(57)【要約】  概して、本発明は、抗体の分野に関する。特に、本発明は、所望の鎖対形成が起こる、および／または選択されるように修飾された多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体に関する。具体的には、これは、軽鎖対形成のための異なる二量体形成ドメインを使用することによって達成される。本発明は、これらの抗体をコードする核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、それらを発現する細胞にさらに関し、さらに当該抗体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、抗体を単離する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体重鎖Ａ、軽鎖Ａまたは、それらの二量体であって、該重鎖は、二量体形成ドメインＣＨ２Ｈと連結された可変ドメインＶＨＡを含み、該軽鎖は、二量体形成ドメインＣＨ２Ｌと連結された可変ドメインＶＬＡを含み、ＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌの両方は、ＩｇＭ定常ドメインＭＣＨ２またはＩｇＥ定常ドメインＥＣＨ２である、前記抗体重鎖Ａ、軽鎖Ａまたは、それらの二量体。
【請求項２】
請求項１に記載の重鎖Ａおよび軽鎖Ａを含む、抗体またはその誘導体。
【請求項３】
重鎖Ｂおよび軽鎖Ｂをさらに含み、重鎖Ｂは、可変ドメインＶＨＢを含み、軽鎖は、可変ドメインＶＬＢを含み、該抗体または誘導体は、好ましくは、多重特異性である、請求項２に記載の抗体または誘導体。
【請求項４】
それぞれが請求項１に記載の第１および第２の重鎖Ａならびに第１および第２の軽鎖Ａを含み、
（ｉ）第１の軽鎖ＡのＣＨ２Ｌドメインは、ＩｇＧ抗体もしくはその誘導体のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインと連結され、第２の軽鎖ＡのＣＨ２Ｌドメインは、ＩｇＧ抗体もしくはその誘導体のその他方のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインと連結されるか、または
（ｉｉ）第１の軽鎖ＡのＣＨ２Ｈドメインは、ＩｇＧ抗体もしくはその誘導体のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインと連結され、第２の軽鎖ＡのＣＨ２Ｈドメインは、ＩｇＧ抗体もしくはその誘導体の他方のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインと連結される、請求項３に記載の抗体または誘導体。
【請求項５】
抗体または誘導体は、非対称性であり、好ましくは、ＶＨＢは、二量体形成ドメインＤＩＭＨと連結され、ＶＬＢは、二量体形成ドメインＤＩＭＬと連結され、ＤＩＭＨおよびＤＩＭＬは、それぞれＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌとは異なる二量体形成ドメインである、請求項２または３に記載の抗体または誘導体。
【請求項６】
ＶＨＢは、二量体形成ドメインＤＩＭＨと連結され、ＶＬＢは、二量体形成ドメインＤＩＭＬと連結され、ＤＩＭＨおよびＤＩＭＬは、それぞれＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌとは異なる二量体形成ドメインであり、
（ｉ）ＤＩＭＨは、ＣＨ２ＨもしくはＣＨ２Ｌと連結されるか、もしくはＤＩＭＬは、ＣＨ２ＨもしくはＣＨ２Ｌと連結される、
（ｉｉ）ＣＨ２Ｈは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２Ａと連結され、ＤＩＭＨは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２Ｂと連結され、場合により、ＣＨ２Ａは、定常ドメインＣＨ３Ａと連結され、ＣＨ２Ｂは、定常ドメインＣＨ３Ｂと連結されるか、または
（ｉｉｉ）（ｉｉ）に付け加えて、重鎖Ａは、ＶＨＡと連結されたさらなる重鎖可変ドメインＶＨＸをさらに含み、軽鎖Ａは、ＶＬＡと連結されたさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＸをさらに含み；および／または重鎖Ｂは、ＶＨＢと連結されたさらなる重鎖可変ドメインＶＨＹをさらに含み、軽鎖Ｂは、ＶＬＢと連結されたさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＹをさらに含む、
請求項５に記載の抗体または誘導体。
【請求項７】
抗体またはその誘導体は、抗体の単離を容易にする１つまたはそれ以上の改変を含み、１つまたはそれ以上の改変は、好ましくは、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成を容易にするか、またはこの対形成を選択することを可能にさせ、改変は、好ましくは：
−  一方の重鎖におけるＴ３６６Ｙ突然変異および、場合により、さらにＳ３５４ＣおよびＴ１６６Ｗ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＹ４０７Ｔ突然変異および、場合により、さらにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異、
−  一方の重鎖におけるＴ３６６Ｗ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異、
−  一方の重鎖におけるＦ４０５Ｌ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＫ４０９Ｒ突然変異、
−  一方の重鎖におけるＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ突然変異、
−  一方の重鎖におけるＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ突然変異、
−  一方の重鎖におけるＤ２２１Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＤ２２１Ｒ、Ｐ２２８ＲおよびＫ４０９Ｒ突然変異、
−  一方の重鎖におけるＳ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ突然変異、ならびにＹ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ突然変異、
−  一方の重鎖に関するＩｇＧ／Ａキメラ、ならびに他方の重鎖に関するＩｇＡ／Ｇキメラ、
−  ＩｇＧ３由来の一方の重鎖のＦｃ領域もしくはその一部、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４由来の他方の重鎖のＦｃ領域もしくはその一部、
−  一方の重鎖におけるＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ突然変異、ならびに他方の重鎖におけるＴ４０７Ｔ突然変異、ならびに／または
−  一方の重鎖におけるＨ４３５Ｒ突然変異、ならびに他方の重鎖における突然変異なし、
のうちの１つまたはそれ以上である、請求項５または６に記載の抗体または誘導体。
【請求項８】
重鎖は、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異およびプロテインＡとの結合を低減する１つまたはそれ以上の突然変異を含み、好ましくは、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異のｈｏｌｅ突然変異を含む重鎖は、プロテインＡとの結合を低減する１つまたはそれ以上の突然変異を含む、請求項７に記載の抗体または誘導体。
【請求項９】
１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドであって、請求項１に記載の重鎖Ａおよび／もしくは軽鎖Ａまたは請求項２〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくは誘導体をコードする、前記１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
１つまたはそれ以上の発現ベクターであって、請求項９に記載の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、前記１つまたはそれ以上の発現ベクター。
【請求項１１】
細胞であって、請求項９に記載の１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載の１つもしくはそれ以上の発現ベクターを含む前記細胞。
【請求項１２】
医薬組成物であって、薬学的に許容される担体ならびに請求項１の重鎖Ａおよび軽鎖Ａの二量体または請求項２〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくは誘導体を含む、前記医薬組成物。
【請求項１３】
第２の態様の抗体またはその誘導体を単離する方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の重鎖Ａおよび軽鎖Ａならびに請求項２に記載の重鎖Ｂおよび軽鎖Ｂを含む溶液を準備する工程、
（ｉｉ）重鎖Ａの軽鎖Ａとの対形成および／または重鎖Ｂの軽鎖Ｂとの対形成を選択する手段を用いずに抗体または誘導体を精製する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
抗体または誘導体は、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成を選択する手段を用いて精製され、手段は、好ましくは、
ａ）プロテインＡ結合を選択する手段、
ｂ）ＣＨ１ドメインもしくはＣκドメインの存在、もしくはＣＨ２ドメインの不在を選択する手段、または
ｃ）ａ）およびｂ）の、好ましくは、その順序での組み合わせ
である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体またはその誘導体は、請求項７に記載のものであり、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異のｈｏｌｅ突然変異を含む重鎖は、プロテインＡとの結合を低減する１つもしくはそれ以上の突然変異を含み、抗体または誘導体は、プロテインＡ結合を選択することによって精製される、方法であって、ＣＨ１ドメインもしくはＣκドメインの存在、またはＣＨ２ドメインの不在を選択することを含まない、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
概して、本発明は、抗体の分野に関する。特に、本発明は、所望の鎖対形成が起こる、および／または選択されるように修飾された多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体に関する。具体的には、これは、軽鎖対形成のための異なる二量体形成ドメインを使用することによって達成される。本発明は、これらの抗体をコードする核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、それらを発現する細胞にさらに関し、さらに当該抗体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、抗体を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に生じるＩｇＧ抗体は、二価および単一特異性である。複数の異なる抗原に対して結合特異性を有する多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、組み換え技術を使用して作製することができ、幅広い臨床用途を有することが見込まれる。完全なＩｇＧ抗体分子は、４つのポリペプチド鎖：２つの重鎖および２つの軽鎖を含むＹ状分子であることがよく知られている。それぞれの軽鎖は、２つのドメインから成り、Ｎ末端ドメインが可変またはＶＬドメイン（もしくは領域）と知られており、Ｃ末端ドメインが定常（すなわち、ＣＬ）ドメイン（定常カッパ（Ｃκ）もしくは定常ラムダ（Ｃλ）ドメイン）と知られている。それぞれの重鎖は、抗体クラスにより４つまたは５つのドメインから成る。Ｎ末端ドメインは、後に第１の定常（すなわち、ＣＨ１）ドメイン、ヒンジ領域、その後、第２および第３の定常（すなわち、ＣＨ２およびＣＨ３）ドメインが続く可変（すなわちＶＨ）ドメイン（または領域）と知られている。集合した抗体では、ＶＬおよびＶＨドメインが互いに結合して抗原結合部位を形成する。また、ＣＬおよびＣＨ１ドメインは、互いに結合して一方の重鎖が一方の軽鎖と結合するのを維持する。２つの重鎖・軽鎖ヘテロ二量体は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの相互作用および２つの重鎖にあるヒンジ領域間の相互作用によって互いに結合する。
【０００３】
単一分子内にいくつかの抗体の抗原結合部位を併せ持つため、いくつかの異なる抗原と同時に結合することができるであろう多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を作製することが関心の対象となってきた。そのような分子は、診断目的の利用の他に、例えば、強力なエフェクター系を（癌細胞が、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のような、モノクローナル抗体によって誘発される正常な免疫応答を抑制するメカニズムを生じることが多い）疾患領域に再び向けることによって、または抗体の活性の中和もしくは刺激を高めることによって新しい治療用途への道を開く。この可能性は、早い時期に認識され、そのような多重特異性抗体を得るための多くのアプローチにつながった。治療のための、異なる標的抗原に対する２つの完全抗体の結合特異性を結合するための最初の試みは、化学的に融合したヘテロ結合分子（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を利用した（非特許文献１）。
【０００４】
単一の宿主細胞において２つの軽鎖および２つの重鎖を共発現させることによる、例えば、二重特異性ＩｇＧ（ＢｓＩｇＧ）の作製は、所望のＢｓＩｇＧの収率の低さおよび緊密に関連した誤対合ＩｇＧ夾雑物を除去する難しさのため、極めて困難な可能性がある（非特許文献２）。これは、重鎖がホモ二量体ならびに所望のヘテロ二量体を形成することを示す−重鎖対形成問題。さらに、軽鎖が非同種重鎖と誤った対形成をする可能性がある−軽鎖対形成問題。したがって、２つの抗体の共発現は、所望のＢｓＩｇＧの他に９つの望ましくないＩｇＧ種を生じる可能性がある。
【０００５】
ヘテロ二量体形成に関する抗体重鎖の操作が、ＢｓＩｇＧ重鎖対形成問題をうまく克服する方策として現れた。ＩｇＧにおける２つの重鎖のホモ二量体形成には、ＣＨ３ドメイン間の相互作用のみが関係する。重鎖は、最初に、１９９０年代に「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」方策を使用してヘテロ二量体形成に関して操作された。ＣＨ３ホモ二量体形成を退けて、「ｈｏｌｅ」突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）（非特許文献３）を補う「ｋｎｏｂ」突然変異（Ｔ３６６Ｗ）（非特許文献４）からの開始が、ファージディスプレイが、ホモ二量体形成を退けると同時に「ｋｎｏｂ」と効率的な対形成をもたらすことによって特定された。ＩｇＧドメイン接合面の入り交じった状態が、近年、重鎖ヘテロ二量体形成に関するいくつかの他の上首尾の方策につながった。
【０００６】
さらに、軽鎖対形成問題を克服するいくつかの方策が開発された。軽鎖の誤った対形成は、軽鎖の多様性が限定されたファージディスプレイライブラリーから特定された共通の軽鎖を有する抗体を使用することによって未然に防ぐことが可能である（非特許文献５）。さらに最近、共通の軽鎖を有する抗体が、単一の軽鎖を有するトランスジェニックマウスを含む、他の技術により特定された（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒら、特許文献１）。現在、ＢｓＩｇＧへの最も広く使用されている経路は、２つの異なる宿主細胞における抗体構成要素の個々の発現に続く、精製およびインビトロにおけるＢｓＩｇＧへの構築による（非特許文献６）。共通の軽鎖アプローチを超える２つの宿主細胞法の重大な利点は、それらが、既存の抗体に対してはるかに広く適用可能であることである。さらに、２つの異なる軽鎖が、抗原結合親和性および特異性に一般に寄与する。共通の軽鎖と比較して２つの宿主細胞法の欠点は、それらが大幅に高い費用および製造の複雑さと関連付けられることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０９７６０３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｔａｅｒｚら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１２）：６２８〜３１ページ
【非特許文献２】Ｓｕｒｅｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３、７９８９〜７９９３ページ、１９８６年
【非特許文献３】Ａｔｗｅｌｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０、２６〜３５ページ、１９９７年
【非特許文献４】Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９、６１７〜６２１ページ、１９９６年
【非特許文献５】Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、６７７〜６８１ページ、１９９８年
【非特許文献６】Ｊａｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５、２０８５０〜２０８５９ページ、２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、軽鎖対形成問題に対処し、同じ細胞において、最低限の望ましくない副生成物、すなわち、所望のもの以外との軽鎖対形成を伴うか、またはさらには望ましくない副生成物をまったく伴わない多重特異性抗体の軽鎖の所望の対形成を実現する。これは、所望のとおりの一方の軽鎖可変ドメインの重鎖可変ドメインとの対形成のためにＩｇＭ（ＭＣＨ２）またはＩｇＥ（ＥＣＨ２）のＣＨ２ドメインを使用することによって、および所望のとおりの他方の軽鎖可変ドメインの重鎖可変ドメインとの対形成のために異なる二量体形成ドメインを使用することによって達成される。ＭＣＨ２およびＥＣＨ２の機能は、わかっていないが、これらは、ＩｇＧ分子のヒンジ領域と対応する可能性が非常に高い。ＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン（ＭＣＨ２）は、ホモ二量体を形成する１１１アミノ酸（１２．２ｋＤａ）のポリペプチドである。二量体は、２つのドメインのＣｙｓ１１０間に形成されるＳ−Ｓ−結合および１つのドメイン内のＣｙｓ３０と９３の間の内部Ｓ−Ｓ−結合を有する。ＭＣＨ２は、Ａｓｎ１０５にグリコシル化部位を有する。本発明者らは、ＭＣＨ２ドメインは、抗体の一方のアームにあるＣＨ１／Ｃκを置き換えるために使用することができることを発見し、ＭＣＨ２の折りたたみは、ＣＨ１／Ｃκと同じ位安定であり、可変ドメインの正しい対形成を可能にさせることを発見した。これは、所望の重鎖対形成を容易にする改変と関連して特に有利である。ＥＣＨ２は、ＩｇＥ抗体において同じ機能を有する高度に一致するドメインであるため、この目的に対して同じ程度に適していることになる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明を下で詳細に記載する前に、本発明は、変化可能であるため、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態を示すためのものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定することは意図していないことも理解されるべきである。別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。好ましくは、本明細書中で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．およびＫｏｌｂｌ，Ｈ編、（１９９５年）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、ＣＨ−４０１０  バーゼル、スイス）に記載されるとおり定義される。
【００１１】
本明細書の文章全体をとおしていくつかの文書が挙げられている。上または下にかかわらず本明細書中で挙げられているそれぞれの文書（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。これらのいずれも、本発明が先行発明の理由でそのような開示を先行する権利が与えられないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００１２】
以下に、本発明の要素を記載する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されているが、当然のことながら、これらは、付加的な実施形態を作り出すために任意の様式で、任意の数で組み合わせることができることが理解されるべきである。さまざまに記載されている例および好ましい／特定の実施形態は、明確に記載されている実施形態のみに本発明を限定するものと解釈されるべきではない。この明細書は、明確に記載されている実施形態を任意の数の開示されている、および／または好ましい要素と組み合わされる実施形態を裏付け、包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願に記載されているすべての要素の任意の変更および組み合わせは、文脈が別のことを示していない限り、本出願の明細書によって開示されていると考慮されるべきである。
【００１３】
以下の明細書全体および請求項をとおして、文脈が別のことを必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明記されている整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むが、その他のいかなる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群も除外しないことを意味すると理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、内容が明らかに別のことを指示しない限り、単数形「ある（ａ、ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は複数の指示対象を含む。
【００１４】
以下の明細書において、抗体に関してアミノ酸番号が使用されるが、これは、配列番号を指すものではない。これらの数は、２０１６年８月２６日に開示されたバージョンのＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）に従って抗体におけるアミノ酸位置を指す。他に指定がない限り、番号は、ヒトＩｇＧ、特に、ヒトＩｇＧ１における位置に対応する。ヒトＩｇＧ１のものを含む、本明細書において言及されている抗体ドメインのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ配列（２０１６年８月２６日に開示されたバージョン）を、本明細書に記載されているドメイン、ならびに下で定義されるその変異体の特定の実施形態として参照により組み入れる。
【００１５】
第１の態様において、本発明は、抗体重鎖Ａ、軽鎖Ａまたは、それらの二量体であって、重鎖は、二量体形成ドメインＣＨ２Ｈと連結された可変ドメインＶＨＡを含み、軽鎖は、二量体形成ドメインＣＨ２Ｌと連結された可変ドメインＶＬＡを含み、ＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌの両方は、ＩｇＭ定常ドメインＭＣＨ２またはＩｇＥ定常ドメインＥＣＨ２である、抗体重鎖Ａ、軽鎖Ａまたは、それらの二量体に関する。ＭＣＨ２およびＥＣＨ２は相同体であり、高度に類似したアミノ酸配列を有する。ＣＨ２ＨおよびＣＨ２ＬがＩｇＭ定常ドメインＭＣＨ２である場合、ＭＣＨ２がアスパラギン２０９のグルタミンへの突然変異を含むのが好ましい（２００８年７月１日に変更されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８７１  ＩｇＨＭ＿ＨＵＭＡＮ  −  ｖ３の番号付けに従った位置）。ＣＨ２ＨおよびＣＨ２ＬがＩｇＥ定常ドメインＥＣＨ２である場合、ＥＣＨ２が、システイン１０５のアラニンへの突然変異（望ましくないシステイン反応性を回避する）および／またはアスパラギン１４６のグルタミンへの突然変異（グリコシル化を回避する）を含むのが好ましい（１９８６年７月２１日に変更されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８５４  ＩｇＨＥ＿ＨＵＭＡＮ  −  ｖ１の番号付けに従った位置）。
【００１６】
言い換えると、本発明の第１の態様は、上で定義されたとおりの抗体重鎖Ａ、抗体軽鎖Ａもしくはそれらの二量体を含む、抗体のフラグメントまたはその誘導体として示すことができる。「二量体」という用語は、重鎖Ａと軽鎖Ａの二量体を指す。
【００１７】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＭＣＨ２またはＥＣＨ２ドメインによって置き換えられた軽鎖・重鎖二量体形成ドメインを有する、抗体、例えば、ＩｇＧ抗体の全構造を有する分子を指す。これは、ＩｇＧ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ３のＣＨ３ドメイン）を含むＩｇＧ１抗体などのさらなるキメラドメイン置換（すなわち、異なる抗体由来のドメインによって置き換えられた少なくとも１つのドメイン）を有する分子も含む。さらに、この用語は、一般に、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体または三重特異性抗体を指す。あるいは、本発明の抗体は、「抗体様タンパク質」または「キメラ抗体」と呼ぶ場合もある。例は、本明細書に記載されるとおり定常ドメインを有する「ＩｇＧ構成」である。
【００１８】
通常、全般的にＩｇＧに言及する場合、別に定義されない限り、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。特に、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。
【００１９】
「抗体誘導体」という用語は、本明細書中で使用される場合、含むことが明記された少なくともそのドメインを含むが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹまたはＩｇＷなどの抗体の全構造は有さない分子を指し、これは、依然として標的分子と結合することができる。上記誘導体は、Ｆａｂ２などのその機能的（すなわち、標的結合、特に、特異的な標的結合）抗体フラグメント、またはそのような誘導体の組み合わせ、例えば、（例えば、本明細書に記載されている）二価Ｆａｂが可能であるが、これらに限定されるものではない。これは、さらなる可変ドメインなどのさらなる抗体ドメインが加えられた抗体にも関する。例は、本明細書に記載されるとおりの「四価二重特異性タンデム免疫グロブリン（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｎｄｅｍ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（ＴＢＴＩ）構成」（「二重可変ドメイン構成」とも呼ばれ、それと同じ）、「ＣＯＤＶ構成」、「ＣＯＤＶキメラ構成」、特に、「三価構成」、および「四価クモ状構成（ｓｐｉｄｅｒ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）」である。
【００２０】
「重鎖」という用語は、本明細書中で使用される場合、軽鎖との二量体形成のためのドメインと連結された少なくとも（通常ＩｇＧ抗体の）可変ドメインを含む重鎖のフラグメントも含み、二量体形成ドメインは、この用語を使用する場合、通常、本明細書においてより具体的に定義される。これは、定常ドメインＣＨ２および、場合により、定常ドメインＣＨ３（通常、ともにＩｇＧ抗体のもの）もさらに含むことができるが、必須ではない。したがって、これは、「軽鎖との二量体形成のためのドメインと連結された少なくとも可変ドメインを含む重鎖のフラグメント」とも言及できる。
【００２１】
通常、一方が他方より改変されない限り、ＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌは、同一（すなわち、それらは、ホモ二量体形成ドメインである）であり、一実施形態において、それぞれは、配列番号：１に従うか、もしくは配列番号：２に従った配列（これらの配列は、この例で使用されるＣＨ２ドメインと対応する）またはそれぞれは、配列番号：１もしくは２と少なくとも８０％の配列同一性を有するいずれかの変異体を有する。ヒトＩｇＭと比較して、配列番号：１は、配列番号：１の位置１０５にアスパラギンのグルタミンへの突然変異を有する。この突然変異は、本発明に望ましいが、必須ではない。したがって、配列番号：１の変異体は、この突然変異を保持する場合もある。ヒトＩｇＥと比較して、配列番号：２は、配列番号：２の位置１０５にシステインのアラニンへの突然変異および配列番号：２の位置１４６にアスパラギンのグルタミンへの突然変異を有する。これらの突然変異の一方または両方は、本発明に望ましいが、必須ではない。したがって、配列番号：２の変異体は、これらの突然変異の一方または両方を保持する場合もある。場合により、ＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌのうちの一方だけが変異体であるか、またはＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌの変異体が互いに異なる。いかなる場合も、変異体は、依然として互いにおよび／またはそれぞれ配列番号：１もしくは２に従ったドメインと二量体を形成することができる。変異体は、それが由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号：１もしくは２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。２つの配列間の同一性パーセントの算出は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、５８７３〜５８７７ページ、１９９３年の数学的アルゴリズムを使用して達成される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０ページのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれる。比較のためにギャップのあるアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２ページに記載されているとおりに利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが使用される。あるいは、変異体はまた、最大２０、１５、１０、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換、特に、保存的なアミノ酸置換を有すると定義することができる。保存的置換は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照）。アミノ酸の物理的および化学的特性の概要は、下記表１に示す。特定の実施形態において、保存的置換は、表１に従って共通の（すなわち、列１および／または２の）少なくとも１つの特性を有するアミノ酸により行われる置換である。「変異体」という用語は、フラグメントも含む。フラグメントは、合計で最大２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１個のアミノ酸の��末端欠失および／またはＣ末端欠失を有する。さらにまたはあるいは、変異体は、例えば、合計で最大５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、もしくは１個のアミノ酸Ｎ末端付加および／またはＣ末端アミノ酸付加によって改変されている場合もある。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
「連結される」という用語は、一般に、他に指定がない限り、ペプチド結合によって２つのドメインを結合することを指す。その場合、２つのドメインがリンカーを伴って、または伴わずに連結される場合もある。本明細書において、これは、０〜Ｘのアミノ酸長さ（「ａａ」）を有するリンカーにより連結することを指す。０ａａは、連結が２つのドメインを直接連結するペプチド結合によるものであることを意味する。これに関して、連結される代わりに「融合される」という用語も使用される場合がある。１つまたはそれ以上のＸは、連結がペプチドリンカーによるものであることを意味する。ペプチドリンカーは、特に、柔軟なペプチドリンカーである、すなわち、ともに連結されるドメインの間に柔軟性を与える。そのような柔軟性は、アミノ酸が小さく、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨げる大きな側鎖を持たない場合、一般に増加する。したがって、本発明のペプチドリンカーは、小さなアミノ酸、特に、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシンおよびイソロイシンの含有量が高いのが好ましい。ペプチドリンカーのアミノ酸のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上がそのような小さなアミノ酸であるのが好ましい。特定の実施形態において、グリシンおよびセリンから選択されるリンカーのアミノ酸、すなわち上記リンカーは、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカーであり、「ポリ」は、リンカー中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはさらに１００％のグリシンおよび／またはセリン残基の割合を意味する。本明細書に記載されるＣＯＤＶ構成のリンカーは、軽鎖および重鎖のドメインにクロスオーバー二重可変領域免疫グロブリン（ｃｒｏｓｓ  ｏｖｅｒ  ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）に折りたたむのに十分な可動性を与える。一般に（ＣＯＤＶ構成に限定されない）、例となるリンカーは、アミノ酸式（ＧｍＳｎ）ｏの配列を含み、式中、ｍは０から４の整数であり、ｎは１または２であり、ｏは０から５の整数である。特定の例は、ｍ＝１、ｎ＝１、ｏ＝０〜５；ｍ＝２、ｎ＝１、ｏ＝０〜５；ｍ＝３、ｎ＝１、ｏ＝０〜５；ｍ＝４、ｎ＝１、ｏ＝０〜５；ｍ＝１、ｎ＝２、ｏ＝０〜５；ｍ＝２、ｎ＝２、ｏ＝０〜５；ｍ＝３、ｎ＝２、ｏ＝０〜５；およびｍ＝４、ｎ＝２、ｏ＝０〜５である。ｏ＞１の場合、ｍおよびｎは、それぞれ、１つまたはそれ以上のさらなる（ＧｍＳｎ）の繰り返しのｍおよびｎとは異なることが可能である。言い換えると、（ＧｍＳｎ）１に関して、ｍおよびｎは、それぞれ、任意の（ＧｍＳｎ）２〜５のｍおよびｎとは異なることが可能である。残りの（ＧｍＳｎ）ｏに対する任意の（ＧｍＳｎ）２〜５に関して同じことが可能である。
【００２４】
第１の態様に関して、ＶＨＡは、０〜３０ａａのリンカーを介してＣＨ２Ｈと連結され、ＶＬＡは、０〜３０ａａのリンカーを介してＣＨ２Ｌと連結される。独立してまたは両方の場合、各リンカーの長さは、１〜３０、５〜２５または１０〜２０、例えば、約１５ａａが可能である。特に、２つのリンカーは、同じ長さを有し、さらには同一である場合もあり、すなわち、同じアミノ酸配列を有する場合もある。一般におよび他に指定がない限り、本明細書において言及されるそれぞれの連結は、そのようなリンカーによる。
【００２５】
特定の実施形態において、ＶＨＡのＣ末端は、ＣＨ２ＨのＮ末端と連結、特に、融合され、ＶＬＡのＣ末端は、ＣＨ２ＬのＮ末端と連結、特に、融合される。さらに、ＣＨ２Ｈは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２と連結することができ、定常ドメインＣＨ２は、定常ドメインＣＨ３と融合することができる。
【００２６】
「ヒンジ領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＩｇＧおよびＩｇＡ、特に、ＩｇＧ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、とりわけ、ＩｇＧ１）免疫グロブリンクラスの重鎖の中心部分にある柔軟なアミノ酸伸張部を指し、これは、ジスルフィド結合によって２つの鎖を結びつける。
【００２７】
さらなる実施形態において、重鎖Ａおよび軽鎖Ａは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のものである。特に、それらは、ＩｇＧ１由来のものであり、その中のドメインは、例えば、本明細書に記載されるとおり変異している、および／またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４によって、特に、ＩｇＧ３ドメインによって置換されている場合もある。
【００２８】
いくつかの実施形態において、重鎖Ａは、第２の態様に記載されているとおりの改変、特に、記載されているとおりの抗体の単離を容易にする１つまたはそれ以上の改変を有する。
【００２９】
第２の態様において、本発明は、第１の態様による重鎖Ａおよび軽鎖Ａを含む、抗体またはその誘導体に関する。
【００３０】
通常、抗体またはその誘導体は、単離されている、および／または組み換え型である。さらに、抗体またはその誘導体は、マウス抗体、特に、ヒト化マウス抗体、またはその誘導体である場合もある。あるいは、抗体は、任意のその他の種、特に、ヒト、ウサギまたはラットを含む、脊椎動物種、例えば、霊長類種などの哺乳動物種由来である場合もある。
【００３１】
抗体またはその誘導体において、二量体形成ドメインＣＨ２Ｈおよび二量体形成ドメインＣＨ２Ｌが二量体を形成することが想定される。さらに、一実施形態において、ＶＨＡおよびＶＬＡが、可変ドメインＦＶＡＡ（すなわち、ＦｖＡＨＡＬ）、それにより、特に、パラトープＡＡ（すなわち、ＡＨＡＬ）を形成することが想定される。代替実施形態において、ＶＨＡおよびＶＬＡは、可変ドメインＦＶＡＡ（またはパラトープＡＡ）を形成しない。特に、代わりに、ＶＨＡは、軽鎖Ａに含まれるさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＸとともに可変ドメインＦｖＡＸ（すなわち、ＦＶＡＨＸＬ）、それにより、特に、パラトープＡＸ（すなわち、ＡＨＸＬ）を形成し、ＶＬＡは、重鎖Ａに含まれるさらなる重鎖可変ドメインＶＨＸとともに可変ドメインＸＡ（すなわちＦＶＸＨＡＬ）、特に、パラトープＸＡ（すなわちＸＨＡＬ）を形成する。この代替は、以下に示されるとおり、「ＣＯＤＶ構成」によって例示される（図１Ｄも参照）。
【００３２】
これらの実施形態によって示されるとおり、第２の態様の抗体またはその誘導体は、通常、多重特異性、例えば、二重特異性または三重特異性である。それゆえに、第２の態様の抗体またはその誘導体は、重鎖Ｂおよび軽鎖Ｂをさらに含み、重鎖は、可変ドメインＶＨＢを含み、軽鎖は、可変ドメインＶＬＢを含む。これらは、ＩｇＧ構成において重鎖および軽鎖Ａとともに配置することが可能である、すなわち、重鎖ＡおよびＢが二量体になり、軽鎖Ａが重鎖Ａと二量体になり、軽鎖Ｂが重鎖Ｂと二量体になる。さらに、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体またはその誘導体は、対称性である場合もあり、または非対称性である場合もある。非対称性は、上記の可変ドメイン、例えば、ＦＶＡＡおよびＦｖＢＢ、特に、２つの抗体アーム（すなわち、２つの重鎖の）にあるパラトープが互いに異なることを意味する。対称性とは、本明細書中で使用される場合、抗体またはその誘導体がＩｇＧ抗体またはその誘導体のそれぞれのアームに同一の可変ドメインを含むことを意味する。二重特異性よりも高い程度の多重特異性は、通常、同じアームにあるさらなる可変ドメインによってこの抗体において達成される。
【００３３】
多重特異性抗体または誘導体は、複数の異なる抗原と結合することができ、二重特異性抗体または誘導体は、２つの異なる抗原を結合することができる。本明細書に記載されているすべての抗体または誘導体に関して、抗原は、例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＢＡＦＦ、ＢｌｙＳ、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄ）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２）、ＳＬＣ、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）、キチナーゼ、ＣＳＦ  １（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＥＧＦＲ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１Ｏ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１２／２３、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ  ４  インテグリン）、ＬＥＰ（レプチン）、ＭＨＣ  クラスＩＩ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＮＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０  リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、トール様レセプター、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＤＮＧＲ−１（ＣＬＥＣ９１）、およびＨＭＧＢ１から成る群からそれぞれの特異性に関して独立して選択される。特に、これは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６から成る群からのものである。本明細書に記載されているにすべての二重特異性抗体または誘導体に関して、抗原ペアは、例えば、抗原ペアＩＬ４およびＩＬ１３、ＩＧＦ１ＲおよびＨＥＲ２、ＩＧＦ１ＲおよびＥＧＦＲ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＢＫおよびＩＬ１３、ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ４およびＭＨＣ  クラスＩＩ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、ＩＬ−ＩαおよびＩＬ−β、ＴＮＦαおよびＩＬ１２／２３、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦαおよびＩＬ−β、ＴＮＦαおよびＩＬ−２３、ならびにＩＬ１７およびＩＬ２３から成る群から選択される。本明細書に記載されているすべての三重特異性抗体または誘導体に関して、２つの抗原は、例えば、抗原ペアＩＬ４およびＩＬ１３、ＩＧＦ１ＲおよびＨＥＲ２、ＩＧＦ１ＲおよびＥＧＦＲ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＢＫおよびＩＬ１３、ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ４およびＭＨＣ  クラスＩＩ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、ＩＬ−ＩαおよびＩＬ−β、ＴＮＦαおよびＩＬ１２／２３、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦαおよびＩＬ−β、ＴＮＦαおよびＩＬ−２３、ならびにＩＬ１７およびＩＬ２３から成る群から選択される。第３の抗原は��上の一覧から選択される別の抗原が可能である。さらに、抗原は、下で第６の態様に関して列挙されており、これも、多重特異性抗体または誘導体に対して使用することができる。
【００３４】
本発明の対称性多重特異性抗体に関する例は、「四価クモ状構成」であり（図１Ｅを参照）、これは、それぞれ第１の態様による第１および第２の重鎖Ａならびに第１および第２の軽鎖Ａを含む第２の態様の抗体またはその誘導体によって定義され、（ｉ）第１の軽鎖ＡのＣＨ２Ｌドメインは、ＩｇＧ抗体またはその誘導体のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメイン（例えば、ＶＨＢもしくはＶＬＢ）と連結され、第２の軽鎖ＡのＣＨ２Ｌドメインは、ＩｇＧ抗体またはその誘導体の他方のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメイン（例えば、ＶＨＢもしくはＶＬＢ）と（例えば、両方の場合、ＶＨ１ドメインもしくはＶＬ１ドメインと）連結されるか、または（ｉｉ）第１の軽鎖ＡのＣＨ２Ｈドメインは、ＩｇＧ抗体もしくはその誘導体のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメイン（例えば、ＶＨＢもしくはＶＬＢ）と連結され、第２の軽鎖ＡのＣＨ２Ｈドメインは、ＩｇＧ抗体またはその誘導体の他方のＶＨ１もしくはＶＬ１ドメイン（例えば、ＶＨＢもしくはＶＬＢ）と（例えば、両方の場合、ＶＨ１ドメインもしくはＶＬ１ドメインと）連結される。この点において、連結は、通常、０〜１０ａａのリンカーによる。無関係に、各リンカーの長さは、１〜１０または２〜６ａａが可能である。特に、２つのリンカーは、同じ長さを有する場合もあり、さらには同一である場合もあり、すなわち、同じアミノ酸配列を有する場合もある。この点においてＩｇＧ抗体の「誘導体」は、特に、Ｆａｂ２フラグメントなどの抗原結合ＩｇＧフラグメントである。
【００３５】
「四価クモ状構成」において、通常、第１の軽鎖ＡのＣＨ２Ｌドメインは、第１の重鎖ＡのＣＨ２Ｈドメインと二量体を形成し、第２の軽鎖ＡのＣＨ２Ｌドメインは、第２の重鎖ＡのＣＨ２Ｈドメインと二量体を形成する。さらに、通常、第１の重鎖および軽鎖ＡのＶＨＡおよびＶＬＡは、可変ドメインＦＶＡＡ（すなわち、ＦｖＡＨＡＬ）、特に、パラトープＡＡ（すなわち、ＡＨＡＬ）を形成し、第２の重鎖および軽鎖ＡのＶＨＡおよびＶＬＡは、可変ドメインＦＶＡＡ（すなわち、ＦｖＡＨＡＬ）、特に、パラトープＡＡ（すなわち、ＡＨＡＬ）を形成する。さらに、ＩｇＧ部分のＶＨ１およびＶＬ１ドメインは、対称性である、すなわち、それらは、それぞれ両方に対して同じ１つの可変ドメインＦＶ（例えば、ＦｖＢＢ）を形成する。
【００３６】
本発明の非対称性多重特異性抗体またはその誘導体、特に、本発明の非対称性二重特異性抗体またはその誘導体は、一般に重鎖Ｂおよび軽鎖Ｂを含み、重鎖は、可変ドメインＶＨＢを含み、軽鎖は、可変ドメインＶＬＢを含む。
【００３７】
この非対称性抗体またはその誘導体の例は、「二価Ｆａｂ構成」（図１Ｂを参照）および「ＩｇＧ構成」（図１Ａを参照）である。そこでは、ＶＨＢは、二量体形成ドメインＤＩＭＨと連結され、ＶＬＢは、二量体形成ドメインＤＩＭＬと連結される。「二価Ｆａｂ構成」において、２つのＦａｂは、図１Ｂに示されるとおりＣＨ２ＨおよびＤＩＭＨドメインを介して互いに連結することができるか、またはＤＩＭドメインの一方が、ＶＡドメインの一方と（例えば、ＤＩＭＨがＶＨＡと）連結することができるか、またはＣＨ２ドメインの一方が、ＶＢドメインの一方と（例えば、ＶＨ２ＨがＶＨＢと）連結することができる。この点において、連結は、通常、０〜３０または１〜３０ａａのリンカーによる。独立して、各リンカーの長さは、５〜２５または１０〜２０、例えば、約１５ａａが可能である。特に、２つのリンカーは、同じ長さを有し、さらには同一である場合もあり、すなわち、同じアミノ酸配列を有する場合もある。
【００３８】
「ＤＩＭ」という用語は、抗体ドメインに関して当該技術分野において知られている用語としては本明細書中では使用されず、二量体形成ドメイン、特に、ホモ二量体形成ドメインに対する略称として使用される。ＤＩＭＨおよびＤＩＭＬは、通常、二量体を形成する。また、ＤＩＭＨおよびＤＩＭＬは、定常ドメインＣＨ２ではない、すなわち、これらは、ペアＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌとは異なる。特に、これらは、ＩｇＭ定常ドメインＭＣＨ２でも、ＩｇＥ定常ドメインＥＣＨ２でもない。一実施形態において、ＤＩＭドメインは、抗体由来のものである。特定の実施形態において、ＤＩＭＨおよびＤＩＭＬは、それぞれ、ＩｇＧ抗体のＣＨ１およびＣＬである。さらに、他に指定がない限り、重鎖Ｂおよび軽鎖ＢがともにＩｇＧ由来であることが想定される。特に、抗体またはその誘導体は、二重特異性である。ＶＨＡおよびＶＬＡは、可変ドメインＦＶＡＡ（すなわち、ＦｖＡＨＡＬ）、特に、パラトープＡＡ（すなわち、ＡＨＡＬ）を形成することができ、ＶＨＢおよびＶＬＢは、可変ドメインＦＶＢＢ（すなわち、ＦｖＢＨＢＬ）、特に、パラトープＢＢ（すなわち、ＢＨＢＬ）を形成することも想定される。
【００３９】
「二価Ｆａｂ構成」において、通常、ＤＩＭＨは、ＣＨ２ＨもしくはＣＨ２Ｌと連結されるか、またはＤＩＭＬは、ＣＨ２ＨもしくはＣＨ２Ｌと連結される。あるいは、ＤＩＭドメインの一方は、ＶＡドメインの一方と（例えば、ＤＩＭＨがＶＨＡと）連結することができるか、またはＣＨ２ドメインの一方は、ＶＢドメインの一方と（例えば、ＶＨ２ＨがＶＨＢと）連結することができる。この点において、連結は、通常、０〜３０または１〜３０ａａのリンカーによる。リンカーの長さは、５〜２５または１０〜２０、例えば、約１５ａａが可能である。
【００４０】
「ＩｇＧ構成」において、通常、ＣＨ２Ｈは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２Ａと連結され、ＤＩＭＨは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２Ｂと連結される。ＣＨ２Ａは、定常ドメインＣＨ３Ａと連結、特に、融合される場合もあり、ＣＨ２Ｂは、定常ドメインＣＨ３Ｂと連結、特に、融合される場合もある。さらに、重鎖Ａは、重鎖Ａのヒンジ領域と重鎖Ｂのヒンジ領域の間のジスルフィド結合、特に、そのうちの２つを介して重鎖Ｂと結合していることが企図される。あるいは、ＩｇＧ構成において、ＣＨ２Ｈは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２Ａと連結されず、ＤＩＭＨは、ヒンジ領域を介して定常ドメインＣＨ２Ｂと連結されないが、ＣＨ２Ｈは、異なるＣＨ２Ｈドメイン（例えば、ＦａｂドメインのＣＨ２ＨがＭＣＨ２Ｈドメインである場合、ＥＣＨ２Ｈドメイン、または逆もまた同様）と連結され、ＤＩＭＨは、その異なるＣＨ２Ｈドメインと対形成可能なＣＨ２Ｈドメイン、特に、その異なるＣＨ２Ｈドメインと同じ（同じタイプの）ＣＨ２Ｈドメインと連結される（例えば、他方のＣＨ２ＨドメインがＥＣＨ２Ｈドメインである場合、ＥＣＨ２Ｈドメイン；または他方のＣＨ２ＨドメインがＭＣＨ２Ｈドメインである場合、ＭＣＨ２Ｈドメイン）。
【００４１】
上記の非対称性抗体またはその誘導体の別の例は、「ＴＢＴＩ構成」である（図１Ｃを参照）。この構成は、「ＩｇＧ構成」と定義されるが
−  重鎖Ａが、ＶＨＡと連結されたさらなる重鎖可変ドメインＶＨＸをさらに含み、
−  軽鎖Ａが、ＶＬＡと連結されたさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＸをさらに含み、
−  重鎖Ｂが、ＶＨＢと連結されたさらなる重鎖可変ドメインＶＨＹをさらに含み、
−  軽鎖Ｂが、ＶＬＢと連結されたさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＹをさらに含む。
【００４２】
これらの連結は、それぞれ０〜１５または通常、１〜１５ａａのリンカーによる。独立して、各リンカーの長さは、５〜１０または約７もしくは８ａａが可能である。特に、リンカーは、同じ長さを有し、さらには同一である場合もあり、すなわち、同じアミノ酸配列を有する場合もある。一実施形態において、ＶＨＸ、ＶＬＸ、ＶＨＹおよびＶＬＹのＣ末端は、それぞれＶＨＡ、ＶＬＡ、ＶＨＢおよびＶＬＢのＮ末端と融合される。この構成に関して、以下のことが企図される
−  ＶＨＡおよびＶＬＡが、可変ドメインＦＶＡＡ（すなわち、ＦｖＡＨＡＬ）、特に、パラトープＡＡ（すなわち、ＡＨＡＬ）を形成し、
−  ＶＨＢおよびＶＬＢが、可変ドメインＦＶＢＢ（すなわち、ＦｖＢＨＢＬ）、特に、パラトープＢＢ（すなわち、ＢＨＢＬ）を形成し、
−  ＶＨＸおよびＶＬＸが、可変ドメインＦＶＸＸ（すなわち、ＦｖＸＨＸＬ）、特に、
パラトープＸＸ（すなわち、ＸＨＸＬ）を形成し、
−  ＶＨＹおよびＶＬＹが、可変ドメインＦＶＹＹ（すなわち、ＦｖＹＨＹＬ）、特に、パラトープＹＹ（またはＹＨＹＬ）を形成する。
【００４３】
上記の非対称性抗体またはその誘導体のさらに別の例は、「クロスオーバー二重可変構成」または「ＣＯＤＶ構成」である。一般的なＣＯＤＶ構成は、ＷＯ２０１２／２１３５３４５Ａ１に記載されており、「ＴＢＴＩ構成」のように以下のものを含む
−  ＶＨＡと連結されたさらなる重鎖可変ドメインＶＨＸを含む重鎖Ａ、
−  ＶＬＡと連結されたさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＸを含む軽鎖Ａ、
−  ＶＨＢと連結されたさらなる重鎖可変ドメインＶＨＹを含む重鎖Ｂ、および
−  ＶＬＢと連結されたさらなる軽鎖可変ドメインＶＬＹを含む軽鎖Ｂ。
【００４４】
一実施形態において、ＶＨＸ、ＶＬＸ、ＶＨＹおよびＶＬＹのＣ末端は、それぞれＶＨＡ、ＶＬＡ、ＶＨＢおよびＶＬＢのＮ末端と融合される。
【００４５】
しかしながら、「ＣＯＤＶ構成」において、）
−  ＶＨＡは、ＶＬＸとともに可変ドメインＦｖＡＸ（すなわち、ＦＶＡＨＸＬ）、特に、パラトープＡＸ（すなわち、ＡＨＸＬ）を形成し、
−  ＶＬＡは、ＶＨＸとともに可変ドメインＦｖＸＡ（すなわちＦＶＸＨＡＬ）、特に、パラトープＸＡ（すなわちＸＨＡＬ）を形成し、
−  ＶＨＢは、ＶＬＹとともに可変ドメインＦｖＢＹ（すなわち、ＦＶＢＨＹＬ）、特に、パラトープＢＹ（すなわち、ＢＨＹＬ）を形成し、
−  ＶＬＢは、ＶＨＹとともに可変ドメインＦｖＹＢ（すなわち、ＦＶＹＨＢＬ）、特に、パラトープＹＢ（すなわち、ＹＨＢＬ）を形成する。
【００４６】
したがって、「ＴＢＴＩ構成」においてとは異なり、ＶＨＡおよびＶＬＡ、ＶＨＢおよびＶＬＢ、ＶＨＸおよびＶＬＸ、ＶＨＹおよびＶＬＹは、それぞれパラトープＡＡ、ＢＢ、ＸＸ、ＹＹを形成しない。
【００４７】
これは、以下の連結によって達成される（Ｌ１：リンカー１、Ｌ２：リンカー２、Ｌ３：リンカー３、Ｌ４：リンカー４）：
（ｉ）
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＣＨ２ＨとＶＨＡ、
−  ３〜１４ａａ、特に、５〜８ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＣＨ２ＬとＶＬＡ、
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＤＩＭＨとＶＨＢ、
−  ３〜１４ａａ、特に、５〜８ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＤＩＭＬとＶＬＢ、
−  １〜８ａａ、特に、１〜５ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＡとＶＨＸ、
−  ３〜１２ａａ、特に、５〜１０ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＡとＶＬＸ、
−  １〜８ａａ、特に、１〜５ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＢとＶＨＹ、および
−  ３〜１２ａａ、特に、５〜１０ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＢとＶＬＹ；または
（ｉｉ）
−  ２〜１５ａａ、特に、２〜１２ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＣＨ２ＨとＶＨＡ、
−  １〜４ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＣＨ２ＬとＶＬＡ、
−  ２〜１５ａａ、特に、２〜１２ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＤＩＭＨとＶＨＢ、
−  １〜４ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＤＩＭＬとＶＬＢ、
−  ２〜１５ａａ、特に、４〜１２ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＡとＶＨＸ、
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＡとＶＬＸ、
−  ２〜１５ａａ、特に、４〜１２ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＢとＶＨＹ、および
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＢとＶＬＹ。
【００４８】
上の（ｉ）において、軽鎖リンカーは、両アームにある重鎖リンカーよりも長く、上の（ｉｉ）において、重鎖リンカーは、両アームにある軽鎖リンカーよりも長い。言い換えると、リンカーに関して、アームは、対称である。しかしながら、それらは、図１Ｄに示したとおり、非対称であることも可能である、すなわち、一方のアームの軽鎖リンカーは、重鎖リンカーより長く、他方のアームの重鎖リンカーは、軽鎖リンカーよりも長い。これは、それぞれ直接以下の代替実施形態（ｉｉｉ）および（ｉｖ）をもたらす：
（ｉｉｉ）
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＣＨ２ＨとＶＨＡ、
−  ３〜１４ａａ、特に、５〜８ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＣＨ２ＬとＶＬＡ、
−  ３〜１４ａａ、特に、５〜８ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＤＩＭＨとＶＨＢ、
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＤＩＭＬとＶＬＢ、
−  １〜８ａａ、特に、１〜５ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＡとＶＨＸ、
−  ３〜１２ａａ、特に、５〜１０ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＡとＶＬＸ、
−  ３〜１２ａａ、特に、５〜１０ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＢとＶＨＹ、および
−  １〜８ａａ、特に、１〜５ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＢとＶＬＹ；または
（ｉｖ）
−  ２〜１５ａａ、特に、２〜１２ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＣＨ２ＨとＶＨＡ、
−  １〜４ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＣＨ２ＬとＶＬＡ、
−  １〜４ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ４）によるＤＩＭＨとＶＨＢ、
−  ２〜１５ａａ、特に、２〜１２ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ２）によるＤＩＭＬとＶＬＢ、
−  ２〜１５ａａ、特に、４〜１２ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＡとＶＨＸ、
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＡとＶＬＸ、
−  １〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー（Ｌ３）によるＶＨＢとＶＨＹ、および
−  ２〜１５ａａ、特に、４〜１２ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー（Ｌ１）によるＶＬＢとＶＬＹ。
【００４９】
上記では、通常、最も一般的な範囲で互いに組み合わされるか、または特定の範囲で互いに組み合わされるか、または最後に言及された単一の値で互いに組み合わされる（第１の代替同士で互いに組み合わされるおよび第２の代替同士で互いに組み合わされる）。（ｉ）に関して、通常、ＣＨ２ＬとＶＬＡおよびＤＩＭＬとＶＬＢのリンカーは、それぞれＣＨ２ＨとＶＨＡおよびＤＩＭＨとＶＨＢのリンカーよりも長く、ＶＬＸとＶＬＡおよびＶＬＹとＶＬＢのリンカーは、それぞれＶＨＡとＶＨＸおよびＶＨＢとＶＨＹのリンカーよりも長い。（ｉｉ）に関して、通常、ＣＨ２ＨとＶＨＡおよびＤＩＭＨとＶＨＢのリンカーは、それぞれＣＨ２ＬとＶＬＡおよびＤＩＭＬとＶＬＢのリンカーよりも長く、ＶＨＡとＶＨＸおよびＶＨＢとＶＨＹのリンカーは、それぞれＶＬＸとＶＬＡおよびＶＬＹとＶＬＢのリンカーよりも長い。（ｉｉｉ）に関して、通常、ＣＨ２ＬとＶＬＡおよびＤＩＭＨとＶＨＢのリンカーは、それぞれＣＨ２ＨとＶＨＡおよびＤＩＭＬとＶＬＢのリンカーよりも長く、ＶＬＸとＶＬＡおよびＶＨＹとＶＨＢのリンカーは、それぞれＶＨＡとＶＨＸおよびＶＬＢとＶＬＹのリンカーよりも長い。（ｉｖ）に関して、通常、ＣＨ２ＨとＶＨＡおよびＤＩＭＬとＶＬＢのリンカーは、それぞれＣＨ２ＬとＶＬＡおよびＤＩＭＨとＶＨＢのリンカーよりも長く、ＶＨＡとＶＨＸおよびＶＬＢとＶＬＹのリンカーは、それぞれＶＬＸとＶＬＡおよびＶＨＹとＶＨＢのリンカーよりも長い。ここでの〜よりも長いは、少なくとも１．５倍長い、少なくとも１．７５倍長いまたは少なくとも２倍長いを意味する場合もある（可能な限り特定の範囲が与えられる）。
【００５０】
さらに、上記は、それぞれのアームに関して重鎖（Ｉ）および軽鎖（ＩＩ）ドメイン式を用いて示すこともでき、これは、
（Ｉ）ＣＨ２Ｈ／ＤＩＭＨ−Ｌ４−ＶＨ−Ｌ３−ＶＨおよび（ＩＩ）ＣＨ２Ｌ／ＤＩＭＬ−Ｌ２−ＶＬ−Ｌ１−ＶＬであり、
ここで、一方のアームは、（Ｉ）および（ＩＩ）に関して、それぞれＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌを有し、他方のアームは、（Ｉ）および（ＩＩ）に関して、それぞれＤＩＭＨおよびＤＩＭＬを有し、
ここで、Ｌ４は、（ａ）１〜３ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー、または（ｂ）２〜１５ａａ、特に、２〜１２ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカーであり、Ｌ３は、（ａ）１〜８ａａ、特に、１〜５ａａ、もしくは約１ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカー、または（ｂ）２〜１５ａａ、特に、４〜１２ａａ、もしくは約７ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカーであり、Ｌ２は、（ａ）３〜１４ａａ、特に、５〜８ａａ、もしくは約５ａａのリンカー、あるいは１０ａａのリンカー、または（ｂ）１〜４ａａ、特に、１〜２ａａ、もしくは約２ａａのリンカー、あるいは０ａａのリンカーである。そこで、実施形態（ａ）は、互いに組み合わせ、実施形態（ｂ）は、互いに組み合わせる。また、最も一般的な範囲が、通常、互いに組み合わされるか、または特定の範囲が互いに組み合わされるか、または最後に言及された単一の値が互いに組み合わされる（互いに組み合わされる第１の代替および互いに組み合わされる第２の代替）。
【００５１】
「ＣＯＤＶ構成」の特定の一実施形態は、「ＣＯＤＶ二価Ｆａｂ構成」であり、これは、図１Ｄに示される、定常ドメインＣＨ２ＡおよびＣＨ３Ａを伴わない「ＣＯＤＶ構成」の左側の「Ａ」アームを含む、すなわち、これは、「ＣＯＤＶ構成」に記載されているとおり構成されたドメインＶＨＡ、ＶＬＡ、ＶＨＸおよびＶＬＸを含む。
【００５２】
上記の非対称性抗体またはその誘導体のさらなる例は、「ＣＯＤＶキメラ構成」であり、特定の例は、「三価構成」である（図１Ｆを参照）。「ＣＯＤＶキメラ構成」において、抗体は、「ＣＯＤＶ構成」にはない１つのアームＡおよび「ＣＯＤＶ構成」の１つのアームＢを含む。アームＡが本明細書に記載されるとおりＣＨ２ドメインを含み、アームＢが本明細書に記載されるとおりＤＩＭドメインを含むか、またはアームＡがＤＩＭドメインを含み、アームＢがＣＨ２ドメインを含むかのいずれかである。
【００５３】
「ＣＯＤＶ構成」にはないアームＡは、「ＩｇＧ構成」または「ＴＢＴＩ構成」などの本明細書に記載されている構成、特に、本明細書に記載されている非対称構成のアームを含む、いかなる抗体アーム構成も有することができる。「ＩｇＧ構成」のアームＡにおいて、重鎖および軽鎖は、その構成に関して上で記載されているとおり構成される（アームＢがＤＩＭドメインを含む場合、ＣＨ２ドメインを伴うか、または代わりにアームＢがＣＨ２ドメインを含む場合、ＤＩＭドメインを伴う）。「ＴＢＴＩ構成」のアームＡにおいて、重鎖および軽鎖は、その構成に関して上で記載されているとおり構成される（アームＢがＤＩＭドメインを含む場合、ＣＨ２ドメインを伴う、または代わりにアームＢがＤＨ２ドメインを含む場合、ＤＩＭドメインを伴う）。
【００５４】
「ＣＯＤＶ構成」のアームＢは、その構成に関して上に記載されているよう定義されるとおり構成される（アームＡがＣＨ２ドメインを含む場合、ＤＩＭドメインを伴う、または代わりにアームＡがＤＩＭドメインを含む場合、ＣＨ２ドメインを伴う）。ドメインの連結は、上で定義される（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかが可能である。
【００５５】
「ＩｇＧ構成」を有するアームＡを伴う実施形態は、３つのパラトープを形成するため、本明細書では「三価構成」とも呼ばれる特定の構成である（図１Ｆを参照）。この構成は、単一特異性（すべてのパラトープが同じ）であるが、通常、二重特異性（３つのパラトープのうちの２つが同じ）または三重特異性（すべてのパラトープが異なる）である。この構成は、三重特異性形態で特に有用である。
【００５６】
第２の態様の多重特異性抗体、特に、二重特異性抗体またはその誘導体のさらなる実施形態において、抗体またはその誘導体は、抗体の単離を容易にする１つまたはそれ以上の改変、とりわけ、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成を容易にするか、もしくはこの対形成の選択を可能にさせる改変を含む。これは、特に、第２の態様の非対称性抗体または誘導体に適用される。
【００５７】
例えば、抗体の単離を容易にする改変は、１つまたはそれ以上の以下のものが可能である：ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ技術改変、ＤｕｏＢｏｄｙ技術改変、Ａｚｙｍｍｅｔｒｉｃ技術改変、電荷対技術改変、ＨＡ−ＴＦ技術改変、ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術改変またはプロテインＡ親和性差改変（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。具体的には、それらは、１つまたはそれ以上の以下ものが可能である：
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｔ３６６Ｙ突然変異ならびに、場合により、さらにＳ３５４（Ｓ３５４Ｃ）および／またはＴ１６６Ｗ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｙ４０７Ｔ突然変異ならびに、場合により、さらなるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ突然変異（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｔ３６６Ｗ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ突然変異（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｆ４０５Ｌ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｋ４０９Ｒ突然変異（ＤｕｏＢｏｄｙ技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ突然変異（Ａｚｙｍｍｅｔｒｉｃ技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ突然変異（電荷対技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８ＲおよびＫ４０９Ｒ突然変異（電荷対技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ突然変異（ＨＡ−ＴＦ技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：ＩｇＧ／Ａキメラ、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：ＩｇＡ／Ｇキメラ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｆｃ領域またはその一部（例えば、ＣＨ３ドメイン）がＩｇＧ３由来である、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）Ｆｃ領域またはその一部（例えば、ＣＨ３ドメイン）がＩｇＧ１、２または４、特に、ＩｇＧ１由来である（プロテインＡ親和性差）、
−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：Ｔ４０７Ｔ突然変異（プロテインＡ親和性差）、ならびに／または−  第１の重鎖（例えば、重鎖Ａ）：Ｈ４３５Ｒ突然変異、第２の重鎖（例えば、重鎖Ｂ）：突然変異なし（プロテインＡ親和性差）。
【００５８】
あるいは、そこでは、第１の重鎖は、重鎖Ｂである場合もあり、第２の重鎖は、重鎖Ａである場合もある。
【００５９】
特定の実施形態において、抗体は、Ｙ状ＩｇＧ様形態（「ＩｇＧ構成」、「ＴＢＴＩ構成」および「ＣＯＤＶ構成」を含む）を有する、定常ドメインＣＨ２Ａ、ＣＨ２Ｂ、ＣＨ３Ａおよび／またはＣＨ３Ｂ、好ましくは、ＣＨ３Ａおよび／またはＣＨ３Ｂは、重鎖ヘテロ二量体形成または重鎖ヘテロ二量体の選択を容易にする。重鎖ヘテロ二量体形成とは、重鎖Ａの重鎖Ｂとの連結を意味し、そのため、重鎖Ａのさらなる重鎖Ａとの連結および／もしくは鎖Ｂのさらなる重鎖Ｂとの連結が、妨げられるか、またはそれらに対抗して選択される。
【００６０】
例えば、重鎖Ａおよび重鎖ＢのＦｃ領域（例えば、定常ドメインＣＨ２ＡとＣＨ２Ｂ、および／またはＣＨ３ＡとＣＨ３Ｂ）、特に、ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂは、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異を含む。そのようなｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異は、特に、ＣＨ３ＡまたはＣＨ３Ｂの一方におけるＴ３６６Ｙおよび他方におけるＹ４０７Ｔであり、ここで、ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂは、ＩｇＧ１定常ドメインであり、場合により、Ｔ３６６Ｙ突然変異（「ｋｎｏｂ」鎖）を含むＦｃ領域は、突然変異Ｓ３５４およびＴ１６６Ｗをさらに含み、Ｙ４０７Ｔ突然変異（「ｈｏｌｅ」鎖）を含むＦｃ領域は、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖをさらに含む。
【００６１】
あるいはまたはさらに、（ｉ）重鎖ＡのＦｃ領域もしくはその一部（例えば、ＣＨ２ＡもしくはＣＨ３Ａ）、特に、ＣＨ３Ａ、もしくは重鎖ＢのＦｃ領域もしくはその一部（例えば、ＣＨ２ＢもしくはＣＨ３Ｂ）特に、ＣＨ３Ｂのいずれかは、ＩｇＧ３由来であるか、または（ｉｉ）重鎖ＡのＦｃ領域（すなわち、ＣＨ２ＡおよびＣＨ３Ａ）、特に、ＣＨ３Ａ、もしくは重鎖ＢのＦｃ領域（すなわち、ＣＨ２ＢおよびＣＨ３Ｂ）、特に、ＣＨ３Ｂのいずれかは、プロテインＡとの結合を低減する、特に、止める１つまたはそれ以上の突然変異を含む。そのような突然変異は、ＣＨ３ＡまたはＣＨ３ＢのいずれかにおけるＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆが可能であり、ここで、ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂは、ＩｇＧ１定常ドメインである。
【００６２】
重鎖Ａおよび重鎖ＢのＦｃ領域（例えば、定常ドメインＣＨ２ＡとＣＨ２Ｂ、および／またはＣＨ３ＡとＣＨ３Ｂ）、特に、ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂは、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異を含み、重鎖ＡのＦｃ領域（すなわち、ＣＨ２ＡおよびＣＨ３Ａ）、特に、ＣＨ３Ａ、もしくは重鎖ＢのＦｃ領域（すなわち、ＣＨ２ＢおよびＣＨ３Ｂ）、特に、ＣＨ３Ｂのいずれかは、プロテインＡとの結合を止める１つまたはそれ以上の突然変異を含むことが特に想定される。さらに一層詳細には、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異のｈｏｌｅ突然変異を含む重鎖は、プロテインＡとの結合を低減するか、または特に止める１つまたはそれ以上の突然変異を含むことが想定される。これは、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅアプローチは、２つの「ｈｏｌｅ」重鎖の二量体形成も可能にするが、２つの「ｋｎｏｂ」重鎖の二量体形成は可能にしないため、この抗体の単離が下記のとおりＫａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィーを用いずに実施できるという利点を有する。したがって、「ｈｏｌｅ」重鎖がプロテインＡとの結合を低減する、特に、止める１つまたはそれ以上の突然変異を有し、プロテインＡクロマトグラフィーにより選択される場合、「ｈｏｌｅ」二量体に対して選択をし、さらなるいかなる工程も用いずに多重特異性抗体、特に、二重特異性抗体のみを単離することになる。
【００６３】
さらなる、第２の態様の抗体またはその誘導体は、低減されたＦｃエフェクター機能を有するか、またはそれをまったく有さないことが可能である。Ｆｃエフェクター機能は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの相互作用および／またはＦｃレセプターとの結合である。エフェクター機能の低減または欠如は、例えば、ＣＨ２Ａおよび／またはＣＨ２Ｂドメインにおける二重突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（いわゆる、「ＬＡＬＡ突然変異」）によって達成することができる。
【００６４】
第２の態様に関して使用されるすべての用語は、具体的に別に定義されない限り、本発明の第１の態様に関して定義されたとおりの意味を有する。さらに、第２の態様に適用できる、第１の態様に関して明記されたすべての実施形態は、第２の態様に対しても想定される。
【００６５】
第３の態様において、本発明は、第１の態様の重鎖Ａおよび／または軽鎖Ａをコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドに関する。一実施形態において、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドはまた、第２の態様の抗体または誘導体の重鎖Ｂおよび／または軽鎖Ｂをコードする。特に、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、第２の態様の抗体または誘導体をコードする。これは、上記のすべての実施形態、特に、本明細書に記載されている任意の抗体構成を指す。一実施形態において、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、単離される。
【００６６】
第３の態様に関して使用されるすべての用語は、具体的に別に定義されない限り、本発明の第１および第２の態様に関して定義されたとおりの意味を有する。さらに、第３の態様に適用できる、第１および第２の態様に関して明記されたすべての実施形態は、第３の態様に対しても想定される。
【００６７】
第４の態様において、本発明は、第３の態様の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、１つまたはそれ以上の発現ベクターに関する。
【００６８】
「ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、コード情報を宿主細胞へ運搬するために使用されるあらゆる分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、それが融合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムに挿入することができる。特定のベクターは、導入させられる宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞への導入時に、その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが含む遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００６９】
第４の態様に適用できる、第１、第２および第３の態様に関して明記されたすべての実施形態は、第４の態様に対しても想定される。
【００７０】
第５の態様において、本発明は、第３の態様の１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドまたは第４の態様の１つもしくはそれ以上の発現ベクターを含む細胞に関する。一実施形態において、細胞は、単離される。
【００７１】
原核細胞および真核細胞、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞など）の使用を含む、多種多様の細胞発現系を、上記のポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる。この目的で、細胞は、本発明のポリヌクレオチドが細胞において発現し、一実施形態においては、細胞が培養される培地に分泌されるよう、上記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターによりトランスフォームまたはトランスフェクションされ、その培地から発現生成物を回収することができる。
【００７２】
第５の態様に適用できる、第１、第２、第３および第４の態様に関して明記されたすべての実施形態は、第５の態様に対しても想定される。
【００７３】
第６の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体および第１の態様の重鎖Ａと軽鎖Ａの二量体または第２の態様の抗体もしくは誘導体を含む医薬組成物であって、特定の実施形態において、二量体または抗体もしくは誘導体は、病原体、罹患細胞、細胞レセプターまたは細胞シグナル伝達分子と特異的に結合する、医薬組成物に関する。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用または経口など消化管を通した送達用に選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の製造は、当該技術分野の技術範囲内にある。
【００７５】
「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗体様結合タンパク質の送達を達成するか、または向上させるのに適した１つまたはそれ以上の製剤化材料を指す。医薬組成物中の主要な担体は、本質的に水性または非水性が可能である。例えば、注射に適したビヒクルまたは担体は、場合によっては、非経口投与用の組成物に一般的な他の材料が加えられた、水、生理的食塩水、または人工脳脊髄液が可能である。中性緩衝生理的食塩水または血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる例となるビヒクルである。その他の例となる医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓトリスバッファーまたは約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファーを含み、これは、ソルビトールまたは適した代替物をさらに含むことが可能である。本発明の一実施形態において、抗体様結合タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で任意の製剤化薬剤と混合することによって保管のために製造することができる。さらに、抗体様結合タンパク質は、スクロースなどの適した賦形剤を使用した凍結乾燥物として製剤化することが可能である。
【００７６】
本医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、もしくは浸透を改変する、維持する、または保護するための製剤化材料を含むことができる。適した製剤化材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなど）、抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）、バッファー（ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくはその他の有機酸など）、増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（マンニトールもしくはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−サイクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピルベータ−サイクロデキストリンなど）、フィラー、モノサッカライド、ジサッカライド、およびその他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなど）、着色剤、香味料、希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールもしくはチロキサパル）、安定性向上剤（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（スクロースもしくはソルビトールなど）、張性向上剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムもしくはマンニトール、ソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的補助薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  （第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０年）、および同のそれに続く版を参照）。
【００７７】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、特に、人体などの生物においてインビトロまたはインビボで標的分子の存在を判断する結合反応を指す。したがって、特定のリガンドは、その特定の標的分子と結合するが、相当な量で存在する他の分子とは結合しない。一般に、標的分子と「特異的に結合する」抗体またはその誘導体は、その標的分子に対して約１０５（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、および１０１２またはそれ以上）モル／リットルを超える平衡親和性定数を有する。
【００７８】
「病原体」という用語は、対象において疾患の原因となる可能性があるあらゆる生物を指す。これは、細菌、原生動物、真菌、線虫、ウイロイドおよびウイルス、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されるものではなく、ここで、それぞれの病原体は、単独で、または別の病原体と協力して、哺乳動物が挙げられるがそれに限定されない、ヒトが挙げられるが、それに限定されない脊椎動物において疾患を誘発することが可能である。本明細書中で使用される場合、「病原体」という用語はまた、非免疫低下宿主においては通常、病原性ではない場合もあるが、免疫低下宿主においては病原性である微生物を包含する。
【００７９】
罹患細胞は、腫瘍細胞、慢性感染細胞、老化細胞、炎症性表現型を示す細胞、アミロイドタンパク質を蓄積した細胞またはミスフォールドしたタンパク質を蓄積した細胞である場合もある。
【００８０】
腫瘍細胞の場合、基礎疾患は、特に、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍（Ｅｗｉｎｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ）、眼癌、胆のう癌、胃腸管系カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、下咽頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟部組織癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、腟癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から成る群から選択される腫瘍である。特に、抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＭＥＴ、ＦＡＰ、ＰＳＭＡ、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＢ３、ＣＥＡ、ＣＡＩＸ、ムチン、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ５５、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ、ＵＰＡＲ、テネイシン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、腫瘍関連糖タンパク質７２、ガングリオシドＧＭ２、Ａ３３、ルイスＹ抗原またはＭＵＣ１などの癌関連抗原である。
【００８１】
慢性感染細胞の場合、基礎疾患は、結核、マラリア、ウイルス性慢性肝炎（ＨＢＶ、Ｄ型肝炎ウイルスおよびＨＣＶ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、ＨＩＶが原因、ヒト免疫不全ウイルス）、またはＥＢＶ関連障害：全身性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、およびシェーグレン症候群）ならびに多発性硬化症（ＭＳ）などの慢性感染性疾患である。特に、慢性感染細胞は、上で挙げた感染性疾患の病原体またはその一部を含む。
【００８２】
老化細胞の場合、基礎疾患は、（ｉ）早期老化を特徴とする早老症候群と呼ばれるまれな遺伝性疾患：ウェルナー症候群（ＷＳ）、ブルーム症候群（ＢＳ）、ロトムンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）、コケイン症候群（ＣＳ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、裂毛症もしくはハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）または（ｉｉ）一般的な加齢関連障害：肥満、２型糖尿病、サルコペニア、骨関節炎、特発性肺線維症および慢性閉塞性肺疾患、白内障、神経変性疾患、もしくは癌治療関連障害などの老化関連疾患である。特に、老化細胞は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ＦａｓＲ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４４、ＥＧＦレセプター、ＣＤ３８、Ｎｏｔｃｈ−１、ＣＤ４４、ＣＤ５９、もしくはＴＮＦレセプターなどの１つまたはそれ以上のタンパク質を、特に、ミスフォールドした形態で発現する、および／または細胞表面において提示する。それにもかかわらず、細胞は、１つまたはそれ以上のこれらのタンパク質を発現する非罹患細胞である場合もある。
【００８３】
炎症性表現型を示す細胞の場合、基礎疾患は、アレルギー、喘息、アテローム動脈硬化症、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、肥満、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、または間質性膀胱炎などの炎症性疾患である。特に、炎症性表現型を示す細胞は、ブラジキニン、Ｃ３、Ｃ５ａ、第ＸＩＩ因子、膜侵襲複合体、プラスミン、トロンビン、リソソーム顆粒、ヒスタミン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ロイコトリエンＢ４、一酸化窒素、プロスタグランジン、ＴＮＦ−アルファ、またはＣ反応性タンパク質などの１つまたはそれ以上の炎症促進因子を過剰発現する細胞である。
【００８４】
アミロイドタンパク質を蓄積した細胞の場合、基礎疾患は、アルツハイマー病、２型真性糖尿病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、甲状腺の髄様癌、心不整脈、アテローム動脈硬化症、関節リウマチ、大動脈内アミロイド（Ａｏｒｔｉｃ  ｍｅｄｉａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ）、プロラクチノーマ、家族性アミロイドポリニューロパチー、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、透析関連アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、脳アミロイド血管症、全身性ＡＬアミロイドーシス、または孤発性封入体筋炎などのアミロイド線維の異常な蓄積と関連する疾患である。特に、アミロイドタンパク質を蓄積した細胞は、ベータアミロイド、ＩＡＰＰ、アルファ−シヌクレイン、ＰｒＰＳｃ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質Ａ１、血清アミロイドＡ、メディン（Ｍｅｄｉｎ）、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、ベータ−２ミクログロブリン、ゲルソリン、ケラトエピセリン（Ｋｅｒａｔｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、またはＳ−ＩＢＭなどの１つまたはそれ以上のアミロイドを過剰発現する細胞である。
【００８５】
ミスフォールドしたタンパク質を蓄積した細胞の場合、基礎疾患は、アルツハイマー病、脳β−アミロイド血管症、緑内障における網膜神経節細胞変性、プリオン病、パーキンソン病、タウオパチー、前頭側頭葉変性症、ＦＴＬＤ−ＦＵＳ、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、ＣＡＤＡＳＩＬ、アレキサンダー病、セイピノパチー（Ｓｅｉｐｉｎｏｐａｔｈｙ）、家族性アミロイドニューロパチー（Ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、老人性全身性アミロイドーシス、ＡＬ（軽鎖）アミロイドーシス、ＡＨ（重鎖）アミロイドーシス、ＡＡ（二次性）アミロイドーシス、ＩＩ型糖尿病、大動脈内アミロイドーシス（Ａｏｒｔｉｃ  ｍｅｄｉａｌ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、アポＡＩアミロイドーシス、アポＡＩＩアミロイドーシス、アポＡＩＶアミロイドーシス、フィンランド型の家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎／ミオパチー、白内障、ロドプシン突然変異を伴う網膜色素変性、甲状腺髄様癌、心房性アミロイドーシス、下垂体プロラクチノーマ（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎｏｍａ）、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、皮膚苔癬アミロイドーシス（Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｃｈｅｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、マロリー小体、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス（Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、肺胞タンパク症、歯原性（ピンドボルグ）腫瘍アミロイド、精嚢アミロイド、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、または重症疾患ミオパチーなどのプロテオパチーである。好ましくは、ミスフォールドしたタンパク質を蓄積した細胞は、アミロイドβペプチド（Ａβ）、タウタンパク質、プリオンタンパク質、α−シヌクレイン、微小管結合タンパク質タウ（タウタンパク質）、ＴＤＰ−４３、Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）タンパク質（Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ  （ＦＵＳ）ｐｒｏｔｅｉｎ）、スーパーオキシドジスムターゼ、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、タンデムグルタミン伸長（ｔａｎｄｅｍ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を伴うタンパク質、ＡＢｒｉ、ＡＤａｎ、シスタチンＣ、Ｎｏｔｃｈ３、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、セイピン（Ｓｅｉｐｉｎ）、トランスサイレチン、セルピン、モノクローナル免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アミロイドＡタンパク質、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ；アミリン）、メディン（ラクトアドヘリン（ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ））、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩＶ、ゲルソリン、リゾチーム、フィブリノーゲン、ベータ−２ミクログロブリン、クリスタリン、ロドプシン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、プロラクチン、ケラトエピセリン、ケラチン、ケラチン中間径フィラメントタンパク質、ラクトフェリン、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）、歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質（Ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｅｌｏｂｌａｓｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒ���ｔｅｉｎ）、セメノジェリン（Ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ）Ｉ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、ヘモグロビン、またはミオシンユビキチン化の高タンパク質分解性状態（Ｈｙｐｅｒｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｍｙｏｓｉｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）などの１つまたはそれ以上のタンパク質をミスフォールドする細胞である。
【００８６】
「細胞レセプター」という用語は、任意の特定のレセプターに限定されない。例えば、これは、Ｇタンパク質共役レセプター、イオンチャネルまたは膜通過輸送体（ｃｒｏｓｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）が可能である。特定の例は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１６、およびＮＫｐ４６である。
【００８７】
細胞シグナル伝達分子は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインもしくは腫瘍壊死因子、またはホルモンもしくは成長因子などのサイトカインが可能である。
【００８８】
第６の態様の特定の実施形態において、抗体またはその誘導体は、多重特異性、特に、二重特異性であり、エフェクター分子、例えば、細胞傷害性物質またはレセプターリガンドとさらに結合する。
【００８９】
さらなる標的として、第６の態様の二量体または抗体もしくは誘導体は、上の第２の態様に関して記載されている抗原と結合することができる。
【００９０】
第６の態様の別の特定の実施形態において、抗体またはその誘導体は、多重特異性、特に、二重特異性であり、さらなる可変領域により上記病原体、罹患細胞または細胞シグナル伝達分子と結合する。
【００９１】
第６の態様に関して使用されるすべての用語は、具体的に別に定義されない限り、本発明の第１、第２、第３、第４および第５の態様に関して定義されたとおりの意味を有する。さらに、第６の態様に適用できる、第１、第２、第３、第４および第５の態様に関して明記されたすべての実施形態は、第６の態様に対しても想定される。
【００９２】
第７の態様において、本発明は、第２の態様の抗体またはその誘導体を単離する方法であって、
（ｉ）第１の態様による重鎖Ａおよび軽鎖Ａならびに第２の態様において定義されるとおりの重鎖Ｂおよび軽鎖Ｂを含む溶液を準備する工程、
（ｉｉ）重鎖Ａの軽鎖Ａとの対形成および／または重鎖Ｂの軽鎖Ｂとの対形成を選択する手段を用いずに抗体または誘導体を精製する工程
を含む、方法に関する。
【００９３】
特に、溶液は、
−  第２の態様の抗体または誘導体、
−  第１の態様による２つの重鎖Ａを含む抗体または誘導体、および
−  第２の態様において定義されるとおりの２つの重鎖Ｂを含む抗体または誘導体
を含むことが可能である。
【００９４】
特に、溶液は、軽鎖Ａが重鎖Ｂと対形成する、および／または軽鎖Ｂが重鎖Ａと対形成する抗体または誘導体を含まない。
【００９５】
一実施形態において、工程（ｉ）は、細胞において、第３の態様の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを発現させる工程および、場合により、細胞を溶解させる工程を含む。抗体または誘導体の精製としては、当該技術分野において知られている手段、例えば、物理化学的分取（例えば、示差沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、サイズ排除または抗体のサイズ、電荷もしくはその他の共有化学的特性に基づく免疫グロブリンの固相結合）、クラス特異的親和性、または抗原特異的親和性を挙げることができる。
【００９６】
特定の実施形態において、抗体またはその誘導体は、「二価Ｆａｂ構成」に従った第２の態様の抗体もしくは誘導体または（例えば、「四価クモ状構成」の）第２の態様の対称性抗体もしくはその誘導体であり、抗体または誘導体は、重鎖対形成、例えば、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成に関して選択する手段を用いずに精製される。
【００９７】
抗体またはその誘導体の重鎖がｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異を含む場合もある別の特定の実施形態において、抗体またはその誘導体は、Ｙ状ＩｇＧ様形態を有する第２の態様の抗体または誘導体であり（「ＩｇＧ構成」、「ＴＢＴＩ構成」および「ＣＯＤＶ構成」を含む）、抗体または誘導体は、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成に関して選択する手段を用いて精製される。特に、重鎖Ａの重鎖Ｂとの対形成に関して選択する手段は、以下のものを含む。
−  プロテインＡ結合を選択する手段（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーによって）、
−  ＣＨ１ドメインもしくはＣＬ（もしくはＣκ）ドメインの存在（例えば、Ｋａｐｐａ
Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィーによって）、もしくはＣＨ２ドメインの不在に関して選択する手段、または
−  プロテインＡ結合を選択すること（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーによって）に続いて、ＣＨ１ドメインもしくはＣＬ（もしくはＣκ）ドメインの存在（例えば、Ｋａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィーによって）、またはＣＨ２ドメインの不在に関して選択する手段。
【００９８】
重鎖Ａおよび重鎖ＢのＦｃ領域が、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異を含み、重鎖ＡのＦｃ領域もしくは重鎖ＢのＦｃ領域のいずれかは、プロテインＡとの結合を止める１つまたはそれ以上の突然変異を含む特に有利な実施形態、ならびにｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異のｈｏｌｅ突然変異を含む重鎖がプロテインＡとの結合を止める１つまたはそれ以上の突然変異を含む特に有利な実施形態において、第７の態様の方法は、ＣＨ１ドメインもしくはＣＬ（もしくはＣκ）ドメインの存在（例えば、Ｋａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィーによって）、またはＣＨ２ドメインの不在に関して選択することを含まない。ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅアプローチは、２つの「ｈｏｌｅ」重鎖の二量体形成も可能にするが、２つの「ｋｎｏｂ」重鎖の二量体形成は可能にしないため、この選択の省略は可能である。したがって、「ｈｏｌｅ」重鎖が、プロテインＡとの結合を低減する、特に、止める１つまたはそれ以上の突然変異を有し、プロテインＡクロマトグラフィーにより選択される場合、「ｈｏｌｅ」二量体に対して選択をし、いかなるさらなる工程も用いずに二重特異性抗体のみを単離することになる。
【００９９】
第７の態様に関して使用されるすべての用語は、具体的に別に定義されない限り、本発明の第１、第２、第３、第４、第５および第６の態様に関して定義されたとおりの意味を有する。さらに、第７の態様に適用できる、第１、第２、第３、第４、第５および第６の態様に関して明記されたすべての実施形態は、第７の態様に対しても想定される。
【０１００】
いくらかの例となる抗体は、以下のとおりのアミノ酸配列によって表される：
以下を有する四価クモ状抗体（図１Ｅを参照）
−  残基１〜１１３が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：３に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１２０が可変ドメインＡであり、異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもでき、残基２３９〜３５８が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：４に従った重鎖、および
−  残基１〜１０７が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：５に従った軽鎖Ｂ。
【０１０１】
以下を有するＭＣＨ２ドメインを有する二重特異性ＩｇＧ１抗体（図１Ａを参照）：
−  残基１〜１１２が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：６に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１１３が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：７に従った重鎖Ａ、
−  残基１〜１０７が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：８に従った軽鎖Ｂ、および
−  残基１〜１１８が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：９に従った重鎖Ｂ。
【０１０２】
以下を有するＭＣＨ２ドメインを有する二重特異性ＩｇＧ１抗体（図１Ａを参照）：
−  残基１〜１１１が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１０に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１１８が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１１に従った重鎖Ａ、
−  残基１〜１０７が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１２に従った軽鎖Ｂ、および
−  残基１〜１２３が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１３に従った重鎖Ｂ。
【０１０３】
ＣＨ２ＨがＤＩＭＨの代わりにＶＨＢと連結されている、以下を有する二価Ｆａｂ（図１Ｂ）
−  残基１〜１１２が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１４に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１２１が可変ドメインＡであり、異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもでき、残基２４０〜３５９が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１５に従った重鎖、および
−  残基１〜１１３が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１６に従った軽鎖Ｂ。
【０１０４】
２つの可変ドメインＢが、重鎖の各部分であり、これらの重鎖ＨＣ１およびＨＣ２が互いに対形成し（それにより可変ドメインＢを対形成する）、重鎖ＨＣ１が、可変ドメインＡと連結されたＭＣＨ２ドメインと連結され、ＭＣＨ２ドメインは、さらなるＭＣＨ２ドメインと対形成し、これが可変ドメインＡと連結されて軽鎖ＬＣ１を形成する（それにより可変ドメインＡを対形成する）、以下を有する二価二重特異性抗体
−  残基１〜１１２が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１７に従った軽鎖ＬＣ１、
−  残基１〜１２１が可変ドメインＡであり、異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもでき、残基２４０〜３５９が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１８に従った重鎖ＨＣ１、および
−  残基１〜１１３が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：１９に従った軽鎖ＬＣ２。
【０１０５】
以下を有するＣＨ２Ｅ・擬似ＣＯＤＶ抗体（ＣＨ２Ｅ−ｐｓｅｕｄｏ−ＣＯＤＶ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（図７Ａを参照）
−  残基１〜１１８が可変ドメイン１であり、残基１２０〜２４２が可変ドメイン２である（ともに、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる）、配列番号：２０に従った鎖１、および
−  残基１〜１０７が可変ドメイン２であり、残基１１５〜２２５が可変ドメイン１である（ともに、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる）、配列番号：２１に従った鎖２。
【０１０６】
以下を有する擬似ヒンジ・ＣＨ２Ｅ・ハイブリッドＦａｂ２（ｐｓｅｕｄｏ  ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２Ｅ−ｈｙｂｒｉｄ−Ｆａｂ２）（図８Ａを参照）
−  残基１〜１２３が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２２に従った重鎖Ａ、
−  残基１〜１０６が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２３に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１１８が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２４に従った重鎖Ｂ、
−  残基１〜１１１が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２５に従った軽鎖Ｂ。
【０１０７】
以下を有するＥＣＨ２ドメインを有する二重特異性ＩｇＧ１抗体（図１Ａを参照）：
−  残基１〜１１０が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２６に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１２３が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２７に従った重鎖Ａ、
−  残基１〜１１１が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２８に従った軽鎖Ｂ、および
−  残基１〜１１８が可変ドメインＢであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる、配列番号：２９に従った重鎖Ｂ。
【０１０８】
以下を有するＭＣＨ２ドメインを有する三価抗体（図１Ｆを参照）：
−  残基１〜１１１が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる（抗−ＩＬ１３−（ｈｕｚｄＢＢ１３）−ＶＬ−ｈｕＭＣＨ２）、配列番号：３０に従った軽鎖Ａ、
−  残基１〜１１８が可変ドメインＡであり、例示されたものと異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる（抗ＩＬ１３−（ｈｕｚｄＢＢ１３）−ＶＨ−ｈｕＭＣＨ２−ｈｕＩｇＧ１−Ｆｃ（ｈｏｌｅ−ＲＦ））、配列番号：３１に従った重鎖Ａ、
−  残基１１８〜２２４が可変ドメインＢであり、残基１〜１０７が可変ドメインＹであり、ともに、例示したものとは異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる（ＣＯＤＶ−抗ＩＬ４−（ｈｕｚｄ８Ｄ４−８）−ＶＬ−抗ＴＮＦファルファ−（アダリムマブ）−ＶＬ−−ｈｕＩＧＬＣ２）、配列番号：３２に従った軽鎖Ｂ、および
−  残基１〜１２１が可変ドメインＢであり、残基１２２〜２４４が可変ドメインＹであり、ともに、例示したものとは異なる特異性を有する可変ドメインで置換することもできる（ＣＯＤＶ−抗ＴＮＦアルファ−（アダリムマブ）−ＶＨ−抗ＩＬ４−（ｈｕｚｄ８Ｄ４−８）−ＶＨ−ｈｕＩＧＨＧ１（ｋｎｏｂ））、配列番号：３３に従った重鎖Ｂ。この抗体は、三重特異性であるが、可変ドメインは、抗体を二重特異性または単一特異性にするようにも置換することができる。
【０１０９】
上の鎖の代わりに、その変異体を使用することもできる。変異体は、それが由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号：３から３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する。２つの配列間の同一性パーセントの算出は、上記のとおり達成される。また、上のすべての例において、ＭＣＨ２／ＥＣＨ２ドメインは、適用可能なように、ＤＩＭ／ＣＨ１Ｃｋドメインで取り替えることができる。
【０１１０】
以下の図および例において、本発明のいくつかの詳細な実施形態をさらに詳細に記載する。やはり、特定の実施形態の詳細による本発明の限定は意図しない。対照的に、本発明は、本明細書中の実施形態において明確に言及されていないが、当業者が労力を要せずにわかる詳細を含むあらゆる実施形態に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１−１】本発明によって容易にされる抗体または誘導体構成の例である。異なる二量体形成ドメインは、可変ドメインの正しい対形成を確実にする。Ａ：ＩｇＧ構成（ヒンジ領域によるＦｃ−Ｆａｂ連結以外、リンカーは示されていない）であり、Ｂ：二価Ｆａｂ構成（Ｆａｂ−Ｆａｂリンカー以外、リンカーは示されていない；このリンカーは、あるいは、ＣＨ２ＨをＤＩＭＬと、ＣＨ２ＬをＤＩＭＨとまたはＣＨ２ＬをＤＩＭＬと連結する場合もある）であり、Ｃ：ＴＢＴＩ構成（ヒンジ領域によるＦｃ−Ｆａｂ連結以外、リンカーは示されていない）であり、Ｄ：左側アームおよび右側アームの２つの可能なリンカー構成を示すＣＯＤＶ構成（両方のアームが同じリンカー構成、すなわち、示した左側または右側アームのものを有することもできる）であり、Ｅ：四価クモ状構成（ヒンジ領域およびＦａｂ−ＦａｂリンカーによるＦｃ−Ｆａｂ連結以外、リンカーは示されていない）であり、Ｆ：単一、二重、および三重特異性を可能にさせる３つの結合部位を含む三価構成（ＣＯＤＶキメラ構成に関する例）である。示した右側アームは、図１ＤのＣＯＤＶ構成の右側アームのリンカー構成を有するＣＯＤＶアームであるが、これは、代わりにこのＣＯＤＶ構成のリンカー構成を有してもよい。左側アームは、従来のＩｇＧアームである。左側および右側アームは交換可能である、すなわち、左側アームがＣＯＤＶアームであり、右側アームがＩｇＧアームであることも可能である。さらに、ＭＣＨ２ドメインは、ＩｇＧアームにあるよう示されているが、代わりに、ＣＯＤＶアームにあることも可能であり（そのリンカー構成とは無関係）、その結果、ＤＩＭドメインがＩｇＧアームにある。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図１−４】図１−３の続き。
【図２】非対称性抗体の構成の略図である。Ａ：抗体様構造の半分にあるＣＨ１／カッパ領域が、ＭＣＨ２ドメインによって置換されている。半分を含むＦａｂのＦｃは、ＩｇＧ３由来のＣＨ３を含むキメラであるが、すべての他のＦｃドメインはＩｇＧ１由来のものである。プロテインＡおよびＫａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィーを含む２段階精製が集合した正しいヘテロ二量体分子の単離を可能にする。Ｂ：還元条件下における鎖組成物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｃ：精製ヘテロ二量体抗体のＳＥＣプロフィールである。
【図３】非対称性抗体の構成の略図である。Ａ：抗体様構造の半分にあるＣＨ１／カッパ領域が、ＭＣＨ２ドメインによって置換されている。ヘテロ二量体形成は、Ｆｃ部分内のｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ突然変異によってなされる。ｈｏｌｅ突然変異を有するＦｃ部分は、ＲＦ突然変異をさらに含む。プロテインＡおよびＫａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィーを含む２段階精製が集合した正しいヘテロ二量体分子の単離を可能にする。Ｂ：還元条件下における鎖組成物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｃ：精製ヘテロ二量体抗体のＳＥＣプロフィールである。
【図４−１】四価クモ状構成である。Ａ：対称性ＩｇＧ様構造の略図である。１段階プロテインＡクロマトグラフィーは、適切に集合したホモ二量体分子の単離を可能にする。Ｂ：還元条件下における鎖組成物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｃ：精製ヘテロ二量体抗体のＳＥＣプロフィールである。ＤおよびＥ：対応する抗原との結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】非対称性抗体の構成の略図である。Ａ：抗体様構造の半分にあるＣＨ１／カッパ領域がＥＣＨ２ドメインによって置換されている。ヘテロ二量体形成は、Ｆｃ部分内のｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ突然変異によってなされる。ｋｎｏｂ突然変異を有するＦｃ部分は、ＲＦ突然変異をさらに含む。Ｂ：還元条件下における鎖組成物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｃ：精製タンパク質のＳＥＣプロフィールである。Ｄ：ＩＬ４およびＩＬ１３との結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図６】二価Ｆａｂ構成である。Ａ：二価二重特異性Ｆａｂフラグメントの略図である。Ｂ：精製タンパク質のＳＥＣプロフィールである。ＣおよびＤ：それぞれＣＤ３およびＣＤ１２３との結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図７】ＣＯＤＶ二価Ｆａｂ構成（ＥＣＨ２）である。Ａ：タンパク質構成の略図である。Ｂ：精製タンパク質のＳＥＣプロフィールである。Ｃ：ＩＬ４およびＩＬ１３の両方との結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図８】Ｆ（ａｂ’）２様構成である。Ａ：二価二重特異性Ｆ（ａｂ’）２様フラグメントの略図である。Ｂ：精製ヘテロ二量体抗体のＳＥＣプロフィールである。Ｃ：還元条件下における鎖組成物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｄ：ＩＬ４およびＩＬ１３との結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
〔実施例〕
材料および方法
発現プラスミドの形成
記載されているすべてのコンストラクトは、遺伝子合成フラグメント（ＧｅｎｅＡｒｔ）から構築し、制限酵素で切断し、哺乳動物発現ベクターｐＸＬに連結した。そのベクターを、大腸菌をトランスフォームするために使用し、クローンを選択し、増幅して、一過性トランスフェクションのためのＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して単離した。そのＤＮＡ配列を関連したＯＲＦおよび配列関係の配列決定によって検証した。得られたコードＯＲＦは、前に列挙され、記載されている配列に従う。
【０１１３】
組み換えタンパク質の発現
すべてのタンパク質産生活動は、一過性の発現によって実現した。Ｆ１７無血清浮遊培養液（Ｌｉｆｅ）中で増殖させたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３（Ｌｉｆｅ）細胞を発現プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションを、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ）を使用して行った。その細胞を、振とうフラスコ中、８％ＣＯ２、３７℃で７日間培養した。組み換えタンパク質を含む培養上清を、遠心分離によって回収し、ろ過（０．２２μｍ）によって清澄にした。組み換えＩｇＧ１コンストラクトを、プロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。１００ｍＭ酢酸バッファーおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５によるカラムからの溶出後、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合したＣＯＤＶ・ＩｇＧ１コンストラクトを、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎを使用して脱塩し、０．２２μｍの膜を使用してろ過した。Ｆａｂ様コンストラクトを、ＨｉＴｒａｐ  ＩＭＡＣ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をつけたＩＭＡＣによって精製した。直線グラジエント（溶出バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０〜５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）を用いてカラムから溶出した後、タンパク質含有画分をプールし、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合したその画分を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎを使用して脱塩し、０．２２μｍの膜を使用してろ過した。非対称性ヘテロ二量体コンストラクトの精製のために、タンパク質サンプルを、プロテインＡによる捕捉および脱塩段階後に、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラム（ＧＥ）にさらに適用し、および／またはＫａｐｐａ  ｓｅｌｅｃｔ（ＧＥ）によって捕捉した。そのタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ）を使用したＳＥＣによって精製した。最終的な限外ろ過濃縮段階の後に、そのタンパク質を、さまざまなアッセイのために使用した。この方策は、ホモ二量体からヘテロ二量体を単離するために使用した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度の測定によって求めた。各バッチを、還元条件および非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、それぞれのサブユニットおよび単量体の純度および分子量を求めた。
【０１１４】
ＭＣＨ２およびＥＣＨ２変異体の特徴づけ
ＭＣＨ２およびＥＣＨ２抗体様タンパク質重鎖および軽鎖が適切に対形成およびフォールディングしたかどうかを判断するために、凝集レベルを分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した。分析的ＳＥＣは、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）およびＴＳＫｇｅｌ  ＳＷＸＬガードカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、集合した対に対して行った。分析は、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．７を使用して１ｍｌ／分で、２８０ｎｍにおける検出で行った。３０μｌのタンパク質サンプル（０．５〜１ｍｇ／ｍｌで）をカラムに適用した。分子サイズの推定のために、そのカラムを、ゲルろ過標準混合物（ＭＷＧＦ−１０００、ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して較正した。データの評価は、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアｖ５．１１を使用して行った。
【０１１５】
ＳＰＲによる結合分析
２組の重鎖および軽鎖を、全動態分析のために選択した。組み換えヒトＩＬ１３およびＩＬ４を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（米国）から購入した。精製した抗体の動態学的な特徴づけを、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による表面プラズモン共鳴技術を使用して行った。調査対象の抗体の捕捉および配向に関する種特異的抗体（例えば、ヒトＦｃ特異的なＭＡＢ  １３０２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用した捕捉アッセイを使用した。捕捉した抗体を、標準的な手順を使用して第一級アミン基（１１０００ＲＵ）により、研究グレードのＣＭ５  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定した。分析対象の抗体は、３０ＲＵの最高の分析物結合をもたらすであろう調節されたＲＵ値を用いて１０μＬ／分の流量で捕捉された。ＨＢＳ  ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中の、０から２５ｎＭの間の濃度範囲にわたる組み換えヒトＩＬ４およびＩＬ１３に対する結合動態を３０μｌ／分の流量で測定した。チップ表面を１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で再生した。動態学的パラメータを、参照として捕捉した抗体を用いないフローセルを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムパッケージｖ４．１において分析および算出した。
【０１１６】
「再指向性」細胞死滅
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離によってＥＤＴＡで処理した健康なドナーの末梢血２００ｍｌから単離した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍｌを、５０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐ−Ｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に予め入れた。血液を、ａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｉｎｓｉｎｇバッファー＋１％ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で希釈し、全部で１０個の用意したチューブの膜の上に入れた。チューブを、１０００×ｇで１０分間、中断せずに遠心分離した。ＰＢＭＣを、回収し、ａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｉｎｓｉｎｇバッファー＋１％ＢＳＡで３回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを、製造業者の説明書に従ってＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したａｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ技術によるＴリンパ球の単離のためにａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）中に再懸濁させた。分離したＴ細胞の純度を、ヒト７−Ｃｏｌｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメトリーによって分析した。二重特異性抗体のＴ細胞結合効果を、細胞傷害アッセイに基づくフローサイトメトリーによって分析した。標的細胞（すなわち、ＴＨＰ−１細胞株）を、１Ｅ７細胞当たりＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ中のＣＦＳＥ  １μＭにより３７℃で１５分間着色した。その後、細胞を、２回洗浄し、ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ＋１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた。２．５Ｅ４の標的細胞を、９６ウェルＵ底浮遊培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）中、１ウェル当たり５０μｌの培地に播いた。単離した初代ヒトＴリンパ球を、ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ＋１０％ＦＣＳに再懸濁させ、１ウェル当たり５０μｌ中、示したエフェクター対標的比で標的細胞に添加した（一般にＥ：Ｔ＝１０：１）。二重特異性抗体を、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１：３段階希釈し、それぞれ５μｌを３０００ｎｇ／ｍｌの最終最高濃度で細胞に添加した。このアッセイを、５％ＣＯ２中３７℃で２０時間インキュベートした。死滅した標的細胞を検出するために、すべての細胞を、７−ＡＡＤで着色した。したがって、ＦＢＳを含むＳｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で希釈した７−ＡＡＤ  ５μｇ／ｍｌを各ウェルに添加し、暗所において４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、それぞれＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）またはＬＳＲＩＩ（ＢＤ）フローサイトメーターを使用して測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してさらなるデータ分析を行った。表示は、ＣＦＳＥおよび７−ＡＡＤダブルポジティブ細胞のパーセンテージとした。これらの調査の結果は、腫瘍細胞の再指向性死滅（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）を仲介するＣＤ１２３×ＣＤ３  Ｆａｂの能力を実証している。
【実施例１】
【０１１７】
ＩｇＧ構成（ＭＣＨ２）、ＲＦ突然変異
材料および方法のセクションに記載されているように、一方のＦｃ鎖にＩｇＧ３−ＣＨ３ドメインおよび他方にＩｇＧ１−ＣＨ３ドメインならびにＩＬ１３およびＩＬ４である可変ドメインを含むＩｇＧ構成の抗体を形成し、ここで、ＣＨ２ＨおよびＣＨ２Ｌドメインは、ＩｇＭ定常ドメインＭＣＨ２である（図２Ａを参照）。これを、以下の工程により精製した：
１．プロテインＡクロマトグラフィー
２．Ｋａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィー
３．ＨｉＰｒｅｐ２６／１０による脱塩
【０１１８】
収率は、４ｍｇ／ｌであった。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ｂ）は、還元条件下におけるフラグメントの予測される数およびサイズを示した。精製したタンパク質のＳＥＣ分析は、９６％の単量体レベルを示した（図２Ｃ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、対応する抗原との結合および親抗体から予測されるとおりの結合動態を示した（表２）。
【０１１９】
【表２】
2019533986.tif 000003
【実施例２】
【０１２０】
ＩｇＧ構成（ＭＣＨ２）、ＲＦおよびｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異
材料および方法のセクションに記載されているように、一方のＣＨ３ドメインに突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ（ＲＦ突然変異）ならびにｋｎｏｗ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異ならびにＩＬ１３およびＩＬ４と結合する可変ドメインを含むＩｇＧ構成の抗体を形成した（図３Ａを参照）。これを、以下の工程により精製した：
１．プロテインＡクロマトグラフィー
２．Ｋａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィー
３．ＨｉＰｒｅｐ２６／１０による脱塩
【０１２１】
収率は、実施例１に記載されている変異体に関してよりも２倍高い１０ｍｇ／ｌであり、Ｆｃフラグメントのｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ改変によってなされる正しい鎖の結合のさらに高い効率を示した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ｂ）は、還元条件下におけるフラグメントの予測される数およびサイズを示した。精製したタンパク質のＳＥＣ分析は、９６％の単量体レベルを示した（図３Ｃ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、対応する抗原との結合および親抗体から予測されるとおりの結合動態を示した。
【実施例３】
【０１２２】
四価クモ状構成
材料および方法のセクションに記載されているように、四価クモ状構成の抗体（図４Ａを参照）を形成した。これを、以下の工程により精製した：
１．プロテインＡクロマトグラフィー
２．ＨｉＰｒｅｐ２６／１０による脱塩
【０１２３】
収率は、５ｍｇ／ｌであった。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４Ｂ）は、非還元条件下において予測されるサイズを有するすべての予測されるフラグメントを示した。ＳＥＣ分析は、９８％の単量体レベルを示した（図４Ｃ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析（図４ＤおよびＥ）は、対応する抗原に対する結合を示した。
【実施例４】
【０１２４】
ＩｇＧ構成（ＥＣＨ２）、ＲＦおよびｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ突然変異
この二価二重特異性抗体（図５Ａを参照）は、アミノ酸位置１０４から２１０のヒトＩｇＥのＣＨ２ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５４）を含む。このドメインは、望ましくないｃｙｓ反応性を回避するためのシステイン１０５のアラニンへの突然変異およびグリコシル化を回避するためのアスパラギン１４６のグルタミンへの突然変異を含む。以下の実施例において「ＣＨ２Ｅ」と呼ぶ。ＣＨ２Ｅ部分をコンストラクトのＨＣと融合させるために、柔軟なリンカー（ＧＳＧＳＧＳ）を組み込んだ。
【０１２５】
以前に示された（ＵＳ２０１００２２６９２３Ａ１）抗原：ＩＬ４およびＩＬ１３を認識する可変ドメイン「ｈｕＢＢ１３」および「ｈｕ８Ｄ４−８」を使用した例は、それぞれが改変されたＩｇＧ１−Ｆｃドメインと融合された異なる標的ＶＤを表す２つの異なるＦａｂから成るＩｇＧ様構造として構成した。ヘテロ二量体の発現および形成を向上させるために、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）突然変異をＣＨ３ドメインに組み込んだ。Ｆｃ主鎖のエフェクター機能を防ぐために、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ突然変異（Ｈｅｚａｒｅｈら、２００１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５：１２１６１ページ）を組み込んだ。ＥＣＨ２ドメインが、ＣＨ１／カッパに取って代わっている。
【０１２６】
鎖
抗ＩＬ４（ｈｕ８Ｄ４−８−ＶＬ１）−ＣＬ１ｇｋ
抗ＩＬ４（ｈｕ８Ｄ４−８−ＶＨ１）−ＣＨ１ｇ−Ｆｃ（ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｋｎｏｂ  ＲＦ）
抗ＩＬ１３−ＶＬ（ｈｕＢＢ１３−ＶＬ３）−ＣＨ２ｅ
抗ＩＬ１３−（ｈｕＢＢ１３−ＶＨ２）−ＣＨ２ｅ−Ｆｃ（ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｏｌｅ）
を含む抗体。
【０１２７】
ヘテロ二量体鎖対の濃縮を確実にするために二段階アフィニティークロマトグラフィーを行った。タンパク質をＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉し、ｐＨシフトによって溶出した。タンパク質画分を回収し、バッファーをＨｉＰｒｅｐ２６／１０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ５３ｍｌ脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってすぐにＰＢＳに交換した。タンパク質溶液を、ＨｉＴｒａｐ  ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ｐＨシフトにより溶出した。タンパク質含有画分を回収し、バッファーをＨｉＰｒｅｐ２６／１０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ５３ｍｌ脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってすぐにＰＢＳに交換した。画分をプールし、限外ろ過によりサンプル体積を減少させた。そのタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用したＳＥＣによって精製した。最後の限外ろ過および０．２２μｍろ過段階の後に、タンパク質溶液をさらなるアッセイのために使用した。
【０１２８】
精製後の収率は１８ｍｇ／ｌであった。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５Ｂ）は、還元条件下におけるフラグメントの予測される数およびサイズを示した。精製したタンパク質のＳＥＣ分析は、約９９％の単量体レベルを示した（図５Ｃ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、対応する抗原ＩＬ４およびＩＬ１３との結合を示した（図５Ｄ）。
【実施例５】
【０１２９】
二価Ｆａｂ構成
材料および方法のセクションに記載されているように、２つのＦａｂが、一方のＦａｂ様フラグメント（ＣＤ３）のＭＣＨ２ドメインの、他方のＦａｂ（ＣＤ１２３）の可変ドメインとの連結により連結された二価Ｆａｂ構成の抗体を形成した。図６Ａを参照。収率は、７ｍｇ／ｌであった。ＳＥＣ分析は、９７％の単量体レベルを示した（図６Ｂ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、対応する抗原との結合（図６ＣおよびＤ）ならびに親抗体から予測されるとおりの結合動態（表３）を示した
【０１３０】
【表３】
2019533986.tif 000004
【実施例６】
【０１３１】
ＣＯＤＶ二価Ｆａｂ構成（ＥＣＨ２）
二重特異性Ｆ様フラグメント（図７Ａを参照）は、アミノ酸位置１０４から２１０のヒトＩｇＥのＣＨ２ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５４）を含む。このドメインは、望ましくないｃｙｓ反応性を回避するためのシステイン１０５のアラニンへの突然変異およびグリコシル化を回避するためのアスパラギン１４６のグルタミンへの突然変異を含む。この例では、以前に示された（ＵＳ２０１００２２６９２３Ａ１）抗原ＩＬ４およびＩＬ１３を認識する可変ドメイン「ｈｕＢＢ１３」および「ｈｕ８Ｄ４−８」を使用した。分子は、ＣＯＤＶ形式として構成される。この例において、ジスルフィド架橋によりＨＣとＬＣを結合するために、ＥＣＨ２ドメインが、通常、両鎖のＣ末端に位置するＣＨ１およびＣＬドメインに取って代わっている。精製のために８×ヒスチジンタグを付加した。
【０１３２】
抗体は、固有の２つの鎖：
鎖１：抗ＩＬ１３（ｈｕＢＢ１３−ＶＨ２）−抗ＩＬ４（ｈｕ８Ｄ４−８−ＶＨ１）−ＥＣＨ２−Ｈｉｓ
鎖２：抗ＩＬ４（ｈｕ８Ｄ４−８−ＶＬ１）−抗ＩＬ１３（ｈｕＢＢ１３−ＶＬ２）−ＥＣＨ２
を含む。
【０１３３】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質をＨｉｓＴｒａｐ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉し、イミダゾールグラジエントによって溶出した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＥＣによって、タンパク質を精製した。最後の限外ろ過濃縮段階によって、タンパク質を濃縮し、さらなるアッセイのために使用した。図７Ｂは、精製後のＦａｂ様フラグメントのＳＥＣプロフィールを示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、ＩＬ４およびＩＬ１３の両方との結合を示した（図７Ｃ）。
【実施例７】
【０１３４】
Ｆ（ａｂ’）２様構成（ヒンジ領域に取って代わっているＥＣＨ２）
このＦ（ａｂ’）２様抗体（図８Ａを参照）は、アミノ酸位置１０４から２１０のヒトＩｇＥのＣＨ２ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５４）を含む。このドメインは、望ましくないｃｙｓ反応性を回避するためのシステイン１０５のアラニンへの突然変異およびグリコシル化を回避するためのアスパラギン１４６のグルタミンへの突然変異を含む。また、この例において、重鎖にあるＣＨ２Ｅドメインを結合する柔軟なリンカーの含有物を導入した。以前に示された（ＵＳ２０１００２２６９２３Ａ１）抗原ＩＬ４およびＩＬ１３を認識する可変ドメイン「ｈｕＢＢ１３」および「ｈｕ８Ｄ４−８」を使用した例は、Ｆａｂ２様形式として構成した。この例において、ＨＣ部分により２つのＦａｂモジュールを結合するために、ＥＣＨ２ドメインが、ヒンジ領域に取って代わっている。二重特異性分子の形成は、２つの別々の標的特異性を示す２つの異なるＦａｂのヘテロ二量体形成により行われる。一方のＦａｂアームはＭＣＨ２ドメインを含み、他方は、未変性のＦａｂ構造に対応する。この例において、抗ＩＬ４  ＶＤはＣＨ１／カッパドメインに結合されており、抗ＩＬ１３  ＶＤは改変されたＭＣＨ２ドメインに融合されている。精製のために１つのＥＣＨ２ドメインのＣ末端（Ｃｔｅｒ）に８×ヒスチジンタグを付加した。
【０１３５】
抗体は、固有の４つの鎖：
抗ＩＬ４（ｈｕ８Ｄ４−８−ＶＨ１）−ＣＨ１ｇ−ＣＨ２ｅ
抗ＩＬ４（ｈｕ８Ｄ４−８−ＶＬ１）−Ｃｋ
抗ＩＬ１３（ｈｕＢＢ１３−ＶＨ２）−ＭＣＨ２−ＥＣＨ２−８×Ｈｉｓ
抗ＩＬ１３（ｈｕＢＢ１３−ＶＬ３）−ＭＣＨ２
を含む。
【０１３６】
ヘテロ二量体鎖対の濃縮を確実にするために二段階アフィニティークロマトグラフィーを行った。タンパク質をＨｉＴｒａｐ  ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉し、製造業者の説明書に従ってｐＨシフトによって溶出した。脱塩カラムによって、バッファーをすぐにＰＢＳに交換した。タンパク質溶液をＨｉｓＴｒａｐ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した後、イミダゾールグラジエントによって溶出した。その後、タンパク質含有画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＥＣによってさらに精製した。最終的な限外ろ過濃縮段階の後に、タンパク質をさらなるアッセイのために使用した。精製後のＳＥＣプロフィールは、約９９％の単量体の画分を明らかにした（図８Ｂ）。還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）は、予測される４つのフラグメントサイズを示した（図８Ｃ）。このコンストラクトは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析において示されるとおり、ＩＬ４およびＩＬ１３の両方と結合することができる（図８Ｄ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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