(57)【要約】本発明は、Ｌ１ＣＡＭ阻害を使用して、対象において、がんの転移拡散を阻害し、および／または既存の転移性疾患の進行を阻害するための方法および組成物に関する。本発明は、Ｌ１ＣＡＭが転移性がん幹様細胞（「ＭｅｔＣＳＣ」）のマーカーであり、これらの静止状態の非常にゆっくり分裂する細胞上に発現し、それゆえに、標準化学療法を逃れ、後で、腫瘍成長を再惹起し得るという発見に、少なくとも一部、基づいている。本発明はさらに、Ｌ１ＣＡＭ枯渇が、乳がん、肺がん、結腸がん、および腎がんの異種移植片からの、脳においてだけでなく、肺、肝臓、および骨における転移の惹起も阻害し、多臓器転移の惹起におけるＬ１ＣＡＭの重要性を実証するという発見に基づいている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性がんについての処置を受けた対象において、前記原発性がんの転移拡散のリスクを低減させる方法であって、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんの化学療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの組合せの１回または複数回のサイクルが完了した後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんまたは転移の本質的に完全な外科的切除が完了した後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、維持レジメンにおいて投与される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも週に１回、投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも月に１回、投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも２カ月に１回、投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも３カ月に１回、投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも６カ月に１回、投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビター処置が、前記対象が前記原発性がんの寛解に達した後に開始される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが免疫グロブリンである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが干渉ＲＮＡである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターがアンチセンスＲＮＡである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記原発性がんが乳がんである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記原発性がんが肺がんである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記原発性がんが腎がんである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記原発性がんが結腸直腸がんである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
原発性がんについての処置を受けた対象において、前記原発性がんの転移拡散のリスクを低減させる方法における使用のためのＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２２】
前記原発性がんの化学療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの組合せの１回または複数回のサイクルが完了した後に投与される、請求項２１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２３】
前記原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される、請求項２１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２４】
前記原発性がんまたは転移の本質的に完全な外科的切除が完了した後に投与される、請求項２１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２５】
維持レジメンにおいて投与される、請求項２１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２６】
前記対象が前記原発性がんの寛解に達した後、最初に、投与される、請求項２１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２７】
免疫グロブリンである、請求項２１から２６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２８】
Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項２７に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項２９】
Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項２７に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３０】
干渉ＲＮＡである、請求項２１から２６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３１】
アンチセンスＲＮＡである、請求項２１から２６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３２】
前記原発性がんが乳がんである、請求項２１から３１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３３】
前記原発性がんが肺がんである、請求項２１から３１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３４】
前記原発性がんが腎がんである、請求項２１から３１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３５】
前記原発性がんが結腸直腸がんである、請求項２１から３１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項３６】
原発性がんについての処置を受けた対象において、原発性がんの転移拡散を阻害する方法であって、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんの化学療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの組合せの１回または複数回のサイクルが完了した後に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんまたは転移の本質的に完全な外科的切除が完了した後に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、維持レジメンにおいて投与される、請求項３６から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも週に１回、投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも月に１回、投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも２カ月に１回、投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも３カ月に１回、投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも６カ月に１回、投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビター処置が、前記対象が前記原発性がんの寛解に達した後に開始される、請求項３６から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが免疫グロブリンである、請求項３６から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが干渉ＲＮＡである、請求項３６から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターがアンチセンスＲＮＡである、請求項３６から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記原発性がんが乳がんである、請求項３６から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記原発性がんが肺がんである、請求項３６から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記原発性がんが腎がんである、請求項３６から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記原発性がんが結腸直腸がんである、請求項３６から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
原発性がんについての処置を受けた対象において、前記原発性がんの転移拡散のリスクを低減させる方法における使用のためのＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項５７】
前記原発性がんの化学療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの組合せの１回または複数回のサイクルが完了した後に投与される、請求項５６に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項５８】
前記原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される、請求項５６に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項５９】
前記原発性がんまたは転移の本質的に完全な外科的切除が完了した後に投与される、請求項５６に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６０】
維持レジメンにおいて投与される、請求項５６に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６１】
前記対象が前記原発性がんの寛解に達した後、最初に、投与される、請求項５６に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６２】
免疫グロブリンである、請求項５６から６１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６３】
Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項６２に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６４】
Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項６２に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６５】
干渉ＲＮＡである、請求項５６から６１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６６】
アンチセンスＲＮＡである、請求項５６から６１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６７】
前記原発性がんが乳がんである、請求項５６から６６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６８】
前記原発性がんが肺がんである、請求項５６から６６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項６９】
前記原発性がんが腎がんである、請求項５６から６６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項７０】
前記原発性がんが結腸直腸がんである、請求項５６から６６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項７１】
原発性がんについての処置を受けた対象において、転移性疾患の進行を阻害する方法であって、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項７２】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんの化学療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの組合せの１回または複数回のサイクルが完了した後に投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、前記原発性がんまたは転移の本質的に完全な外科的切除が完了した後に投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、維持レジメンにおいて投与される、請求項７１から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも週に１回、投与される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも月に１回、投与される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも２カ月に１回、投与される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも３カ月に１回、投与される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、少なくとも６カ月に１回、投与される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビター処置が、前記対象が前記原発性がんの寛解に達した後に開始される、請求項７１から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが免疫グロブリンである、請求項７１から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが干渉ＲＮＡである、請求項７１から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターがアンチセンスＲＮＡである、請求項７１から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記原発性がんが乳がんである、請求項７１から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記原発性がんが肺がんである、請求項７１から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記原発性がんが腎がんである、請求項７１から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記原発性がんが結腸直腸がんである、請求項７１から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
原発性がんについての処置を受けた対象において、前記原発性がんの転移拡散のリスクを低減させる方法における使用のためのＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９２】
前記原発性がんの化学療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの組合せの１回または複数回のサイクルが完了した後に投与される、請求項９１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９３】
前記原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される、請求項９１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９４】
前記原発性がんまたは転移の本質的に完全な外科的切除が完了した後に投与される、請求項９１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９５】
維持レジメンにおいて投与される、請求項９１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９６】
前記対象が前記原発性がんの寛解に達した後、最初に、投与される、請求項９１に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９７】
免疫グロブリンである、請求項９１から９６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９８】
Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項９７に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項９９】
Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４に対して二重特異的な免疫グロブリンである、請求項９７に記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１００】
干渉ＲＮＡである、請求項９１から９６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１０１】
アンチセンスＲＮＡである、請求項９１から９６のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１０２】
前記原発性がんが乳がんである、請求項９１から１０１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１０３】
前記原発性がんが肺がんである、請求項９１から１０１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１０４】
前記原発性がんが腎がんである、請求項９１から１０１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１０５】
前記原発性がんが結腸直腸がんである、請求項９１から１０１のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭインヒビター。
【請求項１０６】
がん細胞の化学療法剤に対する化学抵抗性を好転させる方法であって、有効量のＬ１ＣＡＭインヒビターを前記がん細胞に投与するステップを含む、方法。
【請求項１０７】
前記がん細胞が転移性がん細胞である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記がんが乳がんである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記がんが肺がんである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記がんが腎がんである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記がんが結腸直腸がんである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｌ１ＣＡＭインヒビターが免疫グロブリンである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
前記化学療法剤がカルボプラチンである、請求項１０６から１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１４】
前記化学療法剤がメトトレキセートである、請求項１０６から１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１５】
Ｌ１ＣＡＭを発現するがん細胞を含むオルガノイド培養物を含む、転移を阻害する作用物質を同定するためのアッセイ。
【請求項１１６】
さらに前記がん細胞がＥｐｈＢ２を発現する、請求項１１５に記載のアッセイ。
【請求項１１７】
前記がん細胞が高レベルのＬ１ＣＡＭを発現する、請求項１１５または１１６に記載のアッセイ。
【請求項１１８】
前記がん細胞が中レベルまたは高レベルのＥｐｈＢ２を発現する、請求項１１５から１１７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１１９】
前記がん細胞が表面ＥＰＣＡＭをさらに発現する、請求項１１５から１１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２０】
前記がん細胞がＭｅｔＣＳＣである、請求項１１５から１１９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２１】
前記細胞が蛍光外因性マーカーを発現する、請求項１２０に記載のアッセイ。
【請求項１２２】
転移を阻害する作用物質を同定する方法であって、
（ｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現するがん細胞を含むオルガノイド培養物を提供するステップ；
（ｉｉ）前記オルガノイド培養物を試験物質と接触させるステップ；
（ｉｉｉ）Ｌ１ＣＡＭ発現のレベルが、前記試験物質と接触していない対照オルガノイド培養物と比べて、試験物質接触培養物において減少しているかどうかを決定するステップ
を含み、
前記試験物質との接触に応答する前記Ｌ１ＣＡＭの発現のレベルの減少は、前記試験物質が転移を阻害することを指し示す、方法。
【請求項１２３】
転移を阻害する作用物質を同定するためのキットであって、
（ｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現するがん細胞、および（ｉｉ）Ｌ１ＣＡＭ発現レベルを決定するための手段を含む、キット。
【請求項１２４】
前記がん細胞が高レベルのＬ１ＣＡＭを発現する、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２５】
前記がん細胞が、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、および／またはＥｐｈＢ２の１つまたは複数をさらに発現する、請求項１２３または１２４に記載のキット。
【請求項１２６】
前記Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するための手段が、Ｌ１ＣＡＭと検出可能に結合するオリゴヌクレオチドプローブである、請求項１２３から１２５のいずれかに記載のキット。
【請求項１２７】
前記Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するための手段が、前記Ｌ１ＣＡＭ発現レベルを決定するためにポリメラーゼ連鎖反応に使用することができる１対のプライマーである、請求項１２３から１２５のいずれかに記載のキット。
【請求項１２８】
前記Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するための手段が、Ｌ１ＣＡＭと特異的に結合する抗体である、請求項１２３から１２５のいずれかに記載のキット。
【請求項１２９】
対象において転移性疾患の進行を阻害する方法であって、
がん細胞においてＬ１ＣＡＭ発現を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を介して、低減させる作用物質の治療量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年８月２日に出願された米国仮出願番号第６２／３７０，１０８号に基づく優先権を主張しており、その内容は、本明細書中にそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
助成金情報
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された認可番号５  Ｕ５４  ＣＡ１６３１６７−０３による政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
１．序論
本発明は、対象において、がんの転移拡散を阻害し、および／または既存の転移性疾患の進行を阻害するための方法および組成物に関する。特定の実施形態において、それは、例えば化学療法後残存疾患に存在するような、成長が遅い転移性がん幹様細胞（「ＭｅｔＣＳＣ」）を標的とするレジメンを使用して、Ｌ１ＣＡＭインヒビターで対象を処置するステップを含む方法を提供する。それはさらに、がんの転移性進行を研究するために、および有用な治療剤を同定するために使用され得る、Ｌ１ＣＡＭを発現するＭｅｔＣＳＣを含む転移性疾患のモデルを提供する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
がん治療学における最近の進歩にも関わらず、転移は、依然としてがん死亡の主な原因である。転移性疾患についての化学療法および標的療法は、腫瘍応答を誘導し得るが、ほとんど常に、その後に、抵抗および致死性再発が起こる。治療後も存続し、かつ再成長を駆動する残存疾患は、特に自己再生の能力があり、かつゆっくりした細胞周期で、腫瘍を再惹起し、治療抵抗性である、転移性がん幹様細胞（ＭｅｔＣＳＣ）を含有することが提案されている（Oskarssonら、２０１４年；Hanahanら、２０１１年；Malladiら、２０１６年）。ＭｅｔＣＳＣを標的とすることによって、アジュバント設定において、転移性がんおよび微小転移性残存疾患を処置するための重要なアプローチが得られる可能性がある。
【０００５】
Ｌ１ＣＡＭは、最初、神経細胞接着分子として同定された（Rathjenら、１９８４年；ManessおよびSchachner、２００７年）。Ｌ１ＣＡＭは、多くの固形腫瘍の浸潤先端（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｆｒｏｎｔ）に異所性に発現した大きなマルチドメインのタンパク質であり、一般に、転移および予後不良と関連している（例えば、Altevogtら、２０１５年）。脳に浸潤する、転移性肺がんおよび乳がんの単一細胞は、血管取り込み（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏ−ｏｐｔｉｏｎ）と名付けられた過程において血管に沿って親密に広がるためにＬ１ＣＡＭを使用する（Valienteら、２０１４年；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５６３７９）。ＲＮＡｉ媒介性Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、血管取り込みを阻害し、脳マクロ転移の発生を防止する（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５６３７９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Oskarsson  T,  Batlle  E,  Massague  J.  Metastatic  stem  cells:  sources,  niches,  and  vital  pathways.  Cell  Stem  Cell.  2014  Mar  6;  14(3):306-21
【非特許文献２】Hanahan  D,  Weinberg  RA.  Hallmarks  of  cancer:  the  next  generation.  (2011)  Cell.    144(5):646-74
【非特許文献３】Malladi  S,  Macalinao  DG,  Jin  X,  He  L,  Basnet  H,  Zou  Y,  de  Stanchina  E,  Massague  J.  Metastatic  latency  and  immune  evasion  through  autocrine  inhibition  of  WNT.  Cell.  2016  Mar  24;165(1):45-60
【非特許文献４】Rathjen  FG,  Schachner  M.  Immunocytological  and  biochemical  characterization  of  a  new  neuronal  cell  surface  component  (L1  antigen)  which  is  involved  in  cell  adhesion.  EMBO  J.  1984  Jan;3(1):1-10
【非特許文献５】Maness,  P.F.,  and  Schachner,  M.  (2007).  Neural  recognition  molecules  of  the  immunoglobulin  superfamily:  signaling  transducers  of  axon  guidance  and  neuronal  migration.  Nat  Neurosci  10,  19-26
【非特許文献６】Altevogt  P,  Doberstein  K,  Fogel  M.  L1CAM  in  human  cancer.  Int  J  Cancer.  2015年６月25日
【非特許文献７】Valiente  M,  Obenauf  AC,  Jin  X,  Chen  Q,  Zhang  XH,  Lee  DJ,  Chaft  JE,  Kris  MG,  Huse  JT,  Brogi  E,  Massague  J.  Serpins  promote  cancer  cell  survival  and  vascular  co-option  in  brain  metastasis.  Cell.  2014年２月27日;  156(5):1002-16
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
３．発明の概要
本発明は、転移性疾患を防止および処置する方法、それに有用な、治療剤を同定するためのアッセイ系、および組成物に関する。
【０００８】
本発明は、Ｌ１ＣＡＭがＭｅｔＣＳＣのマーカーであり、これらの静止状態の非常にゆっくり分裂する細胞上に発現し、それゆえに、標準化学療法を逃れ、後で、腫瘍成長を再惹起し得るという発見に、少なくとも一部、基づいている。本発明はさらに、Ｌ１ＣＡＭ枯渇が、乳がん、肺がん、結腸がん、および腎がんの異種移植片からの、脳においてだけでなく、肺、肝臓、および骨における転移の惹起も阻害し、多臓器転移の惹起におけるＬ１ＣＡＭの重要性を実証するという発見に基づいている。特に、進行性マクロ転移性異種移植片における誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、転移の進行を阻害することが観察され、定着した転移性疾患（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）におけるＬ１ＣＡＭ阻害の臨床的関連を浮かび上がらせている。本発明はさらに、細胞傷害性薬剤とは異なる作用機構を裏付ける、Ｌ１ＣＡＭ阻害が化学抵抗性肺がん異種移植片の成長を阻害したという発見、およびＬ１ＣＡＭの阻害が、化学抵抗性腫瘍細胞を化学療法感受性にすることが観察されたという発見に、一部、基づいている。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｄ】図１Ａ〜Ｄ。Ｌ１ＣＡＭは、多臓器転移に必要とされ、がん細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現のノックダウンは、（Ａ）乳がんの肺への転移；（Ｂ）乳がんの骨への転移；（Ｃ）結腸がんの肝臓への転移；および（Ｄ）腎細胞がんの脳への転移を阻害する（低減させる）。
【００１０】
【図２】Ｌ１ＣＡＭ阻害の定着した転移への効果を決定するための、Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン誘導性「ノックダウン」の使用。
【００１１】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜Ｃ。Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、（Ａ）肺がんの脳への転移；（Ｂ）乳がんの骨への転移；および（Ｃ）乳がんの肺への転移を含む、定着した転移の成長を阻害する。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃ。Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、（Ａ）肺がんの脳への転移；（Ｂ）乳がんの骨への転移；および（Ｃ）乳がんの肺への転移を含む、定着した転移の成長を阻害する。
【００１２】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜Ｂ。Ｌ１ＣＡＭ阻害の（Ａ）無しまたは（Ｂ）有りでの定着した転移の組織学的比較。
【００１３】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂ。原発性腫瘍浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭの発現。（Ａ）原発性腫瘍浸潤先端は、強くＬ１ＣＡＭ＋である；（Ｂ）浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭ＋細胞は、静止状態である（比較的低いＫＩ６７発現）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂ。原発性腫瘍浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭの発現。（Ａ）原発性腫瘍浸潤先端は、強くＬ１ＣＡＭ＋である；（Ｂ）浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭ＋細胞は、静止状態である（比較的低いＫＩ６７発現）。
【００１４】
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ〜Ｄ。（Ａ）原発性結腸直腸腫瘍および（Ｂ）肝臓転移物（ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）におけるＬ１ＣＡＭの発現の比較。（Ｃ）は、Ｌ１ＣＡＭ＋である全区域のパーセントを示す。（Ｄ）は、正常な結腸における検出可能なＬ１ＣＡＭ発現の欠如を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄ。（Ａ）原発性結腸直腸腫瘍および（Ｂ）肝臓転移物（ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）におけるＬ１ＣＡＭの発現の比較。（Ｃ）は、Ｌ１ＣＡＭ＋である全区域のパーセントを示す。（Ｄ）は、正常な結腸における検出可能なＬ１ＣＡＭ発現の欠如を示す。
【００１５】
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａ〜Ｃ。（Ａ）正常な結腸、（Ｂ）原発性結腸直腸腫瘍、および（Ｃ）肝臓転移物におけるＬ１ＣＡＭ＋細胞の量。
【００１６】
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂ。化学療法後残存疾患におけるＬ１ＣＡＭ発現。（Ａ）化学療法後残存疾患は、強くＬ１ＣＡＭ＋である；（Ｂ）Ｌ１ＣＡＭ＋細胞は、静止状態である（比較的低いＫＩ６７発現）。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂ。化学療法後残存疾患におけるＬ１ＣＡＭ発現。（Ａ）化学療法後残存疾患は、強くＬ１ＣＡＭ＋である；（Ｂ）Ｌ１ＣＡＭ＋細胞は、静止状態である（比較的低いＫＩ６７発現）。
【００１７】
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａ〜Ｄ。（Ａ）化学療法前；（Ｂ）化学療法後（ネオアジュバント化学療法後）の腫瘍におけるＬ１ＣＡＭの発現；および（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）とのグラフによる比較。（Ｄ）形成されたオルガノイドの数とＬ１ＣＡＭ発現との間の関係。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｄ。（Ａ）化学療法前；（Ｂ）化学療法後（ネオアジュバント化学療法後）の腫瘍におけるＬ１ＣＡＭの発現；および（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）とのグラフによる比較。（Ｄ）形成されたオルガノイドの数とＬ１ＣＡＭ発現との間の関係。
【００１８】
【図１０】図１０。一般的なオルガノイド培養を示す概略図。
【００１９】
【図１１】図１１。患者からの転移細胞の取得、およびオルガノイド培養のためのＥｐＣＡＭ＋、Ｌ１ＣＡＭ＋細胞の選択を示す概略図。
【００２０】
【図１２】図１２。ＥｐｈＢ２２中／高およびＬ１ＣＡＭ＋細胞についてソーティングするＦＡＣＳ結果。
【００２１】
【図１３】図１３。Ｌ１ＣＡＭ高発現細胞およびＬ１ＣＡＭ低発現細胞上のＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４マーカーの同とき発現。
【００２２】
【図１４−１】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１４−２】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１４−３】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１４−４】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１４−５】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１４−６】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１４−７】図１４。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【００２３】
【図１５−１】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１５−２】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１５−３】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１５−４】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１５−５】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１５−６】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【図１５−７】図１５。Ｌ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析。
【００２４】
【図１６】図１６。Ｌ１ＣＡＭ発現とオルガノイド成長との間の関係。
【００２５】
【図１７】図１７。特定の腫瘍試料について、Ｌ１ＣＡＭ発現とオルガノイド形成との間の関係。
【００２６】
【図１８】図１８。オルガノイド培養におけるＬ１ＣＡＭ高細胞によるＬ１ＣＡＭ発現。
【００２７】
【図１９】図１９。ｉｎ  ｖｉｖｏでのオルガノイド培養中のＬ１ＣＡＭ状態における変化の能力。
【００２８】
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｂ。Ｌ１ＣＡＭ発現は、オルガノイド生成中に選択される形質である。（Ａ）患者ＭＳＫＣＲＣ５５；（Ｂ）患者ＭＳＫＣＲＣ５１。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｂ。Ｌ１ＣＡＭ発現は、オルガノイド生成中に選択される形質である。（Ａ）患者ＭＳＫＣＲＣ５５；（Ｂ）患者ＭＳＫＣＲＣ５１。
【００２９】
【図２１】図２１。Ｌ１ＣＡＭ欠失後のオルガノイド形成。
【００３０】
【図２２】図２２。オルガノイドサイズの関数としてのＬ１ＣＡＭ発現。
【００３１】
【図２３】図２３。新生の小さいオルガノイドは、広くＬ１ＣＡＭ＋細胞で構成されるが、オルガノイドが成長するにつれて、細胞は、分裂して、ほとんど、オルガノイドの大部分を占める、Ｌ１ＣＡＭ−分化型子孫を生じる。
【００３２】
【図２４】図２４。誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、Ｋｒａｓ変異体肺がん細胞の化学抵抗性を好転させる。
【００３３】
【図２５Ａ−Ｂ】図２５Ａ〜Ｃ。（Ａ）ＮＳＧマウスにおけるＬ１ＣＡＭ高細胞対Ｌ１ＣＡＭ低細胞による腫瘍再惹起。（Ｂ）形成された腫瘍の組織像。（Ｃ）Ｌ１ＣＡＭ高腫瘍細胞対Ｌ１ＣＡＭ低腫瘍細胞によるオルガノイド形成。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｃ。（Ａ）ＮＳＧマウスにおけるＬ１ＣＡＭ高細胞対Ｌ１ＣＡＭ低細胞による腫瘍再惹起。（Ｂ）形成された腫瘍の組織像。（Ｃ）Ｌ１ＣＡＭ高腫瘍細胞対Ｌ１ＣＡＭ低腫瘍細胞によるオルガノイド形成。
【００３４】
【図２６Ａ−Ｂ】図２６Ａ〜Ｄ。（Ａ）転移細胞の連続世代を産生するための手順の概略図。（Ｂ）親細胞（薄い灰色）またはＭ１世代細胞（濃い灰色）を接種されたマウスの転移なしの生存率。（Ｃ）７日目および７週間目における親細胞（上方パネル）、ならびに７日目および４週間目におけるＭ１世代細胞に起因する転移の相対数を示す巨視的画像。（Ｄ）親細胞、Ｍ１細胞、およびＭ２細胞におけるＬ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡのレベル。
【図２６Ｃ−Ｄ】図２６Ａ〜Ｄ。（Ａ）転移細胞の連続世代を産生するための手順の概略図。（Ｂ）親細胞（薄い灰色）またはＭ１世代細胞（濃い灰色）を接種されたマウスの転移なしの生存率。（Ｃ）７日目および７週間目における親細胞（上方パネル）、ならびに７日目および４週間目におけるＭ１世代細胞に起因する転移の相対数を示す巨視的画像。（Ｄ）親細胞、Ｍ１細胞、およびＭ２細胞におけるＬ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡのレベル。
【００３５】
【図２７】図２７。無傷オルガノイド、２４時間解離したオルガノイド、および２４時間懸濁培養物（対照）における相対的Ｌ１ＣＡＭ発現。
【００３６】
【図２８Ａ−Ｄ】図２８Ａ〜Ｍ。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後のＬ１ＣＡＭ発現のパーセント中央値。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりのオルガノイドの数。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の相対的発光。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりに生成されたオルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン媒介性ノックダウン後の発光日数。（Ｆ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、相対的発光。（Ｇ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、オルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｈ）１４日後にドキシサイクリンが中止された場合の発光。（Ｉ）非依存的なＬ１ＣＡＭ標的化ｓｈＲＮＡを用いた、（Ｈ）と同様の実験。（Ｊ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、解離後のカスパーゼ活性。（Ｋ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、腫瘍再成長。（Ｌ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、３週間後の腫瘍再成長の平均放射輝度。（Ｍ）無傷オルガノイド（対になっているバーのうちの最も左のバー）対解離細胞におけるＬ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子のレベルの相対的差。
【図２８Ｅ−Ｆ】図２８Ａ〜Ｍ。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後のＬ１ＣＡＭ発現のパーセント中央値。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりのオルガノイドの数。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の相対的発光。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりに生成されたオルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン媒介性ノックダウン後の発光日数。（Ｆ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、相対的発光。（Ｇ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、オルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｈ）１４日後にドキシサイクリンが中止された場合の発光。（Ｉ）非依存的なＬ１ＣＡＭ標的化ｓｈＲＮＡを用いた、（Ｈ）と同様の実験。（Ｊ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、解離後のカスパーゼ活性。（Ｋ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、腫瘍再成長。（Ｌ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、３週間後の腫瘍再成長の平均放射輝度。（Ｍ）無傷オルガノイド（対になっているバーのうちの最も左のバー）対解離細胞におけるＬ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子のレベルの相対的差。
【図２８Ｇ−Ｈ】図２８Ａ〜Ｍ。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後のＬ１ＣＡＭ発現のパーセント中央値。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりのオルガノイドの数。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の相対的発光。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりに生成されたオルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン媒介性ノックダウン後の発光日数。（Ｆ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、相対的発光。（Ｇ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、オルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｈ）１４日後にドキシサイクリンが中止された場合の発光。（Ｉ）非依存的なＬ１ＣＡＭ標的化ｓｈＲＮＡを用いた、（Ｈ）と同様の実験。（Ｊ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、解離後のカスパーゼ活性。（Ｋ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、腫瘍再成長。（Ｌ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、３週間後の腫瘍再成長の平均放射輝度。（Ｍ）無傷オルガノイド（対になっているバーのうちの最も左のバー）対解離細胞におけるＬ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子のレベルの相対的差。
【図２８Ｉ−Ｊ】図２８Ａ〜Ｍ。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後のＬ１ＣＡＭ発現のパーセント中央値。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりのオルガノイドの数。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の相対的発光。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりに生成されたオルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン媒介性ノックダウン後の発光日数。（Ｆ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、相対的発光。（Ｇ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、オルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｈ）１４日後にドキシサイクリンが中止された場合の発光。（Ｉ）非依存的なＬ１ＣＡＭ標的化ｓｈＲＮＡを用いた、（Ｈ）と同様の実験。（Ｊ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、解離後のカスパーゼ活性。（Ｋ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、腫瘍再成長。（Ｌ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、３週間後の腫瘍再成長の平均放射輝度。（Ｍ）無傷オルガノイド（対になっているバーのうちの最も左のバー）対解離細胞におけるＬ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子のレベルの相対的差。
【図２８Ｋ−Ｌ】図２８Ａ〜Ｍ。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後のＬ１ＣＡＭ発現のパーセント中央値。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりのオルガノイドの数。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の相対的発光。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりに生成されたオルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン媒介性ノックダウン後の発光日数。（Ｆ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、相対的発光。（Ｇ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、オルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｈ）１４日後にドキシサイクリンが中止された場合の発光。（Ｉ）非依存的なＬ１ＣＡＭ標的化ｓｈＲＮＡを用いた、（Ｈ）と同様の実験。（Ｊ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、解離後のカスパーゼ活性。（Ｋ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、腫瘍再成長。（Ｌ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、３週間後の腫瘍再成長の平均放射輝度。（Ｍ）無傷オルガノイド（対になっているバーのうちの最も左のバー）対解離細胞におけるＬ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子のレベルの相対的差。
【図２８Ｍ】図２８Ａ〜Ｍ。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後のＬ１ＣＡＭ発現のパーセント中央値。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりのオルガノイドの数。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の相対的発光。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性Ｌ１ＣＡＭノックアウト後の２０００細胞あたりに生成されたオルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン媒介性ノックダウン後の発光日数。（Ｆ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、相対的発光。（Ｇ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、オルガノイドを示す蛍光顕微鏡法。（Ｈ）１４日後にドキシサイクリンが中止された場合の発光。（Ｉ）非依存的なＬ１ＣＡＭ標的化ｓｈＲＮＡを用いた、（Ｈ）と同様の実験。（Ｊ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、解離後のカスパーゼ活性。（Ｋ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、腫瘍再成長。（Ｌ）ドキシサイクリン誘導性Ｌ１ＣＡＭノックダウン有りまたは無しでの、３週間後の腫瘍再成長の平均放射輝度。（Ｍ）無傷オルガノイド（対になっているバーのうちの最も左のバー）対解離細胞におけるＬ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子のレベルの相対的差。
【００３７】
【図２９Ａ】図２９Ａ〜Ｆ。（Ａ）ヒトの正常結腸、解離した陰窩、および１４日目のオルガノイド（上方パネル、左から右へ）、ならびにマウスの正常結腸および１４日目のオルガノイドにおけるＬ１ＣＡＭ発現。棒グラフは、３つの異なるヒトまたはマウスにおける陰窩（対になっているバーのうちの最も左のバー）対オルガノイドにおける発現のそれぞれの倍数変化を示す。（Ｂ）正常なマウス結腸オルガノイドにおける経時的な（１−Ｋｉ６７発現と比べて。四角を付けられた線）Ｌ１ＣＡＭ発現（円を付けられた線）。（Ｃ）上皮傷害後のマウス結腸におけるＬ１ＣＡＭ発現を示す概略図および組織像結果。（Ｄ）再生中のＴＡ（transit-amplifying）結腸細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現を示すより大きい拡大図。（Ｅ）結腸上皮傷害を持続するマウスの体重および生存率へのＬ１ＣＡＭ消失の結果。（Ｆ）（Ｅ）の結果の巨視的および微視的組織像。
【図２９Ｂ−Ｃ】図２９Ａ〜Ｆ。（Ａ）ヒトの正常結腸、解離した陰窩、および１４日目のオルガノイド（上方パネル、左から右へ）、ならびにマウスの正常結腸および１４日目のオルガノイドにおけるＬ１ＣＡＭ発現。棒グラフは、３つの異なるヒトまたはマウスにおける陰窩（対になっているバーのうちの最も左のバー）対オルガノイドにおける発現のそれぞれの倍数変化を示す。（Ｂ）正常なマウス結腸オルガノイドにおける経時的な（１−Ｋｉ６７発現と比べて。四角を付けられた線）Ｌ１ＣＡＭ発現（円を付けられた線）。（Ｃ）上皮傷害後のマウス結腸におけるＬ１ＣＡＭ発現を示す概略図および組織像結果。（Ｄ）再生中のＴＡ（transit-amplifying）結腸細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現を示すより大きい拡大図。（Ｅ）結腸上皮傷害を持続するマウスの体重および生存率へのＬ１ＣＡＭ消失の結果。（Ｆ）（Ｅ）の結果の巨視的および微視的組織像。
【図２９Ｄ−Ｆ】図２９Ａ〜Ｆ。（Ａ）ヒトの正常結腸、解離した陰窩、および１４日目のオルガノイド（上方パネル、左から右へ）、ならびにマウスの正常結腸および１４日目のオルガノイドにおけるＬ１ＣＡＭ発現。棒グラフは、３つの異なるヒトまたはマウスにおける陰窩（対になっているバーのうちの最も左のバー）対オルガノイドにおける発現のそれぞれの倍数変化を示す。（Ｂ）正常なマウス結腸オルガノイドにおける経時的な（１−Ｋｉ６７発現と比べて。四角を付けられた線）Ｌ１ＣＡＭ発現（円を付けられた線）。（Ｃ）上皮傷害後のマウス結腸におけるＬ１ＣＡＭ発現を示す概略図および組織像結果。（Ｄ）再生中のＴＡ（transit-amplifying）結腸細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現を示すより大きい拡大図。（Ｅ）結腸上皮傷害を持続するマウスの体重および生存率へのＬ１ＣＡＭ消失の結果。（Ｆ）（Ｅ）の結果の巨視的および微視的組織像。
【００３８】
【図３０Ａ−Ｂ】図３０Ａ〜Ｆ。（Ａ）無傷オルガノイド、解離したオルガノイド、または様々な細胞懸濁液における相対的Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡレベル。（Ｂ）様々な炎症性メディエータの添加での、オルガノイドまたは懸濁培養物におけるＬ１ＣＡＭレベルの変化（凡例におけるリストの上から下に対応する、左から右のバーにより表されている）。（Ｃ）Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤＨ１、ＣＹＲ６１、およびＡＮＫＲＤ１の発現へのｅ−カドヘリンノックダウンの効果。（Ｄ）Ｌ１ＣＡＭ発現へのＲＥＳＴノックダウンの効果。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭ座の最初のイントロンとのＲＥＳＴの結合についてのＣＨＩＰ−ＰＣＲ結果。（Ｆ）原発性ＣＲＣ浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭ、ｅ−カドヘリン、およびＲＥＳＴ（ｐ１２０−カテニン）へ方向づけられた抗体を使用する免疫組織学研究。
【図３０Ｃ−Ｄ】図３０Ａ〜Ｆ。（Ａ）無傷オルガノイド、解離したオルガノイド、または様々な細胞懸濁液における相対的Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡレベル。（Ｂ）様々な炎症性メディエータの添加での、オルガノイドまたは懸濁培養物におけるＬ１ＣＡＭレベルの変化（凡例におけるリストの上から下に対応する、左から右のバーにより表されている）。（Ｃ）Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤＨ１、ＣＹＲ６１、およびＡＮＫＲＤ１の発現へのｅ−カドヘリンノックダウンの効果。（Ｄ）Ｌ１ＣＡＭ発現へのＲＥＳＴノックダウンの効果。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭ座の最初のイントロンとのＲＥＳＴの結合についてのＣＨＩＰ−ＰＣＲ結果。（Ｆ）原発性ＣＲＣ浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭ、ｅ−カドヘリン、およびＲＥＳＴ（ｐ１２０−カテニン）へ方向づけられた抗体を使用する免疫組織学研究。
【図３０Ｅ】図３０Ａ〜Ｆ。（Ａ）無傷オルガノイド、解離したオルガノイド、または様々な細胞懸濁液における相対的Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡレベル。（Ｂ）様々な炎症性メディエータの添加での、オルガノイドまたは懸濁培養物におけるＬ１ＣＡＭレベルの変化（凡例におけるリストの上から下に対応する、左から右のバーにより表されている）。（Ｃ）Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤＨ１、ＣＹＲ６１、およびＡＮＫＲＤ１の発現へのｅ−カドヘリンノックダウンの効果。（Ｄ）Ｌ１ＣＡＭ発現へのＲＥＳＴノックダウンの効果。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭ座の最初のイントロンとのＲＥＳＴの結合についてのＣＨＩＰ−ＰＣＲ結果。（Ｆ）原発性ＣＲＣ浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭ、ｅ−カドヘリン、およびＲＥＳＴ（ｐ１２０−カテニン）へ方向づけられた抗体を使用する免疫組織学研究。
【図３０Ｆ】図３０Ａ〜Ｆ。（Ａ）無傷オルガノイド、解離したオルガノイド、または様々な細胞懸濁液における相対的Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡレベル。（Ｂ）様々な炎症性メディエータの添加での、オルガノイドまたは懸濁培養物におけるＬ１ＣＡＭレベルの変化（凡例におけるリストの上から下に対応する、左から右のバーにより表されている）。（Ｃ）Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤＨ１、ＣＹＲ６１、およびＡＮＫＲＤ１の発現へのｅ−カドヘリンノックダウンの効果。（Ｄ）Ｌ１ＣＡＭ発現へのＲＥＳＴノックダウンの効果。（Ｅ）Ｌ１ＣＡＭ座の最初のイントロンとのＲＥＳＴの結合についてのＣＨＩＰ−ＰＣＲ結果。（Ｆ）原発性ＣＲＣ浸潤先端におけるＬ１ＣＡＭ、ｅ−カドヘリン、およびＲＥＳＴ（ｐ１２０−カテニン）へ方向づけられた抗体を使用する免疫組織学研究。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
５．発明の詳細な説明
説明を明快にするために、かつ限定することなく、本発明の詳細な説明は、以下のサブセクションへ分けられる：
（ｉ）処置の方法；
（ｉｉ）アッセイ系；および
（ｉｉｉ）キット。
【００４０】
５．１  処置の方法
様々な非限定的実施形態において、本発明は、原発性がんについての処置を受けたことがあり、または受けている最中である対象において、原発性がんの転移拡散のリスクを低減させる方法であって、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを対象に投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの化学療法、標的療法、および／または免疫療法の１回または複数回のサイクルが完了した後で投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんまたは転移がんの本質的に完全な（周辺部分においてがんがない）外科的切除が完了した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの処置のサイクルまたは外科的切除後の一時期、維持レジメンにおいて投与される（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与される）。維持治療のための期間は、少なくとも約３カ月間、または少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間であり得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、対象が原発性がんの寛解に達した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの寛解に達した後の一時期、維持レジメンにおいて投与される（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与される）。維持治療のための期間は、少なくとも約３カ月間、または少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間であり得る。
【００４１】
様々な非限定的実施形態において、本発明は、原発性がんについての処置を受けた対象において、原発性がんの転移拡散を阻害する方法であって、対象に、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの化学療法、標的療法、および／または免疫療法の１回または複数回のサイクルが完了した後で投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんまたは転移がんの本質的に完全な（周辺部分においてがんがない）外科的切除が完了した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの処置のサイクルまたは外科的切除後の一時期、維持レジメンにおいて投与される（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与される）。維持治療のための期間は、少なくとも約３カ月間、または少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間であり得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、対象が原発性がんの寛解に達した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの寛解に達した後の一時期、維持レジメンにおいて投与される（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与される）。維持治療のための期間は、少なくとも約３カ月間、または少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間であり得る。
【００４２】
様々な非限定的実施形態において、本発明は、対象において転移性疾患の進行を阻害する方法であって、対象に治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを投与するステップを含む、方法を提供する。様々な非限定的実施形態において、本発明は、原発性がんについての処置を受けた対象において、転移性疾患の進行を阻害する方法であって、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの化学療法、標的療法、および／または免疫療法の１回または複数回のサイクルが完了した後で投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの放射線療法レジメンが完了した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんまたは転移がんの本質的に完全な（周辺部分においてがんがない）外科的切除が完了した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの処置のサイクルまたは外科的切除後の一時期、維持レジメンにおいて投与される（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与される）。維持治療のための期間は、少なくとも約３カ月間、または少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間であり得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、対象が原発性がんの寛解に達した後に投与される。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんの寛解に達した後の一時期、維持レジメンにおいて投与される（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与される）。維持治療のための期間は、少なくとも約３カ月間、または少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間であり得る。
【００４３】
様々な非限定的実施形態において、本発明は、対象において転移性疾患の進行を阻害する方法であって、がん細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現を、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を介して低減させる作用物質の治療量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００４４】
転移は、そのがんの最初の位置と物理的に近接しない位置におけるがん細胞の集団である。
【００４５】
「転移拡散のリスクを低減させること」は、Ｌ１ＣＡＭインヒビターで処置されていない比較可能な対照の対象における転移拡散のリスクと比べて低減させることである。
【００４６】
「原発性がんの転移拡散を阻害すること」とは、Ｌ１ＣＡＭインヒビターで処置されていない比較可能な対照の対象と比べて、転移の数、位置、および／もしくはサイズを低減すること、ならびに／または転移の発生までの期間を増加させること、ならびに／または生存を延ばすことの１つまたは複数を意味する。
【００４７】
「転移性疾患の進行を阻害すること」とは、以下の１つまたは複数を意味する：Ｌ１ＣＡＭインヒビターで処置されていない比較可能な対照の対象と比べて、既存の転移のサイズを減少させること、既存の転移の成長速度を低減させること、新しく検出可能な転移の発生率を低減させること、生活の質を向上させること、ならびに／または再発までの時間を増加させること、および／もしくは生存を延ばすこと。
【００４８】
ある特定の非限定的実施形態において、本発明は、原発性がんを有する対象において、がんの転移拡散を阻害する方法であって、がんの細胞がＬ１ＣＡＭを発現するかどうか決定するステップ、および細胞がＬ１ＣＡＭを発現する場合には、原発性がんの治療に加えて、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００４９】
非限定的実施形態において、増加したリスクのさらなる指標は、ＥｐｈＢ２の高い／中位の表面発現である。
【００５０】
様々な非限定的実施形態において、対象はヒト、または非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、ウサギ、ヒツジ、ウシ、クジラなどである。
【００５１】
様々な非限定的実施形態において、がんは、乳がん、肺がん、腎がん、結腸直腸がん、卵巣がん、前立腺がん、肝がん、またはメラノーマである。
【００５２】
転移の部位は、限定としてではないが、例えば、脳、肺、骨、または肝臓であり得る。
【００５３】
本発明の様々な非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、化学療法および／または標的療法および／または免疫療法および／または放射線療法レジメンと同時に投与され得る。しかしながら、代替の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、化学療法、標的療法、免疫療法、および／または放射線療法のコースが完了した後に投与され得る。特定の非限定的例において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、処置レジメンの終わりに、またはそれから少なくとも１カ月後に、またはそれから少なくとも３カ月後に、またはそれから少なくとも６カ月後に、またはそれから少なくとも１年後に、投与され得る。関連した非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、原発性がんまたは転移の本質的に完全な（周辺部分においてがんがない）外科的切除が完了した後に投与され得る。
【００５４】
様々な非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、化学療法もしくは放射線療法のコースが完了した後の、または原発性がんの完全なもしくは部分的な寛解に達した後の一時期、維持レジメンにおいて投与され得る（例えば、一定の間隔で（例えば、少なくとも週に１回、少なくとも月に１回、少なくとも２カ月に１回、少なくとも３カ月に１回、少なくとも６カ月に１回）投与され得る）。活動性疾患が存在することが決定されているかどうかに関わらず、前記維持レジメンが遂行され得る。
【００５５】
本発明の様々な実施形態において、処置としてＬ１ＣＡＭ阻害を使用することの決定は、処置されるべきがんおよび／またはその転移が、Ｌ１ＣＡＭ、ならびに任意選択でＥｐｈＢ２、ＣＤ１３３、および／またはＣＤ４４のうちの１つまたは複数を発現することを決定することにより支持され得る。Ｌ１ＣＡＭの発現は、当技術分野において公知の、例えば、下記のセクションで論じられているような、任意の方法により決定され得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭの発現は、Ｌ１ＣＡＭに特異的な抗体、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＬ１ＣＡＭコード化ｍＲＮＡの増幅を使用して、検出され得る。
【００５６】
様々な非限定的実施形態において、本発明は、がん細胞に有効量のＬ１ＣＡＭインヒビターを投与するステップを含む、がん細胞の化学療法剤に対する化学抵抗性を好転させる方法を提供する。非限定的実施形態において、がん細胞は転移性がんである。非限定的実施形態において、がんは、乳がん、肺がん、腎がん、または結腸直腸がんである。非限定的実施形態において、化学療法剤は、カルボプラチンまたはメトトレキセートである。特定の非限定的実施形態において、がんは、Ｋｒａｓ変異体肺がんであり、化学療法剤はカルボプラチンまたはメトトレキセートである。「化学抵抗性を好転させること」とは、Ｌ１ＣＡＭインヒビターで処置されていない対照がん細胞（例えば、そのがん細胞が、化学療法剤に対して、予想される応答より低く応答すると見なされる）と比べて、Ｌ１ＣＡＭインヒビターの投与が、がん細胞、細胞または腫瘍の、化学療法剤の抗がん効果に対する感受性を増加させることを意味する。特定の非限定的実施形態において、感受性の増加は、少なくとも約３０パーセントである。
【００５７】
Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭの、血管を取り込む能力、および／またはＬ１ＣＡＭの、腫瘍成長もしくは拡散を再惹起するまたは促進する能力を低減させる作用物質であり（例えば、そのインヒビターは、腫瘍細胞の侵襲性を低減させる）、腫瘍内の静止細胞を排除するために使用することができる。Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、これらに限定されないが、例えば、がん細胞においてＬ１ＣＡＭの発現を低減させ、もしくはＬ１ＣＡＭをがん細胞表面から除去し、もしくはＬ１ＣＡＭと結合して、その結果、例えば、物理的阻害により細胞結合に利用可能なＬ１ＣＡＭの量を低減することにより、そのＬ１ＣＡＭの、内皮細胞もしくは他のがん細胞もしくは正常組織と結合する能力が低減することにより、またはＬ１ＣＡＭ発現細胞を標識し、したがって、免疫系による破壊のためのマークをそれらに付けることにより、作用し得る。
【００５８】
非限定的実施形態において、対象がヒトである場合、阻害されるべきＬ１ＣＡＭは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ３２００４ならびに／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００４２５  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＭ＿０００４２５．４および／もしくはＮＭ＿００１２７８１１６  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＭ＿００１２７８１１６．１に示されているようなアミノ酸配列を有するヒトＬ１ＣＡＭである。
【００５９】
非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭと特異的に結合する免疫グロブリン、例えば、抗体もしくは抗体断片もしくは一本鎖抗体、または１つもしくは複数の免疫グロブリン領域を含む治療用分子であり得る。そのような抗体の非限定的例は、米国特許第８，１３８，３１３号、国際特許出願公開番号ＷＯ  ２００７１１４５５０、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ２００８１５１８１９に開示されており、加えて、これらの引用に記載された抗体とＬ１ＣＡＭ結合において競合する抗体である。ある特定の非限定的実施形態において、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体または抗体断片は、本発明による使用のための、Ｌ１ＣＡＭに特異的であるヒト抗体、ヒト化抗体、またはそうでなければキメラ抗体を調製するために使用され得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ抗体、抗体断片、または一本鎖抗体は、Ｌ１ＣＡＭの、内皮細胞もしくは毛細血管との結合、隣接するがんもしくは間質細胞上のＬ１ＣＡＭもしくは他の分子との結合、または細胞外マトリックスの他のコンポーネントとの結合を、生理的条件下で、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、阻害し得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ１３３と結合する免疫グロブリン領域を含む（その免疫グロブリンは二重特異性である）。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭおよびＣＤ４４と結合する免疫グロブリン領域を含む。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭ、加えてＴ細胞抗原と結合する。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭ、加えてＮＫ細胞抗原と結合する。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭおよびＥｐｈＢ２と結合する。
【００６０】
非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡと相同の領域を含む核酸、例えば、短鎖ヘアピン型、干渉性、アンチセンス、またはリボザイムの核酸であり得る。例えば、そのような核酸は、約１５ヌクレオチド長から５０ヌクレオチド長の間、または約１５ヌクレオチド長から３０ヌクレオチド長の間、または約２０ヌクレオチド長から３０ヌクレオチド長の間であり得、生理的条件下で、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ得る。Ｌ１ＣＡＭを阻害する短鎖ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡの非限定的例は、下記の実施例に示されている。非限定的実施形態において、核酸であるＬ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭ発現がん細胞において、ベクター、例えばレンチウイルスを介して提供され得、そのベクターが、前記がん細胞へと選択的に送り込まれ得、および／またはそこにおいて、Ｌ１ＣＡＭインヒビター核酸の発現が、腫瘍細胞において選択的に活性であるプロモーターにより導かれ得る。Ｌ１ＣＡＭ  ｍＲＮＡの核酸配列の非限定的例には、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００４２５  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＭ＿０００４２５．４および／またはＮＭ＿００１２７８１１６  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＭ＿００１２７８１１６．１に示された配列が挙げられる。一つの特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、
ヘアピン配列５’−ＣＣＧＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号１）および標的配列ＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴ（配列番号２）；または
ヘアピン配列５’−ＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号３）および標的配列ＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号４）；または
ヘアピン配列５’−ＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）および標的配列ＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴ（配列番号６）
を有する、ＲＮＡｉ  ＴＲＣＮ０００００６３９１６（Ｔｈｅ  ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｐｕｂｌｉｃ  ＴＲＣ  Ｐｏｒｔａｌ）である。
【００６１】
ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、ＭｅｔＣＳＣの表面上に高レベルで発現する変異Ｌ１ＣＡＭタンパク質に対して方向づけられた抗体であり得る。変異Ｌ１ＣＡＭタンパク質の非限定的例は、Vos,  Y.J.およびHofstra,  R.M.（２０１０年）ならびにFaltasら、２０１６年、Nat.  Genet.  ４８巻（１２号）：１４９０〜１４９９頁に示されており、どちらも参照により本明細書に組み込まれている。アップデートされ、かつアップグレードされたＬ１ＣＡＭ変異データベース、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３１巻、Ｅ１１０２〜１１０９頁。
【００６２】
ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭインヒビターは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子を、例えば、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックダウンを介して、編集することができる作用物質であり得る（例えば、図２１および下記の実施例を参照）。ゲノム編集は、対象内の１個または複数の細胞に存在する内因性染色体配列を、標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を使用して、編集、例えば改変することができる技術である。ゲノム編集方法は、ゲノム内の特定の領域における核酸配列の挿入、特定の配列のゲノムからの切除、および／または特定のゲノム配列の新しい核酸配列との置き換えを生じ得る。ゲノム編集技術の非限定的例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。そのようなゲノム編集技術の非限定的例は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１４／０９３７０１およびＷＯ２０１４／１６５８２５に開示され、それらの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。ある特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、特定のゲノム配列、例えば、Ｌ１ＣＡＭの発現に必要な配列（遺伝子それ自体のコード領域および／またはそれのプロモーターが挙げられるが、それに限定されない）へヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼをガイドするための、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、ゲノム内の特定の配列に相補的な１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含み得る；その相補領域は、少なくとも約１０ヌクレオチド長、または少なくとも約２０ヌクレオチド長、または少なくとも約３０ヌクレオチド長であり得る。エンドヌクレアーゼの非限定的例には、クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９）（Ｃａｓ９）が挙げられる。ある特定の実施形態において、そのエンドヌクレアーゼは、標的ゲノム配列の切断を生じ、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えを通して切断部位においてゲノムの改変を可能にする。ある特定の実施形態において、本開示のゲノム編集技術は、Ｃａｓタンパク質またはその変異体、例えば、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａをコードする核酸配列を含む発現ベクターの、対象の１個または複数の細胞への導入を含み得る。ある特定の実施形態において、ベクターは、ゲノム内の特定の核酸配列をＣａｓ９タンパク質の標的とするための１つまたは複数のｇＲＮＡをさらに含み得る。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、制御エレメントに作動可能に連結することができ、転写されたとき、１つまたは複数のｇＲＮＡは、ゲノムにおける標的配列へＣａｓタンパク質を方向づけ、かつＣａｓタンパク質によるゲノム座の切断を誘導することができる。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列に隣接して存在するＰＡＭ配列の約３〜４ヌクレオチド上流を切断する。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結した制御エレメントは、プロモーター、例えば、ドキシサイクリン誘導性プロモータ���などの誘導性プロモーターであり得る。例えば発現ベクターにおける、ＤＮＡ配列に適用される場合の用語「作動可能に連結した」は、その配列が、それらの意図された目的を達成するためにそれらが協同的に機能するように配置されていることを示し、すなわち、プロモーター配列は、連結したコード配列を終結シグナルまで進行する転写の開始を可能にする。ある特定の実施形態において、本発明のベクターによりコードされたＣａｓ９酵素は、１つまたは複数の変異を含み得る。変異は、人工的に導入された変異、または機能獲得型もしくは機能喪失型変異であり得る。そのような変異の非限定的例には、Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメイン、例えば、ＲｕｖＣおよびＨＮＨ触媒ドメインにおける変異、例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメイン内のＤ１０変異、およびＨＮＨ触媒ドメインにおけるＨ８４０が挙げられる。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインの１つにおける変異は、「ニッカーゼ」として機能するＣａｓ９タンパク質を生じ、その場合、その変異型Ｃａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡの一本の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生じる。ある特定の実施形態において、変異型Ｃａｓ９タンパク質、例えば、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａの使用は、標的ＤＮＡの両方の鎖の切断を促進する２つのｇＲＮＡの使用を可能にする。Ｃａｓ９変異の追加の非限定的例には、ＶＰ６４、ＫＲＡＢ、およびＳＩＤ４Ｘが挙げられる。ある特定の実施形態において、本開示のゲノム編集技術はさらに、核酸を含む追加のベクターを１つまたは複数の細胞へ導入することを含む。ある特定の実施形態において、このベクターは、ｇＲＮＡにより標的とされるゲノム配列と同じ配列および／またはそれに隣接した配列に、相補的である（例えば、ハイブリダイズすることができる）１つまたは複数の標的配列をさらに含み、相同組換えを起こし、かつ核酸配列（すなわち、ドナー核酸配列）のゲノムへの挿入を可能にすることができる。
【００６３】
５．２  アッセイ系
様々な実施形態において、本発明は、転移性疾患のモデルを作製し、治療剤を同定するためのアッセイ系としてそのようなモデルを使用するための、アッセイ系およびそのコンポーネントに関する。
【００６４】
様々な非限定的実施形態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭを発現するがん細胞を含むオルガノイド培養物を含む、転移を阻害する作用物質を同定するためのアッセイを提供する。前記細胞は、高いレベルのＬ１ＣＡＭおよび／または中位もしくは高いレベルのＥｐｈＢ２を発現し得る。ある特定の非限定的実施形態において、前記がん細胞は、ＭｅｔＣＳＣであり、任意選択で、外因性マーカー、例えば、蛍光外因性マーカーを発現する。ある特定の非限定的実施形態は、細胞がＬ１ＣＡＭを発現すること、例えば、高レベルのＬ１ＣＡＭの表面発現を決定するステップを含む、ＭｅｔＣＳＣを同定する方法を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、ＭｅｔＣＳＣはさらに、中位または高いレベルのＥｐｈＢ２を発現する。Ｌ１ＣＡＭおよび任意選択で、ＥｐｈＢ２の発現は、当技術分野において公知の任意の方法により決定され得、その方法には、抗体に基づいた、またはＰＣＲに基づいた方法が挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の非限定的実施形態において、ＭｅｔＣＳＣは、対象の原発性がんから単離される。ある特定の非限定的実施形態において、ＭｅｔＣＳＣは、対象の転移性がんから単離される。ある特定の非限定的実施形態において、原発性かまたは転移性のいずれかであるがんは、乳房、肺、腎臓、または結腸直腸が起源である。
【００６５】
ある特定の非限定的実施形態において、原発性または転移性である、がんが結腸直腸起源である場合、ＭｅｔＣＳＣはさらに、Ｌ１ＣＡＭおよび任意選択のＥｐｈＢ２に加えて、ＣＤ１３３および／またはＣＤ４４の１つまたは複数の表面発現を示す細胞として同定され得る。
【００６６】
ある特定の非限定的実施形態は、Ｌ１ＣＡＭを発現する単離されたＭｅｔＣＳＣ細胞を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、ＭｅｔＣＳＣは、高レベルのＬ１ＣＡＭを発現する。ある特定の非限定的実施形態において、単離されたＭｅｔＣＳＣは、導入された外因性マーカーを含む。ある特定の非限定的実施形態において、外因性マーカーは、蛍光マーカーである。特別の実施形態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭを発現するＭｅｔＣＳＣの本質的に純粋な集団である細胞を含む組成物を提供する。非限定的実施形態において、ＭｅｔＣＳＣは、ＦＡＣＳ、または当技術分野において公知の他の細胞単離方法を使用して単離され得る。
【００６７】
上記ＭｅｔＣＳＣは、転移過程を研究するために使用され得る転移のモデル系を調製するために使用され得、対象において転移性疾患を阻害し、それにより処置するための作用物質を同定するためのアッセイ系として使用され得る。
【００６８】
ある特定の非限定的実施形態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭおよび任意選択で、ＥＰＣＡＭを発現するがん細胞で形成されたオルガノイド培養物を含む転移のモデル系／アッセイ系を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、がん細胞はさらに、ＥｐｈＢ２を発現する。ある特定の実施形態において、がん細胞は、高レベルのＬ１ＣＡＭおよび中／高レベルのＥｐｈＢ２を発現する。
【００６９】
ある特定の非限定的実施形態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭおよびＥＰＣＡＭを発現するＭｅｔＣＳＣ細胞で形成されたオルガノイド培養物を含む転移のモデル系／アッセイ系を提供する。ある特定の非限定的実施形態において、ＭｅｔＣＳＣ細胞はさらに、ＥｐｈＢ２を発現する。ある特定の実施形態において、ＭｅｔＣＳＣ細胞は、高レベルのＬ１ＣＡＭおよび中／高レベルのＥｐｈＢ２を発現する。オルガノイド培養技術の記載について、例えば、Drostら、２０１６年、Nature  Protocols  １１巻：３４７〜３５８頁を参照されたい。例えば、オルガノイド培養のための培養培地は、Ｗｎｔを含み得る。上記のようなＭｅｔＣＳＣ細胞は、オルガノイド発生のための基盤として使用され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系の非限定的例は、オルガノイド形成を促進する条件化での前記ＭｅｔＣＳＣを含む。転移が生じ、および／または進行するのを阻害するのに有効な作用物質は、前記系においてオルガノイドの発生または成長を低減させる作用物質として同定され得る。
【００７０】
ある特定の非限定的実施形態において、任意選択で培養されてオルガノイドを形成している、上記のようなＭｅｔＣＳＣは、胸腺欠損マウスなどの実験動物、または他の免疫不全非ヒト宿主へ導入され、投与された作用物質が、前記ＭｅｔＣＳＣに起因する転移成長を遅らせ、その数を低減させ、またはそれの成長もしくは分散を阻害することに有効であるかどうかを試験するために使用され、それにより、抗転移治療活性を有するものとしてそれを同定し得る。
【００７１】
関連した非限定的実施形態において、本発明は、転移を阻害する作用物質を同定する方法であって、
（ｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現するがん細胞を含むオルガノイド培養物を提供するステップ；
（ｉｉ）前記オルガノイド培養物を試験物質と接触させるステップ；
（ｉｉｉ）Ｌ１ＣＡＭ発現のレベルが、試験物質と接触していない対照オルガノイド培養物と比べて、試験物質接触培養物において減少しているかどうかを決定するステップ
を含み、試験物質との接触に応答するＬ１ＣＡＭの発現、相互作用、および／またはシグナル伝達のレベルの減少は、試験物質が転移を阻害することを指し示す、方法を提供する。
【００７２】
５．３  キット
ある特定の非限定的実施形態において、本発明は、がんを有する対象が、がんの転移拡散のリスクが増加しているかどうかを決定するためのキットであって、がんの細胞がＬ１ＣＡＭを発現するかどうかを決定するための手段、および任意選択で、Ｌ１ＣＡＭのがん細胞上での発現が、対象がＬ１ＣＡＭインヒビター治療から恩恵を受け得ることを示すということを知らせる指導書を含む、キットを提供する。
【００７３】
ある特定の非限定的実施形態において、本発明は、転移を阻害する作用物質を同定するためのキットであって、（ｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現するがん細胞、および（ｉｉ）Ｌ１ＣＡＭ発現レベルを決定するための手段を含む、キットを提供する。様々な非限定的実施形態において、がん細胞は、高レベルのＬ１ＣＡＭを発現し、任意選択で、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、および／またはＥｐｈＢ２の１つまたは複数をさらに発現し得る。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するための手段は、Ｌ１ＣＡＭと検出可能に結合するオリゴヌクレオチドプローブである。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するための手段は、Ｌ１ＣＡＭ発現レベルを決定するためにポリメラーゼ連鎖反応に使用することができる１対のプライマーである。ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するための手段は、Ｌ１ＣＡＭと特異的に結合する免疫グロブリンである。
【００７４】
キットの型の非限定的例には、アレイ／マイクロアレイ、Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体、およびビーズが挙げられるが、それらに限定されず、それらは、Ｌ１ＣＡＭ、および任意選択で、上記に示された他のマーカー（ＥｐｈＢ２、ＣＤ１３３、ＣＤ４４）を検出するための１つもしくは複数のプライマー、プローブ、抗体、または他の検出試薬を含有し得る。
【００７５】
非限定的実施形態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭ、ならびに任意選択で、ＥｐｈＢ２、ＣＤ１３３、および／またはＣＤ４４のタンパク質レベルを（直接的に、またはｍＲＮＡを介して）検出するための手段を含む、がんを有する対象が、がんの転移を有し、または発生するリスクが増加しているかどうかを決定するためのキットを提供する。
【００７６】
ある特定の非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ、ならびに任意選択で、ＥｐｈＢ２、ＣＤ４４、および／またはＣＤ１３３の表面発現が検出される。
【００７７】
非限定的実施形態において、キットは、Ｌ１ＣＡＭ、ならびに任意選択で、ＥｐｈＢ２、ＣＤ４４、および／またはＣＤ１３３の免疫検出のための少なくとも１つの抗体を含み得る。これらのタンパク質に特異的な、抗体可変領域またはその小領域を含む分子を含むポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、当業者に一般的に知られているような、従来の免疫化技術を使用して調製され得る。キットの免疫検出試薬は、所定の抗体または抗原それ自体に会合し、または連結する検出可能な標識を含み得る。そのような検出可能な標識には、例えば、化学発光または蛍光分子（ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＲＯＸ）、放射標識（３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、１３１Ｉ）、または酵素（アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）が挙げられる。あるいは、検出可能な部分は、一次抗体または抗体断片と選択的に結合する二次抗体または抗体断片に含まれ得る（前記一次抗体または抗体断片がセルピンを特異的に認識する場合）。
【００７８】
さらなる非限定的実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体（または任意選択で、ＥｐｈＢ２、ＣＤ４４、および／またはＣＤ１３３特異的抗体）が、カラムマトリックス、アレイ、またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に結合して提供され得る。あるいは、支持体は、キットの別個の要素として提供され得る。
【００７９】
ある特定の実施形態において、キットの型には、包装されたプローブおよびプライマーセット（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）が挙げられるが、それらに限定されず、それらは、１つもしくは複数のセルピン、例えば、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２、またはセルピンＤ１を検出するための１つもしくは複数のプローブ、プライマー、または他の検出試薬をさらに含有し得る。
【００８０】
特定の非限定的実施形態において、キットは、同定されるべきタンパク質を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸シーケンシングに適した１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。１対のプライマーは、Ｌ１ＣＡＭ、または任意選択で、ＥｐｈＢ２、ＣＤ１３３、および／もしくはＣＤ４４をコードするｍＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列を含み得、かつ前記ｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズするのに十分な長さのものであり得る。複数のマーカータンパク質特異的プライマーが、複数のタンパク質（例えば、Ｌ１ＣＡＭ、および任意選択で、ＥｐｈＢ２、ＣＤ４４、および／またはＣＤ１３３の１つもしくは複数）を同時にアッセイするためにキットに含まれ得る。キットはまた、１つまたは複数のポリメラーゼ、逆転写酵素、およびヌクレオチド塩基を含み得、ヌクレオチド塩基は、任意選択で、さらに検出可能に標識することができる。
【００８１】
非限定的実施形態において、プライマーは、少なくとも約１０ヌクレオチド長、もしくは少なくとも約１５ヌクレオチド長、もしくは少なくとも約２０ヌクレオチド長、および／または約２００ヌクレオチド長まで、もしくは約１５０ヌクレオチド長まで、もしくは約１００ヌクレオチド長まで、もしくは約７５ヌクレオチド長まで、もしくは約５０ヌクレオチド長までであり得る。
【００８２】
さらなる非限定的実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、固体表面または支持体上、例えば、核酸マイクロアレイ上に固定化され得、任意選択で、固体表面または支持体に結合した各オリゴヌクレオチドプライマーの位置は、公知であり、かつ同定可能である。
【００８３】
特定の非限定的実施形態において、キットは、同定されるべきタンパク質を検出するためのインサイチュハイブリダイゼーションまたは蛍光インサイチュハイブリダイゼーションに適した、少なくとも１つの核酸プローブを含み得る。
【００８４】
一つの特定の非限定的実施形態において、キットは、Ｌ１ＣＡＭ、ならびにＥｐｈＢ２、ＣＤ４４、および／またはＣＤ１３３の１つまたは複数を検出するのに適したプローブ、プライマー、マイクロアレイ、抗体、または抗体断片の１つまたは複数を含み得る。
【００８５】
ある特定の非限定的実施形態において、キットは、バイオマーカーの発現レベルを決定するためにアッセイまたは反応を行うのに必要な１つまたは複数の検出試薬および他のコンポーネント（例えば、緩衝液、アルカリフォスファターゼなどの酵素、抗体その他）を含み得る。
【００８６】
ある特定の非限定的実施形態において、本発明は、がんを有する対象ががんの転移拡散のリスクが増加しているかどうかを決定するための診断方法であって、がんの細胞がＬ１ＣＡＭおよびＥｐｈＢ２を発現しているかどうかを決定するための手段を含み、がん細胞がＬ１ＣＡＭおよびＥｐｈＢ２、特に高いＬ１ＣＡＭおよび中位の／高いＥｐｈＢ２を発現していることを見出される場合には、対象が、それらのマーカーを欠くがんを有する対象と比べて転移性疾患を発生するリスクが増加しており、かつＬ１ＣＡＭインヒビター治療から恩恵を受け得る、診断方法を提供する。方法はさらに、決定およびその関連したリスクの結果を対象またはヘルスケアワーカーに伝えるステップを含み得る。方法はさらに、リスクの増加が示された場合、対象が検出可能な転移性疾患を有するかどうかを決定するための追加の診断手順、例えば、画像診断を勧め、または実施するステップを含み得る。画像診断法の非限定的例には、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法、およびポジトロン放出断層撮影法が挙げられる。関連した実施形態において、本発明は、診断方法を実施するステップ、次いで、リスクの増加が示された場合、治療量のＬ１ＣＡＭインヒビターを投与するステップを含む、処置の方法を提供する。
【実施例】
【００８７】
６．実施例：Ｌ１ＣＡＭ阻害は、転移を阻害し／低減させ、定着した転移の進行を阻害する
転移は、原発性腫瘍細胞が、まず、上皮−間葉転換を受け、その原発性腫瘍から逃避しなければならないという点で、高度に非効率的な過程である。血流で広がった後、腫瘍細胞の大部分は死滅し、敵対する異質器官において生存する能力があるほんの一部分だけが残る。これらの残存する少数の腫瘍細胞が、数カ月間または数年間、休眠状態にあり、その後、条件が揃ったとき、増殖し始め、腫瘍成長を再惹起し得る。このいわゆるマクロ転移成長が惹起された時点では、大量の腫瘍細胞を化学療法、放射線療法、標的療法、および／または免疫療法で殺滅することは通常、まだ可能であり、測定可能な疾患がない時点までさえ、可能である場合もあるが、真の治癒が可能であることはめったにない。
【００８８】
これは、マクロ転移を形成する腫瘍細胞、ＭｅｔＣＳＣが、化学療法、放射線療法、標的療法、および／または免疫療法に抵抗性であることを示唆する。ＭｅｔＣＳＣは、最初、原発性腫瘍、および、後に、その転移を処置するために適用されたこれらの治療を生き延びなければならないからである。加えて、ＭｅｔＣＳＣは、長期間の自己複製を起こすことができ、（腫瘍不均一性を反復する）不均一な子孫を発生させる能力をもち、休眠状態に入ったり出たりする能力があり、その休眠状態において、それらは、潜在的に、数年間（ＥＲ／ＰＲ陽性乳がんの症例において見られるように、数十年間までも）、存在することができる。
【００８９】
化学療法は、転移成長を調節するための処置選択肢でないかも知れないため、ＭｅｔＣＳＣを機構的に理解し、かつこれらの細胞を特異的に殺滅する治療標的を同定することが重要である。現在まで、転移を研究するためのモデル系は不完全であった。
【００９０】
Ｌ１ＣＡＭは、様々ながんに付随した分子である。異常なＬ１ＣＡＭ発現は、原発性腫瘍の最先端で実証されており、肺がん、乳がん、および結腸がんを含む多くのヒトがんにおいて浸潤、転移、および予後不良と関連づけられている（Vouraら、２００１年；Benら、２０１０年；Tsutsumiら、２０１１年；Schroderら、２００９年；Tischlerら、２０１１年；Booら、２００７年；Chenら、２０１３年；Fogelら、２００３年ａ；Dobersteinら、２０１１年；Fogelら、２００３年ｂ；Kimら、２００９年；Manessら、２００７年）。Ｌ１ＣＡＭ発現は、正常では、神経細胞に制限され、その神経細胞において、それは、成長円錐の周囲のコンポーネントとの相互作用を通して軸索ガイダンスを媒介する（Castellaniら、２００２年；Wiencken-Bargerら、２００４年）。転移過程中のＬ１ＣＡＭの発現をさらに研究するために、いくつかの免疫組織学的研究が実施された。Ｌ１ＣＡＭは、原発性腫瘍浸潤先端において発現していることが見出され（図５Ａ）、そこでは、細胞は静止状態のままである（低いＫｉ６７；図５Ｂ）。顕著なことには、無傷の腺の形態を有する腫瘍の高分化型区域は、主に、Ｋｉ６７が低い静止細胞において、Ｌ１ＣＡＭを優勢に発現し、一方、上皮完全性が喪失した低分化型区域において、Ｌ１ＣＡＭ発現は、Ｋｉ６７が高い細胞に観察することができた（図５Ａ、５Ｂ）。Ｌ１ＣＡＭは、隣接する正常な結腸上皮細胞には発現していなかった（図６Ｄ）。Ｌ１ＣＡＭの発現は、正常組織と比べて腫瘍において増加し、腫瘍と比べて転移において増加している（図６Ａ〜Ｃ、図７Ａ〜Ｃ）。最後に、化学療法後の残存疾患は、強くＬＣＡＭ１＋であり、その細胞は静止状態である（低いＫｉ６７、図８Ａ〜Ｂ）。全てのこれらの特徴は、Ｌ１ＣＡＭがＭｅｔＣＳＣのマーカー（および機能的に関連した分子）であることと一致している。Ｌ１ＣＡＭの阻害が転移に影響を及ぼすことができるかどうかを決定するために実験を実施した。（Ｌ１ＣＡＭ発現をノックダウンするために）ｓｈＬ１ＣＡＭをトランスフェクションされたがん細胞かまたは対照がん細胞のいずれかを、胸腺欠損マウスへ（脳または骨の転移を評価するための心臓内注射により、および肺転移を評価するために尾静脈注射により）導入し、転移の量を、数週間後、生物発光画像法を使用して決定した。図１Ａ〜Ｄに示されているように、転移性疾患の程度は、Ｌ１ＣＡＭ枯渇がん細胞を受けたマウスにおいて劇的に低減した。Ｌ１ＣＡＭ枯渇（Ｌ１ＣＡＭ阻害）は、乳がんの肺への転移（図１Ａ）、乳がんの骨への転移（図１Ｂ）、結腸がんの肝臓への転移（図１Ｃ）、および腎細胞がんの脳への転移（図１Ｄ）を含む、転移性疾患の進行を有意に低減させた。
【００９１】
Ｌ１ＣＡＭ阻害が既存の転移性疾患を処置するために使用することができるかどうかを決定するために実験をまた実施した。これらの実験において、Ｌ１ＣＡＭのノックダウンが、腫瘍細胞が広がった後にオンにすることができるように、ｓｈＬ１ＣＡＭの発現を、薬物ドキシサイクリンにより活性化され得る誘導性プロモーターの調節下に置いた。ｓｈＬ１ＣＡＭｉｎｄトランスフェクション化がん細胞かまたは対照がん細胞のいずれかを受けた胸腺欠損マウスを、１４日目にドキシサイクリンで処理し、その後、２８日目に生物発光画像法により転移性疾患について評価した（図２）。結果は図２および３Ａ〜Ｃに示され、その図は、Ｌ１ＣＡＭノックダウンが、定着した転移、特に、肺がんの脳への転移（図３Ａ）、乳がんの骨への転移（図３Ｂ）、および乳がんの肺への転移（図３Ｃ）の成長を阻害したことを示している。Ｌ１ＣＡＭは、血管取り込みにおいて役割を果たすことが決定されているが、定着した転移は、血管取り込みの必要性を成長して脱却しており、Ｌ１ＣＡＭ阻害がまた、定着した転移の進行を阻害できたことを観察したことは興味深い（図４Ａ〜Ｂ）。
【００９２】
７．実施例：転移性疾患についてのモデル系
転移性疾患についてのモデルを開発するために実験を実施した。特に、患者由来の細胞を使用して、Ｈａｎｓ  Ｃｌｅｖｅｒｓにより開発された技術の改変（オルガノイドがマトリゲルにおいて３次元に成長し、Ｗｎｔが富化された幹細胞培地が培養に使用される）を使用し、培養中のオルガノイドを作製した（図１０）。例えば、転移性腫瘍を、患者から採取し、単一細胞へ解離させ、その後、細胞のＬ１ＣＡＭ＋、ＥｐＣＡＭ＋画分を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により収集し、オルガノイド培養物を確立するために使用した（図１１）。注目すべきことには、ＥｐｈＢ２中位；Ｌ１ＣＡＭ＋の細胞は、ＭｅｔＣＳＣの新規なサブセットを構成することが見出された（図１２）。結腸直腸がんを有する対象から収集された場合、Ｌ１ＣＡＭ高画分は、Ｌ１ＣＡＭ低細胞と比べて、定着した結腸直腸がん幹細胞マーカーＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＥｐｈＢ２の細胞表面発現の増加を示すことが見出された（図１３）。マーカーＬ１ＣＡＭ、ＥｐｈＢ２２、ＣＤ１３３、およびＣＤ４４についてのＦＡＣＳ分析の結果は、図１４および１５に示されている。
【００９３】
腫瘍Ｌ１ＣＡＭ発現が、オルガノイド惹起能力と関連していることがさらに観察された（図１６および１７）。高レベルの細胞表面Ｌ１ＣＡＭを発現する残存腫瘍は、低いＬ１ＣＡＭレベルをもつ腫瘍より、オルガノイドとして培養され得ることが多かった（図９Ａ〜Ｃ）。新鮮に切除された残存ＣＲＣ肝臓転移物由来のＦＡＣＳソーティングされたＬ１ＣＡＭ高細胞は、同じ腫瘍由来のＬ１ＣＡＭ低細胞より高いオルガノイド生成能力を有した（図９Ｄ）。
【００９４】
興味深いことに、Ｌ１ＣＡＭ高細胞は、Ｌ１ＣＡＭ高子孫とＬ１ＣＡＭ低子孫の両方を生じることが見出された（図１８）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＫｉ６７が低いＬ１ＣＡＭ＋細胞は、Ｌ１ＣＡＭ−細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏでＫｉ６７が高い）よりオルガノイド惹起の能力が高く（図１９）、患者腫瘍内のＬ１ＣＡＭ＋細胞が、許容的な条件下で、細胞周期へ再び入り、腫瘍成長を再惹起し、Ｌ１ＣＡＭ＋細胞とＬ１ＣＡＭ−細胞の両方からなる不均一な腫瘍を再配置することができる、ゆっくりした細胞周期の予備細胞（ｒｅｓｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ）であることを示唆している。これは、図２２に実証され、その図は、新生の小さいオルガノイドが、広くＬ１ＣＡＭ＋細胞で構成されているが、オルガノイドが成長するにつれて、細胞は分裂して、ほとんど、オルガノイドの大部分を占めるＬ１ＣＡＭ−分化型子孫を生じることを示している。
【００９５】
Ｌ１ＣＡＭ発現を、解離腫瘍と、解離腫瘍から生成したオルガノイドとの間で比較した場合、Ｌ１ＣＡＭ発現が、オルガノイド生成中に選択された形質であることが見出された。２人の異なる患者から収集された解離腫瘍からの結果は、図２０Ａおよび２０Ｂに示されている。Ｌ１ＣＡＭを、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ−９を使用して、欠失させた場合、より少ないオルガノイドが生じ（図２１）、Ｌ１ＣＡＭが、オルガノイドを惹起するＭｅｔＣＳＣの生存および／または再成長に必要とされることを示唆している。注目すべきことには、無傷オルガノイドの単一細胞への解離が、Ｌ１ＣＡＭ発現を著しく上方制御した（図２７）。
【００９６】
患者の転移由来のオルガノイドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、Ｌ１ＣＡＭ高集団およびＬ１ＣＡＭ低集団へＦＡＣＳソーティングし、ＮＳＧマウスへ皮下異種移植片として移植し、それにより、Ｌ１ＣＡＭ高細胞は、より高いｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍再惹起能力を呈した（図２５Ａ）。皮下腫瘍は、高分化型腺上皮形態および腸ムチン分泌を呈した（図２５Ｂ）。細胞表面Ｌ１ＣＡＭ発現に基づいた皮下腫瘍由来細胞のＦＡＣＳソーティングにより、Ｌ１ＣＡＭ高細胞がそれらのオルガノイド再惹起能力を保持することが明らかにされた（図２５Ｃ）。
【００９７】
次に、本発明者らは、ステージＩＩＩ  ＣＲＣ由来オルガノイドを免疫不全ＮＳＧマウスの脾静脈へ注射した。その後、このようにして生じた肝臓転移物を、オルガノイドとして継代し、脾静脈へ再び、注射した。そのような連続継代された肝臓転移性オルガノイドは、それらの親オルガノイドより大きい肝臓転移物をより迅速に形成しただけでなく、より高いレベルのＬ１ＣＡＭを発現した（図２６Ａ〜Ｄ）。要するに、治療抵抗性残存転移性患者腫瘍におけるＬ１ＣＡＭ高細胞は、オルガノイドおよび転移の再惹起性幹細胞（ＭｅｔＳＣ）である。
【００９８】
８．実施例：Ｌ１ＣＡＭの阻害は化学抵抗性を好転させる
カルボプラチンおよびメトトレキセートに抵抗性であるＫｒａｓ変異体肺がん細胞に、ドキシサイクリン誘導性プロモーターに作動可能に連結したｓｈＣＯＮＴＲＯＬまたはｓｈＬ１ＣＡＭをトランスフェクションした。その後、ｓｈＣＯＮＴＲＯＬまたはｓｈＬ１ＣＡＭ含有細胞を、胸腺欠損マウスへ心臓内に注射した（０日目）。１４日目に、ドキシサイクリン、およびｖ＝カルボプラチンまたはメトトレキセートでの処理を開始し、３５日目に腫瘍を評価した。図２４に示されているように、Ｌ１ＣＡＭインヒビターを発現するがん細胞は、対照細胞より、カルボプラチンまたはメトトレキセートに対して感受性がより高かった。これは、Ｌ１ＣＡＭ阻害が、化学抵抗性細胞を、化学療法に対してより感受性にし得ることを指し示している。
【００９９】
９．実施例：Ｌ１ＣＡＭは、アノイキス回避およびオルガノイド再生に必要とされる
Ｌ１ＣＡＭが、オルガノイド成長または再生に機能的に必要とされるかどうかを調べるために、本発明者らは、転移由来オルガノイドにおいてＬ１ＣＡＭのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性ノックアウトを実施した（図２１参照）。Ｌ１ＣＡＭノックアウトは、オルガノイド由来単一細胞の新しいオルガノイドを再生する能力を有意に阻害した（図２８Ａ〜Ｄ）。同様に、Ｌ１ＣＡＭのドキシサイクリン誘導性ノックダウンは、オルガノイド再生を阻害した（図２８Ｅ〜Ｇ）。注目すべきことには、１４日間の培養後のドキシサイクリンの中止は、オルガノイド再成長を可能にせず、Ｌ１ＣＡＭ欠損転移性ＣＲＣ前駆体は、オルガノイド再成長を駆動するためだけでなく、上皮構造から脱離したときに生存するためにもＬ１ＣＡＭを必要とすることを示唆している（図２８Ｈ〜Ｉ）。これと一致することには、Ｌ１ＣＡＭ欠損細胞は、解離後の第１週目において、カスパーゼ活性の増加を呈した（図２８Ｊ）。したがって、Ｌ１ＣＡＭ欠損細胞は、脱離誘導性カスパーゼ媒介性細胞死、別名アノイキスを実証する。Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、多能性、ＩＳＣ、ｗｎｔ応答、または分化に関連した遺伝子の発現を変化させなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｌ１ＣＡＭノックダウンは、ＮＳＧマウスにおいて皮下腫瘍成長を抑止した（図２８Ｋ〜Ｌ）。要するに、Ｌ１ＣＡＭは、ＭｅｔＳＣの表現型前駆細胞アイデンティティを駆動しないが、腫瘍伝播および転移の成功のための重大な必要要件である、上皮脱離の際におけるそれらの生存および再成長に必要とされる。
【０１００】
ＹＡＰ活性は、複数の関連において硬い基底膜との上皮相互作用および接触の喪失により誘導される（Zhao  B、Wei  X、Li  W、Udan  RS、Yang  Q、Kim  J、Xie  J、Ikenoue  T、Yu  J、Li  L、Zheng  P、Ye  K、Chinnaiyan  A、Halder  G、Lai  ZC、Guan  KL。  Inactivation  of  YAP  oncoprotein  by  the  Hippo  pathway  is  involved  in  cell  contact  inhibition  and  tissue  growth  control。  Genes  Dev.  ２００７年１１月１日；２１巻（２１号）：２７４７〜６１頁。Aragona  M、Panciera  T、Manfrin  A、Giulitti  S、Michielin  F、Elvassore  N、Dupont  S、Piccolo  S。  A  mechanical  checkpoint  controls  multicellular  growth  through  YAP/TAZ  regulation  by  actin-processing  factors.  Cell。２０１３年８月２９日；１５４巻（５号）：１０４７〜５９頁。Benham-Pyle  BW、Pruitt  BL、Nelson  WJ。Cell  adhesion.  Mechanical  strain  induces  E-cadherin-dependent  Yap1  and  β-catenin  activation  to  drive  cell  cycle  entry。Science  ２０１５年５月２９日；３４８巻（６２３８号）：１０２４〜７頁。Gjorevski  N、Sachs  N、Manfrin  A、Giger  S、Bragina  ME、Ordonez-Moran  P、Clevers  H、Lutolf  MP。Designer  matrices  for  intestinal  stem  cell  and  organoid  culture。Nature  ２０１６年１１月２４日；５３９巻（７６３０号）：５６０〜５６４頁）。実際、オルガノイドの単一細胞への解離は、ＹＡＰ標的遺伝子ＡＮＫＲＤ１、ＣＹＲ６１、およびＩＴＧＢ１の発現を有意に誘導した（図２８Ｍ）。
【０１０１】
１０．実施例：前駆細胞によるＬ１ＣＡＭ発現は、傷害後の上皮再生に必要とされる
Ｌ１ＣＡＭは、形質転換上皮細胞による組織構築の生存、再成長、および回復に必要とされるため、本発明者らは、上皮完全性が破壊されたとき、非形質転換上皮においてそれがまた必要とされるかどうかについて興味をもった。ヒトにおいて見られるように、正常なマウス結腸上皮は、Ｌ１ＣＡＭの有意な量を発現しなかった（図２９Ａ）。しかしながら、オルガノイドとして成長した場合、非形質転換結腸上皮細胞は、Ｌ１ＣＡＭ発現を誘導した（図２９Ａ）。がんオルガノイドに関して見られるように、正常なマウス結腸オルガノイドは、オルガノイド解離直後に、Ｌ１ＣＡＭを劇的に上方制御し、全体のオルガノイドＬ１ＣＡＭは、オルガノイドがより大きく成長するにつれて、経時的に減少した（図２９Ｂ）。Ｌ１ＣＡＭが、ｉｎ  ｖｉｖｏで上皮傷害中に誘導されるかどうかを試験するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ６をデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）水で７日間、処理した。水を与えられた対照マウスにおいてＬ１ＣＡＭは発現しなかったが、ＤＳＳ損傷を示した区域での再生中の結腸陰窩において、１１日目から１６日目まで発現した（図２９Ｃ）。Ｌ１ＣＡＭは、急速に増殖する幹細胞を伴う陰窩基底部コンパートメントにおいても、完全に分化した管腔細胞においても発現しなかったが、その代わり、再生中のＴＡ（transit-amplifying）結腸細胞において発現した（図２９Ｄ）。
【０１０２】
結腸再生におけるＬ１ＣＡＭの機能的意義を調べるために、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭｆｌ／ｆｌマウスを腸幹細胞特異的Ｌｇｒ５−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスと交雑させた。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現は、マウスを、ＤＳＳまたは水処理と同時に、ＩＰタモキシフェンの３回の投与で処理することにより誘導された。水を与えられた場合、タモキシフェン処理マウスは、体重（図２９Ｅ）、挙動、または用便習慣に変化を呈さなかった。ＤＳＳで処理された場合、タモキシフェン処理Ｌｇｒ５−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／Ｌ１ＣＡＭｆｌ／ｙは、対照と比較して、持続性の体重減少および生存率の低下を示した。剖検により、有意に短縮された結腸が明らかにされ、組織病理学により、粘膜裸出の区域を有する広汎性炎症が示された（図２９Ｆ）。
【０１０３】
１１．実施例：上皮破壊は、Ｌ１ＣＡＭプロモーターからＲＥＳＴを排除することによりＬ１ＣＡＭを誘導する
次に、本発明者らは、どのように上皮前駆細胞がＬ１ＣＡＭ発現を誘導し、かつ制御するかを理解しようとした。結腸炎関連炎症性サイトカインがＬ１ＣＡＭ誘導に寄与するかどうかを決定するために、本発明者らは、ヒトＣＲＣオルガノイドを、正常な、または炎症性結腸からの条件培地とインキュベートした。結腸炎条件培地も、結腸炎または神経細胞再生（Ｌ１ＣＡＭが以前、関係づけられている）に関連した組換えサイトカインとのインキュベーションも、Ｌ１ＣＡＭを誘導しなかった（図３０Ａ〜Ｂ）。対照的に、オルガノイドの単一細胞への解離は、Ｌ１ＣＡＭ上方制御に必要かつ十分であった（図３０Ａ〜Ｂ）。無傷上皮における構造的完全性は、接着結合におけるｅ−カドヘリン同種親和性細胞間接触により確保される。したがって、本発明者らは、破壊された上皮における細胞膜からのｅ−カドヘリンの欠損がＬ１ＣＡＭ発現を誘導し得ると仮定した。この仮定と一致して、ＣＲＣオルガノイドにおけるｅ−カドヘリンのｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンが、Ｌ１ＣＡＭおよびＹＡＰ標的遺伝子発現を誘導した（図３０Ｃ）。
【０１０４】
様々な非神経細胞組織において、転写抑制因子ＮＳＲＦ／ＲＥＳＴは、正常では、Ｌ１ＣＡＭおよび他の神経細胞遺伝子の発現を阻止する。ＲＥＳＴは、腫瘍抑制因子として同定されており、転移性結腸直腸がんは、ＲＥＳＴ遺伝子における機能喪失型変異または欠失を高頻度で獲得する。したがって、本発明者らは、ＲＥＳＴが、オルガノイドにおけるＬ１ＣＡＭ発現の抑圧に機能しているのかどうかを調べた。ヒトＣＲＣオルガノイドにおけるＲＥＳＴノックダウンは、Ｌ１ＣＡＭ発現を強く誘導し、ＲＥＳＴが、Ｌ１ＣＡＭ発現を抑圧することに活性であることを示唆した（図３０Ｄ）。ＣＨＩＰ−ＰＣＲにより特異的にプルダウンされたＲＥＳＴは、ＣＲＣオルガノイドにおいて、Ｌ１ＣＡＭ座の最初のイントロン中のイントロンエンハンサーと結合した（図３０Ｅ）。上皮破壊が患者腫瘍においてＬ１ＣＡＭ発現に関連しているかどうかを検証するために、本発明者らは、原発性ＣＲＣ浸潤先端の連続切片を、ｅ−カドヘリンおよびＲＥＳＴに対する抗体で染色した。本発明者らは、患者腫瘍において膜性ｅ−カドヘリンの欠損とＬ１ＣＡＭ発現との間の強い相関を同定した（図３０Ｆ）。これらの結果は、Ｌ１ＣＡＭが、上皮完全性を奪われている細胞の生存に必要とされ、かつ無傷上皮において下方制御されることを指し示している。
【０１０５】
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米国特許第８，１３８，３１３号、国際特許出願公開番号ＷＯ  ２００７１１４５５０、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ２００８１５１８１９
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様々な刊行物が本明細書に引用され、それらの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ−Ｄ】
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【図２７】
2019524768.tif 000049
【図２８Ａ−Ｄ】
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【図２８Ｅ−Ｆ】
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【図２８Ｇ−Ｈ】
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【図２８Ｉ−Ｊ】
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【図２８Ｋ−Ｌ】
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【図２８Ｍ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ−Ｃ】
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【図２９Ｄ−Ｆ】
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【図３０Ａ−Ｂ】
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【図３０Ｃ−Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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