(57)【要約】  本明細書において、抗体重鎖可変ドメインと多量体化ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとを含む、組換え融合ポリペプチドを報告し、ここでの抗体重鎖可変ドメインは多量体化ドメインの一方の末端に（直接的に又は第一の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、抗体軽鎖ドメインは多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に（直接的に又は第二の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、抗体重鎖可変ドメイン又は抗体軽鎖ドメインは多量体化ドメインに対する（ペプチド内）ジスルフィド結合を有する。
2019524681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体重鎖可変ドメイン、多量体化ドメイン、及び抗体軽鎖可変ドメインを含む融合ポリペプチドであって、
−該抗体重鎖可変ドメインは、多量体化ドメインの一方の末端に（直接的に又は第一の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、
−該抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に（直接的に又は第二の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、そして
−該抗体重鎖可変ドメイン又は該抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインに対する（ペプチド内）ジスルフィド結合を有する、融合ポリペプチド。
【請求項２】
ジスルフィド結合が、抗体重鎖可変ドメインと多量体化ドメインとの間に存在する、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが、８２ｂ位（Ｋａｂａｔによる）にシステインアミノ酸残基を含み、ジスルフィド結合が、前記重鎖可変ドメインの８２ｂ位のシステイン残基と多量体化ドメインとの間に存在する、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
多量体化ドメインが、抗体ＣＨ３ドメイン、抗体ＣＨ１ドメイン、又は抗体ＣＬドメイン、又はその各々の断片若しくは変異体に由来する、請求項１〜３のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
多量体化ドメインが、４３３位（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）にシステインアミノ酸残基を有する抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、ジスルフィド結合が、重鎖可変ドメインの８２ｂ位のシステイン残基とＣＨ３ドメインの４３３位のシステイン残基との間に存在する、請求項４記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の２つの融合ポリペプチドからなる抗体。
【請求項７】
ａ）第一の抗体重鎖可変ドメイン、
第一の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第一の多量体化ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
ｂ）第二の抗体重鎖可変ドメイン、
第二の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第二の多量体化ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む抗体であって、
第一のポリペプチドの可変ドメインは、第一の標的に特異的に結合する第一の機能的結合部位を形成し、第二のポリペプチドの可変ドメインは、第二の標的に特異的に結合する第二の機能的結合部位を形成し、
第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、多量体化ドメイン内で／多量体化ドメインによって互いに共有結合又は非共有結合している、抗体。
【請求項８】
−第一及び第二の多量体化ドメインが、抗体ＣＨ３抗体ドメイン又はその断片若しくは変異体であるか、あるいは
−多量体化ドメインの一方が、抗体ＣＨ１ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、それぞれの他方の多量体化ドメインが、抗体ＣＬドメイン又はその断片若しくは変異体である、請求項６〜７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
−一方のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有し、他方のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異を含有し（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）、
−一方のＣＨ３ドメインがさらにＹ３４９Ｃ突然変異を含有し、他方のＣＨ３ドメインがさらにＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃの突然変異を含有している（番号付けはＫａｂａｔによる）、請求項６〜８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が二重特異的抗体である、請求項６〜９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
融合ポリペプチド又は抗体が、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ、及びＩＬ−１βからなる群より選択された１つの抗原に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、又は請求項６〜１０のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ、及びＩＬ−１βからなる群より互いに独立して選択された２つの抗原に特異的に結合する、請求項６〜１１のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１３】
医薬品としての使用のための請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
眼血管疾患の処置のための請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
眼血管疾患が加齢黄斑変性又は糖尿病性網膜症である、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の融合ポリペプチド又は請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体を含有している医薬製剤。
【請求項１７】
請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体を投与する工程を含む、眼血管疾患の処置法。
【請求項１８】
医薬品を生産するための請求項１〜５のいずれか一項記載の融合ポリペプチド又は請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項１９】
加齢黄斑変性又は糖尿病性網膜症の処置のための請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
有効量の請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体を個体に投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法。
【請求項２１】
血管新生を抑制するために有効量の請求項６〜１２のいずれか一項記載の抗体を個体に投与する工程を含む、個体の眼における血管新生を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
完全長抗体と比較してとりわけ低い分子量を有しかつ２つの抗原結合部位を含む新規抗体フォーマット、並びに、その使用が本明細書に記載されている。
【０００２】
技術的背景
加齢黄斑変性は、工業国で５０歳以上の人々に不可逆的な盲目を引き起こす、最も一般的な眼疾患である。現在の治療法は、例えば、抗体／抗体フォーマットによるＶＥＧＦ阻害に基づき、４〜６週間間隔で硝子体内への反復注射を必要とする。さらに、利用可能な抗ＶＥＧＦ単独療法に応答しない患者もいる。すでに証明されている抗ＶＥＧＦ医薬品及び／又は新規標的分子に基づき、処置の有効性及び安全性を高めかつ注射頻度を低下させる目的を有する、組合せ療法に関する徹底的な研究が実施されている。
【０００３】
眼から薬物の排除を駆動する因子の１つは、拡散である。薬物の拡散特性は主に、最終的にはＦｃ受容体との結合と組み合わせた、薬物のサイズによって決定される。
【０００４】
眼から排除された後、薬物は、全身循環中に認められ得る。したがって、高用量の適用及び同時に眼からの多量の薬物の排除により、全身に薬物が曝され、これにより副作用の可能性のリスクが上昇する。
【０００５】
野生型の４本鎖のＹ形の抗体フォーマットから誘導された新規抗体フォーマットが過去に開発されている。これらのフォーマットは主に、二重特異的及び多重特異的フォーマットである。総説については、例えば、Kontermann, R., mAbs 4 (2012) 182-197を参照されたい。
【０００６】
例えば、米国特許出願公開第２００９／０１７５８６７号において、エフェクター機能を有する一本鎖多価結合タンパク質が開示されている。国際公開公報第２０１４／１３１７１１号では、第二及び第三の抗原結合部分が、Ｆｃドメインに直接的に又は免疫グロブリンヒンジ領域を通して融合している可能性がある二重特異的抗体が開示されている。国際公開公報第２０１１／１１７３２９号では、二重特異的で二価の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が開示されている。国際公開公報第２００９／０８０２５３号は、二価の二重特異的抗体を開示している。
【０００７】
発明の要約
本明細書には、新規治療剤を作製するための基盤としての役目を果たし得る、新規で２本鎖で低分子量の二価抗体が報告されている。このような抗体は、例えば、眼科的疾患、例えば加齢黄斑変性に使用することができる。なぜなら、それは眼科適用において改善された特性を有するからである。同様にこのフォーマットは、腫瘍疾患、神経疾患（血液脳関門の通過を含む）、及び抗炎症疾患にも適用を有し得る。
【０００８】
とりわけ、鎖内ジスルフィド橋の導入が、本明細書に報告されているような新規二価抗体の安定性を増加させることが判明した。より詳細には、抗体可変ドメインの１つと、抗体定常ドメインとの間への鎖内ジスルフィド結合の導入により、例えば抗体の融点の上昇によって証明されるように、この新規抗体（フォーマット）の構造的安定性が改善された。
【０００９】
本明細書に報告されているような１つの態様は、
ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に
ｉ）第一の結合部位の第一の部分、
ｉｉ）第一の多量体化ドメイン、及び
ｉｉｉ）第二の結合部位の第一の部分
を含む第一のポリペプチド、並びに
ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に
ｉ）第一の結合部位の第二の部分、
ｉｉ）第二の多量体化ドメイン、及び
ｉｉｉ）第二の結合部位の第二の部分
を含む第二のポリペプチド
を含む（二価）抗体であり、
ここで、第一の結合ドメインの第一の部分及び第一の結合ドメインの第二の部分は一緒に第一の結合部位を形成し、第二の結合ドメインの第一の部分及び第二の結合ドメインの第二の部分は一緒に第二の結合部位を形成し、
ここで、第一の結合部位及び第二の結合部位は、互いに独立して、（異なる）エピトープ／標的／抗原に特異的に結合し、そして
ここで、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメインを介して非共有結合又は共有結合している。
【００１０】
本明細書に報告されているような１つの態様は、
ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に
ｉ）第一の結合部位の第一の部分、
ｉｉ）第一の多量体化ドメイン、及び
ｉｉｉ）第一の結合部位の第二の部分
を含む第一のポリペプチド、並びに
ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に
ｉ）第二の結合部位の第一の部分、
ｉｉ）第二の多量体化ドメイン、及び
ｉｉｉ）第二の結合部位の第二の部分
を含む第二のポリペプチド
を含む（二価）抗体であり、
ここで、第一の結合部位の第一の部分及び第一の結合部位の第二の部分は一緒に（機能的な）第一の結合部位を形成し、第二の結合部位の第一の部分及び第二の結合部位の第二の部分は一緒に第二の（機能的な）結合部位を形成し、
ここで、第一の結合部位及び第二の結合部位は、互いに独立して、（異なる）エピトープ／標的／抗原に特異的に結合し、そして
ここで、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメインを介して非共有結合又は共有結合／会合している。
【００１１】
１つの実施態様では、第一及び第二の多量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域又はその変異体若しくはその断片を含まない／含有していない。
【００１２】
１つの実施態様では、第一及び第二の多量体化ドメインは各々、抗体ＣＨ３ドメイン又はその変異体若しくはその断片である。１つの実施態様では、ＣＨ３ドメインはヒトＣＨ３ドメインである。１つの好ましい実施態様では、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。１つの実施態様では、各々の多量体化ドメインは、好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプのヒトＣＨ２−ＣＨ３ドメイン対である。
【００１３】
１つの実施態様では、第一又は第二の多量体化ドメインは、抗体ＣＨ１ドメイン又はその変異体若しくはその断片であり、それぞれの他方の多量体化ドメインは、抗体ＣＬドメイン又はその変異体若しくはその断片である。１つの実施態様では、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインは、ヒトＣＨ１ドメイン及びヒトＣＬドメインである。１つの好ましい実施態様では、ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、ＣＬドメインはヒトκ又はλＣＬドメインである。
【００１４】
１つの実施態様では、結合部位の部分は、抗体可変ドメインである。１つの実施態様では、結合部位の第一の部分は、抗体重鎖可変ドメインであり、結合部位の第二の部分は、抗体軽鎖可変ドメインであり、又はその逆である。１つの実施態様では、
−抗体重鎖可変ドメインは、多量体化ドメインの一方の末端に（直接的に又は第一の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、
−抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に（直接的に又は第二の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、
−抗体重鎖可変ドメイン又は抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインに対する（ペプチド内／鎖内）ジスルフィド結合を有する。
【００１５】
本明細書に報告されているような１つの態様は、抗体重鎖可変ドメイン、多量体化ドメイン、及び抗体軽鎖可変ドメインを含む（組換え）融合ポリペプチドであり、
ここで、
−抗体重鎖可変ドメインは、多量体化ドメインの一方の末端に（直接的に又は第一の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、
−抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に（直接的に又は第二の（ペプチド）リンカーを介してのいずれかで）融合し、
−抗体重鎖可変ドメイン又は抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインに対する（ペプチド内／鎖内）ジスルフィド結合を有する。
【００１６】
全ての態様の１つの実施態様では、ジスルフィド結合が、抗体重鎖可変ドメインと多量体化ドメインとの間に存在する。
【００１７】
全ての態様の１つの実施態様では、重鎖可変ドメインは、８２ｂ位（Ｋａｂａｔによる）にシステインアミノ酸残基を含み、ジスルフィド結合が、重鎖可変ドメインの８２ｂ位のシステイン残基と多量体化ドメインとの間に存在している。
【００１８】
１つの実施態様では、多量体化ドメインは、抗体ＣＨ３ドメイン、又は抗体ＣＨ１ドメイン、又は抗体ＣＬドメイン、又はその各々の断片若しくは変異体である（に由来する）。
【００１９】
全ての態様の１つの好ましい実施態様では、多量体化ドメインは、４３３位（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）にシステインアミノ酸残基を有する抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、ジスルフィド結合が、重鎖可変ドメインの８２ｂ位のシステイン残基とＣＨ３ドメインの４３３位のシステイン残基との間に存在している。
【００２０】
１つの実施態様では、ポリペプチド又は融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン、多量体化ドメイン、及び抗体軽鎖可変ドメインを含む。
【００２１】
１つの実施態様では、ポリペプチド又は融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン、多量体化ドメイン、及び抗体重鎖可変ドメインを含む。
【００２２】
全ての態様の１つの実施態様では、抗体可変ドメインは、ペプチドリンカーを介して、多量体化ドメインのそれぞれの末端に融合している。
【００２３】
本明細書に報告されているような１つの態様は、本明細書に報告されているような２つの融合ポリペプチドからなる（二価）抗体である。
【００２４】
本明細書に報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗体重鎖可変ドメイン、
第一の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第一の多量体化ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
ｂ）第二の抗体重鎖可変ドメイン、
第二の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第二の多量体化ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む（二価）抗体であり、
ここで、第一及び第二の抗体可変ドメインは、第一の（機能的な）抗原／標的結合部位を形成している（同族）ＶＨ／ＶＬ対であり、第三及び第四の抗体可変ドメインは、第二の（機能的な）抗原／標的結合部位を形成している（同族）ＶＨ／ＶＬ対であり、
ここで、第一及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメイン内で共有結合又は非共有結合し、
ただし、第一及び第二の多量体化ドメインは、免疫グロブリンヒンジ領域を含まない。
【００２５】
本明細書に報告されているような１つの態様は、
ａ）第一の抗体重鎖可変ドメイン、
第一の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第一の多量体化ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
ｂ）第二の抗体重鎖可変ドメイン、
第二の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第二の多量体化ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む（二価）抗体であり、
ここで、第一のポリペプチドの可変ドメインは、第一の標的に特異的に結合する第一の（機能的な）結合部位を形成し、第二のポリペプチドの可変ドメインは、第二の標的に特異的に結合する第二の（機能的な）結合部位を形成し、
ここで、第一及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメイン内で／多量体化ドメインによって共有結合又は非共有結合している。
【００２６】
（（二価）抗体の）１つの実施態様では、
−第一及び第二の多量体化ドメインは、抗体ＣＨ３抗ドメイン又はその断片若しくは変異体であるか、あるいは、
−多量体化ドメインの一方は抗体ＣＨ１ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、それぞれの他方の多量体化ドメインは、抗体ＣＬドメイン又はその断片若しくは変異体である。
【００２７】
（（二価）抗体の）１つの実施態様では、
−一方のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有し、他方のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）を有し、
−一方のＣＨ３ドメインはさらに、Ｙ３４９Ｃ突然変異を有し、他方のＣＨ３ドメインはさらに、Ｅ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃの突然変異（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）を有する。
【００２８】
１つの実施態様では、抗体は二重特異的抗体である。
【００２９】
１つの実施態様では、融合ポリペプチド又は抗体は、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ、及びＩＬ−１βからなる群より選択された１つの抗原に特異的に結合する。
【００３０】
１つの実施態様では、抗体は、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ、及びＩＬ−１βからなる群より互いに独立して選択された２つの抗原に特異的に結合する。
【００３１】
１つの実施態様では、多量体化ドメインは又は全ての多量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域又はその変異体若しくは断片を含まない／含有しない。
【００３２】
１つの実施態様では、ＣＨ３ドメインはヒトＣＨ３ドメインである。１つの好ましい実施態様では、ＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。１つの実施態様では、各々の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン対である。
【００３３】
１つの実施態様では、ＣＨ１ドメインはヒトＣＨ１ドメインであり、ＣＬドメインはヒトＣＬドメインである。１つの好ましい実施態様では、ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、ＣＬドメインは、ヒトκ又はλＣＬドメインである。
【００３４】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、各々の多量体化ドメインは、非天然システイン残基を含有している抗体ＣＨ３ドメインである。１つの実施態様では、各々のＣＨ３ドメインは、Ｈ４３３Ｃ突然変異（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）を含有している。１つの実施態様では、各々のポリペプチドの重鎖可変ドメイン（のＮ末端部分）は、フレームワーク領域３（ＦＲ３）にシステイン残基を含む。１つの実施態様では、各々のポリペプチドの重鎖可変ドメイン（のＮ末端部分）は、８２ｂ位（番号付けはＫａｂａｔによる）にシステイン残基を含む。１つの実施態様では、第一の結合部位の第一の部分（第一の結合部位の重鎖可変ドメイン）は、８２ｂ位にシステイン残基を含み、第二の結合部位の第一の部分（第二の結合部位の重鎖可変ドメイン）は、８２ｂ位（番号付けはＫａｂａｔによる）にシステイン残基を含み、各々のＣＨ３ドメインは、４３３位（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）にシステイン残基を含む。
【００３５】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、ペプチドリンカーが、結合部位の各々の部分と、それぞれの多量体化ドメインとの間に存在する。１つの実施態様では、各々のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、結合部位の部分、第一のペプチドリンカー、多量体化ドメイン、第二のペプチドリンカー、及び結合部位の部分を含む。１つの実施態様では、第一及び第二のペプチドリンカーは、配列番号０１及び配列番号０２のアミノ酸配列を有する。１つの実施態様では、第一及び第二のペプチドリンカーは、配列番号０３及び配列番号０４のアミノ酸配列を有する。１つの実施態様では、第一及び第二のペプチドリンカーは、配列番号０５及び配列番号０６のアミノ酸配列を有する。１つの実施態様では、第一及び第二のペプチドリンカーは、配列番号０７及び配列番号０８のアミノ酸配列を有する。
【００３６】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、第一の結合部位及び第二の結合部位は各々、抗体結合部位（重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対）である。
【００３７】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、第一の結合部位の第一の部分は、抗体軽鎖可変ドメインであり、第一の結合部位の第二の部分は、抗体重鎖可変ドメインであり、第二の結合部位の第一の部分は抗体軽鎖可変ドメインであり、第二の結合部位の第二の部分は、抗体重鎖可変ドメインである。
【００３８】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、第一の結合部位の第一の部分は、抗体軽鎖可変ドメインであり、第一の結合部位の第二の部分は、抗体重鎖可変ドメインであり、第二の結合部位の第一の部分は、抗体重鎖可変ドメインであり、第二の結合部位の第二の部分は、抗体軽鎖可変ドメインである。
【００３９】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、第一の結合部位の第一の部分は、抗体重鎖可変ドメインであり、第一の結合部位の第二の部分は、抗体軽鎖可変ドメインであり、第二の結合部位の第一の部分は抗体重鎖可変ドメインであり、第二の結合部位の第二の部分は抗体軽鎖可変ドメインである。
【００４０】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、抗体軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインは、完全長抗体可変ドメインである。完全長抗体可変ドメインは、以下のサブドメインを含む（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００４１】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、抗体軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインは、短い抗体可変ドメインである。短い抗体可変ドメインは、少なくとも以下のサブドメインを含む（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３。短い抗体可変ドメインはさらに、サブドメインＦＲ１（Ｃ末端断片）及び／又はＦＲ４（Ｎ末端断片）の断片を含み得る。１つの実施態様では、短い抗体可変ドメインは、２〜６個のＣ末端アミノ酸残基が不在／欠失している、完全長抗体可変ドメインである（すなわち、ＦＲ４サブドメインの２〜６個のＣ末端アミノ酸残基が存在していない）。
【００４２】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、多量体化ドメインは、抗体ＣＨ３ドメインに由来する。１つの実施態様では、多量体化ドメインは、抗体ＣＨ３ドメイン又はその変異体若しくはその断片である。１つの好ましい実施態様では、一方のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗの突然変異を含有し、他方のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの突然変異（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）を含有している。別の実施態様では、一方のＣＨ３ドメインはさらに、Ｙ３４９Ｃ突然変異を含有し、他方のＣＨ３ドメインはさらに、Ｅ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃの突然変異（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）を含有している。
【００４３】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、多量体化ドメインは、抗体ＣＨ１ドメイン−ＣＬドメイン対から誘導されたドメイン対である。１つの好ましい実施態様では、一方の多量体化ドメインは、抗体ＣＨ１ドメイン又はその変異体であり、それぞれの他方の多量体化ドメインは抗体ＣＬドメイン又はその変異体である。
【００４４】
本明細書に報告されているような全ての態様の１つの実施態様では、抗体は二重特異的抗体である。
【００４５】
本明細書に記載の全ての態様の１つの実施態様では、抗体は、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ、及びＩＬ−１βを含む群から選択された抗原の１つに特異的に結合する。
【００４６】
本明細書に記載の全ての態様の１つの実施態様では、抗体は、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ、及びＩＬ−１βを含む群から選択された２つの抗原に特異的に結合する。
【００４７】
本明細書に記載の全ての態様の１つの実施態様では、抗体は、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２、又はＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ、又はＶＥＧＦ及びＩＬ−１βの抗原に特異的に結合する。
【００４８】
本明細書に報告されているような１つの態様は、医薬品としての使用のための本明細書に報告されているような（二価）抗体である。
【００４９】
本明細書に報告されているような１つの態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体を含有している医薬製剤である。
【００５０】
１つの実施態様では、医薬製剤は、眼血管疾患の処置に使用するためのものである。
【００５１】
１つの実施態様では、眼血管疾患は、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症である。
【００５２】
本明細書に報告されているような１つの態様は、医薬品の生産のための本明細書に報告されているような（二価）抗体の使用である。
【００５３】
本明細書に報告されているような１つの態様は、医薬品として使用するための本明細書に報告されているような（二価）抗体である。
【００５４】
１つの実施態様では、使用は、眼血管疾患の処置のためである。
【００５５】
１つの実施態様では、眼血管疾患は、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症である。
【００５６】
本明細書に報告されているような１つの態様は、医薬品の製造における本明細書に報告されているような（二価）抗体の使用である。
【００５７】
１つの実施態様では、使用は、眼血管疾患の処置用医薬品の製造のためである。
【００５８】
１つの実施態様では、眼血管疾患は、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症である。
【００５９】
本明細書に報告されているような１つの態様は、眼血管疾患の処置のための本明細書に報告されているような（二価）抗体である。
【００６０】
１つの実施態様では、眼血管疾患は、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症である。
【００６１】
本明細書に報告されているような１つの態様は、眼血管疾患の処置に使用するための本明細書に報告されているような（二価）抗体である。
【００６２】
１つの実施態様では、眼血管疾患は、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症である。
【００６３】
本明細書に報告されているような１つの態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによる、眼血管疾患に罹患している患者の処置法である。
【００６４】
１つの実施態様では、眼血管疾患は、加齢黄斑変性又は糖尿病網膜症である。
【００６５】
本明細書に報告されているような１つの態様は、有効量の本明細書に報告されているような抗体を投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体の処置法である。
【００６６】
本明細書に報告されているような１つの態様は、血管新生を抑制するために有効量の本明細書に報告されているような抗体を個体に投与する工程を含む、個体の眼における血管新生を抑制する方法である。
【００６７】
発明の詳細な説明
加齢黄斑変性に対する新規な治療剤を作製するための基本的なフォーマットとしてとりわけ使用され得、一般的に眼科のための改善された特性を有する、新規抗体フォーマットが本明細書において報告されている。
【００６８】
本明細書において報告する抗体フォーマット、すなわちオフタボディ（Ophthabody）は、伝統的な４本鎖の完全長抗体と比較して低い分子量を有する新規な二価で二重特異的な結合分子であり、他の低分子量の抗体フォーマットと比較して改善された特性を有する。
【００６９】
Ｉ．定義
本明細書において、全ての抗体定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）のアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔの番号付け体系に従って示され（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）、番号付けは、「Ｋａｂａｔによる番号付け」と称される。特に、Ｋａｂａｔの番号付け体系（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）の６４７〜６６０頁参照）は、κ及びλアイソタイプの抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の番号付けに使用され、ＫａｂａｔＥＵ番号付けインデックスは、抗体重鎖の定常ドメインのために使用される（６６１〜７２３頁参照；ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）。
【００７０】
本明細書に使用されているような「含んでいる」という用語は、「からなる」という用語を含むことをここに明白に記載する。したがって、「含んでいる」という用語を含有している全ての態様及び実施態様は同様に、「からなる」という用語を用いて開示される。
【００７１】
「約」という用語は、その後に続く数値の＋/−２０％の範囲を示す。１つの実施態様では、約という用語は、その後に続く数値の＋/−１０％の範囲を示す。１つの実施態様では、約という用語は、その後に続く数値の＋/−５％の範囲を示す。
【００７２】
本明細書における「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体、三重特異的抗体）、及び所望の抗原結合活性及び／又はプロテインＡ結合活性及び／又はＦｃＲｎ結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００７３】
「抗体結合部位」という用語は、抗原との結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示す。一般的には、これは、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとの対である。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」すなわち「ＨＶＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されているような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の領域（免疫グロブリンのフレームワーク）を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３領域は、抗原との結合に最も寄与しかつ抗体を規定する領域である。
【００７４】
「（抗原に）結合している」という用語は、抗体を表面に結合させたインビトロアッセイ、１つの実施態様では結合アッセイにおける、抗体のその抗原に対する結合を示し、抗体への抗原の結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合は、１０−８Ｍ以下、いくつかの実施態様では１０−１３〜１０−８Ｍ、いくつかの実施態様では１０−１３〜１０−９Ｍの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【００７５】
結合は、ビアコアアッセイ（ＧＥヘルスケアバイオセンサー（GE Healthcare Biosensor）社、ウプサラ、スウェーデン）によって調べることができる。結合親和性は、ｋａ項（抗体／抗原複合体に由来する抗体の会合速度定数）、ｋｄ項（解離定数）、及びＫＤ項（ｋｄ／ｋａ）によって定義される。
【００７６】
本明細書において使用する「結合部位」という用語は、標的に対して結合特異性を示す２つの別々のドメインを含む、任意のタンパク質性の実体を示す。例えば、抗体結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲを含み、例えば天然に存在する抗体、すなわち慣用的な抗体の場合には、６つのＨＶＲを含む。
【００７７】
「ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン」という用語は、およそ１１８位（ＥＵ）から２１５位（ＥＵ）（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け体系）まで伸びている、抗体重鎖ポリペプチドの部分を示す。１つの実施態様では、ＣＨ１ドメインは、配列番号２５：
【化１】
2019524681.tif 000003
のアミノ酸配列を有する。
【００７８】
「ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン」という用語は、およそ２３１位（ＥＵ）から３４０位（ＥＵ）（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け体系）まで伸びている、抗体重鎖ポリペプチドの部分を示す。１つの実施態様では、ＣＨ２ドメインは、配列番号２３：
【化２】
2019524681.tif 000004
のアミノ酸配列を有する。
【００７９】
「ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン」という用語は、およそ３４１位（ＥＵ）から４４５位（ＥＵ）まで伸びている、抗体重鎖ポリペプチドの部分を示す。１つの実施態様では、ＣＨ３ドメインは、配列番号２４：
【化３】
2019524681.tif 000005
のアミノ酸配列を有する。
【００８０】
「ヒトκＣＬドメイン」という用語は、およそ１０８位から２１４位（Ｋａｂａｔ及びＫａｂａｔＥＵインデックス）まで伸びている、抗体軽鎖ポリペプチドの部分を示す。１つの実施態様では、ＣＬドメインは、配列番号２１：
【化４】
2019524681.tif 000006
のアミノ酸配列を有する。
【００８１】
「ヒトλＣＬドメイン」という用語は、およそ１０８位から２１５位（Ｋａｂａｔによる）まで伸びている、抗体重鎖ポリペプチドの部分を示す。１つの実施態様では、ＣＬドメインは、配列番号２２：
【化５】
2019524681.tif 000007
のアミノ酸配列を有する。
【００８２】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。５つの主要なクラスの抗体が存在し（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８３】
「同族ＶＨ／ＶＬ対」という用語は、抗原に特異的に結合する抗体結合部位を一緒に形成する、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインの対を示す。同族ＶＨ／ＶＬ対の抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインは、単一の抗体に由来する。この単一の抗体は、例えば、単一の抗体分泌Ｂ細胞から単離され得るか、あるいは、単一のヒト若しくはヒト化抗体から、又はファージディスプレイから得ることができる。
【００８４】
「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の順序で出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８５】
「完全長抗体」という用語は、天然抗体構造と実質的に類似した構造を有するか、又は本明細書に定義されているようなＦｃ領域を含有している重鎖を有する抗体を示す。完全長抗体は、さらなるドメイン、例えば、完全長抗体の鎖の１つ以上にコンジュゲートさせたｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂを含み得る。完全長抗体という用語はまた、これらのコンジュゲートも包含する。
【００８６】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養液」という用語は互換的に使用され、外来性核酸が導入されている細胞（このような細胞の子孫も含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これは初回形質転換細胞及び継代数に関係なくそれから誘導された子孫も含む。子孫は、親細胞に対して核酸含有物において完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有していてもよい。初回形質転換細胞についてスクリーニングされた又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する子孫の突然変異体も本明細書に含まれる。
【００８７】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基及びヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のそれに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のそれに対応する。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００８８】
本明細書において使用する「超可変領域」すなわち「ＨＶＲ」という用語は、超可変的な配列（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）でありかつ構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は、抗原と接触する残基（「抗原との接触部」）を含有している、抗体可変ドメインの各々の領域を指す。一般的には、抗体は、６つのＨＶＲを含む；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。本明細書に示されているようなＨＶＲは
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に存在している超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に存在しているＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）に存在している抗原との接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ
を含む。
【００８９】
１つの実施態様では、ＨＶＲ残基は、本明細書の何処か他の場所で同定されたものを含む。
【００９０】
特記しない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書においてＫａｂａｔＥＵインデックス番号付け体系（Kabat et al.、同上）に従って番号付けされる。
【００９１】
「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト及びヒト以外の霊長類、例えばサル）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、個体又は被験者はヒトである。
【００９２】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィー若しくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定したところ、９５％又は９９％以上の純度まで精製されている。抗体の純度の評価法の総説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【００９３】
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸としては、核酸分子を通常含有している細胞に含有されている核酸分子が挙げられるが、該核酸分子は染色体外に又はその天然の染色体の位置とは異なる染色体の位置に存在している。
【００９４】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に相同な抗体の個体群から得られた抗体を指し、すなわち、個体群に含まれる個々の抗体は、例えば天然に生じる突然変異を含有しているか又はモノクローナル抗体調製物の作製中に生じる変異抗体候補を除いて（このような変異体は一般的に少数存在する）、同一である及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的には含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に相同な抗体個体群から得られた抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生成を必要とするものと解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有しているトランスジェニック動物を利用した方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００９５】
「眼血管疾患」という用語は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、網膜血管腫増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性などの眼内新生血管症候群を含むがこれらに限定されない（例えば、Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710を参照）。
【００９６】
「医薬製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能とするような剤形であり、製剤が投与されるであろう被験者に対して許容できない程に毒性である追加の成分を全く含有していない調製物を指す。
【００９７】
「薬学的に許容される担体」は、被験者に対して無毒性である、活性成分以外の、医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
本明細書において使用する「ペプチドリンカー」という用語は、１つの実施態様では合成起源である、アミノ酸配列を有するペプチドを示す。「ペプチドリンカー」は、直鎖のアミノ酸残基を示す。この直鎖のアミノ酸残基は、１〜３０残基の長さを有する。
【００９９】
１つの実施態様では、ペプチドリンカーは、グリシン残基、グルタミン残基、及び／又はセリン残基が豊富である。これらの残基は、例えば、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳなどの５個までのアミノ酸の小さな反復単位で整列している。小さな反復単位は、１〜５回繰り返されていてもよい。多量体単位のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に、６個までの追加の任意の天然アミノ酸が付加されていてもよい。
【０１００】
ペプチドリンカーは１つの実施態様では、３０個までの長さのアミノ酸残基を有する、１つの実施態様では５〜２０個の長さのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有するペプチドである。１つの実施態様では、ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝２、３、４又は５）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、又は４）であり、１つの実施態様ではｘ＝３、ｎ＝２であり、１つの実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。このペプチドリンカーはそれにも関わらず、その末端の一方又は両方に追加のグリシン残基及び／又はセリン残基を含み得る。
【０１０１】
他の合成ペプチドリンカーは、１０〜２０回繰り返される単一のアミノ残基から構成され、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端に６個までの追加の任意の天然アミノ酸を含んでいてもよい。
【０１０２】
ＧＳの豊富な合成ペプチドリンカーの他にも、天然ペプチドリンカー、例えばヒトＰ糖タンパク質のＩｇＧヒンジリンカー、ヒト複製タンパク質ＡのＣ末端リンカー、副甲状腺ホルモン関連タンパク質のリンカーも使用してもよい。
【０１０３】
全てのペプチドリンカーは核酸分子によってコードされ得、それ故、組換え発現させることができる。リンカーはそれ自体がペプチドであるので、リンカーによって接続されたポリペプチドは、２つのアミノ酸間で形成されたペプチド結合を介してリンカーに接続されている。
【０１０４】
「組換え」又は「組換え産生された」という用語は、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、作製されるか、又は単離されるポリペプチドを示す。これは、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から又はトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離されたポリペプチド、あるいは、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させたポリペプチドを含む。
【０１０５】
本明細書において使用する「処置」（及びその文法上の変化形、例えば「処置する」又は「処置している」）は、処置される個体の自然経過を改変させようとする試みの中での臨床的介入を指し、予防のため又は臨床的病的状態の経過中のいずれかに実施され得る。望ましい処置効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患のあらゆる直接的又は間接的な病的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の減少、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、本明細書において報告されているような抗体又はＦｃ領域融合ポリペプチドは、疾患の発症を遅延させるために又は疾患の進行を緩徐化するために使用される。
【０１０６】
本出願に使用される「価」という用語は、（抗体）分子内の具体的な結合部位の数の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、（抗体）分子におけるそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。本明細書に報告されているような二重特異的抗体は、１つの好ましい実施態様では「二価」である。
【０１０７】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体とその抗原との結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般的に類似した構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、抗原に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離し、これによりそれぞれ相補的ＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングし得る。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。
【０１０８】
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増幅させることのできる核酸分子を指す。該用語は、自己複製している核酸構造としてのベクター、並びに、それが導入されている宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指令することができる。このようなベクターは本明細書において「発現ベクター」と称される。
【０１０９】
ＩＩ．硝子体液／硝子体
眼の大半の空間を充填するマトリックスは、硝子体液／硝子体として示される。
【０１１０】
ヒトの硝子体液は、水晶体と網膜との間に位置する眼の後方区画を充填する透明な水溶液である。それは眼球の容積の約８０％を占め、９９％の水分を含むが、コラーゲン線維ネットワーク及び大きなヒアルロン酸分子に因り生誕時にはゲル様構造を有する。その容積は約４〜５mlである（Beauthier, J.P., (2008) Quelques aspects biochimiques de l’e ´volution post mortem. In: De Boeck Universite ´ [Ed]. Traite ´ de me ´de- cine le ´gale. Bruxelles: 715-725）。硝子体液は、無機塩、糖、及びアスコルビン酸をはじめとする、いくつかの低分子量の溶質を含有している。ヒト硝子体におけるタンパク質総濃度は、約１２００μg/mlであり、その中でコラーゲンは１８０μg/mlを占める（例えば、Aretz, S., et al., Prot. Sci. 11 (2013) 22; Theocharis, A.D., et al., Biochim. 84 (2002) 1237-1243を参照）。主にアルブミン（６０〜７０％）からなる、０．５mg/mLという健康な硝子体液の平均タンパク質濃度が、Angi, M., et al.（Hindawi Publishing Corporation, Mediators of Inflammation, Volume 2012, Article ID 148039）によって報告されている。さらに、そこには、硝子体液の成分が、グロブリン、凝固タンパク質、補体因子、及び低分子量タンパク質であることが報告されている（Ulrich, J.N., et al., Clin. Exp. Ophthalmol. 36 (2008) 431-436）。毛様体は、後眼部への水性流体の拡散、限外ろ過、及び能動輸送により、定常的な流体交換を提供する（Bishop, P.N., Eye, 16 (2002) 454-460）。局所的な分泌（例えば糖タンパク質）、血液からのろ過（例えばアルブミン）、又は周辺組織からの拡散によりタンパク質が硝子体に蓄積し得る（Wu, C.W., Am. J. Ophthalmol., 137 (2004) 655-661）。硝子体と網膜内層との間の近密な接触のために、網膜の生理学的及び病理学的状態は、プロテオームと硝子体液の生化学的特性との両方に影響を及ぼす。
【０１１１】
ＩＩＩ．黄斑変性
眼科は、眼疾患及びその処置に関する医学の一部門である。眼科の分野においては、罹患したヒトの視力に大きな影響を及ぼし、頻繁に盲目に至る、数多くの深刻な疾患が存在する。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に、ドイツだけでほぼ５００万人が罹患し、罹患者数は増え続けている（［１］）。ＡＭＤは、世界中で３番目に多い眼疾患である。それは視力の深刻な障害をもたらし、症例の８．７％は全盲にさえ至る（［２］、［３］）。工業国では、それは５０歳以上のヒトにおいて最も多い眼疾患であり、不可逆的な盲目を引き起こす（［４］、［５］）。１億９６００万人の人々が、２０２０年までにＡＭＤに罹患するだろうと推定されている（［６］）。
【０１１２】
ＡＭＤは、慢性的に進行する疾患であり、これはいくつかの段階に分類され得る。初期の段階では、加齢の過程、及び網膜色素上皮とブルッフ膜（これは脈絡膜（脈絡組織）と網膜色素上皮の間の境界膜を示す）との間の網膜下（腺）への異化産物の沈着物に因る、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の変化が起こる。進行すると、ＡＭＤの２つの後期段階が発生し得る。特定の段階で、該疾患により、地図状萎縮とも称される、緩徐に進行性のドライ型ＡＭＤが起こり得る。これにより、最も鮮明な視力の点である「黄斑（yellow spot）」（ラテン語：黄斑（macula lutea）におけるＲＰＥの分解、及び、脈絡膜における血管の破壊が起こる。あまり頻繁に起こらない段階は、急速に進行するウェット型ＡＭＤであり、これは、網膜下空間における新生血管の内部増殖である、脈絡膜血管新生によって特徴付けられる。これにより、血漿及び血液が周辺組織へと回避する（［４］、［７］）。ドライ型ＡＭＤ及びウェット型ＡＭＤのどちらによっても光受容体の死滅が起こり、中心視力の低下が引き起こされる。
【０１１３】
疑われている様々なＡＭＤの原因がある。ブルッフ膜、網膜色素上皮、及び光受容体の非特異的な加齢に関連した変化に加えて、主に酸化ストレス、補体系の機能異常、局所的炎症、網膜への毒素の蓄積を伴うリソソームによる分解の減少、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の過剰発現の発生が考察されている。上昇したＶＥＧＦ濃度が、脈絡膜血管新生を有する患者の房水及び網膜に検出されている。さらに、数多くのインビボモデルが、脈絡膜血管新生の発症とＶＥＧＦ発現との間の関係を示している（［４］）。
【０１１４】
ＶＥＧＦは、現在のＡＭＤ療法の主要な着目点である（［７］）。ＶＥＧＦの阻害は、疾患の進行を停止し得るか又は少なくとも遅延し得る（［８］）。これは一般的に、硝子体への月１回のＶＥＧＦ阻害剤の硝子体内（硝子体内への）注射を必要とする。利用可能な療法により時々、患者の状況は大きく改善されたが、新規な最適化された治療法が依然として非常に必要とされている。
【０１１５】
現在の臨床研究は、ＶＥＧＦ及び他の血管新生増殖因子、例えばアンジオポエチン−２（ＡＮＧ２）を阻害する分子に焦点が当てられている。研究によりまた、抗ＶＥＧＦ療法の起こり得る副作用である、体内における出血リスクの上昇も示される。
【０１１６】
ＩＶ．硝子体内半減期
医薬品の硝子体内半減期、及びそれによる硝子体内注射回数は、とりわけ、眼における医薬品の拡散特性及びその安定性によって決定される。
【０１１７】
拡散特性は、主に、分子の分子量及び水力学的半径によって規定される。これらは、眼から全身循環中への分子の移動速度に影響を及ぼす。これは特に、血液網膜関門がもはや完全にインタクトではない、ＡＭＤ患者にとって関連がある。眼における滞留時間は、より高い分子量を有する分子が注射されれば長いであろうが、同時に、医薬品への全身曝露の時間も増加するだろう。これは、副作用の発症を促進する可能性がある。全身曝露期間は、主に注射された分子の分子量の関数である。６０ｋＤａ未満の分子量を有する分子は、腎臓を介して迅速に排泄され；より大きな分子は、全身循環中でより長い時間を費やす。最も効率的なろ過は、３０ｋＤａ未満の分子量で観察される（［１０］）。
【０１１８】
熱的安定性は、化合物がどれだけ長く、インビボ条件下で正しく折り畳まれた状態で留まるかどうかを決定する。その熱的安定性のみが異なる２つの分子の半減期を比較することにより、より高い熱的安定性を有する分子が、より長い時間におよびその活性を維持することが示されるだろう。
【０１１９】
硝子体内における半減期が長ければ、より頻度の少ない注射が必要とされ、全身循環中の半減期が短ければ、少ない全身曝露が起こり得、両方を組み合わせれば、増加した効力及び低減された副作用が期待される。
【０１２０】
長い硝子体内半減期は、
−高い分子量（ＩｇＧ、例えばＰＥＧを、ディアボディ、Ｆａｂなどのより小さなフォーマットに付加）、
−標的に対する高い親和性及び結合力（より低い有効薬物濃度により、より頻度の少ない投薬が行なわれる）、
−３７℃での高い熱的安定性、
−硝子体液及び血液網膜関門（ＢＲＢ）を横断する分子の拡散の減少、
−最適な荷電又はｐＩ
によって達成され得る。
【０１２１】
急速な全身クリアランスは、
−ＦｃＲｎへの結合を低減させるために、Ｆｃ領域を工学操作すること、
−（より）低い分子量（Ｆａｂ、ディアボディ、ＤＡＲＰＩＮ）、
−低い投薬用量（用量は親和性にも依存する）
によって達成され得る。
【０１２２】
薬物の硝子体内半減期及び持続性は、とりわけ、例えば薬物の水力学的半径の増加（これにより、眼からの拡散を減速させる）、その標的に対する薬物の高い親和性（これにより、薬物−標的複合体の解離は低減する）、眼における高い（熱的）分解安定性、及び注射可能な高用量などの様々な手段によって増加させることができる。
【０１２３】
持続性に影響を及ぼすと考えられる主な因子は、用量（適用可能な用量の増加により、確実に持続性が増す）、半減期（半減期の延長により、確実に持続性が増す）、及び標的に対する親和性（ＫＤによって示される）（親和性の増加により、確実に持続性が増す）である。
【０１２４】
Ｖ．抗体フォーマット
一価の単一特異的な抗原結合断片（Ｆａｂ）は、完全な軽鎖、並びに、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆａｂは、約５０ｋＤａの分子量を有する。
【０１２５】
一価の単一特異的な一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメイン及びその間に可動性リンカーを含む、単一ポリペプチド鎖である。ｓｃＦｖの分子量は約２８ｋＤａである。
【０１２６】
約５０ｋＤａの分子量を有するディアボディは、ｓｃＦｖに由来する二価の二重特異的な分子フォーマットである。
【０１２７】
完全長モノクローナル抗体（約１５０ｋＤａの分子量）より少ない分子量を有する断片は、組織へのより良好な浸透を示す。しかしながら、これらの分子の全身半減期は、他の因子の中でもとりわけ、低い分子量が原因で大きく減少する。ディアボディ及びｓｃＦｖの両方共が、短い全身半減期を有する。なぜなら、それらは腎ろ過閾値未満であるからである（［１１］、［１２］、［１３］）。
【０１２８】
様々な分子特性が、眼科の分野において重要である。一方で、できるだけ多くの分子を眼に導入するためには高い投薬量レベルが望ましい。これは重要である。なぜなら、現在、５０μLの容量しか、硝子体内に注射することができないからである。また、全身循環からの迅速な排除も望ましい。さらに、抗原に対する高い親和性及び硝子体内半減期も重要である。
【０１２９】
ＶＩ．本明細書に記載のような抗体フォーマット
本明細書に報告されているような（二価）抗体は、「オフタボディ」と呼ばれる新規抗体フォーマットである。それは、Ｆａｂ断片よりも僅かにより高い分子量を有し、それ故、おそらく、幾分より長い硝子体内半減期を有するだろう。他方でそれは依然として、腎臓を介して全身循環から迅速に除去されるのに十分なほどに小さくあるべきである。高い熱的安定性と組み合わせた低分子量及び分子構造により、改善された特性が得られる。この理論に束縛されるものではないが、ＩｇＧと比較してより低い分子量により、組織への浸透も改善され得る。
【０１３０】
オフタボディは、２本の異なるポリペプチド鎖から作製される。それらの各々は３つのドメインを含み、これは、互いに直接的にコンジュゲートしていても、又はペプチドリンカーを介してコンジュゲートしていてもよい。各ポリペプチドのＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメイン又は該ポリペプチドの対応するドメインは、結合部位を形成する。したがって、オフタボディは、２つの結合部位を有し、すなわちそれは二価である。それ故、オフタボディは、単一特異的又は二重特異的であり得る。各鎖の第三ドメイン及び中央ドメインは、多量体化ドメインである。このドメインを介して２つのポリペプチドが互いに会合している。このような多量体化ドメインは、例えば、ロイシンジッパードメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン、ＰＢ１ドメイン、ＣＨ１−ＣＬドメイン対、及びＣＨ３ドメイン対であり得る（［１４］）。どの場合でも二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域ポリペプチドの対ではない。
【０１３１】
【表１】
2019524681.tif 000008
【０１３２】
一例において、アンジオポエチン−２が抗原１として選択され、ＶＥＧＦが抗原２として選択された。本明細書において報告されたオフタボディフォーマットの様々な抗体変異体が設計され、その結果、７つの異なるタンパク質が得られ、タンパク質Ｉは、基本の変異体を示す。
【０１３３】
【表２】
2019524681.tif 000009
【０１３４】
【表３】
2019524681.tif 000010
【０１３５】
【表４】
2019524681.tif 000011
【０１３６】
【表５】
2019524681.tif 000012
【０１３７】
ＨＡ（アンジオポエチン２に特異的に結合する第一ポリペプチド）とＫＶ（ＶＥＧＦに特異的に結合する第二ポリペプチド）の対応する対は、それらのＣＨ３ドメインを介して互いに会合し、オフタボディを形成する。変異体ＶＩＩでは、追加のシステイン残基を導入することにより、安定化した鎖内ジスルフィド橋が形成された。ジスルフィド橋が、１つのポリペプチド内におけるＮ末端ドメインと多量体化ドメインとの間で形成されている。同様に、Ｃ末端ドメインと多量体化ドメインとの間にも工学操作してもよい。
【０１３８】
ルシフェラーゼアッセイ（レポーター遺伝子アッセイ）を使用して、オフタボディ変異体がどのように良好に、ＶＥＧＦによってトリガーされたシグナルカスケードを妨げるかを決定するために試験を実施した（ＥＣ５０＝半数効果濃度；最大効果の５０％に到達する濃度）。
【０１３９】
【表６】
2019524681.tif 000013
【０１４０】
キナーゼ受容体活性化アッセイを使用して、オフタボディ変異体がどのように良好に、ＡＮＧ２によってトリガーされた抗原受容体の自己リン酸化を妨げるかを決定するために試験を実施した（ＥＣ５０＝半数効果濃度；最大効果の５０％に到達する濃度）。
【０１４１】
【表７】
2019524681.tif 000014
【０１４２】
全てのオフタボディ変異体は、両方の抗原に同時に結合することができる。
【０１４３】
様々な抗体の熱的安定性は、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び融点（Ｔｍ）を決定することによって評価された（以下の表を参照）。オフタボディ構築物と同じＶＨ配列及びＶＬ配列を使用した、ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ミニボディ、ディアボディ、及び直列型ジ−ｓｃＦｖについてのそれぞれの数値も決定した。
【０１４４】
【表８】
2019524681.tif 000015
【０１４５】
ジスルフィドの安定化されたオフタボディは、増加した熱的安定性を有することが分かる。
【０１４６】
全てのオフタボディ変異体は、良好な結果で作製された。
【０１４７】
【表９】
2019524681.tif 000016
【０１４８】
文献の引用
【表１０】
2019524681.tif 000017
2019524681.tif 000018
【０１４９】
ＶＩＩ．生成
本明細書に報告されているような（二価）抗体は、組換え手段によって生成される。したがって、本明細書に報告されているような１つの態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体をコードしている核酸であり、さらなる態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体をコードしている核酸を含む細胞である。組換え産生のための方法は、最先端の技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、続いて、（二価）抗体の単離、及び通常は薬学的に許容できる純度までの精製を含む。宿主細胞における前記のような（二価）抗体の発現のために、それぞれの（改変された）軽鎖及び重鎖をコードしている核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現を、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母細胞、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞において実施し、（二価）抗体を、細胞（培養上清又は溶解後の細胞）から回収する。抗体の一般的な組換え産生法は最先端の技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202, Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282, Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160、及びWerner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文に記載されている。抗体はまた、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような組換え法及び製剤を使用して産生されてもよい。
【０１５０】
１つの実施態様では、本明細書に記載のような（二価）抗体をコードしている単離された核酸（群）が提供される。このような核酸は、（二価）抗体の第一のポリペプチドを含むアミノ酸配列及び／又は第二のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードし得る。さらなる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのこのような実施態様では、宿主細胞は、（１）（二価）抗体の第一のポリペプチドを含むアミノ酸配列及び（二価）抗体の第二のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）（二価）抗体の第一のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと、（二価）抗体の第二のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、それを用いて形質転換されている）。１つの実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球系細胞（例えばＹ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）である。１つの実施態様では、本明細書に報告されているような（二価）抗体を作製する方法が提供され、該方法は、上記に提供されているような（二価）抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞を、（二価）抗体の発現に適した条件下で培養し、場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から（二価）抗体を回収する工程を含む。
【０１５１】
したがって、本明細書に報告されているような１つの態様は、
ａ）（二価）抗体をコードしている核酸分子を含む１つ以上のベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ）宿主細胞を、（二価）抗体の合成を可能とする条件下で培養する工程、及び
ｃ）培養液から（二価）抗体を回収する工程
を含む、本明細書に報告されているような（二価）抗体の調製法である。
【０１５２】
１つの実施態様では、ｃ）の下での回収工程は、Ｆｃ領域特異的捕捉試薬の使用を含む。１つの実施態様では、Ｆｃ領域特異的捕捉試薬は、結合そして溶出の様式で使用される。このようなＦｃ領域特異的捕捉試薬の例は、例えば、ブドウ球菌プロテインＡに基づいたアフィニティクロマトグラフィー材料である。
【０１５３】
（二価）抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィー（プロテインＡ−セファロース）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又は透析などの慣用的な免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。
【０１５４】
モノクローナル抗体結合部位をコードしているＤＮＡ及びＲＮＡは、慣用的な手順を使用して容易に単離及びシークエンスされる。Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの入手源としての役目を果たし得る。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し得、これを次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることにより、宿主細胞における組換えモノクローナル（二価）抗体の合成が得られる。
【０１５５】
本明細書に報告されているような分子のいくつかは、異なって改変されているＦｃ領域を含むことによって単離／精製し易さを提供し、改変の少なくとも１つにより、ｉ）（ブドウ球菌）プロテインＡに対する分子の異なる親和性、及びｉｉ）ヒトＦｃＲｎに対する分子の異なる親和性がもたらされ、該分子は、プロテインＡに対するその親和性に基づき、破壊された細胞から、培地から、又は分子の混合物から単離することができる。
【０１５６】
細胞性成分又は他の混入物、例えば他の細胞内核酸又はタンパク質を排除するために、（二価）抗体の精製が、アルカリ／ＳＤＳによる処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野において周知であるその他の技術をはじめとする標準的な技術によって実施される（例えば、Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照）。微生物タンパク質を用いてのアフィニティクロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換クロマトグラフィー（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換クロマトグラフィー（アミノエチル樹脂）及び混合型の交換クロマトグラフィー）、チオ親和性吸着（例えばβ−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いての）、疎水性相互作用クロマトグラフィー又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニル−セファロース、アザアレン親和性樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いての）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えばＮｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料を用いての）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）などの、タンパク質の精製のための様々な方法が確立され、広く使用されている。
【０１５７】
二価抗体をコードしているベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、（二価）抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には細菌内で産生されてもよい。細菌内でのポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載した、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい）。発現後、（二価）抗体は、可溶性画分内の細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
【０１５８】
原核細胞に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物、例えば、そのグリコシル化パターンが「ヒト化」されて、その結果、部分的な又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する（二価）抗体が産生されるような真菌株及び酵母株が、（二価）抗体をコードしているベクターに適したクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０１５９】
グリコシル化（二価）抗体の発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から得られる。無脊椎動物の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と共に使用され得る、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０１６０】
植物細胞培養液も宿主として使用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号、及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物における抗体の産生のためのプランチボディーズ（PLANTIBODIES）（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０１６１】
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中での増殖に適応させた哺乳動物細胞株も有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換させたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例えばGraham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載のようなＨＥＫ２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばMather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載のようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；及び骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。
【０１６２】
ＶＩＩＩ．医薬製剤
本明細書に報告されているような（二価）抗体は、価値ある有効性／安全性プロファイルを有し得、それぞれの療法を必要としている患者にとって利点を提供し得る。
【０１６３】
１つの態様では、医薬品としての使用のための本明細書に報告されているような（二価）抗体が提供される。
【０１６４】
さらなる態様では、本発明は、医薬品の製造又は調製における（二価）抗体の使用を提供する。任意の実施態様による「個体」はヒトであってもよい。
【０１６５】
さらなる態様では、本発明は、例えば本明細書で概略が示されている治療法のいずれかに使用するための、本明細書において提供される（二価）抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。１つの実施態様では、医薬製剤は、本明細書において提供される（二価）抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。
【０１６６】
本明細書に報告されているような１つの態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体を含む医薬製剤である。
【０１６７】
本明細書に記載のような（二価）抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような（二価）抗体を、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水性液剤の剤形で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される用量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、これには、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖、二糖、及び他の糖質、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；並びに／あるいは、非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体としてはさらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（ヒレネックス（HYLENEX）（登録商標）、バクスターインターナショナル社）が挙げられる。ｒｈｕＰＨ２０をはじめとする、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと配合する。
【０１６８】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されたものが挙げられ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸塩緩衝液を含む。
【０１６９】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルションに封入され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.)（1980）に記載されている。
【０１７０】
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例としては、（二価）抗体を含有している半透過性の固形疎水性ポリマーマトリックスが挙げられ、該マトリックスは、例えばフィルムなどの造形品又はマイクロカプセルの形である。
【０１７１】
インビボでの投与に使用しようとする製剤は一般的に無菌である。滅菌は、例えば、滅菌ろ過膜を通してのろ過によって容易に達成され得る。
【０１７２】
本明細書に報告されているような別の態様は、医薬製剤の製造のための本明細書に報告されているような（二価）抗体の使用である。本明細書に報告されているようなさらなる態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体を含む医薬製剤の製造法である。別の態様では、例えば薬学的な担体と一緒に製剤化された本明細書に報告されているような（二価）抗体を含有している医薬製剤などの製剤が提供される。
【０１７３】
本発明の製剤は、当技術分野において公知である様々な方法によって投与され得る。当業者には理解されるであろうように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変更されるだろう。特定の投与経路によって本明細書に報告されているような（二価）抗体を投与するために、（二価）抗体をその不活化を防ぐための材料でコーティングするか又は（二価）抗体を該材料と共投与することが必要であり得る。例えば、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中の（二価）抗体が、被験者に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤としては、食塩水及び緩衝水溶液が挙げられる。薬学的担体としては、無菌水溶液又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。
【０１７４】
多くの可能な送達様式が使用され得、これには、眼内適用又は局所適用が含まれるがこれらに限定されない。１つの実施態様では、適用は、眼内にであり、これには、結膜下への注射、前房内への注射、耳側輪部を介した前眼房への注射、角膜実質への注射、角膜内への注射、網膜下への注射、眼房水への注射、テノン下への注射、又は持続送達装置、硝子体内への注射（硝子体の前部、中央部、又は後部への注射）が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様では、適用は局所的であり、これには、角膜への点眼液が挙げられるがこれに限定されない。
【０１７５】
１つの実施態様では、本明細書に報告されているような（二価）抗体又は医薬製剤は、硝子体内への適用を介して、例えば硝子体内への注射を介して投与される。これは、当技術分野において公知である標準的な手順に従って実施され得る（例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206、及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照）。
【０１７６】
いくつかの実施態様では、本明細書に報告されているような治療キットは、本明細書に記載の医薬製剤に存在する１用量以上の（二価）抗体、医薬製剤の硝子体内への注射に適した器具、及び注射を実施するのに適した被験者及びプロトコールを詳述した説明書を含有し得る。これらの実施態様では、製剤は典型的には、硝子体内への注射を介した処置の必要な被験者に投与される。これは、当技術分野において公知である標準的な手順に従って実施され得る（例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206、及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照）。
【０１７７】
製剤はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤も含有し得る。微生物の存在の防御は、上記の滅菌手順によって、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含の両方によって確実となり得る。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを製剤に含めることも望ましくあり得る。
【０１７８】
さらに、注射可能な医薬剤形の延長吸収が、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらされ得る。
【０１７９】
選択された投与経路に関係なく、適切な水和形で使用され得る本明細書に報告されているような（二価）抗体及び／又は本明細書に報告されているような医薬製剤は、当業者には公知である慣用的な方法によって薬学的に許容される剤形へと製剤化される。
【０１８０】
本明細書に報告されているような医薬製剤中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性を及ぼすことなく、特定の患者、特定の製剤、及び特定の投与様式にとって望ましい治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変更されてもよい。選択された用量レベルは、使用される具体的な製剤の活性、投与経路、投与時刻、使用される具体的な化合物の排泄速度、処置期間、使用される具体的な製剤と併用して使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、容態、全般的な健康状態、及び病歴、並びに医学分野において周知である同様な因子をはじめとする様々な薬物動態的因子に依存するだろう。
【０１８１】
製剤は無菌でなければならず、製剤がシリンジによって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は好ましくは、等張緩衝化食塩水溶液である。
【０１８２】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを製剤に含めることが好ましい。
【０１８３】
製剤は、結膜下投与のための活性薬剤を含む眼用デポ製剤を含み得る。眼用デポ製剤は、実質的に純粋な活性薬剤、例えば本明細書に報告されているような二重特異的抗体の微粒子を含む。本明細書に報告されているような二重特異的抗体を含む微粒子を、生体適合性の薬学的に許容されるポリマー又は液体封入剤に包埋してもよい。デポ製剤は、より長期間にわたり全て又は実質的に全ての活性材料を放出するように適応されていてもよい。ポリマー又は液体マトリックス（存在する場合）は、十分に分解されて、投与部位から全て又は実質的に全ての活性薬剤の放出後に輸送されるように適応されていてもよい。デポ製剤は、薬学的に許容されるポリマーと溶解又は分散させた活性薬剤とを含む、液体製剤であってもよい。注射時に、ポリマーは、例えばゲル化又は沈降によって、注射部位で貯蔵を形成する。
【０１８４】
本明細書に報告されているような別の態様は、眼血管疾患の処置に使用するための本明細書に報告されているような（二価）抗体である。
【０１８５】
本明細書に報告されているような別の態様は、眼血管疾患の処置に使用するための本明細書に報告されているような医薬製剤である。
【０１８６】
本明細書に報告されているような別の態様は、眼血管疾患の処置用の医薬品の製造のための本明細書に報告されているような（二価）抗体の使用である。
【０１８７】
本明細書に報告されているような別の態様は、本明細書に報告されているような（二価）抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによる、眼血管疾患に罹患している患者の処置法である。
【０１８８】
ＩＸ．治療法
本明細書において提供される（二価）抗体のいずれかを、治療法に使用し得る。
【０１８９】
特定の実施態様では、処置法に使用するための（二価）抗体が提供される。上記のいずれかの実施態様による「個体」は１つの好ましい実施態様ではヒトである。
【０１９０】
特定の実施態様では、処置法に使用するための（二価）抗体が提供される。実施態様のいずれかによる「個体」は、１つの実施態様ではヒトである。
【０１９１】
本明細書に報告されているような（二価）抗体は、優良医療規範に準じた様式で製剤化、用量化、及び投与されるだろう。この脈絡において考慮される因子としては、処置される具体的な障害、処置される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与計画、及び医療従事者には公知の他の因子が挙げられる。（二価）抗体は、問題となっている障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される必要はないが、場合によりそれと共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する（二価）抗体の量、障害又は処置の種類、及び上記に考察された他の因子に依存する。これらは一般的に、本明細書に記載のものと同じ用量及び同じ投与経路で、又は本明細書に記載の用量の約１〜９９％で、又は経験的に／臨床的に適切であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
【０１９２】
疾患の予防又は治療のために、本明細書に報告されているような（二価）抗体の（単独で又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合の）適切な用量は、処置される予定の疾患の種類、（二価）抗体の種類、疾患の重症度及び経過、（二価）抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の病歴、並びに（二価）抗体に対する応答、並びに担当医の判断に依存するだろう。（二価）抗体は、一度に又は一連の処置におよび患者に適切に投与される。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎に（例えば、患者が、約２〜約２０、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）投与されてもよい。初回により高い負荷量を投与し、続いて１回以上のより低用量を投与してもよい。この療法の進展は、慣用的な技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１９３】
Ｘ．製品
本明細書に報告されているような別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含有している製品が提供される。製品は、容器と、容器の上又は容器と共に付随しているラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は製剤を保持し、この製剤は単独であるか、あるいは容態を治療、予防及び／又は診断するのに有効な別の製剤と配合されている。製剤中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に報告されているような（二価）抗体である。ラベル又は添付文書は、該製剤が、選択された容態の処置のために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）第一容器（この中に製剤が含有されている）（ここでの製剤は本明細書に報告されているような（二価）抗体を含む）；及び（ｂ）第二の容器（この中に製剤が含有されている）（ここでの製剤はさらに他の治療剤を含む）を含み得る。本明細書に報告されているようなこの実施態様における製品は、該製剤を特定の容態を処置するために使用することができることを示した添付文書をさらに含み得る。代替的に又は追加的に、製品はさらに、薬学的に許容される緩衝液を含む第二（又は第三）の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジをはじめとする、商業的見地及びユーザーの見地から望ましい他の材料も含み得る。
【０１９４】
ＸＩ．改変
さらなる態様では、上記のいずれかの実施態様による（二価）抗体は、以下の第１〜５章に記載のように、特色のいずれかを単独で又は組み合わせて取り込み得る。
【０１９５】
１．抗体の親和性
特定の実施態様では、本明細書において提供される（二価）抗体は、その標的のいずれかに対して１００nM以下、１０nM以下（例えば１０−７Ｍ以下、例えば１０−７Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１９６】
１つの実施態様では、ＫＤは、ビアコア（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ビアコア（登録商標）２０００又はビアコア（登録商標）３０００（ＧＥヘルスケア社、ピスケータウェイ、ＮＪ州）を使用したアッセイは、２５℃で約１０レスポンスユニット（ＲＵ）で固定された抗原ＣＭ５チップを用いて実施される。１つの実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥヘルスケア社）を、業者の説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を１０mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて５μg/mL（約０．２μM）へと希釈し、その後、５μL/分の流速で注入して、約１０レスポンスユニット（ＲＵ）の結合したタンパク質を達成した。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、反応していない基をブロックする。反応速度の測定のために、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中のＦａｂの２倍連続希釈液（０．７８nＭ〜５００nM）を、約２５μL/分の流速で２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にあてはめることによって、単純な１：１のラングミュア結合モデル（ビアコア（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照）。会合速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、会合速度は、撹拌キュベットを有するストップフローを備えた分光光度計（アビブ・インストルメンツ社）又は８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（サーモスペクトロニック社）などの分光光度計で測定されるような、漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０nMの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nmのバンドバス）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定され得る。
【０１９７】
２．キメラ結合部位及びヒト化結合部位
特定の実施態様では、本明細書において提供される（二価）抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体の１つ又は２つの抗体結合部位を含む。
【０１９８】
特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はヒト以外の霊長類、例えばサル由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれとは変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１９９】
特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減させるためにヒト化されているが、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持している。一般的には、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来している、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むだろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基を、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来する抗体）に由来する対応する残基を用いて置換することにより、例えば抗体の特異性又は親和性は回復又は改善する。
【０２００】
ヒト化抗体及びそれらの作製法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に論評され、さらに例えば、Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、及び米国特許第７，０８７，４０９号; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性を決定する領域（ＳＤＲ）の移植を記載); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (「表面再構成」を記載); Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (「ＦＲシャッフル」を記載); Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68；及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフルに対する「誘導選択」アプローチを記載）に記載されている。
【０２０１】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照）；ヒト抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の特定の亜群の共通配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞の突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリーをスクリーニングすることから得られたフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照)が挙げられがこれらに限定されない。
【０２０２】
３．ヒト抗体結合部位
特定の実施態様では、本明細書において提供される（二価）抗体は、ヒト抗体の１つ又は２つの抗体結合部位を含む。
【０２０３】
ヒト抗体は、当技術分野において公知である様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
【０２０４】
ヒト抗体は、抗原による攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫源を投与することによって調製され得る。このような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えているか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体に無作為に組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有している。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載した米国特許第６，０７５，１８１号及び米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭＡＢ（登録商標）技術を記載した米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載した米国特許第７，０４１，８７０号；及びＶＥＲＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体に由来するヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変してもよい。
【０２０５】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づいた方法によって作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている（例えばKozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して作製されたヒト抗体はまた、Li, J.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562にも記載されている。追加の方法としては、例えば米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されている方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191にも記載されている。
【０２０６】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製され得る。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載されている。
【０２０７】
４．ライブラリーから得られた抗体結合部位
本明細書に報告されているような（二価）抗体は、所望の活性又は活性群を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離された抗体の１つ又は２つの抗体結合部位を含み得る。
【０２０８】
例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に記載され、例えば、the McCafferty, J. et al., Nature348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132にさらに記載されている。
【０２０９】
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組み替えられ、これをその後、Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載のように抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてのいずれかで抗体断片を提示する。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく、免疫源に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることにより、Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載のような免疫化を全く伴うことなく、多種多様な非自己抗原及びまた自己抗原に対する単一の抗体入手源を提供してもよい。最後に、幹細胞から再編成されていないＶ遺伝子区域を、高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードしかつHoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388に記載のようなインビトロでの再編成を達成するための無作為な配列を含有しているＰＣＲプライマーを使用してクローニングすることによって、ナイーブライブラリーを合成で作製してもよい。ヒト抗体ファージライブラリーを記載した特許公開としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号、及び米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２１０】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
【０２１１】
５．二価抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書において提供される（二価）抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、（二価）抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。（二価）抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、（二価）抗体をコードしているヌクレオチド配列に導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、（二価）抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換を含む。最終構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行ない得、ただし、最終構築物は所望の特徴、例えば抗原との結合を有する。
【０２１２】
ａ）置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する（二価）抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための関心対象の部位としてはＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、以下の表に「好ましい置換」の表題で示されている。より実質的な変化が、「例示的な置換」の表題で以下の表において、及びアミノ酸側鎖クラスに言及して以下にさらに記載されているように提供されている。アミノ酸置換を、関心対象の（二価）抗体に導入し得、そして産物を所望の活性、例えば保持された／改善された抗原との結合、低減された免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングし得る。
【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
アミノ酸は、共通した側鎖の特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ：
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ：
（５）側鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２１５】
非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのメンバーを、別のクラスのものと交換することを含む。
【０２１６】
ある種類の置換変異体は、親（二価）抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的には、さらなる研究のために選択された結果として得られた変異体（群）は、親抗体（二価）抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば増加した親和性、低減した免疫原性）の改変（例えば改善）を有し、及び／又は、親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有するだろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟（二価）抗体であり、これは例えば本明細書に記載の技術などのファージディスプレイに基づいた親和性成熟技術を使用して慣用的に作製され得る。簡潔に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異（二価）抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２１７】
改変（例えば置換）は、例えば（二価）抗体親和性を改善させるためにＨＶＲにおいて行なわれ得る。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程の最中に高い頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又は抗原と接触する残基において行なわれ得、結果として得られた変異ＶＨ又はＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーの構築及びそれからの再選択による親和性成熟が、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が様々な方法のいずれかによって導入される（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の（二価）抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、ＨＶＲに向けられたアプローチを含み、いくつかのＨＶＲ残基（例えば一度に４〜６個の残基）を無作為化する。抗原との結合に関与するＨＶＲ残基を、例えばアラニン走査突然変異誘発又はモデル化を使用して具体的に同定し得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が特に標的化されることが多い。
【０２１８】
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、このような改変が（二価）抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限りにおいて１つ以上のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されているような保存的置換）がＨＶＲにおいて行なわれ得る。このような改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外であり得る。上記に提供された変異ＶＨ配列及びＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは改変されていないか、又は１つ以下、２つ以下、又は３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２１９】
突然変異誘発のために標的化され得る（二価）抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって記載のような「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の一残基又はグループ（例えば、荷電した残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ）を同定し、中性アミノ酸又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）によって置換することにより、（二価）抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換を、最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入してもよい。代替的に又は追加的に、（二価）抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−（二価）抗体複合体の結晶構造を使用してもよい。このような接触残基及び隣接残基を、置換のための候補として標的化又は排除し得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有しているかどうかを決定し得る。
【０２２０】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有しているポリペプチドまでの長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端への融合物、並びに、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する（二価）抗体が挙げられる。（二価）抗体分子の他の挿入変異体としては、酵素（例えば抗体酵素を用いたプロドラッグ療法のための）又はポリペプチドに対する（二価）抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が挙げられる。
【０２２１】
ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書において提供される（二価）抗体は、（二価）抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために改変される。（二価）抗体へのグルコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作られるか又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって慣用的に成し遂げられ得る。
【０２２２】
いくつかの実施態様では、本明細書に報告されているような抗体におけるオリゴ糖の改変が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行なわれ得る。
【０２２３】
哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般的に付着している分岐した二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照されたい。オリゴ糖は、様々な糖質、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに、ＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」に含み得る。
【０２２４】
二分されたオリゴ糖（例えば（二価）抗体に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている）を有する抗体変異体がさらに提供される。このような（二価）抗体変異体は、低減したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。
【０２２５】
抗体変異体の例は、例えば国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；国際公開公報第１９９８／５８９６４号；国際公開公報第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０２２６】
ｃ）多量体化ドメイン変異体
特定の実施態様では、１つ以上のさらなるアミノ酸改変を、本明細書において提供されている（二価）抗体の多量体化ドメイン（群）に導入し得、これにより、多量体化ドメイン変異体を生成し得る。該変異体は、１つ以上のアミノ酸の位置においてアミノ酸改変（例えば置換／突然変異）を含む少なくとも１つのヒトＣＨ３ドメイン配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン）を含み得る。
【０２２７】
特定の実施態様では、本発明は、いくつかのエフェクター機能を有しているが全てのエフェクター機能を有しているわけではない（二価）抗体変異体を考え、これは、インビボにおける（二価）抗体の半減期は重要であるが特定のエフェクター機能（例えばＣＤＣ及びＡＤＣＣ）は不必要であるか又は有害であるような適用にとって望ましい候補となる。インビトロ及び／又はインビボでの細胞障害性アッセイを実施することにより、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施することにより、抗体がＦｃγＲへの結合を欠失しているが（したがってＡＤＣＣ活性を欠失している可能性がある）、ＦｃＲｎへの結合能は保持していることを確実にし得る。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現しているが、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＲｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４頁の表３に要約されている。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えばHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502参照)；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用し得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞障害性アッセイ（セルテクノロジー社、マウンテンビュー、ＣＡ州）；及びサイトトックス（CytoTox）９６（登録商標）非放射性細胞障害性アッセイ（プロメガ社、マジソン、ＭＩ州）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に又は追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボにおいて、例えばClynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているような動物モデルにおいて評価し得る。Ｃ１ｑ結合アッセイも実施することにより、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠失していることを確認し得る。例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び国際公開公報第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施し得る（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎへの結合及びインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照）。
【０２２８】
低減したエフェクター機能を有する二価抗体としては、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の残基（存在する場合）（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる；米国特許第６，７３７，０５６号参照）の１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる。このような変異体としては、アミノ酸の２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位（存在する場合）（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）の２つ以上において置換を有する変異体、例えば、２６５及び２９７の残基がアラニンへと置換した（存在する場合）（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる；米国特許第７，３３２，５８１号参照）いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ領域突然変異体が挙げられる。
【０２２９】
ＦｃＲに対する結合が改善された又は減少した特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０２３０】
特定の実施態様では、（二価）抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善させる１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８位、３３３位及び／又は３３４位（ＥＵによる残基の番号付け）において置換を有するＣＨ３ドメインを含む。
【０２３１】
いくつかの実施態様では、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載のような、改変された（すなわち改善された又は減少した）Ｃ１ｑへの結合及び／又は補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）をもたらす改変が行なわれる。
【０２３２】
半減期が延長されかつ母体から胎児へのＩｇＧの移動に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合の改善された抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-243）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。そのような抗体は、その中に１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含み、これはＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善させる。このようなＦｃ領域変異体としては、Ｆｃ領域の残基（２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４）の１つ以上における置換、例えばＦｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが挙げられる。
【０２３３】
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照されたい。
【０２３４】
ｄ）ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を強化するためのＣＨ３改変のためのいくつかのアプローチが存在し、これは、例えば国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２０５８７６８号、国際公開公報第２０１３１５７９５４号、国際公開公報第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのこのようなアプローチにおいて、第一のＣＨ３ドメイン及び第二のＣＨ３ドメインは両方共に相補的に工学操作されることにより、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）はもはや自分自身とホモ二量体化することができないが、相補的に工学操作された他方のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化するようになる（よって、第一のＣＨ３ドメインと第二のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２つの第一のＣＨドメイン間又は２つの第二のＣＨ３ドメイン間のホモ二量体は形成されない）。改善された重鎖へテロ二量体化のためのこれらの異なるアプローチは、軽鎖誤対合すなわちベンスジョーンズ型副産物を減少させる、本発明による（二価）抗体における重鎖−軽鎖改変（１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置換、並びに、ＣＨ１／ＣＬ界面に逆の荷電を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた、異なる選択肢であるとと考えられる。
【０２３５】
本発明の１つの実施態様では、本発明による前記（二価）抗体のＣＨ３ドメインは、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によって改変され得、これは、例えば国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681；国際公開公報第９８／０５０４３１号においていくつかの例を用いて詳述されている。この方法では２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変させることにより、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有している両方の重鎖のヘテロ二量体化は増加する。（２本の重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は「ノブ」であり得、他方は「ホール」である。ジスルフィド橋の導入はさらにヘテロ二量体を安定化させ（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量を増加させる。
【０２３６】
したがって、本発明の１つの実施態様では、前記（二価）抗体は（各々のポリペプチドにＣＨ３ドメインを含み、そして）さらに
（二価）抗体の第一のポリペプチドの第一のＣＨ３ドメイン及び（二価）抗体の第二のポリペプチドの第二のＣＨ３ドメインは各々、ＣＨ３ドメイン間の元来の界面を含む界面において遭遇することを特徴とし、
該界面は、（二価）抗体の形成を促進するように改変され、ここでの改変は、
ｉ）一方のポリペプチドのＣＨ３ドメインが改変され、よって、（二価）抗体内の一方のポリペプチドのＣＨ３ドメインの元来の界面に遭遇する他方のポリペプチドのＣＨ３ドメインの元来の界面内において、アミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換することにより、一方のポリペプチドのＣＨ３ドメインの界面内に突起が作られ、これは他方のポリペプチドのＣＨ３ドメインの界面内の空洞に配置することができ、そして
ｉｉ）他方のポリペプチドのＣＨ３ドメインが改変され、よって、（二価）抗体内の第一のＣＨ３ドメインの元来の界面に遭遇した第二のＣＨ３ドメインの元来の界面内において、アミノ酸残基を、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換することにより、第二のＣＨ３ドメインの界面内に空洞が作られ、この中に第一のＣＨ３ドメインの界面内の突起を配置することができる。
【０２３７】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸配残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
【０２３８】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸配残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
【０２３９】
本発明の１つの態様では、両方のＣＨ３ドメイン間においてジスルフィド橋を形成することができるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）を導入することによって、両方のＣＨ３ドメインはさらに改変される。
【０２４０】
１つの好ましい実施態様では、前記（二価）抗体は、「ノブ鎖」の第一のＣＨ３ドメインにアミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び「ホール鎖」の第二のＣＨ３ドメインにアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を含む。例えばアミノ酸Ｙ３４９Ｃ突然変異を「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに、アミノ酸Ｅ３５６Ｃ突然変異又はアミノ酸Ｓ３５４Ｃ突然変異を「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに導入することによって、ＣＨ３ドメイン間に追加の鎖間ジスルフィド橋を使用することもできる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681）。
【０２４１】
１つの実施態様では、前記（二価）抗体（これは、各重鎖にＣＨ３ドメインを含む）は、２つのＣＨ３ドメインの一方にアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインの他方にアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける追加のアミノ酸Ｓ３５４Ｃ突然変異と、他方のＣＨ３ドメインにおける追加のアミノ酸Ｙ３４９Ｃ突然変異は、鎖間ジスルフィド橋を形成している）（番号付けはＫａｂａｔによる）。
【０２４２】
ヘテロ二量体化を強化するためのＣＨ３改変のための他の技術も本発明の代替選択肢として考えられ、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号、国際公開公報第２０１３／０９６２９１に記載されている。
【０２４３】
１つの実施態様では、欧州特許第１８７０４５９Ａ１号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。このアプローチは、両方のポリペプチド間のＣＨ３ドメイン／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置おける逆の電荷を有する荷電アミノ酸の置換／突然変異の導入に基づく。前記（二価）抗体の１つの好ましい実施態様は、（二価）抗体の第一のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅの突然変異、及び（二価）抗体の第二のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋの突然変異（番号付けはＫａｂａｔＥＵインデックスによる）である。
【０２４４】
別の実施態様では、前記（二価）抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異、並びに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおける追加のアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅの突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋの突然変異を含む。
【０２４５】
別の実施態様では、前記（二価）抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインの他方にアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を含むか、又は、前記（二価）抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にアミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインの他方にアミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異、並びにさらに、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０の突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋの突然変異を含む。
【０２４６】
１つの実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。１つの実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｋ突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインポリペプチドはアミノ酸Ｌ３５１Ｄ突然変異を含む。さらなる実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸Ｌ３５１Ｋ突然変異を含む。さらなる実施態様では、第二のＣＨ３ドメインはさらに、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）から選択されたアミノ酸突然変異を含む。
【０２４７】
１つの実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。１つの実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａの突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆの突然変異を含む。さらなる実施態様では、第二のＣＨ３ドメインは、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択された、Ｔ４１１位、Ｄ３９９位、Ｓ４００位、Ｆ４０５位、Ｎ３９０位又はＫ３９２位におけるさらなるアミノ酸突然変異を含む。さらなる実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａの突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆの突然変異を含む。さらなる実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆの突然変異を含む。さらなる実施態様では、第二のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒの突然変異を含む。
【０２４８】
１つの実施態様では、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載のヘテロ二量体化アプローチ、例えば、３６８及び４０９からなる群より選択された位置におけるアミノ酸の改変を代替的に使用してもよい。
【０２４９】
１つの実施態様では、これもまた上記のノブ・イントゥ・ホール技術を使用する国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。１つの実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ａ突然変異を含む。１つの実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｙ突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ｔ突然変異を含む。
【０２５０】
１つの実施態様では、多量体化ドメインはＩｇＧ２アイソタイプであり、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。
【０２５１】
１つの実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。１つの実施態様では、第一のＣＨ３ドメインは、負に荷電したアミノ酸を用いてのアミノ酸Ｋ３９２又はＮ３９２の置換（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第二のＣＨ３ドメインは、正に荷電したアミノ酸を用いてのアミノ酸Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７の置換（例えばリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはさらに、負に荷電したアミノ酸を用いてのアミノ酸Ｋ４０９又はＲ４０９の置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を含む。さらなる実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはさらに又は代替的には、負に荷電したアミノ酸を用いてのアミノ酸Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の置換（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））を含む。
【０２５２】
１つの実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。１つの実施態様では、第一のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄの突然変異を含み、第二のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄの突然変異を含む。
【０２５３】
１つの実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載のヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用してもよい。
【０２５４】
以下の実施例、配列及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく示された手順に改変を行ない得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】２７５秒間の期間におよぶ、ビアコアを使用した、抗原２（ＶＥＧＦ）に対する様々なオフタボディ変異体の結合の決定。親和性は、「会合速度」及び「解離速度」から構成される。「会合速度」については、抗体が抗原に結合する時間が決定される。「解離速度」は、抗体が抗原から解離するまでどれだけ長く結合したままでいるかを示す。さらに、陰性対照（基線）も測定した。
【図２】３５０秒間の期間におよぶ、ビアコアを使用した、抗原１及び抗原２に対するタンパク質１の結合親和性の決定。抗原１をチップ上に固定し、タンパク質１及び抗原２を連続して注入した。抗原に対するタンパク質１の親和性は「会合速度」及び「解離速度」から構成される。「会合速度」については、抗体が抗原に結合する時間が決定される。「解離速度」は、抗体が抗原から解離するまでどれだけ長く結合したままでいるかを示す。陰性対照（基線）を基準として測定した。
【０２５６】
実施例
材料及び方法
分取用の制限酵素消化物
最初に、クローニングベクター ３μgを、２０Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ及びＮｈｅＩ−ＨＦを用いて切り出した。同様に、挿入される予定の合成遺伝子断片 ２μg（ジーンアート社、レーゲンベルク、ドイツ）を、２０Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ及びＮｈｅＩ−ＨＦを用いて切り出した。バッチを続いて、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、バッチをゲル電気泳動によって分析した。
【０２５７】
定性用の制限酵素消化物
５Ｕの制限酵素及び構築物の分取液（約５００ng）を、定性用の制限酵素消化物のバッチのために使用した。バッチを続いて、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、バッチをゲル電気泳動によって分析した。
【０２５８】
ゲル電気泳動
各場合において、１％アガロースゲル及び０．５μgのサイズ標準物質を、分取用の消化物及び定性用の制限酵素消化物の分析のために使用した。１０×ローディング緩衝液と事前に混合しておいた全消化物のバッチを、分取用消化物の範囲内に適用した。臭化エチジウムと配合した１×ＴＢＥ緩衝液を泳動緩衝液として使用した。ゲル電気泳動を、１００Ｖの電圧で約４５分間実施した。ゲルを続いて、ＵＶシステムを使用して分析し、記述した。
【０２５９】
消化物 １００ngを、定性用の制限酵素消化物の分析のためにアプライした。さらに、分取用消化物についてすでに記載されたのと同じ手順に従った。
【０２６０】
ゲル抽出
約１２０mgのゲルを取り出す、Ｘ−ＴＲＡＣＴＡ第ＩＩ世代カッターを切り出しに使用した。ロシュ製のHigh Pure PCR Product Purificationキットを製造業者の仕様書に従って使用することにより、アガロースゲル切片から関心対象の区域のＤＮＡが得られた。類似の手順を使用することにより、切り出しクローニングベクターが得られた。
【０２６１】
ライゲーション
Rapid DNAライゲーションキットを製造業者の仕様書に従ってクローニングベクターと挿入断片のライゲーションのために使用した。クローニングベクターを、rAPidアルカリホスファターゼキットを使用して事前に脱リン酸化することにより、自己ライゲーションを防いだ。キットは同様に製造業者の仕様書に従って使用された。再ライゲーション対照では、クローニングベクターのみをライゲーション用バッチに加えた。
【０２６２】
形質転換
形質転換は、製造業者の仕様書に従って可能な最大の程度まで実施された。しかしながら、細胞から構成されるバッチ及びライゲーション用バッチを、氷上でたったの１５分間インキュベートした。熱ショック及び氷上でのインキュベーション後、３００μL〜６００μLのＳＯＣ培地を、形質転換用バッチのサイズに応じて添加した。バッチを続いてサーモミキサー中で３７℃で３００rpmで１時間インキュベートした。次いで、３０μL〜５０μLのバッチを栄養寒天プレート（１００μg/mLのアンピシリンを含む）上に蒔き、これを３７℃で一晩インキュベートした。
【０２６３】
プラスミド単離
ロシュ製のHigh Pure Plasmid Isolationキットを製造業者の仕様書に従って使用した。栄養寒天プレートからコロニー形成単位（ＣＦＵ）の構築物を拾い上げ、アンピシリンと配合したＬＢ培地 ４mLに接種することによって、事前に微量培養液に接種した。このバッチを３７℃及び２００rpmで一晩インキュベートした。最大培養液を生成するために、微量培養液 ２００μLを使用して、アンピシリンと配合したＬＢ培地 ３５０mLに接種した。このバッチを同様に３７℃及び２００rpmでインキュベートした。
【０２６４】
キアゲン社製のHiSpeed Plasmid Maxiキットを、製造業者の仕様書に従って一晩培養液 １５０mlに使用した。溶出のために、しかしながら、添加されたＴＥ緩衝液を１：４に希釈し、これによりＥＤＴＡは、その後の実験にために低濃度であった。プロトコールの最後の工程後、溶出液を、３回目に５mLのシリンジを用いて採取し、フィルターを通してエッペンドルフチューブに溶出した。チューブを、卓上遠心機で１３，０００rpmで２分間遠心分離にかけた。上清を新たなエッペンドルフチューブに移した。プラスミドＤＮＡ濃度を続いて、ナノドロップ機器を使用して決定した。
【０２６５】
ＤＮＡ沈降
キアゲン社製のHiSpeed Plasmid Maxiキットを使用して単離された特定の容量の組換えＤＮＡを沈降させた。この目的を達成するために、３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）の１/１０容量を、単離されたＤＮＡに加え、ボルテックスにかけた。１００％エタノールの２１/２容量を続いて加え、混合した。バッチを室温で５分間インキュベートした。バッチを続いて、卓上遠心機で１３，０００rpmで５分間遠心分離にかけた。上清を廃棄した。ＤＮＡペレットを１mLの７０％エタノールと配合し、バッチを前後に振り、次いで室温で５分間インキュベートした。バッチをもう一回卓上遠心機で１３，０００rpmで５分間遠心分離にかけた。トランスフェクション用の無菌ＤＮＡを得るために、チューブをクリーンベンチの下に移動し、そこで上清を注意深く除去した。ペレットを蓋の開いたエッペンドルフチューブ中で乾燥させた。最後に、乾燥させたペレットを、再蒸留水に４℃で一晩溶解した。ＤＮＡ濃度を決定するために、再蒸留水に溶かしたＤＮＡを、１０mMのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で１：１０に希釈し、希釈度をナノドロップ機器を使用して測定した。
【０２６６】
細胞培養液
手順を、６mL/Ｌのペニシリン・ストレプトマイシン溶液と事前に配合しておいたギブコ社製のＦ１７培地中に保持していたＨＥＫ２９３Ｆ懸濁培養液を用いて実施した。細胞を３日目〜４日目毎に分割した。細胞を、温度３７℃、ＣＯ２飽和度７％、及び相対室内湿度８０％のインキュベーター中で１３５rpmで撹拌した。
【０２６７】
生存力及び細胞数の決定
ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁培養液の生存力及び細胞数を、ＣＡＳＹモデルＴＴセルカウンター及びアナライザーを使用して決定した。電解質溶液（ＣＡＳＹ（登録商標）ｔｏｎ）中の細胞を測定した［３２］。
【０２６８】
哺乳動物細胞における一過性トランスフェクション
トランスフェクションは、ノバゲン社製の２９３フリートランスフェクション試薬を使用して製造業者の仕様書に従って実施された。たった１回のトランスフェクション後工程が挿入された。２０mL/Ｌの４５％グルコース及び２０mL/ＬのＬ−グルタミンを、トランスフェクション後の初日に細胞に加えた。発現され分泌されたタンパク質を６日目又は７日目に収集した。この目的を達成するために、全トランスフェクションバッチを４℃及び５００×ｇで２０分間遠心分離にかけた。上清を続いて、新たな容器に移し、さらに２０分間４℃で３４５２×ｇで遠心分離にかけた。最後に、上清を発現され分泌されたタンパク質と一緒に滅菌ろ過した。
【０２６９】
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃ−タグアフィニティクロマトグラフィー
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃ−タグアフィニティクロマトグラフィーでは、カラムマトリックス上に固定されたラクダ抗体断片は、Ｃ−キャップペプチドＥＰＥＡを認識する。これにより所望のタンパク質が結合し、上清から精製される。
【０２７０】
表面共鳴測定
表面共鳴測定は、無細胞相互作用アッセイを含む。表面共鳴測定は、抗体が抗原に結合する親和性を決定することを可能とする。親和性は、「会合速度」及び「解離速度」から構成される。「会合速度」については、抗体が抗原と結合する時間が決定される。「解離速度」は、抗体が抗原から解離するまでどれだけ長く結合したままでいるかを示す。２つの抗原の同時結合を測定するために、一方の抗原をチップ上に固定し、抗体及び第二の抗原を連続して注入する。
【０２７１】
細胞アッセイ
細胞アッセイでは、分析される予定の分子がどれだけ良好に、結合される予定の分子が関与する特定のシグナルカスケードを妨げるかを決定するために試験を実施する。細胞アッセイの範囲内において、安定なトランスフェクションの結果として特定の受容体を発現しているＨＥＫ細胞を使用する。この受容体は、調べられる予定の抗体によって認識されかつ結合する抗原に結合する。
【０２７２】
ルシフェラーゼアッセイ（レポーター遺伝子アッセイ）
このアッセイでは、結合される予定の抗原１は、それが適合する受容体と結合した場合にシグナルカスケードをトリガーする。このシグナルカスケードによりルシフェラーゼが発現する。ルシフェラーゼは、５’−フルオロルシフェリンからオキシフルオロルシフェリンへの反応を触媒し、結果として発光が起こる。相対的な発光単位（ＲＬＵ）はルシフェラーゼシグナルに相関する。抗体が抗原１と結合した場合、後者はもはや受容体には結合できないので、シグナルカスケードはトリガーされず、ルシフェラーゼシグナルは存在しない。
【０２７３】
キナーゼ受容体活性化アッセイ
このアッセイは、抗原２と結合中の抗原受容体の自己リン酸化に基づく。リン酸化の程度はＥＬＩＳＡによって決定される。多層プレートを、抗原受容体に対する「捕捉抗体」で覆う。細胞を抗原２及び抗体と共にインキュベートし、溶解し、プレート上に置く。溶解液に由来する抗原受容体は、プレート上の捕捉抗体に結合する。受容体のリン酸化チロシンは、ビオチンに結合させた抗リン酸化チロシン抗体によって検出される。ビオチン基は次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンに結合する。最後に、セイヨウワサビペルオキシダーゼの基質のＴＭＢを加え、これはペルオキシダーゼによって変換され、その結果、物質の吸収が起こる。反応は終了し、光学密度を測定する。
【０２７４】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（1989）に記載のようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は製造業者の説明書に従って使用した。
【０２７５】
遺伝子の合成
所望の遺伝子区画を、ジーンアート社（レーゲンベルク、ドイツ）の所与の仕様書に従って注文した。
【０２７６】
ＤＮＡ配列の決定
ＤＮＡ配列は、MediGenomix社（マルティンスリート、ドイツ）又はSequiServe社（ファーターシュテッテン、ドイツ）で実施された二本鎖シークエンスによって決定された。
【０２７７】
ＤＮＡ配列及びタンパク質配列の分析及び配列データの管理
ＧＣＧ（ジェネティクスコンピューターグループ、マジソン、ウィスコンシン州）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びインフォマックス社製Vector NT1 Advanceスイートバージョン８．０を、配列の作製、マッピング、分析、アノテーション、及び説明のために使用した。
【０２７８】
発現ベクター
記載の抗体の発現のために、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを有する若しくは有さないｃＤＮＡ構成、又はＣＭＶプロモーターを有するゲノム構成のいずれかに基づいた、一過性発現（例えばＨＥＫ２９３−Ｆ細胞における）のための発現プラスミドを使用した。
【０２７９】
抗体遺伝子の転写単位は、以下の配列から構成されていた：
−５'末端における独特な制限酵素部位（群）、
−ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター、
−ｃＤＮＡ構成の場合にはイントロンＡ配列、
−ヒト免疫グロブリン遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードしている核酸、
−ｃＤＮＡとしての又は免疫グロブリンのエキソン−イントロン構成を有するゲノム構成のいずれかで、ヒト抗体鎖（野生型又はドメインが交換された）をコードしている核酸、
−ポリアデニル化シグナル配列を有する３’−非翻訳領域、及び
−３’ 末端における独特な制限酵素部位（群）。
【０２８０】
抗体発現カセットの他に、プラスミドは、
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミドの複製を可能とする複製起点、
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、及び
−真核細胞における選択マーカーとしてのハツカネズミ（Mus musculus）由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有していた。
【０２８１】
抗体鎖をコードしている核酸は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作製され、公知の組換え法及び組換え技術によって、例えばそれぞれのベクター内の独特な制限酵素部位を使用した対応する核酸区画の接続によって構築された。サブクローニングされた核酸配列はＤＮＡシークエンスによって確認された。一過性トランスフェクションのために、大量のプラスミドを、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養液からのプラスミド調製（NucleobondAX、マッハライ・ナーゲル社）によって調製した。
【０２８２】
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載のように使用した。
【０２８３】
二重特異的抗体は、以下に記載のような懸濁液中で増殖させているＨＥＫ２９３−Ｆ細胞内でのそれぞれの発現プラスミドの一過性共トランスフェクションによって発現させた。
【０２８４】
実施例１
トランスフェクション及びタンパク質の精製
ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞における２つのＤＮＡ構築物の共トランスフェクションは、各々の場合において、精製され滅菌された組換えＤＮＡを使用して実施された。タンパク質を続いて、上清からアフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２８５】
特定の共トランスフェクションの上清 ４００mLを各々の場合において精製した。最初に、タンパク質を、CaptureSelectＣ−タグアフィニティクロマトグラフィーを介して精製した（以下の表を参照）。溶出液のタンパク質を続いて、サイズに従ってサイズ排除クロマトグラフィーによって分離又は精製し、所望の分子フォーマットを単離した。
【０２８６】
【表１２】
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【０２８７】
実施例２
質量分析
タンパク質の分子量を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析計を使用して分析し、アミノ酸配列に基づいて決定された理論的分子量と比較した。質量及び同一性を、全ての発現したタンパク質変異体について確認した。
【０２８８】
実施例３
熱的安定性の決定
タンパク質を、Avacta Optim機器を使用して熱的安定性について調べ、融点及び凝集温度を決定した。
【０２８９】
【表１３】
2019524681.tif 000021
【０２９０】
実施例４
結合アッセイ
結合アッセイは、ビアコア機器で、表面共鳴法を使用して実施された。ビアコアアッセイを使用して、オフタボディ変異体が抗原１及び２に結合する親和性を決定した。親和性は「会合速度」及び「解離速度」から構成される。二重特異的ＩｇＧをもう一度、基準標準物質として使用した。
【０２９１】
抗原１に対する様々なオフタボディ変異体の結合親和性の決定を、４２５秒間の期間におよび実施した。抗原２に対する様々なオフタボディ変異体の結合の決定を、ビアコア機器を使用して２７５秒間の期間におよび実施した。
【０２９２】
実施例５
ルシフェラーゼアッセイ（レポーター遺伝子アッセイ）
【表１４】
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【０２９３】
実施例６
Ｔｉｅ−２に対するｈｕＡＮＧ−２の結合の阻害（ＥＬＩＳＡ）
相互作用ＥＬＩＳＡを、３８４ウェルマイクロタイタープレート（MicroCoat、ドイツ、カタログ番号４６４７１８）上で室温で実施した。各インキュベーション工程の後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートを、５μg/mlのＴｉｅ−２タンパク質を用いて１時間（ｈ）かけてコーティングした。その後、ウェルを、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０及び２％ＢＳＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ）の補充されたＰＢＳを用いて１時間かけてブロックした。精製抗体のＰＢＳ希釈液を、０．２μg/mlのヒトアンジオポエチン−２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、イギリス、カタログ番号６２３−ＡＮ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．５μg/mlのビオチニル化抗アンジオポエチン−２クローンＢＡＭ０９８１（Ｒ＆Ｄシステムズ社、イギリス）と１：３０００に希釈されたストレプトアビジンＨＲＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ、カタログ番号１１０８９１５３００１）の混合物を１時間かけて加えた。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、新たに調製されたＡＢＴＳ試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ、緩衝液の番号２０４ ５３０ ００１、タブレット番号１１ １１２ ４２２ ００１）を用いて室温で３０分間かけて展開した。４０５nmにおける吸光度を測定し、ＩＣ５０を決定した。
【０２９４】
【表１５】
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【０２９５】
実施例７
動態の特徴付け
ＡＮＧ２：
ヒトＡＮＧ２受容体結合部位−マウスＦｃ領域融合物に対する二重特異的抗体の結合を、ビアコアＴ２００機器（ＧＥヘルスケア社）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。約４０００ＲＵの抗マウスＦｃ領域抗体（１０μg/mlの抗マウス（Ｆｃ）抗体）を、シリーズＳのＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア社のＢＲ−１００５−３０）上にｐＨ５．０で、ＧＥヘルスケア社によって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって結合させた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、ＧＥヘルスケア社）を、固定化手順中のランニング緩衝液として使用した。以下の動態の特徴付けのための試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；ＧＥヘルスケア社）であった。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックは１２℃に設定し、動態の特徴付けの前にランニング緩衝液を用いて２回プライミングした。
【０２９６】
ヒトＡＮＧ２受容体結合部位−マウスＦｃ領域融合物は、１μg/mlの溶液を５μl/分の流速で３０秒間かけて注入することによって捕捉された。会合は、１：３の連続希釈液中３００nMで開始して、９０μl/分の流速で９０秒間の、様々な濃度の二重特異的抗体溶液の注入によって測定された。解離相は６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによってトリガーした。全ての表面は、５μl/分の流速での３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液を用いての６０秒間の洗浄によって再生された。バルクの屈折率の差は、抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことによって補正された。ブランク注射も差し引かれた（＝二重基準）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０２９７】
ＶＥＧＦ：
ヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１に対する二重特異的抗体の結合を、ビアコアＴ２００機器（ＧＥヘルスケア社）を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。抗ヘキサヒスチジン抗体を、ＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア社のＢＲ−１００５−３０）上に製造業者の説明書に従って、ＧＥヘルスケア社によって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって結合させた。ＨＢＳ−Ｎ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、ＧＥヘルスケア社）を、固定化手順中のランニング緩衝液として使用した。以下の動態の特徴付けのための試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；ＧＥヘルスケア社）であった。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックは１２℃に設定し、動態の特徴付けの前にランニング緩衝液を用いて２回プライミングした。
【０２９８】
ヒスチジンタグを含むヒトＶＥＧＦアイソフォーム１２１は、溶液を５μl/分の流速で３０秒間かけて注入することによって捕捉された。会合は、１：３の連続希釈液中の３００nMから開始して、９０μ/分の流速で９０秒間の、様々な濃度の二重特異的抗体溶液の注入によって測定された。解離相は６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによってトリガーした。全ての表面は、５μl/分の流速での３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液を用いての６０秒間の洗浄によって再生された。バルクの屈折率の差は、抗ヘキサヒスチジン抗体表面から得られた応答を差し引くことによって補正された。ブランク注射も差し引かれた（＝二重基準）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
【０２９９】
実施例８
動的光散乱（ＤＬＳ）による凝集温度
熱的に誘導されたタンパク質の凝集が起こる温度が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定された。ＤＬＳにより、マイクロ秒の尺度で散乱光の強度の変動から導かれた、溶液中の巨大分子のサイズ分布に関する情報が得られる。試料を徐々に加熱すると、凝集がある温度で始まり、これにより、粒径の成長がもたらされる。粒径が増加し始める温度は、凝集温度として定義される。凝集温度及び変性温度は必ずしも同一である必要はない。なぜなら、変性は必ずしも凝集にとっての必要条件ではない場合があるからである。
【０３００】
凝集温度の測定のために、DynaPro DLSプレートリーダー（ワイアット・テクノロジーズ社）を使用した。測定の前に、試料を３８４ウェルのフィルタープレート（ミリポア社のマルチスクリーン３８４ウェルろ過システム、０．４５μm）を介して３８４ウェル光学プレート（コーニング３５４０番）にろ過した。３５μLの試料容量を、製剤緩衝液（２０mMクエン酸塩、１８０mMスクロース、２０mMアルギニン、０．０２％ポリソルベート２０）中約１mg/mLのタンパク質濃度で使用した。各ウェルを２０μLのパラフィンオイル（シグマ社）で覆うことにより、蒸発を回避した。試料を２５℃から８０℃まで０．０５℃/分の速度で加熱し、操作１回あたり最大数１５個の試料についてのＤＬＳデータを連続的に取得した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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