(57)【要約】本明細書では、膜係留ＩＬ−１２を含むポリペプチドを提供する。本明細書ではまた、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞も提供する。さらに本明細書では、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。また、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞と、Ｔ細胞化学誘引物質誘導性ケモカインとを含む併用治療も提供する。加えて、ＮＫＧ２Ｄを発現するようにＴ細胞を活性化させる方法、及びがんの治療にそれを用いる方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜係留インターロイキン１２（ＩＬ−１２）異種二量体タンパク質であって、
ａ）ＩＬ−１２αサブユニットｐ３５もしくはそれに少なくとも９０％類似するポリペプチドを含む、第１ポリペプチド；
ｂ）ＩＬ−１２βサブユニットｐ４０もしくはそれに少なくとも９０％類似するポリペプチドを含む、第２ポリペプチド；ならびに
ｃ）前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドの末端と融合した膜貫通ドメイン
を含む、前記タンパク質。
【請求項２】
前記第１ポリペプチドが前記膜貫通ドメインと融合している、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記膜貫通ドメインが前記第１ポリペプチドのＣ末端側にある、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記第１ポリペプチドが前記第２ポリペプチドのＮ末端側にある、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記第１ポリペプチドが前記第２ポリペプチドのＣ末端側にある、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、前記第１ポリペプチド、前記膜貫通ドメイン及び前記第２ポリペプチドを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、前記第２ポリペプチド、前記膜貫通ドメイン及び前記第１ポリペプチドを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記膜貫通ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のタンパク質。
【請求項９】
要素ａ）が、ＩＬ−１２αサブユニットｐ３５またはそれと少なくとも９０％同一なポリペプチドであり、要素ｂ）が、ＩＬ−１２βサブユニットｐ４０またはそれと少なくとも９０％同一なポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
リンカーをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号６）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７）を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記リンカーが前記ＩＬ−１２αサブユニットｐ３５と前記膜貫通ドメインとの間にある、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記第１ポリペプチドが、配列番号１に少なくとも９０％類似するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記第１ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記第１ポリペプチドが配列番号１に少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％類似する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記第１ポリペプチドが配列番号１と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％同一である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記第２ポリペプチドが、配列番号４に少なくとも９０％類似するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記第２ポリペプチドが、配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記第２ポリペプチドが配列番号４に少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％類似する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記第２ポリペプチドが配列番号４と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％同一である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２３】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターがさらに、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターとして定義される、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターがさらに、レンチウイルスベクターとして定義される、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されているＴ細胞の集団。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞が、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の発現ベクターを発現する、請求項２６に記載の集団。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞が、腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２６に記載の集団。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２６に記載の集団。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞が腫瘍特異的Ｔ細胞である、請求項２６に記載の集団。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞がさらに、腫瘍関連抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されている、請求項２６に記載の集団。
【請求項３２】
前記（ＣＡＲ）が、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む、請求項３１に記載の集団。
【請求項３３】
前記抗原結合領域がＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである、請求項３２に記載の集団。
【請求項３４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＴリンパ球活性化ドメインである、請求項３２に記載の集団。
【請求項３５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体９、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の集団。
【請求項３６】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ξ膜貫通ドメイン、システイン突然変異型ヒトＣＤ３ξドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む、請求項３２に記載の集団。
【請求項３７】
請求項２６〜３６のいずれか１項に記載のＴ細胞の集団を生産する方法であって、
Ｔ細胞の出発集団を得ること、及び
膜係留ＩＬ−１２を発現するベクターを導入し、それによって、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞の集団を生成すること
を含む、前記方法。
【請求項３８】
前記ベクターが、請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ウイルスベクターがさらに、レンチウイルスベクターとして定義される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
膜係留ＩＬ−１２が２つの恒常的プロモーターの制御下にある、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記恒常的プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
導入することが、電気穿孔を実施することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
導入することが、ウイルス形質導入を実施することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３及びＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質で活性化させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
活性化させることが約１〜２日である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
活性化させることが、前記Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を増加させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
対象のがんを治療する方法であって、膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されたＴ細胞を前記対象に有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項４９】
前記Ｔ細胞が、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載のＴ細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記膜係留ＩＬ−１２が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象がヒトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｔ細胞が自家Ｔ細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｔ細胞が、レンチウイルス形質導入によって、膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作された前記Ｔ細胞を投与した後に、前記対象の肺でのＴ細胞蓄積が少ないかまたは本質的にない、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
レンチウイルス形質導入が、サイトカイン応答症候群（ＣＲＳ）の危険度の低減、全身毒性の低減、及び／または治療の有効性の増大をもたらす、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞の投与に先立って前記対象のリンパ球除去をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
リンパ球除去が、シクロホスファミド及び／またはフルダラビンの投与を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法がさらに、少なくとも１つの追加治療剤を投与することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの追加治療剤が化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法または生物学的療法である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化学療法が、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イホスファミド、シスプラチン、ゲムシタビン、ブスルファン、ａｒａ−Ｃ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記化学療法がドキソルビシンまたはシクロホスファミドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記化学療法が、前記Ｔ細胞に先立って施与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記化学療法が前記Ｔ細胞療法の１５〜２５時間前に施与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｔ細胞及び／または少なくとも１つの追加治療剤が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射もしくは灌流によって投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記がんが結腸癌または肺癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
膜係留ＩＬ−１２を発現している前記Ｔ細胞の投与が、
ＩＦＮγを誘導しない、または
野生型ＩＬ−１２を有するＴ細胞の投与と比較してより低いレベルでＩＦＮγを誘導する、
請求項４８に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＩＦＮγが、血清試料において測定されるものである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｔ細胞の投与がＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及び／またはＣＣＬ１７の発現を誘導する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｔ細胞の投与がＮＫＧ２Ｄ及び／またはＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を誘導する、請求項４８に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｔ細胞の投与が共刺激受容体ＣＤ２８及び／またはＣＤ８０の発現を誘導する、請求項４８に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ｔ細胞の投与が免疫チェックポイント阻害物質の発現を減少させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫チェックポイント阻害物質がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｔ細胞及び／または少なくとも１つの追加療法が１回より多く施与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｔ細胞が前記対象の中の腫瘍の中心またはその近傍にまで透過する、請求項５８に記載の方法。
【請求項７５】
ＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する試験管内方法であって、
（ａ）Ｔ細胞の出発集団を得ること；ならびに
（ｂ）ＮＫＧ２Ｄ発現を誘導するのに十分な期間にわたってＴ細胞の前記出発集団を抗ＣＤ３及びＣＤ８０の存在下で培養し、それによってＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成すること
を含む、前記方法。
【請求項７６】
前記培養がさらに、
（ｉ）Ｔ細胞の前記出発集団を抗ＣＤ３で前処理すること、及び
（ｉｉ）前記Ｔ細胞をＣＤ８０で処理すること
として定義される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
Ｔ細胞の前記出発集団がＣＤ２８陽性である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
Ｔ細胞の前記出発集団がＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
Ｔ細胞の前記出発集団がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
抗ＣＤ３による前処理が１２〜４８時間にわたる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
ＣＤ８０の存在下での培養が１〜５日間にわたる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
抗ＣＤ３がさらに、抗ＣＤ３マイクロビーズとして定義される、請求項７５または請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
ＣＤ８０がさらに、ＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質として定義される、請求項７５または請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
ＣＤ８０による処理がＳＴＡＴ３のリン酸化をもたらす、請求項７５に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｔ細胞がさらに、腫瘍関連抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作されている、請求項７５に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＣＡＲが、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗原結合領域がＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＴリンパ球活性化ドメインである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体９、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ξ膜貫通ドメイン、システイン突然変異型ヒトＣＤ３ξドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
対象のがんを治療する方法であって、請求項７５〜９０のいずれか１項に記載のＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記対象に有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項９２】
前記Ｔ細胞が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の膜係留ＩＬ−１２を発現する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象がヒトである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記Ｔ細胞が自家Ｔ細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記方法がさらに、少なくとも１つの追加治療剤を投与することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記少なくとも１つの追加治療剤が化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法または生物学的療法である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記化学療法が、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イホスファミド、シスプラチン、ゲムシタビン、ブスルファン、ａｒａ−Ｃ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記化学療法がドキソルビシンまたはシクロホスファミドである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記化学療法が、前記Ｔ細胞に先立って施与される、請求項９７または請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記化学療法が前記Ｔ細胞療法の１５〜２５時間前に施与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｔ細胞及び／または少なくとも１つの追加治療剤が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射もしくは灌流によって投与される、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０２】
前記がんが結腸癌または肺癌である、請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４０５，７９６号の利益を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
２０１７年１０月６日に作成した、（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓで測って）９ＫＢである「ＵＴＦＣＰ１３０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名前を付けたファイルに入った配列一覧を本明細書と共に電子出願し、参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、総じて、免疫学及び医学の分野に関する。より詳しくはそれは、Ｔ細胞療法、例えば膜係留ＩＬ−１２によるもの、及びがんの治療のためのその用途に関する。
【０００４】
２．関連技術の説明
自家腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）注入は、難治性メラノーマを有する患者の治療において注目すべき躍進であり、ＢＲＡＦ指向療法またはＣＴＬＡ−４遮断療法に比べてより高い奏効率をもたらした。ほとんどの患者はＴＩＬ移入による奏効を経験するはずである、というのも、ＴＩＬは彼らの腫瘍から単離することができるからである。しかしながら、実際の奏効率は、１０〜１５％の完全奏効率を含めてたったの約５０％しかない（Ｂｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｒａｄｖａｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００５】
ＴＩＬ療法の主な課題は、再注入後のＴＩＬの腫瘍帰巣能の低下、及び腫瘍微小環境の変化である。近年の治験では、十分な腫瘍指向性ＴＩＬ及び好結果な腫瘍寛解を確保するために１．５〜２×１０１１個のＴＩＬが注入された（Ｒａｄｖａｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかしながら、そのような多数のＴＩＬをがん患者へ移入させることはオフターゲットな有害作用を招くことがある。ＴＩＬをより効率的に腫瘍部位へ送達することを可能にする、したがって注入するＴ細胞の数がよりはるかに少なくて済む手法が必要である。
【０００６】
ＴＩＬが腫瘍部位に到達することができない１つの決定的理由は、生体外培養中の腫瘍帰巣特性の喪失であり、このため、新たな療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法として知られる、腫瘍抗原（例えばＣＤ１９）を認識する受容体で操作されたＴ細胞を使用する。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、より具体的には腫瘍細胞を標的とし、血液悪性腫瘍を治療するのに実質的に成功しているが、この場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞は血中及び骨髄中の腫瘍細胞を標的とするものである。しかしながら、固形腫瘍ではＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性に限界がある。固形腫瘍では、その異質性ゆえに、一般的な抗原が欠如している。その上、宿主の前処置が腫瘍間質へのＴ細胞の進入を阻むことが多い。
【０００７】
ＣＡＲ−Ｔ、ＴＩＬ及びＴＣＲ−Ｔ（ＣＴＬ）細胞を含めてＴ細胞療法を固形腫瘍の治療のために用いるには複数の課題があり、これには、抗原または標的に対して特異的なＴ細胞の攻撃を逃れる腫瘍異質性、Ｔ細胞の固形腫瘍内への透過性、免疫抑制環境による浸潤Ｔ細胞の不活性化、及びエフェクターＴ細胞の疲弊が含まれる。このように、固形腫瘍の深部まで透過することができるＴ細胞療法に対する未だ満たされない必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００８】
第１の実施形態では、本開示は、ＩＬ−１２αサブユニットｐ３５（例えば配列番号２）もしくはそれに少なくとも９０％類似するポリペプチドを含む、第１ポリペプチド、ＩＬ−１２βサブユニットｐ４０（例えば配列番号４）もしくはそれに少なくとも９０％類似するポリペプチドを含む、第２ポリペプチド、ならびに第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドの末端と融合した膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む、膜係留インターロイキン１２（ＩＬ−１２）異種二量体タンパク質を提供する。
【０００９】
いくつかの態様では、第１ポリペプチドは膜貫通ドメインと融合している。特別な態様では、膜貫通ドメインは第１ポリペプチドのＣ末端側にある。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは配列番号３と少なくとも９０％同一な配列を含む。特定の態様では、膜貫通ドメインは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
特定の態様では、第１ポリペプチドは第２ポリペプチドのＮ末端側にある。他の態様では、第１ポリペプチドは第２ポリペプチドのＣ末端側にある。特別な一態様では、タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１ポリペプチド、膜貫通ドメイン及び第２ポリペプチドを含む。他の態様では、タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２ポリペプチド、膜貫通ドメイン及び第１ポリペプチドを含む。第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、ＴＭＤ、及び場合によってリンカーは、様々な配置で融合されていてよい。例えば、タンパク質は、限定されないが、ｐ３５−ＴＭＤ−ｐ４０、ｐ４０−ＴＭＤ−ｐ３５、ｐ３５−リンカー−ＴＭＤ−ｐ４０、ｐ４０−リンカー−ＴＭＤ−ｐ３５、ｐ３５−ＴＭＤ−リンカー−ｐ４０、ｐ４０−ＴＭＤ−リンカー−ｐ３５、ＴＭＤ−ｐ３５−ｐ４０、ＴＭＤ−ｐ４０−ｐ３５、ｐ３５−ｐ４０−ＴＭＤ、またはｐ４０−ｐ３５−ＴＭＤなどの配置を含んでもよい。
【００１１】
いくつかの態様では、第１ポリペプチドは、ＩＬ−１２αサブユニットｐ３５またはそれと少なくとも９０％同一なポリペプチドであり、第２ポリペプチドは、ＩＬ−１２βサブユニットｐ４０またはそれと少なくとも９０％同一なポリペプチドである。
【００１２】
特定の態様では、タンパク質はさらにリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号５）を含む。さらなるいくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号６）を含む。さらなるいくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７）を含む。特別な態様では、リンカーはＩＬ−１２αサブユニットｐ３５と膜貫通ドメインとの間にある。
【００１３】
いくつかの態様では、第１ポリペプチドは、配列番号１に少なくとも９０％類似するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、第１ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１ポリペプチドは配列番号１に少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％類似する。特別な態様では、第１ポリペプチドは配列番号１と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％同一である。
【００１４】
特定の態様では、第２ポリペプチドは、配列番号４に少なくとも９０％類似するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第２ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第２ポリペプチドは配列番号４に少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％類似する。特別な態様では、第２ポリペプチドは配列番号４と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％または９６％同一である。
【００１５】
本明細書ではさらに、実施形態の膜係留ＩＬ−１２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書ではまた、膜係留ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。
【００１６】
別の実施形態では、実施形態の膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されているＴ細胞の集団を提供する。特定の態様では、Ｔ細胞は、実施形態の発現ベクター、例えば、膜係留ＩＬ−１２をコードするウイルスベクターを発現し得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。特別な態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は腫瘍特異的Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はさらに、腫瘍関連抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されている。特定の態様では、（ＣＡＲ）は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、抗原結合領域は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである。特別な態様では、細胞内シグナル伝達ドメインがＴリンパ球活性化ドメインである。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体９、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ξ膜貫通ドメイン、システイン突然変異型ヒトＣＤ３ξドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む。
【００１７】
さらなる実施形態は、膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されたＴ細胞の集団を生産する方法であって、Ｔ細胞の出発集団を得ること、及び膜係留ＩＬ−１２を発現しているベクターを導入し、それによって、膜係留ＩＬ−１２を発現するＴ細胞の集団を生成することを含む、当該方法を提供する。特定の態様では、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである。いくつかの態様では、膜係留ＩＬ−１２は２つの恒常的プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の制御下にある。いくつかの態様では、導入することは、電気穿孔を実施することを含む。さらなる態様では、Ｔ細胞は抗ＣＤ３及びＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質で活性化され得る。Ｔ細胞を抗ＣＤ３（例えば、約１日間）で処理した後にＣＤ８０−Ｆｃ（例えば、約１〜５日間、例えば４日間）で処理してもよい。
【００１８】
さらに別の実施形態では、対象のがんを治療する方法であって、実施形態の膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されたＴ細胞を前記対象に有効量投与することを含む、当該方法を提供する。いくつかの態様では、対象はヒトである。特定の態様では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。特定の態様では、方法は、Ｔ細胞の投与に先立って対象のリンパ球除去をさらに含む。特別な態様では、がんは結腸癌または肺癌である。いくつかの態様では、Ｔ細胞及び／または少なくとも１つの追加療法を１回より多く投与する。特別な態様では、Ｔ細胞は対象の中の腫瘍の中心またはその近傍にまで透過する。
【００１９】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、レンチウイルス形質導入によって、膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されている。具体的な態様では、膜係留ＩＬ−１２を発現するように操作されたＴ細胞を投与した後に、対象の肺でのＴ細胞蓄積が少ないかまたは本質的にない。特定の態様では、レンチウイルスによる形質導入は、サイトカイン応答症候群（ＣＲＳ）の危険度の低減、全身毒性の低減、及び／または治療の有効性の増大をもたらす。
【００２０】
いくつかの態様では、リンパ球除去は、シクロホスファミド及び／またはフルダラビンの投与を含む。特定の態様では、方法はさらに、少なくとも１つの追加治療剤を投与することを含む。特定の態様では、少なくとも１つの追加治療剤は化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法または生物学的療法である。いくつかの態様では、化学療法は、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イホスファミド、シスプラチン、ゲムシタビン、ブスルファン、ａｒａ−Ｃ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特別な態様では、化学療法はドキソルビシンまたはシクロホスファミドである。いくつかの態様では、Ｔ細胞に先立って化学療法を施与する。特定の態様では、化学療法をＴ細胞療法の１５〜２５時間前に施与する。特定の態様では、Ｔ細胞及び／または少なくとも１つの追加治療剤を、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射もしくは灌流によって投与する。
【００２１】
特定の態様では、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞の投与は、ＩＦＮγを誘導しないか、または野生型ＩＬ−１２を有するＴ細胞の投与と比較してより低いレベルでＩＦＮγを誘導する。いくつかの態様では、ＩＦＮγは、血清試料または培地において測定されるものである。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及び／またはＣＣＬ１７の発現を誘導する。いくつかの態様では、Ｔ細胞の投与はＮＫＧ２Ｄ及び／またはＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を誘導する。特定の態様では、Ｔ細胞は共刺激受容体ＣＤ２８の発現を誘導する。いくつかの態様では、Ｔ細胞は免疫チェックポイント阻害物質の発現を減少させる。特別な態様では、免疫チェックポイント阻害物質はＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１である。
【００２２】
別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する試験管内方法であって、Ｔ細胞の出発集団を得ること、ならびにＮＫＧ２Ｄ発現を誘導するのに十分な期間にわたってＴ細胞の出発集団を抗ＣＤ３（例えば抗ＣＤ３マイクロビーズ）及びＣＤ８０（例えばＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質）の存在下で培養し、それによってＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することを含む、当該方法を提供する。いくつかの態様では、培養はさらに、Ｔ細胞の出発集団を抗ＣＤ３で前処理すること、及びその後にＴ細胞をＣＤ８０で処理することとして定義される。いくつかの態様では、Ｔ細胞の出発集団はＣＤ２８陽性である。特定の態様では、Ｔ細胞の出発集団はＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞の出発集団はＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の態様では、抗ＣＤ３による前処理は１２〜４８時間、例えば約２４時間にわたる。いくつかの態様では、ＣＤ８０の存在下での培養は１〜５日間、例えば、１、２、３、４または５日間にわたる。いくつかの態様では、ＣＤ８０による処理はＳＴＡＴ３のリン酸化をもたらす。
【００２３】
いくつかの態様では、Ｔ細胞はさらに、腫瘍関連抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作されている。特定の態様では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、抗原結合領域はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインはＴリンパ球活性化ドメインである。特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体９、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ξ膜貫通ドメイン、システイン突然変異型ヒトＣＤ３ξドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む。
【００２４】
さらに本明細書では、対象のがんを治療する方法であって、実施形態のＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象に有効量投与することを含む、当該方法を提供する。さらなる態様では、Ｔ細胞は実施形態の膜係留ＩＬ−１２を例えばレンチウイルスベクターのレンチウイルス形質導入によって発現する。いくつかの態様では、対象はヒトである。特定の態様では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。特別な態様では、がんは結腸癌または肺癌である。
【００２５】
さらなる態様において、方法はさらに、少なくとも１つの追加治療剤を投与することを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの追加治療剤は化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法または生物学的療法である。特定の態様では、化学療法は、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イホスファミド、シスプラチン、ゲムシタビン、ブスルファン、ａｒａ−Ｃ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、化学療法はドキソルビシンまたはシクロホスファミドである。特別な態様では、Ｔ細胞に先立って化学療法を施与する。具体的な態様では、化学療法をＴ細胞療法の１５〜２５時間前に施与する。いくつかの態様では、Ｔ細胞及び／または少なくとも１つの追加治療剤を、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射もしくは灌流によって投与する。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しつつも、単に例示として与えられていることが理解されるべきである、というのも、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるであろうからである。
【００２７】
以下の図面は本明細書の一部を成し、本発明の特定の態様をさらに明らかにするために含められている。本発明は、本明細書において提示する具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】抗ヒトＣＤ３及びＡＦ４８８抗ウサギ抗体で染色されたＡ５４９腫瘍切片。画像は各切片の中央を表す。Ｔ細胞透過はこの腫瘍領域における以下の３つの処置でみられ得る：（１）ドキソルビシン（Ｄｏｘ）処置及びそれに続く増殖Ｔ細胞の注入（Ｄｏｘ＋Ｔ）。（２）ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞（ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ）の注入。（３）ａｔｔＩＬ−１２とそれに先立つＤｏｘによる処置（ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘ）。Ｔ細胞単独（ｐＣｔｒｌ−Ｔ）または野生型ＩＬ−１２改変Ｔ細胞（ｗｔＩＬ−１２−Ｔ）の注入によって処置した腫瘍では検出可能なＴ細胞透過がなかった。
【図２】腫瘍の縁から５ｍｍより大きく隔てて腫瘍の中央に向けて採取したＡ５４９腫瘍切片をＴ細胞染色に供した。画像は各切片の中央を表す。ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞移入とそれに先立つドキソルビシンによる処置のみが、注入Ｔ細胞の腫瘍深部浸潤を示した。
【図３】トランスフェクションから２４時間後のＴ細胞上でのａｔｔＩＬ−１２の発現。トランスフェクトされたＴ細胞をスライド上にスピンコートし、固定し、細胞膜上のＩＬ−１２  ｐ４０について染色した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の７％に膜ａｔｔＩＬ−１２発現が認められた。独立した複数のトランスフェクション試験に基づけば、トランスフェクション効率は３〜１０％の範囲で変動したが治療的有効性の結果はこの範囲内で一貫していた。
【図４】１ｍｌのＲＰＭＩ／Ｃｌｉｃｋ培地中でＴ細胞（２．５×１０６）に２μｇのプラスミドをトランスフェクトし、４時間または２４時間インキュベートした。培地を回収し、ＩＬ１２及びＩＦＮ−γの存在についてＥＬＩＳＡを用いて検査した。ｗｔＩＬ−１２トランスフェクション後の培地では高レベルのＩＬ−１２が検出されたが、ａｔｔＩＬ−１２トランスフェクションでは４時間及び２４時間のどちらの時点においても検出可能でなかった。ｗｔＩＬ−１２をトランスフェクトされたＴ細胞はさらに、ａｔｔＩＬ−１２をトランスフェクトされたＴ細胞に比べてよりはるかに高いレベルのＩＦＮγを産生した。
【図５】示されているＴ細胞移入の後の血清中の炎症性サイトカイン。２回目の処置から４日後に血液を採取し、血清中のＩＬ−６、ＴＮＦα及びＩＦＮγのレベルについてＥＬＩＳＡを用いて試験した。どの処置群においてもＩＬ−６及びＴＮＦαは検出することができない。しかしながら、ｗｔＩＬ−１２−Ｔ細胞移入は、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔとドキソルビシンに比べてより劇的に高い血中ＩＦＮγレベルを誘導した。
【図６】Ａ５４９細胞を皮下接種し、接種後１２日目に記載の１回目の処置（図１参照）に供し、続いて３７及び５８日目にもう２回の処置に供したＮＳＧマウスの腫瘍体積である。対照ＤＮＡ（ｃｔｒｌＤＮＡ）、野生型ＩＬ１２（ｗｔＩＬ１２）または膜係留ＩＬ１２（ａｔｔＩＬ−１２）による改変に続いてＴ細胞処置を、特に明記しない限り全てのマウスに施した。
【図７】結腸癌ＰＤＸ腫瘍を皮下埋植し、腫瘍の直径が６〜８ｍｍに達したときに記載の１回目の処置に供し、続いて２８日目にもう１回の処置に供したヌードマウスの腫瘍体積。対照ＤＮＡ（ｃｔｒｌＤＮＡ）、野生型ＩＬ１２（ｗｔＩＬ−１２）または膜係留ＩＬ１２（ａｔｔＩＬ−１２）による改変に続いてＴ細胞処置を、特に明記しない限り全てのマウスに施した。
【図８】特大（直径１６〜１８ｍｍ）のＰＤＸ腫瘍を対照Ｔ細胞、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンに供した。対照Ｔ細胞療法単独と比較して、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置は腫瘍進行を安定化させた。
【図９】対照または、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置の後に、Ａ５４９腫瘍をＴ細胞誘引性ケモカインのｍＲＮＡ発現について試験した。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ１７はａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンによって腫瘍内に劇的に誘導された。ケモカイン誘導が固形腫瘍内へのＴ細胞の透過を説明している。
【図１０】ｃｔｒｌ−Ｔ細胞、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンの後のＰＤＸ腫瘍をフローサイトメトリーに供して腫瘍浸潤リンパ球上でのＣＤ２８及びＰＤ−１の発現を試験した。ｃｔｒｌ−Ｔ細胞処置と比較してａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンは、共刺激受容体ＣＤ２８発現を誘導すると同時にチェックポイント調節物質ＰＤ−１を減少させ、浸潤リンパ球上の共刺激／共抑制受容体の比率を向上させた。
【図１１】ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞浸潤とドキソルビシンを２回施与することを伴って、または伴わずに、Ａ５４９腫瘍細胞を腫瘍から解離させ、次いでフローサイトメトリーに供して腫瘍細胞膜上でのＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡ、ＵＬＢＰ１及びＵＬＢＰ２の発現を試験した。処置は腫瘍細胞上でのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を誘導したが、これはＮＫＧ２Ｄ免疫監視を強化することができるものであった。
【図１２】ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンの投与を伴うまたは伴わない、ＨＴ２９細胞を接種したＮＳＧマウスの腫瘍体積。ドキソルビシンを３回、１３、２７及び３６日目に投与し、続いて翌日（すなわち、１４、２８及び３７日目）にＴ細胞移入を行った。レンチウイルスａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置は腫瘍体積を最も強く抑制した。
【図１３Ａ】サイトカインの非存在下での生体外培養の間の、Ｔ細胞数（Ａ）、生存率（Ｂ）、及びＴ細胞上でのａｔｔＩＬ−１２（Ｔ−８７０）の発現（Ｃ）。
【図１３Ｂ】サイトカインの非存在下での生体外培養の間の、Ｔ細胞数（Ａ）、生存率（Ｂ）、及びＴ細胞上でのａｔｔＩＬ−１２（Ｔ−８７０）の発現（Ｃ）。
【図１３Ｃ】サイトカインの非存在下での生体外培養の間の、Ｔ細胞数（Ａ）、生存率（Ｂ）、及びＴ細胞上でのａｔｔＩＬ−１２（Ｔ−８７０）の発現（Ｃ）。
【図１４】対照ドキソルビシン、またはドキソルビシンとａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞で処置された大型ＨＴ２９腫瘍を保有するマウスの血液化学。
【図１５】対照、対照ウイルス＋ドキソルビシン、またはレンチウイルスａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞＋ドキソルビシンの単回処置を受けたＨＴ２９腫瘍を有するマウスの腫瘍体積。処置後１日目、３日目及び７日目にマウスを安楽死させてＴ細胞分布を試験した。
【図１６】１、３及び７日目にＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ｄ  Ｔ細胞、ＣＤ２８  Ｔ細胞、ＣＤ３９  Ｔ細胞、及びＣＤ８０の発現を検出した。ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置は、高い百分率でＣＤ８  Ｔ細胞を７日目に、そしてＮＫＧ２Ｄ  Ｔ細胞を３日目及び７日目に示した。
【図１７Ａ】Ａ〜Ｂは、対照、またはａｔｔＩＬ−１２とドキソルビシンで処置されたＨＴ２９腫瘍を有するマウスの血液化学である。
【図１７Ｂ】Ａ〜Ｂは、対照、またはａｔｔＩＬ−１２とドキソルビシンで処置されたＨＴ２９腫瘍を有するマウスの血液化学である。
【図１８Ａ】ＨＴ２９腫瘍保有マウスにおける投与後１日目のＴ細胞分布。対照Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置は肺におけるＴ細胞の高蓄積をもたらした。対照Ｔ細胞及びドキソルビシンの場合に比べて、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞とドキソルビシンで処置したマウスの肺ではＴ細胞の蓄積の減少が認められた。
【図１８Ｂ】ＨＴ２９腫瘍保有マウスにおける投与後３日目のＴ細胞分布。ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞及びドキソルビシンで処置したマウスからの肺にはＴ細胞がごくわずかしか見つからなかった。
【図１８Ｃ】ＨＴ２９腫瘍保有マウスにおける投与後３日目のＴ細胞分布。対照Ｔ細胞とドキソルビシンで処置したマウスの肺にはＴ細胞の陽性染色があるが、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞及びドキソルビシンで処置したマウスからの肺にはＴ細胞が見つからなかった。
【図１９】対照またはａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞による処置の後の１、３及び７日目の、示されている臓器におけるＴ細胞分布。
【図２０】ＣＤ８０結合によって媒介されるＣＤ２８活性化は、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ受容体の持続的発現を誘導する。（Ａ）ＣＤ２８欠損はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の誘導を消滅させた。ＬＬＣ腫瘍保有Ｃ５７ｂｌ／６マウス（ｎ＝３）及びＣＤ２８＋／＋マウスを、ＩＬ−１２  ＤＮＡ（１０ｍｇ／マウス）とドキソルビシン（１ｍｇ／ｋｇ）の２回の投与（１０日間隔）に供した。２回目の投与から４日後にＣ５７ｂｌ／６及びＣＤ２８−／−マウスからそれぞれ脾細胞を単離し、抗マウスＣＤ３、ＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄ抗体で染色して蛍光強度中央値（ＭＦＩ）、及びＮＫＧ２Ｄを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を評価した。ＩＬ−１２とドキソルビシンによる処置は、野生型マウスにおいてＮＫＧ２Ｄ発現を誘導したが、ＣＤ２８−／−マウスでは誘導が認められなかった。（Ｂ）ＣＤ２８−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞上ではなくＣＤ２８＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ８０結合によるＮＫＧ２Ｄ発現の誘導。ＣＤ２９＋／＋またはＣＤ２８−／−マウスから得られた脾細胞を抗ＣＤ３マイクロビーズ及び対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃ（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した。インキュベーションから２４時間後に細胞を抗ＣＤ８＋及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で染色してＭＦＩ、及びＮＫＧ２Ｄを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を評価した。（Ｃ）ＣＤ８０結合の結果として生じるＣＤ２８活性化によるＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ＮＫＧ２Ｄ発現の誘導。ＣＤ２８＋／＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた脾細胞を抗ＣＤ３マイクロビーズで刺激し、対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃで処理した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリー分析のためにインキュベーションから１、２、３、４及び５日後にＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄについて染色した。棒グラフは平均（±平均の標準誤差［ＳＥＭ］）を示す。データは３反復実験について表したものである。
【図２１】ＣＤ８０結合によって媒介されるＣＤ２８活性化はＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体発現を誘導する。（Ａ）ＣＤ２８活性化後のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の誘導。健常ドナーから単離されたＰＢＭＣを抗ＣＤ３マイクロビーズで刺激し、対照ＦｃまたはヒトＣＤ８０−Ｆｃ（１ｍｇ／ｍＬ）で２４時間処理した。ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の中央値（±ＳＥＭ）を示す。（Ｂ）ＣＤ２８に対するＣＤ８０−Ｆｃの結合によるＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ＮＫＧ２Ｄ発現の誘導。健常ドナーから得られたＰＢＭＣを１、２、３、４及び５日間、（Ａ）に記載されているように処理し、フローサイトメトリー分析のためにＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄについて染色した。棒グラフはＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄの平均ＭＦＩ（±ＳＥＭ）を示す（ｎ＝３）。結果は５名の異なる健常ドナーについての結果を表したものである。
【図２２】ＣＤ８０結合によって媒介されるＣＤ２８活性化はマウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上でのｐＳＴＡＴ３発現を上方制御する。マウス脾細胞（Ａ）及びヒトＰＢＭＣ（Ｂ）を抗ＣＤ３マイクロビーズで刺激し、対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃで１５分間、３０分間、１時間または２時間処理し、フローサイトメトリー分析のためにＣＤ８＋及び細胞内ｐＳＴＡＴ３について染色した。ＣＤ８＋Ｔ集団についてｐＳＴＡＴ３発現のＭＦＩ中央値（±ＳＥＭ）を示す（ｎ＝３）。データは３反復実験について表したものである。
【図２３】チロシンキナーゼＬｃｋ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を介してＣＤ８０結合によって媒介されるＣＤ２８活性化の結果として増加するＳＴＡＴ３リン酸化。イムノブロットアッセイによる、ＣＤ２８の活性化及び薬理学的阻害薬による処理がｐＳＴＡＴ、総ＳＴＡＴ及びｂ−アクチンの発現に対して与える影響。マウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３マイクロビーズで刺激し、薬理学的阻害薬ＪＳＩ−１２４（０．１ｍＭ）、ＰＰ２（１ｎＭ）またはＡＧ−４９０（５０ｍＭ）の存在下または非存在下でｃｔｒｌＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃで２４時間処理した。ビヒクル対照が含まれている。示されている強度定量（β−アクチンのＲａｅ−１／強度の強度）は、３反復実験からの平均強度を表す。
【図２４】Ｌｃｋ／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達の遮断は、ＣＤ２８活性化によって媒介されるマウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の誘導を消滅させる。マウス（Ａ）及びヒト（Ｂ）のＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３マイクロビーズで刺激し、薬理学的阻害薬ＪＳＩ−１２４、ＰＰ２またはＡＧ−４９０の存在下または非存在下で対照ＦｃまたはＣＤ８０−ＦＣで２４時間処理した。ＣＤ８０＋ビヒクルはＮＫＧ２Ｄの発現が最も高い。フローサイトメトリーを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞の表面でのＮＫＧ２Ｄ発現を測定した。棒グラフはＮＫＧ２ＤのＭＦＩ中央値（±ＳＥＭ）を示す（ｎ＝３）。データは３反復実験について表したものである。
【図２５】ＣＤ８０−Ｆｃでの処理によるＣＤ８＋Ｔ細胞抗腫瘍細胞溶解活性の増大。（Ａ〜Ｃ）Ｒａｅ−１＋ＬＬＣ細胞への曝露の後のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞による抗腫瘍細胞溶解活性の誘導。腫瘍細胞接種後１４日目に脾細胞をＬＬＣ保有マウスから採集した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を脾細胞から単離し、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはＪＳＩ−１２４の存在下または非存在下で対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃで２４時間処理した。（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＦＳＥ標識ＬＬＣ細胞と共に２５：１（Ｅ：Ｔ）の比で５時間共インキュベートした。細胞培養培地をパーフォリンのＥＬＩＳＡ分析に供した。棒グラフはパーフォリンの正規化濃度中央値（±ＳＥＭ）を示す（ｎ＝３）。（Ｂ）ＬＬＣ腫瘍細胞上でのＮＫＧ２ＤリガンドＲａｅ−１発現のフローサイトメトリー分析。（Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＦＳＥ標識ＬＬＣ細胞と共に５：１、１０：１及び２５：１（Ｅ：Ｔ）の比で５時間共インキュベートした。インキュベート後に細胞をＰＩ（１ｍｇ／ｍＬ）で染色した。光散乱パラメータ及びＰＩ陰性によって標的生細胞を同定した。標的細胞の生存率を、ＣＤ８＋Ｔ細胞とのインキュベートの後に残った正規化標的細胞の百分率として測定した。データは３反復実験について表したものである。（Ｄ）標的細胞への曝露の後のＣＤ８０−Ｆｃ結合によるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞脱顆粒の誘導。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＤ３マイクロビーズと共にインキュベートし、ＳＴＡＴ３阻害薬ＪＳＩ−１２４の存在下または非存在下で対照ＩｇＧまたはＣＤ８０−Ｆｃで２４時間処理した。刺激後にヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＦＳＥ標識標的Ｋ５６２細胞に１：１の比で曝露し、抗ＣＤ１０７ａ抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に４時間共インキュベートした。その後、フローサイトメトリー分析のために細胞をＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄで染色した。棒グラフは、標的細胞への曝露の前及び後のＣＤ１０７ａ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均（±ＳＥＭ）百分率を示す（ｎ＝３）。結果は３名の異なる健常ドナーについての結果を表したものである。
【図２６】ＣＤ８＋Ｔ細胞で前処理されたＣＤ８０の養子移入はＬＬＣ腫瘍モデルにおいて抗腫瘍療法の効果を向上させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＬＬＣ腫瘍保有マウスの脾臓から単離し、抗ＣＤ３と対照Ｆｃ（１ｍｇ／ｍＬ）及び対照ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＣＤ８０Ｆｃ（１ｍｇ／ｍＬ）及び対照ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）、またはＣＤ８０Ｆｃ（１ｍｇ／ｍＬ）及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）で４８時間刺激した。刺激された５×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞をＬＬＣ腫瘍保有マウス（ｎ＝６）に毎週、静脈内注射によって養子移入した。（Ａ）対照Ｆｃと対照ＩｇＧ、ＣＤ８０Ｆｃと対照ＩｇＧ、またはＣＤ８０ＦｃとＮＫＧ２Ｄ遮断抗体による４８時間の処理の後の単離ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現。ＣＤ８０Ｆｃ＋対照ＩｇＧはＮＫＧ２Ｄ発現が最も高く、その後には対照Ｆｃ＋対照ＩｇＧ、ＣＤ８０Ｆｃ＋抗ＮＫＧ２Ｄ、及びアイソタイプ対照が続く。（Ｂ）腫瘍を解離させ、抗マウスＣＤ４５、ＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄ抗体で染色して腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を評価した。棒グラフは中央値（±ＳＥＭ）を示す。（Ｃ）個々の腫瘍体積（左パネル）及び生存期間（右パネル）を週に２回追跡評価した。データは３反復実験について表したものである。対照ＩｇＧ＋ＣＤ８０ＦｃによるＴ細胞処置は最も低い腫瘍体積及び最も高い生存パーセントをもたらし、その後には抗ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８０ＦｃによるＴ細胞処置が続いた。
【図２７】ＣＤ８０−Ｆｃによって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ＮＫＧ２Ｄ発現の模式図である。ＣＤ８０−ＦｃのＣＤ２８との結合はチロシンキナーゼ受容体ＬｃＫの持続的活性化を共刺激し得るが、これは、ＺＡＰ７０を動員して活性化Ｌｃｋ誘導シグナルを増幅するカスケードを誘発する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３はＺＡＰ７０の下流にあり、ＺＡＰ７０によって活性化され、ｐＳＴＡＴ３は核に移行してＮＫＧ２Ｄ発現を誘導する。
【図２８】ＬＬＣ保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８０−Ｆｃによる生体内でのＮＫＧ２Ｄ発現の誘導。ＬＬＣを有するマウス（ｎ＝３）に、対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃ（１０□ｇ）による処置を２週間にわたって週に２回施した。ＬＬＣ腫瘍保有マウスから単離した脾細胞をＣＤ８及びＮＫＧ２Ｄについて染色して、ＭＦＩ、及びＮＫＧ２Ｄを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を評価した。棒グラフは平均（±平均の標準誤差［ＳＥＭ］）を示す。データは３反復実験について表したものである。
【図２９】ＣＤ８＋Ｔ細胞をマウス脾細胞及びヒトＰＢＭＣから濃縮した。濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞をそれぞれ抗マウスＣＤ８抗体（Ａ）または抗ヒトＣＤ８抗体（Ｂ）で染色したフローサイトメトリーに供して精製効率の妥当性を確認した。
【図３０】ＪＳＩ−１２４処置後のＣＤ８＋Ｔ細胞生存率。新しく濃縮したマウス（Ａ）及びヒト（Ｂ）のＣＤ８＋Ｔ細胞をビヒクル対照またはＪＳＩ−１２４（０．１μＭ）で１、２、３及び４日間処理した。７−ＡＡＤ染色後にフローサイトメトリーで細胞生存率を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
固形腫瘍におけるＴＩＬまたは改変型Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）からの抗腫瘍活性の欠失は主に、腫瘍細胞の異質性、及び腫瘍指向性抗原の存在にもかかわらず腫瘍内への浸潤が欠如していること、ならびに浸潤Ｔ細胞の不活性化に起因している。したがって、いくつかの実施形態において本開示は、注入されたＴ細胞を異質性のある固形腫瘍の中へと透過させる方法を提供する。具体的には、本明細書では、注入されたＴ細胞の固形腫瘍内への透過を促すことができる膜係留腫瘍指向性ＩＬ−１２（ａｔｔＩＬ−１２）を提供する。本明細書ではさらに、ａｔｔＩＬ−１２を含んでいるＴ細胞の集団（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲを有するＴ細胞、または腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、及び上記改変型Ｔ細胞集団を投与することによってがんを治療する方法を提供する。さらに、Ｔ細胞を対象の血液から単離する方法、ａｔｔＩＬ−１２で改変する方法、及び対象に投与する方法も提供する。加えて、対象を予めドキソルビシンまたは他のＴ細胞動因誘導物質で処置してもよい。
【００３０】
本開示における試験は、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞による処置が、固形腫瘍へのＴ細胞浸潤を増強するのみならず、Ｔ細胞誘引性ケモカインのレベルも上方制御し、結果としてＴ細胞を腫瘍微小環境へと誘引し、共刺激／共抑制受容体の比率を向上させることによって浸潤Ｔ細胞の持続性を強化する、ということを示した。詳しくは、改変型Ｔ細胞は腫瘍の中央（すなわち腫瘍の縁から５〜１０ｍｍ）にまで透過した。興味深いことに、ａｔｔＩＬ−１２改変型Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置は、試験管内での培地中でも、生体内での血清中でも、検出可能な有害ＩＦＮγ発現を何ら誘導しなかった。これは意義深いことである、というのも、野生型ＩＬ１２によるＩＦＮγの誘導は、毒性ゆえにＩＬ１２の臨床的利用を制限しているからである。実際に、ａｔｔＩＬ−１２は、ＩＦＮγ誘導を抑制し、腫瘍内へのＣＤ８＋Ｔ細胞透過を促進して結果的に腫瘍を根絶することが認められた。
【００３１】
さらなる態様では、Ｔ細胞は、ａｔｔＩＬ−１２レンチウイルスのレンチウイルス形質導入によってａｔｔＩＬ−１２を発現するように操作され得る。本発明の試験では、これらのレンチウイルスａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞は、ドキソルビシン処置の後に効果的に腫瘍成長を抑制することが示された。レンチウイルスａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞はさらに、対照レンチウイルスＴ細胞と比較して肺などの臓器の中へのＴ細胞蓄積を低減した。したがって、この正常組織におけるＴ細胞蓄積の低減ゆえに、サイトカイン応答症候群（ＣＲＳ）の危険度は、対照レンチウイルスＴ細胞療法を受ける対象と比較して低減される。いくつかの態様では、この方法はさらに、全身毒性を低減し、処置の有効性を高める。さらに、本発明の方法は、Ｔ細胞生存率を向上させることができ、尽きることのないシグナル遺伝子ＣＤ２８発現を増加させることができ、腫瘍細胞でのＣＤ８０発現を増加させることができる。このＣＤ２８とＣＤ８０との相互作用は、ＮＫＧ２Ｄリガンドによって開始される抗腫瘍免疫応答をいっそう促すことができる。このように、本明細書において提供される改変型Ｔ細胞は、その注入後の腫瘍内への透過によって固形がんの治療のために使用することができる。
【００３２】
さらなる実施形態では、ＣＤ８０の存在下でＴ細胞を培養することによってＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法を提供する。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３マイクロビーズで予め処理され得、その後、Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現を誘導するのに十分な期間（例えば１〜５日間）にわたってＣＤ８０、例えばＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質で処理され得る。本発明の試験では、ＣＤ２８を発現するＴ細胞がＣＤ８０による処理によってＳＴＡＴ３リン酸化依存性機序を介して活性化されることが見出された。このように、ＣＤ８０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を誘導するために使用され得る。
【００３３】
Ｉ．定義
本明細書中で使用する場合、指定成分に関して「本質的に含まない」は、指定成分が、何ら組成物中に意図的に配合されたものでもない、及び／または汚染物質または痕跡量でしか存在していない、ということを意味して本明細書中で使用される。したがって、組成物の何らかの意図せぬ汚染に起因する指定成分の総量は０．０５％を優に下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、標準的分析方法で指定成分の量が全く検出され得ない組成物である。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。本明細書の請求項（複数可）で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は、「含む」という単語と一緒に使用される場合、１つ、または１つより多い、を意味し得る。
【００３５】
請求項での「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明確に示されている、または選択肢が相互に排他的である場合を除いて、「及び／または」を意味して使用されるが、本開示は、選択肢と「及び／または」のみを指す定義を支持する。本明細書中で使用する場合、「別の」は、少なくとも第２以降のものを意味し得る。
【００３６】
本願の全体を通して、「約」という用語は、値を決定するために採用されている装置、方法に固有の誤差の変動量、または試験対象に存在している変動量が当該値に含まれることを表すために使用される。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」または「改善」という用語は、疾患、障害または病状に関して使用される場合、症候または症状の進行または重症度を逆行させる、緩和する、改善させる、抑制する、遅らせる、または停止させる、症状に対する治療処置を指す。「治療すること」という用語は、症状の少なくとも１つの有害作用または症候を低減または緩和することを含む。治療は、１つ以上の症候または臨床マーカーが低減されるならば概して「有効」である。あるいは、治療は、症状の進行が軽減されるかまたは停止するならば「有効」である。つまり、「治療」は、症候またはマーカーの単なる改善のみならず、治療がない場合に予測されるであろう症候の進行または悪化の停止または少なくとも減速をも含む。有益な、または望まれる臨床転帰としては、限定されないが例えば、治療がない場合に予測されるものと比較したときの、１つ以上の症候（複数可）の緩和、不足の程度の減弱、腫瘍または悪性腫瘍の安定化された（つまり悪化していない）状態、腫瘍成長及び／または転移の遅滞または減速、ならびに寿命の延長が挙げられる。
【００３８】
「対象」及び「患者」は、ヒトか、霊長類、哺乳動物及び脊椎動物などの非ヒトかのどちらかを指す。特別な実施形態では、対象はヒトである。
【００３９】
本願の全体を通して使用される「治療的利益」または「治療的に有効」という用語は、この症状の医学的治療に関して対象の健康を促進または増進する任意のものを指す。これには、限定されないが、疾患の徴候または症候の頻度または重症度の低減が含まれる。例えば、がんの治療は、例えば、腫瘍の大きさの低減、腫瘍の侵襲性の低減、がんの成長速度の低減、または転移の防止を伴うものであり得る。がんの治療はさらに、がんを有する対象の生存期間の延長も指し得る。
【００４０】
「抗がん」剤とは、例えば、がん細胞の殺傷を促進すること、がん細胞のアポトーシスを誘導すること、がん細胞の成長速度を低減すること、転移の頻度もしくは数を低減すること、腫瘍の大きさを減少させること、腫瘍成長を抑制すること、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を減らすこと、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を防止もしくは抑制すること、またはがんを有する対象の寿命を延長することによって、対象のがん細胞／腫瘍に負の影響を与えることができるもののことである。
【００４１】
「発現構築物」または「発現カセット」とは、転写を導くことができる核酸分子を意味する。発現構築物は、最低でも、１つ以上の所望の細胞種、組織または臓器における遺伝子発現を導く１つ以上の転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーまたはそれらと機能的に等価な構造体）を含む。転写終結シグナルのような他のエレメントを含んでいてもよい。
【００４２】
「ベクター」または「構築物」（遺伝子送達システムまたは遺伝子移入「ビヒクル」と呼ぶことがある）は、試験管内か生体内かのどちらかで宿主細胞へ送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。
【００４３】
ベクターの一般的なタイプである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは別個の、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる染色体外ＤＮＡ分子である。特定の事例ではそれは円状であり二本鎖である。
【００４４】
特定のタンパク質を「コードする」、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に試験管内または生体内で転写され場合によっては遺伝子産物、例えばポリペプチドへの翻訳もされる、核酸分子である。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態のいずれかで表され得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドン及び３’（カルボキシ）末端にある翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子としては、限定されないが例えば、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡが挙げられる。転写終結配列は大抵、遺伝子配列の３’側に位置しているであろう。
【００４５】
「制御エレメント」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、スプライスジャンクションなどを総合的に指すが、これらは総合的に、レシピエント細胞における複製、転写、転写後プロセシング、及びコード配列の翻訳を提供するものである。選択されたコード配列が適切な宿主細胞内で複製、転写及び翻訳されることができる限り、これらの制御エレメントの全てが存在している必要はない。
【００４６】
「プロモーター」という用語は、本明細書において、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すその普通の意味で使用され、この場合、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来するものである。それは、核酸配列の特異的転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼ及びその他の転写因子などの調節性のタンパク質及び分子と結合し得る遺伝要素を含有し得る。「機能的に配置されている」、「機能的に繋げられている」、「制御下にある」及び「転写制御下にある」という表現は、プロモーターが核酸配列に関して、その配列の転写開始及び／または発現を制御すべく正確な機能的位置及び／または配向にある、ということを意味する。
【００４７】
「エンハンサー」とは、プロモーターの近傍に配置されているときに、エンハンサードメインの非存在下でプロモーターによって生じる転写活性に比べて転写活性の増加を提供する、核酸配列を意味する。
【００４８】
核酸分子に関して、「機能的に繋げられている」または「共発現する」とは、２つ以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、及びエンハンサーエレメント）が、核酸分子の転写を可能にするように連結されていることを意味する。ペプチド及び／またはポリペプチド分子に関して、「機能的に繋げられている」または「共発現する」とは、融合体の各ペプチド及び／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有している単一ポリペプチド鎖すなわち融合ポリペプチドをもたらすように２つ以上のペプチド及び／またはポリペプチド分子が連結されていることを意味する。融合ポリペプチドは好ましくはキメラである、つまり異種分子からなる。
【００４９】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広義の意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体断片を包含する。
【００５０】
本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種である抗体の集団、すなわち、少ない量で存在し得る可能性のある突然変異、例えば天然に存在する突然変異を除けば集団を構成する個々の抗体が同一である集団から得られる、抗体を指す。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではない抗体の性質を表す。特定の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体は典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選抜を含むプロセスによって得られたものである。例えば、選抜プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの独特のクローンの選抜であり得る。例えば標的との親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養物中でのその産生を増加させる、生体内でのその免疫原性を低減する、多重特異性抗体を作り出すなどのために、選抜された標的結合配列をさらに改変することができること、及び改変された標的結合配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることは理解されるべきである。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含むことが典型的であるポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。モノクローナル抗体製剤は、その特異性に加えて、それが典型的に他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有益である。
【００５１】
「薬学的または薬理学的に許容できる」という表現は、必要に応じてヒトなどの動物に投与されたときに有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。抗体または追加活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に鑑みれば当業者にとって既知であろう。さらに、動物（例えばヒト）への投与の場合、ＦＤＡの生物製品基準局によって要求される無菌状態、発熱性、総合的安全性及び純度の基準を製剤が満たしていなければならないことは理解されよう。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、当業者に知られているであろう材料及びその組み合わせのような、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩水、非経口用ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、及びリンガーデキストロース）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存料（例えば、抗菌または抗真菌剤、抗酸化物質、キレート剤、及び不活性ガス）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、流体及び栄養補給剤を含む。医薬組成物中の様々な成分のｐＨ及び厳密な濃度は、よく知られているパラメータによって調整される。
【００５３】
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に不連続な単位を指し、各単位は、その投与すなわち適切な経路及び治療計画に関連して上に述べた所望の奏効をもたらすように算出された所定量の治療組成物を含有するものである。処置回数と単位用量との両方に応じて投与される量は、望まれる効果に依存する。患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、身体的及び生理学的因子、例えば、対象の体重、年齢、健康状態及び性別、治療しようとする疾患の種類、疾患透過の程度、以前の、または並行する治療介入、患者の突発性、投与経路、ならびに特定の治療物質の力価、安定性及び毒性によって決定することができる。例えば、用量は、投与１回あたり約１μｇ／ｋｇ／体重〜１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（このような範囲には、間に存在する用量が含まれる）またはそれ以上、及びそれに含まれる導出可能な任意の範囲を含んでもよい。本明細書中に列挙される数から導出可能な範囲の非限定的な例では、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲などが投与され得る。投与を担当する実施者であれば、任意の事例において個々の対象のために組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び適切な用量（複数可）を決定するであろう。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体と結合することができる分子である。抗原は、一般に、Ｂ及び／またはＴリンパ球の産生につながる体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００５５】
「免疫チェックポイント」という用語は、免疫反応を均衡を保つために免疫系の構成要素に対する抑制シグナルを提供する、免疫系のタンパク質などの分子を指す。既知の免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＩ及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２、さらにはＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲを含む。ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３及びＫＩＲの関与する経路は、当技術分野では、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１依存性経路に類似する免疫チェックポイント経路を構成すると認識されている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４、Ｍｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０−４８９を参照のこと）。
【００５６】
「免疫チェックポイント阻害物質」は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物を指す。阻害には、機能の低減、及び完全な遮断が含まれる。特に、免疫チェックポイントタンパク質はヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイント阻害物質は特に、ヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質である。
【００５７】
「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」及び「がん細胞抗原」という用語は本明細書中では交換可能に使用される。各事例において当該用語は、がん細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質または炭水化物を指す。
【００５８】
「膜係留ＩＬ−１２」または「膜係留腫瘍指向性ＩＬ−１２（ａｔｔＩＬ−１２）」という用語は、膜貫通ドメインを含むように改変されているＩＬ−１２タンパク質を指す。
【００５９】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、あるアミノ酸が機能を喪失せずに別のアミノ酸で置き換えられ得る度合いを指す「類似性パーセント」または「配列類似性」が、特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）である。この類似性パーセントは、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２行列などの行列を使用することによって決定することができる。
【００６０】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が別の配列との特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」または「相同性」を有することは、整列した２つの配列を比較するとその百分率の塩基（またはアミノ酸）が同じである、ということを意味する。このアラインメント及び相同性パーセントまたは配列同一性は、当技術分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、初期設定パラメータをアラインメントのために使用する。好ましいアラインメントプログラムは、初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴである。好ましいプログラムは特に、以下の初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
【００６１】
ＩＩ．養子Ｔ細胞療法
本開示の特定の実施形態は、Ｔ細胞の出発集団を得ること、Ｔ細胞を改変すること、及びがん細胞を指向する免疫療法として改変型Ｔ細胞を対象に投与することに関する。詳しくは、Ｔ細胞は膜係留インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を発現する。機能的抗腫瘍エフェクターＴ細胞の誘導、活性化及び増殖のいくつかの基礎的手法について過去二十年間に記載が成されている。これらには、腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの自家細胞；自家ＤＣ、リンパ球、人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）、もしくはＴ細胞リガンド及び活性化抗体で被覆したビーズを使用して生体外で活性化させたＴ細胞、または標的細胞膜を捕捉することによって単離された細胞；抗宿主腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を天然に発現している同種異系細胞；ならびに、腫瘍反応性ＴＣＲまたは「Ｔボディ」として知られる抗体様腫瘍認識能力を発揮するキメラＴＣＲ分子を発現するように遺伝的に初期化された、または「指向性転換された」、非腫瘍特異的な自家または同種異系細胞が含まれる。これらの手法は、本明細書に記載の方法で使用することができる、Ｔ細胞作製及び免疫化のための数々のプロトコールを生み出した。
【００６２】
Ａ．Ｔ細胞作製
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の出発集団は、血液、骨髄、リンパまたはリンパ器官に由来する。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞である。細胞は典型的な初代細胞、例えば、対象から直接単離されたもの、及び／または対象から単離されて凍結されたものである。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞または他の細胞種の１つ以上のサブセット、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の潜在能、増殖、再循環、局在化及び／または持続する能力、抗原特異性、抗原受容体の種類、特定の臓器または区画での存在、マーカーまたはサイトカインの分泌プロファイル、及び／または分化の度合いによって定義されるものを含む。治療する対象に関して細胞は同種異系及び／または自家性であり得る。いくつかの態様では、即時利用技術のためなどに、細胞は、幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のように多能性及び／または複能性である。いくつかの実施形態では、方法は、対象から細胞を単離すること、それの作製、処理、培養及び／または操作を本明細書に記載されているように行うこと、ならびにそれを凍結保存の前または後に同じ患者へ再導入することを含む。
【００６３】
Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団（例えば、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞及びそれらのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、中枢性メモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）または終末分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然型及び適応型調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞がある。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団の１つ以上は、特異的マーカー、例えば表面マーカーについて陽性である、または特異的マーカーについて陰性である細胞が濃縮または除去されている。いくつかの事例では、そのようなマーカーは、特定のＴ細胞集団（例えば非メモリー細胞）では存在していないかまたは比較的低いレベルで発現するが、他の特定のＴ細胞集団（例えばメモリー細胞）では存在しているかまたは比較的高いレベルで発現するものである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、非Ｔ細胞上、例えば、Ｂ細胞上、単球上または他の白血球上に発現するマーカー、例えばＣＤ１４の負の選択によってＰＢＭＣ試料から分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択ステップを用いてＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離する。そのようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団は、１つ以上のナイーブ、メモリー及び／またはエフェクターＴ細胞亜集団で発現するまたは比較的高い度合いで発現するマーカーについての正または負の選択によって、さらに亜集団に選別することができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに、ナイーブ、中枢性メモリー、エフェクターメモリー及び／または中枢性メモリー幹細胞が例えば各亜集団に関連する表面抗原に基づく正または負の選択によって濃縮または除去されている。いくつかの実施形態では、有効性を高めること、例えば、投与後の長期の生存能、増殖及び／または生着を改善することのために中枢性メモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮を行うが、これはいくつかの態様ではそのような亜集団において特に有効である。Ｔｅｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ．１：７２−８２、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１を参照されたい。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。この方法では、腫瘍試料を患者から得、単一細胞懸濁液を得る。単一細胞懸濁液は、任意の適切な方法で例えば機械的に（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）解離装置を使用して腫瘍を崩して）または酵素的に（例えばコラゲナーゼまたはＤＮアーゼで）得ることができる。腫瘍酵素的消化物の単一細胞懸濁液をインターロイキン−２（ＩＬ−２）の中で培養する。細胞を集密（例えば約２×１０６リンパ球）になるまで例えば約５〜約２１日間、好ましくは約１０〜約１４日間培養する。例えば、細胞を５、５．５または５．８日間〜２１、２１．５または２１．８日間、例えば、１０、１０．５または１０．８日間〜１４、１４．５または１４．８日間培養してもよい。
【００６８】
培養したＴ細胞をプールして急速増殖させることができる。急速増殖は、約１０〜約１４日間の期間を経て抗原特異的Ｔ細胞の数の少なくとも約５０倍（例えば、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍以上）の増加をもたらす。より好ましくは、急速増殖は約１０〜約１４日間の期間を経て少なくとも約２００（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００またはそれ以上）倍の増加をもたらす。
【００６９】
増殖は、当技術分野で知られている数々の方法のいずれかによって成し遂げることができる。例えば、フィーダーリンパ球及び、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の方が好ましいがＩＬ−２かインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）かのどちらかの存在下で、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いてＴ細胞を急速増殖させることができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激物質は、およそ３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ（登録商標），Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．から入手できる）を含み得る。あるいは、場合によってベクターによって発現されるものであり得るがんの１つ以上の抗原（その抗原性部分、例えばエピトープ（複数可）、または細胞を含む）、例えばヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試験管内での刺激によって、Ｔ細胞増殖因子、例えば３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ−１５（ＩＬ−２の方が好ましい）の存在下でＴ細胞を急速増殖させることができる。試験管内で誘導したＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞を瞬時投与されたがんの同じ抗原（複数可）による再刺激によって急速増殖する。あるいは、例えば、放射線照射済み自家リンパ球または、放射線照射済みＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球とＩＬ−２でＴ細胞を再刺激することができる。
【００７０】
自家Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞の成長及び活性化を促進するＴ細胞成長因子を発現するように改変され得る。好適なＴ細胞成長因子としては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−１２が挙げられる。好適な改変方法は当技術分野において既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。特別な態様では、改変型自家Ｔ細胞はＴ細胞成長因子を高レベルで発現する。Ｔ細胞成長因子コード配列、例えばＩＬ−１２のそれは、当技術分野では、Ｔ細胞成長因子コード配列との機能可能な連結によって高レベル発現を促進するプロモーターと同様に容易に入手できる。
【００７１】
Ｂ．Ｔ細胞活性化
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化させてＴ細胞上、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を増加させる方法を提供する。Ｔ細胞の出発集団は、抗ＣＤ３、例えば抗ＣＤ３マイクロビーズで前処理され得る。前処理は約１２時間〜３日間、例えば約２４時間にわたり得る。増殖したＴ細胞をその後、ＣＤ８０タンパク質、例えばＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質と共に培養してＣＤ２８活性化、したがってＮＫＧ２Ｄ発現を誘導することができる。ＣＤ８０との培養は約１〜６日間、例えば約１、２、３、４、５または６日間、とりわけ約４日間にわたり得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞を抗ＣＤ３とＣＤ８０とによって同時に処理してもよい。
【００７２】
Ｃ．膜係留ＩＬ−１２を有するＴ細胞
特別な実施形態では、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞を本明細書で提供する。本開示の膜係留ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２αサブユニットｐ３５（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００８７３．２；配列番号２）、リンカー、膜貫通ドメイン（例えば配列番号３）、及びＩＬ−１２βサブユニットｐ４０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１８９．２；配列番号４）を含む、配列番号１及び配列番号４を含み得る。本明細書ではさらに、膜係留ＩＬ−１２をコードするタンパク質及び／または核酸を含み得る、膜係留ＩＬ−１２を含む組成物も提供する。いくつかの態様では、本明細書で提供される膜係留ＩＬ−１２異種二量体タンパク質は、配列番号１及び配列番号４との少なくとも約９０％の配列同一性、例えば、配列番号１及び配列番号４との少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットのＣ末端は膜貫通ドメインと融合している。膜貫通ドメインは配列番号３を含み得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている、例えばＫｏｚｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ５２４−Ｄ５２９，２０１３に開示されているような他の膜貫通配列を含み得る。他の実施形態では、ＩＬ−１２のｐ４０は膜貫通ドメインを含む。１つ以上の膜貫通ポリペプチドドメインを有する膜貫通タンパク質のよく知られている例としては、インテグリンファミリー、ＣＤ４４、グリコフォリン、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ糖タンパク質、ＥＧＦ受容体、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）ファミリー、受容体チロシンキナーゼ（例えば、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ））、ポリンファミリーのメンバーならびに他の膜貫通タンパク質が挙げられる。本開示の特定の実施形態は、標準的でよく知られている方法論に従って決定され得る膜挿入特性を有する、膜貫通ポリペプチドドメインの一部、例えば先端を切り詰められたポリペプチドを使用することを企図している。
【００７４】
実施形態の膜係留ＩＬ−１２に様々なリンカーを使用することができる。いくつかの態様では、リンカーは、１つ以上（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０個またはそれ以上のアミノ酸）のアミノ酸がランダムに繋がったものであり得る。実施形態に係る用途のためのいくつかの具体的なリンカーとしては、例えば、２１８（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）、ＨＬ（ＥＡＡＡＫ）及びＧ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ）リンカーが挙げられる。
【００７５】
様々な実施形態で使用することができる膜係留ＩＬ−１２タンパク質配列には、本明細書に記載のアミノ酸配列及びその誘導体が含まれる。類縁体及び誘導体は、限定されないが、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の中のアミノ酸残基の付加または置換を含み得るが、それはサイレントな変化を生じさせるものであり、したがって機能的に等価な遺伝子産物を生成するものである。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／または両親媒性の類似性に基づいて成され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ、負に帯電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
【００７６】
あるいは、アミノ酸の疎水性指標に基づいてアミノ酸置換が成されてもよい。各アミノ酸にはその疎水性及び電荷特質に基づいて疎水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する上でのアミノ酸疎水性指標の利用は当技術分野で理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２）。特定の場合において、特定のアミノ酸を、同様の疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換してなおも同様の生物学的活性が保持され得る、ということは知られている。疎水性指標に基づいて変化をもたらす際、特定の実施形態では、疎水性指標が±２以内となるアミノ酸の置換が含められる一方、他の実施形態では、±１以内となるアミノ酸置換が含められ、また他の実施形態では、±０．５以内となるアミノ酸置換が含められる。
【００７７】
あるいは、アミノ酸置換は、特にそれによって作り出される生物学的機能性タンパク質またはペプチドが免疫学的実施形態での使用を意図されている場合には、親水性に基づいて行われてもよい。特定の実施形態では、隣接アミノ酸の親水性によって左右されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性との相関があり、つまりタンパク質の生物学的特性との相関がある。これらのアミノ酸残基には以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸塩（＋３．０±１）、グルタミン酸塩（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて変化をもたらす際、特定の実施形態では、親水性値が±２以内となるアミノ酸の置換が含められ、特定の実施形態では、±１以内となるものが含められ、特定の実施形態では、±０．５となるものが含められる。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープが同定されることもある。
【００７８】
置換変異型は、あるアミノ酸における別のアミノ酸による交換をタンパク質中の１つ以上の部位に含有するのが典型的であり、ポリペプチドの１つ以上の特性を調節するとともに他の機能または特性の喪失を伴うかまたは伴わないように設計され得る。置換は保存的であり得、つまり、あるアミノ酸を、同様の形状及び電荷を有するもので置き換える。保存的置換は当技術分野でよく知られており、これには例えば、アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるような非保存的なものであり得る。非保存的変化は、極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸で置換すること、及びその逆のことなど、残基を化学的に類似しないもので置換することを伴うのが典型的である。
【００７９】
いくつかの態様では、膜係留ＩＬ−１２をコードする核酸を細胞、例えばＴ細胞に投与または導入する。核酸は、典型的には発現ベクターの形態で投与される。いくつかの態様では、発現ベクターはレトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ＤＮＡプラスミド発現ベクターまたはＡＡＶ発現ベクターである。いくつかの態様では、膜係留ＩＬ−１２をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に送達する。いくつかの態様では、送達は、１つ以上のベクター、１つ以上のその転写産物、及び／または１つ以上のそれから転写されるタンパク質を細胞に送達することによって成される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内への導入の結果として細胞内の原位置で合成される。いくつかの態様では、ポリペプチドを細胞外で生成してその後に細胞へと導入することができよう。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞内に導入する方法は既知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムの中に組み込む安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムの中に組み込まない一時的形質転換法、及びウイルス媒介法が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを例えば組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞内に導入してもよい。例えば、いくつかの態様では、一時的形質転換法は、マイクロインジェクション、電気穿孔または粒子撃込みを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞内で発現されることを考慮してベクター、より詳しくはプラスミドまたはウイルスの中に含め込まれ得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ウイルス系及び非ウイルス系の遺伝子移入法を用いて核酸を哺乳動物細胞内または標的組織内に導入することができる。そのような方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ及び／またはＴＡＬＥＮシステムの構成要素をコードする核酸を培養中の細胞へ、または宿主臓器内に投与することができる。非ウイルスベクター送達システムとしては、例えば、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写産物）、裸の核酸、送達ビヒクルと複合体化した核酸、例えばリポソームが挙げられる。ウイルスベクター送達システムとしては、例えば、細胞への送達後にエピソーム性または組込型ゲノムを有する、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２、Ｎａｂｅｌ  ＆Ｆｅｉｇｎｅｒ，１９９３、Ｍｉｔａｎｉ  ＆Ｃａｓｋｅｙ，１９９３、Ｄｉｌｌｏｎ，１９９３、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，１９８８、Ｖｉｇｎｅ，１９９５、Ｋｒｅｍｅｒ  ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９５、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照されたい。
【００８２】
核酸の非ウイルス的送達法としては、例えば、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸抱合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤強化型ＤＮＡ取込みが挙げられる。リポフェクションは（例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号及び第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適するカチオン性及び中性脂質としては、例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ，ＷＯ９１１７４２４；ＷＯ９１１６０２４に記載のものが挙げられる。送達は細胞（例えば、試験管内または生体外での投与）または標的組織（例えば、生体内投与）に対して行われ得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、送達は、核酸の送達のためのＲＮＡウイルス系またはＤＮＡウイルス系システムによって行われ得る。ウイルスベクターは、いくつかの態様では患者に直接（生体内で）投与されてもよいし、またはそれを使用して試験管内もしくは生体外で細胞を処理してその後に患者に投与することができる。ウイルス系システムはいくつかの実施形態では、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単純ヘルペスウイルスベクターを含む。
【００８４】
いくつかの態様では、限定されないがグルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含めた自家蛍光タンパク質を含めたレポーター遺伝子を細胞内に導入して、遺伝子産物の発現の変化または調整を測定するためのマーカーとして役立つ遺伝子産物をコードさせてもよい。さらなる実施形態では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を細胞内にベクターによって導入してもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はルシフェラーゼである。
【００８５】
Ｄ．遺伝子操作された抗原受容体
本開示のＴ細胞を遺伝子操作して操作型ＴＣＲ及び／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を発現させることができる。例えば、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように自家Ｔ細胞を改変する。好適な改変方法は当技術分野で知られている。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。例えば、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９：４９６−５１０（２００８）、及びＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１４：５３５−４６（２００９）に記載されている形質導入技術を用いてがん抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するようにＴ細胞に形質導入してもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１つ以上の抗原受容体をコードする、遺伝子操作によって導入された１つ以上の核酸、及びそのような核酸の遺伝子操作産物を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、異種、つまり、細胞または細胞から得られた試料の中に通常存在していないもの、例えば、別の生物または細胞から得られたものであり、これは例えば、操作されようとしている細胞及び／またはそのような細胞の供給元である生物には通常見つからないものである。いくつかの実施形態では、核酸は、天然に存在しないもの、例えば、天然に見つからない（例えばキメラ）核酸である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞の表面に発現したタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、ＴＣＲと同様に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との関連において細胞表面で認識される、プロセシングされたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原である。
【００８８】
ＣＡＲ及び組換えＴＣＲを含めた例示的な抗原受容体、ならびに受容体を細胞内へと操作及び導入する方法には、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０００１４２５７号、第ＷＯ２０１３１２６７２６号、第ＷＯ２０１２／１２９５１４号、第ＷＯ２０１４０３１６８７号、第ＷＯ２０１３／１６６３２１号、第ＷＯ２０１３／０７１１５４号、第ＷＯ２０１３／１２３０６１号、米国特許出願公開第ＵＳ２００２１３１９６０号、第ＵＳ２０１３２８７７４８号、第ＵＳ２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、第７，４４６，１９０号、第８，２５２，５９２号、第８，３３９，６４５号、第８，３９８，２８２号、第７，４４６，１７９号、第６，４１０，３１９号、第７，０７０，９９５号、第７，２６５，２０９号、第７，３５４，７６２号、第７，４４６，１９１号、第８，３２４，３５３号及び第８，４７９，１１８号ならびに欧州特許出願第ＥＰ２５３７４１６号に記載されているもの、及び／またはＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３  Ａｐｒｉｌ；３（４）：３８８−３９８、Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８、Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；２４（５）：６３３−３９、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２  Ｍａｒｃｈ  １８（２）：１６０−７５に記載されているものが含まれる。いくつかの態様では、遺伝子操作された抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されているようなＣＡＲ、及び国際特許出願公開第ＷＯ／２０１４０５５６６８Ａ１号に記載されているものが含まれる。
【００８９】
いくつかの態様では、腫瘍抗原は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、マウス二重微小染色体２相同体（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、ｌｉｖｉｎ、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｐ５３またはサイクリン（ＤＩ）である。例えば、標的抗原はｈＴＥＲＴまたはサバイビンである。いくつかの態様では、標的抗原はＣＤ３８である。他の態様では、標的抗原はＣＤ３３またはＴＩＭ−３である。他の態様では、それはＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ５３、ＣＤ９２、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２００、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２またはＣＤ３６２である。いくつかの実施形態では、操作型免疫細胞は、１つ以上の他抗原を標的とする抗原を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の他抗原は腫瘍抗原またはがんマーカーである。他抗原としては、例えば、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ及びＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３もしくは４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−アルファ、ＩＬ−１３Ｒ−アルファ２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐｌＯＯ、がん胎児抗原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、及びＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリン、例えばサイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、及び／またはビオチン化分子、及び／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現する分子が挙げられる。
【００９０】
１．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、操作型抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、賦活性または刺激性ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）、及び／または抑制ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５（２１５）（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１３）を参照のこと）を含む。ＣＡＲは、いくつかの態様ではリンカー及び／または膜貫通ドメイン（複数可）を介して、１つ以上の細胞内シグナル伝達構成要素に繋げられた、細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含むことが一般的である。そのような分子は典型的には、天然の抗原受容体を介したシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介したシグナル、及び／または共刺激受容体のみを介したシグナルを模倣した、またはそれに近似されるものである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、特定の抗原（または、マーカーもしくはリガンド）、例えば養子療法の標的にされる特定の細胞種に発現する抗原、例えばがんマーカー、及び／または応答弱化を誘導することを意図した抗原、例えば、正常もしくは非罹患細胞種に発現する抗原に対する特異性を有して構築される。このように、ＣＡＲはその細胞外部分に１つ以上の抗原結合分子、例えば１つ以上の抗原結合断片、ドメインもしくは部分、または１つ以上の抗体可変ドメイン、及び／または抗体分子を含むことが典型的である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗体分子の１つ以上の抗原結合部分、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【００９２】
いくつかの態様では、抗原特異的な結合または認識の構成要素は１つ以上の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインと繋げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、天然にＣＡＲ内のドメインの１つと会合している膜貫通ドメインが用いられる。いくつかの事例では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合することを回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように、選択されるかまたはアミノ酸置換で改変される。
【００９３】
膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態では、天然供給源か合成供給源かのどちらかに由来する。供給源が天然のものである場合、ドメインはいくつかの態様では任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域としては、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来する（つまり、それらの膜貫通領域（複数可）を少なくとも含む）ものが挙げられる。あるいは、膜貫通ドメインはいくつかの実施形態では合成のものである。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは主として疎水性残基、例えばロイシン及びバリンを含む。いくつかの態様では、フェニルアライン、トリプトファン及びバリンの三つ組が合成膜貫通ドメインの各端部にみられるであろう。
【００９４】
ＣＡＲは一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達構成要素を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の細胞内構成要素、例えば、Ｔ細胞の活性化及び細胞傷害性を媒介するＴＣＲ  ＣＤ３＋鎖、例えばＣＤ３ゼータ鎖を含む。このように、いくつかの態様では、抗原結合分子は１つ以上の細胞シグナル伝達モジュールに繋げられている。いくつかの実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または他のＣＤ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはさらに、１つ以上の追加分子の一部、例えば、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６を含む。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３−ＱまたはＦｃ受容体γと、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６との、キメラ分子を含む。
【００９５】
２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／または、天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲを含む。「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる、可変ａ及びβ鎖（それぞれＴＣＲａ及びＴＣＲｐとしても知られる）または可変γ及びδ鎖（それぞれＴＣＲｙ及びＴＣＲ５としても知られる）を含有する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはαβ型である。典型的には、αβ型及びγδ型で存在するＴＣＲは概して構造が類似しているが、それらを発現しているＴ細胞は、異なった解剖学的位置または機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面に、または可溶形態で見つかり得る。一般に、ＴＣＲは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を概して担う、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見つかる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び／または短い細胞質側尾部も含有し得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３３，１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端端部にある短い細胞質側尾部を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合している。特に断らない限り、「ＴＣＲ」という用語は、その機能的ＴＣＲ断片を包含すると理解されるべきである。当該用語は、αβ型またはγδ型のＴＣＲを含めて、完全な、または完全長のＴＣＲも包含する。
【００９６】
このように、本明細書における目的のためのＴＣＲへの言及は、ＭＨＣ分子と結合している特定の抗原性ペプチド、すなわちＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分のような任意のＴＣＲまたは機能的断片を含む。ＴＣＲの「抗原結合部分」または「抗原結合断片」は、交換可能に使用することができ、ＴＣＲの構造ドメインの一部を含有しているにもかかわらず完全ＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）に結合する分子を指す。いくつかの事例では、抗原結合部分は、一般的には各鎖が３つの相補性決定領域を含有している場所などの、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体との結合のための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えばＴＣＲの可変ａ鎖及び可変β鎖を含有する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは会合してループ、または免疫グロブリンに類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成するが、これは、抗原認識を提供し、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性を決定し、ペプチド特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲ同士はフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられている（例えば、Ｊｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９１３８，１９９０、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３７４５，１９８８を参照のこと。また、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５，２００３も参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１も、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、これに対してベータ鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域はさらに超可変（ＨＶ４）領域を含有し得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖（例えば、ａ鎖、β鎖）の細胞外部分は、Ｎ末端の可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；典型的には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５ｔｈ  ｅｄ．のＫａｂａｔ付番に基づいてアミノ酸１〜１１６）と、細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインすなわちＣａ、典型的には、Ｋａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインすなわちＣｐ、典型的には、Ｋａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２９５）との２つの免疫グロブリンドメインを含有し得る。例えば、いくつかの事例では、２本の鎖によって形成されているＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近接定常ドメインと、ＣＤＲを含有する２つの膜遠位可変ドメインとを含有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成している短い連結配列を含有し、結果として２本の鎖の間に連結部が作られている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含有するように、α鎖及びβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有し得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは正に帯電している。いくつかの事例では、ＴＣＲ鎖は細胞質側尾部を含有する。いくつかの事例では、構造が、ＴＣＲとＣＤ３のような他分子との会合を可能にする。例えば、膜貫通領域と共に定常ドメインを含有するＴＣＲは、タンパク質を細胞膜に係留すること、及びＣＤ３シグナル伝達器官または複合体のインバリアントサブユニットと会合することができる。
【０１００】
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物の３本の別個の鎖（γ、δ及びε）とζ鎖とを有し得る多重タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、複合体はＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３５鎖、２本のＣＤ３ｓ鎖、及びＣＤ３ζ鎖の同種二量体を含有し得る。ＣＤ３ｙ、ＣＤ３５及びＣＤ３ｓ鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連している細胞表面タンパク質である。ＣＤ３ｙ、ＣＤ３５及びＣＤ３ｓ鎖の膜貫通領域は負に帯電しているが、これは、正に帯電したＴ細胞受容体鎖とこれらの鎖とが会合するのを可能にする特質である。ＣＤ３ｙ、ＣＤ３５及びＣＤ３ｓ鎖の細胞内尾部は各々、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られる単一の保存モチーフを含有するが、他方、各ＣＤ３ζ鎖は３つ有している。通常、ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関与している。これらの補助的分子は負に帯電した膜貫通領域を有し、シグナルをＴＣＲから細胞内へと伝播させる役割を果たす。ＣＤ３鎖及びζ鎖はＴＣＲと一緒になっていわゆるＴ細胞受容体複合体を形成する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、αとβとの（または場合によってはγとδとの）２本の鎖の異種二量体であってもよく、またはそれは一本鎖ＴＣＲ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、１つ以上のジスルフィド結合などによって繋がった２本の別個の鎖（α鎖とβ鎖、またはγ鎖とδ鎖）を含有する異種二量体である。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えばがん抗原）に対するＴＣＲを同定して細胞内に導入する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸を様々な供給源から例えば公的に入手可能なＴＣＲ  ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得ることができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、生物学的供給源、例えば細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、生体内で単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、患者及び単離されたＴＣＲから高親和性Ｔ細胞クローンを単離することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原システム、またはＨＬＡ）で操作された遺伝子導入マウスにおいて生成させたものである。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１６９−１８０、及びＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５７９９−５８０８を参照のこと）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを用いて標的抗原に対するＴＣＲを単離する（例えば、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１４：１３９０−１３９５、及びＬｉ（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９−３５４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分をＴＣＲの配列についての知識によって合成的に生成させることができる。
【０１０２】
３．抗原提示細胞
抗原提示細胞はマクロファージ、Ｂリンパ球及び樹状細胞を含むが、これは、特定のＭＨＣ分子を発現することによって識別される。ＡＰＣは、抗原を内在化させ、当該抗原の一部をその外側細胞膜の上のＭＨＣ分子と一緒に再発現させる。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、複数の遺伝子座を有する大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣと呼ばれるＭＨＣ膜分子の２つの主要なクラスをコードする。Ｔヘルパーリンパ球は一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合している抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子と会合している抗原を認識する。ＭＨＣは、ヒトではＨＬＡ複合体と呼ばれ、マウスではＨ−２複合体と呼ばれる。
【０１０３】
いくつかの事例では、ａＡＰＣは、実施形態の治療用組成物及び細胞療法製品を作製する際に役立つ。抗原提示システムの作製及び使用に関する一般的指針については、例えば米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、第６，３６２，００１号及び第６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号及び第２００９／０００４１４２号；ならびに国際公開第ＷＯ２００７／１０３００９号を参照されたい。
【０１０４】
ａＡＰＣシステムは少なくとも１つの外来補助分子を含み得る。補助分子の任意の適切な数及び組み合わせを採用してよい。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンド及びＩＬ−２１が挙げられる。接着分子には、例えば細胞対細胞または細胞対マトリックスの接触を促進する、炭水化物結合性糖タンパク質、例えばセレクチン、膜貫通結合性糖タンパク質、例えばインテグリン、カルシウム依存性タンパク質、例えばカドヘリン、及び単回通過型膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質、例えば細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）が含まれる。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１が挙げられる。共刺激分子及び接着分子を含めた例示的補助分子の選抜、クローニング、作製及び発現に有用な技術、方法及び試薬は、例えば米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号及び第６，３６２，００１号に例示されている。
【０１０５】
ＩＩＩ．治療方法
本明細書ではさらに、個体のがんを治療するまたはその進行を遅延させる方法であって、Ｔ細胞療法、例えば、膜係留ＩＬ−１２を発現しているＴ細胞、及び／またはＮＫＧ２Ｄを発現するように活性化されたＴ細胞を個体に有効量施与することを含む、当該方法を提供する。治療のために企図されるがんの例としては、肺癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、子宮頸癌、消化器癌、リンパ腫、肺の前がん病変部、結腸癌、メラノーマ及び膀胱癌が挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、個体は１つ以上の抗がん療法に対して耐性である（耐性であると実証された）がんを有する。いくつかの実施形態では、抗がん療法に対する耐性は、がんの再発または難治性がんを含む。再発は、治療後の元々の部位または新たな部位におけるがんの再出現を指し得る。いくつかの実施形態では、抗がん療法に対する耐性は、抗がん療法による治療の間のがんの進行を含む。いくつかの実施形態では、がんは初期または後期のものである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞療法と組み合わせて化学療法薬を対象に投与する。例えば、化学療法薬は、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）またはシクロホスファミドであり得る。対象をドキソルビシンまたは他のＴ細胞動因誘導薬などの化学療法薬で前処置してもよい。前処置はＴ細胞療法の１６〜２４時間前であり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は自家性である。しかしながら、内在性ＴＣＲがノックアウトされている場合には細胞が同種異系であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞が自家性となるようにＴ細胞を患者自体から単離する。Ｔ細胞が同種異系である場合、内在性ＴＣＲを除去する必要がある。細胞は、治療されようとする疾患の症候及び兆候を制御、軽減または排除するのに十分な量で関心対象の対象に投与される。
【０１０９】
治療の有効性は、当業者に知られている多くの方法によって測定することができる。一実施形態では、白血球計数（ＷＢＣ）を用いて対象の免疫系の応答性を決定する。ＷＢＣは、対象の白血球の数の尺度となる。当技術分野でよく知られている方法を用いて対象の血液試料の中の白血球を他の血球から分離して計数する。白血球の正常値は約４，５００〜約１０，０００白血球／μｌである。白血球の数がより少ないことは対象における免疫抑制状態を指し示している可能性がある。
【０１１０】
別の実施形態では、対象における免疫抑制は、Ｔリンパ球計数を用いて判定され得る。当技術分野でよく知られている方法を用いて対象の血液試料の中の白血球を他の血球から分離する。Ｔリンパ球は、当技術分野の標準的な方法、例えば免疫蛍光法またはＦＡＣＳを用いて他の白血球と区別される。Ｔ細胞またはＴ細胞の特定集団の数の減少を免疫抑制の尺度として用いることができる。Ｔ細胞またはＴ細胞の特定集団の数が治療前のＴ細胞の数（または特定集団の細胞の数）に比べて減少していることを用いて、免疫抑制が誘導されたことを示すことができる。
【０１１１】
さらなる実施形態では、Ｔ細胞の活性化、増殖、または特定抗原に対するものを含めたサイトカイン応答を測定するための試験を実施する。いくつかの例では、対象からの試料の中のＴｒｅｇまたはＢｒｅｇの数を測定することができる。さらなる例では、対象からの試料の中のサイトカイン、例えばＩＬ−１０を測定する。
【０１１２】
別の例では、炎症を評価するために、炎症部位における好中球浸潤が測定され得る。好中球浸潤を評価するためにはミエロペルオキシダーゼ活性が測定され得る。ミエロペルオキシダーゼは多形核白血球及び単球のアズール顆粒に存在するヘモタンパク質である。それは、ハロゲン化物イオンを、食細胞による細菌殺傷のために使用されるものであるその各々の次亜ハロゲン酸へと酸化するのを触媒する。したがって、組織におけるミエロペルオキシダーゼ活性の減少は、好中球浸潤の減少を反映し、炎症の阻害の尺度としての役割を果たすことができる。
【０１１３】
別の例では、対象の有効な治療は、対象のサイトカインレベルを測定することによって評価され得る。体液または細胞試料におけるサイトカインレベルは従来の方法で決定される。例えば、イムノスポットアッセイ、例えば酵素結合型イムノスポットまたは「ＥＬＩＳＰＯＴ」アッセイを用いることができる。イムノスポットアッセイは、単一細胞レベルでサイトカイン分泌を検出するための高感度な定量的アッセイである。イムノスポットの方法及び用途は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、及びＥＰ９５７３５９に記載されている。標準的イムノスポットアッセイの変化形態は当技術分野でよく知られており、本開示の方法においてサイトカイン産生の変化を検出するために用いることができる（例えば、米国特許第５，９３９，２８１号及び米国特許第６，２１８，１３２号を参照のこと）。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、対象はＴ細胞療法に先立って骨髄非破壊的リンパ球除去化学療法が施与され得る。骨髄非破壊的リンパ球除去化学療法は、任意の適切な経路で施与されることができる任意の適切なそのような療法であってよい。骨髄非破壊的リンパ球除去化学療法は、特にがんが転移性であり得るメラノーマである場合に、例えばシクロホスファミド及びフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミド及びフルダラビンの例示的な投与経路は静脈内である。同様に、任意の適切な用量のシクロホスファミド及びフルダラビンを投与することができる。特別な態様では、およそ６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを２日間投与し、その後におよそ２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンを５日間投与する。
【０１１５】
特定の実施形態では、自家Ｔ細胞の成長及び活性化を促進するＴ細胞成長因子を、自家Ｔ細胞と同時か、自家Ｔ細胞の後かのどちらかで対象に投与する。Ｔ細胞成長因子は、自家Ｔ細胞の成長及び活性化を促進する任意の適切な成長因子であり得る。好適なＴ細胞成長因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−１２が挙げられが、これらは、単独または、ＩＬ−２とＩＬ−７、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−７とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−７とＩＬ−１５、ＩＬ−１２とＩＬ−７、ＩＬ−１２とＩＬ−１５、もしくはＩＬ−１２とＩＬ２などの様々な組み合わせで使用することができる。ＩＬ−１２は好ましいＴ細胞成長因子である。
【０１１６】
腫瘍内注射、または腫瘍脈管構造内への注射は、離散した固形の到達可能な腫瘍のために特に企図される。局所、局部または全身投与も好適であり得る。４ｃｍより大きい腫瘍の場合に投与される体積は約４〜１０ｍｌ（特に１０ｍｌ）となる一方、４ｃｍ未満の腫瘍の場合には約１〜３ｍｌ（特に３ｍｌ）の体積を用いることになる。単回用量として送達される複数回の注射が含む体積は約０．１〜約０．５ｍｌである。
【０１１７】
Ｂ．医薬組成物
本明細書ではさらに、Ｔ細胞療法及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物及び製剤を提供する。
【０１１８】
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の度合いの純度を有する活性成分（例えば抗体またはポリペプチド）と薬学的に許容できる１つ以上の任意の担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）とを混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。薬学的に許容できる担体は、大抵、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、限定されないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；単糖、二糖及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。本明細書において薬学的に許容できる例示的な担体はさらに、介在性の薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含めた特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを追加の１つ以上のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせる。
【０１１９】
Ｃ．追加療法
特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法にはＴ細胞集団、例えば膜係留ＩＬ−１２を発現するもの及び／またはＮＫＧ２Ｄを発現するものが、少なくとも１つの追加療法と組み合わさって関与する。追加療法は、放射線療法、外科手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または上記の組み合わせであり得る。追加療法はアジュバントまたはネオアジュバント療法の形態であってもよい。
【０１２０】
Ｔ細胞療法は、ドキソルビシンなどの追加療法の前に、間に、後に、または追加療法に関して様々な組み合わせで、施与され得る。施与は、同時発生から数分、数日、数週間までにわたる間隔で行われ得る。Ｔ細胞療法を追加治療剤とは別個に患者に提供する実施形態では通常、２つの化合物が患者に対して併用効果をなおも好都合に働かせることができるように、各送達時の間に長い期間が経過しないことを確保することになろう。そのような場合には、Ｔ細胞療法と抗がん療法とが互いに約１２〜２４または７２時間以内、特に、互いに約６〜１２時間以内に患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況では、それぞれの施与の間を数日（２、３、４、５、６または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）空けて治療期間を大きく延ばすことが望ましい場合がある。
【０１２１】
Ｔ細胞療法及び追加治療剤は、同じ投与経路によって、または異なる投与経路によって施与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞療法及び／または抗血小板剤を静脈内に、筋肉内に、皮下に、局部的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、埋植によって、吸入によって、クモ膜下腔内に、脳室内に、または鼻腔内に施与する。疾患の予防または治療のために有効な量のＴ細胞療法及び追加治療剤が施与され得る。Ｔ細胞療法及び追加治療剤の適切な投与量は、治療する疾患の種類、疾患の重症度及び経過、個体の臨床症状、個体の臨床履歴及び治療奏効、ならびに担当医の裁量に基づいて決定される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、追加療法は、低分子酵素阻害薬または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態では、追加療法は、副作用制限剤（例えば、治療の副作用の発生及び／または重症度を低減する薬剤、例えば制吐剤など）の投与である。いくつかの実施形態では、追加療法は放射線療法である。いくつかの実施形態では、追加療法は外科手術である。いくつかの実施形態では、追加療法は放射線療法と外科手術との併用である。いくつかの実施形態では、追加療法はガンマ線照射である。いくつかの実施形態では、追加療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害薬、チューブリン阻害薬、アポトーシス阻害薬及び／または化学予防剤である。追加療法は、当技術分野で知られている化学療法剤の１つ以上であってもよい。
【０１２３】
様々な組み合わせが採用され得る。例えば、以下においてＴ細胞療法は「Ａ」であり追加治療剤は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０１２４】
本実施形態の任意の化合物または療法の患者への施与は、薬剤の毒性（あれば）を考慮してそのような化合物の投与のための一般的プロトコールに従うものとする。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性を追跡評価するステップが存在する。
【０１２５】
１．化学療法
多様な化学療法剤が本実施形態に従って使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物または組成物を含意して使用する。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるか否か、及びそれがどの段階で起こるかによって分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡに直接架橋する能力、ＤＮＡ中にインターカレートする能力、または核酸合成に影響を与えることによって染色体及び有糸分裂の異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
【０１２６】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボクオン、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレデパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミンを含めた、エチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類縁体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類縁体ＫＷ−２１８９、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド及びウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エネジイン抗生物質（例えば、カリキアマイシン、特に、カリキアマイシンガンマ１Ｉ及びカリキアマイシンオメガＩ１）などの抗生物質；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；ならびに、ネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシン；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリン及びトリメトレキサートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン及びチオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロキシウリジンなどのピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン及びテストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン及びトリロスタンなどの副腎抑制剤；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジキオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害薬、トランス白金、ならびに薬学的に許容できる上記のいずれかの塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１２７】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こす、幅広く使用されてきた他の因子としては、例えば、γ線、Ｘ線、及び／または放射線同位体の腫瘍細胞への指向的送達として一般に知られるものが挙げられる。他の形態のＤＮＡ損傷因子、例えば、マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び第４，８７０，２８７号）及びＵＶ照射も企図される。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体の集合及び維持に対して広範な損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの１日線量から２０００〜６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射線同位体の線量範囲は広く様々であり、同位体の半減期、放出される放射線の強さ及び種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
【０１２８】
３．免疫療法
当業者であれば、実施形態の方法に併用または連係して追加免疫療法を用いてもよいことを理解するであろう。がん治療に関して免疫療法薬は概して免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依拠してがん細胞を指向及び破壊する。リツキシマブ（リツキサン（商標））はそのような一例である。免疫エフェクターは例えば、腫瘍細胞の表面にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で療法のエフェクターとしての役割を果たすものであってもよいし、他の細胞を動員して実質的に細胞殺傷に影響を与えるものであってもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合した、標的指向性薬剤としての役割を果たすものであってもよい。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
【０１２９】
抗体−薬物複合体は、がん療法を開発する躍進的手法として出現した。がんは世界中で主要な死因の１つである。抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、細胞傷害薬に共有結合で連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。この手法は、抗原標的に対するＭＡｂの高特異性を非常に強力な細胞障害薬と組み合わせるものであり、結果として、濃いレベルで抗原を有する腫瘍細胞に搭載薬（薬物）を送達する「武装」ＭＡｂが得られる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｔｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。薬物の標的指向的送達はさらに、正常組織におけるその曝露を最小限に抑え、結果として毒性が減少し治療指数が向上する。ＦＤＡによる２０１１年のアドセトリス（登録商標）（ブレンツキシマブ  ベドチン）と２０１３年のカドサイラ（登録商標）（トラスツズマブ  エムタンシン、またはＴ−ＤＭ１）との２つのＡＤＣ薬の認可によって当該手法の妥当性が確立された。現在、３０種超のＡＤＣ薬候補が、がん治療の様々な治験段階にある（Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。抗体操作及びリンカー−搭載薬最適化は益々円熟してきているため、新たなＡＤＣの発見及び開発は、この手法に適した新たな標的の同定及び検証（Ｔｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）ならびに標的指向性ＭＡｂの世代に依るところが大きくなってきている。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞における発現の上方制御された／高いレベルと、確実な内在化である。
【０１３０】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化を受けやすい、つまり他の大部分の細胞には存在していない、いくつかのマーカーを保有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが本実施形態との関連において標的指向化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替態様は、抗がん作用と免疫刺激作用とを組み合わせることである。免疫刺激分子も、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含めて存在する。
【０１３１】
現在研究中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び第５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２及びｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０号及び第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）である。本明細書に記載の抗体療法と共に１つ以上の抗がん療法を採用し得ることが企図される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害物質であり得る。免疫チェックポイントは、シグナルを強めるか（例えば共刺激分子）またはシグナルを弱める、免疫システムの調節物質である。免疫チェックポイント遮断の標的となり得る抑制性チェックポイントとしては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、Ｂリンパ球Ｔリンパ球減衰薬（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ−４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン・ムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、及びＴ細胞活性化阻害ＩｇＶドメイン（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害物質はＰＤ−１軸及び／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０１３３】
免疫チェックポイント阻害物質は、小分子、組換え形態のリガンドもしくは受容体であってもよく、または特に抗体、例えばヒト抗体であってもよい（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１５０１６７１８、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２−６４，２０１２；参照により両方を共に本明細書に援用する）。免疫チェックポイントタンパク質の既知の阻害物質またはその類縁体を使用してもよく、特に、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト形態の抗体を使用してもよい。当業者には既知のことであろうが、本開示の中で言及する特定の抗体に対して代替及び／または等価名称を使用してもよい。そのような代替及び／または等価名称は本発明との関連において交換可能である。例えば、ランブロリズマブは、ＭＫ−３４７５及びペンブロリズマブという代替及び等価名称の下でも知られている。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合拮抗物質は、ＰＤ−１とそのリガンド結合相手との結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−１リガンド結合相手はＰＤＬ１及び／またはＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合拮抗物質は、ＰＤＬ１とその結合相手との結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ１結合相手はＰＤ−１及び／またはＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合拮抗物質は、ＰＤＬ２とその結合相手との結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ２結合相手はＰＤ−１である。拮抗物質は、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は米国特許第ＵＳ８７３５５５３号、第ＵＳ８３５４５０９号及び第ＵＳ８００８４４９号（いずれも参照により本明細書に援用する）に記載されている。本明細書において提供される方法に使用される他のＰＤ−１軸拮抗物質は当技術分野では既知であり、例えば、米国特許出願第ＵＳ２０１４０２９４８９８号、第ＵＳ２０１４０２２０２１号及び第ＵＳ２０１１０００８３６９号（いずれも参照により本明細書に援用する）に記載されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合拮抗物質は抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合拮抗物質は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば免疫グロブリン配列のＦｃ領域）と融合した、ＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含んでいるイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合拮抗物質はＡＭＰ−２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られ、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、キイトルーダ（登録商標）及びＳＣＨ−９００４７５としても知られ、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１は、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４は、Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られ、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０１３６】
本明細書において提供される方法において標的となり得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全ｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞の表面にみられ、抗原提示細胞の表面のＣＤ８０またはＣＤ８６と結合したときに「オフ」スイッチとして働く。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、抑制シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８に類似しており、どちらの分子も抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれＢ７−１及びＢ７−２とも呼称される）に結合する。ＣＴＬＡ４が抑制シグナルをＴ細胞に伝達するのに対し、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。調節性Ｔ細胞内には細胞内ＣＴＬＡ４もみられ、その機能にとって重要である可能性がある。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、Ｂ７分子に対する抑制性受容体であるＣＴＬＡ−４の発現増加につながる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）またはその抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。
【０１３８】
本発明の方法に使用されるのに適した抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（または、それに由来するＶＨ及び／またはＶＬドメイン）は、当技術分野でよく知られている方法を用いて生成することができる。あるいは、当技術分野で認知されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用することができる。例えば、ＵＳ８，１１９，１２９、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４（トレメリムマブとしても知られるＣＰ６７５，２０６；以前はチクリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７−１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ−６７５２０６）；及びＭｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５３０１−５３０４に開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書で開示する方法に使用することができる。これをもって参照により上記刊行物の各々の教示内容を援用する。ＣＴＬＡ−４との結合に関してこれらの当技術分野で認知されている抗体のいずれかと競合する抗体を使用することもできる。例えばヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は国際特許出願第ＷＯ２００１０１４４２４号、第ＷＯ２００００３７５０４号及び米国特許第ＵＳ８０１７１１４号（いずれも参照により本明細書に援用する）に記載されている。
【０１３９】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１及びヤーボイ（登録商標）としても知られる）、またはその抗原結合断片及び変異型（例えば、ＷＯＯ１／１４４２４を参照のこと）である。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重軽鎖ＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体はイピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記抗体としてＣＴＬＡ−４上の同じエピトープと結合に関して競合する、及び／またはそれと結合する。別の実施形態では、抗体は上記抗体との少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブとの少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。
【０１４０】
ＣＴＬＡ−４を調節する他の分子としては、例えば、ＣＴＬＡ−４リガンド及び受容体、例えば、米国特許第ＵＳ５８４４９０５号、第ＵＳ５８８５７９６号ならびに国際特許出願第ＷＯ１９９５００１９９４号及び第ＷＯ１９９８０４２７５２号（いずれも参照により本明細書に援用する）に記載されているもの、ならびにイムノアドヘシン、例えば米国特許第ＵＳ８３２９８６７号（参照により本明細書に援用する）に記載されているものが挙げられる。
【０１４１】
４．外科手術
がんを有する人々のうちのおよそ６０％は何らかの種類の外科手術を受けることになるが、これには、予防、診断または病期判定、治癒及び緩和のための外科手術が含まれる。治癒的外科手術は、がん組織の全てまたは一部を物理的に除去、摘出及び／または破壊する切除術を含み、他の療法、例えば、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法と併せて用いられ得る。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡法で管理される外科手術（モース手術）が含まれる。
【０１４２】
がんの細胞、組織または腫瘍の一部または全てを摘出する際、身体に空洞が形成され得る。治療は、領域の追加抗がん療法による灌流、直接注射または局所適用によって完遂され得る。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごと、または１、２、３、４及び５週間ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに繰り返されてもよい。同様にこれらの処置は様々な施与量であってよい。
【０１４３】
５．他の薬剤
治療の治療的有効性を向上させるために他の薬剤が本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いられ得ることが企図される。これらの追加薬剤としては、例えば、細胞表面受容体及びギャップ結合の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着阻害薬、アポトーシス誘導薬に対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤が挙げられる。ギャップ結合の数を多くすることによって細胞間シグナル伝達を増加させることは、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用して治療の抗過剰増殖有効性を向上させることができる。細胞接着阻害薬は本実施形態の有効性を向上させると企図される。細胞接着阻害薬の例は焦点接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害薬及びロバスタチンである。さらに、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５を本実施形態の特定の態様と併せて使用して治療有効性を向上させることができることが企図される。
【０１４４】
ＩＶ．製造品またはキット
膜係留ＩＬ−１２及び／またはＮＫＧ２Ｄを発現しているＴ細胞を含む製造品またはキットも提供する。製造品またはキットはさらに、個体のがんを治療するもしくはその進行を遅らせるべく、またはがんを有する個体の免疫機能を強化すべく養子Ｔ細胞を場合によって追加治療剤（例えばドキソルビシン）と併せて使用するための指示事項を含んだパッケージ添付文書を含むことができる。本明細書に記載の養子Ｔ細胞及び／または追加治療剤のいずれかが製造品またはキットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、養子Ｔ細胞及び追加治療剤は同じ容器または別個の容器に入っている。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（例えばポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン）または金属合金（例えばステンレス鋼またはハステロイ）などの様々な材料で作られ得る。いくつかの実施形態では、容器は製剤を保持し、容器に付けた、またはそれに関連付けたラベルは使用のための説明を表示し得る。製造品またはキットはさらに、商業的な及びユーザーの見地から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用のための指示事項を含んだパッケージ添付文書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、製造品はさらに、１つ以上の別の薬剤（例えば化学療法剤及び抗新生物剤）を含む。１つ以上の薬剤に適する容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。
【実施例】
【０１４５】
Ｖ．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。当業者であれば、以下の実施例中で開示される技術が、本発明の実施において十分に機能すべく本発明者らによって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい形態を構成するとみなされ得る、ということを認識するはずである。しかしながら、開示されている具体的実施形態において本開示に鑑みて多くの変更を加えることができ、なおかつ本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく似通った、または類似した結果を得ることができる、ということは当業者であれば認識するはずである。
【０１４６】
実施例１−Ｔ細胞膜上でのＩＬ−１２の発現は固形腫瘍内へのＴ細胞浸潤を促進する
ＩＬ１２のＴ細胞膜での発現をもたらすために、ＩＬ−１２膜係留タンパク質融合遺伝子を生成した。具体的には、ｐ３５を膜係留配列（下線部）で改変した。ＰＣＭＶ−ｈＰ３５−ＴＭ−ｐＡの構築物の後ろに標準的なｐ４０発現ユニットを続けた。ｐ３５融合タンパク質配列は以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有していた：
2019532648.tif 000002
ｐ４０タンパク質は以下のアミノ酸配列（配列番号４）を有していた：
Ｐ４０サブユニット
2019532648.tif 000003
【０１４７】
ａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞は、エレクトロポレーターを使用する電気穿孔によるＣＤ８＋Ｔ細胞内へのＩＬ１２−膜係留タンパク質融合遺伝子プラスミドのトランスフェクションによって得た。少ない百分率のａｔｔＩＬ１２−Ｔ細胞で、電気穿孔後のａｔｔＩＬ１２の発現持続時間は４〜６時間と検出され、２４時間以内にピークに達したが４日間を超えて持続することができた（表１）。トランスフェクションから２４時間後のＴ細胞上でのａｔｔＩＬ１２の発現。トランスフェクトされたＴ細胞をスライド上にスピンコートし、固定し、細胞膜上のＩＬ−１２  ｐ４０について染色した。ＣＤ８＋Ｔ細の７％が膜ａｔｔＩＬ−１２を発現したことが認められた（図３）。独立した複数のトランスフェクション試験に基づけば、トランスフェクション効率は３〜１０％の範囲で変動した。
【０１４８】
2019532648.tif 000004
【０１４９】
次に、ａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞を特性評価する試験を実施した。Ｔ細胞（２．５×１０６個）に２μｇのプラスミドをトランスフェクトし、１ｍｌのＲＰＭＩ／クリック培地の中で４または２４時間インキュベートした。培地を回収し、ＩＬ１２及びＩＦＮ−γの存在についてＥＬＩＳＡを用いて検査した。高レベルのＩＬ−１２はｗｔＩＬ−１２トランスフェクション後の培地において検出されたが、ａｔｔＩＬ−１２トランスフェクションによる場合では４時間及び２４時間のどちらの時点でも検出することができなかった。ｗｔＩＬ−１２をトランスフェクトされたＴ細胞はさらに、ａｔｔＩＬ−１２をトランスフェクトされたＴ細胞に比べてわずかに高いレベルのＩＦＮγを生成した（図４）。
【０１５０】
ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞浸潤に先立つドキソルビシンによる処置は抗腫瘍治療有効性を強化する：ＮＳＧマウスに５×１０６個のＡ５４９細胞を皮下接種し、接種後１２日目に１回目の処置に供し、続いて３７日目及び５８日目にもう２回の処置に供した。対照ＤＮＡ（ｃｔｒｌＤＮＡ）、野生型ＩＬ１２（ｗｔＩＬ１２）または膜係留ＩＬ１２（ａｔｔＩＬ１２）による改変に続いてＴ細胞処置（注入１回につき２．５×１０６個のＴ細胞を投与した）を全てのマウスに施した。Ｔ細胞投与の１日前にドキソルビシン（Ｄｏｘ）を投与した。腫瘍体積を週に２回測定した。結果は、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞移入とＤｏｘ処置が生存期間の延長を伴って腫瘍発達を効率的に阻害したことを示した。重要なことに、ａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞療法はＤｏｘ処置の有無にかかわらずｗｔＩＬ１２  Ｔ細胞療法を著しく凌駕した（図６）。
【０１５１】
Ａ５４９腫瘍切片を腫瘍の縁から３〜５ｍｍ隔てて採取し、抗ヒトＣＤ３及びＡＦ４８８抗ウサギ抗体染色に供した。画像は各切片の中央を表す。Ｄｏｘに続く増殖Ｔ細胞の注入（Ｄｏｘ＋Ｔ）、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞（ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ）の注入、ａｔｔＩＬ−１２の注入とそれに先立つＤｏｘによる処置（ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘ）によって処置した腫瘍では、Ｔ細胞透過がみられた。対照Ｔ細胞単独（ｐＣｔｒｌ−Ｔ）または野生型ＩＬ−１２改変型Ｔ細胞（ｗｔＩＬ−１２−Ｔ）の注入ではＴ細胞透過を何ら検出することができなかった（図１）。
【０１５２】
腫瘍の縁から５ｍｍより大きく隔てて腫瘍の中央に向けて採取したＡ５４９腫瘍切片をＴ細胞染色に供した。ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞移入とそれに先立つドキソルビシンによる処置のみが、注入Ｔ細胞の腫瘍深部浸潤を示した（図２）。
【０１５３】
ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞浸潤は、ｗｔＩＬ−１２によって誘導される細胞傷害性サイトカインを減少させることができる：Ｔ細胞移入後に血清中の炎症性サイトカインを測定した。２回目の処置から４日後に血液を採取し、血清中のＩＬ−６、ＴＮＦα及びＩＦＮγのレベルについてＥＬＩＳＡを用いて試験した。どの処置群においてもＩＬ−６及びＴＮＦαは検出することができなかった。しかしながら、ｗｔＩＬ−１２−Ｔ細胞移入は、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔとドキソルビシンに比べてより劇的に高い血中ＩＦＮγレベルを誘導した。このように、ａｔｔＩＬ−１２はサイトカインストームの危険度も低下させる、というのも、ａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞はストームの誘因であるＩＦＮγを誘導しないからである。重要なことに、ＩＦＮγは、Ｔ細胞機能を阻害するものであるＰＤ−Ｌ１の発現も誘導する。
【０１５４】
対照、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔとドキソルビシンによる処置の後に、Ａ５４９腫瘍をＴ細胞誘引性ケモカインのｍＲＮＡ発現について試験した。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ１７はａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞とドキソルビシンによって腫瘍内に劇的に誘導された（図９）。ケモカイン誘導が固形腫瘍内へのＴ細胞の透過を説明している。
【０１５５】
ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞注入とドキソルビシンによって、大型（６〜８ｍｍ）の侵攻性固形ＰＤＸ腫瘍が退縮する：ヌードマウスに結腸癌ＰＤＸ腫瘍を皮下埋植し、腫瘍の直径が６〜８ｍｍとなったときに１回目の処置に供し、続いて２８日目にもう１回の処置に供した。対照ＤＮＡ（ｃｔｒｌＤＮＡ）、野生型ＩＬ１２（ｗｔＩＬ１２）または膜係留ＩＬ−１２（ａｔｔＩＬ１２）による改変に続いてＴ細胞処置を全てのマウスに施した。Ｔ細胞投与の１日前にドキソルビシン（Ｄｏｘ）を投与した。腫瘍体積を週に２回測定した。結果は、ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞移入とＤｏｘ処置が生存期間の延長を伴って腫瘍発達を効果的に阻害したことを示した（図７）。各施与において、固形腫瘍透過を達成するのに必要とされるａｔｔＩＬ−１２陽性Ｔ細胞が最小限の３〜２０％であったことが認められた。
【０１５６】
ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞注入（１×１０７細胞）とドキソルビシンは特大（１６〜１８ｍｍ）のＰＤＸ腫瘍を安定化させることができる：特大（直径１６〜１８ｍｍ）のＰＤＸ腫瘍を対照Ｔ細胞、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔとドキソルビシンによる処置に供した。対照Ｔ細胞療法単独と比較して、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞とドキソルビシンによる処置は腫瘍進行を安定化させる（図８）。
【０１５７】
浸潤Ｔ細胞上でのＣＤ２８の誘導及びＰＤ−１の減少による腫瘍微小環境中のＴ細胞特性の改善：ｃｔｒｌ  Ｔ細胞、またはａｔｔＩＬ−１２−Ｔとドキソルビシンによる処置の後のＰＤＸ腫瘍をフローサイトメトリーに供して、腫瘍浸潤リンパ球上でのＣＤ２８及びＰＤ−１の発現を試験した。ｃｔｒｌ−Ｔ処置と比較してａｔｔＩＬ−１２−Ｔとドキソルビシンは、共刺激受容体ＣＤ２８発現を誘導すると同時にチェックポイント調節物質ＰＤ−１を減少させた。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞リガンド及び受容体が誘導された。このように、ドキソルビシンはＴ細胞誘引性ケモカインを上方制御した。同様に、透過Ｔ細胞は疲弊マーカーＬａｇ３の発現レベルが低く、これは対照群においてこのマーカーの発現レベルが高いこととは対照的である。注目すべきことに、ＮＫＧ２Ｄリガンドも２回目の処置の後に高くなっている。
【０１５８】
かくして、Ｔ細胞膜上にＩＬ−１２が係留されているａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞による療法は抗腫瘍特性を強化することが示された。さらに、ａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞の投与の前（例えば１６〜２４時間前）のドキソルビシン（Ｄｏｘ）添加は固形腫瘍内へのａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞透過を著しく増強することが見出された。このドキソルビシン及びａｔｔＩＬ−１２−Ｔ細胞の逐次投与はＴ細胞死の回避と腫瘍透過とを両方とも可能にするが、これをまとめてｉＴＩＬと呼ぶ、というのも、腫瘍内への浸潤Ｔ細胞は天然に存在するＴ細胞によってではなくこの処置によって誘導されるからである。
【０１５９】
実施例２−レンチウイルスａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞の特性評価
ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞の有効性をさらに特性評価するために、結腸腺癌マウスモデルを使用した。ＮＳＧマウスに５×１０６個のＨＴ２９細胞を皮下注射によって接種した。腫瘍の直径が１．０ｃｍに達したときに処置を開始した。ドキソルビシンの３回の投与に続いて１３／１４日目、２７／２８日目及び３６／３７日目にＴ細胞を移入させた。Ｔ細胞注入の前にＴ細胞をレンチ−対照ウイルスまたはレンチ−ａｔｔＩＬ−１２ウイルスに感染させた。注入の６時間前に、Ｔ細胞にａｔｔＩＬ−１２を電気穿孔によってトランスフェクトした。ｐＣｔｒｌ−Ｔ＋Ｄｏｘ、及び５０万ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘは腫瘍進行を遅延させることができなかった。対照的に、２５０万個及び１００万個のレンチウイルスａｔｔＩＬ−１２感染Ｔ細胞とドキソルビシンは腫瘍退縮をもたらした（図１２）。
【０１６０】
アルブミン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、クレアチニン、グロブリン及び総タンパク質のレベルを含めた血液化学分析を大型ＨＴ２９腫瘍を保有するマウスに対して実施した（図１４及び図１７）。ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞で処置したマウスはＡＳＴ及びグロブリンが正常ベースライン値に比べてわずかに増加したが、対照Ｔ細胞で処置したマウスはＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ及びクレアチニンのレベルが異常に高く、肝及び腎損傷を示唆している。しかしながら、ａｔｔＩＬ１２  Ｔ細胞で処置したマウスでは異常に上昇したレベルが認められず、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞が肝または腎損傷を引き起こさないことを指し示していた。
【０１６１】
注入後のＴ細胞分布を試験するために、ＨＴ２９腫瘍保有マウスを、擬似体、レンチ−対照−Ｔ＋Ｄｏｘ、及びレンチ−ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘによる単回処置に供した。マウスを処置の１日後、３日後及び７日後に安楽死させた。ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘは、以前の試験で認められたように腫瘍退縮を誘導した（図１５）。Ｔ細胞分布の分析は、ＣＤ４、ＣＤ８  Ｔ細胞ならびにＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２８及びＣＤ３９陽性Ｔ細胞、ならびに腫瘍細胞上でのＣＤ８０発現が腫瘍内で１、３及び７日目に検出されたことを示した。ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘは処置から早くも１日目に腫瘍内でのＣＤ２８陽性Ｔ細胞の蓄積を強化した。ａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋Ｄｏｘはさらに、腫瘍内でのＣＤ８  Ｔ細胞の蓄積の大きな増加、ならびにＮＫＧ２Ｄ陽性Ｔ細胞を７日目に誘導した。Ｔ細胞上のＣＤ３９は３日目に上方制御されたが、７日目には基底レベルにまで減少した。興味深いことに、早くも１日目にａｔｔＩＬ−１２−Ｔ＋ＤｏｘによってＣＤ８０が劇的に誘導された（図１６）。
【０１６２】
ＨＴ２９腫瘍を保有するマウスに対して免疫組織化学分析も実施して種々の臓器におけるＴ細胞分布を決定した。対照Ｔ細胞で処置したマウスの肺はＴ細胞のかなりの蓄積を示した。他方、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞で処置したマウスの肺にはＴ細胞が少ししか蓄積していないことが認められた（図１８及び図１９）。実際、ａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞で処置したマウスの７日目の肺にはＴ細胞は見つからなかった（図１８Ｃ）。したがって、レンチウイルスａｔｔＩＬ−１２  Ｔ細胞による処置の後でのサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の危険度は対照レンチウイルスＴ細胞処置と比較して低い。
【０１６３】
実施例３−ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫監視の調節
ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２８活性化はＮＫＧ２Ｄ発現増加を誘発する：以前の試験では、ＩＬ−１２とドキソルビシンによる処置によって腫瘍保有マウスからの脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面にＮＫＧ２Ｄ発現が誘導され得ることが実証された（図２０Ａ）。しかしながら、同じ腫瘍モデルを保有するＣＤ２８−／−マウスにおいて同じ処置によってＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団を増加させることはできなかった（図２０Ａ）。これらの観察結果は、ＣＤ２８共刺激がＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の調節において決定的な役割を果たしている可能性があるという仮説につながった。この仮説を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６及びＣＤ２８−／−腫瘍保有マウスから単離した脾細胞を抗ＣＤ３マイクロビーズで前処理し、ＣＤ２８に対する生理学的リガンドである対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質による処置を２４時間施した。ＣＤ８０によるＣＤ２８活性化はＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を著しく増加させることが見出された。しかしながら、ＣＤ２８−ＣＤ８＋Ｔ細胞においてこれが繰り返されることはなく（図２０Ｂ）、ＣＤ２８活性化がＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄの発現を調節することができることが示唆された。マウスＮＫＧ２Ｄ受容体は少数の活性化マウスＣＤ８＋Ｔ細胞の上で一過的に発現するに過ぎない。それゆえ、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の持続期間を決定することを試みた。ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を２４時間、抗ＣＤ３マイクロビーズで前刺激し、その後、対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃで１、２、３、４及び５日間処理した。ＣＤ８０によって誘導されるＮＫＧ２Ｄ発現のピークは４日目であった。対照的に、対照ＦｃはＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄのベースライン発現を誘導したに過ぎなかった（図２０Ｃ）。しかも、ＬＬＣ腫瘍保有マウスに対するＣＤ８０−Ｆｃの週２回の２週間にわたる投与は、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を顕著に増加させた（図２８）。これらの生体内での結果は、ＣＤ２８活性化がＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ＮＫＧ２Ｄ発現を誘導することをさらに裏付けた。
【０１６４】
マウスとは違ってヒトＮＫＧ２Ｄはより一般的にＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現し、ＮＫＧ２Ｄ発現は生体外での増殖中に失われ得る。ＣＤ２８刺激がＣＤ８＋Ｔ細胞上でのヒトＮＫＧ２Ｄ発現を促進する上で重要な役割を果たしているか否かを判定するために、ヒトＴ細胞を健常ドナーのＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３マイクロビーズで前処理し、その後、対照ＦｃまたはヒトＣＤ８０−Ｆｃで刺激した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ受容体の高発現にもかかわらず、ＣＤ８０−Ｆｃによる処置はＮＫＧ２Ｄ発現をなおも顕著に増加させ（図２１Ａ）、このことはマウスで認められたことと一致している。興味深いことに、経時的試験では、抗ＣＤ３マイクロビーズによる前刺激がＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄのベースライン発現をもたらしたものの、ＣＤ２８刺激の非存在下ではＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が１日目から４日目へと急速に減少した、ということが見出された（図２１Ｂ）。これとは著しく対照的に、ＣＤ８０−Ｆｃによる処置はＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ＮＫＧ２Ｄ発現を誘導し、５日目をピークとしていた（図２１Ｂ）。これらの結果は、ＣＤ２８の活性化がＣＤ８＋Ｔ細胞上での持続的ＮＫＧ２Ｄ発現にとって極めて重要であるという仮説を支持していた。
【０１６５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２８活性化の後のＬｃｋ／ＺＡＰ７０チロシンキナーゼカスケードによるＳＴＡＴ３リン酸化：ＮＫ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現がｐＳＴＡＴ３によって調節されることから、次なる疑問は、ｐＳＴＡＴ３発現がＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＤ２８の活性化によって誘導されるか否かということであった。この疑問に取り組むために、マウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において１５分間及び３０分間ならびに１時間及び２時間の対照ＩｇＧまたはＣＤ８０−Ｆｃとのインキュベーションの後にｐＳＴＡＴ３発現を細胞内フローサイトメトリー染色によって測定した。興味深いことに、ＣＤ８０−Ｆｃは１５分という早さでＳＴＡＴ３リン酸化（Ｙ７０５）を誘発したが、対照Ｆｃはそれができなかった（図２２Ａ及びＢ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２８活性化がＳＴＡＴ３リン酸化を生じさせるということを仮定して、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＤ２８がＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達をいかにして活性化させるのかを決定することを試みた。これらの細胞では、共刺激受容体ＣＤ２８はチロシンキナーゼＬｃｋの持続的活性化によってＴＣＲシグナル伝達を強め、それが今度はＺＡＰ７０を動因及び活性化する。以前の試験は、ＣＤ４Ｃ  Ｔ細胞においてＣＤ２８がＬｃｋを介してＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達を誘発することを実証した。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞において上流キナーゼカスケードとしてのＬｃｋ／ＺＡＰ７０がＳＴＡＴ３を活性化させるか否かを判定するために薬理学的モデルを確立した。マウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮し（図２９）、抗ＣＤ３マイクロビーズで刺激し、薬理学的阻害薬ＰＰ２、ＡＧ−４９０またはＪＳＩ−１２４の存在下または非存在下で対照ＩｇＧまたはＣＤ８０−Ｆｃと共に１時間インキュベートした。ＰＰ２を使用したのは、それがＬｃｋ活性化の遮断に対して感受性を有するＳｒｃファミリーキナーゼ阻害物質であるからである。また、ＡＧ−４９０はＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達の活性化を阻害することができる。さらに、ＪＳＩ−１２４は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３活性化及びｐＳＴＡＴ３とＤＮＡとの結合を妨害する。イムノブロッティングの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ３がＣＤ８０−Ｆｃに基づく処置に応答して活性化されたこと、及び薬理学的阻害薬による処置がＳＴＡＴ３のリン酸化の消滅を完結させたことを裏付けた。対照的に、ＳＴＡＴ３発現の総レベルは種々の処置で同程度に保たれており（図２３）、ＣＤ２８によって誘導されるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼカスケードの活性化がＳＴＡＴ３リン酸化において本質的な役割を果たすことが実証された。注目すべきこととして、ｐＳＴＡＴ３の阻害薬は他のＳＴＡＴ３メンバーのリン酸化にも影響を与え得る。ｐＳＴＡＴ３の決定的役割を検証するために、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ５の発現も評価した。結果は、ＣＤ８０−Ｆｃによる処置が１時間目にｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ５の発現に影響を与えることができなかったことを示した。
【０１６６】
ＳＴＡＴ３活性化の遮断はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の誘導を妨害する：ＮＫＧ２Ｄ発現がＣＤ８０−Ｆｃに基づく処置によってｐＳＴＡＴ３を介して誘導されるならば、ＳＴＡＴ３の何らかの上流活性化因子の阻害はＮＫＧ２Ｄ誘導をなくさせるはずである。経時的試験を実施してマウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に対する薬理学的阻害薬の毒性を評価した。ビヒクル対照と比較してＪＳＩ−１２４による処置から４８時間後に細胞生存率が顕著に低下したことに気付いた（図３０）。それゆえ、仮説を試験するために、マウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮し、対照Ｆｃ、ＣＤ８０−Ｆｃと対照ビヒクルまたは、ＣＤ８０−Ｆｃと（ＰＰ２、ＡＧ４９０及びＪＳＩ−１２４を含めた）ＳＴＡＴ３活性化阻害薬で２４時間処理した。ＳＴＡＴ３活性化の弱まりと関連して、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３阻害薬による処理はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を劇的に減少させた（図２４Ａ及びＢ）。総合して、これらの結果は、ＴＣＲ／ＣＤ２８の活性化及びＬｃｋ／ＪＡＫチロシンキナーゼシグナル伝達を介したＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の上方制御におけるＳＴＡＴ３の生物学的役割を示唆した。
【０１６７】
ＣＤ２８活性化は、ＮＫＧ２Ｄ−ＮＫＧ２Ｄリガンド相互作用によって媒介されるパーフォリン産生及び抗腫瘍細胞傷害性を刺激する：ＣＤ２８活性化がＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現を誘導することは実証された。しかしながら、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性は未だ評価されていない。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ発現の機能を評価するために、対照Ｆｃ、ＣＤ８０−Ｆｃと擬似体、またはＣＤ８０−ＦｃとＮＫＧ２Ｄ遮断抗体で処理したマウスＣＤ８＋Ｔ細胞をＮＫＧ２Ｄリガンド陽性マウスＬＬＣ細胞と共に５時間、共インキュベートした。誘導されたＮＫＧ２Ｄ発現がエフェクター機能を有するのならば、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＮＫＧ２Ｄリガンド陽性ＬＬＣ腫瘍細胞に曝露された後にエフェクター分子パーフォリンを産生するはずである。ＣＤ８＋Ｔ細胞から遊離した培地中のパーフォリンの濃度をＥＬＩＳＡによって評価したところ、ＣＤ８０刺激によって媒介されるＣＤ２８活性化がパーフォリン産生の驚くべき増加をもたらしたことが実証された（図２５Ａ）。これとは著しく対照的に、ＮＫＧ２Ｄ発現の遮断はパーフォリン産生を元のベースラインレベルにまで減じ、パーフォリンの発現増加がＮＫＧ２Ｄ−ＮＫＧ２Ｄリガンド相互作用によって生じることを示唆した。
【０１６８】
免疫細胞によるパーフォリン発現の増加は抗腫瘍細胞溶解活性の強化を表していることが多いことから、ＣＤ８０−Ｆｃに基づく処理の後のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球活性を測定した。濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞を２４時間、対照Ｆｃ、ＣＤ８０−Ｆｃと対照ＩｇＧ、ＣＤ８０−Ｆｃと抗ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体、またはＣＤ８０−ＦｃとＳＴＡＴ３阻害薬ＪＳＩ−１２４で前処理した。また、ＬＬＣ細胞をＣＦＳＥで標識し、細胞表面でのＮＫＧ２ＤリガンドＲａｅ−１発現によって確認した（図６Ｂ）。次いでＬＬＣ細胞を、前処理したＣＤ８＋Ｔ細胞と共に５：１、１０：１及び２５：１のＥ：Ｔ比で５時間インキュベートした。インキュベート後に混合細胞をＰＩ（１ｍｇ／ｍＬ）で染色した。標的生細胞を光散乱パラメータ及びＰＩ陰性によって同定した。標的細胞の生存率を、ＣＤ８＋Ｔ細胞とのインキュベートの後に残った正規化標的細胞の百分率として決定した。Ｅ：Ｔ比が増加しても、対照ＩｇＧで処理したＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性は増加しなかった。対照的に、ＣＤ８０−Ｆｃで処理したＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照Ｆｃによって処理したＣＤ８＋Ｔ細胞よりも際立って大きい傷害活性を呈した（図２５Ｃ）。上述したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリン産生と一致して、ＮＫＧ２Ｄ発現の遮断は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害性をなくさせた（図２５Ｃ）。さらに、ＪＳＩ−１２４によるＳＴＡＴ３活性化阻害はＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を弱め（図２５Ｃ）、ＮＫＧ２Ｄの発現がＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍障害能と関連していることが示された。
【０１６９】
同様にして、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を、ＣＤ２８活性化時のその脱顆粒に関して評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞が標的腫瘍細胞への曝露に応答して脱顆粒を経る能力を細胞表面マーカーＣＤ１０７ａの誘導によって評価した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＤ３マイクロビーズと共にインキュベートし、ＳＴＡＴ３阻害薬ＪＳＩ−１２４の存在下または非存在下で対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃで２４時間処理した。刺激後にヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ標識した標的ＮＫＧ２ＤＬ＋Ｋ５６２細胞に１：１の比で曝露し、抗ＣＤ１０７ａ抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に４時間、共インキュベートした。次に、混合細胞をフローサイトメトリー分析のためにＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄで染色した。３名のドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞についての集積データは、標的細胞への曝露なしでは刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ発現が増加したものの、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）のレベルが非常に低かったということを実証した。標的細胞への曝露の後、増加したＮＫＧ２Ｄ発現は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒能力の強化に関連付いていた（図２５Ｄ）。反対に、ＳＴＡＴ３阻害薬ＪＳＩ−１２４による処理はＮＫＧ２Ｄ発現をなくさせ、したがってＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒を減少させた。
【０１７０】
生体外での抗ＣＤ３とＣＤ８０組換えタンパク質による刺激がＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＮＫＧ２Ｄ誘導をもたらすことを仮定すると、これは、前刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入がＮＫＧ２Ｄリガンド陽性腫瘍に対する治療効果を向上させるのか否かという疑問を招いた。この仮説を検証するために、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞をＲａｅ−１＋ＬＬＣ腫瘍保有マウスから単離し、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下または非存在下で４８時間、抗ＣＤ３と対照ＦｃまたはＣＤ８０組換えタンパク質で刺激した。刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞を試験してＮＫＧ２Ｄの誘導を確認し（図２６Ａ）、その後、ＬＬＣ腫瘍保有マウスに毎週養子移入させた。腫瘍の直径が１．５ｃｍに達したときにマウスを安楽死させた。腫瘍を解離させ、腫瘍浸潤ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を検出した。試験管内での結果と一致して、ＣＤ８０による前刺激はＬＬＣ腫瘍においてＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を大いに強化したが（図２６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞注入に先立つＮＫＧ２Ｄ遮断は腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞蓄積を減じた。結果として腫瘍進行は、対照Ｆｃ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞療法とは対照的に、ＣＤ８０刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞療法によって著しく遅滞し（図２６Ｃ）、抗腫瘍作用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄを遮断することによって完全に消滅した。腫瘍発達の阻害と併せてＣＤ８０刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞移入は腫瘍保有マウスの生存時間を劇的に延ばし（図２６Ｃ）、この方策がＮＫＧ２Ｄリガンド陽性腫瘍の処置のために役立ち得ることを示唆した。
【０１７１】
実施例４−材料及び方法
動物：６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス及びＣＤ２８−／−をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスの飼育及び取扱い手順はテキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンターの動物実験委員会によって承認された。移植腫瘍マウスモデルを作り出すために、Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞（マウス１匹あたり１．５×１０５個）をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種した。腫瘍保有体を、対照ＤＮＡ（１０ｍｇ／マウス）、対照ＤＮＡとドキソルビシン（１ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ−１２コードＤＮＡ（１０ｍｇ／マウス）、またはＩＬ−１２コードＤＮＡとドキソルビシンに供し、続いて以前に記載されている電気穿孔に供した。腫瘍体積は式：ＶＤ（π／８）£×（ａ＊ｂ２）によって算出した（ここで、ＶＤは立方センチメートル表示での腫瘍体積であり、Ｄは最大腫瘍直径であり、ｂは、ａに対して９０°の直径である）。
【０１７２】
細胞株：匿名化された正常血液ドナーからのバッフィーコートをＧｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから購入し、その入手はＭＤアンダーソン施設内審査委員会によって承認された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をバッフィーコート試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅによる遠心分離によって単離した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣから濃縮した。ヒトＴ細胞は、ウシ胎仔血清を１０％含有する４５％のＲＰＭＩ１６４０及び４５％のクリック培地の中で培養した。マウスＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐキットを使用して脾細胞から濃縮した。マウスＴ細胞は、１０％のウシ胎仔血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０の中で培養した。
【０１７３】
抗体及び試薬：マウス及びヒトＣＤ３、ＣＤ８＋及びＮＫＧ２Ｄを標的とするモノクローナル抗体、ならびに同位体対照抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。抗マウスパーフォリン、ヒトＣＤ１０７ａ、及びｐＳＴＡＴ３抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗ヒト及びマウスＣＤ３マイクロビーズはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）、ｐＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）及びｂ−アクチンを標的とする抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ｐＳＴＡＴ１（Ｓｅｒ７２７）及び全ＳＴＡＴ３を標的とする抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。薬理学的阻害薬ＪＳＩ−１２４、ＰＰ２及びＡＧ−４９０はＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ヒトＣＤ８０−Ｆｃ組換えタンパク質、ヒト及びマウスＦｃ対照、ならびにヒトＩＬ−２はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。マウスＣＤ８０−Ｆｃ（Ａｓｐ３７−Ｌｙｓ２４５−ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ）組換えタンパク質はＳＹＤ  Ｌａｂｓによって合成された。
【０１７４】
イムノブロッティング：マウス及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。タンパク質抽出物を４℃で２０分間の最大速度での遠心分離によって細胞残屑から分離した。２０マイクログラムの総タンパク質を１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ｉＢｌｏｔゲル転写装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。膜を種々の一次及び二次抗体でブロッティングして関心対象のタンパク質を検出した。
【０１７５】
フローサイトメトリー：細胞を一次及び二次抗体で各々３０分間４℃で順次インキュベートした。染色した細胞を、Ａｔｔｕｎｅ音響集束サイトメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。フローサイトメトリーデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェアプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。
【０１７６】
脱顆粒アッセイ：ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、０．１ｍＭのＪＳＩ−１２４、１ｎＭのＰＰ２、または５０ｍＭのＡＧ−４９０の存在下または非存在下で対照ＦｃまたはＣＤ８０−Ｆｃ（１ｍｇ／ｍＬ）によって処理した。その後、細胞を標的細胞と共に１：１（Ｅ：Ｔ）の比で４時間３７℃で共インキュベートし、共インキュベート中に抗ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）またはアイソタイプ対照抗体を細胞混合物に添加した。細胞をフローサイトメトリー分析のために抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で染色した。
【０１７７】
細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ：ＬＬＣ細胞を５００ｍＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、３７℃で５時間、精製マウスＣＤ８＋Ｔ細胞と一緒に５：１、１０：１及び２５：１（Ｅ：Ｔ）の比でインキュベートした。インキュベート後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ；１ｍｇ／ｍＬ［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ］）で染色した。標的生細胞は光散乱パラメータ及びＰＩ陰性によって同定した。標的細胞の生存率は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とのインキュベートの後に残った正規化標的細胞の百分率として測定した。
【０１７８】
ＥＬＩＳＡ：細胞培養培地中のマウスパーフォリンのレベルは、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅからのパーフォリンＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。
【０１７９】
統計解析：直接測定した結果は、２つの処置群を比較する両側スチューデントｔ検定、または２つより多い処置群を比較するｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ分散分析を用いて解析した。各比較の統計学的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して決定した。０．０５未満のｐ値は統計学的有意性を表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、統計学的有意性なし。
＊  ＊  ＊
【０１８０】
本明細書において開示及び特許請求される全ての方法は、本開示に鑑みて過度の実験なしで実施及び実践することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく本明細書に記載の方法及び方法のステップまたはステップの順序に変化形態を適用してもよいことは明白であろう。より具体的に言えば、同じまたは類似した結果を得つつ、化学的にも生理学的にも関係のある特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置き換えてもよいことは明白であろう。当業者にとって明白なそのような類似した置き換え及び改変は全て、別記の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲及び概念に含まれるものとみなされる。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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