(57)【要約】  本発明は、昆虫細胞における組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生に有用な方法および組成物を提供する。ある態様において、該方法および組成物は、感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するのに有用な量でＡＡＶ ＶＰ１タンパク質を発現する改変型Ｋｏｚａｋ配列の使用を含む。
2019513403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号２−１１から選択される、核酸。
【請求項２】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号８または配列番号９である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質が、ＡＡＶ５血清型由来である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
プロモーター配列をさらに含む、請求項１または３に記載の核酸。
【請求項５】
プロモーター配列がポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター配列である、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンがＡＵＧである、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
核酸が、ウイルス粒子内に、場合によりバキュロウイルス粒子内にパッケージされている、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸を含む、昆虫細胞。
【請求項１０】
核酸が、昆虫細胞のゲノム中に挿入されている、請求項９に記載の昆虫細胞。
【請求項１１】
昆虫細胞において組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、該ｒＡＡＶがＡＡＶ５血清型由来であり、該方法が、
ａ）昆虫細胞を、
ｉ）請求項１に記載の核酸を含むバキュロウイルス；
ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を含むバキュロウイルス；および
ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルス
でトランスフェクトし、
ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養し；そして
ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収すること
を含む、方法。
【請求項１２】
昆虫細胞において組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、該ｒＡＡＶがＡＡＶ５血清型由来であり、該方法が、
ａ）請求項９または請求項１０に記載の昆虫細胞を、場合によりバキュロウイルス内で、プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトし；
ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養し；そして
ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収すること
を含む、方法。
【請求項１３】
昆虫細胞がＳｆ９細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
改変型Ｋｏｚａｋ配列およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号１３−３２から選択される、核酸。
【請求項１５】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質がＡＡＶ８血清型由来である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１７】
プロモーター配列をさらに含む、請求項１４または１６に記載の核酸。
【請求項１８】
プロモーター配列が、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター配列である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２０】
ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンがＡＵＧである、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
核酸が、ウイルス粒子内に、場合によりバキュロウイルス粒子内にパッケージされている、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１４から２１のいずれか一項に記載の核酸を含む、昆虫細胞。
【請求項２３】
核酸が、昆虫細胞のゲノム中に挿入されている、請求項２２に記載の昆虫細胞。
【請求項２４】
昆虫細胞において組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、該ｒＡＡＶがＡＡＶ８血清型由来であり、該方法が、
ａ）昆虫細胞を、
ｉ）請求項１４に記載の核酸を含むバキュロウイルス；
ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を含むバキュロウイルス；および
ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルス
でトランスフェクトし、
ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養し；そして
ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収すること
を含む、方法。
【請求項２５】
昆虫細胞において組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、該ｒＡＡＶがＡＡＶ８血清型由来であり、該方法が、
ａ）請求項２２または請求項２３に記載の昆虫細胞を、場合によりバキュロウイルス内で、プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトし；
ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養し；そして
ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収すること
を含む、方法。
【請求項２６】
昆虫細胞がＳｆ９細胞である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
改変型Ｋｏｚａｋ配列およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号３４−４５から選択される、核酸。
【請求項２８】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４２である、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質がＡＡＶ９血清型由来である、請求項２７に記載の核酸。
【請求項３０】
プロモーター配列をさらに含む、請求項２７または２９に記載の核酸。
【請求項３１】
プロモーター配列が、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター配列である、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３３】
ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンがＡＵＧである、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
核酸が、ウイルス粒子内に、場合によりバキュロウイルス粒子内にパッケージされている、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３５】
請求項２７から３４のいずれか一項に記載の核酸を含む、昆虫細胞。
【請求項３６】
核酸が、昆虫細胞のゲノム中に挿入されている、請求項３５に記載の昆虫細胞。
【請求項３７】
昆虫細胞において組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、該ｒＡＡＶがＡＡＶ９血清型由来であり、該方法が、
ａ）昆虫細胞を、
ｉ）請求項２７に記載の核酸を含むバキュロウイルス；
ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を含むバキュロウイルス；および
ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルス
でトランスフェクトし、
ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養し；そして
ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収すること
を含む、方法。
【請求項３８】
昆虫細胞において組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、該ｒＡＡＶがＡＡＶ９血清型由来であり、該方法が、
ａ）請求項３５または請求項３６に記載の昆虫細胞を、場合によりバキュロウイルス内で、プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトし；
ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養し；そして
ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収すること
を含む、方法。
【請求項３９】
昆虫細胞がＳｆ９細胞である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号９で示される配列を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項４１】
改変型Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号４２で示される配列を有する、請求項２７に記載の核酸。
【請求項４２】
宿主細胞においてｒＡＡＶ粒子を産生するためのＶＰ１翻訳開始配列を同定する方法であって、該方法が、
複数の異なる組換えカプシド遺伝子の各々をプロデューサー細胞に導入し、ここで、各異なる組換えカプシド遺伝子が、ＶＰ１翻訳開始コドンの周辺の異なるＫｏｚａｋ配列を有し、
該プロデューサー細胞からｒＡＡＶ粒子を単離し、ここで、ｒＡＡＶ粒子は、組換えカプシド遺伝子から産生されたカプシドタンパク質を含み、そして
異なる組換えカプシド遺伝子から産生されたｒＡＡＶ粒子を評価すること
を含む、方法。
【請求項４３】
該プロデューサー細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該ＶＰ１翻訳開始コドンがＡＴＧ／ＡＵＧコドンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
該ｒＡＡＶ粒子が、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の相対含有量、その収率、そのＤＮＡ含量、その感染力、またはそれらの２以上の組み合わせをアッセイすることによって評価される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１６年４月１６日出願の、“METHOD OF ENHANCING BIOLOGICAL POTENCY OF BACULOVIRUS SYSTEM-PRODUCED RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS”と題する米国仮出願第６２／３２３，６８４号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体を引用により本明細書中に包含させる。
【０００２】
政府のサポート
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により付与されたＨＬ０９７０８８に基づく政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療のための最も有望なウイルスベクターの１つとして注目されている。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症および他の疾患に対する遺伝子治療臨床治験において評価されている。哺乳動物細胞培養系を用いたｒＡＡＶの大規模産生は歴史的に問題があったが、昆虫細胞を用いたＡＡＶ産生システムは、実行可能な代替法であることが示されている。しかしながら、異なる細胞環境が、いくつかのＡＡＶ血清型のウイルス粒子の組み立て（assembly）に関する課題を提供している。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明は、プロデューサー宿主細胞（例えば、昆虫細胞）におけるｒＡＡＶの産生に関連する組成物および方法を提供する。ｒＡＡＶ粒子の生物学的効力（例えば、感染力）は、ビリオン（ウイルス粒子）カプシド組成物、例えばカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の化学量論比に部分的に依存する。昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）などの異種系で製造された幾つかのｒＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）は、異常なＶＰ１発現レベルにより特徴付けられる。ウイルスの組み立て時に、異常なＶＰ１発現は、不適切なカプシドタンパク質比から成るウイルス粒子の産生をもたらし、それは、該粒子の効率的な細胞形質導入能力を妨げる。有用な化学量論比のカプシドタンパク質を得る方法は、ＶＰ１過剰では、ウイルス粒子を効率的にパッケージする昆虫細胞の能力を損なうことがあり、低レベルのＶＰ１では、粒子の非効率的な形質導入となり得ることを示す結果によって複雑化される。従って、昆虫細胞のｒＡＡＶ産生システムに関しては、現行の技術を用いて、粒子の組み立てに悪影響を及ぼすことなく増量された感染性粒子を産生するという課題が依然としてある。
【０００５】
本明細書に記載の方法および組成物は、ＶＰ１翻訳開始部位に関連する改変型コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む組換えＶＰ１遺伝子を提供する。本明細書に記載の組換えＶＰ１遺伝子は、目的の遺伝子を含む感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するために（例えば、その後の研究および／または治療用途のために）有用である。ある態様において、本明細書に記載の組換えＶＰ１遺伝子を用いて、昆虫細胞において１以上の血清型のｒＡＡＶ粒子を産生させることができる。ある態様において、本明細書に記載の方法および組成物を、昆虫細胞および／または目的の他のプロデューサー細胞（例えば、哺乳動物細胞）において１以上の血清型のｒＡＡＶ粒子を産生するのに有用な１以上の血清型の組換えＶＰ１遺伝子をスクリーニングおよび同定するために用いることができる。ある態様において、１以上の組換えＶＰ１遺伝子は、比較的高頻度で目的の組換えゲノムを含む、および／または誤ってパッケージされた核酸の割合が比較的低い、安定なかつ／または感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するために有用であり得る。
【０００６】
いくつかの側面において、本発明は、ＡＡＶ５血清型に由来するｒＡＡＶの産生に有用な組成物および方法を提供する。いくつかの側面において、本発明は、ＡＡＶ８血清型に由来するｒＡＡＶの産生に有用な組成物および方法を提供する。さらに他の側面において、本発明は、ＡＡＶ９血清型に由来するｒＡＡＶの産生に有用な組成物および方法を提供する。
【０００７】
いくつかの側面において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号２−１１から選択される（表１）。ある態様において、該改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号８または配列番号９である。ある態様において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶ５血清型に由来する。ある態様において、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドタンパク質は、変異体ＡＡＶ５カプシドタンパク質である（例えば、それらは、１以上の変異を含む配列によってコードされ、対応する野生型カプシドタンパク質と比べて１以上のアミノ酸置換を有するカプシドタンパク質をコードする）。
【０００８】
ある態様において、核酸は、プロモーター配列をさらに含む。ある態様において、該プロモーター配列は、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター配列である。ある態様において、改変型Ｋｏｚａｋ配列は、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む。ある態様において、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、ＡＵＧである。ある態様において、核酸は、ウイルス粒子（例えば、バキュロウイルス粒子）中にパッケージされる。ある態様において、本発明は、核酸を含む昆虫細胞を提供する。
【０００９】
いくつかの側面において、本発明は、昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生する方法であって、ここで、該ｒＡＡＶがＡＡＶ５血清型に由来する方法に関し、該方法は、（ａ）昆虫細胞を：（ｉ）改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルスであって、ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号２−１１から選択される、バキュロウイルス、（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、および（ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、でトランスフェクトし；（ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適した条件下で培養し；そして、（ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収することを含む。ある態様において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００１０】
いくつかの側面において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号１３−３２から選択される（表２）。ある態様において、改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２である。ある態様において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８血清型に由来する。ある態様において、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドタンパク質は、変異体ＡＡＶ８カプシドタンパク質である（例えば、それらは、１以上の変異を含む配列によってコードされ、対応する野生型カプシドタンパク質と比べて１以上のアミノ酸置換を有するカプシドタンパク質をコードする）。
【００１１】
ある態様において、核酸は、プロモーター配列をさらに含む。ある態様において、該プロモーター配列は、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター配列である。ある態様において、改変型Ｋｏｚａｋ配列は、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む。ある態様において、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、ＡＵＧである。ある態様において、核酸は、ウイルス粒子（例えば、バキュロウイルス粒子）中にパッケージされる。ある態様において、本発明は、該核酸を含む昆虫細胞を提供する。
【００１２】
いくつかの側面において、本発明は、昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生する方法であって、ここで、該ｒＡＡＶがＡＡＶ８血清型に由来する方法に関し、該方法は、（ａ）昆虫細胞を：（ｉ）改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ８ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルスであって、ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号１３−３２から選択される、バキュロウイルス、（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、および（ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、でトランスフェクトし；（ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適した条件下で培養し；そして、（ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収することを含む。ある態様において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００１３】
いくつかの側面において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号３４−４５から選択される（表３）。ある態様において、改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４２である。ある態様において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型に由来する。ある態様において、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドタンパク質は、変異体ＡＡＶ９カプシドタンパク質である（例えば、それらは、１以上の変異を含む配列によってコードされ、対応する野生型カプシドタンパク質と比べて１以上のアミノ酸置換を有するカプシドタンパク質をコードする）。
【００１４】
ある態様において、核酸は、プロモーター配列をさらに含む。ある態様において、該プロモーター配列は、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター配列である。ある態様において、改変型Ｋｏｚａｋ配列は、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む。ある態様において、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、ＡＵＧである。ある態様において、核酸は、ウイルス粒子（例えば、バキュロウイルス粒子）中にパッケージされる。ある態様において、本発明は、該核酸を含む昆虫細胞を提供する。
【００１５】
いくつかの側面において、本発明は、昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生する方法であって、ここで、該ｒＡＡＶがＡＡＶ９血清型に由来する方法に関し、該方法は、（ａ）昆虫細胞を：（ｉ）改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ９ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルスであって、ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列が配列番号３４−４５から選択される、バキュロウイルス、（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、および（ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、でトランスフェクトし；（ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適した条件下で培養し；そして、（ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収することを含む。ある態様において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００１６】
いくつかの側面において、本発明は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンならびにＶＰ１翻訳開始コドンのすぐ上流の１〜６個のヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列変異体および／またはＶＰ１翻訳開始コドンのすぐ下流の１〜２個のヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列変異体を含む改変型Ｋｏｚａｋ配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸のライブラリーを提供する。ある態様において、核酸は、ＸＸＸＸＸＸ（ＡＴＧ）を含み、ここで、（ＡＴＧ）はＶＰ１開始コドンである。ある態様において、核酸はＸＸＸＸＸＸ（ＡＵＧ）を含み、ここで、（ＡＵＧ）は、ＶＰ１開始コドンである。ある態様において、Ｘは任意のヌクレオチドを示し、例えば、目的のＡＡＶ血清型の野生型ＶＰ１遺伝子におけるその位置での天然ヌクレオチドとは異なる任意のヌクレオチドを表す。
【００１７】
これらおよび他の側面は、以下の明細書の記載ならびに実施例および添付の図面においてより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の側面をさらに説明するために包含され、それは、本明細書に記載の特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することにより、よりよく理解され得る。
【００１９】
【図１】図１は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするカプシドヘルパーヌクレオチドならびにコードされるカプシドタンパク質の限定されないデザインを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｓｆ９細胞にパッケージされたｒＡＡＶ５のウェスタンブロッティング分析の一例を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｓｆ９細胞にパッケージされたｒＡＡＶ８のウェスタンブロッティング分析の一例を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｓｆ９細胞にパッケージされたｒＡＡＶ９のウェスタンブロッティング分析の一例を示す。
【図３】図３は、昆虫細胞における発現のために設計されたＶＰ１カプシド遺伝子の上流の弱毒型(attenuated)Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の非限定的なヌクレオチド配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｄは、Ｓｆ９細胞で産生されたｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質組成物の非限定的な例を示す。図４Ａは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子発現カセットの設計の非限定的な例を示す。図４Ｂは、ｒＡＡＶ５ ＶＰ１タンパク質発現とその相対的ＶＰ１ Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位（ＴＩＳ）効率との直接的相関の例を示す：安定して挿入されたｃａｐ発現カセットを組み込んだ１０個の別個の細胞株から単離されたカプシドタンパク質のウェスタンブロッティング分析。各カプシドＶＰ１遺伝子構築物の相対的なＴＩＳ効率（％）を、それぞれのレーンの下に示す。図４Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞から精製したｒＡＡＶ５のカプシドタンパク質組成物の例を示す：短波ＵＶ光活性化（ステインフリー技術、Bio-Rad）で直接可視化された二重イオジキサノール精製ｒＡＡＶ５−ＧＦＰのＳＤＳ−タンパク質ゲル分析。（＊）は、ＨＥＫ２９３細胞から精製されたｒＡＡＶ５サンプルで観察されることが多く、ＶＰ２定量分析から除かれた、移動の遅いバンドを示す。図４Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞から精製されたｒＡＡＶ９のカプシドタンパク質組成物の例を示す。分析は、図４Ｃのパネルと同じである。
【００２０】
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｄは、ＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図５Ａは、破線で示されるＶＰ１ユニークＮ末端、一点短鎖線（dot-dashed line）で示されるユニークＶＰ２、および黒線で示される通常のＶＰ３ Ｃ末端を有するＡＡＶ５カプシドのアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。下向きの矢印は、それぞれのタンパク質を示す。ＭＳ分析のために選択されたトリプシンペプチドに下線を付し、それぞれの観察された質量を下に示した。トリプシンペプチドは、上から下へ、配列番号５６、４８および５７に対応する。図５Ｂは、Ｈ２１８Ｏで消化されたｒＡＡＶ５の全てのトリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。丸で囲まれたペプチドは、分析した３つのうち代表的な１つである。図５Ｃは、１６Ｏ水中で調製したトリプシンで消化したＶＰ１ゲルバンド由来の、または同じトリプシンペプチドＴＷＶＬＰＳＹＮＮＨＱＹＲ（配列番号４８）、または１８Ｏ水中で調製したトリプシンで消化したＶＰ３ゲルバンド由来の同じトリプシンペプチドＴＷＶＬＰＳＹＮＮＨＱＹＲ（配列番号４８）の２つのオーバーレイされたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。１８Ｏ水は、ペプチドのＣ末端に２つの１８Ｏ原子を組み込み、それにより質量を４原子質量単位（ａｍｕ）シフトさせる。これらの消化産物を別個にスポット／分析し、スペクトルを重ね合わせて、２つの１８ＯがＶＰ３ペプチドに完全に取り込まれることを示した。図５Ｄは、消化産物を１：１の比で混合して相対含量を計算した後のＶＰ１またはＶＰ３由来の同じペプチドの同位体“フィンガー”を示す。
【図６】図６Ａ−６Ｆは、ＨＥＫ２９３細胞（図６Ａ、６Ｄ）またはＳｆ９細胞（図６Ｂ、６Ｅ）において作製されたｒＡＡＶ９（図６Ａ−Ｃ）またはｒＡＡＶ５（図６Ｄ−Ｆ）のサイズおよび力価のナノ粒子トラッキング解析を示す。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、各サンプルについて３０秒間記録された、ｒＡＡＶ／ナノ−金粒子複合体の３つの独立したビデオキャプチャの平均である、Ｆｉｎｉｔｅ Ｔｒａｃｋ Ｌｅｎｇｔｈ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ （ＦＴＬＡ）アルゴリズムのグラフを示す。図６Ｃおよび６Ｆは、各調製物についての完全（full）／総（total）粒子の計算された比を示す。ピークに付した数字は、計算されたｒＡＡＶ／ナノ金粒子複合体のサイズを示す。より大きい直径のより小さいピークは、凝集した、ｒＡＡＶ粒子の二量体および三量体を表す。図６Ｃおよび６Ｆは、各ウイルスストック中のＡＡＶ粒子の総数に対するＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の計算された比率を示す。
【００２１】
【図７】図７Ａ−７Ｃは、ＨＥＫ２９３由来またはＳｆ９ Ｂ８由来のｒＡＡＶ５の線条体内注入後のルシフェラーゼおよびｍＡｐｐｌｅ発現を示す。図７Ａは、ＡＡＶ注入の３週間後に検出された生物発光（ＢＬＩ）シグナルを示すヒートマップ画像を提供する。疑似カラースケールは、カウントされた発光強度を表す。ＭａｘおよびＭｉｎは、それぞれカウント数の最大値および最小値である。図７Ｂは、平均±ＳＥＭ（１群あたり、ｎ＝４）として、総カウント数として表されるＢＬＩ強度を示すグラフを提供する。マンホイットニー検定分析は、群間での有意差を示す（ｐ＝０．０２８６、片側検定）。図７Ｃは、可変モードレーザースキャナー（白黒、Ｂ／Ｗ画像）または蛍光顕微鏡（カラー画像）によって検出された脳の冠状断面におけるｍＡｐｐｌｅ蛍光を示す。
【図８】図８Ａ−８Ｄは、ｒＡＡＶ−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットおよびその直近の接合部のＮＧＳリード（read）の分布を示す。図８Ａは、参照された配列の総リード数で各ヌクレオチド位置でのリード数を割ることにより数値的に正規化されたＨＥＫ２９３細胞中にパッケージされたｒＡＡＶ５−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットのＩｌｌｕｍｉｎａリードのカバー率（coverage）を示す。重複サンプルの配列カバー率グラフは、ＰＣＲフリー（ＰＣＲフリー１およびＰＣＲフリー２）ならびにＰＣＲベース（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）の矢印で示されている。ｒＡＡＶカセットと隣接配列との間のカバー率の低下は、配列カバー率の実際の減少を示すのではなく、バイオインフォマティクス解析限界のグラフ表示を反映する。パネル（図８Ａ）および（図８Ｂ）中の配列のスケールに描かれた参照されたｒＡＡＶ−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットの注釈付きのマップを、グラフの下に表示している。細菌プラスミドＤＮＡ中のｒＡＡＶカセットのすぐ隣に隣接する配列は、薄灰色で陰影付けされている。図８Ｂは、Ｓｆ９ Ｂ８細胞中にパッケージされたｒＡＡＶ５−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットのＩｌｌｕｍｉｎａリードのカバー率を示す。ｒＡＡＶカセット内のＧＣ富化配列は、濃い灰色で陰影付けされている。図８Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９ Ｂ８細胞の両方における左のｒＡＡＶ ＩＴＲのすぐ隣に隣接する配列の、図８Ａおよび図８Ｂのパネルからの拡大図を示す。図８Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９ Ｂ８細胞の両方における右のｒＡＡＶ ＩＴＲのすぐ隣に隣接する配列の、図８Ａおよび図８Ｂのパネルからの拡大図を示す。
【００２２】
【図９】図９Ａ−９Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９ Ｂ８細胞によってカプシド封入されたｒＡＡＶ５−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットにおいて同定された一塩基多型（ＳＮＰ）の分布を示す。図９Ａは、対照ｐＴＲ−Ｂａｃ−ＵＦ２６データベース配列と比べて所定の位置で読み取られた場合に、４つの残基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの置換を累積的にプロットしたものを示す。相対的ＳＮＰ比（Ｙ軸）は、所定の位置における配列決定（シークエンシング）された総深度（読まれた回数）に対する、置換を有する同じ位置における総リード数の割合として定義された。配列決定深度（読まれた回数）は、挿入／欠失（indel）を除く所定の位置における対照および代替ヌクレオチドの配列リードの合計である。ＳＮＰ変異体の分析には、陽性対照、プラスミドｐＴＲ−Ｂａｃ−ＵＦ２６サンプルが含まれた。従って、ゼロ値のＳＮＰ率は、データベース対照と同一の残基を表し、正の値は、親プラスミドデータベース配列と比較して新たに獲得されたＳＮＰを意味する。高ＧＣ含量の領域に陰影を付している。図９Ｂは、図９Ａ中の配列のスケールに描かれた参照されたｒＡＡＶ−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットの注釈付きのマップを示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂは、ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９カプシドにパッケージされたｒＡＡＶカセットの注釈付き図式マップを示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離されたｒＡＡＶ５調製物の走査プロファイルを示す（図４Ｃ）。網掛け領域は、定量化のために描かれた曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。（＊）は、分析から除外したピークを示す。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、ｒＡＡＶ５またはｒＡＡＶ９カプシド内にパッケージされたｒＡＡＶ−ＵＦ５０−ＢＣのインビトロ形質導入アッセイを示す。図１２Ａは、ｒＡＡＶ５−ＵＦ５０−ＢＣの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびその定量化図を示す。図１２Ｂは、ｒＡＡＶ９−ＵＦ５０−ＢＣの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびその定量化図を示す。
【図１３】図１３は、ＮＧＳのｒＡＡＶ５ベクターＤＮＡ調製物の概略フローチャートの非限定的な例を示す。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｃは、ＤＮＡ断片サイズのＮＧＳライブラリーの分布を示す。ＮＧＳライブラリーの分析は、High Sensitive D5000 ScreenTapeによって行った。図１４Ａは、ＮＧＳによって直接配列決定されたＰＣＲフリーライブラリーを示す：１，２−ｒＡＡＶ５／Ｓｆ９；３，４−ｒＡＡＶ５／ＨＥＫ２９３。図１４Ｂは、低サイクルＰＣＲ濃縮に用いられるＰＣＲフリーライブラリーを示す：５，６−ｒＡＡＶ５／Ｓｆ９、７，８−ｒＡＡＶ５／ＨＥＫ２９３。図１４Ｃは、ＰＣＲ富化ライブラリーを示す：９，１０−ｒＡＡＶ５／Ｓｆ９；１１，１２−ｒＡＡＶ５／ＨＥＫ２９３。ライブラリー９−１２は、ＮＧＳによって直接配列決定された。
【図１５】図１５は、ＮＧＳデータ処理の概略フローチャートの非限定的な例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
本発明の側面は、宿主プロデューサー細胞（例えば、昆虫プロデューサー細胞）においてｒＡＡＶ粒子を産生する方法および組成物を提供する。ある態様において、改変型翻訳開始配列（ＴＩＳ、Ｋｏｚａｋ配列とも言う）は、ＶＰ１開始コドン（例えば、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードする組換え遺伝子のＡＴＧ／ＡＵＧ開始コドン）と連結され、目的のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする組換え核酸に挿入されている。ある態様において、本明細書に記載の方法および組成物は、宿主プロデューサー細胞において有効なｒＡＡＶ粒子（例えば、高収率で産生されるｒＡＡＶ粒子、感染性であるｒＡＡＶ粒子、ＤＮＡ含有ｒＡＡＶ粒子、安定なｒＡＡＶ粒子など、またはそれらの任意の組み合わせ）を産生するのに有用なＶＰ１ Ｋｏｚａｋ配列を同定するために用いられ得る。ある態様において、本明細書に記載の方法および組成物を用いて産生されたｒＡＡＶ粒子は、目的の遺伝子（例えば、治療遺伝子）を含んでいてよく、治療目的で使用され得る。
【００２４】
ｒＡＡＶは、遺伝子治療／ＤＮＡワクチン送達のためのベクターとして広く使用されているが、臨床適用のための感染性ｒＡＡＶの大量産生は、現在の技術に基づいて依然として困難である。３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶゲノム中の単一のカプシド遺伝子の選択的スプライシングおよび差異的コドン使用によってもたらされる。ＶＰ３配列は３つすべてのスプライス変異体間で共通であり、ＶＰ２およびＶＰ１はより長いＮ末端配列を有し、ＶＰ１が最も長いカプシドタンパク質である（例えば、図１に例示される）。一般的なカプシド粒子におけるＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の比は、１／１／１０と推定される。さらに、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３化学量論は定義されておらず、かつ、組み立て（アセンブリ）が、カプシドに取り込まれるＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の相対量が主に宿主プロデューサー細胞における（またはインビトロ産生システムにおいる）それらの相対的発現レベルに依存するように確率論的であることが明らかである。本明細書に記載の組成物および方法は、目的の組換え遺伝子を含む感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するのに有用な相対量でプロデューサー細胞においてＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質に翻訳される改変型ＶＰ１ Ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＡＴＧ／ＡＵＧ翻訳開始コドンの周辺の）を有する組換えカプシド遺伝子を提供する。ある態様において、組換えカプシド遺伝子は、カプシド遺伝子の天然スプライシングを可能にする適切なスプライスドナーおよび／またはアクセプター部位を有さない（例えば、いくつかの態様において、組換えカプシド遺伝子の転写産物は、プロデューサー細胞において適当にまたは完璧にスプライシングされない）。ある態様において、リボソームの読み漏らし（leaky ribosomal scanning）を増加させ、カプシド遺伝子からのＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の所望の比を産生するために、弱毒型Ｋｏｚａｋ配列に関連する標準をＶＰ１翻訳開始部位に用いた。カプシド遺伝子から産生され、目的の遺伝子をカプシド形成するｒＡＡＶ粒子を、研究、臨床治験および治療目的のために用いることができる。ある態様において、本明細書に記載の改変型カプシド遺伝子は、ｒＡＡＶ粒子の大量生産のために用いられ得る。
【００２５】
ある側面において、本発明はまた、感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するのに有用な配列を同定するためのＡＡＶカプシド遺伝子発現構築物をスクリーニングおよび評価する方法および組成物も提供する。ある態様において、複数の異なるｒＡＡＶカプシド遺伝子発現構築物が、目的の宿主細胞におけるｒＡＡＶ粒子の組み立てについて評価される。ある態様において、異なるｒＡＡＶカプシド遺伝子発現構築物は、同じプロモーター、同じＡＡＶカプシドをコードする（例えば、目的の任意の血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする、場合により１以上のカプシド変異体を含んでよい）配列を含むが、ＶＰ１の翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ／ＡＵＧ）に関連する異なるＫｏｚａｋ配列を有する。一般的に、ＶＰ２およびＶＰ３の翻訳コドンおよび周囲の開始配列は変えられない（例えば、それらは天然野生型配列として維持される）。しかしながら、ある態様において、これらの配列において１以上の改変を行うことができる。ある態様において、異なるＫｏｚａｋ配列は、ＶＰ１の翻訳開始コドンのすぐ上流の６つのヌクレオチド内の配列変異を示す。ある態様において、異なるＫｏｚａｋ配列は、ＶＰ１の翻訳開始コドンのすぐ下流の２つのヌクレオチド内の配列変異を含む。従って、ある態様において、異なるＫｏｚａｋ配列は、ＶＰ１の翻訳開始コドンのすぐ上流の６つのヌクレオチド内の１以上の位置（例えば、１、２、３、４、５または６つの位置）に、および／またはＶＰ１の翻訳開始コドンのすぐ下流の２つのヌクレオチド内の１以上の位置（例えば、１または２つの位置）にヌクレオチド配列変異を表す異なるＫｏｚａｋ配列のライブラリーから選択される。ある態様において、異なるＫｏｚａｋ配列は、ＶＰ１のＫｏｚａｋ配列の全ての可能な変異体の全てまたはサブセットを表し得る。ある態様において、変異体は、ＡＡＶカプシド血清型（例えば、血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２など）の天然ＶＰ１ Ｋｏｚａｋ配列と比べて、遺伝子が改変されている。ある態様において、（例えば、対照翻訳効率と比べて、例えば天然またはコンセンサスＫｏｚａｋ配列に関連する翻訳効率と比べて）選択された割合の翻訳効率を有する異なるＫｏｚａｋ配列が評価される。ある態様において、異なるＫｏｚａｋ配列は、２５％から５０％、例えば２５％から４５％、例えば３０％から４０％の範囲、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％または他の値（例えば、上記の何れかの中間値）の翻訳効率を表す。ある態様において、所望の翻訳効率または翻訳効率の範囲を有する全てのＫｏｚａｋ配列が評価される。ある態様において、所望のパーセント範囲内の翻訳効率を有するＫｏｚａｋ配列のサブセットが評価される。ある態様において、翻訳効率の目標範囲内のパーセンテージ増分（例えば、１−５％増分、例えば約１％、２％、３％、４％または５％増分）を表すＫｏｚａｋ配列が評価される。ある態様において、異なるＫｏｚａｋ配列は、他のヘルパー遺伝子（例えば、Ｒｅｐおよび他のヘルパー遺伝子）もまた発現し、かつ（ＩＴＲ配列に隣接する目的の遺伝子が、組換えカプシド遺伝子から発現されたカプシド��ンパク質を含むｒＡＡＶ粒子内にパッケージされ得るように）ＩＴＲ配列に隣接する目的の標的遺伝子（例えば、検出可能なマーカーまたは目的の治療遺伝子をコードする制御遺伝子）を有する目的の組換えＡＡＶゲノムもまた含む、宿主細胞中に異なるＫｏｚａｋ配列（例えば、ＶＰ１開始コドンに関連する）を有する組換えカプシド遺伝子をそれぞれ含む組換え核酸を導入することにより評価される。宿主細胞は、任意のタイプの細胞であり得る（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞または他のタイプの宿主細胞）。宿主細胞は、プラスミドトランスフェクション（例えば、他のヘルパー遺伝子を発現する、および／または目的のｒＡＡＶゲノムを含む、１以上のプラスミドを用いて）、ウイルス形質導入（例えば、他のヘルパー遺伝子を発現する、および／または目的のｒＡＡＶゲノムを含む組換えウイルスゲノムを有する、組換えバキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、または他の組換えウイルスのような１以上の組換えウイルスを用いて）、またはゲノムインテグレーション(integration)（例えば、１以上のヘルパー遺伝子および／または目的のｒＡＡＶゲノムとの）の結果として、他のヘルパー遺伝子を発現し得る、および／または目的のｒＡＡＶゲノムを含み得る。異なるカプシド遺伝子構築物を宿主細胞に導入した後、ｒＡＡＶ粒子を産生する条件下で細胞をインキュベートし、ｒＡＡＶ粒子を単離および／または精製して、評価する。単離および／または精製されたｒＡＡＶ粒子は、限定されるものではないが、以下の１つ以上を含む１つまたは複数の要因に基づいて評価することができる：
【００２６】
ａ）ｒＡＡＶ粒子の収量。ある態様において、例えば同じ血清型の（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞において、例えば対照方法(reference methodology)を用いて産生される）対照ｒＡＡＶと同様またはより良い収量が選択される。
ｂ）ｒＡＡＶ粒子中のＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３タンパク質の比。ある態様において、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の比が＞０．５／＞０．５／１０であるものが選択される。従って、ある態様において、ＶＰ１／ＶＰ３の比はおよそ＞０．５／１０、例えばおよそ＞０．７５／１０、例えばおよそ＞１／１０、例えばおよそ＞１．２５／１０、例えばおよそ＞１．５／１０、例えばおよそ＞１．７５／１０、または約２／１０、あるいは任意の中間の比である。同様に、ある態様において、ＶＰ２／ＶＰ３の比は、独立しておよそ＞０．５／１０、例えばおよそ＞０．７５／１０、例えばおよそ＞１／１０、例えばおよそ＞１．２５／１０、例えばおよそ＞１．５／１０、例えばおよそ＞１．７５／１０、または約２／１０、あるいは任意の中間の比である。
ｃ）完全(full)／空(empty)のｒＡＡＶ粒子の比率。ある態様において、対照比（例えばＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞において対照方法を用いて産生される、例えば同じ血清型のｒＡＡＶ粒子について完全／空の比）と同じかまたはそれより大きい、完全／空の粒子比が選択される。
ｄ）ｒＡＡＶ粒子の形質導入効率。ある態様において、例えば同じ血清型（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞において、対照方法を用いて産生される）の対照ｒＡＡＶと同様のまたはより良い形質導入効率が選択される。ある態様において、形質導入効率は、インビトロで（例えば、培養物中で増殖させた細胞において、例えばＨｅＬａ細胞において）評価される。ある態様において、形質導入効率は、インビボで（例えば、動物モデルにおいて、例えばマウスモデルのような齧歯動物モデルにおいて）評価される。
ｅ）ｒＡＡＶ粒子中のＤＮＡパッケージの精度(precision)。ある態様において、対照ｒＡＡＶと同様のまたはそれより高い精度のＤＮＡパッケージ（例えば、他のＤＮＡ、例えば宿主ＤＮＡあるいは宿主細胞中のプラスミドまたはウイルスベクター上のｒＡＡＶゲノムに隣接するＤＮＡと比べて、ｒＡＡＶゲノムＤＮＡ）が選択される。ある態様において、対照ｒＡＡＶは、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞において、対照方法を用いて産生される、例えば同じ血清型のｒＡＡＶであり得る。ある態様において、ＤＮＡパッケージの精度は、パッケージされる非ｒＡＡＶゲノムの割合を決定することによって評価され得る。これは、例えば、ｒＡＡＶ粒子中のパッケージされたＤＮＡを（例えば、ＮＧＳまたは他の技術を用いて）配列決定することによって、任意の適切な方法を用いて決定することができる。
【００２７】
この評価の結果として、１以上のＫｏｚａｋ配列（および／またはＶＰ１翻訳開始コドンの上流のＫｏｚａｋ配列を含むＣａｐ発現構築物）は、特定の細胞タイプにおいて目的のｒＡＡＶを産生するために選択され使用され得る。
【００２８】
従って、本発明の側面は、昆虫細胞におけるｒＡＡＶの産生に有用な方法および組成物に関する。いくつかの側面において、本発明は、ｉ）改変型Ｋｏｚａｋ配列、およびｉｉ）ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を提供する。ある態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ５血清型カプシドタンパク質に由来する。ある態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８血清型カプシドタンパク質に由来する。ある態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型カプシドタンパク質に由来する。ある態様において、ヌクレオチド配列は、プロモーター配列をさらに含む。ある態様において、プロモーターは、改変型Ｋｏｚａｋ配列およびＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている。
【００２９】
本明細書に記載の核酸を含む一般的な構造の非限定的な例を図１に示す。核酸１００は、改変型Ｋｏｚａｋ配列１２０ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質１１０をコードするヌクレオチド配列を含む。野生型（ｗｔ）ＡＡＶにおいて、哺乳動物細胞において、カプシドタンパク質は、スプライシングされて２つのｍＲＮＡイソ型を生成し得る単一のｍＲＮＡとして転写される。この転写後プロセッシングおよびリボソームの読み漏らしは、３つの別個のカプシドタンパク質の産生を可能にする：ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質１１１、代替開始コドンＡＣＧから開始されるＡＡＶ ＶＰ２カプシドタンパク質１１２、およびＡＡＶ ＶＰ３カプシドタンパク質１１３。さらに、ある態様において、同じヌクレオチド配列内の別個のオープンリーディングフレームは、組み立て−活性化タンパク質(assembly-activating protein)（ＡＡＰ）１１４をコードする。ある態様において、プロモーター配列１３０は、ヌクレオチド配列に作動可能に連結される。ある態様において、核酸はエンハンサーを含む。ある態様において、ヌクレオチド配列は、２以上のプロモーターを含む。ある態様において、ｒＡＡＶカプシドにパッケージされたｒＡＡＶカセットは、図１０Ａおよび１０Ｂに見出されるものに似ている。
【００３０】
プロモーターは、該プロモーター配列がヌクレオチド配列の転写を調節および／または制御するとき、該ヌクレオチド配列に“作動可能に”されている。ある態様において、昆虫細胞において活性なプロモーターを利用するのが有利である。ある態様において、プロモーターは、ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターである。ある態様において、プロモーターは、ｐ１０、ｐ３５およびＩＥ−１からなる群より選択される。昆虫宿主細胞において外来遺伝子を発現させるための方法および技術は、当技術分野で公知である。昆虫細胞における分子工学およびポリペプチドの発現のための方法は、例えば、Summers and Smith. 1986、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.；Luckow. 1991、Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152；King, L. A. and R. D. Possee, 1992、The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom；O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992、Baculovirus Expression Vectors： A Laboratory Manual, New York； W.H. Freeman and Richardson, C. D., 1995、Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39；米国特許第４，７４５，０５１号；ＵＳ２００３１４８５０６；およびＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。しかしながら、プロデューサー細胞として用いられる細胞タイプ（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞またはそれ以外の細胞）によって任意の適当なプロモーター（例えば、任意の天然、変異体、合成、キメラ、短縮型（truncated）、構成的、誘導性、組織特異的、種特異的など、プロモーターまたは上記の２以上の組合せ）が使用可能である。
【００３１】
ある態様において、本明細書に記載の改変型Ｋｏｚａｋ配列は、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンを含む。ある態様において、開始コドンはＡＵＧである。ある態様において、本明細書に記載の核酸は、ウイルス粒子をさらに含む。ある態様において、核酸は、ウイルス粒子内に含まれる（例えば、ウイルス粒子によってカプセル化される）。ある態様において、ウイルス粒子はＡＡＶ粒子である。ある態様において、ウイルス粒子はバキュロウイルス粒子である。
【００３２】
いくつかの側面において、本発明は、昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生する方法であって、（ａ）昆虫細胞を、（ｉ）改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むバキュロウイルス（ここで、該改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号２−１１、１３−３２または３３−４５から選択される）、（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス、および（ｉｉｉ）プロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスでトランスフェクトする工程；（ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養する工程；および、（ｃ）該昆虫細胞からｒＡＡＶを回収する工程、を含む方法を提供する。
【００３３】
ある態様において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む昆虫細胞を提供する（ここで、改変型Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号２−１１、１３−３２または３３−４５から選択される）。ある態様において、核酸は、昆虫細胞ゲノムに組み込まれる。ある態様において、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子は、昆虫細胞ゲノムに組み込まれる。従って、ある態様において、本発明は、（ａ）昆虫細胞にプロモーター配列に作動可能に連結された目的の遺伝子に隣接する２つのＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスをトランスフェクトする工程（ここで、昆虫細胞のゲノムは、本明細書に記載のヌクレオチドを含む）；（ｂ）該昆虫細胞を、ｒＡＡＶを産生するのに適する条件下で培養する工程；および、（ｃ）昆虫細胞からｒＡＡＶを回収する工程、を含む昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生する方法を提供する。
【００３４】
昆虫細胞におけるｒＡＡＶの産生は既報である（例えば、米国特許出願公開番号第ＵＳ２０１２０１００６０６号を参照のこと。その内容全体を引用により本明細書中に包含させる）。本明細書に記載の方法および組成物は、ＡＡＶの複製を可能にし、かつ培養中に維持され得る、任意の昆虫細胞において利用され得る。例えば、用いる細胞株は、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞株、ショウジョウバエ細胞株、または蚊細胞株（例えば、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）由来の細胞株）由来であり得る。ある態様において、昆虫細胞は、バキュロウイルス感染（例えば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２およびＨｚ２Ｅ５）に感受性であり得る。従って、本明細書に記載の方法および組成物は、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を用いてｒＡＡＶを産生するのに有用である。
【００３５】
ＢＥＶは、タンパク質産生のための最も汎用性の高いシステムの１つとして明らかになってきた。基本的なタンパク質産生に加えて、ＢＥＶは、異種多タンパク質複合体の合成およびＡＡＶなどの遺伝子治療ビークルのアセンブリなどのより複雑な作業に利用されている。ある態様において、後者の戦略は、各々がヘルパー機能を提供する３つのＢＥＶで同時感染した昆虫細胞を利用する。例えば、昆虫細胞は、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する目的の遺伝子を含む第１のバキュロウイルス、ＡＡＶ ｒｅｐを含む第２のバキュロウイルス、およびＡＡＶ ｃａｐを含む第３のバキュロウイルスで同時に感染される。ＡＡＶ ｃａｐは、組み立て活性化タンパク質（ＡＡＰ）ならびにウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、同じｍＲＮＡ転写物から翻訳され、それらは、２つの異なるサイズのｍＲＮＡイソ型のいずれかに転写後にスプライシングされ得る。哺乳動物細胞における転写後スプライシングは、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３カプシドタンパク質の適切な化学量論比の発現をもたらすｍＲＮＡ形態の分布を生成するのに適当な割合で生じる。また、昆虫細胞においていくつかの血清型（例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）の産生が、細胞の形質導入において非効率的な粒子を生じる。従って、組成物および方法は、昆虫細胞または任意の他の目的の宿主細胞タイプ（例えば、哺乳動物宿主プロデューサー細胞または他のタイプの細胞）におけるｒＡＡＶ産生を改善するためにＶＰ１発現レベルを改変するために有用である。
【００３６】
いくつかの側面において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を提供する（ここで、該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ５血清型に由来する）。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンおよび該開始コドンの上流のさらなるヌクレオチドを含む。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、該開始コドンの下流のヌクレオチドをさらに含む。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列ＲＮＸＴＸＴ（ＡＴＧ）ＮＹ（配列番号１）のヌクレオチドを含み、ここで、（ＡＴＧ）は、ＶＰ１開始コドンであり；ＲはＣまたはＴヌクレオチドであり；Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣから選択されるヌクレオチドであり；ＸはＧまたはＴヌクレオチドであり；および、Ｙは、Ａ、ＴまたはＣから選択されるヌクレオチドである。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、表１に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
【表１】
2019513403.tif 000003
【００３８】
いくつかの側面において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を提供し、ここで、該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８血清型に由来する。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＡＡＶ８ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンおよび該開始コドンの上流のさらなるヌクレオチドを含む。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、該開始コドンの下流のヌクレオチドをさらに含む。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列ＹＮＸＲＮＲ（ＡＴＧ）ＸＺ（配列番号１２）のヌクレオチドを含み、ここで、（ＡＴＧ）は、ＶＰ１開始コドンであり；Ｙは、Ａ、ＴまたはＣから選択されるヌクレオチドであり；ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣから選択されるヌクレオチドであり；Ｘは、ＧまたはＴヌクレオチドであり；Ｒは、ＣまたはＴヌクレオチドであり；および、Ｚは、ＧまたはＣヌクレオチドである。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、表２に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
【表２】
2019513403.tif 000004
【００４０】
いくつかの側面において、本発明は、改変型Ｋｏｚａｋ配列ならびにＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を提供し、ここで、該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型に由来する。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンおよび該開始コドンの上流のさらなるヌクレオチドを含む。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、該開始コドンの下流のヌクレオチドをさらに含む。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列ＴＮＸＴＸＴ（ＡＴＧ）ＸＺ（配列番号３３）のヌクレオチドを含み、ここで、（ＡＴＧ）は、ＶＰ１開始コドンであり；Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧから選択されるヌクレオチドであり；ＸはＧまたはＴヌクレオチドであり；および、ＺはＧまたはＣヌクレオチドである。ある態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、表３に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
【表３】
2019513403.tif 000005
【００４２】
言及される核酸がＲＮＡ分子であるかＤＮＡ分子であるかによって、ＵヌクレオチドまたはＴヌクレオチドが言及され得ることが理解されるべきである。
【００４３】
野生型ＡＡＶゲノムは、陽性または陰性のセンス鎖のいずれかの、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に１つずつの２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＩＴＲ間のｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶ生活環に必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子を含む。ｃａｐ ＯＲＦは、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（それらは、相互作用してウイルスカプシドを形成する）をコードする重複遺伝子を含む。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１つのｍＲＮＡ転写物から翻訳され、それらが２つの異なる様式でスプライシングされ得る：より長いかまたはより短いイントロンのいずれかを切り取ることにより、２つのアイソフォームのｍＲＮＡ：〜２．３ｋｂおよび〜２．６ｋｂのｍＲＮＡイソ型、を形成することができる。カプシドは、約６０個の個々のカプシドタンパク質サブユニットの超分子集合体を、ＡＡＶゲノムを保護することができる非エンベロープのＴ−１二十面体格子に形成する。成熟カプシドは、約１：１：１０の凡その比でＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（それぞれ約８７、７３および６２ｋＤａの分子量）から構成される。ＶＰ２およびＶＰ３に対するＶＰ１のレベルは、昆虫細胞における感染性粒子の効率的な産生を得るために、本明細書に記載の通りに調節することができる。ある態様において、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比は、（０．５−２）：（０．５−２）：１０の範囲内である。ある態様において、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比は、（０．５−１．５）：（０．５−１．５）：１０の範囲内である。
【００４４】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子は、核酸ベクターを含んでいてよく、それは、少なくとも、（ａ）目的のタンパク質またはポリペプチドあるいは目的のＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）をコードする目的の遺伝子を含む１以上の異種核酸領域；および（ｂ）該１以上の核酸領域（例えば、異種核酸領域）に隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む１以上の領域を含んでいてよい。ある態様において、核酸ベクターは、２ｋｂから７ｋｂのサイズである。ある態様において、核酸ベクターは、４ｋｂから５ｋｂのサイズ（例えば、４．２から４．７ｋｂのサイズ）である。ある態様において、核酸ベクターは環状である。ある態様において、核酸ベクターは一本鎖である。ある態様において、核酸ベクターは二本鎖である。ある態様において、二本鎖核酸ベクターは、例えば、核酸ベクターの別の領域に相補的であり、二本鎖（double‐strandedness）の核酸ベクターの形成を開始する、核酸ベクターの領域を含む自己相補的ベクターである。
【００４５】
ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）から誘導され得るか、または２以上の血清型に由来し得る。ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、当該分野で公知であり、市販されている（例えば、Vector Biolabs、Philadelphia、PA；Cellbiolabs、San Diego、CA； Agilent Technologies、Santa Clara、Ca；および、Addgene、Cambridge、MA；および、Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein.  Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; および、Curtis A. Machida.  Methods in Molecular Medicine（商標）.  Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.  10.1385/1-59259-304-6:201 （著作権） Humana Press Inc. 2003.  Chapter 10.  Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.  Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski; 米国特許第５，１３９，９４１号および同第５，９６２，３１３号の製品およびサービス、それらは全て引用により本明細書中に包含される）。
【００４６】
ある態様において、ｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ調製物内の粒子は、任意の誘導体または偽型を含む任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／８、２／９、３／１、３／５、３／８または３／９）のものであり得る。本明細書で用いる、ｒＡＡＶウイルスベクターの血清型（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は、組換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型を意味する。誘導体および偽型の限定されない例としては、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５、ＡＡＶ−ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ−＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１およびＡＡＶｒ３．４５が挙げられる。かかるＡＡＶ血清型および誘導体／偽型、およびそのような誘導体／偽型を産生する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287, Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照のこと）。ある態様において、ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）１つの血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３）由来のＩＴＲを含む核酸ベクター、ならびに（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）由来のカプシドタンパク質を含むカプシドを含む、偽型のｒＡＡＶ粒子である。ある態様において、本明細書に記載の方法は、昆虫細胞において、任意の血清型、または誘導体／偽型（例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９または他の血清型もしくはそれに基づく誘導体／偽型）のＡＡＶを産生するために用いられ得る。偽型のｒＡＡＶベクターを産生および使用するための他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532、2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；および、Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照のこと）。ある態様において、１以上のカプシド置換（例えば、対応する野生型配列と比べて）が、組換えカプシド遺伝子（例えば、本明細書に記載の組換えＶＰ１遺伝子）中にコードされていてもよい。
【００４７】
ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを産生する方法は、本明細書に記載されている。他の方法もまた、当技術分野で公知であり、購入可能である（例えば、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および、米国特許出願公開第ＵＳ２００７００１５２３８号および同第ＵＳ２０１２０３２２８６１号（引用により本明細書中に包含させる）を参照；ならびに、ＡＴＣＣおよびCell Biolabs、Inc.より利用可能なプラスミドおよびキット）。例えば、核酸ベクターを含むプラスミドは、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、ＲｅＰ６８、ＲｅＰ５２およびＲｅＰ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする、本明細書に記載のとおり改変型ＶＰ３領域を含む）を含む１以上のヘルパープラスミドと組み合わされて、ｒＡＡＶ粒子がパッケージされ、続いて精製され得るようにプロデューサー細胞株にトランスフェクトされ得る。
【００４８】
ある態様において、プロデューサー細胞株は、昆虫細胞に由来する。昆虫細胞の例としては、Ｓｆ９細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１７１１（商標））が挙げられるが、これに限定されない。プロデューサー細胞は、本明細書に記載の方法に使用するためのＲｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質をコードする、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子（例えば、本明細書に記載のＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする核酸）を含み得る。ある態様において、パッケージはインビトロで実施される。
【００４９】
本明細書で提供される方法のいくつかの態様において、核酸ベクターを含むプラスミドは、例えば、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子および同じ血清型または異なる血清型のｃａｐ遺伝子を含む１以上のヘルパープラスミドと組み合わされて、ｒＡＡＶ粒子がパッケージされるようにヘルパー細胞株にトランスフェクトされる。
【００５０】
ある態様において、１以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミドならびにＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２遺伝子およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを含む。ある態様において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子である。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、PlasmidFactory、Bielefeld、Germanyの、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Vector Biolabs、Philadelphia、PA；Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；および、Addgene, Cambridge, MAから提供されている他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303;および、Moullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照のこと）。
【００５１】
ある態様において、１以上の宿主細胞（例えば、プロデューサー細胞）は、１以上のヘルパー機能（例えば、宿主細胞ゲノムに組み込まれた組換え核酸によりコードされる、または宿主細胞内のプラスミドもしくはウイルス核酸ベクターによりコードされる）を有し得る。ある態様において、本明細書に記載の改変型Ｋｏｚａｋ配列を含む組換えカプシド遺伝子（例えば、ＶＰ１遺伝子）は、プラスミド、ウイルスゲノム（例えば、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスまたは他のウイルスゲノム）上に提供されてよい、あるいは宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞または例えばＳｆ９細胞などの昆虫細胞）のゲノムに組み込まれてもよい。
【００５２】
ある態様において、目的の遺伝子（例えば、ｒＡＡＶ粒子内にパッケージされる遺伝子）は、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドまたは他のタンパク質をコードする。ある態様において、目的の遺伝子は、治療的に有用なタンパク質をコードする。ある態様において、目的の遺伝子は、対照またはマーカータンパク質（例えば、検出可能マーカー、例えばＧＦＰ）をコードする。ある態様において、目的の遺伝子は、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡもしくは他の調節ＲＮＡなどの調節ＲＮＡ（例えば、治療的ＲＮＡ）をコードする。ある態様において、治療薬は、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはその抗原結合断片、リボザイム、ペプチド−核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスポリヌクレオチドである。ある態様において、目的の遺伝子は、治療タンパク質をコードする。ある態様において、治療遺伝子は、抗体、ペプチボディ、増殖因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに作用する活性化または阻害ペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞透過性ペプチド、血栓溶解、酵素、骨形成タンパク質、遺伝子編集に使用されるヌクレアーゼまたは他のタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは遺伝子編集のための他の核酸もしくはタンパク質をコードする。ある態様において、治療用タンパク質は、リソソーム蓄積症の治療剤である。ある態様において、治療用タンパク質は、神経学的障害、神経障害、神経骨格障害または神経筋疾患の治療剤である。ある態様において、治療用タンパク質は、筋障害または筋ジストロフィー、ミオパチーまたは心筋症の治療剤である。ある態様において、目的の遺伝子は、ワクチン（例えば、核酸またはペプチドワクチン）をコードする。
【００５３】
ある態様において、（例えば、治療剤をコードする）目的の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、天然プロモーター、合成または組換えプロモーター、キメラプロモーター、短縮型プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、種特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、あるいは上記の２つまたはそれ以上の組み合わせであり得るが、それらに限定されない。ある態様において、プロモーターは、調節可能であり得る（例えば、プロモーターからの発現レベルは、外部条件を変化させることによって、または調節分子を添加もしくは除去することによって増加または減少させ得る）。ある態様において、目的の遺伝子は、その天然プロモーターに、あるいは別のプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００５４】
ある態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、哺乳動物対象（例えば、ヒト）を処置するために使用できる。ある態様において、対象は、癌、糖尿病、自己免疫疾患、腎疾患、心血管疾患、膵臓疾患、腸疾患、肝臓疾患、神経疾患、神経筋疾患、バッテン病（Bratten's disease）、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、肺疾患、α１−アンチトリプシン欠乏症、神経障害、神経運動損傷、神経骨格障害、虚血、脳卒中、リソソーム蓄積症、ポンペ病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症、カナバン病、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素欠損症、血友病Ａ／Ｂまたは他の疾患、あるいはそれらの何れかの組合せを有する。
【００５５】
さらなる詳述を要せず、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。従って、以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の後半部分の記載を限定するものではない。本明細書に引用される全ての刊行物は、参考とすべき目的または主題のために引用により本明細書に包含させる。
【実施例】
【００５６】
実施例
実施例１：弱毒型Ｋｏｚａｋ配列を用いた安定な細胞株におけるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比の調節
ｒＡＡＶ粒子の生物学的効力（例えば、感染力）は、ビリオンカプシド組成に部分的に依存し、例えば、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の化学量論比に部分的に依存する。昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）などの異種システムで製造された幾つかのｒＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）は、異常なＶＰ１発現レベルにより特徴付けられる。ウイルスの組み立て時に、異常なＶＰ１発現は結果として、不適切なカプシドタンパク質比からなるウイルス粒子の産生をもたらし、それは、該粒子の効率的な細胞形質導入能力を妨げる。有用な化学量論比のカプシドタンパク質を得る方法は、過剰量のＶＰ１が、ウイルス粒子を効率的にパッケージする昆虫細胞の能力を損なうことがあり、ＶＰ１のレベルが低いと、形質導入が非効率的な粒子になる可能性があること示す結果によって複雑になる。従って、現在のシステムを用いた昆虫細胞ｒＡＡＶ産生に関して、粒子の組み立てに有害な影響を及ぼすことなく感染性粒子の収量を増加させる方法を見出すことは依然として課題である。
【００５７】
現在の研究は、Ｓｆ９昆虫細胞で発現されたｒＡＡＶにおけるＶＰ１の翻訳開始速度を修飾することによってカプシドタンパク質比を改善することを目指している。具体的には、標準的ＡＴＧ開始コドンを一定に保ちながら、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９におけるＶＰ１のＫｏｚａｋ配列を弱毒化し、形質導入効率を測定して、組み立てられた粒子を評価した。
【００５８】
一組の弱毒型ＫｏｚａｋエレメントをＡＡＶ５について設計し、これらのエレメントをコードする核酸を作製した。コードされたＫｏｚａｋ配列を表４に示す。４つのＫｏｚａｋエレメントのサブセットは、図２Ａに示すウェスタンブロッティング分析によって示されるように、野生型ＡＡＶ５ ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比が１：１：１０に近いカプシドタンパク質をコードすることが見いだされた。これらのエレメント（ＡＡＶ５ Ｋｏｚａｋ配列７−１０）については、（ＶＰ１）：（ＶＰ２）：（ＶＰ３）のそれぞれの比は、（０．５−２）：（０．５−１）：１０の範囲内であった。翻訳開始配列（ＴＩＳ、Ｋｏｚａｋ配列とも称する）のインビトロの相対効率は、それぞれの組み立てられた粒子について測定された（表４）。これらの数字は、図４Ｂのウェスタンブロットパネルの下の数字に対応する。ＡＡＶ５ Ｋｏｚａｋ配列７（配列番号８）および８（配列番号９）は、最大の効率を示し、さらなる分析のために選択されたｒＡＡＶを産生した。
【００５９】
【表４】
2019513403.tif 000006
【００６０】
ＡＡＶ５ Ｋｏｚａｋ配列７は、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比をそれぞれ２：１：（８−９）とした。ＨＥＫ２９３細胞から単離されたＡＡＶ５と比較して、昆虫細胞で産生された配列７の粒子は、２倍高い形質導入効率を示した。ＡＡＶ５ Ｋｏｚａｋ配列８は、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比をそれぞれ（１−１．５）：１：１０とした。ＨＥＫ２９３細胞から単離されたＡＡＶ５と比較して、配列８の粒子は、３から５倍高い形質導入効率を示した。配列８のパッケージされたｒＡＡＶ５変異体の収量は、配列７のｒＡＡＶ５変異体の収量の約１０倍高いことが示された。
【００６１】
一組の弱毒型ＫｏｚａｋエレメントをＡＡＶ８について設計し、これらのエレメントをコードする核酸を作製した。コードされたＫｏｚａｋ配列を表５に示す。
【００６２】
【表５】
2019513403.tif 000007
【００６３】
ＡＡＶ８ Ｋｏｚａｋ配列１−１２は、図２Ｂに示されるウェスタンブロッティング分析によって示されるように、ＶＰ１の過剰発現ならびにＶＰ２およびＶＰ３の低発現を示した。これらの配列は、その後の試験から除外した。残りのエレメント（配列１３−２０）は、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の発現を、ＨＥＫ２９３細胞から単離したＡＡＶ８と同様の比率でもたらした。
【００６４】
一組の弱毒型ＫｏｚａｋエレメントをＡＡＶ９について設計し、これらのエレメントをコードする核酸を作製した。コードされたＫｏｚａｋ配列を表６に示す。
【００６５】
【表６】
2019513403.tif 000008
【００６６】
ＡＡＶ９ Ｋｏｚａｋ配列２（配列番号３５）、３（配列番号３６）、５（配列番号３８）および９（配列番号４２）は、図２Ｃに示されるウェスタンブロッティング分析によって示されるように、満足できるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比のＡＡＶ９カプシドをもたらした。各ＡＡＶ血清型を用いて行った実験を考慮すると、“コンセンサス”の弱毒型Ｋｏｚａｋエレメントが得られた。図３に示すように、−５（開始コドンから５ヌクレオチド上流）の位置は、ＡＡＶ血清型５、８および９から選択された所与のカプシドについてのＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３発現比の正確な調節のために最もフレキシブルである。
【００６７】
実施例２：ｒＡＡＶの評価
ｒＡＡＶ製造のためのバキュロウイルス／Ｓｆ９システムの主な欠点は、Ｂａｃ由来のｒＡＡＶベクター血清型のほとんどが、ほとんど例外なく、変更されたカプシド組成およびより低い生物学的効力を示すことである。ＡＡＶカプシドタンパク質の化学量論の血清型特異的調節を達成するための、弱毒型Ｋｏｚａｋ配列およびリボソームの読み漏らしを利用した新しい昆虫細胞ベースの生産プラットフォームが記載されている。例として、ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９が産生され、ＨＥＫ２９３由来のベクターと並行して、総合的に特徴付けられた。質量分析は、ヒト細胞由来のベクターと比較して、ＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質含量の両方において３倍の増加を証明した。さらに、次世代シークエンシングを用いて、カプシド化された一本鎖ウイルスＤＮＡの広範な分析を行い、昆虫細胞で産生されたｒＡＡＶ５について、副次的にパッケージされた混入ＤＮＡの６倍の減少が示された。その結果、再設計されたｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ５の場合、マウスにおける脳組織の４倍高い形質導入を仲介するＨＥＫ２９３により製造されたｒＡＡＶとの比較においてさえ、有意に高い生物学的効力を示した。従って、記載されたシステムは、優れた感染性かつ例外的な純度のｒＡＡＶベクターをもたらし、ＧＭＰグレードのベクター産生のための増産可能な（scalable）プラットフォームを提供する。
【００６８】
ｒＡＡＶは、遺伝子治療／ＤＮＡワクチン送達のためのベクターとして広く使用されているが、臨床治験のための高度に感染性のｒＡＡＶのスケールアップ産生は依然として課題である。ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶゲノム中の単一カプシド遺伝子の選択的スプライシングおよび異なるコドン使用を介して誘導された３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる。ＶＰ３配列は、３つ全てのスプライス変異体間で共通であり、ＶＰ２およびＶＰ１は、ウイルス感染に重要なホスホリパーゼドメインＡ２を含むＶＰ１のユニークな領域を有するＮ末端の長い配列を有する１。カプシドにおけるＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の正確な量は、未知であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたカプシドタンパク質のデンシトメトリー分析に基づいて、１／１／１０であると推定される２−４。さらに、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３化学量論は定義されておらず、組み立て（アセンブリ）は、カプシドに組み込まれるＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の相対量が主としてそれらの相対的発現レベルによって変わるように確率論的(stochastic)であると考えられる５。従って、所与のｒＡＡＶ産生システムにおけるカプシドタンパク質発現ユニットの設計は、生物学的に強力な遺伝子治療ベクターの構築に必須である。
【００６９】
この目的のために、元のスケーラブルなシステムの１つは、ｒＡＡＶ遺伝子導入カセット、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐヘルパー遺伝子をそれぞれコードするオートグラファ・カリフォルニカ・マルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に由来する３つの組換えバキュロウイルスを同時感染させたＳｆ９昆虫細胞の懸濁培養液を利用した６。しかしながら、このシステムで産生されたＡＡＶ血清型の大部分は、ＶＰ１カプシドタンパク質の不適切な含有量およびそのホスホリパーゼＡ２活性によって、ＨＥＫ２９３由来のベクターと比較して低い形質導入率によって特徴付けられた７−１０。この欠点は、ＶＰ１についての非標準的なＡＣＧ開始コドンを利用するリボソームの読み漏らしを誘導する、カプシド遺伝子ヘルパーベクター設計の結果であった６。他のグループが、異なる開始コドンＣＵＧ １１または人工イントロン １２を利用してこの問題をある程度解決したとしても、その解決策は、血清型特異的配列調整に必要な柔軟性を欠くことが明らかであった。調整可能なリボソームの開始コドンスキャニング漏れによる相対的ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３組成の調節の新規システムが導入された。
【００７０】
哺乳動物起源の細胞では、ＡＡＶにおけるＰ４０により駆動される転写産物はスプライシングを受けて、ＶＰ１またはＶＰ２／ＶＰ３カプシドタンパク質をそれぞれコードする２つのスプライシングされたｍＲＮＡ変異体を産生する。バキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおいては、ｐｏｌｈプロモーターがＰ４０／イントロン配列の代わりに用いられるため、スプライシングによる調節は利用できず、リボソームの開始コドンスキャニング漏れによるＶＰ１発現の代替調節が用いられる。コンセンサス配列ＧＣＣＲＣＣＡＵＧＧＣ（配列番号４９）（Ｒ＝ＡまたはＧ）は、Ｋｏｚａｋ配列としても知られる有効な哺乳動物翻訳開始部位（ＴＩＳ）であると考えられる１３。この配列からの逸脱は、ＶＰ１ ＡＵＧの開始コドンの読み漏らし（leaky scanning）の増加およびインフレームの下流のＶＰ２ ＡＣＧまたはＶＰ３ ＡＵＧコドンからの翻訳の開始をもたらし、それによりＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の化学量論比の変化をもたらす。最近の研究では、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおけるＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３カプシド組成物の比を合理的に調節して、より高いＶＰ１／ＶＰ２含量を有する粒子をもたらし、結果としてＨＥＫ２９３由来のベクターと比較しても顕著に大きな生物学的効力をもたらす方法が説明されている。
【００７１】
この先進的な産生プラットフォームの全体を特徴付けるために、製造されたカプシド形成されたＤＮＡの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析を以下の２つの方法により行った：従来のＨＥＫ２９３のトリプルプラスミド同時トランスフェクションおよび安定して組み込まれたｒｅｐ／ｃａｐヘルパー遺伝子を挿入したＳｆ９細胞株の単独ＢＥＶ感染。２つのプラットフォームにより製造されたｒＡＡＶカセットの直接的なサイドバイサイド（side-by-side）ＮＧＳ分析は、混入しているＤＮＡを有意に少なくカプセル化した昆虫細胞におけるウイルスＤＮＡパッケージの精度を高めた。
【００７２】
ＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９カプシド遺伝子の設計。リボソームの読み漏らしを増加させるため、弱毒型Ｋｏｚａｋ配列が先行する基準ＡＵＧコドンを用いた。８つの残基の関連ストレッチにまたがる可能性のあるＴＩＳ配列の複雑性は６５，５３６の可能性のある並べ替え（permutation）があるため、ＡＵＧの上流または下流のヌクレオチドをランダムに修飾することは現実的なアプローチではないであろう。さらに、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、酵母１４、高等植物１５、無脊椎動物１６、または脊椎動物１７について異なっていることが明らかである。従って、弱毒型ＴＩＳのスクリーニングを合理化する１つの方法は、Nodererら１８により行われた全ての可能性のある哺乳動物ＴＩＳ配列の実証されたヒートマップを利用することであって、これにより、ＴＩＳの全ての可能な組み合わせに、コンセンサスＫｏｚａｋ配列と比較して“開始効率（initiation efficiency）”の値が割り当てられた。
【００７３】
１２−４３％の範囲の開始効率が選択され、２−４％の増加により異なる１０個の変異体について試験した。１０個すべてのＡＡＶ５ ＶＰ１で試験したＴＩＳを表９に示し、既報７の通りにＢＳＲプール細胞株を誘導し、それらのカプシド組成を評価するために、ｃａｐ発現ヘルパープラスミド（図４Ａ）という観点で用いた。顕著な例外を除いて（例えば、図４Ｂ、レーン６）、相対的ＶＰ１含量は徐々に減少し、それは相対的ＴＩＳ効率の理論値の低下に密接に従った。この相関は、翻訳開始コドンの読み漏らしがＶＰ１含量を調節するのに利用できるという元々の仮説を支持する。有用なＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３化学量論をさらに同定するために、１０個のｒＡＡＶ５ベクターのそれぞれの感染力および全体の力価をアッセイした。感染性ｒＡＡＶ５ベクターを産生するために、ＢＥＶをコードするＣＢＡにより駆動されるＧＦＰ（図１０Ａ、ｐＴＲ−Ｂａｃ−ＵＦ２６）を作製した。サイドバイサイド比較は、４０％のＴＩＳ相対効率を有する構築物（図４Ｂ、レーン２）が、他の全ての構築物と比較して優れており、最も高い収量を生じることを明らかにした。従って、弱毒型ＴＩＳ、ＵＧＵＵＵＵＡＵＧＵＣ（表９の配列番号９）を組み込んだ、この特定のカプシド遺伝子含有ヘルパー構築物を選択して、プロデューサー細胞株を誘導した。しかしながら、他の配列もまた使用可能である。同様の方法で、弱毒型Ｋｏｚａｋ配列を有する１２個のＡＡＶ９ ＶＰ１プラスミド構築物をスクリーニングした（表９）。ＡＡＶ９について、特に有用な配列は、ＵＡＧＵＧＵＡＵＧＧＣ（配列番号４２）であって、４５％の相対的ＴＩＳ効率を構成した。しかしながら、他の配列もまた使用可能である。
【００７４】
ｒｅｐ２／ｃａｐ５安定細胞株の特徴付け。個々の細胞株は、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を欠くＲｅｐ２−およびＣａｐ５を発現するプラスミドを用いて誘導された８。Ｃａｐ５ヘルパーは、以下の弱毒型ＴＩＳを含んだ：ＵＧＵＵＵＵＡＵＧＵＣ（配列番号９）。５個の個々の細胞株を増殖させ、上記のように試験した７。ｒＡＡＶ５−−ＵＦ２６の最高収量を示す１つの細胞株、吹き替え(dubbed)Ｂ８を、特徴付けのために選択した。以下のパラメーターを調べた。
【００７５】
【表７】
2019513403.tif 000009
【００７６】
ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３化学量論。連続二倍イオジキサノール勾配によりＨＥＫ２９３細胞から精製されたｒＡＡＶ５−ＧＦＰのカプシド組成は、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３について１／１／１０の理論値から逸脱しており、すなわち、より低いＶＰ１含量であった（図４Ｃ）。さらに、このカプシドは、わずかに高いＭＷを有するさらなるＶＰ２カプシドタンパク質を組み込んでいた。対照的に、Ｓｆ９ Ｂ８由来のベクターは、より高いレベルのＶＰ１およびＶＰ２から構成された（図４Ｃ）。ｒＡＡＶ９について、Ｓｆ９由来のベクターのカプシド組成は、ＨＥＫ２９３細胞で作製されたベクターのものとほぼ同一であった（図４Ｄ）。ｒＡＡＶ５とは異なり、両ウイルスサンプルは、ＶＰ２より多くのＶＰ１を取り込み、カプシド特異的タンパク質分解の産物であり得るＶＰ３よりも小さいバンドを含むことも明らかである １９。
【００７７】
正確な数値を定量化するために、ｒＡＡＶ５についてのそれぞれのカプシドバンドの密度を、曲線下面積（ＡＵＣ）としてプロットした（図１１）。以下の値（ＶＰ３＝１０の共通の分母に調整した、２つの独立した実験の平均）を導出した：ＨＥＫ２９３ ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３＝０．２／０．５／１０；Ｓｆ９ Ｂ８ ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３＝０．７／１．７／１０。計算された化学量論を検証するために、ｒＡＡＶ５カプシド組成物を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて質量分析によって分析した。
【００７８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。ビリオン殻を構成するＡＡＶ ＶＰは、それらのＶＰ3 Ｃ末端を共有する（図５Ａ、黒色で示す）。ＶＰ１（破線）およびＶＰ２（一点短鎖線）のユニークなＮ末端は、共通の共有ＶＰ３ドメインと比較して比較的小さく、それらのユニークなトリプシンペプチドを分析することにより相対的化学量論を読み解くことを困難にしている。従って、差異的１６Ｏ／１８Ｏ 標識アプローチを用いて、同一のペプチドであるがＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３に由来するペプチドを識別した。重酸素の安定同位体である水Ｈ２１８Ｏ をトリプシン消化中に使用するとき、２つの１８Ｏ原子がトリプシンペプチドのＣ末端カルボキシル基で交換され、４Ｄａだけ質量シフトする ２０、２１。２個の異なるタンパク質に由来する同一のペプチド（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）間のこのシフトは、タンパク質の同定および定量を可能にする。
【００７９】
パイロット消化を行った後、ＶＰ３領域の３つのペプチド（図５Ａ）を選択して、各タンパク質の相対存在量を定量した。２個の１８Ｏ原子の完全な取り込みを、ＶＰ３／ＶＰ１サンプルおよびＶＰ２／ＶＰ３サンプルを別々に試験することによって確認した。その後、Ｈ２１８Ｏ中の全てのＶＰ３消化トリプシン産物の完全なＭＡＬＤＩスペクトルを分析した（図５Ｂ）。全てのペプチドは、予測されたペプチド分子量から４Ｄａの質量シフトを示し、２つの１８Ｏ原子が組み込まれていることを確認した。観察された質量シフトが２Ｄａのみの場合、反応が完全でないか、または不完全なトリプシン不活性化からの逆交換が起きたかのいずれかである ２０。図５Ｃは、別々にスポットされ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析されたＶＰ１（元のカラー図では赤色）またはＶＰ３（元のカラー図では青色）のいずれかからトリプシンペプチドＴＷＶＬＰＳＹＮＮＨＱＹＲ（配列番号４８）の重複を示す。ＶＰ３サンプルについての４Ｄａの明確な質量シフトは、逆交換は見られず、完全な１８Ｏ原子交換を証明した。図５Ｄは、Ｈ２１８Ｏで消化され、Ｈ２１６Ｏ中で消化されたＶＰ１と１：１で混合されたＶＰ３の代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。ピーク領域を統合し、各タンパク質の存在量を計算するために用いた。
【００８０】
それぞれ３回反復したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験において、各タンパク質当たり、３つのユニークなペプチド（図５Ａ）を分析した（表１０および１１）。これにより、それらの相対存在量の信頼性の高い定量化が可能になった２２。以下の値（３つの独立した実験の平均、ＶＰ３＝１０の公分母に合わせた）が得られた：ＨＥＫ２９３ ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３＝０．４／０．５／１０；Ｓｆ９ Ｂ８ ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３＝１．１／１．７／１０。これらの数値は、上記のＡＵＣ密度と顕著に一致した。
【００８１】
【表８】
2019513403.tif 000010
【００８２】
【表９】
2019513403.tif 000011
【００８３】
完全粒子／空粒子の比。このパラメーターを調べて、２つの製造プラットフォームのいずれが、有害な免疫応答の潜在的な発生源およびベクター精製中の技術的課題である、より高い比率で空粒子を生じるかどうかを決定した。ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９は、単一特異性抗体親和性樹脂、ｒＡＡＶ５についてＡＶＢおよびｒＡＡＶ９についてＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）を用いた一工程のクロマトグラフィーにより精製した。精製後、ベクターゲノム粒子の力価を、ＱＣ ＰＣＲを用いてアッセイした。ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９ベクターの全粒子力価を、金ナノ粒子で装飾されたｒＡＡＶカプシドのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を用いてアッセイした。この方法は、金ナノ粒子などの高度に光散乱する材料とウイルスカプシドとの間の静電引力を利用する。得られた金標識されたウイルス粒子は、光学システムによって視覚化され追跡されるのに十分な光を散乱させ（図６Ａ−６Ｆ）、ＮＴＡを用いて、ＡＡＶのサイズおよび濃度を測定することができる。興味深いことに、両プラットフォームのｒＡＡＶ９粒子の平均サイズは同一であった（３８ｎｍの主要ピーク、図６Ａ、６Ｂ）が、ＨＥＫ２９３由来およびＳｆ９ Ｂ８由来のｒＡＡＶ５の平均サイズは異なっていた（４８ｎｍ 対 ４２ｎｍ、図６Ｄ、６Ｅ）。注目されるのは、これらのサイズは、ウイルス粒子の電荷の関数である、ウイルス／金ナノ粒子複合体の近似値である。
【００８４】
全体−対−完全粒子の比を計算した後、ＨＥＫ２９３由来のｒＡＡＶ９についてこれらの値は２．８であって、Ｓｆ９由来のｒＡＡＶ９については−３．１であった（図６Ｃ）。同様に、ｒＡＡＶ５について、比は有意には相違しなかった：１４．８ 対 １５．２（図６Ｆ）。明らかに、ｒＡＡＶ９について全体的なより低い比は、ＤＮＡ含有ｒＡＡＶ９粒子の優先的結合および濃縮を示したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂クロマトグラフィーの精製バイアスに起因した（データ示さず）。
【００８５】
インビトロでの形質導入効率。ルシフェラーゼおよびｍＡｐｐｌｅレポーター遺伝子を組み込んだｒＡＡＶ導入遺伝子カセット（図１０Ｂ、ｐＴＲ−ＵＦ５０−ＢＣ ２３）を用いて、形質導入効率を試験するためにＳｆ９ Ｂ８細胞株に感染するそれぞれのＢＥＶを生成した。また、同じプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞の三重プラスミド同時トランスフェクションによってｒＡＡＶを生成した。精製され、サイドバイサイドで滴定された、両方のｒＡＡＶ５−Ｌｕｃ−ｍＡｐｐｌｅベクターを用いて、ＨｅＬａ由来のＣ１２細胞株を感染させた ２４。ＦＡＣＳ分析（図１２Ａ）は、Ｓｆ９により産生されたｒＡＡＶ５ベクターについての形質導入効率よりも顕著に高い（５倍まで）ことを明らかにした。ｒＡＡＶ９について、ｒＡＡＶ９の２つのサンプル間に有意差はなかった（図１２Ｂ）。両方の実験からのデータは、タンパク質含有量と一致する。
【００８６】
インビボでの形質導入効率（図７）。ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９ Ｂ８細胞で産生されたｒＡＡＶ５−Ｌｕｃ−ｍＡｐｐｌｅを、マウスの脳（線条体）においてインビボでアッセイした。注入の３週間後、形質導入効率を生物発光（ＢＬＩ）により決定した（図７Ａ）。Ｓｆ９ Ｂ８由来のＡＡＶ５を注入された動物は、ＨＥＫ２９３由来のＡＡＶ５よりも４倍高いＢＬＩシグナル強度を示した（図７Ｂ、それぞれ４．３ｘ１０５±１．８ｘ１０５、および１．１ｘ１０５±３．５ｘ１０４）。同様に、脳切片の蛍光分析は、ＨＥＫ２９３と比べて、Ｓｆ９ Ｂ８由来のサンプルにおいてより強いｍＡｐｐｌｅシグナルを示した（図７Ｃ）。
【００８７】
ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞で産生されたｒＡＡＶ５ベクターの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）解析。より高い効力のｒＡＡＶ５ベースのベクターの産生のための改善されたＯｎｅＢａｃシステムを確立するために、ＨＥＫ２９３細胞における標準トリプル同時トランスフェクションプロトコールによって製造されたか、または安定なｒｅｐ２ｃａｐ５ Ｓｆ９細胞株Ｂ８の単一のＢＥＶ−ＵＦ２６感染により製造された、カプシド化ｓｓＤＮＡ（ｐＴＲ−Ｂａｃ−ＵＦ２６、図１０Ａ）の比較ＮＧＳ解析を行った。ＮＧＳ解析の目的は、ｒＡＡＶカセット特異的なＤＮＡ種、ならびに副次的にパッケージされた混入ＤＮＡ種を特徴付けることであり、そのために、ＧＭＰグレードのｒＡＡＶベクター産生の要求を満たす好ましいプラットフォームを確立した。全てのＮＧＳライブラリーを調製し、配列決定し、デュプリケートで分析した。一般的なワークフローは、フローチャートに示されている（図１３）。以下のパラメーターが分析されている。
【００８８】
混入ＤＮＡ配列の副次的パッケージ。
フィルタリング後、インデックスに割り当てられたリード総数は７５７，４３３，１１６であった。対照配列に対してリードをアライメント後、ｒＡＡＶカセットのカバレッジ（coverage）は、２，２６０，０７４リード数／ｎｔ（ｎｔ位置 ２，０００）に高まった。副次的にパッケージされた配列に関して、カバレッジは顕著に低かった：１０，７８１リード数／ｎｔ（ｎｔ位置 １，２９９、ベクター骨格）、または６，４２４リード数／ｎｔ（ｎｔ位置 ２００、ＡｃＭＮＰＶゲノム）。
【００８９】
両方の産生プロトコールについて、大部分のリードは、すべてのカプシド化されたＤＮＡ配列の９６．５％（ＨＥＫ２９３）および９９．４％（Ｓｆ９）を占めるｒＡＡＶ−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットであった（表１２、図８Ａ、８Ｂ）。ＨＥＫ２９３システムの混入ＤＮＡの大部分は、低レベルのｒｅｐ２／ｃａｐ５ヘルパー配列（０．７％）およびヒトゲノムＤＮＡ（０．１７％）を含む細菌プラスミド骨格（２．５％）であったが、一方、Ｓｆ９調製物中の混入物質は、シャトルプラスミド骨格（０．３％）およびＡｃＭＮＰＶゲノム（０．２％）であった。Ｓｆ９由来のｒＡＡＶ５については、近年、ＡＴＣＣから得られたＳｆ９細胞株から単離された外来性の(adventitious)ラブドウイルス（Ｓｆ−ラブドウイルス）と相同であることが見いだされたリードはなかった２５。
【００９０】
副次的にパッケージされた配列は、ｒＡＡＶカセットおよびそのそれぞれの骨格：ＨＥＫ２９３細胞について細菌プラスミド、およびＳｆ９細胞についてバキュロウイルスゲノム、の即時の連結によってより豊富に表示された。注目すべきことに、２つのシステム間のジャンクションリードのカバレッジにおいて少なくとも１０倍の有意な差があり、それにより、ＨＥＫ２９３細胞が、より高い頻度で左右の両方のＡＡＶ末端リピートからより離れた細菌プラスミド骨格配列をカプシド化することが明らかであった（図８Ｃ、８Ｄ）。従って、混入ＤＮＡ配列の解析は、ＨＥＫ２９３細胞について３．５％に対して、カプシド形成されたベクターゲノムの０．６％のみが外来ＤＮＡを取り込むことにより、ＯｎｅＢａｃシステムがより正確に送達し、より高品質のｒＡＡＶベクターを提供することを示唆する。
【００９１】
【表１０】
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【００９２】
ｒＡＡＶゲノムカバレッジ。ＮＧＳライブラリーを作製するために８サイクルのＰＣＲ増幅工程のみを含む標準プロトコールを用いて、いくつかの配列がＣＢＡプロモーター内で同定され、下流イントロンがＡＡＶカセットの残りと比べて、少なくとも１０倍低い配列決定カバレージを示した。厳密な試験により、これらの配列が顕著にＧＣリッチであることが明らかとなった（図８Ａ、８Ｂ）。この比較的低いカバレッジは、ＤＮＡ複製中の短縮化のために、パッケージされたビリオン中のこれらの配列のより低い表示を反映している可能性がある。あるいは、この低下は、ＰＣＲ関連ＮＧＳライブラリー調製によって導入された人工的な効果である。第２の可能性を排除するために、ＮＧＳライブラリーを、ＰＣＲ増幅せずに精製したカプシド化したｒＡＡＶ ＤＮＡから直接調製した。このようにして、目的の配列のカバレッジはカセットの残りの部分に匹敵するレベルに回復した。従って、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞は両方とも、短縮化の証拠がほとんどなく、全長ｒＡＡＶカセットのパッケージを支持する。
【００９３】
ｒＡＡＶ−Ｂａｃ−ＵＦ２６カセットのゲノム同一性。ＡＡＶカセットの高い配列決定深度は、そのそれぞれの親細菌プラスミドに対するパッケージされたＤＮＡの配列同一性および相関の詳細な分析を可能にした。誤った呼び出し（call）の可能性を減らし、一塩基多型（ＳＮＰ）分析の信頼性を高めるために、ＰＣＲフリーサンプルのＮＧＳデータのみを利用した。両ウイルスサンプルならびに陽性対照プラスミドサンプルからのＤＮＡのＳＮＰ変異体は、置換の顕著に類似したプロファイルを示した（相関係数０．７５−０．７７）（図９Ａ）。興味深いことに、ＳＮＰの大部分が、ＧＣ含有が豊富な領域として上記で同定された非コーディング配列：ニワトリβアクチンプロモーターおよびイントロン配列と共局在していた（図９Ｂ）。さらに、およびLecomteら２６と一致して、ＡＡＶ ＴＲは、比較的高いＳＮＰ変動性を示した。
【００９４】
昆虫細胞で製造されたＡＡＶ５およびＡＡＶ８血清型のｒＡＡＶベクターの相対的に低い効力は、Urabeら１０およびKohlbrennerら９により以前に報告されている。その後、多くの他のＯｎｅＢａｃ由来のＡＡＶ血清型が、２９３由来のＡＡＶと比べて低い感染力により特徴付けられることが示された ２７。全ての影響を受けた血清型の統一の原因は、カプシドヘルパー遺伝子の改変型配列であって、結果としてホスホリパーゼＡ２活性を組み込んだＶＰ１カプシドタンパク質のより低い含有量がもたらされる。予期されるように、推奨される解決策は、異なる開始コドンであるＣＵＧ １１または人工イントロン ８、１２を用いることによってこの問題を緩和することを目的とした。新しいデザインがいくつかのベクターの感染力を増加させるのに役立ったとしても、その解決策は、血清型特異的配列の調整に必要なフレキシビリティがないようであった。
【００９５】
カプシドの相対的ＶＰ１／ＶＰ２含有量を増加させるための新しい方法が本明細書に記載されている。これは、ＶＰ１ ＡＵＧ開始コドンに先行する標準的Ｋｏｚａｋ配列を改変することにより達成される。原理の証明のため、最も好ましい翻訳開始部位が、ＨＥＫ２９３由来の対応物の形質導入効率を上回るｒＡＡＶベクターを血清型特異的に産生することを示す、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型についてある範囲のＫｏｚａｋ配列を試験した。しかしながら、記載された方法は、異なる血清型についても変化する相対的なＴＩＳ効率の狭いウインドウにおけるＶＰ１ Ｋｏｚａｋ配列の微調整を必要とする。この変化の理由の１つは、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比が、ＶＰ１ ＴＩＳの相対的効率だけでなく、すべての血清型についても異なるＶＰ２およびＶＰ３ ＴＩＳの相対効率にも依存することである（表１３）。さらに、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比が理論値である１：１：１０から大幅にシフトすると、ウイルスの収量が急激に減少するため、意図的に任意の閾値を上回るＶＰ１含有量に増加させること（例えば、図４Ｂ、レーン１および６）は、逆効果であるようである。特定の用途のための特異的ＴＩＳが経験的に同定され得るという理解の下で、当業者は、‘コンセンサス’ＶＰ１ＴＩＳ： Ｕ（Ｃ）Ａ（Ｃ／Ｇ）Ｕ（Ｇ）ＵＧ（Ｕ）ＵＡＵＧＧ （配列番号５０）を導き出すことができる。
【００９６】
【表１１】
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【００９７】
分析のために選択されたｒＡＡＶ５構築物において、相対的ＶＰ１含有量の数値は、ＨＥＫ２９３由来のベクターにおける０．２−０．４（２つの独立したアッセイによる）からＳｆ９細胞における０．７−１．１まで増加した（すなわち、平均３倍増加した）。ＶＰ２について、これらの値は、０．５から１．７に増加し、同様に３倍増加であった。ＶＰ２の同時増加は、ｒＡＡＶ５ ＶＰ１の相対的増加の予期しない影響の１つであった。ＶＰ１およびＶＰ２の両方のＮ末端には、ＡＡＶがそのゲノムを核内に送達し、その後細胞に形質導入するのに有用な保存的核局在配列（ＮＬＳ）モチーフを表す、いわゆる塩基性領域３（ＢＲ３、ＰＫＲＫＫＡＲＴ（配列番号５１））を組み込む２８−３０。従って、各ＶＰ１およびＶＰ２の３倍の増加が、より感染性のウイルスの収量を増加させることは驚くべきことではない。
【００９８】
上記のデータには、最近記載されたＯｎｅＢａｃ２．０ ８ および現在のシステムで製造されたｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９の直接比較は含まれない。しかしながら、当業者は、それぞれのカプシド比を関連付け、これらの血清型について、新たに設計されたｃａｐ ヘルパー遺伝子が、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９カプシドの両方の化学量論を顕著に改善させ、より高い効率のウイルスベクターに翻訳されることを結論付けることができる。
【００９９】
別の予期せぬ発見は、ＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞によって提示されたパッケージ効率の類似性であって、完全−対−空の粒子比の代替パラメーターによって評価された。１：２．５のｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットの以前に同定された比を用いて、安定なプロデューサー細胞株を構築し 7、ＨＥＫ２９３と同様に、パッケージ効率を達成した。
【０１００】
多くの臨床治験が進行中であり、異なるプロトコールによって製造されたｒＡＡＶ株（stock）の遺伝的同一性を評価することは、規制上の重大な課題となっている。多くのグループが、パッケージ宿主細胞２６，３１，３２、細菌ヘルパープラスミド骨格 ２６、３３、ヘルパーウイルス ８、３２、およびｗｔ ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列 ２６、３４に由来する配列の副次的なカプシド形成を報告している。パッケージされたｒＡＡＶカセットの遺伝的同一性を評価するために、カプシド化された一本鎖ウイルスＤＮＡのＮＧＳ分析が行われた。パイロット分析は、両プラットフォームでほぼ同一であるＧＣ富化配列における該カセットの不均一な配列カバレージを示した。ＰＣＲフリープロトコールを利用することにより、カバレッジの低下は、明らかに、ライブラリー調製中のＰＣＲ誘導性人工物に起因し、短縮型ｒＡＡＶゲノムのパッケージが原因でないことが示された３５、３６。ＮＧＳライブラリー調製のためのＰＣＲベースの方法の精度は、とりわけ逆位末端反復（ＩＴＲ）などのＧＣに富むパリンドロームでのＡＡＶ関連解析には適切ではない ３７、またはＧＣ富化配列に適用される３８といくつかのグループによって調べられた。従って、ｒＡＡＶベクター調製物のＮＧＳ解析は、適当なプロトコールを用いて行われるべきである。
【０１０１】
両プラットフォーム由来のウイルスＤＮＡの遺伝的同一性の分析は、昆虫細胞 対 ヒト細胞においてカプシド化されたｒＡＡＶ ＤＮＡ間に有意差を示さなかった。しかしながら、注目すべきことは、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために用いられるｐＴＲ−Ｂａｃ−ＵＦ２６プラスミドＤＮＡプールの配列の、データベース中のこのプラスミドの配列とのずれという本明細書に記載された事実である。プラスミドＤＮＡのそのような遺伝的浮遊の事実は、驚くべきことであるが、以下のメカニズムによって説明することができる。ｒＡＡＶカセット含有プラスミドを、ＡＡＶ ＩＴＲの完全性を維持するために大腸菌の組換え欠損株において増殖させる。これらの株は、非標準的な二次および三次構造の再構成および消失を触媒する経路の成分（ｅｎｄＡ、ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ）を欠く。その結果、プラスミドＤＮＡは、ミスマッチ修復系によって修復され得るミスマッチ塩基および点突然変異を蓄積する。ＤＮＡにおけるミスマッチは、修復されなければ、自然突然変異頻度が高いという結果になる。従って、トランスフェクション中、変異したプラスミドＤＮＡは、宿主ＨＥＫ２９３細胞核にそのヘテロ二重鎖“インプリント”構造を有し、ここで、それは修復された ３９ または複製された変異の複製物である。従って、同時トランスフェクションプロトコールにおけるプラスミドＤＮＡプールは、いくつかのＧＣに富む配列にとって実質的であり得るカプシド形成されたＡＡＶカセットへの大腸菌の突然変異の導入頻度が高いものをいくつか含む。興味深いことに、ＧＦＰレポーターｃＤＮＡは、その合成“ヒト化”複製起点を反映し得る、最小限の変異を有する（図８Ａ） ４０。この点に関して、その免疫原性関連作用に加えて ４１、ｒＡＡＶカセットからＣｐＧモチーフを枯渇させることは、親プラスミドＤＮＡの遺伝的安定性を高めるのに役立つかもしれない。
【０１０２】
２つのプラットフォームにより製造されたｒＡＡＶカセットの直接的なサイドバイサイドＮＧＳ解析は、予期せず、昆虫細胞におけるウイルスＤＮＡパッケージが高い精度であり、混入ＤＮＡがかなり少ない量でカプシド化されること（０．６％ 対 ３．５％）を明らかにする。この６倍の減少は、当業者が、ＦＤＡガイドラインの“細胞基質ＤＮＡ残存量が１用量あたり１０ｎｇ以下でなければならない”との記載を考慮するときに、重要であると思われる（fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandOtherBiologics/VaccinesandRelatedBiologicalProductsAdvisoryCommittee/UCM319573.pdf）。
【０１０３】
現在のｒＡＡＶを用いる臨床治験を考慮すると、用量が６ｘ１０１３ ｖｇ／ｋｇまで高くなると ４２、４３、ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞で産生された場合、ＦＤＡガイドラインを超える量の混入ＤＮＡを取り込み得る。ここで、ＯｎｅＢａｃシステムを用いて産生されたｒＡＡＶ５ベクターは、顕著により感染性であり、同時に、より少ない量の外来ＤＮＡをカプシド形成することが示された。従って、この産生方法は、その有効用量を低下させ、安全性を向上させることにより、ベクター投与の可能性のある治療結果を改善する。
【０１０４】
材料および方法
以下の非限定的な材料および方法を、本明細書に記載のいくつかの実験に関連して用いた。これらの、または他の材料および方法は、本明細書に記載の態様と関連して用いることができる。
【０１０５】
ＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９産生
ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９ベクターは両方とも、既報の三重同時トランスフェクト法 ４４により産生された。ｒＡＡＶカセット（ｒＡＡＶ５−Ｂａｃ−ＵＦ２６、またはｒＡＡＶ５−ＵＦ５０−ＢＣ、ならびにｒＡＡＶ９−Ｂａｃ−ＵＦ２６、図１０Ａ−１０Ｂ）を有するプラスミドを、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲｅｐ２Ｃａｐ５（または、ｐＲｅｐ２Ｃａｐ９）と１：１：１モル比で組み合わせて用いた。ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９の両方を、連続２回のイオジキサノール浮遊密度勾配遠心分離（sequential double rounds iodixanol buoyant density centrifugation）を用いて精製した。具体的には、完全粒子を含有する第１ラウンドのイオジキサノール画分を１×PBS−ＭＫ緩衝液で２．５倍に希釈し、標準勾配で１５％のイオジキサノール−１Ｍ ＮａＣｌ工程のかわりに用いた４４。
【０１０６】
Ｓｆ９細胞におけるｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９産生
Ｂａｃ−ＵＦ２６、またはＵＦ５０−ＢＣ ｒＡＡＶカセットを、ｐＦａｓｔＢａｃ骨格に挿入し、それぞれのＢＥＶをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムガイドラインに従って誘導した。既報７の通りに、プラーク精製したＢＥＶをＰ３に増殖させ、プラークアッセイにより滴定し、そしてｒｅｐ２ｃａｐ５またはｒｅｐ２ｃａｐ９誘導性ヘルパー遺伝子を有するＳｆ９ベースの安定な細胞株を感染させるために用いた。回収時、凍結融解溶解物をベンゾナーゼで処理し、２０，０００ｇで３０分間の高速遠心によって清澄化した。上清を、ＨＥＫ２９３により製造されたＡＡＶについて上記の通りに精製した。
【０１０７】
ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ９の一工程精製。ｒＡＡＶ５を、既報４５のとおりに、ＡＶＢセファロース 高速親和性クロマトグラフィー樹脂（GE Healthcare）を用いて、清澄化された粗溶解物から精製した。ｒＡＡＶ９を、ＰＯＲＯＳ ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（商標） ＡＡＶ９樹脂（Thermo Fisher）を用いて一工程親和性クロマトグラフィーにより粗溶解物から精製した。具体的には、清澄化された粗溶解物を重力下で樹脂０．５ｍｌを含むカラムに適用し、その後、該カラムを１０倍のカラム容量の１ｘＰＢＳで洗浄し、次いで１ｍｌの溶出緩衝液：５０ｍＭ クエン酸緩衝液ｐＨ３．０−１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。溶出されたｒＡＡＶ９を、０．１ｍｌ １Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．４で直ちに中和した。
【０１０８】
ｒＡＡＶ滴定（力価測定）
ｒＡＡＶベクターの直接比較分析には、それぞれのウイルス力価の正確な予測が必要である。４つの独立したアッセイを用いて、ＨＥＫ２９３またはＳｆ９細胞に由来するｒＡＡＶを力価測定した：１）ＢｉｏＲａｄ ＱＸ２００ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを用いて対照標準を確立する、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ （ｄｄＰＣＲ） ４６；２）ｉＴａｑ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘキット（BioRad、1725121）およびｑＰＣＲ ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ ＲｅａｌＴｉｍｅ システムを用いる、定量的競合ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）；３）ピコグリーンベースのプロトコール ４７、および４）ｒＡＡＶ粒子の力価およびサイズを定量化する、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ３００（NS-300、Malvern Instruments、Malvern、UK）を用いるナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）。各プロトコールの条件を確立し、ｄｄＰＣＲによる対照標準を用いた後、プロトコール２）および３）から計算した力価は、常に、２倍以内であり、平均して作用力価を得た。簡潔には、以下の手順に従った。
【０１０９】
ｄｄＰＣＲ．０．０５％プルロニックＦ−６８を補充した１ｘ乳酸リンゲル（ＬＲ）溶液を用いて、反応当たり１〜１０３ ウイルスゲノムコピーの範囲内で３組の希釈物のセットを調製した。ＤｄＰＣＲを以下のプライマーを用いて行った：TM_CMV_F ５’−ＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣ−３’（配列番号５２）、TM_CMV_R ５’―ＴＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧ−３’（配列番号５３）、TM_CMV_プローブ FAM ５’― ＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’ BHQ （配列番号５４）。
【０１１０】
ＱＣ−ＰＣＲ．標準曲線を得るために、ｒＡＡＶ−ＵＦ２６導入遺伝子カセットを、それぞれのプラスミドｐＴＲ−Ｂａｃ−ＵＦ２６のＳｍａＩ消化後にゲル精製した。回収したＤＮＡをおよそ１ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、正確な濃度をＱＵＢＩＴ ｄｓＤＮＡアッセイにより決定した。高度に精製されたＳｆ９またはＨＥＫ ２９３より産生されたｒＡＡＶの直接的ＱＣ−ＰＣＲ滴定を、同じプライマーセットを用いて、対照ｒＡＡＶサンプル（ｄｄＰＣＲ）およびゲル精製されたｒＡＡＶカセット（ＱＣ−ＰＣＲ）の１０倍連続希釈によって作成された標準曲線を用いて行った。
【０１１１】
ピコグリーンベースのアッセイを、既報４７のように、標準曲線を較正するためにＬａｍｂｄａ ＤＮＡ標準を用いて、Ｑｕａｎｔｉ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（Life Technology、P7589）により行った。光学密度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｖにより測定した。
【０１１２】
ＮＴＡ．ＮＴＡ解析の前に、ウイルスストックの力価をＰＡＡＧゲル電気泳動によって評価した。およその力価を知ると、ＬＲ緩衝液で希釈した５０μｌのＡＡＶストック液を、標識緩衝液（２０ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．５、０．１％プルロニックＦ６８、１ｍＭ ＮａＣｌ）および金ナノ粒子（Sigma、カタログ番号 ７４１９４９）を含む標識ミックスに添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーション後、金標識したＡＡＶを、標識緩衝液で終濃度５ｘ１０８−３ｘ１０９粒子／ｍＬまで希釈した。ＡＡＶを含まない標識ミックスおよび金を含まない標識緩衝液中のＡＡＶを陰性対照として用いた。測定を以下の設定を用いて、ＮＳ−３００装置を用いて行った：レーザータイプ−Ｂｌｕｅ４８８、カメラレベル−１５、フレーム数−７４９、記録時間−３０秒、記録数−各データ点毎に３つ。ＮＳ−３００によって生成された少なくとも４つのデータ点を用いてＡＡＶ力価を計算した。
【０１１３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ．ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３バンドをＳＤＳ−ＰＡＡＧから切り出し、トリプシン消化のために調製した。カプシドタンパク質を、製造者推奨プロトコールを用いてＰｒｏｍｅｇａ（Madison WI）のシークエンシンググレードのトリプシンを用いてゲルスライス内で消化した。簡潔には、バックグラウンドポリアクリルアミド材料を最小限に抑えるために、バンドを可能な限りそれに近くトリミングした。次いで、ゲル片をナノピュアＨ２Ｏ中で５分間洗浄した。洗浄工程を２回繰り返した後、各サイクル１０分間の１：１ ｖ／ｖのメタノール：５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムでの脱染色を２サイクル行った。ゲル片を、１：１ ｖ／ｖのアセトニトリル：５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムで脱水した。ゲルスライスを再水和し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液（１００ｍＭ 重炭酸アンモニウム中２５ｍＭ）と共に３０分間インキュベートした後、１００ｍＭ 重炭酸アンモニウム溶液中５５ｍＭのヨードアセトアミドを添加した。ヨードアセトアミドを暗闇下でゲルスライスと共に３０分間インキュベートした。ゲルスライスを再度、２サイクルのＨ２Ｏで洗浄し、１：１ ｖ／ｖ アセトニトリル：５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムで脱水した。０．０１％ｐｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ界面活性剤中１２ｎｇ／ｍｌのトリプシン中で、５分間、再水和することによりゲル片内にプロテアーゼを導入した。その後、該ゲル片を、４０μＬの０．０１％のｐｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ界面活性剤：５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム上に置き、振とう機で１時間穏やかに混合した。０．５％ ＴＦＡの添加により消化を停止させた。ＭＳ分析を、高品質のトリプシンペプチドで最小限の非特異的切断を確実にするために直ちに行うか、またはサンプルを分析するまで−８０℃で凍結させた。ｐｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ界面活性剤以外は同じ方法で１８Ｏ−標識した消化を行い、トリプシンをＨ２１８Ｏ中で調製した。逆交換を防ぐために、トリプシンを１００℃で１５分間インキュベートすることにより不活性化した。ＶＰ３をＨ２１８Ｏを用いて消化し、一方で、ＶＰ１を通常のＨ２１６Ｏ中で消化した；消化産物を１：１で混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。ＶＰ２／ＶＰ３についても同様の分析を行った。
【０１１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＬＲＦ質量分光計（Bruker Daltonics、Breman、Germany）にて、Ｎ２レーザーを用いて、リフレクトロン（reflectron）のポジティブイオン（正イオン検出）モードで操作して行った。レーザー出力は、シグナルを生成するのに必要な閾値レベルで用いた。この機器を、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシンＩ、サブスタンスＰ、ボンベシン、ＡＣＴＨクリップ１−１７、ＡＣＴＨクリップ１８−３９、ソマトスタチン２８、ブラジキニンフラグメント１−７、〜７００Ｄａ−３２００Ｄａの質量範囲のブタ（porcine）のレニン基質であるテトラデカペプチドの混合物である、ペプチド較正標準ＩＩ（Bruker Daltonics）で較正した。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして用い、５０％ ＡＣＮ／０．１％ ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ中）中の飽和溶液として調製した。１μＬのマトリックスおよび１μＬのサンプルの分液（allotment）を完全に混合した；これの０．５μＬを標的プレート上にスポットし、乾燥させた。
【０１１５】
インビトロ形質導入アッセイ。ｒＡＡＶ５−Ｂａｃ−ＵＦ２６およびｒＡＡＶ９−Ｂａｃ−ＵＦ２６を、ＭＯＩが２，０００でｒＡＡＶを感染させ、ＭＯＩが５でＡｄ５を共感染させたＣ１２細胞２４を用いてアッセイした。感染の４８時間後、ｍＡｐｐｌｅ蛍光が陽性の細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって計数した。
【０１１６】
ＡＡＶ注射
全ての動物実験手順は、フロリダ大学動物実験センター（University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee）の承認を受けている。４〜５週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ（The Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME USA）マウスをこの実験に用いた。
全ての外科的処置は、無菌操作およびイソフルランガス麻酔を用いて行った。脳外科手術は既報の通りに行った２３。簡潔には、麻酔した後、マウスを定位フレーム（Kopf Instruments、Tujunga、CA）に入れ、２μｌのＨＥＫ−または８Ｂ−由来のｒＡＡＶ５−ＵＦ５０−ＢＣ ベクター（４．７５×１０１１ ｖｇ／ｍｌ）のいずれかを、３０−４０μｍの内径を有するガラス製マイクロピペットを通して、０．５μｌ／分の速度で、右線条体（座標：前方（anterior）−後方（posterior）−０．３ｍｍ、外側（lateral） −２．０ｍｍ、背腹側（dorsoventral） −３．０ｍｍ）に注射した。針を脳から抜く前に、５分間その場に留置した。
【０１１７】
生物発光イメージング
マウスを既報の通りに画像化した２３。Ｄ−ルシフェリン（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍＬ、１２６ｍｇ ルシフェリン／ｋｇ体重）の腹腔内注射の１２分後に、生物発光測定を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉａ インビボイメージングシステム（PerkinElmer、Waltman、MA）を用いて目的の領域（region-of-interest）の分析から得た。３匹のマウスを、２５ｃｍの視野で同時に画像化した。中間感度の（medium）ビニングで６０秒の撮影時間およびエフストップ（f-stop）＝１を、カメラ設定に用いた。各データセットに表示された画像は、適当な色強度スケールに正規化された。ＢＬＩデータは、電荷結合素子検出器に到達する総カウント数として生データとして報告される。
【０１１８】
脳組織調製および蛍光イメージング
マウスをペントバルビタール（Beuthanasia-D）で深麻酔し、１０ｍｌの生理食塩溶液、次いで、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中１０ｍｌの氷冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で上行大動脈を灌流した。脳を取り出し、ＰＦＡ中、４℃で一晩固定化した。６０マイクロメートル厚の冠状切片をビブラトームステージＶＴ１０００ Ｓ（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）で切断した。可変モードレーザースキャナー（Typhoon 9200、GE Amersham、Pittsburgh、PA、USA）により、または倒立顕微鏡ＤＭＩ４０００ Ｂ（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）を用いてｍＡｐｐｌｅ蛍光を分析した。
【０１１９】
ＮＧＳ解析
ＮＧＳを、ＨｉＳｅｑ ３０００ 装置（Illumina、San Diego、CA）およびペアエンドシーケンシングを用いて、ＵＦ ＩＣＢＲコアにより実施した。選択されたＮＧＳプロトコールの再現性を実証するために、全てのＤＮＡサンプルをデュプリケートで調製した。同様に、ＮＧＳライブラリー合成、シークエンシングおよびバイオインフォマティクスのすべてのステップを並行して、デュプリケートで行った。
【０１２０】
ＨＥＫ２９３ベースの産生のための対照ＤＮＡは、ｒＡＡＶストックを汚染する可能性のある全てのＤＮＡ配列を含んだ：ヒトゲノム配列（ＨＥＫ２９３、ＧＲＣｈ３８.Ｐ９、ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.35 またはＲｅｆＳｅｑアセンブリ受託：GCF_000001405.35）；アデノウイルスヘルパープラスミド（pHelper、GenBank：AF369965.1）；ＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＡＡＶ５ ＶＰタンパク質（ｒｅｐ２ｃａｐ５）をコードするｐＡＣＧｒ２ｃ５、ならびにそれぞれのプラスミド骨格。Ｓｆ９ベースの産生については、以下の配列を分析した：ヨウトガ（S．frugiperda）ゲノム（JQCY02.1.fsa_nt.gz、GenBank: JQCY00000000.2）；ＡｃＭＮＰＶゲノム（GenBank NC_001623.1）；S．frugiperdaラブドウイルス単離体 Ｓｆ（GenBank KF947078.1）； FastBac シャトルプラスミド骨格、ならびにＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＡＡＶ５ ＶＰをコードする配列。
【０１２１】
ＰＣＲフリーおよびＰＣＲ濃縮オプションの両方を含むＡＣＣＥＬ−ＮＧＳ（登録商標）２Ｓ ＰＣＲ−フリー ＤＮＡライブラリーキット（Swift Biosciences、Ann Arbor、MI）を利用して、ＮＧＳライブラリーを作製した。精製したｒＡＡＶ粒子の十分なＤＮＡｓｅ処理および二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ合成を、Lecomteら２６の文献に記載のプロトコールに僅かな修正を加えて行った。簡潔には、４ｘ１０１１のベクターゲノム（ｖｇ）を含む粒子を、ベースラインＺＥＲＯおよびＰｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅのエキソヌクレアーゼで、次いで、プロテイナーゼＫおよびＲＮＡｓｅＡ処理により十分に処理した。ＤＮＡを、２：１のビーズ：ＤＮＡ比を用いてＭａｇ−Ｂｉｎｄ ＲｘｎＰｕｒｅ Ｐｌｕｓキット（Omega Bio-Tek、Norcross、GA）を用いて精製した。ＤＮＡｐｏｌＩを用いて第２鎖を合成後、ＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ装置を用いて超音波処理した。ＤＮＡせん断のために以下の設定を用いた：標的サイズ ４００ｂｐ、ピーク出力増加−１７５Ｗ、デューティ比（duty factor） −１０％、バースト当たりのサイクル数−２００；時間−３８秒、水位−１５、水温−７．６〜７．８℃、および反応容積−４７μＬ。せん断されたインプットｄｓＤＮＡおよび合成されたＮＧＳライブラリーのプロファイルを図１４に示す。Ｓｆ９細胞およびＨＥＫ２９３細胞に由来するｒＡＡＶ ＤＮＡのサンプルは、ＮＧＳライブラリー調製中の各段階において同様のプロファイルおよび品質を示した。ライブラリー調製の全段階において、ＤＮＡ品質を、テープステーション（Agilent）およびＱｕｂｉｔ（Thermo Fisher Scientific）によりモニタリングした。ＰＣＲフリーのＮＧＳライブラリーの合成のために、２２０ｎｇのｄｓＤＮＡをせん断して、２００ｂｐのオプションインプットの標的サイズにした。ＰＣＲ富化ライブラリーについて、ライゲーション工程２の後のＤＮＡの１０％を、製造業者の推奨に従って８サイクル増幅させた。最後に、全てのライブラリーを１ｘＭａｇ−Ｂｉｎｄビーズで精製した。
【０１２２】
バイオインフォマティクス分析
バイオインフォマティクスワークフローのフローチャートを図１５に示す。Ｆａｓｔｑファイルを、そのデフォルト設定でスーパーコンピューティングクラスタで使用されるように改変された専用のオープンソースソフトウェアＣｏｎｔａＶｅｃｔ ｖ２．０ ２６を用いて分析した。ＣｏｎｔａＶｅｃｔのコードは、ジョブスケジューラ（job scheduler）によって管理されるバッチ環境で最大の効率およびスループットを得るために、ｂｌａｓｔｎツールおよびｂｗａツールの実行を適切にスケーリングするように適合された。変更の１つは、コンピューターを起動するノード（computing node）上のＣＰＵコアの総数に等しいスレッド数で常にｂｌａｓｔｎとｂｗａを実行するＣｏｎｔａＶｅｃｔの制限に関連していた。共有コンピューティング環境においてパーソナルワークステーションで使用するとき、この仮定が有効な場合もあるが、一般的に、スレッド数はバッチ処理（batch job）に要求されたかまたは仮想マシン内で利用可能なＣＰＵコア数と等しくなければならない。そうでなければ、問題のプログラムの効率は、分析のスループットを大幅に低下させる。ＣｏｎｔａＶｅｃｔのコンフィグレーションファイルにおいてスレッド番号が０に設定されているとき、新しい改変により、互換性のために古いモデルを使用できるようになったが、現行のＣｏｎｔａＶｅｃｔは、指定されたスレッド数でｂｌａｓｔｎとｂｗａを実行できる。デフォルトでは１つのスレッドが使用される。さらに、ＭＡＴＰＬＯＴＬＩＢＲＣ環境変数を介して環境にエクスポートできるオプションの構成ファイルが追加されて、ＣｏｎｔａＶｅｃｔを、Ｘ１１環境を使用しないクラスタノードで駆動するとき、失敗なくｍａｔｐｌｏｔｌｉｂを用いてグラフを生成できるようにする。上記の変更により、分析は、ＵＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＨｉＰｅｒＧａｔｏｒ スーパーコンピューターで成功裏（正常）に完了し、データに対するＣｏｎｔａＶｅｃｔの実行時間は、数日から数時間に短縮された。全ての変更は、ＧｉｔＨｕｂコードのPull Request（プルリクエスト）として以下のリポジトリ：github.com/a-slide/ContaVect and github.com/a-slide/pyDNAにおいてＣｏｎｔａＶｅｃｔの作成者に提出された。記載されている全ての適合が承認され、ソースコードに組み込まれている。ＳＮＰ変異体は、ＢＡＭファイルから、高深度カバレッジの配列解析に利用されるＪａｖａベースのアプリケーション（github.com/lindenb/jvarkit/wiki/MiniCaller）であるＭｉｎｉＣａｌｌｅｒソフトウェアにより検索された。ＨＥＫ２９３またはＳｆ９ ｒＡＡＶライブラリーのためのＭｉｎｉＣａｌｌｅｒにより作成されたＶＣＦファイル、ならびに陽性対照ライブラリー（各デュプリケート）を、ＧｅｎＢａｎｋの対照分子とアライメントした。ＶＣＦファイルの解析は、ＣＳＶファイルを生成するＰｙｔｈｏｎスクリプト（nbviewer.ipython.org/github/a-slide/iPython-Notebook/blob/master/Notebooks/VCF_analysis.ipynb）により実行された。ＶＣＦファイルおよびＣＳＶファイルは、Ｄｒｙａｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手可能である：bio.rc.ufl.edu/secure/zolotukhin/genther/; ユーザー名：“genther”、パスワード：“KrAkkegZ8F”。
【０１２３】
参考文献
1.  Girod, A, Wobus, CE, Zadori, Z, Ried, M, Leike, K, Tijssen, P et al. (2002). The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J Gen Virol 83: 973-978.
2.  Rose, JA, Maizel, JV, Jr., Inman, JK & Shatkin, AJ. (1971). Structural proteins of adenovirus-associated viruses. J Virol 8: 766-770.
3.  Johnson, FB, Ozer, HL & Hoggan, MD. (1971). Structural proteins of adenovirus-associated virus type 3. J Virol 8: 860-863.
4.  Buller, RM & Rose, JA. (1978). Characterization of adenovirus-associated virus-induced polypeptides in KB cells. J Virol 25: 331-338.
5.  Snijder, J, van de Waterbeemd, M, Damoc, E, Denisov, E, Grinfeld, D, Bennett, A et al. (2014). Defining the stoichiometry and cargo load of viral and bacterial nanoparticles by Orbitrap mass spectrometry. J Am Chem Soc 136: 7295-7299.
6.  Urabe, M, Ding, C & Kotin, RM. (2002). Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Hum Gene Ther 13: 1935-1943.
7.  Aslanidi, G, Lamb, K & Zolotukhin, S. (2009). An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 5059-5064.
8.  Mietzsch, M, Casteleyn, V, Weger, S, Zolotukhin, S & Heilbronn, R. (2015). OneBac 2.0: Sf9 Cell Lines for Production of AAV5 Vectors with Enhanced Infectivity and Minimal Encapsidation of Foreign DNA. Hum Gene Ther 26: 688-697.
9.  Kohlbrenner, E, Aslanidi, G, Nash, K, Shklyaev, S, Campbell-Thompson, M, Byrne, BJ et al. (2005). Successful production of pseudotyped rAAV vectors using a modified baculovirus expression system. Mol Ther 12: 1217-1225.
10.  Urabe, M, Nakakura, T, Xin, KQ, Obara, Y, Mizukami, H, Kume, A et al. (2006). Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol 80: 1874-1885.
11.  Urabe, M, Ozawa, K, Haast, S & Hermens, W in EP 2311967 A2 20110420 (EN) (Amsterdam Molecular Therapeutics (AMT) B.V., 2015).
12.  Chen, H. (2008). Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Mol Ther 16: 924-930.
13.  Kozak, M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234: 187-208.
14.  Cigan, AM & Donahue, TF. (1987). Sequence and structural features associated with translational initiator regions in yeast--a review. Gene 59: 1-18.
15.  Joshi, CP, Zhou, H, Huang, X & Chiang, VL. (1997). Context sequences of translation initiation codon in plants. Plant Mol Biol 35: 993-1001.
16.  Pesole, G, Gissi, C, Grillo, G, Licciulli, F, Liuni, S & Saccone, C. (2000). Analysis of oligonucleotide AUG start codon context in eukariotic mRNAs. Gene 261: 85-91.
17.  Kozak, M. (1987). An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res 15: 8125-8148.
18.  Noderer, WL, Flockhart, RJ, Bhaduri, A, Diaz de Arce, AJ, Zhang, J, Khavari, PA et al. (2014). Quantitative analysis of mammalian translation initiation sites by FACS-seq. Mol Syst Biol 10: 748.
19.   Salganik, M, Venkatakrishnan, B, Bennett, A, Lins, B, Yarbrough, J, Muzyczka, N et al. (2012). Evidence for pH-dependent protease activity in the adeno-associated virus capsid. J Virol 86: 11877-11885.
20.   Storms, HF, van der Heijden, R, Tjaden, UR & van der Greef, J. (2006). Considerations for proteolytic labeling-optimization of 18O incorporation and prohibition of back-exchange. Rapid Commun Mass Spectrom 20: 3491-3497.
21.   Ye, X, Luke, B, Andresson, T & Blonder, J. (2009). 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct Genomic Proteomic 8: 136-144.
22.   Qian, WJ, Liu, T, Petyuk, VA, Gritsenko, MA, Petritis, BO, Polpitiya, AD et al. (2009). Large-scale multiplexed quantitative discovery proteomics enabled by the use of an (18)O-labeled "universal" reference sample. J Proteome Res 8: 290-299.
23.   Marsic, D, Mendez-Gomez, HR & Zolotukhin, S. (2015). High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Mol Ther Methods Clin Dev 2: 15041.
24.   Clark, KR, Voulgaropoulou, F & Johnson, PR. (1996). A stable cell line carrying adenovirus-inducible rep and cap genes allows for infectivity titration of adeno-associated virus vectors. Gene Ther 3: 1124-1132.
25.   Ma, H, Galvin, TA, Glasner, DR, Shaheduzzaman, S & Khan, AS. (2014). Identification of a novel rhabdovirus in Spodoptera frugiperda cell lines. J Virol 88: 6576-6585.
26.   Lecomte, E, Tournaire, B, Cogne, B, Dupont, JB, Lindenbaum, P, Martin-Fontaine, M et al. (2015). Advanced Characterization of DNA Molecules in rAAV Vector Preparations by Single-stranded Virus Next-generation Sequencing. Mol Ther Nucleic Acids 4: e260.
27.   Mietzsch, M, Grasse, S, Zurawski, C, Weger, S, Bennett, A, Agbandje-McKenna, M et al. (2014). OneBac: platform for scalable and high-titer production of adeno-associated virus serotype 1-12 vectors for gene therapy. Hum Gene Ther 25: 212-222.
28.   Grieger, JC, Snowdy, S & Samulski, RJ. (2006). Separate basic region motifs within the adeno-associated virus capsid proteins are essential for infectivity and assembly. J Virol 80: 5199-5210.
29.   Sonntag, F, Bleker, S, Leuchs, B, Fischer, R & Kleinschmidt, JA. (2006). Adeno-associated virus type 2 capsids with externalized VP1/VP2 trafficking domains are generated prior to passage through the cytoplasm and are maintained until uncoating occurs in the nucleus. J Virol 80: 11040-11054.
30.   Popa-Wagner, R, Sonntag, F, Schmidt, K, King, J & Kleinschmidt, JA. (2012). Nuclear translocation of adeno-associated virus type 2 capsid proteins for virion assembly. J Gen Virol 93: 1887-1898.
31.   Allay, JA, Sleep, S, Long, S, Tillman, DM, Clark, R, Carney, G et al. (2011). Good manufacturing practice production of self-complementary serotype 8 adeno-associated viral vector for a hemophilia B clinical trial. Hum Gene Ther 22: 595-604.
32.   Ye, GJ, Scotti, MM, Liu, J, Wang, L, Knop, DR & Veres, G. (2011). Clearance and characterization of residual HSV DNA in recombinant adeno-associated virus produced by an HSV complementation system. Gene Ther 18: 135-144.
33.   Chadeuf, G, Ciron, C, Moullier, P & Salvetti, A. (2005). Evidence for encapsidation of prokaryotic sequences during recombinant adeno-associated virus production and their in vivo persistence after vector delivery. Mol Ther 12: 744-753.
34.   Nony, P, Chadeuf, G, Tessier, J, Moullier, P & Salvetti, A. (2003). Evidence for packaging of rep-cap sequences into adeno-associated virus (AAV) type 2 capsids in the absence of inverted terminal repeats: a model for generation of rep-positive AAV particles. J Virol 77: 776-781.
35.   Kapranov, P, Chen, L, Dederich, D, Dong, B, He, J, Steinmann, KE et al. (2012). Native molecular state of adeno-associated viral vectors revealed by single-molecule sequencing. Hum Gene Ther 23: 46-55.
36.   Wang, Y, Ling, C, Song, L, Wang, L, Aslanidi, GV, Tan, M et al. (2012). Limitations of encapsidation of recombinant self-complementary adeno-associated viral genomes in different serotype capsids and their quantitation. Hum Gene Ther Methods 23: 225-233.
37.   Cogne, B, Snyder, R, Lindenbaum, P, Dupont, JB, Redon, R, Moullier, P et al. (2014). NGS library preparation may generate artifactual integration sites of AAV vectors. Nat Med 20: 577-578.
38.   Kozarewa, I, Ning, Z, Quail, MA, Sanders, MJ, Berriman, M & Turner, DJ. (2009). Amplification-free Illumina sequencing-library preparation facilitates improved mapping and assembly of (G+C)-biased genomes. Nat Methods 6: 291-295.
39.   Folger, KR, Thomas, K & Capecchi, MR. (1985). Efficient correction of mismatched bases in plasmid heteroduplexes injected into cultured mammalian cell nuclei. Mol Cell Biol 5: 70-74.
40.   Zolotukhin, S, Potter, M, Hauswirth, WW, Guy, J & Muzyczka, N. (1996). A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J Virol 70: 4646-4654.
41.   Faust, SM, Bell, P, Cutler, BJ, Ashley, SN, Zhu, Y, Rabinowitz, JE et al. (2013). CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection. J Clin Invest 123: 2994-3001.
42.   Herzog, RW. (2016). A Cure For Hemophilia: the Promise Becomes a Reality. Mol Ther 24: 1503-1504.
43.   Dolgin, E. (2016). Early clinical data raise the bar for hemophilia gene therapies. Nat Biotechnol 34: 999-1001.
44.   Zolotukhin, S, Byrne, BJ, Mason, E, Zolotukhin, I, Potter, M, Chesnut, K et al. (1999). Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther 6: 973-985.
45.   Smith, RH, Levy, JR & Kotin, RM. (2009). A simplified baculovirus-AAV expression vector system coupled with one-step affinity purification yields high-titer rAAV stocks from insect cells. Mol Ther 17: 1888-1896.
46.   Lock, M, Alvira, MR, Chen, SJ & Wilson, JM. (2014). Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods 25: 115-125.
47.   Piedra, J, Ontiveros, M, Miravet, S, Penalva, C, Monfar, M & Chillon, M. (2015). Development of a rapid, robust, and universal picogreen-based method to titer adeno-associated vectors. Hum Gene Ther Methods 26: 35-42.
【０１２４】
他の態様
本明細書に記載された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に記載の各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。従って、他にこれと異なる記載がない限り、記載された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的なシリーズの一例に過ぎない。
【０１２５】
上述の明細書の記載から、当業者は本明細書の記載の本質的な特徴を容易に確認することができ、そして当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるために、本明細書に記載されるものを改変および修飾することができる。従って、他の態様もまた、本発明の範囲内にある。
【０１２６】
均等物
いくつかの本発明の態様が本明細書に記載され説明されているが、当業者は、機能を実行し、そして／または結果および／もしくは本明細書に記載の利点の１つ以上を得るための種々の他の手段ならびに／あるいは構造を容易に想到することができ、かかる変形および／または修飾の各々は、本明細書に記載の本発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメーター、寸法、材料、および構成が非限定的であることを意味し、実際のパラメーター、寸法、材料および／または構成は、特定の用途または本発明の教示が用いられる用途によって変わり得ることを容易に認識し得る。当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の態様に対する多くの均等物を認識するか、または単に常套的な実験を用いて確認することができる。従って、上記の態様は単なる例示として記載されており、添付の特許請求の範囲およびそれと均等の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載され特許請求される以外の方法で実施され得ることが理解されるべきである。本明細書に記載の本発明の態様は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法を対象とする。さらに、かかる特徴、システム、物品、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような特徴、システム、物品、キットおよび／または方法の２以上の任意の組み合わせは、本発明の範囲内に包含される。
【０１２７】
本明細書で定義され用いられている全ての定義は、辞書の定義、引用により組み込まれた文献の定義、および／または定義された用語の通常の意味を包含すると理解されるべきである。
【０１２８】
本明細書中に記載される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参考文献として組み込まれており、ある場合には、その文献の内容全体が包含され得る。
【０１２９】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる不定冠詞“ａ”および“ａｎ”は、他にこれと異なる記載がない限り、“少なくとも１つ”を意味すると理解されるべきである。
【０１３０】
本明細書および特許請求の範囲において用いる語句“および／または”は、そのように結合された要素の“一方または両方”を意味する、すなわち、複数の要素が、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離して存在することを意味すると理解されるべきである。“および／または”と共に列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の“１つまたはそれ以上”と解釈されるべきである。場合によって、具体的に特定された要素と関連するかどうかにかかわらず、語句“および／または”によって具体的に特定されたそれらの要素以外の他の要素が存在していてよい。従って、非限定的な例として、“Ａおよび／またはＢ”への言及は、“含む（comprising）”などの制限のない用語（open-ended language）と併せて用いられるとき、一態様において、Ａのみを意味してよく（場合により、Ｂ以外の要素を含む）；別の態様において、Ｂのみを意味してよく（場合により、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の態様において、ＡおよびＢの両方を意味してよい（場合により、他の要素を含む）；等。
【０１３１】
本明細書および特許請求の範囲において用いる、“または”は、上で定義した“および／または”と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中で項目を分けるとき、“または”または“および／または”は、包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、多数の要素または要素のリストの少なくとも１つを含むが、２以上も含み、場合により、さらなるリストにない項目も含む。これに対して、“〜のうち１つのみ”または“〜のうち正確に１つ”のように明示された用語または、特許請求の範囲において用いるとき、“〜からなる”と明示された用語のみが、多数の要素または要素のリストのうち正確に１つの要素を含むことを意味し得る。一般的に、本明細書で用いる用語“または”は、“いずれか”、“〜の１つ”、“〜の１つのみ”または“〜の正確に１つ”のような排他的な用語の前にあるとき、排他的な選択肢（すなわち、“一方または他方であるが、両方でない”）を示すものとしてのみ解釈されるべきである。特許請求の範囲に用いるとき、“本質的に〜からなる”は、特許法の分野で用いられる通常の意味を有するものとする。
【０１３２】
本明細書および特許請求の範囲において用いる、１つまたは複数の要素のリストを引用して、“少なくとも１つ”という語句は、要素のリストにおいていずれか１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素および全要素の少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリストにおいて要素の任意の組合せを除外しない。この定義はまた、場合により、要素のリスト内に具体的に特定される要素以外に、要素が存在してもよいことを可能にし、ここで、語句“少なくとも１つ”が、具体的に特定される要素に関連するか、関連しないかを問わない。従って、非限定的な例として、“ＡおよびＢの少なくとも１つ”（または、同様の“ＡまたはＢの少なくとも一方”、または同様の“Ａおよび／またはＢのうち少なくとも１つ”）は、一態様において、少なくとも１つの、場合により２以上の、Ａを含み、Ｂが存在しない（および、場合により、Ｂ以外の要素を含む）ことを意味し得る；別の態様において、少なくとも１つの、場合により２以上の、Ｂを含み、Ａが存在しない（および、場合により、Ａ以外の要素を含む）ことを意味し得る；さらに別の態様において、少なくとも１つの、場合により２以上の、Ａを含み、および少なくとも１つの、場合により２以上のＢを含む（および、場合により他の要素を含む）；等、を意味し得る。
【０１３３】
他にこれと異なる記載がない限り、２以上のステップまたは動作を含む本明細書に記載の任意の方法において、該方法の複数のステップまたは動作の順序は、必ずしも該方法の複数のステップまたは動作が列挙される順に限定されないことも理解されるべきである。
【０１３４】
特許請求の範囲において、ならびに上記の明細書の記載において、“含む（comprising）”、“含む（including）”、“担持する（carrying）”、“有する（having）”、“混入する（containing）”、“伴う（involving）”、“保有する（holding）”、“構成する（composed of）”などのような全ての移行句（transitional phrase）は、制限されない（open-ended）こと、すなわち、包含を意味するが、限定されなないことが理解されるべきである。“〜からなる”および“本質的に〜からなる”という移行句のみが、米国特許商標庁のＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓのセクション２１１１．０３において記載されるように、それぞれ閉鎖式（closed）または半閉鎖式（semi-closed）の移行句であるものとする。制限のない（open-ended）移行句（例えば、“含む（comprising）”）を用いて本明細書に記載された態様もまた、別の態様において、制限のない移行句によって記載された特徴“からなる”および“本質的にそれからなる”として意図されることが理解されるべきである。例えば、本明細書の記載が“ＡおよびＢを含む組成物”を記載するとき、該記載は、別の態様“ＡおよびＢからなる組成物”および“本質的にＡおよびＢからなる組成物”も企図する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019513403.tif 000032
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019513403.tif 000038
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