(57)【要約】  本開示は、例えばポリオ脊髄炎ワクチン製造のためのエンテロウイルスＣの製造方法に関する。いくつかの実施態様において、方法は、ウイルスの接種中又は接種前に細胞培養培地にポリソルベートを添加すること、及び／又は固定層バイオリアクターで細胞を培養することを含む。本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で開示される製造方法によって製造されるエンテロウイルスＣ、並びにそれに関連する組成物、免疫原性組成物、及びワクチンである。【選択図】図１
2019532624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）細胞を第１の細胞培養培地中で培養する工程；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含み、
ここで、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、界面活性剤を第２の細胞培養培地に添加する、方法。
【請求項２】
界面活性剤の非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、工程（ｃ）で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤がポリソルベートである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤がポリエチレングリコール系界面活性剤である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含む、方法。
【請求項６】
エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含む方法。
【請求項７】
エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含み、ここで細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、方法。
【請求項８】
エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含む、方法。
【請求項９】
エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースが第２の培養培地から枯渇している）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含む方法。
【請求項１０】
精製エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程；
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
（ｉ）デプスフィルターが、約０．２μｍ〜約３μｍの間の孔径を有し；
（ｉｉ）工程（ｅ）の前に、第１の溶出液のｐＨが約５．７のｐＨ値に調整され；
（ｉｉｉ）リン酸緩衝液又はポリソルベートを含む緩衝液を使用して、第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させ；
（ｉｖ）第１の溶出液が、約４．５〜約６．０の範囲のｐＨで陽イオン交換膜に結合しており、かつここで第１の溶出液が、約７ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で陽イオン交換膜に結合しており；
（ｖ）第１の結合画分が、ｐＨを約８．０に調整することによって、又は約０．２０Ｍ〜約０．３０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって溶出され、かつここで第１の結合画分が約２０ｍＳ／ｃｍ〜約２５ｍＳ／ｃｍの間で溶出され；
（ｖｉ）工程（ｇ）の前に、第２の溶出液のｐＨを約８．０〜約８．５のｐＨ値に調整し；
（ｖｉｉ）リン酸緩衝液、トリス緩衝液、又はポリソルベートを含む緩衝液を使用して、第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させ；
（ｖｉｉｉ）第２の溶出液が、約７．５〜約８．５の範囲のｐＨで陰イオン交換膜に結合しており、かつここで第２の溶出液が、約３ｍＳ／ｃｍで陰イオン交換膜に結合しており；かつ／又は
（ｉｘ）第２の結合画分が、約０．０５Ｍ〜約０．１０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって溶出され、かつここで第２の結合画分が、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で溶出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
エンテロウイルスＣウイルスがＳ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が哺乳動物細胞であり、任意選択的にＶｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ  受入番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８６）からなる群から選択される、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養される、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第１の細胞培養培地と第２の細胞培養培地は異なる、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）の間の第１の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約５０％を超えて維持され、工程（ｂ）の間の第２の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約５０％を超えて維持される、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも５．０×１０７  ＴＣＩＤ  ５０／ｍＬのエンテロウイルスＣウイルスが工程（ｄ）において回収される、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のベータ―プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）でエンテロウイルスＣを不活性化することをさらに含む、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
任意選択的にウイルスが１つ以上の抗原を含む、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法によって産生される、エンテロウイルスＣウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１６年９月１日に出願された米国特許仮出願第６２／３８２，６２１号の利益を主張する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：６０６７７２００１２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録された日付：２０１７年８月２４日、サイズ：２ＫＢ）。
【０００３】
（発明の分野）
本開示は、ワクチン製造用のウイルス（例えば、エンテロウイルスＣウイルス）を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリオは、いくつかの血清型のポリオウイルスを含むさまざまなウイルス亜型を含む、ヒトエンテロウイルスＣ（ＨＥＶ−Ｃ）のウイルス感染によって引き起こされる。ポリオウイルスは通常、経口分泌又は感染した個体からの糞便物質との接触を介してヒト間で伝染する。ほとんどの感染症は、消化管に限定された無症候性のウイルス複製にのみつながる。しかし、１％未満の感染では、ウイルスは中枢神経系に感染し、脊髄の前角細胞の運動ニューロンに増殖し、急性弛緩性麻痺を引き起こし、場合によっては話すこと、飲み込むことを困難にし、死に至る。米国だけでも、Ｊｏｎａｓ  Ｓａｌｋが不活化ポリオワクチンを開発した１９５５年まで、毎年何万人もの人々がポリオに感染していた。Ａｌｂｅｒｔ  Ｓａｂｉｎは後に弱毒化ウイルスを使った経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）を開発した。これらは、ヒトにおけるポリオ感染のほぼ根絶をもたらした。しかし、２０１２年に２２３例の麻痺性ポリオが報告された（Sutter、R.W. et al. (2014)J. Infect.Dis.210:S434-S438）。ポリオはナイジェリア、アフガニスタン、パキスタンで流行し続けており、中東、アフリカ、及びアジアのさまざまな国で散発的な流行が発生している。
【０００５】
ヒトエンテロウイルスＣは、特定のライノウイルス及び特定のコクサッキーウイルスも含む、エンベロープのない、プラスセンスＲＮＡウイルスのピコルナウイルス科に属する。ＨＥＶ−Ｃグループのメンバーには、３つのポリオウイルス血清型（Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３、ＰＶ１、ＰＶ２、及びＰＶ３としても知られる）及び多数のコクサッキーＡウイルス血清型（例えば、ＣＡＶ血清型１、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、及び２４）が含まれる（Brown, B. et al. (2003) J. Virol. 77:8973-84）。野生型ポリオウイルス血清型２（ＷＰＶ２）は根絶されていると見なされ（１９９９年に最後の既知の感染が発生している）、２０１２年に最後にＷＰＶ３感染が発生したが、ＷＰＶ１感染は依然として報告されている（Lowther, S.A. (2013) Morbidity and Mortality Weekly Report 62:335-8）。
【０００６】
ポリオウイルスは、コートタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ４のそれぞれ６０コピーからなる正二十面体キャプシドを含む（Bubeck, D. et al. (2005) J. Virol. 79:7745-55）。ウイルスが特定のポリオウイルス受容体（Ｐｖｒ、ＣＤ１５５としても知られる）に結合すると、３つのウイルス血清型すべてについて細胞感染が引き起こされる。しかしながら、これらの血清型は、中和抗体によって認識される血清型特異的及び一般的な免疫優性エピトープを含む（Minor, P.D. et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1283-91）。不活化ポリオワクチンは、各血清型のホルマリン不活化野生型株を含む。Ｓａｂｉｎ経口ポリオワクチンは３つの弱毒化生ポリオウイルス血清型の混合物を含むが、各ポリオウイルス血清型に対する一価ワクチンも特定の血清型の伝播を減らすために使用される。しかしながら、これらの弱毒化ウイルスは神経毒性及び伝染性を獲得することが示されており、その結果、循環ワクチン由来ポリオウイルス（ｃＶＤＰＶ）に起因する発生がもたらされる。これらの集団発生と不完全な根絶による野生ポリオウイルスの集団発生が続いていることから、継続的なポリオワクチン製造が必要とされている。
【０００７】
工業規模でのウイルスワクチン製造は、かなりの資源と費用を必要とする。潜在的なワクチンの製造のために、ウイルスワクチンは通常足場依存性細胞株（例えばＶＥＲＯ細胞）によって製造される。工業規模では、これらの細胞は、マルチプレートシステム（例えばセルファクトリー、セルキューブなど）上、ローラーボトル上、又はバイオリアクター中の懸濁液中のマイクロキャリア（多孔性又は非多孔性）上で静的モードで培養される。マルチプレートシステムはかさばっており、かなりの取扱い作業を必要とする。一方、マイクロキャリア培養は、多数の操作（キャリアの滅菌及び水和など）及び複雑な操作（すなわちビーズ間移動）を伴う前培養から最終プロセスまでの多くの工程を必要とする。
【０００８】
ウイルスが産生されると、下流の精製のための既存のプロトコルはしばしば煩雑でリソース集約的である。例えば、米国特許第８，７５３，６４６号は、最終的なカラムベースのウイルス精製の前に、複数回のろ過及び超遠心分離工程を含むポリオウイルス精製のためのプロトコルを記載している。追加の各工程には、人員、時間、及びリソースが必要である。従って、設置面積、人件費、及び運用コストを削減する単純でより短いプロセスを可能にする、より合理化された下流精製スキームを使用するワクチン製造技術が必要とされている。
【０００９】
ポリオワクチンは、ポリオウイルスが依然として流行しているアフリカ及び中東のいくつかの地域で依然として必要とされている。しかしながら、これらの地域は経済的に不利であり、効果的なワクチン接種プログラムのための十分な資源及び／又は基盤が不足している。従って、ポリオ撲滅には、ウイルス製造のためのより費用対効果の高い方法が必要である。
【００１０】
（発明の要旨）
従って、エンテロウイルスＣ製造のための方法、例えば工業規模で費用効果の高いウイルス製造を可能にする方法を開発する必要がある。本明細書に開示されるように、本開示の方法は、とりわけ、より高い費用効率及び合理化された処理でウイルス産生の増強を可能にするために固定層培養システムを使用する。例えば、本明細書に記載されている改良は、ワクチンの１回投与当たりの費用を約５ドルから１．２５ドルに減らすことができる。いくつかの実施態様において、本開示の方法は、細胞へのウイルスの接種中又は接種前にポリソルベートを細胞培地に添加することを追加的又は代替的に含むことができる。有利には、これらの方法は、例えば、ワクチン及び／又は免疫原性組成物の製造に有用であるエンテロウイルスＣの大規模又は工業規模の製造に使用することができる。
【００１１】
従って、本開示の特定の態様は、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法を提供し、これは以下：（ａ）細胞を第１の細胞培養培地中で培養する工程；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含み、ここで、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、界面活性剤を第２の細胞培養培地に添加する。いくつかの実施態様において、界面活性剤の非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、工程（ｃ）で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は増加する。いくつかの実施態様において、工程（ｃ）で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は、界面活性剤の非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。いくつかの実施態様において、界面活性剤はポリソルベートである。いくつかの実施態様において、界面活性剤はポリエチレングリコール系界面活性剤である。本開示の他の態様は、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法を提供し、以下：（ａ）第１の細胞培養培地で細胞を培養する工程；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含み、ここで、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、デキストランを第２の細胞培養培地に添加する。いくつかの実施態様において、工程（ｃ）で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は、デキストランの非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して増加する。いくつかの実施態様において、工程（ｃ）で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は、デキストランの非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。いくつかの実施態様において、細胞は工程（ａ）において液体培養物中で培養される。いくつかの実施態様において、細胞は接着細胞であり、細胞は工程（ａ）においてマイクロキャリア上で培養される。いくつかの実施態様において、細胞は接着細胞であり、細胞は工程（ａ）においてマトリクスを含む固定層中で培養される。いくつかの実施態様において、細胞は工程（ａ）においてバイオリアクター中で培養される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９の感染多重度（ＭＯＩ）でエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、工程（ｃ）は細胞を溶解して細胞により産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースは第２の培養培地から枯渇している。いくつかの実施態様において、方法は、工程（ｃ）の後に、（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、以下：（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される）、及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含む。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、工程（ｃ）は細胞を溶解して細胞により産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される。いくつかの実施態様において、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースは第２の培養培地から枯渇している。いくつかの実施態様において、方法は、工程（ｃ）の後に、（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。
【００１３】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、以下：（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約３２０，０００細胞／ｃｍ２が接種される）；及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含む。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む。工程（ｃ）は細胞を溶解して細胞により産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される。いくつかの実施態様において、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースは第２の培養培地から枯渇している。いくつかの実施態様において、方法は、工程（ｃ）の後に、（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。
【００１４】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、以下：（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程（ここで、細胞は、工程（ａ）、及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される）を含む。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、ここで工程（ｃ）は細胞を溶解して細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される。いくつかの実施態様において、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースは第２の培養培地から枯渇している。いくつかの実施態様において、方法は、工程（ｃ）の後に、（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。
【００１５】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、以下：（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される）；及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含む。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、工程（ｃ）は細胞を溶解して細胞により産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースは第２の培養培地から枯渇している。いくつかの実施態様において、方法は、工程（ｃ）の後に、（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。
【００１６】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、以下：（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースが第２の培養培地から枯渇している）；及び（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含む。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、工程（ｃ）は細胞を溶解して細胞により産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される。いくつかの実施態様において、方法は、工程（ｃ）の後に、（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。
【００１７】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、エンテロウイルスＣウイルスを産生するための方法であって、以下：（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程；（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程を含む。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。
【００１８】
上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、デプスフィルターは約０．２μｍ〜約３μｍの間の孔径を有する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ｅ）の前に、第１の溶出液のｐＨは約５．７のｐＨ値に調整される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１及びＳ２からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ｅ）の前に、第１の溶出液のｐＨが約５．０のｐＨ値に調整され、ここでエンテロウイルスＣウイルスはポリオウイルスＳ３である。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液又はリン酸緩衝液を使用して、第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させる。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、ポリソルベートを含む緩衝液を使用して、第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させる。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第１の溶出液は、約４．５〜約６．０の範囲のｐＨで陽イオン交換膜に結合している。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第１の溶出液は、約８ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で陽イオン交換膜に結合している。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第１の結合画分は、ｐＨを約８．０に調整することによって溶出される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第１の結合画分は、約０．２０Ｍ〜約０．３０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって溶出される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第１の結合画分は約２０ｍＳ／ｃｍ〜約２５ｍＳ／ｃｍの間で溶出される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ｇ）の前に、第２の溶出液のｐＨは約８．０〜約８．５のｐＨ値に調整される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型であり、工程（ｇ）の前に、第２の溶出液のｐＨを約８．０〜約８．５のｐＨ値に調整する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスはＳ１及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型であり、工程（ｇ）の前に第２の溶出液のｐＨを約８．５のｐＨ値に調整する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスはポリオウイルスＳ２であり、工程（ｇ）の前に第２溶出液のｐＨを約８．０のｐＨ値に調整する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、リン酸緩衝液を使用して、第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させる。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、ポリソルベートを含む緩衝液を使用して、第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させる。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第２の溶出液は、約７．５〜約８．５の範囲のｐＨで陰イオン交換膜に結合している。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第２の溶出液は、約３ｍＳ／ｃｍで陰イオン交換膜に結合している。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第２の結合画分��、約０．０５Ｍ〜約０．１０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって溶出される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第２の結合画分は約５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で溶出される。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、工程（ｃ）は細胞を溶解し、細胞により産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される。いくつかの実施態様において、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースは第２の培養培地から枯渇している。
【００１９】
上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、細胞は哺乳動物細胞である。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、細胞はＶｅｒｏ細胞である。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、Ｖｅｒｏ細胞株は、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８６からなる群から選択される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が工程（ａ）で培養される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ａ）において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第１の細胞培養培地と第２の細胞培養培地は異なる。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、方法は、工程（ａ）と（ｂ）の間に、第１の細胞培養培地を除去し、細胞を第２の培養培地ですすぐことをさらに含む。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、第２の細胞培養培地は無血清培地である。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ａ）の間の第１の細胞培養培地中の乳酸濃度は約２５ｍＭを超えない。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ｂ）の間の第２の細胞培養培地中の乳酸濃度は約１５ｍＭを超えない。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ａ）の間の第１の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約５０％を超えて維持される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ｂ）の間の第２の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約５０％を超えて維持される。上記の実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ａ）の間の第１の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約６０％を超えて維持される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、工程（ｂ）の間の第２の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約６０％を超えて維持される。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、固定層は約２ｃｍの層高を有する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、固定層は約１０ｃｍの層高を有する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、マトリクスは繊維マトリクスである。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、繊維マトリクスはカーボンマトリクスである。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、繊維マトリクスは、約６０％から９９％の間の多孔度を有する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、多孔度は約８０％〜約９０％の間である。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、繊維マトリクスは、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の細胞にアクセス可能な表面積を有する。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、繊維マトリクスは、約１０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１５０ｃｍ２／ｃｍ３の細胞にアクセス可能な表面積を有する。いくつかの実施態様において、繊維マトリクスは、細胞にアクセス可能な約１２０ｃｍ２／ｃｍ３の表面積を有する。上記実施態様の何��かのいくつかの実施態様において、少なくとも５．０×１０７  ＴＣＩＤ  ５０／ｍＬのエンテロウイルスＣウイルスが工程（ｄ）において回収される。上記の実施態様のうちの何れかのいくつかの実施態様において、方法は、１つ以上のベータ―プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）でエンテロウイルスＣを不活性化することをさらに含む。上記実施態様の何れかのいくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、ＬＳｃ、２ａｂ；Ｐ７１２、Ｃｈ、２ａｂ；Ｌｅｏｎ、１２ａ１ｂ；及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリオウイルス株である。
【００２０】
さらなる態様において、上記の実施態様の何れかの方法によって製造されたエンテロウイルスＣウイルスが本明細書に提供される。いくつかの実施態様において、ウイルスは１つ以上の抗原を含む。いくつかの実施態様において、ウイルスは、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上で不活性化されている。
【００２１】
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、上記の実施態様の何れかのウイルスを含む組成物である。さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、上記の実施態様の何れかのウイルスを含む免疫原性組成物である。さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、上記の実施態様の何れかのウイルスを含むワクチンである。
【００２２】
本明細書に記載のさまざまな実施態様様の１つ、いくつか、又は全ての特性が、本発明の他の実施態様を形成するために組み合わせてもよいことが理解されるべきである。本発明のこれら及び他の態様は当業者に明らかとなるであろう。本発明のこれら及び他の実施態様は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【図１】図１は、いくつかの実施態様による、固定層バイオリアクターを用いたウイルス製造のための上流処理工程の例示的スキームを示す。ＷＶＳ：ワーキングウイルスシード。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ポリオウイルスＤ抗原生産によって反映されるように、細胞生産性に対する感染時細胞密度（ＣＤＩ）の影響を示す。生産性は２つの方法でプロットされている：「体積（volumetric）」生産性（ＤＵ／ｍＬ；図２Ａ）及び「細胞当たり（per cell）」生産性（ＤＵ／１０６細胞；図２Ｂ）。
【図３】図３は、体積ポリオウイルスＤ抗原生産（ＤＵ／ｍＬ）によって反映されるように、経時的な細胞生産性に対するウイルス感染多重度（ＭＯＩ）の影響を示す。
【図４】図４は、ウイルス安定性に対するＴ―フラスコ（ＣＳ対照、四角）と比較したｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）（菱形）中の細胞増殖の影響を示す。
【図５−１】図５Ａ−５Ｃは、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）における細胞生産性に対するｐＨ及び溶存酸素（ＤＯ）調節の影響（図５Ａ）、並びに調節あり（「対照」）及び調節なし（「調節なし」）の経時的なｐＨ（図５Ｂ）及びＤＯレベル（図５Ｃ）を示す。
【図５−２】同上。
【図６】図６は、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）における細胞外（四角）及び細胞内（菱形）Ｄ抗原の経時的な体積生産を示す。
【図７−１】図７Ａは、ｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）（「ＮＡＮＯ  １」及び「ＮＡＮＯ  ２」）で増殖された２つのバッチと比較して、マイクロキャリア（例えば、ＣＹＴＯＤＥＸ（商標））上で増殖した細胞について、細胞あたりの生産性、グルコース不足、及び感染時の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を比較する。図７Ｂは、本明細書に記載のようにマイクロキャリア（例えばＣＹＴＯＤＥＸ（商標））上で増殖した細胞、文献に記載されているようにマイクロキャリア（「Ｌｉｔ．ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）」）上で増殖した細胞、及びｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）で増殖された２つのバッチ（「ｉＣＥＬＬｉｓ中のＣｙｔｏｄｅｘ  ｃｏｐｙ−ｐａｓｔｅ」及び「Ｂｅｓｔ  ｒｕｎ」）の細胞当たりの生産性を比較する。図７Ｃ及び７Ｄは、本明細書に記載のようにマイクロキャリア上で増殖した細胞、又は文献（図７Ｃ中の「Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）Ｔ」及び「Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）ｌｉｔ」）に記載されるようにマイクロキャリア上で増殖させた細胞の細胞当たりの生産性を、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）において増殖させた２つのバッチ（図７Ｄの「Ｈ」と「Ｐ」）と比較する。図７Ｅ及び７Ｆは、細胞生産性に対する感染期の細胞培養培地中の初期グルコース濃度の影響（Ｄ抗原／ｃｍ２）を示す。図７Ｇは、経時的な容積測定細胞生産性（Ｄ抗原／ｍＬ）に対する感染前のグルコース不足の影響を示す。図７Ｈは、経時的な体積生産性（Ｄ抗原／ｍＬ）に対する感染時の追加のグルコースの添加の効果を示す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図８−１】図８Ａ−８Ｃは、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ−８０）の添加によるウイルス収率の増加を示す。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図９−１】図９Ａ及び９Ｂは、いくつかの実施態様による、固定層バイオリアクターを使用したウイルス製造のための下流処理工程の例示的スキームを図示する。本明細書に記載の改良された下流プロセスと既存のプロセスとの間の比較を図９Ａに示す。下流の精製及び不活性化の詳細な流れ図を図９Ｂに示す。
【図９−２】同上。
【図１０】図１０は、特定の下流処理パラメータを修正することの効果を評価するために使用される３セットの実験条件（実験Ｄ、実験８、及び実験Ｃ）の要約を提供する。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ銀染色を用いて、図１０に示される実験条件によって産生されたポリオウイルスの精製を示す。示されているのは、実験８からのＳ２ウイルスの精製（図１１Ａ）、実験ＤからのＳ２ウイルスの精製（図１１Ｂ）、実験Ｄによって精製されたＳ２ウイルス（図１１Ｃのレーン１）と既存のプロトコルを用いて精製されたＳ２ウイルス（図１１Ｃのレーン２）との比較、実験ＤからのＳ３ウイルスの精製（図１１Ｄ）、実験Ｄによって精製されたＳ３ウイルス（図１１Ｅのレーン１）と既存のプロトコルを使用して精製されたＳ３ウイルス（図１１Ｅのレーン２）との比較である。示されているように、各レーンは特定の精製工程の生成物を表す。ＦＴ：フロースルー。
【図１１−２】同上。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたＤ抗原（ＤＵ）溶出に対する緩衝液組成及びｐＨのさまざまな組み合わせの効果を示す。５×（図１２Ａ）及び３×（図１２Ｂ）希釈物を示す。ポリソルベート（「Ｔｗｅｅｎ」）を含む（＋）及び含まない（−）条件は、示される通りである。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＤ抗原（ＤＵ）溶出に対する緩衝液組成及びｐＨのさまざまな組み合わせの効果を示す。５×（図１３Ａ）及び３×（図１３Ｂ）希釈物を示す。ポリソルベート（「Ｔｗｅｅｎ」）を含む（＋）及び含まない（−）条件は、示される通りである。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｄは、陽／陰イオン交換クロマトグラフィー及びクエン酸（菱形）、トリス（四角）又はリン酸（三角）緩衝液での溶出を用いたｐＨの関数としての結合効率を示す。図１４Ａ：ポリソルベートなしの陰イオン交換。図１４Ｂ：ポリソルベートありの陰イオン交換。図１４Ｃ：ポリソルベートなしの陽イオン交換。図１４Ｄ：ポリソルベートありの陽イオン交換。全ての条件は５倍希釈係数を使用する。図１４Ｅ〜１４Ｈは、ＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールでのウイルスの陰イオン交換クロマトグラフィー溶出を示す。図１４Ｅ及び１４Ｇは、それぞれ、ポリソルベートなし又はポリソルベートありでの、４倍希釈係数及びトリス  ｐＨ８．０緩衝液を用いて得られた溶出プロファイルを示す。図１４Ｆは、図１４Ｅに示す実験の各画分のウイルス収率を示す。図１４Ｈは、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ銀染色を用いた図１４Ｇに示す実験の各画分の純度を示す。図１４Ｉ〜１４Ｌは、ＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールでのウイルスの陽イオン交換クロマトグラフィー溶出を示す。図１４Ｉ及び１４Ｋは、それぞれ、ポリソルベートなし又はポリソルベートありでの、４倍希釈係数及びクエン酸ｐＨ５．５緩衝液を使用して得られた溶出プロファイルを示す。図１４Ｊは、図１４Ｉに示す実験の各画分のウイルス収率を示す。図１４Ｌは、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ銀染色を用いた図１４Ｋに示す実験の各画分の純度を示す。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１４−４】同上。
【図１４−５】同上。
【図１４−６】同上。
【図１４−７】同上。
【図１４−８】同上。
【図１４−９】同上。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｃは、回収率に対する陽イオン及び陰イオン交換条件の影響を試験するための実験設定を示す。図１５Ａ：試験した陽イオン交換条件。図１５Ｂ：試験した陰イオン交換条件。図１５Ｃ：工程及び全体的な回収に対する各条件の影響。０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０が全ての緩衝液中に存在した。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１６−１】図１６Ａ及び１６Ｂは、緩衝液濃度の増加及び陽イオン交換溶出ｐＨ及び陰イオン交換ローディングｐＨの低下の影響を試験するための実験設定を示す。図１６Ａ：試験した条件。図１６Ｂ：回収に対する緩衝液濃度の増加及び陽イオン交換溶出ｐＨ及び陰イオン交換ローディングｐＨの低下の結果（ＤＳＰ１．０の結果は上の２行に表示され、ＤＳＰ１．１の結果は下の２行に表示される）。
【図１６−２】同上。
【図１７】図１７Ａは、回収に対する希釈強度の効果を示す（総ロードに対するパーセンテージとして、総Ｄ抗原によりアッセイされる）。回収率は、溶出液、並びにフロースルー及び洗浄液（「ＦＴ＋洗浄」）に示されている。無希釈条件下でもフロースルー中にＤＵは回収されなかったことに注意されたい。図１７Ｂは、陽イオン交換膜をロードするために使用される希釈係数の関数としてのフロースルー中のＳ２ポリオウイルスの割合（例えば、Ｄ抗原によってアッセイされるように）を示す。
【図１８−１】図１８Ａ及び１８Ｂは、陰イオン交換溶出プロファイルに対する溶出緩衝液の変化に対する効果を示す。ｐＨ８．０のリン酸緩衝液を用いたｐＨベースの溶出を使用すること（図１８Ａ）及びｐＨ８．０のリン酸緩衝液中でＮａＣｌを用いた塩ベースの溶出を使用すること（図１８Ｂ）の結果として得られた溶出プロファイルを示す。
【図１８−２】同上。
【図１９】図１９は、ウイルス産生をスケールアップするための例示的な下流処理フローの概略図を提供する。
【図２０−１】図２０Ａ及び図２０Ｂは、いくつかの実施態様による２つの完全生産プロセスを要約する図を示す。
【図２０−２】同上。
【図２１】図２１Ａは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムを用いたウイルス製造のための全プロセスフローチャートを提供する。図２１Ｂは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムを用いた上流プロセス工程の最適化パラメータを示す。
【図２１−２】同上。
【図２２】図２２は、完全２５Ｌスケールの生産プロセスの結果を示す。
【図２３−１】図２３Ａは、完全２５Ｌスケールの生産プロセスの下流処理工程を示す。図２３Ｂ〜２３Ｄは、２つの異なる導電率での陽イオン交換クロマトグラフィーからのウイルスの溶出を示す。図２３Ｅ〜図２３Ｇは、完全２５Ｌスケールの生産プロセスからの陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶出プロファイルを示す。図２３Ｈは、Ｓ２ウイルスの精製のための下流プロセスパラメータを示す。図２３Ｉは、下流プロセスの各工程についての、体積；Ｄ抗原力価、総量、及び回収率；総タンパク質；タンパク質／Ｄ抗原比を示す。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【図２３−４】同上。
【図２３−５】同上。
【図２３−６】同上。
【図２３−７】同上。
【図２３−８】同上。
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｃは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２及びＮＡＮＯシステムにおけるウイルス製造の上流プロセスパラメータの差及び全体的生産性（ＤＵ）に対するそれらの影響を示す。
【図２４−２】同上。
【図２４−３】同上。
【図２５−１】図２５Ａは、ウイルスの回収及び精製のための上流処理工程を要約する。図２５Ｂは、ウイルスの回収及び精製のための下流処理工程を要約する。
【図２５−２】同上。
【図２６−１】図２６Ａは、陽イオン交換膜上への株Ｓ１のｐＨローディングを示す。図２６Ｂ及び２６Ｃは、陽イオン交換膜からの株Ｓ１のＮａＣｌ溶出を示す。
【図２６−２】同上。
【図２６−３】同上。
【図２６−４】同上。
【図２７−１】図２７Ａは、陰イオン交換膜へのＳ１株のｐＨローディングを示す。図２７Ｂは、陰イオン交換膜からの株Ｓ１のＮａＣｌ溶出を示す。
【図２７−２】同上。
【図２８−１】図２８Ａは、陽イオン交換膜への株Ｓ３のｐＨローディングを示す。図２８Ｂ及び２８Ｃは、陽イオン交換膜からの株Ｓ３のＮａＣｌ溶出を示す。
【図２８−２】同上。
【図２８−３】同上。
【図２８−４】同上。
【図２９−１】図２９Ａは、陰イオン交換膜への株Ｓ３のｐＨローディングを示す。図２９Ｂは、陰イオン交換膜からの株Ｓ３のＮａＣｌ溶出を示す。
【図２９−２】同上。
【図３０−１】図３０Ａ及び図３０Ｂは、いくつかの実施態様による、ＮａＣｌ（図３０Ａ）及びｐＨ（図３０Ｂ）溶出をそれぞれ使用した下流プロセス工程を示す。
【図３０−２】同上。
【図３１】図３１Ａ及び図３１Ｂは、いくつかの実施態様による、ＮａＣｌ（図３１Ａ）及びｐＨ（図３１Ｂ）溶出をそれぞれ使用した完全プロセス実行からの各プロセス工程でのウイルス回収を示す。これらの実験には株Ｓ２を用いた。
【図３２】図３２は、株Ｓ２を使用したプロセス実行を用いた陰イオン交換膜のＮａＣｌ溶出から得られたクロマトグラフを示す。特定の画分及びそれらの対応する容量は示されている通りである。
【図３３−１】図３３Ａ及び図３３Ｂは、さまざまなプロセス工程の後に株Ｓ２を使用したプロセス実行から得られたＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を示す。図３３ＡはＮａＣｌ溶出の結果を示し、図３３ＢはｐＨ溶出の結果を示す。
【図３３−２】同上。
【００２４】
詳細な説明
一般的技術
本明細書に記載又は参照される技術及び手順は一般によく理解されており、当業者によって従来の方法論、例えば、以下に記載されている広く利用されている方法論などを使用して一般的に使用される：Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)：PCR 2：A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987));  Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology：A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture(R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR：The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies：A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies：A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies：A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer：Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
【００２５】
細胞培養
本開示のある態様は、エンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を製造するための方法に関する。エンテロウイルスＣを製造することは、例えば、限定されないが、精製ウイルス、不活性化ウイルス、弱毒化ウイルス、組換えウイルス、又はサブユニットワクチン用の精製及び／又は組換えウイルスタンパク質を含むワクチン及び／又は免疫原性組成物に有用であり得る。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本開示の細胞は哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物細胞株）である。本開示の少なくとも１つのウイルスの増殖に適した細胞株は、好ましくは哺乳動物起源のものであり、限定されないが、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例：ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）又はＭＤＣＫ  ３３０１６、国際公開第９７／３７００１号に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ及びげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１―Ｆなどのハムスター細胞、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））を含み、例えば、成体、新生児、胎児、及び胚を含む、多種多様な発生段階から得ることができる。特定の実施態様において、細胞は不死化されている（例えば、ＰＥＲＣ．６細胞、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０の下で寄託されたものとして）。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞が利用され、１つ以上の以下の非限定的な細胞型から選択され得、かつ／又はそれに由来し得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状、肺、血管、真皮微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例：Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳房細胞（上皮など）、平滑筋細胞（血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頸部、網膜の周皮細胞）、メラニン形成細胞、神経細胞（例えば星状細胞）、前立腺細胞（上皮、平滑筋など）、腎細胞（例、上皮細胞、メサンギウム細胞、近位尿細管）、骨格細胞（例、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞、筋細胞（例、筋芽細胞、骨格筋、平滑筋、気管支）、肝細胞、網膜芽細胞及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液中及び無血清培地中で増殖することができ、かつウイルスの産生及び複製に有用である動物細胞及び細胞株の産生を記載している。
【００２７】
いくつかの実施態様において、細胞は哺乳動物腎臓細胞である。適切な哺乳動物腎臓細胞の例には、限定されないが、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ−２１、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ、及びＨＫＣＣ細胞が含まれる。
【００２８】
特定の実施態様において、細胞はＶｅｒｏ細胞である。適切なＶｅｒｏ細胞株の例には、限定されないが、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８７）、又はＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８６）が含まれる。
【００２９】
いくつかの実施態様において、細胞は接着細胞である。本明細書中で使用される場合、接着細胞とは、培養中に基材に接着又は固着する任意の細胞をいう。
【００３０】
上記の細胞型の培養条件は公知であり、さまざまな刊行物に記載されているか、あるいは培養培地、サプリメント、及び条件は、例えばＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び追加の文献に記載されるように商業的に購入できる。
【００３１】
既知の無血清培地には、Ｉｓｃｏｖｅ培地、Ｕｌｔｒａ―ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＥＸ―ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。通常の血清含有培地には、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）又は最小必須培地（ＭＥＭ）（Eagle,Science,130、432(1959)）又はダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）が含まれ、これらは通常、最大１０％のウシ胎児血清又は同様の添加物とともに使用される。場合によっては、最小必須培地（ＭＥＭ）（Eagle,Science,130,432(1959)）又はダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）をいかなる血清含有サプリメントもなしで使用することができる。ＰＦ―ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような無タンパク質培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような既知組成培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ又はＨｙＰｅｐ  ＴＭのような分裂促進ペプチド（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから）又はラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏ及び他の製造業者）もまた先行技術において十分に知られている。植物加水分解物に基づく培地添加剤は、ウイルス、マイコプラズマ又は未知の感染性物質による汚染を排除できるという特別な利点を有する。
【００３２】
本開示の方法の特定の態様は、細胞が培養される密度に関する。いくつかの実施態様において、第１の培地中で培養された細胞の密度又は絶対数は、細胞培養物が播種される、すなわちウイルス接種前の細胞の密度又は絶対数を指し得る。本明細書に記載されるように、かつ理論に束縛されることを望むものではないが、細胞をより低密度で培養することは、ウイルス接種時の細胞密度を減少させ、細胞の増殖期を延長し、かつ／又は、接種物の大きさ、労働時間、前培養工程におけるフットプリント、インキュベーターの数、及び／又は汚染の危険性を含むがこれらに限定されない要因を減らすのに有利であると考えられている。
【００３３】
いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養される。例えば、いくつかの実施態様において、最初の細胞培養を開始するための播種密度は、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２である。いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２；約５，０００細胞／ｃｍ２；約６，０００細胞／ｃｍ２；約７，０００細胞／ｃｍ２；約８，０００細胞／ｃｍ２；約９，０００細胞／ｃｍ２；約１０，０００細胞／ｃｍ２；約１１，０００細胞／ｃｍ２；約１２，０００細胞／ｃｍ２；約１３，０００細胞／ｃｍ２；約１４，０００細胞／ｃｍ２；約１５，０００細胞／ｃｍ２；又は約１６，０００細胞／ｃｍ２が、その間の任意の値を含み、培養される。いくつかの実施態様において、接種前の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）の何れかより小さい：１６，０００；１５，５００；１５，０００；１４，５００；１４，０００；１３，５００；１３，０００；１２，５００；１２，０００；１１，５００；１１，０００；１０，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；又は４，５００。いくつかの実施態様において、接種前の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）の何れかよりも大きい：４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；１０，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，０００；１２，５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５００；１５，０００；又は１５，５００。すなわち、接種前の細胞密度は、上限１６，０００；１５，５００；１５，０００；１４，５００；１４，０００；１３，５００；１３，０００；１２，５００；１２，０００；１１，５００；１１，０００；１０，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；又は４，５００と、独立して選択される下限４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；１０，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，０００；１２，５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５００；１５，０００；又は１５，５００を有する任意の範囲の密度であり得、ここで、下限は上限よりも小さい。特定の実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種するために、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が初期播種密度として使用され、その後、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２に達するまで培養される。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本開示の細胞は、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染する条件下で、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種される。エンテロウイルスＣが細胞に感染する条件は当技術分野において公知であり、細胞の型、エンテロウイルスＣの型、培地、温度、細胞密度、ウイルス密度（例えば、ＭＯＩ）、細胞増殖速度、細胞継代数などに依存し得る。エンテロウイルスが細胞に感染する条件の例示的な説明は以下に提供される。例えば、いくつかの実施態様において、細胞培養物は、図８Ｂに記載の条件のうちの１つ以上を任意の組み合わせで使用して培養及び／又は接種することができる。
【００３５】
本開示の方法の特定の態様は、ウイルス接種時の細胞密度に関する。本明細書に記載されるように、かつ理論に束縛されることを望むものではないが、感染時の細胞密度はウイルス産生（例えば、ウイルス生産性）に影響を及ぼし得ると考えられる。ウイルス接種時の最適細胞密度は、特異的（細胞あたり）生産性、体積（回収物１ｍＬあたり）生産性、及び／又は安定性の増加、並びに培地消費及び／又は回収物中の汚染物質の減少をもたらし得る。
【００３６】
いくつかの実施態様において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２の間でエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種する。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２の間でエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種する。いくつかの実施態様において、約１５０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２の間でエンテロウイルスＣを接種する。いくつかの実施態様において、約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約２００，０００細胞／ｃｍ２の間でエンテロウイルスＣを接種する。いくつかの実施態様において、接種時の細胞密度は、以下の密度（細胞数／ｃｍ２）：３００，０００；２７５，０００；２５０，０００；２２５，０００；２００，０００；１７５，０００；１５０，０００；１２５，０００；１００，０００；７５，０００；５０，０００；４５，０００；４０，０００；３５，０００；３０，０００；２５，０００；２０，０００；１７，５００；１５，０００；１２，５００；１０，０００；７，５００；又は５，０００の何れかより小さい。いくつかの実施態様において、接種時の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）：２，５００；５，０００；７，５００；１０，０００；１２，５００；１５，０００；１７，５００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；１２０，０００；１５０，０００；１７５，０００；２００，０００；２２５，０００；２５０，０００；又は２７５，０００の何れかよりも大きい。すなわち、接種時の細胞密度は、上限３００，０００；２７５，０００；２５０，０００；２２５，０００；２００，０００；１７５，０００；１５０，０００；１２５，０００；１００，０００；７５，０００；５０，０００；４５，０００；４０，０００；３５，０００；３０，０００；２５，０００；２０，０００；１７，５００；１５，０００；１２，５００；１０，０００；７，５００；又は５，０００と、独立して選択される下限２，５００；５，０００；７，５００；１０，０００；１２，５００；１５，０００；１７，５００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；１２０，０００；１５０，０００；１７５，０００；２００，０００；２２５，０００；２５０，０００；又は２７５，０００を有する任意の範囲の密度であり得、ここで、下限は上限よりも小さい。いくつかの実施態様において、約５，０００細胞／ｃｍ２が、エンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種される。
【００３７】
本開示の方法の特定の態様は、本開示の細胞が（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３などのエンテロウイルスＣウイルスの接種の前、最中、又は後で）培養される体積／表面積比に関連する。本明細書に記載されるように、かつ理論に束縛されることを望むものではないが、細胞が培養される体積／表面積比はウイルス産生（例えば、ウイルス生産性）に影響を及ぼし得ると考えられる。最適な体積／表面積比は、特異的（細胞当たりの）生産性、体積（回収物１ｍＬ当たり）生産性、及び／又は安定性の増加、並びに培地消費及び／又は回収物中の汚染物質の減少をもたらし得る。
【００３８】
いくつかの実施態様において、本開示の細胞が培養される体積／表面積比は、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２である。いくつかの実施態様において、本開示の細胞が培養される体積／表面積比は、接種前に細胞が培養される条件を指す。いくつかの実施態様において、本開示の細胞が培養される体積／表面積比は、接種中に細胞が培養される条件を指す。いくつかの実施態様において、本開示の細胞が培養される体積／表面積比は、接種後に細胞が培養される条件を指す。いくつかの実施態様において、細胞は接着細胞であり、細胞は、例えば本明細書に記載されているように、及び／又は当技術分野で公知のように、マトリクスを備える固定層中で培養される。いくつかの実施態様において、体積／表面積比は、約０．３，０．２７５，０．２５，０．２２５，０．２，０．１７５，０．１５又は０．１２５の何れかの比（ｍＬ／ｃｍ２）よりも小さい。いくつかの実施態様において、体積／表面積比は、約０．１、０．１２５、０．１５０、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、又は０．２７５の何れかの比（ｍＬ／ｃｍ２）よりも大きい。すなわち、体積／表面積比は、上限０．３、０．２７５、０．２５、０．２２５、０．２、０．１７５、０．１５、又は０．１２５と、独立して選択される下限０．１、０．１２５、０．１５０、及び０．２５を有する任意の範囲の比であり得；ここで、下限は上限よりも小さい。
【００３９】
本開示の方法の特定の態様は、本開示の細胞培養物に接種するために使用されるエンテロウイルスのＭＯＩに関する。本明細書では、ＭＯＩは当技術分野で認められている意味と一致して使用され、すなわち、ウイルス標的（例えば、本開示の細胞）に対するウイルス剤（例えば、エンテロウイルスＣウイルス）の既知の比率又は予測される比率である。ＭＯＩは、少なくとも１つのウイルスに感染している培養物中の細胞の割合に影響を及ぼすことが当該技術分野において知られている。より高いＭＯＩはウイルス生産性を増加させ得るが、ある範囲のＭＯＩでは、感染率は飽和し得、閾値又は所望の感染率に到達した後にＭＯＩを減少させることは対応するウイルスシードバンクの量及びコストを下げ得る。
【００４０】
いくつかの実施態様において、細胞にエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を約０．０１から約０．０００９のＭＯＩで接種する。いくつかの実施態様において、ＭＯＩは以下のＭＯＩ：約０．０１０、０．００８、０．００５、０．００２、又は０．００１０の何れかよりも小さい。いくつかの実施態様において、ＭＯＩは、以下のＭＯＩ：約０．０００９、０．００１０、０．００２、０．００５、０．００８、又は０．０１０の何れかよりも大きい。すなわち、ＭＯＩは、上限０．０１０、０．００８、０．００５、０．００２、又は０．００１０と、独立して選択される下限０．０００９、０．００１０、０．００２、０．００５、０．００８、又は０．０１０を有する任意の範囲のＭＯＩであり得、ここで下限は上限よりも小さい。
【００４１】
本開示の方法の特定の態様は、本開示の細胞が接種されるｐＨ（例えば、細胞を含む細胞培養培地のｐＨ）に関する。本明細書に記載されるように、ｐＨは細胞ウイルス産生に影響を及ぼし得る。
【００４２】
いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨでエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種される。いくつかの実施態様において、接種時のｐＨは、約７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、又は６．９の何れかのｐＨより小さい。いくつかの実施態様において、接種時のｐＨは、約６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、又は７．３の何れかのｐＨより大きい。すなわち、接種時のｐＨは、上限７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、又は６．９と、独立して選択される下限６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、又は７．３を有する任意の範囲のｐＨであり得、ここで下限は上限よりも小さい。例えば、いくつかの実施態様において、接種時のｐＨは、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、又は約７．４であり得る。
【００４３】
感染すると、本開示の感染細胞は、第２の細胞培養培地中で（例えば、本開示の固定層中で）培養され得る。本明細書に記載されるように培養された細胞は、ウイルス接種の前に第１の培地で、及び／又はウイルス接種の後に第２の培地で培養され得る。例えば、いくつかの実施態様において、本開示の細胞は、第１の細胞培養培地中で培養され得る。次いで、第１の細胞培養培地を除去し、細胞を任意に（例えば、ＰＢＳなどの水性緩衝液で）すすぎ、第２の培地を細胞に添加してもよい。いくつかの実施態様において、第２の培地は、細胞の接種のためにエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を含み得る。いくつかの実施態様において、第１の培地と第２の培地は同じ培地である（例えば、同じ組成を有し、いくつかの実施態様において必ずしも同じ物理的培地ではない）。他の実施態様では、第１の培地と第２の培地は異なる（例えば、異なる組成を有する）。
【００４４】
いくつかの実施態様において、第１の細胞培養培地は血清（例えば、ウシ胎児血清）を含有する。培養細胞の増殖に適した任意の種類の血清を使用することができる。当技術分野における血清の例としては、限定されないが、ウシ胎児血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ラット血清、マウス血清、及びヒト血清が挙げられる。いくつかの実施態様において、第１の細胞培養培地は１０％未満の血清（例えば、ウシ胎児血清）を含み、細胞は無血清培地に適合されていない。特定の実施態様において、第１の細胞培養培地は５％の血清（例えば、ウシ胎児血清）を含有する。
【００４５】
いくつかの実施態様において、第２の培地は無血清培地である。いくつかの実施態様において、第２の培地は無タンパク質培地である。培地（例えば、本開示の培地）は、本開示の文脈において無血清培地と呼ばれ、ヒト又は動物起源の血清由来の添加物は存在しない。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質を排除して細胞の増殖が起こる培養物を意味すると理解されるが、場合によってはウイルス増殖に必要なトリプシン又は他のプロテアーゼなどのタンパク質を含み得る。そのような培養物中で増殖する細胞は、タンパク質それ自体を天然に含む。
【００４６】
いくつかの実施態様において、界面活性剤及び／又はデキストランは、例えば、細胞にエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を接種する間に、又は回収の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。本開示の細胞培養培地において、限定されないが、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０としても知られる）、４０、６０、及び８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０としても知られる）などのポリソルベート；ＴＲＩＴＯＮ（商標）シリーズなどのポリエチレングリコール系界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ―１００、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）及びＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ―６３０（Ｒｈｏｄｉａ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ）／ＮＯＮＩＤＥＴ（商標）Ｐ―４０（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むさまざまな界面活性剤を適切に使用することができる。いくつかの実施態様において、細胞培養培地に添加される界面活性剤及び／又はデキストランの量は、（例えば、細胞培養培地の体積に対するｖ／ｖの割合として）０．００５％〜０．０５％の範囲、例えば、０．００５％、０．０１０％、０．０１５％、０．０２０％、０．０２５％、０．０３０％、０．０３５％、０．０４０％、０．０４５％、又は０．０５０％（これらの間の任意の値を含む）である。特定の実施態様において、０．０５％のポリソルベートが添加される。特定の実施態様において、０．００５％のポリソルベートが添加される。
【００４７】
本明細書中に記載されるように、ウイルス接種の間又はその前に、細胞培養培地への界面活性剤及び／又はデキストランの添加は、全ウイルス回収及び生産性の有意な増加を促進することが見出された。いくつかの実施態様において、回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は、界面活性剤及び／又はデキストランの非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、界面活性剤（例えば、回収中又は回収前）及び／又はデキストランの添加によって増加する。例えば、いくつかの実施態様において、回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は、界面活性剤及び／又はデキストランの非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、界面活性剤（例えば、回収中又は回収前）及び／又はデキストランを添加することによって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍増加する。特定の実施態様において、回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率は、界面活性剤及び／又はデキストランの非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、界面活性剤（例えば、回収中又は回収前）及び／又はデキストランの添加によって、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。
【００４８】
いくつかの実施態様において、細胞培養物は、マトリクスを有する固定層バイオリアクター内にある（例えば、接着細胞を使用する）。いくつかの実施態様において、細胞培養物は液体培養物である（例えば、懸濁液中での増殖に適した細胞を使用する）。いくつかの実施態様において、細胞はマイクロキャリア上で培養される。いくつかの実施態様において、細胞培養物はバイオリアクター内にある。懸濁液中での増殖及び接着細胞の使用に適したさまざまなバイオリアクターが当技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載されている。
【００４９】
いくつかの実施態様において、ウイルスの接種中にポリソルベートが第２の細胞培養培地に添加される。他の実施態様において、ポリソルベートは、回収の約１時間から約４時間前に第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、回収の約２、３又は４時間前に第２の細胞培養物に添加される。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、回収の約１、２、又は３時間前までに第２の細胞培養物に添加される。すなわち、ポリソルベートは、約２、３、又は４時間の上限、及び約１、２、又は３時間の独立して選択された下限を有する、回収前の任意の時点で第２の細胞培養物に添加することができ、ここで、下限は上限よりも小さい。例えば、いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、回収の約１時間、約２時間、約３時間、又は約４時間前に第２の細胞培養物に添加される。
【００５０】
本開示の方法の特定の態様は、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を細胞に接種する間又はその直前に細胞培地に存在するグルコースの量に関する。本明細書中に記載されるように、代謝ストレス（例えば、細胞培養培地中の利用可能な低いグルコースレベル及び／又は培養細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性によって証明される）は、ウイルスの細胞産生を増強し得る。いくつかの実施態様において、グルコースは本開示の第２の細胞培養培地から枯渇している。例えば、細胞培養培地は、より低い（例えば、枯渇）レベルのグルコースを有する細胞培養培地と交換することができる。細胞培養培地中のグルコースが、外因性グルコースによる置換／補充なしに細胞利用によって枯渇しているように、細胞を第２の細胞培養培地中で増殖させることができる。いくつかの実施態様において、本開示の第２の細胞培養培地にさらなるグルコースは添加されない。いくつかの実施態様において、本開示の細胞培養培地中で培養された細胞は、接種の少なくとも２４時間前、少なくとも４８時間前、又は少なくとも７２時間前にグルコース不足（例えば、細胞培養物中に存在する出発量と比較して減少した量のグルコース）を経験する。いくつかの実施態様において、２５０ｍｇ／Ｌ未満の細胞培養グルコースレベルは、翌日のグルコース不足を示す。いくつかの実施態様において、本開示の細胞培養培地で培養された細胞は、標準的な方法を通じて培養された細胞と比較して、感染時又は感染直前に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の増加及び／又は乳酸産生の増加を示す。
【００５１】
ウイルス接種材料及びウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／又はパルボウイルスは含まれていない（すなわち、試験されて、汚染について否定的な結果が与えられているであろう）［ＷＯ２００６／０２７６９８］。
【００５２】
細胞培養の他のパラメータ及び細胞培養培地もまたウイルス産生に影響を及ぼし得る。いくつかの実施態様において、本開示の細胞は、本開示の第１の培地及び／又は第２の培地中で所望の体積／表面積比で培養されてもよい。理論に拘束されることを望まないが、細胞が培養される体積／表面積比は、細胞生産性、細胞サイズ、増殖速度、及び／又は培地中の栄養素及び他の成分へのアクセスなどのパラメータに影響を及ぼし得る。特定の実施態様において、細胞は、約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で（例えば、ウイルス接種の前、最中、及び／又は後に）培養される。
【００５３】
いくつかの条件下では、本開示の細胞は培養中に乳酸を産生し得る。当技術分野では、培養中の細胞が解糖系代謝又は嫌気型代謝の結果として乳酸を生成し得ることが知られている。理論に拘束されることを望まないが、細胞培養培地中の過剰な乳酸は、例えば、培養培地のｐＨを低下させることによって、細胞増殖、代謝、及び／又はウイルス生産性にマイナスの影響を及ぼす可能性があると考えられる。さらに、培養細胞による過剰な乳酸産生は、ウイルス産生及び／又は増殖にとって所望され得ない細胞代謝状態を示し得る。いくつかの実施態様において、第１の細胞培養培地及び／又は第２の細胞培養培地中の乳酸濃度は、約２５ｍＭを超えない。細胞培養培地中の乳酸濃度を測定するための方法は当技術分野において公知であり、限定されないが、ラクトメーター、乳酸酵素アッセイ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ及び比色又は蛍光検出試薬の使用による）、微量透析サンプリング装置などの使用を含む。
【００５４】
いくつかの実施態様において、本開示の感染細胞は、感染細胞がエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を産生する第２の細胞培養培地中で（例えば、本開示の固定層中で）培養され得る。感染した細胞がエンテロウイルスＣを産生する条件は当技術分野において公知であり、細胞の型、エンテロウイルスＣの型、培養培地、温度、細胞密度、ウイルス密度（例えば、ＭＯＩ）、細胞増殖速度、細胞継代数などに依存し得る。エンテロウイルスが細胞に感染する条件の例示的な説明は以下に提供される。
【００５５】
本明細書に記載の方法の他の態様は、細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）に関する。細胞培養培地中で適切な酸素レベルを維持することは、細胞呼吸のために酸素を供給することによって細胞増殖及び／又はウイルス生産性を促進し得る。さらに、細胞培養物中の細胞による酸素利用は、それらの健康状態、増殖状態、及び／又は代謝の状態を反映し得る。いくつかの実施態様において、第１の細胞培養培地及び／又は第２の細胞培養培地中の酸素密度は約５０％を超えて維持される。細胞培養培地中でＤＯを維持及び／又は測定するための方法は当技術分野で公知であり、限定されないが、自動酸素注入、細胞培養培地の酸素への曝露（好ましくは汚染の危険性を最小にしながら）、酸素制御装置の使用、酸素センサーの使用などを含む。いくつかの実施態様において、本開示の第１の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は、約５０％を超えて維持される。いくつかの実施態様において、本開示の第２の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は、約５０％を超えて維持される。いくつかの実施態様において、本開示の第１の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は、約６０％を超えて維持される。いくつかの実施態様において、本開示の第２の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は、約６０％を超えて維持される。
【００５６】
いくつかの実施態様において、本開示の第１の細胞培養培地は、約２５ｍＭを超えない乳酸濃度を含む。いくつかの実施態様において、本開示の第２の細胞培養培地は、約２５ｍＭを超えない乳酸濃度を含む。細胞培養培地中の乳酸濃度を測定するための方法は、例えば、本明細書中に記載されるように、当技術分野において公知である。
【００５７】
例示的な培養パラメータ及び条件は本明細書に記載される。上記の細胞培養技術及びパラメータは、実施例１１、及び／又は図２４Ａ〜２４Ｃに記載の条件の１つ以上を任意の組み合わせで使用し得ると考えられる。
【００５８】
当技術分野において公知のさまざまな方法を用いて、本開示の方法によって製造された感染性ウイルスの力価を測定することができる。そのような方法は、限定されないが、エンドポイント希釈アッセイ（例えば、ＴＣＩＤ  ５０値を決定するための）、タンパク質アッセイ、定量的透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、プラークアッセイ、焦点形成アッセイ（ＦＦＡ）などを含む。いくつかの実施態様において、ウイルス力価はＴＣＩＤ  ５０／ｍＬで測定される。いくつかの実施態様において、少なくとも５．０×１０７  ＴＣＩＤ  ５０／ｍＬのエンテロウイルスＡウイルスが回収される。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、宿主細胞（すなわち、ウイルスを接種した細胞及びウイルスを産生する細胞）を溶解することによって回収される。本明細書に記載されているように、産生されたウイルスのかなりの量が産生細胞中の細胞内に見いだされる場合があり、従って細胞溶解はウイルスの回収及び収量を著しく増加させることがある。さまざまな細胞溶解方法が当技術分野で公知であり、さまざまなプロデューサー細胞に適している。いくつかの実施態様において、細胞は凍結融解によって溶解される。いくつかの実施態様において、細胞は界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０などのポリソルベート又はＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘなどのポリエチレングリコール系界面活性剤を含むがこれらに限定されない）によって溶解される。いくつかの実施態様において、細胞は物理的剪断によって溶解される。
【００６０】
細胞培養用デバイス
本開示の特定の態様は、細胞を培養するための方法に関する。いくつかの実施態様において、細胞は、固定層、揺動、又は撹拌／撹拌槽バイオリアクターなどの装置中で培養される。例示的な細胞培養装置は市販されており、当技術分野において公知である。例えば、ＵＳ８５９７９３９、Ｓ８１３７９５９、Ｓ  ＰＧ  Ｐｕｂ  ２００８／０２４８５５２、Ｏ２０１４０９３４４４、及びGenzel, Y. et al. (2006) Vaccine 24:6074-87に記載されているバイオリアクター；Ｍｅｄｏｒｅｘのバイオリアクター；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＷＡＶＥ又はＸｃｅｌｌｅｒｅｘバイオリアクター；又はニューヨーク州ポートワシントンのＰａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクター、例えばＮａｎｏ、５００／１００、及び５００／６６バイオリアクターを参照のこと。
【００６１】
いくつかの実施態様において、細胞は固定層バイオリアクターにおいて培養される。固定層バイオリアクターは、細胞の接着と増殖を促進するための固定層又は充填層を形成する固定充填マテリアルの形態のキャリアを含む。固定層の充填マテリアルの配置は、局所の液体、熱、及び物質の移行に影響を与え、通常は高密度であり、所与のスペース中の細胞培養を最大化する。１つの実施態様において、リアクターは、細胞の接着及び増殖を促進するための充填マテリアル（例えばファイバー、ビーズ、球又は同様のもの）から構成される充填層又は固定層を備える内部を形成する壁を含む。マテリアルはリアクターの内部内の区画に位置し、当該区画は、空洞で、垂直に伸長している管の上部を備えていてもよい。第二の区画は、少なくとも部分的に固定層を形成している区画のマテリアルへ液体を往復で運ぶためのリアクターの内部内に提供されている。典型的には、充填マテリアルは、細胞増殖のための表面積を最大化するように配置されていなければならず、１，０００平方メーターが、有益な表面積量であると考えられる（例えば、充填マテリアルとして医療グレードのポリエステルマイクロファイバーを使用して得ることができる）。１つの実施態様において、均一に分配された培地の循環は、内蔵式の磁気駆動羽根車により達成され、それにより剪断応力が低くなり、細胞活性が高くなる。細胞培養培地は、固定層を底部から上部へと流れる。上部では、薄いフィルムのように培地が外壁を落ち、ここでＯ２が取り込まれ、バイオリアクター内の高いＫＬａが維持される。この滝のような酸素化は、穏やかな攪拌とバイオマスの固定化と共に行われ、これによりバイオリアクターが高い細胞密度を得て、維持することができるようになる。いくつかの実施態様において、固定層は約２ｃｍの層高を有する。他の実施態様において、固定層は約１０ｃｍの層高を有する。
【００６２】
いくつかの実施態様において、固定層はマクロキャリア（例えばマトリクス）を含有する。いくつかの実施態様において、マクロキャリアはファイバーマトリクスである。いくつかの実施態様において、マクロキャリアはカーボンファイバーマトリクスである。マクロキャリアは、織りマイクロファイバー又は不繊マイクロファイバー、ポリエステルマイクロファイバー（例えば医療グレードのポリエステルマイクロファイバー）多孔質炭素及びキトサンのマトリクスから選択されてもよい。マイクロファイバーは任意でＰＥＴ、又は他の任意のポリマーもしくはバイオポリマーから作製されてもよい。いくつかの実施態様において、マクロキャリアはビーズを含有する。ポリマーは、もしかかる処置が必要であれば、細胞培養に適合するよう処置されてもよい。
【００６３】
適切なマクロキャリア、マトリクス、又は「担持マテリアル」は、例えばケイ酸塩、リン酸カルシウムなどのミネラルキャリア、例えば多孔質炭素などの有機化合物、例えばキトサンなど天然生成物、細胞増殖に適合したポリマー、又はバイオポリマーである。マトリクスは、正規構造又は非正規構造を伴うビーズの形態を有することができ、又はポリマーの織りマイクロファイバーもしくは不繊マイクロファイバー、又は細胞増殖に適合した任意の他のマテリアルを含有してもよい。また、充填物は、孔及び、又はチャンネルを有する１つの成形物として提供されることもできる。レシピエント内の充填物は、様々な形態及び大きさを有することができる。いくつかの実施態様において、マトリクスは、固形もしくは多孔性の球、薄片、多角形の微粒子マテリアルである。典型的には、充分な量のマトリクスを使用し、マトリクス粒子が使用時にレシピエント内を移動しないようにするが、これは、移動が細胞にダメージを与える可能性があり、並びに気体及び／又は培地の循環に影響を与える可能性があるためである。あるいは、マトリクスは、内部レシピエントに適合する要素、又はレシピエントの区画に適合する要素からなり、並びに適切な多孔性及び表面を有している。本明細書の例としては、Ｃｉｎｖｅｎｔｉｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により作製されるカーボンマトリクス（Ｃａｒｂｏｓｃａｌｅ）が挙げられる。いくつかの実施態様において、ファイバーマトリクスは、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞にアクセス可能な表面積を有する。あるいは、マトリクスは、内側のレシピエント又はレシピエントの区画に適合し、かつ適切な多孔性及び表面を有する要素からなる。その一例は、Ｃｉｎｖｅｎｔｉｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって製造されたカーボンマトリクス（Ｃａｒｂｏｓｃａｌｅ）である。いくつかの実施態様では、繊維マトリクスは、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞に接触可能な表面積を有する。いくつかの実施態様では、繊維マトリクスは、約１０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１５０ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞に接触可能な表面積を有する。例えば、繊維マトリクスは、細胞に接触可能な約１０ｃｍ２／ｃｍ３；約２０ｃｍ２／ｃｍ３；約４０ｃｍ２／ｃｍ３；約６０ｃｍ２／ｃｍ３；約８０ｃｍ２／ｃｍ３；約１００ｃｍ２／ｃｍ３；約１２０ｃｍ２／ｃｍ３；約１５０ｃｍ２／ｃｍ３；約２００ｃｍ２／ｃｍ３；約２５０ｃｍ２／ｃｍ３；約５００ｃｍ２／ｃｍ３；又は約１０００ｃｍ２／ｃｍ３（その間の任意の値を含む）の表面積を有することができる。いくつかの実施態様では、繊維マトリクスは、細胞に接触可能な表面積が、以下（ｃｍ２／ｃｍ３単位）：約１，０００；９００；８００；７００；６００；５００；４００；３００；２００；１７５；１５０；１２５；１００；９０；８０；７０；６０；５０；４０；３０；又は２０の何れか未満である。いくつかの実施態様では、繊維マトリクスは、細胞に接触可能な表面積が、以下（ｃｍ２／ｃｍ３単位）：約１０；２０；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１２５；１５０；１７５；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；又は９００の何れかより大きい。すなわち、繊維マトリクスは、上限１，０００；９００；８００；７００；６００；５００；４００；３００；２００；１７５；１５０；１２５；１００；９０；８０；７０；６０；５０；４０；３０；又は２０と、独立して選択される下限１０；２０；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１２５；１５０；１７５；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；又は９００を有する任意の範囲（ｃｍ２／ｃｍ３単位）であり得る、細胞に接触可能な表面積を有し；ここで下限は上限よりも小さい。いくつかの実施態様では、繊維マトリクスは、細胞に接触可能な約１２０ｃｍ２／ｃｍ３の表面積を有する。
【００６４】
いくつかの実施態様において、マクロキャリア（例えばファイバーマトリクス）は、約６０〜９９％の多孔性を有している。いくつかの実施態様において、マクロキャリア（例えばファイバーマトリクス）は、約８０〜約９０％の多孔性を有している。任意で、充填物は、５０％〜９８％の範囲の多孔性Ｐを有していてもよい。多孔性Ｐという用語は、マテリアルの所与の体積に存在する空気の体積であり、マテリアルの所与の体積の割合として表される。多孔性は、多孔質マテリアルの体積当たりの重量Ｗｘを測定し、以下の式を使用することで測定することができる：
Ｐ＝１００−（１−Ｗｘ  Ｗｓｐｅｃ）
式中、Ｗｓｐｅｃは、マテリアルの比重である。多孔性マテリアルは、１つの固体単位の多孔性マテリアルであってもよく、又は複数の個々の単位であってもよく、例えばグレイン、チップ、ビーズ、ファイバー、又はファイバー凝集体などであってもよい。
【００６５】
いくつかの実施態様において、固定層は、単回使用、又は使い捨ての固定層である。例えば、市販のバイオリアクターの例えばｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯ及び５００／１００バイオリアクターのＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｐａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）は、取り外し可能で、使い捨て又は単回使用の固定層を備えたバイオリアクターシステムを含んでもよく、その固定層により、小型のバイオリアクターの容積で、大きな増殖表面積がもたらされる。マイクロキャリアを使用する標準的な攪拌タンク型バイオリアクターと比較し、かかるシステムは、マイクロキャリアの手動操作、滅菌、及び水和、並びに前培養プロセスから最終プロセスへのビーズ間の移送を含む、いくつかの繊細で時間のかかる手順を回避する。本明細書に記載される場合、かかるバイオリアクターは、大規模（例えば５００平方メートル）の培養面積相当での処理と、最大で１５００〜２０００Ｌの回収液量を可能にすることができ、これは、ウイルスの産業規模での生産（例えばワクチン製造での使用）に有益である。本明細書に例示される場合、かかるデバイスは、例えば、少ない細胞接種材料；短い前培養期間で感染に最適な細胞密度に達すること；並びに／又は培養増殖期の間のＭＯＩ、培地、及び血清の濃度の最適化といったさらなる利点が可能となり得る。かかるデバイスは、培養中の細胞の急速なかん流が可能となるように構成されてもよく、それによって例えば、９０％以上の細胞が同じ培地環境におかれる。さらに、学説に拘束されることは望まないが、単回使用、又は使い捨ての固定層によって合理化された下流処理が可能となり、それに伴い生産性は最大化され、並びに、たとえ大規模な従来型培養容器の数個に相当するスケールアップがなされていても、処理面積の負荷は低減される。ゆえに、有益な生産性及び純度を、最小限の工程とコストで達成することができる。
【００６６】
１つの実施態様において、細胞培養のレシピエントは内部空間を有しており、それは環状である場合もあるが、他の形態をとっている場合もある。その空間は充填物を含有している。レシピエントが細胞培養に使用される予定である場合、充填物は、細胞増殖に適合していなければならない。環状構造の場合、内部空間は、第一の外端と第二の外端を有する外側管状壁と、縦軸方向に延びる縦壁により区切られた環状の体積を有している。外側管状壁は、環状体積の外側境界を縦軸方向に区切る；第一のクロージャと第二のクロージャは、外側管状壁のそれぞれ第一の外端と第二の外端で環状体積を区切り、閉鎖する；内側伸長壁は、外側管状壁の第一の外端へと向かう第一の外端と、外側管状壁の第二の外端へと向かう第二の外端を有している。内側伸長壁は、外側管状壁内に位置づけられている。内側伸長壁は、縦軸方向に伸長しており、環状体積の内部境界を区切り、その内部境界は外部境界に取り囲まれている。内部伸長壁の第二の外端は、第二のクロージャと同一の空間に存在する。例としては、外側管状壁は、シリンダー状の外側管状エレメントにより提供される。内側伸長壁は、固形状の内側シリンダー状エレメント、例えばシリンダー状の棒により提供される場合もある。外側管状エレメントは、シリンダー状の管状エレメントであり、縦軸方向に平行な中心軸を有している。内側シリンダー状エレメントと外側管状エレメントは、同軸上に取り付けられていてもよい。
【００６７】
いくつかの実施態様において、内部シリンダー状エレメントの第一の外端は、内側シリンダー状エレメントと外側管状エレメントに固定されているクロージャ、さらに外側管状エレメントを使用して、内側シリンダー状エレメントを、例えばバイオリアクターのモーターなどの動力機械装置に連結するためのカップリングエレメントを備えていてもよい。第二のクロージャは、培地及び／もしくはガスを、内部空間へ、並びに／又は内部空間から、提供するための、並びに／又は抽出するための、培地又はガス源へレシピエントを連結するのに適したコネクターと共に提供される。このコネクター、又はあるいは追加のコネクターが、第一のクロージャ又は第二のクロージャへと備え付けられていてもよい。
【００６８】
いくつかの実施態様において、レシピエントの移動時、充填物、特に多孔性マテリアルは、レシピエントに対し固定された相対位置に置かれてもよく、又はレシピエント内をレシピエントに関連して移動してもよく、又は場合によっては、レシピエントの区画内を移動してもよい。レシピエントは、任意で０．１〜２５回転／分の回転スピードで、その軸を中心として回るものである。
【００６９】
いくつかの実施態様において、内部空間は、培養培地、例えば細胞培養培地で部分的に満たされている。例として、液面は少なくとも内側伸長壁に接触し、又は内側伸長壁は部分的に培地中に沈んでいる。液面下に位置する充填物部分は、培養培地、例えば細胞培養培地により湿っている。液面上に位置する充填物は、内部空間に存在するガス又は空気と接触している。レシピエントが軸を中心として一方向、例えば時計回りに回転する場合、培養培地、例えば細胞培養培地は、充填物に対して反対方向に、すなわち反時計回りの方向に回転する。培養培地、例えば細胞培養培地は、栓流に従って全充填物を通過する。レシピエントを例えば時計回りに回転すると、培養培地、例えば細胞培養培地は、栓流の前縁のガス又は空気を強引に動かし、反時計回りに移動させる。培地の後縁では、任意で限定的な沈下が生じ、それによってガス又は気体は後縁へと吸い込まれる。そのようにして、培地、及びガス又は気体は全充填物を通過する。
【００７０】
いくつかの実施態様において、シリンダー状管状エレメントによって、別のレシピエントの内側伸長壁が提供される場合もある。例として、外側管状壁は、外側管状エレメントにより提供される。内側伸長壁は、伸長シリンダー状管状エレメントにより提供される。外側管状エレメントと伸長シリンダー状管状エレメントは、２つの取り外し可能なクロージャに固定されている。第一のクロージャは、レシピエントを縦軸方向に軸を中心として回転させるための駆動手段にレシピエントを連結させるためのカップリングエレメントと共に提供される。第一のクロージャはさらに、内部空間を導管、例えば可撓管に接続するためのコネクターを備えている。
【００７１】
いくつかの実施態様において、外側管状エレメントは、例えば１１０ｍｍの長さＬと、例えば１３５ｍｍの内側直径Ｄｏを有するガラス管であってもよい。内側伸長エレメントは、例えば８８．９ｍｍの外側直径Ｄｉを有するポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）管であってもよい。内側伸長エレメントの外端、すなわち内側伸長壁の外端は、クロージャと同じ場所にある。このクロージャは、ステンレススチール又はＰＶＤＦの環状ディスクであってもよく、それらはシリコンを使用し、内側エレメント及び外側エレメントに付加されていてもよい。コネクターを備えて提供され得る第一のクロージャは、例えば約３５ｍｍの外側直径Ｄｉを有するカップリングエレメントを有する。内側空間は、充填物で少なくとも部分的に満たされている。
【００７２】
いくつかの実施態様において、レシピエントはさらに、内側空間を２つの区画に分割する２個の流体透過可能な分割物を備えている。流体透過可能な分割物は、内側伸長壁から外側管状壁へ、及び第一のクロージャから第二のクロージャへと、管の軸の方向と平行な縦方向に伸長している。１つの区画は充填物と共に提供される。１つの区画は充填物と共に提供されない。流体透過可能な分割物は、例えば多孔性分割物を提供するための多孔性マテリアルを使用することにより、孔を備えて提供されてもよく、又は液体すなわち培養培地及びガスの通過を許可する場合には、開口部を備えて提供される。しかしながら分割物は、分割物の片側から反対側へと充填物が通過してしまうのを防ぐのに充分な小ささの孔又は開口部を備えて提供される。
【００７３】
いくつかの実施態様において、外側管状壁は、縦軸方向に対して垂直な面に沿った水路横断面を有する外側管状エレメントにより提供され、当該横断面は、円の形状を有している。内側伸長壁は、縦軸方向に対して垂直な面に沿った水路横断面を有する内側伸長エレメントにより提供され、その横断面は、不完全な円又は弓型の形を有している。１つの実施態様において、当該弓型は、円部分と弦を有している。例えば当該弓型の高さは、２００ｍｍの（Ｄｅｃ）、４００ｍｍ（Ｄｏ）、２４０ｍｍ（Ｄｉ）及び１２５ｍｍ（Ｌ）の寸法を有している。分割物はこの実施態様において当該弓型の弦と同一平面上にある。二つのクロージャのうちの第二のクロージャは、二つのコネクターを備えて提供される。第一のコネクターは、外側管状壁の近くに提供される。第二のコネクターは、内側伸長壁の近くに提供される。レシピエントが部分的にのみ培養培地で満たされている場合、その培地は液体表面を有し、レシピエントは、その液体が内側伸長壁に接触せず、しかし内側伸長壁から所与の距離に留まるような位置へ回転してもよい。レシピエントがこの位置に移動したとき、第一のコネクターを使用して、充填物で満たされていない区画に対し、培地を除去してもよく、又は培地を提供してもよい。コネクターを用いて、その培地液体表面の上にガスを提供してもよく、又は除去してもよい。時計回り、又は反時計回りのいずれかに、例えば３６０°以下又はそれ以上の角度でレシピエントを回転させることにより、培地は２つの分割物のうちの１つを通過し、より具体的には、培地中に徐々に沈む分割物を通過する。回転によって充填物が徐々に培地を通過するに従い、培地はゆっくりと充填物を流れて通る。レシピエントの回転によって、培地は栓流に従い全充填物を流れて通過する。環状体積のあらゆる場所で培地と充填物の間に均一な接触が生じる。充填物の一部が培地を通過すると、培地は徐々に充填物から吐き出され、それに従い、レシピエント中のガスが再び充填物と接触することができ、それによって充填物のあらゆる場所での均一な細胞の増殖が可能となる。
【００７４】
レシピエントの別の実施態様において、内部空間の環状体積は、複数の環状セクションにより提供され、この特定の場合においては、４つの環状の４半分（クオーター）により提供される。各セクションは、外側管状壁セクションによって外側管状壁の一部を提供する。各セクションは、内側伸長壁セクションによって内側伸長壁の一部を提供する。各セクションは、２個の放射状に伸長するセクション壁を有する。これらのセクション壁は、液体及びガスが不透過性である。各セクション壁は、隣接するセクションとの相互連結が可能となる取付手段を備えて提供される。第一のセクションのクロージャと第二のセクションのクロージャは、それぞれ、外側管状壁の第一と第二の外端で、環状セクションの体積を区切り、閉鎖する。セクションのクロージャはともに、それぞれ、レシピエントの環状体積の第一及び第二のクロージャを形成する。
【００７５】
いくつかの実施態様において、各セクションはさらに、２個の流体透過可能な分割物を備えて提供されてもよく、それらは３個の区画の各環状セクションの内部空間を分割する。流体透過可能な分割物、例えば多孔性分割物は、内側伸長壁から外側管状壁へ、及び第一のクロージャから第二のクロージャへと、管の軸の方向と平行な縦軸方向に伸長する。１つの区画は充填物を備えて提供される。２つの区画は充填物を備えて提供されない。各環状セクションに対し、第一のコネクターは、外側管状壁の近くに提供される。第二のコネクターは、内側伸長壁の近くに提供される。各セクションは、レシピエントが軸を中心として回転しているとき、レシピエントの独立したレシピエントセクションとして機能してもよい。各セクションの充填物は、培地を備えて提供され、セクションの半径上の位置に従ってこのセクション中に存在する。
【００７６】
セクションを取り付けることによって、４セクションのこの実施態様においては、外側管状壁と内側伸長壁を有するレシピエントが得られ、その環状体積は、２個のクロージャを用いて、外側管状壁の２個の外端で閉鎖される。２個の放射状に伸長したセクション壁の取り付けと連結によって、セクションの連結が行われるため、２個の連続的なセクション壁の組み合わせが液体及びガスが不透過性の分割物を形成し、分割物は内側伸長壁から外側管状壁へ、及び第一のクロージャから第二のクロージャへと、管の軸の方向と平行な縦軸方向に伸長する。この実施態様には、各セクションが、異なる細胞培養用の異なる培地を備えて提供され得るという利点を有する。また、セクションのうちの１つにおいて充填反応が不完全に機能した場合、その１つのセクションのみが置き換えられる。レシピエント（又は本明細書に開示される任意の他のレシピエント）の回転は、回転機により提供される場合がある。１つの例において、この回転機は、外側管状壁と、少なくとも２個の支持車輪を接触させることを含んでもよく、その車輪の少なくとも１つが駆動している。
【００７７】
別の実施態様において、レシピエントの各セクションは、２個の放射状に伸長するセクション壁を有する。これらのセクション壁は、液体及びガスが透過性である。各セクションは、いくつかの開口部を備えており、これら開口部の各々は、隣接する区画の第二のセクション壁の対応する開口部につながる。第一のセクション壁の開口部は、外向きに伸長する縁を備えて提供されてもよく、その縁は、第二のセクション壁の対応する開口部を通って伸長する。任意で、接触している壁の間に培地が漏れることを防ぐため、隣接するセクション壁の開口部周囲にシールが備えられる。別の実施態様においては、シールの代わりに可撓菅がレシピエント間に配置される。
【００７８】
バイオリアクターがレシピエントを使用する実施態様において、少なくとも１個のレシピエントが容器内に回転可能に取り付けられ、例えば円形、又は長方形などの多角形（任意で正方形）といった任意の適切な放射状の横断面を有してもよい。容器は、部分的に培養培地で満たされ、それによって液面は、任意でバイオリアクターの軸よりも高く上昇しないが、少なくとも内側伸長壁には接触する。レシピエントは軸を中心として回転し、その軸はレシピエントの縦軸と一致している。レシピエントの縦軸は、外側管状壁の縦軸方向と平行な軸である。任意で、外側管状壁は、開口部を備えて提供され、又は例えば液体及びガス透過性マテリアルなどの多孔質から作製される。かかる液体透過性の外側管状壁が、外側管状壁の一部のみが培地中に沈むように部分的に培地で満たされた容器の中で回転する場合、充填物は培地を備えて提供され、培地は外側管状壁を通って環状体積へと流れ込む。レシピエントが容器の中で回転する場合、培地の一部は、充填物に沿ってのろのろと進む場合がある。
【００７９】
いくつかの実施態様において、レシピエントのうちの少なくとも１つは、磁気エレメントを備えている。さらにバイオリアクターも磁気エレメントを備え、この磁気エレメントは、レシピエントの磁気エレメントと協働する。両磁気エレメントは、バイオリアクターの磁気エレメントの回転軸を中心とした回転が、レシピエントの磁気エレメントの回転を誘導するよう配置され、それによって全レシピエントが回転する。隣接するレシピエントは、それらが回転する近くの共通シャフト上に取り付けられてもよい。隣接するレシピエントは、固定された位置で互いに連結されてもよく、それによって、レシピエントの回転が、次のレシピエントの回転を誘導する。
【００８０】
いくつかの実施態様において、レシピエントは液体及びガスが不透過性の外側管状壁を有しており、壁は、レシピエントと、ガス又は培地の貯蔵場所を、任意で可撓管によって接続するためのコネクターを有する。レシピエントは、バイオリアクターを提供するための駆動システムを用いて回転されてもよい。レシピエントは回転可能なシャフト上に取り付けられ、そのシャフトは、レシピエントの軸と一致する回転軸を中心として回転可能である。シャフトは、内側伸長エレメントの内部空間内の固有の回転位置に配置され、適合される。従って、シャフトの回転位置を制御することにより、軸周囲のレシピエントの位置が明確に定義される。駆動システムはさらに、例えばリニアモーターなどのモーター、又はシャフト回転の正確な制御に適した任意の他の手段を備えていてもよい。レシピエントがシャフトを超えて縦軸方向にずれることを防ぐための締め付けねじ、又は任意の適切な手段が、シャフト上で縦軸方向にレシピエントの位置を固定してもよい。任意で２個以上のレシピエントが共通シャフト上に取り付けられる場合があることを理解されたい。内側伸長エレメントの内部空間の形状、及びシャフト外周の形状は、シャフトとレシピエントが、限定された方法、さらには固有の方法で取り付けられることができるよう選択される。
【００８１】
レシピエントの１つの実施態様において、内側伸長エレメントは、内側伸長エレメントの内側壁に縦軸のくぼみを有する。シャフトの頭部はこのくぼみに適合する。レシピエントは、シャフト上に明白な形で適合する。頭部は、くぼみの中で滑るように動くことが可能であってもよい。レシピエントの別の実施態様において、内側伸長エレメントは、内側伸長エレメントの内側壁に縦軸のくぼみを２個有する。シャフト上の２個の互いに垂直な頭部は、これらのくぼみに適合する。レシピエントは、２つの方法でシャフト上に適合する。第一の位置は、第二の位置に対し、軸を中心として１８０°回転している。頭部は、くぼみの中で滑るように動くことが可能であってもよい。レシピエントのさらなる実施態様において、内側伸長エレメントは、４個の縦軸のくぼみを有し、内側伸長エレメントの内側壁の各々のくぼみは、区画によりもたらされる。シャフトは、実質的に十字形様の横断面を有し、シャフト上に４つの相互に垂直な頭部を備えている。各頭部は、区画のうちの１つのくぼみに適合する。レシピエントは、シャフト上に４つの方法で適合する。頭部は、くぼみの中で滑るように動くことが可能であってもよい。
【００８２】
バイオリアクターのレシピエントのさらなる実施態様において、内部空間の体積は、複数のセグメントにより提供され、この特定の場合においては４つの４半分（クオーター）により提供される。各セクションは、外側管状壁部分を用いて外側管状壁の一部を提供する。各セグメントは、内側伸長壁部分を用いて内側伸長壁の一部を提供する。各セグメントは、２個の放射状に伸長するセグメント壁を有する。例として、セグメントは、２個の放射状に伸長するセグメント壁を有する。さらに、培養培地が内側伸長壁の内部空間を満たしてもよい。開口部を通り、培養培地がそのセクションに流入又は流出してもよく、及び任意で隣接するセクションへと流れてもよい。レシピエントは、縦壁、及びキャップの形態の末端を形成する体部を含む。このキャップは取り外し可能であってもよく、及び接続された位置で、体部内に任意の液体を含有するための、液密シールを形成してもよい。各キャップは、培養培地を受け入れるための流入口と流出口を形成する開口部を含んでもよいが、この流入口と流出口は各々、同様に同じキャップに備えられてもよく、又は体部の縦壁に備えられてもよい。少なくとも１つ又はペアの液体透過性の構造、例えば穴の開いた仕切りなどが備えられ、任意の充填物を含有するための区画を形成する。各仕切りの穴は、区画内の液体の流れ及び滞留時間を制御するための形状及びサイズで備えられてもよく、及びそれら仕切りは同じであっても、異なっていてもよい。充填物は、レシピエントの区画を完全に占有するような方法で備えられることができ、それによって、体部の壁の内側表面、並びに液体透過性構造に周辺が接触する。
【００８３】
いくつかの実施態様において、レシピエントは、回転デバイスと関連づけられていてもよい。そのデバイスは、体部の縦軸を中心としてレシピエントを受け取り、支持し、及び回転するための一対のローラーを含んでもよい。レシピエントは、多くの場合、このローラーと連動し、このローラーによって回転されるよう適合されたシリンダー状の体部を備えて提供され、区画内に存在する任意の充填物を通過させて任意の液体（例えば培養培地又は任意のリンス剤又は回収剤）が分配されるのを補助してもよい。また、区画に液体を送達するために、管状コネクターを流入口と流出口に関連付けて提供してもよい。これは、レシピエントが静止状態にある間、又は回転している間に行われてもよい。後者の場合、コネクターは、例えばスナップ式の咬合などを経由して作製される回転ジョイントを使用して、又はベアリングを使用して、相対的回転が可能となるような方法で接続されてもよい。例えばＯリングなどのシールを使用して、何らかの漏出を防ぐことを補助し、及び細胞培養に望ましい滅菌状態を維持することを補助してもよい。レシピエントの１つの利点は、アレンジの単純さである。例えば、レシピエントは、センサー、プローブ、ミキサー又は同様のものを含まず、しかしかかる構造を含むことが望ましい場合には、これは可能であり、閉回路でレシピエントをレゼルボアに接続することにより達成することができる。レゼルボアは、任意の数のセンサー、又は循環液の特性の１つ以上を測定するための同種のものを含んでもよく、及び単回使用の容器（例えば可撓性バッグ）を含み、洗浄と滅菌の必要性を無くしてもよい。液体を、ループを通って循環させるために、例えば蠕動ポンプなどのポンプを備えてもよい。
【００８４】
この実施態様において、レシピエントは、上述のいずれかに従い構築されてもよく（そして回転瓶を形成する）、及び流入口と流出口を含有する。流入口と流出口のそれぞれは、レシピエントの回転が可能な導管に接続されていてもよく、導管は過度に巻かれたり回転させられることなく、液体の移送に干渉することのない方法で接続され、及びそれによって、回転しながら、レシピエントからの継続的な液体の流出と流入が可能となる。具体的には、導管は、流出口と流入口のそれぞれに接続するための開口端を有するコイル管を備えていてもよく、及び反対側の端で、任意の液体レゼルボアと関連づけられていてもよい。また、導管とレシピエントを通り液体を移動させるための、適切なポンプ配置が備えられていてもよい。
【００８５】
１つの実施態様において、レシピエントは、適切な回転機（例えば、ローラー）を使用して、例えば時計回りなどの第一の方向に、１回以上の全回転の間、回転していてもよい。導管を巻き付けることなく可能な回転数は変動し得るが、最小で２〜３回転が可能であろうと予想される。次いで、レシピエントはすぐに１回以上の全回転の間、反対方向に回転されてもよい。より具体的には、回転は、コイル管がそのホームポジションへと戻るための第一の方向での回転数に、コイル管が巻き付かず、又はさもなければ液体移送に干渉しない間は、第二の方向での対応する回転数を加えたものであってもよい。回転、及び反回転は、連続的に、又は断続的に行われてもよく、及び導管を介した液体の送達及び回収も同様である。また、レシピエントがセンサーを含む場合には、検出に使用される任意のエネルギー源へとレシピエントが接続され得ることを理解することができるであろう。そのような場合には、例えばケーブルなどの任意の伝送回線をぐるぐる巻き、又はらせん巻きにし、回転又は巻き付けられることのない上述の予期される方法での相対的回転に適合させてもよい。とはいえ、再度ではあるが、任意のセンサー又は同種のものを、何れかの再循環ループ内に配置したほうが望ましく、その理由は、これによって、レシピエントのコストが低下するからである。
【００８６】
レシピエントが回転瓶の形態であるさらなる実施態様において、流入口と流出口は、共有壁に備えられてもよい。また、流入口は、固定層内の液体透過性内部シリンダー内に位置付けられた管と関連づけられていてもよく、それによって、導入された流体（ガス、液体、又はその両方）が、ただちに単純に流出口から出て行ってしまうことを防ぐ補助となる。ガスは、再循環ループ内において、例えばロータメーターなどのインジェクターを配置することにより液体へと導入されてもよい。配置は、流入口のすぐ上流であってもよい。液流と接続されたガス導入のこの方法は、泡の発生の低減、及び物質移動速度の改善に有益に役に立ち、その理由は、ガスが液体により分離されるポケット内に留まるためである。流出口と関連づけられた移送ラインはレゼルボアへと戻り、これは示されているフィルターを介して放出され、レシピエントとの直接接続用の排出口を回避する。
【００８７】
いくつかの実施態様において、他のエレメントをレシピエントとバイオリアクターに付加してもよい。例として、内側伸長壁は、伸長管状の、任意でシリンダー状の壁であってもよい。内側管状壁の内部空間を使用して、例えば温度センサー、位置センサー（例えば、回転軸に対し、レシピエントの方向を定義するため）、光学センサー（例えば、細胞培養培地などの培養培地のカラーデータを作成するため）、ｐＨセンサー、酸素センサー（例えば溶存酸素（ＤＯ）センサー）、ＣＯ２センサー、アンモニアセンサー、又は細胞バイオマスセンサー（例えば、濁度密度計）などのセンサーの１つ以上を収容してもよい。かかるセンサーは、付加的に、もしくは任意で、クロージャ内又はクロージャ上に位置付けられてもよい。レシピエントはまた、かん流、新鮮な栄養培地の連続的な添加、及び使用した培地と等量の培地の廃棄に適合してもよく、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況に可能な限り近い細胞培養状態を実現することができる。かん流細胞培養と、例えば酵素グルコースバイオセンサーを組み合わせることによって、細胞培養のグルコース消費を連続的にモニターすることが可能となる。また、レシピエント内の培地及び充填物を加熱し、その温度を維持するために、例えば加熱ブランケットなどの加熱エレメントを、外側壁、及び任意で内側壁に備えてもよい。
【００８８】
別の実施態様において、バイオリアクターは、実質的に垂直でシリンダー状の培養容器を備える細胞培養容器を備えているが、他の形態、例えば任意の角柱型、好ましくは正の角柱型などを予期することもできる。培養容器は、互いに連通している少なくとも四個のゾーンを備えている。容器の中心から外側に向かって、容器は第一のゾーン、第三のゾーン、第二のゾーン、及び第四のゾーンを備えている。
【００８９】
いくつかの実施態様において、培養容器は、底部に培地循環手段を備えている。培地循環手段は、この好ましい実施態様においては、例えば現実又はバーチャルな中心回転軸を中心とした回転をする磁気棒などの磁気デバイスから構成されており、その第一末端は上部咬合手段に収納され、その第二末端は、底部咬合手段に収納されている。磁気棒は、培養容器の外部にある回転磁気駆動モーターにより駆動されるが、本明細書には示されていない。循環手段は、少なくとも１つの培地流入口を備えている。培地流入口は、少なくとも１つの第一末端を備えており、その末端は培地の流入のための分水バッフルに終わる。磁気棒は、遠心力ポンプとして機能し、すなわち、培地はこの棒により生じた培地移動によって、比較的中心のゾーンへと吸い込まれ、そして培地は中心点に対して外側へと推進される。培地分水バッフルは、培地を、この棒の比較的中心ゾーンへと導き、それによって培地はその中に吸い込まれ、次いで外側に推進される。流入口は同じ平面にあり（星型構成）、流入口の数は、その位置が対称を示すような数であるのが有益である。より具体的には、もし３個の流入口を検討する場合、およそ１２０°の角度でそれらを互いに分離すると好都合であり、もし流入口の数が４個である場合、流入口は実質的に９０°に等しい角度で互いに分離され、もし流入口の数が１０個である場合、流入口はおよそ３６°の分離角度で配置される。また、培地循環手段は、少なくとも１つの培地流出口を備えている。培地流出口は、培地が磁気棒の遠心効果によって推進される場所に置かれるのが有益である。流出口の数は、その位置が対称を示すような数が有益である。より具体的には、もし３個の流出口を検討する場合、およそ１２０°の角度でそれらを互いに分離すると好都合であり、もし流出口の数が４個である場合、流出口は実質的に９０°に等しい角度で互いに分離され、もし流出口の数が１０個である場合、流出口はおよそ３６°の分離角度で配置される。好ましくは、流出口は、流入口のように同じ水平面には配置されない。培養容器の底部は、少なくとも１つの培地誘導手段を備え、その手段は前記少なくとも１つの流出口に隣接し、推進された培養培地を培養容器の上部へと誘導する。
【００９０】
いくつかの実施態様において、培養容器の第一のゾーンが実質的に中心ゾーンであり、培地移送ゾーンである。第一のゾーンは、基底部分を備え、特定の実施態様においては、第一のゾーンは任意でシリンダー部分も備えている。基底部分の直径は、培養容器の直径よりも小さい。基底部分は、前記培地循環手段の前記少なくとも１つの培地流出口と培地が連通している。基底部分は、第一のゾーンの上部において、シリンダーへと小さくなっており、基底部分よりも直径が小さい。上部のシリンダー状部分は外壁を備えており、前記第一の培地移送ゾーンの基底部分と直接、培地が連通している。第三のゾーンは、培地移送ゾーンであり、第一の培地移送ゾーンに対して外側にある。第三のゾーンは、実質的に基底部分（スリーブの形状）を備え、特定の実施態様においては、第三のゾーンは任意でシリンダー状の上部も備えている。
【００９１】
いくつかの実施態様において、第三の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分は、第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分と、原則として同心にあり、これら２つの部分は培地が連通している。培地の連通は、排水管を介して水をあふれさせること（図に示す）により、又はこの連通を行うための任意の他の可能な手段により、開口部又は管を介して行われる。第二のゾーンは細胞培養ゾーンであり、担体もしくはマイクロキャリアを伴う、又は伴わない。第二のゾーンはまた、スリーブの形状であり、その中心は、第一と第三の培地移送ゾーンである。第二のゾーンは、底部壁と上部壁を備えており、各壁は開口部が備えられ、それによって、原則的に細胞の無い培養済み培地の移送が行われる。第二の培養ゾーンは、培地の通過が可能な底部壁の開口部によって、第三の培地移送ゾーンの比較的底の部分と培地が連通している。第四のゾーンは、培地移送ゾーンであり、第二の培養ゾーンの外側であるが、培養容器の内部にある。第四のゾーンは、第二の培養ゾーンと培地が連通している。また、前記少なくとも１つの流入口を介して、培地循環手段と培地が連通している。培地の連通は、水をあふれさせることにより、又はこの連通を行うための任意の他の可能な手段により、開口部又は管を介して行われる。
【００９２】
いくつかの実施態様において、培養デバイスは、実質的にシリンダー状の培養容器を備えているが、他の実施態様では、上述されるように例えば実質的に角柱型の容器、好ましくは正の角柱型の容器が予期され得る。また、このことが様々な培地及び培養移送ゾーンにも当てはまることが明白である。また、角柱型、好ましくは正の角柱型であってもよく、任意の形状の組み合わせの可能性もある。この場合において、スリーブという用語は、角柱の想定される横断面と類似した横断面を有するエンベロープとして想定されるはずである。培地循環手段が操作中であるとき、培地は、前記少なくとも１つの流出口を通って出る。培地循環手段が複数ある場合、様々な流出口を通り、誘導手段により流用され、最終的には第一の培地移送ゾーンの実質的に底の部分に行き着く。第一の培地移送ゾーンの構造、及びポンプの拍出量は、培地が第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分へと向かうことが必要とされる。実質的にシリンダー状の部分の壁の上部に達したとき、排水管を介して第三の培地移送ゾーンへと培地があふれ出る。
【００９３】
この特定の実施態様において、第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分の壁が、効率性及び流速を理由として、第三の培地移送ゾーンの壁よりも低い高さであることが当分野の当業者には明白であるが、第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分の壁が、第三の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分の壁よりも高い場合もあり得ることが容易に理解されるであろう。それゆえ、培地は、ポンプにより与えられた流速、及び重力に従い、実質的にシリンダー状の部分を流れ落ちながら第三の培地移送ゾーンから下に向かい、第三の培地移送ゾーンの実質的に底の部分へと到達する。次に、培地の流れは、ポンプの与えられた流速による、連通容器の効力を介して、上向きの方向を有しており、及び第二の培養ゾーンの上部に到達する。培地は、第二の培養ゾーンの底部壁の、実質的に細胞が無い培地の継代用の開口部を介して、第三の培地移送ゾーンから第二の培養ゾーンに到達する。すでに述べたように、培地移動開口部は、培養のタイプに従った大きさである。培養が、キャリアを使用しない培養である場合、開口部を備えた壁は、多孔質の膜であり、膜の孔のサイズは、細胞の直径よりも小さい。培養がマイクロキャリア又はキャリア上で行われる場合、開口部のサイズは、マイクロキャリア又はキャリアのサイズよりも小さい。培地の流れの縁が第二の培養ゾーンの壁の上部に到達したとき、培地は第四の培地移送ゾーンへとあふれ出る。当然ながら、もし開口部が存在する場合、又は管である場合、培地の流れの縁が開口部又は管に到達したとき、培地は第四のゾーンへと流れることが理解されるはずである。
【００９４】
１つの実施態様において、第四の培地移送ゾーンは傾斜壁を備えており、培地が第二のゾーンから第四のゾーンへと通過するとき、傾斜壁の上を培地が流れる。好ましくは傾斜壁は、前記傾斜壁のフィルムの形成を改善するための親水性膜を備えている。フィルムは、好ましくは、可能な限り発泡を防ぐための薄層でなければならない。フィルムを安定化させるため、培養培地に添加物を加え、水、特に培養培地のレオロジー特性を改変することも可能であり、例えば添加剤は、界面活性剤、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、グリセリン、第四級アンモニウム、及び培養培地のレオロジー特性を改変するための任意の他の添加剤からなる群に含まれる。親水性膜は、例えば、ポリオキシエチレンからなる膜である。傾斜壁上でのフィルムの形成は重要な工程であり、その理由は、「薄いフィルム」上での酸素化が可能となるためである。実際に、この第四の培地移送ゾーンの培地量に対してガス性体積は大きく、交換を改善する。さらに、傾斜壁上でのフィルム形成は、ガス−液体の接触表面積を増加させる。
【００９５】
いくつかの実施態様において、培養容器は好ましくはカバーを備えており、カバーを介して少なくとも１つのガス流入開口部と、少なくとも１つのガス流出開口部が通っている。ガス流入開口部は好ましくは、第四の培地移送ゾーンと直接連通するよう配置されている。一部の変化形では、ガス流入開口部は、培養容器の垂直壁、又は培養容器の底部に存在することが好ましい場合があり、すなわち、ガスは、カバーと反対側の培養容器の壁を通った開口部を介して通過し、及びこの開口部は、液面上で終わるよう、管を備えて提供されることが好ましい場合がある。
【００９６】
この実施態様において、カバーは、固定手段によって、第二の培養ゾーンの上部壁に固定されている。変化形において、カバーは、第二の培養ゾーンの上部壁の不可欠な部分を形成していてもよく、この部分は、培養容器のカバーが持ち上げられたときに開く。この方法では、例えば細胞密度、細胞の構造、及び培養の健常状態を反映している細胞の他の物質的な特性などを評価するための細胞サンプルの採取が、キャリアの有無にかかわらず容易となる。実際に、この２つを共に接続することによって、培養容器のカバーを単純に持ち上げるだけで、培養区画を開くことが可能となる。懸濁液での培養の場合において、第二の培養ゾーンの開口部を備えた上部壁に多孔質の膜を接続したほうが有益であり、この組立によって、サンプル採取のためのカバー／膜の組立の硬直性を改善することができる。
【００９７】
いくつかの実施態様において、磁気棒は、らせんの形状を有している。実質的な中心回転軸を有する磁気デバイスの設計は、原則として培養量に依存している。実際に、少量の培養に対しては、デバイスは、例えば培地循環用の磁気チップなどのシンプルな棒を使用できるように設定される。多量の場合には、デバイスは、例えば高速の培地循環速度が可能な、水槽で使用されるローター等の、外部モーターにより駆動される磁気ローターが想定される。
【００９８】
細胞培養デバイスのいくつかの実施態様は、気泡生成デバイス、より普遍的には、生成される泡のサイズによって、「スパージャー」又は「マイクロスパージャー」と呼称されるデバイスを使用することが想定される場合がある。気泡が使用される場合、気泡生成デバイスの穴の開いた末端、例えば管などは、第四の培地移送ゾーンの底部で培地中に浸され、又は第一の培地移送ゾーンに浸されることが有益である。このタイプの酸素化が選択される場合、薄フィルム上での酸素化を継続することが常に出来、それによって、ガスの流れを低下させ、泡の形成を少なくすることができ、その結果、発泡の形成が低下する。この場合において、培養容器のカバーに、又は後者の垂直壁上に２つのガス流入口を設けるという対策が想定される。さらに、気泡生成デバイスが、単にＳＯＳ手順としてのみ存在すること、及び必要な場合にのみ使用されることを想定することが可能である。
【００９９】
いくつかの実施態様において、培養デバイスはまた、例えば溶存酸素分圧ｐＯ２、酸性ｐＨ、温度、混濁度、光学密度、グルコース、ＣＯ２、乳酸塩、アンモニウム、及び細胞培養をモニターするために通常に使用される他の任意のパラメータなどの、一連の培養パラメータセンサーを備えている。これらのセンサーは好ましくは、培養容器の内側と外側の間の接続を必要としない光学センサーである。これらセンサーの好ましい配置は、それらを培養容器の壁近くに位置づけること、それらを培地と接触させること、及び好ましくは、例えば培地が細胞を通過する前又は通過した直後に培地が通過するゾーンなどの戦略的配置におくことが有益であるという点で重要な配置である。
【０１００】
いくつかの実施態様において、細胞培養デバイスは、上述の単純性及び経済性などの全ての理由から、使い捨てのバイオリアクターを備えている。結果として、これが、培養容器の内側と外側の間の接続を減少させる理由である。さらに、バイオリアクターは、特に信頼できるバイオリアクターを備えており、使い捨てであることによってコンタミネーションのリスクが特に低くなっている。
【０１０１】
また、ある実施態様でデバイスは、大量培養用の一連のモジュールを備えたモジュール設計を想定している。例えば、このタイプのモジュール設計では、非常に限定された数の標準的なモジュールの使用を介して、例えば約５００ｍｌ〜１００リットルの培養量が想定される。いくつかの実施態様において、デバイスは、培地循環手段とカバーを備えた標準的な培養容器に配置された、第一の培地移送ゾーンの周囲に、「滑らせる」ことができる一連のモジュールを提供する。特定の変化形において、デバイスは、様々な標準的なモジュールを備えた取付システムを備えている。これら標準的なモジュールは、例えば組立の底部に配置される循環手段モジュール、１つ以上の培養モジュール、及びカバーモジュールである。これらモジュールを固定する他の手段も想定され得るが、モジュールは、例えば液体及びガスという観点で完全に不浸透性なレイピッドコネクター（ｒａｐｉｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）の手段によって、互いに固定される。
【０１０２】
結果として、培養のタイプ及び必要とされる量に従い、ユーザは、ストックから、培地循環手段を備えた基礎モジュールを選ぶことができ、また、必要とされる培養量に従い、ユーザが必要とする培養モジュールの数をそれらから選択し、次いでカバーに対応するヘッドモジュールを選択しなければならない。次に、これらすべてのモジュールは滅菌方式でパッケージされ、ユーザに必要なのは、ただそれらを開き、上下に「クリップする」だけである。積み重ねることにより、「使い捨てのバイオリアクター」を形成することができ、又は適切な容器内に配置することができる。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、循環手段を備えた基礎モジュールは培養容器の底部に固定することができ、また培養容器へと滑り込ませて配置することができ、他の培養用には他のものを使用することにより、交差汚染を防ぐことができる。これら培地循環手段は、中心回転軸を中心とした回転をする磁気デバイスを備えており、その第一末端は上部咬合手段に収納され、その第二末端は、底部咬合手段に収納されている。循環手段は、少なくとも１つの培地流入口を備えている。また、培地循環手段は、少なくとも１つの培地流出口を備えている。培養容器の基礎モジュールは、少なくとも１つの培地誘導手段を備え、その手段は前記少なくとも１つの流出口に隣接し、推進された培養培地を培養容器の上部へと誘導する。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、培養容器は、上下に積み重ねられた一連の培養モジュールを備えている。また、それらは単純に互いに隣接していること、すなわち並んで配置されていることも想定され得る。いくつかの実施態様において、モジュールはレイピッドコネクター又はクリップによって互いに固定される。さらに、各モジュールが、各培養モジュールの第四のゾーンと連通したガス流入口又はガス混合物流入口を備えることが有益である場合がある。また容器は、その部分に関して、過剰なガス又はガス混合物のための流出口を備えていてもよい。例えば、ガス流入開口部は、培養容器の底部に存在してもよく、すなわち、ガスは、カバーと反対側の培養容器の壁を通った開口部を介して通過し、及びこの開口部は、モジュールの液面上で終わるよう、管を備えて提供される。結果として、ガス性混合物は、このモジュールの第四の培地移送ゾーンに到達する。モジュールの上に配置されたモジュールもまた、培養モジュールの第四のゾーンに存在するガス性混合物を、モジュールの第四のゾーンと連通させることができる管を備え得る。従って、この管は、モジュールの底部壁を有益に貫通している。
【０１０５】
特定の実施態様において、長期間培養中、培養培地の一部を、新鮮な培地を交換することが有益である場合があり、又は栄養素の添加を行うことが有益である場合がある。結果として、基礎モジュールは栄養素流入口を備える場合がある。また有益なことに、培養容器は、培地循環手段で、あふれることを防ぐための培地流出口を備える場合がある。類似した方法で、培養容器は、カバーを備えたヘッドモジュールを備えており、カバーは、上記のように位置づけられたモジュール中でのサンプル採取を単純化するため、培地継代開口部を備えて提供される上部壁に固定手段により有益に接続されている。さらに有益なことに、培養パラメータセンサーを各培養モジュールに備えてもよい。また、センサーを、たった１つの培養モジュール、又は数個の培養モジュールに、全てのゾーンで、又は基礎モジュールにおいて備えることが可能である。
【０１０６】
いくつかの実施態様又は基礎モジュールにおいて、培地は、前記少なくとも１つの流出口を介して培地循環手段から推進され、流出口が数個ある場合には様々な流出口を通って推進され、誘導手段により流される。第一の培地移送ゾーンの実質的に基礎部分で、終了する。この実施態様の実質的な基礎部分は、全ての培養モジュールに共通のゾーンであり、解説される実施態様において、基礎モジュール内に位置付けられている。これは、培養モジュールが積み重ねられているか、又は並置されているかにかかわらず有効である。第一の培地移送ゾーンの構造、及びポンプの拍出量は、培地が、第一のモジュールの第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分へと向かい、第二のモジュールの第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分へと向かうことを必要とする。この実施態様では、実質的にシリンダー状の部分を備えた大きな第一の培地移送ゾーンを生成するモジュールの組立である。培地が、第二の培養モジュールの実質的にシリンダー状の部分の壁上部に到達したとき、第二の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンへと培地があふれ出る。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、培地はそれゆえに、ポンプにより与えられた流速、及び重力に従い、第二の培養モジュールの実質的にシリンダー状の部分を流れ落ちながら、第二のモジュールの第三の培地移送ゾーンの底に向かい、第二の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンの実質的に基礎部分へと到達する。次に、培地の流れは、連通容器の効力を介して、及びポンプにより与えられた流速を介して、上向きの方向を有し、そして第二の培養モジュールの第二の培養ゾーンの上部に到達する。培地は、第二の培養モジュールの底部壁の、実質的に細胞が無い培地の継代用の開口部を介して、第二の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンから、第二の培養モジュールの第二の培養ゾーンに到達する。培地の流れの縁が第二の培養モジュールの第二の培養ゾーンの外壁の上部に到達したとき、培地は第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへとあふれ出る。当然ながら、もし培養ゾーンの外壁に開口部又は管が存在する場合、培地の流れの縁が開口部又は管に到達したとき、培地は第二の培養モジュールの第四のゾーンへと流れることを理解することが必要である。デバイスの特定の好ましい実施態様において、第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンは傾斜壁を備えており、培地が第二の培養モジュールの第二のゾーンから第二の培養モジュールの第四のゾーンへと通過するとき、傾斜壁の上を培地が流れる。好ましくは傾斜壁は、前記傾斜壁上のフィルムの形成を改善するための親水性膜を備えている。フィルムは、好ましくは、可能な限り発泡を防ぐための薄層でなければならない。フィルムを安定化させるために、前述のように培養培地に添加剤を加え、水のレオロジー特性を改変することも可能である。次に、第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーン中に存在する培養培地は、第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンの管を通って、又は壁の上部を超えての何れかで、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンへとあふれ出る。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、培地は、ポンプにより与えられた流速、及び重力に従い、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンから下に向かい、第一の培養モジュールの実質的にシリンダー状の部分を流れ落ちながら、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンの実質的な基礎部分に到達する。次に、培地の流れは、連通容器の効力を介して、及びポンプにより与えられた流速を介して、上向きの方向を有し、そして第一の培養モジュールの第二の培養ゾーンの上部に到達する。培地は、第一の培養モジュールの底部壁の、実質的に細胞が無い培地の継代用の開口部を介して、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンから、第一の培養モジュールの第二のゾーンに到達する。培地の流れの縁が、第一の培養モジュールの第二の培養ゾーンの壁の頂点に到達したとき、培地は第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへとあふれ出る。当然ながら、もしこの壁に開口部又は管が存在する場合には、培地の流れの縁が開口部又は管に到達したとき、培地は第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへと流れることが理解されるはずである。第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンは、傾斜壁を備えることもでき、培地が第一の培養モジュールの第二の培養ゾーンから第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへと通過するとき、傾斜壁の上を培地が流れる。この傾斜壁は、上述のように親水性膜を備えて提供される場合もある。次に、培地は、流入口（パイプ）を通って基礎モジュール及び培地循環手段に戻り、すなわち、第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンに存在する培養培地は、第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンの管を介して、又は壁の上部を超えての何れかで、パイプにおいてあふれ出る。パイプは、培地循環手段を構成する前記遠心力ポンプにより形成されるサイフォンの実質的に中心ゾーンに終わる。
【０１０９】
この実施態様の変化形において、積み重ねられたモジュールが培養容器を構成する。この変化形において、例えば、基礎モジュール、四個のゾーンを備えるモジュール、及びヘッドモジュールｍｘの三種のモジュールが存在してもよい。基礎モジュール又は基礎的モジュールは、培地循環手段及び組立手段を備えている。基礎モジュールは、上記に説明されるように、４ゾーンモジュールの第一の組立手段を連動させるように、及び容器の底部を構成するように設計される。ヘッドモジュールは、４ゾーンモジュールの第二の組立手段を連動させるように設計される。基礎モジュールにより連動された４ゾーンモジュールは、ヘッドモジュールにより連動されたものと同じであってもよく、又は基礎モジュールにより連動された４ゾーンモジュールは、第一の一連の４ゾーンモジュールであってもよく、及びヘッドモジュールにより連動されたものは、その結果として、前記一連の４ゾーンモジュールにおける第二の４ゾーンモジュールである。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、全てのモジュールは固定手段を備えており、それによって、他の培養モジュールと、基礎モジュール又はヘッドモジュールの両方と組み立てることができる単一の培養モジュールを得ることができる。これら固定手段は例えば、円形のシール、細胞培養分野において公知のレイピッドコネクター、スクリューピンチ、及びセラーション（ｓｅｒｒａｔｉｏｎ）、又はこれらモジュールの組立用の任意の他のデバイスを備えて提供される二個の同心円である。
【０１１１】
この実施態様において、基礎モジュールの基礎部分は、実質的に管形状の開口部と結合され、この場合において開口部はガス又はガス混合物の導入を可能とする開口部である。ガス流入口開口部は、管に接続され、管は培養培地の面の上で終わり、それによって、ガス又はガス混合物は、培養デバイスの少なくとも第四の培地移送ゾーンに到達することができる。第四の培地移送ゾーンのすべての外気は、類似した管により接続され、ガス混合物が上部に到達できるようになっている。高さに対し積み重ね可能なモジュールを備えたデバイスは、非常に高くなることができ、リアクターの底部を通ってガス供給を提供することができる点で特に有益である。変化形において、基礎部分は、磁気デバイスが置かれているゾーンへガス性物質を運ぶためのガス又はガス混合物のフィードチューブを備えている。この方法において、流入ガスは、磁気デバイスの回転により攪拌され、酸素の溶解は培地の移動により改善される。過剰なガスもまた攪拌され、小さな泡の形態となって再度上昇する。加えて、外部からこれら開口部へアクセスするためのへこみもまた提供され、それによって、これら開口部が、ガス、ガス混合物、新鮮な培地などの供給口に接続されることができる。モジュールの上部部分の集団は、固定手段によりグリップされ、及び基礎モジュールの底部上の円形シールにより密閉されるよう設計されたエレメントである。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、デバイスは、カバーを通る管、又はデバイスの壁のうちの１つを通る管の何れかにおいて、栄養素供給口も備えている。同様に、デバイス、又はモジュールもしくは各４ゾーンモジュールの第一のゾーン又は第四のゾーンに加熱手段が存在してもよい。場合によって、デバイスは、例えば数個の遠心力ポンプなどの数個の培地循環手段を備えることができる。第二のゾーンの底部の開口部を通って培養培地が入ると、及びその後に、この第二のゾーンを通って培地がさらに移動する間も、デバイスは培養培地の均一な流れを可能とする。第一のゾーンが第二のゾーンに直接接触し、それによって第二のゾーン全体に非均一な流れが生じているデバイスとは対照的である。そのような非均一な流れによって、酸素と栄養素が充分に供給されない、細胞培養ゾーン内の供給不足な領域又はデッドゾーンが生じてしまい、そこでは細胞増殖及び／又は代謝は決して最適とはならない。
【０１１３】
デバイス及び方法の特定の実施態様は、第三のゾーンが、前記第二のゾーンに対し内部のゾーンであり、前記第一のゾーンに対し外部のゾーンである、デバイス及びその使用に関するものである。第一のゾーンの基礎部分から、第一のゾーンの上部シリンダー状部分を経由して上へ、さらに第三の移送ゾーンのシリンダー状上部部分を経由して第三のゾーンの基礎部分へ下へと向かう培地の流れは、第二のゾーンの底部に入った時点で所望される均一な流れを生じさせる。シリンダー状部分の存在により、第二のゾーンへ入る前のその特性を分析するための培地へのアクセスがさらに容易となる。シリンダー状エレメントの存在はまた、デバイス中に高い圧力が生じることも防ぐ。さらにシリンダー状部分の存在により、異なるモジュールを備えたデバイスの製造が可能となる。
【０１１４】
他の実施態様は、シリンダー状部分を通る液体の流れが迂回されるよう改変されたデバイスに関する。これらデバイスの別の実施態様において、第三のゾーンは、完全に第二のゾーンの下に位置づけられ、及び完全に第一のゾーンの上に位置づけられる。デバイスの１つの実施態様において、第一のゾーンと第二のゾーンのシリンダー状部分に相当するデバイスの部分は、例えばプラスチック、ガラス、又は金属などの固体エレメントにより置き換えられる。
【０１１５】
別の実施態様において、第一のゾーンと第二のゾーンは、それぞれ基礎部分に相当する平坦な形状の体積からなり、シリンダー状部分を欠いている。この適合により、培養培地は、排水管を経由し、第一のゾーンから第三のゾーンへと均等にあふれることができる。攪拌デバイスにより生じた培地の流れは、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁により均一な状態となり、第二のゾーンへの流入時に均一な流れを生じさせる。
【０１１６】
特定の実施態様において、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁は、水平部分並びに垂直部分からなり、排水管を伴うこの垂直部分は、第三のゾーンの高さの約５％以下、１０％以下、２０％以下、又はさらには５０％以下の高さを有している。他の特定の実施態様において、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁の垂直部分は存在しない。
【０１１７】
特定の実施態様において、固体エレメントは、例えば第三のゾーン中の培地の状態（ｐＨ、酸素、温度）を測定するためのプローブを組み込むために適合されたチャンネルを伴い提供される。他の特定の実施態様において、固体エレメントは、過剰な圧力が第一のゾーンと第三のゾーンに生じたときに開くことができる安全圧力弁を備えたチャンネルを伴い提供される。デバイスの別の実施態様において、第一のゾーンと第三のゾーン、第二のゾーンのそれぞれのシリンダー状部分は存在しない。以前にエレメントによって占有されていた体積は、今や、細胞増殖に適した拡張された体積から生じたデバイスのより効率的な使用を生じさせる第二のゾーンの部分となる。
【０１１８】
第三のゾーンへの均一な流量分布を伴わない、第一のゾーンから第二のゾーンへの培地の直接的な流入を防ぐため、第二のゾーンの底部壁の開口部は、第一のゾーンと第三のゾーンの間の壁の開口部の上に位置する領域では閉じられる。開口部の上に閉鎖領域を備えたことによるデバイス適合によって、第一の培養培地移送ゾーンから第三の培養培地移送ゾーンへの培養培地のオーバーフローが生じ、その後、培地は均一に流れながら第二のゾーンへと入る。
【０１１９】
特定の実施態様において、複数の開口部と、対応する閉鎖領域がそれぞれ、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁に、及び第三のゾーンと第二のゾーンの間の壁に備えられる。典型的には、そのような複数の開口部と対応する閉鎖領域は対称性に分布する。
【０１２０】
デバイスの別の実施態様において、培地の均一な流れは、第三のゾーン内に流れ再分布エレメントを備えることにより達成される。そのようなエレメントは、第一のゾーンから来た培地を適切に再分布させ、第三のゾーンに均一な液体の流れを形成させ、その後に第二のゾーンへと入るために適した任意の形状を有することができる。特定の実施態様において、エレメントは、円形、ひし形、又は卵型の横断面を有する、一連の放射状に伸長する棒の形状を有しており、放射状に適合された対応する開口部の上に位置付けられる。
【０１２１】
下流のウイルス精製
いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を製造するための本開示の方法は、細胞が第１の細胞培養培地中で培養されるマトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養すること；エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種すること；及び細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、ポリソルベートは、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される。いくつかの実施態様において、細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される。いくつかの実施態様において、約１５０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。いくつかの実施態様において、細胞は、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）はさらに、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することを含み、工程（ｃ）は細胞を溶解して、細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む。いくつかの実施態様において、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される。いくつかの実施態様において、細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成すること（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成すること（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成すること（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成すること（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを産生することをさらに含む。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスを製造するための本開示の方法は、第１の細胞培養培地中で細胞を培養すること；エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種すること；及び細胞に産生されるエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含み、ここで、ポリソルベートは、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを接種する間、又は工程（ｃ）の前の約１時間から約４時間の間に第２の細胞培養培地に添加される。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、本開示の回収されたエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、ウイルスを含む第１の溶出液を生成するためにデプスフィルターを通過させる。当技術分野で知られているように、エンテロウイルスＣ（例えば、培養細胞によって産生される、及び／又は細胞溶解によって培養細胞から回収される）から生産細胞、細胞片、及び他の薬剤を分離するために深層ろ過を使用して、回収したウイルスの清澄化を与えることができる。デプスフィルターは、Ｂｉｏ  ２０  ＳＥＩＴＺ（登録商標）デプスフィルターシートを使用する、ＳＵＰＲＡＣＡＰ（商標）シリーズのデプスフィルターカプセル（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などを用いて、カートリッジ又はカプセル形式で適用することができる。他の適切な深層ろ過技術及び装置は当技術分野において公知である。いくつかの実施態様において、デプスフィルターは、約０．２μｍ〜約３μｍの間の孔径を有する。いくつかの実施態様において、デプスフィルターの孔径は、以下の孔径（μｍ単位）：約３、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、及び０．４の何れか未満である。いくつかの実施態様において、デプスフィルターの孔径は、以下の孔径（μｍ単位）：約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、又は２．８の何れかよりも大きい。すなわち、デプスフィルターの孔径は、上限３、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、及び０．４と、独立して選択される下限０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、又は２．８を有する任意の範囲の孔径（μｍ単位）であり得；ここで、下限は上限よりも小さい。
【０１２３】
本明細書中に記載されるように、陽イオン交換及び陰イオン交換クロマトグラフィーは、本開示の細胞から回収されたエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を精製するために本開示の方法において使用され得る。有利には、本明細書に実証されるように、これらのクロマトグラフィー技術の組み合わせは、回収されたウイルスの高収率及び高純度を可能にする。例えば、清澄化ウイルス回収物を酸性化し、陽イオン交換膜にロードし、塩又はｐＨにより溶出し、ろ過し、塩基性にし、陰イオン交換膜にロードし、塩又はｐＨにより溶出し、ろ過し、不活性化し得る。これは例示的なスキームにすぎず、当業者は置換、削除、挿入、又は並べ替えの工程を有するその変形を容易に企図することができる。
【０１２４】
陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーは両方とも、移動相中の目的の荷電高分子（例えば、ウイルス）の反対の電荷を有する基質への引力に依存する。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、負に荷電した基質又は膜は、正に荷電した高分子を引き付ける。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、正に荷電した基質又は膜は、負に荷電した高分子を引き付ける。一旦高分子が基質上に結合又はロードされると、それらはそれらの特性に応じた方法で基質から直線的又は段階的に溶出され、それによって異なる荷電分子の分離が可能になる。この原理は他の高分子からウイルスを精製するために使用され得る。溶出は、移動相緩衝液のｐＨ又は塩含有量を変えることによって行われ得る。本明細書で実証されるように、ｐＨ及び塩含有量などの特定のローディング及び溶出パラメータは、エンテロウイルスＣウイルス精製の収率及び純度に劇的な影響を与える。さまざまな適切な緩衝液が当技術分野で公知であり、本明細書中に記載される。イオン交換クロマトグラフィーを用いるウイルス精製方法もまた一般的に知られている。例えば、https://www.pall.com/pdfs/Biopharmaceuticals/MustangQXT_AcroPrep_USD2916.pdfでオンラインで入手可能なインフルエンザウイルスの精製を参照のこと。
【０１２５】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを精製するために使用され得る。本明細書に示されるように、陽イオン交換クロマトグラフィーのローディング（例えば、陽イオン交換膜への結合）及び溶出に使用される緩衝液及び条件は、ウイルスの純度及び収率に大きく影響する。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を陽イオン交換膜に結合させて、ウイルスを含む結合画分を生成する。いくつかの実施態様において、溶出液は深層ろ過を受けている。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に（例えば、２倍、３倍、４倍、又は５倍希釈係数を用いて）希釈される。他の実施態様では、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陽イオン交換クロマトグラフィーの前には希釈されない。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陽イオン交換膜に結合する前にｐＨ約５．７に調整される（例えば、Ｓ１又はＳ２などのポリオウイルスを使用する）。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陽イオン交換膜に結合する前にｐＨ約５．０に調整される（例えば、Ｓ３などのポリオウイルスを使用する）。孔径０．６５μｍの陽イオン交換膜を使用するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような当技術分野において公知のさまざまな装置が陽イオン交換クロマトグラフィー（任意選択的にろ過を含む）に適している。陽イオン交換膜には、限定されないが、架橋ポリマーコーティング中にペンダントスルホン酸官能基を含むさまざまな官能基が使用される。本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液を陽イオン交換膜に結合させるためにさまざまな緩衝液を使用することができる。例示的な緩衝液としては、限定されないが、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液が挙げられる（追加の緩衝液については後述する）。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて（例えば、ローディング及び／又は溶出において）使用される緩衝液は、ポリソルベート（例えば、０．０５％、０．１％、０．２５％、又は０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０）を含有する。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を含有する溶出液は、約４．５〜約６．０の範囲のｐＨで陽イオン交換膜に結合する。いくつかの実施態様において、溶出液は、以下のｐＨ：約６．０、５．５、又は５．０のうちの何れかよりも低いｐＨで陽イオン交換膜に結合する。いくつかの実施態様において、溶出液は、以下のｐＨ：約４．５、５．０、又は５．５の何れかのｐＨよりも高いｐＨで陽イオン交換膜に結合する。すなわち、溶出液は、上限６．０、５．５、又は５．０と、独立して選択される下限４．５、５．０、又は５．５を有するｐＨの範囲内のｐＨで陽イオン交換膜に結合することができ；ここで下限は上限よりも小さい。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、約８ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で陽イオン交換膜に結合する。例えば、溶出液は、約８、約９、又は約１０ｍＳ／ｃｍで結合することができる。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を含有する結合画分は、ウイルスを含有する溶出液を生成するために陽イオン交換膜から溶出される。いくつかの実施態様において、本開示の陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、膜への結合前、クロマトグラフィー中、及び／又は膜からの溶出後のろ過工程を含む。溶出は勾配的でも段階的でもよい。本明細書中に記載されるように、溶出は、移動相のｐＨの変化を用いて、又は移動相のイオン強度の変化を用いて（例えば、塩の添加を通して）行われ得る。溶出のために、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムを含むがこれらに限定されないさまざまな塩が使用される。特定の実施態様において、塩はＮａＣｌである。例えば、いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する結合画分は、約０．２０Ｍ〜約０．３０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって、例えば、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、又は約３００ｍＭの塩化ナトリウムを添加することによって陽イオン交換膜から溶出される。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する結合画分は、約２０ｍＳ／ｃｍ〜約２５ｍＳ／ｃｍの間で、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ｍＳ／ｃｍで陽イオン交換膜から溶出される。ｐＨ溶出には、マレイン酸、メチルマロン酸、クエン酸、乳酸、ギ酸、コハク酸、酢酸、ＭＥＳ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、及びＢＩＣＩＮＥを含むがこれらに限定されないさまざまな緩衝液が使用される。特定の実施態様において、緩衝液はリン酸塩又はクエン酸塩である。これらの緩衝液のそれぞれを用いた溶出に適したｐＨ範囲は当技術分野において公知であり；一般に、緩衝液のｐＨは、分子（例えば、エンテロウイルスＣウイルス）のｐＩと固定相上の荷電基のｐＫａとの間にある。例えば、いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する結合画分は、ｐＨを約８．０に調整することによって陽イオン交換膜から溶出される。
【０１２８】
例示的な陽イオン交換結合及び溶出パラメータ及び条件は本明細書に記載されている。上記の陽イオン交換クロマトグラフィーは、実施例８〜１０及び１２及び／又は図９Ａ〜図１１Ｅ、図１２Ａ〜図２０Ｂ、図２１Ａ〜図２３Ｇ、及び図２５〜図３３Ｂに記載の条件の１つ以上を任意の組み合わせで使用し得ると考えられる。
【０１２９】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を精製するために使用され得る。本明細書に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーのローディング（例えば、陰イオン交換膜への結合）及び溶出に使用される緩衝液及び条件は、ウイルスの純度及び収率に大きく影響する。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、ウイルスを含有する結合画分を生成するために陰イオン交換膜に結合される。いくつかの実施態様において、溶出液は深層ろ過及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーに供されている。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に（例えば、２倍、３倍、４倍、又は５倍希釈係数を用いて）希釈される。他の実施態様では、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーの前には希釈されない。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陰イオン交換膜に結合する前に、約８．０〜約８．５のｐＨに調整される（例えば、Ｓ１、Ｓ２、又はＳ３などのポリオウイルスを使用する）。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陰イオン交換膜に結合する前にｐＨ約８．０に調整される（例えば、Ｓ２などのポリオウイルスを使用する）。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、陰イオン交換膜に結合する前に（例えば、Ｓ１又はＳ３などのポリオウイルスを使用して）約８．５のｐＨに調整される。孔径０．８μｍの陰イオン交換膜を使用するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑシステム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような、当技術分野で公知のさまざまな装置が陰イオン交換クロマトグラフィー（任意選択的にろ過を含む）に適している。架橋ポリマーコーティング中のペンダント四級アミン官能基を含むがこれらに限定されないさまざまな官能基が陰イオン交換膜に使用される。本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液を陰イオン交換膜に結合させるためにさまざまな緩衝液を使用することができる。例示的な緩衝液は、限定されないが、リン酸緩衝液が挙げられる（追加の緩衝液については後述する）。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて（例えば、ローディング及び／又は溶出において）使用される緩衝液は、ポリソルベート（例えば、０．０５％、０．１％、０．２５％、又は０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０）を含有する。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を含有する溶出液は、約７．５〜約８．５の範囲のｐＨで陰イオン交換膜に結合する。例えば、ｐＨは、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、又は約８．５に調整することができる。特定の実施態様において（例えば、ポリオウイルスＳ１又はＳ３を使用して）、溶出液は、約８．５のｐＨで陰イオン交換膜に結合する。他の実施態様では（例えば、ポリオウイルスＳ２を使用して）、溶出液は約８．０のｐＨで陰イオン交換膜に結合する。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する溶出液は、約３ｍＳ／ｃｍで(at between)陰イオン交換膜に結合する。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を含有する結合画分は、ウイルスを含有する溶出液を生成するために陰イオン交換膜から溶出される。いくつかの実施態様において、本開示の陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、膜に結合する前、クロマトグラフィー中、及び／又は膜から溶出した後のろ過工程を含む。溶出は勾配的でも段階的でもよい。本明細書中に記載されるように、溶出は、移動相のｐＨの変化を用いて、又は移動相のイオン強度の変化を用いて（例えば、塩の添加を通して）行われ得る。塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムを含むがこれらに限定されないさまざまな塩が溶出に使用される。特定の実施態様において、塩はＮａＣｌである。例えば、いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する結合画分は、約０．０５Ｍ〜約０．１０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって陰イオン交換膜から溶出される。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣウイルスを含有する結合画分は、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で、例えば、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０ｍＳ／ｃｍで陽イオン交換膜から溶出される。ｐＨ溶出のために、限定されないが、リン酸塩、Ｎ―メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ―ヒスチジン、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、トリエタノールアミン、トリス、Ｎ―メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパン１，３―ジアミノ、エタノールアミン、及びピペリジンを含むさまざまな緩衝液が用いられる。特定の実施態様において、緩衝液はリン酸又はトリスである。これらの緩衝液のそれぞれを用いた溶出に適したｐＨ範囲は当技術分野において公知であり；一般に、緩衝液のｐＨは、分子（例えば、エンテロウイルスＣウイルス）のｐＩと固定相上の荷電基のｐＫａとの間にある。
【０１３２】
例示的な陰イオン交換結合及び溶出パラメータ及び条件は本明細書に記載されている。上記の陰イオン交換クロマトグラフィーは、実施例８〜１０及び１２及び／又は図９Ａ〜図１１Ｅ、図１２Ａ〜図２０Ｂ、図２１Ａ〜図２３Ｇ、及び図２５〜図３３Ｂに記載の条件の１つ以上を任意の組み合わせで使用し得ると考えられる。
【０１３３】
ウイルス
本開示の特定の態様は、エンテロウイルスＣウイルスの産生に関する。
ヒトのポリオは、ヒトエンテロウイルスＣ（ＨＥＶ−Ｃ）グループの３つの血清型のポリオウイルス（ＰＶ１、ＰＶ２、及びＰＶ３）によって引き起こされる。ヒトエンテロウイルスＣは、エンベロープのない、プラスセンスＲＮＡウイルスのピコルナウイルス科に属し、これにはポリオウイルス及び多数のコクサッキーＡウイルス血清型も含まれる（例えば、ＣＡＶ血清型１、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、及び２４）（Brown, B. et al. (2003) J. Virol. 77:8973-84）。従って、適切なエンテロウイルスＣの例としては、限定されないが、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＶ３、又はそれらの任意の組み合わせ、変異体、若しくは組換え体が挙げられる。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣは、その組換え体及びそのワクチン由来の変異体を含む、３つのＳａｂｉｎ株（例えば、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３）のうちの１つ以上を指すことがある。（例えば、Kew O M, Nottay B K.  ヒトにおける経口ポリオワクチン株の進化は、突然変異及び分子内組換えの両方によって起こる(Evolution of the oral poliovaccine strains in humans occur by both mutation and intramolecular recombination). In：Chanock R, Lerner R, editors. Modern approaches to vaccines. N.Y：Cold Spring Harbor Press; 1984. pp. 357-367を参照のこと）。３つ全てのポリオウイルス血清型を産生する例を本明細書に提供する。特定の実施態様において、エンテロウイルスＣウイルスは、ＬＳｃ、２ａｂ（Ｓ１）Ｐ７１２、Ｃｈ、２ａｂ（Ｓ２）；Ｌｅｏｎ、１２ａ１ｂ（Ｓ３）；及び任意の組み合わせから選択されるポリオウイルス株である。これらのポリオウイルス株は当技術分野において公知である。例えば、Toyoda, H. et al. (1984) J. Mol. Biol. 174:561-85を参照のこと。
【０１３４】
従って、いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、本明細書に開示される任意のワクチン及び／又は免疫原性組成物において使用され得る。例えば、本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、必要とする対象においてポリオを治療又は予防すること、及び／又は必要とする対象においてポリオに対して防御免疫応答などの免疫応答を誘導することに有用な１つ以上の抗原又はウイルス株（例えば、不活性化株又は弱毒化生株）を提供するために使用され得る。
【０１３５】
本開示の抗原は、本開示のエンテロウイルスＣ（本明細書に記載の方法によって産生及び／又は精製されたエンテロウイルスＣ、例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３など）に由来し得る。本開示の抗原は、免疫応答を誘発することができる任意の物質であり得る。適切な抗原の例には、限定されないが、全ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、ポリサッカライド、ポリサッカライドコンジュゲート、ペプチド及びポリサッカライドの非ペプチド模倣物、その他の分子、小分子、脂質、糖脂質、炭水化物が含まれる。
【０１３６】
本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含み得る。適応突然変異は、ウイルスを特定の細胞株における増殖に適応させることによって生じさせることができる。例えば、細胞をウイルスでトランスフェクトし、ウイルスが複製し、その核酸が突然変異するように継代することができる。核酸突然変異は、点突然変異、挿入突然変異、又は欠失突然変異であり得る。核酸変異は、非ヒト細胞におけるウイルスの増殖を促進するウイルスタンパク質内のアミノ酸変化をもたらし得る。適応突然変異は、プラークサイズ、増殖動態、温度感受性、薬剤耐性、病原性、及び細胞培養におけるウイルス収量の変化を含む、ウイルスの表現型の変化を促進し得る。これらの適応突然変異は、細胞株中で培養されたウイルスの速度と収率を増加させることによってワクチン製造において有用であり得る。さらに、適応突然変異は、免疫原性エピトープの構造を変えることによってウイルス抗原の免疫原性を増強し得る。
【０１３７】
従って、特定の実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含み得る。特定の実施態様において、適応変異は、非ヒト細胞に対するウイルス抗原の変異である。いくつかの実施態様において、非ヒト細胞は哺乳動物細胞であり得る。非ヒト哺乳動物細胞の例には、限定されないが、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載されている受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施態様において、非ヒト細胞はサル細胞であり得る。いくつかの実施態様において、サル細胞はＶｅｒｏ細胞株由来である。適切なＶｅｒｏ細胞株の例には、限定されないが、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８７）、又はＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８６）が含まれる。
【０１３８】
ポリオウイルスなどのエンテロウイルスＣは、線状の、プラスセンスの、一本鎖ＲＮＡゲノムを有する（例えば、Brown, B. et al. (2003) J. Virol. 77:8973-84を参照のこと）。これらのウイルスゲノムの各々は、構造的及び非構造的ポリペプチドの両方をコードする。これらのウイルスの各々によってコードされる構造ポリペプチドとしては、限定されないが、一緒にウイルスキャプシドを構成し得るＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ４が挙げられる。これらのウイルスの各々によってコードされる非構造ポリペプチドとしては、限定されないが、例えば、ウイルス複製及び病原性に関与する２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄが挙げられる。
【０１３９】
従って、特定の実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又はそれ以上の非ヒト細胞適応突然変異を、限定されないが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄを含む１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上のウイルス抗原内に含み得る。いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＡは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、又はそれ以上の非ヒト細胞適応突然変異をウイルスの５’又は３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部に含み得る、不活化ウイルス全体を含む。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０以上の弱毒化突然変異を、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上の非コード領域内、及び／又は、限定されないが、５’及び３’非コード領域、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄを含むウイルス抗原の内部に含み得る。例えば、Ｓａｂｉｎポリオウイルス株由来の弱毒化突然変異が当技術分野で公知であり、限定されないが、５’及び３’非コード領域に見いだされる突然変異（例えば、ＩＲＥＳ突然変異）、キャプシドタンパク質などに見いだされる突然変異を含む（例えば、Kawamura, N. et al. (1989) J. Virol. 63:1302-9及びMinor, P.D. (1992) J. Gen. Virol. 73:3065-77を参照のこと）。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、本開示の任意のワクチン及び免疫原性組成物において使用され得る。例えば、本開示のエンテロウイルスＣは、必要とする対象においてポリオを治療又は予防すること、及び／又は必要とする対象においてポリオに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することに有用であり得る。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣは、Ｓａｌｋ型不活化ワクチンにおいて有用な不活化ポリオウイルス又はポリオウイルス血清型の組み合わせであり得る。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣは、Ｓａｂｉｎ経口ポリオワクチンに有用な弱毒化ポリオウイルス又はポリオウイルス血清型の組合せ（それらの組換え体及び誘導体を含む）であり得る（例えば、Kohara, M. et al. (1988) J. Virol. 62:2828-35及びShimizu, H. (2016) Vaccine 34:1975-85を参照）。
抗原の製造
【０１４２】
ポリオを治療もしくは予防するための、及び／又はポリオに対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応を誘導するための、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、並びに／又はサブユニットワクチンのための精製ウイルスタンパク質及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質をはじめとする、ワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のための本開示の抗原は、当分野に公知の任意の適切な方法により製造されてもよく、及び／又は精製されてもよく、もしくはさもなければ単離されてもよい。本開示の抗原の例としては、ポリオを引き起こす少なくとも１つのウイルスから産生された、誘導された、精製された、及び／又はさもなければ単離された、全粒子ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド模倣体及び非ペプチド模倣体、並びに他の分子、小分子、脂質、糖脂質及び炭水化物が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、適切な抗原としては、本開示のエンテロウイルスＣなどのウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４などの構造ポリペプチド、並びに２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄなどの非構造ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本開示の抗原は、化学的又は酵素的に合成されてもよく、組み換え技術により製造されてもよく、天然源から単離されてもよく、又は前述の組み合わせであってもよい。特定の実施態様において、本開示の抗原は、例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３（ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＶ３とも呼ばれる）などのポリオを引き起こす本開示のウイルスの少なくとも１つから産生、精製、単離、及び／又は誘導される。本開示の抗原は、精製されていてもよく、部分的に精製されていてもよく、又は粗抽出物であってもよい。いくつかの実施態様では、本開示の抗原は、上記の「ワクチン及び免疫原性組成物の製造」の項に記載されるように製造された例えば不活化ウイルスなどのウイルスである。
【０１４４】
特定の実施態様において、本開示の１つ以上の抗原は、非ヒト細胞を培養することにより製造されてもよい。本開示の１つ以上の抗原の製造に適した細胞株は、好ましくは哺乳類起源であり、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）又はＭＤＣＫ  ３３０１６、寄託番号はＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９であり、ＷＯ９７／３７００１に記述されている）、ネコ及び齧歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が挙げられ、例えば、成体、新生仔、胎子、及び胚をはじめとする広範な発育段階から得てもよい。特定の実施態様において、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記述され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲＣ．６細胞など）。好ましい実施態様では哺乳類細胞が使用され、以下の非限定的な細胞型のうちの１つ以上から選択されてもよく、及び／又は誘導されてもよい：線維芽細胞（例えば、皮膚、肺）、内皮細胞（大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝臓細胞、角化細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頚、網膜周皮細胞）、メラニン細胞、神経系細胞（例えば、星状膠細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地中での増殖が可能で、ウイルス抗原の製造に有用な動物細胞及び細胞株の製造を記載している。特定の実施態様において、非ヒト細胞は無血清培地中で培養される。
【０１４５】
ポリペプチド抗原は、当分野に公知の標準的なタンパク質精製法を用いて天然源から単離されてもよく、当該方法としては、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む）、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術が挙げられるがこれらに限定されない。多くの実施態様において、抗原は、例えば、約５０％〜約７５％の純度、約７５％〜約８５％の純度、約８５％〜約９０％の純度、約９０％〜約９５％の純度、約９５％〜約９８％の純度、約９８％〜約９９％の純度、又は９９％超の純度の精製抗原である。
【０１４６】
固相ペプチド合成法を用いてもよく、かかる技術は当分野の当業者に公知である。Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994)を参照のこと。一般的に、かかる方法において、ペプチドは、固相結合伸長ペプチド鎖に活性化単量体単位を連続添加することにより製造される。
【０１４７】
ポリペプチドの製造に、確立された組み換えＤＮＡ法を用いてもよく、この場合、例えばポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える発現構築物を適切な宿主細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で単細胞体として増殖される真核宿主細胞であり、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）又は原核細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で増殖する）に導入し、遺伝子改変された宿主細胞を生成し、適切な培養条件下で当該遺伝子改変された宿主細胞からタンパク質を産生させる。
【０１４８】
死滅ウイルス及び弱毒化ウイルスの免疫原性組成物に加え、サブユニット免疫原性組成物、又はポリオウイルスの抗原性構成要素を動物に提示する他のタイプの免疫原性組成物を使用してもよい。抗原性構成要素は、ヒトに注入された際にヒトの免疫反応を刺激し、ヒトがポリオに対する防御的免疫を発現するタンパク質、糖タンパク質、脂質結合したタンパク質もしくは糖タンパク質、改変脂質部分、又は他のウイルス構成要素であってもよい。サブユニット免疫原性組成物に関しては、ウイルスは上述の哺乳類細胞上で培養されてもよい。細胞培養物をホモジナイズし、この細胞培養物ホモジネートを適切なカラム上で免疫原性組成物を単離してもよく、又は適切な孔サイズのフィルターを通して免疫原性組成物を単離してもよく、又はこの細胞培養物ホモジネートを遠心することにより免疫原性組成物を単離してもよい。
【０１４９】
抗原性構成要素がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードする核酸を単離し、当該単離された核酸を含有する免疫原性組成物を作製してもよい。抗原性構成要素をコードする核酸は、真核細胞プロモーターのシグナル配列の下流で、プラスミド上に配置されていてもよい。そのプラスミドは、１つ以上の選択可能なマーカーを含有してもよく、例えばサルモネラ属、シゲラ属、又は他の適切な細菌などの弱毒化原核生物へとトランスフェクトされてもよい。次いで、ヒトが抗原性構成要素に対する防御的免疫反応を起こすことができるよう、この細菌をヒトに投与してもよい。あるいは、抗原性構成要素をコードする核酸は、原核細胞プロモーターの下流に配置されてもよく、１つ以上の選択可能マーカーを有してもよく、及びサルモネラ属、シゲラ属又は他の適切な細菌などの弱毒化された原核生物へとトランスフェクトされてもよい。次いで、対象抗原に対する免疫反応が所望される真核生物対象へと細菌が投与されてもよい。例えば、Ｈｏｎｅらへの米国特許第６，５００，４１９号を参照のこと。
【０１５０】
サブユニット免疫原性組成物に関し、ポリオウイルスのタンパク性抗原性構成要素をコードする核酸を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３２０４７（Ｇａｌｅｎ）及び国際特許出願公開ＷＯ０２／０８３８９０（Ｇａｌｅｎ）に記載されるプラスミドなどのプラスミドへとクローニングしてもよい。次いで、プラスミドを細菌へとトランスフェクトし、その細菌が所望される抗原性タンパク質を産生してもよい。両特許出願に記載されている様々な方法により、所望される抗原性タンパク質を単離及び精製してもよい。
ウイルス不活化
【０１５１】
いくつかの実施態様において、本開示方法により生成及び／又は精製されたエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は不活化されている。哺乳類細胞への感染能力を破壊するためのウイルスの不活化方法又は死滅方法は当分野に公知である。かかる方法としては、化学的手段及び物理的手段の両方が挙げられる。ウイルス不活化の適切な手段としては、洗剤、ホルマリン（本明細書において、「ホルムアルデヒド」とも呼称される）、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、加熱、電磁線照射、Ｘ線照射、γ線照射、紫外線照射（ＵＶ照射）、ＵＶ−Ａ照射、ＵＶ−Ｂ照射、ＵＶ−Ｃ照射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、及びそれらすべての任意の組み合わせから選択される１つ以上の手段の有効量を用いた処置が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
化学的不活化のための剤、及び化学的不活化のための方法は、当分野に公知であり、本明細書に記載されている。いくつかの実施態様において、エンテロウイルスＣは、ＢＰＬ、ホルマリン、又はＢＥＩのうちの１つ以上を用いて化学的に不活化されている。エンテロウイルスＣがＢＰＬを用いて化学的に不活化されている特定の実施態様において、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。いくつかの実施態様では、１つ以上の改変は、改変核酸を含んでもよい。いくつかの実施態様では、改変核酸は、アルキル化核酸である。他の実施態様では、１つ以上の改変は、改変ポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施態様では、改変ポリペプチドは、改変されたシステイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上を含む改変アミノ酸を含有する。エンテロウイルスＣがホルマリンを用いて化学的に不活化されている特定の実施態様において、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。いくつかの実施態様では、１つ以上の改変は、改変ポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施態様では、１つ以上の改変は、架橋ポリペプチドを含んでもよい。エンテロウイルスＣがホルマリンを用いて化学的に不活化されているいくつかの実施態様において、ワクチン又は免疫原性組成物はホルマリンをさらに含む。本開示の特定の実施態様において、エンテロウイルスＣは、ＢＥＩを用いて不活化されていた。エンテロウイルスＣがＢＥＩを用いて不活化されていた特定の実施態様において、ウイルスは１つ以上の改変を含有している。いくつかの実施態様では、１つ以上の改変は、改変核酸を含む。いくつかの実施態様では、改変核酸は、アルキル化核酸である。
【０１５３】
エンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）がＢＥＩ又はＢＰＬを用いて化学的に不活化されているいくつかの実施態様では、反応しなかった残留ＢＥＩ又は残留ＢＰＬはいずれもチオ硫酸ナトリウムを用いて中和されていてもよい（すなわち加水分解されていてもよい）。一般的に、チオ硫酸ナトリウムは過剰に添加される。いくつかの実施態様では、チオ硫酸ナトリウムは、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で添加されてもよい。特定の実施態様において、チオ硫酸ナトリウムは、ＢＥＩが２０に対し、濃チオ硫酸ナトリウムが１の比率で、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭの濃度で添加されてもよい。いくつかの実施態様では、溶液は、たとえばインライン静的ミキサーなどのミキサーを用いて混合され、次いでろ過（例えば、浄化）されてもよい。一般的に、２つの溶液はポンプでミキサーに通すことにより完全に混合し、チオ硫酸ナトリウムによりＢＥＩが中和される。
【０１５４】
本開示の特定の実施態様は、エンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を不活化する方法に関する。いくつかの実施態様において、当該方法は、有効量のＢＥＩを用いてウイルス調製物を処置することを含む。特定の実施態様において、ＢＥＩの有効量を用いた処置は、約０．２５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量でＢＥＩを用いて処置することを含むが、これに限定されない。特定の実施態様において、単離され、処置されるウイルスは、ＰＶ１、ＰＶ２、及びＰＶ３のうちの１つ以上から選択される。この方法の特定の実施態様において、ウイルス調製物は、約２５℃〜約４２℃の範囲の温度でＢＥＩを用いて処置される。この方法の特定の実施態様において、ウイルス調製物は、約１時間〜約１０時間の範囲の期間、ＢＥＩを用いて処置される。特定の実施態様において、当該方法はさらに、チオ硫酸ナトリウムの有効量を用いて、反応しなかったＢＥＩを不活化する（すなわち、加水分解する）ことを含む。いくつかの実施態様では、チオ硫酸ナトリウムの有効量は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルス調製物を処置すること、及び任意で、有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルスを調製するときと同時、又はその後に、有効量のホルマリンを用いてウイルス調製物を処置すること、を含む。あるいは、いくつかの実施態様では、当該方法は、有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルス調製物を第一の期間、処置すること、及び有効量のＢＰＬを用いてウイルス調製物を第二の期間、処置して、ウイルス調製物を完全に不活化すること、を含む。いくつかの実施態様において、第一の期間及び／又は第二の期間は、約１２時間〜約３６時間の範囲である。ある実施態様においては、第一の期間及び／又は第二の期間は、約２４時間である。ある実施態様においては、有効量のＢＰＬを用いた処置は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、又は約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲の量で、ＢＰＬを用いて処置することを含むが、これに限定されない。特定の実施態様において、有効量のＢＰＬを用いて処置は、０．０５％ｖ／ｖ、０．０６％ｖ／ｖ、０．０７％ｖ／ｖ、０．０８％ｖ／ｖ、０．０９％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ、０．２％ｖ／ｖ、０．３％ｖ／ｖ、０．４％ｖ／ｖ、０．５％ｖ／ｖ、０．６％ｖ／ｖ、０．７％ｖ／ｖ、０．８％ｖ／ｖ、０．９％ｖ／ｖ、又は１％ｖ／ｖのＢＰＬを用いて処置することを含むが、これに限定されない。この方法の特定の実施態様において、ウイルス調製物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でＢＥＩを用いて処置される。特定の実施態様において、この方法は、ＢＰＬを加水分解するのに十分な期間、３７℃の温度でウイルス調製物を加熱することを含む。特定の実施態様において、当該期間は、約１時間〜約６時間の範囲である。あるいは、いくつかの実施態様では、当該方法はさらに、チオ硫酸ナトリウムの有効量を用いて反応していないＢＰＬを不活化（すなわち加水分解）することを含む。いくつかの実施態様では、チオ硫酸ナトリウムの有効量は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である。
【０１５６】
いくつかの実施態様において、当該方法は、有効量のホルマリンを用いてウイルス調製物を処置すること、及びホルマリンからウイルス調製物を精製すること、を含む。特定の実施態様において、ホルマリンの有効量を用いた処置は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、又は約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲の量でホルマリンを用いて処置することを含むが、これに限定されない。特定の実施態様において、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の量でホルマリンから高度に精製される。ホルマリンを使用してポリオウイルスを不活性化する方法は当技術分野において周知である；例えば、Wilton, T. et al. (2014) J. Virol. 88:11955-64を参照。
【０１５７】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物の製剤化
本開示のさらなる態様は、本開示方法により生成されたウイルス（例えば本開示のエンテロウイルスＣ、例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）を含有する組成物、免疫原性組成物、及び／又はワクチンに関する。かかる組成物、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象におけるポリオの治療又は予防に有用であり得、及び／又はその必要のある対象におけるポリオに対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であり得る。
【０１５８】
典型的には、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、溶液又は懸濁液の何れかの注射物質として調製される。注射の前に液体となる溶液又は懸濁液に適した固形形態が調製されてもよい。かかる調製物はまた、乳化されてもよく、又は乾燥粉末として製造されてもよい。活性な免疫原性成分はしばしば、薬学的に受容可能であり、当該活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノール又はその同等物、及びそれらの組み合わせである。さらに、もし所望の場合には、ワクチン又は免疫原性組成物は、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又は当該ワクチンもしくは免疫原性組成物の効果を増強させるアジュバントなどの補助的物質を含有してもよい。
【０１５９】
ワクチン又は免疫原性組成物は、非経口的に注射によって、例えば皮下、経皮、皮内、真皮下、又は筋肉内に簡便に投与されてもよい。他の投与様式に適したさらなる剤型としては、座薬が挙げられ、及び一部の場合においては、口腔、経口、鼻内、頬側、舌下、腹腔、膣内及び頭蓋内の剤型が挙げられる。経口及び注射ポリオワクチンは当技術分野において周知であり、５０年以上にわたって使用されてきた。座薬に関しては、従来型の結合剤及び担体として、例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドなどが挙げられ、かかる座薬は、０．５％〜１０％、又はさらには１〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成される。特定の実施態様において、例えば脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に溶け、本明細書に記載される手足口病ワクチン又は免疫原性組成物抗原が例えば攪拌などにより均一に分散される。溶解した均一な混合物は、次いで、利便なサイズの型に注がれ、冷却され、凝固する。
【０１６０】
鼻内送達に適した剤型としては、液体（例えば、エアロゾル又は点鼻薬としての投与のための水溶液）及び乾燥粉末（例えば鼻腔内での急速な沈着のための）が挙げられる。製剤は、通常に用いられる賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、及びキトサンなどを含有する。例えばキトサンなどの粘膜付着剤は、鼻内投与された製剤の粘膜絨毛クリアランスを遅延させる液体又は粉末製剤の何れかで使用されてもよい。例えばマンニトール及びスクロースなどの糖類は、液体製剤中の安定剤として使用することができ、乾燥粉末製剤中では安定剤、膨化剤、粉体流剤、及びサイズ剤として使用することができる。さらに、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）又はその誘導体、又はＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、免疫賦活剤として液体製剤及び乾燥粉末製剤の両方において使用することができる。
【０１６１】
経口送達に適した剤型としては、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、トローチなどが挙げられる。経口送達に適した剤型としては、錠剤、トローチ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが挙げられる。製剤は、このように通常に使用される賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有する。他の手足口病ワクチン及び免疫原性組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、徐放製剤又は粉末の形態をとってもよく、及び１０〜９５％の活性成分、又は２５〜７０％の活性成分を含有してもよい。経口製剤に関し、コレラ毒素は興味深い製剤パートナーである（また、可能性のある結合パートナーである）。
【０１６２】
膣投与用に製剤化された場合、ポリオワクチン及び免疫原性組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体、又はスプレーの形態であってもよい。前述の剤型のいずれも、ポリオワクチン及び免疫原性組成物抗原に加え、例えば適切であると当分野において知られている例えば担体などの剤を含有してもよい。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、本開示のポリオワクチン及び免疫原性組成物は、全身送達用又は局所送達用に製剤化されていてもよい。かかる製剤は、当分野に公知である。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、液体、及び栄養補助物質、電解質補助物質（例えば、リンゲルのデキストロースに基づいたもの）などが挙げられる。全身及び局所の投与経路としては、例えば皮内、局所塗布、静脈内、筋肉内などが挙げられる。
【０１６４】
本開示のワクチン及び免疫原性組成物は、投与製剤に適合した様式で、治療有効であり、及び免疫原性のある量で、投与されてもよい。投与される量は、例えば、免疫反応を開始させる個々の免疫システムの能力、及び所望される防御の程度などをはじめとする、治療される対象に依存している。適切な用量範囲は、ワクチン１回当たり数百マイクログラムの活性成分の桁の用量であり、例示的な範囲は約０．１μｇ〜１０μｇ（より高い量の１〜１０ｍｇの範囲も予期されるが）であり、例えば、約０．１μｇ〜５μｇの範囲、又は０．６μｇ〜３μｇの範囲、又は約１μｇ〜３μｇの範囲、又は０．１μｇ〜１μｇの範囲である。特定の実施態様において、用量は、１回投与量当たり約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、又は約３μｇであってもよい。特定の実施態様において、本開示のワクチン及び免疫原性組成物は、１回投与量当たり、１μｇの量で投与されてもよい。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、投与量は、ポリオウイルスワクチンのためのＤ抗原単位などの複数の単位に基づく。いくつかの実施態様において、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、ポリオウイルス株Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の投与量を含む。例えば、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の適切な投与量は、１．５：５０：５０、０．７５：２５：２５、又は３：１００：１００の比のＳ１：Ｓ２：Ｓ３（例えば、各株のＤＵに基づく比率）を含み得るが、これらに限定されない。
【０１６６】
初回投与及びブースター注射のための適切なレジメンもまた可変であるが、初回投与とそれに続く接種又は他の投与が典型的である。投与は、成人、乳児、及び腎機能障害のような複雑な徴候を伴う者で変わる可能性がある。経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）及び不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）を投与するのに適した投与レジメンは当技術分野において公知である。例えば、成人及び小児において、Ｏｒｉｍｕｎｅポリオワクチンは、０．５ｍＬの単回経口用量で投与され得、いくつかの実施態様では、その後８週間後に２回目の用量、及び２回目の用量から８〜１２ヶ月後に３回目の用量が投与され得る。乳児では、最初の０．５ｍＬ経口用量が６−１２週齢で投与され得、続いて最初の用量の８週間後に２回目の０．５ｍＬ経口用量、６〜１８ヶ月齢の間に３回目の０．５ｍＬ経口用量が投与され得る。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、ＯＰＶワクチン接種レジメンには、３回のＯＰＶ用量と１回のＩＰＶ用量が含まれ、投与は６週齢から開始され、ＯＰＶ投与の間隔は最短で４週間である。単回ＩＰＶ用量が使用される場合、好ましくは１４週間から与えられ、ＯＰＶ用量と共投与され得る。ＩＰＶ投与単独の場合、２ヶ月齢から始めて最初の一連の３回のＩＰＶ用量を投与することができ、ブースター用量を少なくとも６ヶ月の間隔の後に投与することができる。
【０１６７】
いくつかの実施態様において、本開示のエンテロウイルスＣ（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）は、混合ワクチンにおける使用のために製造され得る。例えば、Ｐｅｄｉａｒｉｘ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、不活化ポリオ、ＤＴａＰ、及びＢ型肝炎の混合ワクチンであり；Ｋｉｎｒｉｘ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、不活化ポリオとＤＴａＰの混合ワクチンであり；Ｐｅｎｔａｃｅｌ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）は、不活化ポリオ、ＤＴａＰ、及びインフルエンザの混合ワクチンであり；Ｑｕａｄｒａｃｅｌ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）は、不活化ポリオとＤＴａＰの混合ワクチンである。
【０１６８】
適用方法は広く変化し得る。ワクチン又は免疫原性組成物の任意の簡便な投与方法が適用可能である。これらには、生理学的に受容可能な固形の基剤、又は生理学的に受容可能な分散剤での経口適用、注射などによる非経口適用が挙げられる。ワクチン又は免疫原性組成物の用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種される人物の年齢、及び抗原の剤型に従い変化する。
【０１６９】
粘膜付着を改善させる送達剤を用いて、特に鼻内、経口、肺をベースとした送達剤型に対する送達、及び免疫原性を改善してもよい。そのような化合物の１つであるキトサンは、キチンのＮ脱アセチル型であり、多くの医薬製剤に使用されている。キトサンは、粘膜絨毛クリアランスを遅延させるその能力から、鼻内ワクチン送達の魅力的な粘膜付着剤であり、粘膜の抗原取込と処理のための時間をより長期化させる。さらに、キトサンは、抗原のＮＡＬＴへの経上皮輸送を増強させ得るタイトジャンクションを一過性に開かせることができる。最近のヒト臨床試験において、キトサンのみを用いて、追加のアジュバントは何も用いていない鼻内投与された三価の不活化インフルエンザワクチンにより、抗体陽転が生じ、ＨＩ価は、鼻内接種後に得られたＨＩ価よりもわずかに低かった。
【０１７０】
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、薬学的に受容可能である。それらは抗原とアジュバントに追加して構成要素を含有してもよく、例えばそれらは一般的に１つ以上の医薬担体（複数含む）及び／又は賦形剤（複数含む）を含有する。かかる構成要素に関する詳細な検討は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472で入手可能である。
【０１７１】
張性を制御するために、たとえばナトリウム塩などの生理学的な塩を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１７２】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含有してもよい。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）、又はクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【０１７３】
ワクチン又は免疫原性組成物のｐＨは、多くの場合、５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば、６．５〜７．５、又は７．０〜７．８である。本開示の製造方法は、従って、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含む。
【０１７４】
ワクチン又は免疫原性組成物は、好ましくは滅菌されている。好ましくは非発熱性であり、例えば、１回投与量当たり１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的測定）未満、及び好ましくは１回投与量当たり０．１ＥＵ未満を含有する。好ましくはグルテンフリーである。
【０１７５】
特定の実施態様において、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、有効な濃度で洗剤を含有してもよい。いくつかの実施態様では、洗剤の有効量は、約０．００００５％  ｖ／ｖ〜約５％  ｖ／ｖ、又は約０．０００１％  ｖ／ｖ〜約１％  ｖ／ｖを含み得るが、これに限定されない。特定の実施態様において、洗剤の有効量は、約０．００１％  ｖ／ｖ、約０．００２％  ｖ／ｖ、約０．００３％  ｖ／ｖ、約０．００４％  ｖ／ｖ、約０．００５％  ｖ／ｖ、約０．００６％  ｖ／ｖ、約０．００７％  ｖ／ｖ、約０．００８％  ｖ／ｖ、約０．００９％  ｖ／ｖ、又は約０．０１％  ｖ／ｖである。学説には拘らないが、洗剤は、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の溶解を補助し、ワクチン及び／又は免疫原性組成物の凝集予防を補助する。
【０１７６】
特にスプリットワクチン又は表面抗原ワクチンに対して適切な洗剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（Ｔｗｅｅｎとして知られている）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ１００）又はｔオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、及びデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。潜在は、微量のみで存在してもよい。微量の他の残りの構成要素は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。いくつかの実施態様では、洗剤はポリソルベートを含有する。いくつかの実施態様では、洗剤の有効濃度は、約０．００００５％  ｖ／ｖ〜約５％  ｖ／ｖの範囲を含む。
【０１７７】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは凍結させてはならない。それらは理想的には直射日光を避けなければならない。抗原及び乳液は、典型的には混合されているが、はじめはその場で混合するための別々の構成要素のキットの形態であってもよい。ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、対象に投与されるとき、多くの場合は水性形態である。
アジュバント
【０１７８】
本開示の組成物、免疫原性組成物、及び／又はワクチンは、１つ以上のアジュバントと組み合わせて使用されてもよい。本開示のかかるアジュバント化ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象におけるポリオの治療又は予防に有用であってもよく、又はその必要のある対象においてポリオに対する防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。アルミニウムアジュバント、リン酸カルシウム、油性エマルジョン、キトサン、ビタミンＤ、オリゴヌクレオチド、ステアリル又はオクタデシルチロシン、及びリポソームを含む数種類のアジュバントが使用されており、それらの有効性はＩＰＶ及びＯＰＶにおいて特徴付けられている（例えば、Hawken J. and Troy S. B. (2012) Vaccine30:6971-9を参照のこと）。
【０１７９】
ワクチンに対しアジュバント効果を得るためのさまざまな方法が公知であり、本明細書に開示されるポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物と併せて使用されてもよい。一般的な原理と方法は、"The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, and also in "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9に詳述されている。
【０１８０】
いくつかの実施態様では、ポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物は、抗原とアジュバントを含有する。抗原は、少なくとも１つのアジュバントと、約１０：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの重量を基にした比率で混合されていてもよく、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、又は約１０９：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの比率で混合されていてもよい。当業者であれば、アジュバントに関する情報と、最適な比率を決定するための日常的な実験を介して適切な比率を容易に決定することができる。
【０１８１】
例示的なアジュバントとしては、限定されないが、アルミニウム塩、トールライク受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。いくつかの実施態様では、アジュバントはＭＬＡ又はその誘導体である。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、アジュバントはアルミニウム塩である。いくつかの実施態様では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５のうち少なくとも１つを含有する。いくつかの実施態様では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のエンテロウイルスＣウイルス（例えば、ポリオウイルスＳ１、Ｓ２、又はＳ３）ワクチン及び／又は免疫原性組成物の抗原の吸着を増強することが判明している。従って、いくつかの実施態様では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の抗原がアルミニウム塩アジュバントに吸着している。
【０１８３】
モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）はサルモネラ由来のリピドＡの非毒性誘導体であり、ワクチンアジュバントとして開発された強力なＴＬＲ−４作動薬である（Evans et al. 2003）。前臨床マウス実験において、鼻内ＭＬＡは、分泌反応並びに全身反応、液性反応を増強することが示されている（Baldridge et al. 2000；Yang et al. 2002）。また、１２０，０００人を超える患者の臨床試験においても、ワクチンアジュバントとしての安全性及び有効性が証明されている（Baldrick et al., 2002；2004）。ＭＬＡは、ＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激し、それにより、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方、ウイルス並びに寄生虫をはじめとする広範な感染性病原体に対する非特異的免疫反応を惹起することができる（Baldrick et al. 2004；Persing et al. 2002）。鼻内製剤中のＭＬＡの含有は、自然免疫の急速な誘導をもたらし、ウイルスチャレンジから非特異的免疫反応を惹起させ、一方で、ワクチンの抗原性構成要素により生じする特異的反応を増強させるはずである。
【０１８４】
従って、１つの実施態様において、本開示は、獲得免疫及び自然免疫の増強剤としてのモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、又はそれらの誘導体を含有する組成物を提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＬＡは、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５又は６個のアシル化鎖の混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、欧州特許０  ６８９  ４５４  Ｂ１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡ）に開示されている。他の実施態様では、本開示は、例えばＢｉｏＭｉｒａ’ｓ  ＰＥＴ  Ｌｉｐｉｄ  Ａなどの合成リピドＡ、リピドＡ模倣体もしくはアナログ、又はＴＬＲ−４作動薬のように機能するよう設計された合成誘導体を含有する組成物を提供する。
【０１８５】
さらなる例示的なアジュバントとしては、ポリペプチド構成要素との共発現により、又はキメラポリペプチドを産生するポリペプチド構成要素との融合により、本明細書に開示される抗原に容易に付加され得るポリペプチドアジュバントが挙げられるが、これに限定されない。細菌フラジェリンは、鞭毛の主要なタンパク構成物質であり、トールライク受容体ＴＬＲ５により自然免疫系に認識されることを理由に、アジュバントタンパク質として注目が高まっているアジュバントである（６５）。ＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナル伝達は、ＤＣの成熟と移動を誘導し、並びにマクロファージ、好中球及び腸上皮細胞を活性化し、その結果、炎症促進性メディエーターが産生されることによって、自然免疫と獲得免疫の両方に効果を有している（６６−７２）。
【０１８６】
ＴＬＲ５は、このタンパク質に固有であり、鞭毛の機能に必要なフラジェリン単量体内の保存構造を認識しており、その変異体は免疫的圧力に対する反応ができない（７３）。受容体は、１００ｆＭの濃度に感受性であるが、そのままのフィラメントは認識しない。結合及び刺激には鞭毛の単量体への分解が必要である。
【０１８７】
非経口又は鼻内の何れかで投与された異種抗原に対する防御的反応の誘導に関し、アジュバントとしてフラジェリンは強力な活性を有しており、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果も報告されている。フラジェリンが用いられた場合、例えばインフルエンザなどの呼吸器系のウイルスに適したＴｈ２偏向が観察されているが、マウス又はサルにおいてＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。さらに、サルにおいて、鼻内又は全身への投与後の局所炎症反応又は全身炎症反応は報告されていない。ＭｙＤ８８依存性の様式のＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナル、及びＴＬＲを介した他のすべてのＭｙＤ８８依存性のシグナルは、Ｔｈ１偏向を生じさせることが示されていることから、フラジェリン使用後に惹起されるＴｈ２を特徴とする反応はいささか驚きである。重要なことは、従前から存在したフラジェリンに対する抗体は、アジュバント効果に関しては適切な効果を有しておらず、このことから、本発明は多様な使用ができるアジュバントとして魅力的である。
【０１８８】
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）、腫瘍壊死因子、インターロイキン２、７、１２、インターフェロン及び他の成長因子のようなものをアジュバントとして用いてもよく、それらはポリペプチド構成要素と混合することにより、又は融合させることにより容易にポリオワクチン又は免疫原性組成物中に含ませることができる。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、本明細書に開示されるポリオワクチン及び免疫原性組成物は、例えば５’−ＴＣＧ−３’配列を含有する核酸ＴＬＲ９リガンド、イミダゾキノリンＴＬＲ７リガンド、置換グアニンＴＬＲ７／８リガンド、例えばロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、及びレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンド、などのトールライク受容体を介して作用する他のアジュバントを含有してもよい。
【０１９０】
あるアジュバントは、例えば樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取り込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント、例えば毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント、油性製剤、ポリマー、ミセル形成アジュバント、サポニン、免疫刺激複合体マトリクス（ＩＳＣＯＭマトリクス：immunostimulating complex matrix）、粒子、ＤＤＡ、アルミニウムアジュバント、ＤＮＡアジュバント、ＭＬＡ、及びカプセル化アジュバントからなる群から選択される。
【０１９１】
アジュバントのさらなる例としては、例えば水酸化物又はリン酸塩などのアルミニウム塩（ミョウバン）などの剤が挙げられ、それらは通常、緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１％溶液として使用され（例えば、Nicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493を参照のこと）、０．２５％溶液として使用される糖類の合成ポリマー（例えば、カーボポール（登録商標））と混合され、７０℃〜１０１℃の範囲の温度でそれぞれ３０秒〜２分の間の加熱処置によりワクチン中のタンパク質を凝集させ、また、架橋剤による凝集も可能である。ペプシン処置抗体（Ｆａｂ断片）を用いた再活性化によるアルブミンへの凝集、例えばクリプトスポリジウム・パルバムなどの細菌細胞、又はエンドトキシン、又はグラム陰性細菌のリポ多糖成分との混合、たとえばマンニド一モノオレイン酸塩（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に受容可能な油性ビヒクル中のエマルション、又はブロック代替品（ｂｌｏｃｋ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）として用いられるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液とのエマルションを用いてもよい。例えば、スクアレン及びＩＦＡなどの油との混合を用いてもよい。
【０１９２】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は興味深いアジュバント候補であるが、フロイントの完全及び不完全アジュバント、並びに例えばＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１などのキラヤ属サポニンも興味深い。さらなる可能性としては、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、及びスレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）などのリポ多糖体のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体が挙げられる。Ｔｈ１型反応を優先的に生じさせるために、例えば３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせをはじめとするリポ多糖をベースとしたアジュバントを使用してもよい。
【０１９３】
リポソーム製剤もまた、アジュバント効果をもたらすことが知られており、そのため、リポソームアジュバントを手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物と併せて用いてもよい。
【０１９４】
免疫刺激複合体マトリクス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリクス）アジュバントを、手足口病抗原及び免疫原性組成物と共に用いてもよく、特に、このタイプのアジュバントはＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御させることができることが示されている。ＩＳＣＯＭマトリクスは、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の（任意選択で分画化された）サポニン（トリペルテノイド）、コレステロール、及びリン脂質からなる。例えばポリオワクチン又は免疫原性組成物抗原などの免疫原性タンパク質と混合し、得られた微粒子製剤は、サポニンが６０〜７０％  ｗ／ｗを構成し、コレステロール及びリン脂質が１０〜１５％  ｗ／ｗを構成し、及びタンパク質が１０〜１５％  ｗ／ｗを構成し得るＩＳＣＯＭ粒子として知られる製剤である。組成及び免疫刺激複合体の使用に関する詳細は、例えばアジュバントを扱っている上述のテキスト中に見いだされ、また、Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475、並びにBarr I G and Mitchell G F, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25は、完全免疫刺激複合体の調製に関する有用な解説を提供している。
【０１９５】
ｉｓｃｏｍの形態であるか否かを問わず、サポニンは本明細書に開示される手足口病ワクチン抗原及び免疫原性組成物とのアジュバントの組み合わせに用いられてもよく、米国特許第５，０５７，５４０号及び”Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55、及びＥＰ  ０  ３６２  ２７  Ｂ１に記載されるＱｕｉｌＡと称されるシャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から誘導されるサポニン及びその画分を含み得る。例示的なＱｕｉｌＡ画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、及びＱＳ１７である。
【０１９６】
β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）は、手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物のアジュバント組成物における使用のための他の溶血性サポニンである。エスシンは、セイヨウトチノキ（ｈｏｒｓｅ  ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｔｒｅｅ）、Ｌａｔ：Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍの種子中に生じるサポニンの混合物として、メルクインデックス（第１２版：エントリー３７３７）に記述されている。その単離は、クロマトグラフィー及び精製（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)）、及びイオン交換樹脂（Erbring et al., 米国特許第３，２３８，１９０号）により行うと記載されている。エスシンの画分は精製され、生物的に活性があることが示されている（Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8):1454-1464)）。β−エスシンは、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）とも知られている。
【０１９７】
手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のための他の溶血性サポニンはジギトニンである。ジギトニンはメルクインデックス（第１２版：エントリー３２０４）にサポニンとして記載されており、宿根草（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の種子から誘導され、Gisvold et al., J.Am.Pharm.Assoc., 1934, 23, 664、及びRuhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1955, 301, 621に記載される手順に従い精製される。その使用は、コレステロール定量のための臨床試薬であるとして記載されている。
【０１９８】
アジュバント効果が得られる他の興味深い可能性は、Gosselin et al., 1992に記載される技術を用いることである。簡潔に述べると、例えば本開示のポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物中の抗原などの関連抗原の提示は、単球／マクロファージのＦＣ受容体に対する抗体にこの抗原を結合させることにより増強させることができる。特に、抗原と抗ＦＣＲＩの間の結合は、ワクチンを目的とした免疫原性を増強させることが示されている。抗体は、生成された後に、又はポリオワクチン及び免疫原性組成物の抗原のポリペプチド成分の何れか１つへの融合物として発現させることを含む生成物の一部として、手足口病ワクチン又は免疫原性組成物に結合されてもよい。
【０１９９】
他の可能性は、標的化物質及び免疫調節物質（すなわちサイトカイン）の使用を含む。さらに、例えばポリＩ：Ｃなどのサイトカインの合成誘導物質を用いてもよい。
【０２００】
適切なマイコバクテリア派生物は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、並びに例えばＴＤＭ及びＴＤＥなどのトレハロースのジエステルからなる群から選択されてもよい。
【０２０１】
適切な免疫標的化アジュバントの例としては、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体、又は特にそれらの結合断片（上述を参照）、マンノース、Ｆａｂ断片、並びにＣＴＬＡ−４が挙げられる。
【０２０２】
適切なポリマーアジュバントの例としては、例えばデキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、及びマンノースなどの炭水化物、プラスチックポリマー、及び例えばラテックスビーズなどのラテックスが挙げられる。
【０２０３】
免疫反応を調節する他のさらなる興味深い方法は、免疫原を（任意選択でアジュバント並びに薬学的に受容可能な担体及びビヒクルとともに）、「バーチャルリンパ節（ＶＬＮ：ｖｉｒｔｕａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）」（ImmunoTherapy,Inc.,360LexingtonAvenue,NewYork,N.Y.10017-6501により開発され、所有される医療デバイス）に含ませることである。ＶＬＮ（薄い管状のデバイス）はリンパ節の構造及び機能を模倣している。皮膚の下にＶＬＮを挿入することで無菌の炎症部位が創出され、サイトカイン及びケモカインが急増する。Ｔ細胞及びＢ細胞並びにＡＰＣがこの危険なシグナルに急速に反応し、炎症部位に誘導され、ＶＬＮの多孔質マトリクスの内部に蓄積される。ＶＬＮを使用した場合、抗原に対する免疫反応を開始させるために必要とされる抗原の必要投与量は少ないことが示されており、及びＶＬＮを用いたワクチン化により与えられる免疫防御は、アジュバントとしてＲｉｂｉを使用した従来的なワクチン化を凌いだことが示されている。この技術は、Gelber C et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif."に簡潔に記載されている。
【０２０４】
ポリオワクチン及び免疫原性組成物の抗原と併せて、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いてもよく、及びオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ以上、又はさらには少なくとも６つ以上のヌクレオチドにより区別される２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有してもよい。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）は、Ｔｈ１反応を優先的に誘導する。かかるオリゴヌクレオチドは公知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、並びに米国特許第６，００８，２００号及び第５，８５６，４６２号に記載されている。  
【０２０５】
かかるオリゴヌクレオチドアジュバントは、デオキシオリゴヌクレオチドであってもよい。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド主鎖は、ホスホロジチオアート、又はホスホロチオアートの結合であるが、ホスホジエステル、及び例えば混合主鎖結合を有するオリゴヌクレオチドを含むＰＮＡなどの他のヌクレオチド主鎖を用いてもよい。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオアートの作製方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号、及びＷ０９５／２６２０４に記載されている。
【０２０６】
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有するものである。この配列は、ホスホロチオアート改変ヌクレオチド主鎖を含有してもよい。
（配列番号１）オリゴ１：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ  （ＣｐＧ  １８２６）、
（配列番号２）オリゴ２：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  （ＣｐＧ  １７５８）、
（配列番号３）オリゴ３：ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ、
（配列番号４）オリゴ４：ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  （ＣｐＧ  ２００６）、及び
（配列番号５）オリゴ５：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ  （ＣｐＧ  １６６８）
【０２０７】
別のＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、配列に些末な欠失又は付加を伴う上述の配列が挙げられる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当分野に公知の任意の方法により合成されてもよい（例えば、ＥＰ４６８５２０）。例えば、かかるオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を利用して合成されてもよい。かかるオリゴヌクレオチドアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであってもよい。他のアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に公開されている。
【０２０８】
多くの単層又は多層のエマルション系が記載されている。当業者であれば、このエマルションが抗原構造を破壊しないように、かかるエマルション系をポリオワクチン及び免疫原性組成物の抗原との使用に容易に適合させることができる。水中油型エマルションアジュバントはそもそもアジュバント組成物として有用であることが提唱されており（ＥＰＯ  ３９９  ８４３Ｂ）、水中油型エマルションと他の活性剤との組み合わせもワクチンのアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９８／５６４１４、ＷＯ９９／１２５６５、ＷＯ９９／１１２４１）。例えば油中水型エマルション（米国特許第５，４２２，１０９号、ＥＰ  ０  ４８０  ９８２  Ｂ２）及び水中油中水型エマルション（米国特許第５，４２４，０６７号、ＥＰ  ０  ４８０  ９８１  Ｂ）などの他の油性エマルションアジュバントが記載されている。
【０２０９】
本明細書に記載される手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成との使用のための油性エマルションアジュバントは、天然であっても又は合成であってもよく、及び鉱物又は有機であってもよい。鉱物油及び有機油の例は、当分野の当業者には容易に明白であろう。
【０２１０】
任意の水中油型組成物をヒト投与に適合させるために、エマルション系の油相に代謝可能な油を含有させてもよい。代謝可能な油という用語の意味は、当分野に公知である。代謝可能とは、「代謝により転換されることができる」と定義することができる（Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)）。油は任意の植物油、魚油、動物油、又は合成油であってもよく、それらはレシピエントに対して非毒性であり、代謝により転換されることができるものである。堅果（例えば、ピーナッツ油）、種子、及び穀物が植物油の一般的な源である。合成油を用いてもよく、合成油は例えばＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油を含有してもよい。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）は、サメ肝臓油中に大量に存在するが、オリーブオイル、コムギ胚種油、ぬか油、及び酵母中には少量で存在する不飽和油であり、手足口病ワクチン及び免疫原性組成物の抗原と共に用いられてもよい。スクアレンはコレステロールの生合成中の中間体であるという事実により代謝可能な油である（メルクインデックス、第１０版、エントリー番号８６１９）。
【０２１１】
例示的な油性エマルションは、水中油型エマルションであり、特に水中スクアレンエマルションである。
【０２１２】
さらに、ポリオワクチン及び免疫原性組成物の抗原との使用のための油性エマルションアジュバントは、例えば油性α−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ  ０  ３８２  ２７１  Ｂ１）などの抗酸化剤を含有してもよい。
【０２１３】
ＷＯ９５／１７２１０及びＷＯ９９／１１２４１は、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を基にし、任意選択で免疫刺激物質ＱＳ２１及び／又は３Ｄ−ＭＬＡを用いて製剤化したエマルションアジュバントを公開している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相にステロールを添付した、これらスクアレンエマルションに対する改善を記載している。さらに例えばトリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを油相に添加し、エマルションを安定化させてもよい（ＷＯ９８／５６４１４）。
【０２１４】
この安定な水中油型エマルション内に存在する油滴のサイズは、１ミクロン未満であってもよく、光子相関法（ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）による測定で、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲であってもよく、実質的に約３０〜５００ｎｍの直径であってもよく、又は実質的に１５０〜５００ｎｍの直径であってもよく、及び特に約１５０ｎｍの直径であってもよい。この点で、数により８０％の油滴は、これら範囲内にあってもよく、数により９０％超又は９５％超の油滴は、既定のサイズ範囲内である。油性エマルション中に存在する成分の量は、例えばスクアレンなど、慣例的に２〜１０％の油の範囲内であり、存在する場合にはアルファトコフェロールは２〜１０％の範囲であり、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤は、０．３〜３％の範囲である。油：アルファトコフェロールの比率は、等しいか、１未満であり、これにより安定なエマルションが提供される。ＳＰＡＮ８５（商標）もまた、約１％のレベルで存在してもよい。一部の例では、本明細書に開示されるポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物は安定剤をさらに含有することが有益である場合がある。
【０２１５】
水中油型エマルションの作製方法は当分野の当業者に公知である。一般的に、当該方法は、油相と、例えばＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤を混合する工程、次いで、ホモジナイザーを用いてホモジナイズする工程を含み、少量の液体をホモジナイズするには、この混合物を注射針に２回通すことを含む方法が適していることは当業者には明らかである。同様に、当業者であれば、マイクロフルダイザーにおける乳化プロセス（Ｍ１１０Ｓ微小流体装置、最大５０パス、６バールの最大入力圧力で２分間（出力圧力は約８５０バール））を適合させ、より小量、又はより多量のエマルションを製造することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物を得るまで、得られたエマルションを測定することを含む、日常的な実験により行うことができる。
【０２１６】
あるいは、ポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物は、キトサン（上述）から構成されるワクチンビヒクルと混合されてもよく、又は他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチド、及びポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基にしたポリマーマトリクス、多糖又は化学的に改変された多糖から構成される粒子、リポソーム及び脂質を基にした粒子、グリセロールモノエステルから構成される粒子などと混合されてもよい。例えばリポソーム又はＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成させるために、コレステロールの存在下でサポニンもまた製剤化されてもよい。さらに、サポニンは、非粒子溶液もしくは懸濁液中、又は寡層薄膜（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒状構造中の何れかにおいて、例えばポリオキシエチレンエーテル又はエステルと共に製剤化されてもよい。
【０２１７】
本明細書に記載されるポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のためのさらなる実例となるアジュバントとしては、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、カフォルニア州、米国）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ、例えば、Granoff et al. (1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715を参照のこと。）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えばＳＢ−ＡＳ２（ＭＬＡ及びＱＳ２１を含有する水中油型エマルション）、ＳＢＡＳ−４（ミョウバン及びＭＬＡを含有するアジュバント系）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギーから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、及びＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、及び例えば係属中の米国特許出願０８／８５３，８２６及び０９／０７４，７２０に記載されているものなどの他のアミノアルキルグルコサミド４−リン酸塩（ＡＧＰ）が挙げられる。
【０２１８】
他のアジュバントの例としては、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ジョージア州）、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｇａｉｂｅｒｇ、ドイツ）、ニトロセルロース（Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557）、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルションを基にした、鉱物油、非鉱物油を含む製剤、油中水型エマルション又は水中油型エマルション、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など。Ｓｅｐｐｉｃ、パリ、フランス）、及びＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＯＭ−１７４（リピドＡに関連したグルコサミン二糖）、リーシュマニア伸長因子、例えばＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、及びＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、O'Hagan et al. (2001) Biomol Eng. 18(3):69-85；及び "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols" D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Pressを参照のこと。
【０２１９】
他の例示的なアジュバントとしては、以下の一般式のアジュバント分子が挙げられる：
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ，  （Ｉ）
式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合又は−−Ｃ（Ｏ）−−、であり、Ｒは、Ｃ１−５０アルキル又はフェニルＣ１−５０アルキルである。
【０２２０】
１つの実施態様は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含有するワクチン製剤からなり、式中、ｎは１〜５０であり、４〜２４、又は９であり、Ｒ構成要素は、Ｃ１−５０、Ｃ４−Ｃ２０アルキル、又はＣ１２アルキルであり、Ａは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、０．１〜１０％の範囲、又は０．１〜１％の範囲でなければならない。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。例えばポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、メルクインデックス（第１２版、エントリー７７１７）に記載されている。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版：エントリー７７１７）に記載されている。これらアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
【０２２１】
上述の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、もし望ましい場合には、他のアジュバントと混合されてもよい。例えば、アジュバントの組み合わせは、上述のＣｐＧを含んでもよい。
【０２２２】
本明細書に記載されるポリオワクチン及び／又は免疫原性組成物との使用に適切な薬学的に受容可能な賦形剤のさらなる例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、等張緩衝溶液が挙げられる。
【０２２３】
いくつかの実施態様において、本開示のワクチン製剤は、０．５ｍｇ／用量のミョウバンを含む、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３（ＰＶ１、ＰＶ２、及びＰＶ３）に対するＳａｂｉｎ不活性化ポリオワクチン（ｓＩＰＶ）を含む。他の実施態様では、本開示のワクチン製剤は、０．０６７ｍｇ／ｍＬのミョウバンを含む、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型のｓＩＰＶに対するＳａｂｉｎ不活性化ポリオワクチン（ｓＩＰＶ）を含む。他の実施態様では、本開示のワクチン製剤は、０．１３３ｍｇ／ｍＬのミョウバンを含む、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型のｓＩＰＶに対するＳａｂｉｎ不活化ポリオワクチン（ｓＩＰＶ）と、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、及び百日咳ワクチンを含む。
【０２２４】
本開示のさらなる態様は、その必要のある対象におけるポリオを治療又は予防するための、及び／又はその必要のある対象においてポリオに対する免疫反応を誘導するための、ポリオを引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の使用方法に関する。いくつかの実施態様では、本開示は、ポリオを引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することによる、その必要のある対象におけるポリオを治療又は予防する方法に関する。いくつかの実施態様では、本開示は、ポリオを引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することによる、その必要のある対象においてポリオに対する免疫反応を誘導する方法に関する。本開示の任意の方法は、不活化ポリオウイルス又は生きている弱毒ポリオウイルスを使用し得る
【０２２５】
いくつかの実施態様では、防御的免疫反応は、ＰＶ１、ＰＶ２、及びＰＶ３のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む。
【０２２６】
いくつかの実施態様では、投与工程は、１回以上の投与を含む。投与は、単回投与スケジュールによるものであってもよく、又は複数回の投与スケジュール（プライム−ブースト）によるものであってもよい。複数回の投与スケジュールにおいて、様々な投与量が同じ経路又は異なる経路により与えられてもよく、例えば、プライムが非経口でブーストが粘膜、プライムが粘膜でブーストが非経口などがある。典型的には、それらは同じ経路で投与される。複数回の投与は、典型的には、少なくとも１週（例えば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１２週、約１６週など）離れて投与される。２５〜３０日間（例えば、２８日間）に分けて２回投与することが特に有用である。上記のように、ポリオワクチン接種のための例示的な投与レジメンは当技術分野で公知である。
【０２２７】
本開示方法は、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量又は免疫刺激量を投与することを含む。治療有効量又は免疫刺激量は、投与される非感染対象、感染対象、又は非曝露対象において、防御的免疫反応を誘導する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の量であってもよい。かかる反応は、多くの場合、対象において、ワクチンに対する分泌性、細胞性、及び／又は抗体介在性の免疫反応の発現をもたらす。通常、かかる反応は、以下の効果のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。例えばイムノグロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭなどの任意の免疫学的分類の抗体の産生；Ｂリンパ球及びＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増殖及び分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の増殖。
【０２２８】
好ましくは、治療有効量又は免疫刺激量は、疾患の症状の治療又は予防をもたらすのに十分な量である。正確な必要量は、他の因子の中でも治療される対象、治療される対象の年齢及び一般状態、対象の免疫システムが抗体を合成する能力、望ましい防御の程度、治療される状態の重篤度、選択された特定の手足口病抗原ポリペプチド、及びその投与様式によって変化する。適切な治療有効量又は免疫刺激量は、当分野の当業者により容易に決定することができる。治療有効量又は免疫刺激量は、日常的な試験を介して決定することができる、比較的広い範囲におさまる。
【０２２９】
列挙された実施態様
以下の列挙された実施態様は本開示のいくつかの態様の代表例である。
１．エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）細胞を第１の細胞培養培地中で培養する工程；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含み、
ここで、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、界面活性剤を第２の細胞培養培地に添加する、方法。
２．界面活性剤の非存在下で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率と比較して、工程（ｃ）で回収されたエンテロウイルスＣウイルスの収率が増加する、実施態様１に記載の方法。
３．界面活性剤がポリソルベートである、実施態様１又は実施態様２に記載の方法。
４．界面活性剤がポリエチレングリコール系界面活性剤である、実施態様１又は実施態様２に記載の方法。
５．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様１〜４の何れか１項に記載の方法。
６．細胞が工程（ａ）において液体培養物中で培養される、実施態様１〜５の何れか１項に記載の方法。
７．細胞が接着細胞であり、細胞が工程（ａ）においてマイクロキャリア上で培養される、実施態様１〜５の何れか１項に記載の方法。
８．細胞が接着細胞であり、細胞が工程（ａ）においてマトリクスを含む固定層中で培養される、実施態様１〜５の何れか１項に記載の方法。
９．細胞が工程（ａ）においてバイオリアクター中で培養される、実施態様１〜５の何れか１項に記載の方法。
１０．細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される、実施態様８に記載の方法。
１１．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様８又は実施態様１０に記載の方法。
１２．約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様８又は実施態様１０に記載の方法。
１３．約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様１２に記載の方法。
１４．細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、実施態様８又は実施態様１０〜１３の何れか１項に記載の方法。
１５．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、実施態様８及び実施態様１０〜１４の何れか１項に記載の方法。
１６．細胞が、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される、実施態様８及び実施態様１０〜１５の何れか１項に記載の方法。
１７．さらなるグルコースが第２の細胞培養培地に添加されない、実施態様８及び実施態様１０〜１６の何れか１項に記載の方法。
１８．工程（ｃ）の後に、
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
をさらに含む、実施態様８及び実施態様１０〜１７の何れか１項に記載の方法。
１９．エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含む、方法。
２０．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様１９に記載の方法。
２１．ポリソルベートが、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される、実施態様１９又は実施態様２０に記載の方法。
２３．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様１９〜２１の何れか１項に記載の方法。
２３．約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様１９〜２１の何れか１項に記載の方法。
２４．約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様２３に記載の方法。
２５．細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、実施態様１９〜２４の何れか１項に記載の方法。
２６．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、実施態様１９〜２５の何れか１項に記載の方法。
２７．細胞が、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される、実施態様１９〜２６の何れか１項に記載の方法。
２８．さらなるグルコースが第２の細胞培養培地に添加されない、実施態様１９〜２７の何れか１項に記載の方法。
２９．工程（ｃ）の後に、
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
をさらに含む、実施態様１９〜２８の何れか１項に記載の方法。
３０．エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約３２０，０００細胞／ｃｍ２が接種される）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含む
方法。
３１．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様３０に記載の方法。
３２．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約２５０，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様３０に記載の方法。
３３．約２００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様３０に記載の方法。
３４．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様３０に記載の方法。
３５．ポリソルベートが、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される、実施態様３０〜３４の何れか１項に記載の方法。
３６．細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される、実施態様３０〜３５の何れか１項に記載の方法。
３７．細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、実施態様３０〜３６の何れか１項に記載の方法。
３８．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、実施態様３０〜３７の何れか１項に記載の方法。
３９．細胞が、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される、実施態様３０〜３８の何れか１項に記載の方法。
４０．さらなるグルコースが第２の細胞培養培地に添加されない、実施態様３０〜３９の何れか１項に記載の方法。
４１．工程（ｃ）の後に、
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
をさらに含む、実施態様３０〜４０の何れか１項に記載の方法。
４２．エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含み、
ここで細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、方法。
４３．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様４２に記載の方法。
４４．ポリソルベートが、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される、実施態様４２又は実施態様４３に記載の方法。
４５．細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される、実施態様４２〜４４の何れか１項に記載の方法。
４６．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様４２〜４５の何れか１項に記載の方法。
４７．約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様４２〜４５の何れか１項に記載の方法。
４８．約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様４７に記載の方法。
４９．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、実施態様４２〜４８の何れか１項に記載の方法。
５０．細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される、実施態様４２〜４９の何れか１項に記載の方法。
５１．さらなるグルコースが第２の細胞培養培地に添加されない、実施態様４２〜５０の何れか１項に記載の方法。
５２．工程（ｃ）の後に、
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
をさらに含む、実施態様４２〜５１の何れか１項に記載の方法。
５３．エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程を含む、方法。
５４．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様５３に記載の方法。
５５．ポリソルベートが、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される、実施態様５３又は実施態様５４に記載の方法。
５６．細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される、実施態様５３〜５５の何れか１項に記載の方法。
５７．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様５３〜５６の何れか１項に記載の方法。
５８．約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様５３〜５６の何れか１項に記載の方法。
５９．約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様５８に記載の方法。
６０．細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、実施態様５３〜５９の何れか１項に記載の方法。
６１．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、実施態様５３〜６０の何れか１項に記載の方法。
６２．さらなるグルコースが第２の細胞培養培地に添加されない、実施態様５３〜６１の何れか１項に記載の方法。
６３．工程（ｃ）の後に、
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
をさらに含む、実施態様５３〜６２の何れか１項に記載の方法。
６４．エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程（ここで、さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースが第２の培養培地から枯渇している）；及び
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程
を含む方法。
６５．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様６４に記載の方法。
６６．ポリソルベートが、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される、実施態様６４又は実施態様６５に記載の方法。
６７．細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される、実施態様６４〜６６の何れか１項に記載の方法。
６８．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様６４〜６７の何れか１項に記載の方法。
６９．約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様６４〜６７の何れか１項に記載の方法。
７０．約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様６９に記載の方法。
７１．細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、実施態様６４〜７０の何れか１項に記載の方法。
７２．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含む、実施態様６４〜７１の何れか１項に記載の方法。
７３．細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される、実施態様６４〜７２の何れか１項に記載の方法。
７４．工程（ｃ）の後に、
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
をさらに含む、実施態様６４〜７３の何れか１項に記載の方法。
７５．精製エンテロウイルスＣウイルスを製造するための方法であって、
（ａ）マトリクスを含む固定層中で接着細胞を培養する工程（ここで、細胞は第１の細胞培養培地中で培養される）；
（ｂ）エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で、細胞にエンテロウイルスＣウイルスを第２の細胞培養培地中で接種する工程；
（ｃ）細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収する工程；
（ｄ）細胞によって産生された回収エンテロウイルスＣウイルスをデプスフィルターに通して第１の溶出液を生成する工程（ここで、第１の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｅ）第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させて第１の結合画分を生成する工程（ここで、第１の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｆ）陽イオン交換膜から第１の結合画分を溶出して第２の溶出液を生成する工程（ここで、第２の溶出液はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；
（ｇ）第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させて第２の結合画分を生成する工程（ここで、第２の結合画分はエンテロウイルスＣウイルスを含む）；及び
（ｈ）陰イオン交換膜から第２の結合画分を溶出して精製エンテロウイルスＣウイルスを生成する工程
を含む、方法。
７６．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様７５に記載の方法。
７７．デプスフィルターが、約０．２μｍ〜約３μｍの間の孔径を有する、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜７６の何れか１項に記載の方法。
７８．工程（ｅ）の前に、第１の溶出液のｐＨが約５．７のｐＨ値に調整される、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜７７の何れか１項に記載の方法。
７９．エンテロウイルスＣウイルスが、Ｓ１及びＳ２からなる群から選択されるポリオウイルス血清型である、実施態様７８に記載の方法。
８０．工程（ｅ）の前に、第１の溶出液のｐＨが約５．０のｐＨ値に調整され、ここでエンテロウイルスＣウイルスはポリオウイルスＳ３である、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜７６の何れか１項に記載の方法。
８１．リン酸緩衝液を使用して、第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させる、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８０の何れか１項に記載の方法。
８２．ポリソルベートを含む緩衝液を使用して、第１の溶出液を陽イオン交換膜に結合させる、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８１の何れか１項に記載の方法。
８３．第１の溶出液が、約４．５〜約６．０の範囲のｐＨで陽イオン交換膜に結合している、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８２の何れか１項に記載の方法。
８４．第１の溶出液が、約７ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で陽イオン交換膜に結合している、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８３の何れか１項に記載の方法。
８５．第１の結合画分が、ｐＨを約８．０に調整することによって溶出される、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８４の何れか１項に記載の方法。
８６．第１の結合画分が、約０．２０Ｍ〜約０．３０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって溶出される、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８５の何れか１項に記載の方法。
８７．第１の結合画分が約２０ｍＳ／ｃｍ〜約２５ｍＳ／ｃｍの間で溶出される、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８６の何れか１項に記載の方法。
８８．工程（ｇ）の前に、第２の溶出液のｐＨを約８．０〜約８．５のｐＨ値に調整する、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜８７の何れか１項に記載の方法。
８９．エンテロウイルスＣウイルスは、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型であり、工程（ｇ）の前に、第２の溶出液のｐＨを約８．０〜約８．５のｐＨ値に調整する、実施態様１８に記載の方法。
９０．エンテロウイルスＣウイルスはＳ１及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型であり、工程（ｇ）の前に第２の溶出液のｐＨを約８．５のｐＨ値に調整する、実施態様８８に記載の方法。
９１．エンテロウイルスＣウイルスはＳ２及びＳ３からなる群から選択されるポリオウイルス血清型であり、工程（ｇ）の前に第２の溶出液のｐＨを約８．０のｐＨ値に調整する、実施態様８８に記載の方法。
９２．リン酸緩衝液又はトリス緩衝液を使用して、第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させる、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜９１の何れか１項に記載の方法。
９３．ポリソルベートを含む緩衝液を使用して、第２の溶出液を陰イオン交換膜に結合させる、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜９２の何れか１項に記載の方法。
９４．第２の溶出液が、約７．５〜約８．５の範囲のｐＨで陰イオン交換膜に結合している、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜９３の何れか１項に記載の方法。
９５．第２の溶出液が、約３ｍＳ／ｃｍで陰イオン交換膜に結合している、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜９４の何れか１項に記載の方法。
９６．第２の結合画分が、約０．０５Ｍ〜約０．１０Ｍの塩化ナトリウムを添加することによって溶出される、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜９５の何れか１項に記載の方法。
９７．第２の結合画分が、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの間で溶出される、実施態様１８、２９、４１、５２、６３、及び７４〜９６の何れか１項に記載の方法。
９８．ポリソルベートが、エンテロウイルスＣウイルスを細胞に接種する間、又は工程（ｃ）の約１時間から約４時間前に、第２の細胞培養培地に添加される、実施態様７５〜９７の何れか１項に記載の方法。
９９．細胞は、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩでエンテロウイルスＣウイルスを接種される、実施態様７５〜９８の何れか１項に記載の方法。
１００．約１２０，０００細胞／ｃｍ２〜約３００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様７５〜９９の何れか１項に記載の方法。
１０１．約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様７５〜９９の何れか１項に記載の方法。
１０２．約５，０００細胞／ｃｍ２が接種される、実施態様１０１に記載の方法。
１０３．細胞が、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の間に、約０．１ｍＬ／ｃｍ２〜約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比で培養される、実施態様７５〜１０２の何れか１項に記載の方法。
１０４．工程（ｂ）が、エンテロウイルスＣウイルスが細胞に感染し、感染した細胞がエンテロウイルスＣウイルスを産生する条件下で接種細胞を培養することをさらに含み、工程（ｃ）が、細胞を溶解して細胞によって産生されたエンテロウイルスＣウイルスを回収することを含む、実施態様７５〜１０３の何れか１項に記載の方法。
１０５．細胞は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨで接種される、実施態様７５〜１０４の何れか１項に記載の方法。
１０６．さらなるグルコースは第２の細胞培養培地に添加されず、かつ／又はグルコースが第２の培養培地から枯渇している、実施態様７５〜１０５の何れか１項に記載の方法。
１０７．細胞が哺乳動物細胞である、実施態様１〜１０６の何れか１項に記載の方法。
１０８．細胞がＶｅｒｏ細胞である、実施態様１０７に記載の方法。
１０９．Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣ  受入番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５８６）からなる群から選択される、実施態様１０８に記載の方法。
１１０．工程（ａ）において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養される、実施態様１〜１０９の何れか１項に記載の方法。
１１１．工程（ａ）において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される、実施態様１０９に記載の方法。
１１２．第１の細胞培養培地と第２の細胞培養培地は異なる、実施態様１〜１１１の何れか１項に記載の方法。
１１３．工程（ａ）と（ｂ）の間に、第１の細胞培養培地を除去し、細胞を第２の培養培地ですすぐことをさらに含む、実施態様１１２に記載の方法。
１１４．工程（ａ）の間の第１の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約５０％を超えて維持される、実施態様１〜１１３の何れか１項に記載の方法。
１１５．工程（ｂ）の間の第２の細胞培養培地中の酸素密度（ＤＯ）は約５０％を超えて維持される、実施態様１〜１１４の何れか１項に記載の方法。
１１６．固定層が約２ｃｍの層高を有する、実施態様８〜１１５の何れか１項に記載の方法。
１１７．固定層が約１０ｃｍの層高を有する、実施態様８〜１１６の何れか１項に記載の方法。
１１８．マトリクスが繊維マトリクスである、実施態様８〜１１７の何れか１項に記載の方法。
１１９．繊維マトリクスがカーボンマトリクスである、実施態様１１８に記載の方法。
１２０．繊維マトリクスが約６０％から９９％の間の多孔度を有する、実施態様１１８又は請求項１１９に記載の方法。
１２１．多孔度が約８０％〜約９０％の間である、実施態様１２０に記載の方法。
１２２．繊維マトリクスが、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞に接触可能な表面積を有する、実施態様１１８〜１２１の何れか１項に記載の方法。
１２３．繊維マトリクスが、約１０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１５０ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞に接触可能な表面積を有する、実施態様１１８〜１２１の何れか１項に記載の方法。
１２４．繊維マトリクスが、細胞に接触可能な約１２０ｃｍ２／ｃｍ３の表面積を有する、実施態様１２３に記載の方法。
１２５．少なくとも５．０×１０７  ＴＣＩＤ  ５０／ｍＬのエンテロウイルスＣウイルスが工程（ｄ）において回収される、実施態様１〜１２４の何れか１項に記載の方法。
１２６．エンテロウイルスＣウイルスが、ＬＳｃ、２ａｂ；Ｐ７１２、Ｃｈ、２ａｂ；Ｌｅｏｎ、１２ａ１ｂ；及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリオウイルス株である、実施態様１〜１２５の何れか１項に記載の方法。
１２７．１つ以上のベータ―プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）でエンテロウイルスＣを不活性化することをさらに含む、実施態様１〜１２６の何れか１項に記載の方法。
１２８．実施態様１〜１２７の何れか１項に記載の方法によって製造されるエンテロウイルスＣウイルス。
１２９．ウイルスが１つ以上の抗原を含む、実施態様１２８に記載のエンテロウイルスＣウイルス。
【０２３０】
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本開示の任意の態様又は範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２３１】
実施例１：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を用いたポリオウイルス産生に対する感染時細胞密度（ＣＤＩ）の影響
固定層バイオリアクターシステム（例えば、Ｎａｌ及び５００／１００バイオリアクターのような、Ｐａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｒｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ製のｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）バイオリアクター）は、ワクチン製造（例えば、Ｓａｂｉｎ不活性化ポリオワクチン又はｓＩＰＶ）に有用な産業規模での宿主細胞増殖及びウイルス産生の効率の改善を可能にし得る。これらのシステムを用いたウイルス産生のための上流プロセス工程を図１に示す。これらのシステムは、収率の向上と製造コストの削減を可能にすると考えられている。例えば、固定層バイオリアクターシステムは、マイクロキャリア培養系システムの５７日と比較して、わずか３８日の上流処理を必要とし得る。しかしながら、ウイルス産生のために固定層バイオリアクターシステムを実装することは、工業的規模の生産が費用効果的であるか又は可能でさえあるとする前に、いくつかの製造パラメータについて最適条件を同定することを必要とする。これらのパラメータは、上流プロセス工程のさまざまな態様、例えば、前培養増殖及び培養条件、播種及び感染時の細胞密度、感染多重度（ＭＯＩ）、培養／増殖期のｐＨ、温度（例えば、前培養時、増殖期、及び／又はウイルス培養時）、培養期間（例えば、前培養時、増殖期、及び／又はウイルス培養時）を含む。
【０２３２】
ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムにおいて、感染時の細胞密度（ＣＤＩ）を、生産性に与える潜在的な影響について調べた。
【０２３３】
方法
ウイルス及び細胞ストック
ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８１（商標）に由来するＳ２ポリオウイルス及びＶｅｒｏ細胞を使用した。
【０２３４】
Ｄ抗原の測定
標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いてＤ抗原をアッセイした。
【０２３５】
グルコース／乳酸測定
乳酸はＳｃｏｕｔ  ＴＭラクトメーターを用いて測定した。グルコースはＡＣＣＵＣＨＥＫ  Ａｖｉｖａ  Ｐｌｕｓシステムを使用して測定した。
【０２３６】
Ｖｅｒｏ蘇生
Ｖｅｒｏ細胞の蘇生を行った。１ｍｌバイアルのＶｅｒｏ細胞を３７℃に予熱した水浴中で素早く解凍し、１５ｍＬの遠心分離管中で室温で１０ｍＬの増殖培地と混合した。アリコート（１．０ｍｌ）を細胞計数及び生存率のために採取した。残りを、５０ｍＬの遠心分離管中で３７℃に予熱した２０ｍＬの増殖培地と混合した。１０ｍＬの細胞懸濁液を、３つのＴ−１７５フラスコのそれぞれにおいて３７℃で７７ｍＬの予め温めた増殖培地と混合した。これらのフラスコをＣＯ２（５％）インキュベーター内で３７℃に置いた。翌日、使用済み培地を廃棄し、新鮮培地（８７ｍｌ）と入れ替え、培養を続けた。
【０２３７】
細胞培養及び感染
特記しない限り、以下の培養条件を用いた。これらの条件は、少なくとも部分的には、以下に記載されているさまざまなパラメータに対する改良に基づいている。
【０２３８】
前培養のために、Ｖｅｒｏ細胞を、通気式Ｔ―１７５フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＡＧ＆Ｃｏ．，Ｎｕｒｅｍｂｒｅｃｈｔ  Ｇｅｒｍａｎｙ）中、５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で０．５ｍＬ／ｃｍ２の容量で培養した。細胞を１５，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で４日間継代した。
【０２３９】
すすぎのために、細胞を、ＤＯ又はｐＨ調節なしで、３４．０℃で８００ｍＬのＭ１９９培地中ですすいだ。細胞を５３０ｒｐｍで撹拌し、すすぎの時間は１５分であった。
【０２４０】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）における増殖期のために、細胞を、５％ＦＢＳ及び１ｇ／Ｌフルクトースを補充した１６００ｍＬのＤＭＥＭ中、３７℃で５，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で増殖させた。総マイクロキャリア面積は５３００ｃｍ２であった（これは、０．３ｍＬ／ｃｍ２のＶ／Ｓ及び０．２×１０６細胞／ｃｍ２までの許容密度に対応する。より高い密度の場合、０．５ｍＬ／ｃｍ２が使用された）。攪拌速度は４３０ｒｐｍであった。ｐＨは７．１５であり、ＤＯは＞５０％であった。
【０２４１】
感染期については、細胞密度は０．１２５〜０．２×１０６細胞／ｃｍ２であった。細胞を、３４．０℃で３．５ｇ／Ｌのグルコース及び０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０を補充した１６００ｍＬのＭ１９９培地に０．００２のＭＯＩで感染させ、ＤＯを＞５０％に調節し、ｐＨを７．４０に調節した。細胞を４３０ｒｐｍで撹拌し、６日間インキュベートした。
【０２４２】
下流の処理
下流の酸性化、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程に使用されるパラメータを以下に記載する。
【０２４３】
結果
生産性のために感染時の最適密度を同定するために、細胞培養物をそれぞれ０．１〜０．５×１０６細胞／ｃｍ２の異なる細胞密度で感染させた５個のｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯ固定層バイオリアクター中で増殖させた。生産性はＤ抗原含有量として測定した。
【０２４４】
結果を、生産性を体積の関数として（すなわち、ＤＵ／ｍＬ；図２Ａ）又は細胞数の関数として（すなわち、ＤＵ／１０６細胞；図２Ｂ）示すためにプロットした。これらのデータは、ほぼ最大の生産性がわずか０．１２×１０６細胞／ｃｍ２で達成され、最大に近い安定した生産性が０．１２〜０．３５×１０６細胞／ｃｍ２の範囲のＣＤＩで達成されたことを示している。
【０２４５】
有利なことに、これらの結果は、より低い細胞密度でほぼ最大の生産性が達成され得、それによって細胞培養培地の消費が少なくなることを示している。例えば、０．１２〜０．２×１０６細胞／ｃｍ２のＣＤＩを標的とすることは、０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積比（Ｖ／Ｓ）で達成可能であるが、より高いＣＤＩはより高いＶ／Ｓ、従ってより多くの培地消費を必要とする。別の言い方をすれば、より高いＣＤＩを使用しても生産性に大きな改善は見られず、その一方でより高い培地消費が生じる。
【０２４６】
実施例２：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を用いたポリオウイルス産生に対する感染多重度（ＭＯＩ）の影響
【０２４７】
次に、ＭＯＩが生産性に与える影響について調べた。
【０２４８】
結果
細胞を培養し、実施例１に記載のようにウイルスに感染させた。体積生産性は、上記の図２Ａを参照して記載されるように測定した。
【０２４９】
細胞を２つのｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯ固定層バイオリアクター中で増殖させ、０．０１（「高ＭＯＩ」）又は０．００２（「低ＭＯＩ」）の何れかのＭＯＩでウイルスに感染させた。両方とも、同様のＣＤＩで感染させた（低ＭＯＩについては０．１２×１０６細胞／ｃｍ２、高ＭＯＩについては０．１６×１０６細胞／ｃｍ２）。図３に示すように、体積生産性（ＤＵ／ｍＬ）によってアッセイした場合、両方のＭＯＩが同様の生産性をもたらした。従って、最大の生産性及びウイルス放出動態を依然として達成しつつ、より小さいウイルスＭＯＩを使用することができる。従って、０．００２のＭＯＩをその後の実験に使用した。
【０２５０】
実施例３：Ｔ―フラスコと比較した、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を用いた細胞培養物の製造
標準的なｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステム（すなわち、本明細書に記載の改良前）の使用と比較して、細胞を従来の組織培養フラスコ中で増殖させると、生産性は２〜３倍高い。ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムと組織培養フラスコの違いの１つは、ＮＡＮＯは循環培地を含む動的環境を使用するのに対し、フラスコは静的環境であることである。従って、ウイルスの安定性に対するｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯ条件の影響を試験した。別の違いはｐＨとＤＯの調節にあり、そのためｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯの生産性に対するこれらの影響も試験された。
【０２５１】
結果
細胞を培養し、実施例１に記載のようにウイルスに感染させた。体積生産性を、上記の図２Ａを参照して記載したように測定した。
【０２５２】
単一のｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯバイオリアクターからの最終回収物は、以下のように分けられた：２００ｍＬの培養物をＣＳ―１フラスコ中３４℃でＣＯ２インキュベーター中で５日間インキュベートし（「ＣＳ対照」）、１２００ｍＬの培養物を３４℃で５日間、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯ中で、５０％ＤＯ、ｐＨ７．４、３０ｍＬ／分の空気（「ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ」）を再循環させた。
【０２５３】
図４に示すように、Ｄ抗原の産生は両方の条件下で安定していた。ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯではＤ抗原の〜１５％の損失が観察されたが、この損失は時間の経過とともに減少することはなかった。これらのデータは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯの動的環境は、Ｔフラスコの使用と比較して生産性の低下の原因ではないことを示唆している。
【０２５４】
次に、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムにおけるｐＨ及びＤＯ調節が増殖に及ぼす影響を評価した。
培養物は、ｐＨ及びＤＯの能動的調節あり又はなしでｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯにおいて増殖させた。能動的調節なしに、空気／ＣＯ２（５％ｖ／ｖ）の混合物を３０ｍＬ／分の流量でバイオリアクターに注入した。「調節なし」及び調節された条件に対するＣＤＩは、それぞれ０．１８×１０６及び０．１６×１０６細胞／ｃｍ２であった。
【０２５５】
図５Ａは、生産性が、能動的ｐＨ／ＤＯ調節がないよりも能動的ｐＨ／ＤＯ調節がある場合にはるかに高いことを示す。図５Ｂ及び５Ｃは、経時的な対照及び「調節なし」条件のｐＨ及びＤＯレベルを示す（感染は両方の条件で６日目前後に起こった）。これらの結果は、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムにおける能動的ｐＨ／ＤＯ調節の重要性を強調している。
【０２５６】
実施例４：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を用いたポリオウイルス産生に対する細胞溶解の影響
回収に対する細胞溶解の影響を調べた。
結果
細胞を増殖させ、ポリオウイルス感染後に毎日、細胞外又は細胞内Ｄ抗原の体積生産性についてアッセイした。試料を各培養物から採取し、細胞を溶解するために凍結融解しＤ抗原含有量を測定した。凍結融解工程を行わずに細胞外Ｄ抗原含有量を測定した。細胞内Ｄ抗原は、（凍結融解プロセス後の試料のＤ抗原レベル）−（凍結融解プロセスなしの試料のＤ抗原レベル）として計算した。
【０２５７】
図６は、経時的な細胞外及び細胞内Ｄ抗原の産生を示す。例えば、感染後４日目で、総Ｄ抗原の最大２０％が依然として細胞内に見出された。これらの結果は、回収時の細胞溶解がウイルス回収を改善し得ること、例えば、細胞溶解により１０〜２０％のさらなるウイルスが回収され得ることを示している。
【０２５８】
実施例５：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を用いたポリオウイルス産生に対する細胞代謝状態の影響
細胞生産性に対する代謝（例えば、グルコース消費及び／又は乳酸産生）の影響を調べた。
結果
細胞を培養し、上記のようにウイルスに感染させた。グルコース及び乳酸を上記のように測定した。マイクロキャリア（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＣＹＴＯＤＥＸ（商標）マイクロキャリア）上で増殖した細胞について、細胞当たりの生産性（ＤＵ／１０６細胞）、グルコース不足、及び感染時のＬＤＨ活性を測定し、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムを使用して増殖させた細胞の２つのバッチと比較した（図７Ａ）。培養中にグルコースレベルが２５０ｍｇ／Ｌを下回った場合、グルコース不足／枯渇が翌日に観察されるであろう。
【０２５９】
結果は、最適化されていないｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）システムベースのプロセスと比較して、マイクロキャリア上で増殖した細胞の細胞あたりの生産性が向上することを示した。生産性の違いが２つの系で培養された細胞間の代謝の違いによって決定され得るかどうかを決定するために、感染時のグルコース不足及びＬＤＨ活性を調べた。感染の４８〜７２時間前にグルコース不足を経験したマイクロキャリア上で増殖した細胞と比較して、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて増殖した細胞はグルコース不足を経験しなかった。ｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて増殖された細胞も、マイクロキャリアで増殖した細胞と比較して、感染時のＬＤＨ活性が１０倍低下したことを示した。これらの結果は、２つの培養システム間の代謝の違いを示している。理論に拘束されることを望まないが、これらの結果は、代謝ストレス（例えば感染時）及び／又はより高い細胞密度が生産性の向上をもたらし得ることを示唆している。
【０２６０】
次に、本開示に従ってマイクロキャリア上で増殖した細胞において細胞当たりの平均生産性を測定し、科学文献中のプロトコルに従ってマイクロキャリア上で増殖した細胞と比較した。図７Ｂに示されるように、ｃｙｔｏｄｅｘベースの培養プロトコルは科学文献に見られる培養物を用いる培養よりも優れていた（「ｃｙｔｏｄｅｘ」バー及び「ｌｉｔ．ｃｙｔｏｄｅｘ」バーを参照）。ｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）システムで「ｃｙｔｏｄｅｘ」プロトコルと同じ温度及びｐＨ条件を使用すると、生産性がわずかに低下した（「ｃｙｔｏｄｅｘ」を用いた「ｉＣＥＬＬｉｓにおけるｃｙｔｏｄｅｘコピーペースト」を参照）。最適化されていないｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）条件を使用したベストラン（best run)は「ベストラン」として表示される。
【０２６１】
次に、培地中のグルコースレベルをこれらのプロトコル間で比較し（図７Ｃ）、そしてまたｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおける細胞生産性と比較した（図７Ｄ）。マイクロキャリア培養と比較して、細胞ストレスはｉＣＥＬＬｉｓＮＡＮＯ（登録商標）システムで大幅に減少した。理論に拘束されることを望まないが、これらの結果は、細胞ストレス及びより高い細胞密度は生産性の向上につながる可能性があり、細胞代謝を考慮すると、細胞代謝にとって重要なより多くのグルコースがｃｙｔｏｄｅｘよりもｉＣＥＬＬｉｓ  において３日後の細胞培養培地に残るため、ｉＣＥＬＬｉｓは細胞培養のためにより好ましいことを示唆している。
【０２６２】
図７Ｅ及び７Ｆに示すように、感染中のグルコース添加が生産性に与える影響を調べた。２つの培養物を１〜１０ｇ／Ｌの範囲の初期グルコース濃度（細胞培養培地、Ｍ１９９中）でＴフラスコ中で増殖させた。細胞を、０．５ｍＬ／ｃｍ２のＶ／ＳでＴフラスコ中で増殖期に増殖させた。感染期のグルコース濃度が示されている。一方の培養物は生産性に対してより高いグルコース濃度のプラス効果を示したが（図７Ｅ）、他方の培養物は影響を示さなかった（図７Ｆ）。グルコースの添加は生産性に悪影響を及ぼさないので、理論に拘束されることを望まないが、グルコース添加を（例えば、４．５ｇ／Ｌのレベルで）維持することは感染期中のグルコース不足を回避するために有利であり得ると考えられる。
【０２６３】
図７Ｇは、細胞生産性に対する感染前のグルコース不足の影響を示す。
細胞は、感染前に２４時間の完全なグルコース不足を伴わせてｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて増殖期に増殖させた。感染期（０．３ｍＬ／ｃｍ２の細胞を含む）では、さらなるグルコースを添加しなかった。ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて予想される生産性は約２０ＤＵ／ｍＬであったので、グルコース不足が生産性に潜在的に悪影響を及ぼすことが観察された（図７Ｇ）。対照細胞スタック培養システムにおいて増殖した細胞には悪影響は観察されなかった。
【０２６４】
図７Ｈは、細胞生産性における、感染時に追加のグルコースを添加することの効果を示す。細胞は、感染前にグルコース不足なしでｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて増殖期に増殖させた。感染期（０．３ｍＬ／ｃｍ２の細胞を含む）で、追加のグルコースを加えた（５％ＦＢＳを含む４．５ｇ／Ｌ）。ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて予想される生産性は約２０ＤＵ／ｍＬであったので、感染時の追加のグルコースの添加は生産性に潜在的に悪影響を及ぼすことが観察された（図７Ｈ）。対照細胞スタック培養システムにおいて増殖した細胞には悪影響は観察されなかった。要約すると、ＦＢＳとともに追加のグルコースをウイルス培養培地へ添加するとポリオウイルス収率を改善しなかった。同様に、増殖期におけるグルコース欠乏はポリオウイルス収率を改善しなかった。
【０２６５】
実施例６：ウイルス回収に対するポリソルベートの効果
ウイルス回収収率に対するポリソルベート添加の効果を調べた。
結果
ウイルスは、能動的なｐＨ／ＤＯ調節及び攪拌を用いて、上記のようにｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）において増殖させた。回収の１時間前に、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０を培養物に添加した。回収後、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ７．４）ですすいだ。Ｄ抗原生産は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０を添加する前、ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０を添加した後、及びトリス緩衝液でＮＡＮＯをすすいだ後の最初の回収時に測定した。
【０２６６】
図８Ａは、回収の前のポリソルベート（この実施例ではＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）の添加が、回収されたウイルスの量の２倍の増加をもたらしたことを示す。総回収量（ＤＵ生産量によって測定）のうち、４５％がＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０の添加前に捕捉され、４６％がＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０の添加後に捕捉され、９％がトリス緩衝液ですすいだ後に回収された。これらの結果は、ウイルス回収の前又はその間にポリソルベートを添加した結果として、生産性が著しく向上したことを示している。
【０２６７】
２つのプロセス（プロセス１とプロセス２）の間の比較が行われ、図８Ｂに要約される。プロセス１と比較したプロセス２の違いは太字で示される。これらのデータは、感染時に高いＭＯＩ又はより低いＶ／Ｓ比を使用することは生産性にほとんど影響を及ぼさないことを示唆している。例えば、０．１ｍＬ／ｃｍ２又は０．３ｍＬ／ｃｍ２の感染時のＶ／Ｓ比を使用することは全体的な生産性に影響を与えない。
【０２６８】
プロセス１及びプロセス２の生産性を図８Ｃに示す。「感染中のＴｗｅｅｎ」条件では、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０が感染培地中に存在した。「リピート」条件では、同じ感染培地をＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０なしで使用して、最初の回収で回収されるウイルスの量ははるかに少ない結果となった。「リピート」回収物の「余分な回収Ｔｗｅｅｎ」部分は、最初の回収後にＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有するすすぎ緩衝液でバイオリアクターを洗浄した後に回収されたＤ抗原力価を示す。これらのデータは、感染媒体に界面活性剤を含めることによって達成された収率の増加を示している。
【０２６９】
実施例７：異なるポリオウイルス株に対する上流プロセスの改善の比較
ウイルス産生は、上記の上流プロセスの改善を用いて、３つの異なる株−Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３−について測定された。各血清型に使用された株は以下の通りであった。Ｉ型：ＬＳｃ、２ａｂ、ＩＩ型：Ｐ７１２、Ｃｈ、２ａｂ、ＩＩＩ型：Ｌｅｏｎ、１２ａ１ｂ。
【０２７０】
結果
上記の方法を用いてｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムにおいて３つのウイルス血清型が産生された。結果を以下の表Ａに示す。
【０２７１】
【表１】
2019532624.tif 000003
【０２７２】
実験Ａ（Ｅｘｐ−Ａ）と実験Ｂ（Ｅｘｐ−Ｂ）との間の唯一のパラメータの相違は、感染時の細胞密度（上記に示されている）及び感染の１日目及び２日目のウイルス培地の循環であった。循環は，Ｅｘｐ−Ａ  Ｓ２については１日目、Ｅｘｐ−Ａ  Ｓ３並びにＥｘｐ−Ａ２  Ｓ１及びＳ２については２日目に開始した。
【０２７３】
これらの結果は、上記の上流プロセスの改善が３つの異なるポリオウイルス血清型の収率の改善に有効であることを示している。全体として、各血清型を２，４００ｍＬ容量のＦＢＳ含有培地中に回収した。総Ｄ抗原生産は、Ｓ１について１０４，８９０ＤＵ、Ｓ２について６１，００１ＤＵ、及びＳ３について３０２，２０８ＤＵであった。Ｄ抗原濃度（回収時のＤＵ／ｍＬ）は、Ｓ１が４３．７、Ｓ２が３３．３、及びＳ３が１２５．９であった。
【０２７４】
実施例８：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）を用いたポリオウイルス産生のための下流処理工程の改善
既存の下流処理プロトコルは時間及び資源集約的である。例えば、図９Ａは、本明細書に記載の改良されたプロトコルを米国特許第８，７５３，６４６号からの既存のプロトコルと比較する。（既存のプロトコルと同様に）複数のろ過及び超遠心分離工程を必要とするのではなく、本明細書に記載の改善された方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹのＭｕｓｔａｎｇ―Ｑ膜を用いる）及び陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹのＭｕｓｔａｎｇ―Ｓ膜を用いる）を使用する。この改善されたプロセスは、より合理化された費用効率の高い下流処理スキームを可能にする。
【０２７５】
ウイルス産生不活性化のための改良された下流プロセスを説明する流れ図を図９Ｂに示す。以下の実施例は、この改善された精製方法の検証及び最適化、並びにこの方法とｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（登録商標）システムを用いたウイルス産生との組み合わせを詳述する。
【０２７６】
結果
ウイルス産生に対するさまざまな下流の処理パラメータの効果を試験するために３つの実験計画法を用いた（図１０）。これらの実験の結果を以下の表Ｂ及びＣに示す。
【０２７７】
【表２】
2019532624.tif 000004
【０２７８】
【表３】
2019532624.tif 000005
【０２７９】
これらの実験からのさまざまな精製工程の生成物を図１１Ａ〜１１Ｅに示す。実験８（図１１Ａ）からのＳ２ウイルスの精製は、Thomassen, Y.E. et al. (2013) PLoS ONE 8:e83374の図３Ｂに示されたものと同様である。これは、陰イオン交換膜からの溶出液（図１１Ａのレーン５）がポリオウイルスを含有していること、及びこのポリオウイルス懸濁液が連続的な陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて十分に精製されたことを示す。これらの結果は、ポリオウイルスが陽イオン／陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、本明細書に記載されるような適切なパラメータ設定を用いて十分に精製されたことを示す。図１１Ｂは、Ｄ抗原の回収率を向上させるために精製プロセスにおいて特定のパラメータが変更されたが、余分なタンパク質（例えば６０ｋＤ）が完全に除去されなかったことを示す。図１１Ｄに示すように、Ｓ３株は、Ｓ１株及びＳ２株とは陽イオン交換ローディングのために異なるｐＨを必要とする。図１１Ｅは、同じｐＨにおいて、少量のＳ３が陽イオン交換膜に結合したことを示す。レーン７の３０ｋＤ付近のバンドは、Ｓ３ポリオウイルスの構成成分ではない。
【０２８０】
これらの結果は、実験８からのＳ２ウイルスの精製（図１１Ｃ）が既存のプロトコルの精製方法を用いて生成されたものと類似していたことを示している（図１１Ｃのレーン１及び２参照）。既存のプロトコル（例えば、米国特許第８，７５３，６４６号に記載されているように）は、図９Ｂに要約されている（「既存」）。従って、図９Ｂ及び１０に概説される合理化された精製スキームは、既存のプロトコル、クロマトグラフィー、又はThomassen, Y.E. et al. (2013) PLoS ONE 8:e83374に記載のプロトコルなどの先行技術を使用して精製されたものと同様のバンドを有する高純度をもたらす。しかしながら、Ｓ３ウイルスの精製は、既存のプロトコルと同様に精製ウイルスを産生するために、陽イオン交換ローディングのための異なるｐＨを必要とする（図１１Ｅのレーン１及び２参照）。
Ｓ３ウイルスの精製を容易にするための下流処理に対する改良は、本明細書中にさらに記載される。ウイルス血清型Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３についての精製プロセスの結果の要約を以下の表Ｄに提供する。
【０２８１】
【表４】
2019532624.tif 000006
【０２８２】
これらの結果は、３つ全てのウイルス血清型について、陰イオン及び陽イオン交換工程、並びに全体的な精製プロセスについての高い回収率を示す。
精製薬物中の総タンパク質／Ｄ抗原比は０．１未満であった。従って、全ての血清型の最終精製産物は不活性化後にこの規格を満たすべきである。
【０２８３】
実施例９：陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィーのための捕捉条件の同定
ｐＨ、緩衝液組成、ポリソルベートの存在／非存在、及びＤ抗原の収率を改善するための希釈係数などの捕捉条件を試験した。
結果
陰イオン交換クロマトグラフィーのさまざまなパラメータ（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑシステム、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを使用）を、９６ウェルＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）プレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、条件をスクリーニングすることによってウイルス捕捉に対する効果について評価した。試料は、清澄化した回収物の〜１２Ｄ抗原単位（理論値）であった。試料を５倍（図１２Ａ）又は３倍（図１２Ｂ）に希釈し、指示された条件を用いて結合させ、指示された緩衝液中０．７５ＭのＮａＣｌを含む０．７５ｍＬで溶出した。溶出画分をＤ−抗原（ＤＵ）について分析した。
【０２８４】
図１２Ａは、５倍希釈係数を用いた結果を示す。７．０〜８．５のｐＨでトリス緩衝液を用いて効率的な捕捉（〜８０％以上の収率）が観察された。同程度のｐＨのトリス緩衝液と比較して、リン酸緩衝液を用いたほとんどの条件で捕捉は効率が悪かった。低いｐＨで、しかし低い効率で、いくらかの捕捉が見られた。ポリソルベート（０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）の添加は、ほとんどの条件下で捕捉効率に多少の影響を及ぼしたが、その添加は純度に影響を及ぼす可能性がある。理論に拘束されることを望まないが、ｔｗｅｅｎを含む希釈なしの結果は矛盾であり、ほとんどの場合、希釈なしで捕捉されないことを示すと考えられる。
【０２８５】
図１２Ｂは、３倍希釈係数を用いた結果を示す。５倍希釈と比較して、希釈量の減少は、特にｐＨ８．０及び８．５でのトリスを除いて、全ての条件下で捕捉効率を低下させた。これらの結果は希釈の余地を示している。まとめると、これらの結果は、最も効率的な捕捉がｐＨ８．０〜８．５のトリス緩衝液を用いて観察されたこと、及び希釈係数が３倍以上に低下し得ることを示している。理論に拘束されることを望まないが、ｔｗｅｅｎを含む希釈なしの結果は矛盾であり、ほとんどの場合、希釈なしで捕捉されないことを示すと考えられる。
【０２８６】
次に、陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓシステム、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを使用）のさまざまなパラメータを、上記のように条件をスクリーニングすることによってウイルス捕捉に対する影響について評価した。
【０２８７】
図１３Ａは、５倍希釈係数を用いた結果を示す。観察された最高の捕捉効率は、ｐＨ５．５のクエン酸緩衝液及びポリソルベートを用いた場合、約９０％の収率であった。ｐＨ４．５又は６．０のクエン酸緩衝液は、あまり効率的ではない捕捉を引き起こした。ポリソルベートの使用は捕捉効率のわずかな増加を引き起こした。
【０２８８】
図１３Ｂは、３倍希釈係数を用いた結果を示す。５倍希釈と比較して、３倍への希釈係数の低下は、ｐＨ４．５又は５．５のクエン酸緩衝液を除く全ての条件の捕捉効率を減少させた。これらの結果は希釈の余地を示している。まとめると、これらの結果は、ポリソルベートを含むｐＨ４．５〜５．５のクエン酸緩衝液を用いて最も効率的な捕捉が観察されたこと、及び希釈係数が３倍以上に低下し得ることを示している。
【０２８９】
陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたクエン酸、トリス、又はリン酸緩衝液を用いたｐＨの関数としての結合効率（ポリソルベートあり及びなし）を図１４Ａ〜１４Ｄに示す。
【０２９０】
陰イオン交換条件は、次に、プロセスサイズをＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ  ＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールにスケールアップするために試験された。図１４Ｅは、ポリソルベートを含まないトリスｐＨ８．０緩衝液を用いた４倍希釈係数で得られた溶出プロファイルを示す。各画分から得られたウイルスの総量（例えば、総Ｄ抗原）、並びにパーセント収率が図１４Ｆに示される。図１４Ｅ及び１４Ｆに示されるように、フロースルー中に有意なＤ抗原は検出されず、収率は約１００％であった。低い導電率（例えば１０ｍＳ）が最良の溶出をもたらした。
【０２９１】
図１４Ｇは、ポリソルベートを含むトリスｐＨ８．０緩衝液を用いて４倍希釈係数で得られた溶出プロファイルを示す。ＳＤＳ―ＰＡＧＥ銀染色によって決定される純度は、図１４Ｈに示される。図１４Ｇ及び１４Ｈに示すように、フロースルー中に有意なＤ抗原は検出されず、純度は５０％未満であった。低い導電率（例えば１０ｍＳ）が最良の溶出をもたらした。
【０２９２】
陽イオン交換条件は、次に、プロセスサイズをＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ  ＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールにスケールアップするために試験された。図１４Ｉは、ポリソルベートなしでクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて４倍希釈係数で得られた溶出プロファイルを示す。各画分から得られたウイルス（例えば、総Ｄ抗原）の総量、並びにパーセント収率は、図１４Ｊに示されている。図１４Ｉ及び１４Ｊに示すように、１０％未満のＤ抗原がフロースルー中に検出され、収率は約９０％であった。２つのピークが高い溶出伝導率で観察された。
【０２９３】
図１４Ｋは、ポリソルベートを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて４倍希釈係数で得られた溶出プロファイルを示す。ＳＤＳ―ＰＡＧＥ銀染色によって決定された純度を図１４Ｌに示す。図１４Ｋ及び１４Ｌに示されるように、フロースルー中に５％未満のＤ抗原が検出され、収率は約９５％であった。２つのピークが高い溶出伝導率で観察された。ＳＤＳ―ＰＡＧＥによって分離されたピークの銀染色分析によって推定されるように、純度は５０％を超えていた。
【０２９４】
上記のような陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー工程のスケールアップの要約を表Ｄ２に提供する。
【０２９５】
【表５】
2019532624.tif 000007
【０２９６】
さまざまな下流処理パラメータを試験するための実験計画を図１５Ａ及び１５Ｂに示す。陽イオン交換（図１５Ａ）及び陰イオン交換（図１５Ｂ）条件の４つの組み合わせを試験した。これらの試験の結果を図１５Ｃに示す。これらの結果は、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、クエン酸又はリン酸緩衝液を、収率に対してほとんど又は全く影響を与えずに使用できることを示している。しかしながら、上流陽イオン交換工程にクエン酸を使用する場合と比較して、上流陽イオン交換工程にリン酸緩衝液を使用した場合、陰イオン交換収率はより高いように見えた（番号１と２と比較した場合のＭｕｓｔａｎｇＱ番号３と４の工程と全体的な回収を参照）。
【０２９７】
次に、緩衝液濃度を増加させることの影響を、陽イオン交換溶出ｐＨ及び陰イオン交換ローディングｐＨを低下させることと組み合わせて調べた。これらの実験は、緩衝能を改善し、より中性のｐＨを標的とすることを目的とした。
【０２９８】
実験設定を図１６Ａに示す。上記の条件を用いたＤＳＰ１．０の回収に関する性能を、陽イオン交換カラムローディングのためのより高い緩衝液濃度（２０ｍＭ対１０ｍＭリン酸緩衝液）、より低い陽イオン交換溶出ｐＨ（ｐＨ７．５対８．０）、及びローディングのために同じより高い緩衝液濃度及び同じｐＨを用いた陰イオン交換工程を使用したＤＳＰ１．１の性能と比較した。図１６Ｂに示されるように、ＤＳＰ１．１はより低い工程及び全体的回収をもたらした。陽イオン交換の場合、２０ｍＳでｓＩＰＶのわずかな溶出が観察されたが、これは溶出ｐＨが低いことに起因し得る。陰イオン交換の場合、フロースルー中に５０％のｓＩＰＶが観察されたが、これはより低いローディングｐＨ及びより高い緩衝液伝導率に起因し得る。これらの結果は、より高い緩衝液ｐＨ及び／又は減少した緩衝液伝導率がより高い回収をもたらし得ることを示唆する。
【０２９９】
次に、陽イオン交換クロマトグラフィー工程の希釈係数を、回収に対するその影響について試験した。膜としてＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ  ＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）を使用した。インラインロードは、ｐＨを５．５に調整した（例えば、清澄化及び酸性化後の）清澄化ウイルス回収物であった。希釈緩衝液は１０ｍＭクエン酸であった。図１７Ａに示されるように、ほぼ完全な回収が達成され、希釈なしでさえもフロースルー中に回収はなかった（ＤＵにより測定）。従って、ｐＨ５．７では２倍希釈係数は許容可能であったが、ｐＨ５．５では、０倍希釈係数でさえ許容可能であった。図１７Ｂは、１．３未満の希釈係数がフロースルー中の５％超のＳ２Ｄ抗原の損失をもたらしたことを示す。
【０３００】
次に、陰イオン交換クロマトグラフィー用のｐＨ及び塩ベースの溶出を比較した。図１８Ａは、ｐＨ８．０リン酸緩衝液を用いた陰イオン交換基質のｐＨベースの溶出の溶出プロファイルを示す。図１８Ｂは、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液中のＮａＣｌを用いた、陰イオン交換基質のＮａＣｌベースの溶出の溶出プロファイルを示す。これらの結果は、ｐＨ溶出と比較して、ＮａＣｌ溶出を使用するとより良い純度が達成されたことを示す。両方の溶出は＞  １００％の収率をもたらした。ｐＨ溶出は陰イオン交換工程の前に希釈を必要としないであろうが、ＮａＣｌは１０倍希釈係数を必要とするであろう。しかしながら、ＮａＣｌ溶出はｐＨ溶出よりも高い純度をもたらした。従って、各タイプの溶出は利点を有し、所望されるタイプは下流の処理及びスケールアップのための純度要件に依存し得る。
【０３０１】
要約すると、ウイルス産生をスケールアップするための例示的な下流処理フローの図が図１９に提供される。製造工程全体を詳述する２つの例示的なフローチャートが図２０Ａ及び２０Ｂに提供される。
【０３０２】
実施例１０：パイロットスケールプロセスにおけるウイルス産生のためのプロセスパラメータの改善
ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムを使用して、ウイルス産生、回収、及び精製のためのパイロットスケールのプロセス実行を実施した。このスケールアップされたシステムは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯと比較してバイオリアクターの容量を７０倍増加させる（７０Ｌ対１Ｌ）。
【０３０３】
結果
回収及び下流処理工程を伴う、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムを用いたウイルス産生のための全工程フローチャートを図２１Ａに示す。ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムを用いた上流処理のための最適化パラメータを図２１Ｂに示す。
【０３０４】
図２１Ａ及び２１Ｂに示されるプロセスは２５Ｌスケールで行われた。このプロセスの結果を分析し、より小さなＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールと比較した（図２２）。図２２において強調されているように、Ｄ抗原収率に関して、２つのピークが段階的勾配手順を用いたＭｕｓｔａｎｇ−Ｓ溶出工程において観察された。最初のピークのみを含む画分をＭｕｓｔａｎｇ−Ｑに適用した。この状況では、最終的なＤ抗原の収率は３５％であった。しかしながら、理論に拘束されることを望まないが、両方のピークを含むウイルス懸濁液をＭｕｓｔａｎｇ−Ｑに適用した場合、最終収率は５２％に増加し得ると考えられる。総タンパク質／ＤＵに関して、最終精製ウイルスの合計値は規格を満たし、かつ総タンパク質濃度の値は３つの異なる手順の間で異なっていた。
【０３０５】
低収率の潜在的な原因を調査するために、次に下流の処理工程を調べた。下流の処理工程の概要は、図２３Ａに流れ図として示されている。図２３Ｂ及び２３Ｃに示されるように、陽イオン交換クロマトグラフィーの最中に２つの異なる導電率（２０及び２５ｍＳ／ｃｍ）での溶出が観察された。これらの結果は、２０及び２５ｍＳ／ｃｍ溶出からのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に対応するタンパク質バンドの検出によって確認された（図２３Ｄ）。ＶＰ４は検出されなかった。
【０３０６】
次に、陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶出プロファイルを決定した（図２３Ｅ）。図２３Ｆに示されるように、２回目のロード、フロースルー及び１回目の洗浄、並びに２回目の洗浄工程におけるウイルス回収の欠如は、約４５％の損失を示し得る。さまざまな陰イオン交換溶出液中のタンパク質の検出は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３よりも高い分子量を移動するさらなる未同定のバンドの存在を示した（図２３Ｇ）。
【０３０７】
これらの結果のために、下流の処理を最適化し、大規模で純度を高めるために追加の実験が行われる。理論に拘束されることを望まないが、上記のように観察された溶出プロファイル及び純度は、不特定のウイルス／タンパク質相互作用によって駆動され得ると考えられる。これらの相互作用を弱めることは、より期待される溶出プロファイルを潜在的に回復し、より強いウイルス／膜相互作用を提供し、単一ピークの溶出及びより良好な純度をもたらすと考えられる。
【０３０８】
純度の向上
一態様では、より高い（例えば５倍高い）ポリソルベート濃度（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０）が、クロマトグラフィーのローディング、洗浄、及び溶出中に使用される。
【０３０９】
別の態様では、ローディング中に、より高い導電率（例えば、１０〜１５ｍＳ／ｃｍ）が使用される。
【０３１０】
別の態様では、図２３Ｇに示される汚染バンドが同定される（例えば、銀染色／ＭＳ分析を使用して）。バンドがＢＳＡを反映している場合は、改良されたｉＣＥＬＬｉｓすすぎ工程が採用される。
【０３１１】
単一の陽イオン交換溶出ピークを達成する
最初に、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムの回収物を、より小さいＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールを使用して精製し、２ピークの溶出が観察されるかどうかを決定する。
【０３１２】
別の態様では、クロマトグラフィーローディング、洗浄、及び溶出中に、より高い（例えば、５倍高い）ポリソルベート濃度（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０濃度）が使用される。例えば、以下の濃度のポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０）を試験する：０％（陰性対照として）、０．０５％、０．１％、０．２５％、及び０．５％。
【０３１３】
別の態様では、ローディング中に、より高い導電率（例えば、１０〜１５ｍＳ／ｃｍ）が使用される。
【０３１４】
陰イオン交換クロマトグラフィーからの回収の向上
最初に、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムの回収物を、より小さいＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールを使用して精製し、同様の回収が観察されるかどうかを決定する。
【０３１５】
別の態様では、（例えば、ＡｃｒｏＤｉｓｃ（登録商標）スケールと比較して）観察されたより低い収率が定量化の誤差によるものであるかどうかを決定するために、２５Ｌスケールの定量化を再チェックする。
【０３１６】
サイジングクロマトグラフィー工程
陽イオン交換カラム（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓクロマトグラフィー膜）及び陰イオン交換カラム（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑクロマトグラフィー膜）の最大ローディング容量が決定される。例えば、１２５ｍＬ／ｍＬＭＶ、２５０ｍＬ／ｍＬＭＶ、５００ｍＬ／ｍＬＭＶの回収物が１０ｍＬのＭｕｓｔａｎｇ膜スケールでロードされる。
【０３１７】
陰イオン交換クロマトグラフィーの改良
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した捕捉を改善するために、複数のアプローチが使用される。希釈後の最終ｐＨは７．４であり、８．０ではなかった。一態様では、緩衝能力は希釈中にｐＨ８．０に達するように増加する。別の態様において、収率に対するｐＨ７．４の影響が決定される。Ｍｕｓｔａｎｇ−Ｑロードの許容ｐＨ範囲は、例えば製造記録に基づいてもよい。
【０３１８】
別の態様において、１５ｍＭ及び２０ｍＭリン酸緩衝液を希釈のために使用し、導電率、希釈係数、及び収率に及ぼすそれらの影響について試験する。
【０３１９】
別の態様では、より低いｐＨの潜在的な使用を評価するために、ｐＨ７．５の陰イオン交換膜上での捕捉を試験する。
【０３２０】
Ｓ２ウイルスを用いてフル生産の実行を行った。下流プロセスのパラメータを図２３Ｈに示す。下流プロセスの各工程について、体積；Ｄ抗原の力価、総量、及び回収率；総タンパク質；及びタンパク質／Ｄ抗原比を含む結果を図２３Ｉに示す。
【０３２１】
実施例１１：パイロットスケールプロセスにおけるウイルス産生のための上流プロセスパラメータの比較
ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムを使用したウイルス生産、回収、及び精製のために追加のパイロットスケールのプロセス実行を実施し、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムを使用した生産と比較した。生産性に対する潜在的な影響について、さまざまな上流プロセスパラメータを監視した。複数のポリオウイルス株の産生を調べた。
【０３２２】
結果
４つの独立した製造の実行が行われた：２つはｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムにおいて増殖した細胞を用い、もう２つはｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムにおいて増殖した細胞を用いた。図２４Ａは、各条件における細胞培養物のさまざまなパラメータを示す（全ての条件は株Ｓ２を使用した）。重要なことに、最高のＤ抗原力価／ｍＬが、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システム（「ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／６６  Ｂ」）において増殖した培養物のうちの１つについて観察され、これは、１回の実行から０．５５Ｍ用量のワクチンに相当する推定３９．４Ｍ  ＤＵを生成した。図２４Ｂ及び２４Ｃに示すように、さらに３回の実行（２つはｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムにおいて増殖した細胞を用い、１つはｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムにおいて増殖した細胞を用いる）が実行された（全ての条件は株Ｓ３を用いた）。これらの結果は、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００／６６ｍ２システムにおける増殖が、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯシステムにおける増殖と比較して、ほぼ同等の相対的生産性をもたらすことを示している（ｖ／ｓ  ０．３でのＤ抗原力価が、５００／６６について１１８．９ＤＵ／ｍＬ対ＮＡＮＯについて１０４．０ＤＵ／ｍＬ）。
【０３２３】
実施例１２：パイロットスケールプロセスにおけるウイルス産生のための下流プロセスパラメータの改善
次にウイルス産生のための下流の処理工程に対するさらなる改良を調べた。これらの実験に使用された上流処理工程は、図２５Ａに図示される。
【０３２４】
結果
ウイルスの回収及び精製のための例示的な下流プロセスを図２５Ｂに示す。
１つのプロセスは、ＮａＣｌ緩衝液を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーの洗浄及び溶出を使用するのに対して、代替プロセスは、リン酸緩衝液を使用するｐＨベースの洗浄及び溶出を使用する。プロセス間の違いは以下の表Ｅ及び表Ｆに要約されている。
【０３２５】
【表６】
2019532624.tif 000008
【０３２６】
【表７】
2019532624.tif 000009
【０３２７】
以下の表Ｇ及び表Ｈに示すように、これらのパラメータをＳ１及びＳ３ウイルスに適用した。
【０３２８】
【表８】
2019532624.tif 000010
【０３２９】
【表９】
2019532624.tif 000011
【０３３０】
陽イオン交換膜ローディングのためのｐＨを株Ｓ１を用いて調べた。図２６Ａに示されるように、総ウイルス（ＤＵ）の９９．２％がｐＨ５．４と５．７の間で捕捉された。陽イオン交換膜からのＮａＣｌ溶出もまた株Ｓ１を用いて調べた。約１００％のウイルスが２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することが観察された（図２６Ｂ及び２６Ｃ）。これらの結果は、Ｓ１株を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーについては、陽イオン交換ローディングがｐＨ５．７で最も効果的であり、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液が溶出のために最も効果的であることを示している。
【０３３１】
陰イオン交換膜ローディングのためのｐＨを次に株Ｓ１を用いて調べた。試料を２倍に希釈し、２単位に等分した（ｐＨ４．０及び１０．０）。ローディング伝導率は３．８８ｍＳ／ｃｍであり、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０が含まれていた。図２７Ａに示されるように、総ウイルス（ＤＵ）の８１．１７％がｐＨ８．２４と８．６０の間に捕捉された。陰イオン交換膜からのＮａＣｌ溶出もＳ１株を用いて調べた。２８６４．５５ＤＵのウイルスをローディングｐＨ８．５から精製し、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含めた。３００ｍＭのＮａＣｌで約９０．６１％のウイルスが溶出することが観察された（図２７Ｂ）。フロースルー及び洗浄においてＤＵは観察されなかった。これらの結果は、Ｓ１株を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーでは、３００ｍＭのＮａＣｌ溶出を伴う１０ｍＭリン酸緩衝液が最も効果的であることを示している。
【０３３２】
陰イオン及び陽イオン交換工程もまた株Ｓ３を用いて調べた。図２８Ａに示されるように、陽イオン交換膜へのｐＨローディングのために、１００％の総ウイルス（ＤＵ）がｐＨ５．００と５．５１の間で捕捉された。陽イオン交換膜からのＮａＣｌ溶出もまた、株Ｓ３を用いて調べた。約９１．７％のウイルスが２００ｍＭから３００ｍＭのＮａＣｌで溶出することが観察された（図２８Ｂ及び２８Ｃ）。これらの結果は、Ｓ３株を用いた陽イオン交換膜のローディングはｐＨ５．０で最も効果的であり、溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液及び３００ｍＭ  ＮａＣｌで最も効果的であることを示している。
【０３３３】
次に陰イオン交換膜ローディングのためのｐＨを株Ｓ３を用いて調べた。試料を２倍に希釈し、２単位に等分した（ｐＨ４．０及び１０．０）。ローディング伝導率は３．８８ｍＳ／ｃｍであり、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０が含まれていた。図２９Ａに示されるように、１００％の全ウイルス（ＤＵ）がｐＨ８．１５と９．９３の間に捕捉された。陰イオン交換膜からのＮａＣｌ溶出もまた、株Ｓ３を用いて調べた。４１６１．２ＤＵウイルスをローディングｐＨ  ８．５から精製した。約１２．６２％のウイルスが２００ｍＭのＮａＣｌで溶出することが観察された（図２９Ｂ）。フロースルー及び洗浄においてＤＵは観察されなかった。これらの結果は、Ｓ３ウイルスの精製には、陰イオン交換膜からの溶出のために２００ｍＭのＮａＣｌが最も効果的であることを示している。理論に拘束されることを望まないが、Ｓ３とＳ１／Ｓ２との間の表面電荷差は、Ｓ３株についての陽イオン交換よりも陰イオン交換についてのより厳しいパラメータ設定をもたらすと考えられる。
【０３３４】
要約すると、ＮａＣｌ及びｐＨ溶出を使用する下流処理スキームがそれぞれ図３０Ａ及び３０Ｂに提供される。
【０３３５】
ポリオウイルスＳ２株を用いた製造の実行も行った。ＮａＣｌ溶出を用いたプロセス実行の各プロセス工程におけるウイルス回収を図３１Ａに要約する。この実行からの回収及び収量パラメータを下記の表Ｉ及びＪに示す。総タンパク質／ＤＵ比及び観察されたＢＳＡ濃度に基づいて標的純度を達成した（表Ｎを参照）。回収から陰イオン交換クロマトグラフィーまでの総収率は８１．６％であった。ローリー法を用いて総タンパク質を測定した。ＢＳＡ及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は両方ともＥＬＩＳＡを用いて測定した。リアルタイムＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を測定した。
【０３３６】
【表１０】
2019532624.tif 000012
【０３３７】
【表１１】
2019532624.tif 000013
【０３３８】
ｐＨ溶出を用いたプロセス実行の各プロセス工程におけるウイルス回収を図３１Ｂに要約する。この実行からの回収及び収量のパラメータを以下の表Ｋ及びＬに提供する。標的純度は、総タンパク質／ＤＵ比に基づいて達成された（表Ｎを参照）。ＢＳＡ濃度は決定されなかった。回収から陰イオン交換クロマトグラフィーまでの総収率は６９．５％であった。
【０３３９】
【表１２】
2019532624.tif 000014
【０３４０】
【表１３】
2019532624.tif 000015
【０３４１】
次に、ＮａＣｌ溶出を用いたＳ２プロセス実行から得られたデータを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーの収率及び純度に対する溶出容量の影響を調べた。以下の表Ｍに示されるように、画分１（図３２の対応するクロマトグラフ参照）は標的範囲内の純度を有していた。しかしながら、より大きな画分２も含まれると、純度は低下し、標的範囲外となった。これらの結果は、溶出容量が下流のプロセス純度にとって重要であることを示している。１０ｍＬの膜容量（ＭＶ）が、６０Ｌスケールの精製に基づいて十分であると考えられる。
【０３４２】
【表１４】
2019532624.tif 000016
【０３４３】
両方のプロセスの実行を用いて得られたＳ２ウイルスの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってさらに分析した。図３３Ａは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が、陽イオン交換クロマトグラフィー後よりもＮａＣｌ溶出画分１中でより高い収率で検出されたことを示す。図３３Ｂは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が、陽イオン交換クロマトグラフィー後よりも１００ｍＭ  ＮａＣｌでのｐＨ溶出においてより高い収率で検出されたことを示す。これらの結果は、陰イオン交換溶出が１００ｍＭ  ＮａＣｌで最も効果的であること、及び余分のタンパク質バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されたが、Ｓ２回収物は本明細書に記載の陽イオン及び陰イオン交換工程を用いて効果的に精製されることを示す。
【０３４４】
下流工程段階の標的収率及び純度パラメータを以下の表Ｎに示す。
【０３４５】
【表１５】
2019532624.tif 000017
【０３４６】
本明細書に記載の結果に基づいて、表Ｏ中の下流プロセスパラメータが、各ポリオウイルス株についての大規模生産のための最適化設定であると考えられる。
【０３４７】
【表１６】
2019532624.tif 000018
【０３４８】
実施例１３：改善された方法を適用することによって製造されたｓＩＰＶワクチンを用いたウサギにおける毒性学試験
ウサギにおいて、本明細書に記載の改善された方法から製造されたウイルス材料を用いて毒性試験を行った（上記の実施例１２参照）。ミョウバン及び薬学的に許容される担体と共に処方されたＳ１、Ｓ２、及びＳ３からのウイルス材料を用いてワクチンを処方した。原薬を２―フェノキシエタノールを含有するリン酸緩衝食塩水と混合した。次いで、混合溶液を０．２マイクロメートルの膜でろ過し、ミョウバンアジュバント（アルヒドロゲル）を添加することによって処方した。Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３の試料Ｄ抗原は、使用した最高強度で３、１００、及び１００ＤＵ／用量であった。
【０３４９】
結果
Ｓ１：Ｓ２：Ｓ３の３：１００：１００ＤＵ／用量の投与量でのＳａｂｉｎベースの不活化ポリオワクチン（ｓＩＰＶ）を、雄及び雌のＫｂｌ：ＪＷウサギに１回筋肉内投与し（単回投与群：２匹の動物／性別／群）、又は毎週１回、５週間連続して投与した（複数回投与群：５匹の動物／性別／群；１、８、１５、２２、及び２９日目に投与）。単回投与群及び複数回投与群の動物をそれぞれ単回投与又は５回目の投与の２日後に剖検し、潜在的な毒性を評価した。各動物は各投与につき０．５ｍＬの被験物質を受けた。各群に生理食塩水とアルミニウムアジュバント（ビヒクル）の２つの同時対照群を設定し、ワクチン接種群と同じ方法で投与した。８週間の回復期間後の潜在的な毒性変化の可逆性を調べるために、さらなる５匹の動物／性別／群に与えられた。本研究で収集した血清試料の免疫原性の結果に基づいて、ウサギが毒性を評価するのために適切な種であることが確認された。
【０３５０】
投与期間中及び回復期間中に被験物質に関連した死亡は観察されなかった。ワクチン接種を受けた回復群の１匹の雄は、食欲不振の徴候を示し、３８日目に安楽死させた。この動物では、５回目の投与後に、糞便量の減少、食物消費量の減少及び体重減少が見られた。液体補給は２回与えられた；しかしながら、動物の状態は改善しなかった。動物の健康悪化の原因を解明するために、動物を動物福祉の観点から安楽死させ、剖検を行った。剖検所見には、小さな胸腺、胃の中の毛玉、及び膀胱の内腔拡張が含まれていた。病理組織学的所見には、消化管粘膜（食道、空腸、及び回腸）の萎縮性変化皮膚の表皮、涙腺の腺房細胞、盲腸のリンパ組織、肝臓における門脈周囲肝細胞の空胞化が含まれた。これらの所見は、安楽死の前に動物が拒食症様状態を悪化させたことに起因していた。胃毛毛嚢虫症はウサギでは一般的であり、小さな毛玉（又はそれほど目立たない凝集体）でさえウサギで食欲不振を引き起こすことがあるので、この動物で観察された食欲不振様症状はおそらく胃で見つかった毛玉によるものであり、被験物質に関連する可能性は低い。
【０３５１】
回復群の予定された剖検の日（８５日目）に、ワクチン接種された回復群の１匹の雌が、死亡前の臨床徴候にいかなる異常を伴うことなく死亡したことが判明した。８４日目、及び投与期間中（２、８、及び３０日目）に行われた血液学的検査及び血液化学検査は、この動物におけるいかなる顕著な変化も明らかにしなかった。注射部位の異物は顕微鏡で観察されたが、これらの観察はアルミニウムアジュバント又はワクチンを投与された他の回復動物においても見出された。剖検時又は病理組織学的検査時に観察された死因に起因する病変はなかった。このウサギの死因は特定されていないが、この動物における投与及び回復期間を通して顕著な変化は観察されなかったので、被験物質に関連するとは考えられなかった。
【０３５２】
回復期に、臨床徴候体重、摂餌量、摂水量、体温、眼科学、尿検査、又は血液学において、被験物質関連の異常は認められなかった。皮膚反応の観察では、５回目の投与後３０〜３４日目に、ワクチン接種群の１匹の雄において、右外側広筋（注射部位３）において注射時の赤い変色が見られた。単回投与群の剖検では、生理食塩水、アルミニウムアジュバント、ワクチン接種群の両方の性において、左外側広筋（注射部位１）における注射部位に（１回目の投与の２日後）、暗赤色の焦点が認められた。多回投与群では、アルミニウムアジュバント群及びワクチン接種群の両方の性において、（５回目の投与の２日後）注射部位３にて暗赤色の焦点が観察された。
【０３５３】
単回投与群の病理組織学的検査は、アルミニウムアジュバント群とワクチン接種群の両方について、（１回目の投与の２日後）注射部位１における単核球浸潤、筋肉の壊死／再生、及び／又はマクロファージ凝集を明らかにした。これらの変化の発生率／重症度は、これらの群の間で同等であった。異物は、アルミニウムアジュバント及びワクチンなどの残留投与物質に由来すると考えられていた。さらに、マクロファージの凝集は、投与物質に対する異物反応を示していた。複数回投与群の病理組織学的検査により、アルミニウムアジュバント群及びワクチン接種群における注射部位３での筋肉の壊死／再生、出血、異物、単核球浸潤、偽好酸球浸潤、浮腫及び／又はマクロファージ凝集などの免疫／炎症反応が明らかになった。これらの変化のうち、ワクチン接種群における免疫／炎症反応の発生率／重症度は、アルミニウムアジュバント群で観察されたものよりも高かった。注射部位１（１回目の投与から４週間後）では、マクロファージの凝集及び異物がアルミニウムアジュバント及びワクチン接種群で見られ、同程度の発生率／重症度であった。単核球浸潤及び偽好酸球浸潤はワクチン接種群においてのみ認められた。ワクチン接種群における単核球及び偽好酸球浸潤並びに異物の発生率／重症度は、注射部位３と比較して減少した。これは、ワクチン注射後の局所的免疫／炎症性変化の可逆性を示した。アルミニウムアジュバント群とワクチン接種群において、（２回目から４回目の投薬の複数回投与の１週間後）左仙髄筋への注射（注射部位２）で、単核球浸潤、偽好酸球浸潤、筋肉の壊死／再生、異物、及び／又はマクロファージ凝集が認められた。これらの変化のうち、偽好酸球浸潤はワクチン接種群でのみ認められた。しかし、単回注射後の所見と比較した場合、免疫／炎症反応又は筋肉壊死の明らかな悪化はワクチン接種群では認められなかった。これらの結果は、同じ領域に複数回投与した後の耐容性を示した。
【０３５４】
複数回投与群において認められた注射部位の変化に加えて、脾臓及び内部腸骨リンパ節の胚中心の数及び大きさが増加した。副皮質のリンパ球の数の増加、並びに内腸骨リンパ節の偽好酸球浸潤の増加もあった。これらの変化はすべて、繰り返されたワクチン接種に対する正常な免疫反応であると考えられており；これらの変化はワクチン接種された複数回投与群で認められた。
【０３５５】
回復期間中、注射部位における異物及びマクロファージの凝集は、複数回投与後（１回目の投薬から４週間後）に注射部位１と同程度の発生率／重症度で継続的に認められた。しかしながら、他の所見はワクチン接種された群では消えた。さらに、投与期間の終わりに観察されたリンパ節及び脾臓における所見は、回復期間の後に消えた。従って、ワクチン接種によって誘発された免疫／炎症反応の可逆性が確認された。
【０３５６】
結論として、８週間の回復期間を伴う４週間のウサギへのｓＩＰＶの筋肉内投与（１週間の間隔で合計５用量を投与）は忍容性が良好であった。ウサギへの単回投与又は複数回投与後に全身毒性は観察されなかった。注射部位における局所免疫／炎症反応（及び局所リンパ節及び脾臓における関連所見）がワクチン接種群において認められた。しかしながら、これらの反応はワクチン接種と一致しており、投与期間の終わりに観察された所見は投与物質に対するわずかな異物反応を除いて回復期間中に消散した。無作用量（ＮＯＥＬ）は注射部位での被験物質関連の変化に基づいて確立されなかった：回復期間後の免疫／炎症反応の可逆性に基づいて、この試験の条件下でワクチンの無作用量（ＮＯＡＥＬ）は０．５ｍＬ／動物であると決定された。まとめると、これらの実験は、本明細書に記載の改善された方法を使用して、ウイルス材料の首尾よい製造、及びこのウイルス材料を含有する有効なワクチンのその後の処方を明らかにした。
【図１】
2019532624.tif 000019
【図２】
2019532624.tif 000020
【図３】
2019532624.tif 000021
【図４】
2019532624.tif 000022
【図５−１】
2019532624.tif 000023
【図５−２】
2019532624.tif 000024
【図６】
2019532624.tif 000025
【図７−１】
2019532624.tif 000026
【図７−２】
2019532624.tif 000027
【図７−３】
2019532624.tif 000028
【図７−４】
2019532624.tif 000029
【図８−１】
2019532624.tif 000030
【図８−２】
2019532624.tif 000031
【図８−３】
2019532624.tif 000032
【図９−１】
2019532624.tif 000033
【図９−２】
2019532624.tif 000034
【図１０】
2019532624.tif 000035
【図１１−１】
2019532624.tif 000036
【図１１−２】
2019532624.tif 000037
【図１２】
2019532624.tif 000038
【図１３】
2019532624.tif 000039
【図１４−１】
2019532624.tif 000040
【図１４−２】
2019532624.tif 000041
【図１４−３】
2019532624.tif 000042
【図１４−４】
2019532624.tif 000043
【図１４−５】
2019532624.tif 000044
【図１４−６】
2019532624.tif 000045
【図１４−７】
2019532624.tif 000046
【図１４−８】
2019532624.tif 000047
【図１４−９】
2019532624.tif 000048
【図１５−１】
2019532624.tif 000049
【図１５−２】
2019532624.tif 000050
【図１５−３】
2019532624.tif 000051
【図１６−１】
2019532624.tif 000052
【図１６−２】
2019532624.tif 000053
【図１７】
2019532624.tif 000054
【図１８−１】
2019532624.tif 000055
【図１８−２】
2019532624.tif 000056
【図１９】
2019532624.tif 000057
【図２０−１】
2019532624.tif 000058
【図２０−２】
2019532624.tif 000059
【図２１−１】
2019532624.tif 000060
【図２１−２】
2019532624.tif 000061
【図２２】
2019532624.tif 000062
【図２３−１】
2019532624.tif 000063
【図２３−２】
2019532624.tif 000064
【図２３−３】
2019532624.tif 000065
【図２３−４】
2019532624.tif 000066
【図２３−５】
2019532624.tif 000067
【図２３−６】
2019532624.tif 000068
【図２３−７】
2019532624.tif 000069
【図２３−８】
2019532624.tif 000070
【図２４−１】
2019532624.tif 000071
【図２４−２】
2019532624.tif 000072
【図２４−３】
2019532624.tif 000073
【図２５−１】
2019532624.tif 000074
【図２５−２】
2019532624.tif 000075
【図２６−１】
2019532624.tif 000076
【図２６−２】
2019532624.tif 000077
【図２６−３】
2019532624.tif 000078
【図２６−４】
2019532624.tif 000079
【図２７−１】
2019532624.tif 000080
【図２７−２】
2019532624.tif 000081
【図２８−１】
2019532624.tif 000082
【図２８−２】
2019532624.tif 000083
【図２８−３】
2019532624.tif 000084
【図２８−４】
2019532624.tif 000085
【図２９−１】
2019532624.tif 000086
【図２９−２】
2019532624.tif 000087
【図３０−１】
2019532624.tif 000088
【図３０−２】
2019532624.tif 000089
【図３１】
2019532624.tif 000090
【図３２】
2019532624.tif 000091
【図３３−１】
2019532624.tif 000092
【図３３−２】
2019532624.tif 000093
【配列表】
2019532624000001.app
【国際調査報告】
2019532624.tif 000094
2019532624.tif 000095