(57)【要約】  本発明は、酵母細胞の改善された酵母形質転換と、それによって形質転換された酵母細胞ライブラリーに関する。より具体的には、本発明は、電気穿孔による酵母の形質転換に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）酵母細胞を１．０〜２のＯＤ６００に培養するステップと；
ｂ）前記細胞を冷水で洗浄するステップと；
ｃ）前記細胞をソルビトールとＣａＣｌ２とを含んでなる冷溶液で洗浄するステップと；
ｄ）前記細胞を酢酸リチウムとトリス２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とを含んでなる溶液中でインキュベートするステップと；
ｅ）前記細胞をソルビトールとＣａＣｌ２とを含んでなる冷溶液で洗浄するステップと；
ｆ）前記細胞をソルビトールを含んでなる溶液に再懸濁するステップと；
ｇ）任意選択的に、前記細胞を適切に保存するステップと
を含んでなる、エレクトロコンピテント酵母細胞を調製する方法。
【請求項２】
ａ）請求項１に記載の方法によるエレクトロコンピテント酵母細胞を提供するステップと；
ｂ）前記細胞をソルビトールを含んでなる冷溶液で洗浄するステップと；
ｃ）前記細胞を形質移入されるＤＮＡと混合し、電気穿孔前混合物を形成するステップと；
ｄ）前記電気穿孔前混合物を適切な電気穿孔キュベットに移し入れるステップと；
ｅ）前記細胞を２．５ｋＶ／ｃｍ〜１２．５ｋＶ／ｃｍで２〜５ミリ秒間電気穿孔するステップと
を含んでなる、エレクトロコンピテント酵母細胞を形質移入する方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが線状または環状である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、例えば酵母表面ディスプレイライブラリーの形態である、目的のタンパク質のライブラリーをコードするＤＮＡ断片のライブラリーを含んでなる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ディスプレイライブラリーが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ライブラリーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換効率が、１×１０８酵母形質転換体／μｇベクターＤＮＡよりも高く、好ましくは２×１０８酵母形質転換体／μｇベクターＤＮＡよりも高い、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法
【請求項７】
ａ）請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法による形質移入された酵母細胞を提供するステップと；
ｂ）前記形質移入細胞を増殖培地中でソルビトール溶液の１：１混合物に希釈するステップと；
ｃ）細胞を適切な増殖培地中に再懸濁するステップと；
ｄ）任意選択的に、多様性の計算のために希釈を実施して、前記希釈液をカナマイシンを含有するＳＤ−ＣＡＡプレート上播に種するステップと；
ｅ）前記ライブラリーを適切な増殖培地に移し入れ、前記ライブラリーを電気穿孔毎に拡大するステップと；
ｆ）任意選択的に、前記拡大されたイブラリーを適切に保存するステップと
を含んでなる、例えば酵母表面ディスプレイライブラリーの形態である、目的のタンパク質の改善された酵母ライブラリーを生成する方法。
【請求項８】
前記ディスプレイライブラリーが、Ｔ細胞受容体ライブラリーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ライブラリーの多様性が、１０１２よりも高い、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母細胞の改善された酵母形質転換と、それによって形質転換された酵母細胞ライブラリーに関する。より具体的には、本発明は、電気穿孔による酵母の形質転換に関する。
【背景技術】
【０００２】
多年にわたり、がん治療の基礎は、手術、化学療法、および放射線療法であった。過去１０年間にわたり、主にそれらの細胞上に見られる特定の分子変化を追尾することによってがん細胞を標的化する薬物である、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））やトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））のような標的療法もまた、いくつかのがんの標準治療法として浮上してきている。
【０００３】
現在、患者の免疫系の力を利用して疾患と闘う治療法である、免疫療法がますます盛んになっている。免疫療法の１つのアプローチは、患者自身の免疫細胞を操作し、腫瘍を認識して攻撃することを伴う。養子細胞移入（ＡＣＴ）と称されるこのアプローチは、進行がんを有する患者でいくつかの顕著な応答を生じた。
【０００４】
典型的には、天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、治療有効性を達成するのに十分に高い親和性を有することが期待されているものの、例えば、可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）などの治療用ＴＣＲまたはそれらの誘導体を開発する場合、通常は生体内で生産的免疫応答を引き出すために、いわゆる親和性成熟が所望／要求される。
【０００５】
成熟のために、酵母表面ディスプレイ技術を用いる方法が、一般的に用いられる。それにもかかわらず、十分な多様性を有するライブラリーを作製するためには、酵母形質転換のための非常に効率的な方法が必要である。
【０００６】
例えば、ＴＣＲ、またはそれらの可溶性類似体を開発して、潜在的な治療薬の基礎を提供し得るように、特定の抗原に特異的に結合する天然のα鎖配列およびβ鎖配列から本質的になるＴＣＲを同定することが、長い間望まれてきた。同定されたＴＣＲによって認識される抗原は、がん、ウイルス感染症、自己免疫疾患、寄生虫感染症、および細菌感染症などの疾患と関連していてもよい。したがって、このような療法は前記疾患の治療に使用され得る。
【０００７】
さらに、ひとたび天然または固有のＴＣＲが同定されてそれらの配列が決定されれば、必要に応じて、親和性または半減期の増加をもたらす変異が導入され得る。伝統的に、がんウイルス抗原、自己免疫抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原に特異的に結合するＴＣＲを同定する試みは、ボランティアドナーから採取された血液サンプルの使用に限定されてきた。このようなサンプルを使用して、疾患関連抗原に結合する、Ｔ細胞およびそれらの対応するＴＣＲが単離される。このアプローチは、一般に少なくとも２０人のドナーを必要とする。その過程は長くそして労働集約的であり、抗原結合Ｔ細胞受容体が同定されるという保証はない。機能性Ｔ細胞受容体が同定された場合、それらはしばしば抗原に対する弱い親和性、低い特異性を有し、および／または生体外で適切に折り畳まれない。スクリーニングできるＴ細胞の多様性は、ドナー内のＴ細胞の多様性に限定される。大部分のがん抗原をはじめとするいくつかの疾患関連抗原は、自己抗原であり；胸腺選択は自己抗原を認識するＴＣＲを除去する役割を果たすので、疾患関連抗原に特異的なＴＣＲは、ドナーの天然のレパートリーには存在しないこともあり、そうでなければ抗原に対して弱い親和性を有することもある。
【０００８】
抗原結合特異性を有する新たなＴＣＲを単離するためのライブラリーを設計する試みが、数年間続けられている。ＴＣＲ鎖は安定性が低く、しばしば正しく提示されないので、ＴＣＲライブラリーは、同等の抗体ライブラリーよりも作製がはるかに困難である。ＴＣＲのライブラリーを構築することに伴う複雑さは、非常に大きい。（天然のレパートリーに見られるように）ＣＤＲ３長の多様性を維持することが好ましい。いかなるライブラリーもかなりの部分は、停止コドン、フレームシフト、折り畳みの問題、およびＨＬＡ複合体に決して結合できないＴＣＲ鎖組み合わせのために、一般に失われる。多数の可変αおよび可変β遺伝子、ならびにＪおよびＤ遺伝子を考慮に入れると、一緒になって必要な特異性を有する抗原ペプチドに結合するＴＣＲを形成する、機能性の折り畳みα鎖および機能性の折り畳みβ鎖を作製して同定する見込みは極めて低い。
【０００９】
酵母などの真核細胞系における、核酸ライブラリーの作製手段、およびそれによって生成される医薬タンパク質などの組換え産物の利用可能性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞系の使用と比較して、顕著な利点を提供する。酵母は一般的に細菌よりも高い細胞密度に培養され得て、連続発酵工程に容易に適応できる。しかし、組換え産物およびライブラリーの作製のための宿主／ベクター系としての酵母種の開発は、形質転換条件に関する知識の欠如、および外来核酸を酵母宿主細胞に安定に導入する適切な手段の欠如によって、著しく妨げられている。
【００１０】
細胞の電気的形質転換を促進する様々な電気的および生物学的パラメータには、細胞表面へのＤＮＡの吸着がある。低強度の電界交代もまた、おそらくＤＮＡパーミアーゼの電気刺激によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌へのＤＮＡ移入を促進する。高分子電解質ＤＮＡの電気穿孔遺伝子移入に対する、優勢な電気拡散または電気泳動効果の証拠が、蓄積している。電気穿孔によって促進される、電気浸透効果および膜陥入もまた報告されている。
【００１１】
酵母細胞膜を横切る電界の印加は、電気穿孔工程にとって重要な一時的な孔の形成をもたらす。電気穿孔装置シグナル発生器は、電極間の間隙（ｃｍ単位）を横切って移動する電圧（ｋＶ単位）を提供する。この電位差はいわゆる電界強度を画定し、ＥはｋＶ／ｃｍに等しい。各細胞は、最適電気穿孔のためのそれ自身の臨界電界強度を有する。これは、細胞サイズ、膜の構成、および細胞壁それ自体の個々の特性に起因する。例えば、哺乳類細胞は、典型的には、細胞死および／または電気穿孔が起こる前に、０．５&#12316;５．０ｋＶ／ｃｍを必要とする。一般に、必要な電界強度は細胞の大きさに反比例して変化する。
【００１２】
欧州特許第２２５７６３８Ａ１号明細書は、電気穿孔による酵母の形質転換方法に関する。これらには、細胞コンディショニング剤としての酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）の組み合わせが含まれ、これらはどちらも酵母形質転換の頻度を高めるために使用されている。表２に示されるように、ＤＴＴはまたはＬｉＡｃ前処理の除外は、それぞれ９３．３％および８５．７％の効率低下をもたらした。
【００１３】
同様に、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｉｎ：Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１９：９５−１４１）は、抗原の結合における、ペプチド−ＭＨＣ（ｐｅｐＭＨＣ）リガンドとしてのＴＣＲに関する研究を開示している。現在、抗体を使用して実施されているのと同様の方法で、このクラスの分子を使用するために、ＴＣＲの親和性を操作することに関心が寄せられてきた。ＴＣＲを操作し、それらの結合特性をより迅速に分析するために、彼らは、プラットフォームとして酵母ディスプレイ系を使用した。抗体由来のｓｃＦｖフラグメントに類似した、一本鎖形態のＴＣＲの発現および操作は、ＴＣＲが種々の可能なｐｅｐＭＨＣリガンドによって親和性成熟できるようにする。さらに、酵母ディスプレイプラットフォームは、多様な結合親和性を有するＴＣＲ変異体を迅速に生成し、可溶性形態のＴＣＲを精製する必要なしに、特異性および親和性を分析できるようにする。この論文は、酵母ディスプレイを用いて、一本鎖ＴＣＲを操作し分析するための方法を記載している。
【００１４】
酵母ライブラリーは、ファージライブラリーによって達成されたサイズまたは効率を達成しておらず、典型的な最大ファージライブラリーサイズが１０１０〜１０１１であるのに対して、典型的な酵母ライブラリーは１０７のサイズである。電気穿孔プロトコルにおける最近の進歩（Ｃｈａｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １（２）：７５５−７６８（２００６）を参照されたい）は、単回形質転換において最大５×１０７の酵母ライブラリーサイズを達成することを可能にしたが、これまでのところ達成されている酵母ライブラリーのサイズが、ファージディスプレイライブラリーによって日常的に達成可能な、１０１０１０〜１０１１サイズよりも依然として顕著に低いことは、依然として正しい記述である。
【００１５】
上記の方法および開示は、ますます高い変換効率を達成しながらも依然として面倒であり、１０６〜１０７サイズ範囲の複数の小さなライブラリーを、１０８〜１０９サイズ範囲のより大きな統合ライブラリーサイズに蓄積するために、著しい時間と反復努力を要する。
【００１６】
磁気ビーズおよび蛍光活性化細胞選別の双方を用いた酵母ディスプレイライブラリー選択は、特に蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）との適合性により、標的抗原に対する特異的バインダーを濃縮するための効率的かつ高感度の方法を提供する。しかし、この選択能力の利点は、酵母細胞の形質転換効率が低いことに起因する、典型的な酵母ディスプレイライブラリーの限られたサイズによって妨げられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、酵母を使用して、例えばＴＣＲライブラリーなどのタンパク質ライブラリーを作製するための効率的な方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一態様では、ａ）酵母細胞を約１．０〜２のＯＤ６００に培養するステップと；ｂ）細胞を冷水で洗浄するステップと；ｃ）細胞をソルビトールとＣａＣｌ２とを含んでなる冷溶液で洗浄するステップと；ｄ）細胞を酢酸リチウムとトリス２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とを含んでなる溶液中でインキュベートするステップと；ｅ）細胞をソルビトールとＣａＣｌ２とを含んでなる冷溶液で洗浄するステップと；ｆ）細胞をソルビトールを含んでなる溶液に再懸濁するステップと；ｇ）任意選択的に、前記細胞を適切に保存するステップとを含んでなる、エレクトロコンピテント酵母細胞を調製する方法が提供される。
【００１９】
本発明は、それによって、例えば、改善された酵母細胞ライブラリーの作製ために、酵母細胞を形質転換する非常に効率的な方法を提供する。本発明の方法は、これまで研究されていないはるかに大きなＴＣＲ多様性空間にアクセスするための実用的なツールとして、酵母ディスプレイ技術を適用する際の重大なボトルネックを取り除く。
【００２０】
次に本発明のさらに別の態様は、ａ）本発明による方法によるエレクトロコンピテント酵母細胞を提供するステップと；ｂ）細胞をソルビトールを含んでなる冷溶液で洗浄するステップと；ｃ）細胞を形質移入されるＤＮＡと混合し、電気穿孔前混合物を形成するステップと；ｄ）前記電気穿孔前混合物を適切な電気穿孔キュベットに移し入れるステップと；ｅ）前記細胞を約２．５ｋＶ／ｃｍ〜約１２．５ｋＶ／ｃｍで約２〜約５ミリ秒間電気穿孔するステップとを含んでなる、エレクトロコンピテント酵母細胞を形質移入する方法に関する。
【００２１】
前記ＤＮＡが線状または環状である、本発明による方法が好ましい。より好ましいのは、前記ＤＮＡが、例えば酵母表面ディスプレイライブラリーの形態である、目的のタンパク質のライブラリーをコードする、ＤＮＡ断片のライブラリーを含んでなる、本発明による方法である。最も好ましいのは、前記ディスプレイライブラリーがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ライブラリーである、本発明による方法である。
【００２２】
トリス２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を還元剤として使用することで、本発明による方法の形質転換効率が、ＤＴＴと比較してより高いことが驚くことに分かり、例えば、１×１０８酵母形質転換体／μｇベクターＤＮＡよりも高く、好ましくは２×１０８酵母形質転換体／μｇベクターＤＮＡよりも高い。
【００２３】
次に、本発明のさらに別の態様は、ａ）本発明による方法による形質移入された酵母細胞を提供するステップと；ｂ）形質移入細胞を増殖培地中でソルビトール溶液の１：１混合物に希釈するステップと；ｃ）細胞を適切な増殖培地中に再懸濁するステップと；ｄ）任意選択的に、多様性の計算のために希釈を実施して、前記希釈液をカナマイシンを含有するＳＤ−ＣＡＡプレート上に播種するステップと；ｅ）前記ライブラリーを適切な増殖培地に移し入れ、前記ライブラリーを電気穿孔毎に拡大するステップと；ｆ）任意選択的に、前記拡大されたイブラリーを適切に保存するステップとを含んでなる、例えば酵母表面ディスプレイライブラリーの形態である、目的のタンパク質の改善された酵母ライブラリーを作製する方法に関する。
【００２４】
好ましいのは、前記ディスプレイライブラリーがＴ細胞受容体ライブラリーである、本発明による方法である。好ましいのは、前記ライブラリーの多様性が約１０１２よりも高い、発明による方法である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の文脈では、「発現ベクター」という用語は、自律複製部位（ＡＲＳ）と、転写開始部位と、宿主生物において発現されるタンパク質をコードする少なくとも１つの構造遺伝子とを含む、ＤＮＡコンストラクトを意味する。複製部位、または複製起点は、クローニングおよび発現ベクターの複製を制御する、任意のＤＮＡ配列である。発現ベクターはまた、通常、宿主酵母におけるタンパク質の発現を制御する、１つまたは複数のエンハンサーおよび／またはプロモーター、サプレッサーおよび／またはサイレンサー、ならびにターミネーターなどの適切な制御領域も含有する。本発明による発現ベクターは、本明細書に記載されるような必須遺伝子を含んでなる選択マーカーもまた含有してもよい。発現ベクターは、一般的に利用可能で当業者に周知であるその他の選択可能なマーカーもまた、任意選択的に含有する。発現ベクターは、ベクターの一種である。ベクターは、１つまたは複数の酵母株に由来する、１つまたは複数のＡＲＳ配列（要素）を任意選択的に含んでもよい。
【００２６】
「作動可能に連結された」という用語は、ＤＮＡセグメントがそれらの意図された目的のために協調して機能するように配置されていることを意味し、例えば、転写はプロモーター中で開始し、コーディングセグメントを通じてターミネーターまで進行する。
【００２７】
「形質転換」または「形質移入」という用語は、遺伝子型を変化させる、ＤＮＡまたはその他の核酸の受容体酵母宿主細胞への導入を意味する。
【００２８】
「形質転換体」または「形質転換細胞」という用語は、形質転換を受けた受容体酵母宿主細胞およびその子孫を意味する。
【００２９】
特に断りのない限り、「約」は所与の値の＋／−１０％を意味するものとする。
【００３０】
本発明の電気穿孔法において有用なベクターとしては、酵母細胞によって増殖され得る、ｐＹＤベクター、その他の任意のベクター、およびそれらの誘導体コンストラクト、あるいは核酸全般が挙げられる。本発明の発現ベクターは、ベクターが宿主酵母細胞を形質転換、形質移入または形質導入できさえすれば、任意の種類のベクターに基づいてもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは、特にＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のものである、酵母プラスミドに基づく。酵母細胞の形質転換後、ライブラリー配列をコードする外因性ＤＮＡは、細胞に取り込まれ引き続いて形質転換細胞によって発現される。
【００３１】
より好ましくは、発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母のどちらかにおいて増殖され得る、酵母−細菌シャトルベクターであってもよい（Ｓｔｒｕｈｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）。ｐＢＲ３２２などの大腸菌プラスミドＤＮＡ配列の組み入れは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるベクターＤＮＡの定量的調製、ひいては酵母の効率的な形質転換を容易にする。
【００３２】
シャトルの役割を果たしてもよい酵母プラスミドベクターのタイプは、増殖型ベクターまたは組み込み型ベクターであってもよい。増殖型ベクターは、機能性のＤＮＡ複製起点の存在によって、酵母の染色体ＤＮＡとは無関係にそれ自身の維持を媒介できる酵母ベクターである。組み込み型ベクターは、染色体ＤＮＡとの組換えに依存して複製を容易にし、ひいては宿主細胞中での組換えＤＮＡの継続的な維持を容易にする。増殖型ベクターは、２ミクロンベースのプラスミドベクターであってもよく、その中ではＤＮＡ複製起点は、内因性２ミクロンプラスミド酵母に由来する。代案としては、増殖型ベクターは自律複製（ＡＲＳ）ベクターであってもよく、その中では「見かけの」複製起点は、酵母の染色体ＤＮＡに由来する。任意選択的に、増殖型ベクターは、上記のＤＮＡ複製起点の１つに加えて、セントロメアを保有することが知られている酵母染色体ＤＮＡの配列を有する、動原体（ＣＥＮ）プラスミドであってもよい。
【００３３】
ベクターは、閉環または直鎖形で、酵母細胞に形質転換されてもよい。組み込み型ベクターによる酵母の形質転換は、遺伝的安定性はあるが、ベクターが閉環形である場合には効率的でないこともある（例えば、１μｇのＤＮＡ当たり約１&#12316;１０個の形質転換体しか得られない）。酵母染色体ＤＮＡと相同的なＤＮＡ配列に自由端が位置する線状化ベクターは、より高い効率（１００&#12316;１０００倍）で酵母を形質転換し、形質転換ＤＮＡは一般に、切断部位に相同的な配列に組み込まれていることが見いだされている。したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼでベクターＤＮＡを切断することにより、形質転換の効率を高め、染色体への組込み部位を標的化することが可能になる。組み込み形質転換は、形質転換の効率が十分に高く、組込みのための標的ＤＮＡ配列が、宿主細胞の代謝に必須の遺伝子を破壊しない領域内にあるという条件で、醸造酵母の遺伝子修飾に適用可能であってもよい。
【００３４】
本発明の方法の電気穿孔によって形質転換され得る酵母株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母種が挙げられる。一実施形態では、酵母細胞は二倍体酵母細胞である。代案としては、酵母細胞は、酵母半数体細胞の「ａ」および「α」株などの半数体細胞である。
【００３５】
本発明の文脈では「Ｔ細胞受容体ライブラリー」は、好ましくは、例えば、２Ａ−ペプチドなどの自己切断ペプチドに任意選択的に融合した、例えば、Ｖβ−リンカー−Ｖα一本鎖（ｓｃＴＣＲ）；またはＶα−リンカー−Ｖβ一本鎖などのＴＣＲの一本鎖形態である、スクリーニングされるヒトおよび／または変異ヒトＴＣＲの適切な部分を含んでなってもよい。野生型アミノ酸配に対する最小限の修飾でＴＣＲ発現を最適化するための公開された方法もまた使用され得る（例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ’ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ’２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，５８９−５９４（２００４）；Ｙａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １５，１４１１−１４２３（２００８）；Ｋｕｂａｌｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＣＲ  ｃｈａｉｎｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，２３３１−２３３８（２００７）；Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７，３８９８−３９０３（２００７）；Ｓｃｈｏｌｔｅｎ，Ｋ．Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｄｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９，１３５−１４５（２００６））。
【００３６】
ベクターＤＮＡと挿入ＤＮＡの比率は、約１：０．５〜約１：１０の範囲、例えば、１：０．５、１：１；１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０である。一実施形態では、約１μｇのベクターＤＮＡおよび約１μｇの挿入ＤＮＡが、反応で使用される。別の実施形態では、約１μｇのベクターＤＮＡおよび約２μｇの挿入ＤＮＡが沈殿する。別の実施形態では、約１μｇのベクターＤＮＡおよび約３μｇの挿入ＤＮＡが沈殿する。なおも別の実施形態では、約１μｇのベクターＤＮＡおよび約４μｇの挿入ＤＮＡが沈殿する。さらに別の実施形態では、約１μｇのベクターＤＮＡおよび約５μｇの挿入ＤＮＡが沈殿する。
【００３７】
一実施形態では、細胞懸濁液は、約５０〜約４００μｌの酵母細胞、例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００μｌの酵母細胞を含んでなる。
【００３８】
一実施形態では、酵母細胞懸濁液は、約１〜約１０×１０９酵母細胞／ｍＬ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｏｒ１０×１０９酵母細胞／ｍＬである。
【００３９】
一実施形態では、酵母細胞を電気穿孔するために使用される電界強度は、約０．５ｋＶ／ｃｍ〜約１２．５ｋＶ／ｃｍ、例えば、０．５、１．０、約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、ｋＶ／ｃｍであった。
【００４０】
一実施形態では、酵母細胞は、約１０〜約５０μＦ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０μＦの静電容量で電気穿孔される。
【００４１】
一実施形態では、酵母細胞は、約０．１〜約１０Ｍのソルビトールおよび０．１〜１０ｍＭのＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２、例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０Ｍのソルビトール、または例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２に懸濁される。
【００４２】
一実施形態では、酵母細胞は、約０．０１〜約１．０ＭのＬｉＡｃ、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、約０．７、０．８、０．９、または１．０ＭのＬｉＡｃ、および１〜１００ｍＭのＴＣＥＰ、例えば、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、約７０、８０、９０、または１００ｍＭのＴＣＥＰ中でインキュベートされる。
【００４３】
本発明は、酵母を含有する細胞懸濁液を１つまたは複数の核酸コンストラクトで電気穿孔するステップを含んでなる、酵母細胞を形質転換する方法を提供する。酵母細胞の形質転換は、単一クローンから集団（すなわち、酵母ライブラリー）に至る酵母細胞をもたらし得て、それは（ａ）酵母表面タンパク質への係留によって、あるいは酵母細胞表面タンパク質またはその他の成分との特異的共有結合または非共有相互作用を介する結合によって、酵母細胞の表面に提示されるペプチドまたはタンパク質；（ｂ）細胞内で発現されるペプチドまたはタンパク質；または（ｃ）培地などの細胞外空間に分泌され、また固体表面に沈積するペプチドまたはタンパク質をスクリーニングするために使用され得る。このような酵母ライブラリーは、ペプチドまたはタンパク質と、酵母細胞に導入されまたは外因的に添加され得る別のタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその他の化学物質との間の相互作用をスクリーニングしまたは特性決定するための複数の用途に好都合に適し得る。具体例は、酵母ディスプレイ、酵母ツーハイブリッド、酵母スリーハイブリッドなどに見られるものである。
【００４４】
本発明は、酵母細胞を形質転換するのに十分な抵抗、電界強度、およびパルス持続時間の１つまたは複数を用いて、１つまたは複数の制御配列と１つまたは複数の遺伝子または遺伝子断片とを含んでなる１つまたは複数の核酸コンストラクトと共に、酵母を含有する細胞懸濁液を電気穿孔するステップを含んでなる、酵母細胞を形質転換する方法を提供する。
【００４５】
一実施形態では、電界強度は約２．５ｋＶ／ｃｍ〜約１２．５ｋＶ／ｃｍである。特定の実施形態では、電界強度は、０．５ｋＶ／ｃｍ、１．０ｋＶ／ｃｍ、１．５ｋＶ／ｃｍ、２．０ｋＶ／ｃｍ、または２．５ｋＶ／ｃｍである。これらの値は、電気穿孔キュベットが０．２ｃｍの間隙を有することを考慮に入れている。より高い電界強度が可能であるが、それらの実用性は、より強力なパルスを送達し得る装置の開発に大きく依存している。
【００４６】
一実施形態では、パルス持続時間は約３ミリ秒〜約１０ミリ秒である。特定の実施形態では、パルス持続時間は約４ミリ秒である。
【００４７】
本発明の電気穿孔法による細胞の処理は、１対の電極間において、酵母細胞懸濁液に電界を印加することによって実施される。細胞に対する損傷なしに、または最小の損傷で、細胞の電気穿孔が起こるように、電界強度は適度に正確に調節されなくてはならない。次に電極間の距離が測定され、式、Ｅ＝Ｖ／ｄに従って、適切な電圧が電極に印加され得る（Ｅ＝Ｖ／ｃｍ単位の電界強度；Ｖ＝ボルト単位の電圧；およびｄ＝ｃｍ単位の距離）。
【００４８】
本明細書に記載の手順を実施するためのパルス発生器は、長年にわたって市販されている。１つの適切なシグナル発生器は、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である。典型的なセットアップは、静電容量エクステンダープラスおよびパルスコントローラープラスモジュールに接続された、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩからなる。
【００４９】
電気穿孔は、酵母細胞へのＤＮＡの導入を容易にするために本発明において使用される。電気穿孔は、パルス電界を用いて細胞膜を一時的に透過性にし、ＤＮＡなどの巨大分子が細胞内に移行できるようにする工程である。しかし、ＤＮＡが細胞に移入される実際の機序は良く分かっていない。例えば、カンジダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）の形質転換では、約１０〜約１３ｋＶ／ｃｍの電界強度および約Ｒ５（１２９Ω）の抵抗値、および約４．５ミリ秒の時定数を有する、実験的に減衰するパルス電界に細胞が曝露された場合、電気穿孔は驚くほど効率的である。典型的には、選択された電気穿孔装置に応じて、抵抗および静電容量が存在するか、または使用者によって選択されてもよい。いずれにしても、装置は製造会社の使用説明書に従って構成され、適切な場合は電界強度と減衰パラメータが提供される。
【００５０】
本発明は、任意の１つまたは複数の所望の内因性（すなわち、その酵母細胞内に天然に存在する）または異種遺伝子の高レベルの発現を可能にする、酵母の非常に効率的な形質転換方法にさら関する。本発明の方法は、例えば、ＴＣＲ、ｓｃＴＣＲ、キメラまたはそれらの断片を発現するライブラリーを調製する方法にさらに関する。
【００５１】
１つのシナリオでは、目的の遺伝子を保有する発現ベクターが、電気穿孔によって酵母宿主細胞に形質転換され、細胞内タンパク質（例えば、核または細胞質タンパク質）、膜タンパク質（例えば、膜貫通タンパク質または膜結合タンパク質）、または分泌タンパク質を発現する多数の形質転換細胞を含んでなる、単一クローンまたはライブラリーが作製され得る。形質転換細胞またはライブラリーを使用して、タンパク質を精製し、タンパク質機能を研究し、タンパク質−タンパク質相互作用を同定し、または新規タンパク質バインダーもしくは相互作用パートナーが同定できるであろう。特記すべきは、ＴＣＲおよびＴＣＲ断片を提示しまたは発現する、非常に大きな酵母ライブラリーを作製する能力である。ライブラリーは標的抗原による選択に供され、選択抗原に結合するＴＣＲが同定され得る。
【００５２】
形質転換酵母は、人工的に構築されたプラスミドを失う傾向があるので、それらに正の選択圧を及ぼすように培地を使用することが有利である。株が必須代謝産物に対する栄養要求性変異体であり、使用されるベクタープラスミドが、例えば、ＬＥＵ２遺伝子などの株原栄養性を回復できるマーカー遺伝子を含んでなる場合、この選択圧は培地から代謝産物を省くことにより発揮されてもよい。同じ結果を得るための別の手段が存在し、本発明を実施するために使用されてもよい。
【００５３】
目的の構造遺伝子の性質に応じて、生成物または発現生成物は、酵母宿主細胞の細胞質内に残留してもまたは分泌されてもよい。細胞内に残留するタンパク質だけでなく、分泌されるタンパク質もまた可溶性であることが分かった。生成物または発現生成物が酵母宿主細胞中に残留する場合、形質転換体が高密度に達するまで、所望の生成物の発現または産生がほとんどまたは全くないように、誘導性転写開始領域を有することが一般に望ましくあってもよい。生成物または発現生成物が発現されるのに十分な時間が経過した後、細胞は、例えば、遠心分離、溶菌、および目的の生成物の単離などの従来の手段によって単離されてもよい。生成物の性質および用途に応じて、溶解物は、クロマトグラフィー、電気泳動、溶媒抽出、結晶化、透析、限外濾過などの様々な精製方法に供されてもよい。クロマトグラフィーの方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および当業者に知られているその他のクロマトグラフィー方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。純度は、約５０％〜９０％以上、好ましくは最大約１００％まで変化してもよい。
【００５４】
代案としては、発現生成物または目的の生成物は培地中に分泌されて連続的に産生され得て、培地は部分的に抜き取られ、所望の生成物は、例えば、カラムまたはアフィニティークロマトグラフィー、限外濾過、沈殿などにより抽出され、消耗培地は廃棄され、または必須成分を回復させることによって再循環される。限外濾過からの生成物を含有する透過液は、さらに蒸発させることによってさらなる濃縮に供し得て、アルコールおよび／またはｐＨ調節を用いた結晶化または沈殿がそれに続く。当業者は、多数の方法の選択肢を承知している。生成物が分泌される場合、通常は構成的転写開始領域が用いられるが、非構成的領域が用いられてもよい。
【００５５】
その他の好ましい実施形態は、本明細書に記載の図を参照して実施例から導き出し得るが、それにもかかわらず、それらに限定されることはない。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】同一条件下でＤＴＴと比較した、ＴＣＥＰの改善された形質移入効率の比較を示す。
【実施例】
【００５７】
本発明の実施は、特に断りのない限り、当該分野で周知である細胞電気穿孔および酵母細胞生物学の従来の技術を用いる。
【００５８】
Ｉ．培地
１．ＹＰＤ培地
酵母抽出物  １０ｇ
バクトペプトン  ２０ｇ
デキストロース  ２０ｇ
Ｈ２Ｏで容積を１Ｌにする（滅菌グルコースを高圧蒸気滅菌溶液に添加する）
【００５９】
２．ＳＤ−ＣＡＡ（ｐＨ４．５）：
クエン酸ナトリウム二水和物  １４．８ｇ（５０ｍＭ最終）
クエン酸一水和物  ４．２ｇ（２０ｍＭ最終）
８００ｍｌのＨ２Ｏ中、高圧蒸気滅菌。
カザミノ酸  ５．０ｇ
酵母窒素原礎培地（アミノ酸なし）  ６．７ｇ
グルコース  ２０ｇ
Ｈ２Ｏで容積を１Ｌにして滅菌濾過する
【００６０】
３．ＳＤ−ＣＡＡプレート：
ソルビトール  １８２．２ｇ
寒天  １５ｇ
クエン酸ナトリウム  １４．８ｇ
クエン酸一水和物  ４．２ｇ
８００ｍｌのＨ２Ｏ中、高圧蒸気滅菌し約５５°Ｃに冷却する。
カザミノ酸  ５．０ｇ
酵母窒素原礎培地（アミノ酸なし）  ６．７ｇ
グルコース  ２０ｇ
カナマイシン硫酸塩  ３５ｍｇ
２００ｍｌのＨ２Ｏ中、滅菌濾過、冷却した高圧蒸気滅菌溶液に添加する
【００６１】
ＩＩ．エレクトロコンピテント酵母細胞の調製
−８０℃から新たに解凍した２０μｌの酵母原液をＹＰＤ寒天プレート上に画線塗抹し、３０℃で２日間培養した。単一コロニー（コロニー全体を採取する）をＹＰＤ寒天プレートから１５ｍｌのＹＰＤ培地に採取して、３０℃で一晩振盪した。翌朝、１０ｍｌの培養物を１００ｍｌの新鮮なＹＰＤ培地に移し入れ、振盪を３０℃で７時間継続した。ＯＤ６００を測定して、１Ｌの冷ＹＰＤ培地をＯＤ６００が０．２になるように接種した。振盪フラスコを予冷した（４℃）振盪機に入れた。振盪機は、就業日が始まる５時間前に加熱（３０℃）および振盪（２５０ｒｐｍ）が開始するようにプログラムした。ＯＤ６００が１．５に達するまで培養を実施したが、これは通常、振盪開始後６時間であった。
【００６２】
特に明記されない場合は、引き続く工程は氷上において、冷却された溶液、チューブ、キュベット、および遠心分離機を用いて実施しなくてはならない。
【００６３】
細胞を２，０００ｇおよび４°Ｃで３分間ペレット化し（１０本のＦａｌｃｏｎチューブ内の二段法、５０ｍｌ）、２５ｍｌの冷Ｈ２Ｏで２回洗浄し、２，０００ｇで３分間ペレット化した。細胞を２５ｍｌの冷ソルビトール、１Ｍ／ＣａＣｌ２、１ｍＭで洗浄し、２，０００ｇで３分間ペレット化した。細胞を２５ｍｌの酢酸リチウム、１００ｍＭ／ＴＣＥＰ、１０ｍＭに再懸濁した。フィルター蓋付きの５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブを使用して曝気させ；細胞を１６０ｒｐｍで３０分間振盪しながら３０℃でインキュベートし、氷上に置き、細胞を２，０００ｇおよび４℃で３分間ペレット化した。細胞を２５ｍｌの冷１Ｍソルビトール／１ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗浄し；２，０００ｇおよび４°Ｃで３分間ペレット化し、２５ｍｌの冷１Ｍソルビトールで洗浄し；２，０００ｇおよび４°Ｃで３分間ペレット化した。細胞を円錐管内で冷１Ｍソルビトールに懸濁し、電気穿孔反応当たり４００μｌの最終容積にした。エレクトロコンピテント細胞は、−８０℃で直接、保存し得る。サンプルを電気穿孔で使用する前に、漏出した塩を遠心分離（２，０００ｇ、４℃、５分間）および１Ｍ冷ソルビトールで２回洗浄することによって除去した。
【００６４】
ＩＩＩ．電気穿孔
４００μｌの細胞をＨ２Ｏ中の５&#12316;１０μｌのＤＮＡ（ベクター）と混合し、３分間氷上に保ち、予冷した０．２ｃｍ電気穿孔キュベットに移し入れた。ＢｉｏＲａｄ  ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ電気穿孔システムを用いて、細胞を２．５ｋＶで電気穿孔した。典型的な時定数は約４ミリ秒であり、好ましくは４ミリ秒であった。電気穿孔した細胞を、振盪せずに３０℃で１時間、１０ｍｌの１Ｍソルビトール：ＹＰＤ培地の１：１混合物に移し入れた。細胞を室温で３分間２，０００ｇで収集し、室温で１０ｍｌのＳＤ&#8722;ＣＡＡに再懸濁した。多様性の計算のために希釈を実施した（１：１０５〜１：１０７）。カナマイシンを含有するＳＤ&#8722;ＣＡＡプレート上で、希釈液を３０℃で１日間℃、そして室温で３日間培養した。ライブラリーを１００ｍｌのＳＤ−ＣＡＡに移し入れ（好ましくは電気穿孔毎に）、振盪を３０℃および１６０ｒｐｍで２４時間継続した。拡大されたライブラリーは、誘導のために直接使用し得て、または４℃で２週間保存し得る。長期保存は、−８０℃で３０％のグリセロール中で凍結することによって実施し得る。
【００６５】
最適な電気穿孔条件を使用することによって、約２×１０８個の酵母形質転換体／μｇベクターＤＮＡの酵母形質転換効率を日常的に達成し得る（図１を参照されたい）。この形質転換効率は、最小限の細胞容積（１００μｌ）で達成されるため、自動化およびマルチウェル電気穿孔装置に非常に適している。
【図１】
2019531751.tif 000002
【国際調査報告】
2019531751.tif 000003
2019531751.tif 000004