(57)【要約】  ポリマー３−ヒドロキシプロピオンアミド（３ＨＰアミド）を製造するための方法であって、以下：ホスフェート及びアンモニウムを含有する増殖培地中で、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌を培養すること、を含み、ここで、前記細菌の培養によりポリマー３ＨＰアミドが製造される、方法が記載される。次いで、ポリマー３ＨＰアミドは、３ＨＰアミドへと加水分解されるか、又は他の目的の化合物へと変換され得る。
2019503192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー３−ヒドロキシプロピオンアミドを製造するための方法であって、以下：
ホスフェート及びアンモニウムを含有する増殖培地中で、アセトバクタ―・ロバニエンシス（Acetobacter lovaniensis）細菌を培養すること、
を含み、ここで、
前記細菌の培養によりポリマー３ＨＰアミドが製造される、方法。
【請求項２】
前記増殖培地が、０．１ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増殖培地が、０．５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖培地が、０．５〜１ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖培地が、１ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖培地が、１．５ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記増殖培地が、１〜３ｇ／リットルでのホスフェートを含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記増殖培地が、１〜３ｇ／リットルでのホスフェート及び０．５〜１ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増殖培地中の窒素とリンとの比が、重量で約２：１〜約１：２である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増殖培地が外来性の炭素源を含有しない、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖培地が５〜７のｐＨを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌が、１０℃〜４０℃の温度で培養される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌が、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８０８を有するＦＪ１株である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法がさらに、前記ポリマー３ＨＰアミドを前記増殖培地から分離するステップを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がさらに、前記ポリマー３ＨＰアミドを加水分解して、モノマー３ＨＰアミドを形成するステップを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法がさらに、前記モノマー３ＨＰアミドを分離するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法がさらに、ポリマー又はモノマー３ＨＰアミドを他の化合物に変換することを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法がさらに、ポリマー又はモノマー３ＨＰアミドを、３ＨＰ酸、３ＨＰエステル、３−ヒドロキシプロピオンアミン（hydroxypropionamine）、３−ヒドロキシプロピオニトリル、アクリルアミド、アクリルアミン、アクリル酸、アリルアミン、アクリロニトリル、ポリアミンポリマー、ポリニトリルポリマー又は他のヘテロポリマー、例えばアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）に変換することを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、以下：
１〜３ｇ／リットルのレベルでのホスフェート及び０．５〜１ｇ／リットルのレベルでのアンモニウムを含有する増殖培地中で、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８０８を有するアセトバクタ―・ロバニエンシスＦＪ１株を培養すること、
を含み、ここで、
前記細菌の培養によりポリマー３ＨＰアミドが製造される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
３ＨＰアミドを製造するための方法であって、以下：
ホスフェート及びアンモニウムを含有する増殖培地中で、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌を培養し、ここで、前記細菌の培養によりポリマー３ＨＰアミドが製造され；並びに
前記ポリマー３ＨＰアミドを加水分解して、３ＨＰアミドを製造すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特定の増殖条件下でのアセトバクター（Acetobacter）微生物の培養を介して、ポリマー３−ヒドロキシプロピオンアミド（３ＨＰアミド）を製造するための方法に関する。ポリマー３ＨＰアミドは３ＨＰアミドに変換することができる。この生物は、大気中の二酸化炭素と窒素の同化を介して、このプラットフォーム分子（platform molecule）を産生する。３ＨＰアミドは商業的な量で容易に製造することができる。所望であれば、３ＨＰアミドは、様々な他の商業的に有用な製品、例えばアクリルアミド及びアクリロニトリルに変換することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの微生物が３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を産生することが示されている（Andreeken, B. 及びSteinbuchel, A.、Applied and Environmental Microbiology(2010)、76、4919-4925）。３ＨＰ並びに他の関連するヒドロキシル化カルボン酸及びポリアルカノアート（polyalkanoates）の合成は一般に、増殖制限培養条件下で起こる（Brigham C. J. ら、S3 Microbiol and Biochemical Technology(2011)）。ヒドロキシルカルボン酸及びそれらのポリマー形態、特に３ＨＰの製造は、商業的に重要である。３ＨＰ（CAS No.503-66-2）は脱水時にアクリル酸（CAS No.79-10-7）へと変換することができ、有用なプラットフォーム分子である。
【０００３】
微生物を用いる商業的に有用なアミドの合成の先の報告は、一般に、ニトリラーゼ／ニトリルヒドラターゼ系を用いる細菌、例えばロドコッカス（Rhodococcus）又はシュードモナス（Pseudomonas）種によるニトリルの加水分解について言及している。そのような細菌系は、工業プロセス（三菱プロセス（Mitsubishi process））におけるアクリロニトリルからのアクリルアミドの合成への好影響のために使用される。しかしながら、微生物によるアクリルアミド、アクリロニトリル又は前駆体分子３ＨＰアミドのデノボ（de novo）合成はこれまでに報告されていない。
【０００４】
合成への２つのグリーン経路、すなわちグリセロールからの合成（V. Calvino-Casildaら、Green Chemistry(2009)、11、939-941）及びグルタミン酸からの合成（J. Le Notre ら、Green Chemistry(2011)、13、807-809）が報告されている。グリセロールからの合成は化学的アミノ化を必要とするが、同時にそれは、分子又は前駆体のデノボ合成ではないグリーンケミストリー（green chemistry）を表す。バイオ燃料操作からのグリセロールの利用可能性は、限定的であり得、かつ「燃料用食品」についての議論の問題を表す。また、糖加工の副産物、例えば蒸留残渣（vinasse）（テンサイ由来）からの発酵により製造される、グルタミン酸からの合成は、石油化学的等価物よりも大きなカーボンフットプリントを表し、かつ利点がない可能性がある。
【０００５】
国際公開第２０１３／０１１２９２号及び国際公開第２０１５／１１８３４１号は、長鎖脂肪族カルボン酸及び３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを産生することができる微生物を記載している。これらの文書は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８０８を有するアセトバクタ―・ロバニエンシス（Acetobacter lovaniensis）ＦＪ１（ブダペスト条約の条項の下で２０１１年１月１２日にNCIMB Ltd.（Ferguson Building、Craibstone Estate、Bucksburn、Aberdeen、AB21 9YA）に寄託された）と称される特定の株に関する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
驚くべきことに、国際公開第２０１３／０１１２９２号及び国際公開第２０１５／１１８３４１号に記載されたアセトバクタ―・ロバニエンシス株が、ポリマー３ＨＰアミドを産生し得ることが見出された。これまでは、この微生物がこの生成物を産生することができることは知られていなかった。これは、３ＨＰアミドの（ポリマー３ＨＰアミドの形態での）デノボ合成を表す。さらに、この微生物は、商業的に実行可能な収率で３ＨＰアミドを（ポリマー３ＨＰアミドの形態で）産生することができる。次にこれは、アクリルアミド及びアクリロニトリルへと変換され得る。
【０００７】
本発明は、国際公開第２０１３／０１１２９２号に記載された微生物を用いて、ポリマー３ＨＰアミドを製造するための方法に関する。国際公開第２０１３／０１１２９２号の開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。この微生物は、ホスフェート及びアンモニウムを含有する培地を用いて増殖させた場合に、ポリマー３ＨＰアミドを産生する能力を有することが示されている。
【０００８】
第一の態様では、本発明は、ポリマー３ＨＰアミドを製造するための方法であって、以下：ホスフェート及びアンモニウムを含有する増殖培地中でアセトバクタ―・ロバニエンシス細菌を培養すること、を含み、ここで、細菌の培養によってポリマー３ＨＰアミドが製造される、方法を提供する。
【０００９】
上記方法におけるポリマー３ＨＰアミドの合成は、アクリルアミド又はアクリロニトリルを得るために、３ＨＰが最初に精製され、次いでアミノ化されることを必要とする既存の技術を越える利点を提供する。さらに、ポリマー３ＨＰアミドは、非常に低コストの原料から生成することができる。加えて、窒素含有原料に対する経路は直接的であり、アクリルアミド又はアクリロニトリルへの変換はよく知られた化学的プロセスを含む。
【００１０】
ポリマー３ＨＰアミドを合成する生物アセトバクタ―・ロバニエンシスＦＪ１の能力は、ユニークであると思われ、この生物は、３ＨＰアミドそれ自体の毒性効果を回避するために重合の戦略を発達させた。毒性が高く発癌性の化学物質である現在入手可能なモノマーアクリロニトリルの代わりに、比較的安全なポリマー前駆体を製造することは、経済的及び安全性両方の観点から有利である。
【００１１】
アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌は、ホスフェートを含有する増殖培地中で培養される。ホスフェートは、ポリマー３ＨＰアミドの製造を可能にする適切なレベルであるべきである。いくつかの実施形態では、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌は、１ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する増殖培地中で培養される。１ｇ／リットルとは、増殖培地中のホスフェート含有化合物の量よりもむしろ、増殖培地中のリン酸イオン（ＰＯ43-）の量である。例えば、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）は１３６の相対分子量を有する。このリン酸部分は９５の相対分子量を有する。それゆえ、１３６グラムのＫＨ2ＰＯ4が１００リットルの水に添加された場合、水中には１．３６ｇ／リットルのＫＨ2ＰＯ4が存在することになるが、水中には０．９５ｇ／リットルのホスフェートが存在することになる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、好ましくは、１．１ｇ／リットル超のレベルでホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、１．２ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、１．３ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１．４ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１．５ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、１．６ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、１．７ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１．８ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１．９ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、２ｇ／リットル超でのホスフェートを含有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、５０ｇ／リットル未満のレベルでホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、４０ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、３０ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。様々な実施形態では、増殖培地は、２０ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１５ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１０ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、９ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、８ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、７ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、６ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、５ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、４ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、３ｇ／リットル未満でのホスフェートを含有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、１〜５０ｇ／リットルのレベルでホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、１〜４０ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、１〜３０ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。様々な実施形態では、増殖培地は、１〜２０ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１〜１５ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１〜１０ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、１〜９ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、１〜８ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１〜７ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１〜６ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、１〜５ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、１〜４ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１〜３ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。好ましい実施形態では、増殖培地は、約２ｇ／リットルでのホスフェートを含有する。
【００１５】
増殖培地中のホスフェート含有化合物は、可溶性であり、かつ細菌の増殖及びポリマー３ＨＰアミドの産生を可能にする、任意の好適な化合物であり得る。好適な化合物としては、リン酸アンモニウム（リン酸二水素アンモニウム及びリン酸水素二アンモニウムを含む）、リン酸ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸三ナトリウムを含む）、リン酸カリウム（リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸三カリウムを含む）、リン酸カルシウム（リン酸一カルシウム、リン酸二カルシウム及びリン酸三カルシウムを含む）、リン酸マグネシウム（リン酸一マグネシウム、リン酸二マグネシウム、リン酸三マグネシウムを含む）及びリン酸、が挙げられる。リン酸化合物は、リン酸アンモニウム（リン酸二水素アンモニウム及びリン酸水素二アンモニウムを含む）、リン酸ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸三ナトリウムを含む）、リン酸カリウム（リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸三カリウムを含む）及びリン酸から選択され得る。いくつかの実施形態では、リン酸化合物は、リン酸アンモニウム、例えば、リン酸水素二アンモニウムである。
【００１６】
アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌は、アンモニウムを含有する増殖培地中で培養される。アンモニウムのみが、ポリマー３ＨＰアミドの産生を開始する働きをすることが見出されている。硝酸塩、亜硝酸塩及び窒素の複合供給源、例えばアミノ酸は機能しない。アンモニウムは、ポリマー３ＨＰアミドの製造を可能にする適切なレベルであるべきである。いくつかの実施形態では、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌は、０．１ｇ／リットル超のアンモニウムを含有する増殖培地中で培養される。０．１ｇ／リットルとは、増殖培地中のアンモニウム含有化合物の量よりもむしろ、増殖培地中のアンモニウムイオン（ＮＨ4+）の量である。例えば、リン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ4）2ＨＰＯ4-、リン酸アンモニウム二塩基性としても知られる）は、１３２の相対分子量を有する。このアンモニウム部分は３６の相対分子量を有する（１８の相対分子量を有する２部のアンモニウム）。それゆえ、１３２グラムの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4が１００リットルの水に添加された場合、水中には１．３２ｇ／リットルの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4が存在することになるが、水中には０．３６ｇ／リットルのアンモニウムが存在することになる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、好ましくは、０．１５ｇ／リットル超のレベルでアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．２ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、０．２５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、０．３ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．３５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．４ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、０．４５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、０．５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。様々な実施形態では、増殖培地は、０．５５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．６ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。好ましい実施形態では、増殖培地は、０．６５ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。別の好ましい実施形態では、増殖培地は、０．７ｇ／リットル超でのアンモニウムを含有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、５ｇ／リットル未満のレベルでアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、４ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、３ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。様々な実施形態では、増殖培地は、２ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１．８ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１．６ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、１．４ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、１．２ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、１ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．９ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．８ｇ／リットル未満でのアンモニウムを含有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．１〜５ｇ／リットルのレベルでアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．１〜４ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、０．１〜３ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。様々な実施形態では、増殖培地は、０．１〜２ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、０．１〜１．８ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．２〜１．６ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．３〜１．４ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。さらなる実施形態では、増殖培地は、０．４〜１．２ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。特定の実施形態では、増殖培地は、０．５〜１ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．６〜０．９ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。他の実施形態では、増殖培地は、０．７〜０．８ｇ／リットルでのアンモニウムを含有する。
【００２０】
増殖培地中のアンモニウム含有化合物は、可溶性であり、かつ細菌の増殖及びポリマー３ＨＰアミドの産生を可能にする、任意の好適な化合物であり得る。好適な化合物としては、リン酸アンモニウム（リン酸二水素アンモニウム及びリン酸水素二アンモニウムを含む）、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及び水酸化アンモニウムが挙げられる。好ましくは、アンモニウム含有化合物は、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）ではない。いくつかの実施形態では、リン酸化合物は、リン酸アンモニウム、例えば、リン酸水素二アンモニウムである。
【００２１】
細菌は大気から窒素を固定することができるが、低レベルの窒素（アンモニウムの形態での）は３ＨＰアミドの合成を誘導する。増殖培地中の窒素とリンとの比は、好ましくは、重量で約３：１〜約１：３である。これは、窒素及びリン原子の重量間の比である（原子の数の間の比ではない）。例えば、リン酸アンモニウム二塩基性（（ＮＨ4）2ＨＰＯ4）を、窒素（アンモニウムの形態で）及びリン（ホスフェートの形態で）の唯一の供給源として増殖培地に添加した場合、窒素とリン原子との重量比は約１：１であろう（（ＮＨ4）2ＨＰＯ4は１３２の分子量を有し、従って窒素とリン原子との重量比は２８／１３２対３１／１３２であり、これは１：１．１に等しい）。様々な実施形態では、増殖培地中の窒素とリンとの比は、好ましくは、重量で約２．５：１〜約１：２．５である。いくつかの実施形態では、増殖培地中の窒素とリンとの比は、好ましくは、重量で約２：１〜約１：２である。他の実施形態では、増殖培地中の窒素とリンとの比は、好ましくは、重量で約１．５：１〜約１：１．５である。特定の実施形態では、増殖培地中の窒素とリンとの比は、好ましくは、重量で約１：１である。
【００２２】
アンモニウム及びホスフェートを含有する培地で培養されると、３ＨＰアミドが合成され、次いで、ペプチド結合と同様の結合を介して短いポリマー鎖へと組み立てられる。典型的には、ポリマー３ＨＰアミドは、２〜約１５個の３ＨＰアミドの繰り返し単位から構成される。
【００２３】
増殖培地は、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌が増殖及び繁殖し、ポリマー３ＨＰアミドを産生することを可能にする任意の好適な増殖培地であり得る。増殖培地は、細菌の増殖及び繁殖を可能にする様々な成分／栄養素を含有し得る。増殖培地は、以下の添加剤：カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、銅塩、コバルト塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、モリブデン塩、塩化物、硫酸塩、モリブデン酸塩および炭酸塩、の１つ又は複数を含有してもよい。これらの添加剤は、一般に、０．０１〜２ｇ／リットルで増殖培地中に存在する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、以下の添加剤の１つ又は複数を指定された量で有し得る：
【表１】
2019503192.tif 000003
特定の実施形態では、増殖培地は、以下の組成を有する：
【表２】
2019503192.tif 000004
【００２５】
細菌は二酸化炭素を固定することができる。それゆえ、増殖培地は、大気中から増殖培地に溶解した二酸化炭素以外の外来性の炭素源を必要としない。しかしながら、いくつかの実施形態では、細菌が培養される前に、又は培養中に、二酸化炭素を増殖培地にバブリングして、増殖培地中に溶解した二酸化炭素の量を増加させることができる。細菌は唯一の炭素源として二酸化炭素を使用することができる。いくつかの実施形態では、二酸化炭素以外の炭素源は存在しない。
【００２６】
増殖培地は、約５〜約７のｐＨを有し得る。好ましくは、増殖培地は、ポリマー３ＨＰアミドの合成に最適な約５．５のｐＨを有する。
【００２７】
培地は好ましくは、栄養素／添加剤が水に溶解されるように水性である。
【００２８】
細菌は０〜６０℃の温度で培養される。好ましくは、細菌は１０〜４０℃の温度で培養される。ポリマー３ＨＰアミドの合成に最適な温度は約３０℃である。
【００２９】
細菌は、固定支柱（rigid support）からなる固定床で培養することができ、斯かる固定支柱は、生物への空気の流れを可能にするために層が分離されるように反応槽内に配置されている。増殖培地は、循環ポンプ及びスプレーバー（spray bar）によって床を通過することができる。床に細菌が生息すると、生成物はバッチで又は連続的に収集することができる。
【００３０】
ポリマー３ＨＰアミドは、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌を培養することによって製造される。細菌は、ポリマー３ＨＰアミドを製造することができる任意の好適なアセトバクタ―・ロバニエンシス細菌であり得る。これは、ＦＪ１株（受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８０８を有する）、及びＦＪ１に関連するか又は由来する類似の株を含む。用語「に由来する」とは、ＦＪ１を改変し又は突然変異させて、さらなる細菌を作り出すことができることを意味する。例えば、遺伝子がＦＪ１に挿入され又は除去されてもよい。ＦＪ１に由来する細菌は、ＦＪ１と機能的に同等であるべきであり、かつポリマー３ＨＰアミドを産生することができるべきである。さらに、由来細菌は、ＦＪ１と同じ条件下で増殖することができる必要がある。好ましくは、細菌は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８０８を有するＦＪ１株である。細菌は、当業者に良く知られている方法によって、例えば１６Ｓ ｒＤＮＡ解析を用いることによって、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌として同定することができる。
【００３１】
細菌は成長するにつれてポリマー３ＨＰアミドを産生し、従って、細菌の培養中に、ポリマー３ＨＰアミドは増殖培地中に存在することになる。次いで、所望であれば、ポリマー３ＨＰアミドを抽出することができる。
【００３２】
当該方法はさらに、ポリマー３ＨＰアミドを増殖培地から分離するステップを含んでもよい。これは任意の好適な方法で行うことができ、多数の方法が当業者に明らかであろう。例えば、ポリマー３ＨＰアミドは、蒸留を用いて分離することができ、斯かる蒸留には、標準的な蒸留、分別蒸留、真空蒸留、共沸剤（entrainer）による蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留又は薄膜抽出が含まれる。他の分離方法としては、膜灌流、電気化学的分離、又は超臨界二酸化炭素の使用が挙げられる。さらに、分離は沈殿、例えばカルシウムによる沈殿によって行われ得る。
【００３３】
当該方法はさらに、ポリマー３ＨＰアミドを加水分解して、モノマー３ＨＰアミドを形成するステップを含んでもよい。これは、任意の好適な方法で行うことができ、多数の方法が当業者に明らかであろう。
【００３４】
さらに、ポリマー３ＨＰアミドがモノマー３ＨＰアミドに加水分解されると、当該方法はさらに、３ＨＰアミドを分離することを含み得る。
【００３５】
加えて、当該方法はさらに、ポリマー又はモノマー３ＨＰアミドを、３ＨＰ酸、３ＨＰエステル、３−ヒドロキシプロピオンアミン（hydroxypropionamine）、３−ヒドロキシプロピオニトリル、アクリルアミド、アクリルアミン、アクリル酸、アリルアミン、アクリロニトリル、ポリアミンポリマー、ポリニトリルポリマー又は他のヘテロポリマー、例えばアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）に変換することを含み得る。
【００３６】
３ＨＰアミドモノマーは、アンモニアを除去するためのアルカリでの処理によって３ＨＰ酸に、そして、還元によって３−ヒドロキシプロピオンアミン（hydroxypropionamine）及び３−ヒドロキシプロピオニトリルに変換することができる。これらの分子の脱水は、それぞれアクリルアミド、アクリル酸、アリルアミン及びアクリロニトリルをもたらす。あるいは、カルボニル酸素を介して結合した３ＨＰアミドの繰り返し構造である短鎖ポリマー３ＨＰアミドは、還元されて、順次ポリアミン又はポリニトリルポリマーを与えることができ、これは次に加水分解されて、モノマー単位を放出し得る。
【００３７】
特定の実施形態では、ポリマー３ＨＰアミドを製造するための方法であって、以下：
１〜３ｇ／リットルのレベルでのホスフェート及び０．５〜１ｇ／リットルのレベルでのアンモニウムを含有する増殖培地中で、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１８０８を有するアセトバクタ―・ロバニエンシスＦＪ１株を培養すること、を含み、ここで、ここで、細菌の培養によりポリマー３ＨＰアミドが製造される、方法が提供される。
【００３８】
３ＨＰアミドを製造するための方法であって、以下：
ホスフェート及びアンモニウムを含有する増殖培地中で、アセトバクタ―・ロバニエンシス細菌を培養し、ここで、細菌の培養によりポリマー３ＨＰアミドが製造され；並びに
ポリマー３ＨＰアミドを加水分解して、３ＨＰアミドを製造すること、
を含む、方法が提供される。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明をこれより、以下の図面を参照して単なる実施例によって詳細に説明することになる：
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】図１は、細菌培地の液体クロマトグラフィー−質量分析スペクトル（電子スプレー−１を用いた）である。これは、３−ヒドロキシプロピオンアミドのペントマー（pentomer）を表す質量３７５．７の共通フラグメントを有する一連の化合物（４〜１９）を示す。
【図１−２】図１は、細菌培地の液体クロマトグラフィー−質量分析スペクトル（電子スプレー−１を用いた）である。これは、３−ヒドロキシプロピオンアミドのペントマー（pentomer）を表す質量３７５．７の共通フラグメントを有する一連の化合物（４〜１９）を示す。
【図２】図２は、３−ヒドロキシプロピオンアミドモノマーの赤外スペクトルである。
【図３】図３は、３−ヒドロキシプロピオンアミドモノマーの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、３−ヒドロキシプロピオンアミドモノマーの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、３−ヒドロキシプロピオンアミドモノマーのガスクロマトグラフィー−質量分析スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
概要
低下したレベルのホスフェートと低レベルの添加窒素との存在下で、アセトバクタ―・ロバニエンシスＦＪ１は、３ＨＰアミドを短鎖ポリマー材料として産生する。
【００４２】
特定の理論に拘束されることを望むことなく、低レベルの添加窒素は酵素系を誘導し得ると考えられ、斯かる酵素系は、ヒドロキシルプロピオン酸サイクル（hydroxyl propionate cycle）を介した３ＨＰの合成後のアミノ化をもたらす（Tabita, F.J. PNAS（2009）106、21015-21016; Strauss, G. 及びFuchs.G., Eur. J. Biochem（1993）、215、633-643）。添加窒素は、３ＨＰアミドの形態での窒素の合計出力を考慮せず、これは最終生成物中に最小限で１０倍高く、窒素固定が添加窒素源によって抑制されないことを示唆している。この効果はアンモニウム含有塩に特異的であり、硝酸塩及び亜硝酸塩は効果的でないことが示されている。ニトロゲナーゼ酵素型複合体を介したこの生物による窒素の固定は、水素の生成をもたらし（Tamagnini P. ら、Microbiology and Molecular Biology Reviews（2002）、66、11-20）、斯かる水素は、生物のヒドロゲナーゼ酵素系によって使用され、生物のレドックス（redox）系を釣り合わせる。炭素及び窒素同化は他の生物で記載されているが（Levican G. ら、BMC Genomics（2008）581 1186; Dubbs J.M.及びTabita F.R. Fems Microbiol Rev（2004）28、353-356; McKinlay J.B.及びHarwood C.S.、PNAS（2010）、1073、1-7）、レドックスリサイクリング機構としての二酸化炭素固定の使用は、これまでに、酸素非発生型光合成細菌、例えば非硫黄細菌においてのみ記載され、ここでは、二酸化炭素がカルビン・ベンソン・バッシャム回路（Calvin Benson Basham cycle）を介して還元される。アセトバクター種はこの効果を活用することが可能であり得る。機能するカルビン・ベンソン・バッシャム回路を有さないが、アセトバクター種はその遺伝的要素を保持し、あるいは３ＨＰサイクルが同じ効果に使用される。このことに加えて、３ＨＰのためのプロトン駆動力依存排出システムは、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）に見られるように動作し得る（Matsushita K.ら、Bacteriol.（2005）、187、4346-4352）。
【００４３】
３ＨＰアミドの合成は、３ＨＰの合成が可能な細菌において記載されていない。直接的な証拠を欠いているが、それは、窒素並びに炭素を同時に固定する能力に関連し得る。３ＨＰアミドは、短い長さのポリマー材料に組み立てられるようであり、これは、生成物が、アクリルアミド、アクリロニトリル又はアクリル酸のいずれかへの変換前の安全な形態で収集されることを可能にする。生成物は、水を除去するための蒸発、蒸留残渣（stillage）中の生成物を濃縮するための大気圧での蒸留、４０℃及び５０ｍＢａでの真空蒸留、カルシウム又は亜鉛塩での沈殿、好適な溶媒での抽出、あるいは吸着クロマトグラフィーによって収集され得る。
【００４４】
３ＨＰアミド−ＣＡＳ番号２６５１−４３−６を製造するためのプロセス
アセトバクタ―・ロバニエンシスＦＪ１を、窒素源、具体的にはアンモニウム塩としての窒素源が含まれ、かつ窒素とリンとの比が重量で約１：１である、最小塩培地で増殖させる。培地の組成を以下の表に示す：
【表３】
2019503192.tif 000005
【００４５】
培地を水に溶解させ、濾過する。使用する水は蒸留水又は水道水のいずれかとすることができる。微生物を非無菌条件下で増殖させることができる。
【００４６】
微生物は固定トリクルダウン(trickle down)反応器内で増殖され、斯かる反応器は、不活性材料、例えばポリウレタンフォーム又は木材チップの固定されているが多孔性の床からなる。不活性床は、反応容器内のトレイ又は他の好適な容器に支持される。反応容器は、床を支持するタンク、生成物を収集するサンプ(sump)、及び、スプレーバーを介してサンプから反応器の頂部に培地を循環させるためのサンプの底にある循環ポンプを含む。空気は、遠心空気ポンプを用いて床の底に送り込まれる。
【００４７】
微生物を、振とうフラスコ又は他の好適な容器中の２リットル量の培地に接種し、０．７５〜１．００のＡ６００に増殖させる。次いで、２リットルの培地を新鮮な培地で１０リットルの体積に希釈し、再度０．７５〜１．００のＡ６００に培養する。培養物を繰り返し分割することによって、培養培地の体積を所望の体積まで増加させる。次いで、この培地を頂部の床に適用し、トリクルダウンさせる。サンプ中のＡ６００が、細菌が床に固定されたことを示す０．１未満に低下するまで、培地を循環させる。次いで、床をさらに７日間の期間循環させ、最小塩培地を１０ｘ濃縮して、床を生息可能にする。増殖期間の最後には、最小塩培地は表１に示された濃度に減少して、増殖を維持し、生物が生体内変換を行うことを可能にする。サンプ内の材料のＡ６００をモニターして、生物が床に固定されたままであることを保証する。床の温度は、培地の循環に連結された熱交換器を用いて３０℃に維持される。
【００４８】
生成物は、サンプ内の使用済み培地から収集される。使用済み培地はバッチで、又は連続的に取り出すことができる。ポリ３ＨＰアミドは、カルシウム又は亜鉛塩による沈殿、大気圧又は真空下での蒸留による濃縮、膜灌流、溶媒抽出、吸着あるいは臨界二酸化炭素の使用によって収集することができる。
【００４９】
回収物は、濃縮あるいはカルシウム又は亜鉛塩による沈殿を含む様々な予備精製方法の後に測定される。このステップの後に、材料はｐＨ２．０に酸性化され、好適な触媒が添加されて、ポリ３ＨＰアミドのモノマー３ＨＰアミドへの加水分解をもたらす。典型的には、試料は、濃硫酸又は濃塩酸のいずれかを用いてｐＨ２．０に酸性化される。過酸化水素が２．０％の最終濃度まで添加され、試料は好適な容器中で１００℃で３０分〜１時間還流下で加熱される。これは、ポリマー材料のモノマー単位への加水分解をもたらし、次いで、斯かるモノマー単位は高圧液体クロマトグラフィーを用いて測定することができる。典型的には、３ＨＰアミドは、２５ｃｍのＯＤＳ−Ｈ、４．６ｍｍカラムを用いて９０％エタノール及び１０％水の移動相により均一濃度で溶離し得る。０．３ｍｌ／分の流速及び４０℃のカラム温度が用いられる。同定及び定量は、Sigma Aldrichから入手できる標準に対して行うことができる。
【００５０】
ポリマー材料は、電子スプレー＋１又は電子スプレー−１のいずれかでＬＣ−質量分析を用いて同定することができる。ポリマーは、最大で１２回の繰り返しの一連の短鎖として、両方の培地、濃縮された培地及びカルシウム沈殿物の加水分解から調製された材料中に存在する。細菌培地の電子スプレー−１分析の示された例において（図１）、一連の化合物は、３ＨＰアミドのペントマー（pentomer）を表す質量３７５．７の共通のフラグメントを示す。ポリマーは、３ＨＰアミドの繰り返し及びアクリルアミドとしても存在し、これは調製中のポリマーの脱水の結果であり得る。カルシウム沈殿ポリマー及びポリマー濃縮物のＮＭＲは、１２ｐｐｍ付近で、アクリル様分子を含むが、Ｃ＝Ｏの典型的な特徴を欠いている物質を示す。ポリマー材料は、モノマー単位に戻るよう加水分解され、ＨＰＬＣにより分析され得る；３ＨＰアミド標準及び試料物質はカラムに共に流される（co-run）。濃縮培地又はカルシウム沈殿物の加水分解から生成される物質を水酸化ナトリウムと共にさらに過熱すると、アンモニアが放出され、３−ヒドロキシプロピオン酸が生成される。
【００５１】
アミドは様々な技法によって同定することができる。赤外線（図２）は、１６６０ｃｍ-1に低い周波数のＣ＝Ｏ、並びに３５００ｃｍ-1及び３１００ｃｍ-1にＮ−Ｈストレッチ（ＮＨ2について２つ及びＮＨについて１つ）の典型的な存在を示す。１Ｈ ＮＭＲは、ＮＨについての５〜８ｐｐｍの間及びＨ−Ｃ−Ｃ−Ｏについての２〜２．４の幅広い交換可能なシグナルを与える（図３）。１３Ｃ ＮＭＲは典型的には、Ｃ＝Ｏについて１６０〜１８０ｐｐｍ間のシグナル（Ｏによる脱遮蔽）、並びに、結合したＨのシグナルを有さないＣのシグナルに特徴的な最小強度シグナルを与える（図４）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃスペクトルはいずれも、既知の標準のスペクトルに一致する。ＵＶ−可視スペクトルは、Ｏ孤立電子対及び反結合性Ｃ＝Ｏからの２１５ｎｍ付近の吸収極大を示す。質量分析はアミドに典型的である（図５）。
【実施例】
【００５２】
実施例
実施例１：添加アンモニウム塩の存在下での生物の増殖
固定床上で増殖させた場合、ポリ３ＨＰアミドは、２４時間間隔で取り出されるバッチでサンプから収集することができる。１ｍ3の体積を有する試験床、２００リットルのサンプ体積、３０℃の温度、ｐＨ５．５の出発培地を用いて、生物は３０〜５０ｇ／ｌの製造のレベルを達成する。ＨＰＬＣを使用すると、標準は９．３０８分で保持され、試料はポリマー３ＨＰアミド材料の加水分解後に９．２９４分で保持される。４．９５％又は４９．５ｇ／ｌの収率が達成されたが、これは約２ｇ／ｌ／ｈに相当する。３ＨＰ標準は８．９７３分で保持され、加水分解された材料のものとは一致しなかった。
【００５３】
実施例２：３ＨＰアミドからのアクリルアミドの合成
使用済み細菌培地を、上記に詳述した方法のいずれかによって回収及び濃縮し、あるいはカルシウム沈殿物として収集する。次いで、濃縮培地又はカルシウム沈殿物を、濃塩酸又は濃硫酸を用いて２．０のｐＨに酸性化することによって加水分解する。次いで、好適な触媒を使用して、存在するポリマー３ＨＰアミド材料をモノマー単位に戻るよう加水分解する。生成した材料をさらに濃縮及び脱水する。脱水はアクリルアミドの生成をもたらす。生成したアクリルアミドはさらに、好適な触媒系を用いてアミンへと還元することができる。例えば、１，１，３，１，テトラメチルシロキサン及び１，２−ｂビス（ジメチルシリル）ベンゼンは白金触媒に効果的な還元剤である（S. Hanada、E. Tsutsumi、Y. Motoyama、H. Nagashima、J.Am.Chem. Soc 2009、131、15032-15040）。Ｔｆ２Ｏによる活性化、室温でのＴＨＦ中の水素化ホウ素ナトリウムによる還元に続く（S.-H. Xiang、J. Xu、H.-Q. Yuan、P.-Q. Huang Synlett. 2010、1829-1832）。
【００５４】
実施例３：３ＨＰアミドからのアクリロニトリルの合成
３ＨＰアミドは、Ｎ，Ｎ−ジヒドロ−Ｃ−オキソ−ビ（N,N-dihydro-C-oxo-bi）除去を用いてニトリルに脱水することができる（アクリルアミド／ポリアクリルアミド：Overview of the Chemistry(1988)pp 9、C.G. Daughton）。五酸化リンを脱水剤として使用することができるが、酸ハロゲン化物又は無水物も使用することができる。
【００５５】
【化１】
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【００５６】
代替的に、実施例２で生成された第一級アミンをさらに、穏やかな酸化条件下でトリクロロイソシアヌル酸を用いてアクリロニトリルに変換することができる（F.-E. Chen、Y.-Y. Kuang、H.-F. Dai、L. Lu、M. Huo、Synthesis 2003、2629-2631）。あるいは、第一級アミンは、ルテニウム錯体触媒を用いて非酸化条件下でニトリルに直接変換することができる（K.-N.T. Tseng、A.M. Rizzi、N.K. Szymczak、J.Am.Chem Soc. 2013、135、16352-16355; O.D. Pavel、P. Goodrich、L. Cristian、S.M. Coman、V.I. Parvulescu及びC. Hardacre、Catal. Sci. Technol. 2015、5、2696-2704）。
【００５７】
実施例４：３ＨＰアミドからのアクリルアミンの合成
アミド形態は、金属水素化物、例えばＬｉＡｌＨ4又はＢＨ3を用いてアミンに還元することができる。ニトリルは、非置換アミドの還元における中間体である。ジグリコールメチルエーテル中で、第一級アミドは定量的に還元され、ニトリルで止めることができる。同じ効果に使用することができる他の還元剤はビトリド（Vitride）（（ＮａＡｌＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3）2）、ボランテトラヒドロフラン（ＢＨ3．ＴＨＦ）、ボランメチルスルフィド（borane methyl sulphide）（（ＣＨ3）２Ｓ：ＢＨ3））である。
【００５８】
実施例５：３ＨＰアミドからの３ＨＰ酸の合成
３ＨＰアミドは、水酸化ナトリウムの希釈溶液の存在下で加熱して、アンモニアを放出することによって、３ＨＰの酸形態に変換することができる。
【００５９】
実施例６：３ＨＰからのアクリル酸の合成
アクリル酸は、先の特許、例えば国際公開第２０１３／１９２４５１号又は米国特許第８，８４６，３５３号明細書に詳述された技法の１つを用いて、脱水によって３ＨＰから生成することができる。
【００６０】
実施例７：カルシウム沈殿物からの３ＨＰエステルの合成
３ＨＰエステル、例えばメチル ３−ヒドロキシプロピオン酸は、カルシウム沈殿したポリマー又は濃縮ポリマーの直接メチル化によって生成することができる。沈殿物又は濃縮物を、触媒としての硫酸の存在下でメタノールと反応させる。反応混合物を６０℃に６０分間加熱し、メチル化エステルを蒸留により収集する。
【図１−１】
2019503192.tif 000007
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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