(57)【要約】  本発明は、Ｄ−乳酸またはその塩を生産するための発酵プロセスに関する。上記プロセスは以下の工程：種培養物を得るための、サトウキビ汁を用いた発酵によるＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株の培養工程；得られた種培養物の、サトウキビ汁中における発酵工程を含み、上記培養工程は、当該培養工程におけるＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の終期濃度が、１リットルあたり乾燥細胞４００〜１，６００ｍｇの範囲になる時間、行われる。本発明に係る上記プロセスは、高い光学純度を有するＤ−乳酸の、高い生産性および収率を提供することができる。その上、上記プロセスは容易に行うことができ、複雑な工程を減らすことができる。
2019536445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−乳酸またはその塩を生産するための発酵プロセスであって、以下の工程を含み：
（ａ）種培養物を得るために、サトウキビ汁中において、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）から得られた上記種培養物をサトウキビ汁中で発酵させる工程；
工程（ａ）におけるＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の終期濃度が、１リットルあたり乾燥細胞４００〜１，６００ｍｇの範囲になる時間、工程（ａ）が行われることを特徴とする発酵プロセス。
【請求項２】
上記工程（ａ）におけるＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の終期濃度が、１リットルあたり乾燥細胞１，０００〜１，４００ｍｇの範囲である、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項３】
上記工程（ａ）が好気性条件下で行われる、請求項１または２に記載の発酵プロセス。
【請求項４】
上記工程（ａ）は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の初期濃度が１リットルあたり乾燥細胞４０〜２４０ｍｇの範囲である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発酵プロセス。
【請求項５】
上記工程（ａ）は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の初期濃度が１リットルあたり乾燥細胞１２０〜１６０ｍｇの範囲である、請求項４に記載の発酵プロセス。
【請求項６】
上記工程（ｂ）が微好気性条件下で行われる、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項７】
上記工程（ｂ）が１２〜５０時間の範囲の時間で行われる、請求項１または６に記載の発酵プロセス。
【請求項８】
上記工程（ｂ）が４５〜５０時間の範囲の時間で行われる、請求項７に記載の発酵プロセス。
【請求項９】
上記工程（ｂ）におけるサトウキビ汁は、工程（ｂ）における糖濃度の範囲が４〜１５体積％となる糖を含む、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１０】
上記工程（ａ）および（ｂ）が３５〜４０℃の範囲の温度で行われる、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１１】
上記工程（ａ）および（ｂ）が３７℃の温度で行われる、請求項１０に記載の発酵プロセス。
【請求項１２】
上記Ｄ−乳酸またはその塩が９５％を超える光学純度を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発酵プロセス。
【請求項１３】
上記Ｄ−乳酸またはその塩が９９％を超える光学純度を有するものである、請求項１２に記載の発酵プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
バイオテクノロジーは、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株を用いてＤ−乳酸またはその塩を生産するための発酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、プラスチック産業、食品および医薬品産業、および化粧品産業において広く使用されていることがよく知られている。上記プラスチック産業では、乳酸が特にポリエステル、例えばポリ乳酸またはポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）の生産に広く使用されている。乳酸から生産される重合体は、その生分解性および生体適合性において利点を有する。上記重合体は、医療分野において、例えば織物繊維、フィルム、包装、腸線縫合糸、または足場材といった、多くの用途に使用することができる。
【０００３】
現在、乳酸の生産プロセスには、例えば化学合成またはバイオテクノロジーによる方法がある。当該生産プロセスには、微生物発酵における原料として、例えばキャッサバ、トウモロコシ、小麦、またはサトウキビといった天然資源を使用できることなどを含む、いくつかの利点がある。上記原料は、継続的に再生産することができる。その上、微生物発酵は、高い光学純度を有する乳酸を生産することができるという、もう１つの利点がある。
【０００４】
工業規模での乳酸の生産の大半は、例えばグルコース、スクロース、マルトース等の糖、または例えばデンプンもしくはセルロースといった他の炭水化物の発酵による生産であって、乳酸を生産する能力がある微生物は、細菌および真菌である。現在、Ｌ−乳酸は工業規模で広く生産されている。
【０００５】
しかしながら、工業規模でのＤ−乳酸の生産は開示されていない。それにはいくつかの問題があり、例えば天然に見出される細菌または真菌の大部分はＬ−乳酸を高い光学純度で生産するが、Ｄ−乳酸を生産することができる細菌または真菌は、ほとんどいない。この理由から、これらの細菌または真菌の詳細についての研究はほんのわずかしかなかった。したがって、天然に見出される微生物によるＤ−乳酸の生産開発はより困難になる。
【０００６】
現在の重合体の生産における別の問題は、原料が高価であることである。能率的であり、生産費用を低減し、高い収率および生産性を目的とした、乳酸の生産開発が必要とされている。良好に成長し、再生産可能な微生物および微生物の培養工程を開発する試みがなされてきた。ラクトバチルス、ロイコノストックおよびストレプトコッカスは、嫌気性条件下で糖から乳酸を生産する細菌株であることが良く知られている。当該細菌株は、費用を節約し、真菌よりも高濃度の生産物を提供する。それにもかかわらず、上記細菌群は選好性細菌である。したがって、いくつかのビタミンおよび必須アミノ酸を上記選好性細菌の成長に使用する必要がある。その上、上記細菌群は、デンプンの加水分解のための酵素を生産することができない。したがって、原料に使用されるデンプンは、発酵に使用する前に加水分解して糖にする必要があった。この理由により、生産費用が高くなる。
【０００７】
上記乳酸の生産費用を低減する１つの試みは、乳酸を生産するための発酵においてサトウキビ汁を用いることによって、糖を精製する工程を減らすことである。これにより、乾燥工程を減らすことができ、サトウキビ汁を直接、発酵液とすることで、サトウキビ汁の中の栄養を微生物の栄養源として利用することができる。
【０００８】
しかしながら、サトウキビ汁を用いた乳酸、特にＤ−乳酸の生産を達成するのは、微生物発酵工程が複雑であることから困難である。したがって、高濃度且つ、生産性の高いＤ−乳酸生産物を得ることができない。
【０００９】
Prachamorn et al. (The production of the lactic acid using sugarcane juice as precursor, KKU Research Journal, 2008, 8(3), July - September, 2008)には、ラクトバチルス属の細菌によって、サトウキビ汁を使用してＬ−乳酸を生産する方法が開示されている。上記の結果は、酵母エキスに由来する窒素化合物で栄養価を高めた１５０ｇ／Ｌのスクロース濃度のサトウキビ汁を使用したとしても、２３ｇ／Ｌより高い濃度のＬ−乳酸は生産できないことを示した。
【００１０】
ＵＳ２０１０／０１１２６５２には、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を使用した、サトウキビ汁におけるＤ−乳酸の発酵工程が開示されている。上記開示から、酵母エキスに由来する窒素化合物を加えたにもかかわらず、Ｄ−乳酸の最大濃度はわずか２０ｇ／Ｌであることが分かった。
【００１１】
Kanwar et al. (Lactic acid production from molasses by Sporolactobacillus cellulosolvens.  Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 1995. 42 (4), 331-318)では、Ｄ−乳酸の生産において、発酵している糖液とともに、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓを用いた結果、上記乳酸の終期濃度は２４．２ｇ／Ｌであり、当該濃度では工業規模での生産には不十分であると報告されている。
【００１２】
Sawai et al. (Membrane-integrated fermentation system for improving the optical purity of the D-lactic acid produced during continuous fermentation. Bioscience and Biotechnology Biochemistry. 2011. 75 (12), 2326 - 2332)では、純粋なスクロースを用いたＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ、 Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓおよびＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅによる発酵が報告されている。上記の発酵では、高濃度のＤ−乳酸を生産することができたとはいえ、発酵に１２０時間かかり、非常に高い生産費用をもたらした。
【００１３】
上記の全ての理由から、本発明は、サトウキビ汁などの安価な原料を使用してＤ−乳酸を生産するための発酵プロセスを開発することによって、上記の問題を克服することを目的とする。これらの開発されたプロセスは、高い光学純度を有するＤ−乳酸の高い生産性および収率を提供することができる。その上、上記プロセスは容易に行うことができ、複雑な工程を減らすことができる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、Ｄ−乳酸またはその塩を生産するための発酵プロセスに関する。上記プロセスは以下の工程：種培養物を得ることを目的とした、サトウキビ汁を用いた発酵による、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株の培養工程；得られた上記種培養物のサトウキビ汁の中での発酵工程を含み、上記培養工程は、当該培養工程においてＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の終期濃度が、１リットルあたり乾燥細胞４００〜１，６００ｍｇの範囲になる時間、行われる。本発明に係るプロセスは、高い光学純度を有するＤ−乳酸の高い生産性および収率を提供することができる。その上、上記プロセスは容易に行うことができ、複雑な工程を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）の構造を示す。
【図３】図３は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）の陽性カタラーゼ試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
〔定義〕
本明細書で使用される技術用語または科学用語は特に断らない限り、当業者によって理解される定義を有する。
【００１７】
本明細書で言及されるいくらかの道具、機器、方法、または化学薬品は、具体的に本発明における道具、機器、方法、または化学薬品であることが別途明記されない限り、当業者によって一般に操作または使用される道具、機器、方法、または化学薬品を意味する。
【００１８】
請求項または明細書における「含む」を伴う単数名詞または単数代名詞の使用は、「１つ」および「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多い」をも指す。
【００１９】
本出願を通じて、用語「約」は、本明細書に提示され、または示される任意の値が物理的特性の変化から生じる変動または逸脱を含む、個々の操作者が使用する装置または方法から潜在的に変化し、または逸脱し得ることを示すために使用される。
【００２０】
「サトウキビ汁」とは、他の処理を伴う、または伴わないサトウキビを絞る工程から得られる収穫物をいう。上記収穫物は糖、デンプン、有機酸、ポリフェノール、タンパク質、アミノ酸、繊維、クロロフィル、硫酸塩灰分、ゴム、ワックス、シリカのＳｉＯ２形態、リン酸塩のＰ２Ｏ５形態、カルシウムのＣａＯ形態、カリウムのＫ２Ｏ形態、マグネシウムのＭｇＯ形態、またはこれらの混合物を含むことができるが、その限りではない。
【００２１】
糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物から選択される単分子糖；スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、またはそれらの混合物から選択される二分子糖；ラフィノース、イソマルトトリオース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、ケストース、またはそれらの混合物から選択される三糖であってもよい。
【００２２】
本発明を通して、サトウキビ汁は、サトウキビ汁を濃縮プロセスに供することから得られる生成物を含むサトウキビ汁から得られる溶液を指す。サトウキビ汁から得られる上記溶液の例は、ハイテストモラセスと呼ばれる高濃度になるまでの蒸発プロセスにより得た上記溶液、またはサトウキビ汁の中の糖の沈殿物から得られ、そして、得られた上記沈殿物を再び水に再溶解した生成物である。
【００２３】
「微好気性条件」とは、既存の空気を置換する目的で、空気の添加や不活性ガスの添加を問わず、それ以上のガスを添加することなく、空気の量を制限するように制御される条件をいう。
【００２４】
以下、本発明の実施形態は、本発明の範囲を限定することを目的としないものとして示される。
【００２５】
本発明はＤ−乳酸またはその塩を生産するための発酵プロセスに関し、以下の工程を含む：：
（ａ）種培養物を得るための、サトウキビ汁におけるＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）の培養工程；および、
（ｂ）工程（ａ）から得られた上記種培養物のサトウキビ汁中での発酵工程；
工程（ａ）におけるＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の終期濃度が、１リットルあたり乾燥細胞約４００〜１，６００ｍｇの範囲、好ましくは１リットルあたり乾燥細胞約１，０００〜１，４００ｍｇの範囲になる時間、工程（ａ）が行われることを特徴とする。
【００２６】
本発明の一実施形態において、工程（ａ）は、好気性条件下で行われる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、工程（ａ）は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ株の初期濃度が１リットルあたり乾燥細胞約４０〜２４０ｍｇの範囲、好ましくは１リットルあたり乾燥細胞約１２０〜１６０ｍｇの範囲である。
【００２８】
本発明の一実施形態において、工程（ｂ）は、約１２〜５０時間の範囲、好ましくは約４５〜５０時間の範囲の時間行われる。
【００２９】
本発明の一実施形態において、工程（ｂ）のサトウキビ汁は、工程（ｂ）の糖濃度が約４〜１５体積％の範囲となる糖を含むものであって、サトウキビ汁は処理されたまたは処理されていないサトウキビ汁から得られるサトウキビ汁であり得る。
【００３０】
一実施形態では、工程（ａ）および（ｂ）が約３５〜４０℃の範囲の温度で行われ、好ましくは約３７℃の温度で行われる。
【００３１】
一実施形態では、工程（ａ）および（ｂ）がさらに振盪機混合を含んでもよく、工程（ａ）における振盪機混合速度は１０〜１，２００ｒｐｍの範囲であってもよく、工程（ｂ）における振盪機混合速度は１０〜１，２００ｒｐｍの範囲であってもよい。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明に係る発酵プロセスから得られるＤ−乳酸またはその塩が９５％を超える光学純度、より好ましくは９９％を超える光学純度を有する。
【００３３】
＜本発明に係る適切な微生物＞
本発明に係る適切な微生物は、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株、特に、日本のＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されたＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）である。
【００３４】
一実施形態では、本発明に係るＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓを、３０℃を超える温度での好気性条件下で増殖させることができ、高い光学純度を有するＤ−乳酸またはその塩を生産することができる。
【００３５】
上記Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓを３０〜４２℃の範囲の温度での好気性条件下で増殖させることができ、９５％を超える光学純度を有するＤ−乳酸またはその塩を生産することができることが、好ましい。
【００３６】
上記Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓを約３７℃の温度での好気性条件下で増殖させることができ、９９％を超える光学純度を有するＤ−乳酸またはその塩を生産することができることが、最も好ましい。
【００３７】
本発明に係るＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓは、図１に示すような１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列、図２に示すような構造を有し、かつ図３に示すようなカタラーゼ試験において陽性である、グラム陽性細菌である。
【００３８】
＜Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株の培養およびＤ−乳酸を生産するためにサトウキビ汁から調製した種培養物の発酵＞
以下は、本発明に係るＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株の培養およびＤ−乳酸の生産のためのサトウキビ汁から調製した種培養物の発酵の実施例である。これらの実施例は本発明の目的を説明するだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００３９】
上記発明に係る各物性の測定は、以下に説明するような方法および機器によって行われるものであって、各試験方法および機器は一般に使用されている方法および機器であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４０】
糖、乳酸、および副生成物の量は、高性能液体クロマトグラフィー（Agilent Technology）を装備しているＢｉｏｒａｄ社製カラム、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ-８７Ｈイオン排除有機酸（ion exclusion organic acid）３００ｍｍ×７．８ｍｍを用いて、５０℃の温度で測定した。使用した検出器は、標準溶液の信号機器を比較するための、示差屈折率検出器（Agilent Technology）であった。
【００４１】
光学純度は、キラルカラム（Sumipack，Sumichiral OA5000）を用いて４０℃の温度で測定した。硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を溶離剤として使用した。流速は１ｍＬ／分であった。２５４ｎｍの波長の信号をＵＶ検出器により検出した。
【００４２】
培養工程または発酵工程の間の光学密度（ＯＤ）を、６００ｎｍの波長で、分光測光法によって測定した。
【００４３】
収率は、上記発酵中に使用した糖に対する、生産される乳酸の比率から算出した。
【００４４】
実施例１：培養および発酵が振盪機混合を含む、本発明に係るプロセスを用いたＤ−乳酸の生産
培養工程で使用されたＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）の調製は、１リットルにつき以下の組成物を含む固形培地に上記細菌を添加することによって行われ得る：約１０ｇのスクロース、約１５ｇの酵母エキス、約４ｇの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、約０．２５ｇのリン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、約０．２５ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、約５ｇの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、約５ｇの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、約４００ｍｇの硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）、約２０ｍｇの硫酸第一鉄、約２０ｍｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および約２０ｇの寒天。ミキサーは、約３７℃で、約２４時間インキュベートした。
【００４５】
上記種培養物を生産するための培養は、上記固体培地中の細菌を約０．５〜２％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で希釈して、１リットルあたり乾燥細胞約１２，０００〜１６，０００ｍｇの細菌細胞を得ることによって行うことができた。次に、約１重量％の糖濃度の２５Ｌのサトウキビ汁、約０．３８ｇの酵母エキス、約０．１０ｇの塩化アンモニウム、約６．２５ｍｇのリン酸水素二カリウム、約６．２５ｍｇのリン酸二水素カリウム、約０．１３ｇの炭酸カルシウム、約１０ｍｇの硫酸マグネシウム、約０．５ｍｇの硫酸マンガン、約０．５ｍｇの硫酸第一鉄、および約０．５ｍｇの食塩を含む、２５０ｍＬフラスコに、約２５０μＬの上記希釈細菌を添加する工程を行う。この工程によって、１リットル当たり乾燥細胞約１２０〜１６０ｍｇの初期濃度の細菌細胞を得ることができた。次に、種培養物を得るために、約３７℃の温度、好気性条件下で培養を行った。細菌細胞の終期濃度が１リットルあたり乾燥細胞約１，０００〜１，４００ｍｇになるまで、約５時間の振盪機混合速度は約２００ｒｐｍであった。
【００４６】
その後、糖濃度が約２０重量％のサトウキビ汁を約２５ｍＬ、添加することにより、上記種培養物を発酵させた。炭酸カルシウムでｐＨを約５．５〜６．５に制御した。上記発酵は、微好気性条件下で約３７℃の温度で行った。振盪機混合速度は、約４８時間、約２５０ｒｐｍであった。
【００４７】
実施例２：培養工程が振盪機混合工程を含む、本発明に係るプロセスによるＤ−乳酸の生産
実施例１に記載の方法に従って、種培養物を調製した。その後、実施例１に記載の方法に従って、上記振盪機混合工程をせずに、上記種培養物を発酵させた。
【００４８】
実施例３：培養および発酵工程が振盪機混合工程を含み、上記発酵が５Ｌ発酵槽で行われる、本発明に係るプロセスによるＤ−乳酸の生産
種培養物を生産するための培養は、実施例１に記載の工程から得られた固形培地中の上記細菌を約０．５〜２％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液で希釈して、１リットルあたり乾燥細胞約１２，０００〜１６，０００ｍｇの濃度の細菌細胞を得ることによって行うことができた。次に、糖濃度が約１重量％の７５Ｌのサトウキビ汁、約１．１４ｇの酵母エキス、約０．３０ｇの塩化アンモニウム、約１８．７５ｍｇのリン酸水素二カリウム、約１８．７５ｍｇのリン酸二水素カリウム、約０．３９ｇの炭酸カルシウム、約３０ｍｇの硫酸マグネシウム、約１．５０ｍｇの硫酸マンガン、約１．５０ｍｇ硫酸第一鉄、および約１．５０ｍｇの食塩を含む、５００ｍＬフラスコに、約７５０μＬの上記希釈細菌を添加する工程を行う。この工程によって、１リットルあたり乾燥細胞約１２０〜１６０ｍｇの初期濃度の細菌細胞を得ることができた。次に、上記種培養物を得るために約３７℃の温度で培養を行った。ｐＨは、好気性条件下で炭酸カルシウムによって、約５．５〜６．５に制御された。細菌細胞の終期濃度が、１リットルあたり乾燥細胞約１，０００〜１，４００ｍｇになるまで、振盪機混合速度は約２００ｒｐｍであった。その後、得られた溶液を、糖濃度が約１重量％の約１．５Ｌのサトウキビ汁、約２２．５ｇの酵母エキス、約６．０ｇの塩化アンモニウム、約０．３８ｇのリン酸水素二カリウム、約０．３８ｇのリン酸二水素カリウム、約７．５ｇの炭酸カルシウム、約６００ｍｇの硫酸マグネシウム、約３０ｍｇの硫酸マンガン、約３０ｍｇの硫酸第一鉄、および約３０ｍｇの食塩を含む、５Ｌの発酵槽に添加した。その後、上記細菌を約３７℃の温度で培養し、好気条件下で炭酸カルシウムによりｐＨを約５．５〜６．５に制御した。空気を１．５Ｌ／分の速度で添加した。細菌細胞の濃度が１リットルあたり乾燥重量約１，０００〜１，４００ｍｇになるまで、振盪機混合速度は、約３００ｒｐｍであった。
【００４９】
その後、糖濃度が約２０重量％の約１．５Ｌのサトウキビ汁を添加することにより、上記工程で調製した種培養物を発酵させた。ｐＨは、炭酸カルシウムで約５．５〜６．５に制御された。発酵は、約３７℃の温度で、微好気性条件下で行われた。上記振盪機の混合速度は、約４５時間、約３００ｒｐｍであった。  表１は、本発明に係るサトウキビ汁を用いた発酵プロセスによる、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ細菌株（微生物アクセッション番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２３３４）のＤ−乳酸の生産を示す。
【００５０】
【表１】
2019536445.tif 000003
表１から、実施例１、２および３は、サトウキビ汁を用いたＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓの培養を行い、良好なＤ−乳酸を与える、本発明に係るプロセスで得られた種培養物を発酵させたことが分かった。言い換えれば、Ｄ−乳酸の最大量は約１１７ｇ／Ｌであり、初期の糖当たりの最大収率は約１．０ｇ／ｇであり、得られたＤ−乳酸の光学純度は約９９％であった。
【００５１】
＜発明の最良の形態＞
発明の最良の形態は、発明の説明に提供されている通りである。
【図１】
2019536445.tif 000004
【図２】
2019536445.tif 000005
【図３】
2019536445.tif 000006
【配列表】
2019536445000001.app
【国際調査報告】
2019536445.tif 000007
2019536445.tif 000008