(57)【要約】本発明は、グラム陰性菌又はカビ又は酵母の培養においてグラム陽性汚染菌の増殖を抑制する為に、抗菌剤を使用する方法に関する。該抗菌剤は、i)一般式(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM(式1)に従うラクチレート；一般式CH2OR1-CHOR2-CH2OR3(式2)に従うグリセロールエステル；及びそれらの混合物から選択される。上記の一般式において、RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；aは、1〜3の整数であり；及びbは、Mの原子価に等しい1又は2である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵培地であって、
微生物増殖用の基質；並びに
外因性の添加成分として、
i)下記の式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
ii)下記の式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
iii)そのような化合物の混合物
から選択される抗菌剤
を含み、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である、
上記発酵培地。
【請求項２】
グラム陰性菌、カビ又は酵母の培養物を含む接種物をさらに含む、請求項１に記載の発酵培地。
【請求項３】
該抗菌剤が、式1に従うラクチレート又はその塩である、請求項１又は２に記載の発酵培地。
【請求項４】
Rが、4〜18の炭素原子からなる直鎖又は分岐鎖を有するアシル基を表す、請求項３に記載の発酵培地。
【請求項５】
Rが、12〜14の炭素原子からなる直鎖又は分岐鎖を有するアシル基を表す、請求項４に記載の発酵培地。
【請求項６】
式1におけるaが1である、請求項５に記載の発酵培地。
【請求項７】
該抗菌剤が、式2に従うグリセロールエステルである、請求項１又は２に記載の発酵培地。
【請求項８】
R1、R2及びR3のうちの1つ又は2つが8の炭素原子を有するアシル基であり、且つ他がHである、請求項７に記載の発酵培地。
【請求項９】
該抗菌剤の量が、該培地の全重量に基づいて0.001〜0.5重量％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発酵培地。
【請求項１０】
該抗菌剤の量が、該培地の全重量に基づいて0.025〜0.5重量％である、請求項９に記載の発酵培地。
【請求項１１】
エタノール；1,3-プロパンジオール；グリセロール；ブタノール；1,4-ブタンジオール；アラビトール；キシリトール；ソルビトール；マンニトール；酢酸；プロピオン酸；3-ヒドロキシプロピオン酸；乳酸；コハク酸；2,5-フランジカルボン酸；フマル酸；リンゴ酸；アジピン酸；クエン酸；アコニット酸；グルタミン酸；イタコン酸；レブリン酸；グルタル酸；アスパラギン酸；マロン酸；及びそれらの混合物の生産の為の、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発酵培地。
【請求項１２】
1,4-ブタンジオール；プロピオン酸；3-ヒドロキシプロピオン酸；乳酸；コハク酸；2,5-フランジカルボン酸；フマル酸；リンゴ酸；又はイタコン酸の生産の為の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発酵培地。
【請求項１３】
発酵培地用の接種物であって、
グラム陰性菌、カビ又は酵母の培養物；並びに
i)下記の式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
ii)下記の式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
iii)そのような化合物の混合物
から選択される抗菌剤
を含み、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である、
上記接種物。
【請求項１４】
グラム陰性菌又はカビ又は酵母の培養においてグラム陽性汚染菌の増殖を抑制する為に、抗菌剤を使用する方法であって、該抗菌剤は、
式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
そのような化合物の混合物
から選択され、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である、
上記方法。
【請求項１５】
グラム陰性菌の発酵培養におけるグラム陽性菌によって引き起こされる微生物感染を防ぐ又は低減する為の方法であって、
式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
そのような化合物の混合物
から選択される抗菌剤の有効量を培養物に添加することを含み、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である、
上記方法。
【請求項１６】
発酵生産物を得る為の方法であって、
発酵培地を用意すること、そして
グラム陰性菌、カビ又は酵母の培養物を含む接種物を培地内に導入すること
を含み、
該方法は、該発酵培地が、
微生物増殖用の基質；並びに
外因性の添加成分として、
i)式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
ii)式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
iii)そのような化合物の混合物
から選択される抗菌剤
を含むことを特徴とし、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である、
上記方法。
【請求項１７】
該接種物が、大腸菌(Escherichia  coli)；アシネトバクター(Acinetobacter)；ボルデテラ(Bordetella)；ブルセラ(Brucella)；カンピロバクター(Campylobacter)；シアノバクテリア(Cyanobacteria)；エンテロバクター(Enterobacter)；エルウィニア(Erwinia)；フランシセラ(Franciscella)；ヘリコバクター(Helicobacter)；クレブシエラ(Klebsiella)；レジオネラ(Legionella)；モラクセラ(Moraxella)；ナイセリア(Neisseria)；パンテア(Pantooea)；パスツレラ科(Pasteurellaceae)；シュードモナス(Pseudomonas)；プロテウス(Proteus)；サルモネラ菌(Salmonella)；セレノモナス属(Selenomonadales)；セラチア(Serratia)；赤痢菌(Shigella)；トレポネーマ(Treponema)；ビブリオ(Vibrio)；エルシニア(Yersinia)；ザイノモナス(Zynomonas)；及びそれらの混合物から成る群から選択されるグラム陰性菌を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該接種物が、大腸菌、シュードモナス種、及びパスツレラ科の種、特にアクチノバチルス(Actinobacillus)属、ヘモフィルス(Hemophilus)属及びパスツレラ(Pasteurella)属の種、から成る群から選択される1以上のグラム陰性菌を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該接種物が、アスペルギルス(Aspergillus)及びクモノスカビ(Rhizopus)の属から選択される1以上のカビ、好ましくはアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus  oryzae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus  terreus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus  niger)；リゾプス・オリゴスポラス(Rhizopus  oligosporus)及びリゾプス・オリゼ(Rhizopus  oryzae)から選択される1以上のカビ、を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該接種物が、ブレタノマイセス属(Brettanomyces)；カンジダ属(Candida)；デッケラ属(Dekkera)；ピキア属(Pichia)；及びサッカロミセス属(Saccharomyces)の属から選択される1以上の酵母を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
エタノール；1,3-プロパンジオール；グリセロール；ブタノール；1,4-ブタンジオール；アラビトール；キシリトール；ソルビトール；マンニトール；酢酸；プロピオン酸；3-ヒドロキシプロピオン酸；乳酸；コハク酸；2,5-フランジカルボン酸；フマル酸；リンゴ酸；アジピン酸；クエン酸；アコニット酸；グルタミン酸；イタコン酸；レブリン酸；グルタル酸；アスパラギン酸；マロン酸；及びそれらの混合物から成る群から選択される発酵生産物を得る為の、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
プロピオン酸；乳酸；コハク酸；1,4-ブタンジオール；及び2,5-フランジカルボン酸から選択される発酵生産物を得る為の、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌、カビ及び酵母の培養におけるグラム陽性菌の増殖を抑制する為の方法に関する。特に、本発明は、ラクチレート、グリセロールエステル又はそれらの混合物を含む抗菌剤に及び発酵槽培養におけるそのような剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
他の微生物による感染の危険性は、純粋な培養物が用いられる全ての微生物学的プロセスに共通である問題の1つである。この危険性は、他の微生物による汚染の危険性が大規模工業発酵プロセスの規模の為に、実験室発酵槽プロセスと比較してより大きい場合の該大規模工業発酵プロセスに特に当てはまる。
【０００３】
酵母発酵において、作業者は、細菌防除剤(bacterial  control  agents)を用いることによって細菌汚染の危険性を軽減しようとしてきた。これらの剤は、例えば、（天然の）抗生物質及び亜硫酸塩を、酵母の生存率に影響を及ぼさないが汚染細菌の増殖を防ぐ濃度で含む。そのような剤の詳細は下記において記載されている：Ruckle等，Hop  acids  as  natural  anti-bacterials  can  efficiently  replace  antibiotics  in  ethanol  production，International  Sugar  Journal  108：139-147  (2006年)；及びLimayem等，Alternative  antimicrobial  compounds  to  control  potential  Lactobacillus  contamination  in  bioethanol  fermentations，Journal  of  Environmental  Science  and  Health，Part  B  46(8)：709-714，(2011年)。
【０００４】
今日では、遺伝子組み換えされた細菌はしばしば、多くの発酵生産物の生産菌として用いられている。一例は、Chang等，Homo-fermentative  production  of  D(-)  or  L(+)  lactate  in  metabolically  engineered  Escherichia  coli  RR1，Applied  and  Environmental  Microbiology  65(4)：1384-1389  (1999年)に記載されている通り、R-乳酸を生産することができる大腸菌の使用である。この生物は比較的単純で且つ安価な化学的に定義された培地上で増殖することが証明されたが、この生物の培養物は容易に感染する可能性があることが繰り返され観察された。汚染物質は、胞子形成微生物又はグラム陽性微生物であるように思われた。汚染グラム陽性菌の中には、例えば下記の病原菌がある：腸球菌(Enterococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、リステリア(Listeria)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、様々なバチルス(Bacillus)種、及び連鎖状球菌(Streptococcus)。汚染物質は乳酸の光学純度を著しく低下させる可能性があり、且つそれは他の発酵生成物を生成し、それによって発酵収率を低下させる可能性があるために、該汚染物質は望ましくない。それ故に、これらの微生物の増殖を抑制することには正当な理由がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、製造方法及び特には、関心のある発酵生産物の収率を安定化させることである。
【０００６】
グラム陰性菌又はカビ及び酵母を培養するときに、中鎖脂肪酸のラクチレート及び／又はグリセロールエステルの添加は、グラム陽性菌の増殖を特異的に阻害することが今見出された。有効量のラクチレート、グリセロールエステル又はそれらの混合物を添加すると、生産微生物は、発酵槽内で増殖し続けるが、汚染グラム陽性菌の増殖は防止又は抑制される。これは、発酵プロセスが、望ましくない微生物の増殖、望ましくない副産物、及びエネルギー源の非効率的な使用によって妨げられないことを確実にする。それはさらに、細菌汚染制御剤、例えば抗生物質、の必要添加量を減らす。
【０００７】
ラクチレートは、１つ(モノラクチレート)又は幾つかの乳酸分子(ジラクチレートなど)に結合した脂肪酸からのアシル基及び末端カルボキシレートに結合したプロトン（Ｈ＋）又は他のカチオンを有する化合物を云う。脂肪酸部分は典型的には、末端でカルボキシル基に結合された炭化水素鎖からなる。該炭化水素鎖は、異なる数の炭素原子を含むことができ、及び炭素原子間の結合は飽和又は不飽和であることができる。
【０００８】
ラクチレートは、既知の界面活性剤である。これらの界面活性剤は、R-乳酸若しくはS-乳酸又はこれら２つの任意の混合物を脂肪酸と反応させ、同時に塩基で中和することによって製造される。ラクチレートは食品業界において周知であり、肌の感触、肌の柔らかさ及び保湿を改善し且つ製品施与後の湿潤から乾燥への移行中の粘着性を減少させるためにパーソナルケア用途において用いられている。或るラクチレートは抗菌特性を有することが知られている。米国特許出願公開US2007/010856号(Cohen等)は、抗菌性化合物としてのなかんずくラクチレートで処理された縫合糸を記載する。米国特許出願公開US2006/062832号(Lopes)は、抗菌性化合物としてのラクチレートを含む拭き取り組成物を記載する。国際公開特許第WO2004/037177号パンフレット(Eveready  Battery  Inc．)は、抗菌性化合物としてのラクチレートを含む抗菌のシェービングフォーム又はゲル製剤を記載する。
【０００９】
国際公開特許第WO01/06877号パンフレット(Rhodia)は食品中のホップ酸と組み合わせたラクチレートの使用を記載し、該ホップ酸はグラム陽性菌に対して活性を有し、及びラクチレートは非常に広範囲の食品用乳化剤の中で一つのありうる補助成分として提案されている（第6頁）。ラクチレートの特定の使用は例示されておらず、及びラクチレートがグラム陽性細菌に対して個々の活性を有するという事実は、この参考文献において認識されていない。
【００１０】
国際公開特許第WO2004/107877号パンフレット(Purac  Biochem  BV)は、乳酸又はその誘導体と無機酸との混合物を含む抗微生物組成物を記載することに留意されたい。該組成物は、一般に抗菌剤として記載されている。サルモネラ菌(Salmonella)及び大腸菌に対する使用が指定されている。ラクチレートがありうる乳酸誘導体として言及されているが、それらの使用はさらに解明されていない。この文献は、グラム陽性菌に対するラクチレートの特定の有効性をグラム陰性菌と比較して教示又は示唆するものは何もない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の観点に従うと、下記の発酵培地が提供され、該発酵培地が、
微生物増殖用の基質；並びに
外因性の添加成分として、
i)下記の式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
ii)下記の式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
iii)そのような化合物の混合物
から選択される抗菌剤を含み、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である。
【００１２】
完全を期すために、本明細書において用いられる場合に、語「そのような化合物の混合物」は、抗菌剤が下記を含みうることを意味する：式1に従う2以上の化合物；式2に従う2以上の化合物；又は、式1及び式2に定義された化合物の混合物。
【００１３】
該発酵培地は、該培地の全重量に基づいて、0.001〜0.5重量％、好ましくは0.025〜0.5重量％、の量の抗菌剤を含みうる。代替的な表現において、該発酵培地は、0.1〜1000mg/L、好ましくは0.5〜500mg/L、及びより好ましくは1〜100mg/L、の発酵培地の濃度で抗菌剤を含みうる。
【００１４】
該発酵培地はさらに、グラム陰性菌、カビ又は酵母の培養物を含む接種物を含みうる。そのような培地を形成する際には、該抗菌剤は、グラム陰性菌、カビ又は酵母のその培養の前、後又はそれと一緒に添加されることができる。これらの添加様式は相互に排他的でなく、且つ本発明は、発酵の一段階より多い段階での抗菌剤の添加を排除しない。
【００１５】
しかしながら、好ましい実施態様において、該発酵培地は、該発酵培地を発酵微生物の接種前に、微生物増殖用の基質を上記抗菌剤と1分〜48時間、好ましくは1〜24時間、接触させることによって得られる。
【００１６】
代替的な又は追加の実施態様において、該発酵媒体は、発酵の生成物から誘導されるが、なかんずく水収支の為の発酵培地への投入物としてリサイクルされる流体である水性リサイクルプロセス流体に上記抗菌剤を添加することによって得られうる。
【００１７】
本発明の第2の観点に従うと、下記の発酵培地用の接種物が提供され、該発酵培地が、
グラム陰性菌、カビ又は酵母の培養物；及び
i)下記の式1に従うラクチレート
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
ii)下記の式2に従うグリセロールエステル
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3           (式2)；及び
iii)そのような化合物の混合物
から選択される抗菌剤を含み、
ここで、
RはC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し；
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、該アシル基は、分岐されていてもよく又は分岐されていなくてもよいアルキル又はアルケニル鎖を有し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基であり；
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム、若しくは1以上のヒドロキシで任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表し；
aは、1〜3の整数であり；及び
bは、Mの原子価に等しい1又は2である。
【００１８】
本発明のこの第２の観点は、グラム陽性菌による接種物の汚染を防ぐ。発酵培地を接種すると、抗菌剤はその培地中に分散され、そこで該培地の汚染物質として導入される可能性があるグラム陽性菌の増殖を抑制又は防止し続けることができる。
【００１９】
本発明はまた、グラム陰性菌、カビ又は酵母の培養においてグラム陽性汚染菌の増殖を抑制する為に、抗菌剤を使用する方法であって、該抗菌剤は、本明細書の上記に定義された式1に従うラクチレート；本明細書の上記に定義された式2に従うグリセロールエステル；又はそのような化合物の混合物から選択される、該方法を提供する。
【００２０】
本発明の更なる観点において、グラム陰性菌の発酵培養におけるグラム陽性菌によって引き起こされる微生物感染を防ぐ又は低減する為の方法であって、本明細書の上記に定義された式1に従うラクチレート；本明細書の上記に定義された式2に従うグリセロールエステル；及びそのような化合物の混合物から選択される抗菌剤の有効量を培養物に添加することを含む、上記方法が提供される。
【００２１】
そして、本発明の最後の観点に従うと、発酵生産物を得る為の方法であって、該方法は、添付された特許請求の範囲において定義されており、及び発酵培地を用意すること、そしてグラム陰性菌、カビ又は酵母の培養物を含む接種物を培地内に導入することを含む、上記方法が提供される。
【００２２】
定義
【００２３】
本明細書において用いられる場合に、語「含む(comprising)」は、以下のリストが網羅的ではなく、且つ必要に応じて、他の任意の追加の適切な項目、例えば１以上の更なる特徴、１以上の構成成分、１以上の成分及び／又は１以上の置換基、を含んでもよく又は含んでいなくてもよい。
【００２４】
「抗菌」である活性又は剤は、本明細書において、細菌を殺す及び／又は細菌の増殖を抑制することができる活性又は剤を意味する。
【００２５】
語「微生物増殖」は、その標準的な意味に従って本明細書において用いられる：例えば、「微生物増殖」は、微生物細胞、例えば細菌、カビ、真菌及び藻類を含む微生物細胞、の数及び/又は代謝活性における増大を云う。
【００２６】
本明細書において用いられる場合に、語「発酵培地」は、発酵容器内に保持されている三相（固体−液体−気体）系を意味する。液相は、水、溶存栄養素、微生物増殖の為の溶存基質及び溶存代謝物を含む；水の供給源は限定されず、及び特に、プロセス水、例えばバックセット(backset)及び／又は薄い蒸留塔、スクラバー水、蒸発かん凝縮液若しくは蒸留物、蒸留からのサイドストリッパー水、又は他の発酵生成物プラントプロセス水を含む。固相は、個々の細胞、ペレット、微生物増殖用の不溶性基質及び沈殿した代謝産物を含む。
【００２７】
微生物増殖の文脈において、語「基質」は、酵素の作用によって転化される又は他の化合物に転化されることを意味するところの任意の物質又は化合物を云う。語「基質」は、出発物質としての使用に適した炭素源、例えば任意のバイオマス由来炭水化物、を提供する化合物だけでなく、微生物に関連付けられた代謝経路において用いられる中間代謝産物を包含することを意図されている。該発酵培地は典型的には、基質として、1つ以上の発酵性炭水化物、例えば糖類、を含みうる。
【００２８】
本発明の発酵プロセスにおいて用いられる発酵基質及び他の原料を含む発酵培地は、発酵プロセスの前又はそれと同時に、粉砕、液化、糖化などによって処理されうる。従って、該発酵培地は、発酵微生物が添加される前の培地、例えば液化及び／又は糖化中の培地又はそれらから生じる培地、並びに発酵微生物を含む培地、例えば同時糖化発酵(SSF：simultaneous  saccharification  and  fermentation)又はワンステップ発酵プロセスにおいて用いられる培地、を云う。完全を期すために、完全性のために、抗菌剤が接種微生物の前に発酵培地に添加される上記のその実施形態において、これは液化及び／又は糖化の間の上記剤の添加を含む。
【００２９】
本明細書において用いられる場合に、語「発酵容器」は、発酵反応が行われる容器を意味する。語「発酵槽」は、発酵容器と互換的に使用されうる。
【００３０】
本明細書において用いられる場合に、「接種物」は、発酵容器に添加されることが意図されるが微生物群の最終組成を制限しない複雑な微生物群の元の供給源を意味する；該最終組成は発酵容器の操作条件及び生産性によって決定される。該接種物は典型的には、発酵容器よりもはるかに小さい適切な増殖タンク内で所望の1以上の微生物を増殖させることによって形成される。
【００３１】
該接種物は典型的には、関心のある発酵生産物を産生するために自然選択によって又はバイオテクノロジー手段によって適合されていてもよい微生物の1以上の「産生株」の培養物を含む。例示的であるが非限定的な接種物は、エタノールの産生用の酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces  cerevisiae)の培養物を含む。
【００３２】
語「培養物」は、それらの増殖を助長する所定の培養培地中における微生物、特に生産菌株、の繁殖を示す為に当技術分野において公知の様式において用いられる。本明細書において用いられる場合に、語「発酵培養」は、上記発酵培地内又は上記発酵培地に適した接種物内に存在する微生物の1以上の生産菌株の増殖を云う。
【００３３】
本発明において生産菌株として培養され且つ利用されうるグラム陰性菌を限定する意図はない。例示的であるが非限定的なグラム陰性菌は、下記を含む：大腸菌(Escherichia  coli)；アシネトバクター(Acinetobacter)；ボルデテラ(Bordetella)；ブルセラ(Brucella)；カンピロバクター(Campylobacter)；シアノバクテリア(Cyanobacteria)；エンテロバクター(Enterobacter)；エルウィニア(Erwinia)；フランシセラ(Franciscella)；ヘリコバクター(Helicobacter)；クレブシエラ(Klebsiella)；レジオネラ(Legionella)；モラクセラ(Moraxella)；ナイセリア(Neisseria)；パンテア(Pantooea)；パスツレラ科(Pasteurellaceae)、特にアクチノバチルス(Actinobacillus)属、ヘモフィルス(Hemophilus)属及びパスツレラ(Pasteurella)属の細菌；シュードモナス(Pseudomonas)；プロテウス(Proteus)；サルモネラ菌(Salmonella)；セレノモナス属(Selenomonadales)、特にプロピオニスピラ(Propionispira)、プロピオニスポラ(Propionispora)及びシュバルチア属(Schwartzia  genera)の細菌；セラチア(Serratia)；赤痢菌(Shigella)；トレポネーマ(Treponema)；ビブリオ(Vibrio)；エルシニア(Yersinia)；及び、ザイノモナス(Zynomonas)。興味深い実施形態において、該発酵培養物又は発酵培地は、大腸菌、シュードモナス種、及びパスツレラ科の種から成る群から選択される1以上のグラム陰性菌を含む。
【００３４】
言及されうる例示的なカビは、下記の属のカビである：アスペルギルス(Aspergillus)、特にアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus  oryzae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus  terreus)及びアスペルギルス・ニガー(Aspergillus  niger)；リゾプス(Rhizopus)、例えばリゾプス・オリゴスポラス(Rhizopus  oligosporus)及びリゾプス・オリゼ(Rhizopus  oryzae)；フサリウム(Fusarium)、例えばフサリウム・オキシスポルム(Fusarium  oxysporum)；ムコール(Mucor)、例えばムコール・ラセモサス(Mucor  racemosus)；クラドスポリウム(Cladosporium)、例えばクラドスポリウム・ヘルバルム(Cladosporium  herbarum)；ペニシリウム(Penicillum)、例えばペニシリウム・エキスパンサム(Penicillum  expansum)；及びトリコデルマ(Trichoderma)、例えばトリコデルマ・(Trichoderma  harzanium)。
【００３５】
本発明において用いられうる酵母属の非限定的な例は下記を含む：ブレタノマイセス属(Brettanomyces)；カンジダ属(Candida)；デッケラ属(Dekkera)；ピキア属(Pichia)；及びサッカロミセス属(Saccharomyces)。
【００３６】
特定の微生物が発酵することができる炭水化物は、当業者に一般に知られているか、又は公開されている、背景の文献で容易に入手可能である。完全を期すために、乳酸産生微生物によって発酵可能な一般的な炭水化物は以下を含むがこれらに限定されない：C5糖類、例えばアラビノース、キシロース及びリボース；C6糖類、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース及びマンノース；並びに、C12糖類、例えばスクロース、マルトース及びイソマルトース。
【００３７】
発酵性の炭水化物は主に、デンプンベース又は糖ベースの供給原料(feedstocks)から誘導される。供給原料の例は以下を含むが、これらに限定されない：トウモロコシ、小麦、ライコムギ、オオムギ、キャッサバ、ライムギ、上述の原料から得られる段階的なデンプンストリーム、サトウキビ、テンサイ、糖蜜(molasses)、稲わら、ジャガイモ廃棄物、木材廃棄物、スイッチグラス、マツ及び他の木材誘導体、都市廃棄物、食品廃棄物並びに飲料（アルコール及び非アルコール）産業廃棄物。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces  cerevisiae)による発酵用の例示的であるが非限定的な供給原料は糖蜜である。必要に応じて、バイオマス中の発酵性炭水化物の含有量が当技術分野において公知の方法によって決定されうる。特に有益な開示は、Milne等，Sourcebook  of  Methods  of  Analysis  for  Biomass  Conversion  and  Biomass  Conversion  Processes．SERI/SP-220-3548．Golden，CO：Solar  Energy  Research  Institute，1990年2月である。
【００３８】
グラム陰性菌、カビ及び酵母、例えば上述された微生物、によって生産されうる発酵生産物の例示的であるが非限定的なリストとして、下記が言及されうる：エタノール；1,3-プロパンジオール；グリセロール；ブタノール；1,4-ブタンジオール；アラビトール；キシリトール；ソルビトール；マンニトール；アセトイン；酢酸；プロピオン酸；3-ヒドロキシプロピオン酸；乳酸；コハク酸；フランジカルボン酸；フマル酸；リンゴ酸；アジピン酸；クエン酸；アコニット酸；グルタミン酸；イタコン酸；レブリン酸；グルタル酸；アスパラギン酸；マロン酸；グリシン；セリン；スレオニン；リジン；イソプレン；及び、ポリヒドロキシブチレート。1つの実施態様において、本発明において定義された抗菌剤を含む発酵培地は、エタノール；1,3-プロパンジオール；グリセロール；ブタノール；1,4-ブタンジオール；アラビトール；キシリトール；ソルビトール；マンニトール；酢酸；プロピオン酸；3-ヒドロキシプロピオン酸；乳酸；コハク酸；2,5-フランジカルボン酸；フマル酸；リンゴ酸；アジピン酸；クエン酸；アコニット酸；グルタミン酸；イタコン酸；レブリン酸；グルタル酸；アスパラギン酸；マロン酸；及びそれらの混合物の生産用でありうる。
【００３９】
抗菌剤が、1,4-ブタンジオール；プロピオン酸；3-ヒドロキシプロピオン酸；乳酸；コハク酸；2,5-フランジカルボン酸；フマル酸；リンゴ酸；又はイタコン酸の生産用の発酵培地に添加されている場合に良好な結果が得られた。そして、プロピオン酸；乳酸；コハク酸；1,4-ブタンジオール；又は2,5-フランジカルボン酸の生産用の発酵培地における上記抗菌剤を使用することが最も好ましい。完全を期すために、乳酸が発酵生成物として得られる場合に、本発明はまた下記を包含する：ラクチドを得る為のその乳酸の二量化；その乳酸の重縮合によるポリ乳酸の合成；及び、その乳酸から得られるラクチドの重合によるポリ乳酸の合成。
【００４０】
本明細書で言及され且つ適切な微生物での発酵性基質の発酵によって得られうるところの所望の1以上の発酵生成物は、典型的にはさらに、微量の発酵性基質；微生物によって生産された他の物質；及び微生物それ自体の痕跡、例えば細胞の残屑及び／又は細胞成分、を含む組成物の成分として産生されるであろうことを認識されるだろう。語「発酵生産物」は、粗生成物と、それが清澄化、精製及び／又は濃度を受けた後の生産物との両方を包含することを意図されている。例示的であるが非限定的な精製方法は、濾過、例えば精密濾過及び限外濾過を含む濾過；蒸留；（再）結晶化；抽出；化学処理、例えば酸性化；イオン交換；活性炭処理；及び電気透析の1以上を含む。
【００４１】
当技術分野において知られている通り、グラム陽性菌は、主にそれらの細胞壁中の多量のペプチドグリカンの為に、グラム染色によって濃い青又は紫に染色される。本発明は、発酵培養物中のそのような細菌の増殖を抑制又は防ぐことに関する。本発明は特に下記を含むグラム陽性菌の増殖を抑制又は防ぐことに関する：腸球菌(Enterococci)；クロストリジウム(Clostridium)、特にクロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium  perfringens)及びクロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium  pasteurianum)；リステリア(Listeria)、特にリステリア・モノサイトゲネス(Listeria  monocytogenes)及びリステリア・イノキュア(Listeria  innocua)；ブドウ球菌(Staphylococcus)、特にスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus  aureus)；様々なバチルス(Bacillus)種、特にバチルス・アンスラシス(Bacillus  anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus  cereus)及びバチルス・スブチリス(Bacillis  subtilis)；並びに連鎖状球菌(Streptococcus)。
【００４２】
本明細書において用いられる場合に、語「アシル基」は、カルボン酸からヒドロキシル基を除去することから誘導され且つ式RxCO-（式中、Rxは単一結合を有するCO基に結合されるアルキル基又はアルケニル基である）を有する官能基を意味する。1以上の不飽和結合が、アルケニル基中に存在しうる。従って、アシル鎖中の総炭素原子数は、Rx鎖中の炭素原子数＋１である。語(C4〜C18)アシルは、4〜18の炭素原子を有するアシル基を意味する。
【００４３】
本明細書において用いられる場合に、C4〜C18の1つのアシル基側鎖のみを有するグリセロールエステルは、(C4〜C18)グリセロールモノエステルと呼ばれる；C4〜C18の2つのアシル基を有するグリセロールエステルは、(C4〜C15)グリセロールジエステルと呼ばれる。上記のエステルの混合物は、(C4〜C18)グリセロールモノ／ジエステル又は(C4〜C18)グリセロールモノ／ジと呼ばれうる。
【００４４】
例示的なアシル基は、C6アシル基、例えばイソヘキサノイル基；C8のアシル基、例えばイソオクタノイル基；C10のアシル基、例えばデカノイル基；C12のアシル基、例えばラウリル(ドデカノイル)；C14のアシル基、例えばミリスチル(テトラデカノイル)基；C16のアシル基、例えばセチル及びパルミチル(ヘキサデカノイル)基；及びC18のアシル基、例えばオクタデカノイル、を含む。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
概括的に、上記の式1及び式2で定義された化合物は、これらの化合物のうちの1以上を培養培地に添加することを通じてグラム陰性菌、カビ又は酵母を培養する際のグラム陽性汚染菌の増殖の抑制に用いられる。グラム陽性汚染菌の増殖を抑制する際に、所望の発酵生産物の生産を改善することが可能である。
【００４６】
本発明は、抗菌剤として、式1に適合する2以上の化合物又は式2に適合する2以上の化合物の添加を排除するものでない。その上、式1及び式2に定義された化合物の混合物がまた使用されうる。
【００４７】
発酵培地、接種物又は発酵培養物に投与される抗菌剤の総量は、グラム陽性菌によって引き起こされる汚染を抑制する、防ぐ又は軽減するのに有効であるようなものである。抗菌剤の正確な量は、多くの要因、例えば用いられる特定の剤、培養される生産株、培地の種類及びエネルギー源、に依存するだろう。しかしながら、ほとんどの実施形態において、発酵培地又は他の培養培地は、該培地の全重量に基づいて、上記の定義された抗菌剤の0.001〜0.5重量％、好ましくは0.025〜0.5重量％、及びより好ましくは0.1〜0.5重量％、を含むだろう。
【００４８】
ラクチレート及び／又はグリセロールエステルに基づく上記の抗菌剤に加えて、該発酵培地は、グラム陽性菌に対して有効性を有するがグラム陰性菌に対して実質的に影響を及ぼさない少なくとも1つの補助抗菌成分を含みうる。そのような補助成分は、外因性成分として発酵培地に直接添加されうる。追加的に又は代替的に、該補助成分は発酵培地用の接種物に含まれうる。
【００４９】
1つの実施態様において、該発酵培地、接種物又は発酵培養物は、該培地の全重量に基づいて、下記からなる群から選択される補助抗菌剤の最大1重量％含みうる：リゾチーム；ナイシン；ペジオシン；ε-ポリリジン；プロタミン；ホップベータ酸；ロジン酸；ピメリン酸；安息香酸；p-ヒドロキシ安息香酸；サリチル酸；ケイ皮酸；クエン酸；8〜16の炭素原子の鎖長を有する飽和脂肪酸；8〜16の炭素原子の鎖長を有する飽和脂肪酸の糖エステル；及びそれらの混合物。代替的な表現において、該発酵培地は、2000mg/Lまでの上記補助抗菌剤を含みうる。
【００５０】
式1
【００５１】
本発明において用いられるラクチレートは、下記の式1に従う構造を有する：
(R-(O-CH(CH3)-CO)aO)bM        (式1)；
【００５２】
Rは、C4〜C18のアシル基、好ましくはC8〜C14のアシル基、より好ましくはC10〜C14のアシル基、及び最も好ましくはC12〜C14のアシル基、を表す。
【００５３】
Mは、プロトン(H+)、又はLi、Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe(II)、Cu、Mn、Ag、アンモニウム若しくは1以上の水酸基で任意的に置換されていてもよい1以上の(C1〜4)アルキルを有する置換アンモニウムの群から選択される対カチオンを表す。好ましくは、Mは、Na、K、Ca及びMgから成る群から選択される。より好ましくは、MはNaである。
【００５４】
(O-CH(CH3)-CO)O基は、R又はS-乳酸から誘導されるR又はS立体配置（1979年版のIUPAC有機化学命名法のセクションEに定義されている通り）のいずれかのラクチル基を表す。該基はまた、そのような立体異性体配置の混合物を表しうる。
【００５５】
bの値はMの価数に等しい。それによって、Mがプロトン(H+)、又は一価のカチオン、例えばNa、K、Ag、アンモニウム(NH4)若しくは置換アンモニウムである場合、該bは、1の値を達成する。該bは、Mが二価のカチオン、例えばCa、Mg、Zn、Mn、Fe(II)又はCuである場合に、2の値を達成する。
【００５６】
該aの値は1〜3であってもよく、1が好ましい。該aが1であるラクチレートはモノラクチレートと呼ばれる；該aが2である化合物はジラクチレートと呼ばれる；及び該aが3である化合物はトリラクチレートと呼ばれる。モノラクチレート(a=1)が、本明細書における使用において好ましい。しかしながら、モノラクチレートが抗菌剤に含まれる場合、それらの中の微量のジラクチレート及びトリラクチレートの存在を排除するものでないこと；より高次の種はモノラクチレートを合成する過程で生じることができることに留意されたい。
【００５７】
本発明における抗菌剤として有用性を見出す式1の例示的なラクチレートは、下記を含むが、これらに限定されない：ドデカノイル-ラクチレート(C12-ラクチレート)；テトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)；ヘキサデカノイル-ラクチレート(C16-ラクチレート)；オクタデカノイルラクチレート(C18：0-ラクチレート)、及びオクタデカ-9-エノイル-ラクチレート(C18：1-ラクチレート)。
【００５８】
そのようなラクチレートの合成方法は当該分野において知られている。下記が言及されうる：米国特許第3,883,669(Tsen等)；米国特許第4,146,548(Forsythe)；Elliger，A  convenient  preparation  of  pure  stearoyl-2-lactylic  acid，Journal  of  Agricultural  and  Food  Chemistry  27：527(1979年)；及び国際特許公開WO2012/036693号パンフレット(Caravan  Ingredients  Inc.)。さらに、そのような合成方法において得られた粗ラクチレートは、濾過；遠心分離；蒸留；結晶化；抽出；及びクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない慣用的な方法によって精製されうる。
【００５９】
式2
【００６０】
本発明における抗菌剤としての使用に適したグリセロールエステルは下記の式2に定義される。
CH2OR1-CHOR2-CH2OR3         (式2)
【００６１】
R1、R2及びR3はそれぞれ独立して、H又はC4〜C18のアシル基を表し、但し、R1、R2及びR3の少なくとも1つはHであり且つR1、R2及びR3の少なくとも1つはアシル基である。
【００６２】
第1の実施態様において、R1、R2及びR3のうちの1つ又は2つがC6〜C14のアシル基であり、且つ残りのRn基がHである。好ましくは、R1、R2及びR3のうちの1つ又は2つがC8のアシル基であり、且つ残りのRn基がHである。
【００６３】
本発明は、抗菌剤内のグリセロールモノエステル及びジエステルの混合物の使用を排除しないことに留意されたい。例えば、良好な結果が、(C8)グリセロールモノ／ジエステルの使用から得られている。
【００６４】
そのようなモノ及びジエステルの合成方法は、当技術分野において知られている。例えば、グリセロールのC4〜C18エステルの商業的合成は典型的には、２つの異なる経路によって行われる：グリセロールで脂肪酸を直接エステル化し（グリセロリシス）、均一な酸、例えば硫酸又はスルホン酸、によって、又は、NaOH、KOH若しくはCa(OH)2のようなアルカリ性水酸化物、及び低分子量アルコール、例えばメタノール、のナトリウム塩によって触媒されるトリグリセリド及びポリアルコールのエステル交換によって触媒される。下記がまた参照されうる：Mostafa等，Production  of  mono-，di-，and  triglycerides  from  waste  fatty  acids  through  esterification  with  glycerol  Advances  in  Bioscience  and  Biotechnology  Advances  in  Bioscience  and  Biotechnology，2013年，4，900-907；Hyun等，.A  single  step  non-catalytic  esterification  of  palm  脂肪酸  distillate  (PFAD)  for  iodiesel  roduction．Fuel，93，373-380  (2012年)。さらに、そのような合成方法において得られた粗グリセロールエステルは、濾過；遠心分離；蒸留；結晶化；抽出；及びクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない慣用的な方法によって精製されうる。
【００６５】
本発明は下記の実施例によってさらに説明されるが、該実施例は本発明の利点を示したものであり、本発明はそれらに限定されるものでない。
【００６６】
実施例
【００６７】
AMCET  200C：C8-グリセロールモノ−及びジエステル混合物，Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国から購入された。
【００６８】
AMCET  3400E：デカノイル-ラクチレート(C10-ラクチレート)及びドデカノイル-ラクチレートの混合物(C12-ラクチレート，Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国から購入された。
【００６９】
AMCET  4530E：ドデカノイル-ラクチレート(C12-ラクチレート)及びテトラデカノイル-ラクチレートの混合物(C14-ラクチレート)，Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国から購入された。
【００７０】
ATCC：  American  Type  Culture  Collection，Manassas，Virginia，米国
【００７１】
Bioscreen  C：Oy  Growth  Curves  Ab  Ltd，Helsinki，フィンランド，から入手可能な培養系。バイオスクリーン(Bioscreen)  Cは、同時に最大200ウェルまでの垂直測光によって濁度(成長)の発生を動力学的に測定する。
【００７２】
EMPLEX：C18-ラクチレート，Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国から購入された。
【００７３】
MIC：光学濃度試験において測定される最小阻止濃度は、培養物の吸光度における増加が閾値を超えない最低濃度であり、それはブランクの吸光度値における平均増加＋3倍の標準偏差として定義された。
【００７４】
オラクタ(Olacta)：オクタデセノイル-ラクチレート(C18：1-ラクチレート)は、Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国から購入された。
【００７５】
Pationic  122A：1.3：1のモル比における2つのラクチレート，特にデカノイルラクチレートナトリウム(カプロイルラクチレートナトリウム)及びドデカノイルラクチレートナトリウム(ラウリルラクチレートナトリウム)，の混合物は、Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国から購入された。
【００７６】
実施例1：大腸菌とクロストリジウム・パストゥリアヌムとの混合培養物に対するテトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)の影響
【００７７】
テトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)が生物工学的ホモラクティックR-乳酸産生大腸菌TG128(NRRL  B-30962，NRRL：Agricultural  Research  Service  Culture  Collection，National  Center  for  Agricultural  Utilization  Research，Peoria，Illinois，米国)の培養物中でのクロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2(NCCB  100154，NCCB：Netherlands  Culture  Collection  of  Bacteria，Utrecht，オランダ)の増殖を防ぐことができるかどうかを決定する為に、３つの異なる発酵が設定され、そして同時に行われた。これらの発酵は下記の通りである：
i）発酵槽1：大腸菌TG128  純粋培養発酵；
ii）発酵槽2：大腸菌TG128  クロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2と混合された；
iii）発酵槽3：大腸菌TG128  0.05％(w/v)のテトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート：Corbion  Caravan，Lenexa，Kansas，米国)を添加して、クロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2と混合された。
【００７８】
3回全ての発酵は、無菌の7リットル発酵槽において行われた。発酵槽1、2及び3は、下記の組成の3.5リットルの無菌増殖培地を受け入れた：3.25リットルの脱塩水、385gのグルコース一水和物、12.25gのリン酸二アンモニウム、17.75gのリン酸水素二カリウム、12.25gのリン酸水素二カリウム、3.5mlの1M  塩酸ベタイン溶液、5.25mlの1M  MgSO4(硫酸マグネシウム)溶液、3.5mlの1M  CaCl2(塩化カルシウム)溶液及び5.25mlの微量金属溶液。該微量元素溶液は、1リットル当たり下記を含む：1.6gのFeCl3(塩化鉄(III))、0.2gのCoCl2.6H2O(塩化コバルト)、0.1gのCuCl2(塩化銅)、0.2gのZnCl2.4H2O(塩化亜鉛)、0.2gのNaMoO4(モリブデン酸ナトリウム)、H3BO3(ホウ酸)及び10mlの37％(w/w)HCl(塩酸)。発酵槽3は、0.05％(w/v)のテトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)を受け入れた。
【００７９】
3つの全ての発酵槽はpHプローブを備えていた。発酵のpHが、脱塩水中のCa(OH)2のスラリーを添加することによって6.5の値に制御された。Ca(OH)2スラリーの濃度は、およそ220g／リットルであった。発酵槽の温度は37℃の値で一定に保たれた。
【００８０】
各発酵槽(1、2及び3)は、80mlの活発に増殖している大腸菌TG128で接種された。発酵槽2及び3はまた、ブレインハートインフュージョンブロス(brain  heart  infusion  broth)上で増殖するクロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2の培養物の1mlで接種された。発酵の進行に依存して、発酵槽培養が25〜35時間運転された後、それらが分析された。(化学的)分析の結果が、本明細書中の下記の表１において要約されている。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
接種の12時間後に、発酵槽2が大量の泡と腐敗臭とを生成し始めたことが観察された。培養ブロスの顕微鏡検査は、多数の内生胞子を有する細胞の存在を明らかにした。この現象は、クロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2が無制限に増殖しているときに見られる。
【００８３】
大腸菌TG128及びクロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2の混合培養物でまた接種されたが0.05％(w/v)のテトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)もまた受け入れられた発酵槽3は、泡又は腐敗臭を生じなかった。その上、発酵槽3から採取された培養ブロスの顕微鏡検査は、それが内生胞子担持細胞を含まないことを示した。
【００８４】
発酵槽3の性能は大腸菌TG128の純粋培養物で接種された発酵槽1の性能とあらゆる点で同様であった。その上、発酵ブロスの化学分析(表1)は、大腸菌TG128標準発酵(発酵槽1)とテトラデカノイル-ラクチレートを含む大腸菌／クロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2混合培養物(発酵槽3)との間に不純物プロファイルにおいて差がないことを示した。発酵槽1及び3において生成されたラクテートの鏡像体過剰率は100に近く、及び少量のS-ラクテートのみが発酵槽3において検出されたが、これはおそらくはラクチレートエステルの鹸化により導入されたものである。
【００８５】
他方では、発酵槽2における鏡像体過剰率パーセントは、クロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2の無制限の増殖の故にかなり低かった。その上、さらに、発酵槽2において生産される乳酸の総量がまたかなり低かった。鏡像体過剰率パーセントは、下記の通り定義される：((R-S)/(R+S))*100、ここで、R及びSは、R-及びS-ラクテート含有発酵ブロスにおけるエナンチオマーの個々の画分を表す。
【００８６】
発酵槽3が、0.05％(w/v)の代わりに0.025％(w/v)のテトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)で強化された場合に全く同じ結果が得られた。
【００８７】
実施例2：大腸菌及びクロストリジウム・パストゥリアヌムの混合培養物に対するデカノイル-ラクチレート(C10-ラクチレート)とドデカノイル-ラクチレート(C12-ラクチレート)との混合物又はデカノイル-ラクチレート(C12-ラクチレート)とテトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)との混合物の影響
【００８８】
実施例1において記載された同じ実験設定において、大腸菌TG128の培養物におけるクロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2の増殖を抑制する為の、0.05％(w/v)のAMCET  3400E及び0.05％(w/v)のAMCET  4530Eの有効性が試験された。
【００８９】
AMCET  3400E又はAMCET  4530Eのいずれかを用いた発酵槽3の性能は、大腸菌TG128の純粋培養物で接種された発酵槽1の性能とあらゆる点で同様であった。その上、発酵ブロスの化学分析は、大腸菌TG128標準発酵(発酵槽1)と、AMCET  3400E又はAMCET  4530Eを含む大腸菌／クロストリジウム・パストゥリアヌムJEG2混合培養物(発酵槽3)との間に不純物プロファイルにおいて差がないことを示した。発酵槽1及び3において生成されたラクテートの鏡像体過剰率は、AMCET  3400E及びAMCET  4530Eについて100に近い。
【００９０】
実施例3：クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium  perfringens)に対するラクチレートのイン・ビボ試験
【００９１】
増殖を阻害する為に、式1に定義された通りのラクチレート及び式2に定義された通りのグリセロールエステルの有効性が、バイオスクリーン(Bioscreen)C培養系において、クロストリジウム・パーフリンゲンスATCC  13124に対して試験された。
【００９２】
培養物の光学密度が、広帯域フィルターを用いて420〜580nmで一定の時間間隔で自動的に測定された。試験有機体の増殖速度が30℃で測定された。低酸素状態を確実にする為に、バイオスクリーン(Bioscreen)がM-12型酸素センサーを備えられた嫌気性キャビネット内に置かれた(In  Vivo2  400  hypoxia  workstation，Biotrace  International  Plc，Bridgend，英国)。酸素圧が、Ruskinnガスミキサーモジュール(Biotrace  International  Plc)を用いて調節された。
【００９３】
ブレインハートインフュージョンブロスが、本明細書の下記の表2において示されている通り、種々のラクチレート及びグリセロールエステルの様々な量を用いて調製された。
【００９４】
下記の化合物が試験された：オクタノイル-ラクチレート(C8-ラクチレート)、デカノイル-ラクチレート(C10-ラクチレート)、ドデカノイル-ラクチレート(C12-ラクチレート)、テトラデカノイル-ラクチレート(C14-ラクチレート)、ヘキサデカノイル-ラクチレート(C16-ラクチレート)、オラクタ(オクタデセノイル-ラクチレート，C18：1-ラクチレート)、AMCET  3400E、AMCET  4530E、C8-グリセロールモノ／ジ，C10-グリセロールモノ／ジ，C12-グリセロールモノ／ジ，C14-グリセロールモノ／ジ，テトラデカン酸(ミリスチン酸)及びテトラデシル硫酸ナトリウム(硫酸ナトリウムミリスチル)。
【００９５】
【表２】
2019531066.tif 000003
【００９６】
テトラデカン酸(ミリスチン酸)、テトラデシル硫酸ナトリウム(硫酸ナトリウムミリスチル)は、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)から購入された。
【００９７】
培地のpHが、Blueline  16  pH  (マイクロ)プローブ(No．285129163)を備えられたHandylab  pH  12  pHメーターを用いて9Mの硫酸で6.0に調整された。全ての培地は、0.45μmの酢酸セルロースフィルター(Minisart  syringefilter，sterile  and  non-pyrogenic，no．16555，Sartorius，Gottingen，ドイツ)を用いた濾過によって滅菌された(9)。300μlの各培地が、滅菌Bioscreen  Honeycombe  100ウェルプレート(Thermo  electron  Oy，Vantaa，フィンランド)のパネルに移された。完成したウェルプレートが、さらに使用するまで&#8211;30℃で保存された。ウェルプレートは、滅菌ハミルトン反復ディスペンサー(Hamilton  repeating  dispenser)(Hamilton，Bonaduz，スイス)を用いて3μlの種培養物を接種された。クロストリジウム・パーフリンゲンスATCC  13124の液体種培養物が、10mlのブレインハートインフュージョンブロス(Oxoid  CM225，Basingstoke，英国)を含むスクリューキャップ付きチューブ(100x16mm)中、24時間、30℃で調製された。
【００９８】
表3は、ブレインハートインフュージョンブロス中のクロストリジウム・パーフリンゲンスATCC  13124についてのラクチレート、グリセロールエステル、テトラデカン酸(ミリスチン酸)及びテトラデシル硫酸ナトリウム(硫酸ナトリウムミリスチル)のMIC値を示す。括弧内において、反復数が与えられている。
【００９９】
【表３】
2019531066.tif 000004
【０１００】
非常に低い濃度でさえ、ラクチレート及びグリセロールエステルは、ロストリジウム・パーフリンゲンスATCC  13124の増殖を抑制することができると思われる。
【０１０１】
実施例4：幾つかのラクチレート及びC8-グリセロールモノ／ジエステルの抗菌特性
【０１０２】
増殖を阻害する為の、式1において定義された種々のラクチレートの選択された数及び式2において定義されたC8-グリセロールモノ／ジエステル(カプリル酸モノ／ジ)の有効性が、バイオスクリーンC培養系(Bioscreen  C  culture  system)において、グラム陽性及びグラム陰性菌の選択に対して試験された。培養物の光学密度が、広帯域フィルターを用いて420〜580nmで一定の時間間隔で自動的に測定された。試験有機体の増殖速度が30℃で測定された。
【０１０３】
ブレインハートインフュージョンブロスが、様々な量のラクチレート又はC8-グリセロールモノ／ジエステル(カプリル酸モノ／ジ)で調製された。下記の化合物が試験された：AMCET  3400E；AMCET  4530E；EMPLEX；及びAMCET  200C。
【０１０４】
培地のpHが、Blueline  16  pH  (マイクロ)プローブ(No．285129163)を備えられたHandylab  pH  12  pHメーターを用いて9Mの硫酸で6.0に調整された。全ての培地は、0.45μmの酢酸セルロースフィルター(Minisart  syringefilter，sterile  and  non-pyrogenic，no．16555，Sartorius，Gottingen，ドイツ)を用いた濾過によって滅菌された。300μlの各培地が、滅菌Bioscreen  Honeycombe  100ウェルプレート(Thermo  electron  Oy，Vantaa，フィンランド)のパネルに移された。完成したウェルプレートが、さらに使用するまで4℃で保存された。ウェルプレートは、滅菌ハミルトン反復ディスペンサー(Hamilton，Bonaduz，スイス)を用いて3μlの適切な試験培養物を接種された。
【０１０５】
液体種培養物が調製され、下記の培養物が本試験において用いられた：
大腸菌  serotype  O157：H7  (ATCC  700728)；
大腸菌  (ATCC  8739)；
スタフィロコッカス・アウレウス  (ATCC  6538P)；
リステリア・モノサイトゲネス  (F2399)；
リステリア・モノサイトゲネス  (ATCC  7644)；
リステリア・モノサイトゲネス  NFPA  83  (Seman，D．L．，A．C．Borger等，(2002年)  Journal  of  Food  Protection  65(4)：651-658)；
リステリア・モノサイトゲネス  LCDC  861  (Seman，D．L．，A．C．Borger等，(2002年)  Journal  of  Food  Protection  65(4)：651-658)； 
リステリア・イノキュア  (ATCC  33090)；
リステリア・イノキュア  TNO  strain  (TNO，Zeist，オランダ)；
サルモネラ・エンテリカ(Salmonella  enterica)  (ATCC  13076，S．Enteritidis)；
サルモネラ・エンテリカ  (ATCC  13311，S．Typhimurium)；
サルモネラ・エンテリカ  JAVA  (NCTC  8458，NCTC： National  Collection  of  Type  Cultures，Porton  Down，Salisbury，英国)；
ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus  sakei)  (DSMZ  20017，DSMZ：Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen  GmbH，Braunschweig，ドイツ)；
ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus  plantarum)  (DSMZ  20174)；
ラクトバチルス・カルバタス(Lactobacillus  curvatus)  (DSMZ  20019)；
バチルス・セレウス  (ATCC  11778)；
シュードモナス・ルンデンシス(Pseudomonas  lundensis)  (LMG  13517，LMG：Belgian  Coordinated  Collections  of  Microorganisms／LMG  Bacteria Collection，Gent，ベルギー)；及び
シュードモナス・フラギ(Pseudomonas  fragi)  (LMG  2191)。
【０１０６】
全ての培養物が、10mlのブレインハートインフュージョンブロス(Oxoid  CM0225，Basingstoke，英国)含むスクリューキャップ付きチューブ(100x16mm)中に毎日移された。ラクトバチルス種が、MRSブロス(Oxoid  CM0359)中に移された。全ての培養物が、30℃で、撹拌せずにインキュベーションされた。
【０１０７】
我々は、AMCET  3400E、AMCET  4530E、EMPLEX及びAMCET  200Cの種々の濃度の影響を調べた。
【０１０８】
本明細書における下記の表4及び表5に要約されているデータは、グラム陽性菌がグラム陰性菌種よりもこれらの化合物に対してより感受性があることを示す。表5におけるデータはまた、AMCET  200Cがラクチレートよりもはるかに広い範囲の有機体に対して活性であること及びそれがまたグラム陰性菌を包含することを示す。グラム陰性菌に対するAMCET  200C(C8-グリセロールモノ／ジ)の有効濃度は0.5〜1％(w/w)である。
【０１０９】
【表４】
2019531066.tif 000005
【０１１０】
下記の2つの濃度範囲が試験された：0〜0.1％(w/w)及び0〜0.01％(w/w)。表4の中で、0〜0.01％の濃度範囲についての結果が括弧内において示されている。「+」記号は阻害を示す。グラム陽性有機体は、リステリア、バチルス、ブドウ球菌及びラクトバチルスである。
【０１１１】
【表５】
2019531066.tif 000006
【０１１２】
試験された濃度範囲は、0〜1％(w/w)である。表5内において、「+」記号は阻害を示し、NTは、試験されなかったことを示す。グラム陽性有機体は、リステリア、バチルス、ブドウ球菌及びラクトバチルスである。
【０１１３】
実施例5：サッカロマイセス・セレビシエを用いたエタノール発酵
【０１１４】
この実施例は、サッカロマイセス・セレビシエを用いたエタノール発酵における低濃度のラクチレート混合物の効果を文書化したものであり、該発酵はサトウキビ糖蜜で進行し、且つラクトバチルス種の混合培養物で意図的に汚染されている。
【０１１５】
培養及び培養条件
【０１１６】
サッカロマイセス・セレビシエMUCL30115は、Mycotheque  de  l'Universite  Catholique  de  Louvain(BCCM/MUCL，Louvain-la-Neuve，ベルギー)から入手され、酵母-ペプトン-グルコースブロス(YPG：yeast-peptone-glucose  broth)中で前培養された。該YPG-ブロスは、1リットルの脱塩水当たり、下記を含んでいた：40gのグルコース一水和物；10gのBacto(商標)ペプトン(Becton，Dickinson  and  Company，Sparks，Maryland，米国)；及び5gのBacto(商標)酵母抽出物(Becton，Dickinson  and  Company，Sparks，Maryland，米国)。該培地のpHが、1NのHClで6.0〜7.0に調整された。培養物が、室温で、振盪フラスコ中でインキュベーションされた。
【０１１７】
ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus  brevis)LMG11438は、Laboratorium  voor  Microbiologie，Universiteit  Gent(BCCM/LMG，Gent，ベルギー)から入手された。ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus  fermentum)AR748及びラクトバチルス・フルクティヴォランス(Lactobacillus  fructivorans)AR742は、Corbion  Purac  B．V．，Gorinchem，オランダから得られた。全ての菌株は、MRS-ブロス(de  Man等  (1960年)  A  medium  for  the  cultivation  of  lactobacilli．J．Appl．Bacteriology  23(1)：130-135)上で前培養され、そして固定スクリューキャップ付きフラスコ中、30℃でインキュベーションされた。混合培養物が、等容量の3つのラクトバチルス培養物を混合することによって調製された。
【０１１８】
全ての発酵実験が、下記の組成を有する0.5リットルの液体培地を含む3リットルのジャケット付きガラス発酵槽において行われた：50gのサトウキビ糖蜜(85oBrix)；及び450mlの脱塩水。各発酵の温度は、循環水浴を用いて30°Cで制御され、且つpHは、1NのNaOHを用いて5.5に制御された。
【０１１９】
2つの一次発酵槽(A，B)が、それぞれ50mlの活発に発酵するサッカロミセス培養物で接種された：これらの培養物の両方がまた10mlの混合ラクトバチルス培養物を受け入れられた。これらの発酵槽(A)のうちの1つに、その上にラクチレートの影響を研究する為に、10％(w/w)のPationic  122Aを含む0.5mlの溶液が添加された。
【０１２０】
24時間の発酵後、9〜10容量％の接種物が各発酵槽(A，B)から除かれ、そして新鮮培地を含む更なる発酵槽(A’，B’)にそれぞれ移された：一次発酵槽(A，B)における発酵が進行された。このバックスロープ(back  slopping)法を用いて、接種物の6〜8回の更なる移動が、ソース発酵槽において24時間の発酵後にそれぞれ行われた。
【０１２１】
分析方法
【０１２２】
L(+)乳酸、D(-)乳酸及び残余のグルコースの量は、酵素的手順を用いて決定された。具体的に且つ指定された製造業者のプロトコルそれぞれ従って、グルコースは、Megazyme  Internationalから入手可能なK-Glucキットを用いてアッセイされた；D-乳酸は、Megazyme  Internationalから入手可能なK-Dateキットを用いてアッセイされた；及び、L-乳酸は、Megazyme  Internationalから入手可能なL-Dateキットを用いてアッセイされた。
【０１２３】
有機酸及びエタノールが、ガスクロマトグラフィー分析によって測定された。
【０１２４】
結果
【０１２５】
下記の表6は、ラクトバチルス種の混合培養物で汚染された発酵物中の決定された量のL(+)乳酸、D(-)乳酸及びエタノールを示す。Pationic  122Aをまた含むサッカロマイセス・セレビシエのそれらの発酵培養物において、ラクチレートブレンドを含まない培養物と比較して、L(+)、特にD(-)乳酸、の定常濃度の有意な低下があることが示されている。その上、Pationic  122Aを含むサッカロマイセス・セレビシエの培養物のエタノール濃度は、ラクチレートブレンドが存在しない培養物よりも有意に上昇している。Pationic  122Aのプラスの効果は、少なくとも6〜8回の連続した移動に対して維持されることができた。
【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
本明細書を考慮すると、様々な修正が本発明の範囲から逸脱することなしに開示された実施形態に加えられることができることは当業者には明らかであろう。それ故に、実施形態及び実施例は例示的なものにすぎないことが意図され、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示されている。
【国際調査報告】
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