(57)【要約】  液体試料中の標的分子の存在量を決定するための方法であって、反応チャンバー中で、前記液体試料を、蛍光プローブに複合体形成させた単一ドメイン抗体を含む標的分子結合性プローブとインキュベートし、反応混合物を提供する工程と、前記反応チャンバー中の前記反応混合物を蛍光偏光についてアッセイし、励起光と放出光の間の偏光の変化を検出する工程と、前記偏光の変化を、前記試料中の前記標的分子の存在量と関連付ける工程とを含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の標的分子の存在量を決定するための方法であって、
−  反応チャンバー中で、前記液体試料を、蛍光プローブに複合体形成させた単一ドメイン抗体を含む標的分子結合性プローブとインキュベートし、反応混合物を提供する工程であって、単鎖抗体が標的分子に選択的に結合できる工程と、
−  前記反応チャンバー中の前記反応混合物を蛍光偏光についてアッセイし、励起光と放出光の間の偏光の変化を検出する工程と、
−  前記偏光の変化を、前記試料中の前記標的分子の存在量と関連付ける工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記蛍光プローブは、少なくとも４ｎｓの寿命を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一ドメイン抗体は、標的抗体の超可変領域に特異的に結合できる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単一ドメイン抗体は、標的抗体の定常領域に特異的に結合できる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
複数の液体試料中の少なくとも１つの標的分子の存在量を同時に決定する迅速で高スループットな方法であり、各液体試料がマイクロタイタープレートのウェル中で個々にインキュベートされる、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、蛍光偏光についてマイクロタイタープレートの複数のウェルを同時にアッセイすることができる蛍光偏光分析器を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液体試料又は液体試料の各々が、細胞培養物を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的分子が組換えタンパク質であり、前記細胞培養物が組換えタンパク質を発現するように操作された産生細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えタンパク質がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
単一ドメイン抗体及び蛍光プローブの複合体。
【請求項１１】
前記蛍光プローブは長寿命の蛍光プローブである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法を実施するのに、一般的に適したキットであり、（ａ）蛍光プローブに複合体形成された単一ドメイン抗体を含む標的分子結合性プローブと、（ｂ）蛍光偏光分析器とを含む、キット。
【請求項１３】
前記蛍光プローブは長寿命蛍光プローブである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記蛍光偏光分析器は、マイクロタイタープレートの複数のウェルの蛍光偏光の変化を同時に検出できるように構成される、請求項１２又は請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫蛍光法は、蛍光顕微鏡を備えた光学顕微鏡検査法に使用される技術であり、主に微生物学的試料に使用される。この技術は、抗体の抗原に対する特異性を使用して、細胞内の特異的生物分子標的に対して蛍光色素を標的として設定し、これによって試料を通した標的分子の分布の視覚化を可能にする。免疫蛍光法は、広く使用される免疫染色の例であり、フルオロフォアを使用して抗体の位置を視覚化する免疫組織化学の具体例である。
【０００２】
蛍光偏光免疫検定法は、Nielsenら（Nielsen et al. Methods 22, 71-76, 2000)（非特許文献１））に記載されており、抗体又は抗原の迅速且つ正確な検出に使用されている。このアッセイは、溶液中で、小さな分子は大きな分子よりも早く回転するという特徴、及び回転速度が蛍光偏光によって検出できることに基づいている。試料中の抗体が、蛍光プローブで標識されたその抗体に特異的な抗原とインキュベートされた場合、試料中の抗体−抗原複合体の存在が蛍光偏光によって検出できる。この技術の問題は、与えられた抗体の検出のためには、その抗体に特異的な抗原が必要であり、これは多くの会社にとってアッセイを高価にするということである。この技術の更なる問題は、試料中の抗体の定量的検出に適していないということである。
【０００３】
Min Chenら（Min Chen et al. Food additives & Contaminants: part A, vol. 31(12), pp. 1959-1967 (2014)（非特許文献２））は、反応容器中で牛乳と、二重特異性単鎖抗体及びＦＩＴＣ標識化標的分子とを反応して競争反応を標的分子の量と関連付けることによって、牛乳中の抗生物質の存在量を決定するための方法のキットと複合体を記載している。Giridhara Gokulranganら（Giridhara Gokulrangan et al. Analytical Chemistry, vol. 77(1), pp. 17-32 (2011)（非特許文献３））は、標的抗体結合性プローブがフルオロフォアに結合したアプタマーである蛍光偏光によって、標的抗体の存在量を決定する方法を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際特許出願番号ＰＣＴ／ＮＬ９７／００６５３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nielsen et al. Methods 22, 71-76, 2000)
【非特許文献２】Min Chen et al. Food additives & Contaminants: part A, vol. 31(12), pp. 1959-1967 (2014)
【非特許文献３】Giridhara Gokulrangan et al. Analytical Chemistry, vol. 77(1), pp. 17-32 (2011)
【非特許文献４】Chakravarty et al., Theranostics 2014; 4(4): 386-398
【非特許文献５】ADC Review / Journal of Antibody-drug Conjugates: Stable Linker (technologies), May 23, 2013
【非特許文献６】Methods Mol Biol. 2013; 1045:1-27. doi: 10.1007/978-1-62703-541-5_1
【非特許文献７】"Cell killing by antibody-drug conjugates". Cancer letters 255(2): 232-40.doi:10.1016/j.canlet.2007.04.010. PMID 17553616
【非特許文献８】"New method of peptide cleavage based on Edman degradation". Molecular diversity 17(3): 605-11. doi:10.1007/s11030-013-9453-y. PMC 3713267. PMID 23690169
【非特許文献９】"Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids". Proceedings of the National Academy of Sciences 109(40): 16101-6.doi:10.1073/pnas.1211023109. PMC 3479532.PMID 22988081
【非特許文献１０】“Current methods for the synthesis of homogenous antibody-drug conjugates” Biotechnology Advances (33) Issue 6, Part 1 (see especially Table 1)
【非特許文献１１】Badescu et al., Bioconj. Chem. 25 (2014), 1124-1136
【非特許文献１２】Dennler et al. Bioconj. Chem. 25 (2014), 569-578
【非特許文献１３】Drake et al. Bioconj. Chem. 25 (2014), 1131-1341
【非特許文献１４】Hofer et al. Biochemistry, 48 (2009), 12047-12057
【非特許文献１５】Senter et al. Nat. Biotechnol. 30 (2012) 631-637
【非特許文献１６】Shumacher et al. Org. Biomol. Chem. 12 (2104), 7261-7269
【非特許文献１７】Strop et al. Chem. Biol. 20 (2013), 161-167
【非特許文献１８】Zhou et al. MAbs 6 (2014), 1190-1200
【非特許文献１９】Zimmerman et al. 25 (2014), 351-361
【非特許文献２０】http://www.uu.nl/en/research/cell-biology/facilities/utrecht-nanobody-facility-unf
【非特許文献２１】Harmsen et al., Appl. Micrbiol. Biotechnol. 77 (1) 13-22
【非特許文献２２】Ghahroudi et al., FEBS Letters, 414 (3) 521-526
【非特許文献２３】Saerens et al, Current Opinion in Pharmacology, 8 (5) 600-608
【非特許文献２４】Holt et al, Trends in Biotechnology 21 (11) 484-490
【非特許文献２５】Borrebaeck et al, Nature Biotechnology 20 (12)
【非特許文献２６】www.creative-biolabs.com
【非特許文献２７】www.precisionantibody.com
【非特許文献２８】www.Fluorophores.tugraz.at/substance
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記の少なくとも１つの問題を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の簡単な説明
本発明は、蛍光偏光と、単一ドメイン抗体に複合体形成した蛍光色素を含むトレーサーであって、小サイズの単一ドメイン抗体が蛍光偏光フォーマットを用いて試料中の標的分子の高感度定量化を可能にするものとを用いて、試料中の標的分子の存在又は存在量を決定できることを見出したことに基づく。
【０００８】
第１の側面では、本発明は、液体試料中の標的分子の存在又は存在量を決定する方法であって、
−  反応チャンバー中で、液体試料を、蛍光プローブに複合体形成させた単一ドメイン抗体を含む標的分子結合性プローブとインキュベートし、反応混合物を提供する工程であって、単鎖抗体が標的分子に選択的に結合できる工程と、
−  反応チャンバー中の反応混合物を蛍光偏光についてアッセイし、励起光と放出光の間の偏光の変化を検出する工程と、
−  偏光の変化を、試料中の標的分子の存在又は存在量と関連付ける工程と
を含む方法を提供する。
【０００９】
一実施形態では、標的分子は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどのポリアミノ酸であるか、又はそれを含む。一実施形態では、標的タンパク質は、標的抗体である。一実施形態では、単鎖抗体は標的抗体の定常領域に選択的に結合することができる。一実施形態では、単鎖抗体は標的抗体の可変領域に選択的に結合することができる。一実施形態では、単鎖抗体は、標的抗体のパラトープに選択的に結合することができる。一実施形態では、単鎖抗体は、抗体の特異的アイソタイプに選択的に結合することができる（即ち、試料中の全てのＩｇＥ抗体に結合することができる）。一実施形態では、標的抗体はＩｇＥ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＧ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＭ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＡ抗体である。一実施形態では標的抗体はＩｇＡ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＹ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＷ抗体である。一実施形態では、標的分子は抗原である。一実施形態では、抗原は微生物特異的抗原である。一実施形態では、抗原は疾患特異的抗原である。一実施形態では、抗原は細胞特異的抗原である。一実施形態では、抗原は表現型特異的（phenotype specific）抗原である。
【００１０】
一実施形態では、標的分子は標的オリゴ糖であるか、又はこれを含む。
【００１１】
一実施形態では、標的分子は標的核酸であるか、又はこれを含む。
【００１２】
一実施形態では、標的分子は、細胞によって発現される。一実施形態では、反応混合物は、標的分子を発現する細胞培養物を含む。一実施形態では、細胞培養物はモノクローナル抗体産生細胞を含み、この場合、モノクローナル抗体が標的分子である。一実施形態では、細胞は原核性又は真核性産生細胞である。
【００１３】
好ましくは、反応チャンバーはマルチウォールプレート（multiwall plate）のウェルである。
【００１４】
好ましくは、蛍光プローブは、長寿命蛍光プローブである。
【００１５】
一実施形態では、この方法は、液体試料中の標的分子の存在量を決定するための迅速な方法である。一実施形態では、この方法は、液体試料中の標的分子の存在量を決定するための高スループット法である。
【００１６】
一実施形態では、複数の細胞培養試料は、クローン産生細胞のパネルを含む。従って、本発明はまた、クローン産生細胞のパネル中の抗体力価を決定する、迅速で高スループットな方法であって、該抗体が標的分子である方法に関する。
【００１７】
典型的には、方法は、マイクロタイタープレートの複数のウェルについて、同時に蛍光偏光アッセイを実施できる蛍光偏光分析器を使用する。
【００１８】
本発明はまた、単一ドメイン抗体と蛍光プローブの複合体を提供する。一実施形態では、蛍光プローブは長寿命蛍光プローブである。一実施形態では、蛍光プローブはＦＩＴＣである。
【００１９】
本発明はまた、キット、典型的には本発明の方法を実施するのに適したキットであり、（ａ）蛍光プローブに結合された単一ドメイン抗体を含む標的分子結合性プローブと、（ｂ）蛍光偏光分析器を含むキットを提供する。一実施形態では、プローブは、少なくとも３ｎｓの蛍光寿命を有する蛍光プローブを含む。一実施形態では、蛍光偏光分析器は、マイクロタイタープレートの複数のウェルの蛍光偏光の変化を、同時に検出できるように構成される。
【００２０】
本発明は、付随する図面を参照して、例示としてのみ与えられる、その実施形態の以下の説明からより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液中で標識化ナノボディの０．００５ｍｇ／ＬをヒトＩｇＥに添加した場合の、ＩｇＥのナノボディ結合性の検出を示すグラフである。各濃度での偏光シグナルを測定した。
【図２】図２は、ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液中で標識化ナノボディ０．００５ｍｇ／ＬをヒトＩｇＧに添加した場合の、ＩｇＧのナノボディ結合性の検出の欠如を示すグラフである。各濃度での偏光シグナルを測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
「標的分子結合性プローブ」は、単一ドメイン抗体と蛍光プローブの複合体を意味し、この複合体化された状態で単一ドメイン抗体は標的分子に選択的に結合することができ、蛍光プローブは励起の際の光を再び発することができる。複合体は、例えば、開裂できるか又は開裂できない安定なリンカーを用いて共有結合によって得ることができる。単一ドメン抗体及び単鎖抗体を含む抗体を、別の要素（entity）にカップリングする具体的な方法は、当業者に周知であり、例えば以下の文献に記載されている。
Chakravarty et al., Theranostics 2014; 4(4): 386-398（非特許文献４）;
ADC Review / Journal of Antibody-drug Conjugates: Stable Linker (technologies), May 23, 2013（非特許文献５）;
Methods Mol Biol. 2013; 1045:1-27. doi: 10.1007/978-1-62703-541-5_1（非特許文献６）;
"Cell killing by antibody-drug conjugates". Cancer letters 255(2): 232-40.doi:10.1016/j.canlet.2007.04.010. PMID 17553616（非特許文献７）;
"New method of peptide cleavage based on Edman degradation". Molecular diversity 17(3): 605-11. doi:10.1007/s11030-013-9453-y. PMC 3713267. PMID 23690169（非特許文献８）; 
"Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids". Proceedings of the National Academy of Sciences 109(40): 16101-6.doi:10.1073/pnas.1211023109. PMC 3479532.PMID 22988081（非特許文献９）;
“Current methods for the synthesis of homogenous antibody-drug conjugates” Biotechnology Advances (33) Issue 6, Part 1 (see especially Table 1)（非特許文献１０）;
Badescu et al., Bioconj. Chem. 25 (2014), 1124-1136（非特許文献１１）;
Dennler et al. Bioconj. Chem. 25 (2014), 569-578（非特許文献１２）;
Drake et al. Bioconj. Chem. 25 (2014), 1131-1341（非特許文献１３）;
Hofer et al. Biochemistry, 48 (2009), 12047-12057（非特許文献１４）;
Senter et al. Nat. Biotechnol. 30 (2012) 631-637（非特許文献１５）;
Shumacher et al. Org. Biomol. Chem. 12 (2104), 7261-7269（非特許文献１６）;
Strop et al. Chem. Biol. 20 (2013), 161-167（非特許文献１７）;
Zhou et al. MAbs 6 (2014), 1190-1200（非特許文献１８）;及び
Zimmerman et al. 25 (2014), 351-361（非特許文献１９）；及び
【００２３】
単一ドメイン抗体と蛍光色素の部位特異的複合体は、例えば、ユニバーシティ・オブ・ユトレヒト・ナノボディ・ファシリティ（the University of Utrecht Nanobody Facility）(http://www.uu.nl/en/research/cell-biology/facilities/utrecht-nanobody-facility-unf（非特許文献２０））から市販品として得ることができる。
【００２４】
一実施形態では、単一ドメイン抗体は、蛍光プローブを単一ドメイン抗体に取り付けるための付着部分を含むように操作される。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、一般に、付着部分を含むように操作される。とりわけ色素用の付着部分を含むように操作された抗体の合成は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＮＬ９７／００６５３（特許文献１）に記載されている。
【００２５】
この明細書において、用語「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」又は「ナノボディ（nanobody）」は、特定の抗原、例えば特定のタンパク質、特定のＩｇＧ分子、又はＩｇＥ分子に選択的に結合することができる単一の単量体抗体可変ドメインからなる抗体断片である（Harmsen et al., Appl. Micrbiol. Biotechnol. 77 (1) 13-22（非特許文献２１））。これらは、典型的には、１８ｋＤａ未満の分子量を有する。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、約１０〜１５ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、約１２〜１５ｋＤａの分子量を有する。これらは一般に、重鎖抗体から、又は従来の抗体から得られる。重鎖抗体から単一ドメイン抗体を得ることには、所望の抗原による特定の動物の免疫化、重鎖抗体をコードするｍＲＮＡの単離、逆転写及びＰＣＲによる単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーの生成が含まれる（Ghahroudi et al., FEBS Letters, 414 (3) 521-526（非特許文献２２））。特定の場合には、初期免疫化段階は必要とされず、単一ドメイン抗体のナイーブ遺伝子ライブラリーの産生をもたらす（Saerens et al, Current Opinion in Pharmacology, 8 (5) 600-608（非特許文献２３））。単鎖抗体は、免疫化されたドナー又はナイーブドナーからの遺伝子ライブラリーの生成を含むプロセスにおいて、ヒト又はネズミＩｇＧ抗体などの従来の抗体から得ることができる（Holt et al, Trends in Biotechnology 21 (11) 484-490（非特許文献２４)、Borrebaeck et al, Nature Biotechnology 20 (12)（非特許文献２５））。一実施形態では、従来の抗体はヒト抗体である。一実施形態では、従来の抗体はヒト化抗体である。単鎖抗体は市販源、例えばクリエイティブ・バイオラブズ（Creative Biolabs）（www.creative-biolabs.com（非特許文献２６））及びプレシジョン・アンチボディ（Precision Antibody）（www.precisionantibody.com（非特許文献２７））から得ることができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、標的抗体に選択的に結合することができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、特異的抗体アイソタイプに選択的に結合する（例えば試料中の全てのＩｇＥ抗体に結合する）ことができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、特定の抗体に選択的に（例えば抗体のパラトープに選択的に結合することによって）結合することができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、生物薬学的産生細胞の発現産物に特異的である。このような発現産物の例には、モノクローナル抗体、融合タンパク質が含まれる。生物薬学的産生細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が含まれる。一実施形態では、単鎖抗体は、標的抗体の定常領域に選択的に結合することができる。一実施形態では、単鎖抗体は、標的抗体の可変領域（例えば超可変領域）に選択的に結合することができる。一実施形態では、単鎖抗体は標的抗体のパラトープに選択的に結合することができる。一実施形態では、単鎖抗体は抗体の特異的アイソタイプに選択的に結合する（例えば試料中の全てのＩｇＥ抗体に結合する）ことができる。一実施形態では、標的抗体はＩｇＥ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＧ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＭ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＤである。一実施形態では、標的抗���はＩｇＡ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＹ抗体である。一実施形態では、標的抗体はＩｇＷ抗体である。
【００２６】
この明細書において、用語「抗体」及び「標的抗体」は、ヒト化型又は非ヒト化型の、モノクローナル形態又はポリクローナル形態の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＹ又はＩｇＷ免疫グロブリン、又はこれらの断片を意味すると理解されるべきである。
【００２７】
この明細書において、用語「蛍光偏光について反応チャンバー中の試料をアッセイする」は、蛍光プローブの励起波長に対応する波長の（垂直又は水平）平面偏光で試料を励起し、垂直又は水平面の両方の適切な放出波長において、蛍光プローブによって放出される光の強度を検出することを意味すると解されるべきである。放出の強度が励起平面（即ち垂直）から逆の平面（即ち水平）まで移動する程度、即ち励起光と放出光の間の偏光の変化は、蛍光プローブの回転の程度の関数である。標的分子結合性プローブが標的分子に結合したとき、複合体は標的分子結合性プローブよりもゆっくり回転し、定量化できる放出光の偏光を増加させる。
【００２８】
用語「偏光の変化を標的分子の存在量と関連付ける」は、蛍光プローブによって放出される光の偏光の変化に基づいた試料中の標的分子の存在量を意味すると理解されるべきである。標的分子の存在量を計算するための方法には、標的分子の公知の濃度の標準曲線から、又は解離定数及び必要なパラメータを計算することによって存在量を推定すること、及び第一原理から濃度を推定することが含まれる。
【００２９】
この明細書において、用語「迅速な」は、その方法が、１２時間以下、好ましくは１０、８、６、４、２又は１時間未満で実施されうることを意味すると理解されるべきである。この明細書において、用語「高スループット」は、多量の試料、例えば、少なくとも２０、５０、９０、１２０、即ち２０〜５００の試料を同時にアッセイできる方法を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「抗体力価」は、与えられた時間点において試料中に存在する、抗体、一般には組換え抗体、理想的には組換えモノクローナル抗体の量をいう。典型的には、試料は細胞培養試料である。好ましくは、試料は細胞培養試料由来の上清である。力価は、絶対的に又は相対的に定量化されうる。一般的に、力価は、培養物の体積あたりの生成物の重量で表され−グラム／リットル（ｇ／Ｌ）が共通のメートル法である。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「試料」は、液体試料、例えば細胞培養試料、又は細胞培養試料由来の上清を意味する。好ましくは、細胞は産生細胞（即ち、組換えタンパク質を産生するように遺伝子操作がなされた細胞）、例えば原核産生細胞（即ち、Ｅ．Ｃｏｌｉ）又は真核産生細胞（即ち、ＣＨＯ細胞）である。原核及び真核産生細胞の例は、当業者に公知である。
【００３２】
この明細書において、用語「蛍光プローブ」又は「蛍光色素」又は「フルオロフォア」は、特定の波長の光を吸収し、異なる、典型的にはより長い波長の光を放出する蛍光化学を意味すると理解されるべきである。蛍光プローブの例は、当業者に公知であり、ＧＦＰ、ＹＦＰ及びＲＦＰなどの蛍光タンパク質、並びに、テトラピロール誘導体、ピレン誘導体、キサンテン誘導体及びシアニン誘導体を含む非タンパク質有機フルオロフォアを含む。蛍光プローブの具体的な例は以下に提供される。この明細書において、用語「長寿命蛍光プローブ」は、少なくとも４、５、１０、１２、１４、１６、１８又は２０ナノ秒の蛍光寿命を有する蛍光プローブを意味すると理解されるべきである。好ましくは、蛍光プローブは、４〜１００ｎｓ、４〜５０ｎｓ、４〜４０ｎｓ、４〜３０ｎｓ、又は４〜２５ｎｓ、典型的には、１０〜１００ｎｓ、１０〜５０ｎｓ、１０〜４０ｎｓ、１０〜３０ｎｓ又は５〜２５ｎｓ、及び理想的には、１５〜１００ｎｓ、１５〜５０ｎｓ、１５〜４０ｎｓ、１５〜３０ｎｓ又は１５〜２５ｎｓの蛍光寿命を有する。蛍光プローブの例は、www.Fluorophores.tugraz.at/substance（非特許文献２８）に記載されており、長寿命フルオロフォアを含め、具体的な例を以下の表に提供する。
【００３３】
【表１】
2019503477.tif 000003
【００３４】
用語「産生細胞（producer cell）」は、特に望まれたタンパク質を生成するために使用される細胞をいう。一般には、この細胞は、一般に特定のプロモーターの制御下にある所望のタンパク質をコードする導入遺伝子の１つ又は複数のコピーを含むように遺伝子操作される。従って、特定のタンパク質は、通常、組換えタンパク質である。産生細胞は当業者に周知であり、これには、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が含まれる。理想的には、産生細胞はＣＨＯ細胞である。典型的には、産生細胞はモノクローナル抗体産生細胞である。
【００３５】
この明細書において、用語「マイクロタイタープレート」は、複数のウェル、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個のウェルを有するプレートをいう。一実施形態では、プレートは、固体の非可撓性プレートであってよく、或いはまた、可撓性材料のロールとして提供されてもよい。
【実施例】
【００３６】
ナノボディの標識化
抗ヒトＩｇＥナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００３７】
抗ヒトＩｇＧナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００３８】
抗ヒトＩｇＤナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００３９】
抗ヒトＩｇＡナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００４０】
抗ヒトＩｇＭナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００４１】
抗ヒトＩｇＹナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００４２】
抗ヒトＩｇＷナノボディをクリエイティブ・バイオラブズ、米国（Creative Biolabs, US）から購入した。これを、８：１の色素対タンパク質のモル比で、ＦＩＴＣ（シグマ、ＵＫ）を使用し、室温で１時間のインキュベーション時間を用いて、ＰＢＳ中でＮ末端標識した。これを、セファデックス脱塩カラム（Sephedex desalting column）（ＧＥ、ＵＫ）を用いて精製し、３ＫＤａカットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用いて濃縮した。
【００４３】
溶液中でＩｇＥを定量化するための蛍光偏光の実証
概念を立証するために、標識化したナノボディを、非特異的結合を防ぐために１ｍｌ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ中で０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ヒトＩｇＥの標準曲線を、以下のｍｇ／Ｌの濃度、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、０を用いてＰＢＳで準備した。アッセイのために、６０ｕｌのＦＩＴＣナノボディを、希釈したＩｇＥ６０ｕｌに加え、これを暗所で３０分インキュベートし、次いで蛍光偏光を読み取った。図１に基づいて、このアプローチが偏光シグナルのシフトから溶液中のＩｇＥを定量化するのに使用できることが明らかとなった。
【００４４】
ナノボディアイソタイプの特異性の実証
特異性を立証するために、ヒトＩｇＧを用いて、上記を繰り返した。抗ＩｇＥナノボディ−ＦＩＴＣを、非特異的結合を防ぐために１ｍｌ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ中で０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ヒトＩｇＧの標準曲線を、以下のｍｇ／Ｌの濃度、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、０を用いてＰＢＳで準備した。６０ｕｌのＦＩＴＣナノボディを希釈したＩｇＧ６０ｕｌに加え、これを暗所で３０分インキュベートし、次いで蛍光偏光を読み取った。図２から、免疫グロブリンの他のアイソタイプと交差反応性がないことが明らかとなり、従って、ＩｇＥに対する特異性が実証された。
【００４５】
溶液中でＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ及びＩｇＷを定量化するための蛍光偏光の実証
概念を立証するために、標識化した抗−Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｍ、Ｙ及びＷナノボディ（それぞれ）を、非特異的結合を防ぐために１ｍｌ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ中で０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ及びＩｇＷのそれぞれに対する標準曲線を、以下のｍｇ／Ｌの濃度、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、０を用いてＰＢＳで準備した。アッセイのために、６０ｕｌのＦＩＴＣ抗−Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｍ、Ｙ及びＷナノボディ（それぞれ）を、希釈したＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ及びＩｇＷの６０ｕｌのそれぞれに加え、これらを暗所で３０分インキュベートし、次いで蛍光偏光を読み取った。このアプローチは、偏光シグナルのシフトから溶液中のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ及びＩｇＷを定量化するのに使用できる。
【００４６】
ナノボディアイソタイプの特異性の実証
特異性を立証するために、ヒトＩｇＥを用いて、上記を繰り返した。抗ＩｇＡ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＹ及び抗ＩｇＷナノボディ−ＦＩＴＣを、非特異的結合を防ぐために１ｍｌ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ中で０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度に、別々に、希釈した。ヒトＩｇＥの標準曲線を、以下のｍｇ／Ｌの濃度、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、０を用いてＰＢＳで準備した。６０ｕｌの各ＦＩＴＣナノボディを、希釈したＩｇＥ６０ｕｌに、別々に加え、これらを暗所で３０分インキュベートし、次いで蛍光偏光を読み取った。これは、免疫グロブリンの他のアイソタイプと交差反応性がないことを示し、従って、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ及びＩｇＷの各々に対する特異性が実証された。
【００４７】
本発明は、上に記載した実施形態に制限されることなく、本発明の趣旨から逸脱することなく構成及び細部を変更することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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