(57)【要約】ドセタキセルを送達するためのＥｐｈＡ２標的イムノリポソームは、ある特定のタイプのがんの治療に有用である。イムノリポソームは、ＥｐｈＡ２標的化部分（例えば、ｓｃＦＶ）を含み、安定した塩形態のドセタキセルプロドラッグを約１００ｎｍの平均サイズを有するリポソーム内にカプセル化することができる。ナノリポソーム（イムノリポソームを含む）への装填に適した新規のドセタキセルプロドラッグが、新規の他の有用なＥｐｈＡ２標的化部分と共に、ＥｐｈＡ２標的化ドキソルビシン産生イムノリポソーム療法を用意するために提供される。１つ以上のドセタキセルプロドラッグをカプセル化するナノリポソーム、及び／またはＥｐｈＡ２結合部分を含み１つ以上のドセタキセルプロドラッグをカプセル化するイムノリポソームまたはナノ粒子を含む、医薬組成物を調製することができる。当該医薬組成物は、がんの治療のための患者への投与に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームであって、１つ以上の脂質を含む脂質小胞内にカプセル化されたドセタキセルプロドラッグと、ＰＥＧ脂質誘導体と、前記脂質小胞の外側にあるＥｐｈＡ２結合部分とを含む、前記リポソーム。
【請求項２】
前記ＥｐｈＡ２結合部分が、前記脂質小胞内の脂質に共有結合したｓｃＦｖ部分である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記ドセタキセルプロドラッグが式（Ｉ）の化合物である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のリポソーム
【化４】
2019508434.tif 000017
（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨまたは低級アルキルであり、ｎは２〜３の整数である）。
【請求項４】
前記ＥｐｈＡ２結合部分が、配列番号４０または配列番号４１のＣＤＲを含むｓｃＦｖ部分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記ＥｐｈＡ２結合部分が、配列番号４１の配列を含むｓｃＦｖ部分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記脂質小胞が、スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記脂質小胞が、スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧを約４．４：１．６：１の重量比で含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記リポソームが、式（Ｉ）のドセタキセル産生プロドラッグをカプセル化する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリポソーム
【化５】
2019508434.tif 000018
（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＣ１〜Ｃ３アルキルであり、ｎは２または３の整数である）。
【請求項９】
前記ドセタキセル産生プロドラッグが、式（Ｉ）の化合物をスクロースオクタサルフェートと共にカプセル化する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記ドセタキセルプロドラッグが、リポソーム内にカプセル化された請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物のスクロースオクタサルフェート塩である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１１】
前記リポソームがさらに、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥとして、前記リポソームにおける総スフィンゴミエリンに対し約１：１４２の重量比のＰＥＧ−ＤＳＰＥに共有結合したｓｃＦｖ部分を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１２】
最終リポソームにおける薬物：リン脂質の比が、２５０ｇドセタキセル当量／ｍｏｌリン脂質より大きく、好ましくは２５０〜３５０ｇ／ｍｏｌ（薬物装填がドセタキセル当量に基づく場合）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１３】
保管緩衝液のｐＨが中性未満、好ましくは４〜６．５、より好ましくは５〜６である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記ＥｐｈＡ２結合部分が、配列番号４１からなるｓｃＦｖと同じＥｐｈＡ２上のエピトープに結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記ＥｐｈＡ２結合部分が、ＥｐｈＡ２との結合において配列番号４１からなるｓｃＦｖと競合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１６】
がんの治療を必要とするヒト患者のがんの治療方法における請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリポソームの使用であって、前記方法が、前記ヒト患者に医薬組成物中の治療有効量の前記リポソームを投与することを含む、前記使用。
【請求項１７】
前記がんが、乳癌、固形腫瘍、胃癌、食道癌、肺癌、前立腺癌、及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記がんが、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記がんが、胃癌、胃食道接合部癌、または食道癌である、請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】
前記がんが、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、請求項１４に記載の使用。
【請求項２１】
前記がんが、卵巣癌、子宮内膜癌、または尿路上皮癌である、請求項１４に記載の使用。
【請求項２２】
前記がんが前立腺癌である、請求項１４に記載の使用。
【請求項２３】
前記がんが、軟部組織癌または頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である、請求項１４に記載の使用。
【請求項２４】
前記がんが膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である、請求項１４に記載の使用。
【請求項２５】
前記リポソームが、配列番号４１の配列を含むＥｐｈＡ２結合ｓｃＦｖ部分を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記リポソームが、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、及び化合物６からなる群から選択されるドセタキセルプロドラッグを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ドセタキセルプロドラッグが化合物３である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
前記ドセタキセルプロドラッグが化合物６である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２９】
血液学的毒性が遊離ドセタキセルの血液学的毒性よりも低い、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項３０】
前記リポソームにおける送達ドセタキセルの用量の血液学的毒性が、遊離ドセタキセルの同じ用量の血液学的毒性よりも低い、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本特許出願は、以下の係属中の米国仮特許出願それぞれに対する優先権を主張し、それぞれの全体が参照により本明細書に援用される：第６２／３０９，２２２号（２０１６年３月１６日出願）、第６２／３２２，９４０号（２０１６年４月１５日出願）、第６２／３３８，０５２号（２０１６年５月１８日出願）、第６２／４１９，０１２号（２０１６年１１月８日出願）、及び第６２／４６４，５３８号（２０１７年２月２８日出願）。
【０００２】
配列表
本明細書と共に提出され、「１１０６ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の、１つの４８．０ＫＢ  ＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別されるコンピューター読み取り可能な配列表は、その全体が参照により援用される。
【０００３】
技術分野
本開示は、エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）に結合し、ＥｐｈＡ２陽性癌の治療に有用なドセタキセルを送達するナノリポソームに関する。
【背景技術】
【０００４】
エフリン受容体は、シグナリングを媒介し、神経反発、細胞遊走、及び脈管形成に関与する細胞間接着分子である。ＥｐｈＡ２は、細胞間接合タンパク質のエフリンファミリーの一部であり、いくつかの固形腫瘍で過剰発現する。エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）は、ある特定の固形腫瘍で過剰発現し、ある特定の癌状態における予後不良に関連する。Ｅｐｈ受容体は、Ｎ末端リガンド結合ドメインの相同性に基づいて２つのグループ（Ａ及びＢ）に分けられる、チロシンキナーゼ受容体の大きなファミリーから構成されている。Ｅｐｈ受容体は、細胞増殖、遊走、及び分化を制御するいくつかの主要なシグナリング経路に関与している。これらの受容体は、リガンドが近接細胞の表面に結合するという点において独特である。Ｅｐｈ受容体及びＥｐｈ受容体のリガンドは、発生中に特定のパターンの発現を示す。例えば、ＥｐｈＡ２受容体は胚発生期の神経系に発現し、成人の増殖上皮細胞の表面にも発現する。また、ＥｐｈＡ２は、リガンドエフリンＡ１を通じて媒介される脈管形成及び腫瘍血管新生で重要な役割を果たしている。さらにＥｐｈＡ２は、尿路上皮癌、乳癌、胃／ＧＥＪ癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、及び前立腺癌を含めた様々なヒトの腫瘍で過剰発現する。ＥｐｈＡ２の発現は、腫瘍血管でも検出され得る。
【０００５】
固形腫瘍の治療には、根治的状況または対症療法的状況、治療の最初の選択または後の選択のいずれにおいてもタキサンが広く使用されているが、ドセタキセルの用量反応関係の解析からは、用量が高いほど高い反応がもたらされると共に高い毒性ももたらされることが強く示唆されている。このことは、ドセタキセルにおける臓器特異性及び細胞特異性の欠如（正常な組織への高度な曝露につながる）や、比較的短い循環半減期（より高い用量が間接的に要求される）に関係する可能性がある。ある特定のがん状態に対する治療の改善を可能にする治療用タキサン組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
出願人らは、浸透性及び保持力の強化を通じて臓器特異性にてこ入れ可能であり、かつナノリポソーム膜に共有結合したＥｐｈＡ２標的化部分を通じて細胞特異性にもてこ入れ可能な、ドセタキセルを腫瘍に送達させるための新規のＥｐｈＡ２標的ナノリポソームを発見した。
【０００７】
遊離ドセタキセルの薬物動態的限界及び細胞特異性の欠如に対処することを目的に、発明者らは、広範囲の腫瘍で過剰発現するエフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）を標的とする新規のドセタキセルベースのナノリポソームを開発した。これらのＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームは、固形腫瘍に蓄積後、ドセタキセルの持続放出をもたらす。前臨床モデルによって、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームは、浸透性及び保持効果の強化を通じて腫瘍特異的蓄積にてこ入れし、また、リポソームの表面に結合した特異的ｓｃＦｖ抗体断片によるＥｐｈＡ２のアクティブ標的化を通じて細胞特異性にてこ入れすることが実証された。
【０００８】
ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソームと遊離ドセタキセルとの比較を行うため、マウス及びラットにおける薬物動態及び体内分布の研究を実施した。動物の全体的健康状態及び血液学的毒性に焦点を当てて、げっ歯類モデル及び非げっ歯類モデルにおける長期耐容性の研究を実施した。ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームと遊離（すなわち、リポソーム内にない）ドセタキセルとの間の違いを評価するために、乳房、肺、及び前立腺の異種移植片におけるいくつかの細胞由来モデルを使用した。
【０００９】
ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物の半減期は、腫瘍部位における曝露が持続するために遊離ドセタキセルよりも顕著に長かった。長期耐容性研究において、ある特定のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物の耐容性は遊離ドセタキセルよりも６〜７倍良好であることが見いだされ、最大耐容量は、遊離ドセタキセルが２０ｍｐｋであるのに対し当該組成物は少なくとも１２０ｍｐｋ（すなわち、動物体重１ｋｇ当たりの薬物ｍｇ）であり、血液学的毒性は検出不可能であった。等毒投与では、いくつかの乳房、肺、及び前立腺の異種移植片モデルにおいて、ある特定のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物５０ｍｐｋがドセタキセル１０ｍｐｋよりも高い活性を示した。
【００１０】
発明者らは、臓器及び細胞の標的化を可能にするための、循環時間が長く薬物放出動態が緩速で持続的な、新規のＥｐｈＡ２標的ドセタキセルナノリポソームを開発した。ある特定のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物は、げっ歯類モデル及び非げっ歯類モデルにおける遊離ドセタキセルによる治療で観察された血液学的毒性を克服することができた。また、ある特定のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物は、いくつかの細胞由来の異種移植片モデルにおいて腫瘍退縮の誘発または腫瘍成長の制御をすることもでき、また、ほとんどのモデルにおいて遊離ドセタキセルよりも活性が高いことが見いだされた。
【００１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的リポソームと細胞との結合を、細胞株の大きなパネルでフローサイトメトリーを用いて評価した。３Ｄスフェロイドを使用して標的化に加えてリポソームの浸透性を評価した。標的化がｉｎ  ｖｉｖｏでのリポソームの微小分布に及ぼす影響を試験するため、原発性及び転移性腫瘍を有する動物に、２種の異なる親油性蛍光色素で標識したＥｐｈＡ２標的リポソーム（ＥｐｈＡ２ーＬｓ）及び非標的リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ）の混合物を注射した。蛍光顕微鏡法を用いて組織を評価した。ＥｐｈＡ２標的化の有効性への寄与を評価するため、４種の胃の異種移植片モデルを、遊離ドセタキセルと比較して、試験対象のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物またはこの薬物の非標的バージョンのいずれかで処置した。
【００１２】
発明者らは、細胞懸濁液モデルにおいて、１００倍超のリポソーム会合増加というＥｐｈＡ２−Ｌｓの高レベルの特異性を観察した。３Ｄスフェロイドアッセイからは、ＥｐｈＡ２−ＬｓがＥｐｈＡ２＋スフェロイドに結合し浸透する一方で非標的リポソームが最小限の浸透を示すに過ぎないことが示された。ＥｐｈＡ２−Ｌｓ／ＮＴ−Ｌｓ混合物を注射した後のトリプルネガティブ乳房腫瘍モデル及び食道腫瘍モデルに対する組織微小分布解析からは、リポソームの微小分布における標的媒介シフトが示された。ＥｐｈＡ２−Ｌｓは病変部内に深く浸透したが、ＮＴ−Ｌｓは微小血管に近接した領域内に高レベルで沈着した。微小分布における標的媒介シフトは、播種性腫瘍細胞に一致する可能性のある分布パターンを有する肺転移モデルでも観察された。同じ動物において、肝臓、脾臓、及び皮膚などの正常な臓器の微小分布は標的化の影響を受けなかった。胃癌及び食道癌の４つのモデルを使用して、細胞標的化と腫瘍成長制御との間のつながりの可能性について試験した。ドセタキセルプロドラッグをカプセル化する非標的リポソーム及びＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物は、いずれもほとんどのモデルにおいて腫瘍成長を制御し退縮をもたらすことができたが、４つのモデル中３つのモデルにおいて、２５ｍｐｋのＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物とドセタキセルプロドラッグをカプセル化する非標的リポソームとの間に統計的に有意な差が見られた。標的化の媒介に必要な主要パラメーターを評価するためにバイオマーカー解析が進行中である。
【００１３】
結論として、これらのデータは、２Ｄ細胞懸濁液、３Ｄスフェロイド、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの原発性及び転移性腫瘍モデルにおける標的化についての明らかな根拠を示唆するものである。ｉｎ  ｖｉｖｏの有効性データからは、いくつかの胃癌モデルにおいてＥｐｈＡ２標的化の腫瘍成長制御及び退縮に寄与している根拠が示された。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ＥｐｈＡ２結合部分（抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ  ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を含むドセタキセル産生リポソームの概略図である。
【図１Ｂ】スクロースオクタサルフェート（ＳＯＳ）を捕捉剤として含むリポソームにドセタキセルプロドラッグを装填するプロセスと、ドセタキセル産生のプロセスとを示す概略図である。塩が低ｐＨ環境と組み合わせた際にリポソーム内部で不溶であることにより、プロドラッグを安定化して、活性ドセタキセルへの早期転換を低減または防止することができる。
【図２Ａ】ある特定のドセタキセルプロドラッグ合成における化学反応スキームである。
【図２Ｂ】ドセタキセルプロドラッグの選択された例を示す図表である。
【図２Ｃ】ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅの合成を示す反応スキームである。
【図３−１】Ａは、好ましいドセタキセルプロドラッグのセ氏３７度における加水分解プロファイルを示す概略図である。加水分解プロファイルは、実施例１１の方法を用いて得ることができる。Ｂは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。
【図３−２】Ｃは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。Ｄは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。
【図３−３】Ｅは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。Ｆは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。
【図４Ａ】ＥｐｈＡ２結合部分に有用であり、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物の調製に使用することができる、様々なＣＤＲ配列を示している。
【図４Ｂ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物の調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｃ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｄ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｅ】実施例２−９で使用されているＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物ＥｐｈＡ２−ＩＬにおける、ｓｃＦｖ  ＥｐｈＡ２結合部分のアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。
【図４Ｆ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができるｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｇ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができるｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｈ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができるｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｉ】ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。
【図４Ｊ】実施例４で使用されているアミノ酸配列、及び対応するコードＤＮＡ配列である。
【図５】化合物３のＤＴＸ（ドセタキセル）及びドセタキセルプロドラッグの腫瘍、脾臓、及び肝臓におけるレベルを示している。
【図６】Ａは、スイスウェブスターマウスにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の耐容性を示す図表である。Ｂは、スイスウェブスターマウスにおける遊離ドセタキセルの耐容性を示す図表である。
【図７−１】Ａは、ＳＵＭ−１５９異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。Ｂは、ＳＵＭ−１４９異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図７−２】Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。Ｄは、ＳＵＭ−１５９異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の耐容性を示す図表である。
【図７−３】Ｅは、ＳＵＭ−１４９異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の耐容性を示す図表である。Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の耐容性を示す図表である。
【図８−１】Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）と比較しての、非標的ドセタキセル産生リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）と比較しての、非標的ドセタキセル産生リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸ）の耐容性を示す図表である。
【図８−２】Ｃは、ＯＥ−１９異種移植片モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）と比較しての、非標的ドセタキセル産生リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。Ｄは、ＭＫＮ−４５異種移植片モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）と比較しての、非標的ドセタキセル産生リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図８−３】Ｅは、ＯＥ−２１異種移植片モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）と比較しての、非標的ドセタキセル産生リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。Ｆは、ＯＥ−１９、ＭＫＮ−４５、及びＯＥ−２１異種移植片モデルの最大反応及び再成長時間の解析で示される、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）と比較しての、非標的ドセタキセル産生リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図８−４】Ｇは、ＳＫ−ＬＭＳ−１異種移植片モデルにおけるＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図９】Ａ５４９異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図１０Ａ】ＤＵ−１４５異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図１０Ｂ】ＤＵ−１４５異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【図１１】３Ｄスフェロイドにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＥｐｈＡ２標的化を示す図表である。
【図１２−１】Ａは、ＥｐｈＡ２標的イムノリポソーム（ＥｐｈＡ２−ＩＬ）及び非標的リポソーム（ＮＴ−Ｌ）の混合物の尾静脈注射または１Ｃ１の尾静脈注射を１回投与した動物から得たデータの図表である。注射から２４時間後に全ての組織を採取した。Ｂは、非標的ドセタキセル産生リポソーム組成物と比較しての、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物のリポソーム共存解析を示す図表である。
【図１２−２】Ｃは、食道癌ＯＥ−１９異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的化のリポソームレシオメトリック解析を示す画像である。
【図１２−３】Ｄは、ＥｐｈＡ２標的化のリポソームレシオメトリック解析を示す図表であり、これはＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物と非標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物との混合物の尾静脈注射を１回投与した動物から得られたデータの図表である。全ての組織を２４時間後に採取した。
【図１２−４】Ｅは、トリプルネガティブ乳癌の同所性移植の転移モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的化のリポソームレシオメトリック解析を示す画像である。Ｆは、トリプルネガティブ乳癌の静脈注射の転移モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的化のリポソームレシオメトリック解析を示す画像である。
【図１３−１】Ａは、同所性ＯＶＣＡＲ−８異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物の抗腫瘍有効性を示す図表である。Ｂは、ガウシアルシフェラーゼを発現するＯＶＣＡＲ−８細胞株の産生に使用するレンチウイルスコンストラクトを示す図表である。
【図１３−２】Ｃは、ガウシアルシフェラーゼを発現するＯＶＣＡＲ−８細胞株の産生に使用するトランスフェクションプロトコルを示す図表である。
【図１４−１】Ａは、実施例１３においてＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをマウスに投与した後の経時的なドセタキセル濃度を示す図表である。
【図１４−２】Ｂは、実施例１３においてＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをマウスに投与した後の経時的な脂質濃度を示す図表である。Ｃは、実施例１３においてＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをマウスに投与した後の経時的なドセタキセル／脂質の比を示す図表である。
【図１５】４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３、または遊離ドセタキセルの投与影響のあるスプラーグドーリーラットのプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、及びフィブリノゲンレベルを示す図表のセットである。
【図１６Ａ】ＥｐｈＡ２標的ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３投与時の様々な異種移植片モデルにおける最大腫瘍退縮を示す図表である。
【図１６Ｂ】１０ｍｇ／ｋｇの遊離ドセタキセルまたは５０ｍｇ／ｋｇのＥｐｈＡ２標的ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を投与した様々な異種移植片モデルにおける最大腫瘍退縮を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＥｐｈＡ２標的ナノリポソームを使用して、（例えば、カプセル化されたドセタキセルプロドラッグとしての）ドセタキセルをがん細胞及び／または腫瘍に送達させ、浸透性効果の強化を通じて臓器特異性にてこ入れし、ＥｐｈＡ２標的化を通じて細胞特異性にてこ入れすることができる。発明者らは、浸透性効果の強化を通じて臓器特異性にてこ入れし、ＥｐｈＡ２標的化を通じて細胞特異性にてこ入れする、新規のＥｐｈＡ２標的ドセタキセルナノリポソームを開発した。
【００１６】
「ＥｐｈＡ２」とはエフリンＡ型受容体２を指し、エフリンＡリガンドに結合し、またエフリンＡリガンドにより活性化され得る受容体チロシンキナーゼである「上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）」とも呼ばれる。「ＥｐｈＡ２」という用語は、天然に存在する任意のＥｐｈＡ２のアイソフォームを指すことができる。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２として記録されている。
【００１７】
本明細書において、「ＥｐｈＡ２陽性」とは、１細胞当たり少なくとも約３０００ＥｐｈＡ２受容体を有するがん細胞（または、このようながん細胞を含む腫瘍を有する患者）を指す。ＥｐｈＡ２陽性細胞は、細胞ごとにＥｐｈ−Ａ２標的リポソームに対し、特異的に結合し得る。詳細には、ＥｐｈＡ２標的リポソームは、１細胞当たり少なくとも約３０００以上のＥｐｈＡ２受容体を有するＥｐｈＡ２陽性がん細胞に対し、特異的に結合し得る。
【００１８】
本明細書において、非標的リポソームは「Ｌ」または「ＮＴ−Ｌ」と称され得る。Ｌ（またはＮＴ−Ｌ）は、ドセタキセルプロドラッグを有する非標的リポソームもドセタキセルプロドラッグを有しない非標的リポソームも指すことができる。「Ｌｓ−ＤＴＸ」とは、本明細書で開示されるドセタキセルプロドラッグに対する同等または代替の実施形態を含めた、任意の適したドセタキセルプロドラッグを含有するリポソームを指す。「ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸ」とは、本明細書で開示されるドセタキセルプロドラッグに対する同等または代替の実施形態を含めた、任意の好適なドセタキセルプロドラッグをカプセル化する標的化部分を有しないリポソームを指す。特定のドセタキセルプロドラッグを含めた非標的リポソームの例は、「Ｌｓ−ＤＴＸｐ［ｙ］」または「ＮＴ−ＤＴＸｐ［ｙ］」（［ｙ］は、本明細書で指定される特定の化合物番号を指す）という形式で指定することができる。例えば、別段の指示がない限り、Ｌｓ−ＤＴＸｐ１は、本明細書における化合物１のドセタキセルプロドラッグを含有し、抗体標的化部分を有しないリポソームである。
【００１９】
本明細書において、標的イムノリポソームは「ＩＬ」と称され得る。「ＩＬｓ−ＤＴＸｐ」という記載は、ｓｃＦｖなどの標的化部分を含む標的化ドセタキセル産生イムノリポソームの任意の実施形態またはバリエーションを指す。本明細書で開示されるＩＬとは、生物学的エピトープ結合部分（例えば、イムノリポソームのエピトープ結合ｓｃＦｖ部分）を含むイムノリポソームを指す。別段の指示がない限り、本明細書で記載されるＩＬとは、ＥｐｈＡ２結合イムノリポソーム（代替的に「ＥｐｈＡ２−ＩＬ」と呼ばれる）を指す。本明細書において「ＥｐｈＡ２−ＩＬ」という用語は、本開示によって有効になる、ＥｐｈＡ２に結合するように標的化された部分を有するイムノリポソームを指す。ＩＬには、（例えば、ＥｐｈＡ２に結合する任意のｓｃＦｖ配列を用いて）ＥｐｈＡ２に結合する部分を有するＥｐｈＡ２−ＩＬが含まれる。好ましい標的ドセタキセル産生イムノリポソームとしては、ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、ＩＬｓ−ＤＴＸｐ４、及びＩＬｓ−ＤＴＸｐ６が挙げられる。反対の指示が存在しない場合、これらは、ＥｐｈＡ２結合部分と、（それぞれ）化合物３、化合物４、または化合物６のカプセル化ドセタキセルプロドラッグとを有するイムノリポソームを含む。ＥｐｈＡ２−ＩＬは、ドセタキセルプロドラッグを有するイムノリポソームもドセタキセルプロドラッグを有しないイムノリポソーム（例えば、ドセタキセルプロドラッグを有しない、スクロースオクタサルフェートなどの捕捉剤をカプセル化するイムノリポソーム）も指すことができ、また含むことができる。
【００２０】
「［ｘ］ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ［ｙ］」という省略形式は、ｓｃＦｖ「標的化」部分を含むイムノリポソーム（「ＩＬ」）の例を説明するために本明細書で使用され、このｓｃＦｖ「標的化」部分は、特定の配列番号［ｘ］で指定されるアミノ酸配列を有し、本明細書で指定される特定の化合物番号（［ｙ］）を有するドセタキセルプロドラッグ（「ＤＴＸｐ」）をカプセル化または含有するリポソームに結合している。別段の指示がない限り、標的ＩＬのｓｃＦｖ配列はＥｐｈＡ２標的に結合することができる。
【００２１】
「ＮＴ−Ｌ」という用語は、本開示によって有効になる、標的化部分を有しない非標的リポソームを指す。「ＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３」という用語は、本開示によって有効になる、ドセタキセルプロドラッグ（「ＤＴＸ」）をカプセル化する非標的リポソームを指す。
【００２２】
本明細書において「ｍｐｋ」という用語は、動物に投与する用量における体重１ｋｇ当たりのｍｇを指す。
【００２３】
好ましくは、イムノリポソーム（ＩＬ）または非標的リポソーム（ＬまたはＮＴ−Ｌ）は、投与により所望の血漿半減期をもたらすために、リポソーム小胞の１つ以上の成分に結合した好適な量のＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ化）を含む。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームであって、１つ以上の脂質を含む脂質小胞内にカプセル化されたドセタキセルプロドラッグと、ＰＥＧ脂質誘導体と、脂質小胞の外側にあるＥｐｈＡ２結合部分とを含む、リポソームである。
【００２５】
一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２結合部分は、脂質小胞内の脂質に共有結合したｓｃＦｖ部分である。一部の実施形態では、ドセタキセルプロドラッグは、式（Ｉ）の化合物である
【化１】
2019508434.tif 000002
（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨまたは低級アルキルであり、ｎは２〜３の整数である）。
【００２６】
一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２結合部分は、配列番号４０または配列番号４１のＣＤＲを含むｓｃＦｖ部分である。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２結合部分は、配列番号４１の配列を含むｓｃＦｖ部分である。
【００２７】
一部の実施形態では、脂質小胞は、スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧを含む。一部の実施形態では、脂質小胞は、スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧを約４．４：１．６：１の重量比で含む。
【００２８】
一部の実施形態では、当該リポソームは、式（Ｉ）のドセタキセル産生プロドラッグをカプセル化する
【化２】
2019508434.tif 000003
（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＣ１〜Ｃ３アルキルであり、ｎは２または３の整数である）。一部の実施形態では、ドセタキセル産生プロドラッグは、式（Ｉ）の化合物をスクロースオクタサルフェートと共にカプセル化する。一部の実施形態では、ドセタキセルプロドラッグは、リポソーム内にカプセル化された化合物１〜３のいずれか１つのスクロースオクタサルフェート塩である。
【００２９】
一部の実施形態では、当該リポソームはさらに、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥとして、当該リポソームにおける総スフィンゴミエリンに対し約１：１４２の重量比のＰＥＧ−ＤＳＰＥに共有結合したｓｃＦｖ部分を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、最終リポソームにおける薬物：リン脂質の比は、２５０ｇドセタキセル当量／ｍｏｌリン脂質より大きく、好ましくは２５０〜３５０ｇ／ｍｏｌ（薬物装填がドセタキセル当量に基づく場合）である。
【００３１】
一部の実施形態では、保管緩衝液のｐＨが中性未満、好ましくは４〜６．５、より好ましくは５〜６である。
【００３２】
一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２結合部分は、配列番号４１からなるｓｃＦｖと同じＥｐｈＡ２上のエピトープに結合する。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２結合部分は、ＥｐｈＡ２との結合において配列番号４１からなるｓｃＦｖと競合する。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、がんの治療を必要とするヒト患者のがんの治療方法におけるリポソームの使用であって、当該方法が、ヒト患者に医薬組成物中の治療有効量のリポソームを投与することを含む、使用である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、前立腺癌、及び卵巣癌からなる群から選択される。一部の実施形態では、当該がんは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。一部の実施形態では、当該がんは、胃癌、胃食道接合部癌、または食道癌である。一部の実施形態では、当該がんは、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である。一部の実施形態では、当該がんは、卵巣癌、子宮内膜癌、または尿路上皮癌である。一部の実施形態では、当該がんは、前立腺癌である。一部の実施形態では、当該がんは、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である。一部の実施形態では、当該がんは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。一部の実施形態では、当該がんは、ＧＩＳＴ、デスモイド腫瘍、及び多形性横紋筋肉腫以外の軟組織肉腫サブタイプである。
【００３４】
一部の実施形態では、当該リポソームは、配列番号４１の配列を含むＥｐｈＡ２結合ｓｃＦｖ部分を含む。一部の実施形態では、当該リポソームは、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、及び化合物６からなる群から選択されるドセタキセルプロドラッグを含む。一部の実施形態では、ドセタキセルプロドラッグは化合物３である。一部の実施形態では、ドセタキセルプロドラッグは化合物６である。
【００３５】
一部の実施形態では、血液学的毒性は、遊離ドセタキセルの血液学的毒性よりも低い。一部の実施形態では、リポソームにおける送達ドセタキセルの用量の血液学的毒性は、遊離ドセタキセルの同じ用量の血液学的毒性よりも低い。
【００３６】
ドセタキセル送達用ＥｐｈＡ２標的リポソーム
図１Ａは、ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的ナノサイズイムノリポソーム（ナノリポソーム）の構造を示す概略図である（例えば、リポソームのサイズは約１００ｎｍ程度である）。イムノリポソームは、（例えば、共有結合したＰＥＧ−ＤＳＰＥ部分を通じて）当該リポソームに結合したエフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）標的部分、例えば、ｓｃＦｖを含むことができる。ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソームは、ＥｐｈＡ２受容体を認識する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片を、本明細書に記載のプロドラッグの形態でドセタキセルを含有するＰＥＧ化リポソームと共有結合させることによって作成することができ、これによってイムノリポソーム薬品がもたらされる（図１Ａ）。ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソーム（本明細書では「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸ」と称される）の特定の一例では、脂質膜は、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリルメトキシポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧ−ＤＳＧ）から構成され得る。ナノリポソームは、水性緩衝液（例えば、ヒトへの非経口投与用に配合した無菌医薬組成物）中に分散させることができる。
【００３７】
図１ＡのＥｐｈＡ２標的ナノリポソームは、好ましくは、直径がおよそ１１０ｎｍの単層の脂質二重膜小胞であって、本明細書で開示される化合物をスクロソファート（スクロースオクタサルフェート）塩としてゲル化状態または沈殿状態で含有する水性空間をカプセル化する、小胞である。実施例１では、ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソームを調製する方法を説明する。
【００３８】
ドセタキセルプロドラッグは、保管中やインタクトなリポソームが全身循環する間、リポソーム内部で安定化させることができるが、リポソームから放出され循環血液の環境に入ると、迅速に加水分解して（例えば、ｔ１／２＝約１０時間）活性ドセタキセルになる。図１Ｂは、本明細書で開示されるドセタキセルプロドラッグを用いたドセタキセルのナノ産生体を示している。ドセタキセルプロドラッグは、不溶性形態で安定化する電気化学的勾配を用いて、弱酸性のｐＨで装填しリポソームの酸性内部に封入することができる。リポソームから放出されると、次にドセタキセルプロドラッグは、中性ｐＨにおける単純な塩基媒介の加水分解によって活性ドセタキセルに転換される。
【００３９】
ドセタキセルプロドラッグ化合物
ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソームは、１つ以上の好適なドセタキセルプロドラッグをカプセル化することができる。好ましくは、ドセタキセルプロドラッグは弱塩基を含み、例えば、エステル結合を通じてドセタキセルのヒドロキシル基の２’または７位に導入されてドセタキセルプロドラッグを形成する第３級アミンを含む。リポソームに装填するための好ましい２’−ドセタキセルプロドラッグは、酸性ｐＨにおける比較的高い安定性によって特徴づけられるが、生理学的ｐＨにおいて酵素に依存しない加水分解を通じてドセタキセルに転換される。
【００４０】
図１Ｂに示されるように、２’−エステル結合の化学環境を系統的に調整して、比較的低いｐＨでは安定であるが生理学的ｐＨでは加水分解を通じて迅速に遊離ドセタキセルを放出するドセタキセルプロドラッグを得ることができる。ドセタキセルプロドラッグは、ポリ硫酸化ポリオール（例えば、スクロースオクタサルフェート）などの捕捉剤と共に安定した複合体を形成することにより、比較的低いｐＨでリポソームに装填される。捕捉剤のスクロースオクタサルフェートは、アミン塩（例えば、ジエチルアミン塩（ＤＥＡ−ＳＯＳ）、またはトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＳＯＳ））の溶液として、リポソーム内部に含めることができる。捕捉剤のアミン塩を使用することで、プロドラッグをリポソームに装填する助けになる膜間イオン勾配の創出に役立つと共に、プロドラッグを装填したリポソームが解剖学的標的に到達する前にプロドラッグがドセタキセルに早期転換することを防ぐのに好ましい酸性のリポソーム内環境の維持にも役立つ。このようにしてドセタキセルプロドラッグをリポソーム内にカプセル化することで、患者体内でのリポソームからの放出時にｐＨをトリガーとしてドセタキセルを放出させることが実用化可能になる。したがって、ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するリポソームは、ドセタキセルナノ産生体と呼ぶことができる。
【００４１】
リポソームの装填及びカプセル化に適したドセタキセルプロドラッグは、ドセタキセルプロドラッグ化合物の加水分解プロファイルを評価することによって決定することができる。加水分解プロファイルは、実施例１１の方法を用いて得ることができる。リポソーム内のカプセル化に好ましいドセタキセルプロドラッグは、ｐＨ２．５における高い安定性（例えば、４日以上後に１０％未満、５％未満、より好ましくは１％未満、または検出不可能な、活性化薬物産生のためのエステル加水分解）と、ｐＨ７．５（生理学的ｐＨ）における、ドセタキセル形成のための迅速かつ完全な加水分解（例えば、２４時間後に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または実質的に完全な、活性化薬物形成のためのエステル加水分解）とを含む、３７℃における（例えば、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中の）加水分解プロファイルを有する。図３Ａは、実施例１１の方法を用いて、リポソームへの装填に適したドセタキセルプロドラッグのセ氏３７度における加水分解プロファイルを示している。ｐＨ２．５では、ドセタキセルプロドラッグは最小限（好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満）のドセタキセル化合物形成のための加水分解を経る。図３Ａにおける領域（２００）は、好ましい範囲の加水分解％値を経時的に示している。ｐＨ７．５において、ドセタキセルプロドラッグは高レベルの加水分解を経てドセタキセルを形成することが好ましい（好ましくは２４時間後に少なくとも約５０％、より好ましくは２４時間後に少なくとも約６０％の加水分解）。図３Ａにおいて、ボックス（１００）は、実施例１１の方法を用いて、ｐＨ７．５におけるドセタキセルプロドラッグ加水分解の好ましい値範囲を示している。例えば、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃におけるドセタキセルプロドラッグのプロファイルは、ｐＨ２．５において４日後に検出不可能な、活性化薬物産生のエステル加水分解と、ｐＨ７．５において２４時間後に実質的に完全な、活性化薬物形成のためのエステル加水分解とを含み得る。化合物
【００４２】
好ましくは、ドセタキセルプロドラッグは、式（Ｉ）の化合物（その医薬的に許容される塩を含む）であり、式中Ｒ１及びＲ２ならびにｎは、所望のリポソーム装填及び安定性特性、そして所望のドセタキセル産生（例えば、本明細書で開示されるように、様々なｐＨ値における加水分解プロファイルによって測定される）をもたらすように選択される。ドセタキセルプロドラッグ（ＤＴＸ’）化合物は、リポソーム内に医薬的に許容される塩を形成することができる（例えば、スルホン化ポリオールなどの好適な捕捉剤との塩）。一部の例において、式（Ｉ）の化合物の式中、Ｒ１及びＲ２は独立してＨまたは低級アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ４直鎖状または分枝状アルキル、最も好ましくはＣ２またはＣ３）であり、ｎは整数である（好ましくは１〜４、最も好ましくは２〜３）。ドセタキセルプロドラッグの例としては、式（Ｉ）において２’置換基−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ１）（Ｒ２）を有するドセタキセルアナログ化合物も挙げられ、これは、参照により全体が本明細書に援用されるＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第４，９６０，７９０号（１９８９年３月９日出願）の式（ＩＩＩ）で開示されている方法で置換される。
【００４３】
【化３】
2019508434.tif 000004
（Ｉ）
ドセタキセルプロドラッグ（式（Ｉ）の化合物を含む）は、図２Ａの反応スキームを用いて調製することができる。２つの具体的なドセタキセルプロドラッグ調製物を実施例１０Ａ（化合物３）及び実施例１０Ｂ（化合物４）で説明する。他のドセタキセルプロドラッグの例としては、２’−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−ドセタキセルまたは７−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−ドセタキセルが挙げられる。
【００４４】
好ましい式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ化合物としては、ｐＨ７．５において迅速な加水分解速度を提供し、ｐＨ２．５と比較してｐＨ７．５の化合物において十分に高い相対加水分解速度を提供するための、（ｎ）が２または３である化合物が挙げられる（例えば、実施例１１の加水分解アッセイを用いて、ｐＨ２．５での加水分解速度と比較して、ｐＨ７．５においてドセタキセルへの最大加水分解速度を有するドセタキセルプロドラッグを選択する）。図３Ｃ〜３Ｆは、ドセタキセルプロドラッグの様々な例における加水分解プロファイルを示している。
【００４５】
ＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖ部分
ドセタキセル産生リポソームは、ＥｐｈＡ２標的化部分を含むことができる。標的化部分は単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）とすることができ、これは、本明細書で開示されるドセタキセル産生リポソームを標的化するためのリポソームに共有結合することができるタンパク質である。ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬが互いに共有結合した単一のポリペプチド鎖から構成され得、典型的には、ＶＨ及びＶＬは、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲから構成された機能的抗原結合部位の形成を可能にするリンカーペプチドを介して共有結合している。Ｉｇ軽鎖または重鎖可変領域は、３つの超可変領域と交互に出現する複数の「フレームワーク」領域（ＦＲ）から構成され、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。フレームワーク領域及びＣＤＲは、公開データベースで見いだされる配列との相同性に基づいて定義することができる。例えば、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｅ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）を参照。本明細書で使用する全てのｓｃＦｖ配列ナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．による定義の通りである。
【００４６】
本明細書において、別段の指示がない限り、「抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ」という用語は、免疫特異的にＥｐｈＡ２、好ましくはＥｐｈＡ２のＥＣＤに結合するｓｃＦｖを指す。ＥｐｈＡ２特異性ｓｃＦｖは、ＥｐｈＡ２タンパク質中に存在しない抗原には免疫特異的に結合しない。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＦｖには、表１に示すＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の１つまたは任意の組合せが含まれる。一実施形態では、ｓｃＦｖは、下記表１の全てのフレームワークを含有する。
【表１】
2019508434.tif 000005
【００４８】
ある特定の態様では、本明細書で開示されるｓｃＦｖは熱安定性であることから、例えば、ｓｃＦｖはロバストかつスケーラブルな製造に適切である。本明細書において「熱安定性」のｓｃＦｖとは、例えば示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いた測定で、少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）を有するｓｃＦｖである。
【００４９】
好ましい抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドの細胞外ドメイン、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２またはＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９３１７に示される配列におけるアミノ酸残基の少なくとも２５〜５３４に及ぶＥｐｈＡ２タンパク質の一部に結合する。
【００５０】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖには、それぞれが表２に示す配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３が含まれる。ＶＨ  ＣＤＲ２配列（ＣＤＲＨ２とも呼ばれる）は、表２に示す１８の異なるＶＨ  ＣＤＲ２配列から選択される任意の１つとなることに留意されたい。
【表２】
2019508434.tif 000006
【００５１】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、内在化抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖである。適切な条件下での生細胞の表面に存在するＥｐｈＡ２分子及びＥｐｈＡ２分子のＥＣＤに対するこのようなｓｃＦｖの結合によって、ｓｃＦｖの内在化がもたらされる。内在化の結果、細胞膜の外部に接触したｓｃＦｖが細胞の細胞膜結合内部に輸送される。内在化ｓｃＦｖは、例えば、薬物、毒素、酵素、ナノ粒子（例えば、リポソーム）、ＤＮＡなどの標的送達用のビヒクルとして、例えば治療用途に使用される。
【００５２】
本明細書に記載のある特定のｓｃＦｖは、単鎖Ｆｖ  ｓｃＦｖ、例えばｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ’）２ｓである。このようなｓｃＦｖにおいて、ＶＨ及びＶＬのポリペプチドは、２つの向きのいずれかで（すなわち、ＶＬに対しＶＨがＮ末端側、またはＶＨに対しＶＬがＮ末端側）、直接またはアミノ酸リンカーを介して、互いに連結している。このようなリンカーは、例えば、１〜５０、５〜４０、１０〜３０、または１５〜２５アミノ酸長とすることができる。ある特定の実施形態では、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％のアミノ酸リンカーの残基は、セリン（Ｓ）及び／またはグリシン（Ｇ）である。好適な例示的ｓｃＦｖリンカーは、以下の配列を含む、または以下の配列からなる。
ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３２）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、
ＡＳＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号３５）、
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号３６）、
ＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＴＳＧＳ（配列番号３７）、及び
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３８）
【００５３】
例示的な内在化抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ  ＴＳ１（配列番号４０）である。ｓｃＦｖ  ＴＳ１において、そして本明細書で開示されるある特定の他のｓｃＦｖにおいて、ｓｃＦｖのＶＨは、ｓｃＦｖのアミノ末端にあり、またイタリックで示されるリンカーによってＶＬに連結している。ｓｃＦｖのＣＤＲには下線が引かれ、以下の順に提示される：ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３。
【００５４】
ドセタキセル産生ＥｐｈＡ２標的リポソームは、図４Ｂ（「Ｄ２−１Ａ７」と称される配列番号４１、「Ｄ２−１Ａ７  ＤＮＡ」と称される配列番号５６のＤＮＡ配列によりコードされる）、または図４Ｃ（「ＴＳ１」と称される配列番号４０、「ＴＳ１  ＤＮＡ」と称される配列番号４３のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｄ（「ｓｃＦｖ２」と称される配列番号４４、「ｓｃＦｖ２  ＤＮＡ」と称される配列番号４５のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｅ（「ｓｃＦｖ３」と称される配列番号４６、「ｓｃＦｖ３  ＤＮＡ」と称される配列番号４７のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｆ（「ｓｃＦｖ８」と称される配列番号４８、「ｓｃＦｖ８  ＤＮＡ」と称される配列番号４９のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｇ（「ｓｃＦｖ９」と称される配列番号５０、「ｓｃＦｖ９  ＤＮＡ」と称される配列番号５１のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｈ（「ｓｃＦｖ１０」と称される配列番号５２、「ｓｃＦｖ１０  ＤＮＡ」と称される配列番号５３のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｉ（「ｓｃＦｖ１３」と称される配列番号５４、「ｓｃＦｖ１３  ＤＮＡ」と称される配列番号５５のＤＮＡ配列によってコードされる）に示される、１つ以上のＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖ配列も含むことができる。
【００５５】
また、上の表２に示す１８の異なるＣＤＲＨ２配列のいずれかからＶＨ  ＣＤＲ２が選択される、ｓｃＦｖ  ＴＳ１のバリアントも提供される。
【００５６】
本明細書で提供される情報を用いて、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、標準的技法を用いて調製することができる。例えば、本明細書で提供されるアミノ酸配列を、ｓｃＦｖをコードする適切な核酸配列の決定に使用し、次にこの核酸配列を１つ以上のｓｃＦｖの発現に使用することができる。核酸配列（複数可）は、標準的方法に従って、様々な発現系における特定のコドン「優先性」を反映するように最適化することができる。
【００５７】
本明細書で提供される配列情報を用いて、複数の標準的方法に従って核酸を合成することができる。オリゴヌクレオチド合成は、好都合には、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機器で行うか、または手動で、例えば固相ホスホロアミダイトトリエステル法を用いて合成する。ひとたび本明細書で開示されるｓｃＦｖをコードする核酸を合成したら、標準的方法に従ってこれを増幅及び／またはクローニングすることができる。
【００５８】
本明細書で開示されるｓｃＦｖをコードする天然または合成の核酸は、ｓｃＦｖをコードする核酸をプロモーター（構成的であっても誘導的であってもよい）に作用可能に連結させ、コンストラクトを発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを産生することによって、発現を達成することができる。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製及び組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、ｓｃＦｖをコードする核酸の発現を調節するのに有用な、機能的に適切に配向した転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。ベクターは、任意選択により一般的な発現カセットを含有し、これには、少なくとも１つの独立したターミネーター配列と、真核生物及び原核生物の両方でカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクターに見いだされるもの）と、原核生物系及び真核生物系の両方用の選択マーカーとが含まれる。
【００５９】
クローニングした核酸を高レベルで発現できるようにするために、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始用のリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネーター（それぞれが互いに対し、そしてタンパク質コード配列に対し機能的に配向）を含有する発現プラスミドを構築することは一般的である。また、ｓｃＦｖ遺伝子（複数可）は、同定、精製、及び操作を容易にするために、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖ）のＣ末端またはＮ末端にタグ配列（例えば、ＦＬＡＧ（商標）またはＨｉｓ６）を付加することが可能な発現ベクターにサブクローニングすることもできる。ひとたびｓｃＦｖをコードする核酸を単離及びクローニングすると、この核酸を様々な組換え操作細胞で発現させることができる。このような細胞の例としては、細菌、酵母、糸状菌、昆虫、及び哺乳類細胞が挙げられる。
【００６０】
本明細書で開示されるｓｃＦｖの単離及び精製は、構成的にかつ／または誘導によってタンパク質を発現するように遺伝子修飾した細胞の溶解物からの単離、または合成反応混合物からの単離、精製については例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを使用）によって、遂行することができる。単離したｓｃＦｖは、透析や、タンパク質精製で通常用いられている他の方法によってさらに精製することができる。
【００６１】
本開示は、主題ｓｃＦｖを産生する細胞も提供する。例えば、本開示は、本明細書で開示されるｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子修飾された組換え宿主細胞を提供する。ＤＮＡは、細菌（例えば、バクテリオファージ）、酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ）、昆虫（例えば、バキュロウイルス）、または哺乳類の発現系にクローニングする。好適な技法の１つは、糸状バクテリオファージベクター系を使用する。例えば、ＵＳ５，８８５，７９３；ＵＳ５，９６９，１０８；及びＵＳ６，５１２，０９７を参照。
【００６２】
ＥｐｈＡ２標的ナノリポソーム用のＥｐｈＡ２標的化配列のさらなる例としては、参照により援用されるＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第９，２２０，７７２号に開示されている配列が挙げられる。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．は、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合する単離モノクローナル抗体を開示しており、当該エピトープは、アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号９）を含むＶＨ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号２８）を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドと、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２９）を含むＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号３０）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号３１）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドと、を含む抗体によって特異的に結合している。
【００６３】
ＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ２（ｓｃＦｖ）をマレイミド活性化ＰＥＧ−ＤＳＰＥに対して用いてリポソームに結合することができる。例えば、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ原薬は、ｓｃＦｖのＣ末端システイン残基を介してマレイミドＰＥＧ−ＤＳＰＥに結合している、十分にヒト化された単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）とすることができる。一部の例において、ＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖは、相互作用してミセル構造を形成するリポポリマー脂質との安定したチオエーテル結合、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを通じて共有結合している。好ましくは、ｓｃＦｖはグリコシル化されていない。
【００６４】
ドセタキセル送達用ＥｐｈＡ２標的リポソームの調製
ドセタキセルプロドラッグは、種々のアプローチを通じてリポソームに装填することができる。リモート装填法は、高い装填効率及び良好なスケーラビリティーを可能にする。典型的には、リポソームは、勾配形成イオン及び薬物沈殿剤または薬物複合化剤を含み得る装填助剤（捕捉剤）内で調製する。リポソーム外部装填助剤は、例えばダイアフィルトレーションによって除去して、リポソーム二重膜を横断してのイオン勾配を生じさせる。選択された薬物は脂質二重膜を通過し、イオン勾配を消費してリポソーム内部に蓄積し、装填助剤と共に複合体または沈殿物を形成することができる。リポソーム脂質が周囲温度でゲル状態である場合、装填は、リポソーム膜が液晶状態となる高温でもたらされる。薬物装填が完了したら、装填した薬物を堅い膜内で保持できるようにリポソームを急速冷凍する。薬物装填ステップに関与する任意の因子が装填効率に影響を及ぼし得る。
【００６５】
ＥｐｈＡ２標的ナノリポソームは、ｓｃＦｖをＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ部分に結合させるのに有効な条件下でＥｐｈ−Ａ２結合ｓｃＦｖをＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌと合わせることによって得ることができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ結合体は、ポリ硫酸化ポリオール装填助剤及び他の脂質成分と合わせて、脂質小胞でカプセル化されたポリ硫酸化ポリオールを含有するリポソームを形成することができる。
【００６６】
再び図１Ｂを参照すると、薬物は、捕捉剤をカプセル化するリポソームに装填することができる。薬物の放出速度は、捕捉剤のタイプ及び濃度を変化させることによって制御することができ、プロドラッグの加水分解に対する安定性も同様に制御することができる。捕捉剤の例としては、以下に限定するものではないが、アンモニウム＝スクロースオクタサルフェート（ＳＯＳ）、ジエチルアンモニウムＳＯＳ（ＤＥＡ−ＳＯＳ）、トリエチルアンモニウムＳＯＳ（ＴＥＡ−ＳＯＳ）、及びジエチルアンモニウム＝デキストランサルフェートが挙げられる。捕捉剤の濃度は、所望の薬物装填特性をもたらすように選択することができ、所望の薬物：脂質比に応じて２５０ｍＮ〜２Ｎに変動し得る。捕捉剤溶液の規定濃度（Ｎ）は、薬物複合化対イオンのイオン価に依存し、対イオンのモル濃度とイオン価との積である。例えば、ＤＥＡ−ＳＯＳ溶液の規定濃度は、ＳＯＳが八価イオンであることから、ＳＯＳのモル濃度×８に等しい。したがって、１ＮのＳＯＳは０．１２５ＭのＳＯＳに等しい。ＤＥＡ−ＳＯＳが捕捉剤として使用される場合、濃度は、好ましくは０．５Ｎ〜１．５Ｎの範囲であり、最も好ましくは０．８５Ｎ〜１．２Ｎの範囲である。１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを用いた配合では、リン脂質１ｍｏｌ当たり３００〜８００グラムのドセタキセル相当プロドラッグを含有する最終配合物がもたらされ得る。これにより、患者に対する２５０ｍｇドセタキセル当量／ｍ２の用量で、８〜２２ｍｇの総脂質／ｋｇ（３０２〜８０６ｍｇ／ｍ２）である脂質の用量がもたらされる。この最終配合物は、好ましい薬物：リン脂質比である２５０〜４００ｇドセタキセル当量／ｍｏｌリン脂質を有する。
【００６７】
ドセタキセルプロドラッグは、酸性緩衝液に直接、または他の可溶化試薬（例えば、ヘキサ（エチレングリコール）（ＰＥＧ６）、または平均分子量が２００、３００、または４００のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−２００、ＰＥＧ−３００、ＰＥＧ−４００））の存在下で、溶解することができる。いかなる状況においても、塩基条件下で加水分解するドセタキセルプロドラッグの可溶化プロセスでは塩基条件を回避すべきである。
【００６８】
タキサンプロドラッグの装填に使用するリポソームは、例えば、エタノール注入水和法及び膜押出法によって調製される。脂質成分は、所望の特性をもたらすように選択することができる。
【００６９】
概して、様々な脂質成分をリポソームの作製に使用することができる。通常、脂質成分としては、以下に限定するものではないが、（１）非荷電脂質成分（例えば、コレステロール、セラミド、ジアシルグリセロール、アシルポリ（エーテル）、またはアルキルポリ（エーテル））、及び（２）中性リン脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアルキルホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）が挙げられる。１つ以上の所望の機能を果たす、変更する、または付与するために様々な脂質成分を選択することができる。例えば、リン脂質は主要な小胞形成脂質として使用することができる。コレステロールを含めることは、膜の剛性を維持し薬物の漏出を減らすために有用である。ポリマー結合脂質は、肝臓及び脾臓によるリポソームクリアランスを低減することにより循環のライフタイムを増加させるために、また、循環延長効果の不在下で保管中の凝集に対するリポソームの安定性を向上するために、リポソームの配合で使用することができる。
【００７０】
好ましくは、リポソームは、非荷電脂質成分と、中性リン脂質成分と、ポリエチレン（ＰＥＧ）−脂質成分とを含む。好ましいＰＥＧ化脂質成分は、ＰＥＧ（分子量２，０００）−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、またはＮ−パルミトイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（ＰＥＧ−セラミド）である。例えば、脂質成分は、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＧを好適なモル比で含むことができる（例えば、所望の量のＰＥＧ−ＤＳＧと共に、スフィンゴミエリン及びコレステロールを３：２のモル比で含む）。好ましくは、ＰＥＧ−ＤＳＧの量は、総リポソームリン脂質の１０ｍｏｌ％（例えば、４〜１０ｍｏｌ％）以下の量、例えば、総リン脂質の８ｍｏｌ％未満、好ましくは総リン脂質の５〜７ｍｏｌ％の量で組み込まれる。別の実施形態では、スフィンゴミエリン（ＳＭ）リポソームが配合に用いられ、この配合は所与のモル比、例えば３：２：０．０３のモル比のスフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅから構成される。この配合で使用する中性リン脂質及びＰＥＧ脂質の成分は、概して、酸加水分解に対するいっそうの安定性及び耐性を有する。スフィンゴミエリン及びジアルキルホスファチジルコリンは、好ましいリン脂質成分の例である。より具体的には、３７℃より高い相転移温度（Ｔｍ）を有するリン脂質が好ましい。このようなリン脂質としては、以下に限定するものではないが、卵由来スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、Ｎ−ステアロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシルホスフォリルコリン、及びＮ−パルミトイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシルホスフォリルコリンが挙げられる。リポソーム配合の選択は、ある特定の条件下における特定のプロドラッグの安定性、及び製造コストに依存する。
【００７１】
タキサンプロドラッグは、好ましくは４〜６の範囲の酸性ｐＨで、好ましくは５〜４０ｍＭの緩衝液の存在下で、リポソームに装填する。好適な酸性緩衝液としては、以下に限定するものではないが、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、及びプロパン−１，２，３−トリカルボン酸が挙げられる。タキサンプロドラッグのリポソームへの効率的な装填を容易にするために、種々の薬物装填方法が開発されている。一実施形態では、プロドラッグ溶液は、まず室温でリポソームと混合し、次に高温でｐＨ調整及びインキュベートを行う。別の実施形態では、プロドラッグ溶液及びリポソームのｐＨをまず所望の装填ｐＨに調整し、所望の装填温度に予め温め、次に混合及びインキュベートを行う。さらに別の実施形態では、プロドラッグは、まず高濃度で８０％のＰＥＧ６溶液に可溶化させ、予め温めたリポソームに少しずつ添加する。さらなる実施形態では、プロドラッグは、まず８０％のＰＥＧ４００に溶解し、デキストロースＭＥＳ緩衝液中約８％のＰＥＧ４００へと希釈し、リポソームとまず室温で混合し、次に装填温度に温める。
【００７２】
カプセル化されていないポリ硫酸化ポリオール材料は、組成物から除去することができる。次に、ポリ硫酸化ポリオール装填助剤（好ましくはＴＥＡ−ＳＯＳまたはＤＥＡ  ＳＯＳ）を含有するリポソームを、好適なタキサンまたはタキサンプロドラッグ、例えば式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ、好ましくは化合物３、化合物４、または化合物６のドセタキセルプロドラッグと、タキサンまたはタキサンプロドラッグをリポソームに装填するのに有効な条件下で、好ましくはカプセル化されたポリ硫酸化ポリオールを含む安定した塩をリポソーム内に形成する条件下で、接触させることができる。同時に、装填助剤の対イオン（例えば、ＴＥＡまたはＤＥＡ）は、薬物がリポソームに装填されるに伴ってリポソームから離れる。最後に、カプセル化されていない薬物（例えば、ドセタキセルプロドラッグ）を、リポソームを含む組成物から除去する。リポソーム薬物装填の方法は、参照により援用される２００５年５月２日出願の米国特許第８，１４７，８６７号に記載されている。
【００７３】
リポソーム組成物の作製に適した方法の例としては、押出、逆相蒸発、超音波処理、溶媒（例えば、エタノール）注入、微小溶液操作、界面活性剤透析、エーテル注入、及び脱水／再水和が挙げられる。リポソームのサイズは、低圧押出に使用する膜の孔径の制御、または微小溶液操作または他の任意の好適な方法で利用する圧力及びパス回数の制御によって、制御することができる。一実施形態では、所望の脂質は、まず薄膜水和またはエタノール注入によって水和させ、次に定義された孔径（最も一般的には０．０５μｍ、０．０８μｍ、または０．１μｍ）の膜を通じた押出によってサイズ調整する。好ましくは、リポソームの平均直径は約９０〜１２０ｎｍであり、より好ましくは約１１０ｎｍである。
【実施例】
【００７４】
別段の指示がない限り、「ＥｐｈＡ２−Ｌｓ−ＤＴＸ」と称される例示的なＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物を、以下の実施例に記載のように試験した。具体的には（別段の指示がない限り）、以下の実施例における実験は、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と称されるＥｐｈＡ２−Ｌｓ−ＤＴＸ標的リポソームの代表例から得られたものである。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、約４．４：１．６：１の重量比の卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧから形成された脂質小胞内にカプセル化された本明細書では化合物３と称される式（Ｉ）の化合物を含み、また、脂質小胞内のリン脂質の総量に対し約１：３５〜１：２８５（例えば、１：３６〜１：２８４）の重量比、好ましくは約１：１４２の重量比のＰＥＧ−ＤＳＰＥに共有結合した配列番号４６のｓｃＦｖ部分も含む。一部の例（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ、８Ａ、及び８Ｂ、ならびに本明細書において対応する実施例）では、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３  ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソームを使用してデータを得た（％  ＰＥＧ−ＤＳＧ及び薬物：脂質の比の相違以外は４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と同じリポソーム組成物を含む。当該配合についての情報は実施例の説明に追加されている）。一部の例（図６Ａ、６Ｂ、及び９）では、４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３  ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソームを使用してデータを得た（％  ＰＥＧ−ＤＳＧ及び薬物：脂質の比の相違以外は４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と同じリポソーム組成物を含む。当該配合についての情報は実施例の説明に追加されている）。一部の例では、ミセルにおけるｓｃＦｖ：ＰＥＧ−ＤＳＰＥのｍｏｌ比は約１：４である。一部の例では、ｓｃＦｖの分子量は約２６ｋＤａであり、ＰＥＧ−ＤＳＰＥの分子量は約２．８ｋＤａであり得る。一部の例では、ｓｃＦｖと総ＰＥＧ−ＤＳＰＥとの重量比は約２：１〜３：１であり、約２．２５〜２．５：１の比もこれに含まれる。ＥｐｈＡ２−Ｌｓ−ＤＴＸリポソームは、緩衝液システム（例えば、クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）、及び希釈剤としての滅菌水ビヒクル（例えば、注射用水）を含めた、薬品の形成に適した組成物中で配合することができる。本発明におけるある特定の実施形態が本明細書で開示されているが、これらの代表例によって、本開示のバリエーションの用意及び使用が可能になる。
【００７５】
実施例１：ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製
実施例１Ａ  スクロースオクタサルフェートジエチルアミン塩（ＤＥＡ−ＳＯＳ）の調製
ステップ１  パッキング及びコンディショニング：Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８−２００カラム。３５０ｇのＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８−２００アニオン交換樹脂を大型カラム（５０ｍｍ×３００ｍｍ）に装填し、樹脂を１Ｍの水酸化ナトリウム１２００ｍｌ、脱イオン水１６００ｍｌ、３Ｍの塩酸１２００ｍｌ、脱イオン水１６００ｍｌで連続的に洗浄する。
【００７６】
ステップ２  スクロースオクタサルフェート（ＳＯＳ）溶液：３０．０ｇのスクロースオクタサルフェートナトリウムを、セ氏５０度で激しくボルテックスしながら５０ｍｌの遠心管中の脱イオン水１５ｍｌに溶解する。０．２μｍの膜を通じて溶液をシリンジ濾過する。
【００７７】
ステップ３  ステップ１で用意したＤｏｗｅｘカラムにＳＯＳ溶液を装填する。脱イオン水でカラムを溶離させる。伝導率が５０〜１００ｍＳ／ｃｍの画分をプールＡとして収集し、１００ｍＳ／ｃｍより大きい画分をプールＢとして収集する。直ちに、ジエチルアミンを用いてプールＢ内のＳＯＳを６．７〜７．１の最終ｐＨまで滴定する。プールＢのｐＨがｐＨ７．１を過ぎた場合、プールＡからの酸性ＳＯＳを用いてｐＨを低下させる。ＳＯＳ濃度は、サルフェートアッセイにより決定し、滴定データにより検証する。
【００７８】
実施例１Ｂ  ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅの調製
ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅは、リポソームに曝露した加水分解条件に対する不安定性が少ないように設計されたエーテル脂質及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の新規の結合体である。カルバメートリンカー及びエーテル脂質を使用することにより、ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅは穏やかな酸性条件下で安定性が高く、加水分解により生じるＰＥＧ損失を防止する。
【００７９】
材料：１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロール：ＣＡＳ：８２１８８−６１−２（ＢＡＣＨＥＭ）；メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２：カタログ番号１２  ２０００−２（ＲＡＰＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）；Ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート：ＣＡＳ：７６９３−４６−１（Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００８０】
合成手順：ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅを図２Ｃに示す経路に従って合成する。詳細な手順を以下のように記載する。
【００８１】
ステップ１：１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロール。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５８２ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ、１．０５当量）を１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロール（１．６４２ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４０２．５μｌ、２．８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン３５ｍｌ溶液に添加する。反応混合物を室温で終夜攪拌する。粗製混合物（ＲＨ１：７９）をＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル、３／１）によって解析する。ＴＬＣからは、出発材料１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロールの大部分が活性化エステルＲＨ１：７９に転換されることが示される。
【００８２】
ステップ２：ＰＥＧの結合。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２（５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン１０ｍｌ溶液を、室温でＲＨ１：７９の反応混合物中に注ぐ。Ａｒで混合物をパージし、混合物を室温で終夜攪拌する。反応混合物を約１０ｍｌに濃縮する。激しく攪拌しながら無水ジエチルエーテル８０ｍｌを添加することにより、粗生成物を沈殿させる。混合物をセ氏−２０度で１時間置き、次に濾過し、濾過ケークを収集する。濾過ケークをジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、無水ジエチルエーテル８０ｍｌからセ氏−２０度で再び生成物を沈殿させる。濾過ケークをジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、溶液を８０ｇのシリカゲルカラムに装填する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。移動相Ａ：クロロホルム、Ｂ：メタノール。溶離セグメント：ステップ１：０％のＢ〜１０％のＢ、６ＣＶ；ステップ２：１０％〜１５％のＢ、２ＣＶ。ＵＶ及びＥＬＳＤによって検出された全てのピークを収集する。画分１８〜２２をＲＨ１：８１Ａとしてプールし、画分２４〜４０をＲＨ１：８１Ｂとしてプールする。収量、ＲＨ１：８１Ａ、２．５ｇ、ＲＨ１：８１Ｂ、１．８ｇ。
【００８３】
反応混合物のＴＬＣ分析を展開溶媒：クロロホルム／メタノール、９／１、ｖ／ｖを用いて実施した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＲＨ１：８１Ａが所望の結合体であることを示している。
【００８４】
実施例１Ｃ  リポソームの調製
リポソームをエタノール注入−押出法によって調製する。スフィンゴミエリン（ＳＭ）リポソームの脂質は、３：２のモル比のスフィンゴミエリン、コレステロールと、スフィンゴミエリンの６〜８ｍｏｌ％の量のＰＥＧ−ＤＳＧから構成されている。簡潔に述べると、リポソーム３０ｍｌを調製するために、脂質を、５０ｍｌ丸底フラスコ中のエタノール３ｍｌにセ氏７０度で溶解する。ＤＥＡ−ＳＯＳ（２７ｍｌ、０．６５〜１．１Ｎ）をセ氏７０度の水浴でセ氏６５度超に温め、激しい攪拌下で脂質溶液と混合して、５０〜１００ｍＭのリン脂質を有する懸濁液を得る。次に、得られた乳白色の混合物を、例えばｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  Ｌｉｐｅｘエクストルーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、０．２μｍ及び０．１μｍのポリカーボネート膜を通じて６５〜７０℃で繰り返し押出する。リン脂質濃度をホスフェートアッセイによって測定する。粒子直径を動的光散乱法によって解析する。この方法によって調製したリポソームのサイズは約９５〜１１５ｎｍである。
【００８５】
実施例１Ｄ  水溶性薬物の装填方法
ステップ１：脱イオン水で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４ＢカラムにＤＥＡ−ＳＯＳリポソームを装填する（カラムボリュームの５％未満）。リポソームの完全な吸収を待ち、次に脱イオン水でカラムを溶離させ、フロースルーの伝導率を監視する。
【００８６】
ステップ２：フロースルーの混濁度に従ってリポソーム画分を収集する。リポソームの多くは伝導率０で出てくる。伝導率が４０μＳ／ｃｍより高いテーリング画分を廃棄する。
【００８７】
ステップ３：リポソーム体積を測定し、リポソームに５０ｗｔ％のデキストロースを添加することによって直ちにオスモル濃度を平衡させて、リポソーム内のＤＥＡ−ＳＯＳ濃度に応じて最終濃度７．５〜１７ｗｔ％のデキストロースを得る。緩衝液は、緩衝ｐＨ範囲及び能力から選択する。薬物装填ｐＨは６を超えるべきではない。
【００８８】
ステップ４：濃縮バッファー、ＨＣｌ、及びＮａＯＨを用いてリポソームのｐＨを調整する。最終緩衝液強度は５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。
【００８９】
ステップ５：ホスフェートアッセイによって脂質濃度を解析し、所与の入力薬物／脂質比に必要な脂質の量を計算する。
【００９０】
ステップ６：リポソーム溶液で使用したものと同じ緩衝液を用いて、７．５〜１７ｗｔ％のデキストロース中薬物溶液を調製する。異なるプロドラッグ間の比較を可能にするため、添加する薬物の量は、変換係数を用いてプロドラッグ塩形態の測定量から補正し、ドセタキセル重量当量に基づいた（表３）。
【００９１】
ステップ７：薬物及びリポソーム溶液を混合して所望の薬物／リン脂質比（例えば、リン脂質１モル当たり１５０、２００、３００、４５０、または６００ｇドセタキセル当量）を達成し、次にセ氏７０度（または所望の温度で）１５〜３０分間、絶えず振とうしながらインキュベートする。
【００９２】
ステップ８：装填混合物を氷水浴で１５分間冷やす。
【００９３】
ステップ９：リポソームの一部を、ＭＥＳ緩衝生理食塩水（ＭＢＳ）ｐＨ５．５、またはクエン酸緩衝生理食塩水ｐＨ５．５、またはＨＢＳ  ｐＨ６．５で平衡化したＰＤ−１０カラムに装填し、同じ緩衝液で溶離し、リポソームを収集する。精製されたリポソームも精製されていないリポソームも次のステップの解析用に確保する。
【００９４】
ステップ１０：カラムサンプルの前後両方で、ホスフェートアッセイによってリン酸脂質濃度を測定する。
【００９５】
ステップ１１：カラムサンプルの前後両方で、ＨＰＬＣによって薬物濃度を解析する。
【００９６】
ステップ１２：カプセル化効率を［薬物／リン脂質（カラム後）］／［薬物／リン脂質（カラム前）］＊１００として計算し、薬物／ｍｏｌリン脂質のグラムとして説明する。
【００９７】
リポソームに装填した薬物の量を、リポソームにおけるリン脂質１ｍｏｌ当たりのドセタキセル当量として表現する。所与量のアミノドセタキセル塩酸塩のドセタキセル当量数を計算するため、下の表３の変換係数を塩の測定量に掛ける。例えば、１ｇの化合物１は、１ｇ×０．７８６＝０．７８６ｇのドセタキセルに相当する。同様に、２ｇの化合物３は、２ｇ×０．８１９＝１．６３８ｇのドセタキセルに相当する。
【表３】
2019508434.tif 000007
【００９８】
実施例１Ｅ  短鎖ポリエチレングリコールの使用により、水への可溶性が乏しい（１ｍｇ／ｍｌ未満）薬物を装填する方法
この方法では、非常に水溶性の低い（１ｍｇ／ｍｌ未満）薬物を溶解し装填する一例として、ヘキサ（エチレングリコール）（ＰＥＧ６）を使用する。分子量２００〜５００ダルトンの他の短鎖ＰＥＧも、同じ目的で機能し得ると考えられる。薬物を、脱イオン水中８０％のＰＥＧ６（体積による）に４０ｍｇ／ｍｌで溶解する。リポソームをセ氏７０度に予め温め、薬物装填の前に溶液を絶えず攪拌する。次に、薬物のＰＥＧ６溶液を少量ずつ１分間隔で８回、８分かけてリポソームに添加する。装填混合物をセ氏７０度でさらに２２分間インキュベートし、氷浴で１５分間冷却する。ＰＤ−１０カラムでｐＨ５．５のＭＥＳ緩衝生理食塩水またはｐＨ５．５のクエン酸緩衝生理食塩水を溶離溶液として使用することにより、リポソームから遊離薬物を分離する。ホスフェートアッセイ及びＨＰＬＣ解析によってカラムの前後の薬物／脂質比を決定する。カプセル化効率を［薬物／リン脂質（カラム後）］／［薬物／リン脂質（カラム前）］＊１００として計算する。
【００９９】
実施例１Ｆ  ＰＥＧ４００の使用によって薬物を装填する方法
この例では、タキサンプロドラッグ用の可溶化剤として、より高価なＰＥＧ６の代わりとするためにＰＥＧ４００を使用する。この方法は、化合物４リポソームを調製するプロトコルによって例示する。
【０１００】
パート１：薬物溶液の調製
１．２５０ｍｌのガラス瓶において３９５ｍｇの化合物４を秤量する。
２．８０％のＰＥＧ４００  ｐＨ２．８溶液１０ｍｌを添加し、次に３ＭのＨＣｌ溶液１３４μｌを添加する。
３．上記混合物を５０℃の水浴で約１０分間、断続的に振とうしながら温める。透明な化合物４の溶液が得られる。
４．５ｍＭのＭＥＳ  ５％デキストロースｐＨ３．８溶液９０ｍｌを添加することによって、溶液を１０倍に希釈する。最終溶液のｐＨは４．５である。
５．希釈溶液を６５℃に温め、１μｍのＰＥＳ膜を通じて溶液を濾過する。
【０１０１】
パート２：ＳＯＳリポソームの調製
１．リポソーム配合：ＳＭ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＳＧ＝３／２／０．２４ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ、１．１ＭのＤＥＡ−ＳＯＳ、サイズ：９９．７ｎｍ。
２．外部ＳＯＳを、ゲルクロマトグラフィーによりＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂで残留伝導率４０μＳ／ｃｍ以下で除去する。
３．４５ｗｔ％のデキストロースをリポソームに添加して、最終の１２％のデキストロースを得る。
４．１ＭのｐＨ５．４クエン酸溶液をリポソームに添加して、最終的に２０ｍＭにする。
５．ホスフェートアッセイによってホスフェート濃度を決定する。
【０１０２】
パート３：化合物４の装填
１．化合物４溶液及びパート２で調製したリポソームを、６００ｇ／ｍｏｌの薬物／脂質比において室温で混合する。
２．混合物を、７０℃のテフロン（登録商標）の薄肉管で作られた熱交換器に送り、混合物が２分以内に６５℃超に加温されていることを確認する。
３．装填混合物を７０℃で３０分間攪拌しながらインキュベートする。
４．装填したリポソームを氷水に浸した熱交換器に送ることにより、急速冷却する。
【０１０３】
パート４：精製及び濃縮
１．タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって遊離化合物４を除去し、緩衝液をクエン酸緩衝生理食塩水ｐＨ５．５に交換する。
２．リポソームをＴＦＦにより濃縮し、次に順次１μｍ、０．４５μｍ、及び０．２μｍのＰＥＳ膜を通じてリポソームを濾過する。
【０１０４】
実施例１Ｇ  抗体−脂質結合体の調製
抗体−ＰＥＧ−脂質結合体を使用して、抗体に連結したリポソームを形成する。このリポソームは、好都合な系（例えば、哺乳類細胞）で発現したｓｃＦｖタンパク質から開始して調製することができ、精製は、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたは他の任意の好適な方法によって行うことができる。結合をもたらすために、システイン残基を含有するＣ末端配列を用いてｓｃＦｖタンパク質を設計する。ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−脂質結合体、例えばｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの調製については、文献で説明されている（Ｎｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００５，ｖｏｌ．２１，ｐ．２０５−２２０；Ｎｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００５，ｖｏｌ．２１，ｐ．２２１−２３２；ＵＳ  Ｐａｔ．Ｎｏ．６，２１０，７０７）。例えば、以下のプロトコルを使用することができる。
【０１０５】
ステップ１：ｓｃＦｖタンパク質ストック溶液を、ｐＨ６．０のＣＥＳ緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１４４ｍＭの塩化ナトリウム）に対し４℃で２時間透析する。
【０１０６】
ステップ２：抗体の還元処理をｐＨ６．０のＣＥＳ緩衝液中で２０ｍＭの２−メルカプトエタンアミンの存在下、３７℃で１時間行う。
【０１０７】
ステップ３：還元処理した抗体をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムで精製する。
【０１０８】
ステップ４：還元処理した抗体のインキュベートを、４モルの過剰なマレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥと共に、ｐＨ６．０のＣＥＳ緩衝液中、室温で２時間行う。システインの添加によって反応をクエンチし、０．５ｍＭの最終濃度にする。
【０１０９】
ステップ５：結合混合物をＡｍｉｃｏｎ攪拌式細胞濃縮器で濃縮する。
【０１１０】
ステップ６：Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ４４カラムで遊離抗体から結合体を分離する。
【０１１１】
ステップ７：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって結合体を解析する。
【０１１２】
実施例１Ｈ  標的リポソームの調製
抗体標的リポソームは、抗体−ＰＥＧ−脂質結合体（実施例１Ｇ）をリポソームと共に水性バッファー中、抗体の熱安定性に応じて３７℃で１２時間または６０℃で３０分間インキュベートすることにより、調製することができる。ミセル結合体の脂質部分は、自らを自発的にリポソーム二重膜に挿入する。例えば、参照により本明細書に援用される１９９８年５月１２日出願の米国特許第６，２１０，７０７号を参照。リガンドが挿入されたリポソームを、例えばサイズ排除クロマトグラフィーによってＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムで精製し、ホスフェートアッセイによって脂質濃度を解析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体の定量化を行う。
【０１１３】
実施例１Ｉ  トリチウム標識リポソームの調製
非交換型トリチウムで標識した脂質、３Ｈ−コレステリルヘキサデシルエーテル（３Ｈ−ＣＨＤＥ）を脂質二重膜内に有する薬物装填リポソーム（トリチウム標識リポソーム）により、薬物及び脂質の両方の薬物動態を同時に監視することが可能になる。様々な捕捉試薬を有する種々の配合のトリチウム標識リポソームを押出法によって調製する。トリチウムで標識された「空の」リポソーム（すなわち、薬物を含有しないリポソーム）を調製するための一般的プロトコルは、例えば以下の通りであり得る。
【０１１４】
１．１２ｍＬのガラスバイアルをクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）で洗浄し、次にアセトンで洗浄し、ヒートガンでバイアルを乾燥する。
２．トルエン中の市販品３Ｈ−ＣＨＤＥ溶液１ｍＬをガラスバイアルに移す。溶液をアルゴン流を用いて室温で３０分間乾燥し、バイアルをオイルポンプ真空下で終夜放置する。
３．配合に従って脂質を秤量し、３Ｈ−ＣＨＤＥを含有するバイアルに脂質を添加する。
４．２００プルーフエタノール１ｍＬを脂質バイアルに添加し、７０℃に加熱して脂質を溶解し、最終的に透明な溶液を得る。
５．この温かい脂質溶液を、予め温めた捕捉試薬溶液１０ｍＬに添加する。混合物を７０℃で１５分間攪拌し続けて、多重層の小胞（ＭＬＶ）を生成する。
６．適切な孔径（例えば、０．２μｍ、０．１μｍ、及び０．０８μｍ）を有するポリカーボネートトラックエッチド膜フィルターを通じて７０℃でＭＬＶを繰り返し通過させ、最終的に所望のリポソームサイズ（例えば、約１１０ｎｍ）を達成する。押出を行ったリポソームを４℃に保つ。
【０１１５】
薬物の特性に応じて実施例１Ｄ〜Ｆに記載の方法に従って、ドセタキセルプロドラッグをトリチウム標識リポソームに装填する。実施例１Ｈに記載の方法により、標的化抗体を薬物装填リポソームに挿入する。
【０１１６】
実施例２：マウストリプルネガティブ乳癌異種移植片モデルにおける、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物及びドセタキセルの薬物体内分布。
この実施例では、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソーム及びドセタキセルの薬物体内分布をヒトトリプルネガティブ乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の異種移植片モデルにおいて研究したことについて記載する。
【０１１７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し、ＲＰＭＩ培地に５％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、インスリン５μｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン１μｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したものの中で、３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。
【０１１８】
ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸイムノリポソームは、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール（３：２のモル比）、及び５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧから構成された脂質部分を有し、捕捉された１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを含有し、実施例１に記載のように３１５ドセタキセル当量／モルリン脂質の薬物／脂質比で化合物３と共に調製及び装填し、配列番号４０のｓｃＦｖがリポソームの外部に結合している、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３とした。
【０１１９】
ＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅホモ接合雌マウス（５〜６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスの乳腺右胸部脂肪パッドに、３０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３０）を追加したＰＢＳに懸濁させた０．５×１０６細胞を含有する懸濁液０．０８ｍＬを同所的に接種した。腫瘍が２００ｍｍ３〜３５０ｍｍ３を達成したら、以下の方法に従って動物を処置群に割り当てた。腫瘍サイズに従って動物をランク付けし、腫瘍サイズが大きいものから小さいものへ６つのカテゴリーに分類した。各処置群で全ての腫瘍サイズが同等に示されるように各サイズカテゴリーから１匹の動物をランダムに選択することにより、４動物／群の処置群を形成した。処置群及び屠殺時点を表４に概括する。各群は３匹の動物からなる。「Ｍｐｋ」は動物体重１ｋｇ当たりの薬物のｍｇを表す。
【表４】
2019508434.tif 000008
【０１２０】
動物に、５０ｍｐｋの４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３または１０ｍｐｋの遊離ドセタキセルの尾静脈注射を１回投与した。各時点において動物を屠殺し、腫瘍、肝臓、及び脾臓を採取し瞬間冷凍した。
【０１２１】
全ての腫瘍試料を解凍し、秤量し、次に、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ａｖｅｒｉｌｌ  Ｐａｒｋ，ＮＹ）を用いて０．２５％のトリフルオロ酢酸を含有する４０％のアセトニトリルの溶液中で機械的に均質化した。当該酸は、化合物３のｐＨ安定化のために溶媒に含まれていた。ターゲット組織濃度は、総ホモジェネート（すなわち、組織及び溶媒）の１ミリリットル当たり組織２００ｍｇとしたが、組織の重量が低い（＜１００ｍｇ）場合には、最終組織濃度を１００ｍｇ／ｍＬとした。
【０１２２】
均質化した組織試料を２つの生体解析アッセイを利用して解析し、個々に化合物３及びＤＴＸを測定した。いずれの方法も、高圧液体クロマトグラフィーアッセイをタンデム型質量分析検出（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と共に用いている。両アッセイにおいて、エレクトロスプレーイオン化を用いた陽イオンモードでの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）により、分析対象物の化合物３及びＤＴＸを検出した。抽出した較正標準物質、そして化合物３またはＤＴＸを酸性化血漿マトリックス（雌のＣＤ−１リチウムヘパリン化マウス血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，ＬＬＣ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）と２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）との３：２混合物）に追加することにより調製した品質管理（ＱＣ）試料を用いて、均質化した組織試料の化合物３及びＤＴＸを定量化した。化合物３及びＤＴＸの較正範囲は、それぞれ１５．０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ及び３．００〜１，０００ｎｇ／ｍＬとする。酸性化血漿ＱＣは、化合物３用に４５．０、３７５、及び３，７５０ｎｇ／ｍＬで調製し、ＤＴＸ用に９．００、７５．０、及び７５０ｎｇ／ｍＬで調製した。名目濃度（ｎｇ／ｍＬ）及び重み係数１／濃度２による重み付き線形回帰に対する分析対象物／内部標準物質（ＩＳ）ピーク面積反応比を用いて、較正曲線を生成した。
【０１２３】
化合物３の試料抽出には、組織ホモジェネートの５０μＬアリコートとＩＳのパクリタキセルを含有する酸性化アセトニトリル２００μＬとの混合によるタンパク質沈殿を利用する。得られた溶液を十分にボルテックスし、次に１４，０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心処理する。上清の５０μＬアリコートを取り出し、オートサンプラーバイアル中の１２％のアセトニトリル及び０．１％のギ酸を含有する水２００μＬと混合する。得られた溶液の１０μＬアリコートを注入する。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳ  Ｐｕｍｐ  ＰｌｕｓシステムをＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＰＡＬオートサンプラー及びＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と共に用いて、抽出した化合物３試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を実施する。Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８、２．１×１５０ｍｍカラム（パート番号：１８６００１３０１、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）において、水／ギ酸含有アセトニトリルの勾配、３０℃のカラム温度、４００μＬ／分の流量、及び１１．０分の実行時間を用いてクロマトグラフィー分離を達成する。
【０１２４】
ドセタキセル（ＤＴＸ）の解析には液−液抽出（ＬＬＥ）手順を利用し、均質化した組織の５０μＬアリコート、酸性化メタノール中パクリタキセルＩＳ５０μＬ、１％のトリフルオロ酢酸９００μＬ、及びｎ−ブチルクロリド：アセトニトリル（４：１）４．０ｍＬを共にガラスのねじ蓋付きチューブに添加する。テフロン（登録商標）で裏打ちされた蓋でチューブに蓋をし、ボルテックスし、１５分間回転し、次に３，０００ｒｐｍ及び４℃で１５分間遠心処理して液相を分離した。乾燥氷／アセトン浴で水相を凍結させた後、ｎ−ブチルクロリド：アセトニトリル層を新たなガラスのねじ蓋付きチューブに注ぎ、窒素下３５℃で蒸発させる。残渣を２．５Ｍのギ酸を含む３０％のアセトニトリル７５μＬ中で再構成し、３，２００ｒｐｍ及び４℃で２０分間遠心処理して不溶性の材料を分離する。得られた上清をオートサンプラーバイアルに移し、２０μＬアリコートを注入した。Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ３０００質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて、抽出したＤＴＸ試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を実施する。Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８、２．１×１５０ｍｍカラム（パート番号：１８６００１３０１、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）において、水／ギ酸含有アセトニトリルの勾配、３０℃のカラム温度、４００μＬ／分の流量、及び１３．０分の実行時間を用いてクロマトグラフィー分離を達成する。図５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で測定した腫瘍、脾臓、及び肝臓におけるＤＴＸ（ドセタキセル）及び化合物３（ドセタキセルプロドラッグ）のレベルを示す図表である。化合物３に見られるように、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は腫瘍内での曝露の延長を示している。遊離ドセタキセルと比較すると、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３がもたらすドセタキセル蓄積はより遅い時点から開始したものの、１０日目まで（２４０時間）持続した。ドセタキセル／化合物３比の変化は、化合物３からドセタキセルへの転換が腫瘍部位では持続し、肝臓及び脾臓では程度が小さいことを示唆している。
【０１２５】
実施例３：ＥｐｈＡ２標的リポソームは、スフェロイドとして培養したＥｐｈＡ２発現細胞に特異的に結合し浸透する
本研究において、発明者らは、標的に結合するリポソームが浸透の深さに及ぼす効果を解析する目的で、リポソームの腫瘍への浸透についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏの３次元（３Ｄ）モデルを確立した。発明者らは、ＥｐｈＡ２標的化が非常に特異的であり、リポソーム−スフェロイド会合は、ＥｐｈＡ２＋細胞でインキュベートした場合にＥｐｈＡ２標的リポソームで見られるに過ぎないことを見いだした。蛍光脂質標識ＤｉＩＣ１８（３）−ＤＳ及びＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳを含む試験リポソームを、以下の実施例４に記載のようにして調製した。
【０１２６】
細胞培養
ＢＴ４７４−Ｍ３細胞は、Ｈｅｒｍｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）からの寄贈物であり、ＯＶＣＡＲ−８はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。ＮＣＩ−Ｈ１９９３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からのものであった。細胞株をＲＰＭＩで培養した。細胞継代用の培地に１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを追加し、通常の培養物に対する継代はトリプシン処理により行った。全てのイメージング実験に使用する培地をフェノールレッドフリーＲＰＭＩとした。細胞を、培養またはＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）実験用に５％のＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
【０１２７】
スフェロイド形成の試験
細胞系がスフェロイドとして成長するかどうかを判定するため、５０００細胞をＣｏｓｔａｒ７００７Ｕ底、超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ）内の完全培地にプレーティングし、４日培養してスフェロイドを確立させた。この細胞プレーティングの方法をスフェロイドを用いた全ての後続の実験に使用した。
【０１２８】
リポソーム取込みにおける受容体標的化のエビデンス試験
細胞を穏やかにウェル底に沈降させた後に、完全培地をプレートから除去し、プラセボ非薬物装填蛍光タグリポソーム（ＤｉＩＣ１８（３）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄ−２８２））を含有する血清フリー・フェノールレッドフリー培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを追加）で置き換えた。ＤｉｌＣ１８（３）−Ｌｓは、リン脂質２５μＭの最終濃度における、標的化されているもの（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ）または標的化されていないもの（ＮＴＬｓ）であった。陰性対照ウェルには血清フリー培地のみを入れた。プレートを軽く回転してスフェロイドをウェル底の中央に寄せてからＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）に装填した。リポソームの追加から１時間以内にスキャンを開始し、３０〜４５分おきに最低１８時間継続するようにスケジュールした。
【０１２９】
リポソーム取込みにおける受容体密度の影響試験
使用した細胞株は全てスフェロイドを形成することができた：ＮＣＩ−Ｈ１９９３（肺）、ＯＶＣＡＲ−８（卵巣）、及びＢＴ４７４−Ｍ３（乳房）。受容体標的化の試験のために行う血清フリー・フェノールレッドフリー培地におけるリポソーム取込みのイメージングの４日前にＵ底プレートの培養物を確立させた。標的化リガンド４６ｓｃＦＶと蛍光結合したリポソームをリン脂質２５μＭの最終濃度で適用した。
【０１３０】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）から得た画像の解析
各ウェルの各時点における対になった蛍光画像及び位相差画像と共に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）からＴＩＦＦ形式でエクスポートした。インハウスのＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ  ＭＡ）スクリプトを画像の解析に使用した。要約すると、スフェロイドを位相差画像に基づいてエッジ検出アルゴリズムを用いて分割し、形態学的演算子（例えば、クロージング及びホールフィリング）を用いてスフェロイドの境界面をさらに精緻化し、マッチする蛍光画像ファイルにおける赤色蛍光シグナルの強度を抽出し、スフェロイドの境界面からの赤色シグナルの平均強度を計算した。平均蛍光強度とスフェロイド端部までの距離との間の関係式を、リポソーム浸透性の推定に使用する。周囲からの距離対シグナル強度のプロットに由来するＡＵＣを各測定時点について計算した。
【０１３１】
スフェロイド培養物におけるＥｐｈＡ２レベルのアッセイ
イメージング実験が完了したところでＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）から９６ウェル培養プレートを取り出し、氷の上に置いた。複数のウェルからのスフェロイドをプールし、冷たいＰＢＳ中ですすいだ。細胞を、冷却したＢｉｏＰｌｅｘ溶解緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）に４℃で３０分間溶解し、次に−８０℃で保管した。製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）の指示、そしてＢＳＡ標準物質（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を用いたＢＣＡアッセイによって測定した総タンパク質に対し表現された値に従って、ヒトＥｐｈＡ２用のＥＬＩＳＡアッセイを実行した。
【０１３２】
スフェロイドによる標的リポソーム取込みはＥｐｈＡ２発現を要する
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）データビューイングツールを用いて、リポソーム取込みの観察を実施した。最初にスフェロイドの周囲に蛍光シグナルが見られ、蛍光シグナルは時間と共に中央に向かって伸びるように思われた。リポソームの細胞結合は、ＥｐｈＡ２＋細胞においてＥｐｈＡ２標的リポソームを用いた場合にのみ見られた。非標的リポソームは、ＥｐｈＡ２レベルにかかわらずスフェロイドの表面にも内部にも蛍光を示さなかった。ＥｐｈＡ２発現が非常に低い細胞株（例えば、ＢＴ４７４−Ｍ３）は、本実験で許容された約２４時間の期間にわたってスフェロイドを取り込まなかった。
【０１３３】
標的Ｄｉｌ−５標識リポソームとのインキュベート前に細胞にスフェロイドを形成させた代表的実験の完了時（２３時間時）に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（商標）で得られる画像を２つの細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９９３及びＢＴ４７４−Ｍ３）用に入手した。代表的実験の完了時におけるリポソーム取込みの程度を示すために、赤色蛍光画像または位相差画像のいずれかを含む生データファイルを重ねた。これらの画像は、蛍光チャネルに対し同じ尺度を用いて作成した。ＥｐｈＡ２の測定レベルは、ＮＣＩ−Ｈ１９９３スフェロイドで２４ｐｇ／μｇ総タンパク質、ＢＴ４７４−Ｍ３スフェロイドで２ｐｇ／μｇ総タンパク質であった。
【０１３４】
リン脂質成分に対する標的化分子の濃度を変化させてのリポソーム取込みは、リポソーム取込みが最も高い細胞株において最も明確に視覚化された。標的リポソームとの２５時間（研究終了時）インキュベート時のＮＣＩ−Ｈ１９９３スフェロイド。
【０１３５】
３Ｄ腫瘍スフェロイドにおけるＥｐｈＡ２リポソーム浸透性の動態
平均蛍光強度（ＭＦＩ）の解析からは、最終解析時点まで飽和に達することなく持続する緩やかなリポソーム取込みが示された。この緩やかな増加は、細胞によるリポソーム結合／内在化と共に、リポソームがスフェロイド内の深い層に浸透していることも反映するものである。
【０１３６】
実施例４：マウス食道癌異種移植片モデル及び転移性乳癌モデルの正常組織及び腫瘍における、ＥｐｈＡ２標的リポソーム、非標的リポソーム、及びＥｐｈＡ２抗体の微小分布。
ＥｐｈＡ２標的非薬物装填リポソーム（４６ｓｃＦｖ−Ｌ）、非標的リポソーム（ＮＴ−Ｌ）、及びＥｐｈＡ２抗体１Ｃ１（配列番号３９クローン１Ｃ１，２００８年８月４日出願の発行されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／３４８９４に開示）の微小分布について、ヒト食道癌異種移植片モデルＯＥ−１９の腫瘍及び正常組織、ならびにトリプルネガティブ乳癌の転移性モデルＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍及び肺において研究を行った。
【０１３７】
ＯＥ−１９細胞をＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。５％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、インスリン５μｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン１μｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したＲＰＭＩ１６４０培地において３７℃、５％のＣＯ２で細胞を増殖させた。
【０１３８】
ＯＥ−１９モデルについては、ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雄ヌードマウス（５〜６週齢）をＴａｃｏｎｉｃから入手した。１群当たり５匹のマウスの側腹部に、ＰＢＳに懸濁させた１０×１０６細胞を含有する０．１ｍＬの懸濁液を異所的に接種した。腫瘍が１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３のサイズを達成したら、動物にリポソーム混合物またはＥｐｈＡ２  ＩｇＧ抗体（１Ｃ１、配列番号３９として含まれる）を注射した。
【０１３９】
ＭＤＡ−Ｍ−２３１細胞株に基づいた転移性トリプルネガティブ乳癌の２つのモデルを使用した。１）がん細胞の静脈内接種を通じて産生された転移性病変（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＩＶモデル）、２）少数のがん細胞を乳房脂肪パッド内に同所的に移植（肺内の伝播及び病変発生に十分な時間をもたらす）することを通じて産生された転移性病変（同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）。
【０１４０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＩＶモデルについては、ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雌ヌードマウス（５〜６週齢）をＴａｃｏｎｉｃから入手した。ＰＢＳに懸濁させた０．５×１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、３匹のマウスの尾静脈に静脈注射した。細胞注射から４週間後に動物を屠殺し、転移性病変部の解析のために肺を摘出した。
【０１４１】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性モデルについては、ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅ雌マウス（５〜６週齢）をＴａｃｏｎｉｃから入手した。５匹のマウスの乳房脂肪パッド内に両側的、同所的に接種した。各腺に対して、３０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３５４２３０）を追加したＰＢＳに懸濁させた、０．５×１０６細胞を含有する０．２ｍＬの懸濁液。転移可能性向上のため、各動物に両側的に接種し２つの原発性腫瘍を有するようにした。細胞接種から８週間後に動物を屠殺し、原発性腫瘍及び転移性病変部の解析のために腫瘍及び肺を摘出した。
【０１４２】
標的化がｉｎ  ｖｉｖｏでのリポソーム微小分布に及ぼす影響を試験するため、屠殺の２４時間前、動物に対し、ＥｐｈＡ２標的非薬物装填プラセボリポソームと非標的非薬物装填プラセボリポソームとの混合物を、それぞれ２種の異なる親油性蛍光色素、ＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ及びＤｉＩＣ１８（３）−ＤＳで標識して、１マイクロモル／リポソームタイプ／動物の用量で注射した。（ＥｐｈＡ２−ＩＬ／ＮＴ−Ｌ群）ＤｉＩＣ１８（５）及びＤｉＩＣ１５（３）の蛍光の差を制御するため、各モデルからの動物１匹に対し、組織内で同等に分散するはずである非標的リポソームの混合物を注射した（ＮＴ−Ｌ／ＮＴ−Ｌ群）。
【０１４３】
第２群の動物に対し、５ｍｇ／ｋｇ体重の抗ＥｐｈＡ２抗体クローン１Ｃ１（配列番号３９）を注射した。
【０１４４】
非薬物装填リポソームをエタノール注入−押出法によって調製する。スフィンゴミエリン（ＳＭ）リポソームについては、脂質はスフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧ（３：２：０．２４モル部）から構成され、ＤｉＩＣ１８（３）−ＤＳ（ＤｉＩ３−Ｌｓ）またはＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ（ＤｉＩ５−Ｌｓ）のいずれかの蛍光脂質標識を総リン脂質の０．３ｍｏｌ％の比率で添加する。簡潔に述べると、リポソーム３０ｍｌを調製するために、脂質を、５０ｍｌ丸底フラスコ中のエタノール３ｍｌにセ氏７０度で溶解する。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）をセ氏７０度の水浴でセ氏６５度超に温め、激しい攪拌下で脂質溶液と混合して、５０〜１００ｍＭのリン脂質を有する懸濁液を得る。次に、得られた乳白色の混合物を、例えばｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  Ｌｉｐｅｘエクストルーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、０．２μｍ及び０．１μｍのポリカーボネート膜を通じて６５〜７０℃で繰り返し押出する。ホスフェートアッセイによってリン脂質濃度を測定する。粒子直径を動的光散乱法によって解析する。この方法によって調製したリポソームのサイズは約９５〜１１５ｎｍである。抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖタンパク質を哺乳類細胞培養物で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、１：４タンパク質／ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥモル比の水性溶液中で、Ｃ末端システイン残基を通じてマレイミド末端リポポリマーのｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥに結合させた。得られたミセルｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合体をゲルクロマトグラフィーによりＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で精製した。標的ＤｉＩ３−ＬｓまたはＤｉＩ５−Ｌｓの調製は、ミセル抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合体を６０℃で３０分間、抗体の熱安定性に応じて、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓについては１０〜１２ｇ／ｍｏｌリン脂質、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓについては５ｇ／ｍｏｌリン脂質のｓｃＦｖ／リポソーム比でインキュベートすることにより行った。リガンドが挿入されたリポソームをＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムで精製し、ホスフェートアッセイによって脂質濃度を解析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体の定量化を行う。
【０１４５】
ＯＥ−１９モデルについては４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓを使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルについては４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓリポソームを使用した。全ての組織を注射から２４時間後に採取した。マウスを１匹ずつＣＯ２を用いた窒息により屠殺し、組織を採取直前にＰＢＳ  １０〜１５ｍｌで灌流させた。動物１匹当たり３つのクリオモルドを用いて、切除組織をＯＣＴ培地中で凍結した：１）心臓、肺、肝臓、脾臓；２）腫瘍、結腸、腎臓、脳；３）皮膚。全ての凍結組織及びクリオスタット切片を−８０℃で保管した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性モデル用に肺及び腫瘍を切除し、１つのＯＣＴブロック中で凍結した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＩＶモデルについては肺のみを切除し、動物１匹当たり１つのＯＣＴブロック中で凍結した。リポソーム注射群については、凍結切片を室温で５〜１０分置いてから４％のパラホルムアルデヒドで１０分固定した。試料をＴＢＳですすぎ、ＤａＶｉｎｃｉ  Ｇｒｅｅｎ希釈剤（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ  ＣＡ）で希釈したＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）で核対比染色した。試料をＴＢＳですすぎ、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントし、終夜置いてからイメージングした。
【０１４６】
１Ｃ１群（配列番号３９）については、抗体を染色するために追加のステップを実施した。要約すると、凍結切片を室温で５〜１０分置いてから冷たいＮＢＦで１０分固定した。試料をＴＢＳ−Ｔですすぎ、次にＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ）で非特異性結合を１０分ブロックした。ＴＢＳ−Ｔでさらにすすいだ後、ＤａＶｉｎｃｉ  Ｇｒｅｅｎ希釈剤中５μｇ／ｍｌのヤギ−抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異性；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）でヒトＩｇＧを検出し、終夜湿度チャンバー内で４℃でインキュベートした。対照スライドの連続切片をヤギ抗ウサギＩｇＧに等しい濃度で並行してインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、２０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ６４７結合ロバ抗ヤギＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３０分、室温により、結合した抗ヒト抗体または抗ウサギ抗体を検出した。リポソームの視覚化について説明されているように、これらの試料をＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２で対比染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄにマウントした。
【０１４７】
２０×倍率のＡｐｅｒｉｏＦＬ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ  ＩＬ）で画像を収集した。ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｓｃｈｔ染色核）、ＳＰＯＲ−Ｂ（ＤｉＩ３リポソーム、及びＣＹ５（ＤｉＩ５リポソーム、Ａｌｅｘａ６４７結合抗体）のフィルターにより、各チャネルを独立して収集した。ヒトＩｇＧ  １Ｃ１の視覚化のため、抗ウサギＩｇＧ染色対照スライドに対し、試験試料に使用したものと同じ設定でイメージングした。
【０１４８】
リポソーム沈着の定量化ならびに標的リポソーム及び非標的リポソームの重複程度の比較は、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いて開発したインハウスのアルゴリズム及びユーザーインターフェイスを用いて行った。要約すると、核染色の分割により決定される腫瘍または正常臓器内の組織面積を２００×２００μｍのタイルで再分割し、対応する蛍光画像からＥｐｈＡ２標的リポソーム及び非標的リポソームの平均輝度を抽出した。、単一ピクセルレベルにおける２つのチャネルの比を計算することにより、レシオメトリックイメージングを実施した。１ピクセル当たり１０ミクロンの解像度で画像を開き、比を計算し、次にメジアンフィルターを３〜１０の範囲のサイズで適用してノイズをフィルター除去した。クローン１Ｃ１（配列番号３９）を別々の動物に注射したことから、リポソームとＩｇＧとの比較を目視検査によって行った。
【０１４９】
ＯＥ−１９モデルにおいて、臓器内の全体的なリポソーム沈着の解析（ＮＴ−Ｌｓ及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ）から示されたことは、肝臓、脾臓、及び腫瘍を含めた特定の臓器における優先的な体内分布と、採取した他の全ての臓器における顕著に低いレベルである（図１２Ａ）。リポソームは肝臓及び脾臓内の特定の組織サブ区画に沈着し、皮膚の真皮及び皮下区域ではそれより低いレベルで沈着していた。正常な臓器では、ＥｐｈＡ２標的化はリポソームの微小分布に対し顕著には影響を及ぼさず、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及びＮＴ−Ｌｓはほとんどの解析対象臓器の同じ区域に共存していた。リポソームの微小分布における標的媒介シフトを解析するため、発明者らは画像のレシオメトリック解析を実施した。この解析は、リポソーム沈着が十分に高度な組織において比の誤りを最小化するのに専ら有意義である。したがって、発明者らはレシオメトリック解析を肝臓、脾臓、及び腫瘍に対し実施した。正常な組織とは異なり、腫瘍ではＥｐｈＡ２標的化がリポソームの微小分布に影響を及ぼした。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓの局在化を非標的リポソームの局在化と比較した解析からは微小分布における顕著なシフトが示され、一部の区域では非標的リポソームよりも２〜３倍標的化されていた。リポソーム平均蛍光強度の空間分布及び共存の定量化により、全ての動物において４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓに向かって対角線を越えた顕著なシフトが示されている。このシフトは主として沈着の少ない区域で見られた（図１２Ｂ）。４６ｓｖＦｖ−ＩＬｓのＮＴ−Ｌｓに対する比が表示されるレシオメトリック画像の解析からは、腫瘍において、詳細には中心部においてより高い比が示されている。
【０１５０】
図１２Ｂは、ＥｐｈＡ２標的化に対するリポソームレシオメトリック解析を示す図表である。図１２Ｃは、ＥｐｈＡ２標的化に対するリポソームレシオメトリック解析を示す画像である。
【０１５１】
臓器レベルでは、１Ｃ１抗体（配列番号３９）は、ＮＴ−ＬｓやＥｐｈＡ２−ＫＬｓの沈着パターンとは異なり、ほとんどの解析対象臓器に対し非常に分散した形で生態分布していた。１Ｃ１（配列番号３９）は表皮内の高度な染色を示し、一方４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓは主に真皮内に位置していた。
【０１５２】
いずれの転移モデルも、肺においてサイズが異なる複数の病変部の出現をもたらした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＩＶは広範な転移負荷を有し、肺の大部分が浸潤性びまん性腫瘍で置き換えられる。同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、転移負荷はＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＩＶより小さく、組織学的に識別可能な微小または巨大な病変部の出現を介して別々になっていた。
【０１５３】
両方のモデルにおいて、ＮＴ−Ｌｓ／ＮＴ−Ｌｓ群の動物の解析から、腫瘍または転移病変部の同じ区域で両方のリポソームの沈着が示された。リポソーム平均蛍光強度の空間分布及び共存の定量化により、全ての動物において４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓに向かって対角線を越えた顕著なシフトが示されている（図１２Ｄ）。レシオメトリック解析は１に近い比を示した。原発性腫瘍では、ＥｐｈＡ２標的化がリポソームの微小分布に影響を及ぼした。４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓの局在化を非標的リポソームの局在化と比較した解析からは微小分布における顕著なシフトが示され、一部の区域では非標的リポソームよりも２〜５倍標的化されていた（図１２Ｅ）。同様のパターンが肺転移病変部にも見られ、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓが肺の転移性病変部または病変周囲区域に散在的に沈着していた。転移性肺病変部におけるこのパターンのリポソーム沈着は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ＩＶ（図１２Ｆ）及び同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１２Ｅ）の両方のモデルで見られた。
【０１５４】
実施例５：マウストリプルネガティブ乳癌異種移植片における４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ヒトトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株ＳＵＭ−１５９、ＳＵＭ−１４９、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６の異種移植片モデルにおいて、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を研究した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３６をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、１０％のウシ胎児血清、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、及び硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したＬ１５培地において３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。ＳＵＭ−１５９及びＳＵＭ−１４９細胞株をＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し、５％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、インスリン５μｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン１μｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したハムＦ−１２培地において３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。
【０１５５】
ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雄ヌードマウス（４〜５週齢、少なくとも１６ｇの体重）をＴａｃｏｎｉｃから入手した。マウスの右乳腺胸部脂肪パッドに、３０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３０）を追加したＰＢＳに懸濁させた１０×ｌ０６細胞を含有する懸濁液０．１ｍＬを同所的に接種した。腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３に到達したとき、以下の方法に従って動物を処置群に割り当てた。腫瘍サイズに従って動物をランク付けし、腫瘍サイズが大きいものから小さいものへ６つのカテゴリーに分類した。各処置群で全ての腫瘍サイズが同等に示されるように各サイズカテゴリーから１匹の動物をランダムに選択することにより、８動物／群の処置群を形成した。
【０１５６】
ＳＵＭ−１５９及びＳＵＭ−１４９異種移植片モデルについては以下の処置群を形成した：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり１０ｍｇ／ｋｇの用量のドセタキセル；３）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３。
【０１５７】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルについては以下の通り：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり１０ｍｇ／ｋｇの用量のドセタキセル；３）注射１回当たり１２．５ｍｇ／ｋｇの用量の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３；４）注射１回当たり２５ｍｇ／ｋｇの用量の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３；５）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３。
【０１５８】
動物に４回の尾静脈注射を７日間隔で投与した。
【０１５９】
ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸイムノリポソームは、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール（３：２のモル比）、及び８ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧから構成された脂質部分を有し、捕捉された１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを含有し、実施例１に記載のように４５０ドセタキセル当量／モルリン脂質の薬物／脂質比で化合物３と共に調製及び装填し、配列番号４０のｓｃＦｖがリポソームの外部に結合している、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３とした。
【０１６０】
注射用濃縮ドセタキセル（Ａｃｃｏｒｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、２０ｍｇ／ｍｌアルコール溶液）を投与前にＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍｌにした。
【０１６１】
動物の体重及び腫瘍サイズを週に２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
【０１６２】
処置関連毒性を評価するため、動物の体重も週に２回測定した。群における腫瘍がマウス体重の１０％に達したら、群の動物を安楽死させた。群間の平均腫瘍体積を一緒にプロットし経時的に比較した。
【０１６３】
図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃに示されるように、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、３つの異種移植片モデル全てにおいて、同等の中毒量のドセタキセルよりも顕著に強力な抗腫瘍有効性を有する。動物体重の動態によって処置関連毒性を評価した（図７Ｄ、７Ｅ、及び７Ｆ）。比較的成長が遅いモデル：ＳＵＭ−１４９及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６では、いずれの群もいかなる顕著な毒性も示さなかった。全ての処置群における動物の体重は対照群に匹敵し、一貫して増加していた。一方、より攻撃的なモデルのＳＵＭ−１５９では、重度のドセタキセル毒性及び中程度の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３毒性が観察された。
【０１６４】
図７Ａは、ＳＵＭ−１５９異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図７Ｂは、ＳＵＭ−１４９異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図７Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図７Ｄは、ＳＵＭ−１５９異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。図７Ｅは、ＳＵＭ−１４９異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。図７Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。
【０１６５】
実施例６  複数の患者由来及び細胞由来のマウス異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ＤＴＸｐ３装填ナノ治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ＥｐｈＡ２標的ＤＴＸｐ３装填ナノ治療薬の抗腫瘍有効性の研究を、２９の異種移植片モデルにおいて週１回５０ｍｇ／ｋｇの用量で４週間行った。患者由来モデルは、ＲＰＣＩ及びＴｅｘａｓ  Ｔｅｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙなどの共同研究機関から、またはＪａｃｋｓ  Ｌａｂなどのベンダーから入手した。さらに、２１のモデルにおいて、５０ｍｇ／ｋｇのＥｐｈＡ２標的ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を１０ｍｇ／ｋｇの等毒量または中毒を上回る量の遊離ドセタキセルと比較して研究した。
【０１６６】
動物の体重及び腫瘍サイズを週に２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
【０１６７】
以下の式（式中、ＴＶは腫瘍体積である）に従って、最大腫瘍退縮を計算した。
最大腫瘍退縮＝［（最小ＴＶ−０日時のＴＶ）／０日時のＴＶ］×１００
【０１６８】
図１７Ａに示されるように、ＥｐｈＡ２標的ＤＴＸｐ３装填ナノ治療薬は、試験モデルにおいて５０％を超える腫瘍退縮をもたらしている。完全腫瘍退縮（−１００％）は９５／２５０（３９％）の試験動物に見られ、部分腫瘍退縮（−３０％以上）は１１２／２５０（４４．８％）に見られ、腫瘍退縮なしは４３／２５０（１８％）に見られるに過ぎなかった。図１７Ｂに示されるように、１０／２１モデル（４８％）においてＥｐｈＡ２標的ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は遊離ドセタキセルよりも顕著に優れていた。残りのモデルでは、ＥｐｈＡ２標的ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は遊離ドセタキセルと同様であった。遊離ドセタキセルがＥｐｈＡ２標的ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３よりも顕著に大きく腫瘍退縮をもたらしたモデルは存在しなかった。
【０１６９】
実施例７：マウスにおける、トリプルネガティブ乳癌異種移植片における４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び非標的ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性、ならびに胃／食道及び肉腫異種移植片における４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び非標的ＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ヒトトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−４３６及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の異種移植片モデルにおいて、胃／食道ヒト細胞株のＯＥ−１９、ＭＫＮ−４５、及びＯＥ−２１の異種移植片モデルにおいて、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を非標的バージョンのＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３と比較した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３６をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、ＯＥ−１９、ＯＥ−２１をＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）から入手し、ＭＫＮ−４５をＧｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１７０】
１０％のウシ胎児血清、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したＬ１５培地において３７℃、５％のＣＯ２でＭＤＡ−ＭＢ−４３６を増殖させた。１０％のウシ胎児血清、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、及び硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したＲＰＭＩ１６４０培地において、３７℃、５％のＣＯ２でＯＥ−１９、ＭＫＮ−４５、及びＯＥ−２１を増殖させた。
【０１７１】
ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雄ヌードマウス（４〜５週齢、少なくとも１６ｇの体重）をＴａｃｏｎｉｃから入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３６については、マウスの右乳腺胸部脂肪パッドに、３０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３０）を追加したＰＢＳに懸濁させた１０×ｌ０６細胞を含有する懸濁液０．１ｍＬを同所的に接種した。胃／食道及び肉腫モデルについては、マウスの側腹部に、ＯＥ−１９、ＯＥ−２１、ＭＫＮ−４５、及びＳＫＬＭＳ−１をそれぞれ５×１０６細胞、５×１０６細胞、５×１０６細胞、及び６×１０６細胞含有する懸濁液０．２ｍＬを異所的に接種した。全てのモデルについて、細胞をＰＢＳに懸濁させた。腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３に到達したとき、以下の方法に従って動物を処置群に割り当てた。腫瘍サイズに従って動物をランク付けし、腫瘍サイズが大きいものから小さいものへ３つのカテゴリーに分類した。各処置群で全ての腫瘍サイズが同等に示されるように各サイズカテゴリーから１匹の動物をランダムに選択することにより、５〜８動物／群の処置群を形成した。
【０１７２】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６については以下の処置群を形成した：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量のＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３；３）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３。動物に４回の尾静脈注射を７日間隔で投与した。
【０１７３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６モデルについては、ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸイムノリポソームは、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール（３：２のモル比）、及び８ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧから構成された脂質部分を有し、捕捉された１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを含有し、実施例１に記載のように４５０ドセタキセル当量／モルリン脂質の薬物／脂質比で化合物３と共に調製及び装填し、配列番号４０のｓｃＦｖがリポソームの外部に結合している、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３とした。
【０１７４】
胃モデルは感受性が高いため、低い用量を使用した。ＯＥ−１９、ＭＫＮ−４５、及びＯＥ−２１については以下の処置群を形成した：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり２５ｍｇ／ｋｇの用量のＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３；３）注射１回当たり２５ｍｇ／ｋｇの用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）。
【０１７５】
肉腫モデルはＤＴＸに耐性を有することが知られており、高い用量での処置で試験した。以下の処置群を形成した：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量のＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３；３）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）。
【０１７６】
動物の体重及び腫瘍サイズを週に１回または２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
【０１７７】
処置関連毒性を評価するため、動物の体重も週に２回測定した。群における腫瘍がマウス体重の１０％に達したら、群の動物を安楽死させた。
【０１７８】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６については、群間の平均腫瘍体積を一緒にプロットし経時的に比較した。
【０１７９】
ＯＥ−１９、ＭＫＮ−４５、及びＯＥ−２１については、以下の式（式中、ＴＶは腫瘍体積である）に従って最大反応及び再成長時間を計算した。
最大反応＝［（最小ＴＶ−０日時のＴＶ）／０日時のＴＶ］×１００
再成長時間＝ＴＶが０日時のＴＶの４倍に成長する時間
【０１８０】
図８Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおいて、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３が非標的バージョンのＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３よりも顕著に強力な抗腫瘍有効性を有することを示している。
【０１８１】
動物体重の動態によって処置関連毒性を評価した（図８Ｂ）。いずれの群も顕著な毒性を示さなかった。全ての処置群における動物の体重は対照群に匹敵し、一貫して増加していた。
【０１８２】
図８Ｃ、図８Ｄ、及び図８Ｅは、ＯＥ−１９、ＭＫＮ−４５、及びＯＥ−２１異種移植片モデルにおいてそれぞれ、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３が非標的バージョンのＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３よりも顕著に強力な抗腫瘍有効性を有することを示している。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、ほとんどのモデルにおいて顕著に高い反応及び／または再成長時間の顕著な増加を示している（図８Ｆ）。
【０１８３】
図８Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおける４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較したＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図８Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６異種移植片モデルにおけるＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。図８Ｃは、ＯＥ−１９異種移植片モデルにおけるＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図８Ｄは、ＭＫＮ−４５異種移植片モデルにおけるＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図８Ｅは、ＯＥ−２１異種移植片モデルにおけるＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図８Ｆは、ＯＥ−１９、ＯＥ−２１、及びＭＫＮ−４５異種移植片モデルにおけるＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図８Ｇは、ＳＫ−ＬＭＳ−１異種移植片モデルにおけるＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【０１８４】
実施例８：マウス非小細胞肺癌異種移植片モデルにおける４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ヒト非小細胞肺癌細胞株の異種移植片モデルにおいて、４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を研究した。Ａ５４９をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、１０％のウシ胎児血清、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、及び硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したＲＰＭＩ１６４０培地において３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。
【０１８５】
ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雄ヌードマウス（５〜６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスの側腹部に、ＰＢＳに懸濁させた５×１０６細胞を含有する０．２ｍＬの懸濁液を異所的に接種した。腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３〜２００ｍｍ３に到達したとき、以下の方法に従って動物を処置群に割り当てた。腫瘍サイズに従って動物をランク付けし、腫瘍サイズが大きいものから小さいものへ６つのカテゴリーに分類した。各処置群で全ての腫瘍サイズが同等に示されるように各サイズカテゴリーから１匹の動物をランダムに選択することにより、８動物／群の処置群を形成した。以下の処置群を形成した：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり１０ｍｇ／ｋｇの用量のドセタキセル；３）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量の４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３。
【０１８６】
動物に４回の尾静脈注射を７日間隔で投与した。ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸイムノリポソームは、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール（３：２のモル比）、及び５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧから構成された脂質部分を有し、捕捉された１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを含有し、実施例１に記載のように３１５ドセタキセル当量／モルリン脂質の薬物／脂質比で化合物３と共に調製及び装填し、配列番号４１のｓｃＦｖがリポソームの外部に結合している、４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３とした。
【０１８７】
実施例１バージョンの４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３．１に従ってリポソームを調製した。注射用濃縮ドセタキセル（Ａｃｃｏｒｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、２０ｍｇ／ｍｌアルコール溶液）を投与前にＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍｌにした。
【０１８８】
腫瘍サイズは、週に２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
【０１８９】
群間の平均腫瘍体積を一緒にプロットし経時的に比較した。
【０１９０】
図９に示されるように、４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、Ａ５４９モデルにおいて、同等の中毒量のドセタキセルよりも顕著に強力な抗腫瘍有効性を有する。図９は、Ａ５４９異種移植片モデルにおける４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【０１９１】
実施例９：マウス前立腺癌及び卵巣癌異種移植片モデルにおける４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ヒト前立腺癌及び卵巣癌細胞株の異種移植片モデルにおいて、４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を研究した。ＤＵ−１４５をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、ＯＶＣＡＲ−８をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。１０％のウシ胎児血清、ペニシリンＧ  ５０Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを追加したＲＰＭＩ培地において３７℃、５％のＣＯ２で両方の細胞株を増殖させた。
【０１９２】
腹腔におけるＯＶＣＡＲ−８細胞の同所性モニタリングを可能にするため、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｌ  Ｃａｊｏｎ，ＣＡ）から入手したガウシアルシフェラーゼ（ＧＬＵＣ）発現レンチウイルス上清をＯＶＣＡＲ−８細胞に感染させた（図１３Ｂ）。簡潔に述べると、図１３Ｂは、一般に使用されているウイルスの産生及び感染のプロトコルである。感染時（ＭＯＩ約１０）及び所望の細胞株のピューロマイシン選択時（２週間、１μｇ／ｍｌ）に、培地中のＧＬＵＣ発現を評価するために生物発光アッセイを使用する。分泌ＧＬＵＣの測定における原理は、過去にＣｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ２００９，Ｄｅｃ  １５；４（１２）：ｅ８３１６で説明されている。しかし、標的化システムから適合及び改変したプロトコル（図１３Ｃ）を使用し、これは図２に記載されている。簡潔に述べると、血漿または培地いずれかの試料を９６ウェルプレートに移した。プレートルミノメーター（ＭＬＸ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｄｙｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用いてＧｌｕｃ活性を測定した。ＰＢＳ中１００ｍＭのセレンテラジン（ＣＴＺ，Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，ＡＺ）１００ｍｌを自動的に注入するようにルミノメーターを設定し、光子カウントを１０秒間取得した。本アッセイは、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価用には上清で使用し、腫瘍負荷のｉｎ  ｖｉｖｏモニタリング用には血漿で使用した。要約すると、週に１回伏在静脈の出血から血液試料を採取し、血液を遠心処理し、血漿を抽出した。シグナル安定性を保証するため、上述の生物発光アッセイを採取と同じ日に使用した。
【０１９３】
ＯＶＣＡＲ−８実験については、ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雌ヌードマウス（５〜６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスの腹腔に、ＲＰＭＩに懸濁させた０．５×ｌ０６細胞を含有する０．３ｍＬの懸濁液を接種した。ＧＬＵＣ評価のために毎週動物を出血させた。腫瘍負荷が２０ｎｇ／ｍｌの血漿ＧＬＵＣレベルに達したら、以下の方法に従って動物を処置群に割り当てた。可変性が疾患進行であることから、動物を回転式に様々な群に割当て、対照群または４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３群のいずれかにランダム化した。以下の処置群を形成した：１）生理食塩水（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり２０ｍｇ／ｋｇの用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３  ２０ｍｐｋ）。
【０１９４】
図１３Ａに示されるように、２０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、処置期間全体において持続的に腫瘍成長の阻害を誘発した。
【０１９５】
ＤＵ−１４５実験については、ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合無胸腺雌ヌードマウス（５〜６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスの側腹部に、５０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３０）を追加したＲＰＭＩに懸濁させた３．３×ｌ０６細胞を含有する懸濁液０．２ｍＬを異所的に接種した。腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３〜２００ｍｍ３に到達したとき、以下の方法に従って動物を処置群に割り当てた。腫瘍サイズに従って動物をランク付けし、腫瘍サイズが大きいものから小さいものへ４つのカテゴリーに分類した。各処置群で全ての腫瘍サイズが同等に示されるように各サイズカテゴリーから１匹の動物をランダムに選択することにより、６動物／群の処置群を形成した。以下の処置群を形成した：１）生理食塩水（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回当たり１０ｍｇ／ｋｇの用量のドセタキセル（ＤＴＸ  １０ｍｐｋ）；３）注射１回当たり２５ｍｇ／ｋｇの用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３  ２５ｍｐｋ）；４）注射１回当たり５０ｍｇ／ｋｇの用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３  ５０ｍｐｋ）。
【０１９６】
動物に４回の尾静脈注射を７日間隔で投与した。注射用濃縮ドセタキセル（Ａｃｃｏｒｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、２０ｍｇ／ｍｌアルコール溶液）を投与前にＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍｌにした。腫瘍サイズは、週に１回または２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝［（長さ）×（幅）２］／２
【０１９７】
以下の式（式中、ＴＶは腫瘍体積である）に従って、最大反応を計算した。
最大反応＝［（最小ＴＶ−０日時のＴＶ）／０日時のＴＶ］×１００
【０１９８】
群間の単一腫瘍体積を一緒にプロットし経時的に比較した。
【０１９９】
図１０Ａ及び１０Ｂに示されるように、５０ｍｇ／ｋｇ体重の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、ＤＵ−１４５モデルにおいて、等毒量１０ｍｇ／ｋｇの遊離ドセタキセルよりも顕著に強力な抗腫瘍有効性を有する。図１０Ａは、ＤＵ−１４５異種移植片モデルにおける４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。図１０Ｂは、ＤＵ−１４５異種移植片モデルにおける４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を示す図表である。
【０２００】
実施例１０：スイスウェブスターマウスにおける４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び遊離ドセタキセルのｉｎ  ｖｉｖｏ耐容性
本実施例では、ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウスにおいて研究したＥｐｈＡ２標的ドセタキセルナノリポソーム（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）及び遊離ドセタキセルのｉｎ  ｖｉｖｏ耐容性について説明する。
【０２０１】
スイスウェブスターホモ接合雌マウス（５〜６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。動物に、試験用量の試験化合物の尾静脈注射を７日間隔で投与した（表５：実験計画）。４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の用量を相当するドセタキセル重量で表現する。
【表５】
2019508434.tif 000009
【０２０２】
ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸイムノリポソームは、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール（３：２のモル比）、及び６ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧから構成された脂質部分を有し、捕捉された１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを含有し、実施例１に記載のように３１５ドセタキセル当量／モルリン脂質の薬物／脂質比で化合物３と共に調製及び装填し、配列番号４１のｓｃＦｖがリポソームの外部に結合している、４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３とした。動物に、特定の用量の４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３または遊離ドセタキセルの尾静脈注射を投与した。マウスに対する週に３〜４回の臨床所見（臨床所見表）に基づいて、動物体重及びパフォーマンス状態スコアを監視した。ＩＡＣＵＣプロトコルに従って、重度の毒性を経験する動物を安楽死させる。マウスの３０％超が重度の毒性を経験する場合、試験用量は耐容性がないものとみなされる。
【表６−１】
2019508434.tif 000010
【表６−２】
2019508434.tif 000011
【０２０３】
１６７ｍｐｋの４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の３回用量の後、群の全ての動物は、潰瘍形成前の赤みのある外観を伴う乾燥した落屑性の皮膚を有し、処置の終了及び動物の安楽死が必要となった。１２３ｍｐｋの４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、安楽死を必要としない軽度の皮膚乾燥及び落屑を示し、水分補給クリームで処置した。この知見から、スイスウェブスターマウスにおける４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３による週１回の処置の最大耐容量は１２３ｍｐｋと特定される。いずれの群についても、体重損失は軽度の１０％未満であった。
【０２０４】
２３及び２６ｍｐｋの遊離ドセタキセルの３回用量の後、群の全ての動物に１０％〜１５％の範囲の体重損失や、過敏症の徴候（触れると声を出す（ｖｏｃａｌ  ａｔ  ｔｏｕｃｈ））や、注射部位における局所毒性の証拠（尾の腫れ）が見られた。これらの徴候は、処置の遅延または中断を必要とする重度なものとみなされ、用量制限毒性と考えられる。２０ｍｐｋのドセタキセルは耐容性が良好であり、いかなる検出可能な体重損失もいかなる毒性徴候ももたらさなかった。この知見から、スイスウェブスターマウスにおける遊離ドセタキセルによる週１回の処置の最大耐容量は２０ｍｐｋである。
【０２０５】
図６Ａは、スイスウェブスターマウスにおける４１ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。図６Ｂは、スイスウェブスターマウスにおける遊離ドセタキセルの耐容性を示す図表である。
【０２０６】
実施例１１：ドセタキセルプロドラッグの合成
式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグは、図２Ａに示す反応スキームを含めた様々な反応法によって調製することができる。２つの化合物の代表的な合成例を以下に示す。これらまたは他のドセタキセルプロドラッグ、及びその医薬的に許容される塩は、様々な好適な合成方法によって調製することができる。図２Ｂの表は、ある特定のドセタキセルプロドラッグの例についての代表的リストを示している。
【０２０７】
実施例１１Ａ：２’−Ｏ−（４−ジエチルアミノブタノイル）ＤＴＸ塩酸塩（化合物３）の合成
ドセタキセル（ＤＴＸ）（０．２５ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、４−ジエチルアミノ酪酸塩酸塩（０．１２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ．ＨＣｌ（０．１２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．０８ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を全て秤量しＡｒ下で１５ｍＬバイアルに入れた。これに無水ＤＣＭ  ６ｍＬを室温、Ａｒ下で添加し、室温で１８時間攪拌した。１８時間攪拌後のＨＰＬＣは４３％の生成物を示し、５７％のＤＴＸは未反応のままであった。追加量の４−ジエチルアミノ酪酸塩酸塩（０．１５ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌をさらに２４時間継続した。ＨＰＬＣは９１％の生成物を示し、８％のＤＴＸは未反応のままであった。反応を停止させ、１２ｇのカートリッジに直接装填し、３〜１２％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を用いてＦＣＣを実施した。画分３０〜４９を一緒にプールし、２−プロパノール中０．０５ＮのＨＣｌ  ０．５ｍＬを添加し、３０℃で蒸発させて０．１９ｇの白色の固体（６３％の収率）を得た。
【０２０８】
ＨＮＭＲ：δ  ＝  ８．１１  （ｄ，  ２Ｈ），  ７．６５−７．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５６−７．４６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４５−７．２９  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．２９−６．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ５．９９  （ｄ，  １Ｈ），  ５．６８  （ｄ，  １Ｈ），  ５．５８−５．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ５．３１  （ｄ，  １Ｈ），  ５．２４  （ｓ，  １Ｈ），  ４．９６  （ｄ，  １Ｈ），  ４．３８−４．０８  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．９１  （ｄ，  １Ｈ），  ３．２０−２．３０  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．７０−２．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．５０−２．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２５−２．０５  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９２−１．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７５  （ｓ，  ３Ｈ），  １．５０−１．３５  （ｍ，  ９Ｈ），  １．３２  （ｓ，  ９Ｈ），  １．３０−１．２０  （ｍ，  ６Ｈ），  １．１２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．  ｐｐｍ．ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：  ９４９．４  ［Ｍ］＋
【０２０９】
実施例１１Ｂ：２’−Ｏ−［４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブタノイル］ＤＴＸ塩酸塩（化合物４）の合成
ドセタキセル（ＤＴＸ）（０．２８ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ酪酸塩酸塩（０．０７ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ．ＨＣｌ（０．１３ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を全て秤量しＡｒ下で１５ｍＬバイアルに入れた。これに無水ＤＣＭ  ７ｍＬを添加し、この混合物を室温で１８時間攪拌した。１８時間後のＨＰＬＣは９４％の生成物を示し、３％の副生成物及び３％のＤＴＸが残存していた。反応残渣を１２ｇのカートリッジに直接装填し、５〜５０％の２−プロパノール／ＣＨＣｌ３を用いてＦＣＣを実施した。画分２１〜４１を一緒にプールし、２−プロパノール中０．０５ＮのＨＣｌ  ０．５ｍＬを添加し、４０℃で蒸発させて重量０．１６ｇの白色の固体（４８％の収率）を得た。ＤＴＸから生成物への良好な転換にもかかわらず収率が比較的低いのは、おそらくは生成物の２−プロパノールに対する可溶性が不十分であることに起因するものであった。
【０２１０】
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３＋  （ＣＤ３）２ＳＯ）：  δ  ＝  ８．０２  （ｄ，  ２Ｈ），  ７．６０−７．４２  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３８−７．２５  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２４−７．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９２  （ｄ，  １Ｈ），  ６．４０−５．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ５．５３  （ｄ，  １Ｈ），  ５．３５−５．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ５．２０−５．０８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．８５  （ｄ，  １Ｈ），  ４．７４  （ｄ，  １Ｈ），  ４．２６  （ｓ，  １Ｈ），  ４．１３  （ｄｄ，  ３Ｈ），  ３．７４  （ｄ，  １Ｈ），  ３．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．１６−２．７４  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．６４−２．４８  （ｍ，  ７Ｈ），  ２．４９−２．００  （ｍ，  ５Ｈ），  １．８４−１．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６２  （ｍ，  ３Ｈ），  １．３０  （ｓ，  ９Ｈ），  １．０７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．０２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：  ９２１．４  ［Ｍ］＋
【０２１１】
実施例１２：緩衝液における加水分解の手順
必要に応じて所望の濃度を提供するための、あるボリュームのＤＭＳＯ中薬物の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（典型的には、８０μｇ／ｍＬ溶液をもたらすには１６μＬ）をガラスの試験管または４ｍＬバイアルに入れる。追加のＤＭＳＯ（例えば、薬物溶液１６μＬを使用する場合は６４μＬ）を添加して、４％の最終総ＤＭＳＯ濃度を得ることもできる。ＤＭＳＯ溶液を短時間のボルテックスにより混合し、次にｐＨ７．５用に２ｍＬ（２０ｍＭ）のＨＥＰＥＳ緩衝液、そしてｐＨ２．５用に２ｍＬ（２０ｍＭ）のリン酸緩衝液を添加し、混合物を再びボルテックスする。初期ｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって調整することができる。２０ｍＭの緩衝液の使用は、より良好なｐＨ制御をもたらし、インキュベート中のｐＨドリフトを回避することが見いだされた。
【０２１２】
次に、薬物の緩衝溶液の１００μＬアリコートをＨＰＬＣバイアルに移し、３７℃の水浴でインキュベートする。残りの溶液も、ｐＨ監視のために４ｍＬバイアル中３７℃でインキュベートする。
【０２１３】
各時点において、アセトニトリル（ＡＣＮ）中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９００μＬをＨＰＬＣバイアルに添加し、内容物をボルテックスする。次に、ＨＰＬＣ解析のためにバイアルを４℃のオートサンプラーラックに入れる。
【０２１４】
ゼロ時間のデータポイントは、典型的には０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮ（８μｇ／ｍＬ）５ｍＬ中ＤＭＳＯストック４μＬの溶液から得る。
【０２１５】
ＳＹＮＥＲＧＩ  ４ミクロンＰｏｌａｒ  ＲＰ−８０Ａ、２５０×４．６ｍｍカラムで、１ｍＬ／分の流量、５０μＬの注入体積、２５℃のカラム温度、及び２２７ｎｍにおけるＵＶ検出を用いてＨＰＬＣ解析を実施する。ほとんどの化合物は、０．１％の水性ＴＦＡ中３０から６６％のアセトニトリルの勾配を１３分（方法Ａ）、次に３０％に戻しながらの勾配を１分、そして３０％での保持を６分間行うことによって解析する。この方法をとるには保持時間が長すぎる場合、３０から９０％のアセトニトリルの勾配を２０分（方法Ｂ）、次に３０％への戻しを１分、そして３０％での９分間保持を用いる。
【０２１６】
加水分解の程度を、相対ピーク面積に基づいた％ＤＴＸ形成として下の表７に報告する。
【表７】
2019508434.tif 000012
【０２１７】
実施例１３：緩衝血漿における加水分解の手順
ヒト血漿（ＨＰ１０５５（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）；クエン酸Ｎａで保存した貯留ヒト血漿）を遠心処理して沈殿物を除去する。１．５ｍＬ遠心処理チューブに、血漿０．９ｍＬ及びｐＨ７．５、０．９ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液４０〜５０μＬを添加する（４０〜５０ｍＭの最終濃度及び７．５のｐＨ）。これを反転によって混合し、次にチューブを３７℃に温める。次に、薬物の１０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ溶液７．２μＬを添加し（８０μｇ／ｍＬの最終濃度）、内容物を反転によって混合する。次に、血漿中の溶液を１．５ｍＬ遠心処理チューブに分取し、３７℃浴に置く。各時点において、アセトニトリル（ＡＣＮ）中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９００μＬをチューブに添加する。内容物をボルテックス混合し、次に１３，０００ｒｐｍで５分間遠心処理する。緩衝液における加水分解の手順に記載のようにして、上清をＨＰＬＣによって解析する。ゼロ時間のデータポイントは、０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮ（８μｇ／ｍＬ）５ｍＬ中ＤＭＳＯストック４μＬの溶液から得る。結果の比較は、典型的には、緩衝液における加水分解の手順を使用して４％のＤＭＳＯを用いた５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中８０μｇ／ｍＬについて得られたものに対して行う。
【０２１８】
実施例１４：マウスにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの薬物動態
実験動物の飼育及び処置は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドライン、プロトコルＭＡＰ００４に従った。６〜８週齢の雌スイスウェブスターマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。実施例１で調製したリポソームを薬物動態研究に使用した。各リポソーム配合について、３匹のマウスからなる群に所与用量（２〜５０ｍｇ／ｋｇ）のトリチウム標識リポソームを投与した。５分、１．５時間、４時間、８時間、２４時間として指定される時点において、血液試料（３０〜６０μＬ）を伏在静脈からリチウムヘパリンコーティングチューブに採取した。４８時間時点において、血液およそ４００μＬを最後の心臓出血から採取した。直ちに（１０分以内）血液試料を１２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心処理した。次に血漿試料を除去し、３以上の希釈因子を有する２００ｍＭのｐＨ２．５リン酸緩衝液で安定化させた。安定化させた試料を放射能カウント及び薬物濃度測定用に分割した。ＮＣＡモデルを用いたＰｈｏｅｎｉｘソフトウェアにより、脂質、化合物３、及び薬物脂質比についての経時的な濃度データを解析した。種々のリポソーム配合のＰＫ結果を表８に概括する。種々の薬物：リン脂質（Ｄ／Ｌ）比におけるリポソームＬｓ−ＤＴＸｐ３の配合物、及び種々の％ＰＥＧ−ＤＳＧにおけるイムノリポソーム４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３について評価した。
【表８】
2019508434.tif 000013
【０２１９】
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３−３００の薬物動態は、薬物対時間、脂質対時間、及び薬物／脂質比対時間について、それぞれ図１４Ａ、１４Ｂ、及び１４Ｃに示されている。実験データをノンコンパートメント解析に適合させる（実線で表示）。
【０２２０】
実施例１５：ラットにおける遊離ドセタキセル及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を用いた長期処置により誘発される血液学的毒性及び凝集パラメーター
本研究の目的は、雄ラットにおいて週に１回静脈注入（４回用量）を行った場合の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び遊離ドセタキセルの曝露からもたらされるタキサン誘発型血液学的毒性を評価することであった。研究計画は以下の通りであった。
【表９】
2019508434.tif 000014
【０２２１】
本研究では以下のパラメーター及びエンドポイントを評価した：臨床徴候、体重、食物摂取、臨床病理パラメーター（血液学、凝集、臨床化学、及び尿分析）、全体的な剖検所見、及び病理組織学的検査。
【０２２２】
血液の採取は、頸静脈から（１８日目＝３回目の投与から４日目）、またはイソフルラン麻酔後に腹大動脈から（研究終了＝４回目の投与から９日目）行った。１８日目に、体重が３５０ｇ未満のマウスの血液学的試料のみを採取した。採取後、処理のために試料を適切な研究所に送った。採血の前に動物を終夜絶食させた。
【０２２３】
血液試料に対し、指定されたパラメーターを解析した：赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均血球容積、赤血球分布幅、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球ヘモグロビン量、網状赤血球数（絶対数）、血小板数、白血球数、好中球数（絶対数）、リンパ球数（絶対数）、単球数（絶対数）、好酸球数（絶対数）、好塩基球数（絶対数）、大型の非染色細胞。
【０２２４】
週に１回１０分の遊離ドセタキセル１０ｍｐｋの静脈内注入によって、汎血球減少が誘発されて３回目の投与から４日目に血液学的プロファイルの全要素の広範な減少を伴い、４回目の最後の投与から１０日目まで部分的に持続した。スプラーグドーリーラットにおける、週に１回１０分の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の遊離ドセタキセルの１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量での合計４回用量の静脈内注入でもたらされた血液学的毒性は顕著により少ないものであり、赤血球に対する検出可能な影響はなく、白血球に対する可変性の影響が見られた。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の影響は、最も高用量の４０ｍｐｋにおいてのみ、解析した両方の時点（３回目の投与から４日目及び４回目の投与から１０日目）で見られた。
【表１０】
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【表１１】
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【０２２５】
４０ｍｇ／ｋｇのＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３で週１回処置したスプラーグドーリーラットの追加群を使用して、ＥｐｈＡ２標的化が媒介する凝集への影響が存在する可能性について試験した。研究終了時に全ての試験群から採取した血液試料の凝集関連パラメーター（プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、及びフィブリノーゲンレベルを含む）を解析した。図１５は、全ての群におけるＰＴ、ＡＰＴＴ、及びフィブリノーゲンの平均及び平均の標準誤差を示している。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３またはＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸｐ３の影響は遊離ドセタキセルに非常に類似し、ＰＴ、ＡＰＴＴ、及びフィブリノーゲンに及ぼす影響が比較的低かった。
【０２２６】
実施例１６：新規のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル抗体指向ナノ治療薬（ＡＤＮ）
タキサンは、固形腫瘍の治療のために、根治的状況または対症療法的状況、治療の最初の選択または後の選択のいずれにおいても広く使用されている。ドセタキセルの用量反応関係の解析からは、用量が高いほど高い反応がもたらされると共に高い毒性ももたらされることが強く示唆されている。このことは、ドセタキセルにおける臓器特異性及び細胞特異性の欠如（正常な組織への高度な曝露につながる）や、比較的短い循環半減期（より高い用量が間接的に要求される）に関係する可能性がある。遊離ドセタキセルの薬物動態的限界及び細胞特異性の欠如に対処することを目的に、発明者らは、広範囲の腫瘍で過剰発現するエフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）を標的とするドセタキセルを送達する新規のリポソームを開発した。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は固形腫瘍に蓄積後、ドセタキセルの持続放出をもたらす。前臨床モデルによって、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、浸透性及び保持効果の強化を通じて腫瘍特異的蓄積にてこ入れし、また、リポソームの表面に結合した特異的ｓｃＦｖ抗体断片によるＥｐｈＡ２のアクティブ標的化を通じて細胞特異性にてこ入れすることが実証された。
【０２２７】
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と遊離ドセタキセルとの比較を行うため、マウス及びラットにおける薬物動態及び体内分布の研究を実施した。動物の全体的健康状態及び血液学的毒性に焦点を当てて、げっ歯類モデル及び非げっ歯類モデルにおける長期耐容性の研究を実施した。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と遊離ドセタキセルとの間の違いを評価するために、乳房、肺、及び前立腺の異種移植片におけるいくつかの細胞由来モデルを使用した。
【０２２８】
前臨床試験において、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の半減期は、腫瘍部位における曝露が持続するために遊離ドセタキセルよりも顕著に長かった。長期耐容性研究において、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性は遊離ドセタキセルよりも６〜７倍良好であることが見いだされ、最大耐容量は、遊離ドセタキセルが２０ｍｇ／ｋｇであるのに対し４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇであり、血液学的毒性は検出不可能であった。等毒投与では、いくつかの乳房、肺、及び前立腺の異種移植片モデルにおいて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３  ５０ｍｇ／ｋｇがドセタキセル１０ｍｇ／ｋｇよりも高い活性を示した。
【０２２９】
結論として、発明者らは、臓器及び細胞の標的化を可能にするための循環時間が長く薬物放出動態が緩速で持続的な、新規のＥｐｈＡ２標的ドセタキセルナノリポソームを開発した。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、げっ歯類モデル及び非げっ歯類モデルにおける遊離ドセタキセルによる治療で観察された血液学的毒性を克服することができた。また、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、細胞に由来するいくつかの異種移植片モデルにおいて腫瘍退縮の誘発または腫瘍成長の制御をすることもでき、また、ほとんどのモデルにおいて遊離ドセタキセルよりも活性が高いことが見いだされた。
【０２３０】
スプラーグドーリーラットに対し、１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇ／用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３または１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルの週１回１０分の静脈内注入を合計４回用量で投与した。凝集パラメーターに関して顕著な影響は見られなかった。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）は、４０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルを研究終了時（３０日目）に投与したラットにおいて、ビヒクル対照に比べて短縮された。プロトロンビン時間（ＰＴ）は、４０ｍｇ／ｋｇ／用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を投与した動物においてわずかに増加した。フィブリノーゲンはこれらの処置による影響を受けなかった。赤血球及び白血球のパラメーターにおいて造血及びリンパ系の変化に関連する用量依存の変化が観察されたが、顕微鏡的に認められる変化であった（データは示さない）。１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルとは異なり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３が好中球レベルに及ぼす影響はいかなる用量レベルにおいても存在しなかった。
【０２３１】
ビーグル犬における、週１回１時間の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の１、３、及び９ｍｇ／ｋｇ／用量の合計４回用量の静脈内注入は、血液学にもいかなる凝集パラメーターにも影響を及ぼさなかった。
【０２３２】
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は緩速で持続的な薬物放出を示すことから、循環中には専ら低いレベルの生体利用可能な遊離ドセタキセルが、腫瘍内には高いレベルの活性薬物がもたらされた。この標的ナノ配合物は、最小限の好中球減少、現在市販されているドセタキセルのポリソルベート配合物における用量制限毒性を含めた好ましい毒性プロファイルを示した。また、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、複数の前臨床異種移植片モデルにおいて、等毒投与または等毒未満の投与で遊離ドセタキセルよりも優れた抗腫瘍活性も示した。
【０２３３】
実施例１７：ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの臨床試験
固形腫瘍を有する患者におけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの活性を評価するために、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの臨床試験を行う。ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームは、最大耐容量（ＭＴＤ）が確立するまでは単剤療法として評価されることになる。ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームは、各２１日周期の１日目に９０分にわたる静脈内注入によって投与されることになる。
【０２３４】
選択基準：
本研究における選択に適格であるためには、患者は、臨床的利益を与えることが知られている全ての療法を受けたことがある、またはそれに対する耐容性を有しない、以下のがんのうちの１つを有しなければならない。
●  尿路上皮癌
●  胃／胃食道接合部／食道癌（Ｇ／ＧＥＪ／Ｅ）
●  頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）
●  卵巣癌
●  膵管腺癌（ＰＤＡＣ）
●  前立腺癌（ＰＡＣ）
●  非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）
●  小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）
●  トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）
●  子宮内膜癌
●  ＧＩＳＴ、デスモイド腫瘍、及び多形性横紋筋肉腫以外の軟組織肉腫サブタイプ
追加的な選択基準
●  インフォームドコンセントを提供できる、またはインフォームドコンセントが可能でありその意向がある法定代理人を有する
●  １８歳以上
●  生検に適用できるがん性病変が利用可能であり、治療前の生検を受ける意向がある
●  ０または１のＥＣＯＧパフォーマンスステータス
●  以下によって証明される十分な骨髄予備能：
○  ＡＮＣ＞１，５００／μｌ（成長因子によってサポートされていない）
○  血小板数＞１００，０００／μｌ
○  ヘモグロビン＞９ｇ／ｄＬ
●  患者は、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、及び正常な施設限界値内の国際標準比（ＩＮＲ）によって証明される十分な凝血機能を有しなければならない
●  以下によって証明される十分な肝機能：
○  血清総ビリルビン≦ＵＬＮ
○  アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）≦２．５×ＵＬＮ
○  アルカリホスファターゼ≦２．５×ＵＬＮ（骨転移によってアルカリホスファターゼが高い場合を除く）
○  アルカリホスファターゼ＞２．５×ＵＬＮの場合、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）≦１．５×ＵＬＮの患者であれば選択に適格である。
●  血清／血漿／クレアチニン＜１．５×ＵＬＮによって証明される十分な腎機能
●  任意の事前の手術、放射線療法、または他の抗悪性腫瘍療法の影響からＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３のグレード１、ベースライン以下（脱毛を除く）に回復している
●  妊娠可能な女性または生殖機能を有する男性及びそのパートナーは、研究中及びＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの最終投与後６ヵ月間、性交渉を絶つまたは有効な避妊形態を使用する意向を有しなければならない。真の禁断以外で許容される有効な避妊方法としては、以下のものが挙げられる：１）経口、注射、または移植によるホルモン性避妊方法の確立された使用、２）子宮内デバイス（ＩＵＤ）または子宮内システム（ＩＵＳ）の設置、コンドームまたは殺精子性発泡剤／ゲル／クリーム／座薬を有する閉塞性キャップを含めたバリア避妊方法、３）射精時の精子不在についての適切な精管切除後の文書化を伴う男性不妊化（本研究における女性患者に関しては、精管切除した男性パートナーが当該対象の唯一のパートナーであるべきものとする）
除外基準
●  研究登録から６ヵ月以内のドセタキセルによる事前の治療
●  妊娠中または授乳中
●  全身性抗凝固剤（アスピリンを除く）による治療（例えば、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗Ｘａ阻害剤など）
●  吐血、メレナ、血便、グレード２以上の喀血、または肉眼的血尿の任意の証拠
●  遺伝性出血系障害の任意の病歴
●  スクリーニング来診中または最初の投与スケジュール日に活動性感染が存在するか３８．５℃を超える不明な熱があり、研究者の意見において、患者の試験参加に支障を来すか研究結果に影響を及ぼす可能性が考えられる場合。研究者の自由裁量により、腫瘍熱を有する患者も登録され得る
●  既知のＣＮＳ転移
●  ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの成分、またはドセタキセルに対する既知の過敏性
●  ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームによる事前の治療
●  最初の投与スケジュール日からさかのぼって２８日以内または５半減期以内（いずれか短い方）に、いかなる適用または疾患状態についても規制上の承認を受けていない任意の治験薬による治療を受け、全ての事前の臨床的に顕著な治療関連毒性がグレード１またはベースラインに消散している
●  ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの最初の投与スケジュールからさかのぼって１４日以内に（または、直近の療法の任意の実際の毒性からまだ回復していない）任意の標準的な化学療法または放射線照射を含めた他の新しい抗腫瘍療法を受けた
●  抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ活性を有することが知られている任意の抗がん薬物を、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの最初の投与スケジュールからさかのぼって当該薬物の５半減期期間以内（例えば、ベバシズマブは１００日、ラムシルマブは７５日）に受けた
●  最初の投与予定から６ヵ月以内における、ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶうっ血性心不全、不安定狭心症、急性心筋梗塞を含めた臨床的に顕著な心臓疾患、療法を必要とする不整脈（多形性心室頻拍を含み、期外収縮、軽微な伝導異常、またはコントロールされ良好に治療された慢性心房細動を除く）
●  研究者により、他の任意の理由から本臨床研究の参加候補者に適切ではないとみなされる患者
●  臓器移植または同種骨髄移植または末梢血液幹細胞移植を受けた患者
●  ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルリポソームの開始予定前の４週間の間に１日１０ｍｇのプレドニゾン相当を超えるコルチコステロイドを長期使用
●  ＣＹＰ３Ａの強力な阻害剤の同時使用
●  グレード２以上の末梢性神経障害を有する患者
【図１Ａ】
2019508434.tif 000019
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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