(57)【要約】本開示は、ＧＤＦ１５の発現レベルを使用して緑内障の重症度を判定する方法を提供した。緑内障の重症度の判定は、治療決定に役立つ。
2019508064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障と診断された対象における緑内障の重症度を判定する方法であって、
ａ）前記対象から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、
ｂ）前記生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較すること、及び
ｃ）前記基準値に対する前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、緑内障の重症度を判定すること、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記対象が、軽度から中等度の緑内障と診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、緑内障と診断されないが、緑内障を有する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、緑内障と診断されないが、緑内障を有する疑いがある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、前記基準値に対する前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を有すると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、緑内障のグレードに基づいて治療される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が、房水または網膜組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料が、房水である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記房水を、手術の開始時に採取する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＤＦ１５タンパク質を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準値を上回るｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
約２０ｐｇ／ｍｌ〜約８０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩの緑内障を示し、約８０ｐｇ／ｍｌ〜約１６０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩＩの緑内障を示し、約１６０ｐｇ／ｍｌ以上の量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
約４６．４±１２．１ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質が、グレードＩの緑内障を示し、約１２９．５±３８．０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質が、グレードＩＩの緑内障を示し、約１９０±４８．７ｐｇ／ｍｌ以上の量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象を、前記基準値を上回る前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記基準値が約２０ｐｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記基準値が約８．９±７．７ｐｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＤＦ１５タンパク質の量を、試料をＧＤＦ１５に特異的な抗体と接触させ、抗体に結合した前記ＧＤＦ１５の量を定量することによって検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＤＦ１５タンパク質の量を、イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光ベースアッセイ、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）、ラジオメトリックアッセイ、マルチプレックスイムノアッセイ、及びサイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡ）からなる群から選択される方法によって検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＤＦ１５タンパク質の量を、ＥＬＩＳＡによって検出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
臨床症状を評価すること、眼内圧を測定すること、視野測定を実施すること、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
緑内障と診断された対象における治療を決定する方法であって、
ａ）前記対象から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、
ｂ）前記生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較し、前記基準値を上回る前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が緑内障の重症度を示すこと、及び
ｃ）前記検出された緑内障の重症度に基づいて前記対象の治療を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記対象が、緑内障と診断されないが、緑内障を有する危険性がある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、緑内障と診断されないが、緑内障を有する疑いがある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、前記基準値に対する前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を有すると判定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
約２０ｐｇ／ｍｌ〜約８０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩの緑内障を示し、約８０ｐｇ／ｍｌ〜約１６０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩＩの緑内障を示し、約１６０ｐｇ／ｍｌ以上のＧＤＦ１５タンパク質の量がグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象を、緑内障のグレードに基づいて治療する、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療が、点眼剤、丸薬、レーザー手術、切開手術、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象における緑内障の進行をモニタリングする方法であって、
ａ）前記対象から得られた第１の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、
ｂ）後の時点で前記対象から得られた第２の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、
ｃ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量と比較すること、及び
ｄ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に対して増加している場合、緑内障が進行していると判定すること、を含む、前記方法。
【請求項２９】
対象における緑内障治療に対する応答をモニタリングする方法であって、
ａ）前記対象から得られた第１の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、
ｂ）前記対象を治療すること、
ｃ）後の時点で前記対象から得られた第２の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、
ｄ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量と比較すること、及び
ｅ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に対して減少している場合、治療に対する応答を判定すること、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
ＧＤＦ１５タンパク質を検出する、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記基準値を上回るＧＤＦ１５タンパク質の量が、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
約２０ｐｇ／ｍｌ〜約８０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩの緑内障を示し、約８０ｐｇ／ｍｌ〜約１６０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質がグレードＩＩの緑内障を示し、約１６０ｐｇ／ｍｌ以上のＧＤＦ１５タンパク質の量がグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
約４６．４±１２．１ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ１５タンパク質の量が、グレードＩの緑内障を示し、約１２９．５±３８．０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ１５タンパク質の量が、グレードＩＩの緑内障を示し、約１９０±４８．７ｐｇ／ｍｌ以上のＧＤＦ１５タンパク質の量がグレードＩＩＩの緑内障を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＧＤＦ１５タンパク質の量を、試料をＧＤＦ１５に特異的な抗体と接触させ、前記抗体に結合したＧＤＦ１５の量を定量することによって検出する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＧＤＦ１５タンパク質の量を、イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光ベースアッセイ、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）、ラジオメトリックアッセイ、マルチプレックスイムノアッセイ、及びサイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡ）からなる群から選択される方法によって検出する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＧＤＦ１５タンパク質の量を、ＥＬＩＳＡによって検出する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
臨床症状を評価すること、眼内圧を測定すること、視野測定を実施すること、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により与えられたＥＹ０１９２８７に基づく政府の支援によってなされたものである。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月２９日出願の米国仮特許出願第６２／２８９，０３０号の利益を主張し、その開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、ＧＤＦ１５の発現レベルを使用して緑内障の重症度を判定する方法を提供した。緑内障の重症度の判定は、治療決定に役立つ。
【０００４】
発明の背景
緑内障は、眼の視神経を損傷し、視力喪失及び失明をもたらすことがある疾患群である。しかし、早期検出と治療では、重篤な視力喪失から目を保護することができる。現在、緑内障の重症度または進行を検出する利用可能なバイオマーカーはない。Ｔｇｆｂ２は緑内障を引き起こすことがあるが、緑内障のバイオマーカーではない。現在、眼内圧（ＩＯＰ）及び視野測定に基づいて緑内障治療を決定する。しかし、ＩＯＰは患者ごとに大きな差があり、視野測定は自覚的検査である。したがって、緑内障の治療決定に役立つバイオマーカーが必要である。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本開示は、緑内障と診断された対象における緑内障の重症度を判定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）前記対象から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｂ）前記生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較すること、及び（ｃ）基準値に対する前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、緑内障の重症度を判定すること、を含む。
【０００６】
別の態様では、本開示は、緑内障と診断された対象における治療を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）前記対象から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｂ）前記生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較し、前記基準値を上回るｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が緑内障の重症度を示すこと、及び（ｃ）前記検出された緑内障の重症度に基づいて前記対象の治療を決定すること、を含む。
【０００７】
更に別の態様では、本開示は、対象における緑内障の進行をモニタリングする方法を提供する。この方法は、（ａ）前記対象から得られた第１の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｂ）後の時点で前記対象から得られた第２の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｃ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量と比較すること、及び（ｄ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に対して増加している場合、緑内障が進行していると判定すること、を含む。
【０００８】
更に別の態様では、本開示は、対象における緑内障治療に対する応答をモニタリングする方法を提供する。この方法は、（ａ）前記対象から得られた第１の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｂ）前記対象を治療すること、（ｃ）後の時点で前記対象から得られた第２の生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｄ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量と比較すること、及び（ｅ）前記第２の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が、前記第１の生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に対して減少している場合、治療に対する応答を判定すること、を含む。
【０００９】
本出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面（複数可）による本特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】視神経挫滅モデル（ＯＮＣ）と、エンドトキシン誘発ブドウ膜炎モデル（ＥＩＵ）と、光曝露誘発網膜変性モデル（ＬＥ）との間で重複するアップレギュレートされた遺伝子を示すベン図を表す。
【図２】ＯＮＣと、ＥＩＵと、ＬＥとの間で重複するダウンレギュレートされた遺伝子を示すベン図を表す。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、ＯＮＣ（図３Ａ）、ＥＩＵ（図３Ｂ）及びＬＥ（図３Ｃ）におけるｇｄｆ１５の遺伝子発現レベルを示すグラフを表す。Ｇｄｆ１５遺伝子発現は、ＯＮＣモデルにおいてのみアップレギュレートされる。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、ＯＮＣ（図４Ａ）、ＥＩＵ（図４Ｂ）及びＬＥ（図４Ｃ）におけるｔｇｆｂ２の遺伝子発現レベルを示すグラフを表す。Ｔｇｆｂ２は、すべてのモデルにおいて対照と同等である。
【図５】図５Ａ、図５Ｂは、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ、及び図５Ｊは、ＯＮＣモデルにおいて他のｇｄｆ遺伝子のいずれも変化しないことを示すグラフを表す。（図５Ａ）ｇｄｆ１；（図５Ｂ）ｇｄｆ２；（図５Ｃ）ｇｄｆ３；（図５Ｄ）ｇｄｆ５；（図５Ｅ）ｇｄｆ６；（図５Ｆ）ｇｄｆ７；（図５Ｇ）ｇｄｆ８；（図５Ｈ）ｇｄｆ９；（図５Ｉ）ｇｄｆ１０；及び（図５Ｊ）ｇｄｆ１１。
【図６】ＧＤＦ１５タンパク質がＯＮＣマウスモデルにおいて上昇したことを示すグラフを表す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ｇｄｆ１５がＯＮＣ（図７Ａ）において有意にアップレギュレートされ、ｔｇｆｂ２がＯＮＣ（図７Ｂ）において変化しなかったことを示すグラフを表す。図７Ｃは、房水で実施したＥＬＩＳＡアッセイによって検出されたＧＤＦ１５タンパク質発現が、ＯＮＣのラットモデルにおいてもアップレギュレートされることを示すグラフを表す。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃは、それぞれ前眼部、水晶体及び網膜におけるｇｄｆ１５の６時間での発現を示すグラフを表す。結果は、いずれの眼組織においても有意なアップレギュレーションがないことを示した。図８Ｄ、図８Ｅ、及び図８Ｆは、ｇｄｆ１５発現が網膜（図８Ｆ）では有意にアップレギュレートされたが、前眼部または水晶体では有意にアップレギュレートされなかったことを示すグラフを表す（それぞれ図８Ｄ、図８Ｅ）。
【図９】図９Ａは、対照対ＯＮＣモデルにおけるマクロファージの有意差がないことを示すグラフを表す。図９Ｂ及び図９Ｃは、ＥＩＵモデル及びＬＥモデルの両方が、対照と比較してマクロファージの有意な増加をそれぞれ示すグラフを表す。
【図１０】対照患者と比較して、緑内障患者におけるＧＤＦ１５発現の有意な増加が存在することを示すグラフを表す。
【図１１】ＧＤＦ１５の発現が疾患の重症度と相関することを示すグラフを表す。緑内障の重症度がグレードＩからグレードＩＩ、グレードＩＩＩへと進行するにつれて、検出されるＧＤＦ１５の量が増加する。テューキーの多重比較検定＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１
【図１２】対照組織及びＯＮＣ組織のインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を示す画像を表す。ＧＤＦ１５は、ＯＮＣ組織の外顆粒層（ＯＮＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）と比較して、神経節細胞層（ＧＣＬ）において特にアップレギュレートされている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、ＧＤＦ１５タンパク質の房水濃度の増加と緑内障の重症度の増加との間の統計的に有意な関係を提供する。成長／分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーに属するタンパク質である。ＧＤＦ１５は、成長／分化因子１５、ＴＧＦ−ＰＬ、ＭＩＣ−１、ＰＤＦ、ＰＬＡＢ、ＮＡＧ−１、及びＰＴＧＦＢとも称してもよい。ＧＤＦ１５のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４８５５．２に見出すことができ、ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４８６４．３に見出すことができる。当業者は、提供されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に基づいて配列を決定することができるであろう。網膜神経節細胞の慢性損傷に起因する緑内障においてＧＤＦ１５タンパク質レベルが上昇し、ＧＤＦ１５の上昇が緑内障のグレードと特異的に相関することは、思いがけないことであった。驚くべきことに、ＧＤＦ１５は、網膜神経節細胞傷害によりアップレギュレートされる唯一の特異的遺伝子である。したがって、本明細書では、この関係を利用して、緑内障の重症度を判定し治療決定に役立つ本発明の手段を提供する方法を提供する。
【００１２】
本明細書において、ｇｄｆ１５核酸及びＧＤＦ１５タンパク質を検出するための方法、ならびに対象における緑内障の重症度を分類する際のそれらの使用を提供する。これらの方法の種々の態様は、以下でより詳細に説明する。
【００１３】
Ｉ．方法
一態様では、本開示は、対象から得られた生体試料中で測定したｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、対象を分類する方法を提供する。この方法は、一般に（ｉ）前記生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｉｉ）前記生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較すること、及び（ｉｉｉ）前記試料中で測定した前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、前記対象を、増加したもしくは減少した前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を有するものとして分類すること、を含む。
【００１４】
別の態様では、本開示は、緑内障と診断された対象における緑内障の重症度を判定する方法を提供する。この方法は、一般に（ｉ）前記対象から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｉｉ）前記生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較すること、及び（ｉｉｉ）前記基準値に対する前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、緑内障の重症度を判定することを含む。対象の緑内障を診断する方法は、当該技術分野において既知であり、眼圧測定（眼内圧（ＩＯＰ）、眼圧検査）、眼の排液角度の検査（隅角鏡検査）、視神経の検査（眼底検査）、周辺視力検査（視野検査、視野測定）、角膜の厚さ測定（パキメトリー）が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、対象は、緑内障と診断されない場合があるが、症状に基づいて緑内障を有する疑いがある。診断につながる場合がある緑内障の症状の非限定的な例としては、周辺視における盲点、かすみ目、ハロー、軽度の頭痛、眼の痛み、目または額に重度の痛み、目の充血、視力低下、虹視症、悪心及び／または嘔吐が挙げられる。他の実施形態では、対象は、緑内障と診断されない場合があるが、緑内障を有する危険性がある。緑内障の危険因子の非限定的な例としては、高ＩＯＰ、６０歳超の年齢、アフリカ系アメリカ人またはヒスパニック系、緑内障の家族歴、糖尿病、心臓病、高血圧及び鎌状赤血球貧血などの病状、近視、眼の傷害歴または特定のタイプの眼の手術歴などの目の状態、４３歳以前に両側卵巣摘出術後に起こりうる早期エストロゲン欠乏症、及び／または長期間のコルチコステロイド薬、特に点眼薬の服用が挙げられる。
【００１５】
一般に、緑内障の重症度は、ＩＣＤ−９病期分類定義に基づいて判定する。しかし、本開示は、生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を使用して、緑内障の重症度を判定し得ることを提供する。ＩＣＤ−９病期分類の定義によれば、緑内障の重症度は、軽度または初期段階の緑内障（グレードＩ）、中等度段階の緑内障（グレードＩＩ）または重度段階の緑内障、高度段階の緑内障、末期段階の緑内障（グレードＩＩＩ）でありうる。軽度または初期段階の緑内障（グレードＩ）は、緑内障に一致する視神経異常として定義されるが、ホワイト  オン  ホワイト視野検査での視野異常は存在せず、または短波長自動視野測定または周波数二倍錯視視野測定においてのみ視野異常が存在する。中等度段階の緑内障（グレードＩＩ）は、緑内障に一致する視神経異常及び１つの半視野においてであり、固視５度内にはない緑内障性視野異常と定義される。重度段階の緑内障、進行段階の緑内障、末期の緑内障（グレードＩＩＩ）は、緑内障に一致する視神経異常及び両半視野の緑内障性視野異常、及び／または少なくとも１つの半視野における固視５度内として定義される。当該技術分野において既知であるその他の病期分類系を使用してもよい。当業者であれば、ＩＣＤ−９病期分類系を、他の病期分類系と相関させることができるであろう。したがって、生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、対象は、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障に分類することができる。次いで、治療決定は、緑内障の段階に基づいて行うことができる。
【００１６】
さらに別の態様では、本開示は、緑内障と診断された対象の治療を決定する方法を提供する。この方法は、一般に（ｉ）前記対象から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を測定すること、（ｉｉ）前記生体試料中の前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を基準値と比較し、前記基準値を上回る前記ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が緑内障の重症度を示すこと、及び（ｉｉｉ）検出された緑内障の重症度に基づいて前記対象の治療を決定すること、を含む。ある実施形態では、対象は、緑内障と診断されない場合があるが、症状に基づいて緑内障を有する疑いがある。他の実施形態では、対象は、緑内障と診断されない場合があるが、緑内障を有する危険性がある。生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいて、対象は、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障に分類することができる。緑内障は、点眼剤、丸薬、レーザー手術、切開手術、またはこれらの方法の組み合わせで治療することができる。緑内障による失明は不可逆的であるため、あらゆる治療の目標は、視力の喪失を防ぐことである。一般に、点眼剤は、低グレードの緑内障を治療するために使用する。点眼剤が十分にＩＯＰを制御しない場合、点眼剤に加えて丸薬を使用してもよい。投薬により所望の結果が達成されないか、または耐えられない副作用がある場合、手術が次の選択肢であり得る。手術は、レーザー手術または切開手術であり得る。レーザー手術は、投薬と切開手術の中間段階と考えられる。レーザー手術の非限定的な例としては、アルゴンレーザー線維柱帯形成術（ＡＬＴ）、選択的線維柱帯形成術（ＳＬＴ）、レーザー末梢虹彩切開術（ＬＰＩ）及びシクロアブレーションが挙げられる。切開手術の非限定的な例としては、線維柱帯切除術、ドレナージインプラント手術、非穿孔性手術、エクスプレスミニ緑内障シャント、トラベクトーム及び管形成術が挙げられる。生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいたグレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの分類に基づいて、対象は、点眼剤、丸薬、レーザー手術及び／または切開手術で治療され得る。
【００１７】
更に別の態様では、本開示は、対象における緑内障をモニタリングする方法を提供する。このような実施形態では、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法を使用して、ある時点における対象の緑内障の重症度を評価することができる。その後次いで、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法を使用して、対象における緑内障の重症度の経時変化を判定することができる。例えば、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法は、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を最初に決定した数日後、数週間後、数ヶ月後または数年後に、同じ対象に使用することができる。したがって、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法を使用して、より重度の疾患に進行する危険性が高く、それによって治療を必要とする時期を判定するために、対象を経時的に追跡することができる。さらに、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法を使用して、疾患の進行速度を測定することができる。例えば、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量の減少は、疾患の進行の弱まりを示し得る。あるいは、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量の増加は、疾患の進行を示し得る。対象における緑内障の重症度の早期評価によって、介入の改善が可能になるか、またはより早期の介入が可能になり、緑内障に関連する症状の発症及び／または進行を低減させる場合がある。
【００１８】
さらに、対象における緑内障をモニタリングする方法を用いて、治療に対する応答を判定することもできる。本明細書中で使用する場合、治療に応答する対象は、治療の恩恵を受けたと言われる。治療に対する応答は、臨床的実践において、眼圧測定（眼内圧（ＩＯＰ）、眼圧検査）、眼の排液角度の検査（隅角鏡検査）、視神経の検査（眼底検査）、周辺視力検査（視野検査、視野測定）、角膜の厚さ測定（パキメトリー）が含まれるが、これらに限定されない試験により測定する。これらの試験は、当該分野で周知であり、当業者が臨床試験中及び臨床的実践において測定した特定のパラメーターを意味することを意図している。例えば、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法は、治療の開始前に、対象の生体試料において実施してもよい。その後次いで、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法を使用して、経時的治療への応答を判定することができる。例えば、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法は、治療の開始後の数日間、数週間、数ヶ月間または数年間、同じ対象の生体試料に行うことができる。したがって、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する方法は、治療を受けている対象の追跡に使用して、これにより対象が治療に応答しているかどうかを判定することができる。ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が増加するかまたは同じままである場合、対象は治療に応答していない可能性がある。ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量が減少する場合、対象は治療に応答している可能性がある。これらの工程を反復して、経時的治療に対する応答を判定することができる。
【００１９】
好適な対象としては、ヒト、家畜動物、コンパニオンアニマル、実験動物及び動物学上の動物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象は、例えばマウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類であってもよい。別の実施形態では、対象は家畜動物であってもよい。好適な家畜動物の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ及びアルパカを挙げてよい。さらに別の実施形態では、対象はコンパニオンアニマルであってもよい。コンパニオンアニマルの非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、及びトリなどのペットを挙げてよい。さらに別の実施形態では、対象は動物学上の動物であってもよい。本明細書で使用する場合、「動物学上の動物」とは、動物園で見出され得る動物を意味する。そのような動物としては、非ヒト霊長類、大型のネコ、オオカミ、及びクマを挙げてよい。好ましい実施形態では、動物は実験動物である。実験動物の非限定的な例としては、げっ歯類、イヌ科動物、ネコ科動物、及び非ヒト霊長類を挙げてよい。ある実施形態では、動物はげっ歯類である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００２０】
（ａ）生体サンプル
本明細書中で使用する場合、「生体試料」という用語は、対象から得られた試料を意味する。ＧＤＦ１５タンパク質またはｇｄｆ１５核酸を含む任意の生体試料が好適である。多くの種類の生体試料が、当該技術分野において既知である。好適な生体試料としては、組織試料または体液が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生体試料は、組織生検などの組織試料である。生検組織を固定し、パラフィンまたはプラスチックに包埋し、切開してもよく、または生検組織を凍結して凍結切開してもよい。特定の実施形態では、生検組織は網膜組織である。他の実施形態では、試料は体液であってもよい。好適な体液の非限定的な例としては、房水が挙げられる。特定の実施形態では、生体試料は房水である。流体は「そのまま」使用してもよく、細胞成分を流体から単離してもよく、または標準的な技術を用いて画分を流体から単離してもよい。
【００２１】
当業者が理解するように、生体試料を採取する方法は、生体試料の性質及び実施するべき分析のタイプに応じて変化する。当該技術分野において一般的に既知である種々の方法のうちのいずれかを利用して、生体試料を採取することができる。一般的に言うと、この方法により、好ましくは、試料の完全性を維持し、これにより本開示に従ってｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を正確に検出することができ、その量を測定することができる。特定の実施形態では、房水は、外科手術の開始時に採取する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、単一の試料を対象から得て、試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質を検出する。あるいは、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質は、対象から経時的に得られた試料中で検出してもよい。このように、複数の試料を、経時的に対象から採取してもよい。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上の試料を、経時的に対象から採取してもよい。いくつかの実施形態では、２、３、４、５または６の試料を、経時的に対象から採取する。他の実施形態では、６、７、８、９または１０の試料を、経時的に対象から採取する。さらに他の実施形態では、１０、１１、１２、１３または１４の試料を、経時的に対象から採取する。さらに他の実施形態では、１４、１５、１６またはそれ以上の試料を、経時的に対象から採取する。
【００２３】
複数の試料を経時的に対象から採取する場合、試料は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の日ごとに採取してもよい。いくつかの実施形態では、試料は約６日ごとに採取する。いくつかの実施形態では、試料は１、２、３、４、または５日ごとに採取する。他の実施形態では、試料は５、６、７、８、または９日ごとに採取する。さらに他の実施形態では、試料は９、１０、１１、１２、またはそれ以上の日ごとに採取する。さらに他の実施形態では、１ヶ月間隔、３ヶ月間隔、６ヶ月間隔、１年間隔、２年間隔、５年間隔、１０年間隔またはそれ以上の間隔で、試料を採取する。
【００２４】
（ｂ）ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の検出
試料を得ると、それをインビトロで処理して、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を検出及び測定する。当業者に既知の、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を検出及び測定するための全ての好適な方法は、本発明の範囲内であると考えられる。核酸発現及びタンパク質発現を検出する方法は、以下に詳細に記載する。
【００２５】
ｉ．核酸発現
一実施形態では、ｇｄｆ１５核酸発現を測定して、生体試料中のｇｄｆ１５核酸の量を判定することができる。特定の実施形態では、ｇｄｆ１５のｍＲＮＡを測定して、生体試料中のｇｄｆ１５核酸の量を判定することができる。
【００２６】
試料中の核酸発現の量を評価するための方法は、当該技術分野において周知であり、当業者に既知の核酸発現の量を評価するための全ての好適な方法は、本発明の範囲内であると考えられる。本明細書で使用する「核酸発現量」または「核酸発現レベル」という用語は、発現するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物、または特定の変異体またはｍＲＮＡの他の部分のレベル、核酸の酵素的または他の活性、及び特定の代謝産物のレベルなどであるがこれらに限定されない、核酸の発現の測定可能なレベルに依存する。「核酸」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得る。核酸発現の量を評価するための好適な方法の非限定的な例としては、マイクロアレイなどのアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ（定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む）などのＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ及びノーザンブロット分析を挙げてよい。特定の実施形態では、標的核酸の発現量を判定することは、部分的に、標的核酸ｍＲＮＡ発現のレベルを測定することを含む。
【００２７】
一実施形態では、核酸発現量は、マイクロアレイなどのアレイを用いて判定することができる。核酸マイクロアレイを使用する方法は、当該技術分野において広範にわたってよく知られている。例えば、標的遺伝子の発現産物と相補的またはハイブリダイズ可能な核酸プローブを、アレイに使用することができる。「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ可能な」という用語は、相補的核酸との配列特異的非共有結合相互作用を意味する。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシー条件下で行われる。ハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は、当業者に既知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１  ６．３．６に見出すことができる。本明細書で使用する「プローブ」という用語は、標的核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を意味する。一例では、プローブは、核酸のＲＮＡ産物またはその相補的な核酸配列にハイブリダイズする。プローブの長さは、ハイブリダイゼーション条件及びプローブ及び標的核酸配列の配列に依存する。一実施形態では、プローブは、少なくとも８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００またはそれ以上のヌクレオチド長である。
【００２８】
別の実施形態では、核酸発現量は、ＰＣＲを用いて判定することができる。ＰＣＲを使用する方法は、当該技術分野において広範にわたってよく知られており、定量的ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。具体的には、核酸発現量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて判定することができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野において一般的である。このような実施形態では、定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマーは、標的遺伝子のためのフォワード及びリバースプライマーを含むことができる。本明細書で使用する「プライマー」という用語は、精製された制限消化物中に天然に存在するか、または合成的に作製されたかに関係なく、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（例えば、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、適切な温度及びｐＨで）に置かれた場合に、合成のポイントとして作用することができる核酸配列を意味する。プライマーは、誘導剤の存在下で、所望の伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの配列及び使用方法を含む因子に依存する。プライマーは、典型的には１５〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないまたはより多いヌクレオチドを含むことができる。プライマーの適切な長さの決定に関与する因子は、当業者には容易に知られる。
【００２９】
核酸発現量は、核酸配列のｍＲＮＡ転写物全体を測定することによって、または核酸配列のｍＲＮＡ転写物の一部を測定することによって、測定することができる。例えば、核酸アレイを、ｍＲＮＡ発現量を測定するために利用する場合、アレイは、目的の核酸配列のｍＲＮＡの一部のプローブを含むことができるか、またはアレイは、目的の核酸配列の完全なｍＲＮＡのプローブを含むことができる。同様に、ＰＣＲ反応において、プライマーは、目的の核酸配列のｃＤＮＡ配列全体またはｃＤＮＡ配列の一部を増幅するように設計してもよい。当業者は、目的の核酸配列のｃＤＮＡ全体またはｃＤＮＡの一部のいずれかを増幅するために使用され得る一組以上のプライマーが存在することを、認識するであろう。プライマーを設計する方法は、当該技術分野において既知である。生体試料からＲＮＡを抽出する方法は、当該技術分野において既知である。
【００３０】
発現レベルは、対照核酸のレベルに対して標準化されてもされなくてもよい。これにより、異なる機会に実施されるアッセイ間の比較が可能になる。
【００３１】
ｉｉ．タンパク質発現
別の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質発現を測定して、生体試料中のＧＤＦ１５タンパク質の量を決定することができる。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質発現は、ＥＬＩＳＡを用いて測定して、生体試料中のＧＤＦ１５タンパク質の量を決定することができる。
【００３２】
タンパク質発現量を評価するための方法は、当該技術分野において周知であり、当業者に既知のタンパク質発現の量を評価するための全ての好適な方法は、本発明の範囲内であると考えられる。タンパク質発現の量を評価するための好適な方法の非限定的な例としては、エピトープ結合剤ベースの方法及び質量分析に基づく方法を挙げてよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現量を評価する方法は、質量分析法である。質量及び電荷の固有の特性を利用することにより、質量分析（ＭＳ）は、タンパク質を含む多種多様の複合化合物を解析し、確実に同定することができる。従来の定量的ＭＳでは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）に続いてタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）を使用し（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、一方、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）に続いて飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳを使用して（Ｂｕｃｋｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｍｉｒｇｏｒｏｄｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｇｏｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、より新しい定量法が開発されている。本発明によれば、質量分析を用いて、本発明の標的核酸からコードされたタンパク質のレベルを検出することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現量を評価する方法は、エピトープ結合剤ベースの方法である。本明細書で使用する「エピトープ結合剤」という用語は、標的遺伝子タンパク質を認識しそれに結合することができる、抗体、アプタマー、核酸、オリゴ核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、代謝産物、小分子、またはその断片を意味する。核酸類としてはＲＮＡ、ＤＮＡ、及び天然に存在するか、または合成的に作製した誘導体を挙げてよい。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、一般に、抗原のエピトープを認識し、これに結合することができるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書中で使用する場合、抗体は、当該技術分野において理解されるような、すなわち２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全な抗体であり得るか、または抗原結合領域を有し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、及び一本鎖Ｆｖなどの抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない、任意の抗体様分子であり得る。抗体という用語はまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を意味する。種々の抗体ベースの構築物及び断片を調製及び使用するための技術は、当該技術分野において周知である。抗体の調製及び特性評価のための手段も、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８を参照のこと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「アプタマー」という用語は、生化学的活性、分子認識または結合特性に関して有用な生物学的活性を有するポリヌクレオチド、一般にＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。通常、アプタマーは、特定のエピトープ（領域）における標的分子への結合などの分子活性を有する。ポリペプチドに結合するそれに特異的なアプタマーは、インビトロ進化法によって合成及び／または同定され得ることが一般に認められている。インビトロ進化法を含むアプタマーの調製及び特性評価のための手段は、当該技術分野において周知である（例えば、ＵＳ７，９３９，３１３を参照のこと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
一般に、タンパク質発現量を評価するエピトープ結合剤ベースの方法は、エピトープ結合剤とポリペプチドとの間の複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、このポリペプチドを含む試料を、このポリペプチドに特異的なエピトープ結合剤と接触させることを含む。エピトープ結合剤ベースの方法は、溶液中で生じてもよく、またはエピトープ結合剤または試料が固体表面上に固定化されてもよい。好適な表面の非限定的な例としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、樹脂類、及び他のポリマー類が挙げられる。
【００３８】
エピトープ結合剤は、当業者には理解されるように、多種多様な方法で基質に付着することができる。エピトープ結合剤は、最初に合成して、続いて基質に付着させてもよく、または基質上で直接合成してもよい。基質及びエピトープ結合剤は、化学官能基で誘導体化し、その後この２つを結合してもよい。例えば、基質は、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基を含むが、これに限定されない化学官能基で誘導体化することができる。これらの官能基を使用して、エピトープ結合剤は、官能基を用いて直接的にまたはリンカーを用いて間接的に付着することができる。
【００３９】
エピトープ結合剤はまた、基質に非共有結合していてもよい。例えば、ビオチン化エピトープ結合剤を調製することができ、これはストレプトアビジンで共有結合的にコートされた表面に結合し、付着をもたらす。あるいは、エピトープ結合剤は、光重合及びフォトリソグラフィなどの技術を用いて表面上で合成してもよい。エピトープ結合剤を固体表面に付着させるさらなる方法及び生体分子を基質上で合成する方法は、当該分野で周知であり、すなわちＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＶＬＳＩＰＳ技術である（例えば、米国特許第６，５６６，４９５号及びＲｏｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄｉｘ、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ３０（２）：１５５−１７７、これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４０】
有効な条件下で複合体の形成を可能にするのに十分な時間、エピトープ結合剤と試料を接触させることは、一般に、エピトープ結合剤組成物を試料に添加すること、及びエピトープ結合剤が、存在する任意の抗原に結合するのに十分な時間、混合物をインキュベートすることを含む。この時間経過後、複合体を洗浄し、複合体は、当該技術分野で周知の任意の方法によって検出し得る。エピトープ結合剤−ポリペプチド複合体を検出する方法は、一般に、標識またはマーカーの検出に基づく。本明細書で使用する「標識」という用語は、エピトープ結合剤または他の基質物質に付着した任意の物質であって、検出方法によって検出可能である任意の物質を意味する。好適な標識の非限定的な例としては、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、及び酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びルシフェラーゼを含む）が挙げられる。標識またはマーカーの検出に基づいてエピトープ結合剤−ポリペプチド複合体を検出する方法は、当該技術分野において周知である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法は、イムノアッセイである。イムノアッセイは、多数の異なる形式で実行できる。一般的に言うと、イムノアッセイは２つのカテゴリー、すなわち競合イムノアッセイ及び非競合イムノアッセイに分けることができる。競合イムノアッセイでは、試料中の非標識分析物が標識分析物と競合して抗体に結合する。結合していない分析物を洗い流し、結合した分析物を測定する。非競合イムノアッセイでは、抗体が標識され、分析物は標識されない。非競合イムノアッセイは、１つの抗体（例えば、捕捉抗体が標識されている）または２つ以上の抗体（例えば、標識されていない少なくとも１つの捕捉抗体及び標識された少なくとも１つの「キャッピング」または検出抗体）を使用してもよい。好適な、標識については、上述した通りである。
【００４２】
一実施形態では、エピトープ結合剤の方法は、イムノアッセイである。別の実施形態では、エピトープ結合剤の方法は、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光ベースアッセイ、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）、ラジオメトリックアッセイ、マルチプレックスイムノアッセイ、及びサイトメトリービーズアッセイ（ＣＢＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法は、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。他の実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法は、ラジオイムノアッセイである。さらに他の実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法はイムノブロットまたはウェスタンブロットである。代替実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法はアレイである。別の実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法は、フローサイトメトリーである。異なる実施形態では、エピトープ結合剤ベースの方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。ＩＨＣでは、インタクトな組織試料中の抗原を検出及び定量するために、抗体を使用する。組織試料は、ＩＨＣによる試験のために調製した新鮮凍結及び／またはホルマリン固定、パラフィン包埋（またはプラスチック包埋）組織ブロックであってもよい。ＩＨＣによる試験のための組織ブロックを調製する方法、ならびにＩＨＣを実施する方法は、当該技術分野において周知である。
【００４３】
（ｃ）ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量と基準値との比較
生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量を、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の基準値とそれぞれ比較することができる。生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の対象発現レベルを、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の基準値とそれぞれ比較し、対象を分類し、対象における緑内障の重症度を判定し、対象の治療を決定し、対象における緑内障をモニタリングし、及び／または治療に対する応答をモニタリングする。一般的に言えば、対象は、基準値と比較して、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の増加量または減少量を有するものとして分類することができ、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の増加量は基準値を超える量であり、減少量は基準値以下の量である。
【００４４】
より具体的には、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルを、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の基準値と比較して、試験試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質が、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の基準値それぞれに対して、差次的に発現するかどうかを判定する。本明細書で使用する「差次的に発現する」または「差次的発現」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ転写物またはその一部の発現レベル、または発現したタンパク質の核酸のレベルなどの核酸の産物の発現レベルを測定することによって分析することができる核酸の発現レベルにおける差異を意味する。
【００４５】
「発現レベルの差異」という用語は、例えば、基準試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の測定可能な発現レベルと比較したときの、生体試料中のメッセンジャーＲＮＡ転写物の量及び／またはタンパク質の量によって測定される、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の測定可能な発現レベルの増加または減少を意味する。一実施形態では、差次的発現は、基準試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルと比較するとき、ｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルの割合を使用して比較することができ、この割合は１．０に等しくない。例えば、核酸またはタンパク質は、第１の試料を、第２の試料と比較したときの発現レベルの割合が１．０より大きいか、または１．０未満である場合、差次的に発現する。例えば、１以上、１．２以上、１．５以上、１．７以上、２以上、３以上、３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上の割合、または１以下、０．８以下、０．６以下、０．４以下、０．２以下、０．１以下、０．０５以下、０．００１以下の割合である。別の実施形態では、差次的発現はｐ値を用いて測定する。例えば、ｐ値を用いる場合、核酸またはタンパク質は、ｐ値が０．１未満、好ましくは０．０５未満、より好ましくは０．０１未満、さらにより好ましくは０．００５未満、最も好ましくは０．００１未満である場合に、第１の試料と第２の試料との間で差次的に発現していると同定する。基準値に使用する試料に応じて、発現レベルの差異は統計的に有意であってもなくてもよい。例えば、基準値に使用する試料が緑内障と診断された対象（複数可）からのものである場合、発現レベルの差異が有意に異ならないときには、対象は緑内障を有する。しかし、発現レベルの差が有意に異なる場合、対象は緑内障を有していない。例えば、基準値に使用する試料が疾患のない対象からのものである場合、発現レベルの差異が有意に異ならないときには、対象は緑内障を有していない。しかし、発現レベルの差異が有意に異なる場合、対象は緑内障を有する。
【００４６】
当該技術分野において既知である任意の好適な基準値を使用してもよい。例えば、好適な基準値は、疾患（すなわち、緑内障）の兆候または症状を有していない同じ種の対象または対象群から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。別の例では、好適な基準値は、疾患（すなわち、緑内障）と診断されていない同じ種の対象または対象群から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。さらに別の例では、好適な基準値は、緑内障の兆候または症状を有する同じ種の対象または対象群から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。さらに別の例では、好適な基準値は、緑内障と診断された同じ種の対象または対象群から得られた生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。異なる例では、好適な基準値は、当該技術分野において既知の方法によって決定されるアッセイのバックグラウンドシグナルであり得る。別の異なる例では、好適な基準値は、コンピュータ可読媒体に保存された非罹患試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。さらに別の異なる例では、好適な基準値は、コンピュータ可読媒体に保存された罹患試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、または他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤＲＷ、ＤＶＤ、または他の光媒体、パンチカード、紙テープ、光学マークシート、または穴のパターンを有する他の物理媒体、他の光学的に認識可能な証印、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、または他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波、またはコンピュータが読み取ることができる他の媒体を含む。
【００４７】
他の例では、好適な基準値は、同じ対象から得られた基準試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。基準試料は、緑内障が疑われていないときに対象から得られたものであっても、そうでなくてもよい。当業者は、対象が他の点では健康な場合に、対象から基準試料を得ることが必ずしも可能ではないか、または望ましいとは限らないことを理解するであろう。例えば、短期治療では、基準試料は、診察時に対象から得られた最初の試料であってもよい。別の例では、治療の有効性をモニタリングする場合、基準試料は、治療開始前の対象から得られた試料であり得る。このような例では、対象は緑内障の疑いがあるが、緑内障の他の症状を有していない可能性があるか、または対象は緑内障及び緑内障の１つまたは複数の他の症状を疑われる可能性がある。
【００４８】
特定の実施形態では、基準値は、非罹患試料中のＧＤＦ１５タンパク質の量であり得る。ＧＤＦ１５タンパク質の好適な基準値は、約１０ｐｇ／ｍｌ、約１１ｐｇ／ｍｌ、約１２ｐｇ／ｍｌ、約１３ｐｇ／ｍｌ、約１４ｐｇ／ｍｌ、約１５ｐｇ／ｍｌ、約１６ｐｇ／ｍｌ、約１７ｐｇ／ｍｌ、約１８ｐｇ／ｍｌ、約１９ｐｇ／ｍｌまたは約２０ｐｇ／ｍｌである。具体的には、実施例に提示されたデータは、緑内障ではない対象が８．９±ＳＥ  ７．７ｐｇ／ｍｌの平均ＧＤＦ１５を有することを示す。本開示によれば、基準値を超えるＧＤＦ１５タンパク質の量は、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を示す。例えば、約２０ｐｇ／ｍｌ〜約８０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質はグレードＩの緑内障を示し、約８０ｐｇ／ｍｌ〜約１６０ｐｇ／ｍｌの量のＧＤＦ１５タンパク質はグレードＩＩの緑内障を示し、約１６０ｐｇ／ｍｌ以上のＧＤＦ１５タンパク質の量はグレードＩＩＩの緑内障を示す。これらの値は、追加の実験データによって変化し得ることが理解されるべきである。例示的な実施形態において、約４６．４±１２．１ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ１５タンパク質の量は、グレードＩの緑内障を示し、約１２９．５±３８．０ｐｇ／ｍｌのＧＤＦ１５タンパク質の量はグレードＩＩの緑内障を示し、約１９０±４８．７ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上のＧＤＦ１５タンパク質の量はグレードＩＩＩの緑内障を示す。
【００４９】
基準値に対するｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量の増加は、緑内障の重症度の増加を示す。具体的には、ＧＤＦ１５タンパク質の量が約１０ｐｇ／ｍｌ超及び約８０ｐｇ／ｍｌ未満の場合、対象は、グレードＩの緑内障を有する可能性がある。ある実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０ｐｇ／ｍｌ超かつ約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、または約８０ｐｇ／ｍｌ超である場合、対象は、グレードＩの緑内障を有する可能性がある。一実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が、約１０ｐｇ／ｍｌ超及び約５０ｐｇ／ｍｌ未満、約２０ｐｇ／ｍｌ超及び約５０ｐｇ／ｍｌ未満、約１０ｐｇ／ｍｌ超及び約６０ｐｇ／ｍｌ未満、約２０ｐｇ／ｍｌ超及び約６０ｐｇ／ｍｌ未満、約１０ｐｇ／ｍｌ超及び約７０ｐｇ／ｍｌ未満、約２０ｐｇ／ｍｌ超及び約７０ｐｇ／ｍｌ未満、約１０ｐｇ／ｍｌ超及び約８０ｐｇ／ｍｌ未満、または約２０ｐｇ／ｍｌ超及び約８０ｐｇ／ｍｌ未満である場合、対象は、グレードＩの緑内障を有する可能性がある。特定の実施形態では、対象は、ＧＤＦ１５タンパク質の量が約２０ｐｇ／ｍｌ超及び約８０ｐｇ／ｍｌ未満である場合に、グレードＩの緑内障を有する可能性がある。
【００５０】
あるいは、ＧＤＦ１５タンパク質の量が、約５０ｐｇ／ｍｌ〜約１８０ｐｇ／ｍｌの間である場合、対象は、グレードＩＩの緑内障を有する可能性がある。ある実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８７、約８８、約８９、または約９０ｐｇ／ｍｌと、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９または約１８０ｐｇ／ｍｌとの間にある場合に、対象は、グレードＩＩの緑内障を有する可能性がある。一実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が、約５０ｐｇ／ｍｌ超及び約１７０ｐｇ／ｍｌ未満、約５０ｐｇ／ｍｌ超及び約１６０ｐｇ／ｍｌ未満、約５０ｐｇ／ｍｌ超及び約１５０ｐｇ／ｍｌ未満、約６０ｐｇ／ｍｌ超及び約１８０ｐｇ／ｍｌ未満、約６０ｐｇ／ｍｌ超及び約１７０ｐｇ／ｍｌ未満、約６０ｐｇ／ｍｌ超及び約１６０ｐｇ／ｍｌ未満、約６０ｐｇ／ｍｌ超及び約１５０ｐｇ／ｍｌ未満、約７０ｐｇ／ｍｌ超及び約１８０ｐｇ／ｍｌ未満、約７０ｐｇ／ｍｌ超及び約１７０ｐｇ／ｍｌ未満、約７０ｐｇ／ｍｌ超及び約１６０ｐｇ／ｍｌ未満、約７０ｐｇ／ｍｌ超及び約１５０ｐｇ／ｍｌ未満、約８０ｐｇ／ｍｌ超及び約１８０ｐｇ／ｍｌ未満、約８０ｐｇ／ｍｌ超及び約１７０ｐｇ／ｍｌ未満、約８０ｐｇ／ｍｌ超及び約１６０ｐｇ／ｍｌ未満、約８０ｐｇ／ｍｌ超及び約１５０ｐｇ／ｍｌ未満、約９０ｐｇ／ｍｌ超及び約１８０ｐｇ／ｍｌ未満、約９０ｐｇ／ｍｌ超及び約１７０ｐｇ／ｍｌ未満、約９０ｐｇ／ｍｌ超及び約１６０ｐｇ／ｍｌ未満、または約９０ｐｇ／ｍｌ超及び約１５０ｐｇ／ｍｌ未満である場合に、対象は、グレードＩＩの緑内障を有する可能性がある。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が約８０ｐｇ／ｍｌ超及び約１６０ｐｇ／ｍｌ未満の場合、対象は、グレードＩＩの緑内障を有する可能性がある。
【００５１】
さらに、ＧＤＦ１５タンパク質の量が１６０ｐｇ／ｍｌ超の場合、対象は、グレードＩＩＩの緑内障を有する可能性がある。ある実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、または約２４０ｐｇ／ｍｌ超である場合に、対象は、グレードＩＩＩの緑内障を有する可能性がある。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質の量が約１４０ｐｇ／ｍｌ超の場合、対象は、グレードＩＩＩの緑内障を有する可能性がある。
【００５２】
（ｄ）治療
緑内障の重症度の判定は、緑内障対象の治療を選択するために使用することができる。本明細書で説明するように、ｇｄｆ１５核酸及びＧＤＦ１５タンパク質によって、対象をグレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を有するものとして、対象において治療の恩恵を受ける可能性のある群、または対象の適切な緑内障治療を決定する群に、分類することができる。一実施形態では、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障を有すると分類された対象を、治療することができる。当業者は、グレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの緑内障の標準治療を決定することができるであろう。したがって、本明細書に開示される方法は、緑内障対象の治療を選択するために使用することができる。一実施形態では、対象は、基準値に対するｇｄｆ１５核酸及びＧＤＦ１５タンパク質の量の差異に基づいて治療する。この分類は、治療が必要である、またはより積極的な治療が必要な群を同定するために使用され得る。本明細書で使用する「治療」または「療法」という用語は、緑内障の治療に好適な任意の治療を意味する。治療は、緑内障のための標準治療からなっていてもよい。緑内障の標準治療の非限定的な例としては、点眼剤、丸薬、レーザー手術、切開手術、またはこれらの方法の組み合わせが挙げられる。一般に、点眼剤は、低グレードの緑内障を治療するために使用する。点眼剤が十分にＩＯＰを制御しない場合、点眼剤に加えて丸薬を使用してもよい。投薬により所望の結果が達成されないか、または耐えられない副作用がある場合、手術が次の選択肢であり得る。手術は、レーザー手術または切開手術であり得る。レーザー手術は、投薬と切開手術の中間段階と考えられる。レーザー手術の非限定的な例としては、アルゴンレーザー線維柱帯形成術（ＡＬＴ）、選択的線維柱帯形成術（ＳＬＴ）、レーザー末梢虹彩切開術（ＬＰＩ）及びシクロアブレーションが挙げられる。切開手術の非限定的な例としては、線維柱帯切除術、ドレナージインプラント手術、非穿孔性手術、エクスプレスミニ緑内障シャント、トラベクトーム及び管形成術が挙げられる。生体試料中のｇｄｆ１５核酸またはＧＤＦ１５タンパク質の量に基づいたグレードＩ、グレードＩＩまたはグレードＩＩＩの分類に基づいて、対象は、点眼剤、丸薬、レーザー手術及び／または切開手術で治療され得る。さらに、治療決定は、あるグレードから次のグレードへ進行しているという根拠に基づいて行うことができる。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることが、当業者には理解されるべきである。しかし、当業者であれば、本開示の見地から、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更がなされ、依然として同様のまたは類似の結果が得られることを認識すべきである。
【００５４】
実施例１：
現在、緑内障の重症度または進行を検出する利用可能なバイオマーカーはない。Ｔｇｆｂ２は緑内障を引き起こすことがあるが、緑内障のバイオマーカーではない。現在、眼内圧（ＩＯＰ）及び視野測定に基づいて緑内障治療を決定する。しかし、ＩＯＰは患者ごとに大きく異なり、視野測定は自覚的検査である。したがって、緑内障の治療決定に役立つバイオマーカーが必要である。
【００５５】
緑内障のバイオマーカーを同定するために、本発明者らは網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死を反映するバイオマーカーを同定しようとした。涙、房水、硝子体及び血清（血漿）を調べた。異なる網膜細胞死モデルを用いて８８の遺伝子を評価したサイトカインアレイを実施した（表１）。サイトカインアレイから得られたデータを分析したところ、視神経挫滅モデル（ＯＮＣ）では、８個の遺伝子がアップレギュレートされ、０個の遺伝子がダウンレギュレートされ、エンドトキシン誘導ブドウ膜炎モデル（ＥＩＵ）では、１５個の遺伝子がアップレギュレートされ、１個の遺伝子がダウンレギュレートされ、光誘発網膜変性モデル（ＬＥ）では、２２個の遺伝子がアップレギュレートされ、８個の遺伝子がダウンレギュレートされたことが明らかとなった。図１は、異なる疾患モデルの間で重複する、アップレギュレートされた遺伝子を示す。１つの遺伝子は、ＯＮＣでは特異的にアップレギュレートされるが、ＥＩＵまたはＬＥではアップレギュレートされない。表２は、ｇｄｆ１５がＯＮＣにおいてのみアップレギュレートされることを示すこれらの遺伝子のリストを提示する。図２は、異なる疾患モデル間で重複するダウンレギュレートされた遺伝子を示し、表３は、これらの遺伝子のリストを提示する。
【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
ｇｄｆ１５がＯＮＣに特異的であったことを考慮して、ｇｄｆ１５の発現プロファイルを、各疾患モデルにおいてさらに評価した。図３は、ＯＮＣ（図３Ａ）、ＥＩＵ（図３Ｂ）及びＬＥ（図３Ｃ）におけるｇｄｆ１５の遺伝子発現レベルを示す。Ｇｄｆ１５遺伝子発現は、ＯＮＣモデルにおいてのみアップレギュレートされる。対照的に、ｔｇｆｂ２は、すべてのモデルにおいて対照と同等である（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ）。これらの結果は、ｇｄｆ１５遺伝子発現がＯＮＣに特異的であることを確認した。
【００６０】
Ｇｄｆは、ｔｇｆβスーパーファミリーの一部である。他のｇｄｆファミリーメンバーがＯＮＣにおいて改変されているかどうかを判定するために、ＯＮＣモデルにおいて、２４時間でのｇｄｆ１、ｇｄｆ２、ｇｄｆ３、ｇｄｆ５、ｇｄｆ６、ｇｄｆ７、ｇｄｆ８、ｇｄｆ９、ｇｄｆ１０及びｇｄｆ１１遺伝子発現を評価した。図５Ａ、図５Ｂは、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ及び図５Ｊは、他のｇｄｆ遺伝子のいずれもＯＮＣモデルにおいて変化しないことを示す。
【００６１】
ｇｄｆ１５遺伝子発現がＯＮＣにおいてアップレギュレートされたことを考慮して、ＯＮＣのマウスモデルにおいて、ＧＤＦ１５タンパク質レベルの上昇が房水において検出可能であるかどうかを判定した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＧＤＦ１５タンパク質を検出すると、ＧＤＦ１５タンパク質がＯＮＣマウスモデルにおいて上昇したことが見出された（図６）。次いで、ＧＤＦ１５タンパク質及びｇｄｆ１５核酸発現を、ＯＮＣのラットモデルにおいて評価した。ｇｄｆ１５及びｔｇｆｂ２核酸発現の評価は、ｇｄｆ１５がＯＮＣにおいて有意にアップレギュレートされ、ｔｇｆｂ２がＯＮＣにおいて変化しないことを示した（図７Ａ、図７Ｂ）。さらに、房水で実施したＥＬＩＳＡアッセイによるＧＤＦ１５タンパク質発現の評価は、ＧＤＦ１５タンパク質もＯＮＣのラットモデルにおいてアップレギュレートされることを示した（図７Ｃ）。
【００６２】
次いで、Ｇｄｆ１５核酸発現を、眼内の種々の領域で評価した。具体的には、前眼部、水晶体及び網膜におけるｇｄｆ１５の発現を評価した。結果は、６時間において、いずれの眼組織においても有意なアップレギュレーションがないことを示した（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ）。しかし、２４時間後、ｇｄｆ１５の発現は、網膜（図８Ｆ）では有意にアップレギュレートされたが、前眼部または水晶体では有意にアップレギュレートされなかった（それぞれ図８Ｄ、図８Ｅ）。これらのデータは、ｇｄｆ１５発現が網膜に特異的であることを示唆している。ＧＤＦ１５は、さらにインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を用いて、ＯＮＣモデルの外顆粒層（ＯＮＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）と比較して、神経節細胞層（ＧＣＬ）において特にアップレギュレートされることが容易に観察される（図１２）。
【００６３】
次に、ＧＤＦ１５発現が疾患モデルにおけるマクロファージの増加に関連する可能性があるかどうかを判定した。Ｆ４／８０抗原を用いてマクロファージを検出した。図９Ａは、対照対ＯＮＣモデルにおけるマクロファージに有意差がないことを表す。対照的に、ＥＩＵ及びＬＥモデルの両方は、対照と比較してマクロファージの有意な増加を示す（それぞれ、図９Ｂ、図９Ｃ）。
【００６４】
破砕した神経モデルは、網膜神経節細胞に対する急性損傷のモデルである。緑内障が慢性疾患であり、その結果、網膜神経節細胞の慢性的な損傷をもたらすため、このモデルが緑内障で起こるものを再現するかどうかは、不明である。したがって、ＯＮＣにおけるＧＤＦ１５のアップレギュレーションがヒト緑内障におけるアップレギュレーションに変換されるかどうかは不明なので、ヒト試料をＧＤＦ１５タンパク質発現について評価した。緑内障患者から房水を採取し、ＥＬＩＳＡによってＧＤＦ１５の量を測定した。図１０は、対照患者と比較して緑内障患者におけるＧＤＦ１５発現の有意な増加があったことを示す。したがって、これらの結果より、ＧＤＦ１５がヒト緑内障においてアップレギュレートされることを示すことができた。重要なことに、本発明者らは、ＧＤＦ１５発現が疾患の重症度と相関していることを示した（図１１）。緑内障の重症度がグレードＩからグレードＩＩ、グレードＩＩＩへと進行するにつれて、検出されたＧＤＦ１５の量が増加した。したがって、これらの結果は、ＧＤＦ１５が、緑内障の進行に感受性でありかつ特異的なマーカーであり、治療上の意思決定を導くことを実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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