(57)【要約】本発明は、ナノポアおよび光学的検出を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含むポリヌクレオチド等の少なくとも２つの型のモノマーの直鎖を含むポリマーを分析するための方法に向けられる。一部の実施形態では、わずか２つの異なる種類のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方において選択された種類のヌクレオチドについて識別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識される。標識された鎖は、その鎖のヌクレオチドが光学的検出領域を逐次的に通過するように制約されるナノポアを通って転置し、その光学的検出領域において、それらの標識が、光学的シグネチャーを構成する一連の光学的シグナルを生成する。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方からの光学的シグネチャーからの情報が、組み合わされて、標的ポリヌクレオチドの完全なヌクレオチド配列を決定する。
2019517252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ポリヌクレオチドを分析する方法であって、
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップ；
該ヌクレオチドアナログを、同じ少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された相補体を形成するように、該鎖の相補体をコピーするステップ；
該標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、該標識された鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ；
該標識された鎖が該ナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；
該標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、該標識された相補体を、ナノポアを通して転置させるステップ；
該標識された相補体が該ナノポアを通って転置して相補体光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；
該鎖光学的シグネチャーおよび該相補体光学的シグネチャーから該二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記決定するステップが、前記鎖光学的シグネチャーを前記相補体光学的シグネチャーと、該光学的シグネチャーの相補性によりペアリングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２種類のヌクレオチドの２つがピリミジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コピーするステップが、プライマー伸長反応により実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記鎖および前記相補体が単一のプライマー伸長によりコピーされ得るように、前記二本鎖ポリヌクレオチドの末端にヘアピンアダプタをライゲートするステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記コピーするステップが、前記少なくとも２種類のヌクレオチドのことごとく１個１個の代わりに前記ヌクレオチドアナログを用いて前記標識された鎖および前記標識された相補体を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも２種類のヌクレオチドの２つがプリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２種類のヌクレオチドの少なくとも１つがピリミジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップ；
該標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、該標識された鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ；
該標識された鎖が該ナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；
該鎖光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、該鎖光学的シグネチャーから該二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含む、ポリヌクレオチドを同定する方法。
【請求項１０】
前記鎖がヒトゲノム由来であり、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、前記参照光学的シグネチャーがヒトゲノム配列に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記鎖が微生物ゲノム由来であり、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、前記参照光学的シグネチャーが微生物ゲノム配列に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物ゲノムが細菌ゲノムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記鎖がウイルスゲノム由来であり、少なくとも１００ヌクレオチド長であり、前記参照光学的シグネチャーがウイルスゲノム配列に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子発現を測定する方法であって、
ｍＲＮＡの試料を得るステップ；
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された第１鎖を形成するように、ｍＲＮＡの鎖を逆転写するステップ；
該標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、該標識された第１鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ；
該標識された第１鎖が該ナノポアを通って転置して第１鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；
該第１鎖光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、該第１鎖光学的シグネチャーから該ｍＲＮＡ鎖を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡの前記試料がヒト試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記同定するステップが、前記第１鎖光学的シグネチャーを、ヒトゲノム配列および／またはヒトメッセンジャーＲＮＡ配列の参照光学的シグネチャーと比較することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現を測定する方法であって、
ｍＲＮＡの試料を得るステップ；
ｍＲＮＡの鎖を逆転写して、第１のＤＮＡ鎖を生じるステップ；
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識されたｃＤＮＡを形成するように、該第１のＤＮＡ鎖を転写するステップ；
該標識されたｃＤＮＡのヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、該標識されたｃＤＮＡを、ナノポアを通して転置させるステップ；
該標識されたｃＤＮＡが該ナノポアを通って転置してｃＤＮＡ光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；
該ｃＤＮＡ光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、該ｃＤＮＡ光学的シグネチャーから該ｍＲＮＡ鎖の配列を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１８】
前記決定するステップが、前記ｃＤＮＡ光学的シグネチャーを、ヒトゲノム配列および／またはヒトメッセンジャーＲＮＡ配列の参照光学的シグネチャーと比較することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
集団の二本鎖ポリヌクレオチドを分析する方法であって、
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、各二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップであって、各二本鎖ポリヌクレオチドが所定の最小限の長さを有する、ステップ；
該ヌクレオチドアナログを、同じ少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された相補体を形成するように、該鎖の相補体をコピーするステップ；
該標識された鎖および該標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、該標識された鎖および該標識された相補体を、ナノポアを通して別々に転置させるステップ；
該標識された鎖が該ナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナル、および、該標識された相補体が該ナノポアを通って転置して相補体光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを、別々に検出するステップ；
各二本鎖ポリヌクレオチドからの該鎖光学的シグネチャーと該相補体光学的シグネチャーとを関連付けるステップであって、所定の最小限の長さが、そのような関連付けが少なくとも９０パーセントの確率で正しくなるように選択される、ステップ；
該関連付けられた鎖光学的シグネチャーと該相補体光学的シグネチャーから各二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
前記集団が、ヒトゲノム、細菌ゲノム、または単細胞型真核生物のゲノムのＤＮＡ断片を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ断片の長さが、それぞれ、少なくとも１００塩基対である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ断片の長さが、１００塩基対から１０，０００塩基対までの範囲である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記集団が、１０１５個未満の別個の二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３４３，２８３号、および２０１６年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４２１，８０４号の優先権の利益を主張し、その両方の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ナノポア配列決定は、１ラン当たりの配列決定にかかる費用の低下、試料調製の単純化、ランタイムの低下、配列読み取りの長さの増加、リアルタイムの試料分析の提供などを含む、現在のＤＮＡ配列決定技術における多くの課題を克服するためのアプローチとして提案されている。しかしながら、ナノポアを用いる、ＤＮＡ分析等のポリマー分析は、例えば、ＤＮＡ移動を制約するための信頼できるナノ構造体の製作、ＤＮＡ転置速度（DNA  translocation  rate）の制御、明確なヌクレオチド識別、ナノスケールセンサの大規模アレイからのシグナルの検出および処理等々、それ自体の一連の技術的困難を有する（例えば、Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年））。
ヌクレオチドの光学的検出は、ナノポア配列決定の分野における技術的困難の一部、例えば、ナノポアの大規模アレイからの独立的なシグナルを収集することの困難に対する有望な解法として提案されている。しかしながら、斯かる解法の実行にとって多数の課題があり、それには、例えば、光学に基づいた単一分子分析に特有のバックグラウンドノイズを克服すること、および光学的標識をヌクレオチドに結合させるための信頼でき、便利な方法を確立することが挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記を考慮して、わずか２つの異なる光学的標識を用いる標的ポリヌクレオチドの光学に基づいたナノポア配列分析を可能にする方法が利用可能である場合、光学に基づいたナノポア配列決定等のナノポア配列決定技術およびその特定の適用に有利であろう。
【０００５】
本発明は、ナノポアおよび異なるモノマーについてのわずか２つの光学的標識を用いる、ポリヌクレオチド分析等のポリマー分析のための方法およびデバイスに向けられる。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップ；（ｂ）前記ヌクレオチドアナログを、その同じ少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された相補体を形成するように、前記鎖の相補体をコピーするステップ；（ｃ）標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、標識された鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ；（ｅ）標識された鎖がナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；（ｆ）標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、標識された相補体を、ナノポアを通して転置させるステップ；（ｇ）標識された相補体がナノポアを通って転置して相補体光学的シグネチャーを生じるときの光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；（ｈ）鎖光学的シグネチャーおよび相補体光学的シグネチャーから二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップで実行され得る。
【０００７】
本発明は、有利には、光学に基づいたナノポア配列決定のために光学的標識をありとあらゆるヌクレオチドに結合させることの問題を克服する。一態様では、その問題は、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方におけるヌクレオチド型のサブセット、例えば、ＴおよびＣを標識し、両方の鎖により生成された光学的シグネチャーからの配列情報を組み合わせて、標的ポリヌクレオチドについてのヌクレオチド配列を得ることにより、対処される。別の態様では、その問題は、標的ポリヌクレオチドの一方または他方の鎖におけるヌクレオチド型のサブセットを標識し、既知のゲノム配列から導かれた、または測定された光学的シグネチャーの参照ライブラリーと、生成された光学的シグネチャーを比較することにより、対処される。本発明の上記のおよび他の利点は、多数の実行および適用において例証されており、その一部は、下記および本明細書全体を通して要約される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態を図解する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態を図解する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態を図解する。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態を図解する。
【図１Ｅ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態を図解する。
【図１Ｆ】図１Ａ〜図１Ｆは、本発明の異なる実施形態を図解する。
【０００９】
【図２】図２は、ＦＲＥＴシグナル生成および落射照明検出システムを用いる光学に基づいたナノポア配列決定システムを図解する。
【００１０】
【図３】図３は、ＦＲＥＴシグナル生成およびＴＩＲＦシステムを用いる光学に基づいたナノポア配列決定システムを図解する。
【００１１】
【図４】図４は、共焦点落射照明システムの基本的構成要素を図解する。
【００１２】
【図５】図５は、ＦＲＥＴシグナル生成なしの光学的標識の励起のためのＴＩＲＦシステムの要素を図解する。
【００１３】
【図６】図６は、複数の光学的標識からの光を含む光学的シグナルの測定に基づいたヌクレオチド配列をコールするためのステップを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、様々な修飾および代替形態を受容するが、これらの詳細については、図面に例として示し、詳しく記載する。しかし、その意図するところは、本発明を、記載されている特定の実施形態に限定することではないことを理解されたい。それどころか、その意図するところは、本発明の精神および範囲内に収まるあらゆる修飾、均等物および代替物を網羅することである。例えば、本発明の特定のナノポアの種類および数、特定の標識、ＦＲＥＴペア、検出スキーム、製作アプローチが、説明目的で示されている。他の型の光学的標識、特に蛍光標識、および他の型のナノポア、ナノポアのアレイ、および他の製作技術が、本明細書に論じられたシステムの様々な態様を実行するのに利用され得るため、本開示がこれらの点で限定的であることを意図するものではないことは認識されるべきである。本発明の態様に関するガイダンスは、当業者に周知の多くの利用できる参考文献および専門書に見出され、そのようなものとして、例えば、Cao、Nanostructures  &  Nanomaterials（Imperial  College  Press、２００４年）；Levinson、Principles  of  Lithography、第２版（SPIE  Press、２００５年）；DoeringおよびNishi編、Handbook  of  Semiconductor  Manufacturing  Technology、第２版（CRC  Press、２００７年）；Sawyerら、Electrochemistry  for  Chemists、第２版（Wiley  Interscience、１９９５年）；BardおよびFaulkner、Electrochemical  Methods:  Fundamentals  and  Applications、第２版（Wiley、２０００年）；Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）；Hermanson、Bioconjugate  Techniques、第２版（Academic  Press、２００８年）；などが挙げられ、これらの関連部分は、参照により本明細書に組み込む。
【００１５】
一態様では、本発明は、ナノポアおよび光学的検出を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含むポリヌクレオチド等の少なくとも２つの型のモノマーの直鎖を含むポリマーを分析するための方法およびデバイスに向けられる。一部の実施形態では、わずか２つの異なる種類のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方において選択された種類のヌクレオチドについて識別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識される。例えば、各標的ポリヌクレオチドの相補的な鎖のＣおよびＴは、標識されたアナログによって置き換えることができ、ＣおよびＴアナログの標識は、別個の光学的シグナルを生成することができる。次いで、ナノポアを通して標識された鎖を転置させることによって光学的シグネチャーが生成されるが、このナノポアにおいて、鎖のヌクレオチドは、その標識が光学的シグナルを生成する原因となる光学的検出領域を逐次に通過するように制約されている。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方からの光学的シグネチャーからの情報が、組み合わされて、標的ポリヌクレオチドの完全なヌクレオチド配列を決定する。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖からの光学的シグネチャーは、別々のナノポア測定から決定され、その後、光学的シグネチャーの相補性に基づいて組み合わされる。一部の斯かる実施形態では、斯かる決定は、標的ポリヌクレオチドの新規の配列決定である。さらなる実施形態では、非限定的にｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドなどを含む、一本鎖ポリマーからの光学的シグネチャーは、その１つまたは複数のモノマー上の１つまたは複数の光学的標識からの発光のナノポア測定から決定され、その後、斯かる光学的シグネチャーは、測定された光学的シグネチャーをデータベース内の参照光学的シグネチャーで同定することにより、モノマー配列と関連付けられる。一部の実施形態では、単一ヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドが、特定の生物体に関して参照ライブラリーにおいてヌクレオチド配列を同定するために用いられ得る単色光学的シグネチャーのみを生成するように、標識される。
【００１６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの選択された種類のヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼを使用した伸長反応において、標識されたヌクレオチドアナログによって置き換えられる。標的ポリヌクレオチドの標識された鎖は、その鎖を、光学的検出領域を通って１列縦隊で移動するように制約するナノポアを通って転置するが、その光学的検出領域において、それらは、励起されて、シグナル生成標識が結合しているヌクレオチドの種類を示す光学的シグナルを生じる。個々の鎖についての光学的シグナルの収集物は、本明細書において、鎖の光学的シグネチャーと称される。例えば、ヘアピンアダプタを介して鎖およびその相補体（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖）が連結された一部の実施形態では、単一の光学的シグネチャーは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に由来するヌクレオチド上の光学的標識からの光学的シグナルを含むことができる。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの異なる鎖は、上述の通り、解析のために組み合わせることができるまたは共に使用することができる、２種の異なる光学的シグネチャーを別々に生成することができる。斯かる別々に分析された鎖は、例えば、分子タグ（例えば、標的ポリヌクレオチドに既知の位置で結合し、即時の関連付けを可能にするような長さおよび配列のパターンおよび多様性を有するオリゴヌクレオチドセグメントであり得る）を用いることにより、光学的シグネチャーの生成後に関連付けられ得る。あるいは、斯かる別々に分析される鎖は、各鎖上の複数の異なる種類のヌクレオチドについて別個の標識が用いられるという条件、および標的ポリヌクレオチドが所定の長さより長く、標的ポリヌクレオチドが所定のサイズより小さい集団から得られるという条件で、それらの固有の光学的シグナルの配列、すなわち、光学的シグネチャーにより、光学的シグネチャーの生成後に関連付けられ得る。すなわち、二本鎖標的ポリヌクレオチドの２つの鎖からの光学的シグネチャーは、用いられる標識スキーム（特に、各鎖上に用いられる標識の数）、標的ポリヌクレオチドの長さ、および標的ポリヌクレオチドが得られる集団のサイズに依存する所定の確率で、同じ元の分子から生成されているとして、正しく関連付けられ得る。斯かるそれらの固有の光学的シグネチャーによる鎖のタグ付けは、内在性鎖タグ（inherent  strand  tag）と本明細書で呼ばれ得る。
【００１７】
その概念は、以下の単純化された例により説明することができる：標的ポリヌクレオチドを、それぞれ長さが１００塩基対の１０８個のランダム配列ポリヌクレオチドの集団のメンバーであるようにし、Ｔ、Ｃ、およびプリンと関連するシグナルが検出可能であるようにＴおよびＣが各鎖において他と異なって標識されているようにしておく。測定することができる３１００個（約５×１０４７個）の別個の光学的シグネチャーがあり、その結果、１０８個の配列の大きな試料に関してでさえも、測定される各光学的シグネチャーが固有であり、したがって、同じ標的ポリヌクレオチドから生成された相補鎖の光学的シグネチャーと一意的に関連付けられ得る確率は非常に高い。一部の実施形態では、少なくとも２種類のヌクレオチド（例えば、ＴおよびＣ）が別個の標識を有し、標的ポリヌクレオチドの長さが少なくとも５０塩基対であり、標的ポリヌクレオチドが１０１０個未満の別個の分子の集団から選択される。他の実施形態では、少なくとも２種類のヌクレオチド（例えば、ＴおよびＣ）が別個の標識を有し、標的ポリヌクレオチドの長さが少なくとも１００塩基対であり、標的ポリヌクレオチドが少なくとも１００塩基対の１０１５個未満の別個の分子の集団から選択される。他の実施形態では、少なくとも２種類のヌクレオチド（例えば、ＴおよびＣ）が別個の標識を有し、標的ポリヌクレオチドの長さが少なくとも１００塩基対であり、標的ポリヌクレオチドが少なくとも１００塩基対の１０１０個未満の別個の分子の集団から選択される。一部の実施形態では、各鎖において他と異なって標識されるヌクレオチドの数、標的ポリヌクレオチドの最小限の長さ、および標的ポリヌクレオチドの集団のサイズが、同じ標的ポリヌクレオチドの相補鎖から生成される光学的シグネチャーが、少なくとも９５パーセントの確率で、または少なくとも９９パーセントの確率で、または少なくとも９９．９パーセントの確率で正しく関連付けられ、もしくは同定され得るように選択される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの集団のサイズは、所定のサイズであり得、またはそれは、単に、集団の既知のサイズであり得、またはそれは、集団の推定サイズであり得る。これらの場合のそれぞれにおいて、相補鎖からの光学的シグネチャーの正しい関連付けまたはペアリングの所望の確率を得るように、他のパラメータ（標識の数、最小のシグネチャーの長さなど）が選択される。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、（例えば、２つの標識のみを用いる）一部の実施形態では、候補相補鎖の光学的シグネチャーに関しての用語「関連付けること」または「ペアリング」は、１つの鎖からのシグナルのパターンを、別の鎖からのシグナル間の間隔のパターン（場合により、実施形態によって、逆の時間的順序になる）にマッチさせることを意味する。シグナル（例えば、ＣシグナルまたはＴシグナル）間の間隔の代わりに、３つの標識が用いられる（例えば、標識１を有するＣ、標識２を有するＴ、および標識３を有するＡまたはＧ）実施形態では、標識３からの「ＡまたはＧ」シグナルの配列がある。
【００１９】
さらなる実施形態では、２種類のヌクレオチドのみ、例えば、ＴおよびＣが標識されて、検出可能である場合には、斯かる標識された鎖からの可能な異なる光学的シグネチャーの数は、内在性鎖タグとして用いられるのにまだ十分大きい。例えば、１００塩基対の長さを有するランダム配列のポリヌクレオチドの集団において、標識されたＴおよびＣは、約２５０個、または約１０１５個の別個の光学的シグネチャーを生成する。
【００２０】
任意の与えられた状況における別個の内在性鎖タグの数の決定が、いくつかの供給源からのノイズの大きさ、例えば、ヌクレオチドの転置速度における鎖内変動、光学的シグナルが収集される検出領域の容量の変動、光学的シグナルの大きさまたは質への局所的な物理的および化学的影響などに、一部、依存することを当業者は理解するはずである。斯かる供給源からのノイズの光学的シグネチャーへの効果は、従来のデータ分析技術により処理され得る。
【００２１】
以下で注記されているように、本発明の光学的シグネチャーは、各検出間隔で検出されるシグナルが、分解能限界区域（resolution  limited  area）または容量内で放射する複数の光学的標識からの寄与を含み得るという点で、混合された光学的シグナルを含み得る；すなわち、それらは、参照により本明細書に組み込まれているHuberら、米国特許出願公開ＵＳ２０１６００７６０９１によって記載されているように、（例えば）混合されたＦＲＥＴシグナルであり得る。
【００２２】
上記で言及されているように、一部の実施形態では、本発明の方法は以下のステップで実行され得る：（ａ）別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップ；（ｂ）前記ヌクレオチドアナログを、同じ少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された相補体を形成するように、前記鎖の相補体をコピーするステップ；（ｃ）標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、標識された鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ；（ｄ）標識された鎖がナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；（ｅ）標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、標識された相補体を、ナノポアを通して転置させるステップ；（ｆ）標識された相補体がナノポアを通って転置して相補体光学的シグネチャーを生じるときの光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；（ｇ）鎖光学的シグネチャーおよび相補体光学的シグネチャーから二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ。一部の実施形態では、２種類のヌクレオチドが標識されて、これは、ＣおよびＴ、ＣおよびＧ、ＣおよびＡ、ＴおよびＧ、ＴおよびＡ、またはＧおよびＡであってもよい。一部の実施形態では、ピリミジンヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、プリンヌクレオチドが標識される。一部の実施形態では、核酸ポリメラーゼを使用したプライマー伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの標識されたアナログｄＮＴＰを取り込むことにより、鎖の選択された種類のヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、伸長反応において選択された種類のヌクレオチドのアナログｄＮＴＰを取り込むことにより、鎖の選択された種類のヌクレオチドが標識され、アナログｄＮＴＰは、その後の反応において異なる種類のヌクレオチドへの異なる標識の結合を可能にする直交反応性の官能基（orthogonally  reactive  functionality）により誘導体化される。この後者の標識アプローチは、参照により本明細書に組み込むJettら、米国特許第５，４０５，７４７号に開示されている。
【００２３】
一部の実施形態では、３種類のヌクレオチドが標識され、これは、Ｃを第１の光学的標識で、Ｔを第２の光学的標識で、ＧおよびＡを第３の光学的標識で標識することを含むことができる。他の実施形態では、次の群のヌクレオチドを、示されている通りに標識することができる：ＣおよびＧをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＡを第３の光学的標識で；ＣおよびＡをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＧを第３の光学的標識で；ＴおよびＧをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＣおよびＡを第３の光学的標識で；ＡおよびＧをそれぞれ第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＣを第３の光学的標識で。
【００２４】
一部の実施形態では、光学的標識は、ナノポアに会合したドナーからのエネルギー移動後に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルを生成する、蛍光アクセプター分子である。一部の実施形態では、さらに以下に記載する通り、ドナーは、例えば、量子ドット、ナノダイアモンド等、光学的に活性なナノ粒子であってもよい。アクセプター分子およびドナーの特定の組合せの選択は、当業者のデザイン選択である。そのうちのいくつかについてより詳しく以下に記載する一部の実施形態では、単一の量子ドットを、ナノポアに結合させ、励起ビームを使用して蛍光を発するように励起され、この励起ビームの波長は、アクセプターによって生成されるＦＲＥＴシグナルに寄与しないように、十分に分離されており、通常、より短い（すなわち、より青色である（bluer））。同様に、その放射波長が、両方のアクセプター分子の吸収バンドに重複する量子ドットが選択されて、ＦＲＥＴ相互作用を容易にする。一部の実施形態では、ナノポアの励起ゾーン毎に２種のドナーを使用することができ、それぞれの放射波長は、アクセプター分子の異なる１つの吸収バンドに最適に重複するように選択される。
【００２５】
図１Ａ〜１Ｅは、上記方法のいくつかの実施形態を図解する。図１Ａにおいて、二本鎖標的ポリヌクレオチド（１００）（配列番号１）は、センス鎖（１０１）および相補的アンチセンス鎖（１０２）からなり、これに、従来方法、例えば、参照により本明細書に組み込むWeissmanら、米国特許第６，２８７，８２５号；Schmittら、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／００４４６８を使用して、「Ｙ」アダプタ（１０４）および（１０６）がライゲートされる（１０３）。アダプタ（それぞれ１０４および１０６）のアーム（Arm）（１０８）および（１１０）は、プライマー（１１６）および（１１８）をアニールさせる（１０５）プライマー結合部位を含む。二本鎖部分（１１２）および（１１４）は、タグ配列を含むことができ、例えば、一方または両方が、所定の長さおよび組成のランダマー（randomer）を含むことができ、これを、鎖の後の再会合に使用して、例えば、鎖のそれぞれの光学的シグネチャーから配列情報を得ることができる。プライマー（１１６）および（１１８）をアニーリングさせた後に、（例えば、図解されている通り）標識されたｄＵＴＰアナログ（標識は、取り込まれたヌクレオチドにおける白丸として示す）および標識されたｄＣＴＰアナログ（標識は、取り込まれたヌクレオチドにおける黒丸として示す）ならびに天然の標識されていないｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、核酸ポリメラーゼによってこれらを伸長させることができる（１０７）（伸長された鎖においてアナログが完全に置換されているように、標識されていないｄＴＴＰも標識されていないｄＣＴＰも存在しない）。ＧおよびＡにおける標識の非存在は、取り込まれたヌクレオチドの上の破線として図解されている。ノイズがない理想的な検出システムにおいて、白丸、黒丸および破線の配列は、ナノポアの励起ゾーンを通過する際に示されているセンス鎖およびアンチセンス鎖によって生成された光学的シグネチャーの優れた表現であろう。この実施形態では、鎖は５’を最初に、ナノポアを通って転置する（translocate  nanopores  5'-first）が、転置配向（すなわち、５’を最初に、または３’を最初に）は、他の実施形態では、逆相補体により必ずしも生成されるとは限らない光学的シグネチャーを生じるように選択され得る。または、代替として、転置配向は、相補性光学的シグネチャーが、両方の配列が３’を最初に転置することに基づいているように、選択され得る。
【００２６】
図１Ｂにおいて、３種の標識を用いる代替的な実施形態に関する、伸長産物（１２０）および（１２２）が図解されている。上述の通り、取り込まれた標識されたｄＵＴＰアナログを白丸として示し、取り込まれた標識されたｄＣＴＰアナログを黒丸として示す。取り込まれた標識ｄＡＴＰアナログおよびｄＧＴＰアナログは、黒色の菱形として示されている（および下部のヌクレオチド配列表示において、それぞれ、「プリン」として「ｐ」と示されている）。３標識の実施形態は、「Ｃ」または「Ｔ」についてのシグナルの間のギャップ（またはヌクレオチドの数）を定量する根拠を提供するという利点を有する。例えば、一連の連続したプリンからの累積シグナルは、プリンの数についての測度を提供し、それは、候補相補配列上のＣおよびＴの連続したセグメントとマッチすることができる。
【００２７】
図１Ａおよび１Ｂの両方の実施形態の変型において、ヌクレオチド配列の演繹は、候補相補配列の光学的シグネチャーを参照配列と最初に比較することにより促進され得る。
【００２８】
標識するためのヌクレオチドの種類、標識およびこれを塩基に結合させるためのリンカーの種類、ならびにｄＮＴＰアナログの存在下での伸長反応のための核酸ポリメラーゼの選択におけるガイダンスは、参照により組み込む次の参考文献に見出すことができる：Goodmanら、米国特許第５，９４５，３１２号；Jettら、米国特許第５，４０５，７４７号；Muehleggerら、米国特許出願公開ＵＳ２００４／０２１４２２１；Gillerら、Nucleic  Acids  Research、３１巻（１０号）：２６３０〜２６３５頁（２００３年）；Tasaraら、Nucleic  Acids  Research、３１巻（１０号）：２６３６〜２６４６頁（２００３年）；Augustinら、J.  Biotechnology、８６巻：２８９〜３０１頁（２００１年）；Brakmann、Current  Pharmacuetical  Biotechnology、５巻（１号）：１１９〜１２６頁（２００４年）；など。本発明での使用のための例示的な核酸ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、Ｔａｑ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｔｇｏ  ｅｘｏ−、クレノウ断片ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−などが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、例示的な核酸ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−およびクレノウ断片ｅｘｏ−が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＮＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６３５、ＭＲ１２１、ローダミン、ローダミングリーン、オレゴングリーン（Oregon  Green）、ＴＡＭＲＡなどが挙げられるがこれらに限定されない。ｄＵＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６６５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ９０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ＭＲ１２１、オレゴングリーン、ローダミン、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡなどが挙げられるがこれらに限定されない。ｄＣＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミン、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡなどが挙げられるがこれらに限定されない。ｄＡＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミングリーンなどが挙げられるがこれらに限定されない。ｄＧＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミングリーンなどが挙げられるがこれらに限定されない。ｄＵＴＰアナログおよびｄＣＴＰアナログのための蛍光標識の例示的なペアとして、（ＴＡＭＲＡ、ローダミングリーン）、（Ａｔｔｏ  ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、ローダミングリーン）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、ローダミングリーン）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｃｙ５）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
図１Ｃは、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０１５２４９２およびＵＳ２０１２／００５８４６８に教示されている通り、２種の標識が使用され、ヘアピンアダプタ（１３０）によってセンス鎖およびアンチセンス鎖が連結される実施形態を図解する。テイルアダプタ（１３２）およびヘアピンアダプタ（１３０）は、標的ポリヌクレオチド（１００）（配列番号１）にライゲートされる。変性およびプライマー（１３４）のアニーリング後に、伸長反応は、セグメント（１３６）（鎖（１０１）の標識された相補体である）と、セグメント（１３８）（鎖（１０１）の標識された逆相補体である）とを含む伸長産物（１３５）を生じる。ナノポアを通した伸長産物（１３５）の転置および光学的シグネチャーの生成後に、標的ポリヌクレオチド（１００）の配列を決定することができる。任意選択で、ヘアピン（１３０）の配列は、伸長反応において標識の所定のパターンが取り込まれるように選択することができ、これは、例えば、セグメント（１３６）が終わる場所およびセグメント（１３８）が始まる場所などを示すことにより、光学的シグネチャーの解析に役立つように使用することができる。
【００３０】
図１Ｄは、２つの同一のヘアピンアダプタ（１４０）が、標的ポリヌクレオチド（１００）（配列番号１）の末端にライゲートされている別の実施形態を図解する。この実施形態では、ヘアピンアダプタ（１４０）はプライマー結合部位を含み、その部位にプライマー（１４２）がアニールし得（１４４）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）において伸長されて、標識された伸長産物（１４８ａおよび１４８ｂ）を生じ得る。一部の実施形態では、ＲＣＡ（１４６）は、少なくとも１つの完全な回路がセンス鎖（１０１）とアンチセンス鎖（１０２）で構成されるように実施される。その後、伸長産物（１４８ａおよび１４８ｂ）は、光学的シグネチャーを生成するために標識されたヌクレオチドが励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、ナノポアを通って転置する。
【００３１】
図１Ｅは、標的ポリヌクレオチド（１００）（配列番号１）が、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）を含有するか、またはそれからなる遺伝子座（１５０）を含有するが、他は既知の配列を含む、測定を図解する。その測定の目的は、Nelsonら、米国特許第８９２１０７２号；米国特許出願公開ＵＳ２０１５／００３１０３５およびＵＳ２００１５／００３１０８６；Linら、国際特許公開ＷＯ２０１５／０８９３３３；Louら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、１１０巻（４９号）：１９８７２〜１９８７７頁（２０１３年）（それらの参考文献は参照により本明細書に組み込まれている）により開示されたものと類似した方法に従って、ＳＮＰの同定を決定することである。すなわち、この実施形態では、目的の遺伝子座（およびその相補体）のローリングサークル複製が、遺伝子座（１５０）の同一性をより高い信頼性と低いエラー率で決定することを可能にする。標的ポリヌクレオチド（１００）は、上記の引用された参考文献に教示されているように、変性され、環状化され（１５５）、その後、標的特異的プライマー（１６０）および（１６１）が、配列（１０１）および（１０２）を含有する一本鎖の環へアニールされる。標的特異的プライマー（１６０）および（１６１）は、選択されたヌクレオチドアナログ、例えば、標識ｄＵＴＰおよび標識ｄＣＴＰの存在下で伸長され、その後、光学的シグネチャーが生成される。センス鎖（１０１）およびアンチセンス鎖（１０２）は、ポリヌクレオチド（１００）における遺伝子座（１５０）の固有の相対的位置からなる標的ポリヌクレオチド（１００）の内在性タグによって関連付けられ得る。図１Ｅの例では、セグメント（１５１）およびセグメント（１５３）の配列ならびにポリヌクレオチド（１００）の長さは、センス鎖およびアンチセンス鎖の同定を可能にする。あるいは、１つまたは複数の分子タグを有するアダプタが、変性および環状化の前に、標的ポリヌクレオチド（１００）にライゲートされ得る。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、完全なヌクレオチド配列を提供することなしに、標識された標的ポリヌクレオチドの同定を可能にする光学的シグネチャーを測定するための方法を含む。特に、斯かる方法は、発現プロファイリングに用いられ得る。一部の実施形態では、本発明のこの態様は、以下のステップにより実行され得る：（ａ）ＲＮＡの試料を得るステップ；（ｂ）別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも２種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された第１鎖を形成するように、ｍＲＮＡの鎖を逆転写するステップ；（ｃ）標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを１列縦隊で通過するように、標識された第１鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ；（ｄ）標識された第１鎖がナノポアを通って転置して第１鎖光学的シグネチャーを生じるときの光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；（ｅ）第１鎖光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、第１鎖光学的シグネチャーからＲＮＡ鎖の配列を決定するステップ。
【００３３】
本明細書に用いられる場合、「参照光学的シグネチャー」は、所定の種類のヌクレオチド上に標準標識を有し、標準条件下で測定された、既知のポリヌクレオチドから生じた光学的シグネチャーのコレクションまたはライブラリーまたはデータベースを意味し、それにより、同じ条件（または実験によるシグナル値のデータベースによるシグナル値への合理的変換を可能にする条件）下で得られた実験による光学的シグネチャーが、参照光学的シグネチャーと関係付けられ、および／または同定され得る。一部の実施形態では、光学的シグネチャーは、まず、標識ヌクレオチドのみ（例えば、非標識ヌクレオチドの同一性を無視する）のヌクレオチド配列を決定する（すなわち、「塩基コール」され、またはヌクレオチド配列へ変換される）ように処理され得る。その後、斯かる「シグネチャー」ヌクレオチド配列は、同定のために参照シグネチャー配列のライブラリーと比較される。斯かる参照シグネチャー配列のライブラリーは、特定の生物体または生物体の群、例えば、ヒト（ゲノム、トランスクリプトーム等）、微生物、細菌等についてであり得る。
【００３４】
図１Ｆは、上記方法の一実施形態を図解する。ポリＴプライマー（１８４）は、ｍＲＮＡ（１８０）（配列番号２）のポリＡテイルにアニールされ（１８２）、その後、それは、標識ｄＵＴＰおよび標識ｄＣＴＰの存在下で逆転写酵素により伸長されて、伸長産物（１８５）を生じる。その後、伸長産物（１８５）を、単離し、ナノポアを通して転置させて、光学的シグネチャーを生じ、その光学的シグネチャーを同定のために参照シグネチャーのデータベースと比較することにより、分析する（１８８）。ＲＮＡ（１８０）または他の標的ポリヌクレオチドの長さが、データベースシグネチャーとの比較により一意的に同定されることの高い確率を有する光学的シグネチャーを生成するための最小限の長さを有しなければならないことは当業者により理解されている。一部の実施形態では、これらの実施形態の標的ポリヌクレオチドまたはＲＮＡは、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチド、または少なくとも３００ヌクレオチドの長さを有する。他の実施形態では、斯かる標的ポリヌクレオチドまたはＲＮＡは、少なくとも５００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、別個の蛍光標識で標識された少なくとも２種類のヌクレオチドを有するＤＮＡを生成するために、ＲＮＡ分析物が用いられる。さらなる実施形態では、斯かるＲＮＡ分析物は、ＲＮＡ分析物をコードする遺伝子が少なくとも９５パーセントの確率で、または追加の実施形態では少なくとも９９パーセントの確率で同定されるように選択される、同定のための最小限の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも２種類のヌクレオチドはＣおよびＴである。一部の実施形態では、ＲＮＡ分析物は、ヒト試料、例えば、血液試料または他の組織試料から得られる。
【００３５】
光学的シグナル検出
一部の実施形態では、一連の光学的シグナルは、分解能限界区域から測定され得、各光学的測定値は、異なる隣接モノマー（ポリマーにおけるその順序は、例えば、成分シグナルが回折限界区域（diffraction  limited  area）内から生成されるため、単一測定値から決定することができない）からの複数の成分シグナルを含む。これらの状況下で、ポリマーの光学に基づいたナノポア分析は、（ｉ）１つより多い標識モノマーの配列からの重複寄与を含む時系列の光学的測定値を生成し、それにより、単一測定値からのモノマーの順序を決定することを、不可能でないにしても、困難にさせており、（ｉｉ）識別可能なシグナルを生成するモノマーについての光学的標識を選択することにより、光学的測定値は、異なる種類のモノマー上の異なる標識からの寄与へ分離することができ、それは、重複測定値が配列情報へ変換されるのを可能にする。
【００３６】
一態様では、本発明の方法は、以下のステップにより実行され得る：（ａ）ポリマーを、ナノポアを通して転置させるステップであって、前記ポリマーの異なる種類のモノマーが、識別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識されており、前記ナノポアが前記モノマーを、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを１列縦隊で移動するように制約する、ステップ；（ｂ）前記ポリマーが励起ゾーンを通過するときのモノマーからの時系列の光学的シグナルを検出するステップ；（ｃ）異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップ；および（ｄ）前記ポリマーからの分離された時系列の光学的シグナルからモノマーの配列を決定するステップ。
【００３７】
一部の実施形態では、光学的シグナルはＦＲＥＴシグナルであり得、またはそれらは、モノマーに結合した直接的に励起される蛍光標識からの蛍光放射であり得る。図２は、タンパク質ナノポア（２００）が、固体状態膜（２０６）の開口部（２０４）にわたって（順々に）配置された脂質二重層（２０２）に配置されており、その固体状態膜は不透明層（２０８）（金属層等）、窒化ケイ素層（２１０）、およびシリコン支持層（２１２）を含む、一実施形態の構成要素を図解する。不透明層（２０８）は、励起ビーム（２１４）の固体状態膜（２０６）を通っての透過を防止または低減し、その透過は望ましくないバックグラウンド蛍光を励起する可能性がある。（黒色（２２２）および白色（２２４）として図示された）異なって標識されたモノマーを含むポリマー（２２０）がナノポア（２００）を通過する時、各測定間隔において、複数のモノマー（例えば、２４１、２４２、および２４３）が、同じ分解能限界区域内の励起ゾーン（２２６）および（２２８）内に存在する。図解された実施形態では、光学的測定は、落射照明システムでなされ、ナノポア（２００）は、ナノポア（２００）の内側のモノマーからの光学的シグナルが抑制され、測定される光学的シグナルに寄与しないように選択されていると仮定される。励起ゾーン（２２８）は、ＦＲＥＴドナー（２３０）に隣接したＦＲＥＴゾーンである；すなわち、励起ゾーン（２２８）は、その中で、ＦＲＥＴドナー（２３０）とモノマーに結合した光学的標識（それはまた、アクセプター標識またはＦＲＥＴアクセプター標識とも呼ばれ得る）との間にＦＲＥＴが起こり得る、ＦＲＥＴドナー（２３０）からの距離を定義する。励起ゾーン（２２６）は、励起ビーム（２１４）の開口部（２０４）への成分の非伝搬突出部（non-propagating  protrusion）であり、開口部（２０４）の寸法が、励起ビーム（２１４）の波長を十分下回るように選択される場合はいつでも存在する。図解されているように、この実施形態では、複数のモノマー（２４１、２４２、および２４３）が、モノマー（２４１、２４２、および２４３）が励起ゾーン（２２６）および（２２８）内にある間の瞬間に、または間隔において、測定される光学的シグナルに寄与する。
【００３８】
図３は、参照により本明細書に組み込まれている、Soniら、Review  of  Scientific  Instruments、８１巻：０１４３０１頁（２０１０年）および米国特許出願公開２０１２／０１３５４１０に記載されているようなシステムにおける全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）励起で光学的測定がなされる、実施形態を図解する。この実施形態では、ＦＲＥＴドナー（３０２）が結合しているタンパク質ナノポア（３００）が、開口部（３０８）を有する固体状態膜（３０６）上に配置された脂質二重層（３０４）へ挿入される。全内部反射（ＴＩＲ）は、異なる屈折率を有する固体状態膜（３０６）のシス（３０５）側およびトランス（３０７）側における電解質を選択することにより、可能となる。結果として、ＴＩＲ境界（３１０）は、エバネッセント場が固体状態膜（３０６）のシス（３０５）側に生じるように、固体状態膜（３０６）が配置されている平面に、または平面の近くに生じる。エバネッセント場は、光学的標識を、それらのナノポア（３００）への進入前に励起し得る。ＦＲＥＴが、ＦＲＥＴゾーン（３２０）内でＦＲＥＴドナー（３０２）とモノマー上の標識（３１９）との間で起こり得るように、ＦＲＥＴドナー（３０２）は、ＴＩＲ境界（３１０）において反射された光により直接的に励起される。図２の実施形態においてのように、ナノポア（３００）は、標識モノマーがナノポア（３００）の穿孔にあるとき、標識による蛍光放射が抑制されるように、選択され得る。３２５、３２６、および３２７等の複数のモノマーが、図における示された配置において記録された光学的測定値に寄与する。
【００３９】
一部の実施形態では、モノマー上の標識は、図５に示されたものと類似した機器を用いてエバネッセント場だけにより励起され得る。この機器において、ナノポアまたはナノポアアレイのトランス側における非常に狭い第２のチャンバは、エバネッセント場が、下にあるスライドガラスの表面から広がって、ナノポアの入口と出口の両方において励起ゾーンを確立することを可能にし、その結果、ナノポアに関連した各光学的測定値が、複数の標識モノマーからの寄与を含む。開口部のアレイ（５００）（脂質二重層内に挿入されたタンパク質ナノポアを含み得る）は、２０〜１００ｎｍの範囲の厚さを有し得る窒化ケイ素層（５０２）内に形成され得る。窒化ケイ素層（５０２）は、シリコン支持層（５０３）上に形成され得る。第２のチャンバ（５０６）は、窒化ケイ素層（５０２）、二酸化ケイ素層（５０４）（第２のチャンバ（５０６）の高さを決定する）、およびスライドガラス（５１０）の表面（５０８）により形成され得る。二酸化ケイ素層（５０４）は、５０〜１００ｎｍの範囲の厚さを有し得る。表面（５０８）から窒化ケイ素層（５０２）を越えて広がる望ましいエバネッセント場（５０７）は、ＴＩＲが起こるように、スライドガラス（５１０）に対して適切な角度で光線（５１２）を向けることにより確立され得る。標識ポリヌクレオチド分析物を、アレイ（５００）を通過させるために、シス（−）条件が第１のチャンバ（５１６）内に確立され得、トランス（＋）条件が第２のチャンバ（５０６）内に確立され得、電極が、第１および第２のチャンバ（５０６および５２１）へ操作上、接続される。
【００４０】
混合されたＦＲＥＴシグナルでの配列決定
本発明によれば、標識ポリマーがナノポアおよびその関連した励起ゾーンを通って転置するとき、光学的測定値の時間順序セットが記録される。隣接した時点における光学的測定値は、各光学的測定値が隣接したモノマーの標識からの寄与を含有するという意味で重複している。したがって、例えば、３つのモノマーが各時点でシグナルを生成する場合（例えば、ポリマー・・・−Ａ−（Ｂ−Ｃ−Ｄ）−・・・のＢ、Ｃ、およびＤが励起ゾーンを通って左から右へ移動する）、および連続的測定の間に、１つのモノマーが励起ゾーンから出て、別のモノマーが励起ゾーンに入る（括弧で示されている）場合（例えば、Ａが入って、Ｄが出る：−（Ａ−Ｂ−Ｃ）−Ｄ・・・）には、２つの連続する光学的測定値は、同じモノマーからの寄与を含有する（この例では、両方の測定値は、ＢおよびＣからの寄与を含む）。上記の例は、ナノポアを通ってのポリマー転置の非常に単純化されたモデルに基づいている；しかしながら、連続重複光学的測定（successive  overlapping  optical  measurement）の概念は、ポリマー転置のより複雑な記載に適用できる。
【００４１】
ナノポアにおける複数の異なる標識モノマーからの発光が同じ分解能限界区域から生じるため、そのモノマーについての相対的位置情報（特に、配列情報）は、単一の光学的測定値から決定することができない。しかしながら、一部の実施形態では、重複、およびモノマー特異的シグナルを生成する標識の使用のために、配列情報は、光学的シグナル測定値の時間順序セットが、複数のモノマー特異的シグナルの時間順序セットへ分離される場合、光学的シグナル測定値の時間順序セットから決定され得る。ハイブリダイゼーションデータから標的ポリヌクレオチド配列を再構築するためのハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）に用いられるものと類似したアルゴリズムが、本明細書において標的ポリヌクレオチドを再構築するために用いられ得る（例えば、参照により組み込まれている、米国特許第５，００２，８６７号；Timpら、Biophys.  J.、１０２巻：Ｌ３７〜Ｌ３９（２０１２年）など）。（ｉ）時間順序重複シグナルおよび（ｉｉ）それらのモノマー特異的成分への分離の制約は、光学的検出の場合の決定ステップを有意に単純化する。
【００４２】
図６は、ナノポア転置の単純なモデルに基づいて重複光学的シグナルの時間順序セットからモノマー配列情報を決定するためのステップの一実施形態を図解する。この単純なモデルは、各時点（ポリマーのナノポアへの進入時点およびナノポアからの退出時点を除く）における光学的測定値がそれぞれ、同じ数のモノマーからのシグナル寄与を含有する（測定値が、ｎ個のモノマーからの寄与を含有することを示すために図６において「ｎ−タプル」と呼ばれている）ことを仮定する。より複雑なモデルが、各測定値における寄与するモノマーの異なる数、転置速度の局所的変動、モノマーの直線運動における偏向、および他の同様の現象を許容し得ることは理解される。すなわち、一部の実施形態では、異なる時点での光学的測定値は、異なる数のヌクレオチドからの寄与を有し得る。一部の実施形態では、異なる数のヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのセグメントに沿って順序付けられる。図６により図解された決定するステップは、標識ポリマーがナノポアを通過していること、および光学的測定値の時間順序セットが、光学的シグナルのモノマー特異的シグナルへの分離を含め、作成されていること（６００）を仮定する。ポリマーの進入および退出は、進入および退出の際、励起ゾーン（複数可）において必然的に、異なる数のモノマーがあるため、異なって処理される。この実施形態では、これらの条件下で最初と最後の光学的測定値は、最初と最後のモノマーがそれらのモノマー特異的シグナルから直接的に決定されることを可能にすると仮定される。他の実施形態では、分析のための標識ポリマーの調製は、配列決定ステップを助けるために光学的シグナルの既知の配列を生成することを目的として、斯かる標識ポリマーの一端または両端に複数の所定の標識ヌクレオチドの挿入を含み得る。斯かる所定の標識ヌクレオチドは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔまたは４５４シーケンシングにおける鍵となる配列に類似している（例えば、参照により組み込まれている、米国特許第７，５７５，８６５号）。
【００４３】
図６に戻ると、決定するステップの開始時点において、時間インデックス、ｉは、ゼロに設定される；本時点、ｉでの候補配列についてのインデックス、ｊは１に設定される（６０２）；そして、モノマー特異的時間順序光学的シグナルのセットの最初のｎ−タプルが調べられる（６０４）。斯かる試験は、時点ｉにおける測定値から、その測定値と一致するモノマーの全ての可能なモノマーのｎ−タプルをまず、決定し、その後、それらのｎ−タプルから、どれが、候補配列Ｓｉと適切に重複するかを決定することを含む。新しい候補配列Ｓｉ＋１が、その測定値と一致したセットについての各適切に重複しているｎ−タプルにより形成される（および配列Ｓｉが伸長される）（６０６）。新しく伸長した候補配列Ｓｉ＋１は保存され、時点ｉ＋１における候補配列の数を示すインデックス、Ｊｉ＋１が更新される（６０８）。このステップは、あらゆる候補配列、Ｓｉを調べ終えるまで繰り返され（６１０）、時間順序セットにおける各光学的測定値を調べ終えるまで、同様の調査が各時点ｉにおいて実行される。
ナノポアおよびナノポアアレイ
【００４４】
本発明で用いられるナノポアは、固体状態膜または同様のフレームワークに構成された、固体状態ナノポア、タンパク質ナノポア、あるいはタンパク質ナノポアまたは炭素もしくはグラフェンナノチューブ等の有機ナノチューブを含むハイブリッドナノポアであり得る。ナノポアの重要なフィーチャー（feature）は、ポリヌクレオチド等のポリマー分析物を、それらのモノマーがシグナル生成領域（または励起ゾーンなど）を順々に通過するように、すなわち、ヌクレオチド等のモノマーが１列縦隊で検出ゾーン（または励起領域または同様の領域）を通過するように、制約することを含む。一部の実施形態では、ナノポアの追加のフィーチャーは、一本鎖核酸を通過させるが、二本鎖核酸または同等に嵩高い分子を通過させないことを含む。他の実施形態では、ナノポア、特にタンパク質ナノポアは、それらの穿孔が、モノマーの標識が、ＦＲＥＴシグナルまたはさらに蛍光シグナルが抑制されるように立体的に制約されるようなサイズであるように選択され得る。
【００４５】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスに関連して使用されるナノポアは、平面状の表面に規則的に配置され得る、ナノポアのクラスターのアレイ等、アレイの形態で提供される。一部の実施形態では、異なるクラスターのナノポア由来の光学的シグナルが、用いられる光学的検出システムによって識別可能となるように、クラスターはそれぞれ、別々の分解能限界区域に存在するが、同じクラスター内のナノポア由来の光学的シグナルは、用いられる光学的検出システムによって斯かるクラスター内の特定のナノポアに必ずしも割り当てられ得ない。
【００４６】
固体状態ナノポアは、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）などが挙げられるがこれらに限定されない、種々の材料において製作することができる。ＤＮＡ配列決定等、分析的適用のためのナノポアの製作および操作は、参照により組み込む次の例示的な参考文献に開示されている：Ling、米国特許第７，６７８，５６２号；Huら、米国特許第７，３９７，２３２号；Golovchenkoら、米国特許第６，４６４，８４２号；Chuら、米国特許第５，７９８，０４２号；Sauerら、米国特許第７，００１，７９２号；Suら、米国特許第７，７４４，８１６号；Churchら、米国特許第５，７９５，７８２号；Bayleyら、米国特許第６，４２６，２３１号；Akesonら、米国特許第７，１８９，５０３号；Bayleyら、米国特許第６，９１６，６６５号；Akesonら、米国特許第６，２６７，８７２号；Mellerら、米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号；Howorkaら、国際特許公開ＷＯ２００９／００７７４３；Brownら、国際特許公開ＷＯ２０１１／０６７５５９；Mellerら、国際特許公開ＷＯ２００９／０２０６８２；Polonskyら、国際特許公開ＷＯ２００８／０９２７６０；Van  der  Zaagら、国際特許公開ＷＯ２０１０／００７５３７；Yanら、Nano  Letters、５巻（６号）：１１２９〜１１３４頁（２００５年）；Iqbalら、Nature  Nanotechnology、２巻：２４３〜２４８頁（２００７年）；Wanunuら、Nano  Letters、７巻（６号）：１５８０〜１５８５頁（２００７年）；Dekker、Nature  Nanotechnology、２巻：２０９〜２１５頁（２００７年）；Stormら、Nature  Materials、２巻：５３７〜５４０頁（２００３年）；Wuら、Electrophoresis、２９巻（１３号）：２７５４〜２７５９頁（２００８年）；Nakaneら、Electrophoresis、２３巻：２５９２〜２６０１頁（２００２年）；Zheら、J.  Micromech.  Microeng.、１７巻：３０４〜３１３頁（２００７年）；Henriquezら、The  Analyst、１２９巻：４７８〜４８２頁（２００４年）；Jagtianiら、J.  Micromech.  Microeng.、１６巻：１５３０〜１５３９頁（２００６年）；Nakaneら、J.  Phys.  Condens.  Matter、１５巻、Ｒ１３６５〜Ｒ１３９３頁（２００３年）；DeBloisら、Rev.  Sci.  Instruments、４１巻（７号）：９０９〜９１６頁（１９７０年）；Clarkeら、Nature  Nanotechnology、４巻（４号）：２６５〜２７０頁（２００９年）；Bayleyら、米国特許出願公開第２００３／０２１５８８１号；など。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の遮光層、すなわち、１つまたは複数の不透明層を有するナノポアアレイを含む。典型的には、ナノポアアレイは、例えば、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化アルミニウムなどの材料の薄いシートにおいて製作され、これは特に、使用される厚さ、例えば、５０〜１００ｎｍ未満の厚さでは光を容易に透過する。分析物の電気的検出のため、これは問題とならない。しかし、ナノポアを転置する標識された分子の光学に基づく検出において、アレイを透過する光は、意図される反応部位の外側で材料を一定に励起し、これにより、例えば、非特異的バックグラウンド蛍光、ナノポアに未だ進入していない分子の標識由来の蛍光などから光学的ノイズを生成する。一態様では、本発明は、励起ビームからの光を反射および／または吸収する１つまたは複数の遮光層を有するナノポアアレイを提供し、それにより、アレイのナノポアに関連した、意図される反応部位において生成される光学的シグナルについてのバックグラウンドノイズを低下させることにより、この問題に対処する。一部の実施形態では、これは、意図される反応部位における光学的標識が、直接的照射によって励起されることを可能にする。一部の実施形態では、不透明層は、金属層であってもよい。斯かる金属層は、Ｓｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。一部の実施形態では、斯かる金属層は、Ａｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。さらに他の実施形態では、斯かる金属層は、アルミニウムもしくは金を含むことができる、またはアルミニウムを唯一含むことができる。不透明層の厚さは、広く変更することができ、層を構成する材料の物理的および化学的特性に依存する。一部の実施形態では、不透明層の厚さは、少なくとも５ｎｍまたは少なくとも１０ｎｍまたは少なくとも４０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚さは、５〜１００ｎｍの範囲内であってもよい；他の実施形態では、不透明層の厚さは、１０〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。不透明層は、励起ビームからの光の１００パーセントを遮断（すなわち、反射または吸収）する必要はない。一部の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも１０パーセントを遮断することができ；他の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも５０パーセントを遮断することができる。
【００４８】
不透明層またはコーティングは、本技術分野で公知の種々の技法によって固体状態膜に製作することができる。化学的蒸着、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸発およびスパッタリングを含む物理的蒸着、鋳造などを含む、材料沈着技法を使用することができる。一部の実施形態では、原子層沈着を使用することができ、例えば、米国特許第６，４６４，８４２号；Weiら、Small、６巻（１３号）：１４０６〜１４１４頁（２０１０年）を参照により組み込む。
【００４９】
一部の実施形態では、１〜１００ｎｍのチャネルまたは開口部は、膜等の固体基材、通常、平面基材を貫いて形成され得、それを通って、一本鎖ＤＮＡ等の分析物が転置するように誘導される。他の実施形態では、２〜５０ｎｍのチャネルまたは開口部が、基材を貫いて形成され、さらに他の実施形態では、基材を貫いて形成される場合には、２〜３０ｎｍ、または２〜２０ｎｍ、または３〜３０ｎｍ、または３〜２０ｎｍ、または３〜１０ｎｍのチャネルまたは開口部が形成される。ナノポアを生成する固体状態アプローチは、頑強性および耐久性、ならびにナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハスケールでナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質に基づくシステムと比較して優れた機械的、化学的および熱的特徴、ならびに電子的または光学的読み取り技法と統合する可能性を提案する。他方では、生物学的ナノポアは、特に、１〜１０ナノメートル範囲内の、再現性のある狭い穿孔または管腔を提供すると共に、ナノポアの物理的および／または化学的特性を仕立てるため、ならびに従来のタンパク質工学方法によってＦＲＥＴドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光標識等の化学基または要素を直接的にまたは間接的に結合させるための技法を提供する。タンパク質ナノポアは典型的に、機械的支持のために繊細な脂質二重層に頼り、正確な寸法を有する固体状態ナノポアの製作は、依然として難易度が高い。一部の実施形態では、固体状態ナノポアは、生物学的ナノポアと組み合わせて、これらの弱点のいくつかを克服する、いわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成し、これにより、生物学的ポアタンパク質の正確さに、固体状態ナノポアの安定性を付与することができる。光学的読み取り技法のため、ハイブリッドナノポアは、データ取得を大幅に単純化するナノポアの正確な位置を提供する。
【００５０】
一部の実施形態では、クラスターは、開口部のアレイを含有する固相膜によって支持された脂質二重層にタンパク質ナノポアを配置することによって形成することもできる。例えば、斯かるアレイは、固相支持体において製作された（例えば、穿孔された、エッチングされたなど）開口部を含むことができる。斯かる開口部の幾何学的配置は、用いられた製作技法に応じて変更し得る。一部の実施形態では、斯かる開口部のそれぞれは、別々の分解能限界区域に会合されるまたはこれによって包含される；しかし、他の実施形態では、複数の開口部が、同じ分解能限界区域内に存在してもよい。開口部の断面積は、広く変更することができ、異なるクラスター間で同じであっても同じでなくてもよいが、斯かる面積は通常、従来の製作アプローチの結果として実質的に同じである。一部の実施形態では、開口部は、１０ｎｍから２００ｎｍまでの範囲の最小直線寸法（例えば、円形開口部の場合の直径）を有し、または約１００ｎｍ２から３×１０４ｎｍ２までの範囲の区域を有する。開口部にわたって、脂質二重層が配置され得る。開口部あたりのタンパク質ナノポアの分布は、例えば、挿入ステップの際にタンパク質ナノポアの濃度を制御することにより変更され得る。斯かる実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含むことができる。タンパク質ナノポアが開口部にランダムに挿入する一部の実施形態では、平均して１個または複数の開口部を含有するクラスターは、ゼロを超えるいくつかのタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．２５を超えるいくつかのタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．５を超えるいくつかのタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．７５を超えるいくつかのタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、１．０を超えるいくつかのタンパク質ナノポアを有する。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、第１のチャンバおよび第２のチャンバ（「シスチャンバ」および「トランスチャンバ」と称される場合もある）の間に連通（communication）を提供する、そこを通る開口部のアレイを有し、第２のチャンバすなわちトランスチャンバに直面する表面上で脂質二重層を支持する、ＳｉＮ膜等の固相膜を含む。一部の実施形態では、斯かる固相膜における開口部の直径は、１０〜２００ｎｍの範囲内または２０〜１００ｎｍの範囲内であってもよい。一部の実施形態では、斯かる固相膜は、斯かる二重層が、トランスチャンバに直面する表面における開口部に及ぶ領域において脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアをさらに含む。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、本明細書に記載されている技法を使用して、固相膜のシス側面から挿入される。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたは穿孔を含み、一端に「キャップ」構造を有し、他端に「ステム」構造を有するという点で、α−ヘモリジンと同一または同様の構造を有する（Songら、Science、２７４巻：１８５９〜１８６６頁（１９９６年）の用語法を使用）。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアを使用すると、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバに曝露され、そのステム構造がトランスチャンバに曝露されるように配向されたタンパク質ナノポアをもたらす。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明は、特に、ポリヌクレオチドの光学に基づくナノポア配列決定のために、クラスターにおけるハイブリッドナノポアを用いることができる。斯かるナノポアは、タンパク質ナノポア等のタンパク質バイオセンサが安定的に挿入された、固体状態オリフィスまたは開口部を含む。荷電ポリマーは、従来のタンパク質工学技法によってタンパク質ナノポア（例えば、アルファヘモリジン）に結合させることができ、その後、印加した電界を使用して、固体状態膜における開口部にタンパク質ナノポアをガイドすることができる。一部の実施形態では、固体状態基材における開口部は、タンパク質よりも僅かに小さくなるように選択され、これにより、これが開口部を通して転置することを防止する。その代わりに、タンパク質は、固体状態オリフィスに包埋される。
【００５３】
一部の実施形態では、ドナーフルオロフォアは、タンパク質ナノポアに結合させる。次に、この複合体は、タンパク質ナノポアが固体状態ナノホールに輸送されてハイブリッドナノポアを形成するまで、固体状態ナノホールまたは開口部にわたり電界を印加することにより、固体状態開口部またはナノホール（例えば、３〜１０ｎｍの直径）に挿入される。ハイブリッドナノポアの形成は、（ａ）固体状態ナノホールの部分的遮断に基づく電流の降下を引き起こす挿入されたタンパク質ナノポア、および（ｂ）ドナーフルオロフォアの光学的検出によって検証することができる。
【００５４】
固体状態または合成のナノポアは、上に引用されている参考文献において例証される通り、種々の方法で調製する（preprared）ことができる。一部の実施形態では、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、例えば、参照により本明細書に組み込むYangら、Nanotechnolgy、２２巻：２８５３１０頁（２０１１年）によって開示される通り、種々の材料において合成ナノポアを穿孔することができる。独立した膜となるように加工された薄膜材料、例えば、窒化ケイ素の１個または複数の領域を支持するチップが、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバに導入される。顕微鏡を、低倍率に設定する一方で、ＨＩＭモーター制御を使用して、イオンビームの通路に独立した膜をもたらす。焦点および非点収差（stigmation）を含むビームパラメータは、独立した膜に隣接する領域において、ただし、固体基材上で調整される。パラメータが適切に固定されたら、独立した膜領域がイオンビーム走査領域の中央に置かれ、ビームがブランキングされるように、チップ位置が移動される。ＨＩＭ視野は、予期されるナノポアパターン全体を含有するのに十分であり、将来的な光学的読み取りにおいて有用となるのに十分な（すなわち、光学的倍率、カメラ分解能等に依存する）寸法（μｍ単位の）に設定される。次に、イオンビームは、ピクセル滞留時間において視野全体にわたって１回ラスターされ、これは、膜自己蛍光の全てまたは大部分の除去に十分な総イオン線量をもたらす。次に、視野は、単一のナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかのリソグラフィーにより画定されたミリングの実行に適切な値（上で使用されるものよりも小さい）に設定される。パターンのピクセル滞留時間は、試料加工に先立つ較正試料の使用により決定される、１個または複数の所定の直径のナノポアをもたらすように設定される。このプロセス全体は、単一のチップにおける所望の領域毎に、および／またはＨＩＭチャンバ内に導入されたチップ毎に反復される。
【００５５】
一部の実施形態では、ナノポアは、光学に基づくナノポア配列決定方法における使用のために結合させた１個または複数の標識を有することができる。標識は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアのメンバーであってもよい。斯かる標識は、有機フルオロフォア、化学発光標識、量子ドット、金属性ナノ粒子および／または蛍光タンパク質を含むことができる。標的核酸は、ヌクレオチドにつき１個の別個の標識を有することができる。ヌクレオチドに結合させた標識は、有機フルオロフォアからなる群から選択され得る。ポアタンパク質における標識結合部位は、従来のタンパク質工学方法によって生成することができ、例えば、標識の特異的結合を可能にする変異体タンパク質を構築することができる。例として、タンパク質の所望の位置にシステイン残基を挿入することができ、これにより、標識の結合に使用することができるチオール（ＳＨ）基を挿入する。システインは、天然起源のアミノ酸を置き換えてもよく、または付加アミノ酸として取り込まれてもよい。次に、マレイミド活性化標識は、タンパク質ナノポアのチオール残基に共有結合により結合させる。好まれる実施形態では、タンパク質ナノポアへの標識の結合または核酸における標識は、可逆的である。切断可能クロスリンカーを与えることにより、容易に破壊できる化学結合（例えば、Ｓ−Ｓ結合またはｐＨに不安定な結合）が導入され、対応する条件が満たされたときに、標識を除去することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、励起ビームが送達され、光学的シグナル収集が単一の対物レンズを通して生じる落射照明システムが、ポリマー分析物上の標識またはナノポア上のドナーの直接的照明に用いられ得る。本発明で用いられる共焦点落射照明システムの基本的構成要素は図４に図解されている。励起ビーム（４０２）が二色性ミラー（４０４）を通って、対物レンズ（４０６）上へと通過し、その対物レンズが、励起ビーム（４０２）を層状膜（４００）上へ集束させ（４１０）、その層状膜において、標識が直接的に励起されて、蛍光シグナル等の光学的シグナルを放出し、または（of）ＦＲＥＴ相互作用により間接的に励起されて、光学的シグナルを放出する。斯かる光学的シグナルは、対物レンズ（４０６）により収集されて、二色性ミラー（４０４）へ向けられ、二色性ミラーは、励起ビーム（４０２）の光を通過させるが、光学的シグナル（４１１）の光を反射するように選択される。反射された光学的シグナル（４１１）は、レンズ（４１４）を通過して、レンズは、それを、ピンホール（４１６）を通して、検出器（４１８）上へ集束させる。
【００５７】
一部の実施形態では、ポリマー（例えば、一本鎖ポリヌクオチド）を分析するための上記方法を実行するためのデバイスは、典型的には、層状膜およびナノポアにわたる電界を確立するための１セットの電極を含む。一本鎖核酸は、それらを第１のチャンバにおける電解質中に置くことによりナノポアに曝露され、その第１のチャンバは、そのチャンバにおける負電極の配置により層状膜の「シス」側として構成される。電界の印加により、負に帯電した一本鎖核酸は、ナノポアにより捕捉されて、層状膜の他方側の第２のチャンバへ転置され、その第２のチャンバは、そのチャンバにおける正電極の配置により膜の「トランス」側として構成される。転置のスピードは、第１および第２のチャンバ中の電解質のイオン強度、ならびにナノポアにわたり印加された電圧に部分的に依存する。光学に基づいた検出において、転置速度は、予備的較正測定により、例えば、異なる電圧についてナノポアあたりの異なる速度でシグナルを生成する標識された一本鎖核酸の所定の標準を用いて、選択され得る。よって、ＤＮＡ配列決定適用のため、転置スピードは、斯かる較正測定からのシグナル速度に基づき選択され得る。結果として、斯かる測定から、例えばナノポアのアレイにわたって、信頼できるヌクレオチド同定を可能にし、または最大にする電圧が選択され得る。一部の実施形態では、斯かる較正は、（所定の標準配列の代わりに、またはそれに加えて、）分析されることになっている鋳型の試料由来の核酸を用いてなされ得る。一部の実施形態では、斯かる較正は、配列決定ランの際にリアルタイムで行うことができ、印加された電圧は、斯かる測定に基づき、例えば、ヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化するように、リアルタイムで修飾することができる。
【００５８】
ナノポアを通ってのポリマー転置速度の制御は、そこから配列情報を得ることができる、データの収集を可能にするのに必要である。転置速度は、ナノポアにわたる電圧差（または電界強度）、および核酸ポリマーが、（例えば、第１のチャンバの１つの壁を作り上げる固相膜内に配置された）ナノポアに曝露される第１のチャンバの反応混合物における条件に一部、依存する。ナノポアによる核酸ポリマー捕捉速度は、斯かるポリマーの濃度に依存する。一部の実施形態では、ナノポア配列決定についての従来の反応混合物の条件が、本発明で使用され得、例えば、１Ｍ  ＫＣｌ（または等価の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌなど）および（例えば、用いられることになっているタンパク質、例えば、タンパク質ナノポア、ヌクレアーゼなどが変性されないことを保証する）ｐＨ緩衝系である。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝系を使用して、６．８〜８．８の範囲内の値に実質的に一定にｐＨを維持することができる。一部の実施形態では、ナノポアにわたる電圧差は、７０〜２００ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態では、ナノポアにわたる電圧差は、８０〜１５０ｍＶの範囲内であってもよい。操作に適切な電圧は、従来の測定技術を用いて選択され得る。ナノポアにわたる電流（または電圧）は、市販の機器を使用して容易に測定することができる。転置スピードが所望の範囲内となるように、電圧差を選択することができる。一部の実施形態では、転置スピードの範囲は、毎秒１０００ヌクレオチド未満のスピードを含む。他の実施形態では、転置スピードの範囲は、毎秒１０〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、転置スピードの範囲は、毎秒１０〜６００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、転置スピードの範囲は、毎秒２００〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、転置スピードの範囲は、毎秒２００〜５００ヌクレオチドである。
ナノポアおよびポリマーのための標識
【００５９】
一部の実施形態では、ナノポアは、１種または複数種の量子ドットで標識することができる。特に、一部の実施形態では、１種または複数種の量子ドットは、ナノポアに結合させることができる、またはナノポアに隣接する（およびナノポアの入口または出口のＦＲＥＴ距離内の）固相支持体に結合させることができ、分析物におけるアクセプターとのＦＲＥＴ反応におけるドナーとして用いることができる。量子ドットの斯かる使用は、周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，２５２，３０３号；同第６，８５５，５５１号；同第７，２３５，３６１号；等、科学および特許文献に広く記載されている。
【００６０】
ポア標識として利用され得る量子ドットの一例は、水溶液において合成され得るＣｄＴｅ量子ドットである。ＣｄＴｅ量子ドットは、一級アミン、チオール等の求核基またはカルボン酸等の官能基で機能させ得る。ＣｄＴｅ量子ドットは、タンパク質ポアの外部における一級アミンへの量子ドットの共有結合による連結に利用され得るカルボン酸官能基を有するメルカプトプロピオン酸キャッピングリガンドを含むことができる。架橋反応は、バイオコンジュゲーションの技術分野の当業者に公知の標準架橋試薬（ホモ二官能性およびヘテロ二官能性）を使用して達成することができる。修飾が、ナノポアを通した核酸の転置を損なわないまたは実質的に損なわないことを確実にするためには注意を要し得る。これは、ナノポアへのドナー標識の結合に使用される、用いられているクロスリンカー分子の長さを変えることにより達成することができる。
【００６１】
例えば、天然アルファヘモリジンタンパク質のリシン残基１３１の一級アミン（Song,  L.ら、Science  ２７４巻（１９９６年）：１８５９〜１８６６頁）を使用して、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）カップリング化学により、カルボキシ修飾ＣｄＴｅ量子ドットを共有結合することができる。あるいは、アミノ酸１２９（スレオニン）を、システインへと交換することができる。天然アルファヘモリジンタンパク質には他のシステイン残基が存在しないため、新たに挿入されたシステインのチオール側基を使用して、他の化学部分を共有結合により結合させることができる。
【００６２】
生物学的ポリマー、例えば、核酸分子またはポリマーは、１種または複数種のアクセプター標識で標識することができる。核酸分子のため、核酸分子の４種のヌクレオチドまたは基本要素のそれぞれをアクセプター標識で標識し、これにより、各天然起源のヌクレオチドに対する標識された（例えば、蛍光）対応物を作製することができる。アクセプター標識は、変換された核酸の部分または鎖全体における１個または複数のヌクレオチドに結合させることができる、エネルギー受容分子の形態であってもよい。
【００６３】
種々の方法を利用して、核酸分子またはポリマーのモノマーまたはヌクレオチドを標識することができる。標識されたヌクレオチドは、鋳型として元の試料を使用した新たな核酸の合成の際に核酸に取り込むことができる（「合成による標識」）。例えば、核酸の標識は、ＰＣＲ、全ゲノム増幅、ローリングサークル増幅、プライマー伸長などにより、または当業者に公知の上述の方法の様々な組合せおよび拡張により達成することができる。
【００６４】
標識は、求核剤（アミン、チオール等）等の反応基を含むことができる。次に、天然の核酸には存在しない斯かる求核剤を使用して、例えば、ＮＨＳエステル、マレイミド、エポキシ環、イソシアネート等、アミンまたはチオール反応化学により蛍光標識を結合させることができる。斯かる求核剤反応性蛍光色素（すなわち、ＮＨＳ−色素）は、異なる供給源から容易に商業的に入手することができる。小型の求核剤で核酸を標識する利点は、「合成による標識」アプローチが使用される場合の、斯かる標識されたヌクレオチドの取り込みの高い効率にある。嵩高い蛍光標識された核酸基本要素は、新たに合成されたＤＮＡへの重合プロセスの際の標識の立体障害のために、ポリメラーゼによる取り込みが不十分な場合がある。
【００６５】
２種またはそれよりも多い相互にクエンチする色素が使用される場合は常に、斯かる色素は、オルトゴナル結合化学（orthogonal  attachment  chemistry）を使用してＤＮＡに結合させることができる。例えば、ＮＨＳエステルを使用して、一級アミンと非常に特異的に反応させることができる、またはマレイミドは、チオール基と反応する。一級アミン（ＮＨ２）またはチオール（ＳＨ）修飾ヌクレオチドのどちらも市販されている。これらの相対的に小型の修飾は、ポリメラーゼ媒介性ＤＮＡ合成において容易に取り込まれ、ＮＨＳまたはマレイミド修飾色素のいずれかを使用して、その後の標識反応に使用することができる。斯かるオルトゴナルリンカー化学を選択および使用するためのガイダンスは、Hermanson（上に引用）に見出すことができる。
【００６６】
典型的な結合位置のための追加的なオルトゴナル結合化学は、銅触媒反応および無触媒反応のためのヒュスゲン型環化付加；例えば、Gutsmiedlら、Org.  Lett.、１１巻：２４０５〜２４０８頁（２００９年）に開示されているアルケンプラス酸化ニトリル環化付加；例えば、Seeligら、Tetrahedron  Lett.、３８巻：７７２９〜７７３２頁（１９９７年）に開示されているディールスアルダー環化付加；例えば、Casiら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１３４巻：５８８７〜５８９２頁（２０１２年）；Shaoら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１１７巻：３８９３〜３８９９頁（１９９５年）；Rideout、Science、２３３巻：５６１〜５６３頁（１９８６年）に開示されているカルボニルライゲーション；例えば、Brinkley、Bioconjugate  Chemistry、３巻：２〜１３頁（１９９２年）に開示されているマイケル付加；例えば、Schulerら、Bioconjugate  Chemistry、１３巻：１０３９〜１０４３頁（２００２年）；Dawsonら、Science、２６６巻：７７６〜７７９頁（１９９４年）に開示されているネイティブケミカルライゲーション；または例えば、Hermanson（上に引用）に開示されている活性エステルを介したアミド形成を含む。
定義
【００６７】
「エバネッセント場」は、非伝搬電磁場を意味する；すなわち、それは、ポインティングベクトルの平均値がゼロである電磁場である。
【００６８】
「ＦＲＥＴ」または「フェルスターまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起されたドナーフルオロフォアから基底状態のアクセプターフルオロフォアへの、無放射双極子−双極子エネルギー移動機構を意味する。ＦＲＥＴ相互作用におけるエネルギー移動の速度は、アクセプターの吸収スペクトルとドナーの放射スペクトルとのスペクトル重複の程度、ドナーの量子収率、ドナーおよびアクセプター遷移双極子の相対的配向性、ならびにドナー分子およびアクセプター分子の間の距離に依存する；Lakowitz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）。特に興味深いＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターに移動され、次いで、そのドナーを励起する光（すなわち、「ＦＲＥＴシグナル」）のそれよりも低い周波数を有する光子としてアクセプターによって放出されるエネルギーの部分を生じる相互作用である。「ＦＲＥＴ距離」は、ＦＲＥＴ相互作用が起こり得、検出可能なＦＲＥＴシグナルがＦＲＥＴアクセプターによって生じ得る、ＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターの間の距離を意味する。
【００６９】
「キット」は、本発明の方法を行うための材料または試薬を送達するためのいずれかの送達系を指す。反応アッセイの文脈において、斯かる送達系は、ある位置から別の位置への、反応試薬（例えば、適切な容器内の、相互にクエンチする蛍光標識等の蛍光標識、蛍光標識連結剤、酵素等）および／または支持材料（例えば、バッファー、アッセイを行うための書面の指示等）の貯蔵、輸送または送達を可能にする系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１個または複数の同封物（例えば、箱）を含む。斯かる内容物は、一緒にまたは別々に、意図されるレシピエントに送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含有することができ、一方、第２またはそれよりも多い容器は、相互にクエンチする蛍光標識を含有する。
【００７０】
「ナノポア」は、所定のまたは識別できる順序での基材を通した分析物の通過を可能にする、あるいはポリマー分析物の場合は、所定の（pretermined）または識別可能な順序での基材を通したそのモノマー単位の通過を可能にする、基材に位置するいずれかの開口を意味する。後者の場合、所定のまたは識別可能な順序は、ポリマーにおけるモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例として、タンパク質性またはタンパク質に基づくナノポア、合成または固体状態ナノポア、およびタンパク質ナノポアが包埋された固体状態ナノポアを含むハイブリッドナノポアが挙げられる。ナノポアは、１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍの内径を有することができる。タンパク質ナノポアの例として、例えば、参照により本明細書に組み込むRhee,  M.ら、Trends  in  Biotechnology、２５巻（４号）（２００７年）：１７４〜１８１頁；Bayleyら（上に引用）；Gundlachら、米国特許出願公開第２０１２／００５５７９２号；などに開示されている、アルファ−ヘモリジン、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡおよびＬａｍＢ（マルトポリン）が挙げられるがこれらに限定されない。単一の核酸分子の転置を可能にするいずれかのタンパク質ポアを用いることができる。ナノポアタンパク質は、ポア外部の特異的部位において、またはポア形成タンパク質を構成する１個もしくは複数のモノマー単位外部の特異的部位において、標識することができる。ポアタンパク質は、アルファ−ヘモリジン、ＭｓｐＡ、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、炭疽ポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびＬａｍＢ（マルトポリン）等であるがこれらに限定されない、タンパク質の群から選択される。固体状態の孔へのポアタンパク質の組み込みは、荷電ポリマーをポアタンパク質に結合させることにより達成される。電界を印加した後に、荷電複合体は、固体状態の孔内に電気泳動的に引き入れられる。合成ナノポアまたは固体状態ナノポアは、様々な形態の固体基材に作製することができ、その例として、シリコーン（例えば、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３）  プラスチック、ガラス、半導体材料およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。合成ナノポアは、脂質二重層膜に位置する生物学的タンパク質ポアよりも安定的であってもよい。合成ナノポアは、重合したエポキシ等であるがこれに限定されない、適した基材に包埋されたカーボンナノチューブを使用することにより作製することもできる。カーボンナノチューブは、均一かつ明確に定義された化学的および構造的特性を有することができる。１〜数百ナノメートルに及ぶ、様々なサイズのカーボンナノチューブを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、結果として、ナノポアを通した核酸の電気泳動的輸送は、単純かつ予測可能になる（Ito,  T.ら、Chem.  Commun.１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの基材表面は、タンパク質ポアの共有結合による結合を可能にするために、または表面特性を光学的ナノポア配列決定に適したものにするために化学修飾されていてよい。斯かる表面修飾は、共有結合または非共���結合であってもよい。大部分の共有結合修飾は、オルガノシラン沈着を含み、これに関する最も一般的なプロトコールについて記載する：１）水性アルコールからの沈着。これは、シリル化表面を調製するための最も手軽な方法である。９５％エタノール−５％水の溶液は、ｐＨ４．５〜５．５となるように酢酸で調整される。撹拌しつつシランを添加して、２％最終濃度を得る。加水分解およびシラノール基形成後に、基材を２〜５分間添加する。エタノールに短時間浸漬することにより過剰な材料をすすぎ出した。シラン層の硬化は、５〜１０分間、１１０℃で為される。２）気相沈着。シランは、化学的蒸着方法によって乾燥非プロトン性条件下で基材に適用することができる。このような方法は、単層沈着に好都合である。閉鎖チャンバデザインにおいて、基材は、５ｍｍ蒸気圧の達成に十分な温度まで加熱される。あるいは、シラン蒸発が観察されるまで真空状態にすることができる。３）スピンオン沈着。スピンオン適用は、最大の機能化および多層沈着に好都合な加水分解性条件下で、または単層沈着に好都合な乾燥条件下で為すことができる。一部の実施形態では、本発明の方法により単一のナノポアが用いられる。他の実施形態では、複数のナノポアが用いられる。後者の実施形態の一部では、複数のナノポアは、通常、固相膜等の平面状基材に配置された、ナノポアのアレイとして用いられる。ナノポアアレイのナノポアは、例えば、直線的パターンで、規則的に間隔をあけていてよい、またはランダムに間隔をあけていてよい。好まれる実施形態では、ナノポアは、平面状固相基材において直線的パターンで規則的に間隔をあける。
【００７１】
「ナノ構造体」（「ナノスケール構造体」および「ナノスケールフィーチャー」と互換的に使用される）は、数ナノメートル〜数百ナノメートル、例えば、１〜１０００ナノメートルの範囲内の少なくとも一寸法を有する構造を意味する。一部の適用では、斯かる範囲は、２〜５００ナノメートルであり；他の適用では、斯かる範囲は、３〜５００ナノメートルである。ナノ構造体の形状および幾何学的配置は、広く変更し得、ナノポア、ナノウェル、ナノ粒子、および一連の反応の実行に特に適した他のいずれかの簡便な形状が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ナノ構造体は、固相膜と操作的に会合したタンパク質ナノポアであってもよい。ナノポアおよびナノウェル等、一部のナノ構造体は、固相膜または他の固体等、より大型の共通の基材に形成されて、ナノポアまたはナノウェルのアレイを形成することができる。特に興味深いナノ構造体は、化学的、物理的（例えば、ＦＲＥＴ）、酵素的および／または結合反応物、または一連の斯かる反応物を支持または含有することができるナノ構造体である。一部の実施形態では、ナノウェル等、ナノ構造体は、１ナノリットル（１０−９リットル）未満の、１ピコリットル未満のまたは１フェムトリットル未満の容量を封入する。他の実施形態では、個々のナノウェルのそれぞれは、１０００ゼプトリットル未満の、１００ゼプトリットル、８０ゼプトリットルまたは５０ゼプトリットル未満のまたは１ゼプトリットル未満の、またはさらには１００ヨクトリットル（yactoliter）未満の容量を提供する。一部の実施形態では、ナノウェルは、ゼロモード導波路を含む。
【００７２】
「ポリマー」は、線形の鎖となるよう接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含むポリヌクレオチドとして、または２種類以上のアミノ酸を含むポリペプチドとして、２つの型以上のモノマーを含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体またはアナログ、ならびにアミノ酸ならびにその誘導体およびアナログを限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、ポリマーは、ホスホジエステル連結によってヌクレオシドモノマーが接続されたポリヌクレオチドまたはそのアナログである。
【００７３】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの線形ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、例えば、ワトソンクリック型の塩基対形成、塩基のスタッキング、フーグスティーンまたはリバースフーグスティーン型の塩基対形成等、モノマー対モノマーの相互作用の規則的パターンにより天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。斯かるモノマーおよびそのヌクレオシド間連結は、天然起源またはそのアナログ、例えば、天然起源のまたは非天然起源のアナログであってもよい。非天然起源のアナログは、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、フルオロフォアまたはハプテン等の標識の結合を可能にする連結基を含有する塩基などを含むことができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、例えば、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーション等、酵素による加工を要求する場合は常に、当業者は、これらの事例におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、いずれかまたは一部の位置に、ヌクレオシド間連結、糖部分または塩基のある特定のアナログを含有しないことを理解するはずである。ポリヌクレオチドは典型的に、「オリゴヌクレオチド」と通常称される場合の数個のモノマー単位、例えば、５〜４０個から、数千個のモノマー単位まで、サイズに幅がある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」等、文字（大文字または小文字）の配列によって表される場合は常に、ヌクレオチドが、左から右へ５’→３’順序であり、他に示されていなければ、または文脈から明らかでなければ、「Ａ」が、デオキシアデノシンを表示し、「Ｃ」が、デオキシシチジンを表示し、「Ｇ」が、デオキシグアノシンを表示し、「Ｔ」が、チミジンを表示し、「Ｉ」が、デオキシイノシンを表示し、「Ｕ」が、ウリジンを表示することが理解される。他に記されていなければ、用語法および原子番号付けの慣習は、StrachanおよびRead、Human  Molecular  Genetics  2（Wiley-Liss、New  York、１９９９年）に開示されているものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル連結によって連結された４種の天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡはこれらのリボース対応物）を含む；しかし、これは、例えば、修飾された塩基、糖またはヌクレオシド間連結を含む、非天然ヌクレオチドアナログを含むこともできる。当業者には、酵素が、活性のために特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件を有する場合（例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスなど）、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、十分に、当業者の知識範囲内、特に、Sambrookら、Molecular  Cloning、第２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York、１９８９年）および同様の参考文献等、専門書からのガイダンス内であることが明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖型または二本鎖型（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそれぞれの相��体のデュプレックス）のいずれかを指すことができる。当業者には、用語使用の文脈から、いずれの型が、または両方の型が意図されているかどうかが明らかである。
【００７４】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とデュプレックスを形成した後に、核酸合成の開始点として作用することができ、伸長されたデュプレックスが形成されるように鋳型に沿ってその３’端から伸長されることができる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は通常、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ等、核酸ポリメラーゼにより行われる。伸長プロセスにおいて付加されたヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲内または１８〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用した線形増幅反応、または２種またはそれよりも多いプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の適用のためのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参照により組み込む次の参考文献によって証明される通り、当業者には周知である：Dieffenbach編、PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual、第２版（Cold  Spring  Harbor  Press、New  York、２００３年）。
【００７５】
「分解能限界区域」は、個々のフィーチャーまたは発光源が光学的シグナル検出システムにより識別することができない、ナノポアまたはナノウェルアレイの表面の区域である。理論によって限定されることを意図するものではないが、斯かる分解能限界区域は、光学的システムの分解能限界（「回折限界」または「回折バリア」とも時々呼ばれる）により決定される。斯かる限界は、発光源および光学的成分の波長により決定され、ｄ＝λ／ＮＡ（式中、ｄは分解され得る最小のフィーチャーであり、λは光の波長であり、ＮＡは、光を集束させるために用いられる対物レンズの開口数である）により定義され得る。したがって、２つまたはそれより多くのナノポアが分解能限界区域内にあり、２つまたはそれより多くの光学的シグナルがそれぞれのナノポアで生成されるときはいつでも、光学的検出システムは、どの光学的シグナルがどのナノポアから来たのかを識別または決定することができない。本発明によれば、ナノポアアレイの表面は、分解能限界区域に対応する、重複していない領域、または実質的に重複していない領域へ分割または細分され得る。分解能限界区域に対応する斯かる細分のサイズは、使用される特定の光学的検出システムに依存し得る。一部の実施形態では、発光源が可視スペクトル内にあるときはいつでも、分解能限界区域は、３００ｎｍ２から３．０μｍ２までの範囲である；他の実施形態では、分解能限界区域は、１２００ｎｍ２から０．７μｍ２の範囲である；他の実施形態では、分解能限界区域は、３×１０４ｎｍ２から０．７μｍ２までの範囲であり、区域の前述の範囲は、ナノポアまたはナノウェルアレイの表面に関連している。一部の実施形態では、可視スペクトルは、約３８０ｎｍから約７００ｎｍまでの範囲の波長を意味する。
【００７６】
ポリヌクレオチドに関連した「配列の決定」、「配列決定」または「ヌクレオチド配列の決定」などの用語は、ポリヌクレオチドの部分的および完全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、例えば、標的ポリヌクレオチドの単にＡおよびＣの配列等、４種の天然ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの完全セットのサブセットの配列を含む。すなわち、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち１、２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、配列の決定は、その配列が、２進コード、例えば、「ｃ−（非ｃ）（非ｃ）ｃ−（非ｃ）−ｃ．．．」を表す「１００１０１．．．」などとして表されるような、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内における単一の種類のヌクレオチド、例えば、シトシンの順序付けおよび位置を同定することにより達成することができる。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチドのためのフィンガープリントとして機能する標的ポリヌクレオチドの部分配列を含むこともできる；すなわち、ポリヌクレオチドのセット、例えば、細胞によって発現される全て異なるＲＮＡ配列内で、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを一意的に同定する部分配列。
【００７７】
本開示は、明記されている特定の形態の範囲に限定されることを意図しないが、本明細書に記載されている変種の代替物、修飾および均等物を網羅することを意図する。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮することにより当業者にとって明らかとなり得る他の変種を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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