(57)【要約】代替的な実施形態では、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすための方法であって、プロキネチシン２（ＰＫ２）の発現もしくは活性ならびに／またはＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、および／もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）の発現もしくは活性を修飾することができる化合物または組成物を、哺乳動物またはヒトに投与することを含む、方法が、提供される。
2019513738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に記載される構造を有する化合物、またはその同等物、またはその立体異性体、またはその類似体、またはその薬学的に許容される塩、またはそのバイオアイソスターであって、
プロキネチシン２（ＰＫ２）アンタゴニストあるいはＰＫ２の活性を減少するかもしくはそれを脱活性化することができるか、またはＰＫ２受容体アンタゴニストとして作用することができる化合物もしくは組成物として作用する、化合物、またはその同等物、またはその立体異性体、またはその類似体、またはその薬学的に許容される塩、またはそのバイオアイソスター。
【請求項２】
請求項１に記載される化合物または組成物を含む、製剤であって、任意選択で、固体、半固体、液体、エアゾール、粉末、またはエマルション製剤である、製剤。
【請求項３】
請求項１に記載される化合物または組成物を含む、医薬組成物であって、
任意選択で、前記医薬組成物が、腸内または非経口投与のために製剤化され、
任意選択で、前記化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために、または腸内もしくは非経口投与のために、または軟膏剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、ゲルタブ、液体剤、ローション剤、エアゾール剤、もしくはインプラント剤として、製剤化され、
任意選択で、前記化合物が、ナノ粒子またはナノリポ粒子として製剤化される、医薬組成物。
【請求項４】
−  哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、あるいは
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性または慢性疼痛の症状を治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫または膵臓がんである、がんを治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で乾癬または関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、または緩和するための方法であって、
（ａ）（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾するため、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）活性を修飾するため、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾するため、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾するため
のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる、化合物または組成物を用意することと、
（ｂ）（ａ）の化合物または組成物のうちの１つまたは任意の組合せ物を、それを必要とする哺乳動物またはヒトに投与することと、を含み、
任意選択で、前記組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＶＲ、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許第８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または請求項１に記載の化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物であり、
ＰＫ２アゴニストまたはプロキネチシン２（ＰＫ２）もしくはＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を増加もしくは活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物による目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、
ＶＲアゴニストまたはＶＲ活性を増加もしくは活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物による目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、
ＭＲアゴニストまたはＭＲ活性を増加もしくは活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、
ＰＫ２アンタゴニストまたはプロキネチシン２（ＰＫ２）もしくはＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における活性抑制および睡眠誘導を引き起こすかまたはもたらし、
ＶＲアンタゴニストまたはＶＲ活性を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における活性抑制および睡眠誘導を引き起こすかまたはもたらし、
ＭＲアンタゴニストまたはＭＲ活性を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における活性抑制および睡眠誘導を引き起こすかまたはもたらし、
アンタゴニストまたはプロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、ＶＲ活性、および／もしくはＭＲ活性を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療もしくは緩和すること、
−  羞明を治療または緩和すること、または
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療もしくは緩和すること、
−  急性もしくは慢性疼痛の症状を治療、予防、もしくは緩和すること、
−  任意選択で膠芽腫もしくは膵臓がんである、がんを治療、予防、もしくは緩和すること、
−  任意選択で乾癬もしくは関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、もしくは緩和すること
を引き起こすかまたはもたらす、方法。
【請求項５】
前記概日リズムの調節と関連する神経精神障害が、気分障害；うつ；時差ぼけ；交代労働者症候群；睡眠相前進障害（ＡＳＰＤ）；季節性情動障害（ＳＡＤ）；家族性睡眠相前進症候群；睡眠相後退型、不規則睡眠−覚醒型、または非２４時間睡眠−覚醒型の概日リズム睡眠障害である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物または組成物が、医薬組成物として製剤化され、任意選択で、腸内または非経口投与のために製剤化され、任意選択で、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与、または経口、粘膜、もしくは鼻腔内投与のために製剤化され、任意選択で、軟膏剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、軟膏剤、ゲルタブ、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤、液体剤、ローション剤、エアゾール剤、またはインプラント剤として製剤化され、任意選択で、前記化合物が、粒子、リポソーム、ナノ粒子、またはナノリポ粒子として製剤化される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物または組成物が、任意選択で皮下（ＩＣ）、筋肉内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、および／または皮内注射または注入による、注射のために製剤化される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物または組成物が、局所または粘膜投与のために製剤化され、任意選択で、ゲル剤、局所剤、軟膏剤、スプレー剤、点眼剤または眼軟膏剤として製剤化される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組成物、化合物、または製剤が、経口、非経口、吸入スプレーにより、鼻内、局所、髄腔内、髄腔内、脳内、硬膜外、頭蓋内、または直腸内に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アゴニストまたはアンタゴニスト組成物または化合物が、プロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）に特異的に結合し、かつＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を阻害するか、またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を増加もしくは持続する、抗体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アゴニストまたはアンタゴニスト組成物または化合物が、プロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）遺伝子もしくは転写産物に特異的に結合し、かつ／またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を阻害するか、またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を増加もしくは持続する、核酸であり、任意選択で、前記アンタゴニストが、阻害性核酸であり、任意選択で、前記阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アゴニストまたはアンタゴニスト組成物または化合物が、プロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）遺伝子もしくは転写産物に特異的に結合し、かつ／またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を阻害するか、またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を増加もしくは持続する、低分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物または脂質である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
−  哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、あるいは
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性または慢性疼痛の症状を治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫または膵臓がんである、がんを治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で乾癬または関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、または緩和するための治療組合せ物であって、
前記治療組合せ物は２つまたはより多くの化合物または組成物を含み、前記２つまたはより多くの化合物または組成物は、
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができ、
任意選択で、前記組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許第８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または請求項１に記載の化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物である、
治療組合せ物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物、請求項２に記載の製剤、請求項３に記載の医薬組成物、請求項１０に記載の治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物
を含むキットであって、
任意選択で、前記組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許第８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または請求項１に記載の化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物である、キット。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物、請求項２に記載の製剤、請求項３に記載の医薬組成物、請求項１０に記載の治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）がＶ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物を含む、製品であって、
任意選択で、前記治療組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または請求項１に記載の化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開第２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物であり、
任意選択で、前記製品が、キット、ポンプ、デバイス、皮下注入デバイス、皮下連続注入デバイス、注入ペン、ニードル、リザーバ、アンプル、バイアル、シリンジ、カートリッジ、ペン、使い捨てペンまたはジェット式注射器、事前充填ペンまたはシリンジまたはカートリッジ、カートリッジ式または使い捨てペンまたはジェット式注射器、２チャンバ式またはマルチチャンバ式ポンプである、製品。
【請求項１６】
請求項１に記載の組成物、請求項２に記載の製剤、請求項３に記載の医薬組成物、請求項１０に記載の治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物
の医薬の製造における使用であって、
任意選択で、前記使用が、
−  哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、または
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性もしくは慢性疼痛の症状を治療、予防、もしくは緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫もしくは膵臓がんである、がんを治療、予防、もしくは緩和するため、
−  任意選択で乾癬もしくは関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、もしくは緩和するため
の使用である、使用。
【請求項１７】
医薬としての使用のための、化合物、式、製品または組成物であって、
任意選択で、前記医薬は、
−  哺乳動物における概日タイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、あるいは
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性または慢性疼痛の症状を治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫または膵臓がんである、がんを治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で乾癬または関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、または緩和するために使用され、
前記化合物、式、製品または組成物は、請求項１に記載の組成物、請求項２に記載の製剤、請求項３に記載の医薬組成物、請求項１０に記載の治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物、
あるいは請求項１０に記載のキット、あるいは請求項１２に記載の製品
を含む、化合物、式、製品または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明は、ＮＩＨ、ＤＨＨＳによって授与された認可番号ＤＫ９１９１６の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、日周リズムに依存する神経生物学および光生物学ならびに哺乳動物挙動に関する。代替的な実施形態では、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすための組成物および方法であって、プロキネチシン２（ＰＫ２）の発現もしくは活性ならびに／またはＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、および／もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）の発現もしくは活性を修飾することができる化合物または組成物を、哺乳動物またはヒトに投与することを含む、組成物および方法が、提供される。代替的な実施形態では、ＰＫ２アゴニスト、またはプロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、ＶＲ活性、および／もしくはＭＲ活性を増加もしくは活性化する化合物もしくは組成物の投与は、哺乳動物による目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、ＰＫ２アンタゴニスト、またはプロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、ＶＲ活性および／もしくはＭＲ活性を減少もしくは脱活性化する化合物もしくは組成物の投与は、哺乳動物における活性抑制および睡眠の誘導を引き起こすかまたはもたらす。
【背景技術】
【０００３】
背景
約２％の人口が、睡眠または気分症状を伴う何らかの形態の概日リズム障害を患っている。概日リズム睡眠障害の他の例としては、時差ぼけおよび交代労働者症候群が挙げられ、これらは、外部環境に対する内部概日系の調節不全と関連している。概日リズム睡眠障害の別の例は、睡眠相前進障害（ＡＳＰＤ）であり、これは、夜の就寝時刻が早く、朝の覚醒が早い（およそ午前２〜５時）ことによって特徴付けられる。睡眠問題は、一般集団、特に老齢者に一般的である。多くの老齢者が、朝の覚醒が早いことを報告しており、一部の症状は、ＡＳＰＤに類似している。
【０００４】
概日リズム性またはタイミングの乱れは、睡眠の症状に加えて、気分に対して顕著な影響を有する。現在、精神障害における概日異常の高い出現率は、精神症状の結果のみならず、概日調節系における変化にも起因することが、認識されている。季節性情動障害の典型的な治療には、抗うつ医薬および光療法が含まれる。季節性情動障害に対する抗うつ薬の有効性の根拠は、限られている。光療法、特に、青色光を用いたものは、季節性情動障害に有効であるとみられる。しかしながら、光療法は、扱いづらく時間がかかり、季節性情動障害などの慢性的または再発する障害を有する大半の対象のための標準的な治療法とはなり得ない。
【０００５】
視交叉上核（ＳＣＮ）には、哺乳動物のすべての種について、主概日時計が存在すると考えられている。そのような主張を裏付ける根拠は、マウスおよびラットなどの夜行性哺乳動物に関して極めて強力である。しかしながら、概日覚醒状態レベル調節のための主時計がＳＣＮに存在するという同じ主張は、実際には、ヒトを含め、昼行性動物の事例においては、裏付けとなる根拠が限られている。リスザルにおけるＳＣＮ病変による睡眠の増加に関してよく引用される文献（Ｅｄｇａｒら、１９９３年）は、ＳＣＮが昼行性動物の覚醒状態または目覚めを促進すると解釈されるが、これは、網膜視床下部路に同時発生した病変部に起因する可能性がある。したがって、ＳＣＮ以外の部位に、ヒトを含む霊長類などの昼行性動物の覚醒状態レベルを調節する重要な概日時計が存在する可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
代替的な実施形態では、プロキネチシン２アゴニストおよびアンタゴニストを使用して、哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、ならびに概日および日周リズムの障害を治療、緩和、または予防するための組成物、製品、および方法が、提供される。
【０００７】
代替的な実施形態では、表１に記載される構造を有する化合物、またはその同等物、またはその立体異性体、またはその類似体、またはその薬学的に許容される塩、またはそのバイオアイソスターであって、
プロキネチシン２（ＰＫ２）アンタゴニストあるいはＰＫ２の活性を減少するかもしくはそれを脱活性化することができるか、またはＰＫ２受容体アンタゴニストとして作用することができる化合物もしくは組成物として作用する、化合物、またはその同等物、またはその立体異性体、またはその類似体、またはその薬学的に許容される塩、またはそのバイオアイソスターが提供される。
【０００８】
代替的な実施形態では、本明細書に提供される化合物または組成物を含む製剤であって、任意選択で、固体、半固体、液体、エアゾール、粉末、またはエマルション製剤である、製剤が提供される。
【０００９】
代替的な実施形態では、本明細書に提供される化合物または組成物を含む医薬組成物であって、任意選択で、前記医薬組成物が、腸内または非経口投与のために製剤化され、任意選択で、前記化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために、または腸内もしくは非経口投与のために、または軟膏剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、ゲルタブ、液体剤、ローション剤、エアゾール剤、もしくはインプラント剤として、製剤化され、任意選択で、前記化合物が、ナノ粒子またはナノリポ粒子として製剤化される、医薬組成物が提供される。
【００１０】
代替的な実施形態では、
−  哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、あるいは
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性または慢性疼痛の症状を治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫または膵臓がんである、がんを治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で乾癬または関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、または緩和するための方法であって、
（ａ）（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾するため、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）活性を修飾するため、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾するため、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾するため
のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる、化合物または組成物を用意することと、
（ｂ）（ａ）の化合物または組成物のうちの１つまたは任意の組合せ物を、それを必要とする哺乳動物またはヒトに投与することと、を含み、
任意選択で、前記組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＶＲ、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許第８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または本明細書に提供される通りの化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物であり、
ＰＫ２アゴニストまたはプロキネチシン２（ＰＫ２）もしくはＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を増加もしくは活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物による目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、
ＶＲアゴニストまたはＶＲ活性を増加もしくは活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物による目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、
ＭＲアゴニストまたはＭＲ活性を増加もしくは活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における目覚めまたは覚醒の反応を引き起こすかまたはもたらし、
ＰＫ２アンタゴニストまたはプロキネチシン２（ＰＫ２）もしくはＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における活性抑制および睡眠誘導を引き起こすかまたはもたらし、
ＶＲアンタゴニストまたはＶＲ活性を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における活性抑制および睡眠誘導を引き起こすかまたはもたらし、
ＭＲアンタゴニストまたはＭＲ活性を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、前記ヒトまたは哺乳動物における活性抑制および睡眠誘導を引き起こすかまたはもたらし、
アンタゴニストまたはプロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、ＶＲ活性、および／もしくはＭＲ活性を減少もしくは脱活性化することができる化合物もしくは組成物の投与が、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療もしくは緩和すること、
−  羞明を治療または緩和すること、または
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療もしくは緩和すること、
−  急性もしくは慢性疼痛の症状を治療、予防、もしくは緩和すること、
−  任意選択で膠芽腫もしくは膵臓がんである、がんを治療、予防、もしくは緩和すること、
−  任意選択で乾癬もしくは関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、もしくは緩和すること
を引き起こすかまたはもたらす、方法が提供される。
【００１１】
代替的な実施形態では、概日リズムの調節と関連する神経精神障害は、気分障害；うつ；時差ぼけ；交代労働者症候群；睡眠相前進障害（ＡＳＰＤ）；季節性情動障害（ＳＡＤ）；家族性睡眠相前進症候群；睡眠相後退型、不規則睡眠−覚醒型、または非２４時間睡眠−覚醒型の概日リズム睡眠障害である。
【００１２】
代替的な実施形態では、化合物または組成物は、医薬組成物として製剤化され、任意選択で、腸内または非経口投与のために製剤化され、任意選択で、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与、または経口、粘膜、もしくは鼻腔内投与のために製剤化され、任意選択で、軟膏剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、軟膏剤、ゲルタブ、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤、液体剤、ローション剤、エアゾール剤、またはインプラント剤として製剤化され、任意選択で、前記化合物が、粒子、リポソーム、ナノ粒子、またはナノリポ粒子として製剤化される。
【００１３】
代替的な実施形態では、化合物または組成物は、任意選択で皮下（ＩＣ）、筋肉内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、および／または皮内注射または注入による、注射のために製剤化される。代替的な実施形態では、化合物または組成物は、局所または粘膜投与のために製剤化され、任意選択で、ゲル剤、局所剤、軟膏剤、スプレー剤、点眼剤または眼軟膏剤として製剤化される。代替的な実施形態では、組成物、化合物、または製剤は、経口、非経口、吸入スプレーにより、鼻内、局所、髄腔内、髄腔内、脳内、硬膜外、頭蓋内、または直腸内に投与される。
【００１４】
代替的な実施形態では、アゴニストまたはアンタゴニスト組成物または化合物は、プロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）に特異的に結合し、かつＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を阻害するか、またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を増加もしくは持続する、抗体である。
【００１５】
代替的な実施形態では、アゴニストまたはアンタゴニスト組成物または化合物は、プロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）遺伝子もしくは転写産物に特異的に結合し、かつ／またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を阻害するか、またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を増加もしくは持続する、核酸であり、任意選択で、前記アンタゴニストが、阻害性核酸であり、任意選択で、前記阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
代替的な実施形態では、アゴニストまたはアンタゴニスト組成物または化合物は、プロキネチシン２（ＰＫ２）、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）、バソプレシン受容体（ＶＲ）、もしくはメラトニン受容体（ＭＲ）遺伝子もしくは転写産物に特異的に結合し、かつ／またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を阻害するか、またはＰＫ２、ＰＫＲ２、ＶＲ、もしくはＭＲの活性もしくは発現を増加もしくは持続する、低分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物または脂質である。
【００１７】
代替的な実施形態では、
−  哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、あるいは
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性または慢性疼痛の症状を治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫または膵臓がんである、がんを治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で乾癬または関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、または緩和するための治療組合せ物であって、
前記治療組合せ物は２つまたはより多くの化合物または組成物を含み、前記２つまたはより多くの化合物または組成物は、
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができ、
任意選択で、前記組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許第８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または本明細書に提供される通りの化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物である、
治療組合せ物が提供される。
【００１８】
代替的な実施形態では、本明細書に提供される通りの組成物、本明細書に提供される通りの製剤、本明細書に提供される通りの医薬組成物、本明細書に提供される通りの治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物
を含むキットであって、
任意選択で、前記組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許第８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または本明細書に提供される通りの化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物である、キットが提供される。
【００１９】
代替的な実施形態では、本明細書に提供される通りの組成物、本明細書に提供される通りの製剤、本明細書に提供される通りの医薬組成物、本明細書に提供される通りの治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）がＶ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物を含む、製品であって、
任意選択で、前記治療組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、
任意選択で、プロキネチシン（ＰＫ２）受容体アンタゴニストが、米国特許８，７２２，８９６号に記載される化合物、または式１に記載される構造を有する化合物、または本明細書に提供される通りの化合物、または米国特許出願公開第２０１５／０１１１９２２号、もしくは米国特許出願公開第２０１４／００３８９６８号、もしくは米国特許第７，８５５，２０１号（またはＷＯ２００７０６７５１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６３３０）に記載される化合物であり、
任意選択で、メラトニン受容体（ＭＲ）アンタゴニストが、米国特許第８，９０７，１２６号またはＷＯ／２０１４／１０３９９８に記載される化合物であり、
任意選択で、バソプレシン受容体（ＶＲ）アンタゴニストが、米国特許出願公開第２０１６−０２２１９４４Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５−００７３０３２Ａ１号、またはＷＯ／２０１５／０３６１６０に記載される化合物であり、
任意選択で、前記製品が、キット、ポンプ、デバイス、皮下注入デバイス、皮下連続注入デバイス、注入ペン、ニードル、リザーバ、アンプル、バイアル、シリンジ、カートリッジ、ペン、使い捨てペンまたはジェット式注射器、事前充填ペンまたはシリンジまたはカートリッジ、カートリッジ式または使い捨てペンまたはジェット式注射器、２チャンバ式またはマルチチャンバ式ポンプである、製品が提供される。
【００２０】
代替的な実施形態では、本明細書に提供される通りの組成物、本明細書に提供される通りの製剤、本明細書に提供される通りの医薬組成物、本明細書に提供される通りの治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物
の医薬の製造における使用であって、
任意選択で、前記使用が、
−  哺乳動物における概日リズム性またはタイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、または
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性もしくは慢性疼痛の症状を治療、予防、もしくは緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫もしくは膵臓がんである、がんを治療、予防、もしくは緩和するため、
−  任意選択で乾癬もしくは関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、もしくは緩和するため
の使用である、使用が提供される。
【００２１】
代替的な実施形態では、医薬としての使用のための、化合物、式、製品または組成物であって、
任意選択で、前記医薬は、
−  哺乳動物における概日タイミングを修正するため、
−  ヒト概日調節系における変化に起因するか、あるいはその機能不全もしくは遺伝的欠陥またはその非野生型パターンもしくはバイオフィードバック機序によって引き起こされる、精神状態または症状を治療または緩和するため、
−  概日リズムの調節と関連する神経精神障害を治療または緩和するため、
−  哺乳動物における睡眠問題または睡眠障害を治療または緩和するため、
−  睡眠もしくは活性抑制を誘導するか、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、
−  羞明を治療または緩和するため、あるいは
−  注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療または緩和するため、
−  急性または慢性疼痛の症状を治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で膠芽腫または膵臓がんである、がんを治療、予防、または緩和するため、
−  任意選択で乾癬または関節炎である、炎症性疾患を治療、予防、または緩和するために使用され、
前記化合物、式、製品または組成物は、本明細書に提供される通りの組成物、本明細書に提供される通りの製剤、本明細書に提供される通りの医薬組成物、本明細書に提供される通りの治療組合せ物、あるいは
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾すること、
（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾すること、
（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）が、Ｖ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾すること、または
（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾すること
のうちの少なくとも１つを行うことができる化合物または組成物、
あるいは本明細書に提供される通りのキット、あるいは本明細書に提供される通りの製品
を含む、化合物、式、製品または組成物が提供される。
【００２２】
本発明の１つまたは複数の例示的な実施形態の詳細が、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特性、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００２３】
本明細書において引用されるすべての刊行物、特許、特許出願は、あらゆる目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００２４】
本明細書に記載される図面は、本明細書において提供される例示的な実施形態の例証であり、特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を制限することを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、ＰＫ２−／−マウスにおける自発運動活性および目覚めのレベルに対する光パルスの抑制作用を試験した研究からのデータをグラフで示す。以下の実施例１に詳述されるように、図１Ａは、明または暗曝露の関数としての活性計数を示し、光パルス（１５０ルクス）を、暗期間の半ば（ＺＴ１６〜ＺＴ１８．５として示される）に野生型マウスに与えた場合、自発運動活性が有意に抑制され、対照的に、ＰＫ２−／−マウスについては、光パルスによって自発運動活性のわずかな抑制のみが観察され、図１Ｂは、明または暗曝露の関数として分単位での覚醒時間を示し、ＥＥＧ／ＥＭＧ記録により、光パルスが、野生型マウスまたはＰＫ２−／−マウスにおいて覚醒状態を抑制したことが判明した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、ＰＫ２−／−マウスにおける自発運動活性および目覚めのレベルに対する光パルスの抑制作用を試験した研究からのデータをグラフで示す。以下の実施例１に詳述されるように、図１Ａは、明または暗曝露の関数としての活性計数を示し、光パルス（１５０ルクス）を、暗期間の半ば（ＺＴ１６〜ＺＴ１８．５として示される）に野生型マウスに与えた場合、自発運動活性が有意に抑制され、対照的に、ＰＫ２−／−マウスについては、光パルスによって自発運動活性のわずかな抑制のみが観察され、図１Ｂは、明または暗曝露の関数として分単位での覚醒時間を示し、ＥＥＧ／ＥＭＧ記録により、光パルスが、野生型マウスまたはＰＫ２−／−マウスにおいて覚醒状態を抑制したことが判明した。
【００２６】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、暗状態および薄明かりの曝露の関数として、活性計数および覚醒状態の時間を比較する研究からのデータをグラフで示す。ＰＫ２−／−マウスについては、以下の実施例１に詳述されるように、薄明かり下および暗状態下における覚醒状態の時間は、非常に類似しており、ＰＫ２シグナル伝達の不在下における薄明かりによるわずかな目覚めの阻害のみを示した。野生型マウスについては、以下の実施例１に詳述されるように、薄明かりのこの４時間の間、活性計数および覚醒が維持された時間は、暗状態下よりも大いに低減され、薄明かりの強力な睡眠誘導作用が明らかとなった。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｂは、暗状態および薄明かりの曝露の関数として、活性計数および覚醒状態の時間を比較する研究からのデータをグラフで示す。ＰＫ２−／−マウスについては、以下の実施例１に詳述されるように、薄明かり下および暗状態下における覚醒状態の時間は、非常に類似しており、ＰＫ２シグナル伝達の不在下における薄明かりによるわずかな目覚めの阻害のみを示した。野生型マウスについては、以下の実施例１に詳述されるように、薄明かりのこの４時間の間、活性計数および覚醒が維持された時間は、暗状態下よりも大いに低減され、薄明かりの強力な睡眠誘導作用が明らかとなった。
【００２７】
【図３】図３Ａ〜Ｄは、ＰＫ２を発現する網膜神経節細胞の画像を示し、ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２の発現を試験した。以下の実施例１に詳述されるように、図３Ａは、ＰＫ２が、一部の網膜神経節細胞において強力に発現されることを示し、さらなる共免疫染色研究により、すべてのＯＰＮ４陽性網膜神経節細胞が、ＰＫ２を発現することが示され（図３Ｂ）、図３Ｃは、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ染色（ＤＮＡを染色する）の画像を示し、図３Ｄは、図３Ａ〜Ｃの統合画像である。
【００２８】
【図４】図４Ａ〜Ｄは、昼行性サルの網膜神経節細胞の画像を示す。以下の実施例１に詳述されるように、図４Ａは、サルｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２染色を示し、図４Ｂは、同じ網膜神経節細胞におけるＯＰＮ４染色を示し、図４Ｃは、網膜神経節細胞におけるＨｏｅｓｃｈｓｔ染色を示し、図４Ｄは、ＰＫ２が、サルｉｐＲＧＣにおいてＯＰＮ４と共発現されることを示す、図４Ａ〜Ｃの統合画像である。
【００２９】
【図５】図５Ａ〜Ｄは、マウスの脳およびサルの脳におけるＰＫＲ２発現の画像を示す。以下の実施例１に詳述されるように、図５Ａは、ＰＫＲ２が、サルの脳の背側ＳＣＮにおいてのみ発現され、腹側ＳＣＮにおいては検出されないことを示す、ＰＫＲ２染色を示し、図５Ｂは、ＰＫＲ２が、マウスの脳のＳＣＮの腹側および背側の両方のコンパートメントを含め、ＳＣＮ全体に発現されることを示す、ＰＫＲ２染色を示し、図５Ｃは、ＰＫＲ２が、サルの脳においてＳＣの浅層に強く発現したことを示す、ＰＫＲ２染色を示し、図５Ｄは、ＰＫＲ２発現が、マウスの脳のＳＣにおいて検出されなかったことを示す、ＰＫＲ２染色を示す。
【００３０】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、マウスおよびサルにおける目覚めのレベルに対する合成ＰＫ２アンタゴニストであるＰＫＲＡ８３の作用を試験した研究からのデータをグラフで示す。以下の実施例１に詳述されるように、図６Ａおよび図６Ｂは、ＰＫＲＡ８３の投与により、マウスにおける自発運動活性（図６Ａ）および覚醒状態（図６Ｂ）が有意に増加したことを示すデータを示し、図６Ｃは、サルにおけるＰＫ２アンタゴニストの投与により、睡眠時間の有意な増加がもたらされたことを示す、データを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、マウスおよびサルにおける目覚めのレベルに対する合成ＰＫ２アンタゴニストであるＰＫＲＡ８３の作用を試験した研究からのデータをグラフで示す。以下の実施例１に詳述されるように、図６Ａおよび図６Ｂは、ＰＫＲＡ８３の投与により、マウスにおける自発運動活性（図６Ａ）および覚醒状態（図６Ｂ）が有意に増加したことを示すデータを示し、図６Ｃは、サルにおけるＰＫ２アンタゴニストの投与により、睡眠時間の有意な増加がもたらされたことを示す、データを示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、マウスおよびサルにおける目覚めのレベルに対する合成ＰＫ２アンタゴニストであるＰＫＲＡ８３の作用を試験した研究からのデータをグラフで示す。以下の実施例１に詳述されるように、図６Ａおよび図６Ｂは、ＰＫＲＡ８３の投与により、マウスにおける自発運動活性（図６Ａ）および覚醒状態（図６Ｂ）が有意に増加したことを示すデータを示し、図６Ｃは、サルにおけるＰＫ２アンタゴニストの投与により、睡眠時間の有意な増加がもたらされたことを示す、データを示す。
【００３１】
【図７】図７Ａ〜Ｂは、マウスの網膜の網膜神経節細胞におけるＰＫ２の発現を示す画像を示す。以下の実施例１に詳述されるように、図７Ａは、２つのＰＫ２陽性網膜神経節細胞の例であり、１つが変位しておらず、１つが変位しているＰＫ２陽性網膜神経節細胞が、矢印で示されており、図７Ｂは、２つのＰＫ２陽性網膜神経節細胞の例であり、１つが強力に染色され、１つがより中等度に染色されたものが、矢印で示されている。
【００３２】
【図８】図８は、以下の実施例１に詳述されるように、脳内標的に対するｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達による差次的な目覚めの調節を示す図を示す。
【００３３】
【図９】図９Ａ〜Ｂは、継続的な暗状態の間に増加することが見出された網膜の外顆粒層におけるＰＫ２発現を示す画像を示す。以下の実施例１に詳述されるように、画像は、ＺＴ４（図９Ａ）と比較して、ＣＴ４（図９Ｂ）では網膜の外顆粒層におけるＰＫ２の上方調節を示し、ＰＫ２免疫染色が示されており、枠内の領域は、マウスの網膜の外節を示し、核の対比染色は、青色として示される。
【００３４】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２の時計依存性の発振性発現をグラフで示す。以下の実施例１に詳述されるように、図１０Ａは、定量化され、平均±標準誤差として示される、ＰＫ２の免疫蛍光強度のデータおよび対応する画像を示し、図１０Ｂは、Ｂｍａｌ１欠損マウス（ＢＭＡＬ  ＫＯ）のｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２レベルが、一貫して低く、明らかな発振を示さなかったことを示す、データおよび対応する画像を示し、カラムの上の挿入図は、ｉｐＲＧＣのＰＫ２免疫染色（緑色）の代表的な画像を示し、核の対比染色は、青色として示される。
【００３５】
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、ＰＫ２受容体であるＰＫＲ２が、ある特定の網膜神経節細胞において発現されることを示す、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの画像を示す。以下の実施例２に詳述されるように、図１１Ａは、網膜神経節細胞層におけるＰＫＲ２シグナルを示し、図１１Ｂは、図１１Ａの枠内の領域のより高倍率の画像を示し、図１１Ｂにおいて、ＰＫＲ２陽性である個々の網膜神経節細胞が、明らかであり、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂに対応する眼切片のＮｉｓｓｌ染色を示す。
【００３６】
【図１２】図１２は、目覚めのレベルが、ＰＫ２欠損（ＰＫ２−／−）マウスにおいては、深夜の間に増加したことを示すデータをグラフで示し、これは、以下の実施例２に詳述されるように、深夜の期間（ＺＴ２０〜ＺＴ２４）に、ＰＫ２−／−マウスにおいて覚醒状態の増加を示す。
【００３７】
【図１３】図１３は、以下の実施例２に詳述されるように、ＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ）の局所的な眼送達により、ＰＫＲＡを投与したマウスの自発運動活性が、対照マウス（アンタゴニストを与えていない）と比較して、増加したことを示すデータをグラフで示す。
【００３８】
【図１４】図１４は、以下の実施例２に詳述されるように、対照マウス（アンタゴニストを与えていない）と比較した、マウスの目覚めのレベルに対するＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ）の作用を示すデータをグラフで示す。
【００３９】
【図１５】図１５は、以下の実施例２に詳述されるように、対照（アンタゴニストを与えていない）と比較した、サルの睡眠のレベルに対するＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ８３）の作用を示すデータをグラフで示す。
【００４０】
【図１６】図１６は、以下の実施例２に詳述されるように、ｉｐＲＧＣの分子装置、連結、および戦略的な位置、ならびに夜行性および昼行性哺乳動物における目覚めのレベルの制御のための極めて重要な脳中枢との関係性を示す図を示す。
【００４１】
【図１７】図１７は、以下の実施例２に詳述されるように、ＣＴ４において網膜の外顆粒層におけるバソプレシン（ＡＶＰ）の上方調節を示す画像を示し、左上のパネルは、ＰＫ２染色を示し、右上のパネルは、ＡＶＰ染色を示し、左下のパネルは、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ染色を示し、右下の画像は、他の３つのパネルの統合画像である。
【００４２】
【図１８】図１８は、以下の実施例２に詳述されるように、バソプレシン（ＡＶＰ）が、ｉｐＲＧＣにおいても発現されることを示し、左上のパネルは、ＰＫ２染色を示し、右上のパネルは、ＡＶＰ染色を示し、左下のパネルは、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ染色を示し、右下の画像は、他の３つのパネルの統合画像である。
【００４３】
【図１９】図１９は、以下の実施例２に詳述されるように、ＰＫＲＡを投与したサルと対照（アンタゴニストなし）とを対比した、睡眠時間のデータをグラフで示し、ＰＫ２受容体アンタゴニストの鼻腔内適用により、サルにおいて睡眠が促進されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
様々な図面における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【００４５】
詳細な説明
代替的な実施形態では、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすための組成物および方法であって、プロキネチシン２（ＰＫ２）の活性を修飾することができる化合物または組成物を、哺乳動物またはヒトに投与することを含む、組成物および方法が、提供される。本発明は、任意の特定の作用機序によって制限されるものではないが、例えば、ある特定の中枢神経障害、例えば、睡眠（ｓｅｅｐ）、気分障害、および概日リズムの調節と関連する他の神経精神障害の治療のための、内因性光感受性網膜神経節細胞に発現される受容体の活性もしくは活性化、または受容体シグナル伝達の阻害もしくは活性化の結果を標的とし、それを修飾する、組成物および方法が、提供される。
【００４６】
ＰＫ２が、内因性光感受性網膜神経節細胞（ｉｐＲＧＣ）に連結し、さらに、目覚めのレベルおよび睡眠／覚醒サイクルの調節のためにｉｐＲＧＣの脳内標的にシグナル伝達を行うことが、本明細書において初めて記載される。ｉｐＲＧＣの分子装置および戦略的な位置により、ｉｐＲＧＣは、概日時計情報および環境的明／暗条件を統合することが可能である。ｉｐＲＧＣは、特に、ヒトを含めた昼行性哺乳動物に関して、目覚めのレベルおよび睡眠覚醒サイクルの調節に極めて重要である、上丘などの脳中枢に投射する。本明細書において提供されるように、ｉｐＲＧＣ、特に、ｉｐＲＧＣに発現される受容体を薬理学的に標的とすることは、関連する中枢神経障害、特に、睡眠および気分障害、例えば、季節性情動障害および双極性障害を治療するための手段を提供する。
【００４７】
本明細書に記載されるように、活性がプロキネチシン２（ＰＫ２）シグナル伝達のモジュレーションによって修飾され得る内因性光感受性網膜神経節細胞（ｉｐＲＧＣ）が、覚醒状態および睡眠の調節に関して、昼行性哺乳動物における概日リズムの調節に極めて重要であることを示すデータが、本明細書において初めて記載される。覚醒状態および睡眠の調節のためにｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達をモジュレートするための方法が、本明細書において提供される。
【００４８】
本発明者らは、内因性光感受性網膜神経節細胞（ｉｐＲＧＣ）に、周囲明暗条件下において昼行性動物の主概日時計のうちの１つが存在することを発見した。特に、時計出力分子であるプロキネチシン２（ＰＫ２）が、マウス（図３）およびサル（図４）のｉｐＲＧＣに発現されることを示した。ｉｐＲＧＣは、光マスキング（ｌｉｇｈｔ  ｍａｓｋｉｎｇ）および光同調（ｌｉｇｈｔ  ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ）を媒介する光チャネルである。ｉｐＲＧＣは、それ自体の感光色素を介して直接的に光を感知し、網膜の外節における古典的な光受容体を介して間接的に光を感知する。ｉｐＲＧＣからのＰＫ２シグナル伝達は、視交叉上核（腹側ＳＣＮ）の網膜受容（ｒｅｔｉｎｏｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）コンパートメントに到達し、さらには、中脳の上丘（ＳＣ）に到達する。マウスの脳において、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）は、網膜受容ＳＣＮに強く発現されるが、ＳＣには本質的に不在であり、したがって、ＰＫ２シグナル伝達は、主として、ｉｐＲＧＣ−ＳＣＮ経路を通じて送られる。対照的に、ＰＫＲ２は、サルの脳の網膜受容腹側ＳＣＮには発現されないが、ＳＣの網膜受容浅層に強力に発現される。したがって、サルにおけるｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達は、ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路を介して送られる。全体として、ＰＫ２シグナル伝達は、昼行性サルの目覚めのレベルにとっては刺激性であり、夜行性マウスにとっては阻害性である（図８、以下の実施例１を参照されたい）。
【００４９】
ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路は、後外側／視床枕を通じた経路を通る皮質野への投射を介して、または脳幹における網様体賦活系を介して、目覚めのレベルをモジュレートする。ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路のＰＫ２シグナル伝達は、夜行性マウスおよび昼行性サルの両方の目覚めのレベルにとって刺激性である可能性が高い。光によるｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路の目覚め刺激は、ラットおよびマウスなどの夜行性動物においては、比較的小さい（短時間であり、持続するものではない）可能性が高い。これは、マウスの脳のＳＣにおけるＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）発現の不在と一致している。ＳＣの全体的なサイズ、視床の外側陽性／視床枕複合体、および関連する皮質は、すべてが、霊長類などの昼行性哺乳動物において、マウスなどの夜行性哺乳動物と比較して、有意に拡大および拡張されていることに、留意されたい。ＳＣＮ（腹側および背側の両方）におけるＰＫ２経路は、覚醒中枢、例えば、視床下部の腹外側視索前核、外側視床下部、および青斑核に、直接的または間接的に、投射する可能性が高い。ｉｐＲＧＣ−ＳＣＮ経路のＰＫ２シグナル伝達経路は、ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を含め、夜行性マウスの目覚めのレベルにとっては、明らかに阻害性である。本発明者らの発見により、哺乳動物の昼行性／夜行性の決定が、脳内標的へのｉｐＲＧＣの差次的シグナル伝達によって媒介されることが明らかとなった。サルのＳＣＮにおけるＰＫ２は、マウスのものと同じ相で発振することが公知である（Ｂｕｒｔｏｎら、２０１６年）。
【００５０】
製品およびキット
（１）プロキネチシン２（ＰＫ２）活性を修飾するため、（２）ＰＫＲ２（ＰＫ２受容体）を修飾するため、（３）任意選択でバソプレシン受容体（ＶＲ）がＶ１ａもしくはＶ１ｂ型のＶＲである、ＶＲ活性を修飾するため、または（４）メラトニン受容体（ＭＲ）活性を修飾するための、本明細書において提供される治療組合せ物、または本明細書において提供される化合物もしくは組成物、例えば、医薬組成物を含む、製品およびキットであって、任意選択で、この組合せ物が、ＰＫＲ２およびＶＲ、ＰＫＲ２およびＭＲ、ＰＫＲ２およびＰＫ２、ＶＲおよびＰＫ２、ＭＲおよびＰＫ２、またはＰＫＲ２、ＶＲ、およびＭＲのアゴニストまたはアンタゴニストを含む、製品およびキットが提供される。
【００５１】
代替的な実施形態では、キットは、本明細書に提供される方法を実施するための説明書をさらに含む。
【００５２】
本発明は、本明細書に記載される実施例を参照してさらに説明されるが、しかしながら、本発明は、そのような実施例に制限されないことを理解されたい。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
哺乳動物の昼行性および夜行性の決定のための新規な神経および分子機序
本実施例は、本明細書に提供される通りの方法が、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすために有効であることを実証する。哺乳動物の昼行性および夜行性の決定のための新規な神経および分子装置が、本明細書において初めて記載される。本明細書において、これまでは視交叉上核の概日時計の出力分子として示されていたプロキネチシン２（ＰＫ２）が、内因性光感受性網膜神経節細胞において発現されること、ならびにＰＫ２シグナル伝達が、マウスにおいて光による活性および目覚めの抑制に必要とされることを、実証する。夜行性マウスと昼行性サルとの間で、ＰＫ２のシグナル伝達受容体は、内因性光感受性網膜神経節細胞の脳内投射標的である網膜受容視交叉上核および上丘において差次的に発現されることが示されている。選択的アンタゴニストによる遮断により、夜行性マウスおよび昼行性サルの目覚めのレベルに対して、それぞれ、阻害性および刺激性のＰＫ２シグナル伝達の作用が明らかとなる。したがって、哺乳動物の昼行性または夜行性は、内因性光感受性網膜神経節細胞からの網膜受容脳内標的へのＰＫ２の差次的なシグナル伝達によって、決定される。
【００５４】
この実施例において、これまでは重要なＳＣＮ出力シグナルとして示されていた分子であるＰＫ２が、内因性光感受性網膜神経節細胞（ｉｐＲＧＣ）において、メラノプシン（ＯＰＮ４）と共発現されることを示す。さらに、ＰＫ２シグナル伝達が、マウスにおける持続的な光誘導性の活性抑制および睡眠誘導に必要とされることを示す。ＰＫ２アンタゴニストによる遮断は、夜行性マウスおよび昼行性サルにおける目覚めのレベルに対して、対照的なＰＫ２シグナル伝達作用を示した。夜行性マウスと昼行性サルとの間で観察されたｉｐＲＧＣの網膜受容脳内標的におけるＰＫ２シグナル伝達受容体の差次的発現と合わせると、哺乳動物の昼行性／夜行性の決定は、ＳＣＮ時計の上流にある網膜−脳入力経路間に存在する可能性が高い。
【００５５】
結果
１．ＰＫ２シグナル伝達は、マウスにおける自発運動活性および目覚めの持続的な光誘導性抑制に必要とされる。
ＰＫ２（ＰＫ２−／−）またはその受容体（ＰＫＲ２）のいずれかの遺伝子が欠損したマウスは、恒暗条件下において、低減された自発運動活性の概日リズムを有した２９、３０。ＰＫ２−／−マウスが、明／暗（ＬＤ）サイクル下において、日中の自発運動活性の増加も示したことを観察したが、これは、これまでの明期間中のＰＫ２−／−マウスにおける覚醒状態の増加の観察と一致する３１。これらの観察により、光の抑制作用が、ＰＫ２シグナル伝達の不在下において異常となることが示唆された。したがって、ＰＫ２−／−マウスにおける自発運動活性および目覚めのレベルに対する光パルスの抑制作用を試験した。光パルス（１５０ルクス）を、暗期間の半ば（ＺＴ１６〜ＺＴ１８．５）に野生型マウスに与えた場合、自発運動活性が、有意に抑制された（図１Ａ）。対照的に、ＰＫ２−／−マウスについては、光パルスによって自発運動活性のわずかな抑制のみが観察された（図１Ａおよび挿入図）。予測したとおり、ＥＥＧ／ＥＭＧ記録により、光パルスが、野生型マウスにおいては覚醒状態を抑制したことが判明した（図１Ｂおよび挿入図）。ＰＫ２−／−マウスについては、光による覚醒状態の抑制は、最初の３０分間のみ有意であった（図１Ｂ）。したがって、光は、依然としてＰＫ２−／−マウスにおいて覚醒状態を抑制することができたが、抑制作用は維持されなかった。
【００５６】
薄明かりを用いた自発運動活性および目覚めのレベルに対する光の抑制作用を、さらに調査した。通常のおよそ１５０ルクスの照明条件がＺＴ１２において終了する直前に、光の強度を、ＺＴ１２〜ＺＴ１６に対応する４時間の間、約３０ルクスに弱めた。この低減された照明は、野生型マウスの自発運動活性を継続的に抑制した（図２Ａおよび挿入図）。対照的に、ＰＫ２−／−マウスは、光強度の低減に応答して極めて強い自発運動活性を示し、暗状態下のものにほぼ匹敵する活性レベルを達成した（図２Ａ）。この観察は、１日の後半における活性の高い恒常性作動性では、薄明かりは、もはやＰＫ２−／−マウスにおける自発運動活性を顕著に抑制することができなかったことを示した。ＥＥＧ／ＥＭＧ記録により、この薄明かり処置により、対応する目覚めのレベルが影響を受けることが確認された。野生型マウスについては、薄明かりのこの４時間の間、覚醒が維持された時間は、暗状態下よりも大いに低減され、薄明かりの強力な睡眠誘導作用が明らかとなった（図２Ａ）。ＰＫ２−／−マウスについては、薄明かり下および暗状態下における覚醒状態の時間は、非常に類似しており、ＰＫ２シグナル伝達の不在下における薄明かりによるわずかな目覚めの阻害のみが示された（図２Ｂ）。
【００５７】
２．内因性光感受性網膜神経節細胞におけるＰＫ２の発現
ＰＫ２−／−マウスにおける目覚めのレベルおよび自発運動活性の光による抑制作用の減少は、ＰＫ２シグナル伝達が、ｉｐＲＧＣ−脳神経経路に関与する可能性が高いことに関係することを示すが、これは、ｉｐＲＧＣが、自発運動活性の抑制および睡眠の誘導を含む、非視覚的な光の機能の中枢的な伝達のための光チャネルとして示されていたためである２２、２３、２４、２５、３２、３３。したがって、ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２の発現の可能性について試験した。図３Ａおよび図７）に示されるように、ＰＫ２は、一部の網膜神経節細胞において強力に発現される。さらなる共免疫染色研究により、すべてのＯＰＮ４陽性網膜神経節細胞が、ＰＫ２を発現することが示された（２８／２８細胞、図３）。ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２およびＯＰＮ４のおよそ１００％の共発現は、ｉｐＲＧＣのＰＫ２が、ＳＣＮおよび脳の他の非視覚的な光の機能領域、例えば、上丘に投射することを示した３４、３５、３６。
【００５８】
３．夜行性マウスと昼行性サルとの間における、内因性光感受性網膜神経節細胞の脳内標的におけるＰＫ２受容体の差次的発現
夜行性マウスにあるように、ＰＫ２の発現は、昼行性サルの網膜神経節細胞においても検出された（図４Ａ）。また、マウスのものと一致して、ＰＫ２は、サルｉｐＲＧＣにおいてＯＰＮ４と共発現される（図４Ｂ／Ｄ）。重要なことに、ＳＣＮコンパートメントにおける、脳内ＰＫ２受容体であるＰＫＲ２の差次的発現が、夜行性マウスおよび昼行性サルで観察された。マウスの脳において、ＰＫＲ２は、ＳＣＮの腹側および背側の両方のコンパートメントを含め、ＳＣＮ全体に発現される（図５Ｂ）６、３７。腹側ＳＣＮは、網膜受容である、すなわち、光マスキングおよび概日時計同調に関する網膜入力を受けることが、示されている９、３８。マウスにおける網膜受容ＳＣＮにおけるＰＫＲ２の発現は、マウスの腹側ＳＣＮが、ｉｐＲＧＣからのＰＫ２シグナルに応答する可能性が高いことを示す。本発明者らのこれまでの電気生理学研究では、ＰＫ２が、ＰＫＲ２を発現するニューロンの電気活性を増加することが示されている３９、４０。サルの脳において、ＰＫＲ２は、背側ＳＣＮにおいてのみ発現され、腹側ＳＣＮにおいては検出されない（図５Ａ）。夜行性動物にあるように、腹側ＳＣＮは、ＳＣＮ時計の網膜受容コンパートメントとして示されている３８、４１。腹側ＳＣＮにおけるＰＫＲ２発現の不在は、サルのＳＣＮが、ｉｐＲＧＣからのＰＫ２シグナルに応答することができないことを示す。マウスの脳とサルの脳との間で異なるＰＫＲ２の発現はまた、別の重要な非視覚的なｉｐＲＧＣの脳内標的である上丘（ＳＣ）においても観察された３４、３５、３６。図５Ｃに示されるように、ＰＫＲ２は、サルの脳において、ＳＣの浅層に強く発現された。ＳＣの浅層は、ｉｐＲＧＣを含め、網膜神経節細胞からの入力を受けることが公知である３４、３５、３６。対照的に、ＰＫＲ２発現は、マウスの脳のＳＣにおいては検出されておらず（図５Ｄ）、マウスにおいてはｉｐＲＧＣ−ＳＣを介したＰＫ２シグナル伝達が不在であることを示した。
【００５９】
４．夜行性マウスおよび昼行性サルにおける目覚めのレベルに対するＰＫ２遮断の対照的な作用
次に、マウスおよびサルにおける目覚めのレベルに対する合成ＰＫ２アンタゴニストであるＰＫＲＡ８３の作用を試験した。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、ＰＫＲＡ８３の投与により、マウスにおける自発運動活性および覚醒状態が有意に増加した。これらの結果は、これまでのＰＫ２−／−マウスにおける覚醒状態の増加の観察と一致している３１。したがって、ＰＫ２シグナルは、夜行性マウスの目覚めのレベルにとって、全般的に阻害性である。対照的に、サルにおけるＰＫ２アンタゴニストの投与は、睡眠時間の有意な増加（７０分を上回る）をもたらし（図６Ｃ）、ＰＫ２シグナルが、昼行性サルにおける目覚めのレベルにとっては、刺激性であることが示された。
【００６０】
結論
ＰＫ２が、中枢的に投射するｉｐＲＧＣにおいて発現されることを示した。ｉｐＲＧＣは、非視覚的な光の機能の中枢的な伝達のための唯一の光チャネルであるため、ＰＫ２−／−マウスにおける持続的な光誘導性の活性抑制および睡眠誘導の不在は、ｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達が、夜行性マウスにおける目覚めの調節に対する光の作用を伝達することに極めて重要であることを示す。ＰＫ２アンタゴニストの投与を介したＰＫ２シグナル伝達の遮断は、目覚めのレベルに対するＰＫ２シグナルの対照的な作用を示した：夜行性マウスにとっては阻害性であり、昼行性サルにとっては刺激性である。まとめると、これらの結果は、夜行性および昼行性の分岐の機序が、脳内標的への差次的なｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達にあることを示す（図８）。
【００６１】
ｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達は、ｉｐＲＧＣの脳内標的、特に、ＳＣＮおよびＳＣへの到達を介して、目覚めのレベルを調節する可能性が高い。ＳＣＮの網膜受容コンパートメントおよびＳＣの網膜受容浅層におけるＰＫ２受容体（ＰＫＲ２）の差次的発現は、したがって、夜行性マウスと昼行性サルとの間で対照的な目覚めのレベルに対する光の作用の基礎となっている可能性がある。マウスの脳において、ＰＫＲ２は、網膜受容ＳＣＮには強く発現されるが、ＳＣには不在であり、ｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達は、したがって、夜行性マウスにおいて、目覚めを阻害するｉｐＲＧＣ−ＳＣＮ経路を通じて送られる。対照的に、ＰＫＲ２は、サルの脳の網膜受容腹側ＳＣＮには発現されないが、ＳＣの網膜受容浅層においては強力に発現され、したがって、ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路が、昼行性サルでは優勢である。
【００６２】
ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路のＰＫ２シグナル伝達は、目覚めのレベルにとって刺激性である可能性が高い。ＳＣは、これまでに、光誘導性の目覚めまたは目覚めの増加と緊密に関係する他のより高次な脳の機能、例えば、注意の極めて重要な中核として示されている４２、４３、４４、４５。ＳＣは、視床の後外側／視床枕複合体を通じた経路を通る皮質への上行性投射を介して、光作動性の目覚めを媒介し得る４６、４７。あるいは、ＳＣは、上行性賦活系の重要な構成要素である中脳網様体への下行性投射を介して目覚めを促進し得る４２、４３、４４、４５。サルにおいて、ＳＣの両側病変部は、光に対する応答を含め、目覚めのレベルに劇的に影響を及ぼすことが見出されている４２。ラットにおける病変部研究により、ＳＣが、光フラッシュに応答したＥＥＧ脱同調（目覚め）に重要であることが判明している４３。このラット病変部研究は、ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路が、光フラッシュに応答して少なくとも一時的に、夜行性動物の目覚めのレベルにとって刺激性となり得ることを示唆する。全体として、阻害性ｉｐＲＧＣ−ＳＣＮ経路が優勢となるため、光は、夜行性動物の目覚めのレベルにとっては阻害性である。夜行性動物と比較して、ＳＣの全体的なサイズ、視床の後外側／視床枕複合体、および関連する皮質は、すべてが、霊長類などの昼行性哺乳動物種において、有意に拡大および拡張されていることが、周知である４８、４９。哺乳動物種は、夜行性から始まったと考えられるため５０、哺乳動物の昼行性は、目覚めを刺激する網膜−ＳＣ経路の増強および同時に発生する目覚めを阻害する網膜−ＳＣＮ経路の減少によって進化する可能性がある。このモデルは、夜行性／昼行性の決定が、ＳＣＮ概日時計の上流に存在し、したがって、ＳＣＮ時計の下流の多様なシグナル伝達は、必要でない可能性があることを示す。
【００６３】
方法
動物：混合した遺伝的バックグラウンドのＰＫ２−／−マウスおよびその同腹の野生型対照を、記載されるように生成した２９、３１。マウスは不断食餌し、午前７：００（ツァイトゲーバー時間ＺＴ０、明期間ＺＴ０〜ＺＴ１２）に点灯し、午後７：００（ＺＴ１２、暗期間ＺＴ１２〜ＺＴ０）に消灯する、光（およそ１５０ルクスの白色光）を用いた規則的な明／暗サイクルで、収容した。すべての動物の手順は、適切な動物実験委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認を受けた。
【００６４】
マウスにおける自発運動活性の測定および分析：自発運動活性のモニタリングを、記載されるように行った２９。簡単に述べると、マウスを、自発運動活性のモニタリングのために、赤外光線を備えるケージに個別に収容した（ＡｃｃｕＳｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）。マウスを、規則的な１２時間の明（およそ１５０ルクスの白色光）：１２時間の暗サイクルで収容した。自発運動活性を、１０分間隔当たりの計数として記録し、３０分または６０分のピン（ｐｉｎ）で分析した。光パルスまたは薄明かりを、示された強度で与えた。
【００６５】
マウスにおける目覚めのレベルの測定および分析：脳波記録法（ＥＥＧ）および筋電図（ＥＭＧ）のシグナルを記録するための電極を、記載されるように埋め込んだ２９、３１。マウスを、ＥＥＧ／ＥＭＧシグナルの収集のために、テザー／整流器システムのスイベルシステム（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ、Ｒｏａｎｏｋｅ、ＶＡ）に接続した。ＥＥＧ／ＥＭＧシグナルを、Ｇｒａｓｓ  Ｍｏｄｅｌ７８（商標）（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｗａｒｗｉｃｋ、ＲＩ）を使用して増幅させ、フィルタリング（ＥＥＧ：０．３〜１００Ｈｚ、ＥＭＧ：３０〜３００Ｈｚ）した後、１２８Ｈｚのサンプリング速度でデジタル化し、コンピュータに記憶した。睡眠データを収集した後、ＥＥＧ／ＥＭＧ記録を、ＳｌｅｅｐＳｉｇｎ（商標）ソフトウェアの睡眠スコアリングシステム（Ｋｉｓｓｅｉ  Ｃｏｍｔｅｃ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を記載されるように用いて、スコアリングした３１。マウスを、規則的な１２時間の明／１２時間の暗サイクルで収容した。光パルスまたは薄明かりを、示された強度で与えた。
【００６６】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの手順は、記載されるのと同様に行った６、７。組織切片を、−２０℃で切断した後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄し、空気乾燥させ、使用するまで−２０℃で保管した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、切片を、室温で乾燥させた後、プロテイナーゼＫ（１μｇ／ｍｌ）の予備処置を行った。切片を、次いで、空気乾燥させ、６０℃で１８時間インキュベートすることによって、Ｓ３５標識したリボプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に、組織切片を、ＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処置し、塩濃度を減少させるための洗浄およびハイストリンジェンシー（６８℃）洗浄を行った。脱水および空気乾燥の後、組織切片を、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ（商標）フィルムに曝露した。画像分析システム（ＭＣＩＤ、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、画像を捕捉した。
【００６７】
免疫組織化学検査：これまでの刊行物に従って、免疫組織化学検査を行った５１、５２。網膜切片を、コーティングされたガラススライドに載置した。切片を、ＰＢＳ中で２０分間再水和した後、２％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有するブロッキング緩衝液中に１時間浸漬させた。ＰＫ２に対する一次抗体（ハムスターモノクローナル、１：２００、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）またはＯＰＮ４に対する一次抗体（親和性精製したウサギポリクローナル、１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、４℃で一晩、切片に添加した。スライドを、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで、５分間ずつ５回洗浄した。次いで、抗ウサギまたは抗ハムスター二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８または５５５、１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を適用した後、１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ）とともに、室温で５分間インキュベートして、核を染色した。切片を、Ｎｉｋｏｎ倒立蛍光顕微鏡（Ｍｏｄｅｌ  ＴＥ−２０００Ｕ（商標）、株式会社ニコン、東京、日本）下で確認した。画像を、ＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）で捕捉した。ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）免疫染色のために、切片を、抗ＰＫ２抗体（ハムスターモノクローナル、１：５００希釈）抗体とともにインキュベートした後、ビオチン化抗ハムスター二次抗体とともにインキュベートした。ＤＡＢ免疫染色の発色現像を、標準的なＡＢＣ方法を用いて行った５２。
【００６８】
マウスおよびサルにおける活性または目覚めのレベルに対するＰＫ２アンタゴニストの作用を試験する薬理学的実験：
ＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ８３）を、記載されるのと同様に調製した５３。ＰＫＲＡ８３（４０ｍｇ／ｋｇ）を、ＺＴ６においてマウスに腹腔内投与した。ＰＫＲＡ８３（１０ｍｇ／ｋｇ）を、ＺＴ１０においてサルに筋肉内投与した。薬理学的実験のために、動物を、ビヒクルまたはアンタゴニストのいずれかで処置した後、１週間後に逆の処置によりクロスオーバーを行って、対応する対照を形成した。
【００６９】
ＰＫ２アンタゴニストまたは対照で処置したマウスの睡眠および活性のデータを、ＰＫ２−／−マウスについて記載されるように取得し、分析した。サルの睡眠研究については、若齢成体サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、標準的な明（白色光、約２５０ルクス）および暗のサイクル下で収容した。サルにおける目覚めのレベルの測定および分析を、以下のように行った。これまでにヒト対象５４、５５、５６、５７および非ヒト霊長類５８に関して記載されているものに類似の着用可能な無線睡眠トラッカーを、使用した。この無線システムにより、サルに対する妨害を最小限に抑えながら長時間外来環境のサルの睡眠／覚醒の状態を遠隔でモニタリングすることが可能となった。無線睡眠トラッカーから得られた睡眠データを、赤外線ビデオカメラの同時記録とともに検証した。睡眠トラッカーの睡眠データを、動物ケージから約１０メートル離れて設置した携帯電話を用いて、サルと物理的に接触することなく毎日取り出した。これまでの研究は、睡眠トラッカーによって得られた睡眠データ、ビデオカメラ、ＥＥＧ／ＥＭＧ方法によって得られた古典的な睡眠／覚醒データの優れた一致を示している５４、５７、５９。
【００７０】
統計学：超概日リズム（ｕｌｔｒａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ）に起因するデータ変動の影響を低減するために、マウスの自発運動活性およびＥＥＧ／ＥＭＧの測定を、２回行い、これらの２回の測定の平均値を、統計学的分析に使用した。統計学的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０（商標）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した一方向または二方向ＡＮＯＶＡによって行った後、適切な事後検定を行った。
【００７１】
図の凡例
図１Ａ．自発運動活性および目覚めのレベルに対する光パルスの作用。白色のバーは、ＺＴ１６〜ＺＴ１８．５（２．５時間）の間に、野生型（Ｎ＝６匹）およびＰＫ２−／−マウス（Ｎ＝７匹）に与えた光パルス（１５０ルクス）を示す。分析ビンのサイズは、３０分であり、値は、平均±標準誤差である。Ａ．光パルスにより、野生型マウスにおいて自発運動活性が有意に阻害された（Ｐ＜０．０１、二方向ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニの事後検定による）。ＰＫ２−／−マウスの自発運動活性に対する光パルスの作用は、有意ではなかった（Ｐ＞０．０５、二方向ＡＮＯＶＡ）。挿入図は、２．５時間全体における自発運動活性を示す（＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００７２】
図１Ｂ．光パルスにより、野生型マウスにおいて覚醒時間が有意に減少した（Ｐ＜０．０００１、二方向ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ボンフェローニの事後検定による）。ＰＫ２−／−マウスの目覚めのレベルに対する光パルスの阻害性作用は、最初の３０分間のみ有意であった（Ｐ＜０．０５、二方向ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニの事後検定による）。挿入図は、２．５時間全体の覚醒分数を示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。２．５時間全体における目覚めのレベルに対する光パルスの阻害性作用は、ＰＫ２−／−マウスでは有意でなかった（Ｐ＞０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００７３】
図２Ａ．自発運動活性および目覚めのレベルに対する薄明かりの作用。灰色のバーは、ＺＴ１２〜ＺＴ１６の間に、野生型（Ｎ＝６匹）およびＰＫ２−／−マウス（Ｎ＝７匹）に与えた４時間の薄明かり（３０ルクス）を示す。Ａ．暗状態と比較して、薄明かりにより、野生型マウスにおいて自発運動活性が有意に減少した（Ｐ＜０．０００１、二方向ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ボンフェローニの事後検定による）。自発運動活性に対する薄明かりの阻害性作用は、ＰＫ２−／−マウスでは有意ではなかった（Ｐ＞０．０５、二方向ＡＮＯＶＡ）。挿入図は、４時間全体における自発運動活性を示す（＊＊Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。
【００７４】
図２Ｂ．暗状態と比較して、薄明かりにより、野生型マウスにおいて目覚めのレベルが有意に減少した（Ｐ＜０．０００１、二方向ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ボンフェローニの事後検定による）。ＰＫ２−／−マウスの目覚めのレベルに対する薄明かりの阻害性作用は、最初の３０分間のみ有意であった（Ｐ＜０．０５、二方向ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニの事後検定による）。
【００７５】
図３．マウス網膜の網膜神経節細胞におけるＰＫ２およびＯＰＮ４の共発現。ＰＫ２免疫染色は、緑色として示し（Ａ）、一方でＯＰＮ４蛍光免疫標識は、赤色で示す（Ｂ）。核対比染色は、青色として示す（Ｃ）。網膜神経節細胞におけるＰＫ２およびＯＰＮ４の共発現が、明らかである（Ｄ）。ＰＫ２およびＯＰＮ４によって強力に免疫染色された２つの細胞を、示す。スケールバー、４０μｍ。
【００７６】
図４．サル網膜の網膜神経節細胞におけるＰＫ２およびＯＰＮ４の共発現。ＰＫ２免疫標識は、緑色として示し（Ａ）、一方でＯＰＮ４蛍光免疫標識は、赤色として示す（Ｂ）。核対比染色は、青色として示す（Ｃ）。網膜神経節細胞におけるＰＫ２およびＯＰＮ４の共発現が、明らかである（Ｄ）。挿入図は、代表的な陽性細胞のより高倍率の画像を示す。スケールバー、２０μｍ。
【００７７】
図５．マウスおよびサルの脳の網膜受容標的におけるＰＫＲ２  ｍＲＮＡの差次的発現。Ａ．サルの脳の視交叉上核（ＳＣＮ）の背側コンパートメントにおけるＰＫＲ２  ｍＲＮＡの検出。腹側ＳＣＮには検出されない。Ｂ．マウスの脳におけるＳＣＮ全体、腹側および背側の両方のコンパートメントにおけるＰＫＲ２  ｍＲＮＡの検出。Ｃ．サルの脳の上丘（ＳＣ）の浅層におけるＰＫＲ２  ｍＲＮＡの検出。Ｄ．マウスの脳のＳＣにおけるＰＫＲ２  ｍＲＮＡの不在。マウスおよびサルの両方の脳の背側縫線核（ＤＲ）におけるＰＫＲ２の発現に留意されたい。スケールバー、１ｍｍ。
【００７８】
図６．マウスおよびサルにおける自発運動活性および目覚めのレベルに対するＰＫ２アンタゴニストＰＫＲＡ８３の差次的作用。Ａ．ＰＫＲＡ８３により、マウスの自発運動活性が有意に増加した（Ｎ＝１６匹、Ｐ＜０．０５、二方向ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニの事後検定による）。Ｂ．ＰＫＲＡ８３により、マウスの覚醒時間が有意に増加した（Ｎ＝６匹、二方向ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニの事後検定による）。ＡおよびＢの挿入図は、ＰＫＲＡ８３により、それぞれ、６時間の日中の期間の間に、自発運動活性および覚醒分数が増加したことを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。Ｃ．ＰＫＲＡ８３により、サルの睡眠時間が有意に増加した（Ｎ＝９匹、＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００７９】
図７．マウス網膜の網膜神経節細胞におけるＰＫ２の発現。ＰＫ２免疫標識は、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）によって現像した。Ａ．１つが変位しておらず、１つが変位している、２つのＰＫ２陽性網膜神経節細胞の例を、矢印で示す。Ｂ．ヘマトキシリン対比染色によるＰＫ２  ＤＡＢ免疫染色。１つが強力に染色され、１つがより中等度に染色された、２つのＰＫ２陽性網膜神経節細胞の例を、矢印で示す。スケールバー、２０μｍ。
【００８０】
図８．脳内標的に対するｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達の差次的な目覚め調節を示す図。ＰＫ２は、中枢的な非視覚の光の機能を伝達する唯一の光チャネルであるｉｐＲＧＣにおいて発現される。全体として、ＰＫ２シグナル伝達は、アンタゴニスト遮断およびＰＫ２欠損性によって示されるように、昼行性サルにとっては刺激性であり、夜行性マウスにとっては阻害性である。網膜受容腹側ＳＣＮおよびＳＣの浅層におけるＰＫＲ２の差次的発現は、ｉｐＲＧＣのＰＫ２シグナル伝達が、マウスおよびサルについて、それぞれ、ｉｐＲＧＣ−ＳＣＮおよびｉｐＲＧＣ−ＳＣを通じて送られることを示す。夜行性動物については、ｉｐＲＧＣ−ＳＣ経路を介した光による目覚めの刺激は、わずかであり（一過的であり、持続するものではない）、マウスの脳のＳＣにおけるＰＫＲ２の不在と一致する。ｉｐＲＧＣＳＣＮ経路のＰＫ２シグナル伝達は、夜行性マウスにとっては明らかに阻害性であるが、昼行性動物にとって阻害性であるか刺激性であるかははっきりしない。実際に、主概日時計としてのＳＣＮを裏付ける根拠は、夜行性動物では極めて強力であるが、そのような主張は、実際には、昼行性動物の事例では裏付ける根拠が限られている。リスザルにおけるＳＣＮ病変による睡眠の増加に関してよく引用される文献は、ＳＣＮが昼行性動物の目覚めを促進すると解釈されるが、これは、網膜視床下部路に同時発生した病変部によって説明することができる。本発明者らのモデルは、哺乳動物の昼行性／夜行性の決定が、脳内標的に対するｉｐＲＧＣの差次的なシグナル伝達によって媒介され、したがって、ＳＣＮの下流の多様なシグナル伝達機序は、必要でない可能性があることを示す。
【００８１】
（実施例２）
ＰＫ２は、ｉｐＲＧＣの脳への接続のためのシグナル分子としての機能を果たす
この実施例では、ＰＫ２が、哺乳動物の覚醒状態および睡眠を調節するｉｐＲＧＣにおける概日時計の出力分子としての機能を果たすこと、ならびにＰＫ２アンタゴニストが、睡眠を誘導または促進することを示す研究について記載する。
【００８２】
網膜における概日時計は、大部分が、局所的な生理学および機能、例えば、網膜電図増幅および視細胞外節盤（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｄｉｓｋ）のファゴサイトーシスを調節すると考えられている。本発明者らの発見により、ＰＫ２が、哺乳動物の覚醒状態および睡眠を調節するｉｐＲＧＣにおける概日時計の出力分子としての機能を果たすことが判明した。
【００８３】
網膜の外顆粒層におけるＰＫ２の発現は、継続的な暗状態の間に増加することが見出された。図９に示されるように、網膜の外顆粒層におけるＰＫ２の発現は、ＣＴ４において、ＺＴ４よりもはるかに高い。細胞計数により、ＺＴ４において、ＰＫ２陽性であった光受容器の割合が、およそ０．１％であったことが判明した。ＣＴ４において、ＰＫ２陽性光受容器の割合は、およそ２％に増加し、ＰＫ２陽性細胞が、錐体である可能性が高いことを示した。図９は、ＺＴ４（パネルＡ）と比較して、ＣＴ４（パネルＢ）において、網膜の外顆粒層におけるＰＫ２の上方調節を示す画像を示す。図９において、ＺＴ４（パネルＡ）と比較して、ＣＴ４（パネルＢ）において、網膜の外顆粒層におけるＰＫ２の上方調節が示されている。ＰＫ２の免疫染色が示されており、枠内の領域は、マウス網膜の外節を示す。核の対比染色が、青色として示されおり、ＺＴ４（パネルＡ）と比較して、ＣＴ４２３（パネルＢ）におけるＰＫ２の上方調節が、明らかである。哺乳動物の網膜の外顆粒層におけるＰＫ２の上方調節は、暗状態の間の光受容器の神経活性の増加と関連している可能性がある。
【００８４】
ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２発現は、明暗条件下において、Ｂｍａｌ１依存性様式で、発振することがさらに示された（図１０）。野生型マウスにおいて、ｉｐＲＧＣにおけるピークおよびトラフＰＫ２レベルは、それぞれ、およそＺＴ４およびＺＴ２０であった。対照的に、Ｂｍａｌ１欠損マウスのｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２レベルは、一定して低く、明らかなＰＫ２の発振は観察されなかった。それぞれおよそＺＴ４およびおよそＺＴ２０におけるピークおよびトラフのタイミングを含む、ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２レベルの発振相は、ＳＣＮ時計において観察されたＰＫ２の発振に非常に類似であり、同じ分子発振体による調節を示す。合わせると、これらの結果は、ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２の発振性発現が、時計依存性プロセスであることを示す。
【００８５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＰＫ２受容体であるＰＫＲ２が、ある特定の網膜神経節細胞において発現されることを示す（図１１）。ＰＫＲ２発現は、網膜神経節細胞においてのみ検出され、双極細胞においては検出されない。網膜神経節細胞の層におけるこれらのＰＫＲ２陽性細胞の存在度および直径の特性は、これらのＰＫＲ２陽性細胞が、ｉｐＲＧＣであることを示す。図１１は、ある特定の網膜神経節細胞においてＰＫＲ２の発現を示す画像を示す。図１１において、ある特定の網膜神経節細胞におけるＰＫＲ２の発現を示す。ＰＫＲ２  ｍＲＮＡは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出される。パネルＡは、網膜神経節細胞層におけるＰＫＲ２シグナルを示し、枠内の領域のより高倍率の画像を、パネルＢに示す。パネルＢにおいて、ＰＫＲ２陽性である個々の網膜神経節細胞が、明らかである。パネルＣおよびＤは、それぞれ、パネルＡおよびＢに対応する眼切片のＮｉｓｓｌ染色を示す。
【００８６】
図１２に示されるように、目覚めのレベルは、深夜の間、特に、ＺＴ２０〜ＺＴ２４（光点灯前の４時間の期間）の間に、ＰＫ２欠損（ＰＫ２−／−）マウスにおいて、増加した。したがって、ＰＫ２シグナルは、この期間の間に、マウスにおいて、目覚めのレベルを阻害する。図１２は、深夜の期間（ＺＴ２０〜ＺＴ２４）に、ＰＫ２−／−マウスにおいて覚醒状態の増加を示すデータをグラフで示す。
【００８７】
自発運動活性に対するＰＫ２アンタゴニストの作用を、野生型マウスにおいて試験した。図１３に示されるように、局所的な眼適用により深夜の間に送達されたＰＫ２アンタゴニストにより、マウスにおいて、自発運動活性が増加し、したがって、覚醒状態レベルが増加した。図１３は、ＰＫ２アンタゴニストの局所的な眼送達により、マウスの自発運動活性が増加したことを示すデータをグラフで示す。
【００８８】
図１４は、マウスの目覚めのレベルに対するＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ）の作用を示すデータをグラフで示す。日中におけるＰＫ２アンタゴニストの局所的な眼適用により、マウスの覚醒時間が有意に増加した（＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００８９】
目覚めのレベルに対するＰＫ２シグナル伝達の作用は、昼行性哺乳動物では、夜行性哺乳動物と比較して逆転するため、ＰＫ２シグナル伝達は、サルまたはヒトなどの昼行性対象において覚醒状態を刺激することである。ＰＫ２アンタゴニストは、マウスにおいて覚醒状態を増加させることが示されているため（図１４）、同じＰＫ２アンタゴニストは、サルなどの昼行性対象においては、覚醒状態を阻害する、すなわち、睡眠を促進することが予測される。図１４は、マウスの目覚めのレベルに対するＰＫ２アンタゴニスト（（３Ｒ）−１−（４−フルオロ−３−メトキシベンジル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミド、いわゆる「ＰＫＲＡ８３」）の作用をグラフで示す。ＰＫ２アンタゴニストの局所的な眼適用により、マウスの覚醒時間が有意に増加した（＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００９０】
局所的な眼送達により、サルにおける目覚めのレベルに対するＰＫ２アンタゴニストの作用を試験した。図１５に示されるように、ＰＫ２アンタゴニストの局所適用により、サルにおいて睡眠が促進される。図１５は、サルの睡眠に対するＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ８３）の作用を示すデータをグラフで示す。ＰＫ２アンタゴニストの局所的な眼適用により、サルの睡眠が有意に増加した（＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００９１】
ｉｐＲＧＣは、深夜からおよび日中全体の期間に、ＰＫＲ２を発現し、さらにはＰＫ２も発現するため、ＰＫ２はまた、ｉｐＲＧＣの樹状突起または軸索側枝から放出されて、隣接するｉｐＲＧＣにおいてＰＫＲ２受容体を活性化する可能性が高い、すなわち、ＰＫ２は、ｉｐＲＧＣの神経活性を連結する。したがって、本明細書において提供されるように、網膜におけるＰＫ２シグナル伝達を遮断する方法は、ＰＫ２シグナルの相の前進を有することが予測される睡眠相前進障害などの疾患状態については睡眠を促進するであろう。
【００９２】
本明細書において初めて提供されるデータは、ＰＫ２シグナル伝達が、図１６に概略的に示されるように、目覚めのレベルの調節のために、ｉｐＲＧＣの概日時計に連結し、続いてｉｐＲＧＣの脳内標的に連結することを示す。図１６は、ｉｐＲＧＣの戦略的な位置を、図として、概略的に示す。ｉｐＲＧＣは、明／暗および時計の情報を統合する。ＰＫ２は、夜行性および昼行性の哺乳動物における目覚めのレベルの制御のために、極めて重要な脳中枢に、ｉｐＲＧＣおよびｉｐＲＧＣの神経投射の連結のためシグナルを伝達する。
【００９３】
ｉｐＲＧＣの分子装置および戦略的な位置により、ｉｐＲＧＣは、概日時計情報および環境的明／暗条件を統合することが可能である。さらに、ｉｐＲＧＣは、目覚めのレベルおよび睡眠覚醒サイクルの調節に極めて重要である、上丘などの脳中枢に投射する。したがって、ｉｐＲＧＣおよび代替的な実施形態ではｉｐＲＧＣに発現される受容体を薬理学的に標的とする、本明細書において提供される方法を使用して、羞明、睡眠および気分障害、季節性情動障害、ならびに双極性障害を含む、ｉｐＲＧＣにより調節されるおよびそれに関連する中枢神経障害を治療、緩和、または予防することができる。
【００９４】
羞明は、網膜における光受容器の過剰刺激、または視神経に対する過剰な電気インパルス、または脳における過剰な応答によって引き起こされ得る。ＰＫ２は、非視覚の光の機能を脳に通信することに関与するため、ＰＫ２アンタゴニストを介したＰＫ２シグナルの軽減により、脳への光シグナルを弱めることになる。したがって、ＰＫ２アンタゴニストの投与は、羞明の症状を緩和、治療、または予防するのに有用である可能性が高い。
【００９５】
網膜の外顆粒層におけるバソプレシン（ＡＶＰ）もまた、図１７の画像に示されるように、継続的な暗状態の間に上方調節されることを示した。この図は、ＣＴ４において、ＰＫ２と同様に、網膜の外顆粒層におけるバソプレシン（ＡＶＰ）の上方調節を示す。図１８の画像に示されるように、ＰＫ２と同様に、バソプレシンもまた、ｉｐＲＧＣに発現される。この図は、ｉｐＲＧＣにおけるＰＫ２とバソプレシン（ＡＶＰ）との共局在化を示す。したがって、ｉｐＲＧＣ、および続いてｉｐＲＧＣから極めて重要な脳内標的への連結のための、ＰＫ２およびバソプレシンの並行したシグナル伝達が存在すると考えられる。したがって、ｉｐＲＧＣに発現されるバソプレシン受容体の薬理学的操作もまた、関連する中枢神経障害、特に、睡眠および気分障害（季節性情動障害および双極性障害）を治療するのに有用であろう。
【００９６】
ＰＫ２受容体アンタゴニストの鼻腔内適用によってもサルにおける睡眠が促進されたことを、示した（図１９）。この局所経路で送達されるＰＫ２受容体アンタゴニストは、脳内に入り、ｉｐＲＧＣからのＰＫ２投射によって支配されている上丘などの重要な核においてＰＫ２受容体を遮断することができる可能性が高い）。図１９は、サルの睡眠に対するＰＫ２アンタゴニスト（ＰＫＲＡ）の作用を示すデータをグラフで示す。ＰＫ２受容体アンタゴニストの局所的な鼻内適用により、サルの睡眠時間が有意に増加した（＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【００９７】
（実施例３）
昼行性および夜行性哺乳動物の疾患ならびに関連する状態を治療するため、ならびに他の重要なヒト障害、例えば、疼痛、がん、乾癬、および関節炎を治療するための組成物
この実施例では、本明細書において提供される方法および組成物を実践するために使用することができるプロキネチシンアンタゴニストの合成および製剤化について記載する。
【００９８】
代替的な実施形態では、本明細書において提供される方法を実践するために使用される化合物は、興味深い可溶性および薬理学的プロファイルを有するアミド誘導体である。特に、プロキネチシンアンタゴニストまたはそれらのプロドラッグが、それらを含む脂質製剤および注射用デポー製剤を含めて、本明細書において提供される。これらの誘導体およびその長時間作用型製剤は、例えば、哺乳動物における概日リズム性タイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすために、そして任意選択で、ある特定のヒト疾患、例えば、がんを処置するためにも好適であり、本明細書に提供される通りの方法および組成物を実施するために使用することができる。
【００９９】
代替的な実施形態では、本明細書において提供される方法を実践するために使用される化合物、特に、ＰＫ２（プロキネチシン）受容体アンタゴニストは、式１による構造を有するアミド誘導体および化合物であり（例えば、米国特許第８，７２２，８９６号を参照されたい）：
【化１】
2019513738.tif 000003
【０１００】
式中、Ｒ１は、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、または縮合複素環を有する任意選択で置換されるアリールであり、ＸおよびＹは、独立して、低級アルキルであり、Ｑは、ＮＨもしくはＮＲ６であり、Ｒ６は、低級アルキルであり、Ｚは、ＣＨ２またはＣＨＲ７であり、Ｒ７は、低級アルキルであるか、またはＱおよびＺは、互いに共有連結して、ＱがＮであり、ＺがＣＨである複素環式４〜６員環を形成し、Ｒ２は、低級アルキレンであり、Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、またはアルカリルであり、Ａは、ＮまたはＣであり、Ｗは、Ｈもしくはハロゲンであるか、またはＷは、ＡがＮの場合にはヌルであり、Ｒ４およびＲ５は、独立して、アルコキシであるか、または互いに共有連結して、少なくとも１つの酸素原子を有する任意選択で置換される複素環式６もしくは７員環を形成する。
【０１０１】
代替的な実施形態では、Ｒ１は、任意選択で置換されるフェニル、任意選択で置換されるインドリル、もしくは任意選択で置換されるインドリニルであり、かつ／またはＸおよびＹは、ＣＨ２である。任意選択で、ＸおよびＹは、互いに共有連結してピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、チオモルホリン環、またはモルホリン環を形成する。本発明の主題を限定するものではないが、任意選択で、Ｒ３は、任意選択で分岐される低級アルキルであり、かつ／またはそのＲ４、Ｒ５、Ｗ、ならびにＲ４、Ｒ５、およびＷが共有連結するフェニル環は、任意選択でハロゲン化されたベンゾジオキセピン環を形成する。最も典型的には、Ｒ２は、ＣＨ２であり、かつ／またはＷは、ＣｌもしくはＦである。
【０１０２】
プロキネチシンアンタゴニストの多数の可能性のある臨床適応症は、慢性疾患であるため、長期間のＰＫ受容体の阻害の延長が、非常に望ましい。したがって、長時間作用型プロキネチシンアンタゴニストが、そのようなヒト障害の治療に有用であり得る。長時間作用型プロドラッグまたは長時間作用型剤形の医薬が、代替的な解決策であり得る。長時間作用型アンタゴニスト、または持続放出製剤は、１回で数日間または数週間の間、患者の系において治療レベルを保つことができる。
【０１０３】
代替的な実施形態では、下記の式Ｉまたは表１による化合物および薬学的に許容される担体を含む、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、および任意選択で、また、がんを処置するための医薬組成物が提供される。代替的な実施形態では、化合物は、がん、例えば、腫瘍と関連する異常性を治療または予防するのに有効な量で、経口投与のための投薬単位で存在する。代替的な実施形態では、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、および任意選択で、また、がんを処置するための医薬の製造における、式Ｉによる化合物の使用である。
【０１０４】
代替的な実施形態では、慢性ヒト疾患を治療するために理想的な薬物動態パラメーターである、長い半減期および／または分布容積の増大を有するアミド誘導体が、提供される。代替的な実施形態では、ヒト疾患の治療に効果的な濃度である持続時間にわたって薬物を送達するアミドＰＫアンタゴニストおよび製剤が、提供される。
【０１０５】
代替的な実施形態では、プロキネチシンアンタゴニストのデポー送達のための組成物および方法が、提供される。
【０１０６】
代替的な実施形態では、（３Ｒ）−１−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミドが、提供される。
【化２】
2019513738.tif 000004
【０１０７】
代替的な実施形態では、合成は、以下を含む。
ステップ１．  １Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸。２，３−ジアミノ安息香酸（７ｇ）を、オルトギ酸トリエチル（１００ｍｌ）中に懸濁し、撹拌しながら１３０℃に一晩加熱した。室温に冷却した後、ジエチルエーテル（３００ｍｌ）を、次いで、添加し、結果として得られた沈殿物を濾過した。７．３ｇの１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸の固体粉末が、乾燥後に得られた。Ｍ＋１＝１６３．１。
ステップ２．  （１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）メタノール。１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルボン酸（７．３ｇ）を、３５０ｍｌのテトラヒドロフラン中に懸濁し、ドライアイス−アセトン浴で冷却した。水素化アルミニウムリチウム（４Ｍ、２１ｍｌ）を、緩徐に添加した。反応物を撹拌し、一晩室温に温めた。反応を、５ｍｌのメタノールで停止させ、８００ｍｌの２０％メタノールおよび８０％酢酸エチルで抽出した。濾過した後、固体を廃棄した。減圧下での濾液の蒸発により、７ｇの粗製（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）メタノール（Ｍ＋１＝１４９．１）が得られ、次のステップで使用した。
ステップ３．  １Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルバルデヒド。７ｇの（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−イル）メタノールを、３５０ｍｌのジメチルスルホキシド中に溶解した。３６ｍｌのジイソプロピルエチルアミンおよび３３ｇの三酸化硫黄ピリジン錯体を、添加した。反応物を、一晩撹拌した。８００ｍｌの水を添加し、混合物を、４００ｍｌの酢酸エチルで５回抽出した。有機層を、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）により、黄色っぽい粉末の１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルバルデヒドを得た（Ｍ＋１＝１４７．１）。
ステップ４．  （３Ｒ）−１−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミド。（３Ｒ）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミドを、記載されるように調製した。（３Ｒ）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミド（３８００ｍｇ、ＷＯ／２０１０／０７７９７６に記載されるように調製）、１Ｈ−ベンゾイミダゾール−４−カルバルデヒド（１５５０ｍｇ）、氷酢酸（４．７ｍｌ）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３．０ｇ）のジクロロメタン（１５０ｍｌ）中の混合物を、一晩撹拌した。Ｋ２ＣＯ３水溶液（２Ｎ、１２００ｍＬ）の添加後に、混合物を、１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせ、ブライン（５００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残渣を、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中１００％酢酸エチル）により精製し、（３Ｒ）−１−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミドを、樹脂として得た。ＭＳ  （ｍ＋１）  ＝  ４９７．２；  Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  ０．９５  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．００  （ｍ，  １Ｈ），２．０９  （ｓ，  １Ｈ），２．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．１４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．２３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．３０（ｍ，  １Ｈ），  ３．３８  （ｑ，  １Ｈ），  ４．２０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．４５  （ｍ，  ２Ｈ），４．６６  （ｄ，  １Ｈ），  ６．６−８．０  （ｍ，  ６Ｈ）．
【０１０８】
代替的な実施形態では、（３Ｒ）−１−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミド塩酸塩が、提供される。
【化３】
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【０１０９】
代替的な実施形態では、合成は、以下を含む。
ステップ１．  １，７７ｇの（３Ｒ）−１−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミドを、２０ｍｌのジクロロメタン中に溶解した。１，４−ジオキサン中の４Ｍ塩酸塩を添加し、室温で４時間撹拌した。混合物を、減圧下で蒸発させて、（３Ｒ）−１−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルピロリジン−３−カルボキサミド塩酸塩を得た。融解点、１２０〜１２２℃。
【０１１０】
代替的な実施形態では、（−）−（２Ｒ）−２−メチル−３−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチルアミノ）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルプロパンアミドが、提供される。
【化４】
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【０１１１】
記載されるように（ＷＯ／２０１０／０７７９７６）調製した（−）−（２Ｒ）−２−メチル−３−アミノ−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルプロパンアミドを利用して、（−）−（２Ｒ）−２−メチル−３−（ベンゾイミダゾール−４−イルメチルアミノ）−Ｎ−（９−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イルメチル）−Ｎ−イソブチルプロパンアミドを、上述のように調製した。
【０１１２】
選択された生物学的実験の実施例
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣａ２＋動員アッセイ
カルシウム動員についてのエクオリンに基づく発光アッセイを使用して、細胞内Ｃａ２＋の動員を測定した（Ｂｕｌｌｏｃｋら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６５巻、５８２〜５８８頁、２００４年）。発光タンパク質エクオリンおよび組換えＰＫＲ１またはＰＫＲ２を安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、この方法によって試験した。簡単に述べると、細胞を、３７℃で２時間、８μＭセレンテラジンｃｐを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填した。細胞を、短時間のトリプシン処理によって分離させ、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および０．１％ＢＳＡを加えたものに、約５×１０５個の細胞／ｍｌで、維持した。発光測定を、Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを使用して行った。
【０１１３】
すべての化合物を、ＨＢＳＳに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および０．１％ＢＳＡを加えたものに、希釈した。アゴニスト活性を試験するために、１００μｌの細胞を、２０μｌの化合物とともにチューブに注射した。アンタゴニストアッセイについては、８０μｌの細胞を、２０μｌの異なる濃度のアンタゴニストとともにチューブにおいて室温で２０分間インキュベートした後、１００μｌの組換えＰＫ２を注射した。アッセイから得られたＩＣ５０を、次いで、以下の式を使用して、Ｋｉ値に変換した：ＩＣ５０／（１＋［ＰＫ２］／ＥＣ５０ＰＫ２）。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるある特定の実施形態を説明し、特許請求するために使用される成分の量、特性、例えば濃度、反応条件などを表す数は、一部の事例では、「約」という用語によって、修飾されているものとして理解されたい。したがって、一部の実施形態では、書面による説明および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、近似値であり、特定の実施形態によって得ようとする所望される特性に応じて、多様であり得る。一部の実施形態では、数値パラメーターは、報告された有効桁の数を考慮し、通常の端数処理技法を適用することによって、解釈されるべきである。本明細書において提供される一部の実施形態の広範な範囲について記載する数値範囲およびパラメーターは、近似値ではあるが、特定の実施例において記載される数値は、実用可能な限り正確なものとして報告されている。本明細書において提供される一部の実施形態で提示されている数値は、それらのそれぞれの試験測定において見出された標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を含み得る。
【０１１５】
本明細書の説明およびそれに続く特許請求の範囲全体において使用されるとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の意味には、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形の参照物が含まれる。また、本明細書の説明において使用されるとき、「中に（ｉｎ）」の意味には、文脈により別途明確に指示されない限り、「中に」および「上に（ｏｎ）」が含まれる。
【０１１６】
本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に含まれるそれぞれの別個の値に個別に言及する簡略的な方法の機能を果たすことが意図される。本明細書において別途示されない限り、それぞれの個別の値は、それが、本明細書において個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において別途示されるか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。本明細書においてある特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例または例示的な語法（例えば、「など」）の使用は、単に、本明細書において提供される実施形態を良好に示すことを意図するものであり、別途特許請求される本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書におけるいずれの語法も、本発明の実施に必須の任意の特許請求されていない要素を示すとして解釈されるべきではない。
【０１１７】
本明細書に開示される代替的な要素または実施形態の群分けは、制限として解釈されるものではない。各群のメンバーは、個別または群の他のメンバーもしくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで、参照され、特許請求され得る。群の１つまたは複数のメンバーは、便宜上および／または特許性の理由で、ある群に含まれ得るか、またはそこから削除され得る。任意のそのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、添付の特許請求の範囲に使用されるすべてのマーカッシュ群の書面による説明を満たすように修飾された群を包含することが、本明細書において想定される。
【０１１８】
本明細書において使用されるとき、かつ文脈により別途指示されない限り、「に連結した」という用語は、直接的な連結（２つの要素が、互いに接触して連結している）および間接的な連結（少なくとも１つの追加の要素が、２つの要素の間に位置している）の両方を含むことが意図される。したがって、「に連結した」および「と連結した」という用語は、同義的に使用される。
表１
【０１１９】
代替的な実施形態では、本明細書において提供される新規な化合物が、表１に列挙され、そのそれぞれを、本明細書において提供される方法を実施するために使用することができる。これらの化合物を、使用される出発材料、試薬、または条件を変化させることによって、前述の手法を使用して調製した。必須の試薬は、市販入手可能であったか、または文献に記載されているかもしくは当業者によって容易に合成されたかのいずれかであった。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【０１２０】
企図される化合物の生物学的活性の本発明者らの発見に基づいて、本明細書において提供される化合物が、哺乳動物における概日リズム性もしくはタイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠の問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、およびさらには任意選択で様々ながんを治療するために、製剤化され得ることが概して企図される。代替的な実施形態では、本明細書に記載の化合物を含む医薬組成物であって、これらの化合物が、哺乳動物における概日リズム性タイミングを修正するため、ヒト概日調節系における変化に起因する精神状態もしくは症状を治療するため、哺乳動物における睡眠問題を治療するため、または睡眠もしくは活性抑制を誘導するため、または目覚めもしくは覚醒の反応を引き起こすため、および任意選択で、多様な種類のがんを処置または予防するためにも有効であり、企図される医薬組成物は、治療有効量の企図される化合物（またはその薬学的に許容される塩、水和物またはプロドラッグ）および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物が提供される。例えば、一態様では、組成物は、神経膠腫、膵臓がん、または他の腫瘍の治療のために製剤化される。
【０１２１】
代替的な実施形態では、１つまたは複数の非毒性の薬学的に許容される担体とともに製剤化される組成物が、提供される。代替的な実施形態では、固体、半固体、もしくは液体形態での経口投与のため、または非経口注射のために製剤化される医薬組成物が、提供される。代替的な実施形態では、これらの医薬組成物は、経口、直腸、非経口、腹腔内、膣内、または局所を含む様々な経路を使用して、ヒトおよび他の動物に投与され得る。
【０１２２】
代替的な実施形態では、例えば、薬学的に許容される滅菌の水性または非水性の溶液、分散液、エマルション、または懸濁液、ならびに使用前に滅菌の注射溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末を含む、注射用医薬組成物が、提供される。好適な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、油、ならびに注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。代替的な実施形態では、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および／または分散剤を含む、様々な不活性成分を含むかまたは含有する組成物が、提供される。滅菌性は、抗細菌剤および／または抗真菌剤（例えば、パラベン、フェノールソルビン酸、クロロブタノールなど）の包含によって確保することができる。適切な場合には、浸透圧活性剤が、含まれてもよい（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）。
【０１２３】
代替的な実施形態では、経口投与のために固体または半固体の剤形に製剤化された組成物が、提供され、したがって、軟膏剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、および顆粒剤であり得る。代替的な実施形態では、固体または半固体の剤形の企図される化合物は、薬学的に許容される賦形剤または担体（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、またはケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースなど）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、または炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート）、および吸収剤（例えば、カオリン、またはベントナイト粘土）、および滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）のうちの少なくとも１つと混合される。
【０１２４】
代替的な実施形態では、類似の種類の固体または半固体の組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いることもできる。固体または半固体剤形の錠剤、ドラジェ剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび医薬製剤の分野において周知の他のコーティングを用いて調製することができる。代替的な実施形態では、任意選択で遅延様式で、活性成分のみを放出するか、または代替として腸管のある特定の部分に放出するように、製剤化される組成物が、提供される。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。代替的な実施形態では、適切であれば、上述の賦形剤のうちの１つまたは複数を有する、マイクロカプセル封入形態の化合物が、提供される。
【０１２５】
代替的な実施形態では、薬学的に許容されるエマルション剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む、経口投与のための液体剤形が、提供される。活性化合物に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤（例えば、水、または他の溶媒、可溶化剤）、乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド）、油（ならびに特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに芳香剤などのアジュバントも含み得る。
【０１２６】
代替的な実施形態では、本明細書において提供される化合物を、好適な非刺激性賦形剤または担体、例えば、室温では固体または半固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で溶けて活性化合物を放出するカカオバター、ポリエチレングリコール、または坐剤用ワックス（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｗａｘ）と混合することによって調製することができる、直腸または膣内投与のための組成物、例えば、坐剤が、提供される。
【０１２７】
代替的な実施形態では、単層、多層、または複数層であり得る、リポソームの形態で投与される化合物が、提供される。企図されるリポソーム形態の組成物は、安定剤、保存剤、賦形剤などをさらに含有し得る。代替的な実施形態では、天然および合成の両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）を含む、リポソーム製剤のための脂質が、提供される。リポソームを形成する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７６年）、３３頁以下を参照されたい。
【０１２８】
本明細書において提供される医薬組成物での化合物の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式に所望される治療応答を達成するのに有効な量の企図される化合物が得られるように、変動し得る。したがって、選択される投薬レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、治療されている状態の重症度、ならびに治療されている患者の状態およびこれまでの病歴を含む、様々な要因に依存するであろう。しかしながら、所望される治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルの化合物の用量で開始し、所望される効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、当業者の技能の範囲内である。代替的な実施形態では、１日につき体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇの企図される化合物の投薬レベルが、提供され、哺乳動物患者に経口で投与される。所望される場合、有効な１日用量は、投与目的で、複数の用量、例えば、１日当たり２〜４回の別個の用量に、分割されてもよい。
【０１２９】
代替的な実施形態では、追加の薬学的に活性な化合物を含む医薬組成物が、提供される。代替的な実施形態では、追加の薬学的に活性な化合物は、同じ医薬組成物中に含まれてもよく、または別個で投与されてもよい。当業者であれば、追加の薬学的に活性な化合物の好適な共投与のスケジュールおよび経路を、容易に決定することができる。代替的な実施形態では、企図される化合物の代謝産物および／またはプロドラッグ形態も含み得る組成物が、提供され、そのすべての化合物は、ラセミ混合物または立体化学的に純粋な（または部分的に精製された）形態で存在し得る。
【０１３０】
参考文献−実施例１
【表２−１】
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【表２−２】
2019513738.tif 000021
【表２−３】
2019513738.tif 000022
【表２−４】
2019513738.tif 000023
【表２−５】
2019513738.tif 000024
【０１３１】
すでに記載されたもの以外にさらに多くの修正形が、本明細書における本発明の概念から逸脱することなく可能であることが、当業者には明らかなはずである。本発明の主題は、したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨以外において、制限されるものではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際、すべての用語は、文脈に一致する可能な限り広範な様式で解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的な様式で要素、構成要素、またはステップに言及すると解釈されるべきであり、参照される要素、構成要素、またはステップは、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、またはステップとともに存在し得るか、または利用され得るか、または組み合わされ得ることが示される。本明細書の主張が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．、およびＮからなる群から選択される何らかのもののうちの少なくとも１つに言及する場合、この文言は、Ａに加えてＮまたはＢに加えてＮなどではなく、群のうちの１つの要素のみを必要とすると解釈されるべきである。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施形態が、記載されている。いずれにせよ、様々な修正形が、本明細書に記載される実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく作製され得ることを、理解することができる。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019513738.tif 000032
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2019513738.tif 000035
【図６Ｂ】
2019513738.tif 000036
【図６Ｃ】
2019513738.tif 000037
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2019513738.tif 000039
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
2019513738.tif 000049
【図１４】
2019513738.tif 000050
【図１５】
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【図１６】
2019513738.tif 000052
【図１７】
2019513738.tif 000053
【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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