(57)【要約】  本発明は、アテローム血栓症の治療および／または予防における使用のためのブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤に関する。本発明はさらに、医薬有効量のブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤をアテローム血栓症の治療および／または予防を必要とする対象に投与することを含む、アテローム血栓症を治療および／または予防する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム血栓症の治療および／または予防における使用のためのブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤。
【請求項２】
医薬有効量のブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤をアテローム血栓症の治療および／または予防を必要とする対象に投与することを含む、アテローム血栓症を治療および／または予防する方法。
【請求項３】
前記阻害剤が、小分子、抗体または抗体模倣体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンス核酸分子である、請求項１に記載の阻害剤または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、アゾールモチーフおよび／またはアジンモチーフを含む小分子である、請求項３に記載の阻害剤または方法。
【請求項５】
前記阻害剤が、Ｂｔｋに不可逆的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害剤または方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、またはそれらのアナログである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の阻害剤または方法。
【請求項７】
前記阻害剤が、場合により、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物に含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の阻害剤または方法。
【請求項８】
前記阻害剤が、２８０〜５６０ｍｇの負荷用量、および１日当たり１０〜１４０ｍｇまたは隔日４０〜２８０ｍｇの維持投与量において使用／投与される、請求項５または６に記載の阻害剤または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム血栓症の治療および／または予防における使用のためのブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤に関する。本発明はさらに、医薬有効量のブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤をアテローム血栓症の治療および／または予防を必要とする対象に投与することを含む、アテローム血栓症を治療および／または予防する方法に関する。
【０００２】
本明細書において、多数の文献、例として、特許出願および製造業者のマニュアルが引用される。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとみなされない一方、参照により全体として本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が参照により組み込まれることが具体的および個別的に示されるのと同一の程度で参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血管壁損傷は、血小板の活性化および血小板血栓の形成と、それに続くさらなる凝固活性をもたらし、それは損傷血管を閉塞するフィブリン含有血栓の形成をもたらす。したがって、止血は、内皮下マトリックスの活性化構成成分、例えば、コラーゲンへの血小板の粘着から開始するイベントである。同様に、アテローム動脈硬化性プラークのびらんまたは破裂は、露出材料、例えば、細胞外マトリックス構成成分上で循環血小板を停止させることにより血小板およびフィブリンリッチ血栓の形成をもたらす。正常の止血は重要な機能である一方、アテローム動脈硬化性プラークのびらんまたは破裂に起因する血栓形成は、それが世界中の主な死因の２つである心筋梗塞および虚血性脳卒中をもたらし得るため有害であり得る（Ｆｕｓｔｅｒ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００５；４６：９３７−９５４；Ｂａｄｉｍｏｎ  Ｌ．ａｎｄ  Ｖｉｌａｈｕｒ  Ｇ．Ｊ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  ２０１４；２７６：６１８−６３２）。
【０００４】
線維状コラーゲンは、血小板粘着および活性化において特に重要な反応性マトリックス構成成分である。いくつかの血小板コラーゲン受容体がこれまで同定されており、その中で特に糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）および糖タンパク質Ｉａ−ＩＩａ（インテグリンα２β１）は、現在臨床的に重要とみなされている。Ｋｕｉｊｐｅｒｓ  ＭＪＥ．ｅｔ  ａｌ．（ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００３；１７（６）：６８５−６８７）は、血小板上のこれら２つの重要なコラーゲン受容体ＧＰＶＩおよびインテグリンα２β１の役割、ならびにそれぞれＴＰαおよびＰ２Ｙ１受容体を介してＴｘＡ2およびＡＤＰにより誘発される血小板応答におけるＧαqヘテロ三量体シグナリングの役割を調査した。これらの知見は、流動血液に露出されるコラーゲンへの初期血小板テザリングは、コラーゲン上の血漿から沈着したＧＰＩｂおよびフォンヴィレブランド因子間の相互作用に強く関与すること、ならびに高い壁剪断速度（＞５００ｓ-1）下での安定な血小板−コラーゲン粘着が、インテグリンα２β１および活性ＧＰＶＩ受容体の両方に依存することを示した。ＧＰＶＩを介する血小板結合および活性化は、インテグリン媒介粘着について細胞をプライミングすること、および活性化インテグリンα２β１はコラーゲン上の血小板を安定化させることが仮定された。著者らは、インテグリンα２β１を阻害する薬剤が、潜在的に、抗ＧＰＶＩ効果との組合せで、血小板指向抗血栓療法に有用であり得ることを結論付けた。
【０００５】
Ａｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５；１９（７）：８２５−８２７およびｆａｓｅｂｊ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０９６／ｆｊ．０４−１９４０ｆｊｅのもとワールドワイドウエブに公開されている論文全文）において、著者らは、コラーゲン上の血小板の粘着におけるインテグリンα２β１およびＧＰＶＩの個々の役割について文献においてある論議が存在することに留意した。したがって、前記研究の目的は、それらの論争に対処する実験を実施することである。この目的のため、ヒトおよびマウス血小板の両方を同一の実験条件下で、同一または等価実験ツールを使用して分析した。著者らは、２つの区別される安定的粘着の経路が存在し、一方はＧＰＶＩおよびＳｒｃファミリーキナーゼの活性化に基づき、他方はインテグリンα２β１に依存的であることを見出した。Ａｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．はさらに、インテグリンα２β１がＧＰＶＩ発現または下流Ｓｒｃキナーゼ活性および細胞外カルシウム上昇の不存在下でマウス血小板の粘着を媒介し得ることを見出した。
【０００６】
プラーク材料の組成は健常血管の組成と異なるため、調査中の一態様は、それらの組成の正確な性質および血栓形成に対するそれらの影響であり、今もなおそうである。ヒト脂質リッチアテローム動脈硬化性プラークの破裂をシミュレートするモデルを使用して血栓形成にフォーカスした研究（Ｐｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５；１９（７）：８９８−９０９）により、プラーク中の形態的に変更されたコラーゲンＩ型およびＩＩＩ型陽性構造の存在が明らかになった。この研究の著者らは、ＧＰＶＩのコラーゲン結合部位に特異的に結合する抗体１０Ｂ１２によるＧＰＶＩの阻害が、流動血液中でのプラーク上への血小板血栓形成を完全に遮断する一方、インテグリンα２β１の抗体媒介阻害による効果は観察されないことを見出した。この研究は、Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００８；１０３：３５６−３６７）により裏付けられ、拡大され、異なる抗ＧＰＶＩ抗体（５Ｃ４）を使用してＩ型およびＩＩＩ型含有構造への結合がさらに調査された。これら２つの研究の著者らは、プラーク中の形態的に多様なコラーゲンＩ型およびＩＩＩ型含有構造が血小板ＧＰＶＩを活性化させることにより血栓形成を刺激すること、ならびにＧＰＶＩの阻害が心血管リスクがある患者におけるアテローム血栓症を予防するための新規抗血栓方針を提供し得ることを結論付けた。二量体ＧＰＶＩ−Ｆｃまたは種々の抗ＧＰＶＩ抗体を使用することによるアテローム動脈硬化性プラーク誘導血小板活性化の阻害についてのさらなる研究は、Ｊａｍａｓｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；６５：２４０４−２４１５）に記載された。著者らは、抗体が免疫応答を潜在的に誘導し得、出血を増加させ得るという懸念が存在するため、ＧＰＶＩ−Ｆｃの使用が治療法に好ましいことを示唆したが、そのような有害な免疫応答または出血効果の増加はこの研究において用いられた抗体について示されなかった。
【０００７】
代替アプローチがＰｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７；９７：４３５−４４３）に記載されており、著者らは、プラークコラーゲン構造上に存在するフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）と相互作用する血小板受容体ＧＰＩｂαにフォーカスした。この相互作用は、初期血小板テザリングおよび一過的粘着を誘導する血栓形成の最初のステップを表すと考えられる。著者らは、１．５００ｓ-1の剪断速度を有する流動条件下で、静的条件とは対照的に、アスピリンがプラーク誘導血栓形成を有意に阻害し得ず、Ｐ２Ｙ1およびＰ２Ｙ12受容体アンタゴニスト（ＡＤＰ受容体アンタゴニスト）の組合せがプラーク刺激血小板血栓形成の低減においてＧＰＩｂαの遮断よりも有効でないことを見出した。したがって、著者らは、ＶＷＦがプラーク破裂後の血小板血栓形成における重要な役割を担い得ることを結論付け、異なる抗血小板薬、例えば、Ｐ２Ｙ1／Ｐ２Ｙ12受容体アンタゴニストおよびＧＰＩｂαまたはＧＰＶＩの阻害剤の組合せがプラーク破裂後のヒトプラーク誘導血栓形成の予防を改善し得ることを示唆した。
【０００８】
上記に示されるとおり、血小板活性化および凝集（両方とも健常血管およびアテローム動脈硬化性プラークの破裂をシミュレートするモデルにおいて）の機序を解明するための多数の研究が実施されてきた。しかしながら、それらの研究に多くの試行が現在投資されているという事実にかかわらず、現在の最も一般的な治療法は、依然として、アスピリンおよびＰ２Ｙ１２アンタゴニストによる二重抗血小板療法である。この治療法は虚血性心血管イベントを低減させるが、その効力は限定され、最も重要なことに、この治療法は、それらの化合物がプラークトリガー血小板活性化を標的化するだけでなく、生理学的止血機序にも影響を与えるため出血リスクの増加を伴うという欠点を有する（Ｂｏｎａｃａ  ＭＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５；３７２：１７９１−１８００）。したがって、高い効力でプラークトリガー血小板活性化を特異的に目的とするが、生理学的止血機序をインタクトのまま残す新規治療法が、本分野に多大な価値を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この必要性は、請求項に特徴付けされる実施形態の条項により対処される。
【００１０】
したがって、本発明は、アテローム血栓症の治療および／または予防における使用のためのブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】イブルチニブは、プラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を阻害するが、ＴＲＡＰおよびＡＤＰにより刺激される静的血小板凝集を阻害しない。血液試料を、プラーク（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．１〜０．３μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、ＡＡ（０．６ｍＭ）による刺激前に、または刺激なしで溶媒（ＤＭＳＯ、０．１％）またはイブルチニブ（１μＭ）と１５分間プレインキュベートした。（Ａ）代表的なＭＥＡトレーシング。トレーシングにおける数字は、１０分間において計測された累積凝集値（ＡＵ＊ｍｉｎ）を示す。（Ｂ）プラーク誘導血小板凝集の阻害に関するイブルチニブの用量応答曲線。（Ｃ）コラーゲン誘導血小板凝集の阻害に関するイブルチニブの用量応答曲線。（Ｄ）プラーク、コラーゲン、ＴＲＡＰ、ＡＤＰ誘導血小板凝集および自然血小板凝集に対するイブルチニブ（１μＭ）の効果。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図１−２】イブルチニブは、プラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を阻害するが、ＴＲＡＰおよびＡＤＰにより刺激される静的血小板凝集を阻害しない。血液試料を、プラーク（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．１〜０．３μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、ＡＡ（０．６ｍＭ）による刺激前に、または刺激なしで溶媒（ＤＭＳＯ、０．１％）またはイブルチニブ（１μＭ）と１５分間プレインキュベートした。（Ａ）代表的なＭＥＡトレーシング。トレーシングにおける数字は、１０分間において計測された累積凝集値（ＡＵ＊ｍｉｎ）を示す。（Ｂ）プラーク誘導血小板凝集の阻害に関するイブルチニブの用量応答曲線。（Ｃ）コラーゲン誘導血小板凝集の阻害に関するイブルチニブの用量応答曲線。（Ｄ）プラーク、コラーゲン、ＴＲＡＰ、ＡＤＰ誘導血小板凝集および自然血小板凝集に対するイブルチニブ（１μＭ）の効果。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図１−３】イブルチニブは、プラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を阻害するが、ＴＲＡＰおよびＡＤＰにより刺激される静的血小板凝集を阻害しない。血液試料を、プラーク（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．１〜０．３μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、ＡＡ（０．６ｍＭ）による刺激前に、または刺激なしで溶媒（ＤＭＳＯ、０．１％）またはイブルチニブ（１μＭ）と１５分間プレインキュベートした。（Ａ）代表的なＭＥＡトレーシング。トレーシングにおける数字は、１０分間において計測された累積凝集値（ＡＵ＊ｍｉｎ）を示す。（Ｂ）プラーク誘導血小板凝集の阻害に関するイブルチニブの用量応答曲線。（Ｃ）コラーゲン誘導血小板凝集の阻害に関するイブルチニブの用量応答曲線。（Ｄ）プラーク、コラーゲン、ＴＲＡＰ、ＡＤＰ誘導血小板凝集および自然血小板凝集に対するイブルチニブ（１μＭ）の効果。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図２−１】イブルチニブは、低剪断速度（６００／ｓ）における動脈流下でプラーク誘導血小板凝集物形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板凝集を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブと１５分間プレインキュベートした。左図の代表的な顕微鏡写真は、血流開始の０分および５分後におけるプラークホモジネート（Ａ）、プラーク組織切片（Ｂ）およびコラーゲン（Ｃ）上への血小板沈着に対する溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブ（１μＭ）の効果を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するイブルチニブ（０．２、０．５および１μＭ）の効果を示す。イブルチニブ（１μＭ）によるプラーク誘導血小板沈着の阻害は、（Ａ、下段右側）において引き延ばしスケールにおいて示す。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図２−２】イブルチニブは、低剪断速度（６００／ｓ）における動脈流下でプラーク誘導血小板凝集物形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板凝集を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブと１５分間プレインキュベートした。左図の代表的な顕微鏡写真は、血流開始の０分および５分後におけるプラークホモジネート（Ａ）、プラーク組織切片（Ｂ）およびコラーゲン（Ｃ）上への血小板沈着に対する溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブ（１μＭ）の効果を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するイブルチニブ（０．２、０．５および１μＭ）の効果を示す。イブルチニブ（１μＭ）によるプラーク誘導血小板沈着の阻害は、（Ａ、下段右側）において引き延ばしスケールにおいて示す。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図２−３】イブルチニブは、低剪断速度（６００／ｓ）における動脈流下でプラーク誘導血小板凝集物形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板凝集を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブと１５分間プレインキュベートした。左図の代表的な顕微鏡写真は、血流開始の０分および５分後におけるプラークホモジネート（Ａ）、プラーク組織切片（Ｂ）およびコラーゲン（Ｃ）上への血小板沈着に対する溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブ（１μＭ）の効果を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するイブルチニブ（０．２、０．５および１μＭ）の効果を示す。イブルチニブ（１μＭ）によるプラーク誘導血小板沈着の阻害は、（Ａ、下段右側）において引き延ばしスケールにおいて示す。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図３−１】イブルチニブは、高剪断速度（１５００／ｓ）における動脈流下でプラーク誘導血小板凝集物形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板凝集物形成を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブとプレインキュベートした。左図の代表的な顕微鏡写真は、血流開始の０分および５分後におけるプラークホモジネート（Ａ）およびコラーゲン（Ｂ）上への血小板沈着に対する溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブ（０．５μＭ）の効果を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するイブルチニブ（０．２および０．５μＭ）の効果を示す。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図３−２】イブルチニブは、高剪断速度（１５００／ｓ）における動脈流下でプラーク誘導血小板凝集物形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板凝集物形成を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブとプレインキュベートした。左図の代表的な顕微鏡写真は、血流開始の０分および５分後におけるプラークホモジネート（Ａ）およびコラーゲン（Ｂ）上への血小板沈着に対する溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）またはイブルチニブ（０．５μＭ）の効果を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するイブルチニブ（０．２および０．５μＭ）の効果を示す。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図４】経口イブルチニブ処理は、プラークおよびコラーゲン誘導静的血小板凝集を阻害する。イブルチニブにより処理された患者および対照患者からの血液試料を、プラークホモジネート（８３３μｇ／ｍｌ）もしくはコラーゲン（０．１５〜０．３μｇ／ｍｌ）による刺激前に、または刺激なしで３７℃において３分間プレインキュベートした。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図５−１】経口イブルチニブ処理は、動脈流下でアテローム動脈硬化性プラーク上への血小板血栓形成を阻害するが、コラーゲン上への血小板血栓形成を阻害しない。左図の代表的な顕微鏡写真は、イブルチニブ処理患者および対照患者からの血液を用いる流動（剪断速度６００／ｓ）開始の０分および６分後におけるプラークホモジネート（Ａ）、プラーク組織切片（Ｂ）およびコラーゲン（Ｃ）の血小板被覆を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対する患者のイブルチニブ処理の効果を示す。イブルチニブによるプラーク誘導血小板沈着の阻害は、（Ａ、下段右側）において引き延ばしスケールにおいて示す。血液試料を、血小板標識のためのＤｉＯＣ６と１０分間プレインキュベートした。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図５−２】経口イブルチニブ処理は、動脈流下でアテローム動脈硬化性プラーク上への血小板血栓形成を阻害するが、コラーゲン上への血小板血栓形成を阻害しない。左図の代表的な顕微鏡写真は、イブルチニブ処理患者および対照患者からの血液を用いる流動（剪断速度６００／ｓ）開始の０分および６分後におけるプラークホモジネート（Ａ）、プラーク組織切片（Ｂ）およびコラーゲン（Ｃ）の血小板被覆を示す。右図の線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対する患者のイブルチニブ処理の効果を示す。イブルチニブによるプラーク誘導血小板沈着の阻害は、（Ａ、下段右側）において引き延ばしスケールにおいて示す。血液試料を、血小板標識のためのＤｉＯＣ６と１０分間プレインキュベートした。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図６−１】インビトロでの出血時間に対する経口イブルチニブ処理の効果（ＰＦＡ−１００）。イブルチニブ処理の５人の患者および５人の対照患者からの血液試料を（Ａ）コラーゲン／エピネフリンまたは（Ｂ）コラーゲン／ＡＤＰカートリッジに移し、血小板機能分析装置ＰＦＡ１００（登録商標）によりインビトロ閉止時間を計測した。（Ａ、Ｂ）それぞれの患者について結果を示す。２本の水平線は、正常範囲（コラーゲン／ＥＰＩ８４〜１６０秒；コラーゲン／ＡＤＰ６８〜１２１秒）を示す。（Ｃ）コラーゲン／エピネフリンおよびコラーゲン／ＡＤＰカートリッジにより測定された対照およびイブルチニブ患者の平均閉止時間。（Ｄ）対照およびイブルチニブ患者の平均血小板数（Ｇ／ｌ）。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図６−２】インビトロでの出血時間に対する経口イブルチニブ処理の効果（ＰＦＡ−１００）。イブルチニブ処理の５人の患者および５人の対照患者からの血液試料を（Ａ）コラーゲン／エピネフリンまたは（Ｂ）コラーゲン／ＡＤＰカートリッジに移し、血小板機能分析装置ＰＦＡ１００（登録商標）によりインビトロ閉止時間を計測した。（Ａ、Ｂ）それぞれの患者について結果を示す。２本の水平線は、正常範囲（コラーゲン／ＥＰＩ８４〜１６０秒；コラーゲン／ＡＤＰ６８〜１２１秒）を示す。（Ｃ）コラーゲン／エピネフリンおよびコラーゲン／ＡＤＰカートリッジにより測定された対照およびイブルチニブ患者の平均閉止時間。（Ｄ）対照およびイブルチニブ患者の平均血小板数（Ｇ／ｌ）。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図７】動脈流下で抗α２β１抗体６Ｆ１は固定化可溶性コラーゲン上への血小板粘着を阻害するが、イブルチニブは阻害しない。血液を流動（剪断６００／ｓ）開始前にＤｉＯＣ６、アブシキシマブ（２０μｇ／ｍｌ）、およびＤＭＳＯ（０．１％；対照）、イブルチニブ（１μＭ）または６Ｆ１（２０μｇ／ｍｌ）のいずれかと３７℃において１５分間プレインキュベートした。値は平均＋ＳＤ（ｎ＝４）である。
【図８】抗ＧＰＩｂα抗体６Ｂ４は、高剪断速度（１５００／ｓ）における動脈流下でプラークおよびコラーゲン誘導血小板凝集物形成を阻害する。血液試料を灌流前に６Ｂ４（５μｇ／ｍｌ）の不存在または存在下でＤｉＯＣ６とプレインキュベートした。プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対する６Ｂ４の効果。値は平均＋ＳＤ（ｎ＝４〜５）である。
【図９】アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）は、プラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を阻害するが、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびアラキドン酸（ＡＡ）により刺激される静的血小板凝集を阻害しない。血液試料をプラーク（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．１〜０．３μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、ＡＡによる刺激前に、または刺激なしで溶媒（ＤＭＳＯ、０．１％）またはＡＣＰ−１９６と１５分間プレインキュベートした。（Ａ）プラーク誘導血小板凝集の阻害に関するＡＣＰ−１９６の用量応答曲線。（Ｂ）プラーク、コラーゲン、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびＡＡ誘導血小板凝集ならびに自然血小板凝集に対するＡＣＰ−１９６（２μＭ）の効果。値は平均±ＳＤ（ｎ＝４）である。
【図１０】ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、プラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を阻害するが、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびアラキドン酸（ＡＡ）により刺激される静的血小板凝集を阻害しない。血液試料をプラーク（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．１〜０．３μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、ＡＡ（０．６ｍＭ）による刺激前に、または刺激なしで溶媒（ＤＭＳＯ、０．１％）またはＯＮＯ／ＧＳ−４０５９と１５分間プレインキュベートした。（Ａ）プラーク誘導血小板凝集の阻害に関するＯＮＯ／ＧＳ−４０５９の用量応答曲線。（Ｂ）プラーク、コラーゲン、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびＡＡ誘導血小板凝集ならびに自然血小板凝集に対するＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（２μＭ）の効果。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図１１】アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）は、動脈流下でプラーク誘導血小板血栓形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板血栓形成を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）または増加濃度のＡＣＰ−１９６（全てＤＭＳＯ中、最終濃度０．１％）と６００／ｓの剪断速度における血流開始前に１５分間プレインキュベートした。線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するＡＣＰ−１９６（０．５、１および２μＭ）の効果を示す。値は平均＋ＳＤ（ｎ＝３）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図１２】ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、動脈流下でプラーク誘導血小板血栓形成を阻害するが、コラーゲン誘導血小板血栓形成を阻害しない。血液試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と、および溶媒（０．１％のＤＭＳＯ）または増加濃度のＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（全てＤＭＳＯ中、最終濃度０．１％）と６００／ｓの剪断速度における血流開始前に１５分間プレインキュベートした。線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（０．５、１および２μＭ）の効果を示す。値は平均＋ＳＤ（ｎ＝３）である。有意性は、血流開始の５分後に示される。
【図１３】ＤＭＳＯは、動脈流下でプラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着を損傷しない。血液をＮａＣｌまたはＤＭＳＯ（０．１％）と３７℃において流動（剪断６００／ｓ）開始前に１５分間プレインキュベートした。値は平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。
【図１４】Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）負荷用量（３×１４０ｍｇ）の経口摂取は、３時間後にプラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を阻害するが、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびアラキドン酸（ＡＡ）により刺激される静的血小板凝集を阻害しない。血液を２人の血液ドナーＡおよびＢからＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの摂取前（対照）および摂取３時間後に採取し、プラークホモジネートＡおよびＢの２つの異なるプール（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．２μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、またはＡＡ（０．６ｍＭ）により刺激した。血液中での凝集をＭＥＡにより計測した。値はトリプリケートの平均＋ＳＤである。
【図１５】１週間の低用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の経口摂取は、プラークおよびコラーゲンにより刺激される静的血小板凝集を抑制するが、ＡＤＰおよびアラキドン酸（ＡＡ）により刺激される静的血小板凝集を抑制しない。血液をＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）（ドナーＡ、１４０ｍｇ／日；ドナーＢ、２日に１回の１４０ｍｇ）の摂取前（対照）および摂取１週間後に採取し、プラークホモジネートＡおよびＢの２つの異なるプール（８３３μｇ／ｍｌ）、コラーゲン（０．２μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＰ（５μＭ）、ＡＤＰ（５μＭ）、またはＡＡ（０．６ｍＭ）により刺激した。値はトリプリケートの平均＋ＳＤである。
【図１６】Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の負荷および低維持用量によるプラーク誘導血小板凝集の急速および持続的抑制。血液をＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの摂取前（対照）、摂取３時間後、およびＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（１４０ｍｇ／日）の摂取後の異なる日数において採取した。試料をプラークホモジネート（８３３μｇ／ｍｌ）、ＡＤＰ（５μＭ）により刺激し、または刺激しなかった。値はデュプリケートの平均である。
【図１７Ａ】１週間のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の負荷および低維持用量により動脈流下でプラーク誘導血小板血栓形成は急速および持続的に抑制されるが、コラーゲン誘導血小板血栓形成は急速および持続的に抑制されない。血液をドナーＡから、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの摂取前（対照）、摂取３時間後、およびＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（１４０ｍｇ／日）の摂取１週間後に採取した（Ａ）。血液を、ドナーＢからＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの摂取前（対照）、摂取３時間後、およびＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（隔日１４０ｍｇの摂取１週間後に採取した（Ｂ）。試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と６００／ｓの剪断速度における血流開始前に１０分間プレインキュベートした。線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）摂取の効果を示す。値はトリプリケートの平均＋ＳＤである。
【図１７Ｂ】１週間のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の負荷および低維持用量により動脈流下でプラーク誘導血小板血栓形成は急速および持続的に抑制されるが、コラーゲン誘導血小板血栓形成は急速および持続的に抑制されない。血液をドナーＡから、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの摂取前（対照）、摂取３時間後、およびＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（１４０ｍｇ／日）の摂取１週間後に採取した（Ａ）。血液を、ドナーＢからＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの摂取前（対照）、摂取３時間後、およびＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（隔日１４０ｍｇの摂取１週間後に採取した（Ｂ）。試料を血小板標識のためのＤｉＯＣ６と６００／ｓの剪断速度における血流開始前に１０分間プレインキュベートした。線図は、プラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着のキネティクスに対するＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）摂取の効果を示す。値はトリプリケートの平均＋ＳＤである。
【図１８】インビトロでの出血時間に対する１週間のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の負荷および低維持用量の効果（ＰＦＡ−２００）。ドナーＡおよびドナーＢからの血液試料を、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（イブルチニブ）３×１４０ｍｇの前（対照）、３時間後、およびＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）（１４０ｍｇ／日：ドナーＡ；隔日１４０ｍｇ：ドナーＢ）の１週間後に採取し、（Ａ）コラーゲン／エピネフリンまたは（Ｂ）コラーゲン／ＡＤＰカートリッジに移した。インビトロ閉止時間を血小板機能分析装置ＰＦＡ１００（登録商標）により計測した。２本の水平線は、正常範囲（コラーゲン／ＥＰＩ８４〜１７０秒；コラーゲン／ＡＤＰ６８〜１２０秒）を示す。値は単一計測値である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
用語「ブルトン型チロシンキナーゼ」は、本明細書においてＢｔｋとも略記され、ヒトにおいてＢＴＫ遺伝子によりコードされるチロシンキナーゼを指す。ヒトＢｔｋタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００００５２．１（最終更新２０１６年１月５日）を有し、コードｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００００６１．２（同様に最終更新２０１６年１月５日）を有する。Ｂｔｋは、受容体を細胞内遊離カルシウムレベルの上昇に結び付けることによりプレＢ細胞およびＢリンパ球の発生における重要な役割を担う。Ｂｔｋ阻害剤、例えば、イブルチニブは、Ｂ細胞機能および増殖を阻害する。
【００１３】
イブルチニブおよびＢｔｋ活性を阻害する他の化合物は、血小板を阻害することも公知である。Ｂｔｋは、コラーゲン／ＧＰＶＩおよびＶＷＦ／ＧＰＩｂトリガー血小板シグナル伝達経路における重要な役割を担う（Ｑｕｅｋ  ＬＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＢ．１９９８；８：１１３７−１１４０；Ｏｄａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：１６６３−１６７０；Ｌｉｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００６）。ＶＷＦによる血小板ＧＰＩｂ関与およびコラーゲンによるＧＰＶＩ刺激時、チロシンキナーゼＬｙｎおよびＳｙｋが最初に活性化され、それによりアダプタータンパク質ならびにＢｔｋおよびＰＬＣγ２を含む酵素のシグナリング複合体の集合が開始する（Ｌｉｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８：２５９６−２６０；Ｗａｔｓｏｎ  ＳＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５；３：１７５２−１７６）。ＢｔｋはＳｙｋおよびＬｙｎによりリン酸化され、さらに自己リン酸化され、エフェクタータンパク質ＰＬＣγ２のチロシンリン酸化および活性化に関与し（Ｑｕｅｋ  ＬＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９８；８：１１３７−１１４０；Ｗａｔｓｏｎ  ＳＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５；３：１７５２−１７６；Ｌｉｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８：２５９６−２６０）、それは血小板活性化についての２つの主な下流シグナリング経路である細胞質のＣａ2+増加およびプロテインキナーゼＣ活性化をもたらす（Ｓｉｅｓｓ  Ｗ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９８９；６９：５８−１７８）。さらに、トロンビン誘導血小板凝集の間の血小板インテグリンαＩＩｂβ３のアウトサイドインシグナリングがＢｔｋを刺激することが報告されている（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９）４４３：６６−７０）。血小板インテグリンαＩＩｂβ３は主なフィブリノゲン受容体であり、血小板凝集に不可欠である。
【００１４】
したがって、イブルチニブは、静的アッセイにおいて、およびインビトロでの動脈流下で、およびイブルチニブにより処理された患者においてエクスビボで、コラーゲンおよびフォンＶＷＦ依存的血小板機能を阻害することが見出されている（Ｌｅｖａｄｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４：３９９１−３９９５；Ｋａｍｅｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９：７８３−７８７；Ｋａｚｉａｎｋａ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１６），１−６）。インビトロでのイブルチニブ添加後またはイブルチニブ処理患者においてエクスビボで研究された血小板機能の一部は、ＰＲＰにおけるコラーゲンまたはＣＲＰ（ＧＰＶＩアゴニスト）刺激血小板凝集、血液中でのリストセチン誘導血小板凝集（リストセチンは、ＧＰＩｂへのＶＷＦの結合を媒介する）、ならびに流動血液中でのコラーゲンおよびｖＷＦ誘導血小板血栓形成の阻害であった（Ｌｅｖａｄｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４：３９９１−３９９５；Ｋａｍｅｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９：７８３−７８７；Ｋａｚｉａｎｋａ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１６），１−６；Ｂｙｅ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．（２０１５），３５（１１）：２３２６−３５）。イブルチニブは、血小板インテグリンαＩＩｂβ３のアウトサイドインシグナリング、ならびに後続の固定化フィブリノゲン上への血小板粘着および拡散をインビトロで阻害することも示されている（Ｂｙｅ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ（２０１５），３５（１１）：２３２６−３５）。コラーゲンおよびＶＷＦ／ＧＰＩｂ媒介血小板応答に対するイブルチニブの阻害効果は、標準的な化学療法と比較してイブルチニブを服用する患者の出血リスクの増加を伴った（Ｌｅｖａｄｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４：３９９１−３９９５；Ｋａｍｅｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９：７８３−７８７；Ｋａｚｉａｎｋａ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１６），１−６；Ｓｈａｔｚｅｌ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓ（２０１７），１５：１−１３）。興味深いことに、新たなより選択的なＢＴＫ阻害剤（第二世代ＢＴＫ阻害剤、例えば、ＡＣＰ−１９６、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、およびＢＧＢ−３１１１）による患者の治療は、見かけ上、イブルチニブによる患者の治療よりも出血リスクを少なく増加させる（Ｗｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ（２０１６）９：８０）。非ヒト霊長類に１０日間経口投与された新たなＢｔｋ阻害剤ＢＴＫＩ−４３６０７およびＢＴＫＩ−４３７６１も、鋳型皮膚出血時間の増加も凝固に対する効果も示さなかった（Ｒｉｇｇ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６；３１０：Ｃ３７３−３８０）。
【００１５】
本発明による用語「阻害剤」は、特定の標的タンパク質の生物学的機能または活性を低減させ、または停止させる阻害剤を指す。阻害剤は、阻害すべきタンパク質の生物学的機能または活性を低減させ、または停止させるために以下の効果のいずれか１つ以上を遂行し得る：（ｉ）阻害すべきタンパク質をコードする遺伝子の転写を低下させる、すなわち、ｍＲＮＡのレベルを低下させる、（ｉｉ）阻害すべきタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を低下させる、および（ｉｉｉ）タンパク質は、阻害剤の存在下でその生化学的および／または細胞機能を低下した効率で遂行する。クラス（ｉ）に入る化合物としては、転写機構ならびに／または前記遺伝子のプロモーターとの、および／もしくはプロモーターから遠位の発現制御エレメント、例えば、エンハンサーとのその相互作用を干渉する化合物が挙げられる。クラス（ｉｉ）の化合物は、アンチセンス構築物および当分野において周知のＲＮＡ干渉を遂行するための構築物（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む（例えば、Ｚａｍｏｒｅ（２００１）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．８（９），７４６；Ｔｕｓｃｈｌ（２００１）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２（４），２３９参照）。クラス（ｉｉｉ）の化合物は、阻害すべきタンパク質の分子機能、例えば、受容体シグナリング活性および下流標的分子の活性化を干渉する。したがって、活性部位結合化合物が想定される。クラス（ｉｉｉ）としては、標的に必ずしも直接結合しないが、例えば、標的に対する公知の活性化因子の親和性もしくは結合の速度を変更することにより、標的への公知の活性化因子の結合と競合することにより、または標的に結合した公知の活性化因子を置き換えることにより、依然としてその機能または活性を干渉する化合物も挙げられる。好ましくは、阻害剤は、Ｂｔｋに直接結合し、それによりその生物学的機能または活性を直接阻害する。
【００１６】
本発明によれば、阻害剤は「Ｂｔｋの阻害剤」であり、すなわち、阻害剤はＢｔｋの生物学的機能または活性を低減させる。阻害剤はＢｔｋに特異的に結合すること、すなわち、それはＢｔｋの生物学的機能または活性のみを阻害するが、他のタンパク質の生物学的機能も活性も阻害しないことが特に好ましい。
【００１７】
生物学的機能または活性は、特に、任意の公知のＢｔｋの生物学的機能または活性、例として、本発明により解明されるものを示す。前記生物学的機能または活性の例は、血小板中のＰＬＣγ２のリン酸化および活性化であり、それにより細胞質カルシウムレベルを増加させ、エフェクター分子プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化させ、次いでそれが血小板の活性化をもたらす。これら全ての機能または活性は、当分野において公知の種々の標準的方法のいずれか、例えば、ＢｔｋもしくはＰＬＣγ２のチロシンリン酸化もしくは細胞質Ｃａ２＋濃度の増加を使用して、または以下に提供される実施例の教示に基づき、場合により、分子技術、例えば、リン酸化アッセイと、もしくは本明細書において引用される文献の教示と併せて試験することができる。
【００１８】
好ましい実施形態において、阻害剤は、上記の引用されるＢｔｋの生物学的機能または活性の少なくとも１つ、好ましくは、全てを少なくとも５０％だけ、好ましくは、少なくとも７５％だけ、より好ましくは、少なくとも９０％だけ、いっそうより好ましくは、少なくとも９５％だけ、例えば、少なくとも９８％またはさらには１００％だけ低減させる。用語「少なくとも〜だけの低減」は、Ｂｔｋがその生物学的機能または活性の１つ以上、好ましくは、全ての引用される量を損失するような生物学的機能または活性の減少を指す。例えば、少なくとも７５％だけの低減は、Ｂｔｋがその生物学的機能または活性の７５％を損失し、結果的に、阻害されないＢｔｋと比較して残りの生物学的機能または活性の２５％のみを有することを意味する。
【００１９】
本発明において称される阻害剤のいずれかの機能は、ハイスループットスクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）を使用することにより同定し、および／または確認することができる。ハイスループットアッセイは、生化学的、細胞または他のアッセイとは独立して、一般に、マイクロタイタープレートのウェル中で実施することができ、それぞれのプレートは、例えば、９６、３８４または１５３６個のウェルを含有し得る。プレートの取扱、例として、周囲温度以外の温度におけるインキュベーション、および試験化合物とアッセイ混合物との接触は、好ましくは、１つ以上のコンピュータ制御ロボットシステム、例として、ピペッティング装置により行われる。試験化合物の大型ライブラリーをスクリーニングすべき場合、および／またはスクリーニングを短時間で行うべき場合、例えば、１０、２０、３０、４０、５０または１００個の試験化合物の混合物をそれぞれのウェルに添加することができる。ウェルが生物学的活性を示す場合、試験化合物の前記混合物をデコンボリュートして観察される生物学的活性を生じさせる前記混合物中の１つ以上の試験化合物を同定することができる。
【００２０】
潜在的阻害剤の結合の測定は、例えば、任意の結合アッセイ、好ましくは、生物物理学的結合アッセイにおいて行うことができ、それを使用して阻害剤を用いる機能／活性アッセイ実施前に試験分子の結合を測定することができる。好適な生物物理学的結合アッセイは当分野において公知であり、蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含む。
【００２１】
阻害剤が標的タンパク質の発現レベルを減少させることにより作用する場合、タンパク質の発現レベルの測定は、例えば、核酸レベルで、またはアミノ酸レベルで実施することができる。核酸レベルでタンパク質の発現を測定する方法としては、限定されるものではないが、ノザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。アミノ酸レベルでタンパク質の発現を測定する方法としては、限定されるものではないが、タンパク質染色技術、例えば、クマシーブリリアントブルーまたは銀染色と併せるウエスタンブロッティングまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が挙げられる。核酸レベルおよびアミノ酸レベルの両方でＢｔｋの発現レベルを測定するそれらの方法は、当分野において周知である。
【００２２】
多数のＢｔｋ阻害剤が現在公知であり、治療法のため、または臨床試験において承認されており、Ｂｔｋ選択的不可逆的小分子阻害剤が発見されている（Ｐａｎ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００７；２：５８−６１）。例えば、小分子阻害剤イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）は、マントル細胞リンパ腫の治療、慢性リンパ球性白血病の治療および非ホジキンリンパ腫の一形態であるワルデンストレームマクログロブリン血症の治療のためにＦＤＡにより承認された選択的Ｂｔｋ阻害剤である（Ｂｙｒｄ  ＪＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１３；３６９：３２−４２；Ｗａｎｇ  ＭＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１３；３６９：５０７−５１６）。現在臨床試験中のＢｔｋ阻害剤のさらなる例としては、再発性ＣＬＬのためのアカラブルチニブ（第３相）、非ホジキンリンパ腫および／またはＣＬＬのためのＧＳ−４０５９またはＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（旧名ＯＮＯ−４０５９；第１相）、ならびにスペブルチニブ（ＡＶＬ−２９２、ＣＣ−２９２；第１相）およびＢＧＢ−３１１１（第１相）が挙げられる（Ｗｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ（２０１６）９：８０）。さらなる可逆的および不可逆的Ｂｔｋ阻害剤、例えば、ＣＮＸ−７７４、イミダゾキノキサリン、ＣＧＩ１７４６、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ４８６などが当分野において記載されており、Ｗｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０１４；１９：１２００−１２０４に関節リウマチの治療のために開発中のＢｔｋ阻害剤としてまとめられている；他の不可逆的ＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫＩ−４３６０７およびＢＴＫＩ−４３７６１である（Ｒｉｇｇ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６；３１０：Ｃ３７３−３８０）。
【００２３】
本発明によれば、阻害剤が血小板特異的阻害剤であることが特に好ましい。本発明による阻害剤は、ある実施形態において、以下により詳細に記載されるとおり、小分子、タンパク質性化合物として、または核酸分子、例えば、干渉もしくは阻害核酸分子などとして提供することができる。阻害剤は、例えば、調節エレメント、例えば、巨核球特異的プロモーターを含む発現ベクター中に取り込ませることができる核酸分子によりコードさせることもできる。例えば、巨核球、続いて血小板中でのＢｔｋのサイレンシングは、糖タンパク質Ｉｂαプロモーターおよび干渉もしくは阻害核酸分子または例えば、タンパク質性阻害剤をコードする核酸分子を保有するサルまたはヒト免疫不全ウイルス１型ベース自己不活性化レンチウイルスベクターを使用することにより達成することができる。細胞の標的化形質移入の方法および好適なベクターは当分野において公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ｏｈｍｏｒｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００７  Ｏｃｔ；２７（１０）：２２６６−７２；Ｌａｖｅｎｕ−Ｂｏｍｂｌｅｄ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７  Ｊｕｎ；２５（６）：１５７１−７；Ｏｈｍｏｒｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００６  Ｊｕｌ；２０（９）：１５２２−４；Ｙａｓｕｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２００５  Ｆｅｂ；７（２）：２４０−７）参照。阻害剤をコードし、またはＢｔｋ転写に直接影響を与える核酸分子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）の発現ベクター中への取り込みにより、巨核球および血小板中でのＢｔｋ発現の選択的抑制が可能となる。
【００２４】
これらの阻害剤は、利用可能で好適な任意の方法により、例として、例えば、経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏剤、滴剤または経皮パッチによる）、バッカルで、または経口もしくは鼻腔スプレーとして対象に投与することができる。経口投与は、特に阻害剤がイブルチニブである場合に特に好ましい。
【００２５】
投与量レジメンは、臨床学的因子に基づき担当医が決定することができる。医学分野において周知のとおり、任意の１人の患者についての投与量は、多くの因子、例として、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身健康、ならびに同時投与されている他の薬物に依存する。所与の状況についての有効量は定型的実験により容易に決定され、通常の臨床医または医師の技能および判断の範囲内である。例えば、阻害剤が唯一の化合物である場合、１用量当たりの投与される有効量は、１人当たり約７０〜１４０ｍｇの範囲であり得るが、上記のとおり、これは治療上の裁量に委ねられる。２つ以上の化合物を投与すべき場合における特定の量、および対応する調整は、当業者に周知の慣用の試験により決定することができる。投与は、単回用量としてとして１回、または反復投与であり得る。要求される反復の間隔時間および量は、当業者がさらなる労力なしで決定することができ、好ましくは、１４０ｍｇの用量が２日に１回投与される。進行は、定期評価によりモニタリングすることができる。本発明の阻害剤は、局所または全身投与することができる。非経口投与用の製剤としては、無菌水性または非水性液剤、懸濁液剤、およびエマルション剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液、例として、生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。
【００２６】
用語「動脈血栓症」は、静脈中で発症する静脈血栓症とは対照的に動脈中で発症する血栓症に関する。動脈血栓症は、一般に、健常動脈の損傷により引き起こされ、血小板およびフィブリンリッチ血栓の形成は壁欠陥の封止および失血の阻止に不可欠である。対照的に、動脈血栓症の特殊形態のアテローム血栓症は、アテローム動脈硬化性プラークの破裂により、または頻度は低いが、アテローム動脈硬化性プラークを覆う内皮のびらんにより引き起こされる。血栓形成は、血小板凝集およびフィブリン形成の雪崩現象を発動させるアテローム動脈硬化性プラーク由来血栓生成物質によりトリガーされる。
【００２７】
アテローム動脈硬化症は動脈壁の慢性疾患であり、アテローム動脈硬化性プラークは動脈壁の内膜中の継続的な脂質沈着、炎症および線維形成プロセスの結果として生涯の間に発生する。健常動脈において内膜は細胞外マトリックスの薄い内層のみからなる一方、アテローム動脈硬化性プラークの内膜は大幅に肥厚している。プラークは、脂質（大部分は、酸化型）、マクロファージ、平滑筋細胞、それらの壊死細胞残屑、カルシウムおよび細胞外マトリックスからなる。ウィルヒョウは、この材料について用語「粉瘤」を造語した。種々のタイプのコラーゲンがアテローム動脈硬化性プラーク中で蓄積し、それらは健常結合組織のコラーゲンと構造的に異なる（ｖａｎ  Ｚａｎｔｅｎ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９９４），９３（２）：６１５−３２；Ｋａｔｓｕｄａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔ．Ｋａｊｉ，Ｊ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ（２００３）．１０（５）：２６７−７４；Ｐｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５；１９（７）：８９８−９０９）。これらは、それらの血小板反応性を変更し得る終末糖化産物も含有する（Ｍｏｎｎｉｅｒ  ＶＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（１９８６），３１４：４０３−８；Ｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ（２０１０），４９３：１９２−２０６）。健常動脈の内膜と比較して根本的に異なるアテローム動脈硬化性プラークの特性は、その異なる血栓形成を説明する：アテローム動脈硬化性プラークは、健常動脈よりも血栓形成を示す。正常動脈と比較して、ヒトアテローム動脈硬化性冠動脈上への血小板沈着は増加し（ｖａｎ  Ｚａｎｔｅｎ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４），９３（２）：６１５−３２）、マウスにおいて、損傷したアテローム動脈硬化性頸動脈に対する血栓応答は、損傷した健常頸動脈よりもかなり高い（Ｈｅｃｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  Ｃ．  Ｇａｃｈｅｔ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ（２０１１）１０５  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３−１２）。
【００２８】
用語「アテローム血栓症」は、粉瘤の破裂の結果として、またはアテローム動脈硬化性プラークを覆う内皮のびらん後に発症する動脈血栓形成を指す。アテローム血栓症において、冠動脈、頭蓋外または頭蓋内動脈（それぞれ頸動脈または脳動脈）および末梢（例えば、大腿）動脈中での脆弱なアテローム動脈硬化性プラークのびらんまたは破裂は、循環血小板を停止させ、血栓形成をトリガーする材料を露出させる。血栓は動脈を閉塞し得、または血栓は下流で血管（動脈、細動脈）を剥離させ、塞栓し、閉塞し得る。動脈循環の閉塞は組織への血液供給を遮断し、血栓または血栓塞栓の局在化に依存的な体内のほとんどの任意の臓器の虚血および梗塞、最も一般には急性冠症候群、心筋梗塞および虚血性脳卒中も引き起こし得るが、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）も引き起こし得る。
【００２９】
アテローム血栓症は、抗血小板療法により予防されない場合、経皮冠動脈インターベンション後にも生じ、新内膜形成、再狭窄およびステント血栓症を促進し得る。
【００３０】
本発明によれば、Ｂｔｋの阻害剤、より具体的には、経口適用される不可逆的Ｂｔｋ阻害剤のイブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）が静的条件下で血液中でのプラークおよびコラーゲントリガー血小板凝集を阻害することが、インビトロおよびエクスビボの両方で見出された。対照的に、ＰＡＲ−１受容体を活性化させるＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびアラキドン酸（ＡＡ）により刺激される血小板凝集は、インビトロでイブルチニブによりやや低減したにすぎなかった。重要なことに、イブルチニブは、２つのアテローム血栓症モデルにおいて、すなわち、動脈流動血液に露出されるプラークホモジネートにおいて、およびプラーク組織切片において動脈流におけるアテローム動脈硬化性プラーク誘導血小板血栓形成を阻害した。
【００３１】
最も重要なことに、イブルチニブの効果は、インビトロで血液に添加されるか、イブルチニブ療法中の患者からの血液試料中で試験されるかにかかわらず、動脈流動条件下で血小板凝集のプラークおよびコラーゲン刺激間で顕著に異なった。イブルチニブは、インタクト冠動脈中の流動に典型的な剪断速度においてプラーク材料上（６００／ｓ；図２および５参照）で、または動脈硬化性冠動脈の軽度の狭窄セグメント上（１５００／ｓ；図３）で血液を灌流させた場合に完全およびプラーク選択的血小板阻害を引き起こした。
【００３２】
動脈流条件下でのプラークおよびコラーゲン刺激血小板凝集に対する効果間のこの差異は、血小板コラーゲン受容体インテグリンα２β１が健常血管における状況と類似する隔離コラーゲン線維上での動脈流の間のコラーゲンへの血小板粘着における重要な役割を担うという観察により説明することができ、インテグリンα２β１は、コラーゲンへの血小板凝集においてＧＰＶＩと相乗作用する。対照的に、動脈流下でのプラーク上への血小板凝集は、もっぱら血小板ＧＰＶＩに依存するが、インテグリンα２β１には依存しない（Ｐｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５；１９（７）：８９８−９０９；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００８；１０３：３５６−３６７）。これと一致して、イブルチニブは、可溶性Ｉ型コラーゲン上へのインテグリンα2β1媒介血小板粘着を阻害しなかった（図７）。したがって、Ｂｔｋは、インテグリンα２β１の下流ではシグナリングせず、したがって、イブルチニブによるＢｔｋの阻害は、ＧＰＶＩ活性化に依存的な流動下で血小板凝集を選択的に遮断するが、ＧＰＶＩおよびインテグリンα２β１の活性化の組合せに依存的な流動下ではコラーゲン上への血小板凝集を遮断しない。
【００３３】
ＧＰＶＩに加え、Ｂｔｋは、ＶＷＦ／ＧＰＩｂシグナリングにおける役割を担うことも報告されている。動脈壁損傷またはプラーク破裂もしくはびらん後に露出されるコラーゲンは、循環ＶＷＦを最初に固定化し得、次いでそれが血小板受容体ＧＰＩｂαに結合する。ＶＷＦによるこの架橋は、循環血小板を減速させ、それにより＞１０００／ｓの剪断速度における動脈血栓の成長を可能とするために決定的に重要である。添付の実施例（例えば、実施例３参照）に示される流動実験において、１５００／ｓの剪断速度において、イブルチニブは、コラーゲン誘導血小板沈着に対してわずかな非有意な効果のみを有したが、それは、プラーク誘導血小板沈着を効率的に阻害した（図３）。さらに、高剪断速度の動脈流におけるプラークおよびコラーゲン誘導血小板凝集の両方は、ＧＰＩｂへのＶＷＦの結合を要求した。ＧＰＩｂαとＶＷＦとの相互作用を阻害する抗体６Ｂ４（Ｐｅｎｚ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７；９７：４３５−４４３）は、この高剪断速度におけるプラークホモジネートおよびコラーゲン誘導血小板血栓形成の両方を等しく阻害した（＞９５％）（図８）。これらの結果は、ＧＰＩｂのＶＷＦ活性化が高剪断動脈流におけるプラークおよびコラーゲン誘導血小板沈着の両方に要求されることを示すが、ＧＰＩｂ下流のＢｔｋシグナリングが機能的に関連しないことも意味する。
【００３４】
添付の実施例におけるさらなる結果は、イブルチニブよりも選択的なＢｔｋの２つの新たな第二世代経口不可逆的阻害剤が、イブルチニブと類似する効果を有したことを示す。
【００３５】
アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、インビトロで静的条件下において血液中でプラークおよびコラーゲントリガー血小板凝集を阻害した。対照的に、ＰＡＲ−１受容体を活性化させるＴＲＡＰ、ＡＤＰまたはＡＡにより刺激される血小板凝集は、それらの阻害剤により低減せず、またはわずかに低減したにすぎなかった（図９、１０）。プラーク誘導血小板凝集の阻害についてのアカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）のＩＣ５０値はほぼ０．４μＭであり、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９のＩＣ５０はほぼ１μＭであった（図９Ａ、１０Ａ）。重要なことに、イブルチニブと同様、２μＭにおけるアカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）および２μＭにおけるＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、動脈剪断速度においてプラーク材料上で血液を灌流させた場合に有効なプラーク選択的血小板阻害を引き起こした（図１１、１２）。Ｂｔｋ阻害剤を溶解させるために使用されるＤＭＳＯ（血中最終濃度０．１％）は、血小板応答に影響を与えなかった（図１３）。
【００３６】
２人のヒトボランティアにおける予備試験は、低用量のイブルチニブ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標））の経口摂取が、静的および流動条件下でプラーク誘導血小板凝集を阻害するために十分であることを示した。プラークおよびコラーゲン誘導血小板凝集は、３×１４０ｍｇのＩｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の負荷用量の経口摂取の３時間後に完全に阻害された（図１４）。プラーク誘導凝集の阻害は、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）１４０ｍｇ毎日または１４０ｍｇ隔日の１週間のいずれかの経口摂取により維持された（図１５、１６）。これらの低いイブルチニブ用量も、動脈流下でアテローム動脈硬化性プラーク上への血小板粘着および凝集を阻害するために十分であったが、コラーゲン上への血小板粘着および凝集を阻害するためには十分でなかった（図１７Ａ、Ｂ）。
【００３７】
イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、確立された二重抗血栓療法であるアスピリンとＰ２Ｙ１２受容体アンタゴニストについて事前に観察されたもの（Ｐｅｎｚ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７；９７：４３５−４４３；Ｊａｍａｓｂｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；６５：２４０４−２４１５）よりもかなり強力にプラークトリガー血小板血栓形成を抑制した。
【００３８】
添付の実施例に示される結果は、Ｂｔｋの標的化がアテローム血栓症を予防し得ることを示し；特に、それは閉塞急性アテローム血栓症をより効率的に、およびより選択的に予防し得る。それというのも、添付の実施例にも示されるとおり、それは止血における生理学的血小板活性化を大部分インタクトのまま残すためである。
【００３９】
止血におけるインタクトな生理学的血小板活性化のこの後者の知見は、特に驚くべきことである。Ｂｔｋ欠損患者、例えば、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）患者などは自然出血も大量出血も示さないことが事前に見出されたが（Ｓｔｅｗａｒｔ  ＤＭ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ａｓｔｈｍａ  ｒｅｐｏｒｔｓ．２００１；１：５５８−５６５；Ｆｕｔａｔａｎｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００１；１１４：１４１−１４９）、Ｂｔｋ阻害剤、例えば、イブルチニブの使用はｖＷＦおよびコラーゲン刺激血小板活性化の撹乱を伴うことが示された（Ｌｅｖａｄｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４：３９９１−３９９５；Ｋａｍｅｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９：７８３−７８７）。低悪性度の出血傾向、例として、自然変色、鼻血または点状出血がイブルチニブ治療患者において観察されることが多い（Ｗａｎｇ  ＭＬ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２６：７３９−７４５．２０１５；Ｓｈａｔｚｅｌ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓ（２０１７）１５：１−１３）。興味深いことに、新たなより選択的なＢＴＫ阻害剤（例えば、ＡＣＰ−１９６、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、およびＢＧＢ−３１１１）による患者の治療は、見かけ上、イブルチニブよりも少ない出血を引き起こす（Ｂｙｒｄ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１６）３７４；４：３２３−３３２；Ｗｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ（２０１６）９：８０；Ｗａｌｔｅｒ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ（２０１７）１２９（２０）：２８０８−２８１０）。新たなＢｔｋ阻害剤ＢＴＫＩ−４３６０７およびＢＴＫＩ−４３７６１も、鋳型皮膚出血時間の増加も、非ヒト霊長類における凝固に対する効果も示さなかった（Ｒｉｇｇ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６；３１０：Ｃ３７３−３８０）。
【００４０】
まとめると、本明細書に提示されるデータは、Ｂｔｋ阻害剤の使用が、アスピリンおよびＰ２Ｙ１２アンタゴニストを用いる標準的な二重血小板療法よりも効率的で安全であることが有望であるままであり、抗体ベース介入の欠点、例えば、抗ＧＰＶＩ抗体を使用した場合に潜在的に直面するものも回避することを示す。
【００４１】
本発明はさらに、医薬有効量のブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）の阻害剤をアテローム血栓症の治療および／または予防を必要とする対象に投与することを含む、アテローム血栓症を治療および／または予防する方法に関する。
【００４２】
本発明の阻害剤に関して本明細書に提供される全ての定義および好ましい実施形態は、特に具体的に詳述されない限り、変更すべきところは変更して本発明のこの方法に適用される。
【００４３】
本発明の阻害剤または方法の好ましい実施形態において、阻害剤は、小分子、抗体または抗体模倣体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ，リボザイム、またはアンチセンス核酸分子である。
【００４４】
本明細書において使用される「小分子」は、好ましくは、有機分子である。有機分子は、炭素原子が炭素−炭素結合により一緒に結合している炭素基礎を有する化合物のクラスに関し、または属する。有機という用語の元の定義は、化合物の資源に関し、有機化合物は、植物または動物または微生物資源から得られる炭素含有化合物である一方、無機化合物は、鉱物資源から得られた。有機化合物は天然物でも合成物でもよい。有機分子は、好ましくは、芳香族分子であり、より好ましくは、複素環式芳香族分子である。有機化学において、芳香族性という用語は、同一の原子セットを有する他の幾何または結合配置よりも大きな安定性を示す共鳴結合の環を有する環式（環形状）、平面（フラット）分子を説明するために使用される。芳香族分子は、芳香族分子は極めて安定的であり、容易に分解せずに他の物質と反応しない。複素環式芳香族分子において、芳香族環中の原子の少なくとも１つは、炭素以外の原子、例えば、Ｎ、Ｓ、またはＯである。
【００４５】
複素環式芳香族分子は、好ましくは、アゾールモチーフ（すなわち、アゾール、ジ−アゾール、トリ−アゾールまたはテトラ−アゾールモチーフ）および／またはアジンモチーフ（すなわち、アジン、ジ−アジン、またはトリ−アジンモチーフ）を含む分子である。複素環式芳香族分子は、より好ましくは、ピリジン（アジン）、ピリミジン（ジアジン）、トリアジン、アジン、ピラゾールまたはイミダゾールモチーフを含む分子である。複素環式芳香族分子は、いっそうより好ましくは、ピリミジン（ジアジン）、ピラゾールまたはイミダゾールモチーフを含む分子である。全ての上記の有機分子について、分子量は、好ましくは、１５０Ｄａ〜１５００Ｄａの範囲、より好ましくは、３００Ｄａ〜１０００Ｄａの範囲である。
【００４６】
あるいは、本発明による「小分子」は、無機化合物であり得る。無機化合物は鉱物資源に由来し、それとしては、炭素原子を有さない全ての化合物（二酸化炭素、一酸化炭素および炭酸塩は除く）が挙げられる。好ましくは、小分子は、約２０００ａｍｕ未満、または約１０００ａｍｕ未満、例えば、約５００ａｍｕ未満、いっそうより好ましくは、約２５０ａｍｕ未満の分子量を有する。小分子のサイズは、当分野において周知の方法、例えば、質量分析により測定することができる。小分子は、例えば、標的分子の結晶構造に基づき設計することができ、生物学的活性を担うと想定される部位は、インビボアッセイ、例えば、インビボハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイにおいて同定し、確認することができる。Ｂｔｋの小分子阻害剤の非限定的な例は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５としても公知）、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９であり、それらを以下で本明細書において提供される実施例に用いた。他の例、例えば、ＢＴＫＩ−４３６０７およびＢＴＫＩ−４３７６１は、血小板中でＢｔｋを不可逆的に阻害することも記載されている（Ｒｉｇｇ  ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６；３１０：Ｃ３７３−３８０）。さらなるＢｔｋの小分子阻害剤、例えば、スペブルチニブ（ＡＶＬ−２９２、ＣＣ−２９２）、ＢＧＢ−３１１１、ＣＮＸ−７７４、イミダゾキノキサリン、ＣＧＩ１７４６、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ４８６、およびＨＭ−７１２２４が当分野において記載されており、とりわけ、Ｗａｎｋ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０１４；１９：１２００−１２０４において、およびＷｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ（２０１６）９：８０）によりまとめられている。以下の表１は、Ｂｔｋの小分子阻害剤イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、ＣＣ−２９２、ＢＭＳ−９８６１４２、ＣＮＸ−７７４、イミダゾキノキサリン、ＣＧＩ１７４６、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ４８６、およびＭ−７１２２４の構造式を示す。他のＢｔｋ阻害剤はＢＴＫＩ−４３６０７およびＢＴＫＩ−４３７６１であり、それらの構造は開示されていない（Ｒｉｇｇ  ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６；３１０：Ｃ３７３−３８０）。
【００４７】
【表１】
2019524695.tif 000002
2019524695.tif 000003
2019524695.tif 000004
2019524695.tif 000005
【００４８】
本発明により使用される用語「抗体」は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む。さらに、標的、例えば、Ｂｔｋへの結合特異性を依然として保持するそれらの誘導体または断片も、用語「抗体」に含まれる。抗体断片または誘導体は、とりわけ、ＦａｂまたはＦａｂ’断片、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片、単一ドメインＶHまたはＶ様ドメイン、例えば、ＶｈＨまたはＶ−ＮＡＲ−ドメイン、ならびに多量体フォーマット、例えば、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディもしくはトリプルボディ、テトラボディ、または化学コンジュゲートＦａｂ’多量体を含む（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  ＥＰ，Ｓｅｒｅｂｒｙａｎａｙａ  ＤＶ，Ｋａｔｒｕｋｈａ  ＡＧ．２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）．，ｖｏｌ．７５（１３），１５８４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ，Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ．２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２３（９），１１２６参照）。
【００４９】
用語「抗体」は、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、単鎖およびヒト化（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）抗体のような実施形態も含む。
【００５０】
抗体産生のための種々の技術は当分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）および（１９９９）ならびにＡｌｔｓｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０（上記引用文中）に記載されている。したがって、ポリクローナル抗体は、添加剤およびアジュバントとの混合物中の抗原による免疫後の動物の血液から得ることができ、モノクローナル抗体は、継続的な細胞系培養物により産生される抗体を提供する任意の技術により産生することができる。このような技術の例は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されており、それとしては、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５により最初に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．４，７；Ｌｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．２００６，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０３（１０），３５５７参照）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，７７−９６）が挙げられる。さらに、組換え抗体は、モノクローナル抗体から得ることができ、または種々のディスプレイ法、例えば、ファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、もしくは細胞ディスプレイを使用してデノボ調製することができる。組換え（ヒト化）抗体の発現に好適な系は、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞系またはトランスジェニック動物もしくは植物から選択することができる（例えば、米国特許第６，０８０，５６０号明細書；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ，Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ．２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２３（９），１１２６５参照）。さらに、単鎖抗体の産生について記載された技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号明細書参照）を適合させてＢｔｋのエピトープに特異的な単鎖抗体を産生することができる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられる表面プラズモン共鳴を使用してファージ抗体の効率を増加させることができる。
【００５１】
本明細書において使用される用語「抗体模倣体」は、抗体と同様、抗原、例えば、本件においてＢｔｋに特異的に結合するが、抗体に構造的に関連しない化合物を指す。抗体模倣体は、通常、約３〜２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。例えば、抗体模倣体は、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、ＫｕｎｉｔｚドメインペプチドおよびＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）からなる群から選択することができる。これらのポリペプチドは当分野において周知であり、以下、本明細書においてさらに詳述される。
【００５２】
本明細書において使用される用語「アフィボディ」は、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに由来する抗体模倣体のファミリーを指す。構造的に、アフィボディ分子は、融合タンパク質中に取り込むこともできる３ヘリックスバンドルドメインをベースとする。アフィボディは、それ自体、ほぼ６ｋＤａの分子質量を有し、高温において、および酸性またはアルカリ性条件下で安定である。標的特異性、すなわち、Ｂｔｋに対する特異性は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する２つのアルファ−ヘリックス中で局在する１３個のアミノ酸の無作為化により得られる（Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈ  Ｊ，Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ  Ｖ．；（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８９９：１０３−２６）。
【００５３】
本明細書において使用される用語「アドネクチン」（「モノボディ」とも称される）は、２〜３つの露出ループを有する９４残基のＩｇ様β−サンドイッチフォールドを取るが、中央ジスルフィド架橋を欠くヒトフィブロネクチンＩＩＩの１０番目の細胞外ドメイン（１０Ｆｎ３）をベースとする分子に関連する（Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５）。所望の標的特異性、すなわち、Ｂｔｋに対する特異性を有するアドネクチンは、一般に、タンパク質の特異的ループ中で改変を導入することにより遺伝子操作することができる。
【００５４】
本明細書において使用される用語「アンチカリン」は、リポカインに由来する遺伝子操作タンパク質を指す（Ｂｅｓｔｅ  Ｇ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＦＳ，Ｓｔｉｂｏｒａ  Ｔ，Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６（５）：１８９８−９０３；Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５）。アンチカリンは、リポカイン間で高度に保存されるコア単位を形成し、開放端における４つの構造的可変ループによりリガンドのための結合部位を天然に形成する８ストランド型βバレルを有する。アンチカリンは、ＩｇＧスーパーファミリーと同種ではないが、抗体の結合部位に典型的であるとこれまでみなされている特徴：（ｉ）配列変異の結果としての高い構造的可塑性および（ｉｉ）異なる形状を有する標的へのフィットの誘導を可能とする上昇した立体構造的フレキシビリティを示す。
【００５５】
本明細書において使用される用語「ＤＡＲＰｉｎ」は、典型的には３つのリピートβターンから生じるリジッドな界面を提供する設計されたアンキリンリピートドメイン（１６６残基）を指す。ＤＡＲＰｉｎは、通常、人工コンセンサス配列に対応する３つのリピートを担持し、リピート当たり６つの位置が無作為化されている。結果的に、ＤＡＲＰｉｎは、構造的フレキシビリティを欠く（Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，２００９）。
【００５６】
本明細書において使用される用語「アビマー」は、それぞれ、種々の膜受容体のＡドメインに由来し、リンカーペプチドにより連結されている３０〜３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列からなる抗体模倣体のクラスを指す。標的分子の結合は、Ａドメインおよび所望の結合特異性、すなわち、Ｂｔｋについての結合特異性を有するドメインを介して生じ、例えば、ファージディスプレイ技術により選択することができる。アビマー中で含有される異なるＡドメインの結合特異性は、同一であり得るが、同一でなくてもよい（Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１０（４）：１５５−６８）。
【００５７】
「ナノフィチン」（アフィチンとしても公知）は、スルフォブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）のＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに由来する抗体模倣体タンパク質である。ナノフィチンは、通常、ほぼ７ｋＤａの分子量を有し、結合表面上のアミノ酸を無作為化することにより標的分子、例えば、Ｂｔｋなどに特異的に結合するように設計される（Ｍｏｕｒａｔｏｕ  Ｂ，Ｂｅｈａｒ  Ｇ，Ｐａｉｌｌａｒｄ−Ｌａｕｒａｎｃｅ  Ｌ，Ｃｏｌｉｎｅｔ  Ｓ，Ｐｅｃｏｒａｒｉ  Ｆ．，（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；８０５：３１５−３１）。
【００５８】
本明細書において使用される用語「アフィリン」は、足場としてガンマ−Ｂクリスタリンまたはユビキチンのいずれかを使用し、それらのタンパク質の表面上のアミノ酸を無作為突然変異導入により改変することにより開発される抗体模倣体を指す。所望の標的特異性、すなわち、Ｂｔｋに対する特異性を有するアフィリンの選択は、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイ技術により行われる。足場に応じて、アフィリンは約１０または２０ｋＤａの分子量を有する。本明細書において使用されるアフィリンという用語は、アフィリンの二量体化または多量体化形態も指す（Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１０（４）：１５５−６８）。
【００５９】
「Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド」は、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビター、例えば、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）または組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメインに由来する。Ｋｕｎｉｔｚドメインは約６ｋＤＡの分子量を有し、要求される標的特異性、すなわち、Ｂｔｋに対する特異性を有するドメインは、ディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイにより選択することができる（Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１０（４）：１５５−６８）。
【００６０】
本明細書において使用される用語「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」は、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチドを指す。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは当分野において周知であり、例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４、国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０（２）：５７−６８，Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５、またはＳｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），ＭＡｂｓ  ４：４，１−１２）に記載されている。
【００６１】
アプタマーは、特異的標的分子に結合する核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きな無作為配列プールからそれらを選択することにより作出されるが、天然アプタマーはリボスイッチ中でも存在する。アプタマーは、巨大分子薬物として基礎研究および臨床目的の両方に使用することができる。アプタマーは、それらの標的分子の存在下で自己開裂するようにリボザイムと組み合わせることができる。これらの化合物分子は、追加の研究、産業および臨床用途を有する（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ．ａｌ．（１９９７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：５−９；Ｓｔｕｌｌ  ＆  Ｓｚｏｋａ（１９９５），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，４：４６５−４８３）。
【００６２】
核酸アプタマーは、通常、オリゴヌクレオチドの（通常、短鎖）ストランドからなる核酸種である。典型的には、これらは、種々の分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織および生物体に結合するようにインビトロ選択または同等にはＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））の反復ラウンドを介して遺伝子操作されている。
【００６３】
ペプチドアプタマーは、通常、細胞内側での他のタンパク質相互作用を干渉するように設計されるペプチドまたはタンパク質である。これらは、タンパク質足場に両末端において付着している可変ペプチドループからなる。この二重構造拘束は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体のものと同等のレベル（ナノモル範囲）に大幅に増加させる。可変ペプチドループは典型的には１０〜２０個のアミノ酸を含み、足場は良好な溶解度特性を有する任意のタンパク質であり得る。現在、細菌タンパク質チオレドキシンＡが最も一般に使用される足場タンパク質であり、可変ペプチドループがレドックス活性部位内に挿入され、それは野生型タンパク質中の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループであり、２つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成し得る。ペプチドアプタマー選択は、様々な系を使用して行うことができるが、現在、酵母ツーハイブリッド系が最も広く使用される。
【００６４】
アプタマーは、それらが一般に使用される生体分子、特に抗体のものに匹敵する分子認識特性を提供するため、生物工学および治療用途についての有用性を提供する。アプタマーは、それらの区別認識に加え、それらを試験管中で完全に遺伝子操作することができ、それらは化学合成により容易に産生され、所望の貯蔵特性を有し、治療用途における免疫原性をほとんど誘発せず、または誘発しないため、抗体を上回る利点を提供する。非改変アプタマーは、血流から急速にクリアランスされ、半減期は、アプタマーの固有の低分子量の結果である主にヌクレアーゼ分解および腎臓による体内からのクリアランスに起因して数分間〜数時間である。非改変アプタマー用途は、現在、一過的病態、例えば、血液凝固の治療、または局所送達が可能な臓器、例えば、眼球の治療にフォーカスしている。この急速なクリアランスは、インビボ診断イメージングのような用途において有利であり得る。いくつかの改変、例えば、２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合、アルブミンまたは他の半減期拡張タンパク質への融合などを科学者が利用可能であり、その結果、アプタマーの半減期を数日間またはさらには数週間増加させることができる。
【００６５】
本明細書において使用される用語「ペプチド」は、最大３０個のアミノ酸からなる分子のグループを説明する一方、本明細書において使用される用語「ポリペプチド」（「タンパク質」とも称される）は、３０個超のアミノ酸からなる分子のグループを説明する。ペプチドおよびポリペプチドのグループは、用語「（ポリ）ペプチド」を使用することにより一緒に称される。
【００６６】
本発明によれば、用語「小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても公知であり、生物学における種々の役割を担う１８〜３０、好ましくは、１９〜２５、最も好ましくは、２１〜２３またはいっそうより好ましくは、２１ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを指す。最も注目すべきことに、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが特異的遺伝子の発現を干渉するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路におけるそれらの役割に加え、ＲＮＡｉ関連経路においても、例えば、抗ウイルス機序として、またはゲノムのクロマチン構造の成形において作用する。
【００６７】
天然に通常見出されるｓｉＲＮＡは、十分に定義された構造：２ｎｔ３’オーバーハングをいずれかの末端上で有するＲＮＡの短鎖二本鎖（ｄｓＲＮＡ）を有する。それぞれのストランドは、５’ホスフェート基および３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。この構造は、長鎖ｄｓＲＮＡまたは小分子ヘアピンＲＮＡのいずれかをｓｉＲＮＡに変換する酵素ダイサーによるプロセシングの結果であり、ｓｉＲＮＡは、細胞中に外因的に（人工的に）導入して目的の遺伝子の特異的ノックダウンを生じさせることもできる。したがって、本質的には、配列が公知である任意の遺伝子を、適切に調整されたｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づき標的化することができる。二本鎖ＲＮＡ分子またはその代謝プロセシング産物は、標的特異的核酸改変、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介し得る。外因的に導入されるｓｉＲＮＡは、それらの３’および５’末端におけるオーバーハングを欠き得るが、少なくとも１つのＲＮＡストランドは５’−および／または３’−オーバーハングを有することが好ましい。好ましくは、二本鎖の一方の末端は、１〜５つのヌクレオチド、より好ましくは、１〜３つのヌクレオチド、最も好ましくは、２つのヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。他方の末端は平滑末端であり得、または最大６つのヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。一般に、ｓｉＲＮＡとして作用するために好適な任意のＲＮＡ分子が、本発明において想定される。最も効率的なサイレンシングは、これまで、２ｎｔ３’−オーバーハングを有する様式で対合している２１ｎｔセンスおよび２１ｎｔアンチセンスストランドから構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖について得られた。２ｎｔ３’オーバーハングの配列は、第１の塩基対に隣接する非対合ヌクレオチドに制限される標的認識の特異性への小さな寄与をなす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。３’オーバーハング中の２’−デオキシヌクレオチドは、リボヌクレオチドと同程度に効率的であるが、合成がより安価であることが多く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性がある。ｓｉＲＮＡの送達は、当分野において公知の方法のいずれかを使用して、例えば、ｓｉＲＮＡを生理食塩水と組合せ、組合せを静脈内もしくは鼻腔内投与することにより、またはｓｉＲＮＡをグルコース（例えば、５％のグルコースなど）中で配合することにより達成することができ、またはカチオン性脂質およびポリマーをインビボｓｉＲＮＡ送達に静脈内（ＩＶ）もしくは腹腔内（ＩＰ）のいずれかの全身経路を介して使用することができる（Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８：２８０−２８５；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４３７：Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【００６８】
短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介する遺伝子発現のサイレンシングに使用することができるタイトなヘアピンターンを作製するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは細胞中に導入されるベクターを使用し、Ｕ６プロモーターを利用してｓｈＲＮＡが常に発現されることを確保する。このベクターは、通常、娘細胞に伝播され、遺伝すべき遺伝子サイレンシングを可能とする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によりｓｉＲＮＡに開裂され、次いでそれがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合される。この複合体は、それに結合しているｓｉＲＮＡにマッチするｍＲＮＡに結合し、それを開裂させる。本発明において使用することができるｓｉ／ｓｈＲＮＡは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学合成される。ＲＮＡ合成試薬の供給業者は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡの分社）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）である。最も簡便には、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、異なる品質およびコストのＲＮＡ合成産物を販売する市販のＲＮＡオリゴ合成供給業者から得られる。一般に、本発明において適用可能なＲＮＡは、慣用に合成され、ＲＮＡｉに好適な品質で容易に提供される。
【００６９】
ＲＮＡｉを行うさらなる分子としては、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。前記ＲＮＡ種は、一本鎖ＲＮＡ分子である。内因的に存在するｍｉＲＮＡ分子は、相補的ｍＲＮＡ転写物に結合し、ＲＮＡ干渉と類似のプロセスを介して前記ｍＲＮＡ転写物の分解をトリガーすることにより遺伝子発現を調節する。したがって、それぞれの細胞中への導入後に外因性ｍｉＲＮＡをＢｔｋの阻害剤として用いることができる。
【００７０】
リボザイム（リボ核酸酵素由来、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムはそれら自体の開裂または他のＲＮＡの開裂のいずれかを触媒するが、それらはリボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも見出されている。十分に特徴付けされた小分子自己開裂ＲＮＡの非限定的な例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、およびインビトロ選択リード依存的リボザイムである一方、Ｉ群イントロンは、より大型のリボザイムについての一例である。触媒自己開裂の原理は、近年、十分に確立されてきた。ハンマーヘッドリボザイムは、リボザイム活性を有するＲＮＡ分子の中で最良に特徴付けされている。ハンマーヘッド構造は異種ＲＮＡ配列中に組み込むことができること、およびそれによりリボザイム活性をそれらの分子に移すことができることが示されたため、標的配列が潜在的マッチング開裂部位を含有することを条件としてほとんどの任意の標的配列についての触媒アンチセンス配列を作出することができることが考えられる。ハンマーヘッドリボザイムを構築する基礎原理は、以下のとおりである：ＧＵＣ（またはＣＵＣ）トリプレットを含有するＲＮＡの目的の領域を選択する。通常、６〜８個のヌクレオチドをそれぞれ有する２つのオリゴヌクレオチドストランドを取り、触媒ハンマーヘッド配列をそれらの間に挿入する。最良の結果は、通常、短鎖リボザイムおよび標的配列について得られる。
【００７１】
本発明においても有用である近年の開発は、小分子化合物を認識するアプタマーと、ハンマーヘッドリボザイムとの組合せである。標的分子への結合時にアプタマー中で誘導される立体構造変化は、リボザイムの触媒機能を調節し得る。
【００７２】
本明細書において使用される用語「アンチセンス核酸分子」は、標的核酸に相補的な核酸を指す。本発明によるアンチセンス分子は標的核酸と相互作用し得、より具体的には、それは標的核酸とハイブリダイズし得る。ハイブリッドの形成に起因して、（１つ以上の）標的遺伝子の転写および／または標的ｍＲＮＡの翻訳が低減し、または遮断される。アンチセンス技術に関する標準的な方法は記載されている（例えば、Ｍｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９１）５１：２８９７−２９０１参照）。
【００７３】
本発明の阻害剤または方法のさらに好ましい実施形態において、阻害剤は、Ｂｔｋに不可逆的に結合する。
【００７４】
本発明による「不可逆的結合」は、例えば、Ｂｔｋの分解またはそれぞれの細胞の細胞死に起因してＢｔｋまたは前記Ｂｔｋ分子を含有する細胞が消失するまで２つの分子が結合したままであるような様式でのＢｔｋへの阻害剤の結合を指す。Ｂｔｋ阻害剤がＢｔｋに不可逆的に結合するか否かを判定する方法は周知であり、それとしては、限定されるものではないが、例えば、Ｈｏｎｉｇｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１０に記載のとおり、例えば、阻害剤をフルオロフォア、例えば、Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬによりタグ付けし、それを細胞溶解物とインキュベートし、ゲル電気泳動タンパク質分離後に蛍光スキャニングにより蛍光Ｂｔｋを検出することにより、阻害剤がＢｔｋの活性ドメイン中のシステイン４８１（Ｃｙｓ−４８１）に共有結合するか否かを試験することが挙げられる。
【００７５】
本発明の阻害剤または方法のより好ましい実施形態において、阻害剤は、イブルチニブまたはその類似体である。
【００７６】
イブルチニブはＰＣＩ−３２７６５としても公知であり、名称Ｉｍｂｒｕｖｉｃａで市販されており、ＩＵＰＡＣ名１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］ピペリジン−１−イル］プロプ−２−エン−１−オンを有する。それは、活性部位中のシステイン残基（Ｃｙｓ−４８１）に共有結合し、それによりＢｔｋを強力に不可逆的に阻害する（Ｈｏｎｉｇｂｅｒｇ  ＬＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０；１０７：１３０７５−１３０８０）。イブルチニブは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＵＳＡ）から市販品として入手することができる。
【００７７】
本発明によれば、阻害剤は、イブルチニブの類似体でもよい。このような類似体としては、イブルチニブの機能的および構造的類似体が挙げられる。Ｂｔｋ阻害剤のさらなる例としては、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９  スペブルチニブ（ＡＶＬ−２９２、ＣＣ−２９２）、およびＢＧＢ−３１１１が挙げられる（Ｗｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ（２０１６）９：８０）。さらなる可逆的および不可逆的Ｂｔｋ阻害剤、例えば、ＣＮＸ−７７４、イミダゾキノキサリン、ＣＧＩ１７４６、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ４８６などが当分野において記載されており、Ｗｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０１４；１９：１２００−１２０４）に関節リウマチの治療のために開発中であるＢｔｋ阻害剤としてまとめられている。他の不可逆的ＢＴＫ阻害剤は、Ｂｔｋ上のシステイン残基との共有結合を形成するイブルチニブの類似体であるＢＴＫＩ−４３６０７およびＢＴＫＩ−４３７６１である（Ｒｉｇｇ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６；３１０：Ｃ３７３−３８０）。イブルチニブの機能的類似体としては、限定されるものではないが、キナーゼドメインの活性部位中の４８１位におけるシステイン残基に共有結合するＢｔｋ阻害剤、例えば、不可逆的阻害剤ＣＣ−２９２、ＣＮＸ−７７４、およびイミダゾキノキサリンなどが挙げられ、それらは全て当分野において記載されており、Ｗｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０１４；１９：１２００−１２０４にまとめられている。
【００７８】
本発明の阻害剤または方法のより好ましい実施形態によれば、阻害剤（前記阻害剤は、好ましくは、イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、またはそれらの類似体である）は、１日当たり１０〜１４０ｍｇまたは隔日２０〜２８０ｍｇの投与量において使用／投与される。この投与量は、好ましくは、１回の２５０〜５６０ｍｇの負荷用量により先行される。
【００７９】
イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、およびそれらの類似体のリスト内で、イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、およびそれらの類似体は、好ましくは、阻害剤として使用／投与される。使用することができるイブルチニブの好ましい投与量は、１日当たり３５〜１４０ｍｇ（好ましくは、１日当たり７０〜１４０ｍｇ）、または隔日７０〜１４０ｍｇの低薬物用量である。使用することができるアカラブルチニブの好ましい投与量は、総１日用量が２０〜１００ｍｇになるような１日当たり２回の１０〜５０ｍｇの低薬物用量である。使用することができるＯＮＯ／ＧＳ−４０５９の投与量は、好ましくは、１日当たり２０〜１００ｍｇおよび隔日５０〜１００ｍｇの低薬物用量である。使用することができるＢＧＢ−３１１１の好ましい投与量は、総１日用量が４０〜１６０ｍｇになるような１日当たり２回の２０〜８０ｍｇの低薬物用量である。
【００８０】
このような低投与量のイブルチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、またはそれらの類似体を用いることにより、主に血小板中で、血小板中のみとまではいかないが、Ｂｔｋの選択的阻害を達成することができる。このような低投与量は、イブルチニブ、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、またはそれらの類似体が、吸収期の間に門脈循環を通過する血小板中でＢｔｋを共有結合により不活性化させることを確保する。このアプローチは、血小板中でのデノボ酵素合成の欠落を利用し、血小板中でのプラーク開始血栓形成についての主要機序の抑制をそれらの寿命にわたり可能とするが、他の細胞中ではＢｔｋを阻害しない。
【００８１】
上記の低投与量のイブルチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９、ＢＧＢ−３１１１、またはそれらの類似体の１つが使用／投与される前に、初回負荷用量が使用／投与されることが好ましい。負荷用量は、上記の低投与量よりも多く、治療すべき患者における血小板に対する即効を確保するためのものである。
【００８２】
本発明の阻害剤または方法のいっそうより好ましい実施形態によれば、阻害剤は、２８０〜５６０ｍｇの負荷用量、および１日当たり１０〜１４０ｍｇまたは隔日４０〜２８０ｍｇの維持投与量において使用／投与される。
【００８３】
好ましい負荷用量（１回服用される）は、イブルチニブについて２８０〜５６０ｍｇであり、アカラブルチニブについて２００〜３００ｍｇであり、ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９について３２０〜４８０ｍｇであり、ＢＧＢ−３１１１について３２０〜４８０ｍｇである。
【００８４】
本発明の阻害剤または方法のさらに好ましい実施形態において、阻害剤は、場合により、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物に含まれる。
【００８５】
本明細書において使用される用語「医薬組成物」は、患者、好ましくは、ヒト患者への投与用の組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上記阻害剤の少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、例えば、少なくとも３つ、さらなる実施形態においては少なくとも４つ、例えば、最後には５つを含む。２つ以上の阻害剤が医薬組成物中に含まれる場合、それらの阻害剤はいずれも、同様に組成物中に含まれる他の阻害剤に対して本質的にいかなる阻害効果も有さないことが理解される。
【００８６】
組成物は、固体、液体または気体形態であり得、とりわけ、（単数または複数の）散剤、（単数または複数の）錠剤、（単数または複数の）液剤または（単数または複数の）エアゾール剤の形態であり得る。
【００８７】
前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤を含むことが好ましい。好適な医薬担体、賦形剤および／または希釈剤の例は当分野において周知であり、それとしては、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルション、例えば、油／水性エマルション、種々のタイプの湿潤剤、滑沢剤、結合剤、充填剤、無菌溶液などが挙げられる。
【００８８】
このような担体を含む組成物は、周知の慣用の方法により配合することができる。これらの医薬組成物は、好適な用量において対象に投与することができる。投与量レジメンは、担当医および臨床学的因子により決定される。本発明の阻害剤の投与に関して上記で本明細書において提供される全ての定義および好ましい実施形態、例えば、投与経路、好ましい投与量およびそれを決定する手段は、変更すべきところは変更して、本発明の医薬組成物の投与に適用される。
【００８９】
前記医薬組成物は、動脈血栓症に拮抗作用を示すことが当分野において公知のさらなる薬剤を含むことが特に好ましい。本発明の医薬製剤は本明細書において称される阻害剤に依存するため、それらの挙げられるさらなる薬剤は補助剤としてのみ、すなわち、唯一薬物として使用される場合の推奨用量と比較して低減した用量において使用して例えば、さらなる薬剤により付与される副作用を低減させることが好ましい。
【００９０】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合、定義を含め本特許明細書が優先される。
【００９１】
本明細書において、特に請求項中で特徴付けされる実施形態に関して、従属請求項に挙げられるそれぞれの実施形態は、前記従属請求項が従属するそれぞれの請求項（独立または従属）のそれぞれの実施形態と組み合わせられることが意図される。例えば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを引用する独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを引用する従属請求項２ならびに請求項１および２に従属し、３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを引用する請求項３の場合、本明細書は、特に具体的に挙げられていない限り、組合せＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態を明らかに開示することを理解すべきである。
【００９２】
同様に、および独立および／または従属請求項が選択肢を引用しない場合においても、従属請求項が複数の前の請求項に戻って参照する場合、それによりカバーされる主題の任意の組合せが明示的に開示されるとみなされることが理解される。例えば、独立請求項１、請求項１に戻って参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方に戻って参照する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せは、請求項３、２および１の主題の組合せとして明確に、および明らかに開示されることとなる。請求項１〜３のいずれか一項を指すさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１の、請求項４、２および１の、請求項４、３および１の、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せが、明確に、および明らかに開示されることとなる。
【００９３】
上記検討事項は、変更すべきところは変更して全ての添付の請求項に適用される。非限定的な例を挙げるため、請求項構造を考慮して請求項７、６および４の組合せが、明確に、および明らかに想定される。同じことが、例えば、請求項７、６および５などの組合せに適用される。
【００９４】
実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【００９５】
実施例１：材料および方法
試薬
イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＵＳＡ）から入手した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびヒト血清からのアルブミン（脂肪酸不含）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。コラーゲン（Ｈｏｒｍ）および希釈溶媒をＴａｋｅｄａ（Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入した。トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）をＢａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。３’−ホスフェート５’−ホスフェート（ＡＤＰ）は、Ｂｉｏｐｏｏｌ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）製であった。ＤｉＯＣ６をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から入手した。ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）はＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）製であった。組換えレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標））はＣｅｌｇｅｎｅ（Ｗｉｎｄｓｏｒ，ＵＫ）製であった。クライオトミー（ｃｒｙｏｔｏｍｙ）用の包埋媒体としてのＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）は、Ｓａｋｕｒａ（Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製であった。
【００９６】
原液
イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で２０ｍＭの濃度において溶解させた。アリコート（３０μｌ）を−８０℃において貯蔵した。それぞれのインビトロ実験前、希釈物をＤＭＳＯ（０．１、０．２、０．５、１および２ｍＭ）中で作製してそれぞれ０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭおよび２μＭの血中最終濃度を得た。血中のＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。コラーゲン（１０００μｇ／ｍｌ）を希釈溶媒中で、凝集測定実験のために１：１０の比（１００μｇ／ｍｌ）で、または流動実験のために１：５０の比（２０μｇ／ｍｌ）で希釈した。ＴＲＡＰを０．９％のＮａＣｌ中で５００μＭの濃度において溶解させた。ＡＤＰを蒸留水中で５００μＭの濃度において溶解させた。血小板標識のためのＤｉＯＣ６をＤＭＳＯ中で５ｍＭの濃度において溶解させた。アリコート（１０μｌ）を−２０℃において貯蔵した。それぞれの流動実験前、原液をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、ＰＢＳ中０．５％）中で１００μＭの濃度において溶解させて１μＭの血液試料中の最終濃度を得た。
【００９７】
ヒト頸動脈アテローム動脈硬化性プラーク
アテローム動脈硬化性プラーク検体が、既に記載のとおり（Ｂｒａｎｄｌ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９７；９６：３３６０−３３６８；Ｒｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＡＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１０；５５：１１４７−１１５８５；Ｐｅｎｚ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２００５；１９：８９８−９０９）、高悪性度頸動脈狭窄のための動脈内膜切除を受けた患者から寄付された。Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈの倫理委員会により承認されるとおり患者同意を得た。脂質リッチプラークを含有する検体を回収した。アテロームプラークを無菌条件下で、アテローム動脈硬化性組織検体の他の領域から慎重に切除した（Ｂｒａｎｄｌ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９７；９６：３３６０−３３６８；Ｒｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＡＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１０；５５：１１４７−１１５８５；Ｐｅｎｚ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２００５；１９：８９８−９０９）。プラークを処理してホモジネートまたは連続組織切片のいずれかを得た。
【００９８】
プラークホモジネートのため、プラーク検体を秤量し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）中でホモジナイズし、１００ｍｇの湿潤重量／ｍｌの濃度に調整し、−８０℃において貯蔵した。５人の患者からのプラークホモジネートをプールした（Ｄｗｉｖｅｄｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１０；８：１２８）。プールしたプラークホモジネートをＰＢＳにより、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）分析装置中での静的試験のために１：１の比で、および流動実験のために１：２０の比で希釈した。
【００９９】
連続プラーク組織切片のために、４人の異なる患者からのアテローム動脈硬化性組織検体をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）中で包埋し、−２０℃においてクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により３ミクロン厚切片に横方向に切断し、ガラスカバースリップ上にコートした。組織切片を−８０℃において貯蔵した。
【０１００】
血液回収
インビトロでのイブルチニブ添加の実験のため、実験前少なくとも２週間、血小板機能に影響を与えるいかなる医薬品も服用していない健常成人から血液を得た。
【０１０１】
エクスビボ実験のため、１５０Ｇ／ｌ超の血小板数を有する、継続イブルチニブ処理（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ、３×１４０ｍｇのカプセル剤１日１回、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  ＮＶ，Ｂ−２３４０  Ｂｅｅｒｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中のＣＬＬ患者（ｎ＝５）および対照患者（ｎ＝５）を選択してその血小板濃度により損なわれていない血液中での血小板機能の分析を可能とした。対照患者の４人はＣＬＬを有し、１人はＭＣＬを有し、治療の必要がなかった。それぞれの実験日について、類似の血小板数を有する１人のイブルチニブおよび対照患者のペアを選択し、それらの血小板機能を並行試験した。患者のインフォームドコンセントは、Ｈｅｌｓｉｎｋｉプロトコルに従って得た。
【０１０２】
２１ゲージ針および０．９％のＮａＣｌ中で溶解させた１／１０容量の組換えヒルジン（血中最終濃度約２００Ｕ／ｍｌ：１３μｇ／ｍｌ）を含有するプラスチックシリンジを使用して静脈穿刺により血液を採取した。空のシリンジに抜かれた血液の最初の３ｍｌを廃棄した。実験を静脈穿刺の３０分〜４時間後の間に実施した。
【０１０３】
血液中での血小板凝集
血液中での血小板凝集を、Ｄｙｎａｂｙｔｅ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）装置を使用して複数の電極凝集測定（ＭＥＡ）により計測した（Ｔｏｔｈ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００６；９６：７８１−８）。イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、またはＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（０．１、０．２、０．５、１または２μＭ）またはＤＭＳＯ（０．１％、対照）をＭＥＡキュベット中の０．３ｍｌの生理食塩水に最初に添加してから０．３ｍｌの血液を添加した。試料を撹拌の不存在下で試験キュベット中で１５分間プレインキュベートした。患者の血液を用いるエクスビボ実験において、試料を撹拌の不存在下で３７℃において３分間プレインキュベートした（Ｂａｍｐａｌｉｓ  ＶＧ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１２；１０：１７１０−４）。続いて、プラークホモジネート（８３３μｇ／ｍｌ）またはコラーゲン（０．２〜０．４μｇ／ｍｌ；プラークホモジネートと同一の凝集値を誘導するために個々の血液ドナーにおいて試験）、ＴＲＡＰ（５μＭ）またはＡＤＰ（５μＭ）を添加し、撹拌を開始し、デュプリケート試料においてインピーダンス変化を１０分間継続して記録した。１０分間の時間にわたる累積凝集値をＡＵ*ｍｉｎ（ＡＵ、凝集単位）として表現する。
【０１０４】
流動全血中での血小板凝集および血栓形成の分析
流動血液中での実験のため、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ＰＢＳ中４％）により既にブロッキングされた粘着スライド（０．１Ｌｕｅｒ粘着スライド、ｉｂｉｄｉ（登録商標）、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してコラーゲン（２０μｇ／ｍｌ）、プラークホモジネートまたはプラーク組織切片によりコートされたガラスカバースリップ（Ｍｅｎｚｅｌ、２４×６０ｍｍ、＃１．５）を並行プレート流動チャンバ中に集めた。次いで、流動チャンバを、インキュベーションチャンバ（３７℃）を備える蛍光顕微鏡（ＴＥ２０００−Ｅ、Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のステージ上にマウントした。流動チャンバをＰＢＳにより灌流させ、続いて４％のＨＳＡを含有するＰＢＳにより２分間ブロッキングしてガラスカバースリップへの血小板の非特異的結合を防止した。
【０１０５】
イブルチニブ、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、またはＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（０．１、０．２、０．５、１または２μＭ）またはＤＭＳＯ（血中最終濃度０．１％；対照）をＦａｌｃｏｎチューブ中に装入された１００μｌのＮａＣｌ（０．９％）に最初に添加し、続いて血液試料（２ｍｌ）を添加した。この手順は溶血を回避し、イブルチニブが完全に血液試料中に存在することを保証した。血小板の蛍光標識のためにＤｉＯＣ６（１μＭ）を血液に添加し、試料を３７℃において１５分間インキュベートした7。ＤＭＳＯまたはＮａＣｌ単独を用いて対照ランを実施した。エクスビボ実験において、イブルチニブ処理を受けたまたは受けていない患者からの血液の３ｍｌをＤｉＯＣ６（１μＭ）と３７℃において１０分間プレインキュベートした。
【０１０６】
抜き取りシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）（Ｊａｍａｓｂｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；６５：２４０４−１５）を用いて血液を２つの剪断速度（６００／ｓ；１５００／ｓ）において流動チャンバに通して灌流させた。１０×空気対物（ＮＡ０．４）およびＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱ２  ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＵＳＡ）を使用して蛍光顕微鏡観察（励起：４８５／２５ｎｍ、発光：５２８／３８ｎｍ）を血小板粘着および凝集物形成のリアルタイム計測のために実施した。蛍光画像を継続的に５〜７分間記録した（１フレーム／秒）。ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔ３．２（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ソフトウェアパッケージ（Ｊａｍａｓｂｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；６５：２４０４−１５）を使用して０分の時間におけるプラーク自己蛍光の減算後に二元蛍光区域分画（１．０＝合計区域）を定量することによりそれらを分析した。この設定において可視化される区域は、６６９μｍ×８９６μｍであった（Ｊａｍａｓｂｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；６５：２４０４−１５）。値は、異なるドナーからの血液を用いるそれぞれの阻害剤についての５つの実験の平均±ＳＤ（毎秒計測）である（Ｊａｍａｓｂｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；６５：２４０４−１５）。
【０１０７】
全血におけるインビトロ閉止時間（ＣＴ）の分析
ＰＦＡ１００（登録商標）およびＰＦＡ２００（登録商標）装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、一次止血をシミュレートし、インビトロで出血時間を計測するために使用されるＴｈｒｏｍｂｏｓｔａｔシステムのさらなる発展である（Ｋｒａｔｚｅｒ  ＭＡ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１９９５；２１  Ｓｕｐｐｌ  ２：２５−３１；Ｋｕｎｄｕ  ＳＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１９９５；２１  Ｓｕｐｐｌ  ２：１０６−１２）。この機器は、一定真空下でクエン酸抗凝固血液（０．８ｍｌ）を容器からキャピラリーならびにコラーゲンおよびＡＤＰ（コラーゲン／ＡＤＰ試験カートリッジ）、またはコラーゲンおよびエピネフリン（コラーゲン／ＥＰＩ試験カートリッジ）によりコートされた膜フィルター中の小穴に通して吸引する。開口部の完全閉塞を得るために要求される時間を「インビトロ閉止時間」として記録した。閉止時間を２人の健常ドナー、イブルチニブ処理を受けたまたは受けていない５人の患者において計測した。５人のイブルチニブ患者は、静的および流動実験において上記で試験された患者と同一であった。
【０１０８】
統計
２つの並行実験条件の平均を、対応のあるスチューデントのｔ検定により比較した（*：ｐ＜０．０５；**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１）。３つ以上の同時実験条件を、反復計測についてＡＮＯＶＡにより検定し、次いでボンフェローニ検定により一対比較した（§：ｐ＜０．０５；§§：ｐ＜０．０１、§§§：ｐ＜０．００１）。
【０１０９】
実施例２：イブルチニブは、静的条件下にて血液中でプラークおよびコラーゲン誘導血小板凝集を阻害する
血液とイブルチニブ（１μＭ）とのプレインキュベーションは、インピーダンス凝集測定により測定されるとおり、プラークおよびコラーゲンによる刺激時に血小板凝集をほぼ完全に阻害した（図１Ａ）。イブルチニブによるプラークおよびコラーゲンにより刺激される血小板凝集の阻害は、類似の用量応答曲線を示した。プラークおよびコラーゲン刺激血小板凝集の阻害についてのイブルチニブのＩＣ５０値は、それぞれ０．１８±０．０５μＭ、および０．１２±０．０４μＭであり、最大抑制は０．５μＭにおいて達した（図１Ｂ、Ｃ）。対照的に、イブルチニブは、ＰＡＲ−１受容体を活性化させるＴＲＡＰおよびＡＤＰにより刺激される血小板凝集をやや低減させたにすぎなかった（それぞれ−３１％、および−１３％だけ；図１Ａ、Ｄ）。刺激の不存在下での自然最小血小板凝集も、イブルチニブにより停止した（図１Ａ、下段、Ｄ）。
【０１１０】
実施例３：イブルチニブは、動脈流条件下でプラークホモジネートおよびプラーク組織により刺激される血小板血栓形成を阻害するが、コラーゲンにより刺激される血小板血栓形成を阻害しない
プラーク破裂による血小板活性化をシミュレートするため、ヒト血液を並行プレート流動チャンバ中で、ヒトプラークホモジネートまたはプラーク組織切片によりコートされたカバースリップ上で、健常頸動脈および冠動脈の生理学的壁剪断速度（６００／ｓ）ならびに軽度に狭窄の冠動脈病変上での速度（１５００／ｓ）において灌流させた。
【０１１１】
６００／ｓにおいて、イブルチニブ（１μＭ）は、プラークホモジネート上への血小板凝集を完全に停止させた一方（−９８±１％）、血小板粘着を保存した（図２Ａ）。イブルチニブ（１μＭ）は、プラーク組織上への血小板血栓形成も強力に阻害した（−７６±１６％だけ；図２Ｂ）が、コラーゲン線維上への最終血小板凝集物形成を遅延させたにすぎず、減弱させなかった（＋８±２％）（図２Ｃ）。より低濃度のイブルチニブ（０．２および０．５μＭ）は依然としてプラークホモジネート（それぞれ−４３±２７および−８４±８％）およびプラーク組織（それぞれ−３３±２３および−４４±３０％）上への血小板凝集を遅延させ、低減させたが、コラーゲン誘導血小板凝集を損傷しなかった（それぞれ＋１±６および＋３±９％）。ＤＭＳＯ溶媒は、血小板凝集に影響を与えなかった（データ示さず）。
【０１１２】
高剪断速度においても、イブルチニブ（０．２μＭおよび０．５μＭ）はコラーゲン上への血小板凝集を低減させなかったが、依然としてプラークホモジネート上への血小板血栓形成を阻害した（それぞれ−６９±１６％および−９３±５％だけ）（図３）。
【０１１３】
実施例４：イブルチニブ療法中の患者における静的および動脈流条件下でのプラークおよびコラーゲン誘導血小板凝集
次に、５人のＣＬＬ患者における進行中のイブルチニブ療法（４２０ｍｇ／日）の効果を分析した。イブルチニブを服用していない５人の合致患者が対照として機能した。血液血小板数は、イブルチニブ患者（１７４±１９Ｇ／ｌ）および対照（１８６±３７Ｇ／ｌ）において類似であった。イブルチニブ中の患者からの血液において、血小板凝集は、静的条件下でプラーク（−８９±７％）またはコラーゲン（−８４±８％）によりインビトロで刺激された場合に阻害され、非刺激自然血小板凝集も遮断された（図４）。注目すべきことに、イブルチニブ処理は、動脈流条件下でプラークホモジネート上への血小板血栓形成を停止させた一方、血小板粘着を保存した（図５Ａ）。プラーク組織上への血小板血栓形成も、大幅に予防された（−８３±２４％だけ；図５Ｂ）。対照的に、イブルチニブは、コラーゲン線維上への流動血液からの初期血小板凝集を最小限に減速させたにすぎなかったが、対照と同一の最大応答に達した（図５Ｃ）。
【０１１４】
実施例５：インビトロ閉止時間（ＣＴ）に対するエクスビボでのイブルチニブの効果
イブルチニブ摂取が出血時間を増加させ得るか否かを試験するため、計測を、上記で試験された患者と同一のイブルチニブを服用する５人の患者において血小板機能分析装置ＰＦＡ−１００により実施した。この装置は、インビトロでの一次止血をシミュレートする。しかしながら、ＰＦＡ−１００またはＰＦＡ−２００装置により見出される異常値がインビボでの潜在的な出血リスクを反映するか否かは、依然として論争の主題である（Ｋｕｎｄｕ  ＳＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１９９５；２１  Ｓｕｐｐｌ  ２：１０６−１１２；Ｐａｎｉｃｃｉａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．２０１５；１１：１３３−１４８）。イブルチニブ療法中の患者における平均閉止時間は、有意に増加しなかったが、５人の患者のうち２人は、コラーゲン／エピネフリン試験カートリッジについて閉止時間の延長を示した（図６Ａ、Ｃ）。コラーゲン／ＡＤＰカートリッジについて、閉止時間は両方の患者群において正常範囲であった（図６Ｂ、Ｃ）。血液血小板数は、両方の患者群において類似であった（図６Ｄ）。
【０１１５】
実施例６：イブルチニブは、ＶＷＦへの血小板インテグリンα２β１およびＧＰＩｂ結合と独立した機序を介して動脈流下でプラーク上への血小板凝集を阻害する
動脈流下で、インテグリンα2β1遮断抗体６Ｆ１は可溶性Ｉ型コラーゲン上への血小板粘着を遮断したが、イブルチニブは遮断しなかった（図７）。これは、インテグリンα2β1が可溶性コラーゲンへの血小板粘着に重要であることを裏付け（Ｊｕｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒｏｉ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（２４）：１４８２７−３７）、イブルチニブが生理学的止血において天然コラーゲンへのインテグリンα2β1媒介血小板粘着を干渉しないことを実証する。
【０１１６】
高剪断流動におけるイブルチニブによる血小板凝集のプラーク特異的阻害が、ＧＰＶＩシグナリングの阻害にのみ起因するか、ＧＰＩｂシグナリングの阻害にも起因するか否かをさらに明確にするため、ＧＰＩｂαとＶＷＦとの相互作用を阻害するモノクローナル抗体６Ｂ４（Ｐｅｎｚ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  （２００７）；９７（３）：４３５−４３と血液をプレインキュベートした。プラークホモジネートおよびコラーゲン上で高剪断において灌流させた場合、プラークホモジネートおよびコラーゲン誘導血小板血栓形成の両方は、同等に十分阻害された（＞９５％）（図８）。これは、ＧＰＩｂのＶＷＦ活性化が高剪断速度においてプラークおよびコラーゲン表面の両方への血小板粘着および凝集に要求されることを示すが、ここではＧＰＩｂ下流のＢｔｋシグナリングが機能的に関連しないことも意味する。
【０１１７】
実施例７：新たな第二世代Ｂｔｋ阻害剤アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、静的条件下にて血液中でプラークおよびコラーゲン誘導血小板凝集を阻害する
血液とアカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９とのプレインキュベーションは、インピーダンス凝集測定により計測されたとおり血中でプラーク誘導血小板凝集を用量依存的に阻害した（図９Ａ；図１０Ａ）。ＡＣＰ−１９６およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９のＩＣ５０値はそれぞれ０．４μＭ、および１μＭであり、最大抑制（それぞれ８０％および８２％）はそれぞれ１および２μＭにおいて達した。コラーゲン誘導血小板凝集は、同等に十分阻害された（図９Ｂ、図１０Ｂ）。対照的に、ＡＣＰ−１９６（２μＭ）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９（２μＭ）は、ＴＲＡＰ、ＡＤＰまたはＡＡにより刺激される血小板凝集をわずかに低減させたにすぎなかった（図９Ｂ、図１０Ｂ）。刺激の不存在下での自然最小血小板凝集は、イブルチニブにより停止した（図１Ａ、下段、Ｄ）。
【０１１８】
実施例８：アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）およびＯＮＯ／ＧＳ−４０５９は、動脈流条件下でプラークホモジネートにより刺激される血小板血栓形成を阻害するが、コラーゲンにより刺激される血小板血栓形成を阻害しない。
ＡＣＰ−１９６は、６００／ｓの剪断速度を有する動脈流においてプラークホモジネート上への血小板凝集を用量依存的に阻害し、２μＭは、血小板凝集を９６％だけ阻害した（図１１）。ＯＮＯ／ＧＳ−４０５９も用量依存的阻害を示し、２μＭにおいて、プラークホモジネート上への血小板血栓形成を−７６％だけ強力に阻害した；図１２）。両方のＢｔｋ阻害剤は試験された最大濃度においてコラーゲン線維上への最終血小板凝集物形成をわずかに遅延させたが、減弱させなかった（図１１、１２）。ＤＭＳＯ溶媒は血小板凝集に影響を与えなかった（図１３）。
【０１１９】
実施例９  低用量のイブルチニブの経口摂取は、静的条件および動脈流下でプラーク誘導血小板凝集を阻害する。
イブルチニブの抗血小板療法としての可能性を試験するため、２人の健常医師（男性、６１および６６歳）は、負荷用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（３回のカプセル剤×１４０ｍｇ＝４２０ｍｇ）を服用し、次いで１週間の１４０ｍｇ／日の低用量（ドナーＡ）または１週間の隔日１４０ｍｇの極低用量（ドナーＢ）を服用した。このレジメンは、２人のドナーにおいていかなる有害な副作用も有さなかった。
【０１２０】
負荷用量３×１４０ｍｇのＩｍｂｒｕｖｉｃａは、ドナーＡにおいて２つのプラークホモジネートプールにより誘導される血小板凝集を９４％および９３％だけほぼ完全に阻害し、コラーゲンにより誘導される血小板凝集を９１％だけほぼ完全に阻害し、ドナーＢにおいてプラーク刺激後に血小板凝集を６８％および７７％だけ低減させ、コラーゲン刺激後に血小板凝集を５８％だけ低減させた（図１４）。ＴＲＡＰ、ＡＤＰまたはＡＡにより誘導される血小板凝集は、ドナーＡおよびＢにおいてわずかに阻害された（図１４）。
【０１２１】
ドナーＡにおいて、１週間のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（１４０ｍｇ／日）後、２つのプラークホモジネートプールにより刺激される血小板凝集は、依然として９４％および９１％だけ、およびコラーゲン刺激後に９１％だけ阻害された（図１５）。ドナーＢにおいて、１週間の極低用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａの摂取（隔日１４０ｍｇ）後、２つのプラークホモジネートプールにより刺激される血小板凝集は、９３％および９１％だけ同様に刺激され、コラーゲン刺激後に８２％だけ阻害された（図１５）。ＡＤＰまたはＡＡにより誘導される血小板凝集は、ドナーＡおよびＢにおいてわずかに阻害された（図１５）。ＴＲＡＰにより刺激される血小板凝集は、ドナーＡにおいて７０％だけ、およびドナーＢにおいて４５％だけ低減した。
【０１２２】
プラーク誘導血小板凝集は、ドナーＡによるＩｍｂｒｕｖｉｃａ（１４０ｍｇ／日）の１週間摂取の間の数日間において計測した。計測用血液が投与２３時間後に採取されたか３時間後に採取されたかに関係なくそれぞれの試験日において＞９０％阻害されることが見出された（図１６）。
【０１２３】
イブルチニブの経口摂取は、動脈流条件下でプラークホモジネートにより刺激される血小板血栓形成を阻害したが、コラーゲンにより刺激される血小板血栓形成を阻害しなかった（図１７Ａ、Ｂ）。負荷用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａ（３×１４０ｍｇ）は、３時間後にプラーク誘導血栓形成を両方のドナーにおいて同等に十分抑制した。１週間後、低用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａ１４０ｍｇ／日および隔日の極低用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａ１４０ｍｇの両方が、プラーク誘導血栓形成を抑制し、極低用量のＩｍｂｒｕｖｉｃａ１４０ｍｇ後に観察された阻害がわずかに少なかった（図１７ＡおよびＢを比較）。
【０１２４】
イブルチニブ摂取が出血時間を増加させ得るか否かを試験するため、ＰＦＡ−２００装置および閉止時間を両方の血液ドナーにおいて計測した。ドナーＢは、イブルチニブ負荷の３時間後および低用量イブルチニブ摂取の１週間後にコラーゲン／エピネフリン試験カートリッジについて閉止時間の延長を示し、ドナーＡはそれほど示さなかった（図１８）。ドナーＢは、イブルチニブ摂取前に正常範囲を超える閉止時間値を既に有することが留意された。コラーゲン／ＡＤＰカートリッジについて、閉止時間は、両方のドナーにおいてイブルチニブ摂取後に正常範囲であった（図１８）。
【０１２５】
Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ摂取（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａの負荷用量または１週間の低用量の摂取）は、赤血球、血小板および白血球（リンパ球、好中球、単球）数に影響を与えなかった。Ｂリンパ球（ＦＡＣＳにより計測）は、両方のドナーにおいて減少するのではなく増加した（表２）。肝酵素はＩｍｂｒｕｖｉｃａ摂取により変更されなかった。
【０１２６】
まとめると、２人の健常被験者において、経口Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ負荷用量（３×１４０ｍｇ）とそれに続く低維持用量（１４０ｍｇ／日または隔日１４０ｍｇ）は、動脈流下で有害な副作用なしでプラーク誘導血小板凝集および血小板血栓形成からの急速および継続的保護を提供した。
【０１２７】
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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