(57)【要約】  クリステンセネラ菌（Christensenella intestinihominis）およびその使用、具体的に、肥満およびその関連疾患の治療と予防におけるクリステンセネラ菌（Christensenella intestinihominis）の使用を提供する。また、肥満およびその関連疾患の治療と予防のための、薬品、飲料、食品、または動物飼料組成物などを含む組成物、ならびに体重、および/または血中脂質を低下させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Christensenella intestinihominisであることを特徴とするクリステンセネラ菌。
【請求項２】
前記クリステンセネラ菌はChristensenella intestinihominisAF73-05CM02で、寄託番号はCGMCC 1.5207であることを特徴とする請求項１に記載のクリステンセネラ菌。
【請求項３】
（a）安全有効量の請求項１に記載のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物と、（b）食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
前記組成物の全体積または全重量に対し、1×10〜1×1010cfu/mLまたはcfu/gのChristensenella intestinihominis AF73-05CM02を、好ましくは1×104〜1×1010cfu/mLまたはcfu/gのChristensenella intestinihominis AF73-05CM02を含有することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
さらに、ほかのプロバイオティクスおよび/またはプレバイオティクスを含有することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のクリステンセネラ菌、または請求項３に記載の組成物の使用であって、（a）肥満の予防および/または治療、（b）血中脂質の低下、（c）心血管疾患の予防または治療、ならびに/あるいは（d）糖尿病の予防および/または治療からなる群から選ばれる一つまたは複数の用途に使用される薬物または製剤の製造のためであることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項１に記載のクリステンセネラ菌、または請求項３に記載の組成物の使用であって、 
（i）哺乳動物のコレステロールレベルの低下、
（ii）哺乳動物の体重増加の抑制、
（iii）哺乳動物の体脂肪率の低下、
（iv）哺乳動物の血中脂質レベルの低下、
（v）哺乳動物における高密度リポタンパク質（HDL-C）のレベルの向上、
（vi）哺乳動物における低密度リポタンパク質（LDL-C）のレベルの低下、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の用途に使用される薬物または製剤の製造のためであることを特徴とする使用。
【請求項８】
前記哺乳動物の血中脂質レベルの低下は、総コレステロール（TC）レベルおよび/またはトリグリセリドレベルの低下を含むことを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１に記載のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物を、食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、請求項３に記載の組成物を形成させる工程
を含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１０】
（a）適切な培養条件において、請求項１に記載のクリステンセネラ菌を培養することによって、培養産物を得る工程、
（b）任意に、前記培養産物からクリステンセネラ菌の菌体および/またはその代謝産物を分離する工程、ならびに
（c）任意に、工程（b）で分離されたクリステンセネラ菌の菌体および/またはその代謝産物を食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、組成物を製造する工程
を含むことを特徴とする生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野に属し、具体的に、肥満およびその関連疾患の治療と予防におけるクリステンセネラ菌（Christensenella intestinihominis）の使用、そして、クリステンセネラ菌を含む組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の腸内に大量の共生微生物が棲み、そのうちの多くの微生物は人体に有益な細菌で、これらの微生物は宿主と協同で物質とエネルギーの代謝を行うだけでなく、宿主の健康の維持にも重要な役割を果たす。現在、国内外で多くの研究によって、腸内微生物は過敏性腸症候群（IBS）、潰瘍性腸炎（US）、肥満、2型糖尿病などの炎症性および代謝性疾患と密接に関連することが開示された。腸内プロバイオティクスに対する研究と開発によって、腸内微生物のバランスの崩れによる疾患、特に細菌叢の乱れによる腸管の炎症性および代謝性疾患に対して有効な治療と予防を行うことができる。
【０００３】
短鎖脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などを含め、腸内における一部の細菌よる代謝産物で、短鎖脂肪酸の生成は腸内の健康の維持に重要な役割を果たす。研究によって、2型糖尿病患者と比べ、健常者の腸内における短鎖脂肪酸を生成する細菌、たとえばロゼブリア菌（Roseburia）、フィーカリバクテリウム菌（Faecalibacterium）、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）などの含有量は顕著に異なることが示された。
【０００４】
コレステロールはビタミンD合成の前駆体物質として人体にとって重要な意義があるが、多くの人は不合理な飲食によって、体内、特に血液におけるコレステロールの含有量が高すぎるようになりやすく、肥満、糖尿病および一連の心脳血管疾患、たとえば冠動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化などにつながる。そのため、体内におけるコレステロールの降下は心脳血管疾患の予防に有効な手段である。
【０００５】
現在、肥満治療薬として使用される処方薬はシブトラミン（アボットのリダクティル）とオルリスタット（ロシュのゼニカル）である。シブトラミンはアルテレノールおよびセロトニンの再吸収を遮断することによって、食欲を調節し、飲食物の摂取量を減らす。しかし、シブトラミンは中枢神経系に作用する物質という特性のため、心拍や血圧などに影響を与えるという副作用がある。シブトラミンに対し、オルリスタットは局部に作用する。胃と小腸の脂肪分解酵素リパーゼ（lipase）の阻害剤として、オルリスタットは脂肪の加水分解を阻害する作用を果たすことによって、飲食物として摂取される脂肪の30％程度が体内に吸収せずに排出されるため、体重を調節する効果がある。しかし、消化されなかった脂肪は胃腸管（gastrointestinal track）に沿って移動すると同時に下痢、脂肪便のような副作用を引き起こし、これらの副作用は不快にさせるだけでなく、正常の社会生活がしにくくなるぐらいである。
【０００６】
そのため、本分野では、毒性・副作用のない、肥満およびその関連疾患の治療と予防のための新規な薬物の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、肥満およびその関連疾患の治療と予防におけるクリステンセネラ菌の使用を提供することである。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、有効で毒性・副作用のない、肥満およびその関連疾患の治療と予防のための薬品、飲料、食品組成物、または動物飼料組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、体重および/または血中脂質を低下させる方法およびその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の側面では、Christensenella intestinihominisであるクリステンセネラ菌を提供する。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記クリステンセネラ菌は腸内クリステンセネラ菌である。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記のクリステンセネラ菌の16s rDNAの配列は、配列番号1で示されるものである。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記クリステンセネラ菌はChristensenella intestinihominis AF73-05CM02で、寄託番号はCGMCC 1.5207である。
【００１４】
本発明の第二の側面では、（a）安全有効量の本発明の第一の側面に記載のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物と、（b）食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記組成物は、食品組成物、保健組成物、薬物組成物、飲料組成物、飼料組成物、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記の組成物は経口投与製剤である。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記の組成物は液体製剤、固体製剤、半固体製剤である。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記の組成物の剤形は、粉末剤、散剤、錠剤、糖衣剤錠剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、ドロップ剤、およびトローチ剤からなる群から選ばれる。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記の食品組成物は、乳液製品、溶液製品、粉末製品、または懸濁液製品を含む。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の食品組成物は、乳製品、粉乳、または液体乳を含む。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の液体製剤は、溶液製品または懸濁液製品からなる群から選ばれる。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記組成物は、前記組成物の全体積または全重量に対し、1×10〜1×1010cfu/mLまたはcfu/gのChristensenella intestinihominis AF73-05CM02を、好ましくは1×104〜1×1010cfu/mLまたはcfu/gのChristensenella intestinihominis AF73-05CM02を含有する。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記の組成物に、前記組成物の全重量に対し、0.0001〜99wt％、好ましくは0.1〜90wt％の前記のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物が含有される。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記の生成物は、単位剤形（1錠、1カプセルまたは1小瓶）で、1単位剤形あたりの質量は0.05〜5 gで、好ましくは0.1〜1 gである。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記の組成物は、さらに、ほかのプロバイオティクスおよび/またはプレバイオティクスを含有する。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記のプロバイオティクスは、乳酸菌、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれる。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記のプレバイオティクスは、フラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、乳果オリゴ糖(LACT)、大豆オリゴ糖(SOS)、イヌリン(Inulin)、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれる。
【００２８】
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載のクリステンセネラ菌、または本発明の第二の側面に記載の組成物の使用であって、（a）肥満の予防および/または治療、（b）血中脂質の低下、（c）心血管疾患の予防または治療、ならびに/あるいは（d）糖尿病の予防および/または治療からなる群から選ばれる一つまたは複数の用途に使用される薬物または製剤の製造のための使用を提供する。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記製剤は、マイクロ生態製剤を含む。
【００３０】
本発明の第四の側面では、本発明の第一の側面に記載のクリステンセネラ菌、または本発明の第二の側面に記載の組成物の使用であって、 
（i） 哺乳動物のコレステロールレベルの低下、
（ii） 哺乳動物の体重増加の抑制、
（iii） 哺乳動物の体脂肪率の低下、
（iv） 哺乳動物の血中脂質レベルの低下、
（v） 哺乳動物における高密度リポタンパク質（HDL-C）のレベルの向上、
（vi） 哺乳動物における低密度リポタンパク質（LDL-C）のレベルの低下、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の用途に使用される薬物または製剤の製造のための使用を提供する。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記哺乳動物はヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む。
【００３２】
もう一つの好適な例において、前記ヒト以外の哺乳動物は、ヒト、齧歯動物（たとえばラット、マウス）を含む。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記哺乳動物の血中脂質レベルの低下は、総コレステロール（TC）レベルおよび/またはトリグリセリドレベルの低下を含む。
【００３４】
本発明の第五の側面では、本発明の第二に記載の組成物の製造方法であって、本発明の第一の側面に記載のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物を、食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、本発明の第二に記載の組成物を形成させる工程を含む方法を提供する。
【００３５】
もう一つの好適な例において、前記組成物は経口投与製剤である。
【００３６】
本発明の第六の側面では、
（a）適切な培養条件において、本発明の第一の側面に記載のクリステンセネラ菌を培養することによって、培養産物を得る工程、
（b）任意に、前記培養産物からクリステンセネラ菌の菌体および/またはその代謝産物を分離する工程、ならびに
（c）任意に、工程（ｂ）で分離されたクリステンセネラ菌の菌体および/またはその代謝産物を食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、組成物を製造する工程
を含む生産方法を提供する。
【００３７】
本発明の第七の側面では、体重および/血中脂質を低下させる方法であって、前記対象に本発明の第一の側面に記載のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物、あるいは本発明の第二の側面に記載の組成物を施用する方法を提供する。
【００３８】
もう一つの好適な例において、前記の施用は経口投与を含む。
【００３９】
もう一つの好適な例において、前記の施用の投与量は0.01〜5 g/50 kg体重/日、好ましくは0.1〜2 g/50 kg体重/日である。
【００４０】
もう一つの好適な例において、前記の対象は、哺乳動物、たとえばヒトを含む。
【００４１】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の腸内クリステンセネラ菌（Christensenella intestinihominis）の顕微鏡におけるグラム染色の写真(1000倍)である。
【図２】腸内クリステンセネラ菌（Christensenella intestinihominis）の4日培養した集落の写真を示す。
【図３】コレステロール測定の標準曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明者は、幅広く深く研究したところ、意外に、クリステンセネラ菌（Christensenella intestinihominis）が肥満およびその関連疾患（たとえば心血管疾患、糖尿病）を予防および治療する作用を有することを見出し、クリステンセネラ菌を含有する活性組成物を実験対象に投与して飼育したところ、当該組成物が体重の増加を抑制し、血中脂質を低下させ、コレステロールを低下させ、体脂肪率を低下させ、低密度リポタンパク質レベルを低下させ、高密度リポタンパク質レベルを向上させ、有効に肥満、心血管および糖尿病などの疾患を軽減することができる。これに基づき、本発明を完成させた。
【００４４】
本明細書で用いられるように、用語「含有」は、各種の成分が一緒に本発明の混合物または組成物に使用することができることを表す。そのため、用語「主に〜からなる」および「〜からなる」は、用語「含有」に含まれる。
【００４５】
クリステンセネラ菌およびその使用
本明細書で用いられるように、用語「クリステンセネラ菌」、「Christensenella intestinihominis」は入れ替えて使用することができる。一つの好適な例において、前記菌株はChristensenella intestinihominisAF73-05CM02で、寄託番号はCGMCC 1.5207で、ヒトの糞便から分離されたものである。クリステンセネラ菌の生理的特性は以下の通りである。クリステンセネラ菌は嫌気環境において37℃で4〜5日培養した後、集落が小さく、直径が約0.2mmで、針先状、灰白色で、透明である。グラム染色と芽胞染色を行い、顕微鏡の1000倍拡大で観察したところ、菌体はグラム陽性で、短桿状で、芽胞がなく、鞭毛がなく、運動せず、菌体の直径が約0.5μmで、長さが1.0〜2.0μmで、単一の菌体または短鎖状になっている。そして、本発明に記載のクリステンセネラ菌はオキシダーゼおよびカタラーゼ反応がいずれも陰性で、生長温度の範囲が30〜42℃で、最適の生長温度が37〜42℃で、耐えられるpH値の範囲が6.0〜8.5で、最適のpH値が6.5〜7.0で、2％のNaClと3％の胆汁塩に耐えることができる。グルコース、マンニトール、マルトース、サリシン、キシロース、アラビノース、マンノース、メレジトース、ラフィノース、ソルビトール、ラムノースを含むいくつかの炭水化物を発酵させることができ、また主にギ酸、酢酸、酪酸のような菌体外多糖を生成することができる。
【００４６】
本発明は、肥満およびその関連疾患（たとえば心血管疾患、糖尿病）の治療と予防におけるクリステンセネラ菌の使用を提供する。高脂肪の食物を摂取する被験者において、Christensenella intestinihominisAF73-05CM02は（i）当該被験者の体重増加の抑制、（ii）血中脂質の低下、（iii）体脂肪率の低下、（iv）低密度リポタンパク質レベルの低下、（v）高密度リポタンパク質レベルの向上からなる群から選ばれる一つまたは複数の用途を有する。本発明の一つの好適な例によれば、C57BL/6J雄マウスを試験マウスとし、高脂肪飼料を投与することによって肥満のマウスを得、菌株Christensenella intestinihominisAF73-05CM02で治療された肥満マウスは、治療を受けなかった対照群（モデル群）と比べ、その体重の増加が緩くなり、かつ血中脂質が低下し、そして肥満または心血管疾患に関連する様々な指標、たとえば体脂肪率、低密度リポタンパク質レベルも低下し、また高密度リポタンパク質レベルも顕著に向上した。そのため、前記菌株は肥満およびその関連疾患（たとえば心血管疾患、糖尿病など）の予防と治療に使用することができる。
【００４７】
組成物及びその使用
また、本発明は組成物、好ましくは薬物組成物を提供する。前記組成物は有効量のクリステンセネラ菌を含む。一つの好適な例において、前記組成物はさらに乳酸菌、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれるプロバイオティクス、ならびに/あるいははフラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、キシロオリゴ糖(XOS)、乳果オリゴ糖(LACT)、大豆オリゴ糖(SOS)、イヌリン(Inulin)、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれるプレバイオティクスを含む。
【００４８】
一つの好適な例において、前記の組成物は液体製剤、固体製剤、半固体製剤である。
【００４９】
一つの好適な例において、前記の液体製剤は、溶液製品または懸濁液製品からなる群から選ばれる。
【００５０】
一つの好適な例において、前記の組成物の剤形は、粉末剤、散剤、錠剤、糖衣剤錠剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、ドロップ剤、およびトローチ剤からなる群から選ばれる。
【００５１】
本発明の薬物組成物は薬物の錠剤、注射剤またはカプセルのいずれかの形態で投与することができ、前記薬物製剤は賦形剤、薬物的に許容される媒体および担体を含み、これらの物質は投与形態によって選択することができる。本発明における薬物製剤はさらに補助する活性成分を含んでもよい。
【００５２】
乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムや鉱物油などはいずれも本発明における薬物組成物の担体、賦形剤や希釈剤などとして使用することができる。
【００５３】
また、本発明の薬物組成物は、さらに、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁液安定剤、防腐剤、甘味剤や香料などを含んでもよい。本発明の薬物組成物は、薬物組成物の活性成分、すなわち、微生物が胃酸に破壊されずに順調に胃を通過することができるように、様々な公知の方法によって腸溶性コーティング製剤として生産してもよい。
【００５４】
さらに、本発明の微生物は通常の方法によって製造されたカプセルの形態で使用してもよい。たとえば、標準賦形剤と本発明の凍結乾燥された微生物を混合して小球のピルとした後、ピルをゼラチンのカプセルに充填する。また、本発明の微生物と薬物的に許容される賦形剤、たとえば液体ガム、セルロース、ケイ酸塩や鉱物油などを混合して懸濁液または分散液とし、この懸濁液または分散液を軟ゼラチンカプセルに充填してもよい。
【００５５】
本発明の薬物組成物は腸溶性コーティング錠として経口投与で使用してもよい。本出願における用語「腸溶性コーティング」は、すべての通常の薬物的に許容される腸溶性コーティングを含み、これらのコーティングは胃酸に分解されないが、小腸において十分に分解して迅速に本発明の微生物を放出することができる。本発明の腸溶性コーティングは合成胃酸、たとえばpH=1のHCl溶液において36〜38℃で2時間以上維持し、かつ好ましくは合成腸液、たとえばpH=7.0の緩衝液において1.0時間内で分解する。
【００５６】
本発明の腸溶性コーティングは1錠あたりに約16〜30 mg、好ましくは16〜25 mg、より好ましくは16〜20 mgでコーティングされる。本発明における腸溶性コーティングの厚さは5〜100μm、理想の厚さは20〜80μmである。腸溶性コーティングの成分はすでに公開されて既知の通常の重合体が選ばれる。
【００５７】
本発明の好適な腸溶性コーティングは酢酸セルロースのフタル酸エステル重合体またはトリメリット酸エステル重合体とメタクリル酸の共重合体（たとえば、40％以上のメタクリル酸とフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはそのエステル系誘導体を含むメタクリル酸の共重合体）で製造される。
【００５８】
本発明における腸溶性コーティングに使用される酢酸フタル酸セルロースの粘度は約45〜90 cpで、アセチル含有量は17〜26％で、フタル酸含有量は30〜40％である。腸溶性コーティングに使用されるトリメリット酸酢酸セルロースの粘度は約5〜21 csで、アセチル含有量は17〜26％である。トリメリット酸酢酸セルロースはイーストマン・コダック社によって生産され、本発明における腸溶性コーティング材料に使用することができる。
【００５９】
本発明の腸溶性コーティングに使用されるフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースは、分子量が一般的に20,000〜130,000ダルトンで、理想の分子量が80,000〜100,000ダルトンで、ヒドロキシプロピル含有量は5〜10％で、メトキシ含有量は18〜24％で、フタロイル含有量は21〜35％である。
【００６０】
本発明の腸溶性コーティングに使用されるフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースはHP50で、日本信越化学工業株式会社によって生産される。HP50は6〜10％のヒドロキシプロピル基、20〜24％のメトキシ基、21〜27％のプロピル基を含有し、その分子量は84,000ダルトンである。もう1種類の腸溶性コーティング物質はHP55で、HP55は5〜9％のフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、18〜22％のメトキシ基、27〜35％のフタル酸を含有し、その分子量は78,000ダルトンである。
【００６１】
本発明の腸溶性コーティングは、通常の方法で腸溶性コーティング溶液をコアに噴霧することによって製造される。当該腸溶性コーティング方法に使用される溶媒はアルコール類（たとえばエタノール）、ケトン類（たとえばアセトン）、ハロ炭化水素化合物（たとえばジクロロメタン）、またはこれらの組み合わせである。軟化剤、たとえばフタル酸ジ-n-ブチルやトリ酢酸グリセリンを腸溶性コーティング溶液に入れ、その比率は1部のコーティング物に対して約0.05部または約0.3部の軟化剤である。噴霧方法は連続に行われることが好ましく、噴霧される材料の量はコーティングに使用される条件によって制御することができる。噴霧の圧力は任意に調整することができるが、一般的に、平均1〜1.5バールの圧力で理想の結果が得られる。
【００６２】
明細書における「薬物有効量」とは、ヒトおよび/または動物に機能や活性があり、且つヒトおよび/または動物にとって受けられる量である。たとえば、本発明において、1×10〜1×1010cfu/mlまたはcfu/g（特に、1×104〜1×1010cfu/mlまたはcfu/g、より特に、1×106〜1×1010cfu/mlまたはcfu/g）のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物を含有する製剤を製造することができる。
【００６３】
薬物組成物の製造に使用される場合、用いられるクリステンセネラ菌またはその代謝産物の有効使用量は、施用の様態と治療しようとする疾患の重篤度によって変更することができる。内服に適する投与量の様態は、固体または液体の薬学的に許容される担体と密接に混合した約1×10〜1×1010cfu/mlまたはcfu/g（特に、1×104〜1×1010cfu/mlまたはcfu/g、より特に、1×106〜1×1010cfu/mlまたはcfu/g）の活性クリステンセネラ菌または発酵による活性成分を含む。この投与量の方案を調節することにより、最適な治療応答を提供することができる。たとえば、治療状況の切望によって、毎日数回に分けた投与量、または比率的に減少する投与量で投与することができる。
【００６４】
前記のクリステンセネラ菌またはその代謝産物は経口投与などの形態によって投与してもよい。固体担体は、澱粉、ラクトース、リン酸水素カルシウム、微晶質セルロース、ショ糖とカオリンを、液体担体は、培地、ポリエチレングリコール、ノニオン性界面活性剤と食用油(例えばトウモロコシ油、落花生油と胡麻油)を含むが、クリステンセネラ菌またはその代謝産物の特性と所期の特定の投与形態に適するものであればよい。薬物組成物の製造に通常用いられる佐剤も有利的に含まれるが、例えば、矯味剤、色素、防腐剤及びビタミンE、ビタミンC、BHTとBHAのような酸化防止剤などが挙げられる。
【００６５】
製造の容易さ及び投与の面から、好ましい薬物組成物は、固形組成物、特に錠剤及び固体充填或いは液体充填のカプセルである。経口投与が好ましい。
【００６６】
本発明の組成物を前記個体に施用し、毎日1回または複数回投与する。投与量の単位はその形態で分けられる、ヒトまたはほかのすべての哺乳動物の個体に適する投与量を示す。各単位は薬物的に許容される担体と有効治療量の本発明の微生物を含む。投与量は患者の体重および肥満または心血管、糖尿病の重篤度、含まれる補充活性成分および使用される微生物によって変わる。また、可能であれば、分けて投与してもよく、かつ必要によって連続に投与してもよい。そのため、前記投与量は本発明の限定にならない。また、本発明における「組成物」は薬品だけでなく、機能性食品および健康食品にしてもよい。一つの好適な例において、前記組成物は、飲料、食品、薬品、動物飼料などを含む。
【００６７】
一つの好適な例において、さらに、有効量のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物と、残量の食品的に許容される担体とを含む食品組成物を提供し、前記の食品組成物の剤形は固体、乳製品、溶液製品、粉末製品、または懸濁液製品を含む。
【００６８】
一つの好適な例において、前記組成物の配合は、1×10〜1×1010cfu/mLのクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物と、食品的にまたは薬学的に許容される担体、および/または賦形剤とである。
【００６９】
もう一つの好適な例において、前記組成物の配合は、1×106〜1×1010cfu/mLのクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物と、食品的にまたは薬学的に許容される担体、および/または賦形剤とである。
【００７０】
マイクロ生態製剤
マイクロ生態製剤はプロバイオティクスおよび代謝産物を含む生物製剤またはプロバイオティクスを増加させる食事サプリメントで、腸内マイクロ生態のバランスを調節、維持することによって、人体の健康レベルを向上させる目的を実現することができる。主にプロバイオティクス、プレバイオティクスおよびバイオスタイム（合生元、Biostime）を含む。
【００７１】
本発明において、前記マイクロ生態製剤は（a）安全有効量のクリステンセネラ菌および/またはその代謝産物と、（b）食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体とを含む。
【００７２】
クリステンセネラ菌の生産方法
通常、クリステンセネラ菌は通常の方法で製造することができる。
【００７３】
本発明において、大規模にクリステンセネラ菌を生産する方法、具体的に、
（a）適切な培養条件において、前記のクリステンセネラ菌を培養することによって、培養産物を得る工程、
（b）任意に、前記培養産物からクリステンセネラ菌の菌体および/またはその代謝産物を分離する工程、ならびに
（c）任意に、工程（ｂ）で分離されたクリステンセネラ菌の菌体および/またはその代謝産物を食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、組成物を製造する工程
を含む方法を提供する。
【００７４】
体重および/または血中脂質を低下させる方法
もう一つの好適な例において、前記方法は、本発明の薬物組成物、食品組成物、飲料組成物、またはこれらの組み合わせを摂取することを含む。前記実験対象はヒトである。
【００７５】
もう一つの好適な例において、前記方法は、本発明の薬物組成物、食品組成物、または動物飼料、またはこれらの組み合わせを摂取することを含む。前記実験対象は動物、好ましくはネズミ類、ウサギ類である。
【００７６】
菌株の寄託
本発明の菌種であるクリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02（寄託名称と同様）は、既に2016年6月13日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（CGMCC）に寄託され、住所は中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号で、寄託番号はそれぞれCGMCC 1.5207である。
【００７７】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（a）本発明のクリステンセネラ菌は顕著に体重、血中脂質、体脂肪率を低下させることができる。
（b）本発明のクリステンセネラ菌は顕著に肥満およびその関連疾患（たとえば心血管疾患）に関連する指標（たとえばコレステロールやトリグリセリド）を低下させることができる。
（c）本発明のクリステンセネラ菌は顕著に総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質のレベルを低下させることができる。
（d）本発明のクリステンセネラ菌は顕著に高密度リポタンパク質のレベルを向上させることができる。
【００７８】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件、あるいは「微生物学：実験マニュアル」（James CappuccinoとNatalie Sherman編、Pearson Education出版社）に記載の条件、あるいはメーカーのお薦めの条件に従う。
【００７９】
特に説明しない限り、実施例で使用された材料、試薬はいずれも市販品である。
【００８０】
Christensenella minuta DSM 22607（C. minuta DSM 22607）は、以下DSM 22607と略し、ドイツ微生物菌株寄託センターから購入され、寄託番号はDSM 22607である。
【００８１】
実施例1  腸内クリステンセネラ菌AF73-05CM02（以下AF73-05CM02と略する）の選別と同定
1．AF73-05CM02の分離
本発明の腸内クリステンセネラ菌AF73-05CM02は深セン市の1名の健康な男性ボランティアの糞便サンプルから分離された。嫌気グローブボックスにおいて約0.2gの糞便サンプルを取り、無菌のPBSに入れて懸濁させ、振とうして均一に混合した後、勾配希釈を行って塗布し、分離培地はPYG培地（HuanKai Microbial社）を使用したが、1L培地はペプトン5g、カゼインの膵消化物 5g、酵母粉10g、牛肉エキス 5g、ブドウ糖 5g、K2HPO42g、Tween 80 1mL、システイン-HCl・H2O 0.5g、ヘム 5mg、ビタミンK11 μL、無機塩溶液(1Lあたりの無機塩溶液は、CaCl2・2 H2O 0.25g、MgSO4・7 H2O 0.5g、K2HPO41g、KH2PO4 1g、NaHCO3 10g、NaCl 2gを含む) 40mL、レサズリン1mg、蒸留水950mLで、pH6.8〜7.0で、115℃で25min滅菌された。プレートを嫌気条件において37℃で5日培養した後、単一集落を取って画線分離を行い、嫌気環境の気体構成は窒素ガス：水素ガス：二酸化炭素=90：5：5（v/v）であった。画線分離によって純粋な培養菌株を得、それをグリセリンで保存し、そして16S rDNAで同定した。
【００８２】
2．AF73-05CM02の微生物学的特徴
（1）形態学的特徴
嫌気環境において37℃で4〜5日培養した後、AF73-05CM02のPYGプレートにおける集落が小さく、直径が約0.2mmで、針先状、灰白色で、透明であった（図2）。
【００８３】
（2）顕微的特徴
グラム染色と芽胞染色を行い、顕微鏡の1000倍拡大で観察したところ、菌体はグラム陽性で、短桿状で、芽胞がなく、鞭毛がなく、運動せず、菌体の直径が約0.5μmで、長さが1.0〜2.0μmで、単一の菌体または短鎖状になっていた（図1）。
【００８４】
（3）生理学・生物化学的特徴
AF73-05CM02はカタラーゼ陰性で、オキシダーゼ陰性で、生長温度の範囲が30〜42℃で、最適の生長温度が37〜42℃で、pH値許容範囲が6.0〜8.5で、最適のpH値が6.5〜7.0で、2％のNaClと3％の胆汁塩に耐えることができた。AF73-05CM02と近縁のモデル菌Christensenella minuta DSM 22607（以下DSM 22607と略し、ドイツ微生物菌株寄託センターから購入され、DSMZ）の酵素反応(API ZYM)および基質の利用状況(API 20A)の生物化学反応の比較は下記表に示す(+は陽性反応を、−は陰性反応を、wは弱陽性反応を表す)。
【００８５】
【表１−１】
2019517992.tif 000002
【表１−２】
2019517992.tif 000003
【００８６】
表1のデータから、AF73-05CM02と近縁のモデル菌のAPI反応に一部の違いが存在し、具体的に、マルトース、サリシン、マンノース、メレジトース、ラフィノースの利用、エスクリンの加水分解およびβ-グルクロニダーゼの活性で表れたことが示された。
【００８７】
3．16S rDNAの同定
AF73-05CM02を定常期まで培養し、2mLの培養菌液を取り、ゲノムDNAの抽出を行った。抽出されたゲノムDNAを鋳型として16S rDNAの増幅を行い、増幅プライマーは8F-1492R（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’（配列番号2）
および5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’（配列番号3））で、PCR増幅プログラムは以下の通りである。
【００８８】
2019517992.tif 000004
【００８９】
増幅されたPCR産物を生成した後、3730配列決定を行い、1366 bpの16S rDNA配列（配列番号1）を得、この配列をEzTaxon-eデータベースでアラインメントし、初歩的に菌株の種の分類情報を得た。16S rDNAの情報から初歩的にAF73-05CM02がChristensenella属に属すると判定された。
【００９０】
配列番号1
2019517992.tif 000005
【００９１】
4．AF73-05CM02の進化分析
AF73-05CM02をEzTaxon-eデータベースにおける16S rDNA配列が近いモデル菌株と多重配列アライメントした後、MEGA 5によって系統樹の作成を行い、最尤推定（maximum likelihood）の方法によって系統発生樹を構築した。
【００９２】
5．細胞脂肪酸の分析
AF73-05CM02およびC. minuta DSM 22607を約4〜5日培養した後、菌体を週出し、細胞脂肪酸を抽出した後、メチルエステル化させ、ガスクロマトグラフィーによってこの2株の菌の脂肪酸メチルの含有量を分析した。
【００９３】
【表２】
2019517992.tif 000006
【００９４】
以上のデータをまとめると、以上のAF73-05CM02の形態的特徴、顕微的特徴、生理学・生物化学的特徴および16S rDNA配列の特徴などから、当該菌株は分類学的に新種であることが示され、本発明においてそれをChristensenella intestinihominis(腸内クリステンセネラ菌)と名付けた。
【００９５】
実施例2  腸内クリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02の生物活性物質
1．短鎖脂肪酸(SCFA)および有機酸などの活性物質の生成および測定
(1)サンプルの前処理
72h培養したAF73-05CM02の発酵液1mLを取り、12000r /minで5min遠心し、上清液を吸い取り、使用に備えた。
【００９６】
(2)SCFAの測定
短鎖脂肪酸の測定は外標準法を使用し、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸で標準曲線の作成を行った。アジレントのガスクロマトグラフ(GC-7890B, Agilent)を使用し、HP-INNOWax(Cross-Linked PEG)、30m×0.25mm×0.25umの毛細柱によって分析し、検出器は水素炎イオン化検出器で、GCパラメーターの設定はカラム温度：180〜200℃、気化室温度：240℃、検出温度：210℃、仕込み量：2μL、キャリアガス流量：N2，50mL/ min、水素ガス流量：50 mL/ min、空気流量：600〜700 mL/ minであった。
【００９７】
測定したところ、SCFAの収量は、ギ酸が5.21 mmol/Lで、酢酸が16.40 mmol/Lで、酪酸が1.63 mmol/Lであった。
【００９８】
(3)有機酸の測定
有機酸の検出標準品は、3-メチル酪酸、吉草酸、キナ酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、安息香酸、マレイン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、アジピン酸、酒石酸、シキミ酸、クエン酸、イソクエン酸およびL-アスコルビン酸を使用した。またアジレントのガスクロマトグラフ(GC-7890B, Agilent)を使用し、クロマトグラフィーカラムは122-5532G DB-5ms(40m × 0.25mm × 0.25 μm)を使用し、カラム温度は270〜290℃で、仕込み口の温度は250℃で、ガス流量は0.86 mL/minであった。腸内クリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02の有機酸の含有量は下記表に詳しく示す。
【００９９】
【表３】
2019517992.tif 000007
【０１００】
実施例3  腸内クリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02の体外でのコレステロール分解機能
コレステロールの含有量の測定方法はo-フタルアルデヒド比色法(OPA法)を使用し、菌株を所定濃度のコレステロールのコレステロール培地で所定時間で培養した場合のコレステロールの含有量の前後の変化によってコレステロールに対する分解能力を考察した。具体的な方法は以下の通りである。
【０１０１】
（1）標準曲線の作成
精密に0.5mg/mLのコレステロール標準溶液40uL、80uL、120uL、160uL、200uL取ってきれいな試験管に置き、無水エタノールを入れて容量を1mLにし、各試験管にOPA 4 mL(0.5mgのo-フタルアルデヒドを1mL氷酢酸に入れたもの)を入れ、振とうして均一に混合し、室温で10min静置した後、2mLの濃硫酸を入れて均一に混合し、10min静置して反応させ、550nmにおいて吸光度を測定した。濃度を横座標とし、吸光度を縦座標として標準曲線を作成し(図3)、計算したところ、線形回帰の方程式は、y = 0.0085x + 0.0072で、相関係数R2は0.9992であった。
【０１０２】
(2)コレステロール培地の調製および実験菌株の培養
所定質量のコレステロールを量ってエタノールに濃度が10mg/mLになるように溶解させ、ろ過で除菌した。調製されたPYG培地（配合は実施例1と同様）にそれぞれ10mg/mLの胆汁塩(高圧滅菌)、濃度10質量％のメルカプト酢酸ナトリウム(ろ過除菌)およびコレステロールを入れ、十分に均一に混合した後、3％の接種量で被験菌株を当該培地に接種し、37℃の嫌気条件において72h培養した。
【０１０３】
(3)コレステロールの測定
コレステロールを含有するPYG培地で培養された菌液を10000 r/minで遠心し、上清を収集し、コレステロールの検出を行うと同時に、接種されなかったコレステロールPYG培地をブランク対照群とした。500μLの被験サンプルをきれいな試験管に取り、95％エタノール3mLと50％のKOH 2mlを入れ、振とうして均一に混合した後、60℃水浴において10min鹸化反応させ、迅速に冷却し、5mLのn-ヘキサンを入れて抽出し、2.5mLの有機相をもう一本のきれいな試験管に取り、さらに60℃水浴において窒素ガスで乾燥し、4mLの0.5g/L o-フタルアルデヒドの酢酸溶液を入れて10min呈色させ、2mLの濃H2SO4を入れて10min反応させ、最後に550nmにおける吸光値を測定した。
【０１０４】
(4)コレステロール分解率の計算
コレステロールの分解は以下の式で計算した。
L=(A-B)/A×100％
L：コレステロール分解率、
A：菌を接種されなかったコレステロール培地におけるコレステロール培地におけるコレステロールの含有量、
B：菌を培養した後のコレステロールの含有量。
【０１０５】
(5)コレステロール分解の結果
計算したところ、AF73-05CM02のコレステロール分解率が46.6％であった。結果から、AF73-05CM02がある程度のコレステロール分解能力を有し、さらに動物体内で研究することができることが示された。
【０１０６】
実施例4  腸内クリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02が生成する菌体外多糖の検出
菌体外多糖の検出はフェノール硫酸法を使用し、フェノール硫酸は遊離の単糖、オリゴ糖および多糖におけるヘキソースなどと呈色反応が発生し、出る色は吸光度に正比例し、その吸収波長は490 nmである。具体的な実験過程は以下の通りである。
【０１０７】
（1）多糖の抽出
実験菌株をPYG培地（配合は実施例1と同様）で3日培養し、10mlの菌液を取って熱湯浴で30min処理した後、10000r/minで遠心し、上清を取り、最終濃度が8％になるまで80％トリクロロ酢酸を入れ、4℃で一晩処理し、タンパク質を沈殿させた。取り出して10000r/minで30min遠心し、NaOHで上清液のpHが6.0になるように調整した。2倍体積の無水エタノールを入れて多糖を沈殿させ、4℃で一晩処理し、取り出して10000r/minで30min遠心し、上清を捨て、沈殿を加熱しておいた蒸留水で溶解させた後、限外ろ過チューブ（3000Daろ過直径）に移して限外ろ過を行い、5000r/minで30min遠心し、内側のチューブに留まった多糖をメスフラスコに移して蒸留水で10mlにし、使用に備えた。
【０１０８】
（2）グルコース標準曲線の作成
精密に標準品のグルコース20mgを100mlスフラスコに量って、目盛まで水を入れた後、それぞれ20、40、60、80、100μg/mlのグルコース標準液を調製した。各組の標準液を400μl取り、三つの平行のものを設け、順に400μlの5％のフェノールおよび1mlの濃硫酸を入れて反応させ、熱湯浴で15min反応させた後室温に冷却し、490nmにおける吸光度を測定した。その後、吸光度を縦座標とし、グルコース標準液の濃度を横座標とし、標準曲線を作成した。
【０１０９】
（3）提出された多糖の濃度の検出
多糖溶液を400μl取り、順に400μlの5％のフェノールおよび1mlの濃硫酸を入れて反応させ、熱湯浴で15min反応させた後室温に冷却し、490nmにおける吸光度を測定した。グルコース標準曲線によって多糖の濃度を計算した。
【０１１０】
（4）結果
計算したところ、3日培養されたAF73-05CM02発酵液における菌体外多糖の含有量は234mg/Lであった。
【０１１１】
実施例5  腸内クリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02の肥満動物モデルにおける体内試験
実験動物および被験菌株の用意：
実験動物：実験はC57BL/6J雄マウスを使用し、広東省医学実験動物センターから購入された。正常に飼育し、マウスは6週齢であった。計30匹のマウスをランダムに3つの群に10匹ずつ分けた。マウスカゴの環境はSPF(Specific pathogen Free)級であった。
【０１１２】
被験菌株：正常に培養されたAF73-05CM02で、培地はPYG液体培地（配合は実施例1と同様）で、37℃の嫌気条件において菌濃度が約109CFU/mLオーダーまで3日培養してから、実験群の胃内投与を行った。菌株の不活性化や死亡を防止するため、1日おきに新鮮な菌液を交換し、菌液を4℃の嫌気条件において保存した。
【０１１３】
試験過程：新しく購入されたマウスをランダムに3群に分け、第1群は対照群（control群）で、第2群は肥満モデル群（model群）で、第3群は菌剤治療群で、ここで、第1群で普通の飼料を投与し、第2、第3群で高脂肪飼料を投与した(肥満モデルの構築のため)。5週間飼育した後、第3群でAF73-05CM02で胃内投与を始め、第1群と第2群で等量の培地を胃内投与し、関与は9週間続いた。胃内投与菌液の量は0.15mL/10g体重であった。モデル構築の前後、関与の前後でそれぞれ毎週マウスの体重、状態、摂食量などのデータを記録した。実験終了後マウスを殺処分し、脂肪含有量を記録し、血清を収集し、キットの使用説明書に従って血清における脂質の含有量を、総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、高密度リポタンパク質（HDL-C）および低密度リポタンパク質（LDL-C）を含めて検出した。
【０１１４】
実験結果：
1．AF73-05CM02の肥満モデルマウスの体重増加量に対する影響
【０１１５】
【表４−１】
2019517992.tif 000008
【０１１６】
【表４−２】
2019517992.tif 000009
【０１１７】
試験群の9週マウスの体重増加量の変化(表4-1と表4-2)を比較すると、AF73-05CM02の胃内投与による関与は有効にマウスの体重増加量の上昇を緩和することができることがわかる(*P＜0.05)。
【０１１８】
2．AF73-05CM02の肥満モデルマウスの体脂肪率に対する影響
【０１１９】
【表５】
2019517992.tif 000010
【０１２０】
表5の結果から、AF73-05CM02が顕著に肥満モデルマウスの体脂肪率を低下させることができたことがわかる（＊P＜0.05）。
【０１２１】
3．AF73-05CM02の実験マウスの血中脂質に対する影響
【０１２２】
【表６−１】
2019517992.tif 000011
【０１２３】
【表６−２】
2019517992.tif 000012
【０１２４】
表6-1と表6-2の結果から、AF73-05CM02(第3群)の関与は有効に血液におけるTC、TG、LDLCのレベルを抑えてHDLCを向上させることができることが示された(*P＜0.05)。中では、血中脂質における主要成分はコレステロールおよびトリグリセリドで、血漿におけるコレステロールおよびトリグリセリドのレベルの向上はアテローム性動脈硬化の発生と密接に関連し、また高密度リポタンパク質の主な機能は血液および細胞における過剰のコレステロールおよび低密度リポタンパク質を除去することで、アテローム性動脈硬化を防止する作用を有する。そのため、AF73-05CM02は血中脂肪を低下させ、アテローム性動脈硬化関連疾患(たとえば心血管疾患)の関連指標を低下させると同時に、顕著に高密度リポタンパク質のレベルを向上させることができる。
【０１２５】
実施例6  腸内クリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02を含む食品組成物
原料の配合は表7に示す。
【０１２６】
【表７】
2019517992.tif 000013
【０１２７】
上記配合の比率で牛乳、白砂糖を混合し、完全に混合するまで撹拌し、予備加熱し、20MPaの圧力で均質化し、90℃程度で5〜10分間殺菌し、40〜43℃に冷却し、1〜100×106cfu/gのChristensenella intestinihominis AF73-05CM02菌を接種し、Christensenella intestinihominis AF73-05CM02菌を含む食品組成物を調製した。
【０１２８】
実施例7  腸内クリステンセネラ菌を含む薬物組成物
原料の配合は表8に示す。
【０１２９】
【表８】
2019517992.tif 000014
【０１３０】
上記比率で乳糖、酵母粉、ペプトンおよび精製水を均一に混合し、60〜65℃に予備加熱し、20MPaの圧力で均質化し、90℃程度で20〜30分間殺菌し、36〜38℃に冷却し、Christensenella intestinihominis AF73-05CM02生菌(1-50×106cfu/mL)を接種し、pH値が6.0になるように36〜38℃で発酵させ、遠心し、水分含有量が3％未満になるまで凍結乾燥し、Christensenella intestinihominis AF73-05CM02菌の凍結乾燥物を調製した。0.5グラムのChristensenella intestinihominis AF73-05CM02凍結乾燥を量って等量のマルトデキストリンと混合した後、カプセルに入れ、Christensenella intestinihominis AF73-05CM02菌を含む薬物組成物を調製した。
【０１３１】
菌株の寄託
本発明の菌種であるクリステンセネラ菌Christensenella intestinihominis AF73-05CM02（寄託名称と同様）は、既に2016年6月13日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（CGMCC）に寄託され、住所は中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号で、寄託番号はそれぞれCGMCC 1.5207である。
【０１３２】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
2019517992.tif 000015
【図２】
2019517992.tif 000016
【図３】
2019517992.tif 000017
【配列表】
2019517992000001.app
【国際調査報告】
2019517992.tif 000018
2019517992.tif 000019
2019517992.tif 000020
2019517992.tif 000021
2019517992.tif 000022
2019517992.tif 000023