(57)【要約】  本発明の実施形態は、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるヒト非間葉系c-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)、並びに肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防におけるそれらの治療的使用に関する。本明細書において、非mhLSCを含む組成物、並びに肺の疾患又は障害を治療及び/又は予防するために非mhLSCを調製及び使用する方法が提供される。【選択図】図１
2019533703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団、並びに
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項２】
肺組織が任意の年齢の対象に由来する、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
非mhLSCの集団が、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
非mhLSCの集団が自己複製性及びクローン原性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
非mhLSCの集団がエクスビボでさらに拡大される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せのために製剤化される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を調製する方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)を含む、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、
a.対象からヒト肺組織を得るステップ、
b.ヒト肺組織由来のhLSCのプールから非mhLSCを選択するステップ、及び
c.培養培地中で前記細胞を増殖させるステップ
を含む、方法。
【請求項９】
c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を増殖させる方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)を含む、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、
a.ヒト肺組織試料由来のhLSCのプールから少なくとも1つの非mhLSCを選択するステップ、
b.前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを培養培地に導入するステップ、及び
c.培養培地中で前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを増殖させるステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、
a.それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、
b.前記肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、
c.前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、並びに
d.それを必要とする対象に前記非mhLSCの拡大された集団を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
それを必要とする対象における損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生する方法であって、
a.肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、
b.前記非mhLSCの集団を培養及び拡大するステップ、並びに
c.対象における損傷を受けた肺組織の領域に、損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生するのに有効な用量の前記非mhLSCの抽出及び拡大された集団を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
ヒト肺組織が、成体又は成体でない肺組織である、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト肺組織が、非mhLSCを選択又は抽出する前に凍結保存される、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
非mhLSCの選択又は抽出が、c-kitに対する抗体を用いて行われる、請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対するネガティブ選択をさらに含む、請求項8〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
選択がフローサイトメトリーによる、請求項8〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
選択が、ビーズにコンジュゲートされたc-kit抗体を用いる免疫磁気選択による、請求項8〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非mhLSCを凍結保存するステップをさらに含む、請求項8〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象に少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む、請求項10〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
非mhLSCの集団が、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成及び/又は生成する、請求項10〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
非mhLSCの集団を投与する前に、肺の疾患又は障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、請求項10〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
非mhLSCの集団を投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、請求項10〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
非mhLSCの集団を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防又は修復又は再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、請求項10〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
投与が、肺内投与、静脈内投与、全身投与、又はそれらの組合せである、請求項10〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、請求項10〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
非mhLSCの集団が自己由来である、請求項10〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
非mhLSCの集団が同種異系である、請求項10〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
対象における肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための組成物であって、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を含む、組成物。
【請求項３０】
肺組織が任意の年齢の対象に由来する、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
非mhLSCの集団が、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる、請求項29又は30に記載の組成物。
【請求項３２】
非mhLSCの集団が自己複製性及びクローン原性である、請求項29〜31のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
非mhLSCの集団がエクスビボでさらに拡大される、請求項29〜32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
肺内投与、静脈内投与、全身投与、又はそれらの組合せのために製剤化される、請求項29〜33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、請求項34に記載の組成物。
【請求項３６】
肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、請求項29〜35のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、請求項29〜36のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む、請求項37又は38に記載の方法。
【請求項４０】
非mhLSCの集団が、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成及び/又は生成する、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
非mhLSCの集団を投与する前に、肺障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、請求項37〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
非mhLSCの集団を投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
非mhLSCの集団を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防又は修復又は再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、請求項37〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
投与が、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せである、請求項37〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、請求項37〜45のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年11月2日に出願された米国仮特許出願第62/416,562号に対する優先権及び利益を主張する。この出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
毎年400,000人を超えるアメリカ人がある種の肺疾患で死亡しており、その数は世界的により大きい。さらに、肺疾患による死亡率は現在増加している。アメリカ肺協会によれば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、2020年までに3番目に多い死因となると予想されている。
【０００３】
肺疾患は、肺機能が損なわれている任意の疾患又は障害である。肺疾患は、とりわけ、喫煙、受動喫煙、大気汚染、職業上の危険、例えば、アスベスト及びシリカ粉塵、腫瘍増殖を誘因する発癌物質、感染性物質、並びに過剰反応性免疫防御への長期及び/又は即時の曝露によって引き起こされ得る。ある期間にわたって、基本機能のために体内のすべての細胞に十分な酸素を供給するのに適切なガス交換を支持するのに十分な健康な組織がないように、気道及び血管を含む肺組織は損傷を受けるようになる。本質的に、これらの人々はゆっくりと死に向かって窒息する。したがって、肺疾患は生命を脅かす病気又は状態であり得る。
【０００４】
以下を含む多数の種類の肺疾患がある:(A)閉塞性の肺疾患、例えば、喘息、並びに慢性気管支炎及び気腫を含むCOPD。これらはすべて人の気道に影響を及ぼし、肺の内外への空気の流れを制限又は遮断する。(B)感染症、例えば、肺炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)及び結核(TB)。細菌又はウイルスはこれらの疾患を引き起こし、肺を取り囲む膜(又は胸膜)にも影響を及ぼし得る。(C)制御されない増殖及び異常細胞の拡散によって特徴付けられる疾患である肺がん。(D)呼吸不全、肺水腫、肺塞栓症及び肺高血圧症。これらの状態は、肺における通常のガス交換及び血流の問題によって引き起こされる。並びに(E)肺線維症及びサルコイドーシス。これらは、危険な物質への曝露によって引き起こされる、肺の硬化及び瘢痕化、並びに職業的疾患、例えば、中皮腫及び石綿肺症によって特徴付けられる疾患である。
【０００５】
現在、肺疾患のすべての治療は主に緩和的であり、症状管理を通じて生活の質を維持することに重点が置かれている。肺移植は、他のすべての利用可能な治療を、改善なしに使い果たした末期肺疾患の患者のための最終手段の治療的処置である。2005年現在、米国における肺移植の最も一般的な理由は、気腫を含む慢性閉塞性肺疾患(COPD)27%、特発性肺線維症16%、嚢胞性線維症14%、特発性(以前は「原発性」として知られていた)肺高血圧症12%、アルファ1-アンチトリプシン欠乏症5%、その後失敗している以前に移植された肺の置き換え2%、並びに気管支拡張症及びサルコイドーシスなどを含む他の原因24%であった。
【０００６】
肺(lung)移植又は肺(pulmonary)移植は、患者の罹患した肺の一部又は全部をドナー由来の肺に置き換える外科的手法である。肺移植はある種の関連したリスクを有するが、末期肺患者の平均余命を延ばし、生活の質を高めることもできる。多くの場合、心臓及び肺の臓器は物理的及び機能的に複雑につながっているために、心臓移植及び肺移植を組み合わせた移植が行われ、二重移植は移植の成功を大きく増加させる。しかしながら、潜在的なドナーについてのある種の基準、例えば、ドナーの健康状態、サイズ適合、すなわち提供された肺は、患者に酸素を適切に送り込むのに十分な大きさであるが、レシピエントの胸腔内に収まるように十分に小さくなければならない、年齢、及び血液型を満たさなければならないため、移植のための二重又は単一の臓器でさえ利用可能性は非常に稀である。結果として、患者は、多くの場合、順番を待っている間に死亡する。
【０００７】
移植を受けるのに十分に幸運な者でさえ、肺移植患者の平均生存期間は、約5〜10年であり、これは、他の種類の臓器移植と比較して相対的に低く、肺移植ではそれぞれ53.4%及び28.4%、心肺移植ではそれぞれ46.5%及び28.3%であった(データは、2008 OPTN/SRTR Annual Report、US Scientific Registry of Transplant Recipientsからの引用)。
【０００８】
時として、肺移植は選択肢にならない。肺疾患を有するすべての患者が肺移植のための良い候補になるわけではない。時として、患者の呼吸器の状態の重症度にもかかわらず、ある種の既存の状態により、人が肺移植のための候補には不十分な場合がある。これらの状態には、併発慢性病(例えば、鬱血性心不全、腎臓疾患、肝臓疾患);HIV及び肝炎を含む現在の感染、現在又は最近のがん、アルコール、タバコ、又は違法薬物の現在の使用;年齢;許容される体重範囲内(顕著な栄養不良又は肥満はどちらも死亡率の増加に関連する);精神状態;医学的指示の不順守の経歴;並びに以前の複数の失敗した肺移植が含まれる。
【０００９】
肺移植を受けた患者にはさらに、臓器拒絶反応、移植後のリンパ増殖性障害、免疫抑制剤によるリンパ腫の形態、並びに胃腸炎、並びに胃及び食道の潰瘍形成を含む、移植に関連した他の合併症があり得る。
【００１０】
これらの患者の生存を維持するための緩和ケアを補完する他の解決策は、例えば、順番を待っている患者、特に肺移植に適格でない患者に望ましい。
【００１１】
ヒト幹細胞、並びにそれらを調製及び使用する方法は、WO2012/047951に開示されており、これはすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。患者に肺移植の順番を待たせない解決策もまた望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2012/047951
【発明の概要】
【００１３】
本発明の実施形態は、ヒト幹細胞並びにそれらを調製及び使用する方法に関する。
【００１４】
本発明の実施形態は、1つの細胞クラス、間葉系エピトープCD44、CD73及びCD105に対して陰性である非間葉系hLSC(非mhLSC)、並びに別の細胞クラス、これらのエピトープを発現し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞及び線維芽細胞に分化する間葉様hLSC(ml-hLSC)から構成されるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールの発見に基づく。両方の細胞型は、組織特異的な成体幹細胞の特性、すなわち自己複製及びクローン形成能を有する。
【００１５】
本発明の実施形態は、ドナー肺の不足の問題、及び肺疾患を有するか又は将来的に肺疾患を発症するリスクがある対象の肺移植への不適格性の問題に対する解決策を提供する。具体的には、肺の修復及び再生を促進し、第1の場合にはドナー肺が利用可能になるまで又は第2の場合には許容される生活の質でできるだけ長い間、対象の寿命を延ばすために、欠陥のある及び/又は損傷を受けた肺に非mhLSCを埋め込むことによって問題を解決する。
【００１６】
したがって、一態様では、本発明は、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せのために製剤化される。別の実施形態では、肺内投与は、気管内投与又は鼻腔内投与である。さらなる実施形態では、非mhLSCの集団はエクスビボでさらに拡大される。
【００１７】
別の態様では、本発明は、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である単離された肺幹細胞(非mhLSC)の集団を調製する方法であって、非mhLSCが、非mhLSC並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(mL-hLSC)からなるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、ヒト肺組織を対象から得るステップ、ヒト肺組織由来のhLSCのプールから非mhLSCを選択するステップ、及び培養培地中で前記細胞を増殖させるステップを含む、方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である単離された肺幹細胞(非mhLSC)の集団を増殖させる方法であって、非mhLSCが、非mhLSC並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)からなるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、ヒト肺組織試料由来のhLSCのプールから少なくとも1つの非mhLSCを選択するステップ、前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを培養培地に導入するステップ、及び前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを培養培地中で増殖させるステップを含む、方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生する方法であって、肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、非mhLSCの集団を培養及び拡大するステップ、及び対象における損傷を受けた肺組織の領域に、損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生するのに有効な用量の前記非mhLSCの抽出及び拡大された集団を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、前記肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、及びそれを必要とする対象に前記非mhLSCの拡大された集団を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、対象における肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための組成物であって、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を含む、組成物を提供する。一実施形態では、単離された非mhLSCの富化集団はまた、肺始原細胞及び肺前駆細胞を含む。一実施形態では、組成物は、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せのために製剤化される。別の実施形態では、肺内投与は、気管内投与又は鼻腔内投与である。さらなる実施形態では、単離された非mhLSCの富化集団は、エクスビボでさらに拡大される。
【００２２】
治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCの集団は、治療又は予防を必要とする対象に由来する。一実施形態では、非mhLSCの集団は自己由来である。
【００２３】
治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCの集団は1人の対象に由来し、別の対象に投与される。これは、非mhLSCのドナーが非mhLSCのレシピエントと同じ人ではないことを意味する。ドナー及びレシピエントはそのような移植について抗原が適合している必要があり、適合の基準及び方法は当該技術分野において周知であると理解される。ドナーの非mhLSCは理想的には同種異系であり、HLA型はレシピエントに適合している必要がある。
【００２４】
したがって、一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、第1の対象から肺組織試料を得るステップ、肺組織試料からc-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、非mhLSCの集団を拡大するステップ、並びに非mhLSCの集団を第2の対象に投与して、非mhLSCが肺に滞留し、第2の対象の肺において肺の細胞及び組織を修復、再構成及び/又は生成するステップを含む、方法を提供する。この治療方法の一実施形態では、第2の対象は、第1の対象、非mhLSCのドナーと適合する少なくとも1つのHLA型である。
【００２５】
記載された治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である、投与される肺幹細胞(非mhLSC)の集団は、対象の肺における肺上皮、肺血管系/肺内皮及び肺胞を修復、再構成又は生成する。
【００２６】
記載された治療又は予防方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である、投与される肺幹細胞(非mhLSC)の集団は、対象の肺の構造的及び機能的完全性を回復させる。
【００２７】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺組織はヒト由来である。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、ヒト肺組織は成体肺組織である。
【００２８】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺組織試料は、非mhLSCの選択の前に凍結保存される。凍結保存はまた、培養培地中での拡大前に肺組織試料由来の単離された非mhLSCについて、及び拡大された非mhLSCについて行うことができる。
【００２９】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCの選択は、c-kitに対する抗体を用いて行われる。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、非mhLSCの選択は、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対するネガティブ選択をさらに含む。
【００３０】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCの集団は、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる。さらなる実施形態では、非mhLSCの集団は自己複製性及びクローン原性である。
【００３１】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kit陽性細胞の選択はフローサイトメトリーによる。
【００３２】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、非mhLSCの選択は、ビーズにコンジュゲートされたc-kit抗体を用いる免疫磁気選択による。
【００３３】
本明細書に記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞の集団を凍結保存することができる。
【００３４】
本明細書に記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺の疾患又は障害は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である。
【００３５】
記載された治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、治療方法は、少なくとも1つの治療剤、例えば、肺高血圧症を減少させるものを投与することをさらに含む。
【００３６】
記載された治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、治療方法は、非mhLSCが富化された集団を投与する前に、肺障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む。
【００３７】
記載された治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、治療方法は、非mhLSCを投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性を回復させることを必要とする対象を選択するステップをさらに含む。
【００３８】
記載された治療又は予防方法のすべての態様のうちの一実施形態では、治療方法は、非mhLSCを投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防又は修復又は再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む。対象、例えば、喫煙者及び/又はアスベストに曝露された対象は、様々な肺疾患を発症するリスクが高く、肺疾患の発症を予防し、また、疾患が開始すると、疾患の進行を予防する方法に対する候補者となり得る。
【００３９】
本明細書に記載された治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、投与は、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せである。
【００４０】
本明細書に記載された治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺内投与は、気管内投与又は鼻腔内投与のいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1は、肺試料を示す図である。対照肺(左上)及びIPF/PPF肺(左下)の標本を酵素消化して単一細胞懸濁液を得た。中密度細胞はヒト肺幹細胞を含有する。
【図２】図2Aは、ヒト肺幹細胞(hLSC)クラスを示す図である。ドットプロットは、hLSCの区画が、エピトープCD44/CD73/CD105を発現しない非間葉系c-kit陽性細胞(非mhLSC) の集団、及びCD44/CD73/CD105を発現するc-kit陽性細胞のカテゴリー、すなわち間葉様hLSC(ml-hLSC)を含有することを示す。これら2つの細胞集団は、対照、IPF/PPF及びCOPD肺に存在する。図2Bは、非mhLSC及びml-hLSCクローンを示す図である。対照及びIPF/PPF非mhLSC由来のクローンは、幹細胞形成コロニーの典型的な特色を提示する。右側の3番目及び4番目のクローンに示されるように、それらはコンパクトな丸い輪郭、及び時折だけ不規則な形状を有する。しかしながら、ml-hLSCは、屈折縁を有する非円形の不規則な形状のクローンのみを生成する。図2Cは、非mhLSC及びml-hLSCクローンの免疫組織化学を示す図である。環状クローンは、c-kitに対して強く陽性であり、核対細胞質比が高く、CD44/CD73/CD105に対して陰性である未分化細胞から構成される(左パネル)。非環状クローンは、c-kitについて弱く標識され、核対細胞質比が低く、CD44/CD73/CD105に対して陽性である細胞によって特徴付けられる(中央及び右パネル)。図2Dは、対照、IPF/PPF及びCOPD肺における非mhLSC及びml-hLSCの割合を示すグラフである。データは平均±SDである。
【図３】図3は、浸潤アッセイを示す図である。マトリゲルコーティングしたトランスウェルチャンバー(図3の上部のスキームを参照されたい)を用いて、細胞浸潤アッセイを行い、ウシ胎児血清(FBS)に曝露された対照及びIPF/PPF非mhLSC及びml-hLSCを分化する浸潤能力を決定した。IPF/PPF ml-hLSCは、基底膜マトリゲルに非常に高い率で浸潤した。移動したml-hLSCは筋線維芽細胞表現型を獲得し、α-平滑筋アクチン(α-SMA;右パネル、赤)とプロコラーゲン(図示せず)の両方について陽性であった。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の実施形態は、1つの細胞クラス、すなわち間葉系エピトープCD44、CD73及びCD105に対して陰性である非間葉系hLSC(非mhLSC)、並びに別の細胞クラス、エピトープCD44、CD73及びCD105を発現する間葉様hLSC(ml-hLSC)から構成されるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールの発見に基づく。両方の細胞型は、組織特異的成体幹細胞の特性、すなわち自己複製及びクローン形成能を有する。
【００４３】
関連性として、クローン性非mhLSCは、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞に分化するが、クローン性ml-hLSCは、上皮及び血管細胞系列を獲得しない。クローン性ml-hLSCは、代わりに、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞及び線維芽細胞に分化する。重要なことに、機能的な非mhLSCのサブセットが罹患した肺に存在し、これらの細胞を回収し、インビトロで繁殖させることができる。一実施形態では、非mhLSCを使用する自己由来細胞治療は、肺疾患、例えば、特発性肺線維症/進行性肺線維症(IPF/PPF)及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)の壊滅的な結果を逆転させるために実施され得る。
【００４４】
周知であるように、幹細胞はその特性上、体のすべての細胞及び組織を生じさせる。したがって、幹細胞を用いて、損傷を受けた及び/又は欠陥のある肺の修復し、又は修復をスピードアップすることができる。十分な量の成体肺幹細胞(LSC)を得ることができる場合、この量の成体(LSC)を使用して、肺に新しい組織を構築することによって損傷を受けた及び/又は欠陥のある肺を修復することができる。欠陥のある及び/又は損傷を受けた肺では、LSCがほとんどないか又は全くない場合がある。成体LSCは自己複製するため、埋め込まれた成体LSCは、欠陥のある及び/又は損傷を受けた肺でコロニー形成し、ニッチを定植させる。クローン性、自己複製性であり、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができることによって、埋め込まれた非mhLSCはまた分裂及び分化して、すべての新しい肺細胞及び組織を産生する。したがって、単離された非mhLSCの集団、又は単離された非mhLSCの集団を含む組成物は、対象における肺疾患の治療又は予防に使用することができる。
【００４５】
したがって、ドナー肺が利用可能になる前、又は肺移植の不適格性のために肺疾患を有する対象が時期尚早に死亡するという問題は、デノボでの肺修復及び再生を促進するために、非mhLSCを対象の欠陥のある及び/又は損傷を受けた肺に埋め込むことによって解決される。デノボでの肺の修復及び再生は、第1の場合、ドナー肺が利用可能になるまで対象の寿命を延ばすことができ、又は第2の場合、許容できる生活の質でできるだけ長い間、対象の生命を維持することができる。
【００４６】
したがって、一実施形態では、本発明は、ヒト肺組織試料由来の単離された、非mhLSCと呼ばれる、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞の富化集団を提供する。別の実施形態では、単離された細胞の集団は、主としてLSC(≧70%)を含むc-kit陽性肺細胞が実質的に富化されている。
【００４７】
一実施形態では、非mhLSCが実質的に富化された、単離された細胞の集団はまた、非常に少数の肺始原細胞及び肺前駆細胞を含む。
【００４８】
一実施形態では、本明細書において、ヒト肺組織試料から単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性(非mhLSC)であるc-kit陽性肺幹細胞の富化集団、並びに薬学的に許与される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せのために製剤化される。別の実施形態では、肺内投与は、気管内投与又は鼻腔内投与である。さらなる実施形態では、非mhLSCの集団はエクスビボでさらに拡大される。
【００４９】
一実施形態では、本明細書において、対象における肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための組成物であって、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を含む、組成物が提供される。一実施形態では、単離された非mhLSCの富化集団はまた、肺始原細胞及び肺前駆細胞を含む。一実施形態では、組成物は、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せのために製剤化される。別の実施形態では、肺内投与は、気管内投与又は鼻腔内投与である。さらなる実施形態では、単離された非mhLSCの富化集団は、エクスビボでさらに拡大される。この組成物の別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である単離された肺幹細胞(非mhLSC)の集団を調製する方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)からなるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、対象からヒト肺組織を得るステップ、ヒト肺組織由来のhLSCのプールから非mhLSCを選択するステップ、及び培養培地中で前記細胞を増殖させるステップを含む、方法を提供する。別の実施形態では、非mhLSCの数は、選択された初期量に対して少なくとも2倍、好ましくは2倍を超えて増加する。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を得る方法であって、対象から得られた肺組織の標本を凍結保存するステップ、凍結保存された標本を後日解凍するステップ、肺組織の標本から少なくとも1つのc-kit陽性非mhLSCを選択するステップ、及び培養培地中で選択された非mhLSCを増殖させるステップを含み、これにより、非mhLSCの数が、選択された初期量に対して少なくとも2倍になり、好ましくは2倍を超える、方法を提供する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である単離された肺幹細胞(非mhLSC)の集団を増殖させる方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)からなるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、ヒト肺組織試料由来のhLSCのプールから少なくとも1つの非mhLSCを選択するステップ、前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを培養培地に導入するステップ、及び培養培地中で前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを増殖させるステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、非mhLSCの数は、選択された初期量に対して少なくとも2倍、好ましくは2倍を超えて増加する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、肺組織由来の単離されたこの非mhLSCの集団を使用する方法、又は肺組織由来の単離された非mhLSCの富化集団を含む医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、単離された非mhLSCの集団は、肺の疾患及び障害の修復、再生及び/又は治療に使用することができる。
【００５４】
本開示の発明者らは、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールに存在するCD44/CD73/CD105に対して陰性である非間葉系ヒト肺幹細胞(非mhLSC)が、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞に分化することができることを見出した。c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールに見出される他のクラスの細胞は、CD44/CD73/CD105に対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)からなる。CD73に対して陰性である非mhLSCは、肺特異的細胞型、すなわち、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞を形成するより高い能力を有し、罹患した肺においてさらなる損傷を生じさせ得る細胞の生成を予防し得る。これに関して、1型及び2型の肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞は、臓器のガス交換単位を形成する。非mhLSCクローンとは異なり、クローン性ml-hLSCは、上皮及び血管細胞系列を獲得しない。クローン性ml-hLSCは、代わりに、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞及び線維芽細胞に分化する。特に、ヒトにおける慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び特発性又は後天性肺線維症(PF)は、線維芽細胞の蓄積及び組織線維症によって特徴付けられる。対照及び罹患した肺組織に由来する非mhLSCクローンは、幹細胞形成コロニーの特色を提示したが、対照及び罹患した肺組織に由来するml-hLSCクローンは、c-kitについて弱く標識され、核対細胞質比が低く、及びCD44/CD73/CD105に対して陽性である細胞によって特徴付けられた非環状クローンを形成する。重要なことに、非mhLSC及びml-hLSCの割合は、対照と罹患した肺との間で大幅に変化し、対照の健康な肺組織と比較して、罹患した肺組織ではml-hLSCの量が増加し、非mhLSCの量が減少する。さらに、罹患した肺由来のml-hLSCは、多数の線維芽細胞/筋線維芽細胞を生成し、マトリゲルに高速で湿潤し、筋線維芽細胞表現型を獲得する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、肺の疾患又は障害、例えば、COPD、IPF又はPPFにおいて、ml-hLSCはそれらを肺病理学の候補にする特徴を有することを示す。COPDでは、ml-hLSCの増加及び非mhLSCの減少は、COPD肺がガス交換単位を形成する能力を弱める場合があり、これは、肺胞の拡張、肺胞壁の破壊及び呼吸不全に至る場合がある。対照的に、CD44/CD73/CD105に対して陰性である非mhLSCの環状クローンは、c-kitに対して強く陽性である未分化細胞から構成され、高い核対細胞質比を有し、対照の健康な肺組織中により多量に存在する。したがって、肺組織由来の単離された非mhLSCの集団は、治療目的のために、影響を受けた/損傷を受けた肺に移植又は埋め込むことができる。非mhLSCは、損傷肺における肺上皮及び肺血管、例えば、上皮細胞、血管細胞、肺胞細胞、分泌細胞などを回復させる及び再構成するために、肺に滞留し、増殖し、肺に通常見出される様々な種類の組織に分化することができる。目的は、影響を受けた肺の疾患により損傷を受けた肺組織の一部を置き換えることである。置換の肺組織は、影響を受けた対象における既存の又は残存する肺組織を補完するのに役立ち、そのため、全体としてその対象における生命を維持するのに適切なガス交換に十分な組織がある。
【００５５】
成体幹細胞移植は、傷害を受けた組織及び臓器の修復を促すための新しい選択肢として出現している。過去10年間で、動物及びヒトにおける一部の研究は、成体骨髄由来幹細胞、すなわち、造血幹細胞が、脳、骨格筋、軟骨細胞、肝臓、内皮、及び心臓を含む非造血細胞型の拡大するレパートリーに分化する能力を記述している。しかしながら、肺及び関連する呼吸構造は、このような治療法に対して比較的耐性がある状態のままである。しかしながら、間葉系幹細胞を肺の幹細胞治療に使用できること、及び造血幹細胞を肺移植の間葉系幹細胞と同時投与できることを示す報告がある。例えば、胎児肺CD34+細胞から非造血細胞として単離された間葉系細胞の同時移植は、造血幹細胞の生着を増強することが記載されている(Noortら、Exp Hematol 2002年; 30巻:870〜78頁)。
【００５６】
他のいくつかの報告はまた、動物モデルの肺治療における骨髄集団由来の間葉系幹細胞及び非造血幹細胞の使用を記載している(Krause DSら、Cell 2001年、105巻:369〜377頁; Kotton DNら、Development 2001年、128巻:5181〜5188頁; Ortiz LAら、Proc Natl Acad Sci USA 2003年、100巻:8407〜8411頁; Theise NDら、Exp Hematol 2002年、30巻:1333〜1338頁; Abe Sら、Cytotherapy 2003年、5巻:523〜533頁; Aliotta JMら、Exp Hematol 2006年、34巻:230〜241頁; Rojas Mら、Am J Respir Cell Mol Biol 2005年、33巻:145〜152頁; Gupta Nら、J Immunol 2007年;179巻:1855〜1863頁;米国特許出願公開第2009/0274665号)。
【００５７】
ある種の骨髄由来幹細胞、すなわち間葉系幹細胞が肺組織を生じさせる能力を支持する証拠が存在するが、他の報告では、骨髄細胞による肺組織の顕著な再生を検出することができなかった(Kotton DNら、Am J Respir Cell Mol Biol 2005年;33巻:328〜334頁; Wagers AJら、Science 2002年、297巻:2256〜2259頁; Chang JCら、Am J Respir Cell Mol Biol 2005年、33巻:335〜342頁)。さらに、他の報告は、鼻腔内経路で投与された骨髄由来の造血幹細胞が肺胞マクロファージをもたらすこと、及びこの集団が呼吸器上皮細胞に分化転換しないことを記載している(Fritzell JAら、Am J Respir Cell Mol Biol 2009年、40巻:575〜587頁)。
【００５８】
肺における正当な幹細胞の存在、及び肺治療のためのこれらの肺幹細胞(LSC)の使用は、WO2012/047951に開示されている。本発明の利点は、自己由来又は同種異系の肺治療にも使用できるLSCのサブセットがあることである。自己由来細胞の使用は、治療の成功率を大いに増加させる。患者の肺の一部は、例えば生検中に外科的に除去される。1立方センチメートルという小さなもので十分である。組織片は、結合組織から単一細胞を放出するように処理される。幹細胞の指標として幹細胞マーカーであるc-kitを用いて、c-kit陽性細胞を選択する。これらのc-kit陽性LSCは、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーについてさらにネガティブに選択することができる。次に、非mhLSCをインビトロで拡大させて、治療に必要な十分な数の細胞を得る。十分な細胞がある場合、細胞を回収し、同じ患者、又は非mhLSCのドナーに関して遺伝的に適合した患者に注射して戻す。各移行ステップで、例えば、選択及び拡大との間に、又は拡大と埋め込みとの間に、非mhLSCを任意選択で凍結保存することができる。一実施形態では、患者は、インビトロで選択及び拡大された患者自身の非mhLSCを取り戻す。別の実施形態では、患者は、遺伝的に適合したドナーに由来する非mhLSCを得る。一部の実施形態では、この方法はまた、肺を有する任意の哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サルなどに広げることもできる。
【００５９】
したがって、本発明は、それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、前記肺組織からc-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、及びそれを必要とする対象に前記非mhLSCの拡大された集団を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６０】
一実施形態では、それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療及び/又は予防する方法であって、c-kitに対して陽性であり、本明細書に記載される間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞の集団を含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書に提供される。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、前記肺組織からc-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、並びにそれを必要とする対象の肺において肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞の修復、再構成又は生成のために、前記非mhLSCの拡大された集団を、それを必要する対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、第1の対象から肺組織を得るステップ、前記肺組織からc-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、並びに前記非mhLSCの拡大された集団を第2の対象に投与して、非mhLSCが肺に滞留し、第2の対象の肺において肺の細胞及び組織を修復、再構成及び/又は生成するステップを含む、方法を提供する。この治療方法の一実施形態では、第2の対象は、第1の対象、非mhLSCのドナーと適合する少なくとも1つのHLA型である。
【００６３】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、単離された細胞集団を主として構成する非mhLSCは、自己複製能及びクローン形成能を有する。これは、単一の単離された非mhLSCが分裂してより多くの非mhLSCを生じさせ、培養物中にコロニーを形成し得ることを意味する。ある種の条件下で刺激した場合、非mhLSCは決定的(すなわち、分化する具体的な細胞系列の選択)になり、さらに肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる。これらの細胞及びその子孫は、決定及び分化により、上皮及び血管細胞系列に特徴的な特定の細胞マーカーを発現する。さらに、決定細胞及びその子孫は、c-kitの発現を喪失する。
【００６４】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺組織はヒト由来である。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、ヒトは成人である。
【００６５】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺組織は、非mhLSCを選択する前に凍結保存される。
【００６６】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCの選択は、c-kitに対する抗体を用いて行われる。
【００６７】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kitに対する抗体はモノクローナル抗体である。
【００６８】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kitに対するモノクローナル抗体は、ヒトc-kitの抗原性エピトープに対するマウスモノクローナルIgGである。
【００６９】
記載された方法のいずれかの一実施形態では、c-kitに対する抗体は、蛍光色素がコンジュゲートされている。
【００７０】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kitに対する抗体は、磁性粒子にコンジュゲートされている。
【００７１】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、方法は、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対するネガティブ選択をさらに含む。
【００７２】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、c-kit陽性細胞の選択及び/又は様々な系列マーカー陰性細胞の選択は、フローサイトメトリーによる。
【００７３】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、選択は、蛍光活性化細胞選別又は高勾配磁気選択による。
【００７４】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCはエクスビボでさらに拡大される。記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCはインビトロでさらに拡大される。目標は、埋め込まれた非mhLSCを、損傷を受けた肺のニッチにうまく生着させることを確実にするために、埋め込み用に十分な大量の非mhLSCを有することである。基本的に、肺の損傷部分を修復及び/又は置換するのに必要なすべての細胞を提供するために、損傷を受けた肺で増殖させる及び増やすのに十分な細胞がなければならない。
【００７５】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCは、拡大又は増殖ステップの後に数が少なくとも2倍である。記載された方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSCの数は、拡大又は増殖により、増殖段階の終わりで、少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍又はそれを超えて増加することが望ましい。培養物中の細胞の数は、当該技術分野において公知である任意の方法によって、例えば、コールターカウンターを使用することによって決定することができる。これらの方法は、当業者に周知である。
【００７６】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、選択された非mhLSCは、拡大前に保存のために凍結保存される。
【００７７】
記載された方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、拡大された非MHLSCは、保存目的で凍結保存される。必要に応じて、凍結細胞を解凍し、次に、それを必要とする対象への埋め込みに使用する。
【００７８】
記載された方法のすべての態様のうちの一実施形態では、方法は、単離された非mhLSCの集団を凍結保存するステップをさらに含む。
【００７９】
肺疾患であると新たに診断された人について、対象の肺の生検試料が診断のために得られた場合、非mhLSCの集団は本明細書に記載される方法に従って調製され得、次に、非mhLSCは、疾患が進行期に進行して、そのため、人が肺移植を必要とした事象における将来の使用のために凍結保存され得る。
【００８０】
同様に、肺疾患を発症するリスクがある人々は、自分の肺組織から非mhLSCの集団を早期に調製し、非mhLSCを凍結保存することから利益を得ることができる。例えば、ヘビースモーカー及び以前にアスベストに曝露したことのある人は利益を得るだろう。これは、喫煙関連の状態又はアスベスト関連の状態の症状が現れるまでに10〜40年又はそれよりも長くかかる場合があり得るからである。肺の疾患又は損傷を発症するリスクがある他の種類の人々には、限定されないが、嚢胞性線維症遺伝子を有する、又は嚢胞性線維症であると診断された乳児、及び交戦地帯に配置された現役軍人が含まれる。
【００８１】
治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、治療すること及び治療は、それを必要とする対象における損傷を受けた肺に対する「構造的及び機能的な完全性の回復」を含む。
【００８２】
記載された方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、治療することは、損傷を受けた又は不適切なヒト肺を修復することを含む。別の実施形態では、治療すること及び治療は、損傷を受けた肺における肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞の修復、再構成又は生成を含む。
【００８３】
回復させること又は修復することは、健康な人の肺のそれに対して100%までである必要はない。対象の症状に改善がある限り、回復させること又は修復することは達成されている。熟練した医師は、治療の前後に症状の重症度を評価し、比較に基づいて改善があるかどうかを判断することができる。多くの場合、対象は、症状に改善があるかどうか述べることができる。一部の症状の例には、限定されないが、息切れ、喘鳴、又は嗄声、持続性の咳、胸部の痛み若しくは締め付け、及び肺内の液体貯留の存在が挙げられる。
【００８４】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、予防すること及び予防は、疾患、例えばCOPD、IPF、又はPPFによる肺の機能の能力及び完全性の低下を遅らせることを含む。
【００８５】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCの集団は、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成又は生成する。
【００８６】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、単離された非mhLSCの集団はさらに、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して実質的に陰性である。
【００８７】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺の疾患又は障害を治療及び/又は予防する方法は、少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む。このような治療剤は、理想的には肺疾患の治療に使用されるものであり、これらは一般的に熟練した医師に公知の、例えば、肺高血圧症又はCOPDの治療である。
【００８８】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺の疾患又は障害を治療及び/又は予防する方法は、非mhLSCの集団を投与する前に、肺の疾患又は障害に罹患している対象、例えば、COPD又は中皮腫に罹患している対象を選択するステップをさらに含む。
【００８９】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺の疾患又は障害を治療及び/又は予防する方法は、非mhLSCを投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象、例えば、サルコイドーシスに罹患している対象を選択するステップをさらに含む。
【００９０】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺疾患を治療及び/又は予防する方法は、細胞を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防又は修復又は再構成又は生成を必要とする対象、例えば、肺線維症に罹患している対象を選択するステップをさらに含む。
【００９１】
例えば、選択された対象は、伝統的な治療に対して全く若しくは十分に応答しなかった対象、及び/又は特定の形態若しくは型の肺疾患について当該技術分野において現在公知であるすべての治療選択肢を使い果たした対象である。選択される対象の他の例は、任意の肺移植に適さないと考えられるか、又は適切なドナーを見出せずに長期間、移植の順番を待っている(生きたドナーもいない)、重体であるものである。
【００９２】
肺疾患を治療又は予防するための治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、投与は、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せである。
【００９３】
肺疾患を治療又は予防するための治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、肺内投与は気管内投与又は鼻腔内投与である。
【００９４】
肺疾患を治療又は予防するための治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、対象は挿管対象である。
【００９５】
肺疾患を治療又は予防するための治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCは自己由来細胞である。
【００９６】
肺疾患を治療又は予防するための治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCは、1人以上のドナーから得られた同種異系細胞である。
【００９７】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCは、細胞のレシピエント対象に適合したヒト白血球抗原(HLA)型である。一実施形態では、非mhLSCは、単一のドナーから単離及び拡大され、始原細胞は、HLAクラスI:HLA-A及びHLA-B;並びにHLAクラスII:DRB1の6つの対立遺伝子のうち少なくとも4つについてレシピエントと適合する。別の実施形態では、非mhLSCは、異なるドナーから単離及び拡大され、始原細胞は、HLAクラスI:HLA-A及びHLA-B;並びにHLAクラスII:DRB1の6つの対立遺伝子のうち少なくとも4つについてレシピエント対象と適合したHLA型である。HLAタイピングの方法は、当該技術分野において公知で、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bodmer, W.、1973年、Manual of Tissue Typing Techniques、Ray, J. Gら編、DHEW Publication No. (NIH) 74〜545, 24〜27頁である。
【００９８】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、方法は、少なくとも1つの治療剤を、非mhLSC、例えば、嚢胞性線維症、COPD、肺線維症及びサルコイドーシスを治療するためのものとともにさらに投与することをさらに含む。
【００９９】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、少なくとも1つの治療剤は、非mhLSCの集団のホーミング、生着、又は生存期間を増強する。
【０１００】
治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は成人である。一実施形態では、非mhLSCの集団はヒト非mhLSCの集団である。
【０１０１】
肺の疾患及び障害の診断及び予後における非mhLSC及びml-hLSC
c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールは、CD44/CD73/CD105に対して陰性である非間葉系ヒト肺幹細胞(非mhLSC)、及びCD44/CD73/CD105に対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)を含む。CD73に対して陰性である非mhLSCは、肺特異的細胞型、すなわち、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞を形成するより高い能力を有し、罹患した肺においてさらなる損傷を生じさせる細胞の生成を予防し得る。これに関して、1型及び2型の肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞は、臓器のガス交換単位を形成する。非mhLSCクローンとは異なり、クローン性ml-hLSCは、上皮及び血管細胞系列を獲得しない。クローン性ml-hLSCは、代わりに、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞及び線維芽細胞に分化する。特に、ヒトにおける慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び特発性又は後天性肺線維症(PF)は、線維芽細胞の蓄積及び組織線維症によって特徴付けられる。重要なことに、非mhLSC及びml-hLSCの割合は、対照と罹患した肺との間で大幅に変化し、対照の健康な肺組織と比較して、罹患した肺組織ではml-hLSCの量が増加し、非mhLSCの量が減少する。さらに、罹患した肺由来のml-hLSCは、多数の線維芽細胞/筋線維芽細胞を生成し、マトリゲルに高速で湿潤し、筋線維芽細胞表現型を獲得する。したがって、ml-hLSCは、それらを肺病理学の候補にし得る特徴を有する。COPDでは、ml-hLSCの増加及び非mhLSCの減少は、COPD肺がガス交換単位を形成する能力を弱める場合があり、これは、肺胞の拡張、肺胞壁の破壊及び呼吸不全に至る場合がある。
【０１０２】
COPDは、米国において3番目に多い死因である。COPDは、その初期段階では診断されていないことが多く、新規の診断ツール及び新しい治療戦略の必要性が強調される。ヒトにおけるCOPD及びPFは、ml-hLSCの増加及び非mhLSCの減少によって特徴付けられる。ml-hLSC及び非mhLSCの割合の変化は、そのプロセスの初期で起こり得、病理学的状態の早期検出を提供する。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の別の利点は、個体における肺の疾患又は障害を診断、予後予測、監視、及び/又は評価するための、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びmL-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せの使用である。
【０１０４】
一実施形態では、本開示は、健康な個体と比較して、影響を受けた個体に広く認められる肺の疾患又は障害を評価する方法であって、(a)影響を受けた個体由来の1つ以上の肺組織試料から非mhLSC及びml-hLSCを単離するステップ、(b)前記影響を受けた個体から得られた肺組織試料中の非mhLSC及びml-hLSCの量を測定するステップ、並びに(c)非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せを、参照が1人以上の健康な個体である参照値又は参照値の範囲と比較するステップを含み、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せの変化が、影響を受けた個体に広く認められる肺の疾患又は障害を示す、方法を提供する。
【０１０５】
一実施形態では、本開示は、個体における肺の疾患又は障害を治療するための治療的介入の治療的有効性を評価する方法であって、(a)初期の時点で、個体から少なくとも1つの初期の肺組織試料を得るステップであって、初期の時点が治療的介入の投与前である、ステップ、(b)後続の時点で個体から少なくとも1つの後続の肺組織試料を得るステップであって、後続の時点が治療的介入の投与後である、ステップ、(c)前記時点のそれぞれで、少なくとも1つの肺組織試料から非mhLSC及びml-hLSCを単離するステップ、(d)初期及び後続の肺組織試料中の非mhLSC及びml-hLSCの量を測定するステップ、並びに(e)少なくとも1つの初期の肺組織試料における、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せを、少なくとも1つの後続の肺組織試料における、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せと比較するステップを含み、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せの変化が、個体における肺の疾患又は障害の治療として、治療的介入の有効性を示す、方法を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、本開示は、個体における肺の疾患又は障害の診断を確認又は否定する方法であって、(a)個体由来の1つ以上の肺組織試料から非mhLSC及びml-hLSCを単離するステップ、(b)前記個体から得られた肺組織試料中の非mhLSC及びml-hLSCの量を測定するステップ、並びに(c)非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せを参照値又は参照値の範囲と比較するステップを含み、前記個体における肺の疾患又は障害の診断が、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せにおける変化に基づいて確認又は否定される、方法を提供する。
【０１０７】
一実施形態では、本開示は、それを必要とする個体における肺の疾患又は障害の治療を監視する方法であって、(a)初期の時点で個体から少なくとも1つの初期の肺組織試料を得るステップであって、初期の時点が、肺の疾患又は障害に対する治療的介入プロトコールの開始前である、ステップ、(b)後続の時点で個体から少なくとも1つの後続の肺組織試料を得るステップであって、後続の時点が、治療的介入プロトコールの開始後である、ステップ、(c)前記時点のそれぞれで、少なくとも1つの肺組織試料から非mhLSC及びml-hLSCを単離するステップ、(d)初期及び後続の肺組織試料中の非mhLSC及びml-hLSCの量を測定するステップ、並びに(e)少なくとも1つの初期の肺組織試料における、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せを、少なくとも1つの後続の肺組織試料における、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せと比較するステップを含み、非mhLSCの量、ml-hLSCの量、非mhLSC及びml-hLSCの量、非mhLSCとmL-hLSCとの割合、又はそれらの組合せの変化が、治療的介入プロトコールの有効性を示す、方法を提供する。
【０１０８】
一部の実施形態では、肺の疾患又は障害は、COPD、IPF、又はPPFである。一部の実施形態では、非mhLSCの量は、肺の疾患又は障害を有する個体において減少する。別の実施形態では、ml-hLSCの量は、肺の疾患又は障害を有する個体において増加する。
【０１０９】
肺幹細胞(LSC)
幹細胞は、有糸分裂細胞分裂を通じてそれら自体の種類を再生する能力を保持している細胞であり、それらの娘細胞は、多様な範囲の特殊化された細胞型に分化することができる。2つの広範な型の哺乳動物幹細胞は、胚盤胞に見出される胚性幹(ES)細胞、及び成体組織に見出される成体幹細胞である。発生中の胚において、ESは、すべての特殊化された胚組織に分化することができる。成体生物において、成体幹細胞及び始原細胞は、体の修復システムとして働き、特殊化された細胞を補充するが、また、再生臓器、例えば、血液、皮膚又は腸組織の正常な代謝回転を維持する。多能性幹細胞は、3つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、増殖することができ、分化した、又は前駆細胞として公知である分化可能な娘細胞を次に生じさせ得る多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの始原細胞を生じさせることができる未分化細胞を指す。娘細胞自体は、増殖するように誘発し、1つ以上の成熟細胞型にその後分化する子孫を産生する一方で、親の発生能を有する1つ以上の細胞を保持することもできる。
【０１１１】
一部の実施形態では、「幹細胞」という用語は、特定の状況下で、より特殊化された又は分化した表現型に分化する能力又は可能性を有し、さらに、ある種の状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持する、前駆体のサブセットも指す。
【０１１２】
本明細書に記載されるLSCは、ESとは対照的に体性幹細胞である。好ましい実施形態では、記載されたLSCは成体幹細胞である。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書で使用されるとき、「c-kit陽性肺幹細胞」又は「c-kit陽性LSC」という用語は、幹細胞、始原細胞及び前駆細胞を包含し、それらはすべてc-kit陽性である。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書で使用されるとき、「c-kit陽性肺幹細胞」又は「c-kit陽性LSC」という用語は、c-kit陽性/KDR陽性細胞及びc-kit陽性/KDR陰性細胞を包含する。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書で使用されるとき、「非mhLSC」又は「非間葉系ヒト肺幹細胞」という用語は、c-kit陽性が強く、CD44/CD73/CD105陰性である肺幹細胞を包含する。非mhLSCは、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる。非mhLSCは、罹患した肺組織と比較して、健康な対照肺組織中により多量に存在する。
【０１１６】
一実施形態では、本明細書で使用されるとき、「ml-hLSC」又は「間葉様ヒト肺幹細胞」という用語は、c-kit陽性が弱く、CD44/CD73/CD105陽性である肺幹細胞を包含する。ml-hLSCは、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞及び線維芽細胞に分化する。ml-hLSCは、健康な対照肺組織と比較して、罹患した肺組織中により多量に存在する。
【０１１７】
細胞分化は、典型的には多数の細胞分裂を通じて起こる複雑なプロセスである。分化細胞は、それ自体が多分化能細胞に由来する多分化能細胞などに由来し得る。これらの多分化能性細胞のそれぞれは幹細胞であると考えられ得るが、それぞれ生じさせることができる細胞型の範囲はかなり異なり得る。一部の分化細胞はまた、より大きな発生能の細胞を生じさせる能力を有する。このような能力は天然のものでもよく、又は様々な因子による処置の際に人工的に誘発されてもよい。多数の生物学的例において、幹細胞は、それらが1つを超える異なる細胞型の子孫を産生することができるため「多分化能性」である。自己複製は、幹細胞の定義の他の古典的な部分であり、それはこの明細書において使用されているように不可欠である。理論的には、自己複製は、2つの主要なメカニズムのいずれかによって起こり得る。幹細胞は非対称的に分裂することがあり、一方の娘は幹状態を保持し、他方の娘は一部の異なる他の特定の機能及び表現型を発現する。あるいは、集団内の一部の幹細胞は、対称的に2つの幹細胞に分裂することができ、したがって、集団内の一部の幹細胞を全体として維持しながら、集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じさせる。
【０１１８】
一部の実施形態では、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールは、2つの細胞クラス:間葉系エピトープCD44、CD73及びCD105に対して陰性である非間葉系hLSC(非mhLSC)、並びにエピトープCD44、CD73及びCD105を発現する間葉様hLSC(ml-hLSC)からなる。両方の細胞型は、組織特異的な成体幹細胞の特性、すなわち自己複製及びクローン形成能を有する。
【０１１９】
一実施形態では、非mhLSCが実質的に富化された、単離された細胞の集団は、主としてLSC(≧70%)、並びに非常に少量の肺始原細胞及び肺前駆細胞(≦10%)を含む。したがって、一実施形態では、非mhLSCが実質的に富化された、単離された細胞の集団は、単離された非mhLSCの集団と呼ばれる。これは、非mhLSCの集団が一部のc-kit陽性始原細胞及び/又はc-kit前駆細胞を含み得ることを意味する。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、一部の実施形態では、「非mhLSCについて単離され、実質的に富化された集団」、「単離された非mhLSCの集団」、「非mhLSCの集団」、「c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞の単離された集団」、「c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73、及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞の集団」、又は「ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞の富化集団」という用語は、非mhLSC及び/又は肺始原細胞及び/又は肺前駆細胞の異種又は同種の集団を包含する。肺始原細胞及び肺前駆細胞は系列決定細胞である。例えば、肺始原細胞が上皮系列について決定的であり、すなわち将来的に肺上皮細胞を産生する場合、この肺始原細胞は、造血系列の細胞である血球にスイッチしこれを産生することはない。一部の実施形態では、肺始原細胞及び肺前駆細胞は、肺上皮系列、肺内皮系列又は肺胞細胞系列について決定的である。少なくとも2つの異なる細胞型からなる単離された非mhLSCの集団は、本明細書において「異種の集団」と呼ばれる。肺幹細胞又は肺始原細胞は、移植前にエクスビボで単離及び拡大されることも本明細書において企図される。ただ1つの細胞型(例えば、肺幹細胞)を含む単離された非mhLSCの集団は、本明細書において「同種の細胞の集団」と呼ばれる。
【０１２１】
ヒト成体肺組織の肺幹細胞は、KIT又はCD117とも呼ばれるc-kitを発現し、これはサイトカイン幹細胞因子(SCF)に結合するサイトカイン受容体である。SCFは、細胞に分裂及び増殖するようにシグナル伝達する。一般的に、c-kitは、有糸分裂によって幹細胞に由来する子孫である始原細胞型及び前駆細胞型と同様に、幹細胞の表面上に発現される。したがって、c-kitは幹細胞マーカーである。ヒト成体肺組織におけるc-kitについて免疫染色することによって、本発明者らはこのようなc-kit陽性細胞を見出した(WO2012/047951を参照されたい)。この発見以前には、肺に幹細胞が存在するという証拠は報告されていなかった。
【０１２２】
一実施形態では、本明細書で使用されるとき、「LSC」という用語は、多系列の肺分化能及び持続的な自己複製活性を有する細胞を指す。「自己複製」は、親細胞と同一の(例えば、自己複製する)特徴を有する少なくとも1つの娘細胞を分裂させ、生成する細胞の能力を指す。第2の娘細胞は、特定の分化経路に関与し得る。例えば、自己複製LSCは分化して、1つの娘幹細胞、及び肺上皮又は肺血管経路における分化に関与する別の娘細胞を形成する。関与する始原細胞は、典型的には自己複製能を喪失し、細胞分裂時に、より分化した(すなわち制限された)表現型を提示する2つの娘細胞を産生する。
【０１２３】
したがって、本明細書に記載の方法において使用される「LCS」は、例えば、限定されないが、肺細胞I型及びII型細胞、肺胞間細胞、平滑筋細胞、肺胞上皮細胞、内皮細胞及び赤血球を含む、呼吸器システムのいくつかの細胞型に分化することができるすべての多能性細胞を包含する。
【０１２４】
「肺始原細胞」は、本明細書で用語として使用するとき、特定の肺細胞系列に関与し、一般的には自己複製しないLSCのサブセットを指し、例えば、細胞表面マーカー又は細胞内タンパク質によって同定することができる。例えば、肺上皮系列への関与を示すTTF1、又は肺血管系列への関与を示すGATA6及び/若しくはEst1。
【０１２５】
非mhLSC及び/又はml-hLSCの存在は、当該技術分野において公知である任意の方法によって、又は当業者に公知である若しくは実施例に記載されるアッセイを用いて細胞表面マーカーの検出を通じて表現型的に決定することができる。
【０１２６】
LSCの単離
記載される組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSC及び/又はml-hLSCは、以下の供給源:流産胎児、胎児生検組織、死亡したばかりの対象、生存している対象由来の組織生検、肺幹細胞株の肺組織試料から誘導又は単離される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSC及び/又はml-hLSCは、他の細胞、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は成体多能性細胞からエクスビボで誘導される。
【０１２７】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、非mhLSCは、当業者に公知である任意の方法を用いて、又は本明細書に記載される方法に従って単離することができる。例えば、生存している対象由来の小さな肺組織試料からの細針吸引。
【０１２８】
非mhLSC及び/又はml-hLSCは、当該技術分野において公知である任意の方法によって肺組織試料から単離することができる。組織試料から個々の細胞を解離する方法は、当該技術分野において、例えば、米国特許第7,547,674号、並びに米国特許出願公開第2006/0239983号、第2009/0148421号、及び第2009/0180998号において公知である。これらの参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、単離された非mhLSCの集団は、以下の方法により単離される。当業者は、異なる供給源からの肺組織に対して必要とされるように、方法に僅かな調整を加えることができる。最小サイズが少なくとも1立方センチメートルである小さな肺組織片をコラゲナーゼで酵素消化して単一細胞を得る(Kajstura, J.ら、2011年、New Engl J Med 364巻: 1795〜1806頁)。インタクトの小さな細胞を再懸濁し、細胞の凝集塊をセルストレーナーで除去する。このセルストレーナーステップは任意選択である。次に、細胞をマウスc-kit抗体とともにインキュベートする。単一のc-kit陽性細胞を単離し、抗マウスIgGでコーティングした免疫磁気ビーズを用いて回収する。非mhLSCを、CD44/CD73/CD105マーカーのネガティブ選択によってさらに選択する。
【０１３０】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、次に、得られた単離された非mhLSCは、以下の方法によって培養される。当業者は、必要に応じて方法に僅かな調整を加えることができる。培養方法を用いて、非mhLSCの数を増やし、拡大する。単離された非mhLSCを、標準的な組織培養条件下で、5〜10%FBS(GIBCO)及びインスリン-セレン-トランスフェリン混合物(SIGMA、St. Louis、MO)を補充したF12培地(GIBCO、Grand Island、NY)を含有する改変F12K培地に播種する。コンフルエントに達した後、細胞を、他のいくつかのプレートに継代し、細胞を取り扱う標準的な組織培養プロトコールを用いて培養物を拡大する。
【０１３１】
記載の組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、本明細書に記載される肺組織由来の非mhLSCは、本明細書に記載される方法で使用する前に、当業者に許容される任意の方法を用いてエクスビボで拡大される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、拡大された非mhLSCはさらに選別され、分画され、処理されて、任意の望ましくない細胞を除去する、又はそうでなければ、移植のための細胞を調製する、当業者に許容される任意の手順を用いて患者を治療するために操作される。望ましくない細胞の例は、悪性細胞である。
【０１３２】
典型的には、肺組織の試料中に非常に少数の非mhLSCが存在し、例えば、100万個の細胞あたり1又は2つの非mhLSCのみが存在し得る。したがって、本明細書に記載される治療的使用に必要とされる細胞数を増加させるため、選択された非mhLSCの拡大が必要である。本明細書に記載される治療的使用において移植されるより多数の非mhLSCは、その中で使用される治療の成功率を増加させる。非mhLSCは、対象の肺において損傷を受けた組織及び細胞の一部を修復、再構成、及び生成するために使用される。したがって、移植されたより多くの非mhLSCは、新しい肺細胞及び肺組織を修復、再構成、及び生成するために利用可能なより多くの細胞を意味する。一部の実施形態では、移植治療の成功は、当該技術分野において公知である任意の方法、及び本明細書において記載される方法、例えば、当該技術分野における専門の医師に公知である、対象の肺機能の改善、血中酸素飽和度及び一般的な健康状態によって測定することができる。
【０１３３】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、LSCを含む肺組織試料は対象から単離され、次に、例えば細胞選別(例えば、FACS)によりさらに処理されて、実質的に富化された非mhLSCの集団が得られる。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、実質的に富化された非mhLSCの集団は、拡大した非mhLSCのインビトロ又はエクスビボ培養物を指す。
【０１３４】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、様々な供給源由来の肺組織試料は、凍結された、例えば、非mhLSCの抽出又は選択の前に凍結又は凍結保存された試料である。肺組織試料は、本明細書中に記載される対象又は他の供給源から得られ、次に凍結防止剤とともに凍結保存される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、肺組織試料由来の単離された非mhLSCの集団は、使用前に凍結防止剤とともに凍結保存される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちのさらに別の実施形態では、インビトロ培養で拡大された、単離された非mhLSCの集団は、使用前に凍結防止剤とともに凍結保存される。凍結防止剤とともに組織及び細胞を凍結保存する方法は、当該技術分野において周知である。使用のために凍結保存された組織又は細胞を解凍するためのさらなる方法もまた当該技術分野において周知である。
【０１３５】
本明細書で使用される「単離する」及び「得る又は調製する方法」という用語は、それによって、細胞又は細胞の集団、例えば、非mhLSCの集団が、対象又はそれが元々見出された肺組織試料から除去されるプロセスを指す。本明細書で使用される「単離された集団」という用語は、生物学的試料から取り出され、分離された細胞の集団、又はこのような試料中に見出される混合若しくは異種の細胞の集団を指す。このような混合集団には、例えば、肺組織試料から得られた非mhLSCの集団が含まれる。一部の実施形態では、単離された集団は、そこから細胞が単離された又はそこから富化された異種の集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。一部の実施形態では、単離された集団は、単離された非mhLSCの集団である。本明細書に記載されたこの態様及びすべての態様のうちの他の実施形態では、単離された集団は、非mhLSCの実質的に富化された集団を含む。一部の実施形態では、単離された細胞又は細胞の集団、例えば、非mhLSCの集団は、例えば、増殖因子又はサイトカインの存在下、インビトロ又はエキソビボでさらに培養され、単離された細胞集団又は実質的に非mhLSCが富化された細胞集団内の細胞数をさらに拡大する。このような培養は、当業者に公知である任意の方法を用いて行うことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって得られた、単離された又は実質的に富化された非mhLSC集団は、後に第2の対象に投与されるか、又は細胞集団が元々単離された対象に再導入される(例えば、同種異系移植対自己由来投与)。
【０１３６】
特定の細胞集団に関して「実質的に富化された」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に対して、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%純粋である細胞の集団を指す。言い換えれば、本明細書に開示される方法における使用のために単離された非mhLSCの集団に関して「実質的に富化された」又は「本質的に精製された」という用語は、本明細書における用語によって定義されるように、非mhLSCではない細胞の約25%より少ない、約20%より少ない、約15%より少ない、約10%より少ない、約9%より少ない、約8%より少ない、約7%より少ない、約6%より少ない、約5%より少ない、約4%より少ない、約3%より少ない、約2%より少ない、約1%より少ない、又は1%未満を含有する非mhLSCの集団を指す。これらの態様の一部の態様は、実質的に純粋な又は富化された非mhLSCの集団を拡大する方法であって、拡大された非mhLSC集団がまた、実質的に純粋な又は富化された非mhLSCの集団である、方法をさらに包含する。
【０１３７】
細胞集団中の特定のマーカーの存在に関して「実質的に陰性である」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に対して、そのマーカーに対して約1%以下、約0.9%以下、約0.8%以下、約0.7%以下、約0.6%以下、約0.5%以下、約0.4%以下、約0.3%以下、約0.2%以下、又は約0.1%以下陽性である細胞の集団を指す。
【０１３８】
「富化する」又は「富化された」という用語は、本明細書において互換的に使用され、1種類の細胞、例えば、本明細書に記載される方法における使用のための非mhLSCの収率(画分)が、出発生物学的試料、培養物、又は調製物中のその種類の細胞の画分に対して、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、又は少なくとも75%増加することを意味する。本明細書に記載される方法における使用のために得られた非mhLSCの集団は、最も好ましくは、非mhLSCが少なくとも60%富化されている。
【０１３９】
一部の実施形態では、非mhLSCに特異的なマーカーを用いて、これらの細胞が単離又は富化される。本明細書で使用される「マーカー」は、細胞の特徴及び/又は表現型を記載する。マーカーは、目的の特徴を含む細胞の選択のために使用することができる。マーカーは、特定の細胞によって異なる。マーカーは、形態学的、機能的又は生化学的(酵素的)にかかわらず、特に細胞型、又は細胞型によって発現される分子に特徴的である。好ましくは、このようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、抗体に対するエピトープ又は当該技術分野において利用可能な他の結合分子を有する。しかしながら、マーカーは、限定されないが、タンパク質(ペプチド及びポリペプチド)、脂質、多糖、核酸及びステロイドを含む、細胞中に見出される任意の分子からなり得る。形態学的特徴又は形質の例としては、限定されないが、形状、大きさ、外観(例えば、滑らか、半透明)、及び核と細胞質との比が挙げられる。機能的特徴又は形質の例には、限定されないが、特定の基質に接着する能力、特定の染料を取り込む又は排除する能力、特定の条件下で移動する能力、及び特定の系列に沿って分化する能力が含まれる。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。
【０１４０】
したがって、本明細書で使用されるとき、「細胞表面マーカー」は、細胞の表面上に発現される任意の分子を指す。細胞表面発現は、通常、分子が膜貫通ドメインを有することを必要とする。細胞表面上に通常は見出されない一部の分子は、細胞の表面上に発現されるように組換え技術によって操作することができる。多くの天然に存在する細胞表面マーカーは、「CD」又は「分化のクラスター」分子と呼ばれる。細胞表面マーカーは、多くの場合、抗体が結合することができる抗原決定基を提供する。本明細書に記載される方法に特に関連する細胞表面マーカーは、CD117又はc-kitである。組成物及び方法による有用な非mhLSCは、好ましくはc-kitを発現するか、言い換えれば、それらはc-kit陽性である。
【０１４１】
細胞は、任意の細胞表面マーカー又は他の細胞内マーカーに対して「陽性」又は「陰性」と指定することができ、このような両方の指定は、本明細書に記載される方法の実施に有用である。細胞が、当業者に公知である方法、例えば、細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、続いて、このような接触させた細胞のフローサイトメトリー分析を行って、抗体が細胞に結合するかどうかを決定することを用いて、検出されるのに十分な量で細胞表面上又は細胞内にマーカーを発現する場合、細胞は細胞表面マーカーに対して「陽性」であるとみなされる。細胞は、細胞表面マーカーのメッセンジャーRNAを発現することができるが、本明細書に記載される方法について陽性とみなすためには、細胞はそれをその表面に発現しなければならないことを理解されたい。同様に、当業者に公知である方法、例えば、細胞をマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、続いて、このような接触させた細胞のフローサイトメトリー分析を行って、抗体が細胞に結合するかどうかを決定することを用いて、検出されるのに十分な量でマーカーを発現しない場合、細胞は細胞表面マーカー又は他の細胞内マーカーに対して「陰性」であるとみなされる。
【０１４２】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSCはネガティブに選択され、選択は、細胞表面マーカーに特異的な作用物質を使用する。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、間葉系間質細胞系列マーカーである。
【０１４３】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、ネガティブ選択の文脈において、系列マーカーに特異的な作用物質が使用される場合、作用物質のすべては、同じ標識又はタグ、例えば、蛍光タグを含むことができ、したがって、その標識又はタグに対して陽性であるすべての細胞を排除又は除去することができ、本明細書に記載される方法における使用のための系列マーカー陰性の非mhLSC、肺始原細胞及び/又は肺前駆細胞が残る。これはネガティブ選択であり、系列マーカーに特異的な作用物質と接触しなかった細胞を選択する。
【０１４４】
したがって、本明細書で定義されるように、「細胞表面マーカー又は他の細胞内マーカーに特異的な作用物質」は、その細胞表面マーカー又は他の細胞内マーカーと選択的に反応するか又はそれに結合することができるが、別の細胞表面マーカー、他の細胞内マーカー又は抗原に対する検出可能な反応性がほとんど又は全くない作用物質を指す。例えば、c-kitに特異的な作用物質は、CD49eを同定もせずそれに結合もしない。したがって、細胞表面マーカー又は他の細胞内マーカーに特異的な作用物質は、マーカーの固有の構造的特色を認識する。一部の実施形態では、マーカーに特異的な作用物質は、マーカーに結合するが、そのマーカーによって媒介される下流のシグナル伝達事象、例えば非活性化抗体の開始を引き起こさない。細胞表面分子に特異的な作用物質には、限定されないが、抗体又はその抗原結合性断片、天然又は組換えリガンド、小分子、核酸配列及び核酸類似体、細胞内抗体、アプタマー、並びに他のタンパク質又はペプチドが含まれる。
【０１４５】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSCを単離するために使用される細胞表面マーカーに特異的な好ましい作用物質は、細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体作用物質であり、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びに抗原結合性誘導体又はその断片を含み得る。周知の抗原結合性断片には、例えば、単一ドメイン抗体(dAb、本質的に単一のVL又はVH抗体ドメインからなる)、一本鎖Fv断片(scFv)、Fab断片、及びF(ab')2断片を含むFv断片が挙げられる。このような抗体分子の構築の方法は、当該技術分野において周知である。したがって、本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、又はFc(結晶化可能な断片)領域を有するモノクローナル若しくはポリクローナル抗原結合性断片、又はFc領域のFcRn結合性断片を指す。抗原結合性断片は、組換えDNA技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生され得る。「抗原結合性断片」には、とりわけ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、及び相補性決定領域(CDR)断片、一本鎖抗体(scFv)、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、及びポリペプチドへの特異的抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2及びFvという用語は、当業者に公知である標準的な免疫学的意味で、例えば、Klein、「Immunology」(John Wiley、New York、N.Y.、1982年); Clark, W. R. (1986年);「The Experimental Foundations of Modern Immunology」(Wiley & Sons, Inc. 、New York);及びRoitt, I. (1991年)「Essential immunology」、第7版、(Blackwell Scientific Publications、Oxford)において用いられている。このような抗体又は抗原結合性断片は、供給業者、例えば、R&D Systems、BD Bioscience、e-Bioscience、及びMiltenyiから市販されているか、又は当業者に公知である方法によってこれらの細胞表面マーカー若しくは他の細胞内マーカーに対して産生され得る。
【０１４６】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、細胞表面分子又は他の細胞内マーカーに特異的な作用物質、例えば、抗体又は抗原結合性断片は、肺幹細胞の単離を容易にするためにタグで標識される。本明細書で使用される「標識」又は「タグ」という用語は、標的の存在、例えば、生物学的試料中の特定の細胞表面マーカーの存在を示す検出可能なシグナルを生成することができる組成物を指す。適切な標識としては、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、化学発光部分、磁性粒子、生物発光部分などが挙げられる。したがって、標識は、LSC、肺始原細胞及び肺前駆細胞を単離及び富化する方法に必要とされる分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【０１４７】
「標識抗体」又は「タグ化抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、検出可能な手段によって標識されている抗体を含み、限定されないが、蛍光標識、酵素標識、放射活性標識、及び化学発光標識されている抗体を含む。抗体はまた、検出可能なタグ、例えば、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、又はHISで標識することができ、これはタグに特異的な抗体、例えば抗c-Myc抗体を用いて検出することができる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当該技術分野で公知であり、使用され得る。本発明の方法において使用する抗体を標識するための蛍光標識又はタグの非限定的な例には、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、スクシンイミジルエステル、メトキシクマリン、カスケードブルー、ヒドラジド、パシフィックブルー、マレイミド、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、R-フィコエリトリン(PE)、PE-Cy5コンジュゲート(サイクローム、R670、トライカラー、クアンタムレッド)、PE-Cy7コンジュゲート、レッド613、PE-テキサスレッド、PerCP、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed(PerCP-Cy5.5コンジュゲート)、FluorX、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-ローダミン(XRITC)、リッサミンローダミンB、テキサスレッド、アロフィコシアニン(APC)、APC-Cy7コンジュゲート、ALEXA FLUOR(登録商標)350、ALEXA FLUOR(登録商標)405、ALEXA FLUOR(登録商標)430、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)500、ALEXA FLUOR(登録商標)514、ALEXA FLUOR(登録商標)532、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)555、ALEXA FLUOR(登録商標)568、ALEXA FLUOR(登録商標)594、ALEXA FLUOR(登録商標)610、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)647、ALEXA FLUOR(登録商標)660、ALEXA FLUOR(登録商標)680、ALEXA FLUOR(登録商標)700、ALEXA FLUOR(登録商標)750、ALEXA FLUOR(登録商標)790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5又はCy7が含まれる。
【０１４８】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、実質的に純粋な又は富化された非mhLSCの集団を単離するための様々な方法が当業者に利用可能であり、免疫選択技術、例えば、フローサイトメトリー法を用いるハイスループット細胞選別、磁気ビーズ、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズに標識された抗体、及びディッシュを含む表面にパンニングされた抗体を用いたアフィニティー法、並びにこのような方法の組合せが挙げられる。
【０１４９】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSCの集団の単離及び富化は、ビーズベースの選別メカニズム、例えば、磁気ビーズを使用して行うことができる。このような方法において、消化された肺組織試料は、1つ以上の特異的細胞表面抗原、例えば、c-kitに対する抗体でコーティングされた磁気ビーズと接触させる。これは、それぞれの抗原を発現する試料中の細胞が磁気ビーズに付着するようにする。c-kit陽性細胞がビーズに結合することを可能にする期間の後、細胞及びビーズの混合物は、強い磁場、例えば、磁石を有するカラム又はラックに曝露される。ビーズに付着した細胞(細胞表面マーカーを発現している)はカラム又は試料チューブ上に留まるが、他の細胞(細胞表面マーカーを発現していない)は溶液を貫流するか又は溶液中に残る。この方法を使用して、細胞は、特定の細胞表面マーカーに関して、ポジティブ若しくはネガティブに、又はその中の組合せを使用して分離され得る。
【０１５０】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、磁気活性化細胞選別(MACS)戦略は、非mhLSCの単離及び事前選択のために使用される。一部の実施形態では、非mhLSCは、ヒト血漿又はヒト血清アルブミン(HSA)、例えば、2%HSAの存在下で単離される。
【０１５１】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の好ましい実施形態では、非mhLSC及び/又はml-hLSCは、細胞表面マーカーc-kitに対するポジティブ選択を用いて単離されるか又は富化される。
【０１５２】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、1つ以上の追加の細胞表面マーカーは、ポジティブ若しくはネガティブ選択方法、又はその中の組合せを用いて、非mhLSCを単離及び/又は富化するために用いられる。このような追加の細胞表面マーカーは、CD44、CD73及びCD105を含む。
【０１５３】
本明細書で定義されるように、「ポジティブ選択」は、特定の細胞表面マーカー又は細胞内タンパク質を発現する細胞の単離又は富化をもたらす技術を指し、「ネガティブ選択」は、特定の細胞表面マーカー又は細胞内タンパク質を発現しない細胞の単離又は富化をもたらす技術を指す。ネガティブ選択は、当該技術分野において公知である任意の方法によって行われ得る。例えば、典型的なネガティブ選択は、目的のマーカーを発現する細胞を除去することによって行われる。
【０１５４】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、ビーズは、当該技術分野において公知である標準的な技術、例えば、市販のビーズコンジュゲーションキットを用いて、当業者によって抗体でコーティングすることができる。一部の実施形態では、ネガティブ選択ステップは、1つ以上の系列マーカーを発現する細胞を除去するために行われ、続いて1つ以上の特定の細胞表面マーカーを発現するml-hLSCをポジティブ選択するための蛍光活性化細胞選別が行われる。例えば、ネガティブ選択プロトコールにおいて、消化された肺組織試料は、最初に、目的の細胞表面マーカー、例えば、CD2、CD3、CD6、CD8、CD34、CD49e、及びCD66bに特異的な標識抗体と接触させ、次に、試料は、抗体の標識に特異的なビーズと接触させ、マーカーCD2、CD3、CD6、CD8、CD34、CD49e、及びCD66bを発現する細胞は、免疫磁気系列枯渇を用いて除去する。
【０１５５】
いくつかの異なる細胞表面マーカーは、特定の分化細胞系列上で特異的な発現を有し、本明細書中に記載される方法のために単離された非mhLSCによっては発現されない。したがって、これらの系列細胞マーカーに特異的な作用物質を非mhLSCと接触させた場合、細胞は「陰性」である。本明細書に記載される非mhLSCによっては発現されない系列細胞マーカーは、(間葉系間質細胞系列について)CD44、CD73及びCD105である。
【０１５６】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、フローサイトメトリー法は、単独で又は磁気ビーズに基づく方法と組み合わせて、非mhLSCを単離又は富化するために使用される。本明細書で定義されるように、「フローサイトメトリー」は、それらを流体の流れの中に懸濁させ、それらを電子的検出装置に通過させることによって、微小粒子、例えば、細胞及び染色体をカウント及び検査するための技術を指す。フローサイトメトリーは、毎秒、最大数千粒子の物理的及び/又は化学的パラメータ、例えば、蛍光パラメータの同時マルチパラメータ分析を可能にする。現代のフローサイトメトリー機器は通常、複数のレーザー及び蛍光検出器を有する。レーザー及び検出器の数を増やすことは、複数の抗体による標識を可能にし、それらの表現型マーカーによってより正確に標的集団を同定し得る。ある種のフローサイトメトリー機器は、個々の細胞のデジタル画像を撮ることができ、細胞内又は細胞表面上の蛍光シグナル位置の分析を可能にする。
【０１５７】
フローサイトメトリー技術の一般的な変形は、「蛍光活性化細胞選別」を使用して、目的の集団を精製するように、粒子をそれらの特性に基づいて物理的に選別することである。本明細書で定義されるように、「蛍光活性化細胞選別」又は「フローサイトメトリーに基づく選別」方法は、各細胞の特定の光散乱及び蛍光特徴に基づいて、単一の生物学的試料からの細胞の異種の混合物を1度に1つの細胞ずつ1つ以上の容器に選別するためのフローサイトメトリー法を指し、個々の細胞からの蛍光シグナルの迅速で、客観的及び定量的な記録、並びに特に目的とする細胞の物理的分離を提供する。したがって、細胞表面マーカーに特異的な作用物質が、フローサイトメーターによって検出され得るタグで標識された抗体である場合の実施形態では、蛍光活性化細胞選別(FACS)は、LSCの集団を単離及び富化するために本明細書に記載される方法において及びそれとともに使用され得る。
【０１５８】
非mhLSCの拡大
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、単離され、実質的に富化された非mhLSCの集団は、本明細書に記載される治療方法においてそれらを使用する前に数を増加させるためにさらに拡大される。
【０１５９】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、本明細書に記載された方法及び技術を用いることによって単離又は富化された非mhLSCは、培養において拡大され、すなわち、細胞数は、必要とする対象に投与する前に、当業者に公知である方法を用いて対象の体外で増やされる。
【０１６０】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一実施形態では、得られた単離された非mhLSCを以下の方法に従って培養中で拡大させる。当業者は、必要に応じて方法に僅かな調整を加えることができる。単離された非mhLSCを、標準的な組織培養条件下、例えば、95%空気、5%CO2、37℃で、5〜10%FBS(GIBCO)及びインスリン-セレン-トランスフェリン混合物(SIGMA、St. Louis、MO)を補充したF12培地(GIBCO、Grand Island、NY)を含有する改変F12K培地に播種する。コンフルエントに達した後、1つのコンフルエントプレートからの細胞を、細胞を取り扱う標準的な組織培養プロトコールを用いて培養物を拡大するためにいくつかの他のプレートに継代する。
【０１６１】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、このような拡大方法は、例えば、LSCの拡大を引き起こす因子、例えば、幹細胞因子、IL-3、及びGM-CSFが補充され、及び/又はLSCの拡大を引き起こす条件下、無血清培地中で非mhLSCを培養するステップを含み得る。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、非mhLSCはさらに、LSCの呼吸器上皮への分化を誘導することを目的とする因子とともに並びに/又は条件下で、例えば、小気道増殖培地、改変マウス気管上皮細胞培地、又はレチノイン酸及び/若しくはケラチノサイト増殖因子が補充された無血清培地を用いて培養され得る。
【０１６２】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、Lu Jら、「A Novel Technology for Hematopoietic Stem Cell Expansion using Combination of Nanofiber and Growth Factors」、Recent Pat Nanotechnol. 2010年  4巻(2号):125〜35頁に概説されているように、非mhLSCは、約0.5%以下をナノテクノロジー又はナノエンジニアリング方法に適合させることによって拡大される。例えば、一部の実施形態では、幹細胞微小環境のナノエンジニアリングを行うことができる。本明細書で使用されるとき、分泌因子、幹細胞-隣接細胞相互作用、細胞外マトリックス(ECM)及び機械的特性は、集合的に「幹細胞微小環境」を構成する。幹細胞微小環境ナノエンジニアリングは、マイクロ/ナノパターン化表面、増殖因子及び生化学物質の放出を制御するためのナノ粒子、細胞外マトリックス(ECM)を模倣するためのナノファイバー、配列された生体材料のナノリットルスケール合成、幹細胞のシグナルクラスターを模倣するための自己集合ペプチドシステム、ナノワイヤー、レーザー加工ナノグローブ、並びにLSCを拡大するためのナノフェーズ薄膜の使用を含み得る。
【０１６３】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、非mhLSCは遺伝子操作され、例えば、外因性核酸でトランスフェクトされる。ナノエンジニアリング、例えば、インビボ遺伝子送達のためのナノ粒子、LSCへの遺伝子送達のためのナノニードル、LSCトランスフェクションのための自己集合ペプチドシステム、LSCへの遺伝子送達のためのナノワイヤー、及びLSCエレクトロポレーションのためのマイクロ/ナノ流体デバイスを、LSCにおけるトランスフェクション及び遺伝子操作のために使用することができる。
【０１６４】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、方法において使用するために単離又は富化された非mhLSCは、バイオリアクターを用いて拡大することができる。
【０１６５】
「増加した」、「増加する」又は「拡大する」という用語は、非mhLSCの拡大との関連で使用される場合、一般的に、統計学的に有意な量だけ非mhLSCの数が増加することを意味し、いずれの疑いも避けるために、「増加した」、「増加する」、「拡大する」又は「拡大した」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、若しくは最大100%又はそれを含む増加、あるいは対照若しくは参照レベルと比較して、少なくとも約2倍、若しくは少なくとも約3倍、若しくは少なくとも約4倍、若しくは少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、若しくは少なくとも約7倍、若しくは少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、若しくは少なくとも約10倍の増加、又は10倍以上の任意の増加を意味する。対照/参照試料又はレベルは、例えば、拡大培養の開始時又は拡大培養に添加された細胞の初期数で、例えば、本明細書に記載される方法を用いて拡大されていない、同じ生物学的供給源から得られた細胞の集団を記載するために本明細書で使用される。
【０１６６】
肺組織試料及び/又は肺幹細胞の保存
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、肺組織試料は、使用前に、すなわち、その中の非mhLSCの抽出、単離又は選択の前に保存される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、消化された肺組織試料は、その中の非mhLSCの抽出又は選択の前に保存される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、単離された非mhLSCは保存される。記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、非mhLSCは、保存前に最初に単離及び/又は拡大される。一実施形態では、保存は凍結保存による。非mhLSCは、本明細書に記載される治療方法に必要とされる場合に解凍される。
【０１６７】
記載された組成物及び方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、肺組織試料又は単離された非mhLSC(拡大又はその他)は、本明細書に記載された方法においてそれらを使用する前に凍結される。試料の凍結は、凍結解凍プロセス中の細胞損傷を最小限に抑えるために、1つ以上の異なる凍結防止剤の存在下で行われ得る。例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、トレハロース、又はスクロースを使用することができる。
【０１６８】
再生医療における非mhLSCの投与及び使用
本明細書に記載されるある種の実施形態は、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞に分化することができるc-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中に存在するCD44/CD73/CD105に対して陰性である非間葉系ヒト肺幹細胞(非mhLSC)の発見に基づく。CD73に対して陰性である非mhLSCは、肺特異的細胞型、すなわち、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞を形成するより高い能力を有し得、罹患した肺においてさらなる損傷を引き起こし得る細胞の生成を予防する。これに関して、1型及び2型の肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞は、臓器のガス交換単位を形成する。これらの観察は、単離された非mhLSCが肺血管再生及び肺胞発生に使用できることを示した。
【０１６９】
したがって、本明細書において、それを必要とする対象における呼吸器/肺の疾患若しくは障害の治療及び/又は予防方法が提供される。本明細書で使用されるとき、「呼吸器の疾患又は障害」、「肺の疾患又は障害」及び「肺障害」という用語は互換的に使用される。これらの方法の一部は、鼻腔内、気管内又は静脈内経路などの肺内投与を使用して、治療有効量の単離された非mhLSCを対象に投与することを伴う。これらの方法の一部の態様では、治療有効量の単離された非mhLSCは、全身経路、例えば、腹腔内又は静脈内経路を用いて投与される。これらの方法の他の態様では、治療的有効量の単離された非mhLSCは、肺内投与と腹腔内投与の両方を用いて投与される。これらの方法は、特に、呼吸器の疾患又は障害を有するか又はそのリスクがあるヒト対象、例えば、COPDを有する対象の治療的及び予防的処置を目的とする。本明細書に記載される単離又は富化された非mhLSCは、任意の呼吸器の疾患若しくは障害を有するか又は発症する素因がある、選択された対象に投与され得、投与は、対象において効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によることができる。本明細書に記載される治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、呼吸器障害を有する対象は、細胞の投与前に最初に選択される。
【０１７０】
「対象」、「患者」及び「個体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載の方法における使用のための細胞を得ることができる動物(すなわち、ドナー対象)、及び/又は本明細書に記載される細胞を用いた予防的処置を含む治療が提供される動物、すなわち、レシピエント対象、例えばヒトを指す。特定の動物、例えば、ヒト対象に特異的であるこれらの状態又は病態の治療の場合、対象という用語はその特定の動物を指す。本明細書において互換的に使用される「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」は、哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長類を含む。「対象」という用語はまた、限定されないが、哺乳動物、爬虫類、両生類及び魚を含む任意の脊椎動物を包含する。しかしながら、有利には、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、又は他の哺乳動物、例えば、飼い慣らされた哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、若しくは食料生産哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなどである。
【０１７１】
したがって、本明細書に記載される治療方法の一部の実施形態では、対象は、レシピエント対象、すなわち、単離された非mhLSCが投与されている対象、又はドナー対象、すなわち、非mhLSCを含む肺組織試料が得られている対象である。レシピエント又はドナー対象は任意の年齢のものであり得る。一部の実施形態では、対象は、本明細書において10歳未満の対象として定義される「若い対象」である。他の実施形態では、対象は、本明細書において2歳未満の対象として定義される「幼児対象」である。一部の実施形態では、対象は、本明細書において28日齢未満の対象として定義される「新生児対象」である。一実施形態では、若い、幼児又は新生児のレシピエント又はドナー対象は、非成人レシピエント又はドナー対象である。一実施形態では、10歳を超えるが成人ではない対象は、非成人対象である。一部の実施形態では、レシピエント又はドナー対象は非成人である。好ましい実施形態では、対象はヒト成人である。
【０１７２】
本明細書に記載される治療方法の一部の実施形態では、投与されている単離された非mhLSC集団は、1人以上のドナーから得られた同種異系の非mhLSCを含む。本明細書で使用されるとき、「同種異系」は、1つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一ではない、同種の1人以上の異なるドナーから得られた非mhLSC、又は非mhLSCを含む肺組織試料を指す。例えば、対象に投与されている単離された非mhLSC集団は、1人以上の無関係なドナー対象から得られた肺組織、又は1人以上の非同一兄弟若しくは他の供給源から得られた肺組織から得ることができる。一部の実施形態では、同系の単離された非mhLSC集団、例えば、遺伝的に同一の動物から、又は同一の双子から得られたものが使用される。この態様の他の実施形態では、単離された非mhLSCは自己由来の非mhLSCである。本明細書で使用されるとき、「自己由来」は、対象から得られた又は単離された、及び同一の、すなわち、ドナー及びレシピエントが同じである対象に投与されている非mhLSC、又は非mhLSCを含む肺組織試料を指す。
【０１７３】
肺疾患は、肺において発生し、又は肺が適切に機能しなくなる原因となる任意の疾患又は障害である。肺疾患には主に3種類がある。ほとんどの肺疾患は、実際には、これらのカテゴリーの組合せを伴う:(1)気道疾患-これらの疾患は、酸素及び他のガスを肺に出し入れするチューブ(気道)に影響を及ぼす。これらの疾患は、気道の狭窄又は閉塞を引き起こす。それらは、喘息、気腫、及び慢性気管支炎を含む。気道疾患のある人々は、「ストローを通じて呼吸することを試している」ような感覚だと説明する場合がある。(2)肺組織疾患-これらの疾患は、肺組織の構造に影響を及ぼす。組織の瘢痕化又は炎症は、肺を完全に拡大できなくする(「拘束性肺疾患」)。それはまた、肺が酸素を取り入れて(酸素化)、二酸化炭素を放出する能力を低下させる。肺線維症及びサルコイドーシスは肺組織疾患の例である。人々は、「きつすぎるセーター又はベストを着ている」ような感覚だと説明する場合があり、これでは深呼吸をすることができない。(3)肺循環疾患-これらの疾患は、肺における血管に影響を及ぼす。それらは、肺における血管の凝固、瘢痕化又は炎症によって引き起こされる。それらは、肺が酸素を取り入れて二酸化炭素を放出する能力に影響を及ぼす。これらの疾患はまた、心機能にも影響を及ぼし得る。
【０１７４】
最も一般的な肺疾患には、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、肺線維症及びサルコイドーシスが含まれる。他の肺疾患には、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、急性浸潤性無気肺、好酸球性肺炎、肺がん、転移性肺がん、壊死性肺炎、胸水性じん肺、ニューモシスチス症、肺炎、免疫不全患者における肺炎、気胸、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺動静脈奇形、肺水腫、肺塞栓、肺組織球症X(好酸球性肉芽腫)、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、及びリウマチ性肺疾患が含まれる。
【０１７５】
本明細書に記載される方法は、いくつかの呼吸器疾患又はそれらの症状、例えば、肺若しくは気道の構造への病理学的な損傷及び/又は肺胞の損傷をもたらすものを治療し、症状を改善し、予防し及び/又はそれらの進行を遅延させるために使用され得る。「呼吸器障害」、「呼吸器疾患」、「肺疾患」、及び「肺障害」という用語は、本明細書において互換的に使用され、肺、胸膜腔、気管支、気管、上気道、気道、又は呼吸器システムの他の構成要素若しくは構造を含む呼吸及び/又は呼吸器システムに関する任意の状態及び/又は障害を指す。このような呼吸器疾患には、限定されないが、気管支肺異形成症(BPD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)状態、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺性心、肺炎、肺膿瘍、急性気管支炎、慢性気管支炎、気腫、肺臓炎、例えば、過敏性肺臓炎、又は放射線曝露に関連する肺臓炎、肺胞肺疾患及び間質性肺疾患、環境肺疾患(例、アスベスト、ヒューム又はガス曝露に関連する)、誤嚥性肺炎、肺出血症候群、アミロイドーシス、結合組織疾患、全身性硬化症、強直性脊椎炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓、肺炎症、肺組織球症X、肺高血圧症、サーファクタント欠乏症、肺形成不全、肺新生物、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、肺切除後、ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫症、肉芽腫性血管炎、好酸球増加症、喘息及び気道過敏症(AHR)、例えば、軽度間欠性喘息、軽度持続性喘息、中等度持続性喘息、重度持続性喘息、急性喘息、慢性喘息、アトピー性喘息、アレルギー性喘息又は特異体質性喘息、嚢胞性線維症及び関連状態、例えば、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性副鼻腔炎、膵臓機能不全、肺又は血管の炎症、細菌又はウイルスの感染、例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)若しくはRSV感染症、又は急性若しくは慢性の成人若しくは小児呼吸窮迫症候群(RDS)、例えば、グレードI、II、III若しくはIVのRDS、又は例えば敗血症、肺炎、再灌流、無気肺若しくは胸部外傷と関連付けられたRDSが含まれる。
【０１７６】
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、気流閉塞が上気道、中型気道、細気管支、又は実質に位置する状態を含み、これは、気管狭窄、気管右心室肥大、肺高血圧症、多発性軟骨炎、気管支拡張症、細気管支炎、例えば、特発性細気管支炎、繊毛ジスキネジア、喘息、気腫、結合組織疾患、慢性気管支炎又は肺移植の細気管支炎として現れ、又は関連付けることができる。
【０１７７】
肺線維症は、経時的に肺の深部の組織が肥厚し、硬くなり、又は瘢痕化する疾患である。瘢痕組織の形成は線維症と呼ばれる。肺組織が肥厚するにつれて、肺は酸素を血流に適切に移動できなくなる。結果として、脳及び他の臓器に、それらが必要とする酸素が届かない。遺伝学は、IPFを引き起こす役割を果たし得る。公知の原因が識別できない肺線維症は特発性肺線維症(IPF)と呼ばれる。IPFは、通常、中年以上の成人に影響を及ぼす重篤な疾患である。IPFは、人によって異なる。IPFでは、瘢痕化は、気嚢の壁とその周囲の空間から始まる。IPFにはまだ救済法がない。多くの人々は、診断後約3〜5年しか生存しない。IPFに関連した最も一般的な死因は呼吸不全である。他の死因には、肺高血圧症、心不全、肺塞栓症、肺炎、及び肺がんが含まれる。IPFの他の名称には、特発性びまん性間質性肺線維症、原因不明の肺線維症、肺線維症、潜在性線維性肺胞炎、通常の間質性肺臓炎及びびまん性線維性肺胞炎が含まれる。
【０１７８】
本明細書に記載される方法はまた、急性若しくは慢性の喘息又はそれらの症状若しくは合併症、例えば、気道上皮傷害、気道平滑筋痙攣若しくは気道過敏性、気道粘膜浮腫、粘液分泌増加、過剰なT細胞活性化、又は落屑、無気肺、肺性心、気胸、皮下気腫、呼吸困難、咳、喘鳴、息切れ、頻呼吸、疲労感、減少した1秒間努力呼気容量(FEV1)、動脈性低酸素症、呼吸性アシドーシス;メディエーター、例えば、IL-4、IL-5、IgE、ヒスタミン、サブスタンスP、ニューロキニンA、カルシトニン遺伝子関連ペプチド;又はアラキドン酸代謝物、例えばトロンボキサン又はロイコトリエン(LTD4又はLTC4)のレベルの望ましくない上昇を含む炎症、並びに例えば、好酸球、リンパ球、マクロファージ又は顆粒球による細胞気道壁浸潤を治療又は改善するために使用することができる。
【０１７９】
これらの肺の疾患及び障害、並びに他の呼吸器又は肺の状態又は症状のいずれも他の箇所、例えば、The Merck Manual、第17版、 M. H. Beers及びR. Berkow編、1999年、Merck Research Laboratories、Whitehouse Station、N.J. 、ISBN 0911910-10-7、又はその全体が本明細書に引用された他の参考文献に記載されている。炎症が状態の病理学に役割を果たしているこれらの状態の一部において、非mhLSCと一緒に使用される治療剤は、炎症からの損傷、例えば、肺上皮への損傷を低減することによって状態の進行を改善又は遅延させることができる。他の場合では、非mhLSCと一緒に使用される治療剤は、病原体複製又は病原体に関連した肺組織損傷を制限するように作用し得る。
【０１８０】
本明細書で使用されるとき、「投与すること」、「導入すること」、「移植すること」及び「埋め込むこと」という用語は、所望の効果が生じるように、所望の部位、例えば、傷害又は修復の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路によって、本発明の細胞、例えば非mhLSCの対象への配置の文脈において、互換的に使用される。細胞、例えば、非mhLSC、又はそれらの分化した子孫(例えば、呼吸器上皮様細胞)は、呼吸気道に直接埋め込む、あるいは埋め込まれた細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部が生存可能な状態である対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間程度、例えば24時間から数日までの短いものから、数年程度に長く、すなわち長期生着であり得る。例えば、本明細書に記載される治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、有効量の単離又は富化された、単離された非mhLSCの集団は、気管内投与により気管支肺異形成症に罹患している乳児の肺に直接投与される。本明細書に記載される治療方法のすべての態様のうちの他の実施形態では、単離され、富化された非mhLSCの集団は、間接的な全身投与経路、例えば、腹腔内又は静脈内経路を介して投与される。
【０１８１】
予防的に提供される場合、単離され、富化された非mhLSCは、呼吸器障害の任意の症状、例えば、喘息発作の対象に前もって、又は嚢胞性線維症の対象のために投与することができる。したがって、単離又は富化された非mhLSC集団の予防的投与は、本明細書に開示されるような呼吸器障害、又は呼吸器疾患のさらなる進行を予防するのに役立つ。
【０１８２】
治療的に提供される場合、単離され、富化された非mhLSCは、呼吸器障害の症状又は兆候の発症(若しくは発症後)、例えばCOPDの発症時に提供される。
【０１８３】
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療」、「治療すること」、又は「改善」という用語は、治療的処置を指し、目的は、疾患若しくは障害を逆転し、軽減し、改善し、減少させ、阻害し、又は疾患若しくは障害と関連した状態の進行若しくは重症度を遅らせることである。「治療すること」という用語には、炎症性疾患、限定されないが、例えば、喘息に関連する状態、疾患又は障害の少なくとも1つの有害な効果又は症状を低減又は軽減することが含まれる。治療は、一般的に、その用語が本明細書において定義されるように、1つ以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合に「効果的」である。あるいは、治療は、疾患の進行が低減又は停止した場合に「効果的」である。すなわち、「治療」は、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療の非存在下で予想される症状の進行若しくは悪化の停止又は少なくともその遅延も含む。有益又は所望の臨床結果には、限定されないが、検出可能又は検出不可能かどうかにかかわらず、1つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化(すなわち悪化しない)、疾患進行の遅延又は遅らせること、病態の改善又は緩和、及び寛解(部分的又は全体的かどうかにかかわらず)が含まれる。一部の実施形態では、「治療」及び「治療すること」はまた、対象が治療を受けなかった場合、予想される生存期間と比較して対象の生存期間を延ばすことを意味し得る。
【０１８４】
本明細書で使用されるとき、「予防」という用語は、予防的(prophylactic)又は予防的(preventative)処置を指し、目的は、疾患若しくは障害の発症を予防又は遅延させ、又は疾患若しくは障害に関連する症状の発症を遅延させることである。一部の実施形態では、「予防」は、肺の疾患又は障害に関連する状態の進行若しくは重症度、又は肺機能の悪化を遅らせることを指す。
【０１８５】
別の実施形態では、肺疾患の「治療」はまた、疾患の症状又は副作用からの軽減を提供すること含む(緩和治療を含む)。例えば、呼吸器障害、例えば、喘息に罹患している対象における炎症、気管支痙攣、気管支収縮、息切れ、喘鳴、下肢浮腫、腹水症、咳嗽、喀血、又はチアノーゼの任意の低減は、どんなに僅かであっても、症状が軽減されたとみなされる。本明細書に記載される態様の一部の実施形態では、疾患又は障害の症状又は測定されたパラメータは、LSCが単離され富化された集団の投与により、対照又は未処置対象と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%軽減される。
【０１８６】
測定された又は測定可能なパラメータは、臨床的に検出可能な疾患のマーカー、例えば、上昇若しくは低下したレベルの臨床的又は生物学的マーカー、並びに臨床的に許容される症状の規模又は疾患若しくは障害のマーカーに関連するパラメータを含む。しかしながら、本明細書に開示される組成物の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。必要とされる正確な量は、因子、例えば、治療される肺疾患の種類、損傷の程度、目的が治療若しくは予防又はその両方のためであるかどうか、対象の年齢、利用可能な細胞の量などに依存して変わる。したがって、当業者は、治療によって病状が改善され得るが、疾患に対する完全な救済法ではない場合があることを認識する。
【０１８７】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、本明細書で使用される「有効量」という用語は、とき、呼吸器の疾患又は障害の少なくとも1つ以上の症状を軽減するために必要とする非mhLSCの単離又は富化された集団の量を指し、所望の効果を提供するのに、例えば、気管支肺異形成症を有する対象を治療するために、十分な量の薬理学的組成物に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えば、気管支肺異形成症を有するか又はそのリスクがある対象に投与した場合に特定の効果を生じさせるのに十分である、本明細書に開示される治療方法を用いて非mhLSCを単離及び富化した量を指す。
【０１８８】
記載された方法のすべての態様のうちの別の実施形態では、本明細書で使用される有効量はまた、疾患の症状の発症を予防若しくは遅延させ、症状の疾患の経過を変更し(例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる)、又はさらには疾患の症状を逆転させるのに十分の量を含む。特定の効果に必要とされる非mhLSCの有効量は、各個体によって変わり、また対処する肺疾患の種類によっても変わる。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、日常的な実験を用いて当業者によって決定され得る。
【０１８９】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載された方法に従って細胞を投与する前に、肺組織に影響を及ぼす疾患又は障害を有するとして最初に診断される。記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、対象、は、細胞を投与する前に、肺の疾患又は障害を発症するリスクがあるとして最初に診断され、例えば長時間の喫煙者、炭鉱作業員及びアスベストに以前に曝露された人である。
【０１９０】
本明細書に記載される治療方法のすべての態様における使用について、有効量の単離された非mhLSCは、投与あたり少なくとも102、少なくとも5×102、少なくとも103、少なくとも5×103の非mhLSC、少なくとも104、少なくとも5×104、少なくとも105、少なくとも2×105、少なくとも3×105、少なくとも4×105、少なくとも5×105、少なくとも6×105、少なくとも7×105、少なくとも8×105、少なくとも9×105、若しくは少なくとも1×106の非mhLSC又はその倍数を含む。一部の実施形態では、単離された非mhLSCの1回を超える投与が対象に行われる。単離された非mhLSCの複数回投与は、ある期間にわたって起こり得る。非mhLSCは、1人以上のドナーから単離若しくは富化され得、又は自己由来供給源から得られ得る。
【０１９１】
本明細書に記載される方法における使用のための例示的な投与様式には、限定されないが、注射、肺内(鼻腔内及び気管内を含む)注入、吸入(鼻腔内を含む)、及び摂取が含まれる。「注射」は、限定されないが、静脈内、動脈内、心室内、心臓内、経気管内注射及び注入を含む。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口投与される」という語句は、通常は注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を指し、限定されないが、静脈内、脳室内、心臓内、経気管内注射及び注入が含まれる。
【０１９２】
記載された治療方法のすべての態様のうちの好ましい実施形態では、有効量の単離された非mhLSCは、肺内投与又は送達によって対象に投与される。本明細書で定義されるように、肺内投与又は肺内送達は、非mhLSCについて単離され、富化された集団が、これらの細胞の対象の気道との直接接触をもたらすように投与されるすべての投与経路を指し、限定されないが、経気管投与、気管内投与、及び鼻腔内投与が挙げられる。このような実施形態では、細胞は、鼻腔又は気管内に注射される。一部の実施形態では、細胞は、対象によって直接吸入される。記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、細胞の肺内送達には、例えば、気管内に配置されたチューブ又は「気管挿管」を介して挿管対象に細胞を、例えば細胞懸濁液として投与する投与方法が含まれる。
【０１９３】
本明細書で使用されるとき、「気管挿管」は、可撓性チューブ、例えば、プラスチックチューブを気管内に配置することを指す。本明細書で「口腔気管挿管」と呼ばれる最も一般的な気管挿管は、喉頭鏡の助けを借りて、気管内チューブを口、喉頭、及び声帯を通って気管へと通す場合である。次に、球状部をチューブの遠位先端付近で膨張させて、それを所定の位置に固定し、血液、嘔吐物、及び分泌物から気道を保護するのを助ける。記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、細胞は、チューブが鼻、喉頭、声帯、及び気管を通過する気管挿管として定義される「鼻気管挿管」を有する対象に投与される。
【０１９４】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、有効量の、単離され、富化された非mhLSCは、全身投与、例えば、静脈内投与によって対象に投与される。
【０１９５】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」及び「末梢投与される」という語句は、肺への直接以外の、代わりに対象の循環器システムに入るような非mhLSCの集団の投与を指す。
【０１９６】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、明確な効果を達成するために1つ以上の投与経路が対象において使用される。例えば、非mhLSCの単離又は富化された集団は、呼吸器上皮を治療又は修復するため、並びに肺血管の修復及び再生のためにそれぞれ気管内と腹腔内投与経路の両方によって対象に投与される。このような実施形態では、異なる有効量の単離又は富化された非mhLSCを各投与経路に使用することができる。
【０１９７】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、方法は、単離又は富化された非mhLSCの投与によって媒介される効果、例えば、非mhLSCのホーミング若しくは生着の増強、呼吸器上皮の修復の増加、又は肺血管系の増殖及び再生の増加、すなわち血管再生を増強又は強化することができる1つ以上の治療剤、例えば、薬物又は分子の投与をさらに含む。治療剤は、タンパク質(例えば、抗体又は抗原結合性断片)、ペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ウイルス、小分子、化学化合物、細胞、薬物などであり得る。本明細書において定義されるように、「血管再生」は、限定されないが、呼吸器疾患を含む、本明細書に記載される、傷害又は外傷後の、新しい血管のデノボ形成、又は損傷を受けた血管(例えば、毛細血管)の置き換えを指す。「血管新生」は、このような現象を説明するために互換的に使用され得る用語である。
【０１９８】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、方法は、肺組織において細胞増殖、分化、及び血管新生を刺激することが当該技術分野において公知である増殖、分化、及び血管新生作用物質又は因子と一緒の1つ以上の投与をさらに含む。一部の実施形態では、これらの因子のうちのいずれか1つは、本明細書に記載される組成物を投与する前又は後に送達することができる。これらの因子のうちのいずれか1つの複数のその後の送達もまた、生着、分化及び/又は血管新生を誘導及び/又は増強するために起こり得る。適切な増殖因子としては、限定されないが、形質転換増殖因子ベータ(TGFβ)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、アンジオポエチン、上皮細胞増殖因子(EGF)、骨形成タンパク質(BMP)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリン及び3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)が挙げられる。他の例は、Dijkeら、「Growth Factors for Wound Healing」、Bio/Technology、7巻:793〜798頁(1989年); Mulder GD、Haberer PA、Jeter KF編、Clinicians' Pocket Guide to Chronic Wound Repair.  第4版  Springhouse、PA: Springhouse Corporation; 1998年:85; Ziegler T.R.、Pierce, G.F.及びHerndon, D.N.、1997年、International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston、1995年、Serono Symposia USA)、Publisher: Springer Verlagに記載され、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
一実施形態では、組成物は、損傷を受けた組織の治癒又は再生を誘導するための、例えば、新生血管のための接続点を提供するために周囲組織から血管形成細胞を動員するための、1つ以上の生物活性剤を含むことができる。適切な生物活性剤としては、限定されないが、薬学的に活性な化合物、ホルモン、増殖因子、酵素、DNA、RNA、siRNA、ウイルス、タンパク質、脂質、ポリマー、ヒアルロン酸、炎症促進性分子、抗体、抗生物質、抗炎症剤、アンチセンスヌクレオチド及び形質転換核酸又はそれらの組合せが挙げられる。他の生物活性剤は、細胞増殖のための有糸分裂及び細胞分化の増加を促進し得る。
【０２００】
多数の増殖因子及び分化因子が、幹細胞及び始原細胞の細胞増殖及び分化を刺激することが当該技術分野において公知である。適切な増殖因子及びサイトカインには、始原細胞を刺激し、維持し、及び/又は動員することができる任意のサイトカイン又は増殖因子が含まれる。それらには、限定されないが、幹細胞因子(SCF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージ刺激因子(GM-CSF)、間質細胞由来因子-1、スチール因子、血管内皮増殖因子(VEGF)、TGFβ、血小板由来増殖因子(PDGF)、アンジオポエチン(Ang)、上皮細胞増殖因子(EGF)、骨形成タンパク質(BMP)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子(IGF-1)、インターロイキン(IL)-3、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、及びIL-13、コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、fit3リガンド、及び腫瘍壊死因子αが含まれる。他の例は、Dijkeら、「Growth Factors for Wound Healing」、Bio/Technology、7巻:793〜798頁(1989年); Mulder GD、Haberer PA、Jeter KF編、Clinicians' Pocket Guide to Chronic Wound Repair.  第4版  Springhouse、PA: Springhouse Corporation; 1998年:85; Ziegler T.R.、Pierce, G.F.及びHerndon, D.N.、1997年、International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston、1995年、Serono Symposia USA)、Publisher: Springer Verlagに記載されている。
【０２０１】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一実施形態では、記載された組成物は、適切な生理学的担体溶液、例えば、生理食塩水中の非mhLSCの懸濁液である。懸濁液は、追加の生物活性剤を含有し得、限定されないが、薬学的に活性な化合物、ホルモン、増殖因子、酵素、DNA、RNA、siRNA、ウイルス、タンパク質、脂質、ポリマー、ヒアルロン酸、炎症促進性分子、抗体、抗生物質、抗炎症剤、アンチセンスヌクレオチド及び形質転換核酸又はそれらの組合せが挙げられる。
【０２０２】
記載された治療方法のすべての態様のうちのある種の実施形態では、治療剤は「血管新生促進因子」であり、これは直接的又は間接的に新しい血管形成を促進する因子を指す。血管新生促進因子には、限定されないが、上皮細胞増殖因子(EGF)、E-カドヘリン、VEGF、アンギオゲニン、アンジオポエチン-1、線維芽細胞増殖因子:酸性(aFGF)及び塩基性(bFGF)、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘパラナーゼ、肝細胞増殖因子(HGF)、アンジオポエチン、低酸素誘導因子-1(HIF-1)、インスリン様増殖因子-1(IGF-1)、IGF、BP-3、血小板由来増殖因子(PDGF)、VEGF-A、VEGF-C、色素上皮由来因子(PEDF)、血管透過性因子(VPF)、ビトロネクチン、レプチン、トレフォイルペプチド(TFF)、CYR61(CCN1)、NOV(CCN3)、レプチン、ミドカイン、胎盤増殖因子  血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)、血小板由来増殖因子-BB(PDGF-BB)、プレイオトロフィン(PTN)、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換増殖因子-アルファ(TGF-α)、形質転換増殖因子-ベータ(TGF-ベータ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-アルファ)、c-Myc、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、間質由来因子1(SDF-1)、散乱因子(SF)、オステオポンチン、幹細胞因子(SCF)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、トロンボスポンジン-1(TSP-1)、プレイトロフィン、プロリフェリン、フォリスタチン、胎盤増殖因子(PIGF)、ミドカイン、血小板由来増殖因子-BB(PDGF)、及びフラクタルカイン、並びに血管新生及び血管分布の増加の誘導因子である炎症性サイトカイン及びケモカイン、例えば、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-8(IL-8)、CCL2(MCP-1)、インターロイキン-8(IL-8)及びCCL5(RANTES)が挙げられる。1つ以上の治療剤の適切な投薬量は、約0.1〜約500ng/ml、約10〜約500ng/ml、約20〜約500ng/ml、約30〜約500ng/ml、約30〜約500ng/ml、約50〜約500ng/ml、又は約80ng/ml〜約500ng/mlの濃度を含み得る。一部の実施形態では、1つ以上の治療剤の適切な投薬量は、約10、約25、約45、約60、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約225、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、又は約500ng/mlである。他の実施形態では、1つ以上の治療剤の適切な投薬量は、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.5、又は約2.0μg/mlである。
【０２０３】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、方法は、治療剤として1つ以上の界面活性剤の投与をさらに含むか、又は1つ以上の界面活性剤治療と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される界面活性剤は、任意の表面活性剤を指し、限定されないが、湿潤剤、表面張力低下剤、洗剤、分散剤及び乳化剤が挙げられる。肺胞表面上で単分子層を形成するものが特に好ましく、限定されないが、リポタンパク質、レシチン、ホスファチジルグリセロール(PG)、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン(DPPG)、アポタンパク質A、アポタンパク質B、アポタンパク質C、アポタンパク質D、パルミトイルオレオイル、ホスファチジルグリセロールパルミチン酸及びスフィゴミエリンが挙げられる。例示的な界面活性剤としては、限定されないが、界面活性タンパク質A、界面活性タンパク質B、界面活性タンパク質C、界面活性タンパク質D、並びにそれらの混合物及び組合せが挙げられる。市販の界面活性剤としては、限定されないが、KL-4、SURVANTA(登録商標)、ウシ脂質抽出物界面活性剤(BLES)、INFASURF(登録商標)(CALFACTANT(登録商標))、CUROSURF(登録商標)、HL-10、AEROSURF(登録商標)、SUBOXONE(登録商標)、ALVEOFACT(登録商標)、SURFAXIN(登録商標)、VENTICUTE(登録商標)、PUMACTANT(登録商標)/ALEC、及びEXOSURF(登録商標)が挙げられる。
【０２０４】
記載された治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、1つ以上の他の標準的な治療剤の投与は、呼吸器障害又は状態、例えば、喘息、RDS又はCOPDを治療するために、富化された非mhLSCの投与と組み合わせることができ、抗コリン薬、β-2-アドレナリン受容体アゴニスト、例えば、ホルモテロール若しくはサルメテロール、コルチコステロイド、抗生物質、抗酸化剤、抗高血圧剤、一酸化窒素、カフェイン、デキサメタゾン、及びIL-10又は他のサイトカインの使用が挙げられる。一部の実施形態では、含まれる標準的な治療剤は、肺疾患の症状を治療するために使用される。表1は、一部の肺疾患に対する標準的な内科治療の一部を示す。
【０２０５】
例えば、状態、例えば、CFを治療し、改善し、又はその進行を遅らせるための本明細書に記載される方法における非mhLSCの使用は、他の適切な治療又は治療剤と任意選択で組み合わせることができる。CFについて、これには、限定されないが、経口又はエアロゾルによるコルチコステロイド治療、イブプロフェン治療、DNAse又はIL-10治療、食事制御、例えば、ビタミンE補充、病原体、例えばインフルエンザ菌に対する予防接種、胸部理学療法、例えば、胸部ドレナージ若しくは打診、又はその中の組合せが挙げられる。
【０２０６】
記載される治療方法のすべての態様のうちの一部の実施形態では、標準的な治療剤は、詳細に記載されているものである、例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine、第15版、2001年、E. Braunwaldら編、McGraw-Hill、New York、N.Y. 、ISBN 0-07-007272-8、特に252〜265章、1456〜1526頁; Physicians Desk Reference 第54版 2000年、303-3251頁、ISBN 1-56363-330-2、Medical Economics Co., Inc. 、Montvale、N.Jを参照されたい。肺疾患のいずれか、呼吸器又は肺状態の治療は、本明細書に記載される治療レジメンを用いて達成することができる。慢性状態では、治療頻度を低減するために間欠的な投薬を使用することができる。間欠投薬プロトコールは、本明細書に記載の通りである。
【０２０７】
本明細書に記載される方法の臨床使用について、本明細書に記載される富化された非mhLSCの単離又は富化された集団は、対象において有効な治療をもたらす任意の薬学的に許容される化合物、材料、担体又は組成物とともに投与され得る。したがって、本明細書に記載される方法ににおける使用のための医薬製剤は、1つ以上の薬学的に許容される成分と組み合わせて、単離又は富化された非mhLSCの集団を含有することができる。
【０２０８】
「担体」という用語は、それとともに治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような医薬担体は、滅菌液体、例えば、水及び油であり得、石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、ライス、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、所望であれば、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤及び担体、例えば、トリグリセリドを用いて、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。適切な医薬担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Gennaro編 (Mack Publishing Co.、1990年)に記載されている。製剤は、投与様式に適するべきである。
【０２０９】
一実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおける使用のために、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されるか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。具体的には、それは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、合理的な利益/リスク比に見合っている、人間及び動物の組織と接触させて使用するのに適している化合物、材料、組成物及び/又は剤形を指す。
【０２１０】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、LSCの単離又は富化された集団の活性の維持、運搬、又は1つの臓器若しくは体の一部から別の臓器若しくは体の一部への輸送に関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、培地(例えば幹細胞培地)、封入材料、製造補助剤(例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウム若しくはステアリン酸亜鉛、又はステリン酸)、又は溶媒封入材料を意味する。
【０２１１】
各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者に有害ではないという意味において「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の一部の例としては、(1)糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース、(2)リン酸緩衝液、(3)発熱物質を含まない水、(4)等張生理食塩水、(5)麦芽、(6)ゼラチン、(7)潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク、(8)賦形剤、例えば、カカオバター及び坐剤用ワックス、(9)油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油、(10)グリコール、例えば、プロピレングリコール、(11)ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール(PEG)、(12)エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、(13)寒天、(14)緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、(15)アルギン酸、(16)セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース及び酢酸セルロース、(17)粉末化トラガカント、(18)リンガー溶液、(19)エチルアルコール、(20)pH緩衝溶液、(21)ポリエステル、ポリカーボネート及び/又はポリ無水物、(22)増量剤、例えば、ポリペプチド及びアミノ酸、(23)血清構成要素、例えば、血清アルブミン、HDL及びLDL、(24)C2〜C12アルコール、例えば、エタノール、(25)デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン、並びに(26)医薬製剤に用いられる他の非毒性適合物質が含まれる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤も製剤中に存在することができる。用語、例えば、「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などは、本明細書において互換的に使用される。
【０２１２】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、明細書、実施例及び特許請求の範囲において用いられるある種の用語はここに集められる。
【０２１３】
本明細書で使用されるとき、インビボ(ラテン語の「生体中で」)は、生物全体、例えば、ヒト対象を使用する方法を指す。本明細書で使用されるとき、「エクスビボ」(ラテン語:生体外で)は、対象の体外で行われる方法を指し、例えば、ドナー対象から得られた肺組織から非mhLSCを単離し、次に、レシピエント対象に単離された非mhLSC試料を投与する手順について、臓器、細胞、又は組織が、生きている対象から採取される手順を指す。本明細書で使用されるとき、「インビトロ」は、対象の外で、例えば、インビトロでの細胞培養実験で行われる方法を指す。例えば、本明細書に記載される方法に従って使用又は投与される前に、単離された非mhLSCをインビトロで培養して、非mhLSCの数を拡大若しくは増加させるか、又は非mhLSCの特定の系列若しくは細胞型、例えば、呼吸器上皮細胞へ直接分化させることができる。
【０２１４】
本明細書で使用される「多能性」という用語は、異なる条件下で、1つ以上の特定の細胞型系列に関与し、関与した系列の1つを超える分化細胞型に分化し、好ましくは3つの胚細胞層すべてに特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いて、1つより多い細胞型、好ましくは3つすべての胚葉に分化するそれらの能力によって主に特徴付けられる。多能性はまた、胚性幹(ES)細胞マーカーの発現によって証明されるが、多能性についての好ましい試験は3つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力の実証である。このような細胞を単に培養することは、それ自体では、それらを多能性にするわけではないことに留意すべきである。初期化された多能性細胞(例えば、その用語が本明細書において定義されるようなiPS細胞)はまた、一般的に、培養中の限られた数の分裂に対してのみ能力を有する初代細胞親と比較して、増殖能を喪失することなく延長して継代する能力の特徴を有する。
【０２１５】
本明細書で使用される「始原」細胞という用語は、分化によって生じることができる細胞と比較して、より原始的な(すなわち、完全に分化した細胞又は最終的に分化した細胞よりも発生経路又は進行に沿ったより早期段階にある)細胞表現型を有する細胞を指す。多くの場合、始原細胞はまた、著しい又は非常に高い増殖能を有することができる。始原細胞は、発生経路に応じて、及び細胞が発生し、分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞型又は単一の分化した細胞型を生じさせることができる。始原細胞は、特定の決定系列の前駆細胞を生じ、例えば、ある種の肺始原細胞は分裂して肺上皮系列前駆細胞を生じる。これらの前駆細胞は分裂し、最終的に肺上皮細胞に分化する多くの細胞を生じる。
【０２１６】
本明細書で使用される「前駆」細胞という用語は、最終的に分化した細胞よりも原始的である細胞表現型を有するが、同じ発生経路に沿う幹細胞又は始原細胞よりも原始的ではない細胞を指す。「前駆」細胞は、典型的には、「幹細胞」の娘の一部である「始原」細胞の子孫細胞である。典型的な非対称細胞分裂の娘の1つは幹細胞の役割を担っている。
【０２１７】
「胚性幹細胞」という用語は、胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために使用される(米国特許第5,843,780号、同第6,200,806号を参照されたい)。このような細胞は、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる(例えば、米国特許第5,945,577号、同第5,994,619号、同第6,235,970号を参照されたい)。胚性幹細胞の識別可能な特徴は、胚性幹細胞の表現型を定義する。したがって、細胞が他の細胞と区別され得るように、胚性幹細胞の固有の特徴の1つ以上を有する場合、細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な識別可能な胚性幹細胞の特徴としては、限定されないが、遺伝子発現プロファイル、増殖能力、分化能力、核型、特定の培養条件に対する応答性などが挙げられる。
【０２１８】
「成体幹細胞」という用語は、胎児、若年及び成人の組織を含む非胚性組織に由来する任意の多分化能幹細胞を指すために使用される。一部の実施形態では、成体幹細胞は、非胎児起源であり得る。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、及び心筋などの多種多様な成体組織から単離されている。これらの幹細胞のそれぞれは、遺伝子発現、因子応答性、及び培養中の形態学に基づいて特徴付けることができる。例示的な成体幹細胞には、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、及び膵臓幹細胞が含まれる。上記のように、幹細胞は、実質的にあらゆる組織に常在していることが見出されている。したがって、本発明は、幹細胞集団を、実質的にあらゆる動物組織から単離することができることを認識する。
【０２１９】
細胞個体発生との関連で、「分化した」又は「分化している」という形容詞は、「分化した細胞」が、比較されている細胞よりも発生経路に沿ってさらに下流に進行した細胞であることを意味する相対的な用語である。したがって、幹細胞は、系列限定された前駆細胞(例えば、肺幹細胞)に分化することができ、それは、次に、経路のさらに下流にある他の種類の前駆細胞(例えば、胸腺細胞又はTリンパ球前駆体)に分化することができ、次に、最終段階の分化した細胞に至り、これはある種の組織型において特徴的な役割を演じ、さらに増殖する能力を保持してもしなくてもよい。
【０２２０】
「分化細胞」という用語は、その用語が本明細書において定義されているように、その本来の形態において多能性ではない任意の初代細胞を意味する。言い換えれば、「分化細胞」という用語は、細胞の分化プロセスにおいて、それほど特殊化されていない細胞型の細胞(例えば、幹細胞、例えば、肺幹細胞)に由来する、より特殊化された細胞型の細胞を指す。理論に限定されることを望まないが、正常な個体発生の過程における多能性幹細胞は、造血幹細胞及び他の細胞型を形成することができる内皮細胞に最初に分化することができる。肺幹細胞のさらなる分化は、I型及びII型の肺細胞、内皮細胞型、平滑筋、及び上皮細胞を含む様々な肺細胞型の形成をもたらす。
【０２２１】
本明細書で使用されるとき、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞(「配偶子」としても知られる)は、受精中に融合して、そこから哺乳動物胚全体が発達する接合子と呼ばれる細胞を産生する、精子及び卵子である。精子及び卵子、それらが作られる細胞(配偶子母細胞)並びに未分化幹細胞を除いて、哺乳動物の体の他のあらゆる細胞型は体細胞である:内臓、皮膚、骨、血液、及び結合組織はすべて体細胞で構成される。一部の実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚中に存在しないか又は胚から得られず、インビトロでのこのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は「成体の体細胞」であり、それは胚又は胎児以外の生物に存在するか若しくはそれから得られる、又はインビトロでのこのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。
【０２２２】
本明細書で使用されるとき、「成体細胞」という用語は、胚発生後に体全体に見出される細胞を指す。
【０２２３】
「表現型」という用語は、実際の遺伝子型とは無関係に、特定の組の環境条件及び因子の下で、細胞又は生物を定義する1つ又はいくつかの総生物学的特徴を指す。例えば、細胞内の細胞表面マーカーの発現。
【０２２４】
本明細書で言及される「細胞培養培地」という用語(本明細書では「培養培地」又は「培地」とも称される)は、細胞生存率を維持し、増殖を支持する栄養素を含有する細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、適切な組合せで、以下:塩、緩衝液、アミノ酸、グルコース又は他の糖、抗生物質、血清又は血清代替物、及び他の構成要素、例えば、ペプチド増殖因子などのいずれかを含有し得る。特定の細胞型のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【０２２５】
「再生」又は「自己複製」又は「増殖」という用語は、本明細書では互換的に使用され、長期間にわたって及び/又は数月から数年にわたって同じ特殊化されていない細胞型に分割することによって、幹細胞がそれ自体再生する能力を指すために使用される。
【０２２６】
一部の例では、「増殖」は、単一の細胞から2つの同一の娘細胞への反復分裂による細胞の拡大を指す。
【０２２７】
本明細書で使用される「系列」という用語は、共通の祖先を有する細胞又は共通の発生運命を有する細胞を表す。
【０２２８】
本明細書で使用される「単離された細胞」という用語は、それが元々見出された生物から取り出された細胞、又はこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。任意選択で、細胞は、後に第2の生物に導入されるか、又は細胞(又はそれが由来する細胞)が単離された生物に再導入される。
【０２２９】
本明細書で使用される単離された細胞の集団に関する「単離された集団」という用語は、混合された又は異種の細胞の集団から取り出され、分離された細胞の集団を指す。一部の実施形態では、単離された集団は、そこから細胞が単離又は富化された異種の集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。
【０２３０】
「組織」という用語は、一緒になってある種の特定の機能を果たす特殊化された細胞の群又は層を指す。「組織特異的」という用語は、特定の組織由来の細胞の供給源を指す。
【０２３１】
「減少する」、「低減した」、「低減」、「減少する」又は「阻害する」という用語はすべて、本明細書において、一般的には統計学的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「低減した」、「低減」又は「減少する」又は「阻害する」は、典型的には、参照レベルと比較して少なくとも約5%〜10%の減少、例えば少なくとも約20%、若しくは少なくとも約30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、若しくは少なくとも約60%、若しくは少なくとも約70%、若しくは少なくとも約80%、若しくは少なくとも約90%の減少(すなわち、参照試料と比較して存在しないレベル)、又は参照レベルと比較して10〜90%の間の任意の減少を意味する。治療又は予防との関連で、参照レベルは、非mhLSCの集団を投与しない場合の対象の症状レベルである。
【０２３２】
「増加した」、「増加する」又は「増強する」という用語はすべて、本明細書において、一般的には統計学的に有意な量の増加を意味するために使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」又は「増強する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば少なくとも約20%、若しくは少なくとも約30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、若しくは少なくとも約60%、若しくは少なくとも約70%、若しくは少なくとも約80%、若しくは少なくとも約90%又はそれを超える増加、又は参照レベルと比較して10〜90%の間の増加、あるいは参照レベルと比較して少なくとも約2倍、又は少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍、又は少なくとも約5倍又は少なくとも約10倍の増加、又は2倍〜10倍の間若しくはそれを超える任意の増加を意味する。インビトロでの非mhLSCの拡大との関連で、参照レベルは、肺組織試料から単離された非mhLSCの初期数である。
【０２３３】
「統計学的に有意な」又は「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般的に、マーカー濃度の通常を2標準偏差(2SD)下回る又はそれより低いことを意味する。本用語は、相違があるという統計学的証拠を指す。帰無仮説が実際に真である場合に、帰無仮説を棄却する決定を下す確率として定義される。多くの場合、決定はp値を使用して行われる。
【０２３４】
本明細書で使用されるとき、「含むこと」又は「含む」という用語は、本発明に本質的であるが、本質的であるかどうかにかかわらず、不特定の要素を含めることに対して開放されている組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素に関して使用される。
【０２３５】
「からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指し、実施形態のその説明に列挙されていない任意の要素を除く。
【０２３６】
他に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes IX、Jones & Bartlett Publishingによる出版、2007年(ISBN-13: 9780763740634); Kendrewら(編) 、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.による出版、1994年(ISBN 0-632-02182-9);及びRobert A. Meyers (編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.による出版、1995年(ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。さらに、文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【０２３７】
特に明記しない限り、本発明は、当業者に公知である標準的な手順、例えば、それらの全体が参照によりすべて本明細書に組み込まれる、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. 、USA (1982年); Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版) 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. 、USA (1989年); Davisら、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier Science Publishing, Inc. 、New York、USA (1986年); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubelら編、John Wiley and Sons, Inc.) 、Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coliganら編、John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacinoら編、John Wiley and Sons, Inc.) 、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney、出版社: Wiley-Liss;第5版(2005年)並びにAnimal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology、57巻、Jennie P. Mather 及びDavid Barnes編、Academic Press、第1版、1998年)を用いて行われた。
【０２３８】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬などに限定されず、したがって変化してもよいことを理解するべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２３９】
操作例以外、又は他に示されない限り、本明細書で使用される成分の量又は反応条件を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージと関連して使用される場合、±1%を意味する。
【０２４０】
特定されたすべての特許及び刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るこのような刊行物に記載された方法論を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。この点に関して、先行発明のために又は他の何らかの理由で、本発明者らがこのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。これらの書面の日付に関する記述又は内容に関する表現はすべて、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの書面の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【０２４１】
一部の実施形態では、本発明は、以下のアルファベット順の段落のうちのいずれかで定義することができる。
[A]ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
[B]肺組織が成人由来である、段落[A]に記載の医薬組成物。
[C]非mhLSCがエクスビボでさらに拡大される、段落[A]又は[B]に記載の医薬組成物。
[D]c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を調製する方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)からなる、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、対象からヒト肺組織を得るステップ、ヒト肺組織由来のhLSCのプールから非mhLSCを選択するステップ、及び培養培地中で前記細胞を増殖させるステップを含む、方法。
[E]c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を増殖させる方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)からなる、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、ヒト肺組織試料由来のhLSCのプールから少なくとも1つの非mhLSCを選択するステップ、前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを培養培地に導入するステップ、及び培養培地中で前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを増殖させるステップを含む、方法。
[F]それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、 前記肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、及びそれを必要とする対象に前記非mhLSCの拡大された集団を投与するステップを含む、方法。
[G]それを必要とする対象における損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生する方法であって、肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、前記非mhLSCの集団を培養及び拡大するステップ、及び対象における損傷を受けた肺組織の領域に、損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生するのに有効な用量の前記非mhLSCの抽出及び拡大された集団を投与するステップを含む、方法。
[H]ヒト肺組織が成体肺組織である、段落[D]〜[G]のいずれか一つに記載の方法。
[I]ヒト肺組織が、非mhLSCを選択又は抽出する前に凍結保存される、段落[D]〜[H]のいずれか一つに記載の方法。
[J]非mhLSCの選択又は抽出が、c-kitに対する抗体を用いて行われる、段落[D]〜[I]のいずれか一つに記載の方法。
[K]間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対するネガティブ選択をさらに含む、段落[D]〜[J]のいずれか一つに記載の方法。
[L]選択がフローサイトメトリーによる、段落[D]〜[K]のいずれか一つに記載の方法。
[M]選択が、ビーズにコンジュゲートされたc-kit抗体を用いる免疫磁気選択による、段落[D]〜[K]のいずれか一つに記載の方法。
[N]非mhLSCを凍結保存するステップをさらに含む、段落[D]〜[M]のいずれか一つに記載の方法。
[O]少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む、段落[F]〜[N]のいずれか一つに記載の方法。
[P]非mhLSCの集団が、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成及び/又は生成する、段落[F]〜[O]のいずれか一つに記載の方法。
[Q]非mhLSCが富化された集団を投与する前に、肺の疾患又は障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、段落[F]〜[P]のいずれか一つに記載の方法。
[R]非mhLSCを投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、段落[F]〜[Q]のいずれか一つに記載の方法。
[S]細胞を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防、修復、再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、段落[F]〜[R]のいずれか一つに記載の方法。
[T]投与が、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せである、段落[F]〜[S]のいずれか一つに記載の方法。
[U]肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、段落[T]に記載の方法。
[V]対象における肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための組成物であって、ヒト肺組織試料から単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を含む、組成物。
[W]肺組織が成人由来である、段落[V]に記載の組成物。
[X]c-kit細胞がエクスビボでさらに拡大される、段落[V]又は[W]に記載の組成物。
[Y]それを必要とする対象における肺障害を治療又は予防する方法であって、段落[A]〜[C]のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
[Z]それを必要とする対象における肺障害を治療又は予防する方法であって、段落[V]〜[X]のいずれか一つに記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
[AA]少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む、段落[Y]〜[Z]に記載の方法。
[BB]非mhLSCの集団が、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成及び/又は生成する、段落[Y]〜[AA]のいずれか一つに記載の方法。
[CC]非mhLSCが富化された集団を投与する前に、肺障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、段落[Y]〜[BB]のいずれか一つに記載の方法。
[DD]細胞を投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、段落[Y]〜[CC]のいずれか一つに記載の方法。
[EE]細胞を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防、修復、再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、段落[Y]〜[DD]のいずれか一つに記載の方法。
[FF]投与が、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せである、段落[Y]〜[EE]のいずれか一つに記載の方法。
[GG]肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、段落[FF]に記載の方法。
【０２４２】
本発明を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明する。本出願の全体を通じて引用されたすべての参考文献の内容、並びに図及び表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４３】
当業者は、せいぜい日常的な実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物、異なる培養培地及び添加物を使用して単離された細胞を培養拡大することができることを認識し、又は確認することができる。当業者は、培養培地及び添加物の選択を評価するための試験を行うことができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０２４４】
本明細書において、及び本明細書の全体を通じて引用された参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２４５】
ヒトの慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、慢性的な炎症、細気管支及び肺胞の拡張、肺胞壁の破壊、線維症、並びに最終的には呼吸不全によって特徴付けられる(1〜6)。テロメアの摩滅及び細胞老化は、気腫に対する感受性を高め、COPDを悪化させる(7〜10)。喫煙は、気腫を引き起こし、肺拡散能の減少に寄与する追加の負の要因となる(11、12)。重要なことに、この疾患の病因は未知であり、COPDの病理学を逆転させることができる治療はない。進行型では、唯一の希望は肺移植である。
【０２４６】
別の重度の疾患は特発性肺線維症(IPF)であり、主に、60歳以上の患者に発症し、死亡率が高い(13〜15)。遺伝的要因、環境障害及びウイルス感染は、IPFの発症及び進化に寄与していると主張されている(14)。テロメラーゼ及びテロメア短縮の突然変異は、IPFとともに見出されている(16〜24)。COPDに関して、現在、IPFのための十分に確立された治療はなく、利用可能な治療のいずれもこの患者集団における生存期間を延ばすものではない(25)。同様に、二次性進行性肺線維症(PPF)は、壊滅的な臨床的結果をもたらす(26〜29)。COPD及びIPF/PPFが、それらの病態生理学を定義し、治療の革新的な形態を開発するために新しい戦略の実施を要求することは明白である。
【０２４７】
最近、移植を拒否された対照肺(n=13)、IPF/PPF(n=8)及びCOPD(n=7)外植肺が研究された(図1)。本発明者らは、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプールが、間葉系エピトープCD44/CD73/CD105に対して陰性である1つの細胞クラス、すなわち非間葉系hLSC(非-mhLSC)、並びにこれらのエピトープを発現し(図2A)、脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞に分化する別の細胞クラス、すなわち間葉様hLSC(ml-hLSC)から構成されることを見出した。両方の細胞型は、組織特異的な成体幹細胞の特性、すなわち自己複製及びクローン形成能を有する(図2B及び2C)。対照及びIPF/PPF非mhLSC由来のクローンの大多数は、幹細胞形成コロニーの特色を示し、それらは、コンパクトな丸い形状であった(図2B、2つの左パネル)。屈折縁を有する非円形の不規則な形状のクローンが、対照の非mhLSCとともに時々見出されたが、IPF/PPFの非mhLSCでは29%の値に達した(図2B、2つの右パネル)。逆に、対照及びIPF/PPFのmhLSCは非環状クローンのみを形成した。重要なことに、環状クローンは、c-kitに対して強く陽性であり、核対細胞質比が高く、間葉系エピトープCD44/CD73/CD105に対して陰性である未分化細胞から構成された(図2C、左パネル)。しかしながら、非環状クローンは、c-kitについて弱く標識され、核対細胞質比が低く、CD44/CD73/CD105に対して陽性である細胞によって特徴付けられた(図2C、中央及び右パネル)。対照肺における非mhLSC(77%)及びml-hLSC(23%)の割合は、IPF/PPF及びCOPDによって著しく変化し、ml-hLSC及び非mhLSCは、それぞれほぼ50%である(図2D)。
【０２４８】
関連性として、クローン性非mhLSCは、肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞に分化するが(図示せず)、クローン性ml-hLSCは、上皮及び血管細胞系列を獲得しない。IPF/PPF肺由来のml-hLSCは、多数の線維芽細胞/筋線維芽細胞を生成し、マトリゲルに高速で湿潤し、筋線維芽細胞表現型を獲得する(図3)。これらのデータは、IPF/PPFでは、ml-hLSCがそれらを肺病理学の候補にする特徴を有することを示す。COPDでは、ml-hLSCの増加及び非mhLSCの減少は、COPD肺がガス交換単位を形成する能力を減弱させ、これは肺胞の拡張、肺胞壁の破壊及び呼吸不全に至る場合がある。
【０２４９】
重要なことに、機能的な非mhLSCのサブセットはIPF/PPF及びCOPD肺に存在し、ここに示されるように、これらの細胞を回収し、インビトロで繁殖させることができる。将来的には、IPF/PPF及びCOPDの壊滅的な結果を逆転させるために、自己由来細胞治療を実施することが可能になるはずである。
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【０２５０】
【表１】
2019533703.tif 000003
2019533703.tif 000004
【図１】
2019533703.tif 000005
【図２】
2019533703.tif 000006
【図３】
2019533703.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月27日(2019.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団、並びに
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項２】
肺組織が任意の年齢の対象に由来する、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
非mhLSCの集団が、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
非mhLSCの集団が自己複製性及びクローン原性である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象における肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための組成物であって、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を含む、組成物。
【請求項６】
肺組織が任意の年齢の対象に由来する、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
非mhLSCの集団が、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる、請求項5に記載の組成物。
【請求項８】
c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を調製する方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)を含む、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、
a.対象からヒト肺組織を得るステップ、
b.ヒト肺組織由来のhLSCのプールから非mhLSCを選択するステップ、及び
c.培養培地中で前記細胞を増殖させるステップ
を含む、方法。
【請求項９】
ヒト肺組織が、成体又は成体でない肺組織である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト肺組織が、非mhLSCを選択又は抽出する前に凍結保存される、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
非mhLSCの選択又は抽出が、c-kitに対する抗体を用いて行われる、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対するネガティブ選択をさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、
a.それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、
b.前記肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、
c.前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、並びに
d.それを必要とする対象に前記非mhLSCの拡大された集団を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
非mhLSCの集団を投与する前に、肺の疾患又は障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、請求項13に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
当業者は、せいぜい日常的な実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物、異なる培養培地及び添加物を使用して単離された細胞を培養拡大することができることを認識し、又は確認することができる。当業者は、培養培地及び添加物の選択を評価するための試験を行うことができる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団、並びに
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
２．肺組織が任意の年齢の対象に由来する、上記1に記載の医薬組成物。
３．非mhLSCの集団が、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる、上記1又は2に記載の医薬組成物。
４．非mhLSCの集団が自己複製性及びクローン原性である、上記1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
５．非mhLSCの集団がエクスビボでさらに拡大される、上記1〜4のいずれかに記載の医薬組成物。
６．肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せのために製剤化される、上記1〜5のいずれかに記載の医薬組成物。
７．肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、上記6に記載の医薬組成物。
８．c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を調製する方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)を含む、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、
a.対象からヒト肺組織を得るステップ、
b.ヒト肺組織由来のhLSCのプールから非mhLSCを選択するステップ、及び
c.培養培地中で前記細胞を増殖させるステップ
を含む、方法。
９．c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である肺幹細胞(非mhLSC)の単離された集団を増殖させる方法であって、非mhLSCが、非mhLSC、並びにc-kit及びCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陽性である間葉様肺幹細胞(ml-hLSC)を含む、c-kit陽性ヒト肺幹細胞(hLSC)のプール中にあり、
a.ヒト肺組織試料由来のhLSCのプールから少なくとも1つの非mhLSCを選択するステップ、
b.前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを培養培地に導入するステップ、及び
c.培養培地中で前記少なくとも1つの選択された非mhLSCを増殖させるステップ
を含む、方法。
１０．それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、
a.それを必要とする対象から又は異なる対象からヒト肺組織を得るステップ、
b.前記肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、
c.前記非mhLSCの集団を拡大するステップ、並びに
d.それを必要とする対象に前記非mhLSCの拡大された集団を投与するステップ
を含む、方法。
１１．それを必要とする対象における損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生する方法であって、
a.肺組織から、c-kitに対して陽性であり、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性である幹細胞(非mhLSC)の集団を抽出するステップ、
b.前記非mhLSCの集団を培養及び拡大するステップ、並びに
c.対象における損傷を受けた肺組織の領域に、損傷を受けた肺組織を修復及び/又は再生するのに有効な用量の前記非mhLSCの抽出及び拡大された集団を投与するステップ
を含む、方法。
１２．ヒト肺組織が、成体又は成体でない肺組織である、上記8〜11のいずれかに記載の方法。
１３．ヒト肺組織が、非mhLSCを選択又は抽出する前に凍結保存される、上記8〜12のいずれかに記載の方法。
１４．非mhLSCの選択又は抽出が、c-kitに対する抗体を用いて行われる、上記8〜13のいずれかに記載の方法。
１５．間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対するネガティブ選択をさらに含む、上記8〜14のいずれかに記載の方法。
１６．選択がフローサイトメトリーによる、上記8〜15のいずれかに記載の方法。
１７．選択が、ビーズにコンジュゲートされたc-kit抗体を用いる免疫磁気選択による、上記8〜15のいずれかに記載の方法。
１８．非mhLSCを凍結保存するステップをさらに含む、上記8〜17のいずれかに記載の方法。
１９．対象に少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む、上記10〜18のいずれかに記載の方法。
２０．非mhLSCの集団が、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成及び/又は生成する、上記10〜19のいずれかに記載の方法。
２１．非mhLSCの集団を投与する前に、肺の疾患又は障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、上記10〜20のいずれかに記載の方法。
２２．非mhLSCの集団を投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、上記10〜21のいずれかに記載の方法。
２３．非mhLSCの集団を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防又は修復又は再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、上記10〜22のいずれかに記載の方法。
２４．投与が、肺内投与、静脈内投与、全身投与、又はそれらの組合せである、上記10〜23のいずれかに記載の方法。
２５．肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、上記24に記載の方法。
２６．肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、上記10〜25のいずれかに記載の方法。
２７．非mhLSCの集団が自己由来である、上記10〜26のいずれかに記載の方法。
２８．非mhLSCの集団が同種異系である、上記10〜26のいずれかに記載の方法。
２９．対象における肺の疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための組成物であって、ヒト肺組織試料由来の単離された、間葉系間質細胞系列のCD44、CD73及びCD105マーカーに対して陰性であるc-kit陽性肺幹細胞(非mhLSC)の富化集団を含む、組成物。
３０．肺組織が任意の年齢の対象に由来する、上記29に記載の組成物。
３１．非mhLSCの集団が、肺胞上皮細胞、毛細血管内皮細胞、又はそれらの組合せに分化することができる、上記29又は30に記載の組成物。
３２．非mhLSCの集団が自己複製性及びクローン原性である、上記29〜31のいずれかに記載の組成物。
３３．非mhLSCの集団がエクスビボでさらに拡大される、上記29〜32のいずれかに記載の組成物。
３４．肺内投与、静脈内投与、全身投与、又はそれらの組合せのために製剤化される、上記29〜33のいずれかに記載の組成物。
３５．肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、上記34に記載の組成物。
３６．肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、上記29〜35のいずれかに記載の組成物。
３７．それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、上記1〜7のいずれかに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
３８．それを必要とする対象における肺の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、上記29〜36のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
３９．少なくとも1つの治療剤を投与することをさらに含む、上記37又は38に記載の方法。
４０．非mhLSCの集団が、肺上皮、肺血管系/肺内皮及び/又は肺胞を修復、再構成及び/又は生成する、上記37〜39のいずれかに記載の方法。
４１．非mhLSCの集団を投与する前に、肺障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む、上記37〜40のいずれかに記載の方法。
４２．非mhLSCの集団を投与する前に、損傷を受けた肺の構造的及び機能的な完全性の回復を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、上記37〜41のいずれかに記載の方法。
４３．非mhLSCの集団を投与する前に、肺血管系又は肺上皮、肺内皮、又は肺胞の治療、予防又は修復又は再構成又は生成を必要とする対象を選択するステップをさらに含む、上記37〜42のいずれかに記載の方法。
４４．投与が、肺内投与、全身投与、静脈内投与、又はそれらの組合せである、上記37〜43のいずれかに記載の方法。
４５．肺内投与が、気管内投与又は鼻腔内投与である、上記44に記載の方法。
４６．肺の疾患又は障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、又は進行性肺線維症(PPF)のうちの1つ以上である、上記37〜45のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2019533703.tif 000008
2019533703.tif 000009
2019533703.tif 000010