(57)【要約】  本発明は、ヒアルロン酸ポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとの新たなグラフトポリマー、その調製、組成物および使用を対象とする。特に、本発明は、活性剤および少なくとも１つの生物活性剤のための送達系として有用なナノ粒子を自発的に形成し得るｐＨおよび／または熱感受性組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸ポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとのグラフトポリマーであって、
前記ヒアルロン酸ポリマーおよび前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系が、少なくとも１つの式（ＩＩ）：
【化１】
2019513868.tif 000024
（式中、ＲａおよびＲｂの一方は、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーに共有結合されており、ＲａおよびＲｂの一方は、前記ヒアルロン酸ポリマーに共有結合されており、ＲａまたはＲｂが前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーに共有結合されている場合、それはＲ１であり、ＲａまたはＲｂが前記ヒアルロン酸ポリマーに共有結合されている場合、それはＲ３であり、ここで、Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲ７Ｒ８−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｓおよび場合により置換されていてもよいポリエチレン鎖から選択される基であり、ここで、Ｒ７およびＲ８は、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；Ｒ３は、基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、ここで、Ｅは存在しないか、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ９−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−Ｃ（Ｏ）−から選択され、Ｇは、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ２０アルキル、場合により置換されていてもよいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、場合により置換されていてもよいアシルアミノＣ１−Ｃ６アルキル、場合により置換されていてもよいアシルＣ１−Ｃ６アルキル、場合により置換されていてもよいアミノカルボニルＣ１−Ｃ６アルキルおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシから選択されるリンカー基であり、Ｌ１は、−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−Ｃ（Ｏ）−から選択され、ここで、Ｒ９およびＲ１０は、Ｈおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択され；Ａは、場合により置換されていてもよいＣ５−Ｃ１０−シクロアルキルまたは場合により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環であり、ここで、Ｒ５は、Ｈ、場合により置換されていてもよいアルコキシおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される１個以上の置換基を表し；ｘ、ｙおよびｚは、１〜２０から独立して選択される整数である）のリンカーＬを介してコンジュゲートされている、グラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化２】
2019513868.tif 000025
（式中、Ｍは、式（Ｍ１）および式（Ｍ２）：
【化３】
2019513868.tif 000026
の残基から選択される基であり、Ｒ２は、基−Ｂ−（ＣＨ２）ｉ−Ｄであり、ここで、Ｂは存在しないか、または−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｓ−および−Ｓ−；から選択され、Ｄは、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１５アルキル、場合により置換されていてもよいアルコキシカルボニルＣ１−Ｃ４アルキル、場合により置換されていてもよいアミノＣ１−Ｃ４アルキル、場合により置換されていてもよいアミノカルボニルＣ１−Ｃ６アルキル、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２から選択される基であり；ｐは、１〜５００から独立して選択される整数であり；ｉは、０〜５００から独立して選択される整数であり；Ｒ６は、置換度に応じて、−ＣＯＯＨおよびＲ３から選択される基であり；Ｌは、請求項１において定義される式（ＩＩ）のリンカーであり、ｎは、１〜７，０００から選択される整数である）の請求項１に記載のグラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩。
【請求項３】
式（Ｉａ）：
【化４】
2019513868.tif 000027
（式中、Ｌ、Ｒ２、Ｒ６およびｐは、前記請求項のいずれかに記載されているとおりである）を有する、請求項１または２のいずれか一項に記載のグラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩。
【請求項４】
前記リンカーＬが、そのＲｂ置換基を介して、前記グラフトポリマーの前記ＨＡ残基に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグラフトポリマー。
【請求項５】
前記リンカーＬが、そのＲａ置換基を介して、前記グラフトポリマーの前記ＨＡ残基に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグラフトポリマー。
【請求項６】
ｘが２〜１０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグラフトポリマー。
【請求項７】
Ｂが存在しないか、または−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｓ−である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のグラフトポリマー。
【請求項８】
Ｌが、式（ＩＩ’）：
【化５】
2019513868.tif 000028
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、場合により置換されていてもよいアルコキシおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキルから独立して選択される１個以上の置換基を表し；ＲａおよびＲｂは、前記請求項のいずれか一項に記載されているとおりである）の基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のグラフトポリマー。
【請求項９】
Ｌが、式（ＩＩ’’）および（ＩＩ’’’）：
【化６】
2019513868.tif 000029
（式中、Ｑは存在しないか、または式：−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）１−４−ＣＨ２−ＣＨ２−の基であり；Ｇ１は、ＰＥＧ、特に（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）１−４−であり、Ｒ１１およびＲ１２は、前記請求項のいずれか一項に記載されているとおりである）から選択される式を有する式（ＩＩ）の基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のグラフトポリマー。
【請求項１０】
約０．５〜５０の置換度を有する以下の基：
【化７】
2019513868.tif 000030
から選択される、請求項１〜３および５〜８のいずれか一項に記載のグラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩。
【請求項１１】
ヒアルロン酸ポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとのグラフトポリマーを調製するための方法であって、前記ヒアルロン酸ポリマーおよび前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系が、前記請求項のいずれか一項に記載されている少なくとも１つの式（ＩＩ）のリンカーＬによってコンジュゲートされており、
（ａ）「クリック化学」反応に関与することができる少なくとも１つの第１の官能基にコンジュゲートされている少なくとも１つのカルボン酸基を有するＨＡポリマーを準備する工程、
（ｂ）前記第１の官能基との「クリック化学」反応に関与することができる少なくとも１つの第２の相補的官能基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーを準備する工程であって、前記官能基の一方がアジド残基であり、前記官能基の他方が前記リンカーＬのアルキン担持前駆体である工程、
（ｃ）「クリック化学」反応を介して、ＨＡ多糖の前記少なくとも１つの第１の官能基と、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーの前記少なくとも１つの第２の相補的官能基とを反応させて、本発明のグラフトポリマー組成物を取得する工程、および
（ｄ）前記グラフトポリマー組成物を単離する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、または請求項１１に記載の方法によって取得可能な少なくとも１つのグラフトポリマーと、少なくとも１つの担体とを含んでなる、組成物。
【請求項１３】
ヒドロゲルまたはナノ粒子組成物である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬組成物であり、前記担体が薬学的に許容され得る担体である、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞または組織栄養素をさらに含む細胞または組織培養培地である、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１６】
再建組織である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
化粧品組成物であり、前記担体が化粧品的に許容され得る担体である、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、もしくは請求項１１に記載の方法によって取得可能な少なくとも１つのグラフトポリマーまたはその組成物を含む、軟組織充填剤。
【請求項１９】
活性成分の送達系を調製するための方法であって、
ａ）ゲル状態の請求項１〜１０または１３のいずれか一項に記載のグラフトポリマーまたはヒドロゲルを準備する工程、
ｂ）送達すべき活性成分を準備する工程、
ｃ）前記グラフトポリマー組成物またはヒドロゲルと前記活性成分とを混合する工程、
ｄ）場合により、温度を前記混合物まで増加させることによって、ナノ粒子の形成を誘導する工程、
ｅ）前記活性成分がロードされた取得された組成物、ヒドロゲルまたはナノ粒子を回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
組織変性、関節病変、関節疾患、眼病変、腫瘍または血管奇形、皮膚欠陥または傷害、泌尿器組織膨化および腫瘍または血管奇形から選択される医学的障害の予防または治療において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、または請求項１１に記載の方法によって取得可能なグラフトポリマーまたはその組成物。
【請求項２１】
薬物送達系、インビトロ細胞もしくは生物学的組織培養物または組織工学材料を調製するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のグラフトポリマーまたは請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のヒドロゲルまたは組成物の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、もしくは請求項１１に記載の方法によって取得可能な少なくとも１つのグラフトポリマーまたはその組成物を含んでなる、キット。
【請求項２３】
被験体における関節病変、関節疾患、眼病変、皮膚欠陥または傷害、泌尿器組織膨化および任意の組織変性、腫瘍または血管奇形から選択される医学的障害を予防、治療または改善する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、または請求項１１に記載の方法によって取得可能な有効量の少なくとも１つのＨＡグラフトポリマーまたはその医薬製剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸ポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとのグラフトポリマー、その調製、組成物および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物医学的用途のためのヒドロゲルが幅広く開発された。それらは、その高い含水量、組織様弾性、そしてかなり良好な生体適合性により、関心の高い重要な材料となっている。
【０００３】
ヒドロゲルは、親水性ホモポリマーまたはコポリマーネットワークから構成され、水または生理液中において膨潤する。ヒアルロナンとも称されるヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩であるヒアルロン酸ナトリウムは、脊椎動物の結合組織および上皮組織に典型的に見られる天然の線状ヘテロ多糖ポリマーであり、１０５〜１０７ダルトンの分子量範囲を有する。ＨＡは、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびβ−１，４−グルクロン酸の反復二糖単位から構成され、優れた粘弾特性、高い保湿能力および高い生体適合性を有する（Ｌａｖｅｒｔｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００８，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，９，６４０−６５）。一般的に、ＨＡは雄鶏のトサカから抽出され、現在のところ、それは、微細藻類または細菌発酵を介して基本的に生産される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．，１０，９９）。ＨＡは、医療、化粧品および栄養補給食品における広範囲の用途に適切である（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２４２，２７−３３；Ｒｏｂｅｒｔ，２０１５，Ｐａｔｈｏｌ  Ｂｉｏｌ，６３，３２−３４）。特に、それは、潤滑および軟骨の恒常性におけるその役割について公知である。しかしながら、ネイティブなＨＡは、人体内においては長時間存続せず、その低い保持能力およびヒアルロニダーゼの効果によるその分解のために、移植部位から排除される（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１，Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７６，１２５−１３４）。したがって、効率的な用途のために、ＨＡの化学的改変、特に架橋改変が検討されている（Ｓｃｈａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，８５，４６９−４８９）。
【０００４】
ｐＨまたは熱感受性ポリマーも合成され、製剤化され、ヒドロゲルマトリックスを形成した（Ｎａ，２００８，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，４８２−４８７；Ｃｏｒｏｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，６７，１０１−１２４およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０，Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，６，９７７−９８３）。しかしながら、これらのｐＨまたは熱感受性ポリマーは、それらの物理化学的特性により、ゲルマトリックスを形成するに過ぎず、効率的なクッション効果を提供しない。さらに、それらのインビボ滞留時間は依然として、急速な酵素的ＨＡ分解によって制限される。
【０００５】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（文献においてはｐＮｉＰＡＭ、ＰＮＩＰＡ、ＰＮＩＰＡＡｍ、ＮＩＰＡ、ＰＮＩＰＡＡまたはＰＮＩＰＡｍのように様々に略記され、ＩＵＰＡＣポリ［１−（イソプロピルカルバモイル）エチレン］にちなんで命名され、Ｎ−（１−メチルエチル）−２−プロペンアミドホモポリマーとも称される）は、ＨＡを改変してｐＨまたは熱感受性を与えるために以前に使用された高ｐＨまたは熱応答性ポリマーである（Ｓｃｈｉｌｄ，１９９２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７，１６３−２４９）。ｐＮｉＰＡＭは、疎水性ドメインの会合およびインサイチュー形成ヒドロゲルを介して物理的架橋を導入するための良好な生体適合性を有する候補である（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０，６８４４−６８５３；Ｃｏｏｐｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３，Ｂｉｏｉｎｔｅｒｐｈａｓｅｓ，８，１９）。約３２℃の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）未満の熱感受性の場合、ｐＮｉＰＡＭの疎水性Ｎ置換基は、水分子によって水和されて均一溶液を形成する。ＬＣＳＴ超の場合、Ｎ置換基間の疎水性相互作用が増加し、水和エネルギーを上回って、疎水性ポリマー鎖の凝集およびヒドロゲル形成がもたらされる（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，８，９９１−１００７）。ｐＮｉＰＡＭモノマーが非生分解性であっても、低分子量の純粋なｐＮｉＰＡＭ鎖は、腎クリアランスによって排除されることが実証されている（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１２７，１８９−２０７）。組織工学、薬物送達系などの複数の分野における用途のために、熱可逆性ヒアルロン酸−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ−ｐＮｉＰＡＭ）ヒドロゲルが既に製剤化されており、純粋なｐＮｉＰＡＭと同様に体温においてヒドロゲルマトリックスを形成する（Ｏｈｙａ  ｅｔ  ａｌ．、２００１，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２，８５６−８６３）。特に、可逆的な付加−開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）および「クリック」化学を介して、すなわち、アルキン基によるＨＡの官能化、ならびに連鎖移動剤（ＣＴＡ）および銅含有触媒の存在下におけるそのようにして形成されたＨＡプロパルギルアミドとアジド末端ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（Ｎ３−ＰＮＩＰＡＭ）との反応を介して、熱可逆性ヒアルロナン−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ−ｐＮｉＰＡＭ）ヒドロゲルが合成された（国際公開第２０１０／０９９８１８号；Ｍｏｒｔｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１１，１２６１−１２７２）。それらの分解産物は、３５×１０３ｇ・ｍｏｌ−１においてｈＴＥＲＴ−ＢＪ１線維芽細胞に対して細胞適合性であることが見出された（Ｍｏｒｔｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、前掲）。これらのＨＡ−ｐＮｉＰＡＭゲルマトリックスの欠点は、それらが長期の潤滑またはクッション効果を提供せず、残留銅をさらに含有し得るという事実にある。
【０００６】
したがって、注射部位において長い体内滞留時間を提供し得るＨＡ由来ポリマーであって、適切な生体力学的特性を有し、耐容性良好かつ合成容易であるＨＡ由来ポリマーを見出す必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、温度および／またはｐＨの変化によってナノ粒子を自発的に形成することができるグラフトポリマーであるＨＡグラフトポリマー（ＨＡ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系コンジュゲート）に関する予想外の知見に関する。それらの新たなＨＡグラフトポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーをＨＡにグラフトして、（ＬＣＳＴ超の）温度および／またはｐＨの変化によってナノ粒子を形成する能力をグラフトポリマーに付与するために使用されるリンカー分子を含むが、これは、ｐＨおよび／または熱感受性ポリマーを用いて以前には決して達成されなかった大きな性能向上である。本発明は、組織再生の分野における内科外科的および化粧品的な必要性を満たし、薬物送達の分野における新規な使用／用途を可能にし得る。それらの新たなＨＡグラフトポリマーは、ｐＨおよび／または熱感受性グラフトポリマーであって、注射可能であり、安定であり、生体適合性であり、生分解性であり、潜在的な自己潤滑ナノ軸受（ＳＬＮＢＢ）特性による自発的なナノ粒子形成により、注射部位において長い体内滞留時間を有し、医学的または化粧品的な用途において新たな関節内補充／潤滑材料として使用され得るｐＨおよび／または熱感受性グラフトポリマーである。
【０００８】
本発明の態様は、本発明のヒアルロン酸とＮ−イソプロピルアクリルアミド系とのグラフトポリマー（ＨＡグラフトポリマー）を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のＨＡグラフトポリマーと、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体とを含む医薬に関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、本発明のＨＡグラフトポリマーを含むナノ粒子に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のＨＡグラフトポリマーを含む化粧品組成物に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のＨＡグラフトポリマーを含むヒドロゲルに関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のＨＡグラフトポリマーまたはその組成物を含む軟組織充填剤に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のＨＡグラフトポリマー、その組成物、ヒドロゲル、軟組織充填剤またはそのナノ粒子を調製する方法に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、インビボ薬物送達、インビトロ細胞もしくは生物学的組織培養および組織工学用途において使用するための本発明のＨＡグラフトポリマーに関する。
【００１６】
別の特定の実施形態によれば、本発明のＨＡグラフトポリマーまたはその組成物を含む細胞または生物学的組織培養培地が提供される。
【００１７】
別の特定の実施形態によれば、本発明のＨＡグラフトポリマーまたはその組成物を含む再建組織が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様は、医学的障害、特に関節病変、関節疾患、眼病変、皮膚欠陥もしくは傷害、泌尿器組織膨化および任意の組織変性の予防もしくは治療、麻酔的もしくは治療的な理由による身体部分の体積の増強／改変および／もしくは増加において使用するための、または腫瘍もしくは血管奇形を治療するための本発明のＨＡグラフトポリマーに関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、医学的障害、特に関節病変、関節疾患、眼病変、皮膚欠陥もしくは傷害、泌尿器組織膨化および任意の組織変性の予防もしくは治療、麻酔的、再建的もしくは治療的な理由による身体部分の体積の増強／改変および／もしくは増加のための、または腫瘍もしくは血管奇形の治療のための医薬製剤を調製するための本発明のＨＡグラフトポリマーの使用に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、細胞もしくは生物学的培養培地または再建組織を調製するための本発明のＨＡグラフトポリマーの使用に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、被験体における関節病変、関節疾患、眼病変、皮膚欠陥または傷害、泌尿器組織膨化および任意の組織変性、腫瘍または血管奇形から選択される医学的障害を予防、治療または改善する方法であって、有効量の少なくとも１つの本発明のＨＡグラフトポリマーまたはその医薬製剤を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、例えば凍結乾燥形態の少なくとも１つの本発明のグラフトポリマーまたはその組成物を含むキットに関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、予防または治療のための材料、例えば生物活性剤、薬物物質、タンパク質または抗体の封入のためのナノ粒子を調製するためのキットであって、少なくとも１つの本発明のグラフトポリマーまたはその組成物を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のグラフトポリマーのＤ２Ｏの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、出発材料のものと比較して示す。実施例１において記載されているように、Ａ：ヒアルロン酸（ＨＡ）、Ｂ：ＨＡ−ＤＢＣＯ、Ｃ：ｐＮｉＰＡＭアジド末端、Ｄ：ＨＡ−Ｂ１、Ｅ：ＨＡ−Ｂ２およびＦ：ＨＡ−Ｐ２。
【図２】実施例２において記載されているように測定した本発明のグラフトポリマーの注入性を示す。Ａ：２３Ｇ針を有するシリンジにおけるピストンのストローク距離（距離％）に応じた、流体を排出するために必要な力（ニュートン（Ｎ）単位）。注入プロファイルの特性評価について、３つの力を評価した：Ｆｉ（初期の力）、Ｆｐ（プラトー力）およびＦｆ（最終的な力）。Ｂ：２０℃の針シリンジシステムにおける２３Ｇ（Ｂ１）および２９Ｇ（Ｂ２）によるＨＡグラフトポリマー注入プロファイルの概要。対照として空のシリンジ、Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標）およびＰＢＳを使用した。Ｃ：３７℃における２９Ｇ針によるＨＡグラフトポリマー注入プロファイルの概要。
【図３】ＨＡ−Ｂ１（Ａ）、ＨＡ−Ｂ２（Ｂ）、ＨＡ−Ｐ２（Ｃ）およびＨＡｐＮｉＰＡＭグラフトポリマー（陰性対照）（Ｄ）のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。スケールバー＝１μｍ、および実施例４において記載されているように測定したナノ粒子追跡分析（Ｅ）によって測定した、温度（４０〜２５℃、３分／工程）に応じて形成されたナノ粒子の割合。
【図４】実施例７において記載されているように、３７℃における生理食塩水、Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標）、ＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２からのデキサメタゾンの累積インビトロ薬物放出プロファイルを示す。２８時間後、加熱（１２１℃）によってポリマーマトリックスを加水分解し、デキサメタゾンの残存含量を測定した。
【図５】実施例５において記載されるように、健常マウスにおける皮下注射および変形性関節症マウスモデルにおける７日間の関節内注射後のマウスにおける白色光画像と重ね合わせたＨＡ−Ｃｙ５およびＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５生体内蛍光の滞留／持続の増加の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖」という用語は、２〜約５，０００個のエチレングリコール単位、好ましくは２〜６個または２〜４個のエチレングリコール単位を含む鎖を指す。
【００２６】
「ヒアルロン酸」（ＨＡ）という用語は、交互にβ−１，４およびβ−１，３グリコシド結合を介して互いに連結されたＤ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンから構成される直鎖状ヘテロ多糖を指す。本発明の適切なＨＡポリマーは、最大１２，５００個の二糖反復から構成される多糖を包含し、起源に応じて約５００〜５，０００，０００Ｄａ、特に約５００〜３，０００，０００Ｄａのサイズの範囲内である。各反復単位は、連結されて本発明のグラフトポリマーを形成する可能性があり得るＤ−グルクロン酸モチーフ上のカルボキシル化学基を有する。特定の態様によれば、本発明のリンカーによるそれらのカルボキシル基の置換度は、約０．５〜５０％、典型的には２〜約１０％である。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「架橋度または置換度」という用語は、ＨＡおよびＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマー上に最初に存在する官能基のペアの総量に対する、架橋またはグラフト結合に変換される官能基のペアの量を意味し、割合として表される。
【００２８】
本発明の適切なＨＡポリマーは、天然（一般に、動物）、半合成またはバイオテクノロジー（例えば、微生物発酵によって産生される非動物的なもの）を含む様々な起源のものであり得る。
【００２９】
「Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマー」という用語は、ＩＵＰＡＣ  Ｎ−プロパン−２−イルプロパ−２−エンアミド（ＣＡＳ番号２２１０．２５．５）によって命名されたすべてのポリマーを含む。本発明の適切なポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーとしては、約５００〜３５，０００Ｄａ、特に２，０００〜２５，０００Ｄａの分子量を有するポリマーが挙げられる。
【００３０】
「コンジュゲートされた」または「グラフトされた」という用語は、本発明のグラフトポリマーまたはコンジュゲートをもたらす、ＨＡとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとの間の共有結合の形成を示すために使用され、このような共有結合は、本発明のリンカーを介して起こる。
【００３１】
「クリック」化学という用語は、Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．、２０１，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．，４０（１１），２００４−２０２１において記載されているように、高い収率、位置選択性、安定性、および不快な副産物の生成を伴わずに進行する能力を特徴とする様々な化学反応（例えば、アジド−アルキン環化付加）を指す。重要なことに、これらの反応は、無害な溶媒中において起こり得、水および酸素に非感受性であり、高い熱力学的駆動を有する。これらの反応の最も一般的な例は、不飽和種の環化付加から生じる炭素ヘテロ原子結合形成、求核置換化学、非アルドールカルボニル化学、および炭素−炭素多重結合への付加である。本発明のグラフトポリマーは、クリック化学によって合成され得、合成経路の例は、本明細書において提供されているが、当業者であれば、標準的な知識を使用してこれらを若干適合させ得る。
【００３２】
「アルキル」という用語は、単独でまたは他の用語と組み合わせて使用される場合、１〜２０個の炭素原子を有する一価アルキル基を指すＣ１−Ｃ２０アルキルの直鎖または分枝鎖を含む。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ｎ−ヘプチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、テトラヒドロゲラニル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−ノナデシルおよびｎ−エイコサニルなどの基によって例示される。好ましくは、これらは、Ｃ１−Ｃ９アルキル、より好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル、特に好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルを含み、同様に、これらはそれぞれ、１〜９個の炭素原子を有する一価アルキル基、１〜６個の炭素原子を有する一価アルキル基、および１〜４個の炭素原子を有する一価アルキル基を指す。特に、それらは、Ｃ１−Ｃ６アルキルを含む。
【００３３】
「Ｃ５−Ｃ１０シクロアルキル」という用語は、単環（例えば、Ｃ６−Ｃ８シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロオクチル））または複数の縮合環（例えば、ノルボルニル）を有する５〜１０個の炭素原子の飽和または不飽和炭素環基を指す。Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキルとしては、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、ノルボルニルなどが挙げられる。
【００３４】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、最大ｘ個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ（Ｒは、水素またはメチルとして定義される）からなる群から選択されるヘテロ原子によって置換されている上記定義に従うＣ５−Ｃ１０−シクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキルとしては、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、アザシクロオクチルなどが挙げられる。
【００３５】
「Ｃ８シクロアルキル」という用語は、単環（例えば、シクロオクチル）または複数の縮合環（例えば、ジベンゾシクロオクチニル、モノフッ素化シクロオクチン、ジベンゾシクロオクチン、ジフルオロシクロオクチン、ビアリールアザシクロオクチノン、シクロオクチン、ジベンゾアザシクロオクチン、ノンフルオロシクロオクチン、アリール−レスシクロオクチン、ビシクロノニンおよびジメトキシアザシクロオクチン）またはＤｅｂｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４（９），８０５−８１５において記載されているものを有する８個の炭素原子の飽和または不飽和炭素環基を指す。
【００３６】
「Ｃ８ヘテロシクロアルキル」という用語は、最大３個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ（Ｒは、水素またはメチルとして定義される）からなる群から選択されるヘテロ原子によって置換されている上記定義に従うＣ８シクロアルキル基を指す。Ｃ８ヘテロシクロアルキルとしては、場合により置換されていてもよいアザ−ジベンゾシクロオクチニルなどが挙げられる。
【００３７】
「アルコキシカルボニル」という用語は、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲ（式中、Ｒは、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「アリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル」または「ヘテロアルキル」を含む）を指す。
【００３８】
「アルコキシカルボニルＣ１−Ｃ６アルキル」という用語は、２−（ベンジルオキシカルボニル）エチルなどを含む、アルコキシカルボニル置換基を有するＣ１−Ｃ６アルキル基を指す。
【００３９】
「アミノ」という用語は、基−ＮＲＲ’（式中、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ１−Ｃ６アルキルアリール」、「Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロアリール」、「シクロアルキル」または「ヘテロシクロアルキル」であり、ＲおよびＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクロアルキル環を場合により形成していてもよい）を指す。
【００４０】
「アミノアルキル」という用語は、２−（１−ピロリジニル）エチルなどを含む、アミノ置換基を有するアルキル基を指す。
【００４１】
「アミノカルボニル」という用語は、Ｎ−フェニルカルボニルなどを含む、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’（式中、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、「アリールＣ１−Ｃ６アルキル」または「ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル」である）を指す。
【００４２】
「アミノカルボニルＣ１−Ｃ６アルキル」という用語は、２−（ジメチルアミノカルボニル）エチル、Ｎ−エチルアセトアミジル、Ｎ，Ｎ−ジエチル−アセトアミジルなどを含む、アミノカルボニル置換基を有するアルキル基を指す。
【００４３】
「アシルアミノ」という用語は、アセチルアミノなどを含む、基−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ’（式中、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」、「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」、「Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「アリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「アリールＣ２−Ｃ６アルケニル」、「ヘテロアリールＣ２−Ｃ６アルケニル」、「アリールＣ２−Ｃ６アルキニル」、「ヘテロアリールＣ２−Ｃ６アルキニル」、「シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル」または「ヘテロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル」である）を指す。
【００４４】
「アシルアミノＣ１−Ｃ６アルキル」という用語は、２−（プロピオニルアミノ）エチルなどを含む、アシルアミノ置換基を有するＣ１−Ｃ６アルキル基を指す。
【００４５】
「アシル」という用語は、アセチルなどを含む、基−Ｃ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、Ｈ、「アルキル」、好ましくは「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル」または「ヘテロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル」を含む）を指す。
【００４６】
「アシルＣ１−Ｃ６アルキル」という用語は、２−アセチルエチルなどを含む、アシル置換基を有するＣ１−Ｃ６アルキル基を指す。
【００４７】
特に個々の置換基の定義による制約がない限り、「置換されている」という用語は、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」、「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」、「Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「Ｃ１−Ｃ６アルキルアリール」、「Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロアリール」、「アリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ１−Ｃ６アルキルシクロアルキル」、「Ｃ１−Ｃ６アルキルヘテロシクロアルキル」、「アミノ」、「アミノスルホニル」、「アンモニウム」、「アシルアミノ」、「アミノカルボニル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「スルフィニル」、「スルホニル」、「アルコキシ」、「アルコキシカルボニル」、「カルバメート」、「スルファニル」、「ハロゲン」、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロなどからなる群から選択される１〜５個の置換基によって置換されている基を指す。
【００４８】
「薬学的に許容され得る」という用語は、生物学的におよび他の点において望ましくないものではなく、特に毒性ではない材料から構成される担体を指す。
【００４９】
「二相ヒドロゲル」という用語は、本明細書において、低粘度ゲル様連続相中の凝縮ゲルナノ粒子の懸濁液を特徴とする下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）超の状態を説明するために使用される。
【００５０】
「単相ヒドロゲル」および「単相グラフトポリマー溶液」という用語は、ＬＣＳＴ未満の流動性単相状態を説明するために互換的に使用され得る。本発明の一態様によれば、本発明のＨＡグラフトポリマーは、約２５℃〜約３２℃であるＬＣＳＴにおいて、例えば体温において単相ヒドロゲルと二相ヒドロゲルとの間を転移する。
【００５１】
「担体」という用語は、医薬製剤中に存在する任意の成分であって、活性剤以外の任意の成分を指すので、希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、充填剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤などを含む。
【００５２】
「生物活性剤」という用語は、生物学的活性を有する任意の薬剤であって、本発明のグラフトポリマー組成物に組み込むべき任意の薬剤を説明するために使用される。それは、天然のもの、合成のもの、半合成のものまたはそれらの誘導体であり得、疎水性化合物、親水性化合物、可溶性化合物および不溶性化合物を含み得る。より具体的には、それは、限定されないが、炎症性疾患（関節炎、変形性関節症および関節リウマチを含む）、眼病変、腫瘍および感染症を含む、哺乳動物、例えば動物およびヒト、特にヒトにおいて公知の任意の治療領域における症状の治療および／または予防および／または診断に有用な任意の生物活性剤であり得る。生物活性剤は、高分子化合物または低分子化合物、例えばペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、抗生物質、抗菌剤、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、麻酔薬、抗悪性腫瘍薬、鎮痛薬、抗凝固剤、止血薬および抗体から選択され得る。より具体的には、少なくとも１つの生物活性剤は、コルチコステロイドおよびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤からなる群から選択され得る。
【００５３】
「皮膚障害」または「皮膚疾患」という用語は、皮膚表面が疼痛性の陥凹を示す皮膚損傷であって、必ずしもその表面上において切り傷を伴わない皮膚損傷、例えば加齢性組織損傷（例えば、しわ）、創傷および瘢痕、例えば座瘡または風疹瘢痕などを含む。それらの障害としてはさらに、創傷、瘢痕、乾癬、座瘡、湿疹および酒さが挙げられる。「創傷」という用語は、例えば外傷または手術後の任意の損傷組織を含む。哺乳動物における創傷としては、例えば、擦過傷、裂傷、挫傷、脳震盪、刺創、皮膚の傷口、手術創、銃創、熱創傷、化学創傷、咬傷および刺傷ならびに電気創傷が挙げられる。それは、慢性皮膚障害、例えば潰瘍をさらに含む。
【００５４】
「眼病変または障害」という用語は、眼、特に角膜を冒す障害または傷害である。このような障害としては、角膜剥離、角膜擦過傷、角膜アルカリ熱傷、加齢性黄斑変性症、眼球突出、白内障、サイトメガロウイルス網膜炎、色覚異常、斜視、糖尿病性黄斑浮腫、飛蚊症およびアイフラッシュ、緑内障、円錐角膜、弱視、低視力、高眼圧症、網膜剥離、眼瞼痙攣、ブドウ膜炎、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）およびドライアイ症候群が挙げられる。
【００５５】
「関節病変」という用語は、変形性関節症、関節痛、関節リウマチ、感染症および炎症性疼痛、軟骨、骨、靱帯または滑膜嚢の損傷をもたらす外傷性膝事象を含む。
【００５６】
「再建組織」という用語は、表皮組織、神経組織、軟骨組織または骨組織などの体の損傷組織を修復するために有用な（内因性または外因性）生物学的組織または合成もしくは半合成材料を指す。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「治療」および「治療する」などは、一般に、所望の薬理学的および／または物理的および／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果は、疾患、その症候もしくは症状の予防もしくは部分的な予防という点において予防的であり得、および／または疾患、症状、症候もしくは疾患に起因する有害効果の部分的もしくは完全な治癒という点において治療的であり得る。本明細書において使用される場合、「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療をカバーし、（ａ）疾患の素因を有し得るがそれを有するとまだ診断されていない被験体における疾患の発生を予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；または疾患を軽減すること（すなわち、疾患および／またはその症候もしくは症状の退行、例えば損傷の改善または修正を引き起こすこと）を含む。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「被験体」という用語は、哺乳動物を指す。例えば、本発明によって企図される哺乳動物としては、ヒト、霊長類および家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、特に競走馬、実験室齧歯類などが挙げられる。
【００５９】
本発明の治療の「有効性」という用語は、本発明の使用に応じた疾患経過の変化に基づいて測定され得る。例えば、本発明の治療の有効性は、関節痛の減少、関節潤滑の改善、被験体の可動性の改善、眼表面の改善または眼圧の減少によって測定され得る。
【００６０】
本発明のグラフトポリマー
一実施形態によれば、ヒアルロン酸ポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとのグラフトポリマーであって、前記ヒアルロン酸ポリマーおよび前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーが、少なくとも１つの式（ＩＩ）：
【化１】
2019513868.tif 000002
（式中、ＲａおよびＲｂの一方は、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーに共有結合されており、ＲａおよびＲｂの一方は、前記ヒアルロン酸ポリマーに共有結合されており、ＲａまたはＲｂが前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーに共有結合されている場合、それはＲ１であり、ＲａまたはＲｂが前記ヒアルロン酸ポリマーに共有結合されている場合、それはＲ３であり、ここで、Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−Ｓ−、−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲ７Ｒ８−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｓおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖から選択される基であり、ここで、Ｒ７およびＲ８は、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルであり；Ｒ３は、基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、ここで、Ｅは存在しないか、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ９−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−Ｃ（Ｏ）−から選択され、Ｇは、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ２０アルキル、例えばエチル、場合により置換されていてもよいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、場合により置換されていてもよいアシルアミノＣ１−Ｃ６アルキル、場合により置換されていてもよいアシルＣ１−Ｃ６アルキル、場合により置換されていてもよいアミノカルボニルＣ１−Ｃ６アルキルおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシから選択されるリンカー基であり、Ｌ１は、−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−Ｃ（Ｏ）−から選択され、ここで、Ｒ９およびＲ１０は、Ｈおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルから独立して選択され；Ａは、場合により置換されていてもよいＣ５−Ｃ１０−シクロアルキルまたは場合により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、例えば場合により置換されていてもよいＣ８シクロアルキルまたは場合により置換されていてもよいＣ８ヘテロシクロアルキル環であり、ここで、Ｒ５は、Ｈ、場合により置換されていてもよいアルコキシ、例えばメトキシおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルから独立して選択される１個以上の置換基を表し；ｘ、ｙおよびｚは、１〜２０から独立して選択される整数である）のリンカーＬを介してコンジュゲートされているグラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩が提供される。
【００６１】
特定の実施形態によれば、式（Ｉ）：
【化２】
2019513868.tif 000003
（式中、Ｍは、式（Ｍ１）および式（Ｍ２）：
【化３】
2019513868.tif 000004
の残基から選択される基であり、Ｒ２は、基−Ｂ−（ＣＨ２）ｉ−Ｄであり、ここで、Ｂは存在しないか、または−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｓ−および−Ｓ−；から選択され、Ｄは、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１５アルキル、例えば場合により置換されていてもよいメチル、エチル、ブチル、プロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デカニル（例えば、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル、例えば場合により置換されていてもよいメチルまたはエチル）場合により置換されていてもよいアルコキシカルボニルＣ１−Ｃ４アルキル、場合により置換されていてもよいアミノＣ１−Ｃ４アルキル、場合により置換されていてもよいアミノカルボニルＣ１−Ｃ６アルキル、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２から選択される基であり；ｐは、１〜５００から独立して選択される整数であり；ｉは、０〜５００から独立して選択される整数であり；Ｒ６は、置換度に応じて、−ＣＯＯＨおよびＲ３から選択される基であり；Ｌは、本明細書において定義される式（ＩＩ）のリンカーであり、ｎは、１〜７，０００から選択される整数である）のＨＡグラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩が提供される。
【００６２】
特定の実施形態によれば、リンカーＬが、そのＲｂ置換基を介して、コンジュゲートのＨＡ残基に連結されている式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６３】
特定の実施形態によれば、リンカーＬが、そのＲａ置換基を介して、コンジュゲートのＨＡ残基に連結されている式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６４】
特定の実施形態によれば、Ｒ１が基−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲ７Ｒ８−であり、Ｒ７およびＲ８が、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６５】
別の特定の実施形態によれば、Ｒ１が基−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｓである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６６】
特定の実施形態によれば、ｘが３である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６７】
別の特定の実施形態によれば、ｘが２である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６８】
別の特定の実施形態によれば、ｙが２である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００６９】
さらなる特定の実施形態によれば、式（Ｉａ）：
【化４】
2019513868.tif 000005
（式中、Ｌ、Ｒ２、Ｒ６およびｐは、本明細書において記載されるとおりである）のＨＡグラフトポリマーまたは任意のその薬学的に許容され得る塩が提供される。
【００７０】
特定の実施形態によれば、Ａが、場合により置換されていてもよいＣ８シクロアルキルまたは場合により置換されていてもよいＣ８ヘテロシクロアルキル環である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７１】
さらなる特定の実施形態によれば、Ａが、場合により置換されていてもよいアザ−ジベンゾシクロオクチニルである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７２】
特定の実施形態によれば、ｐが約５０〜２００である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７３】
特定の実施形態によれば、Ｒ７およびＲ８が、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、特にメチルである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７４】
特定の実施形態によれば、Ｂが−ＳＣ（Ｓ）−Ｓ−である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７５】
特定の実施形態によれば、Ｂが存在しない式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７６】
特定の実施形態によれば、ｉが０〜２０、特に０〜１５、例えば０〜１１、特に１１である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７７】
特定の実施形態によれば、Ｄが、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル、例えば場合により置換されていてもよいメチル（例えば、Ｃ１−Ｃ１２アルキルによって場合により置換されていてもよいメチル）である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７８】
特定の実施形態によれば、Ｌが式（ＩＩａ）：
【化５】
2019513868.tif 000006
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、本明細書において記載されるとおりである）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００７９】
特定の実施形態によれば、Ｌが式（ＩＩｂ）：
【化６】
2019513868.tif 000007
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、本明細書において記載されるとおりである）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８０】
特定の実施形態によれば、Ｌが式（ＩＩ’）：
【化７】
2019513868.tif 000008
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、場合により置換されていてもよいアルコキシ、例えばメトキシおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルから独立して選択される１個以上の置換基を表し、ＲａおよびＲｂは、本明細書において記載されるとおりである）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８１】
さらなる特定の実施形態によれば、Ｌが式（ＩＩａ’）：
【化８】
2019513868.tif 000009
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、場合により置換されていてもよいアルコキシ、例えばメトキシおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルから独立して選択される１個以上の置換基を表し、Ｒ１およびＲ３は、本明細書において記載されるとおりである）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８２】
別のさらなる特定の実施形態によれば、Ｌが式（ＩＩｂ’）：
【化９】
2019513868.tif 000010
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈ、場合により置換されていてもよいアルコキシ、例えばメトキシおよび場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルから独立して選択される１個以上の置換基を表し、Ｒ１およびＲ３は、本明細書において記載されるとおりである）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８３】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、リンカー基Ｇが、場合により置換されていてもよいアシルアミノＣ１−Ｃ６アルキル、特にＰＥＧ基によって置換されているアシルアミノＣ１−Ｃ６アルキル基、例えば以下の式：−Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｊ−ＣＨ２−ＣＨ２−（式中、ｊは、１〜１０、特に１〜８または１〜６から選択され、例えばｊは、１、２、３または４、特に４である）の基などである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８４】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、リンカー基Ｇが、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、例えば場合により置換されていてもよいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖によって場合により置換されていてもよいメチル、例えば以下の式：−Ｃ１−Ｃ６アルキル−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｊ−Ｏ−ＣＨ２−（式中、ｊは、１〜１０、特に１〜８または１〜６から選択され、例えばｊは、１、２、３または４、特に４である）の基などである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８５】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、リンカー基Ｇが、場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ２０アルキル、例えばメチルである式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８６】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｅが存在しない式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８７】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｅが−ＣＯ）−である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８８】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｌ１が−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）−である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００８９】
特定の実施形態によれば、Ｒ１０は、Ｈである。
【００９０】
特定の実施形態によれば、Ｌが以下の式（ＩＩ’’）：
【化１０】
2019513868.tif 000011
（式中、Ｑは存在しないか、または以下の式：−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）１−４−ＣＨ２−ＣＨ２−の基であり、Ｒ１１およびＲ１２は、本明細書において記載されるとおりである）を有する式（ＩＩ）、特に（ＩＩａ’）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００９１】
特定の実施形態によれば、Ｌが以下の式（ＩＩ’’’）：
【化１１】
2019513868.tif 000012
（式中、Ｇ１は、ＰＥＧ、より具体的な実施形態において式：−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）１−４−、例えば−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−の基であり、Ｒ１１およびＲ１２は、本明細書において記載されるとおりである）を有する式（ＩＩ）、特に（ＩＩｂ’）の基である式（Ｉ）のコンジュゲートが提供される。
【００９２】
特定の実施形態によれば、Ｒ１１およびＲ１２は、Ｈである。
【００９３】
特定の実施形態によれば、以下の群：
【化１２】
2019513868.tif 000013
から選択される式（Ｉ）のコンジュゲートであって、約０．５〜５０、好ましくは約２〜１０の置換度を有する式（Ｉ）のコンジュゲートまたは任意のその薬学的に許容され得る塩が提供される。
【００９４】
特定の実施形態によれば、本発明のコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびカルシウムなどを含む。
【００９５】
特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｅがいずれも存在しない本発明のヒアルロン酸ポリマーのグラフトポリマーが提供される。
【００９６】
別の特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｅが−Ｃ（Ｏ）−である本発明のヒアルロン酸ポリマーのグラフトポリマーが提供される。
【００９７】
別の特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｇが、例えばメチル、エチルおよびプロピルから選択される場合により置換されていてもよいＣ１−Ｃ２０アルキルである本発明のヒアルロン酸ポリマーのグラフトポリマーが提供される。
【００９８】
別の特定の実施形態によれば、Ｒ３が、本明細書において記載される基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１−であり、Ｌ１が−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である本発明のヒアルロン酸ポリマーのグラフトポリマーが提供される。
【００９９】
別の特定の実施形態によれば、Ｒ３が基−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である本発明のヒアルロン酸ポリマーのグラフトポリマーが提供される。
【０１００】
別の特定の実施形態によれば、Ｒ３が基−（ＣＨ２）３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である本発明のヒアルロン酸ポリマーのグラフトポリマーが提供される。
【０１０１】
本発明のコンジュゲートの分子量は出発材料の選択によって適合され得、その選択は、本発明のグラフトポリマー組成物、それから形成される製剤およびヒドロゲルの目的の機能に依存すると理解される。例えば、所望のグラフトポリマー組成物の分解速度、場合によりその中に組み込まれていてもよい生物活性剤の所望の放出速度、治療すべき治療条件は、本発明のコンジュゲートの分子量の選択に影響を与える。
【０１０２】
一つの実施形態において、潤滑／充填組成物において使用するための本発明のグラフトポリマーの分子量は、約２，０００〜約２５０，０００，０００Ｄａ、好ましくは約５００，０００〜約１０，０００，０００において選択され得る。
【０１０３】
別の実施形態において、薬物送達系においてまたは薬物送達系として使用するための本発明のグラフトポリマーの分子量は、約２，０００〜約２５０，０００，０００Ｄａ、好ましくは約５００，０００〜約１０，０００，０００において選択され得る。
【０１０４】
本発明のコンジュゲートの調製
本発明の新規ＨＡコンジュゲートは、銅フリー「クリック」化学ならびに以下の一般的な方法および手順を使用することによって、容易に入手可能な出発材料から調製され得る。典型的なまたは好ましい実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル、溶媒など）が示されている場合、特に記述がない限り、他の実験条件も使用され得ると認識されよう。最適な反応条件は、使用される特定の反応剤または溶媒によって変動し得るが、当業者であれば、ルーチンな最適手順を使用して、このような条件を決定し得る。式（Ｉ）のコンジュゲートを得るための一般的な合成アプローチは、アジドを有するＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーと、シクロオクチン残基を有するＨＡポリマーとを反応させるか、またはアジドを有するＨＡポリマーと、シクロオクチン残基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとを反応させることである。
【０１０５】
本発明の態様によれば、ヒアルロン酸ポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとのグラフトポリマーを調製するための方法であって、前記ヒアルロン酸ポリマーおよび前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系が、少なくとも１つの式（ＩＩ）のリンカーＬによってコンジュゲートされており、
（ａ）「クリック化学」反応に関与することができる少なくとも１つの第１の官能基にコンジュゲートされている少なくとも１つのカルボン酸基を有するＨＡポリマーを準備する工程；
（ｂ）前記第１の官能基との「クリック化学」反応に関与することができる少なくとも１つの第２の相補的官能基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーを準備する工程であって、前記官能基の一方がアジド残基であり、前記官能基の他方が前記リンカーＬのアルキン担持前駆体である工程；
（ｃ）「クリック化学」反応を介して、ＨＡ多糖の前記少なくとも１つの第１の官能基と、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーの前記少なくとも１つの第２の相補的官能基とを反応させて、本発明のグラフトポリマー組成物を取得する工程；および
（ｄ）前記グラフトポリマー組成物を単離する工程
を含む方法が提供される。
【０１０６】
さらなる特定の実施形態によれば、本発明の方法は、工程ｄ）において取得されたグラフトポリマー組成物中に、少なくとも１つの生物活性剤を物理的に分散し、および／または共有結合的に連結し、および／または添加するさらなる工程を含み得る。
【０１０７】
式（Ｉ）、特に式（Ｉｃ１）のコンジュゲートを得るための一般的な合成アプローチは、以下のスキーム１において示されている。式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびｐは、詳細な説明において定義される）のＨＡコンジュゲートは、適切な溶媒、例えば１：１の体積比の水−ＤＭＳＯ混合物中において、特注または市販の出発材料から、クリック化学による単一化学工程において調製され得る。
【０１０８】
中間体（Ｉａ１）は市販のものであり得るか、またはアミド化、エステル化、チオエーテル化、酸化もしくはＵｇｉ縮合によって、官能基の１個がアジド残基である化合物とＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとを反応させることによって調製され得る。
【０１０９】
中間体（Ｉｂ１）は市販のものであり得るか、または例えばＳｃｈａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，８５，４６９−４８９において記載されているように、アミド化、エステル化、チオエーテル化、マレイミド−スルフヒドリル反応、酸化もしくはＵｇｉ縮合によって、式（Ｌｐｒｅｃ１）のリンカー前駆体とヒアルロン酸もしくは任意のその薬学的に許容され得る塩とを反応させることによって調製され得る。
【化１３】
2019513868.tif 000014
式中、ＡおよびＲ５は、本明細書において定義されるとおりであり、Ｒ３’は、基−Ｅ−Ｇ−Ｌ１’であり、ＥおよびＧは、本明細書において定義されるとおりであり、Ｌ１’は、アミノ基である。
スキーム１
【化１４】
2019513868.tif 000015
【０１１０】
式（Ｉ）、特に式（Ｉｃ２）のコンジュゲートを得るための別の一般的な合成アプローチは、適切な溶媒、例えば水および／またはジメチルスルホキシド中などにおいて、特注または市販の出発材料から、クリック化学による単一化学工程において、以下のスキーム２において示されている。
スキーム２
【化１５】
2019513868.tif 000016
【０１１１】
中間体（Ｉａ２）は市販のものであり得るか、またはアミド化、エステル化、チオエーテル化、酸化もしくはＵｇｉ縮合によって、式（Ｌｐｒｅｃ２）のリンカー前駆体とＮ−イソプロピルアクリルアミド系ポリマーとを反応させることによって調製され得る。
【化１６】
2019513868.tif 000017
式中、ＡおよびＲ５は、本明細書において定義されるとおりであり、Ｒ１’は、アルコール、カルボン酸、カルボニル、アジド、チオエステル、マレイミド、リン酸アシル、酸無水物、塩化アシル、アミノカルボン酸またはエステル基である。
【０１１２】
中間体（Ｉｂ２）は市販のものであり得るか、またはアミド化、エステル化、チオエーテル化、酸化もしくはＵｇｉ縮合によって、官能基の１個がアジド残基である化合物とヒアルロン酸もしくは任意のその薬学的に許容され得る塩とを反応させることによって調製され得る。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、中間体（Ｉａ２）
【化１７】
2019513868.tif 000018
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびｐは、本明細書において定義されるとおりである）が提供される。
【０１１４】
組成物
本発明は、医学的障害、特に関節病変、関節疾患、眼病変（例えば、加齢性黄斑変性症、眼球突出、白内障、サイトメガロウイルス網膜炎、色覚異常、斜視、糖尿病性黄斑浮腫、飛蚊症およびアイフラッシュ、緑内障、円錐角膜、弱視、低視力、高眼圧症、網膜剥離、眼瞼痙攣、ブドウ膜炎）、皮膚欠陥または傷害（例えば、創傷、瘢痕、乾癬、座瘡、湿疹および酒さ）および任意の組織変性（例えば、腹圧性尿失禁、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、混合結合組織疾患、乾癬性関節炎、マルファン症候群、ペイロニー病、エーラー・ダンロス症候群、骨形成不全症、スティックラー症候群、アルポート症候群、先天性拘縮性クモ指症、ロイス・ディーツ症候群および壊血病）を患っている被験体、好ましくは哺乳動物患者、最も好ましくはヒト患者を治療するための、組成物としての医薬もしくは治療剤またはそれを含む医療デバイスおよび方法を提供する。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明は、医薬として使用するための医薬製剤であって、少なくとも１つの本発明のコンジュゲートまたは組成物を含む医薬製剤を提供する。
【０１１６】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、非経口製剤である。
【０１１７】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、注射用製剤、例えば関節内製剤、動脈内製剤、静脈内製剤、滑液嚢内製剤、皮内製剤、皮下製剤、粘膜下製剤、間質製剤および筋肉内製剤である。
【０１１８】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、経口製剤である。
【０１１９】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、局所製剤である。
【０１２０】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、眼科用製剤である。
【０１２１】
あるいは、本発明は、上記と同じ使用のための組成物であって、別の哺乳動物、したがってヒトにおいて使用され得る組成物を提供する。
【０１２２】
本発明は、化粧品用途、再建手術（例えば、組織再建）および細胞または生物学的組織培養（例えば、幹細胞培養）に有用な組成物または医療デバイスをさらに提供する。それらの組成物は、それぞれ化粧品的に許容され得る担体または細胞もしくは生物学的組織培養栄養素をさらに含む。
【０１２３】
本発明の組成物は、少なくとも１つの本発明のコンジュゲートまたはそのヒドロゲルもしくはナノ粒子を含む軟組織充填組成物、例えば真皮および皮下充填剤を含む。ＨＡ系軟組織充填組成物の調製は当業者に周知であり、例えば、Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００７．７０（３）：ｐ．２５１−２５７、Ｉａｎｎｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ、２０１３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，４５６：５８３−５９２において記載されているように行われ得る。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、２０℃において振動モードによって約１００Ｈｚにおいて測定した場合、本発明の組成物は、約０．００１Ｐａ＊ｓ〜約１００Ｐａ＊ｓ、好ましくは約０．１〜１０Ｐａ．ｓの粘度を有する。
【０１２５】
特定の実施形態によれば、２５℃において２９ゲージ針を介して約１ｍｍ／分の押出速度を用いた場合、本発明の組成物は、約０．０１Ｎ〜約２０Ｎ、好ましくは約１Ｎ〜約５Ｎの押出力を有する。
【０１２６】
特定の実施形態によれば、水性溶媒中において可溶化すると、本発明のグラフトポリマー組成物は、温度変化によって単相二相間相転移を示すｐＨおよび／または熱感受性ヒドロゲルを形成し得る。
【０１２７】
特定の態様によれば、本発明のグラフトポリマー組成物は、約２５℃〜約３２℃未満のようなＬＣＳＴ未満において、単相ヒドロゲルおよび「単相グラフトポリマー溶液」を形成する。別の特定の態様によれば、本発明のグラフトポリマー組成物は、このような下限臨界溶液温度超において、二相ヒドロゲルを形成する。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明のグラフトポリマー組成物は、約２５℃〜約３２℃超において、例えば体温において、ナノ粒子を自発的に形成し得る。
【０１２９】
さらに、本発明のグラフトポリマー組成物は、可逆的なこのナノ粒子形成を受けるという利点を示すので、保存および輸送中の潜在的な温度効果は、ポリマーの物理的状態に不可逆的に影響を与えないであろう。
【０１３０】
特定の実施形態において、約４０〜５００ｎｍの範囲の平均サイズを有する本発明のグラフトポリマー組成物のナノ粒子が提供される。
【０１３１】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、ｐＨおよび／または熱可逆性ヒドロゲル（これは、生分解性および生体適合性である）の形態であり得る。特に、本発明の組成物は、ｐＨおよび／または熱可逆性生分解性ヒドロゲル（これは、室温もしくはその付近またはそれ未満において単相（溶液または液体）状態にあり、生理学的（またはインビボ）温度もしくはそれ付近またはそれ以上においてゲル状態にある）の形態であり得る。
【０１３２】
本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得るさらなる成分、例えばミョウバン、安定剤、抗菌剤、緩衝液、着色剤、香味剤、アジュバントなどをさらに含み得る。
【０１３３】
本発明の組成物は、従来用いられているアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と一緒に医薬組成物の形態にされ、固体、例えば錠剤もしくは充填カプセルまたは液体、例えば溶液、懸濁液、軟膏、エマルジョン、エリキシル剤、またはこれら、フィルムもしくはゲルを充填したカプセルとして用いられ得、これらはすべて、経口使用のためのものである。組成物はまた、使用前に水または別の適切なビヒクルを用いて再構成するための乾燥製品として製剤化され得る。
【０１３４】
液体製剤としての本発明の組成物としては、限定されないが、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。
【０１３５】
このような液体製剤は、限定されないが、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤を含む添加剤を含有し得る。懸濁化剤としては、限定されないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルおよび水素化食用油脂が挙げられる。乳化剤としては、限定されないが、レシチン、ソルビタンモノオレイン酸エステルおよびアカシアが挙げられる。保存剤としては、限定されないが、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびソルビン酸が挙げられる。分散剤または湿潤剤としては、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）が挙げられる。
【０１３６】
さらなる材料および製剤加工技術などは、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ），２２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｌｌｏｙｄ，Ｅｄ．Ａｌｌｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（これは、参照により本明細書に組み込まれる）において示されている。
【０１３７】
本発明の固体組成物は、従来の方法によって製剤化された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、限定されないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤を含む従来の賦形剤を含有し得る。結合剤としては、限定されないが、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液およびポリビニルピロリドンが挙げられる。充填剤としては、限定されないが、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウムおよびソルビトールが挙げられる。潤滑剤としては、限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、ジャガイモデンプンおよびグリコール酸ナトリウムデンプンが挙げられる。湿潤剤としては、限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。錠剤は、当技術分野において周知の方法に従ってコーティングされ得る。
【０１３８】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物またはヒドロゲルは、グラフトポリマー組成物中に分散されているかまたは共有結合的に付加されている生物活性剤をさらに含む。
【０１３９】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物またはヒドロゲルは、生物活性剤送達系の形態である。
【０１４０】
一つの実施形態において、少なくとも１つの生物活性物質は、本発明のグラフトポリマー組成物またはヒドロゲルの総量を基準にして、約０．００１〜４０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜３０ｗｔ％の量において存在し得る。
【０１４１】
別の態様によれば、本発明の組成物は、ＨＡグラフトポリマーまたはその組成物を含む細胞または生物学的組織培養培地を含む。この培養培地は、細胞栄養素、例えばグルコース、ビタミン、成長因子、金属イオンなどをさらに含み得る。
【０１４２】
別の態様によれば、本発明の組成物は、表皮組織、神経組織、軟骨組織または骨組織などの体の損傷組織を修復するために有用な（内因性または外因性）生物学的組織または合成もしくは半合成材料を含む。
【０１４３】
別の特定の実施形態において、培養培地を調製する方法であって、本発明のＨＡグラフトポリマーと、細胞培養栄養素、例えばグルコース、ビタミン、成長因子、金属イオンなどとを混合する工程を含む方法が提供される。
【０１４４】
別の特定の実施形態において、再建組織を調製する方法であって、本発明のＨＡグラフトポリマーまたはその組成物と、幹細胞または表皮組織、神経組織、軟骨組織もしくは骨組織などの体の損傷組織を修復するために有用な材料、組織または細胞とを合わせる工程を含む方法が提供される。
【０１４５】
別の特定の実施形態において、本発明のグラフトポリマー組成物またはヒドロゲル、特に活性成分の送達系を調製する方法であって、
−ゲル状態の本発明のグラフトポリマーもしくはその組成物またはヒドロゲルを準備する工程；
−送達すべき活性成分を準備する工程；
−前記本発明のグラフトポリマーもしくはその組成物またはヒドロゲルと前記活性成分（例えば、薬物）とを混合する工程；
−場合により、温度を前記混合物（典型的には、約２５〜約４０℃）まで増加させることによって、ナノ粒子の形成を誘導する工程；
−前記活性成分（例えば、薬物）がロードされたそのようにして取得された組成物、ヒドロゲルまたはナノ粒子を回収する工程
を含む方法が提供される。
【０１４６】
特定の態様によれば、本発明の組成物、ヒドロゲルまたはナノ粒子は、活性成分がロードされたら、前記活性成分注射の投与およびインサイチュー放出に有用であり得る。
【０１４７】
投与経路
本発明の組成物は、歯肉、口腔底、頬、唇、舌、歯を含む口腔の粘膜表面を含む経口経路によって、任意の方法において投与され得る。
【０１４８】
本発明の組成物はまた、皮下注射、滑液嚢内注射、動脈内注射、静脈内注射、関節内注射、筋肉内注射、皮下注射、粘膜下注射および間質注射などの注射によって、任意の方法において投与され得る
【０１４９】
本発明の組成物はまた、皮膚、様々な粘液または眼に局所投与され得る。
【０１５０】
組み合わせ
一態様によれば、本発明のポリマーまたは任意の適切なその薬学的に許容され得る塩およびその医薬製剤は単独で、または少なくとも１つの助剤と組み合わせて投与され得る。
【０１５１】
特定の態様によれば、本発明の助剤は、純粋なＨＡ、コンドロイチン硫酸または別の関節内薬物組成物および本発明の生物活性剤を含む。
【０１５２】
本発明は、炎症性疾患（関節炎、変形性関節症および関節リウマチを含む）、眼病変、腫瘍および感染症の治療において有用な少なくとも１つの助剤と同時または逐次に、本発明のコンジュゲートおよびその医薬製剤を個体に投与することを包含する。それらの助剤は、抗生物質、抗菌剤、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、抗炎症薬、例えばコルチコステロイド、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、麻酔薬、抗悪性腫瘍薬、鎮痛薬、抗凝固剤および止血薬から選択され得る。
【０１５３】
前記助剤と同時に投与される本発明のポリマー、ナノ粒子もしくはヒドロゲルまたはその医薬製剤は、同じまたは異なる組成物において、同じまたは異なる投与経路によって投与され得る。
【０１５４】
本発明の組成物中の本発明のポリマー、ナノ粒子またはそのヒドロゲルの濃度範囲は、各場合の状況、基礎疾患、臨床的適応、ならびに目的のおよび／または必要な所望の鎮痛強度に応じて変動し得る。
【０１５５】
一実施形態によれば、少なくとも１つの本明細書において記載される助剤と組み合わされた少なくとも１つの本発明のコンジュゲートまたは任意の適切なその薬学的に許容され得るものと、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体とを含む医薬製剤が提供される。
【０１５６】
単回投与または複数回投与として個体に投与される投与量は、薬物動態特性、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康およびサイズ）、症候の程度、併用治療、治療の頻度および所望の効果を含む様々な要因に応じて変動するであろう。
【０１５７】
患者
一実施形態において、本発明の患者は、任意の組織変性、関節疾患、眼病変、皮膚欠陥または傷害を患っているか、またはそれらを患うリスクがある被験体である。
【０１５８】
さらなる実施形態において、本発明の患者は、関節病変および関節疾患、例えば変形性関節症、関節炎、感染症、関節リウマチ、および軟骨、骨、靱帯または滑膜嚢の損傷をもたらす外傷性膝事象を患っているか、またはそれらを患うリスクがある被験体である。
【０１５９】
別のさらなる実施形態において、本発明の患者は、眼病変、例えば加齢性黄斑変性症、眼球突出、白内障、サイトメガロウイルス網膜炎、色覚異常、斜視、糖尿病性黄斑浮腫、飛蚊症およびアイフラッシュ、緑内障、円錐角膜、弱視、低視力、高眼圧症、網膜剥離、眼瞼痙攣およびブドウ膜炎を患っているか、またはそれらを患うリスクがある被験体である。
【０１６０】
別のさらなる実施形態において、本発明の患者は、瘢痕、擦過傷、裂傷、挫傷、脳震盪、刺創、皮膚の傷口、手術創、銃創、熱創傷、化学創傷、咬傷および刺傷ならびに電気創傷を患っているか、またはそれらを患うリスクがある被験体である。それは、慢性皮膚障害、例えば潰瘍をさらに含む。
【０１６１】
別のさらなる実施形態において、本発明の患者は、身体部分の体積の増強または解剖学的な再形成、例えば泌尿器組織膨化、麻酔的または治療的な理由による身体部分の体積の任意の増強／改変および／または増加を望むか、またはそれらを必要とする被験体である。
【０１６２】
別のさらなる実施形態において、本発明の患者は、腫瘍または血管奇形を患っている被験体である。
【０１６３】
本発明の使用
特定の実施形態によれば、本発明のＨＡコンジュゲートまたはその組成物は、化粧品および組織工学用途のために、組織充填剤として、インビトロ細胞または生物学的組織培養などの様々な用途に有用である。
【０１６４】
別の特定の実施形態によれば、送達系、インビトロ細胞もしくは生物学的組織培養物または組織工学材料、例えば神経外科的再建組織、骨再建組織、軟骨再建組織、表皮再建組織を調製するための、本発明のグラフトポリマーまたはヒドロゲルまたはナノ粒子の使用が提供される。
【０１６５】
別の特定の実施形態によれば、本発明のＨＡコンジュゲートおよびその組成物は、医学的障害、特に関節病変、関節疾患、眼病変、皮膚欠陥もしくは傷害、泌尿器組織膨化、任意の組織変性の予防もしくは治療、麻酔的もしくは治療的な理由による身体部分の体積の増強／改変および／もしくは増加において使用するために、または腫瘍もしくは血管奇形を治療するために有用である。
【０１６６】
さらなる特定の実施形態によれば、本発明の製剤は、単相ヒドロゲルの形態下、ＬＣＳＴ未満において、腫瘍または血管奇形の毛細血管床に注射するために使用され得、前記製剤は、（ＬＣＳＴ超の）体温に曝露されると、インサイチューにおいて小さなヒドロゲル粒子を形成し、それにより、血管塞栓を可能にする。その結果起こる前記腫瘍または血管奇形の塞栓は、血液および栄養素の利用の遮断をもたらし、腫瘍の直接的な殺傷において、または例えば放射線療法もしくは化学療法と組み合わせたさらなる外科的切除もしくは治療の準備のために有用である。
【０１６７】
本発明のさらなる特定の態様によれば、血管塞栓において使用するための本発明のＨＡコンジュゲートおよびその組成物が提供される。
【０１６８】
別のさらなる特定の態様によれば、化粧品的使用のための、ならびに麻酔および再建手術のための本発明のＨＡコンジュゲートおよびその組成物が提供される。
【０１６９】
別のさらなる特定の態様によれば、インビボ薬物送達において使用するための本発明のＨＡコンジュゲートおよびその組成物が提供される。
【０１７０】
特定の実施形態によれば、多くの医療用途、例えば少なくとも１つの生物活性剤のための送達系、または組織工学における細胞送達系、細胞もしくは生物学的組織培養系などにおいて有用なｐＨおよび／または熱感受性生分解性ヒドロゲルであって、少なくとも１つの本発明のＨＡコンジュゲートを含むｐＨおよび／または熱感受性生分解性ヒドロゲルが提供される。
【０１７１】
特定の態様によれば、少なくとも１つの生物活性剤のための送達系としての本発明のヒドロゲルの使用が提供される。
【０１７２】
本発明の別の実施形態において、組織変性および関連障害の予防または治療のための医薬製剤を調製するための、少なくとも１つの本発明のＨＡコンジュゲートまたは任意の適切なその薬学的に許容され得る組成物の単独使用、少なくとも１つの助剤と組み合わせたその使用が提供される。
【０１７３】
特定の態様によれば、インサイチューにおいてナノ粒子を自発的に形成することができる本発明のＨＡコンジュゲートおよびその組成物が提供される。
【０１７４】
以下、より詳細に、図面において表されている実施形態を参照して、本発明を例証する実施例を説明する。
【実施例】
【０１７５】
以下の略語は、それぞれ以下の定義を指す：
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）。
【０１７６】
実施例１：本発明のヒアルロン酸コンジュゲートの合成
上記スキーム１において記載されているように、本発明のコンジュゲートを合成し、リンカーを構築するために使用した出発材料（リンカー前駆体）は、以下のものであった：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入したジベンゾシクロオクチン−アミン（ＤＢＣＯ−アミン）（式（Ｌ−ｐｒｅｃ１）（式中、Ａは、ジベンゾシクロオクチンであるＣ８ヘテロシクロアルキル環であり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ３’は、−Ｅ−Ｇ−Ｌ１’基であり、Ｅは、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｇは、エチルであり、Ｌ１’は、−ＮＨ２である）。Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）から購入したジベンゾシクロオクチン−ＰＥＧ４−アミン（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミン）式（Ｌ−ｐｒｅｃ１）（式中、Ａは、ジベンゾシクロオクチンであるＣ８ヘテロシクロアルキル環であり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ３’は、−Ｅ−Ｇ−Ｌ１’基であり、Ｅは、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｇは、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）４−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、Ｌ１’は、−ＮＨ２である）。
【０１７７】
あるいは、リンカー前駆体ＤＢＣＯ−アミンおよびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンは、Ｐｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，５，１３４０において記載されているように調製され得、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）アジド末端（ｐＮｉＰＡＭ−Ｎ３）は、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００７，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４０，９１０３−９１１０において記載されているように調製され得る。
【０１７８】
Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）から購入したアジド−ＰＥＧ３−アミン（Ｎ３−ＰＥＧ４−アミン）。
【０１７９】
ジベンゾシクロオクチン−ＮＨＳエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル）（式（Ｌ−ｐｒｅｃ２）（式中、Ａは、ジベンゾシクロオクチンであるＣ８ヘテロシクロアルキル環であり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ１’は、−Ｅ−Ｇ−Ｒ１’基であり、Ｅは、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｇは、エチルであり、Ｒ１’は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）によって活性化された−ＣＯＯＨである）。
【０１８０】
あるいは、リンカー前駆体Ｎ３−ＰＥＧ４−アミンは、Ｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１８，２１９１−２１９８において記載されているように調製され得、ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルは、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４，１８８８６−１８８８８において記載されているように調製され得る。
【０１８１】
使用したさらなる出発材料は、以下のものである：ヒアルロン酸（ＨＡ）は、Ｓｏｌｉａｎｃｅ（Ｐｏｍａｃｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）（ＭＷ：１．８５ＭＤａ）から購入した；Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）アジド末端（ｐＮｉＰＡＭ−Ｎ３）（ＭＷ：１５ｋＤａ）（式（Ｉａ１）（式中、Ｒ１は、詳細な説明において記載されているとおりであり、ｘは、３であり、Ｒ７およびＲ８は、メチルであり、ｐは、１３２であり、Ｒ２は、詳細な説明において記載されているとおりであり、Ｂは、−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−Ｓ−であり、ｉは、１１であり、Ｄは、メチルである）およびポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）アミン末端（ｐＮｉＰＡＭ−アミン）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。シアニン５−アジド（Ｃｙ５−Ｎ３）は、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された。
【０１８２】
ＨＡ−Ｂ１の合成
以下のスキーム１Ａに従って、本発明の表題コンジュゲートを合成した。
【０１８３】
ＨＡ（１）を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に溶解する。ポリマーの溶解後、ＥＤＣを添加（１当量のＣＯＯ−）し、５分間後に、磁気撹拌（１，２００ＲＰＭにおいて５分間）下においてＮＨＳを溶解（１当量）した。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＮａＯＨ／ＨＣｌ  ０．１ＭによってｐＨを５．０に調整した。上記において定義されている式（Ｌｐｒｅｃ１）の前駆体としてＤＢＣＯ−アミン（２）を使用し、最終体積比４０：６０の水−ＤＭＳＯ混合物のために、ＤＭＳＯと共に添加（１当量）した。反応物を室温において一晩撹拌し、エタノール中において沈殿させて、式（Ｉｂ１）（式中、Ａは、ジベンゾシクロオクチンであるＣ８ヘテロシクロアルキル環であり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ３は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である）の中間体（３）を得た。沈殿物（３）を凍結乾燥し、１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に再溶解し、上記のように式（Ｉａ１）の中間体として使用したｐＮｉＰＡＭ−Ｎ３（１当量）（４）を添加（１，２００ＲＰＭにおいて２時間）した。１，５００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対してＨＡ−Ｐ１を３回透析（ＭＷＣＯ  ２５，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、エタノール中において沈殿させ、凍結乾燥し、４℃において保存した。
【０１８４】
溶媒としてＤ２Ｏを使用して、周囲温度において、Ｖａｒｉａｎ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）製１Ｈ  ＮＭＲ  Ｇｅｍｉｎｉ  ３００  ＭＨｚのスペクトル（図１Ｄ）によって、得られた本発明のコンジュゲートＨＡ−Ｂ１の構造を決定した。
スキーム１Ａ
【化１８】
2019513868.tif 000019
【０１８５】
ＨＡアセチルプロトンピーク（δ  ２．００ｐｐｍ）の積分に対するＤＢＣＯ芳香族プロトンピーク（δ  ７．６７ｐｐｍ）の積分の比を使用して、ＨＡ−ＤＢＣＯの置換度（ＤＳ）を８．０％（１当量のＣＯＯ−）として決定し、最終的に、ｐＮｉＰＡＭメチルプロトンピーク（δ  １．５６ｐｐｍ）の積分に対するＤＢＣＯ芳香族プロトンピーク（δ  ７．６７ｐｐｍ）の積分の比を使用して、ＨＡ−Ｂ１の置換度（ＤＳ）を７．１３％（１当量のＣＯＯ−）として定量した。
【０１８６】
ＨＡ−Ｐ２の合成
以下のスキーム１Ｂに従って、本発明の表題コンジュゲートを合成した。
【０１８７】
ＨＡ（１）を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に可溶化する。ポリマーの溶解後、ＥＤＣを添加（０．５当量のＣＯＯ−）し、５分間後に、磁気撹拌（８００ＲＰＭにおいて５分間）下においてＮＨＳを溶解（０．５当量）した。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＮａＯＨ／ＨＣｌ  ０．１ＭによってｐＨを５．０に調整した。最終体積比４０：６０の水−ＤＭＳＯ混合物のために、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミン（２Ｐ）をＤＭＳＯと共に添加（０．５当量）した。反応物を室温において一晩撹拌し、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対して３回透析（ＭＷＣＯ  １２−１４，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、次いで、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたって蒸留水において３回透析して、式（Ｉｂ１）（式中、Ａは、ジベンゾシクロオクチンであるＣ８ヘテロシクロアルキル環であり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ３は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）４）−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である）の中間体（３Ｐ）を得た。混合物を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に再溶解し、ｐＮｉＰＡＭ−Ｎ３（０．５当量）（４）を添加（１，５００ＲＰＭにおいて２時間）した。９００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対してＨＡコンジュゲートを３回透析（ＭＷＣＯ  ２５，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、次いで、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたって蒸留水において３回透析し、凍結乾燥し、４℃において保存した。また、この方法によって、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミン（２Ｐ）の代わりにＤＢＣＯ−アミン（２）を使用して、比（ｐＮｉＰＡＭ／ＨＡ）が異なる以外は（ＨＡ−Ｂ１）と同じコンジュゲートを得ることによって、本発明のコンジュゲートＨＡ−Ｂ２を合成した。凍結乾燥後、上記のように、Ｄ２Ｏ中において１Ｈ  ＮＭＲスペクトルによって、得られたコンジュゲートの構造およびＤＳを決定した（図１Ｆおよび１Ｅ）。ＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２のＤＳは、それぞれ７．４７％および９．５３％であった（０．５当量のＣＯＯ−）。
スキーム１Ｂ
【化１９】
2019513868.tif 000020
【０１８８】
ＨＡ−Ｂ３の合成
一般的なスキーム２、特に以下のスキーム２Ａに従って、本発明の表題コンジュゲートを合成した。
スキーム２Ａ
【化２０】
2019513868.tif 000021
【０１８９】
ＨＡ（１）を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に可溶化する。ポリマーの溶解後、ＥＤＣを添加（１当量のＣＯＯ−）し、５分間後に、磁気撹拌（１，２００ＲＰＭにおいて５分間）下においてＮＨＳを溶解（１当量）した。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＮａＯＨ／ＨＣｌ  ０．１ＭによってｐＨを５．０に調整し、最終体積比４０：６０の水−ＤＭＳＯ混合物のために、Ｎ３−ＰＥＧ４−アミン（５）をＤＭＳＯと共に添加（１当量）した。１，５００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対してＨＡ−Ｎ３を３回透析（ＭＷＣＯ  １，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、エタノール中において沈殿させ、凍結乾燥して、ＨＡ−Ｎ３（６）（中間体Ｉｂ２、式中、Ｒ３は、基−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−である）を得た。
【０１９０】
磁気撹拌（１，２００ＲＰＭにおいて５分間）下において、ｐＮｉＰＡＭ−アミン（７）を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に溶解する。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＮａＯＨ／ＨＣｌ  ０．１ＭによってｐＨを７．０に調整し、最終体積比４０：６０の水−ＤＭＳＯ混合物のために、上記において定義されている式（Ｌｐｒｅｃ２）（式中、Ａは、アザ−ジベンゾシクロオクチニルであり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ１’は、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）４−オキソブタノイルである）の前駆体として使用したＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル（８）をＤＭＳＯと共に添加（１当量）して、ｐＮｉＰＡＭ−ＤＢＣＯ（９）（中間体Ｉａ２、式中、Ａは、アザ−ジベンゾシクロオクチニルであり、Ｒ５は、Ｈであり、Ｒ３は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｓであり、Ｒ２は、基−Ｂ−（ＣＨ２）ｉ−Ｄであり、Ｂは存在せず、ｉは、０であり、Ｄは、メチルである）を得た。１，５００ＲＰＭにおいて３時間にわたって蒸留水に対してｐＮｉＰＡＭ−ＤＢＣＯを３回透析（ＭＷＣＯ  １，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、凍結乾燥した。
【０１９１】
次いで、ＨＡ−Ｎ３（６）を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に可溶化し、ｐＮｉＰＡＭ−ＤＢＣＯ（９）（１当量）を添加（１，５００ＲＰＭにおいて２時間）した。９００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対してＨＡコンジュゲートを３回透析（ＭＷＣＯ  ２５，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、次いで、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたって蒸留水において３回透析し、凍結乾燥し、４℃において保存して、本発明のコンジュゲートＨＡ−Ｂ３、特に式（Ｉ）（式中、Ｍは、Ｍ２である）のコンジュゲートを得た。
【０１９２】
ＨＡ−ｐＮｉＰＡＭ（比較対照）の合成
以下のように記載されている方法を使用して、リンカーを有しないＨＡ−ｐＮｉＰＡＭの比較コンジュゲートを合成した：ＨＡを１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に可溶化する。ポリマーの溶解後、ＥＤＣを添加（１当量のＣＯＯ−）し、５分間後に、磁気撹拌（１，２００ＲＰＭにおいて５分間）下においてＮＨＳを溶解（１当量）した。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＮａＯＨ／ＨＣｌ  ０．１ＭによってｐＨを５．０に調整し、ｐＮｉＰＡＭ−アミンを添加（１当量）した。反応物を室温において一晩撹拌した。１，５００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対してＨＡ−ｐＮｉＰＡＭを３回透析（ＭＷＣＯ  ２５，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、エタノール中において沈殿させ、凍結乾燥し、４℃において保存した。
【０１９３】
ＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５（蛍光ＨＡコンジュゲート）の合成
一例として、ｐＮｉＰＡＭ−Ｎ３の添加前に０．１％（ｗ／ｗ）のＣｙ５−Ｎ３を混合物に添加した以外は同じ合成パラメータのＨＡ−Ｐ２とＨＡコンジュゲートおよび蛍光色素アジドをカップリングした。
【０１９４】
ＨＡ−Ｃｙ５（比較蛍光対照）の合成
ＨＡ（１）を１．５％（ｗ／ｖ）において蒸留水に可溶化する。ポリマーの溶解後、ＥＤＣを添加（１．１当量のＣＯＯ−）し、５分間後に、磁気撹拌（９００ＲＰＭにおいて５分間）下においてＮＨＳを溶解（１．１当量）した。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＮａＯＨ／ＨＣｌ  ０．１ＭによってｐＨを５．０に調整した。最終体積比１：１の水−ＤＭＳＯ混合物のために、ＤＢＣＯ−アミンをＤＭＳＯと共に添加（１当量）した。反応物を室温において一晩撹拌し、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対して３回透析（ＭＷＣＯ  １２−１４，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、次いで、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたって蒸留水において３回透析した。混合物を１％（ｗ／ｖ）において蒸留水に再溶解し、０．１％（ｗ／ｗ）のＣｙ５−Ｎ３を添加（１，５００ＲＰＭにおいて２時間）した。９００ＲＰＭにおいて３時間にわたってＮａＣｌ  ５％（ｗ／ｖ）蒸留水に対してＨＡコンジュゲートを３回透析（ＭＷＣＯ  １２−１４，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）し、次いで、９００ＲＰＭにおいて３時間にわたって蒸留水において３回透析し、凍結乾燥し、４℃において保存した。
【０１９５】
実施例２：本発明の化合物の注入性
本発明の化合物の注入性を試験するために、注入力５Ｎ未満のＨＡコンジュゲートの最大割合（ｗ／ｖ）を決定した。
【０１９６】
２３Ｇ針を１ｍＬシリンジＮｏｒｍ−ｊｅｃｔ（登録商標）に充填し、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ（商標）２９Ｇ固定針１ｍＬインスリンシリンジを使用した。Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＴＡ．ＸＴ．ｐｌｕｓ（Ｔｒａｃｏｍｍｅ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、２０および３７℃において注入力を測定した。２つのシリンジ−針システムを用いてＨＡコンジュゲートを評価したところ、シリンジ材料によって影響を受ける注入プロファイルを示した（図２Ｂ）。実際、持続的な吸引および注入のためにダブルシーリングリングを有するプランジャーストッパーを用いて、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ（商標）２９Ｇ固定針を作製した。図２において示されているように、２３Ｇシリンジを用いた場合には、Ｆｉ（初期の力）およびＦｐ（プラトー力）は、Ｆｆ（最終的な力）と同等以上であり、２９Ｇシリンジを用いた場合には、Ｆｉ＞Ｆｐ＞Ｆｆであった。ＨＡ−Ｂ１、ＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２の濃度は、それぞれ７．５％、０．５％および０．７５％（ｗ／ｖ）であり、注入容易（＜５Ｎ）であると考えられた。これらの結果により、本発明のＨＡコンジュゲートの注入性が優れており、注入システムに応じて最大濃度を増加させることが可能であることが明らかになった。
【０１９７】
実施例３：本発明の化合物のレオロジー挙動
以下のように、本発明の化合物のレオロジー挙動を調査した：
【０１９８】
２０℃の制御湿度チャンバー内において、３５／２°Ｔｉコーン（Ｖｒｅｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．１ｓ−１〜１００ｓ−１の範囲の剪断速度のコーン・プレートジオメトリーを使用したＨａａｋｅ  Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  １を用いて、０．４ｍＬサンプルのＨＡ−Ｂ１（７．５％ｗ／ｖ）、ＨＡ−Ｂ２（０．５％ｗ／ｖ）、ＨＡ−Ｐ２（０．７５％ｗ／ｖ）およびＯｓｔｅｎｉｌ（登録商標）（１％ｗ／ｖ）に対して、レオロジー測定を実施した。
【０１９９】
結果は、すべての本発明のＨＡグラフトポリマーおよびＯｓｔｅｎｉｌ（登録商標）が非ニュートン性かつ偽塑性の流体であったことを示した。剪断の増加と共に偽塑性流体の粘度は減少したが、これは、注入を容易にする有利な特性である。
【０２００】
１℃／分の加熱速度における温度の関数としての動的レオメトリーＧ’（弾性）およびＧ’’（粘度）係数によって、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）も調査した。Ｇ’およびＧ’’係数の交点によって、ＬＣＳＴを特性評価した。すべてのＨＡコンジュゲートは、それ未満においては混合物が混和性である臨界温度（ＬＣＳＴ）を示した；ＨＡ−Ｐ１については２４〜２５℃ならびにＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２については３１〜３２℃。Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標）とは異なり、すべての本発明のＨＡグラフトポリマーは溶液であり（Ｇ’’＜Ｇ’）、ＨＡ−Ｐ２の場合、ＨＡ−Ｂ１とは異なり、Ｇ’およびＧ’’値、特に弾性特性（Ｇ’）が急速に増加した。ｐＮｉＰＡＭおよびリンカーのグラフトはナノ粒子の形成に影響を与え、そして、ＬＣＳＴ超においてレオロジー特性を変化させたが、これは、二相ナノ粒子−溶媒混合物を示している。
【０２０１】
実施例４：本発明のコンジュゲートの粒子のサイズおよび形態
本発明のＨＡグラフトポリマーを蒸留水に可溶化し、ＨＡグラフトポリマー溶液を３７℃においてインキュベートして、ナノ粒子を形成させた。
【０２０２】
ＬＣＳＴ超において、３つの方法（Ｉｍａｇｅ  Ｊバージョン１．４５ｓ分析ソフトウェア（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して５０個の粒子の直径を測定することによる走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｊｅｏｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＪＳＭ−７００１ＴＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）写真、動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）およびナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ１０，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ））によって、そのようにして形成されたＨＡナノ粒子の平均粒子サイズを決定した。図３において示されているように、ＳＥＭ分析により、３７℃においてインキュベートした後のＨＡコンジュゲートのナノ粒子形態が明らかになった。ＨＡ−Ｂ１ナノ粒子は、他のＨＡコンジュゲートと比較して小さくかつ非常に球状であった。ｐＮｉＰＡＭ／ＨＡの高いグラフト比は、ナノ粒子の球形成（図３ＡＢＣ）に影響を与え、温度の関数としての粘度／弾性にも影響を与えた。ＨＡ−Ｐ２（図３Ｂ）については、ナノ粒子サイズは、ＰＥＧ４リンカーの影響を示した。また、ＨＡ−Ｂ２の高速可逆的転移とは異なり、ＬＣＳＴ未満（３１〜３２℃）において、ＨＡ−Ｐ２ナノ粒子は徐々に再可溶化した（図３Ｅ）。明らかに、ＰＥＧ４リンカーは、ＨＡコンジュゲートの溶解性および形成されたナノ粒子サイズに影響を与えた（表１）。
【表１】
2019513868.tif 000022
【０２０３】
対照的に、リンカーを有しないＯｓｔｅｎｉｌ（登録商標）ヒドロゲルおよびグラフトポリマーＨＡ−ｐＮｉＰＡＭ（陰性対照）（図３Ｄ）は、加熱してもナノ粒子を全く形成しなかった。
【０２０４】
実施例５：生体内蛍光
以下のように、本発明のコンジュゲートのインビボ滞留時間を評価した：
【０２０５】
マウスにおいて２つの注射経路（健常皮下組織および変形性膝関節症における関節内注射）による投与後に、ＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５およびＨＡ−Ｃｙ５（比較対照）について、マウスにおける生体内蛍光を評価した。ＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５およびＨＡ−Ｃｙ５溶液（１％ｗ／ｖ）を関節（ｎ＝７）および皮下（ｎ＝４）に注射した。
【０２０６】
ＨＡ−Ｃｙ５の場合、有意差が観察された。７日後、関節内注射においては総シグナルが減少し、皮下部位については画素面積が増加した。ＨＡ−Ｃｙ５は、注射部位において短い滞留時間を示した（図５）。ＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５は、体温においてナノ粒子を自発的に形成した。画素面積の増加は、平均シグナルの減少とバランスしていた。明確に、ＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５の総シグナルについては、有意差が見られなかった。ＨＡコンジュゲートは、自発的なナノ粒子形成により、注射部位において長い体内滞留時間を示した（図５）。
【０２０７】
実施例６：生体適合性
以下のように、本発明のコンジュゲートの生体適合性を評価した：
【０２０８】
ＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５を健常マウスに皮下注射した７日後（ｎ＝４）および２１日後（ｎ＝４）、シアニン５蛍光が検出された皮膚片を取り出し、矢状面において切断した。パラフィン包埋後、ミクロトームを用いて、４μｍ切片を切断した。ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）によって切片を染色した。注射部位におけるＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５の生体適合性は、組織／材料相互作用によって制御される。２１日後、皮下注射におけるＨＡ−Ｐ２−Ｃｙ５の相互作用および生体適合性を確認した。マクロファージ（組織反応における主な細胞）は、周辺組織において対照群（Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））と比較して多くなかった。
【０２０９】
実施例７：インビトロ薬物放出
本発明のＨＡグラフトポリマー由来のナノ粒子からの薬物放出プロファイルを決定するために、以下のように、インビトロ薬物放出を行った。デキサメタゾン塩基（薬物）によって、生理食塩水（ＮａＣｌ  ０．９％）、Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標）、本発明のグラフトポリマーＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２を飽和した。４００ｍＬのＮａＣｌ  ０．９％（ｗ／ｖ）に対する透析バッグ（ＭＷＣＯ  １，０００，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）膜、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＵＳＡ）に１０ｍＬの前記溶液を入れ、３７℃および８０ＲＰＭにおいてインキュベートした。２８時間後、加熱（１２１℃）によってポリマーマトリックスを加水分解して、デキサメタゾンの残存含量を放出させ、ＤＭＳＯを添加して水：ＤＭＳＯの最終体積比を１：１にした。Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄカラム（５０／２．１、ビーズ粒径１．９μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を使用して、逆相ＵＨＰＬＣによって、各時点において放出された薬物を定量した。移動相は、０．１％ｖ／ｖギ酸水溶液（Ａ）および０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）アセトニトリル溶液（Ｂ）から構成され、４００μＬ．分−１の流速、３０〜９５％Ａ（０〜３分）、９５〜１０％Ａ（３〜４分）、１０〜３０％Ａ（４〜４．５分）および３０％Ａ（４．５〜５分）において勾配溶出を使用した。
【０２１０】
ＨＡグラフトポリマーは、対照（生理食塩水およびＯｓｔｅｎｉｌ（登録商標））と比較して約２．５倍多いデキサメタゾンを溶解した。図４において示されているように、破壊後（ｔ＝３０時間）、デキサメタゾンの４０％は依然として、ＨＡコンジュゲートのナノ粒子の内部にあった。
【０２１１】
ＬＣＳＴ超において、デキサメタゾン塩基として疎水性薬物物質をＨＡコンジュゲートナノ粒子にロードした。この研究により、新たな薬送達系としての本発明のＨＡコンジュゲートナノ粒子の高い効率が実証された。
【０２１２】
実施例８：安定性
以下のように、レオロジーおよびｐＨ／ゼータ電位測定によって、本発明のグラフトポリマーの安定性を評価した：
【０２１３】
ＨＡグラフトポリマーを４℃において保存し、粘度を経時的（ｔ０、ｔ７およびｔ３０）にチェックした。２０℃の制御湿度チャンバー内において、３５／２°Ｔｉコーン（Ｖｒｅｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．１ｓ−１〜１００ｓ−１の範囲の対数剪断速度モードのコーン・プレートジオメトリーを使用したＨａａｋｅ  Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  １を用いて、０．４ｍＬサンプルのＨＡ−Ｂ２（０．５％ｗ／ｖ）およびＨＡ−Ｐ２（０．７５％ｗ／ｖ）に対して、レオロジー測定を実施した。ｐＨゲル電極Ｍｅｔｒｏｈｍ（Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｐＨを測定し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用してゼータ電位を測定した。
【０２１４】
有意な粘度差は観察されなかったが、これは、グラフトポリマーＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２が４℃において１カ月間安定であったことを示している。ＨＡグラフトポリマーは、高いゼータ電位を伴う酸性ｐＨを示したが、これは、コロイド安定性を保証する（表２）。インビトロ／インビボ実験においては、ｐＨを中和するために、ＨＡグラフトポリマーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に可溶化した。
【表２】
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【０２１５】
実施例９：細胞生存アッセイ
ヒト滑膜線維芽細胞を使用して、生存性試験を実施した。細胞を細胞２０，０００個／ウェルの密度において９６ウェルプレートにプレーティングした。２４時間後、ＨＡコンジュゲート（ＨＡ−Ｂ２およびＨＡ−Ｐ２）をＰＢＳに可溶化し、３７℃において２４時間インキュベートした。５０μＬの０．５％ＭＴＴ溶液を３時間かけて各ウェルに添加した。すべてのウェルを１００μＬのＤＭＳＯと共に４５分間インキュベートし、ＢｉｏＴｅＫ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）によって吸光度を５７０ｎｍにおいて測定した（１ウェル当たり８点）。
【０２１６】
ＰＢＳ中のＨＡ−Ｂ２  ０．７５％（ｗ／ｖ）およびＨＡ−Ｐ２  ０．５％（ｗ／ｖ）は、未処理対照と比較して、細胞生存性を減少させなかった。
【図１】
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【図２ＡＢ】
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【図２Ｃ】
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【図３ＡＢＣＤ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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