(57)【要約】  β異常ヘモグロビン症を治療するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連組成物および方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域がそれぞれ、ＨＢＧ１遺伝子またはＨＢＧ２遺伝子に隣接している、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＨＢＧ１調節領域が、配列番号９０２のヌクレオチド１〜２９９０にわたる領域に位置する、請求項２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記ＨＢＧ２調節領域が、配列番号９０３のヌクレオチド１〜２９１４にわたる領域に位置する、請求項２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記標的化ドメインが、ＨＢＧ標的位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に、二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記標的ドメインが、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全に位置する、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記標的化ドメインが、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域における転写調節エレメントを標的とするように構成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記転写調節エレメントがプロモーターである、請求項７に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記プロモーターが、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の１つまたは複数の転写を制御する、請求項８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記転写調節エレメントがサイレンサーである、請求項７に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１項に示されているヌクレオチド配列と、同一である、または１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドのみが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１項に示されているヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ｇＲＮＡ分子が単分子ｇＲＮＡ分子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記標的化ドメインが１６ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記標的化ドメインが１７ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記標的化ドメインが１８ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記標的化ドメインが１９ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記標的化ドメインが２０ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記標的化ドメインが２１ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記標的化ドメインが２２ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記標的化ドメインが２３ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記標的化ドメインが２４ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記標的化ドメインが２５ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記標的化ドメインが２６ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２７】
第１相補性ドメイン、連結ドメイン、第２相補性ドメイン、隣接ドメイン、５’伸長ドメイン、およびテールドメインのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２８】
５’から３’に：標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインを含む、請求項２７に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２９】
テールドメインをさらに含む、請求項２８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０】
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；および１７または１８のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１】
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２５のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；および１７または１８のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２】
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも３０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；および１７のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３３】
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも４０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３４】
（ａ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、を含む核酸組成物。
【請求項３５】
前記ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項３４に記載の核酸組成物。
【請求項３６】
前記標的化ドメインが、ＨＢＧ標的位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に、二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項３４または３５に記載の核酸組成物。
【請求項３７】
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１項に示されているヌクレオチド配列と、同一である、または１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドのみが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項３８】
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１項に示されているヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の核酸組成物。
【請求項３９】
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４０】
前記ｇＲＮＡ分子が単分子ｇＲＮＡ分子である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４１】
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４２】
前記標的化ドメインが１６ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４３】
前記標的化ドメインが１７ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４４】
前記標的化ドメインが１８ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４５】
前記標的化ドメインが１９ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４６】
前記標的化ドメインが２０ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４７】
前記標的化ドメインが２１ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４８】
前記標的化ドメインが２２ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項４９】
前記標的化ドメインが２３ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５０】
前記標的化ドメインが２４ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５１】
前記標的化ドメインが２５ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５２】
前記標的化ドメインが２６ヌクレオチド長以上である、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５３】
前記ｇＲＮＡ分子が、標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５４】
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’に：標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインを含む、請求項５３に記載の核酸組成物。
【請求項５５】
前記ｇＲＮＡがテールドメインをさらに含む、請求項５４に記載の核酸組成物。
【請求項５６】
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８のヌクレオチドの標的化ドメインを含む、請求項３４〜５５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５７】
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２５のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、請求項３４〜５５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５８】
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも３０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、請求項３４〜５５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項５９】
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも４０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、請求項３４〜５５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項６０】
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、請求項３４〜５９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項６１】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項６０に記載の核酸組成物。
【請求項６２】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、請求項６１に記載の核酸組成物。
【請求項６３】
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、請求項６２に記載の核酸組成物。
【請求項６４】
前記ｅａＣａｓ９分子が標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、請求項６２または６３に記載の核酸組成物。
【請求項６５】
前記ｅａＣａｓ９分子が標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、請求項６２または６３に記載の核酸組成物。
【請求項６６】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、請求項６５に記載の核酸組成物。
【請求項６７】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、請求項６６に記載の核酸組成物。
【請求項６８】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項６９】
前記ｅａＣａｓ９分子がＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、請求項６８に記載の核酸組成物。
【請求項７０】
前記ｅａＣａｓ９分子がＤ１０における突然変異を含む、請求項６８または６９に記載の核酸組成物。
【請求項７１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項７２】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、請求項７０に記載の核酸組成物。
【請求項７３】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、請求項７１または請求項７２に記載の核酸組成物。
【請求項７４】
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、請求項３４〜７３のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項７５】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項７４に記載の核酸組成物。
【請求項７６】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが、ＨＢＧ標的位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に、二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項７４または７５に記載の核酸組成物。
【請求項７７】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１項に示されているヌクレオチド配列と、同一である、または１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドのみが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項７８】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１項に示されているヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７７に記載の核酸組成物。
【請求項７９】
前記第２ｇＲＮＡ分子が単分子ｇＲＮＡ分子である、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８０】
前記第２ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８１】
前記第２ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８２】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１６ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８３】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１７ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８４】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１８ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８５】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１９ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８６】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２０ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８７】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２１ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８８】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２２ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項８９】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２３ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９０】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２４ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９１】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２５ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９２】
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２６ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９３】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインの１つまたは複数をさらに含む、請求項７４〜９２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９４】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、５’から３’に：標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインを含む、請求項９３に記載の核酸組成物。
【請求項９５】
前記第２ｇＲＮＡがテールドメインをさらに含む、請求項９４に記載の核酸組成物。
【請求項９６】
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８のヌクレオチドの標的化ドメインを含む、請求項７４〜９５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９７】
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２５のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、請求項７４〜９５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９８】
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも３０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、請求項７４〜９５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項９９】
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも４０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、請求項７４〜９５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１００】
（ｄ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第３ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、請求項７４〜９９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１０１】
（ｆ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第４ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、請求項１００に記載の核酸組成物。
【請求項１０２】
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、請求項３４〜１０１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１０３】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項１０２に記載の核酸組成物。
【請求項１０４】
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、請求項１０３に記載の核酸組成物。
【請求項１０５】
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１０４に記載の核酸組成物。
【請求項１０６】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１０５に記載の核酸組成物。
【請求項１０７】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）；ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）；およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）からなる群から選択される、請求項１０６に記載の核酸組成物。
【請求項１０８】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１０７に記載の核酸組成物。
【請求項１０９】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項１０８に記載の核酸組成物。
【請求項１１０】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１０８または１０９に記載の核酸組成物。
【請求項１１１】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１１２】
前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１０７に記載の核酸組成物。
【請求項１１３】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項１１２に記載の核酸組成物。
【請求項１１４】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１１２または１１３に記載の核酸組成物。
【請求項１１５】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項１１２〜１１４のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１１６】
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（すなわち、ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、請求項１０８〜１１５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１１７】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１０７に記載の核酸組成物。
【請求項１１８】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１１７に記載の核酸組成物。
【請求項１１９】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１０３〜１１８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２０】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１０３〜１１８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２１】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１０３〜１１８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２２】
（ｃ）第２ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、または（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、のいずれも含まない、請求項３４〜１２１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２３】
（ａ）および（ｂ）が１つの核酸分子上に存在する、請求項３４〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２４】
（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）が１つの核酸分子上に存在する、請求項１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２５】
前記核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１２３または１２４に記載の核酸組成物。
【請求項１２６】
（ａ）第１核酸分子上に存在し、かつ（ｂ）第２核酸分子上に存在する、請求項３４〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２７】
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１２６に記載の核酸組成物。
【請求項１２８】
（ａ）および（ｃ）が、１つの核酸分子上に存在する、請求項７４〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１２９】
（ａ）および（ｇ）が、１つの核酸分子上に存在する、請求項１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３０】
前記核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１２８または１２９に記載の核酸組成物。
【請求項１３１】
（ａ）が第１核酸分子上に存在し；かつ（ｃ）が第２核酸分子上に存在する、請求項７４〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３２】
（ａ）が第１核酸分子上に存在し；かつ（ｇ）が第２核酸分子上に存在する、請求項１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３３】
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１３０または１３１に記載の核酸組成物。
【請求項１３４】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、１つの核酸分子上に存在する、請求項６０〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３５】
（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）が、１つの核酸分子上に存在する、請求項１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３６】
前記核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１３４または１３５に記載の核酸組成物。
【請求項１３７】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つが、第１核酸分子上にコードされ；かつ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ目および３つ目が、第２核酸分子上にコードされる、請求項６０〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３８】
（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）のうちの１つが、第１核酸分子上にコードされ；かつ（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）のうちの２つ目および３つ目が第２核酸分子上にコードされている、請求項１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１３９】
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１３７または１３８に記載の核酸組成物。
【請求項１４０】
（ａ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ｃ）が、第２核酸分子上に存在する、請求項１３７または１３９に記載の核酸組成物。
【請求項１４１】
（ａ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ｇ）が、第２核酸分子上に存在する、請求項１３８または１３９に記載の核酸組成物。
【請求項１４２】
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１４０または１４１に記載の核酸組成物。
【請求項１４３】
（ｂ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ａ）および（ｃ）が、第２核酸分子上に存在する、請求項１３７または１３９に記載の核酸組成物。
【請求項１４４】
（ｂ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ａ）および（ｇ）が、第２核酸分子上に存在する、請求項１３８または１３９に記載の核酸組成物。
【請求項１４５】
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１４３または１４４に記載の核酸組成物。
【請求項１４６】
（ｃ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ａ）が、第２核酸分子上に存在する、請求項１３７または１３９に記載の核酸組成物。
【請求項１４７】
（ｇ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ａ）が、第２核酸分子上に存在する、請求項１３８または１３９に記載の核酸組成物。
【請求項１４８】
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項１４６または１４７に記載の核酸組成物。
【請求項１４９】
前記第１核酸分子が、ＡＡＶベクター以外であり、かつ前記第２核酸分子が、ＡＡＶベクターである、請求項１２６、１３１、１３２、１３７、１３９、１４０、１４１、１４３、１４４、１４６、または１４７のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１５０】
（ａ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項３４〜１４９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１５１】
（ｃ）に作動可能に連結された第２プロモーターを含む、請求項７４〜１４９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１５２】
前記プロモーターおよび第２プロモーターが互いに異なる、請求項１５１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１５３】
前記プロモーターおよび前記第２プロモーターが同じである、請求項１５１のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１５４】
（ｂ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項６０〜１４９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
【請求項１５５】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の（ａ）ｇＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項１５６】
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをさらに含む、請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、請求項１５８または１５９に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、請求項１５８または１５９に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、請求項１５８〜１６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、請求項１６４に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、請求項１６４または１６５に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、請求項１５８〜１６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、請求項１６７に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、請求項１６７または１６８に記載の組成物。
【請求項１７０】
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項１５６〜１６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７２】
（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項１５６〜１７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７３】
（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、請求項１５５〜１７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、請求項１７５に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１７６に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１７７に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）；ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）；およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）からなる群から選択される、請求項１７８に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１８０または１８１に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項１７９〜１８２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項１８４に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１８４または１８５に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項１８４〜１８６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（すなわち、ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、請求項１７５〜１８７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１８９に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１７５〜１９０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１７５〜１９０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１７５〜１９０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９４】
細胞を変化させる方法であって、
（ａ）請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子；および
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、に前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項１９５】
前記細胞を、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項１９４または１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、請求項１９５または１９６に記載の方法。
【請求項１９９】
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、請求項１９８または１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、請求項１９８または１９９に記載の方法。
【請求項２０２】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０４】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、請求項１９８〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、請求項２０４または２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、請求項１９８〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０８】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、請求項２０７または２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記細胞を、（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、請求項１９６〜２０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１１】
前記細胞を、（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記細胞が、β−異常ヘモグロビン症に罹患している対象に由来する、請求項１９４〜２１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１３】
前記β−異常ヘモグロビン症が、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌからなる群から選択される、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記細胞が赤血球系細胞である、請求項１９４〜２１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１５】
前記細胞が赤芽球である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記接触させるステップがインビボで行われる、請求項１９４〜２１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１７】
前記細胞におけるＨＢＧ標的位置の配列の知識を得るステップを含む、請求項１９４〜２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１８】
インデルをＨＢＧ標的位置に導入するステップを含む、請求項１９４〜２１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記インデルが、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２；ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２；およびＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２からなる群から選択される、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記インデルが、ＮＨＥＪを使用して導入される、請求項２１８または２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
単一ヌクレオチド変化をＨＢＧ標的位置に導入するステップを含む、請求項１９４〜２２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２２】
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；およびＨＢＧ２  ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇからなる群から選択される、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＤＲを用いて導入される、請求項２２１または２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
ＨＢＧ標的位置の標的部位に変化を導入するステップを含む、請求項１９４〜２２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２５】
前記変化が、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２；ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２；およびＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２からなる群から選択される、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
前記変化が、ＨＤＲを用いて導入される、請求項２２４または２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記細胞を、（ｇ）テンプレート核酸、に接触させるステップをさらに含む、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記５’相同性アームが、前記標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
前記変化が、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）である、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２３０〜２３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記変化が、ＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）である、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２３４または２３５に記載の方法。
【請求項２３８】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項２３２〜２３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３９】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項２３２〜２３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４０】
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、請求項２３２〜２３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４１】
前記変化が、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）である、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２４２】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２４１または２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２２８〜２４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４５】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２２８〜２４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４６】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２２８〜２４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４７】
前記接触させるステップが、前記細胞を、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも１つをコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、請求項１９５〜２４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４８】
前記接触させるステップが、前記細胞を、（ａ）、（ｂ）、（ｇ）、および任意選択による（ｃ）をコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、請求項２２７〜２４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４９】
前記接触させるステップが、前記細胞を、請求項３４〜１５４のいずれか１項に記載の核酸組成物に接触させるステップを含む、請求項２４８または２４９に記載の方法。
【請求項２５０】
前記接触させるステップが、前記細胞を、前記（ｂ）、および（ａ）をコードする核酸組成物に送達するステップを含む、請求項１９５〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５１】
前記核酸組成物が（ｃ）をさらにコードする、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５２】
前記核酸組成物が（ｇ）をさらにコードする、請求項２５０または２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
前記接触させるステップが、前記細胞（ａ）および（ｂ）に送達するステップを含む、請求項１９５〜２５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５４】
前記接触させるステップが、前記細胞（ａ）、および（ｂ）をコードする核酸組成物を送達するステップを含む、請求項１９５〜２５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５５】
前記接触させるステップが、前記細胞（ｃ）に送達するステップをさらに含む、請求項２５３または２５４に記載の方法。
【請求項２５６】
前記接触させるステップが、前記細胞（ｇ）に送達するステップをさらに含む、請求項２２７〜２５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５７】
それを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症を治療する方法であって：
前記対象または前記対象の細胞を：
（ａ）請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子；および
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、に接触させるステップを含む、方法。
【請求項２５８】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
前記β−異常ヘモグロビン症が、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌからなる群から選択される、請求項２５７または２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記対象または前記対象の前記細胞を、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、請求項２５７〜２５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６１】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項２６０に記載の方法。
【請求項２６２】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、請求項２５８〜２６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６３】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ニッカーゼ分子を含む、請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６４】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、請求項２６２または２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、請求項２６２または２６３に記載の方法。
【請求項２６６】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６７】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６８】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、請求項２６３〜２６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６９】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、請求項２６８に記載の方法。
【請求項２７０】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、請求項２６８または２６９に記載の方法。
【請求項２７１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、請求項２６２〜２７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７２】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、請求項２７１に記載の方法。
【請求項２７３】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、請求項２７１または２７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７４】
前記対象または前記対象の前記細胞を、（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、請求項２５７〜２７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７５】
前記対象または前記対象の前記細胞を、第４ｇＲＮＡ分子に接触させるステップをさらに含む、請求項２７４に記載の方法。
【請求項２７６】
単一ヌクレオチド変化をＨＢＧ標的位置に導入するステップを含む、請求項２５７〜２７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７７】
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；およびＨＢＧ２  ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇからなる群から選択される、請求項２７６に記載の方法。
【請求項２７８】
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＤＲを用いて導入される、請求項２７６または２７７に記載の方法。
【請求項２７９】
ＨＢＧ標的位置内の標的部位にインデルを導入するステップを含む、請求項２５７〜２７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８０】
前記インデルが、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２；ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２；およびＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２からなる群から選択される、請求項２７９に記載の方法。
【請求項２８１】
前記変化が、ＨＤＲを用いて導入される、請求項２７９または２８０に記載の方法。
【請求項２８２】
前記対象または前記対象の前記細胞を、（ｇ）テンプレート核酸、に接触させるステップをさらに含む、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項２８２に記載の方法。
【請求項２８４】
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含み、前記置換配列が０ヌクレオチドである、請求項２８３に記載の方法。
【請求項２８５】
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、請求項２８４に記載の方法。
【請求項２８６】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２８５に記載の方法。
【請求項２８７】
前記インデルが、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、配列番号９０２のＨＢＧ１  −１１４〜−１０２である、請求項２８６に記載の方法。
【請求項２８８】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２８７または２８８に記載の方法。
【請求項２９０】
前記インデルが、ＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）である、請求項２８６に記載の方法。
【請求項２９１】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９２】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２９０または２９１に記載の方法。
【請求項２９３】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項２９０〜２９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９４】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項２９０〜２９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９５】
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、請求項２８３〜２９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９６】
前記インデルが、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）である、請求項２５６に記載の方法。
【請求項２９７】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２９６に記載の方法。
【請求項２９８】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項２９６または２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２８３〜２９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３００】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２８３〜２９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０１】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２５８〜２９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０２】
前記接触させるステップがインビボで行われる、請求項２５７〜３０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０３】
前記接触させるステップが静脈内注射を含む、請求項２５７〜３０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０４】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞を、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つをコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、請求項２６０〜３０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０５】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞を、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｇ）の少なくとも１つをコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、請求項２８２〜３０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０６】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞を、請求項３４〜１５４のいずれか１項に記載の核酸組成物に接触させるステップを含む、請求項２５７〜３０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０７】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ｂ）、および（ａ）をコードする核酸組成物を送達するステップを含む、請求項２５７〜３０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０８】
前記核酸組成物が（ｃ）をさらにコードする、請求項３０７に記載の方法。
【請求項３０９】
前記核酸組成物が（ｇ）をさらにコードする、請求項３０７または３０８に記載の方法。
【請求項３１０】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ａ）および（ｂ）を送達するステップを含む、請求項２５７〜３０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１１】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ａ）、および（ｂ）をコードする核酸組成物を送達するステップを含む、請求項２５７〜３０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１２】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ｃ）を送達するステップをさらに含む、請求項３１０または３１１に記載の方法。
【請求項３１３】
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ｇ）を送達するステップをさらに含む、請求項２８２〜３１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１４】
（ａ）請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項３４〜１５４のいずれか１項に記載の核酸組成物、または請求項１５５〜１９３のいずれか１項に記載の組成物；および
β−異常ヘモグロビン症に罹患している対象の細胞を含む、反応混合物。
【請求項３１５】
（ａ）請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物、ならびに：
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ；
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子第２ｇＲＮＡ分子；および
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸組成物、の１つまたは複数を含む、キット。
【請求項３１６】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項３１５に記載のキット。
【請求項３１７】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項３１５または３１６に記載のキット。
【請求項３１８】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸組成物を含む、請求項３１５〜３１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１９】
ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第３ｇＲＮＡ分子をさらに含む、請求項３１５〜３１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２０】
ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第４ｇＲＮＡ分子をさらに含む、請求項３１９に記載のキット。
【請求項３２１】
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、請求項３１５〜３２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２２】
それを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症の治療に使用するための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２３】
前記ｇＲＮＡ分子が、（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、と組み合わせて使用される、請求項２９１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２４】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項３２３に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２５】
前記ｇＲＮＡ分子が、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、と組み合わせて使用される、請求項３２２〜３２４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２６】
前記ｇＲＮＡ分子が、（ｇ）テンプレート核酸、と組み合わせて使用される、請求項３２２〜３２５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２７】
それを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子の使用。
【請求項３２８】
前記薬剤が、（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、をさらに含む、請求項３２７に記載の使用。
【請求項３２９】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９分子である、請求項３２８に記載の使用。
【請求項３３０】
前記薬剤が、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項３２７〜３２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３１】
前記薬剤が、（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、請求項３２７〜３３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３２】
（ａ）請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子；および
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、を含む、ゲノム編集システム。
【請求項３３３】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、請求項３３２に記載のゲノム編集システム。
【請求項３３４】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、請求項３３３に記載のゲノム編集システム。
【請求項３３５】
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、請求項３３４に記載のゲノム編集システム。
【請求項３３６】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、請求項３３４または３３５に記載のゲノム編集システム。
【請求項３３７】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、請求項３３４または３３５に記載のゲノム編集システム。
【請求項３３８】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、請求項３３７に記載のゲノム編集システム。
【請求項３３９】
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、請求項３３７に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４０】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、請求項３３４〜３３９のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、請求項３４０に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４２】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、請求項３４０または３４１に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４３】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、請求項３３４〜３４２のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４４】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、請求項３４３に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４５】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、請求項３４３または３４４に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４６】
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項３３２〜３４５のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４７】
前記第２ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項３４に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４８】
（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項３３２〜３４７のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３４９】
（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、請求項３４８に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５０】
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、請求項３３２〜３４９のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５１】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項３５０に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５２】
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、請求項３５１に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５３】
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、請求項３５２に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５４】
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項３５３に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５５】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）；ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）；およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）からなる群から選択される、請求項３５４に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５６】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項３５５に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５７】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項３５６に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５８】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項１８０または１８１に記載のゲノム編集システム。
【請求項３５９】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項３５５〜３５８のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６０】
前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項３５５に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６１】
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、請求項３６０に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６２】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項３６０または３６１に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６３】
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、請求項３５６〜３６２のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６４】
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（すなわち、ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、請求項３５６〜３６３のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６５】
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項３５５に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６６】
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、請求項３６５に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６７】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項３５１〜３６６のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６８】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項３５１〜３６６のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項３６９】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項３５１〜３６６のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３０８，１９０号明細書、および２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６，６１５号明細書の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は、それらの全体の参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットでＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、これは、その全体の参照により本明細書に援用される。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年３月１４日に作成され、８００９ＷＯ００＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、サイズは３３５ＫＢである。
【０００３】
本発明は、標的核酸配列を編集するため、または標的核酸配列の発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連方法および構成要素、ならびに鎌状赤血球症およびβ−サラセミアを含むβ−異常ヘモグロビン症に関連するそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、肺から赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）の組織に酸素を運ぶ。出生前の発達中および出生直後まで、ヘモグロビンは、２つのアルファ（α）−グロビン鎖および２つのガンマ（γ）−グロビン鎖からなる四量体タンパク質である胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の形態で存在する。ＨｂＦは、グロビンスイッチングとして知られるプロセスによって、ＨｂＦのγ−グロビン鎖がベータ（β）−グロビン鎖で置換された四量体タンパク質である成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）によって大部分が置換される。ＨｂＦは、酸素の運搬においてＨｂＡよりも効率的である。平均的な成人は、全ヘモグロビンのうち１％未満のＨｂＦしか産生しない（Ｔｈｅｉｎ  ２００９）。αヘモグロビン遺伝子は、第１６染色体上に位置し、βヘモグロビン遺伝子（ＨＢＢ）、Ａガンマ（γＡ）グロビン鎖（ＨＢＧ１、ガンマグロビンＡとしても知られている）、およびＧガンマ（γＧ）グロビン鎖（ガンマグロビンＧとしても知られているＨＢＧ２）は、グロビン遺伝子クラスター（すなわち、グロビン遺伝子座）内の第１１染色体上に位置する。
【０００５】
ＨＢＢにおける突然変異は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびβ−サラセミア（β−Ｔｈａｌ）を含むヘモグロビン異常（すなわち、異常ヘモグロビン症）を引き起こし得る。米国では約９３，０００人が異常ヘモグロビン症と診断されている。世界中で、毎年３０万人の子供が異常ヘモグロビン症で生まれている（Ａｎｇａｓｔｉｎｉｏｔｉｓ  １９９８）。これらの状態は、ＨＢＢ突然変異に関連するため、その症状は、典型的にはＨｂＦからＨｂＡへのグロビンスイッチングの後まで現れない。
【０００６】
ＳＣＤは、米国で最も一般的な遺伝性の血液疾患であり、約８万人が罹患している（Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ  ２０１０）。ＳＣＤは、アフリカ系の人々で最も一般的であり、ＳＣＤの罹患率は５００人中１人である。アフリカでは、ＳＣＤの患者数は１５００万人である（Ａｌｉｙｕ  ２００８）。ＳＣＤはまた、インド系、サウジアラビア系、地中海系でより一般的である。ヒスパニック系アメリカ人では、鎌状赤血球疾患の患者数は１，０００人中１人である（Ｌｅｗｉｓ  ２０１４）
【０００７】
ＳＣＤは、ＨＢＢ遺伝子の単一ホモ接合突然変異、ｃ．１７Ａ＞Ｔ（ＨｂＳ突然変異）によって引き起こされる。鎌状突然変異は、ＨＢＢ上の点突然変異（ＧＡＧ→ＧＴＧ）であり、かつ、エクソン１のアミノ酸６位のグルタミン酸がバリンに置換される。βヘモグロビン鎖の６位のバリンは、疎水性であり、β−グロビンタンパク質が酸素に結合していない場合にこのβ−グロビンタンパク質の立体構造に変化をもたらす。この立体構造の変化は、酸素の非存在下でＨｂＳタンパク質の重合を引き起こして、ＲＢＣの変形（すなわち、鎌状化）をもたらす。ＳＣＤは、常染色体劣性の様式で遺伝し、したがって、２つのＨｂＳ対立遺伝子を有する患者のみがこの疾患を有する。ヘテロ接合体対象は鎌状赤血球形質を有し、重度脱水または酸素欠乏の場合に貧血および／または疼痛発作に罹患し得る。
【０００８】
鎌状ＲＢＣは、貧血、鎌状赤血球クリーゼ、血管閉塞クリーゼ、骨髄無形性クリーゼ、および急性胸部症候群を含む複数の症状を引き起こす。鎌状ＲＢＣは、野生型ＲＢＣより弾性が低く、したがって、毛細血管床を容易に通過することができず、閉塞および虚血（すなわち、血管閉塞）を引き起こす。血管閉塞クリーゼは、鎌状細胞が、疼痛、虚血、および壊死をもたらす器官の毛細血管床における血流を妨げるときに生じる。これらのエピソードは、通常５〜７日間持続する。脾臓は、機能不全の赤血球を除去する役割を果たし、したがって、幼児期には通常拡大され、頻繁な血管閉塞クリーゼに曝される。小児期の終わりになると、ＳＣＤ患者の脾臓は、しばしば梗塞を起こし、自己脾臓摘出（ａｕｔｏｓｐｌｅｎｅｃｔｏｍｙ）につながる。溶血は、ＳＣＤの不変の特徴であり、かつ貧血を引き起こす。鎌状細胞は、循環中で１０〜２０日間生存するが、健康なＲＢＣは９０〜１２０日間生存する。ＳＣＤ対象は、十分なヘモグロビンレベルを維持するために必要に応じて輸血される。頻繁な輸血は、対象をＨＩＶ、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎の感染のリスクに曝す。対象はまた、急性胸部クリーゼ（ａｃｕｔｅ  ｃｈｅｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ）、ならびに四肢、末端器官、および中枢神経系の梗塞に罹患する可能性もある。
【０００９】
ＳＣＤ対象は寿命が短くなる。ＳＣＤ患者の予後は、クリーゼおよび貧血の生涯にわたる慎重な管理で着実に改善している。２００１年現在、鎌状赤血球病対象の平均余命は、５０代半ばから後半までであった。現在のＳＣＤの治療法では、クリーゼの最中の水分補給および疼痛管理が行われ、貧血を改善するために必要に応じて輸血が行われる。
【００１０】
サラセミア（例えば、β−Ｔｈａｌ、δ−Ｔｈａｌ、およびβ／δ−Ｔｈａｌ）は、慢性貧血を引き起こす。β−Ｔｈａｌは、全世界で１０万人のうち約１人に影響を及ぼすと推定されている。その罹患率は、罹患率が１万人に約１人であるヨーロッパ系の集団を含む特定の集団でより高い。疾患のより重篤な形態であるβ−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒは、生涯にわたる輸血およびキレート療法で治療しない限り、生命を脅かす。米国では、約３，０００人のβ−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒ対象が存在する。β−Ｔｈａｌ中間体は、輸血を必要としないが、成長遅延および重大な全身性異常を引き起こす可能性があり、しばしば生涯にわたるキレート療法が必要となる。ＨｂＡは、成人ＲＢＣにおいてヘモグロビンの大部分を占めるが、成人ヘモグロビンの約３％が、２つのγ−グロビン鎖が２つのデルタ（Δ）−グロビン鎖で置換されたＨｂＡ変異体であるＨｂＡ２の形態である。δ−Ｔｈａｌは、ＨＢＤ発現の欠失を引き起こすΔヘモグロビン遺伝子（ＨＢＤ）の突然変異に関連している。ＨＢＤ突然変異の共遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）は、ＨｂＡ２のレベルを正常範囲に低下させることによってβ−Ｔｈａｌ（すなわち、β／δ−Ｔｈａｌ）の診断を隠蔽してしまうことがある（Ｂｏｕｖａ  ２００６）。β／δ−Ｔｈａｌは、通常は、両方の対立遺伝子におけるＨＢＢおよびＨＢＤ配列の欠失によって引き起こされる。ホモ接合体（δ０／δ０  β０／β０）患者では、ＨＢＧが発現され、ＨｂＦのみが産生される。
【００１１】
ＳＣＤと同様に、β−Ｔｈａｌは、ＨＢＢ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。β−Ｔｈａｌをもたらす最も一般的なＨＢＢ突然変異は：ｃ．−１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９３−２１Ｇ＞Ａ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１６−１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．−７８Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．３１６−１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．−７８Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．３１６−１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．−１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．−７９Ａ＞Ｇ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．３１６−２Ａ＞Ｇ、およびｃ．３１６−２Ａ＞Ｃである。β−Ｔｈａｌに関連するこれらおよび他の突然変異は、正常なＨｂα−ヘモグロビンとβ−ヘモグロビンの比率を乱す、β−グロビン鎖の突然変異または非存在をもたらす。過剰なα−グロビン鎖は、骨髄の赤血球前駆体に沈殿する。
【００１２】
β−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒにおいて、ＨＢＢの両方の対立遺伝子は、β−グロビン産生の完全な欠損（β０／β０と示される）をもたらすナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、またはスプライシング突然変異を含む。β−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒは、β−グロビン鎖の深刻な減少をもたらし、赤血球細胞におけるα−グロビン鎖の有意な沈殿、およびより重度の貧血を引き起こす。
【００１３】
β−Ｔｈａｌ中間体は、ＨＢＢの５’または３’非翻訳領域における突然変異、ＨＢＢのプロモーター領域もしくはポリアデニル化シグナルにおける突然変異、またはＨＢＢ遺伝子内のスプライシング突然変異から生じる。患者の遺伝子型は、β０／β＋またはβ＋／β＋で示される。β０は、β−グロビン鎖の発現の非存在を表し；β＋は、機能不全を表すが、β−グロビン鎖は存在する。表現型の発現は患者によって異なる。β−Ｔｈａｌ中間体は、β−グロビンがある程度産生されるため、赤血球前駆細胞へのα−グロビン鎖の沈殿を減少させ、β−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒよりも重症度の低い貧血をもたらす。しかし、慢性貧血に続発する赤血球系統の増殖のより重大な結果が存在する。
【００１４】
生後６ヵ月から２歳までの間のβ−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒ対象は、発育不全、発熱、肝脾腫大症、および下痢に悩まされる。適切な治療には、定期的な輸血が含まれる。β−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒの療法には、脾臓切除およびヒドロキシ尿素での治療も含まれる。患者が定期的に輸血される場合、患者は、２０代の初めまで正常に発達する。その時に、患者は、鉄過剰の合併症を防止するために（継続的な輸血に加えて）キレート療法を必要とする。鉄過剰は、成長遅延または性成熟の遅延として現れ得る。成人期では、不十分なキレート療法は、心筋症、心不整脈、肝線維症、および／または肝硬変、糖尿病、甲状腺および副甲状腺異常、血栓症、ならびに骨粗鬆症をもたらし得る。頻繁な輸血はまた、対象をＨＩＶ、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎の感染のリスクに曝す。
【００１５】
β−Ｔｈａｌ中間体の対象は、一般に２〜６歳の間に存在する。対象は、一般的に輸血を必要としない。しかし、骨の異常は、慢性貧血を補償するために赤血球系統の慢性肥大により生じる。対象は、骨粗鬆症による長骨の骨折を有し得る。髄外赤血球生成は、一般的であり、かつ脾臓、肝臓、およびリンパ節の拡大をもたらす。また、脊髄圧迫および神経学的な問題も引き起こし得る。対象はまた、下肢潰瘍にも罹患し、かつ脳卒中、肺塞栓症、および深部静脈血栓症を含む血栓事象のリスクが増大する。β−Ｔｈａｌ中間体の治療には、脾臓切除、葉酸補充、ヒドロキシ尿素療法、および髄外腫瘍の放射線療法が含まれる。鉄過剰を発症する対象には、キレート療法が用いられる。
【００１６】
β−Ｔｈａｌ患者では、しばしば平均余命が短くなる。輸血療法を受けていないβ−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒ対象は、一般に２０代または３０代で死亡する。定期的な輸血および十分なキレート療法を受けているβ−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒ対象は、５０代以降も生存可能である。鉄毒性に続発する心不全は、鉄毒性によるβ−Ｔｈａｌ  ｍａｊｏｒ対象の主な死因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌのための様々な新しい治療法が現在開発中である。遺伝子治療による修正されたＨＢＢ遺伝子の送達は、現在、臨床試験において研究されている。しかし、このアプローチの長期的な有効性および安全性は不明である。ＨＬＡ適合同種異系幹細胞ドナー由来の造血幹細胞による移植は、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌを治癒することが実証されているが、この処置は、移植のために対象の準備をするアブレーション療法に関連したリスク、および移植後の移植片対宿主病のリスクを含むリスクを伴う。加えて、適合同種異系ドナーは、しばしば同定することができない。したがって、これらおよび他の異常ヘモグロビン症を管理する改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
特定の実施形態では、ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集システム）を用いて対象または細胞における１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現（すなわち、転写活性）を増加させるための方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、任意の修復機構を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの全てまたは一部を変化させる（例えば、欠失させる、破壊する、または修飾する）ことができる。特定の実施形態では、これらの方法は、ＤＮＡ修復機構、例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを利用して、１つまたは複数のγグロビン遺伝子調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を欠失させるまたは破壊することができる。特定の実施形態では、これらの方法は、ＤＮＡ修復機構、例えば、ＨＤＲを利用して、γ−グロビン遺伝子調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）における１つまたは複数のヌクレオチドの配列を、突然変異させること、挿入すること、欠失させること、または破壊することを含め、変化させる。特定の実施形態では、これらの方法は、１つまたは複数のＤＮＡ修復機構、例えば、ＮＨＥＪおよびＨＤＲの組み合わせを利用する。特定の実施形態では、これらの方法は、例えば、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；もしくはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；またはＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；もしくはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇを含む、自然発生のＨＰＦＨ変異に関連するγ−グロビン調節エレメントの突然変異または変異をもたらす。
【００１９】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を用いて、１つまたは複数のγグロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現（すなわち、転写活性）を増加させることを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症を治療する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、ＤＮＡ修復機構、例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を欠失させるまたは破壊する。特定の実施形態では、これらの方法は、ＤＮＡ修復機構、例えば、ＨＤＲを利用して、γ−グロビン遺伝子調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）における１つまたは複数のヌクレオチド配列を、突然変異させること、挿入すること、欠失させること、または破壊することを含め、変化させる。特定の実施形態では、これらの方法は、１つまたは複数のＤＮＡ修復機構、例えば、ＮＨＥＪおよびＨＤＲの組み合わせを利用する。特定の実施形態では、これらの方法は、例えば、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；もしくはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；またはＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；もしくはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇを含む、自然発生のＨＰＦＨ変異に関連するγ−グロビン調節エレメントの突然変異または変異をもたらす。特定の実施形態では、β−異常ヘモグロビン症はＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌである。
【００２０】
特定の実施形態では、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現（すなわち、転写活性）を増加させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介方法に使用するためのｇＲＮＡが本明細書で提供される。特定の実施形態では、これらのｇＲＮＡは、配列番号２５１〜９０１に規定のヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、これらのｇＲＮＡは、第１相補性ドメイン、第２相補性ドメイン、連結ドメイン、５’伸長ドメイン、隣接ドメイン、またはテールドメインのうちの１つまたは複数をさらに含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはモジュラーである。他の実施形態では、ｇＲＮＡは単分子（またはキメラ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
[図１Ａ−１Ｉ]いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。
【図１Ａ】部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））に由来する（または部分的に配列をモデルにしている）、モジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号３９および４０）。
【図１Ｂ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４１）。
【図１Ｃ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４２）。
【図１Ｄ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４３）。
【図１Ｅ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４４）。
【図１Ｆ】ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に部分的に由来するモジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４５および４６）。
【図１Ｇ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のモジュラーｇＲＮＡ分子のアライメントを描写する（それぞれ出現順に配列番号３９、４５、４７、および４６）。    [図１Ｈ−１Ｉ]単分子ｇＲＮＡ分子のさらに別の例示的な構造を描写する。
【図１Ｈ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子の例示的な構造を二重鎖構造として示す（配列番号４２）。
【図１Ｉ】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子の例示的な構造を二重鎖構造として示す（配列番号３８）。
【図２Ａ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｂ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｃ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｄ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｅ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｆ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｇ】Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図３Ａ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜９５、１２０〜１２３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。
【図３Ｂ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜９５、１２０〜１２３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。
【図４Ａ】配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜１２３）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図４Ｂ】配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜１２３）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図５Ａ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図５Ｂ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図５Ｃ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図６Ａ】配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１４１、１４８、１４９、１５１〜１５３、１６２、１６３、１６６〜１７４、１７７〜１８７、１９４〜１９８）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図６Ｂ】配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１４１、１４８、１４９、１５１〜１５３、１６２、１６３、１６６〜１７４、１７７〜１８７、１９４〜１９８）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図７】例示的なｇＲＮＡ配列（配列番号４２）を用いたｇＲＮＡドメイン用語を説明する。
【図８Ａ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のドメイン構成の概略図を提供する。図８Ａは、Ｃａｓ９の２つのローブ（認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ）を参照して、アミノ酸位置を含むＣａｓ９ドメインの構成を示す。図８Ｂは、８３のＣａｓ９オルソログにわたる各ドメインのパーセント相同性を示す。
【図８Ｂ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のドメイン構成の概略図を提供する。図８Ａは、Ｃａｓ９の２つのローブ（認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ）を参照して、アミノ酸位置を含むＣａｓ９ドメインの構成を示す。図８Ｂは、８３のＣａｓ９オルソログにわたる各ドメインのパーセント相同性を示す。
【図９】グロビン遺伝子座の文脈におけるＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子（複数可）の概略図を提供する。コード配列（ＣＤＳ）、ｍＲＮＡ領域、および遺伝子が示されている。（Ａ）ｇＲＮＡデザインの標的とされた領域（ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子に近接する遺伝子領域を示す破線および括弧）が示されている。（Ｂ）コアプロモーターエレメントが示されている。（Ｃ）転写活性化因子および転写リプレッサーが結合して遺伝子発現を調節し得る遺伝子調節領域におけるモチーフが示されている。モチーフとｇＲＮＡデザインの標的となるゲノム領域との間の重複に注目されたい。ＨＰＦＨを引き起こすＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子調節領域における欠失の例、ならびにそれぞれに関連する％ＨｂＦが示されている。
【図１０Ａ】ヒトＫ５６２赤白血病細胞における１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異の組み込みについてのｇＲＮＡスクリーニングのデータを示す。（Ａ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）特異的ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｃ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）および（Ｃ）については、編集事象のタイプ（挿入、欠失）および欠失のサブタイプ（部分的に［１２ｎｔ  ＨＰＦＨ］または完全に［１３−２６ｎｔ  ＨＰＦＨ］欠失した１３ｎｔの標的、欠失した他の配列［他の欠失］）は、異なる陰影付き／模様付きのバーによって示されている。（Ｄ）〜（Ｆ）ＨＢＧ１遺伝子調節領域の欠失の例。
【図１０Ｂ】ヒトＫ５６２赤白血病細胞における１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異の組み込みについてのｇＲＮＡスクリーニングのデータを示す。（Ａ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）特異的ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｃ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）および（Ｃ）については、編集事象のタイプ（挿入、欠失）および欠失のサブタイプ（部分的に［１２ｎｔ  ＨＰＦＨ］または完全に［１３−２６ｎｔ  ＨＰＦＨ］欠失した１３ｎｔの標的、欠失した他の配列［他の欠失］）は、異なる陰影付き／模様付きのバーによって示されている。（Ｄ）〜（Ｆ）ＨＢＧ１遺伝子調節領域の欠失の例。
【図１０Ｃ】ヒトＫ５６２赤白血病細胞における１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異の組み込みについてのｇＲＮＡスクリーニングのデータを示す。（Ａ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）特異的ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｃ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）および（Ｃ）については、編集事象のタイプ（挿入、欠失）および欠失のサブタイプ（部分的に［１２ｎｔ  ＨＰＦＨ］または完全に［１３−２６ｎｔ  ＨＰＦＨ］欠失した１３ｎｔの標的、欠失した他の配列［他の欠失］）は、異なる陰影付き／模様付きのバーによって示されている。（Ｄ）〜（Ｆ）ＨＢＧ１遺伝子調節領域の欠失の例。
【図１０Ｄ】ヒトＫ５６２赤白血病細胞における１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異の組み込みについてのｇＲＮＡスクリーニングのデータを示す。（Ａ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）特異的ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｃ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）および（Ｃ）については、編集事象のタイプ（挿入、欠失）および欠失のサブタイプ（部分的に［１２ｎｔ  ＨＰＦＨ］または完全に［１３−２６ｎｔ  ＨＰＦＨ］欠失した１３ｎｔの標的、欠失した他の配列［他の欠失］）は、異なる陰影付き／模様付きのバーによって示されている。（Ｄ）〜（Ｆ）ＨＢＧ１遺伝子調節領域の欠失の例。
【図１０Ｅ】ヒトＫ５６２赤白血病細胞における１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異の組み込みについてのｇＲＮＡスクリーニングのデータを示す。（Ａ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）特異的ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｃ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）および（Ｃ）については、編集事象のタイプ（挿入、欠失）および欠失のサブタイプ（部分的に［１２ｎｔ  ＨＰＦＨ］または完全に［１３−２６ｎｔ  ＨＰＦＨ］欠失した１３ｎｔの標的、欠失した他の配列［他の欠失］）は、異なる陰影付き／模様付きのバーによって示されている。（Ｄ）〜（Ｆ）ＨＢＧ１遺伝子調節領域の欠失の例。
【図１０Ｆ】ヒトＫ５６２赤白血病細胞における１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異の組み込みについてのｇＲＮＡスクリーニングのデータを示す。（Ａ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）特異的ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｃ）示されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをコードするＤＮＡで電気穿孔された後にＫ５６２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ中のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析によって決定した遺伝子編集。（Ｂ）および（Ｃ）については、編集事象のタイプ（挿入、欠失）および欠失のサブタイプ（部分的に［１２ｎｔ  ＨＰＦＨ］または完全に［１３−２６ｎｔ  ＨＰＦＨ］欠失した１３ｎｔの標的、欠失した他の配列［他の欠失］）は、異なる陰影付き／模様付きのバーによって示されている。（Ｄ）〜（Ｆ）ＨＢＧ１遺伝子調節領域の欠失の例。
【図１１Ａ】欠失のために特定の１３ｎｔの配列を標的とするインビトロ転写Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ（ＨＢＧ  ｇＲＮＡ  Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）およびＳｐ３７（配列番号３３３を含む））と複合体化したＲＮＰで電気穿孔された後のヒト臍帯血（ＣＢ）およびヒト成人ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集の結果を示す。図１１Ａは、示されたＲＮＰで処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞またはドナー適合未処理対照細胞（ｎ＝３ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞、３回の別個の実験）から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたインデルのパーセンテージを示す。示されたデータは、３つの別々のドナー／実験における標準偏差に対応する平均バーおよび誤差バーを表す。図１１Ｂは、示されたＲＮＰで処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞もしくは成人ＣＤ３４＋細胞、またはドナー適合未処理対照細胞（ｎ＝３  ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞、ｎ＝３  ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞、３回の別個の実験）から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたインデルのパーセンテージを示す。示されたデータは、３つの別々のドナー／実験における標準偏差に対応する平均バーおよび誤差バーを表す。図１１Ｃ（上のパネル）は、ＨＢＧ  Ｓｐ３５  ＲＮＰまたはＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ  ＋／−  ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０６）またはＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０９）で電気穿孔されたヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出された編集を示す。図１１Ｃ（左下のパネル）は、ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰおよびｓｓＯＤＮ１およびＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１で編集された細胞からのｇＤＮＡのサンガーＤＮＡ配列分析によって決定された遺伝子編集のレベルを示す。図１１Ｃ（右下のパネル）は、左下のパネルに提示されたデータからの全欠失内で検出された特定のタイプの欠失を示す。
【図１１Ｂ】欠失のために特定の１３ｎｔの配列を標的とするインビトロ転写Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ（ＨＢＧ  ｇＲＮＡ  Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）およびＳｐ３７（配列番号３３３を含む））と複合体化したＲＮＰで電気穿孔された後のヒト臍帯血（ＣＢ）およびヒト成人ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集の結果を示す。図１１Ａは、示されたＲＮＰで処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞またはドナー適合未処理対照細胞（ｎ＝３ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞、３回の別個の実験）から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたインデルのパーセンテージを示す。示されたデータは、３つの別々のドナー／実験における標準偏差に対応する平均バーおよび誤差バーを表す。図１１Ｂは、示されたＲＮＰで処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞もしくは成人ＣＤ３４＋細胞、またはドナー適合未処理対照細胞（ｎ＝３  ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞、ｎ＝３  ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞、３回の別個の実験）から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたインデルのパーセンテージを示す。示されたデータは、３つの別々のドナー／実験における標準偏差に対応する平均バーおよび誤差バーを表す。図１１Ｃ（上のパネル）は、ＨＢＧ  Ｓｐ３５  ＲＮＰまたはＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ  ＋／−  ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０６）またはＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０９）で電気穿孔されたヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出された編集を示す。図１１Ｃ（左下のパネル）は、ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰおよびｓｓＯＤＮ１およびＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１で編集された細胞からのｇＤＮＡのサンガーＤＮＡ配列分析によって決定された遺伝子編集のレベルを示す。図１１Ｃ（右下のパネル）は、左下のパネルに提示されたデータからの全欠失内で検出された特定のタイプの欠失を示す。
【図１１Ｃ】欠失のために特定の１３ｎｔの配列を標的とするインビトロ転写Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ（ＨＢＧ  ｇＲＮＡ  Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）およびＳｐ３７（配列番号３３３を含む））と複合体化したＲＮＰで電気穿孔された後のヒト臍帯血（ＣＢ）およびヒト成人ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集の結果を示す。図１１Ａは、示されたＲＮＰで処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞またはドナー適合未処理対照細胞（ｎ＝３ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞、３回の別個の実験）から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたインデルのパーセンテージを示す。示されたデータは、３つの別々のドナー／実験における標準偏差に対応する平均バーおよび誤差バーを表す。図１１Ｂは、示されたＲＮＰで処理されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞もしくは成人ＣＤ３４＋細胞、またはドナー適合未処理対照細胞（ｎ＝３  ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞、ｎ＝３  ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞、３回の別個の実験）から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたインデルのパーセンテージを示す。示されたデータは、３つの別々のドナー／実験における標準偏差に対応する平均バーおよび誤差バーを表す。図１１Ｃ（上のパネル）は、ＨＢＧ  Ｓｐ３５  ＲＮＰまたはＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ  ＋／−  ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０６）またはＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０９）で電気穿孔されたヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出された編集を示す。図１１Ｃ（左下のパネル）は、ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰおよびｓｓＯＤＮ１およびＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１で編集された細胞からのｇＤＮＡのサンガーＤＮＡ配列分析によって決定された遺伝子編集のレベルを示す。図１１Ｃ（右下のパネル）は、左下のパネルに提示されたデータからの全欠失内で検出された特定のタイプの欠失を示す。
【図１２Ａ】Ｋ５６２赤白血病細胞におけるＨＢＧ１およびＨＢＧ２の遺伝子編集を示す。図１２Ａは、示されたｇＲＮＡと複合体化したＲＮＰによるヌクレオフェクションの３日後にＫ５６２細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたＮＨＥＪ（インデル）を示す。図１２Ｂは、１３ｎｔ  ＨＰＦＨ配列（Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）、Ｓｐ３６（配列番号３３８を含む）、Ｓｐ３７（配列番号３３３を含む））を標的とするｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトされた細胞のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のサンガーＤＮＡ配列分析を示す。図１２Ｃは、１３ｂｐのＨＰＦＨ配列（Ｓｐ３５、Ｓｐ３６、Ｓｐ３７）を標的とするｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトされた細胞のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のサンガーＤＮＡ配列分析を示す。図１２Ｂおよび図１２Ｃでは、欠失は、１３ｂｐの標的化欠失（ＨＰＦＨの欠失、１８〜２６ｎｔの欠失、＞２６ｎｔの欠失）および１３ｂｐの欠失を含まない欠失（＜１２ｎｔの欠失、他の欠失、挿入）を含む欠失にさらに分けられた。
【図１２Ｂ】Ｋ５６２赤白血病細胞におけるＨＢＧ１およびＨＢＧ２の遺伝子編集を示す。図１２Ａは、示されたｇＲＮＡと複合体化したＲＮＰによるヌクレオフェクションの３日後にＫ５６２細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたＮＨＥＪ（インデル）を示す。図１２Ｂは、１３ｎｔ  ＨＰＦＨ配列（Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）、Ｓｐ３６（配列番号３３８を含む）、Ｓｐ３７（配列番号３３３を含む））を標的とするｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトされた細胞のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のサンガーＤＮＡ配列分析を示す。図１２Ｃは、１３ｂｐのＨＰＦＨ配列（Ｓｐ３５、Ｓｐ３６、Ｓｐ３７）を標的とするｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトされた細胞のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のサンガーＤＮＡ配列分析を示す。図１２Ｂおよび図１２Ｃでは、欠失は、１３ｂｐの標的化欠失（ＨＰＦＨの欠失、１８〜２６ｎｔの欠失、＞２６ｎｔの欠失）および１３ｂｐの欠失を含まない欠失（＜１２ｎｔの欠失、他の欠失、挿入）を含む欠失にさらに分けられた。
【図１２Ｃ】Ｋ５６２赤白血病細胞におけるＨＢＧ１およびＨＢＧ２の遺伝子編集を示す。図１２Ａは、示されたｇＲＮＡと複合体化したＲＮＰによるヌクレオフェクションの３日後にＫ５６２細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出されたＮＨＥＪ（インデル）を示す。図１２Ｂは、１３ｎｔ  ＨＰＦＨ配列（Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）、Ｓｐ３６（配列番号３３８を含む）、Ｓｐ３７（配列番号３３３を含む））を標的とするｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトされた細胞のＨＢＧ１遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のサンガーＤＮＡ配列分析を示す。図１２Ｃは、１３ｂｐのＨＰＦＨ配列（Ｓｐ３５、Ｓｐ３６、Ｓｐ３７）を標的とするｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトされた細胞のＨＢＧ２遺伝子座から増幅されたＰＣＲ産物のサンガーＤＮＡ配列分析を示す。図１２Ｂおよび図１２Ｃでは、欠失は、１３ｂｐの標的化欠失（ＨＰＦＨの欠失、１８〜２６ｎｔの欠失、＞２６ｎｔの欠失）および１３ｂｐの欠失を含まない欠失（＜１２ｎｔの欠失、他の欠失、挿入）を含む欠失にさらに分けられた。
【図１３Ａ】１３ｂｐの欠失をコードするＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ  ＋／−  ｓｓＯＤＮでのｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の、ヒト成人動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＧの遺伝子編集およびＲＮＰ処理細胞の赤血球子孫における胎児ヘモグロビンの誘導を示す。図１３Ａは、ＲＮＰで処理されたｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞またはドナー適合未処理対照細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出された編集のパーセンテージを示す。図１３Ｂは、ＲＮＰ処理および未処理ドナー適合対照ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞から分化した７日目の赤芽球におけるＨＢＧ  ｍＲＮＡ発現の倍数変化を示す。ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨに対して標準化され、対応する分化の日に未処理対照で検出されたレベルに較正されている。
【図１３Ｂ】１３ｂｐの欠失をコードするＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ  ＋／−  ｓｓＯＤＮでのｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔後の、ヒト成人動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＧの遺伝子編集およびＲＮＰ処理細胞の赤血球子孫における胎児ヘモグロビンの誘導を示す。図１３Ａは、ＲＮＰで処理されたｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞またはドナー適合未処理対照細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって検出された編集のパーセンテージを示す。図１３Ｂは、ＲＮＰ処理および未処理ドナー適合対照ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞から分化した７日目の赤芽球におけるＨＢＧ  ｍＲＮＡ発現の倍数変化を示す。ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨに対して標準化され、対応する分化の日に未処理対照で検出されたレベルに較正されている。
【図１４Ａ】同じドナーからのＲＮＰ処理および未処理ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞のエクスビボ分化能を示す。図１４Ａは、造血骨髄／赤血球コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の能力を示し、コロニーの数およびサブタイプが示されている（ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−単球−マクロファージコロニー、Ｅ：赤血球コロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｍ：マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー）。図１４Ｂは、示された時点および示されたサンプルについてのフローサイトメトリー分析によって決定された赤血球分化の時間経過にわたり発現されたグリコホリンＡのパーセンテージを示す。
【図１４Ｂ】同じドナーからのＲＮＰ処理および未処理ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞のエクスビボ分化能を示す。図１４Ａは、造血骨髄／赤血球コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の能力を示し、コロニーの数およびサブタイプが示されている（ＧＥＭＭ：顆粒球−赤血球−単球−マクロファージコロニー、Ｅ：赤血球コロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｍ：マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー）。図１４Ｂは、示された時点および示されたサンプルについてのフローサイトメトリー分析によって決定された赤血球分化の時間経過にわたり発現されたグリコホリンＡのパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
定義
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸のセグメントを示すために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、いかなる特定の機能特性も有する必要はない。
【００２３】
２つの配列間の相同性または配列同一性（用語は本明細書で同義的に使用される）の計算は、次のようにして実施される。これらの配列は、最適な比較を目的として整列され（例えば、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップを挿入することができ、非相同配列は、比較のために無視することができる）。最適アライメントは、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスを備えたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして決定される。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、これらの配列によって共有される同一の位置数の関数である。
【００２４】
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、ポリペプチドは、５０未満、２０未満、または１０未満のアミノ酸残基を有する。
【００２５】
「Ａｌｔ−ＨＤＲ」、「代替相同組換え修復（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）」、または「代替ＨＤＲ」は、本明細書の用法では、相同核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いるＤＮＡ損傷の修復プロセスを指す。Ａｌｔ−ＨＤＲは、プロセスが標準ＨＤＲとは異なる経路を利用し、かつ標準ＨＤＲメディエーター、ＲＡＤ５１、およびＢＲＣＡ２によって阻害できるという点で、標準ＨＤＲとは異なる。また、ａｌｔ−ＨＤＲは、破壊の修復のために一本鎖またはニック相同核酸（ｎｉｃｋｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を使用する。
【００２６】
「標準ＨＤＲ」または「標準相同組換え修復」は、本明細書の用法では、相同核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いるＤＮＡ損傷の修復プロセスを指す。標準ＨＤＲは、典型的には、ＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖部分を形成する二本鎖切断における有意な切除のときに機能する。通常の細胞では、ＨＤＲは、典型的には、一連のステップ、例えば、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体（ＤＮＡ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）の形成、このクロスオーバー中間体の分解、およびライゲーションを含む。このプロセスは、ＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２を必要とし、相同核酸は典型的には二本鎖である。
【００２７】
特に断りのない限り、用語「ＨＤＲ」は、本明細書の用法では、標準ＨＤＲおよびａｌｔ−ＨＤＲの両方を包含する。
【００２８】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロ相同性媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存性マイクロ相同性媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）を含む、ライゲーション媒介修復および／または非テンプレート媒介修復を指す。
【００２９】
「参照分子」は、本明細書の用法では、修飾分子または候補分子が比較される分子を指す。例えば、参照Ｃａｓ９分子は、修飾または候補Ｃａｓ９分子が比較されるＣａｓ９分子を指す。同様に、参照ｇＲＮＡは、修飾または候補ｇＲＮＡ分子が比較されるｇＲＮＡ分子を指す。修飾分子または候補分子は、配列（例えば、修飾分子または候補分子は、参照分子とのＸ％の配列同一性または相同性を有し得る）または活性（例えば、修飾分子または候補分子は、参照分子の活性のＸ％を有し得る）に基づいて参照分子と比較することができる。例えば、参照分子がＣａｓ９分子である場合、修飾分子または候補分子は、参照Ｃａｓ９分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有すると特徴付けることができる。参照Ｃａｓ９分子の例として、天然起源の未修飾Ｃａｓ９分子、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する天然起源のＣａｓ９分子が挙げられる。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、天然起源のＣａｓ９分子が比較される修飾または候補Ｃａｓ９分子と最も近い配列同一性または相同性を有するこの天然起源のＣａｓ９分子である。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、修飾または候補Ｃａｓ９分子になるように突然変異させた天然起源の配列または既知の配列を有する親分子である。
【００３０】
用語「ゲノム編集システム」は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ編集活性を有する任意のシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、天然起源のＣＲＩＳＰＲシステムに適合する少なくとも２つの構成要素：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む。これらの２つの構成要素は、特定の核酸配列と会合して、その核酸配列中またはその付近のＤＮＡを、例えば、一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）、二本鎖切断（ＤＳＢ）、および／または点突然変異の１つまたは複数を生じさせることによって編集することができる複合体を形成する。
【００３１】
分子の修飾に関連する「置換」または「置換された」は、本明細書の用法では、プロセスの制限を必要とせず、置換実体（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｅｎｔｉｔｙ）が存在することを単に示す。
【００３２】
「対象」は、本明細書の用法では、ヒト、マウス、または非ヒト霊長類を意味し得る。
【００３３】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症または進行を停止または阻止すること；（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の状態を退行させること；（ｃ）疾患の１つまたは複数の症状を緩和すること；および（ｄ）疾患を治癒することを含む、対象、例えば、ヒトの疾患の治療を意味する。例えば、ＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌを「治療すること」は、他にも可能性はあるが、ＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌの発症もしくは進行を防止すること、ＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌの１つまたは複数の症状（例えば、貧血、鎌状赤血球症、血管閉塞クリーゼ）を緩和すること、またはＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌを治癒することを指し得る。
【００３４】
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本明細書の用法では、（ａ）疾患を予防または防止すること；（ｂ）疾患の素因に影響を与えること；および（ｃ）疾患の少なくとも１つの症状の発症を予防または遅延させることを含む、対象、例えば、ヒトの疾患の予防を意味する。
【００３５】
アミノ酸配列の文脈における「Ｘ」は、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、あらゆる２０個の天然アミノ酸）を指す。
【００３６】
「調節領域」は、本明細書の用法では、遺伝子の発現を制御または調節する１つまたは複数の調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を含むＤＮＡ配列を指す。例えば、γ−グロビン遺伝子調節領域は、γ−グロビン遺伝子の発現を制御または調節する１つまたは複数の調節エレメントを含む。特定の実施形態では、調節領域は、制御または調節される遺伝子に隣接している。例えば、γ−グロビン遺伝子調節領域は、γ−グロビン遺伝子に隣接してもよいし、または結合してもよい。他の実施形態では、調節領域は、その発現が制御または調節される遺伝子の上方制御または下方制御をもたらし得る別の遺伝子に隣接してもよいし、または結合してもよい。例えば、γ−グロビン遺伝子調節領域は、γ−グロビン遺伝子発現のリプレッサーを発現する遺伝子に隣接していてもよい。ＨＢＧ１の場合、調節領域は、配列番号９０２の少なくとも１〜２９９０のヌクレオチドを含む。ＨＢＧ２の場合、調節領域は、配列番号９０３の少なくとも１〜２９１４のヌクレオチドを含む。
【００３７】
「ＨＢＧ標的位置」は、本明細書の用法では、標的部位（例えば、欠失または突然変異される標的配列）を含むＨＢＧ１またはＨＢＧ２制御領域における位置（それぞれ、「ＨＢＧ１標的位置」および「ＨＢＧ２標的位置」）を指し、この位置は、変化されると（例えば、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）挿入または欠失の導入によって破壊または欠失される、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＨＤＲ媒介）配列変化によって変化されると））、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２遺伝子産物（すなわち、γ−グロビン）の発現の増加（例えば、脱抑制）をもたらす。特定の実施形態では、ＨＢＧ標的位置は、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２に隣接する調節領域内のＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）内にある。これらのある実施形態は、ＨＢＧ標的位置の変化は、抑制因子結合の低下、すなわち、脱抑制をもたらし、結果としてＨＢＧ１またはＨＢＧ２の発現が増加する。他の実施形態では、ＨＢＧ標的位置は、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２遺伝子発現の制御に関与する遺伝子産物（例えば、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２遺伝子発現のリプレッサー）をコードするＨＢＧ１またはＨＢＧ２以外の遺伝子の調節エレメント内にある。特定の実施形態では、ＨＢＧ標的位置は、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２発現の調節に関与する結合モチーフの密度が最も高い、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域の領域である。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数のＨＢＧ標的位置を同時にまたは連続的に標的とする。
【００３８】
「標的配列」は、本明細書の用法では、ＨＢＧ標的位置を含む核酸配列を指す。
【００３９】
「Ｃａｓ９分子」または「Ｃａｓ９ポリペプチド」はそれぞれ、本明細書の用法では、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と共同して、標的ドメインを含む部位、および特定の実施形態ではＰＡＭ配列に局在し得る分子またはポリペプチドを指す。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、天然起源のＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドの両方、ならびに参照配列、例えば最も類似した天然起源のＣａｓ９分子と、例えば少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる、遺伝子操作された、変化された、または修飾されたＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを含む。
【００４０】
概要
ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集）を使用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現（すなわち、転写活性）を増加させる方法が本明細書で提供される。これらの方法は、ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集）を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節領域を変化させて（例えば、欠失させて、破壊して、または修飾して）、γ−グロビン遺伝子の発現を増加させる（例えば、脱抑制する、促進する）。これらのある実施形態では、この方法は、標的とされるγ−グロビン遺伝子に関連する１つまたは複数の調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を変化させる。他の実施形態では、この方法は、標的とされるγ−グロビン遺伝子以外の遺伝子（例えば、γ−グロビン遺伝子リプレッサーをコードする遺伝子）の１つまたは複数の調節エレメントを変化させる。特定の実施形態では、ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集）を使用して、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２の両方の調節要素（例えばサイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を変化させる。特定の実施形態では、ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集）は、例えば、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；もしくはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；またはＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；もしくはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇを含む、自然発生のＨＰＦＨ変異に関連するγ−グロビン調節エレメントの突然変異または変異をもたらす。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集）を用いる方法は、任意の修復機構を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの全てまたは一部を変化させる（例えば、欠失させる、破壊する、または修飾する）ことができる。特定の実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）挿入または欠失を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの全てまたは一部を破壊する。例えば、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）を利用して、γ−グロビン遺伝子の負の制御エレメント（例えば、サイレンサー）の全てまたは一部を欠失させ、これにより、負の調節エレメントの不活性化（例えば、サイレンサーとリプレッサーとの間の結合の消失）、およびγ−グロビン遺伝子の発現の増加をもたらすことができる。他の実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）挿入または欠失を利用して、γ−グロビン遺伝子リプレッサーをコードする遺伝子に関連する１つまたは複数の調節エレメントの全てまたは一部を破壊する。例えば、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）を利用して、γ−グロビンリプレッサー遺伝子の正の調節エレメント（例えば、プロモーター）の全てまたは一部を欠失させることができ、これにより、リプレッサーの発現の低下、リプレッサーのγ−グロビン遺伝子サイレンサーへの結合の減少、およびγ−グロビン遺伝子の発現の増加をもたらすことができる。他の実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの配列を修飾する（例えば、自然発生のＨＰＦＨ突然変異に対応するＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節エレメントにおける突然変異を導入する、またはＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節エレメントの全てまたは一部を欠失させる）。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のＤＮＡ修復機構の組み合わせ（例えば、ＮＨＥＪおよびＨＤＲ）を使用することができる。特定の実施形態では、この方法は、対象のＨｂＦを持続させる。本明細書ではまた、これらの方法で使用するための組成物（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ポリペプチドおよび分子、テンプレート核酸、ベクター）およびキットが提供される。
【００４２】
γ−グロビン遺伝子（すなわち、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）の発現からＨＢＢの発現への移行（すなわち、グロビンスイッチング）は、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌを含むβ−異常ヘモグロビン症の症状の発症に関連している。したがって、特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を用いて１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現を増加させて、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌを含むβ−異常ヘモグロビン症を治療または予防するための方法、組成物、およびキットが本明細書で提供される。これらのある実施形態では、この方法は、標的とされるγ−グロビン遺伝子に関連する１つまたは複数の調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を変化させる。他の実施形態では、この方法は、標的とされるγ−グロビン遺伝子以外の遺伝子（例えば、γ−グロビン遺伝子リプレッサーをコードする遺伝子）における１つまたは複数の調節エレメントを変化させる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を使用して、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２の両方の調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサー、プロモーター、またはインシュレーター）を変化させる。いくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）挿入または欠失を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの全てまたは一部を破壊する。例えば、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）を利用して、γ−グロビン遺伝子の負の調節エレメント（例えば、サイレンサー）の全てまたは一部を欠失させ、これにより、負の調節エレメントの不活性化（例えば、サイレンサーとリプレッサーとの間の結合の消失）、およびγ−グロビン遺伝子の発現の増加をもたらすことができる。他の実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）挿入または欠失を利用して、γ−グロビン遺伝子リプレッサーをコードする遺伝子に関連する１つまたは複数の調節エレメントの全てまたは一部を破壊する。例えば、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ）を利用して、γ−グロビンリプレッサー遺伝子の正の調節エレメント（例えば、プロモーター）の全てまたは一部を欠失させ、これにより、リプレッサーの発現の低下、リプレッサーのγ−グロビン遺伝子サイレンサーへの結合の減少、およびγ−グロビン遺伝子の発現の増加をもたらすことができる。他の実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を利用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの配列を修飾する（例えば、自然発生のＨＰＦＨ突然変異に対応するＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節エレメントに突然変異を導入する、またはＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節エレメントの全てまたは一部を欠失させる）。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のＤＮＡ修復機構の組み合わせ（例えば、ＮＨＥＪおよびＨＤＲ）を使用することができる。特定の実施形態では、この方法は、対象のＨｂＦを持続させる。
【００４３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用する１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）の発現の増加は、ＨｂＦのＨｂＡに対する優先的な生成および／または総ヘモグロビンのパーセンテージとしてのＨｂＦレベルの増加をもたらす。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を使用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現を増加させることによって、総ＨｂＦレベルを増加させる、総ヘモグロビンレベルのパーセンテージとしてのＨｂＦレベルを増加させる、または対象におけるＨｂＦのＨｂＡに対する比率を高める方法が、本明細書でさらに提供される。同様に、特定の実施形態では、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子の発現の増加は、ＨｂＦのＨｂＳに対する優先的な生成および／または総ヘモグロビンのパーセンテージとしてのＨｂＳのパーセンテージの減少をもたらす。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を使用して、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現を増加させることによって、対象における総ＨｂＳレベルを低下させる、総ヘモグロビンレベルのパーセンテージとしてのＨｂＳレベルを低下させる、またはＨｂＦのＨｂＳに対する比率を高める。
【００４４】
本明細書に開示される方法に使用するためのｇＲＮＡが、特定の実施形態で、本明細書で提供される。特定の実施形態では、これらのｇＲＮＡは、ＨＢＧ標的位置にあるまたはこれに隣接する標的ドメインに相補的または部分的に相補的な標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号２５１〜９０１の１つに示されているヌクレオチド配列を含む、このヌクレオチド配列からなるか、またはこのヌクレオチド配列から本質的になる。
【００４５】
ゲノム研究により、ＢＣＬ１１Ａ、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）、ＭＹＢ、およびβグロビン遺伝子座内の遺伝子を含む、グロビンスイッチングを調節するいくつかの遺伝子が同定された。これらの遺伝子の特定の突然変異は、遺伝性高胎児ヘモグロビン症（ＨＰＦＨ）としても知られている、グロビンスイッチングの阻害または不完全なグロビンスイッチングをもたらし得る。ＨＰＦＨ突然変異は、欠失または非欠失（例えば、点突然変異）であり得る。ＨＰＦＨ対象は、ＨｂＦを生涯にわたって発現する、すなわち、貧血の症状を伴わずに、グロビンスイッチングが起こらない、または部分的なグロビンスイッチングしか起こらない。ヘテロ接合体対象は、２０〜４０％の全細胞型（ｐａｎｃｅｌｌｕｌａｒ）ＨｂＦを示し、かつ共遺伝は、β−異常ヘモグロビン症の緩和をもたらす（Ｔｈｅｉｎ  ２００９；Ａｋｉｎｂａｍｉ  ２０１６）。異常ヘモグロビン症およびＨＰＦＨの複合ヘテロ接合体、例えば、ＳＣＤおよびＨＰＦＨ、β−ＴｈａｌおよびＨＰＦＨ、鎌状赤血球形質およびＨＰＦＨ、またはデルタ−β−ＴｈａｌおよびＨＰＦＨの複合ヘテロ接合体である対象は、ＨＰＦＨ突然変異のない対象よりも疾患および症状が軽度である。ＨＰＦＨ突然変異、例えば、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２の脱抑制によってＨｂＦの発現を誘導する突然変異も共遺伝するＨｂＳのホモ接合体患者は、ＳＣＤ症状もβ−Ｔｈａｌ症状も発症しない（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００９，ｐ．５７０）。ＨＰＦＨは、臨床的に良性である（Ｃｈａｓｓａｎｉｄｉｓ  ２００９）。
【００４６】
ＨＰＦＨの発生は、世界的な集団では稀であるが、南ヨーロッパ系、南米系、アフリカ系の集団を含む、異常ヘモグロビン症の罹患率が高い集団ではより一般的である。これらの集団では、ＨＰＦＨの罹患率は、１，０００人に１〜２人に達し得る（Ｃｏｓｔａ  ２００２：Ａｈｅｒｎ  １９７３）。理論的には、ＨＰＦＨ突然変異は、異常ヘモグロビン症対象の疾患を改善するため、これらの集団で存続している。
【００４７】
最も一般的な自然発生のＨＰＦＨ突然変異は、βグロビン遺伝子座内の欠失である。ＨＰＦＨ欠損突然変異の一般的な例として、フランス人ＨＰＦＨ（２３ｋｂの欠失）、白人ＨＰＦＨ（１９ｋｂの欠失）、ＨＰＦＨ−１（８４ｋｂの欠失）、ＨＰＦＨ−２（８４ｋｂの欠失）、およびＨＰＦＨ−３（５０ｋｂの欠失）が挙げられる。これらの突然変異を有する対象では、β−グロビン合成は減少し、かつγ−グロビン合成は二次的に増加する。
【００４８】
他のＨＰＦＨ突然変異は、γ−グロビン遺伝子調節領域に位置する。このような突然変異の１つは、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子の両方の上流に位置する１３ヌクレオチドの欠失（１３塩基対（ｂｐ）ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；ＣＡＡＴＡＧＣＣＴＴＧＡＣ  ｄｅｌ、ＨＢＧ１／ＨＢＧ２の逆相補体に基づく配列）である。この欠失は、通常はＨＢＧ１／ＨＢＧ２の発現を防止するサイレンサーエレメントを破壊し、この欠失のヘテロ接合体成人対象は約３０％のＨｂＦを示す。別のＨＰＦＨ突然変異は、４ヌクレオチドの欠失（４塩基対（ｂｐ）ｄｅｌ．ｃ．−２２５〜−２２２（ＡＧＣＡ  ｄｅｌ））である。ＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節エレメントの両方に見られる他のＨＰＦＨ突然変異として、例えば、非欠損点突然変異（ｎｏｎ−ｄｅｌ  ＨＰＦＨ）、例えば、ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；およびｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃが挙げられる。
【００４９】
ＨＢＧ１調節エレメントに関連するｎｏｎ−ｄｅｌ  ＨＰＦＨ突然変異として、例えば、ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；およびｃ．−４９９  Ｔ＞Ａが挙げられる。
【００５０】
ＨＢＧ２調節エレメントに関連するｎｏｎ−ｄｅｌ  ＨＰＦＨ突然変異として、例えば、ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；およびｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇが挙げられる。
【００５１】
ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター領域のさらなる多型が、修正ＨｂＦレベルが＞５％のブラジル人ＳＣＤ患者のコホートで同定された（Ｂａｒｂｏｓａ  ２０１０）。これらの多型として、ＨＢＧ２プロモーターにおけるｃ．−３０９  Ａ＞Ｇおよびｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇが挙げられる。
【００５２】
ＨＰＦＨ突然変異を再現するように変化させることができるＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーターエレメントとして、例えば、赤血球Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子（ＥＫＬＦ−２）および胎児Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子（ＦＫＬＦ）転写因子結合モチーフ（ＣＴＣＣＡＣＣＣＡ）、ＣＰ１／Ｃｏｕｐ  ＴＦＩＩ結合モチーフ（ＣＣＡＡＴＡＧＣ）、ＧＡＴＡ１結合モチーフ（ＣＴＡＴＣＴ、ＡＴＡＴＣＴ）、または段階選択エレメント（ＳＳＥ）結合モチーフが挙げられる。ＨＰＦＨ突然変異を再現するように変化させることができるＨＢＧ１およびＨＢＧ２エンハンサーエレメントとして、例えば、ＳＯＸ結合モチーフ、例えば、ＳＯＸ１４、ＳＯＸ２、またはＳＯＸ１（ＣＣＡＡＴＡＧＣＣＴＴＧＡ）が挙げられる。
【００５３】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化を使用して、γ−グロビン遺伝子調節領域における１つの調節エレメントまたはモチーフ、例えば、ＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２調節領域のサイレンサー配列、またはＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２リプレッサーをコードする遺伝子に関連するプロモーターもしくはエンハンサー配列を変化させる。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化を使用して、γ−グロビン遺伝子調節領域の２つ以上（例えば、３つ、４つ、または５つ以上）の調節エレメントもしくはモチーフ、例えば、ＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２サイレンサー配列およびＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２エンハンサー配列；ＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２サイレンサー配列、およびＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２リプレッサーをコードする遺伝子に関連するプロモーターもしくはエンハンサー配列；またはＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２サイレンサー配列、およびＨＢＧ１もしくはＨＢＧ２リプレッサーをコードする遺伝子に関連するプロモーターもしくはエンハンサー配列を変化させる。単一遺伝子の調節領域への複数の変異の導入、または２つ以上の遺伝子の調節領域への１つの変異の導入は、本明細書では「多重化」と呼ばれる。したがって、多重化は、（ａ）１つもしくは複数の同じ細胞内の１つの遺伝子調節領域における２つ以上の位置の修飾、または（ｂ）２つ以上の遺伝子調節領域における１つの位置の修飾を構成する。
【００５４】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化は、自然発生のＨＰＦＨ突然変異に関連する表現型と同一または類似の表現型を生じさせる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化は、自然発生のＨＰＦＨ突然変異に対応する変化を含むγ−グロビン遺伝子調節エレメントをもたらす。他の実施形態では、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントの変化は、自然発生のＨＰＦＨ突然変異（すなわち、天然に存在しない変異）では観察されない変化をもたらす。
【００５５】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、例えば、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；もしくはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；またはＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２；ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；もしくはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇを含む、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化は、自然発生のＨＰＦＨ変異に関連するγ−グロビン調節エレメントに突然変異または変異を生じさせる。
【００５６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、γ−グロビン遺伝子調節エレメントにおける１つまたは複数の転写因子結合モチーフ（例えば、遺伝子調節モチーフ）を変化させることを含む。これらの転写因子結合モチーフには、例えば、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２のプロモーター領域内の転写因子（ＴＦ）、ＴＦ複合体、および転写リプレッサーによって占有される結合モチーフが含まれる。本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化の導入により、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のモチーフにおける転写因子、例えばリプレッサーの結合を変化させる。特定の実施形態では、１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子調節エレメントにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介変化の導入により、例えば、サイレンサー領域におけるリプレッサーの結合の減少によって、例えば、エンハンサー領域に結合する転写因子を増加させることによって、γ−グロビン遺伝子プロモーター領域の近傍またはこの領域でのＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の開始が促進される。
【００５７】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失を利用して、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２の一方もしくは両方の対立遺伝子、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２の両方の対立遺伝子におけるヌクレオチド−１１４〜−１０２の全てまたは一部を欠失させ、これにより、自然発生の１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２突然変異に関連する表現型と同一または類似のＨＰＦＨ表現型を生じさせる。他の実施形態では、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失を利用して、ＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子のヌクレオチド−２２５〜−２２２の全てまたは一部を欠失させ、これにより、自然発生のＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２突然変異に関連する表現型と同一または類似のＨＰＦＨ表現型を生じさせる。他の実施形態では、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失を利用して、ＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子のヌクレオチド−２２５〜−２２２の全てまたは一部を欠失させる。
【００５８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失を利用して、ＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子およびＨＢＧ２の対立遺伝子の一方または両方の対立遺伝子におけるヌクレオチド−１１４〜−１０２の全てまたは一部を欠失させる。
【００５９】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失を利用して、ＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子におけるヌクレオチド−２２５〜−２２２の全てまたは一部、ならびにＨＢＧ２の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド−１１４〜−１０２の全てまたは一部を欠失させる。他の実施形態では、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失またはＨＤＲ媒介欠失）を利用して、ＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子におけるヌクレオチド−２２５〜−２２２の全てまたは一部、およびＨＢＧ１の対立遺伝子の一方または両方におけるヌクレオチド−１１４〜−１０２の全てまたは一部を欠失させる。
【００６０】
ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失を使用して、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節エレメントから１つまたは複数のヌクレオチドを欠失させる実施形態では、この欠失は、自然発生のＨＰＦＨ突然変異で観察される欠失と同一であり得る、すなわち、この欠失は、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２のヌクレオチド−１１４〜−１０２、またはＨＢＧ１のヌクレオチド−２２５〜−２２２からなり得る。他の実施形態では、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）欠失により、これらのヌクレオチドの一部のみを除去する、例えば、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２の−１１４〜−１０２の範囲内の１２以下のヌクレオチドを欠失させる、またはＨＢＧ１の−２２５〜−２２２の範囲内の３つ以下のヌクレオチドを欠失させる。特定の実施形態では、自然発生のＨＰＦＨ突然変異欠失境界内のヌクレオチドの全てまたは一部に加えて、この自然発生の欠失境界の両側（すなわち、−１１４〜−１０２または−２２５〜−２２２の外側）において１つまたは複数のヌクレオチドをノックアウトすることができる。
【００６１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構媒介（例えば、ＮＨＥＪ媒介またはＨＤＲ媒介）挿入を利用して、リプレッサー結合部位を破壊するために、１つまたは複数のヌクレオチドをＨＢＧ１調節領域、ＨＢＧ２調節領域、もしくはＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節領域の両方のヌクレオチド−１１４〜−１０２にわたる領域、またはＨＢＧ１調節領域のヌクレオチド−２２５〜−２２２にわたる領域に挿入する。
【００６２】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えばＨＤＲ）を利用して、ＨＰＦＨに関連する自然発生の突然変異に対応する単一ヌクレオチド変化（すなわち、非欠失突然変異）を生じさせる。例えば、特定の実施形態では、この方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を利用して、ＨＰＦＨに関連する自然発生の突然変異に対応するＨＢＧ１調節領域に、例えば、ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａを含む、単一ヌクレオチド変化を生じさせる。他の実施形態では、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を利用して、ＨＰＦＨに関連する自然発生の突然変異に対応するＨＢＧ２調節領域に、例えば、ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇを含む、単一ヌクレオチド変化を生じさせる。
【００６３】
特定の実施形態では、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を利用して、ＨＢＧ１調節領域には見られないがＨＢＧ２調節領域に見られる自然発生のＨＰＦＨ突然変異に対応するＨＢＧ１調節領域に単一ヌクレオチド変化を生じさせる。このような変化として、例えば、ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇが挙げられる。
【００６４】
同様に、特定の実施形態では、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を利用して、ＨＢＧ２調節領域には見られないがＨＢＧ１調節領域に見られる自然発生のＨＰＦＨ突然変異に対応するＨＢＧ２調節領域に単一ヌクレオチド変化を生じさせる。このような変化として、例えば、ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａが挙げられる。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１１４  Ｃ＞ＴをＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００６６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ（すなわち、ｒｓ７４８２１４４またはＸｍｎＩ−ＨＢＧ２変異）をＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００６７】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１６７  Ｃ＞ＴをＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００６８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって、非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ（すなわち、保存された八量体［ＡＴＧＣＡＡＡＴ］配列のｃ．−１７５位でのＴ→Ｃ置換）をＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。４０％のＨｂＦに関連するこの変異は、遍在性八量体結合核タンパク質がＨＢＧプロモーター断片に結合する能力を無効にすると同時に、２つの赤血球特異的タンパク質が同じ断片結合する能力を３〜５倍増加させることが示されている（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  １９８８）。
【００６９】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１７５  Ｔ＞ＣをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。この変異は、２０〜３０％のＨｂＦ発現に関連する。
【００７０】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１１７  Ｇ＞ＡをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。「ギリシャ型」と呼ばれるこの変異は、最も一般的な非欠失ＨＰＦＨ突然変異であり、遠位ＣＣＡＡＴボックスから２ヌクレオチド上流をマッピングする（Ｗａｂｅｒ  １９８６）。ＨＢＧ１  ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａは、遍在性タンパク質ではなく赤血球特異的因子のＣＣＡＡＴボックス領域断片への結合を大幅に減少させ、かつ１０〜２０％のＨｂＦに関連する（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  １９８８）。この突然変異は、成人赤血球系細胞におけるγ−グロビン転写の抑制に役割を果たす可能性が高い核因子Ｅ（ＮＦ−Ｅ）の結合を妨げると考えられている（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ  １９８８）。他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、非欠損ＨＰＦＨ変異ｃ．−１１７Ｇ＞ＡをＨＢＧ２調節領域に導入し、これにより、非天然ＨＰＦＨ変異を生じさせることを含む。
【００７１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１７０  Ｇ＞ＡをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。
【００７２】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１７５  Ｔ＞ＧをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。
【００７３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１９５  Ｃ＞ＧをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。
【００７４】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１９６  Ｃ＞ＴをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。この変異は、１０〜２０％のＨｂＦに関連している。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１９８  Ｔ＞ＣをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。この変異は、１８〜２１％のＨｂＦに関連している。
【００７６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−２０１Ｃ＞ＴをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−２５１  Ｔ＞ＣをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。
【００７８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−４９９  Ｔ＞ＡをＨＢＧ１調節領域に導入することを含む。
【００７９】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ（「Ｈｅｌｌｅｎｉｃ突然変異」）をＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。この突然変異は、プロモーター領域内のＨＢＧ２  ＣＣＡＡＴボックスの３’末端に位置する（Ｃｈａｓｓａｎｉｄｉｓ  ２００９）。
【００８０】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１１４  Ｃ＞ＡをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１５７  Ｃ＞ＴをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８２】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−１６７  Ｃ＞ＡをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−２０２  Ｃ＞ＧをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。この変異は、１５〜２５％のＨｂＦ発現に関連している。
【００８４】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−２１１  Ｃ＞ＴをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−２２８  Ｔ＞ＣをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−２５５  Ｃ＞ＧをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−３０９  Ａ＞ＧをＨＢＧ２制御領域に導入することを含む。
【００８８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−３６９  Ｃ＞ＧをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００８９】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）によって非欠失ＨＰＦＨ変異ｃ．−５６７  Ｔ＞ＧをＨＢＧ２調節領域に導入することを含む。
【００９０】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２に対してｃ．−５６位、および／またはγ−グロビン遺伝子調節領域の別の位置に位置するＢＣＬ１１ａコア結合モチーフ（すなわち、ＧＧＣＣＧＧ）の欠失、破壊、または突然変異を含む。
【００９１】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＧＡＴＡ（例えば、ＧＡＴＡ１）モチーフ内の１つまたは複数のヌクレオチドを変化させることを含む。これらのある実施形態では、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ）を使用して、Ｔ＞Ｃ突然変異を配列ＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴ内のＨＢＧ１  ＧＡＴＡ結合モチーフに導入し、これにより、変化した配列ＡＡＡＣＡＴＣＴＧＴとなる。この自然発生のＴ＞Ｃ  ＨＰＦＨ突然変異は４０％のＨｂＦに関連している。
【００９２】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数のＤＮＡ修復機構（例えば、ＮＨＥＪおよびＨＤＲの両方の）アプローチを利用する。例えば、特定の実施形態では、この方法は、ＮＨＥＪ媒介欠失、例えば、ＨＤＲ媒介単一ヌクレオチド変化と組み合わせた、１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子への導入、および／または４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子への導入、例えば、ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇの１つまたは複数のＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子への導入を利用する。
【００９３】
特定の実施形態では、この方法は、ＨＤＲ媒介欠失、例えば、ＨＤＲ媒介単一ヌクレオチド変化と組み合わせた、１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子への導入、および／または４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子への導入、例えば、ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇの１つまたは複数のＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子への導入を利用する。
【００９４】
理論に縛られることを望むものではないが、４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入により、７０％のγＡ−グロビン（ＨＢＧ１遺伝子のγ−グロビン産物）と３０％のγＧ−グロビン（ＨＢＧ２遺伝子のγ−グロビン産物）との正常比が逆転し、γ−グロビンが約３０％のγＡ−グロビンおよび約７０％のγＧ−グロビンとして産生される。理論に縛られることを望むものではないが、γＧ−グロビンとγＡ−グロビンとの比率の逆転は、対象におけるγＧ−グロビンの産生を増加させる。理論に縛られることを望むものではないが、同時の４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入と１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ２遺伝子調節領域への導入とにより、対象におけるＨＢＧ２の転写活性の増加、γＧ−グロビンの産生の増加、およびＨｂＦの増加がもたらされる。理論に縛られることを望むものではないが、同時の（ａ）例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失またはＨＤＲ媒介欠失による、４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入と、（ｂ）例えば、ＨＤＲによる、非欠失ＨＰＦＨ変異、例えば、ｃ．−１０９Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；ｃ−５６７  Ｔ＞ＧのＨＢＧ２遺伝子調節領域への導入とにより、対象におけるＨＢＧ２の転写活性の増加、γＧ−グロビンの産生の増加、およびＨｂＦの増加がもたらされる。
【００９５】
理論に縛られることを望むものではないが、４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入により、γＡ−グロビンの産生（ＨＢＧ１遺伝子のγ−グロビン産物）に対するγＧ−グロビンの産生（ＨＢＧ２遺伝子のγ−グロビン産物）が低下し得るため、γＡ−グロビンはγＧ−グロビンよりも産生される。理論に縛られることを望むものではないが、同時の４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ２遺伝子調節領域への導入と、１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入とにより、ＨＢＧ１の転写活性が増加し得るため、対象におけるγＡ−グロビンの産生が増加し、ＨｂＦが増加する。理論に縛られることを望むものではないが、同時の（ａ）例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失またはＨＤＲ媒介欠失による、４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２のＨＢＧ２遺伝子調節領域への導入と、（ｂ）例えば、ＨＤＲによる、非欠失ＨＰＦＨ変異、例えば、ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞ＡのＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入とにより、対象におけるＨＢＧ１の転写活性の増加、γＡ−グロビンの産生の増加、およびＨｂＦの増加がもたらされ得る。
【００９６】
理論に縛られることを望むものではないが、同時の（ａ）例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失またはＨＤＲ媒介欠失による、１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入と、（ｂ）例えば、ＨＤＲによる、非欠失ＨＰＦＨ変異、例えば、ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞ＧのＨＢＧ２遺伝子調節領域への導入とにより、対象におけるＨＢＧ２の転写活性の増加、γＧ−グロビンの産生の増加、およびＨｂＦの増加がもたらされる。
【００９７】
理論に縛られることを望むものではないが、同時の（ａ）例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失またはＨＤＲ媒介欠失による、１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ２遺伝子調節領域への導入と、（ｂ）例えば、ＨＤＲによる、非欠失ＨＰＦＨ変異、例えばｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞ＡのＨＢＧ１遺伝子調節領域への導入とにより、対象におけるＨＢＧ１の転写活性の増加、γＡ−グロビンの産生の増加、およびＨｂＦの増加がもたらされる。
【００９８】
同時の（ａ）ｓｉＲＮＡによるＢＣＬ１１Ａのノックダウンと（ｂ）ｓｉＲＮＡによるＳＯＸ６のノックダウンとにより、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の発現の増加がもたらされる（Ｘｕ  ２０１０）。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター領域のＤＮＡ修復機構（例えば、ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、またはＮＨＥＪおよびＨＤＲ）修飾ならびにＢＣＬ１１Ａの赤血球特異的エンハンサーを単独または同時に使用して、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の発現に対するＢＣＬ１１Ａ、ＳＯＸ６、またはＢＣＬ１１ＡおよびＳＯＸ６の作用を阻害することを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＮＨＥＪおよびＨＤＲによるそのイントロンの赤血球特異的エンハンサーの機能を阻害することによってＢＣＬ１１Ａ発現を低下させること、およびＨｂＦの産生に対する相乗効果のためにＨＰＦＨ突然変異を同時に誘導することを含む。
【００９９】
本明細書に記載される実施形態は、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、およびネコを含むが、これらに限定されない全てのクラスの脊椎動物に使用することができる。
【０１００】
タイミングおよび対象の選択
例えば、遺伝子検査、家族歴、または他の因子に基づいてβ−異常ヘモグロビン症（例えば、ＳＣＤ、β−Ｔｈａｌ）を発症するリスクがあると考えられるが、まだ疾患の徴候または症状を一切示していない対象では、本明細書に開示された方法を用いる治療を、疾患の発症前に開始することができる。これらのある実施形態では、治療は、天然起源のグロビンのスイッチングの前、すなわち主にＨｂＦから主にＨｂＡへの移行の前に開始してもよい。他の実施形態では、治療は、天然起源のグロビンのスイッチングが起きた後に開始してもよい。
【０１０１】
特定の実施形態では、治療は、疾患の発症後、例えば、ＳＣＤもしくはβ−Ｔｈａｌまたはこれに関連する１つまたは複数の症状の発症の１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、７ヶ月後、８ヶ月後、９ヶ月後、１０ヶ月後、１２ヶ月後、１６ヶ月後、２４ヶ月後、３６ヶ月後、または４８ヶ月後、またはそれ以降に開始される。これらのある実施形態では、治療は、疾患の進行の初期段階、例えば、対象が軽度の症状のみまたは症状の一部のみを示したときに開始される。例示的な症状として、限定はしないが、貧血、下痢、発熱、発育不全、鎌状赤血球クリーゼ、血管閉塞クリーゼ、骨髄無形性クリーゼ、および急性胸部症候群貧血、血管閉塞、肝腫脹、血栓症、肺塞栓症、脳卒中、足潰瘍、心筋症、心不整脈、脾腫、骨成長遅延および／または思春期遅発症、ならびに髄外赤血球生成の証拠が挙げられる。他の実施形態では、治療は、疾患発症の十分に後または疾患進行のより進んだ段階、例えば、ＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌの発症の１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、７ヶ月後、８ヶ月後、９ヶ月後、１０ヶ月後、１２ヶ月後、１６ヶ月後、２４ヶ月後、３６ヶ月後、または４８ヶ月後、またはそれ以降に開始される。理論に縛られることを望むものではないが、この治療は、対象が十分に病気の進行中にあると有効であると考えられる。
【０１０２】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、治療される疾患に関連する１つまたは複数の症状の発症を予防する、または遅延させる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、治療を受けていない対象と比較して疾患の進行の防止または遅延をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、疾患の完全な治癒をもたらす。
【０１０３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、１回ずつ行われる。他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数回の投与療法を利用する。
【０１０４】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて治療される対象は輸血依存性である。
【０１０５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、インビボでの細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を用いて１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）の発現を変化させることを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、エクスビボでの細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を用いて１つまたは複数のγ−グロビン遺伝子の発現を変化させ、次いでこの細胞を対象に移植することを含む。これらのある実施形態では、細胞は、もともとは対象に由来する。特定の実施形態では、変化を受ける細胞は、成人赤血球系細胞である。他の実施形態では、細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。
【０１０６】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子および１つまたは複数のＣａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列の細胞への送達を含む。特定の実施形態では、この方法は、１つまたは複数の核酸、例えば、ＨＤＲドナーテンプレートの送達をさらに含む。
【０１０７】
特定の実施形態では、１つまたは複数のこれらの構成要素（すなわち、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子、１つまたは複数のＣａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列、および１つまたは複数の核酸、例えば、ＨＤＲドナーテンプレート）は、１つまたは複数のＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせを用いて送達される。
【０１０８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、β−異常ヘモグロビン症、例えば、ＳＣＤまたはβ−Ｔｈａｌに関連する１つまたは複数の突然変異を含む、ＨＢＢ遺伝子における１つまたは複数の突然変異を有する対象に対して行われる。このような突然変異の例として、限定はしないが、ｃ．１７Ａ＞Ｔ、ｃ．−１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９３−２１Ｇ＞Ａ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１６−１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．−７８Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．３１６−１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．−７８Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．３１６−１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．−１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．−７９Ａ＞Ｇ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．３１６−２Ａ＞Ｇ、およびｃ．３１６−２Ａ＞Ｃが挙げられる。
【０１０９】
インデルのγ−グロビン遺伝子調節エレメント内へのＮＨＥＪ媒介導入
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現を増加させるために、ＮＨＥＪ媒介挿入または欠失を利用してγ−グロビン遺伝子調節エレメントの全てまたは一部を破壊する。
【０１１０】
特定の実施形態では、ＮＨＥＪを利用する本明細書で提供される方法は、ＮＨＥＪによってＨＢＧ１またはＨＢＧ２サイレンサーエレメントの全てまたは一部を欠失させる、または破壊し、これにより、サイレンサーの不活性化およびその後のＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２発現の増加をもたらすことを含む。特定の実施形態では、ＮＨＥＪ媒介欠失は、ＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子におけるｃ．−１１４〜−１０２または−２２５〜−２２２の全てまたは一部の除去、および／またはＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子のｃ．−１１４〜−１０２の全てまたは一部の除去をもたらす。これらのある実施形態では、これらの領域に対して５’側または３’側の１つまたは複数のヌクレオチドも欠失される。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＮＨＥＪを利用する本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の切断（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）をγ−グロビン遺伝子調節領域内に導入することを含み、これらのある実施形態では、１つまたは複数の切断が、切断誘導インデルがＨＢＧ標的位置の全てまたは一部にわたることを合理的に予想できるＨＢＧ標的位置に十分に近接している。
【０１１２】
特定の実施形態では、第１ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ＨＢＧ標的位置に十分に近接した切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断を提供して、ＨＢＧ標的位置でのＮＨＥＪ媒介挿入または欠失を可能にするように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、切断事象、例えば二本鎖切断または一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、ＨＢＧ標的位置の上流または下流に位置し得る。
【０１１３】
特定の実施形態では、第２標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ標的位置に十分に近接した切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断を提供して、ＨＢＧ標的位置がＮＨＥＪ媒介挿入または欠失を、単独で、または前記第１ｇＲＮＡ分子によって配置される切断との組み合わせで可能にするように構成される。特定の実施形態では、第１および第２ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断が、ｇＲＮＡ分子のそれぞれに対して独立に、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。特定の実施形態では、切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、ＨＢＧ標的位置のヌクレオチドの両側に位置する。他の実施形態では、切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断はいずれも、ＨＢＧ標的位置のヌクレオチドの一側、例えば、上流または下流に位置する。
【０１１４】
特定の実施形態では、以下に論じられるように、一本鎖切断は、第２ｇＲＮＡ分子によって配置されるさらなる一本鎖切断を伴う。例えば、ｇＲＮＡ標的ドメインは、切断事象、例えば、２つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができる。特定の実施形態では、第１および第２ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９のニッカーゼを誘導するときに、一本鎖切断が、互いに十分に近接した第２ｇＲＮＡによって配置されるさらなる一本鎖切断を伴い、ＨＢＧ標的位置の変化が起こるように構成される。特定の実施形態では、第１および第２ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９がニッカーゼである場合、前記第２ｇＲＮＡによって配置される一本鎖切断が、前記第１ｇＲＮＡ分子によって配置される切断の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド以内にあるように構成される。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、切断が、異なる鎖上の同じ位置にある、または互いに数ヌクレオチド以内に位置する、例えば、実質的に二本鎖切断を模倣するように構成される。
【０１１５】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、以下に論じられるように、第２ｇＲＮＡ分子によって配置されるさらなる二本鎖切断を伴い得る。例えば、第１ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の上流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成され；かつ第２ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の下流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。
【０１１６】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、第２ｇＲＮＡ分子および第３ｇＲＮＡ分子によって配置される２つのさらなる一本鎖切断を伴い得る。例えば、第１ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の上流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成され；かつ第２および第３ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の下流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。特定の実施形態では、第１、第２、および第３ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断がｇＲＮＡ分子のそれぞれに対して独立に位置するように構成される。
【０１１７】
特定の実施形態では、第１および第２一本鎖切断は、第３および第４ｇＲＮＡ分子によって配置される２つのさらなる一本鎖切断を伴い得る。例えば、第１および第２ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の上流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成され；かつ第３および第４ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の下流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。
【０１１８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＨＢＧ標的位置を含むゲノム配列のＮＨＥＪ媒介欠失を導入することを含む。特定の実施形態では、この方法は、２つの二本鎖切断の導入を含み、これらの一方がＨＢＧ標的位置の５’側にあり、他方がＨＢＧ標的位置の３’側にある（すなわち、隣接している）。２つのｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ標的位置の反対側に２つの二本鎖切断を配置するように構成される。特定の実施形態では、第１二本鎖切断は突然変異の上流に位置し、第２二本鎖切断は突然変異の下流に位置する。特定の実施形態では、２つの二本鎖切断は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧｌ  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２の全てまたは一部を除去するように配置される。一実施形態では、切断（すなわち、２つの二本鎖切断）は、反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復などの不所望の標的染色体エレメント、または内在性スプライス部位を回避するように配置される。
【０１１９】
他の実施形態では、この方法は、２セットの切断、１つの二本鎖切断および一対の一本鎖切断の導入を含む。この２セットは、ＨＢＧ標的位置に隣接している、すなわち、一方のセットがＨＢＧ標的位置の５’側にあり、他方がＨＢＧ標的位置の３’側にある。２つのｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子は、２セットの切断（二本鎖切断または一対の一本鎖切断のいずれか）をＨＢＧ標的位置の反対側に配置するように構成される。特定の実施形態では、切断（すなわち、２セットの切断（二本鎖切断または一対の一本鎖切断のいずれか））は、反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復などの不所望の標的染色体エレメント、または内在性スプライス部位を回避するように配置される。
【０１２０】
他の実施形態では、この方法は、二対の一本鎖切断の導入を含み、これらの一方がＨＢＧ標的位置の５’側にあり、他方がＨＢＧ標的位置の３’側にある（すなわち、隣接している）。２つのｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ標的位置の反対側に２セットの破壊を配置するように構成される。特定の実施形態では、切断（すなわち、二対の一本鎖切断）は、反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復などの不所望の標的染色体エレメント、または内在性スプライス部位を回避するように配置される。
【０１２１】
γ−グロビン遺伝子調節エレメントにおける配列変化のＨＤＲ媒介導入
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現を増加させるために、ＨＤＲを利用して、γ−グロビン遺伝子調節エレメントにおける１つまたは複数のヌクレオチドを修飾する。これらのある実施形態では、ＨＤＲを利用して、ＨＰＦＨに関連する自然発生の突然変異に対応する１つまたは複数のヌクレオチド修飾を組み込む。例えば、特定の実施形態では、ＨＤＲを使用して、次の単一ヌクレオチド変化：ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ−４９９  Ｔ＞Ａの１つまたは複数をＨＢＧ１調節領域に組み込む。他の実施形態では、ＨＤＲを使用して、次の単一ヌクレオチド変化：ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇの１つまたは複数をＨＢＧ２調節領域に組み込む。
【０１２２】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２）の発現を増加させるために、ＨＤＲ媒介変化（例えば、挿入または欠失）を利用して、γ−グロビン遺伝子調節エレメントの全てまたは一部を破壊する。
【０１２３】
特定の実施形態では、ＨＤＲを利用する本明細書に提供される方法は、ＨＤＲによるＨＢＧ１またはＨＢＧ２サイレンサーエレメントの全てまたは一部の欠失または破壊を含み、サイレンサーの不活性化およびその後のＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２発現の増加をもたらす。特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介欠失は、ＨＢＧ１の一方または両方の対立遺伝子におけるｃ．−ｌ１４〜−１０２または−２２５〜−２２２の全てまたは一部の除去、および／またはＨＢＧ２の一方または両方の対立遺伝子におけるｃ．−ｌ１４〜−１０２の全てまたは一部の除去をもたらす。これらのある実施形態では、これらの領域の５’側または３’側の１つまたは複数のヌクレオチドも欠失される。
【０１２４】
特定の実施形態では、ＨＤＲを利用する本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の切断（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）のγ−グロビン遺伝子調節領域内への導入を含み、これらのある実施形態では、１つまたは複数の切断が、切断誘導変化がＨＢＧ標的位置の全てまたは一部にわたることが合理的に予想できるＨＢＧ標的位置に十分に近接している。
【０１２５】
特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介変化は、テンプレート核酸の使用を含み得る。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介遺伝子変化は、１つのγ−グロビン遺伝子対立遺伝子（例えば、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２の１つの対立遺伝子）に組み込まれる。別の実施形態では、遺伝子変化は、両方の対立遺伝子（例えば、ＨＢＧ１および／またはＨＢＧ２の両方の対立遺伝子）に組み込まれる。いずれの状況でも、治療された対象は、γ−グロビン遺伝子発現（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、またはＨＢＧ１およびＨＢＧ２の発現）の増加を示す。
【０１２７】
特定の実施形態では、ＨＤＲを利用する本明細書で提供される方法は、ＨＢＧ標的位置でのＨＤＲに関連する変化を可能にする、この標的位置（例えば、５’または３’のいずれか）に十分に近接した１つまたは複数の切断（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）の導入を含む。
【０１２８】
特定の実施形態では、第１ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ＨＢＧ標的位置に十分に近接した切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断を提供して、この標的位置でのＨＤＲに関連する変化を可能にするように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、ＨＢＧ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、ＨＢＧ標的位置の上流または下流に配置することができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、第２、第３、および／または第４ｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ標的位置（例えば、５’または３’のいずれか）に十分に近接した切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断を提供して、この標的位置でのＨＤＲに関連する変化を可能にするように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、標的位置の上流または下流に配置することができる。
【０１３０】
特定の実施形態では、一本鎖切断は、第２、第３および／または第４ｇＲＮＡ分子によって配置されるさらなる一本鎖切断を伴う。例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、切断事象が、例えば、二つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができる。特定の実施形態では、第１および第２ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９のニッカーゼを誘導するときに、一本鎖切断が、第１鎖の切断に十分に近接した第２ｇＲＮＡによって配置されるさらなる一本鎖切断を伴い、ＨＢＧ標的位置の変化が起こるように構成される。特定の実施形態では、第１および第２ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９がニッカーゼである場合、前記第２ｇＲＮＡによって配置される一本鎖切断が、前記第１ｇＲＮＡ分子によって配置される切断の１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド以内にあるように構成される。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、切断が、異なる鎖上の同じ位置にある、または互いに数ヌクレオチド以内に位置する、例えば、実質的に二本鎖切断を模倣するように構成される。
【０１３１】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、第２、第３、および／または第４ｇＲＮＡ分子によって配置されるさらなる二本鎖切断を伴い得る。例えば、第１ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の上流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができ；かつ第２ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の下流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができる。
【０１３２】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、第２および第３ｇＲＮＡ分子によって配置される２つのさらなる一本鎖切断を伴い得る。例えば、第１ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の上流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができ；かつ第２および第３ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、この標的位置の下流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができる。特定の実施形態では、第１、第２、および第３ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断が、ｇＲＮＡ分子のそれぞれに対して独立して位置するように構成される。
【０１３３】
特定の実施形態では、第１および第２一本鎖切断は、第３ｇＲＮＡ分子および第４ｇＲＮＡ分子によって配置される２つのさらなる一本鎖切断を伴い得る。例えば、第１および第２ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の上流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができ；かつ第３および第４ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、ＨＢＧ標的位置の下流、例えば、この標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成することができる。
【０１３４】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
ｇＲＮＡ分子という用語は、本明細書の用法では、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特異的な標的化またはホーミングを促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、単分子（単一ＲＮＡ分子を有する）（例えば、キメラ）、またはモジュラー（複数、典型的には２つの別々のＲＮＡ分子を含む）であり得る。本明細書で提供されるｇＲＮＡ分子は、標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な核酸配列を含む、この核酸配列からなる、または本質的にこの核酸配列からなる標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、第１の相補性ドメイン、結合ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、テールドメイン、および５’伸長ドメインをはじめとする１つまたは複数の追加ドメインをさらに含む。これらのドメインの各々については、以下にさらに詳しく述べる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する天然に存在する配列と同一の、またはそれと配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
いくつかの例示的なｇＲＮＡ構造を図１Ａ〜１Ｉに示す。ｇＲＮＡの活性形態の３次元形態、または鎖内もしくは鎖間相互作用に関して、高相補性の領域を図１Ａ〜１Ｉ中の二重鎖および本明細書に提供されるその他の描写に示す場合がある。図７は、配列番号４２のｇＲＮＡ配列を用いたｇＲＮＡドメイン命名法を示し、これは、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域内に１つのヘアピンループを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、この領域に２つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の）ヘアピンループを含んでもよい（例えば、図１Ｈ〜１Ｉ）。
【０１３６】
特定の実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’に：
γ−グロビン遺伝子における標的ドメインに相補的な標的化ドメイン
調節領域、例えば、配列番号２５１〜９０１のいずれかからの標的化ドメイン；
第１相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第２相補性ドメイン（第１相補性ドメインに相補的）；
隣接ドメイン；および
任意選択によるテールドメインを含む。
【０１３７】
特定の実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは：
第１鎖であって、好ましくは５’から３’に：
γ−グロビン遺伝子調節領域における標的ドメインに相補的な標的化ドメイン、例えば、配列番号２５１〜９０１のいずれかからの標的化ドメイン；および
第１相補性ドメインを含む、第１鎖；ならびに
第２鎖であって、好ましくは５’から３’に：
任意選択による５’伸長ドメイン；
第２相補性ドメイン；
隣接ドメイン；および
任意選択によるテールドメインを含む、第２鎖を含む。
【０１３８】
標的化ドメイン
標的化ドメイン（時には、代わりにガイド配列または相補性領域と呼ばれる）は、γ−グロビン遺伝子調節領域における標的核酸配列に相補的または部分的に相補的な核酸配列を含む、この核酸配列からなる、または本質的にこの核酸配列からなる。標的化ドメインの全てまたは一部が相補的または部分的に相補的であるγ−グロビン遺伝子調節領域における核酸配列は、本明細書では標的ドメインと呼ばれる。特定の実施形態では、標的ドメインはＨＢＧ標的位置を含む。他の実施形態では、ＨＢＧ標的位置は、標的ドメインの外側（すなわち、その上流または下流）に位置する。特定の実施形態では、標的ドメインは、γ−グロビン遺伝子調節領域内、例えば、γ−グロビン遺伝子に関連する調節エレメントまたはγ−グロビン遺伝子発現のリプレッサーをコードする遺伝子に関連する調節エレメント内に完全に位置する。他の実施形態では、標的ドメインの全てまたは一部は、γ−グロビン遺伝子調節領域の外側、例えば、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２コード領域、エクソン、またはイントロンに位置する。
【０１３９】
標的化ドメインを選択する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｆｕ  ２０１４；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ２０１４を参照のこと）。本明細書に記載される方法、組成物、およびキットで使用するための好適な標的化ドメインの例として、配列番号２５１〜９０１に記載されているものがある。
【０１４０】
標的ドメインを含む標的核酸の鎖は、それが標的化ドメイン配列と相補的であるため、本明細書では「相補鎖」と呼ばれる。標的化ドメインは、ｇＲＮＡ分子の一部であることから、これは、チミン（Ｔ）ではなく、塩基ウラシル（Ｕ）を含み；反対に、ｇＲＮＡ分子をコードするいずれのＤＮＡ分子も、ウラシルではなく、チミンを含むことになる。標的化ドメイン／標的ドメインペアでは、標的化ドメイン中のウラシル塩基は、標的ドメイン中のアデニン塩基と対合することになる。特定の実施形態では、標的化ドメインと標的ドメイン同士の相補性の程度は、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化することを可能にするのに十分なものである。
【０１４１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、コアドメインと任意選択の二次ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、二次ドメインの３’側に位置し、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’側またはその付近に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端の約８〜約１３ヌクレオチドから構成されるか、またはほぼこれらから構成される。特定の実施形態では、コアドメインだけが、標的ドメインの対応部分と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的であり、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的ドメインの対応部分と完全に相補的である。他の実施形態では、二次ドメインも、標的ドメインの一部と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン中のコアドメイン標的と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的であるのに対し、二次ドメインは、標的ドメイン中の二次ドメイン標的と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインと二次ドメインは、標的ドメインのそれぞれの対応部分と同程度の相補性を有する。他の実施形態では、コアドメインとその標的同士の相補性の程度および二次ドメインとその標的同士の相補性の程度は異なっていてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、二次ドメインよりその標的に対する相補性の程度が高いのに対し、他の実施形態では、二次ドメインの方が、コアドメインより相補性の程度が高い。
【０１４２】
特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、または２０〜１００ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインまたはコアドメインは、３〜１５、３〜２０、５〜２０、１０〜２０、１５〜２０、５〜５０、または２０〜５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１０＋／−４、１０＋／−５、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、または１６＋／−２、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、あるいは、１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０１４３】
標的化ドメインがコアドメインを含む特定の実施形態では、コアドメインは、３〜２０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、５〜１５または８〜１３ヌクレオチド長である。標的化ドメインが二次ドメインを含む特定の実施形態では、二次ドメインは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。標的化ドメインが、８〜１３ヌクレオチド長のコアドメインを含む特定の実施形態では、標的化ドメインは、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６ヌクレオチド長であり、二次ドメインは、１３〜１８、１２〜１７、１１〜１６、１０〜１５、９〜１４、８〜１３、７〜１２、６〜１１、５〜１０、４〜９、または３〜８ヌクレオチド長である。
【０１４４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと完全に相補的である。同様に、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含む場合、特定の実施形態では、コアドメインと二次ドメインの一方または両方が、標的ドメインの対応部分と完全に相補的である。他の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと部分的に相補的であり、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含むこれらの実施形態のいくつかでは、コアドメインと二次ドメインの一方または両方が、標的ドメインの対応部分と部分的に相補的である。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインの核酸配列、または標的化ドメイン内のコアドメインもしくは標的化ドメインは、標的ドメインまたは標的ドメインの対応部分と少なくとも８０、８５、９０、または９５％相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアもしくは二次ドメインは、標的ドメインまたはその一部と相補的ではない１または複数個のヌクレオチドを含み、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアもしくは二次ドメインは、標的ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメインの対応部分と相補的ではない１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的ではない１または複数個のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの１または複数個は、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的ドメインと相補的ではないその５’末端、３’末端、またはその５’末端と３’末端の両方の５ヌクレオチド内に１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的ではない２個以上のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの２個以上は、互いに隣接しており、これらの実施形態のいくつかでは、２個以上の連続した非相補的ヌクレオチドは、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態では、２個以上の連続した非相補的ヌクレオチドは、いずれも、標的化ドメインの５’および３’末端から６ヌクレオチド以上に位置する。
【０１４５】
特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／もしくは二次ドメイン、またはそれらの中の１または複数個のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾をはじめとする修飾を有する。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１または複数個のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化ドメインおよび／または標的化ドメインを含むｇＲＮＡを分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、それぞれの５’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾および／またはそれぞれの３’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０１４６】
標的化ドメインが、コアおよび二次ドメインを含む特定の実施形態では、コアおよび二次ドメインは、同じ数の修飾を含む。これらの実施形態のいくつかでは、いずれのドメインも修飾を含まない。他の実施形態では、コアドメインは、二次ドメインより多くの修飾を含むか、あるいは、その逆である。
【０１４７】
特定の実施形態では、コアまたは二次ドメイン内を含め、標的化ドメインにおける１または複数個のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、この効率は、以下に記載されるシステムを用いて、候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を備えた候補標的化ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補標的化ドメインは、選択した標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０１４８】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの全部が、標的ドメイン中に存在する対応ヌクレオチドと相補的であり、かつそれらとハイブリダイズすることができる。別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８個以上のヌクレオチドが、標的ドメイン中に存在する対応ヌクレオチドと相補的であり、かつそれらとハイブリダイズすることができる。
【０１４９】
図１Ａ〜図１Ｉは、ｇＲＮＡ内の標的化ドメインの配置の例を提供する。
【０１５０】
第１および第２の相補性ドメイン
第１および第２の相補性（それぞれ、ｃｒＲＮＡ由来のヘアピン配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ由来のヘアピン配列と呼ばれることもある）ドメインは、互いに完全または部分的に相補的である。特定の実施形態では、相補性の程度は、２つのドメインが少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分である。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメイン同士の相補性の程度は、ｇＲＮＡの他の特性と共に、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にする上で十分である。第１および第２の相補性ドメインの例は、図１Ａ〜１Ｇに示す。
【０１５１】
特定の実施形態では（例えば、図１Ａ〜１Ｂを参照）、第１および／または第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインとの相補性が不足した１つまたは複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含む。例えば、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメイン中の対応ヌクレオチドと対合しない１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、対応する相補性ドメインと相補的ではない第１または第２の相補性ドメイン上のヌクレオチドは、第１および第２の相補性ドメインの間に形成される二重鎖からループアウト（ｌｏｏｐ  ｏｕｔ）する。これらの実施形態のいくつかでは、不対ループアウトは、第２の相補性ドメイン上に位置し、これらの実施形態のいくつかでは、不対領域は、第２の相補性ドメインの５’末端から、１、２、３、４、５、または６番目のヌクレオチドで開始する。
【０１５２】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインは、５〜３０、５〜２５、７〜２５、５〜２４、５〜２３、７〜２２、５〜２２、５〜２１、５〜２０、７〜１８、７〜１５、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、第１の相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインは、５〜２７、７〜２７、７〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、７〜２０、５〜２０、７〜１８、７〜１７、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、第２の相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、各々独立して、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２、２１＋／−２、２２＋／−２、２３＋／−２、または２４＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインよりも、例えば、２、３、４、５、または６個分長い。
【０１５３】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、５’から３’方向に、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、第２の相補性ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインそれぞれ、と完全または部分的に相補的である。
【０１５４】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインは、４〜９ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’サブドメインは、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの５’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’ドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの中心サブドメインは、１、２、または３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの中心サブドメインは、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの３’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、３’サブドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの３’ サブドメインは、４〜９、例えば、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長である。
【０１５５】
第１および／または第２の相補性ドメインは、天然起源のもしくは参照の第１および／または第２の相補性ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、天然起源のもしくは参照の第１および／または第２の相補性ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、もしくは６個以下のヌクレオチドが異なる。これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の相同性を有し得る。
【０１５６】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインもしくはそれらの中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾をはじめとする修飾を有する。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２メチル化を含んでよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、第１および／もしくは第２の相補性ドメインならびに／または第１および／もしくは第２の相補性を含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、そのそれぞれの５’末端、３’末端、またはその５’末端および３’末端の両方の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。他の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、そのそれぞれの５’末端、３’末端、またはその５’末端および３’末端の両方の５ヌクレオチド以内に修飾を一切含まない。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインの一方または両方は、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０１５７】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムにおいて、候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する候補第１または第２の相補性ドメインを有するｇＲＮＡ分子は、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補相補性ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０１５８】
特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインによって形成される二重鎖領域は、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２塩基対長である（あらゆるループアウトまたは不対ヌクレオチドを除く）。
【０１５９】
特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１１の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号４８のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１５の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５０のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１６の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５１のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、２１の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号２９のｇＲＮＡを参照のこと）。
【０１６０】
特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、第１および第２の相補性ドメインの間で交換されて、ポリ−Ｕ配列が除去される。例えば、配列番号４８のｇＲＮＡのヌクレオチド２３と４８またはヌクレオチド２６と４５が交換されて、それぞれ、配列番号４９または３１のｇＲＮＡを生成することができる。同様に、配列番号２９のｇＲＮＡのヌクレオチド２３と３９は、ヌクレオチド５０および６８と交換されて、配列番号３０のｇＲＮＡを生成することができる。
【０１６１】
連結ドメイン
単分子またはキメラｇＲＮＡ中では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインの間に配置されて、これらを結合する働きをする。図１Ｂ〜１Ｅは、結合ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、連結ドメインの一部は、ｃｒＲＮＡ由来領域から、別の部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域からのものである。
【０１６２】
特定の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを共有結合する。特定の実施形態では、連結ドメインは、共有結合から構成されるか、またはこれを含む。他の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを非共有的に結合する。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０以下のヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、連結ドメインは、１０を超えるヌクレオチド長、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜５、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、３０＋／−１０、４０＋／−５、４０＋／−１０、５０＋／−５、５０＋／−１０、６０＋／−５、６０＋／−１０、７０＋／−５、７０＋／−１０、８０＋／−５、８０＋／−１０、９０＋／−５、９０＋／−１０、１００＋／−５、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０１６３】
特定の実施形態では、連結ドメインは、天然起源の配列、例えば、第２の相補性ドメインの５’側にあるｔｒａｃｒＲＮＡの配列と相同性を共有するか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、結合ドメインは、本明細書に記載される結合ドメイン、例えば図１Ｂ〜１Ｅの結合ドメインと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の相同性を有するか、またはそれらと１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドしか違わない。
【０１６４】
特定の実施形態では、連結ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、連結ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾などの修飾を有する。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、連結ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、連結ドメインおよび／または連結ドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、連結ドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、連結ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０１６５】
特定の実施形態では、連結ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムにおいて候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する候補連結ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムで評価することができる。候補連結ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０１６６】
特定の実施形態では、連結ドメインは、典型的に、第１の相補性ドメインの３’末端、および／または第２の相補性ドメインの５’末端に隣接するか、またはそれから１、２、または３ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含む。これらの実施形態のいくつかでは、連結領域の二重鎖領域は、１０＋／−５、１５＋／−５、２０＋／−５、または３０＋／−５塩基対の長さである。特定の実施形態では、連結ドメインの二重鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対の長さである。特定の実施形態では、二重鎖領域を形成する配列は、完全に相補的である。他の実施形態では、二重鎖領域を形成する配列の一方または両方は、他方の二重鎖配列と相補的ではない１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド）を含む。
【０１６７】
５’伸長ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーｇＲＮＡは、５’伸長ドメイン、すなわち、第２の相補性ドメインの５’側に１つまたは複数の追加ヌクレオチドを含む（例えば、図１Ａを参照）。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０以上、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
【０１６８】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、５’伸長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、または以下に記載のその他の修飾で、修飾され得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、または以下に記載のその他の修飾などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位置での修飾）を含み得る。
【０１６９】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含み得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
【０１７０】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたクレオチドは、修飾されていない。
【０１７１】
５’伸長ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補５’伸長ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステム中で評価され得る。候補５’伸長ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０１７２】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の５’伸長ドメインと、本明細書、例えば、図１Ａ〜１Ｇに記載される５’伸長ドメインなどの参照５’伸長ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０１７３】
隣接ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、隣接ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１４＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長である。
【０１７４】
特定の実施形態では、隣接ドメインは、天然起源の隣接ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、本明細書に開示される隣接ドメイン、例えば、図１Ａ〜１Ｇに記載されるものを含む、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の隣接ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０１７５】
特定の実施形態では、隣接ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、隣接ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、本明細書に記載される修飾などの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、隣接ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、隣接ドメインおよび／または隣接ドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、隣接ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０１７６】
特定の実施形態では、隣接ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムで候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補隣接ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムで評価することができる。候補隣接ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０１７７】
テールドメイン
多様なテールドメインが、本明細書に開示されるｇＲＮＡ分子での使用に好適である。図１Ａおよび図１Ｃ〜１Ｇは、そのようなテールドメインの例を提供する。
【０１７８】
特定の実施形態では、テールドメインは、存在しない。他の実施形態では、テールドメインは、１〜１００ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインは、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜５０、１０〜１００、２０〜１００、１０〜９０、２０〜９０、１０〜８０、２０〜８０、１０〜７０、２０〜７０、１０〜６０、２０〜６０、１０〜５０、２０〜５０、１０〜４０、２０〜４０、１０〜３０、２０〜３０、２０〜２５、１０〜２０、または１０〜１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインは、５＋／−５、１０＋／−５、２０＋／−５、２５＋／−１０、３０＋／−１０、３０＋／−５、４０＋／−１０、４０＋／−５、５０＋／−１０、５０＋／−５、６０＋／−１０、６０＋／−５、７０＋／−１０、７０＋／−５、８０＋／−１０、８０＋／−５、９０＋／−１０、９０＋／−５、１００＋／−１０または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０１７９】
特定の実施形態では、テールドメインは、天然起源のテールドメインもしくは天然起源のテールドメインの５’末端と相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、本明細書に開示される天然起源のテールドメイン、例えば、図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｇに記載されるものを含む、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）テールドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０１８０】
特定の実施形態では、テールドメインは、互いに相補的で、しかも、少なくともいくつかの生理学的条件下で二重鎖領域を形成する配列を含む。これらの実施形態のいくつかでは、テールドメインは、テール二重鎖領域を形成しうるテール二重鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、テール二重鎖領域は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対長である。特定の実施形態では、テールドメインは、二重鎖を形成しないテール二重鎖ドメインの３’側に一本鎖ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、一本鎖ドメインは、３〜１０ヌクレオチド長、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または４〜６ヌクレオチド長である。
【０１８１】
特定の実施形態では、テールドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、テールドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、本明細書に記載される修飾などの修飾を含む。特定の実施形態では、テールドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、テールドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、テールドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、テールドメインおよび／またはテールドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、テールドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、テールドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、テールドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０１８２】
特定の実施形態では、テールドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるように候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補テールドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補テールドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０１８３】
特定の実施形態では、テールドメインは、インビトロまたはインビボ転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡのインビトロ転写のためにＴ７プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡテンプレートの３’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。インビボ転写のためにＵ６プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵＵＵ配列であってもよい。転写のためにＨ１プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵ配列であってもよい。交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチドは、例えば、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナルに応じて様々な数のウラシル塩基であってもよいし、または交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）塩基を含んでもよい。
【０１８４】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒に、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載される配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。
【０１８５】
例示的な単分子／キメラｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラｇＲＮＡは、５’［標的化ドメイン］−［第１の相補性ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相補性ドメイン］−［隣接ドメイン］−［テールドメイン］−３’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、１０〜５０ヌクレオチド長であり；
第１の相補性ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第１の相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり；
第２の相補性ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第２の相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
および
テールドメインは非存在であり、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有する。
【０１８６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子ｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に以下；例えば、１０〜５０ヌクレオチドを含む標的化ドメイン；例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドなどを含む第１の相補性ドメイン；連結ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０１８７】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する。
【０１８８】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０１８９】
特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０１９０】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０１９１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部分と相補的であるか、もしくは部分的に相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的化ドメインの全長、標的ドメインの全長、または双方にわたって標的ドメインと相補的である。
【０１９２】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む）は、配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含み、そこで、標的化ドメインは、２０個のＮ（残基１〜２０）として列記されるが、それは、１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であってよく、その中で最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルを表すが、それは存在しなくても、またはより少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子、またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０１９３】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む）は、配列番号３８に記載されるヌクレオチド配列を含み、そこで、標的化ドメインは、２０個のＮ（残基１〜２０）として列記されるが、それは、１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であってよく、その中で最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルを表すが、それは存在しなくてもよいし、またはより少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子またはキメラｇＲＮＡ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０１９４】
例示的なキメラｇＲＮＡの配列および構造も図１Ｈ〜１Ｉに示す。
【０１９５】
例示的なモジュラーｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に以下；例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含む標的化ドメイン；第１の相補性ドメインを含む第１鎖と；好ましくは、５’から３方向に以下：任意選択的に５’伸長ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含む第２鎖とを含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０１９６】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
【０１９７】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０１９８】
特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０１９９】
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０２００】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部分と相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなる。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的ドメインの全長、標的ドメインの全長、または双方にわたって標的ドメインと相補的である。
【０２０１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。これらの実施形態の特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０２】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０６】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２０９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２１０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２１１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０２１２】
ｇＲＮＡ送達
本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、もしくは４つ）のｇＲＮＡ分子の送達を含む。これらのある実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または吸入によって送達される。
【０２１３】
ｇＲＮＡをデザインする方法
本明細書に記載されるｇＲＮＡに使用するための標的化ドメインを選択するため、デザインするため、および検証するための方法が提供される。ｇＲＮＡへの組み込みのための例示的な標的化ドメインも本明細書に提供される。
【０２１４】
標的配列の選択および検証のための方法ならびにオフターゲット分析については既に記載されている（例えば、Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｈｓｕ  ２０１３；Ｆｕ  ２０１４；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ２０１４；Ｂａｅ  ２０１４；Ｘｉａｏ  ２０１４を参照）。例えば、ソフトウェアツールを使用して、使用者の標的配列に対応する潜在的な標的化ドメインの選択を最適化する、例えば、ゲノム全体の全オフターゲット活性を最小限にすることができる。オフターゲット活性は、切断以外であり得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用するそれぞれの可能な標的化ドメインの選択について、このツールは、特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）までのミスマッチ塩基対を含むゲノム全体で全てのオフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭのいずれかに先行する）を同定することができる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に誘導される重み付けスキームを使用して予測することができる。次いで、それぞれの可能な標的化ドメインが、その全予測オフターゲット切断に従ってランク付けされ；最高位の標的化ドメインは、最も多いオンターゲット切断および最も少ないオフターゲット切断を有する可能性が高いことを表す。他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤー（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイ用のプライマーデザイン、ならびに次世代シーケンシングによるオフターゲット切断のハイスループット検出および定量化のためのプライマーデザインも、このツールに含めることができる。候補標的化ドメインおよびこれらの標的化ドメインを含むｇＲＮＡは、当該技術分野で公知の方法および／または本明細書に記載される方法を用いて機能的に評価することができる。
【０２１５】
非限定的な例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と共に使用されるｇＲＮＡで使用するための標的化ドメインが、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを用いて同定された。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）標的に対しては１７量体および２０量体標的化ドメインをデザインしたが、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）標的に対しては１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、および２４量体標的化ドメインをデザインした。ｇＲＮＡデザインは、公的ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒ（Ｂａｅ  ２０１４）に基づくカスタムｇＲＮＡデザインソフトウェアを用いて行った。このソフトウェアは、それらのゲノム全体のオフターゲット性向を計算した後にガイドにスコアを付ける。典型的には、完全な一致から７つのミスマッチまでの範囲のマッチが、長さが１７〜２４のガイドで考慮される。オフターゲット部位が計算上決定されると、集計スコアが各ガイドについて計算され、ウェブインターフェースを用いて表形式の出力に要約される。ＰＡＭ配列に隣接する可能な標的部位を同定することに加えて、ソフトウェアはま、選択された標的部位と１つ、２つ、３つ、または４つ以上のヌクレオチドが異なる全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。ＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節領域のゲノムＤＮＡ配列を、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得て、これらの配列を、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを用いて反復エレメントについてスクリーニグした。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復クレメントおよび低複雑領域について入力ＤＮＡ配列を検索する。出力は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。
【０２１６】
同定の後、標的ドメインは、それらの標的部位までの距離、それらの直交性、および５’Ｇの存在に基づいて（関連ＰＡＭ、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＮＧＧ  ＰＡＭ、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）ＰＡＭを含むヒトゲノムにおける近いマッチの同定に基づいて）階層にランク付けされた。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含むヒトゲノム中の配列の数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、意図される標的以外のヒトゲノムにおける同一配列も、標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含むいかなる配列も有していない、２０量体標的化ドメインを指し得る。直交性が良好な標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小限にされる。
【０２１７】
標的化ドメインは、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」戦略の両方で同定された。標的化ドメインを選択する基準、およびどの標的化ドメインを二重−ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」戦略に用いることができるかの決定は、２つの考慮事項に基づく：
（１）標的化ドメイン対は、ＰＡＭが外側を向き、かつＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼでの切断により５’オーバーハングを生じるようにＤＮＡ上に配向されるべきである；および
（２）二重ニッカーゼ対での切断により、十分な頻度で介在配列全体が欠失するという仮説。
しかし、二重ニッカーゼ対を用いた切断は、ｇＲＮＡの１つのみの部位にインデル突然変異ももたらし得る。候補対メンバーは、１つの標的化ドメインの標的部位にインデル突然変異を引き起こすのに対して、配列全体をいかに効率的に除去するかについて試験することができる。
【０２１８】
ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２の欠失に使用するための標的化ドメイン
本明細書に開示される方法と併せてＨＢＧ１のｃ．−１１４〜−１０２の欠失のためにｇＲＮＡで使用するための標的化ドメインを同定し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について４つの階層にランク付けした。
【０２１９】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合、階層１の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、具体的にはこの標的部位のいずれかの末端から４００ｂｐ以内、（２）高レベルの直交性、および（３）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層２の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）高レベルの直交性に基づいて選択された。階層３の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層４の標的化ドメインは、標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内に基づいて選択された。
【０２２０】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合、階層１の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、および（４）配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号：２０４）を有するＰＡＭに基づいて選択された。階層２の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、（２）高レベルの直交性、および（３）配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）を有するＰＡＭに基づいて選択された。階層３の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）を有するＰＡＭに基づいて選択された。階層４の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）配列ＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）を有するＰＡＭに基づいて選択された。
【０２２１】
階層は、包括的ではないことに留意されたい（各標的化ドメインは戦略上１回のみ記載される）。場合によっては、標的化ドメインは、特定の階層の基準に基づくと同定されなかった。同定された標的化ドメインは以下の表６に要約されている。
【０２２２】
【表１】
2019508051.tif 000002
【０２２３】
ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２の欠失に使用するための標的化ドメイン
本明細書に開示される方法と併せてＨＢＧ２のｃ．−１１４〜−１０２の欠失のためにｇＲＮＡで使用するための標的化ドメインを同定し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について４つの階層にランク付けした。
【０２２４】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合、階層１の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、具体的にはこの標的部位のいずれかの末端から４００ｂｐ以内、（２）高レベルの直交性、および（３）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層２の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）高レベルの直交性に基づいて選択された。階層３の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層４の標的化ドメインは、標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内に基づいて選択された。
【０２２５】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合、階層１の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、および（４）配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号：２０４）を有するＰＡＭに基づいて選択された。階層２の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、（２）高レベルの直交性、および（３）配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）を有するＰＡＭに基づいて選択された。階層３の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）を有するＰＡＭに基づいて選択された。階層４の標的化ドメインは、（１）標的部位（すなわち、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２）のいずれかの末端から上流または下流までの距離、特にこの標的部位のいずれかの末端の４００ｂｐ以内、および（２）配列ＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）を有するＰＡＭに基づいて選択された。
【０２２６】
階層は、包括的ではないことに留意されたい（各標的化ドメインは戦略上１回のみ記載される）。場合によっては、標的化ドメインは、特定の階層の基準に基づくと同定されなかった。同定された標的化ドメインは以下の表７に要約されている。
【０２２７】
【表２】
2019508051.tif 000003
【０２２８】
特定の実施形態では、２つ以上の（例えば、３つまたは４つの）ｇＲＮＡ分子が、１つのＣａｓ９分子と共に使用される。別の実施形態では、２つ以上の（例えば、３つまたは４つの）ｇＲＮＡが２つ以上のＣａｓ９分子と共に使用される場合、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子（複数可）と異なる種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子が２つのＣａｓ９分子と共に使用される場合、１つのＣａｓ９分子は１つの種に由来するものでよく、他のＣａｓ９分子は異なる種に由来するものでよい。両方のＣａｓ９種を用いて、所望に応じて一本鎖切断または二本鎖切断を生じさせる。
【０２２９】
本明細書に記載される表におけるいずれの標的化ドメインも、一本鎖切断を生じさせるＣａｓ９分子（すなわち、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼ）または二本鎖切断を生じさせるＣａｓ９分子（すなわち、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼと共に使用することができる。
【０２３０】
２つのｇＲＮＡが２つのＣａｓ９分子と共に使用されるようにデザインされる場合、２つのＣａｓ９分子は異なる種であり得る。両方のＣａｓ９種を用いて、所望に応じて一本鎖切断または二本鎖切断を生じさせることができる。
【０２３１】
本明細書に記載される任意の上流ｇＲＮＡが、本明細書に記載される任意の下流ｇＲＮＡと対を形成できることが本明細書で企図される。１種のＣａｓ９と共に使用するようにデザインされた上流ｇＲＮＡが、異なる種のＣａｓ９と共に使用するようにデザインされた下流ｇＲＮＡと対を形成する場合、両方の種のＣａｓ９を用いて、所望に応じて一本鎖切断または二本鎖の切断を生じさせる。
【０２３２】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとして、限定はしないが、天然起源のクラス２  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１、ならびにこれらに由来するまたはこれらから得られる他のヌクレアーゼが挙げられる。機能としては、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用する（例えば、複合体化する）；および（ｂ）ｇＲＮＡと共に、（ｉ）ｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的な配列、および任意選択による（ｉｉ）ＰＡＭを含むＤＮＡの標的領域と会合し、任意選択的に切断または修飾するヌクレアーゼとして定義される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、たとえ同じＰＡＭ特異性または切断活性を共有する個々のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ間にバリエーションが存在しても、それらのＰＡＭ特異性および切断活性によって広義に定義することができる。当業者であれば、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性および／または切断活性を有する任意の適切なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて実施できるシステム、方法、および組成物に関することを理解されよう。このため、特に断りのない限り、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼという用語は、一般的な用語として理解するべきであり、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特定のタイプ（例えば、Ｃａｓ９対Ｃｐｆｌ）、種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）対Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、またはバリエーション（例えば、完全長対切断または分割；自然発生のＰＡＭ特異性対遺伝子操作ＰＡＭ特異性など）に限定されない。
【０２３３】
ＰＡＭ配列は、その名称が、ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的な「プロトスペーサー」配列（または「スペーサー」）とのその配列関係に由来する。プロトスペーサー配列と共に、ＰＡＭ配列は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡの組み合わせの標的領域または配列を規定する。
【０２３４】
様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間に異なる配列関係を必要とし得る。一般に、Ｃａｓ９は、上鎖または相補鎖と比較して視覚化されたプロトスペーサーの３’であるＰＡＭ配列を認識し：
【化１】
2019508051.tif 000004
一方、Ｃｐｆ１は、一般に、プロトスペーサーの５’であるＰＡＭ配列を認識する：
【化２】
2019508051.tif 000005
【０２３５】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭおよびプロトスペーサーの特異的な配列の向きを認識することに加えて、特異的なＰＡＭ配列を認識することもできる。例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、Ｎ残基がｇＲＮＡ標的化ドメインによって認識される領域のすぐ３’側にあるＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶのＰＡＭ配列を認識する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を認識する。そしてＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆｌは、ＴＴＮ  ＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は、様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼで同定されており、新規なＰＡＭ配列を同定するための戦略は、Ｓｈｍａｋｏｖ  ２０１５に記載されている。また、遺伝子操作ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、参照分子のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有し得ることにも留意するべきである（例えば、遺伝子操作ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの場合、参照分子は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが由来する天然起源の変異体、または遺伝子操作ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと最も高いアミノ酸配列相同性を有する天然起源の変異体であり得る）。
【０２３６】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらのＰＡＭ特異性に加えて、それらのＤＮＡ切断活性によって特徴付けることができ：天然起源のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、典型的には標的核酸にＤＳＢを形成するが、ＳＳＢ（上記、Ｒａｎ  ２０１３、参照により本明細書に援用される）のみを生じさせるまたは全く切断しない遺伝子操作変異体が作製された。
【０２３７】
Ｃａｓ９分子
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。これらは、例えば、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）からのＣａｓ９分子を含む。
【０２３８】
Ｃａｓ９ドメイン
結晶構造が、ガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合）を用いて、２つの異なる天然起源の細菌Ｃａｓ９分子（Ｊｉｎｅｋ  ２０１４）およびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について決定された（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ  ２０１４）。
【０２３９】
天然起源のＣａｓ９分子は、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブとヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み；これらはそれぞれ、本明細書に記載されるドメインをさらに含む。図８Ａおよび図８Ｂは、主構造における重要なＣａｓ９ドメインの機構の概略図を提供する。本開示全体を通じて使用されるドメイン命名法および各ドメインに包含されるアミノ酸残基の番号付与は、以前記載されている通りである（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４）。アミノ酸残基の番号付与は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９を参照する。
【０２４０】
ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を有せず、それがＣａｓ９特異的機能ドメインであることが示唆される。ＢＨドメインは、長いαらせんおよびアルギニンに富む領域であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸６０〜９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはａｔｒａｃｒＲＮＡなどの反復：抗反復二本鎖の認識に重要であり、したがって標的配列を認識することでＣａｓ９活性に重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸９４〜１７９および３０８〜７１７に、２つのＲＥＣ１モチーフを含む。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直鎖一次構造内ではＲＥＣ２ドメインによって隔てられるが、三次構造に構築されてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその部分はまた、反復：抗反復二本鎖の認識における役割を有してもよい。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１８０〜３０７を含む。
【０２４１】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリー構成要素との構造類似性を有して、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にある、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（それぞれ、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ、当該技術分野で一般にＲｕｖＣＩドメイン、またはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い）から構築される。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内ではその他のドメインによって直線的に隔離される。しかし、三次構造内では、３つのＲｕｖＣモチーフに構築されてＲｕｖＣドメインが形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼとの構造的類似性を有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖などの一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ〜ＩＩＩモチーフの間にあり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸７７５〜９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸１０９９〜１３６８を含む。
【０２４２】
ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含み、これらの特定の実施形態では、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインのドメインの１つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン、および／または例えば、以下に記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメインを含む。
【０２４３】
ＲｕｖＣ様ドメイン
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長以下である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、約１５アミノ酸長などの約１０〜２０個のアミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。
【０２４４】
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含み、切断はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
【０２４５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２０）
のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、または不在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または、例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０２４６】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２４７】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がある。他の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がない。
【０２４８】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２１）
のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＬおよびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、ＩおよびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、ＳおよびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＶおよびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、ＭおよびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、ＭおよびＲから選択されるか、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０２４９】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２５０】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２２）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、ＭおよびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、ＭおよびＲから選択されるか、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０２５１】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２２の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２５２】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＶ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｖ−Ｘ（配列番号２３）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される（例えば、Ｃａｓ９分子は、図２Ａ〜２Ｇに示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る（Ｙとして示される））。
【０２５３】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２３の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２５４】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図３Ａ〜３Ｂにおいて、本明細書で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図３Ａ〜３Ｂで同定された高度に保存された残基のうち、１つ、２つ、３つまたは全部が存在する。
【０２５５】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図４Ａ〜４Ｂにおいて、本明細書で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図４Ａ〜４Ｂで同定された高度に保存された残基のうち、１つ、２つ、３つまたは全部が存在する。
【０２５６】
追加的ＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
【０２５７】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式Ｖ：
Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｅ−Ｘ３−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１５）
のアミノ酸配列を含んでよく、
式中、
Ｘ１は、ＶまたはＨであり；
Ｘ２は、Ｉ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）であり；
Ｘ３は、ＭまたはＴである。
【０２５８】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩ：
Ｉ−Ｖ−Ｘ２−Ｅ−Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１６）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２は、Ｉ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である（例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに示される、追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る（Ｂとして示される））。
【０２５９】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩＩ：
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｘ１−Ｄ−Ａ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１７）
のアミノ酸配列を含んでもよく、
式中、
Ｘ１は、ＨまたはＬであり；
Ｘ２は、ＲまたはＶであり；
Ｘ３は、ＥまたはＶである。
【０２６０】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｌ（配列番号１８）
のアミノ酸配列を含む。
【０２６１】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１５〜１８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの側面に位置する配列は、式ＶＩＩＩ：Ｋ−Ｘ１’−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｚ−Ｔ−Ｄ−Ｘ９’−Ｙ（配列番号：１９）のアミノ酸配列を有し、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され、
Ｘ２’はＶ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えばＶ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され；
Ｘ４’はＬ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され；
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるような、例えば、５〜１２アミノ酸を有するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
【０２６３】
ＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、または２５アミノ酸長であるが、４０、３５または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメインは、以下に記載される。
【０２６４】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２５）のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され；
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０２６５】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２５の配列と、少なくとも１つであるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２６６】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がある。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がない。
【０２６７】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｘ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２６）
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０２６８】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２６の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０２６９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩ、
Ｘ１−Ｖ−Ｘ３−Ｈ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含む。
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０２７０】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２７の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０２７１】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩ、Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｈ−Ｉ−Ｘ５−Ｐ−Ｑ−Ｘ７−Ｆ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｘ１２−Ｓ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｘ１６−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｓ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２８）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含む。
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され；
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され；
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され；Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２０は、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され；
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなＨＮＨ様ドメインを含み得る）。
【０２７２】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０２７３】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩＩ、
Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｘ１’−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｘ５’−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｘ６’−Ｘ７’−Ｌ−Ｓ−Ｘ８’−Ｙ−Ｚ−Ｎ−Ｒ−Ｘ９’−Ｋ−Ｘ１０’−Ｄ−Ｘ１１’−Ｖ−Ｐ（配列番号２４）
のアミノ酸配列を含む。
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され；
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され；
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され；
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され；
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され；
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され；Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され；
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され；
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され；および
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
【０２７４】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２４の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる、アミノ酸配列を含む。
【０２７５】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図５Ａ〜５Ｃなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。特定の実施形態では、図５Ａ〜５Ｃで同定された高度に保存された残基のうち、片方または双方が存在する。
【０２７６】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図６Ａ〜６Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図６Ａ〜６Ｂで同定された高度に保存された残基のうと、１つ、２つ、または３つ全てが存在する。
【０２７７】
Ｃａｓ９機能
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断（またはその他の性質）を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書でｅａＣａｓ９分子（酵素的に活性なＣａｓ９）またはｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。
【０２７８】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：
（１）ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
（２）特定の実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
（３）エンドヌクレアーゼ活性；
（４）エキソヌクレアーゼ活性；および
（５）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
【０２７９】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、双方のＤＮＡ鎖を切断して、二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、それに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨドメインと、不活性のまたは切断能力がないＲｕｖＣドメインとを含む一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＲｕｖＣドメインとを含む。
【０２８０】
標的化およびＰＡＭ
Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドはｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメイン、および特定の実施形態では、ａＰＡＭ配列を含む部位に局在する。
【０２８１】
特定の実施形態では、標的核酸と相互作用して切断するｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ，ＮＡＧ、ＮＧＡを認識して、その配列から、例えば、３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｍａｌｉ  ２０１３を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮ（配列番号１９９）および／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）（配列番号２００）を認識して、これらの配列の例えば、３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ２０１０；Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０１））を認識して、この配列の例えば、３〜５ｂｐなど１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列切断を誘導する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０２）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐ上流などの１〜１０ｂｐの標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０３）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０４）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）（配列番号２０５）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐ上流などの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、上記（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）に記載される形質転換アッセイを使用して判定され得る。それぞれの前述の実施形態（すなわち、配列番号１９９〜２０５）では、Ｎは、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかの任意のヌクレオチド残基であり得る。
【０２８２】
本明細書で考察されるように、Ｃａｓ９分子は遺伝子操作されて、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性が改変され得る。
【０２８３】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子は、上述されている（例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３を参照されたい）。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科、またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。
【０２８４】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１、ＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。
【０２８５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
配列番号１、２、４〜６、または１２と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
比較すると、２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり；
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、または生物種に由来するＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子配列と同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号１〜４あるいはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に記載される）。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
【０２８６】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇのコンセンサス配列のアミノ酸配列のいずれかを含んでなり、その中では、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に存在する任意のアミノ酸を示し、「−」は、非存在を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも１個、但し２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２の配列と、少なくとも１個、但し２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。
【０２８７】
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
【０２８８】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１〜５を含み、十分な追加的Ｃａｓ９分子配列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子などの生物活性分子を提供する。特定の実施形態では、領域１〜５のそれぞれは、独立して、例えば、図２Ａ〜２Ｇからの配列（配列番号１、２、４、５、１４）などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの対応する残基と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する。
【０２８９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１〜１８０と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（番号付与は図２のモチーフ配列に準拠する；図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸、但し９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と同一である。
【０２９０】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１’と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２の４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列の１２０〜１８０と同一である。
【０２９１】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域２と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２の４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列の３６０〜４８０と同一である。
【０２９２】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域３と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２の４つのＣａｓ９配列中の残基の５６％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と同一である。
【０２９３】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域４と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と同一である。
【０２９４】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域５と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の６０％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と同一である。
【０２９５】
遺伝子操作または改変Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に結合する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそれに局在する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
【０２９６】
Ｃａｓ９分子は、遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドを含む（遺伝子操作は、この文脈の用法では、単にＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なることを意味して、プロセスまたは起源制限を暗示しない）。遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、（天然またはその他の標準Ｃａｓ９分子と比較して）改変されたヌクレアーゼ活性、または改変されヘリカーゼ活性などの改変された酵素的性質を含み得る。本明細書で考察されるように、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性（二本鎖ヌクレアーゼ活性との対比で）を有し得る。特定の実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のＣａｓ９活性に対する顕著な影響なしに、例えば、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失などの、そのサイズを変化させる改変を有し得る。特定の実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含み得る。例えば、遺伝子操作Ｃａｓ９分子は、内在性野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように改変され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と、配列が異なり得るが、１つまたは複数のＣａｓ９機能に顕著な改変を有しない。
【０２９７】
所望の性質があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの親ポリペプチドの改変などの、いくつかの様式で生成されて、所望の性質を有する改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され得る。例えば、例えば、天然または遺伝子操作Ｃａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子との１つまたは複数の変異または差異が導入され得る。このような変異および差異としては、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失が挙げられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、親Ｃａｓ９分子などの標準と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００、または８０未満の変異などの１つまたは複数の変異または差異を含み得る。
【０２９８】
特定の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。他の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有する。
【０２９９】
非切断および修飾切断Ｃａｓ９
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖核酸切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【０３００】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
【０３０１】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン、例えば、配列番号２４〜２８）と、不活性なまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。代表的な不活性の、または切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにアスパラギン酸の突然変異を有してよく、例えば、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号２の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型とは異なり、標的核酸を切断しないか、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１もしくは．１％未満などの有意に低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレリウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であってよい。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０３０２】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性の、または切断能力がないＨＮＨドメインと、活性の、または切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる（例えば、配列番号１５〜２３などの本明細書に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性の、または切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数に突然変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の位置８５６に示されるヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換されてよく；例えば、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の位置８７０および／または図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の位置８７９に示されるアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメイン内の１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型とは異なり、標的核酸を切断しないか、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１もしくは０．１％未満などの有意に低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレリウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０３０３】
特定の実施形態では、代表的なＣａｓ９機能は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の９つまたは複数を含む。変異は、例えば、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣドメインなどの１つまたは複数のＲｕｖＣドメイン；ＨＮＨドメイン；ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン外の領域に存在し得る。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインに存在する。一実施形態では、変異（ｓ）は、ＨＮＨドメインに存在する。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方に存在する。
【０３０４】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列に関してＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインに起きてもよい代表的変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列に関してＲｕｖＣドメインに実施され得る例示的な突然変異として、Ｎ５８０Ａがある（例えば、配列番号１１を参照）。
【０３０５】
例えば、置換などの特定の配列が、標的化活性、切断活性などの１つまたは複数の活性に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価することで、評価または予測され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然起源Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
【０３０６】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖切断の切断（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。特定の実施形態では、ニッカーゼは、配列番号１０（Ｄ１０Ａ）または配列番号１１（Ｎ５８０Ａ）の配列を含むＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９由来のニッカーゼである（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ２０１５）。
【０３０７】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複数を含む、ｅａＣａｓ９分子である：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性。
【０３０８】
特定の実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下：
図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なる、配列を含んでなる。
【０３０９】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号２）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０３１０】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号４）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０３１１】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号５）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０３１２】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって表示される、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０３１３】
特定の実施形態では、改変されたＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、２つ以上の異なるＣａｓ９分子、例えば、２つ以上の異なる種の天然起源のＣａｓ９分子の融合物であってよい。例えば、１つの生物種の天然Ｃａｓ９分子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の生物種（例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子の断片に融合され得る。
【０３１４】
ＰＡＭ認識が改変されたまたはＰＡＭ認識がないＣａｓ９
天然起源Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について、上に記載されるＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列を認識し得る。
【０３１５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同一ＰＡＭ特異性を有する。その他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、それに最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性、または天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列が改変されて、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善され；またはＰＡＭ認識要求が排除される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増加する、および／またはＣａｓ９特異性を高レベルの同一性（例えば、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列同士の９８％、９９％もしくは１００％のマッチ）まで向上させる、例えば、オフターゲット部位を減少させる、および／または特異性を増大するように、改変することができる。特定の実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。一実施形態では、Ｃａｓ９特異性は、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列同士の少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を要求する。異なるＰＡＭ配列を認識し、かつ／またはオフターゲット活性が低下したＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、指向性進化を使用して作製することができる。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用することができる例示的な方法およびシステムは、記載されている（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ２０１１を参照のこと）。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、以下に記載される方法によって評価され得る。
【０３１６】
サイズ最適化Ｃａｓ９
本明細書に記載される遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子認識などの所望のＣａｓ９特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含む、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、１つまたは複数の欠失および任意選択的に１つまたは複数のリンカーを含む、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Ｃａｓ９分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるＣａｓ９分子を生成する方法、およびこのようなＣａｓ９分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
【０３１７】
例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの欠失があるＣａｓ９分子は、例えば、低下したアミノ酸数を有するなど、対応する天然Ｃａｓ９分子よりも小型である。Ｃａｓ９分子のより小さなサイズは、送達方法の融通性を増大させ、その結果ゲノム編集の有用性を高める。Ｃａｓ９分子は、結果として生じる本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性に実質的に影響を及ぼさず、またはそれを低下させない、１つまたは複数の欠失を含み得る。本明細書に記載される欠失を含むＣａｓ９分子中で維持される機能としては、ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力で、一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力；ならびに例えば、標的核酸またはｇＲＮＡなどの核酸分子の認識活性。
【０３１８】
本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性は、本明細書または当該技術分野で記載される、活性アッセイを使用して評価することができる。
【０３１９】
欠失に適する領域を同定する
Ｃａｓ９分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。様々な細菌種、例えば、表１に列挙されるもののいずれか１つに由来する天然オルソロガスＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造にモデル化され得て（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４）、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたＣａｓ９オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの境界面などのＣａｓ９活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
【０３２０】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。代表的Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはＣａｓ９ポリペプチドは、上述されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ２０１３；Ｗａｎｇ  ２０１３；Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ２０１２を参照されたい）。
【０３２１】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるようにして、化学修飾され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、（例えば、以下の全てなどの１つまたは複数の特性を有する：それは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換される。
【０３２２】
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンあまり一般的でないコドンは、一般的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
【０３２３】
さらに、または代案としては、ａＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
【０３２４】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３に記載されている。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている。
【０３２５】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号７〜９に記載されている。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、配列番号６に記載される。
【０３２６】
上記Ｃａｓ９配列のいずれかが、Ｃ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合する場合、停止コドンは除外されるものと理解される。
【０３２７】
その他のＣａｓ分子およびＣａｓポリペプチド
本明細書で開示される発明を実施するために、様々なタイプのＣａｓ分子またはＣａｓポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。その他の実施形態では、その他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、上述されている（例えば、Ｈａｆｔ  ２００５およびＭａｋａｒｏｖａ  ２０１１を参照されたい）。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、表２にもまた示される。
【０３２８】
【表３】
2019508051.tif 000006
【０３２９】
【表４】
2019508051.tif 000007
【０３３０】
【表５】
2019508051.tif 000008
【０３３１】
Ｃｐｆｌ分子
ｃｒＲＮＡおよび二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ標的（ＴＴＴＮ  ＰＡＭ配列を含む）と複合体を形成したアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｃｐｆ１の結晶構造が、参照により本明細書に援用されるＹａｍａｎｏ２０１６によって解明された。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のように、２つのローブ：ＲＥＣ（認識）ローブおよびＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブを有する。ＲＥＣローブは、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインを含み、いかなる既知のタンパク質構造とも類似性がない。一方、ＮＵＣローブは、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ−１、ＲｕｖＣ−ＩＩ、およびＲｕｖＣ−ＩＩＩ）およびＢＨドメインを含む。しかし、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆｌ  ＲＥＣローブは、ＨＮＨドメインを欠き、同様に既知のタンパク質構造と類似性を欠いた他のドメイン：構造的にユニークなＰＩドメイン、３つのＷｅｄｇｅ（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ−１、ＷＥＤ−ＩＩ、およびＷＥＤ−ＩＩＩ）、およびヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインを含む。
【０３３２】
Ｃａｓ９およびＣｐｆｌは、構造および機能の類似性を共有するが、特定のＣｐｆｌ活性は、いかなるＣａｓ９ドメインにも類似していない構造ドメインによって媒介されることを理解されたい。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインと配列的および空間的に異なるＮｕｃドメインによって媒介されるようである。加えて、Ｃｐｆｌ  ｇＲＮＡの非標的部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡにおける反復：アンチリピート二重鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、偽ノット構造（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をとる。
【０３３３】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの修飾
上記のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、様々な用途において有用であり得る活性および特性を有するが、当業者であれば、ある場合には、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼもまた、切断活性、ＰＡＭ特異性、または他の構造的もしくは機能的特徴を変化させるために修飾できることを理解されよう。
【０３３４】
まず、切断活性を変化させる修飾については、ＮＵＣローブ内のドメインの活性を低下させるまたは排除する突然変異が上に記載されている。ＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９  ＨＮＨドメイン、またはＣｐｆｌ  Ｎｕｃドメインで生じさせることができる例示的な突然変異は、Ｒａｎ  ２０１３およびＹａｍａｎｏ  ２０１６、ならびにＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ  ２０１６に記載されている。一般に、２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つの活性を低減または排除する突然変異は、ニッカーゼ活性を有するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを生じさせるが、ニッカーゼ活性のタイプは、どのドメインが不活性化されるかによって異なることに留意するべきである。一例として、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの不活性化により、以下に示されるように相補鎖または上鎖を切断するニッカーゼが生じる（ここで、Ｃは切断部位を示す）。
【化３】
2019508051.tif 000009
【０３３５】
他方、Ｃａｓ９  ＨＮＨドメインの不活性化により、底鎖または非相補鎖を切断するニッカーゼが生じる：
【化４】
2019508051.tif 000010
【０３３６】
天然起源のＣａｓ９参照分子に対するＰＡＭ特異性の改変は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の両方についてＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ２０１５ａに記載されている（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ２０１５ｂ）。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらは、Ｃａｓ９の標的化忠実度を改善する改変も記載している（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ２０１６）。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【０３３７】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、参照により援用されるＺｅｔｓｃｈｅ  ２０１５および参照により援用されるＦｉｎｅ  ２０１５に記載されるように、２つ以上の部分に分割されている。
【０３３８】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ会合、標的およびＰＡＭ認識、および切断活性を維持しながらヌクレアーゼのサイズを減少させる１つまたは複数の欠失によって、サイズを最適化または切断することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択的にリンカーを用いて、別のポリペプチド、ヌクレオチド、または他の構造に共有結合または非共有結合で結合する。例示的な結合ヌクレアーゼおよびリンカーは、本明細書の全ての目的のために参照により援用されるＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ２０１４に記載されている。
【０３３９】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはまた、任意選択的に、タグ、例えば、限定はしないが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質の核内への移動を容易にする核局在化シグナルを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃ末端および／またはＮ末端核局在化シグナルを組み込むことができる。核局在化配列は、当該技術分野で公知であり、Ｍａｅｄｅｒ  ２０１５および他の箇所に記載されている。
【０３４０】
前述の修飾のリストは本質的に例示的であることを意図し、当業者であれば、本開示から、特定の用途において他の修飾が可能である、または望ましい場合があることを理解されよう。したがって、簡潔にするために、本開示の例示的なシステム、方法、および組成物は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを参照して提示されるが、使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらの作動原理を変更しないで修飾できることを理解するべきである。このような修飾は、本開示の範囲内である。
【０３４１】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆｌ、またはその機能的断片をコードする核酸が本明細書で提供される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、既に記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ２０１３；Ｗａｎｇ  ２０１３；Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ２０１２を参照）。
【０３４２】
場合によっては、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、化学的に修飾することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、以下の特性のうちの１つまたは複数（例えば、全て）を有し得る：このｍＲＮＡを、キャップする；ポリアデニル化する；ならびに５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換することができる。
【０３４３】
合成核酸配列はまた、コドン最適化することもできる、例えば、少なくとも１つの非共通コドンまたはより一般的でないコドンが、共通コドンによって置換される。例えば、合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導する、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系における発現に最適化することができる。コドン最適化Ｃａｓ９コード配列の例は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ  ２０１６に示されている。
【０３４４】
加えて、または代替的に、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は当該技術分野で公知である。
【０３４５】
候補分子の機能解析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で公知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価するための例示的な方法は既に記載されている（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）。
【０３４６】
結合および切断アッセイ：Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成またはインビトロ転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
【０３４７】
代案としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成され、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μｌでプレインキュベートされる。１μＬの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μＬのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応物がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
【０３４８】
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃａｓ９分子の適合性が評価され得る。
【０３４９】
結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、上記（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）に記載されている。
【０３５０】
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μｌで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイメージングによって視覚化される。
【０３５１】
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性をＤＳＦによって測定することができる。この技術は、結合ＲＮＡ分子、例えば、ｇＲＮＡの添加などの好都合な条件下で増加し得るタンパク質の熱安定性を測定する。
【０３５２】
このアッセイは、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の最良の化学量論比を試験するプロトコルと、ＲＮＰ形成のための最良の溶液条件を決定するプロトコルとの２つの異なるプロトコルを用いて行うことができる。
【０３５３】
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の条件を判定するために、Ｃａｓ９の２μＭ水溶液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が３８４ウェルプレート内に分注される。次に、様々なｐＨの溶液中で希釈された等モル量のｇＲＮＡ、および塩が添加される。室温で１０分間インキュベートし、短時間の遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０３５４】
アッセイ２
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のｇＲＮＡ分子と２ｕＭ  Ｃａｓ９を混合して、３８４ウェルプレート内で、室温で１０分間インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートはＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ粘着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための短時間の遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０３５５】
遺伝子標的化のためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＮＨＥＪ媒介欠失を使用して、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）の負の調節エレメント（例えば、サイレンサー）の全てまたは一部を欠失させる。本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘発性ＮＨＥＪを使用して、標的特異的に調節エレメントの全てまたは一部をノックアウトすることができる。他の実施形態では、ＮＨＥＪ媒介挿入を使用して、γ−グロビン遺伝子の負の調節エレメントに配列を挿入し、調節エレメントの不活性化をもたらす。
【０３５６】
理論に縛られることを望むものではないが、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノム変化は、ヌクレアーゼ誘発性ＮＨＥＪおよびＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質に依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を１つに接合することによってＤＮＡの二本鎖切断を修復する；しかし、一般に、元の配列は、二本鎖切断によって形成される末端と全く同じ２つの適合末端が完全に結合された場合にのみ復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素処理の課題であり、末端の再結合の前に一方または両方の鎖でヌクレオチドが付加または除去される。この結果、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列に挿入および／または欠失（インデル）突然変異が存在する。これらの突然変異の３分の２は、典型的には、リーディングフレームを変化させ、したがって、非機能性タンパク質が産生される。加えて、リーディングフレームを維持するが、相当量の配列を挿入または欠失する突然変異は、タンパク質の機能を破壊し得る。これは、極めて重要な機能的ドメインの突然変異が、タンパク質の非重要領域の突然変異よりも許容されにくい可能性が高いため、遺伝子座依存性である。
【０３５７】
ＮＨＥＪによって生成されるインデル突然変異は、本質的に予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小さな領域の微小相同性により、特定のインデル配列が好まれ、その集団で過剰に表される。欠失の長さは、幅広く変動することがあり；この長さは、最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐを超える範囲に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む配列の短い重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、このような場合、挿入配列は、ゲノムの他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされる場合が多い。
【０３５８】
ＮＨＥＪは、突然変異誘発プロセスであるため、特定の最終配列の生成が要求されない限り、小さな配列モチーフ（例えば、５０ヌクレオチド長以下のモチーフ）を欠失させるのにも使用することができる。二本鎖切断が、標的配列の近傍で標的化される場合、ＮＨＥＪ修復によって引き起こされる欠失突然変異は、しばしば望ましくないヌクレオチドに及ぶため、それらを除去する。より大きなＤＮＡセグメントの欠失の場合には、配列の両側に１つずつ、２つの二本鎖切断を導入することにより末端間にＮＨＥＪが起こり得、介在配列全体が除去される。このようにして、数百キロベースもの大きいＤＮＡセグメントを欠失させることができる。これらのアプローチの両方を用いて、特定のＤＮＡ配列を欠失させることができる；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、依然として修復部位にインデル突然変異を生じさせることができる。
【０３５９】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との両方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルを生じさせることができる。目的の調節領域に標的化されるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、標的調節エレメントを破壊する、または欠失させることができる。
【０３６０】
標的位置に対する二本鎖切断または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる特定の実施形態では、ｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子が、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチドの近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｂｐ未満）離れている。
【０３６１】
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する２つのｇＲＮＡが、ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で２つの一本鎖切断を誘導する特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立した単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドにＮＨＥＪ修復を提供するよう２つの一本鎖切断を配置するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド以内に配置するように構成され、本質的に二本鎖切断を模倣している。特定の実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｂｐ未満）離れており、２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、かつ互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐ以下）離れている。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドの両側に配置するように構成される。
【０３６２】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との両方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断を生じさせることができる。二本鎖切断または対の一本鎖切断を、標的位置の両側に生じさせて、２つの切断で核酸配列を除去することができる（例えば、２つの切断間の領域が欠失される）。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立した単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置するように構成される。他の実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立した単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）、および２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を標的位置の両側に配置するように構成される。さらに他の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立した単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡは、二対の一本鎖切断（すなわち、二対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）が、標的位置の両側に生じるように構成される。二本鎖切断（複数可）、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用される場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、かつ互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐ以下）離れている。
【０３６３】
ＨＤＲ修復、ＨＤＲ媒介ノックイン、ノックアウト、または欠失、およびテンプレート核酸
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介配列変化を使用して、外部から提供されるテンプレート核酸（本明細書ではドナー構築物とも呼ばれる）を用いてγ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）調節領域における１つまたは複数のヌクレオチド配列を変化させる（例えば、欠失させる、破壊する、または修飾する）。理論に縛られることを望むものではないが、γ−グロビン遺伝子調節領域内のＨＢＧ標的位置のＨＤＲ媒介変化は、外部から提供されるドナーテンプレートまたはテンプレート核酸を用いるＨＤＲによって起こると考えられる。例えば、ドナー構築物またはテンプレート核酸は、ＨＢＧ標的位置の変化を提供する。一実施形態では、内在性ゲノム供与体配列を、標的配列と同じ染色体上に位置させることが検討される。さらに、別の実施形態では、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列とは異なる染色体上に位置させることが検討される。内在性ゲノム供与体配列によるＨＢＧ標的位置の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含み得る。
【０３６４】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介変化を使用して、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）の負の調節エレメント（例えば、サイレンサー）の全てまたは一部をノックアウトまたは欠損させる。本明細書に記載されるように、ＨＤＲを使用して、標的特異的に調節エレメントの全てまたは一部をノックアウトまたは欠失させることができる。
【０３６５】
他の実施形態では、ＨＤＲ媒介配列変化を使用して、外部から提供されるテンプレート核酸を使用することなく、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）調節領域の１つまたは複数のヌクレオチド配列を変化させる。理論に縛られることを望むものではないが、内在性ゲノムドナー配列を有するＨＤＲによってＨＢＧ標的位置の変化が起こると考えられている。例えば、内在性ゲノムドナー配列は、ＨＢＧ標的位置の変化をもたらす。一実施形態では、内在性ゲノムドナー配列は、標的配列と同じ染色体上に位置することが企図される。別の実施形態では、内在性ゲノムドナー配列は、標的配列とは異なる染色体上に位置することがさらに企図される。内在性ゲノムドナー配列によるＨＢＧ標的位置の変化は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または二つの一本鎖切断を含み得る。
【０３６６】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介変化を使用して、γ−グロビン遺伝子調節領域の単一ヌクレオチドを変化させる。これらの実施形態は、１つの二本鎖切断または２つの一本鎖切断のいずれかを利用することができる。特定の実施形態では、（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）標的位置の各側で切断が起こる２つの二本鎖切断、（４）標的位置の各側で二本鎖切断および２つの一本鎖切断が起こる１つの二本鎖切断および２つの一本鎖切断、（５）標的位置の各側で一対の一本鎖切断が起こる４つの一本鎖切断、または（６）１つの一本鎖の切断を用いる単一ヌクレオチド変化が包含される。
【０３６７】
一本鎖テンプレート核酸が使用される特定の実施形態では、標的位置は、代替ＨＤＲによって変化させることができる。
【０３６８】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介変化を使用して、γ−グロビン遺伝子調節領域における１つまたは複数のヌクレオチド変化（例えば、欠失）を導入する。特定の実施形態では、γ−グロビン遺伝子調節領域は、ＨＢＧ標的位置であり得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ標的位置内の標的部位に導入され得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２、およびＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２の１つまたは複数から選択され得る。特定の実施形態では、標的部位は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）、およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の１つまたは複数から選択され得る。
【０３６９】
ＨＢＧ標的位置の供与体テンプレートを用いて実施される改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、ニック、二本鎖切断、または２つの一本鎖切断、例えば、標的核酸の各鎖に１つずつを含み得る。標的核酸への切断の導入後、切断末端に切除が起こり、これによってＤＮＡ領域にオーバーラップする一本鎖が生じる。
【０３７０】
標準ＨＤＲでは、標的核酸に対する相同配列を含む二本鎖供与体テンプレートを導入するが、これは、標的核酸に直接組み込むか、または標的核酸の配列を変更するためのテンプレートとして使用する。切断における切除後、修復は、様々な経路、例えば、ダブルホリデイジャンクションモデル（ｄｏｕｂｌｅ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）（もしくは二本鎖切断修復、ＤＳＢＲ、経路）または合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）経路によって進行し得る。ダブルホリデイジャンクションモデルでは、供与体テンプレート中の相同配列に対する標的核酸の２つの一本鎖オーバーハングによる鎖浸潤が起こり、これによって、２つのホリデイジャンクションを含む中間体が形成される。これらのジャンクションは、新たなＤＮＡが、浸潤鎖の末端から合成されているため、移動して、切除によって生じた間隙を充填する。新たに合成されたＤＮＡの末端は、切除された末端と連結し、ジャンクションは分解されて、標的核酸の改変、例えば、対応する標的位置での供与体テンプレートのＨＰＦＨ突然変異配列の組み込みが起こる。供与体テンプレート核酸との交差が、ジャンクションの分解時に起こり得る。ＳＤＳＡ経路では、唯一の一本鎖オーバーハングが供与体テンプレートを浸潤し、新たなＤＮＡが浸潤鎖の末端から合成されて、切除によって生じた間隙を充填する。新たに合成されたＤＮＡは、次に、残る一本鎖オーバーハングとアニールし、新たなＤＮＡが合成されて間隙を充填した後、鎖が連結されて、ＤＮＡ二重鎖を生成する。
【０３７１】
代替ＨＤＲでは、一本鎖供与体テンプレート、例えば、テンプレート核酸を導入する。所望のＨＢＧ標的位置を改変するための標的核酸でのニック、一本鎖切断、または二本鎖切断は、例えば、本明細書に記載されるものなどのＣａｓ９分子によって媒介され、切断における切除が起こって、一本鎖オーバーハングが露出する。ＨＢＧ標的位置を改変するためのテンプレート核酸の配列の組み込みは、典型的に、前述した通り、ＳＤＳＡ経路によって起こる。
【０３７２】
テンプレート核酸についてのさらに詳細は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７９０５号の「テンプレート核酸（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」と題するセクションＩＶに記載されている。
【０３７３】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性と、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子、例えば、野生型Ｃａｓ９によって実施される。このような実施形態は、単一のｇＲＮＡを必要とする。
【０３７４】
特定の実施形態では、１つの一本鎖切断、またはニックは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９ニッカーゼによって実施される。ニック標的核酸は、ａｌｔ−ＨＤＲ用の基質となり得る。
【０３７５】
他の実施形態では、２つの一本鎖切断、またはニックは、例えば、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性、またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性などのニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子によって実施される。このような実施形態は、通常、２つのｇＲＮＡを、すなわち各一本鎖切断の配置に１つずつ必要とする。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断するが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断しない。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断しないが、その代わり、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断する。
【０３７６】
特定の実施形態では、ニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０に突然変異を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異（例えば、配列番号１０）などＨＮＨ活性を有する。Ｄ１０Ａは、ＲｕｖＣを不活性化し；従って、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上にＮＧＧ  ＰＡＭを有していない相補鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｈ８４０、例えばＨ８４０Ａ、突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして用いることができる。Ｈ８４０Ａは、ＨＮＨを不活性化し；従って、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、その配列が、ｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｎ８６３突然変異、例えば、Ｎ８６３Ａ突然変異、突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｎ８６３Ａは、ＨＮＨを不活性化することから、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、かつその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。
【０３７７】
ニッカーゼおよび２つのｇＲＮＡを使用して２つの一本鎖ニックを配置する特定の実施形態では、１つのニックは＋鎖上にあり、かつ１つのニックは標的核酸鎖上にある。ＰＡＭは、外側を向いてもよい。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ同士が、約０〜５０、０〜１００、または０〜２００ヌクレオチドによって隔てられるように選択することができる。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的な標的配列の間にオーバーラップはない。一実施形態では、ｇＲＮＡは、オーバーラップせずに、５０、１００、または２００ヌクレオチド程によって隔てられている。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの使用は、例えば、オフターゲット結合を低減することによって、特異性を増大することができる（Ｒａｎ  ２０１３）。
【０３７８】
特定の実施形態では、単一のニックを用いて、ＨＤＲ、例えば、ａｌｔ−ＨＤＲを誘導することができる。本明細書では、単一のニックを用いて、所与の切断部位でのＨＲとＮＨＥＪの比を増加し得ることが検討される。特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが相補的である標的核酸の鎖中に一本鎖切断を形成する。他の実施形態では、前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが相補的である鎖以外の標的核酸の鎖中に一本鎖切断を形成する。
【０３７９】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
鎖の一方における二本鎖切断または一本鎖切断は、例えば、ＨＰＦＨ突然変異の取り込みである変化が所望の領域で生じるＨＢＧ標的位置に十分に近接するべきである。特定の実施形態では、距離は、ＨＢＧ標的位置から５０、１００、２００、３００、３５０、または４００ヌクレオチド以下である。理論に束縛されることを望むものではないが、特定の実施形態では、切断は、ＨＢＧ標的位置が末端切除中にエキソヌクレアーゼ媒介除去を受ける領域内にあるようにこのＨＢＧ標的位置に十分に近接するべきであると考えられる。ＨＢＧ標的位置と切断との間の距離が大きすぎる場合は、変化させることが望ましい配列を、末端切除に含めなくてもよく、従って、外部から提供されるドナー配列または内在性ゲノムドナー配列のいずれかであるドナー配列として変化させなくてもよく、一部の実施形態では、ドナー配列は、末端切除領域内の配列を変化させるためだけに使用される。
【０３８０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、γ−グロビン遺伝子調節領域（複数可）、例えば、ＨＧＢ１および／またはＨＧＢ２遺伝子（複数可）のエンハンサー領域（複数可）、例えば、サイレンサー領域（複数可）、例えば、プロモーター領域（複数可）の近傍に１つまたは複数の切断を導入する。これらのある実施形態では、調節領域（複数可）、例えば、ＨＧＢ１および／またはＨＧＢ２遺伝子（複数可）のエンハンサー領域（複数可）、例えば、サイレンサー領域（複数可）の少なくとも一部に隣接する２つ以上の切断が導入される。この２つ以上の切断は、γ−グロビン遺伝子調節領域（複数可）、例えば、ＨＧＢｌおよび／またはＨＧＢ２遺伝子（複数可）のエンハンサー領域（複数可）、例えば、サイレンサー領域（複数可）の少なくとも一部を含むゲノム配列を除去する（例えば、欠失させる）。本明細書に記載される全ての方法は、調節領域（複数可）、例えば、ＨＧＢｌおよび／またはＨＧＢ２遺伝子（複数可）のエンハンサー領域（複数可）、例えば、サイレンサー領域（複数可）の変化をもたらす。
【０３８１】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断が、変化させること、例えば、突然変異が望ましい領域の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、または２００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、改変しようとする領域、例えば、突然変異の上流または下流に配置することができる。いくつかの実施形態では、切断は、改変しようとする領域、少なくとも２つの突然変異ヌクレオチドにより画定される領域内に配置される。いくつかの実施形態では、切断は、改変しようとする領域に直接隣接して、例えば、突然変異のすぐ上流または下流に位置する。
【０３８２】
特定の実施形態では、一本鎖切断には、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的一本鎖切断が伴う。例えば、標的化ドメインは、例えば、２つの一本鎖切断などの切断事象が、ＨＢＧ標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ヌクレオチド内に位置するように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼを誘導すると、一本鎖切断が、前記第２のｇＲＮＡによって配置される互いに十分に近い追加的一本鎖切断を伴い、所望する領域の改変をもたらすように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９がニッカーゼである場合、第２のｇＲＮＡによって配置される一本鎖切断が、前記第１のｇＲＮＡ分子によって配置される切断の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内であるように構成される。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド内に、切断を配置させるように設計されて、例えば、二本鎖切断を本質的に模倣する。
【０３８３】
ＨＤＲ媒介性配列改変を誘導するために、ｇＲＮＡ（単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）およびＣａｓ９ヌクレアーゼが、二本鎖切断を誘導する特定の実施形態では、切断部位は、ＨＢＧ標的位置から０〜２００塩基対（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００塩基対）離れている。特定の実施形態では、切断部位は、ＨＢＧ標的位置から０〜１００塩基対（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５、または７５〜１００塩基対）離れている。
【０３８４】
特定の実施形態では、ニッカーゼを使用することによってＨＤＲを促進して、オーバーハングを含む切断を生じさせることができる。オーバーハングの一本鎖性質は、例えば、ＮＨＥＪとは反対に、ＨＤＲによって細胞が切断を修復する可能性を高めることができる。特に、いくつかの実施形態では、第１のニッカーゼを第１の標的配列に標的化する第１のｇＲＮＡと、第１の標的配列とは反対側のＤＮＡ鎖上にあり、しかも第１のニックからずれている第２の標的配列に第２のニッカーゼを標的化する第２のｇＲＮＡとを選択することによって、ＨＤＲを促進する。
【０３８５】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、予め選択されたヌクレオチドが変化されないようにこのヌクレオチドから十分に離れて切断事象を配置するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、エキソン配列の改変または不要なスプライシング事象を回避するために、イントロン切断事象が、イントロン／エキソン境界または天然起源のスプライスシグナルから十分遠くに位置するように設計される。ｇＲＮＡ分子は、以下に記載するように、第１、第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子であってよい。
【０３８６】
第１の切断および第２の切断同士の配置
特定の実施形態では、二本鎖切断は、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０３８７】
特定の実施形態では、二本鎖切断は、第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０３８８】
特定の実施形態では、第１および第２の一本鎖切断は、第３のｇＲＮＡ分子および第４のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０３８９】
２つ以上のｇＲＮＡを用いて、標的核酸内に２つ以上の切断事象、例えば、二本鎖または一本鎖切断を配置する場合、同じまたは異なるＣａｓ９タンパク質によって２つ以上の切断事象を実施し得ることが検討される。例えば、２つのｇＲＮＡを用いて、２つの二本鎖切断を配置する場合、単一のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、双方の二本鎖切断を生成することができる。２つ以上のｇＲＮＡを用いて、２つ以上の一本鎖切断（ニック）を配置する場合、単一のＣａｓ９ニッカーゼを用いて、２つ以上のニックを生成することができる。２つ以上のｇＲＮＡを用いて、少なくとも１つの二本鎖切断と少なくとも１つの一本鎖切断を配置する場合、２つのＣａｓ９タンパク質、例えば、１つのＣａｓ９ヌクレアーゼと１つのＣａｓ９ニッカーゼを用いることができる。２つ以上のＣａｓ９タンパク質を用いる場合、２つ以上のＣａｓ９タンパク質を順次送達することにより、標的核酸の所望の位置で、一本鎖切断に対して二本鎖の特異性を制御し得ることが検討される。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向鎖と相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側に向くように設計される。
【０３９１】
特定の実施形態では、互いに予め選択した距離にある２つの位置のＣａｓ９媒介性切断を指令するように、２つのｇＲＮＡを選択する。特定の実施形態では、２つの切断点は、標的核酸の対向鎖上にある。いくつかの実施形態では、２つの切断点は、平滑末端切断を形成し、他の実施形態では、これらは、ＤＮＡ末端が、１つまたは２つのオーバーハング（例えば、１つまたは複数の５’オーバーハングおよび／または１つまたは複数の３’オーバーハング）を含むようにずれている。いくつかの実施形態では、各切断事象は、ニックである。特定の実施形態では、ニックは、二本鎖切断機構により認識される切断を形成するように、互いに十分接近している（例えば、ＳＳＢｒ機構により認識されるのとは反対に）。特定の実施形態では、ニックは、それらが、ＨＤＲの基質であるオーバーハングを生成する、すなわち、切断の配置が、いくつかの切除を被ったＤＮＡ基質を模倣するように、十分離れている。例えば、いくつかの実施形態では、ニックは、プロセッシブ切除のための基質であるオーバーハングを生成するように隔てられている。いくつかの実施形態では、２つの切断は、互いに２５〜６５ヌクレオチド以内で隔てられている。２つの切断は、例えば、互いに約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。２つの切断は、例えば、互いに少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。２つの切断は、例えば、互いに多くとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。特定の実施形態では、２つの切断は、互いに約２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、または６０〜６５ヌクレオチドであってよい。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、切除された切断を模倣する切断は、３’末端オーバーハング（例えば、ＤＳＢおよびニックによって生成され、ここで、ニックは３’オーバーハングを残す）、５’オーバーハング（例えば、ＤＳＢおよびニックによって生成され、ここで、ニックは５’オーバーハングを残す）、３’および５’オーバーハング（例えば、３つの切断によって生成される）、２つの３’オーバーハング（例えば、互いにずれている２つのニックによって生成される）、または２つの５’オーバーハング（例えば、互いにずれている２つのニックによって生成される）を含む。
【０３９３】
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する２つのｇＲＮＡ（独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）が、ＨＤＲ媒介性改変を誘導する目的で、２つの一本鎖切断を誘導する特定の実施形態では、より近傍のニックは、ＨＢＧ標的位置から互いに０〜２００塩基対（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、または７５〜１００塩基対）離れており、２つのニックは、理想的には互いに２５〜６５塩基対（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５塩基対、４５〜５０塩基対、５０〜５５塩基対、５５〜６０塩基対、または６０〜６５塩基対）以内にあり、ならびに互いから１００塩基対以下（例えば、互いから９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５塩基対）離れている。特定の実施形態では、切断部位は、ＨＢＧ標的位置から０〜１００塩基対（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５または７５〜１００塩基対）離れている。
【０３９４】
特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように設計される。代替の実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に、二本鎖切断（すなわち、ｃａｓ９ヌクレアーゼと１つのｇＲＮＡの複合体）と２つの一本鎖切断または対合一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼと２つのｇＲＮＡの複合体）を配置するように設計される。他の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立した単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡは、二対の一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する二対の２つのｇＲＮＡ）を標的位置の両側に生じさせるように構成される。二本鎖切断（複数可）、または一対の２つの一本鎖ニックの接近は、理想的には、ＨＢＧ標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）である。ニッカーゼを使用する場合、１対の２つのニックは、複数の実施形態では、互いに２５〜６５塩基対（例えば、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、４０〜４５塩基対、４５〜５０塩基対、５０〜５５塩基対、５５〜６０塩基対、または６０〜６５塩基対）以内にあり、ならびに互いから１００塩基対以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、または２０または１０塩基対以下）離れている。
【０３９５】
２つのｇＲＮＡ分子を用いて、Ｃａｓ９分子を切断に標的化する場合、Ｃａｓ９分子の様々な組み合わせが考えられる。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡを用いて、第１のＣａｓ９分子を第１の標的位置に標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて、第２のＣａｓ９分子を第２の標的位置に標的化する。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９分子は、標的核酸の第１鎖にニックを生成し、第２のＣａｓ９分子は、対向鎖上にニックを生成し、これによって、二本鎖切断（例えば、平滑末端切断またはオーバーハングを含む切断）が生じる。
【０３９６】
１つの一本鎖切断を一方の鎖に、また第２の一本鎖切断を対向鎖に標的化するために、ニッカーゼの様々な組み合わせを選択することができる。組み合わせを選択する際、１つの活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼと、１つの活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼがあることを考慮に入れることができる。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、標的核酸分子の非相補的鎖を切断する。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、一本鎖相補的ドメイン、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖を切断する。一般的に、双方のＣａｓ９分子は、同じ活性ドメインを有し（例えば、双方が活性ＲｕｖＣドメインを有するか、または双方が活性ＨＮＨドメインを有する）、標的の対向鎖に２つの結合するｇＲＮＡを選択することになる。さらに詳細には、いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼに結合して、第１のｇＲＮＡと非相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第２鎖をニッカーゼに切断させ；第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼに結合して、第２のｇＲＮＡと非相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第１鎖をニッカーゼに切断させる。反対に、いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼに結合して、第１のｇＲＮＡと相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第１鎖をニッカーゼに切断させ；第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼに結合して、第２のｇＲＮＡと相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第２鎖をニッカーゼに切断させる。別の実施形態では、１つのＣａｓ９分子が活性ＲｕｖＣ様ドメインを有し、他方のＣａｓ９分子が活性ＨＮＨドメインを有する場合、双方のＣａｓ９分子のｇＲＮＡは、標的核酸の同じ鎖と相補的であり得るため、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するＣａｓ９分子は、非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインを有するＣａｓ９分子は、相補鎖を切断することになり、これによって二本鎖切断が生じる。
【０３９７】
供与体テンプレートの相同性アーム
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、供与体テンプレート内の相補的領域を見出すことができるように、末端切除が起こり得る領域と少なくとも同じくらい遠くまで延在すべきである。その全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメーターによって限定され得る。一実施形態では、相同性アームは、反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復配列またはＬＩＮＥ反復配列中に延在しない。
【０３９８】
例示的な相同性アーム長さとしては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、相同性アーム長さは、５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、または４０００〜５０００ヌクレオチドである。
【０３９９】
テンプレート核酸は、本明細書の用法では、ＨＢＧ標的位置の構造を変化させる（例えば、欠失させる、破壊する、または修飾する）ためにＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子と共に使用することができる核酸配列を指す。特定の実施形態では、ＨＢＧ標的位置は、１つまたは複数のヌクレオチドが付加された標的核酸上の２つのヌクレオチド、例えば、隣接するヌクレオチド間の部位であり得る。あるいは、ＨＢＧ標的位置は、テンプレート核酸によって変化される１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ標的位置内の標的部位に導入され得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２、およびＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２の１つまたは複数から選択され得る。特定の実施形態では、標的部位は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）、およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の１つまたは複数から選択され得る。
【０４００】
特定の実施形態では、標的核酸は、テンプレート核酸の配列の一部または全てが、典型的には切断部位（複数可）またはその近傍に来るように修飾される。特定の実施形態では、テンプレート核酸は一本鎖である。他の実施形態では、テンプレート核酸は二本鎖である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。他の実施形態では、テンプレート核酸は一本鎖ＤＮＡである。一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡと同じベクター骨格、例えば、ＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡ上にコードされる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、インビボでベクター骨格から切り出され、例えば、ｇＲＮＡ認識配列に隣接する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、内在性ゲノム配列を含む。
【０４０１】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ＨＤＲ事象に関与することによって標的位置の構造を変化させる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を変化させる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、修飾されたまたは非天然起源の塩基の標的核酸への組み込みをもたらす。
【０４０２】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失をもたらす。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ＨＢＧ標的位置の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失をもたらす。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）を、ＨＢＧ標的位置内の標的部位に導入することができる。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２、およびＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２の１つまたは複数から選択され得る。特定の実施形態では、標的部位は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）、およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の１つまたは複数から選択され得る。
【０４０３】
典型的に、テンプレート配列は、標的配列による切断媒介性または触媒組換えを受ける。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ｅａＣａｓ９媒介切断事象によって切断される標的配列上の１部位に対応する配列を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、第１のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第１部位と、第２のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第２部位の両方に対応する配列を含む。
【０４０４】
γ−グロビン遺伝子調節領域のＨＢＧ標的位置と相同性を有するテンプレート核酸を使用して、調節領域の構造を変化させることができる。例えば、γ−グロビン遺伝子調節領域におけるＨＢＧ標的位置の５’および３’領域と相同性を有するテンプレート核酸を使用して、ＨＢＧ標的位置の１つまたは複数のヌクレオチドを欠失させることができる。
【０４０５】
テンプレート核酸は、典型的に、以下の構成要素：
［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］
を含む。
【０４０６】
相同性アームは、染色体への組換え、従って、置換配列による、望ましくないエレメント、例えば、突然変異またはシグネチャの置換を提供する。相同性アームは、切断されるべき標的核酸内またはその近傍の（例えば、隣接または接触する）ＤＮＡ領域に相同な領域である。特定の実施形態では、相同性アームは、最も遠位の切断部位に隣接する。
【０４０７】
特定の実施形態では、テンプレート核酸を使用して、γ−グロビン遺伝子調節領域（複数可）、例えば、ＨＧＢｌおよび／またはＨＧＢ２遺伝子（複数可）のエンハンサー領域（複数可）、例えば、サイレンサー領域（複数可）の少なくとも一部を含むゲノム配列を除去する（例えば、欠失させる）ことができる。特定の実施形態では、テンプレート核酸を使用して、ＨＢＧ標的位置の１つまたは複数のヌクレオチドを欠失させる、すなわち、ＨＢＧ標的位置に変化（例えば、欠失）を導入することができる。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）を、ＨＢＧ標的位置内の標的部位に導入することができる。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２、およびＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２の１つまたは複数から選択され得る。特定の実施形態では、標的部位は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）、およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の１つまたは複数から選択され得る。
【０４０８】
ドナーテンプレートにおける置換配列は、参考により本明細書に援用される、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ  ２０１６を含む他の場所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さとすることができる。特定の実施形態では、置換配列は、編集が望ましい細胞内の天然起源の配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上の配列修飾を含み得る。
【０４０９】
特定の実施形態では、所望の修復結果が標的核酸の欠失である場合、置換配列は０ヌクレオチドまたは０ｂｐであり得る。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、欠失させるべき標的核酸配列と相同な配列を除外する。置換配列が０ヌクレオチドまたは０ｂｐである場合、５’相同性アームおよび３’相同性アームがテンプレート核酸にアニールする間に位置する標的核酸配列が欠失される。
【０４１０】
特定の実施形態では、５’相同性アームの３’末端は、置換配列の５’末端に隣接した位置である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から５’側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド伸長させることができる。特定の実施形態では、置換配列が０ヌクレオチドまたは０ｂｐである場合、５’相同性アームの３’末端は、３’相同性アームの５’末端に隣接した位置である。置換配列が０ヌクレオチドまたは０ｂｐである特定の実施形態では、５’相同性アームは、３’相同性アームの５’末端から５’側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド伸長させることができる。
【０４１１】
特定の実施形態では、３’相同性アームの５’末端は、置換配列の３’末端に隣接した位置である。一実施形態では、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から３’側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド伸長させることができる。置換配列が０ヌクレオチドまたは０ｂｐである特定の実施形態では、３’相同性アームの５’末端は、５’相同性アームの３’末端に隣接した位置である。一実施形態では、３’相同性アームは、５’相同性アームの３’末端から３’側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド伸長させることができる。
【０４１２】
特定の実施形態では、ＨＢＧ標的位置で１つまたは複数のヌクレオチドを変化させるために、相同性アーム、例えば、５’および３’相同性アームはそれぞれ、最も遠位のｇＲＮＡに隣接する約１０００ｂｐの配列（例えば、ＨＢＧ標的位置の両側に１０００ｂｐの配列）を含み得る。
【０４１３】
本明細書では、特定の配列反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復エレメントまたはＬＩＮＥエレメントの含有を回避するために、一方または双方の相同性アームを短縮し得ることが考慮される。例えば、配列反復エレメントを回避するために、５’相同性アームを短縮してよい。他の実施形態では、配列反復エレメントを回避するために、３’相同性アームを短縮してもよい。いくつかの実施形態では、特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、５’および３’相同性アームの双方を短縮してもよい。
【０４１４】
本明細書において、ＨＢＧ標的位置の配列を変化させるためのテンプレート核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として使用するようにデザインできることが企図される。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’および３’相同性アームは、最大約２００ヌクレオチド長の範囲、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐの長さであり得る。オリゴヌクレオチド合成の改善が継続して実施されるため、より長い相同性アームもｓｓＯＤＮに検討される。いくつかの実施形態では、より長い相同性アームは、化学合成以外の方法、例えば、長い二本鎖核酸を変性させた後、例えば、固体支持体に固定させた鎖特異的配列に対するアフィニティにより鎖の一方を精製することによって実施される。
【０４１５】
理論に縛られることを望むものではないが、特定の実施形態では、ａｌｔ−ＨＤＲは、テンプレート核酸が、ニック（すなわち、ニックの入った鎖の５’方向に）または標的部位（すなわち、標的部位の５’方向に）の５’側に伸長した相同を有するときにより効率的に進行する。したがって、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、長い相同性アームと短い相同性アームを有し、ここで、長い方の相同性アームが、ニックまたは標的部位の５’側にアニールすることができる。いくつかの実施形態では、ニックまたは標的部位の５’側にアニールすることができるアームは、ニックまたは標的部位または置換配列の５’もしくは３’末端から、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ニックまたは標的部位の５’側にアニールすることができるアームは、ニックまたは標的部位の３’側にアニールすることができるアームより、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％長い。いくつかの実施形態では、ニックまたは標的部位の５’側にアニールすることができるアームは、ニックまたは標的部位の３’側にアニールすることができるアームより、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍長い。ｓｓＤＮＡテンプレートが、インタクトな鎖または切断鎖にアニールすることができるか否かに応じて、ニックまたは標的部位の５’側にアニールする相同性アームは、それぞれｓｓＤＮＡテンプレートの５’末端またはｓｓＤＮＡテンプレートの３’末端に位置し得る。
【０４１６】
同様に、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、テンプレート核酸が、ニックの５’側に延在する相同性を有するように、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを有する。例えば、５’相同性アームと３’相同性アームは、実質的に同じ長さであってよいが、置換配列は、ニックの３’側よりもニックの５’側で、より遠くに延在し得る。いくつかの実施形態では、置換配列は、ニックの３’末端よりもニックの５’末端側に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、２倍、３倍、４倍、または５倍遠くに延在する。
【０４１７】
理論に縛られることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、ａｌｔ−ＨＤＲは、テンプレート核酸がニックまたは標的部位の中心に位置するときにより効率的に進行する。したがって、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ほぼ同じサイズである２つの相同性アームを有する。例えば、テンプレート核酸の第１の相同性アームは、テンプレート核酸の第２の相同性アームの１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内の長さを有し得る。
【０４１８】
同様に、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、テンプレート核酸が、ニックまたは標的部位の両側でほぼ同じ距離だけ延在するように、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを有する。例えば、相同性アームは、異なる長さを有してよいが、置換配列は、これを補償するように選択され得る。例えば、置換配列は、ニックの３’側よりもニックの５’側で、より遠く延在し得るが、ニックの５’側の相同性アームは、これを補償するために、ニックの３’側の相同性アームより短い。その逆も可能であり、例えば、置換配列は、ニックの５’側よりもニックの３’側で、より遠くに延在し得るが、ニックの３’側の相同性アームは、これを補償するために、ニックの５’側の相同性アームより短い。
【０４１９】
例示的なテンプレート核酸
特定の実施形態では、テンプレート核酸は二本鎖である。他の実施形態では、テンプレート核酸は一本鎖である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖部分および二本鎖部分を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、および／または置換配列の両側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、６５〜８５、または７０〜８０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、もしくは置換配列の５’側、ニック、標的部位、もしくは置換配列の３’側、またはニック、標的部位、もしくは置換配列の５’側および３’側の両方に約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｂｐの相同性を有する。
【０４２０】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、および／または置換配列の３’側に約１５０〜２００ｂｐ、例えば、１５５〜１９５、１６０〜１９０、１６５〜１８５、または１７０〜１８０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、または置換配列の３’側に約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、または２００ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、または置換配列の５’側に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、または１０ｂｐ未満の相同性を有する。
【０４２１】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、および／または置換配列の５’側に約１５０〜２００ｂｐ、例えば、１５５〜１９５、１６０〜１９０、１６５〜１８５、または１７０〜１８０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、または置換配列の５’側に約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、または２００ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位、または置換配列の３’側に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、または１０ｂｐ未満の相同性を有する。
【０４２２】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸に付加されるまたはこの標的核酸の変化を鋳型とするヌクレオチド配列、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置を変更するために使用することができるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、ＨＢＧ標的位置の１つまたは複数のヌクレオチドを欠失させるために使用することができるヌクレオチド配列を含む。
【０４２３】
テンプレート核酸は、置換配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、５’相同性アームを含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、３’ 相同性アームを含む。
【０４２４】
テンプレート核酸は、５’相同性アーム、０ヌクレオチドまたは０ｂｐである置換配列、および３’相同性アームを含み得る。
【０４２５】
特定の実施形態では、テンプレート核酸は、直鎖二本鎖ＤＮＡである。長さは、例えば、約１５０〜２００塩基対、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対であってよい。長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対であってよい。いくつかの実施形態では、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対以下である。いくつかの実施形態では、二本鎖テンプレート核酸は、約１６０、例えば、１５５〜１６５、１５０〜１７０、１４０〜１８０、１３０〜１９０、１２０〜２００、１１０〜２１０、１００〜２２０、９０〜２３０、または８０〜２４０塩基対の長さを有する。
【０４２６】
テンプレート核酸は、直鎖一本鎖ＤＮＡであり得る。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、（ｉ）標的核酸の切断鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉ）標的核酸のインタクトな鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、またはこれらの２つ以上である。長さは、例えば、約１５０〜２００ヌクレオチド、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドであってよい。長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態では、一本鎖テンプレート核酸は、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５５〜１６５、１５０〜１７０、１４０〜１８０、１３０〜１９０、１２０〜２００、１１０〜２１０、１００〜２２０、９０〜２３０、または８０〜２４０ヌクレオチドの長さを有する。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、環状二本鎖ＤＮＡ、例えば、プラスミドである。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列、標的部位、および／またはニックの両側に、約５００〜１０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいは、ニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対以下の相同性を含む。
【０４２８】
特定の実施形態では、特定の配列反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復、ＬＩＮＥエレメントを含まないように、一方または両方の相同性アームを短縮することができる。例えば、５’相同性アームは、配列反復エレメントを回避するために短縮することができ、３’相同性アームは、配列反復エレメントを回避するために短縮することができる。いくつかの実施形態では、特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、５’および３’相同性アームの両方を短縮することができる。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、アデノウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされることを可能にする長さおよび配列のｓｓＤＮＡ分子である。ベクターは、例えば、５ｋｂ未満であってよく、キャプシド中へのパッケージングを促進するＩＴＲ配列を含んでもよい。ベクターは、組み込み欠陥であってもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列、標的部位、および／またはニックの両側に、約１５０〜１０００ヌクレオチドの相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、約１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、多くとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、レンチウイルスベクター、例えば、ＩＤＬＶ（組み込み欠陥レンチウイルス）である。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列、標的部位、および／またはニックの両側に、約５００〜１０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいはニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニック、標的部位または置換配列の５’側、ニック、標的部位または置換配列の３’側、あるいは、ニック、標的部位または置換配列の５’および３’側の双方に、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対以下の相同性を含む。
【０４３１】
一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９がテンプレート核酸を認識してこれを切断するのを妨げる１つまたは複数の突然変異、例えば、サイレント突然変異を含む。テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０のサイレント突然変異を含んでもよい。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、多くとも２、３、４、５、１０、２０、３０、または５０のサイレント突然変異を含む。一実施形態では、ｃＤＮＡは、Ｃａｓ９がテンプレート核酸を認識してこれを切断するのを妨げる１つまたは複数の突然変異、例えば、サイレント突然変異を含む。テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０のサイレント突然変異を含んでよい。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、多くとも２、３、４、５、１０、２０、３０、または５０のサイレント突然変異を含む。
【０４３２】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介変化を使用して、γ−グロビン遺伝子調節領域における１つまたは複数のヌクレオチドの変化（例えば、欠失）を導入する。特定の実施形態では、γ−グロビン遺伝子調節領域は、ＨＢＧ標的位置であり得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ標的位置内の標的部位に導入され得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２、およびＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２の１つまたは複数から選択され得る。特定の実施形態では、標的部位は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）、およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の１つまたは複数から選択され得る。
【０４３３】
特定の実施形態では、ＨＢＧ標的位置（すなわち、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域）内の標的部位に変化（例えば、欠失）を導入するためのテンプレート核酸は、５’から３’方向に５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含み、この置換配列は０ヌクレオチドまたは０ｂｐである。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。特定の実施形態では、５’相同性アームは、本明細書に記載される任意の５’相同性アームであり得る。特定の実施形態では、３’相同性アームは、本明細書に記載される任意の３’相同性アームであり得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ標的位置内の標的部位に導入され得る。特定の実施形態では、変化（例えば、欠失）は、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２、およびＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２の１つまたは複数から選択され得る。特定の実施形態では、標的部位は、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）、およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の１つまたは複数から選択され得る。
【０４３４】
例えば、標的部位ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）に変化ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ−１１４〜−１０２を導入するためのテンプレート核酸は、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含むことができ、この置換配列は０ヌクレオチドまたは０ｂｐである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００のヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、５’相同性アームは、標的部位ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４−２８３６）の５’側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、７０〜９０、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、５’相同性アームは、配列番号９０４（ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる。特定の実施形態では、５’相同性アームは、配列番号９０７（ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０７から本質的になる、または配列番号９０７からなる。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００のヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、３’相同性アームは、標的部位ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４−２８３６）の３’側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、７０〜９０、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、３’相同性アームは、配列番号９０５（ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる。特定の実施形態では、３’相同性アームは、配列番号９０８（ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０８から本質的になる、または配列番号９０８からなる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、配列番号９０６を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、配列番号９０９（ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０９から本質的になる、または配列番号９０９からなる。
【０４３５】
別の例では、標的部位ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）に変化ＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２を導入するためのテンプレート核酸は、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含むことができ、この置換配列は０ヌクレオチドまたは０ｂｐである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００のヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、５’相同性アームは、標的部位ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、７０〜９０、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、５’相同性アームは、配列番号９０４（ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる。特定の実施形態では、５’相同性アームは、配列番号９０７（ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０７から本質的になる、または配列番号９０７からなる。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００のヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、３’相同性アームは、標的部位ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、７０〜９０、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、３’相同性アームは、配列番号９０５（ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる。特定の実施形態では、３’相同性アームは、配列番号９０８（ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０８から本質的になる、または配列番号９０８からなる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、配列番号９０６を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、配列番号９０９（ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０９から本質的になる、または配列番号９０９からなる。
【０４３６】
別の例では、標的部位ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）に変化ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−２２５〜−２２２を導入するためのテンプレート核酸は、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含むことができ、この置換配列は０ヌクレオチドまたは０ｂｐである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００のヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、５’相同性アームは、標的部位ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、７０〜９０、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００のヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、３’相同性アームは、標的部位ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５、６０〜９０、７０〜９０、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する。
【０４３７】
特定の実施形態では、５’相同性アームは、５’ホスホロチオエート（ＰｈＴｘ）修飾を含む。特定の実施形態では、３’相同性アームは、３’  ＰｈＴｘ修飾を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、５’および３’  ＰｈＴｘ修飾を含む。
【０４３８】
特定の実施形態では、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）調節領域における単一ヌクレオチドを変化させるためのテンプレート核酸は、５’から３’方向に、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含み、この置換は、単一ヌクレオチド変化を取り込むようにデザインされている。例えば、組み込まれる変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；もしくはｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ、またはＨＢＧ２  ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔである場合、置換配列は、単一ヌクレオチドＴ、およびこのＴの片側または両側に任意選択による１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。同様に、組み込まれる変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；もしくはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ、またはＨＢＧ２  ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ  もしくはｃ．−１６７  Ｃ＞Ａである場合、置換配列は、単一ヌクレオチドＡ、およびこのＡの片側または両側に任意選択による１つまたは複数のヌクレオチドを含み得；組み込まれる変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇもしくはｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ、またはＨＢＧ２  ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；もしくはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇである場合、置換配列は、単一ヌクレオチドＧ、およびこのＧの片側または両側に任意選択による１つまたは複数のヌクレオチドを含み得；かつ組み込まれる変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；もしくはｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ、またはＨＢＧ２  ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃもしくはｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃである場合、置換配列は、単一ヌクレオチドＣ、およびこのＣの片側または両側に任意選択による１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。
【０４３９】
特定の実施形態では、５’および３’相同性アームはそれぞれ、置換配列に対応するヌクレオチドに隣接する１つの配列を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、５’相同性アームおよび３’相同性アームに隣接する置換配列を含み、この５’相同性アームおよび３’相同性アームは、それぞれ独立に１０以上、２０以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、５５０以上、６００以上、６５０以上、７００以上、７５０以上、８００以上、８５０以上、９００以上、１０００以上、１１００以上、１２００以上、１３００以上、１４００以上、１５００以上、１６００以上、１７００以上、１８００以上、１９００以上、または２０００以上のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、５’相同性アームおよび３’相同性アームに隣接する置換配列を含み、この５’相同性アームおよび３’相同性アームは、それぞれ独立に少なくとも５０、１００、または１５０のヌクレオチドを含むが、反復エレメントを含むのに十分な長さではない。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、５’相同性アームおよび３’相同性アームに隣接する置換配列を含み、この５’相同性アームおよび３’相同性アームは、それぞれ独立に５〜１００、１０〜１５０、または２０〜１５０のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、置換配列は、プロモーターおよび／またはポリＡシグナルを任意選択的に含む。
【０４４０】
一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって使用される反復配列は、一般に３０ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいＤＮＡ合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがＤＮＡ二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、使用される２つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
【０４４１】
ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を改変するのにテンプレート核酸を必要としない。それに代えて、相補的反復配列が使用される。
【０４４２】
その他のＤＮＡ修復経路
ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム内の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上で論じたＤＳＢ修復機序とは別個の機序であるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセッシング、ＤＮＡギャップ充填、およびＤＮＡライゲーションの４つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ  ２００８に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０４４３】
ＳＳＢが形成する第１段階では、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識して修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合および活性は一過性であり、損傷におけるＳＳＢｒタンパク質複合体の巣状滞留または安定性を促進することで、ＳＳＢｒを加速するようである。議論の余地はあるが、これらのＳＳＢｒタンパク質中で最重要であるのはＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡの３’および５’末端のクリーニングに関与するタンパク質をはじめとする、ＳＳＢｒプロセスの複数の酵素的構成要素と相互作用して、安定化し刺激する分子スキャフォールドとして機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセッシングを促進するいくつかのタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼβ、ＰＮＫ、および３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、およびＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ機能を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０４４４】
全部ではないとしても大多数のＳＳＢの３’および／または５’末端は損傷を受けているため、この末端プロセッシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセッシングは、一般に、末端がライゲーションできるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化状態に回復させ、およびおよび／または損傷を受けた５’末端をリン酸部分に、回復させることを伴う。損傷を受けた３’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、およびＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびＡＰＴＸが挙げられる。ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）はまた、末端プロセッシングにも関与する。ひとたび末端がクリーニングされたら、ギャップ充填が起こり得る。
【０４４５】
ＤＮＡギャップ充填段階では、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｃｕｌｅａｓｅ）１）、ＤＮＡポリメラーゼδ／ε、ＰＣＮＡ、およびＬＩＧ１である。短いパッチ修復および長いパッチ修復の２つのギャップ充填様式がある。短いパッチ修復は、欠損している単一ヌクレオチドを挿入することを伴う。いくつかのＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ以上のヌクレオチドを転置し続けるかもしれない（最高１２塩基の転置が報告されている）。ＦＥＮ１は、転置された５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβをはじめとする複数のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＳＢの修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの起源とタイプによって影響を受ける。
【０４４６】
第４段階では、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）またはＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の連結を触媒する。短いパッチ修復はリガーゼＩＩＩを利用して、長いパッチ修復はリガーゼＩを利用する。
【０４４７】
時に、ＳＳＢＲは、複製−共役する。この経路には、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、およびＦＥＮ１の１つまたは複数が関与し得る。ＳＳＢＲを促進してもよい追加的要素としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼｂ、ＤＮＡポリメラーゼｄ、ＤＮＡポリメラーゼｅ、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、およびＥＲＣＣ１が挙げられる。
【０４４８】
ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、ＭＭＲ、ＢＥＲ、およびＮＥＲの３つの切除修復経路を包含する：切除修復経路は、典型的に、ＤＮＡの１本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ／エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、１〜３０ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像は、Ｌｉ  ２００８に記載され、概要は、本明細書で提供される。
【０４４９】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤対合ＤＮＡ塩基上で機能する。
【０４５０】
ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体は、どちらもミスマッチ認識および修復開始に重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６が、塩基−塩基ミスマッチを優先的に認識して、１または２ヌクレオチドの誤対合を同定する一方で、ＭＳＨ２／３は、より大型のＩＤ誤対合を優先的に認識する。
【０４５１】
ｈＭＬＨ１は、ｈＰＭＳ２とヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有しＭＭＲの複数の段階で重要であるｈＭｕｔＬαを形成する。これは、ＥＸＯ１が関与する３’ニック誘導ＭＭＲにおいて重要な役割を果たす、ＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。（ＥＸＯ１は、ＨＲおよびＭＭＲの双方に参加する。）これは、ミスマッチが誘発する切除の終了を制御する。リガーゼＩは、この経路の関連リガーゼである。ＭＭＲを促進してもよい追加的要素としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ｄ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、およびＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。
【０４５２】
塩基切除修復（ＢＥＲ）
塩基切除修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期全体を通じて活性であり；それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路（次のセクションで考察される）は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ  ２００８に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０４５３】
ＤＮＡ塩基損傷に際して、塩基切除修復（ＢＥＲ）が開始されて、プロセスは、５つの主要な段階に簡略化され得る：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）後続の塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップ内への所望のヌクレオチド（例えば、ＨＰＦＨ突然変異）挿入；および（ｅ）ＤＮＡ骨格内の残りのニックのライゲーション。これらの最終段階は、ＳＳＢＲと類似する。
【０４５４】
第１段階では、損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼが、塩基を糖リン酸骨格に結合するＮグリコシド連結の切断を通じて、損傷を受けた塩基を切除する。次に、関連リアーゼ活性があるＡＰエンドヌクレアーゼ−１（ＡＰＥ１）または二機能性ＤＮＡグリコシラーゼがリン酸ジエステル骨格を切開して、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じた。ＢＥＲの第３段階は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを伴う。ＢＥＲの第４段階は、新規相補的ヌクレオチドを修復ギャップ内に付加するＰｏｌβによって実施され、最終段階で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩがＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールする。これで、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大部分（約８０％）が修復される、短いパッチＢＥＲ経路が完了する。しかし、段階３の５’末端が、末端プロセッシング活性に対して抵抗性であれば、Ｐｏｌβによる１個のヌクレオチド挿入に続いて、ポリメラーゼは複製的ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌδ／εに切り替わり、次にそれは、ＤＮＡ修復ギャップに約２〜８個のヌクレオチドを付加する。これは、５’フラップ構造を作り出し、それは、処理能力要素である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）によって認識され切除される。次にＤＮＡリガーゼＩが、ＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールして、長いパッチＢＥＲを完了する。ＢＥＲ経路を促進してもよい追加的要素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ、Ｐｏｌｅ、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ−１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、およびＡＰＴＸが挙げられる。
【０４５５】
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。ＮＥＲに関する加的な詳細は、Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ２０１４にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路ＮＥＲは、２つのより小型の経路である、全ゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）と、転写と共役する修復ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）とを包含する。ＧＧ−ＮＥＲおよびＴＣ−ＮＥＲは、ＤＮＡ損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
【０４５６】
ひとたび障害が認識されたら、細胞は、損傷を含有する短い一本鎖ＤＮＡ断片を除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１およびＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷のどちらかの側で損傷を受けた鎖を切断し、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップを生成することで、損傷を除去する。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填合成およびライゲーションを実行するこのプロセスに関与するのは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  ＰｏｌεまたはＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびＤＮＡリガーゼＩまたはＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。ライゲーションステップの実行のために、自己複製細胞が、ＤＮＡ  ＰｏｌεおよびＤＮＡリガーゼＩを利用する傾向がある一方で、非自己複製細胞は、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびｔｈｅＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を利用する傾向がある。
【０４５７】
ＮＥＲは、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、およびＬＩＧ１の要素を伴い得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、およびＴＴＤＡの要素を伴い得る。ＮＥＲ修復経路を促進してもよい追加的要素としては、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ−ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、およびＰＣＮＡが挙げられる。
【０４５８】
鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるＤＮＡ鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ＩＣＬ修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、およびＨＤＲである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のＩＣＬを切除するように動員される一方で、ＴＬＳおよびＨＤＲは、協調して切断された鎖を修復する。ＩＣＬ修復は、以下の要素を伴い得る：例えば、ＸＰＦおよびＲＡＤ５１Ｃなどのエンドヌクレアーゼ、ＲＡＤ５１などのエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、ＦａｎｃＪなどのファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質。
【０４５９】
その他の経路
哺乳類には、いくつかのその他のＤＮＡ修復経路が存在する。
【０４６０】
損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断の修復経路であり、例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌβおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼが関与する。
【０４６１】
誤りのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断修復の別の経路である。
【０４６２】
ゲノム編集方法におけるｇＲＮＡの例
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子は、標的核酸の配列、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャを変化させる二本鎖切断または一本鎖切断を生じさせることができＣａｓ９分子と共に使用することができる。これらの方法に有用なｇＲＮＡ分子が以下に記載される。
【０４６３】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ、例えば、キメラｇＲＮＡは、以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される：
（ａ）ｇＲＮＡが、例えば、二本鎖切断を生じさせるＣａｓ９分子を標的とする場合、二本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００ヌクレオチド以内に、または（ｉｉ）この標的位置が端部切除領域内にあるように十分に近くに配置できる；
（ｂ）ｇＲＮＡが、少なくとも１６のヌクレオチド、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６のヌクレオチドの標的化ドメインを有する；および
（ｃ）（ｉ）隣接ドメインおよびテールドメインが、合わせると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；
（ｃ）（ｉｉ）第２相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以下のヌクレオチドが異なる配列が存在する；
（ｃ）（ｉｉｉ）第１相補性ドメインのその対応するヌクレオチドに相補的な第２相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、もしくは５４のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、もしくは５４のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以下のヌクレオチドが異なる配列が存在する；
（ｃ）（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ヌクレオチドの長さである、例えば、このテールドメインが、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；あるいは
（ｃ）（ｖ）テールドメインが、天然起源のテールドメイン、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインの対応する部分の１５、２０、２５、３０、３５、４０のヌクレオチドまたは全てを含む。
【０４６４】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉ）；ａおよびｂ（ｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｖ）；ａおよびｂ（ｖ）；ａおよびｂ（ｖｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｘ）；ａおよびｂ（ｘ）；ａおよびｂ（ｘｉ）；ａおよびｃ；ａ、ｂ、およびｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、またはｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含むように構成される。
【０４６５】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ、例えば、キメラｇＲＮＡは、以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される：
（ａ）ｇＲＮＡの一方または両方が、例えば、一本鎖切断を生じさせるＣａｓ９分子を標的とする場合、一本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００ヌクレオチド以内に、または（ｉｉ）この標的位置が端部切除領域内にあるように十分に近くに配置できる；
（ｂ）一方または両方が、少なくとも１６のヌクレオチドの標的化ドメイン、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６のヌクレオチドの標的化ドメインを有する；および
（ｃ）（ｉ）隣接ドメインおよびテールドメインが、合わせると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；
（ｃ）（ｉｉ）第２相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以下のヌクレオチドが異なる配列が存在する；
（ｃ）（ｉｉｉ）第１相補性ドメインのその対応するヌクレオチドに相補的な第２相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、もしくは５４のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、もしくは５４のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以下のヌクレオチドが異なる配列が存在する；
（ｃ）（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ヌクレオチドの長さである、例えば、このテールドメインが、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；または
（ｃ）（ｖ）テールドメインが、天然起源のテールドメイン、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインの対応する部分の１５、２０、２５、３０、３５、４０のヌクレオチドまたは全てを含む。
【０４６６】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ａおよびｂ（ｉ）；ａおよびｂ（ｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｖ）；ａおよびｂ（ｖ）；ａおよびｂ（ｖｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｘ）；ａおよびｂ（ｘ）；ａおよびｂ（ｘｉ）；ａおよびｃ；ａ、ｂ、およびｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含むように構成される。
【０４６７】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えば、不活性化されたＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。
【０４６８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えば、不活性化されたＨＮＨ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、８４０における突然変異、例えば、Ｈ８４０Ａを有するＣａｓ９分子と共に使用される。
【０４６９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えば、不活性化されたＨＮＨ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｎ８６３における突然変異、例えば、Ｎ８６３Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。
【０４７０】
一実施形態では、第１および第２ｇＲＮＡを含む一対のｇＲＮＡ、例えば、一対のキメラｇＲＮＡは、以下の特性の１つまたは複数を含むように構成される：
（ａ）ｇＲＮＡの一方または両方が、例えば、一本鎖切断を生じさせるＣａｓ９分子を標的とする場合、一本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００ヌクレオチド以内に、または（ｉｉ）この標的位置が端部切除領域内にあるように十分に近くに配置できる；
（ｂ）一方または両方が、少なくとも１６のヌクレオチドの標的化ドメイン、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６のヌクレオチドの標的化ドメインを有する；および
（ｃ）（ｉ）隣接ドメインおよびテールドメインが、合わせると、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；
（ｃ）（ｉｉ）第２相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以下のヌクレオチドが異なる配列が存在する；
（ｃ）（ｉｉｉ）第１相補性ドメインのその対応するヌクレオチドに相補的な第２相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、もしくは５４のヌクレオチド、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、もしくは５４のヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以下のヌクレオチドが異なる配列が存在する；
（ｃ）（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ヌクレオチドの長さである、例えば、このテールドメインが、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ヌクレオチド、またはこれらと１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以下のヌクレオチドが異なる配列を含む；または
（ｃ）（ｖ）テールドメインが、天然起源のテールドメイン、例えば、天然起源のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）テールドメインの対応する部分の１５、２０、２５、３０、３５、４０のヌクレオチドまたは全てを含む；
（ｄ）ｇＲＮＡが、標的核酸にハイブリダイズした場合、これらのｇＲＮＡが、０〜５０、０〜１００、０〜２００、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも５０ヌクレオチド離れるように構成される；
（ｅ）第１ｇＲＮＡおよび第２ｇＲＮＡによって生じる切断が異なる鎖上にある；および
（ｆ）ＰＡＭが外側を向いている。
【０４７１】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡの一方または両方は、ａおよびｂ（ｉ）；ａおよびｂ（ｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｖ）；ａおよびｂ（ｖ）；ａおよびｂ（ｖｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉ）；ａおよびｂ（ｖｉｉｉ）；ａおよびｂ（ｉｘ）；ａおよびｂ（ｘ）；ａおよびｂ（ｘｉ）；ａおよびｃ；ａ、ｂ、およびｃ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、ｄ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｄ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｅ；ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含むように構成される。
【０４７２】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えば、ＲｕｖＣ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。
【０４７３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えば、ＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｈ８４０における突然変異、例えば、Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。
【０４７４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子、例えば、ＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えば、Ｎ８６３における突然変異、例えば、Ｎ８６３Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子と共に使用される。
【０４７５】
標的細胞
Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子、例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、多種多様な細胞において、標的核酸、例えば、γ−グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）調節領域を変化させる（例えば、変異または欠失を導入する）ことができる。特定の実施形態では、標的細胞における標的核酸の変化は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。
【０４７６】
本明細書に記載されるＣａｓ９およびｇＲＮＡ分子は、標的細胞に送達することができる。特定の実施形態では、標的細胞は、赤血球系細胞、例えば、赤芽球である。特定の実施形態では、赤血球系細胞は、優先的に標的化され、例えば、標的化細胞の少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が赤血球系細胞である。例えば、インビボ送達の場合、赤血球系細胞が優先的に標的化され、そして細胞がエクスビボで処理されて対象に戻される場合、赤血球系細胞が優先的に修飾される。
【０４７７】
特定の実施形態では、標的細胞は、循環血液細胞、例えば、網状赤血球、巨核球赤血球前駆（ＭＥＰ）細胞、骨髄球前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ球前駆（ＬＰ）細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）、または内皮細胞（ＥＣ）である。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球系細胞（例えば、赤芽球）、ＭＥＰ細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、ＬＰ細胞、赤血球系前駆（ＥＰ）細胞、ＨＳＣ、多能性前駆（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、造血内皮（ＨＥ）細胞、または間葉系幹細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄前駆細胞（例えば、骨髄球系共通前駆（ＣＭＰ）細胞または顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、リンパ系前駆細胞、例えば、リンパ系共通前駆（ＣＬＰ）細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、赤血球前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞、または系統制限前駆細胞（ＬＲＰ：ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋、またはＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞、または胎盤造血ＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、動員された末梢血造血ＣＤ３４＋細胞（患者が動員剤、例えばＧ−ＣＳＦまたはＰｌｅｒｉｘａｆｏｒで治療された後）である。特定の実施形態では、標的細胞は、末梢血内皮細胞である。
【０４７８】
特定の実施形態では、標的細胞は、γ−グロビン遺伝子調節領域を編集することによってエクスビボで操作されてから、対象に投与される。エクスビボ操作のための標的細胞の供給源として、例えば、対象の血液、骨髄、または臍帯血を挙げることができる。エクスビボ操作のための標的細胞の他の供給源として、例えば、異種ドナー血液、臍帯血、または骨髄を挙げることができる。特定の実施形態では、赤血球が対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。特定の実施形態では、造血幹細胞が対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。特定の実施形態では、赤血球前駆細胞が対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。特定の実施形態では、骨髄前駆細胞が対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。特定の実施形態では、多能性前駆（ＭＰＰ）細胞が対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。特定の実施形態では、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）が対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＣが対象から採取され、上記のようにエクスビボで操作され、対象に戻される。
【０４７９】
特定の実施形態では、エクスビボで作製された改変ＨＳＣは、骨髄破壊的前処理なしで対象に投与される。他の実施形態では、改変ＨＳＣは、生着後に一部の造血細胞が改変ＨＳＣから生じるように軽度の骨髄破壊処理後に投与される。さらに他の実施形態では、生着後に造血細胞の１００％が改変ＨＳＣから生じるように、改変ＨＳＣが完全骨髄破壊後に投与される。
【０４８０】
また、適切な細胞として、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、または造血内皮（ＨＥ）細胞（造血幹細胞および内皮細胞の両方の前駆細胞）が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、またはｉＰＳ細胞、例えば、対象から作製されるｉＰＳ細胞に由来する細胞であり、本明細書に開示の方法を用いて改変され、そして臨床的に適切な細胞、例えば、赤血球に分化する。特定の実施形態では、ＡＡＶを使用して標的細胞を形質導入する。
【０４８１】
特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集に使用される幹細胞は、参照により援用されるＧｏｒｉ  ２０１６の例、例えば、２１９〜２２３頁、２２３〜２２４頁、２２７〜２３１頁、２３１〜２３６頁、２３５〜２３８頁、２４０〜２４１頁、２４２〜２４４頁に記載されている方法に従って使用するために調製することができる。幹細胞は、当業者に公知の適切な任意の様式で培養および増殖させることができる。
【０４８２】
本明細書に記載される方法によって産生された細胞は、すぐに使用することができる。あるいは、細胞を凍結し（例えば、液体窒素で）、後の使用まで保存することができる。細胞は、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、またはこのような凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般的に使用されているようなその他の溶液で凍結され、そして凍結培養細胞の解凍について当該技術分野で一般的に知られている様式で解凍される。細胞はまた、４℃での長期間保存のために熱安定化させることもできる。
【０４８３】
送達、製剤化、および投与経路
ゲノム編集システムの構成要素、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）、およびドナーテンプレート核酸、または３つ全てを、様々な形態で送達、製剤化、または投与することができる。例えば、表３および表４を参照。
【０４８４】
特定の実施形態では、１つのＣａｓ９分子と２つ以上（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の異なるｇＲＮＡ分子は、例えば、ＡＡＶベクターによって送達される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする配列と、２つ以上（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の異なるｇＲＮＡ分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ構成要素が送達され、ＤＮＡにコードされる場合、このＤＮＡは、典型的に、発現を実施するための制御領域（例えば、プロモーターを含む）を含むであろう。Ｃａｓ９分子配列に有用なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＳＦＦＶ、ＥＦＳ、ＥＦ−１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、およびＣＢＨプロモーター、または血液細胞特異的プロモーターが挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。ｇＲＮＡの有用なプロモーターとしては、Ｔ７、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、Ｕ６、Ｕ１およびｔＲＮＡプロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度を有するプロモーターを選択して、構成要素の発現を調整することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、例えば、ＳＶ４０ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする配列は、少なくとも２つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
【０４８５】
表３に、構成要素を製剤化、送達、または投与する方法の例を記載する。
【０４８６】
【表６】
2019508051.tif 000011
【０４８７】
【表７】
2019508051.tif 000012
【０４８８】
表４は、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステム構成要素の様々な送達方法を要約する。
【０４８９】
【表８】
2019508051.tif 000013
【０４９０】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよび／または１つまたは複数のｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）、ｇＲＮＡ分子をコードする核酸、供与体テンプレート核酸、またはそれら（例えば、２つもしくは全て）の任意の組み合わせは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に、または細胞内に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ならびに供与体テンプレート核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはそれらの組み合わせによって、送達することができる。
【０４９１】
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）および／またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、標的細胞（例えば、赤血球、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）と共役させることができる。供与体テンプレート分子も同様に、標的細胞（例えば、赤血球、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）と共役させることができる。
【０４９２】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
【０４９３】
ベクターは、標的とされる領域（例えば、標的配列）と高い相同性を有するＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子および／またはドナーテンプレートをコードする配列を含み得る。特定の実施形態では、ドナーテンプレートは、標的配列の全てまたは一部を含む。例示的なドナーテンプレートは、修復テンプレート、例えば、遺伝子修正テンプレート、または遺伝子突然変異テンプレート、例えば、点突然変異（例えば、単一ヌクレオチド（ｎｔ）置換）テンプレートである。ベクターはまた、例えば、Ｃａｓ９分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０からの）を含み得る。
【０４９４】
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、調節されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。別の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【０４９５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０４９６】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。他の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こす。他の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
【０４９７】
一実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化され；細胞型特異的受容体で改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、もしくは成長因子などの標的化リガンドを組み込むための１つまたは複数のウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または一端がウイルス糖タンパク質を認識すると共に、他端が標的細胞表面の１部分（例えば、リガンド−受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチンおよび化学共役）を認識する二重特異性を有する分子架橋を有するように改変され得る。
【０４９８】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレトロウイルスによって送達される。いくつかの実施形態では、レトロウイルス（例えば、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするものなどの逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されるか、または欠失される。
【０４９９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レトロウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０５００】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達される。一実施形態では、ドナーテンプレート核酸は、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０５０１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達される。一実施形態では、ドナーテンプレート核酸は、組換えアデノウイルスによって送達される。一部の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおける免疫を低下させるように改変される。
【０５０２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えＡＡＶによって送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、本明細書に記載されるような標的細胞などの宿主細胞のゲノムに、そのゲノムを組み込まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。
【０５０３】
一実施形態では、本明細書に記載される方法で用いることができるＡＡＶキャプシドは、血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１、またはＡＡＶ７ｍ８由来のキャプシド配列である。
【０５０４】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、またはＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１由来のキャプシド配列と５０％以上、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列相同性を有する、再改変ＡＡＶキャプシドで送達される。
【０５０５】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、キメラＡＡＶキャプシドによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、キメラＡＡＶキャプシドによって送達される。例示的なキメラＡＡＶキャプシドとしては、限定はしないが、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、またはＡＡＶ８Ｇ９が挙げられる。
【０５０６】
一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。
【０５０７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドなどのハイブリッドウイルスによって送達される。一実施形態では、ハイブリッドウイルスは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、Ｂ１９ウイルス、ブタＡＡＶ、ガチョウＡＡＶ、ネコＡＡＶ、イヌＡＡＶ、またはＭＶＭと、ＡＡＶ（例えば、任意のＡＡＶ血清型の）とのハイブリッドである。
【０５０８】
パッケージング細胞を使用して、標的細胞に感染することができるウイルス粒子を形成する。典型的なパッケージング細胞は、アデノウイルスをパッケージングできる２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングすることができるψ２またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと（妥当な場合）引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばＣａｓ９などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、「Ｔｒｉｐｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」に記載されているように、パッケージング細胞株および／またはアデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ遺伝子を含有するプラスミド、ならびにＡＡＶ由来のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子をコードするプラスミドによってトランスで供給することができる。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。特定の実施形態では、ウイルスＤＮＡは、アデノウイルス由来のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ遺伝子を含有するプロデューサー細胞株にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスもしくはＨＳＶ）またはヘルパープラスミドは、ＡＡＶベクター複製と、ＩＴＲを有するヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
【０５０９】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型を認識することができる。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【０５１０】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ）などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）核エンベロープの分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
【０５１１】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ  ２０１２を参照）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０５１２】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、細胞がＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０５１３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、ベクターと非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）とリポソームを結合させ、これによって、例えば、呼吸上皮細胞中に、ウイルスまたはリポソーム法単独のいずれよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【０５１４】
特定の実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターであり、これらの特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。例示的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子内のペイロードの捕捉）。代表的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質コーティングで被覆されたプロタミン核および酸複合体に加えて、カチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
【０５１５】
遺伝子導入のための例示的な脂質が以下の表１に示されている。
【０５１６】
【表９】
2019508051.tif 000014
【０５１７】
遺伝子導入のための例示的なポリマーが以下の表５に示されている。
【０５１８】
【表１０】
2019508051.tif 000015
【０５１９】
一実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮａｃ））、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞アップデートが増大される。一実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。一実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために）。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
【０５２０】
一実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。一実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定組織を標的化する細菌；修飾表面タンパク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。一実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれた標的化リガンドを有する）。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスのエクスビボ構築によって）。ビヒクルはまた改変されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象（すなわち、患者）由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る）である。
【０５２１】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などの、Ｃａｓシステムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数と同時に、送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素の１つまたは複数とは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子は、例えば、組み込み欠陥レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達することができ、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができるように、電気穿孔によって送達することができる。一実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質などの治療タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、本明細書ＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。
【０５２２】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするＲＮＡの送達
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９分子、および／またはｇＲＮＡ分子を、当該技術分野で公知の方法または本明細書に記載されるように、細胞、例えば、本明細書に記載される標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡを、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ  ２０１２を参照）、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。Ｃａｓ９コードＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡコードＲＮＡを分子にコンジュゲートして、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進することができる。
【０５２３】
一実施形態では、電気穿孔による送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット内で、ドナーテンプレート核酸分子を用いてまたは用いずに、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡと細胞を混合すること、ならびに規定された持続時間および振幅の１つまたは複数の電気インパルスを適用することを含む。一実施形態では、電気穿孔による送達は、システムを用いて行われ、規定された持続時間および振幅の１つまたは複数の電気インパルスが適用されるカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに混合物を供給する装置（例えば、ポンプ）に接続された容器内で、ドナーテンプレート核酸分子を用いてまたは用いずに、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡと細胞が混合され、その後、細胞が第２容器に送達される。Ｃａｓ９コードＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡコードＲＮＡを分子にコンジュゲートして、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進することができる。
【０５２４】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの送達
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９分子は、当該技術分野で公知の方法によって、または本明細書に記載されるように細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ、２０１２を参照）、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡまたはｇＲＮＡを伴い得る。Ｃａｓ９タンパク質を分子にコンジュゲートして、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進することができる。
【０５２５】
一実施形態では、電気穿孔による送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット内で、ドナー核酸を用いてまたは用いずに、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子と細胞を混合すること、ならびに規定された持続時間および振幅の１つまたは複数の電気インパルスを適用することを含む。一実施形態では、電気穿孔による送達は、システムを用いて行われ、規定された持続時間および振幅の１つまたは複数の電気インパルスが適用されるカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに混合物を送達する装置（例えば、ポンプ）に接続された容器内で、ドナー核酸を用いてまたは用いずに、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子と細胞が混合され、その後、細胞が第２容器に送達される。Ｃａｓ９コードＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡコードＲＮＡを分子にコンジュゲートして、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進することができる。
【０５２６】
ゲノム編集システムの構成要素の管理経路
全身投与様式には、経口経路および非経口経路が含まれる。非経口経路には、例えば、静脈内経路、骨髄内経路、動脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、皮下経路、鼻腔内経路、および腹腔内経路が含まれる。全身投与される構成要素は、標的、例えば、ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞、または赤血球前駆体または前駆細胞に合わせて変更するまたは製剤化することができる。
【０５２７】
局所投与様式には、例えば、骨梁骨への骨髄内注射または骨髄腔への大腿骨内注射、および門脈への注入が含まれる。一実施形態では、（全身アプローチと比較して）著しく少ない量の構成要素が、（例えば、静脈内に）全身投与される場合と比較して（例えば、骨髄に直接的に）局所投与される場合に効果を発揮し得る。局所投与方法は、治療有効量の構成要素を全身投与する場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減または排除することができる。
【０５２８】
投与は、定期的なボーラス（例えば、静脈内）として、または内部レザバーもしくは外部レザバー（例えば、静脈内バッグもしくは埋め込みポンプ）からの連続的注入として提供してもよい。構成要素は、例えば、徐放性薬物送達装置からの連続的放出によって局所投与してもよい。
【０５２９】
さらに、構成要素は、長期間にわたる放出を可能にするように、製剤化してもよい。放出系は、生分解性材料、または組み込まれた構成要素を拡散によって放出する材料からなるマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内に均一または不均一に分布することができる。様々な放出系が有用であり得、特定の用途に必要な放出速度に応じて適切な系が選択される。非分解性および分解性放出系の双方を用いることができる。好適な放出系として、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または無機および有機賦形剤および希釈剤、例えば、限定はしないが、炭酸カルシウムおよび糖（例えば、トレハロース）などが挙げられる。放出系は、天然または合成のいずれであってもよい。しかしながら、一般的に、信頼性および再現性が高く、しかもより明確な放出プロフィールを生み出すことから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、様々な分子量を有する構成要素が、上記材料を介した拡散、またはその分解により放出されるように選択することができる。
【０５３０】
代表的な合成生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸グリコール酸共重合体、およびポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；ならびにこれらの化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。代表的な合成非生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、その他のアリキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸などのビニルポリマー−ポリアクレートおよびポリメタクリレート、ならびにポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（酢酸ビニル）などのその他；ポリ（ウレタン）；アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および様々な酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；ポリシロキサン；ならびにこれらの任意の化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。
【０５３１】
また、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ミクロスフェアも使用することができる。典型的に、ミクロスフェアは、乳酸およびグリコール酸のポリマーからなり、中空のスフェアを形成するような構造をしている。スフェアは、直径が約１５〜３０ミクロンであってよく、本明細書に記載される構成要素をロードすることができる。
【０５３２】
ゲノム編集システムの構成要素の２モードまたは差次的送達
Ｃａｓシステム構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素の個別の送達、より具体的には、差次的モードによる構成要素の送達は、例えば、組織特異性および安全性を改善することによって、性能を高めることができる。
【０５３３】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なるモード、または本明細書で差次的モードと呼ぶことがあるモードによって送達される。異なるまたは差次的モードは、本明細書の用法では、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、テンプレート核酸、またはペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学または薬物動態特性を付与する送達モードを指す。例えば、これらの送達モードにより、例えば、選択したコンパートメント、組織、または臓器において、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。
【０５３４】
例えば、細胞、または細胞の子孫において持続する核酸ベクターによる送達、例えば自立複製または細胞核酸への挿入による送達など、いくつかの送達モードは、構成要素のより持続的発現および存在をもたらす。例として、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどのウイルスによる送達がある。
【０５３５】
例として、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、送達される構成要素の、身体、または特定のコンパートメント、組織もしくは臓器において達成される半減期または持続性に関して異なるモードによって送達することができる。Ｃａｓ９分子構成要素は、身体、または特定のコンパートメントまたは組織もしくは臓器に対して、より低い持続性または曝露をもたらすモードによって送達することができる。
【０５３６】
より一般的には、一実施形態では、第１の送達モードを用いて、第１の構成要素を送達し、第２の送達モードを用いて、第２の構成要素を送達する。第１の送達モードは、第１の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。第２の送達モードは、第２の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。
【０５３７】
特定の実施形態では、例えば、分布、持続性、または曝露などの第１の薬力学的または薬物動態特性は、第２の薬力学的または薬物動態特性より限定されている。
【０５３８】
特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最小にするなど、最適化するように選択される。
【０５３９】
特定の実施形態では、第２の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最大にするなど、最適化するように、選択される。
【０５４０】
特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、核酸、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウイルスなどの比較的持続的な要素の使用を含む。このようなベクターは比較的持続的であるため、それらから転写された産物も比較的持続的となる。
【０５４１】
特定の実施形態では、第２の送達モードは、比較的一過性の要素、例えば、ＲＮＡ分子またはタンパク質を含む。
【０５４２】
特定の実施形態では、第１の構成要素は、ｇＲＮＡを含み、送達モードは、比較的持続的であり、例えば、ｇＲＮＡ分子は、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウイルスから転写される。これらの遺伝子は、タンパク質産物をコードせず、ｇＲＮＡは、単独で作用することができないため、これらの遺伝子の転写には生理学的結果がほとんどない。第２の構成要素であるＣａｓ９分子は、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、一過性様式で送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、短い期間だけ存在し、活性である。
【０５４３】
さらに、構成要素は、互いに補完して、安全性および組織特異性を高める異なる分子形態で、または異なる送達ベクターを用いて送達することができる。
【０５４４】
差次的送達モードの使用によって、性能、安全性および／または効率を高めることができ、例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減することができる。細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドは、ＭＨＣ分子による細胞の表面に展示されるため、低持続性モードによる、例えばＣａｓ９分子などの免疫原性構成要素の送達は免疫原性を低減し得る。二部送達システムは、これらの問題を軽減し得る。
【０５４５】
差次的送達モードを用いて、異なっているが、オーバーラップする標的領域に構成要素を送達することができる。活性複合体の形成は、標的領域のオーバーラップの外側で最小にされる。したがって、一実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ分子などの第１の構成要素は、第１の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第１の送達モードによって送達される。例えば、Ｃａｓ９分子などの第２の構成要素は、第２の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第２の送達モードによって送達される。一実施形態では、第１のモードは、リポソーム、例えばポリマーナノ粒子などのナノ粒子、および例えばウイルスベクターなどの核酸から選択される第１の要素を含む。第２のモードは、上記の群から選択される第２の要素を含む。一実施形態では、第１の送達モードは、例えば、細胞特異的受容体もしくは抗体などの第１の標的化要素を含み、第２の送達モードは、その要素を含まない。特定の実施形態では、第２の送達モードは、例えば、第２の細胞特異的受容体もしくは第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。
【０５４６】
Ｃａｓ９分子をウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子で送達する場合、単一の組織を標的化することだけが望ましいと考えられるとき、複数の組織への送達および複数の組織での治療活性の可能性がある。二部送達系は、この課題を解決し、組織特異性を高めることができる。異なっているが、オーバーラップする組織屈性を有する別々の送達ビヒクル中にｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子をパッケージする場合、双方のベクターによって標的化された組織には、完全に機能性の複合体だけが形成される。
【０５４７】
Ｃａｓシステムの構成要素のエクスビボ送達
特定の実施形態では、表３に記載されるＣａｓシステム構成要素を細胞に導入した後、これらの細胞を対象に導入する。構成要素を導入する方法は、表４に記載される送達方法のいずれかを含み得る。
【０５４８】
修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡなどの核酸中に存在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮＡにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
【０５４９】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
【０５５０】
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
【０５５１】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。一実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【０５５２】
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
【０５５３】
一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、インビボおよびエクスビボ双方の細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、インビボおよびエクスビボ双方の細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
【０５５４】
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
【０５５５】
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【０５５６】
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
【０５５７】
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５５８】
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
【０５５９】
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０５６０】
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
【０５６１】
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
【０５６２】
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
【０５６３】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。一実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
【０５６４】
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。一実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
【０５６５】
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
【０５６６】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
【０５６７】
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
【０５６８】
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
【０５６９】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
【０５７０】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
【０５７１】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
【０５７２】
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
【０５７３】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、またはトレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
【０５７４】
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
【０５７５】
ウラシル
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウ���ジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【０５７６】
シトシン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０５７７】
アデニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０５７８】
グアニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０５７９】
代表的修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。配列番号２５１〜９０１の標的化ドメインを含む任意のｇＲＮＡを含む、本明細書に記載されるｇＲＮＡのいずれも、このセクションに従って修飾することができることを理解されたい。
【０５８０】
上記で考察されるように、一過性発現核酸または送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を被りやすい。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する１つまたは複数の修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを含んでもよい。理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に記載される特定の修飾ｇＲＮＡは、細胞集団、特に本発明の細胞に導入された場合、自然免疫応答の低下を示し得ることも考えられる。上記のように、「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出の誘導および細胞死を伴う、一般にウイルス起源または細菌起源の一本鎖核酸を含む外来核酸に対する細胞応答を含む。
【０５８１】
このセクションで議論される例示的な修飾のいくつかは、ｇＲＮＡ配列内の任意の位置に含まれ得るが、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近傍（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその近傍（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５または１〜２ヌクレオチド以内）の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近傍の修飾およびその３’末端またはその近傍の修飾の両方を含む。
【０５８２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））の含有により修飾される。キャップまたはキャップ類似体は、ｇＲＮＡの化学合成またはインビトロ転写のいずれかの間に含めることができる。
【０５８３】
一実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって修飾される。
【０５８４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つまたは複数（例えば、２５〜２００）のアデニン（Ａ）残基の付加によって修飾される。ポリ（Ａ）領域（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔｒａｃｔ）は、ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ウイルスゲノム）に含めることもできるし、または化学合成の間、もしくはポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を用いるインビトロ転写の後にｇＲＮＡに付加することもできる。
【０５８５】
一実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡは、５’キャップ構造またはキャップ類似体および３’ポリ（Ａ）領域の両方を含む。一実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって修飾され、３’ポリ（Ａ）領域を含む。
【０５８６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端Ｕリボースで修飾してもよい。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される（下に示される）修飾ヌクレオシドをもたらす：
【化５】
2019508051.tif 000016
式中、「Ｕ」は、非修飾ウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。
【０５８７】
別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
【化６】
2019508051.tif 000017
式中、「Ｕ」は、非修飾ウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。
【０５８８】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの８位に修飾がある修飾アデノシンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
【０５８９】
いくつかの実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、ＳＨ、ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（ＣＮ）から選択される基によって置換される。いくつかの実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾；または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルをはじめとする２’−フルオロ修飾；グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
【０５９０】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては「ロックド」核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、その中では、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の４’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２） ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。
【０５９１】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）が挙げられる。
【０５９２】
一般に、ｇＲＮＡ分子としては、酸素を有する５員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾ｇＲＮＡｓとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は２’位置に局在するが、４’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。
【０５９３】
いくつかの実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡ分子に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
【０５９４】
ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡｓ）は、天然細胞性１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。それらは、例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲなどで、適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。理論に縛られることを望むものではないが、この下方制御は、核酸分子の安定性の低下または翻訳の阻害のいずれかによって起こると考えられる。本明細書に開示されるＲＮＡ種、例えば、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ結合部位を、例えば、その３’ＵＴＲに含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択される細胞型の発現の下方制御を促進するように選択することができる。
【実施例】
【０５９５】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
【０５９６】
実施例１：１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節領域への挿入に使用するためのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡのスクリーニング
ＨＢＧ１（例えば、変化ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．１１４〜−１０２をもたらす配列番号９０２（ＨＢＧ１））のヌクレオチド２８２４〜２８３６）およびＨＢＧ２（例えば、変化ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．１１４〜−１０２をもたらす配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）のｃ．−１１４〜−１０２における１３ヌクレオチドにわたり、かつこれを含む２６ｎｔの断片を標的とするＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡを、本明細書に記載されるようにデザインした。ｇＲＮＡをコンピューターでデザインして階層化した後、ｇＲＮＡのサブセットを選択し、ヒトＫ５６２細胞における活性および特異性についてスクリーニングした。スクリーニングのために選択されたｇＲＮＡは、表８に示されるように標的化ドメイン配列を含む。Ｕ６プロモーターをコードするＤＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の各ｇＲＮＡを、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡを用いてヒトＫ５６２細胞に同時電気穿孔した（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）。実験条件は、一般に、当該技術分野で公知の条件（例えば、参照により本明細書に援用されるＧｏｒｉ  ２０１６）に従った。電気穿孔の３日後に、ｇＤＮＡをＫ５６２細胞から抽出し、次いでＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子座をｇＤＮＡからＰＣＲ増幅した。遺伝子編集を、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析によってＰＣＲ産物において評価した。スクリーニングされた１０のｓｇＲＮＡのうち、８つが、プロモーター配列におけるＨＢＧ１およびＨＢＧ２標的化領域の両方で切断した（図１０Ａ）。
【０５９７】
８つの活性なｓｇＲＮＡで標的化されたＫ５６２細胞のＨＢＧ１およびＨＢＧ２  ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列分析によって分析し、検出された挿入および欠失についてスコアを付けた。この欠失を、ＨＰＦＨ部位の正確な１３ｎｔの欠失、ＨＰＦＨを含む近位の小さな欠失（１８〜２６ｎｔ）、ＨＰＦＨ標的部位の１２ｎｔの欠失（すなわち、部分欠失）、ＨＰＦＨ標的部位の一部にわたる＞２６ｎｔの欠失、および他の欠失、例えば、近位であるがＨＰＦＨ標的部位の外側の欠失に細分化した。８つのｓｇＲＮＡのうち７つは、ＨＢＧ１の１３ｎｔ（ＨＰＦＨ突然変異誘発）（図１０Ｂ）の欠失を標的とした。８つのｓｇＲＮＡのうちの少なくとも５つはまた、ＨＢＧ２プロモーター領域における１３ｎｔ（ＨＰＦＨ突然変異誘発）（図１０Ｃ）の標的化された欠失を支持した。ＨＢＧ  Ｓｐ３４  ｓｇＲＮＡで処理した細胞におけるＨＢＧ２のＤＮＡ配列の結果は入手できなかったことに留意されたい。これらのデータは、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡが、１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２のＨＰＦＨ突然変異の正確な誘導を支持することを示す。図１０Ｄ〜１０Ｆは、ＨＢＧ１における標的配列で観察された欠失のタイプの例を示す。特定の各実施例で使用されたｇＲＮＡは黒色で示され、各パネルの例において標的化されなかった他のｇＲＮＡは白色で示されている。
【０５９８】
【表１１】
2019508051.tif 000018
【０５９９】
実施例２：ＨＰＦＨ突然変異を標的とするＣａｓ９  ＲＮＰ含有ｇＲＮＡは、ヒト造血幹／前駆細胞における遺伝子編集を支持する
ヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞を、ヒトサイトカイン（幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ））および小分子（プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１））で２日間予備刺激した。実験条件は、一般に、参照により本明細書に援用されるＧｏｒｉ２０１６の２４０〜２４１頁に記載されている方法に従った。ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節領域を標的とするＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＲＮＰ含有（例えば、５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ（２０Ａ）テール）ｓｇＲＮＡ（表８）で電気穿孔した（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）。電気穿孔の３日後に、ｇＤＮＡをＲＮＰ処理ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞から抽出し、遺伝子編集を、Ｔ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０６００】
ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞で試験した異なるｇＲＮＡを含有するＲＮＰのうち、Ｓｐ３７  ｇＲＮＡ（配列番号３３３を含む）のみが、３つの臍帯血ドナー由来の電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞から抽出されたｇＤＮＡから増幅されたＨＢＧ１およびＨＢＧ２特異的ＰＣＲ産物インデルのＴ７Ｅ１分析によって決定されるＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーターの標的部位での検出可能な編集をもたらした（図１１Ａ）。Ｓｐ３７と複合体化したＣａｓ９タンパク質で電気穿孔された細胞で検出された平均編集レベルは、ＨＢＧ１では５±２％のインデルであり、ＨＢＧ２では３±１％のインデルが検出された（３つの別個の実験、およびＣＢドナー）。
【０６０１】
次に、標的部位がＨＢＧプロモーター（Ｓｐ３５（配列番号３３９を含む）、Ｓｐ３６（配列番号３３８を含む）、Ｓｐ３７（配列番号３３３を含む））内にある３つのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡを、野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と複合体化してリボ核タンパク質複合体を形成する。これらのＨＢＧ標的化ＲＮＰＳを、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（ｎ＝３ドナー）および成人動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞ドナー（ｎ＝３ドナー）に電気穿孔した。ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、上記の方法およびＧｏｒｉ  ２０１６の２４０〜２４１頁の方法に従って調製した。成人ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ＳＲ１を添加しない点を除いて、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞と実質的に同じ方法で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ送達の約３日後、標的部位における挿入／欠失のレベルを、サンプルから抽出したゲノムＤＮＡから増幅されたＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析によって分析した。これらの各ＲＮＰは、３つのドナーおよび３つの別個の実験（図１１Ｂ）の全てにおいてＣＢ細胞および成人ＣＤ３４＋細胞の両方で低レベルの遺伝子編集のみを支持した。
【０６０２】
標的部位での遺伝子編集を増加させて、標的部位での１３ｂｐの欠失の発生を増加させるために、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の標的化欠失部位の５’側および３’側の８７ｂｐおよび８９ｂｐの相同性をコードする一本鎖デオキシヌクレオチドドナー修復テンプレート（ｓｓＯＤＮｓ）を作製した。５’および３’相同性アームを含む構築物ｓｓＯＤＮ１（配列番号９０６、表９）を、１３ｂｐの欠失を「コードする」ようにデザインし、遺伝子操作された配列相同性アームが、この欠失配列に隣接して完全な欠失を生じさせている。５’相同性アーム（配列番号９０４、表９）はＨＢＧ１およびＨＢＧ２の、ｃ．−１１４〜−１０２の５’側の配列に相同なヌクレオチド（すなわち、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６の５’側の配列に相同なヌクレオチド、および配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０の５’側の配列に相同なヌクレオチド）を含む。３’相同性アーム（配列番号９０５、表９）は、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２のｃ．−１１４〜−１０２の３’領域に相同なヌクレオチド（すなわち、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６の３’側の配列に相同なヌクレオチド、および配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０の３’側の配列に相同なヌクレオチド）を含む。ｓｓＯＤＮ１構築物は、ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１を形成するために５’および３’末端（配列番号９０９、表９）にホスホチオエート（ＰｈＴｘ）を含むように末端を修飾した。
【０６０３】
【表１２】
2019508051.tif 000019
【０６０４】
ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、上記の方法およびＧｏｒｉ  ２０１６の２４０〜２４１頁の方法に従って調製した。ｓｓＯＤＮ（すなわち、ｓｓＯＤＮ１およびＰｈＴｘｓｓ  ＯＤＮ１）を、Ｓｐ３７  ｇＲＮＡ（ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ）またはＨＢＧ  Ｓｐ３５（ＨＢＧ  Ｓｐ３５  ＲＮＰ）を含むＨＢＧを標的とするＲＮＰと共にＣＢ  ＣＤ３４＋細胞に同時送達した。
【０６０５】
１３ｂｐの欠失をコードするｓｓＯＤＮ１およびＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１ドナーテンプレートと、Ｓｐ３５  ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（すなわち、ＨＢＧ  Ｓｐ３５  ＲＮＰ）またはＳｐ３７  ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（すなわち、ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰ）との同時送達は、標的部位の遺伝子編集においてそれぞれ６倍および５倍の増加をもたらすことが、ＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析によって決定された（図１１Ｃ）。ＨＢＧ２  ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析（サンガー配列決定）は、１５％の欠失および５％の挿入を有するＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰおよびＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１で処理された細胞において２０％の遺伝子編集を示した（図１１Ｃ、左下のパネル）。標的部位における欠失の特定のタイプおよび大きさのさらなる分析は、検出された全欠失の７５％の３／４がＨＰＦＨ１３ｂｐの欠失（隣接プロモーターにおけるＣＡＡＴボックスの欠失を含む）を含むことを明らかにし、その非存在は、ＨｂＦ発現の上昇に関連する（図１１Ｃ、右下のパネル）。残りの１／４の欠失は、完全な１３ｂｐの欠失に及ばない部分欠失であった。これらのデータは、ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＧでの欠失に支持される正確な遺伝子編集（欠失）を有するように遺伝子操作された同種のｓｓＯＤＮの同時送達を示す。
【０６０６】
実施例３：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節領域に１３ｂｐ  ｄｅｌ  ｃ．−１１４〜−１０２をもたらすために使用されるリボ核タンパク質複合体としてＫ５６２細胞に送達されたＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡのスクリーニング
実施例１（図１０）に記載されているＣａｓ９およびｇＲＮＡ  ＤＮＡのＫ５６２細胞への電気穿孔によってスクリーニングされたガイドＲＮＡを、インビトロで転写し、次いでＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｗｔ  Ｃａｓ９タンパク質と複合体化して、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成した。これらのＲＮＰの活性を、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのＫ５６２細胞へのＤＮＡ送達（すなわち、実施例１）およびヒトＣＤ３４＋細胞へのＲＮＰ送達（すなわち、実施例２）によって観察された活性と比較するために、ここでは、ＲＮＰを電気穿孔によってＫ５６２細胞に送達した（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と複合体化したｇＲＮＡは、修飾ｇＲＮＡ（例えば、５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ（２０Ａ）テール；表８）であり、かつＨＢＧ１およびＨＢＧ２調節領域を標的とした。
【０６０７】
電気穿孔の３日後に、ｇＤＮＡをＫ５６２細胞から抽出し、次いでＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター領域をＰＣＲで増幅し、続いてＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析を行った（図１２Ａ）。９つのＲＮＰのうち８つがＮＨＥＪの割合が高い。Ｓｐ３７  ＲＮＰ、ヒトＣＤ３４＋細胞で活性であることが示されている唯一のｇＲＮＡ（ＣＤ３４＋細胞で＜１０％の編集）は、Ｋ５６２細胞で高度に活性であり、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の両方で＞６０％のインデルが検出された（図１２Ａ）。ＨＰＦＨ欠失突然変異部位Ｓｐ３５を標的とする他のｇＲＮＡは、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２で４３％の編集を支持した（図１２Ａ）。
【０６０８】
標的化ＨＰＦＨ部位に最も近いｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９で処理された細胞からのｇＤＮＡ由来のＰＣＲ産物のサブセットに対してＤＮＡ配列決定分析を行った。検出された挿入および欠失についてＤＮＡ配列にスコアを付けた。この欠失を、ＨＰＦＨ部位の正確な１３ｎｔの欠失、ＨＰＦＨを含む近位の小さな欠失（１８〜２６ｎｔ）、ＨＰＦＨ標的部位の１２ｎｔの欠失（すなわち、部分欠失）、ＨＰＦＨ標的部位の一部にわたる＞２６ｎｔの欠失、および他の欠失、例えば、近位であるがＨＰＦＨ標的部位の外側の欠失に細分化した。１３ｎｔの欠失が、ＨＢＧ１／ＨＢＧ２のｇＲＮＡ  Ｓｐ３５および３７（ＨＰＦＨ突然変異誘導）と複合体化したＲＮＰで処理された細胞で検出された（図１２Ｂ）。これらのデータは、リボ核タンパク質複合体として造血細胞に送達されたＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ（Ｓｐ３５およびＳｐ３７）が、ｃ．−１１４〜−１０２  ＨＰＦＨ突然変異を引き起こしたことを示す。
【０６０９】
実施例４：ＨＰＦＨ突然変異を標的とするＣａｓ９  ＲＮＰは、ヒト成人動員末梢血造血幹／前駆細胞における遺伝子編集を支持し、赤芽球子孫におけるＨＢＧ発現の増加を伴う
ＨＢＧのプロモーターにおけるＳｐ３７  ｇＲＮＡまたはＳｐ３５  ｇＲＮＡ（すなわち、ＨＰＦＨに関連する１３ｂｐの欠失を標的とするｇＲＮＡ）と複合体化したＣａｓ９  ＲＮＰを有するＨＢＧを編集して、編集されたＣＤ３４＋細胞の赤血球子孫におけるＨＢＧ発現の増加を支持するか否かを決定するために、動員末梢血（ｍＰＢ）由来のヒト成人ＣＤ３４＋細胞をＲＮＰで電気穿孔した。簡潔に述べると、ｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ヒトサイトカインおよび幹細胞無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）中で、ＰＧＥ２で２日間予備刺激し、次にＳｐ３５およびＳｐ３７にそれぞれプレ複合体化されたＣａｓ９タンパク質を電気穿孔した。Ｇｏｒｉ  ２０１６を参照。ＨＢＧ  ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１分析は、Ｓｐ３７に複合体化したＲＮＰで処理されたｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞では約３％のインデルを示し、Ｓｐ３５に複合体化したＲＮＰで処理された細胞では編集が検出されなかった（図１３Ａ）。
【０６１０】
標的部位での遺伝子編集を増加させて、標的部位での１３ｂｐの欠失の発生を増加させるために、ＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１を、Ｓｐ３７  ｇＲＮＡを含有するプレ複合体化ＲＮＰ標的ＨＢＧと共に同時送達した。１３ｂｐの欠失をコードするＰｈＴｘ  ｓｓＯＤＮ１ドナーの同時送達は、標的部位の遺伝子編集においてほぼ２倍の増加をもたらした（図１３Ａ）。
【０６１１】
ＨＢＧの編集が、編集された成人ＣＤ３４＋細胞の赤血球子孫における胎児ヘモグロビンの産生を増加させるか否かを決定するために、ヒトサイトカイン（エリスロポエチン、ＳＣＦ、ＩＬ３）、ヒト血漿（Ｏｃｔｏｐｌａｓ）、および他の補助剤（ヒドロコルチゾン、ヘパリン、トランスフェリン）の存在下、最大１８日間培養することによってこの細胞を赤芽球に分化させた。分化の時間経過にわたって、ｍＲＮＡを収集して、ＲＮＰ処理したｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞の赤血球系子孫およびドナー適合陰性（未処理）対照でのＨＢＧ遺伝子の発現を評価した。７日目の分化まで、ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰおよび１３ｂｐ  ＨＰＦＨ欠失をコードするｓｓＯＤＮ１（Ｔ７Ｅ１分析によってバルク細胞集団からのｇＤＮＡで約５％のインデルが検出された）で処理されたヒトＣＤ３４＋細胞の赤芽球子孫は、ＨＢＧ  ｍＲＮＡの産生で２倍の増加を示した（図１３Ｂ）。さらに、ＲＮＰ処理ＣＤ３４＋細胞から分化した赤芽球は、赤血球表現型（％グリコホリンＡ＋細胞）の獲得についてのフロー分析（図１４Ａ）によって決定されるように、ドナー適合未処理対照細胞で観察された分化の動力学を維持した。重要なことに、ＨＢＧ  Ｓｐ３７  ＲＮＰおよびｓｓＯＤＮ１で電気穿孔されたＣＤ３４＋細胞は、造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイで決定されるように、それらのエクスビボ造血活性を維持した（すなわち、未処理ドナー適合ＣＤ３４＋細胞陰性対照と比較して赤血球および骨髄コロニーの量または多様性に差異がなかった）（図１４Ｂ）。これらのデータは、ＨＢＧ１／ＨＢＧ２隣接プロモーター領域の標的化破壊が、分化能を変化させることなく、ＲＮＰ処理成人造血幹／前駆細胞の赤血球子孫におけるＨＢＧ発現の増加を支持することを示している。
【０６１２】
配列
本開示によるゲノム編集システムの構成要素（限定はしないが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、ドナーテンプレート核酸、ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、および上記のいずれかの一部または断片）は、配列表に示されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列によって例示されている。配列表に示される配列は、限定することを意図したものではなく、むしろゲノム編集システムおよびその構成部分の特定の原理の例示であり、これらを本開示と組み合わせて、本開示の範囲内であるさらなる実施および変更を当業者に知らせる。提示された配列のリストは以下の表１０に示されている。
【０６１３】
【表１３】
2019508051.tif 000020
【０６１４】
参照による援用
本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含め、本出願が優先される。
【０６１５】
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０６１６】
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Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５６（５）：９３５−９４９（２０１４）
Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４（６）：１３８０−１３８９（２０１３）
Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６０（３）：３８５−３９７（２０１５）
Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９０）：６２−６７（２０１４）
Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ７（１０）：３０９９−３１０７（１９８８）
Ｔｈｅｉｎ  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １８（Ｒ２）：Ｒ２１６−２２３（２００９）
Ｗａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ６７（２）：５５１−５５４（１９８６）
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５３（４）：９１０−９１８（２０１３）
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２４（８）：７８３−７９８（２０１０）
Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６５（４）：  ９４９−９６２（２０１６）
Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３（２）：１３９−４２（２０１５）
【図１Ａ】
2019508051.tif 000021
【図１Ｂ】
2019508051.tif 000022
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
2019508051.tif 000029
【図２Ａ】
2019508051.tif 000030
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2019508051.tif 000033
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019508051.tif 000040
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2019508051.tif 000046
【図８Ａ】
2019508051.tif 000047
【図８Ｂ】
2019508051.tif 000048
【図９】
2019508051.tif 000049
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
2019508051000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月18日(2018.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム編集によってヒト細胞の胎児ヘモグロビンレベルを増加させる方法であって、前記ヒト細胞にリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入するステップを含み、
前記リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が：
（ａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は第１ヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含み、前記第１ヌクレオチド配列が、第２ヌクレオチド配列を含む標的化ドメインと完全にまたは部分的に相補的であり、前記第２ヌクレオチド配列は：
（ｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜４７５８、配列番号９０３のヌクレオチド１〜４７７３、もしくはこれらの両方の範囲内にある；または
（ｉｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜４７５８、配列番号９０３のヌクレオチド１〜４７７３、もしくはこれらの両方の範囲内の配列と相補的である、方法。
【請求項２】
前記ヒト細胞に導入するステップが、前記ヒト細胞に一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト細胞に導入するステップが、電気穿孔によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞に導入するステップが、インビトロまたはエクスビボで行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって作製される細胞。
【請求項６】
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を用いて修飾された細胞であって、
（ａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は第１ヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含み、前記第１ヌクレオチド配列が、第２ヌクレオチド配列を含む標的化ドメインと完全にまたは部分的に相補的であり、前記第２ヌクレオチド配列は：
（ｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜４７５８、配列番号９０３のヌクレオチド１〜４７７３、もしくはこれらの両方の範囲内にある；または
（ｉｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜４７５８、配列番号９０３のヌクレオチド１〜４７７３、もしくはこれらの両方の範囲内の配列と相補的である、細胞。
【請求項７】
前記細胞が、赤芽球、赤血球、または赤芽球もしくは赤血球の前駆体に分化することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項７に記載の方法または請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含むゲノム編集システムであって：
（ａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は第１ヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含み、前記第１ヌクレオチド配列が、第２ヌクレオチド配列を含む標的化ドメインと完全にまたは部分的に相補的であり、前記第２ヌクレオチド配列は：
（ｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜４７５８、配列番号９０３のヌクレオチド１〜４７７３、またはこれらの両方の範囲内にある；または
（ｉｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜４７５８、配列番号９０３のヌクレオチド１〜４７７３、またはこれらの両方の範囲内の配列と相補的である、ゲノム編集システム。
【請求項１０】
前記第２ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜２９９０、配列番号９０３のヌクレオチド１〜２９１４、もしくはこれらの両方の範囲内にある；または
（ｉｉ）配列番号９０２のヌクレオチド１〜２９９０、配列番号９０３のヌクレオチド１〜２９１４、もしくはこれらの両方の範囲内の配列と相補的である、
請求項１〜４もしくは７〜８のいずれか１項に記載の方法：請求項５〜８のいずれか１項に記載の細胞；または請求項９に記載のゲノム編集システム。
【請求項１１】
前記第２ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号９０２のヌクレオチド２４２４〜３２３６、配列番号９０３のヌクレオチド２３４８〜３１６０、もしくはこれらの組み合せの範囲内にある；または
（ｉｉ）配列番号９０２のヌクレオチド２４２４〜３２３６、配列番号９０３のヌクレオチド２３４８〜３１６０、もしくはこれらの組み合せの範囲内の配列と相補的である、
請求項１〜４もしくは７〜８のいずれか１項に記載の方法：請求項５〜８のいずれか１項に記載の細胞；または請求項９に記載のゲノム編集システム。
【請求項１２】
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と同一であるか、または１、２、３、４、もしくは５個以下のヌクレオチドのみ異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４、７〜８、もしくは１１のいずれか１項に記載の方法；請求項５〜８もしくは１１のいずれか１項に記載の細胞；または請求項９もしくは１１に記載のゲノム編集システム。
【請求項１３】
前記ｇＲＮＡが、２’−アセチル化、２’−メチル化、およびホスホロチオエート修飾からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項１〜４、７〜８、もしくは１０〜１２のいずれか１項に記載の方法；請求項５〜８もしくは１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞；または請求項９〜１２のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質が、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質、およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜４、７〜８、もしくは１０〜１３のいずれか１項に記載の方法；請求項５〜８もしくは１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞；または請求項９〜１３のいずれか１項に記載のゲノム編集システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１６】
参考文献
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Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（１０）：１４７３−１４７５（２０１４）
Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏ  Ｒｅｓ  ４３（８）：７０５−７１１（２０１０）
Ｂｏｕｖａ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９１（１）：１２９−１３２（２００６）
Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ  Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８５（１）：７７−７８（２０１０）
Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ９（８）：６１９−６３１（２００８）
Ｃｈａｓｓａｎｉｄｉｓ  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８８（６）：５４９−５５５（２００９）
Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ  １０（５）：７２６−７３７（２０１３）
Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９９（６１２１）：８１９−８２３（２０１３）
Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｄ  Ｓａｕｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａ  １８（５）：１４６９−１４７１（２００２）
Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０７３９９０（２０１６）
Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．５：１０７７７（２０１５）
Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １６：２５７（２０１５）
Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：２７９−２８４（２０１４）
Ｇｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ’ｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／１８２９５９  Ａ１（２０１６）
Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：５７７−５８２（２０１４）
Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）
Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３（６１７６）：１２４７９９７（２０１４）
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２３（７５６１）：４８１−４８５（２０１５ａ）
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３（１２）：１２９３−１２９８（２０１５ｂ）
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２９（７５８７）：４９０−４９５（２０１６）
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２（１２）：６３２２−６３２７（２０１２）
Ｌｅｗｉｓ”Ｍｅｄｉｃａｌ−Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｎｕｒｓｉｎｇ：  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ”（２０１４）
Ｌｉ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １８（１）：８５−９８（２００８）
Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ’ｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ２０１５／１３８５１０（２０１５）
Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６（２０１３）
Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６（１６）：７７８３−７７９７（１９８８）
Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５（７）：４６５−４８１（２０１４）
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５６（５）：９３５−９４９（２０１４）
Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４（６）：１３８０−１３８９（２０１３）
Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６０（３）：３８５−３９７（２０１５）
Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９０）：６２−６７（２０１４）
Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ７（１０）：３０９９−３１０７（１９８８）
Ｔｈｅｉｎ  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １８（Ｒ２）：Ｒ２１６−２２３（２００９）
Ｗａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ６７（２）：５５１−５５４（１９８６）
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５３（４）：９１０−９１８（２０１３）
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２４（８）：７８３−７９８（２０１０）
Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６５（４）：  ９４９−９６２（２０１６）
Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３（２）：１３９−４２（２０１５）
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子。
［２］
前記ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域がそれぞれ、ＨＢＧ１遺伝子またはＨＢＧ２遺伝子に隣接している、［１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［３］
前記ＨＢＧ１調節領域が、配列番号９０２のヌクレオチド１〜２９９０にわたる領域に位置する、［２］に記載のｇＲＮＡ分子。
［４］
前記ＨＢＧ２調節領域が、配列番号９０３のヌクレオチド１〜２９１４にわたる領域に位置する、［２］に記載のｇＲＮＡ分子。
［５］
前記標的化ドメインが、ＨＢＧ標的位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に、二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、［１］〜［４］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［６］
前記標的ドメインが、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全に位置する、［１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［７］
前記標的化ドメインが、ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域における転写調節エレメントを標的とするように構成される、［１］〜［６］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［８］
前記転写調節エレメントがプロモーターである、［７］に記載のｇＲＮＡ分子。
［９］
前記プロモーターが、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の１つまたは複数の転写を制御する、［８］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１０］
前記転写調節エレメントがサイレンサーである、［７］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１１］
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１に示されているヌクレオチド配列と、同一である、または１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドのみが異なるヌクレオチド配列を含む、［１］〜［１０］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１２］
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１に示されているヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む、［１１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１３］
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１４］
前記ｇＲＮＡ分子が単分子ｇＲＮＡ分子である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１５］
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１６］
前記標的化ドメインが１６ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１７］
前記標的化ドメインが１７ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１８］
前記標的化ドメインが１８ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［１９］
前記標的化ドメインが１９ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２０］
前記標的化ドメインが２０ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２１］
前記標的化ドメインが２１ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２２］
前記標的化ドメインが２２ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２３］
前記標的化ドメインが２３ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２４］
前記標的化ドメインが２４ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２５］
前記標的化ドメインが２５ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２６］
前記標的化ドメインが２６ヌクレオチド長以上である、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２７］
第１相補性ドメイン、連結ドメイン、第２相補性ドメイン、隣接ドメイン、５’伸長ドメイン、およびテールドメインのうちの１つまたは複数をさらに含む、［１］〜［１２］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［２８］
５’から３’に：標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインを含む、［２７］に記載のｇＲＮＡ分子。
［２９］
テールドメインをさらに含む、［２８］に記載のｇＲＮＡ分子。
［３０］
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；および１７または１８のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、［１］〜［２９］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３１］
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２５のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；および１７または１８のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、［１］〜［２９］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３２］
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも３０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；および１７のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、［１］〜［２９］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３３］
２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも４０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７のヌクレオチドからなる標的化ドメインを含む、［１］〜［３７］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３４］
（ａ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、を含む核酸組成物。
［３５］
前記ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［３４］に記載の核酸組成物。
［３６］
前記標的化ドメインが、ＨＢＧ標的位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に、二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、［３４］または［３５］に記載の核酸組成物。
［３７］
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１に示されているヌクレオチド配列と、同一である、または１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドのみが異なるヌクレオチド配列を含む、［３４］〜［３６］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［３８］
前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１に示されているヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、［３７］に記載の核酸組成物。
［３９］
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、［３４］〜［３８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４０］
前記ｇＲＮＡ分子が単分子ｇＲＮＡ分子である、［３４］〜［３８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４１］
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、［３４］〜［３８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４２］
前記標的化ドメインが１６ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４３］
前記標的化ドメインが１７ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４４］
前記標的化ドメインが１８ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４５］
前記標的化ドメインが１９ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４６］
前記標的化ドメインが２０ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４７］
前記標的化ドメインが２１ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４８］
前記標的化ドメインが２２ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［４９］
前記標的化ドメインが２３ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５０］
前記標的化ドメインが２４ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５１］
前記標的化ドメインが２５ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５２］
前記標的化ドメインが２６ヌクレオチド長以上である、［３４］〜［４１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５３］
前記ｇＲＮＡ分子が、標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインのうちの１つまたは複数をさらに含む、［３４］〜［５２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５４］
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’に：標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインを含む、［５３］に記載の核酸組成物。
［５５］
前記ｇＲＮＡがテールドメインをさらに含む、［５４］に記載の核酸組成物。
［５６］
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８のヌクレオチドの標的化ドメインを含む、［３４］〜［５５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５７］
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２５のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、［３４］〜［５５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５８］
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも３０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、［３４］〜［５５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［５９］
前記ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも４０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、［３４］〜［５５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［６０］
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、［３４］〜［５９］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［６１］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［６０］に記載の核酸組成物。
［６２］
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、［６１］に記載の核酸組成物。
［６３］
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、［６２］に記載の核酸組成物。
［６４］
前記ｅａＣａｓ９分子が標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、［６２］または［６３］に記載の核酸組成物。
［６５］
前記ｅａＣａｓ９分子が標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、［６２］または［６３］に記載の核酸組成物。
［６６］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、［６５］に記載の核酸組成物。
［６７］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、［６６］に記載の核酸組成物。
［６８］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、［６１］〜［６７］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［６９］
前記ｅａＣａｓ９分子がＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、［６８］に記載の核酸組成物。
［７０］
前記ｅａＣａｓ９分子がＤ１０における突然変異を含む、［６８］または［６９］に記載の核酸組成物。
［７１］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、［６５］〜［７０］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［７２］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、［７０］に記載の核酸組成物。
［７３］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、［７１］または［７２］に記載の核酸組成物。
［７４］
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、［３４］〜［７３］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［７５］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［７４］に記載の核酸組成物。
［７６］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが、ＨＢＧ標的位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に、二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、［７４］または［７５］に記載の核酸組成物。
［７７］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１に示されているヌクレオチド配列と、同一である、または１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドのみが異なるヌクレオチド配列を含む、［７４］〜［７６］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［７８］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが、配列番号２５１〜９０１のいずれか１に示されているヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、［７７］に記載の核酸組成物。
［７９］
前記第２ｇＲＮＡ分子が単分子ｇＲＮＡ分子である、［７４］〜［７８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８０］
前記第２ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、［７４］〜［７８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８１］
前記第２ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、［７４］〜［７８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８２］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１６ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８３］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１７ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８４］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１８ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８５］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが１９ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８６］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２０ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８７］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２１ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８８］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２２ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［８９］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２３ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９０］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２４ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９１］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２５ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９２］
前記第２ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが２６ヌクレオチド長以上である、［７４］〜［８１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９３］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインの１つまたは複数をさらに含む、［７４］〜［９２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９４］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、５’から３’に：標的化ドメイン；第１相補性ドメイン；連結ドメイン；第２相補性ドメイン；および隣接ドメインを含む、［９３］に記載の核酸組成物。
［９５］
前記第２ｇＲＮＡがテールドメインをさらに含む、［９４］に記載の核酸組成物。
［９６］
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８のヌクレオチドの標的化ドメインを含む、［７４］〜［９５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９７］
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも２５のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７または１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、［７４］〜［９５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９８］
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも３０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、［７４］〜［９５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［９９］
前記第２ｇＲＮＡ分子が：２５以下のヌクレオチドを含む連結ドメイン；合わせると、少なくとも４０のヌクレオチドを含む隣接ドメインおよびテールドメイン；ならびに１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含む、［７４］〜［９５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１００］
（ｄ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第３ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、［７４］〜［９９］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１０１］
（ｆ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第４ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、［１００］に記載の核酸組成物。
［１０２］
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、［３４］〜［１０１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１０３］
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、［１０２］に記載の核酸組成物。
［１０４］
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、［１０３］に記載の核酸組成物。
［１０５］
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、［１０４］に記載の核酸組成物。
［１０６］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１０５］に記載の核酸組成物。
［１０７］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）；ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）；およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）からなる群から選択される、［１０６］に記載の核酸組成物。
［１０８］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１０７］に記載の核酸組成物。
［１０９］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［１０８］に記載の核酸組成物。
［１１０］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１０８］または［１０９］に記載の核酸組成物。
［１１１］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［１０８］〜［１１０］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１１２］
前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１０７］に記載の核酸組成物。
［１１３］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［１１２］に記載の核酸組成物。
［１１４］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１１２］または［１１３］に記載の核酸組成物。
［１１５］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［１１２］〜［１１４］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１１６］
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（すなわち、ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、［１０８］〜［１１５］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１１７］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１０７］に記載の核酸組成物。
［１１８］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１１７］に記載の核酸組成物。
［１１９］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、［１０３］〜［１１８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２０］
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、［１０３］〜［１１８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２１］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、［１０３］〜［１１８］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２２］
（ｃ）第２ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、または（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、のいずれも含まない、［３４］〜［１２１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２３］
（ａ）および（ｂ）が１つの核酸分子上に存在する、［３４］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２４］
（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）が１つの核酸分子上に存在する、［１０１］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２５］
前記核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１２３］または［１２４］に記載の核酸組成物。
［１２６］
（ａ）第１核酸分子上に存在し、かつ（ｂ）第２核酸分子上に存在する、［３４］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２７］
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１２６］に記載の核酸組成物。
［１２８］
（ａ）および（ｃ）が、１つの核酸分子上に存在する、［７４］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１２９］
（ａ）および（ｇ）が、１つの核酸分子上に存在する、［１０１］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３０］
前記核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１２８］または［１２９］に記載の核酸組成物。
［１３１］
（ａ）が第１核酸分子上に存在し；かつ（ｃ）が第２核酸分子上に存在する、［７４］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３２］
（ａ）が第１核酸分子上に存在し；かつ（ｇ）が第２核酸分子上に存在する、［１０１］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３３］
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１３０］または［１３１］に記載の核酸組成物。
［１３４］
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、１つの核酸分子上に存在する、［６０］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３５］
（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）が、１つの核酸分子上に存在する、［１０１］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３６］
前記核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１３４］または［１３５］に記載の核酸組成物。
［１３７］
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つが、第１核酸分子上にコードされ；かつ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ目および３つ目が、第２核酸分子上にコードされる、［６０］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３８］
（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）のうちの１つが、第１核酸分子上にコードされ；かつ（ａ）、（ｂ）、および（ｇ）のうちの２つ目および３つ目が第２核酸分子上にコードされている、［１０１］〜［１２２］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１３９］
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１３７］または［１３８］に記載の核酸組成物。
［１４０］
（ａ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ｃ）が、第２核酸分子上に存在する、［１３７］または［１３９］に記載の核酸組成物。
［１４１］
（ａ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ｇ）が、第２核酸分子上に存在する、［１３８］または［１３９］に記載の核酸組成物。
［１４２］
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１４０］または［１４１］に記載の核酸組成物。
［１４３］
（ｂ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ａ）および（ｃ）が、第２核酸分子上に存在する、［１３７］または［１３９］に記載の核酸組成物。
［１４４］
（ｂ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ａ）および（ｇ）が、第２核酸分子上に存在する、［１３８］または［１３９］に記載の核酸組成物。
［１４５］
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１４３］または［１４４］に記載の核酸組成物。
［１４６］
（ｃ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ａ）が、第２核酸分子上に存在する、［１３７］または［１３９］に記載の核酸組成物。
［１４７］
（ｇ）が、第１核酸分子上に存在し；かつ（ｂ）および（ａ）が、第２核酸分子上に存在する、［１３８］または［１３９］に記載の核酸組成物。
［１４８］
前記第１および第２核酸分子が、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、［１４６］または［１４７］に記載の核酸組成物。
［１４９］
前記第１核酸分子が、ＡＡＶベクター以外であり、かつ前記第２核酸分子が、ＡＡＶベクターである、［１２６］、［１３１］、［１３２］、［１３７］、［１３９］、［１４０］、［１４１］、［１４３］、［１４４］、［１４６］、または［１４７］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１５０］
（ａ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む、［３４］〜［１４９］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１５１］
（ｃ）に作動可能に連結された第２プロモーターを含む、［７４］〜［１４９］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１５２］
前記プロモーターおよび第２プロモーターが互いに異なる、［１５１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１５３］
前記プロモーターおよび前記第２プロモーターが同じである、［１５１］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１５４］
（ｂ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む、［６０］〜［１４９］のいずれか１に記載の核酸組成物。
［１５５］
［１］〜［３３］のいずれか１に記載の（ａ）ｇＲＮＡ分子を含む組成物。
［１５６］
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをさらに含む、［１５５］に記載の組成物。
［１５７］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［１５６］に記載の組成物。
［１５８］
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、［１５７］に記載の組成物。
［１５９］
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、［１５８］に記載の組成物。
［１６０］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、［１５８］または［１５９］に記載の組成物。
［１６１］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、［１５８］または［１５９］に記載の組成物。
［１６２］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、［１６１］に記載の組成物。
［１６３］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、［１６１］に記載の組成物。
［１６４］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、［１５８］〜［１６３］のいずれか１に記載の組成物。
［１６５］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、［１６４］に記載の組成物。
［１６６］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、［１６４］または［１６５］に記載の組成物。
［１６７］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、［１５８］〜［１６３］のいずれか１に記載の組成物。
［１６８］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、［１６７］に記載の組成物。
［１６９］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、［１６７］または［１６８］に記載の組成物。
［１７０］
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［１５６］〜［１６９］のいずれか１に記載の組成物。
［１７１］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［１７０］に記載の組成物。
［１７２］
（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［１５６］〜［１７１］のいずれか１に記載の組成物。
［１７３］
（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［１７２］に記載の組成物。
［１７４］
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、［１５５］〜［１７３］のいずれか１に記載の組成物。
［１７５］
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、［１７４］に記載の組成物。
［１７６］
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、［１７５］に記載の組成物。
［１７７］
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、［１７６］に記載の組成物。
［１７８］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１７７］に記載の組成物。
［１７９］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）；ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）；およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）からなる群から選択される、［１７８］に記載の組成物。
［１８０］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１７９］に記載の組成物。
［１８１］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［１８０］に記載の組成物。
［１８２］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１８０］または［１８１］に記載の組成物。
［１８３］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［１７９］〜［１８２］のいずれか１に記載の組成物。
［１８４］
前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１７９］に記載の組成物。
［１８５］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［１８４］に記載の組成物。
［１８６］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１８４］または［１８５］に記載の組成物。
［１８７］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［１８４］〜［１８６］のいずれか１に記載の組成物。
［１８８］
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（すなわち、ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、［１７５］〜［１８７］のいずれか１に記載の組成物。
［１８９］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１７９］に記載の組成物。
［１９０］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１８９］に記載の組成物。
［１９１］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、［１７５］〜［１９０］のいずれか１に記載の組成物。
［１９２］
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、［１７５］〜［１９０］のいずれか１に記載の組成物。
［１９３］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、［１７５］〜［１９０］のいずれか１に記載の組成物。
［１９４］
細胞を変化させる方法であって、
（ａ）［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子；および
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、に前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
［１９５］
前記細胞を、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、［１９４］に記載の方法。
［１９６］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［１９４］または［１９５］に記載の方法。
［１９７］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［１９６］に記載の方法。
［１９８］
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、［１９５］または［１９６］に記載の方法。
［１９９］
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、［１９８］に記載の方法。
［２００］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、［１９８］または［１９９］に記載の方法。
［２０１］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、［１９８］または［１９９］に記載の方法。
［２０２］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、［２０１］に記載の方法。
［２０３］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、［２０１］に記載の方法。
［２０４］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、［１９８］〜［２０３］のいずれか１に記載の方法。
［２０５］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、［２０４］に記載の方法。
［２０６］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、［２０４］または［２０５］に記載の方法。
［２０７］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、［１９８］〜［２０３］のいずれか１に記載の方法。
［２０８］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、［２０７］に記載の方法。
［２０９］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、［２０７］または［２０８］に記載の方法。
［２１０］
前記細胞を、（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、［１９６］〜［２０９］のいずれか１に記載の方法。
［２１１］
前記細胞を、（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、［２１０］に記載の方法。
［２１２］
前記細胞が、β−異常ヘモグロビン症に罹患している対象に由来する、［１９４］〜［２１１］のいずれか１に記載の方法。
［２１３］
前記β−異常ヘモグロビン症が、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌからなる群から選択される、［２１２］に記載の方法。
［２１４］
前記細胞が赤血球系細胞である、［１９４］〜［２１３］のいずれか１に記載の方法。
［２１５］
前記細胞が赤芽球である、［２１４］に記載の方法。
［２１６］
前記接触させるステップがインビボで行われる、［１９４］〜［２１５］２１５のいずれか１に記載の方法。
［２１７］
前記細胞におけるＨＢＧ標的位置の配列の知識を得るステップを含む、［１９４］〜［２１６］のいずれか１に記載の方法。
［２１８］
インデルをＨＢＧ標的位置に導入するステップを含む、［１９４］〜［２１７］のいずれか１に記載の方法。
［２１９］
前記インデルが、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２；ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２；およびＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２からなる群から選択される、［２１８］に記載の方法。
［２２０］
前記インデルが、ＮＨＥＪを使用して導入される、［２１８］または［２１９］に記載の方法。
［２２１］
単一ヌクレオチド変化をＨＢＧ標的位置に導入するステップを含む、［１９４］〜［２２０］のいずれか１に記載の方法。
［２２２］
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；およびＨＢＧ２  ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇからなる群から選択される、［２２１］に記載の方法。
［２２３］
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＤＲを用いて導入される、［２２１］または［２２２］に記載の方法。
［２２４］
ＨＢＧ標的位置の標的部位に変化を導入するステップを含む、［１９４］〜［２２３］のいずれか１に記載の方法。
［２２５］
前記変化が、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２；ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２；およびＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２からなる群から選択される、［２２４］に記載の方法。
［２２６］
前記変化が、ＨＤＲを用いて導入される、［２２４］または［２２５］に記載の方法。
［２２７］
前記細胞を、（ｇ）テンプレート核酸、に接触させるステップをさらに含む、［２２６］に記載の方法。
［２２８］
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、［２２７］に記載の方法。
［２２９］
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、［２２８］に記載の方法。
［２３０］
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、［２２９］に記載の方法。
［２３１］
前記５’相同性アームが、前記標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２３０］に記載の方法。
［２３２］
前記変化が、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）である、［２３１］に記載の方法。
［２３３］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２３２］に記載の方法。
［２３４］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２３０］〜［２３３］のいずれか１に記載の方法。
［２３５］
前記変化が、ＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）である、［２３４］に記載の方法。
［２３６］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２３５］に記載の方法。
［２３７］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２３４］または［２３５］に記載の方法。
［２３８］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［２３２］〜［２３７］のいずれか１に記載の方法。
［２３９］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［２３２］〜［２３８］のいずれか１に記載の方法。
［２４０］
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、［２３２］〜［２３９］のいずれか１に記載の方法。
［２４１］
前記変化が、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）である、［２３１］に記載の方法。
［２４２］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２４１］に記載の方法。
［２４３］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２４１］または［２４２］に記載の方法。
［２４４］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、［２２８］〜［２４３］のいずれか１に記載の方法。
［２４５］
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、［２２８］〜［２４３］のいずれか１に記載の方法。
［２４６］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、［２２８］〜［２４３］のいずれか１に記載の方法。
［２４７］
前記接触させるステップが、前記細胞を、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも１つをコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、［１９５］〜［２４６］のいずれか１に記載の方法。
［２４８］
前記接触させるステップが、前記細胞を、（ａ）、（ｂ）、（ｇ）、および任意選択による（ｃ）をコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、［２２７］〜［２４６］のいずれか１に記載の方法。
［２４９］
前記接触させるステップが、前記細胞を、［３４］〜［１５４］のいずれか１に記載の核酸組成物に接触させるステップを含む、［２４８］または［２４９］に記載の方法。
［２５０］
前記接触させるステップが、前記細胞を、前記（ｂ）、および（ａ）をコードする核酸組成物に送達するステップを含む、［１９５］〜［２４９］のいずれか１に記載の方法。
［２５１］
前記核酸組成物が（ｃ）をさらにコードする、［２５０］に記載の方法。
［２５２］
前記核酸組成物が（ｇ）をさらにコードする、［２５０］または［２５１］に記載の方法。
［２５３］
前記接触させるステップが、前記細胞（ａ）および（ｂ）に送達するステップを含む、［１９５］〜［２５１］のいずれか１に記載の方法。
［２５４］
前記接触させるステップが、前記細胞（ａ）、および（ｂ）をコードする核酸組成物を送達するステップを含む、［１９５］〜［２５１］のいずれか１に記載の方法。
［２５５］
前記接触させるステップが、前記細胞（ｃ）に送達するステップをさらに含む、［２５３］または［２５４］に記載の方法。
［２５６］
前記接触させるステップが、前記細胞（ｇ）に送達するステップをさらに含む、［２２７］〜［２５５］のいずれか１に記載の方法。
［２５７］
それを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症を治療する方法であって：
前記対象または前記対象の細胞を：
（ａ）［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子；および
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、に接触させるステップを含む、方法。
［２５８］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［２５７］に記載の方法。
［２５９］
前記β−異常ヘモグロビン症が、ＳＣＤおよびβ−Ｔｈａｌからなる群から選択される、［２５７］または［２５８］に記載の方法。
［２６０］
前記対象または前記対象の前記細胞を、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、［２５７］〜［２５９］のいずれか１に記載の方法。
［２６１］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［２６０］に記載の方法。
［２６２］
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、［２５８］〜［２６１］のいずれか１に記載の方法。
［２６３］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ニッカーゼ分子を含む、［２６２］に記載の方法。
［２６４］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、［２６２］または［２６３］に記載の方法。
［２６５］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、［２６２］または［２６３］に記載の方法。
［２６６］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、［２６５］に記載の方法。
［２６７］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、［２６５］に記載の方法。
［２６８］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、［２６３］〜［２６７］のいずれか１に記載の方法。
［２６９］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、［２６８］に記載の方法。
［２７０］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、［２６８］または［２６９］に記載の方法。
［２７１］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、［２６２］〜［２７０］のいずれか１に記載の方法。
［２７２］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、［２７１］に記載の方法。
［２７３］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、［２７１］または［２７２］のいずれか１に記載の方法。
［２７４］
前記対象または前記対象の前記細胞を、（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、に接触させるステップをさらに含む、［２５７］〜［２７３］のいずれか１に記載の方法。
［２７５］
前記対象または前記対象の前記細胞を、第４ｇＲＮＡ分子に接触させるステップをさらに含む、［２７４］に記載の方法。
［２７６］
単一ヌクレオチド変化をＨＢＧ標的位置に導入するステップを含む、［２５７］〜［２７５］のいずれか１に記載の方法。
［２７７］
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１１７  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１７０  Ｇ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｇ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−１９５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−１９６  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１９８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２５１  Ｔ＞Ｃ；またはｃ．−４９９  Ｔ＞Ａ；およびＨＢＧ２  ｃ．−１０９  Ｇ＞Ｔ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１１４  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１５８  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−１６７  Ｃ＞Ａ；ｃ．−１７５  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２０２  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−２１１  Ｃ＞Ｔ；ｃ．−２２８  Ｔ＞Ｃ；ｃ．−２５５  Ｃ＞Ｇ；ｃ．−３０９  Ａ＞Ｇ；ｃ．−３６９  Ｃ＞Ｇ；またはｃ．−５６７  Ｔ＞Ｇからなる群から選択される、［２７６］に記載の方法。
［２７８］
前記単一ヌクレオチド変化が、ＨＤＲを用いて導入される、［２７６］または［２７７］に記載の方法。
［２７９］
ＨＢＧ標的位置内の標的部位にインデルを導入するステップを含む、［２５７］〜［２７８］のいずれか１に記載の方法。
［２８０］
前記インデルが、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２；ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２；およびＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２からなる群から選択される、［２７９］に記載の方法。
［２８１］
前記変化が、ＨＤＲを用いて導入される、［２７９］または［２８０］に記載の方法。
［２８２］
前記対象または前記対象の前記細胞を、（ｇ）テンプレート核酸、に接触させるステップをさらに含む、［２８１］に記載の方法。
［２８３］
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、［２８２］に記載の方法。
［２８４］
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含み、前記置換配列が０ヌクレオチドである、［２８３］に記載の方法。
［２８５］
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、［２８４］に記載の方法。
［２８６］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２８５］に記載の方法。
［２８７］
前記インデルが、ＨＢＧ１  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、配列番号９０２のＨＢＧ１  −１１４〜−１０２である、［２８６］に記載の方法。
［２８８］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２８７］に記載の方法。
［２８９］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２８７］または［２８８］に記載の方法。
［２９０］
前記インデルが、ＨＢＧ２  １３ｂｐ  ｄｅｌ  −１１４〜−１０２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）である、［２８６］に記載の方法。
［２９１］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２９０］に記載の方法。
［２９２］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２９０］または［２９１］に記載の方法。
［２９３］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［２９０］〜［２９２］のいずれか１に記載の方法。
［２９４］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［２９０］〜［２９３］のいずれか１に記載の方法。
［２９５］
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、［２８３］〜［２９４］のいずれか１に記載の方法。
［２９６］
前記インデルが、ＨＢＧ１  ４ｂｐ  ｄｅｌ  −２２５〜−２２２であり、かつ前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）である、［２５６］に記載の方法。
［２９７］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２９６］に記載の方法。
［２９８］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［２９６］または［２９７］に記載の方法。
［２９９］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、［２８３］〜［２９８］のいずれか１に記載の方法。
［３００］
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、［２８３］〜［２９８］のいずれか１に記載の方法。
［３０１］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、［２５８］〜［２９８］のいずれか１に記載の方法。
［３０２］
前記接触させるステップがインビボで行われる、［２５７］〜［３０１］のいずれか１に記載の方法。
［３０３］
前記接触させるステップが静脈内注射を含む、［２５７］〜［３０２］のいずれか１に記載の方法。
［３０４］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞を、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つをコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、［２６０］〜［３０３］のいずれか１に記載の方法。
［３０５］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞を、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｇ）の少なくとも１つをコードする核酸組成物に接触させるステップを含む、［２８２］〜［３０３］のいずれか１に記載の方法。
［３０６］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞を、［３４］〜［１５４］のいずれか１に記載の核酸組成物に接触させるステップを含む、［２５７］〜［３０５］のいずれか１に記載の方法。
［３０７］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ｂ）、および（ａ）をコードする核酸組成物を送達するステップを含む、［２５７］〜［３０５］のいずれか１に記載の方法。
［３０８］
前記核酸組成物が（ｃ）をさらにコードする、［３０７］に記載の方法。
［３０９］
前記核酸組成物が（ｇ）をさらにコードする、［３０７］または［３０８］に記載の方法。
［３１０］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ａ）および（ｂ）を送達するステップを含む、［２５７］〜［３０５］のいずれか１に記載の方法。
［３１１］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ａ）、および（ｂ）をコードする核酸組成物を送達するステップを含む、［２５７］〜［３０５］のいずれか１に記載の方法。
［３１２］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ｃ）を送達するステップをさらに含む、［３１０］または［３１１］に記載の方法。
［３１３］
前記接触させるステップが、前記対象または前記対象の前記細胞に（ｇ）を送達するステップをさらに含む、［２８２］〜［３１２］のいずれか１に記載の方法。
［３１４］
（ａ）［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子、［３４］〜［１５４］のいずれか１に記載の核酸組成物、または［１５５］〜［１９３］のいずれか１に記載の組成物；および
β−異常ヘモグロビン症に罹患している対象の細胞を含む、反応混合物。
［３１５］
（ａ）［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物、ならびに：
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ；
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子第２ｇＲＮＡ分子；および
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸組成物、の１つまたは複数を含む、キット。
［３１６］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［３１５］に記載のキット。
［３１７］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［３１５］または［３１６］に記載のキット。
［３１８］
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸組成物を含む、［３１５］〜［３１７］のいずれか１に記載のキット。
［３１９］
ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第３ｇＲＮＡ分子をさらに含む、［３１５］〜［３１８］のいずれか１に記載のキット。
［３２０］
ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第４ｇＲＮＡ分子をさらに含む、［３１９］に記載のキット。
［３２１］
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、［３１５］〜［３２０］のいずれか１に記載のキット。
［３２２］
それを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症の治療に使用するための、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３２３］
前記ｇＲＮＡ分子が、（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、と組み合わせて使用される、［２９１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［３２４］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［３２３］に記載のｇＲＮＡ分子。
［３２５］
前記ｇＲＮＡ分子が、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、と組み合わせて使用される、［３２２］〜［３２４］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３２６］
前記ｇＲＮＡ分子が、（ｇ）テンプレート核酸、と組み合わせて使用される、［３２２］〜［３２５］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子。
［３２７］
それを必要とする対象のβ−異常ヘモグロビン症を治療するための薬剤の製造における、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子の使用。
［３２８］
前記薬剤が、（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、をさらに含む、［３２７］に記載の使用。
［３２９］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９分子である、［３２８］に記載の使用。
［３３０］
前記薬剤が、（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［３２７］〜［３２９］のいずれか１に記載の使用。
［３３１］
前記薬剤が、（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、［３２７］〜［３３０］のいずれか１に記載の使用。
［３３２］
（ａ）［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子；および
（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、を含む、ゲノム編集システム。
［３３３］
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質である、［３３２］に記載のゲノム編集システム。
［３３４］
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、［３３３］に記載のゲノム編集システム。
［３３５］
前記ｅａＣａｓ９分子がニッカーゼ分子を含む、［３３４］に記載のゲノム編集システム。
［３３６］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に二本鎖切断を生じさせる、［３３４］または［３３５］に記載のゲノム編集システム。
［３３７］
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸に一本鎖切断を生じさせる、［３３４］または［３３５］に記載のゲノム編集システム。
［３３８］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖に生じる、［３３７］に記載のゲノム編集システム。
［３３９］
前記一本鎖切断が、前記ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが相補的である標的核酸鎖以外の標的核酸鎖に生じる、［３３７］に記載のゲノム編集システム。
［３４０］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を有するが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性または有意なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有していない、［３３４］〜［３３９］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３４１］
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、［３４０］に記載のゲノム編集システム。
［３４２］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０における突然変異を含む、［３４０］または［３４１］に記載のゲノム編集システム。
［３４３］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を有するが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性または有意なＨＮＨ様ドメイン切断活性を有していない、［３３４］〜［３４２］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３４４］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、［３４３］に記載のゲノム編集システム。
［３４５］
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異を含む、［３４３］または［３４４］に記載のゲノム編集システム。
［３４６］
（ｃ）ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域内に完全にまたは部分的に位置する標的ドメインに相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［３３２］〜［３４５］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３４７］
前記第２ｇＲＮＡ分子が、［１］〜［３３］のいずれか１に記載のｇＲＮＡ分子である、［３４］に記載のゲノム編集システム。
［３４８］
（ｄ）第３ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［３３２］〜［３４７］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３４９］
（ｅ）第４ｇＲＮＡ分子、をさらに含む、［３４８］に記載のゲノム編集システム。
［３５０］
（ｇ）テンプレート核酸、をさらに含む、［３３２］〜［３４９］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３５１］
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、［３５０］に記載のゲノム編集システム。
［３５２］
前記テンプレート核酸が、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを含む、［３５１］に記載のゲノム編集システム。
［３５３］
前記５’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有し；前記置換配列が、０ヌクレオチドの長さを有し；かつ前記３’相同性アームが、約２００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチドの長さを有する、［３５２］に記載のゲノム編集システム。
［３５４］
前記５’相同性アームが、ＨＢＧ標的位置内の標的部位の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有し、かつ前記３’相同性アームが、前記ＨＢＧ標的位置内の標的部位の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［３５３］に記載のゲノム編集システム。
［３５５］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）；ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）；およびＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）からなる群から選択される、［３５４］に記載のゲノム編集システム。
［３５６］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［３５５］に記載のゲノム編集システム。
［３５７］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［３５６］に記載のゲノム編集システム。
［３５８］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２８２４〜２８３６）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［１８０］または［１８１］に記載のゲノム編集システム。
［３５９］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［３５５］〜［３５８］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３６０］
前記標的部位が、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［３５５］に記載のゲノム編集システム。
［３６１］
前記５’相同性アームが、配列番号９０４（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ５’相同性アーム）を含む、配列番号９０４から本質的になる、または配列番号９０４からなる、［３６０］に記載のゲノム編集システム。
［３６２］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ２  ｃ．−１１４〜−１０２（例えば、配列番号９０３（ＨＢＧ２）のヌクレオチド２７４８〜２７６０）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［３６０］または［３６１］に記載のゲノム編集システム。
［３６３］
前記３’相同性アームが、配列番号９０５（すなわち、ｓｓＯＤＮ１  ３’相同性アーム）を含む、配列番号９０５から本質的になる、または配列番号９０５からなる、［３５６］〜［３６２］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３６４］
前記テンプレート核酸が、配列番号９０６（すなわち、ｓｓＯＤＮ１）を含む、配列番号９０６から本質的になる、または配列番号９０６からなる、［３５６］〜［３６３］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３６５］
前記標的部位が、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）であり、かつ前記５’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の５’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［３５５］に記載のゲノム編集システム。
［３６６］
前記３’相同性アームが、ＨＢＧ１  ｃ．−２２５〜−２２２（例えば、配列番号９０２（ＨＢＧ１）のヌクレオチド２７１６〜２７１９）の３’側に、約５０〜１００ｂｐ、例えば、５５〜９５ｂｐ、６０〜９０ｂｐ、７０〜９０ｂｐ、または８０〜９０ｂｐの相同性を有する、［３６５］に記載のゲノム編集システム。
［３６７］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、［３５１］〜［３６６］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３６８］
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、［３５１］〜［３６６］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
［３６９］
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾および３’ホスホロチオエート修飾を含む、［３５１］〜［３６６］のいずれか１に記載のゲノム編集システム。
【国際調査報告】
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