(57)【要約】  炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有する単離の又は組換え体のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチドが提供される。その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する方法もまた提供され、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する量の単離の又は組換え体の肺炎球菌ｐｅｐＮポリペプチドを対象に投与することを含む。その必要がある対象の望ましくない炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を特徴とするか又はそれと関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法もまた提供され、治療有効量の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドを対象に投与することを含む。その必要がある対象の肺炎球菌感染を処置する方法もまた提供され、治療有効量の抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤を対象に投与することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、
その機能的なバリアントが炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、
単離の又は組換え体のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチド。
【請求項２】
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが異種ポリペプチドに融合される、
請求項１に記載の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチド。
【請求項３】
異種ポリペプチドがエピトープタグである、
請求項２に記載の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチド。
【請求項４】
機能的なバリアントが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチド。
【請求項５】
医薬的に許容される担体中に請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドを含む、組成物。
【請求項６】
方法が、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する量の単離の又は組換え体のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチドを対象に投与することを含み、
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、
その機能的なバリアントが、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、
その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する方法。
【請求項７】
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが異種ポリペプチドに融合される、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
異種ポリペプチドがエピトープタグである、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
機能的なバリアントが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である、
請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが医薬的に許容される担体中にある、
請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
炎症性サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される、
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象がヒトである、
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、治療有効量の単離の又は組換え体のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチドを対象に投与することを含み、
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、
その機能的なバリアントが、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、
その必要がある対象の望ましくない炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を特徴とするか又はそれと関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法。
【請求項１４】
疾患、障害、又は状態が、肺、関節、眼、腸、皮膚、又は心臓の疾患、障害、又は状態である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患、障害、又は状態が、喘息、成人型呼吸窮迫症候群、気管支炎、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性膝関節症、骨髄炎、副鼻腔炎、鼻ポリープ、痛風関節炎、ぶどう膜炎、結膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、遠位直腸炎、にきび、乾癬、湿疹、皮膚炎、冠動脈梗塞ダメージ、冠動脈疾患、慢性炎症、エンドトキシンショック、及び平滑筋増殖障害からなる群から選択される、
請求項１３に記載の方法方法。
【請求項１６】
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが異種ポリペプチドに融合される、
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
異種ポリペプチドがエピトープタグである、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
機能的なバリアントが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である、
請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが、医薬的に許容される担体中にある、
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性サイトカインが、インターロイキン１（ＴＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される、
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象がヒトである、
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、治療有効量の抗アミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチド阻害剤を対象に投与することを含み、
抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤が、抗ｐｅｐＮポリペプチド抗体若しくはその抗原結合断片、低分子ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤、ｐｅｐＮポリペプチドに結合若しくはそれと物理的に相互作用するＲＮＡ若しくはＤＮＡアプタマー、可溶性ｐｅｐＮポリペプチド受容体、ｐｅｐＮポリペプチド特異的アンチセンス分子、又はｐｅｐＮポリペプチド特異的ｓｉＲＮＡ分子である、
その必要がある対象の肺炎球菌感染を処置する方法。
【請求項２３】
ｐｅｐＮポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含む単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドであり、
その機能的なバリアントが、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
機能的なバリアントが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象がヒトである、
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学及び医学の分野に関し、肺炎球菌阻害因子組成物及びその使用の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎球菌による感染は重症の疾患をもたらし得る。世界保健機関（ＷＨＯ）は１６０万人よりも多くが肺炎球菌感染によって毎年死亡していると見積もっている。これは５歳未満の８００，０００人よりも多くの児童を包含する。肺炎球菌性髄膜炎は肺炎球菌性疾患の最も重症の形態である。開発途上国においては、肺炎球菌性髄膜炎はそれに罹患した児童の４０から７０パーセントを殺すか又はそれらに障害を残す（非特許文献１）。増大していく薬物耐性肺炎球菌感染率は、抗生物質処置の有効性の脅威になっている（非特許文献２及び３）。肺炎球菌は、多くの場合には、特に児童では上咽頭に保菌される（非特許文献４）。保菌は伝播及び疾患において臨界的であり、多くの場合には下気道感染に先行する。
【０００３】
粘膜抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、肺炎球菌からの防御に重要な役割を果たしている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ依存的な抗体産生及び直接的なＣＤ４＋Ｔ細胞エフェクター機能両方を介して寄与する（非特許文献５〜７）。加えて、マウスモデルにおいては、Ｔｈ１７細胞は保菌に対する防御のために必須である（非特許文献８及び９）。研究は、低いＣＤ４＋Ｔ細胞免疫が児童における保菌と関連しているということを示唆しており、ＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性はヒトにおいて立証されている（非特許文献１０）。加えて、ライト等（Wright et al）による洗練された研究は、ヒトにおける実験的感染が、ＢＡＬ中のＩＬ−１７を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の１７倍超の増大をもたらしたということを示している（非特許文献１１）。このモデルでは、ＩＬ−１７は肺胞マクロファージによる肺炎球菌取り込みを増大させることが示されている。それゆえに、Ｔ細胞は肺炎球菌感染のコントロールの臨界的な成分である。
【０００４】
この病原体のコントロールにおけるＴ細胞の重要性に鑑みて、Ｔ細胞機能を負に制御する能力はクリアランスから逃れるための有効なメカニズムであろう。Ｓｐｎの機械的に破砕された調製物を用いて、Ｓｐｎのある成分がエフェクターＴ細胞の機能を阻害し得るという驚くべき発見がなされた。破砕された細菌の使用は、感染の間に起こり、組織が内部の細菌成分に対して暴露されることを許す自己溶解を模倣する。ここで、エフェクター細胞の機能のシャットオフを再現し、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を用量依存的な様式で阻害する新規蛋白質のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）が同定された。
【０００５】
従って、ｐｅｐＮは、炎症性サイトカインによって媒介される疾患及び障害を処置するための組成物及び方法に用途を見出し、その一方で、抗ｐｅｐＮ阻害剤は、肺炎球菌感染を処置するための組成物及び方法に用途を見出す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】バラフ等（Baraff et al.）著（１９９３年）ザ・ペディアトリック・インフェクシャス・ディジーズ・ジャーナル（The Pediatric Infectious Disease Journal）１２巻：ｐ．３８９−３９４
【非特許文献２】クラグマン（Klugman）著（２００２年）ザ・ヨーロピアン・レスピラトリー・ジャーナル補遺（The European Respiratory Journal Supplement）３６巻：ｐ．３ｓ−８ｓ
【非特許文献３】ダガン（Dagan）著（２０００年）ザ・ペディアトリック・インフェクシャス・ディジーズ・ジャーナル（The Pediatric Infectious Disease Journal）１９巻：ｐ．３７８−３８２
【非特許文献４】ボハールト等（Bogaert et al.）著（２００４年）ザ・ランセット・インフェクシャス・ディジージズ（The Lancet Infectious Diseases）４巻：ｐ．１４４−１５４
【非特許文献５】マリー等（Malley et al.）著（２００５年）米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）１０２巻：ｐ．４８４８−４８５３
【非特許文献６】バセット等（Basset et al.）著（２００７年）インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）７５巻：ｐ．５４６０−５４６４
【非特許文献７】ルー等（Lu et al.）著（２００８年）ＰＬＯＳパソジェンズ（PLOS Pathogens）４巻：ｐ．ｅ１０００１５９
【非特許文献８】チャン等（Zhang et al.）著（２００９年）ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）１１９巻：ｐ．１８９９−１９０９
【非特許文献９】トルチンスキ等（Trzcinski et al.）著（２００８年）インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）７６巻：ｐ．２６７８−２６８４
【非特許文献１０】チャン等（Zhang et al.）著（２００７年）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（The Journal of Infectious Diseases）１９５巻：ｐ．１１９４−１２０２
【非特許文献１１】ライト等（Wright et al.）著（２０１３年）ＰＬＯＳパソジェンズ（PLOS Pathogens）９巻：ｐ．ｅ１００３２７４
【発明の概要】
【０００７】
いくつかの態様において、本開示の主題は単離の又は組換え体のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチドを提供し、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは異種ポリペプチドに融合され、特に異種ポリペプチドはエピトープタグである。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。別の態様において、本開示の主題は、医薬的に許容される担体中に上に記載されている単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドのいずれかを含む組成物を提供する。
【０００８】
他の態様において、本開示の主題は、その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する方法を提供し、方法は、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する量の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドを対象に投与することを含み、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは異種ポリペプチドに融合され、特に異種ポリペプチドはエピトープタグである。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。別の態様において、上に記載されている単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドのいずれかは、医薬的に許容される担体中にある。別の態様において、炎症性サイトカインは、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される。別の態様において、対象はヒトである。
【０００９】
他の態様において、本開示の主題は、その必要がある対象の望ましくない炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を特徴とするか又はそれと関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法を提供し、方法は、治療有効量の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドを対象に投与することを含み、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、疾患、障害、又は状態は、肺、関節、眼、腸、皮膚、又は心臓の疾患、障害、又は状態である。別の態様において、疾患、障害、又は状態は、喘息、成人型呼吸窮迫症候群、気管支炎、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性膝関節症、骨髄炎、副鼻腔炎、鼻ポリープ、痛風関節炎、ぶどう膜炎、結膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、遠位直腸炎、にきび、乾癬、湿疹、皮膚炎、冠動脈梗塞ダメージ、冠動脈疾患、慢性炎症、エンドトキシンショック、及び平滑筋増殖障害からなる群から選択される。別の態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは異種ポリペプチドに融合され、特に異種ポリペプチドはエピトープタグである。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。別の態様において、上に記載されている単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドのいずれかは、医薬的に許容される担体中にある。別の態様において、炎症性サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、及びＩＦＮγからなる群から選択される。別の態様において、対象はヒトである。
【００１０】
他の態様において、本開示の主題は、その必要がある対象の肺炎球菌感染を処置する方法を提供し、方法は、治療有効量の抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤を対象に投与することを含み、抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤は、抗ｐｅｐＮポリペプチド抗体若しくはその抗原結合断片、低分子ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤、ｐｅｐＮポリペプチドに結合若しくはそれと物理的に相互作用するＲＮＡ若しくはＤＮＡアプタマー、可溶性ｐｅｐＮポリペプチド受容体、ｐｅｐＮポリペプチド特異的アンチセンス分子、又はｐｅｐＮポリペプチド特異的ｓｉＲＮＡ分子である。別の態様において、ｐｅｐＮポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含む単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドであり、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。別の態様において、対象はヒトである。
【００１１】
本開示の主題のある種の態様が本明細書において上に書かれており、これらは本開示の主題によって全体的に又は部分的に対応される。他の態様は、本明細書において下に最良に記載される付随する実施例及び図と関連付けられたときに、記載が進むに連れて明らかになるであろう。
【００１２】
ここまで、本開示の主題が一般的な見方から記載された。ここで付随する図面の参照がなされる。これらは必ずしも一定の縮尺で描かれてはいない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＣＤ８＋肺エフェクター細胞へのＳｐｎ成分の追加が、ペプチド刺激に応答してＩＦＮγを産生するそれらの能力を阻害するということを示している。
【図２】図２は、ＣＤ４＋エフェクターがＳｐｎ成分によって阻害されるということを示している（ライセートの２つの濃度が示されている）。
【図３】図３は、Ｓｐｎライセートの存在下において刺激されたエフェクター細胞が、ＩＦＮγのｍＲＮＡの低減されたレベルを有するということを示している。
【図４】図４は、複数の血清型を包摂する種々の臨床及び実験室株両方からのライセートによる処置が、サイトカイン産生を阻害し得るということを示している（ＮＤ＝未実施）。
【図５】図５は、Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉによるｐｅｐＮ−Ｈｉｓの発現と；Ｂ）ＥＦ３０３０のｐｅｐＮ−Ｈｉｓによる処置がＴエフェクター細胞によるサイトカイン産生を阻害するということとを示している。
【図６】図６は、ＳｐｎのｐｅｐＮ−Ｈｉｓの存在下において刺激されたエフェクター細胞が、ＩＦＮγのｍＲＮＡ産生について大いに阻害されるということを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ここで、本開示の主題は、本発明の全てではなくいくつかの実施形態が示されている付随する図を参照して、本明細書において下により詳しく記載される。同類の番号同士は一貫して同類の要素を言う。本開示の主題は多くの異なる形態で実施され得、本明細書に示されている実施形態に限定されると解釈されるべきではない；むしろ、それらの実施形態は本開示が然るべき法的要件を満たすように提供されている。実際に、本明細書に示されている本開示の主題の多くの改変及び他の実施形態が、先の記載及び関連する図面に提示されている教示の利益を有する本開示の主題が関係する当業者には思い浮かぶであろう。よって、本開示の主題が開示される具体的な実施形態に限定されないということと、改変及び他の実施形態は添付の請求項の範囲内に包含されることが意図されるということとは理解されるはずである。
【００１５】
肺炎球菌感染は、地球上の致死的細菌感染の第２の最も共通の原因である（ロスバーグ等（Rothberg et al.）著（２００８年）ザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・メディシン（The American Journal of Medicine）１２１巻：ｐ．２５８−２６４）。世界保健機構（ＷＨＯ）は、重症の肺炎球菌性疾患の世界的に凡そ１４５０万件の発病が起こっており、生後１〜５９ヶ月の児童の約８２６，０００人の死をもたらしていると見積もっている。肺炎レンサ球菌（Ｓｐｎ）は、疾患を引き起こすその能力に寄与するいくつもの病原性因子を有しており、多糖莢膜、ニューモリシン、及び肺炎球菌表面蛋白質Ａ〜Ｃを包含する（フェルドマン及びアンダーソン（Feldman & Anderson）著（２０１４年）Ｆ１０００プライム・レポーツ（F1000Prime Reports）６巻：ｐ．８２）。これらの因子は接着及び宿主の防御からの逃亡を促進する。後者について、莢膜多糖は食作用を有効に防止し（スティール等（Steel et al.）著（２０１３年）メディエイターズ・オブ・インフラメーション（Mediators of Inflammation）２０１３：４９０３４６）、その一方で、ニューモリシンは免疫細胞を殺し得る（リットマン等（Littmann et al.）著（２００９年）ＥＭＢＯモレキュラー・メディシン（EMBO Molecular Medicine）１巻：ｐ．２１１−２２２）。
【００１６】
本開示の主題はＳｐｎの新規の免疫制御特性の同定に関する。下の実施例に記載されているように、機械的に破砕されたＳｐｎから作製された可溶性画分に対するマウスエフェクター細胞の暴露は、サイトカイン産生の有効な阻害をもたらした。破砕された細菌の使用は、感染の間に起こり、内部の細菌成分に対する組織の暴露をもたらす自己溶解を模倣した。観察された阻害は肺炎球菌の高度に新規の予想外の特性であった。
【００１７】
重要なことに、この効果は肺炎球菌のＥＦ３０３０株に限らない。複数の血清型を包摂する多様な臨床及び実験室分離株を試験し、全てがＴエフェクター細胞機能を阻害し得るということを見出した。
【００１８】
阻害因子をキャラクタリゼーションする中で、それが熱不安定性であり、プロテアーゼ感受性であることが見出された。一連の分画及びシーケンシングアプローチによって、候補分子が同定された。２つの候補がクローニングされ、Ｈｉｓタグを発現するように操作され、Ｅ．ｃｏｌｉによって発現され、さらなる試験のための効率的な単離を許した。下の実施例に記載されているように、データは、候補の１つのアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）が、破砕されたＳｐｎによって観察されるＴ細胞阻害効果を再現し得るということを示している。
【００１９】
肺炎レンサ球菌のｐｅｐＮ蛋白質は以前には単離又は研究されていない。ｐｅｐＮがエフェクター細胞の機能を積極的に制御する能力は、この臨床的に重要な細菌による免疫制御の新たなメカニズムを提示している。具体的には、ｐｅｐＮはＴエフェクター細胞の機能のシャットオフを再現し、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を用量依存的な様式で阻害する。従って、ｐｅｐＮは、炎症性サイトカインによって媒介される疾患及び障害を処置するための組成物及び方法に用途を見出し、その一方で、抗ｐｅｐＮ阻害剤は、肺炎球菌感染を処置するための組成物及び方法に用途を見出す。
【００２０】
Ｉ．アミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチド及び関連する組成物
いくつかの態様において、本開示の主題は単離の又は組換え体のアミノペプチダーゼＮ（ｐｅｐＮ）ポリペプチドを提供し、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。配列番号１のアミノ酸配列は表１に提供されている。
【表１】
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【００２１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「蛋白質」は、本明細書においてはアミノ酸残基のポリマーを言うために交換可能に用いられる。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、並びに天然のアミノ酸ポリマーに適用される。本発明のポリペプチドは、本明細書に開示される核酸から、又は標準的な分子生物学技術の使用によってどちらかで産生され得る。例えば、本発明の短縮型蛋白質は、適切な宿主細胞による本発明の組換え体核酸の発現によって、又は代替的にはプロテアーゼ消化及び精製等のエクスビボ手続きの組み合わせによって産生され得る。
【００２２】
本開示の主題は、単離又は実質的に精製されたポリペプチド組成物を包摂する。「単離」又は「精製」されたポリペプチドは、正常ではその天然の環境において見出されるポリペプチドに付随又はそれと相互作用する成分を実質的に又は本質的に不含である。細胞材料を実質的に不含であるポリペプチドは、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量による）のコンタミネーション蛋白質を有する蛋白質の調製物を包含する。本開示の主題のポリペプチドが組換え的に産生されるときに、最高には、培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量による）の化学的前駆体又は目的の蛋白質ではない化学物質に相当する。
【００２３】
開示されるポリペプチドの断片及びバリアントもまた本開示の主題によって包摂される。天然のｐｅｐＮポリペプチドの生物学的活性を保持し、故にＴエフェクター細胞による炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害するポリペプチドの断片及びバリアントは、本明細書においてはｐｅｐＮポリペプチドの「機能的な断片」又は「機能的なバリアント」と言われる。
【００２４】
「断片」は、全長配列のある部分を意味することが意図される。所定のポリペプチドを参照して本明細書において用いられる「全長配列」は、天然の配列のアミノ酸配列全体を有することを意味する。「天然の配列」又は「天然のポリペプチド」は、内在性配列又はポリペプチド、即ちある生物にインビボで見出される操作されていない配列又はポリペプチドを意味することが意図される。
【００２５】
「バリアント」は、天然の配列と実質的に類似の配列を意味することが意図される。バリアントポリペプチドは、天然のポリペプチドの１つ以上の内部の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失若しくは追加、及び／又は天然のポリペプチドの１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換によって、天然のポリペプチドに由来するポリペプチドを意味することが意図される。機能的なバリアントは例えば遺伝子多型又はヒトの操作からもたらされ得る。本開示の主題の天然のｐｅｐＮポリペプチドの機能的なバリアントは、本明細書の他所に記載される配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定されるように、天然のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するであろう。本開示の主題のポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、１〜１５アミノ酸残基ほども少し、１〜１０ほども少し、例えば６〜１０、５ほども少し、４、３、２、又はさらには１アミノ酸残基ほども少しだけそのポリペプチドと異なり得る。
【００２６】
本開示の主題のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮、及び挿入を包含する種々のやり方で変改され得る。かかる操作のための方法は当分野において一般公知である。例えば、ｐｅｐＮポリペプチドのアミノ酸配列バリアント及び断片は、かかるポリペプチドをコードするＤＮＡの変異によって調製され得る。変異導入及びポリヌクレオチド変改のための方法は当分野において周知である。例えば、クンケル（Kunkel）著（１９８５年）米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）８２巻：ｐ．４８８−４９２；クンケル等（Kunkel et al.）著（１９８７年）メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）１５４巻：ｐ．３６７−３８２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８７３，１９２；ウォーカー及びガストラ（Walker and Gaastra）編（１９８３年）テクニックス・イン・モレキュラーバイオロジー（Techniques in Molecular Biology）（マクミラン出版社（MacMillan Publishing Company），ニューヨーク）、並びにそれに引用されている参照を見よ。目的の蛋白質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についての手引きは、参照によって本明細書に組み込まれるデイホフ等（Dayhoff et al.）著（１９７８年）アトラス・オブ・プロテインシークエンス・アンド・ストラクチャー（Atlas of Protein Sequence and Structure）（米国生物医学研究財団（National Biomedical Research Foundation），ワシントンＤ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。保存的置換、例えば類似の特性を有する別のものと１つのアミノ酸を交換することは、最高であり得る。
【００２７】
天然には、いくつかのポリペプチドは複雑な前駆体として産生され、それらが、本願の他所で論じられるシグナルペプチド等のターゲティング標識に加えて、ペプチドの他の断片をもまた含有し、これらが蛋白質成熟の間の何らかの時点で除去され（プロセシングされ）、（シグナルペプチドの除去は別として）一次翻訳産物と異なるポリペプチドの成熟形態をもたらす。「成熟蛋白質」は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド；即ち、一次翻訳産物に存在するいずれかのプレ又はプロペプチドが除去されたものを言う。「前駆体蛋白質」又は「プレプロペプチド」又は「プレプロ蛋白質」は全てｍＲＮＡの翻訳の一次産物を言う；即ちプレ又はプロペプチドが尚存在している。プレ及びプロペプチドは細胞内局在シグナルを包含し得るが、これに限定されない。この命名法の「プレ」は一般的にはシグナルペプチドを言う。シグナルペプチドのみが除去され、さらなるプロセシングはまだである翻訳産物の形態は、「プロペプチド」又は「プロ蛋白質」と呼ばれる。除去されるべき断片又はセグメントは、それら自体もまた「プロペプチド」と言われ得る。それゆえに、プロ蛋白質又はプロペプチドはシグナルペプチドは除去されているが、プロペプチド（ここではプロペプチドセグメントを言う）と成熟蛋白質を構成するであろう部分とを含有する。当業者は、蛋白質が発現されようとする種及び所望の細胞内の所在に依存して、より高い発現レベルが、単に蛋白質の成熟形態、シグナルペプチドを有する成熟形態、又はシグナルペプチドを有するプロ蛋白質（即ち、プロペプチドを包含する形態）をコードする遺伝子コンストラクトを用いることによって得られ得るかどうかを決定する能力がある。
【００２８】
本明細書に包摂される蛋白質配列の欠失、挿入、及び置換は、蛋白質の特徴の大幅な変化を生ずるとは予想されない。しかしながら、そうする前に予め置換、欠失、又は挿入の厳密な効果を予測することが困難であるときには、当業者は、効果が型通りのスクリーニングアッセイによって評価されるということを理解するであろう。即ち、活性は、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を測定するアッセイ、例えば下の実施例に記載されているものによって評価され得る。
【００２９】
次の用語は、２つ以上のポリペプチドの間の配列関係性を記載するために用いられる：（ａ）「参照配列」；（ｂ）「比較ウインドウ」；（ｃ）「配列同一性」；及び（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」。
【００３０】
本明細書において用いられる「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる明確な配列である。参照配列は、例えば、全長アミノ酸配列のセグメント又は完全なアミノ酸配列としての；所定の配列の部分集合又は全体であり得る。
【００３１】
本明細書において用いられる「比較ウインドウ」は、ポリペプチド配列の連続的な所定のセグメントを言い、比較ウインドウ内のポリペプチド配列は、２つのポリペプチドの最高のアラインメントについて、参照配列（これは追加又は欠失を含まない）と比較して追加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。
【００３２】
２つのアミノ酸配列の文脈において本明細書において用いられる「配列同一性」又は「同一性」は、所定の比較ウインドウ内の最大の一致に合わせてアラインメントされたときに同じである２つの配列中の残基を言う。配列同一性のパーセンテージがポリペプチドを参照して用いられるときには、同一でない残基位置は、多くの場合には保存的アミノ酸置換だけ異なり、アミノ酸残基は類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基によって置換されており、よって分子の機能特性を変更しないということが認識される。配列同士が保存的置換だけ異なるとき、パーセントの配列同一性は上方に調整されて、置換の保存的性質について補正され得る。かかる保存的置換だけ異なる配列同士は「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整をなすための手段は当業者には周知である。典型的には、これは保存的置換を完全よりもむしろ部分的なミスマッチとしてスコア付けすることを包含し、それによって、パーセンテージ配列同一性を増大させる。それゆえに、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられるところでは、保存的置換はゼロ及び１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，カリフォルニア州マウンテンビュー）に実装されているように計算される。
【００３３】
本明細書において用いられる「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウ内の２つの最高にアラインメントされた配列を比較することによって決定される値を意味し、比較ウインドウ内の配列の部分は、２つの配列の最高のアラインメントについて参照配列（これは追加又は欠失を含まない）と比較して追加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列中に起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を算出することと、マッチした位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数によって割ることと、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出することとによって計算される。
【００３４】
本開示の主題の別の態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは異種ポリペプチドに融合され、特に異種ポリペプチドはエピトープタグである。用語「エピトープタグ付き」は、本明細書において用いられるときには、「タグポリペプチド」に融合されたｐｅｐＮポリペプチド又はその機能的なバリアントを含むキメラポリペプチドを言う。タグポリペプチドは、それに対して抗体が作られ得るエピトープを提供するために充分な残基を有するが、それが融合されたポリペプチドの活性と干渉しないように充分に短い。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が実質的に他のエピトープと交差反応しないように適当にユニークでもまたある。好適なタグポリペプチドは、一般的には少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８及び５０アミノ酸残基の間を有する（好ましくは、約１０及び２０アミノ酸残基の間）。エピトープタグは、一般的には、ｐｅｐＮポリペプチド又はその機能的なバリアントのアミノ又はカルボキシル末端に置かれる。ｐｅｐＮポリペプチド又はその機能的なバリアントのかかるエピトープタグ付き形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。エピトープタグの提供は、ｐｅｐＮポリペプチド又はその機能的なバリアントが、アフィニティー精製によって、抗タグ抗体、又はエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの別の型を用いて手軽に精製されることをもまた可能にする。種々のタグポリペプチド及びそれらのそれぞれの抗体が当分野において周知である。例は、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）又はポリヒスチジン−グリシン（ポリＨｉｓ−Ｇｌｙ）タグ；インフルＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５；ｃ−ｍｙｃタグ並びにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、及び９Ｅ１０抗体；並びに単純ヘルペスウイルス糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体を包含する。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇペプチド；ＫＴ３エピトープペプチド；α−チューブリンエピトープペプチド；及びＴ７遺伝子１０蛋白質ペプチドタグを包含する。
【００３５】
本開示の主題の別の態様においては、医薬的に許容される担体中に上に記載されている単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドのいずれかを含む組成物が提供される。言い回し「医薬的に許容される」は、正しい医学的判断の範囲内において、人間及び動物の組織の組織と接触しての使用にとって好適であり、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症がなく、妥当なベネフィット／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を言う。本明細書において用いられる言い回し「医薬的に許容される担体」は、医薬的に許容される材料、組成物、又は基剤、例えば液体若しくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、培地、封入材料、製造助剤（例えば、滑剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、カルシウム、若しくは亜鉛、又はステアリン酸）、又はｐｅｐＮポリペプチドの安定性、可溶性、若しくは活性を維持することに関わる溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり患者にとって有害でないという意味で、「許容され」なければならない。医薬的に許容される担体として働き得る材料のいくつかの例は：（１）糖、例えばラクトース、グルコース、及びスクロース；（２）澱粉、例えばコーンスターチ及び馬鈴薯澱粉；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ワックス；（８）油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；（９）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１０）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１１）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１２）寒天；（１３）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１４）アルギン酸；（１５）パイロジェン不含水；（１６）等張生理食塩水；（１７）リンゲル液；（１９）ｐＨ緩衝溶液；（２０）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ酸無水物；（２１）増量剤、例えばポリペプチド及びアミノ酸、（２２）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ、及びＬＤＬ；（２３）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；並びに（２４）医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質を包含する。放出剤、コーティング剤、保存料、及び抗酸化剤もまた製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「医薬的に許容される担体」、又は同類等の用語は、本明細書においては交換可能に用いられる。
【００３６】
ＩＩ．炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する方法並びに関連する処置方法
他の態様において、本開示の主題は、その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する方法を提供し、方法は、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する量の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドを対象に投与することを含み、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは異種ポリペプチドに融合され、特に異種ポリペプチドはエピトープタグである。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。
【００３７】
炎症性サイトカインは炎症を促進するサイトカインである。「サイトカイン」は、細胞間シグナル伝達の主因である種々の生理活性物質の一般的用語である。サイトカインは、特異的な受容体を介して細胞内シグナル伝達に関与することによって種々の生体機能を制御することに関わる物質のある群を形成する。サイトカインが関わる生体機能の例は、生体防御及び免疫応答を包含する。これらのうち、炎症はサイトカインと深く関連している。サイトカインの中でも、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及びインターフェロンガンマ（ＩＦΝγ）、並びに同類は炎症を促進するように作用し、よって炎症性サイトカインに分類される。加えて、これらの炎症性サイトカインの産生を制御する活性を有するサイトカインは抗炎症性サイトカインと言われる（ムーア等（Moore et al.）著（２００１年）アニュアル・レビュー・オブ・イミュノロジー（Annual Review of Immunology）１９巻：ｐ．６８３−７６５；モスマン（Mosmann）著（１９９４年）アドバンシズ・イン・イミュノロジー（Advances in Immunology）５６巻：ｐ．１−２６）。これらの炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインはそれらの相互の産生レベル及び活性を適切に制御することが公知である（モスマン（Mosmann）著（１９９４年）アドバンシズ・イン・イミュノロジー（Advances in Immunology）５６巻：ｐ．１−２６）。
【００３８】
当業者は、「炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する量」の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドが型通りのスクリーニングアッセイによって評価され得るということを理解するであろう。即ち、活性は、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を測定するアッセイ、例えば下の実施例に記載されているものによって評価され得る。
【００３９】
他の態様において、本開示の主題は、その必要がある対象の望ましくない炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を特徴とするか又はそれと関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法を提供し、方法は、治療有効量の単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドを対象に投与することを含み、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含み、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。
【００４０】
特定の態様において、望ましくない炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を特徴とするか又はそれと関連する疾患、障害、又は状態は、肺、関節、眼、腸、皮膚、又は心臓の疾患、障害、又は状態である。他の特定の態様において、望ましくない炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を特徴とするか又はそれと関連する疾患、障害、又は状態は、喘息、成人型呼吸窮迫症候群、気管支炎、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性膝関節症、骨髄炎、副鼻腔炎、鼻ポリープ、痛風関節炎、ぶどう膜炎、結膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、遠位直腸炎、にきび、乾癬、湿疹、皮膚炎、冠動脈梗塞ダメージ、冠動脈疾患、慢性炎症、エンドトキシンショック、及び平滑筋増殖障害からなる群から選択される。別の態様において、炎症性サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、及びＩＦＮγからなる群から選択される。
【００４１】
ＩＩＩ．肺炎球菌感染を処置する方法
他の態様において、本開示の主題は、その必要がある対象の肺炎球菌感染を処置する方法を提供し、方法は、治療有効量の抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤を対象に投与することを含み、抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤は、抗ｐｅｐＮポリペプチド抗体若しくはその抗原結合断片、低分子ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤、ｐｅｐＮポリペプチドに結合若しくはそれと物理的に相互作用するＲＮＡ若しくはＤＮＡアプタマー、可溶性ｐｅｐＮポリペプチド受容体、ｐｅｐＮポリペプチド特異的アンチセンス分子、又はｐｅｐＮポリペプチド特異的ｓｉＲＮＡ分子である。別の態様において、ｐｅｐＮポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的なバリアントを含む単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドであり、その機能的なバリアントは、炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の阻害活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、機能的なバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一のアミノ酸配列の機能的な断片である。
【００４２】
肺炎球菌又は肺炎双球菌ともまた呼称される肺炎レンサ球菌（Ｓｐｎ）はグラム陽性細菌株であり、その中の単一の軸に沿った細胞分裂を行い、それゆえに鎖状又は対で増えるレンサ球菌属のメンバーである。Ｓｐｎは肺炎の主原因として認識されている。Ｓｐｎは正常な上気道に感染し、肺炎を引き起こす。事実、Ｓｐｎは細菌性肺炎のケースの約７０％ほども多くの主因であることが報告されている。生物は、肺の肺炎以外の種々の組織において肺炎球菌感染の多くの型をもまた引き起こし、血液の菌血症、骨の骨髄炎、耳の中耳炎、胃又は十二指腸の腹膜炎、心膜の心膜炎、及び一般的な創傷部位の蜂窩織炎を包含する。Ｓｐｎは乳幼児及び児童の肺炎細菌性髄膜炎の最も共通の原因として公知である。加えて、Ｓｐｎは心不全又は糖尿病の慢性患者にとっては致死的であり得、唾液又は粘液放出によって個体間で広まり得る。
【００４３】
ＩＶ．一般的な定義
本明細書において用いられる用語「投与する」は、少なくともある細胞を、本明細書において定義される単離の若しくは組換え体のｐｅｐＮポリペプチド又は抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤と接触させることを言う。この用語は、細胞が存在する対象への、本開示の単離の若しくは組換え体のｐｅｐＮポリペプチド又は抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤の投与と、細胞が培養される培地中に、本開示の単離の若しくは組換え体のｐｅｐＮポリペプチド又は抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤を導入することとを包含する。
【００４４】
本開示の方法によって処置される対象は、それらの多くの実施形態において望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載される方法が全ての脊椎動物種について有効であり、それらは用語「対象」に包含されることを意図されるということは理解されるはずである。従って、「対象」は、医学的目的のための、例えば既存の疾患、障害、状態の処置、又は疾患、障害、若しくは状態の開始を防止するための予防的処置のためのヒト対象、或いは医学的、獣医学的目的、又は開発目的のための動物対象を包含し得る。好適な動物対象は、霊長類、例えばヒト、サル、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカク、及び同類；ウシ属、例えば畜牛、雄牛、及び同類；ヒツジ属、例えば羊及び同類；ヤギ属、例えばヤギ及び同類；豚、例えば子豚、雄豚、及び同類；馬科、例えば馬、ロバ、シマウマ、及び同類；野生及び家猫を包含する猫科；犬を包含する犬科；家ウサギ、野ウサギ、及び同類を包含するウサギ目；並びにマウス、ラット、モルモット、及び同類を包含する齧歯類を包含する哺乳動物を包含するが、これに限定されない。動物はトランスジェニック動物であり得る。いくつかの実施形態において、対象はヒトであり、胎児、新生児、乳幼児、青少年、及び成人対象を包含するが、これに限定されない。さらに、「対象」は、疾患、障害、又は状態を患うか又は患うことを疑われる患者を包含し得る。それゆえに、用語「対象」及び「患者」は本明細書においては交換可能に用いられる。対象は動物疾患モデルをもまた包含する（例えば、実験に用いられるラット又はマウス、及び同類）。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「処置する」、「処置すること」、「処置」、及び同類は、疾患、障害、又は状態の底にある原因を減少させる、抑制する、減弱させる、縮小させる、停止させる、又は疾患、障害、状態、および／若しくはそれと関連する症状の発生若しくは進行を安定化することを意味される。本明細書において用いられる用語「処置する」、「処置すること」、「処置」、及び同類は治癒的な治療、予防的治療、及び防止的治療を言い得る。本開示の方法に従う処置は、疾患、障害、若しくは状態からの完全な寛解若しくは治癒、又は疾患、疾患、若しくは状態の１つ以上の症状の部分的な改善をもたらし得、一過的又は永久的であり得る。用語「処置」は予防、治療、及び治癒を包摂することもまた意図される。
【００４６】
本明細書において用いられる用語「防止する」、「防止すること」、「防止」、「予防的処置」、及び同類は、疾患、障害、又は状態を有さないが、それを発生する素因があるか又はリスクがある対象の疾患、障害、又は状態を発生する確率を低減することを言う。それゆえに、いくつかの実施形態においては、薬剤及び／又は多糖抗原が、疾患、障害、若しくは状態の開始を防止するために、又は疾患、障害、若しくは状態の再発を防止するために予防的に投与され得る。
【００４７】
治療薬剤の「治療有効量」のような用語「有効量」は、所望の生体応答を誘発するために必要な薬剤の量を言う。当業者によって理解されるであろうように、薬剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達されるべき薬剤、医薬組成物の組成、標的組織又は細胞、及び同類等の因子に依存して変動し得る。より具体的には、用語「有効量」は、所望の効果を生ずるために、例えば、疾患、障害、若しくは状態、又はその１つ以上の症状の重症度、持続期間、進行、若しくは開始を低減又は改善する；疾患、障害、又は状態の前進を防止する、疾患、障害、又は状態の後退を引き起こす；疾患、障害、又は状態と関連する症状の再発、発生、開始、又は進行を防止する、或いは別の治療の予防的又は治療効果（単数若しくは複数）を向上させるか又は改良するために十分な量を言う。
【００４８】
いくつかの態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドの有効量は、その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解を阻害する量である。特定の態様において、本明細書に記載される単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドの投与は、その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、又は１００倍の減少をもたらす。他の特定の態様において、本明細書に記載される単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチドの投与は、その必要がある対象の炎症性サイトカイン産生及び細胞溶解の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はさらには１００％の減少をもたらす。
【００４９】
いくつかの態様において、抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤の有効量は、本明細書に記載される抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤を投与されていない対象と比較して、Ｓｐｎウイルス感染と関連する疾患、障害、若しくは状態の１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０個の）症状、又はＳｐｎウイルス感染と関連する疾患、障害、若しくは状態を発生する蓋然性の少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、又は１００倍の減少をもたらす量である。他の態様において、抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤の有効量は、抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤を投与されていない対象と比較して、Ｓｐｎウイルス感染と関連する疾患、障害、若しくは状態の１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０個の）症状、又はＳｐｎウイルス感染と関連する疾患、障害、若しくは状態を発生する蓋然性の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はさらには１００％の減少をもたらす量である。
【００５０】
用語「減少させる」によって、疾患、障害、又は状態の症状を阻害する、抑制する、減弱させる、縮小させる、停止させる、又は安定化することが意味される。不可能ではないが、疾患、障害、又は状態を処置することは、疾患、障害、状態、又はそれと関連する症状が完全に取り去られることを要求しないということは理解されるであろう。
【００５１】
別の態様において、単離の又は組換え体のｐｅｐＮポリペプチド或いは抗ｐｅｐＮポリペプチド阻害剤はいずれかの好適な投与経路によって対象に投与され得、経口的に、経鼻的に、経粘膜的に、経眼的に、経直腸的に、経膣的に、非経口的に、を包含し、筋肉内的に、皮下的に、髄内注射、及び髄腔内、直接心室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑膜内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、若しくは眼内注射、大槽内的に、粉末、軟膏、又は点薬（点眼薬を包含する）によるものを包含し、バッカル的に及び舌下的に、経皮的に、吸入スプレーによって、又は当分野において公知の他の送達モードを包含する。
【００５２】
本開示の主題に用いられる治療薬剤の投薬量は、最終的には担当医師によって決められなければならない。従って、投与のための投薬量範囲は必要に応じて医師によって調整されるであろう。所望の生体応答を達成するために要求される薬剤の量が、別の目的にとって有効な薬剤の量とは異なり得るということは理解されるであろう。本明細書に記載される薬剤の実際の投薬量レベルは、対象にとって毒性であることなしに、特定の対象、組成物、投与経路、及び疾患、障害、又は状態について所望の治療応答を達成するために有効である薬剤の量を得るように変動し得る。選択される投薬量レベルは、使用される特定の薬剤若しくはその塩の活性、投与経路、投与の時間、使用されようとする特定の薬剤の排泄率、処置の持続期間、使用される特定の薬剤との組み合わせで用いられる他の薬物、薬剤、及び／又は材料、処置されようとする患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康、及び先立つ医学的既往、並びに医学分野において周知の同類の因子を包含する種々の因子に依存するであろう。
【００５３】
長年の特許法の慣習を踏襲して、用語「a」、「an」、及び「the」は、請求項を包含する本願において用いられるときに、「１つ以上」を言う。それゆえに、例えば「対象」の参照は、文脈が明瞭に反対（例えば、複数の対象）等でない限りは、複数の対象を包含する。
【００５４】
本明細書及び請求項においては、用語「含む」、「含む（三人称単数）」、及び「含むこと」は、文脈が別様に要求するところを除いて、非排他的な意味で用いられる。同様に、用語「包含する」及びその文法的異形は限定的でないことを意図され、その結果、一覧としての項目の記載は、一覧化されている項目に追加又は置換され得る他の同類の項目の排除ではない。
【００５５】
本明細書及び添付の請求項の目的のためには、別様に指示されない限り、明細書及び請求項において用いられる量、サイズ、寸法、割合、形状、処方、パラメータ、パーセンテージ、パラメータ、数量、特徴、及び他の数値を表現する全ての数は、全ての場合に用語「約」によって修飾されると理解されるべきであるが、用語「約」は値、量、又は範囲と共にはっきり記載されずにあり得る。従って、反対に指示されない限り、次の明細書及び付属の請求項に示される数的パラメータは厳密ではなく、そうである必要はなく、概算であり得、及び／又は所望のようにより大きいか若しくはより小さくあり得、公差、換算係数、丸め、測定誤差、及び同類、並びに当業者に公知の他の因子を反映し、本開示の主題によって得られようとする所望の特性に依存する。例えば、値を言うときの用語「約」は、いくつかの実施形態においては所定の量からの±１００％、いくつかの実施形態においては±５０％、いくつかの実施形態においては±２０％、いくつかの実施形態においては±１０％、いくつかの実施形態においては±５％、いくつかの実施形態においては±１％、いくつかの実施形態においては±０．５％、いくつかの実施形態においては±０．１％の変動を、かかる変動が開示されている方法を実施又は開示されている組成物を使用するために適切であるように包摂することが意味され得る。
【００５６】
さらに、１つ以上の数又は数的範囲に関連して用いられるときの用語「約」は、範囲内の全ての数を包含する全てのかかる数を言うと理解されるべきであり、示されている数値の上及び下に境界を延長することによってその範囲を改変する。エンドポイントによる数的範囲の記載は、その範囲内に納まる全ての数、例えばその分数を包含する整数（例えば、１から５という記載は、１、２、３、４、及び５、並びにその分数、例えば１．５、２．２５、３．７５、４．１、及び同類を包含する）、及びその範囲内のいずれかの範囲を包含する。
【実施例】
【００５７】
次の例は、当業者に本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための手引きを提供するために包含されている。本開示及び当分野の一般的技術水準に照らして、当業者は、次の例が例示的であることのみを意図されているということと、数々の変更、改変、及び修正が本開示の主題の範囲から外れることなしに使用され得るということとを理解し得る。次の総合的な記載及び具体例は例解の目的のみを意図されており、本開示の化合物を他の方法によって作るためにいずれかの様式で限定すると解釈されるべきではない。
【００５８】
肺炎球菌産物がＴ細胞機能を直接的に制御する能力については非常に少ししか公知ではない。ここに提示されているデータは、肺炎球菌蛋白質ｐｅｐＮの以前には未知の予想外の機能を明らかにしている。細菌のアミノペプチダーゼは、免疫細胞の機能を調節することを報告されてはいない。それゆえに、この観察は、ｐｅｐＮ、並びに宿主−病原体相互作用、及び肺炎球菌による免疫制御のポテンシャルの我々の理解の根本的なシフトに至る。
【００５９】
例１
細菌産物に対する暴露は、低濃度においてサイトカイン産生の、より高濃度において死の阻害をもたらす
インビボのＳｐｎ感染の存在は、損なわれたＴ細胞機能と関連し得る（ブレビンス等（Blevins et al.）著（２０１４年）ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（The Journal of Immunology）１９３巻：ｐ．５０７６−５０８７）。細菌産物がＴ細胞を直接的に制御するポテンシャルを試験するために、インフルエンザウイルスに感染したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｄ８ｐ．ｉ．）からの単離の肺エフェクター細胞を、肺炎球菌のＥＦ３０３０株から作製された細菌ライセートの存在下において刺激した。ライセートを、Ｓｐｎを一晩増やすことと、次にエマルシフレックスＣ３乳化機への複数回の通過による機械的破砕とによって産生した。破砕された細菌を遠心して、不溶性成分を除去した。破砕された細菌の使用は、感染の間に起こり、組織が内部の細菌成分に対して暴露される自己溶解を模倣する。細胞をＮＰペプチドの存在下においてＳｐｎライセート（３μｇ）と一緒に５時間培養し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を標準的なＩＣＣＳによって決定した。
【００６０】
ライセートの存在は、ペプチド刺激されたＩＦＮγ産生のほぼ完全な阻害をもたらした（図１。肺細胞が示されている。類似の結果がリンパ節細胞から得られた）。７−ＡＡＤ陽性の増大を観察することの失敗と組み合わさったＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルの変化の不在によって指示されるように、機能の阻害は細胞死とは関連していなかった。我々はライセートとのインキュベーションを１６ｈまで延長し、生存率の増大した喪失はなかった。それゆえに、制御異常になったサイトカイン産生の媒介因子としての死の証拠はない。最後に、ＴＮＦα産生はＳｐｎライセートの存在によって類似に阻害される。Ｓｐｎ成分がエフェクター機能を阻害する能力はインフルエンザ特異的細胞に限らず、ＬＣＭＶ特異的なインビボ由来のエフェクターもまたＳｐｎライセートの存在下において阻害される。
【００６１】
いずれかの特定の理論によって拘束されないが、Ｓｐｎ成分による処置後のエフェクターのサイトカイン産生の低減を説明するための１つの可能性は、膜近位のＴＣＲシグナル伝達カスケードの変改であった。これがその通りである場合には、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンの追加による刺激は、ライセートの存在下において培養された細胞のサイトカイン産生を促進するはずである。なぜなら、これらの薬剤は、それぞれＰＫＣ活性化及びカルシウム流出を直接的に誘導することによってＴＣＲを迂回するからである。ＰＭＡ／ＩＯＮ刺激は、インフルエンザウイルス感染動物の肺から単離されたＮＰ特異的細胞におけるペプチド刺激に対して相対的にＩＦＮγ産生を増大させず、それによって、エフェクターのサイトカインを産生することの失敗の主因であるメカニズムとしてのＴＣＲシグナル伝達の膜近位の欠陥を排除した。
【００６２】
例２
ＣＤ４＋エフェクターはＳｐｎ成分によって阻害される
Ｓｐｎ由来成分と関連する負の制御がＣＤ４＋エフェクター細胞にまで延長されるかどうかを決定するために、我々は、ＤＯ１１．１０のＴＣＲトランスジェニックマウスから作製したエフェクターを利用した。これらの細胞を、ＩＬ−２のソースとしてＴ−ＳＴＩＭの存在下においてペプチドによる刺激によってインビトロ活性化した。型通りの刺激後の７日目に、細胞をＳｐｎ由来成分の存在下においてペプチドによって刺激し、ＩＦＮγ産生をＩＣＣＳによって測定した。ＣＤ８＋細胞について上で示されているように、ＣＤ４＋エフェクター機能はＳｐｎによって阻害された（図２）。それゆえに、Ｓｐｎ由来成分はＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクター両方を阻害するポテンシャルを有する。
【００６３】
例３
阻害はニューモリシンに非依存的である
いくつもの研究が、肺炎球菌由来ニューモリシンがリンパ球を負に制御する能力を報告している（デノー等（Daigneault et al.）著（２０１２年）ＰＬＯＳパソジェンズ（PLOS Pathogens）８巻：ｐ．ｅ１００２８１４；ブラウン等（Browne et al.）著（１９９９年）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular & Cellular Biology）１９巻：ｐ．８６０４−８６１５）。Ｓｐｎ由来ライセートによって観察された機能阻害がニューモリシンに帰せられ得るかどうかを決定するために、我々はこの蛋白質を欠くＤ３９株（ＰＬＹｄｅｆ）を使用した（ベリー等（Berry et al.）著（１９８９年）インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）５７巻：ｐ．２０３７−２０４２）。予備的研究は、Ｄ３９由来ライセートが機能を阻害する能力を確認した。機能阻害はニューモリシンの存在下又は不在下において類似であった。それゆえに、新規の細菌成分（単数又は複数）が我々のモデルにおけるエフェクター細胞機能の阻害の主因であるように見えた。
【００６４】
例４
ＩＦＮγを産生することの失敗は低減されたｍＲＮＡと関連する
サイトカイン産生の制御をメカニズムレベルで理解し始めるために、我々は、サイトカインを産生することの失敗がメッセージの減少と関連するかどうかを決定した。この研究では、我々は、インフルエンザウイルスに感染したＢＡＬＢ／ｃマウスから元々得られた、インビトロで維持したインフルエンザＮＰ特異的な初代ＣＤ８＋エフェクター細胞を利用した。エフェクター細胞をＳｐｎ成分の存在下又は不在下においてペプチドによって５時間刺激した。それから、ＲＮＡを単離し、ＩＦＮγ及びＧＡＰＤＨに特異的なプライマープローブセットによってｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。図３に示されているように、Ｓｐｎ成分が刺激の間に存在したときのＣＤ８＋細胞では、ＩＦＮγのｍＲＮＡの有意に低減されたレベルが検出された。ライセート処置ｖｓ．未処置の細胞においてＧＡＰＤＨレベルの違いは観察されなかった。これらのデータは、ＮＰ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生の欠如が、転写に先立つステップにおいて制御されているということを示している。
【００６５】
例５
Ｓｐｎの臨床及び実験室株両方はＣＤ８＋エフェクター細胞の機能を阻害することができる
我々が観察した効果が複数の株の間で一般化可能であるかどうかを決定するために、我々は、実験室（ＴＩＧＲ４、Ｄ３９）及び臨床分離株（ＭＮＺ１１１３、Ｌ８−２０４４、ＢＧ１２７４０、ＥＦ６７９６、１６６５４、２６９６８、１０９５５、１３６７８）を包含するいくつもの肺炎球菌株を使用した。ライセートを、ＥＦ３０３０について強い阻害活性を有すると確証された用量、３μｇ／ウェルで追加した。図４のデータは、株の全てに由来するライセートがＣＤ８＋エフェクターの機能を阻害できたが、有効性はいくらかの程度まで変動したということを示している。これらのデータは、阻害成分が肺炎球菌株間で存在しているということを示している。
【００６６】
例６
精製されたＥＦ３０３０のｐｅｐＮ−ＨｉｓはＣＤ８＋エフェクター細胞によるサイトカイン産生を阻害し得る
上に記載されている結果は、多数の細菌成分を含有する清澄化したライセートに頼っている。どの成分が主因であるかを同定し始めるために、我々は、第１に、阻害因子のいくつもの基本的特性を評価し、それが熱不安定性であり、プロテアーゼ感受性であるということを見出した。これに鑑みて、我々は、一連のカラム（１）アニオン交換カラム、２）サイズ排除、３）ヒドロキシアパタイトカラム）を用いる分画によって、各カラム過程後の機能アッセイによる画分の分析によって阻害因子の単離を始めた。ヒドロキシアパタイトカラムによる分離によって得られた阻害機能を有する画分を、ゲル電気泳動によって分解した。増大していく阻害機能との強度の相関的増大を有するバンドを切り出し、シーケンシングし、候補蛋白質としてのＳｐｎアミノペプチダーゼＮの同定をもたらした。ＥＦ３０３０ゲノムは詳しくシーケンシングされてはおらず、それゆえにそのｐｅｐＮ遺伝子座は公開されていないので、我々は肺炎球菌株ＴＩＧＲ４、Ｄ３９、ＡＰ２００、及びＲ６のｐｅｐＮ座の比較分析を実施した（それぞれＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＥ００５６７２、ＣＰ０００４１０、及びＡＥ００７３１７）。我々のシーケンシングプライマーは、株の間で保存されたエリアに基づいて設計した。我々はＥＦ３０３０のｐｅｐＮ及びその周辺遺伝子領域を首尾よくシーケンシングした。ＰｅｐＮをＳｐｎのＥＦ３０３０からクローニングし、ｐＴＨＣｍ中に置き、Ｅ．ｃｏｌｉによるＨｉｓタグ付きｐｅｐＮ（ｐｅｐＮ−Ｈｉｓ）蛋白質の産生を許した。ｐｅｐＮを形質導入されたＥ．ｃｏｌｉからのライセート対空ベクターの分析は、ｐｅｐＮの予想サイズのバンドの発現を示した（図５Ａ）。爾後に、Ｈｉｓタグ付き蛋白質をニッケルカラムへの通過によって精製した。エフェクター細胞へのｐｅｐＮ−Ｈｉｓの追加は、ペプチドに応答したＩＦＮγ産生の阻害をもたらし、Ｓｐｎからの阻害因子としてのｐｅｐＮを支持した（図５Ｂ）。Ｈｉｓタグ付きコントロール蛋白質Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ補酵素Ａジスルフィドレダクターゼ及びα−グリセロリン酸オキシダーゼの追加は効果を有さず、阻害がｐｅｐＮを原因とするということを実証した。死の増大はｐｅｐＮ−Ｈｉｓ処置と関連しなかった。
【００６７】
例７
ｐｅｐＮは、ペプチド刺激に応答して産生されるＩＦＮγのｍＲＮＡの大きい低減をもたらす
我々は、ライセートによる処置と類似に、ｐｅｐＮ−Ｈｉｓの追加がＩＦＮγのｍＲＮＡの低減をもたらすという仮説を立てた。これがその通りであるかどうかを決定するために、インフルエンザＮＰ特異的なエフェクター細胞をｐｅｐＮ−Ｈｉｓの存在下又は不在下においてペプチドによって刺激した。ｍＲＮＡをエフェクターから単離し、ＩＦＮγのメッセージを定量した。ペプチドはｍＲＮＡの４７８倍の増大をもたらした。ｐｅｐＮ−Ｈｉｓの追加はこれを４．５倍まで低減した（図６）。ＧＡＰＤＨのレベルは処置及び未処置の細胞において類似であった。
【００６８】
例８
ｐｅｐＮを過剰発現または欠損するＥＦ３０３０株の作製
上に記載されているデータは、Ｅ．ｃｏｌｉによる発現によって得られた精製されたｐｅｐＮが機能を阻害したということを示している一方で、特異的な活性の増大は、精製された蛋白質について予想されるよりも低かった。いずれかの特定の理論によって拘束されないが、いくつもの因子がこの知見に寄与し得る：１）Ｈｉｓタグの存在は蛋白質の活性に影響し得る；２）Ｅ．ｃｏｌｉによる発現は、最高の機能にとって必要であり得るグリコシル化及び他の修飾を許さない；３）ｐｅｐＮの構造は比較的不安定であり、活性は精製ステップの間に失われる；又は４）補因子が最大の活性には必要とされる。これらの疑問に対応すること及びこの蛋白質のさらなる研究の有意な障壁は、Ｓｐｎの文脈においてこの蛋白質の活性を評価するためのツールの欠如である。この制約を克服するために、我々は：１）ｐｅｐＮ−Ｈｉｓを発現するＥＦ３０３０株；及び２）ｐｅｐＮ欠損ＥＦ３０３０を作製する。
【００６９】
ｐｅｐＮ−Ｈｉｓを発現するＥＦ３０３０の作製：ｐｅｐＮ−Ｈｉｓの活性の予想よりも低い増大は不適切な翻訳後修飾を原因としたという仮説を試験するために、我々はＳｐｎのＥＦ３０３０によってｐｅｐＮを過剰発現する。我々は非インテグレーション型シャトルベクター（ｖＰＴ−ＣＴ７）をフゥイ・ウー（Hui Wu）博士から得た（ライト等（Wright et al.）著（２０１３年）ＰＬＯＳパソジェンズ（PLOS Pathogens）９巻：ｐ．ｅ１００３２７４）。これはＳｐｎにおけるｐｅｐＮ発現を許す。このベクターはＴ７タグをＣ末端に有するように設計されており、これは迅速なイムノアフィニティー精製にとって有用である。このアプローチの実現性の支持として、ＰｅｐＮは他の細菌、即ちＥ．ｃｏｌｉによって首尾よく過剰発現されている（ブレビンス等（Blevins et al.）著（２０１４年）ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（The Journal of Immunology）１９３巻：ｐ．５０７６−５０８７）。加えて、このコンストラクトの作出は、さらなるインビトロ又はインビボの研究のために単離され得る蛋白質の手軽なソースを提供する。
【００７０】
Ｓｐｎによって産生されたｐｅｐＮが増大した活性を有するかどうかを決定するために、Ｓｐｎ又はＥ．ｃｏｌｉによって産生されたｐｅｐＮ−Ｈｉｓのタイトレーションした濃度をＴエフェクター細胞に追加し、サイトカイン産生を阻害する能力をＩＣＣＳによって決定する。最高のｐｅｐＮ活性が、Ｅ．ｃｏｌｉによって産生されたときには存在せずＳｐｎによって産生されたときには存在する翻訳後修飾を要求する場合には、我々は、Ｓｐｎによって産生されたｐｅｐＮのＥＤ５０が、Ｅ．ｃｏｌｉによって産生されたｐｅｐＮのものよりも実質的に（１〜２ｌｏｇ）低いであろうと予想する。用量反応曲線が類似である場合には、これは、Ｅ．ｃｏｌｉによって産生されたｐｅｐＮの予想よりも低い活性の説明としてのＳｐｎ特異的修飾を除外し、代わりに、それが不安定であるか又は補因子を要求するかどちらかであるという仮説を支持する。この後者は下で試験する。
【００７１】
ｐｅｐＮ欠損ＥＦ３０３０の作製：ＥＦ３０３０のｐｅｐＮ欠損（ΔｐｅｐΝ）株を、抗生物質マーカーによってｐｅｐＮ遺伝子全体を置き換えることによって作製する。簡潔には、ｐｅｐＮ遺伝子座の上流及び下流フランキング領域の〜１ｋｂにリンクされたスペクチノマイシン耐性遺伝子ａａｄ９を含有する人工のＰＣＲコンストラクトを製作する。シーケンシングされたコンストラクトの１００ｎｇをケミカルコンピテントなＥＦ３０３０に形質転換し、欠失変異体をスペクチノマイシン耐性によってスクリーニングする。エリア全体をシーケンシングして、他の意図されない遺伝子変化が起こらなかったことを保証する。ｐｅｐＮは他の細菌、例えばラクトバチルス及びＥ．ｃｏｌｉにおいて首尾よく欠失させられているので、我々はこの変異体が生存可能であろうと予測する（クンジ等（Kunji et al.）著（１９９６年）モレキュラー・マイクロバイオロジー（Molecular Microbiology）２１巻：ｐ．１２３−１３１；チャンドゥ等（Chandu et al.）著（２００３年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）２７８巻：ｐ．５５４８−５５５６）。
【００７２】
上に記載されているデータに基づいて、我々は、ｐｅｐＮを発現しないＥＦ３０３０はＴエフェクター細胞のサイトカイン産生を阻害することができないであろうという仮説を立てている。これを試験するために、ライセートをＷＴ及びΔｐｅｐΝのＥＦ３０３０から調製する。ライセートのタイトレーションした濃度をエフェクター細胞刺激の間に追加し、ＩＦＮγ産生をＩＣＣＳによって測定する。それが欠失変異体における蛋白質の喪失を補うであろうという予想をもって、精製されたｐｅｐＮ−Ｈｉｓを追加する。ｐｅｐＮ−Ｈｉｓ単独（即ちライセートなし）のタイトレーションした濃度をもまた利用する。この設計は、肺炎球菌に存在する補因子がｐｅｐＮの活性を増大させるかどうかを決定することを我々に許す。これがその通りである場合には、我々は、ΔｐｅｐΝのＥＦ３０３０からのライセートがｐｅｐＮ−Ｈｉｓと一緒に存在するときには阻害の用量反応曲線がシフトするという仮説を立てている。蓋然的ではないが、ΔｐｅｐΝのＥＦ３０３０ライセートがいくらかの阻害活性を保持するということは可能である。これは、それ自体がＴ細胞の制御ポテンシャルを有する追加の因子がＳｐｎに存在するということを示唆するであろう。これはｐｅｐＮと一緒に又は独立して作用し得る。独立した因子同士は組み合わさったときに相加効果を示すはずであり、補因子は相乗効果を有すると仮説を立てられるであろう。
【００７３】
例９
どのようにＳｐｎ成分の存在がペプチド刺激に応答した転写因子（ＴＦ）活性化に影響するかの決定
上のデータは、ｐｅｐＮによる処置が、刺激に応答してサイトカインを産生することの失敗をもたらすということを示している。サイトカイン産生の欠如は、低減されたメッセージと関連する。さらに、これはＰＭＡ＋イオノマイシンによる処置によって克服され得ず、シグナル伝達カスケードの遠位部分の欠陥を示している。ｐｅｐＮによる制御のメカニズム的基礎を理解する上で第１のステップとして、我々は、ｐｅｐＮ処置された細胞が転写因子の差次的な活性化を見せるという仮説を試験する。多数のＴＦがＩＦＮγ産生の活性化に関わっていると考えられ、ＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、ＡＰ−１、ＡＴＦ２／ｃ−Ｊｕｎ、Ｃ／ＥＢＰ、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｔｓ−１、ＲｕｎＸ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、及びＳＴＡＴ５を包含する（シェーンボルン及びウィルソン（Schoenborn & Wilson）著（２００７年）アドバンシズ・イン・イミュノロジー（Advances in Immunology）９６巻：ｐ．４１−１０１）。同定されたいくつものリプレッサーもまたある。それらは、ＳＴＡＴ６、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１、ＹＹ１、ＳＭＡＤ３、及びＧＡＴＡ−３を包含する（シェーンボルン及びウィルソン（Schoenborn & Wilson）著（２００７年）アドバンシズ・イン・イミュノロジー（Advances in Immunology）９６巻：ｐ．４１−１０１）。ＩＦＮγ産生のあり得る制御因子の多数に鑑みて、我々は、核内のＴＦの幅広い評価を許すアプローチを使用する。Ｓｉｇｎｏｓｉｓ（Signosis, Inc.）のＴＦ活性化４８因子プロファイリングアレイは、ＲｕｎＸ３及びＴ−ｂｅｔ以外の全ての同時評価を許す。それらはアクティブモチーフＴｒａｎｓＡｍキットを用いて測定する。これらの分析は、ペプチド刺激したインビトロで作製したエフェクター細胞からの核抽出物を用いて、ｐｅｐＮの存在下又は不在下において実施する。核抽出物はペプチド刺激の１又は３時間後に単離する。インビトロで作製したエフェクターを利用するので、これらのアッセイについて細胞数又は抗原応答性の懸念はない。それゆえに、我々は略述したアプローチの技術的ハードルを予想していない。
【００７４】
あり得るアウトカム及び解釈：これらの研究からの仮説を立てたアウトカムは、ｐｅｐＮの存在がＴＦ活性化の違いをもたらすということである。ｍＲＮＡターンオーバーの制御がｐｅｐＮによって増大するということは可能ではあるが、我々は、ｐｅｐＮによって処置された細胞において検出されるｍＲＮＡの極めて低いレベルに鑑みて、これはより蓋然的でないと考える。核内のＴＦパターンの違いの同定は、ｐｅｐＮについて処置後に制御異常になる／阻害される経路のもとに我々を導き得る。例えば、我々が低減された／不在のｃ−ｊｕｎを見た場合には、それはＭＥＫＫ１又はＴＮＫ２の制御に注意を引くであろう。
【００７５】
例１０
どのようにＳｐｎのｐｅｐＮの存在がナイーブマウスＴ細胞の活性化及び分化に影響するかの決定
上に記載されている研究は、ＳｐｎのｐｅｐＮの存在が、エフェクター細胞によるサイトカインの産生について強力な制御効果を有するということを示した。分化状態がＳｐｎのｐｅｐＮによる制御に対する感受性に影響するかどうかを理解することは重要である。ＳｐｎのｐｅｐＮがナイーブＴ細胞の活性化に負に影響を及ぼす能力は、肺、即ちＢＡＬＴにおけるＴ細胞の活性化と干渉し得る。下に記載されている研究は、ＳｐｎのｐｅｐＮがナイーブＴ細胞の活性化及び分化を阻害する能力を評価する。
【００７６】
Ｔ細胞活性化、増殖、及び生存に及ぼすＳｐｎのｐｅｐＮの効果：これらの研究は、ＥＦ３０３０のｐｅｐＮがナイーブＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害するという仮説を試験する。我々は、ＯＴ−Ｉ（ＣＤ８＋）及びＯＴ−ＩＩ（ＣＤ４＋）ＴＣＲトランスジェニック細胞を我々のナイーブ集団として用いる。ＣＦＳＥ標識したＯＴ−Ｉ又はＯＴ−ＩＩ細胞を、それぞれＯｖａ２５７−２６４又はＯｖａ３２３−３３９ペプチドとプレインキュベーションしたＬＰＳによって成熟させた骨髄由来樹状細胞によって刺激する。各ペプチドの高（１０−５Ｍ）及び低（１０−９Ｍ）濃度を用いて、ＴＣＲシグナルの強さを増大させることがＳｐｎのｐｅｐＮのいずれかの負の制御効果を克服し得るかどうかを決定する。我々が以前にしたように、ＯＴ−ＩＩ細胞の培養物には次を添加して、別個の表現型への分化を促進する：Ｔｈ１：ｈＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）＋ｍＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）及び中和抗ＩＬ−4抗体（１μｇ／ｍｌ）；Ｔｈ２：ｈＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）＋ｍＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）及び中和抗ＩＬ−１２（１μｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）抗体；Ｔｈ１７：ｈＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）＋ｍＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ｈＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍｌ）及び中和抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−１２、及び抗ＩＦＮγ抗体（全て１μｇ／ｍｌ）（シャイナー等（Shiner et al.）著（２０１４年）ＰＬＯＳワン（PLOS One）９巻：ｐ．ｅ１００１７５）。ＯＴ−Ｉ細胞をＩＬ−２の存在下において培養する。０、２４、４８、又は７２ｈに、細胞を培養物から取り出し、ＣＤ４又はＣＤ８、ＣＤ６９、及びＣＤ２５に対する抗体によって染色する。ＣＤ２５又はＣＤ６９陽性の細胞のパーセント、及び各分子の発現のレベルを定量する。ＣＦＳＥ分析は、分裂に入った細胞のパーセント及び起こった分裂数の決定を許す。各時点のＺｏｍｂｉｅＡｑｕａ染色を用いて、細胞生存を定量する。経時的分析は、活性化の速度論が変改されるかどうかの洞察を提供する。
【００７７】
Ｔ細胞のエフェクター機能獲得に及ぼすＳｐｎのｐｅｐＮの効果：サイトカイン産生を評価するために、上に記載されている培養物からの細胞（刺激後ｄ７）をペプチド及びＤＣ２．４細胞によって刺激する。ＤＣ２．４細胞はクラスＩ及びクラスＩＩ両方を発現して、エフェクター機能の再刺激のための効率的な抗原提示を保証する。ペプチドのタイトレーションした量（１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍ）を使用して、ｐｅｐＮの存在が機能的なアビディティの減少をもたらすかどうかを決定する。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ又はＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤバイオサイエンス）を、測定される特定のサイトカインについて製造者によって推奨されるように包含する。５時間の刺激後に、ＯＴ−ＩＩ細胞を、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１７に対する抗体と一緒に抗ＣＤ４によって染色する。ＯＴ−Ｉ細胞を、ＩＦＮγに対する抗体と共に抗ＣＤ８によって染色する。抗ＣＤ１０７もまた細胞傷害性を評価するためにこれらの培養物に包含される。
【００７８】
あり得るアウトカム及び解釈：我々は、ナイーブＴ細胞が増殖についてｐｅｐＮの阻害効果に対する感受性を見せるという仮説を立てている。我々は、ｐｅｐＮが膜から遠位のＴＣＲシグナル伝達経路の臨界的側面と干渉するという我々の仮説に基づいてこれを提唱する。上に記載されている研究からの結果が出るに連れて、我々はこの制御のより正確な理解を有するであろう。増殖の欠陥は、細胞分裂への進入のブロックとして又は起こる増殖の数の減少として明らかであろう。後者は、最初の分裂を越えて生存することの失敗と関連し得る。ＣＤ２５及びＣＤ６９の分析は、増殖の変化のメカニズム的洞察を提供する。例えば、ＣＤ２５を上方制御することの失敗は、ＩＬ−２を利用する能力欠如が、減少した増殖に寄与し得るということを示唆するであろう。これは、Ｔ細胞の活性化及び分化のこの重要な関与因子を上方制御することの失敗の基礎を理解することを狙った将来的な研究に至るであろう。ＣＤ６９は活性化刺激に対する最初期の応答の中にある。ＣＤ６９上方制御の欠如は、Ｔ細胞活性化が活性化プロセスの最初期のステージにおいて阻害されるということを示唆するであろう。
【００７９】
しかしながら、ナイーブＴ細胞がＳｐｎのｐｅｐＮの効果に対して耐性であるということは可能である。これは、ナイーブ及びエフェクター細胞における転写因子の差次的な制御及び／又は利用によって起こり得る。例えば、ＮＦｋＢ活性化におけるｉＫＫＢについての要件は、ナイーブ及び以前に活性化された細胞の間では異なる（概説はカナン等（Kannan et al.）著（２０１２年）ザ・インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・セルバイオロジー（The International Journal of Biochemistry & Cell Biology）４４巻：ｐ．２１２９−２１３４を見よ）。加えて、ナイーブＴ細胞の活性化に関わるＣＤ２８又は他の共刺激分子によって提供される補助的なシグナルが、ＳｐｎのｐｅｐＮの効果を克服／調節し得る。
【００８０】
最後の可能性は、増殖は正常であるが、ＳｐｎのｐｅｐＮの存在が細胞のエフェクター機能の獲得を選択的に阻害するということである。いくつもの転写因子がエフェクター機能の獲得に関わっており、それらは細胞型によって異なる。Ｔ−ｂｅｔは、ＩＦＮγを産生する能力の臨界的な制御因子である。ｍＴＯＲもまたそれらの細胞のエフェクター機能の獲得に重要である。ｍＴＯＲＣ１及び２は、両方ともＴｈ１細胞の発生に要求される。対照的に、Ｔｈ２分化はｍＴＯＲＣ２のみを、Ｔｈ１７発生はｍＴＯＲＣ１のみを要求する（カナン等（Kannan et al.）著（２０１２年）ザ・インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・セルバイオロジー（The International Journal of Biochemistry & Cell Biology）４４巻：ｐ．２１２９−２１３４）。ナイーブ対エフェクター細胞の別の重要な違いはそれらの代謝状態である。エフェクター細胞は好気的解糖へのシフトを見せる（マチョレク等（Maciolek et al.）著（２０１４年）カレント・オピニオン・イン・イミュノロジー（Current Opinion in Immunology）２７巻：ｐ．６０−７４）。これもまたｐｅｐＮ制御に対する感受性に影響し得る。
【００８１】
我々は、高ペプチドがＳｐｎのｐｅｐＮの負の効果を克服するということを見出し得る。これは我々がエフェクターについて観察するものとは対照的であろう。なぜなら、可溶性ペプチドの比較的高い量（１０−６Ｍ）が、機能を評価するための再刺激の間には存在するからである。しかしながら、上で触れられているように、最高のシグナル伝達についての要件はナイーブ及び活性化細胞において異なる。かかる知見は、阻害が、それをブロックするのではなくシグナル伝達カスケードを弱めるということを示唆し得る。
【００８２】
例１１
どのようにＳｐｎ成分の存在がヒトＴ細胞の機能に影響するかの決定
ここまでのところ、我々の分析は専らマウス細胞によって実施した。このモデルにおける効果が印象的である一方で、我々の知見の重要性は、ヒト細胞がＳｐｎのｐｅｐＮによる制御に対して感受性である程度の理解によって増大するであろう。この狙いのゴールは、ＳｐｎのｐｅｐＮがヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターの機能を阻害するかどうかと、ヒトのナイーブＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に及ぼすその効果とを決定することである。
【００８３】
ヒトエフェクター細胞はＳｐｎのｐｅｐＮによる負の制御に対して感受性であるか？血液をウェイクフォレスト大学医学部（Wake Forest School of Medicine）の臨床研究ユニット（ＣＲＵ）において正常ヒトドナーから収集する。末梢血単核細胞をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いて単離する。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉバイオテック（Miltenyi Biotec）のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットによって単核細胞から精製する。これらのキットは、＞９５％純粋である集団をもたらす。細胞を１０μｇ／ｍｌの固定化した抗ＣＤ３抗体と、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体と共に、又はホルボールミリステートアセテート及びイオノマイシンと培養する。細胞を５日間培養して、エフェクター集団を作製する。各ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、分化誘導性サイトカインの存在下における刺激によってＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７エフェクター細胞に分化させる（アコスタ・ロドリゲス等（Acosta-Rodriguez et al.）著（２００７年）ネイチャー・イミュノロジー（Nature Immunology）８巻：ｐ．９４２−９４９；カズンズ等（Cousins et al.）著（２００２年）ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（The Journal of Immunology）１６９巻：ｐ．２４９８−２５０６）。ｄ５に、細胞を、Ｓｐｎ［ｐｅｐＮ］のタイトレーションした濃度の存在下においてＰＭＡ＋ｉｏｎによって再刺激し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１７の産生をフローサイトメトリーによって決定する。
【００８４】
ＳｐｎのｐｅｐＮの存在は、ナイーブヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び分化に負に影響するか？健康なドナーからのナイーブＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉバイオテック（Miltenyi Biotec）ビーズセレクションキットを用いて製造者の説明の通りに単離する。単離された集団をＣＦＳＥによって標識し、１０μｇ／ｍｌの固定化した抗ＣＤ３抗体と、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体と共に、又はホルボールＰＭＡ＋イオノマイシンと培養する。ＳｐｎのｐｅｐＮのタイトレーションした濃度を培養物に追加する。刺激後の１〜５日目に、細胞を収穫し、計数し、ＣＤ６９及びＣＤ２５と共に、ＣＤ４又はＣＤ８に対する抗体によって染色する。マーカー発現レベル及びＣＦＳＥ希釈プロファイルをフローサイトメトリーによって決定する。各収穫時点において、細胞をＺｏｍｂｉｅ色素によってもまた染色して、生存率を測定する。
【００８５】
あり得るアウトカム及び解釈：上の実験はＳｐｎによる阻害に対するヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の感受性を決定する。分化の結果としてのさらなるあり得る変化をもまた決定する。我々は、ＴＣＲシグナル伝達及び活性化要件の類似性に鑑みて、マウス及びヒトＴ細胞の応答には類似性があるという仮説を立てている。しかしながら、ｐｅｐＮの機能に関わる分子の種特異的な違いがマウス及びヒトにおいては異なり、これが阻害活性を防止するということは常に可能である。これがその通りである場合には、我々の将来的な計画は、Ｓｐｎが疾患を引き起こす他の種、例えば子豚及び畜牛からのＴ細胞を試験することである。
【００８６】
参照
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照は、本開示の主題が関係する当業者の水準を指示するものである。全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照は、各個々の刊行物、特許出願、特許、及び他の参照が具体的に個々に参照によって組み込まれることを指示される場合と同じ程度に参照によって本明細書に組み込まれる。いくつもの特許出願、特許、及び他の参照が本明細書において参照されているが、かかる参照は、それらの文書のいずれかが当分野の共通の一般的知識の一部を形成するという承認には当らないということは理解されるであろう。
【００８７】
先の主題は、理解の明瞭性の目的のための例解及び例としていくらか詳細に記載したが、ある種の変更及び改変が添付の請求項の範囲内で実施され得るということは当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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