(57)【要約】  本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法、ならびにヒト肝機能およびその他の生体機能に影響するであろう任意のタイプの薬物、典型的に小分子薬物の代謝産物をスクリーニングおよび同定するために、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を利用する方法を提供する。
2019524077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、以下の：
（ａ）Ｐｏｒタンパク質の発現の低減または不存在をもたらす、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子の削減または欠失を含む非ヒト動物を提供し、そして
（ｂ）ヒト肝細胞をその非ヒト動物に移殖すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記非ヒト動物を提供することが、Ｐｏｒタンパク質の発現の低減または不存在をもたらす、Ｐｏｒ遺伝子の削減または欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記削減または欠失されたＰｏｒ遺伝子が、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックダウンまたはノックアウトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記削減または欠失されたＰｏｒ遺伝子が、突然変異、導入遺伝子、外因性物質または体細胞ゲノム工学を用いた処理の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記体細胞ゲノム工学が、Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびカスパーゼ９（Ｃａｓ９）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ヒト動物が、Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含み、かつ、該非ヒト動物が、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックアウトを生じさせるのに十分なＣｒｅリコンビナーゼと共に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含む非ヒト動物には、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの初回投与と共に少なくとも提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非ヒト動物には、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与が少なくとも提供される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下の：
（ａ）Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含む非ヒト動物を、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの最初の投与と共に提供し；
（ｂ）ヒト肝細胞を、その非ヒト動物に移殖し；そして
（ｃ）Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与をその非ヒト動物に提供すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ａ）と（ｂ）が連続して起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）と（ｂ）が同時に起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含む非ヒト動物を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物株と交配させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ヒト動物が、薬物代謝に関与した酵素をコードする少なくとも１つの追加遺伝子の削減または欠失を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの追加酵素が、第ＩＩ相薬物酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト動物が、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（ＵＧＤＨ）遺伝子の削減または欠失を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト動物が、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）遺伝子の削減または欠失を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記非ヒト動物が、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、およびブタから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記非ヒト動物が、（ｉ）ＦＲＧ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）非ヒト動物、（ｉｉ）トランスジェニックウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）非ヒト動物（誘導プロモータ、好ましくは肝臓に制限されたアルブミンプロモータ下でｕＰＡを過剰発現するもの）、（ｉｉｉ）チミジンキナーゼ−ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＴＫ−ＮＯＧ）非ヒト動物（肝臓に制限されたプロモータ制御下のチミジンキナーゼのトランスジェニック発現を有する免疫不全ＮＯＧ非ヒト動物）、（ｉｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ８を発現する非ヒト動物、および（ｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ９を発現する非ヒト動物、から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
キメラ非ヒト動物、その子、またはその一部であって、ヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって調製されたもの。
【請求項２１】
前記非ヒト動物が、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、およびブタから成る群から選択される、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２２】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２３】
前記キメラ非ヒト動物が、実質的に自家肝細胞を欠いている、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２４】
前記ヒト肝細胞が、キメラ肝臓のすべての肝細胞のうちの少なくとも６０％を占める、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２５】
前記ヒト肝細胞が、キメラ肝臓のすべての肝細胞のうちの少なくとも７０％を占める、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２６】
前記ヒト肝細胞が、キメラ肝臓のすべての肝細胞のうちの少なくとも８０％を占める、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２７】
前記ヒト肝細胞が、キメラ肝臓のすべての肝細胞のうちの少なくとも９０％を占める、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２８】
前記キメラ非ヒト動物が免疫不全である、請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項２９】
ヒト肝機能に作用する物質をスクリーニングする方法であって、以下の：
（ａ）請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物に試験物質を投与し；
（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラ非ヒト動物において１若しくは複数の値を計測し；そして
（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラ非ヒト動物において計測される１若しくは複数の値と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の値の増大または減少を引き起こす試験物質を選択すること、を含む方法。
【請求項３０】
前記１もしくは複数の値が、試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、および総ビリルビンレベル、クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、トロポニン、血球数、ＴＳＨ、ならびにヒトおよび非ヒト臓器の病理の組織学的評価から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
非ヒトキメラ動物においてヒト肝細胞およびその他の非ヒト臓器に対する試験物質の毒性を評価する方法であって、以下の：
（ａ）請求項２０に記載のキメラ非ヒト動物に試験物質を投与し；
（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラ非ヒト動物において１若しくは複数の指標を計測し；そして
（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラ非ヒト動物において計測される１若しくは複数の指標と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の指標を使用して、ヒト肝細胞に対する試験物質の効果を評価すること、を含む方法。
【請求項３２】
前記１もしくは複数の指標が、任意の１若しくは複数の試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、および総ビリルビンレベルの増加または減少、クレアチニン、ＢＵＮ、トロポニン、血球数およびＴＳＨ、ならびにこれだけに限定されるものではないが、ヒトおよび非ヒト臓器における壊死およびアポトーシスを含めた組織学的変化から成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５５，１０２号および２０１７年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／５０９，９４２号についての優先権と利益を主張する。これらの出願のそれぞれの全内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表の参照による組込み
２０１７年６月２０日に作成され、６７ＫＢのサイズがある、テキストファイル名「ＫＡＲＬ−００１−ＷＯ＿ＳＴ２５」の内容は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
開発中の１０種類の薬物のうちのたった１種類しか臨床用途のために承認されない。その大部分が、ヒトにおける無効力または毒性のため臨床試験中に脱落する。ヒト異物代謝を正確に予測する実験的動物モデルの不足が顕著な制限となり、そしてそれがヒトの寿命を危険にさらし、かつ、薬物開発コストを酷使している。したがって、もっと優れた前臨床ツールを開発する切迫したニーズが存在する。本開示は、ヒト肝臓キメラ非ヒト動物モデル、およびヒトに特有の薬物代謝を予測するための、ヒト肝臓キメラ非ヒト動物モデルを使用する方法を提供することにより、当該技術分野におけるこれらのニーズを解決する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、以下の：（ａ）Ｐｏｒタンパク質の発現の低減または不存在をもたらす、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子の削減または欠失を含む非ヒト動物を提供し、そして（ｂ）ヒト肝細胞をその非ヒト動物に移殖すること、を含む方法を提供する。
【０００５】
非ヒト動物は、Ｐｏｒタンパク質の発現の低減または不存在をもたらす、Ｐｏｒ遺伝子を削減するかまたは欠失することを含み得る。削減または欠失されたＰｏｒ遺伝子は、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックダウンまたはノックアウトであり得る。削減または欠失されたＰｏｒ遺伝子は、突然変異、導入遺伝子、外因性物質を用いた処理、またはＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復）システムを含めた体細胞ゲノム工学の結果であってもよい。体細胞ゲノム工学には、Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびカスパーゼ９（Ｃａｓ９）が含まれる。
【０００６】
非ヒト動物は、Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含み得る、かつ、ここで、該非ヒト動物は、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックアウトを生じさせるのに十分なＣｒｅリコンビナーゼと共に提供される。Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含む非ヒト動物には、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの初回投与と共に少なくとも提供される。非ヒト動物には、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与を少なくとも提供される。Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含む非ヒト動物を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物株と交配した。
【０００７】
１つの態様において、本開示の方法は、（ａ）Ｐｏｒ遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含む非ヒト動物を、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの最初の投与と共に提供し；（ｂ）ヒト肝細胞を、その非ヒト動物に移殖し；そして（ｃ）Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与をその非ヒト動物に提供することを含む。ステップ（ａ）および（ｂ）は、連続してまたは同時に起こり得る。
【０００８】
非ヒト動物は、薬物代謝に関与した酵素をコードする少なくとも１つの追加遺伝子の削減または欠失を更に含む。少なくとも１つの追加酵素は、第ＩＩ相薬物酵素であり得る。一態様において、非ヒト動物は、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（ＵＧＤＨ）遺伝子の削減または欠失、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）遺伝子の削減または欠失、またはそれらの組み合わせを更に含み得る。
【０００９】
ＵＧＤＨ遺伝子の削減または欠失は、ＵＧＤＨタンパク質の発現の低減または不存在をもたらし得る。ＧＳＳ遺伝子の削減または欠失は、ＧＳＳタンパク質の発現の低減または不存在をもたらし得る。ＵＧＤＨ遺伝子の削減または欠失は、ＵＧＤＨ遺伝子の条件付きノックダウンまたはノックアウトであり得る。ＧＳＳ遺伝子の削減または欠失は、ＧＳＳ遺伝子の条件付きノックダウンまたはノックアウトであり得る。削減または欠失されたＵＧＤＨまたはＧＳＳ遺伝子は、突然変異、導入遺伝子、外因性物質を用いた処理、またはＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復）システムを含めた体細胞ゲノム工学の結果であってもよい。体細胞ゲノム工学には、Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびカスパーゼ９（Ｃａｓ９）が含まれる。
【００１０】
非ヒト動物は、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、およびブタから成る群から選択され得る。好ましい態様において、非ヒト動物はマウスである。
【００１１】
削減または欠失されたＰｏｒ遺伝子を含む非ヒト動物は、（ｉ）ＦＲＧ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）非ヒト動物、（ｉｉ）トランスジェニックウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）非ヒト動物（誘導プロモータ、好ましくは肝臓に制限されたアルブミンプロモータ下でｕＰＡを過剰発現するもの）、（ｉｉｉ）チミジンキナーゼ−ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＴＫ−ＮＯＧ）非ヒト動物（肝臓に制限されたプロモータ制御下のチミジンキナーゼのトランスジェニック発現を有する免疫不全ＮＯＧ非ヒト動物）、（ｉｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ８を発現する非ヒト動物、および（ｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ９を発現する非ヒト動物、から成る群から選択され得る。
【００１２】
本開示はまた、キメラ非ヒト動物、その子、またはその一部を提供し、それらは、本明細書中に開示した任意の方法によって調製されたヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する。
【００１３】
キメラ非ヒト動物は、免疫不全であり得る。キメラ非ヒト動物は、実質的に自家肝細胞を欠いている。ヒト肝細胞は、キメラ非ヒト動物のキメラ肝臓のすべての肝細胞のうちの約１％超、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％のヒトキメラの任意のパーセンテージを占め得る。「非ヒト動物」は、両生類、爬虫類、鳥類、またはヒト以外の哺乳類であり得る。非ヒト動物は、例えば、任意のヒト以外の哺乳類、例えば、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジであり得る。好ましい態様において、非ヒト動物はマウスである。
【００１４】
一態様において、本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、以下のステップ：（ａ）その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にし、かつ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようなゲノム工学ツールなどの外因性の要因、またはＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を用いたゲノム工学またはノックダウンのいずれかによって作り出される無機能性ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼを含む、非ヒト動物を、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの初回投与またはＣｒｅトランスジェニック動物と共に提供し、それによって、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックアウトを生じさせ；（ｂ）ヒト肝細胞を、その非ヒト動物に移殖し；そして（ｃ）Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与をその非ヒト動物に提供すること、を含む方法を提供する。キメラ非ヒト動物は、実質的に自家または内生の肝細胞を欠いていてもよく、代わりにヒト肝細胞を含んでもよい。ステップ（ａ）および（ｂ）は、連続してまたは同時に起こり得る。その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にする突然変異および／または導入遺伝子を含む任意の非ヒト動物は、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子のｆｌｏｘｅｄまたは欠失対立遺伝子、またはＰｏｒタンパク質の機能的不活性化と組み合わせて使用されてもよい。態様において、その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にする突然変異および／または導入遺伝子を含む非ヒト動物は、（ｉ）ＦＲＧ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）非ヒト動物、（ｉｉ）トランスジェニックｕＰＡ非ヒト動物（誘導プロモータおよび／または好ましくは肝臓に制限されたアルブミンプロモータ下で、肝臓においてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を過剰発現するもの）、（ｉｉｉ）ＴＫ−ＮＯＧ非ヒト動物（肝臓に制限されたアルブミンプロモータ制御下でのチミジンキナーゼのトランスジェニック発現を有する免疫不全ＮＯＧ非ヒト動物）、（ｉｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ８を発現する非ヒト動物、または（ｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ９を発現する非ヒト動物、（ｖｉ）肝臓細胞特異的アルブミンプロモータ（ａｌｂ−ＴＲＥＣＫ）の制御下でヒトヘパリン結合性上皮成長因子様受容体（ＢＨ−ＥＧＦ）様受容体を発現する非ヒト動物、である。「非ヒト動物」は、両生類、爬虫類、鳥類、またはヒト以外の哺乳類である。
【００１５】
一態様において、本開示は、実質的にマウス肝細胞を欠き、代わりにヒト肝細胞を含むキメラマウスを調製する方法であって、以下のステップ：（ａ）その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にし、かつ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介欠失によるゲノム工学、または外因性の要因もしくはＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を用いたノックダウンのいずれかによって作り出される無機能性ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼを含む、マウスを、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの初回投与またはＣｒｅトランスジェニックマウスと共に提供し、それによって、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックアウトを生じさせ；（ｂ）ヒト肝細胞を、そのマウスに移殖し；そして（ｃ）Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与をそのマウスに提供すること、を含む方法を提供する。ステップ（ａ）および（ｂ）は、連続してまたは同時に起こり得る。その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にする任意のマウスは、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子または体性遺伝子欠失もしくは削減またはＰｏｒ遺伝子、それぞれタンパク質の不活性化と組み合わせて使用されてもよい。態様において、その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にするマウスは、（ｉ）ＦＲＧ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）マウス、（ｉｉ）トランスジェニックｕＰＡマウス（誘導プロモータ、好ましくは肝臓に制限されたアルブミンプロモータ下で、肝臓においてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を過剰発現するもの）、（ｉｉｉ）ＴＫ−ＮＯＧマウス（肝臓に制限されたアルブミンプロモータ制御下でのチミジンキナーゼのトランスジェニック発現を有する重度免疫不全ＮＯＧマウス）、（ｉｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ８を発現するマウス、（ｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ９を発現するマウス、または（ｖｉ）肝臓細胞特異的アルブミンプロモータ（ａｌｂ−ＴＲＥＣＫ）の制御下でヒトヘパリン結合性上皮成長因子様受容体（ＢＨ−ＥＧＦ）様受容体を発現するマウス、である。
【００１６】
本開示はまた、ヒト肝機能に作用するが、その他の身体機能にも作用するであろう任意型の薬物、典型的には小分子薬物の代謝産物をスクリーニングおよび同定する方法であって、以下の：（ａ）本開示のキメラ非ヒト動物に試験物質を投与し；（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラ非ヒト動物において１若しくは複数の値を計測し；そして（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラ非ヒト動物、またはＰｏｒ遺伝子の欠失を伴わないキメラ非ヒト動物、またはヒトキメラを含まない非ヒト動物において計測される１若しくは複数の値と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の値の増大または減少を引き起こす試験物質を選択すること、を含む方法を提供する。好ましくは、１もしくは複数の値は、これだけに限定されるものではないが、試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、および総ビリルビンレベル、クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、トロポニン、血球数、ＴＳＨ、ならびにヒトおよび非ヒト臓器の病理の組織学的評価から成る群から選択される。「非ヒト動物」は、両生類、爬虫類、鳥類、またはヒト以外の哺乳類であり得る。非ヒト動物は、例えば、任意のヒト以外の哺乳類、例えば、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジであり得る。好ましくは、非ヒト動物はマウスである。
【００１７】
本開示は、ヒト肝機能に作用する物質をスクリーニングする方法であって、以下の：（ａ）本開示のキメラマウスに試験物質を投与し；（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラマウスにおいて１若しくは複数の値を計測し；そして（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラマウスにおいて計測される１若しくは複数の値と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の値の増大または減少を引き起こす試験物質を選択すること、を含む方法を更に提供する。好ましくは、１もしくは複数の値は、試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、および総ビリルビンレベル、ならびにヒトおよび非ヒト臓器の病理の組織学的評価から成る群から選択される。
【００１８】
本開示はまた、ヒト肝細胞に対して試験物質の毒性を評価する方法であって、以下の：（ａ）本開示のキメラ非ヒト動物に試験物質を投与し；（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラ非ヒト動物において１若しくは複数の指標を計測し；そして（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラ非ヒト動物において計測される１若しくは複数の指標と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の指標を使用して、ヒト肝細胞に対する試験物質の効果を評価すること、を含む方法を提供する。好ましくは、１もしくは複数の指標は、任意の１若しくは複数の試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、および総ビリルビンレベルの増加または減少、ならびにヒトおよび非ヒト臓器における指標の組織学的評価から成る群から選択される。「非ヒト動物」は、両生類、爬虫類、鳥類、またはヒト以外の哺乳類であり得る。非ヒト動物は、例えば、任意のヒト以外の哺乳類、例えば、霊長類、トリ、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジであり得る。好ましくは、非ヒト動物はマウスである。
【００１９】
明細書を通じて、「含む（comprising）」という言葉、または例えば「comprises」もしくは「comprising」などの変形は、記述された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むが、その他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外しないことは理解される。
【００２０】
約とは、記述された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％の範囲内と理解され得る。文脈から明白な場合を除き、本明細書中に提供されたすべての数値が、「約」という用語によって修飾される。
【００２１】
開示はその詳細な説明と共に記載されたものの、上記の説明は例示することを意図したものであり、開示の範囲を制限することを意図したものではなく、開示の範囲は、添付の請求項の範囲によって規定される。他の態様、利点、および修飾が、以下の請求項の範囲内にある。
【００２２】
本明細書中に言及された特許および科学文献は、当業者にとって利用可能な知識を確立する。本明細書中に引用された、すべての米国特許および公開または未公開米国特許出願は、参照によって援用される。本明細書中に引用されたすべての公開海外特許および特許出願は、参照によって本明細書に援用される。本明細書中に引用された受入番号で示されたＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩ寄託は、参照により本明細書に援用される。本明細書中に引用された、すべての他の公開参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照によって本明細書に援用される。
【００２３】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つの色つき図面を含む。着色図面を含んでいるこの特許または特許出願広報のコピーは、請求と必要な料金の支払いによって特許庁から提供される。
【００２４】
先の特徴および更なる特徴は、添付図面と合わせられたとき、以下の詳細な説明からより明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、ＰＩＲＦ株の作出と、マウスＰ４５０（Ｐｏｒ）オキシドレダクターゼの欠失を示す。図１Ａは、ＰＩＲＦ株における欠失とトランスジェニック遺伝子座の略図である。図１Ｂは、ＣＲＥリコンビナーゼ（Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ）を発現するアデノウイルスの静脈内注射後のＰｏｒ ｍＲＮＡのｑＰＣＲを示すグラフである。図１Ｃは、高い中心静脈周囲（ｃｖ）発現および低い門脈周囲（ｐｖ）発現を有する肝腺房にわたる勾配を実証する一連のＰｏｒの免疫染色写真である。Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅの注射により、Ｐｏｒが辛うじて検出可能である。図１Ｄは、Ｐｏｒタンパク質のほとんど完全な消滅を示すウエスタンブロットの写真である。
【図２Ａ−２Ｅ】図２Ａ〜Ｅは、ＰＩＲＦ株のヒト化と、マウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）の欠失による遺伝子発現プロファイルを示す。図２Ａは、一度（１ｘ）または二度（２ｘ）のＡｄｅｎｏ−Ｃｒｅ（２．２×１０１０ｐｆｕ／マウス）の注射後のマウスＰｏｒ（ｍＰｏｒ）およびヒト核（ｈＮｕｃ）に関するヒト化ＰＩＲＦおよびＦＲＧマウスを示す一連の免疫染色写真である。ＤＡＰＩを使用した組み合わせ画像における対比染色。図２Ｂは、Ｐｏｒ欠損の有無を伴ったキメラ肝臓からマウスおよびヒトトランスクリプトミクスに関する実験の概要を示す図解である。図２Ｃは、ＰＩＲＦモデルの肝臓由来のマウスシトクロムｍＲＮＡを示すグラフである。図２Ｄは、ＰＩＲＦモデルの肝臓由来のヒトシトクロムｍＲＮＡを示すグラフである。図２Ｅは、本来の同質遺伝子的ヒト肝細胞と、ヒト化、Ｐｏｒ欠損ＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）マウスにおける主要な薬物代謝ヒトシトクロム遺伝子発現との比較を示すグラフである。遺伝子発現は、３匹のマウスそれぞれヒトハウスキーピング遺伝子（ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、およびＲＡＢ７Ａ ｒｅｓｐ． Ｒａｂ７２５）に対して正規化にされた。ＰＩＲＦ；Ｐｏｒｃ／ｃ／Ｉｌ２ｒｇ−／−／Ｒａｇ２−／−、Ｆａｈ−／−ＦＲＧ；Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−。
【図３Ａ−３Ｅ】図３Ａ〜Ｅは、ヒト化ＰＩＲＦマウスにおける生体異物代謝を示す。図３Ａは、ゲフィチニブの静脈内注射後２４時間以内にマウス糞便において質量分析法を使用した、非ヒト化ＰＩＲＦマウスにおけるマウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）欠失による、豊富なおよび減少したゲフィチニブ代謝産物の選択を示すグラフである。図３Ｂは、ゲフィチニブ代謝産物および既知の修飾を示す図解である。図３Ｃは、マウスＰｏｒ欠損ヒト肝臓キメラＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）マウスおよび対照群が最も豊富なヒト代謝物、Ｍ４を示すことを示すグラフである。図３Ｄは、マウスＰｏｒ欠損ヒト肝臓キメラＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）マウスと対照群がヒト特異的代謝産物Ｍ２８を示すことを示すグラフである。ＰＩＲＦ；Ｐｏｒｃ／ｃ／Ｉｌ２ｒｇ−／−／Ｒａｇ２−／−、Ｆａｈ−／−、ＦＲＧ；Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−。＊ｐ＜０．０５、ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定を使用する。図３Ｅは、アタザナビル、レトロウイルス治療薬注射３０分後のＰＩＲＦ肝臓ホモジネートの質量分析を示すグラフである。主要なヒト代謝物（Ｍ１５）が見られる。アタザナビルまたはゲフィチニブからの全体的に豊富な代謝産物が、各サンプルで１００％と設定された。データは平均で表される。ＰＩＲＦ；Ｐｏｒｃ／ｃ／Ｉｌ２ｒｇ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｆａｈ−／−、ＦＲＧ；Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−。＊ｐ＜０．０５、ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定を使用する。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、本開示の代表的なプローブの図解を示す。図４Ａは、ターゲッティングベクターおよび修飾Ｐｏｒ遺伝子座のデザインを示す図解である。図４Ｂは、ＥＳＣの適切な標的化を実証する３つのプローブを用いたサザンブロッティングの写真である。
【図５】図５は、ＰＯＲ−ｌａｃＺ対立遺伝子からのβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）発現を示す。ヘテロ接合マウス胚および肝臓のＸ−ｇａｌ染色は、Ｐｏｒ−ｌａｃＺ対立遺伝子からのガラクトシダーゼの発現を実証する。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａは、（色で）ｇＲＮＡの位置およびマウスの遺伝子型を決定するのに使用されるプライマーを示す、Ｉｌ２ ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈ遺伝子のスキームを示す。図６Ｂは、遺伝子型決定から得たＰＣＲ産物の電気泳動ゲルを示す。レーン１：外側（ＦｗおよびＲｖ）プライマーを使用したＰＣＲバンド。Ｒａｇ２およびＦａｈヘテロ接合体について、野性型（矢印）および欠失された（くさび形）対立遺伝子が検出され得る。Ｉｌ２ ｒｇは、Ｘ連鎖遺伝子であり、そして、始祖となるヘテロ接合体の雌は作り出されなかった。Ｉｌ２ ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈのホモ接合マウスは、それぞれ４６０ｂｐ、５３０ｂｐおよび２００ｂｐの対立遺伝子のバンドの単独の欠失を示す。レーン２：外側（ＦｗまたはＲｅｖ）のうちの１つと、２つのｇＲＮＡ部位の間に配置される内側（Ｉｎｔ）プライマーを使用したＰＣＲバンド。ヘテロ接合体だけが、野性型対立遺伝子から形成された明白なＰＣＲバンドを有する。ＦａｈおよびＲａｇ２ホモ接合体が、多発の非特異的バンドを示す一方で、Ｉｌ２ ｒｇホモ接合体は、いずれのバンドも生じない。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、Ｉｌ２−ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈ遺伝子内のゲノム欠失の範囲を示す。図７Ａは、ＤＮＡの欠失の測定のために配列された条件付きＰｏｒ−／−マウスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９導入接合体を示す図解である。図７Ｂは、アミノ酸の欠失の測定のために配列された条件付きＰｏｒ−／−マウスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９導入接合体を示す図解である。
【図８】図８は、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するアデノウイルスを使用したＰｏｒ遺伝子の欠失によるＰＩＲＦマウスの肝臓における脂質表現型を示す。アデノウイルスの注射の２週間後に、肝細胞が脂質の蓄積を開始する。オイルレッドＯ染色肝臓は、Ｐｏｒ遺伝子のそれぞれの発現（下のパネル）の効果的な欠失（上のパネル）について以前に実証された（未掲載）。
【図９】図９は、非ヒト化ＰＩＲＦマウスにおけるＰｏｒ発現肝細胞のクローン性増殖を示す。マウスには、Ｐｏｒ遺伝子（ＰＯＲｆｌ／ｆｌ）を欠失したＣＲＥリコンビナーゼを発現するアデノウイルスが静脈内に注射された。
【図１０】図１０は、ヒト化および非ヒト化対照マウスにおける薬物研究のための実験構成を示す。ヒト化（Ｈｕ）および非ヒト化ＰＩＲＦおよびＦＲＧマウスには、薬物研究をおこなう前に、一度（１ｘ、ヒト肝細胞の移殖前）または二度（２ｘ、高ヒトキメラ性に達する前後）注射をおこなった。注射したアデノウイルスは、ＣＲＥリコンビナーゼを発現し、そしてそれが、ＰＩＲＦのＰｏｒ遺伝子の欠失につながるが、ＦＲＧ株（対照）ではそうならない。オレンジ色；マウス薬物代謝、白色；阻害されたマウス薬物代謝、青色；ヒト薬物代謝。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＰＯＲの条件付きＫＯはまた、トランスジェニック動物を使用しても作出されることができ、そしてそれは、ＣＲＥリコンビナーゼの発現カセット（アルブミンプロモータ）を担持することを示す。図１１Ａは、ＰＯＲが、1つの対立遺伝子だけがｆｌｏｘｅｄ ＰＯＲ配列を担持し、その他が野生型ＰＯＲ（ＰＯＲｃ／＋）を担持する対照群において、免疫蛍光法で検出され得ることを示す。図１１Ｂでは、両ＰＯＲ対立遺伝子がｆｌｏｘｅｄ（ＰＯＲｃ／ｃ）であり、ＰＯＲ遺伝子のほとんど完全な欠失およびわずかに検出可能なＰＯＲタンパク質につながる。ＰＯＲ（緑色）および核（青色、ＤＡＰＩ）。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２は、ヒト化ＰＩＲＦマウスにおけるＰ４５０オキシドレダクターゼの発現を示す。図１２Ａは、それぞれ、ヒトおよびマウスＧａｐｄｈに対して正規化したヒトおよびマウス特異的ＰｏｒのｑＰＣＲを示す棒グラフである。図１２Ｂは、同じヒト化マウスからの肝臓サンプルのマウスＰｏｒおよびβ−アクチンを示すウエスタンブロット画像である。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３は、マウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）欠失によるゲフィチニブ代謝産物を示す。図１３Ａは、ＣＲＥのアデノウイルス送達による欠失を示す棒グラフである。図１３Ｂは、Ａｌｂ−ＣｒｅマウスとＰｏｒｃ／ｃとの交配により、Ａｌｂ−Ｃｒｅ／Ｐｏｒｃ／ｃ株を作出することを示す棒グラフである。
【図１４Ａ−１４Ｃ】図１４は、Ａｌｂ−ＣｒｅトランスジェニックマウスとＰｏｒｃ／ｃとの交配によるマウスＰ４５０オキシドレダクターゼの欠失を示す。図１４Ａは、完全なＰｏｒ欠損を示す共焦点免疫染色画像である。図１４ｂは、対照Ｐｏｒｃ／ｃマウスおよび３種類の異なるＡｌｂ−Ｃｒｅ／Ｐｏｒｃ／ｃマウスからのＰｏｒタンパク質肝臓サンプルを示すウエスタンブロット画像である。図１４Ｃは、マウスＰｏｒ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲを示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、糞便中のゲフィチニブ代謝産物Ｍ２８を示す棒グラフである。
【００２６】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６は、ｈｕ−ＰＩＲＦ−２ｘマウスおよび対照の（Ａ）血清および（Ｂ）尿中のゲフィチニブ代謝産物Ｍ２８を示す１組の棒グラフである。
【図１７】図１７は、標的化ＥＳＣのサザンブロット画像である。図１７Ａは５’プローブの使用を示し、図１７Ｂは３’プローブの使用を示し、および図１７Ｃはネオマイシンプローブの使用を示す。
【図１８】図１８は、Ａｄｅｎｏ−ＣＲＥを注射したＰＩＲＦマウスからのマウスＰｏｒおよびＧａｄｐｈを示すウエスタンブロット画像である。
【図１９Ａ−１９Ｂ】図１９Ａ〜Ｂは、ヒト化ＰＩＲＦマウス（ａ）およびＰｏｒｃ／ｃと（ｂ）Ｐｏｒｃ／ｃ／Ａｌｂ−ＣＲＥマウスからのマウスＰｏｒおよびＧａｄｐｈを示すウエスタンブロット画像である。
【図２０】図２０は、大滴性および小滴性脂肪変性を示すアデノウイルスを用いた形質導入４週間後の肝臓葉のＨ＆Ｅ染色である。左側の画像は、右側の四角で囲った領域のより高い倍率の画像である。
【図２１Ａ−２１Ｂ】図２１Ａ〜Ｂは、ヒト化マウスにおける薬物代謝酵素のゲノム工学によって肝臓特異的欠失のための遺伝子治療ベクターデザインを示す。Ａ．２ベクターデザイン：アデノウイルスベクター（ａｄ）内のＣＭＶプロモータの制御下のＳ．ピオゲネス（S.pyogenes）Ｃａｓ９、および薬物代謝酵素を標的化するｓｇＲＮＡを発現するＡｄｅｎｏ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、そして、同じ構築物上のＧＦＰの同時発現。図２１Ｂ．シングルベクターデザイン：Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡが同じＡＡＶベクター（４．８５ｋｂ）により送達され得る。ＨＡ、ＨＡエピトープ。
【図２２】図２２は、体細胞ゲノム工学によるヒト化マウスにおけるマウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）と、薬物代謝にかかわる他のマウス酵素との同時欠失を示す。ヒト化ＦＲＧマウス（マウス血清中のヒトアルブミン＞２ｍｇ／ｍｌ）には、マウスＰｏｒの初期エクソンを標的化するｓｇＲＮＡを発現するＡｄｅｎｏ随伴ウイルス（ＡＡＶ、血清型８）、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（Ｕｇｄｈ）またはグルタチオンシンテターゼ（Ｇｓｓ）遺伝子（遺伝子治療ベクターデザインを参照、図２１）が注射された。ＡＡＶは、Ｃａｓ９を発現するアデノウイルスの注射（７×１０９ｐｆｕ／Ａｄ／マウス）の１週間前に注射された（２×１０１１ＧＣ／ＡＡＶ／マウス）。対照マウスには、アデノウイルスベクターだけを注射した（下の行）。ヒト特異的Ｐｒｅ−ＡＬＢ（トランスチレチン）、Ｐｏｒ、Ｕｇｄｈ、Ｇｓｓ、ｈＡＬＢおよびＧＦＰへの免疫染色を用いた代表的なヒト化領域の連続切片を示し、後者は、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターから発現される（遺伝子治療ベクターデザインを参照、図２１）。バーは５０μｍを表す。ＡＬＢ、アルブミン。
【図２３】図２３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるｐｏｒのゲノム欠失を示す：野性型およびヒト化ＦＲＧマウス（マウス血清中のヒトアルブミン＞２ｍｇ／ｍｌ）には、マウスＰｏｒの連続した初期エクソンならびにＳ．アウレウスＣａｓ９（遺伝子治療ベクターデザインを参照、図２１）を標的化したｓｇＲＮＡを発現する２つのＡｄｅｎｏ随伴ウイルス（ＡＡＶ、血清型８）が注射される。ＡＡＶが注射される（２×１０１１ＧＣ／ＡＡＶ／マウス）。対照マウスには、Ｃａｓ９だけを発現するアデノウイルスベクターが注射される（７×１０９ｐｆｕ／Ａｄ／マウス）。隣接する２つの標的化部位にわたる領域のＰＣＲ増幅が示されている。両方の標的部位のＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性切断は、より小さいＰＣＲアンプリコンに通じるＰｏｒ遺伝子の欠失をもたらす。
【図２４】図２４は、トランスジェニックＡｌｂ−ＣＲＥおよび薬物代謝にかかわる他のマウス酵素の欠失を有するヒト化ＰＩＲＦマウスを示す。Ｐｏｒは、アデノウイルスＣＲＥの代わりに、ＣＲＥの発現によって欠失されたが、このＰＩＲＦマウスは、マウスゲノム内にＡｌｂ−ＣＲＥ配列を担持する。ヒト化後に、マウスには、初期エクソンＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（Ｕｇｄｈ）またはグルタチオンシンテターゼ（Ｇｓｓ）遺伝子を標的化するＡｄｅｎｏ随伴ウイルス（ＡＡＶ、血清型８）を発現するｓｇＲＮＡが注射された（遺伝子治療ベクターデザインを参照、図２１）。ＡＡＶは、Ｃａｓ９を発現するアデノウイルスの注射（７×１０９ＧＥ／Ａｄ／マウス）の１週間前に注射される（２×１０１１ＧＥ／ＡＡＶ／マウス）。ヒト特異的Ｐｒｅ−ＡＬＢ（トランスチレチン）、Ｐｏｒ、ＵｇｄｈまたはＧｓｓへの免疫染色を用いた代表的なヒト化領域の連続切片が示される。バーは５０μｍを表す。ＡＬＢ、アルブミン。
【図２５Ａ−２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｄは、ＰｏｒおよびＵｇｄｈ欠失の有無を伴ったヒト化および非ヒト化ＦＲＧマウスの肝臓において検出されたトログリタゾンの第ＩＩ相代謝産物を示す。トログリタゾン（６００ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ注射の２時間後にヒト化肝臓において検出された肝臓グルクロニド化および硫酸化代謝産物のパーセンテージ。図２５Ａ．ヒト化ＦＲＧマウス。図２５Ｂ．マウスＰｏｒおよびＵｇｄｈ欠失後のヒト化ＦＲＧマウス。図２５Ｃ．非ヒト化ＦＲＧマウス。図２５Ｄ．ＰｏｒおよびＵｇｄｈ遺伝子の欠失を伴った非ヒト化ＦＲＧマウス。赤色のトログリタゾンの硫酸代謝産物および青色のグルクロニド抱合体。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の詳細な説明
ヒト肝臓キメラマウスは、ヒト生体異物代謝および毒性を予測するために最近導入された。それらの可能性にもかかわらず、Ｐ４５０シトクロムの拡張セットを含むマウス肝臓が残留していることは、ヒト薬物代謝を正確に予測することを難しくする。そのため、本開示は、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子の条件付きノックアウトマウスを提供し、そしてそれが、すべてのマウスシトクロムの唯一の電子供与体であり、そして、欠失された場合、胎生致死であり１、それによって、すべてのマウスシトクロムの機能的不活性化を可能にする。
【００２８】
その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にする、突然変異および／または導入遺伝子を含む任意のマウスは、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子の条件付きノックアウト対立遺伝子または他のゲノム欠失と組み合わせて使用されてもよい。実施形態において、その肝臓がヒト肝細胞を再増殖させることを可能にする突然変異および／または導入遺伝子を含むマウスは、（ｉ）ＦＲＧ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）マウス、（ｉｉ）トランスジェニックｕＰＡマウス（誘導プロモータ、好ましくは肝臓に制限されたアルブミンプロモータ下で、肝臓においてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を過剰発現するもの）、（ｉｉｉ）ＴＫ−ＮＯＧマウス（肝臓に制限されたアルブミンプロモータ制御下でのチミジンキナーゼのトランスジェニック発現を有する免疫不全ＮＯＧマウス）、（ｉｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ８を発現するマウス、（ｖ）肝臓で誘導性カスパーゼ９を発現するマウス、または（ｖｉ）肝臓細胞特異的アルブミンプロモータ（ａｌｂ−ＴＲＥＣＫ）の制御下でヒトヘパリン結合性上皮成長因子様受容体（ＢＨ−ＥＧＦ）様受容体を発現するマウス、である。斯かるマウスと、ＣＲＥを発現するアデノウイルスまたはトランスジェニックストラテジーとを使用することで、マウスＰｏｒ遺伝子のほとんど完全な欠失を作り出して、排他的なヒトシトクロム代謝につながり得る。
【００２９】
ｕＰＡ ＳＣＩＤマウス（Rhim et al 1994; Tateno et al. 2004）では、マウス肝細胞切除の遺伝子的原因は、ウロプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり；マウスは、ＳＣＩＤ免疫不全背景またはＲａｇ２（またはＲａｇ１）−／−および／またはＩｌ２ｒｇ−／−の状態にあり、すべてがヒト肝細胞を移殖するおよび植え付ける能力につながる。
【００３０】
ＦＲＧマウスで（Azuma et al 2007 7, Bissig et al 2007 5）では、マウス肝細胞切除の遺伝子的原因は、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ欠失であり、そして、マウス肝細胞切除は、±ＮＴＢＣおよび／または±低チロシン食で制御され；そのマウスはＩｌ２ｒｇ−／−およびＲａｇ２−／−背景の状態にある。ＦＲＧマウスは、組み換え活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）およびインターロイキン２受容体のγ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）内、免疫不全媒介変異群を、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）遺伝子の機能的なノックアウトと組み合わせる（Azuma et al 2007 7, Bissig et al 2007 5）。後者遺伝子は、チロシン異化経路の酵素をコードし、そして、その突然変異は、肝細胞内への毒性中間体の細胞内蓄積につながる。ｕＰＡ／ＳＣＩＤモデルと異なって、ＦＲＧマウスにおける肝細胞障害の発症と重症度は、保護作用薬２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）の投与と使用中止により制御可能であり、そしてそれは、チロシン経路の上流の酵素を遮断し、それによって、毒性中間体の蓄積を予防する。
【００３１】
ＴＫ−ＮＯＧマウス（Hasegawa et al 2011）では、マウス肝細胞切除の遺伝子的原因は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、そしてマウス肝細胞切除は、±ガンシクロビルによって制御され；そのマウスはＩｌ２ｒｇ−／−およびＳＣＩＤ背景の状態にある。このＴＫ−ＮＯＧモデルにおけるマウス肝細胞切除は、ＨＳＶｔｋが他の方法で無毒性ＧＣＶを毒性中間体に変換するという事実を利用して、重症免疫不全ＮＯＧマウスにおける単純疱疹ウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）の肝臓特異的発現と、ガンシクロビル（ＧＣＶ）の投与によって達成された。
【００３２】
ＡＦＣ８マウス（Washburn et al 2011）では、マウス肝細胞切除の遺伝子的原因は、ＦＫ５０８−ｃａｐｓａｅ８融合であり、マウス肝細胞切除は、±ＡＰ２０１８７によって制御され；そのマウスはＩｌ２ｒｇ−／−およびＲａｇ２−／−背景の状態にある。
【００３３】
Ａｌｂ−ＴＲＥＣＫ／ＳＣＩＤマウス（Zhang et al 2015）では、マウス肝細胞切除遺伝子的原因は、ヒトヘパリン結合ＥＧＦ様受容体であり、マウス肝細胞切除は、±ジフテリア毒素によって制御され；そのマウスは、ＳＣＩＤ免疫不全背景の状態にある。
【００３４】
Sheer and Wilson, 2015は、これまで最も頻繁に使用されてきたモデルにおける、様々な異なる肝臓ヒト化モデルおよび肝臓再構築プロセスの主な特徴を比較する。この参考文献は、その全体が参照により援用される。
【００３５】
本開示はまた、ヒト薬物代謝を予測するためにヒト化、マウスＰｏｒ不全マウスを利用する方法を提供する。ある実施形態において、ＦＲＧマウスと条件付きＰｏｒ−／−マウスを組み合わせて、（ヒト肝細胞の再増殖を可能にする）ＰＩＲＦ（Ｐｏｒ−／−Ｉｌ２ｒｇ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｆａｈ−／−）株を作出する。ホモ接合ＰＩＲＦマウスは、繁殖力があり、そして、高いヒトキメラ性（＞８０％ヒト）を生じるヒト肝細胞を再増殖させ得る。
【００３６】
ヒトｐ４５０シトクロムクラスタは、５７の推定上の機能的な遺伝子および５８の擬似遺伝子を含んでいるが、マウスシトクロムクラスタは、１０２の推定上の機能的な遺伝子および８８の擬似遺伝子から成り、大きく拡張されている２。これが、マウスへの抗原投与によるヒト薬物代謝の精密予測をさせる。加えて、肝毒性は、過敏症／皮膚反応と共に、動物研究と最も乏しい相関関係を有するが、いまだに、臨床開発中の薬物の中止につながる毒性の最も頻度の高い理由である３。
【００３７】
肝臓は薬物代謝の主要な器官であるので、ヒト肝臓キメラマウスは、生体外物質研究のためにますます使用される４−６。ヒト化マウスの短所は、残留しているマウス肝臓組織である。高いヒトキメラ性を実現し得るマウスでさえ、平均ヒト化率が４２％であることが以前に示された７。マウスシトクロム代謝を機能的に遮断するために、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子の条件付き（ｆｌｏｘｅｄエクソン３および４）のノックアウトは、マウス胚性幹細胞（図４）を標的化することによって作り出された８。注射した胚盤胞と適切に標的化した胚性幹細胞は、Ｐｏｒ「ノックアウト第一（knock-out first）」対立遺伝子の生殖細胞伝達を伴ったマウスを作り出した９。ｌａｃＺ発現カセットを使用した標的化Ｐｏｒ遺伝子座からの発現を、胎児および成体肝臓で確認した（図５）。次いで、そのマウスを、フリッパーゼ発現株１０と共に飼育して、ＣＲＥリコンビナーゼ条件付きＰｏｒノックアウト株を作出した。この株からのホモ接合性接合体を、Ｉｌ２−ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈ遺伝子（図６）の重要なエクソンの同時欠失を標的化する、細菌性のＩＩ型のクラスタ化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）システム１１−１３と共に注射して、ＰＩＲＦ株を作り出す（図１Ａ）。ホモ接合ＰＩＲＦマウスは免疫不全（Ｔ−、Ｂ−、およびＮＫ細胞不全）であるが、健康であり、かつ、繁殖力がある。アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、インビボにおいて肝細胞を効率的に形質導入するので、Ｐｏｒ遺伝子は、ＣＲＥリコンビナーゼ（Ａｄｅｎｏ−ＣＲＥ）をコードするアデノウイルスを使用して欠失された。ウイルスの漸増用量（１マウスあたり２．２×１０８−１０）が、ＰＩＲＦマウスに静脈内で注射された。肝臓のＰＯＲ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲは、高用量においてのみ効果的な欠失を明らかにした（図１Ｂ）。ＰＯＲの免疫染色ではこれらの知見を確認したが（図１Ｃ）、その一方で、最小の残留シグナルは、使用した最も高い用量でさえウエスタンブロットによって検出され得る（図１Ｄ）。ＰＯＲ欠失ＰＩＲＦマウス肝臓は、先に報告された肝臓特異的Ｐｏｒ欠損１４と同様に、アデノウイルス形質導入の２週間後に、脂質蓄積を開始した（図７）。
【００３８】
ヒト特異的Ｐ４５０シトクロム代謝を作り出すために、ヒト肝細胞７、１５、１６をＰｏｒ欠損ＰＩＲＦマウスに移殖することによって、ヒト肝臓キメラマウスを作り出した。しかしながら、残留Ｐｏｒ発現性マウス肝細胞のクローン性増殖が、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ処置ＰＩＲＦマウスで観察されたので（図８）、一部のヒト化ＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ）マウスに、Ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅの追加用量を注射した。免疫染色は、二重に注射したヒト化ＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）マウスにおいてのみ、Ｐｏｒ遺伝子のほとんど完全な欠失が達成され得ることを明らかにした（図２Ａ）。
【００３９】
次いで、遺伝子発現プロファイルが、Ｐｏｒ欠損の有無を伴った同一ヒト肝細胞を再増殖させたＨｕ−ＰＩＲＦマウスで比較された（図２Ｂ）。マウスＰ４５０シトクロムの発現は、遺伝子のうちの半分に関して明確に変更された：１４のシトクロムが＞１．５倍上方制御され、そして、１８のシトクロムが＜０．５倍下方制御された（図２ｃ）。これらのマウスシトクロムの発現プロファイルは、非ヒト化マウスにおける先行研究と同等であった（表１）。表１は、キメラ肝臓のマウス遺伝子発現プロフィールと以前公開された非ヒト化マウスとの比較を示す。条件付き（Ａｌｂ−Ｃｒｅ）Ｐｏｒ ＫＯマウスの遺伝子発現は、マイクロアレイ解析によって定量化された（Weng et al. 2005 J Biol Chem 280, 31686-31698 (2005)）。ここで、ＲＮＡ−Ｓｅｑは、Ａｄｅｎｏ−ＣｒｅおよびＡｄｅｎｏ−ＧＦＰで形質導入したヒト化肝臓における遺伝子発現を比較することに使用された（図２Ｂ）。表１は、本明細書中に記載したデータセットと比較した値（倍率変化）と共に、以前に公開されたシトクロムのすべてを列挙する。複数の数字は、マイクロアレイプローブの複数のセットを表す。
【００４０】
【表１】
2019524077.tif 000003
【００４１】
同じキメラ肝臓では、すべてのヒトＰ４５０シトクロムが、ＣＹＰ２Ｃ１８（図２Ｄ）を除いて、マウスＰｏｒの欠失により下方調整された。ヒトシトクロムのうちの半分は、わずかしか（＜５０％）削減されず、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ１９を含めたもう片方の半分は、より顕著に下方制御された（＞１．５倍）。
【００４２】
すべてのヒトシトクロムが、生体異物代謝において重要な役割を果たしているわけではない。米国における２００の主要な転写薬物のうち、約四分の三が、Ｐ４５０シトクロムによって代謝されており、ＣＹＰ３Ａ４／５、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、および１Ａ２が、そのうちの９５％を占める１７。キメラ肝臓（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）からのこれらのヒトシトクロムクラスタを、ドナー肝臓から分離後に、発生した、同質遺伝子の初代肝細胞と比較した。発現レベルは、キメラ肝臓で強く発現された主要なクラスタおよびこれらの重要なシトクロムと類似していた（図３Ｄ）。
【００４３】
ヒト薬物代謝に関するＨｕ−ＰＩＲＦマウスの有用性を実証するために、ゲフィチニブの生体異物代謝１８、肺癌および他の様々な癌に対して使用される上皮成長因子受容体の阻害剤１９を試験した。ゲフィチニブを、ＣＹＰ３Ａ４および２Ｄ６を含めたＰ４５０シトクロムシステムによって主に代謝させる。新しいゲフィチニブ代謝産物が、最近、ヒトとマウス肝臓ミクロソームとの間の大きな相違を同定し、そして、立証した２０。ゲフィチニブは、用量、経路または種に関係なく、糞中に、そして７％未満が尿中に排出される２１、２２。そのため、非ヒト化ＰＩＲＦマウスの糞便を、ゲフィチニブ代謝産物について、ゲフィチニブの静脈内注射後の最初の２４時間の間、分析した。質量分析法では、Ｐｏｒ遺伝子の欠失によりいくつかのゲフィチニブ代謝産物の低減が明らかになり、これらの代謝産物のＰｏｒ依存性Ｐ４５０シトクロム欠損を含意している（図３Ａ）。最も大きく、かつ、関連性のある低減は、Ｏ−デスメチルゲフィチニブ（Ｍ４、Ｍ５２３５９５）について観察され、そしてそれは、ヒト糞便中で群を抜いて最も豊富な代謝産物である一方で、齧歯動物は、Ｍ４を含めて多くの異なる代謝産物を生じる２１、２２（図３Ｂ）。そのため、Ｍ４代謝産物は、マウスＰｏｒ欠損およびＰｏｒ発現ヒト化および非ヒト化対照マウスにおいて分析された（図９）。最高レベルのＭ４は、マウスＰｏｒ不全Ｈｕ−ＰＩＲＦマウスで検出され得るが、ここで、ヒト肝細胞は、ゲフィチニブをＭ４へと優先的に代謝し、そして、残留しているマウス肝細胞はそれらの薬物代謝において阻害される（図３Ｃ）。マウス肝細胞は、Ｍ４以外の代謝産物を優先的に生じるが、ヒト特異的代謝産物が計測された。Ｍ２８は、最も豊富なヒト代謝物であり、そしてそれは、非ヒト化対照マウスで検出されることがあり得ない。質量分析法は、マウスＰｏｒ不全Ｈｕ−ＰＩＲＦマウスにおいて、このヒト特異的代謝産物の最高レベルを再び示し、これらのマウスにおけるヒトにより近い代謝を確認した（図３Ｄ）。ヒト生体異物代謝はまた、別の薬物でも測定されたが、しかしながら、今回は、ＰＩＲＦマウスの肝臓ホモジネートを使用した。ヒトおよびマウスミクロソームを使用して、アタザナビル代謝産物Ｍ１５が、主にヒトの代謝産物であることが以前実証されていた（Li, F et al., “CYP3A-mediated generation of aldehyde and hydrazine in atazanavir metabolism.” Drug Metab Dispos 39, 394-401を参照）。マウスには、レトロウイルス治療薬を静脈内注射し、そして注射の３０分後に肝臓を摘出した。結果は、Ｍ１５が、非欠損マウスと比較して、ＰＯＲ欠失ヒト化ＰＩＲＦマウスにおいて５．４倍上昇したことを示し（図３Ｅ）、この新規マウスモデルにおける最適化されたヒト薬物代謝を改めて確認した。
【００４４】
現在の実験的動物モデルを使用したヒト代謝物の識別は、主要な課題である。それにもかかわらず、それらがヒト薬物毒性の決定要因となっているので、反応性代謝物の識別は重要である２３、２４。本開示の新規ヒト化マウスモデルは、ヒト代謝を妨害することなくマウス薬物代謝を阻害する。マウスＰｏｒ不全ヒト化は、トランスジェニックｕＰＡマウスのような他の再増殖モデルと組み合わせて使用でき、薬物安全性のよりすばらしい利益のためにより容易にヒト特異的代謝産物を同定できる。
【００４５】
大部分のヒトまたはヒト特異的代謝産物の識別は、毒性とは関係なく本開示を用いて可能である。有毒性は存在するが；しかしながら、これはいつもそうであるというわけではない。例えば、本明細書で示したように、ゲフィチニブは、肝臓酵素の少しの上昇も引き起こさないが、それにもかかわらず、主にヒト代謝産物は同定された。
【００４６】
本開示は、マウス肝細胞を実質的に欠き、その代わりにヒト肝細胞を含んでいるキメラマウスを調製する方法であって、以下のステップ：（ａ）Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの初回投与と共に、Ｉｌ２−ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈ遺伝子それぞれの中にノックアウト突然変異、ならびにＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を含むマウスを提供し、それによって、Ｉｌ２−ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈ不全マウスにおいて、Ｐｏｒ遺伝子の条件付きノックアウト、または体細胞ゲノム工学（ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９）と遺伝子治療ベクターを使用したＰｏｒ遺伝子のノックアウトを生じさせ；（ｂ）ヒト肝細胞をそのマウスに移殖し；そして（ｃ）Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするウイルスの二回目の投与をそのマウスに提供すること、を含む方法を提供する。ステップ（ａ）および（ｂ）は、連続して起こっても、または同時に起こってもよい。
【００４７】
条件付きノックアウトＰＯＲ対立遺伝子はまた、当該技術分野で知られている任意の方法によるＣＲＥリコンビナーゼの送達によっても作り出され得る。Ｃｒｅリコンビナーゼ送達の非限定的な例としては、ウイルス性または非ウイルス性遺伝子治療ベクターが挙げられる。一実施形態において、遺伝子治療ベクターはアデノウイルスである。例えば、細胞、組織、または発生特異的プロモータの下、あるいは誘導プロモータの下でのＣｒｅ組み換え遺伝子の送達もまた考慮される。実際には、Ｃｒｅリコンビナーゼは、トランスジェニック動物のマウス肝臓において、アルブミンまたは他の肝臓特異的プロモータの下で発現されたＣｒｅにより活性化される（図１１）。
【００４８】
本開示はまた、キメラマウス、その子、またはその一部を提供し、そしてそれは、ヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する。好ましくは、キメラマウス、その子孫、またはその一部は、本開示の方法によって調製される。キメラマウスは、免疫不全であってもよい。
【００４９】
本開示では、キメラマウスの例としては、マウスの部位が挙げられる。「マウスの一部」という用語は、マウス由来組織、体液、細胞、その破砕生成物またはそこからの抽出物、例えば（その例は、具体的にそれらに限定されない）を指す。斯かる組織の例として、これだけに特に限定されるものではないが、心臓、肺、腎臓、肝臓、胆嚢、膵臓、脾臓、腸、筋肉、血管、脳、精巣、卵巣、子宮、胎盤、髄、甲状腺、胸腺、および乳腺が挙げられる。体液の例としては、具体的にこれだけに限定されるものではないが、血液、リンパ液、および尿が挙げられる。「細胞」という用語は、上記の組織または体液に含まれる細胞を指し、その例としては、培養細胞、精細胞、卵、およびその単離および培養によって得られる受精卵が挙げられる。培養細胞の例としては、初代培養細胞と樹立細胞株の細胞の両方が挙げられる。マウスの部位の例としてはまた、発生段階（胚形成期）の組織、体液、および細胞、ならびにその破砕生成物または抽出物も挙げられる。加えて、本開示のマウスからの樹立細胞株は、既知の方法を使用して確立され得る（Primary Culture Methods for Embryonic Cells (Shin Seikagaku Jikken Koza (New Biochemical Experimental Lecture Series), Vol. 18, pages 125-129, TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD., and Manuals for. Mouse Embryo Manipulation, pages 262-264, Kindai Shuppan)）。
【００５０】
本開示のマウスは、免疫不全マウスであってもよい。本開示の免疫不全マウスは、ヒト肝細胞の移殖のための宿主マウスとして使用されてもよい。「免疫不全マウス」の例は、別の動物起源からの肝細胞（特に、ヒト肝細胞）に対して拒絶反応を示さないあらゆるマウスであり得、そして、これだけに限定されるものではないが、ＴおよびＢ細胞株の欠失を示すＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウス、胸腺の遺伝子欠失のためＴ細胞機能を失ったマウス（ＮＵＤＥマウス）、および既知の遺伝子標的化法（Science, 244: 1288-1292, 1989）によってＲＡＧ２遺伝子をノックアウトすることによって作出されたマウス（ＲＡＧ２ノックアウトマウス）が挙げられる。
【００５１】
そのうえ、本開示は、ヒト肝細胞を有するキメラマウスを提供する。本開示のキメラマウスは、免疫学的に不完全であってもよい。本開示のキメラマウスは、本開示の免疫不全マウス内にヒト肝細胞を移殖することによって調製され得る。
【００５２】
ヒト肝細胞が移殖に使用されるべきなので、例えばコラゲナーゼ灌流法などの従来の方法によって正常ヒト肝臓組織から単離されたヒト肝細胞が使用され得る。よって、分離された肝細胞はまた、凍結保存後に解凍することによっても使用され得る。あるいは、（マウス肝細胞がヒト肝細胞によって置換された）キメラマウス肝臓から、例えばコラゲナーゼ灌流法などの技術によって分離されたヒト肝細胞と規定される、キメラマウス肝細胞が、新鮮な状態で使用でき、そして、低温保存したキメラマウス肝細胞もまた、解凍後に利用可能である。
【００５３】
斯かるヒト肝細胞は、本開示のマウスの脾臓を介して肝臓に移殖され得る。斯かるヒト肝細胞はまた、門脈を介して直接的移殖されてもよい。移殖されるべきヒト肝細胞数は、約１〜２，０００，０００個の細胞の範囲におよび得、そして、好ましくは約２００，０００〜１，０００，０００個の細胞の範囲におよび得る。本開示のマウスの性別は、特に制限されない。また、移殖時の本開示のマウスの日齢も、特に制限されない。ヒト肝細胞が幼若マウス（初期の週齢）に移殖されるとき、ヒト肝細胞は、マウスが成長するに従ってより活発に増殖する。したがって、出生後、約０〜４０日齢のマウス、そして特に、出生後、約８〜４０日齢のマウスが、使用されるのが好ましい。
【００５４】
移殖されたヒト肝細胞は、キメラ非ヒト動物のキメラ肝臓のすべての肝細胞のうちの約１％超、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の任意のパーセンテージのヒトキメラから成る。
【００５５】
本開示は、本開示のキメラマウスの使用を伴う、ヒト肝機能に作用する物質をスクリーニングする方法を更に提供する。該方法の例は、以下のステップ：（ａ）本開示のキメラマウスに試験物質を投与し；（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラマウスにおいて１若しくは複数の値を計測し；そして（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラマウスの１若しくは複数の値と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の値の増大または減少を引き起こす試験物質を選択すること、を含む評価方法である。
【００５６】
好ましくは、１もしくは複数の値は、試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、および総ビリルビンレベル、ならびにヒトおよび非ヒト臓器の毒性の組織学的評価から成る群から選択される。
【００５７】
本開示の方法における「試験物質」の例としては、特に制限されることはなく、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、および単一化合物、例えばアミノ酸や核酸など、ならびに化合物ライブラリ、遺伝子ライブラリからの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、原核細胞からの抽出物、真核単独細胞からの抽出物、および動物細胞からの抽出物を含む。これらの生成物は、精製された生成物であっても、または、例えば植物、動物、または微生物抽出物などの未精製生成物であってもよい。また、試験物質を作製する方法も、特に制限されない。本明細書中で使用される試験物質は、天然物から単離された物質、化学的にもしくは生化学的に合成されるか、または遺伝子工学技術で調製された物質であってもよい。
【００５８】
上記の試験物質は、適切に標識され、次いで必要に応じて使用される。標識の例としては、放射標識および蛍光標識が挙げられる。試験物質の例としては、上記の試験サンプルに加えて、これらの試験サンプルの複数のタイプの混合物が挙げられる。
【００５９】
試験サンプルの例としては、これだけに限定されるものではないが、糞便、尿、血液（および任意の血液製剤、例えば全血、血清、および血漿）、ならびに組織、例えば肝臓組織が挙げられる。肝臓組織は、肝臓（例えば、生検検体または外植片）のサンプルから得ても、または、例えば、マウスを屠殺した後に摘出された、全体の、完全な肝臓から得てもよい。
【００６０】
試験物質をマウスに投与する方法の例は、特に制限されない。斯かる投与方法は、投与される試験物質のタイプに依存して、経口投与または非経口投与、例えば皮下、静脈内、局所的、経皮的、および経腸（直腸内）投与などの中から適切に選択され得る。
【００６１】
本開示は、本開示のキメラマウスの使用を伴う、ヒト肝細胞に対する試験物質の肝毒性評価する方法を更に提供する。この方法の例は、以下のステップ：（ａ）本開示のキメラマウスに試験物質を投与し；（ｂ）（ａ）において試験物質がそこに投与されたキメラマウスにおいて１若しくは複数の値を計測し；そして（ｃ）試験物質がそこに投与されていないキメラマウスの１若しくは複数の指標と比較して、（ｂ）において計測された１若しくは複数の指標を使用してヒト肝細胞に対する試験物質の効果を評価すること、を含む評価方法である。
【００６２】
好ましくは、１もしくは複数の値は、試験物質の代謝産物、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、および総ビリルビンレベルから成る群から選択される。好ましくは、１もしくは複数の指標は、任意の１若しくは複数のヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝臓重量対体重比、総アルブミン値、総タンパク質レベル、ＡＬＴレベル、ＡＳＴレベル、および総ビリルビンレベルの増加または減少、から成る群から選択される。
【００６３】
本開示の代表的なＰｏｒ遺伝子をコードするヒト核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００９４１．２から成るかまたはそれを含む。
【００６４】
【化１】
2019524077.tif 000004
【００６５】
本開示の代表的なＰｏｒ遺伝子をコードする配列に対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０００９３２．３から成るかまたはそれを含む。
【００６６】
【化２】
2019524077.tif 000005
【００６７】
本開示の代表的なＰｏｒ遺伝子をコードするマウス核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００８８９８．２から成るかまたはそれを含む。
【００６８】
【化３】
2019524077.tif 000006
【００６９】
本開示の代表的なＰｏｒ遺伝子をコードする配列に対応するマウスアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０３２９２４．１から成るかまたはそれを含む。
【００７０】
【化４】
2019524077.tif 000007
【００７１】
本開示の代表的なＩＩ２−ｒｇ遺伝子をコードするヒト核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００２０６．２から成るかまたはそれを含む。
【００７２】
【化５】
2019524077.tif 000008
【００７３】
本開示の代表的なＩＩ２−ｒｇ遺伝子をコードする配列に対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０００１９７．１から成るかまたはそれを含む。
【００７４】
【化６】
2019524077.tif 000009
【００７５】
本開示の代表的なＩＩ２−ｒｇ遺伝子をコードするマウス核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１３５６３．４から成るかまたはそれを含む。
【００７６】
【化７】
2019524077.tif 000010
【００７７】
本開示の代表的なＩＩ２−ｒｇ遺伝子をコードする配列に対応するマウスアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０３８５９１．１から成るかまたはそれを含む。
【００７８】
【化８】
2019524077.tif 000011
【００７９】
本開示の代表的なＲａｇ２遺伝子をコードするヒト核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００５３６．３から成るかまたはそれを含む。
【００８０】
【化９】
2019524077.tif 000012
【００８１】
本開示の代表的なＲａｇ２遺伝子をコードする配列に対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０００５２７．２から成るかまたはそれを含む。
【００８２】
【化１０】
2019524077.tif 000013
【００８３】
本開示の代表的なＲａｇ２遺伝子をコードするマウス核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００９０２０．３から成るかまたはそれを含む。
【００８４】
【化１１】
2019524077.tif 000014
【００８５】
本開示の代表的なＲａｇ２遺伝子をコードする配列に対応するアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０３３０４６．１から成る遺伝子から成るかまたはそれを含む。
【００８６】
【化１２】
2019524077.tif 000015
【００８７】
本開示の代表的なＦａｈ遺伝子をコードするヒト核配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００１３７．２から成る遺伝子から成るかまたはそれを含む。
【００８８】
【化１３】
2019524077.tif 000016
【００８９】
本開示の代表的なＦａｈ遺伝子をコードする配列に対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０００１２８．１から成る遺伝子から成るかまたはそれを含む。
【００９０】
【化１４】
2019524077.tif 000017
【００９１】
【化１５】
2019524077.tif 000018
【００９２】
本開示の代表的なＦａｈ遺伝子をコードする配列に対応するマウスアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０３４３０６．２から成る遺伝子から成るかまたはそれを含む。
【００９３】
【化１６】
2019524077.tif 000019
【００９４】
以下の実施例は、請求した開示をもっと十分に例示するために提供され、本開示の範囲を限定していると解釈されるべきではない。特定のモノが言及される程度について、それは単に例示の目的のためだけであって、開示を限定する意図はない。当業者は、発明能力の発揮なしに、かつ、本開示の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発してもよい。
【実施例】
【００９５】
実施例１：  Ｐｏｒ−ｆｌｏｘｅｄマウス株の作出
Ｐｏｒノックアウト第一ターゲッティングベクターを、国立衛生研究所（ＮＩＨ）ノックアウトマウスプログラム（ＫＯＭＰ）から購入した（図４Ａ）。そのベクターを、ＡｓｉｓＩ制限酵素を用いて線形化し、そして、ＤＮＡを、ベイラー医科大学のマウス胚性幹細胞コアによるＪｍ８Ａ３マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）（Pettitt, S.J. et al. “Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.” Nat Methods 6, 493-495 (2009)）内にエレクトポレーション処理した。統合クローンを、ネオマイシン耐性を使用して選択した。ＥＳＣクローンのＤＮＡを、ＮＳｉＩ制限酵素によって消化し、そして、製造業者の取扱説明書に従ってＤＩＧ非同位体検出システム（Roche Applied Biosciences）を使用したサザンブロッティングによって部位特異的組込みについてスクリーニングした（図１７の全ブロット）。ベクターの相同性アームの外側に結合する、５００ｂｐサイズの５’および３’プローブを、以下のプライマセットを使用して合成した。
【００９６】
５’ＰＯＲ Ｆｗ２GGCCTCAGAGAGGACATAGTGCCC（配列番号１）
【００９７】
５’ＰＯＲ Ｒｅｖ２ GCCCTCTGGTGTCAGGTCCC（配列番号２）
【００９８】
３’ＰＯＲ Ｆｗ２ CCTCACGCAGCTTAATGTGGCC（配列番号３）
【００９９】
３’ＰＯＲ Ｒｅｖ２ GGAAGTTAAGGACGTGATTACAGGGAGC（配列番号４）
【０１００】
正しく標的化されたＥＳＣ細胞を、ベイラー医科大学にてGenetically Engineered Mouse CoreによってＣ５７／ＢＬ胚盤胞内に注入した。雄キメラを、Ｃ５７／ＢＬアルビノ雌（Taconic）と一緒に飼育して、標的化ＥＳＣの生殖細胞株伝達を利用可能にする。ＦＲＴ隣接ＬａｃＺおよびネオマイシンカセットを取り除いて、条件付きＰＯＲノックアウト株を作出し、そのマウスを、Ｒｏｓａ２６ＦＬＰｅ株（Farley, F.W., Soriano, P., Steffen, L.S. & Dymecki, S.M. “Widespread recombinase expression using FLPeR (flipper) mice.” Genesis 28, 106-110 (2000)）でと交配した。遺伝子型決定を、Transnetyx（Cordova, TN）によって実施した。
【０１０１】
実施例２：Ｘ−Ｇａｌ染色
【０１０２】
胎児および新鮮な肝切片を、４％のＰＦＡ中、４℃にて１時間固定し、Ｘ−Ｇａｌすすぎバッファー（０．０２％のＩｇｅｐａｌおよび０．０１％のデオキシコレートを含有するＰＢＳ １×）で２×３０分間洗浄し、それに続いて、Ｘ−Ｇａｌ染色溶液（５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．０２％のＩｇｅｐａｌ、０．０１％のデオキシコレート、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＧＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌの新鮮なＸ−Ｇａｌを含有するＰＢＳ １×）と共に一晩インキュベートした。サンプルを、４％のＰＦＡ中、４℃にて一晩、後固定した。
【０１０３】
実施例３：ＰＩＲＦ（Ｐｏｒｃ／ｃ／Ｉｌ２ｒｇ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｆａｈ−／−）マウス株の作出
【０１０４】
Ｒａｇ２、Ｉｌ２−ｒｇまたはＦａｈ遺伝子の６つのｇＲＮＡ配列を標的化する重要なエクソンを、２つの異なるオンラインツール（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕおよびＣＯＳＭＩＤ）（Cradick, T.J., Qiu, P., Lee, C.M., Fine, E.J. & Bao, G. “COSMID: A Web-based Tool for Identifying and Validating CRISPR/Cas Off-target Sites.” Molecular therapy. Nucleic acids 3, e214 (2014)）を使用して選択した（図１Ａ、図６、および図７）。相補的オリゴヌクレオチドを、アニールし、制限酵素ＢｓａＩ（ＮＥＢ）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いた標準的な分子クローニング技術を使用してＤＲ２７４ベクター（Addgene plasmid # 42250）（Hwang, W.Y. et al. “Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.” Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)）に連結した。Ｔ７細菌プロモータ配列を、標準的な分子クローニング技術を使用してｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９ベクター（Addgene plasmid # 42230）内のＣａｓ９転写開始部位の上流に挿入した（Cong, L. et al. “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.” Science 339, 819-823 (2013)）。ＤＲ２７４ベクターを、ＤｒａＩ（ＮＥＢ）を使用して切断し、そして、Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（Zymo, Cat#11-301）を使用してゲル精製した。ｓｇＲＮＡのインビトロ転写を、製造業者の取扱説明書に従ってMEGAshortscript T7 Transcription Kit（life tech AM1345）を使用して実施した。得られたＲＮＡを、RNA Clean&Concentrator-5（Zymo, R1015）を使用して精製し、無ＲＮＡｓｅ水中に溶解した。合成を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。ｐＸ３３０（Ｔ７プロモーター含有）を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして、ゲル精製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってmMessage mMachine T7 ULTRA Kit（life tech AM1345）を使用して、消化したｐＸ３３０−Ｔ７ベクターから合成した。ポリアデニル化を、変性アガロースゲル電気泳動法（ＭＯＰＳバッファー中に１％のアガロースと６．６％のホルムアルデヒド）によって確認した。
【０１０５】
Ｐｏｒｃ／ｃマウスからの接合体を、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ ｍＲＮＡ（６０ｎｇ／μｌ）および６つのｇＲＮＡ（それぞれ１５ｎｇ／μＬ）と共に注射した。すべての可能性のある接合体を、３匹の偽妊娠雌に植えつけられた。欠失領域を検出するために、２３匹の子のすべてを、離乳後に以下のプライマーを使用して遺伝子型決定した：
【０１０６】
Ｆａｈ Ｆｗ CTGGGTTGCATACTGGTGGG（配列番号５）
【０１０７】
Ｆａｈ Ｒｅｖ AAACAGGGTCTTTGCTGCTG（配列番号６）
【０１０８】
Ｆａｈ Ｉｎｔ Ｆｗ ACAAAGGTGTGGCAAGGGTT（配列番号７）
【０１０９】
Ｉｌ２ Ｆｗ CCACCGGAAGCTACGACAAA（配列番号８）
【０１１０】
Ｉｌ２ Ｒｅｖ GGGGGAATTGGAGGCATTCT（配列番号９）
【０１１１】
Ｉｌ２ Ｉｎｔ Ｒｅｖ CTTCTTCCCGTGCTACCCTC（配列番号１０）
【０１１２】
Ｒａｇ２ Ｆｗ CCTCCCACCTCTTCGTTATCC（配列番号１１）
【０１１３】
Ｒａｇ２ Ｒｅｖ AGTCTGAGGGGCTTTTGCTA（配列番号１２）
【０１１４】
Ｒａｇ２ Ｉｎｔ Ｆｗ AGTCTGAGGGGCTTTTGCTA（配列番号１３）
【０１１５】
更なる子孫遺伝子型決定を、Transnetyx（Cordova, TN）によって実施した。
【０１１６】
実施例４：ＰＩＲＦマウスのヒト化
【０１１７】
肝細胞（３×１０６個／マウス）を、マウス肝細胞に関して元々記載されているように脾臓注射によって（Ponder, K.P. et al. “Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation.” Proc Natl Acad Sci U S A 88, 1217-1221 (1991)）、ＰＩＲＦマウスのマウス肝臓内に移殖した。要するに、腹腔を、中腹部切開によって開き、そして、１００μｌのＰＢＳの体積で３×１０６個のヒト肝細胞を脾臓に注入した。移殖直後に、移殖したヒト肝細胞に向けた選択圧を、以下のステップで飲料水から薬物ニチシノン（ＮＴＢＣ）を除くことによって適用した：薬物を完全に中止する前のコロニー維持量（１００％＝７．５ｍｇ／ｌ）に対して、 ２日間２５％、次の２日間１２％、そして最終的に２日間６％（Bissig, K.D. et al. “Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment.” The Journal of clinical investigation 120, 924-930 (2010)）。臨床的症状（猫背の姿勢、嗜眠、体重減少など）を伴うマウスは、先に記載したように再び薬物を断つ前に数日間、１００％のニチシノンに戻した。ヒトキメラの程度を測定するために、以前にヒトアルブミンレベルがヒト肝細胞の免疫染色によって評価したヒトキメラのレベルと相関があることが示された、マウス血液中のヒトアルブミン（ELISA, Bethyl laboratories）を計測した（Bissig, K.D. et al. (2010)）。＞７０％のヒトキメラを有するマウスのみを更に使用した。示されている場合には、一部のＰＩＲＦマウスに、肝細胞移殖の２４時間前および／または高いヒトキメラ（＞７０％）に達するときのいずれかに、１００μｌのＣＭＶプロモータ（Ａｄ５ ＣＭＶ−Ｃｒｅ、２．３×１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、ベイラー医科大学のベクター開発研究所によって提供された）下でＣＲＥリコンビナーゼをコードするアデノウイルスを静脈内に注射した。利用可能な肝細胞ドナーの情報を、表２に示した。すべての動物実験は、ベイラー医科大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。より少ない術後合併症のため、ヒト化に使用したすべての動物（対照を含む）は雌であった。
【０１１８】
実施例５：ｑＰＣＲ
【０１１９】
総ｍＲＮＡを、Purelink RNAミニキット（Invitrogen）を使用して、新鮮な凍結組織サンプルから単離した。２μｇの総ｍＲＮＡを、qScript cDNA supermix（Quanta Biosciences）を使用して逆転写し、そして、２０ｎｇのｃＤＮＡをｑＰＣＲ反応に使用し、Perfecta SYBR Green Fast Mix（Quanta Biosciences）と共に実施し、そして、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosciences）で分析した。以下のプライマーを、ＰＩＲＦマウスサンプルのＰｏｒ ｍＲＮＡ増幅に使用した：
【０１２０】
ｍＰｏｒ Ｆｗ２：GGCCCCACCTGTCAAAGAGAGCAGC（配列番号１４）
【０１２１】
ｍＰｏｒ Ｒｅｖ１：CAAACTTGACACCCGTGAGGTCC（配列番号１５）
【０１２２】
ヒト化ＰＩＲＦマウス肝臓サンプルに関しては、マウスＰｏｒおよびヒトＰＯＲを、以下のプライマセットを使用して増幅した：
【０１２３】
ｍＰｏｒ Ｆｗ１：TCTATGGCTCCCAGACGGGAACC（配列番号１６）
【０１２４】
ｍＰｏｒ Ｒｅｖ２：CCAATCATAGAAGTCCTGCGCG（配列番号１７）
【０１２５】
ｈＰＯＲ Ｆｗ１：CCAATCATAGAAGTCCTGCGCG（配列番号１８）
【０１２６】
ｈＰＯＲ Ｒｅｖ５：ACCTTGGCCGCATCTATGTCGG（配列番号１９）
【０１２７】
各サンプルを、以下のプライマーを使用した内部対照遺伝子としてのＧａｐｄｈ／ＧＡＤＰＨに対して正規化した：
【０１２８】
ｍＧａｐｄｈ Ｆｗ：AGAACATCATCCCTGCATCCA（配列番号２０）
【０１２９】
ｍＧａｐｄｈ Ｒｅｖ：CAGATCCACGACGGACACATT（配列番号２１）
【０１３０】
ｈＧＡＰＤＨ ｆｗ：CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC（配列番号２２）
【０１３１】
ｈＧＡＰＤＨ Ｒｅｖ：TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG（配列番号２３）
【０１３２】
実施例６：ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリ
【０１３３】
全トランスクリプトームＲＮＡ配列（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を、７つの肝臓葉すべてからサンプル抽出した新鮮な冷凍肝臓組織から抽出した全ＲＮＡを使用して実施した。全ＲＮＡを、Purelink RNAミニキット（Invitrogen）を使用して単離した。ライブラリを、TrueSeq Stranded mRNA LTキット（Illumina）を使用して、製造業者の推奨に従って、全ＲＮＡから作製した。ライブラリを、NextSeq500シーケンサにより配列決定した。１サンプルあたりの平均読出しは、１７百万であった。ＲＮＡ−Ｓｅｑ ＴＰＭ発現値を、組み合わせたヒトおよびマウスＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑ（３／２１／１６）トランスクリプトームに適用される、読出しアライナーＢｏｗｔｉｅ２５３を使用したＲＳＥＭ５２（バージョン１．２．１７）を用いて計算した。ＲＮＡ配列決定データは、European Nucleotide Archive、ＥＮＡ受入コードＰＲＪＥＢ１４７１４から入手可能である。低量のシトクロム（ヒト＜２０ＴＰＭおよびマウス＜２０ＴＰＭ）を、実験群のうちの１つが＞２０ＴＰＭに達した場合にだけ比較した。遺伝子発現を、３つのヒトハウスキーピング遺伝子およびそれらのマウス対応物（ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７ＡおよびＶＰＳ２９２９；Ｐｓｍｂ２、Ｐｓｍｂ４、Ｒａｂ７およびＶｐｓ２９）５４に対して正規化した。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、European Nucleotide Archive、ＥＮＡ受入コードＰＲＪＥＢ１４７１４から入手可能である。
【０１３４】
実施例７：ウエスタンブロット
【０１３５】
ウエスタンブロット法を、以前に記載したように実施した（Bissig-Choisat, B. et al. “Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.” Nature communications 6, 7339 (2015)）。急凍した肝臓からの組織を、プロテアーゼ阻害剤（Roche、カタログ番号０４６９３１５９００１）を含有するＲＩＰＡバッファー（Sigma、カタログ番号Ｒ０２７８−５０ｍｌ）中で均質化した。３０μｇの総タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Invitrogen、カタログ番号ＮＰ０３３６ＢＯＸ）で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Millipore、カタログ番号ＩＰＶＨ０００１０）に移しとった。次いで、ブロットを、５％のミルク中でブロッキングし、続いて、一次抗体とインキュベートした。ウサギ抗Ｐｏｒ（Abcamカタログ番号ａｂ１３５１３）またはマウス抗β−アクチン（Sigma、カタログ番号Ａ１９７８）を、それぞれ１：１，０００および１：３，０００に希釈した（図１８および図１９の全ブロット）。二次抗体は、それぞれ１：１０，０００および１：５０，０００にて使用されるロバ抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰおよびロバ抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ（Jackson Immunoresearch Labs、カタログ番号７１１−０３５−１５２および７１１−０３５−１５０）であった。膜を、Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent（General Electric Healthcare Life Sciences、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を使用して画像化した。
【０１３６】
実施例８：免疫組織化学
【０１３７】
低温保存した組織ブロックからの１０μｍ切片を、３％のＰＦＡを用いて１５分間固定し、そして、以下の一次抗体：０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．５％のＢＳＡを含有したＰＢＳ中に１：５００に希釈した抗Ｐｏｒ（Abcam、カタログ番号ａｂ１３５１３）、１：２５０に希釈した抗ヒトＮｕｃｌｅｉ（EMD Millipore、カタログ番号ＭＡＢ１２８１）と共に４℃にて一晩インキュベートした。二次抗体（１：１，０００、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ結合、分子プローブ）を、同じバッファー中で室温にて６０分間インキュベートした。切片を、Vectashield plus DAPI（Vector Labs）を用いて包埋した。
【０１３８】
実施例９：マウスの管理
【０１３９】
すべてのマウス（６〜１０月齢、ヒト化または非ヒト化）は、自由摂取で提供された水および食事のある標準的な１２時間暗／明サイクル下で維持した。すべての動物実験は、ベイラー医科大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０１４０】
実施例１０：質量分析法のためのサンプル調製
【０１４１】
一群のマウスを、ゲフィチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理（ｉ．ｖ．）し、そして、１６時間の採便のために代謝ケージ内に別々に収容した。糞便サンプルを、計量し、そして、水中で均質化した（１，０００μｌのＨ２Ｏ中に１００ｍｇの糞便）。それに続いて、３００μｌのメタノールを、１００μｌの得られた混合物に加え、続いて、１５，０００ｇにて２０分間遠心分離にかけた。二回目の遠心分離（１５，０００ｇ、２０分間）のために、新しいエッペンドルフバイアルに上清を移した。アゴメラチンの終濃度は、２μＭである。分析（以下に記載）のために、各上清をオートサンプラーバイアルに移した。
【０１４２】
肝臓におけるアタザナビル代謝に関して、肝臓サンプルを、アタザナビル（ｉ．ｖ．、３０ｍｇ／ｋｇ）処理の３０分後に採取した。簡単に言えば、肝臓を、計量し、そして、内部標準アゴメラチンと共に水／ＭｅＯＨ中で均質化した［３００μｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ３：１）中に１００ｍｇの肝臓］。それに続いて、３００μｌのメタノールを、１００μｌの得られた混合物に加え、続いて、１５，０００ｇにて２０分間遠心分離にかけた。二回目の遠心分離（１５，０００ｇ、２０分間）のために、新しいエッペンドルフバイアルに上清を移した。アゴメラチンの終濃度は、サンプル中に２μＭである。分析のために、各上清をオートサンプラーバイアルに移した。５μｌの各調製サンプルを、分析のための超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）と四重極飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦＭＳ）とを組み合わせたシステムに注入した。
【０１４３】
実施例１１：質量分析法（ＵＨＰＬＣ−ＱＴＯＦＭＳ分析）
【０１４４】
ゲフィチニブおよびアタザナビルからの代謝産物を、１００ｍｍ×２．７ｍｍ（Agilent XDB C18）カラムを備えた1260Infinity Binary LC System（Agilent Technologies、Santa Clara, CA）を使用して分離した。カラム温度を４０℃に維持した。流量は、０．３ｍＬ／分であり、１５分間の稼働中に、０．１％のギ酸を含むグラジエントが２％〜９８％ 水性アセトニトリルの範囲に及ぶ。四重極飛行時間型質量分析（ＱＴＯＦＭＳ）を、エレクトロスプレーイオン化を用いた陽イオンモードで操作した。超高純度窒素を、乾燥ガス（１２Ｌ／分）およびコリジョンガスとして適用した。乾燥ガス温度を３２５℃に設定し、ネブライザー圧を３５ｐｓｉに保った。キャピラリ管電位を３．５ｋＶに設定した。質量分析中、リアルタイム質量補正および精密質量を、陽イオンモードでｍ／ｚ１２１．０５０８、９２２．００９８にて標準参照イオンを継続的に計測することによって達成した。マスクロマトグラムおよびマススペクトルを、ｍ／ｚ５０〜１０００の質量中心およびプロファイル形式でMassHunter Workstation data Acquisitionソフトウェア（Agilent、Santa Clara, CA）によって取得した。収集率を、毎秒１．５スペクトルとしてに設定した。この試験に使用した方法は、ヒト肝臓ミクロソームにおけるゲフィチニブ代謝に関する以前の試験によって実証された３９。それと同時に、品質管理サンプルを、サンプル実行の途中に１０サンプル毎に実施した。入手できない代謝産物の本物の化合物のため、代謝物の同定は、それらの適確な質量およびＭＳ／ＭＳ断片に基づいた。代謝産物のクロマトグラムおよび相対量を、Qualitative Analysisソフトウェア（Agilent、Santa Clara, CA）により実施した。相対量は、各代謝産物の統合ピーク面積に基づいて評価した。
【０１４５】
実施例１２：統計
【０１４６】
実験のためのサンプルサイズを、群間推定される相違および高度にヒト化されたマウスの利用可能性によって決定した。実験群への割り付け前の動物の無作為化も、実験群の盲検化もおこなわなかった。統計解析を、マン−ホイットニー検定、またはＡＮＯＶＡを使用したＰＲＩＳＭバージョン６．０ソフトウェア（Graph Pad software）を使用して実施した。統計的有意性を、ｐ値＜０．０５（＊）で仮定した。別段の言及が無い限り、グラフ内のバーは、平均±ＳＥＭを表す。群サイズ（Ｎ）は、生物学的サンプルサイズを表す。
【０１４７】
実施例１３：肝細胞再増殖のための新規マウスモデルの作出
【０１４８】
マウスシトクロム代謝を機能的に妨げるために、マウス胚性幹細胞２８を標的化することによるＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）遺伝子の条件付き（ｆｌｏｘｅｄエクソン３および４）ノックアウトを作り出した（図４）。適切に標的化された胚性幹細胞を注射した胚盤胞は、Ｐｏｒ「ノックアウト第一」対立遺伝子の生殖細胞株伝達を伴うキメラを生じた２９。胎児および成体肝臓におけるｌａｃＺ発現カセットを使用した標的化Ｐｏｒ遺伝子座からの発現を確認した（図５）。次のマウスを、フリッパーゼ発現株３０と交配して、ＣＲＥリコンビナーゼ条件付きＰｏｒノックアウト株（Ｐｏｒｃ／ｃ）を作出した。この株からのホモ接合性接合体に、重要なエクソンＩｌ２−ｒｇ、Ｒａｇ２、およびＦａｈ遺伝子（図６および図７）の同時欠失を標的化した細菌性のＩＩ型のクラスタ化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）システム３１、３２、３３を注射して、ＰＩＲＦ株を作出した（図１Ａ）。これにより、ホモ接合ＰＩＲＦマウスは、免疫不全であり、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞を欠いているが、健常であり、かつ、繁殖能力がある。アデノウイルス遺伝子治療ベクターがインビボにおいて効率的に肝細胞を形質導入するので、Ｐｏｒ遺伝子を、ＣＲＥリコンビナーゼをコードするアデノウイルス（Ａｄｅｎｏ−ＣＲＥ）を使用して欠失した。ウイルスの漸増用量（１マウスあたり２．２×１０８−１０）を、ＰＩＲＦマウスへと静脈内注射した。肝臓におけるＰｏｒ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲは、高用量のアデノウイルスのみで効果的な欠失が明らかになった（図１Ｂ）。Ｐｏｒの免疫染色ではこれらの知見を確認したが（図１Ｃ）、最小限の残留シグナルが、使用した最も高い用量（図１Ｄ）においてでさえウエスタンブロット法によって検出できた。Ｐｏｒ欠損ＰＩＲＦマウス肝臓は、アデノウイルス形質導入の約２週間後に、脂質を蓄積し始めたが（図２）、免疫コンピテントＡｌｂ−Ｃｒｅ／Ｐｏｒｃ／ｃ株２５、２７とは対照的に、浸潤はなく、かつ、壊死がなかった（図２０）。それにもかかわらず、残留Ｐｏｒ発現肝細胞は、脂質に富むＰｏｒ欠損肝細胞を超える成長利点を有し、そして、いくつかのＰｏｒ発現細胞のクローン性増殖が、免疫染色によって、アデノウイルス形質導入の４週間後に検できた（図９）。
【０１４９】
実施例１４：ヒト化ＰＩＲＦマウスの特徴づけ
【０１５０】
ＰＩＲＦ株を使用したヒト肝臓キメラマウスを作出した５、２０、３４。チトクロームＰ４５０代謝がヒトに特異的であろうことを確実にするために、我々は、ヒト肝細胞移殖前にＡｄｅｎｏ−Ｃｒｅ（２．３×１０１０ｐｆｕ／マウス）を注射し、さらに、一部の高度にヒト化されたＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ）マウスにおいて、追加用量のＡｄｅｎｏ−Ｃｒｅを注射した。免疫染色では、Ｐｏｒ遺伝子のほぼ完全な欠失が、二重注射ヒト化ＰＩＲＦ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）マウスのみで達成され得ることが明らかになった（図２Ａ）。定量的ＰＣＲおよびウエスタンブロット法では、ＣＲＥのアデノウイルス送達によりマウスＰｏｒの大規模な欠損を確認した（図１２）。Ａｄｅｎｏ−ＣＲＥ（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）またはＡｄｅｎｏ−ＧＦＰのいずれかと共に注射したヒト肝細胞（Ｈｕ−ＰＩＲＦ）が再増殖したＰＩＲＦマウスを比較するために、遺伝子発現プロファイルを実施した（図２Ｂ）。個体内変化を避けるための同じ肝細胞ドナーからのヒト肝細胞が（表２）、両群で再増殖した。
【０１５１】
【表２】
2019524077.tif 000020
【０１５２】
マウスＰ４５０シトクロムの発現は、Ｐｏｒ欠失後に分析した３８個の遺伝子のうち２７個で明らかに変更されていた（図２Ｃ）：２４個のシトクロムが有意に上方制御され（１．５〜１２．５倍）、および３個のシトクロムが有意に下方制御された（０．５〜０．３倍）。これらのマウスシトクロムの発現プロファイルは、一般的に、非ヒト化、Ｐｏｒ欠損マウスにおける先行研究からのそれらに匹敵する（表１）３５。同じキメラ肝臓のヒト部分では、ヒトＰ４５０シトクロムは、マウスＰｏｒの欠失でそれほど変更されなかった（図２Ｄ）。ヒトシトクロムの半分は、わずかに変更されただけであったが（０．５〜１．５倍の変化）、もう片方の半分は適度に上方制御された（１．５〜２．４倍）。
【０１５３】
すべてのヒトシトクロムが、生体異物代謝において重要な役割を果たしているわけではない。米国における２００の最も処方される転写薬物のうち、約四分の三が、Ｐ４５０シトクロムによって代謝されており、ＣＹＰ３Ａ４／５、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、および１Ａ２が、そのうちの９５％を占める３６。キメラ肝臓（Ｈｕ−ＰＩＲＦ２ｘ）からのこれらのヒトシトクロムクラスタの、発生した、同質遺伝子の初代肝細胞との比較。この比較のための、２つのドナー肝細胞（表２）および対応するヒト（同質遺伝子）肝臓キメラマウス（Ｎ＝６）。発現レベルは、キメラ肝臓で強く発現された主要なクラスタおよびこれらの重要なシトクロムと類似していた（図２Ｅ）。興味深いことに、いくつかのヒトクラスタ（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４）が、初代ヒト肝細胞よりキメラ肝臓においてむしろより高いレベルで発現された。
【０１５４】
実施例１５：ヒト化ＰＩＲＦマウスの生体異物代謝
【０１５５】
ヒト薬物代謝に関するＨｕ−ＰＩＲＦマウスを実証するために、ゲフィチニブの生体異物代謝３７、肺癌および他の様々な新生物に対して使用される上皮成長因子受容体の阻害剤３８を使用した。ゲフィチニブを、ＣＹＰ３Ａ４および２Ｄ６を含めたＰ４５０シトクロムシステムによって主に代謝させる。ゲフィチニブ代謝産物は、ヒトとマウス肝臓ミクロソームとの間で大きな相違が立証されたが３９、用量、経路または種に関係なく、ゲフィチニブは、主に糞中に（７％未満が尿中に）排出される４０、４１。次いで、ゲフィチニブの静脈内注射後の最初の２４時間の間のゲフィチニブ代謝産物について非ヒト化ＰＩＲＦマウスの糞便を分析した。
【０１５６】
質量分析法では、Ｐｏｒ遺伝子の欠失によりいくつかのゲフィチニブ代謝産物の低減が明らかになり、これらの代謝産物のＰｏｒ依存性Ｐ４５０シトクロム欠損を含意している（図３Ａおよび図１３Ａ）。一部の代謝産物は有意に変更されなかったので、残留Ｐｏｒ活性が持続するマウスＰ４５０シトクロム代謝システムに関与する可能性を試験した。Ｐｏｒｃ／ｃ株を、アルブミンプロモータ下でＣＲＥを発現するトランスジェニックマウスと交配させた。Ａｌｂ−ＣＲＥ／Ｐｏｒｃ／ｃ動物の肝臓においてＰｏｒタンパク質を効率的に欠損した（図１４）；それにもかかわらず、ゲフィチニブ注射後に形成される代謝プロフィールは、Ｐｏｒのアデノウイルス欠損を用いたＰＩＲＦマウスのものに匹敵していた（図１３）。この結果の類似性は、ゲフィチニブがＰ４５０依存性薬物代謝および非依存性薬物代謝の両方を有していることを示している。
【０１５７】
最も大きく、かつ、最適な低減は、Ｏ−デスメチルゲフィチニブ（Ｍ４、Ｍ５２３５９５）について観察され、そしてそれは、ヒト糞便において群を抜いて最も豊富な代謝産物である。齧歯動物は、Ｍ４に加えて多くの異なる代謝産物を生じるので４０、４１（図３Ｂ）、それで、マウスＰｏｒ欠損およびＰｏｒ発現のヒト化および非ヒト化対照マウスにおけるＭ４代謝産物を分析した（図１０）。最高レベルのＭ４をマウスＰｏｒ不全Ｈｕ−ＰＩＲＦマウスにおいて検出し、ここでは、ヒト肝細胞が優先的にゲフィチニブをＭ４に代謝し、かつ、残留マウス肝細胞がそれらの薬物代謝において阻害されることを使用した（図３Ｃ）。次に、他のヒト特異的代謝産物を測定する。最も豊富なヒト代謝物はＭ２８であり、そしてそれは、非ヒト化対照マウスにおいて全く検出できなかった。質量分析法では、マウスＰｏｒ不全Ｈｕ−ＰＩＲＦマウス（図３Ｄと図１５）におけるこのヒト特異的代謝産物の最高レベルが再び示され、これらのマウスが、よりヒトに近い肝代謝を示したことを確認した。
【０１５８】
Ｐｏｒ不全Ｈｕ−ＰＩＲＦマウスは、薬物代謝試験のための新規モデルシステムであり、そのため、これらの主要なゲフィチニブ代謝産物に関しては、異なる身体要素、例えば血清（注射の１時間後）および尿、を分析するために使用された。Ｍ４は、尿中では検出できず、血清中では大きく削減されたが（Ｈｕ−ＰＩＲＦマウスにおいて２３倍）、Ｍ２８は、Ｈｕ−ＰＩＲＦマウスの尿および血清の両方においてより低濃度にて検出可能であった（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。両方の部分において低レベルで存在したが、Ｍ２８は、糞便で観察された相対量を反映した（図３Ｃ）。これらの知見は、ゲフィチニブ代謝産物が糞便によって主に排出されることを裏付けている４０、４１。
【０１５９】
ＰＩＲＦマウスの肝臓ホモジネートを使用したヒト生体異物代謝を確認するために、ヒト免疫不全ウイルスの治療のための抗レトロウイルス薬（プロテアーゼ阻害剤）であるアタザナビルを試験した。ヒトおよびマウスミクロソームにおける以前の試験は、アタザナビル代謝産物Ｍ１５が主要なヒト代謝物であることを実証した４２。ヒト化ＰＩＲＦマウスにおいてＭ１５のレベルを測定するために、ＰＩＲＦマウスに、アタザナビルを静脈内注射し、そして、その肝臓を、注射の３０分後に摘出した。Ｐｏｒ欠損ヒト化ＰＩＲＦマウスにおけるＭ１５レベルは、非欠損マウス（図３Ｅ）で観察されたものより５．４倍高く、これらのマウスが、ヒトがするように薬物を代謝することを再び示した。
【０１６０】
実施例１６：ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（ＵＧＤＨ）の欠損
【０１６１】
ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（ＵＧＤＨ）の欠損は、ＵＤＰ−グルクロン酸の欠損につながるが、ＵＤＰ−グルクロン酸は、すべてのＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の基質である。ＵＧＴは、肝臓においてグルクロニダート疎水性薬物（第ＩＩ相）であり、それによって、肝臓における薬物の体内変化に貢献する；グルクロニド化された薬物は、より極性（親水性）になるので、より容易に排出される。ＵＧＤＨの欠損は、胎生致死であり、そのため、ＰＯＲのように、条件付きでまたは体細胞ゲノム工学によって欠損させる必要がある。トログリタゾンは、抗糖尿病薬として開発されたが、肝毒性のために市場から消えた。興味深いことに、マウスとヒトは薬物を別の形で代謝する、ヒトがスルファート代謝産物（主な血中代謝物）を主に産生する一方で、トログリタゾンのグルクロニド抱合体は、ヒトではそれほど一般的ではないことを意味している。主にグルクロニド抱合体を産生するマウスとは対照的である。したがって、トログリタゾンは、Ｐｏｒ欠損およびヒト化に加えて、ヒト肝臓キメラマウスにおけるＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（ＵＧＤＨ）の欠損によってＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼが（ＵＧＴ）を阻害するアプローチの有効性を実証するための機会を提供する。
【０１６２】
グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）は、グルタチオン生合成の第二ステップを触媒する。グルタチオンは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の基質であり、そしてそれは、疎水性薬物に分子を結合し（第ＩＩ相）、その結果、肝臓における薬物の体内変化に貢献する。
【０１６３】
体細胞ゲノム工学を、ヒト化マウスにおけるマウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐｏｒ）と、薬物代謝にかかわる他のマウス酵素との同時欠失に使用する。ヒト化ＦＲＧマウス（マウス血清中のヒトアルブミン＞２ｍｇ／ｍｌ）には、マウスＰｏｒの初期エクソンを標的化するｓｇＲＮＡを発現するＡｄｅｎｏ随伴ウイルス（ＡＡＶ、血清型８）、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ（Ｕｇｄｈ）またはグルタチオンシンテターゼ（Ｇｓｓ）遺伝子（遺伝子治療ベクターデザインを参照、図２１）を注射する。ＡＡＶを、Ｃａｓ９を発現するアデノウイルスの注射（７×１０９ｐｆｕ／Ａｄ／マウス）の１週間前に注射する（２×１０１１ＧＣ／ＡＡＶ／マウス）。対照マウスには、アデノウイルスベクターだけを注射する（図２２、下の行）。結果は、マウスｐｏｒ、ならびにｕｇｄｈおよびｇｓｓ遺伝子の欠失を示す。ヒト化マウスにおけるマウスｐｏｒのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるノックダウンは、実質的であるが、ＤＮＡ（図２３）およびタンパク質レベル（図２２）で見たとき、ｌｏｘＰ／ＣＲＥシステムで観察されたノックダウンほど効果的ではない。また、ｐｏｒ欠損は、特にＦＲＧマウスにおいて、それらのｓｇＲＮＡ（標的化分子）がすべて異なるＡＡＶベクター上にあるので、他の２つ遺伝子（ｕｇｄｈおよびｇｓｓ）の欠損から独立している。しかしながら、免疫染色（図２２）では、細胞の相当量がｐｏｒおよびｇｓｓの欠損を有し（図２２）、それに対し、ｕｇｄｈの欠損はそれほど効果的でなかったことが実証された。
【０１６４】
トランスジェニックＡｌｂ−ＣＲＥおよび薬物代謝にかかわる他のマウス酵素の欠失を有するヒト化ＰＩＲＦマウスを使用する。アデノウイルスＣＲＥの代わりに、ＣＲＥの発現によってＰｏｒは欠失されるが、このＰＩＲＦマウスは、マウスゲノム内にＡｌｂ−ＣＲＥ配列を担持する。これらのマウスは、マウス血中の＞２ｍｇ／ｍｌのヒト特異的アルブミン、およびキメラ肝臓におけるトランスチレチン（プレアルブミン）染色によって証明されるように、ヒト肝細胞を効率的に再増殖させる（図２４）。肝臓では後期胚形成期にアルブミンプロモータが既に発現されるので、マウスｐｏｒはこれらのキメラマウス肝臓において効率的に欠失される。また、これらのヒト化ＰＩＲＦマウスにおいて、ｐｏｒに加えて、ｇｓｓおよびｕｇｄｈもまた欠失される（図２３）。
【０１６５】
実施例１７：トログリタゾン代謝産物の分析
【０１６６】
ＰｏｒおよびＵｇｄｈ欠損の有無を伴ったヒト化および非ヒト化ＦＲＧマウスの肝臓におけるトログリタゾン代謝産物（６００ｍｇ／ｋｇのトログリタゾンのｉ．ｐ．注射の２時間後）を分析した。対照マウスの非ヒト化肝臓は、ヒトまたはヒト化ＰＩＲＦマウスよりはるかに大量のグルクロニド抱合体を有した（図２４）。更に、グルクロニド抱合体は、非ヒト化およびヒト化ＰＩＲＦマウスにおけるｕｇｄｈおよびｐｏｒの欠損により有意に低減した。このデータは、ｕｇｄｈの欠損もまた、ヒト肝臓キメラ肝臓におけるＵＧＴの機能不全または無効化につながることを裏づける。
【０１６７】
本開示は、マウスＰ４５０シトクロムから最小限の干渉があるヒト薬物代謝に適している次世代のヒト化マウスモデルを提供する。ヒト化ＰＩＲＦマウスと「通常の」ヒト化ＦＲＧマウスの間で２つの異なる薬物に関するヒト代謝物の産生を比較した。分析では、ＦＲＧマウスにおけるよりもヒト化ＰＩＲＦマウスにおいて、マウス糞便および肝臓ホモジネート中のヒト代謝物のより高い濃度が明らかになり、これらのマウスがヒト化薬物代謝を有することが実証された。この試験に使用したＰＩＲＦおよびＦＲＧ株は、混合された（Ｃ５７Ｂと１２９Ｓ）遺伝的背景がある。２つの以前に樹立されたＦＲＧマウス株に対する背景における潜在的な相違は別として５、７、我々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、あらゆる導入遺伝子、例えば、広範なアミノグリコシド抗生物質を不活化するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、を発現しないノックアウト株を作り出した。このモデルシステムは、反応性代謝物の早期検出に有用であり、さらに、薬物代謝マウス酵素の大きくて困惑するクラスタを妨げる洗練された方法である。本明細書中に提供した新規マウスモデルに加えて、本開示は（ａ）望まれるであろう腸と肝臓または肺と肝臓のように、複数の臓器の組み合わせにおけるＰｏｒのノックアウト、（ｂ）他の薬物代謝酵素における追加の欠損、および／または、より効率的なＰｏｒ欠損の達成、が提供される。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスの使用には、四重トランスジェニック（ＰＩＲＦ）マウスへの更にもう１回の交配ステップを必要とし、初期の臓器特異的欠損は、異種移殖に適する健常株を生じないであろう。
【０１６８】
要約すれば、本開示は、Ｐｏｒ欠損によってすべてのマウスシトクロムの機能的欠損を伴ったヒトキメラを組み合わせた新規マウスモデルを提供する。斯かるマウスＰｏｒ不全ヒト化は、例えばトランスジェニックｕＰＡマウス１１、２１などの他の再増殖モデルと組み合わせて使用できる。２つの異なる身体部分において２つの異なる薬物を用いた試験では、ヒト化ＰＩＲＦマウスにおける試験が効率的なヒト代謝物の確認に役立つことを実証した。
【０１６９】
参考文献
1.    Olson H, et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans
and in animals. Regulatory toxicology and pharmacology : RTP 32, 56-67
(2000).
2.    Nelson DR, Zeldin DC, Hoffman SM, Maltais LJ, Wain HM, Nebert DW.
Comparison of cytochrome P450 (CYP) genes from the mouse and human
genomes, including nomenclature recommendations for genes, pseudogenes and
alternative-splice variants. Pharmacogenetics 14, 1-18 (2004).
3.    Guengerich FP, Cheng Q. Orphans in the human cytochrome P450 superfamily:
approaches to discovering functions and relevance in pharmacology.
Pharmacological reviews 63, 684-699 (2011).
4.    Mercer DF, et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric
human livers. Nat Med 7, 927-933 (2001).
5.    Bissig KD, Le TT, Woods NB, Verma IM. Repopulation of adult and neonatal
mice with human hepatocytes: a chimeric animal model. Proc Natl Acad Sci
U S A 104, 20507-20511 (2007).
6.    Dandri M, et al. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in
vivo infection with hepatitis B virus. Hepatology 33, 981-988 (2001).
7.    Azuma H, et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/
Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol 25, 903-910 (2007).
8.    Hasegawa M, et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is
mature and functional. Biochemical and biophysical research communications
405, 405-410 (2011).
9.    Washburn ML, et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus
infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology 140,
1334-1344 (2011).
10.   Suemizu H, et al. Establishment of a humanized model of liver using
NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem Biophys Res Commun 377, 248-252
(2008).
11.   Heckel JL, Sandgren EP, Degen JL, Palmiter RD, Brinster RL. Neonatal
bleeding in transgenic mice expressing urokinase-type plasminogen
activator. Cell 62, 447-456 (1990).
12.   Tateno C, et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type
metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165, 901-912 (2004).
13.   Samuelsson K, et al. Troglitazone metabolism and transporter effects in
chimeric mice: a comparison between chimeric humanized and chimeric
murinized FRG mice. Xenobiotica; the fate of foreign compounds in
biological systems 44, 186-195 (2014).
14.   Lootens L, et al. Steroid metabolism in chimeric mice with humanized
liver. Drug testing and analysis 1, 531-537 (2009).
15.   Foster JR, et al. Differential effect of troglitazone on the human bile
acid transporters, MRP2 and BSEP, in the PXB hepatic chimeric mouse.
Toxicologic pathology 40, 1106-1116 (2012).
16.   Xu D, et al. Fialuridine induces acute liver failure in chimeric TK-NOG
mice: a model for detecting hepatic drug toxicity prior to human testing.
PLoS medicine 11, e1001628 (2014).
17.   Bateman TJ, Reddy VG, Kakuni M, Morikawa Y, Kumar S. Application of
chimeric mice with humanized liver for study of human-specific drug
metabolism. Drug Metab Dispos 42, 1055-1065 (2014).
18.   Nishimura T, et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict
human drug metabolism and a drug-drug interaction. J Pharmacol Exp Ther
344, 388-396 (2013).
19.   Tanoue C, et al. Prediction of human metabolism of the sedative-hypnotic
zaleplon using chimeric mice transplanted with human hepatocytes.
Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems 43,
956-962 (2013).
20.   Bissig KD, et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis
B and C virus infection and treatment. The Journal of clinical
investigation 120, 924-930 (2010).
21.   Meuleman P, et al. Morphological and biochemical characterization of a
human liver in a uPA-SCID mouse chimera. Hepatology 41, 847-856 (2005).
22.   Kato K, et al. Development of Murine Cyp3a Knockout Chimeric Mice with
Humanized Liver. Drug Metab Dispos 43, 1208-1217 (2015).
23.   Nakada N, et al. Murine Cyp3a knockout chimeric mice with humanized liver:
prediction of the metabolic profile of nefazodone in humans.
Biopharmaceutics & drug disposition,  (2015).
24.   Shen AL, O'Leary KA, Kasper CB. Association of multiple developmental
defects and embryonic lethality with loss of microsomal NADPH-cytochrome
P450 oxidoreductase. J Biol Chem 277, 6536-6541 (2002).
25.   Wu L, et al. Conditional knockout of the mouse NADPH-cytochrome p450
reductase gene. Genesis 36, 177-181 (2003).
26.   Henderson CJ, et al. Inactivation of the hepatic cytochrome P450 system by
conditional deletion of hepatic cytochrome P450 reductase. J Biol Chem
278, 13480-13486 (2003).
27.   Gu J, et al. Liver-specific deletion of the NADPH-cytochrome P450
reductase gene: impact on plasma cholesterol homeostasis and the function
and regulation of microsomal cytochrome P450 and heme oxygenase. J Biol
Chem 278, 25895-25901 (2003).
28.   Thomas KR, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in
mouse embryo-derived stem cells. Cell 51, 503-512 (1987).
29.   Skarnes WC, et al. A conditional knockout resource for the genome-wide
study of mouse gene function. Nature 474, 337-342 (2011).
30.   Farley FW, Soriano P, Steffen LS, Dymecki SM. Widespread recombinase
expression using FLPeR (flipper) mice. Genesis 28, 106-110 (2000).
31.   Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE. A guild of 45
CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes
exist in prokaryotic genomes. PLoS computational biology 1, e60 (2005).
32.   Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A
programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial
immunity. Science 337, 816-821 (2012).
33.   Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Identification of genes that
are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology 43,
1565-1575 (2002).
34.   Bissig-Choisat B, et al. Development and rescue of human familial
hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nature communications 6,
7339 (2015).
35.   Weng Y, DiRusso CC, Reilly AA, Black PN, Ding X. Hepatic gene expression
changes in mouse models with liver-specific deletion or global suppression
of the NADPH-cytochrome P450 reductase gene. Mechanistic implications for
the regulation of microsomal cytochrome P450 and the fatty liver
phenotype. J Biol Chem 280, 31686-31698 (2005).
36.   Williams JA, et al. Drug-drug interactions for UDP-glucuronosyltransferase
substrates: a pharmacokinetic explanation for typically observed low
exposure (AUCi/AUC) ratios. Drug Metab Dispos 32, 1201-1208 (2004).
37.   Barker AJ, et al. Studies leading to the identification of ZD1839
(IRESSA): an orally active, selective epidermal growth factor receptor
tyrosine kinase inhibitor targeted to the treatment of cancer. Bioorganic
& medicinal chemistry letters 11, 1911-1914 (2001).
38.   Herbst RS, Fukuoka M, Baselga J. Gefitinib--a novel targeted approach to
treating cancer. Nat Rev Cancer 4, 956-965 (2004).
39.   Liu X, et al. Metabolomics reveals the formation of aldehydes and iminium
in gefitinib metabolism. Biochem Pharmacol 97, 111-121 (2015).
40.   McKillop D, et al. Metabolic disposition of gefitinib, an epidermal growth
factor receptor tyrosine kinase inhibitor, in rat, dog and man.
Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems 34,
917-934 (2004).
41.   Scheffler M, Di Gion P, Doroshyenko O, Wolf J, Fuhr U. Clinical
pharmacokinetics of tyrosine kinase inhibitors: focus on
4-anilinoquinazolines. Clinical pharmacokinetics 50, 371-403 (2011).
42.   Li F, Lu J, Wang L, Ma X. CYP3A-mediated generation of aldehyde and
hydrazine in atazanavir metabolism. Drug Metab Dispos 39, 394-401 (2011).
43.   Baillie TA. Future of toxicology-metabolic activation and drug design:
challenges and opportunities in chemical toxicology. Chemical research in
toxicology 19, 889-893 (2006).
44.   Guengerich FP, MacDonald JS. Applying mechanisms of chemical toxicity to
predict drug safety. Chemical research in toxicology 20, 344-369 (2007).
45.   Dalvie D, et al. Assessment of three human in vitro systems in the
generation of major human excretory and circulating metabolites. Chemical
research in toxicology 22, 357-368 (2009).
46.   Anderson S, Luffer-Atlas D, Knadler MP. Predicting circulating human
metabolites: how good are we? Chemical research in toxicology 22, 243-256
(2009).
47.   Pettitt SJ, et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic
resources. Nat Methods 6, 493-495 (2009).
48.   Cradick TJ, Qiu P, Lee CM, Fine EJ, Bao G. COSMID: A Web-based Tool for
Identifying and Validating CRISPR/Cas Off-target Sites. Molecular therapy
Nucleic acids 3, e214 (2014).
49.   Hwang WY, et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas
system. Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013).
50.   Cong L, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.
Science 339, 819-823 (2013).
51.   Ponder KP, et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and
function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc Natl Acad
Sci U S A 88, 1217-1221 (1991).
52.   Li B, Dewey CN. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data
with or without a reference genome. BMC Bioinformatics 12, 323 (2011).
53.   Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat
Methods 9, 357-359 (2012).
54.   Eisenberg E, Levanon EY. Human housekeeping genes, revisited. Trends in
genetics : TIG 29, 569-574 (2013).
【図１Ａ】
2019524077.tif 000021
【図１Ｂ−１Ｃ】
2019524077.tif 000022
【図１Ｄ】
2019524077.tif 000023
【図２Ａ−２Ｂ】
2019524077.tif 000024
【図２Ｃ】
2019524077.tif 000025
【図２Ｄ−２Ｅ】
2019524077.tif 000026
【図３Ａ−３Ｂ】
2019524077.tif 000027
【図３Ｃ−３Ｄ】
2019524077.tif 000028
【図３Ｅ】
2019524077.tif 000029
【図４Ａ−４Ｂ】
2019524077.tif 000030
【図５】
2019524077.tif 000031
【図６Ａ】
2019524077.tif 000032
【図６Ｂ】
2019524077.tif 000033
【図７Ａ】
2019524077.tif 000034
【図７Ｂ】
2019524077.tif 000035
【図８】
2019524077.tif 000036
【図９】
2019524077.tif 000037
【図１０】
2019524077.tif 000038
【図１１Ａ】
2019524077.tif 000039
【図１１Ｂ】
2019524077.tif 000040
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2019524077.tif 000041
【図１３Ａ−１３Ｂ】
2019524077.tif 000042
【図１４Ａ−１４Ｃ】
2019524077.tif 000043
【図１５】
2019524077.tif 000044
【図１６Ａ−１６Ｂ】
2019524077.tif 000045
【図１７】
2019524077.tif 000046
【図１８】
2019524077.tif 000047
【図１９Ａ−１９Ｂ】
2019524077.tif 000048
【図２０】
2019524077.tif 000049
【図２１Ａ−２１Ｂ】
2019524077.tif 000050
【図２２】
2019524077.tif 000051
【図２３】
2019524077.tif 000052
【図２４】
2019524077.tif 000053
【図２５Ａ−２５Ｄ】
2019524077.tif 000054
【配列表】
2019524077000001.app
【国際調査報告】
2019524077.tif 000055
2019524077.tif 000056
2019524077.tif 000057