(57)【要約】ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１のモジュレーションを含む、肝臓における遺伝子発現のモジュレーションのための組成物および方法が、本明細書に記載される。詳細には、１つ以上の操作されたヌクレアーゼを使用して、肝臓におけるＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１の発現をモジュレーションするための方法が提供される。本発明は、肝臓におけるＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法、ならびに／または肝臓細胞からの遺伝子産物の特異的阻害剤の発現後に血清におけるそれらの遺伝子産物の量および／もしくは活性をモジュレートするための組成物および方法を記載する。
2019531068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の発現が野生型と比較して変更された、肝臓細胞。
【請求項２】
前記内因性遺伝子の配列が、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む少なくとも１つのヌクレアーゼを使用して前記遺伝子を切断することによって変更される、請求項１に記載の肝臓細胞。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記内因性遺伝子中の標的部位に結合する、請求項２に記載の肝臓細胞。
【請求項４】
前記標的部位が、表１、３、５、７、１１、１３、１４および１６に示される標的部位の少なくとも１２ヌクレオチドを含む、請求項３に記載の肝臓細胞。
【請求項５】
外因性配列を、切断された前記内因性遺伝子中に組み込むことをさらに含む、請求項２に記載の肝臓細胞。
【請求項６】
前記外因性配列が、導入遺伝子を含む、前記遺伝子中に変異を導入する、または前記内因性遺伝子中の変異を修正する、請求項５に記載の肝臓細胞。
【請求項７】
ＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子をさらに含み、前記人工転写因子が、前記内因性遺伝子の発現を変更する、請求項１に記載の肝臓細胞。
【請求項８】
内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子中の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン、ならびに機能的ドメインを含む、融合分子。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメインタンパク質またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、請求項８に記載の融合分子。
【請求項１０】
前記機能的ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインを含む、請求項８または９に記載の融合分子。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載の融合分子をコードするポリヌクレオチドであって、ｍＲＮＡの形態であるか、またはウイルスもしくは非ウイルスベクター上にある、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または請求項８から１０のいずれかに記載の融合分子、または請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ＴＴＲ媒介性アミロイドーシス、Ａ１ＡＴ欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症／スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症の処置のための、請求項１２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または請求項８から１０のいずれかに記載の融合分子、または請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月７日に出願された米国仮出願番号第６２／３８４，４２８号の利益を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、遺伝子治療、特に疾患関連内因性遺伝子のノックアウト、および阻害性タンパク質の発現のための肝臓への導入遺伝子コード構築物の標的化送達の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝子治療は、１つもしくは複数の不活性化された遺伝子を有するように、および／またはその細胞において以前には産生されなかった産物を細胞に発現させるように細胞を遺伝子操作するため使用され得る（例えば、導入遺伝子挿入を介しておよび／または内因性配列の修正を介して）。導入遺伝子挿入の使用の例には、１つもしくは複数の新規治療的タンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているもしくは機能障害性であるタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異型遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子もしくはその断片の挿入、および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの構造的核酸をコードする配列の挿入が含まれる。内因性遺伝子配列の「修正」の有用な適用の例には、疾患関連遺伝子変異の変更、スプライス部位をコードする配列における変更、調節配列における変更、および／またはタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化変更が含まれる。
【０００４】
肝遺伝子移入は、血友病およびリソソーム蓄積障害を含む種々の障害の処置および／または予防のために対象に導入遺伝子を送達する有効な手段を提供する。例えば、米国特許第９，１５０，８４７号ならびに米国特許出願公開第２０１７０１１９９０６号、同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１４００１７２１２号を参照のこと。肝臓指向性遺伝子治療に特異的なベクターも記載されている。例えば、ＷＯ２０１４０６４２７７；ＷＯ２００９１３０２０８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０７４５２６；ＥＰ２４５１４７４Ｂ１、Ｃｈｕａｈら（２０１４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２２巻、１６０５〜１６１３頁；およびＮａｉｒら（２０１４年）Ｂｌｏｏｄ  １２３巻：３１９５〜３１９９頁を参照のこと。これらのベクターは、野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列を含み得る。例えば、ＨａｕｔおよびＰｉｎｔｅｌ（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２巻：１８３４〜１８４３頁；ＨａｕｔおよびＰｉｎｔｅｌ（１９９８年）Ｖｉｒｏｌ．  ２５８巻：８４〜９４頁を参照のこと。従って、肝臓指向性遺伝子治療は、いくつかの疾患の処置または予防に有望である。
【０００５】
人工転写因子およびヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）、転写活性化因子様エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子（ＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドされるヌクレアーゼとも呼ばれる、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知、（Ｓｗａｒｔｓら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁）は、転写調節ドメイン（転写因子について）もしくは切断ドメイン（ヌクレアーゼについて）と会合したまたはそれらに作動可能に連結したＤＮＡ結合ドメイン（ヌクレオチドまたはポリペプチド）を含み、遺伝子発現のモジュレーションおよびゲノム配列の標的化変更に使用されてきた。例えば、人工ヌクレアーゼは、外因性配列を挿入し、１つまたは複数の内因性遺伝子を不活性化し、変更された遺伝子発現パターンを有する生物（例えば、作物）および細胞系を創出するなどのために使用されてきた。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１５００５６７０５号を参照のこと。同様に、特定の配列に標的化される人工転写因子が、内因性遺伝子発現を活性化または抑圧するために使用されてきた。例えば、米国特許第９，２３４，０１６号；同第８，５６３，３１４号および同第８，８４１，２６０号；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻：９７３〜９７６頁を参照のこと。ジンクフィンガータンパク質を含有するこれらの操作された転写因子を使用する臨床試験は、これらの新規転写因子が、種々の状態を処置することが可能であることを示している（例えば、Ｙｕら（２００６年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０巻：４７９〜４８１頁を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第９，１５０，８４７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１７０１１９９０６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１４００１７２１２号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１４０６４２７７号
【特許文献６】国際公開第２００９１３０２０８号
【特許文献７】国際公開第２０１７／０７４５２６号
【特許文献８】欧州特許出願公開第ＥＰ２４５１４７４Ｂ１号明細書
【特許文献９】米国特許第９，２５５，２５０号明細書
【特許文献１０】米国特許第９，２００，２６６号明細書
【特許文献１１】米国特許第９，０４５，７６３号明細書
【特許文献１２】米国特許第９，００５，９７３号明細書
【特許文献１３】米国特許第８，９５６，８２８号明細書
【特許文献１４】米国特許第８，９４５，８６８号明細書
【特許文献１５】米国特許第８，７０３，４８９号明細書
【特許文献１６】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，５３４，２６１号明細書
【特許文献１８】米国特許第６，５９９，６９２号明細書
【特許文献１９】米国特許第６，５０３，７１７号明細書
【特許文献２０】米国特許第６，６８９，５５８号明細書
【特許文献２１】米国特許第７，０６７，３１７号明細書
【特許文献２２】米国特許第７，２６２，０５４号明細書
【特許文献２３】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献２４】米国特許第７，９７２，８５４号明細書
【特許文献２５】米国特許第７，９１４，７９６号明細書
【特許文献２６】米国特許第７，９５１，９２５号明細書
【特許文献２７】米国特許第８，１１０，３７９号明細書
【特許文献２８】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書
【特許文献３３】米国特許出願公開第２００６００６３２３１号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２０１１０２６５１９８号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２０１３０１２２５９１号明細書
【特許文献４０】米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書
【特許文献４１】米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号明細書
【特許文献４２】米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号明細書
【特許文献４３】米国特許第９，２３４，０１６号明細書
【特許文献４４】米国特許第８，５６３，３１４号明細書
【特許文献４５】米国特許第８，８４１，２６０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｕａｈら（２０１４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２２巻、１６０５〜１６１３頁
【非特許文献２】Ｎａｉｒら（２０１４年）Ｂｌｏｏｄ  １２３巻：３１９５〜３１９９頁
【非特許文献３】ＨａｕｔおよびＰｉｎｔｅｌ（１９９８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２巻：１８３４〜１８４３頁
【非特許文献４】ＨａｕｔおよびＰｉｎｔｅｌ（１９９８年）Ｖｉｒｏｌ．  ２５８巻：８４〜９４頁
【非特許文献５】Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻：９７３〜９７６頁
【非特許文献６】Ｙｕら（２００６年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０巻：４７９〜４８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、肝臓指向性遺伝子治療を通じて対処され得るいくつかの疾患の処置または予防が依然として必要とされている。かかる疾患には、ＴＴＲ媒介性アミロイドーシス、Ａ１ＡＴ欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症／スタチン耐性高コレステロール血症（Ｓｔａｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）および高シュウ酸尿症（Ｈｙｐｅｒｘｏａｌｕｒｉａ）が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
要旨
本発明は、肝臓におけるＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法、ならびに／または肝臓細胞からの遺伝子産物の特異的阻害剤の発現後に血清におけるそれらの遺伝子産物の量および／もしくは活性をモジュレートするための組成物および方法を記載する。これらの遺伝子についての遺伝子発現のモジュレーションは、１つもしくは複数の操作されたヌクレアーゼを使用したＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１遺伝子の遺伝子改変（例えば、遺伝子ノックアウトを生じる、遺伝子に対する配列改変を生じる切断）を介して、ならびに／またはＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１遺伝子発現のモジュレーター（活性化因子または阻害剤）、例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１遺伝子の発現を調節する（オフにするもしくは下方調節する、またはオンにするもしくは上方調節する）転写因子の導入を介して達成され得る。遺伝子発現のモジュレーターは、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１およびＨＡＯ１遺伝子に対する直接的作用によって、ならびに／または間接的作用（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１阻害剤の活性化）によって作用し得る。
【００１０】
さらに、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１ヌルの細胞、幹細胞、組織または生物全体を産生するために、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子を欠失（不活性化）または抑圧するための方法および組成物が、本明細書で提供される。ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子のモジュレーションは、例えば、染色体外で（エピソームで）発現され得るまたは肝臓細胞のゲノム中に（例えば、例えばアルブミン遺伝子座中へのヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して）組み込まれ得る、阻害剤をコードする導入遺伝子の、肝臓細胞中への導入による、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子産物の阻害によっても達成され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子産物を阻害することが可能な抗体またはポリペプチドをコードする。一部の態様では、阻害剤は、ＲＮＡｉなどの阻害性核酸である。
【００１１】
従って、一態様では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の発現がモジュレートされた細胞が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、細胞は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子をノックアウトするために１つまたは複数の操作されたヌクレアーゼを使用して、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１が（部分的にまたは完全に）不活性化された細胞など、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子のノックアウトを含む。他の実施形態では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の発現がモジュレートされるように操作された転写因子（ＴＦ）を含む細胞が記載される。一部の実施形態では、細胞は肝臓細胞である。ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の発現が、（例えば、ヌクレアーゼ媒介性不活性化を介しておよび／または１つもしくは複数の操作されたＴＦを使用して）モジュレートされる細胞がさらに記載され、細胞は、少なくとも１つの外因性導入遺伝子、もしくは少なくとも１つの内因性遺伝子のさらなるノックアウト、またはそれらの組合せを含むように、さらに操作される。外因性導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１もしくはＨＡＯ１遺伝子中に組み込まれ得、および／またはセーフハーバー遺伝子座中に組み込まれ得る。一部の例では、外因性導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１阻害剤（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１ポリペプチド阻害剤、例えば抗体、ならびに／またはＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１阻害剤ＲＮＡ分子）をコードする。
【００１２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子配列に対する改変（例えば、欠失および／または挿入）を含み、改変は、選択された標的遺伝子内の配列に結合するヌクレアーゼを使用してなされる。ある特定の実施形態では、示された標的遺伝子の改変に使用されるヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、シングルガイドＲＮＡなど）は、本明細書（例えば、表１、３、５、７、１１、１３、１４および１６）に示される、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはさらにはそれよりも多い塩基対の標的部位に結合する。ヌクレアーゼ標的部位は、連続または非連続配列であり得る。ある特定の実施形態では、対になったヌクレアーゼが使用される。本明細書に記載されるヌクレアーゼ媒介性改変は、切断および／または結合部位の部位の上流の、下流の、および／またはその部位の１つもしくは複数の塩基対を含む１〜３００塩基対（またはそれらの間の任意の塩基対数）以内の配列に対する改変；結合および／または切断部位を含むおよび／またはそれらのいずれかの側の１〜１００塩基対（またはそれらの間の任意の塩基対数）以内の改変；結合および／または切断部位を含むおよび／またはそれらのいずれかの側の１〜５０塩基対（またはそれらの間の任意の塩基対数）以内の改変；ならびに／あるいはヌクレアーゼ結合部位および／または切断部位内の１つまたは複数の塩基対に対する改変が含まれるがこれらに限定されない、ヌクレアーゼ結合および／もしくは切断部位内またはその近傍にある改変（挿入および／または欠失）を生じ得る。ある特定の実施形態では、改変は、本明細書（例えば、表１、３、５、７、１１、１３、１４および１６）に示される標的部位内、それらの間（例えば、対になった標的部位について）またはそれらの近傍（例えば、１〜５０ヌクレオチドまたはそれよりも多く（または任意の数のヌクレオチド））での、細胞のゲノムにおける改変が含まれるがこれらに限定されない、本明細書に示される標的部位内またはその近傍にある。
【００１３】
別の態様では、本明細書に記載される組成物（改変された細胞）および方法は、例えば、障害の処置および／または予防もしくは寛解において使用され得る。方法は、典型的には、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子が不活性化または下方モジュレートされるように、（ａ）ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）もしくはＲＮＡガイドされるヌクレアーゼ系、例えば、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、または操作された転写因子（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦまたはＣａｓ９−ＴＦ）を使用して、細胞（例えば、肝細胞）において内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子を切断またはその発現を下方調節するステップを含み；それによって障害を処置または予防する。
【００１４】
肝臓特異的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１）内の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）および機能的ドメイン（例えば、ヌクレアーゼの場合にはヌクレアーゼ／切断ドメイン、転写因子の場合には転写活性化または抑圧ドメイン）を含む人工ヌクレアーゼおよび／または転写因子もまた、本明細書に記載される。ＤＮＡ結合ドメインは、標的配列内の任意の配列に結合して、遺伝子のモジュレーションをもたらし得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、添付の表に示される標的部位の１２またはそれよりも多くの（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２またはそれよりも多くの）ヌクレオチドの標的部位に結合する。結合したヌクレオチドは、連続または非連続であり得る。次いで、本明細書に記載される人工転写因子のＤＮＡ結合ドメインの、その標的部位への結合は、上方調節または下方調節を介して標的遺伝子の発現をモジュレートする。同様に、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、切断／ヌクレアーゼドメインと会合したＤＮＡ結合ドメイン）の結合は、標的遺伝子中に破断（一本鎖または二本鎖）を引き起こし、これは、ＮＨＥＪ媒介性修復（「インデル」として公知の挿入および／または欠失）、ドナーのＮＨＥＪ媒介性組み込み（例えば、末端捕捉を介した）および／または相同組換え修復（例えば、破断中への相同性アームを有するドナーの組み込み）を介した改変を生じる。切断および／または改変の部位は、ヌクレアーゼ標的部位の内部もしくはそれに隣接し得（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くを含む、１〜５０ヌクレオチド）、または対になった標的部位間にあり得る。
【００１５】
ヌクレアーゼ、転写因子および／または導入遺伝子は、ｍＲＮＡとして、タンパク質形態で、ならびに／またはヌクレアーゼ、ＴＦおよび／もしくは導入遺伝子の１つもしくは複数の構成成分をコードするＤＮＡ配列として、導入され得る。一態様では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、本明細書で提供される。他の実施形態では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子の発現をモジュレートするＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＣａｓ９−ＴＦが、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のヌクレアーゼもしくは転写因子のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ヒトＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子中の標的部位に結合する。ジンクフィンガータンパク質は、１、２、３、４、５、６つまたはそれよりも多くのジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーは、標的遺伝子中の標的下位部位と特異的に接触する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、４または５または６つのフィンガー（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６と称され、Ｎ末端からＣ末端へと、Ｆ１からＦ４またはＦ５またはＦ６へと順序付けられる）を含む。他の実施形態では、シングルガイドＲＮＡは、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子中の標的部位に結合し得る。
【００１６】
本明細書に記載されるヌクレアーゼのいずれかは、切断ドメインおよび／または切断ハーフドメイン（例えば、野生型または操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメイン）をさらに含み得る。従って、本明細書に記載されるＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮのいずれかでは、ヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼハーフドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン）を含み得る。他の実施形態では、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮは、操作されたヌクレアーゼドメインまたはハーフドメイン、例えば、偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ヘテロダイマーを形成する操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号を参照のこと。一部の実施形態では、ＺＦＮは、非特異的ＤＮＡ相互作用を減少させるために、ＺＦＰ骨格に対する改変をさらに含み得る。さらなる実施形態では、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはｄＣａｓ−ＦｏｋＩ融合物中のＦｏｋＩドメインは、ＦｏｋＩドメインとＤＮＡ分子との間の非特異的相互作用を破壊する変異を含む（米国特許出願第１５／６８５，５８０号を参照のこと）。なおさらなる実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＲＮＡガイドされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ニッカーゼとして作用する。一部の例では、二本鎖切断は、２対のニッカーゼを使用して達成される（例えば、米国特許第９，２００，２６６号）。本明細書に記載される転写因子のいずれかは、転写活性化または抑圧ドメインをさらに含み得る。
【００１７】
別の態様では、１つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチド、系および／またはベクターを本明細書に記載される細胞中に導入することによって、細胞においてＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子を不活性化する方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載される方法のいずれかでは、ヌクレアーゼは、標的化変異誘発、細胞ＤＮＡ配列の欠失を誘導、および／または所定の染色体遺伝子座における標的化組換えを促進し得る。従って、ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、標的遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドを欠失または挿入する。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子は、ヌクレアーゼ切断とその後の非相同末端接合とによって不活性化される。他の実施形態では、標的遺伝子中のゲノム配列は、例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ（または前記ヌクレアーゼをコードするベクター）、およびヌクレアーゼによる標的化切断後に遺伝子中に挿入される「ドナー」配列を使用して、置き換えられる。ドナー配列は、ヌクレアーゼベクター中に存在、別々のベクター（例えば、ＡＡＶ、ＡｄまたはＬＶベクター）中に存在し得、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞中に導入され得る。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１モジュレーション（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１もしくはＨＡＯ１標的化ヌクレアーゼおよび／または転写因子を介した下方調節）を含む細胞は、（切断されたＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１もしくはＨＡＯ１、または他の遺伝子、例えば、セーフハーバー遺伝子もしくは遺伝子座中に）１つまたは複数のさらなるゲノム改変、例えば、組み込まれた外因性配列をさらに含む。外因性配列は、ベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶ、ＬＶ）を介して、またはエレクトロポレーションなどの技術を使用することによって、導入され得る。さらなる実施形態では、さらなる改変は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１の野生型ｃＤＮＡコピーを、細胞中の内因性変異体コピーが本明細書に記載される方法のいずれかによってノックアウトされている細胞中に導入することを含む。一部の態様では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１の野生型ｃＤＮＡコピーは、ｃＤＮＡが標的化ヌクレアーゼによる切断に供されないように、サイレントな遺伝子改変を含み得る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡコピーは、ゲノム中に組み込まれるが、他の実施形態では、ｃＤＮＡコピーは、染色体外で維持される。
【００１９】
一部の態様では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１がモジュレートされた細胞は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１活性を阻害する外因性導入遺伝子をコードする遺伝子をさらに含む。他の態様では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子改変を欠如するが、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１阻害活性をコードする導入遺伝子の発現のための構築物を含む細胞が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、阻害性導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１によってコードされるタンパク質を阻害する抗体をコードする。他の実施形態では、阻害性導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１発現を阻害する阻害性核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ）をコードする。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡである（米国特許第９，２４９，４１５号）。これらの細胞の子孫である細胞（例えば、本明細書に記載されるように改変された細胞の子孫である遺伝子改変された細胞）を含む、本明細書に記載される方法によって産生される細胞もまた記載される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、本明細書に開示される標的部位内のおよび／または本明細書に記載される対になった標的部位間の挿入および／または欠失が含まれるがこれらに限定されない、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子内の１つまたは複数の挿入および／または欠失を含む。
【００２０】
一態様では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子発現の１つまたは複数のモジュレーター（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１に標的化される操作されたヌクレアーゼおよび／または操作された転写因子）をコードする導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチド発現構築物が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド発現構築物は、エンハンサー配列（例えば、野生型または変異型Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサー）、プロモーター配列（例えば、トランスサイレチンミニマルプロモーター（ＴＴＲｍ）プロモーター）および導入遺伝子、ならびに任意選択で、ポリアデニル化配列（例えば、合成ポリアデニル化配列（ＳＰＡ）および／またはシグナルペプチド（ＳＰ））をさらに含む（米国特許出願公開第２０１７−０１１９９０６号Ａ１を参照のこと）。ある特定の実施形態では、発現構築物は、イントロン配列（例えば、野生型ＭＶＭもしくは変異型ＭＶＭ配列および／またはキメライントロン）をさらに含む。ある特定の実施形態では、発現構築物は、５’から３’の配向で、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、導入遺伝子（任意選択でシグナルペプチドを含む）およびポリアデニル化シグナルを含む。
【００２１】
本明細書に記載される遺伝子モジュレーターをコードする発現カセットは、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）が含まれるがこれらに限定されない、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター中に含まれ得る。好ましい実施形態では、発現構築物は、ＡＡＶ構築物上にある、本明細書に記載される発現構築物に隣接する５’および３’ＩＴＲをさらに含む。任意選択で、スペーサー分子もまた、発現構築物の１つまたは複数の構成成分間、例えば、５’ＩＴＲとエンハンサーとの間および／またはポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲとの間に含まれる。
【００２２】
一部の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子には、遺伝子モジュレーター、例えば、操作されたヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする配列が含まれる。他の実施形態では、遺伝子をモジュレートする導入遺伝子には、操作された転写因子（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ系）をコードする配列が含まれる。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーター（例えば、ヌクレアーゼおよび／または転写因子）は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１に標的化される。
【００２３】
ある特定の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子をモジュレートする導入遺伝子の発現を駆動しつつ、それらがエピソームで維持されるように、細胞中に導入される。他の態様では、発現構築物は、それらが導入される細胞のゲノム中にランダムに組み込まれる。さらなる態様では、導入遺伝子発現を駆動する発現構築物は、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによってゲノム中に組み込まれる。
【００２４】
なおさらなる態様では、本明細書に開示される遺伝子モジュレーター（ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）のいずれかを含む細胞、ならびに本明細書に記載される遺伝子モジュレーターによってなされた任意の遺伝子改変を含む細胞が、本明細書に記載される。これらの細胞の子孫である細胞、例えば、細胞が遺伝子モジュレーターをもはや含まない、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞の子孫である細胞（幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が含まれるがそれらに限定されない）もまた提供される。単離された細胞は、対象中に導入され得（ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞治療）、または本明細書に記載される細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）は、それが対象の一部である場合、改変され得る（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【００２５】
さらなる態様では、肝臓細胞において１つまたは複数の導入遺伝子（ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１のモジュレーター）を発現させるための方法であって、導入遺伝子が細胞において発現されるように、本明細書に記載される１つまたは複数の発現構築物を細胞中に導入するステップを含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、この発現構築物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２／６またはＡＡＶ２／８）上にある。
【００２６】
別の態様では、生きた動物において１つまたは複数の導入遺伝子（ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１のモジュレーター）を発現させる方法であって、生きた動物に、本明細書に記載される１つまたは複数の発現カセットを投与するステップを含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、生きた動物の肝臓に投与される。ある特定の実施形態では、発現構築物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２またはＡＡＶ２／６）上にある。一部の実施形態では、発現構築物は、末梢静脈を介して全身（例えば、静脈内）投与される。
【００２７】
別の態様では、本明細書に記載される細胞、発現構築物、転写因子および／またはヌクレアーゼの１つまたは複数を含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
ある特定の態様では、肝臓特異的発現カセットの標的化組み込みのための組成物、方法および系が、本明細書に記載される。方法および系は、細胞に、本明細書に記載される１つまたは複数の発現カセットを投与するステップ、および標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／もしくはＨＡＯ１ならびに／またはセーフハーバー遺伝子）に対して特異的な１つまたは複数のヌクレアーゼを投与するステップを含む。標的遺伝子のヌクレアーゼ媒介性切断後に、発現カセットは、相同性依存的または相同性非依存的機構を介して遺伝子中に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は内因性アルブミン遺伝子である。
【００２９】
本発明の発現構築物のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのために、ヌクレアーゼによって切断された領域（遺伝子）中に発現構築物が組み込まれるように、１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび／またはＴｔＡｇｏヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない任意のヌクレアーゼが使用され得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の対のヌクレアーゼが用いられる。ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で導入され得る、または非ウイルスもしくはウイルスベクターを使用して細胞に投与され得る。一部の態様では、ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、レンチウイルスによって、または非組み込みレンチウイルスによって、送達され得る。他の態様では、発現カセットは、ＡＡＶおよび／またはＤＮＡオリゴによって送達され得る。
【００３０】
さらなる態様では、障害を処置するための治療的タンパク質を提供するための方法および組成物であって、治療的タンパク質が単鎖抗体である、方法および組成物が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、方法は、それを必要とする対象の肝臓に、本明細書に記載される発現カセット（例えば、ＡＡＶベクター）を投与するステップを含む。他の実施形態では、方法は、対象に、改変された細胞（対象において異常に発現されるタンパク質の機能的バージョンを、記載される発現カセットから発現させる）を投与するステップを含む。
【００３１】
記載される組成物および方法のいずれかでは、発現カセットおよび／またはヌクレアーゼは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、または偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などが含まれるがこれらに限定されないＡＡＶベクター上にあってもよい。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（発現構築物および／またはヌクレアーゼ）は、同じＡＡＶベクター型を使用して送達される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異なるＡＡＶベクター型を使用して送達される。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のベクターを使用して送達され得る。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、インタクトな動物の肝臓中に、静脈内（例えば、門静脈内または末梢静脈内）投与を介して送達される。
【００３２】
本明細書に記載される組成物および方法は、例えば、ＴＴＲ媒介性アミロイドーシス、Ａ１ＡＴ欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症／スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を含む障害を処置または予防するために使用され得る。
【００３３】
本明細書に記載される方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、生きたインタクトな哺乳動物中に導入される。哺乳動物は、送達の時点で、任意の発生段階、例えば胚、胎仔、新生仔、乳仔、若年、または成体であり得る。さらに、標的化される細胞は、健康または病的であり得る。ある特定の実施形態では、組成物の１つまたは複数は、静脈内（例えば、門静脈内を介して肝臓に、例えば、尾静脈注射、または末梢静脈を介して全身的に）、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、肝臓実質中に（例えば、注射を介して）、肝動脈中に（例えば、注射を介して）、および／または胆樹を介して（例えば、注射を介して）送達される。
【００３４】
特定の型の細胞、例えば、血小板、線維芽細胞、肝細胞などに組成物を標的化するために、投与される組成物の１つまたは複数は、細胞の表面受容体に特異的に結合するホーミング剤と会合し得る。例えば、ベクターは、ある特定の肝系細胞が受容体を有するリガンド（例えば、ガラクトース）にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、共有結合、例えば、グルタルアルデヒドなどの架橋剤、または非共有結合、例えば、アビジン化リガンドのビオチン化ベクターへの結合であり得る。別の形態の共有結合コンジュゲーションは、ベクターストックを調製するために使用されるＡＡＶヘルパープラスミドを操作することによって提供され、その結果、リガンドがウイルス粒子の表面上に曝露されるように、コードされるコートタンパク質の１つまたは複数は、ネイティブＡＡＶコートタンパク質とペプチドまたはタンパク質リガンドとのハイブリッドである。
【００３５】
本明細書に記載される細胞および／または発現構築物を含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓおよび改変されたＣａｓタンパク質をコードするＲＮＡ分子、ならびにガイドＲＮＡ）、転写因子、またはヌクレアーゼのアリコート、転写因子、細胞、本発明の方法を実施するための指示書などをさらに含み得る。
【００３６】
これらおよび他の態様は、全体としての本開示に照らして、当業者に容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｚ変異が位置する場所の近傍のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン５中の領域の部分的配列を示す。図１Ａ（配列番号１３０および１３１）は、Ｚ変異遺伝子配列中のＧ→Ａ変異の部位を示し、ＳＥＲＰＩＮＡ１特異的ＺＦＮが結合する場所もまた示す。図１Ｂ（配列番号１３２）は、Ｇ→Ａ変異を示し、遺伝子修正ドナーの組み込み後の変更されたヌクレオチドの部位の位置もまた示す。
【００３８】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＺＦＮおよび遺伝子修正ドナーで処置したマウスにおけるＮＨＥＪおよびＴＩの量を示すグラフであり、このとき、動物は２週間の時点で屠殺した。図２Ａは、低用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり７．５ｅ１０ｖｇ）または高用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり１．５ｅ１１ｖｇ）のいずれかのＡＡＶ８−ＺＦＮ単独（２５２６４および２５２７７）で処置したマウスの肝臓において検出されたＺＦＮ媒介性ＮＨＥＪの量を示し、図２Ｂは、遺伝子修正ドナー（マウス１匹あたり１．５ｅ１２ｖｇの、遺伝子修正ドナーを含むＡＡＶ８）の標的化組み込みの量を示す。
【００３９】
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＺＦＮおよび／または遺伝子修正ドナーで処置したマウスにおけるＮＨＥＪおよびＴＩデータを示すグラフであり、このとき、動物は６ヶ月の時点で屠殺した。図３Ａは、低用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり７．５ｅ１０ｖｇのＡＡＶ８）または高用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり１．５ｅ１１ｖｇ）のいずれかのＡＡＶ８−ＺＦＮ単独（２５２６４および２５２７７）で処置したマウスの肝臓において検出されたＺＦＮ媒介性ＮＨＥＪの量を示し、図３Ｂは、遺伝子修正ドナー（マウス１匹あたり１．５ｅ１２ｖｇの、遺伝子修正ドナーを含むＡＡＶ８）の標的化組み込みの量を示す。図３Ｃは、６ヶ月試料と比較した２週間試料についての検出されたＮＨＥＪの量における直接的比較を示す。
【００４０】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅ（配列番号１３３〜１３８）は、ＺＦＮで標的化する潜在的エリアを含むＴＴＲ遺伝子の部分的配列を示す。各標的の文字名周囲のボックスの太さは、標的の線の太さと一致する。図４Ａ〜４Ｃは、エクソン１の配列を示すが、図４Ｄは、エクソン２中の配列を示し、図４Ｅは、エクソン３中の配列を示す。例えば、標的「Ａ」は、図４Ａ中に細い線で示される。標的「Ｂ」は、より太い線によって示され、ここで、Ｂ対は共に、図４Ａ中の遺伝子のセンス（ワトソン）鎖に結合するが、「Ｃ」標的は、Ｂの５’センス標的およびアンチセンス鎖上のＣ標的（これも太い線）に結合するＺＦＮ対によって結合される。図４Ｂは、センス鎖上の２つの太い線（配列の下に示される）に対応する「Ｅ」標的を示す。「Ｆ」標的は、センス鎖の５’末端の太いＥ標的線およびＦの近傍のアンチセンス鎖上の太い標的線を使用する。Ｇ標的は、図４Ｂのセンス鎖上の細い線として示される。図４Ｃについて、「Ｄ」標的は、センス鎖およびアンチセンス鎖の下の細い線によって示される。図４Ｄは、「Ｈ」、「Ｉ」および「Ｊ」の標的配列を示し、全ての文字のボックスは、２つのＺＦＮ結合配列の中央に示される。図４Ｅは、２つのＺＦＮ標的「Ｌ」および「Ｍ」を示し、ここで、Ｌ対は太い線に結合し、Ｍ対は細い線に結合する。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｅ（配列番号１３３〜１３８）は、ＺＦＮで標的化する潜在的エリアを含むＴＴＲ遺伝子の部分的配列を示す。各標的の文字名周囲のボックスの太さは、標的の線の太さと一致する。図４Ａ〜４Ｃは、エクソン１の配列を示すが、図４Ｄは、エクソン２中の配列を示し、図４Ｅは、エクソン３中の配列を示す。例えば、標的「Ａ」は、図４Ａ中に細い線で示される。標的「Ｂ」は、より太い線によって示され、ここで、Ｂ対は共に、図４Ａ中の遺伝子のセンス（ワトソン）鎖に結合するが、「Ｃ」標的は、Ｂの５’センス標的およびアンチセンス鎖上のＣ標的（これも太い線）に結合するＺＦＮ対によって結合される。図４Ｂは、センス鎖上の２つの太い線（配列の下に示される）に対応する「Ｅ」標的を示す。「Ｆ」標的は、センス鎖の５’末端の太いＥ標的線およびＦの近傍のアンチセンス鎖上の太い標的線を使用する。Ｇ標的は、図４Ｂのセンス鎖上の細い線として示される。図４Ｃについて、「Ｄ」標的は、センス鎖およびアンチセンス鎖の下の細い線によって示される。図４Ｄは、「Ｈ」、「Ｉ」および「Ｊ」の標的配列を示し、全ての文字のボックスは、２つのＺＦＮ結合配列の中央に示される。図４Ｅは、２つのＺＦＮ標的「Ｌ」および「Ｍ」を示し、ここで、Ｌ対は太い線に結合し、Ｍ対は細い線に結合する。
【００４１】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、示された遺伝子モジュレーター（表１１を参照のこと）で処置したマウス肝細胞におけるパーセント遺伝子改変（ヌクレアーゼ媒介性切断後のＮＨＥＪの挿入および／または欠失特徴を示す「インデル」）を示すグラフである。図５Ａは、ＢＴＸエレクトロポレーションを介してＺＦＮコードｍＲＮＡを導入した場合の、トランスフェクションの３日後のＢ１６−Ｆ１０細胞におけるＺＦＮあたりｍＲＮＡ用量による結果を示す。図５Ｂは、リポフェクションを介してＺＦＮコードｍＲＮＡを導入した場合の、トランスフェクションの３日後のマウス肝細胞における結果を示す。
【００４２】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、マウスにおけるＴＴＲ  ＺＦＮの活性を示すグラフである。図６Ａは、高用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり１．５ｅ１１ｖｇ）または低用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり２．５ｅ１０ｖｇ）のいずれかの、示されたＺＦＮで処置したマウス由来の、処置の２８日後に回収した肝臓における切断活性（％インデル）を示す。図６Ｂは、同じ処置条件下での血漿ｍＴＴＲ濃度を示す。データは、ＺＦＮがｉｎ  ｖｉｖｏでそれらの標的を切断し、血漿ＴＴＲにおける低減を引き起こすことを実証している。
【００４３】
【図７】図７は、エクソンおよび標的化のために選択された部位を示す、マウスＰＣＳＫ９遺伝子の模式図である。
【００４４】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＺＦＮによるマウスＴＴＲ標的の切断を示すグラフである。この分析で試験したＺＦＮは、オフターゲット切断に関連し得る特定のリン酸接触残基を除去するための変異を、それらの骨格中およびＦｏｋＩ切断ドメイン中に含む。図８Ａは、試験タンパク質の各々のオンターゲット位置における活性結果を示し、図８Ｂは、３つの最も高いオフターゲット遺伝子座の合計における活性を示す。変異体タンパク質は、親タンパク質と比較して、増加したオンターゲット活性および減少したオフターゲット活性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
特に肝臓細胞における、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子の発現をモジュレートする方法および組成物、ならびにＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１阻害性導入遺伝子の産生のためのカセットが、本明細書に開示される。ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１発現のモジュレーションは、遺伝子をノックアウトするための標的化ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、および／または内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１もしくはＨＡＯ１発現を阻害するための転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＲＮＡガイドされるＣａｓ−ＴＦ）の使用によって達成され得る。遺伝子モジュレーター（ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）を含むおよび／または遺伝子モジュレーターによってなされた遺伝子改変を含む（が、遺伝子モジュレーター自体は含まない）細胞、ならびにこれらの細胞の子孫である細胞もまた提供される。本発明の方法および組成物は、肝臓特異的発現構築物を介して、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１阻害性導入遺伝子を発現させるために使用され得る。本明細書に記載される組成物（遺伝子モジュレーターを含む構築物、タンパク質、および／または細胞）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝臓細胞に任意の導入遺伝子を送達し得、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏ治療を介した１つまたは複数の導入遺伝子の提供によって寛解され得る任意の疾患または障害の処置および／または予防のために使用され得る。
【００４６】
例えば、発現が変更されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（内因性遺伝子中の標的部位に結合する）および切断ドメインを含む少なくとも１つの人工ヌクレアーゼを使用して、またはＤＮＡ結合ドメイン（内因性遺伝子中の標的部位に結合する）および転写調節ドメイン（活性化因子またはリプレッサー）を含む人工転写因子（リプレッサーまたは活性化因子）を使用して遺伝子を切断することによって、内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の発現が野生型と比較して変更された肝臓細胞が、本明細書で提供される。標的部位は、添付の表（例えば、表１、３、５、７、１１、１３、１４および１６）のいずれかの標的部位に示される少なくとも１２の（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２またはそれよりも多くの）連続または非連続ヌクレオチドを含み得る。外因性配列（例えば、導入遺伝子；遺伝子中に変異を導入する配列または内因性遺伝子中の変異を修正する配列）が、切断後に内因性遺伝子中に組み込まれ得、ならびに／または１つもしくは複数のヌクレオチドが、切断後に挿入および／もしくは欠失され得る。内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子中の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメインタンパク質またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））および機能的ドメイン（例えば、切断ドメイン、転写活性化ドメインまたは転写抑圧ドメイン）を含む融合分子、ならびにこれらの融合分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ウイルスまたは非ウイルスベクターなど）もまた提供される。また、本明細書に記載される細胞、融合分子および／またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供され、内因性遺伝子発現の変更、ならびに／またはＴＴＲ媒介性アミロイドーシス、Ａ１ＡＴ欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症／スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症などの障害の処置（必要とする対象へのその投与を介して）のための、細胞、融合分子および／または医薬組成物を作製および使用する方法も同様に提供される。
【００４７】
遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）は、５０，０００人に１人が罹患する常染色体優性疾患であり、Ｃ１阻害剤の減少したレベルの結果である。患者は、身体の任意の部分における腫脹の再発性のエピソードを経験し、中咽頭、喉頭または腹部に局在化した腫脹は、罹患率および死亡の最も高いリスクを有する（ＴｓｅおよびＺｕｒａｗ（２０１３年）Ｃｌｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄ  ８０巻（５号）：２９７頁を参照のこと）。疾患は、ブラジキニンの過剰産生の結果としての、組織中への血漿の血管外漏出から生じる。機構には、活性な血漿カリクレイン（これは、より多くの第ＸＩＩ因子を活性化する）を放出する、活性化第ＸＩＩ因子によるプレカリクレイン（ＰＫＫ、ＫＬＫ３、ＰＫＫＤ、フレッチャー因子およびキニノゲニン（Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎｉｎ）としても公知）の切断が関与すると思われる。次いで、血漿カリクレインはキニノーゲンを切断し、ブラジキニンを放出する。次いで、ブラジキニンは、内皮細胞上のＢ２ブラジキニン受容体に結合し、内皮の透過性を増加させる。通常、Ｃ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１によってコードされる）は、血漿カリクレインの阻害および第ＸＩＩ因子の活性化によってブラジキニン産生を制御する。ＨＡＥは３つの型で存在し、Ｉ型およびＩＩ型は、存在するＣ１阻害剤の量および型によって識別され、ＩＩＩ型は、第ＸＩＩ因子中のＴｈｒ３０９Ｌｙｓ変異と関係する（Ｐｒｉｅｔｏら（２００９年）Ａｌｌｅｒｇｙ  ６４巻（２号）：２８４頁）。Ｉ型ＨＡＥは、作製されるＣ１阻害剤タンパク質の不十分な発現およびその少量の破壊の結果であると思われる、低レベルのＣ１阻害剤を有する。１型は、ＨＡＥ患者のおよそ８５％を占める。ＩＩ型患者は、正常レベルのＣ１阻害剤を有するが、Ｃ１阻害剤タンパク質は、変異に起因して無効である（ＴｓｅおよびＺｕｒａｗ、同書）。小さいおよび大きい挿入および欠失ならびに重複を含む、Ｉ型ＨＡＥをもたらすＳＥＲＰＩＮＧ１中の２５０よりも多い変異が特徴付けられている（Ｒｉｊａｖｅｃら（２０１３年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８巻（２号）：ｅ５６７１２頁）。ＨＡＥの遺伝的基礎におけるこの高い可変性に起因して、本発明の方法および組成物は、ＨＡＥの顕在化における下流のプレイヤーを標的化することによって、ＨＡＥを予防または処置するために使用され得る。例えば、プレカリクレイン（ＰＫＫと略称する）発現における減少をもたらすためにプレカリクレイン（ＫＬＫＢ１、肝細胞において発現される）をコードする遺伝子を標的化することは、ＨＡＥを引き起こしている上流の変異の型に関係なくブラジキニン産生における減少を生じ、従って、血漿血管外漏出における減少を生じ得る。従って、本発明の方法および組成物は、ＨＡＥを予防または処置するためにＫＬＫＢ１の発現における減少を引き起こすために使用され得る。操作されたヌクレアーゼは、肝細胞のサブセットにおいてＫＬＫＢ１をノックアウトするために使用されて、ブラジキニン産生を低減させ得、および／または操作された転写因子は、ＫＬＫＢ１発現を下方調節するために使用され得る。
【００４８】
ＰＣＳＫ９は、コレステロール恒常性において主要な調節的役割を果たすタンパク質をコードする遺伝子（ＦＨ３；ＨＣＨＯＬＡ３；ＬＤＬＣＱ１；ＮＡＲＣ−１；ＮＡＲＣ１；ＰＣ９としても公知）である。ＰＣＳＫ９タンパク質は、ＬＤＬＲの上皮増殖因子様リピートＡ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合し、ＬＤＬＲ分解を誘導する。ＰＣＳＫ９における常染色体優性の毒性機能獲得型変異（例えば、Ｓ１２７Ｒ、Ｐ２１６Ｌ、Ｄ３７４ＹおよびＮ１５７Ｋ）が記載されており、血漿ＬＤＬコレステロールにおける対応する増加をもたらすＬＤＬＲ分解の増加した速度の結果としての高脂血症および家族性高コレステロール血症（ＦＨ）と関連する（Ａｂｉｆａｄｅｌら（２００３年）Ｎａｔ  Ｇｅｎ  ３４巻（２号）：１５４頁）。さらに、冠動脈心疾患の発生率における８８％の低減をもたらす、血漿ＬＤＬコレステロールの量における関連する実質的な減少を伴う、肝ＬＤＬＲレベルにおける増加を引き起こす機能喪失型ＰＣＳＫ９変異（例えば、Ｙ１４２Ｘ、Ｃ６７９ＸおよびＲ４６Ｌ）が同定されている（Ｃｏｈｅｎら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４巻（１２号）：１２６４頁）。従って、本発明の方法および組成物は、高脂血症および／またはＦＨを処置または予防するために使用され得る。操作されたヌクレアーゼは、毒性機能獲得型と関連する変異を含むＰＣＳＫ９遺伝子をノックアウトするために設計され得る。さらに、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子は、ＬＤＬＲまたはＡＰＯＢなどの他の遺伝子における変異によって引き起こされるＦＨを処置するために、肝臓中のいくつかの細胞においてノックアウトされ得る。あるいは、操作された転写因子が、変異体または野生型ＰＣＳＫ９遺伝子からの発現を抑圧するために使用され得る。
【００４９】
トランスサイレチンアミロイドーシス（ＴＴＲＡ）は、ミスフォールディングおよび凝集されたタンパク質（アミロイド）に関連すると疑われるいくつかの変性疾患の１つである。トランスサイレチン（ＴＴＲ、ＣＴＳ；ＣＴＳ１；ＨＥＬ１１１；ＨｓＴ２６５１；ＰＡＬＢ；ＴＢＰＡとしても公知）は、肝臓において産生されるテトラマーであり、血流中に分泌され、ホロ−レチナール結合タンパク質を輸送するように機能する。しかし、コンフォメーション変化により、これはアミロイド形成性になる。部分的アンフォールディングは、最終的にクロス−βシートアミロイド構造になる前に、ほとんどが構造不定の球状凝集体へと効率的にミスアセンブルする伸展したコンフォメーションの疎水性残基のストレッチを曝露させる（Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０１２年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２１巻（２〜３号）：１８３頁を参照のこと）。ＴＴＲＡは、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）および家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）を含む孤発性および常染色体優性遺伝性形態の両方で、患者において生じ得る。これらの遺伝性形態は通常、早期発症型であり、ＴＴＲ遺伝子において記載された１００を超える点変異と関連する。一般に、変異があるタンパク質が不安定化するほど、ある程度のアミロイド病理を有する可能性が高くなる。形成されたアミロイドは、ＦＡＣでは心組織の、またはＦＡＰでは末梢および中枢神経組織の選択的破壊を引き起こす。これらの疾患を処置するための一部の新たな治療戦略、例えば阻害性ＲＮＡ戦略は、タンパク質の凝集能を減少させるためにＴＴＲの量を減少させる試みに重点を置いている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、同書）。従って、本発明の方法および組成物は、病理学的形態のＴＴＲタンパク質の量を低減させるためおよび／またはＴＴＲ濃度を概して減少させるための努力において、特異的ＴＴＲ変異体を標的化するおよび／または野生型ＴＴＲを標的化するために使用され得る。操作されたヌクレアーゼは、肝細胞のサブセットにおいてＴＴＲをノックアウトするために使用され得、および／またはＴＴＲに対して特異的な操作された転写因子もまた、その発現を下方調節するために使用され得る。
【００５０】
アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症は、ヨーロッパ系の１５００〜３０００人に約１人において生じるが、アジア人家系の個体では稀である。アルファ−１−アンチトリプシンタンパク質は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子によってコードされるプロテアーゼ阻害剤であり、好中球エラスターゼ、トリプシン、メタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）およびプロテイナーゼ−３（ＰＲ−３）を含む、炎症細胞によって放出されるプロテアーゼの活性から細胞を保護するように機能する。欠損症は、ヘテロ接合性個体において変異体ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子によって引き起こされる常染色体共優性または劣性の障害であり、変異体対立遺伝子からの低減された発現、または不十分な阻害活性を有する変異体Ａ１ＡＴタンパク質の発現は、好中球エラスターゼの阻害の慢性的欠如をもたらし、組織損傷を生じる。最も一般的なＳＥＲＰＩＮＡ１変異は、患者肝細胞の小胞体において秩序のあるポリマーをタンパク質に形成させる、Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ置換（Ｚ対立遺伝子とも呼ばれる）を含む。これらを含むことは、肝臓移植によってしか処置できない肝硬変を最終的に引き起こす（Ｙｕｓａら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４７８巻、３９１頁）。肝細胞内での重合は、血漿Ａ１ＡＴレベルにおける重度の減少を生じ、この炎症性疾患の増加したリスクをもたらす。さらに、Ａ１ＡＴ欠損症は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫および慢性気管支炎を含む肺疾患と関連し（Ｔｕｄｅｒら（２０１０年）Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ  ７巻（６号）：３８１頁）、潜在的に、１型および２型糖尿病、急性心筋梗塞、関節リウマチ、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、移植片拒絶、移植片対宿主病および多発性硬化症を含む他の疾患の進行の阻害への、はるかに広い範囲を有し得る（Ｌｅｗｉｓ（２０１２年）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １８巻（１号）９５７頁）。乳児期および幼児期発症型肝臓疾患では、疾患の病理は、新生児黄疸および胆汁うっ滞として現れ、進行した線維症または硬変への進行が後に続き得る。成人では、肝臓疾患は、患者が５０歳代のときに典型的には診断される緩徐に進行性の線維症として顕在化し、これらの患者は、硬変および肝細胞癌の増加したリスクを有する（Ｇｕｏら（２０１４年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４巻（１号）：２５１頁）。集団研究は、これらの疾患を回避するために、およそ０．５ｍｇ／ｍＬの最小Ａ１ＡＴ血漿閾値（正常血漿レベルは、非炎症状態でおよそ０．９〜１．７５ｍｇ／ＭＬである）を提唱しており、現行の治療は、気管支拡張薬などの使用によって、症状を低減させるように主に作用するが、Ａ１ＡＴ（Ｚｅｍａｉｒａ（登録商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ）の毎週の注入の使用もまた、血漿Ａ１ＡＴの実証された重度の欠如を有する肺気腫患者のための選択肢である（Ｋｏｅｐｋｅら（２０１５年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０巻（１号）：ｅ０１１７４９７頁）。Ａ１ＡＴと関連する重症肺疾患もまた、最終的に移植によって処置される。Ａ１ＡＴ欠損症の処置についての臨床試験には、少しだけ挙げると、濃縮されたＡ１ＡＴタンパク質の送達、ＩＭ注射によるＡ１ＡＴ遺伝子を含むＡＡＶ構築物の使用、およびＨＩＶにおけるＡ１ＡＴの使用を含む、種々のアプローチが含まれる。従って、本発明の組成物および方法は、Ａ１ＡＴ欠損症と関連する疾患を処置または予防するために使用され得る。変異体Ａ１ＡＴ対立遺伝子（例えば、Ｚ対立遺伝子）に対して特異的な本明細書に記載される転写因子および系は、遺伝子をサイレンシングして発現を防止し、それによって、硬変をもたらし得る肝凝集体を排除するために作製され得る。さらに、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、発現のために細胞のゲノム中に導入され得、細胞外発現のために非組み込みベクター系（例えば、野生型遺伝子のｃＤＮＡコピーを有する）を介して導入され得、または増加した肝分泌のためにｉｎ  ｖｉｖｏでアルブミン遺伝子座中に導入され得るが、特異的ＳＥＲＰＩＮＡ１ヌクレアーゼは、内因性変異体ＳＥＲＰＩＮＡ１対立遺伝子（例えば、Ｚ点変異を含む遺伝子）をノックアウトするために導入される。一部の実施形態では、Ｚ点変異は、点変異が修正されるように、修正性オリゴヌクレオチドまたは部分的ｃＤＮＡのヌクレアーゼ駆動性挿入によって修正される。
【００５１】
新生児１００，０００人あたり０．１１〜０．２６人で生じる遺伝性の稀な常染色体劣性障害である原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）は、グリオキシル酸代謝の疾患であり、酵素アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ、Ｓｉｅｇａｌら（２０１１年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｍｅｄ）における変異から生じる。この酵素において生じた欠損は、腎臓および多くの他の組織におけるシュウ酸カルシウム結晶形成および沈着を生じる異常に高いシュウ酸産生をもたらし、全身性シュウ酸症および末期腎疾患（ＥＳＲＤ）は、一般的な転帰である。通常、細胞では、細胞質中に存在するグリオキシル酸は、酵素グリオキシル酸レダクターゼによってグリコール酸に変換され、グリコール酸は、ペルオキシソーム中に取り込まれ、ＡＧＴによってグリシンに変換され得る。ＡＣＴが不足している場合、蓄積するグリオキシル酸は、肝臓特異的酵素グリコール酸オキシダーゼまたはヒドロキシ酸オキシダーゼ−１（ＨＡＯ１；ＨＡＯ１Ｘ１、ＧＯＸ１、ＧＯおよびＧＯＸとしても公知）によって、シュウ酸に変換される。シュウ酸のこの増加した蓄積は、シュウ酸による尿の過飽和をもたらし、次いで、シュウ酸尿路結石症、腎石灰化症、腎尿細管損傷、腎不全およびさらには死亡をもたらす。高シュウ酸尿症におけるＥＳＲＤは、皮膚、骨髄、骨（再発性の骨折を引き起こす）、心筋、神経系、骨格筋、血管および網膜におけるシュウ酸カルシウム沈着を伴う。処置は、腎臓損傷の前に小児期に開始するのが最もよく、食餌の配慮（ビタミンＣおよび高シュウ酸食を回避する）および毎日の透析を含み得る。残念ながら、透析は、シュウ酸負荷を顕著に低減させることができる場合が多い。肝臓移植が実施され得るが、拒絶を回避するために必要な治療薬は、ＰＨ１と関連する腎臓障害を悪化させ得る。１つの研究（Ｎｏｌｋｅｍｐｅｒら（２０００年）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ４巻（３号）：１７７〜８１頁）では、患者が１０歳で肝臓移植を受けた場合、８２％の生存があったが、２０歳で移植を実施した場合には、生存は７２％に低下した。対照的に、肝腎移植を実施した場合、５歳で移植を実施した場合には、８０％の患者生存率があったが、２０歳で実施した場合には、これはわずか６６％に低減した（ＥｙｔａｎおよびＷｅｉｓｍａｎｎ（２００９年）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３巻（７号）：８０５〜８０７頁）。ＧＯ特異的ｓｉＲＮＡの注射は、ＧＯの発現を減少させ、マウス疾患モデルにおいて尿中シュウ酸排泄を低減させたので、ＲＮＡｉアプローチは、いくらかの助けになり得る（Ｌｉら（２０１６年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８６２巻（２号）：２３３〜２３９頁）。
【００５２】
一般
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．  ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照のこと。
【００５３】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関しての限定として解釈すべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、ＡのアナログはＴと塩基対合する。
【００５４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、相互交換可能に使用される。用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００５５】
「組換え」とは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによる捕捉が含まれるがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。
【００５６】
本開示のある特定の方法では、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位（例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子）において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖破断（ＤＳＢ）を創出する。ＤＳＢは、本明細書に記載される構築物の組み込みを媒介する。任意選択で、構築物は、破断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれ得、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介した破断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、発現カセット中と同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。従って、細胞クロマチン中の第１の配列は変更され得、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列へと変換され得る。従って、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも要求しない。
【００５７】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性ヌクレオチド配列（「発現構築物」または「発現カセット」または「ベクター」）は、目的の領域中のゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有し得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。従って、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に対して相同な発現カセット配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、発現カセットとゲノム配列との間の相同性は、例えば、１００を超える連続塩基対の、発現カセットの相同性領域とゲノム配列の相同性領域との間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合では、発現カセットの非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有し得る。これらの例では、非相同配列には一般に、目的の領域中の配列に対して相同または同一である、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）の、または１，０００よりも多い任意の数の塩基対の配列が隣接する。
【００５８】
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖、環状または分岐鎖であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「導入遺伝子」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチド長の間（またはそれらの間もしくはそれを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００〜１００，０００ヌクレオチド長の間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２０００〜２０，０００ヌクレオチド長の間（またはそれらの間の任意の値）、さらにより好ましくは約５〜１５ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）のものであり得る。
【００５９】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部分を構成するクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを構成する全ての染色体の収集であるその核型によって特徴付けられる場合が多い。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。
【００６０】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物の細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を２つずつ含むオクタマーと会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む；リンカーＤＮＡ（生物に依存して可変長のもの）がヌクレオソームコア間に伸びる。ヒストンＨ１の分子は一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【００６１】
「アクセス可能な領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン中の部位である。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、アクセス可能な領域は、ヌクレオソーム構造へとまとめられていない領域であると考えられる。アクセス可能な領域の特徴的な構造は、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性によってしばしば検出できる。
【００６２】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件であるならば結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００６３】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミド、ミニサークルおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。本明細書に記載される肝臓特異的構築物は、エピソームで維持され得、あるいは、細胞中に安定に組み込まれ得る。
【００６４】
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。「細胞中の通常の存在」は、特定の発生段階および細胞の環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能不全性バージョンを含み得る。
【００６５】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、あるいは高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変された誘導体、または上記分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖、分岐鎖または環状であり得、任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、これには、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、細胞が由来する種とは異なる種に由来するが、内因性分子と同じ型の分子であり得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞系中に導入され得る。
【００６７】
それに反して、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階において、特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【００６８】
本明細書で使用する場合、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。
【００６９】
「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得る、または異なる化学型の分子であり得る。融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物）、切断ドメインと動作可能に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）間の融合物、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
細胞における融合分子の発現は、細胞への融合分子の送達から、または細胞への融合分子の１つもしくは複数の構成成分をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このとき、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合分子を生成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子および／またはヌクレアーゼの場合、ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡ結合ドメインは、細胞中へのｓｇＲＮＡおよび機能的ドメインコード配列の導入の際に、機能的ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメインまたは転写調節ドメイン）と会合する。トランス−スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示中の別の場所に提示される。
【００７１】
本開示の目的のために、「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照のこと）、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接していてもいなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。
【００７２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
【００７３】
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑圧が含まれ得るがこれらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）は、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。従って、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。従って、「遺伝子モジュレーター」は、遺伝子配列の改変および／または遺伝子発現の改変が含まれるがこれらに限定されない、標的遺伝子の発現をモジュレートする任意の分子である。
【００７４】
「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などであり、外因性分子を結合することが望ましい。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対くらいの小ささ、もしくは最大で２，０００ヌクレオチド対長、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００７５】
「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対するいずれの有害効果もなしに挿入され得る、ゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が近隣遺伝子からのいずれのリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座が、最も有益である。ヌクレアーゼによって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例には、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、ＡＴＰＡ１、ＣＬＹＢＬおよびアルブミンが含まれる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；同第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国特許出願公開第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照のこと。
【００７６】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、必ずしも慣用的なアッセイにおいてではないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結し得る、レポーターをコードする配列が含まれる。
【００７７】
「真核生物」細胞には、幹細胞（多能性および多分化能性）を含む、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
「結合」とは、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。かかる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれよりも低い解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」とは、結合の強さを指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。「非特異的結合」とは、１つの分子中の任意の一般化された位置で生じ得る、目的の任意の分子（例えば、操作されたヌクレアーゼ）と高分子（例えば、ＤＮＡ）との間で生じる一般化された非共有結合相互作用を指し、かかる相互作用は、標的配列に限定されない。
【００７９】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、これはそれ自体に結合でき（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する）、および／または異なるタンパク質（単数または複数）の１つもしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。ＲＮＡガイドされるヌクレアーゼ系の場合、ＲＮＡガイドは、ヌクレアーゼ構成成分（Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）に対して異種であり、両方が操作され得る。
【００８０】
「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合できる分子である。かかるＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きいタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡであるが、他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）であるが、他の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＲＮＡガイドされるヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）のガイドＲＮＡ構成成分である。
【００８１】
「ＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つもしくは複数のジンクフィンガーを介して、またはそれぞれジンクフィンガータンパク質もしくはＴＡＬＥ中の１つもしくは複数のＲＶＤとの相互作用によって、配列特異的様式でＤＮＡを結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称する場合が多い。
【００８２】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡを結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称する場合が多い。
【００８３】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と、少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。
【００８４】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）を介して、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（「リピート可変二残基」またはＲＶＤ領域）の操作によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。従って、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準には、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計ならびに結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための置換ルールおよびコンピューター化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，７４６，８３８号；同第７，２４１，５７３号；同第６，８６６，９９７号；同第７，２４１，５７４号および同第６，５３４，２６１号を参照のこと；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照のこと。
【００８５】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、その産生が実験に基づいたプロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、合理的設計またはハイブリッド選択から主に生じる、天然には見出されないものである。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；同第６，２４２，５６８号；同第６，７３３，９７０号；同第７，２９７，４９１号；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ０２／０９９０８４を参照のこと。
【００８６】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数の切断ドメイン（ヌクレアーゼについて）または転写調節因子ドメイン（転写因子について）を含むヌクレアーゼまたは転写因子系を指す。ｓｇＲＮＡは、任意のＤＮＡ配列に結合するように設計され得る。ｓｇＲＮＡは、切断または転写調節ドメインと会合すると、遺伝子発現のモジュレーションを媒介する。例えば、米国特許第９，２６７，１３５号および同第８，８４１，２６０号ならびに米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号および同第２０１５００３１１３４号を参照のこと。
【００８７】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜６１頁；Ｇ．  Ｓｈｅｎｇら（２０１３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １１１巻、６５２頁を参照のこと。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされる全ての構成成分である。「組換え」とは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉が含まれるがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖破断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として種々に公知であるが、それは、このプロセスが、ドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらすからである。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、かかる移行には、壊れた標的とドナーとの間で形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連のプロセスが含まれ得る。ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、かかる特殊なＨＲは、標的分子の配列の変更を生じる場合が多い。
【００８８】
「組換え」とは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによる捕捉が含まれるがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖破断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として種々に公知であるが、それは、このプロセスが、ドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらすからである。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、かかる移行には、壊れた標的とドナーとの間で形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連のプロセスが含まれ得る。ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、かかる特殊なＨＲは、標的分子の配列の変更を生じる場合が多い。
【００８９】
本開示のある特定の方法では、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位（例えば、目的の遺伝子または遺伝子座）において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖破断（ＤＳＢ）を創出する。ＤＳＢは、本明細書に記載される構築物（例えば、ドナー）の組み込みを媒介する。任意選択で、構築物は、破断の領域中のヌクレオチド配列に対して相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれ得、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介した破断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、発現カセット中と同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。従って、細胞クロマチン中の第１の配列は変更され得、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列へと変換され得る。従って、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも要求しない。
【００９０】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなる操作されたヌクレアーゼが、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
【００９１】
細胞クロマチン中の目的の領域における配列の標的化組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列による相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、破断の領域に対して相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン中の二本鎖破断の存在によって刺激される。
【００９２】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域中のゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有し得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。従って、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に対して相同なドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナーとゲノム配列との間の相同性は、例えば、１００を超える連続塩基対の、ドナーとゲノム配列との間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有し得る。これらの例では、非相同配列には一般に、目的の領域中の配列に対して相同または同一である、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）の、または１，０００よりも多い任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に対して非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
【００９３】
本明細書に記載される方法のいずれかは、ドナー配列の標的化組み込みによる、または標的配列の切断と、その後の目的の遺伝子の発現を破壊するエラープローンなＮＨＥＪ媒介性修復とを介した、細胞における１つまたは複数の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞系もまた提供される。
【００９４】
さらに、本明細書に記載される標的化組み込みの方法は、１つまたは複数の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１つもしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つもしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生し得る。
【００９５】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または粘着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【００９６】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と一緒になって切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−の切断ハーフドメイン」および「右および左の切断ハーフドメイン」は、ダイマー化する切断ハーフドメインの対を指すために、相互交換可能に使用される。
【００９７】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と共に偏性ヘテロダイマーを形成するように改変された切断ハーフドメインである。
【００９８】
用語「動作可能な連結」および「動作可能に連結した」（または「作動可能に連結した」）は、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を与えるように配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に動作可能に連結している。転写調節配列は一般に、コード配列とシスで動作可能に連結するが、それと直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していない場合であっても、コード配列に動作可能に連結した転写調節配列である。
【００９９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をなおも保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子よりも多い、少ない、もしくは同じ数の残基を保有し得、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。
【０１００】
ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。従って、用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。
【０１０１】
用語「対象」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。従って、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用する場合、本発明の発現カセットが投与され得る任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象には、障害を有する対象が含まれる。
【０１０２】
用語「処置する」および「処置」とは、本明細書で使用する場合、症状の重症度および／または頻度における低減、症状および／または根底にある原因の排除、症状および／またはそれらの根底にある原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または矯正を指す。がん、一遺伝子性疾患および移植片対宿主病は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。
【０１０３】
肝臓特異的発現構築物
対象への発現カセットの投与（例えば、末梢または肝静脈送達）後にｉｎ  ｖｉｖｏを含む肝臓細胞において導入遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の１つまたは複数のモジュレーター）の発現を指示することにおける使用のための発現カセット（構築物）が、本明細書に記載される。細胞における使用のためのＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の野生型ｃＤＮＡコピーを含む発現カセット（構築物）であって、内因性変異体バージョンのＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子が、上記１つまたは複数のモジュレーターによってノックアウトされている、発現カセット（構築物）もまた本明細書に記載される。発現構築物は、エピソームで維持され、染色体外で導入遺伝子の発現を駆動し得（米国特許出願公開第２０１７０１１９９０６号を参照のこと）、あるいは、発現構築物は、例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによって、肝臓細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０１０４】
ポリヌクレオチド発現構築物は、エンハンサー配列、プロモーター配列、および１つまたは複数の導入遺伝子を含む。任意選択で、以下：イントロン配列、ポリアデニル化配列および／またはシグナルペプチドの１つまたは複数が含まれる。任意のエンハンサー配列が、本明細書に記載される発現構築物において使用され得る。ある特定の実施形態では、エンハンサーは、野生型または改変されたＳｅｒｐｉｎ１エンハンサーである（Ｃｈｕａｈら（２０１４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２２巻、１６０５〜１６１３頁；Ｎａｉｒら（２０１４年）Ｂｌｏｏｄ  １２３巻、３１９５〜３１９９頁）。
【０１０５】
好ましい実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーは、野生型と比較して１つまたは複数の変異（例えば、点変異）を含み、例えば、Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーは、示されるような１つまたは複数のヌクレオチド改変、即ち、エンハンサー内の１つまたは複数の位置におけるヌクレオチドの改変を含有する。例えば、米国特許出願公開第２０１７−０１１９９０６号Ａ１を参照のこと。
【０１０６】
同様に、任意のプロモーター配列が、本発明の発現カセットにおいて使用され得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、誘導性または組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、トランスサイレチンミニマルプロモーター（ＴＴＲｍ）プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、アルファ−１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである。
【０１０７】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかは、イントロン配列を任意選択でさらに含み得る。ある特定の実施形態では、発現構築物は、短縮されたキメライントロン（Ｔ−キメライントロン）配列を含む。Ｔ−キメライントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４７１２０）中の短縮されたバージョンのキメライントロンである。ｐＣＩ−ｎｅｏ中のキメライントロンは、ヒトβ−グロビン遺伝子由来の５’スプライスドナー部位、ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域の分岐点および３’アクセプター部位である。Ｔ−キメライントロンは、５’スプライスドナーと分岐点との間に４５ｂｐの欠失を含有する。さらに他の実施形態では、発現構築物は、変異型ＭＶＭイントロン配列を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１７−０１１９９０６号Ａ１に示される）。
【０１０８】
あるいは、本明細書に記載される発現構築物は、例えば、米国特許出願公開第２０１７−０１１９９０６号Ａ１に示されるように、イントロン配列を欠如し得る。
【０１０９】
本明細書に記載される構築物は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター内に含有され得る。構築物は、エピソームで維持され得るまたは細胞のゲノム中に（例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して）組み込まれ得る。
【０１１０】
非ウイルスベクターには、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ  ＭＣ、ネイキッド核酸、およびリポソーム、ナノ粒子またはポロクサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。本明細書に記載される発現カセットを運搬するために使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を用いて可能であり、本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ媒介性組み込みによって促進され得る。
【０１１１】
ある特定の好ましい実施形態では、構築物は、エピソームで維持または肝臓細胞のゲノム中に（例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して）組み込まれ得るアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターまたはベクター系中に含まれる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ  ８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含むいくつかの刊行物中にある。
【０１１２】
従って、ある特定の実施形態では、発現構築物は、ＡＡＶ構築物上にあり、本明細書に記載される発現構築物のエレメント（例えば、エンハンサー、プロモーター、任意選択のイントロン、導入遺伝子など）に隣接する５’および３’ＩＴＲをさらに含む。任意選択で、スペーサー分子もまた、発現構築物の構成成分の１つまたは複数の間、例えば、５’ＩＴＲとエンハンサーとの間および／またはポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲとの間に含まれる。スペーサーは、セーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）中への組換えを促進するための相同性アームとして機能し得る。ある特定の実施形態では、構築物は、米国特許出願公開第２０１７−０１１９９０６号Ａ１に示される構築物である。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶに由来し得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、欠損性および非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴２型ウイルスに由来する。全てのかかるベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端リピートのみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム中への組み込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特色である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１巻：９１１７号、１７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型を含む他のＡＡＶ血清型もまた、本発明に従って使用され得る。一部の実施形態では、ウイルス核酸のＬＴＲ配列のウイルス起源がカプシド配列のウイルス起源にとって異種である、キメラＡＡＶが使用される。非限定的な例には、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲおよびＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシドを有するキメラウイルス（即ち、それぞれ、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）が含まれる。
【０１１４】
レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．  １７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
【０１１５】
本明細書に記載される構築物は、アデノウイルスベクター系中にも組み込まれ得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生され得る。
【０１１６】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療的ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。５０％またはそれよりも高い形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングされたベクターについて観察されている（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １巻：１１１〜２頁（１９９７年））。
【０１１７】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）もまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドと共に使用され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作される；引き続いて、複製欠損ベクターは、欠失された遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増殖する。Ａｄベクターは、非分裂性の分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉中で見出される細胞を含む、複数の型の組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入できる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が含まれる。
【０１１８】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、ＡＡＶおよびアデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、ならびにレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主中への引き続く組み込み（適用可能な場合）に必要とされる最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは、バキュロウイルス発現系を使用して産生される。
【０１１９】
多くの遺伝子治療適用では、特定の組織型に対する高い程度の特異性を有する遺伝子治療ベクターを送達することが望ましい。従って、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変され得る。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変され得ること、および組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス−標的細胞対に拡張でき、このとき、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作され得る。上の記載は、ウイルスベクターに主に当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用され得る。かかるベクターは、特異的標的細胞による取込みに有利な特異的取込み配列を含有するように操作され得る。
【０１２０】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然の塩基および／または骨格を含み得る。特に、本明細書に記載される発現カセットは、転写静止の状態を達成するために、目的の領域中にメチル化シトシンを含み得る。
【０１２１】
さらに、本明細書に記載される発現構築物は、さらなる転写もしくは翻訳調節または他の配列、例えば、さらなるプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルもまた含み得る。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントは、キメラ遺伝子を創出するためにレポーター遺伝子に作動可能に連結し得る（例えば、レポーター発現カセット）。
【０１２２】
導入遺伝子
本明細書に記載される構築物は、任意の導入遺伝子の肝送達のために使用され得る。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、１つもしくは複数のこれらの遺伝子の発現を上方調節もしくは下方調節する１つもしくは複数の転写因子、１つもしくは複数のこれらの遺伝子を切断する１つもしくは複数のヌクレアーゼ、および／または１つもしくは複数のこれらの遺伝子を阻害もしくは活性化する１つもしくは複数の配列が含まれるがこれらに限定されない、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の１つまたは複数のモジュレーターを含む配列をコードする。１つまたは複数のこれらの遺伝子中の標的部位に結合する例示的な人工転写因子および／またはヌクレアーゼは、本明細書に記載される。
【０１２４】
他の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子のｃＤＮＡ配列をコードする。これらの導入遺伝子は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子の内因性変異体コピーが本明細書に記載されるヌクレアーゼによってノックアウトされた細胞において使用され得る。ｃＤＮＡ配列は、ゲノム中に組み込まれ得る、または染色体外で（例えば、エピソームで）維持され得る。
【０１２５】
導入遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および種々の型の発現構築物もまた含まれ得る。提供され得るマーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが含まれる。
【０１２６】
好ましい実施形態では、導入遺伝子は、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記のいずれかの機能的断片が含まれるがこれらに限定されない、細胞におけるその発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。コード配列は、例えばｃＤＮＡであり得る。
【０１２７】
他の実施形態では、導入遺伝子は、リソソーム蓄積障害（例えば、ゴーシェ、ファブリー、ハンター、ハーラー、ニーマン（Ｎｅｉｍａｎｎ）−ピックなど）、代謝障害、ならびに／または血液障害、例えば、血友病およびヘモグロビン異常症などが含まれるがこれらに限定されない任意の遺伝疾患において欠如している欠損したタンパク質の機能的バージョンをコードする。例えば、米国特許出願公開第２０１４００１７２１２号および同第２０１４００９３９１３号；米国特許第９，２５５，２５０号および同第９，１７５，２８０号を参照のこと。
【０１２８】
例えば、導入遺伝子は、以下の遺伝疾患のいずれかが含まれるがこれらに限定されない遺伝疾患を有する対象において欠如しているまたは非機能的であるポリペプチドをコードする配列を含み得る：軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、アルファ−サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成症、毛細血管拡張性運動失調症（ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｃｔａｓｉａ）、バース症候群、ベータ−サラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｓ）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータ−グロビンの６番目のコドン中のヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群（Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クラッベ病、ランガー−ギデオン症候群、白血球粘着欠損症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｓｉｐｄｉｕｓ）、神経線維腫症、ニーマン−ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー−ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン−テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス−マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ−サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル−リンダウ病（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌａｎｄａｕ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）、後天性免疫不全、リソソーム蓄積疾患（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ−サックス病）、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｉｄｏｓｉｓ）（例えば、ハンター病、ハーラー病）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）および血友病。
【０１２９】
本明細書に記載される発現され得るタンパク質（短縮されたバージョンなどのその機能的断片を含む）の非限定的な例には、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンヴィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース−６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ−１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質、例えば、ＮＡＧＳ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸シンテターゼＩ）、およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸シンテターゼ）、ＡＳＬ（アルギニノコハク酸（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｓｅ  ａｃｉｄ）リアーゼ）および／もしくはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、ならびに／または溶質輸送体ファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸輸送体）タンパク質、ＵＧＴ１Ａ１もしくはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ポリペプチドＡ１、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌｙａｓｅ）（ＦＡＨ）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質ならびに／あるいは治療的単鎖抗体が含まれる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、マーカー遺伝子（上記）を含み得、標的化組み込みを受けた細胞、およびさらなる機能性をコードする連結された配列の選択を可能にする。マーカー遺伝子の非限定的な例には、ＧＦＰ、薬物選択マーカーなどが含まれる。
【０１３１】
本明細書に記載される構築物は、非コード導入遺伝子の送達にも使用され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的化挿入のために使用され得る。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子には、１ｋｂ長よりも大きい、例えば、２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）の配列（例えば、導入遺伝子とも呼ばれるコード配列）が含まれる。導入遺伝子は、１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位もまた含み得る。
【０１３３】
（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組み込みを介して）組み込まれる場合、導入遺伝子は、内因性遺伝子の全て、一部が発現されるように、またはいずれの内因性遺伝子も発現されないように、内因性遺伝子中に挿入され得る。
【０１３４】
ヌクレアーゼ／転写因子
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子モジュレーターは、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子を不活性化する１つまたは複数のヌクレアーゼを含む。さらに、ヌクレアーゼは、標的遺伝子中に、例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１もしくはＨＡＯ１遺伝子および／またはセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン）中に、１つまたは複数の導入遺伝子を組み込むためにも使用され得る。好ましくは、導入遺伝子構築物の組み込みは、１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼ）による標的遺伝子の切断後に標的化され、構築物は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）駆動性プロセスの間の末端捕捉によって組み込まれる。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１９６３７３号および同第２０１５００５６７０５号を参照のこと。
【０１３５】
任意のヌクレアーゼが、導入遺伝子（例えば、発現構築物）の標的化組み込みのために使用され得る。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号を参照のこと。
【０１３７】
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含むＴＡＬＥＮを含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１３０１９６３７３号を参照のこと。
【０１３８】
なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、標的部位の認識のためのシングルガイドＲＮＡおよび１つまたは複数の切断ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。例えば、米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照のこと。
【０１３９】
ヌクレアーゼの切断ドメインは、偏性ヘテロダイマーを形成する天然に存在しない（操作された）切断ドメインを含む、野生型または変異型であり得る。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号を参照のこと。
【０１４０】
ヌクレアーゼは、標的部位において、１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖カットを作製し得る。切断および／または改変の部位は、ダイマーとして機能するヌクレアーゼを使用する場合、標的部位内および／または２つの標的部位間にあり得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメインを含む（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３２巻（６号）：５７７〜５８２頁を参照のこと。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わさって、ニッカーゼとして、一本鎖カットを作製するように作用し得る。従って、２つのニッカーゼが組み合わせて使用されて、特異的領域において二本鎖カットを作製し得る。ＭｃＣａｆｆｅｒｙら（２０１６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４４巻（２号）：ｅ１１頁．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．２０１５年１０月１９日に電子出版など、さらなるニッカーゼもまた当該分野で公知である。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、ＡＴＰＡ１、ＣＬＹＢＬ、Ｒｏｓａ、アルブミンなど）を切断する。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号を参照のこと。好ましい実施形態では、発現カセットが肝臓細胞の内因性アルブミン遺伝子座中に組み込まれるように、ヌクレアーゼは、内因性アルブミン遺伝子を切断する。アルブミン特異的ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第９，１５０，８４７号；ならびに米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および同第２０１５００５６７０５号に記載されている。
【０１４２】
本明細書に記載されるヌクレアーゼに加えて、またはその代わりに、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子が、１つまたは複数の操作された転写因子の使用によってモジュレート（下方調節）され得る。操作されたヌクレアーゼを用いる場合と同様、操作された転写因子は、典型的には、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的化された遺伝子を結合する）および機能的ドメイン（例えば、転写調節ドメイン）を含む。ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子発現をモジュレートした任意の操作された転写因子が使用され得る。
【０１４３】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメイン、またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ  ＤＮＡ結合複合体（例えば、シングルガイドＲＮＡ）が含まれるがこれらに限定されない任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび転写因子において使用され得る。ある特定の実施形態では、人工転写因子または人工ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に開示される標的部位のいずれかに示される、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位に結合する。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞中に注射する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注射されたタンパク質には、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照のこと）。ＴＡＬＥは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、およそ３４アミノ酸を含有し、これらは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら（２００６年）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照のこと）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００におけるｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称する２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに対して相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５塩基対の欠失により異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と、４０％未満の配列同一性を有する。
【０１４５】
従って、一部の実施形態では、標的遺伝子座中の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｂｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０１頁を参照のこと）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁；米国特許第８，５８６，５２６号；同第８，４２０，７８２号および同第８，４４０，４３１号を参照のこと）に由来するものと類似のＴＡＬエフェクター由来の操作されたドメインである。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、天然に存在しない。例えば、それらの全体が本明細書に参照により全て組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号を参照のこと。
【０１４７】
操作されたジンクフィンガー結合またはＴＡＬＥドメインは、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照のこと。
【０１４８】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１４９】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥドメイン）は、例えば、５またはそれよりも多くのアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。リンカー配列の非限定的な例については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；同第７，１５３，９４９号；同第９，５６７，６０９号；ならびに米国特許出願公開第２０１７０２１８３４９号および同第２０１７０２１１０７５号もまた参照のこと。本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１５０】
標的部位の選択；ＤＮＡ結合ドメイン、ならびに融合分子（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号に詳細に記載されている。
【０１５１】
なおさらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、機能的ドメインと組み合わせた、ＤＮＡ結合シングルガイドＲＮＡを含む（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子）。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照のこと。
【０１５２】
Ｂ．機能的ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載される遺伝子モジュレーション（例えば、抑圧）において有用な任意の機能的ドメインに作動可能に連結し得る。従って、異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）と関連した本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分、例えばシングルガイドＲＮＡ）を含む人工ヌクレアーゼおよび転写因子もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、共活性化因子、共リプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーのメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー；ＤＮＡ再編成酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー；クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイアー（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ改変酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアーが含まれる。従って、本発明は、本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子、ならびにＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含む人工ヌクレアーゼを提供する。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、機能的ドメインは、転写調節ドメイン、例えば、抑圧ドメインを含む。例示的な抑圧ドメインには、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＲｂおよびＭｅＣＰ２が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄら（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９９巻：４５１〜４５４頁；Ｔｙｌｅｒら（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９９巻：４４３〜４４６頁；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９９巻：４４７〜４５０頁；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２５巻：３３８〜３４２頁を参照のこと。さらなる例示的な抑圧ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍら（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８巻：３０５〜３２１頁；およびＷｕら（２０００年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２２巻：１９〜２７頁を参照のこと。
【０１５４】
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間での融合分子（またはそれをコードする核酸）の形成では、抑圧ドメインまたは抑圧ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能的ドメインとして適切であることが、当業者に明らかである。リプレッサー（例えば、タンパク質または複合体）をリクルートすることおよび／または標的遺伝子に対する活性（例えば、ヒストン脱メチル化など）を抑圧することが可能な本質的に任意の分子が、抑圧ドメインとして有用であり、結果的に、特許請求された本発明の実施において使用され得る。融合分子における機能的ドメインとしての使用に適切なインスレータードメイン、局在化ドメインならびにクロマチンリモデリングタンパク質、例えば、ＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、米国特許第６，９１９，２０４号および同第７，０５３，２６４号に記載されている。
【０１５５】
転写活性化ドメインの非限定的な例。活性化を達成するのに適切なドメイン（転写活性化ドメイン）には、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン；核ホルモン受容体；核因子カッパＢｌのｐ６５サブユニット、または人工キメラ機能的ドメイン、例えば、ＶＰ６４およびデグロンが含まれる。さらなる例示的な活性化ドメインには、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２およびＣＴＦ１ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、ＥＲＦ−２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれる。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインによって結合される標的部位は、細胞クロマチンのアクセス可能な領域中に存在する。アクセス可能な領域は、例えば、米国特許第６，５１１，８０８号に記載されるように決定され得る。標的部位が細胞クロマチンのアクセス可能な領域中に存在しない場合、１つまたは複数のアクセス可能な領域が、ＷＯ０１／８３７９３に記載されるように生成され得る。さらなる実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位がアクセス可能な領域中にあるかないかにかかわらず、細胞クロマチンに結合することが可能である。例えば、かかるＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することが可能である。この型の「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）において見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙら（１９８７年）Ｃｅｌｌ  ４８巻：２６１〜２７０頁；Ｐｉｎａら（１９９０年）Ｃｅｌｌ  ６０巻：７１９〜７３１頁；およびＣｉｒｉｌｌｏら（１９９８年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７巻：２４４〜２５４頁。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質および系の少なくとも１つの構成成分は、天然に存在する（例えば、天然に存在する機能的ドメインである）。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、全ての天然に存在しない、即ち、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメインにおいて操作された構成成分から構成される。例えば、天然に存在するドメインのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子モジュレーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子系を構成する。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １巻：ｅ６０頁）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１５９】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて最初に記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次的ステップで、標的化ＤＮＡ二本鎖破断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡであるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介し、プロセシングは、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅ  ＩＩＩによって生じる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的認識のためのさらなる要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対合を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに指向させる。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとその３’末端において塩基対合するので、これも存在しなければならず、この会合がＣａｓ９活性を誘発する。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖破断を創出する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「獲得」と呼ばれるプロセスにおける、さらなる攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中へのエイリアンＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）エイリアン核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉を含む。従って、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、例えばエイリアンＤＮＡの挿入などの機能において役割を果たす。
【０１６０】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、多くの異なる細菌において見出されている。Ｆｏｎｆａｒａら（（２０１３年）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ４２巻（４号）：２３７７〜２５９０頁）による、公に入手可能なゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索は、３４７種の細菌においてＣａｓ９オルソログを見出した。さらに、このグループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９オルソログを使用したＤＮＡ標的のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を実証した。従って、用語「Ｃａｓ９」とは、１つのＤＮＡ結合ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを指し、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、任意の適切な細菌に由来し得る。
【０１６１】
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：一方のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似しているが、他方はＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインと似ている。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ鎖の切断を担うようであるが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つだけが機能的であるように操作され得、Ｃａｓニッカーゼを創出する（Ｊｉｎｅｋら、同書を参照のこと）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的変異によって、またはそれがもはや機能的でないようなドメインの一部もしくは全ての短縮によって、生成され得る。Ｃａｓ９は２つのヌクレアーゼドメインを含むので、このアプローチは、いずれかのドメインに対して行われ得る。二本鎖破断は、２つのかかるＣａｓ９ニッカーゼの使用によって、標的ＤＮＡ中で達成され得る。ニッカーゼは、各々がＤＮＡの一方の鎖を切断し、２つの使用は、二本鎖破断を創出する。
【０１６２】
ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避され得る（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻：８１６頁およびＣｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照のこと）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、即ちｓｇＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロダイマーがＣａｓ会合したＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で形成する場合に、標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９を導く。Ｃａｓ９タンパク質とＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡガイドされるゲノム編集のために使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ同書を参照のこと）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと類似した編集効率で、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集のために有用である（Ｈｗａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１巻（３号）：２２７頁を参照のこと）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子も記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号；Ｐｌａｔｅｋら（２０１４年）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．  ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｐｂｉ．１２２８４およびＰｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻：９７３〜９７６頁）を参照のこと。
【０１６３】
キメラまたはｓｇＲＮＡは、本明細書に記載される転写調節のための任意の所望の標的に対して相補的な配列を含むように操作され得る。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれよりも多くのヌクレオチド長、または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれよりも多くのヌクレオチド長よりも長い。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２またはそれよりも少ないヌクレオチド長未満である。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、標的に対して相補的で形態Ｇ［ｎ１９］の２２塩基と、その後の形態ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを含む。従って、１つの方法では、ｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子におけるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）の公知の標的の利用によって設計され得る。さらに、ｓｇＲＮＡは、（ｉ）ＺＦＮヘテロダイマーの標的配列を、関連するゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種の）の参照配列とアラインさせること；（ｉｉ）ＺＦＮハーフ部位間のスペーサー領域を同定すること；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定すること（１つよりも多いかかるモチーフがスペーサーと重複する場合、スペーサーに対して中心にくるモチーフが選択される）；（ｉｖ）そのモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することによって、公知の対になったヌクレアーゼ部位に対して設計され得る。この方法は、証明されたヌクレアーゼ標的に有利に依存する。あるいは、ｓｇＲＮＡは、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に従う適切な標的配列を単に同定することによって、任意の目的の領域を標的化するように設計され得る。相補的領域と共に、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分のテイル領域に伸びるさらなるヌクレオチドを含み得る（Ｈｓｕら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７を参照のこと）。テイルは、＋６７〜＋８５ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の数のものであり得、好ましい長さは＋８５ヌクレオチドである。短縮されたｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」もまた使用され得る（Ｆｕら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３２巻（３号）：２７９頁を参照のこと）。ｔｒｕ−ｇＲＮＡでは、相補的領域は、１７または１８ヌクレオチド長に減少される。
【０１６４】
さらに、代替的なＰＡＭ配列もまた利用され得、このとき、ＰＡＭ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用するＮＧＧ（Ｈｓｕ、２０１４年、同書）に対する代替法として、ＮＡＧであり得る。さらなるＰＡＭ配列には、最初のＧを欠如するものも含まれ得る（ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３２巻（４号）：３４７頁）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにコードされるＣａｓ９  ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌供給源由来のＣａｓ９タンパク質に対して特異的な他のＰＡＭ配列が使用され得る。例えば、以下に示されるＰＡＭ配列（ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ、同書、ならびにＥｓｖｅｌｔら（２０１３年）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １０巻（１１号）：１１１６頁から適応させた）は、これらのＣａｓ９タンパク質に対して特異的である：
種                                    ＰＡＭ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ                  ＮＧＧ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ                  ＮＡＧ
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ                      ＮＧＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ        ＮＧＧＮＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ        ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ        ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ        ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ                      ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ          ＮＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ                ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ                  ＮＧ
【０１６５】
従って、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系との使用のための適切な標的配列は、以下のガイドラインに従って選択され得る：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇ。あるいは、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従い得る。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌に由来するＣａｓ９タンパク質について、同じガイドラインが使用され得、このとき、代替的ＰＡＭが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＰＡＭ配列を置換する。
【０１６６】
潜在的なオフターゲット配列を回避する、特異性の可能性が最も高い標的配列を選択することが最も好ましい。これらの望ましくないオフターゲット配列は、以下の性状を考慮することによって同定され得る：ｉ）利用されるＣａｓ９タンパク質と共に機能することが公知のＰＡＭ配列が後に続く標的配列中の類似性：ｉｉ）所望の標的配列から３つ未満のミスマッチを有する類似の標的配列；ｉｉｉ）ｉｉ）と類似の標的配列であって、ミスマッチがＰＡＭ近位領域ではなくＰＡＭ遠位領域中に全て位置する（「シード」領域と呼ばれることもある、ＰＡＭに直接隣接するまたは近位のヌクレオチド１〜５（Ｗｕら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ２８８９）が認識にとって最も重要であるといういくつかの証拠が存在し、従って、シード領域中に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、ｓｇＲＮＡによって認識される可能性が最も低い場合がある）；およびｉｖ）ミスマッチが、連続して間隔を空けられることがない、または４ヌクレオチドよりも大きく間隔を空けられる、類似の標的配列（Ｈｓｕ、２０１４年、同書）。従って、どのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系が用いられていても、ゲノム中の潜在的なオフターゲット部位の数の分析を実施することによって、上記これらの基準を使用して、ｓｇＲＮＡに適切な標的配列が同定され得る。
【０１６７】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐにおいて同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞においてロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。機能的に保存されてはいるが、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性においてを含む多くの態様において異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄら、（２０１５年）Ｇｅｎｏｍ  Ｂｉｏ  １６巻：２５１頁を参照のこと）。Ｃａｓ９タンパク質とＣｐｆ１タンパク質との間の主な差異は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、従って、ｃｒＲＮＡのみを必要とするということである。ＦｎＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、４２〜４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドのリピートおよび２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、単一のステム−ループを含有し、これにより、二次構造を保持する配列変化を許容する。さらに、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドよりも顕著に短い操作されたｓｇＲＮＡであり、ＦｎＣｐｆｌのためのＰＡＭ要件は、変位させた鎖上の５’−ＴＴＮ−３’および５’−ＣＴＡ−３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は共に、標的ＤＮＡ中に二本鎖破断を作製するが、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端カットを作製するためにそのＲｕｖＣ様およびＨＮＨ様ドメインを使用する一方で、Ｃｐｆ１は、シードの外側に粘着カットを産生するためにＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１は、重要なシード領域から離れて粘着カットを作製するので、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、従って、所望のＨＤＲ組換え事象が生じるまで、Ｃｐｆ１が同じ部位をカットし続けることができることを確実にする。従って、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質の両方を含むと理解される。従って、本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の両方を指す。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。ネイティブ配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、ネイティブ配列ポリペプチドと共通する質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、ネイティブ配列の断片、ならびにネイティブ配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が含まれるがこれらに限定されないが、ただし、それらは、対応するネイティブ配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有するものとする。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片へと加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドの両方のアミノ酸配列バリアント、共有結合的改変、およびそれらの融合物を包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の単一の生物学的特性を含み得る。他の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の生物学的特性のサブセットを含み得る。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体またはそれらの断片には、Ｃａｓタンパク質の変異体、融合物、共有結合的改変、またはそれらの断片が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から取得可能でありもしくは化学的に合成され、またはこれらの２つの手順の組合せによって取得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するようにもしくは外因性に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の例では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１６９】
特異的遺伝子に標的化される例示的なＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシングルガイドＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号に開示されている。
【０１７０】
従って、本明細書に記載される組成物および系は、細胞中に導入された場合に、組成物（または系）がＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子発現をモジュレートするように、選択された遺伝子中の１つまたは複数の標的部位に特異的に結合する１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つの機能的ドメインを含む。
【０１７１】
標的部位
上に詳細に記載したように、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼおよび／または転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、選択された任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有し得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書（例えば、表１、３、５、７、１１、１３、１４および１６）に示される標的部位の配列または１２もしくはそれよりも多くの塩基対（連続または非連続）に結合するＤＮＡ結合ドメインを含め、本明細書に記載される肝臓特異的遺伝子内の配列、例えば、標的部位（典型的には、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはさらにはそれよりも多くの塩基対）に結合する。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照のこと。ＴＡＬエフェクタードメインおよびシングルガイドＲＮＡの合理的設計もまた公知である。例えば、米国特許第８，７７１，９８５号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照のこと。
【０１７２】
送達
ヌクレアーゼ、転写因子および／または導入遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１阻害剤）は、任意の適切な手段によって任意の細胞型中に、好ましくは肝臓に（全身的にまたは肝送達を介して）、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達され得る。同様に、標的化組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、ヌクレアーゼは、例えば、非ウイルスベクター、ウイルスベクターを使用してポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質形態で、ならびに／またはＲＮＡ形態で、例えばｍＲＮＡとして、送達され得る。
【０１７３】
核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強性の取込みが含まれる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もまた、核酸の送達に使用され得る。さらなる例示的な核酸送達系には、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが含まれる（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照のこと）。
【０１７４】
好ましい実施形態では、発現構築物はＡＡＶベクターである。任意選択のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で、または１つもしくは複数のウイルスベクター（ＡＡＶ、Ａｄなど）を使用して、投与され得る。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によってであり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方の方法が企図される。門静脈への静脈内注射は、投与の好ましい方法である。他のｉｎ  ｖｉｖｏ投与様式には、例えば、肝臓の葉もしくは胆管中への直接的注射、および肝動脈を介するものを含む、肝臓に対して遠位の静脈内注射、肝臓実質中への直接的注射、肝動脈を介した注射、および／または胆樹を介した逆行性注射が含まれる。ｅｘ  ｖｉｖｏ様式の投与には、摘出された肝細胞または肝臓の他の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入と、その後の、ヒト患者の門脈脈管構造、肝臓実質または胆樹中への形質導入された摘出された肝細胞の戻し注入が含まれる。例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６巻：３３５〜３４１頁を参照のこと。
【０１７５】
１つよりも多いポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される構築物およびポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼ）の送達を含む系では、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドが、１つまたは複数の同じおよび／または異なるベクターを使用して送達される。例えば、ポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で送達され得、本明細書に記載される肝臓特異的構築物は、他のモダリティ、例えば、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子などを介して送達され得る。
【０１７６】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。従って、以下に記載されるような、医薬組成物の広範な種々の適切な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照のこと）。
【０１７７】
投与される発現カセット（ならびに任意選択のヌクレアーゼおよび／または改変された細胞）の有効量は、患者ごとに変動する。従って、有効量は、組成物（例えば、細胞）を投与する医師によって最良に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。治療的ポリペプチドの血清または他の組織レベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較は、投与されている量が低すぎるか、正しい範囲内か、高すぎるかを決定できる。初回および引き続く投与のための適切なレジームも変動し得るが、初回投与とその後の必要に応じた引き続く投与によって代表される。引き続く投与は、毎日から毎年から数年ごとまでの範囲の、変動する間隔で投与され得る。当業者は、適切な免疫抑制技術が、送達ベクターの免疫抑制によって形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎら、（１９９５年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６巻：１３９１〜１４０１頁を参照のこと。
【０１７８】
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の投与のための製剤には、液体または乳化された液体中の懸濁液（例えば、遺伝子改変された細胞、リポソームまたはナノ粒子の）が含まれる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性の賦形剤と混合される場合が多い。適切な賦形剤には、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。さらに、組成物は、微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬を含有し得る。
【０１７９】
用途
本明細書に開示される方法および組成物は、ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１阻害性導入遺伝子の提供を介するもの（転写因子、ヌクレアーゼなど）を含め、内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子の発現をモジュレートすることによって、任意のＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１関連障害に対する治療を提供する際に有用である。さらに、方法および組成物は、かかる障害の処置または予防のための、変異体ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子のノックアウト、および野生型ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１  ｃＤＮＡの提供のための方法を提供する。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変され得るまたはｅｘ  ｖｉｖｏで改変され、引き続いて、対象に投与され得る。従って、方法および組成物は、かかるＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１関連障害の処置および／または予防を提供する。従って、本明細書に記載される組成物および方法は、例えば、ＴＴＲ媒介性アミロイドーシス、Ａ１ＡＴ欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症／スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を含む障害を処置または予防するために使用され得る。
【０１８０】
以下の実施例は、任意選択で使用されるヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、本開示の例示的な実施形態を含む。これが例証のみを目的としており、他のヌクレアーゼ、例えば、本明細書に記載される標的部位に結合する操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ならびに／または天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインおよび異種切断ドメインの融合物、ならびに／またはメガヌクレアーゼおよびＴＡＬＥタンパク質の融合物が使用され得ることが理解される。さらに、本明細書に記載される発現構築物は、不十分なタンパク質産生によって引き起こされる障害の処置および／または予防において同じ結果を生じるために、（ＡＡＶ以外の）他のベクター上にあってもよいことが理解される。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１）
ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
【０１８２】
Ｕｒｎｏｖら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５巻（７０４２号）：６４６〜６５１頁、Ｐｅｒｅｚら（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６巻（７号）：８０８〜８１６頁に本質的に記載され、米国特許第８，５８６，５２６号および同第６，５３４，２６１号に記載されるように、転写調節またはヌクレアーゼドメインに作動可能に連結した、マウスまたはヒトのいずれかのＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子に結合するジンクフィンガー、ＣａｓおよびＴＡＬＥタンパク質を設計し、プラスミド、ＡＡＶもしくはアデノウイルスベクター中に取り込み、またはｍＲＮＡにする。
【０１８３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系における使用のためのｓｇＲＮＡを、当該分野で公知の方法によって合成により作製する（Ｈｓｕら、（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７またはＳｔｅｒｎｂｅｒｇら、（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７巻：６２頁を参照のこと）。ｓｇＲＮＡを、上記のように操作し、内因性ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１遺伝子中の配列（例えば、本明細書に示される標的配列）を標的化するように設計する。
【０１８４】
ヒトまたはマウスのＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１特異的ヌクレアーゼを、ｍＲＮＡとしてヒト細胞（例えば、Ｋ５６２）またはマウス細胞中に導入し、切断活性について分析する。簡潔に述べると、細胞に、標準的なプロトコールに従って、ＢＴＸ９６ウェルエレクトロポレーター（ＢＴＸ）を使用して２つの用量のｍＲＮＡ（２つのＺＦＮの合計で２または６μｇ）をトランスフェクトする。次いで、細胞を、さらに７日間拡大増殖させる。細胞を７日目に取り出し、ディープシークエンシング（Ｍｉｓｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、オンターゲットＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１改変について分析する。
【０１８５】
ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１および／またはＨＡＯ１特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ実験について、Ｃａｓ９をｐＶＡＸプラスミド上で供給し、ｓｇＲＮＡを、Ｕ６プロモーターの制御下でプラスミド上で供給する。プラスミドを、１００ｎｇの各々または４００ｎｇの各々のいずれかで混合し、１実行あたり２ｅ５の細胞で混合する。Ａｍａｘａ系を使用して細胞をトランスフェクトする。簡潔に述べると、Ａｍａｘａトランスフェクションキットを使用し、核酸を、標準的なＡｍａｘａシャトルプロトコールを使用してトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を室温で１０分間休ませ、次いで、予め加温したＲＰＭＩ中に再懸濁する。次いで、細胞を、３７℃で標準的条件で成長させる。ゲノムＤＮＡをトランスフェクションの７日後に単離し、ＭｉＳｅｑ分析に供する。
【０１８６】
全てのヌクレアーゼがそれらの標的部位に結合し、（標的遺伝子の切断において）機能的に活性であることが見出された。
（実施例２）
ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１遺伝子発現をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
【０１８７】
ＰＣＳＫ９、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＫＬＫＢ１またはＨＡＯ１に標的化されたジンクフィンガータンパク質を、Ｚｈａｎｇら（２０００年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５巻（４３号）：３３８５０〜３３８６０頁に本質的に記載されるように操作した。ＺＦＰを評価したところ、それらの標的部位に結合し、それを切断することが示された。リンカーおよびＺＦＮ構造は、以前に記載されている（米国特許出願公開第２０１７０２１８３４９号および同第２０１７０２１１０７５号）。例えば、リンカーＬ０はＬＲＧＳＱＬＶＫＳ（配列番号１３９）であり、リンカーＮ７ａはＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ（配列番号１４０）であり、リンカーＮ６ａはＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ（配列番号１４１）であり、リンカーＬ８ｃ４はＬＲＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号１４２）である。
Ｉ．ＰＣＳＫ９のヌクレアーゼ標的化
【０１８８】
ＰＣＳＫ９特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製した。例示的なタンパク質（リンカーを含む）を、以下の表１に示す。
【表１−１】
2019531068.tif 000003
【表１−２】
2019531068.tif 000004
【０１８９】
ヌクレアーゼを、Ｋ５６２細胞において活性について試験し、ここで、パートナーヌクレアーゼをコードする各ｍＲＮＡ  ２μｇを、１００μＬのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。対の組合せの例示的な結果を以下の表２に示し、表中、「％インデル」は活性を示す。％インデルを、ディープシークエンシング（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｎｉａ）によって測定し、次いで、切断部位において挿入および／または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。表２は、これらの例示的なＺＦＮ対が全て活性であったことを実証している。
【表２】
2019531068.tif 000005
【０１９０】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを、Ｍａｃａｃｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  ＰＣＳＫ９遺伝子（ｍｍＰＣＳＫ９）に対しても設計し、以下の表３に示す。
【表３−１】
2019531068.tif 000006
【表３−２】
2019531068.tif 000007
【表３−３】
2019531068.tif 000008
【０１９１】
Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ  ＰＣＳＫ９遺伝子を標的化するヌクレアーゼを、Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ細胞系ＭＫ２において活性について試験した。例示的な対の組合せの結果を、以下の表４に示す。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。ヌクレアーゼ対の各パートナーをコードするｍＲＮＡの総用量が示され、これを、１００μＬのトランスフェクション体積で添加した。活性を、ディープシークエンシング（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｎｉａ）によって測定した％インデルとして示し、次いで、切断部位において挿入および／または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析する。
【表４−１】
2019531068.tif 000009
【表４−２】
2019531068.tif 000010
【０１９２】
ＺＦＮを、マウスＰＣＳＫ９（ｍＰＣＳＫ９）遺伝子に対して設計し、以下の表５に示す。
【表５−１】
2019531068.tif 000011
【表５−２】
2019531068.tif 000012
【表５−３】
2019531068.tif 000013
【表５−４】
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【表５−５】
2019531068.tif 000015
【表５−６】
2019531068.tif 000016
【０１９３】
上に示されるマウスＰＣＳＫ９遺伝子（ｍＰＣＳＫ９）を標的化するヌクレアーゼを、０．１ｕｇの総ＺＦＮ  ｍＲＮＡ用量でマウス肝臓細胞系Ｈｅｐａ１−６において活性について試験した。このとき、用量の半分は、各個々のＺＦＮである。ＺＦＮを、１００μＬのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。対の組合せの例示的な活性（％インデル）結果を、図６に示される特異的部位において、以下の表６Ａ〜６Ｇに示す。％インデルを、ディープシークエンシング（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｎｉａ）によって測定し、次いで、切断部位において挿入および／または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
【表６Ａ】
2019531068.tif 000017
【表６Ｂ】
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【表６Ｃ】
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【表６Ｄ】
2019531068.tif 000020
【表６Ｅ】
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【表６Ｆ】
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【表６Ｇ】
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【０１９４】
形質導入されたＨｅｐａ１−６細胞上清中の分泌されたｍＰＣＳＫ９タンパク質の％インデルとノックダウンとの間の相関を計算する。２つの用量を評価し（低用量は０．５ｕｇの総ＺＦＮ  ｍＲＮＡ用量であり、高用量は４ｕｇの総ＺＦＮ  ｍＲＮＡ用量である）、ｍＰＣＳＫ９タンパク質濃度を、形質導入の３日後（「３ＤＰＴ」）にＥＬＩＳＡによって測定する。分析は、ＺＦＮによって誘導されたパーセントインデルと相関する、上清中のｍＰＣＳＫ９濃度における減少を実証している。
ＩＩ．ＳＥＲＰＩＮＡのヌクレアーゼ標的化
【０１９５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを、Ｚ変異（図１）、表７の位置に隣接するＳＥＲＰＩＮＡ遺伝子を切断するように設計した（Ｙｕｓａら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４７８巻（７３６９号）：３９１〜３９４頁もまた参照のこと）。ジンクフィンガータンパク質を、ＨｅｐＧ２細胞およびＫ５６２細胞において試験した。結果を以下の表８に示す。「リンカー」は、ＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端においてＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに付着されることを示す。
【表７−１】
2019531068.tif 000024
【表７−２】
2019531068.tif 000025
【表８】
2019531068.tif 000026
【０１９６】
次いで、例示的なＺＦＮを、「Ｚ」変異を担うＧ→Ａ変異を修正するオリゴヌクレオチドドナーと組み合わせて使用した。さらに、オリゴヌクレオチドは、一度組み込まれたオリゴヌクレオチドの切断を防止するＺＦＮ標的配列中のサイレントなヌクレオチド変更を含んだ（図１Ｂ）。特に、ＳＢＳ番号２５２６４のフィンガー２および４によって認識されるヌクレオチド（それぞれ、ＴＣＡおよびＣＧＡ）を、これらの三つ組がＴＧＡおよびＣＡＡになるように変更する（バリアントＳＭＳ２４）。これらの新たな配列は、ＳＢＳ番号２５２６４のＺＦＮによってはもはや標的化されず、従って、一旦オリゴヌクレオチドが組み込まれると、切断はもはや生じない。このＳＭＳ２４  ＳＥＲＰＩＮＡ１バリアントオリゴヌクレオチドは、切断部位に隣接するＳＥＲＰＩＮＡ１配列に対して相同な相同性アームもまた含んだ。ＳＭＳ２４バリアントオリゴヌクレオチドをＳＥＲＰＩＮＡ１特異的ＺＦＮと共に使用した場合、オリゴヌクレオチドの標的化組み込みは、ＨｅｐＧ２細胞における対立遺伝子のおよそ４％およびＫ５６２細胞における対立遺伝子の２５％で生じた（表９を参照のこと）。
【表９−１】
2019531068.tif 000027
【表９−２】
2019531068.tif 000028
【０１９７】
次に、修正的オリゴヌクレオチドおよびＳＥＲＰＩＮＡ１特異的ＺＦＮを、その生殖系列中に組み込まれたヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＰｉＺバリアントおよそ１０コピーを含む株であるＰｉＺマウス（Ｃａｒｌｓｏｎら（１９８９年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８３巻：１１８３〜１１９０頁）においてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ＰｉＺマウスは、変異体ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１（「ＳＡ１−ＡＴＺ」）についてトランスジェニックであり、肝細胞におけるＡＴＺ蓄積および肝臓線維症を示す。ＳＭＳ２４オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮ対は共に、静脈内経路を介してＡＡＶ８ベクターによって送達し、マウスの群を、分子的、組織学的および生化学的分析のために、処置の２週間後および６ヶ月後に屠殺した。未処置の年齢／性別が一致したＰｉＺマウスを、対照として使用した。表１０は、実験の概要および注射スケジュールを示す。
【表１０】
2019531068.tif 000029
【０１９８】
実験中の各コホートの半分を、注射の２週間後に屠殺し、肝臓組織を、切断部位におけるＮＨＥＪまたは標的化組み込み（ＴＩ）を有する対立遺伝子のパーセントについて調査した。結果は、より高い用量のＺＦＮが、増加した切断活性をもたらし（図２Ａ）、オリゴヌクレオチドドナーの存在下でのより高い用量のＺＦＮが、より高い量のＴＩをもたらす（図２Ｂ）ことを実証した。注射の６ヶ月後に、コホートの残り半分を屠殺した。肝臓分析により、２週間よりも６ヶ月の時点において、全てのコホートにおいて、ＮＨＥＪ活性を示す対立遺伝子のより大きいパーセントが存在したことが示された（図３Ｃ）。ＮＨＥＪ保有細胞のパーセントにおける明確な増加は、ＰｉＺ対立遺伝子のノックアウトを保有する細胞についての選択的利点を示し得る。対照的に、修正的オリゴを含む検出されたＴＩの量は、２週間の時点の試料と顕著には異ならなかった（図３Ｂ）。より具体的には、処置の２週間後に、肝ＳＡ１−ＡＴＺ遺伝子プールのディープシークエンシングは、低用量または高用量のｒＡＡＶ−ＺＦＮを受けているマウスにおいて、それぞれ８＋４％または２３＋８％の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を示した。ｒＡＡＶ−ＴＩを低用量または高用量のｒＡＡＶ−ＺＦＮと共に共投与した場合、正常ＡＡＴ配列の標的化挿入（ＴＩ）による遺伝子修復は、０．２５＋０．２％および０．５＋０．４のＳＡ１−ＡＴＺ遺伝子において生じた。ＺＦＮ処置は、６ヶ月の時点で肝臓中のＰｉＺ小球含有肝細胞の数を低減させ、これは、ジアスターゼ／過ヨウ素酸シッフ染色によってアッセイされる、ゲノム編集された肝細胞による肝臓再増殖を示している。この時点で、血清ヒトＡＴＺレベルは、対照と比較して、低用量群および高用量群においてそれぞれ３０＋６および４０＋５％減退した。処置の６ヶ月後に、ＳＡ１−ＡＴＺ遺伝子中にＮＨＥＪを有する細胞の百分率は、低用量または高用量のｒＡＡＶ−ＺＦＮのレシピエントのそれぞれ６４＋８％および５８＋２０％に増加した。高用量ｒＡＡＶ−ＺＦＮ＋ｒＡＡＶ−ＴＩを受けているマウスでは、ＳＡ１−ＡＴＺ遺伝子の最大で１．７％が遺伝子修正を示した。並行して、血清ＡＴＺレベルは、低用量および高用量のｒＡＡＶ−ＺＦＮレシピエントにおいてそれぞれ４７％および７０％減退し、シリウスレッド染色によって測定した肝臓線維症は、対照と比較して大きく低減された。
【０１９９】
従って、ＳＡ１−ＡＴＺ導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ媒介性編集は、ＰｉＺマウス肝細胞に増殖利益を提供して、肝臓を大幅に再増殖させ肝線維症を逆転させるようであり、このことは、ＡＴＤに対する治療剤としてのその使用を示している。
ＩＩＩ．ＴＴＲのヌクレアーゼ標的化
【０２００】
ＴＴＲ特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、マウスおよびヒトのＴＴＲを標的化した。ＴＴＲ遺伝子中のいくつかの領域を、潜在的な標的化のために同定した（例えば、図４を参照のこと）。例示的なタンパク質ならびに標的部位および例示的なリンカーおよびＦｏｋＩ変異を、以下の表１１に示す。
【表１１−１】
2019531068.tif 000030
【表１１−２】
2019531068.tif 000031
【表１１−３】
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【表１１−４】
2019531068.tif 000033
【０２０１】
全てのマウス特異的ヌクレアーゼを、Ｂ１６−Ｆ１０細胞（図５Ａ）、初代マウス肝細胞（図５Ｂ）またはＨｅｐａ１−６細胞（図８Ａおよび８Ｂ）において試験したところ、活性であることが見出された。ｍＴＴＲエクソン１、部位Ｃ（５９９１９／５９６４２）およびエクソン２、部位Ｈ（５９７７１／５９２４５）を標的化するリードＺＦＮを、ヒトＡｐｏＥエンハンサーおよびヒトＳＥＲＰＩＮＡ１プロモーターを含有する個々のＡＡＶ発現カセットベクター中にクローニングし、次いで、血清型ＡＡＶ８中にパッケージングした。次いで、ＡＡＶ  ＺＦＮを、高用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり１．５ｅ１１ｖｇ）または低用量（マウス１匹あたりＺＦＮあたり２．５ｅ１０ｖｇ）で野生型Ｃ５７ＢＬ６マウス中に静脈内注射し、２８日後に肝臓を遺伝子改変のために回収し、血漿をｍＴＴＲタンパク質ノックダウンについて分析した。図６Ａは、肝臓内でのロバストな編集を示すが、図６Ｂは、ｍＴＴＲ標的化されたＺＦＮ  ＡＡＶベクターに特異的な循環ｍＴＴＲタンパク質ノックダウンの高いレベルを示している。
【０２０２】
全てのヒト特異的ＺＦＮをヒト肝臓細胞系ＨｅｐＧ２において試験したところ、活性であることが見出された（例示的な対の活性については、以下の表１２を参照のこと）。簡潔に述べると、用量の半分が各個々のＺＦＮである総ＺＦＮ  ｍＲＮＡ用量を、表１２に示し、これを、１００μＬのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。遺伝子のエクソン１およびエクソン３を結合するＺＦＮの対の組合せの例示的な活性（％インデル）結果。％インデルを、ディープシークエンシング（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｎｉａ）によって測定し、次いで、切断部位において挿入および／または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
【表１２】
2019531068.tif 000034
【０２０３】
マウスＴＴＲ遺伝子（ｍＴＴＲ）を結合するＺＦＮの特異性を決定するために、ＺＦＮ対を、Ｂ１６−Ｆ１０細胞において以前に記載された方法（Ｔｓａｉら（２０１５年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３巻：１８７〜１９７頁）と類似の方法を使用した候補オフターゲット部位の不偏同定に供した。簡潔に述べると、Ｂ１６−Ｆ１０細胞に、ＢＴＸエレクトロポレーションデバイスを使用して、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ、ならびにバーコード化ｓｓＤＮＡオリゴをエレクトロポレートして、二本鎖ＤＮＡ切断、およびｓｓＤＮＡオリゴのＮＨＥＪ媒介性組み込みを受けた部位の不偏同定を可能にした。次いで、Ｍｉｓｅｑ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって組み込まれたオリゴを含有すると同定された見出された上位２４の部位を、リポフェクションを介してＺＦＮ  ｍＲＮＡで形質導入した初代マウス肝細胞において確認した（図５Ｂ）。ＺＦＮ処置したマウス肝細胞由来のゲノムＤＮＡを、潜在的ＺＦＮ結合部位を取り囲むおよそ２００ｂｐのアンプリコンを生成するＰＣＲによって増幅した。等モルライブラリーを構築するために、ＰＣＲ産物を、Ｃ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）でのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームのためのＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて定量し、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｖ．３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用するＭｉＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐｌａｔｆｏｒｍで配列決定した。次いで、挿入ならびに欠失および挿入（インデル）の定量を実施した。簡潔に述べると、生のペアードエンド読み出しを接合し、特異的ゲノム標的配列とアラインさせた。ＺＦＮ標的部位を包含する４０ｂｐ領域内に位置する≧１ｂｐのインデルを有する配列を、ヌクレアーゼ誘導されたゲノム改変とみなした。ＧＦＰコードｍＲＮＡをエレクトロポレートした対照と比較して、ボンフェローニｐ値≦０．０５を生じた全ての部位を、オフターゲット部位とみなした。
【０２０４】
触媒活性または潜在的に非特異的なＤＮＡ結合のいずれかに影響を与えるＦｏｋＩに対する変異（米国特許出願第１５／６８５，５８０号）と同様に、ジンクフィンガー骨格中およびＦｏｋＩドメイン中の両方における、ゲノムＤＮＡへの非特異的結合を受けるＺＦＰ内の残基に対する改変を、いくつかのＺＦＮにおいて変異させた（１〜６残基におけるＲからＱへの変化）。作製した変異を、以下、以下の表１３に示す。
【表１３−１】
2019531068.tif 000035
【表１３−２】
2019531068.tif 000036
【０２０５】
次いで、これらのバリアントを、オンターゲットおよびオフターゲット切断活性について試験した。図８Ａは、Ｈｅｐａ１−６細胞における、５９７７１／５９７９０対に起源するリード変異体ＺＦＮのオンターゲット活性を示す。図８Ｂは、これらのリードＺＦＮについて同定された上位３つのオフターゲット部位のインデル合計を示し、変異体ＺＦＮについて、オフターゲット切断における減少を実証している。
ＩＶ．ＨＡＯ１のヌクレアーゼ標的化
【０２０６】
ＨＡＯ１特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  ＨＡＯ１を標的化した。例示的なタンパク質を以下の表１４に示す。
【表１４】
2019531068.tif 000037
【０２０７】
活性を上記のように分析し、以下の表１５に示す。総ＺＦＮ  ｍＲＮＡ用量は、用量の半分が各個々のＺＦＮであることを意味する。これを、１００μＬのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。遺伝子のエクソン４を結合するＺＦＮの対の組合せの例示的な活性（％インデル）結果。％インデルを、ディープシークエンシング（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｎｉａ）によって測定し、次いで、切断部位において挿入および／または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
【表１５】
2019531068.tif 000038
Ｖ．ＫＬＫＢ１のヌクレアーゼ標的化
【０２０８】
以下の表１６に示されるＫＬＫＢ１特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、マウスＫＬＫＢ１を標的化した。ＫＬＫＢ１遺伝子中のいくつかのエクソンを、マウス肝臓細胞系Ｈｅｐａ１−６における標的化のために選択した。
【表１６−１】
2019531068.tif 000039
【表１６−２】
2019531068.tif 000040
【０２０９】
示される全てのヌクレアーゼがそれらの標的部位に結合し、活性であった。以下の表１７は、１００μＬのトランスフェクション体積で添加した各ＺＦＮ  ｍＲＮＡを１：１の質量比で使用した、個々のＺＦＮ  ｍＲＮＡ用量を示す、示された対の活性を示している。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。遺伝子の種々のコード領域を結合するＺＦＮの対の組合せの例示的な活性（％インデル）結果。％インデルを、ディープシークエンシング（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｎｉａ）によって測定し、次いで、切断部位において挿入および／または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
【表１７】
2019531068.tif 000041
【０２１０】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０２１１】
本開示は、理解の明確さを目的として例示および例としていくらか詳細に提供されてきたが、種々の変化および改変が、本開示の精神または範囲から逸脱することなく実施され得ることが、当業者に明らかである。従って、上述の説明および例は、限定として解釈すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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