(57)【要約】本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）の処置のための方法、組成物、およびキットに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病の処置のための、新規クラスの化合物、すなわちＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６Ｋ）の阻害剤、ｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤、およびｒｐｓ６の阻害剤の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するための、特定のＣｈｋ２阻害剤の使用および特定のフェノチアジン誘導体の使用に関する。
2019524735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ｐ９０Ｓ６Ｋ活性を低下させ、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、リボソームｓ６キナーゼであるＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６ｋ）の阻害剤を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、およびＲＳＫ３からなる群から選択されるバリアントを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＲＳＫ２を選択的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、核酸、小分子化合物、またはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＳＬ０１０１（ＳＬ）、またはＳＬ０１０１（ＳＬ）の誘導体もしくはアナログであり、ＳＬ０１０１（ＳＬ）が、以下の構造：
【化３７】
2019524735.tif 000044
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）、またはＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）の誘導体もしくはアナログであり、ＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）が、以下の構造：
【化３８】
2019524735.tif 000045
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ｐ７０Ｓ６Ｋ活性を低下させ、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、ＲＳＫ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）の阻害剤を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記ｐ７０Ｓ６ｋの阻害剤が、核酸、小分子化合物、またはタンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐ７０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）、またはＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）の誘導体もしくはアナログであり、ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）が、以下の構造：
【化３９】
2019524735.tif 000046
を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、Ｃｈｋ２の阻害剤を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記Ｃｈｋ２の阻害剤が、ＣＣＴおよびＩＩＩまたはそれらの誘導体からなる群から選択される化合物を含み、ＣＣＴおよびＩＩＩが、以下の構造：
【化４０】
2019524735.tif 000047
を有する、方法。
【請求項１１】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、カルモジュリンの阻害剤を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記カルモジュリンの阻害剤が、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログであり、前記フェノチアジン化合物が、以下の構造：
【化４１】
2019524735.tif 000048
を有するＡＣＶ−１−２３５（ＡＣＶ）；ＪＪＭ−ＩＩ−２２１Ｅ（２２１Ｅ）；およびＤＢ１０２６（ＰｅｒＳｕｃｃ）からなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、以下の構造：
【化４２】
2019524735.tif 000049
【化４３】
2019524735.tif 000050
【化４４】
2019524735.tif 000051
を有する、ＤＢ−４−０８３（０８３）；ＤＢ−４−０８４（０８４）；ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）からなる群から選択される、方法。
【請求項１３】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、式（Ｉ）：
【化４５】
2019524735.tif 000052
（式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アシル、アリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、またはアルキルアリールであり；
各々のＲは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、またはＳＯ３Ｈである）
の化合物、ならびにその異性体および薬学的に許容される塩である、方法。
【請求項１４】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、式（ＩＩ）：
【化４６】
2019524735.tif 000053
（式中、
各々のＲ２１は、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
の化合物、その異性体および薬学的に許容される塩である、方法。
【請求項１５】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、構造：
【化４７】
2019524735.tif 000054
の化合物である、方法。
【請求項１６】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のカルシウムチャネル遮断剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭまたはその誘導体もしくはアナログを前記対象に投与することを含み、ＢＡＰＴＡ−ＡＭが、以下の構造：
【化４８】
2019524735.tif 000055
を有する、方法。
【請求項１７】
リボソーム障害を有する前記対象が、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）または遺伝性赤芽球減少症を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ＤＢＡ１、ＤＢＡ２、ＤＢＡ３、ＤＢＡ４、ＤＢＡ５、ＤＢＡ６、ＤＢＡ７、またはＤＢＡ８を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、リボソームタンパク質１９（ＲＰＳ１９）に突然変異を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、ＲＰＳ７、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２４、ＰＲＳ２６、ＲＰＳ１７、ＰＲＳ２７Ｌ、ＲＰＳ２９、ＲＰＬ３５Ａ、ＰＲＬ５、およびＰＰＬ１１から選択されるリボソームタンパク質に突然変異を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、ｒＰＬ２Ａ、ｒＰＬ２Ｂ、ｒＰＬ３、ｒｐＬ４Ａ、ｒＰＬ４Ｂ、ｒＰＬ７Ａ、ｒＰＬ７Ｂ、ｒＰＬ１０、ｒＰＬ１１、ｒＰＬ１６Ａ、ｒＰＬ１７Ａ、ｒＰＬ１７Ｂ、ｒＰＬ１８Ａ、ｒＰＬ１８Ｂ、Ｒｐｌ１９Ａ、ｒＰＬ１９、ｒＰＬ２５、ｒＰＬ２９、ｒｐＬ３１Ａ、ｒｐＬ３１Ｂ、ｒＰＬ３６Ａ、ｒＰＬ４０Ａ、ｒＰＳ１Ａ、ｒＰＳ６Ａ、ｒＰＳ６Ｂ、ｒＰＳ１４Ａ、ｒＰＳ１５、ｒＰＳ１９、ｒＰＳ２３Ｂ、ｒＰＳ２５Ａ、ｒＰＳ２６Ｂ、ｒＰＳ２９、ｒＰＳ２９Ｂ、およびｒＰＳ３１からなる群から選択されるリボソームタンパク質に突然変異を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、コルチコステロイド、輸血からなる群から選択される、リボソームタンパク質欠損を処置するための別の治療剤を投与されている、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記有効量が、前記対象におけるＣＤ７１＋赤血球細胞の数を増加させる、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記有効量が、前記対象におけるヘモグロビンレベルを増加させる、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、大球性貧血または頭蓋顔面異常の症状を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記リボソーム病が、骨髄異形成である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記骨髄異形成が、５ｑ−骨髄異形成である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が、Ｒｐｓ１４における突然変異またはＲｐｓ１４発現における減少を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
対象が、異形成骨髄の症状を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記リボソーム病が、シュバッハマンダイアモンド症候群である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、Ｓｂｄｓに突然変異を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
対象が、膵機能不全、骨髄機能不全、骨格奇形から選択される症状を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記リボソーム病が、トリーチャーコリンズ症候群である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、ＴＣＯＦ１（核小体）に突然変異を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、頭蓋顔面変形の症状を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年７月１３日に出願された「ＣＡＬＭＯＤＵＬＩＮ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ，  ＣＨＫ２  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  ＡＮＤ  ＲＳＫ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＲＩＢＯＳＯＭＡＬ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＲＩＢＯＳＯＭＡＰＡＴＨＩＥＳ」と題する米国仮出願番号第６２／３６１，６３１号に基づく利益および優先権を主張しておりこの仮出願は、その全体が参考として本明細書中に本明細書によって援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、部分的に、アメリカ国立衛生研究所の助成金ＮＨＬＢＩ  ５Ｕ０１  ＨＬ１０００１−０２の米国政府の支援によってなされた。米国政府は本出願について、ある一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばダイアモンド−ブラックファン貧血（aanemia）（ＤＢＡ）の処置のための方法、組成物、およびキットに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病を処置するための、新規クラスの化合物、すなわちＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６Ｋ）の阻害剤、ｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤、およびｒｐｓ６の阻害剤の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するための、特定のＣｈｋ２阻害剤の使用および特定のフェノチアジン誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）は、しばしば１歳前に小児に現れる先天性貧血である（Vlachosら、２００８年）。これらの患者の初発症状は、赤血球分化の阻止と造血幹細胞（ＨＳＣ）の起こり得る欠損であり、一部の患者はまた頭蓋顔面異常を有する。リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）は、ＤＢＡ患者において突然変異していると最初に見出された遺伝子である（Draptchinskaiaら、１９９９年）。患者試料の配列決定により、５０％を超える患者において、大（６０ｓ）または小（４０ｓ）サブユニットのリボソームタンパク質のいずれかの突然変異が同定され（Vlachosら、２０１０年）、最近では突然変異がｒｐｓ２９において同定されている。患者はこれらの突然変異についてヘテロ接合型であり、罹患したリボソームタンパク質遺伝子の野生型コピーを常に維持している。
【０００５】
リボソームタンパク質ノックダウンは、遊離リボソームタンパク質の増加をもたらす。ＲＰＬ１１およびＲＰＬ５を含むいくつかのリボソームタンパク質は、それらがＭＤＭ２に結合し、それをｐ５３から隔離することができるので、ｐ５３の分解を防ぐことができる（Fumagalliら、２００９年）。ＲＰＬ２６は、それがｐ５３ｍＲＮＡに結合してその翻訳を増加させることができるので、代替的なメカニズムによってｐ５３タンパク質を増加させることが示されている（Tagakiら、２００５年）。ｐ５３活性化は、現在はリボソーム病と呼ばれる、リボソームおよび関連遺伝子が突然変異している他の疾患と同様に、ＤＢＡの病因において重要な役割を果たす。これらには、１コピーのＲＰＳ１４が欠失する５ｑ−骨髄異形成症候群が含まれる。ｐ５３活性化はまた、ファンコニー貧血などの骨髄機能不全障害における一般的な特徴でもある（Ceccaldiら、２０１２年）。ヒトＣＤ３４＋細胞において、ＲＰＳ１９ノックダウンは、ｐ５３活性化をもたらし（Ebertら、２００５年；Flygareら、２００５年）、赤血球細胞における蓄積の増加を伴う。分化の欠損はｐ５３阻害により救済することができる（Duttら、２０１１年）。ＲＰＳ１９突然変異またはノックダウンのマウスモデルは、ｐ５３突然変異によって救済することができる造血の欠損を有する（McGowanら、２００８年；Jaakoら、２０１１年）。Ｒｐｓ１９はゼブラフィッシュ胚においてモルホリノの標的であり、ｒｐｌ１１突然変異ゼブラフィッシュにおける造血の欠損はｐ５３ノックダウンにより救済される（Danilovaら、２００８年；Toriharaら、２０１１年；Danilovaら、２０１１年）。
【０００６】
リボソームタンパク質の突然変異は、赤血球無形成および頭蓋顔面異常を有する、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）を有する患者において一般的である。本発明者らは、造血および内皮の欠損を有するゼブラフィッシュの突然変異ｒｐｓ２９、すなわち小サブユニットのリボソームタンパク質を以前に分析した（Taylorら、２０１２年）。Ｒｐｓ２９−／−胚は、頭部の形態学的欠損を有し、造血幹細胞、ヘモグロビン、内皮マーカーの染色が減少していた。ＤＢＡの他のモデルと一致して、ｐ５３のノックダウンはほぼ完全にｒｐｓ２９の突然変異表現型を救済する。
【０００７】
本発明者らは、Ｒｐｓ２９−／−胚が動脈の特異化に欠損を有し、ＨＳＣの減少、および受精２４時間後（ｈｐｆ）の分節間血管におけるｆｌｋ１発現の減少をもたらすことを以前に実証した。ｒｐｓ２９−／−胚はヘモグロビンが少ないため、原始赤血球生成もまた影響を受ける。これらの胚はまた、特に頭部におけるアポトーシスの増加を有し、受精５日後（ｄｐｆ）までに死亡する。ｐ５３経路は胚において活性化され、ｐ５３突然変異はすべての造血およびアポトーシスの表現型を救済する。これらのモデル系を使用して、本発明者らは、カルモジュリン（ＣＡＭ）阻害剤およびＣａ２＋阻害剤は、Ｒｐｓ２９−／−表現型を救済することができ、リボソーム障害またはリボソーム病、例えばダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）を処置するために使用することができることを見出した（例えば米国特許出願公開第２０１５／０２６５６２７号を参照）。
【０００８】
処置のための化合物の同定において著しい進歩がなされている一方で、リボソーム障害またはリボソーム病、例えば、リボソームタンパク質の突然変異の処置のための現在の処置選択肢は、特にＤＢＡにとって最適からは程遠い。したがって、リボソーム障害またはリボソーム病、例えばリボソームタンパク質における突然変異に関連するこれらの疾患のための新規で効果的で標的化された治療法を発見することは依然として不可欠である。特に、当技術分野において、ＤＢＡを小分子薬物で処置するための改善された方法に対する強い必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／０２６５６２７号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Vlachos  A,  Ball  S,  Dahl  N,  et  al.  Diagnosing  and  treating  Diamond  Blackfan  anemia:  results  of  an  international  clinical  consensus  conference.  Br  J  Haematol  2008;142:859-76.
【非特許文献２】Draptchinskaia  N,  Gustavsson  P,  Andersson  B,  et  al.  The  gene  encoding  ribosomal  protein  S19  is  mutated  in  Diamond-Blackfan  anemia.  Nat  Genet  1999;21:169-75.
【非特許文献３】Fumagalli  S,  Di  Cara  A,  Neb-Gulati  A,  et  al.  Absence  of  nucleolar  disruption  after  impairment  of  40S  ribosome  biogenesis  reveals  an  rpL11-translation-dependent  mechanism  of  p53  induction.  Nat  Cell  Biol  2009;11:501-8.
【非特許文献４】Takagi  M,  Absalon  MJ,  McLure  KG,  Kastan  MB.  Regulation  of  p53  translation  and  induction  after  DNA  damage  by  ribosomal  protein  L26  and  nucleolin.  Cell  2005;123:49-63.
【非特許文献５】Ebert  BL,  Lee  MM,  Pretz  JL,  et  al.  An  RNA  interference  model  of  RPS19  deficiency  in  Diamond-Blackfan  anemia  recapitulates  defective  hematopoiesis  and  rescue  by  dexamethasone:  identification  of  dexamethasone-responsive  genes  by  microarray.  Blood  2005;105:4620-6.
【非特許文献６】Flygare  J,  Kiefer  T,  Miyake  K,  et  al.  Deficiency  of  ribosomal  protein  S19  in  CD34+  cells  generated  by  siRNA  blocks  erythroid  development  and  mimics  defects  seen  in  Diamond-Blackfan  anemia.  Blood  2005;105:4627-34.
【非特許文献７】Dutt  S,  Narla  A,  Lin  K,  et  al.  Haploinsufficiency  for  ribosomal  protein  genes  causes  selective  activation  of  p53  in  human  erythroid  progenitor  cells.  Blood  2011;117:2567-76.
【非特許文献８】McGowan  KA,  Li  JZ,  Park  CY,  et  al.  Ribosomal  mutations  cause  p53-mediated  dark  skin  and  pleiotropic  effects.  Nat  Genet  2008;40:963-70.
【非特許文献９】Jaako  P,  Flygare  J,  Olsson  K,  et  al.  Mice  with  ribosomal  protein  S19  deficiency  develop  bone  marrow  failure  and  symptoms  like  patients  with  Diamond-Blackfan  anemia.  Blood  2011;118:6087-96.
【非特許文献１０】Danilova  N,  Sakamoto  KM,  Lin  S.  Ribosomal  protein  S19  deficiency  in  zebrafish  leads  to  developmental  abnormalities  and  defective  erythropoiesis  through  activation  of  p53  protein  family.  Blood  2008;112:5228-37.
【非特許文献１１】Danilova  N,  Sakamoto  KM,  Lin  S.  Ribosomal  protein  L11  mutation  in  zebrafish  leads  to  hematopoietic  and  metabolic  defects.  Br  J  Haematol  2011;152:217-28.
【非特許文献１２】Taylor  AM,  Humphries  JM,  White  RM,  Murphey  RD,  Burns  CE,  Zon  LI.  Hematopoietic  defects  in  rps29  mutant  zebrafish  depend  upon  p53  activation.  Exp  Hematol  2012;40:228-37  e5.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、概して、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）の処置のための方法、組成物、およびキットに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病の処置のための、新規クラスの化合物、すなわちＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６Ｋ）の阻害剤、例えばＳＬおよびＳＫ、ならびにｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤、例えばＰＦ、ならびにｒｐｓ６の阻害剤の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡの処置のための、特定のＣｈｋ２阻害剤、例えば、ＣＣＴおよびＩＩＩの使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するための、特定のフェノチアジン誘導体、例えば、ペルフェナジン（ＰｅｒＳｕｃｃ）、またはＡＣＶ、または２２１Ｅ、またはＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）、またはＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）、またはＤＢ−４−０８６（０８６）、またはＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）、またはＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）、またはＤＢ−４−０８９（０８９））の使用に関する。
【００１２】
特に、本発明は、部分的に、リボソームタンパク質欠損細胞、例えばＲＰＡ１９欠損細胞においてＲＳＫシグナル伝達が上方制御されているという発見に基づく。本発明者らは、ＲＳＫがＣＤ３４＋細胞におけるＲＰＳ１９欠損により活性化されること、およびＲＳＫ（ｐ９０ｓ６Ｋ）の阻害剤ならびにｐ７０ｓ６Ｋの阻害剤が、リボソームタンパク質欠損のｉｎ  ｖｉｖｏモデルであるｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚におけるヘモグロビン（Ｈｂ）を増加させることを発見した。本発明者らはさらに、これまでに開示されていない特定のＣｈｋ２の阻害剤、すなわちＣＣＴおよびＩＩＩがｒｐｓ２９−／−胚のＨｂを救済することを決定した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚における形態学的欠損および造血および内皮の欠損を救済するのに特に有効である、ＡＣＶ；２２Ｅ１；ＰｅｒＳｕｃｃ；ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；およびＤＢ−４−０８９（０８９）などのこれまでに開示されていない特定のフェノチアジン誘導体を同定した。フェノチアジン誘導体ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）は有益にも、挙動スクリーニングにおいてはゼブラフィッシュの挙動を変化させず、フェノチアジン誘導体ＤＢ−４−０８９は、低濃度でＨｂを増加させ、赤血球分化を増加させた。フェノチアジン誘導体化合物ＤＢ−４−０８３（０８３）；ＤＢ−４−０８４（０８４）；およびＤＢ−４−０８６（０８６）は、ＤＢ−４−０８９と同一の低濃度においてＨｂを増加させなかった。
【００１４】
ある特定の実施形態では、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するためのフェノチアジン化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
2019524735.tif 000003
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アシル、アリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、またはアルキルアリールであり；
各々のＲは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、またはＳＯ３Ｈである）
の化合物、ならびにその異性体および薬学的に許容される塩である。本明細書のフェノチアジン化合物と題する節を参照されたい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するためのフェノチアジン化合物は、式ＩＩ：
【化２】
2019524735.tif 000004
（式中、
各々のＲ２１は、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
の化合物、ならびにその異性体および薬学的に許容される塩である。本明細書のフェノチアジン化合物と題する節を参照されたい。
【００１６】
一実施形態では、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するためのフェノチアジン化合物は、構造：
【化３】
2019524735.tif 000005
の化合物である。
【００１７】
したがって、ＲＳＫシグナル伝達の阻害剤、例えば、ＲＳＫのｐ９０ｓ６Ｋおよびｐ７０ｓ６Ｋの阻害剤、ｒｓｐ６の阻害剤、ならびに本明細書において開示される特定のフェノチアジン誘導体および（ＣａＭ）阻害剤化合物（例えばＢＡＢＴＡ）は、リボソームタンパク質障害またはリボソーム病、例えば、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）および他のリボソーム病、例えば、ヒト対象における５ｑ−骨髄異形成、シュバッハマンダイアモンド症候群、およびトリーチャーコリンズ症候群を含む骨髄異形成を有する対象の処置のための方法において使用することができる。
【００１８】
したがって、本発明の一態様は、リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ＲＳＫ（ｐ９０ｓ６Ｋ）活性を低下させ、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６ｋ）の阻害剤を対象に投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤は、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、およびＲＳＫ３からなる群から選択されるバリアントを阻害する。一実施形態では、ｐ９０ｓ６Ｋの阻害剤は、ＲＳＫ２を選択的に阻害する。任意のｐ９０ｓ６Ｋの阻害剤は、本発明の方法において有用であり、例えば、阻害剤は、核酸（例えば、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡなどのようなＤＮＡもしくはＲＮＡ）、または小分子化合物、またはタンパク質、例えばペプチドもしくは抗体、もしくは抗体の断片であってもよい。一実施形態では、ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤は、ＳＬ０１０１（ＳＬ）またはＳＬの誘導体もしくはアナログ；ＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）またはＢＩの誘導体もしくはアナログ；またはＳＫまたはこの化合物の誘導体もしくはアナログからなる群から選択される化合物である。
【００１９】
本発明の別の態様では、リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法が提供され、方法は、ｐ７０Ｓ６Ｋ活性を低下させ、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤を対象に投与することを含む。任意のｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤は、本発明の方法において有用であり、例えば、阻害剤は、核酸（例えば、ＲＮＡｉもしくはｓｈＲＮＡなどのようなＤＮＡもしくはＲＮＡ）であり得、または小分子化合物、もしくはタンパク質、例えばペプチドもしくは抗体、もしくはそれらの断片であり得る。一実施形態では、ｐ７０Ｓ６ｋの阻害剤は、この化合物ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）または化合物の誘導体もしくはアナログである。
【００２０】
別の態様では、リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法が提供され、方法は、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のＣｈｋ２の阻害剤を対象に投与することを含み、Ｃｈｋ２の阻害剤は、ＣＣＴおよびＩＩＩ、またはそれらの誘導体からなる群から選択される化合物を含む。
【００２１】
さらに別の態様では、リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のカルモジュリンの阻害剤を対象に投与することを含み、カルモジュリンの阻害剤が、フェノチアジン化合物、またはフェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログであり、フェノチアジン化合物が、ＡＣＶ−１−２３５（ＡＣＶ）；ＪＪＭ−ＩＩ−２２１Ｅ（２２１Ｅ）；およびＤＢ１０２６（ＰｅｒＳｕｃｃ）、ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物からなる群から選択される、方法が提供される。
【００２２】
提供される別の態様は、リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のカルシウムチャネル遮断剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭまたはその誘導体もしくはアナログを対象に投与することを含む、方法である。
【００２３】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、方法は、リボソーム障害を有する対象を処置することを含み、対象は、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）または遺伝性赤芽球減少症を有し、例えば、対照は、ＤＢＡ１、ＤＢＡ２、ＤＢＡ３、ＤＢＡ４、ＤＢＡ５、ＤＢＡ６、ＤＢＡ７、またはＤＢＡ８を有する。いくつかの実施形態では、リボソーム障害を有する対象は、リボソームタンパク質１９（ＲＰＳ１９）に突然変異を有する。代替的な実施形態では、リボソーム障害を有する対象は、ＲＰＳ７、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２４、ＰＲＳ２６、ＲＰＳ１７、ＰＲＳ２７Ｌ、ＲＰＳ２９、ＲＰＬ３５Ａ、ＰＲＬ５、およびＰＰＬ１１のうちの少なくとも１つに由来するがこれに限定されない、リボソームタンパク質に突然変異を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、リボソーム障害を有する対象は、ｒＰＬ２Ａ、ｒＰＬ２Ｂ、ｒＰＬ３、ｒｐＬ４Ａ、ｒＰＬ４Ｂ、ｒＰＬ７Ａ、ｒＰＬ７Ｂ、ｒＰＬ１０、ｒＰＬ１１、ｒＰＬ１６Ａ、ｒＰＬ１７Ａ、ｒＰＬ１７Ｂ、ｒＰＬ１８Ａ、ｒＰＬ１８Ｂ、Ｒｐｌ１９Ａ、ｒＰＬ１９、ｒＰＬ２５、ｒＰＬ２９、ｒｐＬ３１Ａ、ｒｐＬ３１Ｂ、ｒＰＬ３６Ａ、ｒＰＬ４０Ａ、ｒＰＳ１Ａ、ｒＰＳ６Ａ、ｒＰＳ６Ｂ、ｒＰＳ１４Ａ、ｒＰＳ１５、ｒＰＳ１９、ｒＰＳ２３Ｂ、ｒＰＳ２５Ａ、ｒＰＳ２６Ｂ、ｒＰＳ２９、ｒＰＳ２９Ｂ、およびｒＰＳ３１からなる群から選択されるリボソームタンパク質に突然変異を有する。
【００２５】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、方法は、コルチコステロイド、輸血、および当業者に公知の他の処置からなる群から選択される、リボソームタンパク質欠損を処置するための別の治療剤を投与することをさらに含む。
【００２６】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、対象に投与される阻害剤は、対象におけるＣＤ７１＋赤血球細胞の数を増加させ、および／または対象におけるヘモグロビンレベルを増加させる。
【００２７】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法および阻害剤は、ＤＢＡが大球性貧血および／または頭蓋顔面異常の症状を有するなどのリボソーム障害を有する対象を処置するために使用できる。
【００２８】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法および阻害剤および阻害剤は、５ｑ−骨髄異形成などのリボソーム病を有する対象を処置するために使用でき、例えば、対象は、Ｒｐｓ１４における突然変異を有するか、Ｒｐｓ１４発現の減少を有する。いくつかの実施形態では、５ｑ−骨髄異形成を有する対象は、異形成骨髄を有する。
【００２９】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような方法および阻害剤は、シュバッハマンダイアモンド症候群などのリボソーム病を有する対象を処置するために使用でき、例えば、対象は、Ｓｂｄｓに突然変異を有する。いくつかの実施形態では、シュバッハマンダイアモンド症候群を有する対象は、膵機能不全、骨髄機能不全、骨格奇形から選択される１つまたは複数の症状を有する。
【００３０】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような方法および阻害剤は、トリーチャーコリンズ症候群などのリボソーム病を有する対象を処置するために使用でき、例えば、対象はＴＣＯＦ１（核小体）に突然変異を有する。いくつかの実施形態では、トリーチャーコリンズ症候群は、１つまたは複数の頭蓋顔面変形を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、本明細書において開示されるようなリボソームタンパク質障害もしくは疾患またはリボソーム病を有する対象を処置する方法において使用するための、本発明において開示されるような阻害剤を含む組成物を含むキットを提供する。
【００３２】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面による本特許または特許出願発行物のコピーは、要請および必要料金の支払時に特許庁から提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）に関連した臨床的特徴、処置および遺伝学を示している。半分を超える患者が、リボソームタンパク質遺伝子に突然変異を有している（全ての突然変異がヘテロ接合型である）。これらの患者のために利用可能な有効な標的化処置はない。
【００３４】
【図２】図２は、さらなるリボソーム病を示すチャートであり、最もよくみられるものは、ＭＤＳの５ｑサブタイプである。本発明者らがＤＢＡモデルで作用することを見出す任意の薬物は、他のリボソーム病を有する患者にも役立つであろう。
【００３５】
【図３】図３は、リボソームタンパク質欠乏の分子的因果関係の概略図である。リボソーム生合成の破壊は、ｐ５３の負の調節因子ＭＤＭ２に結合し隔離する遊離のリボソームタンパク質の蓄積を通じてｐ５３活性化を導く。これにより活性ｐ５３の核内の蓄積が可能となり、ｐ２１およびＧＡＤＤ４５などのｐ５３の下流標的を活性化しうる。
【００３６】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ゼブラフィッシュの写真である。図４Ａは、ｒｐｓ２９に突然変異を有するゼブラフィッシュを示しており、このゼブラフィッシュは、ｃｍｙｂ（造血マーカー）、ｆｌｋ１（内皮血管マーカー）の発現が減少しており、ベンジジン染色（ヘモグロビン（Ｈｂ）を染色）の欠如によって示される貧血である。これらは、リボソームタンパク質のＤＢＡ魚モデルである。（Taylor,  A.M.ら、（２０１２年）、Exp.  Hematol.、４０巻、２２８〜２３７頁、ｅ５．、Mirabello,  L.ら、（２０１４年）、Blood、１２４巻、２４〜３２頁）。図４Ｂは、救済された表現型のゼブラフィッシュ写真を示す。ＤＢＡの他の動物モデルと一致して、ｒｐｓ２９変異体とｐ５３変異体との掛け合わせはこれらの表現型を救済し、造血および内皮欠陥がｐ５３を通じて媒介されることを示す。
【００３７】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ＤＢＡモデルにおけるＨｂ欠陥を救済することができる新規化合物に関するゼブラフィッシュの写真とその化合物の構造を示す。特定のＣｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩは、魚におけるＨｂを救済することができる。図５Ａ：Ａ−３、Ｗ−７、ＣＣＴおよびＩＩＩ救済に関するゼブラフィッシュの写真。図５Ｂ：ｒｐｓ２９−／−胚におけるＨｂ救済が化学物質スクリーニングによって同定された、ＴＦＰ、Ａ−３、Ｗ−７、ＣＣＴおよびＩＩＩ化合物の化学構造。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ＤＢＡモデルにおけるＨｂ欠陥を救済することができる新規化合物に関するゼブラフィッシュの写真とその化合物の構造を示す。特定のＣｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩは、魚におけるＨｂを救済することができる。図５Ａ：Ａ−３、Ｗ−７、ＣＣＴおよびＩＩＩ救済に関するゼブラフィッシュの写真。図５Ｂ：ｒｐｓ２９−／−胚におけるＨｂ救済が化学物質スクリーニングによって同定された、ＴＦＰ、Ａ−３、Ｗ−７、ＣＣＴおよびＩＩＩ化合物の化学構造。
【００３８】
【図６】図６は、カルモジュリンの機能の簡単な概略図を示す。カルモジュリンは、１）進化的に保存されている、２）細胞に豊富にある、３）Ｃａ２＋センサーである、４）タンパク質と相互作用する、５）キナーゼ／ホスファターゼを活性化する、６）ＣａＭ阻害剤はＦＤＡ承認抗精神病薬である、７）トリフルオペラジン（ＴＦＰ）。
【００３９】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＤＢＡのヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける本発明者らの阻害剤の結果を示す概略図およびグラフである。図７Ａ：概略図。臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を４日間培養で拡大させ、ＲＰＳ１９に対するヘアピンまたは対照としてのルシフェラーゼを含有するレンチウイルスで感染させた。選択の３日後、細胞を赤血球分化培地に移し、１２日目まで薬物とインキュベートした。次いで、細胞を、フローサイトメトリー分析およびＲＮＡのために採集した。１２日目に、ＲＰＳ１９欠損細胞は、赤血球前駆細胞を４０％しか有さず、一方で本発明者らの対照細胞は赤血球前駆細胞を７０％有する。図７Ｂ：ＴＦＰ処置後１２日目の赤血球前駆細胞％。ＴＦＰを用いた処置は、ＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを増加させる。ＲＰＳ１９欠乏は、ｐ２１  ｍＲＮＡレベルを上昇させる。図７Ｃは、ＴＦＰ処置後のｐ２１レベルのグラフである。ＴＦＰによる処置は、ｐ２１  ｍＲＮＡを用量依存的に減少させる。このことは、本発明者らのＣｈｋ２阻害剤を用いた場合でも観察された（データ示さず）。したがって、ＣＡＭ阻害剤は、ＤＢＡのヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを救済し、ｐ５３標的遺伝子発現を減少させる。
【００４０】
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、ｄｏｘ誘導性ＲＰＳ１９ノックダウンマウスモデルを使用して、ＴＦＰがＤＢＡ誘導性マウスモデル（Jaako,  P.ら、（２０１１年）、Blood、１１８巻、６０８７〜６０９６頁）で貧血を部分的に救済することを示す、概略図およびグラフである。図８Ａ：手順の概略図。ＷＴマウスに、放射線を当て、ＲＰＳ１９に対するｄｏｘ誘導性ヘアピンを含有するドナーマウス由来の骨髄を移植した。移植後、マウスにｄｏｘを与えてＲｐｓ１９欠乏を誘導し、ＴＦＰで２日に１回、２週間処置した。２週間後、血液および骨髄を分析のために回収する。図８Ｂ：ｐ２１  ｍＲＮＡレベルのグラフ。マウスの骨髄中のｐ５３活性の尺度にｐ２１  ｍＲＮＡレベルを使用するとき、Ｒｐｓ１９欠損マウスは、ｐ２１  ｍＲＮＡレベルが増加した。マウスをＴＦＰで処置すると、マウスにおけるｐ２１  ｍＲＮＡのレベルが低下する。図８Ｃ：赤血球数のグラフ。図８Ｄ：ヘモグロビンレベルのグラフ。ＴＦＰでＲＰＳ１９欠損マウスを処置すると、赤血球数およびヘモグロビンレベルが有意に増加する。したがって、ゼブラフィッシュ化学物質スクリーニングで見出される化合物は、ＤＢＡのヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび哺乳動物ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを救済することができた。
【００４１】
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、概略図およびグラフを示す。図９Ａ：野生型Ｐ５３および調節領域欠失ｐ５３（ｐ５３−ｒｅｇ）の概略図。図９Ｂ：手順の概略図。Ｓａｏｓ２細胞（ｐ５３−ヌル細胞）をｐ５３構築物で一過性トランスフェクトし、ビヒクルまたは２０μＭのＴＦＰで２４時間処置した。ｐ５３に対するＴＦＰ活性を、ｑＰＣＲによって測定されるｐ２１  ｍＲＮＡレベルをＴＦＰが低下させる能力によって評価した。図９Ｃは、ｐ２１ＲＮＡ発現のグラフである。本発明者らの化合物はｐ５３活性を減少させるので、ＣａＭ阻害剤活性に重要であるｐ５３の領域を決定することにした。核局在化配列の突然変異は、ＴＦＰ活性に影響を及さず、ＴＦＰは、ｐ５３が四量体を形成する能力を阻害しなかった。次いで、ｐ５３からｃ末端の３０アミノ酸（３６３〜３９３）を除去した。この構築物が、ｐ５３−ｒｅｇである。本発明者らは、ｐ５３の調節領域（ＲＥＧ）が、ＴＦＰ活性に必要であることを見出した。
【００４２】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤が、Ｓ３９２リン酸化を減少させることを示す概略図、グラフ、およびゲルを示す。図１０Ａは、保存された調節領域リン酸化部位の概略図である。図１０Ｂは、ＣａＭ阻害剤ＴＦＰまたはＣｈｋ２阻害剤ＢＭＬの存在下で変化したｐ５３の翻訳後修飾を調べる不偏（ｕｎｂｉａｓｅｄ）質量分析のグラフである。２９３Ｔ細胞を、ＧＦＰでタグ化したＷＴ−ｐ５３でトランスフェクトし、ＴＦＰまたはＢＭＬで３時間処置した。Ｐ５３を、ＧＦＰに対する抗体を使用して免疫沈降させ、質量スペクトル分析に付した。驚いたことに、１残基のみが、ＴＦＰおよびＢＭＬの存在下で異なってリン酸化されていることが分かった。従来の質量分析またはペプチドのＴＭＴタグ付けによる二つの異なる質量分析法によって、本発明者らは、両方の場合で、リン酸化セリン３９２を含有するペプチドのパーセンテージがＴＦＰおよびＢＭＬ処置試料で減少していることを見出した（図１０Ｂ）。さらに、このセリンが、ゼブラフィッシュおよびマウスの両方で保存されていることに気付いた（図１０Ａ）。図１０Ｃは、リン酸化減少を示すウエスタンブロットである。セリン６およびセリン３１５がリン酸化されることが同定されたが、これらのリン酸化を含むペプチドのパーセンテージは、ＴＦＰまたはＢＭＬ処置で変化しなかった。
【００４３】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ｐ５３  Ｓ３９２リン酸化模倣物（phhosphomimetic）が、ＴＦＰのｐ５３活性減少を防止することを示す概略図およびグラフである。ｐ５３のリン酸化を遮断するＣａＭ阻害剤の能力の重要性を確認するために、構成的リン酸化を模倣するＳ３９２のアスパラギン酸での置き換えによって、リン酸化模倣物ｐ５３を作製した。また、Ｓ１５をアスパラギン酸で置き換えて、対照リン酸化模倣物ｐ５３も生成した。この変異体は、ＴＦＰがｐ５３活性を減少させる能力に影響を及ぼさないはずである。図１１Ａは、これらの変異体を試験するために使用する実験の概略図である。ＷＴ  ｐ５３、Ｓ１５ＤおよびＳ３９２ＤをＳａｏｓ２細胞に一過性トランスフェクトし、それらをビヒクルまたはＴＦＰで処置した。ｐ５３活性を評価するために、ｐ２１およびＭＤＭ２  ｍＲＮＡレベルを調べた。図１１Ｂは、ｐ２１発現のグラフである。図１１Ｃは、ＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現のグラフである。ＷＴ  ｐ５３またはＳ１５Ｄ  ｐ５３を含有する細胞において、ＴＦＰは、ｐ２１およびＭＤＭ２レベルを低下させることができた。しかしながら、ｐ５３  Ｓ３９２Ｄを含有する細胞において、ＴＦＰは、ｐ２１またはＭＤＭ２レベルを低下させることができなかった。Ｓ３９２リン酸化の遮断がＴＦＰの活性に重要であることが確認された。
【００４４】
【図１２】図１２は、ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性の阻害パーセントのグラフを示す。本発明者らは、ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤が、特定のキナーゼを遮断しているかを調べた。Ｓ３９２をリン酸化する公知のキナーゼは、ＣＫ２およびｐ３８である。しかしながら、これらのキナーゼに対する阻害剤は、ｒｐｓ２９−／−フィッシュでＨｂを救済しなかった。したがって、ＴＦＰ阻害の上流は何であるか、それはＳ３９２をリン酸化するキナーゼを阻害するのか、という疑問が生じた。本発明者らは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎを使用して、ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤をキナーゼプロファイリングに付した。１００種のキナーゼのスクリーニングを通じて、本発明者らは、複数のＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤が、リボソームｓ６タンパク質キナーゼファミリーのｐ７０Ｓ６Ｋとｐ９０Ｓ６Ｋ（ＲＳＫ）の両方における複数のキナーゼの活性を遮断していることを見出した。
【００４５】
【図１３】図１３は、ＲＳＫファミリーメンバーのＲＳｋ１（ｐ９０Ｓ６Ｋ）、ＲＳＫ２（ｐ９０Ｓ６Ｋ）、ＲＳＫ３（ｐ９０Ｓ６Ｋ）、ＲＳＫ４、（ｐ９０Ｓ６Ｋ）およびｐ７０Ｓ６Ｋに対するＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性の阻害パーセントのグラフを示す。
【００４６】
【図１４】図１４は、翻訳およびＲＳＫ経路において役割を果たしているＣａＭの文献証拠を示す概略図である。以下の文献を引用している：ｐ５３阻害剤についての２３Ｋ  ｓｈＲＮＡのスクリーニングにおいて、ＲＳＫ阻害剤は、ｐ５３活性（ｐ２１レベル）は減少させるがタンパク質レベルは減少させないことが見出された（Berns,  K.ら、（２００４年）、Nature、４２８巻、４３１〜４３７頁）；増加したカルシウムまたはイオノマイシン処置は持続的なＲＳＫ活性化を引き起こす（Chuderland,  D.、Marmor,  G.、Shainskaya,  A.およびSeger,  R.、（２００８年）、J.  Biol.  Chem.、２８３巻、１１１７６〜１１１８８頁）；ＡＡ酸はＣａ／ＣａＭシグナル伝達を通じてｍＴＯＲを活性化する（Gulati,  P.ら、（２００８年）、Cell  Metabolism、７巻、４５６〜４６５頁）；ＲＳＫ２および３は、ｒｐｓ２９−／−マイクロアレイにおいてＷＴ／ＨＥＴと比較して向上しており、ｍＴＯＲおよびＲＳＫの下流のｐ７０Ｓ６Ｋはｐ５３  Ｓ３９２をリン酸化することができる（Ci,  Y.ら、（２０１４年）、Cell  Death  and  Disease、５巻、ｅ１５４２〜１０頁）。本発明者らは、ＲＰ欠乏がＲＳＫシグナル伝達を増加させ、ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤がＲＳＫから下流のシグナル伝達を遮断していると仮定し、ＲＳＫ活性がリボソームタンパク質欠乏の間に増加しているか否かを調べた。
【００４７】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｒｐｓ２９−／−胚が、ｒｐｓ２９＋／＋胚と比較して、増加したＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６ｋ）、ｐ７０ｓ６ＫおよびＲＰＳ６レベルを有することを示すゲルおよびチャートである。（ホスホ−ＲＳＫ抗体は、ゼブラフィッシュでは作用しない）。図１５Ａ：胚溶解物のゲル。胚全体をＲＩＰＡ緩衝剤で溶解し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させた。レーン１。ＷＴ＝ＷＴ／ｒｐｓ２９＋／−４８ｈｐｆ胚溶解物。レーン２。ＭＵ＝ｒｐｓ２９−／−４８ｈｐｆ胚溶解物。図１５Ｂ：２４ｈｐｆでＷＴとｒｐｓ２９−／−胚とを比較するマイクロアレイ。ＲＳＫ２が、ＷＴ胚に対して１．６倍の平均倍数変化値を有する最も差次的に発現する遺伝子として同定された。比較のために、ｒｐｓ欠乏中に高いことが公知であるｐ５３およびＭＤＭ２の平均倍数変化値も含めた。
【００４８】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＲＳＫおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤がｒｐｓ２９−／−胚においてＨｂを増加させる。図１６Ａ：胚のＨｂレベル％対ＳＬ１０１０の棒グラフ。図１６Ｂ：胚のＨｂレベル％対ＳＬ１０１０の棒グラフ。図１６Ｃ：代表的ゼブラフィッシュの画像；ＳＬ＝ＲＳＫ阻害剤、ＰＦ＝ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤、ＦＬＵ＝ＣａＭ阻害剤。ＣａＭ阻害剤フルフェナジン（ＦＬＵ）は、ＲＳＫまたはｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤のいずれか単独よりも救済に優れる。
【００４９】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃは、ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤が、ＲＰ欠乏の間にｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を選択的に遮断することを示す概略図およびゲルである。図１７Ａ：概略図。２９３Ｔ細胞を使用し、ＲＰＳ１９のためにｓｈＲＮＡ、または対照のためにＬｕｃを使用して、リボソームタンパク質欠乏を誘導した。図１７Ｂ：ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化がリボソームタンパク質欠乏の間にＴＦＰおよびＢＭＬによって選択的に阻害されることを示すゲル。ＥＲＫリン酸化は、これらの阻害剤によって増加し、このことはＲＳＫ阻害剤でも見られる。図１７Ｃ：リン酸化Ｓ３９２に対するＬｕｃおよびＲＰＳ１０  ｓｈＲＮＡの効果に関するゲル。ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤は、ヒト細胞においてリボソームｓ６キナーゼファミリーを阻害する。ＲＳＫ阻害剤は、負のフィードバックループを通じてＥＲＫリン酸化を増加させる。したがって、ＴＦＰおよびＢＭＬは、同様に、同じ様式でＥＲＫに影響を与える。
【００５０】
【図１８】図１８は、ヒト細胞におけるＲＳＫ活性化のアッセイの概略図である。血液分野で最も重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、初代ヒト細胞、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。
【００５１】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｂは、ＲＳｋが、ＣＤ３４細胞においてＲＰＳ１９欠乏の際に活性化されることを示す。図１９Ａ：ＲＰＳ１９欠損ＣＤ３４細胞のＴＦＰ処置の結果を示すリン酸化に関するゲルであり、ＲＰＳ１９ノックダウン細胞においてＲＳＫが活性化され、ＲＰＳ６リン酸化が増加していることを示す。図１９Ｂ：ＲＰ欠乏の概略図。ＴＦＰ処置は、Ｐ−ＲＰＳ６およびＰ−ｐ５３  Ｓ３９２およびｐ５３全レベルを低下させる。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｂは、ＲＳｋが、ＣＤ３４細胞においてＲＰＳ１９欠乏の際に活性化されることを示す。図１９Ａ：ＲＰＳ１９欠損ＣＤ３４細胞のＴＦＰ処置の結果を示すリン酸化に関するゲルであり、ＲＰＳ１９ノックダウン細胞においてＲＳＫが活性化され、ＲＰＳ６リン酸化が増加していることを示す。図１９Ｂ：ＲＰ欠乏の概略図。ＴＦＰ処置は、Ｐ−ＲＰＳ６およびＰ−ｐ５３  Ｓ３９２およびｐ５３全レベルを低下させる。
【００５２】
【図２０】図２０は、ｐ−７０Ｓ６Ｋが、１０分以内に、Ｓ３９２でｐ５３を直接リン酸化することを示すゲルである。組換え活性ｐ７０Ｓ６ＫまたはＲＳＫを使用し、それを組換えｐ５３およびＡＴＰと組み合わせると、ｐ７０Ｓ６ＫのみがＳ３９２でｐ５３をリン酸化できることが分かる。ＲＳＫは、ＡＴＰと３０分間インキュベーションした後で、ｐ５３をリン酸化しなかった。Ｓ１５、Ｓ２０およびＳ３１５は、ｐ７０Ｓ６Ｋによってリン酸化されず、ＲＳＫ１／２／３／は同じ条件でｐ５３をリン酸化しない（データ示さず）。
【００５３】
【図２１】図２１は、本発明者らの現行モデルの概略図である。ＲＰ欠乏の間には、機能的なリボソームは十分でなく、翻訳は十分でない。細胞は、（特に多くのグロビンを作製する必要がある場合のＲＢＣにおいて）翻訳をアップレギュレートしようとする。補うために、ＲＰ欠乏の間、ＲＳＫ軸は一層積極的になり、より多く翻訳しようと努める。カルシウムは、多くのキナーゼの活性化と、ｍＴＯＲ軸およびＲＳＫ軸の両方のシグナル伝達のために、ＣａＭを必要とする。理論に拘束されないが、ＣａＭ阻害剤は、利用可能なＣａＭを束縛することによってこれらのキナーゼを阻害し、シグナル伝達を遮断することを、本発明者らは提唱する。Ｃｈｋ２阻害剤は、ＲＳＫおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害に直接作用する（本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼプロファイリングを通じて示される）。
【００５４】
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、細胞内Ｃａ２＋レベルがＲＰ欠損細胞で増加しており、キレート化がｐ７０Ｓ６ＫおよびＲＳ６リン酸化を減少させることを示すグラフおよびゲルを示す。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼプロファイリングにおいて、全てのＣａＭ阻害剤が、ＲＳＫまたはｐ７０Ｓ６Ｋを直接的に阻害するわけではない。本発明者らは、ＣａＭ阻害が間接的である、ＣａＭがカルシウムシグナル伝達のために必要である、と仮定する。図２２Ａ：比色カルシウム検出キットを使用した細胞溶解物中のカルシウムのグラフ。本発明者らは、細胞溶解物中のカルシウムの量を測定し、ＲＰＳ１９をノックダウンした細胞ではカルシウムのレベルが増加していること、およびカルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いてこれらの溶解物を処理するとカルシウムレベルを低減することができることを見出した。図２２Ｂは、リン酸化のゲルである。細胞内のカルシウムのキレート化は、ｐ７０Ｓ６ＫおよびＲＰＳ６リン酸化を減少させ、本発明者らのＣａＭ阻害剤（ＴＦ）と同様であることを示す。ＲＳＫ阻害剤：ＳＬおよびＢ１。ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤：ＰＦ。まとめると、１）ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤は、ｐ５３のＳ３９２リン酸化を、リボソームタンパク質欠乏の間にかなり大幅に減少させる、２）ＣａＭおよびＣｈｋ２阻害剤も、Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋを、ＲＰ欠乏の間にかなり大きく減少させる、３）ｐ７０Ｓ６Ｋは、ｐ５３  Ｓ３９２をｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接リン酸化することができる、４）ＲＳＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｒｐｓ６の全タンパク質レベルが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＲＰ欠乏の間に増加した。５）ＲＳＫ２は、ｒｐｓ２０−／−対ＷＴの２４ｈｐｆ胚のマイクロアレイにおいて増加している。タンパク質は、このアップレギュレーションを確証する。６）カルシウムレベルは、ＲＰ欠乏の間に増加している。７）ＣａＭ−カルシウムシグナル伝達（ＣａＭ阻害剤）の遮断またはＲＳＫもしくはｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｃｈｋ２阻害剤）の直接阻害は、Ｐ−ｐ５３およびｐ５３活性の低下を導く。ｐ５３活性の低下は、アポトーシスを受けるＲＢＣの減少につながり、貧血を軽減させる。
【００５５】
【図２３】図２３は、ペルフェナジン（perphenizine）およびフルフェナジンなどのＦＤＡ承認フェノチアジンが、貧血ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚のＨｂを増加させることを示す棒グラフである。しかし、フェノチアジンへの長期暴露は、負の神経学的副作用が付随する。したがって、フェノチアジンの誘導体をスクリーニングした。本発明者らの理論：フェノチアジンは、ゼブラフィッシュにおいて自発運動活性を損なう（Boehmler  Wら、Genes、Brain  and  Behavior.（２００７年））、本発明者らは、脳に入らない化合物を必要とする、他はフェノチアジン誘導体を生成している、そして行動でＢＢＢを排除するハイスループットスクリーニングがある。
【００５６】
【図２４−１】図２４は、フェノチアジン誘導体の生成の概略図である。試験する化合物を生成するために、２つの一般的な合成方法を使用した。合成１：活性なケモタイプ（フェノチアジン環系）を保持し、脂肪族ピペラジンの遠位の許容される部位で系統的に多様化される化合物。簡単には、効率的かつ高度並列バイアスライブラリ戦略を使用する。合成２：生物学的活性について三環式環系の周囲の決定因子を探索する特化したライブラリ。
【図２４−２】図２４は、フェノチアジン誘導体の生成の概略図である。試験する化合物を生成するために、２つの一般的な合成方法を使用した。合成１：活性なケモタイプ（フェノチアジン環系）を保持し、脂肪族ピペラジンの遠位の許容される部位で系統的に多様化される化合物。簡単には、効率的かつ高度並列バイアスライブラリ戦略を使用する。合成２：生物学的活性について三環式環系の周囲の決定因子を探索する特化したライブラリ。
【００５７】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｄは、ｒｐｓ２９−／−胚におけるＨｂを増加させる合成した２つの試料誘導体を示す棒グラフおよびゼブラフィッシュの写真である：ペルフェナジン（Perpenazine）ｓｕｃｃ（ＰｅｒＳｕｃｃ）は図２５Ａを参照、ＡＣＶは図２５Ｃを参照。図２５Ｂ：ＤＭＳＯ胚と比較したＰｅｒｓｕｃｃ処置胚。図２５Ｄ：ＤＭＳＯ胚と比較したＡＣＶ処置胚。
【００５８】
【図２６】図２６は、行動トラッキングのプレートの試料写真である。６ｄｐｆのＷＴゼブラフィッシュを、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１匹で使用した。薬物を、魚を入れた水に送達させた。薬物をウェルに入れ、動きを２時間トラッキングした。次いでＭａｔｌａｂアルゴリズムを使用して動きを定量した。薬物：ペルフェナジンＳｕｃｃ（ＰｅｒＳｕｃｃ）：２２１ＥおよびＡＣＶ。黄色の四角は、非常に不規則な代表的魚の泳ぎを強調している。
【００５９】
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｃは、２時間の記録にわたる魚の活動のヒートマップである。２２１Ｅ（図２１Ｂ）およびＰｅｒｓｕｃｃ（図２１Ｃ）は、薬物である。ＤＭＳＯは対照ビヒクルである（図２１Ａ）。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｃは、２時間の記録にわたる魚の活動のヒートマップである。２２１Ｅ（図２１Ｂ）およびＰｅｒｓｕｃｃ（図２１Ｃ）は、薬物である。ＤＭＳＯは対照ビヒクルである（図２１Ａ）。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜２７Ｃは、２時間の記録にわたる魚の活動のヒートマップである。２２１Ｅ（図２１Ｂ）およびＰｅｒｓｕｃｃ（図２１Ｃ）は、薬物である。ＤＭＳＯは対照ビヒクルである（図２１Ａ）。
【００６０】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｂは、ＰｅｒＳｕｃｃ添加での２時間にわたる魚の動きを、静止（図２８Ａ）または活動（図２８Ｂ）でまとめたグラフデータである。ＰｅｒＳｕｃｃ処置魚は、あまり活発でなく、ＤＭＳＯ処置魚よりも多く静止する。
【００６１】
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂは、ＡＣＶ添加での２時間にわたる魚の動きを、静止（図２９Ａ）または活動（図２９Ｂ）でまとめたグラフデータである。ＡＣＶ処置魚は、ＤＭＳＯ処置魚より活動的であり、静止がより少ない。
【００６２】
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、２２１Ｅ添加での２時間にわたる魚の動きを、静止（図３０Ａ）または活動（図３０Ｂ）でまとめたグラフデータである。２２１Ｅ処置魚は、ＤＭＳＯ処置魚より静止が少なく、移動は多いことから、活動がより不規則である。彼らは、一時停止し、次いで実に速く移動し、そして一時停止し、それを繰り返す。したがって行動試験は、ゼブラフィッシュの動きを区別することができる堅牢かつ迅速なアッセイを表す：多いおよび少ない活動対不規則、ならびに統計が、処置１回あたりわずかに８匹の魚で得ることができる。
【００６３】
【図３１】図３１は、本発明の一部の実施形態で使用される化合物の化学構造を示す。
【００６４】
【図３２】図３２は、特定のフェノチアジン誘導体の化学構造を示す。
【００６５】
【図３３】図３３は、特定のフェノチアジン誘導体の化学構造を示す。略称される化合物名、例えば、ＤＢ−４−０８３＝０８３に注意されたい。
【００６６】
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｂは、ヘモグロビンレベルのスコア化方法に関するゼブラフィッシュの写真である。野生型レベル（図３４Ａ）。高レベル、中レベル、低レベルを示している（図３４Ｂ）。
【００６７】
【図３５Ａ】図３５Ａおよび３５Ｂは、ｒｐｓ−／−胚におけるＨｂレベルに対する様々なフェノチアジン誘導体の効果を示す棒グラフである。図３５Ａ：０８３；０８４；０８６；および０８７−２の効果。図３５Ｂ：０８７−３；０８８−２；０８８−３；および０８９の効果。
【図３５Ｂ】図３５Ａおよび３５Ｂは、ｒｐｓ−／−胚におけるＨｂレベルに対する様々なフェノチアジン誘導体の効果を示す棒グラフである。図３５Ａ：０８３；０８４；０８６；および０８７−２の効果。図３５Ｂ：０８７−３；０８８−２；０８８−３；および０８９の効果。
【００６８】
【図３６Ａ−Ｂ】図３６Ａ〜３６Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３６Ａ：フルフェナジン。図３６Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３６Ｃ：０８３。図３６Ｄ：０８３の化学構造。０８３は、ゼブラフィッシュの動きを低下させる。
【図３６Ｃ−Ｄ】図３６Ａ〜３６Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３６Ａ：フルフェナジン。図３６Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３６Ｃ：０８３。図３６Ｄ：０８３の化学構造。０８３は、ゼブラフィッシュの動きを低下させる。
【００６９】
【図３７Ａ−Ｂ】図３７Ａ〜３７Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３６Ａ：フルフェナジン。図３７Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３７Ｃ：０８８−２。図３７Ｄ：０８８−２の化学構造。０８８−２は、ゼブラフィッシュの動きを変化させない。
【図３７Ｃ−Ｄ】図３７Ａ〜３７Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３６Ａ：フルフェナジン。図３７Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３７Ｃ：０８８−２。図３７Ｄ：０８８−２の化学構造。０８８−２は、ゼブラフィッシュの動きを変化させない。
【００７０】
【図３８Ａ−Ｂ】図３８Ａ〜３８Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３８Ａ：フルフェナジン。図３８Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３８Ｃ：０８９。図３８Ｄ：０８９の化学構造。０８９は、ゼブラフィッシュの動きを変化させる。
【図３８Ｃ−Ｄ】図３８Ａ〜３８Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３８Ａ：フルフェナジン。図３８Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３８Ｃ：０８９。図３８Ｄ：０８９の化学構造。０８９は、ゼブラフィッシュの動きを変化させる。
【００７１】
【図３９Ａ−Ｂ】図３９Ａ〜３９Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３９Ａ：フルフェナジン。図３９Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３９Ｃ：０８８−３。図３９Ｄ：０８８−３の化学構造。０８８−３は、ゼブラフィッシュの動きを変化させる。
【図３９Ｃ−Ｄ】図３９Ａ〜３９Ｄは、ＤＭＳＯまたは薬物を用いた動きの数のグラフである。図３９Ａ：フルフェナジン。図３９Ｂ：Ｃｈ２阻害剤。図３９Ｃ：０８８−３。図３９Ｄ：０８８−３の化学構造。０８８−３は、ゼブラフィッシュの動きを変化させる。
【００７２】
【図４０】図４０は、ＤＢＡのヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの新規フェノチアジン誘導体の試験の概略図である。初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＲＰＳ１９−ＧＦＰ  ｓｈＲＮＡで形質導入してリボソームタンパク質欠乏とした。細胞を、赤血球分化培地に移し、薬物で５日間１回処置した。細胞を採集し、ＣＤ７１＋細胞についてのフローサイトメトリーにより赤血球前駆体を分析した。
【００７３】
【図４１−１】図４１は、図４０に示されるような様々なフェノチアジン誘導体の存在下でのＣＤ７１＋細胞についてのフローサイトメトリーチャートである。
【図４１−２】図４１は、図４０に示されるような様々なフェノチアジン誘導体の存在下でのＣＤ７１＋細胞についてのフローサイトメトリーチャートである。
【００７４】
【図４２】図４２は、ＤＭＳＯ処置細胞と比較した、赤血球細胞の絶対数を示す棒グラフである。フェノチアジン誘導体は、赤血球細胞の絶対数を増加させる。
【００７５】
【図４３】図４３は、Ｈｂ、行動および赤血球（ＲＢＣ）分化に対するフェノチアジン誘導体の効果の概要を含むチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的に、リボソームタンパク質欠損細胞、例えばＲＰＡ１９欠損細胞においてＲＳＫシグナル伝達が上方制御されているという発見に基づく。本発明者らは、ＲＳＫがＣＤ３４細胞におけるＲＰＳ１９欠損により活性化されること、およびＲＳＫ（ｐ９０ｓ６Ｋ）の阻害剤ならびにｐ７０ｓ６Ｋの阻害剤が、リボソームタンパク質欠損のｉｎ  ｖｉｖｏモデルであるｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚におけるヘモグロビン（Ｈｂ）を増加させることを発見した。本発明者らは、Ｃｈｋ２の阻害剤がｒｐｓ２９−／−胚におけるＨｂを救済することをさらに決定した。
【００７７】
したがって、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病を処置するための、新規クラスの化合物、すなわちＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６Ｋ）の阻害剤、例えばＳＬ、ｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤、例えばＰＦ、ならびにｒｐｓ６の阻害剤の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡの処置のための、特定のＣｈｋ２阻害剤、すなわち、ＣＣＴおよびＩＩＩの使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するための、特定のフェノチアジン誘導体、例えば、ＰｅｒＳｕｃｃ、ＡＣＶ、および２２１Ｅ、ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）、三フッ素化置換誘導体、または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物の使用に関する。
【００７８】
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲中、本明細書において用いられる特定の用語をここに集める。他に述べられない限り、または文脈から黙示的でない限り、以下の用語および語句は以下に提示される意味を含む。他に明示的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、その用語または語句が関連する技術分野において獲得している意味を排除するものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、特許請求される発明を限定することを意図しない。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００７９】
定義
遺伝子の発現に関して本明細書で使用される「調節する」という用語は、例えば遺伝子発現に対する効果をもたらすことを指す。いくつかの実施形態では、効果は、遺伝子の発現を増加させるなどの促進性であり得る。いくつかの実施形態では、効果は、遺伝子の発現を減少させるなどの阻害性であり得る。「調節する」および「調整する」という用語は本明細書では交換可能に使用される。
【００８０】
本明細書で交換可能に使用される「カルモジュリン阻害剤」という用語は、カルモジュリンの活性または発現を阻害する薬物または分子を一般的に指す。カルモジュリン阻害剤は合成または生物起源のものであり得る。それらは、カルモジュリンを阻害する、有機または無機分子、またはペプチド、抗体またはアンチセンスＲＮＡであり得る。本発明のカルモジュリンの阻害剤は、カルモジュリンの発現および／またはカルモジュリンの生物活性を阻害することのできる、化学物質または分子であり、例えば、ＴＦＰおよびＦＬＵの化合物、それらのプロドラッグ、誘導体、および薬学的に許容される塩であり、これまでにリボソーム障害の処置に有用であると決定されている（米国特許出願公開第２０１５／０２６５６２７号を参照）。カルモジュリン活性をモニターするアッセイは当技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２６５６２７号を参照されたい。本明細書において、本発明者らは、リボソーム障害の処置に特に有用である、これまでに非開示の化合物、例えば、ＡＣＶ、２２１Ｅ、およびＰｅｒＳｕｃｃ、ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）、三フッ素化置換誘導体、または式ＩもしくはＩＩ（図２５および３２を参照）の化合物を同定した。
【００８１】
「リボソームタンパク質」という用語はまた、本明細書において「ｒ−タンパク質」とも呼ばれ、タンパク質合成に関与する任意の細胞内リボ核タンパク質粒子を指し、それらは可逆的に解離可能な単位からなり、細胞膜に結合しているかまたは細胞質中に遊離しているかのいずれかとして見出される。それらは単独で存在してもよく、またはクラスターで存在（ポリリボソーム）してもよい。それらは、単独でまたはｍＲＮＡによって連結されたリボソームであり、タンパク質合成に積極的に関与しているポリリボソームまたはポリソームと呼ばれる塊で存在し得る。リボ核タンパク質（しばしば「ＲＮＰ」と呼ばれる）は、タンパク質合成に重要であり、それらは一方が大きく（Ｌ）一方が小さい（Ｓ）可逆的に解離可能な単位（真核生物において６０Ｓおよび４０Ｓ（細菌において５０Ｓおよび３０Ｓ）サブユニットとも呼ばれる）の２つからなる。用語は、ｒＲＮＡと共に、細胞の翻訳過程に関与するリボソームサブユニットを構成する任意のタンパク質を含む。用語は、リボソームの小（Ｓ）サブユニットおよび大（Ｌ）サブユニットのタンパク質を包含する。リボソームのＲＮＡ部分とタンパク質部分の両方の、およびリボソーム生合成機構の、酵母および細菌からの高い保存性のために、これらの有機分子に関する知識の大部分は、Ｅ．ｃｏｌｉのリボソームの研究に由来し、ヒトにも適用される。Ｅ．ｃｏｌｉのリボソームの小（３０Ｓ）サブユニットにおいて、Ｓ４、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ１５、Ｓ１７、Ｓ２０と示されるタンパク質は、独立して１６Ｓ  ｒＲＮＡに結合する。これらの一次結合タンパク質のアセンブリ後に、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ９、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１６、Ｓ１８、およびＳ１９が成長中のリボソームに結合する。これらのタンパク質はまた、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１４、およびＳ２１の付加を増強する。らせん接合部へのタンパク質の結合は、ＲＮＡの正確な三次フォールディングを開始し、全体的な構造を構築するために重要である。ほとんどすべてのタンパク質は、１つまたは複数の球状ドメインを含む。さらに、ほとんどすべては、広範囲の領域でＲＮＡと接触することができる長い伸長部を含む。タンパク質の塩基性残基がＲＮＡ骨格の電荷反発力を中和するので、さらなる安定化がもたらされる。タンパク質−タンパク質相互作用はまた、静電相互作用および水素結合相互作用によって構造をまとめて保持するためにも存在する。理論的研究はアセンブリプロセス中の結合親和性に対するタンパク質結合の相関効果を指摘した［２］。
【００８２】
「リボソーム障害」または「リボソームタンパク質障害」という用語は、リボソームタンパク質の変異したおよび／または異常機能に関連する疾患または障害を指す。リボソームタンパク質に突然変異を有することに起因する疾患、または、リボソームタンパク質の減少したレベルもしくは機能の部分的な喪失に起因する疾患、あるいは、通常の健康対照対象と比べて、リボソームタンパク質の増加したレベルに起因する疾患を含み得る。用語リボソーム障害は、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）、骨髄異形成、シュバッハマンダイアモンド症候群（ＳＤＳ）、およびトリーチャーコリンズ症候群（ＴＣＳ）を含むがこれらに限定されない、リボソームタンパク質の遺伝的疾患を含む。
【００８３】
「リボソーム病」または「複数のリボソーム病」という用語は、リボソームの任意の疾患または機能不全を指す。リボソームはすべての細胞に見られる小さい細胞小器官であり、メッセンジャーＲＮＡを翻訳することによってタンパク質産生に関与する。リボソームの疾患または機能不全は、（ｉ）リボソーム生合成タンパク質の疾患、（ｉｉ）小核小体リボ核タンパク質（ribonuceloprotein)の疾患、および（ｉｉｉ）（「リボソームタンパク質障害」の定義において上に論じられるような）リボソームタンパク質の疾患を含み、すべては、Freedらの「When  ribosomes  go  bad:  diseases  of  ribosome  biogenesis」と題される、Mol.  Biosyst.、２０１０年、６巻（３号）、４８１〜４９３頁で総説され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。リボソーム生合成タンパク質の疾患には、トリーチャーコリンズ症候群（ＴＣＳ）、ＵＴＰ１４ｃの突然変異による男性の不妊、ネイティブアメリカンインディアンの小児肝硬変（ＮＡＩＣ）、ボーエン−コンラディ症候群（ＢＣＳ）、脱毛、神経学的異常、内分泌障害、および内分泌障害（endrocrinopathy）（ＡＮＥ症候群）、シュバッハマンダイアモンド症候群（ＳＤＳ）、原発開放隅角緑内障の候補遺伝子（ＰＯＡＧ）、およびＩ型神経線維腫（ＮＦ１）の修飾因子が含まれるがこれらに限定されない。小核小体リボ核タンパク質の疾患には、アノーゼティック（Ａｎａｕｘｅｔｉｃ）異形成（ＡＤ）、軟骨毛髪異形成（骨幹端軟骨異形成（chondrodysplaia）、ＭｃＫｕｓｉｃｋ型；ＣＣＨとも呼ばれる）、寡毛症のない骨幹端異形成（ＭＤＷＨ）、先天性角化異常症（ジンサー−エングマン−コール症候群とも呼ばれる）、ハイエラール−レイダーソン（Ｈｏｙｅｒａａｌ−Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ）症候群（いくつかの症例は、先天性角化異常症の重篤なバリアントである）、およびプラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、別の、すなわち、「親」化合物と呼ぶことのできる「元の」物質に構造的に関連した化学物質を指す。「誘導体」は、構造的に関連した親化合物から１つまたは複数のステップで作製することができる。誘導体の一般的な物理的および化学的性質もまた親化合物に類似する。
【００８５】
「機能的誘導体」および「模倣物」という用語は本明細書では交換可能に使用され、それが機能的誘導体である実体または分子の生物活性と実質的に類似の生物活性（特に機能的生物活性）を有する化合物を指す。機能的誘導体という用語は、分子の断片、バリアント、アナログまたは化学的誘導体を含むことを意図している。ある特定の実施形態では、カルモジュリン阻害剤の機能的誘導体および機能的アナログ（例えば、ＴＦＰ、Ａ−３、Ｗ−７、Ａ−７、Ｗ−５、およびＣＧＳ−９３４３の機能的アナログ）は、本明細書に開示されるアッセイを使用してそれらの生物活性について評価でき、カルモジュリンを阻害する誘導体およびアナログは、そのようなカルモジュリン阻害剤の機能的誘導体または機能的アナログであると考えられる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、それがアナログである分子または化学物質またはポリペプチドと同一の、または実質的に類似の生物学的機能（すなわちカルモジュリンの阻害）および／または構造を保持する薬剤を指す。アナログの例には、ペプチド模倣薬（ペプチドアナログ）、ペプチド核酸（核酸アナログ）、小型および大型の有機または無機化合物、ならびに本明細書のポリペプチドまたは核酸の誘導体およびバリアントが含まれる。
【００８７】
阻害剤（例えば、ｐ９０Ｓ６ｋ、またはｐ７０Ｓ６Ｋ、またはＣｈｋ２、またはカルモジュリンの阻害剤）の誘導体またはアナログの生物活性を、それに対する誘導体またはアナログである阻害剤の生物活性と比べて定義するのに使用される場合、「実質的に類似」という用語は、特定の誘導体またはアナログが、元の親阻害剤と化学構造において、要素の基の置換、欠失または付加を含む１つまたは複数の基または要素について異なり、その正味の効果が、キナーゼもしくは他のＲＳＫ、Ｃｈｋ２の活性および／または発現の阻害に関して元の親阻害剤に見られる生物活性の少なくとも一部を保持することを意味する。機能的誘導体またはそのアナログによる阻害のそのような生物活性は、当技術分野において周知のアッセイ、例えば、基質のリン酸化を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを使用して当業者によって評価され得る。
【００８８】
「組織」という用語は、無傷の細胞、血液、血漿および血清などの血液製剤、骨、関節、筋肉、平滑筋、ならびに臓器を含むことを意図している。
【００８９】
「対象」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物の対象を含む。「対象」および「個体」という用語は本明細書では交換可能に使用され、本発明による細胞による予防的処置を含む処置が提供される動物、例えばヒトを指す。本発明の「非ヒト動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。
【００９０】
本明細書で交換可能に使用される場合、「参照試料」または「参照レベル」という用語は、状態の陰性対照を指す。例えば、処置の文脈において、参照レベルは、対象が処置されていない場合のレベルである。いくつかの実施形態では、診断の文脈における参照レベルは、通常の健康対象に存在するレベルである。「通常の健康対象」という用語は、いかなる疾患もしくは障害の症状も有さないか、またはいかなる疾患もしくは障害とも同定されないか、またはいかなる薬物療法も受けていない対象、または健康診断に基づいて医師によって健康であると同定される対象を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される参照レベルまたは試料は、処置されている対象に由来する以前の時点において測定されたレベルを指す。
【００９１】
「処置する」、「処置」、および「処置すること」という用語は、交換可能に使用され、疾患または障害の処置に関連して、疾患のリスクにさらされている対象において、疾患の発症を予防すること、または疾患の経過を変えること（例えば、限定されないが、疾患の進行を緩徐化すること）、または、疾患の症状を逆転させること、または対象における１つもしくは複数の症状および／もしくは１つもしくは複数の生化学的マーカーを低減させること、１つまたは複数の症状の悪化または進行を防ぐこと、回復を促進することまたは予後を改善すること、ならびに、既存の病気の進行を緩徐化または低減することを意味する。処置することという用語は、不適切なリボソームタンパク質機能に関連する状態、疾患、または障害の少なくとも１つの悪影響または症状を軽減または緩和することを包含する。リボソームタンパク質障害に関連して本明細書で使用される場合、処置することという用語は、リボソームタンパク質障害の症状および／または生化学的マーカーの少なくとも１０％の減少、例えば、対象のＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１および／もしくはｐ５３のレベルの低減、またはヘモグロビンの正常レベルへの復帰、または頭蓋顔面変形の回復もしくは予防を指すのに使用される。例えば、限定されないが、例を示すことのみを目的として対象のＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１および／またはｐ５３のレベルの１０％の低減は、本明細書に開示される方法による有効な処置と考えられる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、リボソームタンパク質障害またはリボソーム病、例えばＤＢＡに関連する状態、疾患、または障害の進行を防止すること、および／またはその少なくとも１つの悪影響もしくは症状を軽減もしくは逆転させることを含む。したがって、いくつかの実施形態では、処置は、リボソームタンパク質障害またはリボソーム病の疾患または徴候または症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得る。例えば、リボソームタンパク質における突然変異、または代替的に特定のリボソームタンパク質の低発現レベルを有することが知られている対象は、リボソームタンパク質におけるそのような突然変異、および／またはリボソームタンパク質のレベルの低下に関連する１つまたは複数の症状の開始を防ぐために予防的処置に付すことができる。いくつかの実施形態では、予防的処置は、リボソームタンパク質障害に関連する疾患の以前の処置を受けたことがある対象に施すことができる。例えば、ＤＢＡの処置のためにコルチコステロイドまたは輸血、および／またはそれらのＤＢＡを安定化するための他のこれまでの処置を受けたことがある対象に対して、（例えば、本明細書において開示されるような、カルモジュリン阻害剤および／またはカルシウムチャネル遮断剤によって）予防的に処置することができる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、疾患または障害の、１つまたは複数の症状または測定可能なマーカーの出現の回避または遅延を指す。症状またはマーカーの出現の遅延は、そのような症状またはマーカーが、疾患または障害を発症する同様の可能性または感受性を有する対照または未処置の対象におけるそのような症状またはマーカーが出現する時間と比較した遅延である。「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、症状またはマーカーの完全な回避または予防だけでなく、疾患または障害を発症する同様の可能性または感受性を有する対照または未処置の対象で起こるそのような症状またはマーカーと比較した、あるいは、疾患または障害に罹患している集団の病歴的または統計学的尺度に基づいて発生する可能性がある症状またはマーカーと比較した、これらの症状またはマーカーのいずれか１つの重症度または程度の低減を含む。「低減した重症度」によって、対照または参照と比較して、症状または測定可能な疾患マーカーの重症度または程度における少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％（すなわち、症状または測定可能なマーカーがない）までもの低減を意味する。
【００９４】
「予防的」または「治療的」処置という用語は、１つまたは複数の対象の組成物の宿主への投与を指す。それが望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床的出現の前に投与される場合、処置は予防的であり、すなわちそれは望ましくない状態の発症に対して宿主を保護し、一方で、望ましくない状態の出現後に投与される場合、処置は治療的である（すなわち、それは既存の望ましくない状態またはそれによる副作用を軽減、改善、または維持することを目的とする）。
【００９５】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性に関して「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」は、標的遺伝子についての細胞中のｍＲＮＡレベルの低下（例えば、ｐ９０Ｓ６ｋ遺伝子、またはｐ７０Ｓ６Ｋ遺伝子について、ｍｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉分子の存在しない細胞に見られるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％）を指す。好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％低下する。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内在性マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。例えば、それは、下流のＲＮＡプロセシングの機構にかかわらず、以前にｓｉＲＮＡとして同定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらすｉｎ  ｖｉｖｏプロセシングの特定の方法を有すると考えられているが、そのような配列は、本明細書において記載される隣接配列の文脈においてベクターに組み込むことができる）。「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子、およびまた遺伝子の発現を活性化するＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含み得る。ほんの一例として、いくつかの実施形態では、阻害または遺伝子サイレンシングとして機能するＲＮＡｉ剤が、ＲＳＫ  ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｐ９０Ｓ６Ｋ遺伝子を阻害するための本明細書に開示される方法、キット、および組成物において有用である。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが同一の細胞中に存在するかまたは標的遺伝子として同一の細胞で発現されるときに遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する。二本鎖ＲＮＡのｓｉＲＮＡは、相補鎖によって形成できる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができる核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。典型的に、ｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各々の相補配列は、約１５〜５０ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０塩基対の長さ、好ましくは、約１９〜３０塩基のヌクレオチド長、好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である）。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「小型ヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも呼ばれる）は、ｓｉＲＮＡの一種である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは、短い、例えば約１９〜約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖、続いて約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖で構成される。代替的に、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行することができ、アンチセンス鎖はそれに続くことができる。
【００９９】
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、内在性ＲＮＡであり、そのうちのいくつかは、転写後レベルでタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節することが公知である。内在性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる、ゲノム中に天然に存在する小型ＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡという用語は、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる内在性マイクロＲＮＡ以外の任意の種類のＲＮＡ配列を含む。マイクロＲＮＡの配列は、Limら、Genes  &  Development、１７巻、９９１〜１００８頁（２００３年）、Limら、Science、２９９巻、１５４０頁（２００３年）、LeeおよびAmbros、Science、２９４巻、８６２頁（２００１年）、Lauら、Science、２９４巻、８５８〜８６１頁（２００１年）、Lagos-Quintanaら、Current  Biology、１２巻、７３５〜７３９頁（２００２年）、Lagos  Quintanaら、Science、２９４巻、８５３〜８５７頁（２００１年）、ならびにLagos-Quintanaら、RNA、９巻、１７５〜１７９頁（２００３年）などの刊行物に記載されており、それらは参照により組み込まれる。複数のマイクロＲＮＡを前駆体分子に組み込むこともできる。さらに、ｍｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ経路を介して内在性遺伝子の発現を調節する目的で、人工ｍｉＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するための媒体として、ｍｉＲＮＡ様ステムループを細胞内で発現させることができる。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、２本の鎖で構成されるＲＮＡ分子を指す。二本鎖分子には、二本鎖構造を形成するためにそれ自体の上で二重鎖へと折りたたまれる単一のＲＮＡ分子で構成されるものが含まれる。例えば、一本鎖ｍｉＲＮＡが由来する前駆体分子のステムループ構造は、プレｍｉＲＮＡと呼ばれ（Bartelら、２００４年、Cell、１１６巻、２８１〜２９７頁）、ｄｓＲＮＡ分子を含む。
【０１０１】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、転写および／または翻訳の調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−および３’−の非翻訳配列および調節配列）を含むゲノム遺伝子であり得る。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列、または、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡなどの機能性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であり得る。遺伝子はまた、それに連結された５’−または３’−非翻訳配列を任意選択で含むコード領域（例えば、エクソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。遺伝子はまた、コード領域の全部もしくは一部および／またはそれに結合した５’−もしくは３’−非翻訳配列を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された増幅核酸分子であり得る。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、または遺伝子によってコードされるもしくはＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含むことを指す。
【０１０３】
「低下させる」、「低減された」、「低減」または「減少させる」、「下方制御する」、または「阻害する」という用語はすべて、本明細書では、一般に統計学的に有意な量の低下を意味するために使用される。しかしながら、疑問を避けるために、「低下させる」、「低減された」、「低減」または「減少」、または「阻害する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の低下、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、または１００％低下（すなわち、参照試料と比較して非存在のレベル）まで（１００％を含む）の低下、または１０〜１００％の間の任意の低下を意味する。「減少」または「阻害」が、遺伝子またはタンパク質、例えばカルモジュリンの発現または活性のレベルの文脈において使用される場合、それは、細胞、細胞抽出物、または細胞上清中のタンパク質または核酸のレベルまたは活性の低減を指す。例えば、そのような減少は、ＲＮＡ安定性、転写または翻訳の低減、タンパク質分解の増加、またはＲＮＡ干渉によるものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような小分子であるカルモジュリン阻害剤は、カルモジュリンの活性または発現を減少させることができる。好ましくは、この減少は、対照条件下の発現または活性のレベルの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはさらには少なくとも約９０％である。カルモジュリンに関して本明細書で使用される場合、「レベル」という用語はカルモジュリンの発現または活性を指す。
【０１０４】
「上方制御する」、「増加させる」、または「活性化する」という用語は、本明細書ではすべて、一般的に統計学的に有意な量の増加を意味するために使用され、疑問を避けるために、「上方制御する」、「増加させる」、または「より高い」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、または１００％の増加もしくはそれを超える増加、または１０〜１００％の間の任意の増加、あるいは、参照レベルと比較して、１００％を超える増加、例えば、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍〜１０倍の間の任意の増加もしくはそれを超える増加を意味する。「増加させる」が、遺伝子またはタンパク質の発現または活性の文脈において使用される場合、細胞、細胞抽出物、または細胞上清中のタンパク質または核酸のレベルまたは活性の正の変化を指す。例えば、そのような増加は、ＲＮＡ安定性、転写、もしくは翻訳の増加、またはタンパク質分解の低下によるものであり得る。好ましくは、この増加は、対照条件下の発現または活性のレベルに対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、またはさらには約５００％もしくはそれよりも大きい。
【０１０５】
「有意に異なる」、「統計学的に有意」という用語、および類似の語句は、比較された２つの個体または群の間の差異が訓練された観察者にとって、明らかにもしくは合理的に異なるか、または統計学的に有意である（この語句が、「統計学的に」という用語を含むか、またはｐ値などの統計学的検定のいくつかの指標が存在する場合、またはデータが分析されたときに当技術分野で公知の標準的な統計学的検定によって統計学的差異を生じる場合）データまたは他の測定値間の比較を指す。
【０１０６】
「医薬組成物」は、哺乳動物対象への投与に適した化学的または生物学的組成物を指す。そのような組成物は、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、舌下、脊髄内、脳室内などを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の多数の経路による投与のために特に製剤化され得る。
【０１０７】
「有効量」という用語は、「治療有効量」という用語と交換可能に用いられ、所望の治療結果を達成するため、例えば、リボソーム障害またはリボソーム病の少なくとも１つの症状、例えば、対象におけるＣＤ３４＋細胞中の高レベルのｐ５３および／またはｐ２１の症状を軽減または停止させるために必要である投与量および期間での、医薬組成物の少なくとも１つの薬剤、例えばカルモジュリン阻害剤および／またはカルシウムチャネル遮断剤の量を指す。例えば、本明細書に開示されるような方法を使用した有効量は、リボソーム障害またはリボソーム病の症状を少なくとも１０％低減させるのに十分な量と考えられる。本明細書で使用される有効量はまた、疾患の症状の発症を予防または遅延させる、症状の疾患の経過を変える（例えば、これらに限定されないが、疾患の症状の進行を緩徐化する）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。したがって、本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、リボソーム障害またはリボソーム病、例えばＤＢＡの症状の少なくとも１つを軽減するための医薬組成物の治療剤（例えば、本明細書で開示するＲＳＫ  ｐ９０およびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤ならびに特定のＣｈｋ２およびカルモジュリン阻害剤）の量を指す。換言すると、本明細書に開示される阻害剤の「治療有効量」は、例えばリボソーム障害またはリボソーム病の症状に有益な効果を及ぼすカルモジュリン阻害剤またはカルシウムチャネル遮断剤の量である。個体への単回投与または複数回投与として投与される投与量は、阻害剤の薬物動態特性、投与経路、対象の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、同時処置、処置の頻度、および所望の効果を含む様々な因子に応じて変動するであろう。治療有効量はまた、治療剤の任意の毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果が上回る量である。各個体の場合における有効量は、当技術分野で確立された方法に従って、過度の実験を伴わずに、当業者によって経験的に決定され得る。一般に、「治療上有効な」および「処置、予防、または阻害に有効な」という語句は、リボソームタンパク質疾患または障害またはリボソーム病の少なくとも１つの症状の重症度における低減の目的を達成するであろう本明細書に開示されているような阻害剤を限定することを意図している。
【０１０８】
「薬学的に許容される」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で用いられる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、１つの臓器または生体の一部から、別の臓器または生体の一部への対象の薬剤の運搬または移送に関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容される物質、組成物、またはビヒクルを意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容され」なければならず、例えば担体は、処置に対する薬剤の影響を減少させない。換言すると、担体は薬学的に不活性である。「生理学的に認容される担体」および「生体適合性送達媒体」という用語は交換可能に使用される。
【０１１０】
「投与された」および「付された」という用語は、疾患または障害の処置の文脈において交換可能に使用される。両方の用語は、非経口または全身投与などの投与方法によって本発明の阻害剤を含む有効量の医薬組成物によって処置されている対象を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖または分岐鎖の、炭素原子鎖を有する飽和脂肪族ラジカルを意味する。ＣｘアルキルおよびＣｘ〜Ｃｙアルキルが典型的に使用され、ＸおよびＹは、鎖中の炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、１〜６個の炭素の鎖を有するアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなど）を含む。別のラジカルと共に表されるアルキル（例えば、アリールアルキルにおけるように）は、示された原子数を有する直鎖または分岐鎖の、飽和アルキル二価ラジカルを意味するか、または原子が示されていないときは結合を意味し、例えば、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ０〜Ｃ３）アルキルは、フェニル、ベンジル、フェネチル、１−フェニルエチル３−フェニルプロピルなどを意味する。アルキルの主鎖は、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの１個または複数のヘテロ原子を任意選択で挿入することができる。
【０１１２】
好ましい実施形態では、直鎖または分岐鎖のアルキルは、その主鎖に３０個またはそれ未満の炭素原子を（例えば、直鎖についてＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖についてＣ３〜Ｃ３０）、より好ましくは２０個またはそれ未満の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、それらの環構造中に３〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくは、環構造中に５、６、または７個の炭素を有する。本明細書、実施例、および特許請求の範囲の全体にわたって使用される場合、「アルキル」（または「低級アルキル」）という用語は、「非置換アルキル」と「置換アルキル」の両方を含むことを意図し、後者は、炭化水素主鎖の１個または複数の炭素上の１個または複数の水素を置き換える置換基を有するアルキル部分を指す。
【０１１３】
炭素数が特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、「低級アルキル」は、その主鎖構造中に１〜１０個の炭素、より好ましくは１〜６個の炭素原子を有する、上で定義されたようなアルキル基を意味する。同様に、「低級アルキル」および「低級アルキニル」は、類似の鎖長を有する。本出願全体にわたって、好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい実施形態では、本明細書においてアルキルとして指定される置換基は低級アルキルである。
【０１１４】
置換アルキルの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、チオール、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（スルフェート、フルホンアミド、スルファモイル、およびスルホネートを含む）、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、−ＣＦ３、−ＣＮなどを含み得る。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の、直鎖、分岐鎖、または環状炭化水素ラジカルを指す。ＣｘアルケニルおよびＣｘ〜Ｃｙアルケニルが典型的に使用され、ＸおよびＹは、鎖中の炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルは、１〜６個の炭素の鎖と少なくとも１つの二重結合とを有するアルケニル、例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチルアリル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニルなど）を含む。別のラジカルと共に表されるアルケニル（例えば、アリールアルケニルにおけるように）は、示される炭素数を有する、直鎖または分岐鎖の、アルケニル二価ラジカルを意味する。アルケニルの主鎖は、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの１個または複数のヘテロ原子を任意選択で挿入することができる。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の炭化水素ラジカルを指す。ＣｘアルキニルおよびＣｘ〜Ｃｙアルキニルが典型的に使用され、ＸおよびＹは、鎖中の炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルは、１〜６個の炭素の鎖と少なくとも１つの三重結合とを有するアルキニル（alkynls）、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、イソペンチニル、１，３−ヘキサージイン−イル、ｎ−ヘキシニル、３−ペンチニル、１−ヘキセン−３−イニルなどを含む。別のラジカルと共に表されるアルキニル（例えば、アリールアルキニルにおけるように）は、示される炭素数を有する、直鎖または分岐鎖の、アルキニル二価ラジカルを意味する。アルキニルの主鎖は、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの１個または複数のヘテロ原子を任意選択で挿入することができる。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される原子を指す。「ハロゲン放射性同位体」または「ハロ同位体」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される原子の放射性核種を指す。
【０１１８】
単離された基またはより大きな基の一部としての「ハロゲン置換部分」または「ハロ置換部分」は、そのような用語が本出願において定義されている場合、１個または複数の「ハロ」原子で置換された、本明細書に記載の脂肪族、脂環式、または芳香族部分を意味する。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「ハロアルキル」という用語は、１個または複数の「ハロ」原子で置換されているアルキルを指す。例えば、ハロ置換アルキルには、ハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル、ペルハロアルキルなどが含まれる（例えば、ハロ置換（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルには、クロロメチル、ジクロロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル（−ＣＦ３）、２，２，２−トリフルオロエチル、ペルフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジクロロエチルなどが含まれる）。
【０１２０】
「アリール」という用語は、芳香族５〜８員単環式、８〜１２員縮合二環式、または１１〜１４員縮合三環式の環系を指す。ＣｘアリールおよびＣｘ〜Ｃｙアリールが典型的に使用され、ＸおよびＹは、環系中の炭素原子の数を示す。いくつかの実施形態では、各々の環の１、２、３、または４個の水素原子が、置換基によって置換され得る。
【０１２１】
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員単環式、８〜１２員縮合二環式、または１１〜１４員縮合三環式の環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）。ＣｘヘテロアリールおよびＣｘ〜Ｃｙヘテロアリールが典型的に使用され、ＸおよびＹは、環系中の炭素原子の数を示す。いくつかの実施形態では、各々の環の１、２、３、または４個の水素原子が、置換基によって置換され得る。
【０１２２】
例示的なアリールまたはヘテロアリールには、ピリジニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、テトラゾリル、インドリル、ベンジル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、アズレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、テトラヒドロナフチル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３  ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルなどが含まれるがこれらには限定されない。
【０１２３】
例示的なヘテロアリールには、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾイミダゾール、イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン、キナゾリン、チエノ［２，３−ｃ］ピリジン、チエノ［３，２−ｂ］ピリジン、チエノ［２、３−ｂ］ピリジン、インドリジン、イミダゾ［１，２ａ］ピリジン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、キノキサリン、ナフチリジン、キノリジン、インドール、イソインドール、インダゾール、インドリン、ベンゾオキサゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾール、イミダゾ［１，５−ａ］ピリジン、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン、イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン、イミダゾ［１，２−ｃ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ｃ］ピリミジン、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、ピロロ［２，３ｃ］ピリジン、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン、ピロロ［３，２−ｂ］ピリジン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン、ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジン、ピロロ［１，２−ｃ］ピリミジン、ピロロ［１，２−ａ］ピリミジン、ピロロ［１，２−ａ］ピラジン、トリアゾ［１，５−ａ］ピリジン、プテリジン、プリン、カルバゾール、アクリジン、フェナジン、フェノチアゼン、フェノキサジン、１，２−ジヒドロピロロ［３，２，ｌ−ｈｉ］インドール、インドリジン、ピリド［１，２−ａ］インドール、２（１Ｈ）−ピリジノン、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨ−カルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３−ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキセパニル、オキセタニル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルから誘導されるものが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの例示的なヘテロアリール基には、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、ピリダジニル、ピラジニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、ナフチリジニル、２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル、テトラヒドロイソキノリニルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
アリールおよびヘテロアリールは、任意選択で、１つまたは複数の位置において１つまたは複数の置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどによって置換され得る。
【０１２５】
「シクリル」または「シクロアルキル」という用語は、３〜１２個の炭素、例えば３〜８個の炭素、例えば３〜６個の炭素を有する飽和および部分不飽和の環状炭化水素基を指す。ＣｘシクリルおよびＣｘ〜Ｃｙシクリルが典型的に使用され、ＸおよびＹは、環系中の炭素原子の数を示す。シクロアルキル基はさらに、例えば１、２、３、または４つの置換基によって任意選択で置換され得る。Ｃ３〜Ｃ１０シクリルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，５−シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、アダマンタン−１−イル、デカヒドロナフチル、オキソシクロヘキシル、ジオキソシクロヘキシル、チオシクロヘキシル、２−オキソビシクロ［２．２．１］ヘプタ−１−イルなどを含む。
【０１２６】
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、非芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式の環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）。ＣｘヘテロシクリルおよびＣｘ〜Ｃｙヘテロシクリルが典型的に使用され、ＸおよびＹは、環系中の炭素原子の数を示す。いくつかの実施形態では、各々の環の１、２、または３個の水素原子が、置換基によって置換され得る。例示的なヘテロシクリル基には、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジル、４−モルホリル、４−ピペラジニル、ピロリジニル、ペルヒドロピロリジニル、１，４−ジアザペルヒドロエピニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキサニルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２７】
「二環式」および「三環式」という用語は、単結合多環式環集合体によって縮合、架橋、または結合されたことを指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「縮合環」という用語は、両方の環に共通の環原子が互いに直接結合しているときに、別の環と結合して二環式構造を有する化合物を形成する環を指す。一般的な縮合環の非限定的な例には、デカリン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、フラン、ベンゾフラン、キノリンなどが含まれる。縮合環系を有する化合物は、飽和、部分飽和、シクリル、ヘテロシクリル、芳香族、ヘテロ芳香族などであり得る。
【０１２９】
「シアノ」という用語は、ラジカル−ＣＮを意味する。
【０１３０】
「ヘテロ原子」という用語は、炭素原子ではない原子を指す。ヘテロ原子の特定の例には、窒素、酸素、硫黄、およびハロゲンが含まれるがこれらに限定されない。「ヘテロ原子部分」は、その部分が結合している原子が炭素ではない部分を含む。ヘテロ原子部分の例には、−Ｎ＝、−ＮＲＮ−、−Ｎ＋（Ｏ−）＝、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、および−ＳＳ−が含まれ、ＲＮは、Ｈまたはさらなる置換である。
【０１３１】
「ヒドロキシ」という用語は、ラジカル−ＯＨを意味する。
【０１３２】
「ニトロ」という用語は、ラジカル−ＮＯ２を意味する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「芳香族」という用語は、構成原子が不飽和環系を構成し、環系内のすべての原子がｓｐ２混成であり、π電子の総数が４ｎ＋２に等しい部分を意味する。芳香環は、環原子が炭素原子のみである（例えば、アリール）か、または炭素原子および非炭素原子を含み得る（例えば、ヘテロアリール）。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、置換部分における１個または複数（典型的には１、２、３、４、または５個）の水素原子の、「置換基」についての定義において下記に列挙されるか、または他で特定されている、置換基の群から独立して選択される置換基による独立した置換を指す。一般的に、非水素置換基は、置換されることが特定されている所与の部分の原子に結合することができる任意の置換基であり得る。置換基の例には、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルデヒド、脂環式、脂肪族、アルカンスルホンアミド、アルカンスルホニル、アルカリル、アルケニル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルキルアミノ、アルキルカルバノイル、アルキレン、アルキリデン、アルキルチオ、アルキニル、アミデ（ａｍｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｏ）、アミノ、アミノ、アミノアルキル、アラルキル、アラルキルスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アレーンスルホニル、芳香族、アリール、アリールアミノ、アリールカルバノイル、アリールオキシ、アジド、カルバモイル、カルボニル、カルボニル（ケトン、カルボキシ、カルボキシレートを含む）、ＣＦ３、シアノ（ＣＮ）、シクロアルキル、シクロアルキレン、エステル、エーテル、ハロアルキル、ハロゲン、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、イミノ、イミノケトン、ケトン、メルカプト、ニトロ、オキサアルキル、オキソ、オキソアルキル、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、シリル基、スルホンアミド、スルホニル（スルフェート、スルファモイル、およびスルホネートを含む）、チオール、およびウレイド部分が含まれるがこれらに限定されず、その各々はまた任意選択で置換されていても置換されていなくてもよい。いくつかの場合では、２つの置換基が、それらが結合している炭素と一緒になって環を形成することができる。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は、それに結合した酸素ラジカルを有する、上で定義されたようなアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソ−ブチルオキシなどが含まれる。「エーテル」は、酸素によって共有結合した２つの炭化水素である。したがって、アルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、および−Ｏ−アルキニルのうちの１つによって表すことができるようなアルコキシルであるかまたはそれに類似する。アロキシは、−Ｏ−アリールまたはＯ−ヘテロアリールによって表すことができ、アリールおよびヘテロアリールは以下に定義される通りである。アルコキシ基およびアロキシ基は、アルキルについて上記したように置換することができる。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「アルキルアリール」という用語は、アリール基で置換されたアルキル基を指す。「アルキルヘテロアリール」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキル基を指す。
【０１３７】
「アルキルチオ」という用語は、それに結合した硫黄ラジカルを有する、上で定義されたアルキル基を指す。好ましい実施形態では、「アルキルチオ」部分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、および−Ｓ−アルキニルのうちの１つによって表される。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオなどが含まれる。「アルキルチオ」という用語は、シクロアルキル基、アルケンおよびシクロアルケン基、ならびにアルキン基も包含する。「アリールチオ」は、アリールまたはヘテロアリール基を指す。
【０１３８】
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、それらのいずれも置換基でさらに置換されていてもよい。例示的なアシル基には、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、ｔ−ブチルアセチルなど）、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルカルボニル（例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど）、複素環カルボニル（例えば、ピロリジニルカルボニル、ピロリド−２−オン−５−カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、テトラヒドロフラニルカルボニルなど）、アロイル（例えば、ベンゾイル）およびヘテロアロイル（例えば、チオフェニル−２−カルボニル、チオフェニル−３−カルボニル、フラニル−２−カルボニル、フラニル−３−カルボニル、１Ｈ−ピロイル−２−カルボニル、１Ｈ−ピロロイル−３−カルボニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル−２−カルボニルなど）が含まれるがこれらに限定されない。さらに、アシル基のアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、およびヘテロアリールの部分は、それぞれの定義において記載された基のうちのいずれか１つであり得る。
【０１３９】
「アルキルアミノ」という用語は、窒素に結合した少なくとも１つの直鎖または分岐鎖の不飽和脂肪族、シクリル、またはヘテロシクリルのラジカルを有する窒素部分を意味する。「アルキルアミノ」という用語は、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」、「シクリルアミノ」、および「ヘテロシクリルアミノ」を含む。「アリールアミノ」という用語は、窒素に結合した少なくとも１つのアリールラジカルを有する窒素部分を意味する。例えば、−ＮＨアリール、および−Ｎ（アリール）２である。「ヘテロアリールアミノ」という用語は、窒素に結合した少なくとも１つのヘテロアリールラジカルを有する窒素部分を意味する。例えば、−ＮＨヘテロアリール、および−Ｎ（ヘテロアリール）２である。任意選択で、２つの置換基が窒素と一緒になって環を形成することもできる。他に示さない限り、アミノ部分を含む本明細書に記載の化合物はその保護された誘導体を含み得る。アミノ部分のための好適な保護基には、アセチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが含まれる。
【０１４０】
「モノまたはジアルキルアミノ」という用語は、それぞれ、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２などの−ＮＨ（アルキル）または−Ｎ（アルキル）（アルキル）を意味する。例えば、例示的なアミノ基には、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）２などが含まれる。
【０１４１】
本明細書に提供されるすべての定義に関して、定義は、明記されたものを超えるさらなる置換基が含まれてもよいという意味でオープンエンドであると解釈されるべきであることに留意されたい。したがって、Ｃ１アルキルは、１個の炭素原子があることを示すが、炭素原子における置換基が何であるかを示すものではない。しがたって、Ｃ１アルキルは、メチル（すなわち、−ＣＨ３）、ならびに−ＣＲａＲｂＲｃ（式中、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃが各々独立して、水素または任意の他の置換基であり、炭素に対してアルファの原子は、ヘテロ原子またはシアノである）を含む。したがって、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、およびＣＨ２ＣＮはすべてＣ１アルキルである。
【０１４２】
特に明記しない限り、本明細書に示される構造は、１個または複数の同位体濃縮原子の存在においてのみ異なる化合物を含むことを意味する。例えば、重水素もしくは三重水素による水素原子の置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素による炭素原子の置換を除いて、本発明の構造を有する化合物は本発明の範囲内である。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、特に、遊離形態の化合物と比較して、または化合物の異なる塩形態と比較して、改善された薬物動態特性を、塩が化合物に付与している、その塩の形態で利用される本明細書に記載の任意の化合物を包含することを意図する。薬学的に許容される塩形態はまた、当初はそれが以前には有していなかった化合物に望ましい薬物動態特性を付与することができ、生体内でのその治療活性に関して化合物の薬力学にさらに肯定的な影響を及ぼす可能性さえある。好ましく影響され得る薬物動態学的特性の例は、化合物が細胞膜を横切って輸送される方法であり、それは結果として化合物の吸収、分布、生体内変化および排泄に直接かつ肯定的な影響を及ぼし得る。医薬組成物の投与経路は重要であり、そして様々な解剖学的、生理学的、および病理学的な因子が生物学的利用能に決定的に影響を及ぼし得るが、化合物の溶解度は通常それが利用するその特定の塩形態の性質に依存する。当業者は、化合物の水溶液が処置されている対象の体内への化合物の最も急速な吸収を提供し、一方、脂質溶液および懸濁液、ならびに固形剤形が、化合物のより急速でない結果をもたらすことを理解するであろう。
【０１４４】
薬学的に許容される塩には、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製される塩が含まれる。例えば、Bergeら、「Pharmaceutical  Salts」、J.  Pharm.  Sci.、６６巻、１〜１９頁（１９７７年）を参照されたく、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的な塩にはまた、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート（napthylate）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる。本開示の化合物と塩を形成することのできる好適な酸には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などの無機酸、および１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクタ−２−エン−１−カルボン酸、４，４’−メチレン（mefhylene）ビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、酢酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ナフタレンスルホン酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、第３級ブチル酢酸、トリフルオロ酢酸、トリメチル酢酸などの有機酸が含まれる。本開示の化合物と塩を形成することのできる好適な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジおよびトリアルキルおよびアリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、Ｎ−メチルグルカミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなど）、および任意選択で置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなど）などの有機塩基がまれるむ。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経皮、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射、注入ならびに非限定的に他の注射または注入技術を含む。本明細書で使用される場合、「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」という語句は、本明細書に開示されるような少なくとも１つの阻害剤（例えば特定のＣＨＫ２およびＣＡＭ阻害剤またはｐ７０Ｓ６Ｋもしくはｐ９０Ｓ６Ｋの阻害剤）を含む医薬組成物の、それが動物の系に入り、したがって代謝および他の同様のプロセスに付されるような投与、例えば皮下投与を意味する。
【０１４６】
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、通常は標準より低い、またはより低い活性、例えばｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ９０Ｓ６ｋ、Ｃｈｋ２活性、カルモジュリン活性の阻害の２標準偏差（２ＳＤ）を指す。この用語は、差異が存在するという統計学的証拠を意味する。帰無仮説が実際に真であるとき、それは帰無仮説を棄却する決定を下す確率として定義される。多くの場合、決定はｐ値を使用してなされる。
【０１４７】
「任意選択的な」または「任意選択的に」という用語は、続いて記載された事象、状況、または置換基が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびに記載が、当該事象または状況が起こる場合の例およびそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
【０１４８】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１または１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。したがって、本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」を含む医薬組成物への言及は、２またはそれを超える薬剤への言及を含む。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「含むこと」という用語は、提示された定義された要素に加えて他の要素も存在し得ることを意味する。「含むこと」の使用は限定ではなく包含を示す。「からなる」という用語は、実施形態のその記載に列挙されていない任意の要素を排除した、本明細書に記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」という用語は、所与の実施形態に必要とされるそれらの要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本のおよび新規のまたは機能の特性に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。
【０１５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示していない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つまたは複数の方法、および／または本明細書に記載されているタイプのステップ、および／またはこの開示などを読んだ当業者に明らかになるであろうものを含む。
【０１５１】
操作例、または他に指示がある場合を除いて、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージに関連して使用される場合、±１％を意味し得る。実施例を含む以下で本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はそれらに限定されることはない。
【０１５２】
本発明を実施例によってさらに説明するが、これは限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての参考文献の内容、ならびに図および表は、参照により本明細書に組み込まれる。特定されたすべての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載された方法論を記載および開示する目的で参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみが提供されている。この点に関して、先行発明のために、または他の何らかの理由で、本発明者らがそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する記述またはその内容に関する表現はすべて、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「ｒｐｓ６」は、翻訳を調節するのに関与すると考えられている４０Ｓリボソームサブユニットの構成要素であるリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）を指す。ｒｐＳ６の真の機能は現在調査中であるが、研究はそれが細胞のサイズ、細胞増殖、およびグルコース恒常性の調節に関与していることを示している。研究は、ｐ７０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ１およびＳ６Ｋ２）とｐ９０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ＲＳＫ）との両方がｒｐＳ６をリン酸化すること、ならびにＳ６Ｋ１およびＳ６Ｋ２がこの機能について優位であることを示す。Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託ＮＭ＿００１０１０（例えば、Magnuson  B1ら、（２０１２年）、「Regulation  and  function  of  ribosomal  protein  S6  kinase  (S6K)  within  mTOR  signaling  networks」、Biochemical  Journal、４４１巻（１号）、１〜２１頁を参照）。
【０１５４】
Ｐ９０Ｓ６ＫおよびＰ７０Ｓ６Ｋ
リボソームｓ６キナーゼ（ｒｓｋ）は、タンパク質キナーゼのファミリーである。１）本明細書においてｐ９０Ｓ６Ｋと呼ばれ、ＭＡＰＫ活性化タンパク質キナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１）としても公知の、ｐ９０ｒｓｋ、および２）本明細書においてｐ７０Ｓ６Ｋと呼ばれ、Ｓ６−Ｈ１キナーゼまたは簡単にＳ６キナーゼとしても公知の、ｐ７０ｒｓｋの、ｒｓｋの２つのサブファミリーが存在する。ｒｓｋは、翻訳機構の一部であるリボソームタンパク質ｓ６と命名されているが、他のリボソームタンパク質を含む他のいくつかの基質が同定されている。
【０１５５】
ｐ９０Ｓ６Ｋの細胞質の基質にはタンパク質ホスファターゼ１、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）、Ｌ１  ＣＡＭ、神経細胞接着分子、Ｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、Ｒａｓ交換因子、およびＭｙｔ１、ｃｄｃ２の阻害剤、ならびに他のものが含まれる（Morten  FrodinおよびSteen  Gammeltoft、１９９９年、Role  and  regulation  of  90  kDa  ribosomal  S6  kinase  (RSK)  in  signal  transduction、Molecular  and  Cellular  Endocrinology、１５１巻（１〜２号）、６５〜７７頁）。ある特定の実施形態では、ｐ９０Ｓ６Ｋ活性は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、これらの基質およびモニターされたリン酸化を使用して評価される。ＲＳＫＳはセリン／スレオニンキナーゼであり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路によって活性化される。
【０１５６】
セリン１１３４および１１６１でのＳＯＳ１（Ｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）のＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６Ｋ）によるリン酸化は１４−３−３ドッキング部位を作り出す。ホスホＳＯＳ１と１４−３−３のこの相互作用は、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路を負に調節する。ｐ９０ｒｓｋはまた、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）；エストロゲン受容体−α（ＥＲα）；ＩκＢα／ＮＦ−κＢ；およびｃ−Ｆｏｓを含む転写因子を調節する（Morten  FrodinおよびSteen  Gammeltoft、上述）。９０ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ）のいくつかのアイソフォーム、バリアント、すなわちＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、およびＲＳＫ４が存在する（これらのアイソフォームの突然変異は当技術分野において周知であり、例えば、Laraら、「A  review  of  the  p90-  RSK  family  members:  Common  functions  and  isoform  specificity」、Cancer  Research、７３巻（１７号）２０１３年９月１日、ＯＦ１〜８を参照）。ｐ９０Ｓ６Ｋヒトタンパク質配列には、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｑ１５４１８．２（ＧＩ：２０１７８３０６）；ＮＰ＿０６６９５８．２（ＧＩ：１９９２３５７０）；ＮＰ＿００１３０５８６５．１（ＧＩ：９７４５７６７８９）；ＮＰ＿００１３０５８６７．１（ＧＩ：９７４５７６７９１）；ＮＰ＿００２９４４．２（ＧＩ：２０１４９５４７）；ＸＰ＿００５２４６０２３．１（ＧＩ：５３０３６１３０２）に見られるものが含まれる。ある特定の実施形態では、ｐ９０Ｓ６Ｋの阻害剤は、ｐ９０Ｓ６Ｋに直接結合してそのキナーゼ活性を阻害することによってｐ９０Ｓ６Ｋを直接阻害する。
【０１５７】
ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）
【０１５８】
ヒトにおけるｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）としても公知にリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼベータ−１（Ｓ６Ｋ１）は、ＲＰＳ６ＫＢ１遺伝子によってコードされる。それは、ＰＩ３キナーゼ経路においてＰＩＰ３およびホスホイノシチド依存性キナーゼ１の下流で作用するセリン／スレオニンキナーゼである（Chung  J、Grammer  TC、Lemon  KP、Kazlauskas  A、Blenis  J.、（１９９４年）、「PDGF-  and  insulin-dependent  pp70S6k  activation  mediated  by  phosphatidylinositol-3-OH  kinase」、Nature、３７０巻（６４８４号）、７１〜７５頁；Chung  J、Kuo  CJ、Crabtree  GR、Blenis  J.、（１９９２年）、「Rapamycin-FKBP  specifically  blocks  growth-dependent  activation  of  and  signaling  by  the  70  kd  S6  protein  kinases」、Cell、６９巻（７号）、１２２７〜１２３６頁）。ｍＴＯＲは、トレオニン３８９でｐ７０Ｓ６Ｋをリン酸化することが公知であり、様々な状況においてオートファジー阻害と相関する。ある特定の実施形態では、ｍＴｏｒの阻害剤はｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤である。代替的な実施形態では、ｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤は、ｐ７０Ｓ６Ｋに直接結合してそのキナーゼ活性を阻害することによってｐ７０Ｓ６Ｋを直接阻害する。
【０１５９】
ｐ７０Ｓ６Ｋの基質は他のものと同様にリボソームタンパク質Ｓ６を含む。Ｓ６のリン酸化はリボソームでタンパク質合成を誘導する。ある特定の実施形態では、ｐ７０Ｓ６Ｋ活性は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、これらの基質およびモニターされたリン酸化を使用して評価される。ｐ７０Ｓ６Ｋヒトタンパク質配列には、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２５８９７１．１；ＮＰ＿００１２５８９７２．１；ＮＰ＿００１２５８９７３．１；ＮＰ＿００１２５８９８９．１；ＮＰ＿００３１５２．１に見られるものが含まれる。参照ｍＲＮＡ配列には、例えば、ＮＭ＿００１２７２０４２；ＮＭ＿００１２７２０４３；ＮＭ＿００１２７２０４４；ＮＭ＿００１２７２０６０；ＮＭ＿００３１６１が含まれる。
【０１６０】
ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤
【０１６１】
本明細書において提供されるのは、リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、有効量のリボソームｓ６キナーゼであるＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６ｋ）の阻害剤を対象に投与して、ｐ９０Ｓ６Ｋ活性を低下させ、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させることを含む方法である。
【０１６２】
ｐ９０Ｓ６Ｋの任意の阻害剤を本発明の方法において使用することができる。いくつかの公知のｐ９０Ｓ６Ｋの阻害剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Shiliang  Liら、「Identification  of  Inhibitors  against  p90  Ribosomal  S6  Kinase  2  (RSK2)  through  Structure-Based  Virtual  Screening  with  the  Inhibitor-Constrained  Refined  Homology  Model」、J.  Chem.  Inf.  Model.、２０１１年、５１巻（１１号）、２９３９〜２９４７頁に記載されるものを含む。阻害剤の非限定的な例は、以下の特許および出願公開に開示されている：米国特許第７６０５２４１号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０００７０９。多くは市販され、例えば、Ｋｅｍｐｆｅｒｏｌ、化学名：３，５，７−トリヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；およびＢＲＤ７３９、化学名：１−［（２−フェニルエチル）アミノ］−３Ｈ−ナフト［１，２，３−デ］キノリン−２，７−ジオン；ＰＦ  ４７０８６７１、化学名；２−［［４−（５−エチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール）およびＳＬ  ０１０１−１化学名：３−［（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−６−デオキシ−α−Ｌ−マンノピラノシル）オキシ］−５，７−ジヒドロ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１ベンゾピラン−４−オンは、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｖｏｎｍｏｕｔｈ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＢＳ１１  ９ＱＤ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）より入手可能であり；ならびに、TL  Nguyenら、「Targeting  RSK:  an  overview  of  small  molecule  inhibitors」、Anticancer  Agents  Med.  Chem.、２００８年、８巻（７号）、７１０〜７１６頁に記載されるようなＦＭＫ  ＲＳＫ阻害剤（ｐ９０  ＲＳＫ特異的）は、例えば、Ａｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ  ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより入手可能である。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、ｐ９０Ｓ６Ｋの阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、またはＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）の誘導体もしくはアナログである。ＢＩは分子式（ＭＦ）Ｃ１８Ｈ１９ＦＮ４Ｏ２を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｐ９０リボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ）アイソフォームの各々の強力かつ特異的な阻害剤である。したがって、それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、およびＲＳＫ４を阻害し（ＩＣ５０値はそれぞれ、３１ｎＭ、２４ｎＭ、１８ｎＭ、および１５ｎＭである）（Ａｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ  ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより入手可能である）。ＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）は、以下の構造：
【化４】
2019524735.tif 000006
を有する。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤は、ＳＬ０１０１（ＳＬ）、またはＳＬ０１０１（ＳＬ）の誘導体もしくはアナログであり、ＳＬ０１０１（ＳＬ）は、以下の構造：
【化５】
2019524735.tif 000007
を有する。ＳＬはリボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ）の選択的阻害剤であり、ＲＳＫ２に対する選択制を有する（ＲＳＫ２に対するＩＣ５０＝８９ｎＭである）。ＳＬは、ＭＥＫ、Ｒａｆ、およびＰＫＣなどの上流のキナーゼを阻害しない。
【０１６５】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、有効量のＲＳＫ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）の阻害剤を投与することを含む、方法もまた提供される。ｐ７０Ｓ６Ｋの任意の阻害剤を本発明の方法において使用することができる。いくつかの公知のｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤は、例えば、Upul  Bandarageaら、「4-(Benzimidazol-2-yl)-1,2,5-oxadiazol-3-ylamine  derivatives:  Potent  and  selective  p70S6  kinase  inhibitors」、Bioorganic  &  Medicinal  Chemistry  Letters、１９巻（１７号）、２００９年９月１日、５１９１〜５１９４頁に記載されるもの；ならびに、ラパマイシンおよびその誘導体、ならびに例えば、Sandrine  Faivreら、「Current  development  of  mTOR  inhibitors  as  anticancer  agents」Nature  Reviews  Drug  Discovery、５巻、６７１〜６８８頁（２００６年８月）に記載されるような他のものを含み、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。多くは市販され、例えば、ＰＦ  ４７０８６７１、ＭＦ  Ｃ１９Ｈ２１Ｆ３Ｎ６  ＲＳＫ阻害剤（ｐ７０  ＲＳＫ特異的）（Ａｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ  ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより入手可能）；およびＤＧ２、ＭＦ  Ｃ１６Ｈ１７ＢｒＮ６Ｏ、ＲＳＫ阻害剤（ｐ７０リボソームＳ６キナーゼ１特異的）がある。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、ｐ７０Ｓ６ｋの阻害剤は、ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）、またはＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）の誘導体もしくはアナログであり、ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）は、以下の構造：
【化６】
2019524735.tif 000008
を有する。
【０１６７】
本明細書において同定される標的タンパク質、例えば、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ９０ＳＫを阻害する化合物の能力は、それぞれの阻害剤の非存在におけるタンパク質の活性と比較した、阻害剤によるキナーゼ活性の低下を測定することによって評価できる。
【０１６８】
他の阻害剤
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、有効量のＣｈｋ２の阻害剤を対象に投与して、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させることを含み、Ｃｈｋ２の阻害剤が、ＣＣＴおよびＩＩＩまたはそれらの誘導体からなる群から選択される化合物を含み、ＣＣＴおよびＩＩＩが、以下の構造：
【化７】
2019524735.tif 000009
【化８】
2019524735.tif 000010
を有する、方法もまた提供される。
【０１６９】
チェックポイントキナーゼ（Ｃｈｋ）（例えば、Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２）は、細胞周期の制御に関与するセリン／スレオニンキナーゼである。それらは、正常細胞および損傷細胞における細胞周期の進行を遅らせるための必須の構成要素であり、３つの細胞周期チェックポイントすべてにおいて作用し得る。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「ＣＣＴ」は、上述のＴｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手可能なＣＣＴ  ２４１５３３ジヒドロクロリドを指す。ＣＣＴは強力なＣｈｋ２阻害剤である（ＩＣ５０＝３ｎＭ）。Ｃｈｋ２および８４の他のキナーゼの一団よりもＣｈｋ１に対して６３倍を超える選択性を示す。ＣＣＴは、ＨＴ２９細胞におけるエトポシド誘発ＤＮＡ損傷に応答するＣｈｋ２活性化を阻害し、マウス胸腺細胞の電離放射線誘発アポトーシスを防ぐ。
【０１７１】
フェノチアジン化合物
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、有効量のカルモジュリンの阻害剤を対象に投与して、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させることを含み、カルモジュリンの阻害剤が、フェノチアジン化合物、またはフェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログであり、フェノチアジン化合物が、以下の構造：
【化９】
2019524735.tif 000011
【化１０】
2019524735.tif 000012
を有するＡＣＶ−１−２３５（ＡＣＶ）；ＪＪＭ−ＩＩ−２２１Ｅ（２２１Ｅ）；およびＤＢ１０２６（ＰｅｒＳｕｃｃ）からなる群から選択される、方法もまた提供される。
【０１７２】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、有効量のカルモジュリンの阻害剤を対象に投与して、対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させることを含み、カルモジュリンの阻害剤が、フェノチアジン化合物、またはフェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログであり、フェノチアジン化合物が、以下の構造：
【化１１】
2019524735.tif 000013
【化１２】
2019524735.tif 000014
【化１３】
2019524735.tif 000015
を有するＤＢ−４−０８３（０８３）；ＤＢ−４−０８４（０８４）；ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）からなる群から選択される方法もまた提供される。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するためのフェノチアジン化合物は、式（Ｉ）：
【化１４】
2019524735.tif 000016
（式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アシル、アリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、またはアルキルアリールであり；
各々のＲは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、またはＳＯ３Ｈである）
の化合物、ならびにその異性体および薬学的に許容される塩である。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物においてＸはＳである。いくつかの他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物においてＸはＯである。
【０１７５】
式（Ｉ）の化合物においてＲ１基は、Ｈ、アルキル、シクリル、ヘテロシクリル、アシル、アリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、およびアルキルアリールからなる群から選択され得る。任意選択で、Ｒ１基のアルキル、シクリル、ヘテロシクリル、アシル、アリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、およびアルキルアリールは、１、２、３、または４個の置換基で置換され得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。Ｒ１基に対する例示的なアルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ１はイソプロピルである。
【０１７７】
さらにいくつかの他の実施形態では、Ｒ１は、任意選択で置換されたアルキルアリール、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアリールであり、これは任意選択で置換され得る。Ｒ１基のアルキルアリールに対する例示的なアリールには、Ｃ１〜Ｃ６アルキルフェニルが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｒ１はベンジルである。
【０１７８】
さらに他の実施形態では、Ｒ１は、任意選択で１、２、３、または４個の置換基で置換されたヘテロシクリルである。Ｒ１基に対する例示的なヘテロシクリルには、任意選択で置換されたピペリジニルが含まれるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意選択で、Ｎ原子で置換された４−ピペリジニルである。例えば、Ｒ１はＮ−メチルピペリジン−４−イルである。
【０１７９】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ基は、同一でも異なっていてもよく、Ｈ、ハロ、アルキル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、およびＳＯ３Ｈからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、各々のＲは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ＣＮ、またはＣＯ２Ｈである。
【０１８０】
いくつかのさらなる実施形態では、各々のＲは、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、メチル、トリフルオロメチル、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＣＮ、またはＣＯ２Ｈである。
【０１８１】
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、アルキル、ヘテロシクリル、またはアルキルアリールであり、その各々は任意選択で置換され得、各々のＲは、Ｈ、ハロ、アルキル、またはハロアルキルである。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するためのフェノチアジン化合物は、式ＩＩ：
【化１５】
2019524735.tif 000017
（式中、
各々のＲ２１は、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
の化合物、その異性体および薬学的に許容される塩である。
【０１８３】
式（ＩＩ）の化合物において、すべてのＲ２１が同一であってよく、すべて異なっていてもよく、または２つが同一で１つが異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、各々のＲ２１は、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ＣＮ、またはＣＯ２Ｈである。例えば、各々のＲ２１は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、メチル、トリフルオロメチル、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＣＮ、またはＣＯ２Ｈであり得る。
【０１８４】
一実施形態では、リボソーム障害およびリボソーム病、例えばＤＢＡを処置するためのフェノチアジン化合物は、構造：
【化１６】
2019524735.tif 000018
の化合物である。
【０１８５】
リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、有効量のカルシウムチャネル遮断剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭまたはその誘導体もしくはアナログを対象に投与して、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させることを含み、ＢＡＰＴＡ−ＡＭが、以下の構造：
【化１７】
2019524735.tif 000019
を有する、方法もまた提供される。
【０１８６】
ｐ９０Ｓ６Ｋとｐ７０Ｓ６Ｋとｒｂｓ６のＲＮＡｉ阻害剤
本明細書において論じられるように、本発明者らは、ｒｓｋタンパク質ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害、ならびにｒｐｓ６の阻害剤を、本明細書において開示されるようなリボソームタンパク質障害およびリボソーム病の処置のための方法に使用できることを見出した。いくつかの実施形態では、阻害剤は、小分子化合物ではなく、むしろタンパク質阻害剤であり、いくつかの実施形態では、阻害剤は、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの機能またはｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋのその遺伝子からの発現を阻害する任意の核酸である。いくつかの実施形態では、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤は、遺伝子サイレンシング剤である。
【０１８７】
ヒトｐ９０Ｓ６Ｋは、ＨＵ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ１Ａ、ＲＳＫ、ＲＳＫ１、ｐ９０Ｒｓｋ、９０ｋＤａリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ、１ＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ、１ａＭＡＰＫ活性化タンパク質キナーゼ、１ａＭＡＰＫＡＰキナーゼの別名によっても公知であり、核酸配列、染色体１、ＮＣ＿０００００１．１１（２６５２９７５８．．２６５７５０２９）によってコードされる。１つのｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼＡ２（ＲＰＳ６ＫＡ２）バリアント、すなわち、転写バリアント１は、ＧｅｎｅｂａｎｋのＮＭ＿０２１１３５．５のｍＲＮＡであり、本明細書において配列番号１であり、配列番号２のアミノ酸を有する。ｐ９０Ｓ６Ｋ遺伝子の阻害は、当業者に一般的に公知の方法による遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子によるものであってよい。例えば、ヒトｐ９０Ｓ６Ｋを特異的に標的とする遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、ｐ９０Ｓ６Ｋ発現をノックダウンするために容易に使用できる。ｐ９０Ｓ６ＫのｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを使用して成功裏に標的とすることができ；他のｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの公知の配列に基づいて当業者によって容易に調製できる。したがって、疑問を避けるために、当業者は、以下のような配列番号１の核酸配列に対するＲＮＡｉ（ＲＮＡサイレンシング）剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
【化１８−１】
2019524735.tif 000020
【化１８−２】
2019524735.tif 000021
【化１８−３】
2019524735.tif 000022
【０１８８】
配列番号１は以下のアミノ酸配列、すなわち配列番号２をコードする。
【化１９】
2019524735.tif 000023
【０１８９】
ヒトｐ７０Ｓ６Ｋはまた、ｐ７０  Ｓ６ＫＡ；ｐ７０（Ｓ６Ｋ）−アルファ；ｐ７０−アルファ；ｐ７０−Ｓ６Ｋ；ＰＳ６Ｋ；Ｓ６Ｋ；Ｓ６Ｋ−ベータ−１；Ｓ６Ｋ１；ＳＴＫ１４Ａ；およびＲＰＳ６ＫＢ１の別名によっても公知であり、例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼＢ１（ＲＰＳ６ＫＢ１）、転写バリアント１の、受託番号ＮＭ＿００１２７２０６０．１  ＧＩ：４４０５４６４１５核酸配列（配列番号３）のｍＲＮＡによってコードされ、（配列番号４）のアミノ酸を有する。ｐ７０Ｓ６Ｋ遺伝子の阻害は、当業者に一般的に公知の方法による遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子によるものであってよい。例えば、ヒトｐ７０Ｓ６Ｋを特異的に標的とする遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、ｐ７０Ｓ６Ｋ発現をノックダウンするために容易に使用できる。ｐ７０Ｓ６ＫのｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを用いて成功裏に標的とすることができ；他のｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの公知の配列に基づいて当業者によって容易に調製できる。したがって、疑問を避けるために、当業者は、以下のようなＮＭ＿００１２７２０６０の核酸配列に対するＲＮＡｉ（ＲＮＡサイレンシング）剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
【化２０−１】
2019524735.tif 000024
【化２０−２】
2019524735.tif 000025
【化２０−３】
2019524735.tif 000026
【０１９０】
配列番号３は、以下のような配列番号４をコードする。
【化２１】
2019524735.tif 000027
【０１９１】
ある特定の実施形態では、ｒｐｓ６が阻害される。ｒｐｓ６遺伝子の阻害は、当業者に一般的に公知の方法による遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子によるものであってよい。例えば、ヒトｒｐｓ６（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００１０１０．２）を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、ｒｐｓ６発現をノックダウンするために容易に使用できる。ｒｐｓ６のｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを用いて成功裏に標的とすることができ；他のｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの公知の配列に基づいて当業者によって容易に調製できる。したがって、疑問を避けるために、当業者は、以下のような配列番号５の核酸配列に対するＲＮＡｉ（ＲＮＡサイレンシング）剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
【化２２−１】
2019524735.tif 000028
【化２２−２】
2019524735.tif 000029
【０１９２】
これらの例示された核酸配列の他のバリアントも標的とされ得ることを当業者は当然に理解するであろう。
【０１９３】
当業者は、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋまたはｒｐｓ６の阻害剤が、抗体、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子などのような、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの機能を阻害する任意の薬剤であり得ることを理解するであろう。ｐ９０Ｓ６Ｋ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、およびｒｐｓ６に対する市販の中和抗体および抗体断片は、本明細書に開示されるような方法および組成物における使用のために包含される。
【０１９４】
当業者は、ある特定の化合物がｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤として作用するかどうかを試験することができる。ある特定の化合物のｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋ活性についての試験系は当技術分野において周知である。例えば、そのような試験系は、Rouxら、「Phosphorylation  of  p90  Ribosomal  S6  Kinase  (RSK)  Regulates  Extracellular  Signal-Regulated  Kinase  Docking  and  RSK  Activity」、Mol  Cell  Biol.、２００３年７月、２３巻（１４号）、４７９６〜４８０４頁；およびSapkotaら、「BI-D1870  is  a  specific  inhibitor  of  the  p90  RSK  (ribosomal  S6  kinase)  isoforms  in  vitro  and  in  vivo」、Biochem  J.、２００７年１月１日、４０１巻（第１部）、２９〜３８頁に記載される。Masuda-Robensら、「Assays  for  monitoring  p70  S6  kinase  and  RSK  activation」、Methods  Enzymol.、２００１年、３３３巻、４５〜５５頁もまた参照されたい。例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性キット−ＡＤＩ−ＥＫＳ−４７０−Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）；およびＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からのｐ７０  Ｓ６Ｋ活性キット（ａｂ１３９４３８）などの、当技術分野において利用可能な市販のアッセイもまた存在する。
【０１９５】
さらに、本明細書において記載されるように、Ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚における、形態学的、造血または内皮の欠損の少なくとも１つを救済する能力、および／または、ｓｉＲＮＡによってＲＰＳ１９をノックダウンされたＡ５４９肺がん細胞株におけるｐ５３の機能および核蓄積を防ぐ能力、または、ｓｉＲＮＡによってＲＰＳ１９をノックダウンされたＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１レベルを低下させるかもしくは赤血球マーカーを増加させる能力は、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤の活性をモニターするための手段である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような特定のカルモジュリン阻害剤（例えば、図２４もしくは図３３のフェノチアジン誘導体、または図３２のＰｅｒＳｕｃｃ、もしくは２２１ＥもしくはＡＣＶ、または式Ｉおよび式ＩＩの化合物ならびにそれらのアナログもしくは誘導体）は、当技術分野において周知のアッセイを使用して当業者によって評価でき、例えば、カルモジュリンの阻害は、とりわけ、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）のカルモジュリン依存性活性化を測定する以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて決定される。活性化ＭＬＣＫはニワトリ砂嚢ミオシン軽鎖をリン酸化する。カルモジュリンが阻害される場合、ミオシン軽鎖リン酸化の速度が低下する。これを試験するために、以下の実験が実施される（Itohら、Biochem.  Pharm.、１９８６年、３５巻、２１７〜２２０頁による）。反応混合物（０．２ｍｌ）は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５ｍＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１μＣｉ／アッセイチューブ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのミオシン軽鎖、２４ｎＭのカルモジュリン、および０．１ｍＭのＣａＣｌ２を含む。トリ砂嚢由来のＭＬＣＫ（比活性：４．５モル／分／ｍｇ）濃度は、０．１μｇ／ｍｌである。インキュベーションは３０℃で４分間実施される。反応は、１ｍｌの２０％トリクロロ酢酸の添加によって停止される。次いで、０．１ｍｌのウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を反応混合物に添加する。次いで、試料を１０分間遠心分離し、ペレットを５％のトリクロロ酢酸に再懸濁する。最終ペレットを２ｍｌの１ＮのＮａＯＨ中に溶解し、放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。トリプシン処理ＭＬＣＫは、Itohら、J  Pharmacol.  Exp.  Ther.、１９８４年、２３０巻、７３７頁に記載されるように調製できる。反応を、ＡＴＰの添加によって開始し、可能性のある阻害剤の存在下で、または対照としての溶媒の存在下で実施する。種々の濃度の化合物を上述のアッセイで試験する。キナーゼ活性の５０％低下をもたらす化合物の濃度は、ＩＣ５０濃度となる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤、ｒｐｓ６、または特定のＣｈｋ２阻害剤、およびＣａｍ阻害剤は、示されたＲＳＫ、ｒｐｓ６、Ｃｈｋ２、またはＣａｍの活性を、阻害剤の非存在下の活性レベルと比較して、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％までも阻害または低下させ得る。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるような阻害剤は、それぞれのタンパク質の発現を、阻害剤の非存在下における発現と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％までも低下させ得る。
【０１９８】
ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６ＫまたはＣｈｋ２またはＣａｍまたはｒｐｓ６の発現は、タンパク質をコードする遺伝子から転写されたそれぞれのＲＮＡの量、および／または遺伝子から転写されたＲＮＡの翻訳によって得られるタンパク質の量を含む。例えば、本明細書において開示されるようなｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤は、ｐ９０Ｓ６Ｋ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、Ｃｈｋ２、またはＣａｍまたはｒｐｓ６の発現を、阻害剤の非存在下における参照レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％までも阻害し得る。
【０１９９】
さらに、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋを阻害する化合物の能力はまた、陰性対照、例えば、阻害剤の非存在下の実験条件と比較した、生物学的キナーゼ活性における低下、またはその阻害の低下を測定することによって評価できる。したがって、本明細書において開示されるようなｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤は、ｐ９０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋの生物学的キナーゼ活性を、阻害剤の非存在下における参照レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％までも阻害し得る。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ｐ９０Ｓ６Ｋ、またはｐ７０Ｓ６Ｋ、ｒｐｓ６、またはＣｈｋ２、またはＣａｍを阻害する阻害剤の能力は、本明細書における実施例に実証されるように、そのような阻害剤による処理を伴わない参照条件と比較して、Ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚における、形態学的、造血または内皮の欠損の少なくとも１つを救済することによって、および／または、ｓｉＲＮＡによってＲＰＳ１９をノックダウンされたＡ５４９肺がん細胞株におけるｐ５３の機能および核蓄積を防ぐことによって、または、ｓｉＲＮＡによってＲＰＳ１９をノックダウンされたＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１レベルを低下させるかもしくは赤血球マーカーを増加させることによって評価される。
【０２０１】
投与される阻害剤の投与量は、疾患の臨床的重症度、患者の年齢および体重、乾癬の発生を引き起こす可能性がある状態への患者による曝露、ならびに肝臓および腎臓の代謝などの当技術分野において一般的に理解されている他の薬物動態学的因子に基づいて、当業者によって決定できる。表面積のｍｇ／ｍ３に基づく様々なサイズや種の動物と人間に対する投与量の相互関係は、E.  J.  Freireichら、「Quantitative  Comparison  of  Toxicity  of  Anticancer  Agents  in  Mouse,  Rat,  Hamster,  Dog,  Monkey  and  Man」、Cancer  Chemother.  Rep.、５０巻、２１９〜２４４頁（１９６６年）によって記載される。投与レジメンを調整して治療応答を最適化することができる。用量を分割し、毎日投与することができ、または治療状況に応じて比例的に用量を減らすことができる。
【０２０２】
典型的には、これらの薬物は経口投与され、それらは従来の丸剤または液体形態で投与できる。丸剤形態で投与する場合、それらは賦形剤、充填剤、保存剤、および丸剤形態の医薬製剤に使用される他の典型的な成分と共に従来の製剤で投与することができる。典型的には、薬物は典型的に担体を含む標準的な薬学的に許容される製剤で投与される。当技術分野において公知の従来の薬学的に許容される担体は、アルコール、例えば、エチルアルコール、血清タンパク質、ヒト血清アルブミン、リポソーム、リン酸塩などの緩衝液、水、滅菌食塩水、またはその他の塩、電解質、グリセロール、ヒドロキシメチルセルロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン、その他の界面活性剤、植物油、ならびにパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの従来の抗菌剤または抗真菌剤などを含み得る。本発明の範囲内の薬学的に許容される担体は、無菌性、等張性、安定性、および非発熱性に関する業界基準を満たす。
【０２０３】
薬学的に許容される製剤はまた、当技術分野で公知の通りの丸剤、錠剤またはロゼンジの形態であり得、より大きな安定性または認容性のために賦形剤または他の成分を含み得る。錠剤の場合、賦形剤は、本明細書に開示される阻害剤および他の成分と併存する、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、もしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの滑沢剤であり得る。
【０２０４】
薬物はまた、保存剤、安定剤、着色剤、香味剤、および他の一般的に認められている医薬成分を含み得る、従来の製剤の液体形態で投与することもできる。典型的には、薬物が液体形態で投与されるとき、それらは水溶液である。水溶液は緩衝剤を含み得、エチルアルコールなどのアルコールまたは他の薬学的に許容される化合物を含み得る。
【０２０５】
代替的に、薬物は、当技術分野において周知のいくつかの経路のうちの１つによる注射によって投与することができる。しかしながら、薬物を経口投与することが一般に好ましい。
【０２０６】
薬物は、疾患の重症度、投与される総投与量、および治療医の判断に応じて、１日あたり１回から１日あたり少なくとも５回までで投与することができる。いくつかの場合では、薬物を毎日投与する必要はないが、隔日、３日ごと、または他のそのようなスケジュールで投与することができる。しかしながら、薬物を毎日投与することが一般に好ましい。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている阻害剤のプロドラッグも本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、いくつかの化学的または生理学的プロセス（例えば、酵素プロセスおよび代謝加水分解）を介して機能的に活性である阻害剤（例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６ｋまたはｐ７０Ｓ６ｋ阻害剤；またはＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬまたはＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレーターＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１Ｅ、およびＡＣＶ；または、例えば図３３の阻害剤、または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物）へと変換することができる化合物を指す。
【０２０８】
したがって、「プロドラッグ」という用語はまた、薬学的に許容される生物学的に活性化合物の前駆体を指す。プロドラッグは、対象に投与されるとき不活性、すなわちエステルであり得、しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性化合物へと、例えば加水分解によって遊離カルボン酸または遊離ヒドロキシルへと変換される。プロドラッグ化合物は、しばしば、生物内での溶解性、組織適合性、または遅延放出という利点を提供する。「プロドラッグ」という用語はまた、そのようなプロドラッグが対象に投与されたときにｉｎ  ｖｉｖｏで活性化合物を放出する任意の共有結合担体を含むことを意味する。活性化合物のプロドラッグは、修飾が通常の操作またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで親活性化合物へと切断されるように活性化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。プロドラッグは、活性化合物のプロドラッグが対象に投与されたときに切断してそれぞれ遊離ヒドロキシ、遊離アミノ、または遊離メルカプトの基を形成する任意の基にヒドロキシ、アミノまたはメルカプト基が結合している化合物を含む。プロドラッグの例には、アルコールまたはアセトアミドのアセテート、ホルメート、およびベンゾエートの誘導体、活性化合物中のアミン官能基のホルムアミドおよびベンゾアミドの誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。Jucker編、Progress  in  Drug  Research、４巻、２２１〜２９４頁（１９６２年）中のHarper、「Drug  Latentiation」；E.  B.  Roche編、Design  of  Biopharmaceutical  Properties  through  Prodrugs  and  Analogs、APHA  Acad.  Pharm.  Sci.、４０巻（１９７７年）中のMorozowichら、「Application  of  Physical  Organic  Principles  to  Prodrug  Design」；Bioreversible  Carriers  in  Drug  in  Drug  Design,  Theory  and  Application、E.  B.  Roche編、APHA  Acad.  Pharm.  Sci.（１９８７年）；Design  of  Prodrugs、H.  Bundgaard、Elsevier（１９８５年）；Curr.  Pharm.  Design.、５巻（４号）、２６５〜２８７頁（１９９９年）中のWangら、「Prodrug  approaches  to  the  improved  delivery  of  peptide  drug」；Paulettiら、（１９９７年）Improvement  in  peptide  bioavailability:  Peptidomimetics  and  Prodrug  Strategies、Adv.  Drug.  Delivery  Rev.、２７巻：２３５〜２５６頁；Mizen  etら、（１９９８年）、「The  Use  of  Esters  as  Prodrugs  for  Oral  Delivery  of  (3-Lactam  antibiotics)」、Pharm.  Biotech.、ｌｌ巻、３４５〜３６５頁；Gaignaultら、（１９９６年）「Designing  Prodrugs  and  Bioprecursors  I.  Carrier  Prodrugs」、Pract.  Med.  Chem.、６７１〜６９６頁；Transport  Processes  in  Pharmaceutical  Systems、G.  L.  Amidon、P.  I.  Lee、およびE.  M.  Topp編、Marcell  Dekker、１８５〜２１８頁（２０００年）中の、Asgharnejad、「Improving  Oral  Drug  Transport」；Balantら、「Prodrugs  for  the  improvement  of  drug  absorption  via  different  routes  of  administration」、Eur.  J.  Drug  Metab.  Pharmacokinet.、１５巻（２号）、１４３〜５３頁（１９９０年）；BalimaneおよびSinko、「Involvement  of  multiple  transporters  in  the  oral  absorption  of  nucleoside  analogues」、Adv.  Drug  Delivery  Rev.、３９巻（１〜３号）、１８３〜２０９頁（１９９９年）；Browne、「Fosphenytoin  (Cerebyx)」、Clin.  Neuropharmacol.、２０巻（１号）、１〜１２頁（１９９７年）；Bundgaard、「Bioreversible  derivatization  of  drugs  -  principle  and  applicability  to  improve  the  therapeutic  effects  of  drugs」、Arch.  Pharm.  Chemi、８６巻（１号）、１〜３９頁（��９７９年）；Bundgaard  H.、「Improved  drug  delivery  by  the  prodrug  approach」、Controlled  Drug  Delivery、１７巻、１７９〜９６頁（１９８７年）；Bundgaard  H.、「Prodrugs  as  a  means  to  improve  the  delivery  of  peptide  drugs」、Arfv.  Drug  Delivery  Rev.、８巻（１号）、１〜３８頁（１９９２年）；Fleisherら、「Improved  oral  drug  delivery:  solubility  limitations  overcome  by  the  use  of  prodrugs」、Arfv.  Drug  Delivery  Rev.、１９巻（２号）、１１５〜１３０頁（１９９６年）；Fleisherら、「Design  of  prodrugs  for  improved  gastrointestinal  absorption  by  intestinal  enzyme  targeting」、Methods  Enzymol.、１１２巻（Drug  Enzyme  Targeting,  Pt.  A）、３６０〜８１頁（１９８５年）；Farquhar  Dら、「Biologically  Reversible  Phosphate-Protective  Groups」、Pharm.  Sci.、７２巻（３号）、３２４〜３２５頁（１９８３年）；Freeman  Sら、「Bioreversible  Protection  for  the  Phospho  Group:  Chemical  Stability  and  Bioactivation  of  Di(4-acetoxy-benzyl)  Methylphosphonate  with  Carboxyesterase」、Chem.  Soc.,  Chem.  Commun.、８７５〜８７７頁（１９９１年）；FriisおよびBundgaard、「Prodrugs  of  phosphates  and  phosphonates:  Novel  lipophilic  alphaacyloxyalkyl  ester  derivatives  of  phosphate-  or  phosphonate  containing  drugs  masking  the  negative  charges  of  these  groups」、Eur.  J.  Pharm.  Sci.、４巻：４９〜５９頁（１９９６年）；Gangwarら、「Pro-drug,  molecular  structure  and  percutaneous  delivery」、Des.  Biopharm.  Prop.  Prodrugs  Analogs、[Symp.]  １９７６年開催、４０９〜２１頁（１９７７年）；NathwaniおよびWood、「Penicillins:  a  current  review  of  their  clinical  pharmacology  and  therapeutic  use」、Drugs、４５巻（６号）：８６６〜９４頁（１９９３年）；SinhababuおよびThakker、「Prodrugs  of  anticancer  agents」、Adv.  Drug  Delivery  Rev.、１９巻（２号）、２４１〜２７３頁（１９９６年）；Stellaら、「Prodrugs.  Do  they  have  advantages  in  clinical  practice?」、Drugs、２９巻（５号）、４５５〜７３頁（１９８５年）；Tanら、「Development  and  optimization  of  anti-HIV  nucleoside  analogs  and  prodrugs:  A  review  of  their  cellular  pharmacology,  structure-activity  relationships  and  pharmacokinetics」、Adv.  Drug  Delivery  Rev.、３９巻（１〜３号）、１１７〜１５１頁（１９９９年）；Taylor、「Improved  passive  oral  drug  delivery  via  prodrugs」、Adv.  Drug  Delivery  Rev.、１９巻（２号）、１３１〜１４８頁（１９９６年）；ValentinoおよびBorchardt、「Prodrug  strategies  to  enhance  the  intestinal  absorption  of  peptides」、Drug  Discovery  Today、２巻（４号）、１４８〜１５５頁（１９９７年）；WiebeおよびKnaus、「Concepts  for  the  design  of  anti-HIV  nucleoside  prodrugs  for  treating  cephalic  HIV  infection」、Adv.  Drug  Delivery  Rev.、３９巻（１〜３号）、６３〜８０頁（１９９９年）；Wallerら、「Prodrugs」、Br.  J.  Clin.  Pharmac.、２８巻：４９７〜５０７頁（１９８９年）を参照されたく、このすべての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
本明細書において開示される阻害剤はまた、それらの薬学的に許容される塩を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、例えば無毒の有機または無機酸からの、本明細書中に開示されるような阻害剤の従来の無毒性塩または第４級アンモニウム塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルもしくは剤形製造プロセスにおいてｉｎ  ｓｉｔｕで調製することができ、または遊離の塩基もしくは酸の形態の阻害剤を好適な有機もしくは無機の酸もしくは塩基と別々に反応させ、そのように形成される塩をその後の精製中に単離することによって調製できる。従来の無毒の塩は、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製される塩を含む。例えば、Bergeら、「Pharmaceutical  Salts」、J.  Pharm.  Sci.、６６巻、１〜１９頁（１９７７年）を参照されたく、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
本明細書において記載される態様のいくつかの実施形態では、代表的な薬学的に許容される塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる。
【０２１１】
リボソーム障害およびリボソーム病の処置
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている阻害剤を使用して、リボソームタンパク質に関連する様々な疾患および障害またはリボソーム病を処置することができる。例えば、阻害剤は、１つまたは複数のリボソームタンパク質に突然変異を有するか、または減少したレベルのリボソームタンパク質を有する対象を処置するために使用され得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている阻害剤は、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）などのリボソーム障害を有する対象を処置する方法において使用することができる。ダイアモンド−ブラックファン貧血には様々な種類が存在し、例えば、対象は、ＤＢＡ１、ＤＢＡ２、ＤＢＡ３、ＤＢＡ４、ＤＢＡ５、ＤＢＡ６、ＤＢＡ７、またはＤＢＡ８を有する。ブラックファン−ダイアモンド貧血および遺伝性赤芽球減少症としても公知のダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）は、通常乳児期に存在する先天性赤血球無形成症である。ＤＢＡ患者は赤血球数が少ない（貧血）。残りのその血球（血小板と白血球）は正常である。これは、骨髄の欠損が主に好中球減少症を引き起こすシュバッハマン−ボディアン−ダイアモンド症候群、およびすべての細胞株が罹患して汎血球減少症をもたらすファンコニー貧血とは対照的である。様々な他の先天異常も発生する可能性がある。ダイアモンド−ブラックファン貧血は、骨髄中の赤血球前駆細胞の減少を伴う貧血（低赤血球数）によって特徴付けられる。これは通常新生児期に発症する。罹患者の約４７％はまた、頭蓋顔面奇形、親指または上肢の異常、心臓の欠陥、泌尿生殖器の奇形、および口蓋裂を含む様々な先天的異常を有する。出生時体重の低下や全般的な成長の遅れがしばしば観察される。ＤＢＡ患者は白血病やその他の悪性腫瘍を発症するリスクが中程度である。
【０２１３】
典型的には、ＤＢＡの診断は、血球計算と骨髄生検を通じて実施される。ＤＢＡの診断は、貧血、低い網状赤血球（未熟赤血球）数、および骨髄中の赤血球前駆細胞の減少に基づいて実施される。ＤＢＡの診断を支持する特徴には、先天性異常、大赤血球症、胎児ヘモグロビンの上昇、および赤血球におけるアデノシンデアミナーゼレベルの上昇が含まれる。ほとんどの患者は生後２年以内に診断される。しかしながら、一部の軽度の罹患者は、より重症の罹患者家族が特定されて初めて指摘を受ける。ＤＢＡ患者の約２０〜２５％が、ＲＰＳ１９遺伝子の突然変異に関する遺伝子検査で特定され得る。ＤＢＡ症例の約１０〜２５％が疾患の家族歴を有し、ほとんどの家系は常染色体優性の遺伝様式を示唆している。
【０２１４】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、リボソームタンパク質１９（ＲＰＳ１９）における突然変異を有する対象を処置する方法において使用できる。ＤＢＡ患者の表現型は、赤血球前駆体集団に特異的に影響を及ぼす血液系幹細胞の欠陥を示す。ＲＰＳ１９タンパク質は、リボソームの産生に関与する。疾患の特徴は、ＲＰＳ１９突然変異の性質に関連している可能性がある。この疾患は優性遺伝によって特徴付けられ、したがって、ＲＰＳ１９タンパク質機能の部分的喪失のために起こる。Ｉ
【０２１５】
代替的な実施形態では、本明細書に開示されるような阻害剤は、ＲＰＳ７、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２４、ＰＲＳ２６、ＲＰＳ１７、ＰＲＳ２７Ｌ、ＲＰＳ２９、ＲＰＬ３５Ａ、ＰＲＬ５、およびＰＰＬ１１の少なくとも１つであるがこれらには限定されないリボソームタンパク質における突然変異を有する対象を処置する方法において使用できる。例えば、ＲＰＳ１９における突然変異またはバリアントがＤＢＡ１を引き起こし、ＲＰＳ２４における突然変異またはバリアントがＤＢＡ３を引き起こし、ＲＰＳ１７における突然変異またはバリアントがＤＢＡ４を引き起こし、ＲＰＳ３４Ａにおける突然変異またはバリアントがＤＢＡ５を引き起こし、ＲＰＬ５における突然変異またはバリアントがＤＢＡ６を引き起こし、ＲＰＬ１１における突然変異またはバリアントがＤＢＡ７を引き起こし、ＲＰＳ７における突然変異またはバリアントがＤＢＡ８を引き起こす。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、リボソーム障害を有する対象は、ｒＰＬ２Ａ、ｒＰＬ２Ｂ、ｒＰＬ３、ｒｐＬ４Ａ、ｒＰＬ４Ｂ、ｒＰＬ７Ａ、ｒＰＬ７Ｂ、ｒＰＬ１０、ｒＰＬ１１、ｒＰＬ１６Ａ、ｒＰＬ１７Ａ、ｒＰＬ１７Ｂ、ｒＰＬ１８Ａ、ｒＰＬ１８Ｂ、Ｒｐｌ１９Ａ、ｒＰＬ１９、ｒＰＬ２５、ｒＰＬ２９、ｒｐＬ３１Ａ、ｒｐＬ３１Ｂ、ｒＰＬ３６Ａ、ｒＰＬ４０Ａ、ｒＰＳ１Ａ、ｒＰＳ６Ａ、ｒＰＳ６Ｂ、ｒＰＳ１４Ａ、ｒＰＳ１５、ｒＰＳ１９、ｒＰＳ２３Ｂ、ｒＰＳ２５Ａ、ｒＰＳ２６Ｂ、ｒＰＳ２９、ｒＰＳ２９Ｂ、およびｒＰＳ３１からなる群から選択されるリボソームタンパク質に突然変異を有する。
【０２１７】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、方法は、コルチコステロイド、輸血、および骨髄移植、ならびに当業者に公知の他の処置からなる群から選択される、リボソームタンパク質欠損を処置するための別の治療剤を投与することをさらに含む。コルチコステロイドは、ＤＢＡの貧血を処置するために使用することができる。輸血はまた、ＤＢＡの重症貧血の処置に使用できる。寛解の期間が起こる場合があり、その間に輸血およびステロイド処置は必要とされない。骨髄移植（ＢＭＴ）はＤＢＡの血液学的側面を治癒し、輸血患者に有害事象が発生する可能性がある（Diamond  Blackfan  Anemia  Foundation、Pospisilova  Dら、（２００７年）、「Successful  treatment  of  a  Diamond-Blackfan  anemia  patient  with  amino  acid  leucine.」、Haematologica、９２巻（５号）：ｅ６６頁）。
【０２１８】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、阻害剤は対象に投与され、対象におけるＣＤ７１＋赤血球細胞の数を増加させ、および／または対象におけるヘモグロビンレベルを増加させる。
【０２１９】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような方法および阻害剤は、ＤＢＡが大球性貧血および／または頭蓋顔面異常の症状を有するなどのリボソーム障害を有する対象を処置するために使用できる。
【０２２０】
別の実施形態では、本明細書に開示されている阻害剤は、骨髄異形成、例えばこれらに限定されないが５ｑ−骨髄異形成などのリボソーム障害を有する対象を処置する方法において使用することができる。骨髄異形成または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は前白血病として公知）は、骨髄クラスの血球の無効な産生（または異形成）を伴い、骨髄が正常に機能せず、不十分な数の正常細胞を産生する血液学的（血液関連）医学的状態の多様な集合である。
【０２２１】
ＭＤＳを有する患者はしばしば重症の貧血を発症し、頻繁な輸血を必要とする。多くの場合、この疾患は悪化し、患者は進行性骨髄不全によって引き起こされる血球減少症（低血球数）を発症する。ＭＤＳを有する患者の約３分の１において、この疾患は、通常数カ月から数年以内に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に変化する。
【０２２２】
骨髄異形成症候群はすべて骨髄中の幹細胞の傷害である。ＭＤＳでは、造血（血液産生）は無秩序であり、有効ではない。造血細胞の数と質は不可逆的に低下し、さらに血液産生を損なう。
【０２２３】
ＭＤＳは、赤血球、血小板、および白血球を含むあらゆる種類の、時にはすべての種類の血液細胞の産生に影響を及ぼす（血球減少症）。小児骨髄異形成症の約５０％は、５種類のＭＤＳ：難治性貧血、輪状芽細胞を伴う難治性貧血、過剰な芽球を伴う難治性貧血、形質転換における過剰な芽球を伴う難治性貧血、および慢性骨髄単球性白血病に分類できる。残りの５０％は、典型的には貧血、白血球減少症、および／または血小板減少症（低血小板数）などの単発のまたは組み合わされた血球減少症と共に存在する。慢性ではあるが、ＭＤＳは約３０％の患者で急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になるように進行する。
【０２２４】
ＭＤＳと診断された年齢の中央値は６０〜７５歳であり、少数の患者は５０歳未満であり、ＭＤＳ診断は小児では稀である。男性は女性よりもわずかに一般的に罹患する。徴候および症状は非特異的であり、一般に、これらに限定されないが以下の血球減少症に関連する：
【０２２５】
（ａ）貧血（低ＲＢＣ数、または低減したヘモグロビン）−慢性的な疲労感、息切れ、冷えた感覚、時に胸痛。
【０２２６】
（ｂ）好中球減少症（低好中球数）−感染に対する感受性の増加
【０２２７】
（ｃ）血小板減少症（低血小板数）−出血および斑状出血（紫斑）に対する感受性の増加、ならびに紫斑または溢血点をもたらす皮下出血［５］
【０２２８】
多くの個人は無症状であり、そして血球減少症または他の問題は日常的な血球計数の一部として識別される：好中球減少症、貧血および血小板減少症（それぞれ白血球および赤血球、血小板の細胞数が少ない）；脾腫または稀に肝肥大；細胞内の異常な顆粒、異常な核の形状およびサイズ；ならびに／または染色体転座および異常染色体数を含む染色体異常。
【０２２９】
急性骨髄性白血病を発症するリスクがあるが、出血や感染の結果として約５０％の死亡が発生する。骨髄異形成の結果として発症する白血病は、処置に対する悪名高い抵抗性によって知られる。
【０２３０】
５ｑ−骨髄異形成（染色体５ｑ欠失症候群、染色体５ｑ単一染色体性、または５ｑ−症候群としても公知）は、ヒト染色体５の長腕（ｑ腕、バンド５ｑ３１．１）の一部の欠失によって生じる稀な障害である。５ｑ骨髄異形成は、大球性貧血、しばしば血小板増加症、赤芽球減少症、核低分葉化（ｈｙｐｏｌｏｂａｔｉｏｎ）を伴う巨核球過形成、および第５染色体の単離された間質の欠失によって特徴付けられる。５ｑ−症候群は、主に高齢の女性に見られる。
【０２３１】
５ｑ−骨髄異形成を有するいくらかの対象はＲｐｓ１４発現が低下している。ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１４６遺伝子座の欠失は、５ｑ−症候群と関連した血小板数の増加および巨核球形成異常と関連している。５ｑ−骨髄異形成は、骨髄細胞に影響を及ぼし、処置抵抗性貧血と骨髄異形成症候群を引き起こし、これらは急性骨髄性白血病をもたらす可能性がある。骨髄の検査により、巨核球に特徴的な変化が見られる。それらは、通常よりも多く、小型で単核球である。骨髄での赤血球形成不全が伴う可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、５ｑ−骨髄異形成を有する対象は、異形成骨髄を有する可能性がある。５ｑ−骨髄異形成を有する患者はレナリドマイドで処置することができる（Bennett  Jら、（２００６年）、「Lenalidomide  in  the  myelodysplastic  syndrome  with  chromosome  5q  deletion」、N.  Engl.  J.  Med.、３５５巻（１４号）、１４５６〜６５頁；Razaら、（２００８年）、「Phase  2  study  of  lenalidomide  in  transfusion-dependent,  low-risk,  and  intermediate-1  risk  myelodysplastic  syndromes  with  karyotypes  other  than  deletion  5q」、Blood、１１１巻（１号）、８６〜９３頁）。
【０２３２】
本発明のすべての態様のいくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような方法および阻害剤は、シュバッハマンダイアモンド症候群などのリボソーム病を有する対象を処置するために使用でき、例えば、対象は、Ｓｂｄｓに突然変異を有する。いくつかの実施形態では、シュバッハマンダイアモンド症候群を有する対象は、膵機能不全、骨髄機能不全、骨格奇形から選択される１つまたは複数の症状を有する。
【０２３３】
別の実施形態では、本明細書で開示される阻害剤は、トリーチャーコリンズ症候群などのリボソーム病を有する対象の処置方法において使用でき、例えば、対象はＴＣＯＦ１（核小体）に突然変異を有する。トリーチャーコリンズ症候群は、家族を通して受け継がれる（遺伝性）状態であり、顔の構造の問題をもたらす。トリーチャーコリンズ症候群はｔｒｅａｃｌｅと呼ばれるタンパク質の欠損によって引き起こされる。状態は家族を通して受け継がれる（遺伝性）。この状態は、世代間および個体間で、重症度が異なり得る。トリーチャーコリンズ症候群の症状には、耳の外側部分の異常またはほぼ完全な欠落、聴力の喪失、非常に小さい顎（小顎症）、非常に大きい口、下眼瞼の欠損（亀裂）、頬に達する頭髪、口蓋裂の少なくとも１つが含まれるが、これらに限定されない。したがって、トリーチャーコリンズ症候群を有する対象は、１つまたは複数の頭蓋顔面変形を有する。トリーチャーコリンズ症候群を有する小児は通常正常な知能を示し、診断は乳児の診察に基づいて行うことができ、それは以下を含む様々な問題を明らかにし得る：（ａ）異常な眼の形状、（ｂ）平坦な頬骨、（ｃ）顔面の裂（ｄ）小さい顎、（ｅ）低位耳介、（ｆ）異常形成耳介、（ｇ）異常外耳道、（ｈ）聴覚喪失、（ｉ）眼の欠陥（下眼瞼まで広がる亀裂）、（ｊ）下眼瞼のまつ毛の減少、（ｋ）遺伝子試験は、この状態に関連する遺伝子変化の同定を助け得る。トリーチャーコリンズ症候群の診断は臨床所見およびＸ線撮影による所見にも頼っており、トリーチャーコリンズ症候群には重要な臨床的観点によって検出できる一連の典型的な症状がある。同様の特徴を有する広範囲の疾患は、しばしばＴＣＳを診断することを困難にする。ＯＭＥＮＳ分類は、疾患を区別するための包括的かつ病期ベースのアプローチとして開発された。この頭字語は、５つの異なる異形症状、すなわちＯ；軌道非対称、Ｍ；下顎低形成、Ｅ；耳介変形、Ｎ；神経発達、およびＳ；軟部組織疾患を表す。
【０２３４】
阻害剤を含む医薬組成物の投与のための対象の選択
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される阻害剤を含む組成物による処置に適しているかまたは好適である対象は、造血細胞の対照参照の正常レベルおよび正常対象のｆｌｋ１発現レベルと比較した、造血細胞の低下レベルおよびＣＤ３４＋細胞における低下したｆｌｋ１発現に基づいて選択できる。さらに、本明細書に開示される阻害剤を含む組成物による処置に適しているかまたは好適である対象は、対照参照のｐ２１発現レベルと比較した、ＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１発現の増加したレベルに基づいて選択できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される阻害剤を含む組成物による処置に適しているかまたは好適である対象は、例えばリボソーム障害またはリボソーム病を有さない正常対象からの試料における、対照参照のＣＤ７１＋およびＧＰＡ発現レベルと比較した、ＣＤ３４＋細胞における低下したＣＤ７１＋発現および低下したグリコホリンＡ（ＧＰＡ）発現に基づいて選択できる。いくつかの実施形態では、正常参照レベルは、リボゾーム障害またはリボゾーム病を持たない正常対象、または対照細胞株、または、対応する組織、対応する種、および対応する年齢の生物試料由来の生物学的組織試料である組織試料の正常組織試料由来の細胞からの試料における、造血細胞のレベル、ｆｌｋ１発現レベル、ＣＤ７１＋発現レベル、ＧＰＡ発現レベル、ｐ２１発現レベルに基づく。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ｆｌｋ１発現レベル、ＣＤ７１＋発現レベル、ＧＰＡ発現レベル、およびｐ２１発現レベルは、造血細胞または赤血球細胞または赤血球分化細胞を含む生体試料において測定される。いくつかの実施形態では、生体試料は、がん細胞を含む対象から採取され、血漿、血液、または組織の試料である生体試料であり得る。代替的な実施形態では、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、髄液、複数液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚、呼吸器系、内部および性尿路の外部分泌物、胆汁、涙液、汗、唾液、臓器、乳汁細胞、および一次腹水細胞、生検組織試料、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ培養生検組織試料を含む。
【０２３６】
阻害剤を含む医薬組成物
本発明の別の態様は、リボソームタンパク質または機能不全に関連するまたは対象がリボソーム病を有する疾患または障害、例えばＤＢＡ、骨髄異形成、例えば、限定されないが、５ｑ−骨髄異形成、シュバッハマン−ダイアモンド（Ｓｈｗａｃｈｍａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ）症候群およびトリーチャー・コリンズ（Ｔｒｅａｃｈｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ）症候群、の処置のための医薬組成物に関する。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療有効量の少なくとも１つの本明細書に開示される阻害剤を含む。一実施形態では、阻害剤は、例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬまたはＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；あるいは、例えば図３３の阻害剤または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物であるが、これらに限定されない。
【０２３７】
本明細書に開示される阻害剤は、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．００５〜８ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０１〜６ｍｇ／ｋｇ体重または約０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇ体重または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用することができる。一部の実施形態では、阻害剤は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重または約１〜１００μｇ／ｋｇ体重または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、約０．００１ｍｇ／ｍｌもしくは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、または０．１ｍｇ／ｍｌのより高い濃度で使用することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの阻害剤を、約０．０１μＭ〜３００μＭ、または約０．１μＭ〜１５０μＭ、または約１μＭ〜５０μＭ、または約１μＭ〜２５μＭの濃度で含む。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動しうる。
【０２３８】
投与経路に応じて、当業者は、マウスなどの動物モデルで阻害剤の薬物動態およびバイオアベイラビリティを決定し、阻害剤に特異的な用量応答関係を分析することによって、それに準じてヒト対象などの対象への本明細書に開示される阻害の有効な投薬量を決定および調整することができる。
【０２３９】
毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。
【０２４０】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定式化するために使用することができる。治療有効用量は、例えば、細胞培養アッセイを使用して当業者が決定することができる。用量は、実施例に開示される方法による細胞培養において決定されるＩＣ５０（つまり、症状の半数最大阻害を達成する治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで定式化することができる。阻害剤の有効用量は、処置無しの場合と比較して、阻害剤を用いた処置の経過にわたってヘモグロビンのレベルを測定することによって動物モデルで決定することができる。一部の実施形態では、阻害剤を含む投薬量は、対照（例えば、阻害剤が存在しない場合）と比較して、投薬量が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、９５％、９９％、さらには１００％で、ヘモグロビンレベル、赤血球数を増加させ、および／またはＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１の発現を減少させる場合に、有効であると考えることができる。一部の実施形態では、対象に投与される阻害剤の治療有効量は、阻害剤の生物活性およびバイオアベイラビリティ（例えば、身体における阻害剤の半減期および安定性）、阻害剤の化学的特性（例えば、分子量、疎水性および溶解性）；投与経路および投与頻度、投与時間（例えば、食事の前もしくは後）などを含む当業者にとって公知の因子に依存する。さらに、治療的または予防的利益を提供する本明細書に開示される阻害剤を含む医薬組成物の特定の用量が、対象の身体状態（例えば、年齢、性別、体重）、対象の医学的履歴（例えば、服用医薬、他の疾患もしくは障害）および対象の臨床状態（例えば、健康状態、疾患の段階）などの様々な因子に依存しうることが理解される。阻害剤を含む医薬組成物の正確な用量は、薬理学者および医師などの当業者にとって公知の方法によって決定することができる。
【０２４１】
本発明によれば、本明細書に開示される阻害剤は、治療レジメンまたは治療剤の前に、同時に、または連続的に（例えば、複数の薬物レジメン）、治療有効量で、対象に予防的にまたは治療的に投与することができる。一部の実施形態では、阻害剤は、同じまたは異なる組成物で投与することができる他の治療剤と並行して投与される。さらなる治療剤またはレジメンには、ステロイド、コルチコステロイド、輸血、および骨髄移植が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４２】
本発明による医薬組成物の活性成分（例えば、ｐ９０Ｓ６Ｋの阻害剤；ｐ６０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬ、Ｂ１もしくはＳｋ；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦもしくはＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴもしくはＩＩＩならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥもしくはＡＣＶ；または、例えば、図３３の阻害剤または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物）は、当業者に公知の任意の経路によって個体に投与することができる。投与経路には、皮内、経皮（例えば、徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、口腔、鼻腔、直腸内、硬膜外、局所、くも膜下腔内、直腸、頭蓋内、気管内、髄腔内および鼻腔内経路が含まれる。任意の他の治療的に有効な投与経路、例えば、上皮または内皮組織を通じた吸収または全身投与を介して使用することができる。さらに、本発明による阻害剤は、薬学的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの生物学的に活性な薬剤の他の成分と一緒に投与することができる。
【０２４３】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のために、阻害剤は、薬学的に許容される非経口ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性を維持する添加剤（例えば、マンニトール）または化学的安定性を維持する添加剤（例えば、防腐剤および緩衝剤）と関連させて、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤化することができる。製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌されている。
【０２４４】
一部の実施形態では、投与経路は、皮下経路による投与である。筋肉内投与は、別の代替的な投与経路である。一部の実施形態では、阻害剤を含む医薬組成物は、全身送達のために適合された製剤として投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、特定の臓器、例えば、限定されないが肝臓への送達のために適合された製剤として投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤を含む医薬組成物は、血液脳関門を通過しないように適合された製剤として投与することができる。
【０２４５】
代替的に、一部の実施形態では、医薬組成物は、ゲル、スポンジ、または（例えば、ペレットまたはディスクとして形成された）他の透過性マトリックス中に組み込むことができ、持続的、局所放出のために肝臓内皮に近接して配置することができる。阻害剤を含む医薬組成物は、単回用量で、または異なる時間に投与される複数回の用量で投与することができる。
【０２４６】
正確な投与経路ならびに最適な投薬量は、主に、疾患または障害の性質およびこの疾患の段階に基づいて、各特定の場合のための標準的な臨床技術によって決定することができる。好ましくは、本発明による薬剤は、局所的または全身的に、特に、経口で、静脈内で、非経口で、皮膚上で、皮下的に、吸入または気管支肺胞洗浄によって肺内に、筋肉内に、頭蓋内に、局所的に椎間板または他の結合組織内へ、適用される。
【０２４７】
本明細書に開示されるように、有効量の少なくとも１つの阻害剤を含む医薬組成物は、リボソーム疾患および障害またはリボソーム病の治療的処置または防止（例えば、予防的処置）のために、対象に投与することができる。
【０２４８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤を含む本発明の組成物は、リボソーム疾患および／またはリボソーム病（ribosomophaties）、例えば、ＤＢＡ、骨髄異形成、例えば、限定されないが、５ｑ−骨髄異形成、シュバッハマン−ダイアモンド症候群およびトリーチャー・コリンズ症候群のために製剤化される。一実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、その誘導体、アナログ、プロドラッグ、または薬学的に許容される塩である。
【０２４９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤の少なくとも１つを含む医薬組成物はさらに第２の治療剤を含む。一実施形態では、第２の治療剤は、コルチコステロイドである。一部の実施形態では、第２の治療剤は、本明細書に開示されるようなカルシウムチャネル遮断薬である。
【０２５０】
予防的適用では、阻害剤を含む医薬組成物（または医薬）は、リボソーム疾患もしくは障害および／またはリボソーム病に罹りやすいまたは他のリスクのある対象に、リスクを除去もしくは減少または疾患の開始を遅延させるために十分な量で投与することができる。一実施形態では、本明細書に開示される本発明の医薬組成物は、ｒｐｓ６の阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤、例えば、ＳＬもしくはＢ１；またはｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤、例えば、ＰＦ；またはＣａｍ阻害剤ＴＦもしくはＦＬＵ；またはＣａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；またはｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴもしくはＩＩＩ；または阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥもしくはＡＣＶの１つ、ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）、または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物；またはｒｐｓ６阻害剤；またはそれらのエナンチオマー、プロドラッグ、誘導体もしくは薬学的に許容される塩が含まれる。
【０２５１】
治療適用では、本明細書で提供される発明によれば、リボソーム疾患もしくは障害および／またはリボソーム病を有する対象に、そのようなリボソーム疾患の少なくとも１つの症状を遅延または阻害することができるように、本明細書に開示される阻害剤を含む有効量または有効用量の医薬組成物を投与することができる。一部の実施形態では、阻害剤を含む有効量または有効用量の医薬組成物をリボソーム疾患もしくは障害および／またはリボソーム病を有する対象に投与することは、顔面異常および／またはリボソーム疾患もしくはリボソーム病に関連する他の症状を阻害するまたは進行を遅延させることができる。さらなる実施形態では、阻害剤を含む有効用量の医薬組成物で対象を処置することは、対象におけるリボソーム疾患またはリボソーム病の症状を防止または遅延することができる。
【０２５２】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている治療的および予防的方法を実施するための、本明細書で説明した阻害剤を含む組成物も提供する。一部の実施形態では、阻害剤と別の治療剤との組合せは、各治療剤が異なる症状、異なる疾患または異なる障害を標的とすることができる医薬組成物において組み合わされるように調整することができる。さらなる実施形態では、阻害剤と別の治療剤とは、本明細書に開示される医薬組成物において一緒に混合することができる。他の実施形態では、阻害剤と別の治療剤とは、医薬組成物で組み合わされるときに別の製剤中に存在することができる。例えば、一実施形態では、阻害剤は液体製剤中に存在することができ、一方で別の治療剤は凍結乾燥して粉末にすることができる。本明細書に開示される医薬組成物の異なる活性成分（例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋもしくはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬ、Ｂ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；または図３３の阻害剤化合物、または式ＩもしくはＩＩの化合物）の製剤は、薬物の物理的および化学的特性、バイオアベイラビリティ、投与経路、薬物が持続的またはバースト放出されるかなどの様々な因子に応じて最適化することができる。本発明の治療的および予防的組成物は、本明細書に開示される阻害剤（ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋもしくはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬ、Ｂ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ、または式Ｉもしくは式ＩＩの化合物）またはその誘導体、エナンチオマー、プロドラッグまたは薬学的に許容される塩と一緒に、生理学的に忍容性のある担体をさらに含むことができる。さらなる実施形態では、阻害剤と別の治療剤は、本明細書に開示される本発明の医薬組成物で組み合わせるとき、生理学的に忍容性のある異なる担体を用いることができる。
【０２５３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、他の治療剤および薬学的に許容される賦形剤と一緒に阻害剤を含む。本発明の阻害剤およびそれらの製剤に適した担体は、Ｏｓｌｏらによって編集されたRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、第１６版、１９８０年、Mack  Publishing  Co.に記載されている。典型的に、適切な量の薬学的に許容される塩が、製剤を等張にするために製剤中で使用される。担体の例には、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの緩衝剤が含まれる。さらに、担体には、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出製剤が含まれ、ここでマトリックスは、成形物、例えばリポソーム、フィルムまたは微粒子の形態である。ある特定の担体が、例えば投与される阻害剤の投与経路および濃度に依存して、より好ましい場合があることは当業者には明らかであろう。
【０２５４】
一部の実施形態では、本発明による阻害剤のバイオアベイラビリティは、対象において阻害剤の半減期を増加させるコンジュゲーション手順を使用することによって、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９２／１３０９５に記載されるようなポリエチレングリコールへの阻害剤の連結によっても改善することができる。
【０２５５】
一部の実施形態では、本発明による阻害剤のバイオアベイラビリティは、ヒト身体における阻害剤の半減期を増加させる生体適合性の送達ビヒクルで阻害剤を封入することによって向上させることができる。例示的な生体適合性送達ビヒクルには、ＰＥＧ系ビヒクルなどのポリマービヒクルまたはリポソーム系ビヒクルが含まれる。
【０２５６】
一部の実施形態では、阻害剤は、対象における阻害剤の半減期を増加させるために、生理学的に忍容性のある担体中に活性成分として溶解または分散させることができる。
【０２５７】
活性成分（例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋまたはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬまたはＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；または、例えば図３３の阻害剤；または式ＩもしくはＩＩの化合物）を溶解または分散して含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野でよく理解されており、製剤に応じて限定される必要はない。典型的にそのような組成物は、注射可能な液体溶液または懸濁液として調製されるが、使用前に溶液または懸濁液とするために適した固体形態も調製することができる。また調製物は乳化してもよく、リポソーム組成物として存在してもよい。一部の実施形態では、阻害剤は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に記載されている治療方法で使用するために適切な量で混合してもよい。さらに、所望であれば、阻害剤を含む組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの活性成分の有効性を増強する少量の補助物質を含有することができる。
【０２５８】
生理学的に忍容性のある担体（すなわち、生理学的に許容される担体）は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体の選択は、当業者による投与によって達成することができる。例えば、組成物が経口投与される場合、コーティングされた錠剤、液体、カプレットなどで製剤化することができる。液体担体の例は、活性成分と水の他に物質を含有しない無菌水性溶液、または生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、またはその両方、例えば、リン酸緩衝食塩水を含有する無菌水性溶液である。またさらに水性担体は、１種を超える緩衝塩、さらに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質を含有することができる。局所適用のために、担体は、例えば、限定されないが、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、エアロゾル、坐剤、パッドまたはゲル化スティックの形態であってもよい。一部の実施形態では、組成物は、注射可能な液体溶液または懸濁液として調製される；注射前における液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態を調製してもよい。また上述のように、調製物は、乳化してもよく、あるいはリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリドもしくは増強されたアジュバント効果のためのコポリマーなどの微小粒子中に封入してもよい（Langer、Science、２４９巻、１５２７頁（１９９０年）およびHanes、Advanced  Drug  Delivery  Reviews、２８巻、９７〜１１９頁（１９９７年）を参照）。本明細書に開示される阻害剤は、活性成分の持続またはパルス放出を可能にする様式で製剤化することができるデポー注射またはインプラント調製物の形態で投与してもよい。
【０２５９】
本明細書で使用される場合、「本明細書に開示される阻害剤」には、例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋまたはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬまたはＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびフルフェナジン（ＦＬＵ）；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；ならびにＤＢ−４−０８３、ＤＢ−４−０８４、ＤＢ−４−０８８−２、ＤＢ−４−０８８−３、ＤＢ−４−０８６、ＤＢ−４−０８７−２、ＤＢ−４−０８７−３、ＤＢ−４−０８９、式Ｉおよび式ＩＩの化合物、ならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれる（構造について、例えば、図５、図３１、図３２、および図３３を参照）。
【０２６０】
他の投与様式に適したさらなる製剤には、経口、鼻腔内、および肺用製剤、坐剤、および経皮適用が含まれる。坐剤の場合、結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる；そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成することができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムのなどの賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をとり、１０％〜９５％の活性成分、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０２６１】
当業者は、当技術分野における一般的な知識および技術を考慮して、本明細書に開示される少なくとも１つのＬＳＦ阻害剤を含む医薬組成物を投与する適切な方法を決定することができる。
【０２６２】
処置レジメン
本発明の別の態様は、疾患または障害の治療的および予防的処置のための方法であって、ｐ５３活性化の阻害が、リボソーム障害またはリボソーム病の処置または防止のために好ましい方法に関する。方法は、例えば、ｒｐｓ６、ｐ９０Ｓ６Ｋもしくはｐ７０Ｓ６Ｋの小分子またはタンパク質阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋ阻害剤ＳＬおよびＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；ならびに図３３の阻害剤：ならびに式Ｉおよび式ＩＩの化合物）ならびに本明細書に開示されるアナログおよびバリアントなどの化合物のいずれかまたは組合せから選択される治療有効量の少なくとも１つの阻害剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２６３】
一実施形態では、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）は、本明細書に開示される阻害剤を用いた本発明の方法および組成物によって処置または防止される。
【０２６４】
リボソームタンパク質疾患もしくは障害の処置またはリボソーム病に関連する処置のための本明細書に開示される阻害剤を含む医薬組成物の有効用量は、投与手段、対象の生理学的状態、対象がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬、ならびに処置が予防的または治療的であるかを含む多くの様々な因子に依存する。対象の臨床状態に応じて、本発明の医薬組成物の投与量および頻度は、当業者、例えば医師によって、経時的に適宜に調整することができる。
【０２６５】
治療適用では、疾患の進行が低下または終了するまで、または対象が疾患の症状の部分または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が時に必要となる。その後、対象は、防御的レジームを投与されてもよい。例えば、ＤＢＡを有する対象は、適宜、ｐ２１レベルおよびまたはｐ５３レベルを低下させて正常レベルに戻すための治療レジメンにおいて有効用量で本明細書に開示される阻害剤を用いて処置され、次いで、例えば予防的に、維持用量が投与されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、コルチコステロイドを用いた処置の前に、並行して、もしくは連続的に、および／または対象が輸血および／もしくは骨髄移植などのアジュバント療法を受けているときに、対象に投与することができる。一部の実施形態では、例えば、輸血および／または骨髄移植などの他の治療処置または手術のために選択されたＤＢＡ対象を、本明細書に開示される阻害剤を用いた処置に付すことができる。例えば、本発明の医薬組成物は、治療手順の前に、その間に、またはその後に投与することができる。投与経路は、治療的手順または手術に伴って変化してもよく、当業者によって決定することができる。さらに別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、アジュバント療法として使用してもよい。
【０２６６】
一部の実施形態では、対象はヒトであり、代替的実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために滴定する必要がある。阻害剤の量は、疾患の段階ならびに種に依存する。
【０２６７】
一部の実施形態では、阻害剤は、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．００５〜８ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０１〜６ｍｇ／ｋｇ体重または約０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇ体重または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量の阻害剤を含む医薬組成物で対象に投与することができる。一部の実施形態では、阻害剤は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重または約１〜１００μｇ／ｋｇ体重または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用することができる。一部の実施形態では、阻害剤は、約０．００１ｍｇ／ｍｌもしくは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でまたは０．１ｍｇ／ｍｌの高い濃度で投与することができる。代替的実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの阻害剤を、約０．０１μＭ〜３００μＭ、または約０．１μＭ〜１５０μＭ、または約１μＭ〜５０μＭ、または約１μＭ〜２５μＭの濃度で含む。
【０２６８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、対象から取得される赤血球細胞集団におけるＣＤ７１＋細胞のレベルを、阻害剤が存在しない場合と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または５０％を超えて増加させるために有効な用量で、方法に従って対象に投与することができる。
【０２６９】
別の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、対象から取得される赤血球細胞集団に存在するＣＤ３４＋細胞のｐ２１発現のレベルを、阻害剤が存在しない場合と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％を超えて低下させるために有効な用量で、本明細書に開示される方法に従って対象に投与することができる。
【０２７０】
一般的に、有効な投薬量および投与スケジュールは、例えば、対象の貧血の症状が減少しているかおよび／またはＤＢＡなどのリボソームタンパク質障害に関連する少なくとも１つの症状が減少しているかなどの処置の帰結に基づいて調整することができる。本明細書で提供される教示に従って、処置の有効性は、対象由来の生物学的試料、例えば、血清試料を取得し、ＤＢＡについてのバイオマーカーのレベル、例えば、赤血球細胞集団におけるＣＤ７１＋細胞のパーセンテージおよび／またはＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１のレベルを、当技術分野で周知の方法および本明細書で後に開示の診断の方法を使用して決定することにより、モニタリングすることができる。
【０２７１】
一部の実施形態では、阻害剤を含むボーラス組成物の形態で対象に投与される１日用量は、所望の結果を得るために有効な単回用量で、分割された用量でまたは徐放形態で与えることができる。第２のまたはその後の投与は、個体に投与された初回または前回の用量と同じ、より少ないまたはより多い投薬量で行うことができる。第２のまたはその後の投与は、疾患の間にまたは疾患の発症の前に投与することができる。所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで用量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させていくことも、当技術分野の技術の範囲内である。
【０２７２】
本明細書に開示される少なくとも１つの阻害剤を含む医薬組成物は、予防および／または治療的処置のために、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、腹腔内、鼻腔内または筋肉内手段によって投与することができる。例えば、がん、例えばＨＣＣの処置のための、少なくとも１つのＬＳＦ阻害剤を含む医薬組成物は、例えば静脈内注射により全身的に注射してもよく、または腫瘍への直接注射もしくは手術で曝露される部位への直接適用など関連部位への注射または適用によって注射してもよい。本明細書に開示される阻害剤の他の投与経路は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、または経口であるが、他の経路も等しく有効でありうる。筋肉内注射は、最も典型的には、腕または脚の筋肉に行なわれる。一部の方法では、本明細書に開示される阻害剤は、徐放性組成物、またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）デバイスなどのデバイスとして投与することができる。
【０２７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、任意選択で、リボソームタンパク質疾患および障害の処置に少なくとも部分的に有効である他の薬剤、例えば、輸血、骨髄移植などと組み合わせて投与することができる。他の実施形態では、本発明の阻害剤は、別の疾患もしくは障害または異なる症状を標的とする別の治療薬の投与の前に、それと並行して、またはその投与後に投与することができる。
【０２７４】
様々な実施形態では、阻害剤は、第２の薬剤によって活性化されるプロドラッグであることができる。したがって、そのような実施形態では、阻害剤のプロドラッグをその活性形態に活性化するそのような第２の薬剤の投与は、本明細書に開示される阻害剤を含む医薬組成物の投与と同時に、それと並行して、またはその前に、またはその後に投与することができる。
【０２７５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、活性な治療剤、例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋもしくはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬおよびＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；ならびに図３３の阻害剤ならびに式ＩおよびＩＩの阻害剤）と、様々な他の薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物として、しばしば投与される。Remington’s  Pharmaceutical  Science（第１５版、Mack  Publishing  Company,  Easton,  Pa.、１９８０年）を参照されたい。組成物の製剤は、意図する投与様式および治療適用に依存する。また組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含むことができる。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤などを含むこともできる。しかしながら、動物への投与のために適切な一部の試薬は、ヒトでの使用のための組成物で必ずしも使用されなくてもよい。
【０２７６】
非経口投与のために、本明細書に開示される阻害剤は、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でありうる薬学的担体と共に、注射可能な投薬量の、生理学的に許容される希釈剤中の物質の溶液または懸濁液として投与することができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成起源の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油、および鉱物油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射用溶液のための、好ましい液体担体である。
【０２７７】
局所適用は、経皮または皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、薬剤と、コレラ毒素またはその解毒誘導体もしくはサブユニットまたは他の類似の細菌毒素との同時投与によって促進することができる（Glennら、Nature、３９１巻、８５１頁（１９９８年）参照）。同時投与は、混合物として、または化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現によって得られる連結分子として成分を使用することによって達成することができる。
【０２７８】
他の投与様式には、全身送達が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの阻害剤は、例えば静脈内注射により全身的に注射してもよく、または手術で曝露される部位への直接適用など関連部位への注射または適用によって注射してもよい。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、錠剤で製剤化することができ、全身投与のために経口で使用することができる。様々な実施形態では、本発明の医薬組成物は、非活性成分（つまり、疾患、障害または症状の処置のための治療学的価値を有しない成分）、例えば、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。
【０２７９】
様々な実施形態では、ポリマーの添加による阻害剤の修飾は、詳細には、例えば、ポリマーへの共有結合を使用することが意図されている。他の実施形態では、阻害剤は、生体適合性ポリマーと混合することができ、または生体適合性ポリマーで封入することができる。
【０２８０】
別の態様では、生分解性または吸収性ポリマーは、本明細書に開示される阻害剤の延長された、しばしば局在化された放出を提供することができる。治療薬の半減期の増加または延長放出の潜在的な利点は明らかである。局在化された放出の潜在的な利点は、広がりのある全身投与と比較してはるかに高い局在用量または濃度をより長い時間達成する能力と、全身投与で起こりうる望ましくない副作用を避けることができる潜在能力である。
【０２８１】
本明細書に開示される阻害剤またはそのバリアントもしくは断片もしくは誘導体の送達に適切な生体吸収性ポリマーマトリックスは、文献に広く記載されている様々な合成生体吸収性ポリマーから選択することができる。数週間または数カ月にわたってタンパク質を放出することができるそのような合成の生体吸収性、生体適合性ポリマーは、例えば、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコールとポリブチレンテレフタレートとのセグメント化ブロックコポリマー（ＰＯＬＹＡＣＴＩＶＥ（商標））、チロシン誘導体ポリマーまたはポリ（エステル−アミド）を含むことができる。薬物送達材料およびインプラントの製造に使用される適切な生体吸収性ポリマーは、例えば、とりわけ、米国特許第４，９６８，３１７号、第５，６１８，５６３号（参照により本明細書に組み込まれる）およびS.  W.  Shalaby、Carl  Hanser編、「Biomedical  Polymers」、Verlag、Munich、Vienna、New  York、１９９４年、ならびに上記の刊行物で引用されている多くの参考文献で論じられている。選択されるべき特定の生体吸収性ポリマーは、処置される特定の患者に依存する。
【０２８２】
また本発明の方法は、対象に投与される処置の経過をモニタリングするために有用である。方法は、症状のある対象に対する治療的処置と、無症状の対象に対する予防的処置との両方をモニタリングするために使用することができる。
【０２８３】
対象に投与された処置は、対象から得られた生物学的試料に存在するＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１の発現のレベルが、参照レベルまたは阻害剤が存在しない場合と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、約９９％または約１００％低下する場合に有効であるとみなすことができる。そのような実施形態では、参照レベルは、以前の時間点での対象、例えば、阻害剤が投与されていない対象から得られた生物学的試料に存在するＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１の測定である。処置の帰結に基づいて、本明細書に開示される方法および組成物を使用する投与の投薬量および頻度は、当業者によって適宜調整することができる。
【０２８４】
生物学的試料のＣＤ３４＋細胞におけるｐ２１発現レベルを決定するために、任意のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、または当技術分野で一般的に公知であり、本発明における使用のために包含される免疫組織化学的方法を使用することができる。
【０２８５】
キット
本発明の別の態様は、本明細書に開示される１つまたは複数の阻害剤（例えば、ｒｐｓ６の阻害剤；ｐ９０Ｓ６Ｋもしくはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤；ＲＳｋ  ｐ９０阻害剤ＳＬもしくはＢ１；ｐ７０ｓ６Ｋ阻害剤ＰＦ；Ｃａｍ阻害剤ＴＦおよびＦＬＵ；Ｃａ２＋キレート剤ＢＡＢＴＡ；ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩ、ならびに阻害剤ＰｅｒＳｕｃ、２２１ＥおよびＡＣＶ；ならびに図３３の化合物ならびに式ＩおよびＩＩの化合物）と、本明細書に開示される方法を実施するための使用説明書とを含むキットに関する。
【０２８６】
一部の実施形態では、キットは、任意選択で、対象由来の生物学的試料、例えば血液試料におけるｐ２１発現のレベルを測定するための試薬または薬剤、例えば、本明細書に開示される阻害剤を用いた処置の有効性を同定するための試薬または薬剤をさらに含むことができる。そのような薬剤は、当技術分野で周知であり、ｐ２１タンパク質に特異的に結合する標識抗体および／またはｍＲＮＡなどが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、標識された抗体は、蛍光標識された抗体、または磁気ビーズなどで標識された抗体である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、ハイスループットアッセイにおける対象由来の生物学的試料をプロファイリングし、それに注釈を付けるための少なくとも１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【０２８７】
一部の実施形態では、キットは、阻害剤を含む組成物を、それを必要とする対象、例えば、リボソームタンパク質疾患または障害、例えばＤＢＡを有する対象に投与するための使用説明書、および用量などに関する使用説明書をさらに含むことができる。
【０２８８】
上記成分（単数または複数）に加えて、キットは、情報資料（informational  material）を含むこともできる。情報資料は、本明細書に記載されている方法ならびに／または本明細書に記載されているアッセイ、方法およびシステムの構成要素の使用に関連する説明、指示、販売または他の資料とすることができる。
【０２８９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される阻害剤を含む方法およびキットは、サービスプロバイダによって行われてもよく、例えば、研究者または医師は、対象由来の生物学的対象に存在する赤血球細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞のｐ２１発現のレベルおよび／またはＣＤ７１＋細胞のレベルを測定するために、生物学的試料を、診断検査サービスプロバイダに送ることができる。そのような実施形態では、そのような測定を実施した後に、サービスプロバイダは、研究者または医師に、阻害剤の有効性に関するレポートおよび／または対象が本明細書に開示される方法および組成物に従った阻害剤での処置に好適であるかまたは適しているかに関するレポートを提供することができる。
【０２９０】
代替的実施形態では、サービスプロバイダは、対象由来の生物学的対象に存在する赤血球細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞のｐ２１  ｐ５３発現のレベルおよび／またはＣＤ７１＋細胞のレベルの生データを研究者に提供し、研究者または医師によって実行される分析を残すことができる。一部の実施形態では、レポートは、電子的手段を介して、例えば、安全なウェブサイトへのアップロードを介して、研究者に伝達または送信され、または電子メールもしくはその他の電子通信手段を介して送信される。一部の実施形態では、研究者は、任意の手段、例えば、メール、速達郵便などを介してサービスプロバイダに試料を送ることができ、代替的に、サービスプロバイダは、研究者から試料を回収し、サービスプロバイダの診断検査室にそれらを送るサービスを提供することができる。一部の実施形態では、研究者は、サービスプロバイダの診断検査室の場所で分析される試料を寄託することができる。代替的実施形態では、サービスプロバイダは、ストップ・バイ・サービス（stop-by  service）を提供し、ここでサービスプロバイダは、研究者の研究室に人員を送るサービスを提供し、加えて、研究者の研究室における本明細書に開示される対象由来の生物学的対象に存在する赤血球細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞のｐ２１発現のレベルおよび／またはＣＤ７１＋細胞のレベルを測定するアッセイを実施するためのキット、装置および試薬を提供し、結果を分析し、各対象についてのレポートを研究者に提供し、本明細書に開示される方法に従って阻害剤を含む組成物を用いた対象の処置および投与用量に関する適切な推奨を医師に残す。
【０２９１】
以下の番号の付いたパラグラフは、本発明の実施形態を表す：
【０２９２】
パラグラフ１：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ｐ９０Ｓ６Ｋ活性を低下させ、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、リボソームｓ６キナーゼであるＲＳＫ（ｐ９０Ｓ６ｋ）の阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【０２９３】
パラグラフ２：前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、およびＲＳＫ３からなる群から選択されるバリアントを阻害する、パラグラフ１に記載の方法。
【０２９４】
パラグラフ３：前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＲＳＫ２を選択的に阻害する、パラグラフ１に記載の方法。
【０２９５】
パラグラフ４：前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、核酸、小分子化合物、またはタンパク質である、パラグラフ１に記載の方法。
【０２９６】
パラグラフ５：前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＳＬ０１０１（ＳＬ）、またはＳＬ０１０１（ＳＬ）の誘導体もしくはアナログであり、ＳＬ０１０１（ＳＬ）が、以下の構造：
【化２３】
2019524735.tif 000030
を有する、パラグラフ１に記載の方法。
【０２９７】
パラグラフ６：前記ｐ９０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）、またはＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）の誘導体もしくはアナログであり、ＢＩ−Ｄ１８７０（ＢＩ）が、以下の構造：
【化２４】
2019524735.tif 000031
を有する、パラグラフ１に記載の方法。
【０２９８】
パラグラフ７：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ｐ７０Ｓ６Ｋ活性を低下させ、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、ＲＳＫ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）の阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【０２９９】
パラグラフ８：前記ｐ７０Ｓ６ｋの阻害剤が、核酸、小分子化合物、またはタンパク質である、パラグラフ７に記載の方法。
【０３００】
パラグラフ９：前記ｐ７０Ｓ６ｋの阻害剤が、ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）、またはＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）の誘導体もしくはアナログであり、ＰＦ−４７０８６７１（ＰＦ）が、以下の構造：
【化２５】
2019524735.tif 000032
を有する、パラグラフ７に記載の方法。
【０３０１】
パラグラフ１０：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、Ｃｈｋ２の阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含み、前記Ｃｈｋ２の阻害剤が、ＣＣＴおよびＩＩＩまたはそれらの誘導体からなる群から選択される化合物を含み、ＣＣＴおよびＩＩＩが、以下の構造：
【化２６】
2019524735.tif 000033
を有する、方法。
【０３０２】
パラグラフ１１：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、前記対象におけるＣＤ３４＋細胞、赤血球細胞、または赤血球分化細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、カルモジュリンの阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含み、前記カルモジュリンの阻害剤が、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログであり、前記フェノチアジン化合物が、以下の構造：
【化２７】
2019524735.tif 000034
を有するＡＣＶ−１−２３５（ＡＣＶ）；ＪＪＭ−ＩＩ−２２１Ｅ（２２１Ｅ）；およびＤＢ１０２６（ＰｅｒＳｕｃｃ）からなる群から選択される、方法。
【０３０３】
パラグラフ１２：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログの有効量を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、以下の構造：
【化２８】
2019524735.tif 000035
【化２９】
2019524735.tif 000036
【化３０】
2019524735.tif 000037
を有する、ＤＢ−４−０８３（０８３）；ＤＢ−４−０８４（０８４）；ＤＢ−４−０８８−２（０８８−２）；ＤＢ−４−０８８−３（０８８−３）；ＤＢ−４−０８６（０８６）；ＤＢ−４−０８７−２（０８７−２）；ＤＢ−４−０８７−３（０８７−３）；ＤＢ−４−０８９（０８９）からなる群から選択される、方法。
【０３０４】
パラグラフ１３：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、式（Ｉ）：
【化３１】
2019524735.tif 000038
（式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アシル、アリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、またはアルキルアリールであり；
各々のＲは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、またはＳＯ３Ｈである）
の化合物、ならびにその異性体および薬学的に許容される塩である、方法。
【０３０５】
パラグラフ１４：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、式（ＩＩ）：
【化３２】
2019524735.tif 000039
（式中、
各々のＲ２１は、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、ハロアルキル、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ＣＯ２Ｈ、アシル、ＳＨ、チオアルコキシ、ＳＯ２Ｈ、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
の化合物、その異性体および薬学的に許容される塩である、方法。
【０３０６】
パラグラフ１５：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、フェノチアジン化合物、または前記フェノチアジン化合物の誘導体もしくはアナログを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記フェノチアジン化合物が、構造：
【化３３】
2019524735.tif 000040
の化合物である、方法。
【０３０７】
パラグラフ１６：リボソーム障害またはリボソーム病を有する対象を処置する方法であって、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも１つにおいて活性ｐ５３を低下させるために、有効量のカルシウムチャネル遮断剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭまたはその誘導体もしくはアナログを前記対象に投与することを含み、ＢＡＰＴＡ−ＡＭが、以下の構造：
【化３４】
2019524735.tif 000041
を有する、方法。
【０３０８】
パラグラフ１７：リボソーム障害を有する前記対象が、ダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）または遺伝性赤芽球減少症を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３０９】
パラグラフ１８：前記対象が、ＤＢＡ１、ＤＢＡ２、ＤＢＡ３、ＤＢＡ４、ＤＢＡ５、ＤＢＡ６、ＤＢＡ７、またはＤＢＡ８を有する、パラグラフ１７に記載の方法。
【０３１０】
パラグラフ１９：前記対象が、リボソームタンパク質１９（ＲＰＳ１９）に突然変異を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１１】
パラグラフ２０：前記対象が、ＲＰＳ７、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２４、ＰＲＳ２６、ＲＰＳ１７、ＰＲＳ２７Ｌ、ＲＰＳ２９、ＲＰＬ３５Ａ、ＰＲＬ５、およびＰＰＬ１１から選択されるリボソームタンパク質に突然変異を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１２】
パラグラフ２１：前記対象が、ｒＰＬ２Ａ、ｒＰＬ２Ｂ、ｒＰＬ３、ｒｐＬ４Ａ、ｒＰＬ４Ｂ、ｒＰＬ７Ａ、ｒＰＬ７Ｂ、ｒＰＬ１０、ｒＰＬ１１、ｒＰＬ１６Ａ、ｒＰＬ１７Ａ、ｒＰＬ１７Ｂ、ｒＰＬ１８Ａ、ｒＰＬ１８Ｂ、Ｒｐｌ１９Ａ、ｒＰＬ１９、ｒＰＬ２５、ｒＰＬ２９、ｒｐＬ３１Ａ、ｒｐＬ３１Ｂ、ｒＰＬ３６Ａ、ｒＰＬ４０Ａ、ｒＰＳ１Ａ、ｒＰＳ６Ａ、ｒＰＳ６Ｂ、ｒＰＳ１４Ａ、ｒＰＳ１５、ｒＰＳ１９、ｒＰＳ２３Ｂ、ｒＰＳ２５Ａ、ｒＰＳ２６Ｂ、ｒＰＳ２９、ｒＰＳ２９Ｂ、およびｒＰＳ３１からなる群から選択されるリボソームタンパク質に突然変異を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１３】
パラグラフ２２：前記対象が、コルチコステロイド、輸血からなる群から選択される、リボソームタンパク質欠損を処置するための別の治療剤を投与されている、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１４】
パラグラフ２３：前記有効量が、前記対象におけるＣＤ７１＋赤血球細胞の数を増加させる、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１５】
パラグラフ２４：前記有効量が、前記対象におけるヘモグロビンレベルを増加させる、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１６】
パラグラフ２５：前記対象が、大球性貧血または頭蓋顔面異常の症状を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１７】
パラグラフ２６：前記リボソーム病が、骨髄異形成である、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１８】
パラグラフ２７：前記骨髄異形成が、５ｑ−骨髄異形成である、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３１９】
パラグラフ２８：前記対象が、Ｒｐｓ１４における突然変異またはＲｐｓ１４発現における減少を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２０】
パラグラフ２９：対象が、異形成骨髄の症状を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２１】
パラグラフ３０：前記リボソーム病が、シュバッハマンダイアモンド症候群である、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２２】
パラグラフ３１：前記対象が、Ｓｂｄｓに突然変異を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２３】
パラグラフ３２：対象が、膵機能不全、骨髄機能不全、骨格奇形から選択される症状を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２４】
パラグラフ３３：前記リボソーム病が、トリーチャーコリンズ症候群である、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２５】
パラグラフ３４：前記対象が、ＴＣＯＦ１（核小体）に突然変異を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２６】
パラグラフ３５：前記対象が、頭蓋顔面変形の症状を有する、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３２７】
前述の詳細な説明および以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解される。当業者には明らかであるが、開示された実施形態に対する種々の変更および修正は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。さらに、特定された全ての特許および他の刊行物は、記述および開示する目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれ、例えばそのような刊行物に記載されている方法論は、本発明に関連して使用されうる。これらの刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関し、いかなる刊行物も、本発明者が先行発明によってまたは他の任意の理由によってそのような開示より日時が前であるという権利が与えられないことを認めたものとして解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関して、日付や表現についてのすべての記述は、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認も構成するものではない。本明細書に引用されている全ての参考文献、特許および刊行物は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３２８】
任意の公知の方法、デバイスおよび材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、この観点で方法、デバイスおよび材料が本明細書に記載されている。
【０３２９】
本明細書で提示される実施例は、リボソーム障害またはリボソーム病（ribosomapathy）、例えば、限定されないが、ＤＢＡの処置のための、本明細書に開示される少なくとも１つの阻害剤を含む方法および組成物に関する。本出願の全体にわたり、様々な刊行物が参照されている。刊行物およびそれらの刊行物内で引用されているそれらの参考文献の全ての開示は全体として、本発明が関連する技術の水準をより完全に説明するために、参照により本願明細書に組み込まれる。以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定するものではなく、むしろ特定の実施形態を例示することを意図するものである。当業者に思い当たる例示の方法の任意の変形形態は、本発明の範囲内に入ることが意図されている。
【０３３０】
材料と方法
胚の操作および化学的処置
【０３３１】
魚は、承認された実験条件下で維持した。試験は、ＡＢ野生型系統と、リボソームタンパク質Ｓ２９（ｒｐｓ２９）の第１のイントロンの挿入変異体であるｈｉ２９０３に対して実施した。胚を、Ｅ３で希釈した化学物質に付した。スクリーニングのために、ＩＣＣＢ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｋｎｏｗｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ、ＳｉｇｍａおよびＬｏｐａｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓからの化学物質を、ライブラリストックから１：３００希釈で試験した。化合物を、それぞれ２０胚の２つの独立した実験で試験し、したがって化学物質１つにつきおよそ１０種の変異体の胚をスコア付けした。化合物をＤＭＳＯまたは水で希釈し、５〜５０μｇ／ｍＬの用量で試験した。
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびベンジジン染色
【０３３２】
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を、記述されている通りに（ThisseおよびThisse、２００８年）行った。アンチセンスプローブを、消化されたプラスミドから合成した。Ｏ−ジアニシジンを、以前に記述されているように（Paffett-LugassyおよびZon、２００５年）行った。
【０３３３】
細胞培養および感染
【０３３４】
Ａ５４９およびＣＤ３４＋細胞を、ＲＰＳ１９を標的とする、以前に特徴付けされたレンチウイルスｓｈＲＮＡ（Duttら、２０１１年）で感染させた。特に断りのない限り、薬物を、感染後１日目に加え、細胞を、感染後３〜６日目に分析のために回収した。
【０３３５】
フローサイトメトリーおよび免疫蛍光
【０３３６】
タンパク質レベルのフローサイトメトリーに基づく測定のために、細胞を３７℃で１５分間、２％パラホルムアルデヒドで固定し、メタノールを加え４℃で一晩インキュベーションした。細胞を、１：１００希釈ｐ２１一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １２Ｄ１）と１時間インキュベートし、次いでコンジュゲート二次抗体および１：５０希釈ｐ５３−コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １Ｃ１２）と１時間インキュベートした。免疫蛍光染色を、以前に記述されているように（Duttら、２０１１年）行った。
【０３３７】
（実施例１）
リボソームタンパク質の突然変異は、赤芽球癆および頭蓋顔面異常を持つダイアモンド−ブラックファン貧血（ＤＢＡ）を有する患者に共通している。本発明者らは、以前に、小サブユニットのリボソームタンパク質ｒｐｓ２９におけるゼブラフィッシュ変異体を特徴付けした。Ｒｐｓ２９−／−胚は、頭に形態学的欠陥を有し、そして造血幹細胞、ヘモグロビン、および内皮マーカーの染色が減少している。ＤＢＡの他のモデルと一致して、ｐ５３のノックダウンは、ｒｐｓ２９変異体表現型をほぼ完全に救済する。ｒｐｓ２９変異体表現型を救済することができる化学物質を同定するために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏ化学物質スクリーニングを行った。阻害剤は、形態学、内皮およびヘモグロビン表現型を救済することが分かった。
【０３３８】
ゼブラフィッシュＲＰＳ２９変異体は、ｐ５３依存性造血表現型を有する
【０３３９】
ゼブラフィッシュの研究で、ｒｐｓ２９変異体が着目されている（Amsterdamら、２００４年）。本発明者らは、以前に、Ｒｐｓ２９変異体胚が初期に造血および内皮欠陥を有することを報告している（Burnsら、２００９年）。Ｒｐｓ２９−／−胚は、動脈の仕様に、受精後２４時間（２４ｈｐｆ）で造血幹細胞の減少および区間脈管におけるｆｌｋ１発現の低下をもたらす欠陥を有する。ｒｐｓ２９−／−胚はヘモグロビンが少ないので原始赤血球生成は特に影響を受けるが、一方で原始骨髄造血は影響を受けない。頭部形態の変化およびＴＵＮＥＬ染色によって示されるように、ｒｐｓ２９変異体胚は、アポトーシスが増加している。マイクロアレイ分析により、変異体胚におけるｐ５３およびその標的の活性化が実証された。ｐ５３突然変異が、ｒｐｓ２９変異体のバックグラウンドに掛け合わされたとき、造血およびアポトーシス表現型の全てが救済された。ここで、本発明者らは、ｒｐｓ２９変異体の表現型におけるｐ５３活性化の重要な役割を示す。このｒｐｓ２９変異体の特徴付けおよびｐ５３依存機構の特定が、最近、Journal  of  Experimental  Hematology（Taylorら、２０１２年、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）において公開された。
【０３４０】
化学物質スクリーニングは、特定のＣｈｋ２阻害剤がｒｐｓ２９−／−欠陥を救済することを見出す。
【０３４１】
ｒｐｓ２９−／−変異体胚における内皮および形態学的欠陥を救済することができる化学物質を同定するために、スクリーニングを行った（図５）。特に、本発明者らは、ｒｐｓ２９−／−変異体胚がＣａＭ依存性キナーゼを救済する能力を評価した。驚くべきことに、多数のＣａＭ依存性キナーゼのうち、Ｃｈｋ２阻害剤のみが良好に救済を行い、その後のｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼスクリーニングを通して（図１２および図１３参照）、本発明者らは、Ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴおよびＩＩＩが、ＲＳＫおよびｐ７０ｓ６ｋの阻害に有効であると決定した。Ｒｐｓ２９＋／−フィッシュを近交系間交配し、胚を処置のために芽体段階で回収した（１０ｈｐｆ）。胚を、既知の生物活性を有する化合物で、芽体から２３ｈｐｆまで処理した。頭部形態の救済についてスコア付けした後、胚をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために２４ｈｐｆで固定し、Ｈｂ発現救済をモニタリングした。
【０３４２】
Ｃｈｋ２阻害剤ＣＣＴは、Ｈｂを救済する。
【化３５】
2019524735.tif 000042
【０３４３】
Ｃｈｋ２阻害剤ＩＩＩは、Ｈｂを救済する。
【化３６】
2019524735.tif 000043
【０３４４】
カルモジュリンを阻害することが既知の、Ａ−７およびＷ−５を含む他のナフタレンスルホンアミドも、血管系欠陥を救済することが以前に実証された。
【０３４５】
（実施例２）
特定のフェノチアジン誘導体は、ｒｐｓ２９−／−胚におけるヘモグロビンを増加させる。
【０３４６】
ベンジジンアッセイを実施した。薬物処置のために、ｒｐｓ２９＋／−を近交系間交配し、胚を回収し、およそ受精後５時間（５ｈｐｆ）の５０％被包で処置した。ベンジジン染色を、以前に記載されているように（Paffett-LugassyおよびZon、２００５年）、４０ｈｐｆで行った。図２５は、化合物ＡＣＶおよびＰｅｒＳｕｃｃの、ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュにおけるＨｂ発現の劇的な救済、ヘモグロビン救済を示す。０対照におけるＨｂレベルに差異がある理由は、これらが異なる実験であり、フィッシュの異なるクラッチ間でＨｂにばらつきがあることによる。
【０３４７】
（実施例３）
新規フェノチアジン誘導体は、複数のＤＢＡモデルにおいて赤血球欠陥を改善する。
【０３４８】
本発明者らは、以前に、ｒｐｓ２９遺伝子（リボソームタンパク質Ｓ２９をコードしている）に突然変異を有するゼブラフィッシュ胚ＤＢＡモデルを示した（Taylor,  A.  M.ら）。ＲＰＳ２９に突然変異を有する患者のサブセットが存在し、本発明者らは、ＲＰＳ２９が、ＤＢＡ原因遺伝子であることを以前に確立した（Mirabello,  L.ら）。リボソームタンパク質機能不全の他の動物モデルと一致して、ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュにおけるｐ５３ノックダウンは、赤血球欠陥を救済する。ＤＢＡの表現型を救済することができる新規化合物を見出すために、本発明者らのゼブラフィッシュＤＢＡモデルでｉｎ  ｖｉｖｏ化学物質スクリーニングを行い、カルモジュリン（ＣａＭ）阻害剤がｐ５３活性を遮断し、赤血球欠陥を救済することを見出した。ＲＰＳ１９欠損ヒトＣＤ３４＋細胞にＣａＭ阻害剤を適用すると、赤血球分化に対する遮断が軽減された。さらにＦＤＡ承認ＣａＭ阻害剤トリフルオペラジン（ＴＦＰ）を、ＤＢＡ誘導性マウスモデル（Jaako,  Pら）に注射すると、赤血球数およびＨｂレベルが有意に増加し、骨髄におけるｐ５３活性が減少した。ＴＦＰは、フェノチアジンと呼ばれるＦＤＡ承認抗精神病薬のファミリーに属する。これらの薬物は、容易に血液脳関門（ＢＢＢ）を横断し、その長期使用は、運動障害および錐体外路作用に関連し（Kennedy,  P.  F.ら）、小児での使用は不適切である。この制限を克服するために、本発明者らは、ＢＢＢを横断しないと見込まれる新規フェノチアジン誘導体のライブラリを使用した。図３３。最初に、本発明者らは、ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚において化合物を試験し、いずれかの化合物が赤血球欠陥を改善することができるかを決定した。図３４。本発明者らは、ゼブラフィッシュにおけるＨｂ救済に注目した。２４ウェルプレートに１ウェルあたり２０胚を播種し、５０％被包で、胚を薬物で処置した。次いで、胚を、ヘモグロビン（Ｈｂ）について染色し、４％ＰＦＡで固定した。８種の化合物を試験し、３種の化合物（図中の囲み：０８８−２；０８８−３；および０８９））が、Ｈｂを、陽性対照フェノチアジン（フルフェナジン［Ｆｌｕ］）よりも低い濃度で増加させることができた（図３５）。
【０３４９】
ゼブラフィッシュにおいて、ＣＮＳ活性小分子が即時に神経系に影響しうることはよく確立されている（例えば、自発運動活性機能低下（Giacomini,  N.  J.ら；およびBoehmler,  W.ら））。ゼブラフィッシュのＢＢＢの機能はヒトと類似していることが示されていることから（Jeong,  J.  Y.ら）、ゼブラフィッシュは、ＢＢＢ透過性を試験するための優れたｉｎ  ｖｉｖｏモデルである。これらの化合物のＢＢＢ透過性を試験するために、ゼブラフィッシュ遊泳に影響を与える、したがってＢＢＢを透過していることが示唆される化合物をスクリーニングするためのハイスループット行動試験アッセイを使用した。このアッセイは、受精後６日（６ｄｐｆ）のゼブラフィッシュを９６ウェルに１ウェル中１匹で配置し、各ウェルに薬物を加え、自動分析イメージングソフトウェア（Rihel,  J.ら）を使用して１〜２時間運動を記録することを含む。最初に市販のフェノチアジンをこのアッセイで試験し、ゼブラフィッシュ幼体におけるＤＭＳＯ処置と比較して、薬物が動きを増加させるかまたは減少させるかを統計的に決定することができた（データ示さず）。これにより、高スループット様式でＢＢＢに浸透するプロキシとして行動を使用することができる。市販のフェノチアジン（Ｆｌｕ）、および行動に影響を与えない対照としてのｃｈｋ２阻害剤と共に、４つの新規誘導体を試験した。選択された誘導体のうち、３つ（０８３、０８８−３および０８９）が行動を変化させ、０８９は最高用量で毒性さえあった。一方、１つの薬物０８８−２は遊泳行動に影響を与えず、ゼブラフィッシュの脳に入っていないことが示唆された（図３６〜３９）。
【０３５０】
次に、本発明者らの主要なＤＢＡヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化モデルで３つの誘導体を試験した。これを行うために、２日間の培養でＣＤ３４＋末梢血単核細胞を拡大させ、ＲＰＳ１９  ｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルス（lentirvirus）でリボソームタンパク質欠乏を誘導した（図４０）。３日後、細胞を、新規誘導体を含むまたは含まない赤血球分化培地中に置き、５日間培養する。次いで、赤血球分化を、フローサイトメトリー分析により、トランスフェリン受容体ＣＤ７１＋について評価する。結果は、０８８−２および０８９の両方が、ＤＭＳＯ処置と比較して、赤血球前駆細胞のパーセンテージを増加させたことを示した（図４１）。加えて、新規誘導体は、ＤＭＳＯ処置と比較して、絶対赤血球数を増加させた（図４１）。これらの結果は、新規誘導体０８８−２が、ｒｐｓ２９−／−ゼブラフィッシュ胚およびヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＢＡモデルの両方において赤血球欠陥を改善することを実証する。親フェノチアジン化合物と異なり、０８８−２は、ゼブラフィッシュにおいて行動変化を引き起こさず、その化合物が脳に入り込んでいないことが示唆される。化合物の活性をまとめた表を、図４３に示す。
参考文献
【０３５１】
本明細書および実施例で引用されている全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2019524735.tif 000091
【図３１】
2019524735.tif 000092
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
2019524735.tif 000097
【図３６Ａ−Ｂ】
2019524735.tif 000098
【図３６Ｃ−Ｄ】
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【図３７Ａ−Ｂ】
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【図３７Ｃ−Ｄ】
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【図３８Ａ−Ｂ】
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【図３８Ｃ−Ｄ】
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【図３９Ａ−Ｂ】
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【図３９Ｃ−Ｄ】
2019524735.tif 000105
【図４０】
2019524735.tif 000106
【図４１−１】
2019524735.tif 000107
【図４１−２】
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【図４２】
2019524735.tif 000109
【図４３】
2019524735.tif 000110
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019524735000001.app
【国際調査報告】
2019524735.tif 000111
2019524735.tif 000112
2019524735.tif 000113