(57)【要約】  本発明は、抗腫瘍薬の調製におけるカスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。カスパーゼ活性化剤は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を増強することができ、カスパーゼ活性化剤と腫瘍溶解性ウイルスとの組み合わせは、顕著な相乗的な抗腫瘍効果を奏することができる。他の薬剤治療に敏感ではない腫瘍の治療のための効果的な治療法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるカスパーゼ活性化剤の使用であって、前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択される。
【請求項２】
前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９活性化剤からなる群より選択される少なくとも１つであり、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤であり、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰは、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、又はＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
好ましくは、前記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、タンパク質又は化合物からなる群より選択され、
より好ましくは、前記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、Ｓｍａｃタンパク質又はＳｍａｃ様化合物から選択され、
より好ましくは、前記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、Ｓｍａｃ様化合物であるＬＣＬ１６１及びビリナパントからなる群より選択される少なくとも１つであり、
より好ましくは、前記ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
（ａ）少なくとも１つのカスパーゼ活性化剤、及び
（ｂ）少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物又はキットであって、
前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択され、
好ましくは、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、合成カスパーゼ活性化剤であり、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９活性化剤からなる群より選択される少なくとも１つであり、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤であり、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰは、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つである、医薬組成物又はキット。
【請求項５】
前記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、又はＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、タンパク質又は化合物であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、Ｓｍａｃタンパク質又はＳｍａｃ様化合物からなる群より選択され、
好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、化合物であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、ＬＣＬ１６１及びビリナパントから選択される化合物であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料であり、
好ましくは、前記組成物は、腫瘍を治療する組成物である、請求項４に記載の医薬組成物又はキット。
【請求項６】
前記少なくとも１つのカスパーゼ活性化剤及び前記少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスは、別々の成分として存在する、請求項４又は５に記載のキット。
【請求項７】
腫瘍を治療するための医薬品の調製におけるカスパーゼ活性化剤と腫瘍溶解性ウイルスとの組み合わせの使用であって、
前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択され、
好ましくは、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９活性化剤からなる群より選択される少なくとも１つであり、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤であり、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰは、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つであり、
より好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、又はＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、タンパク質又は化合物からなる群より選択され、
より好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、Ｓｍａｃタンパク質又はＳｍａｃ様化合物からなる群より選択され、
好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、化合物であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰ阻害剤は、ＬＣＬ１６１及びビリナパントから選択される化合物であり、
より好ましくは、前記ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料であり、
好ましくは、前記組成物は、腫瘍を治療する組成物である。
【請求項８】
前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、
好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の使用、組成物、又はキット。
【請求項９】
前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり、
好ましくは、前記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんであり、
好ましくは、前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の腫瘍であり、
好ましくは、前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである、請求項１から８のいずれか１項に記載の使用、組成物、又はキット。
【請求項１０】
カスパーゼ活性化剤と腫瘍溶解性ウイルスとの比は、０．０１〜１５ｍｇ：１０３〜１０９ＰＦＵ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０４〜１０９ＰＦＵ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０５〜１０９ＰＦＵであり、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇで用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０３〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられ、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０４〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられ、
より好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０５〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられ、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤はＬＣＬ１６１又はビリナパントである請求項１から９のいずれか１項に記載の使用、組成物、又はキット。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み、
前記医薬組成物は、凍結乾燥粉末、注射剤、調剤、カプセル剤、キット又はパッチ剤の形態である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
被験体における固形腫瘍又は血液腫瘍を治療する方法であって、
前記治療を必要とする被験体に、少なくとも１つの腫瘍溶解性アルファウイルス及び少なくとも１つのカスパーゼ活性化剤を投与することで腫瘍を治療することを含む、方法。
【請求項１３】
前記腫瘍溶解性アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
前記Ｍ１ウイルスは、ジーンバンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のゲノムを有し、或いは、ジーンバンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のゲノムヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるゲノムを有し、
前記ゲタウイルスは、ジーンバンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムを有し、或いは、ジーンバンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるゲノムを有し、
前記Ｍ１ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有し、
前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有し、
好ましくは、前記カスパーゼ活性化剤は、合成カスパーゼ活性化剤であり、
前記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤であり、或いは
前記カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤であり、或いは
前記ＩＡＰ阻害剤は、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つのＩＡＰを阻害し、
前記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する薬剤、ＩＡＰタンパク質を分解する薬剤、又はＩＡＰタンパク質の発現を低下させる薬剤であり、
前記ＩＡＰ阻害剤は、ペプチド、低分子又は核酸であり、
前記ＩＡＰ阻害剤は、ＳＭＡＣペプチド又はＳｍａｃ様化合物であり、
前記Ｓｍａｃ様化合物は、ＬＣＬ１６１又はビリナパントであり、
前記ＩＡＰ阻害剤は、ＲＮＡ干渉剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項１４】
前記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、及び胃がんからなる群より選択されるがんである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＣＬ１６１又はビリナパント及びアルファウイルスは、０．０１〜１５ｍｇ：１０３〜１０９ＰＦＵの比で提供され、
好ましくは、前記アルファウイルス及びカスパーゼ阻害剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として提供され、
好ましくは、前記医薬組成物は、凍結乾燥粉末、注射剤、調剤、カプセル剤、キット又はパッチ剤に製剤化される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年８月１８日に出願された中国特許出願第２０１６１０６８８０９７．９号の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、生物医学の分野に属し、特にカスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性ウイルスの治療的組み合わせ及び抗腫瘍治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染してそれを殺すことができる複製可能なウイルスである。一部の腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞にほとんど又は全く感染することなく、癌細胞に選択的に感染することができる。一部の腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞及び正常細胞の両方に感染する可能性があるが、癌細胞に対してより大きい又は速い致死性を示す。腫瘍溶解性ウイルス療法は、革新的な腫瘍標的療法であり、天然の又は遺伝子組み換えウイルス（又はそれらの組み合わせ）を使用して腫瘍細胞に感染させ、これらのウイルスを腫瘍細胞中で複製させることにより、正常細胞にほとんど又は全く損傷を与えずに、腫瘍細胞を標的として溶解及び殺傷する効果を達成することができる。
【０００４】
腫瘍溶解性ウイルスの一例は、アルファウイルス属に属するＭ１ウイルス（アルファウイルスＭ１）である。Ｍ１ウイルスは、有効な抗腫瘍薬として認識されている。例えば、中国特許出願Ｎｏ．２０１４１０４２５５１０．３には、Ｍ１ウイルスは正常細胞の生存に影響を与えることなく腫瘍細胞の死を選択的に引き起こすことができることが開示されている。しかし、異なる腫瘍はＭ１ウイルスに対する感受性が異なる。特定の腫瘍に対して、Ｍ１ウイルスは単独で投与する場合に十分な腫瘍溶解効果を発揮することができない。中国特許出願Ｎｏ．２０１４１０４２５５１０．３における、Ｍ１ウイルス及び他のウイルスによる腫瘍の治療についての説明、並びに異なる腫瘍型及び治療レベル／方法論による異なる結果についての説明は、本明細書中に参考として援用される。同出願には、異なる種類の腫瘍に対するＭ１の治療有効性が異なることが開示されている。具体的には、Ｍ１ウイルスは、膵がん、鼻咽頭がん、前立腺がん及び黒色腫に対する治療効果がもっとも有効であり、大腸がん、肝臓がん、膀胱がん及び乳がんに対する治療効果が低くなり、神経膠腫、子宮頸がん、肺がんの場合には、治療効果がより一層低くなり、胃がんに対する治療効果が最も低いことが記載されている。
【０００５】
先の特許出願（中国特許出願２０１５１０９９０７０５．７号）には、クリソファノール及びその誘導体は、Ｍ１ウイルスの抗腫瘍相乗剤として使用され、両者の併用は腫瘍細胞の生存率を３９．６％に減少させることができることが開示されている。しかし、腫瘍溶解性ウイルスを含む治療的組み合わせの開発にはまだ改善の余地がある。本発明は、抗腫瘍効果を増強可能な腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、カスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性アルファウイルスのような腫瘍溶解性ウイルスを含む相乗的な抗腫瘍療法を提供する。
【０００７】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるカスパーゼ活性化剤の使用をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、カスパーゼ活性化剤と併用することにより、腫瘍溶解性ウイルスがより良い抗腫瘍効果を発揮することができる抗腫瘍医薬組成物をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスに対して非感受性の腫瘍に向けられる、腫瘍溶解性ウイルスと併用する相乗的な抗腫瘍薬を提供する。
【００１０】
本発明は、上記の治療的組み合わせの投与を含む、固形腫瘍又は血液系（即ち、血液）腫瘍の治療方法をさらに提供する。
【００１１】
上記及び他の目的、特徴、利点は、添付の図面及び以下の詳細な説明によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面全体を通して、以下の略語が使用される。
ＬＣＬ１６１：ＬＣＬ１６１処理群
ビリナパント（Birinapant）：ビリナパント処理群
Ｍ１＋ＬＣＬ１６１：Ｍ１ウイルス及びＬＣＬ１６１を用いる併用処理群
Ｍ：Ｍ１ウイルス単独処理群
Ｍ＋Ｌ：Ｍ１ウイルス及びＬＣＬ１６１を用いる併用処理群
【００１３】
【図１】ＬＣＬ１６１及びＭ１ウイルスは、感染したヒト大腸がん細胞の形態学的病変を顕著に増加させることを示す。
【図２ａ−２ｈ】ＬＣＬ１６１／ビリナパント及びＭ１ウイルスの併用処理は、ヒト大腸及び肝臓がん細胞株の生存率を顕著に減少させることを示す。図２ａは、Ｍ１単独、ＬＣＬ１６１、又はＭ１とＬＣＬ１６１の組み合わせで処理したＨＣＴ１１６細胞の生存率を示す。図２ｂは、Ｍ１単独、ビリナパント、又はＭ１とビリナパントの組み合わせで処理したＨＣＴ１１６細胞の生存率を示す。また、Ｍ１及びＬＣＬ１６１又はビリナパントによる単独及び併用処理後のＳＷ６２０細胞（図２ｃ及び２ｄ）、Ｈｕｈ７細胞（図２ｅ及び２ｆ）、及びＰＬＣ細胞（図２ｇ及びｈ）の生存率を示す。
【図３ａ−３ｄ】腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせたＬＣＬ１６１の抗腫瘍メカニズムを示す。図３ａ及び３ｂは、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２のウエスタンブロット検出を示す。図３ｃ及び３ｄは、組み合わせたｃＩＡＰ１又はｃＩＡＰ２阻害及びＭ１感染の抗がん細胞有効性を実証するＭＴＴ法の結果を示す。
【図４ａ−４ｂ】ＬＣＬ１６１及びＭ１ウイルスの併用処理は、ヒト肝臓（右パネル）及び大腸（左パネル）がん細胞株の移植可能な腫瘍の増殖を顕著に阻害することを示す。図４ａは、上記処理に応答した経時的な腫瘍体積の定量化を示す。図４ｂは、上記処理に応答した腫瘍サイズの縮小を示す。
【図５ａ−５ｆ】ＬＣＬ１６１とＭ１ウイルスの組み合わせは、ヒト大腸及び肝臓がん細胞株におけるカスパーゼ３／７、８及び９の活性を顕著に向上させることを示す。図５ａ及び５ｂは、ＨＣＴ１１６（５ａ）及びＨｕｈ７（５ｂ）細胞において観察されたカスパーゼ３／７の活性を示すチャートである。図５ｃ及び５ｄは、ＨＣＴ１１６（５ｃ）及びＨｕｈ７（５ｄ）細胞において観察されたカスパーゼ８の活性を示すチャートである。図５ｅ及び５ｆは、ＨＣＴ１１６（５ｅ）及びＨｕｈ７（５ｆ）細胞において観察されたカスパーゼ９の活性を示すチャートである。
【００１４】
記載された配列の簡単な説明
本発明で提供される核酸及び／又はアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字の略語、及びアミノ酸についての３文字のコードを用いて示される。各核酸配列について一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は表示された鎖を参考することによって理解され得る。
【００１５】
配列番号１及び２は、ｃＩＡＰ１のｓｉＲＮＡ干渉断片１のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖である。
配列番号３及び４は、ｃＩＡＰ１のｓｉＲＮＡ干渉断片２のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖である。
配列番号５及び６は、ｃＩＡＰ１のｓｉＲＮＡ干渉断片３のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖である。
配列番号７及び８は、ｃＩＡＰ２のｓｉＲＮＡ干渉断片１のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖である。
配列番号９及び１０は、ｃＩＡＰ２のｓｉＲＮＡ干渉断片２のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖である。
配列番号１１及び１２は、ｃＩＡＰ２のｓｉＲＮＡ干渉断片３のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．用語
【００１７】
他に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単語「又は」は「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子量の値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。「概ね」、「約」、「実質的」などの用語は、説明されている文脈及びパラメータに基づいて当業者人によって理解されるように値／説明を修飾し、理解されるためにさらなるガイダンスが必要とされる場合、５％の値が挙げられ得る。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。用語「含む」は「含有する」ことを意味する。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語の例示に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は「例えば」と同義である。記載されたパーセント配列同一性は、参照配列と同一である、それぞれ所与のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質内の核酸残基又はアミノ酸残基の百分率を指す。
【００１８】
矛盾がある場合は、本明細書（用語の説明を含む）が優先するものとする。さらに、すべての材料、方法、及び実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００１９】
ＩＩ．いくつかの実施形態の概要
【００２０】
本開示は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるカスパーゼ活性化剤の使用である。上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択される。
【００２１】
本開示は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるカスパーゼ活性化剤の使用である。上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択される。
【００２２】
好ましくは、上記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つである。Ｍ１ウイルスは、ゲタ様ウイルスに属し、ゲタウイルスとの相同性が発見された関連ウイルスにおいて９７．８％と高いことが報告されている（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ．２００７；３５（３）：５９７−６０３）。
【００２３】
例えば、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスに関する情報は、中国特許１０４８１４９８４Ａを参照することができる。
【００２４】
本明細書に記載の上記アルファウイルス（例えば、Ｍ１ウイルス、ゲタウイルス）は、既存の腫瘍溶解性ウイルスに加えて、自然変異、突然変異（自然、強制又は選択的）、又は遺伝的修飾（例えば、配列の一部の付加、欠失又は置換）を受けたウイルスを含んでもよい。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、上記の変更を受けたウイルスものを含む。好ましくは、上記変化は、該腫瘍溶解性ウイルスが本開示に記載の機能を発揮するのを妨げない。
【００２５】
上記腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ジーンバンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のＭ１ウイルス、又はジーンバンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを有するウイルスであり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、２０１４年７月１７日に中国典型培養物保蔵センターに寄託されたＭ１ウイルス（寄託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３）である。腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３の上記Ｍ１ウイルスのゲノムヌクレオチドとの同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを含んでもよい。
【００２７】
他の実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、ジーンバンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲタウイルスであってもよいか、又はジーンバンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを有するウイルスであってもよい。
【００２８】
特定の実施形態において、上記腫瘍溶解性アルファウイルスは、２０１４年７月１７日に中国典型培養物保蔵センターに寄託されたＭ１ウイルス（寄託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３）である（中国特許１０４８１４９８４Ａ）。
【００２９】
上記使用のいくつかの実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９の活性化剤からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００３０】
理解できるように、カスパーゼ活性化剤は、上記カスパーゼの少なくとも１つの発現レベルを向上できるか、或いは上記カスパーゼの少なくとも１つのタンパク質活性を向上できる組成物、化合物、物質、又は薬剤である。いくつかの実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８３６に記載のカスパーゼ３、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４０に記載のカスパーゼ７、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４１に記載のカスパーゼ８、又はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４２に記載のカスパーゼ９に対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。他の実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８３６に記載のカスパーゼ３の変異体、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４０に記載のカスパーゼ７の変異体、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４１に記載のカスパーゼ８の変異体、又はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４２に記載のカスパーゼ９の変異体に対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。上記変異体タンパク質は、例えば、カスパーゼタンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼアゴニストである。いくつかの実施形態において、カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤であり得る。いくつかの好適実施態様において、カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤であり得る。好ましくは、上記ＩＡＰ阻害剤は、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つのＩＡＰを標的とする。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段である。特定の実施形態において、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質は、タンパク質又は化合物からなる群より選択される。特定の実施形態において、このような化合物は、Ｓｍａｃタンパク質、又はＬＣＬ１６１及びビリナパントなどのＳｍａｃ様化合物から選択される。
【００３３】
ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する他の化合物であって、本明細書に記載のＩＡＰ阻害剤として適用できるものは、ＡＴ４０６（ＳＭ−４０６）、ＢＶ−６、ＳＭ−１２ｄ、ＧＤＣ−０１５２、ＧＤＣ−０１９７、ＳＭ−１６４、ＨＧＳ、１０２９、ＬＢＷ−２４２、ＷＯ２０１４０６０７６７、ＷＯ２０１４０６０７６８、ＷＯ２０１４０６０７７０、ＷＯ２０１４０２６８８２、ＪＰ１４００、ＪＰ１２０１、ＪＰ１５８４、ＬＢＷ２４２を含む。本明細書に記載されるように使用可能なさらなるＩＡＰ阻害剤は、Ｒａｍａ  Ｒａｔｈｏｒｅ（アポトーシス；２０１７，２２：８９８-９１９；  その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００３４】
さらなる実施形態において、上記ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料である。
【００３５】
本発明の好適な実施形態において、上記ＩＡＰタンパク質阻害剤はＩＡＰのＲＮＡ干渉断片、又はＩＡＰに対する抗体である。いくつかの実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ｃＩＡＰ−１に記載のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３２９、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３３０に記載のｃＩＡＰ−２、又はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３３１に記載のＸＩＡＰに対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。他の実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３２９に記載のｃＩＡＰ−１の変異体、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３３０に記載のｃＩＡＰ−２の変異体、又はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３３１に記載のＸＩＡＰの変異体に対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。上記変異体タンパク質は、上記ＩＡＰタンパク質と、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は抗体である。上記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び／又はＩＡＰ結合抗体断片であり得る。上記抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はヒト抗体であり得る。上記抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、又はＶＬ若しくはＶＨドメインであり得る。上記抗体は、例えばタグ、検出可能な標識、又は細胞毒性薬に結合した結合物の形態であり得る。上記抗体は、アイソタイプＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤであり得る。
【００３７】
上記ＩＡＰ阻害剤は、例えば、ＩＡＰの発現を減少又は除去する低阻害性核酸分子（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、及び小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）など）をさらに含む。
【００３８】
このような低阻害性核酸分子は、互いにハイブリダイズして１つ以上の二本鎖領域を形成する第１鎖及び第２鎖を含み得る。各鎖の長さは、約１８〜２８個のヌクレオチド、好ましくは約１８〜２３個のヌクレオチド、より好ましくは約１８、１９、２０、２１又は２２個のヌクレオチドである。或いは、ｓｈＲＮＡ分子のように、一本鎖には、互いにハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができる領域を含んでもよい。
【００３９】
このような低阻害性核酸分子は、ＩＡＰ発現を減少又は除去する能力を維持しながら修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、安定性、活性及び／又は生物学的利用能などのインビトロ又はインビボの特性を改善するために含まれ得る。例えば、このような低阻害性核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子に存在する総ヌクレオチドに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ｏｒ  １００％の修飾ヌクレオチドを含み得る。このような修飾ヌクレオチドは、例えば、デオキシヌクレオチド、２'−Ｏ−メチルヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、及び／又は２'−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを含み得る。ｓｉＲＮＡなどの低阻害性核酸分子は、エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、例えば「５−及び／又は３」−キャップ構造を含んでもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、配列番号１−１２に記載の核酸と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の核酸である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記低阻害性核酸分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸又はオーバーハングヌクレオチドを含み得る。存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対をもたらすヌクレオチドを含み得る。上記低阻害性核酸分子は、例えばリポソームに封入すること、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲルもしくはシクロデキストリンなどの他の担体に組み込むことによって、投与用に製剤化することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記低阻害性核酸分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸又はオーバーハングヌクレオチドを含み得る。存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対をもたらすヌクレオチドを含み得る。上記低阻害性核酸分子は、例えばリポソームに封入すること、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲルもしくはシクロデキストリンなどの他の担体に組み込むことによって、投与用に製剤化することができる。
【００４３】
本開示は、腫瘍を治療するための医薬組成物をさらに提供する。上記医薬組成物は、（ａ）天然及び合成カスパーゼ活性化剤を含むカスパーゼ活性化剤、及び（ｂ）腫瘍溶解性ウイルスを含む。上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択され、例えば、Ｍ１ウイルス又はゲタウイルスである。特定の実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９活性化剤からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくはカスパーゼ脱阻害剤、より好ましくはＩＡＰ阻害剤である。いくつかの実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つのＩＡＰを標的とする。
【００４４】
上記組成物の特定の実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質（本明細書において薬剤としても記載される）、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、又はＩＡＰタンパク質のレベル（本明細書において発現としても記載される）を低下させる遺伝的手段である。
【００４５】
特定の実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、天然又は合成ペプチド、核酸、又は化合物、例えば、低分子薬剤である。
【００４６】
例えば、いくつかの実施形態において、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、タンパク質又は化合物（例えば、Ｓｍａｃタンパク質、又はＬＣＬ１６１及びビリナパントなどのＳｍａｃ様化合物）から選択される。
【００４７】
特定の実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段、例えば、ＲＮＡｉ剤、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料である。
【００４８】
本開示は、腫瘍を治療するための医薬品キットをさらに提供する。上記医薬品キットは、（ａ）カスパーゼ活性化剤、及び（ｂ）腫瘍溶解性ウイルスを含む。上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスから選択され、好ましくは、上記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つである。上記医薬品キットにおいて、カスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性ウイルスは、別々に包装されている。好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９活性化剤のうちの少なくとも１つであり、より好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤である。より好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤である。より好ましくは、上記ＩＡＰは、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＡＰからなる群より選択される少なくとも１つである。
【００４９】
上記医薬品キットの特定の実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、又はＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段である。好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、タンパク質又は化合物からなる群より選択される。より好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、Ｓｍａｃタンパク質又はＳｍａｃ様化合物から選択される。より好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、Ｓｍａｃ様化合物であるＬＣＬ１６１及びビリナパントからなる群より選択される少なくとも１つである。より好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉剤、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料である。
【００５０】
本開示は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記カスパーゼ活性化剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせの使用をさらに提供する。
【００５１】
様々な実施形態において、カスパーゼ活性化剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせは、さまざまな種類の腫瘍の治療に使用できる。上記使用、医薬組成物及びキットの特定の実施形態において、上記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍である。好ましくは、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんを有する患者の体内におけるものであるか、又はその患者からのものである。好ましくは、上記腫瘍は、上記腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の腫瘍である。より好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである。より好ましい実施形態において、上記腫瘍は、Ｍ１腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の腫瘍である。
【００５２】
単一のカスパーゼ活性化剤を使用してもよく、或いはいくつかを組み合わせて同時に又は連続して使用してもよい。カスパーゼ活性化剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の阻害剤、１つ以上の担体、賦形剤、希釈剤、薬学的に許容される担体、安定剤、緩衝剤、防腐剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤、及び他の添加物を含む組成物の形態であり得る。上記医薬組成物は、経口投与、経皮投与、皮下投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、局所投与などの様々な投与経路で患者に投与することができる。一般的に、上記カスパーゼ活性化剤は、経口的、非経口的、静脈内的又は皮下的に患者に投与される。カスパーゼ活性化剤は、腫瘍溶解性ウイルスと組成物中に混在してもよく、又は別の組成物中に存在してもよい。
【００５３】
本開示は、腫瘍を治療する方法にも関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のカスパーゼ活性化剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍を有する被験体に投与する。上記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり得る。好ましくは、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである。好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の腫瘍である。より好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである。上記カスパーゼ活性化剤は、本明細書の腫瘍溶解性ウイルスと同時に投与してもよく、腫瘍溶解性ウイルスの投与の前後に投与してもよい。さらに、上記カスパーゼ活性化剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、週に１回又は数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）投与することができる。上記カスパーゼ活性化剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、１週間又は数週間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、１ヶ月間又は数ヶ月間（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上）投与することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、カスパーゼ活性化剤（例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）及び腫瘍溶解性ウイルスは、０．０１〜１５ｍｇ：１０３−１０９ＰＦＵの比、好ましくは０．０１−１０ｍｇ：１０４−１０９ＰＦＵの比、より好ましくは、０．０１−１０ｍｇ：１０５−１０９ＰＦＵの比で提供される。より好ましくは、用量は以下の通りである。カスパーゼ活性化剤  （例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲で用いられる一方、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０３〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられる。好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤（例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で用いられる一方、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０４〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられる。より好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤（例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で用いられる一方、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０５〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられる。
【００５５】
いくつかの特定の実施形態において、上記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。他の特定の実施形態において、上記組成物は、投与のために、凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル剤、キット又はパッチ剤に製剤化される。
【００５６】
本発明は、被験体における固形腫瘍又は血液腫瘍を治療する方法をさらに提供する。上記方法は、上記治療を必要とする被験体に、本明細書に記載される腫瘍溶解性アルファウイルス及び本明細書に記載されるカスパーゼ活性化剤を投与することにより腫瘍を治療することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡｉ剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡを含む）などの、核酸を含むＩＡＰ阻害剤である。このようなＲＮＡｉ剤の特定の例は、配列番号：１−１２に記載の核酸を含む。
【００５８】
ＩＩＩ．カスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性アルファウイルスによる抗腫瘍の併用療法
本明細書に記載されているのは、驚くべき抗腫瘍効果をもたらす、カスパーゼ活性化剤とアルファウイルスの組み合わせを用いた抗腫瘍療法の発見である。カスパーゼ活性化は細胞アポトーシスを引き起こすことが知られている。カスパーゼファミリーのプロテイナーゼは、３つの亜群に分けられる。カスパーゼ−１、４、５及び１１は第１亜群、カスパーゼ−２及び９は第２亜群、カスパーゼ−３、７、８，及び１０は第３亜群に属する。最初のカスパーゼは、外来タンパク質シグナルの作用下で切断され活性化され、活性化されたカスパーゼは、さらに及びエグゼキューターカスパーゼを切断し活性化し、活性化されたエグゼキューターカスパーゼは、さらにカスパーゼ標的タンパク質を加水分解することによってプログラム細胞死（即ち、アポトーシス）をもたらす。
【００５９】
腫瘍溶解性ウイルス及びカスパーゼ活性化剤を用いる併用療法において、観察された相乗効果をもたらすメカニズムはまだ明らかではない。しかし、いくつかの組み合わせにおいて、腫瘍溶解性ウイルス及びカスパーゼ活性化剤は、本明細書に記載されるような相乗的なアポトーシス促進効果をもたらさないことが見出された。
【００６０】
好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ−３、７、８及び９活性化剤からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００６１】
より好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤は、カスパーゼ脱阻害剤である。より好ましくは、上記カスパーゼ活性化剤は、ＩＡＰ阻害剤である。より好ましくは、上記阻害剤又はアポトーシス（ＩＡＰ）阻害剤は、アポトーシスタンパク質−１の細胞阻害剤（ｃＩＡＰ−１）、ｃＩＡＰ−２及びアポトーシスのｘ結合阻害剤（ＸＩＡＰ）からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００６２】
代替の技術的解決策として、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質、ＩＡＰタンパク質を分解する物質、又はＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段である。このような物質は、本明細書において「剤」とも呼ばれ、天然又は合成ペプチド（即ち、ポリペプチド又はタンパク質）、ＲＮＡ干渉剤を含む核酸、及び低分子生化学的モジュレーター（阻害剤又は活性化剤）などの化合物を含む。
【００６３】
好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、タンパク質又は化合物から選択される。より好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、第２ミトコンドリア由来カスパーゼ活性化剤（ｓｅｃｏｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅｓ；Ｓｍａｃ）タンパク質又はＳｍａｃ様化合物から選択される。より好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質の活性を阻害する物質又はＩＡＰタンパク質を分解する物質は、Ｓｍａｃ様化合物であるＬＣＬ１６１及びビリナパントからなる群より選択される少なくとも１つである。
【００６４】
より好ましくは、上記ＩＡＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉剤、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料である。ＲＮＡ干渉剤の例は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを含む。上記ｓｉＲＮＡ剤は、配列番号１−１２に記載される。このような薬剤及びそれらの組み合わせは、本明細書に記載の使用、組成物及び方法のいずれかに適用できる。同様に、それらの機能を維持するこのような薬剤の修飾物も適用できる。特定の例において、上記核酸に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％  、９５％、又はそれ以上の配列同一性（すなわち相同性）を有する核酸も適用できる。
【００６５】
本開示は、上記カスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性アルファウイルスを含む医薬組成物、又はＩＡＰ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスが別々に包装される医薬品キットをさらに提供する。特定の実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤は天然に存在する。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤、ＬＣＬ１６１、ビリナパントなどの化合物（又は低分子モジュレーター）を用いる任意の実施形態のように、上記カスパーゼ活性化剤は、合成物である。
【００６６】
上記医薬組成物は、当技術分野において標準的であるように、任意の担体、フィラー、塩などの薬学的に許容される担体を含み得る。特定の例において、上記組成物は、投与又は提供のために、標準的な薬学的担体と共に、溶液、凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、ゲル、カプセル、カプレット剤、キット、パッチ剤又は当分野で標準的な他の投与剤形に製剤化される。
【００６７】
特定の実施形態において、カスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性ウイルスは、同一の組成物において提供される。他の実施形態において、上記カスパーゼ活性化剤及び腫瘍溶解性ウイルスは、別々に製剤化される。同様に、両方の活性剤は、特定の実施形態では同時に投与することができ、他の特定の実施形態では別々に投与することができる。
【００６８】
本明細書に記載の使用、組成物、及び方法は抗腫瘍療法に直接向けられている。特定の実施形態において、上記腫瘍は、固形腫瘍であり得る。他の実施形態において、上記腫瘍は、血液（血）腫瘍であってもよい。
【００６９】
好ましくは、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん，又は胃がんに由来することができる。特定の実施形態において、上記腫瘍又はがんの種類のいずれかは、腫瘍溶解性アルファウイルスのような腫瘍溶解性ウイルスに非感受性の種類であり得る。
【００７０】
上記のように、治療的実施形態において、カスパーゼ活性化剤は、化合物（例えば、低分子）、タンパク質又は遺伝的手段であり得る。
【００７１】
Ｓｍａｃタンパク質（第２ミトコンドリア由来カスパーゼ活性化剤；Ｓｍａｃ又はＳＭＡＣ）は、ミトコンドリア中に存在し、アポトーシスの際にミトコンドリアから細胞リンパへ運ばれ、アポトーシス関連経路を調節する。さらに、Ｓｍａｃ（Ｓｍａｃ様化合物を含む）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）のような細胞因子に対する腫瘍細胞の感受性を可能にするか又は増強することによって、このような因子の傍細胞効果を強化することができる。Ｓｍａｃは、主にＩＡＰファミリーのタンパク質のレベル及び機能を阻害することによってその機能を発揮する。現在、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２、及びＸＩＡＰを含む、８種類の既知のＩＡＰタンパク質がある。ＩＡＰは、カスパーゼの活性化を阻害することによりアポトーシスを阻害する。ＩＡＰタンパク質は、様々な腫瘍において高度に発現されており、腫瘍発生及び予後不良に関連している。従って、Ｓｍａｃ（Ｓｍａｃ様化合物を含む）は、ＩＡＰ阻害による抗腫瘍に用いられている。しかし、本明細書に記載されるように、ＩＡＰの個々の標的化による抗腫瘍効果は、上記の組み合わせよりも小さい。
【００７２】
Ｓｍａｃ様化合物とさらなる化学療法薬との組み合わせは、膵がんの治療について試験されている。．  例えば、Ｄｉｎｅｅｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０；  ７０  （７）  ：  ２８５２−６１）は、ＪＰ１０２１（Ｓｍａｃ様化合物）とゲムシタビンの組み合わせが細胞の増殖を顕著に減少させることができることを見出した。ここで、薬物で処理しなかった細胞は、１７％のアポトーシス率を有し、ＪＰ１０２１（１０μｍｏｌ／Ｌ）単独で処理した細胞、及びゲムシタビン（１０μｍｏｌ／Ｌ）単独で処理した細胞は、それぞれ３１％及び５８％のアポトーシス率を有する。また、本明細書の結果と反対に、ＪＰ１０２１とゲムシタビンの組み合わせは相乗効果を有さず、ゲムシタビン単独を使用する場合に比べて、早期アポトーシス率がわずかに高い。
【００７３】
多くの組成物の治療効果の予測は難しい。例えば、いくつかの薬物間の相互作用は所望の治療効果を低下させるか又は望ましくない副作用を引き起こすことがある。いくつかの医薬組成物については、このような組成物の治療効果は個々の薬物の組み合わせと比較することによって証明され、いくつかの医薬組成物については、このような組成物の治療指数が個々の薬物の組み合わせよりも高い場合に相乗効果が存在する。
【００７４】
本開示は、カスパーゼ活性化剤、例えば、ＩＡＰ阻害剤が腫瘍溶解性アルファウイルスと併用することで相乗効果を奏し、腫瘍溶解性アルファウイルスの抗腫瘍相乗剤として使用できることを初めて発見した。
【００７５】
本発明者は、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２（配列番号１−１２）の干渉断片（ｓｉＲＮＡ）を用いてこの２つの遺伝子の発現を阻害することで、対応するタンパク質の発現を低下させた。結果は、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２単独の干渉及び非干渉が細胞形態の病理学的変化をもたらさず、Ｍ１ウイルス単独を用いる場合も細胞形態の病理学的変化をもたらさないことを示した。ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２の干渉とＭ１ウイルスによる感染との組み合わせは、細胞の生存率を顕著に減少させた。したがって、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２の阻害は腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を顕著に増強できると推定された。また、ＩＡＰ阻害剤であるＳｍａｃ様化合物ＬＣＬ１６１及びビリナパントと腫瘍溶解性ウイルスとの組み合わせは、相乗的な抗腫瘍効果をもたらすことが実証された。
【００７６】
理解できるように、本明細書に記載の所望効果を提供するのに必要な用量は、治療される対象及び使用される薬剤に応じて変化することができる。
【００７７】
腫瘍溶解性アルファウイルスがＬＣＬ１６１又はビリナパントと併用される例示的な実施形態において、化合物及び腫瘍溶解性ウイルスは、０．０１〜１５ｍｇ：１０３−１０９ＰＦＵ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０４−１０９ＰＦＵ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０５−１０９ＰＦＵの比で提供される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、カスパーゼ活性化剤（例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲で用いられる一方、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０３〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられる。いくつかの好適実施態様において、カスパーゼ活性化剤（例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で用いられる一方、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０４〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられる。他の実施形態において、カスパーゼ活性化剤（例えば、ＬＣＬ１６１又はビリナパント）は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で用いられる一方、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０５〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で用いられる。
【００７９】
理解できるように、本明細書に記載の化合物（低分子化合物を含む）のような薬剤は、化学的分離若しくは合成、又は他の標準的な商業的アプローチによって得られるが、これらに限定されない。
【００８０】
例示的な実施形態において、カスパーゼ活性化剤は、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２の干渉ＲＮＡ断片（配列番号１−１２に記載のＲＮＡｉ剤を含むが、これらに限定されない）であってもよい。
【００８１】
本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスなどのアルファウイルス）は、既存の腫瘍溶解性ウイルスを特に指す場合があるが、自然変異、突然変異、修飾、配列の付加若しくは欠失を受けたウイルスは除外され得ない。本開示に記載の前記腫瘍溶解性ウイルスの効果に影響を及ぼさない、自然変異、突然変異、修飾、配列の付加若しくは欠失などの変化を受けた腫瘍溶解性ウイルスは、本開示に記載される同種ウイルスに属する。
【００８２】
他の実施形態において、上記ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰの遺伝子発現を低下、ノックダウン又はそれに影響を与えるか、或いはＩＡＰのタンパク質量又はタンパク質活性を低減する薬剤（物質、例えば、化合物、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列）又は手段である。したがって、上記薬剤は、転写又は翻訳レベルでＩＡＰ発現を阻害するように機能することができると理解されるべきである。さらなる実施形態において、このような薬剤は翻訳後に作用することができ、ＩＡＰタンパク質自体の安定性に影響を及ぼすことができる。当業者は、これらの化合物、アミノ酸配列又は遺伝的手段を修飾、置換及び／又は変更することができる。得られた物質がＩＡＰを阻害する効果を有すれば、このような物質及び薬剤は本明細書に記載されるように使用することができ、明示的に記載される上記化合物、アミノ酸配列及び遺伝的手段の同等の代替物として作用することができる。
【００８３】
本発明は、医薬組成物又は医薬品キットをさらに提供する。上記医薬品キットは、カスパーゼ活性化剤（又はその誘導体若しくはそれらの組み合わせ）が必ずしも腫瘍溶解性ウイルスと混合される必要がなく、通常別々に包装されるという点で組成物とは異なる。別々に包装される腫瘍溶解性ウイルス及びカスパーゼ活性化剤は、それぞれアジュバントを含んでもよい。このようなアジュバントは、医薬品の治療効果を促進できる手段を含む。医薬品キットは、別々に包装されるカスパーゼ活性化剤、その誘導体又はそれらの組み合わせ、及び腫瘍溶解性ウイルスを含んでもよい。
【００８４】
上記医薬品キットに含まれる本明細書に記載のカスパーゼ活性化剤、その誘導体、又はそれらの組み合わせ及び腫瘍溶解性ウイルスは、同時に又は任意の順序（先に一方の薬物を患者に投与し、次いで他方の薬物を患者に投与することを含む）で投与することができる。上記患者は、本明細書に記載の治療的処理を必要とする患者などの哺乳動物被験体、特にヒトを指す。
【００８５】
本発明は、被験体における固形腫瘍又は血液腫瘍を治療する方法をさらに提供する。該方法は、上記治療を必要とする被験体に本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス及び本明細書に記載のカスパーゼ活性化剤を投与することで腫瘍を治療することを含む。上記方法に用いられる腫瘍溶解性ウイルス及びカスパーゼ活性化剤は、上記使用、組成物、及びキットについて記載されたウイルス又は活性化剤であり得る。上記のように、ウイルス及びカスパーゼ活性化剤は、当該分野において標準的であるように、それぞれの製剤又は組み合わせた製剤として投与することができる。理解できるように、薬剤の固体及び液体形態は本開示の範囲内である。局所的及び全身的投与態様も同様である。特定の例において、局所投与形態は、全身投与（注射など）に一般的に使用される方法を含み得ることに留意されたい。本明細書に記載の治療方法は、治療する腫瘍の消失を必要としないこともまた理解されるであろう。治療的であると考えられるいかなる効果も、現在の治療の理解に含まれると理解される。
【００８６】
本開示において、カスパーゼ活性化剤、例えば、ＬＣＬ１６１及びビリナパントは、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を増強することができることにより、抗腫瘍薬としての腫瘍溶解性アルファウイルスの治療有効性を改善することができる。例えば、細胞学的実験により、Ｍ１ウイルスとＬＣＬ１６１又はビリナパントとの組み合わせは、それぞれ腫瘍細胞の形態学的病変を引き起こすことで腫瘍細胞増殖を顕著に阻害することが実証されている。
【００８７】
本発明者は、ＬＣＬ１６１又はビリナパントとＭ１ウイルスとの組み合わせをヒト大腸がんＨＣＴ１１６細胞株に使用した結果、抗ウイルス化合物ＬＣＬ１６１をＭ１ウイルスと併用することにより、腫瘍細胞の形態学的病変が顕著に増加し、腫瘍細胞の生存率が顕著に減少したことを発見した。いくつかの例では、腫瘍細胞の形態変化は、細胞の膨張、核凝縮、細胞の断片化、及びアポトーシスを含む。例えば、本発明の実施例では、以下により詳細に説明するように、大腸がんＨＣＴ１１６細胞の処理にＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）を単独で使用する場合に、腫瘍細胞の生存率は８４％であった。５μｍのＬＣＬ１６１を同じＭＯＩを有するＭ１ウイルスと併用する場合に、腫瘍細胞の生存率は２１．６％に急激に減少した。従って、Ｍ１ウイルス単独の抗腫瘍効果と比較して、ＬＣＬ１６１とＭ１の併用は、腫瘍溶解効果を顕著に改善した。
【００８８】
本発明者により提出された中国特許ＣＮ２０１５１０９９０７０５．７には、ＥＧＦＲ阻害剤クリソファノール及びその誘導体はＭ１ウイルスの抗腫瘍相乗剤として使用でき、両者の組み合わせは腫瘍細胞の生存率を３９．６％に減少させることが開示されている。具体的には、５０μＭのクリソファノールをＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）と併用することにより、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂを顕著に死滅させることができる。しかし、本発明では、より低い濃度のカスパーゼ活性化剤をアルファウイルスと併用することにより、より低い腫瘍細胞の生存率が得られた。さらに、本開示に用いられる腫瘍細胞は、ＣＮ２０１５１０９９０７０５．７に用いられる腫瘍細胞Ｈｅｐ３Ｂに比べて感受性がより低い。本開示において、５μＭのＬＣＬ１６１をＭ１と併用する場合、大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６は顕著に殺され得る。実際には、Ｈｅｐ３Ｂ（０．０１ＭＯＩで処理した後の細胞の生存率は８５．１％であった）細胞に比べて、ＨＣＴ１１６細胞は、Ｍ１細胞（１０ＭＯＩで処理した後の細胞の生存率は８４．０％であった）に対して感受性がさらに低い。明らかに、クリソファノールに比べて、本開示のＭ１の抗腫瘍相乗剤は、非感受性腫瘍に対する殺傷効果を有意に改善することができた。一方、ＬＣＬ１６１の用量は、クリソファノールのわずか１０分の１であり、顕著な優位性を有する。
【００８９】
ＬＣＬ１６１自体は、腫瘍細胞においてアポトーシスを阻害するタンパク質ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２を阻害することによって抗腫瘍効果を生じることが報告されているが、本開示において、ＬＣＬ１６１などのカスパーゼ活性化剤とアルファウイルスとの併用は、同じ濃度でのＬＣＬ１６１などのカスパーゼ活性化剤単独の使用と比較して、腫瘍細胞に対する殺傷効果を顕著に増大させることができることが見出された。例えば、５μＭのＬＣＬ１６１で腫瘍細胞を処理した場合、腫瘍細胞の生存率は９２．６％と高い一方、例えば、５μＭのＬＣＬ１６１をＭ１ウイルスと併用した場合、腫瘍細胞の生存率は、３３．６％に急激に減少した。明らかに、ＬＣＬ１６１とＭ１ウイルスの組み合わせにより大幅に増強された腫瘍溶解効果は、ＬＣＬ１６１の抗腫瘍メカニズムによる機能よりも、ＬＣＬ１６１とＭ１ウイルスとの間の相乗的メカニズムによるものである。
【００９０】
本開示の重要な意義は、薬物に対する感受性が低いいくつかの腫瘍について、本開示に提供される特定の併用療法がこのような腫瘍の治療のために信頼的かつ効果的な治療を提供することにもある。
【００９１】
以下の実施例は、特定の特定の特徴及び／又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本発明を特定の特徴又は実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
【００９２】
特に明記しない限り、本発明で使用される材料及び実験方法は従来の材料及び方法である。
【実施例】
【００９３】
実施例１：  ＬＣＬ１６１及びＭ１ウイルスは、ヒト大腸がん細胞株の形態学的病変を顕著に増加させる。
【００９４】
材料
ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣから購入）、Ｍ１ウイルス（ＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３から取得）、高グルコースＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／ｌグルコース）（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入）、倒立位相差顕微鏡
【００９５】
方法
ａ）細胞培養
ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ完全培地中で増殖させた。全ての細胞を５％ＣＯ２、３７℃の恒温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）に入れて継代培養した。培養した細胞の増殖を倒立顕微鏡で観察した。細胞を約２〜３日毎に継代し、対数増殖期にある細胞をアッセイに使用した。
【００９６】
ｂ）  対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）に入れ、細胞懸濁液を調製した。細胞を２．５×１０４／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに接種した。７２時間後、細胞をＬＣＬ１６１（５μＭ）単独処理し、Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．０１）で感染したか、又はＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．０１）とＬＣＬ１５１（５μＭ）との組み合わせで処理した。倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化を観察した。未処理の培養物を対照群とした。
【００９７】
結果
図１に示すように、位相差顕微鏡により細胞の形態を観察した。ＨＣＴ１１６細胞は、単一層で接着増殖し、同一な表現型で緊密に並んでいた。ＬＣＬ１６１（５μＭ）及びＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝１）で７２時間処理した後、細胞の形態は顕著に変化した。対照群の細胞、Ｍ１単独処理群の細胞、及びＬＣＬ１６１単独処理群の細胞と比較すると、併用処理群の細胞数は顕著に減少し、細胞体は球形に収縮し、屈折率は顕著に増加し、細胞は細胞死を示す病理学的変化を示した。
【００９８】
実施例２．  ＬＣＬ１６１／ビリナパントとＭ１ウイルスとの併用処理は、ヒト大腸及び肝臓がん細胞の生存率を顕著に低下させる。
【００９９】
材料
ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ヒト肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７、ＰＬＣ、Ｍ１ウイルス、高グルコースＤＭＥＭ培地、酵素免疫測定法のための自動マイクロプレートリーダー。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【０１００】
方法
ａ）細胞の培養及び投与処理
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を４×１０３／ウェルの密度で９６ウェル培養プレートに接種した。１２時間後、細胞はウェルに完全に付着した。試験を対照群、単剤群（５μＭＬＣＬ１６１単独又はビリナパント単独）、Ｍ１感染群、及びＬＣＬ１６１／Ｍ１併用群又はビリナパント／Ｍ１併用群に分けた。Ｍ１含有アッセイでは、ウイルスは様々なＭＯＩで提供された。ＬＣＬ１６１又はビリナパントの濃度は５μＭであった。
【０１０１】
ｂ）ＭＴＴと細胞内のコハク酸デヒドロゲナーゼとの反応
培養７２時間後、２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。インキュベートした後、生細胞中に形成された粒状の青紫色ホルマザン結晶を顕微鏡検査により観察した。
【０１０２】
ｃ）ホルマザン粒子の溶解
ホルマザン結晶を有する細胞を含む培養物を以下のようにさらに処理した。上澄みを注意深く吸い取って捨てた後、１００μｌ／ウェルでＤＭＳＯを加えて形成された結晶を溶解し、マイクロ振動機で５分間振盪した。次いで、酵素結合検出器を用いて５７０ｎｍの波長で各ウェルの光学密度（ＯＤ値）を測定した。実験は各群につき３回繰り返した。細胞の生存率＝薬物処理群のＯＤ値／対照群のＯＤ値×１００％
【０１０３】
結果
図２ａに示すように、Ｍ１ウイルス単独処理は、腫瘍細胞株ＨＣＴ１１６の生存率を減少させた（８４．０％）。５μＭのＬＣＬ１６１で処理した腫瘍細胞の生存率は９２．６％と高かった。一方、Ｍ１／ＬＣＬ１６１の組み合わせ（Ｍ１＋ＬＣＬ１６１）で処理した腫瘍細胞は、生存率が３３．６％に急激に低下した。同様に、Ｍ１ウイルス単独処理群又はＬＣＬ１６１単独処理群に比べて、様々な用量のＬＣＬ１６１／Ｍ１の組み合わせで処理した腫瘍細胞は、生存率が大幅に低下した。ビリナパント／Ｍ１併用処理群では、ＨＣＴ１１６について同様な結果が観察された（図２ｂ）。さらに、ＬＣＬ１６１又はビリナパントとＭ１との組み合わせも腫瘍細胞ＳＷ６２０（図２ｃ及びｄ）、Ｈｕｈ７細胞（図２ｅ及びｆ）及びＰＬＣ細胞（図２ｇ及びｈ）の生存率を顕著に低下させた。
【０１０４】
実施例３：  ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２の阻害とＭ１腫瘍溶解性ウイルスによる感染との組み合わせは抗腫瘍効果を達成した。
【０１０５】
材料
Ｍ１ウイルス、ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６、肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２のＲＮＡ干渉断片、ＭＴＴ（メチルチアゾリルテトラゾリウム）（ＭＰｂｉｏから購入）、位相差顕微鏡。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【０１０６】
方法
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を１×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種した。２４時間後、リポソームで包まれたＳｉＲＮＡ標的遺伝子断片を加えた（図３ａ−３ｄ、配列番号１−１２）。４８時間後、細胞をＭ１ウイルスに感染させた。感染の４８時間後、試料を以下のように処理した。
（１）細胞の一部を採取し、タンパク質を単離した。ウエスタンブロットによりＲＮＡ干渉効率を検出した。
（２）ＭＴＴ法により細胞の生存率を計算した。
【０１０７】
結果
異なる干渉断片でｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２をそれぞれ干渉した後、ＩＡＰタンパク質のウエスタンブロット検出により測定した。少なくとも２つのｓｉＲＮＡ断片がｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２タンパク質（図３ａ及び３ｂ）の発現を顕著に低減できることが発見された。これは、ＲＮＡｉ干渉断片が翻訳のレベルでｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２タンパク質の発現を干渉できることを示している。
図３ｃ−３ｄには、ｃｏｎｔｒｏｌは対照群、即ち、未処理群を示し、ｍｏｃｋはトランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸ）単独使用群を示し、ＮＣはスクランブルｓｉＲＮＡ干渉断片群を示し、最後の３つのコラムは発現がｓｉＲＮＡ断片によって阻害された細胞を示す。
処理細胞のＭＴＴ法により、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２単独のＲＮＡ干渉群は、非干渉群（対照群）又はスクランブル干渉（ＮＣ）群と比較して、腫瘍細胞の生存率の変化を引き起こさず、Ｍ１ウイルス単独による干渉も細胞生存率の変化を引き起こさない一方、ｃＩＡＰ１又はｃＩＡＰ２のＲＮＡ干渉とＭ１感染との組み合わせは、腫瘍細胞の生存率を顕著に減少させることが実証された（図３ｃ及び３ｄ）。データをＡＮＯＶＡ統計にかけたところ（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す）、細胞の生存率の減少に統計的有意性があることを示した。
これらの結果は、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２の阻害とＭ１ウイルスの使用との組み合わせは、抗腫瘍効果を生じることを示している。
【０１０８】
実施例４．  ＬＣＬ１６１とＭ１ウイルスとの組み合わせは、ヒト大腸及び肝臓がん細胞株の移植可能な腫瘍の増殖を顕著に阻害する。
【０１０９】
材料
Ｍ１ウイルス、大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６、肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７、４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（南京大学モデル動物研究センター）。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【０１１０】
方法
無作為化単盲検試験を実施した。５×１０６個のＨＣＴ１１６又は１×１０７個のＨｕｈ７細胞を４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背部に皮下注射した。腫瘍の大きさが５０ｍｍ３に達した後、マウスを未処理対照群（対照）、ＬＣＬ１６１単独処理群（ｉ．ｐ．  ２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）、Ｍ１単独感染群（ＨＣＴ１１６がん株の移植可能な腫瘍をＭ１ウイルスと共に尾静脈注射した（２×１０６ＰＦＵ／回）、Ｈｕｈ７がん株の移植可能な腫瘍をＭ１ウイルスと共に尾静脈注射した（５×１０５ＰＦＵ／回））、及びＬＣＬ１６１／Ｍ１併用群（ＬＣＬ１６１及びＭ１ウイルスを同じ方法及び同じ用量で投与する）に分け、注射を４回連続して行った（ＨＣＴ１１６は、５日目、６日目、７日目及び８日目に注射を行った。Ｈｕｈ７は、１０日目、１１日目、１２日目及び１３日目に注射を行った）。腫瘍の重量、長さ及び幅を２日ごとに測定し、腫瘍体積を式：（長さ×幅２）／２に従って計算した。腫瘍体積を測定した後、一元配置分散分析統計を行った。ここで、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を示す。
【０１１１】
結果
腫瘍移植動物についての病理学研究を実施して、腫瘍体積を測定した。結果は、対照群と比較して、ＬＣＬ１６１単独処理群及びＭ１単独処理群は、腫瘍体積のわずかな減少しかもたらさなかった（図４ａ及び４ｂ。左パネル）  ．
ＨＣＴ１１６腫瘍を接種した動物において、ＬＣＬ６１処理群は、対照群と比較して、わずか２９．１５％の腫瘍体積の減少を示した。Ｍ１処理群は、対照群と比較して、わずか２７．９３％の腫瘍体積の減少を示した。一方、ＬＣＬ１６１／Ｍ１併用処理群は、腫瘍体積の顕著な減少を誘導した（図４ａ及び４ｂ、左パネル）。対照群と比較して、併用処理群は８０．４２％の腫瘍体積の減少をもたらした。
同様に、Ｈｕｈ７腫瘍を接種した動物において、ＬＣＬ１６１処理群は、対照群と比較して、わずか１８．１％の腫瘍体積の減少を示した。Ｍ１処理群は、対照群と比較して、わずか４．７％の腫瘍体積の減少を示した。一方、ＬＣＬ１６１／Ｍ１併用処理群は、腫瘍体積の顕著な減少を誘導した（図４ａ及び４ｂ、右パネル）。対照群と比較して、併用処理群は７０．３％の腫瘍体積の減少をもたらした。図に示すように、一元配置分散分析統計は提示されたデータの統計的有意性を示す。
【０１１２】
実施例５．  ＬＣＬ１６１とＭ１ウイルスとの組み合わせは、ヒト大腸及び肝臓がん細胞株のカスパーゼ−３／７、８及び９の活性を顕著に向上させる
【０１１３】
材料
Ｍ１ウイルス、ＬＣＬ１６１、カスパーゼ３／７／８／９の活性を検出するキット  （Ｐｒｏｍｅｇａから購入；カスパーゼ３／７  Ｇ８０９１；カスパーゼ８  Ｇ８２０１；カスパーゼ９  Ｇ８２１１）、ＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６、肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７、酵素免疫測定法のための自動マイクロプレートリーダー。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【０１１４】
方法
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を４×１０３／ウェルの密度で９６ウェル培養プレートに接種した。１２時間後、細胞は培養プレートの壁に完全に付着した。この試験において、培養物を対照群、単剤群（ＬＣＬ１６１単独）、Ｍ１単独感染群、ＬＣＬ１６１／Ｍ１併用処理群に分けた。用量は以下の通りである。細胞を１ＭＯＩ（ＨＣＴ１６１細胞）又は０．１ＭＯＩ（Ｈｕｈ７細胞）でＭ１に感染させ、ＬＣＬ１６１を５μＭの濃度で加えた。ＭＴＴとカスパーゼ３／７、８及び９の活性を検出するために、上記の各処理群を４つに分けた。処理の７２時間後、体積に基づいてカスパーゼ３／７、８及び９を検出するための試薬を各ウェルに添加し、得られたウェルをインキュベーターに入れてさらに３０分間培養した。液体を不透明な９６ウェルプレートに吸い込んで、マイクロプレートリーダーにより化学発光強度を測定した。一方、ＭＴＴを検出して細胞の生存率を計算した。カスパーゼの活性は、ＭＴＴ値に対する化学発光値の比によって標準化された。
【０１１５】
結果
図５ａ−５ｆに示すように、検出されたカスパーゼ３／７、８及び９の活性は、ＨＣＴ１１６細胞及びＨｕｈ７細胞において、対照群（Ｃｔｒｌ）と比較して、ＬＣＬ１６１又はＭ１（Ｍ）単独による処理は、カスパーゼ３／７、８及び９の活性をわずかに向上させることを示した。一方、ＬＣＬ１６１／Ｍ１併用処理群（ＬＭ）は、カスパーゼ３／７、８及び９において顕著な向上を示した（図５ａ−ｆ）。これらの観察は、カスパーゼ活性剤、即ち、ＬＣＬ１６１とＭ１の組み合わせがカスパーゼ３／７、８、及び９の活性を顕著に活性化できることを実証する。
【０１１６】
開示された発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、図示された実施形態は本発明の好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。むしろ、本発明の範囲は特許請求の範囲によって規定される。したがって、これらの請求の範囲と精神の範囲内に入るすべてのものは、本発明に含まれる。
【図１】
2019524838.tif 000003
【図２ａ−２ｈ】
2019524838.tif 000004
【図３ａ−３ｄ】
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【図４ａ−４ｂ】
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【図５ａ−５ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019524838.tif 000010
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