(57)【要約】本発明は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体としても知られる）に結合するヒトモノクローナル抗体を含む。本発明の抗体とＧＩＴＲの結合により、そのリガンドであるＧＩＴＲ−Ｌの結合を阻害し、これをがんの治療に使用することができる。【選択図】図１２
2019524111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｉ．配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｊ．配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
ｋ．配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｌ．配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｍ．配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、ヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、以下：
（ａ）配列番号５３、５４または５５のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号５６、５７、または５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｂ）配列番号５９、６０、または６１のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号６２、６３、または６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｃ）配列番号６５、６６、または６７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号６８、６９、または７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｄ）配列番号７１、７２、または７３のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号７４、７５、または７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｅ）配列番号７７、７８、または７９のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号８０、８１、または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｆ）配列番号８３、８４、または８５のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号８６、８７、または８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｇ）配列番号６５、７２、または８９のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号９０、９１、または９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｈ）配列番号９３、９４、または９５のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号９６、９７、または９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｉ）配列番号９９、１００、または１０１のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号１０２、１０３、または１０４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
ｊ）配列番号６５、７２、または１０５のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号１０６、１０７、または１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｋ）配列番号１０９、７２、または１１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号１１１、１１２、または１１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｌ）配列番号６５、７２、または１１４のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号１１５、１１６、または１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）、あるいは、
（ｍ）配列番号１０１、１１８、または１１９、のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号１２０、１２１、または１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）
を含み、ヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）と結合する、前記抗体または抗原結合性断片。
【請求項３】
一価または二価である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
一本鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
結合親和性が１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記Ｆｃ領域が、アミノ酸の位置２３４及び２３５における変異を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記変異がＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する二重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
治療剤に連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記治療剤が、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、低分子、またはサイトカインである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を産生する、細胞。
【請求項１３】
対象における制御性Ｔ細胞を除去する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
抗原に対する免疫応答を増強させる方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌性抗原、または腫瘍関連抗原である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体の前記投与が、抗原特異的Ｔ細胞活性の増大を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体の前記投与が、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増大を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象にＩＬ−１５を投与することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
がんの症状を治療または軽減する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記がんが、ＧＩＴＲまたはそのリガンドＧＩＴＲ−Ｌが過剰発現しているがんである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象にサイトカインまたは化学療法剤をさらに投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１の核酸配列を含む、核酸。
【請求項２４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項２５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２３または２４に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年７月２２日に提出された米国仮特許出願第６２／３６５，７１２号及び２０１６年８月１６日に提出された米国仮特許出願第６２／３７５，６３４号に対する優先権及び利益を主張するものであり、その記載内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、抗グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）抗体ならびにその使用方法に関する。
【０００３】
政府利益
本発明は、政府の支援により［  ］より助成［  ］を受け実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００４】
配列表の参照による組み込み
［  ］に作成され、サイズ［  ］キロバイトの、名称［  ］というテキストファイルの記載内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
免疫系は、病原体（例えば、がんの場合）を排除するために、効果的な応答同士のバランスを達成しつつ、耐性を維持して自己免疫疾患を予防しなければならない。Ｔ細胞は、免疫機能の抑制と能動的な免疫拒絶とのバランス維持において重要な役割を果たす。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋、ＦＯＸｐ３＋及びグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子関連受容体（ＧＩＴＲ）の発現を特徴とする。Ｔｒｅｇは、病理学的免疫応答を抑制し、免疫自己寛容を調節することにより最終的に免疫恒常性を維持する。Ｔｒｅｇの存在により、さまざまな病原体の排除に関与している活性化エフェクターＴ細胞の活性が抑制される。
【０００６】
ヒトの上皮性悪性腫瘍は、循環中にも、また腫瘍自体の内部にも多量のＴｒｅｇが存在することに関連している。がん患者において抑制性Ｔｒｅｇが多量に存在することによりエフェクター細胞など通常のＴ細胞が抑制され、それによりＩＦＮ−γの産生の下方制御がもたらされる。インビボがん動物モデルにおいてＴｒｅｇの存在または活性を減少させたところ、エフェクターＴ細胞の量及び活性の増大がもたらされたが、このような増大の後で、腫瘍サイズの減少及び／またはがんの他の症状の軽減がしばしばある。
【０００７】
Ｔ細胞が活性化されるとＴｒｅｇ及びエフェクターＴ細胞の両方においてＧＩＴＲレベルの上方制御がもたらされる。Ｔｒｅｇ免疫抑制機能を低下させ、またエフェクターＴ細胞活性を増大させるようなＧＩＴＲ活性調節の方法は、現在盛んに研究が行われている領域である。ＧＩＴＲリガンドであるＧＩＴＲ−Ｌは、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞などさまざまな細胞に発現する。これまでの研究により、がんモデルにおいて、外因性ＧＩＴＲ−Ｌの投与とその後の抗腫瘍免疫活性増大との関連、またはＧＩＴＲに拮抗する代替手段による抗腫瘍免疫活性増大の関連が示されている。
【０００８】
Ｔｒｅｇが多量に存在すること、及びがんにおけるＴｒｅｇの役割を考えると、Ｔｒｅｇの活性と存在を、ＧＩＴＲを介して調節することに対してさらに注目していくことが、理解を深め、最終的に、がんを治療する上で最重要である。したがって、エフェクターＴ細胞の活性を促進し、結果的に抗腫瘍活性を促進する手段として、ＧＩＴＲと特異的に結合し、ＧＩＴＲとそのリガンドＧＩＴＲ−Ｌとの結合を調節することができる薬剤が緊急に必要である。
【発明の概要】
【０００９】
さまざまな態様では、本発明は、ヒト抗グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、配列番号５３、５４または５５のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号５６、５７、または５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号５９、６０、または６１のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号６２、６３、または６４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号６５、６６、または６７のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号６８、６９、または７０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号７１、７２、または７３のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号７４、７５、または７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号７７、７８、または７９のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号８０、８１、または８２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号８３、８４、または８５のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号８６、８７、または８８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号６５、７２、または８９のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号９０、９１、または９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号９３、９４、または９５のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号９６、９７、または９８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号９９、１００、または１０１のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号１０２、１０３、または１０４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号６５、７２、または１０５のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号１０６、１０７、または１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号１０９、７２、または１１０のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号１１１、１１２、または１１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；配列番号６５、７２、または１１４のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号１１５、１１６、または１１７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）；及び配列番号１０１、１１８、または１１９のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖可変相補性決定領域１、２、または３（ＶＨ−ＣＤＲ）；及び配列番号１２０、１２１、または１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変相補性決定領域１、２または３（ＶＬ−ＣＤＲ）を有する単離されたヒト化モノクローナル抗体または抗原結合性断片を提供する。
【００１１】
抗体は一価または二価である。例えば、抗体は一本鎖抗体である。抗体は、結合親和性が１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内である。いくつかの態様では、抗体は、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。他の態様では、抗体は、アミノ酸の位置２３４及び２３５における変異を含有するＦｃ領域を有する。変異は例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである。
【００１２】
他の態様では、本発明には、本発明のヒトＧＩＴＲ抗体を含有する二重特異性抗体、及び、腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する抗体が含まれる。
【００１３】
任意選択で、本発明の抗体を、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、低分子、またはサイトカインなどの治療剤に連結させる。
【００１４】
また、本発明による抗体を産生する細胞も本発明により提供される。
【００１５】
さまざまな態様では、本発明は、対象における制御性Ｔ細胞を除去する方法を提供し、それを必要とする対象に対し本発明による抗体を含む組成物を投与することにより行う。
【００１６】
本発明の他の方法には、それを必要とする対象に対し本発明による抗体を含む組成物を投与することによる、抗原に対する免疫応答の増強が含まれる。抗原は、ウイルス抗原、細菌性抗原、または腫瘍関連抗原である。
【００１７】
さまざまな態様では、本発明による抗体の投与により、抗原特異的Ｔ細胞活性の増大及び／またはＮＫ細胞の細胞傷害性の増大がもたらされる。
【００１８】
いくつかの態様では、本発明の方法にはさらに、対象へのＩＬ−１５の投与が含まれる。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明には、それを必要とする対象に対し本発明による抗体を含む組成物を投与することにより、がんの症状を治療または軽減する方法が含まれる。がんは、ＧＩＴＲまたはそのリガンドＧＩＴＲ−Ｌが過剰発現しているがんである。任意選択で、対象に対しＩＬ−１５などのサイトカインまたは化学療法薬をさらに投与する。
【００２０】
本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、及び５１の核酸配列を有する核酸をさらに提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２のポリペプチドをコードする核酸、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明による核酸を含有するベクターも提供される。また、本発明には、本発明によるベクターを含有している細胞も含まれる。
【００２２】
特別に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。方法及び材料は、本明細書に記載されるものと類似または同等のものを本発明の実施に際して使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、参照によりその全体が明白に組み込まれ、矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先することになる。さらに、本明細書に記載の材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定されることを意図しない。
【００２３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び請求項から明らかとなり、かつそれらにより包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１は、抗ＧＩＴＲ抗体の同定に使用したＥＬＩＳＡのインビトロ結合アッセイの設計及び結果を示す。Ａ）ｈＧＩＴＲ−Ｈｉｓ、Ｂ）ｈＧＩＴＲ−ｍＩｇＧ２ａ、Ｃ）ｍＧＩＴＲ−Ｈｉｓ、またはＤ）ｍＩｇＧ２ａをそれぞれ２ｕｇ／ｍｌずつ用いてプレートをコートした。
【図１−２】図１は、抗ＧＩＴＲ抗体の同定に使用したＥＬＩＳＡのインビトロ結合アッセイの設計及び結果を示す。Ａ）ｈＧＩＴＲ−Ｈｉｓ、Ｂ）ｈＧＩＴＲ−ｍＩｇＧ２ａ、Ｃ）ｍＧＩＴＲ−Ｈｉｓ、またはＤ）ｍＩｇＧ２ａをそれぞれ２ｕｇ／ｍｌずつ用いてプレートをコートした。対応する各ウェルのＯＤ測定をフォーム下に示す。
【図２】メソスケールディスカバリーイムノアッセイにより決定した、記載の４種類の濃度の抗ＧＩＴＲファージ抗体（１Ｅ１０〜１Ｅ１３粒子／ｍＬ）と、２種類の濃度のｈＧＩＴＲ−ｍＩｇとの結合活性を示す一組のグラフである。
【図３】メソスケールディスカバリーイムノアッセイを使用した、記載の抗ＧＩＴＲファージ抗体と、８種類の濃度のｈＧＩＴＲ−ｍＩｇとの結合活性を示す一組のグラフである。
【図４】抗ＧＩＴＲファージ抗体を使用して実施した、フローサイトメトリー結合アッセイのデータを示す。ＧＩＴＲを安定発現している、または対照ＣＡ９を発現しているＣＨＯ細胞とともに、４種類の濃度の抗ＧＩＴＲファージＡＢを試験した。
【図５】個々のコロニーの培養上清から得た単一濃度のファージ抗体を用いた、フローサイトメトリーによるＧＩＴＲ結合データを示すグラフである。橙色のバーは、ＧＩＴＲを発現しているＣＨＯ細胞に対する結合を示し、青色バーは、ＧＩＴＲ発現を欠く（ＣＡ９対照）ＣＨＯ細胞に対する結合を示す。
【図６−１】単一コロニーから得たファージ上清のＥＬＩＳＡによるＧＩＴＲ結合データを示す。クローンのテンプレート、及び各プレートのコーティングパターンを示す。
【図６−２】単一コロニーから得たファージ上清のＥＬＩＳＡによるＧＩＴＲ結合データを示す。個々のクローンのＯＤ４５０値を示す。
【図７】本発明による抗ＧＩＴＲ抗体のフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８】フローサイトメトリーアッセイで分析した場合の、完全ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）変異フォーマットで発現させた抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲ結合を示すグラフである。ＧＩＴＲ（＋）ＣＨＯ細胞株に対する抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂの結合を、５段階の２倍系列希釈により、２連で試験した。
【図９】細胞表面に発現したＧＩＴＲに対する抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）抗体の結合についての別のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。ＧＩＴＲ（＋）ＣＨＯ細胞株に対する抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂの結合を、５段階の２倍系列希釈により、２連で試験した。
【図１０Ａ】フローサイトメトリーで分析した、ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）フォーマット（パネルＡ）で発現させた代表的抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１抗体のＧＩＴＲ結合能力を示す。ＧＩＴＲ（＋）ＣＨＯ細胞株に対する抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂの結合を、４段階の２倍系列希釈により、２連で試験した。
【図１０Ｂ】フローサイトメトリーで分析した、ＩｇＧ４フォーマット（パネルＢ）で発現させた代表的抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１抗体のＧＩＴＲ結合能力を示す。ＧＩＴＲ（＋）ＣＨＯ細胞株に対する抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂの結合を、４段階の２倍系列希釈により、２連で試験した。
【図１１】抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ４、ＴＴ１−３Ｃ６  ＩｇＧ４、または市販のＧＴＩ−１０  ＩｇＧ１抗体を１０段階の２倍系列希釈にしたものと、４７ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドとの結合競合を示す。
【図１２】Ｐｒｏｍｅｇａ製ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いたインビトロアッセイにおいて、抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ４またはＴＴ１−３Ｃ６は、ＧＩＴＲリガンド誘導性ルシフェラーゼ発現を相乗的に増大させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、ＧＩＴＲとしても知られるグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体に対して特異的なヒト化モノクローナル抗体を提供する。かかる抗体は、ヒトＧＩＴＲに対してパニングする、広範にわたり確認済みのＭｅｈｔａ  Ｉ／ＩＩヒト抗体−ファージディスプレイライブラリーの使用により同定された。これらの抗体は、ＧＩＴＲに対する新規クラスのヒトモノクローナル抗体を表す。
【００２６】
本明細書ではこれらの抗ＧＩＴＲヒトモノクローナル抗体を「ｈｕＧＩＴＲ抗体」と呼ぶ。
【００２７】
上皮がんの症例において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増量を記録した証拠がある。また、ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇにより維持される優性免疫自己寛容において重要な役割を果たすという証拠もある。この、ＴｒｅｇでのＧＩＴＲ発現とがん罹患期間中のＴｒｅｇ増大の関連性により、増強されたエフェクターＴ細胞機能の促進手段として、ＧＩＴＲ活性を標的とする機会を得ることができる。具体的に、このことにより、ＧＩＴＲ標的化はがん治療に対する強力な免疫治療方法となる。
【００２８】
Ｔｒｅｇは、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＦＯＸＰ３、及びＧＩＴＲを発現する。エフェクターＴ細胞活性の抑制は主に、ＦＯＸＰ３が活性化Ｔ細胞核内因子ＮＦ−ＡＴと二量体化することによって誘導され、それによりＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−４の抑制がもたらされる。ＧＩＴＲがそのリガンドと結合することによるＧＩＴＲライゲーションの増大は、活性化Ｔ細胞に対してＴｒｅｇが有する抑制効果を低下させることが示されている。さらに、ＧＩＴＲを直接標的とする抗体は、Ｔｒｅｇの抑制機能を低下させることも示されている。
【００２９】
ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇ及びエフェクターＴ細胞の両方に発現するが、ＧＩＴＲの発現量は前者の方が著しく多い。そのため、ＧＩＴＲは、がんを含むさまざまな疾患においてＴｒｅｇの抑制機能を調節するための良好な候補標的とみなされている。マウスモデルでは、ＧＩＴＲを刺激するとＴｒｅｇ抑制活性が低下することが示された。他の研究では、ＧＩＴＲ活性の拮抗により悪性細胞へのＴｒｅｇ動員が減少することも示された。以上をまとめると、これらのデータは、ＧＩＴＲが、がんの病態生理学において極めて重要な受容体であることを示している。
【００３０】
本発明は、ＧＩＴＲタンパク質と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体がＧＩＴＲに結合することにより、ＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲに対する結合能が遮断される。多種多様な機序により、ｈｕＧＩＴＲ抗体は、エフェクター細胞に対してＴｒｅｇが有する抑制機能を低下させる。ｈｕＧＩＴＲ抗体の投与により、Ｔｒｅｇの除去、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）増殖の増大、抗原特異的Ｔ細胞活性の増大、及びエフェクターサイトカインの産生増大がもたらされ得る。いくつかの例では、ｈｕＧＩＴＲ抗体は、抗原特異的免疫応答を促進または増強する。
【００３１】
したがって、本発明のｈｕＧＩＴＲ抗体はＴ細胞活性の調節に有用である。特に、ｈｕＧＩＴＲ抗体は、Ｔｒｅｇ活性を抑制し、Ｔｅｆｆ活性を刺激することができる。さらに、本発明のｈｕＧＩＴＲ抗体は、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増大させ、ＩＦＮγの分泌を亢進させる。
【００３２】
ｈｕＧＩＴＲ抗体は一価または二価であり、一本鎖または二本鎖を含む。機能的に、ｈｕＧＩＴＲ抗体の結合親和性は、１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内である。例えば、ｈｕＧＩＴＲ抗体の結合親和性は、１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−６〜１０−１０Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−５Ｍ〜１０−６Ｍである。
【００３３】
さらに、本発明の抗体は、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡまたはサイトカインを含むが、これに限定されない治療剤を含む。
【００３４】
１３のユニークなモノクローナルｈｕＧＩＴＲ抗体を同定した。これらには、ｍＡｂの＃Ｅ１−３Ｂ４、＃Ｅ１−３Ｅ５（及び＃Ｐ２−２Ｄ１２と呼ぶ）、＃Ｅ１−３Ｅ９、＃Ｅ１−３Ｈ７（＃Ｅ５−３Ｂ２及び＃ＥＴ１−３Ｂ１とも呼ぶ）、＃ＥＴ１−３Ｄ６、＃ＥＴ１−３Ｅ１２、＃Ｐ１−２Ａ１１、＃Ｐ４−２Ｆ１、＃Ｔ１−３Ｇ７、＃ＴＴ１−３Ｃ６（＃Ｅ１−３Ｆ６とも呼ぶ）、ＴＴ１−３Ｃ８、＃ＴＴ１−３Ｆ５、及び＃ＴＴ５−３Ｅ２が含まれる。可変領域の核酸配列及びアミノ酸配列を、表１Ａ〜１３Ｂに示す。これらの抗体の可変領域と関連するＣＤＲのアミノ酸配列を表１４に示す。
【００３５】
モノクローナルヒトＧＩＴＲ抗体の核酸配列及びアミノ酸配列を以下に記載する。
【００３６】
（表１Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｂ４の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000003
【００３７】
（表１Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｂ４の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000004
【００３８】
（表２Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｅ５の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000005
【００３９】
（表２Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｅ５の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000006
【００４０】
（表３Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｅ９の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000007
【００４１】
（表３Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｅ９の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000008
【００４２】
（表４Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000009
【００４３】
（表４Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000010
【００４４】
（表５Ａ）＃ＥＴ１−３Ｄ６の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000011
【００４５】
（表５Ｂ）＃ＥＴ１−３Ｄ６の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000012
【００４６】
（表６Ａ）＃ＥＴ１−３Ｅ１２の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000013
【００４７】
（表６Ｂ）＃ＥＴ１−３Ｅ１２の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000014
【００４８】
（表７Ａ）＃Ｐ１−２Ａ１１の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000015
【００４９】
（表７Ｂ）＃Ｐ１−２Ａ１１の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000016
【００５０】
（表８Ａ）＃Ｐ４−２Ｆ１の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000017
【００５１】
（表８Ｂ）＃Ｐ４−２Ｆ１の可変領域アミノ酸配列
2019524111.tif 000018
【００５２】
（表９Ａ）＃Ｔ１−３Ｇ７の可変領域核酸配列
2019524111.tif 000019
【００５３】
（表９Ｂ）＃Ｔ１−３Ｇ７の可変領域アミノ酸配列
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【００５４】
（表１０Ａ）＃ＴＴ１−３Ｃ６（同じく＃Ｅ１−３Ｆ６）可変領域核酸配列
2019524111.tif 000021
【００５５】
（表１０Ｂ）＃ＴＴ１−３Ｃ６（同じく＃Ｅ１−３Ｆ６）可変領域アミノ酸配列
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【００５６】
（表１１Ａ）＃ＴＴ１−３Ｃ８の可変領域核酸配列
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【００５７】
（表１１Ｂ）＃ＴＴ１−３Ｃ８の可変領域アミノ酸配列
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【００５８】
（表１２Ａ）＃ＴＴ１−３Ｆ５の可変領域核酸配列
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【００５９】
（表１２Ｂ）＃ＴＴ１−３Ｆ５の可変領域アミノ酸配列
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【００６０】
（表１３Ａ）＃ＴＴ５−３Ｅ２の可変領域核酸配列
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【００６１】
（表１３Ｂ）＃ＴＴ５−３Ｅ２の可変領域アミノ酸配列
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【００６２】
本明細書に記載のｈｕＧＩＴＲ抗体はＧＩＴＲに結合する。一態様では、ｈｕＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲに対し親和性が高く、特異性が高い。別の態様では、ｈｕＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ受容体と結合することができ、リガンドであるＧＩＴＲ−Ｌとその受容体ＧＩＴＲとの結合を妨げる、阻害する、または遮断することができる。
【００６３】
（表１４）重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
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【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載のｈｕＧＩＴＲ抗体のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対して特定割合の同一性または類似性を有する抗体を特徴とする。例えば、抗体は、本明細書に記載のｈｕＧＩＴＲ抗体のいずれか１つの特定領域または完全長と比較した場合に６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有し得る。本発明の核酸及びタンパク質に対する配列同一性または配列類似性は、当該技術分野で公知の方法による配列比較及び／またはアラインメントによって決定することができる。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０）、手作業でのアラインメント、または目視確認を利用して、本発明の核酸及びタンパク質に対する配列同一性または類似性の割合を決定することができる。
【００６５】
アミノ酸配列に関し、コードされた配列中の単一アミノ酸もしくはごく一部のアミノ酸を改変する、付加する、欠失させる、または置換する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加を、本明細書では総称して「保存的に修飾された変異型」と呼ぶことを当業者は容易に認識する。いくつかの実施形態では、改変により、アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換される。機能的に類似のアミノ酸を記載している保存的置換表は当該技術分野において周知である。本明細書に開示のｈｕＧＩＴＲ抗体をそのように保存的に修飾した変異型は、非修飾ＧＩＴＲ抗体と比較してＧＩＴＲに対して高い交差反応性を示し得る。
【００６６】
抗体
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応をする）抗原結合部位を含有する分子を指す。「特異的に結合する」または「免疫反応をする」とは、抗体が所望抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２の断片、ｓｃＦｖ、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが含まれるが、これに限定されない。
【００６７】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合で連結したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーであり、これは、ペプチドをコードするリンカーで連結されているＶＨコード遺伝子とＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合で発現させることができる（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９〜５８８３）。天然で凝集しているが化学的には分離している、抗体Ｖ領域由来の軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別する方法が多数記載されており、それらの化学構造は、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；第５，１３２，４０５号；及び第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【００６８】
非常に大きなナイーブヒトｓｃＦｖライブラリーがこれまでに作製されており、また、それらを作製して、大量の標的分子に対する再構成抗体遺伝子を多量に提供することができる。疾患特異的抗体を単離するために、感染症の個人から小さなライブラリーを構築することができる。（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３３９−４３（１９９２）；Ｚｅｂｅｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３１７５−７９（１９９２）を参照のこと）。
【００６９】
一般に、ヒトから得た抗体分子は、分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのクラスのいずれかに関連している。特定のクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などのようなサブクラスもある。さらに、ヒトでは軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成されている。重鎖及び軽鎖のＶ領域内部の高度に異なる３つのストレッチは「超可変領域」と呼ばれ、より保存的な「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるストレッチに挟まれている。したがって、用語「ＦＲ」とは、天然では、両側を免疫グロブリンの超可変領域に挟まれて見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において互いに関連して配置され、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合している抗原の３次元的表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ｓｃＦｖ抗体の、ＣＤＲを含有するＶＨ領域及びＶＬ各領域を表１Ａ〜表１３Ｂに示す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」には、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な表面分子群からなり、通常、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のペプチドに対して生じ得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「免疫学的結合」、及び「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と、かかる免疫グロブリンが特異的な抗原との間に生じる非共有結合性の相互作用の型を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）として表すことができ、その場合、Ｋｄが小さいほど親和性が大きいことを表す。選択ポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知の方法を使用して定量することができる。そのような一方法では、抗原結合部位／抗原の複合体の形成速度及び解離速度を測定することになり、ここで、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用親和性、及び両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、「ｏｎ速度定数」（Ｋｏｎ）及び「ｏｆｆ速度定数」（Ｋｏｆｆ）は、会合及び解離の濃度及び実速度の計算により決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ  ３６：１８６〜８７（１９９３）を参照のこと）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ比により、親和性に関連しないパラメータをすべて消去することができ、この比は、解離定数Ｋｄと等しい。（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３全般を参照のこと）。本発明の抗体は、ラジオリガンド結合アッセイまたは当業者に公知の同様のアッセイなどのアッセイで測定した場合に、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１０μＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭであれば、ＧＩＴＲのエピトープに特異的に結合すると言われる。
【００７２】
本発明のＧＩＴＲタンパク質、またはその誘導体、断片、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質構成成分と免疫特異的に結合する抗体を作製する際に免疫原として利用してよい。プロテオリポソームに結合させた、ＧＩＴＲタンパク質またはその誘導体、断片、アナログ、ホモログ、もしくはオルソログは、これらのタンパク質構成成分と免疫特異的に結合する抗体を作製する際に免疫原として利用してよい。
【００７３】
あるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同一の特異性を有するか否かは、過度の実験をしなくても、前者によって後者のＧＩＴＲ結合が妨げられるか否かを確認することにより決定可能であることを当業者は認識する。本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少により示されるように、試験対象ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合は、これら２つのモノクローナル抗体が同一または密接に関連するエピトープに結合すると考えられる。
【００７４】
あるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを決定する別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を通常はそれと反応性であるＧＩＴＲタンパク質とプレインキュベートし、その後、試験対象ヒトモノクローナル抗体を加え、試験対象ヒトモノクローナル抗体がそのＧＩＴＲ結合能を阻害されているか否かを決定する方法である。試験対象ヒトモノクローナル抗体が阻害されている場合は、かかる抗体はほぼ確実に本発明のモノクローナル抗体と、同一または機能的に同等なエピトープ特異性を有する。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングは、ＧＩＴＲを使用して被験モノクローナル抗体がＧＩＴＲを中和することができるか否かを決定することによっても行うことができる。
【００７５】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、断片、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対するポリクローナルまたはモノクローナルの抗体の作製には、当該技術分野で公知のさまざまな手順を使用してよい。（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。
【００７６】
抗体は、主に免疫血清のＩｇＧ画分が得られる、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティクロマトグラフィーなどの周知の技術により精製することができる。その後、または別法として、求める免疫グロブリンの標的である特定抗原、またはそのエピトープをカラム上に固定化し、イムノアフィニティクロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製してよい。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎにより考察されている（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（Ａｐｒｉｌ  １７，２０００），ｐｐ．２５−２８）。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」または「モノクローナル抗体組成物」とは、固有の軽鎖遺伝子産物及び固有の重鎖遺伝子産物からなる１分子種の抗体分子しか含有しない抗体分子集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その集団の全分子において同一である。ＭＡｂは、それに対する固有の結合親和性を特徴とする抗原の特定エピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。
【００７８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載の方法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、典型的に、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫化剤で免疫し、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生能があるリンパ球を誘発させる。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【００７９】
免疫化剤には典型的に、タンパク質抗原、その断片またはその融合タンパク質が含まれる。一般に、ヒト由来の細胞が所望される場合は末梢血リンパ球が使用されるか、または非ヒト哺乳類の材料が所望される場合は脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。その後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用してリンパ球と不死化細胞株とを融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は通常、哺乳類細胞、特に、げっ歯類、ウシ及びヒトに由来する骨髄腫細胞に形質転換される。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、未融合不死化細胞の増殖または生存を阻害する物質を好ましくは１つ以上含有する適切な培地で培養することができる。例えば、親細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）という酵素を欠いている場合、ハイブリドーマ用培地には、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンが含まれる（「ＨＡＴ培地」）。
【００８０】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体発現の安定した高レベルを支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に対して感受性のある細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手することができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒト骨髄腫ヘテロ細胞株についての記載もある。（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）を参照のこと）。
【００８１】
その後、ハイブリドーマ細胞を培養する培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在について評価することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などによって決定される。そのような技術及びアッセイは当該技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によるスキャッチャード解析法により決定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療用途では、標的抗原に対する高度の特異性及び高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【００８２】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後は、クローンを限界希釈法でサブクローニングし、標準的方法で増殖させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３を参照のこと）。このための適切な培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。別法として、ハイブリドーマ細胞を哺乳類の腹水としてインビボで増殖させることができる。
【００８３】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどにより、培地または腹水液から単離または精製することができる。
【００８４】
モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法などにより作製することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して容易に単離及び配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい材料として役立つ。一旦単離されたらＤＮＡを発現ベクターに入れ、その後、これらのベクターを、それ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。また、ＤＮＡは、例えば、マウス相同配列に代えてヒトの重鎖及び軽鎖の定常ドメインのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）を参照のこと）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で結合させることによって修飾することもできる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換して、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、キメラ型二価抗体の作製も可能である。
【００８５】
完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含め、軽鎖及び重鎖両方の全配列がヒト遺伝子から生じている抗体分子である。そのような抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）；及びヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ，１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）の使用により調製することができる。ヒトモノクローナル抗体を利用してよく、これは、ヒトハイブリドーマの使用によって（Ｃｏｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはヒトＢ細胞をエプスタイン・バー・ウイルスを用いてインビトロで形質転換することによって作製してよい（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）。
【００８６】
さらに、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーなど、さらなる技術を使用して作製することもできる。（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。同様に、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト抗体を作ることができる。曝露時、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子再構成、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含めたあらゆる点でヒトにおいて見られる抗体産生と非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記載されている。
【００８７】
抗原による攻撃に応答してその動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するよう改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、ヒト抗体をさらに作製してよい。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする内在性遺伝子を不能にしておき、ヒト免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノム内に挿入する。ヒト遺伝子を、例えば、ヒト必須ＤＮＡセグメントを含有している酵母人工染色体を使用して組み込む。その後、修飾の全部ではなく、それより少ない数の修飾を含有する中間的なトランスジェニック動物を交雑することにより、所望の修飾すべてを得られる動物を後代として得る。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９６／３４０９６に開示されているようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれる。この動物から完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞が作られる。抗体は、関心対象の免疫原で免疫後に、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として動物から直接得ることも、または別法で、動物由来の不死化Ｂ細胞、例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどから得ることもできる。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、回収し、発現させて抗体を直接得ることも、またはさらに修飾して、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子などの抗体アナログを得ることもできる。
【００８８】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠くマウスとして例示されている、非ヒト宿主を作製する方法の一例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。それは、ある方法により得ることができ、その方法には、遺伝子座の再構成を妨げ、かつ再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写産物の形成を妨げるために、胚性幹細胞の少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座に由来するＪセグメント遺伝子を欠失させ、かかる欠失が、選択マーカーをコードする遺伝子を含有する標的指向ベクターによる影響を受けること、及び体細胞及び生殖細胞がかかる選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から作製することが含まれる。
【００８９】
ヒト抗体などの関心対象抗体を作製する一方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示されている。この方法には、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを、培養によってある哺乳類の宿主細胞に導入すること、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを、別の哺乳類の宿主細胞に導入すること、及び２つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成させることが含まれる。ハイブリッド細胞は、重鎖及び軽鎖を含有する抗体を発現する。
【００９０】
この手法のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、及び関連するエピトープに対して免疫特異的に高親和性で結合する抗体を選択する相関方法が、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【００９１】
抗体は、上記の一本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有しているベクターにより発現させることができる。
【００９２】
これらには、ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバント補助によるＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどが含まれ得る。ベクターには、標的指向部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）と核酸結合部分（例えば、ポリリジン）とを有する、ＷＯ９３／６４７０１に記載のような化学的複合体、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）と核酸結合部分（例えば、プロタミン）とを含有する融合タンパク質である、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載のような融合タンパク質、プラスミド、ファージなどが含まれる。ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクターまたは合成ベクターであり得る。
【００９３】
好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質及び化学的複合体が含まれる。レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックスベクターまたはトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１１４９（１９９０）を参照のこと）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）を参照のこと）、及びアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｍ．Ｇ．．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照のこと）が含まれる。
【００９４】
ポックスウイルスベクターにより細胞質に遺伝子が導入される。トリポックスウイルスベクターでは、短期間しか核酸発現が生じない。核酸を神経細胞に導入するにはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターが好ましい。アデノウイルスベクターでは、アデノ随伴ウイルス（約４か月）よりも短い期間（約２か月）しか発現が生じず、これはＨＳＶベクターよりも短い。選択する特定のベクターは標的細胞及び治療病態に依存する。導入は、標準的技術、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換などにより可能である。遺伝子導入方法の例には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、プロトプラスト融合、リポフェクション法、細胞マイクロインジェクション、及びウイルスベクターが含まれる。
【００９５】
ベクターを利用して、本質的にいかなる所望標的細胞も標的にすることができる。例えば、定位注入法を使用して、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に導入することができる。さらに、粒子は、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのようなミニポンプ注入システムを使用する脳室内（ｉｃｖ）注入により送達することができる。対流法と呼ばれる、バルクフローに基づく方法もまた、脳の広い領域への高分子送達に有効であることが分かっており、標的細胞へのベクター送達に有用であり得る。（Ｂｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２−３０５（１９９４）を参照のこと）。使用可能な他の方法には、カテーテル、静脈内注射、非経口注射、腹腔内注射及び皮下注射、及び経口または他の公知の投与経路が含まれる。
【００９６】
これらのベクターを使用して、さまざまな方法に使用できる抗体を大量に発現させることができる。例えば、試料中のＧＩＴＲの存在を検出することができる。抗体を使用してＧＩＴＲ活性に結合させてＧＩＴＲ活性の破壊を試みることもできる。
【００９７】
各技術を、本発明の抗原性タンパク質に特異的な一本鎖抗体作製用に適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（例えば、Ｈｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）に方法を適合させて、タンパク質またはその誘導体、断片、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を備えたモノクローナルＦａｂ断片の短時間かつ効果的な同定を可能にすることができる。当該技術分野で公知の技術により、タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体断片を作製してよく、それらには、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により作製されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋還元により作製されるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤で抗体分子を処理することにより作製されるＦａｂ断片、及び（ｉｖ）Ｆｖ断片が含まれるが、これに限定されない。
【００９８】
ヘテロ複合体抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロ複合体抗体は、共有結合で繋がれた２つの抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞を標的指向させるため（米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）、及びＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、ＥＰ０３０８９を参照のこと）提案されている。架橋剤を使用する方法を含め、合成タンパク質化学の公知の方法を使用してインビトロで抗体を調製できることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用しても、またはチオエーテル結合の形成によっても構築することができる。このための適切な試薬の例には、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミダート及び、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のものが含まれる。
【００９９】
例えば、がん治療における抗体の有効性などが高まるよう、本発明の抗体をエフェクター機能について修飾することが所望され得る。例えば、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。こうして作製されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能及び／または高い補体介在性細胞殺傷性及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）性を有し得る。（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと）。別法として、抗体を人工的に操作して二重のＦｃ領域を持たせ、それにより、増強された補体溶解性及びＡＤＣＣ能を持たせることができる。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと）。
【０１００】
ある実施形態では、本発明の抗体は、抗体の抗原非依存性エフェクター機能、特に、抗体の循環半減期を改変するアミノ酸置換を含むＦｃ変異型を含んでよい。そのような抗体は、これらの置換を欠く抗体と比べるとＦｃＲｎに対する結合の増大または低下を示し、そのため、それぞれ、血清中半減期が長くなっているかまたは短くなっている。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有するＦｃ変異型は長い血清半減期を有すると予想され、そのような分子は、例えば、慢性の疾患または障害を治療するなどのために投与抗体に長い半減期が所望される哺乳類治療方法での用途に有用である。対照的に、ＦｃＲｎ結合親和性の低いＦｃ変異型は短い半減期を有すると予想され、そのような分子もまた、例えば、インビボでの画像診断のため、または開始抗体が長期間循環中に存在すると毒性副作用がある状況などにおいて、例えば、循環時間が短い方が都合がよい場合がある哺乳類への投与などに有用である。ＦｃＲｎ結合親和性の低いＦｃ変異型もまた、胎盤通過の可能性が低いため、やはり妊娠女性の疾患または障害の治療において有用である。さらに、低いＦｃＲｎ結合親和性が所望され得る他の用途には、脳、腎臓、及び／または肝臓への局在が所望される用途が含まれる。例示的な一実施形態では、本発明の改変抗体は、脈管系から腎糸球体の上皮細胞を通過する輸送は少ない。別の実施形態では、本発明の改変抗体は、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して血管空間へ入る輸送は少ない。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合が改変された抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵ番号付けによる）で構成される。ＦｃＲｎ結合活性が改変されている例示的なアミノ酸置換は国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０４７３２７に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。特定の例示的実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、以下の置換、Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０Ｅ及びＳ３０４Ｄ（ＥＵ番号付け）の１つ以上を有するＦｃドメインを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が改変されるよう、ｍＡｂの定常領域に変異を導入する。例えば、変異は、ＣＨ２ドメインのＬＡＬＡ変異である。一態様では、ｂｓＡｂは、ヘテロ二量体ｍＡｂの１つのｓｃＦｖユニットに変異を含有し、それによりＡＤＣＣ活性を低下させる。別の態様では、ｍＡｂは、ヘテロ二量体ｍＡｂの両鎖に変異を含有し、それによりＡＤＣＣ活性が完全に除去される。例えば、ｍＡｂの一方または両方のｓｃＦｖユニットに導入される変異は、ＣＨ２ドメインのＬＡＬＡ変異である。可変ＡＤＣＣ活性を有するこれらのｍＡｂは、ｍＡｂが、ｍＡｂの認識する１つの抗原を発現する細胞に対して最大選択的傷害性を示すが、ｍＡｂが認識する第２の抗原に対しては最小傷害性を示すように最適化することができる。
【０１０２】
他の実施形態では、本明細書に記載する診断方法及び治療方法で使用するための抗体は、グリコシル化を低下させるかまたは排除するよう改変される定常領域、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を有する。例えば、本発明の抗体は、抗体のグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含むＦｃ変異型も含んでよい。例えば、前記Ｆｃ変異型は、グリコシル化（例えば、Ｎ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化）が低くてよい。例示的な実施形態では、Ｆｃ変異型は、通常、アミノ酸位置２９７（ＥＵ番号付け）に見られるＮ−結合型グリカンの低グリコシル化を含む。別の実施形態では、抗体は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ−結合型グリコシル化モチーフの近傍または内部にアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、抗体は、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を有するＦｃ変異型を含む。さらなる特定の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ及びＴ２９９Ａの変異（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【０１０３】
低グリコシル化または改変グリコシル化を付与する例示的アミノ酸置換は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０１８５７２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片を修飾してグリコシル化を排除する。そのような抗体、またはその断片は、「ａｇｌｙ」抗体、またはその（例えば、「ａｇｌｙ」抗体）断片と呼ばれる。理論に拘束されるわけではないが、「ａｇｌｙ」抗体、またはその断片は、改善された安全性プロファイル及び安定性プロファイルをインビボで有し得ると考えられる。例示的なａｇｌｙ抗体、またはその断片は、Ｆｃエフェクター機能を欠くことにより、ＧＩＴＲを発現する正常な重要臓器に対するＦｃ媒介性毒性の可能性を排除する、ＩｇＧ４抗体の非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃ領域を含む。さらなる他の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、改変グリカンを含む。例えば、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７のＮ−グリカンにあるフコース残基の数が減少している、すなわち、脱フコシル化していてよい。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７のＮ−グリカンにあるシアル酸残基の数が改変されていてよい。ｉｉｉ）共有結合
【０１０４】
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、例えば、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などに結合させた抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１０５】
使用可能な酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。放射性複合体化抗体の作製にはさまざまな放射性核種が利用可能である。例には、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。
【０１０６】
抗体と細胞傷害性薬剤の複合体は、多種多様な二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシニミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トリエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８；１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合させる例示的キレート剤である。（ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。
【０１０７】
当業者は、得られた抗体または本発明の他の分子に対し、考えられる多種多様な部分を結合させることができることを認識する。（記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれる“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照のこと）。
【０１０８】
カップリングは、抗体及び他の部分のそれぞれの活性が保持されるのであれば、２つの分子を結合させる化学反応により達成してよい。この結合には、多くの化学的機序、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、及び錯体形成などが含まれ得る。しかしながら、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖を直接縮合させるかまたは外部架橋分子を組み込むことにより達成可能である。本発明の抗体などのタンパク質分子を他の分子に結合させる際には多くの二価または多価の連結剤が有用である。例えば、代表的カップリング剤には、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアナート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物が含まれ得る。この一覧は、当該技術分野で公知の各種クラスのカップリング剤を網羅することを意図したものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤を例示するものである。（Ｋｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５−２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ６２：１８５−２１６（１９８２）；及びＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）を参照のこと）。好ましいリンカーは文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載したＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４）を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーによって抗体に結合させたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載した米国特許第５，０３０，７１９号も参照のこと。特に、好ましいリンカーには、ＥＤＣに結合させた、（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ（２１５５８Ｇ）、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノアート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５１Ｇ）、（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピアンアミド］ヘキサノアート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ＃２１６５−Ｇ）、及び（ｖ）スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ＃２４５１０）が含まれる。
【０１０９】
上記リンカーは、属性が異なる構成成分を含有するため、生理化学的特性の異なる複合体がもたらされる。例えば、アルキルカルボン酸塩のスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボン酸塩のスルホ−ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ−エステルを含有するリンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも低可溶性である。さらに、リンカーＳＭＰＴは立体障害ジスルフィド結合を含有し、安定性の高い複合体を形成することができる。ジスルフィド結合は一般に、インビトロではジスルフィド結合が切断されるため他の結合よりも安定性が低く、そのため、利用可能な複合体は少ない。特に、スルホ−ＮＨＳはカルボジミドカップリングの安定性を高めることができる。カルボジミドカップリング（ＥＤＣなど）は、スルホ−ＮＨＳと併用した場合、カルボジミドカップリング反応単独の場合よりも加水分解に対する抵抗性があるエステルを形成する。
【０１１０】
本明細書に開示する抗体は、イムノリポソームとして製剤化することもできる。抗体を含有するリポソームは、当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７；４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載のような方法により調製される。循環時間が向上したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１１１】
特に、有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により作製することができる。孔径の定められたフィルターからリポソームを押し出し、所望の直径のリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のようにリポソームに結合させることができる。
【０１１２】
ＧＩＴＲに対する抗体の使用
ＧＩＴＲタンパク質に特異的に結合する本発明の抗体またはその断片は、ＧＩＴＲ関連疾患または障害を治療するために投与することができる。「ＧＩＴＲ関連疾患または障害」には、高レベルのＧＩＴＲ及び／またはＧＩＴＲが関与する細胞シグナル伝達経路の活性化が認められる、疾患の状態及び／または疾患の状態に関連する症状が含まれる。例示的なＧＩＴＲ関連疾患または障害には、がん及び炎症性疾患が含まれるが、これに限定されない。
【０１１３】
がんの多くはＧＩＴＲを過剰発現し、ＧＩＴＲの上方制御はリスクの高い予後因子に関連している。腫瘍細胞におけるＧＩＴＲまたはそのリガンドＧＩＴＲ−Ｌの過剰発現は、腫瘍細胞が抗腫瘍免疫を回避する機序も示し得る。そのようながんには、充実性腫瘍及び血液腫瘍が含まれる。本発明の抗体の使用により、Ｔｒｅｇが抑制または除去され、Ｔｅｆｆが刺激される。さらに、本発明の抗体は、ＮＫ細胞の毒性を高め、ＩＦＮγ産生を高める。
【０１１４】
二重特異性、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体を含む本発明の抗体を治療剤として使用してよい。そのような薬剤は一般に、対象のがんの治療もしくは予防、ワクチン有効性の増大、または自然免疫応答の増強に使用される。抗体調製物、好ましくはその標的とする抗原に対して高特異性かつ高親和性である抗体調製物を対象に投与するが、これは一般に、それが標的と結合することで効果が得られることになる。抗体投与により、ＧＩＴＲタンパク質の活性が抑止または阻害または妨害され得る。
【０１１５】
本発明のＧＩＴＲタンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体は、がんを治療するために医薬組成物の形態で投与することができる。抗体を含む治療用組成物の調製に関する原則及び考慮事項、ならびに構成成分の選択に際してのガイダンスは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９ｔｈ  ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｍｅ，Ｐａ．，１９９４；及びＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１１６】
本発明の抗体の治療的有効量は一般に、治療目的達成に要する量に関連する。上記のように、これは抗体とその標的抗原との結合相互作用であり得、ある場合には、標的の機能性を阻害する。投与に必要とされる量は、抗体が特異的である抗原に対するその結合親和性にさらに依存することになり、かつ、投与抗体が、抗体を投与される自由体積の他の対象から消失する速度にも依存することになる。本発明の抗体または抗体断片の治療的有効投与量の一般的範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的投与頻度は、例えば、１日２回〜週１回の範囲であり得る。
【０１１７】
抗体断片を使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列と結合する能力を保持するようペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的合成及び／または組換えＤＮＡ技術による作製が可能である。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと）。製剤は、治療される特定の適応について必要に応じ２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼすことのない相補的活性を有するものを含有することもできる。別法として、または追加として、組成物は、その機能を増強させる薬剤、例えば、細胞傷害性物質サイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）、化学療法薬、または増殖阻害性薬剤などを含むことができる。そのような分子は、意図する目的に効果的な量で配合され好適に存在する。
【０１１８】
有効成分を、マイクロカプセル、例えば、コアセルベーション技術または界面重合などにより調製したもの、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルそれぞれに内包すること、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロ粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に内包すること、またはマクロエマルジョンに内包することもできる。
【０１１９】
インビボでの投与に使用する製剤は滅菌する必要がある。これは、滅菌ろ過膜に通すろ過により容易に達成される。
【０１２０】
徐放性調製物を調製することができる。適切な徐放性調製物の例には、抗体を含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体とリュープロリド酢酸塩とで構成される注射用ミクロ粒子）など、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日以上にわたって分子放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはタンパク質放出期間がそれより短い。
【０１２１】
本発明による抗体は、試料中のＧＩＴＲ（またはタンパク質またはそのタンパク質断片）の存在を検出する薬剤として使用できる。好ましくは、抗体は検出可能な標識を含有する。抗体は、ポリクローナル抗体、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。完全な抗体、またはその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ）２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して「標識した」という用語により、プローブまたは抗体に検出可能物質をカップリング（すなわち、物理的連結）させることでプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含することが意図される。間接標識の例には、蛍光標識した二次抗体、及び蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようビオチンを用いたＤＮＡプローブ末端標識を使用する、一次抗体の検出が含まれる。用語「生体試料」により、組織、対象から単離された細胞及び生体液、ならびに対象の体内に存在する組織、細胞及び体液を含むことが意図される。したがって、用語「生体試料」の使用においては、血液、及び血液血清、血漿、またはリンパ液など血液の画分または成分が含まれる。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生体試料における分析対象のｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、分析対象ｍＲＮＡを検出するインビトロ技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。分析対象タンパク質を検出するインビトロ技術には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光抗体法が含まれる。分析対象ゲノムＤＮＡを検出するインビトロ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。イムノアッセイの実施手順は、例えば、“ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃｌｉｎｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；及び“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。さらに、分析対象タンパク質を検出するインビボ技術には、対象への標識抗分析対象タンパク質抗体の導入が含まれる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識し、対象におけるその存在及び位置を標準のイメージング技術で検出することができる。
【０１２２】
ＧＩＴＲタンパク質に対する抗体（またはその断片）を、ＧＩＴＲタンパク質の位置決定及び／または定量に関する技術分野で知られる方法に使用してよい（例えば、適切な生理学的試料中のＧＩＴＲタンパク質レベル測定での使用、診断方法での使用、タンパク質イメージングでの使用等）。所与の実施形態では、ＧＩＴＲタンパク質に特異的な抗体、または抗原結合ドメイン由来の抗体を含有するその誘導体、断片、アナログもしくはホモログを、薬理学的活性成分（以下、「治療薬」と呼ぶ）として使用する。
【０１２３】
本発明のＧＩＴＲタンパク質に対して特異的な抗体を使用して、イムノアフィニティ、クロマトグラフィーまたは免疫沈降法のような標準技術によりＧＩＴＲポリペプチドを単離することができる。ＧＩＴＲタンパク質に対する抗体（またはその断片）を、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するなど、臨床試験手順の一部として、組織のタンパク質レベルを監視する診断用に使用することができる。検出は、抗体を検出可能物質にカップリング（すなわち、物理的連結）させることにより容易に行うことができる。検出可能物質の例には、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の一例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【０１２４】
医薬組成物
本発明の抗体または薬剤（本明細書では「活性成分」とも呼ばれる）、ならびにその誘導体、断片、アナログ及びホモログを、投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は典型的に、抗体または薬剤及び薬理学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、用語「薬理学的に許容される担体」により、薬剤投与に適合性のあるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬及び抗真菌薬、等張化剤及び吸収遅延剤等を含むことが意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組み込まれる当該分野で標準的な参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これに限定されない。リポソーム及び不揮発性油などの非水性ビヒクルを使用してもよい。薬理学的活性物質にそのような媒体及び薬剤を使用することは当該技術分野において周知である。従来のいかなる媒体または薬剤も、活性化合物と不適合ではない限り、それを組成物に使用することが意図される。組成物には、補助活性化合物も組み込むことができる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物をその意図される投与経路に適合するよう製剤化する。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮吸収（すなわち、局所）、経粘膜投与、及び直腸投与が含まれる。非経口用途、皮内用途、または皮下用途に使用される溶液または懸濁液には、以下の構成成分、すなわち、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など；抗菌薬、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など；及び等張化剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが含まれ得る。酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムなどでｐＨを調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに密封することができる。
【０１２６】
注射用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性）または分散液、及び滅菌注射液または分散液を用時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理的食塩液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合にも、組成物は滅菌する必要があり、容易に注射針を通過できる程度に流動性がなければならない。製造条件及び保管条件下で安定でなければならず、かつ、細菌及び真菌類などの微生物による汚染作用を受けないよう保存しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びその適切な混合物などを含有する溶媒または分散培地であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合は要求される粒径を維持すること、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物作用の予防は、さまざまな抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０１２７】
滅菌注射液は、適切な溶媒に入れた必要量の活性化合物を、上掲原料の１つまたは組み合わせと必要に応じて合せ、その後、ろ過滅菌により調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散培地と、上掲の原料のうち他に必要な原料とを含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を合せることによって調製する。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、有効成分と任意のさらなる所望原料との事前滅菌ろ過溶液からそれらの粉末が得られる真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【０１２８】
経口組成物には一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらは、ゼラチンカプセルに密封することも、または圧縮して錠剤にすることもできる。経口治療薬投与をする場合は、活性化合物を添加剤と組み合わせ、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で用いることができる。また、経口組成物は、洗口剤として使用するための液体担体を使用して調製することもでき、ここで、液体担体中の化合物は経口塗布され及び口中ですすがれ、吐出されるかまたは飲み込まれる。薬理学的に適合性のある結合剤、及び／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ剤等は、以下の任意の原料、または性質が類似する化合物を含有することができる：結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガントゴムまたはゼラチンなど；添加剤、例えば、デンプンまたは乳糖など、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなど；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅなど；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えば、ショ糖またはサッカリンなど；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ矯味剤など。
【０１２９】
吸入による投与では、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、またはネブライザーの形態で化合物を送達する。
【０１３０】
全身投与は、経粘膜または経皮吸収による手段でも可能である。経粘膜または経皮吸収による投与では、透過するべき障壁に対して適切な浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は一般に当該技術分野で公知であり、それらには、例えば、経粘膜投与用、洗浄液、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体などが含まれる。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮吸収投与では、活性成分は、当該技術分野で一般に公知のように軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリーム剤に製剤化する。
【０１３１】
化合物は、坐剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリド類のような従来の坐薬基剤）または直腸送達用停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１３２】
一実施形態では、活性成分は、制御放出製剤のような、化合物が体から急速に排出されないよう保護してくれる担体を用いて調製され、インプラント送達システム及びマイクロカプセル化送達システムが含まれる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生物分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明らかである。材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ｉｎｃから市販されているものを入手できる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞に指向されるリポソームを含む）を薬理学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のような当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【０１３３】
投与の簡便性及び用量の均一性から、経口または非経口の組成物を投与単位形態で製剤化することが特に都合がよい。本明細書で使用する投与単位形態とは、治療すべき対象に対する単位用量として好適な物理的個別単位を指し、各単位に、要求される医薬担体と共同で所望の治療効果を生み出すよう計算された所定量の活性化合物が含有されているものを指す。本発明の投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特性及び達成すべき特定の治療効果、ならびに個人を治療するためのそのような活性化合物の配合技術に本質的な制約により決定され、かつ、直接依存する。
【０１３４】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー内に投与指示書と共に含めることができる。
【０１３５】
診断アッセイ
例えば、所与の治療及び／または予防レジメンの有効性を決定するなどの臨床試験手順の一部として、ｈｕＧＩＴＲ抗体を診断に使用し、例えば、免疫細胞障害（例えば、ＣＬＬ）の発症または進行を監視することなどができる。
【０１３６】
いくつかの態様では、診断用に、本発明のｈｕＧＩＴＲ抗体を検出可能部分に連結し、これにより、がんまたは慢性感染に罹患している対象のＴ細胞の疲弊を検出する方法が提供される。
【０１３７】
検出可能部分は、抗体または断片に直接結合させることも、または、例えば、蛍光二次抗体などの使用により間接的に結合させることもできる。直接結合は、例えば、フルオロフォアと抗体または抗体断片などを標準的な化学カップリングにより結合させても、または遺伝子工学技術を介して結合させても達成することができる。蛍光タンパク質または生物発光タンパク質に結合させた抗体または抗体断片を含有するキメラ、すなわち融合タンパク質を構築することができる。例えば、Ｃａｓａｄｅｉらは、哺乳類細胞でエクオリンと抗体遺伝子との融合タンパク質の発現能があるベクター構成体の作製方法を記載している。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、プローブまたは抗体に関して「標識した」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能物質をカップリング（すなわち、物理的連結）させることによりプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含することを意図する。間接標識の例には、蛍光標識した二次抗体、及び蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようビオチンを用いたＤＮＡプローブ末端標識を使用する、一次抗体の検出が含まれる。用語「生体試料」により、対象から単離された（バイオプシーなど）組織、細胞及び生体液、ならびに対象の体内に存在する組織、細胞及び体液を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生体試料中でＧＩＴＲを発現する細胞をインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、ＧＩＴＲを検出するインビトロ技術には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光抗体法が含まれる。さらに、ＧＩＴＲを検出するインビボ技術には、対象への標識抗ＧＩＴＲ抗体の導入が含まれる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識し、対象におけるその存在及び位置を標準のイメージング技術で検出することができる。「指向型」複合体、すなわち、対象または動物の内部で特定の部位（複数可）に複合体を局在させるよう設計された分子もしくは特徴である標的部分を含有する複合体の場合、局在とは、対象内部で、結合している「局在した」分子成分と未結合である「遊離の」分子成分との平衡が本質的に達成された場合の状態を指す。そのような平衡が達成される速度は投与経路に依存する。例えば、血栓に局在させるために静脈注射で投与された複合体では、血栓における局在または蓄積が、注射の数分以内に達成され得る。その一方で、腸内感染に局在させるために経口投与された複合体は、局在達成に数時間を要することがある。あるいは、局在は、単純に、分子成分投与後の選択された期間における対象または動物の内部の分子成分の位置を指してよい。別の例として、投与の後に部分が分布した場合、局在は達成されている。
【０１３９】
上記のいずれの場合も、局在達成時間の妥当な推定は当業者が行ってよい。さらに、時間の関数としての局在状態の後、本発明の方法にしたがって、例えば、光検出装置を用いて検出可能部分（例えば、発光複合体）のイメージングを行ってよい。使用する「光検出装置」は、哺乳類内部からの微弱光のイメージングを妥当な時間内に可能にし、かつそのような装置からのシグナルを用いて画像を構築するため、十分に高感度である必要がある。
【０１４０】
極めて明るい光発生部分を使用すること、及び／またはイメージングされる対象または動物の表面近傍に局在している光発生融合タンパク質を検出することが可能な場合には、一対の「暗視」ゴーグルまたは標準的高感度ビデオカメラ、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  Ｔｕｂｅ（ＳＩＴ）カメラ（例えば、Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．製）などを使用してよい。しかしながら、より典型的には、より感度の高い光検出方法が必要である。
【０１４１】
光量が極めて低い場合、単位面積当たりの光子束が非常に低くなるのでイメージングされるシーンはもはや連続的には現われない。その代わり、互いに時間的かつ空間的に別である個々の光子により表される。モニターで見ると、そのような画像は各々が単一の検出光子を表す閃輝の光の点として現われる。これらの検出光子をデジタル画像処理装置で経時的に蓄積させることにより、画像を取得して構築することができる。各像点のシグナルに強度値が割り当てられる従来のカメラとは対照的に、光子計数イメージングではシグナルの振幅には全く有意性はない。目的は、単純にシグナル（光子）の存在を検出すること、及びシグナルの位置に関してその出現を経時的に計測することである。
【０１４２】
以下に記載の少なくとも２種類の光検出装置は、個々の光子を検出し、画像処理装置で分析可能なシグナルを発生することができる。低ノイズ光検出装置は、光子シグナルを増幅させるのではなく、光子検出器のバックグラウンドノイズを低減することにより感度を達成している。主に検出器アレイの冷却によりノイズを低減する。デバイスには、「裏面入射型」冷却ＣＣＤカメラと呼ばれる電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが含まれる。より感度の高い機器では、例えば、ＣＣＤアレイの温度を約−１２０℃にする液体窒素を使用して冷却を達成する。「裏面入射型」とは、光子がたどる検出対象となる光路長を短縮することにより量子有効性を高める超薄型背面プレートを指す。特に感度の高い裏面入射型極低温ＣＣＤカメラは、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚ．）製「ＴＥＣＨ５１２」、２００シリーズのカメラである。
【０１４３】
「光子増幅装置」は、光子が検出画面に当たる前に光子を増幅させる。このクラスには、増強装置付きＣＣＤカメラ、例えば、マイクロチャンネル増強装置などが含まれる。マイクロチャンネル増強装置は典型的に、カメラの検出画面に対して垂直かつ同延の金属アレイのチャンネルを含有する。マイクロチャンネルアレイは、撮像される試料、対象、または動物とカメラとの間に置かれる。アレイのチャンネルに入る光子のほとんどは出る前にチャネル側面に接触する。アレイ両側に電圧を印加すると、それぞれの光子衝突により多くの電子が放出される。そのような衝突から出た電子は元のチャネルから「ショットガン」のようなパターンで出て行き、カメラに検出される。
【０１４４】
増強マイクロチャンネルアレイを直列に配することにより、さらに高い感度を達成することができ、第１段階で発生した電子は、次に第２段階でシグナルが増幅した電子となる。しかしながら、感度増強は空間分解能の犠牲の上に達成され、増幅段階を重ねるにつれて低下する。例示的なマイクロチャンネル増強装置を使用する単一光子検出装置はＨａｍａｍａｔｓｕより入手可能なＣ２４００シリーズである。
【０１４５】
画像処理装置は、光子の計数を行う光検出装置が発生するシグナルを処理して画像を構築し、それを例えば、モニター上で表示するかまたはビデオプリンターで印刷することができる。そのような画像処理装置は典型的に、上記の高感度光子計数カメラが含まれた装置の一部として販売されるため、同一販売元から入手可能である。画像処理装置は通常、ＩＢＭ互換性ＰＣまたはＡｐｐｌｅ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，Ｃａｌｉｆ）などのパーソナルコンピュータに接続されるが、購入するイメージング装置の一部として含まれる場合と含まれない場合がある。画像は、一旦デジタルファイル形式にされた後は、多種多様な画像処理プログラム（“ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ”，Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．など）で操作し、印刷することができる。
【０１４６】
一実施形態では、生体試料は、被験対象由来のタンパク質分子を含有する。好ましい生体試料の１つは、従来の手段で対象から単離された末梢血白血球試料である。
【０１４７】
本発明は、生体試料においてＧＩＴＲまたはＧＩＴＲ発現細胞の存在を検出するキットも包含する。例えば、キットは、生体試料中のがん細胞または腫瘍細胞（例えば、抗ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖまたはモノクローナル抗体）を検出することができる標識した化合物または薬剤；試料中のＧＩＴＲ量を決定する手段；及び試料中のＧＩＴＲ量と標準の量を比較する手段を含むことができる。いくつかの実施形態では、標準とは非がん細胞またはその細胞抽出物である。化合物または薬剤は、適切な容器に包装可能である。キットはさらに、キットを使用して試料中のがんを検出するための指示書を含むことができる。
【０１４８】
二重特異性抗体
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、得られる抗体が２つの異なる抗原を認識するよう２つの可変ドメインまたはｓｃＦｖユニットを含む抗体である。本発明は、ＧＩＴＲ及び第２の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。例示的な第２の抗原には、腫瘍関連抗原、サイトカイン、及び細胞表面受容体が含まれる。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ、またはＧ２５０）、ＩＬ−１０、またはＣＣＲ４であり得る。いくつかの実施形態では、第２の抗原は細胞表面受容体であり得、ここで細胞表面受容体は、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＣＲ４、ＩＬ２１Ｒ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、またはＴＩＭ３である。本発明の二重特異性抗体は、本明細書に開示するｈｕＧＩＴＲ抗体の重鎖及び軽鎖の組み合わせまたはｓｃＦｖを含む。
【０１４９】
二重特異性抗体の構築
本発明の二重特異性抗体は、公知技術の方法を使用して構築することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ断片が長いリンカーポリペプチドで連結された単一ポリペプチドであり、２つのｓｃＦｖユニット同士が分子内で会合して抗体を形成できるだけの十分な長さがある。他の実施形態では、二重特異性抗体は、２つ以上のポリペプチドが共有結合または非共有結合で連結されたものである。
【０１５０】
別の実施形態では、「ノブ・イントゥ・ホール」法（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ７：６１７−６２１（１９９６））を使用して二重特異性抗体を構築する。この方法では、重鎖の対形成を選択的に切断し、重鎖−軽鎖の対形成は保持するよう、２つの異なる可変ドメインのＩｇ重鎖を還元させる。２つの異なる抗原を認識する２つの重鎖−軽鎖ヘテロ二量体を混合してヘテロライゲーションによる対形成を促進するが、これは、ＣＨ３ドメインに工学的な「ノブ・イントゥ・ホール」操作を行うことにより誘導される。
【０１５１】
別の実施形態では、２つ以上の異なる抗体から得た重鎖−軽鎖二量体同士を交換することによって、第１の重鎖−軽鎖二量体がＧＩＴＲを認識しかつ第２の重鎖−軽鎖二量体が第２の抗原を認識するハイブリッド抗体を作製して、二重特異性抗体を構築することができる。重鎖−軽鎖二量体についてのメカニズムは、二重特異性分子としても機能するヒトＩｇＧ４の形成と同様である。ＩｇＧ重鎖の二量体化は、分子内力、例えば、各重鎖のＣＨ３ドメインの対形成及びジスルフィド架橋などにより誘導される。ＣＨ３ドメインに特定アミノ酸（Ｒ４０９）が存在すると、ＩｇＧ４分子の二量体交換及び構築を促進することが示されている。重鎖対形成はまた、抗体のヒンジ領域にある重鎖間ジスルフィド架橋によりさらに安定化される。具体的に、ＩｇＧ４では、ヒンジ領域は、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（比較対照の安定なＩｇＧ１ヒンジ領域は配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含有する）をアミノ酸２２６〜２３０において含有する。この２２９位のセリンによる配列の相違は、ＩｇＧ４がヒンジ領域で新たな鎖内ジスルフィドを形成する傾向と関連付けられている（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７：１５５４−１５５７及びＬａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１８７：３２３８−３２４６）。
【０１５２】
したがって、本発明の二重特異性抗体は、Ｒ４０９残基をＣＨ３ドメインに、またＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ配列を、ＧＩＴＲまたは第２の抗原を認識する抗体のヒンジ領域に導入することにより作製し、重鎖−軽鎖二量体の交換によって、ＧＩＴＲを認識する重鎖−軽鎖二量体１つと、第２の抗原を認識する第２の重鎖−軽鎖二量体とを有する抗体分子が作製されるようにすることができ、ここで、第２の抗原は本明細書に開示される任意の抗原である。本明細書に開示するように、重鎖及び軽鎖がＧＩＴＲまたは第２の抗原を認識するよう既知のＩｇＧ４分子を改変してもよい。Ｆｃ領域が、他のＩｇＧサブタイプとは異なり、免疫応答のエフェクター系、例えば、補体及び特定の白血球が発現するＦｃ受容体などとほとんど相互作用しないＩｇＧ４分子の固有の特性から、本発明の二重特異性抗体の構築に上記方法を使用することは有益であり得る。こうした特異的性質のため、標的（複数可）と結合し、かかる標的（複数可）に関連したシグナル伝達経路を機能的に改変はするがエフェクター活性は誘発しないことが抗体に要求される治療用途にとって、これらのＩｇＧ４を用いた二重特異性抗体は魅力的である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ｂｓＡｂの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改変するようｂｓＡｂの定常領域に変異を導入する。例えば、変異は、ＣＨ２ドメインのＬＡＬＡ変異である。一態様では、ｂｓＡｂは、ＡＤＣＣ活性を低下させる変異をヘテロ二量体ｂｓＡｂの１つのｓｃＦｖユニットに含有する。別の態様では、ｂｓＡｂは、ＡＤＣＣ活性が完全に除去される変異をヘテロ二量体ｂｓＡｂの両鎖に含有する。例えば、ｂｓＡｂのｓｃＦｖユニットの一方または両方に導入される変異は、ＣＨ２ドメインのＬＡＬＡ変異である。可変ＡＤＣＣ活性を有するこれらのｂｓＡｂは、ｂｓＡｂが認識する１つの抗原を発現する細胞に対して最大選択的傷害性を示すが、ｂｓＡｂが認識する第２の抗原に対しては最小傷害性をｂｓＡｂが示すよう最適化することができる。本明細書に開示する二重特異性抗体は、疾患または病状、例えば、がんなどの治療において有用であり得る。本発明の二重特異性抗体は、多量のＴｒｅｇに関連する疾患または病状において特に有用であり得る。
【０１５４】
治療方法
本発明は、がん、または他の細胞増殖関連疾患もしくは障害のリスクがある（または罹患しやすい）対象を治療する予防方法及び治療方法の両方を提供する。そのような疾患または障害には、例えば、ＧＩＴＲの異常発現に関連した疾患または障害が含まれるが、これに限定されない。例えば、方法を用いてがん症状を治療、予防または軽減する。別法として、方法を用いて、ＧＩＴＲがＴ細胞応答において負の調節の役割を果たすがんの症状を、治療、予防、または軽減する。別法として、方法を用いて、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頸がん、脳腫瘍、皮膚がん、肝がん、膵がんまたは胃がんなどの充実性腫瘍の症状を、治療、予防、または軽減する。さらに、本発明の方法を用いて、白血病及びリンパ腫などの血液がんを治療する。別法として、方法を用いて、転移したがんの症状を、治療、予防、または軽減する。
【０１５５】
したがって、一態様では、本発明は、対象のがんまたは細胞増殖性の疾患もしくは障害の症状を、対象に本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ抗体または本発明の二重特異性抗体を投与することにより、予防、治療、または軽減する方法を提供する。例えば、ｈｕＧＩＴＲ抗体を治療的有効量投与してよい。
【０１５６】
がんまたは細胞増殖関連の疾患もしくは障害のリスクがある対象には、がんの家族歴がある患者、または既知または疑いのある発がん性物質に曝露されている対象が含まれる。がんの発症前に予防薬の投与を行って疾患を予防するか、または別法として、その進行を遅延させることができる。
【０１５７】
別の態様では、細胞を本発明のＧＩＴＲ抗体と接触させることにより、腫瘍細胞増殖を阻害するか、Ｔｒｅｇ活性を低下させるか、Ｔｅｆｆ活性を高めるか、またはＮＫ細胞の細胞傷害性を高める。細胞は、ＧＩＴＲを発現するあらゆる細胞である。例えば、細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。
【０１５８】
また、本発明には、抗原に対する免疫応答を高めるかまたは増強させる方法も含まれる。対象にモノクローナル抗体または本発明のｓｃＦｖ抗体を投与することにより免疫応答を高めるかまたは増強させる。例えば、抗原特異的Ｔエフェクター機能を増強させて免疫応答を増強させる。抗原は、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ）、細菌抗原、寄生虫抗原、または腫瘍抗原である。免疫応答は自然免疫応答である。自然免疫応答とは、感染の結果である免疫応答を意味する。感染は慢性感染である。抗原に対する免疫応答の増大または増強は、当該技術分野で公知の多数の方法により測定することができる。例えば、免疫応答は、Ｔ細胞活性、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、エフェクターサイトカイン産生、及びＴ細胞転写プロファイルのうちいずれか１つを測定することにより測定可能である。
【０１５９】
別法として、免疫応答は、ワクチン接種により誘導される応答である。したがって、別の態様では、本発明は、対象に本発明のモノクローナル抗体またはｓｃＦｖ抗体及びワクチンを投与することによりワクチン有効性を高める方法を提供する。抗体及びワクチンは、順次または同時に投与する。ワクチンは、腫瘍ワクチン、細菌ワクチンまたはウイルスワクチンである。
【０１６０】
組み合わせ方法
本発明は、ＧＩＴＲタンパク質の同一エピトープ、または別法として、ＧＩＴＲタンパク質の２つの異なるエピトープに結合する２つの抗体を投与することによる患者のがん治療を提供する。別法として、ＧＩＴＲに結合する第１の抗体及びＧＩＴＲ以外のタンパク質に結合する第２の抗体を投与することにより、がんを治療する。例えば、ＧＩＴＲ以外の他のタンパク質には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、及びＩＬ−１０が含まれ得るが、これに限定されない。例えば、ＧＩＴＲ以外の他のタンパク質は腫瘍関連抗原である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｈｕＧＩＴＲ抗体を単独で、またはＧＩＴＲ以外の別のタンパク質を認識するさらなる抗体と共に投与すること、及び免疫応答をもたらすかまたは増強させる能力がある細胞を提供する。例えば、これらの細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、またはＰＢＭＣ、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などに見られる任意の細胞型であってよい。
【０１６２】
さらに、本発明は、ＧＩＴＲタンパク質に結合するほか、抗腫瘍物質、例えば、低分子、増殖因子、サイトカイン、またはペプチド、ペプチド模倣物質、ペプトイド、ポリヌクレオチド、脂質由来メディエーター、小さな生体アミン、ホルモン、神経ペプチド、及びプロテアーゼといった生体分子が含まれる他の治療薬などに結合する抗体の投与を提供する。低分子には、無機分子及び有機低分子が含まれるが、これに限定されない。適切な増殖因子またはサイトカインには、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、及びＴＮＦ−アルファが含まれる。低分子ライブラリーは当該技術分野で公知である。（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，１２：１４５，１９９７を参照のこと）。
【０１６３】
以下の実施例において本発明を詳述していくが、これらは請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１６４】
実施例１：抗ＧＩＴＲ抗体の単離
ここでの同定では、１３の抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体の単離を記載する。ｈＧＩＴＲ−ｍＩｇのパニングをＭｅｈｔａ  Ｉ／ＩＩファージディスプレイライブラリーを用いて抗原濃度及び洗浄条件を変えて３ラウンド実施した。ｍＧＩＴＲ−ｈｉｓのパニングを抗原濃度及び洗浄条件を変えて２ラウンド実施した。その後、ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、ラウンド２のｈＧＩＴＲ−ｍＩｇＧ２ａまたはｍＧＩＴＲ−Ｈｉｓを２ｕｇ／ｍｌ用いてラウンド２及び３で得た単一クローンのスクリーニングを行った。図１に記載のように、ＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列決定を行い、陰性対照を含めて第２のＥＬＩＳＡアッセイで確認した。４３のユニークなクローンを同定した。
【０１６５】
ＭＳＤ（ｍｅｓｏ  ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙシステム）を使用して、ｈＧＩＴＲへのクローンの結合について２種類の濃度のｈＧＩＴＲ−ｍＩｇＧ２ａ抗原及び４種類の濃度のＰＥＧ精製抗ＧＩＴＲファージ−ＡＢでさらに試験した（図２）。第２の実験を実施し、８種類の濃度のｈＧＩＴＲ−ｍＩｇ及び一定数のＰＥＧ精製抗ＧＩＴＲファージ−ＡＢを試験した（図３）。
【０１６６】
実施例２：ＨＧＩＴＲ及びＭＧＩＴＲパニングから得たＥＬＩＳＡ陽性クローン及びＦＡＣＳ陽性クローンの特性解析
ｈＧＩＴＲ−ｍＩｇパニングを使用した最初のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳスクリーニングの後、合計２９のユニークなクローンを同定した。ＥＬＩＳＡ分析の後、これらのクローンのうち、抗ｈＧＩＴＲには結合するがｈＧＩＴＲ−Ｈｉｓには結合しない１０のクローンを同定した。これらのクローンのうち１９はｈＧＩＴＲ−ｍＩｇにもｈＧＩＴＲ−Ｈｉｓにも結合し、これらのうち４つは結合親和性が弱かった。１５のクローンがＦＡＣＳ解析で陽性であり、３つは他よりも結合が弱かった。また、２ラウンドのｍＧＩＴＲ−Ｈｉｓパニング後、ＥＬＩＳＡで陽性のユニークなクローンが合計６つあった。これらのクローンのうち４つは抗ｍＧＩＴＲ−Ｈｉｓにのみ結合し、２つはｍＧＩＴＲ−Ｈｉｓ及びｈＧＩＴＲ−Ｈｉｓの両方に結合した。ｍＧＩＴＲに対して１つのｓｃＦＶが選択されたが、これはｈＧＩＴＲ−ｍＩｇ及びｈＧＩＴＲ−Ｈｉｓと強く反応する。
【０１６７】
実施例３：抗ＧＩＴＲ抗体の特性解析
４種類の濃度の抗ＧＩＴＲファージ−ＡＢを使用して抗ＧＩＴＲの結合を試験した。さらに、ＧＩＴＲまたはＣＡ９を発現している安定なＣＨＯ細胞を抗ＧＩＴＲ抗体結合について試験した。ＧＩＴＲ結合を評価するＦＡＣＳ解析を使用した、ＦＩＴＣ陽性ＣＨＯ細胞の割合を図４に示す。単一コロニーから得たファージ上清を用いた単一濃度を使用して第３のＦＡＣＳ  ＧＩＴＲ結合アッセイを実施した（図５）。この分析により、ＧＩＴＲ発現ＣＨＯ細胞と結合し、ＣＡ９発現ＣＨＯ細胞とは結合しなかった抗ＧＩＴＲ抗体が明らかになった。単一コロニーから得たファージ上清の単一濃度を使用するさらなるＥＬＩＳＡ分析用に、ＧＩＴＲ結合陽性のものを選択した（図６）。フローサイトメトリーとＥＬＩＳＡの両方で陽性であった選択抗ＧＩＴＲ抗体の最終一覧を図７に記載する。
【０１６８】
実施例４：ＩＧＧ１−Ｆｃ（ＬＡＬＡ）変異フォーマット及びＩＧＧ４フォーマットでの抗ＧＩＴＲ  ＭＡＢの構築及び発現
新たに発見した抗ＧＩＴＲファージｓｃＦｖ抗体のＶＨ断片及びＶＬ断片を哺乳類発現ベクターＴＣＡＥにＰＣＲによりクローニングし、いずれもＡＤＣＣ活性が低いかまたは最小のフォーマットであるＩｇＧ１  Ｆｃ（ＬＡＬＡ）変異型またはＩｇＧ４型で発現させた。２９３Ｆ細胞のインビトロでのトランスフェクション時、細胞上清を回収し、ヒトＩｇＧ定量アッセイによりＩｇＧ濃度を定量化した。その後、上清を使用して、これらのＩｇＧ  ｍＡｂのＧＩＴＲ（＋）ＣＨＯ細胞に対するＧＩＴＲ結合活性をフローサイトメトリーを使用して試験した。図８〜１０に記載された結果から、ほとんどの抗ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧフォーマットに変換した際に、そのＧＩＴＲ結合活性を保持していることが示されている。
【０１６９】
実施例５：ＧＩＴＲリガンドと抗ＧＩＴＲ抗体間の結合競合
新たに発見した抗ＧＩＴＲ抗体をさらに特徴付けるため、漸増量の精製した抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ４またはＴＴ１−３Ｃ６  ＩｇＧ４と、一定濃度のＧＩＴＲリガンドとの競合結合アッセイをそれぞれ、フローサイトメトリーにより実施した。図１１は、ＧＩＴＲリガンドの結合（Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＨＡタグにより検出）は、漸増量の抗ＧＩＴＲ抗体により低下することを示す（ＰＥ標識マウス抗ヒト抗体により検出。程度は低いものの市販のＧＴＩ１０抗体と特徴は共通している）。ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を、漸増濃度の抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ４またはＴＴ１−３Ｃ６  ＩｇＧ４抗体、及び一定濃度のＧＩＴＲリガンドと共にインキュベートしたところ、リガンドまたは抗ＧＩＴＲ抗体単独とインキュベートした場合を大きく超えるレベルまでルシフェラーゼ活性が増大し、この特徴は市販のＧＴＩ１０抗体とは共通しなかった（図１２）。これらの結果は、抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ４またはＴＴ１−３Ｃ６は、Ｐｒｏｍｅｇａ製ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞において相乗的にＧＩＴＲリガンド誘導性ルシフェラーゼ発現を増大させ得ることを示す。
【０１７０】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上述の説明は例示を意図したものであり、添付の請求の範囲に記載の範囲により定義される本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１−１】
2019524111.tif 000032
【図１−２】
2019524111.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月16日(2019.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
[本発明1001]
ａ．配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｂ．配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｃ．配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｄ．配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｅ．配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｆ．配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｇ．配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｈ．配列番号30のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｉ．配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｊ．配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
ｋ．配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｌ．配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｍ．配列番号50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号52のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、ヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[本発明1002]
単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、以下：
（ａ）配列番号53、54または55のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号56、57、または58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｂ）配列番号59、60、または61のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号62、63、または64のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｃ）配列番号65、66、または67のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号68、69、または70のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｄ）配列番号71、72、または73のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号74、75、または76のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｅ）配列番号77、78、または79のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号80、81、または82のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｆ）配列番号83、84、または85のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号86、87、または88のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｇ）配列番号65、72、または89のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号90、91、または92のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｈ）配列番号93、94、または95のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号96、97、または98のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｉ）配列番号99、100、または101のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号102、103、または104のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
ｊ）配列番号65、72、または105のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号106、107、または108のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｋ）配列番号109、72、または110のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号111、112、または113のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、
（ｌ）配列番号65、72、または114のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号115、116、または117のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）、あるいは、
（ｍ）配列番号101、118、または119、のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変相補性決定領域1、2、または3（ＶＨ−ＣＤＲ）、及び配列番号120、121、または122のアミノ酸配列を含む軽鎖可変相補性決定領域1、2または3（ＶＬ−ＣＤＲ）
を含み、ヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）と結合する、前記抗体または抗原結合性断片。
[本発明1003]
一価または二価である、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
一本鎖抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1005]
結合親和性が10−5Ｍ〜10−12Ｍの範囲内である、本発明1001の抗体。
[本発明1006]
ＩｇＧ4重鎖定常領域を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1007]
前記Ｆｃ領域が、アミノ酸の位置234及び235における変異を含有する、本発明1001の抗体。
[本発明1008]
前記変異がＬ234Ａ及びＬ235Ａである、本発明1007の抗体。
[本発明1009]
腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する二重特異性抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1010]
治療剤に連結されている、先行本発明のいずれかの抗体。
[本発明1011]
前記治療剤が、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、低分子、またはサイトカインである、本発明1010の抗体。
[本発明1012]
本発明1001〜1011のいずれかの抗体を産生する、細胞。
[本発明1013]
対象における制御性Ｔ細胞を除去する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1011のいずれかの抗体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1014]
抗原に対する免疫応答を増強させる方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1011のいずれかの抗体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1015]
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌性抗原、または腫瘍関連抗原である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記抗体の前記投与が、抗原特異的Ｔ細胞活性の増大を引き起こす、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記抗体の前記投与が、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増大を引き起こす、本発明1014の方法。
[本発明1018]
前記対象にＩＬ−15を投与することをさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1019]
がんの症状を治療または軽減する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1011のいずれかの抗体を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1020]
前記がんが、ＧＩＴＲまたはそのリガンドＧＩＴＲ−Ｌが過剰発現しているがんである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記対象にサイトカインまたは化学療法剤をさらに投与することを含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記サイトカインがＩＬ−15である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51の核酸配列を含む、核酸。
[本発明1024]
配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52のポリペプチドをコードする、核酸。
[本発明1025]
配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
[本発明1026]
本発明1023または1024の核酸を含む、ベクター。
[本発明1027]
本発明1026のベクターを含む、細胞。
特別に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。方法及び材料は、本明細書に記載されるものと類似または同等のものを本発明の実施に際して使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、参照によりその全体が明白に組み込まれ、矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先することになる。さらに、本明細書に記載の材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定されることを意図しない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（表１４）重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
2019524111.tif 000047
2019524111.tif 000048
2019524111.tif 000049
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019524111000001.app
【国際調査報告】
2019524111.tif 000050
2019524111.tif 000051
2019524111.tif 000052
2019524111.tif 000053
2019524111.tif 000054