(57)【要約】  本発明は、目的抗体の重鎖及び軽鎖に位置特異的にシステイン（Ｃ）を挿入し、位置特異的に挿入されたシステインの遊離チオール基（−ＳＨ）を介して小分子で高活性の細胞毒素が結合したリンカーと部位特異的結合を行うことにより、均一性が良好なシステイン改変抗体−毒素複合体を形成する。本発明に開示されるシステイン挿入位置は、抗体軽鎖の第２０５位及び／又は第２０６位（Ｋａｂａｔ番号）、並びに／或いは重鎖の第４３９位（Ｋａｂａｔ番号）である。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン改変抗体−毒素複合体であって、
前記抗体は、システイン位置特異的挿入抗体であり、前記システイン挿入位置は、ｋａｐｐａ／λ軽鎖定常領域におけるＫａｂａｔ番号第２０５位、軽鎖定常領域におけるＫａｂａｔ番号第２０６、及びＩｇＧ抗体重鎖定常領域におけるＫａｂａｔ番号第４３９位のうちの１つ又は複数の部位を含む、ことを特徴とするシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項２】
前記システイン挿入位置のアミノ酸配列は、
ＬＣ−２０５ｉｎｓ：ＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦ、ＬＣ−２０６ｉｎｓ：ＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦ、及びＨＣ−４３９ｉｎｓ：ＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫのうちの１つ又は複数の配列を含み、
前記Ｃは、目的抗体軽鎖の第２０５位若しくは第２０６位、又は重鎖の第４３９位に挿入されたシステインである、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項３】
高活性の細胞毒素は、リンカーを介して挿入されたシステインの遊離チオール基に部位特異的結合し、リンカーと挿入されたシステインとが結合した抗体の軽鎖のアミノ酸配列はＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦ及びＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦであり、リンカーと挿入されたシステインとが結合した抗体の重鎖のアミノ酸配列はＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫであり、
前記Ｃは、目的抗体軽鎖の第２０５位若しくは第２０６位、又は重鎖の第４３９位に挿入されたシステインである、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項４】
前記抗体の軽鎖は、ｋａｐｐａ又はλアイソタイプを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項５】
前記抗体の重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項６】
前記システインは、チオール基を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項７】
前記チオール基は、化学的に結合することができる、ことを特徴とする請求項５に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項８】
リンカーを介してシステイン挿入変異遊離チオール基に部位特異的結合する高活性細胞毒素は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＢＤ、ＳＮ−３８又はＤｏｘ及びそれらの誘導体からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【請求項９】
部位特異的結合のステップは、
まず、還元剤で抗体を還元することにより、抗体上の改変したシステイン残基上のマスキング基を除去し、陽イオン交換クロマトグラフィー又は、限外濾過及び液体交換などの方式によりＤＴＴ及びマスキング基を除去し、次いで、酸化剤で抗体を酸化して抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させ、最後に、リンカー−毒素を加えてシスチン残基上の遊離チオール基に結合させ、陽イオン交換クロマトグラフィー又は限外濾過及び液体交換などの方式により抗体分子に結合していないリンカー−毒素を除去することである、ことを特徴とする請求項１に記載のシステイン改変抗体−毒素複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物及びその製造方法に関し、特にシステイン改変抗体−毒素複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体−毒素複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、標的療法の分野に属する。米国で販売承認されている２つの薬Ａｄｃｅｔｒｉｓ及びＫａｄｃｙｌａは、優れた臨床効果を示しており、臨床試験段階では５０種を超えるＡＤＣ薬がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の化合物であるシステイン改変抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）において、システイン挿入位置は、軽鎖の第２０５位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦ）、軽鎖の第２０６位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦ）、重鎖の第４３９位（Ｋａｂａｔ番号；アミノ酸配列：ＹＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫ）のうちの１つ又は複数の部位を含む。１つ又は複数の上記システイン挿入変異を含む抗体は、その親抗体の抗原に対する結合の能力（親和性）を保持する。本発明は、軽鎖の第２０５位及び／又は第２０６位、並びに／或いは重鎖の第４３９位に挿入されたシステインチオール基及びリンカー−毒素により抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）部位特異的結合を行う。
【０００４】
システイン改変抗体−毒素複合体において、抗体はシステイン位置特異的挿入抗体であり、システイン挿入位置は、ｋａｐｐａ／λ軽鎖定常領域における第２０５位（Ｋａｂａｔ番号）、軽鎖定常領域における第２０６位（Ｋａｂａｔ番号）及びＩｇＧ抗体重鎖定常領域における第４３９位（Ｋａｂａｔ番号）のうちの１つ又は複数の部位を含む。
【０００５】
システイン挿入位置のアミノ酸配列は、ＬＣ−２０５ｉｎｓ：ＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦ、ＬＣ−２０６ｉｎｓ：ＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦ、及びＨＣ−４３９ｉｎｓ：ＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫのうちの１つ又は複数の配列を含む。
【０００６】
高活性の細胞毒素は、リンカーを介して挿入されたシステインの遊離チオール基（−ＳＨ）  に部位特異的結合し、リンカーと挿入されたシステインとが結合した抗体の軽鎖のアミノ酸配列はＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦ及びＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦであり、リンカーと挿入されたシステインとが結合した抗体の重鎖のアミノ酸配列はＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫであり、Ｃは目的抗体軽鎖の第２０５位若しくは第２０６位、又は重鎖の第４３９位に挿入されたシステインである。
【０００７】
好ましくは、前記抗体の軽鎖は、ｋａｐｐａ又はλアイソタイプを含む。
好ましくは、前記抗体の重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む。  
好ましくは、前記システインはチオール基（−ＳＨ）を含む。
好ましくは、チオール基（−ＳＨ）は化学的に結合することができる
好ましくは、リンカーを介してシステイン挿入変異遊離チオール基に部位特異的結合する小分子高活性の細胞毒素は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＢＤ、ＳＮ−３８、Ｄｏｘ及びそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＢＤ、ＳＮ−３８及びＤｏｘの分子式は、
【化１】
2019533017.tif 000002
【化２】
2019533017.tif 000003
【化３】
2019533017.tif 000004
【化４】
2019533017.tif 000005
【化５】
2019533017.tif 000006
である。
【０００８】
主要な部位特異的結合のステップは、まず、還元剤（例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰなど）で抗体を還元することにより、抗体上の改変したシステイン残基上のマスキング基を除去し、陽イオン交換クロマトグラフィー又は、限外濾過及び液体交換などの方式によりＤＴＴ及びマスキング基を除去し、次いで、酸化剤（例えば、ＤＨＡＡ、ＣｕＳＯ４など）で抗体を酸化して抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させ、最後に、リンカー−毒素を加えてシスチン残基上の遊離チオール基に結合させ、陽イオン交換クロマトグラフィー又は限外濾過及び液体交換などの方式により抗体分子に結合していないリンカー−毒素を除去することである。
【０００９】
本発明のアミノ酸表
2019533017.tif 000007
【００１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６        ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ軽鎖定常領域（Ｋａｐｐａ）アミノ酸配列
＞ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−Ｋａｐｐａ
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＧＬＳＳＰＣＶＴＫＳＦＮにおけるＣは部位特異的結合位置であって、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ｐａｙｌｏａｄと部位特異的結合するものである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８        ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ軽鎖定常領域（Ｋａｐｐａ）アミノ酸配列
＞ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−Ｋａｐｐａ
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＧＬＳＳＰＶＣＴＫＳＦＮにおけるＣは部位特異的結合位置であって、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ｐａｙｌｏａｄと部位特異的結合するものである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０        ＩｇＧ１−Ｆｃ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ重鎖定常領域（Ｆｃ）アミノ酸配列
＞ＩｇＧ１−Ｆｃ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫ
ＴＱＫＳＬＳＣＬＳＰＧＫにおけるＣは部位特異的結合位置であり、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ｐａｙｌｏａｄと部位特異的結合するものである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２        ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ軽鎖定常領域（Ｋａｐｐａ）アミノ酸配列
＞ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−Ｋａｐｐａ
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＣＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＧＬＳＳＰＣＴＫＳＦＮにおけるＣは部位特異的結合位置であり、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ｐａｙｌｏａｄと部位特異的結合するものである。
【００１１】
本発明に開示される新しいシステイン改変抗体−毒素複合体（ＴＤＣ）は、非部位特異的結合ＡＤＣと比較して、薬物均一性が良好で、副作用が小さいなどの利点を有し、前臨床研究により、非部位特異的結合ＡＤＣよりも顕著に優れていることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図２】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図３】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図４】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図５】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図６】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図７】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図８】実施例２５に係るＨＩＣ−ＨＰＬＣによる４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出結果の図である。
【図９】実施例２６に係るＲＰ−ＨＰＬＣによる４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ毒素と抗体との比の測定結果の図である。
【図１０】実施例２７に係るＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＴＤＣ抗体骨格４Ｄ３の凝集状況の検出結果の図である。
【図１１】実施例２７に係るＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＴＤＣ抗体骨格４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓの凝集状況の検出結果の図である。
【図１２】実施例２７に係るＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＴＤＣ抗体骨格４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓの凝集状況の検出結果の図である。
【図１３】実施例２７に係るＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＴＤＣ抗体骨格４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓの凝集状況の検出結果の図である。
【図１４】実施例２８の試験結果の図である。
【図１５】実施例２９に係る抗原ｃ−ｍｅｔに対する４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ抗体の親和性の結果の図である。
【図１６】実施例２９に係る抗原Ｔｒｏｐ２に対するＴＤＣ  ４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ抗体の親和性の結果の図である。
【図１７】ＥＧＦＲｗｔ過剰発現ヒト皮膚扁平上皮がん細胞Ａ４３１に対する２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡのＩＣ５０検出結果の図である。
【図１８】ＦＧＲｖＩＩＩ過剰発現ヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＩＣ５０検出結果の図である。
【図１９】ｃ−Ｍｅｔ中高度発現悪性神経膠腫細胞株Ｕ８７−ＭＧに対する４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１のＩＣ５０検出結果の図である。
【図２０】ｔｒｏｐ２高度発現膵臓がん細胞株ＢＸＰＣ−３に対するＤ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３のＩＣ５０検出結果の図である。
【図２１】４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのヒト血漿における安定性の調査結果の図である。
【図２２】４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのヒト血漿における安定性の調査結果の図である。
【図２３】４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのヒト血漿における安定性の調査結果の図である。
【図２４】４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのヒト血漿における安定性の調査結果の図である。
【図２５】４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのヒト血漿における安定性の調査結果の図である。
【図２６】４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのヒト血漿における安定性の調査結果の図である。
【図２７】４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３親抗体の担癌マウス薬効試験結果の図である。
【図２８】４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３親抗体の担癌マウス薬効試験結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
実施例１：ｍｃの合成
【数１】
2019533017.tif 000008
３０ｍｌ氷酢酸に６−アミノカプロン酸３．９ｇ（０．０３ｍｏｌ）及び１．２ｅｑの無水マレイン酸３．５ｇ（０．０３６ｍｏｌ）を加えた。反応液を１２０℃で撹拌しながら４〜６時間反応させた。反応終了後、加熱を停止し、室温まで自然冷却した。６０℃で減圧濃縮して大部分の酢酸を除去した。得られた黄褐色の粘性液体を水に入れた後、酢酸エチル（２０ｍｌ×３）を加えて抽出し、有機層を合わせた。有機層を順に水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後、濾液を減圧濃縮して黄褐色の油状物を得た。５０ｍｌ水を加えて撹拌することで類白色固体を析出させ、濾過し、５０℃で減圧乾燥して目的製品５．０８ｇを得た。収率は８０％であった。ｍｐ：８９−９２℃。ｍ／ｚ：２１２．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：１３．２１（ｂｒ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）、６．７５（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ＝ＣＨＣＯ）、３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＮＣＨ２ＣＨ２）、２．４２  （ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＯＯＨ）、１．５２  −１．６８  （ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、１．３０  −１．４２（ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【００１４】
実施例２：Ｍｃ−ＯＳｕの合成
【数２】
2019533017.tif 000009
窒素ガスの保護下で５０ｍｌアセトニトリルに４．７ｇ（２２ｍｍｏｌ）ＭＣ及び２５ｇ（２２ｍｍｏｌ）ＨＯＳｕを加えた。別途４．５ｇ（２２ｍｍｏｌ）ＤＣＣを２５ｍｌアセトニトリルに溶解し、内温を約０℃に保持し、反応液にゆっくりと滴下した。反応液を０℃で２時間反応させた後、室温で一晩反応させた。濾過し、濾過ケーキをアセトニトリル（１０ｍｌ×３）で洗浄し、濾液を減圧濃縮することにより乾燥させた。得られた油状物を室温で６時間減圧乾燥して淡褐色固体６．４ｇを得た。収率は９５％であった。生成物を精製せずに次に反応に用いた。ｍ／ｚ：３０９．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ  ，ＣＤＣｌ３）：１〜２（ｍ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ）、２．６８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯ），２．９５（ｓ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）、３．６８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）、６．８１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）。
【００１５】
実施例３：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕの合成
【数３】
2019533017.tif 000010
１００ｍｌＴＨＦにＦｍｏｃ−Ｖａｌ  １０ｇ及びＨＯＳｕ  ３．４ｇを加えた。別途ＤＣＣ６ｇを５０ｍｌアセトニトリルに溶解し、内温を約０℃に保持し、入反応液にゆっくりと滴下した。反応液を室温で撹拌しながら２４時間反応させた。濾過し、濾過ケーキをＴＨＦで洗浄し、濾液を減圧濃縮して透明な油状物を得た。油状物を精製せずに次の反応に用いた。ｍ／ｚ：４３７．４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００１６】
実施例４：Ｆｍｏｃ−ｖｃの合成
【数４】
2019533017.tif 000011
２０ｍｌＴＨＦにＣｉｔ  ４．０ｇ（１．０５ｅｑ）及び重炭酸ナトリウムの水溶液６０ｍｌ（ＮａＨＣＯ３  ２ｇ，１．０５ｅｑ）を加えた。別途２２．３５ｍｍｏｌ  Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕを６０ｍｌ  ＤＭＥに溶解し、さらに反応液に加えた。反応液を室温下で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応系に１５％クエン酸水溶液１１０ｍｌを加えた後、ＥＡで２回抽出し、有機層を合わせ、減圧濃縮して白色固体を得た。白色固体にメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１００ｍｌを加え、撹拌して洗浄し、濾過し、濾過ケーキを４０℃で４時間減圧乾燥し、製品４．８３ｇを得た。収率は６５％であった。ｍ／ｚ：  ４９７．６  （Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＤＭＳＯ）：  ０．９２  （６Ｈ，  ｍ）、１．３５  〜  １．６５  （４Ｈ，  ｍ）、２．１０  （１Ｈ，  ｍ）、３．０１（２Ｈ，  ｑ）、３．９９  （１Ｈ，  ｔ）、４．０１  −４．４５  （２Ｈ，  ｍ）、４．４５  （２Ｈ，  ｔ）、５．４６  （２Ｈ，  ｂｒ）、６．０３（１Ｈ，  ｔ）、７．２０−８．０２  （８Ｈ，  ｍ）、８．２５  （１Ｈ，  ｄ）。
【００１７】
実施例５：Ｆｍｏｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨの合成
【数５】
2019533017.tif 000012
反応フラスコにＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２／１混合溶媒６０ｍｌを加え、さらにＦｍｏｃ−ｖｃ  ２ｇ（４．２ｍｍｏｌ）及びＰＡＢＯＨ  １．０４ｇ（２ｅｑ）を加え、撹拌して一部を溶解した後、ＥＥＤＱ  ２．０ｇ（２ｅｑ）を加えた。反応系を室温条件下で暗所で２日撹拌しながら反応させた。反応終了後、４０℃で減圧濃縮して白色固体を得た。白色固体を収集し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１００ｍｌを加え、撹拌して洗浄し、濾過し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、得られた白色固体を４０℃で減圧乾燥して２．２ｇ製品を得た。収率は約８８％であった。ｍ／ｚ：  ６０２．６  （Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ  （４００Ｍｚ，  ＤＭＳＯ）：  ０．９５  （６Ｈ，ｍ）、１．４５〜１．６９  （４Ｈ，  ｍ）、  ２．１０  （１Ｈ，  ｍ）、３．１１（２Ｈ，  ｍ）、３．９９  （１Ｈ，  ｍ  ）、４．３０  （２Ｈ，  ｄ）、  ４．０５〜−４．６６  （２Ｈ，  ｍ）、４．５５  （２Ｈ，  ｄ）、５．２１  （１Ｈ，  ｔ）、５．５１  （２Ｈ，  ｂｒ）、６．１１（１Ｈ，  ｔ）、７．０９  −８．１０  （１２Ｈ，  ｍ）、  ８．２１  （１Ｈ，  ｄ）、１０．５１（１Ｈ，  ｂｒ）。
【００１８】
実施例６：ｖｃ−ＰＡＢＯＨの合成
【数６】
2019533017.tif 000013
１０ｍｌＮＭＰにＦｍｏｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨ  ４９０ｍｇ（０．８１５ｍｍｏｌ）を加え、撹拌して溶解し、さらにジエチルアミン２ｍｌを加えた。室温下で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、４０℃で減圧濃縮し、得られた油状物に２０ｍｌＤＣＭを加え、撹拌して結晶を析出させ、濾過し、濾過ケーキをＤＣＭで洗浄し、得られた固体を減圧乾燥して製品２７７ｍｇを得た。収率は９０％であった。ｍ／ｚ：  ３８０．２  （Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ  （４００Ｍｚ，  ＤＭＳＯ）：  ０．８９  （６Ｈ，  ｍ），  １．３１〜１．６１  （４Ｈ，  ｍ），  １．８２  （１Ｈ，  ｍ），  ２．８６  （１Ｈ，  ｍ），  ２．８９（２Ｈ，  ｄ），  ４．３８  （２Ｈ，  ｄ），  ４．４４  （１Ｈ，  ｍ），  ５．０１  （１Ｈ，  ｂｒ），  ５．３５  （２Ｈ，  ｂｒ），  ５．８４  （１Ｈ，  ｂｒ），  ７．１４  （２Ｈ，  ｄ），  ７．４２  （２Ｈ，  ｄ），  ８．０８  （１Ｈ，  ｂｒ），  ９．８８  （１Ｈ，  ｂｒ）。
【００１９】
実施例７：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨの合成
【数７】
2019533017.tif 000014
１０ｍｌＮＭＰにｖｃ−ＰＡＢＯＨ  ２０５ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）及びＭＣ−ＯＳｕ  １８４ｍｇ（１．１ｅｑ）を加え、その後、室温下で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、４０℃で減圧濃縮し、得られた油状物に２０ｍｌメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加え、撹拌して結晶を析出させた。濾過し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、３１０ｍｇ製品を得た。収率は１００％であった。ｍ／ｚ：  ５７３．３  （Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ  （４００Ｍｚ，  ＤＭＳＯ）：  ０．８９  （６Ｈ，  ｍ）、  １．１５−１．９９  （１０Ｈ，  ｍ）、２．１１（１Ｈ，  ｍ）、２．３１  （２Ｈ，  ｔ）、３．２１（２Ｈ，  ｍ）、  ３．５３  （２Ｈ，  ｔ）、４．３２  （１Ｈ，  ｔ）、４．５１  （１Ｈ，  ｍ）、４．５９  （２Ｈ，  ｂｒ）、５．２４  （１Ｈ，  ｂｒ）、  ５．５６  （２Ｈ，  ｂｒ）、６．２０（１Ｈ，  ｂｒ）、  ７．１２（２Ｈ，  ｓ）、７．２３（２Ｈ，  ｄ）  ，７．５８  （２Ｈ，  ｄ）、７．９４  （１Ｈ，  ｄ）  ，  ８．１  ７  （１Ｈ，  ｄ）、１０．２１  （１Ｈ，  ｂｒ）。        
【００２０】
実施例８：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＮＰの合成
【数８】
2019533017.tif 000015
窒素ガスの保護下でｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨ  １６８．６ｍｇ（０．２９４ｍｍｏｌ）を５ｍｌ無水ピリジンに溶解し、反応系を約０℃に冷却した。別途ＰＮＰ１７９ｍｇ（３ｅｑ）を５ｍｌＤＣＭに溶解し、さらに反応系にゆっくりと加えた。約０℃に１０ｍｉｎ保持した後、氷浴を取り外し、室温で３時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、７０ｍｌＥＡ及び１００ｍｌ  １５％クエン酸水溶液を加え、有機層を収集した。有機層を順にクエン酸、水、飽和食塩水で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮により乾燥させ、淡黄色油状物を得、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加えて結晶を析出させ、類白色固体８６ｍｇを得た。収率は４０％であった。ｍ／ｚ：  ７３８（Ｍ＋Ｈ）＋。１ＨＮＭＲ  （４００Ｍｚ，  ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：  ０．８４  （６Ｈ，  ｍ）、１．１１−１．８４  （１０Ｈ，  ｍ）、  ２．０５  （１Ｈ，  ｍ）、２．１５  （２Ｈ，  ｔ）、３．０９  （２Ｈ，  ｍ）、３．３２  （２Ｈ，  ｔ）、４．１２  （１Ｈ，  ｍ）、４．３８  （１Ｈ，  ｍ）、５．１５  （２Ｈ，  ｓ）、６．６１  （２Ｈ，  ｓ）、６．８４  （１Ｈ，  ｄ）  ，７．６１  （１Ｈ，  ｄ）、７．２１  （２Ｈ，ｄ），  ７．５０  （２Ｈ，ｄ）、７．６１  （２Ｈ，ｄ），  ８．１８  （２Ｈ，  ｄ）、９．５９  （１Ｈ，  ｂｒ）。
【００２１】
実施例９：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの合成
【数９】
2019533017.tif 000016
２ｍｌＤＭＦに２０ｍｇ  ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（１．５ｅｑ）及び３ｍｇＨＯＢＴを加えた。室温で暫く撹拌した後、１３ｍｇＭＭＡＥ、０．５ｍｌピリジン、２５ｕｌＤＩＥＡを加えた。反応液を室温で２日撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液をそのまま分取カラムで精製し、所要の成分を収集して濃縮した後、冷凍乾燥し、約１０ｍｇ製品を得た。収率は約４２％であった。ｍ／ｚ：  １３１７．１  （Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２２】
実施例１０：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの合成
【数１０】
2019533017.tif 000017
実施例９の操作に従ってｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを約１２．５ｍｇ得た。収率は４５．２％であった。ｍ／ｚ：  １３４５．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２３】
実施例１１：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＢＤの合成
【数１１】
2019533017.tif 000018
実施例９の操作に従ってｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＰＢＤを約９．５ｍｇ得た。収率は３２．５％であった。ｍ／ｚ：  １３２５．４  （Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２４】
実施例１２：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＤＯＸの合成
【数１２】
2019533017.tif 000019
実施例９の操作に従ってｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＤＯＸを約１１．２ｍｇ得た。収率は３８．９％であった。ｍ／ｚ：  １１４３．２  （Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２５】
実施例１４：ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＳＮ−３８の合成
【数１３】
2019533017.tif 000020
購入された１００ｍｇの１０−Ｏ−Ｂｏｃ−ＳＮ−３８を１０ｍｌ乾燥ジクロロメタンで溶解した後、２５．６ｍｇ（１ｅｑ）ＤＭＡＰを加え、０℃でトリホスゲンのジクロロメタン溶液（６２ｍｇトリホスゲンを２ｍｌジクロロメタンで溶解したもの）を滴下し、その後、引き続き０℃で１２時間反応させ、減圧によりジクロロメタンを除去し、１０ｍｌの乾燥ＤＭＦで溶解した後、１４４ｍｇのｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＯＨを加え、室温で２４時間撹拌し、分取液体クロマトグラフィーにより分離してｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＳＮ−３８  ４１ｍｇを得た。総収率は１９．７％であった。ｍ／ｚ：  １０６３．２（Ｍ＋Ｈ）＋  。
【００２６】
実施例１５：目的抗体の発現及び精製
ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞を用いて目的抗体を発現した。トランスフェクションの１日前、６×１０５個／ｍＬの密度で細胞を３００ｍＬ  Ｆ１７完全培地（ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  Ｆ１７発現培地、Ｇｉｂｃｏ社）を含む１Ｌ振盪フラスコに接種し、細胞培養シェーカーを用いて３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、ＰＥＩで抗体発現プラスミドのトランスフェクションを行なった。ここで、プラスミド：ＰＥＩは２：１であった。トランスフェクションの翌日、２．５％（ｖ／ｖ）でＴＮ１フィード培地を加え、引き続き４日培養した後、遠心分離して上澄みを収集した。
【００２７】
得られた細胞発現上澄みを収集し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＬＸ，ＧＥ社）を用い、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）で溶出させ、捕獲された抗体を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で１／１０（ｖ／ｖ）でｐＨ７．０に調整した後、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，ＧＥ社）によりポリマー及びエンドトキシンなどの不純物を除去し、抗体緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に置換し、ＵＶ２８０ｎｍでの目的ピークのサンプルを収集し、限外ろ過遠心管（３０ＫＤ，Ｐａｌｌ社）により２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。このようにして得られた目的抗体のモノマー（ＰＯＩ％）は９０％を超え、次に試験に用いられる。
【００２８】
実施例１６：２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの結合による２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００２９】
細胞で発現された２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００３０】
実施例１７：２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００３１】
細胞で発現された２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００３２】
実施例１８：２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００３３】
細胞で発現された２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００３４】
実施例１９：４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００３５】
細胞で発現された４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．  陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００３６】
実施例２０：４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００３７】
細胞で発現された４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００３８】
実施例２１：４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００３９】
細胞で発現された４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００４０】
実施例２２：４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００４１】
細胞で発現された４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００４２】
実施例２３：４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００４３】
細胞で発現された４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．  陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００４４】
実施例２４：４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体とｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合による４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルの製造
【００４５】
細胞で発現された４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅにより精製し、低ｐＨで溶出させた直後、Ｔｒｉｓ溶液を加えて中和し、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に置換した。化合物ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（白色粉末）をＤＭＡに溶解して準備用とした。変異システイン残基上のマスキング基を除去するために、まず抗体を還元する必要がある。４０倍の分子比で１ＭのＤＴＴ水溶液を４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ抗体溶液に加え、均一に混合した後２時間反応させた。その後サンプルのｐＨを５．０に調整し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーによりサンプルにおけるＤＴＴ及びマスキング基を除去した。次いで、２０倍の分子比でＤＨＡＡ溶液をサンプルに加え、２５℃で暗所で４時間反応させることで抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合させた。次いでｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ溶液を加え、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと抗体変異システインとを結合し、均一に混合した後２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．陽イオン交換クロマトグラフィーにより抗体分子に結合していないｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを除去し、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣサンプルを得た。
【００４６】
実施例２５：ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる毒素と抗体との比ＤＡＲの測定
【００４７】
ＨＰＬＣ疎水性クロマトグラフィー方法によりＴＤＣサンプルを分析し、対応するピーク面積に基づいてＤＡＲを算出した。具体的な方法は以下の通りである。
カラム：Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ（登録商標）  ＨＩＣＢｕ‐ＮＰ５（５μｍ，４．６ｘ３５ｍｍ）
移動相：Ａ：硫酸アンモニウム２Ｍ、ｐＨ７のリン酸塩緩衝液０．０２５Ｍ；Ｂ：ｐＨ７のリン酸塩緩衝液０．０２５Ｍ；Ｃ：１００％イソプロパノール
緩衝液Ａは平衡化、緩衝液Ｂ及び緩衝液Ｃは勾配溶出に用いられ、２５℃、２１４ｎｍ及び２８０波長で検出した。
図１〜３に基づいて算出した部位特異的結合ＤＡＲは１．６〜１．７であり、優れた化合物の均一性を示す。
図４〜６に基づいて算出した部位特異的結合ＤＡＲは１．６０−１．９５であり、優れた化合物の均一性を示す。
図７〜８に基づいて算出した部位特異的結合ＤＡＲは１．６０−１．９０であり、優れた化合物の均一性を示す。
【００４８】
実施例２６：ＲＰ−ＨＰＬＣによる毒素と抗体との比ＤＡＲの測定
ＲＰ−ＨＰＬＣによる毒素と抗体との比ＤＡＲを測定し、采用逆相疎水性高速液体クロマトグラフィーによりＤＴＴで処理したサンプルを分析し、対応するピーク面積に基づいてＤＡＲを算出した。具体的な方法は以下の通りである。
カラム：Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ  ＲＰ−１０００（５μｍ，  ４．６×１００ｍｍ）
移動相：Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液；Ｂ：０．１％アセトニトリル溶液
移動相Ａ及び移動相Ｂを用いて割合で勾配溶出を行い、８０℃、２１４ｎｍ及び２８０波長で検出した。
図９に基づいて算出した部位特異的結合ＤＡＲは１．８２であり、優れた化合物の均一性を示す。
【００４９】
２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの結合効率ＤＡＲ表
【表１】
2019533017.tif 000021
【００５０】
表１は、システイン挿入変異修飾により部位特異的結合したＴＤＣ化合物は、結合効率が高く（理論上の最大値：２．０）、ＤＡＲ≧１．６であることを示している。
【００５１】
実施例２７：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＴＤＣ抗体骨格の凝集状況の検出
【００５２】
ＴＤＣ抗体骨格サンプルを３７℃で保存し、０、７、２１、２９日目にそれぞれＳＥＣ−ＨＰＬＣによりその凝集状況を分析した。具体的な方法は以下の通りである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ  ｍＡｂ  ＨＲ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）
移動相：硫酸ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ６．７のリン酸塩緩衝液０．１Ｍ
２５℃、２８０ｎｍで検出した。
図１０−１３に示すように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによりＴＤＣ抗体骨格４Ｄ３、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ及び４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓの凝集状況を検出した。サンプルを３７℃で４週間保存した後、凝集体の含有量は基本的に変化していない。
【００５３】
上記抗体の検出方法の同様に、２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣをＳＥＣ検出した。
【００５４】
２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣにおける目的モノマーの含有量
【表２】
2019533017.tif 000022
表２は、システイン部位特異的結合したＴＤＣ化合物の目的モノマー含有量は９０％以上であることを示している。
【００５５】
実施例２８：システイン部位特異的変異及び挿入変異により修飾された骨格抗体、及びＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親抗体２Ａ１の親和性、ｃ−ｍｅｔに対する４Ｅ１の親和性、Ｔｒｏｐ２に対する４Ｄ３の親和性
【００５６】
間接ＥＬＩＳＡ法により２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ及び２Ａ１のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する相対親和性を比較した。具体的な方法は以下の通りである。
【００５７】
組み換えＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｈｉｓ＊６抗原をプレートにコーティングし、魚皮ゼラチンでブロックし、２Ａ１、２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ及び２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓをそれぞれ最高濃度１０ｕｇ／ｍｌ、４倍勾配、１１個の濃度で希釈し、ＨＲＰ標識二次抗体をインキュベートし、ＴＭＢ発色し、４５０ｎｍでの吸収を検出した。検出結果をＡ４５０/濃度で図を作成した。システイン部位特異的変異又は挿入変異後の抗体２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ及び２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓは２Ａ１に類似する親和性を保持し、ＥＣ５０値が非常に近かった。これは、２Ａ１での軽鎖Ｖ２０５Ｃの部位特異的変異、第２０５位の挿入変異若しくは第２０６位の挿入変異、又は重鎖第４３９位の挿入変異がＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原に対する親和性に影響を与えないことを示している。
【００５８】
図に示すように、２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ抗体は、抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する２Ａ１の親和性を保持している。
【００５９】
実施例２９：システイン部位特異的変異及び挿入変異により改造された骨格抗体、及び対応する抗原に対するＴＤＣの親和性、ｃ−ｍｅｔに対応する４Ｅ１の親和性、Ｔｒｏｐ２に対応する４Ｄ３の親和性
用間接ＥＬＩＳＡ法により４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ及び４Ｅ１のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する相対親和性を比較した。具体的な方法は以下の通りである。
【００６０】
組み換えｃ−ｍｅｔ−Ｈｉｓ＊１０抗原をプレートにコーティングし、魚皮ゼラチンでブロックし、希釈４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ及び４Ｅ１をそれぞれ最高濃度１０ｕｇ／ｍｌ、４倍勾配、１１個の濃度で希釈し、ＨＲＰ標識二次抗体をインキュベートし、ＴＭＢ発色し、４５０ｎｍでの吸収を検出した。検出結果をＡ４５０／濃度で図を作成した。システイン部位特異的挿入変異後に結合して得られたＴＤＣ４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭは、親抗体４Ｅ１に類似する親和性を保持し、ＥＣ５０値が非常に近かった。これは、４Ｅ１軽鎖第２０５位の挿入変異若しくは第２０６位の挿入変異、又は重鎖第４３９位の挿入変異により得られたＴＤＣがｃ−ｍｅｔ抗原に対する親和性に影響を与えないことを示している。
【００６１】
用間接ＥＬＩＳＡにより４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ及び４Ｄ３のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する相対親和性を比較した。具体的な方法は以下の通りである。
【００６２】
組み換えＴｒｏｐ２−Ｈｉｓ＊１０をプレートにコーティングし、魚皮ゼラチンでブロックし、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ及び４Ｄ３をそれぞれ最高濃度１０ｕｇ／ｍｌ、４倍勾配、１１個の濃度で希釈し、ＨＲＰ標識二次抗体をインキュベートし、ＴＭＢ発色し、４５０ｎｍでの吸収を検出した。検出結果をＡ４５０／濃度で図を作成した。システイン部位特異的挿入変異後に結合して得られたＴＤＣ４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭは、親抗体４Ｄ３に類似する親和性を保持し、ＥＣ５０値が非常に近かった。これは、４Ｄ３軽鎖第２０５位の挿入変異若しくは第２０６位の挿入変異、又は重鎖第４３９位の挿入変異により得られたＴＤＣがＴｒｏｐ２抗原に対する親和性に影響を与えないことを示している。
【００６３】
図１５に示すように、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ抗体は、抗原ｃ−ｍｅｔに対する４Ｅ１の親和性を保持している。
【００６４】
図１６に示すように、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ＭＶＰＭ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ＭＶＰＭ抗体は、抗原Ｔｒｏｐ２に対する４Ｄ３の親和性を保持している。
【００６５】
実施例３０：細胞毒性薬効の検出
以下の実験によりＴＤＣ細胞毒性活性を測定した。即ち、ＴＤＣをそれぞれＥＧＦＲが過剰発現されるか又はＥＧＦＲＶＩＩＩが発現されるヒトの腫瘍細胞培地に加え、７２時間培養した後、細胞生存率を測定した。細胞によるインビトロ試験により、細胞生存率、細胞毒性、及び本発明のＴＤＣ誘導アポトーシスを測定した。
【００６６】
細胞増殖試験により抗体−毒素複合体のインビトロ薬効を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙは、市販品（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ａ）は、比色法により細胞増殖及び細胞毒性を検出する試験に用いられる生細胞数の検出試薬である。この試薬には、新しいテトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩；ＭＴＳ］及び電子結合剤（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ；  ＰＥＳ）が含まれる。ＰＥＳは、強化した化学的安定性を有するため、ＭＴＳと混合して安定な溶液を形成することができる。このような便利な「単一溶液」モデルは、初代ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙをベースにして改良したものである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙに用いられる電子結合剤ＰＭＳ及びＭＴＳ溶液は別々に提供される。ＭＴＳ（Ｏｗｅｎ試薬）は、細胞によって生物学的に還元されてそのまま培地に溶解できる着色ホルマザン生成物製品になる（図１）。このような変換は、代謝的に活性な細胞におけるデヒドロゲナーゼによって産生されたＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの作用下で達成される可能性が高い。検出時には、少量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔをそのまま培地プレートウェルの培地に加え、１〜４時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を読み取れば良い。
【数１４】
2019533017.tif 000023
【００６７】
４９０ｎｍで検出されたホルマザン生成物の量は培養物中の生細胞の数に正比例する。ＭＴＳのホルマザン生成物が組織培地に可溶であるため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡｓｓａｙはＭＴＴ又はＩＮＴ法と比較して操作手順が少ない。
【００６８】
本発明において、Ａ４３１（ＥＧＦＲ過剰発現細胞）、Ｕ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩ（ＥＧＦＲ変異体安定細胞系）、Ｕ８７−ＭＧ（ｃ−Ｍｅｔ中高度発現悪性神経膠腫細胞株）及びＢＸＰＣ−３（ｔｒｏｐ２高度発現膵臓がん細胞株）をインビトロ薬効検出のための研究反応系として用いた。９６ウェルプレート中で６０００／ウェルで細胞を接種し、２４時間後、抗体投与を行った。Ａ４３１、Ｕ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩ細胞株に対応する各ＴＤＣ初期濃度は１０ｕＭであり、５倍勾配で順次希釈し、Ｕ８７−ＭＧ、ＢＸＰＣ−３細胞株に対応する各ＴＤＣ初期濃度は１ｕＭであり、５倍勾配で順次希釈した。７２時間処理後、ＭＴＳにより細胞活性を検出した。
【００６９】
ＥＧＦＲｗｔ過剰発現細胞系Ａ４３１及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現安定性株Ｕ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩに対するＴＤＣ、ＡＤＣの細胞毒性ＩＣ５０の検出結果
【表３】
2019533017.tif 000024
【００７０】
表３の結果から分かるように、２Ａ１−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５Ｃｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、２Ａ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣは、ＥＧＦＲｗｔ過剰発現細胞系Ａ４３１及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現安定性株Ｕ８７−ＥＧＦＲＶＩＩＩｂに対する細胞毒性活性が相当し、４３９位挿入変異ＴＤＣの活性が２０５位及び２０６位挿入変異ＴＤＣよりもやや良い。
４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣは、Ｕ８７−ＭＧ細胞毒性活性及び結合位置には一定の相関があり、４３９位插入変異ＴＤＣの活性は、２０５位及び２０６位挿入変異ＴＤＣよりもやや良く、ＴＤＣの活性は、親抗体の活性よりも顕著に良い。
４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣは、膵臓がん細胞株ＢＸＰＣ−３に対して細胞毒性活性が相当し、４３９位插入変異ＴＤＣの活性が２０５位及び２０６位挿入変異ＴＤＣよりもやや良く、ＴＤＣの活性は親抗体の活性よりも顕著に良い。
【００７１】
実施例３１：血漿安定性の検出
一定量のＡＤＣサンプルを取り、ヒトＩｇＧが除去されたヒト血漿に加え、ＡＤＣごとに２管繰り返し、３７℃水浴中でそれぞれ０時間、７２時間インキュベートした後、ＡＤＣサンプルを取り出し、各管にプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ  ＬＸ  Ｌｏｔ：＃１０２２１４７９  ＧＥ、ＰＢＳで洗浄したもの）１００ｕｌを加え、縦型ミキサーで２時間振盪し、洗浄、溶出により、インキュベートされたＡＤＣを得た。特定の時間インキュベートされたＡＤＣサンプルに対してＨＩＣ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣ検出を行い、サンプルの血漿安定性を判定した。
【００７２】
図２１〜２３は、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣのヒト血漿における安定性の調査結果である。４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出方法は、ＲＰ−ＨＰＬＣであり、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの検出方法はＨＩＣ−ＨＰＬＣである。
【００７３】
図２４〜２６は、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｅ１−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｅ１−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣのヒト血漿における安定性の調査結果であり、検出方法はＨＩＣ−ＨＰＬＣである。
【００７４】
ＴＤＣ血漿安定性の検出結果（ＤＡＲの変化により計算）
【表４】
2019533017.tif 000025
【００７５】
上記ＴＤＣをヒト血漿サンプルに加え、３７℃で７２時間インキュベートした後、いずれも相対的に安定であり、良好な薬物形成特性を示した。比較では、４３９位挿入変異ＴＤＣの安定性は最も高く、２０５位、２０６位挿入変異ＴＤＣの安定性は高いが、４３９位挿入変異ＴＤＣのほどではなかった。
【００７６】
実施例３２：担癌マウスの薬効試験
【００７７】
本発明では、ＴＤＣ及び親抗体のインビボ薬効を評価するためにＢＸＰＣ−３担癌マウスモデルを構築した。皮下注射により３×１０６  ＢＸＰＣ−３細胞を４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背中に投与し、マウスの平均腫瘍サイズが４００〜５００ｍｍ３に成長した後、５匹／群で群分けした。０日目及び７目に、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣをそれぞれ５ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与し、親抗体４Ｄ３を５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。データＡは、測定時の平均腫瘍体積±ＳＥを示す。データＢは、測定時のマウスの平均体重±ＳＥを示す。
【００７８】
図２７は、担癌マウス薬効試験における４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｄ３親抗体の測定結果である。ＴＤＣは、親抗体と比較してインビボで顕著な抗腫瘍効果を示した。
【００７９】
図２８は、担癌マウス薬効試験における４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０５ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＬＣ−Ｃｙｓ２０６ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ、４Ｄ３−ＨＣ−Ｃｙｓ４３９ｉｎｓ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＴＤＣ及び４Ｄ３親抗体の試験結果である。マウスの体重に有意な変化は見られず、それはＴＤＣがインビボで毒性がないかまたはほとんどないことを証明した。
【００８０】
本発明は、実施例中に開示された具体的な実施形態の範囲に限定されず、これらの実施例は、本発明のいくかの態様を例示するためのものであり、機能的に等価な任意の実施形態は、すべて本発明の範囲に属する。実際、本明細書に開示されたもの以外の、本発明の様々な修正は当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
2019533017.tif 000026
【図２】
2019533017.tif 000027
【図３】
2019533017.tif 000028
【図４】
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【図５】
2019533017.tif 000030
【図６】
2019533017.tif 000031
【図７】
2019533017.tif 000032
【図８】
2019533017.tif 000033
【図９】
2019533017.tif 000034
【図１０】
2019533017.tif 000035
【図１１】
2019533017.tif 000036
【図１２】
2019533017.tif 000037
【図１３】
2019533017.tif 000038
【図１４】
2019533017.tif 000039
【図１５】
2019533017.tif 000040
【図１６】
2019533017.tif 000041
【図１７】
2019533017.tif 000042
【図１８】
2019533017.tif 000043
【図１９】
2019533017.tif 000044
【図２０】
2019533017.tif 000045
【図２１】
2019533017.tif 000046
【図２２】
2019533017.tif 000047
【図２３】
2019533017.tif 000048
【図２４】
2019533017.tif 000049
【図２５】
2019533017.tif 000050
【図２６】
2019533017.tif 000051
【図２７】
2019533017.tif 000052
【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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