(57)【要約】  本発明は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質の発現又は機能を改変するステップを含む、植物における側芽の発芽を改変する方法に関する。本発明は、そのような方法により取得可能な植物、植物繁殖材料、採取された葉、及び加工された葉とさらに関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質の発現又は機能を改変するステップを含む、植物における側芽の発芽を改変する方法。
【請求項２】
側芽の発芽が、タンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止することにより低下及び／又は遅延している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質をコードするポリヌクレオチド内に変異をもたらすステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
変異が、タンパク質をコードするポリヌクレオチド内に、未成熟終止コドン、欠損、スプライス変異体、又は非許容性アミノ酸置換をコードするコドンを生じさせる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
変異が、タンパク質をコードするポリヌクレオチド内に、非許容性のアミノ酸置換をコードするコドンを生じさせる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
変異が、配列番号３におけるＴ２３４１変異に対応する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下のステップを含む、側芽の発芽が低下及び／又は遅延している植物を生成する方法。
ａ．側芽の発芽が低下しているドナー植物を、側芽の発芽が低下しておらず、かつ商業的に望ましい特性を有するレシピエント植物と交配させるステップであって、前記ドナー植物が、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止する変異を含むステップ；
ｂ．前記レシピエント植物と交配させた前記ドナー植物の子孫から遺伝物質を単離するステップ；及び
ｃ．分子マーカーを用いて分子マーカー利用選抜を実施するステップであって、
ｉ．ａ．で定義するタンパク質をコードする核酸配列内に変異を含む遺伝子移入領域を識別するステップ
を含む、ステップ；
【請求項８】
タンパク質が、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載する方法。
【請求項９】
タンパク質が、配列番号２、６、若しくは７として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１〜８のいずれかに記載する方法。
【請求項１０】
タンパク質が、配列番号２、６、７として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
側芽の発芽が、タンパク質の発現又は機能を増加させることにより増加及び／又は迅速化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により取得可能な（例えば、取得された）植物細胞。
【請求項１３】
ｉ）請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により取得可能であり、
ii）請求項３〜１１のいずれかで定義する改変されたポリヌクレオチドを含み、
iii）請求項１２に記載の細胞を含む、
植物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の植物であって、請求項１〜１０のいずれかで定義する内在性（又は内在性で機能的な）タンパク質が前記植物内に存在しない、前記植物。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の植物から取得可能な植物繁殖材料（例えば、植物の種子）。
【請求項１６】
請求項１３又は１４に記載の植物の採取された葉、又は請求項１５に記載の繁殖材料から繁殖させた植物から取得可能な採取された葉、又は請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により取得可能な植物から取得可能な採取された葉。
【請求項１７】
裁断された採取された葉である、請求項１３又は１４に記載の植物の採取された葉。
【請求項１８】
ａ．請求項１２に記載の植物細胞を含み、
ｂ．請求項１〜１１のいずれかに記載の方法から取得可能な植物から取得可能であり、
ｃ．請求項１３又は１４に記載の植物を加工することから取得可能であり、
ｄ．請求項１５に記載の植物繁殖材料から繁殖させた植物から取得可能であり、
ｅ．請求項１６又は１７に記載の採取された葉を加工することにより取得可能である、
加工された葉（好ましくは、非生存性の加工された葉）。
【請求項１９】
植物又は葉が、乾燥、発酵、パスチャライジング、又はその組合せにより加工される、請求項１８に記載の加工された葉。
【請求項２０】
裁断された加工された葉である、請求項１８又は１９に記載の加工された葉。
【請求項２１】
植物がナス科（Solanaceae）である、
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法、
請求項１２に記載の植物細胞、
請求項１３又は１４に記載の植物、
請求項１５に記載の植物繁殖材料、
請求項１６又は１７に記載の採取された葉、又は
請求項１８〜２０のいずれかに記載の加工された葉。
【請求項２２】
植物がヤコウカ（Cestoideae）亜科である、請求項２１に記載の方法、細胞、植物、植物繁殖材料、採取された葉、又は加工された葉。
【請求項２３】
植物がニコチアナ属であり、タンパク質が、配列番号３として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み、及び側芽の発芽が、前記タンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止することにより低下している、請求項２２に記載の方法、細胞、植物、植物繁殖材料、採取された葉、又は加工された葉。
【請求項２４】
植物がニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）である、請求項２３に記載の方法、細胞、植物、植物繁殖材料、採取された葉、又は加工された葉。
【請求項２５】
植物が、トマト、キュウリ、ナス、カボチャ、ペチュニア、ナデシコ、トウヒ属、マツ属、ユーカリ、ポプラ属、ジャガイモ、タバコ、綿、レタス、ナス、メロン、カボチャ、エンドウマメ、キャノーラ、大豆、サトウダイコン、ヒマワリ、小麦、大麦、ライ麦、米、及びトウモロコシ、コショウ、ズッキーニ、芽キャベツ、ブロッコリー、及びカリフラワーからなる群から選択される、
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法、
請求項１２に記載の植物細胞、
請求項１３又は１４に記載の植物、
請求項１５に記載の植物繁殖材料、
請求項１６又は１７に記載の採取された葉、又は
請求項１８又は１９に記載の加工された葉。
【請求項２６】
ａ．請求項２３又は２４に記載のタバコ植物又はその一部から調製される、
ｂ．請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により取得される、又は取得可能なタバコ植物又はその一部（好ましくは、前記植物から採取された葉）から調製される、
ｃ．請求項２３又は２４に記載の植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物（好ましくは葉）から調製される、
ｄ．請求項２３又は２４に記載の採取されたタバコ葉から調製される、
ｅ．請求項２３又は２４に記載の加工されたタバコ葉から調製される、
ｆ．請求項２３又は２４に記載のタバコ植物から取得されるタバコ植物抽出物から調製される、又はそれを含む、
タバコ製品。
【請求項２７】
喫煙物品である、請求項２６に記載のタバコ製品。
【請求項２８】
無煙タバコ製品である、請求項２７に記載のタバコ製品。
【請求項２９】
タバコ加熱デバイス、例えば、エアゾール発生デバイスである、請求項２７に記載のタバコ製品。
【請求項３０】
請求項１３又は１４に記載の植物の、又は前記植物の一部分の植物抽出物（例えば、タバコ抽出物）。
【請求項３１】
請求項２６〜２９のいずれかで定義する製品を製造するための、
ａ．請求項２３又は２４に記載のタバコ植物、又はその一部、
ｂ．請求項２３又は２４に記載の植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物（好ましくは、葉）、
ｃ．請求項２３又は２４に記載の採取されたタバコ葉、
ｄ．請求項２３又は２４に記載の加工されたタバコ葉、
ｅ．請求項２３又は２４に記載のタバコ植物から取得されたタバコ植物抽出物
の使用。
【請求項３２】
植物を育成するための、請求項１３又は１４に記載の植物の使用。
【請求項３３】
作物を成長させるための、請求項１３又は１４に記載の植物の使用。
【請求項３４】
葉（例えば、加工された（好ましくは乾燥された）の葉）を製造するための、請求項１３又は１４に記載の植物の使用。
【請求項３５】
配列番号３の配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質を含むタバコ植物又は種子であって、前記タンパク質が、配列番号３の位置２３４に対応するアミノ酸位置において、非許容性のアミノ酸置換を含み、好ましくは置換がＴ２３４Ｉである、前記タバコ植物又は種子。
【請求項３６】
その中に、配列番号３の配列を含むタンパク質又はそのバリアントに対応する内在性の機能的タンパク質が存在しない、請求項３５に記載のタバコ植物又は種子。
【請求項３７】
植物が、ホモ接合性である、請求項３５又は３６に記載のタバコ植物又は種子。
【請求項３８】
植物が、ニコチアナ・タバカム又はニコチアナ・ルスティカである、請求項３５〜３７のいずれかに記載のタバコ植物又は種子。
【請求項３９】
側芽の発芽を低下又は遅延させるための、請求項３５〜３８のいずれかに記載のタバコ植物の使用。
【請求項４０】
側芽の発芽を低下又は遅延させるための、配列番号１若しくは配列番号２のポリヌクレオチド、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号１及び配列番号２のＣ２３０３Ｔ及びＣ７０１Ｔにそれぞれ対応する位置に変異を含むポリヌクレオチドの使用。
【請求項４１】
配列番号４の配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質を含むトマト植物又は種子であって、前記タンパク質が、配列番号４の位置２３２に対応するアミノ酸位置において非許容性のアミノ酸置換を含み、好ましくは置換がＴ２３２Ｉである、前記トマト植物又は種子。
【請求項４２】
その中に、配列番号４の配列を含むタンパク質又はそのバリアントに対応する内在性の機能的タンパク質が存在しない、請求項４１に記載のトマト植物又は種子。
【請求項４３】
植物が、ホモ接合性である、請求項４１又は４２に記載のトマト植物又は種子。
【請求項４４】
植物が、トマト（Solanum lycopersicum）である、請求項４１〜４３のいずれかに記載のトマト植物又は種子。
【請求項４５】
側芽の発芽を低下又は遅延させるための、請求項４１〜４４のいずれかに記載のトマト植物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の側芽の発芽（lateral budding）を改変する方法、及び細胞、植物、植物繁殖材料、採取された葉、加工された（processed）葉、又はその派生製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の形態制御は、生産性及び収率を増強し、耕作及び採取効率を改善し、並びに美的望ましさを実現するための、農業目的又は植栽目的の植物の商業生産において非常に重要である。
【０００３】
形態的な変化が、物理的損傷、草食動物の捕食、病原体感染、低温、高温、及び干ばつを含む、植物に対する環境影響の結果として多くの場合生ずる。そのような変化は、物理的に（剪定、ベンディング、タイピング、ステーキング、又は特別な器官又は構造の切除）、又は化学的に（農薬及び植物成長構造の適用）ヒトが介入することにより多くの場合もたらされる。
【０００４】
形態的変化の制御とこれによる植物の形態改変といった特定の応用例として、葉の腋芽分裂組織からの側枝伸長を調節する、好ましくは阻止する、又は遅延させる場合が挙げられる。側枝の伸長は、茎頂の優越性が除去されると；例えば、物理的損傷若しくは草食動物による捕食を通じて偶発的に、又は農耕作業、例えば摘花の一環として茎頂が損傷を受ける、若しくは除去されると、最も一般的に発生する。例えば、内在性の植物成長物質の産生、輸送、検出、又は代謝を改変するその他の変化も、腋芽分裂組織からの伸長を引き起こす可能性がある。側枝、又は「吸枝」は、純粋に美学理由から望ましくないと考えられ、使用に適さない形態を有する植物を生成し得る、又は様々な代謝物又は植物成長物質に対する追加のソース（source）若しくはシンク（sink）として作用することにより全体として植物に対して有害な代謝的効果を有し得る。
【０００５】
側芽の伸長が生ずる１つの例として、ナス科植物を商業培養する場合が挙げられる。例えば、タバコ植物の培養期間中、残りの葉の成長及び発育を刺激するために、根の成長を増強するために、並びに代謝物及び二次化合物の植物葉への再分配を促進するために、「摘花」と呼ばれるプロセスにおいて、植物の成長期間中の特定の時期に、花序及び最上葉を含む茎頂が除去される。摘花プロセスの欠点として、側枝の伸長も刺激し、これにより代謝物の所望の再分配が相殺されてしまうことが挙げられる。この効果は、極めて労働集約的な側枝の物理的除去により、又は化学的徒長抑制剤、例えばマレイン酸ヒドラジド等の適用により一般的に克服されるが、材料に関してやはりコストが嵩み、また採取された植物に残留化学物質が残るおそれがある。
【０００６】
トマト植物の培養期間中、植物の生産及び健康を改善するために、吸枝は一般的に切り取られる。但し、吸枝の剪定は、植物に不必要な損傷を与えるおそれがあり、また植物を病気にかかりやすくさせるおそれがある。
【０００７】
さらに、例えば、特定の農作物では、植物の側芽の発芽が増加することが望ましい状況も存在する。
【０００８】
側芽の伸長を特異的に標的とすることにより、そのような「吸枝」を改変する、好ましくは低下させるシステムは、したがって、植物の商業的培養に対して非常に大きな利益をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質の発現又は機能を改変するステップを含む、植物の側芽の発芽を改変する方法を提供する。
【００１０】
１つの実施形態では、本発明は、前記タンパク質の発現又は機能を低下又は阻止することにより、側芽の発芽を低下及び／又は遅延させる方法を提供する。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、前記タンパク質の発現又は機能を増加させることにより、側芽の発芽を増加及び／又は迅速化させる方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による方法により取得可能な（例えば、取得された）植物細胞を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、
ｉ）本発明の方法により取得可能であり、
ii）本発明の改変された核酸配列を含み、
iii）本発明の細胞を含む、
植物を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、本発明の植物から取得可能な植物繁殖材料（例えば、植物の種子）を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の植物の採取された葉、又は本発明の繁殖材料から繁殖させた植物から取得可能な採取された葉、又は本発明の方法により取得可能な植物から取得可能な採取された葉を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、
ａ．本発明の植物細胞を含み、
ｂ．本発明の方法から取得可能な植物から取得可能であり、
ｃ．本発明の植物を加工することから取得可能であり、
ｄ．本発明の植物繁殖材料から繁殖させた植物から取得可能であり、
ｅ．本発明の採取された葉を加工することにより取得可能である、
加工された葉（好ましくは、非生存性の加工された葉）を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、
ａ．本発明のタバコ植物又はその一部から調製される、
ｂ．本発明の方法により取得された、又は取得可能なタバコ植物又はその一部（好ましくは、植物から採取された葉）から調製される、
ｃ．本発明の植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物（好ましくは葉）から調製される、
ｄ．本発明の採取されたタバコ葉から調製される、
ｅ．本発明の加工されたタバコ葉から調製される、
ｆ．本発明のタバコ植物から取得されたタバコ植物抽出物から調製される、又はそれを含む、
タバコ製品を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明による植物の、又は前記植物の一部分の植物抽出物を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、植物を育成するための、本発明の植物の使用を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、作物を成長させるための、本発明による植物の使用を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、葉（例えば、加工された（好ましくは、乾燥させた）葉）を製造するための、本発明による植物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
ここで、添付図面を参照しながら、例示目的に限定して、本発明の実施形態を記載する。
【図１】デジタルフェノタイピングを使用して決定した、対照Ｋ３２６植物及び変異体ＴＦＡ０５１２植物における、２４時間間隔での側芽の発芽レベルを示す図である。
【図２】側芽バイオマスの重量により決定した、対照Ｋ３２６植物及び変異体ＴＦＡ０５１２植物における、摘花の１４日後の側芽の発芽レベルを示す図である。
【図３】側芽バイオマスの重量により決定した、対照Ｋ３２６植物及び変異体ＴＦＡ０５１２植物における、側芽の発芽レベルを示す図である。
【図４】ピクセルカウントを作成して吸枝の成長を決定するための画像解析アルゴリズムのアウトプット画像の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明者らは、驚くべきことに、植物における側芽の発芽が、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を改変することにより改変され得ることを初めて示した。
【００２４】
側芽の発芽
側芽の発芽（吸枝発生（suckering））とは、葉の腋芽分裂組織からの側枝伸長を意味する。側枝の伸長は、茎頂の優越性が除去されると、例えば、物理的損傷若しくは草食動物による捕食を通じて偶発的に、又は農耕作業、例えば摘花の一環として茎頂が損傷を受ける、若しくは除去されると最も一般的に発生する。例えば、内在性の植物成長物質の産生、輸送、検出、又は代謝を改変するその他の変化も、腋芽分裂組織からの伸長を引き起こす可能性がある。
【００２５】
「側芽の発芽を改変する」は、本明細書では、植物における側芽の発芽及び／又は側枝の成長のレベル又は量を変化させることを指すのに使用される。特に、「側芽の発芽を改変する」は、植物における側芽の発芽及び／若しくは側枝の成長を低下／減少させ、及び／若しくは遅延させること；又は植物における側芽の発芽及び／若しくは側枝の成長を増加若しくは迅速化させることを意味し得る。
【００２６】
１つの実施形態では、「側芽の発芽を改変する」とは、植物における側芽の発芽及び／又は側枝の成長を低下／減少させ、及び／又は遅延させることを意味し得る。
【００２７】
１つの実施形態では、「側芽の発芽を改変する」とは、植物における側芽の発芽及び／又は側枝の成長を低下／減少させること意味し得る。
【００２８】
１つの実施形態では、本発明の方法を実施して、配列番号３、４又は５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止することにより、側芽の発芽は低下及び／又は遅延する。
【００２９】
植物、例えばタバコ植物における側芽の発芽の低下及び／又は遅延は、極めて有利な技術的効果である。
【００３０】
用語「側芽の発芽を低下させる」又は「側芽の発芽の低下」は、植物における側芽の発芽の量及び／又はレベルが同等の植物に比べて低下していることを意味するように、本明細書では使用される。例えば、同等の植物とは、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性は同一であった（例えば、植物種、成長条件等）植物である。
【００３１】
「側芽の発芽を低下させる」とは、同等の植物に関連して、側芽及び／若しくは側枝の数がより少ない；側芽及び／若しくは側枝のバイオマスがより少ない；並びに／又は側芽及び／若しくは側枝の成長速度がより低いことを意味し得る。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「側芽の発芽を遅延させる」とは、植物における側芽の発芽が、本発明に基づく改変植物では、同等の（対照）植物と比較してそれよりも遅れて生ずることを意味する。例えば、同等の（対照）植物は、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性（例えば、植物種、成長条件等）は同一であった植物である。遅延の長さは、植物種に依存し得る。但し、いくつかの種、例えばタバコ等では、遅延は、本発明により改変されなかった同等の植物と比較して、２週間を超える、好ましくは４週間を超える、好ましくは６週間を超える可能性がある。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明の方法を実施すると、その結果、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止するように改変されなかった植物と比較したとき、側芽の発芽が低下及び／又は遅延する。
【００３４】
側芽の発芽の量及び／又はレベルを決定するための当技術分野において公知の任意の方法は、本発明の文脈において利用可能である。例えば、本明細書に記載する実施例において詳記するような方法が利用可能である。特に、側芽成長のデジタルフェノタイピング、又は側芽バイオマスの重量が決定され得る。
【００３５】
１つの実施形態では、側芽の発芽の量及び／又はレベルは、本発明により改変されなかった同等の植物に関連して少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は１００％低下し得る。いくつかの実施形態では、側芽の発芽の量及び／又はレベルは、本発明により改変されなかった同等の植物に関連して約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、３０％〜約７０％、又は約４０％〜６０％低下し得る。
【００３６】
１つの実施形態では、本発明の方法を実施して、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を増加させることにより、側芽の発芽は増加及び／又は迅速化する。
【００３７】
用語「側芽の発芽の増加」は、植物における側芽の発芽の量及び／又はレベルが、同等の植物に関連してそれより多いことを意味するように、本明細書では使用される。例えば、同等の植物とは、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性（例えば、植物種、成長条件等）は同一であった植物である。
【００３８】
「側芽の発芽の増加」とは、同等の植物に関連して、それよりも側芽及び／若しくは側枝の数が多いこと；側芽及び／若しくは側枝のバイオマスが増加していること；及び／又は側芽及び／若しくは側枝の成長速度が増加していることを意味し得る。
【００３９】
用語「側芽の発芽の迅速化」とは、本明細書で用いる場合、植物における側芽の発芽が、本発明に基づく改変植物において、同等である（対照）植物と比較してそれより早期に生ずることを意味する。例えば、同等の（対照）植物は、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連するすべての特性（例えば、植物種、成長条件等）は同一であった植物である。側芽の発芽の正確な時期は、植物種に依存し得る。但し、いくつかの種では、側芽の発芽は、本発明により改変されなかった同等の植物と比較して、それより２週間超、好ましくは４週間超、好ましくは６週間超、迅速化し得る。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明の方法を実施すると、その結果、配列番号３、４又は５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能が増加するように改変されなかった植物と比較して、側芽の発芽が増加及び／又は迅速化する。
【００４１】
１つの実施形態では、側芽の発芽の量及び／又はレベルは、本発明により改変されなかった同等の植物に関連して、それよりも少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は１００％増加し得る。いくつかの実施形態では、側芽の発芽の量及び／又はレベルは、本発明により改変されなかった同等の植物に関連して、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、３０％〜約７０％、又は約４０％〜６０％増加し得る。
【００４２】
タンパク質
本明細書で用いる場合、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義である。いくつかの事例では、用語「タンパク質」は、用語「ペプチド」と同義である。
【００４３】
用語「タンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止する」、又は「タンパク質の発現又は機能の低下又は阻止」は、本発明の製品、方法、又は使用において、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の量／レベル又は活性が、同等の製品、方法、又は使用に関連して低下していることを意味するように、本明細書では使用される。例えば、同等の製品は、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性（例えば、植物種、成長条件、加工方法等）は同一であった植物に由来する。
【００４４】
配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を低下させる、又は阻止するように改変されなかった同等の植物から取得可能な又は取得された葉、採取された植物の葉、加工された植物の葉、植物の製品、又はその組合せと比較したとき、本発明の植物から取得可能な又は取得された植物の葉、採取された植物の葉、加工された植物の葉、植物の製品、又はその組合せにおいて低下し得る。
【００４５】
１つの実施形態では、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を低下させる、又は阻止するように改変されなかった同等の植物に関連して、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は１００％低下し得る。いくつかの実施形態では、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を低下させる、又は阻止するように改変されなかった同等の植物に関連して、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、３０％〜約７０％、又は約４０％〜６０％低下し得る。
【００４６】
用語「タンパク質の発現又は機能を増加させる（to increase）」、又は「タンパク質の発現又は機能を増加させる（increasing）」は、本発明の製品、方法、又は使用において、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の量／レベル、又は活性が、同等の製品、方法、又は使用に関連して、それより多いことを意味するように、本明細書では使用される。例えば、同等の製品は、本発明により改変されていないが、すべてのその他の関連する特性（例えば、植物種、成長条件、加工方法等）は同一であった植物に由来する。
【００４７】
配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現が増加するように改変されなかった同等の植物から取得可能な又は取得された葉、採取された植物の葉、加工された植物の葉、植物の製品、又はその組合せと比較したとき、本発明の植物から取得可能な又は取得された植物の葉、採取された植物の葉、加工された植物の葉、植物の製品、又はその組合せにおいて増加し得る。
【００４８】
「発現の増加」とは、ある植物が、同一品種の親植物の発現レベルと比較して、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルにおいて増加していることを意味する。発現レベルは、同一条件下で培養される同一品種の親植物内の対応する部分と比較される。発現レベルが、親植物の発現レベルを少なくとも１．１倍上回り増加するケースが、発現レベルが増加するケースとして好ましくはみなされる。この場合、発現レベルの増加が認められるとみなされるためには、植物の発現レベルが、親植物の発現レベルと比較して、ｔ−検定により５％の有意差を有するのがより好ましい。植物及び親植物の発現レベルが、同一の方法により同時に測定されるのが好ましい。但し、バックグラウンドデータとして保管されたデータも利用可能である。
【００４９】
１つの実施形態では、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現が増加するように改変されなかった同等の植物に関連して、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は１００％増加し得る。いくつかの実施形態では、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現が増加するように改変されなかった同等の植物に関連して、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、３０％〜約７０％、又は約４０％〜６０％増加し得る。
【００５０】
配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の量／レベルを決定する当技術分野において公知の任意の方法は、本発明の文脈において利用可能である。例えば、公知の方法、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等が利用可能である。配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現の改変は、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することによっても決定され得る。適するｍＲＮＡ測定法、例えばＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ｑＰＣＲは、当技術分野において公知である。
【００５１】
好適には、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の量／レベル又は活性は、加工された葉において改変され得る。
【００５２】
好適には、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の量／レベル又は活性は、植物の製品において改変され得る。
【００５３】
本明細書で用いる場合、アミノ酸配列は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、それから実質的に構成され得る、又はそれから構成され得る。
【００５４】
本明細書の実施例では、本発明者らは、配列番号３として示すアミノ酸配列は、タバコ植物における側芽の発芽の制御に関係することを確認した。
配列番号３
MATMGSFFILFFLVLTTTGSTISVVGEMVTVLSIDGGGIKGIIPATVLSFLESQLQELDNDENARLADYFDVIAGTSTGGILTTMISAPNEKGRPFSAAKDIVSFYFEHGPKIFPPGAWPPILAPKYDGKYLHKVLQDKLGETRLHQTLTNVVIPTFDMKKFQPTIFTKSEIANSPHLDAKMSDICIGTSAAPTYFPPYYFENDDGKGNQYEFNLIDGGVVAANPALVALSTVTYSAETDPSFAYIKPLDVKNILLLSLGTGTTADFAGKYTAQEAANWGLISWLFHNNSNPLRDMQSEASATMNDYYIATIYRALGAETNYLRIEENALTGTTTQMDNATEANMNLLKQIGENLLKKPASNGNSETNEEALKRFAKLLSERKKLRANKASQ
【００５５】
本発明は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有するタンパク質を含む（「相同的配列（複数可）」とも呼ばれる）。ここで、用語「ホモログ」とは、対象アミノ酸配列と所定の相同性を有するものを意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」に等しいとみなすことができる。
【００５６】
相同的アミノ酸配列は、機能的活性を保持するポリペプチド、すなわち配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列を提供すべきである。１つの実施形態では、相同的アミノ酸配列は、機能的活性を保持するポリペプチド、すなわち配列番号３として示すアミノ酸配列を提供してもよい。
【００５７】
一般的に、相同的配列は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列と同一の活性部位及び機能的ドメイン等を備える。１つの実施形態では、相同的配列は、配列番号３として示すアミノ酸配列と同一の活性部位及び機能的ドメイン等を備えてもよい。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても検討され得るが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性という表現を用いるのが好ましい。
【００５８】
１つの実施形態では、相同的配列は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列と比較して、１又は複数の付加、欠損、及び／又は置換を有するアミノ酸配列を含むものと理解される。１つの実施形態では、相同的配列は、配列番号３として示すアミノ酸配列と比較して、１又は複数の付加、欠損及び／又は置換を有するアミノ酸配列を含むものと理解される。
【００５９】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書で配列番号３、４、５として提示されるタンパク質、或いはこの（親）タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸等、又はそれより多くのアミノ酸、例えば１０若しくは１０個を超えるアミノ酸等が置換、欠損、若しくは付加することにより、親タンパク質に由来するタンパク質であって、かつ親タンパク質の活性を有するタンパク質に関する。
【００６０】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書で配列番号３、４、５として提示されるタンパク質をコードする、又はこの（親）タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９個のアミノ酸等、若しくはそれより多くのアミノ酸、例えば１０若しくは１０個を超えるアミノ酸等が置換、欠損、若しくは付加することにより親タンパク質に由来し、また親タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（又は遺伝子）に関する。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書で配列番号３、４、５として提示される、又はアミノ酸配列が、配列番号３、４、５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００６２】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書で配列番号３として提示される、又はアミノ酸配列が、配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００６３】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書で配列番号４として提示される、又はアミノ酸配列が、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００６４】
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書で配列番号５として提示される、又はアミノ酸配列が、配列番号５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００６５】
核酸配列／ポリヌクレオチド
本方法は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列若しくはポリヌクレオチドに変異をもたらすステップを含み得る。
【００６６】
用語「核酸配列」又は「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で用いる場合、オリゴヌクレオチド配列、又はポリヌクレオチド配列、並びにバリアント、ホモログ、断片及び誘導体（例えば、その一部分等）を意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来であり得るが、二本鎖であっても、一本鎖であってもよく、センスストランド又はアンチセンスストランドのいずれを示すかを問わない。
【００６７】
用語「核酸配列」又は「ポリヌクレオチド」は、本発明に関連して、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡを意味し得る。
【００６８】
１つの実施形態では、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列又はポリヌクレオチドは、配列番号２として示す核酸配列を含み得る。
配列番号２
atggcaactatgggatctttttttattttattttttttggtactgacaactactggatcaacaatctctgtggtgggagaaatggtgactgttcttagcattgatggaggtggcattaaaggcatcatccctgctactgttctttcttttttggaaagccaactccaggaattagacaatgatgaaaatgcaagacttgcagattactttgatgtgattgcggggacaagtacaggtggcatattgaccactatgataagtgctccaaatgaaaagggtcgtcccttctctgcggccaaagatattgtatcattttacttcgagcatggccctaagatttttccacctggggcctggcctcccattttggcccccaaatatgatggaaaatatcttcacaaagttctgcaagataagttgggagagactcgtttgcatcagactttaacaaatgttgttattccaacctttgacatgaaaaaatttcagccaacaatattcaccaagtcggagatagcaaactctcctcatttggatgctaagatgtctgacatatgcattggcacctcggcagctccaacttattttcctccatattactttgagaatgatgatggtaaaggaaatcagtatgagtttaatcttattgatggtggtgttgttgctgccaatccggccttagttgccctaagcacagtaacctacagtgcggaaacggatccatcatttgcttatatcaagccattggacgtcaaaaacattctgctgctctcgttagggaccggcactactgctgattttgctgggaaatacacagcacaggaggcagctaattggggtcttatttcctggctgtttcataataattcgaatcctcttcgtgatatgcaatctgaagcaagtgctaccatgaatgattattacattgccaccatctatcgagctcttggtgctgaaacgaattacctcaggattgaagaaaatgcattaactggcactacaacccaaatggataatgctacagaggctaatatgaacttattgaaacaaattggtgaaaacttgttgaagaaaccagcttccaatgggaattctgaaaccaatgaggaagctctaaagaggtttgcaaaattactctcagaaaggaagaaactccgagcaaacaaagcttctcaataa
【００６９】
配列番号２として示す核酸配列に転写されるゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１として示す核酸配列又はポリヌクレオチドを含み得る。
配列番号１
agaaaatctcaatacttgaactattaattgtttttgcaacatttgtagtccgaaaaagatactctaagtatctgaaatggcaactatgggatctttttttattttattttttttggtactgacaactactggatcaacaatctctgtggtgggagaaatggtgactgttcttagcattgatggaggtggcattaaaggcatcatccctgctactgttctttcttttttggaaagccaactccaggtatactgtaaacatattttccatggtttcttaattgtttcttggctttttctttttattacttggggcttatattttcctgattgatgaatgattgtttttgagtcaggaattagacaatgatgaaaatgcaagacttgcagattactttgatgtgattgcggggacaagtacaggtggcatattgaccactatgataagtgctccaaatgaaaagggtcgtcccttctctgcggccaaagatattgtatcattttacttcgagcatggccctaagatttttccacctgggtacatatggtttttatatatttaacacttagtatattctaaggatgtgtttatttagtagtacgaaaatattttttttatgaatttatgttcgttaggaaaaaattattttcctaccaaaaggagagaaaattattttttaaaacttttttcgacctttctcactgtattgtctaataaaatagatttggtttcatttgcagggcctggcctcccattttggcccccaaatatgatggaaaatatcttcacaaagttctgcaagataagttgggagagactcgtttgcatcagactttaacaaatgttgttattccaacctttgacatgaaaaaatttcagccaacaatattcaccaagtcggaggtaagtcttccataaatcatatcatctggatatgtaagtgcaaatattagttagtttttatttttctattttatggatatatggctagtaattattctttattatgaaacaaatacagatagcaaactctcctcatttggatgctaagatgtctgacatatgcattggcacctcggcagctccaacttattttcctccatattactttgagaatgatgatggtaaaggaaatcagtatgagtttaatcttattgatggtggtgttgttgctgccaatccggtacattccctcatataaatcatcttaatttctcaatcttcttttgttattccaaaagaattaatttagatgtctgtttaattagtgtggattatttcacgtgattttttcaatatgtatgctcatttactctactttaataatcatatgggtttttgattatcatataaatcagtgtgtcatcttactacttgttactactactttctttttattttttcttgtgacggggtctatcggaaacattttctctaacttcaaggtcggggtaaggtctgcgtacacattactctcccagaccccacttgtaggattatattagatttattgttgtagtagtttatataaagaaatttattctccctccgttcacttttacttgtctactatactaaaaatatattttcatttttatctgtccattttagcaaatcatgagaaagacaatctttttttccgtttacccttatcattaaatactcatttctcaaattatttttcaagactttttgaaatgctatcatatttatatgtaaaattataaaatacatacttcgtttattttttcttaaagggattgaaaagtcaaaagtggacaactcaaaatgaaaggaaggagtatatgaataactaggatgtagcatgctttagtaatagtagcgctcacttttgtaacaatgcaaattaatacataaaatatttgcttttgtcacaaaaaaaaaaaaatactccctccatctcatattatcagtcgtgtttactaaaaatatttatctcaaattttttgtcacttagaagttcaagataaaattgatttttttttctttttttacccttagtaataattattttttaagatggagataacacataaaaagaataaatatttaatttaatgaagagagattttatcttaagacataaataagggtaaaatagtttaatccctttcctaattaatatttcttatgggacgtataaaagataaacacgacagagaatttgagacagatggagtagtaattagtagacatttaaaatgacttctaattgatcataaatgttaattagtgcatacatatacaatggttgacaggccttagttgccctaagcacagtaacctacagtgcggaaacggatccatcatttgcttatatcaagccattggacgtcaaaaacattctgctgctctcgttagggaccggcactactgctgattttgctgggaaatacacagcacaggaggcagctaattggggtcttatttcctggctgtttcataataattcgaatcctcttcgtgatatgcaatctgaagcaagtgctaccatgaatgattattacattgccaccatctatcgagctcttggtgctgaaacgaattacctcaggattgaagtaaggcaatctagctcaacaatagcgtaacactcctaattactccctccgttctaatttatgtggcgaagtttaaattagtacggagtttaagagaaaaaagatttttgaaatttatgatgtaaaacaagttatatatatatataagtctcattaaggacaatataggaaatttaagttacaaagtttataaaatttagaatattgctattctttttgcaatagactaaaaatgaaatattgtcacataaattggaacaaaggaagtactatatgattatttcaagttgattatttaagaggggaattaaaactcaccatttcctctccttttaaattatgttcctttctttgtatgtaataacaggaaaatgcattaactggcactacaacccaaatggataatgctacagaggctaatatgaacttattgaaacaaattggtgaaaacttgttgaagaaaccagcttccaatgggaattctgaaaccaatgaggaagctctaaagaggtaaaaacacatatatattatttttatctatttagagtctcctttttgctcgaattaaaaatctattttatttctacttataatagttttctttgtacgtaggtttgcaaaattactctcagaaaggaagaaactccgagcaaacaaagcttctcaataattctaaggtcatgctaaagaataagcgcttgtaaggttgagggataaatttcaatagaaatattgctctatgtaatatgctaaggactatgtaaccttttggttgtctgataaataaataaaatcatccttctaagacaaaacaacataaaaagaaagggaa
【００７０】
本明細書で用いる場合、核酸配列は、配列番号１、２、６又は７として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列（若しくはポリヌクレオチド）を含み得る、それから実質的に構成され得る、若しくはそれから構成され得る。
【００７１】
本発明は、配列番号１、２、６又は７として示す核酸配列（又はポリヌクレオチド）とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する核酸配列も含む（「相同的配列（複数可）」とも呼ばれる）。ここで、用語「ホモログ」とは、対象核酸配列と所定の相同性を有するものを意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」に等しいとみなすことができる。
【００７２】
相同的核酸配列（又はポリヌクレオチド）は、機能的活性を保持するポリペプチド、すなわち配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列をコードすべきである。１つの実施形態では、相同的核酸配列は、機能的活性を保持するポリペプチド、すなわち配列番号３として示すアミノ酸配列をコードすべきである。
【００７３】
一般的に、相同的配列は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列と同一の活性部位及び機能的ドメイン等を備えるタンパク質をコードする。１つの実施形態では、相同的配列は、配列番号３として示すアミノ酸配列と同一の活性部位及び機能的ドメイン等を備えるタンパク質をコードする。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても検討され得るが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性という表現を用いるのが好ましい。
【００７４】
核酸配列又はポリヌクレオチドは、配列番号１、２、６又は７として示す配列、又は配列番号１、２、６又は７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００７５】
核酸配列又はポリヌクレオチドは、配列番号１として示す配列、又は配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００７６】
核酸配列又はポリヌクレオチドは、配列番号２として示す配列、又は配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００７７】
核酸配列又はポリヌクレオチドは、配列番号６として示す配列、又は配列番号６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００７８】
核酸配列又はポリヌクレオチドは、配列番号７として示す配列、又は配列番号７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００７９】
配列同一性
相同性、又は同一性の比較は、目視により、又はより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。このような市販のコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性の割合（％）を計算することができる。
【００８０】
相同性の割合（％）又は同一性の割合（％）は、連続した配列について計算され得る、すなわち一方の配列が他方の配列とアラインメントされ、そして一方の配列内の各アミノ酸が他方の配列内の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較される。これは「非ギャップ」アラインメントと呼ばれる。一般的に、そのような非ギャップアラインメントは、残基数が比較的短い場合にのみ実施される。
【００８１】
これは、非常に単純で、一貫性のある方法であるが、例えば、１つの挿入又は欠損以外は同一である配列の対において、それ以降のアミノ酸残基がアラインメントから排除される原因となり、したがってグローバルアラインメントを実施したときに、相同性の割合（％）の著しい低下を引き起こす可能性があるという点が考慮されない。したがって、ほとんどの配列比較法は、挿入及び欠損の可能性を考慮して、全体的な相同性スコアに対して不当にペナルティーを科さない最適なアラインメントを作成するように設計される。これは、局所的相同性を最大化させるように、配列アラインメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【００８２】
但し、このより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸について、ギャップができる限り少なくなるように配列アラインメントを行い、２つの比較される配列間においてより高い関連性を反映させることにより、多くのギャップを有するスコアよりも高いスコアを実現するように、アラインメント内に生ずる各ギャップに対して「ギャップペナルティー」を割り振る。ギャップの存在に対して比較的高いコスト、及びギャップ内の後続する各残基に対してより小さなペナルティーを科す「アフィンギャップコスト」が一般的に用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーにより、もちろん、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーの修正を可能にする。但し、配列比較用にそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。
【００８３】
最大相同率（％）の計算は、したがってギャップペナルティーを考慮しつつ、最適なアラインメントの作成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実施するのに適するコンピュータープログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を実施することができるソフトウェアの例として、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照）、ＢＬＡＳＴ２（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、及びＡｌｉｇｎＸが挙げられるが、但しこれらに限定されない。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、及びＦＡＳＴＡが、オフライン及びオンラインサーチに利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60を参照）。
【００８４】
最終的な相同性の割合（％）は、同一性に関して測定可能であるが、アラインメントプロセスそのものは、一般的にオールオアナッシングの対比較に基づかない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較に対してスコアを割り振る、スケール化類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴパッケージプログラムのデフォルトマトリックスである。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムは、パブリックデフォルト値、又は供給される場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを一般的に使用する（さらに詳しくは、ユーザーマニュアルを参照）。いくつかの用途では、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩパッケージ用のデフォルト値を使用するのが好ましい。
【００８５】
或いは、相同性の割合（％）は、ＣＬＵＳＴＡＬに類似したアルゴリズムに基づき、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Invitrogen Corp.社）内の複数のアラインメント特性を用いて計算され得る（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）。
【００８６】
ソフトウェアが最適なアラインメントを作成したら、相同性の割合（％）、好ましくは配列同一性の割合（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、一般的に配列比較の一環としてこの計算を行い、そして数値結果を作成する。
【００８７】
配列同一性を決定するときに、ギャップペナルティーを使用する場合、ペアワイズアラインメント用として、下記のパラメーターが使用され得る：
【００８８】
【表１】
2019503180.tif 000002
【００８９】
１つの実施形態では、ＢＬＡＳＴは、上記で定義されたギャップペナルティー及びギャップエクステンションセットと共に利用可能である。
【００９０】
１つの実施形態では、ＣＬＵＳＴＡＬは、上記で定義されたギャップペナルティー及びギャップエクステンションセットと共に利用可能である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＢＬＡＳＴ又はＣＬＵＳＴＡＬアラインメントで用いられるギャップペナルティーは、これまでに詳記したギャップペナルティーとは異なる可能性がある。当業者は、ＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬアラインメントを実施するための標準パラメーターは定期的に変化し得るが、またＢＬＡＳＴ又はＣＬＵＳＴＡＬアラインメントアルゴリズムについて詳記された標準パラメーターに基づきしかるべきパラメーターを、その時に選択することができるものと認識する。
【００９２】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも４０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも６０個の連続したヌクレオチドについて、好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドについて決定される。
【００９３】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定され得る。
【００９４】
配列は、サイレント変化を引き起こし、機能的に同等の物質を生み出すアミノ酸残基の欠損、挿入、又は置換を有し得る。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいてなし得る。例えば、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる；正電荷を有するアミノ酸として、リジン及びアルギニンが挙げられる；並びに類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を備えるアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【００９５】
保存的置換は、例えば、下記の表に基づきなし得る。第２の列の同一ブロック内、及び好ましくは第３の列の同一行内のアミノ酸は、相互に置換し得る：
【００９６】
【表２】
2019503180.tif 000003
【００９７】
本発明は、生じる可能性がある相同的置換（置換及び交換は、いずれも既存のアミノ酸残基と代替残基とが相互に交換することを意味するために本明細書で用いられる）、すなわち似た者同士の置換、例えば塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性等の置換も含む。１つのクラスの残基から別のクラスに、また或いは非天然のアミノ酸、例えばオルニチン（以後、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシン等の組込みを含め、相同的ではない置換も生じる可能性がある。
【００９８】
交換は、非天然アミノ酸によってもなされる可能性があり、非天然アミノ酸として、アルファ＊及びアルファ−二置換型＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化合物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊等、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が含まれる。＊の表記は上記考察のために（相同的又は相同的ではない置換に関連して）利用されており、誘導体の疎水的性質を表し、一方、＃は誘導体の親水性の性質を表し、＃＊は、両親媒性の特徴を表すのに利用されている。
【００９９】
バリアントのアミノ酸配列は、アミノ酸スペーサー、例えばグリシン又はβ−アラニン残基等に付加して、アルキル基、例えば、メチル、エチル、又はプロピル基等を含む、配列内の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る、好適なスペーサー基を含み得る。さらなる変化形態は、ペプトイド形態内の１又は２以上のアミノ酸残基の存在と関係し、当業者には十分に理解される。誤解を回避するために、α炭素置換基がα炭素ではなく残基の窒素原子上にあるようなバリアントのアミノ酸残基を指すのに「ペプトイド形態」が用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は、当技術分野、例えばSimon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134において公知である。
【０１００】
本発明は、本発明の核酸配列に対して相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれと相補的な配列とハイブリダイズする能力を有する配列も含む。
【０１０１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いる場合、「核酸のストランドが塩基対形成を通じて、相補鎖と結合するプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスが含まれるものとする。
【０１０２】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列とも関連する（本明細書に提示するヌクレオチド配列の相補的な配列を含む）。
【０１０３】
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で決定される（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０１０４】
より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件下で決定される（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０１０５】
発現の低下又は阻止
タンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止するための当技術分野において公知の任意の方法が、本方法で利用可能である。
【０１０６】
例として、本方法は、
・配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列に変異を起こさせるステップ；
・配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現制御に寄与する制御領域（例えば、プロモーター及びエンハンサー）に変異を起こさせるステップ；
・配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低下させるアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを提供するステップ、
を含み得る。
【０１０７】
上記アプローチのそれぞれは、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能の低下又は阻止を引き起こす。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、用語「変異」は、天然の遺伝的バリアント又は工学的改変バリアントを含む。特に、用語「変異」とは、タンパク質の発現又は機能を低下させる配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列内の変化を意味する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、植物内に存在する、配列番号３、４又は５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の各コピーは、本明細書で定義するように変異する（例えば、植物内で前記タンパク質をコードする遺伝子の各ゲノムコピーが変異する）。例えば、Ｎ．タバカム（N. tabacum）の異質四倍体ゲノム内の遺伝子の各コピーは、変異し得る。
【０１１０】
好ましい実施形態では、本発明による植物又は植物細胞は、ホモ接合性である。
【０１１１】
１つの実施形態では、好ましくは、本発明による植物又は植物細胞は、変異した核酸のみを発現する。換言すれば、いくつかの実施形態では、内在性の（又は内在性で機能的な）タンパク質は、本発明による植物内に存在しない。換言すれば、内在性タンパク質が存在したとしても、不活性化した形態及び／又はトランケートされた形態であるのが好ましい。
【０１１２】
１つの実施形態では、本方法は、配列番号１、２、６又は７として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列内に変異を起こさせるステップを含み得る。
【０１１３】
変異は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列が、完全に又は部分的に欠損するように、さもなければ非機能的にするように、植物ゲノムを変化させる可能性がある。
【０１１４】
変異は、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を中断させる可能性がある。
【０１１５】
中断は、核酸配列が転写及び／又は翻訳されないようにする可能性がある。
【０１１６】
核酸配列は、例えば、タンパク質の翻訳が低下する又は阻止されるように核酸配列のＡＴＧ開始コドンを欠損させる、さもなければ変化させることにより中断され得る。
【０１１７】
核酸配列は、タンパク質の発現を低下させる、若しくは阻止する、又はタンパク質輸送に影響を及ぼす１若しくは２以上のヌクレオチド変化（複数可）を含み得る。例えば、タンパク質の発現は、１若しくは２以上の未成熟終止コドン、フレームシフト、スプライス変異体、又はオープンリーディングフレーム内の非許容性のアミノ酸置換（a non-tolerated amino acid substitution）の導入により低下し得る又は阻止され得る。
【０１１８】
未成熟終止コドンとは、終止コドンをオープンリーディングフレームに導入し、そして全アミノ酸配列の翻訳を阻止する変異を意味する。未成熟終止コドンは、ＴＡＧ（「ａｍｂｅｒ」）、ＴＡＡ（「ｏｃｈｒｅ」）、又はＴＧＡ（「ｏｐａｌ」又は「ｕｍｂｅｒ」）コドンであり得る。
【０１１９】
フレームシフト変異（フレーミングエラー又はリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れない、核酸配列内のいくつかのヌクレオチドのインデル（挿入又は欠損）により引き起こされた変異である。コドンによる遺伝子発現がトリプレットによるものであることから、挿入又は欠損は、リーディングフレームを変化させる可能性があり、オリジナルとは完全に異なる翻訳を引き起こす。フレームシフト変異は、多くの場合、変異の後ろのコドンが、異なるアミノ酸をコードするように読み取られてしまう原因となる。フレームシフト変異は、未成熟終止コドンの導入を一般的に引き起こす。
【０１２０】
スプライス変異体は、メッセンジャーＲＮＡ前駆体から成熟メッセンジャーＲＮＡへのプロセシング期間中にスプライシングが生ずる特異的部位においていくつかのヌクレオチドの挿入、欠損、又は変化を引き起こす。スプライシング部位が欠損すると、その結果、成熟ｍＲＮＡ内に１又は２以上のイントロンが残留することとなり、異常タンパク質の生成を引き起こす可能性がある。
【０１２１】
非許容性のアミノ酸置換とは、タンパク質の機能の低下又は削剥を引き起こすタンパク質内の非同義的アミノ酸置換の原因となる変異を意味する。
【０１２２】
核酸配列に変異をもたらす当技術分野において公知の任意の方法は、本方法で利用可能である。例えば、相同的な組換えが利用可能であり、そのような組換えでは、関連する核酸配列（複数可）を変異させ、そして植物又は植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターが作製される。変異した配列を発現する組換え植物又は植物細胞が、次に選択され得る。
【０１２３】
１つの実施形態では、変異は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質に非許容性のアミノ酸置換を導入する。例えば、変異は、配列番号３（配列番号１のＣ２３０３Ｔ変異に対応する）として示す核酸配列内のＣ７０１Ｔ変異に対応する可能性がある。これは、配列番号３の位置２３４のＴｈｒからＩｌｅ置換を引き起こす（Ｔ２３４Ｉ）。
【０１２４】
１つの実施形態では、変異は、配列番号３、４、５として示すタンパク質、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列に関連して、タンパク質の活性を低下させる。
【０１２５】
１つの実施形態では、変異は、レベル又は発現を変化させないが、配列番号３、４、５として示すタンパク質、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列に関連して、タンパク質の活性を低下させる。
【０１２６】
核酸配列は、完全に又は部分的に欠損し得る。欠損は、連続的であり得る、又は複数のセクションの配列を含み得る。欠損は、核酸配列が機能的タンパク質をもはやコードしないように、十分な量のヌクレオチド配列を取り除くのが好ましい。欠損は、例えば核酸配列のコーディング部分の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％を除去し得る。
【０１２７】
欠損は、全部であり得、この場合同等の非改変型植物の対応するゲノムと比較したとき、核酸配列のコーディング部分の１００％が存在しない。
【０１２８】
植物内の核酸配列を欠損させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、相同的な組換えが利用可能であり、同法では、関連する核酸配列（複数可）が欠如しており、植物又は植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターが構築される。配列の新規の部分を発現する組換え植物又は植物細胞が、次に選択され得る。
【０１２９】
上記ベクターを用いて形質転換された植物細胞は、例えばアミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の必要な成長因子が補給された好適な培養培地内で細胞を培養すること等による、周知の組織培養法に基づき増殖及び維持され得る。
【０１３０】
核酸配列の修飾は、標的化変異誘発法（標的化ヌクレオチド交換法（ＴＮＥ，targeted nucleotide exchange）、又はオリゴ変異誘発法（ＯＤＭ，oligo-directed mutagenesis）とも呼ばれる）を使用して実施され得る。標的化変異誘発法として、非限定的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（国際公開第２０１１／０７２２４６号及び同第２０１０／０７９４３０号を参照）、Ｃａｓ９−様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲシステム（国際公開第２０１４／０７１００６号及び同第２０１４／０９３６２２号を参照）、メガヌクレアーゼ（国際公開第２００７／０４７８５９号及び同第２００９／０５９１９５号を参照）を利用する方法、又はおそらくは遺伝子に対する配列相補性を用いて、植物プロトプラストへの変異誘発を増強するための化学修飾されたヌクレオチドを含有する変異原性オリゴヌクレオチドを利用する標的化変異誘発法が挙げられる（例えば、KeyBase（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）。
【０１３１】
或いは、変異誘発システム、例えばゲノム内局所損傷誘導標的設定法（ＴＩＬＬＩＮＧ，Targeting Induced Local Lesions IN Genomics; McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, and McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442、いずれも参照として本明細書に組み込まれている）等が、変異を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む植物系統を生成するのに利用可能である。ＴＩＬＬＩＮＧは、従来型の化学的変異誘発法（例えば、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ，ethyl methanesulfonate）変異誘発法）、その後に変異に関してハイスループットスクリーニングを使用する。こうして、所望の変異を有する遺伝子を含む植物、種子、及び組織が取得され得る。
【０１３２】
方法は、植物種子に変異を誘発するステップ（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、植物の個体又はＤＮＡをプールするステップ、所望の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出、変異体植物の同定、変異体ＰＣＲ産物の配列決定を含み得る。その他の変異誘発法及び選択方法も、そのような改変された植物を生成するのに同じように使用され得るものと理解される。種子は、例えば、放射線処理され得る、又は化学的に処置され得るが、また植物は、改変された表現型についてスクリーニングされ得る。
【０１３３】
改変された植物は、分子法、例えばＤＮＡ中に存在する変異（複数可）等により、及び改変された表現型の特徴により、非改変植物、すなわち野生型植物から区別され得る。改変された植物は、変異についてホモ接合性又は異型接合性であり得る。
【０１３４】
１つの実施形態では、配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を低下させる、又は阻止する方法は、化学物質（例えば、農薬）を用いて植物を処置するステップを含まない。
【０１３５】
発現の増加
１つの態様では、本発明は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を増加させることにより、植物において側芽の発芽を増加させる方法を提供する。
【０１３６】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を増加させることにより、植物において側芽を増加させる方法を提供する。
【０１３７】
発現の増加は、当業者にとって公知の任意の手段により達成され得る。
【０１３８】
遺伝子の発現又は遺伝子産物を増加させる方法は、当技術分野において十分に実証されており、また、例えば適するプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用を含む。プロモーター又はエンハンサーエレメントとして機能する単離された核酸は、所望のポリペプチドをコードする核酸の発現を上方制御するために、異種ではない形態（non-heterologous form）のポリヌクレオチドのしかるべき位置（一般的に上流）に導入され得る。例えば、内在性プロモーターが、インビボでの突然変異、欠損、及び／若しくは置換により変更され得る（米国特許第５，５６５，３５０号明細書；国際公開第９３２２４４３号パンフレットを参照）、又は遺伝子の発現を制御するために、単離されたプロモーターが、適切な向きで、本発明の遺伝子から距離を置いて植物細胞に導入され得る。
【０１３９】
ポリペプチドの発現が望ましい場合には、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端に、ポリアデニル化領域を含むのが一般的に望ましい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、その他の様々な植物遺伝子、又はＴ−ＤＮＡに由来し得る。付加される３１末端配列は、例えばノパリンシンターゼ又はオクトピンシンターゼ遺伝子に、又は代替的に別の植物遺伝子に、又はそれほど好ましくないが任意のその他の真核生物遺伝子に由来し得る。
【０１４０】
サイトゾル内に蓄積する成熟したメッセージの量を増やすために、イントロン配列も、コーディング配列又は部分的コーディング配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に付加され得る。転写ユニット内にスプライス可能なイントロンを組み込むと、植物発現コンストラクト及び動物発現コンストラクトのいずれにおいても、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において、最大１０００倍、遺伝子発現が増加することが明らかにされている（Buchman and Berg (1988) MoI. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200）。そのようなイントロンによる遺伝子発現の増強は、転写ユニットの５’末端近傍に配置したときに、一般的に最大となる。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、及び６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は、当技術分野において公知である。一般情報については、The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994)を参照。
【０１４１】
１つの実施形態では、発現の増加は、遺伝子編集又は標的を定めた突然変異誘発の使用により達成され得る。
【０１４２】
方法は、植物内で、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、外来性のポリヌクレオチド）を発現させるステップを含み得る。
【０１４３】
ポリヌクレオチド配列は、配列番号６又は７として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。
【０１４４】
核酸配列は、前記植物における前記核酸配列の転写を指示する異種プロモーターと作動可能に連結し得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生制御型プロモーター（a developmentally-regulated promoter and an inducible promoter）、及び誘導性プロモーターからなる群から選択され得る。
【０１４６】
１つの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
【０１４７】
遺伝子はすべての細胞型において同一レベルで発現されない可能性はあるものの、構成的プロモーターは、植物の発育期間中に植物の様々な部分全体にわたり、連続的に遺伝子の発現を指示する。公知の構成的プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物（Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature. 313 810-2）、ライスアクチン１遺伝子（Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991). Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3 1155-65）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）と関連したものが挙げられる。構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ，carnation etched ring virus）プロモーター等（Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986) The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses. EMBO Journal, 5(2):3083-3090）。
【０１４８】
構成的プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、ライスアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来のプロモーターから選択され得る。
【０１４９】
プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。１つの実施形態では、プロモーターは、側生分裂組織特異的プロモーターである。
【０１５０】
組織特異的プロモーターは、植物の１つの（又はいくつかの）部分内にある遺伝子の発現を、通常そのような植物の部分の寿命全体にわたり指示するプロモーターである。組織特異的プロモーターのカテゴリーには、特異性が絶対的ではないプロモーターも一般的に含まれる、すなわち、該プロモーターは、好ましい組織以外の組織内においても低レベルの発現を指示し得る。
【０１５１】
側生分裂組織特異的プロモーターの例は、国際公開第２００６／０３５２２１号に提示されている。
【０１５２】
別の実施形態では、プロモーターは、発生制御型プロモーターであり得る。
【０１５３】
発生制御型プロモーターは、植物の発育期間中の特定の時期において、１又は２以上の植物の部分に存在する遺伝子の発現変化を指示する。遺伝子は、その他の時期に、異なる（通常より低い）レベルで当該植物の部分内で発現し得るが、またその他の植物の部分においても発現し得る。
【０１５４】
１つの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０１５５】
誘導性プロモーターは、インデューサーに反応して遺伝子の発現を指示する能力を有する。インデューサーが存在しない場合には、遺伝子は発現しない。インデューサーは、プロモーター配列に直接作用し得る、又はリプレッサー分子の効果を和らげることにより作用し得る。インデューサーは、化学物質、例えば代謝物、タンパク質、増殖制御因子、又は毒性元素等、生理学的ストレス、例えば熱、傷害、若しくは浸透圧等、又は病原体若しくは害虫がもたらす作用の間接的結果であり得る。発生制御型プロモーターは、植物の生活環の特定の時点において、植物により産生される内在性インデューサー、又は環境上の刺激に応答する誘導性プロモーターの特定のタイプとして記載される場合もある。公知の誘導性プロモーターの例として、Warner SA、Scott R、Draper J. ((1993) Plant J. 3 191-201)等により記載される傷害反応と関連したプロモーター、Benfey及びChua (1989) (Benfey, P.N.、及びChua, N-H. ((1989) Science 244 174-181)により開示される温度応答と関連したプロモーター、及びGatz ((1995) Methods in Cell Biol. 50 411-424)が記載するように化学的に誘導されたプロモーターが挙げられる。
【０１５６】
本発明は、本明細書で定義するような、配列番号３、４又は５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含むコンストラクト又はベクターも提供する。
【０１５７】
本発明は、植物において側芽の発芽を増加及び／又は迅速化させるために、配列番号３、４又は５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の使用をさらに提供する。
【０１５８】
本発明は、本明細書で定義するような、配列番号３、４又は５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結したプロモーターを含むキメラコンストラクトも提供する。
【０１５９】
適するプロモーター配列は、構成的、非構成的、組織特異的であり得る、発生学的に制御され得る、又は誘導可能／抑制可能であり得る。
【０１６０】
１つの実施形態では、適するプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ，Carnation Etched Ring Virus）プロモーター、エンドウマメ・プラストシアニンプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α、β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、又はセネッセンス特異的プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり得る。
【０１６１】
コンストラクトは、ベクターに含まれ得る。好適には、ベクターは、プラスミドであり得る。
【０１６２】
外来性ポリヌクレオチドが、適するベクター、例えば、植物形質転換ベクターによって、本発明による植物に導入され得る。植物形質転換ベクターは、５’→３’に、転写方向で、プロモーター配列、所望の遺伝子コーディング配列（例えば、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列）を含む発現カセットを含み得、イントロンを含んでもよく、並びにＲＮＡポリメラーゼに対する終止シグナル及びポリアデニラーゼに対するポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳、転写終結配列を含んでもよい。プロモーター配列は、１又は２以上のコピー内に存在し得るが、またそのようなコピーは、上記プロモーター配列と同一、又はそのバリアントであり得る。転写終結コドン配列は、植物、細菌、又はウイルスの遺伝子から取得され得る。適する転写終結コドン配列は、例えば、エンドウマメｒｂｃＳ  Ｅ９転写終結コドン配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓ転写終結コドン配列、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓ転写終結コドン配列である。当業者は、その他の適する転写終結コドン配列を容易に認識する。
【０１６３】
発現カセットは、プロモーターの強度を高める遺伝子発現強化機構も含み得る。そのようなエンハンサーエレメントの例として、エンドウマメプラストシアニン遺伝子のプロモーターの一部分に由来するエレメントが挙げられ、それは国際特許出願第９７／２００５６号の主題である。適するエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。このような制御領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同一の遺伝子に由来し得る、又は例えば、ナス科植物から得られる異なる遺伝子に由来し得る。すべての制御領域は、形質転換される組織の細胞で作動する能力を有するべきである。
【０１６４】
プロモーターＤＮＡ配列は、本発明で使用される配列をコーディングする所望の遺伝子（例えば、プロモーターが指示する遺伝子、例えば配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の活性又は発現が増加するように植物の改変をコードする遺伝子）と同一の遺伝子に由来し得る、又は、例えばナス科植物から得られる異なる遺伝子に由来し得る。
【０１６５】
発現カセットは、基本的植物形質転換ベクター、例えばｐＢＩＮ１９プラス、ｐＢＩ１０１等、又は当技術分野において公知のその他の適する植物形質転換ベクターに組み込まれ得る。発現カセットに付加して、植物形質転換ベクターは、形質転換プロセスに必要な配列を含む。そのような配列は、アグロバクテリウム属ｖｉｒ遺伝子、１若しくは２以上のＴ−ＤＮＡ境界配列、及び選択マーカー、又は遺伝子導入植物細胞を識別するその他の手段を含み得る。
【０１６６】
用語「植物形質転換ベクター」とは、インビボ又はインビトロで発現する能力を有するコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」には、好ましくは、ゲノムへの安定な組込みが含まれる。
【０１６７】
植物を形質転換する技術は当技術分野において周知されており、例えば、アグロバクテリウム媒介型の形質転換を含む。遺伝子改変植物の構築における基本的な原則は、挿入された遺伝物質の安定的維持が得られるように、植物ゲノム内に遺伝情報を挿入することである。一般技術のレビューは、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）、及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27）による文献に見出され得る。
【０１６８】
一般的に、アグロバクテリウム媒介型形質転換では、外来の所望のＤＮＡを担持するバイナリーベクターを、アグロバクテリウムと標的植物から得た外植片との同時培養により適するアグロバクテリウム系統から標的植物に移動させる。形質転換植物組織は、次に選択培地上で再生するが、同選択培地は、選択マーカー及び植物成長ホルモンを含む。代替法として、フローラルディップ法（Clough及びBent、1998）が挙げられ、同法により、インタクトな植物の花芽がキメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム系統の懸濁液と接触することとなり、そして結実後、形質転換された個々の植物を発芽させ、そして選択培地上で成長させることにより識別される。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は単純な技法であり、幅広く採用されているが、同法はButcher D. N.ら,(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208に記載されている。
【０１６９】
さらに適する形質転換方法として、例えば、ポリエチレングリコール、又はエレクトロポレーション技術、粒子衝突（particle bombardment）、マイクロインジェクション、及びシリコンカーバイドファイバーの使用等を用いたプロトプラスト中への直接遺伝子移入法が挙げられる。
【０１７０】
シリコンカーバイドホイスカー技術を含むバリスティック形質転換法を用いた植物の形質転換は、Frame B R、Drayton P R、Bagnaall S V、Lewnau C J, Bullock W P、Wilson H M、Dunwell J M、Thompson J A & Wang K (1994)）で教示されている。シリコンカーバイドホイスカー媒介式形質転換による、結実能力のある遺伝子導入トウモロコシ植物の製造は、The plant Journal 6: 941-948)に教示されており、またウイルス形質転換技術は、例えば、Meyer P、Heidmmm I & Niedenhof I (1992)に教示されている。植物用のベクター系としてのキャッサバモザイクウイルスの使用は、Gene 110: 213-217に教示されている。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号明細書に見出され得る。
【０１７１】
さらなる態様では、本発明は、所望の遺伝子（例えば、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列）をコードするヌクレオチド配列を担持するベクター系、及び植物等の生物のゲノムにベクター系を導入するステップに関する。ベクター系は、１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含んでもよい。２ベクターの場合、ベクター系は、バイナリーベクター系と通常呼ばれる。バイナリーベクター系は、Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19においてさらに詳細に記載されている。
【０１７２】
植物細胞を形質転換するために広範に採用されている１つの系は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴｉプラスミド、又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）に由来するＲｉプラスミドを使用する、Anetal., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208。植物を対象とした本発明による所望の外来性遺伝子導入法をそれぞれ実施した後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となり得る。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用について集中的に研究されており、欧州特許第Ａ−１２０５１６号明細書; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V; Fraley, etal., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284に記載されている。
【０１７３】
所望のタンパク質（例えば、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードする外来性遺伝子で形質転換された植物細胞は、周知された組織培養法に基づき、例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の必要な成長因子が供給された好適な培養培地内で細胞を培養すること等により増殖及び維持することができる。
【０１７４】
本発明に関連する用語「遺伝子導入植物」には、所望の遺伝子をコードする外来性遺伝子、例えば本明細書による配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む任意の植物が含まれる。好ましくは、外来性遺伝子は、植物のゲノムに組み込まれる。
【０１７５】
「遺伝子導入植物」及び「外来性遺伝子」が、その本来のプロモーターの制御下に置かれており、プロモーターもその天然の環境にあるとき、用語「遺伝子導入植物」及び「外来性遺伝子」は、その天然の環境内に天然のヌクレオチドコーディング配列を含まない。
【０１７６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする外来性遺伝子（キメラコンストラクト又はベクター）を、非改変植物中に導入するステップを含む、遺伝子導入植物を生成する方法に関する。
【０１７７】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号３、４、５として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクト又はベクター（例えば、キメラコンストラクト）を用いて植物細胞を形質転換するステップ；及び形質転換植物細胞から植物を再生するステップを含む、遺伝子導入植物を生成する方法に関する。
【０１７８】
本発明に基づき、外来性核酸配列（コンストラクト又はベクター又はキメラコンストラクト）を使用すれば、例えば、外来性核酸配列（コンストラクト又はベクター又はキメラコンストラクト）により植物の形質転換が生じ、これによって植物における側芽の発芽が増加又は迅速化する。
【０１７９】
１つの実施形態では、本発明は、本発明に基づく外来性核酸配列（コンストラクト又はベクター又はキメラコンストラクト）を含む宿主細胞にさらに関する。
【０１８０】
配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列内に変異が生ずると、配列番号３、４、５として示すタンパク質、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列に関連して、タンパク質の活性を増加させる可能性がある。
【０１８１】
配列番号３、４、５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列内に変異が生じても、タンパク質のレベル又は発現に変化が生じない可能性があるが、配列番号３、４、５として示すタンパク質、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列に関連して、タンパク質の活性が増加する可能性がある。
【０１８２】
商業的に望ましい特性
用語「商業的に望ましい特性」として、特性、例えば収率、品質、非生物的（例えば、干ばつ）ストレス耐性、除草剤耐性、及び／又は生物的（例えば昆虫、細菌、又は菌類）ストレス耐性等が挙げられる。
【０１８３】
植物の繁殖
１つの実施形態では、本発明は、側芽の発芽が低下している植物を生成する方法であって、
ａ．側芽の発芽が低下しているドナー植物を、側芽の発芽が低下しておらず、かつ商業的に望ましい特性を有するレシピエント植物と交配させるステップであって、前記ドナー植物が、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止する変異を含むステップと、
ｂ．前記レシピエント植物と交配させた前記ドナー植物の子孫から遺伝物質を単離するステップと、
ｃ．分子マーカーを用いて分子マーカー利用選抜（molecular marker-assisted selection）を実施するステップであって、
ｉ．配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる、又は阻止する変異を含む遺伝子移入領域を識別するステップ
を含むステップと、
を含む方法を提供する。
【０１８４】
１つの実施形態では、本発明は、側芽の発芽が増加している植物を生成する方法であって、
ａ．側芽の発芽が増加しているドナー植物を、側芽の発芽が増加しておらず、かつ商業的に望ましい特性を有するレシピエント植物と交配させるステップと、
ｂ．前記レシピエント植物と交配させた前記ドナー植物の子孫から遺伝物質を単離するステップと、
ｃ．分子マーカーを用いて分子マーカー利用選抜を実施するステップであって、
ｉ．配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を増加させる変異を含む遺伝子移入領域を識別するステップ
を含むステップと、
を含む方法を提供する。
【０１８５】
分子マーカー利用選抜は、配列番号３、４又は５として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる、阻止する、又は増加させる変異を含む遺伝子移入された核酸配列を識別するために、ＰＣＲを実施するステップを含み得る。
【０１８６】
植物
１つの実施形態では、本明細書で引用する植物は、ナス科である。
【０１８７】
特に、植物は、ヤコウカ（Cestoideae）亜科であり得る。例えば、植物は、トマト、ジャガイモ、ナス（aubergine）、ペチュニア、又はタバコ植物であり得る。
【０１８８】
配列番号３として示すアミノ酸配列と相同であると考えられ得るトマト及びジャガイモのアミノ酸配列の例は、受託番号ＮＰ＿００４２４４５２９．１、及びＸＰ＿００６３６７４７２を有する。これらのアミノ酸配列は、配列番号４（トマト（Solanum lycopersicum））、及び配列番号５（ジャガイモ（Solanum tuberosum））としてそれぞれ表わされる。
配列番号４
MATTKSFLIL IFMILATTSS TFATEEMVTV LSIDGGAIRG IIPGVILRYL EAELQRIDNN
TDARVADYFD LIGGTSTGGL VTAMLTTPNE NNRPFAAANE IVPFYFEHGP KIFEPSGNPL
FGPQYNGTYL MQVIQEKVGE TFLNQTLTEV VISSFDIQTN KPVIFTKSSL AKSPELNAKM
YDICYSTAAA PTYFAPLGFN TSHNGDQYRF NLVDGGVATV GDPALLSVSV ATKLAEEDPA
FSSIRSLNFK RMLLLSLGTG TTSDFDKTYT AEQAATWGIL QWGSAIQAMT GAASSYMTDY
YLSTVFQALD SQDNYLRVQD NALTGTTTAW DDASMANMLL LEQVGENLLK KQVSNDETYE
QALTRFAEKL SAQKKLRENK ASY
配列番号５
MATSKTFLIL FFMILATTSS TFATLGEMVT VLSIDGGGIK GIIPGTILEF LEGQLQDVDN
NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN XNNRPFAAAK DIVPFYFKYG PHIFNSSDPQ
IFGPINDGKY FMQVLQEKLG ETRLHQALTE VAISTFDIKT NKPVIFTKSQ LAKSPELDAK
MYDICYSTAA VPMYFPPHYF VTNTSNGDKY EFNLVDGGVA AGDPALLSVS VAMKHAENED
PAFASIKSLN YKKXLLLSLG TGTTSEFAKN YTAEEAAKWA IVQWILPLRE MGNAASSYMN
DYYLSTVFQA LDSKNNYLRV QENALTGTTT KMDDASVANM KLLEQVGKNL LKKNVSEDSH
ETYEVALKRF AKLLSDRKKL RANKASY 
【０１８９】
配列番号４は、配列番号３に対して５７％の同一性を有する。配列番号５は、配列番号３に対して６２％の配列同一性を有する。
【０１９０】
配列番号２をコードする核酸配列と相同であると考えられ得るトマト及びジャガイモの核酸配列の例は、受託番号ＸＭ＿００４２４４４８２．２、及びＸＭ＿００６３６７４１０．１が付与された核酸配列である。これらに由来する予測コーディング配列は、配列番号６（トマト）及び配列番号７（ジャガイモ）としてそれぞれ表わされる。
配列番号６
atggcaacta ctaaatcttt tttaatttta atttttatga tattagcaac tactagttca        
acatttgcta cagaagaaat ggtgactgtt cttagtattg atggaggtgc aataagggga       
atcattccag gtgtcattct tagatatctc gaagcagaac ttcagagaat tgacaataat       
acagatgcaa gagtggctga ttactttgat ctaattggag gaacaagtac tggaggatta       
gtgactgcta tgttaactac tccaaatgaa aacaatagac cctttgctgc tgccaatgaa       
atagtacctt tttacttcga acatggccca aagatttttg aacctagtgg taatccactt       
tttggcccac aatataatgg aacatatctt atgcaagtta ttcaagaaaa agttggagaa       
acttttttga atcaaacttt gacagaagtt gtcatctcaa gctttgacat ccaaacaaat       
aagccagtaa tattcactaa gtcaagttta gcgaaatctc cagaattgaa cgctaagatg       
tatgacatat gttattccac agcagcagct ccaacatatt ttgctccact tggatttaat       
actagtcata atggagatca atataggttc aatcttgttg atggtggtgt tgctactgtt       
ggtgatccgg cgttattatc agttagcgtt gctacgaaac ttgcagaaga ggatccagca       
ttttcttcaa ttaggtcatt gaatttcaaa agaatgttgt tgctctcatt aggcactggc       
actacatcag attttgataa aacatataca gcagaacagg cagctacatg gggtatttta       
caatggggat cagctataca agcaatgact ggtgcagcaa gttcgtacat gactgattat       
tatctttcta ctgtttttca agctcttgat tcacaagaca attacctcag ggtccaagac       
aatgcattaa caggcacaac tactgcatgg gatgatgctt ctatggctaa tatgctatta      
ttagaacaag ttggtgaaaa cttactgaag aaacaagttt ccaatgatga aacctatgag      
caagctctga ctaggtttgc agaaaagctc tctgctcaga agaaacttcg agaaaacaaa      
gcgtcttatt ag
配列番号７
atggcaacta gtaaaacttt tttaatttta ttttttatga tattagcaac tactagttca        
acatttgcta cgttgggaga aatggtgact gttcttagta ttgatggagg tggaattaag       
ggaatcattc cgggtaccat tctcgaattt cttgaaggac aacttcagga tgtggacaat       
aataaagatg caagacttgc agattacttt gatgtaattg gaggaacaag tacaggaggt       
ttattgactg ctatgataac tactccaaat ngaaacaatc gaccctttgc tgctgccaaa       
gatattgtac ctttttactt caaatatggc cctcatattt ttaattctag tgatcctcaa       
atttttggcc caataaatga tggaaaatat tttatgcaag ttcttcaaga aaaattagga       
gaaactcgtt tgcatcaagc tttgacagaa gttgccatct caacctttga catcaaaaca       
aataagccag taatattcac taagtcacag ttagcaaagt ctccagaatt ggatgctaag       
atgtatgaca tatgttattc cacagcagca gttcccatgt attttcctcc acattatttt       
gttactaata ctagtaatgg cgataaatat gagttcaatc ttgttgatgg tggtgttgct       
gctggtgatc cggcgttatt atcagttagc gttgcaatga aacatgcaga aaatgaggat       
ccagcatttg cttcaattaa gtcattgaat tacaaaaaat agttgttgct ctcattaggc       
actggcacta cttcagagtt tgctaaaaac tatacagcag aagaggcagc taaatgggct       
attgtacaat ggatattacc tttacgggaa atgggaaatg cagcaagttc ttacatgaat       
gattattacc tttctactgt ttttcaagct cttgattcaa aaaacaatta cctcagggtt       
caagaaaatg cattaacagg cacaactact aaaatggatg atgcttctgt ggctaatatg      
aaattattag aacaagttgg taaaaactta ctgaagaaaa atgtttccga agacagtcat      
gaaacctatg aggtagctct aaagaggttt gcaaaattgc tctctgatag gaagaaactc      
cgagcaaaca aagcttctta ttaa
【０１９１】
配列番号６は、配列番号２に対して７４％の同一性を有する。配列番号７は、配列番号２に対して７６％の同一性を有する。
【０１９２】
タバコ植物
１つの実施形態では、植物は、タバコ植物である。
【０１９３】
１つの実施形態では、本発明は、タバコ植物並びにタバコ細胞と関連する方法、使用、タバコ植物、及び植物繁殖材料を提供する。
【０１９４】
植物がタバコ植物である実施形態では、タンパク質は、配列番号３として示す配列、又はそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１９５】
好ましい実施形態では、側芽の発芽は、本発明に基づく方法によるタバコ植物において低下している。特に、好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３として示す配列、又はそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質の発現又は機能を低下させる又は阻止することを含む、タバコ植物において側芽の発芽を低下させる方法を提供する。
【０１９６】
用語「タバコ植物」とは、本明細書で用いる場合、タバコ製品の製造で使用されるニコチアナ属の植物を意味する。適するタバコ植物の非限定的な例として、Ｎ．タバカム及びＮ．ルスチカ（例えば、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、Ｔｌ  １４０６、バスマ、ガルパオ、ペリケ、ベインハルト１０００−１、及びペチコ）が挙げられる。用語「タバコ」を、タバコ製品の製造に役立たないニコチアナ種にまで拡張する意図はない。
【０１９７】
したがって、１つの実施形態では、タバコ植物には、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）が含まれる。
【０１９８】
タバコ材料は、バーレイ品種として一般的に知られているニコチアナ・タバカム種の品種、フルー又はブライト品種、ダーク品種、及びオリエンタル／トルコ品種に由来し得る。いくつかの実施形態では、タバコ材料は、バーレイ、バージニア、熱風乾燥式、空気乾燥式、火力乾燥式、オリエンタル、又はダークタバコ植物に由来する。タバコ植物は、メリーランドタバコ、レアタバコ、スペシャリティタバコ、膨化タバコ等から選択され得る。
【０１９９】
タバコ栽培品種及びエリートタバコ栽培品種の使用も、本明細書において検討される。本明細書で使用されるタバコ植物は、したがってタバコ品種又はエリートタバコ栽培品種であり得る。
【０２００】
特に有用なニコチアナ・タバカム品種として、バーレイタイプ、ダークタイプ、熱風乾燥タイプ、及びオリエンタルタイプのタバコが挙げられる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、タバコ植物は、例えば下記の品種のうちの１又は２以上から選択され得る：Ｎ．タバカムＡＡ３７−１、Ｎ．タバカムＢ１３Ｐ、Ｎ．タバカム・クサンシ（N.tabacum Xanthi）（ミッチェル-モール(Mitchell-Mor)）、Ｎ．タバカムＫＴ  Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｎ．タバカムＢｅｌ−Ｗ３、Ｎ．タバカム７９−６１５、Ｎ．タバカム・サムスンホルムズ（Samsun Holmes）ＮＮ、Ｎ．タバカムＢＵ２１×Ｎ．タバカム・ホジャパラド（Hoja Parado）の交配に由来するＦ４、ライン９７、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１  １０、Ｎ．タバカム・バーレイ２１、Ｎ．タバカムＰＭ０１６、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃５ＫＹ１６０ＳＩ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃７ＦＣＡ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃６ＴＮ８６ＳＩ、Ｎ．タバカムＰＭ０２１、Ｎ．タバカムＫ１４９、Ｎ．タバカムＫ３２６、Ｎ．タバカムＫ３４６、Ｎ．タバカムＫ３５８、Ｎ．タバカムＫ３９４、Ｎ．タバカムＫ３９９、Ｎ．タバカムＫ７３０、Ｎ．タバカムＫＹ１０、Ｎ．タバカムＫＹ１４、Ｎ．タバカムＫＹ１６０、Ｎ．タバカムＫＹ１７、Ｎ．タバカムＫＹ８９５９、Ｎ．タバカムＫＹ９、Ｎ．タバカムＫＹ９０７、Ｎ．タバカムＭＤ６０９、Ｎ．タバカム・マクネイル（McNair）３７３、Ｎ．タバカムＮＣ２０００、Ｎ．タバカムＰＧ０１、Ｎ．タバカムＰＧ０４、Ｎ．タバカムＰ０１、Ｎ．タバカムＰ０２、Ｎ．タバカムＰ０３、Ｎ．タバカムＲＧ１  １、Ｎ．タバカムＲＧ１７、Ｎ．タバカムＲＧ８、Ｎ．タバカム・スペイト（Speight）Ｇ−２８、Ｎ．タバカムＴＮ８６、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＶＡ５０９、Ｎ．タバカムＡＳ４４、Ｎ．タバカム・バンケット（Banket）Ａ１、Ｎ．タバカム・バスマドラマ（Basma Drama）Ｂ８４／３１、Ｎ．タバカム・バスマＩジクナ（Basma I Zichna）ＺＰ４／Ｂ、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ（Basma Xanthi）ＢＸ２Ａ、Ｎ．タバカム・バテク（Batek）、Ｎ．タバカム・ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｎ．タバカムＣ１０４、Ｎ．タバカム・コーカー（Coker）３１９、Ｎ．タバカム・コーカー３４７、Ｎ．タバカム・クリオロミシオネロ（Criollo Misionero）、Ｎ．タバカムＰＭ０９２、Ｎ．タバカム・デルクレスト（Delcrest）、Ｎ．タバカム・ジェベル（Djebel）８１、Ｎ．タバカムＤＶＨ４０５、Ｎ．タバカム・ガルパオコマム（Galpao Comum）、Ｎ．タバカムＨＢ０４Ｐ、Ｎ．タバカム・ヒックスブロードリーフ（Hicks Broadleaf）、Ｎ．タバカム・カバクラクエラッソナ（Kabakulak Elassona）、Ｎ．タバカムＰＭ１０２、Ｎ．タバカム・クツァゲ（Kutsage）Ｅ１、Ｎ．タバカムＫＹ１４×Ｌ８、Ｎ．タバカムＫＹ１７１、Ｎ．タバカムＬＡ  ＢＵ２１、Ｎ．タバカム・マクネイル９４４、Ｎ．タバカムＮＣ２３２６、Ｎ．タバカムＮＣ７１、Ｎ．タバカムＮＣ２９７、Ｎ．タバカムＮＣ３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０９、Ｎ．タバカムＰＶＨ１９、Ｎ．タバカムＰＶＨ２１  １０、Ｎ．タバカム・レッドロシアン（Red Russian）、Ｎ．タバカム・サムスン（Samsun）、N.タバカム・サプラク（Saplak）、Ｎ．タバカム・シンマバ（Simmaba）、Ｎ．タバカム・タルガー（Talgar）２８、Ｎ．タバカムＰＭ１３２、Ｎ．タバカム・ウィスリカ（Wislica）、Ｎ．タバカム・ヤヤルダグ（Yayaldag）、Ｎ．タバカムＮＣ４、Ｎ．タバカムＴＲマドーレ（Madole）、Ｎ．タバカム・プリレップ（Prilep）ＨＣ−７２、Ｎ．タバカム・プリレップＰ２３、Ｎ．タバカム・プリレップＰＢ１５６／１、Ｎ．タバカム・プリレップＰ１２−２／１、Ｎ．タバカム・ヤカ（Yaka）ＪＫ−４８、Ｎ．タバカム・ヤカＪＢ１２５／３、Ｎ．タバカムＴＩ−１０６８、Ｎ．タバカムＫＤＨ−９６０、Ｎ．タバカムＴＩ−１０７０、Ｎ．タバカムＴＷ１３６、Ｎ．タバカムＰＭ２０４、Ｎ．タバカムＰＭ２０５、Ｎ．タバカム・バスマ（Basma）、Ｎ．タバカムＴＫＦ４０２８、Ｎ．タバカムＬ８、Ｎ．タバカムＴＫＦ２００２、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＧＲ１４１、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ、Ｎ．タバカムＧＲ１４９、Ｎ．タバカムＧＲ１５３、及びＮ．タバカム・ペティットハバナ（Petit Havana）。
【０２０２】
品種又は栽培品種の非限定的な例は、ＢＤ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＤ２６３、ＤＦ９１  １、ＤＴ５３８ＬＣガルパオタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、ＨＢ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド４０３ＬＣ、ハイブリッド４０４ＬＣ、ハイブリッド５０１ＬＣ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ＬＣ、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、マクネイル３７３、マクネイル９４４、ｍｓＫＹ１４×Ｌ８、ナロウリーフマドーレ（Narrow Leaf Madole）、ナロウリーフマドーレＬＣ、ＮＢＨ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１ＬＣ、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣ  ＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニールスミスマドーレ（Neal Smith Madole）、ＯＸＦＯＲＤ２０７、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ’Periq’e’タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１１、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ１４０６、ＴＩ１２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（トムロッソン（Tom Rosson））マドーレ、ＶＡ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、クサンシ（ミッチェル-モール）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、サムスンホルムズＮＮ、ＫＴＲＤＣナンバー２ハイブリッド４９、バーレイ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ１  １、ＲＧ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケットＡ１、バスマドラマＢ８４／３１、バスマＩジクナＺＰ４／Ｂ、バスマクサンシＢＸ２Ａ、バテク、ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｃ１０４、コーカー３４７、クリオロミシオネロ、デルクレスト、ジェベル８１、ＤＶＨ４０５、ガルパオコマム、ＨＢ０４Ｐ、ヒックスブロードリーフ、カバクラクエラッソナ、クツァゲＥ１、ＬＡ  ＢＵ２１、ＮＣ２３２６、ＮＣ２９７、ＰＶＨ２１  １０、レッドロシアン、サムスン、サプラク、シンマバ、タルガー２８、ウィスリカ、ヤヤルダグ、プリレップＨＣ−７２、プリレップＰ２３、プリレップＰＢ１５６／１、プリレップＰ１２−２／１、ヤカＪＫ−４８、ヤカＪＢ１２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、バスマ、ＴＫＦ４０２８、���８、ＴＫＦ２００２、ＧＲ１４１、バスマクサンシ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、ペティットハバナである。上記これらの低コンバーター亜品種も、たとえ本明細書で特に識別されないとしても検討される。
【０２０３】
１つの実施形態では、タバコ植物は、バーレイタイプのタバコ植物、好適にはバーレイＰＨ２５１７である。
【０２０４】
１つの実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から取得可能であり得る。
【０２０５】
「植物繁殖材料」とは、本明細書で用いる場合、さらなる植物が生成し得る、植物から得られるあらゆる植物由来物質を意味する。
【０２０６】
好適には、植物繁殖材料は、種子であり得る。
【０２０７】
１つの実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明による方法により取得可能であり得る（例えば、取得され得る）。１つの実施形態では、本発明のタバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、配列番号３として示す配列、又はそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸配列内に変異を含み得る。
【０２０８】
好適には、本発明によるタバコ植物は、非改変型タバコ植物と比較して、側芽の発芽が低下している可能性があり、その場合、改変は、配列番号３として示す配列、又はそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質の発現の低下又は阻止である。
【０２０９】
１つの実施形態では、本発明に基づくタバコ植物は、本発明のタバコ細胞を含む。
【０２１０】
別の実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から取得可能であり得る（例えば、取得され得る）。
【０２１１】
１つの実施形態では、タバコ製品の製造のための上記実施形態において提供されるようなタバコ細胞の使用が提供される。
【０２１２】
さらに、タバコ植物を育成するための、本明細書に記載するタバコ植物の使用が提供される。
【０２１３】
本発明は、別の実施形態では、タバコ製品の製造のための、上記実施形態のタバコ植物の使用も提供する。
【０２１４】
別の実施形態では、作物を成長させるための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
【０２１５】
製品
本発明は、本発明によるタバコから取得可能な、又は取得された製品も提供する。
【０２１６】
１つの実施形態では、タバコ葉を製造するための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。
【０２１７】
好適には、タバコ葉は、加工工程等の下流の用途に供され得る。したがって、１つの実施形態では、上記実施形態の使用は、加工されたタバコ葉を提供し得る。好適には、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、パスチャライジング（pasteurising）、又はそれらの組合せの対象となり得る。
【０２１８】
別の実施形態では、タバコ葉は裁断され得る。いくつかの実施形態では、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、パスチャライジング、又はそれらの組合せに供される前又は後において裁断され得る。
【０２１９】
１つの実施形態では、本発明は、採取された本発明のタバコ植物の葉を提供する。
【０２２０】
さらなる実施形態では、採取された葉は、本発明の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であり得る（例えば、取得され得る）。
【０２２１】
別の実施形態では、本発明の方法又は使用から取得可能な採取葉が提供される。
【０２２２】
好適には、採取された葉は、裁断された採取された葉であり得る。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、採取された葉は生存性のタバコ細胞を含み得る。その他の実施形態では、採取された葉はさらなる加工の対象となり得る。
【０２２４】
加工されたタバコ葉も提供される。
【０２２５】
加工されたタバコ葉は、本発明のタバコ植物から取得可能であり得る。好適には、加工されたタバコ葉は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかに基づき取得されたタバコ植物から取得可能であり得る。
【０２２６】
別の実施形態では、加工されたタバコ葉は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であり得る。
【０２２７】
本発明の加工されたタバコ葉は、採取された本発明の葉を加工することにより取得可能であり得る。
【０２２８】
用語「加工されたタバコ葉」とは、本明細書で用いる場合、当技術分野においてタバコが供される１又は２以上の加工ステップを経たタバコ葉を意味する。「加工されたタバコ葉」は、生存細胞を含まない又は実質的に含まない。
【０２２９】
用語「生存細胞」とは、増殖することができ、及び／又は代謝的に活性である細胞を意味する。したがって、細胞が生存していないと言われる場合には、「非生存性（non-viable）」とも呼ばれ、その場合、細胞は生存細胞の特徴を示さない。
【０２３０】
用語「実質的に生存しない細胞」とは、全細胞のうち約５％未満が生存していることを意味する。全細胞のうち、好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満、なおいっそうより好ましくは約０．１％未満が生存している。
【０２３１】
１つの実施形態では、加工されたタバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、パスチャライジングのうちの１又は２以上により加工され得る。
【０２３２】
好適には、加工されたタバコ葉は乾燥工程により加工され得る。
【０２３３】
タバコ葉は、当技術分野において公知の任意の方法により乾燥され得る。１つの実施形態では、タバコ葉は、空気乾燥、火力乾燥、熱風乾燥、及び天日乾燥からなる群から選択される乾燥法のうちの１又は２以上により乾燥され得る。
【０２３４】
好適には、タバコ葉は空気乾燥され得る。
【０２３５】
一般的に、空気乾燥は、十分に換気された収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、そして放置乾燥することにより達成される。これは、４〜８週間にわたり通常実施される。空気乾燥は、バーレイ種のタバコに特に適する。
【０２３６】
好適には、タバコ葉は火力乾燥され得る。火力乾燥は、大型の収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、その収蔵室内で、連続的又は間欠的に弱く煙らせながら広葉樹の炎を継続することにより一般的に達成され、その乾燥は、プロセス及びタバコに応じて３日間〜１０週間を通常要する。
【０２３７】
別の実施形態では、タバコ葉は熱風乾燥され得る。熱風乾燥は、タバコ葉をタバコスティック上に糸で吊るし、そしてそれを乾燥収蔵室内のタイアーポールから吊り下げる工程を含み得る。収蔵室は、外部供給式の火室から通ずる煙道を通常有する。これにより、一般的に、煙に曝露されないで加熱乾燥させたタバコが得られる。通常、温度は乾燥工程の過程全体にわたりゆっくりと上昇し、全プロセスに約１週間を要する。
【０２３８】
好適には、タバコ葉は天日乾燥され得る。この方法は、むき出しのタバコの天日への曝露を一般的に含む。
【０２３９】
好適には、加工されたタバコ葉は発酵工程により加工され得る。
【０２４０】
発酵は、当技術分野において公知の任意の方式で実施可能である。一般的に、発酵期間中に、タバコ葉は、湿気を保持するために、例えば黄麻布でくるまれたスタック状（バルク状）の乾燥タバコに積層される。葉内に残留する水とタバコの重量が組み合わさって自然の熱が生成し、タバコを熟成させる。バルク中心部の温度は毎日モニタリングされる。いくつかの方法では、毎週、バルク全体が開放される。次に葉を取り出して振動及び湿度を与え、そして内側の葉が外側に来るように、また底部にあった葉がバルクの最上部に配置されるようにバルクを回転させる。これにより、バルク全体を通じて均等な発酵が保証される。葉の上のさらなる湿気に加え、葉それ自体が実際に回転することで熱が生成し、タバコに本来含まれるアンモニアが放出され、そしてニコチンが低下する一方、色の深みも増し、またタバコのアロマも良化する。一般的に、発酵プロセスは、タバコの品種、葉上の葉柄の位置、厚さ、及び葉の使用目的に応じて最長６カ月継続する。
【０２４１】
好適には、加工されたタバコ葉は、パスチャライジングにより加工され得る。パスチャライジングは、タバコ葉が、無煙タバコ製品、最も好ましくはスヌースを製造するのに用いられる場合、特に好ましい可能性がある。
【０２４２】
タバコ葉のパスチャライゼーション（pasteurisation）は、当技術分野において公知の任意の方法により実施され得る。例えば、パスチャライゼーションは、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、J Fould, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359に詳記するように実施され得る。
【０２４３】
スヌースの製造期間中、パスチャライゼーションは、タバコが蒸気で２４〜３６時間加熱処理されるプロセス（約１００℃の温度に達する）により一般的に実施される。これにより、ほぼ無菌の製品がもたらされ、また理論に束縛されるものではないが、この結果のひとつとして、さらなるＴＳＮＡ形成が制限されるものと考えられている。
【０２４４】
１つの実施形態では、パスチャライゼーションは蒸気式パスチャライゼーションであり得る。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、加工されたタバコ葉は裁断され得る。加工されたタバコ葉は、加工前又は後で裁断され得る。好適には、加工されたタバコ葉は、加工後に裁断され得る。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、タバコ植物、採取されたタバコ植物の葉、及び／又は加工されたタバコ葉は、ニコチンを抽出するのに利用可能である。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実現され得る。例えば、タバコからニコチンを抽出する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２，１６２，７３８号明細書に教示されている。
【０２４７】
別の態様では、本発明はタバコ製品を提供する。
【０２４８】
１つの実施形態では、タバコ製品は、本発明のタバコ植物又はその一部分から調製され得る。
【０２４９】
好適には、タバコ植物又はその一部分は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖され得る。
【０２５０】
用語「その一部分」とは、タバコ植物の文脈において本明細書で用いる場合、タバコ植物の一部分を意味する。好ましくは、「その一部分」とはタバコ植物の葉である。
【０２５１】
別の実施形態では、タバコ製品は、採取された本発明の葉から調製され得る。
【０２５２】
さらなる実施形態では、タバコ製品は、加工された本発明のタバコ葉から調製され得る。
【０２５３】
好適には、タバコ製品は、乾燥工程、発酵工程、及び／又はパスチャライジングのうちの１又は２以上により加工されたタバコ葉から調製され得る。
【０２５４】
好適には、タバコ製品は裁断されたタバコ葉を含み得るが、上記実施形態にしたがって加工されてもよい。
【０２５５】
１つの実施形態では、タバコ製品は喫煙物品であり得る。
【０２５６】
本明細書で用いる場合、用語「喫煙物品」は、タバコ、タバコ派生品、膨化タバコ、再構成タバコ、又はタバコ代用品に基づき、喫煙可能な製品、例えば巻きタバコ、シガレット、シガー、及びシガリロ等を含み得る。
【０２５７】
別の実施形態では、タバコ製品は無煙タバコ製品であり得る。
【０２５８】
用語「無煙タバコ製品」とは、本明細書で用いる場合、喫煙する及び／又は燃焼させるように意図されないタバコ製品を意味する。１つの実施形態では、無煙タバコ製品として、スヌース、嗅ぎ煙草、噛みタバコ等を挙げることができる。
【０２５９】
さらなる実施形態では、タバコ製品はタバコ加熱デバイスであり得る。
【０２６０】
一般的に、加熱式喫煙物品では、熱源から、熱源の内部、近傍、又は下流に位置し得る物理的に分離したエアゾール形成基材又は材料に熱を移動させることにより、エアゾールが生成する。喫煙期間中、熱源からの熱移動により揮発性化合物がエアゾール形成基材から放出され、そして喫煙物品を通じて吸引された空気中に取り込まれる。放出された化合物が冷やされると、凝縮してエアゾールを形成し、ユーザーにより吸入される。
【０２６１】
消費用のエアゾール発生物品及びデバイス、又はタバコ喫煙用の加熱デバイスは、当技術分野において公知である。そのようなデバイスとして、例えば、電気加熱式エアゾール発生デバイスを挙げることができ、同デバイス内では、エアゾール発生デバイスの１又は２以上の電気発熱要素からタバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材に熱を移動させることにより、エアゾールが発生する。
【０２６２】
好適には、タバコ加熱デバイスは、エアゾール発生デバイスであり得る。
【０２６３】
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、非燃焼加熱式デバイスであり得る。非燃焼加熱式デバイスは、当技術分野において公知であり、またタバコを燃焼させるのではなく、加熱することにより化合物を放出させる。
【０２６４】
非燃焼加熱式デバイスの適する例として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット、又は英国特許第２５１５５０２号明細書に教示するものが該当し得る。
【０２６５】
１つの実施形態では、タバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材は、本発明に基づくタバコ製品であり得る。
【０２６６】
別途規定しない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示で使用される用語の多くについて、当業者に一般的なディクショナリーを提供する。
【０２６７】
本開示は、本明細書に開示する例示的な方法及び材料に限定されず、また本明細書に記載するものと類似した又は同等のあらゆる方法及び材料は、本開示の実施形態を実践又は試験するのに利用可能である。数値の範囲には、範囲を規定する数字も含まれる。別途明示しない限り、核酸配列はいずれも、左から右に５’→３’の向きで記載されており、アミノ酸配列は、左から右にアミノ基→カルボキシ基の向きでそれぞれ記載されている。
【０２６８】
本明細書に提示される表題は、本明細書を全体的に参照することにより理解され得る本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下で定義する用語は、本明細書を全体的に参照することにより、さらに完全に定義される。
【０２６９】
アミノ酸は、本明細書ではアミノ酸の名称、３文字略号、又は１文字略号を用いて表される。
【０２７０】
用語「タンパク質」には、本明細書で用いる場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドが含まれる。
【０２７１】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。
【０２７２】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられる。本開示及び特許請求の範囲では、アミノ酸残基について、従来方式の１文字及び３文字コードが使用され得る。アミノ酸の３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ生化学命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ，Joint Commission on Biochemical Nomenclature）に準拠して規定される通りである。またポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して、１を超えるヌクレオチド配列によりコードされ得るものとやはり理解される。
【０２７３】
用語のその他の定義も、本明細書全体を通じて提示され得る。例示的な実施形態がより詳細に記載する前に、本開示は、記載されている特定の実施形態に限定されない、したがって、当然ながら変化する可能性もあると理解される。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、そして本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限するようには意図されないものとやはり理解される。
【０２７４】
ある範囲の値が提示される場合、その内容について別途明確な指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、当該範囲の上限及び下限の間の中間的な値それぞれも特に開示されるものと理解される。記載された任意の値の間のより狭い範囲のそれぞれ、又は記載された範囲内の中間的な値、及び当該記載された範囲内の任意のその他の記載された値、又は中間的な値は本開示に含まれる。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、該範囲に独立して含まれる又はそれから除外され得る、並びにいずれか一方若しくは両方の限界がより狭い範囲に含まれる、又はそのいずれも含まれない場合の各範囲も本開示に含まれ、記載された範囲内において、特に除外された任意の限界が設けられる。一方又は両方の限界が、記載された範囲に含まれる場合、そのような含まれる限界の一方又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。
【０２７５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、その内容について別途明確な指示がない限り、複数形の指示物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「タンパク質」又は「核酸配列」を指す場合、それには、複数のそのような候補薬剤、及び当業者にとって公知のその同等物等が含まれる。
【０２７６】
本明細書で議論される公開資料は、本出願の出願日に先立つそれらの開示のためにもっぱら提供される。本明細書内のいずれも、そのような公開資料が、本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術に該当するとした承認として解釈されない。
【０２７７】
本発明は、下記の図及び実施例を参照しながら、例示目的に限定して以下に記載される。
［実施例］
【実施例１】
【０２７８】
側芽の発芽が低下している変異したニコチアナ・タバカム植物
１つのオープンリーディングフレームが、ニコチアナ・タバカムにおいて側芽の発芽に関与する候補タンパク質として識別された。
【０２７９】
オープンリーディングフレーム候補についてバイオインフォマティクス解析を行い、ゲノム配列（配列番号１）、コーディング配列（ｃｄｓ）（配列番号２）、並びに予測されたアミノ酸配列（配列番号３）を識別した。
【０２８０】
オープンリーディングフレーム候補内に非許容性のアミノ酸置換を有するＫ３２６ニコチアナ・タバカム変異体が生成され、サンガー配列決定法により妥当性確認された。変異体は、ゲノム配列（配列番号３）内にＣ２３０３Ｔ変異を含み、その結果、ｃｄｓ（配列番号２）内のＣ７０１Ｔ変異、及びア配列番号３の位置２３４におけるＴｈｒからＩＩe置換をもたらした（Ｔ２３４）。この変異体を、ＴＦＡ０５１２と呼んだ。
【０２８１】
デジタルフェノタイピング
ＴＦＡ０５１２ホモ接合性植物及び対照Ｋ３２６植物を、汎用のポット土壌を３リットルのポット中で成長させた。ベルトに移動させる前に、植物を１１週間成長させた。第８〜１２葉期の植物を摘み取り、そして葉を切り取った。すべての植物を、開花期に到達したか否かを問わず、同時に摘み取った。摘み取り時、最下部の２又は３葉を除きすべてを植物から除去した。
【０２８２】
摘み取り後、植物を１日１回、１４日間画像化した。ＲＧＢカメラを使用して、側方角度が９、９０、１８０、及び２７０°の順番で、画像を４方向の角度から毎日取得し、また真上から１画像撮影した。実験期間中に吸枝の成長を決定するのに、ピクセルカウントを使用した。得られた浄化検出後のピクセルサイズデータセットを、成長モデルに当て嵌めるのに用い、同モデルから異なる遺伝子型毎に成長速度（日々のピクセルの増加）を見積もった。この速度を比較して、遺伝子型間の相違を推測した。植物×角度の各組合せに成長モデルを適用し、そして該当する場合には、温室位置等の関連する要因について補正を行い、遺伝子型の平均を取得する。
【０２８３】
これらの結果から、ＴＦＡ０５１２植物は、対照Ｋ３２６植物と比較して側芽の発芽（吸枝化）が低下及び／又は遅延していることが実証された（図１参照）。
【０２８４】
従来型のバイオマス表現型
摘み取り前、開花期に達するまでこの植物を放置した点を除き、上記デジタルフェノタイピングと同様に、ＴＦＡ０５１２及び対照Ｋ３２６植物を成長させ、次に必要に応じて摘み取った。
【０２８５】
各植物を、摘み取り後継続的に１４日間成長させ、その時点で最上部の３つの吸枝を除去、プール、乾燥し、そして秤量した。この重量を、吸枝化の表現型の指標として用いた。
【０２８６】
この結果から、対照Ｋ３２６植物と比較して、ＴＦＡ０５１２植物では、側芽の発芽（吸枝化）が低下していることが実証された（図２及び３参照）。
【０２８７】
上記明細書に記載するすべての公開資料は、本明細書に参照として組み込まれる。記載されている本発明の方法及びシステムについて、本発明の範囲及び精神から逸脱しないその様々な修飾形態及び変更形態は、当業者にとって明白である。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、主張されるような本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解すべきである。確かに、本発明を実施するに当たり、生化学及びバイオテクノロジー、又は関連分野の当業者にとって、記載するモードの様々な改変は明らかであるが、そのような改変も下記の特許請求の範囲内であるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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