(57)【要約】  Ｎ−グリコシル化部位に少なくとも８０％ＮＡＮＡグリコシル化末端シアル酸Ａｓｎ２９７およびＧａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有するキメラセツキシマブ様モノクローナル抗体(ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ)が開示される。開示されるＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体はセツキシマブ(アービタックス(登録商標))と同一のアミノ酸配列(配列番号１／配列番号３の軽鎖／重鎖)を有するキメラ抗体であり、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))は少なくとも８０％ＮＧＮＡ末端シアル酸およびＧａｌ−α(ｌ,３)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す軽鎖アミノ酸配列および配列番号３に示す重鎖アミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲ抗体医薬組成物であって、
ここで、抗ＥＧＦＲ抗体が動的光散乱法(ＤＬＳ)解析により決定して、約１０〜２５nmのｚ平均(ｚ−ａｖｇ)を有し、
抗ＥＧＦＲ抗体がＧａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌグリカンを含む、
ＥＧＦＲ抗体医薬組成物。
【請求項２】
抗体のｚ−ａｖｇが１５〜２０nmである、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体医薬組成物。
【請求項３】
シアル酸グリコシル化が、Ｎ−グリコシル化部位で少なくとも８０％ＮＡＮＡグリコシル化末端シアル酸である、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体医薬組成物。
【請求項４】
Ｎ−グリコシル化部位に少なくとも８０％ＮＡＮＡグリコシル化末端シアル酸およびＧａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有する、キメラ抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｎ−グリコシル化部位に少なくとも８０％ＮＡＮＡグリコシル化末端シアル酸およびＧａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有するキメラセツキシマブ様モノクローナル抗体(ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ)を提供する。本発明のＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体は、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と同一のアミノ酸配列(配列番号１／配列番号３の軽鎖／重鎖)を有するキメラ抗体である。しかしながら、これは、少なくとも８０％ＮＧＮＡ末端シアル酸およびＧａｌ−α(１,３)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有する。それ故に、本発明の抗体は、セツキシマブを超える改善された安全性および有効性を示す。
【背景技術】
【０００２】
背景
上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)はｃ−ｅｒｂＢｌ／ＨＥＲｌとしても知られ、そのファミリーメンバーは、増殖因子受容体チロシンキナーゼであり、その細胞表面は、特異的増殖因子または天然リガンド相互作用、例えば、ＥＧＦまたはＴＧＦ  ｃｉ相互作用を備え、それにより受容体チロシンキナーゼを活性化する。このファミリーの最初のメンバーは、１６５KDの見かけの分子量を有する糖タンパク質であることが発見された。ＥＧＦＲ阻害剤はモノクローナル抗体を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞株の増殖を阻害できる。
【０００３】
グリコシル化は、翻訳後修飾である。タンパク質分子表面糖鎖は、該タンパク質分子の構造および機能に影響を有し得る。モノクローナル抗体のグリコシル化およびグリカン構造は、ＩｇＧ分子の抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)および半減期を調節するためにＩｇＧ分子のＦｃＲｓ、ＣｌｑおよびＦｅＲｎへの結合に影響することにより、その機能との相関性を有する。グリコシル化はまたｍＡｂ、特に非ヒトグリカンの安全性特性にも影響し、免疫原性の可能性を有する。Ｆａｂ機能的領域に位置するグリカンは、これらの薬物の安全性および有効性特性の両者にも影響し得る。
【０００４】
グリコシル化は、細胞発現系およびサブクローン選択、細胞培養因子、例えば培地成分および培養条件に依存する。さらに、グリコシル化は、治療タンパク質の生物活性、有効性、免疫原性および薬物動態に影響する。
【０００５】
ＣＨＯ細胞およびマウス骨髄腫細胞(ＮＳ０、ＳＰ２／０)発現系は、治療抗体およびＦｃ融合タンパク質のために使用されている。統計によると、現在承認されている治療モノクローナル抗体の約４８％がＣＨＯ細胞で発現され、一方、４５％がマウス細胞(２１％ＮＳ０細胞、１４％ＳＰ２／０細胞、１０％ハイブリドーマ細胞)で発現されている。
【０００６】
セツキシマブ(アービタックス(登録商標)、Ｃ２２５  ｍａｂ)は、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)を特異的に標的とする組み換えキメラモノクローナル抗体であり、多くの国で転移結腸直腸癌および頭頸部扁平上皮細胞癌の処置に承認された。しかしながら、臨床適用で、薬物過敏性反応が高い発生率で生じることを報告するいくつかの試験がある。薬物特異的ＩｇＥ抗体(これはに対して特異的に反応する)が、過敏性反応を有した大部分の患者の血清で見られた。承認されたセツキシマブは、哺乳動物細胞(マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０)で発現され、調製される。このマウス細胞株は、付加的α１,３−ガラクトシダーゼトランスフェラーゼを含み、これは主にα配置のＵＤＰ−Ｇａｌからのガラクトース残基の末端ガラクトース残基への移動に介在し、それによりα−Ｇａｌを産生する。α−Ｇａは、ｍＡｂ、特にマウス細胞株で発現されたｍＡｂ上のあるグリカンに見られる非ヒト二糖である。高レベルの抗α−Ｇａｌ  ＩｇＥ抗体が、セツキシマブで処置された一部患者で見られた。さらに、ヒトとマウス細胞ＩｇＧグリコシル化の差異は、マウス細胞がα−Ｇａｌエピトープを作る生合成機構を有すると共に、Ｎ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮＡ)ではなくてＮ−グリコリルノイラミン酸(ＮＧＮＡ)を産生することである。ＮＧＮＡには１個余分の酸素原子がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
糖タンパク質は、ＮＧＮＡ残基を含むならば、しばしばヒトにおける免疫原性と関連する。いくつかの市販治療糖タンパク質は、ＮＧＮＡ残基を含むため、患者における重度有害反応を引き起こす。それ故に、当分野において、免疫原性低減により、セツキシマブの安全性を改善する必要がある。本発明は、薬物安全性を改善するために行った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明は、Ｎ−グリコシル化部位に少なくとも８０％ＮＡＮＡグリコシル化末端シアル酸およびＧａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有するキメラモノクローナル抗体(ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ)を提供する。本発明のＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体は、少なくとも８０％ＮＧＮＡ末端シアル酸およびＧａｌ−α(１,３)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有する点以外、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と同一のアミノ酸配列(配列番号１／配列番号３の軽鎖／重鎖)を有する、キメラ抗体である。
【０００９】
ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)は、９９％が、示す化学構造(図５)を有する、ヒトＮＡＮＡ(Ｎ−アセチルノイラミン酸)のグリコシル化シアル酸を有する。しかしセツキシマブ(アービタックス(登録商標))は、９７％が、示す化学構造(図５)を有する、ヒトＮＧＮＡ(Ｎ−グリコリルノイラミン酸)のグリコシル化シアル酸を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と類似する結合反応速度を有する開示される抗体ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)の比較を示す。
【００１１】
【図２】セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と類似する結合反応速度を有する開示される抗体ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)のＭＤＡ−ＭＢ４７６細胞におけるＥＧＦＲとの細胞結合の比較を示す。
【００１２】
【図３】セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と類似する結合反応速度を有する開示される抗体ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)のＩＣ５０を超える用量での細胞増殖の比較を示す。両抗体は、類似の有効性を示した。
【００１３】
【図４】セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と類似する結合反応速度を有する開示される抗体ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)の複数用量にわたる腫瘍体積の比較を示す。両抗体は、類似の有効性を示した。
【００１４】
【図５】ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)は、そのグリコシル化シアル酸の９９％が、式示の化学構造を有する、ヒトＮＡＮＡ(Ｎ−アセチルノイラミン酸)であることを示す。しかし、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))は、そのグリコシル化シアル酸の９７％が、式示の化学構造を有する、ヒトＮＧＮＡ(Ｎ−グリコリルノイラミン酸)であることを示す。
【００１５】
【図６】開示されるＳＴＩ−００１および市販セツキシマブ(アービタックス(登録商標))のトリプシン消化によるペプチド地図を示す。
【００１６】
【図７】１７００〜１５００cm−１の波長範囲にわたる、ＳＴＩ−００１およびアービタックスの二次構造比較に使用した、フーリエ変換赤外スペクトル分析(ＦＴ−ＩＲ)を示す。スペクトル(図７)は、３生成物のプロファイルが実質的に同一であることを示し、これは、ＳＴＩ−００１とアービタックス(登録商標)の構造的類似性を示す。
【００１７】
【図８】重ね合わせた代表的近紫外線円偏光二色性プロファイルを示し、これらは、視覚的に類似している。ＳＴＩ−００１(灰色)、アービタックス−ＵＳ(黒色)およびアービタックス−ＥＵ(青色)の近紫外線スペクトル。
【００１８】
【図９】ＤＳＣ(示差走査熱量測定)走査は、ＳＴＩ−００１およびアービタックスで視覚的に類似しており、類似する熱力学的性質を示す。ＳＴＩ−００１(黒色)、アービタックス−ＵＳ(青色)およびアービタックス−ＥＵ(緑色)のＤＳＣ。
【００１９】
【図１０】ＳＴＩ抗体存在下のＡＤＣＣ細胞毒性レベルは、アービタックスより、わずかに良いとは言えないとしても、同程度良好であった。抗体非存在下または対照抗体存在下で、細胞毒性レベルは５％であった。
【００２０】
【図１１】本発明抗体存在下での補体依存性細胞毒性レベルは、アービタックスと同程度に良好であった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な記載
本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体をチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で産生したときに、安全性上の治療的利益を提供する。ＣＭＡＢ００９は、ＣＨＯ細胞で産生され、セツキシマブのアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体である。セツキシマブと比較して、癌を有する患者へのＣＭＡＢ００９の投与は、免疫原性反応の低減および、疾患進行時間の延長を含む有効性改善を示した。
【００２２】
構造的に、セツキシマブは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖を有する。セツキシマブ軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を下に記載する。
【化１】
2019508380.tif 000002
【化２】
2019508380.tif 000003
【００２３】
ここで使用する用語“ＣＭＡＢ００９”は、ＣＨＯ細胞で産生される抗体をいう。それ故に、ＣＭＡＢ００９抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖を含む。さらに、ＣＭＡＢ００９抗体は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸(ＮＧＮＡ)グリカンまたはＧａｌ−α(１,３)−Ｇａｌグリカンを含まない。ＣＭＡＢ００９抗体は、例えば、Ｇａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌグリカンを含む、ＣＨＯ細胞発現と関連するグリカンを含む。
【００２４】
ＣＨＯ細胞のグリコシル化機構は、ヒトにおけるＩｇＧグリコシル化機構に類似する。本発明は、セツキシマブと異なるグリカン構造を有する、遺伝子改変抗ＥＧＦＲ抗体(ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ)を提供する。構造解析により、セツキシマブグリカンが多数のα−Ｇａｌおよび末端シアル酸として大部分ＮＧＮＡを含むことが決定された。ＮＧＮＡは、極めて高い免疫原性を有する。ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂグリカンは、対象的に、α−Ｇａｌを含まず、末端シアル酸は主にＮＡＮＡの形である。ここに記載する臨床治験は、優勢なＮＡＮＡ  ＣＭＡＢ００９抗体が良好な耐容性を有し、薬物関連過敏性は観察されず、ＩｇＥ特異的ＡＤＡは検出されなかったことを示す。大きな免疫原性の低下と共に、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体のインビボクリアランス特性はキメラ抗体のインビボ代謝と同等であり、薬物動態パラメータは、セツキシマブのそれと一致する。
【００２５】
セツキシマブモノクローナル抗体と比較して、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体は、同じアミノ酸一次構造を有するが、α−Ｇａｌを含まず、末端シアル酸は主としてＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮＡ)である。これは、臨床治験で観察された良好な耐容性に一致する。大きな免疫原性の低下と共に、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体のインビボクリアランス特性はキメラ抗体のインビボ代謝と同等であり、薬物動態パラメータは、セツキシマブのそれと一致する。
【００２６】
本発明は、Ｎ−グリコシル化部位に少なくとも８０％ＮＡＮＡグリコシル化末端シアル酸およびＧａｌ−α(２,３／６)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有するキメラセツキシマブ様モノクローナル抗体(ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ)を提供する。開示されるＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体は、少なくとも８０％ＮＧＮＡ末端シアル酸およびＧａｌ−α(１,３)−Ｇａｌのグリコシル化パターンを有するセツキシマブ(アービタックス(登録商標))と同一のアミノ酸配列(配列番号１／配列番号３の軽鎖／重鎖)を有する、キメラ抗体である。
【００２７】
ＣＭＡＢ００９とセツキシマブの比較
両抗体を、インビトロおよびインビボでの結合、有効性について相互に比較した。図１は、Biacore結合比較を使用する、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と類似する結合動態を有する本発明抗体ＣＭＡＢ００９(別称ＳＴＩ００１)の比較を示す。共通標的ＥＧＦＲに対する結合を、細胞でも測定した。図２は、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))と類似する結合動態を有する、本発明抗体ＣＭＡＢ００９のＭＤＡ−ＭＢ４７６細胞内におけるＥＧＦＲとの細胞内結合の比較を示す。
【００２８】
有効性をインビトロでも測定し、比較した。図３は、セツキシマブに類似する結合動態を有する本発明抗体ＣＭＡＢ００９のＩＣ５０を超える用量での細胞増殖のインビトロ比較を示す。両抗体は、類似の有効性を示した。有効性をインビボでも測定し、比較した。図４は、セツキシマブと類似する結合動態を有する本発明抗体ＣＭＡＢ００９の複数用量にわたる腫瘍体積のインビボ比較を示す。両抗体は、類似の有効性を示した。
【実施例】
【００２９】
実施例１：ＣＨＯ細胞産生
チャイニーズハムスターの好ましいコドンを選択した。シグナルペプチドを、チャイニーズハムスターＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質β鎖から選択した。
【化３】
2019508380.tif 000004
ＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ−／−のリポソームベースの共トランスフェクションを実施し、安定な細胞クローンを得るためにＣＳ選択システムの圧の下、スクリーニングした。数回のトランスフェクションおよびスクリーニング後、２０pg／細胞／日より多い発現量の細胞クローンを得た。
【００３０】
実施例２：培養条件の決定
ＣＨＯ−ＣＲ−Ｇ５−／−の汎用基底培地は、化学的に規定されたタイプの培地(Chemical Defined, CD)である。この基底培地は、細胞増殖ニーズおよび特定のパーセンテージにより、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースおよび微量元素を合わせることにより製造する。この基底培地は、実施例１で得た操作細胞の初期増殖要求を満たす。操作細胞からの所望の抗体収率をさらに改善するために、ホルモン、遺伝子改変組み換え増殖因子添加、アミノ酸量調節を含み、基底培地の最適化を実施した。
培養ＰＨは６.５〜６.９であった。操作細胞の発現収率は、Ｆｅｄバッチ培養モードを使用して、最適化培地で３０pg／細胞／日より多かった。
精製後、ＣＭＡＢ００９を、標準動的光散乱(ＤＬＳ)解析により特徴付けした。ＣＭＡＢ００９は、アービタックスと比較してサイズ分布がより均一であることが決定された。アービタックスのｚ平均(ｚ−ａｖｇ)は３１.５６nmであり、一方ＣＭＡＢ００９のｚ−ａｖｇは１６.７９nmであったことが決定された。さらに、アービタックスのＰｄｌ(多分散指数)は０.３１３であるのに対し、ＣＭＡＢ００９は０.１２８であることが決定された。
【００３１】
実施例３：培養産物のグリコシル化の比較
ＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ技法を、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体およびセツキシマブ(アービタックス(登録商標))の糖鎖の比較解析に使用した。
サンプル調製：ＦａｂからのＦｃフラグメントおよびオリゴ糖を、グルコシダーゼ消化後調製し、Ｆａｂ上のオリゴ糖をオリゴ糖エキソヌクレアーゼ処理し、オリゴ糖を２−ＡＢ蛍光標識し、過剰の２−ＡＢ除去のためのＨＩＬＩＣ固相抽出後、蛍光標識糖鎖を有するオリゴ糖を得て、次いで、ＬＣ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳクロマトグラフィーにより分析した。
ＭＡｂのグリコシダーゼ処理からの遊離グリカンを、蛍光標識後、ＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳおよびオリゴ糖エキソヌクレアーゼ処理により分析した。結果は、ＣＭＡＢ００９抗体およびセツキシマブが、各々２グリコシル化部位を有することを示す。しかし、Ｆａｂセグメントは、異なるグリカン鎖構造を示した。開示されるＣＭＡＢ００９抗体は、少なくとも８０％ＮＡＮＡグリカン鎖構造を含んだ。しかしながら、セツキシマブは、少なくとも８０％ＮＧＮＡグリカン鎖構造を有した。換言すると、ＣＭＡＢ００９  Ｆａｂのグリカンはα−ガラクトースを含まず、一方セツキシマブＦａｂのグリカンは、相当量のα−ガラクトースを含んだ。
【００３２】
実施例４：臨床的耐容性研究
ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ臨床的耐容性の初期評価
最初の治験は計１８対象が登録され、単回静脈内投与の治験において、各３名、６名、６名の対象が、それぞれ１００mg／ｍ２用量、２５０mg／ｍ２用量および４００mg／ｍ２用量に割り当てられた。単回投与治験登録対象のうち、３対象が、疾患進行により中止し、治験設計に従い、残りの１５対象複数投与対象選択基準は、複数用量群ミーティングに登録され、３名のさらなる対象を、複数用量に登録した(表１)
【表１】
2019508380.tif 000005
【００３３】
本治験に登録された対象は、有効な慣用処置法に対して難治性であり、慣用処置の失敗を経験しているかまたは１０症例の結腸直腸癌、７症例の肺癌、１症例の胃癌を含む進行癌の再発を有する患者であり、対象の人口統計特徴および先の処置を表２に示す。複数投与相は、２群で設計された、群Ａは、４週間、週に１回２５０mg／ｍ２の点滴を与えた。群Ｂは、４００mg／ｍ２の初期点滴と、４週間、週１回の２５０mg／ｍ２点滴の維持用量を与えた。
【表２】
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【００３４】
比較および解析を、単回投与の３群および複数投与の２群からの対象の、対象のベースラインおよび年齢、身長、体重、体表面、ＥＣＯＧスコアについて実施した。結果を表３に示し、統計学的有意差はなかった。
【表３】
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【００３５】
結果は、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体が良好な耐容性であったことを示した。表４に示すとおり、１８対象中、グレードIII〜IV薬物関連毒性はなく、全ての発生した薬物関連毒性はグレードＩ〜IIであり、毒性発生率は用量または投与頻度と無関係であった。用量規制毒性は観察されず、薬物関連過敏性は観察されなかった。
【表４】
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【００３６】
ＣＭＡＢ００９抗体関連過敏性は、本治験で観察されなかった。セツキシマブと関連する過敏性反応について発表されている発生率は、これに反して、３１％に達し、１３％のクラスIII〜IV過敏性発生率を含む。セツキシマブ処置を受けた７６対象中、２５対象は過敏性を有し、過敏性発生率は３３％に達した(Chung et al. “Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose” New Engl. J. Med. 2008; 358 (11):  1109-17)。
【００３７】
実施例５：安全性および免疫原性の臨床試験結果
ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体臨床的安全性で、大部分の有害事象は薬物関連発疹であった。臨床的に顕著な新規毒性は観察されず、試験した７３対象で重篤な過敏性は観察されなかった。
本治験において、バイオセンサーをバイオフィルム干渉技術および光ファイバーにより製造し、その底を、生体分子適合性層にコンジュゲートしたＳＡリガンドで覆った。捕捉ビオチニル化抗体がそのリガンドに結合したら、バイオフィルム厚が増加し、反射光干渉スペクトル曲線は、測定可能な距離横滑りした。それ故に、分子間相互作用の実時間測定を行った。この方法は、捕捉抗体の自己凝集過程に等しく、これは、バイオセンサー表面の捕捉抗体についてある距離で一定範囲の最適構造を形成し、分析感度を上げるだけでなく、また直線範囲も増加させ、これは、非特異的結合からの偽陽性反応を減らすことに役立つ。
本治験におけるＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体の免疫原性解析に関して、結果は、ＡＤＡ(抗薬物抗体)が対象の１.４％(１／７３)で検出されることを示し、サブタイプ解析によりＩｇＧタイプが確認された。これは、ＩｇＥタイプＡＤＡが介在する過敏性ではなかった。この治験の結果は、臨床試験において対象に重篤な過敏性反応が観察されなかったため、臨床的安全性評価の結果に一致した。
【００３８】
実施例６：ＣＭＡＢ００９処置は、癌処置の有効性改善および免疫原性低減をもたらす
ＣＭＡＢ００９を、フェーズ２／３治験において、転移結腸直腸癌を有する患者に投与し、ＣＭＡＢ００９の有効性および免疫原性を決定した。下記のとおり、本治験からの結果を、次いで、セツキシマブを使用して行った類似試験と比較した。驚くべきことに、ＣＭＡＢ００９が、セツキシマブについて知られる有効性を超えるさらなる有効性を有することが判明した。例えば、ＣＭＡＢ００９は、患者において全生存および疾患進行までの時間の延長ができた。下記の治験は、Cunningham et al. (2004) New Eng. J. Med. 351:337-345に記載のセツキシマブ治験と同等である。
【００３９】
ＣＭＡＢ９００治験を、ＥＧＦＲ陽性、転移結腸直腸癌の患者を同定するための、スクリーニングにより開始した。５０１患者が同定され、２：１方法で、群１または群２に無作為化した。群１は３３７患者を含み、ＣＭＡＢ００９とイリノテカンの組み合わせを投与された。特に、群１の患者は、ＣＭＡＢ００９の４００mg／ｍ２の初期用量、続いて、２５０mg／ｍ２の週１回の点滴を投与された。イリノテカン用量は、各患者の治験前治療に従い維持した。群２は、１６４患者を含み、治験前の患者の治療と一致した用量でのイリノテカン単剤療法を投与された。両群の患者を、疾患が進行するかまたは患者の毒性レベルが許容されなくなるまで処置した。患者ベースライン特徴を表５に提供する。
【表５】
2019508380.tif 000009
【００４０】
患者を、群１および群２両方で放射線学的応答について評価した。結果を、表６に記載する。表６における全奏効率(ＯＲＲ)はＣＲおよびＰＲの率の加算により決定し、疾患制御率(ＤＣＲ)は、ＣＲ、ＰＲおよびＳＤの率の加算により決定したことに注意。
【００４１】
類似治験のセツキシマブで報告されるデータ(Cunningham et al. (2004) New Eng. J. Med. 351:337-345参照)と比較したとき、ＣＭＡＢ９００を受けている患者は、良好な全生存(セツキシマブ＋イリノテカンを受けている患者で８.６ヶ月対ＣＭＡＢ９００＋イリノテカンを受けている患者で１７.６ヶ月)および疾患進行までの時間延長(セツキシマブ＋イリノテカンを受けている患者で４.１ヶ月対ＣＭＡＢ９００＋イリノテカンを受けている患者で６.６ヶ月)を示した。
【表６】
2019508380.tif 000010
【００４２】
セツキシマブについて報告されているデータと比較したとき、驚くべきことに、患者の全生存は、ＣＭＡＢ００９を受けている患者で良好であり、すなわち、セツキシマブ＋イリノテカンで８.６ヶ月に対し、ＣＭＡＢ００９＋イリノテカンで１７.５ヶ月であった。このＣＭＡＢ００９治験からの疾患進行の延長を示すデータも図５に示す(公開されているセツキシマブと比較のこと；図２のCunningham et al. (2004) New Eng. J. Med. 351:337-345参照)。このＣＭＡＢ００９治験からの全生存延長を示すデータも図６に提供する(公開されているセツキシマブと比較のこと；図３のCunningham et al. (2004) New Eng. J. Med. 351:337-345)参照。
【００４３】
本治験の安全性評価を、下の表７に提供する。
【表７】
2019508380.tif 000011
【００４４】
顕著なことに、ＣＭＢＡ００９治験からの有害事象は、セツキシマブで報告されるより低かった。グレード３〜４有害事象を、下の表８に記載する(Cunningham et al. (2004) New Eng. J. Med. 351:337-345の表４と比較のこと)。
【表８】
2019508380.tif 000012
【００４５】
纏めると、同じ一次構造を有するにもかかわらず、ＣＭＡＢ９００は、驚くべきことにセツキシマブより有効であるだけでなく、例えば、疾患進行までの長い時間を提供するだけでなく、過敏性反応と関連する有害事象、例えば、挫瘡様発疹または下痢の割合を減少させた。
【００４６】
実施例７：ＣＭＡＢ００９処置結果ｉ
この実施例は、２つの抗ＥＧＦＲセツキシマブ、ＳＴＩ−００１およびアービタックス(登録商標)の物理化学的、生化学的および機能的性質の比較を記載する。これらの試験からの結果は、ＳＴＩ−００１およびアービタックス(登録商標)が、同じアミノ酸配列、一次構造、二次および三次構造ならびに熱安定性を有することを開示する。比較生物学的活性、製品関連サイズバリアント、凝集および粒子レベルは類似した。ＳＴＩ−００１は、アービタックスよりも種々の荷電バリアントおよびグリコシル化パターンを有し、これは、異なる宿主発現系の使用により引き起こされる。ＳＴＩ−００１は、９９％を超えるヒトシアル酸形態ＮＡＮＡを有する。アービタックスは、大部分非ヒトタイプシアル酸ＮＧＮＡを有する。
【００４７】
この実施例に提供する実験は、最先端分析法を使用する、ＳＴＩ−００１と２つのセツキシマブ対照製品の間の分析的類似性の評価を目的とする。比較試験は、７バッチのＳＴＩ−００１、３バッチのアービタックス−ＵＳおよび３バッチのアービタックス−ＥＵを使用した。ＳＴＩ−００１およびＵＳおよびＥＵ承認アービタックス(登録商標)の生化学的および生物物理学的インビトロ特徴付け。ＳＴＩ−００１はMabtech Inc.により製造され、およびアービタックスはＵＳ市場およびＥＵ市場から購入した。これらの試験に使用した材料および装置を表に要約する。
【表９】
2019508380.tif 000013
【００４８】
【表１０】
2019508380.tif 000014
【００４９】
還元および非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム(ＣＥ−ＳＤＳ)を、製造業者の指示に従い、Agilent Bioanalyzer 2100を使用して、セツキシマブサンプルで実施した。サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を、ＴＳＫゲルSuperSW mAb HRカラム(４μm、７.８mm×３００mm)および０.２Ｍリン酸カリウム、０.２５Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６.２の移動相を、流速０.８mL／分で使用して、セツキシマブサンプルで実施した。５０μgサンプルをカラムに載せた。データをモニターし、紫外(ＵＶ)検出器により、２８０nmで集めた。
【００５０】
ＳＴＩ−００１およびアービタックスサンプルの荷電バリアントを、フッ化炭素(ＦＣ)被覆キャピラリーカートリッジを備えたiCE3 Analyzerを使用する、ｉｃＩＥＦ(Imaging Capillary Isoelectric Focusing)により決定した。両性イオン溶液は、４％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ｐＨ３〜１０、０.３５％(Ｖ／Ｖ)メチルセルロース、１Ｍ  尿素と、ｐＩマーカー６.６１および９.５０各０.７％(Ｖ／Ｖ)からなった。セツキシマブサンプルをＤＩ水で２mg／mLに希釈し、次いで、３：１７(Ｖ／Ｖ)比で両性イオン溶液と混合した。陽極液(analyte)は８０mMリン酸であり、陰極液は１００mM水酸化ナトリウムであり、両方０.１％ＭＣであった。充填したら、サンプルを、１,５００ボルト電圧で１分、続いて３,０００ボルト電圧で６分の導入によりフォーカスさせた。フォーカスさせたセツキシマブの画像を、２８０nm  ＵＶ光を、キャピラリーから電荷結合素子(ＣＣＤ)デジタルカメラのレンズにとおすことにより得た。
【００５１】
ＤＳＣ(示差走査熱量測定)実験を、MicroCal VP-DSCで実施した。サンプルを解析前製剤緩衝液で１mg／mLに希釈し、１０分脱気した。対照セルを製剤緩衝液で満たした。サンプルを、６０℃／時間の加熱速度で２０℃から９０℃まで加熱した。プレスキャンは１５分であり、フィルタリング時間は１０秒であり、フィードバックモード／獲得は、受動に設定した。熱転移温度中間点(Ｔｍまたは熱転移温度)を、Origin 7ソフトウェアを使用するデータ解析により得た。
【００５２】
アービタックスおよびＳＴＩ−００１(脱グリコシル化)の還元タンパク質解析のために、まず抗体(２０μg)をFabRICATORで処理して、タンパク質をヒンジ領域で開裂させた。次いで得られた溶液を、変性および還元のためにRapid PNGase F緩衝液で８０℃で１０分、脱グリコシル化のためにRapid PNGase Fで５０℃で１５分、処理した。
【００５３】
ＬＣＭＳ解析のために、一定量(５μg)サンプルをWaters Acquityカラム(BEH300 C4、１.７μm、２.１ｘ１５０mm、８０℃カラム温度)に注入した。抗体を、１２分勾配(２５〜４０％Ｂ、０.４mL／分流速)でカラムから溶出させた。還元抗体解析のために、前実験を、Waters Xevo G2 TOFマススペクトロメーターに連結したWaters HクラスUPLCシステムで実施した。マススペクトロメーターを、５００〜４０００ｍ／ｚの範囲を検出する、陽イオン中、感受性モードで操作した。製造元パラメータは次のとおりであった：キャピラリー電位、３.０kV；サンプリングコーン電圧、４０.０Ｖ；製造元温度、１２５℃；脱溶媒和温度、３５０℃；コーンガス流、１０Ｌ／時間；脱溶媒和ガス流、８００Ｌ／時間。タンパク質ピークを、次のパラメータによりMassLynx MaxEnt1機能によりデコンヴォルーションした：出力分解能、２.０Da／チャネル；均一ガウシアン半値幅(uniform Gaussian width at half height)、インタクト抗体について０.８Da、還元抗体について０.５Da；左および右について最小強度比３３％；反復最大数２０。
【００５４】
トリプシンでの還元ペプチドマッピングのために、抗体を変性緩衝液(６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、３６０mM  Ｔｒｉｓ、１mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.６)で１mg／mlに希釈し、ＤＴＴ(最終濃度５mM、８０℃で１５分)で還元し、ヨードアセトアミド(最終濃度１５mM、３７℃で１５分)でアルキル化した。次いで、サンプルを消化緩衝液(２５mM  Ｔｒｉｓ、１mM  ＣａＣｌ２、ｐＨ８.３)に移した。消化緩衝液中のサンプルを、トリプシンで４時間、３７℃で消化させた。次いで消化をギ酸で停止させて、０.２％(ｖ／ｖ)の最終濃度とした。
【００５５】
次いで、ペプチドを、Ｑ−ＴＯＦマススペクトロメーターにオンラインで連結したWaters UPLCで解析した。一定量(１０μg)サンプルを、Agilent AdvanceBioペプチドマッピングカラム(Ｃ１８、２.７μm、２.１×１５０mm)に注入した。抗体を、０〜１９％を３０分、１９％〜２７％を１８分および２７〜５１％を２７分の勾配でカラムから溶出し、流速は２００μL／分であり、カラム温度は４５℃に設定した。移動相Ａは０.１％ギ酸および移動相Ｂはアセトニトリル中０.１％ギ酸であった。
【００５６】
ＦＴＩＲ実験は、HTL Biosolution Inc., Camarillo, CAにより実施された。簡潔には、ＦＴＩＲスペクトルを、室温ＴＧＳ検出器およびｓＡＴＲデバイスを備えたJASCO 4200 FTIRスペクトロメーターに集めた。スペクトルを、２５６走査のデータ平均の４cm−１解像度で回収した。残存湿度ピークも、さらに解析する前にサンプルのスペクトルから減算した。緩衝液のＦＴＩＲスペクトルも回収しており、緩衝液のスペクトルは、タンパク質サンプルから減算されている。緩衝液スペクトルの減算後、残存湿度ピークをまた回収した全スペクトルから減算した。最後に、第二誘導スペクトルを、多項式関数の二次を有するSavitzky-Golay法を使用して計算し、コンボリューション点の数は１３である。
【００５７】
ＣＤ実験は、Alliance Protein Laboratories, San Diego, CAにより実施された。抗体サンプルを、近ＵＶ  ＣＤのために製剤緩衝液で１mg／mlに希釈した。ＣＤ測定を、室温で、Jasco J-715分光旋光計で、１cmセルを使用して実施した。緩衝液スペクトル減算後、タンパク質のＣＤスペクトルを、該タンパク質濃度、１０９.８５の平均残基重量(アミノ酸あたりの平均重量)およびセルの経路長を使用して、平均残基楕円率(アミノ酸あたりのＣＤ強度)に変換した。
【００５８】
動的光散乱法(ＤＬＳ)測定を、Malvern ZEN3600で室温で実施した。散乱光を、９０°の角度で検出した。Ｎ結合オリゴ糖解析について、Ｎ−グリカンを、PNGase Fを使用して変性条件下２００μgのタンパク質から遊離させ、続いてＳＰＥカートリッジ(Ｃ１８およびＰＧＣ)を使用してグリカンを精製した。Ｎ結合グリカンを２−Ａｂで標識し、ＵＰＬＣ−ＦＬＲおよびマススペクトロメーターにより検出した。総シアル酸解析のために、シアル酸解析は、ＵＣＳＤ(University of California, San Diego) Glycotechnology Core Facility, La Jolla, CAにより実施された。抗体サンプルを２Ｍ酢酸の最終濃度で溶解し、８０℃で３時間加熱して、シアル酸を遊離させた。遊離シアル酸を、３,０００ＭＷＣＯを用いるｕｌｔｒａ−１０フィルターで濾過することにより回収し、乾燥させ、Ｎ−アセチルノイラミン酸とＮ−グリコリルノイラミン酸を分離する酢酸ナトリウム勾配で溶出するDionex CarboPac PA-1カラムを使用するHPAEC-PADにより解析した。
【００５９】
細胞結合アッセイは、無酵素細胞解離緩衝液(ＧＩＢＣＯ)を用いて回収した、ＥＧＦＲを高度に発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８トリプルネガティブ乳癌(ＴＮＢＣ)細胞を提供し、Ｖ底９６ウェルプレート(５０,０００細胞／ウェル)に移した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ)で連続希釈したＳＴＩ−００１抗体と共に、４５分間、氷上でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、フィコエリトリンコンジュゲート抗ヒトＩｇＧの１：１０００希釈を添加し、２０分インキュベートした。最終洗浄後、蛍光強度を、Hypercyt High Throughput Flow Cytometer(HTFC, Intellicyt)で測定した。データをGraphpad Prismソフトウェアおよび非線形回帰フィットを使用して解析した。データ点を、正に標識された細胞の中央蛍光強度(ＭＦＩ)±標準誤差として示す。ＥＣ５０値を、細胞への最大結合の５０％を達成する、抗体濃度として報告する。
【００６０】
細胞増殖アッセイ提供のために、対数増殖期のＥＧＦＲ発現細胞(ＭＤＡ−ＭＢ−４６８)を採り、ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳに５５,５５５細胞／mlで再懸濁した。細胞を白色９６ウェル透明底プレートに播種した(９０μlに５,０００細胞／ウェル)。同日、抗体の連続希釈物をＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ中、１０倍予混合で調製し、細胞(１０μｌ／ウェル)にトリプリケートで添加した。３７℃で３日インキュベーション後、細胞増殖を次のとおり解析した：１００μlのCell Titer Glo緩衝液(Promega)を各ウェルに添加した。プレートを、室温で２０分振盪させながらインキュベートした。次いで、発光シグナルをFlexstation 3プレートリーダーで測定した。データを相対的発光単位として報告した。用量応答曲線をGraphPad prismで作成し、ＩＣ５０値を、非線形回帰フィットを使用して計算した(対数(阻害剤)対応答  −  可変傾斜式)。
【００６１】
抗ヒトＦｃ抗体(ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９)を、標準ＮＨＳ／ＥＤＣ結合法を使用して、約１０００ＲＵまでＣＭ５センサーチップ(Biocore)に固定化した。抗体(約５μg／mL)を、６０秒、流速１０μL／分で捕捉した。組み換えヒトＥＧＦＲ／Ｈｉｓを、ランニング緩衝液(ＨＢＳ−ＥＰ)で連続的に希釈した。全測定を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、３０μL／分の流速で実施した。抗体を適当に希釈して、一連の濃度を得た。１：１(ラングミュア)結合モデルをデータのフィットに使用した。実験を、GE Biacore T200で行った。
【００６２】
試験抗体存在下または非存在下でプレインキュベートしたトリプルネガティブ乳癌細胞株を、ナチュラルキラー細胞(エフェクター細胞)と培養した。適当な期間の後、腫瘍細胞溶解量を決定した。
【００６３】
エフェクター細胞(ＮＫ細胞)：末梢血単核細胞を、いずれもStemcell TechnologiesからのSepMate-50チューブ(Cat.# 15450)およびLymphoprep(Cat.#0780)を使用して、San Diego血液銀行から得た血液から調製した。ここから、ＮＫ細胞を、またStemcell TechnologiesからのEasySep陰性選択“Human NK cell Enrichment Kit” Cat.# 19055を使用して単離した。次いで、得られたＮＫ細胞(＞９５％純度)集団を、１０％ウシ胎児血清＋インターロイキン２(Prospec, Ness Ziona, Israel)を１００Ｕ／mlで添加したＲＰＭＩ培地で培養した。翌日、細胞を採取し、洗浄し、新鮮ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。
【００６４】
標的細胞の調製：ＥＧＦＲ陽性、トリプルネガティブ、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに維持した。アッセイの日、細胞を、細胞解離緩衝液(Gibco cat# 13151-014)を利用して、培養フラスコから除去した。細胞が剥離したら、洗浄し、新鮮ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。
【００６５】
アッセイ実行：標的細胞を、平底白色プレート(Costar cat# 3917)のウェルに、５×１０３／ウェルで添加した。１０μg／mlの試験抗体または培地を、適切なウェルに添加した。２０分、３７℃後、プレートを洗浄し、続いてエフェクター細胞(１.５×１０５／ウェル)を添加して、エフェクター対標的比３０：１とする。４時間、３７℃後、CytoTox-Gloキット(Promega Cat.# G9291)からの基質を添加し、プレートを、該キットに提供された指示に従い処理した。
【００６６】
抗ＥＧＦＲ結合ＥＬＩＳＡアッセイは、直接結合ＥＬＩＳＡ形式を使用した。組み換えヒトＥＧＦＲ−Ｈｉｓ(Cat#10001-H08H, lot# LC08DE1601, Sino Bio)をマイクロタイタープレートに吸着させ、続いてプレートをブロックし、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ希釈物を添加した(出発濃度１０ng／mLのｍＡｂで２.５倍連続希釈)。ＨＲＰ(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)標識抗ヒトＩｇＧ試薬は、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを結合する。最後に、ＨＲＰにより可視色に変換される、基質(ＴＭＢ)を添加した。次いでＨＲＰ酵素反応を酸で停止させ、色シグナルをプレートリーダーにより検出する。結合した抗ＥＧＦＲ量は、発生した色の量と直接比例した。各段階後で、基質添加前、過剰の未結合試薬を除去するための洗浄工程がインキュベーション間に含まれた。ｍＡｂのＥＣ５０値を、Ａ４５０対ｍＡｂ濃度をプロットし、曲線をシグモイド用量−応答解析(４パラメータフィット)にフィッティングすることにより、Prism 7で計算した。
【００６７】
抗体ＳＴＩ−００１を、一対一で、ＥＵおよびＵＳ市場からの対照医薬品(ＲＭＰ)−アービタックス(登録商標)と比較した。ロット情報を表８に提供する。
【表１１】
2019508380.tif 000015
【００６８】
比較特徴付け結果を表９および１０に要約する。ＳＴＩ−００１の一次および高次構造ならびにサイズバリアントは、アービタックス(ＵＳ)およびアービタックス(ＥＵ)ＲＭＰに類似する。ＳＴＩ−００１およびアービタックスＲＭＰの凝集、粒子レベルおよび製品純度は同等である。さらに、増殖バイオアッセイ、抗原結合アッセイ、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ、ＦｃγＲ結合アッセイなどのエフェクター機能を含む機能的生物学的特徴付けはＳＴＩ−００１が、アービタックス(ＵＳ)およびアービタックス(ＥＵ)と等価な生物学的活性を有することを確認した。ＳＴＩ−００１は、アービタックスＲＭＰと異なるグリコシル化パターンを示している。ＳＴＩ−００１は、優勢ヒトシアル酸形態Ｎ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮＡ)を有する。アービタックスは、優勢非ヒトシアル酸形態Ｎ−グリコリルノイラミン酸(ＮＧＮＡ)を有する。
【００６９】
【表１２】
2019508380.tif 000016
【００７０】
【表１３】
2019508380.tif 000017
【００７１】
抗体アミノ酸配列同定を、ＳＴＩ−００１およびアービタックスのインタクト分子でＬＣ−ＭＳ解析と組み合わせたトリプシンペプチドマッピングにより実施した。同一のアミノ酸配列があった。図６は、代表的クロマトグラフ的プロファイルを示す。データは、ＳＴＩ−００１が、ＵＳ市販アービタックスおよびＥＵ市販アービタックスのものと適合するクロマトグラフ的プロファイルを有することを示した。３品の比較で、付加的ペプチドまたは欠失ペプチドは検出されなかった。
【００７２】
ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳ)およびアービタックス(ＥＵ)の一次構造類似性も、還元および脱グリコシル化ＨＣおよびＬＣ質量解析を使用して調査した。ＨＣおよびＬＣ解析の結果を表１１に示し、これは、ポリペプチド組成物が類似の測定分子量を有したことをさらに確実にする。
【表１４】
2019508380.tif 000018
【００７３】
フーリエ変換赤外スペクトロスコピー(ＦＴ−ＩＲ)を、１７００〜１５００cm−１の波長範囲にわたり、ＳＴＩ−００１およびアービタックスの二次構造比較に使用した。スペクトル(図７)は、３生成物のプロファイルが実質的に同一であることを示し、これは、ＳＴＩ−００１とアービタックス(登録商標)の構造類似性を示す。
【００７４】
抗体の三次構造を、近紫外線円偏光二色性(ＣＤ)により決定した。“近ＵＶ”スペクトル領域(２５０〜３５０nm)でのタンパク質のＣＤスペクトルは、三次構造のある態様を感知できる。これらの波長で、発色団は芳香族アミノ酸およびジスルフィド結合であり、それらが産生するＣＤシグナルは、タンパク質の全体的三次構造を感知する。全ての個々のＳＴＩ−００１ロットの近ＵＶ−ＣＤスペクトルは、アービタックスと比較して類似した。図８は重ね合わせた代表的近紫外線−ＣＤプロファイルを示し、これは、類似して見える。
【００７５】
ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳおよびＥＵ承認)製品の熱力学的性質を、ＤＳＣ(示差走査熱量測定)により測定し、比較した。ＤＳＣ走査は、ＳＴＩ−００１およびアービタックスＲＭＰで類似して見え(図９)、熱融解温度は３品で類似し(表１２)、類似する熱力学的性質を示す。
【表１５】
2019508380.tif 000019
【００７６】
抗原結合を測定して、抗ＥＧＦＲ抗体(ＳＴＩ−００１およびアービタックスＵＳおよびアービタックスＥＵ)の組み換えＥＧＦＲ／Ｈｉｓへの結合親和性を決定した。これはBiacoreにより測定した。Ｋｄ値を表１３に示す。抗ＥＧＦＲ抗体アービタックス(ＵＳおよびＥＵ)およびＳＴ−００１は、表１３に示すとおり、ヒトＥＧＦＲタンパク質への結合について類似する動態特性を示した。
【表１６】
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【００７７】
ＳＴＩ−００１、アービタックス(ＵＳ／ＥＵ)を、同族抗原に対して、標準ＥＬＩＳＡで力価測定し、ＥＬＩＳＡにより抗原結合親和性を測定するために、ＨＲＰ標識二次抗体を使用して検出した。表１４は、ＥＣ５０値が、これら抗体ロットで類似することを示す。
【表１７】
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【００７８】
細胞ベースの抗原結合アッセイは、ＥＧＦＲを高度に発現するトリプルネガティブ乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を用いて、ＳＴＩ−００１およびアービタックスの結合を測定した。
表１５に示す結果によると、ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳおよびＥＵ)の間に有意な差は見られなかった。抗体は、細胞抗原に同等な親和性で結合する。
【表１８】
2019508380.tif 000022
【００７９】
細胞増殖アッセイは、細胞増殖アッセイにおいてＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳおよびＥＵ)の抗増殖性効果を測定した。簡潔には、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、ＳＴＩ−００１またはアービタックス存在下で３日培養し、次いで細胞生存能を測定した。表１６に示す結果は、ＳＴＩ−００１およびアービタックスが、細胞増殖に極めて類似する阻害活性を示すことを示す。
【表１９】
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【００８０】
ＳＴＩ−００１またはアービタックス(ＵＳ／ＥＵ)を、標準ＥＬＩＳＡで濃度を上げながら組み換えＦｃγＲＩと結合させた。ＥＣ５０値を、４ＰＬ曲線解析から導いた。結果は、これら抗体のＥＣ５０値が、ＳＴＩ−００１およびアービタックスで全て類似することを示す。
【表２０】
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【００８１】
ＡＤＣＣを支持する能力について、ＳＴＩ−００１抗体をアービタックスＥＵおよびアービタックスＵＳと比較した。これらの試験のために、トリプルネガティブＥＧＦＲ発現乳癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞と、１０μg／ml試験抗体存在下または非存在下で培養した。細胞毒性の測定を、４時間のインキュベーション後、Promegaからのルシフェラーゼベースのキットを使用して実施した。図１０は、ＳＴＩ抗体存在下のＡＤＣＣ細胞毒性のレベルは、アービタックスより、わずかに良いとは言わないが、同程度良好であったことを示す。抗体非存在下または対照抗体で、細胞毒性レベルは５％であった。
【００８２】
補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)を支持する能力について、ＳＴＩ−００１抗体をアービタックスＥＵおよびアービタックスＵＳと比較した。これらの試験のために、トリプルネガティブＥＧＦＲ発現乳癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、１０μg／mlで添加した試験抗体の存在下または非存在下で培養した。２０分後、子ウサギ補体を１０％ｖ／ｖ溶液として添加した。細胞毒性評価のために、ヨウ化プロピジウムを、１時間インキュベーション後に添加し、死滅細胞パーセンテージをフローサイトメトリーにより定量した。図１１は、開示される抗体存在下の補体依存性細胞毒性のレベルが、アービタックスと同程度良好であったことを示す。
【００８３】
製品モノマー含量を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した(表１８)。ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳ)およびアービタックス(ＥＵ)いずれも、優勢なモノマー含量(＞９７％)を示した。これらの結果は、ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳ)およびアービタックス(ＥＵ)が、純度の点で類似することを確認した。
【表２１】
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【００８４】
動的光散乱法(ＤＬＳ)は、直径１nm単位までの粒子径を測定できる技術である。懸濁液中の粒子は、無作為ブラウン運動を受ける。これらの粒子がレーザービームにより照射されたら、散乱光の強度が、粒子径に依存する割合で変動する。これらの強度変動の解析が、ブラウン運動速度、従って、粒子径をもたらす。表１９は、ＳＴＩ−００１およびアービタックスサンプルの３反復測定から得た強度サイズ分布を示す。ＳＴＩ−００１およびアービタックスは、類似する主サイズ分布を有する。
【表２２】
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【００８５】
ＣＥ−ＳＤＳを、製品純度評価に使用した。ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳおよびＥＵ)を、非還元および還元条件下分析した。既知分子量のタンパク質マーカーおよびサンプルを、平行に流した。ＣＥ−ＳＤＳは、ＳＴＩ−００１およびアービタックス(ＵＳおよびＥＵ)が、還元および非還元条件両方で、同じ純度を有することを示した(表２０)。
【表２３】
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【００８６】
ＳＴＩ−００１およびアービタックスの荷電バリアントを、イメージングキャピラリー等電点分画(ｉｃＩＥＦ)により解析した。ＳＴＩ−００１およびアービタックスＲＭＰを、異なる宿主細胞を使用することにより発現させた。ＳＴＩ−００１はＣＨＯ細胞系を使用し、アービタックスはＳＰ２／０細胞株を使用した。手順も異なる。それ故に、荷電バリアントは、異なることが予測される。しかしながら、それらの主ｐＩｓおよび荷電バリアントパーセンテージは極めて類似した。
【００８７】
１.１ グリカン解析
Ａｓｎ  ２９７での保存Ｆｃグリコシル化に加えて、セツキシマブはまたＶＨドメインＡｓｎ  ９９にもう一つのＮ結合グリコシル化部位を有する。ＳＴＩ−００１およびアービタックスＲＭＰに関連するグリカン不均質性を比較するために、ＬＣ−ＭＳ、遊離グリカンマススペクトロメトリーおよび総シアル酸解析を含むいくつかの方法を使用した。
ＦｃおよびＦａｂグリコシル化を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより遊離させ、２−ＡＢ(２−アミノベンズアミド)で標識した。２−Ａｂ標識グリカンをＵＰＬＣおよびＴＯＦ−ＭＳにより解析する。ＵＰＬＣクロマトグラムは、ＳＴＩ−００１およびアービタックスが異なるグリカンプロファイルを有することを示した。アービタックスは、ＳＴＩ−００１よりも多くのオリゴ糖種を示した。表２１は、特定されたグリカン形態全ておよびそれらの相対的存在量を示す。
【００８８】
ＳＴＩ−００１およびアービタックスにより示されるグリカン構造をキャッピングするシアル酸のそれぞれの形態の量を評価した。シアル酸は、アービタックスについてはＮ−グリコリル−ノイラミン酸(ＮＧＮＡ)が、そしてＳＴＩ−００１についてはＮ−アセチル−ノイラミン酸(ＮＡＮＡ)が主に検出された(表２２)。ヒトにより製造される優勢なシアル酸はＮＡＮＡである。ＮＧＮＡは、ヒトにおける免疫原性／過敏性に寄与する可能性が示されている。ＳＴＩ−００１は、ヒトシアル酸形態ＮＡＮＡを有する。アービタックスは非ヒトタイプシアル酸ＮＧＮＡを有する。
【表２４】
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【００８９】
結論として、前記解析比較は、ＳＴＩ−００１およびアービタックス(登録商標)(ＵＳおよびＥＵ)抗体が同じアミノ酸配列、一次構造、二次および三次構造および熱安定性、極めて同等な純度、不純物、生化学的および機能的性質を有することを示す。しかし、ＳＴＩ−００１は、アービタックス(ＵＳおよびＥＵ)と異なる荷電バリアントおよびグリコシル化パターンを有する。ＳＴＩ−００１は、９９％を超えるヒトシアル酸形態ＮＡＮＡを有する。アービタックスは、多くの非ヒトタイプシアル酸ＮＧＮＡを有し、これがヒトにおける免疫原性／過敏性を誘発すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2019508380.tif 000032
【図５】
2019508380.tif 000033
【図６】
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【図７】
2019508380.tif 000035
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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