(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、細胞の細胞老化または細胞内の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の誘導を調節するための組成物および方法である。この方法は一般に、細胞老化およびＳＡＳＰの誘導を制御するための手段として、ＩＲＥ１αのレベルまたは活性を調節することを含む。対象の眼の中の細胞をビグアニド化合物およびビグアニド化合物を含む眼科用組成物と接触させることを含む、眼血管疾患を治療および予防するための方法も記載される。【選択図】図２０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を低下させることを含む、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を阻害または予防する方法。
【請求項２】
前記方法が、前記細胞をＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）対象における細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防する方法であって、有効量のＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４】
前記ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストが、（ａ）ＳＥＭＡ３Ａ抗体、（ｂ）ＳＥＭＡ３ＡアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または（ｃ）ＳＥＭＡ３Ａまたはその機能的多様体もしくは断片に結合する可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド（ＮＲＰ１トラップ）である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドが、表２に記載のＮＲＰ１トラップまたはその機能的多様体もしくは断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、ニューロン、ミクログリア細胞、内皮細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、または脂肪組織細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が最終分化細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記老化がパラクリン老化である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記老化が、細胞性虚血に続発する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記細胞においてＩＲＥ１αの活性化、ならびにＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１β、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を減少させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストおよび担体を含む、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防するための組成物。
【請求項１２】
細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防するためのＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストの使用。
【請求項１３】
前記ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストが、（ａ）ＳＥＭＡ３Ａ抗体、（ｂ）ＳＥＭＡ３ＡアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または（ｃ）（ｉ）ＳＥＭＡ３Ａまたはその機能的多様体もしくは断片に結合する可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド（ＮＲＰ１トラップ）であるか、または（ｉｉ）（ｉ）の前記ポリペプチドをコードする核酸、または前記核酸を含むベクターである、請求項１１に記載の組成物または請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記細胞が、ニューロン、ミクログリア細胞、内皮細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、または脂肪組織細胞である、請求項１１もしくは１３に記載の組成物、または請求項１２もしくは１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記細胞が最終分化細胞である、請求項１１もしくは１３に記載の組成物、または請求項１２もしくは１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記老化がパラクリン老化である、請求項１１、１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記アンタゴニストが、前記細胞において、ＩＲＥ１αの活性化、ならびにＰａｉ１、ＩＬ−６、ＩＩ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、およびＶｅｇｆａの発現を減少させる、請求項１１、１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
（ｉ）細胞の老化を阻害または予防するための、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）のための医薬品の調製に使用するためのＳＥＭＡ３Ａアンタゴニスト。
【請求項１９】
前記アンタゴニストが、（ａ）ＳＥＭＡ３Ａ抗体、（ｂ）ＳＥＭＡ３ＡアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または（ｃ）（ｉ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド（ＮＲＰ１トラップ）またはその機能的多様体もしくは断片、または（ｉｉ）（ｉ）の前記ポリペプチドをコードする核酸、または前記核酸を含むベクターである、請求項１８に記載の使用のためのＳＥＭＡ３Ａアンタゴニスト。
【請求項２０】
前記細胞は、サルコペニア、神経変性、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、腸管疾患、緑内障、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵臓線維症、または嚢胞性線維症、肥満、またはメタボリックシンドロームを患っている対象からのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、請求項１１、１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の使用、または請求項１８または１９に記載の使用のためのＳＥＭＡ３Ａアンタゴニスト。
【請求項２１】
ＳＥＭＡ３Ａレベルまたは活性を増大させることを含む、細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を刺激または誘導する方法。
【請求項２２】
細胞をＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片と接触させることを含む、細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型を刺激または誘導する方法。
【請求項２３】
ＳＥＭＡ３Ａポリペプチドを発現させるために、ＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、または前記ＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片をコードする核酸を対象に投与することを含む、細胞の老化または対象の細胞の老化関連分泌表現型を刺激または誘導する方法。
【請求項２４】
創傷治癒（例えば、皮膚創傷治癒）を改善するための、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞におけるＩＲＥ１αの活性化、ならびにＰａｉ１、ＩＬ−６、ＩＩ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を増加させる、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、または前記ＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片をコードする核酸を含む、細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型を刺激または誘導するための組成物。
【請求項２７】
細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型を刺激または誘導するためのＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片の使用。
【請求項２８】
前記細胞が、肝線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、癌、腎線維症または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する、請求項２６に記載の組成物または請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
創傷治癒を改善するための、請求項２６もしくは２８に記載の組成物、または請求項２７もしくは２８に記載の使用。
【請求項３０】
細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型を誘導するための医薬品の調製に使用するためのＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片。
【請求項３１】
細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型の刺激または誘導に使用するためのＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片。
【請求項３２】
前記細胞が、肝線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する、請求項３０または３１に記載の使用のためのＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片。
【請求項３３】
創傷治癒を改善するための、請求項３０または３１に記載の使用するためのＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片。
【請求項３４】
細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型を刺激または誘導するための医薬品の調製に使用するためのＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片をコードする核酸。
【請求項３５】
前記細胞が、肝線維症、肺高血圧症、心筋梗塞または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
請求項３５または３６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３７】
請求項３６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３８】
ＳＡＳＰ阻害剤を対象に投与することを含む、血管性眼疾患または障害を治療または予防する方法であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、（ｉｉ）ビグアニド化合物、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、方法。
【請求項３９】
前記血管性眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虚血性網膜症、高血圧性網膜症、薬物誘発性網膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、若年性黄斑変性症、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分岐網膜静脈閉塞症、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、目に対する物理的な傷害、緑内障、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜血管炎、網膜マクロ動脈瘤、網膜細動脈瘤、フックスジストロフィー症、虚血性視神経症、黄斑性毛細血管拡張症、視神経炎、アッシャー症候群、網膜色素変性症、ぶどう膜炎、虚血性視神経症（ＩＯＮ）、またはシュタルガルト病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血管性眼疾患もしくは障害が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑浮腫、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分枝網膜静脈閉塞症、または脈絡膜血管新生である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記血管性眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾性（萎縮性）加齢黄斑変性症、湿性（滲出性）加齢黄斑変性症、分枝網膜静脈閉塞症、または黄斑性毛細血管拡張症である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ＳＡＳＰ阻害剤を対象に投与することを含む、網膜血管形成を阻害する方法であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、（ｉｉｉ）ビグアニド化合物、または（ｉｖ）ｍＴＯｒ阻害剤である、方法。
【請求項４３】
前記網膜血管形成が、細胞性虚血に続発する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、網膜中心静脈閉塞症、分枝網膜静脈閉塞症、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、黄斑性毛細血管拡張症と診断されている、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＡＳＰ阻害剤を対象に投与することを含む、眼球血管修復を促進するおよび／または眼虚血を軽減する方法であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、（ｉｉｉ）ビグアニド化合物、または（ｉｖ）ｍＴＯｒ阻害剤である、方法。
【請求項４６】
ＳＡＳＰ阻害剤を対象に投与することを含む、眼の細胞老化を予防または低減する方法であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、（ｉｉｉ）ビグアニド化合物、または（ｉｖ）ｍＴＯｒ阻害剤である、方法。
【請求項４７】
前記投与は局所または局所眼投与である、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記局所眼投与は、結膜下（テノン嚢下）、硝子体内、眼球後部、後強膜近傍または房内投与である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記局所眼投与は、硝子体内投与である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＳＡＳＰ阻害剤がビグアニド化合物である、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ビグアニド化合物が、メトホルミン、フェンホルミン、ブホルミン、プログアニル、クロルプログアニル、シンタリンＡまたはシンタリンＢである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ビグアニド化合物がメトホルミンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ビグアニド化合物と好適な医薬担体とを含む眼科用組成物。
【請求項５４】
前記ビグアニド化合物が、（ｉ）メトホルミン、（ｉｉ）フェンホルミン、（ｉｉｉ）ブホルミン、（ｉｖ）プログアニル、（ｖ）クロルプログアニル、（ｖｉ）シンタリンＡ、（ｖｉｉ）シンタリンＢ、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせである、請求項５３に記載の眼科用組成物。
【請求項５５】
前記ビグアニド化合物がメトホルミンである、請求項５４に記載の眼科用組成物。
【請求項５６】
血管性眼疾患または障害を治療または予防するためのものである、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の眼科用組成物。
【請求項５７】
網膜血管形成を阻害するための、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の眼科用組成物。
【請求項５８】
眼球血管修復を促進するため、および／または眼虚血を軽減するための、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の眼科用組成物。
【請求項５９】
血管性眼疾患または障害の治療または予防に使用するための、ＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、組成物。
【請求項６０】
前記血管性眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虚血性網膜症、高血圧性網膜症、薬物誘発性網膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、若年性黄斑変性症、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分岐網膜静脈閉塞症、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、目に対する物理的な傷害、緑内障、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜血管炎、網膜マクロ動脈瘤、網膜細動脈瘤、フックスジストロフィー症、虚血性視神経症、黄斑性毛細血管拡張症、視神経炎、アッシャー症候群、網膜色素変性症、ぶどう膜炎、虚血性視神経症（ＩＯＮ）、またはシュタルガルト病である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
網膜血管形成の阻害使用するための、ＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、組成物。
【請求項６２】
眼血管修復の促進、および／もしくは眼虚血の軽減に使用するための、ＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、組成物。
【請求項６３】
眼細胞老化の予防または軽減に使用するための、ＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、組成物。
【請求項６４】
前記組成物が眼科用組成物である、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
血管性眼疾患または障害を治療または予防するためのものである、請求項５３〜５５、５９、６０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項６６】
（ｉ）網膜血管形成を阻害する、（ｉｉ）病理学的網膜血管新生を阻害する、（ｉｉｉ）眼血管修復を促進する、（ｉｖ）眼虚血を軽減する、かつ／または（ｖ）眼細胞老化を予防または軽減するための、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項６７】
血管性眼疾患または障害を治療または予防するための医薬品の調製において使用するための、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
（ｉ）網膜血管形成を阻害する、（ｉｉ）眼血管修復を促進するおよび／もしくは眼虚血を軽減する、かつ／または（ｖ）眼細胞老化を予防または軽減するための、医薬品の調製に使用するための、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項６９】
（ｉ）網膜血管形成を阻害する、（ｉｉ）病理学的網膜血管新生を阻害する、（ｉｉｉ）眼血管修復を促進する、（ｉｖ）眼虚血を軽減する、かつ／または（ｖ）眼細胞老化を予防または軽減するための、ＳＡＳＰ阻害剤を含み、前記ＳＡＳＰ阻害剤である、組成物の使用。
【請求項７０】
血管性眼疾患または障害の治療または予防のための、医薬品の調製に使用するためのＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物であって、前記ＳＡＳＰ阻害剤が、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、組成物。
【請求項７１】
（ｉ）網膜血管形成（病理学的的網膜血管新生）を阻害する、（ｉｉ）眼血管修復を促進する、（ｉｉｉ）眼虚血を軽減する、かつ／または（ｉｖ）眼細胞老化を予防または軽減するための医薬品の調製に使用するための、ＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物であって、（ｉ）ＩＲＥ１αの発現の阻害剤、（ｉｉ）ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅの活性の阻害剤、または（ｉｉｉ）ｍＴＯｒ阻害剤である、組成物。
【請求項７２】
ＩＲＥ１αの発現または活性を低下させることを含む、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防する方法。
【請求項７３】
前記活性がＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記方法が、前記細胞をＩＲＥ１α阻害剤と接触させることを含む、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）対象の細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防する方法であって、ＩＲＥ１α阻害剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７６】
前記阻害剤が、ＩＲＥ１α、４ｕ８ｃ、ボルテゾミブ、Ｎ−［（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）メチレン］−２−チオフェンスルホンアミド（ＳＴＦ−０８３０１０）、またはＭＫＣ−３９４６に対するアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡである、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞が最終分化細胞である、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞がニューロンまたはミクログリア細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記老化がパラクリン老化である、請求項７２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＳＡＳＰが細胞性虚血に続発する、請求項７２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞におけるＩＲＥ１αの活性化、ＳＡ−β−ｇａｌの活性、および／またはＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を減少させる、請求項７２〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＩＲＥ１α阻害剤を含む、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防するための組成物。
【請求項８３】
（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防するためのＩＲＥ１α阻害剤の使用。
【請求項８４】
前記ＩＲＥ１α阻害剤が、ＩＲＥ１α、４ｕ８ｃ、ボルテゾミブ、Ｎ−［（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）メチレン］−２−チオフェンスルホンアミド（ＳＴＦ−０８３０１０）、またはＭＫＣ−３９４６に対するアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡである、請求項８２に記載の組成物、または請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
前記細胞が最終分化細胞である、請求項８２もしくは８４に記載の組成物、または請求項８３もしくは８４に記載の使用。
【請求項８６】
前記細胞がニューロンまたはミクログリア細胞である、請求項８５に記載の組成物または使用。
【請求項８７】
前記老化がパラクリン老化である、請求項８２、８４〜８６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８８】
前記ＳＡＳＰが細胞性虚血に続発する、請求項８２、８４〜８７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８９】
前記細胞におけるＩＲＥ１αの活性化、ＳＡ−β−ｇａｌの活性、および／またはＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を減少させる、請求項８２、８４〜８８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９０】
（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型を阻害または予防するための医薬品の調製に使用するためのＩＲＥ１α阻害剤。
【請求項９１】
前記阻害剤が、ＩＲＥ１α、ボルテゾミブ、Ｎ−［（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）メチレン］−２−チオフェンスルホンアミド（ＳＴＦ−０８３０１０）、またはＭＫＣ−３９４６に対するアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡである、請求項９０に記載の使用のためのＩＲＥ１α阻害剤。
【請求項９２】
前記細胞は、サルコペニア、神経変性、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、腸管疾患、緑内障、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵臓線維症、または嚢胞性線維症を患っているか、またはその危険性のある対象からのものである、請求項７２〜８１のいずれか一項に記載の方法、請求項８２、８４〜８９のいずれか一項に記載の組成物、請求項８３〜８９のいずれか一項に記載の使用、または請求項９０もしくは９１に記載の使用のためのＩＲＥ１α阻害剤。
【請求項９３】
前記細胞が、癌治療を受けたことがある、または癌治療を受けている対象からのものである、請求項７２〜８１、９２のいずれか一項に記載の方法、請求項８２、８４〜８９、９２のいずれか一項に記載の組成物、請求項８３〜８９、９２のいずれか一項に記載の使用、または請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の使用のためのＩＲＥ１α阻害剤。
【請求項９４】
前記細胞が、網膜細胞ではなく、かつ前記老化が網膜血管疾患と関連していない、請求項７２〜８１、９２、９３のいずれか一項に記載の方法、請求項８２、８４〜８９、９２、９３のいずれか一項に記載の組成物、請求項８３〜８９、９２、９３のいずれか一項に記載の使用、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の使用のためのＩＲＥ１α阻害剤。
【請求項９５】
ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させることを含む、細胞の老化または細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を刺激または誘導する方法。
【請求項９６】
前記方法が、前記細胞をＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる化合物と接触させることを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
細胞の老化または対象の細胞の老化関連分泌表現型を刺激または誘導する方法であって、ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる有効量の化合物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９８】
前記化合物がＡｐｙ２９またはスニチニブである、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞が、肝線維症、腎線維症、肺高血圧症、心筋梗塞または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する、請求項９６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
創傷治癒を改善するための、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記方法は、前記細胞におけるＩＲＥ１αの活性化、ＳＡ−β−ｇａｌの活性、および／またはＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を増加させる、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる化合物を含む、細胞の老化または細胞内の老化関連分泌表現型を刺激または誘導するための組成物。
【請求項１０３】
前記化合物がＡｐｙ２９またはスニチニブである、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
細胞の老化または細胞内の老化関連分泌表現型を刺激または誘導するためのＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる化合物の使用。
【請求項１０５】
前記細胞が、肝線維症、腎線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する、請求項１０２もしくは１０３に記載の組成物または請求項６７に記載の使用。
【請求項１０６】
創傷治癒を改善するための、請求項１０２、１０３もしくは１０５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項６７もしくは６８に記載の使用。
【請求項１０７】
細胞の老化または細胞内において老化関連分泌表現型を誘導するための医薬品の調製において使用するためのＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる化合物。
【請求項１０８】
細胞の老化または細胞内の老化関連分泌表現型の刺激または誘導に使用するためのＩＲＥ１αを増加させる化合物。
【請求項１０９】
前記細胞が、肝線維症、腎線維症、肺高血圧症、心筋梗塞または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する、請求項１０７または１０８に記載の使用のための化合物。
【請求項１１０】
創傷治癒を改善するための、請求項１０８〜１０９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１１１】
対象において脂質パラメータを変更する方法であって、前記方法は、前記対象に、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を投与することを含み、
前記脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである、方法。
【請求項１１２】
対象において脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための方法であって、前記対象に（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１１３】
脂肪蓄積に関連する前記疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
対象において体組成パラメータを変更するための方法であって、前記方法は、対象に（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を投与することを含み、
前記体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである、方法。
【請求項１１６】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片が、表２に記載されているか、または図１７もしくは図１８に記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる、請求項１１１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片が全身投与される、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
対象において脂質パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を含む組成物であって、
前記脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである、組成物。
【請求項１１９】
対象における脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を含む組成物。
【請求項１２０】
脂肪蓄積に関連する前記疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である、請求項１１９に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である、請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
対象において体組成パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を含む組成物であって、
前記体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである、組成物。
【請求項１２３】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドが、表２に記載されているか、または図１７もしくは図１８に記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる、請求項１１８〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片が、全身投与のためのものである、請求項１１８〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２５】
対象において脂質パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用であって、
前記脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである、使用。
【請求項１２６】
対象における脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（Ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用。
【請求項１２７】
脂肪蓄積に関連する前記疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
前記心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である、請求項１２７に記載の使用。
【請求項１２９】
対象において体組成パラメータを変更するための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用であって、
前記体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである、使用。
【請求項１３０】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片が、表２に記載されているか、または図７もしくは図９Ａに記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる、請求項１２５〜１２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３１】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片が、全身投与のためのものである、請求項１２５〜１３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３２】
対象において脂質パラメータを変更するための医薬品の調製のための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用であって、
前記脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである、使用。
【請求項１３３】
対象における脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための医薬品を調製するための、ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用。
【請求項１３４】
脂肪蓄積に関連する前記疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である、請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３５】
前記心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である、請求項１３４に記載の使用。
【請求項１３６】
対象において体組成パラメータを変更するための医薬品の調製のための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用であって、
前記体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである、使用。
【請求項１３７】
前記可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドが、表２に記載されているか、または図１７もしくは図１８に記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる、請求項１３２〜１３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３８】
前記医薬品が全身投与のためのものである、請求項１３２〜１３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３９】
配列番号５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、もしくは７６に示される可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、またはその機能的多様体もしくは断片。
【請求項１４０】
請求項１３９に記載の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、機能的多様体または断片をコードする核酸。
【請求項１４１】
請求項１４０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４２】
ウイルスベクター（好ましくはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）である、請求項１４１に記載のベクター。
【請求項１４３】
請求項１４０に記載の核酸または請求項１４２もしくは１４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１７年９月２２日に出願されたシリアル番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／＊を有するＰＣＴ出願であり、ＰＣＴ第２１条（２）に基づき英語で公開され、それ自体が２０１６年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４７４，８２７号、２０１６年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３９８，７９７号、および２０１６年９月２２日に出願された米国仮出願第６２／３９８，１８３号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表の参照
【０００２】
本出願は、２０１７年９月２２日に作成され、約２４９ＫＢのサイズを有する、「１２８１０＿６５１＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のコンピュータ可読形式の配列表を含む。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の分野
【０００３】
本発明は、細胞老化を調節するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、血管性眼疾患などの細胞老化に関連する疾患および状態の予防および治療における老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の調節に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞老化は、細胞が依然として生存可能であり、かつ代謝的に活性であるが、増殖する能力を失っている細胞の状態として一般に定義されている。細胞老化は、ＤＮＡ末端複製によるテロメア短縮、ＤＮＡ損傷、腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子の活性変化、酸化ストレス、炎症、化学療法剤、ならびにＵＶ照射および電離放射線への曝露など、様々な刺激または因子によって引き起こされ得る（Ｋｕｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．（２０１０）２４：２４６３−２４７９）。
【０００５】
老化表現型を導く３種類の細胞経路、すなわち複製老化、早期老化および分化後老化（ＳＡＤ）が記載されている。複製老化は、多数の細胞分裂後に起こる老化の一種である。例えば、培養中で増殖すると、初代細胞は約５０回の細胞分裂後に細胞老化を受ける。さらなる増殖に対するこうした障壁は、連続細胞分裂のたびに細胞のテロメアが短くなり、このため、細胞がＤＮＡ損傷応答の引き金となる点（いわゆる「ヘイフリック限界」）に到達し、最終的に増殖停止の誘導および老化の原因となると考えられる。
【０００６】
細胞老化はまた、テロメアの喪失または機能不全の非存在下でも誘発され得る。この種の細胞老化は、早期細胞老化と呼ばれ、例えば化学療法、放射線療法、ＤＮＡ損傷化合物への曝露から生じるＤＮＡ損傷などの刺激、または日光および紫外線、酸化ストレス、炎症、強い分裂促進シグナル伝達、およびリボソームストレスなどの刺激など、様々な刺激から生じる可能性がある。ＤＮＡ損傷は、有糸分裂中の染色体不等分離、ＤＮＡ鎖の切断、またはＤＮＡの化学修飾（例えばアルキル化）から生じる異数性などの染色体機能不全の形態をとり得る。早期細胞老化はまた、実際のＤＮＡ損傷を反映していても反映していなくてもよいＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）によって誘発され得る。
【０００７】
近年では、いくつかの疾患では、最終分化した有糸分裂後の細胞が老化様表現型（ＳＡＳＰを含む）を獲得することが示されているので、老化過程には、細胞増殖の単純な停止以上のものを伴うことが明らかになった。この第３のタイプの老化は、分化後老化（ＳＡＤ）と呼ばれており、遺伝毒性、タンパク質毒性、酸化的およびリボソームストレッサーなど様々なストレッサーによって誘発され得る（例えば、Ｎａｙｌｏｒ  Ｒ．Ｍ．ら、２０１３  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．９３（１）：１０５−１１６を参照されたい）。
【０００８】
すべての老化細胞がすべての可能な老化マーカーを発現するわけではない。それにもかかわらず、老化細胞の顕著な特徴としては、（ｉ）増殖停止、（ｉｉ）細胞形態の拡大および平坦化、（ｉｉｉ）核内におけるＤＮＡ損傷病巣、（ｉｖ）増殖因子プロテアーゼ、サイトカインおよび老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）として定義されている他の因子の分泌、（ｖ）老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）活性（これはリソソーム量の増加を一部反映する）、（ｖｉ）腫瘍抑制因子ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現（ｐＲＢを活性化する可能性があり、かつ老化関連ヘテロクロマチン病巣（ＳＡＨＦ）の形成を引き起こす可能性がある）、および（ｖｉｉ）ＰＭＬ核小体の数およびサイズの増加が挙げられる。さらに、多様な因子が細胞老化を誘導することが知られているが、２つの腫瘍抑制経路、ｐ５３／ｐ２１およびｐ１６ＩＮＫ４／ｐＲＢが細胞老化の調節において重要な役割を果たすことが示されている。
【０００９】
近年の研究は、細胞老化の関与を胚形成および組織修復などの複雑な生理学的過程にまで広げた（１９−２２）。逆に、慢性疾患および加齢では、老化細胞の増加は組織の機能不全を悪化させる（２３−２５）。その状態に応じて、細胞老化は有益であるか、または有害であるかのいずれかであることが示されている（ＲｏｄｉｅｒおよびＣａｍｐｉｓｉ，ＪＣＢ，２０１１，１９２（４）：５４７−５５６およびＮａｙｌｏｒら、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３  ９３（１）：１０５−１１６  ｆｏｒ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅを参照されたい）。
【００１０】
細胞老化は、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛および白髪、筋肉の厚さおよび筋力の低下（サルコペニア）、炎症発生率の増加、代謝障害、持久力の喪失、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、神経変性疾患、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、ならびに白内障など、様々な加齢性疾患および状態の病因に因果関係があるとされてきた。加えて、細胞老化は、化学療法および／または放射線療法中およびその後に経験する健康な組織への損傷、ならびに化学療法および／または放射線療法後の劣った健康への影響に寄与すると考えられている。
【００１１】
細胞老化は、また有益でもあり得る。例えば、ＤＮＡ損傷に応答した抗癌メカニズムとしてのその役割は、何十年もの間に確立されてきた。さらに、老化細胞は、効率的な組織修復および創傷治癒にとって重要であることが示されている。実際、ＳＡＳＰの多くの因子（例えば、創傷治癒に関与する増殖因子およびプロテアーゼ、病原体を死滅させる免疫細胞の誘引剤、ならびに幹細胞または前駆細胞を動員するタンパク質）は、組織修復にとって重要である。したがって、ＳＡＳＰはまた、細胞損傷／機能不全を周囲組織に伝達し、必要に応じて修復を刺激するように機能し得る。近年の研究では、この概念が裏付けられている。例えば、老化細胞は、増殖期の間に治癒の過程を開始させる炎症反応が（ＳＡＳＰを介して）始まるのを助けるために、創傷の近くに迅速に確立されることが研究により示されている。このように老化が急速に早まることにより、免疫細胞を引き付けて活性化させ、感染と戦い、死細胞および細片を取り除く。再構築期の間、老化細胞は増殖期の間にある繊維状タンパク質を溶解するにあたってある役割を果たし、瘢痕の形成を制限する。細胞老化の有益な効果はまた、肝線維症、心筋梗塞および心臓線維化、アテローム性動脈硬化症、ならびに肺高血圧症においても報告されている。
【００１２】
したがって、細胞が細胞老化を受けるのを予防すること、または老化を活性化する（例えば、ＳＡＳＰをもたらし得る）ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ損傷応答経路もしくはクロマチン変化を妨げること、細胞老化を逆転もしくは制限すること、および／または細胞老化を受ける細胞においてパラクリン老化を減少させることは、老化が有害である疾患および状態を予防もしくは治療するのに有利となる。逆に、細胞老化によって積極的に影響を受ける疾患および状態において細胞老化を促進することは、回復を改善するか、またはそのような疾患もしくは状態の重症度を軽減し得る。
【００１３】
肥満およびそれに続くメタボリックシンドロームの続発症、２型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）、および心血管合併症は、世界的流行病となる。世界的な肥満は１９８０年以来２倍以上となり、２０１４年には１９億人以上の成人が過体重であり、そのうち６億人が肥満であった（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）、２０１５）。
【００１４】
過体重および肥満は、健康を害する可能性のある異常または過剰な脂肪蓄積として定義されている。体格指数（ＢＭＩ）は、成人の過体重および肥満を分類するために一般的に使用される身長に対する体重の単純な指数である。この指数は、ヒトの体重キログラムを身長の平方メートルで割ったもの（ｋｇ／ｍ２）として定義されている。ＷＨＯの定義は、以下のとおりである。（ｉ）ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２以上の場合、過体重である、および（ｉｉ）ＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２以上である場合、肥満である。男女において、および成人のすべての年齢において、ＢＭＩは同じであるため、過体重および肥満の有用な集団レベルの尺度となる。しかし、ＢＭＩは、異なる個人において、同じ肥満度に相当しない可能性もあるため、おおよそのガイドとして考えられている。
【００１５】
脂肪蓄積は、肥満、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドローム、およびリポジストロフィー症候群などのある状態の範囲において観察される。ＢＭＩの上昇（過体重または肥満）は、次の疾患および状態の主な危険因子である：心血管疾患（（ＣＶＤ）、主に心臓病や脳卒中）、インスリン抵抗性（ＴＩＩＤＭを発症する危険性が上昇）。過剰な脂肪蓄積はまた、筋骨格障害（特に変形性関節症）、およびいくつかの癌（子宮内膜、乳房、および結腸）などの他の疾患または状態に罹患する危険性が高まる。これらの疾患の危険性は一般的に、ＢＭＩが増加するとともに増す。
【００１６】
シンドロームＸとしても公知であるメタボリックシンドロームは、肥満のヒトならびに腹部脂肪の量が増加しているヒトに影響を及ぼし、インスリン抵抗性、脂質異常症（高トリグリセリド血症、低血清ＨＤＬコレステロール値、ＬＤＬコレステロール値の上昇）および高血圧を特徴とする。これらの条件は互いに関連しており、根底にある媒介物質、メカニズムおよび経路を共有している。脂肪分布の変化、ＷＨＲ（ウエストヒップ比）の増加、および内臓脂肪の蓄積は、代謝リスク指数の増加に関連している。
【００１７】
メタボリックシンドロームに関連する症状のほとんどは症状がないが、ウエストが大きいことは明らかな徴候である。いくつかの組織は、メタボリックシンドロームを診断するための基準を有する。ＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩの定義は、メタボリックシンドロームの最も広く使用されている基準の１つである。この定義には、高血糖／インスリン抵抗性、内臓肥満、アテローム性脂質異常症、および高血圧／内皮機能不全の重要な特徴を組み込んでいる。国立衛生研究所が使用しているガイドラインによれば、以下の特性のうちの３つ以上が存在するか、または対象がそれらの特性を制御するために薬を服用している場合、対象はメタボリックシンドロームを有する：（ｉ）内臓肥満（すなわち、胴囲が大きい、例えば、女性の場合は少なくとも３５インチ（８９センチメートル）、男性の場合は４０インチ（１０２センチメートル）の腹囲である、（ｉｉ）高トリグリセリドレベル−１デシリットルあたり１５０ミリグラム（ｍｇ／ｄＬ）、または１リットルあたり１．７ミリモル（ｍｍｏｌ／Ｌ）、または血中に見られるこのタイプの脂肪が多い、（ｉｉｉ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの減少−男性では「良い」コレステロールの４０ｍｇ／ｄＬ（１．０４ｍｍｏｌ／Ｌ）未満、女性では５０ｍｇ／ｄＬ（１．３ｍｍｏｌ／Ｌ）未満、（ｉｖ）血圧の上昇−１３０／８５ミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）以上、および（ｖ）空腹時血糖値の上昇−１００ｍｇ／ｄＬ（５．６ｍｍｏｌ／Ｌ）以上。
【００１８】
肥満誘発メタボリックシンドロームの現在認められているメカニズムは、脂肪性脂質の蓄積がサイトカインの放出を引き起こし、Ｍ１活性化および全身性炎症を誘発するというものである（ＯｌｅｆｓｋｙおよびＧｌａｓｓ、２０１０）。慢性炎症およびマクロファージ活性化は、インスリン抵抗性を引き起こすと仮定されているが（ＯｓｂｏｒｎおよびＯｌｅｆｓｋｙ、２０１２）、脂肪組織の炎症が過剰な栄養素を効率良く貯蔵できる適応応答であるかどうか（Ｗｅｒｎｓｔｅｄｔ  Ａｓｔｅｒｈｏｌｍら、２０１４）、および脂肪組織の拡大にとって適切な血管形成が必須であるかどうかについては議論の余地がある（Ｃｕｌｌｂｅｒｇら、２０１３）。脂肪細胞の酸素消費量（Ｌｅｅら、２０１４）および脂肪組織血管リモデリング（Ｓｕｎｇら、２０１３）の両方が脂肪組織の炎症状態を制御し、引き続き、インスリン非感受性および高血糖症を引き起こす。
【００１９】
肥満関連問題についての社会的認識が高まっているにもかかわらず、過体重および肥満の対象の割合は上昇し続けている。したがって、依然として、それらの高い有病率ならびに関連する罹患率および死亡率を考慮して、脂肪の蓄積に関連する疾患および状態の予防および／または治療のための新しいアプローチを開発する必要がある。
【００２０】
本明細書は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるいくつかの文書を参照する。
【発明の概要】
【００２１】
虚血性網膜症における血管床の崩壊は、それが糖尿病性網膜症（ＤＲ）において糖血症主導型であるか、未熟児網膜症（ＲＯＰ）において酸素主導型であるかにかかわらず、細胞機能を損なう生化学的および炎症性ストレッサーの集合を受けた低酸素性／虚血性中枢神経系（ＣＮＳ）組織となる。これらの無血管帯は、これらの領域を切除するレーザー光凝固療法の臨床的成功によって証明される（５）ように、病理学的血管形成を媒介する血管新生促進因子の供給源である（４）。病理学的前網膜血管形成の次の波を理解することに多くの努力が注がれてきたが、神経組織低酸素症の前駆状態の間に遊んでいる細胞プロセスについては比較的ほとんど知られていない。網膜虚血の初期段階で機能する細胞性反応をより完全に理解することは、新生血管網膜疾患を呈している、毎年生まれる９，３００万人のＤＲおよび１５００万人の早産児のうちの一部分に利益をもたらす治療手段を提供し得る（６〜８）。
【００２２】
虚血性網膜症における変性血管系に直接並べられる網膜神経節細胞（ＲＧＣ）などの中枢ニューロンは、適切な機能のために安定した代謝供給を必要とする。興味深いことに、ＤＲの進行中に、明白な網膜血管病変の程度（９）とＲＧＣで観察される比較的微妙で長期にわたる形態学的および機能的異常（１０〜１２）との間に断絶がある。さらに、ＤＲにおいてＲＧＣアポトーシスを裏付けるエビデンスがあるが（１３〜１５）、神経細胞死の規模および動態は依然として議論の的となっている（１６〜１８）。ＤＲにおける網膜神経節ニューロンの相対的な回復力は、それらが代替的脈管叢から代謝供給を受けるか、またはそれらを虚血誘導性細胞死に影響されにくくする防御メカニズムを開始することを示唆している。
【００２３】
虚血性傷害の間に神経組織の完全性を維持するために誘発されるメカニズムは、重大な生存上の利点を与え、適時の機能の修復および回復を可能にする（４４、６１、６２）。細胞老化をもたらすメカニズムは、発癌を制限するためにアポトーシスのメカニズムと並行して進化した可能性があるが（２１）、網膜に見られるような有糸分裂後のＣＮＳニューロンについては、細胞老化はストレッサー誘発性神経変性を妨げ得る。６０年近く、加齢および疾患の状況において研究されているが（６３）、本明細書に報告されている本出願人の研究では、ＣＮＳにおける耐候性虚血における細胞老化についての新しい役割を提示する。これらの研究ではさらに、病理学的過程におけるパラクリン老化など、老化の調節におけるＳＥＭＡ３Ａの、これまでに記載されていない役割を明らかにし、老化に関連する疾患および状態においてＳＥＭＡ３Ａ活性を調節するにあたっての治療的利益を明らかにする。
【００２４】
より具体的には、一態様では、本出願人らは、無血管化網膜帯内のニューロンによって引き起こされる予想外のメカニズムを同定した。このメカニズムでは、ニューロンは、早期細胞老化状態に入り、ＥＲストレスエフェクターイノシトール要求性酵素−１α（ＩＲＥ−１α）のエンドリボヌクレアーゼ活性を活性化することによって老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）をとる。分泌された胚パターン形成の手がかりであるセマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）などのＳＡＳＰを介して産生される因子により、虚血性網膜において老化がニューロン、ミクログリアおよびその上にある血管系まで広がり（パラクリン老化）、このことが破壊的な網膜前血管形成に寄与する。
【００２５】
１．眼疾患を治療および予防するためのＳＡＳＰモジュレータおよび老化アテニュエータを含む組成物、ならびにそれらの使用。
第１の態様では、本明細書に記載のデータは、低酸素ストレスに耐えるために、老化の経路が網膜において恒常性のメカニズムとして最初に関与していることを示している。しかしながら、それが持続すると、老化経路は病理学的になり、組織の完全性が損なわれる。細胞老化の結果として、炎症性因子の分泌を介して適切な血管再生を妨げるＳＡＳＰとなる。特に、本明細書に示すように、増殖性糖尿病性網膜症を患っている患者を分析すると、硝子体内にＳＡＳＰ関連サイトカインが示された。さらに、周知のビグアニドメトホルミンによるＳＡＳＰの薬理学的阻害、またはＩＲＥ１αに対する薬理学的もしくは遺伝的干渉は、老化を制限し、修復的血管再生を増強し、破壊的な血管新生を防止し（図６Ｈ〜Ｊ）、インビボにおいて網膜の病状を失速させる。これらのデータでは、病理学的血管形成における細胞およびパラクリン老化を示唆する、これまでに記載されていないパラダイムのエビデンスを提供し、網膜症、ならびに加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）および黄斑浮腫などの眼血管疾患（血管障害）を治療するためのＳＡＳＰのモジュレータの眼送達の治療的利益を明らかにする。
【００２６】
したがって、本発明によれば、血管性眼疾患または障害（眼血管症、特に老化に関連する眼の疾患または障害、例えば網膜症）を治療または予防する方法であって、対象の眼において細胞老化を低減する（減衰する／阻害する）ことを含む方法が提供される。細胞老化は、対象の細胞を、細胞老化を減少させる１種以上の化合物（老化阻害剤）と接触させることによって減少させ得る。実施形態では、老化阻害剤は、眼細胞中のＳＡＳＰを低減または阻害する。
【００２７】
本発明は、老化阻害剤（例えば、ＳＡＳＰ阻害剤）を対象に投与することを含む、網膜血管形成（病理学的血管新生）を阻害する方法をさらに提供する。実施形態では、網膜血管形成は虚血に続発する。
【００２８】
本発明はまた、老化阻害剤（例えば、ＳＡＳＰ阻害剤）を対象に投与することを含む、眼血管修復を促進するおよび／または眼虚血を軽減する方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、老化阻害剤を対象に投与することを含む、眼細胞老化を予防または軽減する方法を提供する。実施形態では、老化阻害剤はＳＡＳＰ阻害剤である。
【００３０】
本発明はまた、眼細胞を老化阻害剤と接触させることを含む、眼細胞の老化を予防または軽減する方法を提供する。実施形態では、老化阻害剤はＳＡＳＰ阻害剤である。
【００３１】
実施形態では、上記の老化はパラクリン老化である。実施形態では、老化は、分化後の老化である。実施形態では、老化は、早期老化である。実施形態では、早期老化は、ＩＲＥ１αの発現および／またはＲＮＡｓｅ活性の増加を特徴とする。実施形態では、老化は、網膜老化である。実施形態では、老化は、（ｉ）Ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｔｐ５３、ＩＲＥ１α、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ａの発現および／または活性、ならびに／もしくは老化関連β−ｇａｌ活性の増加、（ｉｉ）γＨ２Ａｘおよび／またはＰＭＬの発現、および／または（ｉｉｉ）老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の発現を特徴とする。実施形態では、ＳＡＳＰは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、Ｐａｉ１、ＴＧＦβ１、ＩＲＥ１αおよび／またはＶＥＧＦ−αの分泌を含む。実施形態では、上記のＳＡＳＰは、細胞性虚血に続発する。
【００３２】
実施形態では、細胞はヒト細胞である。実施形態では、細胞は、網膜細胞である。実施形態では、細胞は内皮細胞である。実施形態では、細胞はミクログリア細胞である。実施形態では、細胞はニューロンである。実施形態では、細胞は網膜神経節細胞である。実施形態では、細胞は網膜神経節ニューロンである。実施形態では、細胞は、血管細胞である。実施形態では、細胞は血管内皮細胞である。実施形態では、細胞は、血管細胞ではない（すなわち、無血管領域／区域に位置する）。実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。実施形態では、細胞は、マクロファージである。
【００３３】
実施形態では、投与は局所または局所眼投与である。実施形態では、局所眼投与は、結膜下（テノン嚢下）、硝子体内、眼球後部、後強膜近傍または前房内投与である。実施形態では、局所眼投与は、硝子体内投与である。特定の実施形態では、局所眼投与は、硝子体内注射である。
【００３４】
本発明はまた、本発明の方法で使用するための老化阻害剤またはＳＡＳＰ阻害剤を含む組成物に関する。実施形態では、組成物は眼科用組成物である。実施形態では、組成物は好適な医薬担体、希釈剤、または賦形剤を含む。実施形態では、好適な医薬担体、希釈剤または賦形剤は通常、本明細書に開示される阻害剤との混合物には見られない（すなわち、非天然担体または組成物は、天然には見られない、すなわち合成または人工である）。実施形態では、組成物は、血管性眼疾患または障害を治療または予防するためのものである。実施形態では、組成物は、網膜血管形成を阻害するためのものである。実施形態では、組成物は、眼血管修復を促進するため、かつ／または眼虚血を軽減するためのものである。実施形態では、組成物は、眼の細胞老化を予防または軽減するためのものである。実施形態では、組成物は、（ｉ）血管性眼疾患もしくは障害を治療もしくは予防する、（ｉｉ）網膜血管形成を阻害する（例えば、病理学的網膜血管新生）、（ｉｉｉ）眼血管修復を促進する、かつ／もしくは眼虚血を軽減する、かつ／または（ｉｖ）眼細胞老化を予防または軽減するための医薬品の調製において使用するためのものである。
【００３５】
実施形態では、上記のＳＡＳＰ阻害剤は、ＩＲＥ１αの阻害剤ではない。実施形態では、ＳＡＳＰ阻害剤は、ビグアニド化合物である。実施形態では、ビグアニド化合物は、メトホルミン、フェンホルミン、ブホルミン、プログアニル、クロルプログアニル、シンタリンＡまたはシンタリンＢである。実施形態では、ビグアニド化合物は、メトホルミンである。実施形態では、ＳＡＳＰ阻害剤は、ＩＲＥ１αの阻害剤である。
【００３６】
実施形態では、血管性眼疾患または障害は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虚血性網膜症、高血圧性網膜症、薬物誘発性網膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、若年性黄斑変性症、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分岐網膜静脈閉塞症、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、目に対する物理的な傷害、緑内障、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜血管炎、網膜マクロ動脈瘤、網膜細動脈瘤、フックスジストロフィー症、虚血性視神経症、黄斑性毛細血管拡張症、視神経炎、アッシャー症候群、網膜色素変性症、ぶどう膜炎、虚血性視神経症（ＩＯＮ）、またはシュタルガルト病である。一実施形態では、血管性眼疾患もしくは障害は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑浮腫、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分枝網膜静脈閉塞症、または脈絡膜血管新生である。一実施形態では、血管性眼疾患は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾性（萎縮性）加齢黄斑変性症、湿性（滲出性）加齢黄斑変性症、分枝網膜静脈閉塞症、または黄斑性毛細血管拡張症である。
【００３７】
実施形態では、本発明のＳＡＳＰ阻害剤または組成物で治療された対象は、上記の血管性眼疾患または障害のうちの１つと診断されている。実施形態では、対象は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、病理学的網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分枝網膜静脈閉塞症、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、または黄斑性毛細血管拡張症と診断された。
【００３８】
２．ＩＲＥ１αまたはＳＥＭＡ３Ａモジュレータを含む細胞老化を調節するための組成物および方法。
（ｉ）ＩＲＥ１αモジュレータ
本発明はまた、（ｉ）細胞の細胞老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（および／またはその誘導）を阻害または予防する方法であって、ＩＲＥ１αの発現、活性化または活性を低減させることを含む方法を提供する。本発明はまた、（ｉ）細胞の細胞老化、または（ｉｉ）対象の細胞内において老化関連分泌表現型の誘導を阻害または予防する方法であって、その対象にＩＲＥ１α阻害剤を投与することを含む方法に関する。実施形態では、本発明の方法は、細胞におけるＩＲＥ１αの活性化、ＳＡ−β−ｇａｌの活性、および／またはＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を減少させる。
【００３９】
本発明はさらに、（ｉ）細胞の細胞老化を阻害もしくは予防するため、または（ｉｉ）ＩＲＥ１α阻害剤を含む細胞内において老化関連分泌表現型を誘導するためのＩＲＥ１α阻害剤を含む組成物に関する。実施形態では、組成物は、（ｉ）細胞の細胞老化を阻害もしくは予防するため、または（ｉｉ）細胞内において老化関連分泌表現型を誘導するためのものである。実施形態では、組成物は、（ｉ）細胞の細胞老化を阻害もしくは予防するため、または（ｉｉ）細胞内において老化関連分泌表現型を誘導するための医薬品の調製に使用するためのものである。
【００４０】
実施形態では、ＩＲＥ１α阻害剤は、ＩＲＥ１α、４ｕ８ｃ、ボルテゾミブ、Ｎ−［（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）メチレン］−２−チオフェンスルホンアミド（ＳＴＦ−０８３０１０）、またはＭＫＣ−３９４６に対するアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡである。実施形態では、阻害剤は、細胞においてＩＲＥ１αの活性化、ＳＡ−β−ｇａｌの活性、および／またはＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を低減させる。
【００４１】
本発明はまた、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）（および／またはその誘導）を刺激または誘導する方法であって、ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させることを含む方法を提供する。本発明はまた、ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させることを含む創傷修復の改善方法を提供し、この方法では、（ｉ）細胞の細胞老化または（ｉｉ）細胞内の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を増加または誘導する。本発明は、（ｉ）細胞の細胞老化または（ｉｉ）対象の細胞における老化関連分泌表現型を刺激または誘導する方法であって、ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させることを含む方法をさらに提供する。実施形態では、上記の方法は、細胞を、ＩＲＥ１αのレベルまたは活性を増大させる化合物と接触させることを含む。実施形態では、上記の方法は、細胞においてＩＲＥ１αの活性化、ＳＡ−β−ｇａｌの活性、および／またはＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を増加させる。
【００４２】
実施形態では、ＩＲＥ１α活性は、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性およびキナーゼ活性を含む。
【００４３】
本発明は、ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる化合物を含む組成物をさらに提供する。実施形態では、組成物は、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞内において老化関連分泌表現型を誘導するためのものである。実施形態では、組成物は、肝線維症、腎線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、または心臓線維化を治療または予防するためのものである。実施形態では、組成物は、創傷治癒を改善するためのものである。実施形態では、組成物は、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞内において老化関連分泌表現型を誘導するための医薬品の調製に使用される。実施形態では、組成物は、肝線維症、腎線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、または心臓線維化を治療または予防するための医薬品の調製に使用される。実施形態では、組成物は、創傷治癒を改善するための医薬品の調製に使用するためのものである。
【００４４】
実施形態では、ＩＲＥ１αレベルまたは活性を増大させる化合物は、Ａｐｙ２９またはスニチニブである。
【００４５】
実施形態では、上記の細胞は、最終分化細胞である。実施形態では、細胞はニューロン、ミクログリア細胞、または内皮細胞である。実施形態では、細胞は、網膜細胞である。実施形態では、細胞は、骨髄性細胞である。実施形態では、細胞は、網膜神経節細胞である。実施形態では、細胞は、網膜神経節ニューロンである。実施形態では、細胞は、血管細胞である。実施形態では、細胞は、血管内皮細胞である。実施形態では、細胞は、血管細胞ではない（すなわち、無血管領域／区域に位置する）。実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。実施形態では、細胞は、マクロファージである。実施形態では、細胞は、単球である。実施形態では、細胞は、肝細胞である。実施形態では、細胞は、肝星細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト微小血管内皮細胞である。特定の実施形態では、細胞は、眼細胞ではない。
【００４６】
実施形態では、上述の老化は、パラクリン老化である。実施形態では、老化は、分化後の老化である。実施形態では、老化は、早期老化である。実施形態では、早期老化は、ＩＲＥ１αの発現および／またはＲＮＡｓｅ活性の増加を特徴とする。実施形態では、老化は、網膜老化である。実施形態では、老化は、（ｉ）Ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｔｐ５３、ＩＲＥ１ａ、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ａの発現および／または活性の増加、ならびに／もしくは老化関連β−ｇａｌ活性、（ｉｉ）γＨ２Ａｘおよび／またはＰＭＬの発現、および／または（ｉｉｉ）老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の発現を特徴とする。実施形態では、ＳＡＳＰは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、Ｐａｉ１、ＴＧＦβ１、ＩＲＥ１ａおよび／またはＶＥＧＦａの分泌を含む。実施形態では、上記のＳＡＳＰは、細胞性虚血に続発する。実施形態では、細胞は、サルコペニア、神経変性、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症またはパーキンソン病、腸管疾患、緑内障、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵臓線維症、または嚢胞性線維症に罹患しているかまたは罹患する危険性がある対象に由来する。実施形態では、細胞は、癌治療を受けたことがある、または癌治療を受けている対象に由来する。実施形態では、細胞は、網膜細胞ではない。実施形態では、細胞老化は、網膜血管疾患と関連していない（すなわち、それは網膜疾患の状況では生じない）。実施形態では、細胞老化は、血管性眼疾患と関連していない（すなわち、眼疾患の状況では生じない）。実施形態では、細胞老化は、糖尿病性網膜症に関連していない（すなわち、糖尿病性網膜症の状況では生じない）。実施形態では、細胞老化は、黄斑変性症と関連していない。実施形態では、細胞は、肝線維症、腎線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する。実施形態では、対象は創傷を受けている（例えば、皮膚／組織創傷（例えば、切り傷）を有する）。
【００４７】
（ｉｉ）ＳＥＭＡ３Ａモジュレータ
さらなる態様では、本明細書に提示されるデータは、病理学的過程におけるパラクリン老化など、老化の調節におけるＳＥＭＡ３Ａの、これまでに記載されていない役割のエビデンスを提供し、老化に関連する疾患および状態においてＳＥＭＡ３Ａ活性を調節するにあたっての治療的利益を明らかにする。実際に、データは、ＳＥＭＡ３ＡがＥＲストレスエフェクターイノシトール要求性酵素−１α（ＩＲＥ−１α）ならびに老化エフェクターｐ５３およびｐ１６を活性化することを実証している。
【００４８】
したがって、一態様では、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）（および／またはその誘導）を調節する方法であって、ＳＥＭＡ３Ａレベルまたは活性を調節することを含む方法を提供する。実施形態では、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を調節することは、細胞をＳＥＭＡ３ＡアンタゴニストまたはＳＥＭＡ３Ａアゴニストと接触させることを含む。
【００４９】
関連する態様では、本発明は、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）（および／またはその誘導）を阻害または予防する方法であって、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を減少させることを含む方法を提供する。実施形態では、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を減少させることは、細胞をＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストと接触させることを含む。
【００５０】
本発明は、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）対象の細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）（および／またはその誘導）を阻害または予防する方法であって、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を減少させることを含む方法をさらに提供する。実施形態では、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を減少させることは、ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストを対象に投与する（または対象の細胞に接触させる）ことを含む。
【００５１】
さらなる態様では、本発明は、ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストに関する。実施形態では、ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストは、（ａ）ＳＥＭＡ３Ａ抗体、（ｂ）ＳＥＭＡ３ＡアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または（ｃ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド、もしくはその機能的断片（ＮＲＰ１トラップ）である。
【００５２】
本発明はまた、上記のＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストを含む組成物に関する。このようなアンタゴニストまたはそれを含む組成物は、上記の方法において使用され得る（例えば、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の誘導の阻害または予防における使用のため）。
【００５３】
関連する態様において、本発明は、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）（および／またはその誘導）を阻害または予防するための医薬品の調製における本発明のＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストまたは組成物の使用に関する。実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物は、サルコペニア、神経変性（例えば、アルツハイマー病）、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、腸管疾患、緑内障、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵臓線維症、または嚢胞性線維症メタボリックシンドロームおよび／もしくは肥満である、老化に関連する疾患もしくは状態を治療もしくは予防するためのものである。実施形態では、細胞は、網膜細胞ではない。実施形態では、細胞は、網膜神経節細胞ではない。実施形態では、細胞は、対象の眼由来（眼細胞）ではない。実施形態では、細胞老化は、網膜血管疾患と関連していない。
【００５４】
実施形態では、上記の方法は、細胞におけるＩＲＥ１αの活性化ならびにＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、および／またはＶｅｇｆａの発現を低減させる。
【００５５】
実施形態では、細胞は、最終分化細胞である。実施形態では、細胞はニューロン、ミクログリア細胞、または内皮細胞である。実施形態では、細胞は、網膜細胞である。実施形態では、細胞は、骨髄性細胞である。実施形態では、細胞は、脂肪組織細胞である。実施形態では、細胞は、網膜神経節細胞である。実施形態では、細胞は、網膜神経節ニューロンである。実施形態では、細胞は、血管細胞である。実施形態では、細胞は、血管内皮細胞である。実施形態では、細胞は、血管細胞ではない（すなわち、無血管領域／区域に位置する）。実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。実施形態では、細胞は、マクロファージである。実施形態では、細胞は、単球である。実施形態では、細胞は、肝細胞である。実施形態では、細胞は、肝星細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト微小血管内皮細胞である。特定の実施形態では、細胞は、眼細胞ではない。実施形態では、上述の老化は、パラクリン老化である。実施形態では、老化は、細胞性虚血に続発する。実施形態では、ＳＡＳＰは、細胞性虚血に続発する。実施形態では、老化は、耐糖能異常に続発する。実施形態では、ＳＡＳＰは、耐糖能異常に続発する。
【００５６】
実施形態では、細胞は、サルコペニア、神経変性（例えば、アルツハイマー病）、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、腸管疾患、緑内障、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵臓線維症、または嚢胞性線維症、メタボリックシンドロームおよび／もしくは肥満である老化関連疾患または状態に罹患している、または罹患する危険性がある対象に由来する。実施形態では、細胞は、網膜細胞ではない。実施形態では、細胞は、網膜神経節細胞ではない。実施形態では、細胞は、対象の眼由来（眼細胞）ではない。実施形態では、細胞老化は、網膜血管疾患と関連していない。実施形態では、細胞老化は、眼の疾患（眼細胞の老化）と関連していない。実施形態では、細胞老化は、アルツハイマー病と関連していない。実施形態では、細胞老化は、糖尿病と関連していない。実施形態では、細胞老化は、癌と関連していない。実施形態では、細胞老化は、敗血症性ショックと関連していない。
【００５７】
別の態様では、本発明は、（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞の老化関連分泌表現型を刺激もしくは誘導する方法であって、細胞をＳＥＭＡ３Ａポリペプチドもしくはその機能的多様体もしくは断片に接触させることを含む方法に関する。
【００５８】
（ｉ）細胞の細胞老化、または（ｉｉ）対象の細胞における老化関連分泌表現型を刺激または誘導する方法であって、有効量のＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片を対象に投与することを含む、方法も提供される。
【００５９】
さらなる態様では、本発明は、細胞を含む組織において創傷治癒を改善するための方法に関し、この方法は、細胞をＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片と接触させることを含む。
【００６０】
関連する態様では、本発明は、ＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、それをコードする核酸、ＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片を送達および／または発現するためのベクター、ならびにそのようなポリペプチドもしくは機能多様体もしくは断片、核酸および／もしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６１】
本発明はまた、上記のＳＥＭＡ３Ａポリペプチド、もしくはその機能的多様体もしくは断片、核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を含む組成物に関する。このような組成物、ＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたは機能的多様体もしくは断片、核酸、ベクターおよび宿主細胞は、（例えば、（ａ）（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞において老化関連分泌表現型を誘導するために、（ｂ）（ｉ）細胞の老化、または（ｉｉ）細胞における老化関連分泌表現型を誘導するための医薬品の調製において、または（ｃ）創傷治癒を改善するために）、上述の方法において使用され得る。
【００６２】
実施形態では、（ｉ）細胞老化、（ｉｉ）ＳＡＳＰ、または（ｉｉｉ）創傷治癒を刺激または誘導する方法における上述の細胞は、最終分化細胞である。実施形態では、細胞はニューロン、ミクログリア細胞、または内皮細胞である。実施形態では、上述の老化は、パラクリン老化である。実施形態では、ＳＡＳＰは、細胞性虚血に続発する。実施形態では、細胞は、肝線維症、肺高血圧症、心筋梗塞、癌、腎線維症、または心臓線維化を有するかまたは有する危険性がある対象に由来する。
【００６３】
実施形態では、上述の方法は、細胞におけるＩＲＥ１αの活性化ならびにＰａｉ１、ＩＬ−６、Ｉｌ−１ｂ、ＴＧＦ−ｂ、ｔｐ５３、ＸＢＰ１（複数可）、およびＶｅｇｆａの発現を低減させる。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に開示のポリペプチド（例えば、ＮＲＰ１トラップ、ＳＥＭＡ３Ａ、ＩＲＥ１αなど）アンチセンス、ｓｈＲＮＡなどをコードする核酸、ならびに本明細書に開示の核酸、ポリペプチド、アンチセンス、ｓｈＲＮＡを送達および／または発現するためのベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００６５】
本発明の他の目的、利点、および特徴は、添付の図面を参照して例示としてのみ与えられる、その特定の実施形態の以下の非限定的な説明を読むことによってより明らかになるであろう。
【００６６】
３．脂質パラメータの調節  別の態様では、本発明は、対象において脂質パラメータを変更する方法に関し、本方法は、対象に以下を投与することを含む：（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物。脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである。
【００６７】
別の態様では、本発明は、対象において脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための方法に関し、本方法は、対象に以下を投与することを含む：（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物。
【００６８】
一実施形態では、脂肪蓄積に関連する疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である。
【００６９】
一実施形態では、心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である。
【００７０】
別の態様では、本発明は、対象において体組成パラメータを変更するための方法に関し、本方法は、対象に以下を投与することを含む：（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物。体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、および／または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである。
【００７１】
実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、表２に記載されているか、または図７もしくは図９Ａに記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる。
【００７２】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、全身投与される。
【００７３】
別の態様では、本発明は、対象において脂質パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を含む組成物に関する。脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである。
【００７４】
別の態様では、本発明は、対象における脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を含む組成物に関する。
【００７５】
一実施形態では、脂肪蓄積に関連する疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である。
【００７６】
一実施形態では、心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である。
【００７７】
別の態様では、本発明は、対象において体組成パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を含む組成物に関する。
体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである。
【００７８】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、表２に記載されているか、または図７もしくは図９Ａに記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる。
【００７９】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、全身投与のためのものである。
【００８０】
別の態様では、本発明は、対象において脂質パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用に関する。
脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである。
【００８１】
別の態様では、本発明は、対象における脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用に関する。
【００８２】
一実施形態では、脂肪蓄積に関連する疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である。
【００８３】
一実施形態では、心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である。
【００８４】
別の態様では、本発明は、対象において体組成パラメータを変更するために、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用に関する。
体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである。
【００８５】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、表２に記載されているか、または図７もしくは図９Ａに記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる。
【００８６】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、全身投与のためのものである。
【００８７】
別の態様では、本発明は、対象において脂質パラメータを変更するための医薬品を調製するための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用に関する。
脂質パラメータの変更は、（ａ）総コレステロールレベルを低下させること、（ｂ）非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させること、（ｃ）トリグリセリドレベルを低下させること、（ｄ）総コレステロール：ＨＤＬコレステロールの比を低下させること、（ｅ）循環遊離脂肪酸を減少させること、（ｆ）ＨＤＬコレステロールを上昇させること、または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせである。
【００８８】
別の態様では、本発明は、対象における脂肪蓄積に関連する疾患または状態を予防または治療するための医薬品の調製のために、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用に関する。
【００８９】
一実施形態では、脂肪蓄積に関連する疾患または状態は、高体格指数（ＢＭＩ）、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ）、高血圧および／またはＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）である。
【００９０】
一実施形態では、心血管疾患は、鬱血性心不全、高コレステロール血症、および／またはアテローム性動脈硬化症である。
【００９１】
別の態様では、本発明は、対象において体組成パラメータを変更するための医薬品を調製するための、（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物の使用に関する。
体組成パラメータは、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率（ＷＨｅＲ）、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルである。
【００９２】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片は、表２に記載されているか、または図７もしくは図９Ａに記載されているＮＲＰ１ポリペプチドトラップを含むかまたはそれからなる。
【００９３】
一実施形態では、医薬品は、全身投与のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１−１】網膜虚血が、細胞老化および老化関連分泌表現型を誘発することを示す図である。（Ａ）酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルの概略図。（Ｂ）Ｐ１４酸素正常状態およびＯＩＲ網膜の大規模ゲノムワイドＲＮＡ配列からの炎症およびアポトーシスの特徴に対応する代表的な遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）。ＯＩＲ表現型と正および負に相関する遺伝子発現プロファイルを表す。
【図１−２】網膜虚血が、細胞老化および老化関連分泌表現型を誘発することを示す図である。（Ｃ）Ｐ１４ＯＩＲ（左列）対酸素正常網膜（右列）におけるＦｒｉｄｍａｎの老化関連遺伝子（２８）のヒートマップおよびＧＳＥＡクラスター。（ＮＥＳ＝正規化濃縮スコア、ＦＤＲｑ＝偽発見率）、ｌｏｇ２の発現（倍変化）を低発現（−２、左）から高発現（２、右）まで表すカラースケール。
【図１−３】網膜虚血が、細胞老化および老化関連分泌表現型を誘発することを示す図である。（Ｄ）Ｐ１４ＯＩＲおよび酸素正常状態マウスからの網膜細胞溶解物の免疫ブロットが老化マーカー誘導されていることを示している。（Ｅ）ＲＴ−ｑＰＣＲは、Ｐ１４ＯＩＲ対酸素正常網膜における老化関連遺伝子、Ｃｄｋｎ１ａ（ｐ２１）およびＣｄｋｎ２ａ（ｐ１６）の発現が誘導されていることを示している。
【図１−４】網膜虚血が、細胞老化および老化関連分泌表現型を誘発することを示す図である。（Ｆ）Ｐ１４酸素正常状態およびＯＩＲフラットマウント網膜の代表的なイソレクチンＢ４（ＩＢ４）および老化関連β−ガラクトシダーゼ染色（ＳＡ−β−ｇａｌ）。
【図１−５】網膜虚血が、細胞老化および老化関連分泌表現型を誘発することを示す図である。（Ｇ）Ｐ１４ＯＩＲ対酸素正常フラットマウント網膜における老化関連β−ガラクトシダーゼ染色（ＳＡ−β−ｇａｌ）の定量化（百分率）。網膜の四角で囲まれた中央（ｃ）／末梢（ｐ）および血管／無血管帯の高倍率像を示す（末梢ＯＩＲ網膜と比較して中央＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｎ＝１０）、中心Ｐ１４酸素正常網膜と比較して無血管†††Ｐ＜０．０００１（ｎ＝７））。（Ｈ）Ｐ１４酸素正常およびＯＩＲ網膜の矢状切片の代表的なＩＢ４およびＳＡ−β−ｇａｌ染色。四角で囲まれた中央の無血管網膜帯の高倍率画像を右パネルに示す。配向のために、網膜神経節細胞（ＧＣＬ）、内核層（ＩＮＬ）および外核層（ＯＮＬ）を示す。（Ｉ）Ｐ１４での網膜矢状切片におけるＳＡ−β−ｇａｌで染色した面積率の定量化（＊酸素正常網膜と比較してＰ＜０．０５（Ｎ＝１０）、†網膜の他のＰ１４のＯＩＲ層と比較してＰ＜０．０５（ｎ＝７）、ｎｓ＝有意ではない）。
【図１−６】網膜虚血が、細胞老化および老化関連分泌表現型を誘発することを示す図である。（Ｊ）Ｐ１４  ＯＩＲおよび酸素正常網膜のＴＵＮＥＬ染色。スケールバーは、５００μＭ（Ｈ）である。高倍率の画像および（Ｈ、Ｊ）スケールバーは、２００μＭである。データは平均値±ＳＥＭで表す。
【図２−１】細胞老化が網膜症の進行中に伝播することを示す図である。（Ａ）ＯＩＲの進行中（Ｐ１４、Ｐ１７およびＰ２１）の網膜のイソレクチンＢ４（ＩＢ４）染色。（Ｂ）ＯＩＲ全体において細胞老化の伝播の概略図を示す。下部パネルにＳＡ−β−ｇａｌ染色フラットマウントＯＩＲ網膜を示す（スケールバー５０μｍ）。より高倍率の画像により、異なる老化細胞集団が明らかになる（スケールバー２５μｍ）。
【図２−２】細胞老化が網膜症の進行中に伝播することを示す図である。（Ｃ）Ｐ１４  ＯＩＲ網膜の代表的な共焦点顕微鏡写真では、ＲＧＣ（Ｂｒｎ３ａ染色（２列目））における老化マーカー（γＨ２ＡＸ（上段）およびＰａｉ１（中段））の強い染色を示す。差し込み図は、囲った領域の高倍率画像である。
【図２−３】細胞老化が網膜症の進行中に伝播することを示す図である。（Ｄ）Ｐ１７  ＯＩＲフラットマウント網膜の代表的な共焦点顕微鏡写真により、老化マーカー（ＰＭＬ（下段）およびγＨ２ＡＸ（上段））がミクログリア（ＩＢＡ１）および血管ＩＢ４と同時標識することが明らかである。
【図２−４】細胞老化が網膜症の進行中に伝播することを示す図である。（Ｅ）２つの異なるサンプルについてのＰ１４  ＯＩＲ対酸素正常状態網膜のパラクリン老化関連遺伝子のヒートマップおよびＧＳＥＡクラスター。（Ｆ）ＲＴ−ｑＰＣＲは、Ｐ１４  ＯＩＲ対酸素正常網膜において、Ｐａｉ１、Ｉｌ１β、Ｔｇｆ−β１、Ｉ１６、Ｖｅｇｆ−ａ、Ｉｒｅ１αおよびＴｐ５３の発現が誘導されていることを示す。β−アクチンを参照遺伝子として使用した。ＣおよびＤでは、スケールバーは、１００μｍである。データは平均値±ＳＥＭで表す。
【図３−１】ＳＥＭＡ３Ａが老化およびパラクリン老化を媒介することを示す図である。（Ａ）Ｐ１０、Ｐ１４、Ｐ１７およびＰ２１での酸素正常対照と比較した、ＯＩＲ中のＳＥＭＡ３Ａタンパク質発現レベルのウエスタンブロット分析。β−アクチンは、添加対照として使用する。（Ｂ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＲａｓ誘導老化中のＳＥＭＡ３Ａタンパク質レベルの免疫ブロット分析。選択後１４日目に採取したＨ−ＲａｓＶ１２癌遺伝子または対照空ベクターでレトロウイルスにより形質導入したＭＥＦからの細胞溶解物。（Ｃ）空ベクター、ＭＥＫ１単独またはＭＥＫおよびヒトパピローマウイルス癌タンパク質Ｅ６およびＥ７でレトロウイルスにより形質導入されたヒト正常二倍体線維芽細胞（ＩＭＲ９０）におけるＳＥＭＡ３Ａ転写産物レベル。データは、ＧＥＯプロファイルＧＳＥ２４８７（７７）からのものである（＊＊ＭＥＫと比較してＰ＜０．０５ＣＴ、および††ＭＥＫ／Ｅ６／Ｅ７と比較してＰ＜０．０５）。（Ｄ）増殖性または老化培養初代ヒト活性化肝星状細胞（ＨＳＣ）中のＳＥＭＡ３Ａ転写産物レベル（＊＊Ｐ＝０．０２７）。
【図３−２】ＳＥＭＡ３Ａが老化およびパラクリン老化を媒介することを示す図である。（Ｅ）Ｐ２で組換えＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）の硝子体内注射を受け、Ｐ５で採取されたＰ５仔マウスの網膜を、老化マーカーに対する免疫ブロット分析に供し、矢状凍結切片をＳＡ−β−ｇａｌ染色に供した（Ｆ）。（Ｇ）処理７日後のＦＡＣＳ分析によって得られたＳＥＭＡ３Ａ処理（１００および５００ｎｇ／ｍｌ）ＨＲＭＥＣ（ヒト網膜微小血管内皮細胞）の細胞周期分布プロファイル（Ｐ＜０．０００１；二元配置ＡＮＯＶＡ）、（Ｈ）電気細胞インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）によってリアルタイムで測定された経内皮抵抗は、ＳＥＭＡ３Ａが内皮細胞の増殖を減少させることを実証した（３〜７日）（０．０４８＞Ｐ＞０．００９）。
【図３−３】ＳＥＭＡ３Ａが老化およびパラクリン老化を媒介することを示す図である。（Ｉ）ＨＲＭＥＣ、網膜ニューロン（６６１Ｗ）、およびＪ７７４（マクロファージ様細胞）を組換えＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクル（ＣＴ）で７日間刺激し、ＳＡ−β−ｇａｌで染色し、（Ｊ）において定量化した。（ｎ＝３別々の実験）、両側スチューデントｔ検定Ｊより、＊＊Ｐ＜０．００５および＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｋ）馴化培地（ＣＭ）を老化網膜ニューロン（６６１Ｗ）およびＨ２Ｏ２刺激後に７日間増殖させたマクロファージ様のＪ７７４細胞（１５０μＭ、２時間）から回収した。老化細胞をＳＡ−β−ｇａｌで染色し（右）、ＣＭ中の分泌されたＳＥＭＡ３Ａ（Ｓ３Ａ）タンパク質のレベルを免疫ブロットにより評価した（左）。（Ｌ）示されたベクター（Ｌｖ．ｓｈ＿ＧＦＰまたはＬｖ．ｓｈ＿ＳＥＭＡ３Ａ）を感染させ、Ｈ２Ｏ２またはビヒクル（ＣＴ）で処理したニューロン６６１Ｗ細胞のＳＡ−β−ｇａｌ染色。老化は、７日間の処理後に評価した。（Ｍ）（Ｊ）におけるように処理されたＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の百分率の定量化（ｎ＝３の独立した実験）。＊Ｐ＜０．００５、未処理ｓｈ＿ＧＦＰ細胞と比較したＨ２Ｏ２処理ｓｈ＿ＧＦＰ細胞；および†Ｐ＜０．００５、Ｈ２Ｏ２処理ｓｈ＿ＧＦＰ細胞と比較したＨ２Ｏ２処理ｓｈ＿Ｓ３Ａ細胞。両側スチューデントのｔ検定。データは平均値±ＳＥＭで表す。
【図３−４】ＳＥＭＡ３Ａが老化およびパラクリン老化を媒介することを示す図である。（Ｎ）ＨＲＭＥＣにおけるパラクリン老化の誘導（老化したまたはしていないニューロン前駆細胞由来のＣＭ（（６６１Ｗ）図（Ｉ）参照））を、ＳＡ−β−ｇａｌ染色によって７日後に評価した。（Ｏ）老化した６６１Ｗ細胞由来のＣＭを用いて、（Ｉ）におけるように処理されたＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞を定量化（百分率）したもの。
【図３−５】ＳＥＭＡ３Ａが老化およびパラクリン老化を媒介することを示す図である。（Ｐ）Ｐ１２においてＬｖ．ｓｈ＿Ｓ３ＡまたはＬｖ．ｓｈ＿ＧＦＰを硝子体内注射したＰ１４  ＯＩＲマウス由来の網膜のＩＢ４染色およびＳＡ−β−ｇａｌ染色したもの。（Ｑ）定量化したもの（＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【図４】Ｐ１４  ＯＩＲ対酸素正常網膜における折畳み不全タンパク質応答の特徴についてのヒートマップおよびＧＳＥＡを示す図である。（Ａ）ＯＩＲ表現型と正および負に相関する遺伝子発現プロファイルを表す。（Ｂ）Ｐ１４およびＰ１７  ＯＩＲにおけるＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ＥＹＦＰｆｌ／ｆｌ網膜の代表的なＳＡ−β−ｇａｌおよびＩＢ４染色。（Ｃ）Ｐ１４およびＰ１７  ＯＩＲにおけるＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ＥＹＦＰｆｌ／ｆｌからの中央領域における代表的なγＨ２ＡＸ染色およびＥＹＦＰ。白い矢状は、γＨ２ＡＸおよびＥＹＦＰ＋ミクログリアの同時標識を指す。
【図５】ＳＥＭＡ３Ａが老化細胞によって分泌され、ヒト網膜微小血管系内皮細胞においてパラクリン老化を誘発することを示す図である。ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定された、Ｐ１４（Ａ）およびＰ１７、Ｐ２１（Ｂ）網膜におけるＳＥＭＡ３Ａの相対的ｍＲＮＡレベル（酸素正常対ＯＩＲ）。（Ｃ）神経細胞（６６１Ｗ）におけるＳｈ−ＲＮＡ下方制御の効率を示す、ＳＥＭＡ３Ａタンパク質発現のウエスタンブロット分析。（Ｄ）パラクリン老化の寄与を得るための馴化培地（ＣＭ）実験を説明する概略図。ｓｈ＿ＧＦＰまたはｓｈ＿ＳＥＭＡ３Ａを発現する網膜ニューロン前駆細胞株由来のＣＭをＨ２Ｏ２で老化させ、ＣＭを採取してＨＲＭＥＣに適用した。ＨＲＭＥＣにおけるパラクリン老化の誘導を、ＳＡ−β−ｇａｌ染色によって７日後に評価した。（Ｅ）Ｌｖ．ｓｈ＿ＧＦＰまたはＬｖ．ｓｈ＿Ｓ３Ａに感染した網膜ニューロン前駆細胞由来のＣＭ中の分泌されたＳＥＭＡ３Ａのレベルを免疫ブロットにより評価した。（Ｆ）老化した（またはしていない）網膜ニューロン前駆細胞（Ｈ２Ｏ２またはビヒクル処理）からのＣＭに曝露したＨＲＭＥＣにおけるｐ５３の発現の免疫ブロット分析。（Ｇ）ｓｈ＿ＧＦＰまたはｓｈ＿ＳＥＭＡ３Ａ（ｓｈ＿Ｓ３Ａ）をトランスフェクトし、Ｈ２Ｏ２またはビヒクルで処理した網膜ニューロン前駆細胞からのＣＭに曝露したＨＲＭＥＣの免疫ブロット分析。（Ｈ）組換えＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）または老化Ｊ７７４細胞由来のＣＭ（Ｓｅｎ−Ｊ７７４）で処理し、７日後に採取したＨＲＭＥＣ溶解物中のＥＲストレスエフェクター、ｐ−ＩＲＥ１αＳ７２４の免疫ブロット分析。
【図６−１】ＳＥＭＡ３ＡがＪ７７４マクロファージ／単球において老化を誘導することを示す図である。（Ａ）Ｌｖ．ｓｈ＿ＧＦＰまたはＬｖ．ｓｈ−ＩＲＥ１αの硝子体内注射を受けたマウス由来のＰ１４網膜溶解物を抗ＩＲＥ１αおよびＣｒｅに対して免疫ブロットした。（Ｂ）陽性対照として、ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、７日間）またはＨ２Ｏ２で処理したＪ７７４マクロファージのＳＡ−β−ｇａｌ染色。四角で囲まれた領域には、より高い倍率の図を示す。（Ｃ）陽性対照として、ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、７日）またはＨ２Ｏ２に曝露されたＪ７７４マクロファージ、および破線矢印で示されるそれぞれのＪ７７４条件からの馴化培地（ＣＭ）で処理されたＨＲＭＥＣの免疫ブロット分析。（Ｄ）ＩＲＥ１αに対する免疫ブロットにより、ＨＲＭＥＣにおけるＩＲＥ１αのレンチウイルス媒介性枯渇の効率が実証される。
【図６−２】ＳＥＭＡ３ＡがＪ７７４マクロファージ／単球において老化を誘導することを示す図である。に感染させ、次いで組換えＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、７日）またはビヒクル（ＣＴ）で処理したＨＲＭＥＣのＳＡ−β−ｇａｌ染色。（Ｆ）ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、７日間）またはビヒクル（ＣＴ）で処理したＪ７７４におけるＣｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ａの相対的ｍＲＮＡ発現レベル。
【図７】ＩＲＥ１αのＲＮＡｓｅ活性が老化に寄与していることを示す図である。（Ａ）３日間または７日間ＳＥＭＡ３Ａ（Ｓ３Ａ）（１００ｎｇ／ｍＬ）またはビヒクルで刺激したＪ７７４細胞溶解物中の老化マーカーについての免疫ブロットは、ｐ−ＩＲＥ１αＳ７２４、ｐ５３、Ｐａｉ１が誘導されていることを示している（ｎ＝３）。（Ｂ）Ｊ７７４マクロファージにおけるＲＴ−ｑＰＣＲでは、７日間のＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）への曝露後にｍＲＮＡがＰａｉ１、Ｉ１６、Ｉ１１β、Ｔｇｆ−β１およびＴｐ５３の発現を増大させることが明らかになった。（Ｃ）７日間ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）またはビヒクルで刺激したＪ７７４マクロファージのγＨ２ＡＸおよびＤＡＰＩの代表的な共焦点免疫蛍光染色（スケールバーは１００μｍであｚる）。囲った領域の高倍率の図を示す（スケールバーは５０μｍである）。処理後７日目にビヒクル、Ｓ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、および／または４μ８ｃ（１ｎｇ／ｍｌ）とで処理したＪ７７４細胞溶解物中の（Ｄ）ＸＢＰ１（複数可）（スプライスアイソフォーム）の免疫ブロットならびに（Ｅ）ＸＢＰ１（複数可）および非スプライスＸＢＰ１（ｕ）のＰＣＲ。（Ｆ）ＳＥＭＡ３Ａ単独または４μ８ｃで刺激したＪ７７４におけるＰａｉ１、Ｉ１６、Ｉ１１β、Ｔｇｆ−β１、Ｔｐ５３、Ｉｒｅ１αおよびＴｎｆαのレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ。β−アクチンを参照遺伝子として使用した。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．００５。スケールバー：Ｃ＆Ｇについては１００μｍ。Ｃの高倍率は５０μｍである。データは平均値±ＳＥＭで表す。
【図８−１】メトホルミンがＳＡＳＰおよび病理学的網膜血管形成を無効にすることを示す図である。（Ａ）この研究のために選択された患者から得られた血管造影法、スペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ−ＯＣＴ）および３Ｄ網膜マップ。非血管性眼病理を有する対照患者（ＣＴ）（ｎ＝１０）を、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を有する患者（ｎ＝１０）と比較した。表１（実施例６）には、患者の特徴を示す。（Ｂ）パラクリン老化に関与するサイトカインについての患者の硝子体液のマルチプレックス査定は、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｐａｉ１、ＩＬ−６、およびＩＬ−８における誘導を示している。結果は、ＣＴ患者に対して標準化された倍変化として表す。点は、個々の値を表すものである；＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図８−２】メトホルミンがＳＡＳＰおよび病理学的網膜血管形成を無効にすることを示す図である。（Ｃ）Ｐ１２においてメトホルミンまたはビヒクルを硝子体内注射したＯＩＲマウスのＰ１４およびＰ１７からの網膜溶解物中のｐ−ＮＦκＢＳ５３６およびｐ−ＩＲＥ１αＳ７２４の免疫ブロット分析。（Ｄ）Ｐ１２においてメトホルミンまたはビヒクルを硝子体内注射したＰ１４  ＯＩＲマウスの網膜において測定したＣｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ａおよびＩｌ６のレベルについてのＲＴ−ｑＰＣＲ（β−アクチンを参照遺伝子として使用した）。Ｐ１２においてメトホルミンまたはビヒクルを硝子体内注射したマウスにおける、ＩＢ４およびＳＡ−β−ｇａｌで標識した代表的なＰ１４（Ｅ）およびＰ１７（Ｆ）ＯＩＲフラットマウント網膜。
【図８−３】メトホルミンがＳＡＳＰおよび病理学的網膜血管形成を無効にすることを示す図である。（Ｇ）ＥおよびＦと同様に処理したＰ１４およびＰ１７  ＯＩＲマウスにおけるＳＡ−β−ｇａｌ染色面積の割合の定量化（＊＊Ｐ１４でＰ＝０．００４２（ｎ＝９）、＊＊Ｐ１７でＰ＝０．００１３（ｎ＝１１）。メトホルミンと媒体注入網膜との比較）。（Ｈ）Ｐ１２でメトホルミンまたはビヒクルを硝子体内注射したＰ１４およびＰ１７  ＯＩＲマウスの代表的なＩＢ４染色フラットマウント網膜。ＯＩＲのＰ１４（Ｉ）およびＰ１７（Ｊ）における無血管領域を定量化したものである。網膜前の血管新生は、Ｐ１７ＯＩＲで査定した（Ｋ）。結果は、全網膜領域に対する無血管領域または新生血管領域の百分率として表す（＊＊＊Ｐ＜０．０００１および＊＊＊Ｐ＜０．００１；メトホルミンとビヒクル注射網膜とを比較（ｎ＝１３））。横線は割合（パーセント）の平均値を表し、点は個々の値を表す。スケールバーは、５００μＭである。データは平均値±ＳＥＭで表す。
【図９−１】アフリベルセプトが血管修復または細胞老化を促進することなく病理学的血管形成を無効にすることを示す図である。Ｐ１２においてアフリベルセプトまたはビヒクルを硝子体内注射したマウスにおける、ＩＢ４およびＳＡ−β−ｇａｌで標識した代表的なＰ１４（Ａ）およびＰ１７（Ｃ）ＯＩＲフラットマウント網膜。ＡまたはＣと同様に処理したＰ１４（Ｂ）およびＰ１７（Ｄ）ＯＩＲマウスにおけるＳＡ−β−ｇａｌ染色面積の割合の定量化（Ｐ１４でＰ＝０．３０８７（ｎ＝１３〜１４）、Ｐ１７でＰ＝０．１５８０（ｎ＝１３）、アフリベルセプトとビヒクル注入網膜との比較）。ＯＩＲのＰ１４（Ｐ＝０．４８９７、ｎ＝１１〜１３）
【図９−２】アフリベルセプトが血管修復または細胞老化を促進することなく病理学的血管形成を無効にすることを示す図である。Ｐ１２においてアフリベルセプトまたはビヒクルを硝子体内注射したマウスにおける、ＩＢ４およびＳＡ−β−ｇａｌで標識した代表的なＰ１４（Ａ）およびＰ１７（Ｃ）ＯＩＲフラットマウント網膜。ＡまたはＣと同様に処理したＰ１４（Ｂ）およびＰ１７（Ｄ）ＯＩＲマウスにおけるＳＡ−β−ｇａｌ染色面積の割合の定量化（Ｐ１４でＰ＝０．３０８７（ｎ＝１３〜１４）、Ｐ１７でＰ＝０．１５８０（ｎ＝１３）、アフリベルセプトとビヒクル注入網膜との比較）。ＯＩＲのＰ１４（Ｐ＝０．４８９７、ｎ＝１１〜１３）（Ｅ）、およびＰ１７（Ｐ＝０．９５０２、ｎ＝６〜７）（Ｆ）における無血管領域の定量化。網膜前の血管新生は、Ｐ１７ＯＩＲで査定した（Ｇ）。結果は、全網膜領域に対する無血管領域または新生血管領域の百分率として表す（＊＊＊Ｐ＜０．０２０７、ｎ＝５〜６）、アフリベルセプトとビヒクル注射網膜とを比較（ｎ＝５〜６））。横線は割合（パーセント）の平均値を表し、点は個々の値を表す。スケールバーは、５００μＭである。データは平均値±ＳＥＭで表す。
【図１０−１】ＯＩＲ中およびＩ型糖尿病のＳＴＺモデルにおいて網膜細胞老化が誘導されていることを示す図である。（Ａ）図１Ｉにおいて表されるＰ１４  ＯＩＲおよび酸素正常状態での全眼凍結切片のイソレクチンＢ４（ＩＢ４）およびＴＵＮＥＬ染色。
【図１０−２】ＯＩＲ中およびＩ型糖尿病のＳＴＺモデルにおいて網膜細胞老化が誘導されていることを示す図である。（Ｂ）凍結切片化したＰ１４酸素正常状態およびＯＩＲ網膜でのγＨ２ＡＸ（緑色；左列）、ｐ−ＩＲＥ１αＳ７２４（緑色；中央列）およびＰａｉ１（緑色；右列）、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）（赤色）、ならびにＤＡＰＩ（青色）の代表的な共焦点免疫蛍光。
【図１０−３】ＯＩＲ中およびＩ型糖尿病のＳＴＺモデルにおいて網膜細胞老化が誘導されていることを示す図である。（Ｃ）凍結切片化したＰ１４  ＯＩＲ眼のＰＭＬ（緑色；左列）、ｐ１６（緑色；右列）、ＩＢ４およびＤＡＰＩの代表的な共焦点免疫蛍光。（Ｄ）Ｐ２１  ＯＩＲでのフラットマウント網膜のＰＭＬ、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）およびＤＡＰＩに対する代表的な共焦点免疫蛍光。
【図１０−４】ＯＩＲ中およびＩ型糖尿病のＳＴＺモデルにおいて網膜細胞老化が誘導されていることを示す図である。（Ｅ）クエン酸塩およびＳＴＺ網膜からの凍結切片の代表的なＳＡ−β−ｇａｌ染色。網膜神経節細胞（ＧＣＬ）、内核層（ＩＮＬ）および外核層（ＯＮＬ）は配向のために示されている。（Ｆ）成体マウスクエン酸塩（対照）またはＳＴＺ（糖尿病）由来のフラットマウント網膜上のα−ＳＭＡまたはＮＧ２、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）の代表的な共焦点免疫蛍光。
【図１１】ＯＩＲ中の血管到達率を示す図である。酸素正常状態およびＯＩＲの間に、Ｐ１７およびＰ２１において、α−ＳＭＡ（Ａ）またはＮＧ２（Ｂ）、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）について染色された網膜フラットマウントの代表的な共焦点免疫蛍光。スケールバーは、２００μＭである。
【図１２】メトホルミンがＯＩＲ中に老化を抑制することを示す図である。（Ａ）メトホルミン（１０μｇ／μｌ、Ｐ１２）またはビヒクル（ＰＢＳ）を注射したＰ１４およびＰ１７  ＯＩＲ網膜からの凍結切片の代表的なＳＡ−β−ｇａｌ染色。（Ｂ）メトホルミンで処理されたか、または処理されていない凍結切片化されたＰ１４ＯＩＲ網膜上のＴＵＮＥＬ（左）およびＤＡＰＩ（中央）の代表的な共焦点免疫蛍光。網膜神経節細胞（ＧＣＬ）、内核層（ＩＮＬ）および外核層（ＯＮＬ）は配向のために示されている。（Ｃ）ＯＩＲ中の切断カスパーゼ−３タンパク質発現レベルのウエスタンブロット分析（Ｐ１４、Ｐ１７およびＰ２１）。β−アクチンを添加対照として使用する。スケールバーは、２００μｍである。
【図１３】ＯＩＲにおいて、メトホルミンおよびアフリベルセプトの影響を受けない遺伝子を示す図である。（Ａ）Ｐ１２においてメトホルミンまたはビヒクルを硝子体内注射したＰ１４  ＯＩＲマウスの網膜において測定したＶｅｇｆ−ａ、Ｖｅｇｆ−ｃ、Ｖｅｇｆｒ−１およびＶｅｇｆｒ−２のレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ（β−アクチンを参照遺伝子として使用した）。（Ｂ）Ｐ１２においてアフリベルセプトまたはビヒクルを硝子体内注射したＰ１４ＯＩＲマウスの網膜において測定したＣｄｋｎ２ａ、Ｔｐ５３、Ｉｌ１β、Ｔｇｆ−β１およびＳｅｍａ３ａのレベルについてのＲＴ−ｑＰＣＲ（β−アクチンを参照遺伝子として使用した）。
【図１４】ＳＡ−β−ｇａｌの定量化がどのように行われるかを示す図である。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア解析を使用した、フラットマウント網膜（または矢状の眼の切片）上のＳＡ−β−ｇａｌ染色の定量化の略図。
【図１５】例示的なビグアニド化合物およびＩＲＥ１αの阻害剤の構造を示す図である。（Ａ）ビグアニド（ＣＡＳ＃５６−０３−１）、（Ｂ）メトホルミン（Ｎ，Ｎ−ジメチルイミドジカルボンイミド酸ジアミド；ＣＡＳ＃６５７−２４−９）、（Ｃ）ブホルミン（１−ブチルビグアニド、ＣＡＳ＃６９２−１３−７）、および（Ｄ）フェンホルミン（２−（Ｎ−フェネチルカルバムイミドイル）グアニジン、ＣＡＳ＃１１４−８６−３）、（Ｅ）ＩＲＥ１αのＲＮＡｓｅ活性を阻害する「化合物３」ＩＲＥ１α阻害剤（Ｗａｎｇら、２０１２、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．８（１２）：９８２−９８９）。
【図１６】ヒトＳＥＭＡ３Ａ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。この配列（配列番号５０）は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２１）を除去することによってさらに成熟形態に加工される。
【図１７−１】ラット（受託番号ＥＤＬ９６７８４、ＮＰ＿６５９５６６、配列番号４８）、ヒト（受託番号ＮＭ００３８７３、配列番号９６）、およびマウス（受託番号ＮＰ＿０３２７６３、配列番号４８）、ＮＲＰ１コンセンサス配列と共にＮＲＰ１タンパク質配列（配列番号４７）のアライメントを示す図である。ＮＲＰ１シグナルドメイン（アミノ酸１〜２０／１〜２１／１〜２７）、サブドメインａ１（約ａａ２２〜約ａａ１４８）、サブドメインａ２（約ａａ１４９〜約ａａ２７５）、サブドメインｂ１（約ａａ２７６〜ａａ４２８）、およびサブドメインｂ２（約ａａ４２９〜約ａａ５８９）、ドメインｃ（約ａａ５９０〜約ａａ８５９）、膜貫通ドメイン（約ａａ８６０〜約ａａ８８３）および細胞質ドメイン（約ａａ８８４〜約ａａ９２３）が同定されている。
【図１７−２】ラット（受託番号ＥＤＬ９６７８４、ＮＰ＿６５９５６６、配列番号４８）、ヒト（受託番号ＮＭ００３８７３、配列番号９６）、およびマウス（受託番号ＮＰ＿０３２７６３、配列番号４８）、ＮＲＰ１コンセンサス配列と共にＮＲＰ１タンパク質配列（配列番号４７）のアライメントを示す図である。ＮＲＰ１シグナルドメイン（アミノ酸１〜２０／１〜２１／１〜２７）、サブドメインａ１（約ａａ２２〜約ａａ１４８）、サブドメインａ２（約ａａ１４９〜約ａａ２７５）、サブドメインｂ１（約ａａ２７６〜ａａ４２８）、およびサブドメインｂ２（約ａａ４２９〜約ａａ５８９）、ドメインｃ（約ａａ５９０〜約ａａ８５９）、膜貫通ドメイン（約ａａ８６０〜約ａａ８８３）および細胞質ドメイン（約ａａ８８４〜約ａａ９２３）が同定されている。
【図１８−１】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１８−２】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１８−３】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１８−４】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１８−５】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１８−６】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１８−７】図１８Ａ〜Ｇは、本発明の例示的トラップ間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（示されている各トラップに対応する配列番号は、表２および９を参照されたい）。
【図１９】ヒト可溶性ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）タンパク質配列を示す図である。（Ａ）ＮＲＰ１アイソフォームｂ／ｓ１２（６４４アミノ酸；参照番号ＮＰ＿００１０１９７９９．１；ＮＭ＿００１０２４６２８．２；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ−１４７８６−２、配列番号４４）、（Ｂ）ＮＲＰ１アイソフォームｃ／Ｓｉｖ（６０９アミノ酸；参照番号ＮＰ＿００１０１９８００．１；ＮＭ００１０２４６２９．２；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ１４７８６、配列番号４５）、（Ｃ）ＮＲＰ１アイソフォームＳＩＩＩ（７０４アミノ酸；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＰ０００００３６３９５６、配列番号４６）。
【図２０】ＮＲＰ１トラップの単回注射による細胞老化の減衰を示す図である。（Ａ）Ｐ１２においてトラップＭおよびＧを硝子体内注射されたマウスにおけるＳＡ−β−ｇａｌで標識された代表的なＰ１７  ＯＩＲフラットマウント網膜。（Ｂ）ＳＡ−β−ｇａｌ染色の定量化は、マウスがトラップＭまたはトラップＧの単回注射を受けたときに、細胞老化が有意に減衰していることを明らかにしている。
【図２１−１】食餌誘発性肥満の間にＮＲＰ１発現マクロファージが脂肪組織に蓄積することを示す図である。（Ａ）好酸球のＮＲＰ１発現レベル（脂肪組織、末梢血）、好中球（血液、滑液、骨髄）、単球（古典的：ＭＨＣＩＩ＋、ＭＨＣＩＩ−、ＭＨＣＩＩ−ＬＮ、骨髄、非古典的：ＭＨＣＩＩ中間体、ＭＨＣＩＩが高い、ＭＨＣＩＩ−、骨髄）、マクロファージ（脂肪組織、骨髄、赤脾髄、肺常在性、肺ＣＤ１１ｂ＋、中枢神経系、定常状態腹膜（高）、定常状態腹膜（低）小腸漿膜、小腸固有層）（１群あたりｎ＝１〜４）。
【図２１−２】食餌誘発性肥満の間にＮＲＰ１発現マクロファージが脂肪組織に蓄積することを示す図である。（（Ｂ）１０週間の高脂肪食（ＨＦＤ）における脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）集団ＦＡＣＳ、および白色脂肪組織（ＷＡＴ）における通常食（ＲＤ）Ｃ５７ＢＬ／６の年齢一致対照、（Ｃ）マクロファージ（ＡＴＭ）におけるＮＲＰ１発現レベル（１群あたりｎ＝９）。（Ｄ〜Ｇ）ＮＲＰ１リガンドのｍＲＮＡ発現：Ｃ５７ＢＬ／６腹膜後白色脂肪組織（ＲＰＷＡＴ）（群当たりｎ＝５）のＲＤおよび１０週間のＨＦＤにおける（Ｄ）Ｓｅｍａ３ａ、（Ｅ）Ｖｅｇｆａ、（Ｆ）Ｖｅｇｆｂ、および（Ｇ）Ｔｇｆｂ１。データは平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントの対応のないｔ検定（Ｂ〜Ｇ）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２２】ＮＲＰ１がＦＡの取り込みおよび食作用を促進することを示す図である。（Ａ）対照およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマクロファージ内での急性ＢＯＤＩＰＹ（商標）の取り込み（１群あたりｎ＝７〜８）、ＨＦＤ給餌対照およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウスの（Ｂ）後腹膜白色脂肪組織（ＲＰＷＡＴ）、（Ｃ）肝臓、（Ｄ）血漿、および（Ｅ）心臓でのＢＯＤＩＰＹ（商標）の取り込み（ｎ＝６／群）。（Ｆ）対照および（Ｇ）脂肪細胞馴化培地中でインキュベートしたＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマクロファージのＯＲＯ（オイルレッドＯ）染色。（Ｈ）対照および脂肪細胞馴化培地（ＤＭＥＭおよびインスリン）中でインキュベートしたＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマクロファージ、（Ｉ）ＤＭＥＭおよびインスリン、（Ｊ）ＤＭＥＭ、（Ｋ）マクロファージ培地（Ｆ１２）のＯＲＯ染色の定量化（１群あたりｎ＝１８〜３５）。データは平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントの対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２３】ＮＲＰ１を欠くマクロファージが食作用能力を低下させることを示す図である。食作用は、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌおよび対照マクロファージ中のｐＨｒｏｄｏグリーンザイモサンバイオ粒子コンジュゲート（ｐＨｒｏｄｏ  ｇｒｅｅｎ  ｚｙｍｏｓａｎ  ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いて測定した。ｐＨｒｏｄｏ蛍光は、対照およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマクロファージで検出された（１群あたりｎ＝８）。データは平均±ＳＥＭで表した。スチューデントの対応のないｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２４】高脂肪食を与えられたマウスにおいて、ＮＲＰ１ポリペプチドトラップが体重増加を妨げることを示す図である（実施例４を参照されたい）。体重増加に対するＮＲＰ１トラップの効果を査定した。ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２およびｂ１を含む可溶性ＮＲＰ１トラップ（トラップＭ、図９Ａ）を発現するアデノウイルス；アデノＧＦＰ；または生理食塩水（対照）を雄マウスに投与し、同時にマウスは、通常食から高脂肪食（ＨＦＤ、Ｔ０）に切り替えた。体重増加は、１０週間にわたって監視した。データは平均値±ＳＥＭで表す。スチューデントの対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、生理食塩水対アデノトラップＭ、二元配置アノバ、ボンフェローニ事後検定、Ｎ＝５。
【図２５】トラップＭを発現するマウスにおける耐糖能試験を示す図である。（Ａ）マウス１ｋｇあたり２ｇのグルコースの腹腔内注射後にＨＦＤを与えたマウスの異なる時点での糖血（ｍＭ）。６〜８週齢のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスに食塩水またはアデノ−トラップＭを静脈内注射した（０．２５ｘ１０１０ＰＦＵ／注射）。注射直後にマウスに高脂肪食を与えた。糖血は、マウス１ｋｇあたり２ｇのグルコースの腹腔内注射後の異なる時点で査定した。（Ｂ）二元配置のＡｎｏｖａ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定において（Ａ）＊＊Ｐ＜０．０１（アデノＧＦＰ対アデノトラップＭ）に示す曲線下面積。Ｎ＝５。
【図２６】全身注射後のトラップＭの薬力学的特性の分析を示す図である。Ｃ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）に精製したトラップＭ（０．５ｍｇ／ｋｇ用量）を尾静脈注射し、注射から６時間、２４時間および４８時間後に血清サンプルを採取した。ＩＭＡＣセファロースを用いて約７５μｌの血清から捕捉されたトラップＭを、抗ヒトＮＲＰ１（ｃｕｂＡＩドメイン）を用いた免疫ブロット法によって検出した。
【図２７】アデノウイルス原種による形質導入後のトラップＧ、Ａ、ＤおよびＭのＣｏｓ細胞発現を示す図である。Ｃｏｓ細胞は、示されたアデノウイルス原種により形質導入した。トラップＧおよびＭは、ＩＭＡＣセファロースを用いて形質導入細胞の上清から精製し、トラップＡおよびＤは、プロテインＡ／Ｇセファロースを用いて濃縮した。トラップは、抗ヒトＮＲＰ１（ｃｕｂＡＩドメイン）を用いた免疫ブロッティングによって検出した。凡例：ＮＩ）非感染Ｃｏｓ細胞からの上清、アデノ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）感染Ｃｏｓ細胞からのＧＦＰ上清、Ｓ１）リポフェクタミン（商標）２０００トランスフェクションアデノウイルス原種、Ｓ２）エフェクテントランスフェクションアデノウイルス原種、Ｓ３）ＰＥＩトランスフェクションアデノウイルス原種、Ａ２）アデノウイルス原種増幅ラウンド２、Ａ３）アデノウイルス原種増幅ラウンド３。具体的には、精製はＩＭＡＣセファロース（ＩＭＡＣ）またはプロテインＡ／Ｇセファロース（Ａ／Ｇ）を用いて行った。
【図２８】アデノウイルス−トラップＭ構築物による全身感染後のトラップＭの薬理学的分布の解析を示す図である。Ｃ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）に、アデノウイルストラップＭまたは対照アデノウイルス−ＧＦＰ原種を尾静脈注射した。マウスは、感染の２週間後に屠殺し、血清、腎臓および肝臓組織を回収し、解析まで−８０℃で貯蔵した。トラップＭは、ＩＭＡＣセファロースを用いてＰＢＳ／２％トリトンｘ−１００に溶解した血清（約７５μｌ）または腎臓もしくは肝臓由来の組織溶解物（約４０ｍｇ）から捕獲し、抗ヒトＮＲＰ１（ｃｕｂＡＩドメイン）を用いた免疫ブロットにより検出した。凡例；１）非感染マウス、２）アデノＧＦＰ感染マウス、および３）アデノトラップＭ感染マウス。
【図２９】アデノウイルス感染の２週間後のトラップＭの発現を示す図である。トラップＭは、ＩＭＡＣセファロースを使用してＰＢＳ２％トリトンＸ−１００に溶解した血液（約２５μｌ）から捕獲し、抗ヒトＮＲＰ１（ｃｕｂＡＩドメイン）を用いた免疫ブロッティングにより検出した。凡例；ＮＩ：非感染マウス。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
１．眼血管疾患における細胞老化およびＳＡＳＰの役割
本明細書に提示されたデータは、耐候性虚血における細胞老化および眼血管疾患における血管形成の調節についての新規の役割を確立する。異なる網膜症モデルにおいては、実際に、網膜の異なる細胞内集団において老化細胞の一時的な蓄積が確立された。より具体的には、ＳＡＳＰを採用することによって、網膜ニューロンは、老化を網膜ミクログリアおよび内皮細胞に広げ、さらに病理学的な網膜前血管形成をさらに悪化させる一連のパラクリン因子および炎症性合図の産生を刺激することが見出された。本出願人らは、ＳＡＳＰを阻害（例えば、ビグアニド化合物（例えば、メトホルミン）の投与、またはＩＲＥ１αの薬理学的もしくは遺伝的阻害）することにより細胞老化を調節することで、血管性眼疾患において、虚血誘発老化を阻害し、血管再生を増やし、病理学的血管新生を抑制することを示した。したがって、ＳＡＳＰは、虚血性細胞が早期老化状態に入り、パラクリン老化を駆動し、破壊的血管形成を悪化させ、かつ修復的血管再生を妨げる炎症性サイトカインを分泌することで、病理学的血管増殖の媒介に関与していることが示された。
【００９６】
本明細書に提示されるデータは、網膜症などの眼血管疾患の文脈において、細胞老化が、最初にニューロンを細胞死から保護し、同時にそれらが修復血管形成プログラムを誘発することを妨げるという点で、同じ疾患内で二分の役割を果たすことを裏付けている。加えて、網膜症において観察されるパラクリン老化およびそれに関連した血管調節因子の産生は、生理学的に無血管の硝子体へ新生血管が行われないようにし、かつ網膜血管系における早期加齢関連合併症を促進し得る。このことは、加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症など、加齢に関連する血管新生性眼疾患の発生率が上昇する点において、特に関連がある。そのため、老化のモジュレータを投与することにより、病理学的血管新生段階の間において細胞老化を予防することは、それ故に、眼血管疾患および網膜血管障害などの障害のための簡単な治療的解決策を表し得る。
【００９７】
２．細胞老化を伴う血管性眼疾患を治療または予防する方法
したがって、本発明の一態様によれば、対象における血管性眼疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を治療および／または予防するための組成物および方法が提供される。本発明のこの態様による方法は、ＳＡＳＰの阻害剤（例えば、メトホルミンなどのビグアニド化合物）を対象に投与することを含む。特定の態様では、ＳＡＳＰの阻害剤は、対象の眼内に局所的（例えば、全身的とは対照的に局所にまたは硝子体内に）に投与される。メトホルミンなどのビグアニド化合物の場合、全身投与では血液網膜障壁が存在するために化合物をその標的部位に到達させることが一般に不可能となるため、眼内投与が特に好ましい。実施形態では、血管性眼疾患または障害は、細胞性虚血に続発する。
【００９８】
本発明によるＳＡＳＰの阻害から利益を得ることができる血管性眼疾患または状態としては、異常な血管形成（例えば、病理学的血管新生および／または血管再生の減少）を特徴とするあらゆる疾患、障害または状態が挙げられる。これらの疾患は、正常な眼の機能に寄与する細胞（例えば、眼球血管細胞、網膜細胞、ニューロン、ミクログリア）への代謝供給（例えば、酸素、血液、栄養素）が減少（一過性または持続／慢性）することによって引き起こされ得、これにより、老化細胞（または老化表現型を有する細胞）の存在を導く。このような状態は、虚血事象の後に存在し得るが、このように限定されるものではない。このため、本明細書で使用される用語「血管性眼疾患もしくは障害」または「血管性眼疾患もしくは状態」は、眼内の血管の正常な生理機能に影響を及ぼす疾患、障害または状態を指す。このような眼疾患または症状の非限定的な例としては、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虚血性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞症、分岐網膜静脈閉塞症、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、眼に対する物理的な損傷、緑内障、裂孔原性網膜剥離（ＲＲＤ）、網膜血管炎、網膜マクロ動脈瘤、網膜細動脈瘤、フックスジストロフィー症、虚血性視神経症、若年性黄斑変性症、黄斑性毛細血管拡張症、視神経炎、アッシャー症候群、網膜色素変性症、ぶどう膜炎、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）が挙げられる。実施形態では、血管性眼疾患または障害は、虚血性網膜症である。実施形態では、虚血性網膜症は、糖尿病性網膜症、網膜症または未熟児、眼静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、または分枝網膜静脈閉塞症に関連する。
【００９９】
本発明に従ってＳＡＳＰを阻害する化合物または剤は、ビグアニド化合物（例えば、メトホルミン）、ｍＴｏｒ阻害剤（例えば、ラパログ、Ｔｏｒｉｎ  １）、および／またはＩＲＥ１α発現の阻害剤（例えば、アンチセンス、ｓｈＲＮＡなど）、ＩＲＥ１α活性化（Ｓ７２４リン酸化）の阻害剤、および／またはＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅ活性の阻害剤（例えば、薬理学的阻害剤／アンタゴニスト）が挙げられる。一般に、本発明に従ってＳＡＳＰを阻害する「ＩＲＥ１α阻害剤」は、最終的にＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅ活性を低下させるかまたは無効にするものである。
【０１００】
特定の態様では、血管性眼疾患および障害（例えば、増殖性網膜症を伴う）の文脈において、ＳＡＳＰを阻害し、細胞老化を予防および／もしくは減衰する化合物および剤は、生理学的血管形成（すなわち有益な血管形成）を増やし、病理学的血管形成を減少し（病理学的血管新生）、したがって組織修復を促進する。
【０１０１】
ＩＲＥ１αは、ヒトにおいてＥＲＮ１遺伝子によってコードされる酵素である（Ｅｎｔｒｅｚ：２０８１、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＧ０００００１７８６０７、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ７５４６０、Ｒｅｆｓｅｑ  ｍＲＮＡ：ＮＭ＿１５２４６１、ＮＭ＿００１４３３、Ｒｅｆｓｅｑ（ｐｒｏｔｅｉｎ）：ＮＰ＿００１４２４．３）。このタンパク質は、固有のキナーゼ活性およびエンドリボヌクレアーゼ活性を有し、また。小胞体に基づくストレスシグナルに対する応答としての遺伝子発現の変化において重要である（主に折畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ））。この遺伝子について、異なるアイソフォームをコードする２つの選択的スプライス転写多様体が見出された。ＩＲＥ１αは、２つの機能的酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼ、およびトランス自己リン酸化キナーゼドメインを有する。ＩＲＥ１αは、活性化されると、オリゴマー化し、従来とは異なるＲＮＡスプライシング活性を行い、Ｘボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ１）ｍＲＮＡからイントロンを除去し、それが機能的転写因子ＸＢＰ１に翻訳されるようになる。ＸＢＰ１は、ＥＲストレスからの回復を促進するＥＲシャペロンおよび小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）遺伝子を上方制御する。ＩＲＥ１αを阻害する化合物（すなわち、阻害剤）もまた、当該分野において公知である。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「ＩＲＥ１α阻害剤」または「ＩＲＥ１αアンタゴニスト」とは、細胞老化およびＳＡＳＰの誘導（すなわち、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性およびＸＢＰ１プロセシング）に関連するＩＲＥ１α媒介細胞シグナル伝達を低減または遮断することができる剤を指す。非限定的例としては、ＩＲＥ１αの発現（転写または翻訳）を低減または遮断する剤、ＩＲＥ１α活性化を低減または遮断することができる剤（例えば、Ｓ７２４のリン酸化および／またはＩＲＥ１αの二量体化）が挙げられる。このように限定されるものではないが、剤は天然または合成であってもよく、小分子またはタンパク質／ポリペプチド／核酸であってもよく、例えばこれらに限定されないが、本明細書に記載のＩＲＥ１αタンパク質または任意の薬理学的阻害剤をコードするＩＲＥ１α核酸配列に特異的なアンチセンスまたはｓｈＲＮＡであってもよい。本発明のＩＲＥ１α阻害剤またはＩＲＥ１αアンタゴニストは、ＩＲＥ１α核酸またはＩＲＥ１αタンパク質に結合して、ＩＲＥ１αの発現、活性化または活性を低下させ、最終的には細胞内のＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅ活性の低下をもたらす。
【０１０３】
ＲＮａｓｅドメインの触媒コアおよび／またはキナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットを標的とする阻害剤が記載されている。ＲＮＡｓｅ結合ポケットを標的とする阻害剤の非限定的な例としては、サリチルアルデヒド（例えば、３−メトキシ−６−ブロモサリチルアルデヒド−Ｖｏｌｋｍａｎら、２０１１、ＪＢＣ  ２８６（１４）：１２７４３〜１２７５５、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０６９４７４）、４μ８Ｃ、ＭＫＣ−３９４６、ＳＴＦ−０８３０１０、およびトヨカマイシンが挙げられる。キナーゼドメインを介してＩＲＥ１αのＲＮａｓｅ活性を阻害する化合物も同定され、これは、「キナーゼ阻害ＲＮａｓｅアテニュエータ」（ＫＩＲＡ）と命名されており、ＫＩＲＡ３およびＫＩＲＡ６（Ｃａｓ＃１５８９５２７−６５−０）を含み、ＩＲＥ１αのキナーゼおよびＲＮＡｓｅ活性を両方とも阻害する。スニチニブおよびＡＰＹ２９は、ＡＴＰ結合ポケットを阻害するが、ＩＲＥ１α  ＲＮａｓｅドメインをアロステリックに活性化する化合物の例である（Ｗａｎｇら、２０１２年、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．８（１２）：９８２−９８９）。ＩＲＥ１αのさらなるキナーゼおよび／またはＲＮＡｓｅ阻害剤および活性化剤は、Ｗａｎｇ（上記）に記載されている。特定の実施形態では、本発明に従って使用されるＩＲＥ１α阻害剤は、ＩＲＥ１αのＲＮＡｓｅ活性を阻害するが、そのキナーゼ活性を阻害することはない。
【０１０４】
ビグアニドは、式ＨＮ（Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２）２を有する有機化合物のクラスである。これらの化合物は元来フレンチライラック（Ｇａｌｅｇａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）抽出物から発見され、血糖値を下げることが示された。したがって、それらは元来２型糖尿病の治療に使用されていた。様々なビグアニドの誘導体が、糖尿病の治療用の医薬剤として使用されているが、多嚢胞性卵巣症候群および癌など、他の疾患および状態のためにも使用されている。非限定的な例としては、メトホルミン（Ｎ、Ｎ−ジメチルイミドジカルボン酸ジアミド（ＩＵＰＡＣ名）、ＣＡＳ６５７−２４−９；ＤｒｕｇＢａｎｋＤＢ００３３１；ＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ３９４９；Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ  ＸＲ（商標）；Ｃａｒｂｏｐｈａｇｅ  ＳＲ（商標）；Ｒｉｏｍｅｔ（商標）；Ｆｏｒｔａｍｅｔ（商標）；Ｇｌｕｍｅｔｚａ（商標）；Ｏｂｉｍｅｔ（商標）；ｇｌｕｆｏｒｍｉｎ（商標）；Ｄｉａｎｂｅｎ（商標）；Ｄｉａｂｅｘ（商標）；Ｄｉａｆｏｒｍｉｎ（商標）；Ｓｉｏｆｏｒ（商標）；およびＭｅｔｆｏｇａｍｍａ（商標））、ブホルミン（１−ブチルビグアニド、ＣＡＳ＃６９２−１３−７）、フェンホルミン（２−（Ｎ−フェネチルカルバムイミドイル）グアニジン、ＣＡＳ＃１１４−８６−３）、プログアニル、（１−［アミノ−（４−クロロアニリノ）メチリデン］−２−プロパン−２−イルグアニジン、クロルグアニドとしても知られている）クロルプログアニル、シンタリンＡ、（１，１’−デカン−１、１０−ジイルジグアニジン、Ｃａｓ＃１１１−２３−９）およびシンタリンＢ、（１，１’−ドデカメチレンジグアニジニウムジクロリド、Ｃａｓ＃６１１６７−４３−９）が挙げられる。図１５は、本発明に従って使用され得るビグアニドおよびいくつかの機能的誘導体の構造を示す。
【０１０５】
本発明のＳＡＳＰ阻害剤は、アンジオポエチン−２阻害剤（例えば、国際公開第２０１６／０８５７５０号に記載されているもの）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブ／ＬＵＣＥＮＴＩＳ（商標）））、小分子ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、スネチニブ）、ＶＥＧＦ−阻害融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト／ＥＹＥＬＥＡ（商標））、および／またはＳＥＭＡ３Ａアンタゴニスト（例えば、以下（表２および図１８を参照されたい）、または、例えば、国際公開第２０１６／０３３６９９号に記載のＳＥＭＡ３ａ抗体またはＮＲＰ１トラップ）など、血管性眼疾患および障害を治療するために使用される他の薬物と組み合わせて投与されてもよい。
【０１０６】
３．ＩＲＥ１αを阻害することによる細胞老化およびＳＡＳＰの減少または予防
本明細書に提示されたデータは、細胞老化およびＳＡＳＰの調節におけるＩＲＥ１αの役割をさらに確立する。細胞老化（オートクリンおよび／またはパラクリンなど）、パラクリン老化は、ＩＲＥ１α活性（すなわち、ＩＲＥ１α活性化および細胞シグナル伝達）を低下させることによって阻害または予防され得る。
【０１０７】
ＩＲＥ１α活性は、いくつかのアプローチによって阻害され得る。ＩＲＥ１α細胞活性の阻害は、ＩＲＥ１α（ｉ）核酸またはタンパク質の発現、（ｉｉ）活性化（セリン７２４リン酸化）、および／または（ｉｉｉ）細胞内のＲＮＡｓｅ活性（および任意によりそのキナーゼ活性）を低下させることによって直接行われ得る。上記のように、ＩＲＥ１α阻害剤は当該分野で公知であり、ＩＲＥ１αの発現（例えば、ｓｈ＿ＲＮＡのＩＲＥ１αアンチセンス）、ＩＲＥ１αの活性化（例えば、ＫＩＲＡ３、ＫＩＲＡ６）、および／またはＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ（および任意によりキナーゼ）（例えば、サリチルアルデヒド、４μ８Ｃ、ＭＫＣ−３９４６、ＳＴＦ−０８３０１０、ＫＩＲＡ３、ＫＩＲＡ６、およびトヨカマイシン）の活性を阻害する剤が挙げられる。
【０１０８】
したがって、本発明は、ＩＲＥ１αのレベルまたは活性を低下させることを含む、細胞の細胞老化または細胞内の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の誘導を阻害または予防する方法を提供する。
【０１０９】
本発明はまた、細胞をＩＲＥ１αの阻害剤と接触させることを含む、細胞の細胞老化または細胞内の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の誘導を阻害または予防する方法に関する。
【０１１０】
対象にＩＲＥ１αの阻害剤を投与することを含む、細胞の細胞老化、または対象の細胞内において老化関連分泌表現型の誘導を阻害または予防する方法も提供される。
【０１１１】
上記の方法は、細胞老化が有害である疾患または状態、例えば、種々の年齢加齢状態（例えば、サルコペニア、神経変性、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛および白髪、白内障、肥満、メタボリックシンドローム、ならびに他の老年期疾患など）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症、緑内障、パーキンソン病、腸管疾患、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵線維症、血管性眼疾患（例えば、網膜血管疾患（増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、黄斑変性症、緑内障）ならびに嚢胞性線維症などの治療または予防に有用であり得る。細胞老化の阻害または予防はまた、例えば代謝機能不全、加齢の加速、後年の癌の危険性の増加などの、化学療法／放射線療法の副作用を軽減するために、癌治療中および／または癌治療後に有用であり得る。実施形態では、本発明に包含される老化関連疾患または状態は、１つ以上の血管性眼疾患（例えば、網膜血管疾患（増殖性網膜症、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、黄斑変性、緑内障））を除くものとする。
【０１１２】
ＩＲＥ１αの発現、したがってＩＲＥ１α媒介細胞老化を減少させるために様々なアプローチが利用可能である。非限定的な例としては、小型ヘアピンｓｈＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、リボザイム、ＩＲＥ１αプロモーターを標的とするＴＡＬエフェクターなどの使用が挙げられる。細胞におけるｓｈＲＮＡまたは類似の阻害性ＲＮＡの発現は、プラスミドの送達、またはウイルス（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）または細菌ベクターを介した送達によって得ることができる。
【０１１３】
したがって、代替的実施形態において、本発明は、目的のｍＲＮＡの分解および／または翻訳の阻害をもたらすための外因性投与のためのアンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子およびリボザイムを提供する。本発明はまた、本明細書に開示のアンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子、リボザイムなどを送達および／または発現するためのベクターおよび宿主細胞を提供する。アンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子、およびリボザイムは、好ましくは哺乳動物（好ましくはヒト）のＩＲＥ１αを標的とする。治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド適用の例としては、以下が挙げられる：１９９２年８月４日に発行の米国特許第５，１３５，９１７号、１９９２年３月２４日に発行の米国特許第５，０９８，８９０号、１９９２年２月１１日に発行の米国特許第５，０８７，６１７号、１９９２年１１月２４日に発行の米国特許第５，１６６，１９５号、１９９１年４月２日に発行の米国特許第５，００４，８１０号、１９９３年３月１６日に発行の米国特許第５，１９４，４２８号、１９８９年２月２１日に発行の米国特許第４，８０６，４６３号、１９９４年２月１５日に発行の米国特許第５，２８６，７１７号、米国特許第５，２７６，０１９号、および米国特許第５，２６４，４２３号、ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ、１９９４年４月２９日、ｐ．３。
【０１１４】
好ましくは、アンチセンス分子において、特異的結合が望まれる条件下、例えばこの場合は生理的条件下で、インビボアッセイもしくは治療処置の場合、またはインビトロアッセイの場合、アッセイが行われる条件下において、アンチセンス分子の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の目的のｍＲＮＡに対する相補性がある。アンチセンス結合のための標的ｍＲＮＡとしては、タンパク質をコードするための情報のみでなく、例えば５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域、およびイントロン／エクソン接合部リボヌクレオチドを形成する関連リボヌクレオチドも挙げることができる。本発明のＩＲＥ１α阻害剤として、こうした分子を提供するために使用され得るアンチセンスおよびリボザイム核酸のスクリーニング方法が、米国特許第５，９３２，４３５号に開示されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約１００のヌクレオチド単位を含み得る。理解されるように、ヌクレオチド単位は、ホスホジエステルまたは骨格構造を形成する他の結合を介して隣接するヌクレオチド単位に好適に結合した塩基−糖の組み合わせ（または類似構造の組み合わせ）である。
【０１１６】
さらなる実施形態では、目的のポリペプチドをコードする核酸（ＩＲＥ１α）、またはその断片の発現は、一種の転写後遺伝子サイレンシングであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術、を使用して阻害または予防され得る。ＲＮＡｉを使用して、疑似「ノックアウト」、すなわち目的の遺伝子またはコード領域によりコードされる産物の発現が低減されるシステムを作り出すことができ、その結果、システム内においてコードされた産物の活性が全体的に低下する。このように、ＲＮＡｉは、目的の核酸またはその断片もしくは多様体を標的とし、それがコードする産物の発現および活性レベルを低下させるために行われ得る。このようなシステムは、このような産物の活性に関連する障害を治療するためのみでなく、その産物の機能的研究のためにも使用され得る。ＲＮＡｉは、例えば公開された米国特許出願第２００２０１７３４７８号（Ｇｅｗｉｒｔｚ；２００２年１１月２１日公開）および第２００２０１３２７８８号（Ｌｅｗｉｓら；２００２年１１月７日公開）に記載されている。ＲＮＡｉを実施するための試薬およびキットは、例えばＡｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から市販されている。
【０１１７】
いくつかの系におけるＲＮＡｉのための最初の剤は、標的核酸に対応するｄｓＲＮＡ分子である。次いで、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、２１〜２３ヌクレオチド長（１９〜２１ｂｐ二重鎖、それぞれ２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する）である短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断されると考えられる。この最初の切断工程に影響を与えると考えられている酵素は「ダイサー」と呼ばれており、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのメンバーとして分類される。あるいは、ＲＮＡｉは、細胞に直接導入すること、またはそのようなｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の好適な前駆体（例えば、前駆体（複数可）をコードするベクター（アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター））を細胞に導入することによって細胞内で生成することによってもたらされ得る。次いで、ｓｉＲＮＡは他の細胞内成分と会合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し得る。このようにして形成されたＲＩＳＣは、その後、相同性により、そのｓｉＲＮＡ成分と標的転写物との間の塩基対相互作用を介して目的の転写物を標的化し、その結果、ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２のヌクレオチドの標的転写物を切断する。したがって、標的ｍＲＮＡが切断され、コードするタンパク質産物のレベルが低下する。
【０１１８】
ＲＮＡｉは、好適インビトロ合成ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に導入することによってもたらされ得る。ＲＮＡｉは、例えば化学合成ＲＮＡを用いて実施することができる。あるいは、好適な発現ベクターを使用して、そのようなＲＮＡをインビトロまたはインビボのいずれかで転写してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖（同じベクター上または別々のベクター上に存在する配列によってコードされる）のインビトロ転写は、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してもたらされ得る。この場合、ベクターは、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結された好適なコード配列を含んでもよい。実施形態では、インビトロ−転写ＲＮＡは、インビトロでプロセシングを行って（例えば大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを用いて）、ＲＮＡｉに繋がるサイズにしてもよい。センスおよびアンチセンス転写物は、組み合わせて目的の標的細胞に導入されるＲＮＡ二本鎖を形成する。ｓｉＲＮＡ様分子にプロセシングされ得る小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現する他のベクターが使用されてもよい。インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、種々のベクターを使用した方法、およびそのようなベクターを細胞に導入するための種々の方法（例えば遺伝子治療）が、当技術分野において公知である。
【０１１９】
したがって、一実施形態では、目的のポリペプチド（ＩＲＥ１α）をコードする核酸、またはその断片の発現は、目的のポリペプチド（例えば、ＩＲＥ１α）をコードする核酸またはその断片、あるいはそれらと相同な核酸に対応するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子を細胞内に導入するか、または細胞内で生成することによって阻害され得る。「ｓｉＲＮＡ様分子」とは、ｓｉＲＮＡに類似しており（例えば、サイズおよび構造について）、ｓｉＲＮＡ活性を引き出すことができる、すなわち発現のＲＮＡｉ媒介阻害をもたらすことができる核酸分子を指す。様々な実施形態では、こうした方法は、細胞内へのｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子の直接投与、または上記のベクターを利用した方法の使用を必然的に伴い得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、約３０ヌクレオチド長未満である。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は約２１〜２３ヌクレオチド長である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、１９〜２１ｂｐの二重鎖部分を含み、各鎖は２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、目的のポリペプチドをコードする核酸、またはその断片もしくは多様体（もしくは多様体の断片）と実質的に同一である。このような多様体は、目的のポリペプチドと同様の活性を有するタンパク質をコードすることができる。
【０１２０】
４．ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の増大により細胞老化を促進する方法
特定の条件下では、細胞老化の刺激が有益な場合もある。オートクリンおよびパラクリン老化などの細胞老化は、ＩＲＥ１α活性（すなわち、ＩＲＥ１α  ＲＮＡｓｅ活性および細胞シグナル伝達）を刺激または増大させることによって促進または誘導することができる。ＩＲＥ１α活性は、細胞内のＩＲＥ１αの発現を増加させること、またはＩＲＥ１αＲＮＡｓｅ活性を活性化する化合物（例えば、ＡＰＹ２９、スニチニブ、または化合物３（Ｊｏｓｈｉら、２０１５、６（１５）：１３０９−１３３５に記載））と細胞を接触させることなど、いくつかのアプローチによって増大させることができる。
【０１２１】
細胞老化を促進する方法は、老化が組織修復、創傷治癒、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞、心臓線維化、アテローム性動脈硬化症、肺高血圧症および癌などの有益な効果を有する疾患および状態において有用であり得る。
【０１２２】
５．ＳＥＭＡ３Ａモジュレータを含む細胞老化を調節するための組成物および方法。
クラス３セマフォリン（Ｓｅｍａ３）は、その既知の生物学的役割が多様であり、かつ成長しているタンパク質のサブファミリーである。Ｓｅｍａ３の作用機序は、ニューロピリン、プレキシンおよび細胞接着分子（ＣＡＭ）のヘテロマー複合体を含む膜貫通受容体への結合を必要とする。ＳＥＭＡ３Ａ遺伝子（ＧｅｎｅＣａｒｄ  ＩＤ：ＧＣ０７Ｍ０８３９５５；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０３７１；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００７５２１３）は、シグナルペプチド、Ｉｇ−様Ｃ２−型（免疫グロブリン様）ドメイン、ＰＳＩドメイン、およびＳｅｍａドメイン（これはシグナル伝達に必要である）を含む７７１のアミノ酸タンパク質（ＮＰ＿００６０７１．１；ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｑ１４５６３、配列番号５０）をコードする。この分泌タンパク質は、軸索誘導合図として最初に記載されていたが、現在では臓器の発生、骨代謝、血管形成、血管透過性、成長円錐の崩壊、筋形成再生、および神経筋接合部の形成など、免疫系、炎症、統合失調症、および糖尿病性網膜症などの網膜疾患など、様々な生理学的および病理学的プロセスに関与している。
【０１２３】
Ｓｅｍａ３ａは一般に、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）および共受容体（例えばクラスＡプレキシン（例えばＰＬＸｎａ１−Ｐｌｘｎａ４、Ｐｌｘｎｄ１）、Ｌ１ｃａｍ、ｃｈＬ１、Ｒｏｂｏ１）を含む受容体複合体を介してシグナル伝達する。ＮＲＰ１（Ｅｎｓｅｍｂｌｅ；ＥＮＳＧ００００００９９２５０；ＥＮＳＴ０００００２６５３７１；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ１４７８６；ＯＭＩＭ：６０２０６９；ＨＧＮＣ：８００４；ＧｅｎｅＣａｒｄ  ＩＤ：ＧＣ１０Ｍ０３３２１６、配列番号４４〜４７、９５および９６）は、大きい細胞内ドメインを有する単回通過膜貫通受容体である。ニューロピリン−１の基本構造は、５つのドメイン：３つの細胞外ドメイン（ａ１ａ２（ＣＵＢ）、ｂ１ｂ２（ＦＶ／ＦＶＩＩＩ）、およびｃ（ＭＡＭ））、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質ドメインを含む。ａ１ａ２ドメインは、ジスルフィド架橋を形成する４つのシステイン残基を一般に含む補体成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ（ＣＵＢ）と相同である。このドメインは、ＳＥＭＡ３Ａに結合する。ドメインｂ１ｂ２（ＦＶ／ＦＶＩＩＩ）は、ＶＥＧＦに結合する。サブドメインｂ１中のアミノ酸Ｙ２９７は、Ｙ２９７をアラニンに置換することで、ＮＲＰ１へのＶＥＧＦの結合が著しく低下するため、ＶＥＧＦへの結合に重要である。サブドメインｂ１も、ＳＥＭＡ３Ａのリガンド結合に寄与する。実際、本出願人らは、驚くべきことに、Ｙ２９７（Ｙ２９７Ａ）の置換もまたＳＥＭＡ３ＡのＮＲＰ１への結合を有意に減少させることを見出した。結晶学的エビデンスでは、ＶＥＧＦ１６５およびＳｅｍａ３Ａが直接ＮＲＰ１について競合するというよりも、別個の重複しない部位において、ＮＲＰ１に同時に結合できることを明らかにした。
【０１２４】
膜貫通型（アイソフォーム１、９２３  ａａ、図１７、配列番号：４７、９５、および９６、ＮＭ００３８７３、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ１４７８６−１）に加えて、細胞外ドメインの一部のみを含有する天然に存在する可溶性ＮＲＰ１タンパク質（ｓＮＲＰ１）は、細胞によって分泌され得る。５５１〜７０４のアミノ酸（アイソフォームｂ／ｓ１２  ＮＲＰ１（６４４のアミノ酸；ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１０１９７９９．１；ＮＭ＿００１０２４６２８．２、配列番号４４）、ｓ１１  ＮＲＰ１（７０４のアミノ酸；ＥＮＳＰ０００００３６３９５６、配列番号４６）、ｓＩＩＩ  ＮＲＰ１（５５１ａａ）およびｃ／ｓＩＶ  ＮＲＰ１（６０９のアミノ酸；ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１０１９８００．１；ＮＭ００１０２４６２９．２、配列番号４５）（Ｃａｃｋｏｗｓｋｉら、２００４、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８４（１）：８２−９４；Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌ  Ｍら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０００；７０（２）：２１１−２２２；およびＧａｇｎｏｎ  ＭＬら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；９７（６）：２５７３−２５７８））の範囲の異なる可溶性形態が記載されている。タンパク質の全長型は１７のエクソンすべてを含むのに対して、可溶性アイソフォームは、ＮＲＰ１遺伝子の選択的スプライシングまたはイントロンによる読み取りによって作製される。ｂ／ｓ１２およびｃ／ｓＩＶ  ＮＲＰ１アイソフォームは、ａ１ａ２ドメインおよびｂ１ｂ２ドメイン、ならびにｂ／ｃリンカーのほどんどを含むが、ｃドメインは含まない。アイソフォームｓＩＩＩは、ａ１ａ２ドメイン、ｂ１サブドメインを含み、ｂ２サブドメインについては一部のみを含む。ｓ１１  ＮＲＰ１アイソフォームは、ａ１ａ２ドメインおよびｂ１ｂ２ドメインを含み、その後にエクソン１１および８３の新規アミノ酸によってコードされるｂ／ｃリンカーの一部分が続く。
【０１２５】
本発明の第２の態様では、虚血性網膜症のモデルにおける以下の研究において、驚くべきことに、ＳＥＭＡ３Ａは、細胞老化のモジュレータとして同定された。実際に、無血管化された網膜帯のニューロンによって引き起こされる予想外のメカニズムは、それらが早期細胞老化状態に入り、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）をとるところで同定された。本明細書に記載のデータは、老化細胞によるＳＥＭＡ３Ａの分泌がＩＲＥ１ａを介してパラクリン老化を駆動し、虚血組織において、ニューロン、ミクログリア、およびその上にある血管系などの様々な細胞型に対して老化を伝播する（パラクリン老化）ことを示すものである。さらに、ＳＥＭＡ３Ａへ持続的に曝露することにより、ＩＲＥ１αを活性化し、老化を誘導し、かつ老化状態を促進し、強化するために重要であることが知られている一群の遺伝子、例えばＰａｉ１、Ｉ１６、Ｉｌ１β、ＴＧＦ−βおよびＴｐ５３の発現を駆動することが示された。ＳＥＭＡ３Ａはまた、細胞老化の特徴であるγＨ２ＡＸを発現する老化関連ＤＮＡ損傷病巣を促進することも示された。特に、かつ本明細書に示されるように、ＳＥＭＡ３Ａに対する遺伝的干渉は老化を制限し、かつ組織修復を刺激する。
【０１２６】
本発明者らは、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を調節することが、細胞老化、および細胞老化中に放出されるタンパク質（典型的には、ＳＡＳＰの炎症誘発性サイトカイン）の分泌を制御できることを見出した。本発明者らは、ＳＥＭＡ３Ａの発現または活性を阻害することによって、細胞老化を予防、制限または減少させることができ、また、ＳＡＳＰの誘導を予防または減少させることができることを見出した。同様に、（例えば、その発現を増加させることによって、または細胞をＳＥＭＡ３Ａポリペプチドと接触させることによって）ＳＥＭＡ３Ａ活性を増大させることで、老化を促進し、ＳＡＳＰを誘導する。
【０１２７】
これらのデータは、病理学的プロセスにおいてＳＡＳＰを介したオートクリンおよびパラクリンの老化を調節する際におけるＳＥＭＡ３Ａの、これまでには予期されなかった役割についてのエビデンスを提供するものであり、老化に関連する疾患および状態において、ＳＥＭＡ３Ａ活性を調節する治療上の利点を明らかにするものである。
【０１２８】
（ｉ）ＳＥＭＡ３Ａシグナル伝達を阻害することによって細胞老化を阻害または予防する方法
オートクリンおよびパラクリン老化などの細胞老化は、ＳＥＭＡ３Ａ活性（すなわち、ＳＥＭＡ３Ａ細胞シグナル伝達）を低下させることによって阻害または予防することができる。ＳＥＭＡ３Ａ活性は、いくつかのアプローチによって阻害され得る。ＳＥＭＡ３Ａ細胞活性の阻害は、（ｉ）ＳＥＭＡ３Ａ核酸またはタンパク質の発現を減少させることによって、（ｉｉ）細胞によるその分泌を阻害することによって、または（ＩＩＩ）細胞表面上においてその受容体への結合を阻害するために、分泌されたＳＥＭＡ３Ａを隔離することによって、直接行われ得、これによって、細胞内シグナル伝達、ＩＲＥ１αの活性化、ならびに細胞老化の開始および／もしくは伝播を妨げる。ＳＥＭＡ３Ａの活性を阻害するための剤およびアプローチの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）ＳＥＭＡ３Ａに対する抗体、（ｉｉ）その受容体の１つに対する（すなわち、その受容体に結合するＳＥＭＡ３Ａと競合するもの）抗体、（ｉｉｉ）ＳＥＭＡ３Ａの発現を減少させるためのアンチセンスおよびＲＮＡｉ法、ならびに／または（ｉｖ）機能的ＳＥＭＡ３Ａトラップとして作用する可溶性受容体もしくはその断片の使用。
【０１２９】
したがって、本発明は、ＳＥＭＡ３Ａのレベルまたは活性を低下させることを含む、細胞の細胞老化または細胞内の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の誘導を阻害または予防する方法を提供する。
【０１３０】
本発明はまた、細胞をＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストと接触させることを含む、細胞の細胞老化または細胞内の老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の誘導を阻害または予防する方法に関する。
【０１３１】
対象に有効量のＳＥＭＡ３Ａアンタゴニストを投与することを含む、細胞老化または対象の細胞における老化関連分泌表現型の誘導を阻害または予防する方法も提供される。
【０１３２】
本明細書で使用される用語「ＳＥＭＡ３Ａ阻害剤」または「ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニスト」は、ＳＡＳＰのＳＥＭＡ３Ａ誘導およびＳＥＭＡ３Ａ誘導細胞老化に関連するＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞シグナル伝達を低減または遮断することができる剤を指す。本発明の「ＳＥＭＡ３Ａ阻害剤」または「ＳＥＭＡ３Ａアンタゴニスト」は、ＳＥＭＡ３Ａポリペプチドの発現またはその同族の受容体との相互作用を低減し、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞シグナル伝達が減少するか無効になるようにするために、ＳＥＭＡ３ＡポリペプチドまたはＳＥＭＡ３Ａ核酸（ＳＥＭＡ３Ａ遺伝子またはｍＲＮＡ）に結合するか、または相互作用する。非限定的な例としては、ＳＥＭＡ３Ａの発現（転写または翻訳）を低減または遮断する剤、ＳＥＭＡ３Ａ分泌を低減もしくは遮断することができる剤、またはその受容体ＮＲＰ１へのＳＥＭＡ３Ａの結合を低減もしくは遮断することができる剤が挙げられる。そのように限定されるものではないが、剤は天然または合成であってもよく、これに限定するものではないが、ＳＥＭＡ３ＡまたはＮＲＰ１受容体に特異的に結合する抗体などのタンパク質／ポリペプチド、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片（例えばＳＥＭＡ３Ａに結合するＮＲＰ１トラップ）、ペプチド、小分子、限定するものではないが、ＳＥＭＡ３Ａタンパク質をコードするＳＥＭＡ３Ａ核酸配列に特異的なアンチセンスまたはｓｈＲＮＡなどのポリヌクレオチド、またはその機能的多様体もしくは断片であってもよい。
【０１３３】
上記の方法は、細胞老化が有害である疾患または状態、例えば種々の加齢状態（例えば、サルコペニア、神経変性、表皮の薄化、皮膚の皺、抜け毛および白髪、白内障、ならびに他の老年期疾患など）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、骨粗鬆症およびパーキンソン病、緑内障、腸管疾患、椎間板変性、脳動脈瘤、大動脈瘤、膵臓線維症、嚢胞性繊維症の治療または予防に有用であり得る。細胞老化の阻害または予防はまた、例えば代謝機能不全、加齢の加速、後年の癌の危険性の増加など、化学療法／放射線療法の副作用を軽減するために、癌治療中および／または癌治療後に有用であり得る。実施形態では、本発明に包含される老化関連疾患または状態には、眼疾患（例えば、網膜血管疾患（虚血性網膜症、黄斑浮腫））、炎症、脳虚血、卒中または癌を含まない。
【０１３４】
ａ．抗体
本発明の特定の態様において、ＳＥＭＡ３Ａ活性（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ誘導性ＩＲＥ１αの活性化）は、ＳＥＭＡ３Ａ抗体を用いることによって阻害され得る。これらの抗体は、それがその同族の受容体であるＮＲＰ１へのその結合を阻害する方法でＳＥＭＡ３Ａに結合し、これによってＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞シグナル伝達を防止する（７９、８０）。
【０１３５】
あるいは、ＮＲＰ１へのＳＥＭＡ３Ａの結合を遮断する、ＮＲＰ１受容体を直接標的とする抗体が使用されてもよい。本発明の特定の態様では、ＮＲＰ１を標的とする抗体は、その受容体へのＳＥＭＡ３Ａの結合を遮断するが、ＮＲＰ１へのＶＥＧＦの結合を実質的に干渉するものではない。一実施形態では、ＮＲＰ１抗体は、ＮＲＰ１ポリペプチドのａ１ａ２（Ａ）ドメインに結合する。
【０１３６】
本明細書で使用される用語「ＳＥＭＡ３Ａ抗体」は、ＳＥＭＡ３Ａタンパク質に特異的に結合（相互作用）し、かつＳＥＭＡ３Ａタンパク質と同じ抗原決定基を共有するもの以外の他の天然タンパク質に対して、実質的な結合を示さない抗体を指す。同様に、用語「ＮＲＰ１抗体」は、ＮＲＰ１タンパク質に特異的に結合（相互作用）し、かつＮＲＰ１タンパク質と同じ抗原決定基を共有するもの以外の他の天然タンパク質に対して、実質的な結合を示さない抗体を指す。ＳＥＭＡ３Ａ／ＮＲＰ１抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ならびにキメラ抗体が挙げられる。抗体または免疫グロブリンという用語は最も広い意味で使用され、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、および抗体断片を網羅する。抗体断片は、全長抗体の一部分、一般にその抗原結合領域またはその可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物由来）、サメＮＡＲ単一ドメイン抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片はまた、これに限定するものではないが、ＶＨ領域（ＶＨ、ＶＨ−ＶＨ）、アンチカリン、ＰｅｐＢｏｄｙ（商標）、抗体−Ｔ細胞エピトープ融合（Ｔｒｏｙｂｏｄｙ）、またはＰｅｐｔｉｂｏｄｙなど、ＣＤＲまたは抗原結合ドメインを含む結合部分を指すことができる。
【０１３７】
抗ヒトＳＥＭＡ３Ａ／ＮＲＰ１抗体は、これまでにも調製されおり（８０）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚなど、様々な供給元からも市販されている。一般に、抗体（モノクローナル抗体およびハイブリドーマなど）を調製するための技術および抗体を用いて抗原を検出するための技術は、当該分野において周知であり、種々のプロトコールが周知であり、かつ容易に利用可能である。
【０１３８】
ｂ．可溶性受容体またはその断片
Ｓｅｍａ３媒介細胞老化の調節は、天然に存在する可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたは合成ＮＲＰ１ポリペプチド（例えば、インビトロで細胞株中で（組換えにより）産生されるかまたは化学合成される）を使用することによって達成され得る。本明細書で使用される用語「ＮＲＰ１トラップ」または「ＮＲＰ１ポリペプチドトラップ」は、天然に存在する可溶性ＮＲＰ１ポリペプチド（例えば、図１７、１９、表２、および配列番号４４〜４７、９５および９６に示されるＮＲＰ１分泌アイソフォームなど）、ＳＥＭＡ３Ａリガンド結合に関して内因性（細胞性、膜結合性）ＮＲＰ１と競合するＮＲＰ１の任意の機能的可溶性断片またはＮＲＰ１の任意の機能的多様体など、天然に存在しない可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドおよび合成可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドを包含する。一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは天然には存在しない（すなわち、天然発生ではない）が、天然に存在するＮＲＰ１ポリペプチドに「由来する」ものである（すなわちそれらは合成である。例えばＮＲＰ１アイソフォーム１の細胞外ドメインを含むＮＲＰ１トラップ（例えば、膜貫通（細胞）ＮＲＰ１のアミノ酸１〜８５７）またはその断片もしくは多様体）。一般に、本発明のＮＲＰ１トラップは、最初にそれらのＮ末端にシグナルペプチドを含み（例えば、図１７に示されるＮＲＰ１アミノ酸配列のアミノ酸約１〜２１）、これは細胞による成熟および分泌の際に切断される。したがって、本発明のＮＲＰ１ポリペプチドトラップは、精製ポリペプチドとして投与した場合、または精製されたか、もしくは実質的に純粋である形態を含む医薬組成物として調製した場合、アミノ酸１〜２１を欠いている。同様に、本発明のＮＲＰ１トラップをコードする核酸は、ＮＲＰ１トラップを合成し、細胞により分泌されるようにするシグナルペプチド（例えば、Ｎ末端において最初の２１アミノ酸をコードする最初の６３のヌクレオチド）をコードする５’内のポリヌクレオチド配列を含む。条件および細胞型に応じて、分泌のために除去されるシグナルペプチドの長さは異なり得る。アミノ酸１〜２０、１〜２１および１〜２７の除去（図１７〜１８を参照されたい、例えば配列番号４７、９５および９６）が記載されている。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、図１７、または配列番号４７、９５または９６に記載のＮＲＰ１ポリペプチドの最初の２１アミノ酸に対応する。
【表１】
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【０１３９】
本発明に従って使用され得るＮＲＰ１トラップの非限定的な例としては、配列番号４４〜４７、９５および９６に示される天然の可溶性ＮＲＰ１、下記の表２、図１８および国際公開第２０１６／０３６９９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＮＲＰ１トラップが挙げられる。当然のことながら、対象に投与されるかまたは細胞と接触する成熟した活性型の可溶性ＮＲＰ１トラップは、シグナルペプチドならびに細胞膜膜結合ＮＲＰ１内に通常存在する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列の部分を欠いている。
【表２】
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【０１４０】
一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、以下を含む：（ｉ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜８５６（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸８５６）、（ｉｉ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜５８３（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸５８３）、（ｉｉｉ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４２４（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸４２４）、（ｉｖ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２６５（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸２６５）、（ｖ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４３０および５８４〜８５６（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸４３０、およびアミノ酸５８４〜アミノ酸８５６）、（ｖｉ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２７４および５８４〜８５６（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸２７４、およびアミノ酸５８４〜アミノ酸８５６）、（ｖｉｉ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのアミノ酸１〜４３０および５８４〜８５６（好ましくはその成熟形態、シグナルペプチドに続くアミノ酸（例えば、アミノ酸２１、２２または２８）〜アミノ酸４３０、およびアミノ酸５８４〜アミノ酸８５６）。実施形態では、ＮＲＰ１ポリペプチドは、図１７、配列番号４４、４５、４６、４７、９５、もしくは９６に記載のアミノ酸配列、またはその対立遺伝子多様体もしくは機能的多様体を含むかまたはそれらからなる。
【０１４１】
ＮＲＰ１がシグナル伝達および細胞応答に及ぼすそのリガンドの効果を明確に調節していることを考えると、他のものではなくＳＥＭＡ３Ａの活性を特異的に阻害することが有利であり得る。特定の実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＮＲＰ１が、例えばＶＥＧＦに結合する能力を低下させる１つ以上の突然変異を含み得る。そのような突然変異は、他のリガンドと関連する内因性ＮＲＰ１活性への影響をより少なくしながら、ＳＥＭＡ３Ａの結合と関連するＮＲＰ１の活性をより特異的に調節するために使用され得る。
【０１４２】
したがって、一実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップはＳＥＭＡ３Ａに結合するが、ＶＥＧＦには結合しないポリペプチドである。例えば、ＮＲＰ１トラップは、ＳＥＭＡ３Ａに結合するが、ＶＥＧＦ結合に必要なｂ１および／またはｂ２サブドメイン（複数可）には結合しないａ１および／またはａ２サブドメイン（複数可）（例えば、１．１、トラップＭ、トラップＮ、トラップＹ−表２を参照されたい）を含んでもよい。一実施形態では、ＮＲＰ１由来トラップは、図１７に記載のヒトＮＲＰ１アミノ酸配列のアミノ酸２２〜２７５に対応するドメインａ１およびａ２を含む。ＮＲＰ１トラップはまた、ＮＲＰ１に対するＶＥＧＦの結合を無効にするかまたは有意に減少させるが、ＮＲＰ１に対するＳＥＭＡ３Ａの結合についてはそれらを行わない突然変異（例えば、欠失または置換）を含み得るか、またはＶＥＧＦ（例えば、トラップＺ、表２および６も参照されたい）と比較して、ＳＥＭＡ３Ａに優先的に結合し得る。そのような突然変異の非限定的な例としては、ＮＲＰ１の３１９位でのグルタミン酸および３２０位でのアスパラギン酸での置換が挙げられる（例えば、トラップＡＣおよびＺにおけるようにＥ３１９ＫおよびＤ３２０Ｋ）。
【０１４３】
一実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片（すなわち、ＮＲＰ１トラップ）は、図１７、図１８、配列番号４４、４５、もしくは４６、または表２に記載のトラップ、またはＳＥＭＡ３Ａに結合するその任意の機能的多様体を含むか、またはそれらからなる。実施形態では、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドトラップは、配列番号４７、９５または９６に記載のポリペプチドの細胞外ドメインを含むかまたはそれらからなる。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも３倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも４倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも５倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも１０倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも１５倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも１８倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも１０倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する。実施形態では、本発明に従って使用されるＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性の少なくとも２０倍であるＳＥＭＡ３Ａに対する結合親和性を有する（例えば、表６を参照されたい）。
【０１４４】
本発明のＮＲＰ１トラップは分泌されるので、一般に、例えば、ヒトＮＲＰ１アイソフォーム１（配列番号９５、９６、および図１７）に見いだされる、膜貫通ドメイン（例えば、図１７に示すＮＲＰ１ポリペプチド配列のアミノ酸残基８６０〜８８３に対応する）および細胞質ドメイン（例えば、図１７に示すＮＲＰ１ポリペプチドアイソフォーム１配列のアミノ酸残基８８４〜９２３に対応する）を欠いている。実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＮＲＰ１のドメインｃを完全にまたは部分的に欠いている。ＮＲＰ１アイソフォーム１は、より大きなｃドメインを含み（図１７を参照されたい）、一方、アイソフォームｂおよびｃのドメインの方がより短い。
【０１４５】
上記のように、本発明はまた、本明細書に記載の方法における本明細書に記載のＮＲＰ１ポリペプチドトラップの機能的多様体および機能的断片の使用を包含する。機能的多様体は、「野生型」（天然）ヒトＮＲＰ１ポリペプチド配列（集団中に天然に見出される任意の対立遺伝子多様、すなわち対立遺伝子多様体を含む）に由来する。したがって、本明細書で使用される場合、「機能的多様体」または「機能的断片」は、細胞老化に関して本発明のＮＲＰ１トラップと実質的に同じ生物学的活性を有する（すなわち、ＳＡＳＰの誘導および細胞老化を減少または予防することができる）あらゆるＮＲＰ１誘導体を指す。したがって、機能的誘導体としては、これに限定するものではないが、本明細書に開示のＮＲＰ１ポリペプチドトラップと、任意の修飾、および／またはアミノ酸置換、欠失、付加（例えば、配列内挿入）、またはカルボキシル末端融合が異なるタンパク質が挙げられる。これらは、本発明のＮＲＰ１トラップの企図された生物学的効果（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞老化の阻害もしくは予防、またはＳＡＳＰによる細胞老化のＳＥＭＡ３Ａ依存性伝播の阻害もしくは予防、および最終的にはＩＲＥ１α活性化およびＲＮＡｓｅ活性などの阻害）を有意に低下させることはない。修飾は、本発明のＮＲＰ１トラップの企図された機能に実質的に悪影響を及ぼすことがない限り、ポリペプチド骨格（すなわち、アミノ酸配列）、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシ末端など、どこにおいても起こり得る（すなわち、多様体は、ＳＥＭＡ３Ａポリペプチドを結合および隔離することができる機能的多様体である（例えば、天然のヒト可溶性ＮＲＰ１アイソフォームまたは表２および図１８に例示したものなど、「野生型」ヒトＮＲＰ１の細胞外ドメインのポリペプチド断片に対応するＮＲＰ１トラップ）。
【０１４６】
表３は、本発明のＮＲＰ１トラップにおいて修飾（変化または改変）され得るアミノ酸の例を提供する。好ましくは、機能的多様体における修飾（複数可）は、（ｉ）以下の表３に従ってなされた保存的置換である、（ｉｉ）集団において見出される機能的対立遺伝子もしくは多型多様に対応している、または（ｉｉｉ）ヒトＮＲＰ１ポリペプチドのオルソログに見られるアミノ酸多様に対応している。ＮＲＰ１タンパク質のいくつかのオルソログが、当該分野において公知である。例えば、ヒトＮＲＰ１ポリペプチド配列を他の既知のオルソログ（例えば、マウスおよびラット−図１７を参照されたい）のＮＲＰ１ポリペプチド配列と比較することによって、当業者は保存された残基および種間で異なる残基を容易に同定することができる。したがって、所望の生物学的活性（例えば、細胞老化の阻害もしくは予防、またはＳＡＳＰを介する細胞老化の伝播の阻害もしくは予防）に実質的な影響を与えることなく修飾され得るアミノ酸を同定することができる。このようなアミノ酸の非限定的な例は表４に提供されている。
【表３】
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【表４】
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【０１４７】
本発明のＮＲＰ１トラップの他の機能的多様体は、集団において検出された天然の（対立遺伝子）多様体に対応する１つ以上の突然変異を導入することによって作製され得る。これらの天然の多様体は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎｅＣａｒｄ、ＨＯＭＩＭおよびＥｎｓｅｍｂｌのＷｅｂサイトなど周知の公的に利用可能なデータベースを用いて、容易に同定できる。
【０１４８】
実施形態では、本発明のＮＲＰ１トラップの機能的多様体は、配列番号４７のアミノ酸１〜８５７またはその機能的断片を含むかまたはそれからなる。実施形態では、機能的多様体は、表４に記載の１つ以上のアミノ酸位置に配置された１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。実施形態では、アミノ酸置換は表４に記載のとおりである。実施形態において、本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドトラップまたはその機能的断片もしくは多様体（対立遺伝子多様体）は、合成、精製、安定性および／または生物学的利用能を増大させるための１つ以上の追加のポリペプチドドメイン（複数可）を含んでもよい。例えば、本発明のＮＲＰ１トラップは、ＦＣドメイン（またはヒトＦＣドメインなどのその一部）または精製タグ（例えば、６ｘ−ヒスチジンタグ）を含んでもよい。そのような追加のポリペプチドドメイン（複数可）は、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは多様体に直接的または間接的に（リンカーを介して）連結され得る。一実施形態では、１つ以上の追加のドメインは、ＮＲＰ１ポリペプチドトラップのＣ末端にある。一実施形態では、１つ以上の追加のドメインは、ＮＲＰ１ポリペプチドトラップのＮ末端にある。
【０１４９】
本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片は、１つ以上のポリペプチドリンカーを任意により含んでもよい。このようなリンカーは、１つ以上の追加のポリペプチドドメイン（複数可）を本発明の可溶性ポリペプチド（例えば、インビボでポリペプチドの安定性を増大させるポリペプチドドメイン、および／またはポリペプチドの精製を促進するドメイン）に連結するために使用されてもよい。リンカー配列は、１つ以上のポリペプチド断片またはドメインを除去する（例えば、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片のインビボ投与前の精製タグを除去する）ために使用され得るペプチダーゼまたはプロテアーゼ切断部位を任意により含んでもよい。ポリペプチドの切断および例えばポリペプチドドメイン（複数可）（例えば、６ｘＨｉｓタグ精製ドメイン）の除去を可能にするリンカーまたはドメインの１つの非限定的な例としては、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド（例えば、ＥＸＸＹＸＱ\ＧまたはＳ（式中、\は切断部位を表す、配列番号９７および９８）が挙げられる。他の多くのＴＥＶ切断部位が知られており、また他の多くのプロテアーゼ／ペプチダーゼ切断部位が当業者に知られており、本発明のポリペプチドに導入して、１つ以上のポリペプチドドメインまたは断片を任意により除去し得る。
【０１５０】
ポリペプチドリンカーはまた、野生型ＮＲＰ１ポリペプチドに通常見られるが、本発明の可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片には存在しないドメインを全体的にまたは部分的に置換するために使用されてもよい。例えば、本発明のＮＲＰ１トラップにおいて、合成リンカーは、完全にまたは部分的にサブドメインａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２およびｃを置換し得る。リンカーの長さは、除去されたドメインの全長またはその一部分に対応し得る。こうしたリンカーは、タンパク質の折畳み、安定性、またはＮＲＰ１リガンドへの結合を増加させ得る。リンカーを含むＮＲＰ１トラップの非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０３３６９９号に記載されている。有用なポリペプチドリンカーの１つの非限定的な例は、ポリアルギニンポリペプチドである。他のリンカーは当該分野において公知であり、本発明に従って使用され得る。
【０１５１】
したがって、本発明は、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその機能的多様体もしくは断片、可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたは機能的多様体もしくは断片をコードする核酸、その核酸を含むベクター、およびその核酸またはベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【０１５２】
ｃ．ＳＥＭＡ３Ａ発現の阻害
ＳＥＭＡ３Ａの発現、したがってＳＥＭＡ３Ａ媒介細胞老化を減少させるために様々なアプローチが利用可能である。非限定的な例としては、小型ヘアピンｓｈＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、リボザイム、ＳＥＭＡ３Ａプロモーター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系などを標的とするＴＡＬエフェクターなどの使用が挙げられる。
【０１５３】
細胞におけるｓｈＲＮＡまたは類似の阻害性ＲＮＡの発現は、プラスミドの送達、またはウイルス（例えば、レンチウイルスベクター）もしくは細菌ベクターを介した送達によって得ることができる。ＳＥＭＡ３Ａの発現を阻害するために使用され得るｓｈＲＮＡの非限定的な例を表９に提供する（実施例１１を参照されたい）。
【０１５４】
したがって、代替的実施形態において、本発明は、目的のｍＲＮＡの分解および／または翻訳の阻害をもたらすための外因性投与のためのアンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子（ｉＲＮＡ）およびリボザイムを提供する。好ましくは、アンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子、およびリボザイムは、哺乳動物（好ましくはヒト）のＳＥＭＡ３Ａを標的とする。本発明のＳＥＭＡ３Ａ阻害剤として、こうした分子を提供するために使用され得るアンチセンスおよびリボザイム核酸の例示的スクリーニング方法が、米国特許第５，９３２，４３５号に開示されている。
【０１５５】
さらなる実施形態では、目的のポリペプチドをコードする核酸（ＳＥＭＡ３ＡもしくはＮＲＰ１）、またはその断片の発現は、一種の転写後遺伝子サイレンシングであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を使用して阻害または予防され得る。治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド適用の例、ならびにアンチセンス分子、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉ技術に関する追加の情報は、ＩＲＥ１αの阻害に関して上記に提供されており、またＳＥＭＡ３Ａの発現の阻害にも同じ程度に適用される。
【０１５６】
したがって、一実施形態では、目的のポリペプチド（ＳＥＭＡ３ＡもしくはＮＲＰ１）をコードする核酸、またはその断片の発現は、目的のポリペプチド（例えば、ＳＥＭＡ３Ａ）をコードする核酸またはその断片、あるいはそれらと相同な核酸に対応するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子を細胞内に導入するか、または細胞内で生成することによって阻害され得る。
【０１５７】
（ｉｉ）ＳＥＭＡ３Ａ活性の増大による細胞老化の促進方法
オートクリンおよびパラクリン老化などの細胞老化は、ＳＥＭＡ３Ａ活性（すなわち、ＳＥＭＡ３Ａ細胞シグナル伝達）を刺激または増大させることによって促進または誘導することができる。ＳＥＭＡ３Ａ活性は、細胞内のＳＥＭＡ３Ａの発現を増大させることによるか、または細胞をＳＥＭＡ３Ａポリペプチドまたはその機能的断片もしくは多様体と接触させることによることなど、いくつかのアプローチによって、増大させることができる。
【０１５８】
細胞老化を促進する方法は、老化が組織修復、癌、腎線維症、創傷治癒、肝線維症、心筋梗塞、心臓線維化、アテローム性動脈硬化症および肺高血圧症などの有益な効果を有する疾患および状態において有用であり得る。
【０１５９】
６．脂質パラメータの調節
本出願人は、ＮＲＰ１遺伝子が脂質代謝（脂肪摂取／貯蔵／蓄積）の制御に関与していること、および可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたはその断片（例えば、ＮＲＰ１トラップ）を投与することが、食事誘発性体重増加を有意に減少させ、かつ脂質パラメータを改善し、血糖値およびインシュリン感受性に対する利点を伴う（または同時に好結果を伴う）ことを見出した。
【０１６０】
したがって、さらなる態様において、本発明は、ＮＲＰ１遺伝子および／またはその関連ＮＲＰ１タンパク質（例えば、膜貫通アイソフォーム１）の発現および／または活性を調節することを含む、対象における脂質パラメータを変更する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、ＮＲＰ１タンパク質の発現および／または活性を低減または阻害する化合物または組成物を対象に投与することを含む。実施形態では、この方法は、対象に（ａ）可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドもしくはその断片（例えば、ＮＲＰ１トラップ）、（ｂ）ＮＲＰ１抗体、または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）を薬学的に許容される担体と共に含む組成物を投与することを含む。
【０１６１】
本明細書で使用されるとき、表現「脂肪蓄積に関連する疾患または状態」は、脂肪蓄積によって引き起こされるかまたは脂肪蓄積との共存症と見なされるあらゆる疾患または状態（例えば、食事誘発性過体重または肥満）を含む。共存症は、元の状態（例えば、脂肪蓄積、過体重または肥満）の存在下で、その有病率が非常に上昇する（すなわち、こうした追加の疾患または状態に罹患する危険性が増加する）医学的状態である。この用語は、元の代謝状態（例えば、脂肪蓄積）と同時に存在する状態、またはそのような共存状態を発症する危険性のいずれかを示し得る。脂肪蓄積に関連する疾患または状態は、対象における脂肪蓄積によって引き起こされるか、そうでなければ脂肪蓄積に関連すると言われている。脂肪の蓄積に関連する疾患や状態は次のとおりである：高ＢＭＩ、肥満、メタボリックシンドローム、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患（ＣＶＤ；心疾患（例えば、鬱血性心不全）、冠状動脈疾患（高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症）、肺塞栓症、脂質異常症および脳卒中）、高血圧、ならびにＩＩ型糖尿病（ＴＩＩＤＭ）。実施形態では、脂肪蓄積は、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩに相当する。別の実施形態では、脂肪蓄積は、３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩに相当する。
【０１６２】
脂肪蓄積に関連する体組成パラメータは、当技術分野において周知である。こうした体組成パラメータとして、内臓脂肪面積（ＶＦＡ）、体格指数（ＢＭＩ）、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）、ウエストと身長の比率、胴囲（ＷＣ）、上腕囲（ＡＣ）、円錐度指数、体脂肪率（ＰＢＦ）、上腕三頭筋皮下脂肪、肩甲骨下皮膚襞、白色脂肪組織（ＷＡＴ）レベル、または褐色脂肪性（ＢＡＴ）組織レベルが挙げられる。
【０１６３】
ＮＲＰ１媒介脂質代謝の調節は、天然に存在する可溶性ＮＲＰ１ポリペプチドまたは本明細書に記載の合成（例えば、組換えにより産生されたもしくは化学合成された）ＮＲＰ１ポリペプチドを使用して達成され得る。
【０１６４】
７．組成物／製剤
活性成分（複数可）（例えば、１つ以上のＩＲＥ１α阻害剤など１つ以上のＳＡＳＰ阻害剤、ＳＥＭＡ３Ａの阻害剤（例えば、ＮＲＰ１トラップ）など）は、医薬組成物中に提供されてもよい。本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用できる調製物に加工するのを容易にする賦形剤および助剤を含む１種以上の生理学的に許容される担体を用いて、従来の様式で製剤されてもよい。医薬組成物としては、他の医薬品または医薬剤、担体、アジュバント、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤を挙げることができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。注射のために、本発明の剤は、水溶液中、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液中で製剤されてもよい。製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（第２０版）編、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ  Ｒ．，２０００，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓに見出すことができる。
【０１６５】
実施形態では、本発明の組成物は、眼への送達、例えば点眼剤または眼注射剤用に製剤される。眼投与のために、化合物は、当該技術分野で周知のように、活性化合物を眼投与に好適である薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に製剤することができる。実施形態では、担体は、本発明の化合物／剤／阻害剤との混合物中に天然には見られない担体（すなわち、天然に存在しない担体）である。
【０１６６】
例えば、医薬組成物は、局所投与、硝子体内投与、嚢内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与、眼球後投与、後強膜近傍投与、またはそれらの組み合わせのために製剤され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は局所投与用に製剤されている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、硝子体内投与用に製剤されている。
【０１６７】
注射用製剤は、防腐剤を添加した単位剤形、例えばアンプル、または複数回投与用容器で提供することができる。この組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤のような形態を取ってもよく、製剤化剤（懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤など）を含んでもよい。
【０１６８】
あるいは、医薬化合物のための他の送達系を使用してもよい。リポソームおよび乳剤は、周知の送達ビヒクルの例である。眼周囲薬物送達に特に有用な送達系（例えば、予防および／もしくは治療、または網膜疾患などの眼疾患において）としては、後部の内膜において一貫した治療薬剤濃度を達成する最も安全な手段のうちの１つと考えられる経強膜吸収経路が挙げられる。
【０１６９】
効果的な投与量。本発明での使用に好適である医薬組成物は、活性成分（複数可）が企図する目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物を含む。より具体的には、治療有効量は、治療されている対象の現存する症状のうちの少なくとも１つの発症を予防するかまたは軽減するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１７０】
実施形態では、本発明に従って使用される化合物（複数可）の有効量は、本明細書に記載の疾患および状態（例えば、眼血管疾患および本明細書に記載の他の疾患および状態）において、細胞老化に関連する少なくとも１つの症状または生理学的影響を低減または予防するのに十分に細胞老化または細胞老化の（ＳＡＳＰを介した）伝播を阻害する。こうした活性を有する特定の化合物は、ＳＡＳＰおよび／またはＩＲＥ１αの用量依存的阻害を決定するインビトロアッセイによって同定することができる。
【０１７１】
あるいは、他の実施形態では、本発明に従って使用される化合物（複数可）の有効量は、ＳＡＳＰを誘発または増大させ、かつ細胞老化を引き起こすのに十分なものである。
【０１７２】
本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療上有効な用量は細胞アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、細胞アッセイにおいて決定されるＩＣ５０（すなわち、ＳＡＳＰおよび／またはＩＲＥ１αの細胞内シグナル伝達機能の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）（通常、Ｉｌ−１βなどの炎症メディエーターまたは低酸素、虚血、細胞ストレス、ＥＲストレスなどの他の活性化刺激に反応して）を含む循環濃度範囲を達成するために、細胞および動物モデルにおいて製剤され得る。
【０１７３】
治療有効量とは、対象における症状の改善をもたらす化合物の量を指す。同様に、予防上有効な量は、患者の症状（例えば、血管透過性亢進、斑点および／またはかすみ目、周皮細胞喪失（ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ  ｌｏｓｓ）、黄斑浮腫、網膜腫脹、血液網膜関門漏出、病理学的血管新生、血管修復の減少など）を予防するか、または遅延させるのに必要な量を指す。このような化合物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば最大耐量（ＭＴＤ）およびＥＤ（５０％最大応答に対する有効量）を決定することによって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これはＭＴＤとＥＤ５０との比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。正確な製剤化、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。
【０１７４】
投与量および投与間隔は、所望の調節効果または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分なレベルの活性化合物を提供するように個々に調整することができる。ＭＥＣは化合物ごとに異なるが、インビトロデータから推定することができる。例えば、ＳＡＳＰおよび／またはＩＲＥ１αの発現または活性の実質的な阻害を達成するのに必要な濃度（例えば、ＳＡＳＰに関連するサイトカイン、プロテアーゼおよび増殖因子の分泌、リボヌクレアーゼ活性の活性化およびＸＢＰ１のプロセシング）である。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特性および投与経路に依存する。
【０１７５】
定義
本出願における用語の明確であり、かつ一貫した理解を提供するために、以下のさらなる定義が提供される。
【０１７６】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書では、１つまたは１つより多い（すなわち少なくとも１つの）冠詞の文法上の目的語を指すために使用される。
【０１７７】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の任意の形態」）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」など、有している（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の任意の形態）の単語は、包括的またはオープンエンド型であり、記載されていない追加の要素または方法ステップを除外するものではなく、「含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」および「含むがこれらに限定されない（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という句と同義的に使用される。
【０１７８】
本明細書における数値範囲の列挙のために、それらの間にある同じ程度の精度を有するそれぞれの介在する数が明示的に企図される。例えば、１８〜２０の範囲である場合、１８、１９および２０の数が明示的に企図され、また、６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数が明示的に企図される。用語「などの」は、本明細書において、「などであるが、限定されない」という句を意味するために使用され、それと同義的に使用される。
【０１７９】
本明細書において他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法およびその技術は、当技術分野において周知のものであり、かつ一般的に使用されるものである。用語の意味および範囲は明確であるものとするが、何らかの潜在的なあいまいさがある場合には、本明細書で提供される定義は、あらゆる辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【０１８０】
本明細書に開示されている方法の実施、ならびに産物および組成物の調製および使用は、特に明記しない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技術が使用され、当該技術の範囲内である。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１４；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３および定期更新版；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第３０４巻「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ、編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【０１８１】
本明細書で使用される「治療する／治療している／治療」および「予防する／予防している／予防」という用語は、所望の生物学的応答、すなわちそれぞれ治療効果および予防効果を引き出すことを指す。本発明によれば、治療効果は、本発明の医薬組成物または化合物（例えば、ＳＡＳＰ阻害剤）の投与後の症状の改善、および／または疾患もしくは状態（例えば、血管性眼疾患）の重症度の低下を含む。
【０１８２】
本明細書で使用されるように、老化に関連する疾患または状態に関して用語「予防する」または「予防」は、疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状の進行の減少または発症の遅延または細胞老化の１つの特徴を指すことを意味する。
【０１８３】
本明細書に記載されるのは、細胞老化を調節するための方法である。本明細書で使用される場合、「細胞老化」とは、細胞が生存可能であり、かつ代謝的に活性であるが、増殖する能力を失うかまたは組織構造の一部のままであるが組織の残部と適切に機能／伝達できない細胞の状態（すなわち休眠状態になる）を指す。細胞老化は、年齢、または突然変異もしくは染色体損傷などのＤＮＡ損傷を誘発する因子、またはＳＡＳＰに関連する遺伝子などの遺伝子発現の変化をもたらすＤＮＡ損傷応答もしくはクロマチン構造の破壊を誘発する因子への曝露とともに増加する可能性がある。老化は、テロメア短縮、染色体異数性、ＤＮＡ鎖切断、ＤＮＡ化学修飾（例えばアルキル化）、またはＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の誘発など、ＤＮＡまたは染色体傷害の結果であると考えられている。細胞老化は、例えば、虚血、癌遺伝子活性化（ＤＤＲによる）ＤＮＡ損傷化合物、例えば化学療法剤、またはＤＮＡ損傷放射線、例えばイオン化およびＵＶ照射によって引き起こされ得る。老化は、コルチコイド治療、抗レトロウイルス治療、ＰＰＡＲγアゴニストによる治療、キサンチンオキシダーゼ阻害剤による治療、ビスホスホネートによる治療、抗原虫剤による治療、および炎症剤による治療など、他の様々な治療レジメンによって引き起こされ得る。老化はまた、カロリー摂取量の増加、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、高脂肪食、高タンパク質食、ＥＲストレス応答（本明細書において実証されるＵＰＲ応答）、およびこれらの疾患に関連する腸内細菌叢の変化など、代謝の不均衡によっても引き起こされ得る。老化細胞は、メタロプロテアーゼ、成長因子および炎症性サイトカイン、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）と呼ばれるプロセスなど、独特のセクレトームを発達させ（３７）、これにより、細胞自律的および細胞非自律的（パラクリン）な方式において、周囲組織に老化を伝播することができる（３８〜４０）。したがって、パラクリン細胞老化は、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の結果として細胞において誘導され得る。パラクリン老化とは、老化細胞による炎症促進性サイトカイン（ＳＡＳＰ）など、タンパク質の分泌が増大している状態を指す。
【０１８４】
様々な実施形態において、細胞老化は以下によって引き起こされる：（ａ）虚血、（ｂ）細胞の老化、（ｃ）細胞に対するＤＮＡ損傷、（ｄ）化学療法剤との接触、（ｅ）ＤＮＡ損傷放射線による細胞の照射、（ｆ）細胞と抗レトロウイルス剤との接触、（ｇ）細胞と炎症誘発剤との接触、（ｈ）細胞とＤＮＡ損傷剤との接触、（ｉ）クロマチン構造を破壊する剤と細胞との接触、（ｊ）テロメア侵食、（ｋ）低酸素症、（１）癌遺伝子の活性化、（ｍ）テロメア機能不全、および（ｏ）（ａ）〜（ｍ）のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせ。
【０１８５】
細胞老化を受けた細胞は、以下の特徴のうちの１つ以上を呈し得る：成長停止、γ−Ｈ２ＡＸ（ヒストン多様体Ｈ２ＡＸのリン酸化型）核病巣の形成、ｐＩ６ＩＮＫ４Ａのレベルの上昇、ｐ２１の発現レベルの上昇（Ｃｉｐｌ／Ｗａｆ１）、老化関連β−ガラクトシダーゼの活性の増加、老化関連ヘテロクロマチン病巣（ＳＡＨＦ）の生成、増殖の喪失、ヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、小胞体ストレスおよび折畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）の誘導、ｔｐ５３のレベルおよび／または活性化の増加、ＰＭＬ核小体の数およびサイズの増大、ＩＲＥ１αの活性化、グルコース消費量の増加、炎症誘発性サイトカイン、「老化関連分泌表現型」（ＳＡＳＰ）のプロテアーゼおよび増殖因子の発現および／または分泌の増加、（これに限定するものではないが、以下を挙げることができる；Ｐａｉ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−ｌβ、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ４、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−３ａ、エオタキシン−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＰＩＧＨ、ＮＧＦ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰ７、フィブロネクチン、カテプシンＢ、ＴＩＭＰ−２）；Ｋｉ６７の発現の欠如、細胞形態の拡大および平坦化、持続的ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）のシグナル伝達、および老化を増強するクロマチン変化を伴うＤＮＡセグメントの形成（ＤＮＡ−ＳＣＡＲＳ）（これは、ホスホＡＴＭおよびＡＴＲ基質などのＤＤＲタンパク質を含み得る核病巣である）。細胞老化を受けた細胞は、典型的には、細胞老化を受けていない細胞におけるＰ１６ＩＮＫ４ａの発現レベルと比較して、ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現レベルの増加を有する。また、細胞老化を受けた細胞は、典型的には細胞老化を受けていない細胞と比較して、増加したレベルのＳＡ−β−Ｇａｌ活性を有する。
【０１８６】
本明細書で使用されるとき、「老化細胞」または「老化表現型を有する細胞」は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する細胞を指す：（ｉ）成長停止、（ｉｉ）細胞形態の拡大および平坦化、（ｉｉｉ）核内のＤＮＡ損傷病巣、（ｉｖ）老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）として定義される成長因子プロテアーゼ、サイトカインおよび他の因子の分泌（例えば、ＰＡＩ１、ＴＮＦＡＡＩＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＶＩＭ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＦＮ１、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＲＡＳ、ＩＲＦ７、ＨＳＰＡ２、ＴＥＳ、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ１、ＥＳＭ１、ＴＨＢＳ１、Ｓ１００Ａ１１、ＲＡＢ３１、ＩＧＦＢＰ５、ＩＬ６、ＩＬ１β、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦＡ、ＴＰ５３）、（ｖ）老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）活性（リソソーム質量の増加を部分的に反映する）、（ｖｉ）腫瘍抑制因子ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現（ｐＲＢを活性化し、かつ老化関連ヘテロクロマチン病巣（ＳＡＨＦ）の形成を引き起こし得る）、（ｖｉｉ）ＳＥＭＡ３Ａの発現、（ｖｉｉｉ）ＩＲＥ１α活性化（Ｓ７２４リン酸化）、およびＸＢＰ１のスプライシングの増加、および／または（ｉｘ）γＨ２ＡＸの発現の増加、ＰＭＬおよび／またはｐ５３の活性化。実施形態では、「老化細胞」は、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｉｘ）の特徴を有する細胞である。実施形態では、老化は、細胞性虚血に続発する。実施形態では、老化は、パラクリン老化である。実施形態では、老化は、分化後の老化である。実施形態では、老化は、早期老化である。実施形態では、早期老化は、ＩＲＥ１αの発現および／またはＲＮＡｓｅ活性の増加を特徴とする。実施形態では、老化は、網膜老化である。実施形態では、老化は、ミクログリア老化である。実施形態では、老化は、（ｉ）Ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｔｐ５３、ＩＲＥ１ａ、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ａの発現および／または活性の増加、ならびに／もしくは老化関連β−ｇａｌ活性の増加、（ｉｉ）γＨ２Ａｘおよび／またはＰＭＬの発現、および／または（ｉｉｉ）老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の発現を特徴とする。実施形態では、ＳＡＳＰは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、Ｐａｉ１、ＴＧＦβ１、ＩＲＥ１αおよび／またはＶＥＧＦ−αの分泌を含む。実施形態では、上述のＳＡＳＰは、細胞性虚血に続発する。
【０１８７】
実施形態では、上記の細胞は、最終分化細胞である。実施形態では、細胞は、ニューロン、ミクログリア細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、内皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、および／または網膜細胞である。実施形態では、細胞は、細胞性虚血を患っている。実施形態では、細胞は、網膜神経節細胞である。実施形態では、細胞は、網膜神経節ニューロンである。実施形態では、細胞は、血管細胞である。実施形態では、細胞は、血管内皮細胞である。実施形態では、細胞は、無血管細胞である（すなわち、無血管領域／区域に位置する）。実施形態では、細胞は、肝星細胞である。実施形態では、細胞は、微小血管内皮細胞である。特定の実施形態では、細胞は、眼細胞ではない。特定の実施形態では、細胞は、網膜細胞ではない。実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
【０１８８】
本明細書で使用される「細胞性虚血」とは、細胞代謝に必要な（組織の生存を維持するため）酸素および／または栄養素（例えば、グルコース）供給が制限されること、ならびに代謝廃棄物が不適切に除去されることを指す。細胞性虚血には、鬱血（血管収縮、血栓症または塞栓症など）から生じることもある、身体のある部分での局所貧血を含む。虚血は、部分的（灌流不足）または全体的であり得る。虚血は一般に、血管の問題（例えば、塞栓症、血栓症（例えば、アテローム性動脈硬化症）、外傷、動脈瘤、心筋症、低血糖、放射線療法、低血圧、貧血など）によって引き起こされ、結果として、組織の損傷または機能不全となる。
【０１８９】
本明細書に記載の化合物（複数可）、生物製剤および医薬組成物に適用される用語「有効量」は、所望の治療結果を得るのに必要な量を意味する。例えば、有効量は、治療用化合物、生物学的製剤または組成物が投与されている障害の症状を治療、治癒、または軽減するのに有効なレベルである。求められる特定の治療目的に有効な量は、治療される障害、およびその重症度および／または発症／進行の段階、生物学的利用能、および使用される特定の化合物、生物学的組成物もしくは医薬組成物の活性、対象の投与経路、もしくは投与方法、および導入場所、特定の化合物のクリアランス速度、もしくは生物学的特性および他の薬物動態学的特性、治療期間、接種レジメン、特定の化合物、生物製剤もしくは組成物と組み合わせて、または同時に使用する薬物、治療される対象の年齢、体重、性別、食事、生理機能および全身健康状態、および関連する科学技術の当業者に周知である同様の因子など、様々な因子に左右される。投与量のいくらかの変動は、治療されている対象の状態に応じて起こり得、医師または他の治療を施す個人は、いずれの事象においても、個々の患者にとって適切な用量を決定する。
【０１９０】
「相同性」および「相同な」とは、２つのペプチドまたは２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、整列した配列中の各位置を比較することによって決定することができる。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列によって共有される位置において、同一のまたは一致するヌクレオチドまたはアミノ酸の数を対応させたものである。この用語が本明細書で使用されるとき、２つの配列が実質的に同一であり、配列の機能的活性が保存されている場合、核酸／ポリヌクレオチド配列は別の配列に対して「相同」である（本明細書で使用する用語「相同」は、進化的関係を推定するものではない）。２つの核酸配列は、（許容されるギャップを有し）最適に整列された場合、それらが少なくとも約５０％の配列類似性もしくは同一性を共有する場合、または配列が規定の機能的モチーフを共有する場合には、実質的に同一とみなされる。代替の実施形態では、最適に整列された実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。本明細書で使用されるとき、配列間の相同性の所与の割合は、最適に整列された配列における配列同一性の程度を表す。「無関係」または「非相同」配列は、本明細書に開示される核酸およびポリペプチドのいずれとも、４０％未満の同一性、好ましくは約２５％未満の同一性を共有する。
【０１９１】
実質的に相補的な核酸は、一方の分子の相補体が他方の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸またはタンパク質配列は、最適に整列されたときにそれらが少なくとも約７０％の配列同一性を共有する場合、実質的に同一であると見なされる。代替の実施形態では、配列同一性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。同一性を比較するための配列の最適なアラインメントは、局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２）、相同性アライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、類似性検索法（ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）、およびこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）など、様々なアルゴリズムを用いて行ってもよい。配列同一性はまた、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（公開されている既定の設定を使用））を用いて決定してもよい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｋから（インターネットｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）入手可能であり得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列したときに、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって高得点配列ペア（ＨＳＰ）を特定する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の近隣ワードヒットは、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。累積的アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットは各配列に沿って両方向に伸長される。以下のパラメータが満たされると、各方向へのワードヒットの伸長は停止する：累積アラインメントスコアは、その最大達成値から数量Ｘ、減少する、１つ以上のネガティブスコアの残基アラインメントの累積により、累積スコアがゼロ以下になる、またはいずれかの配列の終わりに達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）（または１もしくは０．１、もしくは０．０１、もしくは０．００１、もしくは０．０００１）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用してもよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた２つの配列間の統計的類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。本発明の代替の実施形態において、試験配列の比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は実質的に同一であるとみなされる。
【０１９２】
２つの核酸配列が実質的に相補的であることの別の指標は、２つの配列が中程度に厳格であるか、または好ましくは厳格な条件下で互いにハイブリダイズしていることである。中程度に厳格である条件下でのフィルター結合配列のハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡにおいて実施し、４２℃において０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄してよい（Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐ．２．１０．３を参照されたい）。代替的に、厳格な条件下でのフィルター結合配列に対するハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃で０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおいて実施し、６８℃において０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄してよい（Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、１９８９、前出を参照されたい）。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて、既知の方法に従って変更してもよい（Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，第Ｉ部、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。一般に、厳格な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融点よりも約５℃低くなるように選択される。例えば、実施形態では、本発明の化合物は、ＮＲＰ１またはＳＥＭＡ３Ａ核酸配列（好ましくはヒト配列）にハイブリダイズするアンチセンス／ＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡである。
【０１９３】
本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明する。
【０１９４】
実施例１
網膜虚血誘発性細胞老化
虚血性網膜症における血管変性に続いて引き起こされる細胞過程を解明するために、マウス仔にＤＲおよびＲＯＰで観察されるものと同様の無血管性神経帯をもたらす酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）のモデルに供した（２７）。マウス仔は、生後（Ｐ）７日から１２日まで７５％の酸素に曝露して、血管閉塞を誘発し、周囲空気に戻し、Ｐ１７において最大の網膜前血管新生が達成された（２７）（図１Ａ）。次に、（病理学的前網膜血管形成が始まるときに）Ｐ１４  ＯＩＲで網膜のハイスループットＲＮＡシーケンシングによる不偏トランスクリプトーム分析を行い、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を行って、調節された規定の遺伝子発現パターンを同定した。予想通り、本発明者らは、炎症のクラスター（ＮＥＳ（正規化濃縮スコア）＝１．５８；ＦＤＲｑ（偽発見率）＝０．００４）およびアポトーシス（ＮＥＳ＝１．６３；ＦＤＲｑ＝０．００２）において強い正の相関を見出した（図１Ｂ）。神経網膜の非常に有糸分裂後の性質を考えると、本発明者らは、予想外にも、Ｆｒｉｄｍａｎ老化特徴（２８）クラスターにおける有意な濃縮に気付いた（ＮＥＳ＝１．８１；ＦＤＲｑ＝０．０）（図１Ｃ）。
【０１９５】
細胞老化は、細胞が生存可能であり、かつ代謝的に活性なままである、永久的な細胞周期停止の状態である（２９）。網膜などの主に有糸分裂後の組織では、老化は、虚血性網膜において活性化されることが報告されているＤＮＡ損傷応答または腫瘍抑制ネットワークの刺激により引き起こされ得る（３０）。したがって、老化状態は、虚血に関連する低代謝供給から網膜細胞を保護し、低酸素関連細胞死から回避するのを補助し得る。ＯＩＲ中の老化の誘導は、ｐ５３、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐａｉ１、ＰＭＬ、γＨ２ＡＸなどの古典的な老化関連タンパク質の上方制御およびＥＲストレスエフェクターイノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）の活性化によってさらに裏付けられ、これにより、細胞老化を促進することが示唆されており（３１）（図１Ｄ）、ＯＩＲ網膜においてサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫｉ）Ｃｄｋｎ１ａおよびＣｄｋｎ２ａの転写レベルが有意に増加していた（図１Ｅ）。
【０１９６】
ＯＩＲ中に老化プログラムを引き起こした細胞を決定するために、Ｐ１４において網膜フラットマウント上で老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）染色を行った。イソレクチンＢ４（ＩＢ４）で対比染色すると、老化細胞は血管化領域（１８．７９％；Ｐ＜０．０００１）と比較して、主に無血管帯に存在することが明らかになった（細胞のうちの３６．９９％がＳＡ−β−ｇａｌ＋である）。少数のＳＡ−β−ｇａｌ＋細胞もまた、対照酸素正常網膜において見出された（図１Ｆおよび図１Ｇ）。それに一致して、矢状方向の網膜切片の分析により、網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）の無血管化領域（１０．７７％対０．３％；Ｐ＝０．０１６７）において、および内核層において（ＩＮＬ）はより少ない範囲まで（２．６１％対０．４５％；Ｐ＝０．０３４２）（図１Ｈおよび図１Ｉ）、ＳＡ−β−ｇａｌ染色が有意に増加していることが明らかになった。いずれの層も、虚血性網膜症において変性する網膜内血管系と密接に関連している。図１Ｂの虚血性網膜の低酸素性／酸化性および炎症性（３２）、ならびにアポトーシス遺伝子のＧＳＥＡのために、さらに、どの細胞がＯＩＲの間にアポトーシス死を受けていたかを確かめることを目指した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ビオチン化ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）は、ＩＮＬ（図１Ｊ）および末梢（図１０Ａ）の大部分において、アポトーシス細胞が優勢であることを明らかにした。まとめると（図１Ｊ）、これらのデータから、網膜細胞老化およびアポトーシスの相互に排他的なパターン（中央区域に関連するＧＣＬの細胞は主に老化表現型をとり、ＩＮＬの細胞はアポトーシスに対してより感受性が高いこと）が明らかになった。
【０１９７】
実施例２
網膜症が、細胞老化を伝播する老化関連分泌型表現型を引き起こす
ＳＡＳＰは、典型的にはオートクリンおよびパラクリン様式で老化を強化し、炎症を高め、組織微小環境に有害な影響を与える（３４）。本発明者らは、Ｐ１４においてＯＩＲの間にＧＣＬで最初に観察された細胞老化（図１Ｊ）が、網膜の他の細胞集団に伝播するかどうかを調べた。Ｐ１４でのＯＩＲの最初のＳＡ−β−ｇａｌ染色は、無血管領域に集中し（図２Ａおよび図２Ｂの左のパネル）、Ｂｒｎ３ａ＋ＲＧＣと老化マーカー（γＨ２ＡＸ、Ｐａｉ１、およびｐ−ＩＲＥ１αＳ７２４）との共局在化によって実証されるように、網膜神経節ニューロン（ＲＧＣ）を中心とした（図２Ｃ）。この初期の時点では、血管内に老化関連標識は存在しない（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。Ｐ１７では、老化マーカーγＨ２ＡＸまたはＰＭＬをＩＢ４（血管）およびＩＢＡ１（ミクログリア）により同時標識するによって証明されるように（図２Ｄ）、最大の新血管新生の間に、細胞老化は、病理学的血管房（図２Ａおよび図２Ｂの中間のパネル）および網膜ミクログリアに局在する。この血管系は、蛇行状で、かつ漏れやすく（３５）、周皮細胞への到達が少なく安定しない（図１１Ａ、図１１Ｂ）（３６）。ＯＩＲの  Ｐ２１までに、網膜血管系が再生されると、ＳＡ−β−ｇａｌ染色は主に血管細胞に限定される（図２Ａおよび図２Ｂの右のパネル、図１０Ｄ）。この後の時点で、周皮細胞の到達が再度得られる（図１１Ａ、図１１Ｂ）。加えて、本発明者らは、ストレプトゾトシン誘発Ｉ型糖尿病の８週目に、マウスのＧＣＬ中においてＳＡ−β−ｇａｌ染色細胞を観察した（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。ＯＩＲモデルがマウス仔において実施され、血管形成反応が年齢に従って広がることを考えると、ＳＴＺモデルにおける網膜老化の存在は、特に重要である（３７）。これらの所見は、広範囲の眼血管障害における細胞老化の存在を裏付けるものである。ＯＩＲモデルが眼血管病理学においてよく知られ、確立されているモデルであることを考慮して、このモデルにおいてさらなる研究が行われた。それにもかかわらず、網膜症の異なるモデルでは、網膜の異なる細胞内集団において、老化細胞が一時的に蓄積していることを観察した。疾患の進行と対応させて、細胞老化の動的に進化するパターンは、パラクリン老化を裏付けるものである。
【０１９８】
老化細胞は、メタロプロテアーゼ、成長因子および炎症性サイトカイン、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）と呼ばれるプロセスなど、独特のセクレトームを発達させ（３９）、これにより、細胞自律的および細胞非自律的（パラクリン）な方式において、周囲組織に老化を伝播することができる（４０〜４２）。また、ＯＩＲ網膜のヒートマップおよびＧＳＥＡにより、網膜虚血とパラクリン老化関連遺伝子との間の正の相関が同定された（ＮＥＳ＝１．４；ＦＤＲｑ＝０．０４９）（図２Ｅ）。ＯＩＲにおけるＳＡＳＰ関連サイトカインの発現の上昇は、Ｐａｉ１、Ｉｌ６、Ｉｌ１β、Ｔｇｆ−β１、Ｖｅｇｆ−ａ、ならびにＩＲＥ１α、および腫瘍抑制因子Ｔｐ５３については、ＲＴ−ｑＰＣＲによって確認され（図２Ｆ）、病理学的血管形成の中心となるいくつかのサイトカインが、老化網膜細胞に由来し得ることが示唆される。
【０１９９】
実施例３
老化細胞によるＳＥＭＡ３Ａの分泌がパラクリン老化を駆動する
細胞老化の広がりを考えて、本発明者らは、ＯＩＲにおいてこのプロセスを駆動する要因を識別しようとした。細胞周期を乱すことが示唆されている網膜虚血に関連するエフェクター分子（４３）は、古典的なガイダンス分子セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）である。ＳＥＭＡ３Ａは、ＯＩＲの血管閉塞期および血管増殖期全体において誘導され（４４）、かつ低酸素ニューロンによって分泌され、再生中の血管および代謝供給を網膜があまり罹患していない領域に偏らせる（４４、４５）。ＳＥＭＡ３Ａの発現が網膜症の進行中の老化細胞に関連するマーカーと一時的に一致していることを考えると（図３Ａ、図５Ａおよび図５Ｂ）、本発明者らは、ＳＥＭＡ３Ａによるパラクリン老化の伝播への寄与を疑問視した。
【０２００】
第一に、パラクリン老化に対してＳＥＭＡ３Ａが潜在的に寄与しているというエビデンスは、ストレス誘発老化ヒト肝星状細胞（ＨＳＣ）（図３Ｄ）と同様に、ＲａｓＶ１２（図３Ｂ）およびＭＥＫ（図３Ｃ）などの老化誘発癌遺伝子がＳＥＭＡ３Ａの産生を引き起こすという観察から生じたものである。また、Ｐ５仔において、組換え型Ｓｅｍａ３Ａを硝子体内注射することにより、ｐ５３、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、およびＩＲＥ１α（図３Ｅ）の著しい増加を誘導し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色（図３Ｆ）の顕著な増大を伴っていた。
【０２０１】
最終的に、７日間、ＨＲＭＥＣをＳＥＭＡ３Ａへ曝露（ＯＩＲの最初の週を模倣して）することで、電気細胞インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）によって測定されるように、Ｓ期を有意に減少させながらＧ０／Ｇ１における細胞周期停止を増加させ（図３Ｇ）、かつ正常な内皮細胞の成長を妨げた（図３Ｈ）。
【０２０２】
老化の促進におけるＳＥＭＡ３Ａの役割は、組換えＳＥＭＡ３Ａへ細胞を直接曝露することによってさらに実証される。これにより、マクロファージ様Ｊ７７４細胞（Ｐ＜０．０００１）において、網膜ニューロンの細胞系（網膜ニューロンのモデル化に使用される６６１Ｗ光受容体）（４６）（Ｐ＜０．００１）において、およびＨＲＭＥＣにおいて（Ｐ＜０．００１）において、老化が誘導される（図３Ｉおよび図３Ｊ）。さらに、網膜症における酸化環境を模倣するＨ２Ｏ２駆動老化（３）は、マクロファージ様Ｊ７７４細胞（Ｊ７７４）およびニューロン６６１Ｗ細胞など、網膜症において老化に入る集団をモデル化する細胞株において、ＳＥＭＡ３Ａの分泌を引き起こした（図３Ｋ）。
【０２０３】
パラクリン内皮細胞の老化の駆動におけるニューロン由来ＳＥＭＡ３Ａの潜在的な関与を検証するために、本発明者らは、老化した６６１Ｗ細胞由来の馴化培地（ＣＭ）にヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を曝露し（図３Ｌおよび図３Ｍ）、Ｓｅｍａ３ａは、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を担持するレンチウイルス（Ｌｖ）ベクターによってサイレンシングさせた（４４、４７）。このアプローチの有効性が実証された（図５Ｃ〜図５Ｅ）。老化した網膜ニューロン細胞株からのＣＭは、ＨＲＭＥＣの６８％において、ＳＡ−β−ｇａｌ発現の誘導が得られたパラクリン様式で老化を効果的に伝播させた（Ｐ＜０．００５）（図３Ｎ、左のパネル、Ｏ）。老化細胞によって分泌された因子が、隣接細胞において老化を刺激する傾向を有することが強調されている。逆に、Ｓｅｍａ３Ａ欠損老化網膜ニューロンの前駆体細胞由来のＣＭは、ＨＲＭＥＣ細胞において有意に少ないパラクリン老化を引き起こした（Ｐ＜０．００５）（図３Ｎ、右のパネル、Ｏ）。並行して、ＨＲＭＥＣを老化ニューロン前駆体由来の馴化培地（ＣＭ）でインキュベーションすることは、ＳＥＭＡ３Ａ依存の様式ではｐ５３を活性化するのに十分であった（図５Ｆおよび図５Ｇ）。興味深いことに、ＯＩＲのＰ１２においてＬｖ．ｓｈ＿Ｓｅｍａ３ａを硝子体内投与することによってＳＥＭＡ３Ａを下方制御することで、Ｐ１４において老化ＳＡ−β−ｇａｌ陽性網膜細胞の数が７５％有意に減少し、ＯＩＲ中における老化に対するＳＥＭＡ３Ａの重大な寄与が強調された（図３Ｐおよび図３Ｑ）。まとめると、これらのデータは、細胞老化の間のＳＥＭＡ３Ａの産生およびパラクリン老化の伝播におけるその寄与のエビデンスを提供するものである
【０２０４】
。
実施例４
網膜症におけるＥＲストレス転写物の濃縮
ＥＲストレス条件下において引き起こされる折畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）の経路では、虚血など、代謝が不均衡である間に生き残るための適応メカニズムを細胞に提供することができる（４８、４９）。本出願人の所見によって裏付けられるように、ＥＲストレスの活性化は早期老化を駆動するのを助け得る。ＯＩＲの網膜のトランスクリプトーム分析では、ＵＰＲに関連する転写物における有意なＧＳＥＡ濃縮が明らかになった（ＮＥＳ＝１．４１；ＦＤＲｑ＝０．０４７）（図４Ａ）。ＳＥＭＡ３ＡがＵＰＲのＩＲＥ１α分枝を活性化することが示されたことを考慮して（図３Ｅおよび図５Ｈ）、虚血性網膜における早期老化に対するＩＲＥ１αの寄与について調べた。
【０２０５】
虚血性網膜症の間に、ミクログリア、およびミクログリアマーカーを発現する骨髄細胞の浸潤の実質的な関係がある。骨髄性ドライバーＬｙｓＭ−ＣｒｅマウスをＲＯＳＡ２６ＥＹＦＰｆｌ／ｆｌと交配させ、ＥＦＹＰ＋骨髄／ミクログリア細胞に富む無血管帯（図４Ｂ）においてＳＡ−β−ｇａｌ染色を観察した（図４Ｃ）。ＥＦＹＰ＋ミクログリアはまた、老化関連ＤＮＡ損傷マーカーγＨ２ＡＸで染色し、Ｐ１４  ＯＩＲ網膜の血管／無血管境界、およびＰ１７での病理学的血管形成部位（房）に優先的に局在化した（図４Ｃ）。
【０２０６】
実施例５
ＳＥＭＡ３ＡがＩＲＥ１αを活性化し、ＩＲＥ１αのＲＮＡｓｅ活性が老化に寄与する
ＩＲＥ１αは、その細胞質ゾル末端にセリン／トレオニンキナーゼドメインおよび別個のエンドリボヌクレアーゼドメインの両方を有するＩ型膜貫通タンパク質である（５４、５５）。ＩＲＥ１αは、ＩＲＥ１α  依存性崩壊（ＲＩＤＤ）とも呼ばれるそのＲＮａｓｅ活性を介して、ＥＲ−ゴルジ分泌経路を横断するタンパク質をコードするｍＲＮＡを優先的に標的とする（５６）。ＳＥＭＡ３ＡがＩＲＥ１αを介して老化を駆動することを踏まえて（図２、図３）、本発明者らは次に、いずれの触媒アームがこの生理学的応答を説明できるかについて調べた。骨髄性細胞が網膜虚血により老化する確証を得たことを考慮して、Ｊ７７４マクロファージ／単球細胞を使用し、ＳＥＭＡ３Ａへ持続して曝露を行うことでＩＲＥ１αを活性化し（図７Ａ）、老化を誘導し（図６Ｂ）、Ｐａｉ１、Ｉｌ６、Ｉｌ１β、ＴＧＦ−βおよびＴｐ５３などの老化状態を促進および強化するために重要であることが知られている遺伝子の一団の発現をもたらした（図７Ｂ）。また、ＳＥＭＡ３Ａは、細胞老化の特徴であるγＨ２ＡＸ（図７Ｃ）を発現する老化関連ＤＮＡ−損傷病巣を促進した（５７）。同様に、内皮細胞内でのＩＲＥ１αのｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが、ＳＥＭＡ３Ａにより駆動された老化を予防した（図６Ｄおよび図６Ｅ）。
【０２０７】
ＳＥＭＡ３Ａにより駆動された老化が、ＩＲＥ１αのキナーゼ活性またはＲＮＡｓｅ活性を介して起こっているのかを判断するために、ＩＲＥ１αのエンドリボヌクレアーゼ活性の選択的細胞透過性クマリンｏ−ヒドロキシアルデヒド薬理学的阻害剤４μ８ｃを用いた。４μ８ｃに曝露（図７Ｄ）することで、ＳＥＭＡ３Ａの誘導による成長の停止を防ぎ、ＳＥＭＡ３Ａ誘導による老化が無効となった（データは示さず）。裏付けとして、４μ８ｃはまた、ＳＥＭＡ３Ａ媒介によるスプライシングおよびＩＲＥ１αエフェクターＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ１）の活性化を妨げた（図７Ｄおよび図７Ｅ）。最終的に、ＩＲＥ１αのエンドリボヌクレアーゼ活性の薬理学的阻害が、Ｔｎｆ−αまたはＩＲＥ１α自体にはいかなる影響も及ぼさないが、特定の老化関連遺伝子Ｖｅｇｆ−ａ、Ｔｇｆ−β１、Ｉｌ−１β、Ｉｌ−６、Ｐａｉ−１、Ｔｐ５３の産生を阻害した（図７Ｆ）。これらのデータは、老化を引き起こすにあたってＩＲＥ１αのエンドリボヌクレアーゼ活性が重要であることを強調したものである。
【０２０８】
実施例６
メトホルミンがＳＡＳＰおよび病理学的網膜血管形成を無効にする
虚血性網膜症におけるＳＡＳＰおよびパラクリン老化の治療的阻害の臨床的関連性を確立するために、本発明者らは、活発な増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を患っている患者の硝子体における重要なＳＡＳＰタンパク質のレベルを査定した。血管造影法およびスペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ−ＯＣＴ）を実施し、三次元（３Ｄ）網膜マップを作成して、網膜損傷の範囲を評価した（図８Ａ）。非希釈硝子体は、糖尿病に関連しない網膜損傷のみを示した網膜上膜および黄斑円孔などの非血管病理を有するＰＤＲ患者および対照患者から得た。患者の詳細な特徴は、表１に含む。多重磁気ビーズを用いたイムノアッセイによる硝子体ＳＡＳＰタンパク質を評価することにより、ＰＤＲ患者において老化関連因子Ｐａｉ−１（Ｐ＝０．０００４）、ＩＬ−６（Ｐ＝０．００１）、ＩＬ−８（Ｐ＝０．００３７）、およびＶＥＧＦ−Ａ（Ｐ＝０．００８５）の有意な増加が明らかになった（図８Ｂ）。パラクリン老化と網膜症との間の関連性を考えると（図１Ｃおよび図３Ｅ）、本発明者らは、治療上、ＳＡＳＰを調節して、病理学的網膜血管形成についての結果を査定しようとした。この点について、広く使用されているビグアニド系抗糖尿病薬メトホルミンは、成長停止プログラムを妨害することなくＳＡＳＰを減少させることが報告されている（５８）。Ｐ１２においてメトホルミンを単回硝子体内注射することにより、ＯＩＲのマウス網膜においては、ＮＦ−κＢおよびＩＲＥ１α活性化が減衰した（図８Ｃ）。これは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって判定されたときに、ＩＬ６、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ａおよびＳｅｍａ３Ａの大幅な減少につながり（図８Ｄ）、また、Ｐ１４（Ｐ＝０．００８６）（図８Ｅおよび図８Ｇ、ならびに図１２Ａ）、およびＰ１７（Ｐ＝０．００３６）（図８Ｆおよび図８Ｇ、ならびに図１２Ａ）においてＳＡ−β−ｇａｌの有意な減少となった。ＶＥＧＦシグナル伝達経路の成分は、影響を受けなかった（図１３Ａ）。全身投与によりマウスの体重増加を妨げられ、それゆえ交絡因子となり得ることを考えて、メトホルミンの硝子体内注射を行うことを選択した（３２）。
【表５】
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【０２０９】
本発明者は次に、メトホルミンによる処理およびその後のＳＡＳＰの阻害がアポトーシスの増加をもたらすかどうかを判断した。ＴＵＮＥＬ染色では、ＧＣＬの細胞においてアポトーシスを悪化させることなく、ビヒクル処理した網膜と比較した場合、メトホルミンによる処理がＩＮＬ層におけるアポトーシス細胞の数を減少させることが明らかになった（図１２Ｂ）。これらの所見は、網膜のウエスタンブロッティングによって、網膜症の様々な段階での切断カスパーゼ−３を確認した（図１２Ｃ）。最終的に、Ｐ１７において査定したとき、メトホルミンを硝子体内注射することで、血管再生が２倍以上増加し（Ｐ＜０．０００１）（図８Ｈおよび図８Ｊ）、病理学的血管新生を半分に抑制した（Ｐ＜０．０００１）（図８Ｈ、図８Ｋ）。全身経路によりメトホルミンを投与しても、局所硝子体内投与の必要性が強調されている病理学的網膜血管形成については、いかなる利点も示さなかったことに留意することが重要である。まとめると、これらのデータは、病理学的眼球血管形成（病理学的血管新生）の治療において、メトホルミンなどのビグアニドによりＳＡＳＰが治療的に阻害されることを裏付けるものである。
【０２１０】
実施例７
ＶＥＧＦトラップ眼は、病理学的網膜血管形成を無効にするが、血管再生を増加させること、または老化を減少させることはない。
本発明者らは次に、現在使用されているＶＥＧＦトラップ眼（アフリベルセプト）などの抗ＶＥＧＦ治療法（５９、６０）が網膜症の間の網膜老化に影響を与えるかどうかを判断した（６０）。アフリベルセプトは、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインならびにＦｃ部分から構成される組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、少なくともＶＥＧＦ−Ａおよび胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）に結合する（５９）。ＯＩＲのＰ１２において、アフリベルセプトを硝子体内注射しても、Ｐ１４（Ｐ＝０．３０８７）（図９Ａ、図９Ｂ）、またはＰ１７（Ｐ＝０．１５８０）（図９Ｃ、図９Ｄ）において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色に有意な影響を及ぼさなかった（Ｐ＝０．３０８７）。興味深いことに、ＳＡＳＰを減少させ、かつ血管再生を増強するメトホルミンによる治療とは対照的に、アフリベルセプトは、Ｐ１４（Ｐ＝０．４８９７）（図９Ａ、図９Ｃ）またはＰ１７（Ｐ＝０．９５０２）（図８Ｂ、図８Ｄ）において、血管再生速度を調節することはなく、また、老化の駆動因子でもない（図１３Ｂ）。予想通り、アフリベルセプトを硝子体内注射することで、Ｐ１７  ０ＩＲでの新血管新生の顕著な減少をもたらした（Ｐ＝０．０２０７）（図９Ｇ）、（＊Ｐ＜０．００１））。したがって、アフリベルセプトによる治療は、網膜虚血または老化を軽減すること、または網膜血管修復を増強することなく、病理学的血管新生を直接阻止するのみである。まとめると、これらのデータは、細胞老化と虚血により駆動された病理学的血管形成との間の関連性をさらに強めている。
【０２１１】
実施例８
可溶性ＳＥＭＡ３Ａ中和トラップの調製
ＳＥＭＡ３Ａを阻害／中和するための高親和性トラップを生成した。これらのトラップは、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）に由来し、任意により６Ｘ−ＨｉｓタグまたはＦＣタンパク質に結合された（図１８および表２参照）。全ＮＲＰ１細胞外ドメインまたはＳＥＭＡ３Ａ結合を維持することができる機能的多様体のいずれかを含む様々な多様体が生成された。ｂ１ドメイン（ＶＥＧＦに結合する）を含み、中和ＶＥＧＦ１６５突然変異を含むトラップが生成された。トラップは、形質転換ヒト細胞において高度に発現され、分泌されることが示された。構造−活性相関（ＳＡＲ）およびインビボ有効性研究のためのトラップサンプルを産生するための簡単な精製および製剤化プロトコールを開発した。
【０２１２】
方法
細胞培養および材料。ヒトニューロピリン１（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＭ＿００３８７３、配列番号６６）は、Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．から入手した。Ｏｒｉｇｅｎクローンは、ロイシンをイソロイシンに変えるアミノ酸１４０に保存的突然変異を含む。２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ１ベクターは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０２１３】
クローニング。ニューロピリン−１の細胞外ドメイン（残基１〜８５６）、またはその一部分を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＯｒｉｇｅｎｅクローンＲＣ２１７０３５からＰＣＲ増幅し、ヒトＦＣ−１コード配列とインフレームであるｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ１のＥｃｏＲ１−ＢｇｌＩＩにクローニングした。可溶性型のトラップをコードする構築物は、対応するＦＣ構築物のＦＣコード部分の上流に、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする配列、続いて６×Ｈｉｓ残基および終止コドンを挿入することによって生成した。Ｑ５  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用して、さらなる欠失（ｂ１、ｂ１ｂ２）またはＶＥＧＦ１６５結合突然変異（例えば、Ｙ２９７Ａ）を導入した。構築物配列はすべて、サンガーシーケンシング（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃ）により検証した。
【０２１４】
ヒト細胞におけるトラップの発現の評価。マウスおよびヒトのトラップをコードする構築物を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でトランスフェクションの４８時間後に増殖させた。細胞溶解物は、トランスフェクションの４８時間後に２９３Ｔ細胞から調製した。細胞をＰＢＳで広範に洗浄し、標準量のプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ＴＰＣＫ、ＴＬＣＫ、アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、およびＥ６４、Ｓｉｇｍａ）を補充した氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％トリトンＸＨ−１００および１０％グリセロール）中で溶解した。細胞溶解物は、微量遠心分離（１２０００ｇ、２０分）によって清澄化した。溶解物濃度は、標準マイクロＢＣＡ（Ｓｉｇｍａ）によって決定した。等量のタンパク質を５〜２０％ＰＡＧＥ−ＳＤＳ勾配ゲルにロードし、ＰＶＤＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。トランスフェクトされた細胞からの清澄化した馴化培地を、プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＴａｌｏｎレジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のいずれかと共にＦＣまたは６ｘＨｉｓタグのためにインキュベートした。レジンをＰＢＳで洗浄し、ゲル分離および転写の前に２ＸＰＡＧＥ−ＳＤＳサンプル緩衝液中で希釈した。免疫ブロッティングに使用した抗体は、抗ヒトニューロピリン−１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウスモノクローナル抗６Ｘ−ＨＩＳ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびレポーターＨＲＰ結合抗ヒト、マウスおよびウサギＩｇＧ（ＢｉｏＲＡＤ）であった。すべての抗体を１／２０００希釈で使用した。メンブレンをＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートした後、Ｆｕｊｉイメージングシステムを使用して化学発光シグナルを捕捉した。
【０２１５】
トラップの発現および精製。２９３−Ｔ細胞は、ポリエチルアミン（ＰＥＩ）またはリン酸カルシウム沈殿標準トランスフェクション法のいずれかにより、種々のトラップをコードするプラスミドでトランスフェクトした。翌日、細胞を無血清培地で２回洗浄し、無血清完全培地（Ｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ２９３培地、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を供給した。無血清培地中で６０〜７２時間成長させた後、馴化培地を回収し、スウィングバケット遠心分離（２０００ＲＰＭ、２０分間）によって細胞破片から除去した。プロテインＡまたはＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で継代し、続いてＰＢＳで広範に洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出することにより、ＦＣトラップをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の馴化培地から精製した。溶出画分は、１／１０容量の１Ｍトリス（ｐＨ８）および１／１０容量の１０ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加することによって直ちに中和した。可溶性６ＸＨＩＳタグ付きトラップは、Ｔａｌｏｎアガロース（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により継代し、その後ＰＢＳにより広範に洗浄し、段階的イミダゾール溶出（典型的には１０〜１５０μＭの範囲）によって、トランスフェクト２９３Ｔ細胞の馴化培地から精製した。トラップの精製画分のサンプルを５〜１５％または５〜２０％勾配ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル上で分析した。ゲルは、Ｓａｆｅｌｙ  Ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。
【０２１６】
インビボ注射用精製トラップの無菌配合物４０ｍｌの馴化培地からの精製溶出画分をプールし、ＰＢＳ中において総容量１０ｍｌに希釈した。希釈したトラップタンパク質を０．２μＭの低タンパク質結合フィルター（Ｐｒｏｇｅｎｅ）を通して濾過することにより滅菌した。タンパク質溶液を濃縮し、滅菌ＰＥＳ濃縮装置（Ｐｉｅｒｃｅ、公称ＭＷＣＯ  ３０ＫＤ）によりＰＢＳと緩衝液を交換した。無菌濃縮トラップサンプル（約３０〜５０μｌ）を分析し、上記のようにＰＡＧＥ−ＳＤＳで染色した。
【０２１７】
実施例９
ＳＥＭＡ３Ａのトラップの親和性
ＡＰ−ＶＥＧＦ１６５の産生。ヒトＶＥＧＦ１６５多様体１（ＮＭ＿００１０２５３６６）のコード配列を、アルカリホスファターゼドメイン（ＡＰ−ＶＥＧＦ１６５）とインフレームで、ｐＡＰｔａｇ５ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）にサブクローニングした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＡＰ−ＶＥＧＦ１６５構築物をトランスフェクトした。一晩のトランスフェクション工程後、細胞を無血清培地（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でさらに６０時間培養した。細胞培地を回収し、ＰＥＳ装置（Ｐｉｅｒｃｅ）で濃縮した。濃縮したＡＰ−ＶＥＧＦ１６５リガンドをＰＡＧＥ−ＳＤＳで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ｓａｆｅ  ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量化した。
【０２１８】
Ｓｅｍａ３ＡおよびＡＰ−ＶＥＧＦ１６５結合アッセイ。ＳＥＭＡ３ＡまたはＶＥＧＦ１６５への結合のＫＤを決定するための飽和曲線は、以下のようにして得た。高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）のウェルを、ＰＢＳで希釈した精製トラップでコーティングし、その後結合緩衝液（２％カゼインおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳ）でブロックした。ＳＥＭＡ３Ａ−ＦＣ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＡＰ−ＶＥＧＦ１６５リガンドを広範囲の濃度にわたって結合緩衝液中で希釈し、ウェルに添加した。一晩インキュベートした後、ウェルを０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳで洗浄した。結合ＳＥＭＡ３ａ−ＦＣは、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）およびＥＣＬ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出した。あるいは、結合ＡＰ−ＶＥＧＦ１６５は、ＣＰＤスター基質（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。化学発光シグナルは、ＴＥＣＡＮリーダーで取得した。解離定数（ＫＤ）は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形曲線フィッティングによって決定した。
【０２１９】
本発明のトラップのＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦに対する相対的親和性を査定した。トラップは、実施例８に記載したように調製した。試験されたトラップの概略図（ＨＩＳまたはＦＣタグなし）も図１８に示す。
【表６】
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【０２２０】
試験した可溶性ＮＲＰ１トラップは、一般に、ＶＥＧＦよりもＳＥＭＡ３Ａに対してより効率良く結合する。ＳＥＭＡ３ＡおよびＶＥＧＦは通常、ＮＲＰ１に対して同じ一般的親和性を有すると考えられることから、ＳＥＭＡ３Ａに対するこうした優先は、驚くべきことであることがわかった。出願人らはまた、驚くべきことに、ＮＲＰ１の２９７位（Ｙ２９７Ａ）に突然変異を導入すると、ＶＥＧＦへの結合のみでなく、ＮＲＰ１への結合も阻害することを見出した。こうした突然変異は、これまではＳＥＭＡ３Ａに対する親和性の増加と関連していていると考えられていたが、ＶＥＧＦの阻害よりもＳＥＭＡ３Ａ阻害が好ましい条件において有利であり得る。ベバシズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤を用いてＶＥＧＦを阻害することは、インビトロおよびインビボにおける結腸直腸癌細胞において、細胞老化を誘導することが示唆されており（Ｈａｓａｎら、２０１１  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １；１２９（９）：２１１５〜２１２３）、ＶＥＧＦに対して低い親和性を有するＮＲＰ１トラップを使用することは、老化関連疾患および状態の状況において好ましい場合もある。さらに、好ましくはＶＥＧＦよりもＳｅｍａ３ａと相互作用するＮＲＰ１トラップは、ＶＥＧＦ細胞シグナル伝達の阻害に関連する副作用の減少を示すことが予想される。
【０２２１】
実施例１０
ＮＲＰ１トラップによる細胞老化の減衰
ＯＩＲマウスに、Ｐ１２においてＮＲＰ１トラップＧまたはＭまたはビヒクルを硝子体内注射し、細胞老化について網膜を監視した。図２０に示すように、Ｐ１７  ＯＩＲフラットマウント網膜をＳＡ−β−ｇａｌ染色により定量化することにより、マウスがトラップＭまたはトラップＧの単回注射を受けたときに細胞老化の有意な減衰を示し、トラップＭは細胞老化の阻害により効果的であることが判明した。興味深いことに、トラップＭはＳＥＭＡ３Ａに対して、ＶＥＧＦに対する場合より約２０倍大きいｋｄを有するが、トラップＧについては、ＳＥＭＡ３Ａに対する優先度はそれほど重要ではない（表６を参照されたい）。
【０２２２】
実施例１１
実験手順
動物。すべての研究は、眼科および視覚研究における動物の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に関するＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）の声明に従って行われ、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によって制定されたガイドラインに同意してモントリオール大学の動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ）によって承認された。Ｃ５７Ｂｌ／６野生型（ＷＴ）は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＬｙｚＭ−Ｃｒｅ（Ｌｙｚ２ｔｍ１（ｃｒｅ）Ｉｆｌｏ／Ｊ；ｎｏ．００４７８１）は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。（Ｃ５７Ｂｌ／６ＷＴ、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ、およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ＥＹＦＰｆｌ／ｆ、本発明者らは、骨髄系列のＥＹＦＰ発現細胞を有するマウスを作製した（７１）。
【０２２３】
Ｏ２誘発性網膜症。異なる系統（Ｃ５７Ｂｌ／６ＷＴ、ＬｙｚＭ−Ｃｒｅ、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＩＲＥ１ｆｌ／ｆｌ、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＩＲＥ１＋／＋、ＩＲＥ１ｆｌ／ｆｌおよびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ＥＹＦＰｆｌ／ｆｌ）由来のマウス仔およびそれらのマウス育成中の母親（ＣＤ１、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）は、出生後７日目（Ｐ７）から１２日目まで７５％Ｏ２にさらされ、その後、室内の空気に戻された。このモデルは、破壊的な病理学的血管形成の後期を特徴とするＲＯＰおよび糖尿病性網膜症など、ヒトの眼の血管新生疾患の代用として役立つ（７２、７３）。室内空気に戻すと、低酸素により駆動された新血管新生（ＮＶ）が、Ｐ１４以降に発生する（２７）。本発明者らは、異なる時点で眼球を摘出し、ｍＲＮＡ、タンパク質アッセイまたはフラットマウントのために網膜を切開した。
【０２２４】
ＲＮＡ−Ｓｅｑサンプルの調製およびシーケンシング。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて網膜から全ＲＮＡを単離した。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、１μｇの全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。全トランスクリプトームライブラリーは、Ｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ２を用いて調製した。増幅ライブラリーの収量およびサイズ分布は、ＤＮＡ１０００キットを使用してＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーで査定した。シーケンシングは、Ｉｏｎ  Ｃｈｅｆ（商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で実施した。
【０２２５】
ｃＤＮＡライブラリーの構築およびシーケンシング。分析は、Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアｖ４．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および全トランスクリプトーム解析プラグインｖ  ４．２−ｒ７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて行った。全トランスクリプトーム解析プラグインにより、Ｔｏｐｈａｔ２を使用してマウス参照ゲノム（ｍｍ１０）にリードを揃え、次にマッピングされていないリードをＢｏｗｔｉｅ２を使用して整列させ、一緒にマージする。ＦＰＫＭは、Ｃｕｆｆｌｉｎｋを使用して計算される。
【０２２６】
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＭＩＴおよびＨａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって提供されたＧＳＥＡ  ｖ２．２．１ソフトウェアを使用して、遺伝子セット濃縮分析を行った。目的の表現型における分子シグネチャ間の相関を検証するためにＧＳＥＡを使用した。ＴｏＰｈａｔ／Ｃｕｆｆｄｉｆｆコマンドパイプラインによって生成されたｌｏｇ２で正規化されたＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ）データを用いて濃縮分析を実施した。ＦＰＫＭ値は比率として変換された（ＦＰＫＭｘ／［ＦＰＫＭ酸素正常］平均）、次に、ｌｏｇ２を正規化し（ｌｏｇ２［比率］）、中央値を中央に配置する（ｌｏｇ２比率−［ｌｏｇ２比率酸素正常］平均）。
【０２２７】
デフォルトのパラメータは以下のように変更した：目的の遺伝子セットは、分子シグネチャデータベース（ＭＳｉｇＤＢ）からの機能的注釈付き遺伝子セットのカタログにおいて見出した。表現型は１０００回並び替えた。表現型ラベルは、「ＯＩＲ」対「酸素正常状態」とした。１５より小さく５００より大きい遺伝子セットは解析から除外した。ヒットを採点するために使用される統計は、「加重ｐ２」とし、使用されるクラス分離メトリックは「ｔ検定」であった。
【０２２８】
半定量的およびリアルタイムＰＣＲ分析。ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡの増幅を防ぐためにＤＮａｓｅ  Ｉによる消化を行った。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いてＲＮＡを逆転写し、ＡＢＩ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置でＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（商標）を用いて遺伝子発現を解析した。β−アクチンを参照遺伝子として使用した。プライマー配列は、表７に表示する。ＸＢＰ−１半定量ＰＣＲ産物を０．４Ｕ／μＬのＰｓｔＩ酵素と３７℃で５時間インキュベートした後、２．５％アガロースゲルで分離することにより、ＸＢＰ−１のスプライシングを調べた。
【表７】
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【０２２９】
フローサイトメトリー分析。ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）細胞周期分析（ＰＩ  ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を製造業者の説明書に従って、また以前に報告されたように（４３）実施した。簡単に説明すると、ＨＲＭＥＣ（１ｘ１０６）を６ウェルプレートに播種し、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌのＳＥＭＡ３Ａと共に７日間インキュベートした。サンプルを、フローサイトメトリーによって分析した。ＦＡＣＳは、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置で行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン７．６．５）を用いて分析した。
【０２３０】
電気細胞−基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）増殖アッセイ。経内皮電気抵抗のリアルタイム分析は、５０００ＨＲＭＥＣ／ｍｌを８Ｗ１０Ｅ＋標準８ウェルアレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＰｈｙｓｉｃｓ、ＮＹ）に播種することによって行った。細胞は、１０ｎＦ未満の静電容量まで成長させた。細胞を内皮基本培地（ＥＢＭ−２、Ｌｏｎｚａ）で５時間飢餓状態にした後、１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＭＡ３Ａまたはビヒクル（ＥＢＭ−２）で１２０時間処理し、インピーダンスをＥＣＩＳＺθインピーダンス機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＰｈｙｓｉｃｓ、ＮＹ）を用いて測定した。測定は処理後１２０時間行った。
【０２３１】
ヒトのサンプル。Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＨＭＲ）倫理委員会（Ｒｅｆ．ＣＥＲ：１００５９）によるヒト臨床プロトコールおよびインフォームド・コンセントフォームの承認、ならびに増殖性網膜症に罹患した患者からの局所コア硝子体生検サンプリングのための患者の募集を受けた。全手順が、Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの眼科の外来診療所内の小処置室で外来患者用処置として行われた。すべての器具を開梱して、無菌様式で取り扱った。この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に準拠している。
【０２３２】
硝子体切除。以前にＰＤＲと診断された患者は全員追跡され、一名の硝子体網膜外科医（ＦＡＲ）によって手術された。対照患者は、同じ外科医による非血管病理（ＥＲＭまたはＭＨ）のための外科的治療を受けたものとした。手術室の設定では、患者は局所後眼窩／眼窩周囲麻酔下で手術を受けた。５％ポビドンヨード溶液を使用して眼周囲の皮膚を清浄し、眼の中および盲嚢内への局所滴下を５分間そのままにした。３ポート２５ゲージ経毛様体扁平部硝子体切除術は、２５ゲージバルブ付きカニューレ（Ａｌｃｏｎ）によって行った。広角観察システム（Ｒｅｓｉｇｈｔ、Ｚｅｉｓｓ）を使用する顕微鏡による可視化の下で、未希釈硝子体を２５ゲージ硝子体切除装置（ｖｉｔｒｅｃｔｏｒ）で収集した。硝子体生検後、注入ラインを開き、糖尿病性硝子体出血および牽引性網膜剥離を治療するために、硝子体切除術および膜剥離を通常の様式で行った。これに続いて、汎網膜眼内レーザー光凝固術、液体−空気交換、および硝子体内抗ＶＥＧＦ注射を行った。
【０２３３】
マルチプレックスによるサイトカインの定量化。硝子体サンプルをドライアイス上で凍結し、生検直後に−８０℃で保存した。分析前に、硝子体サンプルを４℃で５分間、１５０００ｘｇで遠心分離した。Ｐａｉ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８。マルチプレックスパネル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ  １（Ｂｉｏ−ｒａｄ））は、製造者のプロトコールに従って使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００アレイリーダー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて分析した。それぞれの分析物の定量的測定は、患者サンプルから得られた生データを標準曲線と比較することによって達成された。検出限界のため、合計４つのサイトカイン（Ｃｒｏａ、ＧｒｏｂおよびＩＬ−１β）を除外する必要があった。
【０２３４】
免疫蛍光法（ＩＦ）。タンパク質の発現を局在化するために、マウスから眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中で室温で４時間固定し、３０％スクロース中で一晩インキュベートし、次いでＯＣＴ化合物中で凍結した。その後、目全体を−２０℃の最適な切断温度の化合物に埋め込み、１２μｍの切片を作製した。落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ）または共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ＦＶ１０００）を用いてＩＦ実験および切片の視覚化を行った。
【０２３５】
汎網膜血管系を視覚化するために、切開した網膜をフラットマウントし、網膜血管系用にＰＢＳ中１ｍＭのＣａＣｌ２中のローダミン標識グリフォニア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）シンプリシフォリアレクチンＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に一晩インキュベートした。ＩｍａｇｅＪおよびＳＷＩＦＴ−ＮＶ法を用いたＰ１７での無血管領域または新血管新生領域の範囲（７４）。
【０２３６】
タンパク質の局在化のために、フラットマウント網膜を、指示されたように異なる抗体とインキュベートした。インビトロＩＦのために、培養細胞を０．１％ゼラチンコーティングカバーガラス上にプレーティングし、一晩血清飢餓状態にし、７日間ＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）により刺激した。細胞冷ＰＢＳで簡単に洗浄し、３．５％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で２０分間固定した。細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の０．３％トリトンで５分間透過処理した。固定細胞を１％ＢＳＡでブロックし、次いでＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ中の一次抗体と共に１時間インキュベートした。結合した一次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体を用いて１時間インキュベーションした後に可視化した。カバーガラスをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて取り付け、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ＦＶ１０００）により分析した。サンプルは、ｘ６３／１．４ＮＡ  ｏｉｌまたは３０倍対物レンズで観察した。画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアセンブルした。免疫組織化学に使用したすべての抗体については、表８を参照されたい。
【表８】
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老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）アッセイ。老化関連β−ガラクトシダーゼアッセイは、以前に記載されたように実施した（５７、７５）。
【０２３７】
インビボでのＳＡ−β−ｇａｌの定量化。フラットマウント網膜または目の矢状切片における老化関連β−ガラクトシダーゼ染色は、図１４に記載のＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して解析した。
【０２３８】
レンチウイルスの産生。本発明者らおよび他の発明者らが以前に記載したように（３５、４４、７６）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、Ｃｒｅ、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ、または小型ヘアピンＲＮＡ（Ｓｈ＿ＲＮＡ）を含むベクタープラスミドを、ＳＥＭＡ３Ａ、ＩＲＥ１α、またはＧＦＰに対して（以下の表９を参照されたい）、第３世代のパッケージプラスミドｐＶ−ＳＶＧ、ｐＭＤＬ、およびｐＲＥＶ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともにトランスフェクトすることによって、レンチウイルス（ＨＩＶ−由来）を調製した。ＤＭＥＭ完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で約１０７個の細胞を播種し、上記のプラスミドでトランスフェクトし、３０時間インキュベートした。続いて、上清を新鮮な完全ＤＭＥＭ培地と交換し、さらに３０時間インキュベートした。分泌されたウイルスを回収し、５００００ｇで超遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁し、等分し、−８０℃で保存した。
【０２３９】
硝子体内注射。Ｐ２、Ｐ１０またはＰ１２  Ｃ５７ＢＬ／６の仔を３．０％イソフルランで麻酔し、５０ゲージのガラス製キャピラリーチップを取り付けた１０μＬのハミルトンシリンジを用いて、０．５μＬのレンチウイルス（「レンチウイルスの産生」を参照されたい）、組換えＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／μＬ）、メトホルミン（１０μｇ／μＬ）、またはアフリベルセプト（１０μｇ／μＬ）を硝子体腔内に注射した。約２５４±１１．０ｎｇ／μＬのレンチウイルスＳｈ＿ＧＦＰおよびＳｈ＿Ｓｅｍａ３ａ、Ｌｖ．Ｃｒｅ（１５．０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌｖ．ＧＦＰ（１５．０ｎｇ／ｍＬ）を含む３２３．３±１５．３ｎｇ／μＬを注射した。ウイルス力価は、ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ）を用いて査定した。使用したレンチウイルスの力価は（ｎｇ  ｐ２４において）、ＬＶ．Ｓｈ＿ＲＮＡＩＲＥ１α（８．５２ｎｇ／ｍＬ）、およびＬＶ．Ｓｈ＿ＲＮＡ．ＧＦＰ（８．４７ｎｇ／ｍＬ）であった。
【表９】
2019536813.tif 000014
【０２４０】
馴化培地（ＣＭ）の調製。ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）、網膜ニューロン６６１Ｗ光受容体細胞およびマウスマクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１細胞株）は、トランスフェクションの４８時間後、または各実験に示されているとおりではないが、組換えＳＥＭＡ３Ａ（１００ｎｇ／μＬ）、Ｈ２Ｏ２（１５０μＭ、２時間）と共に７日間インキュベートした。上清を遠心分離し、濾過し、次いで、その後の使用のために凍結した。ウエスタンブロットのために、超遠心式アミコンフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＣＭで濃縮した。
【０２４１】
ウエスタンブロッティング。本発明者らは、様々な時点で眼球を摘出し、網膜タンパク質レベルを査定するために網膜を迅速に切開し、均質化した。網膜ホモジネート、細胞溶解物からのタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ）によって査定し、次いでタンパク質３０μｇは、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による各条件について分析した。ウエスタンブロッティングに使用した抗体は、上記の表８に列挙する。
【０２４２】
統計分析。必要に応じて、スチューデントＴ検定およびＡＮＯＶＡを使用した。それぞれＡＰ＜０．００５およびＰ＜０．０５は、Ｐｒｉｓｍ、バージョン５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、統計的に異なると見なした。
【０２４３】
使用した組換えタンパク質。組換えヒトセマフォリン３Ａ（マウス骨髄腫細胞株、ＮＳ０）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）濃度は、インビトロでは、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌ、ならびにインビボでは１００ｎｇ／ｍｌで使用した。
【０２４４】
材料。メトホルミン、アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液、プロテアーゼ阻害剤カクテル、およびホスファターゼ阻害剤は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（商標）は、Ｂａｙｅｒから購入した。４μ８ｃ阻害剤は、Ｔｏｒｃｉｓ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。
【０２４５】
安定な細胞株およびトランスフェクションのプラスミドおよび生成。製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用して、３７℃で１６時間、６６１Ｗ細胞およびＨＲＭＥＣ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）細胞をそれぞれ５００ｎｇのＳｈ＿ＲＮＡプラスミドターゲティング、Ｓｅｍａ３ａ、ＩＲＥ１αおよび非関連ｓｈ＿ＲＮＡ（ｓｈ＿ＧＦＰ）で安定的にトランスフェクトした。本発明者らは、２週間にわたって２ｍｇのピューロマイシンを用いて選択することによって安定な細胞株を生成した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用する、Ｊ７７４細胞中でのＧＦＰ、ＩＲＥ１αＷＴ、ＩＲＥ１αのドミナントネガティブ変異体、ＲＮａｓｅデッド変異体Ｋ９０７Ａの発現プラスミド。ＩＲＥ１α用のプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した（Ｆｕｍｉｈｉｋｏ  Ｕｒａｎｏ：プラスミド＃２０７４４および＃２０７４５）。
【０２４６】
実施例１２
実施例１３〜１５の実験手順
マウス。すべての研究は、カナダ動物管理協会のガイドラインに従って実施し、モントリオール大学の動物実験委員会によって承認された。Ｃ５７Ｂｌ／６野生型マウス、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅマウス（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｌｙｚ２ｔｍ１（ｃｒｅ）Ｉｆｏ／Ｊ；Ｎｏ．００４７８１）、およびニューロピリン−１フロックスマウス（Ｂ６．１２９（ＳＪＬ）−ＮＲＰ１ｔｍ２Ｄｄｇ／Ｊ；Ｎｏ．００５２４７）は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ハウス内で飼育した。食餌：ＨＦＤ：６０％脂肪カロリー、ＢｉｏＳｅｒｖ  Ｆ３２８２。対照飼料：２０１８  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％タンパク質げっ歯類飼料。
【０２４７】
脂肪組織マクロファージの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）。後腹膜脂肪パッドを回収し、秤量し、ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地中で均質化し、次いで１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で４５分間インキュベートした。次にＥＤＴＡを１０ｍＭの濃度で添加し、混合物をさらに５分間インキュベートした。次に、ホモジネートを７０μｍのセルストレーナーで濾過し、遠心分離した。ペレットを再懸濁し、溶解緩衝液（１０ｍＭＫＣＨＯ３；１５０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ；０．１ｍＭＥＤＴＡ）中において室温で５分間インキュベートし、遠心分離した。ペレットを１ｘＰＢＳに再懸濁し、１００μｍセルストレーナーで濾過した。細胞懸濁液をＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に室温で１５分間インキュベートした。次いで細胞をＬＥＡＦ精製抗マウスＣＤ１６／３２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に室温で１５分間インキュベートして、Ｆｃ受容体を遮断した。次いで、細胞を以下の抗体と共に４℃で２５分間インキュベートした：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ７８５抗マウスＣＤ４５．２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ７１１抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／ＣＹ７抗マウスＬｙ−６Ｇ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｐｅ／Ｃｙ７抗マウスＦ４／８０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ抗マウスＣＤ１１ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ抗マウスＬｙ−６Ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ３０４（ニューロピリン−１）またはＡＰＣラットＩｇＧ２ａ、κ  アイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。ＣＤ２０６発現を分析するために、細胞の透過処理および固定は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、４℃で２０分間行った。次いで、細胞内受容体を遮断するために、細胞をラット血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）と共に４℃で２５分間インキュベートした。細胞を最後にＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１抗マウスＣＤ２０６（ＭＭＲ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で４℃にて２５分間染色した。ＦＡＣＳは、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置で実施し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン７．６．５）を使用して解析した。
【０２４８】
インビボでのＢＯＤＩＰＹの取り込み。インビボでのＢＯＤＩＰＹの取り込みアッセイを、１０週間ＨＦＤを給餌したＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１＋／＋およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌの雄マウスで行った。マウスを４時間飢餓状態にした後、１％ＢＳＡ中の１００μＬの３０μＭ  ＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ１、Ｃ１２の腹腔内注射を行った。ＢＯＤＩＰＹ（商標）注射３時間後に、マウスを安楽死させた。心臓穿刺により血液を採取し、その後血漿を遠心分離により分離した。心臓、肝臓および白色脂肪組織のサンプルを採取し、１ｘＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中で均質化した。ホモジネートおよび血漿のＢＯＤＩＰＹ（商標）蛍光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて、４８８ｎｍの波長発光および５２５ｎｍの励起で読み取り、タンパク質濃度に対して正規化した（ＱｕａｎｔｉＰｒｏ（商標）ＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて定量化した）。
【０２４９】
一次マクロファージ培養。８〜１２週齢のＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１＋／＋およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウスを２Ｌ／分の酸素中２％イソフルランで麻酔し、次いで頸椎脱臼により安楽死させた。その後、マウスの腹部皮膚の小切開を行った。皮膚を各サイズのマウスに合わせて引き出し、腹腔を５ｍｌのＰＢＳ＋３％ＦＢＳで２分間洗浄した。次いで、採取した細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地（ＤＭＥＭ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリン）に再懸濁し、プレーティングした。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１時間培養した後、培地を交換し、ＢＯＤＩＰＹ取り込み、ｐＨｒｏｄｏ食作用アッセイ、またはオイルレッド−Ｏ染色に使用する前に、細胞を同じ条件で次の２４時間培養した。
【０２５０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。トリゾール試薬プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、１００〜５００ｍｇの凍結（−８０℃）ＲＰ−ＷＡＴを用いてＲＮＡ抽出を行った。製造業者の指示に従って、全ＲＮＡ（１μｇ）を逆転写した（ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および一反応物あたり４０ｎｇのｃＤＮＡを用いてｑＰＣＲを行った（７５００リアルタイムＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）。発現レベルは、β−アクチンの発現に対して正規化した。プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）配列は、以下に列挙する：
【表１０】
2019536813.tif 000015
【０２５１】
ＩｍｍＧｅｎ  ｓｋｙｌｉｎｅデータセット。免疫学的ゲノムプロジェクトデータフェーズ１（ＧＥＯ受託コードＧＳＥ１５９０７）およびフェーズ２（ＧＳＥ３７４４８）を抽出し、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）によってＲに正規化し、ａｎｔｉＬｏｇ値をプロットした。
【０２５２】
免疫組織化学（ＩＨＣ）。ＲＰＷＡＴ組織を４％ＰＦＡ中で４８時間固定し、次いで２０％メタノール中で１０分間インキュベートし、ＰＢＳですすいだ。３％ＢＳＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ）＋０．３％トリトン（商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）中で１時間ブロッキング後、ローダミン標識グリフォニア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）シンプリシフォリアレクチンＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、抗ラットＦ４／８０（ロバＩｇＧ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ウサギペリリピン（ロバＩｇＧ；Ａｂｃａｍ）、抗ラットニューロピリン−１抗体（ロバＩｇＧ；Ｒ＆Ｄ）と共に４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ二次抗体を２時間２０℃でインキュベートした。次いで、ＲＰＷＡＴを顕微鏡スライド上に載せ、画像を共焦点顕微鏡によって撮影した。
【０２５３】
マクロファージＢＯＤＩＰＹの取り込み。ＬｙｓＭＣＲＥ−ＮＲＰ１＋／＋およびＬｙｓＭＣＲＥ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌから抽出したマクロファージを１ｘ１０５細胞／ウェルで４８ウェルプレートに播種した。ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０Ｃ１、Ｃ１２（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．５および１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、５分間室温でインキュベートし、次いで、氷上に置いた。ウェルを冷ＰＢＳで洗浄し、次いで１％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で固定した。蛍光をＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて、波長発光４８８ｎｍおよび励起５２５ｎｍで読み取った。次いで細胞を１／２００００の濃度のＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、励起３５８ｎｍ、発光４６１ｎｍで蛍光を測定した。
【０２５４】
ｐＨｒｏｄｏ食作用アッセイ。ＬｙｓＭＣＲＥ−ＮＲＰ１＋／＋およびＬｙｓＭＣＲＥ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌから抽出したマクロファージを９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）グリーンザイモサンバイオ粒子コンジュゲート（Ｇｒｅｅｎ  Ｚｙｍｏｓａｎ  Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、０．５％／ｍＬの濃度でＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ（商標）ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ中に再懸濁した。バイオ粒子再懸濁液１００μＬは、陰性対照として、細胞および空のウェルに添加した。細胞を３７℃で９０分間インキュベートし、ｐＨ／食作用依存性蛍光を励起５０９ｎｍ、発光５３３ｎｍにおいて、ＴＥＣＡＮプレートリーダーで検出した。正味の食作用は、実験サンプルの蛍光から陰性対照の蛍光を差し引くことによって計算した。
【０２５５】
オイルレッドＯ染色および定量化。培養脂肪細胞および腹腔マクロファージをＰＢＳで洗浄し、１０％ＰＦＡ中で３０分間固定し、すすいだ。次いで、細胞を、２回濾過した０．３％オイルレッドＯ溶液と共に６０分間インキュベートし、すすいだ。脂肪細胞については倍率１０倍、マクロファージについては倍率６３倍で光学顕微鏡下で写真を撮影した。脂肪滴の定量化は、ＩｍａｇｅＪから、限界値限界法（Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて行った。
【０２５６】
アデノトラップＭプロトコールの存在下での体重増加。６〜８週齢のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスを６つの群（通常食＋食塩水、通常食＋アデノトラップＭ、通常食＋アデノＧＦＰ、高脂肪食＋食塩水、高脂肪食＋アデノトラップＭ、高脂肪食＋アデノＧＦＰ）に分けた。マウスに生理食塩水、アデノトラップＭまたはアデノＧＦＰを静脈内注射した（尾静脈）（０．２５ｘ１０１０ＰＦＵ／注射）。これらのマウスの半分には高脂肪食を与え、残りの半分には通常食を与え、毎週の間隔で体重を測定した。
【０２５７】
注射の２週間および８週間後に、尾から一滴の血液を採取した。トラップＭの存在は、抗Ｈｉｓ抗体を用いた免疫沈降により血液中で査定した（図２６、図２８および図２９を参照されたい）。
【０２５８】
耐糖能試験（ＧＴＴ）。６〜８週齢のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスに食塩水またはアデノ−トラップＭを静脈内注射した（０．２５ｘ１０１０ＰＦＵ／注射）。注射直後にマウスに高脂肪食を与えた。糖血は、ベースライン時、および２ｇのＤ−グルコース／ｋｇの腹腔内注射から１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、および２４０分後に査定した。記録された測定値を図２５に示す（Ｎ＝５、Ｎ.Ｓは二元配置Ａｎｏｖａ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定では有意でないことを意味する）。
【０２５９】
インスリン耐性試験（ＩＴＴ）。マウスは、５．５時間（午前中）飢餓にした。血糖は、ベースライン時、０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンの腹腔内注射から３０分後、６０分後および１２０分後に測定した。
【０２６０】
インビボでのＢＯＤＩＰＹ（商標）の取り込み。インビボＢＯＤＩＰＹ（商標）取り込みアッセイは、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１＋／＋およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌ雄マウスで、１０週間ＨＦＤを与えて実施した。マウスを４時間飢餓状態にした後、１％ＢＳＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ）中の１００μＬの３０μＭＢＯＤＩＰＹ（商標）５００／５１０Ｃ１、Ｃ１２（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の腹腔内注射を行った。ＢＯＤＩＰＹ注射３時間後に、マウスを安楽死させた。心臓穿刺により血液を採取し、その後血漿を遠心分離により分離した。心臓、肝臓および白色脂肪組織のサンプルを採取し、１ｘＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中で均質化した。ホモジネートおよび血漿のＢＯＤＩＰＹ蛍光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて、４８８ｎｍの波長発光および５２５ｎｍの励起で読み取り、タンパク質濃度に対して正規化した（ＱｕａｎｔｉＰｒｏ（商標）ＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて定量化した）。
【０２６１】
オイルレッドＯ染色および定量化。培養脂肪細胞および腹腔マクロファージをＰＢＳで洗浄し、１０％ＰＦＡ中で３０分間固定し、すすいだ。次いで、細胞を、２回濾過した０．３％オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）溶液と共に６０分間インキュベートし、すすいだ。脂肪細胞については倍率１０倍、マクロファージについては倍率６３倍で光学顕微鏡下で写真を撮影した。脂肪滴の定量化は、ＩｍａｇｅＪから、限界値限界法（Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて行った。
【０２６２】
アデノウイルスの産生。トラップＡＤおよびＡＥは、Ｑ５  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＶＥＧＦ１６５結合変異体残基Ｄ３２０Ｋを導入することによって、トラップＭおよびＯ（前述の国際公開第２０１６／０３３６９９号に記載）から誘導した。アデノウイルストラップ構築物は、最初にトラップＭ、Ｇ、ＡおよびＤのコード配列をｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングし、続いて目的ベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＬＲクロナーゼ相同組換えを行うことによって作製した。現在の構築物セットは、ｐＡｄｅｎｏ−ＴｒａｐＡ、Ｃ、ＧまたはＭおよびｐＡｄｅｎｏ−ＧＦＰと称される。すべての構築物挿入配列をサンガーシーケンシング（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃ）により検証した。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ｄｅｓｔへのトラップコーディング配列組換え後に生成されたすべての接合領域も同様にシーケンシングを行った。
【０２６３】
統計分析。データは平均値±ＳＥＭで表す。必要に応じて、両側スチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡを使用して、異なる群を比較した。Ｐ＜０．０５は統計的に異なると見なした。
【０２６４】
実施例１３
食餌誘発性肥満の間の脂肪組織において蓄積するＮＲＰ１発現マクロファージ
食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）の際に、壊死脂肪細胞放出脂肪酸（ＦＡ）は、冠状構造を形成する周囲のマクロファージによって部分的に取り込まれる。脂質代謝および肥満におけるマクロファージの重要性を考慮して、骨髄性細胞におけるＮＲＰ１の発現プロファイルを、ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＩｍｍＧｅｎのデータを用いて分析した（ＨｅｎｇとＰａｉｎｔｅｒ、２００８）。ＮＲＰ１の発現は、他の定常状態の組織内在性マクロファージ、単球および好中球と比較して、脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）において最も頑強であった（図２１Ａ）。このデータは、脂肪組織恒常性におけるＮＲＰ１＋マクロファージの潜在的な役割を示した。
【０２６５】
したがって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを８週齢から始めて１０週間高脂肪食（ＨＦＤ；６０％脂肪カロリー）に入れ、ＡＴＭ集団を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により調べた。他の研究によれば、年齢を一致させた通常食（ＲＤ；１８％脂肪カロリー）の対照と比較したとき、ＨＦＤを与えたマウスの脂肪組織において、ＡＴＭの存在の増加が検出された（図２１Ｂ）。これは、ＮＲＰ１＋ＡＴＭにおいて比例した増加と平行であった（図２１Ｃ）。１０週齢のＨＦＤ給餌マウスおよび年齢を一致させたＲＤマウスの両方からの後腹膜白色脂肪組織（ＲＰＷＡＴ）の免疫組織化学（ＩＨＣ）では、マクロファージおよび血管におけるＮＲＰ１の頑強な発現が確認された（データは示さず）。２２週のＨＦＤの後、ＮＲＰ１は冠状構造に局在し、これは死にかけているおよび死亡した脂肪細胞を取り囲む食作用性マクロファージのクラスターに対応している（データは示さず）。調べたＮＲＰ１リガンドのうち、トランスフォーミング成長因子ベータ１（Ｔｇｆｂ１）のみがＨＦＤ給餌マウスの後腹膜白色脂肪組織（ＲＰＷＡＴ）において有意に上昇したが（図２１Ｇ）、一方、セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３ａ）、血管内皮成長因子−Ａ（Ｖｅｇｆａ）、または−Ｂ（Ｖｅｇｆｂ）は影響を受けなかった（図２１Ｄ〜図２１Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＡＴＭにおけるＮＲＰ１の頑強な発現を実証しており、かつＨＦＤ誘発性体重増加の間の脂肪組織におけるＮＲＰ１＋マクロファージの増加を示唆している。
【０２６６】
実施例１４
ＮＲＰ１は、マクロファージによる脂肪酸の取り込みおよび食作用を促進する。
肥満において、長鎖脂肪酸（ＦＡ）の取り込みは、脂肪細胞において上方制御されている（Ｂｅｒｋら、１９９９；Ｐｅｔｒｅｓｃｕら、２００５）。脂肪組織の恒常性および体重増加におけるＮＲＰ１＋マクロファージの役割を解明するために、骨髄系統の細胞において特異的に除去されたＮＲＰ１を用いてＬｙｓＭ−ＣＲＥ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウス系統を作製した（Ｄｅｊｄａら、２０１４）。したがって、長鎖ＦＡ類似体（Ｃ１−ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２、１８−炭素ＦＡ）の取り込みを、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌおよび対照ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１＋／＋マクロファージにおいて測定した。ＮＲＰ１欠損マクロファージは、急性曝露中、対照マクロファージよりも有意に少ないＦＡを取り込んだ（図２２Ａ）。加えて、Ｃ１−Ｃ１２  ＢＯＤＩＰＹを全身投与することで、血漿および心臓と比較した場合（図２２Ｄ、図２２Ｅ）、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマウスのＲＰＷＡＴおよび肝臓において有意に上昇したレベルのタグ付きＦＡが明らかになった（図２２Ｂおよび図２２Ｃ）。これにより、脂質取り込みにおけるＮＲＰ１＋マクロファージの役割が固まる。
【０２６７】
ＮＲＰ１が、マクロファージにおける脂質の隔絶に影響を与えたかどうかを判断するために、マクロファージ内の中性脂質をオイルレッドＯ染色で染色したが、オイルレッドＯ染色は、脂肪細胞馴化培地中でインキュベートしたＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌマクロファージにおいては有意に減少した（図２２Ｆ〜図２２Ｇ）。脂肪細胞およびマクロファージ培地は、グルコースおよびインスリン濃度が異なるので、ＮＲＰ１欠損マクロファージにおける内在化脂質の減少が、インスリンを含むか、または含まない脂肪細胞培地、ならびにマクロファージ培地などの非馴化培地においても生じるかを査定した。すべての条件において、ＮＲＰ１マクロファージは、対照よりも有意に少ない中性脂質を隔離した（図２２Ｈ〜図２２Ｋ）。
【０２６８】
肥満マウスおよびヒトにおいて脂肪細胞死が増加するにつれて、細胞残屑を貪食し、放出された脂質を隔離するためにマクロファージが壊死部位に誘致される（Ｃｉｎｔｉら、２００５）。ＮＲＰ１欠損マクロファージにおいて脂質の取り込みの減少を観察したため、本発明者らはそれらの食作用能力も損なわれているかどうかを疑問視した。食作用は、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ−ＮＲＰ１ｆｌ／ｆｌおよび対照マクロファージにおけるｐＨｒｏｄｏグリーンザイモサンバイオ粒子コンジュゲートを用いて測定し、ＮＲＰ１を欠くマクロファージが貪食能の低下（図２３）を有していたことがわかった。
【０２６９】
まとめると、上記の結果は、ＮＲＰ１欠損マクロファージがＦＡの取り込みおよび食作用能力を損なっていることを実証している。
【０２７０】
実施例１５
ＮＲＰ１トラップは高脂肪食に関連した体重増加を減少させる
体重増加に対するＮＲＰ１トラップの効果を査定した。ＮＲＰ１のドメインａ１、ａ２およびｂ１を含む可溶性ＮＲＰ１トラップを発現するアデノウイルス（トラップＭ、表２参照）；アデノＧＦＰ；または生理食塩水（対照）を雄マウスに投与し、同時にマウスは、通常食から高脂肪食（ＨＦＤ、Ｔ０）に切り替えた。体重増加は、１０週間にわたって監視した。データは平均値±ＳＥＭで表す。スチューデントの対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、生理食塩水対アデノトラップＭ、二元配置アノバ、ボンフェローニ事後検定、Ｎ＝５。
【０２７１】
図２４に示すように、ＮＲＰ１を投与することで、マウスの体重増加を妨げた。７週目および８週目に観察された体重増加の増加は、ＮＲＰ１トラップを発現する循環アデノウイルスの減少と一致する。驚くべきことに、体重増加の防止は、雌マウスよりも雄マウスにおいて重要であった（データは示さず）。
【０２７２】
耐糖能に対するＮＲＰ１トラップの効果も査定した。６〜８週齢のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスに生理食塩水、アデノＧＦＰまたはアデノトラップＭを静脈内注射し、注射直後に高脂肪食を与えた。糖血は、２ｇのグルコース／ｋｇマウスの腹腔内注射後の異なる時点で査定した。図２５Ｂに示すとおり、アデノトラップＭで処理したマウスは、生理食塩水またはアデノＧＦＰで処理したマウスよりもグルコースに対する耐性が高かった。
【表１１】
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【０２７３】
特許請求の範囲は、実施例に記載されている好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、説明全体と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
参考文献
【表１２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月11日(2019.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019536813000001.app
【国際調査報告】
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2019536813.tif 000081
2019536813.tif 000082
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