(57)【要約】  本発明は、対象において、放射線治療（ＲＴ）後の、皮膚萎縮、毛細血管拡張、硬結（線維化）、壊死または潰瘍として定義される乳房晩発効果（ＢＬＥ）を発症するリスクを、Ｔリンパ球アポトーシスを用いた放射線誘発晩発効果（ＲＩＬＡ）および臨床パラメータを用いて予測するための、新規診断方法および計算機に関する。本発明はまた、本方法およびノモグラムを実行するための診断キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、放射線治療後の、乳房晩発効果（ＢＬＥ）を発症するリスクを診断するためのインビトロ法であって、以下のステップを含む方法：
ａ．対象において、対象の生物サンプル、好ましくは対象の血液サンプルから、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関する少なくとも１つの生化学マーカーの値、特に、ＲＩＬＡ、放射線感受性のタンパク質および／または遺伝子から選択される、少なくとも１つの生化学マーカーの値を決定すること；
ｂ．対象において、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関する少なくとも２つの臨床パラメータのレベル、特に、年齢、乳房の体積、補助ホルモン療法、ブースト、リンパ節照射、およびタバコの喫煙から選択される、少なくとも２つの臨床パラメータのレベルを決定すること；
ｃ．ＢＬＥを発症するリスクを決定するための最終値を得るために、当該データを、多変量Ｃｏｘ関数を用いて組み合わせること；
ここで、多変量Ｃｏｘ関数からの多変量Ｃｏｘ回帰は、以下の方法を通して得られる:
ｉ）当該生化学マーカーと当該臨床パラメータとを組み合わせることにより、多変量Ｃｏｘ回帰を構築すること;および
ｉｉ）多変量Ｃｏｘ回帰を解析して、生化学マーカーおよび臨床パラメータの独立した判別値を評価すること。
【請求項２】
当該少なくとも１つの生化学マーカーが、放射線治療（ＲＴ）後のＣＤ４および／またはＣＤ８の応答、好ましくは、放射線治療（ＲＴ）後のＣＤ８の応答に基づくＲＩＬＡに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該少なくとも２つの臨床パラメータが、少なくともタバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
当該生化学マーカーが、放射線感受性のタンパク質および／または遺伝子と組み合わせて用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
放射線感受性のタンパク質が、ＡＫ２、ＨＳＰＡ８、ＡＮＸ１、ＡＰＥＸ１およびＩＤ２からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
放射線感受性の遺伝子が、ＴＧＦβ、ＳＯＤ２、ＴＮＦαおよびＸＲＣＣ１からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
多変量Ｃｏｘ関数が以下から成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
ハザード（ＢＬＥを経験）＝ベースラインハザード＊ｅｘｐ（β１＊ＲＩＬＡ＋β２＊（補助ホルモン療法［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）＋β３＊（タバコの喫煙習慣［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）、ここで、
・β１は、−０．０７７〜−０．０１０に含まれる；
・β２は、０．２８３〜１．９８０に含まれる；
・β３は、−０．０６３〜０．９６５に含まれる。
【請求項８】
多変量Ｃｏｘ関数の最終値が、適切な放射線治療投与レジメンなどの、患者にとって好適な処置の選択のために用いられ、ここで：
−患者が乳房晩発効果を発症するリスクがある場合、例えば部分乳房少分割処置の実施により、適切な放射線治療投与レジメンは、減少され得；
−患者が乳房晩発効果を発症するリスクが低い、または無い場合、例えば少分割処置（５または１６分割）の実施により、適切な放射線治療投与レジメンは、増加され得る、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
多変量Ｃｏｘ関数の最終値が、乳房切除術と温存手術との間での選択のために用いられ、好ましくは、最終値が２０％を超える場合に、温存手術の代わりに乳房切除術の決定が考えられ、またその逆も言える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
多変量Ｃｏｘ回帰の最終値が、温存手術または乳房切除術後直ちに乳房再建を行うことについての決定に使用され、好ましくは、当該最終値が８％未満であれば、温存手術または乳房切除術後直ちに乳房再建を行うことが考えられ得る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
関数的表現がノモグラムである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象のデータを収集するのに好適なキットであって、以下を含むキット：
−生体サンプル、特に血液サンプルの生物学的輸送に好適な箱／容器およびバッグ、並びに、
−患者および／または看護師および／または医師によって完成されるべき書式であって、特に、放射線感受性試験およびノモグラム解析を実行するためにデザインされ、必要とされる書式。
【請求項１３】
対象において、乳房晩発効果（ＢＬＥ）の発症リスクを検出するのに好適なキットであって、以下を含むキット：
・請求項１、２および４〜６に記載の少なくとも１つの生化学マーカーの値を決定するための試薬；ならびに、
・場合により、請求項１または３に記載の少なくとも２つの臨床パラメータについての情報を収集する手段。
【請求項１４】
以下を含む、請求項１３に記載のキット：
−サンプルの照射が線形加速器またはラボ照射器によって行われ得る独立した試験所でＲＩＬＡアッセイを実行するために必要な、いくつかまたは全ての特定の試薬、および
−場合により、患者および／または看護師および／または医師によって完成されるべき特定の書式であって、特に、放射線感受性試験およびノモグラム解析を実行するためにデザインされ、必要とされる書式。
【請求項１５】
コンピューターまたは／および計算機などの機械可読メモリ、および、請求項１〜７に記載の多変量Ｃｏｘ関数を計算するプロセッサ、並びに、好ましくはさらに、ノモグラムを構築して、対象について放射治療後にＢＬＥを発症する瞬間的リスクを計算するためのソフトウエアを実行するためのモジュールを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対象において、放射線治療（ＲＴ）後の、皮膚萎縮、毛細血管拡張、硬結（線維化）、壊死または潰瘍として定義される乳房晩発効果（breast late effect）（ＢＬＥ）を発症するリスクを、Ｔリンパ球アポトーシスを用いた放射線誘発晩発効果（ＲＩＬＡ）および臨床パラメータを用いて予測するための、新規診断方法および計算機に関する。本発明はまた、本方法およびノモグラムを実行するための診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
治療目的のＲＴ後の、重度であるが中等度の毒性、例えば乳癌後の美容上の転帰不良などは、生活の質に悪影響を及ぼし、その後の心理的転帰に著しい影響を与え得る(Al-Ghazal, Fallowfield et al. 1999)。内因性の放射線感受性を含む多くの因子が、放射線毒性のリスクを高めることが知られている(Azria, Betz et al. 2012)。患者集団に対する毒性リスクは知られているが、個体の正常組織の放射線感受性の決定は、処置前にはほとんど可能ではない。したがって、現在の診療基準は、一般に、照射されている個体の遺伝子型または表現型に関係なく、標準的な推奨値から臨床シナリオに従って放射線量を処方する。
【０００３】
その文脈で、Azria et らは(Azria, Riou et al. 2015)、ＲＩＬＡのフローサイトメトリー評価に基づく放射線感受性アッセイが、個体間の乳房線維化（breast fibrosis)の差異を有意に予測でき、ＲＴに対して潜在的に過敏な患者の迅速スクリーニングとして使用できることを示した。ＲＩＬＡ値が高く、グレードが２以上の乳房線維化が少ない場合に、陰性的中率が見られた（Ozsahin, Crompton et al. 2005）。加えて、ＲＩＬＡ値の低い患者において、全て重度の乳房線維化（グレード２以上）が観察された。さらに、これらの結果を、多施設試験（multicentric trial）で確認し、ＲＩＬＡ値が高く、グレードが２以上の乳房線維化が少ない場合に、９１％の陰性的中率を示した（Azria, Riou et al．2015）。それにもかかわらず、ＲＩＬＡに基づくこの放射線感受性アッセイの予測は、感度および信頼度の点でいくらかの制限を示す。単独では、ＲＩＬＡは感度と特異度の点から高度な予測をすることはできない。
【０００４】
従って、ＲＴ後にＢＬＥを発症するリスクを診断的に予測する方法を開発し、感度および信頼度を向上させることに重要なニーズがある。
【０００５】
Azria et al. 2015の論文では、前向き多施設試験（prospective multicenter trial）において、乳房の補助放射線治療後の、乳房線維化の独立予測因子としてのＲＩＬＡの役割を評価した。しかし、多変量解析では、急性効果（acute effect）と、ＲＩＬＡまたは他の臨床的に関連のあるパラメータとの間に相関は認められなかった。特に、この先行技術に開示されているように、タバコの喫煙パラメータは、線維化および再発についての多変量回帰分析において、重要ではなかった。
【０００６】
本発明は、乳房晩発病効果（ＢＬＥ）を発症する確率を予測するための新規診断方法であって、ＲＩＬＡを、臨床パラメータ、特にタバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法と組み合わせる方法を提供し、患者に対するＢＬＥを発症するリスクの総合評価が改善される。
【０００７】
例示的な実施例にさらに開示されるように、他のいかなる組み合わせ臨床パラメータも有さずに２０％のＲＩＬＡ（放射線誘発ＣＤ８ Ｔリンパ球アポトーシス）を有する患者は、３年でＢＬＥも再発リスクも有さないと考えられる患者であり（ＢＬＥのリスクがおよそ２〜３％）、一方、本発明による新規のインビトロ診断方法では、ＲＩＬＡと臨床パラメータ、特にタバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法とを組み合わせると、ＢＬＥを発症するリスクは１６％と測定（majored）される。そして、他の組み合わせ臨床パラメータを有さずに１２％のＲＩＬＡを有する（ＢＬＥのリスクがおよそ５％の）患者の場合、タバコの喫煙の臨床パラメータと組み合わせると、８％のＢＬＥのリスクを有すると測定されるであろうし、タバコの喫煙および補助ホルモン療法と組み合わせると、２２％のＢＬＥのリスクを有するとさえ測定されるであろう。
【０００８】
これらのデータは、患者に対するＢＬＥのリスクの総合評価を最適化するための、本発明による組み合わせアプローチの、利益および効率を示していた。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の概要
本発明は、対象において、放射線治療（ＲＴ）後の、乳房晩発効果（ＢＬＥ）を発症するリスクを診断するためのインビトロ法であって、以下のステップを含む方法に関する：
ａ．対象の生物サンプル（biologic sample）から、少なくとも１つの生化学マーカーの値を決定すること；
ｂ．少なくとも２つの臨床パラメータのレベルを決定すること；
ｃ．ＢＬＥを発症するリスク（確率）を決定するための最終値を得るために、当該データを、多変量Ｃｏｘ関数を用いて組み合わせること；
ここで、多変量Ｃｏｘ関数からの多変量Ｃｏｘ回帰は、以下の方法を通して得られる：
ｉ）当該生化学マーカーと当該臨床パラメータとを組み合わせることにより、多変量Ｃｏｘ回帰を構築すること；および
ｉｉ）多変量Ｃｏｘ回帰を解析して、生化学マーカーおよび臨床パラメータの独立した判別値を評価すること。
【００１０】
本発明による「ＢＬＥを発症するリスクを診断する（確率を予測する）ためのインビトロ法」とは、総合的な方法が、データの解析がインビトロ（ＲＩＬＡアッセイ）またはエクスビボ（予め患者について評価された臨床パラメータにより得られた多変量ｃｏｘ回帰モデル）で行われるステップを含むことを意味する。
【００１１】
特に、本発明は、対象において、放射線治療後の、乳房晩発効果を発症するリスクを診断するためのインビトロ法であって、以下のステップを含む方法に関する：
a．対象において、対象の生物サンプル、好ましくは対象の血液サンプルから、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関する少なくとも１つの生化学マーカーの値、特に、ＲＩＬＡ、放射線感受性のタンパク質および／または遺伝子から選択される、少なくとも１つの生化学マーカーの値を決定すること;
b．対象において、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関する少なくとも２つの臨床パラメータのレベル、特に、年齢、乳房の体積、補助ホルモン療法、ブースト、リンパ節照射、およびタバコの喫煙から選択される、少なくとも２つの臨床パラメータのレベルを決定すること; 
c．ＢＬＥを発症するリスクを決定するための最終値を得るために、当該データを、多変量Ｃｏｘ関数を用いて組み合わせること;
ここで、多変量Ｃｏｘ関数からの多変量Ｃｏｘ回帰は、以下の方法を通して得られる:
ｉ）当該生化学マーカーと当該臨床パラメータとを組み合わせることにより、多変量Ｃｏｘ回帰を構築すること；および
ｉｉ）多変量Ｃｏｘ回帰を解析して、生化学マーカーおよび臨床パラメータの独立した判別値を評価すること。
【００１２】
好ましい実施形態では、当該少なくとも１つの生化学マーカーがＲＩＬＡに存在し、当該少なくとも２つの臨床パラメータが、タバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法である。
【００１３】
有利には、当該少なくとも１つの生化学マーカーＲＩＬＡは、放射線治療（ＲＴ）後のＣＤ４および／またはＣＤ８、好ましくはＣＤ８の応答に基づく。
【００１４】
特定の実施形態では、当該少なくとも１つの生化学マーカーは、放射線感受性のタンパク質および／または遺伝子と組み合わせて用いられる。
【００１５】
特定の実施形態では、当該少なくとも１つの生化学マーカーは、好ましくは、ＡＫ２、ＨＳＰＡ８、ＡＮＸ１、ＡＰＥＸ１およびＩＤ２からなる群から選択される、放射線感受性のタンパク質と組み合わせて用いられる。
【００１６】
別の特定の実施形態では、当該少なくとも１つの生化学マーカーは、好ましくは、ＴＧＦβ、ＳＯＤ２、ＴＮＦα、ＸＲＣＣ１からなる群から選択される、放射線感受性の遺伝子と組み合わせて用いられる。
【００１７】
特定の実施形態では、当該少なくとも１つの生化学マーカーは、ＡＫ２、ＨＳＰＡ８、ＡＮＸ１、ＡＰＥＸ１およびＩＤ２からなる群から選択される、少なくとも１つの放射線感受性のタンパク質、特に少なくとも２つの放射線感受性のタンパク質、より特に少なくとも３つの放射線感受性のタンパク質、より特に少なくとも４つの放射線感受性のタンパク質、さらにより特に５つの放射線感受性のタンパク質と組み合わせて用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
定義
「乳房晩発効果（ＢＬＥ）」とは、放射線治療（ＲＴ）後の、対象における、皮膚萎縮、毛細血管拡張、硬結（線維化）、壊死または潰瘍を意味する。「硬結」と「線維化」は同義語である（臨床的意味と医療的意味）。
【００１９】
「対象」とは、ヒトを意味する。
【００２０】
「生体サンプル」とは、特に血液サンプルを意味し、好ましくは、白血球含有全血抽出物、リンパ球含有全血抽出物、およびＴリンパ球含有全血抽出物を意味する。
【００２１】
「臨床パラメータ」とは、対象における、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関連する任意の臨床パラメータを意味し、特に、さらに表１に開示されるように、乳房の体積、補助ホルモン療法、ブースト（照射量の補完）、リンパ節照射、およびタバコの喫煙から選択される。本発明の臨床パラメータは、好ましくは、タバコの喫煙習慣、補助ホルモン療法、およびそれらの複合（mixtures）からなる群から選択される。
【００２２】
「タバコの喫煙習慣」とは、以下に規定するタバコ喫煙患者または非喫煙患者を意味する。タバコ喫煙患者は、日常喫煙者（daily smoker）、間欠的な喫煙者（intermittent smoker）、または毎日ではない喫煙者（non-daily smoker）として、一律に（consistently）規定し（多変量Ｃｏｘ関数において、ｖａｌｕｅ＝１が与えられる）、一方、非喫煙患者は、数日喫煙者（some-day somker）または非日常喫煙者（never daily smoker）として規定する（多変量Ｃｏｘ関数において、ｖａｌｕｅ＝０が与えられる）。
【００２３】
「日常喫煙者（daily smoker)」という用語は、現在日常的に喫煙している対象を規定する。
【００２４】
「間欠的な喫煙者（intermittent smoker）」という用語は、日常的には喫煙しない（DiFranza et al., 2007; Lindstrom, Isacsson, & the Malmo Shoulder-Neck Study 群, 2002）、または前月に１〜１５日喫煙した（McCarthy, Zhou, & Hser, 2001）として、規定されている。
【００２５】
「毎日ではない喫煙者（non-daily smoker）」という用語は、少なくとも週一回（ただし毎日ではない）または週一回未満の頻度で喫煙する対象；一生のうち少なくとも１００本のタバコを喫煙し、現在数日喫煙する対象；一生のうち１００本を超えてタバコを喫煙し、現在数日喫煙し、過去３０日のうち３０日未満の日に喫煙した対象；一生のうち１００本を超えて喫煙し、過去３０日のうち数日または１〜２日喫煙した対象；または、一生のうち１００本未満のタバコを喫煙し、過去３０日の間に喫煙した対象を規定する（Gilpin, White, & Pierce, 2005; Hassmiller et al., 2003; Husten, McCarty, Giovino, Chrismon, & Zhu, 1998; Leatherdale, Ahmed, Lovato, Manske, & Jolin, 2007; McDermott et al., 2007; Tong, Ong, Vittinghoff, & Perez-Stable, 2006; Wortley, Husten, Trosclair, Chrismon, & Pederson, 2003）。
【００２６】
「数日喫煙者（some-day somker）」という用語は、喫煙者の一生の間に１００本のタバコを喫煙したことがあり、現在は数日喫煙している（毎日ではない(not every day)；CDC, 1993; Hassmiller, Warner, Mendez, Levy, & Romano, 2003）対象を規定する。
【００２７】
「非日常喫煙者（never daily smoker）」は、６ヶ月以上の間、日常的に喫煙したことがない対象を規定する(Gilpin et al., 1997)。
【００２８】
「補助ホルモン療法」とは、癌の再発の可能性を低下させるために手術、化学療法、および／または放射線治療の後に行われる処置を意味する。ホルモン受容体陽性乳癌は、成長するのに、エストロゲンおよび／またはプロゲステロンと呼ばれるホルモンに依存している。補助ホルモン療法は、体内のこれらのホルモンのレベルを下げるか、またはこれらのホルモンが、残存する癌細胞に達するのを妨げることを可能にする。ホルモン受容体陽性乳癌のためのホルモン療法は、タモキシフェン、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）、およびレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ）などのアロマターゼインヒビター（ＡＩｓ）、並びに、手術による、またはゴナドトロピン、黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ）、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ）およびリュープロリド（Ｌｕｐｒｏｎ）から選択される薬剤による卵巣抑制から選択される。
【００２９】
「生化学マーカー」とは、対象における、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関連する、任意の生化学マーカーを意味する。本発明の生化学マーカーは、ＲＩＬＡ生化学マーカー（放射線誘発ＣＤ４および／またはＣＤ８、好ましくはＣＤ８Ｔ−リンパ球アポトーシス）、ＡＫ２、ＨＳＰＡ８、ＩＤＨ２、ＡＮＸ１、ＡＰＥＸ１などの放射線感受性のタンパク質、および放射線感受性の遺伝子からなる群から選択される。
【００３０】
本技術分野において当業者からよく知られているように（Ozsahin et al., 1997 and 2005）、ＲＩＬＡは、生体サンプル、好ましくは血液サンプルを、８ＧｙのＸ線で照射した後の放射線誘発リンパ球アポトーシスの割合と、照射なしのリンパ球アポトーシスの割合（０Ｇｙ）との間の百分率（％）の差である。リンパ球とは、ＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔリンパ球、特にＣＤ８  Ｔリンパ球を包含する。ＲＩＬＡはまた、放射線誘発ＣＤ８  Ｔリンパ球アポトーシスとして規定される(Azria et al., 2015参照)。
【００３１】
したがって、本発明の「ＲＩＬＡ生化学マーカー」とも呼ばれる「ＲＩＬＡに存在する生化学マーカー」によって、生体サンプル、好ましくは血液サンプルを８ＧｙのＸ線で照射した後の、放射線誘発リンパ球アポトーシスの割合と、照射なしのリンパ球アポトーシスの割合（０Ｇｙ）との間の百分率（％）の差が、理解される。
【００３２】
実施例にさらに開示されているように、放射線によるリンパ球アポトーシスと、放射線によらないリンパ球アポトーシスの割合は、当業者によって一般的に知られているＲＩＬＡアッセイ(Ozsahin et al., 1997 and 2005)に従い、測定される。
【００３３】
「放射線感受性のタンパク質」とは、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ２）、熱ショック同族タンパク質７１ｋＤａ（ＨＳＣ７０またはＨＳＰＡ８）、ミトコンドリアイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、アネキシン１（ＡＮＸ１）、およびＤＮＡ−（脱プリンまたは脱ピリミジン部位）リアーゼ（ＡＰＥＸ１）、その特異的断片、それをコードする核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を意味する。これらのタンパク質およびその断片は、ＷＯ２０１４／１５４８５４に開示されている。
【００３４】
当該放射線感受性のタンパク質の存在またはレベルは、免疫検出に基づく方法、ウエスタンブロットに基づく方法、質量分析に基づく方法、クロマトグラフィーに基づく方法、または、フローサイトメロリーに基づく方法、および特異的な核酸の検出のための方法からなる群において選択される少なくとも１つの方法によって判定される。これらの方法は、化合物、特にタンパク質を、検出かつ定量化する当技術分野の当業者によく知られており、ここでタンパク質の発現の存在およびレベルは、直接決定することができ、または、タンパク質特異的な核酸、特にｍＲＮＡを検出することにより、好ましくは定量化することにより、核酸レベルで分析することができる。第１のステップでは、タンパク質および／または核酸を、生体サンプルから単離する。本発明の方法は、周知の生化学法を用いた、タンパク質抽出、精製および特徴付けを含み得る。
【００３５】
「放射線感受性の遺伝子」とは、線維化経路およびＲＯＳ管理（ROS management）に関与する遺伝子として特定された一塩基多型（ＳＮＰ）を意味する。これらの遺伝子は、候補遺伝子として、それぞれ特定されている：ＴＧＦβ、ＳＯＤ２、ＴＮＦα、ＸＲＣＣ１。これらの遺伝子は、Azria et al., 2008に開示されているようにゲノムアッセイによって分類されている。放射線感受性の遺伝子の存在またはレベルは、当業者から知られている通常の方法、特にＰＣＲおよび定量的ＰＣＲなどの、特定の核酸を検出および定量するための方法によって決定される。特定の実施形態では、Azria et al.,2008に開示されている方法には、リンパ球の単離、DNAの抽出と増幅、およびTransgenomicのWAVE高感度核酸断片分析システム（WAVE High Sensitivity Nuclei Acid Fragment Analysis システム）を用いた変性高速液体クロマトグラフィーまたはSurveyorヌクレアーゼアッセイが含まれる。上記に開示した目的のＳＮＰを包含するＤＮＡアンプリコン用のＰＣＲプライマーは、ＮＣＢＩから得られたゲノム配列を用いて設計した。
【００３６】
「放射線治療」とは、癌細胞を殺すか、または損傷させて、それらが成長および増殖するのを止めるための、Ｘ線、γ線、電子ビームまたはプロトンなどの高エネルギー放射線の使用を包含する処置を指す。
【００３７】
ＲＩＬＡアッセイ
ＲＩＬＡアッセイは、通常、以下のステップを含む：
ａ）血液サンプルの細胞培養
ｂ）線形加速器を用いた８Ｇｙでのサンプル照射、および
ｃ）特にＦＡＣＳ解析によるＴリンパ球アポトーシスの評価のためのサンプル標識
【００３８】
当業者は、ＲＩＬＡアッセイを行うために、古典的方法を用いてよい。
ステップｃ）でのＴリンパ球アポトーシスの評価は、アネキシン５の投与、カスパーゼの投与などの代替方法またはＦＡＣＳ解析を用いてよく、好ましくはＦＡＣＳ解析を用いてよい。
【００３９】
各工程ａ）〜ｃ）の詳細のいくつかは、特定の実施形態として以下に開示される。
【００４０】
血液サンプルの細胞培養：
−放射線治療（ＲＴ）の前に、各患者から１つの血液サンプルをヘパリン化チューブに集め、ある量の血液をウェルプレートに分注した；
−アッセイは一般的に、３連で行われる（０Ｇｙおよび８Ｇｙ）。
−６ウェル組織培養プレートに、ウェルごとに培地を添加する（例えば、２０％ＦＣＳを添加した培地ＲＰＭＩ１６４０（Gibco）２ｍｌを添加する）。
−組織培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養する。
【００４１】
線形加速器を用いた８Ｇｙでのサンプル照射：
−１５〜３０時間の培養後、特に２４時間後に、プレートを安全に照射器に運び、１Ｇｙ／分の線量率で８Ｇｙの照射を適用するために放射線技師に渡される。
特定の実施形態では、照射の条件は以下の通りである：
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−対照細胞をインキュベーターから取り出し、同じ期間、放射線処置をせずに置いた。
−プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４０〜５０時間培養する。
【００４２】
特にＦＡＣＳ解析によるＴリンパ球アポトーシスの評価のためのサンプル標識：
−４０〜５０時間のインキュベーション、特に４８時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、室温に置く；
−各ウェルの内容物を、予め標識した遠心分離管に移し、遠心分離（例：１４５０ｒｐｍ、５分間）後に、内容物を抗ヒトＣＤ４および／またはＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体、好ましくはＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体で標識する；
−溶解バッファーを添加した後、当業者から知られている通常の方法、特に、試薬としてヨウ化プロピジウムおよびＲＮａｓｅ  Ａを用いたフローサイトメトリー法（ＦＡＣＳ）によって、リンパ球アポトーシスを評価するために、試薬を各遠心分離管に添加した。
【００４３】
多変量ｃｏｘ回帰
多変量ｃｏｘ回帰は、事象までの時間の解析（time-to-event analysis）（Cox,  et al. 1984）のための一般的な統計モデルの１つである。二値または多クラス（multi-class）の転帰（outcome）を直接扱う分類アルゴリズムとは異なり、多変量Ｃｏｘ回帰は、予測変数と実際の転帰とを直接関連付けるセミパラメトリックモデルを規定し、一般に実際の転帰は、生存期間（月数または年数）である。多変量Ｃｏｘ関数は、事象までの時間のエンドポイントの識別という観点で、独立パラメータを組み合わせるのに最良のハザード関数である。本発明によれば、当該独立パラメータは、対象におけるＢＬＥの発症に関連する生化学マーカーおよび／または臨床パラメータであり、例えば、ＲＩＬＡ、補助ホルモン療法、およびタバコの喫煙習慣である。
【００４４】
多変量Ｃｏｘ関数は、多変量Ｃｏｘ回帰で個々に決定された各パラメータの相対的な重みを、当該マーカーが線維化の観察と負の相関を有する場合に、負の符号と組み合わせることによって得られる。本発明において、患者の分類は、研究の臨床追跡調査中の、ＢＬＥの検出に基づいて行った。
【００４５】
モデリングは、放射線治療および温存手術によって処置された多施設の乳癌患者の集団（「参照集団」とも呼ばれる）に基づく。モデルを構築するステップは、次の通りである：
・バイオマーカーの特定（例えば、対象における、ＲＩＬＡ、および放射線毒性のリスクの増加を評価することに関連する臨床パラメータ）；
・ＢＬＥの予後因子として関連する共変数を特定するための、多施設臨床試験における特定したバイオマーカーの使用；
・生化学マーカー（ＲＩＬＡ）と臨床パラメータの組み合わせの、ＢＬＥの予測的役割を特定するための、大規模多施設臨床試験におけるこれらの変数の適用。
【００４６】
「多施設研究試験」とは、複数の医療センターまたは診療所で行われる臨床試験を意味する。
【００４７】
本発明によれば、多変量Ｃｏｘ関数は以下の通りである：
ハザード（乳房晩発線維化を経験）＝ベースラインハザード＊ｅｘｐ（（β１＊生化学マーカー）＋β２＊（臨床パラメータ１）＋β３＊（臨床パラメータ２）＋…βｎ＊（臨床パラメータ（ｎ−１）（ｎは３以上））、ここで、ベースラインハザードは、全ての共変数がゼロの場合の、事象（ＢＬＥ）を経験するハザードに相当する。
【００４８】
上記の方程式の右辺は、本モデルの基礎となる関数を指定している。方程式の左辺は、ノモグラムで表示され、患者に伝えられる、予測される確率である。どのような統計的報告書でもそうであるように、β係数は各共変量について推定され、効果の尺度としてハザード比に変換されなければならない。問題の事象（乳房晩発線維化を経験）の予測される確率を得るために、上記の方程式は、患者の個々の特性と本モデルから導出されたβ係数を使って計算される。
【００４９】
ベースラインハザードは、共変数なしでＢＬＥを発症する基準リスク（ｂａｓａｌ  ｒｉｓｋ）に相当する定数である。ｃｏｘ回帰モデルに従ったモデリングは、上記のように参照集団から得られるデータからこのベースラインハザードを与える。
【００５０】
臨床パラメータ「１」〜「ｎ」は、さらに表１に開示されるように、年齢、乳房の体積、補助ホルモン療法、ブースト（照射量の補完）、リンパ節照射、およびタバコの喫煙からなる群から選択される。
【００５１】
臨床パラメータ「年齢」の場合、５５歳以下の患者（多変量Ｃｏｘ関数において、ｖａｌｕｅ＝０が与えられる）と、５５歳を超える患者（多変量Ｃｏｘ関数において、ｖａｌｕｅ＝１が与えられる）とを規定するために、年齢の中央値は５５歳である。
【００５２】
臨床パラメータ「タバコの喫煙」の場合、タバコ喫煙患者は、一律に、日常喫煙者、間欠的な喫煙者、または毎日ではない喫煙者（多変量Ｃｏｘ関数において、ｖａｌｕｅ＝１が与えられる）として規定され、一方非喫煙患者は、数日喫煙者または非日常喫煙者として規定される（多変量Ｃｏｘ関数において、ｖａｌｕｅ＝０が与えられる）。
【００５３】
特定の実施形態では、ハザード（乳房晩発線維化を経験）＝ベースラインハザード＊ｅｘｐ（（β１＊生化学マーカー）＋β２＊（臨床パラメータ１［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）＋β３＊（臨床パラメータ２［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］））であり、ここで、ベースラインハザードは、全ての共変数がゼロの場合の、事象（ＢＬＥ）を経験するハザードに相当し、好ましくは、ハザード（乳房晩発線維化を経験）＝ベースラインハザード＊ｅｘｐ（β１＊ＲＩＬＡ生化学マーカー＋β２＊（タバコの喫煙［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）＋β３＊（補助ホルモン療法［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）であり、ここで、ベースラインハザードは、全ての共変数がゼロの場合の、事象（ＢＬＥ）を経験するハザードに相当する。
【００５４】
本明細書では、ハザード（乳房晩発線維化を経験）は、対象のＢＬＥを発症する瞬間的リスクとも呼ばれる。
【００５５】
この多変量Ｃｏｘ関数に基づいて、当業者であれば、任意の追加の関連する生化学マーカーおよび／または臨床パラメータを、当該多変量Ｃｏｘ関数に導入することができるであろう。
【００５６】
本発明の最適モデルの選択は、打ち切り観測に対するハレルのＣ指数（Ｈａｒｒｅｌｌ’ｓ  Ｃ−ｉｎｄｅｘ）によって評価され、ハレルのＣ指数は、２つの生存分布間の一致の確率に等しい。Ｃ指数または一致指数は、予測された確率と目的の事象が発生する実際の可能性との間の一致レベルを定量化する。
【００５７】
一実施形態では、本発明の予後予測方法は、０．６８７６のハレルのＣ指数を有する。
【００５８】
多変量Ｃｏｘ回帰における様々なマーカーについて得られた値に使用される様々な係数は、実施例に記載されるように、統計解析を通して計算することができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明の多変量Ｃｏｘ関数は、以下から成る：
多変量Ｃｏｘ関数（ＢＬＥを経験）＝ベースラインハザード＊ｅｘｐ（β１＊ＲＩＬＡ＋β２＊（補助ホルモン療法［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）＋β３＊（タバコの喫煙習慣ｓ［０＝ｎｏ；１＝ｙｅｓ］）、ここで、
・β１は、−０．０７７〜−０．０１０に含まれる；
・β２は、０．２８３〜１．９８０に含まれる；
・β３は、−０．０６３〜０．９６５に含まれる。
【００６０】
上記式の「多変量Ｃｏｘ関数（ＢＬＥを経験）」とは、多変数Ｃｏｘ関数によるハザード（ＢＬＥを経験）を意味し、多変量Ｃｏｘ関数によるハザード比（ＢＬＥを経験）ともいう。このモデルは、２つの患者集団を比較するものである。
【００６１】
患者についての最終値およびその使用
各患者のＢＬＥを発症する瞬間的なリスクまたは「最終値」は、基準リスク（ベースライン特性）および共変数（臨床パラメーター）を考慮に入れて推定される；「最終値」は、各患者についての事象発生が予測される確率である。
【００６２】
ノモグラムは、これらのパラメータの組み合わせを用いた、決定支援のための、事象発生の予測確率を表示する一般的なビジュアルプロットである。
ｃｏｘ多変量モデルを当てはめた後にこのノモグラムを構築するために、Iasonos et al. (2008)によって記載された方法に従って、線形予測子を得る。
【００６３】
特定の実施形態では、各患者のＢＬＥを発症する確率（「最終値」）を決定するプロセスは、以下を含む：
１．対象において、ＲＩＬＡと、放射線毒性のリスクの増加を評価することに関連する臨床パラメータであって、特に、さらに表１に開示されるように、年齢、乳房の体積、補助ホルモン療法、ブースト（照射量の補完）、リンパ節照射、およびタバコの喫煙から選択される臨床パラメータとを記述すること；
２．ｃｏｘ回帰モデル下での、単変量解析（ｐ値≦０．２を有する全ての有意なパラメータを選択するために、各パラメータについて１つずつ推定する）；
３．ｃｏｘ回帰モデル下での、多変量解析（単変量解析で選択された全てのパラメータを含み、臨床的に関連のある任意の有意でないパラメータ追加して、推定する）；
４．最終モデルを得るための、有意なパラメータ、および／または臨床的に関連のあるパラメータの選択。最終モデルの線形予測子を、ＢＬＥを発症するリスク（確率）を推定するために抽出し、線形予測子をソフトウエアに組み込んだ。
５．ソフトウエアの実行による、Iasonos et al. 2008に従ったノモグラム（主効果、交互作用および区分線形効果を含む、各パラメータについての０〜１００の間の線形予測子）の構築。この表示は、個々のパラメータに従って、各患者について、放射線治療後の最終値の計算によって、ＢＬＥを発症するリスク（確率）を与える。
【００６４】
本発明による統計解析のプロセス（多変量Ｃｏｘ関数および線形予測子の抽出）、および多変量Ｃｏｘ回帰を用いた解析によって得られた最終値に応じて、放射線治療後の追跡調査中にＢＬＥを発症するリスクを、患者について予測することができる。例えば、９２％の「最終値」は、８％のＢＬＥを発症するリスクを意味する。
【００６５】
患者について最終値を決定することは、医師が、放射線療法処置の線量および順序を患者に適合させ、乳房晩発効果を制限するのを助けるであろう。
【００６６】
本発明の方法の多変量Ｃｏｘ関数の最終値が、適切な放射線治療レジメンなどの、患者にとって好適な処置の選択、または乳房切除術と温存手術との間での選択のために用いられる特定の実施形態では、好ましくは、最終値が２０％（専門家により規定されたカットオフ値）を超える場合では、温存手術の代わりに乳房切除術の決定が考えられ、またその逆も言える。照射量と処方線量については、リスクのレベルに応じて検討されるであろう。すなわち、最終値が８％（すべての独立予測因子を含むノモグラムから得られるカットオフ値）を超える場合は、放射線治療後に、ＢＬＥを発症するリスクがある。ブースト放射線療法の欠如、リンパ節照射の欠如、および２．５Ｇｙ未満の１回線量は、ＢＬＥの高リスクと、最適な臨床上の利益である再発の低リスクとの場合では、異なる処置となる可能性がある。
【００６７】
特定の実施形態では、多変量Ｃｏｘ関数の最終値は、適切な放射線治療投与レジメンなどの、患者にとって好適な処置の選択のために用いられ、ここで：
−患者が乳房晩発効果を発症するリスクがある場合、例えば部分乳房少分割処置の実施により、適切な放射線治療投与レジメンは、減少され得；
−患者が乳房晩発効果を発症するリスクが低い、または無い場合、例えば少分割処置（この処置において一般的な分割数である、５または１６分割）の実施により、適切な放射線治療投与レジメンは、増加され得る。
【００６８】
特に、ＢＬＥを発症するリスクが８％を超える場合、（高）リスク患者と考える。
【００６９】
特に、ＢＬＥを発症するリスクが８％未満である場合、低リスク患者と考える。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の方法の多変量Ｃｏｘ回帰の最終値は、温存手術または乳房切除術後直ちに乳房再建を行うことについての決定に使用され、好ましくは、当該最終値が８％未満であれば、温存手術または乳房切除術後直ちに乳房再建を行うことが考えられ得る。
【００７１】
ノモグラム
本発明の別の目的は、医師がＲＴ後にＢＬＥを発症するリスクを解釈するのを助けるための、当該多変量Ｃｏｘ関数を実行する、ユーザーフレンドリーなインターフェース、すなわち、ノモグラム、コンピューターまたは計算機を対象とする。従って、本発明は、本発明の多変量Ｃｏｘ関数を実行するノモグラムを包含する。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「ノモグラム」は、例えば、１つ以上の容易に得られるパラメータに基づいて対象におけるＢＬＥの発症リスクの推定を可能にする多変量Ｃｏｘモデリングからの、予後予測式（演算式（ａｅ））のグラフィカルな表示を指す。当該パラメータには、ＲＩＬＡ、補助ホルモン療法、タバコの喫煙習慣、およびＡＫ２、ＨＳＰＡ８、ＩＤＨ２、ＡＮＸ１、ＡＰＥＸ１などの放射線感受性タンパク質、および／または放射線感受性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
ノモグラムの有用性は、ユーザーフレンドリーなグラフィカル・インターフェースで、予測された確率を０から１００までのスケール上のポイントにマッピングする点である。さまざまな共変数により累積された合計ポイントは、患者についての予測される確率に相当する。
【００７４】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法のステップｂ）およびｃ）は、ステップａ）で得られたデータを、多変量Ｃｏｘ回帰およびＢＬＥ発症リスクを計算するコンピューターまたは計算機において実行することにより、実施することができる。したがって、医師により得られたデータはより容易に解釈可能であり、温存手術、または乳房切除術後直ちに乳房再建を実施する必要性を決定するためのプロセスにおける改善を可能にするであろう。
【００７５】
キット
本発明の別の目的は、対象においてＢＬＥの発症リスクを検出するためにさらに使用される、対象のデータを収集するためのキットに関し、該キットは以下を含む：
−生体サンプル、特に血液サンプルの、生物学的輸送に好適な箱／容器およびバッグ、並びに、
−患者および／または看護師および／または医師によって完成されるべき書式（form）であって、特に、放射線感受性試験およびノモグラム解析を実行するためにデザインされ、必要とされる書式。
【００７６】
例として、本書式には、患者が補助処置（化学療法、ホルモン療法）を受けたことがあるかどうか、あるいは受ける予定であるかどうか、タバコ習慣、および血液サンプルを採取した日および時間など、予測解析を実行するために必要な情報を収集することを目的とした、特定の質問が含まれてよい。
【００７７】
本発明の別の目的は、対象においてＢＬＥの発症リスクを検出するためのキットに関し、該キットは以下を含む：
・本発明の少なくとも１つの生化学マーカーの値を決定するための試薬
・場合により、本発明の少なくとも２つの臨床パラメータについての情報を収集する手段、例えば調査票(survey)、および
・場合により、本発明のノモグラム。
【００７８】
本発明の少なくとも１つの生化学マーカーの値を決定するための「試薬」とは、サンプルの照射が線形加速器またはラボ照射器によって行われ得る独立した試験所で、ＲＩＬＡアッセイを実行するために必要な、特定の実施形態における、いくつかまたは全ての特定の試薬を意味する。
【００７９】
本発明の少なくとも２つの臨床パラメータについての「情報を収集する手段」とは、特定の実施形態では、患者および／または看護師および／または医師によって完成されるべき特定の書式を意味し、特に、放射線感受性試験およびノモグラム解析を実行するためにデザインされ、必要とされる書式を意味する。好ましい実施形態では、これらの書式には、患者が補助処置（化学療法、ホルモン療法）を受けたことがあるかどうか、あるいは受ける予定であるかどうか、およびタバコ習慣など、予測解析を実行するために必要な情報を収集することを目的とした特定の質問が含まれる。
【００８０】
特定の実施形態では、対象においてＢＬＥを発症するリスクを検出するためのキットには、以下が含まれる：
−サンプルの照射が線形加速器またはラボ照射器によって行われ得る独立した試験所で、ＲＩＬＡアッセイを実行するために必要な、いくつかまたは全ての特定の試薬、および
−場合により、患者および／または看護師および／または医師によって完成されるべき特定の書式であって、特に、放射線感受性試験およびノモグラム解析を実行するためにデザインされ、必要とされる書式。
【００８１】
例として、本発明のＲＩＬＡアッセイを実行するための必要とされる特定の試薬には、ＰＢＳ、抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムが含有されてよい。
【００８２】
有利には、本発明は、ＲＩＬＡの濃度の値を決定するための試薬、タバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法の消費（consumption）に関する調査票、並びに本発明のノモグラムを含む、対象におけるＢＬＥの発症リスクを検出するためのキットに関する。
【００８３】
場合により、本発明のキットはさらに、当該キットの使用上の注意をさらに含む。
【００８４】
コンピューターシステム
本発明の別の目的は、コンピューターまたは／および計算機などの機械可読メモリ、および、本発明の多変量Ｃｏｘ関数を計算するプロセッサを含む、システムを対象とする。本システムは、対象において放射線治療後に乳房晩発病効果（ＢＬＥ）を発症するリスクを診断するという、本発明の方法を実行するためのものである。
【００８５】
特定の実施形態では、当該システムは、ノモグラム（主効果、交互作用および区分線形効果を含む、各パラメータについての０〜１００の間の線形予測子）を構築して、対象について放射治療後にＢＬＥを発症する瞬間的リスク（「最終値」）を計算するためのソフトウエアを実行するためのモジュールを、さらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】蓄積データについてのＲＯＣ曲線。ＲＯＣ曲線は、患者の分類後に、異なる閾値についてロジスティック関数について得られた値（０から１まで）に従って、１−特異度に対して感度をプロットすることによって描いた。
【図２】蓄積データについての、乳房晩発効果の状態によるＲＩＬＡの散布図。
【実施例】
【００８７】
材料および方法
・患者解析
多施設臨床研究適性化プログラム（ＰＨＲＣ「Program Hospitalier de Recherche Clinique」）研究に含まれた５０２名の乳癌患者で解析を行い（蓄積データ）、追跡調査中に、ＢＬＥに関して放射線治療および温存手術によって処置された患者の予測ＲＩＬＡ試験を評価した。４３４名の患者が、本研究に適格であった。患者は、２００７年１月１日から２０１１年７月１１日の間を対象とし、その後の追跡調査期間中央値は３８．６ヶ月であった。表１に記載される、一般的な社会人口統計管理データ、リスク因子、ならびに各来院時の臨床的項目および生物学的項目および処置項目、ならびに組織学的データを含む特定の質問票（症例報告書）を、各患者について記入した。ベースラインでは、１６名の患者が大きな逸脱のため除外され、１名の患者が処置の前に同意を撤回し、２９名の参加者については、血液サンプルが技術的に利用不可能であった。これらの患者は全員（ｎ＝４６）、現行のガイドラインに従って治療され、データが収集されなかったため解析に含めなかった。従って、追跡調査に入る前に、４５６名の患者（９０．８％）に対してＲＩＬＡと完全なＲＴを行った。プロトコールに従って、４３４名の患者（８６．５％）を、少なくとも３６ヶ月間、追跡調査した。他の２２名の患者は、３６ヶ月より前に、計画された追跡調査を中断した。
【００８８】
選択したパラメータについての完全なデータを用いて、合計４１５名の患者（「参照集団」）に対して、多変量モデルを構築した。
【００８９】
・放射線誘発ＣＤ８  Ｔリンパ球アポトーシス（ＲＩＬＡ）の手順
本プロトコールは、Ozsahin ら(Ozsahin, Crompton et al. 2005)の研究から適合させた。ＲＴの前に、５ｍｌのヘパリン化チューブに、各患者から血液サンプル１検体を採取した。２００μＬの血液を６ウェルプレートに分注した。全ての試験は、０Ｇｙおよび８Ｇｙの両方について、３連で行った。照射（１Ｇｙ／分の線量率、２５ｃｍ×２５ｃｍの照視野サイズ、８Ｇｙの単回線量）を、線形加速器（２１００ＥＸ、２００ＵＭ／分、Varian, US）を用いて２４時間後に（Ｈ２４）、放射線科で行った。対照細胞をインキュベーターから取り出し、同じ期間ライナックの元に置いたが、放射線処置は行わなかった。照射後、直ちにフラスコを３７℃（５％  ＣＯ２）でインキュベートした。さらに４８時間後（Ｈ７２）、それを抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体（１０μＬ／テスト、Becton Dickinson, USA）で標識した。溶解バッファー（Becton Dickinson, USA）を添加後、ヨウ化プロピジウム（Sigma, France）およびＲＮＡｓｅ（Qiagen, France）を各チューブに添加し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）用に調製した。
【００９０】
・放射線治療の準備および照射
シミュレーションおよび処置中の再現性を確保するために、ＲＴを仰臥位で照射した。計画目標体積は、必要に応じて全乳房（ＷＢ）および所属リンパ節（ＲＬＮ）を含んだ。センター間での処置の標準化を可能にするために、ＷＢ照射は光子線（photon）のみが許可された。
【００９１】
目標体積に対して５０Ｇｙの線量中央値を推奨した。照射野の配置には、４４〜５０Ｇｙでの、鎖骨上窩領域での前方光子線照射野の使用と、内胸リンパ節への前方電子線および光子線の組み合わせを含んだ。ＷＢに、１日５０Ｇｙの線量を、２つの対向する接線照視野によって照射した。必要に応じて手術台に最大１０〜１６Ｇｙのブーストを照射した。分割照射（Fractionation）は、１回線量２Ｇｙを、週５回行った。計算は、３次元線量測定を用いた。ＩＣＲＵレポート６２の処方点（prescription point）を、線量を処方するために使用した。最低限、最初の３日間は毎日、そして残りの処置期間中は１週間に１回、オンライン・ポータルイメージング（on-line portal imaging）を行った。
【００９２】
・補助全身療法
必要が示された（indicated）場合（リンパ節陽性およびグレード３の場合）の化学療法（ＣＴ）レジメンは、６サイクルのＦＥＣ１００［５ＦＵ（５００ｍｇ／ｍ２）、エピルビシン（１００ｍｇ／ｍ２）、シクロホスファミド（５００ｍｇ／ｍ２）］を１日目と、２１日ごとに１回繰り返すか、または３サイクルのＦＥＣ１００の後、３サイクルのドセタキセル（１００ｍｇ／ｍ２）を３週間ごとに１回繰り返すかの、いずれかであった。ＨＥＲ２過剰発現または遺伝子増幅の場合には、トラスツズマブ（初回負荷量８ｍｇ／ｋｇで開始）をプロトコールに追加した（１年間、３週間毎に６ｍｇ／ｋｇ）。手術後またはＲＴ終了後にホルモン療法（ＨＴ：タモキシフェンまたはアロマターゼインヒビター）を開始し、５年間毎日投与した。
【００９３】
・エンドポイント評価：参照集団に対する、ＢＬＥの予後因子としての、バイオマーカーおよび関連する共変数の特定
主要目的は、放射線誘発グレード≧２のＢＬＥ（皮膚萎縮、毛細血管拡張、硬結（線維化）、壊死または潰瘍として規定される）における、ＲＩＬＡの予測的役割であった。副次的目的は、急性副作用の発生率、局所再発率、無再発生存率（relapse-free survival）（ＲＦＳ）、無乳房線維化生存率（breast fibrosis-free survival）（ＢＦ−ＦＳ）、乳房線維化無再発生存率（breast fibrosis-relapse-free survival）（ＢＦ−ＲＦＳ）および全生存率（ＯＳ）であった。急性および遅発性の副作用は、ＣＴＣ  ｖ３．０スケールに従って評価および等級付けした（Trotti、Colevas et al．2003）。
【００９４】
毒性評価は、ＲＴ中の毎週、最後のＲＴの分割照射の１、３および６ヶ月後に、６ヶ月ごとに最大３６ヶ月まで、ベースラインで実施した。各評価は、ＲＩＬＡについて盲検化された医師によって評価された。ＲＴ後の追跡調査中に観察された最も重度のＢＬＥを、主要なエンドポイントとみなした。ＲＴの１２週間後から３年後に観察された最も重度の晩発効果（肺、心臓）と、ＲＴの開始からＲＴの１２週間後に観察された最も重度の急性副作用（主に皮膚と肺）とを、副次的なエンドポイントとみなした。毒性は、「皮膚科／皮膚領域」、「肺／上気道」および「心臓全般」のスケール（Trotti、Colevas et al．2003）に記載されているすべての可能な定義を用いて評価した。
【００９５】
すべてのエンドポイントは、ＲＴの開始と最初の事象後の期間として規定した：ＯＳについては死亡、ＲＦＳについては局所再発、対側再発、遠隔再発または死亡、ＢＦ−ＦＳについてはグレード２以上のＢＬＥ、およびＢＦ−ＲＦＳについてはＲＦＳおよびＢＦ−ＦＳの最初の事象とした（Peto、Pike et al．1977）。打ち切り患者は、ＯＳについては最後の追跡調査のための来院時に生存中の患者、ＲＦＳについては再発の無い生存中の患者、ＢＦ−ＦＳについてはグレード２以上のＢＬＥを経験したことのない生存中の患者、ＢＦ−ＲＦＳについてはグレード２以上のＢＬＥまたは再発を経験したことのない生存中の患者であった。
【００９６】
症例数計算および統計解析
ＢＬＥの発症におけるＲＩＬＡ率の予後予測値を調べるために、我々の予備研究（Azria、Gourgou et al．2004）の結果から開始した。詳細は次のプロトコールに示している。簡単に言えば、σ２＝０．５４、推定される合併症発症率ψ１５％（両側検定のαエラー０．０５およびβエラー０．０５（検出力＝０．９５））に基づいて、４３０名の患者を含める必要があった。追跡調査の損失とＢＬＥに対するブーストの影響を考慮して、患者数を少なくとも１５％増加させた（ｎ＝４９４）。
【００９７】
σ２は研究対象の変数（ｌｏｇＣＤ  ８）の分散、ψは毒性が予測される事象に対する合併症の発症率である。
【００９８】
予後変数の関数としての合併症の累積発生率は、ノンパラメトリックモデル（Pepe and Mori 1993）を用いて計算した。主な統計的手順には、本病態において競合リスク事象と見なされる他の事象（再発または死など）の存在下での、ＢＬＥの発症に対するＲＩＬＡ率の影響を評価するための、競合リスクについてのＦｉｎｅらのモデル（Fine 2001）を用いた多変量解析が含まれた。多変量解析では、選択した因子は、単変量解析でｐ値（統計的有意性）が０．２０未満のベースラインパラメータであった。最終モデルは、ステップワイズ変数選択の変数減少法（backward stepwise selection）（ｐ＜０．１５）を用いて規定し、段階的方法（step by step method）を用いて、有意なパラメータ（ｐ＜０．０５）、または臨床的に関連のあるパラメータおよび／または（ｐ＜０．１０）のみを含んだ。
【００９９】
データは、カテゴリー変数の頻度および割合、並びに連続変数の中央値および範囲によってまとめた（summarized）。照射前後のＲＩＬＡ数の絶対変化は、連続変数およびカテゴリー変数として評価した。３３％分位点を中心に３つのカテゴリーが構成され（＜１２、１２〜２０、および≧２０）、その後２つのカテゴリーにマージした（＜１２および≧１２）。
【０１００】
ＯＳ、ＲＦＳ、ＢＦ−ＦＳおよびＢＦ−ＲＦＳ率は、カプラン・マイヤー法（Kaplan and Meier 1958）により推定した。９５％信頼区間（９５％ＣＩ）もまた決定した。
【０１０１】
Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデル（Cox, et al. 1984）を用いて、単変量解析および多変量解析を行い、ベースライン特性および処置パラメータを含むハザード比を推定した。単変量解析についてはログランク検定を用いて比較を行った。独立した効果（Independent effect）は、尤度比統計量から評価した。
【０１０２】
乳房線維化無再発生存率（ＢＦ−ＲＦＳ）に対するＲＩＬＡの影響を評価した。原因別ハザード関数とＲＦＳとＢＦ−ＦＳの複合分布から得られた推定値（Arriagada, Rutqvist et al.1992）を用いて、競合リスクモデルからＢＬＥおよび、再発または死亡の累積発生率を推定し、Ｇｒａｙの検定を用いて比較した。
【０１０３】
追跡期間中央値は、インバース（inverse）カプラン・マイヤー法で推定した。０．０５未満のｐ値を有意と見なした。全ての統計検定は両側であった。Ｓｔａｔａ（バージョン１３．０）を、すべての統計解析に使用し、ＳＡＳマクロ％ｃｉｆを、Ｇｒａｙの検定に用いた。
【０１０４】
解析を補足するために、追跡調査中に少なくともグレード２のＢＬＥを経験した患者を特定するために、ＲＩＬＡの受信者動作特性曲線（Receiving Operating Characteristic curve、ＲＯＣ曲線）解析を行った（Kramar, Faraggi et al．2001）。ＲＩＬＡについて、ＲＯＣ曲線下の実験上の領域（ＡＵＣ）およびそれぞれの９５％ＣＩを使用して、感度、特異度、陽性的中率（ＰＰＶ）、および陰性的中率（ＮＰＶ）を決定した。
【０１０５】
実施例１：モデリングのための記述統計解析
下記の表１に示されるように、独立変数が観察される全ての患者についての研究から選択されたデータについて解析を行った。
【０１０６】
【表１】
2019532304.tif 000003
【０１０７】
ＣＴＣＡＥ  Ｖ３．０(Trotti, Colevas et al. 2003)に従い、毒性を評価して、患者を２群に分けた（ＢＬＥあり、またはなし）。
【０１０８】
主要なエンドポイントは、追跡調査中の患者のＢＬＥの有無の特定であった。第一段階は、一次元解析によるこれらの群間で有意に異なる因子の特定と、ログランク検定の使用により構成された。
【０１０９】
第二段階は、ＢＬＥの診断のための独立パラメータを評価するため、および、ハザード比（ＨＲ）として規定されるエフェクトサイズを推定するための、多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルの解析により構成された。
【０１１０】
さらに総合的な診断値を、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）により推定した。ＲＩＬＡの診断値を、感度（Ｓｅ）、特異度（Ｓｐ）、陽性的中率および陰性的中率（ＰＰＶ、ＮＰＶ）により評価した。
【０１１１】
応答性（responding）の表現型の当該診断または予後予測については、応答性の症状または検査結果を、陽性結果と見なし、一方で、非応答性の症状または検査結果を、陰性結果を見なす。真陽性および偽陽性、ＮＰＶ、ＰＰＶ、特異度、感度は、以下のように規定して計算する：
2019532304.tif 000004
【０１１２】
「ＲＯＣ」または「ＲＯＣ曲線」は、診断検査の評価のためのツールであり、患者の分類後のパラメータの様々なカットオフ点について、真陽性率（感度）を、偽陽性率（1−特異度）の関数としてプロットする（図１）。ＲＯＣ曲線上の各点は、特定の識別閾値に対応する感度／特異度の対（０から１まで）を表す。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、あるパラメータが２つの診断群（疾患／正常）をいかにうまく識別することができるかの尺度である。検査の精度は、その検査が、検査されている群を、問題の疾患を有するものと有さないものにいかにうまく分けるかによる。精度は、ＲＯＣ曲線下面積により測定される。ＲＯＣ曲線下面積が１の場合は完全な検査を表し、０．５の場合は無価値な（worthless）検査を表す。
【０１１３】
通常、ＲＯＣ曲線下面積が０．７より優れた値を有すれば、診断のための優れた予測曲線であることが認められている。ＲＯＣ曲線は、本方法の診断の質の予測を可能にする曲線として認められるべきである。
【０１１４】
ＲＩＬＡマーカーの診断値（曲線下面積）を、表２に示す。
【０１１５】
【表２】
2019532304.tif 000005
【０１１６】
結果
本解析において、陰性的中率（カットオフ≧２０のＲＩＬＡ）は９０％を超えて優れており、患者にとって有用であり得ることが確認された。
【０１１７】
臨床応用に関しては、ＲＩＬＡが高い（ＲＩＬＡ≧２０）患者は、ＢＬＥが観察されないだろうし、少分割照射レジメンを提案されるだろう。
【０１１８】
結論
ＲＩＬＡマーカーは、追跡調査中におけるＢＬＥの優れたマーカーであり、患者のプロファイルに従った個別の処置を開発することにつながる。
【０１１９】
本発明者らはまた、ＲＩＬＡマーカーと２つの臨床パラメータ（タバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法）の組み合わせにより、ＡＵＣが、ＲＩＬＡ単独（０．６１）と比較して０．６８  ＩＣ９５％［０．６０８―０．７４９］に改善され、最適な閾値であることを実証した：
Ｓｅ：０．８０
Ｓｐ：０．４８７
ＶＰＰ：０．２０９
ＶＰＮ：０．９３５
【０１２０】
これらの結果は、３つのパラメータ（ＲＩＬＡと２つの臨床パラメータ（タバコの喫煙習慣と補助ホルモン療法））の組み合わせにより、インビトロ法の特異度が改善され、陰性的中率が９３％を超えさえすることを示した。
【０１２１】
４１５名の患者の参照集団を用いてなされた以下の実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく例示的な実施例である。
【０１２２】
実施例２：多変量Ｃｏｘ関数の決定
乳癌であり、温存手術後に補助放射線治療を受けた合計４１５名の患者を、独立パラメータを用いて多変量Ｃｏｘ回帰により選択した。
【０１２３】
ＢＬＥの総有病率は１４．５％であった（４１５名の患者のうち６０事象）。
【０１２４】
有意な乳房晩発効果（ＢＬＥ）の診断
ＢＬＥの状態に従ってＲＩＬＡのレベルを比較するために、各研究について散布図を描いた。ＢＬＥ患者は低レベルのＲＩＬＡを示した。
【０１２５】
さらに、ＢＬＥのリスクは、ＲＩＬＡの値が低いほど高かった。ＢＬＥのリスクは、いくつかの臨床パラメータ（タバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法；表３）と組み合わせると、有意に増加した。
【０１２６】
乳房晩発病効果（ＢＬＥ）は、専門の臨床医によって臨床的に評価し、当業者によく知られている毒性ＣＴＣＡＥ  Ｖ３．０についての国際グレード付けスコアを用いて評価した（Trotti, Colevas et al. 2003）。ＮＣＩ有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）ｖ３．０は、有害事象（ＡＥ）報告に利用できる記述用語である。グレード（重症度）スケールは、各ＡＥ用語について与えられている。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
結果
多変量モデルにより、３つのパラメータ（ＲＩＬＡ、タバコの喫煙、および補助ホルモン療法）を、独立パラメータとして特定し、現役／過去（Active/former）の喫煙患者についてはＢＬＥのリスクが増加し（ＨＲ＝１．５７、ＣＩ９５％［０．９３９−２．６２５］）、ホルモン療法で処置した患者についてもＢＬＥのリスクが増加し（ＨＲ＝３．１０、ＣＩ９５％［１．３２７−７．２４３］）、また、ＲＩＬＡのレベルの上昇についてはＢＬＥのリスクが減少した（ＨＲ＝０．９６、ＣＩ９５％［０．９２６±０．９９０］）。臨床的関連性のため、他の臨床パラメータ（年齢、ブーストおよびリンパ節照射）を調整のために多変量モデルに統合した。最終的には、これらのパラメータは、決定モデルには選択しなかった。
【０１２９】
結論
臨床パラメータ（タバコの喫煙習慣および補助ホルモン療法）およびＲＩＬＡの組み合わせは、乳房晩発効果を発症する確率を予測することを可能にし、臨床パラメータと処置パラメータとの統合を可能にした。これらのパラメータは全て、ＲＩＬＡによってのみ評価されるリスクの推定を改善する。
【０１３０】
これは、陰性的中率が優れており（９０％を超えている）、患者にとって有用であり得ることが確認されている。臨床応用の観点では、乳房再発リスクが低く、ＲＩＬＡが高い患者には、少分割照射レジメンまたは部分乳房照射が提案されるであろう。分割数が減らされるであろうし、より高い１回線量が提案されるであろう。このスキームはＲＩＬＡアッセイのおかげで安全に照射されるであろう。
【０１３１】
さらに、直ちに乳房再建および放射線治療を望む患者には、高いＲＩＬＡ値で評価された乳房線維化のリスクが低い場合（約８％未満のリスク）にのみ、この戦略が提案され得る。
【０１３２】
実施例３：患者が、放射線治療後の追跡調査中に乳房線維化を発症する確率を決定するノモグラムの構築
ノモグラムは、Iasonos et al. (2008)により記載された方法により、例示的な実施例として、実施例２に従って関連性があると特定された選択されたパラメータを含む多変量Ｃｏｘ関数による推定パラメータを使用して、構築した：
−ＲＩＬＡ                    ｐ値＝０．０１
−タバコの喫煙                ｐ値＝０．０８５
−補助ホルモン療法            ｐ値＝０．００９。
【０１３３】
最適なβ係数は、古典的な統計解析によって得ることができ、ノモグラムはこれらの係数および結果として得られるハザード（resulted hazard）（ＢＬＥを経験）に基づいて当業者によって容易に構築することができる。
【０１３４】
例えば、ＲＩＬＡ＝１０％（血液サンプルについて、上記に開示されているように決定された）であり、非喫煙者であり、かつ、補助ホルモン療法による処置を受けた患者では、以下のリスクを段階的に計算することができる：
１／ＲＩＬＡ＝１０％                              ≧８２ポイント
２／非喫煙者／タバコ＝０                          ≧０ポイント
３／補助ホルモン療法による処置あり／Ａｄｊ＿ＨＲＭ＝１      ≧４６ポイント
４／合計ポイント：８２＋０＋４６＝１２８ポイント
５／３ｙ−ＢＦ−ＦＳの確率は０．８５〜０．８０で、乳房晩発効果の発症リスクが１５〜２０％に相当。
【０１３５】
参考文献
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2019532304.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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