IUでウイルスおよび細胞を含むいくつかの態様では、該方法は、該方法により生成された組成物中の細胞の少なくとも10％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、または少なくとも75％に例えば組換えウイルスベクターが形質導入された、アウトプット組成物を産生することが可能である。
【００７４】
いくつかのこのような態様では、細胞、例えば休止T細胞などの細胞周期非進行宿主細胞、またはその細胞集団にレトロウイルスベクターの形質導入または他の形態の移入を行った後に、レトロウイルスベクターのゲノム中に含有される核酸によりコードされる異種分子またはタンパク質などの組換え分子またはタンパク質の発現レベルを測定することにより、レトロウイルスベクター粒子による細胞の形質導入効率をモニタリングおよび／または観察することができる。例えば細胞表面タンパク質に関連するアフィニティーベースの方法、例えばイムノアフィニティーベースの方法、例えばフローサイトメトリーによる検出などの、組換え分子の発現レベルを判断するためのいくつかの周知の方法が、使用される場合がある。一部の例では、発現は、形質導入マーカーおよび／またはレポーター構築物の検出により測定される。いくつかの態様では、切断型表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含まれ、発現および／またはその強化のマーカーとして使用される。
【００７５】
いくつかの態様では、提供される方法は、ウイルス粒子と一緒の細胞のインキュベーション、例えば形質導入の前または後の、凍結保存段階を含むことができる。いくつかの態様では、このような段階は、工程に中断段階を提供して、物質の出荷、物質のサンプリング、または患者の状態を未決定のままにする「留まり」（'hold' on）治療を可能にすることもできる。
【００７６】
いくつかの局面では、提供される方法が、細胞の事前活性化および／または刺激のための段階を含まないのに対し、この方法は、形質導入と同時および／または形質導入後の細胞の活性化または刺激を含むことができる。活性化または刺激は、エクスビボまたはインビボで実施することができる。いくつかの態様では、ウイルス粒子と一緒の細胞のインキュベーション、例えば形質導入の後、インビボ活性化および拡大のために細胞を患者に注入することができる。
【００７７】
いくつかの態様では、インキュベーションの途中またはインキュベーションに続いて、提供される方法は、インプット組成物、アウトプット組成物および／または形質導入細胞をエクスビボで、細胞刺激のための条件、例えば細胞の増殖および／または活性化を誘導する条件などで培養することをさらに含むことができる。いくつかの態様では、培養は、30℃よりも高い、例えば32℃、35℃、もしくは37℃、または約32℃、35℃、もしくは37℃よりも高い温度で、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日またはそれよりも長く実施される。いくつかの態様では、刺激は、1種または複数種の刺激剤の存在下で実施される。いくつかの態様では、1種または複数種の刺激剤は、CD3結合分子、CD28結合分子、または組換えIL-2、組換えIL-15、もしくは組換えIL-7などのサイトカインである。いくつかの態様では、結合分子は、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体などの抗体または抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、さらに培養することは、細胞の拡大をもたらすための、例えば対象に養子細胞療法により投与するための治療有効細胞用量を得るための条件で実施される。
【００７８】
いくつかの態様では、アウトプット組成物または形質導入細胞は、30℃よりも高い温度でエクスビボでさらに培養されず、かつ／または1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でさらに培養されない。
【００７９】
いくつかの態様では、提供される方法は、T細胞にCARなどの組換え受容体をコードする核酸を導入、移入および／または形質導入する工程中にT細胞の分化状態をエクスビボで変化させることを実質的に回避する、かつ／またはその変化を最小限にする。いくつかの態様では、提供される方法により産生された、投与された細胞は、消耗がより少ない表現型を示す。
【００８０】
いくつかの態様では、例えばT細胞を含む、インプット組成物および／またはアウトプット組成物は、インプット組成物の細胞がインキュベーションの前に活性化および／または刺激された、例えば抗CD3／抗CD28抗体で少なくとも24時間または少なくとも約24時間活性化および／または刺激された組成物中の細胞よりも低い比率またはパーセンテージのエフェクター細胞、例えば消耗したT細胞表現型を有するエフェクター細胞を含む。いくつかの態様では、インプット組成物および／またはアウトプット組成物中のT細胞は、インプット組成物の細胞がインキュベーション前に活性化および／または刺激された、例えば抗CD3／抗CD28抗体で少なくとも24時間または少なくとも約24時間活性化および／または刺激された組成物よりも低い比率またはパーセンテージのエフェクターメモリーT（TEM）またはエフェクターT（TEFF）細胞、例えばCD45RO+CD62L-CCR7-細胞を含有する。いくつかの態様では、該比率またはパーセンテージは、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍、または少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍低い。
【００８１】
いくつかの態様では、例えばT細胞を含む、インプット組成物および／またはアウトプット組成物は、インプット組成物の細胞がインキュベーション前に活性化および／または刺激されたことがある、例えば抗CD3／抗CD28抗体で少なくとも24時間または少なくとも約24時間活性化および／または刺激されことがある組成物中の細胞よりも高い比率またはパーセンテージの、メモリーT細胞表現型を有するT細胞を示す。例えば、いくつかの態様では、メモリーT細胞は、中枢性メモリーT細胞（TCM）表現型を有する細胞、例えばCD45RO+CCR7+CD62L+T細胞および／またはCD45RO+CCR7+CD27+CD28+CD62L+T細胞である。いくつかの態様では、比率またはパーセンテージは、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍または少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、もしくは5倍低い。
【００８２】
いくつかの態様では、提供される方法が実施されることにより、例えば養子細胞療法における、臨床使用のための細胞を調製する1つ、複数、またはすべての段階は、細胞を非無菌条件に曝露せずに、かつ無菌室または無菌キャビネットを使用する必要なしに実施される。このような工程のいくつかの態様では、細胞は、すべて閉鎖システム内で単離、分離または選択、形質導入、洗浄、任意で活性化または刺激および製剤化される。いくつかの態様では、閉鎖システムは、遠心チャンバーを含むデバイスである、またはそれを含む。いくつかの態様では、方法は、自動的に実施される。いくつかの態様では、段階の1つまたは複数は、閉鎖システムまたはデバイスと別に、例えば遠心チャンバーシステムと別に実施される。
【００８３】
いくつかの態様では、提供される方法は、細胞がエクスビボでより短い期間プロセシングされることで時間を節約しコスト削減を可能にする、最適化または改良された工程を提供する。いくつかの局面では、提供される方法は、また、対象に投与するための、より良好なまたはより望ましい表現型を有する形質導入細胞、例えば消耗がより少ない細胞および／またはエフェクターメモリー細胞よりも多い中枢性メモリー細胞を有する形質導入細胞を産生する場合がある。
【００８４】
いくつかの態様では、該方法により産生されたこのような細胞、またはこのような細胞を含む組成物が、疾患または状態を処置するために対象に投与される。
【００８５】
いくつかの態様では、提供される方法は、対象に最適以下の細胞用量を投与することを含む。いくつかの態様では、細胞の用量は、疾患または状態を処置するための細胞の治療有効用量よりも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、もしくは10倍少ない、または約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、もしくは10倍少ない。このような例では、治療有効量の細胞を産出するための細胞の拡大は、対象に細胞を投与した際にインビボで起こることができる。
【００８６】
いくつかの態様では、提供される方法は、細胞のインビボ拡大を含む。いくつかの局面では、細胞のインビボ拡大は、投与された細胞の導入遺伝子特異的な活性化または刺激によりインビボで起こることができる。いくつかの態様では、抗原受容体（例えばCAR）は、抗原を認識すると、刺激、例えば活性化または拡大される。いくつかの態様では、1種または複数種の剤は、対象における細胞の刺激、活性化または拡大をインビボでブースト、増大または増加させるために対象に投与される。
【００８７】
いくつかの態様では、提供される方法は、対象に投与したときに存続の増加および／またはT細胞消耗の減少を示す、遺伝子操作T細胞を産生する。いくつかの態様では、存続が増加および／または消耗が減少した遺伝子操作細胞は、それが投与された対象において、より良好な効力を示す。いくつかの態様では、提供されるレトロウイルスベクター粒子および方法は、例えば対象に投与する前のT細胞のエクスビボ操作を最小限にするおよび／または減少させることにより、養子免疫療法の方法における処置結果におけるばらつきを減少させる。いくつかの態様では、T細胞のエクスビボ活性化を排除することは、エクスビボ操作のために要する時間および試薬を減少させることにより、養子免疫療法のための遺伝子操作T細胞を産生または調製する工程を改善する。
【００８８】
いくつかの態様では、形質導入細胞または操作細胞についての選択が、遺伝子操作の後に実施される。いくつかの態様では、操作された細胞周期非進行細胞および／または休止T細胞などの休止もしくは静止細胞を、養子免疫療法に使用するために富化することができる。
【００８９】
CARおよび／または他の組換え受容体などの組換え抗原受容体などの遺伝子操作受容体を発現している細胞などの、結果として生じた遺伝子操作細胞、ならびにこのような遺伝子操作細胞の養子免疫療法のための方法および使用も、提供される態様に含まれる。
【００９０】
II.  形質導入方法
インプット組成物の細胞をレトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスベクター粒子と一緒にインキュベーションするまたは接触させる方法が、本明細書に提供される。いくつかの局面では、インプット組成物は、場合によっては、細胞の亜集団またはサブセットが選択および／または富化された、対象から得られた初代細胞の組成物である。インプット組成物の特徴が提供される。
【００９１】
いくつかの態様では、細胞は、提供される方法にしたがって遺伝子操作を介して導入された1種または複数種の核酸を含み、それにより、このような核酸の組換え産物または遺伝子操作産物を発現する。いくつかの態様では、核酸は、異種である、すなわち細胞または細胞から得られた試料、例えば別の生物または細胞から得られた試料中に通常は存在せず、これは、例えば、操作される細胞および／またはこのような細胞が由来する生物に通常は見出されない。いくつかの態様では、核酸は、非天然であり、例えば複数の異なる細胞型からの多様なドメインをコードする核酸のキメラ組合せを含む核酸を含めて、自然界に見られない核酸である。
【００９２】
方法のプロセシング段階は、いくつかの細胞プロセシング段階の任意の1つまたは複数を単独でまたは組み合わせて含みうる。特定の態様では、プロセシング段階は、細胞に発現させるための組換え産物をコードするレトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを含有するウイルスベクター粒子を細胞に形質導入することを含む。該方法は、他のプロセシング段階、例えば細胞の単離、分離、選択、洗浄、懸濁、希釈、濃縮、および／または製剤化のための段階をさらにおよび／または代替的に含みうる。場合によっては、方法は、培養のためのエクスビボ段階（例えば、細胞の増殖および／または活性化を誘導するための、例えば細胞の刺激）も含むことができる。他の場合には、細胞を刺激または活性化するための段階は、抗原の認識により、ならびに／または細胞の拡大、活性化および／もしくは増殖をブーストもしくは増大するための1種もしくは複数種の剤の投与後に、対象に細胞を投与する際にインビボで実施される。いくつかの態様では、方法は、対象から細胞を単離すること、それらを調製、プロセシング、培養および／または操作すること、ならびに凍結保存の前または後にそれらを同じ対象に再導入することを含む。
【００９３】
いくつかの態様では、方法は、細胞、例えば初代細胞が、生物学的試料から最初に単離され、例えば選択または分離され；選択された細胞が形質導入のためにウイルスベクター粒子と一緒にインキュベーションされ；形質導入細胞が組成物中に製剤化される順序で実施されるプロセシング段階を含む。場合によっては、形質導入細胞は、刺激試薬の存在下で刺激などによりエクスビボで活性化、拡大または増やされる。いくつかの態様では、方法は、細胞を洗浄、懸濁、希釈および／または濃縮することの中からの1つまたは複数のプロセシング段階を含むことができ、プロセシング段階は、分離もしくは選択などの単離、形質導入、刺激、および／または製剤化段階のうちの1つまたは複数の前、途中もしくは同時または後に起こることができる。
【００９４】
いくつかの態様では、プロセシング段階、例えば、単離、選択および／または富化、プロセシング、形質導入および操作に関連するインキュベーション、ならびに製剤化段階のうちの1つまたは複数またはすべては、統合型もしくは内臓型のシステム中のシステム、デバイス、もしくは装置を使用して、かつ／または自動的もしくはプログラム可能的に実施される。いくつかの局面では、システムまたは装置は、ユーザーにプロセシング、単離、操作、および製剤化段階をプログラム、制御、その結果を判断、および／またはその多様な局面を調整させる、システムまたは装置と通信するコンピュータおよび／またはコンピュータープログラムを含む。一例では、システムは、国際公開公報第2009/072003号、またはUS20110003380A1に記載されたようなシステムである。一例では、システムは、国際公開公報第2016/073602号に記載されたようなシステムである。
【００９５】
いくつかの態様において、提供された形質導入方法に関連して細胞を調製すること、処理すること、および/またはインキュベートすることに関連する細胞プロセシング段階の1つまたは複数を、ある種の利点を他の利用可能な方法と比較して提供することができる遠心分離チャンバーの内部キャビティー（例えば、形状が一般に円筒状であり、かつ、回転軸の周りに回転可能である実質的に剛性のチャンバーなど）において行うことができる。いくつかの態様において、すべてのプロセシング段階が、同じ遠心分離チャンバーにおいて行われる。いくつかの態様において、1つまたは複数のプロセシング段階が、異なる遠心分離チャンバーにおいて、例えば、同じタイプの複数の遠心分離チャンバーなどにおいて行われる。そのような方法には、国際公開公報番号WO2016/073602に記載されるような方法のいずれもが含まれる。
【００９６】
例示的な遠心分離チャンバーとして、Biosafe SAによって製造および販売されるものが、Sepax（登録商標）システムおよびSepax（登録商標）2システムとともに使用されるためのもの、例えば、A-200/FおよびA-200の遠心分離チャンバー、ならびにそのようなシステムとともに使用されるための様々なキットを含めて挙げられる。例示的なチャンバー、システム、ならびに処理用の機器類およびキャビネットが、例えば、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許出願公開第2008/0171951号、ならびに国際特許出願公開公報番号WO 00/38762に記載される（それらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。特定のプロセス（例えば、希釈、洗浄、形質導入、製剤化）に依存して、プロセスに適している特定のキットを選ぶことは当業者のレベルの範囲内である。そのようなシステムとともに使用されるための例示的なキットには、CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2の製品名でBioSafe SAによって販売される単回使用キットが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
いくつかの態様において、システムは、該システムにおいて実行される様々なプロセシング段階の局面を操作し、自動化し、制御し、および/またはモニターするための機器類を含めて、他の機器類とともに含められ、ならびに/あるいは他の機器類と連携させられる。この機器類はいくつかの態様において、キャビネット内に格納される。いくつかの態様において、機器類には、制御回路を含有する筺体、遠心分離機、カバー、モーター、ポンプ、センサー、ディスプレイおよびユーザーインターフェースを含むキャビネットが含まれる。例示的なデバイスが、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許出願公開第2008/0171951号に記載される。
【００９８】
いくつかの態様において、システムは、一連の容器（例えば、バッグなど）、管類、ストップコック、クランプ、コネクターおよび遠心分離チャンバーを含む。いくつかの態様において、容器（例えば、バッグなど）は、形質導入を受ける細胞と、ウイルスベクター粒子とを同じ容器または別個の容器（例えば、同じバッグまたは別個のバッグなど）において含有する1つまたは複数の容器（例えば、バッグなど）を含む。いくつかの態様において、システムはさらに、構成成分および/または組成物を方法の期間中に希釈するために、再懸濁するために、および/または洗浄するために、チャンバーおよび/または他の構成要素に引き入れられる媒体（例えば、希釈剤および/または洗浄液など）を含有する1つまたは複数の容器（例えば、バッグなど）を含む。容器は、システムにおいて1つまたは複数の位置で、例えば、投入ライン、希釈剤ライン、洗浄ライン、廃棄物ラインおよび/または排出ラインに対応する位置などで接続することができる。
【００９９】
いくつかの態様において、システム（例えば、閉鎖システムなど）は無菌である。いくつかの態様において、システムの構成要素のすべての接続、例えば、コネクターを介した管類ラインと容器との間などにおける接続が、無菌条件のもとでなされる。いくつかの態様において、接続が層流のもとでなされる。いくつかの態様において、接続が、無菌接続（例えば、無菌溶接など）を管類と容器との間に生じさせる無菌接続デバイスを使用してなされる。いくつかの態様において、無菌接続デバイスは、無菌性を維持するために十分に高い熱条件のもとで、例えば、少なくとも200℃の温度（例えば、少なくとも260℃または300℃など）などで接続をもたらす。
【０１００】
いくつかの態様において、システムは使い捨て型であってもよく、例えば、単回使用キットなどであってもよい。いくつかの態様において、単回使用キットを、例えば、連続様式または半連続様式で行われるプロセスにおいて、複数回の1つまたは複数のプロセスで、例えば、少なくとも2回、3回、4回、5回またはそれ以上などで利用することができる。いくつかの態様において、システム（例えば、単回使用キットなど）が、ただ1名の患者からの細胞を処理するために用いられる。
【０１０１】
遠心チャンバーは、一般的に回転軸の周りを回転可能であり、キャビティーは、典型的にはチャンバーと同軸である。いくつかの態様では、遠心チャンバーは、一般的に、チャンバー内を移動（例えば軸方向に移動）して、キャビティーの容積を変動させることが可能な、ピストンなどの可動部材をさらに含む。したがって、特定の態様では、内部キャビティーは、チャンバーの側壁および端壁ならびに可動部材により結合され、可動部材を移動させることにより調整されうる可変体積を有する。可動部材は、剛性材料、実質的もしくは一般的剛性材料、柔軟性材料、またはその組合せからできている場合がある。
【０１０２】
チャンバーは、一般的に、キャビティー内への液体および／または気体の取入れならびに当該キャビティーからの液体および／または気体の圧出を可能にすることができる1つまたは複数の開口部、例えば1つもしくは複数の入口、1つもしくは複数の出口、および／または1つもしくは複数の入口／出口を含む。場合によっては、開口部は、液体および／または気体の取入れおよび圧出の両方が起こる入口／出口であることができる。場合によっては、1つまたは複数の入口は、1つまたは複数の出口と別々または異なることができる。1つまたは複数の開口部は、端壁の1つにある場合がある。いくつかの態様では、液体および／または気体は、キャビティーの容積を増加および／または減少させるような可動部材の移動により、キャビティー内に取り込まれ、かつ／またはキャビティーから圧出される。他の態様では、例えば、自動的に制御されうるポンプ、シリンジ、または他の機構と接続されて制御されるラインまたはチャンネルを置くことにより、液体および／または気体は、開口部に接続するまたは接続して配置されるチューブラインまたは他のチャンネルを経由して、キャビティー内に取込みおよび／またはキャビティーから圧出される場合がある。
【０１０３】
いくつかの態様では、チャンバーは、チューブラインおよびコネクターおよびキャップなどの多様な追加的な構成要素を有する、無菌システムなどの閉鎖システムの部分であり、その内部でプロセシング段階が起こる。したがって、いくつかの態様では、提供される方法および／またはその段階は、閉鎖または半閉鎖無菌システムなどの完全閉鎖または半閉鎖環境中で実施され、バイオセーフティーキャビネットまたはバイオセーフティールームなどの別個の無菌環境を必要としない、対象に治療的に投与するための細胞の産生を促進する。いくつかの態様では、該方法は、自動的、または部分的に自動的に、実施される。
【０１０４】
いくつかの態様では、チャンバーは、その回転軸周辺などの、チャンバーの回転を引き起こすことが可能な遠心分離機と関連する。回転は、プロセシング段階のうちの1つまたは複数におけるインキュベーションの前、途中、および／または後に起こりうる。したがって、いくつかの態様では、多様なプロセシング段階のうちの1つまたは複数は、回転下で、例えば特定の力を加えて実施される。遠心分離の間チャンバーが垂直方向に位置し、側壁および軸が垂直または概して垂直方向であり、端壁が水平または概して水平方向であるように、チャンバーは、典型的には垂直または概して垂直方向の回転が可能である。
【０１０５】
方法の様々な局面において、プロセスは、同じ閉鎖システムにおいて、例えば、同じ遠心分離チャンバーなどにおいて実施される必要はなく、しかし、異なる閉鎖システムのもとで、例えば、異なる遠心分離チャンバーなどにおいて実施することができる。いくつかの態様において、そのような異なる遠心分離チャンバーは、同じシステムと連携させられる方法、例えば、同じ遠心分離機と連携させられる方法などのそれぞれの点に存在する。いくつかの態様において、すべてのプロセシング段階が閉鎖システムで実施され、この場合、それぞれ1つまたは複数のプロセシング段階のすべてまたは一部が、同じ遠心分離チャンバーまたは異なる遠心分離チャンバーにおいて実施される。
【０１０６】
A. 試料および細胞の調製
細胞は一般には真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞など）であり、典型的にはヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、血液、骨髄、リンパまたはリンパ系器官に由来しており、免疫系の細胞、例えば、自然免疫または適応免疫の細胞などであり、例えば、リンパ球（典型的にはT細胞および/またはNK細胞）を含めて、骨髄系細胞またはリンパ系細胞である。他の例示的細胞として、幹細胞、例えば、誘導多能性幹細胞（iPSC）を含めて、複能性幹細胞および多能性幹細胞などが挙げられる。
【０１０７】
細胞は典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接に単離された細胞、および/または対象から単離され、凍結された細胞などである。いくつかの態様において、細胞は、T細胞または他の細胞タイプの1つまたは複数のサブセット、例えば、全T細胞集団、CD4＋細胞、CD8＋細胞、およびそれらの亜集団（例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、増殖能、再循環能、局在化能および/または持続能についての潜在的能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官もしくは区画における存在、マーカープロフィルもしくはサイトカイン分泌プロフィル、ならびに/あるいは分化の程度によって規定される亜集団など）などを含む。処置されることになる対象に関して、細胞は同種および/または自家であってもよい。方法には、既製の方法が挙げられる。いくつかの局面において、例えば、既製の技術などのために、細胞は多能性および/または複能性であり、例えば、幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞（iPSC）など）などである。いくつかの態様において、方法は、細胞を対象から単離し、調製し、処理し、培養し、および/または工学的に改変し、同じ対象に凍結保存前もしくは凍結保存後に再導入することを含む。
【０１０８】
T細胞のサブタイプおよび亜集団、ならびに/あるいはCD4＋および/またはCD8＋ T細胞のサブタイプおよび亜集団には、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそのサブタイプ（例えば、幹細胞メモリーT（TSCM）細胞、セントラルメモリーT（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）細胞または最終分化エフェクターメモリーT細胞など）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在する適応性の制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞（例えば、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞およびデルタ/ガンマT細胞など）がある。
【０１０９】
いくつかの態様において、細胞はナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの態様において、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球および/または好塩基球である。
【０１１０】
いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。細胞は、いくつかの態様において、異種供給源、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタから得られる。
【０１１１】
いくつかの態様において、細胞は、生物学的試料などの試料、例えば対象から得られるものまたは対象に由来するものから単離しうる。いくつかの態様において、細胞の単離源となる対象は、疾患または状態を有する者、または細胞療法の必要がある者、または細胞療法が施行される予定である者である。対象は、いくつかの態様において、特定の治療的介入を必要とするヒト、例えばその治療のために細胞が単離され、処理され、かつ/または工学的に改変されている養子細胞療法を必要とするヒトである。
【０１１２】
したがって細胞は、いくつかの態様において、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料としては、対象から直接採取された組織、体液、および他の試料、ならびに例えば分離、遠心分離、遺伝子改変（例えばウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、および/またはインキュベーションなどといった1つまたは複数のプロセシング段階の結果として得られる試料が挙げられる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接的に得られる試料であるか、処理された試料であることができる。生物学的試料としては、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液試料、組織試料および器官試料（それらに由来する処理済み試料を含む）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１３】
いくつかの局面において、細胞の由来源または単離源となる試料は、血液または血液由来の試料であるか、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であるか、またはそれに由来する。例示的試料として、全血、末梢血単核球（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、大腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃、もしくは他の器官、および/またはそれらに由来する細胞が挙げられる。細胞療法、例えば養子細胞療法との関連において、試料には、自家供給源および同種異系供給源からの試料が包含される。
【０１１４】
いくつかの例において、対象の循環血からの細胞が、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面において、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および/または血小板を含めて、リンパ球を含有し、また、いくつかの局面において、赤血球および血小板ではない細胞を含有する。
【０１１５】
いくつかの態様では、例えば血漿画分を除去したり、後続のプロセシング段階に適した緩衝液または培地に細胞を入れたりするために、対象から収集した血球を洗浄する。いくつかの態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。いくつかの態様では、洗浄溶液がカルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多くのもしくはすべての二価カチオンを欠く。いくつかの局面では、洗浄段階が半自動「フロースルー」遠心分離機（例えばCobe2991細胞処理装置、Baxter）により、製造者の指示に従って達成される。いくつかの局面では、洗浄段階がタンジェンシャルフロー濾過（TFF）により、製造者の指示に従って達成される。いくつかの態様では、洗浄後に、例えばCa＋＋/Mg＋＋非含有PBSなどのさまざまな生物適合性緩衝液に、細胞を再懸濁する。一定の態様では、血球試料の構成成分を取り出し、細胞を培養培地に直接再懸濁する。
【０１１６】
いくつかの態様では、細胞を富化および／または選択する前に、試料は、血清または血漿、例えばヒト血清または血漿と接触させられる、かつ／またはそれを含有する。いくつかの態様では、血清または血漿は、細胞が得られた対象について自己の血清または血漿である。いくつかの態様では、血清または血漿は、試料中に少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度で存在する。いくつかの態様では、細胞の選択および／または形質導入の前に、初代細胞を含有する試料は、抗凝固薬と接触される、またはそれを含有する。いくつかの態様では、抗凝固薬は、遊離クエン酸イオン、例えば抗凝固性クエン酸デキストロース溶液である溶液A（ACD-A）であるかまたはそれを含有する。
【０１１７】
いくつかの態様では、細胞を富化および／または選択する前に、試料からの細胞が無血清培地中に移されるまたはその中で懸濁される。いくつかの態様では、無血清培地は、細胞培養用の限定培地および／または詳細限定培地である。ある特定の態様では、無血清培地は、阻害剤および／または成長因子を除去するようにプロセシング（例えば濾過）された、制御された培養培地である。いくつかの態様では、無血清培地は、タンパク質を含有する。ある特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質、および／または付着因子を含有しうる。いくつかの態様では、無血清培地は、タンパク質、例えばウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、および／または組換えアルブミンなどのアルブミンを含有する。いくつかの態様では、無血清培地は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤、抗酸化剤およびエネルギー源を含有する基本培地、例えば、DMEMまたはRPMI 1640を含有する。いくつかの態様では、無血清培地に、非限定的にアルブミン、化学的に限定された脂質、成長因子、インスリン、サイトカイン、および／または抗酸化剤などが補充される。いくつかの態様では、無血清培地は、ある特定の細胞型の細胞、例えば免疫細胞、T細胞、ならびに／またはCD4+およびCD8+ T細胞の成長、増殖、健康、ホメオスタシスを支援するように製剤化される。
【０１１８】
いくつかの態様では、細胞の選択および／または富化の前に、試料または試料中の細胞をさらなるプロセシング段階の前に休止させるまたは保持することができる。いくつかの態様では、試料は、2℃〜8℃または約2℃〜8℃の温度で最大48時間、例えば最大12時間、24時間または36時間維持されるまたは保たれる。
【０１１９】
いくつかの態様では、調製方法は、単離、選択および／または富化ならびに／または形質導入および操作のためのインキュベーションの前または後のいずれかに、細胞を凍結、例えば凍結保存するための段階を含む。いくつかの態様では、凍結およびその後の解凍段階は、細胞集団中の顆粒球を除去し、かつ、ある程度は単球を除去する。いくつかの態様では、細胞は、例えば血漿および血小板を除去するための洗浄段階の後に、凍結溶液中に懸濁される。多様な公知の凍結溶液およびパラメーターのうちのいずれかが、いくつかの局面で使用される場合がある。一例は、20% DMSOおよび8% ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結媒を使用することを含む。次にこれは、DMSOおよびHSAの終濃度がそれぞれ10%および4%になるように培地と1：1希釈される。次に、細胞は、一般的に毎分1°の速度で-80℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で貯蔵される。
【０１２０】
いくつかの態様では、細胞の単離は、1つまたは複数の調製段階および／または非アフィニティーベースの細胞分離段階を含む。一部の例では、例えば望まれない成分を除去する、所望の成分を富化する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解または除去するために、細胞は、洗浄され、遠心分離され、かつ／または1種または複数種の試薬の存在下でインキュベーションされる。一部の例では、細胞は、密度、接着特性、サイズ、特性の成分に対する感受性および／または耐性などの1つまたは複数の特性に基づき分離される。
【０１２１】
いくつかの態様において、本方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば赤血球の溶解およびPercollまたはFicoll勾配での遠心分離による末梢血からの白血球の調製を含む。
【０１２２】
いくつかの態様において、単離方法は、細胞における1つまたは複数の特異的分子、例えば表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸の発現または存在に基づく、異なる細胞タイプの分離を含む。いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づいて分離するための任意の公知方法を使用しうる。いくつかの態様では、分離がアフィニティーまたはイムノアフィニティーに基づく、分離である。例えば単離は、いくつかの局面において、例えば細胞をそのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーと共にインキュベートし、続いて一般に洗浄段階を行い、抗体または結合パートナーに結合した細胞を抗体または結合パートナーに結合しなかった細胞から分離することなどによる、1つまたは複数のマーカー（典型的には細胞表面マーカー）の細胞発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離を含む。
【０１２３】
そのような分離段階は、試薬に結合した細胞をその後の使用のためにとっておく陽性選択および/または抗体もしくは結合パートナーに結合しなかった細胞をとっておく陰性選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方のフラクションをその後の使用のためにとっておく。いくつかの局面において、不均一な集団中の一細胞タイプを特異的に同定する抗体を利用できず、所望の集団以外の細胞が発現するマーカーに基づいて分離を実行することが最善である場合に、陰性選択は特に役立ちうる。
【０１２４】
分離が、特定マーカーを発現する特定の細胞集団または細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、ある特定タイプの細胞（例えばあるマーカーを発現するもの）の陽性選択または濃縮とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指し、当該マーカーを発現しない細胞が全く存在しない状態をもたらす必要はない。同様に、特定タイプの細胞（例えばあるマーカーを発現するもの）の陰性選択、除去、または枯渇とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指し、すべてのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
【０１２５】
いくつかの例では、分離段階を複数回実行し、1つの段階で陽性選択または陰性選択されたフラクションを別の分離段階（例えば後続の陽性選択または陰性選択）に供する。いくつかの例では、例えば陰性選択のための標的となるマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることなどにより、単一の分離段階で、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、さまざまな細胞タイプ上での発現物と複数の抗体または結合パートナーを共に細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時に陽性選択することもできる。
【０１２６】
例えば、いくつかの局面では、T細胞の特定亜集団、例えば1つまたは複数の表面マーカーが陽性であるか高レベルに発現する細胞、例えばCD28＋、CD62L＋、CCR7＋、CD27＋、CD127＋、CD4＋、CD8＋、CD45RA＋、および/またはCD45RO＋ T細胞が、陽性選択技法または陰性選択技法によって単離される。
【０１２７】
例えば、CD3＋かつCD28＋ T細胞を、抗CD3/抗CD28コンジュゲート化磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を使用して陽性選択することができる。
【０１２８】
いくつかの態様では、陽性選択で特定細胞集団を濃縮することによって、または陰性選択で特定細胞集団を枯渇させることによって、単離が実行される。いくつかの態様において、陽性選択または陰性選択は、それぞれ陽性選択または陰性選択される細胞上に発現しているか（マーカー＋）、比較的高レベルに発現している（マーカーhigh）、1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合作用物質と共に、細胞をインキュベートすることによって達成される。
【０１２９】
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞上に発現するマーカー（例えばCD14）の陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4＋ヘルパーT細胞とCD8+細胞傷害性T細胞とを分離するために、CD4＋またはCD8＋選択段階が使用される。そのようなCD4＋集団およびCD8＋集団はさらに、1つまたは複数のナイーブT細胞亜集団、メモリーT細胞亜集団、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現しているマーカーまたは比較的高度に発現しているマーカーに関する陽性選択または陰性選択によって亜集団に選別することができる。
【０１３０】
いくつかの態様では、CD8＋細胞を、ナイーブ細胞、中枢メモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、および/または中枢メモリー幹細胞について、例えば各亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択などによって、さらに濃縮するか、または枯渇させる。いくつかの態様では、効力を増加させるために、例えば投与後の長期生存、増殖および/または定着を改良するために、中枢メモリーT（TCM）細胞の濃縮が実行される（いくつかの局面において、前記の性質はそのような亜集団では特にロバストである）。Terakuraら（2012）Blood.1:72-82; Wang et al.（2012）J Immunother. 35（9）:689-701参照。いくつかの態様では、TCM濃縮CD8＋ T細胞およびCD4＋ T細胞を組み合わせることによって、効力がさらに強化される。
【０１３１】
諸態様において、メモリーT細胞は、CD8＋末梢血リンパ球のCD62L＋サブセットとCD62L-サブセットの両方に存在する。抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用するなどして、PBMCを、CD62L-CD8＋フラクションおよび/またはCD62L＋CD8＋フラクションについて、濃縮し、または枯渇させることができる。
【０１３２】
中枢メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、いくつかの態様では、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性発現または高い表面発現に基づき、いくつかの局面では、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現または高度に発現する細胞の陰性選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞が濃縮されたCD8＋集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって実行される。一局面において、中枢メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択される細胞の陰性フラクションから出発して実行され、それが、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択およびCD62Lに基づく陽性選択に付される。そのような選択は、いくつかの局面では同時に実行され、別の局面では逐次的に、いずれかの順序で実行される。いくつかの局面では、CD8+細胞集団または亜集団の調製に使用したものと同じCD4発現に基づく選択段階を、CD4＋細胞集団または亜集団を作製するためにも使用することで、CD4に基づく分離からの陽性フラクションおよび陰性フラクションの両方をとっておき、任意で1つまたは複数のさらなる陽性選択段階または陰性選択段階後に、本方法の後続の段階において使用する。
【０１３３】
特定の一例では、PBMCの試料または他の白血球試料をCD4＋細胞の選択に付し、陰性フラクションと陽性フラクションの両方をとっておく。次に、陰性フラクションを、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく陰性選択およびCD62LまたはCCR7などの中枢メモリーT細胞に特有のマーカーに基づく陽性選択に供する。この場合、前記陽性選択と陰性選択はいずれかの順序で行われる。
【０１３４】
細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、CD4＋ Tヘルパー細胞を、ナイーブ細胞、中枢メモリー細胞、およびエフェクター細胞に選別する。CD4＋リンパ球は標準的方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4＋ Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA＋、CD62L＋、CD4＋ T細胞である。いくつかの態様において、中枢メモリーCD4＋細胞はCD62L＋かつCD45RO＋である。いくつかの態様において、エフェクターCD4＋細胞はCD62L-かつCD45RO-である。
【０１３５】
一例では、CD4＋細胞を陰性選択によって濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルが、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様では、陽性選択および/または陰性選択のための細胞の分離に備えて、抗体または結合パートナーを磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固形支持体またはマトリックスに結合させる。例えば、いくつかの態様では、免疫磁気（またはアフィニティー磁気）分離技法を使って、細胞および細胞集団が分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S.A. Brooks and U. Schumacher（c）Humana Press Inc., Totowa, NJに概説されている）。
【０１３６】
いくつかの局面では、分離しようとする細胞の試料または組成物を、小さな磁化可能材料または磁気応答材料、常磁性ビーズなどの磁気応答粒子または微粒子（例えばDynalビーズまたはMACSビーズなど）と共にインキュベートする。磁気応答材料、例えば粒子は、一般に、分離することが望まれる（例えば陰性選択または陽性選択することが望まれる）1つまたは複数の細胞または細胞の集団上に存在する分子（例えば表面マーカー）に特異的に結合する結合パートナー（例えば抗体）に、直接的または間接的に取り付けられる。
【０１３７】
いくつかの態様において、磁気粒子または磁気ビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合構成要素に結合した磁気応答材料を含む。磁気分離法において使用される周知の磁気応答材料は数多くある。適切な磁気粒子には、Moldayの米国特許第4,452,773号および欧州特許明細書EP452342Bに記載されているものがあり、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。他の例には、コロイドサイズの粒子、例えばOwenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものがある。
【０１３８】
インキュベーションは一般に、抗体もしくは結合パートナー、またはそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば二次抗体または他の試薬であって、磁気粒子または磁気ビーズに取り付けられているものが、細胞表面分子に（それがもし試料内の細胞上に存在するのであれば）特異的に結合するような条件下で実行される。
【０１３９】
いくつかの局面において、試料を磁場に入れると、磁気応答粒子または磁化可能粒子が取り付けられている細胞は磁石に引きつけられ、非標識細胞から分離されるであろう。陽性選択の場合は、磁石に引きつけられた細胞をとっておき、陰性選択の場合は、磁石に引きつけられなかった細胞（非標識細胞）をとっておく。いくつかの局面では、同じ選択段階中に陽性選択と陰性選択との組み合わせを実施して、陽性フラクションと陰性フラクションとをとっておいて、さらに処理するか、さらなる分離段階に供する。
【０１４０】
一定の態様において、磁気応答粒子は、一次抗体もしくは他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンで被覆される。一定の態様において、磁気粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に取り付けられる。一定の態様では、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーで標識してから、細胞タイプ特異的二次抗体被覆磁気ビーズまたは他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）被覆磁気ビーズを加える。一定の態様では、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズをビオチン化一次または二次抗体と共に使用する。
【０１４１】
いくつかの態様では、磁気応答粒子を細胞に取り付けたままにしておき、その細胞を引き続いてインキュベートする、培養する、かつ/または工学的に改変する。また、いくつかの局面では、患者に投与するために粒子を細胞に取り付けたままにしておく。いくつかの態様では、磁化可能粒子または磁気応答粒子を細胞から取り除く。磁化可能粒子を細胞から取り除くための方法は公知であり、例えば競合非標識抗体の使用、切断可能なリンカーにコンジュゲートされた磁化可能粒子または抗体などがある。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。
【０１４２】
いくつかの態様において、アフィニティーに基づく選択は、磁気活性化細胞選別法（magnetic-activated cell sorting: MACS）（Miltenyi Biotech、カリフォルニア州オーバン）による。磁気活性化細胞選別（MACS）システムでは、磁気粒子が取り付けられている細胞の高純度選択が可能である。一定の態様において、MACSは、外部磁場の適用後に非ターゲット種とターゲット種とが逐次的に溶出するモードで作動する。すなわち、磁化粒子に取り付けられた細胞はその場に保持され、一方、取り付けられていない種は溶出する。次に、この第1溶出段階が完了した後に、磁場に捕らわれて溶出が妨げられていた種が、溶出して回収されうるような何らかの方法で解放される。一定の態様では、非ターゲット細胞を標識して、不均一な細胞集団から枯渇させる。
【０１４３】
一定の態様では、単離または分離が、本方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、および/または製剤段階のうちの1つまたは複数を実行するシステム、デバイス、または装置を使って実行される。いくつかの局面では、例えばエラー、ユーザー操作および/または汚染を最小限に抑えるために、システムを使って、閉鎖環境または無菌環境においてこれらの段階のそれぞれを実行する。一例において、システムは、国際特許出願公開番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載のシステムである。一例では、システムは、国際公開番号WO 2016/073602に記載のシステムである。
【０１４４】
いくつかの態様では、該方法は、選択のすべてまたは一部が遠心チャンバーの内部キャビティー中で、例えば遠心回転下で実施される細胞選択を含む。いくつかの態様では、イムノアフィニティーベースの選択試薬などの選択試薬と一緒の細胞のインキュベーションは、遠心チャンバー中で行われる。
【０１４５】
例えば、イムノアフィニティーベースの選択は、選択される細胞と、細胞上のマーカーと特異的に結合する分子、例えば固体表面、例えば粒子上の抗体または他の結合パートナーとの間の好都合なエネルギー相互作用に依存することができる。ビーズなどの粒子を使用するアフィニティーベースの分離のためのある特定の利用可能な方法において、粒子および細胞は、エネルギー的に好都合な相互作用を促進することを助けるために、チューブまたはバッグなどの容器の中で一定の細胞密度対粒子（例えばビーズ）比で振盪または混合しながらインキュベーションされる。このようなアプローチは、例えば、それらが所望の数の細胞を維持しながら最適または所望の細胞対粒子比を維持するために、大きな体積の使用を必要としうる点で、大規模生産での使用に理想的でない場合がある。したがって、このようなアプローチは、バッチ様式または形式でのプロセシングを必要とする可能性があり、そのことが、増加した時間、段階数および取扱いを必要とする可能性があり、コストおよびユーザーエラーのリスクを増加させる。
【０１４６】
いくつかの態様では、遠心チャンバーのキャビティー中でこのような選択段階またはその一部分（例えば、抗体コーティング粒子、例えば磁気ビーズと一緒のインキュベーション）を行うことにより、ユーザーは、多様な溶液の体積、プロセシングの間の溶液の添加およびそのタイミングなどのある特定のパラメーターを制御することができ、これは、他の利用可能な方法と比較して利点を提供することができる。例えば、インキュベーションの間にキャビティー中の液体体積を減らせることで、選択に使用される粒子（例えばビーズ試薬）の濃度を増加させることができ、したがって、キャビティー中の合計細胞数に影響せずに溶液の化学ポテンシャルを増加させることができる。これにより、今度は、プロセシング途中の細胞と、選択のために使用される粒子との間の2つ一組の相互作用を強化することができる。いくつかの態様では、チャンバー中でインキュベーション段階を実施することは、例えば、本明細書記載のシステム、回路、および制御に関連するとき、インキュベーションの間にユーザーが所望の時間に溶液の撹拌を引き起こせるようにし、そのことで相互作用も改善することができる。
【０１４７】
いくつかの態様では、選択試薬と一緒の細胞のインキュベーションを含む選択段階の少なくとも一部は、遠心チャンバー中で行われる。このようなプロセスのいくつかの局面では、ある体積の細胞がある量の所望のアフィニティーベースの選択試薬と混合されるが、その量は、同じ数の細胞および／または体積の細胞を製造業者の説明書により選択するためにチューブまたは容器を用いて類似の選択を行うときに通常採用される量よりもずっと少ない。いくつかの態様では、同じ数の細胞および／または同じ体積の細胞について製造業者の説明書によりチューブまたは容器ベースのインキュベーションで細胞を選択するために採用される1種または複数種の選択試薬の量の5%以下、10%以下、15%以下、20%以下、25%以下、50%以下、60%以下、70%以下または80%以下である同じ選択試薬が採用される。
【０１４８】
例えばチャンバーのキャビティー中で行われうる選択方法の一部としての1種または複数種の選択試薬と一緒のインキュベーションは、表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの1種または複数種の特定の分子の細胞中または細胞上における発現または存在に基づき1つまたは複数の異なる細胞型を選択するために、1種または複数種の選択試薬を使用することを含む。いくつかの態様では、このようなマーカーに基づく分離のために1種または複数種の選択試薬を使用する任意の公知の方法が使用されうる。いくつかの態様では、1種または複数種の選択試薬は、アフィニティーまたはイムノアフィニティーベースの分離である分離を結果として招く。例えば選択は、いくつかの局面では、1種または複数種のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞発現または発現レベルに基づき細胞および細胞集団を分離するために、1種または複数種の試薬と一緒にインキュベーションすることを含み、例えば選択は、このようなマーカーと特異的に結合する抗体または結合パートナーと一緒にインキュベーションすること、および一般的にはそれに続いて、洗浄する段階、および抗体または結合パートナーと結合した細胞を抗体または結合パートナーと結合しなかった細胞から分離することによる。
【０１４９】
いくつかの態様では、選択、例えば細胞のイムノアフィニティーベースの選択のために、細胞は、チャンバーのキャビティー中で、選択試薬と一緒に選択緩衝液も含有する組成物としてインキュベーションされ、選択試薬は、例えば、組成物中の他の細胞上ではなく、富化および／または枯渇させることが望ましい細胞上の表面マーカーと特異的に結合する抗体などであり、任意でポリマーまたは表面、例えば、ビーズ、例えば、CD4およびCD8に特異的なモノクローナル抗体と結合した磁気ビーズなどの磁気ビーズなどの足場と結合している。いくつかの態様では、所望により、選択試薬は、選択がチューブ中で振盪または回転させながら行われるときと同じ数の細胞または同じ体積の細胞の選択とほぼ同じまたは類似の効率を達成するために典型的に使用されるまたは必要である選択試薬の量と比較して、実質的に少ない量で（例えば5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%または80%以下の量で）チャンバーのキャビティー中の細胞に添加される。いくつかの態様では、インキュベーションは、選択試薬のインキュベーションに関して例えば10mL〜200mL、例えば、少なくとも10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mL、または少なくとも約10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mL、または約10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mL、または10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mLの標的体積を達成するために、細胞および選択試薬に選択緩衝液を添加して行われる。いくつかの態様では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞の添加前に予備混合される。いくつかの態様では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に別々に添加される。いくつかの態様では、選択インキュベーションは、周期的な穏やかな混合条件で実施され、このことは、エネルギー的に好都合な相互作用を促進することを助けることができ、それにより、高い選択効率を達成しながらも、全てではない選択試薬の使用を可能にすることができる。
【０１５０】
いくつかの態様では、選択試薬と一緒のインキュベーションの合計持続時間は、5分〜6時間、または約5分〜6時間、例えば30分〜3時間、例えば少なくとも30分、60分、120分、もしくは180分、または少なくとも約30分、60分、120分、もしくは180分である。
【０１５１】
いくつかの態様では、インキュベーションは、一般的に回転の存在下などの混合条件下で、一般的に比較的小さい力または低い速度、例えば細胞をペレットにするために使用される速度よりも低い速度、例えば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜1700rpmで（例えば600rpm、1000rpm、1500rpm、もしくは1700rpmで、または約600rpm、1000rpm、1500rpm、もしくは1700rpmで、または少なくとも600rpm、1000rpm、1500rpm、もしくは1700rpmで）、例えば試料またはチャンバーもしくは他の容器の壁でRCFが80g〜100gまたは約80g〜100gで（例えば80g、85g、90g、95g、もしくは100gで、または約80g、85g、90g、95g、もしくは100gで、または少なくとも80g、85g、90g、95g、もしくは100gで）実施される。いくつかの態様では、回転は、このような低速の繰り返し間隔の回転に続く休止期間、例えば回転および／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10秒の休止、例えば約1または2秒の回転に続く約5、6、7、または8秒の休止を使用して実施される。
【０１５２】
いくつかの態様では、このようなプロセスは、チャンバーが一体である完全閉鎖システム内で実施される。いくつかの態様では、このプロセスは（およびいくつかの局面では、アフェレーシス試料などの細胞含有試料を洗浄する事前の洗浄段階などの1つまたは複数の追加的な段階もまた）、自動プログラムを使用して単一の閉鎖システム中で洗浄および結合段階を完了するように自動的に実施され、それにより、細胞、試薬、および他の構成要素が適切な時間にチャンバー内に取り入れられ、チャンバーから押し出され、遠心分離が行われる。
【０１５３】
いくつかの態様では、細胞ならびに／または1種および／もしくは複数種の選択試薬をインキュベーションならびに／または混合した後、インキュベーションされた細胞が分離に供されて、1種または複数種の特定の試薬の存在または不在に基づき細胞が選択される。いくつかの態様では、遠心チャンバー外でさらなる選択が行われる。いくつかの態様では、遠心チャンバーが存在する同じ閉鎖システム中で分離が行われ、遠心チャンバー中で選択試薬と一緒に細胞のインキュベーションが行われる。いくつかの態様では、選択試薬と一緒のインキュベーションの後、選択試薬が結合した細胞を含めたインキュベーションされた細胞が、細胞のイムノアフィニティーベースの分離のために遠心チャンバーから圧出され、例えば遠心チャンバーから移出され、システム内に入る。いくつかの態様では、イムノアフィニティーベースの分離のためのシステムは、磁気分離カラムである、またはそれを含有する。いくつかの態様では、分離の前に、1つまたは複数の他のプロセシング段階、例えば洗浄をチャンバー中で行うことができる。
【０１５４】
いくつかの局面において、分離段階および/または他の段階は、例えば閉鎖された無菌系における臨床スケールレベルでの細胞の自動分離のために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotic）を使って実行される。構成部品には、組み込みマイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、およびさまざまなピンチ弁が含まれうる。組み込みコンピュータは、いくつかの局面において、計器のすべての構成部品を制御し、標準化されたシーケンスで反復手順を行うようにシステムに指示する。磁気分離ユニットは、いくつかの局面において、可動永久磁石および選択カラム用の保持具を含む。蠕動ポンプは管系セット全体の流速を制御し、ピンチ弁と共に、システムを通る緩衝液の制御された流れと細胞の絶え間ない懸濁とを保証する。
【０１５５】
CliniMACSシステムは、いくつかの局面において、無菌非発熱性溶液に入れて供給される抗体カップリング磁化可能粒子を使用する。いくつかの態様では、磁気粒子による細胞の標識化後に、細胞を洗浄して過剰の粒子を除去する。次に、細胞調製バッグを管系セットに接続し、そしてその管系セットを緩衝液を含有するバッグおよび細胞収集バッグに接続する。管系セットは組み立て済みの無菌管系（プレカラムおよび分離カラムを含む）からなり、1回限りの使い捨て用である。分離プログラムの開始後に、システムは自動で細胞試料を分離カラムに適用する。標識細胞はカラム内に保持され、一方、非標識細胞は一連の洗浄段階によって除去される。いくつかの態様では、本明細書に記載する方法で使用するための細胞集団が標識されておらず、カラム中に保持されない。いくつかの態様では、本明細書に記載する方法で使用するための細胞集団が標識されており、カラム中に保持される。いくつかの態様では、磁場の除去後に、本明細書に記載する方法で使用するための細胞集団をカラムから溶出させて、細胞収集バッグ内に収集する。
【０１５６】
一定の態様では、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を使って、分離および/または他の段階が実行される。CliniMACS Prodigyシステムは、いくつかの局面において、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニット（cell processing unity）を装備している。CliniMACS Prodigyシステムは、ソース細胞産物（source cell product）の肉眼的層を識別することによって最適な細胞分画終点を決定する内蔵カメラおよび画像認識ソフトウェアも含むことができる。例えば末梢血は、赤血球、白血球および血漿層へと自動的に分離される。CliniMACS Prodigyシステムは、例えば細胞の分化および増殖、抗原負荷、および長期細胞培養などの細胞培養プロトコールを遂行する組み込み細胞培養チャンバーも含むことができる。投入口は、培地の無菌的取り出しおよび補充を可能にすることができ、組み込み顕微鏡を使って細胞を監視することができる。例えばKlebanoff et al.（2012）J Immunother. 35（9）:651-660、Terakura et al.（2012）Blood.1:72-82、およびWang et al.（2012）J Immunother. 35（9）:689-701を参照されたい。
【０１５７】
いくつかの態様では、複数種の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流にのせて運ばれるフローサイトメトリーによって本明細書に記載する細胞集団が収集され、濃縮（または枯渇）される。いくつかの態様では、調製用（FACS）選別法によって、本明細書に記載する細胞集団が収集され、濃縮（または枯渇）される。一定の態様では、微小電気機械システム（MEMS）チップをFACSベースの検出システムと併用することによって、本明細書に記載する細胞集団が収集され、濃縮（または枯渇）される（例えばWO 2010/033140、Cho et al.（2010）Lab Chip 10, 1567-1573、およびGodin et al.（2008）J Biophoton. 1（5）:355-376を参照されたい）。どちらの場合も、細胞を複数種のマーカーで標識して、高純度の明確なT細胞サブセットの単離を可能にすることができる。
【０１５８】
いくつかの態様では、陽性選択および/または陰性選択のための分離が容易になるように、抗体または結合パートナーが、1つまたは複数の検出可能マーカーで標識される。例えば分離は蛍光標識抗体への結合に基づきうる。いくつかの例では、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離が、流体流中で、例えば蛍光活性化細胞選別法（FACS）（例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせされた分取用（FACS）および/または微小電気機械システム（MEMS）チップを含む）によって行われる。そのような方法により、複数種のマーカーに基づく陽性選択および陰性選択が同時に可能になる。
【０１５９】
いくつかの態様では、提供されるレトロウイルスベクター粒子による形質導入のための細胞には、例えば、単球、単球由来マクロファージ、単球由来樹状細胞または休止T細胞が含まれる。特定の態様では、提供されるレトロウイルス粒子を休止T細胞に形質導入することができる。いくつかの態様では、インプット組成物は、細胞周期非進行および／もしくは静止および／もしくは休止である免疫細胞、例えばT細胞などの複数の細胞、ならびに／または大部分の細胞、例えばそのように形質導入された集団中の50%、60%、70%、80%、もしくは80%以上よりも多い細胞が、細胞周期非進行および／もしくは静止および／もしくは休止である複数の細胞を含む。いくつかの態様では、インプット組成物は、集団中のT細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれよりも多くが、T細胞活性化マーカー、例えば表面マーカーもしくは細胞内サイトカインもしくは他のマーカーを欠如するT細胞などの休止T細胞であるT細胞集団、ならびに／または細胞周期のG0もしくはG0G1a期にあるT細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、非リン酸化SAMHD1などの活性SAMHD1を含有する。いくつかの態様では、細胞は、細胞周期のG0、G0/G1aまたはG1期にある。
【０１６０】
いくつかの態様では、該方法は、T細胞の5％、10％、20％、30％、または40％以下がT細胞活性化マーカーを発現する、T細胞の形質導入を含む。いくつかの態様では、T細胞の5％、10％、20％、30％、または40％以下が、1つまたは複数のT細胞活性化マーカーHLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L（CD154）および／または4-1BB（CD137）について表面陽性である。いくつかの態様では、T細胞の5％、10％、20％、30％、または40％以下は、IL-2、IFN-ガンマおよび／またはTNF-アルファであるサイトカインの細胞内発現を有する。
【０１６１】
B.  ウイルスベクター粒子
いくつかの態様では、ウイルスベクター粒子は、組換えおよび／または異種分子、例えば、組換えまたは異種タンパク質、例えば組換えおよび／または異種受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）または他の抗原受容体をコードする核酸をウイルスベクターのゲノム中に含有する、レンチウイルス粒子などのレトロウイルスベクター粒子である。ウイルスベクター粒子のゲノムは、典型的には、組換え分子をコードする核酸以外に配列を含む。このような配列は、ゲノムをウイルス粒子中にパッケージングできるようにする配列および／またはCARなどの組換え受容体をコードする核酸の発現を促進する配列を含む場合がある。
【０１６２】
1.  ウイルスベクター
いくつかの態様では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムベースのベクターに由来する、例えばレンチウイルスゲノムベースのベクターに由来する、ゲノムを含有する。提供されるウイルスベクターのいくつかの局面では、CARなどの抗原受容体などの組換え受容体をコードする異種核酸は、ベクターゲノムの5'LTR配列と3'LTR配列との間に含有されるおよび／または位置する。
【０１６３】
いくつかの態様では、ウイルスベクターゲノムは、HIV-1ゲノムまたはSIVゲノムなどのレンチウイルスゲノムである。例えば、レンチウイルスベクターは、病原性遺伝子を多重弱毒化することにより生成されており、例えば、遺伝子env、vif、vpuおよびnefを欠失させて、ベクターを治療目的のためにより安全にすることができる。レンチウイルスベクターは、公知である。Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998、米国特許第6,013,516号；および同第5,994,136号）を参照されたい。いくつかの態様では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を組み込むため、選択のため、および宿主細胞に核酸を移入するために不可欠な配列を担持するように構成されている。公知のレンチウイルスは、American Type Culture Collection（「ATCC」; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209）のような寄託機関もしくは保存機関から容易に得る、または通常利用可能な技法を使用して公知の供給源から単離することができる。
【０１６４】
レンチウイルスベクターの非限定的な例には、ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）、HIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトTリンパ球向性ウイルス1（HTLV-1）、HTLV-2またはウマ伝染性貧血ウイルス（E1AV）などのレンチウイルス由来のベクターが含まれる。例えば、レンチウイルスベクターは、HIV病原性遺伝子を多重弱毒化することにより生成されており、例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpuおよびnefを欠失させて、ベクターを治療目的のためにより安全にしている。レンチウイルスベクターは、当技術分野において公知であり、Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998、米国特許第6,013,516号；および同第5,994,136号）を参照されたい。いくつかの態様では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を組み込むため、選択のため、および宿主細胞に核酸を移入するために不可欠な配列を担持するように構成されている。公知のレンチウイルスは、American Type Culture Collection（「ATCC」; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209）のような寄託機関もしくは保存機関から容易に得る、または通常利用可能な技法を使用して公知の供給源から単離することができる。
【０１６５】
いくつかの態様では、ウイルスゲノムベクターは、レンチウイルスなどのレトロウイルスの5'および3'LTRの配列を含有することができる。いくつかの局面では、ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの5'および3'LTRからの配列を含有する場合があり、特に、レンチウイルスの5'LTRからのRおよびU5配列ならびにレンチウイルスからの不活性化されたまたは自己不活性化3'LTRを含有することができる。LTR配列は、任意の種からの任意のレンチウイルスからのLTR配列であることができる。例えば、それらは、HIV、SIV、FIVまたはBIVからのLTR配列でありうる。典型的には、LTR配列は、HIVのLTR配列である。
【０１６６】
いくつかの態様では、HIVウイルスベクターなどのウイルスベクターの核酸は、追加的な転写ユニットを欠如する。ベクターゲノムは、不活性化されたまたは自己不活性化3'LTRを含有することができる（Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998）。例えば、ウイルスベクターRNAを産生するために使用される核酸の3'LTRのU3領域における欠失を使用して、自己不活性化（SIN）ベクターを生成させることができる。次に、逆転写の間にこの欠失をプロウイルスDNAの5'LTRに移行させることができる。自己不活性化ベクターは、一般的に、3'末端反復配列（LTR）からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、ベクターの組込みの間にこの欠失が5'LTR中にコピーされる。いくつかの態様では、TATAボックスの除去を含めて十分な配列を排除して、LTRの転写活性を消失させることができる。これにより、形質導入細胞における完全長ベクターRNAの産生を阻止することができる。いくつかの局面では、3'LTRのU3エレメントは、そのエンハンサー配列、TATAボックス、Sp1およびNF-カッパB部位の欠失を含有する。自己不活性化3'LTRの結果として、侵入および逆転写に続いて生成するプロウイルスは、不活性化された5'LTRを含有する。これで、ベクターゲノムの可動化のリスクおよび近傍の細胞プロモーターに及ぼすLTRの影響を減少させることにより安全性を向上することができる。自己不活性化3'LTRは、当技術分野において公知の任意の方法により構築することができる。いくつかの態様では、これは、ベクターの力価またはベクターのインビトロもしくはインビボ特性に影響しない。
【０１６７】
任意で、レンチウイルス5'LTRからのU3配列をウイルス構築物中のプロモーター配列、例えば異種プロモーター配列と置き換えることができる。これは、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価を増加させることができる。エンハンサー配列も含むことができる。パッケージング細胞株におけるウイルスRNAゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー／プロモーターの組合せが使用される場合がある。一例では、CMVエンハンサー／プロモーター配列が、使用される（米国特許第5,385,839号および同第5,168,062号）。
【０１６８】
ある特定の態様では、挿入変異誘発のリスクは、レンチウイルスベクターゲノムなどのレトロウイルスベクターゲノムを組込み欠損であるように構築することにより最小限にすることができる。多様なアプローチを追求して、非組込みベクターゲノムを産生することができる。いくつかの態様では、pol遺伝子不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、pol遺伝子のインテグラーゼ酵素成分に変異を操作することができる。いくつかの態様では、ベクターゲノム自体は、例えば結合部位の一方もしくは両方を変異もしくは欠失させること、または3'LTR近位のポリプリントラクト（PPT）を欠失もしくは修飾により非機能性にすることによって、組込みを阻止するように修飾することができる。いくつかの態様では、非遺伝的アプローチが利用可能であり；これらには、インテグラーゼの1つまたは複数の機能を阻害する薬理作用物質が含まれる。アプローチは、相互排他的でなく；すなわち、それらのうちの1つよりも多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび結合部位の両方が非機能性であることができる、またはインテグラーゼおよびPPT部位が非機能性であることができる、または結合部位およびPPT部位が非機能性であることができる、またはこれらのすべてが非機能性であることができる。このような方法およびウイルスベクターゲノムは、公知および入手可能である（Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999)；国際公開公報第2009/076524号；McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996を参照されたい）。
【０１６９】
いくつかの態様では、ベクターは、原核宿主細胞などの宿主細胞における増加のための配列を含有する。いくつかの態様では、ウイルスベクターの核酸は、細菌細胞などの原核細胞における増加用に1つまたは複数の複製起点を含有する。いくつかの態様では、原核複製起点を含むベクターは、その発現が薬物耐性などの検出可能マーカーまたは選択マーカーを付与する遺伝子も含有しうる。
【０１７０】
2.  SAMHD1阻害アクセサリータンパク質
ビリオン中に封入されたSAMHD1阻害アクセサリータンパク質を含有するレトロウイルスベクター粒子が、提供される態様の中に含まれる。いくつかの局面では、これらの粒子は、細胞周期非進行免疫細胞、例えば休止T細胞などの細胞周期非進行細胞の効率的な形質導入を可能にする。いくつかの局面では、このような粒子は、単球、単球由来マクロファージまたは単球由来樹状細胞の効率的な形質導入を可能にする。いくつかの局面では、提供されるレトロウイルスベクター粒子は、細胞の活性化および／または刺激のための操作などの、形質導入のための細胞のエクスビボ操作の必要性を最小限にするおよび／または減少させる。
【０１７１】
SAMHD1は、dGTP依存性デオキシヌクレオチドトリホスホヒドロラーゼ活性を有し、細胞性デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）を脱リン酸化することができる、いくつかの細胞周期非進行および／または静止免疫細胞に存在するタンパク質である。非リン酸化SAMHD1などの抗ウイルス活性を有する活性SAMHD1が細胞中に存在することで、ヌクレオチドプールを減少させることができる。このような減少は、それにより、ウイルスRNA、例えばウイルスゲノムの十分な逆転写を促進するのに十分な数のヌクレオチドとウイルスベクターが遭遇するのを阻止することにより、レトロウイルスの形質導入を制限することができる。場合によっては、活性化されたT細胞または増殖中のT細胞などの細胞周期進行細胞は、SAMHD1を発現することができるのに対し、SAMHD1の抗ウイルス活性は、いくつかの局面では、SAMHD1の細胞周期依存性リン酸化により調節される（Cribier et al. (2013) Cell Reports, 3:1036-1043）。例えば、細胞周期進行細胞において、SAMHD1は、一般的に細胞周期関連タンパク質と相互作用し、いくつかの局面では、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）によりリン酸化される。ヒトSAMHD1の例示的な配列は、SEQ ID NO:19に示される（例えば、UniProt No. Q9Y3Z3を参照されたい）。例えば、いくつかの態様では、SAMHD1は、SEQ ID NO:19に示されるSAMHD1の例示的な配列の位置T592に対応する位置でリン酸化されることができる。リン酸化SAMHD1は、減少したおよび／または最小限の活性を有するが、それにより、細胞周期進行T細胞においてウイルス形質導入の制限が欠如していることが説明される。
【０１７２】
提供されるベクター粒子および方法のいくつかの態様では、ビリオン中にSAMHD1阻害アクセサリータンパク質を組み込むことにより、SAMHD1は、提供されるレトロウイルスベクター粒子が導入された細胞において阻害され、例えば分解される。これにより、ヌクレオチドプールが増加し、それにより、SAMHD1を発現する静止および／または細胞周期非進行細胞に形質導入を起こせるようになる。いくつかの態様では、提供されるレトロウイルス粒子は、SAMHD1阻害タンパク質を含有し、非リン酸化SAMHD1タンパク質などの活性SAMHD1を含有する細胞に形質導入することができる。いくつかの態様では、提供されるレトロウイルスベクター粒子による形質導入は、SEQ ID NO:19に示されるSAMHD1の例示的な配列中の位置T592に対応する位置でSAMHD1がリン酸化されていない細胞において起こる。SAMHD1の発現および／またはリン酸化を判断する方法は、公知の技法を使用して、例えば、SAMHD1特異的抗体を使用して、以下のSDS-PAGEおよび／もしくはPhos-tagアクリルアミド技法を使用するホスフェートアフィニティーSDS-PAGEのウエスタンブロットまたは他の類似の方法（例えばCribier et al.を参照されたい）により、判断することができる。
【０１７３】
特定の態様では、ビリオン中にSAMHD1阻害アクセサリータンパク質を含有するように修飾された、提供されるレトロウイルスベクター粒子は、形質導入用の宿主ヌクレオチドに依存する任意のウイルスベクターである。このようなウイルスベクター粒子は、細胞dNTPを利用してウイルス逆転写酵素によりウイルスRNAからウイルスcDNAを合成するレトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子を含むことができる。
【０１７４】
いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、SAMHD1阻害活性を示すウイルス宿主細胞タンパク質である。いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、SAMHD1阻害活性を示すレンチウイルスタンパク質、例えばレンチウイルスVpxもしくはVprタンパク質、またはその変種もしくは部分である。異なるレンチウイルスで発現するVpxおよびVprは、配列および構造相同性を共有し、それが集合する際にビリオン中にパッケージングされるビリオン関連タンパク質である。細胞に導入すると、Vpxおよびいくつかの局面ではVprは、CUL4A-DDB1-DCAF1宿主細胞タンパク質から形成される、細胞中のユビキチンリガーゼ複合体によるSAMHD1のユビキチン化を妨害することができ、それにより、プロテオソーム分解のためにSAMHD1を標的指向する（Schwefel et al. (2014) Nature 505:234-238）。いくつかの態様では、VprまたはVpxタンパク質によるSAMHD1の分解などの阻害は、SAMHD1ならびに／またはユビキチンリガーゼ複合体中のDDB1もしくはDCAF1のうちの1つもしくは複数に対するVpxまたはVprレンチウイルスタンパク質の結合により媒介される。
【０１７５】
いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、SAMHD1と特異的に結合し、かつ／またはそれを阻害する抗体またはそのフラグメントである。
【０１７６】
いくつかの態様では、提供されるレトロウイルスベクター粒子は、ウイルスベクター粒子が導入された休止T細胞などの宿主細胞におけるSAMHD1を分解する活性を示す。いくつかの局面では、SAMHD1は、レトロウイルスベクター粒子を導入されていない同じ細胞におけるSAMHD1の発現またはレベルと比較して、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍またはそれよりも大きく分解されることができる。いくつかのこのような態様では、SAMHD1の分解は、休止T細胞などの細胞周期非進行宿主細胞に、SAMHD1阻害タンパク質を含有する、提供されるレトロウイルスベクター粒子の形質導入または他の形態の移入を行った後にモニタリングまたは観察することができる。分解は、レトロウイルスベクター粒子を導入されなかった同じ細胞におけるSAMHD1の発現と比較したSAMHD1の相対発現度を決定することにより測定することができる。タンパク質の発現レベルを判断するためにいくつかの周知の方法が使用されうる。いくつかの態様では、SAMHD1は、SAMHD1特異抗体を利用するイムノブロットにより、例えば溶解細胞からの試料中から検出することができる。発現の程度またはレベルは、また、標準的な手順、例えばデンシトメトリーにより定量および／または定量化することができる。いくつかの態様では、SAMHD1のレベルおよび／または発現は、経時的にモニタリングすることができ、かつ／またはウイルスの投入量を変動させることによりモニタリングすることができる。
【０１７７】
いくつかの局面では、VpxまたはVprタンパク質などのSAMHD1阻害タンパク質を含有する、提供されるレトロウイルスベクター粒子は、遺伝子操作受容体、例えばCARなどの組換え抗原受容体および／または他の組換え受容体、例えば細胞外リガンド結合もしくは認識ドメインならびにITAM含有および／もしくはT細胞共刺激ドメインなどの、T細胞への刺激シグナルを強化することが可能な1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する受容体をコードするベクターなどの、このようなベクターによりコードされる遺伝子操作分子の形質導入および導入に対して、細胞周期非進行および／または静止もしくは休止免疫細胞をより感受性にする。いくつかの態様では、Vpxタンパク質またはVprタンパク質などのSAMHD1阻害タンパク質を含有する、提供されるレトロウイルスベクター粒子を使用して、CARおよび／または他の組換え受容体などの組換え抗原受容体などの遺伝子操作受容体を単球由来マクロファージ、単球由来樹状細胞または休止T細胞に形質導入および／または導入する方法が提供される。
【０１７８】
いくつかの態様では、SAMHD1阻害剤は、Vpxタンパク質、Vprタンパク質、またはVpxもしくはVprタンパク質のSAMHD1阻害活性を示す機能性変種もしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxは、霊長類レンチウイルスに見られるアミノ酸（aa）112個の18kDaタンパク質である。SIVおよびHIV-2からのVpxは、アミノ酸レベルで83%同一であり（Goujon et al., J Virol, 82:12335-12345 (2008)、SAMHD1と結合し、それを分解する活性を示す（Laguette et al., Nature, 474: 654-657 (2011)。Vpxは、いくつかのレンチウイルスにだけ存在し；HIV-1中に見られない。Vpxと高度の構造および配列相同性を共有する近縁遺伝子Vprは、すべての霊長類レンチウイルスによりコードされ、場合によっては、SAMHD1活性も示すように進化している。VpxおよびVprの両方は、それとp55gag前駆体のp6領域との相互作用によりビリオン中にパッケージングされる。
【０１７９】
提供される粒子、組成物および方法では、SAMHD1阻害活性を示す任意の適切なVpxおよび／またはVprタンパク質を使用することができる。細胞中のSAMHD1を阻害、例えば分解できるならば、タンパク質は、SAMHD1阻害活性を示す。場合によっては、阻害は、このようなタンパク質を含有するウイルスベクター粒子の導入後に、当技術分野において公知の方法または記載された方法などを使用して、このようなタンパク質を含有しないウイルスベクターと比較して、休止T細胞などの細胞周期非進行細胞においてSAMHD1の分解を判断することにより、モニタリングすることができる。いくつかの態様では、Vpx、Vprおよびその変種は、多様な公知の方法のうちの1つまたは複数により、SAMHDlの活性を阻害する能力について試験される。Lim et al., Cell Host & Microbe, 11, 194-204 (2012)およびLahouassa et al., Nature Immunol, 13:3, 223-229 (2012)を参照されたい。場合によっては、当技術分野において公知または記載された方法などを使用して、このようなタンパク質を含有するウイルスベクター粒子の導入後の、休止T細胞などの細胞周期非進行細胞における形質導入効率を、匹敵するまたは同じであるがVpxまたはVprタンパク質を含有しないウイルスベクターと比較して判断することにより、阻害をモニタリングすることができる。
【０１８０】
いくつかの態様では、ビリオンへのパッケージングおよび組込みのためにVpxおよび／もしくはVprまたは変種もしくは部分が提供される。いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはVpxもしくはVprタンパク質の変種もしくは部分をコードする遺伝子は、レンチウイルスゲノムに含まれ、ウイルス粒子が標的細胞に感染すると発現する。
【０１８１】
いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、野生型霊長類レンチウイルスなどの野生型レンチウイルスによりコードされるVpxタンパク質、またはSAMHD1阻害活性を示すその変種もしくは部分である（例えば、Fregoso (2013) PLoS Pathogens, 9:e1003496を参照されたい）。Vpxをコードする霊長類レンチウイルスの中に、HIV-2、SIVスーティーマンガベイ（SIVsm）、SIVレッドキャップマンガベイ（SIVrcm）、およびSIVマカク（SIVmac）、SIVマンドリル（SIVmnd2）、SIVドリル（SIVdrl）、SIVブタオザル（SIVmne）などのHIV-2/SIVsmc関連およびSIVrcm/SIVmnd2関連系列ウイルス（Lim et al. (2012) Cell Host & Microbe, 11:194-204）が含まれる。
【０１８２】
いくつかの態様では、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、HIV-2、SIVsm、SIVrcm、SIVmac、SIVmnd2、SIVdrl、SIVmneによりコードされる野生型Vpxタンパク質を含有する、またはSAMHD1阻害活性を示すその変種もしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:1（SIVmac Vpx）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:2（SIVsm Vpx）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:3（SIVrcm Vpx）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:4（HIV-2）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:16（SIVmnd2）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:17（SIVdrl）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:18（SIVmne）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはこのようなタンパク質の機能性フラグメントもしくは部分である。
【０１８３】
いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、SAMHD1阻害活性を示すVprタンパク質である。Vprは、一般的に天然レンチウイルスによりコードされる。すべてのVprタンパク質がSAMHD1阻害活性を示すわけではない。例えば、SIVdeb、SIVmus、SIVagm、SIVden、SIVtal、SIVgsn、SIVmonおよびSIVsykからのVprは、SAMHD1阻害活性を示すと報告されている（Lim et al. (2012) Cell Host & Microbe, 11:194-204）。
【０１８４】
いくつかの態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、SIVdeb Vpr、SIVmus Vpr、SIVagm Vpr、SIVden Vpr、SIVtal Vpr、SIVgsn Vpr、SIVmon VprもしくはSIVsyk Vprである、またはSAMHD1阻害活性を示すその変種もしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:5（SIVdeb）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:6（SIVmus）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:7（SIVagm Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:8（SIVagm Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:9（SIVdeb Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:10（SIVden Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、変種は、SEQ ID NO:11（SIVtal Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:12（SIVgsn Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:13（SIVgsn Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:14（SIVmon Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:15（SIVsyk Vpr）と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしく99%同一なアミノ酸配列を有する、またはその機能性フラグメントもしくは部分である。
【０１８５】
いくつかの態様では、VpxまたはVprタンパク質などのSAMHD1阻害タンパク質は、ウイルスに対して異種である。これに関連する異種は、タンパク質が組み込まれたウイルスと比べて異なる科、クラスまたは種のウイルスに当該タンパク質が由来することを意味する。例えば、いくつかの局面では、SIVmacからのVpxタンパク質をHIV-1ベクター粒子に組み込むことができる。他の局面では、任意のレンチウイルスから、例えばSIVmacからのVpxタンパク質をMLVなどのガンマレトロウイルスに組み込むことができる。
【０１８６】
いくつかの態様では、VpxまたはVprタンパク質などのSAMHD1阻害タンパク質は、例えばSEQ ID NO:19に示されるヒトSAMHD1を阻害する、例えば分解する（Lim et al. (2012) Cell Host & Microbe, 11:194-204）。いくつかの態様では、ヒトSAMHD1を分解するVpxタンパク質は、HIV-2もしくはSIVmacによりコードされる、またはヒトSAMHD1を分解するその変種もしくは機能性フラグメントもしくは部分である。例えば、いくつかの態様では、Vpxタンパク質は、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:4と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはヒトSAMHD1を分解するその機能性フラグメントもしくは部分である。いくつかの態様では、ヒトSAMHD1を分解するVprタンパク質は、SIVdebもしくはSIVmusによりコードされることができる、またはヒトSAMHD1を分解するその変種もしくは機能性フラグメントもしくは部分である。例えば、いくつかの態様では、Vprタンパク質は、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:6と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一なアミノ酸配列を有する、またはヒトSAMHD1を分解するその機能性フラグメントもしくは部分である。
【０１８７】
いくつかの態様では、変種は、野生型または参照VpxまたはVprタンパク質の配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸欠失、挿入および／または置換を含有するタンパク質を含む。場合によっては、変種は、非保存的または保存的置換のいずれかを含む。場合によっては、Vpxタンパク質および／またはVprタンパク質の配列アライメントからの情報を使用して、VpxまたはVprの機能性変種および機能性フラグメント変種を生成させることができる。例えば、1つまたは複数の保存的または非保存的置換を、VpxまたはVprタンパク質をコードするウイルスの間で異なる位置に導入することができる。
【０１８８】
例えば、いくつかの態様では、SIVおよびHIV-2によりコードされるVpxタンパク質の間およびVpxタンパク質中で同一性を共有する残基は、本明細書に提供されるVpxタンパク質の変種において変動または変化していない。例えば、以下の変異は、Vpx活性を減少または消失させることが示されている：プロリンリッチのC末端11残基の欠失、Ser13Ala、Lys84Ala/Lys85Ala、Thr17Ala、Thr28Ala、Gly86Ala/Cys87Ala、Ser13Ala/Thr17Ala/Thr28Ala、His39Ala、Tyr66Ala/Tyr69Ala/Tyr71Ala、Trp49Ala/Trp53Ala/Trp56Ala、Lys68Ala/Lys77Ala、Gln76Ala、Pro9Gly、Asn12Ala、Glu15Ala、Glu16Ala、Phe80Ala（それぞれSEQ ID NO:1に示される残基を基準とする）。Goujon et al., Gramberg et al. (2010) Journal of Virology, 84:1387-1396.、Laguette et al. (2011)を参照されたい。したがって、いくつかの態様では、Vpxタンパク質の変種は、活性に必要であることが示されたSEQ ID NO:1中の上記残基のいずれに対応する残基に置換を含有しない。いくつかの態様では、Vpxタンパク質の変種は、SEQ ID NO:1中の上記残基のいずれに対応する残基に非保存的置換ではなく保存的置換を含有する。
【０１８９】
いくつかの態様では、VpxまたはVprタンパク質の変種は、SAMHD1阻害活性に影響しないことが公知である変異を含むことができる（Goujon et al., J Virol, 82:12335-12345 (2008)を参照されたい）。例えば、いくつかの態様では、SEQ ID NO:1中のAsn26Ala、Ser52Ala、およびSer63Ala/Ser65Ala変異のうちの1つまたは複数に対応するアミノ酸置換などの変異は、Vpxの機能に影響しない。
【０１９０】
いくつかの態様では、SAMHD1の阻害および／または分解は、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分などのSAMHD1阻害タンパク質の核局在を必要とする。Vpxは、核内でSAMHD1のユビキチン化および分解を誘導するので、結果としてSAMHD1およびVpxの両方が核に局在しなければならない。したがって、いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、核局在シグナルを含有する。いくつかの態様では、Vpxタンパク質またはその変種もしくは部分は、SEQ ID NO:4を基準として残基62〜80または65〜72に対応する核局在シグナルを含有する。
【０１９１】
いくつかの態様では、SAMHD1の阻害および／または分解は、DCAFとの結合および／または相互作用を含む。したがって、いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、DCAFと結合する。いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、Wx4Φx2Φx3AΦxHモチーフを含有する（SEQ ID NO:26に示される; Wei et al. (2012) Cell Microbiol., 14:1745-56）。例えば、いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:4を基準として残基24〜39に対応する残基にWx4Φx2Φx3AΦxHモチーフを含有する。いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、SEQ ID NO:1の位置76に対応する位置にGln（Q）を含有する。
【０１９２】
いくつかの態様では、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、当該タンパク質のN末端部分、ヘリックス1、ヘリックス2および／またはヘリックス3の残基に対応する残基を含有する（Gramberg et al. (2010) Journal of Virology, 84:1387-1396）。例えば、Vpxタンパク質、Vprタンパク質またはその変種もしくは部分は、いくつかの態様では、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列の残基1〜86に対応するアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1の残基1〜86と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を示し、SAMHD1阻害活性を示す、そのアミノ酸置換変種を含有する。
【０１９３】
いくつかの態様では、VpxもしくはVprタンパク質、またはその機能性部分もしくは変種は、ビリオン中にパッケージングされるが、これにより、宿主細胞に感染したときプロウイルスの組込み前に、該タンパク質がSAMHD1を阻害、例えば分解できるようになる。いくつかの態様では、レトロウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター中へのSAMHD1阻害レンチウイルスタンパク質のパッケージングを促進するGagタンパク質のp6ドメインを含有する。VpxおよびVprは、Gag前駆ポリペプチド（p6gag）のp6領域中にアミノ酸パッケージングモチーフとの相互作用によりパッケージングされる。いくつかの態様では、内因性ウイルスp6 Gagを用いて十分な組込みが達成される。いくつかの態様では、組込みは、パッケージングを促進するパッケージングモチーフを含有するキメラp6 Gagを使用することにより引き起こされ、かつ／または増加する。
【０１９４】
いくつかの態様では、パッケージングモチーフは、SEQ ID NO:21のアミノ酸残基17〜23に対応するアミノ酸を含む、P6のN末端におけるモチーフに対応する（Accola et al. (1999) J. Virol., 73:9992-9）。例えば、パッケージングモチーフは、いくつかの態様では、ロイシン含有モチーフDXAXXLL（SEQ ID NO:22）を含む。
【０１９５】
いくつかの態様では、レトロウイルスベクター粒子は、ビリオン中へのVpxまたはVprのパッケージングを媒介および／または促進するパッケージングモチーフの導入により修飾される。いくつかの態様では、パッケージングモチーフは、内因性ウイルスp6領域の対応する位置に挿入される。いくつかの態様では、パッケージングモチーフは、SEQ ID NO:21に示されるSIVmac p6の、それぞれアミノ酸17〜23またはアミノ酸17〜26に対応するアミノ酸DPAVDLL（SEQ ID NO:23）またはDPAVDLLKNY（SEQ ID NO:24）の配列を含む。いくつかの態様では、パッケージングモチーフは、米国特許出願公開第2013/0183334号に記載されたパッケージングモチーフのうちのいずれかである。いくつかの態様では、SEQ ID NO:20に示されるHIV-1 p6の対応する位置へのモチーフの移入の結果として、VpxをパッケージングするHIV-1ビリオンが生じる。
【０１９６】
いくつかの態様では、VpxもしくはVprタンパク質、またはその変種もしくは部分は、Gagタンパク質のp6領域を修飾せずにパッケージングされる。いくつかのこのような態様では、レトロウイルスベクターは、HIV-1由来であり、HIV-1 p6 Gagを使用して十分な組込みが達成される。いくつかのこのような態様では、SAMHD1阻害タンパク質は、SIVmac VpxまたはSAMHD1阻害活性を示すその変種もしくは部分である。
【０１９７】
いくつかの態様では、レトロウイルスベクターは、HIV-1由来であり、SIVmac p6パッケージングモチーフが挿入されたHIV-1 p6を含むキメラまたはハイブリッドp6ドメインを含む。例えば、いくつかの態様では、レトロウイルスベクターは、SEQ ID NO:20に示されるHIV-P6のアミノ酸1〜14に対応するアミノ酸残基、SEQ ID NO:21の残基17〜26に示されるSIVmacパッケージングモチーフに対応するアミノ酸、およびSEQ ID NO:20のアミノ酸残基21〜52に対応するHIV-1 p6のC末端部分を連続した順序で含むキメラまたはハイブリッドp6ドメイン（SIV 17-23bと称される；US2013/0183334; Sunseri et al. (2011) J. Virol., 85:6263-6274を参照されたい）を含む。例えば、いくつかの態様では、ハイブリッドまたはキメラp6ドメインは、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１９８】
3.  異種タンパク質をコードする核酸
いくつかの態様では、ウイルスベクターは、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含有する。いくつかの態様では、異種組換え分子は、組換え受容体、例えば抗原受容体、SB-トランスポゾン、例えば遺伝子サイレンシング用のもの、カプシドに包有されるトランスポゾン、相同二本鎖核酸、例えばゲノム組換え用のものまたはレポーター遺伝子（例えばGFPもしくはルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質）である、またはそれを含む。
【０１９９】
いくつかの態様では、ウイルスベクターは、異種受容体タンパク質などの組換え受容体および／またはキメラ受容体をコードする核酸を含有する。異種受容体などの組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）、およびトランスジェニックT細胞受容体（TCR）などの他の抗原結合受容体を含めた機能性非TCR抗原受容体などの抗原受容体を含みうる。受容体は、特定のリガンドと結合し、CARに存在するものと類似の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインを有する受容体などの他のキメラ受容体などの他の受容体も含みうる。
【０２００】
このような例のいずれかでは、核酸は、ウイルスベクターの領域、例えば一般的にウイルスゲノムの非必須領域に挿入または位置される。いくつかの態様では、核酸は、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損のウイルスを産生する。
【０２０１】
いくつかの態様では、コードされる組換え抗原受容体、例えばCARは、標的とされるべき細胞上または疾患（例えばがん、感染性疾患、炎症性もしくは自己免疫疾患、または提供される方法および組成物を用いて標的とするための本明細書記載のものを含めた他の疾患もしくは状態など）の、1種または複数種のリガンドと特異的に結合することが可能な抗原受容体である。
【０２０２】
ある特定の態様では、例示的な抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水素酵素9（CA9、CAIXまたはG250としても公知）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、がん胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、切断型上皮成長因子タンパク質（tEGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFRvIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体相同体5またはFCRH5としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Gタンパク質共役受容体5D（GPCR5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、melan A（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG、5T4としても公知）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮成長因子受容体（VEGFR）、血管内皮成長因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異抗原、もしくはユニバーサルタグ関連抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子である、またはそれらを含む。受容体により標的とされる抗原は、いくつかの態様では、いくつかの公知のB細胞マーカーのうちのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様では、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bまたはCD30であるまたはそれらを含む。
【０２０３】
いくつかの態様では、例示的な抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3、もしくは4、FBP、胎児アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソセリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、およびMAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、例えばサイクリンA1（CCNA1）、および／もしくはビオチン化分子、ならびに／またはHIV、HCV、HBV、HPV、および／もしくは他の病原体により発現されるおよび／もしくはそれに特徴的もしくは特異的な分子および／もしくはその腫瘍形成バージョンである。
【０２０４】
いくつかの態様では、抗原は、病原体に特異的な、または病原体により発現される抗原であるまたはそれを含む。いくつかの態様では、抗原は、ウイルス抗原（HIV、HCV、HBVその他からのウイルス抗原など）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。
【０２０５】
CARおよび組換えTCRを含めた抗原受容体、ならびにその産生および導入は、いくつかの態様では、例えば国際公開公報第200014257号、同第2013126726号、同第2012/129514号、同第2014031687号、同第2013/166321号、同第2013/071154号、同第2013/123061号、米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337号、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319、号7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、および欧州特許出願第2537416号に記載されたもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載されたものを含む。
【０２０６】
a.  キメラ抗原受容体
いくつかの態様では、ウイルスベクターのゲノム内に含有される核酸は、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする。CARは、一般的に、抗体またはそのフラグメントを含有する細胞外部分などの細胞外リガンド結合ドメインが1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素と連結した遺伝子操作受容体である。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを連結している膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを含む。このような分子は、典型的には、天然抗原受容体を経由するシグナルおよび／または共刺激受容体と組み合わせてこのような受容体を経由するシグナルを模倣もしくは近似する。
【０２０７】
いくつかの態様では、CARは、養子療法により標的とされる特定の細胞型において発現されたマーカーなど、例えば、がんマーカーおよび／または記載された抗原のうちのいずれかの、特定のマーカーに対して特異性を有するように構築される。したがって、CARは、典型的には、抗体の1つもしくは複数の抗原結合フラグメント、ドメイン、もしくは部分、または1つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および／もしくは抗体分子を含む。いくつかの態様では、CARは、抗体分子の１つまたは複数の抗原結合部分、例えば可変重鎖（VH）もしくはその抗原結合部分、またはモノクローナル抗体（mAb）の可変重（VH）鎖および可変軽（VL）鎖に由来する単鎖抗体フラグメント（scFv）を含む。
【０２０８】
いくつかの態様では、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば特定の細胞型の表面に発現された抗原に特異性を有するCARを発現する、T細胞などの操作された細胞が、提供される。いくつかの態様では、抗原は、ポリペプチドである。いくつかの態様では、抗原は、糖質または他の分子である。いくつかの態様では、抗原は、正常または非標的化細胞または組織と比較して、疾患またはある状態の細胞、例えば腫瘍または発症している細胞上に、選択的に発現または過剰発現される。他の態様では、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ／または操作細胞上に発現される。
【０２０９】
特定の態様では、キメラ受容体などの組換え受容体は、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することが可能な細胞質（細胞内）領域などの細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域（互換的に細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる）、例えば、T細胞受容体（TCR）構成要素の細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域（例えば、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインもしくは領域またはその機能性変種もしくはシグナル伝達部分）を含む、および／または免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む、細胞内シグナル伝達領域を含有する。
【０２１０】
いくつかの態様では、キメラ受容体は、リガンド（例えば抗原）と特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインをさらに含有する。いくつかの態様では、キメラ受容体は、抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有するCARである。いくつかの態様では、抗原などのリガンドは、細胞表面に発現されるタンパク質である。いくつかの態様では、CARは、TCR様CARであり、抗原は、細胞内タンパク質のペプチド抗原などのプロセシングされたペプチド抗原であり、このペプチド抗原は、TCRのように、主要組織適合抗原複合体（MHC）分子に関連して細胞表面で認識される。
【０２１１】
CARを含む例示的な抗原受容体、ならびにこのような受容体を操作して細胞内に導入するための方法には、例えば、国際公開公報第200014257号、同第2013126726号、同第2012/129514号、同第2014031687号、同第2013/166321号、同第2013/071154号、同第2013/123061号、米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337号、米国特許第6,451,995、7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、ならびに欧州特許出願第2537416号に記載されたもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載されたものが含まれる。いくつかの局面では、抗原受容体には、米国特許第7,446,190号に記載されたCAR、およびWO/2014055668A1に記載されたものが含まれる。CARの例には、国際公開公報第2014031687号、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)などの、前記刊行物のうちのいずれかに開示されたようなCARが含まれる。WO2014031687、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、および同第8,389,282号も参照されたい。
【０２１２】
いくつかの態様では、CARは、養子療法により標的とされる特定の細胞型において発現された抗原、例えば、がんマーカーおよび／または減衰性の応答を誘導することを意図した抗原、例えば正常もしくは非疾患細胞型に発現される抗原などの、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）に対して特異性を有するように構築される。したがって、CARは、典型的には、1つもしくは複数の抗原結合フラグメント、ドメイン、もしくは部分、または1つもしくは複数の可変ドメインなどの1つもしくは複数の抗原結合分子、および／あるいは抗体分子をその細胞外部分に含む。いくつかの態様では、CARは、抗体分子の1つまたは複数の抗原結合部分、例えばモノクローナル抗体（mAb）の可変重（VH）鎖および可変軽（VL）鎖に由来する単鎖抗体フラグメント（scFv）を含む。
【０２１３】
いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の部分として細胞上に発現される。抗原受容体の中に、キメラ抗原受容体（CAR）などの機能性非TCR抗原受容体が含まれる。一般的に、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様特異性を示す、抗体または抗原結合フラグメントを含有するCARも、TCR様CARと呼ばれる場合がある。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的な、TCR様CARの細胞外抗原結合ドメインは、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素と、いくつかの局面ではリンカーおよび／もしくは膜貫通ドメインを介して連結される。いくつかの態様では、このような分子は、TCRなどの天然抗原受容体を経由するシグナルおよび任意で共刺激受容体と組み合わせてこのような受容体を経由するシグナルを、典型的には模倣または近似することができる。
【０２１４】
いくつかの態様では、キメラ受容体（例えばCAR）などの組換え受容体は、抗原（またはリガンド）と結合する（例えば特異的に結合する）リガンド結合ドメインを含む。キメラ受容体により標的とされる抗原の中に、養子細胞療法を介して標的とされるべき疾患、状態、または細胞型に関連して発現される抗原が含まれる。該疾患および状態の中に、増殖性、腫瘍性、および悪性の疾患および障害が含まれ、これには、血液がん、免疫システムのがん、例えばリンパ腫、白血病、および／または骨髄腫、例えばB、T、および骨髄性白血病、リンパ腫、ならびに多発性骨髄腫を含めた、がんおよび腫瘍が含まれる。
【０２１５】
いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）は、ポリペプチドである。いくつかの態様では、これは、糖質または他の分子である。いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）は、正常または非標的化細胞または組織と比較して、疾患またはある状態の細胞、例えば、腫瘍または発症している細胞上に選択的に発現または過剰発現される。他の態様では、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ／または操作された細胞上に発現される。
【０２１６】
いくつかの態様では、CARは、細胞表面に発現された無傷抗原などの抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合フラグメント（例えばscFv）を含有する。
【０２１７】
いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）は、腫瘍抗原またはがんマーカーである。いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水素酵素9（CA9、CAIXまたはG250としても公知）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知）、がん胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、切断型上皮成長因子タンパク質（tEGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体相同体5またはFCRH5としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Gタンパク質共役受容体5D（GPCR5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソセリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、melan A（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG、5T4としても公知）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮成長因子受容体（VEGFR）、血管内皮成長因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異抗原、もしくはユニバーサルタグ関連抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体により発現される分子である、またはそれを含む。受容体により標的とされる抗原は、いくつかの態様では、いくつかの公知のB細胞マーカーのうちのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様では、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bまたはCD30である、またはそれを含む。
【０２１８】
いくつかの態様では、抗原は、病原体に特異的な、または病原体により発現される抗原である、またはそれを含む。いくつかの態様では、抗原は、ウイルス抗原（HIV、HCV、HBVその他からのウイルス抗原など）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。いくつかの態様では、CARは、細胞表面にMHCペプチド複合体として提示された、腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合フラグメント（例えばscFv）などのTCR様抗体を含有する。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の部分として、細胞上に発現されることができる。抗原受容体の中に、キメラ抗原受容体（CAR）などの機能性非TCR抗原受容体が含まれる。一般的に、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様特異性を示す、抗体または抗原結合フラグメントを含有するCARも、TCR様CARと呼ばれる場合がある。
【０２１９】
「主要組織適合抗原複合体」（MHC）への言及は、場合によっては、細胞機構によりプロセシングされたペプチド抗原を含めた、ポリペプチドのペプチド抗原と複合体を形成することができる多形性ペプチド結合部位または結合溝を含有するタンパク質、一般的に糖タンパク質を表す。場合によっては、MHC分子は、ペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体などとして、TCRまたはTCR様抗体などの、T細胞上の抗原受容体により認識可能なコンフォメーションで抗原を提示するために細胞表面にディスプレイまたは発現されることができる。一般的に、MHCクラスI分子は、場合によっては3つのαドメインを有する膜貫通α鎖と、非共有結合的に会合したβ2ミクログロブリンとを有する、ヘテロ二量体である。一般的に、MHCクラスII分子は、2種の膜貫通糖タンパク質、αおよびβから構成され、その両方が、典型的には膜を貫通する。MHC分子は、ペプチドと結合するための1つまたは複数の抗原結合部位を含有するMHCの有効部分および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含むことができる。いくつかの態様では、MHCクラスI分子は、サイトゾルを起源とするペプチドを細胞表面に送達し、細胞表面でMHC-ペプチド複合体は、一般的にCD8+ T細胞、場合によってはCD4+ T細胞などのT細胞により認識される。いくつかの態様では、MHCクラスII分子は、小胞システムを起源とするペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチドは典型的にはCD4+ T細胞により認識される。一般的に、MHC分子は、1群の連結した遺伝子座によりコードされ、これらの遺伝子座は、マウスではひとまとめにH-2と呼ばれ、ヒトではヒト白血球抗原（HLA）と呼ばれる。したがって、典型的には、ヒトMHCをヒト白血球抗原（HLA）と呼ぶこともできる。
【０２２０】
「MHC-ペプチド複合体」もしくは「ペプチド-MHC複合体」という用語またはそれらの変形は、一般的に、MHC分子の結合溝または間隙におけるペプチドの非共有結合的相互作用などによる、ペプチド抗原とMHC分子との複合体または会合物を表す。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、細胞表面に存在する、またはディスプレイされる。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、TCR、TCR様CARまたはその抗原結合部分などの抗原受容体により、特異的に認識されることができる。
【０２２１】
いくつかの態様では、ポリペプチドのペプチド抗原またはエピトープなどのペプチドは、抗原受容体による認識などのためにMHC分子と会合することができる。一般的に、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質などのより長い生物学的分子のフラグメントに由来する、またはそれに基づく。いくつかの態様では、ペプチドは、典型的には、約8〜約24アミノ酸長である。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のために9〜22または約9〜22アミノ酸長を有する。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のために8〜13または約8〜13アミノ酸長を有する。いくつかの態様では、MHC分子に関連してMHC-ペプチド複合体のようにペプチドを認識すると、抗原受容体、TCRまたはTCR様CARなどの抗原受容体は、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答または他の応答などのT細胞応答を誘導する、T細胞への活性化シグナルを産生またはトリガーする。
【０２２２】
いくつかの態様では、TCR様抗体または抗原結合部分は、公知である、または公知の方法により産生することができる（例えば、米国特許出願公開第2002/0150914号；同第2003/0223994号；同第2004/0191260号；同第US2006/0034850号；同第2007/00992530号；同第20090226474号；同第20090304679号；および国際公開公報第03/068201号を参照されたい）。
【０２２３】
いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特異的MHC-ペプチド複合体を含有する免疫原の有効量を宿主に免疫処置することにより産生することができる。場合によっては、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、腫瘍抗原、例えばユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原または下記の他の抗原などの、MHCと結合することが可能な抗原のエピトープである。いくつかの態様では、次に、免疫原の有効量が、免疫応答を誘発するために宿主に投与され、その際、免疫原は、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元提示に対する免疫応答を誘発するために十分な期間、その三次元形態を保持する。次に、宿主から採取された血清がアッセイされて、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元提示を認識する所望の抗体が産生されているかどうかが判定される。いくつかの態様では、産生される抗体を判断して、抗体がMHC-ペプチド複合体を、MHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと無関係のペプチドとの複合体と識別できることを確認することができる。次に、所望の抗体を単離することができる。
【０２２４】
いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、ファージ抗体ライブラリーなどの抗体ライブラリーディスプレイ法を採用することにより、産生することができる。いくつかの態様では、例えばライブラリーのメンバーが、1つまたは複数のCDRの1つまたは複数の残基で変異された変異型Fab、scFvまたは他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーを生成させることができる。例えば、米国特許出願公開第20020150914号、同第2014/0294841号；およびCohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい。
【０２２５】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、無傷抗体を含めたポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに抗原結合（Fab）フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、組換えIgG（rIgG）フラグメント、抗原と特異的に結合することが可能な可変重鎖（VH）領域、単鎖可変フラグメント（scFv）、および単一ドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディー）フラグメントを含めた単鎖抗体フラグメントを含めた機能性（抗原結合）抗体フラグメントを含む。この用語は、一般的に、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および／またはその他の方法で修飾された形態、例えばイントラボディー、ペプチボディー、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディー、タンデム型ジ-scFv、タンデム型トリ-scFvを包含する。特に述べないかぎり、「抗体」という用語は、その機能性抗体フラグメントを包含すると理解すべきである。この用語は、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、ならびにIgDを含めた、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含めた、無傷または完全長抗体も包含する。
【０２２６】
いくつかの態様では、抗原結合タンパク質、抗体およびその抗原結合フラグメントは、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様では、抗体の重鎖および軽鎖は、完全長であることができる、または抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fvもしくは単鎖Fvフラグメント（scFv））であることができる。他の態様では、抗体の重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選択され、特に例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4から、より詳細にはIgG1（例えば、ヒトIgG1）から選択される。別の態様では、抗体軽鎖定常領域は、例えばカッパまたはラムダ、特にカッパから選択される。
【０２２７】
提供される抗体の中に、抗体フラグメントが含まれる。「抗体フラグメント」は、無傷抗体が結合する抗原と結合する、無傷抗体の一部を含む、無傷抗体以外の分子を表す。抗体フラグメントの例には、非限定的に、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディー；線状抗体；可変重鎖（VH）領域、scFvおよび単一ドメインVH単一抗体などの単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。特定の態様では、抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む、scFvなどの単鎖抗体フラグメントである。
【０２２８】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを表す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つのCDRを含む。例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングするために、抗原と結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使用して、特定の抗原と結合する抗体が単離される場合がある。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
【０２２９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様では、CARは、抗原、例えば、腫瘍細胞またはがん細胞などの、標的とされるべき細胞または疾患のがんマーカーまたは細胞表面抗原、例えば本明細書記載または公知の標的抗原のうちのいずれかと特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。
【０２３０】
抗体フラグメントは、非限定的に無傷抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞による産生を含めた、多様な技法により製造することができる。いくつかの態様では、抗体は、組換え産生されたフラグメント、例えば自然に存在しない配置を含むフラグメント、例えば合成リンカー、例えばペプチドリンカーにより結合された2つ以上の抗体領域もしくは鎖を有するフラグメント、および／または天然無傷抗体の酵素消化により産生されない場合があるフラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントはscFvである。
【０２３１】
「ヒト化」抗体は、すべてまたは実質的にすべてのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDR由来であり、すべてまたは実質的にすべてのFRアミノ酸残基がヒトFR由来である抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。「ヒト化形態」の非ヒト抗体は、典型的にはヒトへの免疫原性を減少させる一方で、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持するために、ヒト化を受けた非ヒト抗体の変種を表す。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば抗体特異性または親和性を回復または改善するために非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されている。
【０２３２】
したがって、いくつかの態様では、TCR様CARを含めたキメラ抗原受容体は、抗体または抗体フラグメントを含有する細胞外部分を含む。いくつかの態様では、抗体またはフラグメントは、scFvを含む。いくつかの局面では、キメラ抗原受容体は、抗体またはフラグメントを含有する細胞外部分および細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することが可能なシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）構成要素のシグナル伝達ドメイン、および／または免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインである、またはそれを含む。
【０２３３】
いくつかの態様では、CARの細胞外部分、例えばその抗体部分は、抗原認識構成要素（例えばscFv）と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域などのスペーサーをさらに含む。スペーサーは、ヒンジ領域、例えばIgG4ヒンジ領域、および／またはCH1/CLおよび／またはFc領域などの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部またはその変種もしくは修飾バージョンでありうる、またはそれを含む。いくつかの態様では、組換え受容体は、スペーサーおよび／またはヒンジ領域をさらに含む。いくつかの態様では、定常領域もしくは部分は、ヒトIgG、例えばIgG4またはIgG1のものである。いくつかの局面では、定常領域の部分は、抗原認識構成要素、例えばscFvと、膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として役立つ。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:27に示される配列を有し、SEQ ID NO:28に示される配列によりコードされる。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:29に示される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:30に示される配列を有する。
【０２３４】
いくつかの態様では、定常領域または部分は、IgDのものである。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:31に示される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:27、29、30および31のうちのいずれかと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも大きい配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【０２３５】
いくつかの態様では、スペーサーは、ヒンジ領域、例えば、IgG4ヒンジ領域、および／またはCH1／CLおよび／またはFc領域などの免疫グロブリン定常領域またはその変種もしくは修飾バージョンの少なくとも一部でありうる、またはそれを含む。いくつかの態様では、組換え受容体は、スペーサーおよび／またはヒンジ領域をさらに含む。いくつかの態様では、定常領域または部分は、IgG4またはIgG1などのヒトIgGのものである。いくつかの局面では、定常領域の部分は、抗原認識構成要素（例えばscFv）と膜貫通ドメインとの間のスペーサーとして役立つ。スペーサーは、スペーサーの不在下と比較して、抗原結合後の細胞の応答性の増加を提供する長さであることができる。一部の例では、スペーサーは、12もしくは約12アミノ酸長または12アミノ酸長以下である。例示的なスペーサーは、少なくとも約10〜229個のアミノ酸、約10〜200個のアミノ酸、約10〜175個のアミノ酸、約10〜150個のアミノ酸、約10〜125個のアミノ酸、約10〜100個のアミノ酸、約10〜75個のアミノ酸、約10〜50個のアミノ酸、約10〜40個のアミノ酸、約10〜30個のアミノ酸、約10〜20個のアミノ酸、または約10〜15個のアミノ酸を有するスペーサーを含み、アミノ酸の個数は、記載された任意の範囲の端点の間の任意の整数を含む。いくつかの態様では、スペーサー領域は、約12個もしくはそれ未満のアミノ酸、約119個もしくはそれ未満のアミノ酸、または約229個もしくはそれ未満のアミノ酸を有する。例示的なスペーサーは、IgG4ヒンジ単独、CH2およびCH3ドメインと連結したIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインと連結したIgG4ヒンジを含む。例示的なスペーサーには、非限定的に、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153または国際公開公報第2014/031687号に記載されたスペーサーが含まれる。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:27に示される配列を有し、SEQ ID NO:28に示される配列によりコードされる。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:29に示される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:30に示される配列を有する。
【０２３６】
いくつかの態様では、定常領域もしくは部分は、IgDのものである。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:31に示される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO:27、29、30および31のうちのいずれかと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも大きい配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【０２３７】
抗原認識ドメインなどに結合する細胞外リガンドは、一般的に、CARの場合はTCR複合体などの抗原受容体複合体を経由する活性化を模倣するシグナル伝達構成要素などの1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素と連結され、かつ／または別の細胞表面受容体を介してシグナルを伝達する。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する。いくつかの態様では、抗原結合構成要素（例えば抗体）は、1つまたは複数の膜貫通領域および細胞内シグナル伝達領域と連結される。いくつかの態様では、CARは、細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含む。一態様では、自然に受容体（例えばCAR）におけるドメインのうちの1つと会合される膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を回避するためにアミノ酸置換により選択または修飾されて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にする。
【０２３８】
膜貫通ドメインは、いくつかの態様では、天然または合成起源のいずれかに由来する。起源が天然の場合、ドメインは、いくつかの局面では、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、T細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137またはCD154由来のものを含む（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの態様では合成である。いくつかの局面では、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの主として疎水性の残基を含む。いくつかの局面では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見られる。いくつかの態様では、連結は、リンカー、スペーサー、および／または膜貫通ドメインによる。
【０２３９】
いくつかの態様では、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、例えばグリシンおよびセリンを含有するものなど、例えばグリシン-セリンダブレットなどの2〜10アミノ酸長のリンカーが存在し、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成する。
【０２４０】
組換え受容体、例えばCARは、一般的に少なくとも1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素を含む。いくつかの態様では、受容体は、T細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、例えばCD3ゼータ鎖などのTCR複合体の細胞内構成要素を含む。したがって、いくつかの局面では、抗原結合部分は、1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールと連結される。いくつかの態様では、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、受容体、例えばCARは、1種または複数種の追加的な分子、例えばFc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16の一部をさらに含む。例えば、いくつかの局面では、CARまたは他のキメラ受容体は、CD3-ゼータ（CD3-ζ）またはFc受容体γとCD8、CD4、CD25またはCD16との間のキメラ分子を含む。
【０２４１】
いくつかの態様では、CARまたは他のキメラ受容体と連結すると、受容体の細胞質ドメインおよび／もしくは領域、または細胞内シグナル伝達ドメインおよび／もしくは領域は、免疫細胞、例えばCARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、一部の状況では、CARは、サイトカインまたは他の因子の分泌などの、細胞傷害活性またはTヘルパー活性などのT細胞機能を誘導する。いくつかの態様では、抗原受容体構成要素または共刺激分子の切断型細胞内シグナル伝達ドメイン部分は、例えばそれがエフェクター機能のシグナルを伝達するならば、無傷の免疫刺激鎖の代わりに使用される。いくつかの態様では、例えば1つまたは複数の細胞内ドメインを含む、細胞内シグナル伝達領域は、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列を含み、いくつかの局面では、また、自然状況でこのような受容体と協調して抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するように作用する共受容体の細胞質配列、および／またはこのような分子の任意の誘導体もしくは変種、および／または同じ機能性能力を有する任意の合成配列も含む。
【０２４２】
天然TCRに関連して、完全活性化は、一般的に、TCRを経由するシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの態様では、完全活性化を促進するために、二次または共刺激シグナルを発生するための構成要素もCARに含まれる。他の態様では、CARは、共刺激シグナルを発生するための構成要素を含まない。いくつかの局面では、追加的なCARが同じ細胞に発現され、二次または共刺激シグナルを発生するための構成要素を提供する。
【０２４３】
T細胞活性化は、いくつかの局面では、少なくとも2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：TCRを経由する抗原依存性一次活性化を開始する配列（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）により媒介されると説明されている。いくつかの局面では、CARは、このようなシグナル伝達構成要素の一方または両方を含む。
【０２４４】
いくつかの局面では、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例には、TCRまたはCD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD8、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d由来のものが含まれる。ある特定の態様では、一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMには、TCRもしくはCD3ゼータ、FcRガンマ、またはFcRベータ由来のものが含まれる。いくつかの態様では、CARにおける細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、またはCD3ゼータに由来する配列を含有する。
【０２４５】
いくつかの態様では、CARは、CD28、4-1BB、OX40、CD27、DAP10、およびICOSなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。いくつかの局面では、同じCARは、活性化またはシグナル伝達領域と共刺激構成要素との両方を含む。
【０２４６】
いくつかの態様では、活性化ドメインは、1つのCAR内に含まれるのに対し、共刺激構成要素は、別の抗原を認識する別のCARにより提供される。いくつかの態様では、CARは、両方とも同じ細胞に発現される、活性化または刺激CARおよび共刺激CARを含む（WO2014/055668を参照されたい）。いくつかの局面では、CARは、刺激または活性化CARであり；他の局面では、これは共刺激CARである。いくつかの態様では、細胞は、第1の抗原を認識するCARを経由して送達される活性化シグナルが、阻害性CARがそのリガンドに結合することにより減衰または阻害されて、例えばオフターゲット効果を減少させる、異なる抗原を認識するCARなどの阻害性CAR（iCAR、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December、2013)を参照されたい）をさらに含む。
【０２４７】
ある特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3細胞内ドメインと連結したCD28膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3細胞内ドメインと連結したキメラCD28およびCD137共刺激ドメインを含む。
【０２４８】
いくつかの態様では、CD8+細胞傷害性T細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD4+ヘルパーT細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。いくつかの態様では、CD8+細胞傷害性T細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD4+ヘルパーT細胞の細胞内シグナル伝達ドメインとは異なる。
【０２４９】
いくつかの態様では、CARは、細胞質部分に1つまたは複数、例えば2つ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを包含する。例示的なCARは、CD3-ゼータ、CD28、および4-1BBの細胞内構成要素を含む。
【０２５０】
いくつかの態様では、提供されるウイルスベクター内の核酸によりコードされる組換え受容体（例えばCAR）は、例えば、受容体を発現するための細胞の形質導入もしくは操作を確認するため、ならびに／またはポリヌクレオチドによりコードされる分子を発現している細胞の選択および／もしくは標的化のために、1種または複数種のマーカーをさらに含む。いくつかの局面では、このようなマーカーは、異なる核酸またはポリヌクレオチドによりコードされる場合があり、該核酸またはポリヌクレオチドも、遺伝子操作工程の間に典型的には同じ方法により、例えば本明細書提供の方法のうちのいずれかによる形質導入により、例えば同じベクターまたは同じ種類のベクターにより、導入され得る。
【０２５１】
いくつかの局面では、マーカー、例えば形質導入マーカーは、タンパク質および／または細胞表面分子である。例示的なマーカーは、天然の切断型変種、例えば内因性マーカー、例えば天然細胞表面分子である。いくつかの局面では、変種は、天然または内因性細胞表面分子と比較して減少した免疫原性、減少した輸送機能、および／または減少したシグナル伝達機能を有する。いくつかの態様では、マーカーは、切断型EGFR（tEGFR）などの細胞表面受容体の切断型バージョンである。いくつかの局面では、マーカーは、CD34、NGFR、または上皮成長因子受容体（例えばtEGFR）のすべてまたは部分（例えば切断型）を含む。いくつかの態様では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばT2A P2A、E2Aおよび／またはF2Aなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、WO2014/031687を参照されたい。
【０２５２】
いくつかの態様では、マーカーは、T細胞上に自然に見られない、またはT細胞の表面に自然に見られない、分子、例えば、細胞表面タンパク質またはその一部である。
【０２５３】
いくつかの態様では、分子は、非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移入された宿主の免疫システムにより「自己」として認識されない分子である。
【０２５４】
いくつかの態様では、マーカーは、治療的機能を果たさず、かつ／または遺伝子操作のため、例えば、操作に成功した細胞を選択するためのマーカーとして使用される以外に効果を生まない。他の態様では、マーカーは、インビボで遭遇されるべき細胞に対するリガンド、例えば養子移入およびリガンドとの遭遇の際に、細胞の応答を強化および／または減衰させるための共刺激分子または免疫チェックポイント分子などの、治療分子またはある所望の効果を別の方法で発揮している分子でありうる。
【０２５５】
場合によっては、CARは、第1、第2、および／または第3世代のCARと称される。いくつかの局面では、第1世代のCARは、抗原結合の際にCD3鎖誘導シグナルだけを提供するCARであり；いくつかの局面では、第2世代のCARは、CD28またはCD137などの共刺激受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARなどの、このようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するCARであり；いくつかの局面では、第3世代のCARは、いくつかの局面では、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むCARである。
【０２５６】
いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、抗体またはそのフラグメントなどの抗原結合部分などの細胞外リガンド結合部分、および細胞内ドメインを含む。いくつかの態様では、抗体またはフラグメントは、scFvまたは単一ドメインVH抗体を含み、細胞内ドメインは、ITAMを含有する。いくつかの局面では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと、細胞内シグナル伝達領域またはドメインとを連結する、および／またはそれらの間に配置された膜貫通ドメインを含む。
【０２５７】
いくつかの局面では、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分を含有する。細胞外ドメインおよび膜貫通部を、直接または間接的に連結することができる。いくつかの態様では、細胞外ドメイン；および膜貫通部は、本明細書記載のいずれかなどの、スペーサーにより連結されている。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間などに、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの局面では、T細胞共刺激分子は、CD28または4-1BBである。
【０２５８】
いくつかの態様では、CARは、抗体、例えば、抗体フラグメント、CD28の膜貫通部分またはその機能性変種であるまたはそれを含有する膜貫通ドメイン、ならびにCD28のシグナル伝達部分またはその機能性変種、およびCD3ゼータまたはその機能性変種のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの態様では、CARは、抗体、例えば抗体フラグメント、CD28またはその機能性変種の膜貫通部分であるまたはそれを含有する膜貫通ドメイン、および4-1BBまたはその機能性変種のシグナル伝達部分およびCD3ゼータまたはその機能性変種のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかのこのような態様では、受容体は、ヒトIg分子などのIg分子の一部、例えばIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジを含有するスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
【０２５９】
いくつかの態様では、受容体、例えばCARの膜貫通ドメインは、例えば、ヒトCD28またはその変種の膜貫通ドメイン、例えば、ヒトCD28のアミノ酸27個の膜貫通ドメイン（アクセッション番号：P10747.1）、またはSEQ ID NO:34に示されるアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:34と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれよりも大きい配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインであり；いくつかの態様では、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、SEQ ID NO:35に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれよりも大きい配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６０】
いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの局面では、T細胞共刺激分子は、CD28または4-1BBである。
【０２６１】
いくつかの態様では、細胞内ドメインは、ヒトCD28またはその機能性変種もしくは部分の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、例えばそのアミノ酸41個のドメインおよび／または天然CD28タンパク質の位置186〜187にLLからGGへの置換を有するこのようなドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域および／またはドメインは、SEQ ID NO:36もしくは37に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:36もしくは37と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれよりも大きい配列同一性を示すアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様では、細胞内領域および／またはドメインは、4-1BBまたはその機能性変種の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、例えばヒト4-1BB（アクセッション番号Q07011.1）またはその機能性変種もしくは部分のアミノ酸42個の細胞質ドメイン、例えばSEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:38と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれよりも大きい配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【０２６２】
いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域および／またはドメインは、ヒトCD3鎖、任意でCD3ゼータ刺激性シグナル伝達ドメインまたはその機能性変種、例えばヒトCD3ζのアイソフォーム3（アクセッション番号：P20963.2）の112AA細胞質ドメインまたは米国特許第7,446,190号もしくは同第8,911,993号に記載されるようなCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、SEQ ID NO:39、40、もしくは41に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:39、40、もしくは41と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれよりも大きい配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【０２６３】
いくつかの局面では、スペーサーは、IgGのヒンジ領域だけ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジだけ、例えばSEQ ID NO:27に示されるヒンジだけのスペーサーを含有する。他の態様では、スペーサーは、CH2および／またはCH3ドメインと連結したIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、例えば、CH2およびCH3ドメインと連結した、SEQ ID NO:29に示されるようなIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、例えば、CH3ドメインだけと連結した、SEQ ID NO:30に示されるようなIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または公知の可動性リンカーなどの他の可動性リンカーである、またはそれを含む。
【０２６４】
例えば、いくつかの態様では、CARは、細胞外リガンド結合部分、例えば抗原、例えば本明細書記載の抗原と特異的に結合する、sdAbおよびscFvを含めた抗体またはそのフラグメントなどの抗原結合部分；スペーサー、例えば任意のIg-ヒンジ含有スペーサー；CD28またはその変種の一部である膜貫通ドメイン；CD28またはその機能性変種のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメイン；ならびにCD3ゼータシグナル伝達ドメインまたはその機能性変種のシグナル伝達部分を含む。いくつかの態様では、CARは、細胞外リガンド結合部分、例えば抗原、例えば本明細書記載の抗原と特異的に結合する、sdAbおよびscFvを含めた抗体またはそのフラグメントなどの抗原結合部分；スペーサー、例えば任意のIgヒンジ含有スペーサー；CD28またはその変種の一部である膜貫通ドメイン；4-1BBまたはその機能性変種のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメイン；ならびにCD3ゼータシグナル伝達ドメインまたはその機能性変種のシグナル伝達部分を含む。いくつかの態様では、このようなCAR構築物は、T2Aリボソームスキップエレメントおよび／またはtEGFR配列を、例えばCARの下流にさらに含む。
【０２６５】
b. T細胞受容体(TCR)
いくつかの態様において、核酸によってコードされる組換え分子は、組換えT細胞受容体(TCR)であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、組換えTCRは、抗原、一般に、腫瘍特異的抗原などの標的細胞上に存在する抗原、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に関連する特定の細胞タイプ上に発現される抗原、またはウイルス病原体もしくは細菌病原体に由来する抗原に対して、特異的である。いくつかの態様において、腫瘍、ウイルスまたは自己免疫タンパク質の抗原などの標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはT細胞エピトープを認識するTCRまたはその抗原結合部分を発現する、改変された細胞、例えばT細胞が提供される。
【０２６６】
いくつかの態様において、「T細胞受容体」または「TCR」は、可変α鎖およびβ鎖(それぞれTCRαおよびTCRβとしても公知)もしくは可変γ鎖およびδ鎖(それぞれTCRαおよびTCRβとしても公知)、またはその抗原結合部分を含有し、かつ、MHC分子に結合しているペプチドに特異的に結合することができる、分子である。いくつかの態様において、TCRは、αβ形態である。典型的には、αβ形態およびγδ形態で存在するTCRは、一般に、構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は、明確に異なる解剖学的な所在または機能を有し得る。TCRは、細胞の表面上にまたは可溶性形態で見いだすことができる。一般に、TCRは、T細胞(またはTリンパ球)の表面上に見いだされ、そこで、一般に、主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合している抗原を認識することを担っている。
【０２６７】
特に指定のない限り、用語「TCR」は、完全TCRもその抗原結合部分または抗原結合断片も包含するものと理解されるべきである。いくつかの態様において、TCRは、αβ形態またはγδ形態のTCRを含む、インタクトなTCRまたは完全長のTCRである。いくつかの態様において、TCRは、完全長未満のTCRであるがMHC分子中に結合している特異的なペプチドに結合する、例えばMHC-ペプチド複合体に結合する、抗原結合部分である。いくつかの場合に、TCRの抗原結合部分または断片は、完全長のTCRまたはインタクトなTCRの構造ドメインの一部だけを含有することができるが、それでもなお、完全TCRが結合するペプチドエピトープ、例えばMHC-ペプチド複合体に結合することができる。いくつかの場合に、抗原結合部分は、特異的なMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分な、TCRの可変ドメイン、例えばTCRの可変α鎖および可変β鎖を含有する。一般に、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHCおよび/またはMHC-ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。
【０２６８】
いくつかの態様において、TCRの可変ドメインは、一般に抗原認識ならびに結合能および特異性への一次寄与因子である、超可変ループ、または相補性決定領域(CDR)を含有する。いくつかの態様において、TCRのCDRまたはその組み合わせは、所与のTCR分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。TCR鎖の可変領域内の様々なCDRは、一般に、CDRと比較してTCR分子間で小さい変動性を一般に提示するフレームワーク領域(FR)によって、隔てられている(例えば、Jores et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照のこと;また、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照のこと)。いくつかの態様において、CDR3は、抗原結合もしくは特異性を担う主要CDRであるか、または、所与のTCR可変領域上の3つのCDRの中で、抗原認識および/もしくはペプチド-MHC複合体のプロセシングされたペプチド部分との相互作用に最も重要なものである。いくつかの状況では、アルファ鎖のCDR1は、ある特定の抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況では、ベータ鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況では、CDR2は、MHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用もしくはその認識に最も強く寄与するか、またはそれを担う一次CDRである。いくつかの態様において、β鎖の可変領域は、一般に超抗原結合に関与するが抗原認識には関与しないさらなる超可変領域(CDR4またはHVR4)を含有することができる(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426)。
【０２６９】
いくつかの態様において、TCRはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または短い細胞質尾部を含有することができる(例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照のこと)。いくつかの局面において、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメインと、1つの免疫グロブリン定常ドメインと、膜貫通領域と、C末端にある短い細胞質尾部を保有することができる。いくつかの態様において、TCRは、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体の不変タンパク質と会合する。
【０２７０】
いくつかの態様において、TCR鎖は、1以上の定常ドメインを含有する。例えば、所与のTCR鎖(例えば、α鎖またはβ鎖)の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン(例えば、VαまたはVβ;典型的にはKabatナンバリング(Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.)に基づきアミノ酸1〜116)と、細胞膜に隣接する定常ドメイン(例えば、α鎖定常ドメインもしくはCα、典型的にはKabatナンバリングに基づき鎖の位置117〜259、またはβ鎖定常ドメインもしくはCβ、典型的にはKabatに基づき鎖の位置117〜295)を含有することができる。例えば、いくつかの場合に、2つの鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインおよび2つの膜遠位可変ドメインを含有し、その可変ドメインは各々、CDRを含有する。TCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成することによってTCRの2つの鎖を連結する、短い接続配列を含有してよい。いくつかの態様において、TCRが、定常ドメイン中に2つのジスルフィド結合を含有するように、TCRは、α鎖およびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してよい。
【０２７１】
いくつかの態様において、TCR鎖は、膜貫通ドメインを含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、正に荷電されている。いくつかの場合に、TCR鎖は、細胞質尾部を含有する。いくつかの場合に、その構造は、TCRが、CD3のような他の分子およびそのサブユニットと会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域と共に定常ドメインを含有するTCRは、タンパク質を細胞膜に固定し、CD3シグナル伝達装置または複合体の不変サブユニットと会合し得る。CD3シグナル伝達サブユニット(例えば、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖およびCD3ζ鎖)の細胞内尾部は、TCR複合体のシグナル伝達能に関与する1以上の免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはITAMを含有する。
【０２７２】
いくつかの態様において、TCRは、2つの鎖αおよびβ(または場合によりγおよびδ)のヘテロ二量体であっても、単鎖TCR構築物であってもよい。いくつかの態様において、TCRは、1以上のジスルフィド結合などによって連結されている2つの別々の鎖(α鎖およびβ鎖またはγ鎖およびδ鎖)を含有するヘテロ二量体である。
【０２７３】
いくつかの態様において、TCRは、実質的に完全長のコード配列が容易に利用可能である公知のTCR配列、例えばVα,β鎖の配列から作製することができる。V鎖配列を含む完全長TCR配列を細胞源から得るための方法が周知である。いくつかの態様において、1以上の所与の細胞内のもしくはそれから単離されたTCRをコードする核酸のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、または公的に入手可能なTCR DNA配列の合成などによって、多種多様な供給源からTCRをコードする核酸を得ることができる。
【０２７４】
いくつかの態様において、TCRは、生物学的供給源から、例えば細胞から、例えばT細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)、T細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの態様において、T細胞は、インビボ単離された細胞から得ることができる。いくつかの態様において、TCRは、胸腺で選択されたTCRである。いくつかの態様において、TCRは、ネオエピトープ拘束性TCRである。いくつかの態様において、T細胞は、培養されたT細胞ハイブリドーマまたはクローンであることができる。いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分もしくはその抗原結合断片は、TCRの配列の知識から合成によって作製することができる。
【０２７５】
いくつかの態様において、TCRは、標的ポリペプチド抗原またはその標的T細胞エピトープに対する候補TCRのライブラリーをスクリーニングすることから同定または選択されたTCRから作製される。TCRライブラリーは、PBMC、脾臓または他のリンパ系器官に存在する細胞を含む、対象から単離されたT細胞由来のVαおよびVβのレパートリーの増幅によって作製することができる。いくつかの場合に、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)からT細胞を増幅することができる。いくつかの態様において、TCRライブラリーを、CD4+またはCD8+細胞から作製することができる。いくつかの態様において、TCRを、正常な健常対象のT細胞源、すなわち正常なTCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様において、TCRを、疾患対象のT細胞源、すなわち疾患TCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様において、縮重プライマーを使用して、ヒトから得られた試料、例えばT細胞でRT-PCRなどによって、VαおよびVβの遺伝子レパートリーが増幅される。いくつかの態様において、増幅された産物がクローニングまたはアセンブルされてリンカーによって隔てられている、ナイーブなVαおよびVβライブラリーから、scTvライブラリーをアセンブルすることができる。対象および細胞の供給源に応じて、ライブラリーは、HLAアレル特異的であることができる。あるいは、いくつかの態様において、TCRライブラリーを、親TCR分子または足場TCR分子の変異誘発または多様化によって作製することができる。いくつかの局面において、TCRは、例えばα鎖またはβ鎖の、変異誘発などによる指向性進化に供される。いくつかの局面において、TCRのCDR内の特定の残基が変更される。いくつかの態様において、選択されたTCRを、親和性成熟によって修飾することができる。いくつかの態様において、抗原特異的T細胞をスクリーニングなどによって選択して、ペプチドに対するCTL活性を評価してよい。いくつかの局面において、TCR、例えば抗原特異的T細胞上に存在するTCRを、結合活性、例えば、抗原に対する特定の親和性またはアビディティなどによって選択してよい。
【０２７６】
いくつかの態様において、遺伝子改変された抗原受容体は、組換えT細胞受容体(TCR)および/または天然に存在するT細胞からクローニングされたTCRを含む。いくつかの態様において、TCRは、天然に存在するT細胞からクローニングされたものである。いくつかの態様において、標的抗原(例えば、がん抗原)に対する高親和性T細胞クローンが、患者から同定および単離され、細胞に導入される。いくつかの態様において、標的抗原に対するTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子(例えば、ヒト白血球抗原系、またはHLA)で改変されたトランスジェニックマウスにおいて作製された。例えば、腫瘍抗原を参照のこと(例えば、Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 および Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808を参照のこと)。いくつかの態様において、ファージディスプレイを使用して、標的抗原に対するTCRが単離される(例えば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 および Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354を参照のこと)。いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分は、修飾または改変されたものである。いくつかの態様において、指向性進化法を使用して、特性が変更された、例えば特異的MHC-ペプチド複合体に対する親和性がより高いTCRが作製される。いくつかの態様において、指向性進化は、酵母ディスプレイ(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92)、ファージディスプレイ(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54)、またはT細胞ディスプレイ(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)を非限定的に含むディスプレイ法によって達成される。いくつかの態様において、ディスプレイアプローチは、公知TCR、親TCRまたは参照TCRを改変すること、または修飾することを伴う。例えば、いくつかの場合に、野生型TCRを、CDRの1以上の残基が変異した変異誘発TCRを生産するための鋳型として使用することができ、特性が所望に変更された、例えば所望の標的抗原に対する親和性がより高い変異体が選択される。
【０２７７】
いくつかの態様において、関心対象のTCRの生産または作製に使用するための標的ポリペプチドのペプチドは、公知であるか、または当業者が容易に同定することができる。いくつかの態様において、TCRまたは抗原結合部分の作製における使用に適したペプチドを、関心対象の標的ポリペプチド、例えば下記の標的ポリペプチド中の、HLA拘束性モチーフの存在に基づいて決定することができる。いくつかの態様において、ペプチドは、利用可能なコンピュータ予測モデルを使用して同定される。いくつかの態様において、MHCクラスI結合部位を予測するために、そのようなモデルは、ProPred1(Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237)およびSYFPEITHI(Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照のこと)を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、MHC拘束性エピトープは、HLA-A0201であり、これは、全ての白人のおよそ39〜46%において発現され、それ故、TCRまたは他のMHC-ペプチド結合分子の調製に使用するためのMHC抗原の好適な選択肢である。
【０２７８】
コンピュータ予測モデルを使用したプロテアソームおよび免疫プロテアソームのHLA-A0201結合モチーフおよび切断部位が公知である。MHCクラスI結合部位を予測するために、そのようなモデルは、ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001により詳細に記載されている)およびSYFPEITHI(Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007を参照のこと)を含むが、それらに限定されない。
【０２７９】
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分は、1以上の特性、例えば結合特性が変更されている、組換え生産された天然のタンパク質またはその変異形態であってよい。いくつかの態様において、TCRは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物などの様々な動物種の1つに由来してよい。TCRは、細胞結合形態であっても可溶性形態であってもよい。いくつかの態様において、提供される方法の目的のために、TCRは、細胞の表面上に発現される細胞結合形態である。
【０２８０】
いくつかの態様において、TCRは、完全長TCRである。いくつかの態様において、TCRは、抗原結合部分である。いくつかの態様において、TCRは、二量体TCR(dTCR)である。いくつかの態様において、TCRは、単鎖TCR(sc-TCR)である。いくつかの態様において、dTCRまたはscTCRは、WO 03/020763、WO 04/033685、WO2011/044186に記載されているような構造を有する。
【０２８１】
いくつかの態様において、TCRは、膜貫通配列に対応する配列を含有する。いくつかの態様において、TCRは、細胞質配列に対応する配列を含有する。いくつかの態様において、TCRは、CD3とのTCR複合体を形成することができる。いくつかの態様において、dTCRまたはscTCRを含むTCRのいずれかを、T細胞の表面に活性なTCRを生成するシグナル伝達ドメインに連結させることができる。いくつかの態様において、TCRは、細胞の表面上に発現される。
【０２８２】
いくつかの態様において、dTCRは、TCRα鎖可変領域配列に対応する配列がTCRα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合した第一のポリペプチドと、TCRβ鎖可変領域配列に対応する配列がTCRβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合した第二のポリペプチドとを含有し、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの態様において、この結合は、ネイティブな二量体αβ TCR中に存在するネイティブな鎖間ジスルフィド結合に対応することができる。いくつかの態様において、鎖間ジスルフィド結合は、ネイティブなTCR中に存在しない。例えば、いくつかの態様において、dTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列に、1以上のシステインを組み込むことができる。いくつかの場合に、ネイティブなジスルフィド結合と非ネイティブなジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。いくつかの態様において、TCRは、膜に固定するための膜貫通配列を含有する。
【０２８３】
いくつかの態様において、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に取り付けられた第一の二量体化モチーフを含有するTCRα鎖と、可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に取り付けられた第一の二量体化モチーフを含むTCRβ鎖とを含有し、ここで、第一の二量体化モチーフと第二の二量体化モチーフは、容易に相互作用して、第一の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第二の二量体化モチーフ中のアミノ酸との間で共有結合が形成され、TCRα鎖とTCRβ鎖を連結する。
【０２８４】
いくつかの態様において、TCRは、scTCRである。典型的には、公知の方法を使用してscTCRを作製することができる。例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); 国際公開PCT第WO 96/13593号、第WO 96/18105号、第WO 99/60120号、第WO 99/18129号、第WO 03/020763号、第WO 2011/044186号;およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照のこと。いくつかの態様において、scTCRは、TCR鎖の会合を容易にする、導入された非ネイティブなジスルフィド鎖間結合を含有する(例えば、国際公開PCT第WO 03/020763号を参照のこと)。いくつかの態様において、scTCRは、そのC末端に融合された異種のロイシンジッパーが鎖会合を容易にする、非ジスルフィド連結された短縮TCRである(例えば、国際公開PCT第WO99/60120号を参照のこと)。いくつかの態様において、scTCRは、ペプチドリンカーを介してTCRβ可変ドメインに共有連結されたTCRα可変ドメインを含有する(例えば、国際公開PCT第WO99/18129号を参照のこと)。
【０２８５】
いくつかの態様において、scTCRは、TCRα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第一のセグメントと、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合されたTCRβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第二のセグメントと、第一のセグメントのC末端を第二のセグメントのN末端に連結するリンカー配列とを含有する。
【０２８６】
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合されたα鎖可変領域配列によって構成される第一のセグメントと、配列β鎖細胞外定常のN末端に融合されたβ鎖可変領域配列によって構成される第二のセグメントと、膜貫通配列と、場合により、第一のセグメントのC末端を第二のセグメントのN末端に連結するリンカー配列とを含有する。
【０２８７】
いくつかの態様において、scTCRは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合されたTCRβ鎖可変領域配列によって構成される第一のセグメントと、配列α鎖細胞外定常のN末端に融合されたα鎖可変領域配列によって構成される第二のセグメントと、膜貫通配列と、場合により、第一のセグメントのC末端を第二のセグメントのN末端に連結するリンカー配列とを含有する。
【０２８８】
いくつかの態様において、第一のTCRセグメントと第二のTCRセグメントとを連結するscTCRのリンカーは、TCR結合特異性を保持しながら単一のポリペプチド鎖を形成することができる、任意のリンカーであることができる。いくつかの態様において、リンカー配列は、例えば、式-P-AA-P-(式中、Pはプロリンであり、AAはアミノ酸配列を表し、ここで、アミノ酸はグリシンおよびセリンである)を有し得る。いくつかの態様において、第一のセグメントと第二のセグメントは、その可変領域配列がそのような結合のために配向されるように、対合する。よって、いくつかの場合に、リンカーは、第一のセグメントのC末端と第二のセグメントのN末端との間(逆もまた同様)の距離に広がるのに十分な長さを有するが、標的リガンドへのscTCRの結合を遮断または低減させるほど長すぎることはない。いくつかの態様において、リンカーは、10〜45アミノ酸または約10〜45アミノ酸、例えば10〜30アミノ酸または26〜41アミノ酸残基、例えば29、30、31または32アミノ酸を含有することができる。いくつかの態様において、リンカーは、式-PGGG-(SGGGG)5-P-(式中、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである)を有する(SEQ ID NO:48)。いくつかの態様において、リンカーは、配列：
2019536461.tif 000003
を有する。
【０２８９】
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基をβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する、共有ジスルフィド結合を含有する。いくつかの態様において、ネイティブなTCR中に鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、いくつかの態様において、scTCRポリペプチドの第一のセグメントおよび第二のセグメントの定常領域細胞外配列に、1以上のシステインを組み込むことができる。いくつかの場合に、ネイティブなジスルフィド結合と非ネイティブなジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。
【０２９０】
導入された鎖間ジスルフィド結合を含有するdTCRまたはscTCRのいくつかの態様において、ネイティブなジスルフィド結合は、存在しない。いくつかの態様において、ネイティブな鎖間ジスルフィド結合を形成するネイティブなシステインの1以上が、別の残基、例えばセリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様において、第一のセグメントおよび第二のセグメント上の非システイン残基をシステインに変異させることによって、導入されたジスルフィド結合を形成することができる。TCRの例示的な非ネイティブなジスルフィド結合は、公開された国際PCT第WO2006/000830号に記載されている。
【０２９１】
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合断片は、標的抗原に対する平衡結合定数が10-5〜10-12 Mまたは約10-5〜10-12 Mならびにその中の全ての個々の値および範囲の親和性を示す。いくつかの態様において、標的抗原は、MHC-ペプチド複合体またはリガンドである。
【０２９２】
いくつかの態様において、α鎖およびβ鎖などのTCRをコードする1以上の核酸を、PCR、クローニングまたは他の好適な手段によって増幅して、1以上の好適な発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであることができ、これを使用して、任意の好適な宿主を形質転換またはトランスフェクトすることができる。好適なベクターは、プラスミドおよびウイルスなどの、増加および拡大のためまたは発現のためまたは両方のために設計されたものを含む。
【０２９３】
いくつかの態様において、ベクターは、pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pET系列(Novagen, Madison, Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)、またはpEX系列(Clontech, Palo Alto, Calif.)のベクターであることができる。いくつかの場合に、また、λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4、およびλNM1149などのバクテリオファージベクターを使用することもできる。いくつかの態様において、植物発現ベクターを使用することができ、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121およびpBIN19(Clontech)を含むことができる。いくつかの態様において、動物発現ベクターは、pEUK-Cl、pMAMおよびpMAMneo(Clontech)を含む。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用される。
【０２９４】
いくつかの態様において、標準的な組換えDNA技術を使用して組換え発現ベクターを調製することができる。いくつかの態様において、必要に応じてかつベクターがDNAベースかRNAベースかどうかを考慮して、ベクターは、ベクターが導入される宿主のタイプ(例えば、細菌、真菌、植物、または動物)に特異的である、転写および翻訳の開始コドンおよび終結コドンなどの調節配列を含有することができる。いくつかの態様において、ベクターは、TCRまたは抗原結合部分(または他のMHC-ペプチド結合分子)をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、非ネイティブなプロモーターを含有することができる。いくつかの態様において、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見いだされるプロモーターなどの、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーターであることができる。他の公知のプロモーターも想定される。
【０２９５】
いくつかの態様において、T細胞クローンが得られた後、TCRアルファ鎖およびベータ鎖が単離され、遺伝子発現ベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、TCRアルファ遺伝子およびベータ遺伝子が、両方の鎖が共発現されるように、ピコルナウイルス2Aリボソームスキップペプチドを介して連結される。いくつかの態様において、TCRをコードする核酸は、受容体を発現する細胞の形質導入または改変を確認するためのマーカーをさらに含む。いくつかの態様において、TCRの遺伝的移入は、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターを介してまたはトランスポゾンを介して達成される(例えば、Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; and Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683を参照のこと)。
【０２９６】
いくつかの態様において、TCRをコードするベクターを作製するために、関心対象のTCRを発現するT細胞クローンから単離されたトータルcDNAから、α鎖およびβ鎖がPCR増幅され、発現ベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、α鎖およびβ鎖は、同じベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、α鎖およびβ鎖は、異なるベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、作製されたα鎖およびβ鎖は、レトロウイルス、例えばレンチウイルスのベクターに組み込まれる。
【０２９７】
c. キメラ自己抗体受容体(CAAR)
いくつかの態様において、組換え受容体は、キメラ自己抗体受容体(CAAR)である。いくつかの態様において、CAARは、自己抗体に特異的である。いくつかの態様において、CAARを発現する細胞、例えばCAARを発現するように改変されたT細胞が使用され、自己抗体発現細胞に特異的に結合してそれを殺傷することができるが、正常な抗体発現細胞にそうすることはできない。いくつかの態様において、CAAR発現細胞を使用して、自己免疫疾患などの自己抗原の発現に関連する自己免疫疾患を処置することができる。いくつかの態様において、CAAR発現細胞は、最終的に自己抗体を産生して自己抗体をその細胞表面上に提示するB細胞を標的とすることができ、治療介入のためにこれらのB細胞を疾患特異的標的としてマークすることができる。いくつかの態様において、CAAR発現細胞を使用して、抗原特異的なキメラ自己抗体受容体を使用して疾患を引き起こすB細胞を標的とすることによって、自己免疫疾患における病原体B細胞を効率的に標的化および殺傷することができる。いくつかの態様において、組換え受容体は、米国特許出願公開第US 2017/0051035号に記載のいずれかのようなCAARである。
【０２９８】
いくつかの態様において、CAARは、自己抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体(TCR)成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、二次シグナル伝達領域または共刺激シグナル伝達領域(二次細胞内シグナル伝達領域)を含む。
【０２９９】
いくつかの態様において、自己抗体結合ドメインは、自己抗原またはその断片を含む。自己抗原の選択は、標的とされる自己抗体のタイプに依存し得る。例えば、自己抗原は、特定の疾患状態、例えば自己免疫疾患、例えば自己抗体媒介性自己免疫疾患に関連する、標的細胞、例えばB細胞上の自己抗体を認識するので、それを選択してよい。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、尋常性天疱瘡(PV)を含む。例示的な自己抗原は、デスモグレイン1(Dsg1)およびDsg3を含む。
【０３００】
d. 多重標的化
いくつかの態様において、該細胞および方法は、各々が異なる抗原を認識し、典型的には各々が異なる細胞内シグナル伝達成分を含む、2以上の遺伝子改変された受容体を、細胞上で発現させるなどの、多重標的化戦略を含む。そのような多重標的化戦略は、例えば、国際特許出願公開第WO 2014055668 A1号(活性化CARと共刺激CARの組み合わせであって、例えば、オフターゲット細胞、例えば正常細胞上に個々に存在するが処置されるべき疾患または病状の細胞上にしか一緒に存在しない2つの異なる抗原を標的とする、活性化CARと共刺激CARの組み合わせについて説明している)およびFedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)(活性化CARと阻害性CARを発現する細胞、例えば、活性化CARが正常細胞または非疾患細胞と処置されるべき疾患または病状の細胞の両方に発現される一方の抗原に結合し、阻害性CARが正常細胞または処置が望ましくない細胞上にしか発現されない別の抗原に結合する、細胞について説明している)に記載されている。
【０３０１】
例えば、いくつかの態様において、細胞は、一般に第一の受容体によって認識される抗原、例えば第一の抗原への特異的結合時に、細胞に対して活性化シグナルまたは刺激シグナルを誘導することができる、第一の遺伝子改変された抗原受容体(例えば、CARまたはTCR)を発現する受容体を含む。いくつかの態様において、細胞は、一般に第二の受容体によって認識される第二の抗原への特異的結合時に、免疫細胞に対して共刺激シグナルを誘導することができる、第二の遺伝子改変された抗原受容体(例えば、CARまたはTCR)、例えば、キメラ共刺激性受容体をさらに含む。いくつかの態様において、第一の抗原および第二の抗原は同じである。いくつかの態様において、第一の抗原および第二の抗原は異なる。
【０３０２】
いくつかの態様において、第一および/または第二の遺伝子改変された抗原受容体(例えば、CARまたはTCR)は、細胞に対して活性化シグナルまたは刺激シグナルを誘導することができる。いくつかの態様において、該受容体は、ITAMまたはITAM様モチーフを含有する細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの態様において、第一の受容体によって誘導される活性化は、免疫応答の開始、例えばITAMリン酸化および/もしくはITAM媒介性シグナル伝達カスケードの開始をもたらす、細胞におけるシグナル伝達もしくはタンパク質発現の変化、免疫シナプスの形成および/もしくは結合した受容体の近くの分子(例えばCD4またはCD8など)のクラスター化、NF-κBおよび/もしくはAP-1などの1以上の転写因子の活性化、ならびに/またはサイトカインなどの因子の遺伝子発現の誘導、増殖、および/もしくは生存を伴う。
【０３０３】
いくつかの態様において、第一の受容体および/または第二の受容体は、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、および/またはICOSなどの共刺激性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、第一の受容体および第二の受容体は、異なる共刺激性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、第一の受容体は、CD28共刺激性シグナル伝達領域を含有し、第二の受容体は、4-1BB共刺激シグナル伝達領域を含有する(逆もまた同様)。
【０３０４】
いくつかの態様において、第一の受容体および/または第二の受容体は、ITAMまたはITAM様モチーフを含有する細胞内シグナル伝達ドメインと、共刺激性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインの両方を含む。
【０３０５】
いくつかの態様において、第一の受容体は、ITAMまたはITAM様モチーフを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有し、第二の受容体は、共刺激性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。同じ細胞において誘導される共刺激シグナルと活性化シグナルまたは刺激シグナルの組み合わせは、免疫応答、例えばロバストで持続した免疫応答をもたらすもの、例えば、増加した遺伝子発現、サイトカインおよび他の因子の分泌、ならびに細胞殺傷などのT細胞媒介性エフェクター機能をもたらすものである。
【０３０６】
いくつかの態様において、第一の受容体単独の連結も第二の受容体単独の連結も、ロバストな免疫応答を誘導しない。いくつかの局面において、1つの受容体だけが連結される場合、細胞は、抗原に対して寛容もしくは非応答となるかまたは阻害され、かつ/または、細胞は、増殖するようにもしくは因子を分泌するようにもしくはエフェクター機能を実行するように誘導されることはない。しかしながら、いくつかのそのような態様において、第一の抗原および第二の抗原を発現する細胞に遭遇したときなど、複数の受容体が連結するとき、例えば、1以上のサイトカインの分泌、増殖、持続、および/または標的細胞の細胞傷害性殺傷などの免疫エフェクター機能の実行によって示されるような、完全な免疫活性化または刺激などの所望の応答が達成される。
【０３０７】
いくつかの態様において、2つの受容体はそれぞれ、一方の受容体によるその抗原への結合が細胞を活性化するかまたは応答を誘導するが、第二の阻害性受容体によるその抗原への結合がその応答を抑制または減少させるシグナルを誘導するように、細胞に対して活性化シグナルおよび阻害シグナルを誘導する。例は、活性化CARと阻害性CARまたはiCARの組み合わせである。例えば、活性化CARが、疾患または病状において発現されるが正常な細胞上にも発現される抗原に結合し、阻害性受容体が、正常な細胞上に発現されるが疾患または病状の細胞上には発現されない別個の抗原に結合する、戦略を使用してよい。
【０３０８】
いくつかの態様において、特定の疾患または病状に関連する抗原が、一過性(例えば、遺伝子改変と関連した刺激時)または恒久的のいずれかで、非疾患細胞上に発現されるおよび/または改変された細胞それ自体上に発現される場合に、多重標的化戦略が用いられる。そのような場合、2つの別々のかつ個々に特異的な抗原受容体の連結を要求することによって、特異性、選択性、および/または効力が改善され得る。
【０３０９】
いくつかの態様において、複数の抗原、例えば、第一の抗原および第二の抗原は、標的とされる細胞、組織、または疾患もしくは病状、例えば、がん細胞上に、発現される。いくつかの局面において、細胞、組織、疾患または病状は、多発性骨髄腫または多発性骨髄腫細胞である。いくつかの態様において、複数の抗原の1以上は、一般に、細胞療法で標的とすることが望ましくない細胞、例えば、正常もしくは非疾患の細胞もしくは組織、および/または改変された細胞自体上にも発現される。そのような態様において、細胞の応答を達成するために複数の受容体の連結を要求することによって、特異性および/または効力が達成される。
【０３１０】
e. 他の調節エレメント
本明細書に提供される方法および組成物のいくつかの態様において、組換え受容体、例えば抗原受容体、例えばCARをコードするウイルスベクターゲノムに含有される核酸配列は、関心対象の配列の発現を特定の様式で調節するために、他の遺伝エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列と機能的な関係で機能的に連結される。ある特定の状況では、そのような転写調節配列は、活性に関して時間的および/または空間的に調節されるものである。成分の発現を調節するために使用できる発現制御エレメントは公知であり、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサーおよび他の調節エレメントを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、組換え受容体および/または改変された細胞、例えば改変された受容体を発現する細胞の発現、機能および/または活性が、調節されることができる、例えば、誘導性になる、抑制性になる、調節可能になるおよび/またはユーザーによって制御されるように、ウイルスベクターゲノムに含有される核酸配列は、異なるコードされた成分、例えば、異なる受容体成分および/またはシグナル伝達成分を制御する複数の発現制御エレメントを含有する。いくつかの態様において、核酸配列が一緒になって、コードされた成分、例えば組換え受容体または改変された細胞の発現、活性および/または機能を調節できるように、1以上のベクターは、1以上の発現制御エレメントおよび/または1以上のコードされた成分を含有する1以上の核酸配列を含有することができる。
【０３１１】
いくつかの態様において、組換え受容体、例えば抗原受容体、例えばCARをコードする核酸配列は、内部プロモーター/エンハンサー調節配列と機能的に連結される。用いられるプロモーターは、導入されたDNAセグメントの高レベル発現に向けるために、適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、および/または有用であり得る。プロモーターは、異種であっても内因性であってもよい。いくつかの態様において、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、合成によって生産される。いくつかの態様において、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、組換えクローニングおよび/または核酸増幅技術を使用して生産される。
【０３１２】
いくつかの場合に、組換え受容体をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。いくつかの局面において、シグナル配列は、ネイティブなポリペプチドに由来するシグナルペプチドをコードしてよい。他の局面において、シグナル配列は、異種または非ネイティブなシグナルペプチド、例えば、SEQ ID NO:51に示されかつSEQ ID NO:50に示されるヌクレオチド配列によってコードされるGMCSFRアルファ鎖の例示的なシグナルペプチドをコードしてよい。いくつかの場合に、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。シグナルペプチドの例示的な非限定例は、例えば、SEQ ID NO:51に示されかつSEQ ID NO:50に示されるヌクレオチド配列によってコードされるGMCSFRアルファ鎖シグナルペプチド、またはSEQ ID NO:52に示されるCD8アルファシグナルペプチドを含む。
【０３１３】
いくつかの態様において、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するために機能的に連結された、少なくとも1つのプロモーターを含有する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するために機能的に連結された、2、3またはより多いプロモーターを含有する。
【０３１４】
核酸分子が2以上の異なるポリペプチド鎖、例えば組換え受容体およびマーカーをコードするある特定の場合に、ポリペプチド鎖の各々は、別個の核酸分子によってコードされることができる。例えば、2つの別々の核酸が提供され、各々を、細胞における発現のために細胞に個々に移入または導入することができる。いくつかの態様において、組換え受容体をコードする核酸およびマーカーをコードする核酸は、同じプロモーターに機能的に連結され、場合により、内部リボソーム進入部位(IRES)によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸(場合により、T2A、P2A、E2AまたはF2Aである)によって隔てられる。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、2つの異なるプロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、細胞のゲノム内の異なる位置に存在するかまたは挿入される。いくつかの態様において、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、培養細胞を含有する組成物に、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換などによって導入される。
【０３１５】
ポリヌクレオチドが第一の核酸配列および第二の核酸配列を含有する態様などのいくつかの態様において、異なるポリペプチド鎖の各々をコードするコード配列を、同じであっても異なっていてもよいプロモーターに機能的に連結させることができる。いくつかの態様において、核酸分子は、2以上の異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含有することができる。いくつかの態様において、そのような核酸分子は、マルチシストロン性(バイシストロン性またはトリシストロン性、例えば、米国特許第6,060,273号を参照のこと)であることができる。いくつかの態様において、単一のプロモーターからのメッセージによって遺伝子産物(例えば、マーカーをコードするものおよび組換え受容体をコードするもの)の共発現を可能にする、IRES(内部リボソーム進入部位)を含有するバイシストロン性単位として、転写単位を改変することができる。あるいは、いくつかの場合に、単一のプロモーターは、自己切断ペプチドをコードする配列(例えば、2A配列)またはプロテアーゼ認識部位(例えば、フーリン)をコードする配列によって互いに隔てられた2つまたは3つの遺伝子(例えば、マーカーをコードするものおよび組換え受容体をコードするもの)を単一のオープンリーディングフレーム(ORF)に含有するRNAの発現に向け得る。したがって、ORFは、翻訳の間(2Aの場合)またはその後のいずれかに個々のタンパク質にプロセシングされる、単一のポリペプチドをコードする。いくつかの場合に、T2Aなどのペプチドは、リボソームに、2AエレメントのC末端でのペプチド結合の合成をスキップさせることができ(リボソームスキッピング)、それによって、2A配列の端と次のペプチド下流との間の隔たりを導くことができる(例えば、de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) and de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照のこと)。様々な2Aエレメントが公知である。本明細書に開示の方法およびシステムにおいて使用できる2A配列の例は、非限定的に、米国特許公報第20070116690号に記載の通りの、口蹄疫ウイルス由来の2A配列(F2A、例えば、SEQ ID NO:47)、ウマ鼻炎Aウイルス由来の2A配列(E2A、例えば、SEQ ID NO:46)、Thosea asignaウイルス由来の2A配列(T2A、例えば、SEQ ID NO:32または43)、およびブタテッショウウイルス-1由来の2A配列(P2A、例えば、SEQ ID NO:44または45)を含む。
【０３１６】
本明細書に記載の組換え受容体はいずれも、組換え受容体をコードする1以上の核酸配列を含有するポリヌクレオチドによって、任意の組み合わせまたは配置でコードされることができる。例えば、1、2、3またはより多くのポリヌクレオチドは、1、2、3またはより多くの異なるポリペプチド、例えば組換え受容体をコードすることができる。いくつかの態様において、1つのベクターまたは構築物は、マーカーをコードする核酸配列を含有し、そして、別個のベクターまたは構築物は、組換え受容体、例えばCARをコードする核酸配列を含有する。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、2つの異なるプロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様において、組換え受容体をコードする核酸は、マーカーをコードする核酸の下流に存在する。
【０３１７】
いくつかの態様において、ベクター骨格は、1以上のマーカーをコードする核酸配列を含有する。いくつかの態様において、1以上のマーカーは、形質導入マーカー、代理マーカーおよび/または選択マーカーである。
【０３１８】
いくつかの態様において、マーカーは、形質導入マーカーまたは代理マーカーである。形質導入マーカーまたは代理マーカーを使用して、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドが導入されている細胞を検出することができる。いくつかの態様において、形質導入マーカーは、細胞の修飾を示唆するかまたは裏付けることができる。いくつかの態様において、代理マーカーは、組換え受容体、例えばCARと共に細胞表面上に共発現されるタンパク質である。特定の態様において、そのような代理マーカーは、活性をほとんど有さないように修飾されている表面タンパク質である。ある特定の態様において、代理マーカーは、組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチド上にコードされる。いくつかの態様において、組換え受容体をコードする核酸配列は、マーカーをコードする核酸配列に、場合により、内部リボソーム進入部位(IRES)によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードする核酸、例えば2A配列、例えばT2A、P2A、E2AまたはF2Aによって隔てられて、機能的に連結される。いくつかの場合には、外来性のマーカー遺伝子を、細胞の検出または選択を可能にするために、いくつかの場合には、また、細胞自殺を促進するために、改変された細胞と共に利用してよい。
【０３１９】
例示的な代理マーカーは、短縮ヒト上皮成長因子受容体2(tHER2)、短縮上皮成長因子受容体(EGFRt、SEQ ID NO:33または42に示される例示的なEGFRt配列)もしくは前立腺特異的膜抗原(PSMA)またはその修飾された形態などの、短縮細胞表面ポリペプチドを含むことができる。EGFRtは、EGFRt構築物および組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体(CAR)で改変されている細胞を同定もしくは選択するためにおよび/または該受容体を発現する細胞を排除または分離するために使用することができる、抗体セツキシマブ(Erbitux(登録商標))または他の治療用抗EGFR抗体または結合分子によって認識されるエピトープを含有してよい。米国特許第8,802,374号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434を参照のこと。いくつかの局面において、マーカー、例えば代理マーカーは、CD34、NGFR、または上皮成長因子受容体(例えば、tEGFR)の全てまたは一部(例えば、短縮形態)を含む。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば切断可能リンカー配列、例えばT2Aをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカー、および場合によりリンカー配列は、PCT公開第WO2014031687号に開示の通りのいずれかであることができる。例えば、マーカーは、場合によりリンカー配列、例えばT2A切断可能リンカー配列に連結されている、短縮EGFR(tEGFR)であることができる。短縮EGFR(例えばtEGFR)についての例示的なポリペプチドは、SEQ ID NO:33もしくは42に示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:33もしくは42に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれより大きい配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
【０３２０】
いくつかの態様において、マーカーは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、例えばスーパーフォールドGFP、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えばtdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRedまたはDsRed2、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色緑色蛍光タンパク質(BFP)、高感度青色蛍光タンパク質(EBFP)、および黄色蛍光タンパク質(YFP)、ならびにそれらのバリアント(蛍光タンパク質の種バリアント、単量体バリアント、ならびにコドン最適化および/または増強されたバリアントを含む)などの蛍光タンパク質であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、マーカーは、ルシフェラーゼ、大腸菌（E. coli）由来のlacZ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)などの酵素であるかまたはそれを含む。例示的な発光受容体遺伝子は、ルシフェラーゼ(luc)、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-グルクロニダーゼ(GUS)またはそれらのバリアントを含む。
【０３２１】
いくつかの態様において、マーカーは、選択マーカーである。いくつかの態様において、選択マーカーは、外因性の作用物質または薬物に対する耐性を付与するポリペプチドであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様において、選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様において、選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子もしくはゼオシン耐性遺伝子またはそれらの修飾された形態であるかまたはそれを含む。
【０３２２】
追加の核酸の中で、例えば、導入のための遺伝子は、移入された細胞の生存率および/または機能を促進するなどによって治療の効力を改善するもの;インビボ生存または局在を評価するなどのための、細胞の選択および/または評価のための遺伝子マーカーを提供する遺伝子;例えば細胞をインビボでの負の選択に感受性にすることによって、安全性を改善する遺伝子である(Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); および Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)に記載されている通り);また、ドミナントな正の選択可能マーカーと負の選択可能マーカーとを融合することから誘導される二官能性の選択可能融合遺伝子の使用を説明しているLuptonらのPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の刊行物も参照のこと。例えば、Riddellらの米国特許第6,040,177号の14〜17行を参照のこと。
【０３２３】
いくつかの態様において、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、コードセグメントおよび/またはエクソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することによって得られるような、核酸配列に天然で関連するものであってよい。あるいは、いくつかの態様において、コード核酸セグメントは、天然の状況下でコード核酸配列に通常関連しない、組換えおよび/または異種のプロモーターおよび/またはエンハンサーの制御下に位置付けてよい。例えば、組換えDNA構築において使用される例示的なプロモーターは、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)、ラクトース、トリプトファン(trp)、RNAポリメラーゼ(pol)IIIプロモーター(ヒトおよびマウスのU6 pol IIIプロモーターならびにヒトおよびマウスのH1 RNA pol IIIプロモーターを含む);RNAポリメラーゼ(pol)IIプロモーター;サイトメガロウイルス最初期プロモーター(pCMV)、伸長因子-1アルファ(EF-1アルファ)、およびラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター(pRSV)のプロモーター系を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから得てよい。プロモーターはまた、例えば、異種の哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、またはネイティブな配列に通常関連するプロモーターであってもよいが、但し、そのようなプロモーターは、標的細胞と適合可能であるものとする。一態様において、プロモーターは、ウイルス発現系における天然に存在するウイルスプロモーターである。
【０３２４】
いくつかの態様において、プロモーターは、構成的に活性であってよい。使用してよい構成的プロモーターの非限定例は、ユビキチン用プロモーター(米国特許第5,510,474号;WO 98/32869)、CMV用プロモーター(Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984;米国特許第5,168,062号)、ベータアクチン用プロモーター(Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835)、およびpgk用プロモーター(例えば、Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417; および Dobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637を参照のこと)を含む。
【０３２５】
いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターおよび/または標的細胞特異的プロモーターであってよい。いくつかの態様において、関心対象の配列の誘導性発現を可能にするプロモーターを選択してよい。テトラサイクリン応答系、lacオペレーター-レプレッサー系、ならびに、熱ショック、金属イオン(例えば、メタロチオネインプロモーター)、インターフェロン、低酸素、ステロイド(例えば、プロゲステロンまたは糖質コルチコイド受容体プロモーター)、放射線(例えば、VEGFプロモーター)を含む多種多様な環境または生理学的変化に応答性のプロモーターを含め、誘導性発現のための多数の系が公知である。いくつかの態様において、tetオペレーター配列(TECO)に対する大腸菌（Escherichia coli）のtet抑制(tetr)の阻害作用に基づくテトラサイクリン-(tet)-調節可能系を、哺乳動物系で使用するために修飾して、発現カセットのための調節可能エレメントとして使用することができる。これらの系は、周知である(Goshen and Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992), Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996), Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)を参照のこと)。
【０３２６】
また、関心対象の遺伝子の所望の発現を得るために、プロモーターの組み合わせを使用してもよい。当業者は、関心対象の生物または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができる。
【０３２７】
いくつかの態様において、関心対象の遺伝子の発現を増加させるためにウイルス構築物中にエンハンサーが存在してもよい。エンハンサーは、典型的には、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常約10〜300の長さのシス作用性核酸エレメントである。HIVまたはCMVなどのウイルスゲノム内の多くのエンハンサーが公知である。例えば、CMVエンハンサー(Boshart et al. Cell, 41:521, 1985)を使用することができる。他の例は、例えば、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp 100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。いくつかの場合に、エンハンサーは、哺乳動物遺伝子由来のもの、例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトタンパク質またはインスリン由来のエンハンサーである。エンハンサーを、異種のプロモーターと組み合わせて使用することができる。エンハンサーを、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に対して5’または3’の位置でベクターに接合してよいが、一般にプロモーターから5’の部位に位置する。当業者は、所望の発現パターンに基づいて、適切なエンハンサーを選択することができる。
【０３２８】
ウイルスベクターゲノムはまた、追加の遺伝エレメントを含有してもよい。構築物に含めることができるエレメントのタイプは、いかようにも限定されることなく、当業者が選択することができる。
【０３２９】
例えば、標的細胞におけるウイルスゲノムの核移行を容易にするシグナルを含んでよい。そのようなシグナルの例は、HIV-1フラップシグナル(いくつかの場合に、フラップ配列と称される)である。加えて、ベクターゲノムは、関心対象の遺伝子の発現を増強するように設計された1以上の遺伝エレメントを含有してよい。いくつかの態様において、そのゲノムは、転写後活性を示す転写後調節エレメント(PRE)またはその修飾された形態を含有する。例えば、いくつかの態様において、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答エレメント(WPRE)を構築物内に置いてよい(Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190)。いくつかの態様において、ベクターゲノムは、フラップ配列を欠いており、かつ/またはWPREを欠いている。いくつかの態様において、ベクターゲノムは、変異したまたは欠陥のあるフラップ配列および/またはWPREを含有する。
【０３３０】
いくつかの状況で、別々の異種タンパク質をコードする1を超えるオープンリーディングフレームを含めることができる。例えば、いくつかの態様において、発現構築物にレポーター遺伝子ならびに/または検出可能および/もしくは選択可能遺伝子が含まれる場合、内部リボソーム進入部位(IRES)配列を含めることができる。典型的には、追加の遺伝エレメントは、独立のプロモーター/エンハンサーと機能的に連結され、それによって制御される。追加の遺伝エレメントは、レポーター遺伝子、選択可能マーカーまたは他の所望の遺伝子であることができる。
【０３３１】
いくつかの態様において、他の様々な調節エレメントは、転写開始領域および/または終結領域を含むことができる。発現ベクターはまた、転写の終結のための配列およびmRNAを安定化させる配列を含有してもよい。そのような配列は、公知であり、天然では真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’、時には3’の非翻訳領域に見いだされることが多い。転写終結領域の例は、ポリアデニル化シグナル配列を含むが、それに限定されない。ポリアデニル化シグナル配列の例は、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリ(A)、SV40後期ポリ(A)、ウサギベータ-グロビン(RBG)ポリ(A)、チミジンキナーゼ(TK)ポリ(A)配列、およびそれらの任意のバリアントを含むが、それらに限定されない。
【０３３２】
いくつかの態様において、調節エレメントは、組換え受容体、例えばCARの調節可能な発現および/または活性を可能にする、調節エレメントおよび/または系を含むことができる。いくつかの態様において、調節可能な発現および/または活性は、特定の調節エレメントおよび/または系を含有するようにまたはそれによって制御されるように組換え受容体を構成することによって、達成される。いくつかの態様において、1以上の追加の受容体を発現調節系において使用することができる。いくつかの態様において、発現調節系は、組換え受容体の発現および/または活性を調節できる特異的リガンドへの曝露またはその結合を必要とする系を含むことができる。いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCARの調節された発現は、調節可能な転写因子放出系、例えば、修飾されたNotchシグナル伝達系で達成される(例えば、Roybal et al., Cell (2016) 164:770-779; Morsut et al., Cell (2016) 164:780-791を参照のこと)。いくつかの態様において、組換え受容体の活性の調節は、ポリペプチド、例えば組換え受容体の立体構造変化および/または多量体化を誘導することができる、追加の作用物質の投与によって達成される。いくつかの態様において、追加の作用物質は、化学誘導因子である(例えば、米国特許公報第2016/0046700号, Clackson et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10437-42; Spencer et al. (1993) Science 262(5136):1019-24; Farrar et al. (1996) Nature 383 (6596):178-81; Miyamoto et al. (2012) Nature Chemical Biology 8(5): 465-70; Erhart et al. (2013) Chemistry and Biology 20(4): 549-57を参照のこと)。
【０３３３】
4. ウイルスベクター粒子の調製
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージング細胞株または産生細胞株にトランスフェクトすることができるプラスミド形態で構築される。多種多様な公知の方法のいずれかを使用して、そのゲノムがウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含有するレトロウイルス粒子を生産することができる。いくつかの態様において、少なくとも2つの成分が、ウイルスベースの遺伝子送達系の製造に関与する:第一に、ウイルスベクター粒子を生成するために必要な構造タンパク質ならびに酵素を包含するパッケージングプラスミド、ならびに、第二に、ウイルスベクターそれ自体、すなわち移入されるべき遺伝物質。これらの成分の一方または他方の設計にバイオセーフティー予防措置を導入することができる。
【０３３４】
いくつかの態様において、パッケージングプラスミドは、エンベロープタンパク質以外の全てのレトロウイルス、例えばHIV-1のタンパク質を含有することができる(Naldini et al., 1998)。他の態様において、ウイルスベクターは、追加のウイルス遺伝子、例えば病原性と関連するもの、例えば、vpr、vif、vpuおよびnef、ならびに/またはTat(HIVの一次トランス活性化因子)を欠いていることができる。いくつかの態様において、レンチウイルスベクター、例えばHIV系レンチウイルスベクターは、親ウイルスの3つの遺伝子gag、polおよびrevのみ含み、これは、組換えを介した野生型ウイルスの再構築の実現性を低減または排除する。
【０３３５】
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするのに必要な成分全てを含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、関心対象の1以上の配列、例えば、組換え核酸の他に、ウイルス成分をコードする1以上の遺伝子を含んでよい。しかしながら、いくつかの局面において、標的細胞におけるゲノムの複製を防止するために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株において別々に提供される。
【０３３６】
いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、粒子を生成するのに必要な成分を含有する1以上のプラスミドベクターがトランスフェクトされる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、LTRを含むウイルスベクターゲノム、シス作用性パッケージング配列および関心対象の配列、すなわち抗原受容体(例えば、CAR)をコードする核酸を含有する、プラスミド；ならびにウイルスの酵素成分および/または構造成分(例えば、Gag、polおよび/またはrev)をコードする1以上のヘルパープラスミドがトランスフェクトされる。いくつかの態様において、レトロウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝子成分を分けるために複数のベクターが利用される。いくつかのそのような態様において、分けられたベクターをパッケージング細胞へ提供することは、そうしなければ複製能を有するウイルスを生成し得る組換え事象の機会を低減する。いくつかの態様において、レトロウイルス成分の全てを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。
【０３３７】
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を増加させるようにシュードタイプ化される。例えば、レトロウイルスベクター粒子、例えばレンチウイルスベクター粒子は、いくつかの態様において、VSV-G糖タンパク質でシュードタイプ化され、これは、形質導入することができる細胞タイプを拡張する広範な細胞宿主範囲を提供する。いくつかの態様において、例えば、異種指向性、多指向性または両指向性のエンベロープ、例えばシンドビスウイルスエンベロープ、GALVまたはVSV-Gを含めるために、パッケージング細胞株に、非ネイティブなエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドがトランスフェクトされる。
【０３３８】
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAのレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングにトランスで必要な、ウイルス調節タンパク質および構造タンパク質を含む成分を提供する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現して機能的レンチウイルスベクター粒子を生産することができる、任意の細胞株であってよい。いくつかの局面において、好適なパッケージング細胞株は、293細胞(ATCC CCL X)、293T細胞、HeLA細胞(ATCC CCL 2)、D17細胞(ATCC CCL 183)、MDCK細胞(ATCC CCL 34)、BHK細胞(ATCC CCL-10)およびCf2Th細胞(ATCC CRL 1430)を含む。
【０３３９】
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質を安定に発現する。例えば、いくつかの局面において、gag、pol、revおよび/または他の構造遺伝子を含有するがLTRおよびパッケージング成分を含有しないパッケージング細胞株を構築することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、異種タンパク質をコードする核酸分子および/またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含有するウイルスベクターゲノムと一緒に、1以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子を一過性にトランスフェクトすることができる。
【０３４０】
いくつかの態様において、ウイルスベクターならびにパッケージングおよび/またはヘルパープラスミドは、トランスフェクションまたは感染を介して、パッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有するウイルスベクター粒子を生産する。トランスフェクションまたは感染のための方法は、周知である。非限定例は、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法およびリポフェクション法、エレクトロポレーションならびにマイクロインジェクションを含む。
【０３４１】
組換えプラスミドならびにレトロウイルスのLTR配列およびパッケージング配列が特定の細胞株に導入されたとき(例えば、リン酸カルシウム沈降などによって)、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子内にパッケージングされることを許可し得、これが次いで培養培地中に分泌され得る。組換えレトロウイルスを含有する培地は、いくつかの態様において、その後収集され、場合により濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。例えば、いくつかの局面において、パッケージングプラスミドおよび導入ベクターのパッケージング細胞株への共トランスフェクション後、ウイルスベクター粒子が培養培地から回収され、当業者によって使用される標準的な方法によって力価測定される。
【０３４２】
いくつかの態様において、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入によって、パッケージング細胞株、例えば例示的なHEK 293T細胞株において、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを生産することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞に、gagおよびpolをコードするポリヌクレオチド、ならびに組換え受容体、例えば抗原受容体、例えばCARをコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、かつ/またはそれを含有する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、場合によりおよび/または追加的に、revタンパク質をコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、かつ/またはそれが含有される。いくつかの態様において、パッケージング細胞株に、場合によりおよび/または追加的に、非ネイティブなエンベロープ糖タンパク質、例えばVSV-Gをコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、かつ/またはそれが含有される。いくつかのそのような態様において、細胞、例えば、HEK 293T細胞のトランスフェクションのおよそ2日後、細胞上清は、回収および力価測定することができる組換えレンチウイルスベクターを含有する。
【０３４３】
回収および/または生産されたレトロウイルスベクター粒子を使用して、記載の通りの方法を使用して標的細胞を形質導入することができる。一旦標的細胞に入れば、ウイルスRNAは、逆転写され、核に輸送され、そして宿主ゲノムに安定に組み込まれる。ウイルスRNAの組み込みの1日後または2日後に、組換えタンパク質、例えば抗原受容体、例えばCARの発現を検出することができる。
【０３４４】
C. インキュベーション
いくつかの態様において、提供される方法は、複数の細胞を含む細胞組成物(本明細書で以降「インプット組成物」とも呼ばれる)と(1)ウイルス粒子とを接触させる、例えばインキュベートすることによる、細胞を形質導入する方法を伴う。いくつかの態様において、インプット組成物は、対象から得られた初代細胞、例えば対象から濃縮および/または選択された細胞であるかまたはそれを含む。
【０３４５】
いくつかの態様において、インプット組成物は、対象から得られた初代細胞を含む。いくつかの局面において、試料は、全血試料、バッフィーコート試料、末梢血単核細胞(PBMC)試料、未分画のT細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物、または白血球除去産物である。
【０３４６】
いくつかの態様において、細胞の選択および/または形質導入の前に、初代細胞を含有する試料を、少なくとも10%(v/v)もしくは少なくとも約10%(v/v)、少なくとも15%(v/v)もしくは少なくとも約15%(v/v)、少なくとも20%(v/v)もしくは少なくとも約20%(v/v)、少なくとも25%(v/v)もしくは少なくとも約25%(v/v)、少なくとも30%(v/v)もしくは少なくとも約30%(v/v)、少なくとも35%(v/v)もしくは少なくとも約35%(v/v)、少なくとも40%(v/v)もしくは少なくとも約40%(v/v)、または少なくとも50%もしくは少なくとも約50%の濃度の血清または血漿とエクスビボで接触させるかまたはそれを含有する。いくつかの態様において、試料は、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、もしくは35%(v/v)であるか、またはおよそ約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、もしくは35%(v/v)、または少なくとも約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、もしくは35%(v/v)である濃度の血清または血漿を含有する。いくつかの態様において、血清または血漿は、ヒトである。いくつかの態様において、血清または血漿は、対象に対して自己である。いくつかの態様において、細胞の選択および/または形質導入の前に、初代細胞を含有する試料を抗凝血剤と接触させるかまたはそれが含有される。いくつかの態様において、抗凝血剤は、遊離クエン酸イオン、例えば抗凝血剤クエン酸デキストロース溶液Solution A(ACD-A)であるかまたはそれが含有される。
【０３４７】
いくつかの態様において、細胞の選択および/または形質導入の前に、試料は、2℃〜8℃または約2℃〜8℃の温度で最大48時間、例えば最大12時間、24時間または36時間維持される。
【０３４８】
いくつかの態様において、インプット組成物は、CD4+および/またはCD8+T細胞を含むT細胞を含み、かつ/または濃縮される。いくつかの局面において、濃縮は、初代細胞と初代細胞のサブ集団上に発現される細胞表面分子に特異的に結合する1以上の選択試薬または親和性試薬とのインキュベーションによる、親和性に基づく選択によって行うことができ、それによって選択試薬への結合に基づいて初代細胞が濃縮される。いくつかの態様において、濃縮は、細胞と、抗体コート粒子、例えば磁気ビーズとのインキュベーションによって行うことができる。
【０３４９】
いくつかの態様において、インプット組成物は、対象由来の試料から得られた75%、80%、85%、90%、95%超または約75%、80%、85%、90%、95%超のT細胞またはそれより多いT細胞を含む。いくつかの局面において、インキュベーションの前、インプット組成物のT細胞の5%、10%、20%、30%、または40%以下は、活性化された細胞であり、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し;IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、細胞周期のG1もしくはより後期にあり、かつ/または、増殖することができる。
【０３５０】
いくつかの態様において、そのような細胞、例えばインキュベートおよび/または接触の前に1以上の刺激物質によるエクスビボ刺激に供されていない細胞を含有するインプット組成物は、細胞の20%、30%、40%、50%、60%、70%超またはそれより多くが低密度脂質受容体(LDL-R)を発現する組成物である。いくつかの態様において、インプット組成物は、T細胞、例えばCD4+および/またはCD8+T細胞について濃縮および/または選択され、そして、前記インキュベートの前に、T細胞の20%、30%、40%、50%、60%、70%超またはそれより多くが低密度脂質受容体(LDL-R)を発現する。
【０３５１】
いくつかの態様において、インキュベートおよび/または接触の間またはその少なくともの一部の間、インプット組成物は、1以上のサイトカインを含むことができる。いくつかの態様において、サイトカインは、IL-2、IL-7またはIL-15から選択される。いくつかの態様において、サイトカインは、組換えサイトカインである。いくつかの態様において、インプット組成物中のサイトカインの濃度は、独立に、1IU/mL〜1500IU/mLまたは約1IU/mL〜1500IU/mL、例えば1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、5IU/mL〜10IU/mL、10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mLもしくは100IU/mL〜200IU/mL、50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mLもしくは200IU/mL〜600IU/mL、または約1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、5IU/mL〜10IU/mL、10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mLもしくは100IU/mL〜200IU/mL、50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mLもしくは200IU/mL〜600IU/mLである。いくつかの態様において、インプット組成物中のサイトカインの濃度は、独立に、少なくとも1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mLもしくは1500IU/mL、または少なくとも約1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mLもしくは1500IU/mLである。ある特定の局面において、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体などのTCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる作用物質を、インキュベートの間もしくはその少なくともの一部の間またはインキュベートに続く間もしくはその少なくともの一部の間に含めることもできる。
【０３５２】
いくつかの態様において、インキュベートおよび/または接触の間またはその少なくともの一部の間、インプット組成物は、血清を含むことができる。いくつかの態様において、血清は、ウシ胎児血清である。いくつかの態様において、血清は、ヒト血清である。いくつかの態様において、血清は、インプット組成物中に、0.5%〜25%(v/v)、1.0%〜10%(v/v)、もしくは2.5%〜5.0%(v/v)、または約0.5%〜25%(v/v)、1.0%〜10%(v/v)、もしくは2.5%〜5.0%(v/v)(各数値を含む)の濃度で存在する。いくつかの態様において、血清は、インプット組成物中に、少なくとも0.5%(v/v)、1.0%(v/v)、2.5%(v/v)、5%(v/v)もしくは10%(v/v)、または少なくとも約0.5%(v/v)、1.0%(v/v)、2.5%(v/v)、5%(v/v)もしくは10%(v/v)である濃度で存在する。
【０３５３】
いくつかの態様において、インキュベートおよび/または接触の間またはその少なくともの一部の間、インプット組成物は、血清を含有しないおよび/または実質的に含有しない。いくつかの態様において、インキュベートおよび/または接触の間またはその少なくともの一部の間、インプット組成物を、血清の非存在下でインキュベートおよび/または接触させる。特定の態様において、インキュベートおよび/または接触の間またはその少なくともの一部の間、インプット組成物を、血清不含培地中でインキュベートおよび/または接触させる。いくつかの態様において、血清不含培地は、規定されたおよび/または十分に規定された細胞培養培地である。ある特定の態様において、血清不含培地は、阻害剤および/または成長因子を除去するように処理された、例えば濾過された、制御培養培地である。いくつかの態様において、血清不含培地は、タンパク質を含有する。ある特定の態様において、血清不含培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、キャリアタンパク質、および/または接着因子を含有してよい。いくつかの態様において、血清不含培地は、タンパク質、例えば、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、および/または組換えアルブミンを含有する。いくつかの態様において、血清不含培地は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝液、酸化防止剤およびエネルギー源を含有する、基礎培地、例えばDMEMまたはRPMI 1640を含有する。いくつかの態様において、血清不含培地に、例えば限定されないが、アルブミン、化学的に定義された脂質、成長因子、インスリン、サイトカイン、および/または酸化防止剤が補充される。いくつかの態様において、血清不含培地は、免疫細胞、T細胞、ならびに/またはCD4+およびCD8+T細胞などのある特定の細胞タイプの細胞の成長、増殖、健康、恒常性を支援するように編成される。
【０３５４】
いくつかの態様において、インキュベートおよび/または接触の間またはその少なくともの一部の間、インプット組成物は、N-アセチルシステインを含む。いくつかの態様において、インプット組成物中のN-アセチルシステインの濃度は、0.4mg/mL〜4mg/mL、0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは1.6mg/mL〜2.4mg/mL、または約0.4mg/mL〜4mg/mL、0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは1.6mg/mL〜2.4mg/mL(各数値を含む)である。いくつかの態様において、インプット組成物中のN-アセチルシステインの濃度は、少なくとも0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mLもしくは4.0mg/mL、または少なくとも約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mLもしくは4.0mg/mL、または約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mLもしくは4.0mg/mLである。
【０３５５】
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞の濃度は、1.0×105の細胞/mL〜1.0×108の細胞/mLまたは約1.0×105の細胞/mL〜1.0×108の細胞/mL、例えば、少なくとも1.0×105の細胞/mL、5×105の細胞/mL、1×106の細胞/mL、5×106の細胞/mL、1×107の細胞/mL、5×107の細胞/mLもしくは1×108の細胞/mL、または少なくとも約1.0×105の細胞/mL、5×105の細胞/mL、1×106の細胞/mL、5×106の細胞/mL、1×107の細胞/mL、5×107の細胞/mLもしくは1×108の細胞/mL、または約1.0×105の細胞/mL、5×105の細胞/mL、1×106の細胞/mL、5×106の細胞/mL、1×107の細胞/mL、5×107の細胞/mLもしくは1×108の細胞/mLである。
【０３５６】
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子のコピーまたはその感染単位(IU)の、インプット組成物中の総細胞数当たりの特定の比率(IU/細胞)または形質導入されるべき総細胞数当たりの特定の比率のウイルス粒子が提供される。例えば、いくつかの態様において、ウイルス粒子は、接触させる間、1細胞当たり、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、もしくは60IU、または約0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、もしくは60IU、または少なくとも0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、もしくは60IU、または少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、もしくは60IUのウイルスベクター粒子で存在する。
【０３５７】
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子の力価は、1×106IU/mL〜1×108IU/mLまたは約1×106IU/mL〜1×108IU/mL、例えば5×106IU/mL〜5×107IU/mLまたは約5×106IU/mL〜5×107IU/mL、例えば少なくとも6×106IU/mL、7×106IU/mL、8×106IU/mL、9×106IU/mL、1×107IU/mL、2×107IU/mL、3×107IU/mL、4×107IU/mL、または5×107IU/mLである。
【０３５８】
いくつかの態様において、形質導入は、100未満、例えば一般に60、50、40、30、20、10、5未満またはより少ない多重感染度(MOI)で達成することができる。
【０３５９】
いくつかの態様において、該方法は、細胞とウイルス粒子とを接触またはインキュベートすること、例えば混合することを伴う。いくつかの態様において、接触させることは、30分間〜72時間、例えば30分間〜48時間、30分間〜24時間または1時間〜24時間、例えば少なくとも30分間、1時間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、または少なくとも約30分間、1時間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間またはそれより長い接触である。
【０３６０】
いくつかの態様において、接触させることは、溶液中で実施される。いくつかの態様において、細胞とウイルス粒子とを、0.5mL〜500mLまたは約0.5mL〜500mL、例えば0.5mL〜200mL、0.5mL〜100mL、0.5mL〜50mL、0.5mL〜10mL、0.5mL〜5mL、5mL〜500mL、5mL〜200mL、5mL〜100mL、5mL〜50mL、5mL〜10mL、10mL〜500mL、10mL〜200mL、10mL〜100mL、10mL〜50mL、50mL〜500mL、50mL〜200mL、50mL〜100mL、100mL〜500mL、100mL〜200mLもしくは200mL〜500mL、または約0.5mL〜200mL、0.5mL〜100mL、0.5mL〜50mL、0.5mL〜10mL、0.5mL〜5mL、5mL〜500mL、5mL〜200mL、5mL〜100mL、5mL〜50mL、5mL〜10mL、10mL〜500mL、10mL〜200mL、10mL〜100mL、10mL〜50mL、50mL〜500mL、50mL〜200mL、50mL〜100mL、100mL〜500mL、100mL〜200mLもしくは200mL〜500mLの量で接触させる。
【０３６１】
いくつかの態様において、接触させることは、スピン接種(例えば遠心接種)などの遠心分離で達成することができる。いくつかの態様において、細胞、ウイルス粒子および試薬を含有する組成物を、一般に、比較的低い力または速度で、例えば細胞をペレット化するのに使用されるより遅い速度、例えば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜1700rpm(例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpm、もしくは1700rpm、または約600rpm、1000rpm、もしくは1500rpm、もしくは1700rpm、または少なくとも600rpm、1000rpm、もしくは1500rpm、もしくは1700rpm)で回転させることができる。いくつかの態様において、回転は、例えばチャンバーまたはキャビティーの内壁もしくは外壁で測定された場合に100g〜3200gまたは約100g〜3200g(例えば、100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3200g、または約100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3200g、または少なくとも100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3200g、または少なくとも約100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3200g)の力、例えば、相対遠心力で行われる。「相対遠心力」またはRCFという用語は、一般に、回転軸と比較した空間内の特定の点における、地球の重力に相対的な、物体または物質(例えば、細胞、試料、もしくはペレットおよび/または回転させられているチャンバーもしくは他の容器内の点)に付与される有効力であると理解される。その値は、周知の式を使用して、重力、回転速度および回転半径(回転軸とRCFが測定されている物体、物質、または粒子との距離)を考慮に入れて決定してよい。
【０３６２】
いくつかの態様において、細胞とウイルスベクター粒子とのインキュベーションは、ウイルスベクター粒子で形質導入された細胞を含むアウトプット組成物をもたらすかまたは生産する。
【０３６３】
D. 他の処理工程
いくつかの態様において、形質導入のための処理工程、例えば細胞改変に関連する処理工程は、細胞の培養（culture）、培養(cultivation)、刺激、活性化、増加および/または製剤化を追加で含むことができる。いくつかの態様において、アウトプット組成物または細胞は、刺激条件または刺激物質の存在下でインキュベートされる。そのような条件は、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化、および/もしくは生存を誘導するように、ならびに/または抗原曝露を模倣するように、設計された条件を含む。刺激は、対象への投与後にエクスビボまたはインビボで行うことができる。
【０３６４】
1. 細胞の形質導入後活性化および/または拡大
いくつかの態様において、細胞、例えばアウトプット組成物は、遺伝子改変に関連してさらにインキュベートおよび/またはさらに培養される。インキュベーション工程は、培養（culture）、培養(cultivation)、刺激、活性化、および/または増加を含むことができる。いくつかのそのような態様において、さらなるインキュベーションは、1以上の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組み込みをもたらす条件下で達成される。インキュベーションおよび/または改変は、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養ディッシュ、バッグ、または細胞を培養（culture）もしくは培養する（cultivating）ための他の容器などの培養容器中で行ってよい。いくつかの態様において、組成物または細胞は、刺激条件または刺激物質の存在下でインキュベートされる。そのような条件は、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化、および/もしくは生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、かつ/または、遺伝子改変のため、例えば組換え抗原受容体の導入のため細胞をプライミングするように、設計された条件を含む。
【０３６５】
いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、室温よりも高い、例えば25℃または約25℃よりも高い、例えば一般に32℃、35℃もしくは37℃または約32℃、35℃もしくは37℃よりも高い温度で行われる。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、37℃±2℃または約37℃±2℃の温度で、例えば37℃または約37℃の温度で達成される。
【０３６６】
いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、細胞の刺激および/または活性化のための条件下で実施され、その条件は、特定の媒体、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質の1以上を含むことができる。
【０３６７】
いくつかの態様において、刺激条件または刺激物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる、1以上の作用物質(例えば、刺激物質および/またはアクセサリー物質)、例えば、リガンドを含む。いくつかの局面において、一次シグナルを送達するのに、例えば、ITAM誘導性シグナルの活性化を開始するのに好適な作用物質、例えばTCR成分に特異的な作用物質、および/または共刺激シグナルを促進する作用物質、例えばT細胞共刺激性受容体に特異的な作用物質、例えば、抗CD3、抗CD28、もしくは抗41-BB(例えば、場合によりビーズなどの固体支持体に結合している)、および/または1以上のサイトカインなどの作用物質は、T細胞においてTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを有効にするかまたは開始する。中でも、刺激物質は、抗CD3/抗CD28ビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T Cell Expander、および/またはExpACT(登録商標)ビーズ)である。場合により、拡大法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培養培地に添加する工程をさらに含んでよい。いくつかの態様において、刺激物質は、IL-2および/またはIL-15、例えば、少なくとも約10ユニット/mLの濃度のIL-2を含む。
【０３６８】
いくつかの態様において、刺激条件または刺激物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる、1以上の作用物質、例えば、リガンドを含む。いくつかの局面において、作用物質は、T細胞においてTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを有効にするかまたは開始する。そのような作用物質は、抗体、例えばTCR成分および/または共刺激性受容体に特異的な抗体、例えば、抗CD3、抗CD28(例えば、ビーズなどの固体支持体に結合している)、および/または1以上のサイトカインを含むことができる。場合により、拡大法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培養培地に(例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で)添加する工程をさらに含んでよい。いくつかの態様において、刺激物質は、IL-2および/またはIL-15、例えば、少なくとも約10ユニット/mL、少なくとも約50ユニット/mL、少なくとも約100ユニット/mLまたは少なくとも約200ユニット/mLの濃度のIL-2を含む。
【０３６９】
該条件は、特定の媒体、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質の1以上を含むことができる。
【０３７０】
いくつかの局面において、インキュベーションは、Riddell等の米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および/またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されているものなどの技術に従って行われる。
【０３７１】
いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、接触が行われる同じ容器または装置内で行われる。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、回転または遠心分離なしで行われ、それは、一般には、回転下で、例えば、遠心分離またはスピン接種と共に行われるインキュベーションの少なくとも一部に続いて行われる。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、固定相以外で、例えばクロマトグラフィーマトリックス以外で、例えば、溶液中で行われる。
【０３７２】
いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、ウイルス粒子および試薬との接触に続いて細胞組成物を異なる容器または装置内へ移送、例えば、自動移送することなどによって、接触が行われるものとは異なる容器または装置内で行われる。
【０３７３】
いくつかの態様において、培養開始組成物に、フィーダー細胞、例えば非分裂末梢血単核細胞(PBMC)を(例えば、得られた細胞集団が、拡大されるべき初期集団中のTリンパ球毎に少なくとも約5、10、20、もしくは40またはそれより多いPBMCフィーダー細胞を含有するように)添加し;培養物を(例えば、T細胞数が増加するのに十分な時間)インキュベートすることによって、T細胞が拡大される。いくつかの局面において、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ照射PBMCフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの態様において、細胞分裂を防止するために、PBMCに、約3000〜3600radの範囲のガンマ線が照射される。いくつかの局面において、T細胞集団の添加の前に、フィーダー細胞が培養培地に添加される。
【０３７４】
いくつかの態様において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の成長に適した温度、例えば、少なくともセ氏約25度、一般に少なくとも約30度、そして、一般にセ氏37度または約37度を含む。場合により、インキュベーションは、分裂しない、ウイルスで形質転換されたリンパ芽球様細胞(LCL)をフィーダー細胞として添加することをさらに含んでよく、例えば、ウイルスは、EBV、CMV、またはインフルエンザであってよく、そして、形質転換されたLCLは、その表面上に、場合によりMHCの状況において、ウイルス由来抗原を提示する。いくつかの態様において、T細胞は、ウイルス抗原を認識するTCRを発現する。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、EBV、CMV、またはインフルエンザに由来してよい。LCLに、約6000〜10,000radの範囲のガンマ線を照射することができる。LCLフィーダー細胞は、いくつかの局面において、任意の好適な量で、例えば少なくとも約10:1のLCLフィーダー細胞と初期Tリンパ球の比で提供される。
【０３７５】
いくつかの態様において、さらなる培養またはインキュベーション、例えばエクスビボ拡大を容易にするためのさらなる培養またはインキュベーションは、24時間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間もしくは14日間超、または約24時間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間もしくは14日間超行われる。いくつかの態様において、さらなる培養またはインキュベーションは、6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または24時間以内で行われる。
【０３７６】
いくつかの態様において、インキュベーション、例えば刺激物質とのインキュベーションの全期間は、1時間〜96時間、1時間〜72時間、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間、または約1時間〜96時間、1時間〜72時間、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間、例えば少なくとも6時間、12時間、18時間、24時間、36時間もしくは72時間、または少なくとも約6時間、12時間、18時間、24時間、36時間もしくは72時間である。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間、または約1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間(数値を含む)の時間のインキュベーションである。
【０３７７】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法は、さらなる培養もしくはインキュベーションを含まない、例えば、エクスビボ拡大工程を含まないか、または、実質的により短いエクスビボ拡大工程を含む。
【０３７８】
いくつかの態様において、細胞を改変する全プロセス、例えば、選択および/もしくは濃縮、形質導入に関連したインキュベーションおよび/またはさらなる培養（culturing）もしくは培養（cultivation）は、対象から試料を得た後9日以内、8日以内、7日以内、6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内の期間内に行われる。そのようなタイミングは、細胞を凍結保存に供する期間を全く含まないことが理解される。
【０３７９】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、改変された細胞、例えばアウトプット組成物または製剤化された組成物は、対象に、形質導入直後にまたは間もなく、ほとんどエクスビボ拡大なしに投与される。いくつかの態様において、改変された細胞を、形質導入工程直後に投与することができる。いくつかの態様において、改変された細胞を、形質導入工程後間もなく、例えば、ほとんどエクスビボ拡大なしでまたは従来の方法よりも実質的に短いエクスビボ拡大で投与することができるが、これは、顕著なインビトロ活性化、拡大および/または濃縮を必要とし得る。例えば、本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、改変された細胞を、形質導入の3、2または1日以内に投与することができる。いくつかの態様において、改変された細胞を、形質導入工程の48、36、24、20、16、12、8、4、2、1時間以内またはより少ない時間以内に投与することができる。いくつかの態様において、改変された細胞は、従来の方法よりも実質的に短いインビトロ拡大に、例えば、48、36、24、20、16、12、8、4、2、1時間またはより少ない時間供される。
【０３８０】
そのような態様のいずれかにおいて、細胞の拡大および/または活性化、例えば、細胞の投与後の対象の体内での改変された細胞の拡大を、抗原への曝露後インビボで行うことができる。いくつかの態様において、投与された細胞、例えば、組換え受容体発現細胞の拡大、増殖、生存および/または効力をモジュレート、例えば増加させることができる様々な方法によって、インビボ拡大の程度、度合いまたは大きさを、さらに増大、ブーストまたは強化させることができる。
【０３８１】
いくつかの態様において、そのような方法は、分子の発現または活性を変更(例えば、増加または減少)させる作用物質、例えば核酸でさらに修飾されている改変細胞の投与を伴う方法であって、そのような変更された発現または活性が、投与された細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を増大、ブーストまたは強化する方法を含む。いくつかの態様において、作用物質、例えば核酸の発現は、誘導因子または他のモジュレート分子の投与などによって、誘導性である、抑制性である、調節可能であるおよび/またはユーザーによって制御される。
【０３８２】
いくつかの態様において、そのような方法は、投与された細胞、例えば、組換え受容体発現細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を増大、ブーストまたは強化することができる薬物または作用物質との組み合わせ投与、例えば同時投与または連続投与を伴う方法を含む。例示的なそのような薬物および作用物質をセクションIIIに記載する。
【０３８３】
2. 製剤化
いくつかの態様において、さらなるインキュベーションに続いて、細胞を調製するためのプロセスは、細胞を洗浄または製剤化することをさらに含むことができる。したがって、中でも、処理工程は、そのような組成物を製剤化することを含んでよい。
【０３８４】
また、そのような方法において使用するための薬学的組成物または製剤であって、いくつかの態様において、提供される処理方法と共に、例えば自動または一部自動方式などの他の処理工程が行われる閉鎖系で製剤化される、薬学的組成物または製剤も提供される。
【０３８５】
いくつかの態様において、細胞および組成物は、薬学的組成物または製剤の形態、例えば細胞または細胞集団と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物の形態で、対象に投与される。
【０３８６】
用語「薬学的製剤」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態でありかつ製剤が投与される対象に対して許容されない毒性である追加の成分を含有しない、調製物を指す。
【０３８７】
薬学的組成物は、いくつかの態様において、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどを追加で含む。いくつかの態様において、作用物質は、塩の形態、例えば薬学的に許容される塩の形態で投与される。好適な薬学的に許容される酸付加塩は、鉱酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸、ならびに、有機酸、例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸、例えばp-トルエンスルホン酸に由来するものを含む。
【０３８８】
「薬学的に許容される担体」は、対象に無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存料を含むが、これらに限定されない。
【０３８９】
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には、特定の細胞によっておよび/または投与方法によって決定される。したがって、多種多様な好適な製剤がある。例えば、薬学的組成物は、保存料を含有することができる。好適な保存料は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを含んでよい。いくつかの局面において、2以上の保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、全組成物の重量に対して約0.0001%〜約2%の量で存在する。担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されない。
【０３９０】
緩衝剤が、いくつかの局面において、組成物に含まれる。好適な緩衝剤は、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩を含む。いくつかの局面において、2以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、全組成物の重量に対して約0.001%〜約4%の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)により詳述されている。
【０３９１】
製剤は、水溶液を含むことができる。製剤または組成物はまた、細胞で処置されている特定の適応症、疾患、または病状に有用な1を超える活性成分、好ましくは細胞を補完する活性を有するものを含有してもよく、この場合、それぞれの活性は、互いに悪影響を及ぼさない。そのような活性成分は、意図する目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンをさらに含む。
【０３９２】
薬学的組成物は、いくつかの態様において、疾患または病状を治療または予防するのに有効な量、例えば治療有効量または予防有効量で細胞を含有する。治療有効性または予防有効性は、いくつかの態様において、処置される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。細胞の単回ボーラス投与によって、細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって、所望の投与量を送達することができる。
【０３９３】
製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐剤投与のための製剤を含む。いくつかの態様において、細胞集団は、非経口投与される。用語「非経口」は、本明細書において使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、腟、および腹腔内投与を含む。いくつかの態様において、細胞は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達を使用して対象に投与される。
【０３９４】
組成物は、いくつかの態様において、無菌液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、これらは、いくつかの局面において、選択されたpHに緩衝化されてよい。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製しやすい。追加的に、液体組成物が、投与に、とりわけ、注射による投与にいくらか便利である。他方で、粘性組成物を、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすように適切な粘性の範囲内で製剤化することができる。液体組成物または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる担体を含むことができる。
【０３９５】
無菌注射液は、溶媒中に、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤または賦形剤と混合された溶媒中に細胞を取り入れることによって、調製することができる。組成物は、望ましい投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤(例えば、メチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化もしくは粘性増強添加物、保存料、着香剤、および/または着色剤などの補助物質を含有することができる。いくつかの局面において、好適な調製物を調製するために標準的な教科書に助言を求めてよい。
【０３９６】
抗菌保存料、酸化防止剤、キレート剤および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって保証することができる。注射用薬学的剤形の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。
【０３９７】
インビボ投与に使用されるべき製剤は、一般に無菌のものである。無菌は、例えば滅菌濾過膜で濾過することによって、容易に達成され得る。
【０３９８】
III. 治療法および投与のための組成物
いくつかの局面において、該方法の生成物は、処置法、例えば治療法、例えば養子細胞療法において細胞および組成物を対象に投与するための方法において使用される。また、そのような方法ならびに該方法によって処理および生産された細胞の使用、ならびにその中で使用される薬学的組成物および製剤も提供される。提供される方法は、一般に、細胞または組成物、例えば、アウトプット組成物および/または製剤化された組成物を対象に投与することを伴う。
【０３９９】
いくつかの態様において、細胞は、CARなどの組換え受容体、またはトランスジェニックTCRなどの他の抗原受容体、例えば、本明細書に提供される形質導入法において移入されたものを発現する。そのような細胞は、一般に、受容体によって特異的に認識されるリガンドに関連する疾患または病状を有する対象に投与される。一態様において、細胞は、疾患もしくは病状に関連するかまたはその細胞もしくは組織によって発現されるリガンドに特異的に結合する、組換え受容体またはキメラ受容体、例えば抗原受容体、例えばCARまたはTCRを発現する。例えば、いくつかの態様において、受容体は、抗原受容体であり、そして、リガンドは、疾患もしくは病状に特異的なおよび/またはそれに関連する抗原である。投与は、一般に、疾患もしくは病状の1以上の症状の改善を達成し、かつ/または、疾患もしくは病状またはその症状を治療もしくは予防する。
【０４００】
中でも、疾患、病状、および障害は、腫瘍(固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および黒色腫を含み、かつ、限局性および転移性腫瘍を含む)、ウイルスまたは他の病原体、例えばHIV、HCV、HBV、CMVによる感染などの感染性疾患、および寄生虫性疾患、ならびに自己免疫疾患および炎症性疾患である。いくつかの態様において、疾患または病状は、腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物、または他の増殖性疾患もしくは障害である。そのような疾患は、白血病、リンパ腫、例えば、慢性リンパ性白血病(CLL)、ALL、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性B細胞リンパ腫、B細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫、骨がん、および脳のがん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結直腸がん、膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および/または中皮腫を含むが、それらに限定されない。
【０４０１】
いくつかの態様において、そのような疾患は、白血病、リンパ腫、例えば、急性骨髄性(または骨髄で生じた)白血病(AML)、慢性骨髄性(または骨髄で生じた)白血病(CML)、急性リンパ性(またはリンパ芽球性)白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病(HCL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、濾胞性リンパ腫、難治性濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)および多発性骨髄腫(MM)を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、疾患または病状は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、成人ALL、慢性リンパ芽球性白血病(CLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)の中から選択されるB細胞悪性腫瘍でる。いくつかの態様において、疾患または病状は、NHLであり、そして、NHLは、侵攻性NHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、NOS(無痛性型からデノボで形質転換された)、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫(PMBCL)、T細胞/組織球豊富型大細胞型B細胞リンパ腫(TCHRBCL)、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、および/または濾胞性リンパ腫(FL)、場合により、濾胞性リンパ腫グレード3B(FL3B)からなる群より選択される。
【０４０２】
いくつかの態様において、疾患または病状は、感染性の疾患または病状、例えば限定されないが、免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタインバールウイルス(EBV)、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスを含む、ウイルス、レトロウイルス、細菌、および原虫による感染症である。いくつかの態様において、疾患または病状は、自己免疫または炎症性の疾患または病状、例えば、関節炎、例えば関節リウマチ(RA)、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、および/または移植に関連する疾患もしくは病状である。
【０４０３】
いくつかの態様において、疾患または障害に関連する抗原は、αvβ6インテグリン(avb6インテグリン)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9(CA9、CAIXまたはG250としても公知)、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B(CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知)、がん胎児性抗原(CEA)、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮成長因子タンパク質(EGFR)、短縮上皮成長因子タンパク質(tEGFR)、III型上皮成長因子受容体変異(EGFR vIII)、上皮糖タンパク質2(EPG-2)、上皮糖タンパク質40(EPG-40)、エフリンB2、エフリン受容体A2(EPHa2)、エストロゲン受容体、Fc受容体様5(FCRL5;Fc受容体相同体5またはFCRH5としても公知)、胎児アセチルコリン受容体(胎児AchR)、葉酸結合タンパク質(FBP)、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2(OGD2)、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100(gp100)、Gタンパク質結合受容体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受容体チロシンキナーゼerb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1(HLA-A1)、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)、IL-22受容体アルファ(IL-22Ra)、IL-13受容体アルファ2(IL-13Ra2)、キナーゼ挿入ドメイン受容体(kdr)、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子(L1-CAM)、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピートを含有する8ファミリーメンバーA(LRRC8A)、ルイスY、黒色腫関連抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソテリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス(CMV)、ムチン1(MUC1)、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D)リガンド、メランA(MART-1)、神経細胞接着分子(NCAM)、腫瘍胎児抗原、選択的に発現された黒色腫の抗原(PRAME)、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質(TPBG、5T4としても公知)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)、血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2)、ウィルムス腫瘍1(WT-1)、病原体特異的抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子を含む。受容体が標的とする抗原は、いくつかの態様において、任意の多数の公知のB細胞マーカーなどのB細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bまたはCD30であるかまたはそれを含む。
【０４０４】
いくつかの態様において、細胞または組成物が標的とする疾患または障害に関連する抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、または4、FBP、胎児アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原(CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、およびMAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT-1)、サイクリン、例えばサイクリンA1(CCNA1)、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子からなる群より選択される。
【０４０５】
いくつかの態様において、抗原は、病原体特異的抗原または病原体発現抗原であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原(例えば、HIV、HCV、HBVなどに由来のウイルス抗原)、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。
【０４０６】
本明細書において使用される場合、「処置(treatment)」(および「treat」または「treating」などの文法上の変形体)は、疾患もしくは病状もしくは障害、またはそれに関連する症状、有害作用もしくは帰趨、または表現型の完全または部分的な改善または低減を指す。望ましい処置効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善または軽減、および寛解または予後の改善を含むが、これらに限定されない。この用語は、疾患の完治を意味するものでも、いずれかの症状または全ての症状もしくは帰趨に及ぼす影響の完全な排除を意味するものでもない。
【０４０７】
本明細書において使用される場合、「疾患の発症を遅延させる」とは、疾患(例えば、がん)の発症を延ばす、邪魔する、遅らせる、減速する、安定化する、抑制する、および/または延期することを意味する。この遅延は、病歴および/または処置されている個体に応じて様々な長さの時間の遅延であることができる。当業者に明らかなように、十分なまたは顕著な遅延は、実際には、個体が疾患を発症しないという点では予防を包含することができる。例えば、転移の発症などの末期がんを遅延させてよい。
【０４０８】
「予防すること(preventing)」は、本明細書において使用される場合、疾患の素因を有し得るがまだ疾患と診断されていない対象における疾患の発生または再発に関して、予防法を提供することを含む。いくつかの態様において、提供される細胞および組成物は、疾患の発症を遅延させる、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０４０９】
本明細書において使用される場合、機能または活性を「抑制する」ことは、関心対象の条件もしくはパラメーター以外は同じ条件と比較したときに、または代替的に、別の条件と比較して、機能または活性を低減させることである。例えば、腫瘍成長を抑制する細胞は、細胞の非存在下での腫瘍の成長速度と比較して腫瘍の成長速度を低減させる。
【０４１０】
養子細胞療法のための細胞の投与法は、公知であり、提供される方法および組成物と併用してよい。例えば、養子T細胞療法は、例えば、Gruenbergらの米国特許出願公報第2003/0170238号;Rosenbergの米国特許第4,690,915号; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照のこと。
【０４１１】
処置される疾患または病状は、抗原の発現が、疾患、病状または障害の病因に関連するおよび/またはそれに関与する、例えば、そのような疾患、病状、または障害を引き起こすか、悪化させるかまたはそうでなければ関与する、任意の疾患または病状であることができる。例示的な疾患および病状は、悪性腫瘍もしくは細胞の形質転換(例えば、がん)、自己免疫もしくは炎症性疾患、または感染性疾患(例えば、細菌、ウイルスまたは他の病原体によって引き起こされる)に関連する疾患または病状を含むことができる。処置することができる様々な疾患および病状に関連する抗原を含む例示的な抗原は、上に記載している。特定の態様において、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックTCRは、疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する。
【０４１２】
細胞および組成物は、標準的な投与技術、製剤、および/またはデバイスを使用して投与してよい。細胞の投与は、自己または異種、例えば同種異系のものであることができる。例えば、免疫応答性細胞または前駆細胞を、ある対象から得て、同じ対象または異なる適合性の対象に投与することができる。末梢血由来免疫応答性細胞またはそれらの子孫(例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来)を、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与することができる。治療用組成物(例えば、遺伝子修飾された免疫応答性細胞を含有する薬学的組成物)を投与するとき、それは、一般に、注射用単位剤形(溶液、懸濁液、エマルジョン)で製剤化される。
【０４１３】
いくつかの態様において、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞療法を受けようとする対象からまたはそのような対象に由来する試料から細胞が単離されかつ/または別の方法で調製される、自己移入によって行われる。したがって、いくつかの局面において、細胞は、処置および細胞を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および処理された後に細胞が同じ対象に投与される。
【０４１４】
いくつかの態様において、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞療法を受けようとするまたは細胞療法を最終的に受ける対象以外の対象、例えば第一の対象から細胞が単離されかつ/または別の方法で調製される、同種異系移入によって行われる。そのような態様において、次いで、細胞が、同じ種の異なる対象、例えば第二の対象に投与される。いくつかの態様において、第一の対象および第二の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの態様において、第一の対象および第二の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの態様において、第二の対象は、第一対象と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。
【０４１５】
細胞を、任意の好適な手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下(subconjectval、subconjuntival)注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または強膜近傍後方(posterior juxtascleral)送達によって投与することができる。いくつかの態様において、これらは、非経口、肺内、および鼻腔内、局所処置が望ましい場合は病巣内投与によって投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。いくつかの態様において、細胞の単回ボーラス投与によって、例えば3日以内の期間にわたる細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって、所与の用量が投与される。
【０４１６】
A. 投与量および投与
細胞または組成物は、疾患または病状を処置するためインビボで組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞の治療有効量をもたらす用量で投与される。疾患の予防または治療のために、適切な投与量は、処置されるべき疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、組み合わせられる他の薬物または作用物質、例えば細胞拡大をブースト、増大または強化するものの投与、疾患の重症度および経過、細胞が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の療法、対象の病歴および細胞に対する応答、ならびに主治医の判断に依存し得る。組成物および細胞は、いくつかの態様において、一度または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０４１７】
投与という状況下で、作用物質、例えば、薬学的製剤、細胞、または組成物の「有効量」は、所望の結果、例えば、治療結果または予防結果を達成するために有効な、必要な投与量/量および期間にわたる量を指す。
【０４１８】
作用物質、例えば、薬学的製剤または細胞の「治療有効量」は、所望の治療結果、例えば、疾患、病状、もしくは障害の処置のための所望の治療結果、および/または処置の薬物動態学的もしくは薬力学的効果を達成するために有効な、必要な投与量および期間にわたる量を指す。治療有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに、投与される細胞集団、および、例えば同時に組み合わせて投与される他の薬物または作用物質などの要因に応じて変動し得る。
【０４１９】
「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するために有効な、必要な投与量および期間にわたる量を指す。典型的には、疾患の前にまたはその初期段階に対象において予防用量が使用されるので、予防有効量は治療有効量より少ないが、必ずしもそうとは限らない。
【０４２０】
いくつかの態様において、細胞または組成物は、疾患または病状を治療または予防するのに有効である量、例えば治療有効量または予防有効量で投与される。したがって、いくつかの態様において、投与法は、細胞および組成物の有効量での投与を含む。治療または予防有効性は、いくつかの態様において、処置される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。数日またはより長期にわたる繰り返し投与については、病状に応じて、所望の疾患症状の抑制が起こるまで処置が繰り返される。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であってよく、かつ、これを決定することができる。
【０４２１】
いくつかの態様において、治療有効量の細胞が、対象に投与される。いくつかの態様において、準最適用量の細胞が、例えば、細胞のインビボ拡大条件下で細胞が投与されるある特定の場合に、対象に投与される。
【０４２２】
ある特定の態様において、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、対象に、約10万〜約1000億の細胞および/または対象の体重1キログラム当たりのその細胞量、例えば、10万〜約500億の細胞(例えば、50万未満の細胞、100万未満の細胞、約10万の細胞、約20万の細胞、約30万の細胞、約40万の細胞、約50万の細胞、約100万の細胞、約500万の細胞、約2500万の細胞、約5億の細胞、約10億の細胞、約50億の細胞、約200億の細胞、約300億の細胞、約400億の細胞、または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)、100万〜約500億の細胞(例えば、約500万の細胞、約2500万の細胞、約5億の細胞、約10億の細胞、約50億の細胞、約200億の細胞、約300億の細胞、約400億の細胞、または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)、例えば約1000万〜約1000億の細胞(例えば、約2000万の細胞、約3000万の細胞、約4000万の細胞、約6000万の細胞、約7000万の細胞、約8000万の細胞、約9000万の細胞、約100億の細胞、約250億の細胞、約500億の細胞、約750億の細胞、約900億の細胞、または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)、そして、いくつかの場合に、約1億の細胞〜約500億の細胞(例えば、約1億2000万の細胞、約2億5000万の細胞、約3億5000万の細胞、約4億5000万の細胞、約6億5000万の細胞、約8億の細胞、約9億の細胞、約30億の細胞、約300億の細胞、約450億の細胞)の範囲またはこれらの範囲の間の任意の値、および/または対象の体重1キログラム当たり任意の値で投与される。投与量は、疾患もしくは障害および/または患者および/または他の処置が特に原因で変動し得る。いくつかの態様において、そのような値は、組換え受容体発現細胞の数を指し;他の態様において、これらは、投与されるT細胞もしくはPBMCまたは総細胞の数を指す。
【０４２３】
いくつかの態様において、細胞療法は、少なくとも0.1×106の細胞/対象の体重kg、0.2×106の細胞/kg、0.3×106の細胞/kg、0.4×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg、1×106細胞/kg、2.0×106の細胞/kg、3×106の細胞/kgもしくは5×106の細胞/kg、または少なくとも約0.1×106の細胞/対象の体重kg、0.2×106の細胞/kg、0.3×106の細胞/kg、0.4×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg、1×106細胞/kg、2.0×106の細胞/kg、3×106の細胞/kgもしくは5×106の細胞/kg、または0.1×106の細胞/対象の体重kg、0.2×106の細胞/kg、0.3×106の細胞/kg、0.4×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg、1×106細胞/kg、2.0×106の細胞/kg、3×106の細胞/kgもしくは5×106の細胞/kg、または約0.1×106の細胞/対象の体重kg、0.2×106の細胞/kg、0.3×106の細胞/kg、0.4×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg、1×106細胞/kg、2.0×106の細胞/kg、3×106の細胞/kgもしくは5×106の細胞/kgである細胞数を含む用量の投与を含む。
【０４２４】
いくつかの態様において、細胞療法は、0.1×106の細胞/対象の体重kg〜1.0×107の細胞/kgもしくは約0.1×106の細胞/対象の体重kg〜1.0×107の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg〜5×106の細胞/kgもしくは約0.5×106の細胞/kg〜5×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg〜3×106の細胞/kg、もしくは約0.5×106の細胞/kg〜3×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg〜2×106の細胞/kg、もしくは約0.5×106の細胞/kg〜2×106の細胞/kg、0.5×106の細胞/kg〜1×106の細胞/kg、もしくは約0.5×106の細胞/kg〜1×106の細胞/kg、1.0×106の細胞/対象の体重kg〜5×106の細胞/kg、もしくは約1.0×106の細胞/対象の体重kg〜5×106の細胞/kg、1.0×106の細胞/kg〜3×106の細胞/kg、もしくは約1.0×106の細胞/kg〜3×106の細胞/kg、1.0×106の細胞/kg〜2×106の細胞/kg、もしくは約1.0×106の細胞/kg〜2×106の細胞/kg、2.0×106の細胞/対象の体重kg〜5×106の細胞/kg、もしくは約2.0×106の細胞/対象の体重kg〜5×106の細胞/kg、2.0×106の細胞/kg〜3×106の細胞/kg、もしくは約2.0×106の細胞/kg〜3×106の細胞/kg、または3.0×106の細胞/対象の体重kg〜5×106の細胞/kg、もしくは約3.0×106の細胞/対象の体重kg〜5×106の細胞/kg(各数値を含む)である細胞数を含む用量の投与を含む。
【０４２５】
いくつかの態様において、細胞の用量は、2×105の細胞/kgもしくは約2×105の細胞/kgから、2×106の細胞/kgもしくは約2×106の細胞/kgの間、例えば4×105の細胞/kgもしくは約4×105の細胞/kgから、1×106の細胞/kgもしくは約1×106の細胞/kgの間、または6×105の細胞/kgもしくは約6×105の細胞/kgから、8×105の細胞/kgもしくは約8×105の細胞/kgの間を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、対象の体重1キログラム当たり2×105の細胞(例えば、抗原発現細胞、例えばCAR発現細胞)(細胞/kg)以下、例えば、3×105の細胞/kg以下もしくは約3×105の細胞/kg以下、4×105の細胞/kg以下もしくは約4×105の細胞/kg以下、5×105の細胞/kg以下もしくは約5×105の細胞/kg以下、6×105の細胞/kg以下もしくは約6×105の細胞/kg以下、7×105の細胞/kg以下もしくは約7×105の細胞/kg以下、8×105の細胞/kg以下もしくは約8×105の細胞/kg以下、9×105の細胞/kg以下もしくは約9×105の細胞/kg以下、1×106の細胞/kg以下もしくは約1×106の細胞/kg以下、または2×106の細胞/kg以下もしくは約2×106の細胞/kg以下を含む。
【０４２６】
いくつかの態様において、細胞の用量は、対象の体重1キログラム当たり少なくとも2×105の細胞(例えば、抗原発現細胞、例えばCAR発現細胞)(細胞/kg)、もしくは少なくとも約2×105の細胞(例えば、抗原発現細胞、例えばCAR発現細胞)(細胞/kg)、もしくは2×105の細胞(例えば、抗原発現細胞、例えばCAR発現細胞)(細胞/kg)、もしくは約2×105の細胞(例えば、抗原発現細胞、例えばCAR発現細胞)(細胞/kg)、例えば、少なくとも3×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約3×105の細胞/kg、もしくは3×105の細胞/kg、もしくは約3×105の細胞/kg、少なくとも4×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約4×105の細胞/kg、もしくは4×105の細胞/kg、もしくは約4×105の細胞/kg、少なくとも5×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約5×105の細胞/kg、もしくは5×105の細胞/kg、もしくは約5×105の細胞/kg、少なくとも6×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約6×105の細胞/kg、もしくは6×105の細胞/kg、もしくは約6×105の細胞/kg、少なくとも7×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約7×105の細胞/kg、もしくは7×105の細胞/kg、もしくは約7×105の細胞/kg、少なくとも8×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約8×105の細胞/kg、もしくは8×105の細胞/kg、もしくは約8×105の細胞/kg、少なくとも9×105の細胞/kg、もしくは少なくとも約9×105の細胞/kg、もしくは9×105の細胞/kg、もしくは約9×105の細胞/kg、少なくとも1×106の細胞/kg、もしくは少なくとも約1×106の細胞/kg、もしくは1×106の細胞/kg、もしくは約1×106の細胞/kg、または少なくとも2×106の細胞/kg、もしくは少なくとも約2×106の細胞/kg、もしくは2×106の細胞/kg、もしくは約2×106の細胞/kgを含む。
【０４２７】
いくつかの態様において、細胞の用量は、細胞の用量が対象の体表面積にも体重にも、連動することも基づくこともないような、細胞のフラット用量または細胞の固定用量である。
【０４２８】
ある特定の態様において、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、対象に、約100万〜約1000億の細胞および/または体重1キログラム当たりのその細胞量、例えば、100万〜約500億の細胞(例えば、約500万の細胞、約2500万の細胞、約5億の細胞、約10億の細胞、約50億の細胞、約200億の細胞、約300億の細胞、約400億の細胞、または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)、例えば約1000万〜約1000億の細胞(例えば、約2000万の細胞、約3000万の細胞、約4000万の細胞、約6000万の細胞、約7000万の細胞、約8000万の細胞、約9000万の細胞、約100億の細胞、約250億の細胞、約500億の細胞、約750億の細胞、約900億の細胞、または前述の値の任意の2つによって規定される範囲)、そして、いくつかの場合に、約1億の細胞〜約500億の細胞(例えば、約1億2000万の細胞、約2億5000万の細胞、約3億5000万の細胞、約4億5000万の細胞、約6億5000万の細胞、約8億の細胞、約9億の細胞、約30億の細胞、約300億の細胞、約450億の細胞)の範囲またはこれらの範囲の間の任意の値、および/または体重1キログラム当たり任意の値で投与される。投与量は、疾患もしくは障害および/または患者および/または他の処置が特に原因で変動し得る。
【０４２９】
いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、用量は、約5×108より少ない総組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞(PBMC)、例えば、約1×106〜5×108のそのような細胞、例えば2×106、5×106、1×107、5×107、1×108、または5×108の範囲のそのような総細胞、または前述の値の任意の2つの間の範囲を含む。
【０４３０】
いくつかの態様において、細胞療法は、1×105〜5×108もしくは約1×105〜5×108の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞(PBMC)、5×105〜1×107もしくは約5×105〜1×107の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞(PBMC)、または1×106〜1×107もしくは約1×106〜1×107の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞(PBMC)(各数値を含む)の細胞数を含む用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、少なくとも1×105の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞(PBMC)、または少なくとも約1×105の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞(PBMC)、例えば、少なくとも1×106もしくは少なくとも約1×106、少なくとも1×107もしくは少なくとも約1×107、少なくとも1×108もしくは少なくとも約1×108のそのような細胞の細胞数を含む細胞用量の投与を含む。いくつかの態様において、その数は、CD3+またはCD8+細胞、いくつかの場合には、また組換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の総数に準拠する。いくつかの態様において、細胞療法は、1×105〜5×108もしくは約1×105〜5×108のCD3+もしくはCD8+総T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞、5×105〜1×107もしくは約5×105〜1×107のCD3+もしくはCD8+総T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞、または1×106〜1×107もしくは約1×106〜1×107のCD3+もしくはCD8+総T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞(各数値を含む)の細胞数を含む用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、1×105〜5×108もしくは約1×105〜5×108の総CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞、5×105〜1×107もしくは約5×105〜1×107の総CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞、または1×106〜1×107もしくは約1×106〜1×107の総CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞(各数値を含む)の細胞数を含む用量の投与を含む。
【０４３１】
いくつかの態様において、その用量のT細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞またはCD4+およびCD8+T細胞を含む。
【０４３２】
いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、CD4+およびCD8+T細胞を含むある用量を含む用量のCD8+T細胞は、約1×106〜5×108の総組換え受容体(例えば、CAR)発現CD8+細胞、例えば、約5×106〜1×108の範囲のそのような細胞、例えば1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、または5×108のそのような総細胞、または前述の値の任意の2つの間の範囲を含む。いくつかの態様において、患者には、複数用量が投与され、そして、その用量または総用量の各々は、前述の値のいずれか以内であることができる。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×107〜0.75×108もしくは約1×107〜0.75×108の総組換え受容体発現CD8+T細胞、1×107〜2.5×107の総組換え受容体発現CD8+T細胞、1×107〜0.75×108もしくは約1×107〜0.75×108の総組換え受容体発現CD8+T細胞(各数値を含む)の投与を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、もしくは5×108または約1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、もしくは5×108の総組換え受容体発現CD8+T細胞の投与を含む。
【０４３３】
いくつかの態様において、細胞、例えば、組換え受容体発現T細胞の用量は、対象に、単一用量として投与されるか、または、2週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年もしくはより長い期間内に一回だけ投与される。
【０４３４】
養子細胞療法という状況下で、細胞の所与の「用量」の投与は、単一組成物としての細胞の所与の量もしくは数の投与および/または単一の途切れのない投与、例えば、単回注射もしくは連続注入としての投与を包含し、そしてまた、分割用量としてのまたは複数の組成物としての、複数の個々の組成物または注入で提供される、一定の期間にわたる、例えば3日間以内にわたる、細胞の所与の量または数の投与も包含する。したがって、いくつかの状況では、用量は、単一の時点に与えられるかまたは開始される、一定の細胞数の単回または連続投与である。しかしながら、いくつかの状況では、用量は、複数回の注射または注入で、3日以内の期間にわたって、例えば3日間もしくは2日間で1日1回投与されるか、または1日間にわたる複数の注入によって投与される。
【０４３５】
したがって、いくつかの局面において、その用量の細胞は、単一の薬学的組成物で投与される。いくつかの態様において、その用量の細胞は、その用量の細胞をまとめて含有する複数の組成物で投与される。
【０４３６】
用語「分割用量」は、1日を超える期間にわたって投与されるように分割された用量を指す。このタイプの投薬は、本方法に包含され、単一用量であると見なされる。いくつかの態様において、分割用量の細胞は、その用量の細胞をまとめて含む複数の組成物で、3日以内の期間にわたって投与される。
【０４３７】
したがって、細胞の用量は、分割用量として、例えば、経時的に投与される分割用量として投与してよい。例えば、いくつかの態様において、用量は、対象に2日間または3日間にわたって投与してよい。分割投薬の例示的な方法は、1日目に用量の25%を投与し、2日目に残りの用量の75%を投与することを含む。他の態様において、用量の33%を1日目に投与し、残りの67%を2日目に投与してよい。いくつかの局面において、用量の10%が1日目に投与され、用量の30%が2日目に投与され、そして、用量の60%が3日目に投与される。いくつかの態様において、分割用量は、3日間超に拡張されることはない。
【０４３８】
いくつかの態様において、その用量の細胞は、各々がその用量の細胞の一部を含有する複数の組成物または溶液、例えば第一および第二、場合により、より多くの組成物または溶液の投与によって投与してよい。いくつかの局面において、各々が異なる細胞集団および/またはそのサブタイプを含有する複数の組成物が、別々にまたは独立に、場合によりある特定の期間内に投与される。例えば、細胞集団および/またはそのサブタイプは、それぞれCD8+およびCD4+T細胞、および/または、それぞれCD8+およびCD4+濃縮集団、例えば、各々が組換え受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を個々に含むCD4+および/またはCD8+T細胞を含むことができる。いくつかの態様において、その用量の投与は、ある用量のCD8+T細胞またはある用量のCD4+T細胞を含む第一の組成物の投与、および他の用量のCD4+T細胞およびCD8+T細胞を含む第二の組成物の投与を含む。
【０４３９】
いくつかの態様において、組成物または用量の投与、例えば、複数の細胞組成物の投与は、別々に細胞組成物の投与を伴う。いくつかの局面において、別々の投与は、同時に、または連続的に任意の順序で行われる。いくつかの態様において、用量は、第一の組成物および第二の組成物を含み、そして、第一の組成物および第二の組成物は、0〜12時間あけて、0〜6時間あけて、または0〜2時間あけて投与される。いくつかの態様において、第一の組成物の投与の開始と第二の組成物の投与の開始は、2時間以内、1時間以内、または30分以内あけて、15分以内、10分以内または5分以内あけて行われる。いくつかの態様において、第一の組成物の投与の開始および/または完了と第二の組成物の投与の完了および/または開始は、2時間以内、1時間以内、または30分以内あけて、15分以内、10分以内または5分以内あけて行われる。
【０４４０】
いくつかの組成物において、第一の組成物、例えば、その用量の第一の組成物は、CD4+T細胞を含む。いくつかの組成物において、第一の組成物、例えば、その用量の第一の組成物は、CD8+T細胞を含む。いくつかの態様において、第一の組成物は、第二の組成物の前に投与される。
【０４４１】
いくつかの態様において、細胞の用量または組成物は、組換え受容体を発現するCD4+細胞と組換え受容体を発現するCD8+細胞の規定のもしくは標的比および/またはCD4+細胞とCD8+細胞の規定のもしくは標的比を含み、その比は、場合により、およそ1:1であるか、またはおよそ1:3〜およそ3:1の間、例えばおよそ1:1である。いくつかの局面において、異なる細胞集団の標的または所望の比(例えば、CD4+:CD8+比またはCAR+CD4+:CAR+CD8+比、例えば、1:1)での組成物または用量の投与は、集団の1つを含有する細胞組成物の投与と、次の他の集団を含む別個の細胞組成物の投与を伴うが、この場合、投与は、標的または所望の比での投与またはおよそ標的または所望の比での投与である。いくつかの局面において、既定の比での細胞の用量または組成物の投与は、T細胞療法の拡大、持続および/または抗腫瘍活性の改善を導く。
【０４４２】
いくつかの態様において、対象は、複数用量、例えば、2以上の用量または複数の連続用量の細胞を受ける。いくつかの態様において、2つの用量が対象に投与される。いくつかの態様において、対象は、連続用量を受け、例えば、第二の用量が、第一の用量のおよそ4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間後に投与される。いくつかの態様において、1以上の追加の用量が連続用量の投与に続いて投与されるように、複数の連続用量が第一の用量に続いて投与される。いくつかの局面において、追加の用量で対象に投与される細胞数は、第一の用量および/または連続用量と同じであるかまたは類似する。いくつかの態様において、1以上の追加の用量は、前の用量よりも多い。
【０４４３】
いくつかの局面において、第一の用量および/または連続用量のサイズは、前処置、例えば化学療法に対する対象の応答、対象における疾患負担、例えば、腫瘍負荷、嵩、サイズもしくは度合い、転移の程度もしくはタイプ、ステージ、ならびに/または、対象が毒による帰趨、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性を発症する可能性もしくは発生率、ならびに/または、投与されている細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答などの1以上の基準に基づいて決定される。
【０４４４】
いくつかの局面において、第一の用量の投与と連続用量の投与の間の時間は、約9〜約35日間、約14〜約28日間、または15〜27日間である。いくつかの態様において、連続用量の投与は、第一の用量の投与後、約14日超、かつ約28日未満の時点での投与である。いくつかの局面において、第一の用量と連続用量の間の時間は、約21日間である。いくつかの態様において、1以上の追加の用量、例えば連続用量は、連続用量の投与に続いて投与される。いくつかの局面において、1以上の追加の連続用量は、前の用量の投与に続いて、少なくとも約14日、かつ約28日未満に投与される。いくつかの態様において、追加の用量は、前の用量の投与に続いて、約14日未満で、例えば、前の用量の4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13日後に投与される。いくつかの態様において、前の用量の投与に続いて約14日未満で用量が投与されることはなく、かつ/または、前の用量の約28日超後に用量が投与されることはない。
【０４４５】
いくつかの態様において、細胞、例えば、組換え受容体発現細胞の用量は、T細胞の第一の用量およびT細胞の連続用量を含む2つの用量(例えば、二重用量)を含み、ここで、第一の用量および第二の用量の一方または両方は、T細胞の分割用量の投与を含む。
【０４４６】
いくつかの態様において、細胞の用量は、一般に、疾患負担の低減に有効であるくらい十分に大きい。
【０４４７】
いくつかの態様において、細胞は、所望の投与量で、いくつかの局面においては、細胞もしくは細胞タイプの所望の用量もしくは数および/または所望の細胞タイプの比を含む、所望の投与量で投与される。したがって、細胞の投与量は、いくつかの態様において、総細胞数(または体重1kg当たりの数)および個々の集団またはサブタイプの所望の比、例えばCD4+とCD8+の比に基づく。いくつかの態様において、細胞の投与量は、個々の集団におけるまたは個々の細胞タイプの所望の総細胞数(または体重1kg当たりの数)に基づく。いくつかの態様において、投与量は、そのような特徴、例えば所望の総細胞数、所望の比、および個々の集団における所望の総細胞数の組み合わせに基づく。
【０４４８】
いくつかの態様において、細胞、例えばCD8+およびCD4+T細胞の集団またはサブタイプは、総細胞の所望の用量、例えばT細胞の所望の用量でまたはその許容差内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、所望の細胞数、または細胞が投与される対象の単位体重当たりの所望の細胞数(例えば、細胞/kg)である。いくつかの局面において、所望の用量は、最少細胞数または単位体重当たりの最少細胞数であるかまたはそれを超える。いくつかの局面において、所望の用量で投与される総細胞の中で、個々の集団またはサブタイプは、所望のアウトプット比(例えばCD4+とCD8+比)でまたはその近くで、例えば、そのような比のある特定の許容差または誤差内で存在する。
【０４４９】
いくつかの態様において、細胞は、細胞の個々の集団またはサブタイプの1以上の所望の用量、例えばCD4+細胞の所望の用量および/またはCD8+細胞の所望の用量で、またはその許容差内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、サブタイプまたは集団の所望の細胞数、または細胞が投与される対象の単位体重当たりの所望の細胞数(例えば、細胞/kg)である。いくつかの局面において、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの最少細胞数、または単位体重当たりの集団もしくはサブタイプの最少細胞数であるかまたはそれを超える。
【０４５０】
したがって、いくつかの態様において、投与量は、総細胞の所望の固定用量および所望の比に基づき、かつ/または、個々のサブタイプもしくはサブ集団の1以上、例えば、各々の所望の固定用量に基づく。したがって、いくつかの態様において、投与量は、T細胞の所望の固定用量または最少用量および所望のCD4+細胞とCD8+細胞の比に基づき、かつ/または、CD4+細胞および/もしくはCD8+細胞の所望の固定用量または最少用量に基づく。
【０４５１】
いくつかの態様において、細胞は、複数の細胞集団またはサブタイプ、例えばCD4+細胞およびCD8+細胞またはサブタイプの所望のアウトプット比で、またはその許容範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の比は、ある特定の比であっても、ある範囲の比であってもよい。例えば、いくつかの態様において、所望の比(例えば、CD4+細胞とCD8+細胞の比)は、5:1もしくは約5:1から、5:1もしくは約5:1の間(または、約1:5超、約5:1未満)、または1:3もしくは約1:3から、3:1もしくは約3:1の間(または、約1:3超、約3:1未満)、例えば2:1もしくは約2:1から、1:5もしくは約1:5(または、約1:5超、約2:1未満、例えば5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5、または約5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5である。いくつかの局面において、許容差は、所望の比の約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%以内であり、これらの範囲の間の任意の値を含む。
【０４５２】
特定の態様において、細胞の数および/または濃度は、組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞の数を指す。他の態様において、細胞の数および/または濃度は、投与される全ての細胞、T細胞、または末梢血単核細胞(PBMC)の数または濃度を指す。
【０４５３】
いくつかの局面において、用量のサイズは、前処置、例えば化学療法に対する対象の応答、対象における疾患負担、例えば、腫瘍負荷、嵩、サイズもしくは度合い、転移の程度もしくはタイプ、ステージ、ならびに/または、対象が毒による帰趨、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性を発症する可能性もしくは発生率、ならびに/または、投与されている細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答などの1以上の基準に基づいて決定される。
【０４５４】
いくつかの態様において、該方法はまた、1以上の追加の用量のキメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞および/またはリンパ球枯渇療法を投与することを含み、かつ/または、該方法の1以上の工程が繰り返される。いくつかの態様において、1以上の追加の用量は、初期用量と同じである。いくつかの態様において、1以上の追加の用量は、初期用量と異なる、例えば、初期用量よりも高い、例えば、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍もしくは10倍またはそれより高いか、または、初期用量よりも低い、例えば、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍もしくは10倍またはそれより低い。いくつかの態様において、1以上の追加の用量の投与は、初期処置または任意の前処置に対する対象の応答、対象における疾患負担、例えば、腫瘍負荷、嵩、サイズもしくは度合い、転移の程度もしくはタイプ、ステージ、ならびに/または、対象が毒による帰趨、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性を発症する可能性もしくは発生率、ならびに/または、投与されている細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答に基づいて決定される。
【０４５５】
いくつかの態様において、比較的低い用量の細胞、例えば準最適用量の細胞または治療有効量よりも低い用量の細胞を、投与してよく、そのときのインビボ刺激(例えば、内因性抗原または外因性の作用物質による)は、対象中に存在する改変された細胞の数のブースト、例えば増加または拡大を導くことができる。そのような態様のいずれかにおいて、細胞の拡大および/または活性化、例えば、細胞の投与後の対象の体内の改変された細胞の拡大は、抗原へのインビボ曝露で行うことができる。いくつかの態様において、投与された細胞、例えば、組換え受容体発現細胞の拡大、増殖、生存および/または効力をモジュレート、例えば増加させることができる様々な方法によって、インビボ拡大の程度、度合いまたは大きさを、さらに増大、ブーストまたは強化させることができる。
【０４５６】
細胞が対象(例えば、ヒト)に投与されたら、細胞集団の生物学的活性が、いくつかの局面において、多数の公知の方法のいずれかによって測定される。評価するためのパラメーターは、インビボでは、例えば、画像検査による、またはエクスビボでは、例えば、ELISAもしくはフローサイトメトリーによる、細胞の抗原への特異的結合を含む。ある特定の態様において、標的細胞を破壊する細胞の能力を、当技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)、およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載されている例えば細胞傷害性アッセイを使用して測定することができる。ある特定の態様において、細胞の生物学的活性はまた、CD107a、IFNγ、IL-2およびTNFなどのある特定のサイトカインの発現および/または分泌をアッセイすることによっても測定することができる。いくつかの局面において、生物学的活性は、臨床的転帰、例えば腫瘍量または負荷の低減を評価することによって測定される。いくつかの局面において、細胞の毒による帰趨、持続および/もしくは拡大、ならびに/または宿主免疫応答の存在もしくは非存在が評価される。
【０４５７】
B. 組成物および製剤
いくつかの態様において、組換え抗原受容体、例えばCARまたはTCRで改変された細胞を含む細胞の用量は、組成物または製剤として、例えば薬学的組成物または製剤として提供される。そのような組成物を、提供される方法に従って、および/または、提供される製造品または組成物と共に、例えば、疾患、病状、および障害の予防または治療において、または検出法、診断法、および予測法において使用することができる。
【０４５８】
用語「薬学的製剤」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態でありかつ製剤が投与される対象に対して許容されない毒性である追加の成分を含有しない、調製物を指す。
【０４５９】
「薬学的に許容される担体」は、対象に無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存料を含むが、これらに限定されない。
【０４６０】
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には、特定の細胞もしくは作用物質によっておよび/または投与方法によって決定される。したがって、多種多様な好適な製剤がある。例えば、薬学的組成物は、保存料を含有することができる。好適な保存料は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを含んでよい。いくつかの局面において、2以上の保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、全組成物の重量に対して約0.0001%〜約2%の量で存在する。担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されない。
【０４６１】
緩衝剤が、いくつかの局面において、組成物に含まれる。好適な緩衝剤は、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩を含む。いくつかの局面において、2以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、全組成物の重量に対して約0.001%〜約4%の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)により詳述されている。
【０４６２】
製剤または組成物はまた、細胞または作用物質で予防または治療されている特定の適応症、疾患、または病状に有用な1を超える活性成分を含有してもよく、この場合、それぞれの活性は、互いに悪影響を及ぼさない。そのような活性成分は、意図する目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどをさらに含む。いくつかの態様において、作用物質または細胞は、塩の形態、例えば薬学的に許容される塩の形態で投与される。好適な薬学的に許容される酸付加塩は、鉱酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸、ならびに、有機酸、例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸、例えばp-トルエンスルホン酸に由来するものを含む。
【０４６３】
薬学的組成物は、いくつかの態様において、疾患または病状を治療または予防するのに有効な量、例えば治療有効量または予防有効量で作用物質または細胞を含有する。治療有効性または予防有効性は、いくつかの態様において、処置される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。数日またはより長期にわたる繰り返し投与については、病状に応じて、所望の疾患症状の抑制が起こるまで処置が繰り返される。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であってよく、かつ、これを決定することができる。組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の連続注入投与によって、所望の投与量を送達することができる。
【０４６４】
作用物質または細胞を、任意の好適な手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下(subconjectval、subconjuntival)注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または強膜近傍後方送達によって投与することができる。いくつかの態様において、これらは、非経口、肺内、および鼻腔内、局所処置が望ましい場合は病巣内投与によって投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。いくつかの態様において、所与の用量は、細胞または作用物質の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの態様において、それは、例えば3日以内の期間にわたる、細胞または作用物質の複数回ボーラス投与によって、または、細胞または作用物質の連続注入投与によって投与される。
【０４６５】
疾患の予防または治療のために、適切な投与量は、処置されるべき疾患のタイプ、1以上の作用物質のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、作用物質または細胞が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の療法、対象の病歴および作用物質または細胞に対する応答、ならびに主治医の判断に依存し得る。組成物は、いくつかの態様において、一度または一連の処置にわたって対象に適切に投与される。
【０４６６】
細胞または作用物質は、標準的な投与技術、製剤、および/またはデバイスを使用して投与してよい。組成物の保存および投与のための、製剤およびデバイス、例えばシリンジおよびバイアルが提供される。細胞に関して、投与は、自己のものであっても異種のものであってもよい。例えば、免疫応答性細胞または前駆細胞を、ある対象から得て、同じ対象または異なる適合性の対象に投与することができる。末梢血由来免疫応答性細胞またはそれらの子孫(例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来)を、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与することができる。治療用組成物(例えば、神経毒性の症状を処置または改善する遺伝子修飾された免疫応答性細胞または作用物質を含有する薬学的組成物)を投与するとき、それは、一般に、注射用単位剤形(溶液、懸濁液、エマルジョン)で製剤化される。
【０４６７】
製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐剤投与のための製剤を含む。いくつかの態様において、作用物質または細胞集団は、非経口投与される。用語「非経口」は、本明細書において使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、腟、および腹腔内投与を含む。いくつかの態様において、作用物質または細胞集団は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達を使用して対象に投与される。
【０４６８】
組成物は、いくつかの態様において、無菌液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、これらは、いくつかの局面において、選択されたpHに緩衝化されてよい。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製しやすい。追加的に、液体組成物が、投与に、とりわけ、注射による投与にいくらか便利である。他方で、粘性組成物を、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすように適切な粘性の範囲内で製剤化することができる。液体組成物または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる担体を含むことができる。
【０４６９】
無菌注射液は、溶媒中に、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤または賦形剤と混合された溶媒中に作用物質または細胞を取り入れることによって、調製することができる。
【０４７０】
インビボ投与に使用されるべき製剤は、一般に無菌のものである。無菌は、例えば滅菌濾過膜で濾過することによって、容易に達成され得る。
【０４７１】
C. 組み合わせ療法、例えば、細胞の拡大および活性をモジュレートするための作用物質
いくつかの態様において、細胞は、組み合わせ処置の一部として、例えば、別の作用物質、例えば治療用物質、例えば薬物と同時にまたは任意の順序で連続的に投与される。いくつかの態様において、他の作用物質、例えば薬物は、治療介入、例えば抗体または改変された細胞または受容体または作用物質、例えば細胞傷害性物質または治療用物質であることができる。いくつかの態様において、他の作用物質、例えば薬物は、細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を増強、増大またはブーストする作用物質であることができる。いくつかの状況では、細胞は、細胞集団が1以上の追加の治療用物質の効果を増強するような十分に短い期間で別の療法と共投与される(逆もまた同様である)。いくつかの態様において、細胞は、1以上の追加の治療用物質の前に投与される。いくつかの態様において、細胞は、1以上の追加の治療用物質の後に投与される。
【０４７２】
いくつかの態様において、該方法は、投与された細胞、例えば組換え受容体発現細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を増大、ブーストまたは強化することができる薬物または作用物質との組み合わせ投与、例えば同時または連続投与を伴う方法を含む。いくつかの態様において、そのような作用物質は、別の作用物質、例えば薬物と同時にまたは任意の順序で連続的に投与される。いくつかの態様において、作用物質は、細胞、例えば、組換え受容体、例えばCARを発現する細胞の投与の前、その間、その経過の間またはその後に投与される。いくつかの態様において、そのような作用物質は、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする導入遺伝子を特異的にモジュレートすることによって、改変された細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を特異的に増大、ブーストまたは強化する、作用物質を含む。いくつかの態様において、そのような作用物質は、投与された細胞、例えば免疫細胞、例えばT細胞の細胞拡大および/または活性をモジュレートする作用物質を含む。
【０４７３】
いくつかの態様において、投与された細胞、例えば、組換え受容体を発現するように改変された細胞は、投与された細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を増大、ブーストまたは強化するように修飾される。いくつかの態様において、投与された細胞、例えば、組換え受容体を発現するように改変された細胞は、作用物質の投与などによって、改変された細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を調節および/または制御することができるように修飾される。
【０４７４】
いくつかの態様において、該方法は、改変された細胞の増殖、拡大および/または生存を抑制する阻害因子の効果をインビボで低減、阻害および/または最小化するためのインビボ工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、改変された細胞の増殖、拡大および/または生存をインビボで促進、支援および/または増強するためのインビボ工程を含む。
【０４７５】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、低分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、抗体模倣体、アプタマーもしくは核酸分子(例えば、siRNA)、脂質、多糖またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、特定の因子、分子、受容体、機能および/または酵素の阻害剤または活性化剤である。いくつかの態様において、追加の作用物質は、特定の因子、分子、受容体、機能および/または酵素のアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、1以上の因子および/または代謝物の類似体または誘導体である。いくつかの態様において、追加の作用物質は、タンパク質またはポリペプチドである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、細胞、例えば改変された細胞である。
【０４７６】
1. 導入遺伝子特異的拡大のための作用物質
いくつかの態様において、該方法は、投与された細胞、例えば、組換え受容体を発現するように改変された細胞以外の作用物質を、例えば組み合わせ療法において投与することを含む。いくつかの態様において、作用物質は、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする導入遺伝子を特異的にモジュレートすることによって、改変された細胞の拡大、増殖、生存および/または効力を特異的に増大、ブーストまたは強化する。いくつかの態様において、作用物質は、導入遺伝子、例えば、組換え受容体を特異的に標的とする。いくつかの態様において、作用物質は、組換え受容体に結合し、活性化し、かつ/または、その活性および/または導入遺伝子によってコードされる組換え分子の全てもしくは一部の他の機能を増強する。いくつかの態様において、作用物質と組換え細胞を組み合わせた投与は、投与された細胞の増殖、拡大および/または生存を強化、ブーストまたは増大する、例えば、細胞のインビボ拡大を強化することができる。
【０４７７】
いくつかの態様において、導入遺伝子特異的拡大のための例示的な方法または作用物質は、内因性抗原曝露、ワクチン接種、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片および/または調節可能な組換え受容体を含む。例えば、いくつかの態様において、導入遺伝子特異的拡大のための方法は、ワクチン接種法を含む。いくつかの態様において、作用物質は、ペプチドワクチンまたは細胞ベースワクチン、例えば、組換え受容体によって認識される特定の抗原を発現するように改変された細胞である(例えば、WO 2016/069647、WO 2011/066048、US 2016/0304624、米国特許第9,476,028号およびHailemichael and Overwijk, Int J Biochem Cell Biol. (2014) 53: 46-50を参照のこと)。いくつかの態様において、導入遺伝子特異的拡大のための方法は、抗イディオタイプ抗体を投与することを含む。その抗原結合断片を含む抗イディオタイプ抗体は、抗体のイディオトープまたはその抗原結合断片、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)などの組換え受容体の抗原結合ドメインを、特異的に認識し、それに特異的に標的とされ、かつ/またはそれに特異的に結合する。イディオトープは、抗体の可変部分内の任意の単一の抗原決定基またはエピトープである。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、アゴニストであり、かつ/または、特定の抗体またはその抗原結合断片を含有するコンジュゲートまたは組換え受容体を含む、特定の抗体を発現する細胞を刺激する特異的活性を示す(例えば、米国特許公報第US 2016/0096902号;第US 2016/0068601号;第US 2014/0322183号;第US 2015/0175711号;第US 2015/283178号;米国特許第9,102,760号;Jena et al. PloS one (2013) 8(3):e57838; Long et al., Nature Medicine (2015) 21(6):581-590; Lee et al., The Lancet (2015) 385(9967):517-528; Zhao et al., PloS One (2014) 9(5):e96697;Leung et al., MAbs. (2015) 7(1):66-76を参照のこと)。
【０４７８】
2. 細胞の拡大または活性をモジュレートするための作用物質
いくつかの態様において、該方法は、投与される改変細胞を一般に含む免疫細胞または免疫機能の拡大、増殖、生存および/または活性のモジュレーションを含む。いくつかの態様において、該方法は、インビボで、例えば対象の体内で、一般に免疫刺激性である工程、または、投与された細胞を含む免疫細胞の拡大、増殖、生存および/もしくは活性を一般に促進、強化、増大および/もしくはブーストする工程を含む。いくつかの態様において、作用物質は、免疫細胞、例えば投与された細胞の増殖、拡大および/または生存を抑制する阻害因子の効果をインビボで低減、阻害および/または最小化することができる。
【０４７９】
a. 負の調節因子の阻害
いくつかの態様において、該方法は、改変された細胞の拡大を、例えば、投与された細胞、例えば、改変された免疫細胞の増殖、拡大および/または活性化の負の調節因子を阻害することによって、モジュレートすることを含む。対象の体内の特定の環境で、組換え受容体を発現する投与された細胞は、細胞の成長、増殖、拡大および/または生存を抑止または抑制する環境、例えば免疫抑制環境と遭遇し得る。例えば、免疫抑制環境は、免疫抑制サイトカイン、調節モジュレーターおよび共阻害性受容体を含有することができる。いくつかの態様において、追加の作用物質を使用して、投与された細胞の拡大をモジュレートする、例えば、抑制環境を克服することができる。
【０４８０】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、免疫調節物質、免疫チェックポイント阻害剤、代謝経路、アデノシン経路のモジュレーターまたはアデノシン受容体アンタゴニストもしくはアゴニストおよびシグナル伝達経路のモジュレーター、例えば、キナーゼ阻害剤を含む。
【０４８１】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、免疫調節物質、例えば免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの例では、追加の作用物質は、投与された細胞の拡大および/または増殖を増加、強化または増大させ、それによって、免疫応答を、免疫チェックポイントタンパク質(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤)を遮断することによって、増加、強化または増大させる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、改変された細胞、例えば、組換え受容体発現細胞の活性を増強する作用物質であり、免疫阻害性分子または免疫チェックポイント分子を阻害する分子である。免疫阻害性分子の例は、PD-1、PD-L1、CTLA4、TEVI3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFR βを含む。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に対して指向される抗体、例えば、細胞傷害性T-リンパ球抗原4(CTLA4またはCD152)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、またはプログラム細胞死タンパク質1リガンド1(PD-L1)に対して指向される抗体であることができる(例えば、Pardoll、Nat Rev Cancer. 2012 Mar. 22; 12(4):252-264を参照のこと)。
【０４８２】
いくつかの態様において、該方法は、組換え受容体を発現する細胞と、阻害性細胞表面受容体、例えば形質転換成長因子ベータ受容体(TGFβR)を阻害する作用物質とを接触させることを含む。いくつかの態様において、投与される細胞、例えば組換え受容体発現細胞を、エフェクター機能を阻害し得る免疫抑制サイトカインの効果に抵抗するように改変することができる(例えば、Foster et al., J Immunother. (2008) 31:500-505; Bollard et al., Molecular Therapy. (2012) 20:S22; Bendle et al., J. Immunol. (2013) 191(6):3232-3239を参照のこと)。いくつかの態様において、追加の作用物質は、抗TGFβ抗体または抗TGFβR抗体である(例えば、WO 2011/109789を参照のこと)。
【０４８３】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、免疫抑制因子、例えばアデノシンの代謝、シグナル伝達および/または輸送をモジュレートする。いくつかの態様において、追加の作用物質は、細胞外アデノシンもしくはアデノシン受容体の阻害剤、または細胞外アデノシンレベルの低減もしくは減少を引き起こす作用物質、例えば、細胞外アデノシンの形成を防止する、細胞外アデノシンを分解する、不活性にするおよび/もしくは減少させる作用物質である。いくつかの態様において、追加の作用物質は、A2a、A2bおよび/またはA3受容体などのアデノシン受容体アンタゴニストである。
【０４８４】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、アデノシンレベルおよび/またはアデノシン経路成分のモジュレーターである。アデノシンは、体内で免疫調節物質として機能することができる。例えば、アデノシン受容体サブタイプを非選択的に活性化するアデノシンおよびいくつかのアデノシン類似体は、炎症性酸化産物の好中球産生を減少させる(Cronstein et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 451:291, 1985; Roberts et al., Biochem. J., 227:669, 1985; Schrier et al., J. Immunol. 137:3284, 1986; Cronstein et al., Clinical Immunol. Immunopath. 42:76, 1987)。いくつかの場合に、細胞外アデノシンまたはアデノシン類似体の濃度は、特定の環境、例えば、腫瘍微小環境(TME)において増加することができる。いくつかの場合に、アデノシンまたはアデノシン類似体シグナル伝達は、低酸素または低酸素もしくはその調節に関与する因子、例えば、低酸素誘導性因子(HIF)に依存する。いくつかの態様において、アデノシンシグナル伝達の増加は、炎症誘発性サイトカイン産生の阻害をもたらす細胞内cAMPおよびcAMP依存性タンパク質キナーゼの増加であることができ、免疫抑制分子の合成およびTregの発生を導くことができる(Sitkovsky et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(7):598-605)。いくつかの態様において、追加の作用物質は、アデノシン、アデノシン類似体および/またはアデノシンシグナル伝達の免疫抑制効果を低減または逆転させることができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、低酸素によって駆動されるA2-アデノシン作動性のT細胞免疫抑制を低減または逆転させることができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、アデノシン受容体のアンタゴニスト、細胞外アデノシン分解物質、CD39/CD73外酵素によるアデノシン生成の阻害剤、および低酸素-HIF-1αシグナル伝達の阻害剤の中から選択される。いくつかの態様において、追加の作用物質は、アデノシン受容体アンタゴニストまたはアゴニストである。
【０４８５】
細胞外アデノシンの阻害剤(例えば、細胞外アデノシンの形成を防止する、細胞外アデノシンを分解する、不活性にするおよび/もしくは減少させる、作用物質)、および/またはアデノシン受容体阻害剤(例えば、アデノシン受容体アンタゴニスト)による、細胞外アデノシンまたはアデノシン受容体の阻害または低減は、マクロファージ、好中球、顆粒球、樹状細胞、T細胞および/またはB細胞媒介性応答などの免疫応答を増強することができる。加えて、Gsタンパク質媒介性cAMP依存性細胞内経路の阻害剤およびアデノシン受容体誘発性Giタンパク質媒介性細胞内経路の阻害剤も、急性炎症および慢性炎症を増加させることができる。
【０４８６】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、アデノシン受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、例えば、アデノシン受容体A2a、A2b、A1、およびA3の1以上のアンタゴニストまたはアゴニストである。A1およびA3は、アデニル酸シクラーゼ活性を阻害し、A2aおよびA2bはそれを刺激する。A2a、A2b、およびA3などのある特定のアデノシン受容体は、炎症の間、免疫応答を抑制または低減することができる。したがって、免疫抑制アデノシン受容体と拮抗することは、免疫応答を、例えば、投与される細胞、例えばCAR発現T細胞からの免疫応答を増大、ブーストまたは強化することができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、細胞外アデノシンの産生およびアデノシン誘発性シグナル伝達をアデノシン受容体を介して阻害する。例えば、免疫応答、局所組織炎症、および標的とされた組織破壊の増強は、アデノシン産生局所組織低酸素を阻害もしくは低減することによって;蓄積した細胞外アデノシンを分解することによって(もしくは不活性にすることによって);免疫細胞上のアデノシン受容体の発現を防止もしくは減少させることによって;および/または、アデノシン受容体を介してアデノシンリガンドによってシグナル伝達を阻害する/それと拮抗することによって、増強することができる。
【０４８７】
アンタゴニストは、生物学的応答を誘起することなしに細胞受容体に結合する作用物質のような、別のものの作用を無効にする傾向のある任意の物質である。いくつかの態様において、アンタゴニストは、A2a、A2b、またはA3受容体などのアデノシン受容体に対するアンタゴニストである化合物である。いくつかの態様において、アンタゴニストは、アデノシン受容体に結合するがG1タンパク質依存性細胞内経路を誘発しない、ペプチド、またはペプチド模倣体である。例示的なアデノシン受容体アンタゴニストは、米国特許第5,565,566号;第5,545,627号、第5,981,524号;第5,861,405号;第6,066,642号;第6,326,390号;第5,670,501号;第6,117,998号;第6,232,297号;第5,786,360号;第5,424,297号;第6,313,131号、第5,504,090号;および第6,322,771号;ならびにJacobson and Gao, Nat Rev Drug Discov. (2006) 5(3): 247-264に記載されている。
【０４８８】
b. 免疫刺激の促進
いくつかの態様において、該方法は、免疫刺激性である追加の作用物質を投与することを含む。いくつかの態様において、追加の作用物質は、一般に、免疫細胞の増殖、拡大、生存および/または効力を促進することができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、投与される細胞、例えば、組換え受容体発現細胞を特異的に増進させることができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、サイトカインである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、リガンドである。
【０４８９】
いくつかの態様において、追加の作用物質は、免疫刺激リガンド、例えば、CD40Lである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、サイトカイン、例えば、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、アルファ、ベータまたはガンマインターフェロン(IFN)およびエリスロポエチン(EPO)である。
【０４９０】
3. リンパ球枯渇療法
いくつかの局面において、提供される方法は、1以上のリンパ球枯渇療法を、例えば、細胞、例えば組換え受容体発現細胞の投与の開始の前にまたはそれと同時に投与することをさらに含むことができる。いくつかの態様において、リンパ球枯渇療法は、シクロホスファミドなどのホスファミドの投与を含む。いくつかの態様において、リンパ球枯渇療法は、フルダラビンの投与を含むことができる。いくつかの態様において、フルダラビンは、リンパ球枯渇療法から除外される。いくつかの態様において、リンパ球枯渇療法は投与されない。
【０４９１】
対象を免疫枯渇(例えば、リンパ球枯渇)療法でプレコンディショニングすることは、養子細胞療法(ACT)の効果を改善することができる。シクロスポリンとフルダラビンの組み合わせを含むリンパ球枯渇剤でのプレコンディショニングは、移入された細胞の応答および/または持続を改善することを含め、細胞療法における移入された腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)細胞の効力を改善する際に有効である。例えば、Dudley et al., Science, 298, 850-54 (2002); Rosenberg et al., Clin Cancer Res, 17(13):4550-4557 (2011)を参照のこと。同様に、CAR+T細胞の状況において、いくつかの研究では、リンパ球枯渇剤、最も一般的には、シクロホスファミド、フルダラビン、ベンダムスチン、またはそれらの組み合わせが、時に低線量照射を伴って、組み入れられている。Han et al. Journal of Hematology & Oncology, 6:47 (2013); Kochenderfer et al., Blood, 119: 2709-2720 (2012); Kalos et al., Sci Transl Med, 3(95):95ra73 (2011); Clinical Trial Study Record Nos.: NCT02315612; NCT01822652を参照のこと。
【０４９２】
療法の効力を弱め得る様々な帰趨の1以上のリスクを低減することを目的に、そのようなプレコンディショニングを行うことができる。これらは、IL-2、IL-7、および/またはIL-15などの恒常性サイトカインおよび活性化サイトカインに対してT細胞、B細胞、NK細胞がTILと競合する「サイトカインシンク」として公知の現象;制御性T細胞、NK細胞、または免疫系の他の細胞によるTILの抑制;腫瘍微小環境における負の調節因子の影響を含む。Muranski et al., Nat Clin Pract Oncol. December; 3(12): 668-681 (2006)。
【０４９３】
したがって、いくつかの態様において、提供される方法は、リンパ球枯渇療法を対象に投与することをさらに伴う。いくつかの態様において、該方法は、細胞の用量の投与の前に、リンパ球枯渇療法を対象に投与することを伴う。いくつかの態様において、リンパ球枯渇療法は、フルダラビンおよび/またはシクロホスファミドなどの化学療法剤を含有する。いくつかの態様において、細胞および/またはリンパ球枯渇療法の投与は、外来送達(outpatient delivery)を介して行われる。
【０４９４】
いくつかの態様において、該方法は、細胞の用量の投与の前に、プレコンディショニング剤、例えばリンパ球枯渇剤または化学療法剤、例えばシクロホスファミド、フルダラビン、またはそれらの組み合わせを対象に投与することを含む。例えば、対象に、最初の用量または後続の用量の少なくとも2日前、例えば少なくとも3、4、5、6、または7日前に、プレコンディショニング剤を投与してよい。いくつかの態様において、対象に、細胞の用量の投与前の7日以内、例えば6、5、4、3、または2日以内に、プレコンディショニング剤が投与される。
【０４９５】
いくつかの態様において、対象は、20mg/kg〜100mg/kgもしくは約20mg/kg〜100mg/kg、例えば40mg/kg〜80mg/kgもしくは約40mg/kg〜80mg/kgの用量のシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの局面において、対象は、約60mg/kgのシクロホスファミドありまたはなしでプレコンディショニングされる。いくつかの態様において、シクロホスファミドを、単一用量で投与しても、例えば毎日、1日おきにまたは3日毎に与えられる複数用量で投与してもよい。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、1日1回で、1日または2日間投与される。いくつかの態様において、リンパ球枯渇剤がシクロホスファミドを含む場合、対象に、シクロホスファミドが、100mg/m2〜500mg/m2もしくは約100mg/m2〜500mg/m2、例えば200mg/m2〜400mg/m2もしくは約200mg/m2〜400mg/m2、または250mg/m2〜350mg/m2(数値を含む)の用量で投与される。いくつかの状況で、対象に、約300mg/m2のシクロホスファミドが投与される。いくつかの態様において、シクロホスファミドを、単一用量で投与しても、例えば毎日、1日おきにまたは3日毎に与えられる複数用量で投与してもよい。いくつかの態様において、シクロホスファミドが、毎日、例えば1〜5日間、例えば、3〜5日間投与される。いくつかの状況で、細胞療法の開始前に、対象に、約300mg/m2のシクロホスファミドが3日間毎日投与される。
【０４９６】
いくつかの態様において、フルダラビンを、単一用量で投与しても、例えば毎日、1日おきにまたは3日毎に与えられる複数用量で投与してもよい。いくつかの態様において、フルダラビンが、毎日、例えば1〜5日間、例えば、3〜5日間投与される。いくつかの状況で、細胞療法の開始前に、対象に、約30mg/m2のフルダラビンが3日間毎日投与される。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、1日1回で、1日または2日間投与される。
【０４９７】
いくつかの態様において、リンパ球枯渇剤がフルダラビンを含む場合、対象に、フルダラビンが、1mg/m2〜100mg/m2または約1mg/m2〜100mg/m2、例えば10mg/m2〜75mg/m2、15mg/m2〜50mg/m2、20mg/m2〜30mg/m2、もしくは24mg/m2〜26mg/m2または約10mg/m2〜75mg/m2、15mg/m2〜50mg/m2、20mg/m2〜30mg/m2、または24mg/m2〜26mg/m2の用量で投与される。いくつかの状況で、対象に、25mg/m2のフルダラビンが投与される。いくつかの態様において、フルダラビンを、単一用量で投与しても、例えば毎日、1日おきにまたは3日毎に与えられる複数用量で投与してもよい。いくつかの態様において、フルダラビンが、毎日、例えば1〜5日間、例えば、3〜5日間投与される。
【０４９８】
いくつかの態様において、リンパ球枯渇剤は、作用物質の組み合わせ、例えばシクロホスファミドとフルダラビンの組み合わせを含む。したがって、作用物質の組み合わせは、上述したものなどの任意の用量または投与スケジュールでのシクロホスファミドと、上述したものなどの任意の用量または投与スケジュールでのフルダラビンを含んでよい。例えば、いくつかの局面において、細胞の用量の前に、対象に、60mg/kg(約2g/m2)のシクロホスファミドおよび3〜5用量の25mg/m2のフルダラビンが投与される。
【０４９９】
1つの例示的な投薬レジメンでは、第一の用量を受ける前に、対象は、シクロホスファミドおよびフルダラビン(cy/flu)のリンパ球枯渇プレコンディショニング化学療法を受け、これは、CAR発現細胞の第一の用量の少なくとも2日前、一般に細胞の投与の前の7日以内に投与される。プレコンディショニング処置後、対象に、上述した通りのCAR発現T細胞の用量が投与される。
【０５００】
いくつかの態様において、細胞の用量の注入前のプレコンディショニング剤の投与は、処置の帰趨を改善する。例えば、いくつかの局面において、プレコンディショニングは、その用量での処置の効力を改善するか、または、組換え受容体発現細胞(例えば、CAR発現細胞、例えばCAR発現T細胞)の対象における持続を増加させる。いくつかの態様において、プレコンディショニング処置は、無病生存、例えば、細胞の用量の後の所与の期間後に生存しておりかつ微小残存疾患も分子的に検出可能な疾患も示さない対象の割合を増加させる。いくつかの態様において、無病生存期間の中央値までの時間が増加する。
【０５０１】
細胞が対象(例えば、ヒト)に投与されたら、改変された細胞集団の生物学的活性が、いくつかの局面において、多数の公知の方法のいずれかによって測定される。評価するためのパラメーターは、インビボでは、例えば、画像検査による、またはエクスビボでは、例えば、ELISAもしくはフローサイトメトリーによる、改変されたもしくは天然のT細胞または他の免疫細胞の抗原への特異的結合を含む。ある特定の態様において、標的細胞を破壊する改変細胞の能力を、当技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)、およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載されている、例えば細胞傷害性アッセイを使用して測定することができる。ある特定の態様において、細胞の生物学的活性はまた、CD107a、IFNγ、IL-2およびTNFなどのある特定のサイトカインの発現および/または分泌をアッセイすることによっても測定することができる。いくつかの局面において、生物学的活性は、臨床的帰趨、例えば腫瘍量または負荷の低減を評価することによって測定される。いくつかの局面において、細胞の毒による帰趨、持続および/もしくは拡大、ならびに/または宿主免疫応答の存在もしくは非存在が評価される。
【０５０２】
いくつかの態様において、細胞の用量の注入前のプレコンディショニング剤の投与は、その用量での処置の効力を改善することなどによって処置の帰趨を改善するか、または、組換え受容体発現細胞(例えば、CAR発現細胞、例えばCAR発現T細胞)の対象における持続を増加させる。
【０５０３】
D. 細胞の修飾
ある特定の態様において、治療有効性または予防有効性が増加するようにかつ/または拡大、増殖、生存および/もしくは効力をモジュレートできるように、いくつもの手法で細胞が修飾される。いくつかの態様において、対象への投与後にインビボで拡大、増殖、生存および/または効力をモジュレートできるように、例えば、強化、ブーストおよび/または増大できるように、細胞が修飾される。いくつかの態様において、導入遺伝子および/または免疫調節因子の発現をモジュレートおよび/または制御できるように、細胞が修飾される。いくつかの態様において、組換え受容体の特定の成分の発現および/または活性をモジュレートするように、細胞が修飾される。いくつかの態様において、作用物質、例えば核酸、例えば阻害性核酸の発現を増加または減少させるように、細胞が修飾される。いくつかの態様において、作用物質を発現および/または分泌するように、細胞が修飾される。
【０５０４】
いくつかの態様において、改変された細胞によって発現される改変された組換え受容体、例えばCARを、直接的にまたはリンカーを介して間接的に、標的指向部分にコンジュゲートすることができる。標的指向部分への化合物、例えば組換え受容体のコンジュゲートの実施は、当技術分野において公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)、および米国特許5,087,616を参照のこと。
【０５０５】
1. 阻害性核酸および遺伝子変更
いくつかの態様において、該方法は、細胞と、投与された細胞（例えば、組換え受容体を発現する改変されたT細胞）の負の調節因子の発現を低減するかまたはその低減を達成することができる作用物質とを接触させることによって、投与されるべき細胞を修飾することを含む。細胞の負の調節因子は、免疫チェックポイント阻害剤、阻害性受容体および/またはアデノシンモジュレーターなどの本明細書に記載したいずれかを含む。いくつかの態様において、負の調節因子の発現を低減するかまたはその低減を達成することができる作用物質は、負の調節因子をコードする遺伝子または核酸に相補的である、それを標的とする、阻害するおよび/またはそれに結合するものなどの阻害性核酸分子であるかまたはそれを含む作用物質を含む。いくつかの態様において、作用物質は、Cas9、例えばいくつかの場合に酵素的に不活性なCas9と負の調節因子をコードする遺伝子を標的とするgRNAとを含む、リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を含む複合体であるかまたはそれを含む。
【０５０６】
いずれかのそのような態様のいくつかにおいて、阻害性核酸分子は、RNA干渉物質を含む。いずれかのそのような態様のいくつかにおいて、阻害性核酸は、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA適合shRNA、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、ヘアピンsiRNA、前駆体マイクロRNA(プレmiRNA)またはマイクロRNA(miRNA)であるかまたはそれを含有するかまたはコードする。阻害性核酸を設計する方法および阻害性核酸を発現するように細胞を修飾する方法は、当技術分野において公知である(例えば、WO 2004/0455543およびWO 2004/048566を参照のこと)。
【０５０７】
いくつかの態様において、改変された細胞は、免疫モジュレーション、免疫細胞の負の調節および/または免疫抑制に関与する遺伝子をコードする遺伝子座を標的とする、遺伝子変更、または遺伝子編集に供される。いくつかの態様において、遺伝子編集は、標的とする遺伝子座における挿入もしくは欠失、または標的とする遺伝子座の「ノックアウト」およびコードされたタンパク質の発現の排除をもたらす。いくつかの態様において、遺伝子編集は、CRISPR/Cas9系を使用した非相同末端結合(NHEJ)によって達成される。いくつかの態様において、1以上のガイドRNA(gRNA)分子を、1以上のCas9ヌクレアーゼ、Cas9ニッカーゼ、酵素的に不活性なCas9もしくはそのバリアント、または改変されたジンクフィンガーもしくはTALE系と共に使用することができる。遺伝子改変の方法は、当技術分野において公知である(例えば、WO 2015/161276;米国特許第6,140,081号;第6,453,242号;および第6,534,261号;WO 98/53058;WO 98/53059;WO 98/53060;WO 02/016536、WO 03/016496ならびに米国公報第2011/0301073号を参照のこと)。
【０５０８】
2. 追加の作用物質を発現させるための修飾
いくつかの態様において、細胞、例えば、組換え受容体発現細胞は、投与された細胞の増殖、拡大、生存および/または効力を促進、強化、ブーストおよび/または増大させる追加の作用物質を発現および/または分泌するようにさらに修飾される。例えば、組換え受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞を、T細胞および組換え受容体の免疫抑制効果を克服するならびに/またはその拡大および/もしくは機能を増強する追加の作用物質を発現および/または分泌するようにさらに改変することができる。いくつかの態様において、投与された細胞の拡大を促進するサイトカインを発現するように細胞を改変することができる。一部の態様において、そのような追加の作用物質を、誘導性発現系、例えば、誘導性プロモーターに機能的に連結させることができる。
【０５０９】
いくつかの態様において、投与された細胞を、免疫抑制因子、例えば本明細書に記載したいずれかを阻害するおよび/または免疫刺激因子を刺激する作用物質を発現および/または分泌するように修飾することができる。いくつかの態様において、投与された細胞によって発現される追加の作用物質は、前記細胞の腫瘍微小環境における免疫抑制を減少または防止する(例えば、米国特許公報第US 2016/0045551号を参照のこと)。いくつかの態様において、投与された細胞によってコードされるおよび/または分泌される追加の作用物質は、本明細書に記載の追加の作用物質のいずれかを含むことができる。
【０５１０】
いくつかの態様において、投与された細胞によってコードされる追加の作用物質は、可溶性であるかまたは分泌される。いくつかの態様において、追加の作用物質は、可溶性scFvである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、サイトカインである。
【０５１１】
3. 組換え受容体の発現および/または活性の調節
いくつかの態様において、該方法は、組換え受容体、例えばCARの調節可能な発現および/または活性を可能にするように細胞を修飾すること、それによって組換え受容体を介してシグナルを調節することを含む。いくつかの態様において、調節可能な発現および/または活性は、特定の調節エレメントおよび/または系、例えば本明細書に記載したいずれかを含有するようにまたはそれによって制御されるように組換え受容体を構成することによって達成される。いくつかの態様において、改変された細胞の対象の身体への投与および/または特定のリガンドへの曝露は、組換え受容体、例えばCARの発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、組換え受容体の発現および/または活性の調節は、組換え受容体、例えばCARの発現を調節できる追加の作用物質の投与によって達成される。いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCARの調節された発現は、調節可能な転写因子放出系によって、または、ポリペプチド、例えば組換え受容体の立体構造変化および/もしくは多量体化を誘導できる追加の作用物質の投与によって達成される。いくつかの態様において、追加の作用物質は、化学誘導因子である。
【０５１２】
IV.  定義
特に定義しないかぎり、本明細書において使用されるすべての専門用語、表記ならびに他の技術および科学用語または術語は、請求される主題が属する技術分野における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確さのためおよび／または容易な参照のために本明細書において定義され、本明細書におけるこのような定義の包含は、当技術分野において一般的に理解されるものと実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
【０５１３】
本明細書に使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに他のことを定めるのでないかぎり、複数の指示対象を含む。例えば、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、「少なくとも1つ」または「1つもしくは複数」を意味する。
【０５１４】
本開示を通して、請求される主題の様々な局面が、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔性のためのものであると理解されるべきであり、請求される主題の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、すべての考えうる部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、およびその記述される範囲における他の任意の記述される値または介在値は、請求される主題内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、このより小さい範囲内に独立して含まれる場合があり、かつ記述される範囲において具体的に除外される任意の限度次第で、請求される主題内にも包含される。記述される範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を除外する範囲も、請求される主題に含まれる。このことは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０５１５】
本明細書に使用される「約」という用語は、この技術分野における当業者に容易に分かる、それぞれの値に対する通常の誤差範囲を表す。本明細書における「約」が付いた値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に向けられている態様を含む（かつ記載する）。
【０５１６】
本明細書に使用される対象は、ヒトおよび他の哺乳動物などの任意の生きた生物を含む。哺乳動物には、非限定的に、ヒト、および農用動物、競技動物、げっ歯類およびペットを含めた非ヒト動物が含まれる。
【０５１７】
1つまたは複数の特定の細胞型または細胞集団に言及するときの、本明細書に使用される「枯渇させること」は、例えば、組成物中の細胞の総数もしくは組成物の体積と比較して、または集団もしくは細胞により発現されるマーカーに基づく負の選択により、または枯渇されるべき細胞集団もしくは細胞に存在しないマーカーに基づく正の選択などにより、他の細胞型に対して、細胞型または集団の数またはパーセンテージを減少させることを表す。この用語は、組成物からの細胞、細胞型、または集団の完全な除去を必要としない。
【０５１８】
1つまたは複数の特定の細胞型または細胞集団に言及するときの、本明細書に使用される「富化すること」は、例えば、組成物中の細胞の総数もしくは組成物の体積と比較して、または集団もしくは細胞により発現されるマーカーに基づく正の選択により、または枯渇されるべき細胞集団もしくは細胞上に存在しないマーカーに基づく負の選択などにより、他の細胞型に対して、細胞型または集団の数またはパーセンテージを増加させることを表す。この用語は、組成物からの他の細胞、細胞型、または集団の完全な除去を必要とせず、そのように富化された細胞が、富化された組成物中に100％またはほぼ100％で存在することを必要としない。
【０５１９】
本明細書に使用される、細胞または細胞集団が特定のマーカーについて「陽性」または「+」であるという記述は、細胞上または中に特定のマーカー、典型的には表面マーカーが検出可能に存在することを表す。表面マーカーに言及するとき、この用語は、いくつかの態様では、フローサイトメトリーにより、例えばマーカーに特異的に結合する抗体を用いて染色し、抗体を検出することにより検出される表面発現の存在を表し、ここで、染色は、フローサイトメトリーにより、アイソタイプがマッチする対照を用いてその他の同一の条件で同じ手順を実施して検出される染色を実質的に超えるレベルで、および／またはマーカーについて陽性であることが公知の細胞と実質的に類似のレベルで、および／またはマーカーについて陰性であることが公知の細胞と比べて実質的に高いレベルで、検出可能である。
【０５２０】
本明細書に使用される、細胞または細胞集団が特定のマーカーについて「陰性」であるという記述は、細胞上または細胞中に特定のマーカー、典型的には表面マーカーが実質的に検出可能に存在しないことを表す。表面マーカーに言及するとき、この用語は、いくつかの態様では、フローサイトメトリーにより、例えばマーカーと特異的に結合する抗体を用いて染色し、抗体を検出することにより検出される表面発現の不在を表し、ここで、染色は、フローサイトメトリーにより、アイソタイプがマッチする対照を用いてその他の同一の条件で同じ手順を実施して検出される染色を実質的に超えるレベルで、および／またはマーカーについて陽性であることが公知の細胞よりも実質的に低いレベルで、および／またはマーカーについて陰性であることが公知の細胞と比べて実質的に類似のレベルで、検出されない。
【０５２１】
本明細書に使用される「アミノ酸配列の同一率（%）」および「同一率」は、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して使用されるとき、配列を整列させ、最大配列同一率を達成するために、およびいかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに必要に応じてギャップを導入した後に参照ポリペプチド配中のアミノ酸残基と同一な、候補配列（例えばVpxもしくはVprタンパク質）中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一率を決定するためのアライメントは、当業者の技能の範囲内である様々な方法で、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の完全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０５２２】
アミノ酸置換は、別のアミノ酸によるポリペプチド中の1つのアミノ酸の置き換えを含みうる。アミノ酸は、一般的に以下の共通の側鎖特性により群分けすることができる。
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖の配向に影響する残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【０５２３】
非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの1つのメンバーを他のクラスに交換することを含む。
【０５２４】
本明細書に使用される「に対応する位置の」またはヌクレオチドもしくはアミノ酸位置が、配列リストなどに示される、開示された配列中のヌクレオチドもしくはアミノ酸位置に「対応する」という詳述は、標準的なアライメントアルゴリズム、例えばGAPアルゴリズムを使用して同一性を最大にするために、開示された配列とのアライメントの際に同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸位置を表す。いくつかの態様では、VpxもしくはVprタンパク質の例示的な対応する残基は、SEQ ID NO:1に示される例示的なVpx配列または本明細書に示される他のVpxもしくはVpr配列との配列のアライメントにより同定することができる。いくつかの態様では、SAMHD1の例示的な対応する残基は、SEQ ID NO:19に示される例示的なSAMHD1配列との配列のアライメントにより同定することができる。配列を整列させることにより、当業者は、例えば保存された残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して、対応する残基を同定することができる。一般に、対応する位置を同定するために、最高の順序のマッチが得られるようにアミノ酸の配列が整列される（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を参照されたい）。
【０５２５】
本明細書に使用される「ベクター」という用語は、核酸分子と連結された別の核酸を増やすことが可能な当該核酸分子を表す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターおよびベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれた当該ベクターを含む。ある特定のベクターは、機能的に連結された核酸の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターは、別の核酸を保有するゲノムを有し、その増加のために宿主ゲノム中に挿入可能なウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクターを含む。
【０５２６】
本明細書に使用される組成物は、細胞を含めた2つ以上の産物、物質、または化合物の任意の混合物を表す。これは、溶液、懸濁物、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組合せでありうる。
【０５２７】
本明細書に使用される「処置」、「処置する」、および「処置すること」という用語は、疾患もしくは状態もしくは障害、または症状、有害作用もしくは帰趨、またはそれに関連する表現型の完全または部分的な回復または軽減を表す。ある特定の態様では、効果は、疾患もしくは状態またはそれに起因し得る有害症状を部分的または完全に治癒するような治療的である。
【０５２８】
本明細書に使用される化合物または組成物または組合せの「治療有効量」は、疾患状態、もしくは障害の処置および／または処置の薬物動態的もしくは薬力学的効果のためなどの、所望の治療結果を達成するために必要な、投薬および期間での有効量を表す。治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重、および投与される細胞集団などの要因に応じて変動する場合がある。
【０５２９】
本出願において参照される特許文書、科学論文およびデータベースを含めたすべての刊行物は、各個別の刊行物が個別に参照により組み入れられるのと同じ程度に、すべての目的のためにその全体で参照により組み入れられる。本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開された出願および他の刊行物に示される定義に反するまたは他の方法で矛盾するならば、本明細書に示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義に優先される。
【０５３０】
本明細書に使用される節の見出しは、単に構成上のためであり、記載される主題を限定していると解釈されるべきでない。
【０５３１】
Ｖ．例示的態様
以下の態様が提供される：
１．
組換え核酸を含むウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られた複数のT細胞を含むインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、
インキュベーションする工程が、対象から試料を得た後24時間以内に開始される；かつ／あるいは
インキュベーションする工程の前に、T細胞が、15℃、18℃、22℃、もしくは25℃よりも高い、または約15℃、約18℃、約22℃、もしくは約25℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、または24時間よりも長い期間供されたことがない；かつ／あるいは
インキュベーションする工程の前に、T細胞が、37°±2.0℃、約37°±2.0℃、37°±2.0℃よりも高い、または約37°±2.0℃よりも高い温度に、対象から試料を得た後15分、30分、1時間、または2時間よりも長い期間供されたことがない、
方法。
２．
インキュベーションする工程が、対象から試料を得た後1時間、3時間、6時間、12時間、もしくは18時間以内、または約1時間、3時間、6時間、12時間、もしくは18時間以内に開始される、態様1記載の方法。
３．
前記インキュベーションの前に、細胞活性化を促進する条件でT細胞を刺激することを含まない、態様1または2記載の方法。
４．
インキュベーションする工程の前に、インプット組成物が、
37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高いインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞を活性化することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、
TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤；CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7の存在下でのインキュベーション
を含むエクスビボ刺激に供されたことがない、態様1〜3のいずれかに記載の方法。
５．
インキュベーションする工程の前に、T細胞の5％、10％、20％、30％、もしくは40％以下が、活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、G1もしくはより後期の細胞周期である、かつ／または増殖することが可能である、態様1〜4のいずれかに記載の方法。
６．
組換え核酸を含むウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られたT細胞を含むインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、
インキュベーションする工程の前に、
T細胞またはインプット組成物が、37°±2.0℃よりも高い、もしくは約37°±2.0℃よりも高いインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞を活性化することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、
TCR複合体を経由するシグナルを誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤の存在下でのインキュベーション、ならびに／または
T細胞、CD4+ T細胞、および／もしくはCD8+ T細胞の増殖を誘導することが可能な1種もしくは複数種の剤；CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7の存在下でのインキュベーション
を含むエクスビボ刺激に供されたことがない、方法。
７．
1種または複数種の剤が、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含む、態様4または6記載の方法。
８．
組換え核酸を含むウイルスベクター粒子と、対象からの試料から得られたT細胞を含有するインプット組成物とをインキュベーションする工程を含む、T細胞に形質導入するための方法であって、
インキュベーションの前に、T細胞の5％、10％、20％、30％、もしくは40％以下が、活性化細胞である、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現する；IL-2、IFN-ガンマ、TNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含む、かつ／またはG1もしくはより後期の細胞周期である、方法。
９．
インプット組成物中のT細胞の10%以下が、インキュベーションの直前にHLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L、および4-1BBからなる群より選択されるT細胞活性化マーカーを含む、態様5または態様8記載の方法。
１０．
インキュベーションする工程の前に、T細胞の5%、10％、20％、30％、または40％よりも多くが、低密度脂質受容体（LDL-R）を発現する、態様1〜9のいずれかに記載の方法。
１１．
対象が、ヒトである、態様1〜9のいずれかに記載の方法。
１２．
インキュベーションする工程の前に、T細胞が、2℃〜8℃の温度で48時間よりも長く維持されたことがない、かつ／または維持されていない、態様1〜8のいずれかに記載の方法。
１３．
試料が、血液試料である、態様1〜12のいずれかに記載の方法。
１４．
試料が、白血球除去試料である、態様1〜12のいずれかに記載の方法。
１５．
T細胞が、未分画T細胞である、富化もしくは単離されたCD3+ T細胞である、富化もしくは単離されたCD4+ T細胞である、または富化もしくは単離されたCD8+ T細胞である、態様1〜14のいずれかに記載の方法。
１６．
T細胞が、対象からの試料から選択または富化されている、態様1〜15のいずれかに記載の方法。
１７．
前記インキュベーションの前に、対象から試料を得る工程および任意で試料からT細胞を選択もしくは富化する工程をさらに含み、
そのことが、任意で富化された組成物である、かつ／またはインプット組成物を生成する、態様1〜16のいずれかに記載の方法。
１８．
インプット組成物中のT細胞のパーセンテージが、T細胞の75%、80%、85%、90%、もしくは95%、または約75%、80%、85%、90%、もしくは95%よりも大きい、態様1〜17のいずれかに記載の方法。
１９．
T細胞が、CD4+またはCD8+細胞を含む、態様3〜18のいずれかに記載の方法。
２０．
T細胞が、CD4+およびCD8+細胞を含む、態様3〜18のいずれかに記載の方法。
２１．
CD4+細胞とCD8+細胞の比が、1：1、1：2、2：1、1：3、もしくは3：1、または約1：1、1：2、2：1、1：3、もしくは3：1である、態様20記載の方法。
２２．
試料が、少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも33％（v/v）もしくは少なくとも約33％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度の血清または血漿を含む；かつ／あるいは
インキュベーションする工程の前に、試料が、少なくとも10％（v/v）もしくは少なくとも約10％（v/v）、少なくとも15％（v/v）もしくは少なくとも約15％（v/v）、少なくとも20％（v/v）もしくは少なくとも約20％（v/v）、少なくとも25％（v/v）もしくは少なくとも約25％（v/v）、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）、少なくとも33％（v/v）もしくは少なくとも約33％（v/v）、少なくとも35％（v/v）もしくは少なくとも約35％（v/v）、または少なくとも40％（v/v）もしくは少なくとも約40％（v/v）の濃度の血清または血漿とエクスビボで接触されたことがある、
態様1〜21のいずれかに記載の方法。
２３．
試料が、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）の濃度の血清もしくは血漿を含む；かつ／または
インキュベーションする工程の前に、試料が、少なくとも30％（v/v）もしくは少なくとも約30％（v/v）の濃度の血清もしくは血漿とエクスビボで接触されたことがある、
態様1〜22のいずれかに記載の方法。
２４．
血清または血漿が、ヒトの血清または血漿である、態様22または態様23記載の方法。
２５．
血清または血漿が、対象について自己の血清または血漿である、態様22〜24のいずれかに記載の方法。
２６．
試料が、抗凝固薬を含む、態様1〜22のいずれかに記載の方法。
２７．
抗凝固薬が、遊離クエン酸イオンを含む、態様26記載の方法。
２８．
インキュベーションする工程の前に、T細胞を、任意で試料中でまたは富化された組成物中で、凍結保護物質の存在下で凍結保存し、それにより、凍結保存組成物を産生する工程を含む、態様1〜27のいずれかに記載の方法。
２９．
インキュベーションする工程の前に、凍結保護物質を減少させるもしくは除去するおよび／またはインプット組成物を生成させる条件で凍結保存組成物を洗浄する、態様28記載の方法。
３０．
インプット組成物が、N-アセチルシステイン（NAC）；血清、任意でヒト血清；組換えインターロイキン-2（IL-2）、組換えインターロイキン-15（IL-15）、および／または組換えインターロイキン-7（IL-7）を含む、態様1〜29のいずれかに記載の方法。
３１．
インプット組成物が、0.4mg/mL〜4mg/mL、0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは1.6mg/mL〜2.4mg/mL、または約0.4mg/mL〜4mg/mL、約0.8mg/mL〜3.6mg/mL、もしくは約1.6mg/mL〜2.4mg/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度のN-アセチルシステインを含む；あるいは
インプット組成物が、少なくとも0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mL、または少なくとも約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mL、または約0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL、もしくは4.0mg/mLの濃度のN-アセチルシステインを含む、
態様1〜30のいずれかに記載の方法。
３２．
インプット組成物が、0.5%〜25％（v/v）、1.0%〜10％（v/v）、もしくは2.5%〜5.0％（v/v）、または約0.5%〜25％（v/v）、1.0%〜10％（v/v）、もしくは2.5%〜5.0％（v/v）（それぞれ両端の値を含む）の濃度の血清、任意でヒト血清を含む；あるいは
インプット組成物が、少なくとも0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%、または少なくとも約0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%、または約0.5%、1.%、2.5%、5％（v/v）、もしくは10%の濃度の血清、任意でヒト血清を含む、態様1〜31のいずれかに記載の方法。
３３．
インプット組成物が、10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL、または約10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、もしくは500IU/mL、または少なくとも約10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、もしくは500IU/mLの濃度の組換えIL-2、任意で組換えヒトIL-2を含む；かつ／あるいは
インプット組成物が、1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、もしくは5IU/mL〜10IU/mL、または約1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、もしくは5IU/mL〜10IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL、もしくは50IU/mL、または少なくとも約1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL、もしくは50IU/mLの濃度の組換えIL-15、任意で組換えヒトIL-15を含む；かつ／あるいは
インプット組成物が、50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは200IU/mL〜600IU/mL、または約50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは200IU/mL〜600IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度の；あるいは少なくとも50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、もしくは1000IU/mL、または少なくとも約50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL、もしくは1000IU/mLの濃度の組換えIL-7、任意で組換えヒトIL-7を含む、
態様1〜32のいずれかに記載の方法。
３４．
インキュベーションする工程が、ウイルスベクター粒子をインプット組成物と一緒にスピン接種する（spinoculate）段階を含む、態様1〜33のいずれかに記載の方法。
３５．
スピン接種する段階が、遠心チャンバーの内部キャビティー中でウイルスベクター粒子およびインプット組成物を回転させることを含み、
該回転が、該キャビティーの側壁内面で、
500g〜2500g、500g〜2000g、500g〜1600g、500g〜1000g、600g〜1600g、600g〜1000g、1000g〜2000g、もしくは1000g〜1600g、または約500g〜2500g、500g〜2000g、500g〜1600g、500g〜1000g、600g〜1600g、600g〜1000g、1000g〜2000g、もしくは1000g〜1600g（それぞれ両端の値を含む）；あるいは
少なくとも600g、800g、1000g、1200g、1600g、もしくは2000g、または少なくとも約600g、800g、1000g、1200g、1600g、もしくは2000g
である相対遠心力を及ぼす、
態様34記載の方法。
３６．
スピン接種する段階が、
5分よりも長いもしくは約5分、10分よりも長いもしくは約10分、15分よりも長いもしくは約15分、20分よりも長いもしくは約20分、30分よりも長いもしくは約30分、45分よりも長いもしくは約45分、60分よりも長いもしくは約60分、90分よりも長いもしくは約90分、または120分よりも長いもしくは約120分；あるいは
5分〜60分、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分、または約5分〜60分、10分〜60分、15分〜60分、15分〜45分、30分〜60分、もしくは45分〜60分（それぞれ両端の値を含む）
である時間にわたる、
態様34または35記載の方法。
３７．
インプット組成物および／またはウイルスベクター粒子を形質導入アジュバントと接触させる工程をさらに含む、態様1〜36のいずれかに記載の方法。
３８．
接触させる工程が、ウイルスベクター粒子をインプット組成物と一緒にスピン接種する前、それと同時、またはその後に実施される、態様37記載の方法。
３９．
前記インキュベーションの少なくとも一部が、37℃±2℃または約37℃±2℃で実施される、態様1〜38のいずれかに記載の方法。
４０．
前記インキュベーションの少なくとも一部が、スピン接種の後に実施される、態様34〜39のいずれかに記載の方法。
４１．
前記インキュベーションの少なくとも一部が、2時間、4時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以下、または約2時間、4時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以下にわたり実施される、態様39または40記載の方法。
４２．
前記インキュベーションの少なくとも一部が、24時間または約24時間実施される、態様39〜41のいずれかに記載の方法。
４３．
前記インキュベーションの合計持続時間が、12時間、24時間、36時間、48時間または72時間以下である、態様1〜42のいずれかに記載の方法。
４４．
ウイルスベクター粒子が、レンチウイルスベクター粒子である、態様1〜43のいずれかに記載の方法。
４５．
レンチウイルスベクター粒子が、HIV-1に由来する、態様44記載の方法。
４６．
ウイルスベクター粒子が、ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化されている、態様1〜45のいずれかに記載の方法。
４７．
ウイルスエンベロープ糖タンパク質が、VSV-Gである、態様46記載の方法。
４８．
ウイルスベクター粒子が、SAMHD1阻害活性を示すレンチウイルスタンパク質を含み、該タンパク質が、ウイルス粒子中にパッケージングされている、態様1〜47のいずれかに記載の方法。
４９．
SAMHD1阻害タンパク質が、野生型Vpxタンパク質もしくは野生型Vprタンパク質である、または野生型VpxもしくはVprタンパク質の、SAMHD1阻害活性を示す変種もしくは部分である、態様48記載の方法。
５０．
SAMHD1阻害タンパク質が、レトロウイルスベクター粒子に対して異種である、態様48または49記載の方法。
５１．
SAMHD1阻害タンパク質が、野生型Vpxタンパク質である、または野生型Vpxタンパク質の、SAMHD1阻害活性を示す変種もしくは部分である、態様48〜50のいずれかに記載の方法。
５２．
ウイルスベクター粒子が、20.0未満もしくは約20.0未満、または10.0未満もしくは約10.0未満の感染多重度でインキュベーションされる、態様1〜51のいずれかに記載の方法。
５３．
ウイルスベクター粒子が、1.0IU/細胞〜10IU/細胞、もしくは2.0U/細胞〜5.0IU/細胞、または約1.0IU/細胞〜10IU/細胞、もしくは2.0U/細胞〜5.0IU/細胞の感染多重度でインキュベーションされる；あるいは
ウイルスベクター粒子が、少なくとも1.6IU/細胞、1.8IU/細胞、2.0IU/細胞、2.4IU/細胞、2.8IU/細胞、3.2IU/細胞、3.6IU/細胞、4.0IU/細胞、5.0IU/細胞、6.0IU/細胞、7.0IU/細胞、8.0IU/細胞、9.0IU/細胞、もしくは10.0IU/細胞、または少なくとも約1.6IU/細胞、1.8IU/細胞、2.0IU/細胞、2.4IU/細胞、2.8IU/細胞、3.2IU/細胞、3.6IU/細胞、4.0IU/細胞、5.0IU/細胞、6.0IU/細胞、7.0IU/細胞、8.0IU/細胞、9.0IU/細胞、もしくは10.0IU/細胞の感染多重度でインキュベーションされる、
態様1〜52のいずれかに記載の方法。
５４．
インプット組成物が、少なくとも50×106個、100×106個、もしくは200×106個、または少なくとも約50×106個、100×106個、もしくは200×106個、または約50×106個、100×106個、もしくは200×106個の細胞を含む、態様1〜53のいずれかに記載の方法。
５５．
組換え核酸が、抗原受容体をコードする、態様1〜54のいずれかに記載の方法。
５６．
抗原受容体が、トランスジェニックT細胞受容体（TCR）である、態様55記載の方法。
５７．
抗原受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様55または56記載の方法。
５８．
キメラ抗原受容体（CAR）が、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様57記載の方法。
５９．
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、態様58記載の方法。
６０．
細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結している膜貫通ドメインをさらに含む、態様58または59記載の方法。
６１．
膜貫通ドメインが、CD28の膜貫通部分を含む、態様60記載の方法。
６２．
細胞内シグナル伝達ドメインが、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、態様58〜61のいずれかに記載の方法。
６３．
T細胞共刺激分子が、CD28および41BBからなる群より選択される、態様62記載の方法。
６４．
抗原受容体が、疾患もしくは状態と関連する抗原と特異的に結合する、またはユニバーサルタグと特異的に結合する、態様55〜63のいずれかに記載の方法。
６５．
疾患または状態が、がん、および自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、態様64記載の方法。
６６．
組換え核酸を形質導入されたT細胞を含むアウトプット組成物を産生する、態様1〜65のいずれかに記載の方法。
６７．
アウトプット組成物中のT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%に組換え核酸が形質導入されている、態様66記載の方法。
６８．
態様66または67記載の方法により産生された形質導入T細胞をアウトプット組成物から回収または単離する工程をさらに含む、態様66または67記載の方法。
６９．
アウトプット組成物の細胞または態様66または68記載の方法により形質導入された細胞を活性化または拡大する工程をさらに含む、態様66または68記載の方法。
７０．
前記活性化および／または拡大が、エクスビボで行われる、態様69記載の方法。
７１．
前記インキュベーションに続いて、アウトプット組成物中の細胞が、T細胞を活性化すること、TCR複合体を経由するシグナルを誘導すること、および／またはT細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の刺激剤の存在下でさらにインキュベーションされる、態様69または70記載の方法。
７２．
1種または複数種の刺激剤が、CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7からなる群より選択される、態様71記載の方法。
７３．
1種または複数種の刺激剤が、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含む、態様71または72記載の方法。
７４．
活性化および／または拡大が、インビボで行われる、態様69記載の方法。
７５．
活性化および／または拡大が、抗原受容体により特異的に結合された抗原の存在下で起こり、かつ／または導入遺伝子特異的である、態様69または74記載の方法。
７６．
前記インキュベーションに続いて、アウトプット組成物中の細胞が、任意でCD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7からなる1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でエクスビボでさらにインキュベーションされず、かつ／またはアウトプット組成物中の細胞が、30℃よりも高い温度で24時間よりも長くさらにインキュベーションされない、態様72または75記載の方法。
７７．
態様1〜76のいずれかに記載の方法により産生される、遺伝子操作T細胞。
７８．
態様77記載の遺伝子操作T細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
７９．
疾患または状態を有する対象に態様78記載の組成物を投与する工程を含む、処置方法。
８０．
前記組成物が、対象から試料を得た後5日以内に対象に投与される、態様79記載の方法。
８１．
前記組成物が、対象から試料を得た後1日、2日、3日または4日以内に対象に投与される、態様80記載の方法。
８２．
以下の工程を含む、養子細胞療法のための方法：
（a）疾患または状態を有する対象から得られた試料からT細胞を富化または単離する工程；
（b）態様1〜71のいずれかに記載の方法により、T細胞を含むインプット組成物にウイルスベクター粒子を形質導入し、それにより、形質導入細胞を含むアウトプット組成物を産生する工程であって、ウイルスベクター粒子が、疾患または障害と関連する抗原と特異的に結合する抗原受容体をコードする組換え核酸を含む、工程；
（c）疾患または状態を処置するために、形質導入細胞を含むアウトプット組成物を対象に投与する工程であって、アウトプット組成物が、対象から試料を得た後9日以内に該対象に投与される、工程。
８３．
疾患または状態を処置するために、組換え核酸を形質導入されたT細胞を含むアウトプット組成物を対象に投与する工程を含む、養子細胞療法の方法であって、アウトプット組成物が、態様1〜71のいずれかに記載の方法により産生される、方法。
８４．
アウトプット組成物が、対象から試料を得た後1日、2日、3日、4日、または5日以内に対象に投与される、態様82または83記載の方法。
８５．
前記組成物を投与する前に、アウトプット組成物の形質導入細胞または細胞が、薬学的に許容される緩衝液中で製剤化される、態様82〜84のいずれかに記載の方法。
８６．
形質導入細胞を含むアウトプット組成物を投与する前に、細胞が、形質導入後最大24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、または9日間エクスビボで培養され、該培養が、30℃よりも高い温度で行われる、態様82〜85のいずれかに記載の方法。
８７．
形質導入に続いて、形質導入細胞を含むアウトプット組成物または細胞が、T細胞を活性化すること、TCR複合体を経由するシグナルを誘導すること、および／またはT細胞の増殖を誘導することが可能な1種または複数種の刺激剤の存在下で培養され、それにより、形質導入細胞を含む組成物を産生する、態様82〜86のいずれかに記載の方法。
８８．
形質導入細胞を投与する前に、形質導入細胞を含むアウトプット組成物または細胞が、1種もしくは複数種の刺激剤の存在下でエクスビボでさらにインキュベーションされず、かつ／または30℃よりも高い温度で24時間よりも長くさらにインキュベーションされない、態様82〜85のいずれかに記載の方法。
８９．
1種または複数種の刺激剤が、CD3結合分子；CD28結合分子；組換えIL-2；組換えIL-15；および組換えIL-7、抗原受容体により特異的に認識される抗原を含むワクチン、ならびに抗原受容体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体からなる群より選択される、態様87または88記載の方法。
９０．
1種または複数種の刺激剤が、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を含む、態様89記載の方法。
９１．
アウトプット組成物の細胞または形質導入細胞が、最適以下の用量で投与される、態様82〜90のいずれかに記載の方法。
９２．
対象に1種または複数種の剤を投与する工程であって、形質導入T細胞のインビボ刺激および／または拡大を誘導または強化する、工程
をさらに含む、態様82〜91のいずれかに記載の方法。
９３．
1種または複数種の剤が、導入遺伝子に特異的であり、かつ／または任意で抗原受容体であるかもしくはそれを含む発現した導入遺伝子を介して細胞を刺激もしくは活性化する、態様92記載の方法。
９４．
1種または複数種の剤が、抗原受容体により特異的に認識される抗原を含むワクチン、抗原受容体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体、または抗原受容体の二量体化を化学的に誘導することが可能な剤の中より選択される、態様92または93記載の方法。
９５．
1種または複数種の剤が、免疫調節剤；免疫チェックポイント阻害剤；細胞外アデノシンまたはアデノシン受容体、任意でA2aR受容体の阻害剤；キヌレニン経路モジュレーター、およびシグナル伝達経路のモジュレーター、例えばキナーゼ阻害剤である、態様92記載の方法。
９６．
標的抗原と特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）またはトランスジェニックTCRを発現するように遺伝子操作された初代ヒトT細胞集団を含む組成物であって、
該集団が、複数の休止T細胞を含み；かつ
該複数の休止T細胞が、該組成物中の遺伝子操作細胞の少なくとも7.5％を構成する、
組成物。
９７．
遺伝子操作された休止T細胞が、前記組成物中の遺伝子操作細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%を構成する、態様96記載の組成物。
９８．
休止T細胞が、HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L（CD154）および4-1BB（CD137）からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーについて表面陰性であり；IL-2、IFN-ガンマおよびTNF-アルファからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を欠如し；G0もしくはG0G1a期の細胞周期であり；かつ／または活性SAMHD1を含有する、態様96または97記載の組成物。
９９．
休止T細胞が、CD25およびCD69について表面陰性（CD25-/CD69-）である、態様98記載の組成物。
１００．
休止T細胞が、CD4+および／またはCD8+ T細胞を含む、態様96〜99のいずれかに記載の組成物。
１０１．
標的抗原が、疾患または障害に関連する、態様96〜100のいずれかに記載の組成物。
１０２．
疾患または障害が、感染性疾患もしくは状態、自己免疫疾患、炎症疾患またはがんである、態様100記載の組成物。
１０３．
標的抗原が、B細胞成熟抗原（BCMA）、炭酸脱水素酵素9（CAIX）、tEGFR、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerbB2）、CD19、CD20、CD22、メソセリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、TAG72、B7-H6、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、デュアル抗原（dual antigen）、がん精巣抗原、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児抗原、Gタンパク質共役受容体5D（GPCR5D）、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、病原体特異抗原およびユニバーサルタグに関連する抗原からなる群より選択される、態様96〜102のいずれかに記載の組成物。
１０４．
初代ヒトT細胞が、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARを発現するように遺伝子操作されている、態様96〜103のいずれかに記載の組成物。
１０５．
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、態様104記載の組成物。
１０６．
CARが、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、態様104または105記載の組成物。
１０７．
膜貫通ドメインが、CD28の膜貫通部分を含む、態様106記載の組成物。
１０８．
CARの細胞内シグナル伝達ドメインが、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、態様104〜107のいずれかに記載の組成物。
１０９．
T細胞共刺激分子が、CD28および41BBからなる群より選択される、態様108記載の組成物。
１１０．
薬学的に許容される担体を含む、態様96〜108のいずれかに記載の組成物。
【実施例】
【０５３２】
VI. 実施例
以下の実施例は、例証を目的としてのみ含まれ、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０５３３】
実施例1:事前細胞活性化なしでの初代ヒトT細胞のレンチウイルス形質導入の評価
まず、形質導入の前に細胞をエクスビボT細胞活性化工程に供することなしに、ヒト白血球除去試料から濃縮された初代CD4+およびCD8+T細胞のレンチウイルス形質導入を行った。
【０５３４】
単核細胞が濃縮されたヒト白血球除去試料を、対象由来の全血試料から白血球除去収集システムを使用して得た。血液を処理して、単核細胞、自己血漿および抗凝血剤ACD-A(抗凝血剤クエン酸デキストロースA)を含有する白血球除去試料を生成した。
【０５３５】
白血球除去試料の細胞を、親和性に基づく選択において使用するために、リン酸緩衝食塩水(PBS)、EDTAおよびヒト血清アルブミンを含有する緩衝液中で洗浄し、再懸濁した。T細胞の免疫親和性に基づく選択のために、選択緩衝液中の洗浄した細胞を、選択用のモノクローナル抗体にカップリングさせた磁気ビーズと室温で30分間インキュベートし、磁気分離カラムを使用した選択に供した。濃縮したT細胞を凍結保存培地に再懸濁し、細胞を液体窒素中で冷凍保存し、さらなる使用まで貯蔵した。冷凍保存したCD4+およびCD8+T細胞を融解し、形質導入用培地中で洗浄し、再懸濁した。
【０５３６】
次いで、細胞をT細胞活性化剤とインキュベートすることなしに、例えば細胞を抗CD3試薬および抗CD28試薬とインキュベートすることなしに、T細胞をレンチウイルスベクター粒子と接触させた。形質導入のために、T細胞を、200μLの量で24ウェルプレートの個々のウェルに添加した。ポリカチオン形質導入アジュバントと事前混合した、導入遺伝子をコードする核酸を含有するレンチウイルスベクター粒子(この場合、例示的なキメラ抗原受容体(CAR)と自己切断T2A配列によってCAR配列から隔てられた形質導入マーカーとして使用するための短縮EGFR(EGFRt)配列をコードする)を、2倍段階希釈でウェルに添加した。1ウェル当たりの最終量を1.1mLに調整した。組成物を遠心分離におよそ1時間供し、次いで、37℃で24時間インキュベートした。
【０５３７】
対照として、形質導入の前に、抗CD3抗体断片および抗CD28抗体断片(試薬1または試薬2と命名)でコートした磁気ビーズを各々含有する2つの異なる活性化試薬の1つと37℃でおよそ24時間培養することによってT細胞を活性化させた以外は、冷凍保存した組成物から融解したCD4+およびCD8+T細胞を使用して上記の通り形質導入をまた実施した。
【０５３８】
上の条件の各々での形質導入に続いて、各組成物の細胞を、培地およびIL-2の存在下、37℃で48時間培養した。
【０５３９】
形質導入効率の尺度として、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して、CARの表面発現に関して陽性の細胞の百分率を決定した(この場合、代理マーカーEGFRtを認識する抗EGFR抗体を使用して検出した)。図1A〜1Bに示すように、この研究において、活性化なしの形質導入効率(EGFRt表面発現によって反映される通り)は、形質導入の前に抗CD3/抗CD28試薬で活性化した細胞における形質導入効率と同等であった。結果は、レンチウイルスベクターを使用して、T細胞のエクスビボ活性化のための作用物質との事前インキュベーションなしで、T細胞の同等な形質導入を達成できたことを示した。
【０５４０】
実施例2:事前細胞活性化なしでの初代ヒトT細胞のレンチウイルス形質導入のための大規模プロセス
この実施例は、大規模プロセスを介した、健常ドナーアフェレーシス由来のCD4+およびCD8+選択T細胞の形質導入を説明する。このプロセスでは、細胞を、様々な条件下で、取得、親和性選択、形質導入(事前活性化ありまたはなし)、および培養またはインキュベートした。洗浄、親和性に基づく選択および形質導入を、例えば、国際公開番号WO2016/073602に記載の通り、実質的に縦型の遠心分離処理チャンバー内で実施した。
【０５４１】
1. 試料収集および白血球除去
白血球除去収集システムを使用して、患者から自己末梢血単核細胞(PBMC)を収集した。血液を処理して、単核細胞およびおよそ1/3の体積の自己血漿および抗凝血剤ACD-A(抗凝血剤クエン酸デキストロースA)を含有する試料を生成した。白血球除去試料を、2〜8℃でおよそ24時間、貯蔵および密閉した。
【０５４２】
2. 白血球除去洗浄
白血球除去試料を移入パックに無菌移入した。白血球除去試料の細胞を、親和性に基づく選択のために、PBS、EDTA、およびヒト血清アルブミンを含有する選択緩衝液中で洗浄し、再懸濁した。遠心分離処理チャンバー(A-200F)を含む、再生医療において使用するためのBiosafe SAによって販売されている無菌の単回使用ディスポーザブルキット内で洗浄を行った。細胞を含有する移入パックおよび緩衝液を含有するバッグを、Sepax(登録商標)2処理ユニットと連携して設置されたキットに無菌接続した。キャビティー内壁のRCFおよそ200gで180秒行い、続いて、20mL中に細胞を最終再懸濁する、洗浄サイクルを2回実施した。プロトコールの最後に、親和性に基づく選択用の試薬とのその後のインキュベーションのために、遠心分離チャンバーの処理キャビティー中に細胞を保持した。
【０５４３】
3. 親和性に基づく選択
モノクローナル抗体にカップリングさせた磁気ビーズを使用した免疫親和性に基づく選択によって、CD4およびCD8 T細胞を濃縮し、これを遠心分離チャンバー内の洗浄した白血球除去に添加した。ビーズを上述の選択緩衝液中で混合し、次いで、これを装置に無菌接続した。Sepax(登録商標)2ユニットでプログラムを実行して、洗浄した細胞を有するチャンバー内にビーズ混合物および選択緩衝液を流入させ、チャンバーの内容物を30分間混合した。
【０５４４】
プログラムの最後に、Sepax(登録商標)2ユニットによって、細胞をペレット化して過剰な緩衝液/ビーズを排出し、ペレット化した細胞を洗浄し、そして、選択緩衝液中に再懸濁した。プログラムによって、洗浄した細胞を移入パックに収集した。
【０５４５】
次いで、細胞を、移入パックから、閉鎖無菌系のチュービングラインおよび分離カラムに、標準的な方法を使用して磁場の存在下で通し、CD4および/またはCD8特異的試薬に結合している細胞を分離した。次いで、これらの磁気標識細胞を、さらなる処理のために移入パックに収集した。
【０５４６】
4. 形質導入
Sepax(登録商標)処理ユニットと連携して設置されたキットに内蔵された遠心分離チャンバー中で、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行った。選択された細胞を、形質導入(t=0で形質導入)するかまたは抗CD3/CD28試薬を使用して活性化した(t=0で活性化し、t=24時間で形質導入した)。
【０５４７】
最初に活性化した細胞について、選択された細胞を、Sepax(登録商標)2システムを使用して完全培地中で洗浄して、再懸濁し、次いで、これをチャンバーのキャビティー中室温で抗CD3/28試薬と結合させた。インキュベーション後、インキュベートした物質を、Sepax(登録商標)2ユニットを介して細胞培養バッグに移し、次いで、これを37℃で24時間インキュベートした。
【０５４８】
形質導入を開始するために、以下の工程を行った。
【０５４９】
完全培地(5%(v/v)ヒト血清、1.6mg/mL N-アセチルシステイン(NAC)、および100IU/mL IL-2を含有するX-VIVO-15)と、（形質導入開始中の終濃度に十分な量である10μg/mL）のポリカチオン、ウイルスベクター粒子(およそ3.2IU/細胞)および適用可能な場合に空気を含有する形質導入試薬溶液を調製した。形質導入試薬溶液を無菌で遠心分離バッグに移した。
【０５５０】
およそ200×106の選択細胞または200×106の活性化細胞を有する組成物を含有する生成物バッグを、Sepax(登録商標)2処理ユニットと連携して設置された単回使用ディスポーザブルキットに無菌接続した。チャンバーのキャビティーへの細胞を含有する組成物の流入、細胞をペレット化するためのSepax(登録商標)2での組成物の回転、および所望の量（例えば10mL）に達するのに必要な液体の適切な量の除去、を容易にする自動サイクルをSepax(登録商標)2で実行した。次いで、形質導入試薬溶液の内容物を、細胞を有するチャンバーのキャビティーに流入させた。次いで、得られた200mL容量(細胞およびウイルスを含有する)を遠心分離バッグに移した。
【０５５１】
形質導入を開始するために、ウイルスおよび細胞を含有する遠心分離バッグを取り出し、キットのインプット位置に無菌接続し、チャンバーのキャビティーに移した。ウイルスおよび細胞を、チャンバーのキャビティー中、キャビティー内壁での概算RCF 1600gで回転させた。回転を指定の速度で1時間行った。次いで、形質導入された物質をアウトプットバッグに移した。完全培地をチャンバーに移し、60秒混合し、次いで、処理キャビティーからアウトプットバッグに移して、形質導入された物質を含有するアウトプットバッグ中の総量を200mLにした。
【０５５２】
次いで、事前活性化工程なしの選択後形質導入された細胞を、(1)FBS、100IU/mL IL-2および10IU/mL IL-15を補充した培養培地中、抗CD3/抗CD28試薬で直ちに活性化して、9日目に採取した;(2)37℃、5% CO2で24時間インキュベートし、次いで、培養培地中、抗CD3/抗CD28で活性化して、9日目に採取した;(3)活性化なしで37℃、5% CO2で3日間の培養によって維持した;(4)37℃、5% CO2で24時間インキュベートし、冷凍保存し、融解し、培養培地中抗CD3/抗CD28試薬で活性化して、14日目に採取した。形質導入の前に活性化して24時間後に形質導入した対照細胞について、細胞を培養培地の存在下(活性化なし)で拡大させ、9日目に採取した。条件毎に、細胞を37℃、5% CO2で培養した。
【０５５３】
表1は、試験群および形質導入後のインキュベーション条件をまとめる。
【０５５４】
(表1)形質導入群
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【０５５５】
白血球除去からの細胞の選択後の様々な日数での形質導入頻度を実施例1に記載の通り測定した。図2に示す通り、T細胞をまず形質導入して次いで直ちに活性化させたときに、形質導入する24時間前にまず活性化したT細胞と比較して、同等の形質導入頻度(表面マーカー発現によって測定される通り)が観察された(選択の9日後に採取された冷凍保存生成物において、それぞれ63% 対 68%)。この結果は、形質導入の前にT細胞を活性化しなくても比較的高い形質導入効率を得ることができたことを実証した。
【０５５６】
事前T細胞活性化が形質導入(遺伝子組み込み)に必要なかったのに対して、この研究では、細胞と活性化剤とのインキュベーションが組換えタンパク質の持続した表面発現に重要であることが観察されたことを結果は示した。活性化しなかった細胞では、表面EGFRt発現(CAR発現の表面代理マーカー)は一過性であった;検出されたEGFRtの表面発現(形質導入の指標である)の頻度は、形質導入の24時間後に29%のピークに達し、形質導入後3日目に<1%まで低下した。
【０５５７】
加えて、図2は、活性化試薬とのインキュベーションを24時間遅らせても(形質導入の前に活性化した細胞と比較して)、43%の大幅に高いマーカー頻度(形質導入頻度の指標である)をもたらしたことを示した。形質導入後の活性化試薬(抗CD3/CD28を有する磁気ビーズ)との即時のインキュベーションは、活性化を24時間遅らせたときよりも、形質導入マーカーの表面発現を提示する細胞を高い頻度でもたらした(選択の9日後に採取された冷凍保存生成物において測定された頻度、それぞれ63% 対 43%)。後続の融解および活性化試薬とのインキュベーションの前の、形質導入細胞の凍結保存(形質導入後24時間)は、凍結保存なしで形質導入して活性化試薬とインキュベートした細胞と比較して、形質導入マーカー頻度の減少をもたらした(冷凍保存生成物において測定された形質導入頻度、それぞれ16% 対 43%)。
【０５５８】
本発明は、例えば本発明の様々な局面を例証するために提供されている特定の開示した態様に、範囲が限定されることを意図していない。本明細書の説明および教示から記載の組成物および方法への様々な修飾が明らかであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲および主旨から逸脱することなく実施されてよく、これらが本開示の範囲内にあると意図される。
【０５５９】
配列
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【０５６０】
本発明は、例えば本発明の様々な局面を例証するために提供されている特定の開示した態様に、範囲が限定されることを意図していない。本明細書の説明および教示から記載の組成物および方法への様々な修飾が明らかであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲および主旨から逸脱することなく実施されてよく、これらが本開示の範囲内にあると意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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