(57)【要約】  本発明は、先行技術の抗ＣＴＬＡ４抗体と異なるエピトープに結合する新規の抗ｈＣＴＬＡ−４抗体、この抗体を産生する方法、ならびにこの抗体の治療及び診断の使用に関する。この抗体は、ＣＴＬＡ４抗原に対し同様の親和性を示し、また、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６に対するＣＴＬＡ４の結合をブロックすることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ａ〜ｆで定義されるポリペプチド配列の１つ以上を含み、任意選択で、前記ポリペプチド配列の各々がａ〜ｃで定義され、及び／または前記ポリペプチド配列の各々がｄ〜ｆで定義される、前記抗体またはその抗原結合断片：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号１と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号２と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号３と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号４と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号５と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号６と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合断片が、ａ〜ｆで定義されるポリペプチド配列のいずれか１つを含み、任意選択で、前記ポリペプチド配列の各々がａ〜ｃで定義され、及び／または前記ポリペプチド配列の各々がｄ〜ｆで定義される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【請求項３】
以下からなる群から選択される、軽鎖免疫グロブリン、重鎖免疫グロブリン、または軽鎖及び重鎖両方の免疫グロブリンを含む、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片：
ａ．配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び／または配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；
ｂ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、または３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；
ｃ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を備える可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を備える可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；
ｄ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を備える可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を備える可変軽鎖を含む抗体もしくはその抗原結合断片であって、任意の配列バリエーションが、前記抗体またはその抗原結合断片のフレームワーク領域内で生じる、前記抗体またはその抗原結合断片；
ｅ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；ならびに
ｆ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片であって、任意の前記置換が、前記抗体またはその抗原結合断片のフレームワーク領域内で生じる、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、以下の特徴の１、２、３、または４つ全てを有する、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片：
ｉ．ヒトＣＴＬＡ−４に対し、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技法（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により少なくとも約１×１０−９Ｍと測定されるＫＤ値で結合する；
ｉｉ．ｈＣＤ８０に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｉｉｉ．ｈＣＤ８６に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｉｖ．イピリムマブまたはトレメリムマブとは異なるＣＴＬＡ−４エピトープに結合する。
【請求項５】
ヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号４４のマウス−ヒトキメラＣＴＬＡ−４分子に結合しない、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含む抗体と同じヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号４４のマウス−ヒトキメラＣＴＬＡ−４分子に結合せず、かつ以下の特徴の少なくとも１つを有する、前記抗体またはその抗原結合断片：
ａ．ヒトＣＴＬＡ−４に対し、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技法（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により少なくとも約１×１０−９Ｍと測定されるＫＤ値で結合する；
ｂ．ｈＣＤ８０に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｃ．ｈＣＤ８６に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｄ．イピリムマブまたはトレメリムマブとは異なるＣＴＬＡ−４エピトープに結合する。
【請求項７】
ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）の少なくとも８つの連続した残基を含むヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記エピトープがＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）からなる、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、配列ＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）内のヒトＣＴＬＡ−４における１つ以上の変異が、ヒトＣＴＬＡ４に対する前記抗体の結合を防止する、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
ヒトＣＴＬＡ−４に対する結合において抗体ｈＣＴＬＡ４．２７Ａと競合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むヒト化抗体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号１〜８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１１に記載のいずれか１つの抗体もしくは抗原結合断片または請求項１２に記載のいずれか１つのポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体、結合断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
Ｐｉｃｈｉａ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片と、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または安定化剤とを含む、組成物。
【請求項１８】
以下からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項１７に記載の組成物：
抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片；
抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合断片；
抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片；
抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片；
抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片；
抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片；
抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片；
抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片；
抗ＰＤＬ１抗体またはその抗原結合断片；
抗ＰＤＬ２抗体またはその抗原結合断片；
抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片；
抗ＩＬＴ２抗体またはその抗原結合断片；
抗ＩＬＴ３抗体またはその抗原結合断片；
抗ＩＬＴ４抗体またはその抗原結合断片；
抗ＩＬＴ５抗体またはその抗原結合断片；
抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＮＫ２ＧＡ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＮＫ２ＧＣ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＮＫ２ＧＥ抗体またはその抗原結合断片；
抗ＴＳＬＰ抗体またはその抗原結合断片；
ＳＴＩＮＧアゴニスト；及び
抗ＩＬ１０抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片が、ペムブロリズマブまたはその抗原結合断片及びニボルマブまたはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
以下の群から選択される化合物をさらに含む、請求項１７に記載の組成物：ＡＤＵ−Ｓ１００、メルファラン、ビンクリスチン、フルダラビン、クロラムブシル、ベンダムスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、シスプラチン、コルチコステロイドのような免疫調節剤、例えばデキサメタゾンもしくはプレドニゾロン、サリドマイド類似体、例えばサリドマイド、レナリドミド、もしくはポマリドミド、キナーゼ阻害剤、例えばイブルチニブ、イデラリシブ、ＣＤ２０標的抗体、例えばリツキシマブ、オファツムマブ、もしくはオビヌツズマブ、ＣＤ５２標的抗体、例えばアレムツズマブ、ＣＤ３８標的抗体、例えばダラツムマブ、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体標的抗体、例えばサリルマブもしくはトシリズマブ、ＣＳ−１標的抗体、例えばエロツズマブ、ＢＣＭＡ標的抗体、例えばＧＳＫ２８５７９１６、ＢＡＦＦもしくはＢＬｙｓｓ標的抗体、例えばタバルマブ、ビスホスホネート、例えばパミドロネートもしくはゾレドロン酸、ボルテゾミブ、またはこれらの組合せ。
【請求項２１】
抗体または抗原結合断片を産生する方法であって、
請求項１〜１１に記載のいずれか１つの抗体または抗原結合断片の重鎖及び／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養することと、
任意選択で、前記宿主細胞及び／または培地から、前記抗体または抗原結合断片を回収することと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
対象、好ましくはヒト対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または前記対象内での前記抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクターを、任意選択でさらなる治療剤または治療手順に付随して、投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
対象、好ましくはヒト対象における感染症または感染性疾患を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または前記対象内での前記抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクターを、任意選択でさらなる治療剤または治療手順に付随して、投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片及び抗原を含む、ワクチン。
【請求項２５】
試料中のＣＴＬＡ−４ペプチドまたはその断片の存在を検出する方法であって、前記試料を請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体または断片と接触させることと、前記抗体または断片と前記ペプチドとの間の複合体の存在を検出することとを含み、前記複合体の検出が前記ＣＴＬＡ−４ペプチドの存在を示す、前記方法。
【請求項２６】
免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または前記対象内での前記抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクターを投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記方法が、以下の目的で使用される、請求項２６に記載の方法：
がんの処置；
感染症もしくは感染性疾患の処置；または
ワクチンアジュバントとして。
【請求項２８】
以下を目的とする医薬の調製で使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、または対象内での前記抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクター：
免疫細胞活性化の増大；
がんの処置；または
感染症もしくは感染性疾患の処置。
【請求項２９】
以下を目的とするがんの処置用の医薬製造のための、請求項１〜１１に記載の抗体または抗原結合断片の使用：免疫細胞活性化の増大；がんの処置；または感染症もしくは感染性疾患の処置。
【請求項３０】
前記断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域と、軽鎖定常領域カッパまたはラムダから選択される軽鎖定常領域とを含む、請求項１〜１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
配列番号５０の位置２２８にＳｅｒ→Ｐｒｏ変異を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
対象における免疫応答を刺激する方法であって、それを必要とする対象に、前記免疫応答を刺激するのに有効な量の、請求項１〜１１に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記がんが、肺癌、黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、骨髄腫、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、甲状腺癌、血液癌、リンパ腫、骨髄腫、もしくは白血病、または前記がんの転移病変からなる群から選択される、請求項２２に記載のがんを処置する方法。
【請求項３５】
前記抗体分子が、１つ以上の治療剤または手順との併用で投与され、前記第２の治療剤または手順が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法、標的抗がん療法、腫瘍溶解性薬物、細胞傷害性薬剤、免疫ベース療法、サイトカイン、外科的手順、放射線手順、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、または細胞免疫療法からなる群から選択される、請求項２２に記載のがんを処置する方法。
【請求項３６】
前記抗体分子が、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３リガンドからなる群から選択される１つ以上の共刺激分子のアゴニストとの併用で投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、またはＴＧＦＲからなる群から選択される免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤との併用で投与される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年８月２日に出願されたオランダ特許出願第２０１７２７０号に対する優先権を主張し、当該出願は、その全体が、全ての表、図、及び請求項を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、免疫応答の刺激により、詳細には抗原特異的Ｔリンパ球の刺激により、改善される状態の処置に関する。より具体的には、本発明は、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体、ならびにがん及び感染性疾患のような疾患の処置におけるこの抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の本発明の背景技術の解説は、読者の本発明の理解の一助とするために提供されるに過ぎず、本発明に対する先行技術を説明または構成するように認められるものではない。
【０００４】
Ｔリンパ球は、抗原に対する適応免疫応答で中心的な役割を果たす。ナイーブＴ細胞は、完全な活性化に２つのシグナルを必要とする（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ  １９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１８５−９０）。第１のシグナルは抗原特異的であり、これは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣ／ペプチド複合体との抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での相互作用によりもたらされる。第２のシグナルは、共刺激シグナルであり、これは、Ｔ細胞上の受容体とＡＰＣ上のそのリガンドとの間の相互作用によりもたらされる。ＴＣＲ／ＭＨＣ及び共刺激の両方の相互作用が係合することにより、複数の細胞内経路（カルシウムカルシニューリン及びＲＡＳマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを含む）を介したＴ細胞活性化や、次に続く複数のエフェクター化合物（ＩＬ−２のようなサイトカインを含む）に対する転写因子の活性化がもたらされる。
【０００５】
複数の正及び負の共刺激経路がＴ細胞制御に関与しているが、最もクリティカルなものは、Ｔ細胞上のＣＤ２８とＡＰＣ上のＢ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）との間の経路である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞分化を促進し、Ｂ細胞による抗体産生及びＴ細胞の活性化を増強する。ＣＤ８０及びＣＤ８６は、樹状細胞及びＢ細胞のようなＡＰＣ上に発現し、これらは重複するが別々の機能を有する。ＣＤ８６は常在的に発現し、ＴＣＲ／ＭＨＣの係合と同時発生的にＡＰＣ上で迅速に上方制御される。ＣＤ８０の発現量は、静止細胞上では非常に低いが、典型的には持続的なＴ細胞刺激の後に誘導される。これらの違いから、ＣＤ８６はＴ細胞活性化の初期化に重要であり得る一方、ＣＤ８０は免疫応答の永続化により大きな役割を果たし得ることが示唆される。
【０００６】
Ｔ細胞活性化に続いて、負の制御受容体である細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４またはＣＴＬＡ−４、別名ＣＤ１５２）がＴ細胞上で上方制御される（Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：２２０−８）。ＣＴＬＡ−４はＣＤ２８に対し構造的に相同であるが、より緊密にＣＤ８０及びＣＤ８６の両リガンドに結合する。ＣＴＬＡ−４は、２つの主要な方法で免疫応答を阻害する。すなわち、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ８０及びＣＤ８６リガンドに対しＣＤ２８と競合することで共刺激をブロックし、また負の方法でシグナルを発してＴ細胞活性化を阻害する（Ｋｒｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：４５９−４６５；Ｗａｌｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：４０５−４１３）。さらに、ＣＤ８６は、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８と免疫シナプスにおいて係合し、一方ＣＤ８０は、ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４とライゲーションすることが示されている（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：２０１−２１０；Ｊａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：１５７５−１５８５）。
【０００７】
ＣＴＬＡ−４ブロックは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞応答を増大させ、抗腫瘍免疫を憎悪させ、自己免疫疾患の誘導を増強することが報告されている。また、ＣＴＬＡ−４が、Ｔ細胞免疫応答の初期特徴に代替的または追加的影響を及ぼすことも報告されている。これは、一部の自己免疫患者がＣＴＬＡ−４に対する自己抗体を有するという知見に一致するものである。ＣＴＬＡ−４ブロック自己抗体がこれらの患者において病原的役割を果たしている可能性がある。さらに、ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト抗体は、例えば、ウイルス及び細菌感染の処置または予防やがんの処置のような、複数の疾患状態における免疫刺激調節物質として説明されている。イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４がＡＰＣ上に発現するＣＤ８０及びＣＤ８６に結合するのをブロックし、これらの分子の相互作用により誘発される免疫応答の負の下方制御をブロックする、ヒト抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体である。無進行期間の持続を伴った腫瘍後退のエビデンスが、イピリムマブ（１０Ｄ１）または別の抗ＣＴＬＡ−４抗体、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）を投与された黒色腫患者で見られ、また、イピリムマブによる持続的な応答が黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、及び腎細胞癌の患者で観察されている。興味深いことに、抗腫瘍応答は、短期間の進行後に後退が遅延することを特徴とする可能性があり、抗ＣＴＬＡ−４抗体における重要な、場合によっては固有の臨床的特徴は、臨床的応答の期間が、また安定病態の期間さえも、しばしば非常に持続的であることである。進行した黒色腫の患者の前臨床研究及び早期臨床研究からは、イピリムマブが、単剤療法として、及び化学療法、抗体、ワクチン、またはサイトカインのような処置との組合せで、抗腫瘍活性を促進することが示されている（Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１２（７）：８６４−８７２，２００７；Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｃａｎｃｅｒ）１２：２７８−２８７，２０１２；Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３（８）：７１１−７２３，２０１０；Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３３（１７）：１８８９−１８９４，２０１５；Ｌａｒｋｉｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５；Ｒｉｂａｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１（５）：６１６−６２２，２０１３）。
【０００８】
イピリムマブによるＣＴＬＡ−４標的化における第２に提唱される機構は、ＣＴＬＡ−４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇であり、これは、マウスにおいて、ＣＴＬＡ−４標的化の有効性の背後にあるクリティカルな駆動要因であることが示されている（Ｐｅｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００９，ＤＯＩ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００８２４９２；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  ｍｅｄ，２０１３，ＤＯＩ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１３０５７９；Ｓｅｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３  ＤＯＩ：１０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１３−００１３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
イピリムマブは、既に一部のがん療法向けに市販され、他の抗がん適応向けにも試験されており、また、トレメリムマブも臨床試験フェーズが進行しているものの、依然として代替的な抗ＣＴＬＡ−４抗体が必要とされており、特に既知の抗ＣＴＬＡ−４抗体の活性と区別され得る活性を有する抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、抗体または抗原結合断片が以下の１つ以上、任意選択で以下の各々を含む、抗体またはその抗原結合断片に関する：
配列番号１のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号１と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
配列番号１のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号２と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、
配列番号３のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号３と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３、
配列番号４のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号４と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
配列番号５のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号５と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
配列番号６のアミノ酸配列、または１、２、３、もしくはそれ以上の保存的置換により配列番号６と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【００１１】
好ましくは、前述の抗体または抗原結合断片は、以下の１つ以上、好ましくは以下の各々を含む：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【００１２】
好ましくは、前述の抗体は、配列番号７の重鎖を有する。さらに好ましくは、前述の抗体は、配列番号８の軽鎖を有する。より好ましくは、重鎖は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかから選択される。より好ましくは、軽鎖は、配列番号２２、２４、２６、３０のいずれかから選択される。
【００１３】
本発明はさらに、以下からなる群から選択される、軽鎖免疫グロブリン、重鎖免疫グロブリン、または軽鎖及び重鎖両方の免疫グロブリンを含む、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する：
ａ．配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び／または配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；
ｂ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、または３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；
ｃ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を備える可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を備える可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；
ｄ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を備える可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を備える可変軽鎖を含む抗体もしくはその抗原結合断片であって、任意の配列バリエーションが、抗体または抗原結合断片のフレームワーク領域内で生じる、抗体またはその抗原結合断片；
ｅ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片；ならびに
ｆ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変重鎖、及び／または配列番号２２、２４、２６、もしくは３０のいずれか１つについて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片であって、任意の前述の置換が、抗体または抗原結合断片のフレームワーク領域内で生じる、抗体またはその抗原結合断片。
【００１４】
好ましくは、前述の抗体または抗原結合断片は、以下の特徴の少なくとも１つを有する：
ａ）ヒトＣＴＬＡ−４に対し、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技法（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により少なくとも約１×１０−９Ｍと測定されるＫＤ値で結合する；
ｂ）ｈＣＤ８０に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｃ）ｈＣＤ８６に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｄ）イピリムマブまたはトレメリムマブとは異なるＣＴＬＡ−４エピトープに結合する。
【００１５】
本発明はさらに、ヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前述の抗体または抗原結合断片が、配列番号４４のマウス−ヒトキメラＣＴＬＡ−４分子に結合しない、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含む抗体と同じヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号４４のマウス−ヒトキメラＣＴＬＡ−４分子に結合せず、かつ以下の特徴の１、２、３、または４つ全てを有する、抗体またはその抗原結合断片である：
ｇ．ヒトＣＴＬＡ−４に対し、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技法（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により少なくとも約１×１０−９Ｍと測定されるＫＤ値で結合する；
ｈ．ｈＣＤ８０に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｉ．ｈＣＤ８６に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、約１００ｎＭ以下のＩＣ５０でブロックする；
ｊ．イピリムマブまたはトレメリムマブとは異なるＣＴＬＡ−４エピトープに結合する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）の少なくとも８つの連続した残基を含むヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合断片である。
【００１８】
エピトープがＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）からなる、請求項３４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【００１９】
ヒトＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、配列ＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）内のヒトＣＴＬＡ−４における１つ以上の変異が、ヒトＣＴＬＡ４に対する当該抗体の結合を防止する、抗体またはその抗原結合断片。
【００２０】
ヒトＣＴＬＡ−４に対する結合において抗体ｈＣＴＬＡ４．２７Ａと競合する、抗体またはその抗原結合断片。
【００２１】
好ましくは、本発明の抗体または抗原結合断片は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むヒト化抗体である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、配列番号１〜８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、本発明のいずれか１つの抗体もしくは抗原結合断片または上記で定義されたいずれか１つのポリペプチドをコードする、単離された核酸を対象とする。また、本発明は、このような単離された核酸を含む発現ベクターも含む。
【００２４】
また、本発明は、本発明の抗体、結合断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または発現ベクターを含む宿主細胞も含む。前述の宿主細胞は、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００２５】
本発明の一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、１つ以上の環状ジヌクレオチドまたは他のＳＴＩＮＧ経路アゴニストに付随して使用される。ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子刺激因子、別名ＴＭＥＭ１７３、ＭＩＴＡ、ＥＲＩＳ、及びＭＰＹＳ）は、ＥＲに局在化された膜貫通タンパク質であり、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の直接的結合に応答したコンフォメーション変化を経て、ＴＢＫ１活性化、ＩＲＦ−３リン酸化、ならびにＩＦＮ−β及び他のサイトカインの産生を伴う下流シグナリングカスケードをもたらす。腫瘍常在の宿主抗原提示細胞におけるＳＴＩＮＧ経路は、腫瘍由来抗原に対する自発的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の誘導に関与する。この経路の活性化及び次に続くＩＦＮ−β産生は、放射線の抗腫瘍効果にも寄与することが報告されている。ＳＴＩＮＧアゴニスト及びその使用については、例えば、ＵＳ２００６００４０８８７、ＵＳ２００８０２８６２９６、ＵＳ２０１２００４１０５７、ＵＳ２０１４０２０５６５３、ＷＯ２０１４１７９３３５、ＷＯ２０１４１７９７６０、ＵＳ２０１５００５６２２４、ＷＯ２０１６０９６１７４、ＷＯ２０１７０１１４４４、ＷＯ２０１７０２７６４５、及び２０１７０２７６４６に記載されており、当該化合物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物として投与される。Ｓｔｉｎｇアゴニストは、１つ以上の経口または非経口経路により投与することができる。一部の実施形態において、投与は、皮下、筋肉内、皮内、粘膜、膣、腫瘍周囲、腫瘍内、または直接腫瘍排出リンパ節（複数可）内である。ある特定の実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び本発明の抗体または抗原結合断片は、別々の投与として投与され、例えば、異なる時間に、及び／または異なる投与経路により、投与される。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体または抗原結合断片と、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または安定化剤とを含む組成物により、形成される。好ましくは、前述の組成物は、以下からなる群から選択される薬剤をさらに含む：
ｋ．抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片；
ｌ．抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合断片；
ｍ．抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片；
ｎ．抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片；
ｏ．抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片；
ｐ．抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片；
ｑ．抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片；
ｒ．抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片；
ｓ．抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片；
ｔ．抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片；
ｕ．抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片；
ｖ．抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片；
ｗ．抗ＰＤＬ１抗体またはその抗原結合断片；
ｘ．抗ＰＤＬ２抗体またはその抗原結合断片；
ｙ．抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片；
ｚ．抗ＩＣＯＳ抗体またはその抗原結合断片；
ａａ．抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片；
ｂｂ．抗ＩＬＴ２抗体またはその抗原結合断片；
ｃｃ．抗ＩＬＴ３抗体またはその抗原結合断片；
ｄｄ．抗ＩＬＴ４抗体またはその抗原結合断片；
ｅｅ．抗ＩＬＴ５抗体またはその抗原結合断片；
ｆｆ．抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片；
ｇｇ．抗ＮＫ２ＧＡ抗体またはその抗原結合断片；
ｈｈ．抗ＮＫ２ＧＣ抗体またはその抗原結合断片；
ｉｉ．抗ＮＫ２ＧＥ抗体またはその抗原結合断片；
ｊｊ．抗ＴＳＬＰ抗体またはその抗原結合断片；
ｋｋ．ＳＴＩＮＧアゴニスト、及び；
ｌｌ．抗ＩＬ１０抗体またはその抗原結合断片。
【００２７】
また、好ましくは、前述の組成物において、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片は、ペムブロリズマブまたはその抗原結合断片及びニボルマブまたはその抗原結合断片からなる群から選択される。
【００２８】
別の実施形態において、本発明の組成物は、以下の群から選択される化合物をさらに含む：ＡＤＵ−Ｓ１００、メルファラン、ビンクリスチン、フルダラビン、クロラムブシル、ベンダムスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、シスプラチン、コルチコステロイドのような免疫調節剤、例えばデキサメタゾンもしくはプレドニゾロン、サリドマイド類似体、例えばサリドマイド、レナリドミド、もしくはポマリドミド、キナーゼ阻害剤、例えばイブルチニブ、イデラリシブ、ＣＤ２０標的抗体、例えばリツキシマブ、オファツムマブ、もしくはオビヌツズマブ、ＣＤ５２標的抗体、例えばアレムツズマブ、ＣＤ３８標的抗体、例えばダラツムマブ、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６受容体標的抗体、例えばサリルマブもしくはトシリズマブ、ＣＳ−１標的抗体、例えばエロツズマブ、ＢＣＭＡ標的抗体、例えばＧＳＫ２８５７９１６、ＢＡＦＦもしくはＢＬｙｓｓ標的抗体、例えばタバルマブ、ビスホスホネート、例えばパミドロネートもしくはゾレドロン酸、ボルテゾミブ、またはこれらの組合せ。
【００２９】
また、本発明は、抗体または抗原結合断片を産生する方法であって、
ｍｍ．本発明のいずれか１つの抗体または抗原結合断片の重鎖及び／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養することと、
ｎｎ．任意選択で、宿主細胞及び／または培地から、抗体または抗原結合断片を回収することと
を含む、方法にも関する。
【００３０】
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み、この発現ベクターは、抗体または抗原結合断片の発現を駆動する、ポリヌクレオチドに対し作用可能に結合した調節配列を含む。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、宿主細胞による抗体または抗原結合断片の分泌を媒介する分泌シグナル配列を含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、対象、好ましくはヒト対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、有効量の、本発明の抗体もしくは抗原結合断片、または対象内での抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクターを、任意選択でさらなる治療剤または治療手順に付随して、投与することを含む、方法である。
【００３２】
また、ヒト対象における感染症または感染性疾患を処置する方法であって、対象に、有効量の、本発明による抗体または抗原結合断片を、任意選択でさらなる治療剤または治療手順と付随して、投与することを含む方法も、本発明の一部である。
【００３３】
本発明はさらに、本発明による抗体または抗原結合断片及び抗原を含むワクチンを含む。
【００３４】
別の態様において、本発明は、試料中のＣＴＬＡ−４ペプチドまたはその断片の存在を検出する方法であって、試料を本発明の抗体または断片と接触させることと、抗体または断片とペプチドとの間の複合体の存在を検出することとを含み、複合体の検出がＣＴＬＡ−４ペプチドの存在を示す、方法を含む。
【００３５】
また、本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、本発明による抗体もしくは抗原結合断片、または対象内での抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクターを投与することを含む、方法にも関する。好ましくは、前述の方法は、以下の目的で使用される：
ｏｏ．がんの処置；
ｐｐ．感染症もしくは感染性疾患の処置；または
ｑｑ．ワクチンアジュバントとして。
【００３６】
別の態様において、本発明は、以下を目的とする医薬の調製で使用するための、本発明による抗体もしくは抗原結合断片、または対象内での抗体もしくは抗原結合断片の発現を媒介する発現ベクターを対象とする：
ｒｒ．免疫細胞活性化の増大；
ｓｓ．がんの処置；または
ｔｔ．感染症もしくは感染性疾患の処置。
【００３７】
以下の態様において、本発明は、以下を目的とするがんの処置用の医薬製造のための、本発明の抗体または抗原結合断片の使用を含む：免疫細胞活性化の増大；がんの処置；または感染症もしくは感染性疾患の処置。
【００３８】
また、本発明は、断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である、本発明の抗体またはその抗原結合断片も含む。
【００３９】
以下の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域と、軽鎖定常領域カッパまたはラムダから選択される軽鎖定常領域とを含む。抗体またはその抗原結合断片がヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む実施形態において、前述のＩｇＧ４配列は、好ましくは、配列番号５０に示されるように、位置２２８にＳｅｒ→Ｐｒｏ変異を有する。
【００４０】
また、本発明は、対象における免疫応答を刺激する方法であって、それを必要とする対象に、免疫応答を刺激するのに有効な量の、本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法も対象とする。好ましくは、このような方法において、抗体分子は、１つ以上の共刺激分子のアゴニスト、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３リガンドからなる群から選択される１つ以上の分子のアゴニストとの併用で、投与される。代替的に、抗体分子は、免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、またはＴＧＦＲからなる群から選択される免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤との併用で、投与される。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明は、がんを処置する方法であって、当該がんが、肺癌、黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、骨髄腫、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、甲状腺癌、血液癌、リンパ腫、骨髄腫、もしくは白血病、または当該がんの転移病変からなる群から選択される、方法を含む。
【００４２】
また、がんを処置する方法に関連して、本発明は、抗体分子が、１つ以上の第２の治療剤または手順との併用で投与される方法であって、例えば、第２の治療剤または手順が、化学療法、標的抗がん療法、腫瘍溶解性薬物、細胞傷害性薬剤、免疫ベース療法、サイトカイン、外科的手順、放射線手順、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、または細胞免疫療法からなる群から選択される、方法も対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ジャーカットベースのレポーターアッセイにおけるｈＣＴＬＡ４．２７Ａ抗体の機能性。
【図２】ｈＣＴＬＡ４．２７抗体の他との差異を示すｈＣＤ８０ブロックプロファイル。
【図３】ＰＢＭＣ  ＳＥＢアッセイにおけるｈＣＴＬＡ４．２７抗体によるＩＬ２産生誘導。
【図４Ａ】ｈＣＴＬＡ４．２７抗体及び対照抗体：ＡＤＣＣアッセイにおけるエフェクター機能。
【図４Ｂ】ｈＣＴＬＡ４．２７抗体及び対照抗体：ＣＤＣアッセイにおけるエフェクター機能。
【図５】ヒト／マウスＣＴＬＡ−４交換変異体に対するｈＣＴＬＡ４．２７ＡキメラｈＩｇＧ４の固有な結合プロファイル。
【図６】ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃに対するｈＣＴＬＡ４．２７Ａの結合のエピトープマッピング結果を示している。種々のタンパク質分解アプローチにより検出される架橋ペプチドは、配列番号５４−５７である。ｈＣＴＬＡ−４残基４６−７６（配列番号４８）は、参照のために示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明を実施するための形態及び本発明の実施例の全体において、以下の略語が使用される。
ＡＤＣＣ    抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ    補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ    免疫グロブリン可変領域における相補性決定領域（Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて定義される）
ＣＨＯ    チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＥＣ５０    ５０％の総結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＲ    抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除外した免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ    ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＦＮ    インターフェロン
ＩＣ５０    ５０％阻害の総シグナルをもたらす濃度
ＩｇＧ    免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ    Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔ（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により開発された免疫グロブリンアラインメント及びナンバリングシステム
ｍＡｂまたはＭａｂまたはＭＡｂ    モノクローナル抗体
ＳＥＢ    ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ
ＴＴ    破傷風トキソイド
Ｖ領域    異なる抗体間で配列が可変であるＩｇＧ鎖のセグメント。Ｖ領域は、軽鎖における１０９及び重鎖における１１３のＫａｂａｔ残基に及ぶ。
ＶＨ    免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＬ    免疫グロブリン軽鎖可変領域
ＶＫ    免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
【００４５】
以下は、本明細書で参照される配列のリスト（表１）である。
【００４６】
【表１−１】
2019532619.tif 000002
【００４７】
【表１−２】
2019532619.tif 000003
【００４８】
【表１−３】
2019532619.tif 000004
【００４９】
【表１−４】
2019532619.tif 000005
【００５０】
【表１−５】
2019532619.tif 000006
【００５１】
【表１−６】
2019532619.tif 000007
【００５２】
【表１−７】
2019532619.tif 000008
【００５３】
【表１−８】
2019532619.tif 000009
【００５４】
【表１−９】
2019532619.tif 000010
【００５５】
「処置する」または「処置すること」とは、治療剤、例えば、本発明のいずれかの抗体または抗原結合断片を含有する組成物を、当該治療剤が治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有するまたは疾患を有する疑いのある対象または患者に、内部的または外部的に投与することを意味する。典型的には、この治療剤は、任意の臨床的に測定可能な程度にこのような症状（複数可）の後退を誘導するまたは進行を阻害することにより、処置を受ける対象または集団における１つ以上の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療剤の量は、患者の疾患状態、年齢、及び体重のような諸因子、ならびに患者において所望の応答を誘発する薬物の能力に応じて変動し得る。疾患症状が緩和したかどうかは、典型的には医師または技量を有する他の医療提供者により症状の重症度または進行状態を評価するために使用される、任意の臨床的測定により評価することができる。
【００５６】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその使用方法を含む。本明細書において、「抗体」という用語は、所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、以下に限定されないが、モノクローナル抗体（２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、及びラクダ化単一ドメイン抗体を網羅する。
【００５７】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４抗原結合断片及びその使用方法を含む。本明細書において、別段の指示がない限り、「抗体断片」または「抗原結合断片」とは、抗体の抗原結合断片を指し、すなわち、全長抗体により結合される抗原に対し特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片を指す。抗原結合断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；ナノボディ、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００５８】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ断片及びその使用方法を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、もう１つの重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ断片」は、抗体のパパイン切断の産物であり得る。
【００５９】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びＦｃ領域を含むその抗原結合断片、ならびにこれらの使用方法を含む。「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。この２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合により、そしてＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により、一緒に保持される。
【００６０】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ’断片及びその使用方法を含む。「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間の領域を含有する、１つの重鎖の一部または断片とを含有する。
【００６１】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆ（ａｂ’）２断片及びその使用方法を含む。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖と、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含有する、２つの重鎖とを含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖によるジスルフィド結合により一緒に保持されている、２つのＦａｂ’断片から構成されている。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、抗体のペプシン切断の産物であり得る。
【００６２】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｖ断片及びその使用方法を含む。「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００６３】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ断片及びその使用方法を含む。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体という用語は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの概説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照。また、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号及び米国特許第４，９４６，７７８及び第５，２６０，２０３号も参照。
【００６４】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４ドメイン抗体及びその使用方法を含む。「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域はペプチドリンカーと共有結合して、二価のドメイン抗体を創出する。この二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じ抗原を標的化することもあれば、異なる抗原を標的化することもある。
【００６５】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４二価抗体及びその使用方法を含む。「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。場合によっては、この２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。ただし、二価抗体は二重特異性であってもよい（以下参照）。
【００６６】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４ラクダ化単一ドメイン抗体及びその使用方法を含む。ある特定の実施形態において、本明細書における抗体は、ラクダ化単一ドメイン抗体も含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ  ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号を参照。
【００６７】
一実施形態において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を伴った２つのＶＨドメインを含む、単一ドメイン抗体を提供する。
【００６８】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４ダイアボディ及びその使用方法を含む。本明細書において、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する低分子の抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間を対合させることができない程度に短いリンカーを使用することにより、これらのドメインは、強制的に別の鎖の相補的なドメインと対合して２つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８において、より十分に説明されている。操作された抗体バリアントの概説については、概してＨｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を参照。
【００６９】
典型的には、何らかの方法で修飾されている本発明の抗体または抗原結合断片は、その結合活性をモルベースで表現した場合に、（親抗体との比較で）結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合断片は、親抗体としてのＣＴＬＡ−４結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％、またはそれ以上を保持する。また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、その生物学的活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的バリアント」または「機能保存されたバリアント」と呼ばれる）を含み得ることも意図されている。
【００７０】
本発明は、単離された抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片、ならびにこれらの使用方法を含む。「単離された」抗体またはその抗原結合断片は、これらが産生される細胞または細胞培養物からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含まない。このような生物学的分子としては、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞デブリ及び成長培地のような他の材料が挙げられる。単離された抗体または抗原結合断片はさらに、宿主細胞からのまたはその成長培地の生物学的分子のような発現システム構成成分を少なくとも部分的に含まなくてもよい。一般的には、「単離された」という用語は、このような生物学的分子の完全な不在、または水、緩衝液、もしくは塩、または抗体もしくは断片を含む医薬製剤の構成成分の不在を指すようには意図されていない。
【００７１】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４キメラ抗体（例えば、ヒト定常ドメイン／マウス可変ドメイン）及びその使用方法を含む。本明細書において、「キメラ抗体」は、第１の抗体からの可変ドメイン及び第２の抗体からの定常ドメインを有する抗体であり、この第１及び第２の抗体は異なる種からのものである（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。典型的には、可変ドメインはげっ歯類のような実験動物からの抗体（「親抗体」）から取得され、定常ドメイン配列はヒト抗体から取得され、これにより、得られるキメラ抗体が、親（例えば、マウス）抗体の場合よりも、ヒト対象において有害な免疫応答を誘発しにくいようにする。
【００７２】
本発明は、抗ＣＴＬＡ−４ヒト化抗体及びその抗原結合断片（例えば、ヒト化されたラットまたはマウス抗体）、ならびにこれらの使用方法を含む。本発明は、実施例に示すような任意のヒト化バージョンのｈＣＴＬＡ４．２７Ａ抗体を含む。本明細書において、「２７抗体」及び「ｈＣＴＬＡ４．２７」は互換的に使用され、配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を含む抗体、より好ましくは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、または２０のいずれかのＶＨ領域と、配列番号２２、２４、２６、または３０のいずれかのＶＬ領域とを含む抗体を指す。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト及び非ヒト（例えば、マウスまたはラット）両方の抗体からの配列を含有する、抗体の形態を指す。概して、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、フレームワーク領域（ＦＲ）の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むことができる。
【００７３】
概して、基本的な抗体構造ユニットは、四量体を含む。各四量体は、同一な２対のポリペプチド鎖を含み、各対が１つの「軽」（約２５ｋＤａ）鎖及び１つの「重」（約５０〜７０ｋＤａ）鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約１００から１１０、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義し得る。典型的には、ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。さらにヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義する。軽鎖及び重鎖内において、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。
【００７４】
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、概して、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体以外では、概して、２つの結合部位は同じである。
【００７５】
典型的には、重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）に位置する３つの超可変領域（別名相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域により整列され、それにより、特定のエピトープへの結合が可能になる。概して、軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割当ては、一般的には、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義に従う。
【００７６】
本明細書において、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列による抗体のＣＤＲ領域の定義）を参照。また、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（構造による抗体のＣＤＲ領域の定義）も参照。本明細書において、「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。
【００７７】
「単離された核酸分子」または「単離されたポリヌクレオチド」とは、この単離されたポリヌクレオチドが天然に見いだされるポリヌクレオチドの全てもしくは一部に関連していない、または天然に結合していないポリヌクレオチドに結合している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの何らかの組合せを意味する。本開示の目的において、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、インタクトな染色体を含まないものと理解されるべきである。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、この指定された配列に加えて、１０まで、または２０もしくはそれ以上までの他のタンパク質またはその一部もしくは断片のコード配列を含むことができ、あるいは、列挙された核酸配列のコード領域の発現を調節する作用可能に結合した制御配列を含むことができ、及び／またはベクター配列を含むことができる。
【００７８】
「調節配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な調節配列としては、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを使用することが知られている。
【００７９】
核酸またはポリヌクレオチドは、別の核酸配列と機能的な関係に置かれているときに「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに対し作用可能に結合しており、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に提供を及ぼす場合、コード配列に対し作用可能に結合しており、あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置付けられている場合、コード配列に対し作用可能に結合している。一般的には、ただし常にではないが、「作用可能に結合」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接していることを意味し、分泌リーダーの場合には、近接し、かつリーディングフェーズにあることを意味する。ただし、エンハンサーは近接していなくてもよい。結合は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより遂行される。このような部位が存在しない場合、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００８０】
本明細書において、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、全てのこのような呼称は後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代の主題細胞と、移行の回数に関係なくそれに由来する培養物とを含む。また、計画的または偶発的な変異に起因して、全ての後代が正確に同一なＤＮＡ内容物を有するわけではないことも理解される。最初に形質転換された細胞において同じ機能または生物学的活性を有するものとしてスクリーニングされる変異後代も含まれる。別々の名称が意図されている場合、それは文脈から明らかとなる。
【００８１】
本明細書において、「生殖系列配列」とは、再編成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を指す。任意の好適な再編成されていない免疫グロブリン配列の供給源を使用することができる。ヒト生殖系列配列は、例えば、米国国立衛生試験所のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  ＤｉｓｅａｓｅｓのウェブサイトにあるＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ生殖系列データベースから取得することができる。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１に記載のように取得することができる。
【００８２】
本発明の抗体は、本出願で定義する配列番号７及び８で提示する重鎖及び軽鎖の任意の組合せ、より好ましくは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、または２０で提示する重鎖と、配列番号２２、２４、２６、及び３０で提示する軽鎖とを含むことができる。
【００８３】
このことは、以下の組合せがなされ得ることを意味する：
配列番号１０の重鎖及び配列番号２２の軽鎖を有する抗体；
配列番号１２の重鎖及び配列番号２２の軽鎖を有する抗体；
配列番号１４の重鎖及び配列番号２２の軽鎖を有する抗体；
配列番号１６の重鎖及び配列番号２２の軽鎖を有する抗体；
配列番号１８の重鎖及び配列番号２２の軽鎖を有する抗体；
配列番号２０の重鎖及び配列番号２２の軽鎖を有する抗体；
配列番号１０の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を有する抗体；
配列番号１２の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を有する抗体；
配列番号１４の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を有する抗体；
配列番号１６の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を有する抗体；
配列番号１８の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を有する抗体；
配列番号２０の重鎖及び配列番号２４の軽鎖を有する抗体；
配列番号１０の重鎖及び配列番号２６の軽鎖を有する抗体；
配列番号１２の重鎖及び配列番号２６の軽鎖を有する抗体；
配列番号１４の重鎖及び配列番号２６の軽鎖を有する抗体；
配列番号１６の重鎖及び配列番号２６の軽鎖を有する抗体；
配列番号１８の重鎖及び配列番号２６の軽鎖を有する抗体；
配列番号２０の重鎖及び配列番号２６の軽鎖を有する抗体；
配列番号１０の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を有する抗体；
配列番号１２の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を有する抗体；
配列番号１４の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を有する抗体；
配列番号１６の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を有する抗体；
配列番号１８の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を有する抗体；
配列番号２０の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を有する抗体。
【００８４】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体の物理的及び機能的特性
本発明は、指定された構造的及び機能的特徴を有する抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片、ならびに疾患（例えば、がんまたは感染性疾患）の処置または予防における抗体またはその抗原結合断片の使用方法を提供する。これらは全て、実施例に記載のように見いだされた、配列番号３２の重鎖及び配列番号３４の軽鎖を有する（これらをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３１及び３３である）マウス抗体に由来するものである。
【００８５】
この抗体及びこれに由来するヒト化抗体は、２０ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）に結合し、ｈＣＤ８０またはｈＣＤ８６に対するｈＣＴＬＡ−４の結合を、ｈＣＤ８０のブロックについては１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＩＣ５０で、ｈＣＤ８６のブロックについては好ましくは１０ｎＭ未満、より好ましくは２．５ｎＭ未満のＩＣ５０でブロックすることができることから特徴づけられる。注目すべきことは、本発明の抗体のｈＣＤ８０ブロックプロファイルが、１０Ｄ１（イピリムマブ）及びＣＰ−６７５，２０６（トレメリムマブ）のｈＣＤ８０ブロックプロファイルの間にあることである（図２参照）。当該抗体は、ＣＴＬＡ−４分子の異なるエピトープに結合するため、イピリムマブ及びトレメリムマブとは異なる。相違点の１つは、配列が配列番号４４で示されるキメラマウス−ヒトＣＴＬＡ４分子（図５も参照）に対し、本発明の抗体または抗原結合断片は結合せず、一方１０Ｄ１及びＣＰ−６７５，２０６は結合することである。
【００８６】
標的抗原に対する抗体エピトープの精細なマッピングに利用できる方法はいくつか存在し、これにはＨ／Ｄ−Ｅｘ質量分析、Ｘ線結晶解析、ペプチドアレイ、及び部位特異的変異誘発が含まれる。例えば、ＨＤＸ（水素−重水素交換）をタンパク質分解及び質量分析と共に使用して、特定の抗原Ｙに対する抗体のエピトープを決定することができる。ＨＤＸ−ＭＳは、抗原単独及び抗体の存在下で、様々な時間間隔においてＤ２Ｏでインキュベートしたときの、抗原による重水素取込み程度の正確な測定及び比較に依存する。重水素は、露出エリア内のタンパク質のアミド骨格上にある水素と交換される一方、抗体に結合した抗原の領域は、保護され、タンパク質分解断片のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析の後にほとんどまたは全く交換を示さない。
【００８７】
また、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合し、ただし配列番号４４のマウス−ヒトキメラＣＴＬＡ−４分子には結合しない、抗ＣＴＬＡ−４抗体も含む。
【００８８】
他の実施形態において、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４（例えば、ヒト化抗体）に結合し、配列番号７〜３０のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または３０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体またはその抗原結合断片であって、このバリアントが所望の結合及び特性、すなわちＣＴＬＡ−４に結合する能力ならびにＣＤ８０及び／またはＣＤ８６に対するＣＴＬＡ−４の結合をブロックする能力を提供する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の実施形態において、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４（例えば、ヒト化抗体）に結合し、配列番号７〜３０のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または３０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の実施形態において、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４（例えば、ヒト化抗体）に結合し、配列番号７〜３０のアミノ酸配列に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または３０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の実施形態において、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４（例えば、ヒト化抗体）に結合し、配列番号７−３０のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または３０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００８９】
「保存的に修飾されたバリアント」または「保存的置換」とは、タンパク質内のアミノ酸が、同様の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格コンフォメーション、及び合成など）を有する他のアミノ酸との置換であって、この変更が、タンパク質の生物学的活性を改変することなく頻繁に行うことができるような置換を指す。当業者は、概して、ポリペプチドの本質的でない領域における単一のアミノ酸置換は、生物学活性を実質的に改変しないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照）。加えて、構造的または機能的に類似するアミノ酸の置換は、生物学的活性を損なう可能性がより低い。例示的な保存的置換を、表２に示す。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
本発明の抗体の機能保存的バリアントも、本発明により企図されている。本明細書において「機能保存的バリアント」とは、抗原親和性及び／または特異性のような所望の特性を改変することなく、１つ以上のアミノ酸残基が変更された抗体または断片を指す。このようなバリアントとしては、以下に限定されないが、同様の特性を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換え、例えば、表２の保存的アミノ酸置換が挙げられる。また、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上までのアミノ酸置換を有する、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体のＶＬドメイン（例えば、配列番号２２、２４、２６、３０）を含む単離されたポリペプチド、及び本発明のＣＴＬＡ−４抗体のＶＨドメイン（例えば、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０）を含む単離されたポリペプチドも提供される。
【００９２】
別の実施形態において、ヒトＣＴＬＡ−４に結合し、本明細書に記載のＶＬドメイン及びＶＨドメインの１つ以上に対し少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％の配列同一性を有するＶＬドメイン及びＶＨドメインを有し、ＣＴＬＡ−４に対する特異的な結合を示す、抗体またはその抗原結合断片が提供される。別の実施形態において、本発明の結合する抗体またはその抗原結合断片は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上までのアミノ酸置換を有するＶＬ及びＶＨドメイン（シグナル配列を伴うまたは伴わない）を含み、ＣＴＬＡ−４に対する特異的な結合を示す。
【００９３】
ポリヌクレオチド及びポリペプチド
本発明はさらに、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片のポリペプチドまたは免疫グロブリン鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、配列番号１〜３０に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００９４】
一実施形態において、本明細書に示される単離された抗体または抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が提供される。一実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、本発明による少なくとも１つの成熟した免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び／または本発明による少なくとも１つの成熟した免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、抗体またはその抗原結合断片をコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド分子上の軽鎖及び重鎖の両方をコードし、他の実施形態において、軽鎖及び重鎖は、別々のポリヌクレオチド分子上でコードされる。別の実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、シグナル配列をコードする。
【００９５】
一実施形態において、本発明は、ＨＣＤＲ−１（配列番号１）、ＨＣＤＲ−２（配列番号２）、及びＨＣＤＲ−３（配列番号３）を含む抗体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００９６】
一実施形態において、本発明は、ＬＣＤＲ−１（配列番号４）、ＬＣＤＲ−２（配列番号５）、及びＬＣＤＲ−３（配列番号６）を含む抗体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインまたはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００９７】
一実施形態において、本発明は、配列番号７の免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、配列番号８の免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００９９】
一実施形態において、本発明は、ヒト化重鎖をコードする配列番号９、１１、１３、１５、１７、または１９のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドを含む。
【０１００】
一実施形態において、本発明は、ヒト化軽鎖をコードする配列番号２１、２３、２５、または２９のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドを含む。
【０１０１】
本発明のさらなる実施形態において、ヒト化重鎖をコードする配列番号９、１１、１３、１５、１７、または１９のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドと、ヒト化軽鎖をコードする配列番号２１、２３、２５、または２９による単離されたポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これらの全ての考えられる組合せが含まれる。したがって、本発明は、配列番号９及び配列番号２１を含むポリヌクレオチド、配列番号１１及び配列番号２１を含むポリヌクレオチド、配列番号１３及び配列番号２１を含むポリヌクレオチド、配列番号１５及び配列番号２１を含むポリヌクレオチド、配列番号１７及び配列番号２１を含むポリヌクレオチド、配列番号１９及び配列番号２１を含むポリヌクレオチド、配列番号９及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド、配列番号１１及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド、配列番号１３及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド、配列番号１５及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド、配列番号１７及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド、配列番号１９及び配列番号２３を含むポリヌクレオチド、配列番号９及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド、配列番号１１及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド、配列番号１３及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド、配列番号１５及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド、配列番号１７及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド、配列番号１９及び配列番号２５を含むポリヌクレオチド、配列番号９及び配列番号２９を含むポリヌクレオチド、配列番号１１及び配列番号２９を含むポリヌクレオチド、配列番号１３及び配列番号２９を含むポリヌクレオチド、配列番号１５及び配列番号２９を含むポリヌクレオチド、配列番号１７及び配列番号２９を含むポリヌクレオチド、及び／または配列番号１９及び配列番号２９を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１０２】
また、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、プラスミドのような発現ベクター）であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞がベクターで形質移入されたときに宿主細胞により認識される制御配列に対し作用可能に結合している、ベクターも提供する。また、本発明のベクターを含む宿主細胞、及び本明細書で開示されている抗体もしくはその抗原結合断片またはポリペプチドを産生する方法であって、抗体またはその抗原結合断片の免疫グロブリン鎖をコードする発現ベクターまたは核酸を有する宿主細胞を培地中で培養することと、抗体またはその抗原結合断片を宿主細胞または培地から単離することとを含む、方法も提供される。
【０１０３】
また、本発明には、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチド）であって、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を実施したときに、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％同一な、８０％同一な、より好ましくは少なくとも約９０％同一な、最も好ましくは少なくとも約９５％同一な（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）アミノ酸配列を含む、ポリペプチドも含まれ、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターは、それぞれの配列とそれぞれの全長の参照配列との間で最大のマッチをもたらすように選択される（例えば、予測閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリー範囲における最大マッチ：０；ＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリックス；ギャップコスト：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １；条件付き組成スコアマトリックス調整）。
【０１０４】
配列同一性とは、２つの配列を最適にアラインメントしたときに、２つのポリペプチドのアミノ酸が、同等の位置において同じである程度を指す。
【０１０５】
以下の参考文献は、配列解析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２（２０）：５１０１−５１０９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アラインメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アラインメント統計：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１０６】
結合親和性
限定ではなく例として、本明細書で開示されている抗体及び抗原結合断片は、以下のアミノ酸配列：（配列番号３６）：
【０１０７】
【化１】
2019532619.tif 000012
【０１０８】
を含むヒトＣＴＬＡ−４（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５２１４．４）に対し、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技法（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により少なくとも約１×１０−９Ｍと測定されるＫＤ値（すなわち、１×１０−９Ｍ以下のＫＤ値）で、結合することができる。
【０１０９】
免疫細胞活性化
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫細胞の活性を増大させる。免疫細胞の活性の増大は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて検出することができる。一実施形態において、免疫細胞の活性の増大は、免疫細胞の増殖を測定することにより検出することができる。例えば、Ｔ細胞の活性の増大は、Ｔ細胞の増殖、またはシグナル伝達事象（例えば、転写調節因子にシグナルを伝える免疫受容体もしくは下流キナーゼのチロシンリン酸化）を測定することにより、検出することができる。他の実施形態において、免疫細胞の活性の増大は、特定の標的細胞に対するＣＴＬもしくはＮＫ細胞の細胞傷害機能、または抗腫瘍免疫の刺激に付随するＩＦＮγサイトカイン応答を測定することにより、検出することができる。また他の実施形態において、免疫細胞の活性の増大は、対象に由来する試料においてＴ細胞活性化をｅｘ  ｖｉｖｏで測定することにより、検出することができる。一実施形態において、Ｔ細胞活性の増大は、以下により決定される：（ｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３から選択される１つ以上の炎症促進性サイトカインのＳＥＢ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ）誘導産生、またはＣＤ２５及びＣＤ６９からなる群からの膜活性化マーカーの上方制御、またはフローサイトメトリーもしくは３Ｈ取込みによる芽細胞形成の検出を用いた増殖の誘導を測定すること、あるいは（ｉｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインの産生を誘導するための、混合リンパ球反応またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナリングの直接的抗ＣＤ３  ｍＡｂ刺激、またはＣＤ２５及びＣＤ６９からなる群からの膜活性化マーカーの上方制御、またはフローサイトメトリーもしくは３Ｈ取込みによる芽細胞形成の検出を用いた増殖の誘導を測定すること。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現するラージ細胞に提示されたときにＣＤ３＋  Ｔ細胞を刺激して、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３からなる群から選択される炎症促進性サイトカイン、またはＣＤ２５及びＣＤ６９からなる群からの膜活性化マーカーの上方制御、またはフローサイトメトリーもしくは３Ｈ取込みによる芽細胞形成の検出を用いた増殖の誘導をもたらす。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、活性化Ｔ細胞によるＩＬ−２及び／またはＩＦＮγの産生を少なくとも１．５倍刺激する。実験部分から明らかであるように、本発明の抗体におけるＴ細胞活性化の特徴は、公知の先行技術のｈＣＴＬＡ４抗体イピリムマブ及びトレメリムマブにおけるＴ細胞刺激の特徴にほぼ等しい。
【０１１０】
抗ｈＣＴＬＡ−４抗体のエフェクター機能
一部の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗原結合断片は、ＣＴＬＡ−４＋制御性Ｔ細胞を枯渇させることができる。このようなエフェクター機能を発揮する抗体の能力は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。一実施形態において、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導する抗体の能力は、エフェクター細胞としてのナチュラルキラー細胞と、ヒトＣＴＬＡ−４を安定的に発現する細胞株とを用いて決定する。実験セクションで示すように、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分を有するｈＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４＋細胞上でＡＤＣＣを誘導することができる。
【０１１１】
別の実施形態において、抗体における補体依存性細胞傷害を誘導する能力は、ヒト補体と、ヒトＣＴＬＡ−４を安定的に発現する細胞株とを用いて決定される。実験セクションで示すように、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分を有するｈＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４＋細胞上でＣＤＣを誘導することができる。
【０１１２】
別の実施形態において、細胞媒介性溶解を誘導する抗体の能力は、イピリムマブのようなｈＩｇＧ１  ＣＴＬＡ−４抗体の文脈でＣＴＬＡ−４＋  ＴｒｅｇのＦｃγＲＩＩＩＡ依存性溶解を誘導する非古典的なＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋単球を用いて決定することができる（Ｒｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ；ＰＮＡＳ；２０１５；６１４０−６１４５；ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１７３２０１１２）。
【０１１３】
ｈＣＤ８０及びｈＣＤ８６に対する結合をブロックする抗ｈＣＴＬＡ−４抗体の能力
一部の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗原結合断片は、ヒトＣＤ８０及び／またはヒトＣＤ８６に対するヒトＣＴＬＡ−４の結合をブロックすることができる。ヒトＣＤ８０及び／またはヒトＣＤ８６に対しヒトＣＴＬＡ−４が結合するのをブロックする能力は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。一実施形態において、ヒトＣＤ８０及び／またはヒトＣＤ８６に対するヒトＣＴＬＡ−４の結合をブロックする抗体の能力は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定する。
【０１１４】
実験セクションで示すように、ＣＴＬＡ−４がヒトＣＤ８０及び／またはヒトＣＤ８６に結合するのをブロックする効力は、公知の抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ及びトレメリムマブの活性に似ている。強調されるべきは、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体が、ｈＣＤ８０のブロックについて、イピリムマブ及びトレメリムマブの効果の中間の有効性を示したことである（図２参照）。
【０１１５】
抗体及びその抗原結合断片を作製する方法
したがって、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、抗体または断片を発現するハイブリドーマ細胞をこのような発現に好ましい条件下で培養することと、任意選択で、ハイブリドーマ及び／または成長培地（例えば、細胞培地）から抗体または断片を単離することとを含む、方法を含む。
【０１１６】
ラット及びマウス以外の動物に由来するモノクローナル抗体は、固有の利点をもたらす。マウス、ラット、及びヒト間では、シグナル伝達及び疾患に関連する多くのタンパク質標的が高度に保存されており、そのため、このようなタンパク質標的はマウスまたはラット宿主により自己抗原として認識され、免疫原性を低下させる恐れがある。この問題は、ウサギを宿主動物として使用すると回避することができる。例えば、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２４，２９５−３０２，２００５を参照。
【０１１７】
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を産生しスクリーニングする方法は、通常に行われており、当技術分野において周知である。非限定的な一例では、マウスは、対象の抗原またはこのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。ひとたび免疫応答が検出されたら（例えば、抗原に対し特異的な抗体がマウス血清中で検出されたら）、マウスの脾臓を採取し、脾細胞を単離する。Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−１３４で説明されているように、Ｂ細胞を培養した。
【０１１８】
次に、反応性上清からのＢ細胞クローンを、例えば、公開されている手順に従ったミニ電気融合により、不死化する（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：６９−７７；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−３４）。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。
【０１１９】
次に、ハイブリドーマクローンについて、当技術分野で公知の方法により、抗原に結合可能な抗体を分泌する細胞をアッセイする。腹水液（一般的には高レベルの抗体を含有する）は、マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することにより生成することができる。
【０１２０】
抗体生成の方法で使用され得るアジュバントとしては、以下に限定されないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、全細菌（ＢＣＧ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）及び細菌構成成分（細胞壁骨格、トレハロースジマイコレート、モノホスホリルリピドＡ、ｔｕｂｅｒｃｌｅ  ｂａｃｉｌｌｕｓのメタノール抽出可能な残渣（ＭＥＲ）、完全もしくは不完全フロイントアジュバント）；ウイルスアジュバント；化学アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、ヨード酢酸塩、及びヘミコハク酸コレステリル；またはネイキッドＤＮＡアジュバントが挙げられる。本発明の方法で使用され得る他のアジュバントとしては、コレラ毒素、パロポックス（ｐａｒｏｐｏｘ）タンパク質、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；以下も参照：Ｂｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“ＧＡＤ６５  Ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｂ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（９−２３）Ａｒｅ  Ｎｏｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＢＢ  Ｒａｔ，”Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，３１（１）：１５−２４（参照により本明細書に組み込まれる））、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；以下も参照：Ｌｏｄｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）“ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｉｃｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｒｏｕｔｅ  Ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ（ＭＰＬ），”Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：１０５９−１０６６；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“３−Ｏ−Ｄｅｓａｃｙｌ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：４６４０−４６４９；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ（ＭＰＬ）Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９：１０３−１０７（いずれも参照により本明細書に組み込まれる））、ＲＣ−５２９アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｉｘａのアミノアルキルグルコサミニド−４−ホスフェート（ＡＧＰ）化学物質ライブラリーからのリード化合物、ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍも参照）、及びＤＥＴＯＸ（商標）アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＤＥＴＯＸ（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント（モノホスホリルリピドＡ）及びマイコバクテリア細胞壁骨格を含む；以下も参照：Ｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｂ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｗｈｏｌｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｌｕｓ  ＤＥＴＯＸ  Ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔ��  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ，”Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（３）：６１９−６２７；及びＧｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  −  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ，Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅ，１３（１４）：１２６３−１２７６（いずれも参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１２１】
多数の刊行物が、選択アナライトに結合するポリペプチドのライブラリーを産生しスクリーニングするためのファージディスプレイ技術の使用について論じている。例えば、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３７８−８２，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，４０４−６，１９９０，Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３８６−８８，１９９０；及びＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５７１，６９８号を参照。ファージディスプレイ法の基本概念は、スクリーニング対象のポリペプチドをコードするＤＮＡと、当該ポリペプチドとの間の物理的会合の確立である。この物理的会合はファージ粒子によりもたらされ、ファージ粒子は、ポリペプチドを、当該ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入するカプシドの一部として提示する。ポリペプチドとその遺伝的材料との間の物理的会合が確立することにより、極めて多数の異なるファージ担持ポリペプチドを同時に質量スクリーニングすることが可能になる。ある標的に対する親和性を有するポリペプチドを提示するファージはこの標的に結合し、このファージは標的に対する親和性スクリーニングにより濃縮される。このファージから提示されるポリペプチドの同一性は、それぞれのゲノムから決定することができる。この方法を用いて、所望の標的に対する結合親和性を有すると同定されたポリペプチドは、次に、従来的手段によりバルク合成することができる。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０５７，０９８号を、全ての表、図、及び請求項を含めて参照。
【０１２２】
これらの方法により生成される抗体は、次に、精製された対象ポリペプチドとの親和性及び特異性についての第１のスクリーニングにより選択され、必要な場合、その結果は、結合から除外されることが所望されるポリペプチドとの親和性及び特異性と比較することができる。スクリーニング手順は、精製されたポリペプチドをマイクロタイタープレートの別々のウェルに固定化することを伴い得る。次に、潜在的な抗体または抗体集団を含有する溶液をそれぞれのマイクロタイターウェルに淹れ、約３０分から２時間インキュベートする。次にマイクロタイターウェルを洗浄し、標識された二次抗体（例えば、産生抗体がマウス抗体の場合は、アルカリホスファターゼに結合した抗マウス抗体）をウェルに添加し、約３０分間インキュベートし、次に洗浄する。基質をウェルに添加すると、固定化されたポリペプチド（複数可）に対する抗体の存在箇所に着色反応が表れる。
【０１２３】
このように同定された抗体は、次に、選択されたアッセイ設計において親和性及び特異性についてさらに解析することができる。標的タンパク質に対する免疫アッセイの開発において、精製された標的タンパク質は、選択された抗体を用いた免疫アッセイの感受性及び特異性を判断するための標準物質として作用する。種々の抗体の結合親和性は異なることがあり、（例えば、サンドイッチアッセイにおける）ある特定の抗体のペアは、互いに立体的に干渉するなどの可能性があるため、抗体のアッセイ性能は、抗体の絶対的な親和性及び特異性よりも重要であり得る。
【０１２４】
また、抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現不可能でヒト免疫グロブリン遺伝子を発現可能なトランスジェニックマウスを用いて、産生することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同的組換えにより、マウス胚幹細胞に導入することができる。代替的に、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域を、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えてマウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入と別々にまたは同時に、機能しないようにすることができる。詳細には、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内在性抗体の産生を防止する。修飾された胚幹細胞を増やし、胚盤胞にマイクロインジェクトして、キメラマウスを作製する。次に、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作製する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全てまたは一部）により、従来的方法論を用いて免疫化する。この抗原を対象とするモノクローナル抗体は、従来的なハイブリドーマ技術を用いて、免疫化されたトランスジェニックマウスから取得することができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成し、続いてクラススイッチ及び体細胞変異を経る。したがって、このような技法を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＥ抗体を産生することが可能である。このヒト抗体産生のための技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ，”Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体の産生のための技術ならびにこのような抗体産生のためのプロトコルについては、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９６／３４０９６号、及びＷＯ９６／３３７３５号；ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、及び第５，９３９，５９８号を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎ（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）及びＭｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ｋｙｍａｂ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）及びＭｅｒｕｓ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のような企業は、上述と同様の技術を用いて、選択された抗原を対象とするヒト抗体の提供に従事している可能性がある。
【０１２５】
本明細書で開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体は、組換えにより産生することもできる（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現システム、哺乳類細胞発現システム、またはより下等な真核生物発現システムにおいて）。この実施形態において、本発明の免疫グロブリン分子をコードする核酸（例えば、ＶＨまたはＶＬ）は、ｐＥＴベースのプラスミドに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現システムで発現させることができる。例えば、本発明は、抗体もしくはその抗原結合断片、またはその免疫グロブリン鎖を宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＢＬ２１またはＢＬ２１ＤＥ３）のような細菌宿主細胞）内で発現させる方法であって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ７プロモーターに作用可能に結合した免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドも含む細胞内で発現させることを含む、方法を含む。例えば、本発明の一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主細胞は、ｌａｃプロモーターに作用可能に結合したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、このポリメラーゼ及び鎖の発現は、宿主細胞をＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）と共にインキュベートすることにより誘導される。
【０１２６】
モノクローナル抗体調製物は、ハイブリドーマの使用、組換え体、及びファージディスプレイ技術、またはこれらの組合せを含めた、当技術分野で公知の多岐にわたる技法を用いて産生することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の技法や、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  Ｔ−ＣＥＬＬ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ，ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））（いずれについても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で教示されている技法を含めたハイブリドーマ技法を用いて、産生することができる。本明細書において「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物、原核生物、またはファージのクローンを含めた単一クローンに由来する抗体を指し、その産生に用いる方法を指すものではない。抗体の組換え産生のための方法の一例は、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０１２７】
したがって、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片、またはその免疫グロブリン鎖を作製するための組換え方法であって、抗体または断片の１つ以上の免疫グロブリン鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖）をコードするポリヌクレオチドを導入することと、宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはＰｉｃｈｉａもしくはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を、このような発現に好ましい条件下で培養することと、任意選択で、抗体もしくは断片または鎖を、宿主細胞及び／または宿主細胞が成長する培地から単離させることとを含む、方法を含む。
【０１２８】
また、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第６，３３１，４１５号に示されている方法のいずれかにより合成することもできる。
【０１２９】
真核生物及び原核生物の宿主細胞は、本明細書で開示されている抗体もしくは断片または免疫グロブリン鎖の発現のための宿主としての哺乳類細胞を含めて、当技術分野で周知であり、これには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、及び他の多くの細胞株が含まれる。哺乳類宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、及びハムスターの細胞が挙げられる。特定の好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有するかを決定することにより選択される。使用され得る他の細胞株は、Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞、及び真菌細胞である。真菌細胞としては酵母及び糸状菌細胞が挙げられ、これには例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、任意のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａが含まれる。重鎖または抗原結合部分もしくはその断片、軽鎖及び／またはその抗原結合断片をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞内での抗体もしくは断片または鎖の発現、あるいは宿主細胞��成長する培地内への分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより、産生される。
【０１３０】
様々な宿主発現ベクターシステムを利用して、本発明の抗体を発現させることができる。このような宿主発現システムは、抗体のコード配列が産生され、続いて精製され得るためのビヒクルに相当するが、さらに、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入されたときに本発明の抗体をｉｎ  ｓｉｔｕで発現する細胞にも相当するものである。これらには、以下に限定されないが、免疫グロブリンコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞システム；免疫グロブリンコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞システム；あるいは、哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ細胞（米国特許第５，８０７，７１５号参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたラット網膜細胞））が含まれる。
【０１３１】
細菌システムでは、発現させる抗体について意図されている使用に応じて、複数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、ある抗体の医薬組成物の生成のためにこのようなタンパク質を大量に産生しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質産物が高レベルに発現するように方向付けるベクターが望ましいと考えられる。このようなベクターとしては、以下に限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）“Ｅａｓｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅｓ，”ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１−１７９４）（抗体のコード配列は、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームでベクターに個別にライゲーションさせることができる）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）“Ｕｐ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｌｐｐ  Ｇｅｎｅ  Ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１１０；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）；などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターを使用して、外部ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。概して、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞からの精製は、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズに吸着及び結合させ、次に遊離グルタチオンの存在下で溶離させることにより、容易に行うことができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、これにより、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出させることができる。
【０１３２】
昆虫システムでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外部遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で成長する。抗体のコード配列は、ウイルスの本質的でない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の調節下で配置することができる。
【０１３３】
哺乳類宿主細胞では、複数のウイルスベースの発現システムを利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、対象の抗体のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列に、ライゲーションさせることができる。次に、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムにおける本質的でない領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入することにより、生存可能であり、感染された宿主内で免疫グロブリン分子を発現可能である組換えウイルスがもたらされる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｌｅａｄｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  Ｌａｔｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８１：３６５５−３６５９を参照）。特定の開始シグナルも、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。このシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。この外来の翻訳調節シグナル及び開始コドンの由来は、天然及び合成の両方において様々であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより強化することができる（Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照）。
【０１３４】
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するもの、または遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾しプロセシングするものが選択され得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための、特徴的かつ特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主システムは、発現した外部タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的に対し、適正な一次転写物のプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。このような哺乳類宿主細胞としては、以下に限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
【０１３５】
長期においては、組換えタンパク質の高収率産生、安定した発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定的に発現する細胞株が操作されてもよい。ウイルス由来の反復を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切は発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により調節されたＤＮＡ及び選択マーカーを用いて、宿主細胞を形質転換させることができる。外部ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、濃縮培地で１〜２日間成長させることができ、次に選択的培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が安定的にプラスミドを染色体に統合し、成長して、細胞株にクローニングさせ増やすことができる増殖巣を形成することができるようにする。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞株を操作するのに有利に使用することができる。このような操作された細胞株は、本発明の抗体と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。
【０１３６】
複数の選択システムを使用することができ、これには、以下に限定されないが、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｃｅｌｌ  １１：２２３−２３２）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９６２）“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｓｓ  Ｌｉｎｅ．ＩＶ．ＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｒａｉｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）４８：２０２６−２０３４）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＤＮＡ：Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ａｐｒｔ  Ｇｅｎｅ，”Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−８２３）が含まれ、遺伝子は、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞で用いられる。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子に対する選択の基盤として使用することができる：ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ａｍｐｌｆｉａｂｌｅ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ａｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７：３５６７−３５７０；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｂｙ  Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ａ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８：１５２７−１５３１）；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８：２０７２−２０７６）；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与）（Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｂｙ  ｐＳＶ２−Ｎｅｏ  Ｇｅｎｅ，”Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（３）：２１９−２２６；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３）“Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｉａｌｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒ��ａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）“Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；及びＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７）。組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般的に知られている、使用され得る方法は、以下に記載されている：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；及びＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９４，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ．；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４；及びｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  Ａｎｄ  Ｇ４１８  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｓ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｇｅｎｅ  ３０：１４７−１５６）。
【０１３７】
本発明の抗体の発現レベルは、ベクター増幅により増大させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｎ  Ｍａｍｍａｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，”（ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｖｏｌ．３．）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照）。抗体を発現するベクターシステム内のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増大させることで、マーカー遺伝子のコピー数が増大する。増幅された領域は抗体のヌクレオチド配列に関連するため、抗体の産生も増大する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７−２６６）。
【０１３８】
宿主細胞に対し、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターを同時形質移入することができる。この２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。代替的に、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用することができる。このような状況において、軽鎖は、過剰量の毒性フリーの重鎖を回避するために、重鎖の前に配置するべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８６）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５６２−５６５；Ｋｏｈｌｅｒ（１９８０）“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｌｏｓｓ  Ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｌｉｎｅｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７：２１９７−２１９９）。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０１３９】
抗体及びその抗原結合断片ならびに免疫グロブリン鎖は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの、本発明の抗体及びその抗原結合断片ならびに免疫グロブリン鎖（またはそれに由来する他の部分）の発現は、複数の公知の技法を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンセターゼ遺伝子発現システム（ＧＳシステム）は、ある特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳシステムは、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５号、及び０  ３２３  ９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して、全体的または部分的に論じられている。したがって、本発明の一実施形態において、哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）は、グルタミンシンセターゼ遺伝子を欠いており、培地中、グルタミンの不在下で成長するが、免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドはグルタミンシンセターゼ遺伝子を含み、宿主細胞における遺伝子の欠如を補完する。
【０１４０】
本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を精製する方法であって、抗体または断片を含む試料を精製培地（例えば、カチオン交換培地、アニオン交換培地、疎水性交換培地、親和性精製培地（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ））に導入することと、前述の試料の精製された抗体または断片を培地に結合しないフロースルー画分から収集するか、またはフロースルー画分を廃棄し、結合した抗体もしくは断片を培地から溶離し、溶離物を収集することとを含む、方法を含む。本発明の一実施形態において、培地は、試料が適用されるカラム中にある。本発明の一実施形態において、この精製方法は、宿主細胞内での抗体または断片の組換え発現の後に行われ、このとき、例えば、最初に宿主細胞を溶解し、任意選択で、この溶解物を不溶性の材料から精製してから培地上での精製を行う。
【０１４１】
概して、特定の細胞株またはトランスジェニック動物内で産生される糖タンパク質であれば、この細胞株またはトランスジェニック動物内で産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。そのため、ある抗体における特定のグリコシル化パターンは、この抗体の産生に使用される特定の細胞株またはトランスジェニック動物に依存することになる。しかし、本明細書で提供される核酸分子によりコードされる、または本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体が有し得るグリコシル化パターンとは無関係に、本発明を含む。同様に、特定の実施形態において、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体は、典型的に、フコシル化された対応物よりも強力な有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で呈することが示されているため、有利であり得る（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号及び第７，２１４，７７５号）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこの抗体は、その炭水化物構造がヒト血清ＩｇＧに存在する集団の正常な構成成分であるため、免疫原性ではない可能性がある。
【０１４２】
本発明は、ＣＴＬＡ−４及び別の抗原、例えば、免疫刺激においてある役割を担う抗原（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＳＬＰ、ＩＬ−１０、４−ＩＢＢ、ＳＩＲＰ−ａｌｐｈａ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ａ、ＫＲ２ＤＬ及びＫＩＲ３ＤＬ抗原、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＩＴＬ−１からＩＴＬ−８、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＳ１、ＣＤ２７、ＡＰＲＩＬ、もしくはＬＡＧ−３）、またはがん細胞への標的化及び認識においてある役割を担う抗原（例えば、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＥＲＢＢ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＥＡ、アルファ−フェトプロテイン、ＣＣ４９、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ（ＭＥＴ）、ＣＡ−１２５、テネイシン、インテグリン、ＦＡＢ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、もしくはＲＡＮＫＬ）に対し結合特異性を有する、二重特異性及び二重機能性抗体及び抗原結合断片、ならびにその使用方法を含む。本発明の一実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４鎖は、配列番号７〜３０に示されるＶＨ／ＶＬ配列のいずれか１つ（または前述の配列、例えば配列番号１〜６に示されるようなもののいずれかの抗原結合断片）を含む。二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する、人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合やＦａｂ’断片の結合を含めた様々な方法により、産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１，Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照。加えて、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）として、または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２）として形成されることもある。加えて、二重特異性抗体は、「デュオボディ」（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０（１３）：５１４５−５１５０）として形成されることもある。
【０１４３】
本発明は、さらに、本明細書で開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体の抗ＣＴＬＡ−４抗原結合断片を含む。この抗体断片はＦ（ａｂ）２断片を含み、これは（例えば、ペプシンによる）ＩｇＧ酵素切断により、産生することができる。Ｆａｂ断片は、例えば、ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンによるＦ（ａｂ）２の還元により、産生することができる。
【０１４４】
免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。一部の実施形態において、異なる定常ドメインは、本明細書で提供されるＣＤＲに由来するヒト化ＶＬ及びＶＨ領域に付加され得る。免疫グロブリンには少なくとも５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４；ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）に分類することができる。本発明は、抗体におけるこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかについての抗体及び抗原結合断片を含む。
【０１４５】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、重鎖定常領域、例えば、ヒト定常領域、例えば、γ１、γ２、γ３、もしくはγ４ヒト重鎖定常領域、またはそのバリアントを含む。別の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域、例えば、ヒト軽鎖定常領域、例えば、ラムダもしくはカッパヒト軽鎖領域、またはそのバリアントを含む。限定ではなく例として、ヒト重鎖定常領域はγ４とすることができ、ヒト軽鎖定常領域はカッパとすることができる。代替的な実施形態において、抗体のＦｃ領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を伴ったγ４である（Ａｎｇａｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８、２４１位はＫａｂａｔナンバリングシステムに基づく）。
【０１４６】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ１サブタイプの重鎖定常領域を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ２サブタイプの重鎖定常領域を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ４サブタイプの重鎖定常領域を含む。
【０１４７】
抗体の操作
さらに含まれるのは、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片が、例えば、抗体または断片の特性を改善するために、親ｈＣＴＬＡ４．２７Ａモノクローナル抗体の可変ドメイン内のフレームワーク残基に対する修飾を含むように操作された抗体である、実施形態である。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体または断片の免疫原性を低下させるために行われる。これは、通常、親（例えば、げっ歯類）抗体または断片における可変ドメイン（すなわち、フレームワーク残基）内の非ＣＤＲ残基を、抗体が使用される種（例えば、ヒト用治療薬の場合にはヒト残基）の免疫レパートリーからの類似する残基で置き換えることにより、遂行される。このような抗体または断片は、「ヒト化」抗体または断片と呼ばれる。場合によっては、操作（例えば、ヒト化）された抗体の親和性を増大させるか、または特異性を改変することが望ましい。１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異させる（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より具体的には、体細胞変異を経た抗体または断片は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有することができる。このような残基は、抗体または断片のフレームワーク配列を、抗体または断片が由来する生殖系列配列と比較することにより、同定することができる。もう１つのアプローチは、操作（例えば、ヒト化）された抗体の１つ以上の位置において元の親（例えば、げっ歯類）の残基に復帰して、例えば、フレームワーク残基を置き換えるプロセスで失われた可能性のある結合親和性を回復することである（例えば、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号、及び米国特許第５，５３０，１０１号を参照）。
【０１４８】
ある特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片は、その特性を改善するためのフレームワーク及び／またはＣＤＲに対する修飾を含むように、操作（例えば、ヒト化）される。このような操作された変更は、分子モデリングに基づき得る。親（非ヒト）抗体の配列の可変領域についての分子モデルは、抗体の構造的特徴を理解するために構築し、抗原と相互作用し得る抗体上の潜在的な領域を同定するために使用することができる。従来的なＣＤＲは、免疫グロブリン配列のアラインメント及び可変領域の同定に基づいている。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者らは、抗体の結晶構造におけるループコンフォメーションを慎重に検証し、超可変ループを提唱した。Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３。「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」として分類される領域間にはバリエーションが存在する。その後の研究（Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ．２５，３，１０３−１１３）ではいくつかの抗体−抗原結晶複合体が解析され、抗体における抗原結合領域が必ずしも厳密に「ＣＤＲ」残基または「超可変」ループに従うわけではないことが観察された。非ヒト抗体の可変領域についての分子モデルは、潜在的に抗原に結合し得る領域の選択の指針とするために使用することができる。実際には、モデルに基づいた潜在的な抗原結合領域は、従来的な「ＣＤＲ」または「超可変」ループと異なる。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（ＢＩＯＶＩＡ，Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ）のような市販の科学ソフトウェアを分子モデリングに使用することができる。ヒトフレームワークは、フレームワーク及びＣＤＲの両方において、非ヒト配列とのベストマッチに基づき選択することができる。ＶＨ内のＦＲ４（フレームワーク４）については、ヒト生殖系列のＶＪ領域が、対応する非ヒト領域と比較される。ＶＬ内のＦＲ４（フレームワーク４）については、ヒト生殖系列のＪ−カッパ及びＪ−ラムダ領域が、対応する非ヒト領域と比較される。ひとたび好適なヒトフレームワークが同定されると、ＣＤＲが、選択されたヒトフレームワークにグラフトされる。場合によっては、ＶＬ−ＶＨ界面におけるある特定の残基は、非ヒト（親）配列内のように保持され得る。また、分子モデルは、潜在的にＣＤＲコンフォメーションを改変し抗原に結合する可能性のある残基を同定するために使用することもできる。場合によっては、この残基は、非ヒト（親）配列内のように保持される。また、分子モデルは、グリコシル化��脱アミド、及び酸化のような望ましくない効果をもたらし得る溶媒露出アミノ酸の同定に使用することもできる。これらの潜在的な問題を排除／最小化するために、設計段階の早い時期に開発可能性フィルターを導入することができる。
【０１４９】
もう１つのタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内で、または１つ以上のＣＤＲ領域内でも、１つ以上の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。このアプローチは、「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、米国特許第７，１２５，６８９号でさらに詳細に説明されている。
【０１５０】
特定の実施形態では、最終抗体の化学的安定性をより高めて脱アミドまたは異性化を回避するために、露出側鎖を含有するある特定のアミノ酸を別のアミノ酸残基に変更することが望ましいと考えられる。アスパラギンの脱アミドは、ＮＧ、ＤＧ、ＮＧ、ＮＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＱＧ、またはＱＳの配列で生じ、また、ポリペプチドにねじれを導入しその安定性を低下させる、イソアスパラギン酸残基の創出をもたらし得る（イソアスパラギン酸効果）。異性化は、ＤＧ、ＤＳ、ＤＡ、またはＤＴ配列に生じ得る。ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、脱アミド部位もアスパラギン異性化部位も含有しない。
【０１５１】
例えば、（特にＣＤＲ内の）任意のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列でイソアスパルテートが形成される可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）残基をＧｌｎまたはＡｌａに変更してもよい。同様の問題が、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列で生じ得る。Ｒｅｉｓｓｎｅｒ  ａｎｄ  Ａｓｗａｄ（２００３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１２８１。イソアスパルテート形成は、抗体がその標的抗原に結合するのを弱めるか、または完全に抑止する恐れがある。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１（７３４頁）を参照。一実施形態において、アスパラギンは、グルタミン（Ｇｌｎ）に変更される。また、アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接するアミノ酸を、脱アミドの可能性を低減するように改変することが望ましい場合もある（脱アミドは、アスパラギンまたはグルタミンに隣接して低分子アミノ酸が生じたときに、より高い割合で生じる）。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ＆  Ｋｏｌｂｅ（１９９４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．６６２：２６１を参照。加えて、ＣＤＲ内の任意のメチオニン残基（典型的には溶媒露出Ｍｅｔ）は、メチオニン硫黄が酸化する（抗原結合親和性を低減し、また最終抗体調製物における分子不均一性に寄与する恐れもある）可能性を低減するため、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、もしくはＰｈｅ、または他のアミノ酸に変更することができる。同上。加えて、潜在的な切断しやすいＡｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合を防止または最小化するため、ＣＤＲ内に見いだされる任意のＡｓｎ−Ｐｒｏの組合せをＧｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、またはＡｓｎ−Ａｌａに改変することが望ましい場合がある。このような置換を有する抗体は、続いてスクリーニングにかけて、この置換が、ＣＴＬＡ−４に対する抗体の親和性もしくは特異性、または他の所望の生物学的活性を許容されないレベルに低下させないことを確実にする。
【０１５２】
【表３】
2019532619.tif 000013
【０１５３】
Ｆｃ領域の抗体操作
本明細書で開示されている抗体（例えば、ヒト化抗体）及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／またはエフェクター機能（例えば、抗原依存的な細胞の細胞傷害性）のような、抗体の１つ以上の特性を変更するように、操作してもよい。さらに、本明細書で開示されている抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、化学修飾し（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に付着させてもよい）、またはそのグリコシル化を改変するように修飾して、さらに抗体または断片の１つ以上の特性を変更してもよい。これらの実施形態の各々が、以下でさらに詳細に説明される。Ｆｃ領域内の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスナンバリングである。
【０１５４】
本明細書で開示されている抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、エフェクター機能の改変をもたらすように修飾（またはブロック）されたＦｃ領域を有する抗体及び断片も含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２を参照。このような修飾は、診断及び治療において考えられる有益な効果を伴って、免疫システムの様々な反応を増強または抑制するために使用することができる。Ｆｃ領域の改変としては、アミノ酸変更（置換、欠失、及び挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化、ならびに複数のＦｃ領域の付加が挙げられる。Ｆｃに対する変更は、治療用抗体における抗体の半減期も改変することができ、これは、投薬頻度の低下や、それによる利便性の向上及び材料使用の減少を可能にする。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１（７３４−３５頁）を参照。
【０１５５】
一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、重鎖定常領域のヒンジ領域において２２８位に対応する位置におけるセリンからプロリンへの変異（Ｓ２２８Ｐ；ＥＵインデックス）を含む、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体または断片である。この変異は、ヒンジ領域における重鎖ジスルフィド架橋間の不均一性を消失させることが報告されている（Ａｎｇａｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８；２４１位は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに基づく）。
【０１５６】
本発明の一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が増加または減少するように修飾される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号でさらに説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組立を容易にするように、または抗体の安定性を向上もしくは低下させるように、改変される。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）のＦｃヒンジ領域は、抗体または断片の生物学的半減期を減少させるように変異させる。より具体的には、１つ以上のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入し、抗体または断片が、天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対してＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌプロテインＡ（ＳｐＡ）結合障害を有するようにする。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号でさらに詳細に説明されている。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、その生物学的半減期を増大させるように修飾される。様々なアプローチが考えられる。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、以下の変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入することができる。代替的に、生物学的半減期を増大させるため、米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号に記載のように、抗体は、ＣＨ１またはＣＬ領域内で、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有するように改変することができる。
【０１５９】
また他の実施形態において、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて、抗体または抗原結合断片のエフェクター機能（複数可）を改変することにより、改変される。例えば、アミノ酸残基２３４，２３５、２３６，２３７、２９７、３１８、３２０、及び３２２から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体が、エフェクターリガンドに対し改変された親和性を有し、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１構成成分であり得る。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号でさらに詳細に説明されている。
【０１６０】
別の例において、アミノ酸残基３２９、３３１、及び３２２から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体が、Ｃ１ｑ結合の改変及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減もしくは消失を有するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号でさらに詳細に説明されている。
【０１６１】
別の例において、アミノ酸位置２３１及び２３９内の１つ以上のアミノ酸残基は、抗体の補体固定能力を改変するように改変される。このアプローチは、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号でさらに説明されている。
【０１６２】
また別の例において、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３８、２３９、２４３、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９で１つ以上のアミノ酸を修飾することにより、本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介能力を減少させるように、及び／またはＦｃγ受容体に対する抗体または断片の親和性を減少させるように、修飾される。このアプローチは、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号でさらに説明されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、結合が改善されたバリアントが説明されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照）。
【０１６３】
本発明の一実施形態において、Ｆｃ領域は、残基２４３及び２６４を修飾することにより、本発明の抗体（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）におけるエフェクター機能媒介能力を減少させるように、及び／または抗炎症特性を向上させるように、修飾される。一実施形態において、抗体または断片のＦｃ領域は、２４３位及び２６４位における残基をアラニンに変更することにより、修飾される。一実施形態において、Ｆｃ領域は、２４３、２６４、２６７、及び３２８の残基を修飾することにより、抗体または断片におけるエフェクター機能媒介能力を減少させるように、及び／または抗炎症特性を向上させるように、修飾される。
【０１６４】
エフェクター機能の増強
一部の実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体のＦｃ領域は、抗体または抗原結合断片におけるエフェクター機能媒介能力を向上させるように、及び／またはＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲｓ）に対するそれらの結合を向上させるように、修飾される。
【０１６５】
本明細書において「エフェクター機能」という用語は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）介在性応答、Ｆｃ媒介性貪食作用または抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、及びＦｃＲｎ受容体を介した抗体再利用の１つ以上を指すように意図されている。
【０１６６】
抗原結合タンパク質と、ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含めた様々なＦｃ受容体（ＦｃＲ）との間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を媒介すると考えられている。また、Ｆｃ受容体は、抗腫瘍免疫にとって重要であり得る抗体の架橋にとっても重要である。
【０１６７】
エフェクター機能は複数の方法で測定することができ、これには、例えば、ＦｃガンマＲＩＩＩのナチュラルキラー細胞に対する結合またはＦｃガンマＲＩの単球／マクロファージに対する結合を介してＡＤＣＣエフェクター機能を測定する方法が含まれる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞アッセイでＡＤＣＣエフェクター機能について評価することができる。このようなアッセイの例は、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，ｐ６５９１−６６０４；Ｃｈａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ  ２６８，ｐ２５１２４−２５１３１；Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６  ＰＮＡＳ，１０３；４００５−４０１０に見いだすことができる。
【０１６８】
本発明の抗体におけるＡＤＣＣまたはＣＤＣ特性、またはその架橋特性は、複数の方法で増強することができる。
【０１６９】
Ａｓｎ２９７の残基に特定の変異またはグリコシル化改変を含有するヒトＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体に対する結合を増強することが示されている。場合によっては、この変異は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを増強することも示されている（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３；４００５−４０１０；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１，２７６；６５９１−６６０４；Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，４４；１８１５−１８１７）。
【０１７０】
本発明の一実施形態において、このような変異は、２３９、３３２、及び３３０（ＩｇＧ１）から選択される１つ以上の位置、または他のＩｇＧアイソタイプにおける同等の位置にある。好適な変異の例は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ及びＡ３３０Ｌである。一実施形態において、本明細書に記載の本発明の抗原結合タンパク質は、２３９位及び３３２位で変異しており（例えば、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ）、またはさらなる実施形態では、２３９及び３３２及び３３０から選択される３つ以上の位置で変異している（例えば、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ及びＡ３３０Ｌ）（ＥＵインデックスナンバリング）。
【０１７１】
本発明の代替的な実施形態において、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するようなグリコシル化プロファイルの改変を伴った重鎖定常領域を含む、抗体が提供される。例えば、抗体が、増強されたＡＤＣＣもしくは増強されたＣＤＣを有する場合、または抗体が、増強されたＡＤＣＣ及び増強されたＣＤＣ両方のエフェクター機能を有する場合である。グリコシル化プロファイルの改変を伴った抗原結合タンパク質を産生するための好適な方法論の例は、ＷＯ２００３０１１８７８、ＷＯ２００６０１４６７９、及びＥＰ１２２９１２５で説明されている。
【０１７２】
さらなる態様において、本発明は、「非フコシル化（ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」抗体または「無フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」抗体を提供する。非フコシル化抗体は、フコース残基を伴わないＦｃの複合型Ｎ−グリカンのトリマンノシルコア構造を有する。Ｆｃ  Ｎ−グリカンからコアフコース残基を欠いている、この糖鎖操作された（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩａ結合能力が増強されているため、フコシル化された同等物よりも強力なＡＤＣＣを示し得る。
【０１７３】
また、本発明は、本発明による抗体を産生する方法であって、以下ステップ：ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することであって、組換え宿主細胞がアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼを含まない、培養することと、ｂ）抗原結合タンパク質を回収することと、を含む方法も提供する。組換え宿主細胞は、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を通常含有しないこともあれば（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．のような酵母宿主細胞）、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼを不活性化するように遺伝子修飾されていることもある。アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を不活性化するように遺伝子修飾されている組換え宿主細胞が入手可能である。例えば、ＦＵＴ８遺伝子の機能コピーを欠いたＣＨＯＫ１ＳＶ細胞が、増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性（機能的なＦＵＴ８遺伝子を有する細胞で産生された同一のモノクローナル抗体と比べて増大している）を有するモノクローナル抗体を産生する、ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）から入手可能なＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）テクノロジーシステムを参照。ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）テクノロジーシステムの態様は、ＵＳ７２１４７７５、ＵＳ６９４６２９２、ＷＯ００６１７３９、及びＷＯ０２３１２４０で説明されている。当業者であれば、他の適切なシステムも認識する。
【０１７４】
このような修飾は、単体で使用されてもよいだけでなく、エフェクター機能をさらに増強するために互いとの併用で使用されてもよいことが、当業者には明らかとなる。
【０１７５】
グリコシル化修飾を伴った抗体の産生
さらに別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、無フコシル化もしくは無グリコシル化された抗体または断片を作製することができる（すなわち、抗体が、それぞれフコースまたはグリコシル化を欠いている）。抗体または断片のグリコシル化パターンは、例えば、ＣＴＬＡ−４抗原に対する抗体または断片の親和性または結合活性を増大させるように改変することができる。このような修飾は、例えば、抗体または断片の配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することにより、遂行することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより当該部位におけるグリコシル化を排除する、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような無グリコシル化は、抗原に対する抗体または断片の親和性または結合活性を増大させ得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照。
【０１７６】
本明細書で開示されている抗体及び抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）はさらに、哺乳類またはヒト類似グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された、より下等な真核生物宿主細胞、特に真菌宿主細胞（例えば、酵母及び糸状菌）内で産生されたものを含むことができる（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５０２７；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４−１２４６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３；Ｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ２８（３）：２３７−５２（２０１１）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｏｃｔ；１８（５）：３８７−９２（２００７）を参照）。これらの遺伝子修飾された宿主細胞の、現在使用されている哺乳類細胞株に対する特定の利点は、特定のＮ−グリカン構造が優勢である糖タンパク質の組成物が産生され得るように、細胞内で産生される糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを調節する能力である（例えば、米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許第７，４４９，３０８号）。これらの遺伝子修飾された宿主細胞は、優勢に特定のＮ−グリカン構造を有する抗体を産生するために使用されている（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５を参照）。
【０１７７】
特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、さらに、より下等な真核生物宿主細胞内で産生され、フコシル化及び非フコシル化されたハイブリッド及び複合型Ｎ−グリカン（以下に限定されないが、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンを含めた、二分岐及び多分岐種が含まれる）を含むものを含む。
【０１７８】
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；及びＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される、少なくとも１つのハイブリッドＮ−グリカンを有する抗体または断片を含むことができる。特定の態様において、ハイブリッドＮ−グリカンは、組成物中で優勢なＮ−グリカン種である。
【０１７９】
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される、少なくとも１つの複合型Ｎ−グリカンを有する抗体及び断片を含む。特定の態様において、複合型Ｎ−グリカンは、組成物中で優勢なＮ−グリカン種である。さらなる態様において、複合型Ｎ−グリカンは、組成物中に約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の複合型Ｎ−グリカンを含む、特定のＮ−グリカン種である。一実施形態において、本明細書で提供される抗体及びその抗原結合断片は、複合型Ｎ−グリカンを含み、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の複合型Ｎ−グリカンが構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含み、このような構造は無フコシル化されている。このような構造は、例えば、操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞内で産生させることができる。
【０１８０】
特定の実施形態において、Ｎ−グリカンはフコシル化されている。概して、フコースは、Ｎ−グリカンの還元末端にあるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、Ｎ−グリカンの還元末端にあるＧｌｃＮＡｃとのα１，６−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端にあるＧａｌとのα１，２−結合、Ｎ−グリカンの非還元末端にあるＧｌｃＮａｃとのα１，３−結合、またはＮ−グリカンの非還元末端にあるＧｌｃＮＡｃとのα１，４−結合をとる。
【０１８１】
そのため、上記の糖タンパク質組成物の特定の態様において、グリコフォームは、α１，３−結合またはα１，６−結合フコースをとって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを産生するか、α１，３−結合もしくはα１，４−結合フコースをとって、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを産生するか、またはα１，２−結合フコースをとって、Ｇａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、及びＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを産生する。
【０１８２】
さらなる態様において、抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片は、高マンノースＮ−グリカン（以下に限定されないが、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を含む）、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造からなるＮ−グリカンが含まれる。
【０１８３】
上記のさらなる態様において、複合型Ｎ−グリカンは、さらに、フコシル化及び非フコシル化された、二分岐及び多分岐種を含む。
【０１８４】
本明細書において、「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」という用語は互換的に使用され、Ｎ−結合オリゴ糖、例えば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によりポリペプチドのアスパラギン残基に付着しているものを指す。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質におけるアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上に見いだされる優勢な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖の群のプロセシングは、ＥＲのルーメン内で同時翻訳的に生じ、翻訳後にゴルジ体内でＮ−結合糖タンパク質のために継続する。
【０１８５】
Ｎ−グリカンは、共通のペンタサッカライドコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」とはマンノースを指し、「Ｇｌｃ」とはグルコースを指し、「ＮＡｃ」とはＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃとはＮ−アセチルグルコサミンを指す）を有する。通常、Ｎ−グリカン構造は、左側に非還元末端、右側に還元末端を呈する。Ｎ−グリカンの還元末端は、タンパク質上のグリコシル化部位を含むＡｓｎ残基に付着している末端である。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造（「トリマンノースコア」、「ペンタサッカライドコア」、または「少マンノースコア」とも呼ばれる）に付加される周辺の糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、及びシアル酸）を含む分枝（分岐）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その枝分かれした構成要素に従って分類される（例えば、高マンノース、複合型、またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５つ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，３−マンノースアームに付着している少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，６−マンノースアームに付着している少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有する。また、複合型Ｎ−グリカンは、任意選択でシアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」（Ｎｅｕとはノイラミン酸を指し、「Ａｃ」とはアセチルを指す））で修飾される、ガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有してもよい。また、複合型Ｎ−グリカンは、「二分岐」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有してもよい。また、複合型Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」上に複数の分岐を有してもよい（しばしば「多分岐グリカン」と呼ばれる）。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６−マンノースアーム上にゼロ以上のマンノースとを有する。この様々なＮ−グリカンは、「グリコフォーム」とも呼ばれる。
【０１８６】
複合型Ｎ−グリカンに関して、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」、及び「Ａ２」という用語は、下記の意味を有する。「Ｇ−２」とは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指し、「Ｇ−１」という用語は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指し、「Ｇ０」という用語は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指し、「Ｇ１」という用語は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指し、「Ｇ２」という用語は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指し、「Ａ１」という用語は、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指し、「Ａ２」という用語は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけることができるＮ−グリカン構造を指す。別段の指示がない限り、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」、及び「Ａ２」という用語は、Ｎ−グリカンの還元末端にあるＧｌｃＮＡｃ残基に付着しているフコースを欠いたＮ−グリカン種を指す。この用語が「Ｆ」を含む場合、「Ｆ」は、Ｎ−グリカン種が、Ｎ−グリカンの還元末端にあるＧｌｃＮＡｃ残基上にフコース残基を含有することを示す。例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ａ１Ｆ、及びＡ２Ｆはいずれも、Ｎ−グリカンが、Ｎ−グリカンの還元末端にあるＧｌｃＮＡｃ残基に付着しているフコース残基をさらに含むことを示す。酵母及び糸状菌のようなより下等な真核生物は、通常、フコースを産生するＮ−グリカンを産生しない。
【０１８７】
多分岐Ｎ−グリカンに関して、「多分岐Ｎ−グリカン」という用語は、Ｎ−グリカンの１，６アームもしくは１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基上にＧｌｃＮＡｃ残基をさらに含むＮ−グリカン、またはＮ−グリカンの１，６アーム及び１，３アームの非還元末端を含む各マンノース残基上にＧｌｃＮＡｃ残基をさらに含むＮ−グリカンを指す。したがって、多分岐Ｎ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけることができる。「１−４」という用語は、１、２、３、または４つの残基を指す。
【０１８８】
二分岐Ｎ−グリカンに関して、「二分岐Ｎ−グリカン」という用語は、ＧｌｃＮＡｃ残基がＮ−グリカンの還元末端にあるマンノース残基に結合しているＮ−グリカンを指す。二分岐Ｎ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけることができ、各マンノース残基は、その非還元末端でＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。これに対し、多分岐Ｎ−グリカンはＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられ、この式は、２つのＧｌｃＮＡｃ残基が、Ｎ−グリカンの２つのアームの一方の非還元末端にあるマンノース残基に結合し、１つのＧｌｃＮＡｃ残基が、Ｎ−グリカンの他方のアームの非還元末端にあるマンノース残基に結合していることを示す。
【０１８９】
抗体の物理的特性
本明細書で開示されている抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、さらに、軽鎖または重鎖いずれかの免疫グロブリン可変領域内の１つ以上のグリコシル化部位を含有することができる。このようなグリコシル化部位は、抗原結合の改変に起因して、抗体もしくは断片の免疫原性の増加、または抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２；Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４；Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７；Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで生じることが知られている。
【０１９０】
各抗体または抗原結合断片（例えば、２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は固有の等電点（ｐＩ）を有し、等電点は、一般的には６から９．５の間のｐＨ範囲内に収まる。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。
【０１９１】
各抗体または抗原結合断片（例えば、２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、特徴的な融解温度を有し、高い融解温度ほどｉｎ  ｖｉｖｏにおける全体的な安定性が高いことを示す（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  ＭＣ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１）。概して、ＴＭ１（初期アンフォールディングの温度）は、６０℃超、６５℃超、または７０℃超とすることができる。抗体または断片の融点は、示差走査熱量測定（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２）または円偏光二色性（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９）を用いて測定することができる。
【０１９２】
さらなる実施形態において、抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、急速に分解しないものが選択される。抗体または断片の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＡＪ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ＤＥ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２）を用いて測定することができる。
【０１９３】
さらなる実施形態において、抗体（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）及びその抗原結合断片は、凝集効果（望ましくない免疫応答、及び／または改変されたもしくは好ましくない薬物動態特性を作動させる恐れがある）を最小限有するものが選択される。一般的には、抗体及び断片は、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の凝集が許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び光散乱を含めたいくつかの技法により測定することができる。
【０１９４】
抗体結合体
本明細書で開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、化学部分に結合していてもよい。化学部分は、特に、ポリマー、放射性核種、または細胞傷害性因子とすることができる。特定の実施形態において、化学部分は、対象の体内で抗体または断片の半減期を増大させるポリマーである。好適なポリマーとしては、以下に限定されないが親水性ポリマーが挙げられ、親水性ポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストラン、及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、ＰＥＧ結合単鎖抗体を開示している。Ｗｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））に付着しているＰＥＧとの結合抗体を開示している。
【０１９５】
また、抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、及び４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、及び５６Ｆｅのような標識と結合させてもよい。
【０１９６】
また、本明細書で開示されている抗体及び抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、例えば、その生物学的（例えば、血清）半減期を増大させるために、ＰＥＧ化してもよい。抗体または断片をＰＥＧ化するには、抗体または断片を、典型的には反応性形態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着するような条件下で反応させる。特定の実施形態において、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書において、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの任意の形態（例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミド）を含むように意図されている。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ化される抗体または断片は、無グリコシル化された抗体または断片である。タンパク質をＰＥＧ化する方法は、当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ  ０  １５４  ３１６及びＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照。
【０１９７】
また、本明細書で開示されている抗体及び抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、蛍光または化学発光標識と結合してもよく、これには、フルオロフォア、例えば希土類キレート、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、イソシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、及び安定性のフリーラジカルが含まれる。
【０１９８】
また、本発明の抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、細胞傷害性因子、例えば、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質及び化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、及びエノマイシンに結合させてもよい。
【０１９９】
本発明の抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）を様々な部分に結合させるために、当技術分野で公知の任意の方法を用いることができ、これには、Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５；Ｄａｖｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４；Ｐａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７により説明されている方法が含まれる。抗体及び断片を結合させる方法は、当技術分野において従来的であり周知のものである。
【０２００】
抗体または他のポリペプチドは、アッセイで使用するために様々な固体担体に固定することができる。特定の結合メンバーの固定に使用することができる固相には、固相結合アッセイで固相として開発され及び／または使用されているものが含まれる。好適な固相の例としては、膜フィルター、セルロースベースの紙、ビーズ（ポリマー、ラテックス、及び常磁性の粒子を含む）、ガラス、シリコンウェハー、微粒子、ナノ粒子、ＴｅｎｔａＧｅｌ、ＡｇｒｏＧｅｌ、ＰＥＧＡゲル、ＳＰＯＣＣゲル、及びマルチウェルプレートが挙げられる。アッセイストリップは、固体担体上のアレイ内の１つの抗体または複数の抗体をコーティングすることにより、調製することができる。このストリップを、次に試験試料に浸漬し、次に洗浄及び検出ステップにより迅速に処理して、測定可能なシグナル（例えば、着色スポット）を精製することができる。抗体または他のポリペプチドは、アッセイデバイス表面に直接結合させるか、または間接的に結合させることにより、アッセイデバイスの特定のゾーンに結合させることができる。後者の場合の一例では、抗体または他のポリペプチドは、粒子またはデバイス表面に固定された他の固体担体上に固定することができる。
【０２０１】
生物学的アッセイには検出方法が必要であり、結果の定量化のための最も一般的な方法の１つは、検出可能な標識を、研究対象の生物学的システム内の１つ以上の構成成分に対し親和性を有するタンパク質または核酸に結合させることである。検出可能な標識としては、それ自体が検出可能な分子（例えば、蛍光部分、電気化学的標識、金属キレートなど）に加えて、検出可能な反応産物（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）の産生により、またはそれ自体が検出可能であり得る特定の結合分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）により、間接的に検出され得る分子を挙げることができる。
【０２０２】
固相及び検出可能な標識結合体の調製は、しばしば化学的架橋剤の使用を含む。架橋試薬は、少なくとも２つの反応性基を含有し、一般的には、ホモ官能性架橋剤（同一の反応性基を含有）及びヘテロ官能性架橋剤（同一でない反応性基）に分類される。アミン、スルフヒドリルを介して結合するか、または非特異的に反応するホモ二官能性架橋剤は、多くの市販供給元から入手可能である。マレイミド、アルキル及びアリールハロゲン化物、アルファ−ハロアシル、ならびにピリジルジスルフィドは、チオール反応性基である。マレイミド、アルキル及びアリールハロゲン化物、及びアルファ−ハロアシルは、スルフヒドリルと反応してチオールエーテル結合を形成し、一方ピリジルジスルフィドは、スルフヒドリルと反応して混合ジスルフィドを産生する。ピリジルジスルフィド産物は、切断可能である。イミドエステルも、タンパク質間の架橋に対し非常に有用である。首尾よい結合のために各々が異なる属性を組み合わせている、様々なヘテロ二官能性架橋剤が市販されている。
【０２０３】
抗ＣＴＬＡ−４抗体の治療的使用
さらに提供されるのは、本明細書で開示されている単離された抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）による処置を必要とする、対象（ヒト対象を含む）を処置する方法である。本発明の一実施形態において、このような対象は、感染症または感染性疾患を患っている。本発明の別の実施形態において、このような対象は、がんを患っている。一実施形態において、がんは、例えば、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、腎臓癌、白血病、腎移行上皮癌、膀胱癌、ウィルム癌、卵巣癌、膵癌、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、胃癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、滑膜肉腫、頭頚部癌、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、網膜芽腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳癌、神経膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、乏突起神経膠腫、脳室上皮腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、軟部組織肉腫、甲状腺癌、子宮内膜癌、カルチノイド癌または肝臓癌、乳癌または胃癌である。本発明の一実施形態において、当該がんは、（例えば、上記バラエティーの）転移性癌である。
【０２０４】
一実施形態において、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）を用いて、ウイルス感染症を患っている対象を処置する方法を提供する。一実施形態において、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、（Ａ、Ｂ、またはＣ型）肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、またはアルボウイルス脳炎からなる群から選択されるウイルスによる、感染症である。
【０２０５】
一実施形態において、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を用いて、細菌感染症を患っている対象を処置する方法を提供する。一実施形態において、細菌感染症は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、リケッチア細菌、例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ、及びＲｉｃｅｋｅｔｔｓｉａ、マイコバクテリア、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ、ブドウ球菌、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、及び淋菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、桿菌、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、ならびにＢｏｒｒｉｅｌｌａからなる群から選択される細菌による、感染症である。
【０２０６】
一実施形態において、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を用いて、真菌感染症を患っている対象を処置する方法を提供する。一実施形態において、真菌感染症は、Ｃａｎｄｉｄａ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなど）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒなど）、Ｇｅｎｕｓ  Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、及びＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍからなる群から選択される真菌による、感染症である。
【０２０７】
一実施形態において、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を用いて、寄生虫感染症を患っている対象を処置する方法を提供する。一実施形態において、寄生虫感染症は、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ａｎｄ、及びＮｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓからなる群から選択される寄生虫による、感染症である。
【０２０８】
「対象」は、哺乳類、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル））、またはウサギとすることができる。本発明の好ましい実施形態において、対象とは、ヒト対象である。
【０２０９】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、他の抗体分子、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法、他の抗がん療法（例えば、標的抗がん療法、遺伝子療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、骨髄移植、ナノ療法、もしくは腫瘍溶解性薬物）、細胞傷害性薬剤、免疫療法（例えば、サイトカインもしくは細胞に基づく免疫療法）、外科的手順（例えば、乳腺腫瘍摘出術もしくは乳房切除術）、または放射線手順、あるいは上記のいずれかの組合せの１つ以上との併用で、投与される。追加的療法は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態をとることができる。一部の実施形態において、追加的療法は、酵素阻害剤（例えば、低分子酵素阻害剤）または転移阻害剤である。併用で投与することができる例示的な細胞傷害性薬剤としては、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、挿入剤、シグナル伝達経路を妨害可能な薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、プロテオソーム阻害剤、及び放射線（例えば、局所または全身の照射（例えば、ガンマ照射））が挙げられる。他の実施形態において、追加的療法は、手術もしくは放射線、またはその組合せである。他の実施形態において、追加的療法は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１つ以上を標的化する療法、ＨＳＰ９０阻害剤、またはチューブリン阻害剤である。代替的に、または前述の組合せとの併用で、本明細書に記載の方法及び組成物は、免疫調節剤（例えば、共刺激分子の活性化剤、もしくは阻害分子（例えば、免疫チェックポイント分子）の阻害剤）、ワクチン（例えば、治療用がんワクチン）、または他の形態の細胞免疫療法の１つ以上との併用で投与することができる。
【０２１０】
特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、がんのような任意の疾患を処置または予防するために、このような処置または予防を必要としている対象において、単体で使用しても、他のさらなる治療剤及び／または治療手順に付随して使用してもよい。このような抗体及び断片をさらなる治療剤に付随して含む組成物（例えば、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物）も、本発明の一部である。
【０２１１】
特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、単体で使用しても、腫瘍ワクチンに付随して使用してもよい。
【０２１２】
特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、単体で使用しても、化学療法剤に付随して使用してもよい。
【０２１３】
特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、単体で使用しても、放射線療法に付随して使用してもよい。
【０２１４】
特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、単体で使用しても、標的療法に付随して使用してもよい。標的療法の例としては、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ））、ＨＥＲ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）及びペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ））、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）及びダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ））、ＡＬＫ阻害剤（例えば、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ）及びセリチニブ（Ｚｙｋａｄｉａ））、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）及びダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ））、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導剤（例えば、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）及びカルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ））、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）及びラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ））、毒素に付着したモノクローナル抗体（例えば、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）及びアド−トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ））が挙げられる。
【０２１５】
特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、抗がん治療剤または免疫調節受容体阻害剤のような免疫調節薬物、例えば、免疫調節受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片との併用で使用することができる。
【０２１６】
したがって、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）を、以下ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロック抗体の１つ以上：ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＭＥＤＩ−０６８０、ＰＤＲ−００１、ＳＨＲ−１２１０、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＰＦ−０６８０１５９１、ＴＳＲ−０４２、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９に付随して含む組成物、ならびに対象におけるがんを処置または予防する方法であって、有効量の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片と、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０の１つ以上とを、対象に投与することを含む、方法を含む。任意選択で、対象は、さらなる治療剤も投与される。
【０２１７】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、ペムブロリズマブの重鎖及び軽鎖をコードする単離された抗体に付随する。
【０２１８】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、ニボルマブの重鎖及び軽鎖をコードする単離された抗体に付随する。
【０２１９】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、以下の１つ以上に付随する：抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１））、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳ１Ｋ応対（例えば、エロツズマブ）、抗ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３抗体（例えば、リリルマブ）、抗ＣＤ１３７抗体（例えば、ウレルマブ）、抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、ＴＲＸ５１８）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、またはＭＰＤＬ３２８０Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＩＬＴ１抗体、抗ＩＬＴ２抗体、抗ＩＬＴ３抗体、抗ＩＬＴ４抗体、抗ＩＬＴ５抗体、抗ＩＬＴ６抗体、抗ＩＬＴ７抗体、抗ＩＬＴ８抗体、抗ＣＤ４０Ｋ応対、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＣＯＳ、抗ＳＩＲＰα、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ４抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ３抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＮＫＧ２Ｃ抗体、抗ＮＫＧ２Ｅ抗体、抗４−１ＢＢ抗体（例えば、ＰＦ−０５０８２５６６）、抗ＴＳＬＰ抗体、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＡＰＲＩＬ（例えば、ＢＩＯＮ１３０１）、抗ＣＤ３８（ダラツムマブ）、抗ＩＬ−１０もしくはＰＥＧ化ＩＬ−１０、またはこのような標的における任意の小有機分子阻害剤。
【０２２０】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＰＤ１抗体に付随する。
【０２２１】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＰＤＬ１抗体（例えば、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、またはＭＰＤＬ３２８０Ａ）に付随する。
【０２２２】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＣＤ２７抗体に付随する。
【０２２３】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＣＳ１抗体に付随する。
【０２２４】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３抗体に付随する。
【０２２５】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＣＤ１３７（例えば、ウレルマブ）抗体に付随する。
【０２２６】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＧＩＴＲ（例えば、ＴＲＸ５１８）抗体に付随する。
【０２２７】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体に付随する。
【０２２８】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ１抗体に付随する。
【０２２９】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ２抗体に付随する。
【０２３０】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ３抗体に付随する。
【０２３１】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ４抗体に付随する。
【０２３２】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ５抗体に付随する。
【０２３３】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ６抗体に付随する。
【０２３４】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ７抗体に付随する。
【０２３５】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＴＬ８抗体に付随する。
【０２３６】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＣＤ４０抗体に付随する。
【０２３７】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＯＸ４０抗体に付随する。
【０２３８】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体に付随する。
【０２３９】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３抗体に付随する。
【０２４０】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ２ＤＬ４抗体に付随する。
【０２４１】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ抗体に付随する。
【０２４２】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ抗体に付随する。
【０２４３】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体に付随する。
【０２４４】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体に付随する。
【０２４５】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＫＩＲ３ＤＬ３抗体に付随する。
【０２４６】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体に付随する。
【０２４７】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＮＫＧ２Ｃ抗体に付随する。
【０２４８】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＣＯＳ抗体に付随する。
【０２４９】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＳＩＲＰα抗体に付随する。
【０２５０】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗４−１ＢＢ抗体に付随する。
【０２５１】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＩＬ−１０抗体に付随する。
【０２５２】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗ＴＳＬＰ抗体に付随する。
【０２５３】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、ＩＬ−１０またはＰＥＧ化ＩＬ−１０に付随する。
【０２５４】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＫＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは医薬組成物の一部として、Ｔｉｍ−３経路アンタゴニストに付随する。
【０２５５】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは医薬組成物の一部として、Ｖｉｓｔａ経路アンタゴニストに付随する。
【０２５６】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは医薬組成物の一部として、ＢＴＬＡ経路アンタゴニストに付随する。
【０２５７】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは医薬組成物の一部として、ＬＡＧ−３経路アンタゴニストに付随する。
【０２５８】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは医薬組成物の一部として、ＴＩＧＩＴ経路アンタゴニストに付随する。
【０２５９】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは医薬組成物の一部として、ＳＴＩＮＧアゴニストに付随する。環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である環状ジ−ＡＭＰ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び他の細菌）ならびにその類似体である環状ジ−ＧＭＰ及び環状ジ−ＧＭＰ−ＡＭＰは、宿主細胞により病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として認識され、病原体認識受容体（ＰＲＲ）（インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）として知られる）に結合する。ＳＴＩＮＧは、宿主哺乳類細胞の細胞質中のアダプタータンパク質であり、ＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ１）−ＩＲＦ３及びＮＦ−カッパＢシグナリング軸を活性化し、強力に先天免疫を活性化するＩＦＮ−βや他の遺伝子産物の誘導をもたらす。現在、ＳＴＩＮＧが宿主細胞基質サーベイランス経路（Ｖａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）の構成成分であることが認識されているが、この経路は、細胞内病原体による感染を関知し、それに応答してＩＦＮ−βの産生を誘導し、抗原特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋  両Ｔ細胞ならびに病原体特異的抗体からなる、適応保護的な病原体特異的免疫応答の発生をもたらす。環状プリンジヌクレオチドの例は、例えば、米国特許第７，７０９４５８号及び７，５９２，３２６号、特許出願ＷＯ２００７／０５４２７９、ＷＯ２０１４／０９３９３６、及びＷＯ２０１４／１８９８０５、ならびにＹａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１８：５６３１（２００８）で、ある程度詳細に説明されている。
【０２６０】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫細胞の活性を増大させる。免疫細胞の活性の増大は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて検出することができる。一実施形態において、免疫細胞の活性の増大は、免疫細胞の増殖を測定することにより検出することができる。例えば、Ｔ細胞の活性の増大は、Ｔ細胞の増殖、またはシグナル伝達事象（例えば、転写調節因子にシグナルを伝える免疫受容体もしくは下流キナーゼのチロシンリン酸化）を測定することにより、検出することができる。他の実施形態において、免疫細胞の活性の増大は、特定の標的細胞に対するＣＴＬもしくはＮＫ細胞の細胞傷害機能、または抗腫瘍免疫の刺激に付随するＩＦＮγサイトカイン応答を測定することにより、検出することができる。また他の実施形態において、免疫細胞の活性の増大は、対象に由来する試料においてＴ細胞活性化をｅｘ  ｖｉｖｏで測定することにより、検出することができる。一実施形態において、Ｔ細胞活性の増大は、以下により決定される：（ｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３から選択される１つ以上の炎症促進性サイトカインのＳＥＢ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ）誘導産生を測定すること、または（ｉｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインの産生を誘導するための、混合リンパ球反応またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナリングの直接的抗ＣＤ３  ｍＡｂ刺激を測定すること。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮγの抗原特異的なＴ細胞産生、及び／またはＣＤ２５及び／またはＣＤ６９の上方制御を、少なくとも１．５倍刺激する。ある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現するラージ細胞に提示されると、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を刺激して、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３からなる群から選択される炎症促進性サイトカインを産生する。
【０２６１】
細胞溶解性Ｔ細胞応答を生じさせるのに有益な追加的薬剤を、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片との併用で使用することができる。この薬剤としては、以下に限定されないが、Ｂ７共刺激分子、インターロイキン−２、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＯＸ−４０／ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、サルグラモスチム、レバミソール、ワクシニアウイルス、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、リポソーム、ミョウバン、フロイント完全または不完全アジュバント、無毒化エンドトキシン、鉱油、表面活性物質、例えばリポレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、及び油または炭化水素のエマルジョンが挙げられる。
【０２６２】
Ｔ細胞免疫応答を誘導する組成物は、抗体応答に対し細胞溶解性Ｔ細胞応答を優先的に刺激するものが好ましいが、両タイプの応答を刺激する組成物も使用することができる。薬剤がポリペプチドである場合、ポリペプチド自体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することができる。担体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹状細胞のような細胞とすることができる。抗原提示細胞には、マクロファージ、樹状細胞、及びＢ細胞のような細胞タイプが含まれる。他の専門的な抗原提示細胞としては、単球、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、指状嵌入樹状細胞、濾胞性樹状細胞、及びＴ細胞が挙げられる。通性抗原提示細胞も使用することができる。通性抗原提示細胞の例としては、星状細胞、濾胞細胞、内皮、及び線維芽細胞が挙げられる。
【０２６３】
組成物は、ポリペプチドを発現するように、またはワクチン接種された個体の細胞内でその後発現するポリヌクレオチドを送達するように形質転換されている、細菌細胞を含むことができる。アジュバント、例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを、免疫応答を作動させる、増強する、または延長するワクチンの能力を増大させるために添加してもよい。
【０２６４】
組成物は、ポリペプチドを発現するように、またはワクチン接種された個体の細胞内でその後発現するポリヌクレオチドを送達するように形質転換されている、細菌細胞を含むことができる。以下に限定されないが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、またはマイコバクテリア種を含めた複数の細菌種がワクチン用に開発されており、これらは本発明におけるワクチンプラットフォームとして使用することができる。このリストは、限定的であるようには意図されていない。本発明は、弱毒化細菌株、共生細菌株、及び／または殺滅され、ただし代謝的に活性の細菌株をワクチンプラットフォームとして使用することを企図している。好ましい実施形態において、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。
【０２６５】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、不活性化腫瘍細胞ワクチンと一緒である。「不活性化腫瘍細胞」とは、細胞の分割を防止するように処理された（患者由来または患者と同種の）腫瘍細胞を意味する。本発明の目的において、このような細胞は、その免疫原性及び代謝活性を保持する。このような腫瘍細胞は遺伝子修飾されて、がん療法の一部として患者内で発現する導入遺伝子を発現させる。したがって、本発明の組成物またはワクチンは、処置を受ける患者に由来するまたは患者と同種である、最も好ましくは患者が罹患しているものと同じ一般型の腫瘍細胞である、新生物性（例えば、腫瘍）細胞を含む。例えば、黒色腫を患っている患者であれば、典型的には、黒色腫に由来する遺伝子修飾細胞を投与される。本発明で使用するための（例えば、照射用）腫瘍細胞を不活性化する方法は、当技術分野において周知である。
【０２６６】
一部の実施形態において、本発明の不活性化腫瘍細胞は、１つ以上のヒートショックタンパク質を発現及び分泌させるように修飾される。例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質を発現及び分泌させて、免疫応答を刺激することができる（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１６３：５１７８−５１８２；Ｓｔｒｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｄｅｃ；５７（１−３）：３１１−２５）。一部の実施形態において、不活性化腫瘍細胞は、ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパク質を発現及び分泌させるように修飾される。
【０２６７】
本発明の不活性化腫瘍細胞は、１つ以上の共刺激分子または共刺激剤と共に患者に投与される。好ましい共刺激剤は、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを含む。このような共刺激剤を評価する方法は、文献において周知である。ＤＣの誘導及び成熟は、典型的には、ＣＤ８０及びＣＤ８６のようなある特定の膜分子の発現の増加、及び／または刺激後のＩＬ１２−及びＩ型インターフェロンのような炎症促進性サイトカインの分泌により、評価される。
【０２６８】
好ましい実施形態において、不活性化腫瘍細胞自体は、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを発現及び分泌させるように修飾される。本発明は、ＧＭ−ＣＳＦの使用に関して、例示的な用語で説明されている。したがって、例として、腫瘍細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、第５，９０４，９２０号、第６，２７７，３６８号、及び６，３５０，４４５号、ならびに米国特許公開第２０１００１５０９４６号で説明されているように、ＧＭ−ＣＳＦをコードする導入遺伝子を発現させることができる。膵臓癌の処置のためのＧＭ−ＣＳＦ発現遺伝子操作がん細胞または「サイトカイン発現細胞ワクチン」の一形態は、米国特許第６，０３３，６７４号及び第５，９８５，２９０号で説明されている。
【０２６９】
このような非活性化腫瘍細胞及び／またはバイスタンダー細胞により、ＧＭ−ＣＳＦ以外に、またはＧＭ−ＣＳＦと共に発現し得る他の好適なサイトカインとしては、以下に限定されないが、ＣＤ４０リガンド、ＦＬＴ−３リガンド、ＩＬ−１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２１の１つ以上が挙げられる。このリストは、限定的であるようには意図されていない。
【０２７０】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の所定の抗原に対する免疫応答を刺激するように意図されている１つ以上のワクチンと共に投与される。抗原（複数可）は、個体に直接投与してもよく、または、例えば、自己由来または同種であり得る腫瘍細胞ワクチン（例えば、ＧＶＡＸ）、樹状細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、ウイルスベースのワクチン、細菌もしくは酵母ワクチン（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などから、個体内で発現させてもよい。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１１９：４２１−４７５；Ｏｂｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５  Ａｕｇ；４２（４）：５４９−５６１を参照。本発明で使用され得る標的抗原の例が、以下の表に収載されている。また、標的抗原は、表に収載された抗原の免疫学的活性部分を含む、断片または融合ポリペプチドであってもよい。このリストは、限定的であるようには意図されていない。
【０２７１】
【表４−１】
2019532619.tif 000014
【０２７２】
【表４−２】
2019532619.tif 000015
【０２７３】
【表４−３】
2019532619.tif 000016
【０２７４】
【表４−４】
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【０２７５】
【表４−５】
2019532619.tif 000018
【０２７６】
【表４−６】
2019532619.tif 000019
【０２７７】
【表４−７】
2019532619.tif 000020
【０２７８】
【表４−８】
2019532619.tif 000021
【０２７９】
【表４−９】
2019532619.tif 000022
【０２８０】
【表４−１０】
2019532619.tif 000023
【０２８１】
【表４−１１】
2019532619.tif 000024
【０２８２】
【表４−１２】
2019532619.tif 000025
【０２８３】
【表４−１３】
2019532619.tif 000026
【０２８４】
【表４−１４】
2019532619.tif 000027
【０２８５】
【表４−１５】
2019532619.tif 000028
【０２８６】
【表４−１６】
2019532619.tif 000029
【０２８７】
当技術分野で好適な抗原が公知である他の生物としては、以下に限定されないが、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ  Ｓｔｒｅｐ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａ（グループＢ  Ｓｔｒｅｐ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種（ｔｙｐｈｉ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含む）、ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、及び他のグループＤ  ｓｈｉｇｅｌｌａ種を含む）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含む）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓが挙げられる。このリストは、限定的であるようには意図されていない。
【０２８８】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、以下のような阻害剤（例えば、小有機分子または抗体もしくはその抗原結合断片）の１つ以上に付随する：ＭＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質）阻害剤、細胞傷害性薬剤、白金薬剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、微小管安定化剤、タキサン、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ５２阻害剤、ＣＤ３０阻害剤、ＲＡＮＫ（核内因子カッパ−Ｂ活性化受容体）阻害剤、ＲＡＮＫＬ（核内因子カッパ−Ｂ活性化受容体リガンド）阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＣＤ２２阻害剤、ＣＤ７９ｂ阻害剤、ＥｒｂＢ２阻害剤、またはファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤。
【０２８９】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、以下のいずれか１つ以上に付随する：１３−シス−レチノイン酸、３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル］−キノロン、４−ヒドロキシタモキシフェン、５−デオキシウリジン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、７−ヒドロキシスタウロスポリン、Ａ−４４３６５４、アビラテロン酢酸エステル、アブラキサン、ＡＢＴ−５７８、アコルビフェン、ＡＤＳ−１００３８０、ＡＬＴ−１１０、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンジオスタチン、ＡＰ−２３５７３、ＡＲＱ−１９７、アルゾキシフェン、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０５２４０、アスパラギナーゼ、ＡＴ−９２６３、アトラセンタン、アキシチニブ、ＡＺＤ１１５２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチン、バタブリン、ＢＣ−２１０、ベスドトクス、ベバシズマブ、ビカルタミド、Ｂｉｏ１１１、ＢＩＯ１４０、ブレオマイシン、ＢＭＳ−２１４６６２、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−２７５２９１、ＢＭＳ−３１０７０５、ボルテジミブ、ブセレリン、ブスルファン、カルシトリオール、カンプトテシン、カネルチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣ８４９０、セジラニブ、ＣＧ−１５２１、ＣＧ−７８１、クラミドシン、クロラムブシル、クロロトキシン、シレンジタイド、シメチジン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、ＣＯＬ−３、ＣＰ−７２４７１４、シクロホスファミド、シプロテロン、シプロテロン酢酸エステル、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、ダシノスタット、ダクチノマイシン、ダロツズマブ、ダヌセルチブ、ダサタニブ、ダウノルビシン、デカタニブ、デグエリン、デニロイキン、デオキシコホルマイシン、デプシペプチド、ジアリールプロピオニトリル、ジエチルスチルベストロール、ジフチトクス、ドセタキセル、ドビチニブ、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、エドテカリン、イットリウム９０標識エドトレオチド、エドトレオチド、ＥＫＢ−５６９、ＥＭＤ１２１９７４、エンドスタチン、エンザルタミド、エンザスタウリン、エピルビシン、エピチロンＢ、ＥＲＡ−９２３、エルビタックス、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィクラツズマブ、フィナステリド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ＦＯＬＦＯＸレジメン、フルベストラント、ガレテロン、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ギマテカン、ゴセレリン、ゴセレリン酢酸塩、ゴシポール、ＧＳＫ４６１３６４、ＧＳＫ６９０６９３、ＨＭＲ−３３３９、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、ヒドロキシウレア、ＩＣ８７１１４、イダルビシン、イドキシフェン、イホスファミド、ＩＭ８６２、イマチニブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＩＮＣＢ２４３６０、ＩＮＯ１００１、インターフェロン、インターロ���キン−１２、イピリムマブ、イリノテカン、ＪＮＪ−１６２４１１９９、ケトコナゾール、ＫＲＸ−０４０２、ラパチニブ、ラソフォキシフェン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロイプロリド酢酸塩、レバミソール、リポソーム内包パクリタキセル、ロムスチン、ロナファルニブ、ルカントン、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６４６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９４００２、ＬＹ３１７６１５、マリマスタット、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、メゲストロール酢酸エステル、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミスラマイシン、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、トザセルチブ、ＭＬＮ８０５４、ネオバスタット、ネラチニブ、ノイラジアブ（ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ニロチニブ、ニルタミド、ノラトレキセド、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、オブリメルセン、オクトレオチド、オファツムマブ、オレゴボマブ、オルテロネル、オキサリプラチン、パクリタキセル、パルボシクリブ、パミドロネート、パニツムマブ、パゾパニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＰＥＧ−インターフェロン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリフォシン、フェニルアラニンマスタード、ＰＩ−１０３、ピクチリシブ、ＰＩＫ−７５、ピペンドキシフェン、ＰＫＩ−１６６、プリカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロゲスチン、ＰＸ−８６６、Ｒ−７６３、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラゾキシン、リダホロリムス、リツキシマブ、ロミデプシン、ＲＴＡ７４４、ルビテカン、スクリプタイド、Ｓｄｘ１０２、セリシクリブ、セルメチニブ、セマキサニブ、ＳＦ１１２６、シロリムス、ＳＮ３６０９３、ソラフェニブ、スピロノラクトン、スクアラミン、ＳＲ１３６６８、ストレプトゾシン、ＳＵ６６６８、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スニチニブ、合成エストロゲン、タラムパネル、タリモジーン・ラハーパレプベック、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テスミリフェン、テストステロン、テトランドリン、ＴＧＸ−２２１、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チシリムマブ、チピファルニブ、チボザニブ、ＴＫＩ−２５８、ＴＬＫ２８６、トポテカン、トレミフェンクエン酸塩、トラベクテジン、トラスツズマブ、トレチノイン、トリコスタチンＡ、トリシリビンホスフェート一水和物（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、トリプトレリンパモ酸塩、ＴＳＥ−４２４、ウラシルマスタード、バルプロ酸、バルルビシン、バンデタニブ、バタラニブ、ＶＥＧＦトラップ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビタキシン、ビテスパン、ボリノスタット、ＶＸ−７４５、ウォルトマニン、Ｘｒ３１１、ザノリムマブ、ＺＫ１８６６１９、ＺＫ−３０４７０９、ＺＭ３３６３７２、ＺＳＴＫ４７４。
【０２９０】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、以下に限定されないが、以下の１つ以上の制吐薬に付随する：カソピタント（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ネツピタント（ＭＧＩ−Ｈｅｌｓｉｎｎ）及び他のＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン（ＡｌｏｘｉとしてＭＧＩ  Ｐｈａｒｍａが販売）、アプレピタント（ＥｍｅｎｄとしてＭｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．；Ｒａｈｗａｙ，ＮＪが販売）、ジフェンヒドラミン（Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標）としてＰｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹが販売）、ヒドロキシジン（Ａｔａｒａｘ（登録商標）としてＰｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹが販売）、メトクロプラミド（Ｒｅｇｌａｎ（登録商標）としてＡＨ  Ｒｏｂｉｎｓ  Ｃｏ，；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡが販売）、ロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ（登録商標）としてＷｙｅｔｈ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪが販売）、アルプラゾラム（Ｘａｎａｘ（登録商標）としてＰｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹが販売）、ハロペリドール（Ｈａｌｄｏｌ（登録商標）としてＯｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ；Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪが販売）、ドロペリドール（Ｉｎａｐｓｉｎｅ（登録商標））、ドロナビノール（Ｍａｒｉｎｏｌ（登録商標）としてＳｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＧＡが販売）、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）としてＭｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．；Ｒａｈｗａｙ，ＮＪが販売）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）としてＰｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹが販売）、プロクロルペラジン（Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標）としてＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣが販売）、グラニセトロン（Ｋｙｔｒｉｌ（登録商標）としてＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．；Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪが販売）、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ（登録商標）としてＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣが販売）、ドラセトロン（Ａｎｚｅｍｅｔ（登録商標）としてＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹが販売）、トロピセトロン（Ｎａｖｏｂａｎ（登録商標）としてＮｏｖａｒｔｉｓ；Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪが販売）。
【０２９１】
がん処置における他の副作用としては、赤血球及び白血球の欠乏が挙げられる。したがって、本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、このような欠乏を処置または予防する薬剤（例えば、フィルグラスチム、ＰＥＧ−フィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファ、またはダルベポエチンアルファ）に付随する。
【０２９２】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、抗がん放射線療法に付随して投与される。例えば、本発明の一実施形態において、放射線療法とは、外部照射療法（ＥＢＴ）（高エネルギーＸ線ビームを腫瘍の位置に送達させる方法）のことである。ビームは患者の外部で（例えば、直線加速器により）生成され、腫瘍部位において標的化される。このＸ線はがん細胞を破壊することができ、入念な処置計画により、周囲の正常な組織の温存が可能である。患者の体内には放射性線源を配置しない。本発明の一実施形態において、放射線療法は、プロトンビーム療法（Ｘ線ではなくプロトンで病的組織を衝撃する原体療法の一タイプ）である。本発明の一実施形態において、放射線療法は、原体外部ビーム放射線療法（高度な技術を使用して放射線療法を個々の身体構造に合わせる手順）である。本発明の一実施形態において、放射線療法は、近接照射療法（体内に一時的に放射性物質を配置。通常、ある区域に過剰線量（または追加量）の放射線を投与するために用いられる）である。
【０２９３】
本発明の一実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）に付随して適用することができる外科的手順は、外科的腫瘍摘出術である。
【０２９４】
「〜に付随して（ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」という用語は、本発明の方法で投与される構成成分（例えば、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）及びペムブロリズマブ）は、同時送達のための単一の組成物に製剤化しても、別々に２つ以上の組成物（例えば、キット）に製剤化してもよいことを示す。各構成成分は、対象に対し、他方の構成成分を投与するときとは異なる時間に投与してもよく、例えば、各投与は、所与の時間期間にわたるいくつかの間隔をおいて、非同時に（例えば、別々にまたは逐次的に）行うことができる。さらに、別々の構成成分は、同じ経路でも異なる経路でも対象に投与することができる。
【０２９５】
実験的及び診断的使用
本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、親和性精製剤として使用することができる。このプロセスにおいて、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で周知の方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ガラスもしくはアガロース樹脂、または濾紙のような固相に固定される。固定された抗体または断片を、ＣＴＬＡ−４タンパク質（またはその断片）試料と接触させて精製し、その後に、試料中のＣＴＬＡ−４タンパク質以外の実質的に全ての材料を除去する好適な溶媒で支持体を洗浄し、固定された抗体または断片に結合させる。最後に、結合したＣＴＬＡ−４（例えば、プロテインＡ）を溶離させる溶媒で支持体を洗浄する。このような固定された抗体及び断片は、本発明の一部を形成する。
【０２９６】
さらに提供されるのは、二次抗体を生成する抗原であり、これは、例えば、ウェスタンブロットや本明細書で論じられている他のイムノアッセイの実施に有用である。
【０２９７】
また、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト化抗体）及びその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ−４タンパク質の診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織、または血清（例えば、黒色腫細胞のような腫瘍細胞）内でその発現を検出することにも有用であり得る。このような診断方法は、様々な疾患の診断において有用であり得る。
【０２９８】
本発明は、本明細書で開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）の使用を組み込むＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含む。
【０２９９】
例えば、このような方法は、以下のステップを含む：
（ａ）基質（例えば、マイクロタイタープレートウェル（例えば、プラスチックプレート）の表面）を抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片でコーティングする；
（ｂ）ＣＴＬＡ−４の有無を調べるために試験する試料を基質に適用する；
（ｃ）プレートを洗浄して、試料中の結合していない材料を除去する；
（ｄ）検出可能に標識され、またＣＴＬＡ−４抗原に対し特異性も有する抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用する；
（ｅ）基質を洗浄し、結合していない標識された抗体を除去する；
（ｆ）標識された抗体が酵素に結合している場合、酵素により蛍光シグナルに変換される化学物質を適用する；及び
（ｇ）標識された抗体の存在を検出する。
基質に結び付いた標識の検出は、ＣＴＬＡ−４タンパク質が存在することを示す。
【０３００】
さらなる実施形態において、標識された抗体またはその抗原結合断片は、ＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な色の変化をもたらすペルオキシダーゼで標識される。代替的に、標識された抗体または断片は、シンチレーション物質の存在下でシンチレーションカウンターにより検出することができる、検出可能な放射性同位体（例えば、３Ｈ）で標識される。
【０３０１】
本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）は、ウェスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット手順で使用することができる。このような手順は、本発明の一部を形成するものであり、例えば、以下のものが挙げられる。
（１）任意選択で、ＣＴＬＡ−４の有無を調べるために試験する試料からの（例えば、試料中のタンパク質におけるＰＡＧＥまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分離からの）タンパク質を、当技術分野で公知の方法（例えば、セミドライブロッティングまたはタンクブロッティング）を用いて、膜または他の固体基質に移し、結合したＣＴＬＡ−４の有無を調べるために試験する膜または他の固体基質を、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片に接触させる。
このような、ＣＴＬＡ−４の有無を調べるために試験する、未変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル中のタンパク質を（例えば、ゲル中の電気泳動分離後に）移す対象となる膜は、ニトロセルロースまたはビニール系（例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））の膜の形態をとることができる。膜を抗ＣＴＬＡ−４抗体または断片に接触させる前に、任意選択で膜を（例えば、無脂肪粉乳などで）ブロックして、膜上で非特異的なタンパク質結合部位を結合させるようにする。
（２）膜を１回以上洗浄して、結合していない抗ＣＴＬＡ−４抗体または断片や、他の結合していない物質を除去する。
（３）結合した抗ＣＴＬＡ−４抗体または断片を検出する。
結合した抗体または断片の検出は、ＣＴＬＡ−４タンパク質が、膜または基質上及び試料中に存在することを示す。結合した抗体または断片の検出は、抗体または断片が、検出可能に標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と結合し、次に二次抗体の存在を検出することによるものと考えられる。
【０３０２】
本明細書で開示されているある特定の抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、免疫組織化学検査に使用することもできる。このような方法は、本発明の一部を形成するものであり、例えば、以下を含む：
（１）ＣＴＬＡ−４タンパク質の有無を調べるために試験する細胞（例えば、黒色腫細胞のような腫瘍細胞）を、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片に接触させる；及び
（２）細胞上または細胞内の抗体または断片を検出する。
【０３０３】
抗体または断片自体が検出可能に標識されている場合、抗体または断片を直接検出することができる。代替的に、抗体または断片は、検出可能に標的された二次抗体（検出される）と結合させてもよい。
【０３０４】
本明細書で開示されているある特定の抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍イメージングに使用することもできる。このような方法は、放射標識された抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片を、ＣＴＬＡ−４発現に結び付いた腫瘍（例えば、ＣＴＬＡ−４を（例えば、腫瘍浸潤リンパ球上で）発現させる腫瘍）の有無を調べるために試験する患者の体内に注射することと、その次に患者の身体の核イメージングを行って、標識された抗体または断片の存在を、例えば、高濃度の抗体または断片を含む、腫瘍に結合した座位で検出することと、を含むことができる。この座位の検出は、腫瘍内にＣＴＬＡ−４＋細胞が存在することを示す。
【０３０５】
イメージング技法としては、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放射型コンピューター断層撮影法）またはＰＥＴイメージング（陽電子放出断層撮影法）が挙げられる。標識としては、例えば、（例えば、ＳＰＥＣＴイメージングと共に用いる）ヨウ素−１２３（１２３Ｉ）及びテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、または（例えば、ＰＥＴイメージングと共に用いる）１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、もしくは１８Ｆ、またはインジウム−１１１が挙げられる（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：３８５−４４０を参照）。
【０３０６】
医薬組成物及び投与
本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体及びその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）の医薬組成物または無菌組成物を調製するために、抗体またはその抗原結合断片は、医薬的に許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照。
【０３０７】
治療及び診断用薬剤の製剤は、許容される担体、賦形剤、または安定化剤と共に、例えば、凍結乾燥された粉末、スラリー、水性溶液、または懸濁液の形態で混合することにより、調製することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。
【０３０８】
単体で、または他の治療剤との併用で投与される、本発明の抗体の毒性及び治療効果は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＬＤ５０の判定（個体群の５０％に対する致死的用量）及びＥＤ５０の判定（個体群の５０％において治療的に有効な用量）、によって判定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。この細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための薬用量範囲を公式化するのに使用することができる。このような化合物の薬用量は、毒性がわずかであるか全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。薬用量は、用いられる剤形及び投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０３０９】
さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）に付随して対象に投与されるさらなる治療剤は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；５７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １，２００２））に従う。
【０３１０】
投与様式は様々であり得る。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸管の、非経口、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼球内、吸入、ガス注入、局所、皮膚、経皮、または動脈内が挙げられる。
【０３１１】
特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、注射のような侵襲的経路により投与することができる。本発明のさらなる実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片、またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達により、投与される。非侵襲的経路（例えば、経口（例えば、ピル、カプセル、または錠剤で））による投与も、本発明の範囲内にある。
【０３１２】
本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）またはその医薬組成物のいずれかを含む、容器（例えば、プラスチックもしくはガラスのバイアル（例えば、キャップ付き）、またはクロマトグラフィーカラム、中空穿孔針、もしくはシリンジシリンダー）を提供する。また、本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）またはその医薬組成物のいずれかを含む、注射デバイスも提供する。注射デバイスは、非経口経路（例えば、筋肉内、皮下、または静脈内）を介して、ある物質を患者の体内に導入するデバイスである。例えば、注射デバイスは、シリンジ（例えば、オートインジェクターのような、医薬組成物が予め充填されているもの）とすることができ、シリンジは、例えば、注射する液体（例えば、抗体もしくは断片またはその医薬組成物）を保持するためのシリンダーもしくは注射筒、液体を注射するために皮膚及び／または血管を貫通させるための針、ならびにシリンダー外から液体を押し出し穿孔針に通すためのプランジャーを含む。本発明の一実施形態において、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはその医薬組成物を含む注射デバイスは、静脈内（ＩＶ）注射デバイスである。このようなデバイスは、抗体もしくは断片またはその医薬組成物をカニューレまたはトロカール／針内に含み、カニューレまたはトロカール／針は、チューブに取り付けることができ、チューブは、カニューレまたはトロカール／針を通じて患者の体内に導入される液体（例えば、食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２を含み、任意選択でグルコースを含む乳酸リンゲル液）を保持するバッグまたはリザーバーに取り付けることができる。本発明の一実施形態において、抗体もしくは断片またはその医薬組成物は、ひとたびトロカールカニューレが対象の静脈に挿入され、挿入されたカニューレからトロカールが除去されたら、このデバイスに導入することができる。ＩＶデバイスは、例えば、（例えば、手または腕の）末梢静脈、上大静脈、または下大静脈に挿入しても、心臓の右心房（例えば、中心ＩＶ）内に挿入しても、鎖骨下静脈、内頸静脈、または大腿静脈に挿入してもよく、さらに、例えば、上大静脈または右心房に達するまで心臓に向けて進めてもよい（例えば、中心静脈カテーテル）。本発明の一実施形態において、注射デバイスは、オートインジェクター、ジェットインジェクター、または外部注入ポンプである。ジェットインジェクターは、患者の体内に抗体もしくは断片またはその医薬組成物を導入するために、表皮を貫通する高圧で幅狭の液体ジェットを使用している。外部注入ポンプは、調節された量の抗体もしくは断片またはその医薬組成物を患者の体内に送達させる医療デバイスである。外部注入ポンプの動力供給は、電気的であっても機械的であってもよい。異なるポンプは異なる方法で作動し、例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバーに液体を保持し、可動ピストンが液体送達を調節しており、エラストマーポンプは伸縮性のバルーンリザーバーに液体を保持し、バルーンの弾性の壁からの圧力が液体の送達を推進している。蠕動ポンプでは、一式のローラーが柔軟な管を端から端へ圧迫していき液体を押し出す。マルチチャネルポンプでは、複数種の液体を複数のリザーバーから複数の速度で送達させることができる。
【０３１３】
本明細書で開示されている医薬組成物は、米国特許第６，６２０，１３５号；第６，０９６，００２号；第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；または第４，５９６，５５６号で開示されているデバイスのような、針のない皮下注射デバイスで投与することもできる。このような医薬組成物を含む針のないデバイスも、本発明の一部である。本明細書で開示されている医薬組成物は、注入により投与することもできる。医薬組成物を投与するための、周知された植込み装置及びモジュールの例としては、米国特許第４，４８７，６０３号（調節された速度で薬剤を投与するための植込み型マイクロ注入ポンプを開示）；米国特許第４，４４７，２３３号（正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示）；米国特許第４，４４７，２２４号（持続的な薬物送達のための可変流植え込み型注入装置を開示）；米国特許第４，４３９，１９６号（マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示）が挙げられる。他にも多くのこのような植込み装置、送達システム、及びモジュールが当業者に周知されており、本発明の医薬組成物を含むものは本発明の範囲内にある。
【０３１４】
代替的に、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、全身的方法ではなく局所的方法で、例えば、抗体または断片を直接腫瘍内に注射することにより、投与してもよい。さらに、抗体または断片は、標的化された薬物送達システムにおいて、例えば、（例えば免疫病理学により特徴づけられた、例えば腫瘍を標的化する）組織特異的抗体でコーティングされたリポソームにおいて、投与してもよい。リポソームは、罹患組織を標的とし、罹患組織により選択的に取り入れられる。このような方法及びリポソームは、本発明の一部である。
【０３１５】
投与レジメンは、治療用抗体または抗原結合断片における血清または組織のターンオーバー速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、及び生物学的マトリックスにおける標的細胞のアクセス性を含めたいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、標的疾患状態における改善をもたらし、それと同時に所望されない副作用を最小化するために十分な治療用抗体または断片を送達する。したがって、送達される生物学的薬剤の量は、部分的には、特定の治療用抗体や、処置対象の状態の重症度に依存する。治療用抗体または断片における適切な用量を選択するための指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照）。
【０３１６】
適切な用量の決定は、臨床医により、例えば、当技術分野で処置に影響を及ぼすことが知られているまたはその可能性が疑われるパラメーターまたは因子を用いて、行われる。一般的には、用量は、最適な用量よりも多少少ない量から開始し、その後、任意の負の副作用に対し所望のまたは最適の効果が達成されるまで、少量ずつ増加させる。重要な診断尺度には、例えば、炎症の症状の尺度、または産生された炎症性サイトカインのレベルが含まれる。概して、使用する生物学的薬剤は、処置の対象となる動物と同じ種に由来し、それにより試薬に対する任意の免疫応答を最小化することが望ましい。例えば、ヒト対象の場合には、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体が望ましいと考えられる。
【０３１７】
本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、持続注入により、または投与用量、例えば、１日１回、１週間に１〜７回、１週間に１回、２週間に１回、１ヵ月に１回、２ヵ月に１回、４ヵ月に１回、半年に１回、１年に１回などの用量により、提供することができる。用量は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内に、または吸入により、提供することができる。１週間当たりの合計用量は、一般的には、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（例えば、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１５１−１４４を参照）。また、用量は、対象の血清中の抗ＣＴＬＡ−４抗体において所定の標的濃度、例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度を達成するように提供することもできる。他の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、皮下または静脈内に、１週間に１回、２週間に１回、「４週間ごと」、１ヵ月に１回、２ヵ月に１回、または３ヵ月に１回、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００、または２５００ｍｇ／対象にて投与される。
【０３１８】
本明細書において、「有効量」という用語は、本発明の抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）が、単体で、または追加的治療剤との併用で細胞、組織、または対象に投与されたときに、疾患の１つ以上の症状（例えば、がんまたはがんの進行）における測定可能な改善をもたらすのに有効である、本発明の抗体またはその抗原結合断片の量を指す。さらに、有効用量とは、少なくとも部分的な症状の軽減（例えば、腫瘍の縮小または消失、腫瘍成長の欠如、生存時間の増加）をもたらすのに十分な抗体または断片の量を指す。個々の活性成分単体に対し適用する場合、有効用量は、その成分単体を指す。ある組合せに対し適用する場合、併用で、連続的に、または同時に投与されるいずれの場合においても、有効用量は、治療効果をもたらすこれらの活性成分を合わせた量を指す。有効量の治療薬は、少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の診断基準またはパラメーターにおける改善をもたらす。また、有効量は、疾患の重症度の評価に主観的尺度が使用される場合、主観的尺度における改善ももたらすことができる。
【０３１９】
キット
さらに提供されるのは、以下に限定されないが、本明細書で論じられている抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）を含む１つ以上の構成成分を、以下に限定されないが、本明細書で論じられている医薬的に許容される担体及び／または治療剤を含む１つ以上の追加的構成成分に付随して含む、キットである。抗体もしくは断片及び／または治療剤は、純粋な組成物として製剤化しても、医薬的に許容される担体との併用で医薬組成物に製剤化してもよい。
【０３２０】
一実施形態において、キットは、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａまたはそのヒト化バージョン）またはその医薬組成物を、１つの容器（例えば、無菌のガラスまたはプラスチックのバイアル）内に含み、及び／または治療剤をもう１つの容器（例えば、無菌のガラスまたはプラスチックのバイアル）内に含む。
【０３２１】
別の実施形態において、キットは、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、ヒト化２７Ａ）及び医薬的に許容される担体を含めた本発明の組合せを、任意選択で、一緒に製剤化された１つ以上の治療剤との併用で、任意選択で、１つの医薬組成物において、単一の共通の容器内に含む。
【０３２２】
キットが、対象への非経口投与用の医薬組成物を含む場合、キットは、そのような投与を実施するためのデバイスを含むことができる。例えば、キットは、１つ以上の皮下注射針、または上記で論じられている他の注射デバイスを含むことができる。
【０３２３】
キットは、キット内の医薬組成物や剤形に関する情報を含む添付文書を含むことができる。一般的には、このような情報は、患者及び医師が封入された医薬組成物や剤形を有効かつ安全に使用するための一助となる。例えば、本発明の組合せに関する以下の情報が、添付文書で提供され得る：薬物動態、薬物力学、臨床研究、有効性パラメーター、指示及び用法、禁忌、警告、注意、有害反応、過量投与、適切な薬用量及び投与、供給方法、適切な保管条件、文献、製造業者／販売業者の情報、ならびに特許情報。
【０３２４】
検出キット及び治療キット
利便性のため、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体２７Ａ及びそのヒト化バージョン）は、キット、すなわち、所定量の試薬の組合せをパッケージ化したものを、診断アッセイまたは検出アッセイを実施するための使用説明書と共に提供してもよい。抗体または断片が酵素で標識される場合、キットは、酵素に必要な基質及び補因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団をもたらす基質前駆体）を含むことになる。加えて、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などのような他の添加物が含まれてもよい。種々の試薬の相対量は、試薬の溶液中濃度がアッセイの感受性を実質的に最適化するように、広範囲に変動させることができる。詳細には、試薬は、溶解すると適切な濃度の試薬溶液をもたらす賦形剤を含む、（通常は凍結乾燥された）乾燥粉末として提供することができる。
【０３２５】
また、診断用または検出用の試薬や、様々な検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型または競合フォーマット）のような免疫アッセイを含む）で使用するための、１つ以上のこのような試薬を含むキットも提供される。キットの構成成分は、固体担体に予め付着していてもよく、またはキットの使用時に固体担体の表面に適用されてもよい。本発明の一部の実施形態において、シグナル発生手段は、本発明の抗体または断片に予め付随してもたらされる場合もあれば、使用前に、１つ以上の構成成分（例えば、緩衝液、抗体−酵素結合体、酵素基質など）と合わせることを必要とする場合もある。また、キットは、追加的試薬、例えば、固体担体表面への非特異的結合を低減するためのブロック試薬、洗浄用試薬、酵素基質なども含むことができる。固体担体表面は、管、ビーズ、マイクロタイタープレート、ミクロスフェア、またはタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドの固定に好適な他の材料の形態をとることができる。特定の態様において、化学発光性産物もしくは発色性産物の形成、または化学発光性基質または発色性基質の還元を触媒する酵素は、シグナル生成手段の一構成成分である。このような酵素は、当技術分野で周知されている。キットは、捕捉剤及び本明細書で説明されている検出試薬のいずれかを含むことができる。任意選択で、キットは、本発明の方法を行うための使用説明書も含むことができる。
【０３２６】
また、容器内にパッケージ化された抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片を含み、さらに、容器に添付または容器と共にパッケージ化された標識であって、容器の内容物を記載し、本明細書で説明されている１つ以上の疾患状態を処置するための容器の内容物の用法に関する指示及び／または使用説明を提供する、標識を含むキットも提供される。
【０３２７】
一態様において、キットは、がんを処置するためのものであり、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片と、さらなる治療剤またはワクチンとを含む。キットは、任意選択で、さらに非経口（例えば、静脈内）用のシリンジを含んでもよい。別の態様において、キットは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合断片と、容器に添付または容器と共にパッケージ化された、ワクチンまたはさらなる治療剤を伴った抗体または断片の用法を記載する標識とを含む。また別の態様において、キットは、ワクチンまたはさらなる治療剤と、容器に添付または容器と共にパッケージ化された、抗ＣＴＬＡ−４抗体または断片を伴ったワクチンまたはさらなる治療剤の用法を記載する標識とを含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びワクチンまたはさらなる治療剤は、別々のバイアルに入れるか、同じ医薬組成物中で一緒に合わせる。
【０３２８】
上記の併用療法セクションで論じられているように、２つの治療剤の同時発生的投与は、これらの薬剤が治療効果を発揮する時間期間の重複が存在する限りにおいて、これらの薬剤の同時投与も同じ経路での投与も必要とされない。同時投与または逐次投与が企図されており、異なる日または週の投与も同様である。
【０３２９】
また、本明細書で開示されている治療キット及び検出キットは、本明細書で開示されている抗体、ペプチド、抗原結合断片、またはポリヌクレオチドの少なくとも１つと、検出試薬または治療剤としての組成物を使用するための使用説明書を含むように調製することもできる。このようなキットで使用する容器は、典型的には、１つ以上の検出組成物及び／または治療組成物（複数可）を入れ、好ましくは好適に分割することができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の好適な容器を含むことができる。第２の治療剤も提供される場合、キットは、この第２の検出組成物及び／または治療組成物を入れることができる、第２の別個の容器も含むことができる。代替的に、複数の化合物は、単一の医薬組成物に調製してもよく、また、単一の容器手段（例えば、バイアル、フラスコ、シリンジ、瓶、または他の好適な単一の容器）の中にパッケージ化してもよい。本明細書で開示されているキットは、典型的には、市販向けにバイアル（複数可）を密閉して収容するための手段（例えば、所望のバイアル（複数可）を保持する射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器）も含むことになる。放射標識、発色性、蛍光発生的、または他のタイプの検出可能な標識または検出手段がキット内に含まれる場合、標識剤は、同じ容器内で検出組成物または治療組成物そのものとして提供してもよく、代替的に、この第２の組成物を入れ好適に分割することができる、第２の別個の容器手段に入れてもよい。代替的に、検出試薬及び標識は、単一の容器手段内で調製してもよく、ほとんどの場合において、キットは、典型的には、市販向けに、及び／または好都合なパッケージ化及び運搬のために、バイアル（複数可）を密閉して収容するための手段も含むことになる。
【０３３０】
また、本明細書で説明されている検出またはモニタリングの方法を行うためのデバイスまたは装置も提供される。このような装置は、試料を投入することができるチャンバーまたは管と、試料の流れがデバイスを通るように向けるためのバルブまたはポンプを任意選択で含む液体操作システムと、任意選択で、血液から血漿または血清を分離するためのフィルターと、捕捉剤または検出試薬を添加するための混合チャンバーと、任意選択で、捕捉剤免疫複合体に結合した検出可能な標識の量を検出するための検出デバイスと、を含むことができる。試料の流れは、受動的（例えば、毛管力、静水力、またはひとたび試料が適用されたらデバイスのさらなる操作を要しない他の力）であってもよく、能動的（例えば、機械的ポンプ、電気浸透ポンプ、遠心力、または空気圧上昇を介し生成された力の適用によるもの）であってもよく、能動的力と受動的力との組合せによるものであってもよい。
【０３３１】
さらなる実施形態において、プロセッサー、コンピューター可読メモリー、及びコンピューター可読メモリーに格納し、プロセッサー上で実行させて、本明細書で説明されている方法のいずれかを実施するように適合させたルーチンも提供される。好適なコンピューティングシステム、環境、及び／または構成の例としては、パーソナルコンピューター、サーバーコンピューター、ハンドヘルドもしくはラップトップデバイス、マルチプロセッサーシステム、マイクロプロセッサーベースシステム、セットトップボックス、プログラム可能な一般向け電子装置、ネットワークＰＣ、ミニコンピューター、メインフレームコンピューター、上記のシステムもしくはデバイスのいずれかを含む分散型コンピューティング環境、または当技術分野で公知の他のシステムが挙げられる。
【０３３２】
一般的な方法
分子生物学における標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２  ＆  １９８９  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡで説明されている。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも掲載されており、細菌細胞におけるクローニング及びＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞及び酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質及びタンパク質の発現（Ｖｏｌ．３）、及びバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）について説明されている。
【０３３３】
免疫沈殿法、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化を含めたタンパク質精製方法が説明されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が説明されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照）。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の産生、精製、及び断片化が説明されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上記参照）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技法が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０３３４】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びヒト化抗体を調製することができる（例えば、Ｓｈｅｐｅｒｄ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（ｅｄｓ．）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１３９−２４３；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５；Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１−２７３７８；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９；米国特許第６，３２９，５１１号を参照）。
【０３３５】
ヒト化に替わる方法は、ファージ上に示されるヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリーの使用である（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−３１４；Ｂａｒｂａｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３９７−３９９）。
【０３３６】
単鎖抗体及びダイアボディが説明されている（例えば、Ｍａｌｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：２１３−２１８；Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７３４６−７３５０；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−２６２９０；Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１７７−１８９；及び米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。二機能性抗体が提供される（例えば、Ｍａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７０２１−７０２５；Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：７−１５；Ｖｏｌｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：８１５−８２３；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：１−６；Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｒａｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７６２３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９；ならびに米国特許第５，９３２，４４８号、第５，５３２，２１０号、及び第６，１２９，９１４号を参照）。
【０３３７】
二重特異性抗体も提供される（例えば、Ａｚｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４９３；Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７４：９１１５；Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８６３３；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：１２９９９；Ｐｒｏｐｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２１４；Ｌｏｎｇ（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８７５を参照）。
【０３３８】
抗原の精製は、抗体の生成に必須ではない。動物は、対象の抗原を有する細胞で免疫化することができる。次に、免疫化した動物から脾細胞を単離することができ、脾細胞は黒色腫細胞株と融合してハイブリドーマを産生させることができる（例えば、Ｍｅｙａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２８３−２９０；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：２３３−２４２；Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｋａｉｔｈａｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１５７−５１６４を参照）。
【０３３９】
抗体は、例えば、小薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させてもよい。抗体は、治療、診断、キット、またはその他の目的に有用であり、例えば、色素、放射性同位体、酵素、または金属（例えば、コロイド金）に結合した抗体を含む（例えば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；Ｈｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９を参照）。
【０３４０】
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含めたフローサイトメトリーの方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照）。核酸の修飾に好適な蛍光試薬（例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマー及びプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む）が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０３４１】
免疫システムの組織診断の標準的な方法が説明されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。
【０３４２】
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アラインメントを決定するための、ソフトウェアパッケージ及びデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照）。
【実施例】
【０３４３】
以下の実施例は、本発明を例示する役割を果たすものである。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【０３４４】
実施例１：抗ｈＣＴＬＡ−４抗体の免疫化及び選択
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に対する抗体を単離するため、ｈＣＴＬＡ−４をコードする発現コンストラクトでマウスを免疫化した。このコンストラクトを生成するため、ｈＣＴＬＡ−４の全長オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５２１４．４、配列番号３５）をｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターにサブクローニングした。Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）及びＤＮＡコーティング金弾丸（ＢｉｏＲａｄ）を製造業者の指示に従って用いた遺伝子銃免疫化により、マウスを免疫化した。簡潔に述べると、１μｍの金粒子を、２：１：１の比率のｐＣＩ−ｎｅｏ−ＣＴＬＡ−４  ｃＤＮＡならびにマウスＦｌｔ３Ｌ及びマウスＧＭ−ＣＳＦの市販の発現ベクター（いずれもＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆｒａｇｏ，ＮＤ）製）でコーティングした。合計１μｇのプラスミドＤＮＡを使用して、５００μｇの金粒子をコーティングした。具体的には、７〜８週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃマウスの耳に対し遺伝子銃で免疫化を行い、両耳において４投与サイクルを受けさせた。３回のＤＮＡ免疫化後のマウス血清において、フローサイトメトリーにより、およそ１：１２５−６２５の抗ｈＣＴＬＡ−４力価が検出された。このスクリーニングに関しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＩ−ｎｅｏ−ＣＴＬＡ−４コンストラクトを一時的に形質移入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した。形質移入細胞を一晩培養し、続いて細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて単細胞懸濁液を得た。７，５＊１０５個の細胞を、希釈したマウス血清の各試料と共に、４℃にて３０分間インキュベートした。次に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による染色を４℃にて３０分間行った。再び細胞をＰＢＳ／２％のＦＢＳで洗浄し、次にＰＢＳ／２％のＦＢＳに再懸濁させ、ＦＩＴＣ標識に基づいて抗体結合細胞を検出し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により評価した。ｈＣＴＬＡ−４に対する反応性を示したマウスに対し、最後の４回目の免疫化を行い、４日後に屠殺した。赤血球枯渇脾臓及びリンパ節細胞集団を、先に説明されているように調製し（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：６９−７７；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−１３４）、−１４０℃で凍結させた。
【０３４５】
Ｂ細胞選択及びＣＥＬＩＳＡのため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、変異体ｈＣＴＬＡ−４  ｃＤＮＡ（Ｙ１６６Ｇ及びＹ１８３Ｇ、配列番号３７）をコードするｐＣＩ−ｎｅｏベクターをトランスフェクトすることにより、ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４安定性細胞株を生成した。限界希釈により、安定したクローンを得た。
【０３４６】
抗ｈＣＴＬＡ−４抗体を産生するＢ細胞を選択するため、このｈＣＴＬＡ−４に結合する抗体を発現する優先結合Ｂ細胞の選択戦略を設計及び開発した。ｈＣＴＬＡ−４免疫化マウスから脾細胞及びリンパ節を採取し、単離した細胞を、３，０００ＲＡＤにて照射されたＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞と共にインキュベートした。１時間後、培地を用いた複数回の洗浄ステップにより、結合していない細胞を除去した。続いて、結合リンパ球を伴うＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞を解離緩衝液で採取した。Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−１３４で説明されているように、結合Ｂ細胞を培養した。簡潔に述べると、９６ウェル平底組織培養プレートにおける最終体積２００μｌの培地中で、選択されたＢ細胞を、７．５％（ｖ／ｖ）のＴ細胞上清及び５０，０００個の照射された（２，５００ＲＡＤ）ＥＬ−４  Ｂ５フィーダー細胞と混合した。８日目に、以下で説明するＣＥＬＩＳＡにより、上清に対しｈＣＴＬＡ−４反応性をスクリーニングした。
【０３４７】
ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞を、組織培養プレート中の培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）に１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたもの）に播種し、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて、細胞がコンフルエントになるまで培養した。続いて培地を除去し、細胞を、Ｂ細胞培養物からの上清と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｈＣＴＬＡ−４免疫反応性をＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０３４８】
加えて、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイフォーマットを用いて、上清のｈＣＴＬＡ−４／ｈＣＤ８０相互作用遮断を評価した。上清を、ビオチン化組換え型ｈＣＤ８０と共に、ＨＴＲＦ緩衝液（ＰＢＳ／０．５３Ｍのフッ化カリウム／０．１％のＢＳＡ）中で共インキュベートした。組換え型ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃを、検出試薬のストレプトアビジンＫ（Ｄｏｎｏｒ）及び抗ヒトＦｃ  Ｄ２（Ａｃｃｅｐｔｏｒ）と組み合わせて添加した。完全な混合物を室温（ＲＴ）にて３時間インキュベートし、続いて、Ｖｉｃｔｏｒ２リーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、６１５ｎｍ及び６６５ｎｍの波長における蛍光を測定した。ｈＣＤ８０に対するｈＣＴＬＡ−４の結合は、このセットアップ（１００％に設定）において蛍光シグナルをもたらす。ブロック抗体を含有する上清は、蛍光を低減させた。
【０３４９】
ｈＣＴＬＡ−４／ｈＣＤ８０相互作用をブロックすることが示されたｈＣＴＬＡ−４反応性上清からのＢ細胞クローンを、公開されている手順（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：６９−７７；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−３４）に従ったミニ電気融合により、不死化させた。簡潔に述べると、電気融合等モル浸透圧（ｉｓｏｍｏｌａｒ）緩衝液中で、Ｂ細胞を１０６個のＳｐ４／０−Ａｇ１４  黒色腫細胞と混合した。５０μＬの融合チャンバー内で、３０秒、１ＭＨｚ、１５Ｖｒｍｓの交番電界、次に１０マイクロ秒、３ｋＶ／ｃｍの方形高電界パルス、そして再び３０秒、１ＭＨｚ、１５Ｖｒｍｓの交番電界により、電気融合を実施した。チャンバーの内容物をハイブリドーマ選択培地に移し、限界希釈条件下で９６ウェルプレートにプレーティングした。１２日目の電気融合後、上で説明されているように、ハイブリドーマ上清に対しｈＣＴＬＡ−４結合活性をスクリーニングした。ｈＣＴＬＡ−４に結合した上清中で抗体を分泌したハイブリドーマを、限界希釈によりサブクローニングして、ハイブリドーマの完全性及び安定性を保護した。安定性のハイブリドーマを無血清培地中で７〜１０日間培養した。上清を採取し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅプロテインＡを製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の指示に従って用いて、抗体を精製した。分光光度法を用いて、抗体濃度を定量化した。ハイブリドーマ培養物の上清を使用して、ハイブリドーマのアイソタイピングを行った。簡単に述べると、アイソタイピングは、一般的なマウスのアイソタイプ及び軽鎖の各々に対する固定されたヤギ抗マウス抗体バンドを有する試験紙に基づいた、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて行った。回収された抗体は、全てマウスＩｇＧ１として同定された。以下の方法を用いて、マウスＩｇＧ１ハイブリドーマ材料の可変領域をシークエンシングすることにより、抗体の配列を解明した：ハイブリドーマ細胞の総ＲＮＡを抽出することで、ｃＤＮＡ合成を行った。ＴＯＰＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ベクター内での陽性断片のクローニングを可能にするｃＤＮＡ末端高速増幅（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ）（ＲＡＣＥ）を実施した。ＴＯＰＯクローンをシークエンシングし、ＶＢＡＳＥ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）を用いて配列にアノテーションを付けた。
【０３５０】
実験において、結合及びブロックを、１０Ｄ１（ＵＳ２００２００８６０１４）またはＣＰ−６７５，２０６（ＷＯ２００７１１３６４８）（それぞれヒトＩｇＧ１カッパ及びＩｇＧ２カッパとして発現）と比較した。２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って用いた、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／１７、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１２６８）への形質移入により、ＶＨコンストラクト及びＶＬコンストラクトをコードするプラスミドを一時的に発現させた。７日後に上清（３０ｍｌ）を採取し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅプロテインＡを製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の指示に従って用いて、抗体を精製した。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、緩衝液を１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．５緩衝液に交換した。精製した抗体の濃度をＯＤ２８０（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００）に基づいて決定した。製造業者（Ｌｏｎｚａ）の指示に従うＬＡＬ試験により、エンドトキシンレベルを決定した。
【０３５１】
ｈＣＴＬＡ−４抗体のキャラクタリゼーションを、ｈＣＴＬＡ−４、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＣＴＬＡ−４に対する結合及びリガンド結合（ｈＣＤ８０／ｈＣＤ８６）の遮断について行った。次に、ジャーカットベースのレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性を決定した。簡単に述べると、ｈＣＤ８０／ｈＣＤ８６を発現するラージ細胞を、膜ＣＴＬＡ−４及びＩＬ２−ＲＥルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するジャーカットＴ細胞と共インキュベートした。この混合物に、マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、次に、ある希釈範囲のｈＣＴＬＡ−４マウス抗体（２００μｇ／ｍｌ及びその希釈物で開始）を添加した。３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度における６時間のインキュベート後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加及びＥｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の使用により、ＩＬ−２プロモーター活性を検出した。図１に示すように、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａは１０Ｄ１よりも強力にＩＬ−２プロモーターを増強している。
【０３５２】
実施例２：ヒト化抗体設計及びＣＤＲグラフト
ＣＤＲグラフト技術により、マウスｈＣＴＬＡ４．２７Ａ抗体をヒト化した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１を参照）。
【０３５３】
最初に、ＩｇＢＬＡＳＴを用いてヒト生殖系列配列を同定した（Ｙｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：Ｗ３４−４０）。ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＨヒト生殖系列配列に関しては、Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ１−４６＊０１が同定され（６２．２％の同一性）、ＶＬヒト生殖系列配列に関しては、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１が同定された（６８．４％の同一性）。これら２つの生殖系列配列を使用してマウスＣＤＲに直接グラフトし、以下２つのｃＤＮＡコンストラクト：配列番号１５（ＶＨ、配列番号１６をコード）及び配列番号２７（ＶＬ：配列番号２８をコード）が得られた。次に、８２，９５８の個別の配列を同定するＩＭＧＴデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２）で入手可能な、全てのヒトの配列を含むデータベースを構築した。ＴＢＬＡＳＴＮ（２．２．３０＋）を用いてこれらの配列をクエリーにかけて、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＨ及びＶＬ配列のフレームワークに対し最も高い同一性を示す鋳型配列を同定した。７０％以上の類似性スコアを示し、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のＣＤＲ長とそれぞれ同様な、好ましくは同一なＣＤＲ長を示す、３つのＶＨ配列及び３つのＶＬ配列を同定した。
【０３５４】
重鎖に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１（Ｄ１）：Ｄ３６−４２）アクセッション番号Ｌ３９１３０、ＤＩ１０９２５９、及びＤＤ４３１６３４によりコードされたフレームワークを、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＨ  ＣＤＲのストレートグラフト用鋳型として選択し、その結果、それぞれについて以下のｃＤＮＡコンストラクト：配列番号９、１１、及び１３が得られた。軽鎖に関しては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６３９５５、ＤＩ１１２３５０、及びＡＢ３６３３０５によりコードされたフレームワークを、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＬ  ＣＤＲのストレートグラフト用鋳型として選択し、その結果、以下のｃＤＮＡコンストラクト：配列番号２１、２３、及び２５が得られた。フレームワーク及びＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により説明されている定義とした。
【０３５５】
ヒト化フレームワーク残基がＦｖの構造に及ぼす効果を調べるため、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５における「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｃａｓｃａｄｅ」（デフォルトのパラメーター）を用いて、マウスｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  Ｆｖの相同性モデルを作製した。相同性モデルは、ＰＤＢ  ＩＤ  ３Ｖ７Ａに基づいて構築した。
【０３５６】
ＣＤＲをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでグラフトして、ＣＤＲのいずれかに近接し、ループコンフォメーションに影響を及ぼし得る残基（Ｖｅｒｎｉｅｒ残基と呼ばれる）を調べた。ループコンフォメーションに影響を及ぼす可能性があり、ＣＤＲ表面に対し＜５Å以内にある残基を同定し、この位置にあるマウスアミノ酸で置換した。得られた鋳型における翻訳後修飾（ＰＴＭ）モチーフの有無をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５を用いてチェックし、可能な場合（すなわち、ＣＤＲでもＶｅｒｎｉｅｒ残基でもない場合）はＰＴＭを防止するように変更した。重鎖に関しては、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＨにおける予測された配列ＰＴＭモチーフの除去及び構造的考慮（すなわち、骨格の剛性）の結果、２つの追加的コンストラクト：配列番号１７及び１９の設計がもたらされた。軽鎖に関しては、ＰＴＭ除去の結果、以下のコンストラクト：配列番号２９がもたらされた。
【０３５７】
同定した鋳型の各々にＣＤＲをグラフトし、これらを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター内でクローニングしＨＥＫ２９３  Ｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ細胞内で一時的に形質移入した、ヒトＩｇＧ４（配列番号５０）、カッパ（配列番号５２）抗体として発現させた。セリン２２８がプロリンに変換された安定化Ａｄａｉｒ変異（Ａｎｇａｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８）を伴う、ＩｇＧ４バージョンのヒト化抗体を産生した。
【０３５８】
ｈＣＴＬＡ４．２７ＩｇＧ１も、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター内でクローニングしＨＥＫ２９３  Ｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ細胞内で一時的に形質移入した、ヒトＩｇＧ１（配列番号４８）、カッパ抗体（配列番号５２）として発現させた。ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖のコンストラクトをコードするプラスミドを１：１の比（合計１２８０μｇ）で混合し、２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って用いた、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／１７、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１２６８）への形質移入により、一時的に発現させた。７日後に上清（１２５０ｍｌ）を採取し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅプロテインＡを製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の指示に従って用いて、ｈＣＴＬＡ４．２７ＩｇＧ１を精製した。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、緩衝液を１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．５緩衝液に交換した。精製したｈＣＴＬＡ４．２７ＩｇＧ１の濃度をＯＤ２８０（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００）に基づいて決定した。
【０３５９】
加えて、マウスｈＣＴＬＡ４．２７Ａ  ＶＨ及びＶＬ（配列番号３２及び３４）を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター内でクローニングしＨＥＫ２９３  Ｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ細胞内で一時的に形質移入した、キメラヒトＩｇＧ１（ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ１）及びＩｇＧ４（ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ４）、カッパ抗体として発現させた。
【０３６０】
実施例３：ヒト化コンストラクトの合成、発現、及び精製
重鎖及び軽鎖のコンストラクトをコードするプラスミドを１：１の比（合計３０μｇ）で混合し、２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って用いた、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／１７、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１２６８）への形質移入により、一時的に発現させた。７日後に上清（３０ｍｌ）を採取し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅプロテインＡを製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の指示に従って用いて、抗体を精製した。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、緩衝液を１０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．５緩衝液に交換した。精製した抗体の濃度をＯＤ２８０（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００）に基づいて決定した。製造業者（Ｌｏｎｚａ）の指示に従うＬＡＬ試験により、エンドトキシンレベルを決定した。
【０３６１】
実施例４：ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体の結合
ｈＣＴＬＡ−４に対するヒト化抗体の結合をＣＥＬＩＳＡフォーマットで調べた。ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞を、組織培養プレート中の培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）に１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたもの）に播種し、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて、細胞がコンフルエントになるまで培養した。続いて培地を除去し、細胞を、精製されたｈＣＴＬＡ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ及びその希釈物）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｈＣＴＬＡ−４免疫反応性をＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて、ＥＣ５０値（合計結合シグナルの５０％が観察される濃度）を計算した。表５に、ヒト化ｈＣＴＬＡ４．２７抗体のＥＣ５０値を示す。
【０３６２】
【表５】
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【０３６３】
ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした、カニクイザルＣＴＬＡ−４（配列番号３９）の全長オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを一時的に形質移入したＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いて、カニクイザルＣＴＬＡ−４（配列番号４０）に対するｈＣＴＬＡ−４抗体の結合を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１．ｃｙｎｏＣＴＬＡ−４細胞を組織培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて、細胞層がコンフルエントになるまでインキュベートした。続いて、培地を除去し、細胞を、精製されたｈＣＴＬＡ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ及びその希釈物）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ＣＴＬＡ−４免疫反応性をＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０３６４】
ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞上で発現したＣＴＬＡ−４に対するｈＣＴＬＡ４．２７ヒト化抗体の結合を、フローサイトメトリーにより確認した。以下のようにして、ヒトバフィーコートからヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を単離した。最初に、バフィーコートを室温にてＰＢＳで希釈して、合計体積１８０ｍｌにした。細胞懸濁液を混合した後、Ｓｅｐｍａｔｅチューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ勾配上で分割量を装填し、遠心処理を１２００ｇで１０分間、２０℃にてブレーキなしで行った。次に、血漿を吸引により除去し、血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面からＰＢＭＣを回収した。ＰＢＭＣをＰＢＳ中で３回洗浄した。続いて、磁気ビーズを用いてＣＤ３＋  Ｔ細胞単離を行った（ＣＤ３＋  Ｔ細胞ビオチン−Ａｂカクテル；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。次に、Ｔ細胞をαＣＤ３／αＣＤ２８コーティングビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４８時間刺激した。フローサイトメトリーを用いた芽球形成の検出により、最初のＴ細胞刺激を確認した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）によるＴ細胞の固定及び透過処理の後、ｈＣＴＬＡ４．２７ヒト化抗体の構築を評価した。細胞をｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ）中で２回洗浄し、ｈＣＴＬＡ４．２７ヒト化抗体と共にインキュベートし、３回洗浄し、最後にＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトｈＩｇＧ検出抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。この標識手順の後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）上でのフローサイトメトリーにより解析した。Ｆｌｏｗｊｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータを処理し解析した。
【０３６５】
Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＰＢＭＣ上で発現したＣＴＬＡ−４に対するｈＣＴＬＡ４．２７ヒト化抗体の結合を、フローサイトメトリーにより確認した。この目的に対し、カニクイザルの血液をＰＢＳで１：１希釈し、１３ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  ９５％／ＰＢＳ  ５％を含有する５０ｍｌのチューブに添加した。細胞の遠心処理を３０分間、４５０ｇ及び２０℃にてブレーキなしで行った。次に、血漿を吸引により除去し、血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面からＰＢＭＣを回収した。ＰＢＭＣをＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を液体窒素中で凍結させ、実験当日に冷凍庫から取り出した。静止免疫細胞上でのＣＴＬＡ−４の内在性発現量は低いことから、解凍したＰＢＭＣをαＣＤ３／αＣＤ２８／αＣＤ２コーティングビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）で４８時間刺激した。続いて、フローサイトメトリーを用いた芽球形成の検出により、ＰＢＭＣの刺激を確認した。次に、細胞に対し、フローサイトメトリーにより、ｈＣＴＬＡ４．２７抗体の細胞内結合について解析した。
【０３６６】
実施例５：ヒト化ｈＣＴＬＡ４．２７抗体による、ｈＣＴＬＡ−４に対するｈＣＤ８０結合の遮断
ｈＣＤ８０遮断の評価を、ＣＥＬＩＳＡフォーマットでヒト化ｈＣＴＬＡ４．２７抗体の完全パネルに対し行った。ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞を組織培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて培地中でインキュベートした。ひとたび細胞がコンフルエントになったら培地を除去し、細胞を、ヒト化ｈＣＴＬ４．２７抗体バリアント（１０μｇ／ｍｌ及びその希釈物）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ビオチン化組換え型ｈＣＤ８０／Ｆｃタンパク質と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳＴで洗浄し、次にストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を細胞に添加し、これを３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。続いて細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、ｈＣＤ８０／Ｆｃタンパク質の結合をＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。このデータからｈＣＤ８０の遮断についてのＩＣ５０値を計算した。このＩＣ５０値を表６に示す。ＩＣ５０値は、阻害の半数が観察される濃度に相当する。
【０３６７】
【表６】
2019532619.tif 000031
【０３６８】
実施例６：１０Ｄ１（イピリムマブ）及びＣＰ−６７５，２０６（トレメリムマブ）と比較してのｈＣＴＬＡ４．２７の親和性、ｈＣＴＬＡ−４に対する結合、及びｈＣＤ８０／ｈＣＤ８６相互作用のブロック能力
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６上でバイオライトインターフェロメトリー（ｂｉｏ−ｌｉｇｈｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いてｈＣＴＬＡ４．２７の結合動態及び平衡結合定数をプロファイリングし、当技術分野で公知のいくつかの抗体と比較した。最初に、標準的なアミン化学を用いて抗ｈＣＴＬＡ−４  ｍＡｂをアミン反応性第２世代バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に結合させた。次に、バイオセンサーに対するｈＣＴＬＡ−４の結合及び解離を様々なｈＣＴＬＡ−４濃度で観察した。アミン反応性バイオセンサーは、０．１ＭのＭＥＳ  ｐＨ＝５．５を含むウェルに１０分間浸漬することにより、予め湿らせた。次に、０．１ＭのＮＨＳ／０．４ＭのＥＤＣ混合物を用いてバイオセンサーを５分間活性化した。０．１ＭのＭＥＳ中２．５または１２ｕｇ／ｍＬの抗体の溶液に７．５分間バイオセンサーを浸漬することにより、抗体を結合させた。１Ｍのエタノールアミンの溶液を用いてバイオセンサー表面を５分間クエンチした。バイオセンサーをＯｃｔｅｔ動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で５分間平衡化した。様々なｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ濃度（２．５−４０ｎＭ）を含有するウェルにバイオセンサーを入れ、１５分間インターフェロメトリーをモニタリングすることにより、ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の会合を観察した。バイオセンサーを動態緩衝液に移し、インターフェロメトリーシグナルを４５分間モニタリングした後に、解離を測定した。このアッセイは、３０℃のプレート温度で実行した。全試験濃度を含む１：１結合の全体的適合モデルを用いて、観察したオン速度及びオフ速度（ｋｏｎ及びｋｄｉｓ）を適合させ、平衡結合定数ＫＤを計算した。表７に示すように、ｈＣＴＬＡ４．２７は、対照抗体と同様の結合親和性を有する。
【０３６９】
【表７】
2019532619.tif 000032
【０３７０】
次に、ｈＣＴＬＡ−４に対するｈＣＴＬＡ４．２７抗体の結合と、ｈＣＴＬＡ４．２７抗体のｈＣＤ８０／ｈＣＤ８６相互作用ブロック能力とを、ＣＥＬＩＳＡフォーマットにおいて１０Ｄ１及びＣＰ−６７５，２０６と比較した。簡単に述べると、ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞において、ｈＣＴＬＡ−４結合についてのＣＥＬＩＳＡを実施した。結合抗体の検出を、マウスｈＣＴＬＡ４．２７Ａについてはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ｈＣＴＬＡ４．２７ＡキメラｈＩｇＧ１及びｈＩｇＧ４ならびに対照抗体についてはヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてそれぞれ行った。ｈＣＤ８０及びｈＣＤ８６の遮断の評価に関しては、ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４細胞を組織培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて培地中でインキュベートした。ひとたび細胞がコンフルエントになったら培地を除去し、細胞を、ｈＣＴＬ４．２７抗体及び対照抗体（１０μｇ／ｍｌ及びその希釈物）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ビオチン化組換え型ｈＣＤ８０／Ｆｃタンパク質またはｈＣＤ８６／Ｆｃタンパク質と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳＴで洗浄し、次にストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を細胞に添加し、これを３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。続いて細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、ｈＣＤ８０／Ｆｃタンパク質またはｈＣＤ８６  ／Ｆｃタンパク質の結合をＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。ＩＣ５０値は、阻害の半数が観察される濃度に相当する。
【０３７１】
図２に示すように、ｈＣＴＬＡ４．２７ＩｇＧ１及びｈＣＴＬＡ４．２７ＩｇＧ４のｈＣＤ８０ブロックプロファイルは、イピリムマブ及びトレメリムマブのｈＣＤ８０プロファイルの間にある。したがって、ＩＣ５０値は同等であるが、有効性プラトーは異なる。
【０３７２】
【表８】
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【０３７３】
実施例７：ヒトＰＢＭＣ  ＳＥＢアッセイにおけるヒト化ｈＣＴＬＡ４．２７抗体の機能性
一次抗体細胞におけるヒト化ｈＣＴＬＡ４．２７の機能性を確認するため、ヒトドナー血液のバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。最初に、バフィーコートを室温にてＰＢＳで希釈し混合して、合計体積１８０ｍｌにした。Ｓｅｐｍａｔｅチューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ勾配上で分割量を装填し、遠心処理を１２００ｇで１０分間、２０℃にてブレーキなしで行った。次に、血漿を吸引により除去し、血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面からＰＢＭＣを回収した。アッセイで使用する前に、ＰＢＭＣをＰＢＳ中で３回洗浄した。ＰＢＭＣをウェル当たり２＊１０５細胞にて播種した。続いて、１０％のウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ  １６５０培地（Ｇｉｂｃｏ）中にヒト化ｈＣＴＬＡ４．２７及び対照抗体を希釈し、１０の平方根の希釈ステップによる１００ｕｇ／ｍｌで開始する濃度範囲で添加した。１０％のウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ  １６４０培地中に希釈したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。プレートを３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて７時間インキュベートし、次に上清を単離した。
【０３７４】
上清中で、免疫活性化の尺度となるＩＬ−２分泌を検出した。遠心分離により、任意の細胞材料から上清を除去し、４℃における最小限期間１６時間のインキュベートによりＰＢＳ中の抗ｈＩＬ−２抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコーティングしておいたＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡパネルに添加した。上清を添加する前にウェルを空にし、室温（ＲＴ）にて１時間、ＰＢＳ／１％のＢＳＡでブロックした。上清を抗ｈＩＬ−２抗体コーティングプレート中で室温にて１時間インキュベートし、その後にプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。続いて、０．５μｇ／ｍｌの抗ｈＩＬ２ビオチン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＰＢＳＴ／０．５％のＢＳＡに添加し、室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１：５０００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＰＢＳＴ／０．５％のＢＳＡに添加した。ＰＢＳＴで６回洗浄した後、ＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加によりＩＬ−２を検出した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。このアッセイでは、組換え型ヒトＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ）を、上清中のＩＬ−２タンパク質レベルを定量化するための参照物質として使用した。図３は、ｈＣＴＬＡ４．２７抗体が免疫活性化を増強することを示している。
【０３７５】
実施例８：エフェクター機能アッセイにおけるｈＣＴＬＡ４．２７
キメラｈＣＴＬＡ４．２７Ａ抗体：ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ１及びｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ４における抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力について調べた。このＡＤＣＣアッセイに関しては、ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用した。ＮＫ細胞は、ヒト血液から単離した。Ｒｏｓｅｔｔｅ  ＳＥＰ  ＮＫ濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてバフィーコートのＮＫ細胞を濃縮した。続いて、バフィーコートをＰＢＳ／２％のＦＢＳと１：１混合し、Ｆｉｃｏｌ  Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で層状化させた。遠心分離後に中間相を収集し、細胞をＰＢＳ／２％のＦＢＳで洗浄した。フローサイトメトリーによる単離ＮＫ細胞のキャラクタリゼーションにより、ＣＤ１６及びＣＤ５６の発現が確認された。
【０３７６】
ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４を標的細胞として使用し、ＮＫ細胞と共に、１０：１のエフェクター：標的比で平底細胞培養プレートに播種した。ｈＣＴＬＡ４．２７抗体または対照抗体（１０Ｄ１またはアイソタイプが一致した対照抗体（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４））を添加した（１００μｇ／ｍｌ及びその希釈物）。プレートを３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ及び０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて３０分間インキュベートした。続いてＣｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、次に３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて３時間インキュベートした。ｉＥＭＳリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＯＤ４９２−６９０の解析により、細胞生存能を評価した。図４Ａに示すように、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ１は２名の異なるドナーにおいてＮＫ媒介性細胞溶解を誘導したが、その一方でｈＩｇＧ４としてフォーマットされたものは細胞傷害性を誘導することができなかった。
【０３７７】
補体依存性細胞傷害を評価するため、ＣＨＯ−Ｋ１．ｈＣＴＬＡ−４標的細胞のコンフルエントな単層に対し、ある濃度範囲のｈＣＴＬＡ４．２７抗体を添加した。１５分のインキュベート期間後、５０％のヒト補体血清（Ｓｉｇｍａ）を細胞に添加した。３，５時間のインキュベート後、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ及び０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、追加のＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）と共にインキュベートし、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて３０分間インキュベートした。続いてＣｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、次に３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて３時間インキュベートした。ｉＥＭＳリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）におけるＯＤ４９２−６９０の解析により、細胞生存能を評価した。図４Ｂに示すように、ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ１はＣＤＣアッセイにおいて補体媒介性細胞溶解を誘導しているが、その一方でｈＩｇＧ４としてフォーマットされたものは補体媒介性細胞傷害性を誘導していない。
【０３７８】
実施例９：ｈＣＴＬＡ４．２７及び対照抗体のクロス競合
１０Ｄ１（イピリムマブ）及びＣＰ−６７５，２０６（トレメリムマブ）と比較してのｈＣＴＬＡ４．２７の結合部位の違いを特徴づけるため、先に説明されているようにバイオライトインターフェロメトリーを用いて抗体間の競合をプロファイリングした。アミン反応性バイオセンサーは、０．１ＭのＭＥＳ  ｐＨ＝５．５を含むウェルに１０分間浸漬することにより、予め湿らせた。次に、０．１ＭのＮＨＳ／０．４ＭのＥＤＣ混合物を用いてバイオセンサーを５分間活性化した。ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４としてフォーマットされたｈＣＴＬＡ４．２７を、０．１ＭのＭＥＳ中１２μｇ／ｍｌのｍＡｂの溶液に７．５分間バイオセンサーを浸漬することにより結合させた。１Ｍのエタノールアミンの溶液を用いてバイオセンサー表面を５分間クエンチした。バイオセンサーをＯｃｔｅｔ動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で５分間平衡化した。固定濃度のｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ（１２μｇ／ｍｌ）を含有するウェルにバイオセンサーを入れ、１５分間インターフェロメトリーをモニタリングすることにより、ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃの会合を観察した。次に、さらなる２分間、バイオセンサーに結合させた同じ抗ｈＣＴＬＡ−４  ｍＡｂを結合させて、全ての利用可能なｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ結合部位の結合を確実にした。競合か非競合かの判定は、バイオセンサーを５分間、固定濃度（６μｇ／ｍｌ）の別のまたは同じ抗ｈＣＴＬＡ−４  ｍＡｂを含有するウェルに入れるか、または動態緩衝液のみを含有する参照ウェルに入れることにより行った。表９に示すように、この直接競合アッセイでは、ｒｈＣＴＬＡ−４に対するｈＣＴＬＡ４．２７の結合は、ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃに対する対照抗体の結合をブロックしていない。
【０３７９】
【表９】
2019532619.tif 000034
【０３８０】
実施例１０：ヒト／マウスＣＴＬＡ−４交換変異体への結合
２つのｈＣＴＬＡ−４変異体を用いて、１０Ｄ１及びＣＰ−６７５，２０６と比較してのｈＣＴＬＡ４．２７間の結合領域の違いを確認した。ｈＣＴＬＡ−４を、半分がヒトで半分がマウスであるように設計した。ＣＴＬＡ−４の折り畳み、Ｉｇ様Ｖ型（免疫グロブリン様）ドメインに基づいて、タンパク質を２つのサブドメイン（１つは接続ループを含めてベータストランド１、２、５、及び６を含有し、１つは接続ループを含めてベータストランド３、４、７、８を含有する）に分けることができる。ヒト−マウスバリアント（配列番号４２、Ｈｕｍ−Ｍｏｕ−ＣＴＬＡ−４）は、ストランド１、２、５、及び６にヒト残基を含有し、ストランド３、４、７、及び８にマウス残基（配列番号４６）を含有する。マウス−ヒトバリアント（配列番号４４、Ｍｏｕ−Ｈｕｍ−ＣＴＬＡ−４）は、ストランド１、２、５、及び６にマウス残基を含有し、ストランド３、４、７、及び８にヒト残基を含有する。
【０３８１】
これらのコンストラクト（それぞれ配列番号４１及び４３）をコードするｃＤＮＡを合成し、ｐＣＩ−Ｎｅｏベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ）にサブクローニングした。この交換変異体に対するｈＣＴＬＡ４．２７ＡキメラｈＩｇＧ４（ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ４）、１０Ｄ１、及びＣＰ−６７５，２０５の結合を、ＣＥＬＩＳＡを用いて試験した。この目的に対し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞への一時的な形質移入を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）、マウスＣＴＬＡ−４（ｍＣＴＬＡ−４）（配列番号４５）、Ｈｕｍ−Ｍｏｕ−ＣＴＬＡ−４、及びＭｏｕ−Ｈｕｍ−ＣＴＬＡ４をそれぞれ発現するｐＣＩ−Ｎｅｏベクターで行った。形質移入した細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて、培地（５％の新生仔ウシ血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ））中で、コンフルエントになるまで培養した。続いて、細胞をトリプシン処理し、組織培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて培地中でコンフルエントになるまで培養した。次に、培地を除去し、細胞を、ｈＣＴＬＡ−４抗体と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、１：２，０００ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の湿度にて１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ＣＴＬＡ−４免疫反応性をＴＭＢ安定化色原体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６１０ｎｍにおける吸光度を読み取った。ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ．Ｃ４はヒト−マウス交換変異体に対する結合を示したが、その一方で、１０Ｄ１及びＣＰ−６７５，２０６はマウス−ヒト交換変異体に結合することができなかった（図５）。
【０３８２】
実施例１１：ｈＣＴＬＡ−４とｈＣＴＬＡ４．２７Ａとの間の相互作用界面のマッピング
重水素化した化学架橋を行い、次に酵素消化を行い、質量分析法を用いて検出することを伴う手順により、ｈＣＴＬＡ−４に対するｈＣＴＬＡ４．２７Ａの結合エピトープを解明した。最初に、抗体ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ及び抗原ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ６Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；配列番号５９）をインキュベートして結合及び完全性を促進し、ＨＭ４相互作用モジュール（ＣｏｖａｌＸ）を搭載したＵｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）により、凝集レベルを検証した。この対照実験向けに、抗体または抗原の１０μＬの試料の希釈系列（１から１２８倍希釈、１ｍｇ／ｍＬで開始）を調製した。各試料のうち、９μＬは、Ｋ２００  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ解析キットを製造業者（ＣｏｖａｌＸ）の指示に従って用いて架橋に供し、１８０分間インキュベートした。一方、１μＬは質量分析法解析（Ｈｉｇｈ−Ｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ）に直接使用した。質量分析法解析により、抗体及び抗原が予測された分子量を有することが示され、それぞれ１５２．２５ｋＤａ（架橋剤を伴って１６０．９４ｋＤａ）及び８８．２５ｋＤａ（架橋剤を伴って９５．１９ｋＤａ）であった。抗原−抗体複合体のキャラクタリゼーション向けに、２倍過剰の抗原（抗原：抗体の比は４μＭ：２μＭ）を用いて混合物を作製した。抗原−抗体複合体混合物のうち、９μＬは、Ｋ２００  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ解析キットを製造業者の指示に従って用いて架橋に供し、一方１μＬは、質量分析法解析に直接使用した。検出された質量（抗体（１４９．９１６ｋＤａ）及び抗原（８８．２１１））は、先に検出された分子量に対応している。抗原−抗体複合体は、架橋後、１：１（２３９．１１３ｋＤａ）及び１：２（３２６．４１５ｋＤａ）の化学量論（ｈＣＴＬＡ４．２７Ａ：ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ）を有する２つの非共有結合の複合体として検出された。非共有結合的に結合した抗体及び抗原、非共有結合の凝集体、または非特異性の多量体は検出されなかった。
【０３８３】
次に、ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃのペプチドマスフィンガープリンティングを実施した。試料を、製造業者の指示に従って、ＡＳＰ−Ｎ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びサーモリシン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）のタンパク質分解に供し、次にＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適合したＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）システムを用いたｎＬＣ−ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ／ＭＳによる解析を行った。このタンパク質分解アレイの結果から、同定されたペプチドにより網羅される配列の９２．５２％がもたらされた。
【０３８４】
ｒｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ抗原上における抗体ｈＣＴＬＡ４．２７Ａのエピトープを高分解能で決定するため、抗体／抗原複合体（抗原：抗体の比４μＭ：２μＭ）を、重水素化した架橋剤ｄ０／ｄ１２（Ｋ２００  ＭＡＬＤＩキット）と共に１８０分間インキュベートし、酵素ＡＳＰ−Ｎ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びサーモリシンによる多酵素切断に供した。架橋ペプチドを濃縮した後、高分解能質量分析法（ｎＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ）により試料を解析し、ＸＱｕｅｓｔ［Ｙ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．，２００８，４，８１６−８２３］及びＳｔａｖｒｏｘ［Ｇｏｔｚｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２  Ｊａｎ；２３（１）：７６−８７］を用いて生成データを解析した。これらの種々のタンパク質分解アプローチから得られた架橋ペプチドを図６に示す。ｈＣＴＬＡ４．２７Ａの結合エピトープは、ＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴ（配列番号５３）として同定された。これは、抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１のエピトープ（Ｒａｍａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２０１７；１１４（２１）：Ｅ４２２３−Ｅ４２３２）やＣＰ−６７５，２０６のエピトープ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１３３５４）とは明確に異なる。
【０３８５】
当業者は、本発明が、目的の実行や、言及された目標及び利点、そしてその中に本来備わるものの取得に十分適応していることを容易に理解する。本明細書で提供される実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されていない。
【０３８６】
本発明が、その適用において、以下の説明で示されているまたは図面で例示されている構成の詳細にも構成成分の配置にも限定されないことを理解されたい。本発明は、記載されているもの以外の実施形態も可能であり、また様々なやり方で実施及び実行が可能である。また、本明細書及び要約で用いられる表現や用語は、説明を目的としているものであり、限定的なものとしてみなされるべきではないことも理解されたい。
【０３８７】
そのため、当業者であれば、本開示が基づいている概念が、本発明のいくつかの目的を実行するための他の構造、方法、及びシステムの設計の基礎として、容易に利用され得ることを理解する。したがって、このような等価的構成が本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない限りにおいて、請求項が当該構成を含むものとしてみなされることは重要である。
【０３８８】
本発明は、当業者が作製及び使用するのに十分に詳細な説明及び例示がなされてきたが、様々な代替物、修正、及び改善が、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく明らかであるはずである。本明細書で提供される実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されていない。当業者であれば、これにおける修正及び他の用法を想到する。このような修正は、本発明の趣旨の範囲内に含まれ、請求項の範囲により定義される。
【０３８９】
本明細書で開示されている本発明に対し、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な置き換え及び修正がなされ得ることが、当業者には容易に明らかとなる。
【０３９０】
本明細書で言及されている全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野における当業者のレベルを示すものである。
【０３９１】
本明細書で例示的に説明されている本発明は、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素（１つまたは複数）、限定（１つまたは複数）の不在下で、好適に実施することができる。したがって、本発明は好ましい実施形態及び任意選択の特徴により具体的に開示されているものの、本明細書で開示されている概要の修正及びバリエーションは当業者に委ねられ得るものであり、このような修正及びバリエーションは、付属の請求項により定義される本発明の範囲内にあると考えられる。
【０３９２】
その他の実施形態は、以下の請求項内に示される。
【図１】
2019532619.tif 000035
【図２】
2019532619.tif 000036
【図３】
2019532619.tif 000037
【図４Ａ】
2019532619.tif 000038
【図４Ｂ】
2019532619.tif 000039
【図５】
2019532619.tif 000040
【図６】
2019532619.tif 000041
【配列表】
2019532619000001.app
【国際調査報告】
2019532619.tif 000042
2019532619.tif 000043
2019532619.tif 000044