(57)【要約】本開示は細胞外基質（ＥＣＭ）ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスを提供し、このデバイスは、マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた第１層表面と、ＥＣＭハイドロゲルを受け入れるためのローディングポートと連通するローディングチャネルを備えた第２層とを備え、第１層は第２層上に取り付けられ、パターニングされた表面はローディングチャネルに面し、断面積が減少した開放チャンバを画成し、ＥＣＭハイドロゲルをこの領域に充填することで開放チャンバに灌流チャネルを形成する。本開示は、第２層がローディングチャネルを有さず光学的に透過性の基板である同じデバイスも提供し、また追加でＥＣＭハイドロゲルをパターニングするための方法を提供し、この方法は上記のデバイスを使用することを含む。重要なことは、ＥＣＭパターニングは、マイクロチャネル境界部でのＥＣＭハイドロゲルと第１層との間の表面張力により達成される。
2019531731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスであって、
マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、
細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための１つ以上のローディングポートと流体連通しているローディングチャネルを備えた第２層とを備え、
前記第１層は前記第２層上に取り付けられ、前記パターニングされた表面は前記ローディングチャネルに面し、前記パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、
前記細胞外基質ハイドロゲルが、前記断面積が減少した１つ以上の領域に限定的に充填されることで前記開放チャンバに灌流チャネルを形成する、デバイス。
【請求項２】
前記第１層及び前記第２層の両方が、ポリジメチルシロキサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン又はシリコンを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記マイクロチャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記パターニングされた表面が、前記ローディングチャネルに向かって延びる同一の高さを有する複数の構造体を備え、前記同一の高さを有する複数の構造体及び前記ローディングチャネルが前記細胞外基質ハイドロゲルを充填する断面積が減少した１つ以上の領域を画成して灌流チャネルを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記灌流チャネルの幅が少なくとも１００μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記灌流チャネルの幅が１００〜１０００μｍである、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記灌流チャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスであって、
少なくとも１つのマイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、
前記細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための基板とを備え、
前記基板はローディングチャネルを備えず、
前記第１層は前記基板上に取り付けられ、前記パターニングされた表面は前記基板に面し、前記パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、
細胞外基質ハイドロゲルが、前記断面積が減少した１つ以上の領域に限定的に充填されることで前記開放チャンバに少なくとも１つの灌流チャネルを形成する、デバイス。
【請求項９】
前記第１層が、ポリジメチルシロキサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン又はシリコンを含む、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのマイクロチャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項８又は９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記基板が光学的透過性である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記光学的透過性基板がカバーガラス又はスライドガラスである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記パターニングされた表面が、前記基板から遠ざかる方向に延びる、異なる深さを有する複数の凹部を備え、前記異なる深さを有する複数の凹部及び前記基板が、前記細胞外基質ハイドロゲルを充填する前記断面積が減少した１つ以上の領域を画成して少なくとも１つの灌流チャネルを形成する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記パターニングされた表面が、前記基板から遠ざかる方向に延びる同一の深さを有する複数の凹部を備え、前記同一の深さを有する複数の凹部及び前記基板が、前記細胞外基質ハイドロゲルを充填する前記断面積が減少した１つ以上の領域を画成して少なくとも１つの灌流チャネルを形成する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの潅流チャネルの幅が少なくとも１００μｍである、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの灌流チャネルの幅が１００〜１０００μｍである、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの灌流チャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項８〜１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングする方法であって、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のデバイスを用意する工程、
前記細胞外基質ハイドロゲルを前記デバイスにロードする工程、及び
前記デバイスの断面積が減少した１つ以上の領域において前記細胞外基質ハイドロゲルを重合させることで前記デバイスの開放チャンバにおいて少なくとも１つの灌流チャネルを形成する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記ロードする工程に先立って、第１の複数の細胞を前記細胞外基質ハイドロゲルと混合する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞外基質ハイドロゲルが、コラーゲン、フィブリンゲル及び／又はエンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ロードする工程が４００〜７００Ｐａの圧力で行われる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記重合させる工程が２０〜４０分間にわたって３０〜４５℃で行われる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞外基質ハイドロゲルの重合後に、前記少なくとも１つの灌流チャネルに第２の複数の細胞を播種する工程をさらに含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の複数の細胞を播種する前に、前記少なくとも１つの灌流チャネルに細胞接着剤をコーティングする工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞接着剤が、フィブロネクチン、タイプＩコラーゲン、ゼラチン又はエンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物を含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイス及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮機能不全は、糖尿病、循環器疾患及びがんを含めた数多くの疾患における病態生理学的な特徴である。血管に関する殆どの研究において複雑な動物モデル及びインビボでのイメージング技術が用いられているが、これは血管における血行力学的及び細胞間相互作用のキャラクタリゼーションを妨げている。慣用のインビトロ血管モデルはトランスウェルアッセイ及び組織工学をベースにすることが多いが、イメージングの困難さにより制約を受けやすく、エンドポイント研究しかできない。マイクロフルイディクスは、十分に制御された微小環境における細胞の挙動を調査してインビボでは視覚化及び定量化が困難になりがちな生物学的な現象を理解するための、そのような従来のやり方より有益な代案になり得る。二次元（２Ｄ）マイクロ流体血管モデルは生理学的関連性を欠くため、近年、血管新生、がん転移及びアテローム性動脈硬化向けに生体模倣型の三次元（３Ｄ）の血管プラットフォームが開発されている。しかしながら、作製の困難さゆえに、これらの「オンチップ臓器（ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」系におけるチャネルデザインは制限されがちであり、分岐、狭窄又は動脈瘤等の重要な病理学的血管形状の再現ができない。
【０００３】
マイクロ流体血管又は細胞培養モデルを開発するための一部の従来法ではＥＣＭハイドロゲルパターニングを用いており、ＥＣＭハイドロゲルパターニングはマイクロピラー、マイクロニードル／ガラスキャピラリー、ＥＣＭスキャフォールド、粘性フィンガープリント法又は犠牲的ゲル化を用いて達成し得る。
【０００４】
マイクロピラー又はマイクロポストを用いたＥＣＭのローディングは数年前に報告されている。簡単に説明すると、マイクロピラーアレイ（約５０〜２００μｍの間隔）がチャネル間に置かれ、三次元ＥＣＭハイドロゲルローディングがピラー間で生じ、これにより隣接するチャネルへのゲルの漏出を防止する。その結果、別々のチャネルで複数の細胞タイプを空間的パターニングすることができ、内皮を介した血管新生又は腫瘍細胞の血管内異物侵入の研究に用い得る。しかしながら、この技法には幾何学的制約という大きな限界がある。典型的には、血管チャネルデザインはゲルの漏出を防ぐために直線だからである。したがって、この方法を用いて分岐、狭窄又は動脈瘤等の病理学的な血管形状を作り出すのは困難である。加えて、ＥＣＭと血管細胞との界面は、ピラーアレイが存在するため連続していない。このことは灌流をベースとした研究に悪影響を及ぼすが、これはＥＣＭ（軟らかい）又はＰＤＭＳマイクロピラー（硬い）支持体上でのその位置によって血管細胞は異なる生体力学的刺激を受けるからである。
【０００５】
マイクロニードル／ガラスキャピラリー技法では、ゲル重合中にミクロンサイズのニードルをＥＣＭハイドロゲル内に挿入し、続いてニードルを引き抜くことで円形の管腔を形成する。血管細胞をこの円形チャネルに播種し、同時に典型的には周囲のＥＣＭ内に周皮細胞を埋め込むことで、生理学的微小環境を模した共培養系を設置し得る。細胞の組織化を空間的により良く制御するためには、複数の血管壁を作り出すための異なるサイズのニードルの組み合わせを使用し得る。ニードルをＥＣＭから１本抜くたびに、血管細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞が層状に播種される。それでもなお、そのような技法の作製プロセスは複雑になりがちであり、結果として得られる血管チャネルはニードルの形状ゆえに直線となってしまう。この問題はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）光ファイバーを使用することで克服し得るものの（様々な血管形状を作り出すために形状を変化させ易い）、そのような技法は具体的にはＰＤＭＳで行われており、より軟らかい材料での作製は困難であるため、ハイドロゲル等の軟質材料では実証されていない。
【０００６】
一方、ＥＣＭスキャフォールドにおいて、マイクロ流体微小血管網は複雑な多段階リソグラフィを用いてコラーゲンスキャフォールド内に作ることができるが、チップアセンブリは依然として技術的に困難である。微小血管床は、内皮細胞、ストローマ細胞及びフィブリンを約２〜３週間にわたって３Ｄコラーゲンにおいて共培養することによる脈管形成により作り出し得る。これには時間がかかり、新しい血管の形成は、空間的方向が制御できず、ランダムなものになることが多い。
【０００７】
粘性フィンガープリント法は、ＥＣＭハイドロゲルを通る管腔をマイクロ流体系に作るために開発された技法である。簡単に説明すると、液状の媒体（より低粘度）を未重合のハイドロゲル内へとピペットで手作業で入れることで管腔を形成し、この管腔は追って重合されて血管細胞用の灌流可能なマイクロチャネルとなる。しかしながら、この管腔の断面形状は不規則であり、その形状を制御することは難しく、この方法は直線のチャネルデザインには強いが、病理学的に複雑な形状には弱い。
【０００８】
犠牲的ゲル化の場合、ゼラチン製のマイクロ流体構造体はコラーゲンパターニング用の犠牲テンプレートとして機能し、続いてこれを溶解させることでコラーゲンに埋め込まれた灌流可能なマイクロチャネルを形成する。この技法では様々な形状のチャネルを形成できるが、適合するゲル化特性を有する２種の異なるハイドロゲルの重合を必要とする。
【０００９】
総体的に、上記の技法は時間がかかり、作製過程が複雑になりがちであり、複雑な病理学的血管形状を作り出せず、また連続的なＥＣＭ／血管細胞界面を形成するための柔軟性に欠く。
【００１０】
したがって、上記の制約に取り組みつつもＥＣＭハイドロゲルに様々な血管形状のマイクロチャネルを効率的にパターニングするための改善された方法が必要とされている。この改善された方法は、非熟練者により特殊な器具を必要とすることなく行い得る手動でのピペット作業によるハイドロゲルローディングも可能でなくてはならない。
【００１１】
また、上述した問題を解決及び／又は改善するためのそのような方法を可能にするデバイスも必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
１つの態様において、細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスが提供され、このデバイスは、マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための１つ以上のローディングポートと流体連通しているローディングチャネルを備えた第２層とを備え、第１層は第２層上に取り付けられ、パターニングされた表面はローディングチャネルに面し、パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、細胞外基質ハイドロゲルをこの断面積が減少した１つ以上の領域に充填することで開放チャンバに灌流チャネルを形成する。
【００１３】
別の態様において、細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスが提供され、このデバイスは、少なくとも１つのマイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための基板とを備え、この基板はローディングチャネルを備えず、第１層は基板上に取り付けられ、パターニングされた表面は基板に面し、パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、細胞外基質ハイドロゲルを、この断面積が減少した１つ以上の領域に充填することで開放チャンバに少なくとも１つの灌流チャネルを形成する。
【００１４】
別の態様において、細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするための方法が提供され、この方法は、上で開示のデバイスを用意し、細胞外基質ハイドロゲルをデバイスにロードし、デバイスの断面積が減少した１つ以上の領域において細胞外基質ハイドロゲルを重合させることでデバイスの開放チャンバにおいて少なくとも１つの灌流チャネルを形成する。
【００１５】
図面において、同様の参照符号は概して同様の部位を指す。例えば、図の１つにおいて参照番号１００とふられた部位は、別の図において参照番号１００’とふられた同じ部位のことである
図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の原理を説明するにあたって概して強調して描かれている。以下の発明を実施するための形態の項においては、本開示の様々な実施形態について、以下の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】本明細書で開示の実施形態にしたがって作製した細胞外基質（ＥＣＭ）ハイドロゲルパターニングのための多層ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）デバイスの上部及び底側テンプレート／層を示す。具体的には、左の画像は複数のゲルローディングポートを有する様々なＥＣＭローディングチャネル構成を示し（底側テンプレート／層）、右の画像は血管マイクロチャネルデザインを示す（上側テンプレート／層）。後者は、ＥＣＭハイドロゲルを閉じ込める場所の境界を画成するのに役立つ。
【図１ｂ】ＥＣＭハイドロゲルローディング手順の概略図である。ＥＣＭローディングチャネル（底層）及び血管マイクロチャネルデザイン（上層）を位置合わせし、プラズマ処理後に接合する。ＥＣＭハイドロゲルは底側ポートからロードされ、ハイドロゲルは流れ、表面張力により、上層のマイクロチャネルにより画成された境界で停止する。３７℃での３０分間にわたる静置後、ＥＣＭハイドロゲルは重合されて灌流チャネルが形成され、次に、細胞を培養するために、血管細胞をこの灌流チャネル内に播種する。
【図２】ＥＣＭハイドロゲルローディングのための機能性マイクロデバイスの３つの明視野画像である。具体的には、ａの左の画像は、Ｔ字路形状を有するマイクロチャネル（上層）と位置合わせされたＥＣＭローディングチャネル（底層）を示す。食用色素を加えたタイプＩコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を用いることで、ａの中央及び右の画像に示すようなハイドロゲルをパターニングした灌流チャネルを例示した。ｂの左の画像は、蛇行形状を有するマイクロチャネル（上層）と位置合わせされたＥＣＭローディングチャネル（底層）を示す。食用色素を加えたタイプＩコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を用いることで、ｂの中央及び右の画像に示すようなハイドロゲルをパターニングした灌流チャネルを例示した。ｃの左の画像は、Ｙ字路形状を有するマイクロチャネル（上層）と位置合わせされたＥＣＭローディングチャネル（底層）を示す。食用色素を加えたタイプＩコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を用いることで、ｃの中央及び右の画像に示すようなハイドロゲルをパターニングした灌流チャネルを例示した。ｄの左の画像は、フィレットを付けたＹ字路形状を有するマイクロチャネル（上層）と位置合わせされたＥＣＭローディングチャネル（底層）を示す。食用色素を加えたタイプＩコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を用いることで、ｄの中央及び右の画像に示すようなハイドロゲルをパターニングした灌流チャネルを例示した。
【図３】タイプＩコラーゲンを用いてパターニングし且つ血管細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種した灌流チャネルの画像である。具体的には、ａの左の蛍光画像は、Ｔ字路の灌流チャネルのための、ＦＩＴＣコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ。ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネートを表す）を使用してきれいに画成されたＥＣＭハイドロゲル壁を示す。ａの右の画像は、Ｔ字路形状を有するパターニングされた灌流チャネル内に播種されたＨＵＶＥＣを示し、コラーゲン壁内への侵入は最小限である。ｂの左の蛍光画像は、蛇行形状を有する灌流チャネルのための、ＦＩＴＣコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を使用してきれいに画成されたＥＣＭハイドロゲル壁を示す。ｂの右の画像は、蛇行形状を有するパターニングされた灌流チャネル内に播種されたＨＵＶＥＣを示し、コラーゲン壁内への侵入は最小限である。ｃの左の蛍光画像は、Ｙ字路の灌流チャネルのための、ＦＩＴＣコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を使用してきれいに画成されたＥＣＭハイドロゲル壁を示す。ｃの右の画像は、Ｙ字路形状を有するパターニングされた灌流チャネル内に播種されたＨＵＶＥＣを示し、コラーゲン壁内への侵入は最小限である。ｄの左の蛍光画像は、フィレットを付けたＹ字路形状を有する灌流チャネルのための、ＦＩＴＣコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を使用してきれいに画成されたＥＣＭハイドロゲル壁を示す。ｄの右の画像は、フィレットを付けたＹ字路形状を有するパターニングされた灌流チャネル内に播種されたＨＵＶＥＣを示し、コラーゲン壁内への侵入は最小限である。
【図４ａ】ＥＣＭハイドロゲルにおける生体分子の安定した拡散勾配を示す。具体的には、図４ａの左の画像は、Ｙ字路形状（幅５００μｍ）を有するコラーゲンをパターニングした灌流チャネル内にロードしたＦＩＴＣデキストラン（４０ｋＤａ）を示す。灌流チャネルを横断する（Ｘ−Ｘ’）蛍光強度ライン走査により、６０分後に生体分子が安定的に拡散していることがわかる。図４ａの右の画像の強調された領域は、灌流チャネル位置に対応する。
【図４ｂ】ＥＣＭにおける生体分子の安定した拡散勾配を示す。具体的には、図４ｂは、異なる時点（０分、６０分、１２０分及び１８０分）でのＥＣＭハイドロゲル領域における蛍光強度ライン走査を示し、長期的で安定した拡散勾配を示している。ＦＩＴＣデキストラン（４０ｋＤａ）をロードした灌流チャネルは幅６００μｍを有する。
【図５ａ】コラーゲンをパターニングしたマイクロデバイスにおけるＨＵＶＥＣを示す。具体的には、図５ａの左の画像は、０日目のＨＵＶＥＣ播種を示す位相差画像であり、図５ａの右の画像は、２日目のコンフルエントな細胞単層の形成を示す位相差画像である。
【図５ｂ】コラーゲンをパターニングしたマイクロデバイスにおけるＨＵＶＥＣを示す。具体的には、図５ｂの左の画像は灌流チャネルにおけるｚ位置（Ａ及びＢ）を示し、作製されたマイクロ流体デバイスにおける細胞単層の蛍光画像はこの位置で撮影した（図５ｂの右の２つの画像）。図５ｂの右の第１の画像において（画像Ａ）、細胞は灌流チャネルの底部でコンフルエントであった（図５ｂの左の画像における位置Ａに対応）。図５ｂの右の第２の画像においては（画像Ｂ）、コラーゲン壁に沿って単層が観察された（図５ｂの左の画像における位置Ｂに対応）。
【図６ａ】ＦＩＴＣ含有コラーゲンゲルを使用してパターニングした灌流チャネルの蛍光画像である（左の画像；スケールバーは２００μｍ）。図６ａの右の画像は、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ及び１０００μｍの対応するチャネル寸法を示す対応する断面概略図である。
【図６ｂ】異なるマイクロチャネル深さのＦＩＴＣ含有コラーゲンゲルの断面図である。
【図６ｃ】切断したチップ内のＦＩＴＣ含有コラーゲンゲルの蛍光画像であり（図６ａの左上画像に示すようにｘ−ｘ’に沿って切断）、上部接触角（θｔ）の増大を示しており、一方、コラーゲンはより高いローディング圧力でも上端に固定されたままであった。挿入画像１、２及び３は、ローディング圧力の上昇に伴う上端でのコラーゲンの固定効果を強調している。図６ｃの中央のグラフは、θｔ（θ上部）と最大ゲル距離（Ｄ；コラーゲンの膨らみの中心で測定）及び底面に沿ったゲル距離（ｄ）との間にある強い一次性を示唆している。図６ｃの右のグラフは、圧力の低下と最大ゲル距離（Ｄ；コラーゲンの膨らみの中心で測定）及び底面に沿ったゲル距離（ｄ）との間にある強い一次性を示唆している。
【図７】異なるＥＣＭハイドロゲルのパターニングを示す。具体的には、図７の左の画像はＹチャネル型マイクロ流体デバイスの概略図であり、図７の右の画像は、コラーゲン、フィブリン及びマトリゲルを使用したＥＣＭハイドロゲルパターンの拡大明視野画像である。
【図８】コラーゲンをパターニングしたデバイスにおけるＨＵＶＥＣを示す。具体的には、図８の左の画像はＹチャネル型マイクロ流体デバイスの概略図であり、図８の右の画像は微小血管系の断面の共焦点画像であり、ＥＣＭハイドロゲル側壁に沿ったＨＵＶＥＣの単層を強調している。スケールバーは５０μｍである。
【図９ａ】内皮ＨＵＶＥＣバリア機能のキャラクタリゼーションを示す。具体的には、図９ａはＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン（４０ｋＤａ）をロードした灌流チャネルの蛍光強度ライン走査及び画像を示す。強調された領域は灌流チャネル位置を示す。
【図９ｂ】内皮ＨＵＶＥＣバリア機能のキャラクタリゼーションを示す。具体的には、図９ｂは、異なる分子量（１０ｋＤａ及び４０ｋＤａ）（ｎ＝４）のＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン分子を使用した内皮単層の選択的バリア透過性を示す。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（ｓ．ｄ．は標準偏差のことであり、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１）。
【図９ｃ】内皮ＨＵＶＥＣバリア機能のキャラクタリゼーションを示す。具体的には、図９ｃは、ＴＮＦ−αで処理した場合の内皮バリア透過性の顕著な上昇を示す（ｎ＝４；ＴＮＦ−αは腫瘍壊死因子アルファを表す）。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１）。
【図９ｄ】内皮ＨＵＶＥＣバリア機能のキャラクタリゼーションを示す。具体的には、図９ｄは、灌流中の対流的バリア透過性を示す代表画像である。正常な内皮細胞と比較すると（図９ｄの左の画像））、ＴＮＦ−α処理した内皮細胞（ＥＣ）では２μｍのビーズがコラーゲンゲル内により深く侵入した（図９ｄの右の画像）。
【図９ｅ】内皮ＨＵＶＥＣバリア機能のキャラクタリゼーションを示す。具体的には、図９ｅは、コラーゲンゲル内への２μｍビーズの侵入を示すグラフである。（１００μｍにある）色が濃い線はＥＣバリアの位置に対応する。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１）。
【図９ｆ】内皮ＨＵＶＥＣバリア機能のキャラクタリゼーションを示す。具体的には、図９ｆは、正常な及びＴＮＦ−α処理ＥＣの場合の蛍光スペクトルの半値全幅（ＦＷＨＭ）をキャラクタリゼーションしている（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１）。
【図１０ａ】安定したケモアトラクタント（ｆＭＬＰ：Ｎ−ホルミルメチオニン−ロイシル−フェニルアラニン）濃度勾配における好中球走化性の結果を示す。具体的には、図１０ａは、異なる時点でのコラーゲンゲル中のＦＩＴＣ色素（ｆＭＬＰ）の蛍光ライン走査を示すグラフである。全ての値は時間Ｔ＝０時間に正規化される。
【図１０ｂ】安定したケモアトラクタント濃度勾配における好中球走化性の結果を示す。具体的には、図１０ｂは、図１０ｂの様々な曲線の勾配を強調したグラフであり、安定した勾配が作られることをさらに示唆している。
【図１０ｃ】安定したケモアトラクタント濃度勾配における好中球走化性の結果を示す。具体的には、図１０ｃは、ケモアトラクタントであるｆＭＬＰをコラーゲンゲルの片側に導入して好中球が遊走するための濃度勾配を作り出すことを示す。図１０ｃの右の明視野画像からは、２時間後に好中球がＨＵＶＥＣバリアを越えてコラーゲンゲル内へと遊走しているのがわかる。
【図１０ｄ】安定したケモアトラクタント濃度勾配における好中球走化性の結果を示す。具体的には、図１０ｄは、ｆＭＬＰが存在する場合及び不在の場合の遊走した好中球の細胞数を示す（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（＊はｐ＜０．０５）。
【図１１ａ】内皮−平滑筋細胞（ＥＣ−ＳＭＣ）共培養系についての結果を示す。具体的には、図１１ａは、大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）に取り囲まれた内皮化灌流チャネルの共焦点画像である。図１１ａにおける右上の画像は、ＥＣ−ＳＭＣ境界部を一部拡大した挿入画像であり、図１１ａの右下画像は、異なる細胞タイプが三次元で配置されたことを示すその対応するＺスタック画像である。
【図１１ｂ】ＥＣ−ＳＭＣ共培養系についての結果を示す。具体的には、図１１ｂでは、正常な（色なし）及びＴＮＦ−α処理（べた塗り）条件におけるＳＭＣがある場合とない場合のＥＣバリア透過性を比較している。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１）。
【図１１ｃ】ＥＣ−ＳＭＣ共培養系についての結果を示す。具体的には、図１１ｃは、ＳＭＣがコラーゲンゲルの１つの面に導入され、残りの面にはＳＭＣがないままであることを示している。図１１ｃの右側の挿入画像は、ＨＵＶＥＣチャネルの一面上にＳＭＣがあるチップの一部の明視野画像である。
【図１１ｄ】ＥＣ−ＳＭＣ共培養系についての結果を示す。具体的には、図１１ｄは、ＨＵＶＥＣチャネルのいずれかの面から測定した炎症を起こした内皮のバリア透過性を示す。ＳＭＣにより内皮バリアの漏出性は低下した（ｎ＝４）。データは平均±ｓ．ｄ．として表される（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１）。
【図１２ａ】本方法及びデバイスに基づいて開発した血管狭窄モデルを示す。具体的には、図１２ａは、コラーゲンをパターニングして５０％狭窄させた灌流チャネルにおける、ＳＭＣに取り囲まれた内皮化管腔の明視野画像（上）及び共焦点（下）画像である。
【図１２ｂ】本方法及びデバイスに基づいて開発した血管狭窄モデルを示す。具体的には、図１２ｂの上の２つの画像は、ＰＤＭＳ及びコラーゲンをパターニングして狭窄させた（８０％）灌流チャネルにおけるＦＩＴＣコンジュゲート２μｍビーズの灌流を示す代表蛍光画像である。ビーズが、コラーゲン隆起部の近位縁（矢印で示す）に１０ダインｃｍ−２（１Ｐａ）の入口壁ずり応力で蓄積したことが観察できる。一方、図１２ｂの下は、内皮化灌流チャネルにおけるＥＣバリアでのビーズの蓄積を示す合成画像である。
【図１２ｃ】本方法及びデバイスに基づいて開発した血管狭窄モデルを示す。具体的には、図１２ｃは、異なるチャネル狭窄部を有する灌流チャネルにおける、異なる流速でのＦＩＴＣコンジュゲート２μｍビーズの蛍光画像である。狭窄度５０％、１０ダインｃｍ−２（１Ｐａ）でビーズの蓄積は観察されなかったが、狭窄度８０％ではビーズが蓄積した（矢印参照）。
【図１３ａ】狭窄チップでの全血灌流の結果を示す。具体的には、図１３ａは、コラーゲンをパターニングした狭窄部（８０％）を有するマイクロ流体チップでの全血灌流を示す。
【図１３ｂ】狭窄チップでの全血灌流の結果を示す。具体的には、図１３ｂは、１０ダインｃｍ−２（１Ｐａ）での全血灌流下、血小板（Ｒ６Ｇ染色）が５０％及び８０％コラーゲン狭窄部の近位領域に結合することをキャラクタリゼーションしている。代表画像（左の２つの画像）及び蛍光強度のグラフ（右の画像）は、狭窄度８０％の灌流チャネルにおける著しい血小板の蓄積（矢印参照）を示している。
【図１４】血管炎症時の内皮−血液細胞相互作用を示す。具体的には、ａは、１ダインｃｍ−２（０．１Ｐａ）での１５分間にわたる全血（Ｒ６Ｇ染色）灌流後の正常な内皮の代表蛍光画像である。狭窄部に焦点を当てた近位領域拡大画像では（囲みで強調。ａの右の挿入画像に示す）、血小板の付着が強調されている（矢印で示す）。ｂは、１ダインｃｍ−２（０．１Ｐａ）での１５分間にわたる全血灌流後の炎症を起こしている内皮（ＴＮＦ−α処理）の代表蛍光画像である。ｂの右の挿入画像は、血小板（１本の破線の矢印で示す）及び白血球（実線の矢印で示す）の付着を示す拡大画像である。ｃは、１０ダインｃｍ−２（０．１Ｐａ）での１５分間にわたる全血灌流後の炎症を起こしている内皮（ＴＮＦ−α処理）の代表蛍光画像である。ｃの右の挿入画像（拡大）において、２本の破線の矢印及び３本の実線の矢印は、血小板及び白血球−血小板の閉塞部の近位縁での著しい蓄積をそれぞれ示している。ｄは狭窄領域全体の蛍光画像であり、コラーゲンをパターニングした狭窄部（８０％）の近位領域及び遠位領域両方での血小板及び白血球の付着（下の６つの矢印）と、チャネル狭窄部により近い近位領域でのより多い血小板結合（上方の３つの矢印）が強調されており、さらにＥＣＭ（コラーゲン）内へと対流的流れが生じている。
【図１５ａ】ＰＤＭＳの２つの層を利用する本方法を示す概略図である。
【図１５ｂ】図１５ａに図示した本方法の変化形を示す概略図である。変形法では、２つのＰＤＭＳ層を使用する代わりに、基板（例えば、スライドガラス）に接合したＰＤＭＳの単層（同一又は異なる深さ／高さを有する構造体でパターニング）を利用する。
【図１６ａ】２段階フォトリソグラフィ手順で得られる異なるチップ構成の概略図（左の画像）及びその対応する断面図（右の画像）である。
【図１６ｂ】２段階フォトリソグラフィ手順のキャラクタリゼーション結果を示す。具体的には、図１６ｂは、ＦＩＴＣ含有ハイドロゲルの載ったチップの上面図及び断面図の顕微鏡画像である。開放チャンバ内部に異なる高さ／深さを作り出すことで、キャピラリーバーストバルブ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｂｕｒｓｔ  ｖａｌｖｅ：ＣＢＶ）効果により、ＥＣＭハイドロゲルがそれぞれの領域（断面積が減少した領域）に保持される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の詳細な説明では添付の図面を参照し、図面は、実例として、具体的な詳細及び本発明を実行し得る実施形態を示す。
ある実施形態において説明した特徴は、対応して、残りの実施形態における同一又は同様の特徴にも適用可能である。ある実施形態において説明した特徴は、これら他の実施形態で明確に記載されていなくとも、残りの実施形態にも対応して適用し得る。さらに、ある実施形態におけるある特徴について説明した追加物及び／又は組み合わせ及び／又は代替物は、残りの実施形態における同一又は同様の特徴に対応して適用し得る。
【００１８】
本開示では、インビトロのマイクロ流体血管モデル用に細胞外基質（ＥＣＭ）ハイドロゲルを迅速に３Ｄパターニングする方法について説明する。本発明のやり方では、有利には、従来の方法では製造できなかった又は製造が困難であった複雑な病理学的形状を有するものさえ含めた、パターニングを施した灌流可能なＥＣＭハイドロゲル血管構造体及び生細胞の製造を可能にする。
【００１９】
有利には、本デバイス及び方法は、インビトロのマイクロ流体血管モデル用のＥＣＭハイドロゲルの迅速なパターニングを可能にする。この技法では、２つのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層を必要とし、一方はＥＣＭハイドロゲルローディング用のローディングチャネルがパターニングされ（底側）、もう一方は、テンプレートとして血管マイクロチャネルデザインがパターニングされる（上側）。この技法では、血管マイクロチャネルとローディングチャネルの両方のデザインをパターニングした１つだけのＰＤＭＳ層並びに別の平坦な基板も利用し得る。次に、ＥＣＭハイドロゲルパターニングは、血管チャネルにより画成される境界部にて、表面張力により達成し得て、複雑な技法を伴うことなく異なる形状の灌流チャネルが形成される。したがって、現実の血管モデルを模したマイクロ流体血管モデルを容易に作製し得る。
【００２０】
本デバイス及び方法は、従来の方法で課せられた制約を軽減する、あるいは完全に回避さえできる点でも有利である。例えば、従来のマイクロ流体法、例えばマイクロピラーではマイクロピラー間で気泡が発生することがあり、これらの気泡は灌流中のバリア機能及び細胞間相互作用の研究を妨げる。本デバイス及び方法（そのようなマイクロピラーを必要としない）ではそのような問題を回避できる。
【００２１】
したがって、本デバイス及び方法はさらに、特定の１つの血管モデルの研究のためだけでなく様々な種類の研究に役立つ様々なタイプのマイクロ流体モデルの開発に使用できる点で有利である。
【００２２】
本デバイス及び方法の様々な利点について略述してきたが、様々な実施形態の詳細にはいる前に、まず特定の表現の定義について論じる。
上層を底層に配置する、形成する又は取り付けるという文脈において使用する語「上」とは、上層を、底層の含意される側面又は表面「上に直接」（例えば、直接接触）形成し得ることを意味する。言い換えると、第２層「上」の第１層とは、第１層と第２層との間に介入要素が何もなく、第２層上に第１層が直接あることを意味する場合がある。
【００２３】
本開示の文脈において、「灌流可能な」という語句は、チャネルに関して使用する場合、生物学的物質がそこで増殖し、流れ又は分散できるチャネルを指す。例えば、細胞培養液を供給したチャネルでは、細胞をチャネル内に流し又はチャネル内で増殖させ得る。
【００２４】
「実質的に」という語は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まないものになり得る。必要に応じて、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略し得る。
【００２５】
様々な実施形態の文脈において、ある特徴又は要素に関して用いられる「１つの」及び「その」は、特徴又は要素の１つ以上を含む。
様々な実施形態の文脈において、数値に用いる「約」又は「およそ」という語は、きっかりの値及び妥当な変動を含む。
【００２６】
本明細書において、「及び／又は」という表現は、列挙した関連する品目のいずれか及び１つ以上の全ての組み合わせを含む。
本明細書において、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」の形態の文言は、Ａ若しくはＢ又はＡ及びＢの両方を含み得る。これに対応して、「Ａ及びＢ及びＣの少なくとも１つ」又は列挙されたさらなる品目を含む形態の文言は、列挙した関連する品目のいずれか及び１つ以上の全ての組み合わせを含み得る。
【００２７】
特に指定がない限り、「含んでいる」及び「含む」及びこれらの文法的変化形は「制限がない」又は「一切を含む」ことを表すものとし、記載の要素を含むだけでなく、追加の、記載のない要素も含み得る。
【００２８】
様々な語句について定義してきたが、ここで様々な実施形態の詳細について説明していく。
本開示においては、細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスが提供され、このデバイスは、マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための１つ以上のローディングポートと流体連通しているローディングチャネルを備えた第２層とを備え、第１層は第２層上に取り付けられ、パターニングされた表面はローディングチャネルに面し、パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、細胞外基質ハイドロゲルをこの断面積が減少した１つ以上の領域に充填することで開放チャンバに灌流チャネルを形成し得る。
【００２９】
本デバイスの様々な実施形態において、第１層とは、マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を有する層のことである。この第１層の表面は、マイクロチャネルを形成するための任意の既知の方法、例えばフォトリソグラフィ及び／又はソフトリソグラフィを用いてパターニングすることができるフォト。言い換えると、本デバイスの第１層とは、マイクロチャネルを事前に形成した層になり得る。したがって、「マイクロチャネル」という語は、第１層に言及する際に特に用いられる。
【００３０】
マイクロチャネルは、第２層と共に、本デバイスに幾何学構成を付与するために使用し得る。つまり、マイクロチャネルを有する第１層は、ＥＣＭハイドロゲルをパターニングするためのデバイス形成用部品の１つとして機能し、特には、本デバイスに所望の血管マイクロチャネルデザインを付与する。
【００３１】
マイクロチャネルの幾何学構成は、単純又は複雑な、例えば直線的なマイクロチャネル、曲線的なマイクロチャネル等のいずれのランダムな形状にもなり得る。このマイクロチャネルはＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成し得る。有利には、マイクロチャネルは様々な幾何学構成をとることができるため、血管構造又は病理学的網目構造等の最も複雑な幾何学デザインでさえデバイス上に付与できる。
【００３２】
第１層の表面をパターニングする必要があるため、刻み込まれた構成を保持するのが困難なほどに軟らかくはない適切な材料を使用し得る。したがって、第１層は刻印可能な材料になり得る。そのような刻印可能な材料は、以下に限定するものではないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン又はシリコンを含み得る。したがって、第１層はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み得る又はポリジメチルシロキサンから成り得る。第２層も、同一又は異なる刻印可能な材料から形成し得る。幾つかの実施形態においては、第１層及び第２層の両方がＰＤＭＳを含み得る。
【００３３】
本デバイスの様々な実施形態においては、第２層もあり、第１層と組み合わせることでＥＣＭハイドロゲルをパターニングするためのデバイスを形成し得る。第２層は、ＥＣＭハイドロゲルを供給するためのローディングチャネルを備えることができる。第２層（その表面）をパターニングすることでローディングチャネルを形成し得る。（ローディングチャネルを画成する）第２層の表面上のパターン形状は、正方形、長方形、円形、五角形等になり得る。つまり、ローディングチャネルはいずれの構成にもなり得る。これらの形状又は構成は、第２層の表面上のパターン（すなわち、ローディングチャネル）のことであり、ローディングチャネルの断面ではないことを区別されたい。「ローディングチャネル」又は「ＥＣＭローディングチャネル」という文言は、そのような第２層を有する実施形態において第２層に言及する際に使用し得る。
【００３４】
第２層の表面のパターニングに用いられる技法は、上記の第１層をパターニングするためのものと同じ技法になり得る。ローディングチャネルの形状及びマイクロチャネルのデザインはカスタマイズし得るため、本デバイスひいては本方法は有利には、マイクロ流体モデルにおいて任意のデザインを自由自在に作り出すことができる。
【００３５】
第２層は刻印可能な材料、例えばＰＤＭＳになり得る。第２層は、上述の第１層と同一の又はそれとは異なる材料になり得る。
ローディングチャネルに供給するＥＣＭハイドロゲルは、第２層に設けられたローディングポートにロード又は注入し得る。これらのローディングポートはローディングチャネルと流体連通してもよく、ロードされた又は注入されたＥＣＭハイドロゲルはローディングチャネルに流入し得る。第２層は、様々な実施形態において、ＥＣＭハイドロゲルを受け入れるための１つ以上のローディングポートと流体連通したローディングチャネルを備え得る。有利には、ローディングポートからのＥＣＭハイドロゲルのローディング（例えば、注入）は、ＥＣＭパターンの簡単で制御された形成を可能にする。他方で、ＥＣＭハイドロゲルを第１層と第２層との間に画成された空間に直接ロードする場合（すなわち、ローディングポートを使用しない）、制御が困難となり、ＥＣＭハイドロゲルのパターニングは失敗し易くなる。
【００３６】
幾つかの実施形態においては、第２層の表面をパターニングすることでＥＣＭハイドロゲルを受け入れるためのローディングチャネルを画成する一方で、第１層の表面をパターニングすることで同一の高さを有する複数の構造体を構成させ得る。これらの複数の構造体は、マイクロチャネルの幾何学構成を画成する。これらの構造体の高さは、マイクロチャネルの深さを定義し得る。
【００３７】
ローディングチャネル及びマイクロチャネルの幾何学構成が一旦決定されたならば、第１層と第２層とを組み合わせてデバイスを形成、すなわちＥＣＭハイドロゲルをパターニングするためのテンプレートを形成し得る。様々な実施形態において、第１層は上層としての役割、第２層は底層としての役割を果たし得て、まず第１層を第２層の上に位置合わせし、次に複数の構造体を有する第１層の表面をローディングチャネルに向けて、第２層に直接取り付ける。この文脈において、「組み合わせる」とは、ＥＣＭハイドロゲルがデバイスから漏出しないように２つの層を取り付ける任意の形態のことである。つまり、第１層は第２層上に取り付け得る。非限定的な例において、第１及び第２層はプラズマ処理で接合し得る。
【００３８】
２つの層を取り付けると、開放チャンバが画成され得る。この開放チャンバは、ローディングチャネルに向かって及び／又は内へと突出した複数の構造体の存在のせいで断面積が減少した１つ以上の領域を有し得る。断面積は、開放チャンバ全体の長さ全体にわたるものになり得る。
【００３９】
断面積が減少した１つ以上の領域においては、これら狭くなった領域で生じる表面張力により、ローディングチャネルに供給されたＥＣＭハイドロゲルをこれらの領域に閉じ込め得る。続いて、ＥＣＭハイドロゲルを硬化させると（すなわち、重合又は架橋させる）、（ＥＣＭハイドロゲル及び第１層の複数の構造体により画成される）灌流チャネルを開放チャンバ内に形成し得る。したがって、幾つかの実施形態において、第１層のパターニングが施された表面は、ローディングチャネルに向かって延びる同一の高さを有する複数の構造体を備えることができ、同一の高さを有する複数の構造体及びローディングチャネルは、断面積が減少した１つ以上の領域を画成し得、その領域に細胞外基質ハイドロゲルを充填すると灌流チャネルが形成される。
【００４０】
開放チャンバ内に形成された灌流チャネルには細胞を播種することができ、あるいは上記灌流チャネルを各種研究に利用可能な血管モデルに変化させることができる。様々な実施形態において、灌流チャネルは少なくとも幅１００μｍになり得る。幾つかの例において、灌流チャネルは幅１００〜１０００μｍになり得る。灌流チャネルの幅はマイクロチャネルの幅から導き得る。幅１００μｍ未満のマイクロチャネルを使用する場合、灌流チャネルが正しく形成されない場合がある。ＥＣＭハイドロゲルが、充填された領域からあふれ易いからである。
【００４１】
灌流チャネルは第１層の幾何学構成をとり得る。幾つかの例において、灌流チャネルはＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成し得る。
他の実施形態においては細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスも提供され、このデバイスは、少なくとも１つのマイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための基板とを備え、この基板はローディングチャネルを備えず、第１層は基板上に取り付けられ、パターニングされた表面は基板に面し、パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、細胞外基質ハイドロゲルを、この断面積が減少した１つ以上の領域に充填することで開放チャンバに少なくとも１つの灌流チャネルを形成する。上記の実施形態に関わる特定の利点は、他の実施形態にも適用することができ、その逆も考えられる。
【００４２】
しかしながら、これらの実施形態は、第２層を用いない点で前に説明した実施形態とは異なる。代わりに、第２層を、今度はローディングチャネルを有さない基板（すなわち、表面をパターニングしてローディングチャネルを形成しなくていい）に置き換える。これにより２つの別々の層をパターニングする必要がなくなる。代わりに、上述したように、血管マイクロチャネル及びローディングチャネルのデザインは１つの第１層だけに刻まれ得る。
【００４３】
基板は光学透過性であってもよく、すなわち一部又は全ての光を通すことができる。光学的透過性基板は透明又は半透明であり得る。有利には、この光学的透過性基板は、より高倍率、より良好な解像度でもってイメージングを向上させる。この光学的透過性基板はカラーガラス又はスライドガラス等であり得る。光学的透過性基板は平坦な表面を有し得る。
【００４４】
これらの実施形態における本デバイスの他の部品は、上述の前の実施形態と同様であり得る。これらの実施形態のデバイスも第１層を有し得る。第１層はＰＤＭＳ、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン又はシリコンを含み得る又はこれらの材料からなり得る。第１層は、上述した幾何学構成のいずれかをとるマイクロチャネルも有し得る。例えば、マイクロチャネルは、Ｔ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成し得る。
【００４５】
しかしながら、これらの実施形態においては第１層を異なる形でパターニングし得るため（すなわち、血管マイクロチャネル及びローディングチャネルのデザインの両方を取り入れる）、２つ以上のマイクロチャネルを第１層に形成し得る。これらの実施形態においては、両方のデザインを取り込むように第１層の表面を変更し得るため、有利には、刻印可能な第２（例えば、ＰＤＭＳ）層の代わりに基板を使用し得る。
【００４６】
第１層のパターニングの変化形に関して、パターニングを施した第１層の表面は、例えば、基板から遠ざかる方向に延びる、異なる深さを有する複数の凹部を備えてもよく、異なる深さを有する複数の凹部及び基板が、細胞外基質ハイドロゲルを充填し得る断面積が減少した１つ以上の領域を画成して少なくとも１つの灌流チャネルを形成し得る。
【００４７】
幾つかの他の例において、パターニングを施した表面は、基板から遠ざかる方向に延びる同一の深さを有する複数の凹部を備えてもよく、同一の深さを有する複数の凹部及び基板が、細胞外基質ハイドロゲルを充填し得る断面積が減少した１つ以上の領域を画成して少なくとも１つの灌流チャネルを形成し得る。
【００４８】
第１層のパターニングの違いにも関わらず、形成された少なくとも１つの灌流チャネルは依然として少なくとも１００μｍの幅又は１００〜１０００μｍの幅になり得る。少なくとも１つの灌流チャネルは第１層の少なくとも１つのマイクロチャネルの幾何学構成をとることができ、例えばＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する。
【００４９】
本開示においては、細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするための方法がさらに提供され、この方法は、上記の実施形態のいずれかに記載のデバイスを用意し、細胞外基質ハイドロゲルをデバイスにロードし、デバイスの断面積が減少した１つ以上の領域において細胞外基質ハイドロゲルを重合させることでデバイスの開放チャンバにおいて少なくとも１つの灌流チャネルを形成することを含む。この方法は、有利には、ＥＣＭハイドロゲルをパターニングするための上述の実施形態で説明したデバイスに用い得るという点で万能である（第２層を使用するか基板を使用するかに関わらず）。
【００５０】
上述の本デバイスの様々な実施形態に関わる利点は本方法にも適用することができ、その逆も考えられる。
本方法は特に、使用する本デバイスにより、ＥＣＭハイドロゲルを様々な幾何学構成にパターニング可能である。
【００５１】
幾つかの実施形態においては、本方法で第１層及び基板を利用する場合、第１層と基板とを位置合わせする必要はなくなり得る。フォトリソグラフィ中、血管マイクロチャネル及びローディングチャネルのパターンを並列させるからである。これに関し、有利には、１つの層上にローディングチャネル及びマイクロチャネルを作り出すことができる２段階リソグラフィを用い得る。様々な実施形態において、本方法では、第１層に少なくとも１つのマイクロチャネルが形成され得る。
【００５２】
幾つかの実施形態においては、デバイスを用意した後、本方法は、ローディングステップに先立って、第１の複数の細胞をＥＣＭハイドロゲルと混合するステップをさらに含み得る。共培養系を構築できることからこれは有利である。
【００５３】
ロードする又は注入するＥＣＭハイドロゲルは、コラーゲン、フィブリンゲル及び／又はエンゲルブレス−ホルム−スウォーム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ：ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物を含み得る。
【００５４】
様々な実施形態において、ＥＣＭハイドロゲルのローディングステップは、４００〜７００Ｐａの圧力で起き得る。ＥＣＭハイドロゲルのローディングは４００Ｐａ未満の圧力では制御が困難になりがちである。７００Ｐａを超えると、ロードしたＥＣＭハイドロゲルが表面張力を克服し、キャピラリーバーストバルブ効果の喪失を引き起こす場合があり、ＥＣＭハイドロゲルは第１層と基板との間の空間全体に広がってしまい、ＥＣＭのパターニングに失敗する。ＥＣＭハイドロゲルを本デバイスの１つ以上の（表面積が減少した）領域に充填した後、重合ステップを３０〜４５℃で２０〜４０分間にわたって行い得る。例えば、３７℃では、ロードしたＥＣＭハイドロゲル（例えば、コラーゲン）は３０分以内に多孔質ゲルを形成し得る。より低温では、ゲル形成にはより時間がかかる（例えば、４℃では最高４８時間）。一方、より高い温度では（４５℃を超える）、ロードしたＥＣＭハイドロゲルの脱水及び収縮が起きる。重合中、ＥＣＭハイドロゲル内では架橋が起き得る。ＥＣＭハイドロゲルの架橋により機械的安定性が上昇し易くなり、インビボの細胞微小環境を模倣した多孔質マトリクスが形成される。
【００５５】
様々な実施形態において、本方法は、細胞外基質ハイドロゲルの重合後に、少なくとも１つの灌流チャネルに第２の複数の細胞を播種するステップをさらに含み得る。これは、共培養系を必要とする場合に行い得る。そうではないならば、上述の第１の複数の細胞は不要となり得る。
【００５６】
細胞の成長又は増殖を促進するために、本方法は、第２の複数の細胞を播種する前に、少なくとも１つの灌流チャネルに細胞接着剤をコーティングするステップをさらに含み得る。幾つかの例において、この細胞接着剤はＥＣＭハイドロゲルと同一の材料から構成することができ、これはそのような材料は細胞の播種も促進し得るからである。幾つかの実施形態において、細胞接着剤はフィブロネクチンを含み得る又はフィブロネクチンから成り得る。様々な実施形態において、細胞接着剤はフィブロネクチン、タイプＩコラーゲン、ゼラチン又はエンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物を含み得るか、又はこれらから成り得る。
【００５７】
上述の方法を一連のステップ又は事象として例示、説明してきたが、そのようなステップ又は事象はどんな順序でもよく、限定的に解釈されないものと理解されたい。例えば、一部のステップは、本明細書で例示及び／若しくは説明したものとは異なる順序で並びに／又は他のステップ若しくは事象と同時に起き得る。加えて、本明細書に記載の１つ以上の態様又は実施形態を実行するのに例示した全てのステップが必要というわけではない。また、本明細書で説明したステップの１つ以上は１つ以上の別々の段階及び／又は局面で行い得る。
【実施例】
【００５８】
本開示は、マイクロ流体血管研究用の、細胞外基質（ＥＣＭ）ハイドロゲルの迅速な三次元パターニングのための方法に用いるデバイス及びその方法自体に関する。本デバイス及び方法、またその用途については以下の実施例において説明する。
【００５９】
実施例１ａ：デバイスのデザイン
２層のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）デバイスはＥＣＭハイドロゲルローディングチャネル（底側）と、ＥＣＭをパターニングするためのテンプレートとして機能する血管マイクロチャネルデザイン（上側）とから成る（図１ａ）。各ＥＣＭローディングチャネルには複数対のゲルローディングポート（入口及び出口）がデザインされ、デザインの複雑さは、最終的な灌流チャネルの形成に必要なＥＣＭ壁の数に左右される。例えば、直線又は蛇行形状の灌流チャネルは、その形状を画成するために２つのＥＣＭ領域を必要とし、２対のゲルローディングポート（各チャネル側に１つ）を有する。同様に、Ｔ字路又はＹ字路形状では３つのＥＣＭ領域を必要とし、３対のゲルローディングポートを有し得る（図２ｃ参照）。
【００６０】
図１ｂは、ＥＣＭハイドロゲルローディング／パターニングの概略図である。マイクロチャネルデザインの上側のテンプレート（第１層）１００を底側のＥＣＭローディングチャネル（第２層）１０２上に位置合わせし、プラズマ接合／処理（１）により取り付ける。これにより断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバ１０４が形成される。ＥＣＭハイドロゲルをロードすると（２）、開放チャンバ（すなわち、断面積は減少）により、ロードされたＥＣＭハイドロゲル１０６は、表面張力ゆえに、開放チャンバ内の断面積が減少した１つ以上の領域に閉じ込められる。したがって、ロードしたＥＣＭハイドロゲル１０６は断面積が減少した領域だけに充填される。その後、ロードしたＥＣＭハイドロゲル１０６を３７℃で約３０分間にわたって静置することで（ＥＣＭハイドロゲルを重合させるための重合ステップ３としての役割も果たす）灌流チャネル１０８を形成する。次に、血管細胞１１０を灌流チャネル１０８に播種し（４）、２〜４日間にわたって培養する（５）。
【００６１】
要約すると、微細加工されたＥＣＭローディングチャネル（例えば、深さ１５０μｍ）及び血管マイクロチャネルデザイン（例えば、深さ１５０μｍ）を位置合わせし、プラズマ処理を用いて接合する。マイクロチャネルデザイン（上層）により、表面張力ゆえにＥＣＭハイドロゲルが閉じ込められる境界が画成され、ＥＣＭ側壁により境界が定められる灌流チャネルが形成される。ＥＣＭハイドロゲルを重合させた後、血管細胞を灌流チャネルに播種し、約２〜４日間にわたってコンフルエントになるまで成長させる。図２ａ〜図２ｄは、様々な幾何学形状のマイクロチャネルデザインテンプレートと位置合わせされたＥＣＭローディングチャネルを示す。概念を実証するために、タイプＩコラーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を使用してＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状及びフィレットを付けたＹ字路形状の灌流チャネル（例えば、チャネル幅５００μｍ）を形成した。
【００６２】
この実施例に記載の方法を用いると、架橋した（又は重合させた）ＥＣＭ壁は、ＦＩＴＣコラーゲンの使用により立証されるように、きれいに画成された（図３ａ〜３ｄ参照。ＦＩＴＣはフルオロセインイソチオシアネートを表す）。静置インビトロ細胞培養のために、血管細胞（ＨＵＶＥＣ）を灌流チャネルに播種した。必要ならば、系においてフロー灌流も確立できる。
【００６３】
実施例１ｂ：デバイスの調製
上側の血管マイクロチャネルデザインテンプレートと底側のＥＣＭローディングチャネルテンプレートの調製について説明する。
【００６４】
２層ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、ダウコーニング社）オンチップ血管モデルを、標準的なフォトリソグラフィ及びソフトリソグラフィ手順を用いて作製した。簡単に説明すると、ＰＤＭＳプレポリマーを硬化剤と１０：１の比（ｗ／ｗ）で混合し、パターニングを施したシリコンウェハテンプレート上に注いだ。混合物を８０℃の炉で２時間にわたって硬化させ、ウェハから慎重に剥離した。注入口（１．５ｍｍ）を上層に、バイオプシーパンチャを用いて形成した。ＰＤＭＳ層を位置合わせすることで高さに違いが生じ（チャネル拡大）、チャネル交差部は合わせて３００μｍの高さ又は深さを有する。高さは各ＰＤＭＳ層の切断片から光学顕微鏡を用いて測定した。
【００６５】
実施例２：パターニングを施したＥＣＭハイドロゲルにおける拡散効果
生理学的な微小環境を模倣するために、ＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤａ）をＹチャネルに導入し、マイクロチャネルに近いＥＣＭ領域における拡散効果を研究した。安定した拡散勾配が最初の１時間以内に確立され、長時間にわたる細胞培養中、維持された（図４ａ及び図４ｂ）。これは、平滑筋細胞、線維芽細胞及び周皮細胞を含めた他の血管関連細胞タイプをＥＣＭハイドロゲル内に播種して共培養系を作り出せることを意味している。細胞間の伝達は多孔質ＥＣＭを介した生体分子の拡散により確立され、細胞間の相互作用（細胞の遊走、血管新生）は、ＥＣＭ内で直接可視化できる。
【００６６】
実施例３：パターニングを施したＥＣＭハイドロゲルにおける血管網の発達
この実施例においては、パターニングを施したＥＣＭマイクロデバイスにおけるよく発達した血管網を実証するために、ＨＵＶＥＣを灌流チャネルにおいて２〜４日間にわたって培養し、チャネル底部にコンフルエントな単層を形成した。共焦点イメージングを行うことで、ＥＣＭ側壁に沿ってＨＵＶＥＣ単層が存在することを確認した（図５ａ及び図５ｂ）。これは、内皮単層を介したバリア透過性及び白血球の血管内移動を含めた内皮バリア機能の研究にとって重要である。
【００６７】
実施例４：マイクロチャネルの寸法及びハイドロゲルタイプの効果
ＥＣＭパターニングの方法は、キャピラリーバーストバルブ（ＣＢＶ）効果により引き起こされる表面張力をベースにしている点で有利である。ＣＢＶは流体力学的現象であり、流れる液体をマイクロチャネルの広がりで固定する。本方法は、ｘ−ｙ面（水平）でのチャネルの広がりの代わりにｚ軸（垂直）に沿ってＣＢＶを利用することで連続的なＥＣＭ壁のパターニングを実現する点が特徴的である。本方法におけるパターニング精細度をまず、異なる寸法のマイクロチャネルを用いてキャラクタリゼーションする。
【００６８】
ＦＩＴＣ含有コラーゲンを、異なるマイクロチャネル幅のデバイスに導入した（図６ａ）。幅が広いチャネル（２００μｍ、５００μｍ及び１０００μｍ。１５０μｍの一定のチャネル高さ又は深さ）の場合、再現性は極めて高かった。しかし、チャネル幅が１００μｍの場合、ローディング中、慎重にしないと、両側（開放チャンバの断面積が減少した領域）からコラーゲンゲルが張り出して灌流チャネルを封止してしまう傾向がある。そのため、この方法を用いたＥＣＭパターニングの下限は１００μｍとした。本開示において、「高さ」又は「深さ」という語の使用は、測定値がチャネルを画成している構造体の高さを指すのか、チャネルの深さを指すのかに依存する。例えば、寸法を構造体について定義する場合は「高さ」を用い得る。寸法を凹部について定義するならば、「深さ」を用い得る。
【００６９】
マイクロチャネルの高さ又は深さがＥＣＭパターニングの成功に及ぼす影響を研究するために、異なる高さ又は深さ（５００μｍの一定チャネル幅で２５μｍ、５０μｍ及び１５０μｍ）を有するマイクロチャネルのキャラクタリゼーションも行った。これを視覚化するために、チップをｘ軸に沿ってスライスし（Ｘ−Ｘ’）、チャネル切断面をカバーガラス上に接着した。図からわかるように（図６ｂ）、ＥＣＭパターニングは、上層（すなわち、第１層）におけるマイクロチャネルの高さ又は深さに依存しなかった。
【００７０】
２つのパラメータをさらに定義した（図６ｃ参照）。２つのパラメータとは、（上部マイクロチャネルの端部からの）膨らみの中心での最大ゲル距離Ｄ及び底面に沿ったゲル距離ｄである。印加されるゲルローディング圧力が増大するにつれて（Ｐａ）、膨らみ距離（Ｄ及びｄ）は増大するが、ゲルは上面に固定されたままであることが観察された（図６ｃ）。加えて、膨らみ距離は上面との接触角との強い線型性を示し、これはヤング−ラプラスの方程式と一致した。Ｄについて約５０μｍの最大値も観察された。これはこれまでの観察結果と同様であり、また約１００μｍの最小チャネル幅にも対応した（図６ｃ）。
【００７１】
最後に、他の一般的に用いられるＥＣＭ、例えばフィブリン（すなわち、フィブリンゲル）及びエンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物（すなわち、マトリゲル）でもデバイスをうまくパターニングできたことから、本方法はハイドロゲルタイプに依存しないことが実証された（図７参照）。
【００７２】
実施例５：本方法及びデバイスを用いたオンチップ血管
パターニングを施したＥＣＭマイクロデバイスにおいて血管網が十分に発達することを実証するために、ＨＵＶＥＣを灌流チャネルにおいて約２〜３日にわたって培養し、コンフルエントな単層をチャネル全体にわたって三次元で形成した。共焦点イメージングを行うことで、ＥＣＭ側壁に沿って無傷且つ連続的なＨＵＶＥＣ単層が形成されたことを確認した（図８）。組織内への分子のサイズ選択的拡散及びホメオスタシスの維持等の重要な機能を果たすにあたってはインビボにおいて内皮バリアが無傷である必要があるため、このことは極めて重要である。
【００７３】
コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層が一旦形成されたならば、ＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン（４０ｋＤａ及び１０ｋＤａ）を灌流チャネルにロードし、静的条件下でのＨＵＶＥＣバリア透過性を試験した（図９ａ参照）。有効バリア透過性（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：ＥＰ）は、以下の方程式：
【００７４】
【数１】
2019531731.tif 000003
【００７５】
で表されるフィックの法則を用いて、１時間後のＦＩＴＣ−デキストランの蛍光強度から計算した。
式中、Ｉｂは開始時のバックグラウンド強度であり、Ｉ０は開始時の特定の部位の平均蛍光強度である。Ｉ６０は１時間後の同一部位での平均蛍光強度であり、Ｗはセンチメートルでのチャネルの幅であり（すなわち、ＥＣＭローディング後の灌流チャネル）、Ｔは秒での合計時間である。
【００７６】
予想通り、ＦＩＴＣデキストランはサイズ選択的に拡散し、より小さい分子はより大きく拡散した（図９ｂ参照）。さらに、これらの有効バリア透過性値（６．９３×１０−６ｃｍ／ｓ（１０ｋＤａデキストラン）対３．０１４×１０−６ｃｍ／ｓ（４０ｋＤａデキストラン、ｐ＜０．０１）は報告された結果と一致した。
【００７７】
さらに、脈管構造を強力な炎症マーカーである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍ）を使用して処理することで、本方法及びデバイスを用いて炎症誘発性の血管漏出性を研究した。正常な脈管構造と比較して、炎症により、血管漏出性における顕著な変化が観察された（正常なＥＣの場合：３．０１４×１０−６ｃｍ／ｓ対炎症を起こしたＥＣの場合：７．９×１０−６ｃｍ／ｓ。ｐ＜０．０１）（図９ｃ参照）。
【００７８】
灌流中の脈管構造の完全性も、蛍光タグ付けした２μｍのビーズを３ダインｃｍ−２（０．３Ｐａ）の壁ずり応力で灌流させることで評価した（図９ｄ参照）。デキストラン拡散アッセイと同様に、炎症により、ビーズの通過において顕著な増加（約２倍）が観察された（図９ｅ参照）。そのような漏出性の血管は、がん及びアテローム性動脈硬化等の病態においては命に関わる。
【００７９】
正常な及びＴＮＦ−α処理したＥＣ（ｎ＝４）についての蛍光スペクトルの半値全幅（ＦＷＨＭ）のキャラクタリゼーションを図９ｆに示す。
上記の結果は、本モデル及びデバイスが、静置及び灌流培養における病理学的状態を研究するためのマイクロ流体モデルの開発に有用であることを強調している。
【００８０】
実施例６ａ：走化性を研究するための本方法及びデバイスの使用
好中球経内皮遊走（走化性）は、身体の自然免疫応答の１つとして、感染部位に好中球が遊走する生理学的プロセスである。この重要なプロセスを再現することで、本脈管構造モデルの生理学的関連性をさらに解明する。
【００８１】
ケモアトラクタントであるＮ−ホルミルメチオニン−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ、５００ｎＭ）をＥＣＭチャンバのゲルポートに導入し、コラーゲンゲルを経て灌流チャネルへと拡散させた。ＦＩＴＣ色素をｆＭＬＰと共に添加して勾配を視覚化した。安定した勾配が８時間にわたって得られた（図１０ａ及び図１０ｂ参照）。全血からの好中球をディーン・フロー分画を用いて精製し、ｆＭＬＰをＥＣＭポートに導入してから２時間後に内皮化脈管構造内に導入した。ＴＮＦ−αを用いて灌流チャネル内のＨＵＶＥＣに炎症を引き起こすことで、好中球との相互作用を強化した。ｆＭＬＰの存在下、好中球は漏出性のＨＵＶＥＣ単層を通ってコラーゲン内へと、ケモアトラクタントの濃度が高くなる方向へと遊走した（図１０ｃ）。好中球の遊走をリアルタイムで４時間にわたってモニタリングしたところ、ｆＭＬＰ勾配により、顕著な好中球の遊走が観察された（図１０ｄ）。リスク評価のマーカーとしての好中球又は免疫細胞の機能不全のエビデンスが特に糖尿病等の疾患において増えることから、そのようなモデルは、疾患研究において、好中球及び他の血液細胞の機能の分析に有用であることがわかる。
【００８２】
実施例６ｂ：平滑筋細胞（ＳＭＣ）及びＨＵＶＥＣの共培養
この実施例においては、血管周囲細胞を、脈管構造を取り巻くＥＣＭ内部において３Ｄで培養した。大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ、ロンザ社）をコラーゲンと混合し、チップに導入し、続いてＥＣを灌流チャネル内でコンフルエントになるまで培養した。細胞を３日間にわたって培養し、共焦点イメージングを行うことで、内皮化灌流チャネル周囲の周囲脈管構造（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）の三次元定位を視覚化した（図１１ａ）。これまでの研究は、血管の完全性の維持における周囲脈管構造の役割を実証している。
【００８３】
次に、炎症時のＳＭＣの存在下でのＨＵＶＥＣ単層の血管完全性を分析した。明らかに、ＳＭＣの存在により、炎症を起こしたＨＵＶＥＣ単層の拡散透過性が４０ｋＤａデキストランまで低下した（図１１ｂ）。
【００８４】
これらの結果が正しいことをさらに確認するために、ＳＭＣをチップの一部で培養し、残りの部位はＳＭＣ不在とした（図１１ｃ）。これらの系のバリア透過性を炎症下で試験した。これまでの観察結果と一致して、ＳＭＣ不在部位では漏出性が高かった（図１１ｄ）。これらの結果は、臓器の機能研究及び薬剤試験のための様々なオンチップ臓器モデルの作製に必要な複数の細胞タイプの共培養系を作り出すのに使用するマイクロ流体脈管構造モデルの開発に関し、本方法及びデバイスには柔軟性があることを示している。
【００８５】
実施例７：本方法及びデバイスを用いた循環器疾患用の３Ｄ生体模倣モデル
ＥＣＭパターニング技法を包括的にキャラクタリゼーションした後、本方法を応用することで、動脈硬化性プラークを模倣した狭窄した微小血管系モデルを開発する（図１２ａ）。血管の狭窄（狭くなること）はアテローム性動脈硬化における重要な段階であり、血流の異常やせん断による内皮機能不全が起きる。本ＥＣＭパターニング技法は、マイクロチャネルデザインを変化させることで、チャネルに様々な狭窄部を作り出すのに用いることができる。開発した狭窄チャネルの意義は、ＦＩＴＣコンジュゲート２μｍビーズの１０ダインｃｍ−２（１Ｐａ）の入口壁ずり応力、狭窄度８０％の灌流チャネルでの灌流をＰＤＭＳ及びコラーゲン製の狭窄部の場合で比較することでわかる。ＰＤＭＳ狭窄部ではビーズの蓄積が観察されないが、コラーゲンにパターニングを施したチャネルの近位縁には大量のビーズが蓄積された（図１２ｂ）。これは、おそらくは、狭窄部の近位側の多孔質コラーゲンゲルを通る対流によってビーズとゲルとの接触が促されるからである。同一の実験でチャネルの狭窄部を変化させたが、他のチャネル狭窄部ではビーズの蓄積は観察されず（図１２ｃ）、アテローム性動脈硬化の研究におけるチャネルの形状の重要性を示している。
【００８６】
実施例８：本方法及びデバイスを用いた全血灌流研究
この実施例においては、ヒトの全血（生理食塩水で３倍に希釈してＥＣＭ完全性を維持）をコラーゲン製狭窄チップに灌流させた（図１３ａ）。まず、細胞相互作用の影響を排除し、またコラーゲン−狭窄誘発性の流れの悪さが血液細胞に及ぼす影響を理解するために全血をＨＵＶＥＣの不在下で灌流チャネルに灌流させた。細胞の付着は、狭窄部の上流領域でも下流領域でも観察されなかった。ただし、狭窄部の近位縁では、顕著な血小板の蓄積が観察された（図１３ｂ）。さらに、狭窄度５０％の場合より狭窄度８０％の場合により多くの血小板の蓄積が観察された。この効果は、狭窄度５０％の場合よりチャネル狭窄度８０％の場合のほうがずり応力により血小板がより活性化されるからであると考えられる。
【００８７】
次に、全血を、内皮化された狭窄度８０％のコラーゲン灌流チャネルに１ダインｃｍ−２（０．１Ｐａ）で灌流させた。１５分後、正常な内皮では最小限の白血球付着が観察された。しかしながら、ずり応力による活性化により、狭窄部周囲の内皮に血小板が付着した（図１４ａ）。対照的に、全血を１ダインｃｍ−２（０．１Ｐａ）で１５分間にわたって炎症を起こさせた（ＴＮＦ−α）内皮に灌流させると白血球−内皮相互作用は増加した（ローリング及び付着）。しかしながら、流量が１０ダインｃｍ−２（１Ｐａ）に増加すると、白血球−内皮相互作用は減少するが、対応して、狭窄部の近位及び遠位縁で血小板の付着の増加が見られた（図１４ｃ及び図１４ｄ）。狭窄部の近位縁での２μｍのビーズの蓄積と同様に、血小板の著しい蓄積が観察された。これは、多孔質コラーゲン狭窄部に沿って対流が存在するという仮説を裏づける。以上の結果を考慮すると、本ＥＣＭパターンモデルは、液体細胞診で重要な全血灌流実験の信頼できるサポートとなることが実証される。そのようなアテローム性動脈硬化モデルは、アテローム性動脈硬化の進行、単球−内皮相互作用並びに薬剤試験及び個別化医療のためのプラットフォームを研究するための疾患モデルとしても使用できる。
【００８８】
実施例９：本方法及びデバイスのさらなる変化形
上記の作製手順のさらなる変化形（２層ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップ）では、キャピラリーバーストバルブ（ＣＢＶ）効果に必要な異なる高さ又は深さを作り出すために２段階フォトリソグラフィを利用する［図１５ａ（本方法）及び図１５ｂ（変形法）参照］。
【００８９】
図１５ａに示す本方法によりマイクロ流体チップを作製するためには、パターニングを施したＰＤＭＳ上層（第１層）を基板に接合する必要があり、この基板はこの例においては底側ＰＤＭＳ層（第２層）であり得る。この第１のアプローチにおいて、（ＥＣＭローディングチャネルデザインを有する）底側ＰＤＭＳ層は基板として機能する。ＰＤＭＳの２つの層を接合すると、刻み込まれたチャネルデザインが、ＣＢＶ効果により表面張力を発生させるのに必要な複数の高さを有する構造体を画成する。
【００９０】
第１ＰＤＭＳ層（上層）及び平坦な基板を用いたもう一方のアプローチにおいては、第１ＰＤＭＳ層を、２段階リソグラフィを用いて血管マイクロチャネル及びハイドロゲルローディングチャネルデザインの両方を同一シリコンウェハ上に作り出すことで作製し、これらの異なるデザインはＰＤＭＳの単層上に一緒に刻み込まれた。したがって、スライドガラス等の平坦な基板を使用してこのチップを完成させることができる。
【００９１】
簡単に説明すると、後者のアプローチの場合、シリコンウェハにフォトレジスト（ＳＵ−８、マイクロケム社）にスピンコーティングし、紫外線（ＵＶ）（３６５ｎｍ）に曝露することで、ＥＣＭチャンバ用の型を用意した。次に、別のフォトレジスト層を同一Ｓｉウェハ上（ＥＣＭチャンバデザイン上）にスピンコーティングし、マイクロチャネルデザインを位置合わせし、紫外線に曝露することで異なる高さ／深さを有するパターニングを施された型を作製した。最後に、ソフトリソグラフィを用いてＰＤＭＳ素子を作製し、ＰＤＭＳ素子を、カバーガラス又はスライドガラスを含むがこれらに限定されない光学的に透過性の基板に接合することでチップを完成させた。
【００９２】
異なる高さ／深さは（１）基板から遠ざかる方向に延びる同一若しくは異なる深さを有する１つ以上の凹部から又は（２）基板に向かって延びる同一又は異なる高さを有する１つ以上の構造体として作り出すことができるため、この変更例は有利である。これとは別に、この変更例は実施しやすくもあり、以下のようなさらなる利点を有する。（１）上記の方法とは異なり、ＥＣＭローディングチャネル及びマイクロチャネルはフォトリソグラフィ中に並置されるため、位置合わせする必要がない。ＰＤＭＳチップをカバーガラス又はスライドガラスに位置合わせする必要なく、直接接合できる。（２）ＰＤＭＳチップのベースとしてのカバーガラス又はスライドガラスの使用により、より高い倍率及び良好な解像度でイメージングできる。
【００９３】
変更した作製手順の場合の概念実証として、中央にハイドロゲルチャネルを有するチップと、側面にハイドロゲルチャネルを有するチップの２つのチップ構造を作製した（図１６ａ）。これらのチップのハイドロゲルパターン形成能を、ＦＩＴＣ色素含有コラーゲンハイドロゲルをそれぞれのチャネルにロードすることで試験した（図１６ｂ）。
【００９４】
実施例１０：商業的応用
マイクロ流体デバイスにおける迅速なＥＣＭハイドロゲルパターニングのやり方を技術的に発展させることは、組織工学から創薬に至る多数のバイオメディカル応用例にとって商業的に関心が極めて高い。したがって、本方法及び本方法により作製したデバイスは様々なハイドロゲル（コラーゲン、マトリゲル、フィブリン等）に柔軟に応用可能であり、またがん（血管新生）、糖尿病／循環器疾患（脈管形成）及び血液脳関門（バリア透過性）における内皮の機能を研究するための異なる形状を有する内皮化インビトロ血管モデルの作製に使用できる。本明細書で開示の方法及びデバイスで提示される任意の血管形状を形成するためのハイドロゲルパターニングは平易且つ柔軟性があるため、そのような方法及びデバイスは、「オンチップ臓器」及び血管関連の研究に大きな影響を与えることが予想される。
【００９５】
特定の実施形態に言及しながら本発明について具体的に図示、説明してきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細には様々な変更を加え得ることが理解される。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲及び等価物の範囲内の全ての変更も本発明に包含されるものとする。
【図１ａ】
2019531731.tif 000004
【図１ｂ】
2019531731.tif 000005
【図２】
2019531731.tif 000006
【図３】
2019531731.tif 000007
【図４ａ】
2019531731.tif 000008
【図４ｂ】
2019531731.tif 000009
【図５ａ】
2019531731.tif 000010
【図５ｂ】
2019531731.tif 000011
【図６ａ】
2019531731.tif 000012
【図６ｂ】
2019531731.tif 000013
【図６ｃ】
2019531731.tif 000014
【図７】
2019531731.tif 000015
【図８】
2019531731.tif 000016
【図９ａ】
2019531731.tif 000017
【図９ｂ】
2019531731.tif 000018
【図９ｃ】
2019531731.tif 000019
【図９ｄ】
2019531731.tif 000020
【図９ｅ】
2019531731.tif 000021
【図９ｆ】
2019531731.tif 000022
【図１０ａ】
2019531731.tif 000023
【図１０ｂ】
2019531731.tif 000024
【図１０ｃ】
2019531731.tif 000025
【図１０ｄ】
2019531731.tif 000026
【図１１ａ】
2019531731.tif 000027
【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
2019531731.tif 000032
【図１２ｃ】
2019531731.tif 000033
【図１３ａ】
2019531731.tif 000034
【図１３ｂ】
2019531731.tif 000035
【図１４】
2019531731.tif 000036
【図１５ａ】
2019531731.tif 000037
【図１５ｂ】
2019531731.tif 000038
【図１６ａ】
2019531731.tif 000039
【図１６ｂ】
2019531731.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月12日(2019.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスであって、
マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、
細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための１つ以上のローディングポートと流体連通しているローディングチャネルを備えた第２層とを備え、
前記第１層は前記第２層上に取り付けられ、前記パターニングされた表面は前記ローディングチャネルに面し、前記パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、
前記断面積が減少した１つ以上の領域は、細胞外基質ハイドロゲルを閉じ込めるように構成されていることにより、前記開放チャンバに灌流チャネルが形成される、デバイス。
【請求項２】
前記第１層及び前記第２層の両方が、ポリジメチルシロキサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン又はシリコンを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記マイクロチャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記パターニングされた表面が、前記ローディングチャネルに向かって延びる同一の高さを有する複数の構造体を備え、前記同一の高さを有する複数の構造体及び前記ローディングチャネルが細胞外基質ハイドロゲルを充填する断面積が減少した１つ以上の領域を画成して灌流チャネルを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記灌流チャネルの幅が少なくとも１００μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記灌流チャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスであって、
少なくとも１つのマイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、
細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための基板とを備え、
前記基板はローディングチャネルを備えず、
前記第１層は前記基板上に取り付けられ、前記パターニングされた表面は前記基板に面し、前記パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成し、
前記断面積が減少した１つ以上の領域は、細胞外基質ハイドロゲルを閉じ込めるように構成されていることにより、前記開放チャンバに少なくとも１つの灌流チャネルが形成される、デバイス。
【請求項８】
前記第１層が、ポリジメチルシロキサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ガラス、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン又はシリコンを含む、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記少なくとも１つのマイクロチャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項７又は８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記パターニングされた表面が、前記基板から遠ざかる方向に延びる、異なる深さを有する複数の凹部を備え、前記異なる深さを有する複数の凹部及び前記基板が、細胞外基質ハイドロゲルを限定的に充填する前記断面積が減少した１つ以上の領域を画成して少なくとも１つの灌流チャネルを形成する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記パターニングされた表面が、前記基板から遠ざかる方向に延びる同一の深さを有する複数の凹部を備え、前記同一の深さを有する複数の凹部及び前記基板が、細胞外基質ハイドロゲルを限定的に充填する前記断面積が減少した１つ以上の領域を画成して少なくとも１つの灌流チャネルを形成する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの潅流チャネルの幅が少なくとも１００μｍである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの灌流チャネルがＴ字路形状、蛇行形状、Ｙ字路形状又はフィレットを付けたＹ字路形状を構成する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングする方法であって、
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスであって、
マイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、
細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための１つ以上のローディングポートと流体連通しているローディングチャネルを備えた第２層とを備え、
前記第１層は前記第２層上に取り付けられ、前記パターニングされた表面は前記ローディングチャネルに面し、前記パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成しているデバイスを用意する工程、
細胞外基質ハイドロゲルを前記デバイスにロードする工程、及び
前記デバイスの断面積が減少した１つ以上の領域において細胞外基質ハイドロゲルを重合させることで前記デバイスの開放チャンバにおいて灌流チャネルを形成する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記ロードする工程に先立って、第１の複数の細胞を細胞外基質ハイドロゲルと混合する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ロードする工程が４００〜７００Ｐａの圧力で行われる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記重合させる工程が２０〜４０分間にわたって３０〜４５℃で行われる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞外基質ハイドロゲルの重合後に、前記灌流チャネルに第２の複数の細胞を播種する工程をさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の複数の細胞を播種する前に、前記灌流チャネルに細胞接着剤をコーティングする工程をさらに含み、前記細胞接着剤が、フィブロネクチン、タイプＩコラーゲン、ゼラチン又はエンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状タンパク質混合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングする方法であって、
細胞外基質ハイドロゲルをパターニングするためのデバイスであって、
少なくとも１つのマイクロチャネルを画成するようにパターニングされた表面を備えた第１層と、
細胞外基質ハイドロゲルを受け入れるための基板であって、ローディングチャネルを備えない基板とを備え、
前記第１層は前記基板上に取り付けられ、前記パターニングされた表面は前記基板に面し、前記パターニングされた表面により断面積が減少した１つ以上の領域を有する開放チャンバを画成しているデバイスを用意する工程、
細胞外基質ハイドロゲルを前記デバイスにロードする工程、及び
前記デバイスの断面積が減少した１つ以上の領域において細胞外基質ハイドロゲルを重合させることで前記デバイスの開放チャンバにおいて少なくとも１つの灌流チャネルを形成する工程を含む方法。
【国際調査報告】
2019531731.tif 000041
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2019531731.tif 000043