(57)【要約】本発明は、TPBG抗体及びその調製方法、その共役体並びに用途を公開した。前述したTPBG抗体は、TPBG抗体の重鎖可変領域重鎖CDR1、重鎖CDR2及び重鎖CDR3の1又は複数の種類、及び/又は、TPBG抗体の軽鎖可変領域軽鎖CDR1、軽鎖CDR2及び軽鎖CDR3の1又は複数の種類を含み、そのアミノ酸配列がそれぞれ本発明に記載の通りである。前述したTPBG抗体は、ヒト化抗体であり、高い親和力を有し、低分子薬物毒素MMAFと共役することによって得られた共役体がTPBG陽性細胞に対して細胞毒性傷害作用を発揮できるため、腫瘍等を治療する薬物の調製に利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TPBG抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2及び重鎖CDR3の1又は複数の種類、及び/又は、TPBG抗体の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2及び軽鎖CDR3の1又は複数の種類を含む分離したタンパク質であって、
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66又はSEQ ID No.74に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67又はSEQ ID No.75に示され、前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68又はSEQ ID No.76に示され、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70又はSEQ ID No.78に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71又はSEQ ID No.79に示され、前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72又はSEQ ID No.80に示され、あるいは、
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66又はSEQ ID No.74に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67又はSEQ ID No.75に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68又はSEQ ID No.76に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70又はSEQ ID No.78に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71又はSEQ ID No.79に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72又はSEQ ID No.80に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であることを特徴とする、分離したタンパク質。
【請求項２】
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.2に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.3に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.4に示され、前記の重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.10に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配が、配列表SEQ ID No.11に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.12に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.18に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.19に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.20に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.26に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.27に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.28に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.34に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.35に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.36に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.42に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.43に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.44に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.50に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.51に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.52に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.58に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.59に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.60に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.66に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.67に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.68に示され、あるいは、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.74に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.75に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.76に示され、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.6に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.7に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.8に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.14に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.15に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.16に示され、あるいは、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.22に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.23に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.24に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.30に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.31に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.32に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.38に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.39に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.40に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.46に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.47に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.48に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.54に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.55に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.56に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.62に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.63に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.64に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.70に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.71に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.72に示され、あるいは、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.78に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.79に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.80に示されたことを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
TPBG抗体の重鎖可変領域及び/又はTPBG抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33、SEQ ID No.41、SEQ ID No.49、SEQ ID No.57、SEQ ID No.65又はSEQ ID No.73に示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37、SEQ ID No.45、SEQ ID No.53、SEQ ID No.61、SEQ ID No.69又はSEQ ID No.77に示されたことを特徴とする、分離したタンパク質。
【請求項４】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.1に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.5に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.9に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.13に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.17に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.21に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.25に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.29に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.33に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.37に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.41に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.45に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.49に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.53に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.57に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.61に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.65に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.69に示され、あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.73に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.77に示されたことを特徴とする、請求項3に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、抗体重鎖定常領域及び/又は抗体軽鎖定常領域をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト又はマウス抗体重鎖定常領域であり、前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト又はマウス抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする、請求項5に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト抗体重鎖定常領域であり、前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする、請求項6に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質は、TPBG抗体、モノクローナル抗体、抗体全長タンパク、抗原抗体結合領域タンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体又は単一領域抗体であることを特徴とする、請求項1又は3に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81、配列表SEQ ID No.83、配列表SEQ ID No.85、配列表SEQ ID No.87、配列表SEQ ID No.89、配列表SEQ ID No.91、配列表SEQ ID No.93、配列表SEQ ID No.95、配列表SEQ ID No.97又は配列表SEQ ID No.99に示され、及び/又は、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82、配列表SEQ ID No.84、配列表SEQ ID No.86、配列表SEQ ID No.88、配列表SEQ ID No.90、配列表SEQ ID No.92、配列表SEQ ID No.94、配列表SEQ ID No.96、配列表SEQ ID No.98又は配列表SEQ ID No.100に示されたことを特徴とする、請求項9に記載の核酸。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.91に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.92に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98に示され、あるいは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100に示されたことを特徴とする、請求項10に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項9〜11のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項12に記載の組換え発現ベクターを含む、組換え発現形質転換体。
【請求項１４】
請求項13に記載の組換え発現形質転換体を培養し、培養物からTPBG抗体を得る工程を含む、TPBG抗体の調製方法。
【請求項１５】
細胞毒性薬に共有付着される請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質を含むことを特徴とする、免疫共役体。
【請求項１６】
1当量の請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質が、x当量のアダプターによりy当量の細胞毒性薬と連結し、式1に示された構造を有することを特徴とする、請求項15に記載の免疫共役体。
Ab-(L)x-(D)y
式1
ただし、Abは、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質であり、Lはアダプターであり、Dは細胞毒性薬であり、xは自然数であり、好ましくは1〜20の整数であり、yは0又は自然数であり、好ましくは0〜20の整数であり、x及びyは、各々独立に1〜2、又は2〜4、又は4〜8、又は8〜20の整数が好ましく、xとyとの比は、好ましくは、1：1である。
【請求項１７】
前記アダプターLは、活性エステル、炭酸塩系、カルバメート系、イミノホスフェート、オキシム系、ヒドラゾン系、アセタール系、オルトエステル系、アミノ系、小ペプチド断片又はヌクレオチド断片であり、好ましくは、前記アダプターLは、マレイミドカプロイル（MC）、マレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリンp-アミノベンジルアルコール（MC-VC-PAB）又はスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）であり、及び/又は、
前記Dは、細胞毒素、化学療法剤、放射性同位元素、治療的核酸、免疫調節剤、血管新生阻害剤、抗増殖・プロアポトーシス剤又は溶菌酵素から選択され、好ましくは、メチルアウリスタチンE、メチルアウリスタチンF又はN2'-デアセチル-N2'-3-メルカプト-1オキソプロピル-メイタンシンから選択されることを特徴とする、請求項16に記載の免疫共役体。
【請求項１８】
前記式1において、x＝y＝nであり、前記免疫共役体の構造は、式3、式4又は式5に示されることを特徴とする、請求項17に記載の免疫共役体。
【化１】
2019508023.tif 000025
式3中、mは1〜10であり、好ましくは5（即ち、Lがマレイミドカプロイルである）であり、DはメチルアウリスタチンFであり、
【化２】
2019508023.tif 000026
式4中、Lはスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートであり、DはN2'-デアセチル-N2'-3-メルカプト-1オキソプロピル-メイタンシン（DM1）であり、
【化３】
2019508023.tif 000027
式5中、Lはマレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリンp-アミノベンジルアルコールであり、DはメチルアウリスタチンE（MMAE）であり、
ただし、nは自然数であり、好ましくは1〜20の整数であり、より好ましくは1〜2、又は2〜4、又は4〜8、又は8〜20の整数である。
【請求項１９】
請求項15〜18のいずれか一項に記載の免疫共役体と、薬学的に許容可能なベクターとを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２０】
前記医薬組成物は、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質0.01〜99.99%と、薬用ベクター0.01〜99.99%とを含み、前記百分率は、前記医薬組成物に占める質量百分率であることを特徴とする、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質の抗腫瘍薬の調製における用途。
【請求項２２】
請求項15〜18のいずれか一項に記載の免疫共役体の抗腫瘍薬の調製における用途。
【請求項２３】
請求項19〜20のいずれか一項に記載の医薬組成物の抗腫瘍薬の調製における用途。
【請求項２４】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質を、検査試料とインビトロで接触させ、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質と前記検査試料の結合を検出すれば良い工程を含むことを特徴とする、TPBGタンパク質を過剰発現する細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、2015年12月24日の出願日の中国特許出願CN201510990545.6号の優先権を主張する。本出願は、上記した中国特許出願の全ての内容を援用する。
［技術分野］
本発明は、抗体分野に関し、具体的に、TPBG抗体およびその調製方法、その共役体並び用途に関する。
［背景技術］
胚性幹細胞栄養膜と癌細胞の比較を行っているうちに、栄養膜特異的糖タンパク質（TPBG、5T4とも称する）が胚栄養膜より発現される特異的タンパク質である細胞表面分子が発見された。ヒトTPBGタンパク質は、分子量が約72kDaであり、420つのアミノ酸を含み、そのN末端におけるオリゴ糖構造が多様であり、タンパク質の加水分解を防止することができると共に、細胞膜におけるシグナル伝達中で他の分子と相互作用がある。TPBGタンパク質には、反復のロイシンドメイン（LRR）を合計7つ含み、タンパク質間の相互作用に関与することができる。
【０００２】
栄養膜は、プラセンタと胎児の間に特別な1層胚性幹細胞であり、TPBGが胚発生段階における各種の栄養膜細胞によく発現されている。正常成人組織に関しては、TPBGがただ限られたいくつか種類の上皮細胞に発現する。但し、TPBGは、多くの癌細胞に発現し、例えば、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、卵巣癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌あるいは腎臓癌の組織に共にTPBGの発現が検出され、結腸癌、胃癌や、卵巣癌に、TPBGの発現量が癌の低い治癒率に関連することを証拠だてる。また、非小細胞肺癌、腎臓癌或いは膵臓癌の組織において、TPBGの発現が95%以上と高い。
【０００３】
多くの研究によると、当該TPBGの過剰発現は、細胞遷移を促すと共に、免疫監視から逃れることができる。マウスの線維芽細胞において、TPBGを過剰発現することによって、細胞を紡錘体形態へ誘導し、細胞接着を下げる。マウスの正常上皮細胞において、同様に、TPBGが上皮細胞カドヘリン（E-cadherin）を阻害し、細胞遷移を促すことができると分かった。また、TPBGの細胞における一部は、細胞骨格の形成を阻害する機能がある。同時に、TPBGは、上皮細胞間葉転換（EMT）に関連し、胚性幹細胞発育の早期マーカーとして、細胞外マトリックスプロテアーゼの活性を増加させ、アクチン細胞骨格の配列を妨害し、E-cadherinの発現を減少する。さらに、研究によると、細胞膜におけるTPBGとCXCR4の共局在化によって、そのリガンドCXCL12ケモカインの結合を誘導し、炎症と腫瘍の拡散を促すことができることを発見した。TPBG陰性細胞において、CXCL12は、もう1つの受容体CXCR7と結合し、遊走反応を抑制することによって、細胞の成長および生存に役たつ。Wnt/b-cateninシグナル経路は、発育および細胞再生に重要な役割を果たしており、TPBGがLRP6とWnt受容体のエンドサイトーシスを阻害し、Wntシグナル経路を抑制することによって、細胞接着および細胞骨格の形成を阻害し、腫瘍の遷移および拡散を促す。また、TPBGは、乳癌や胃癌細胞中で非標準なWnt経路を関与するので、同様に、癌細胞の遷移および浸潤を促す。
【０００４】
抗体薬剤共役薬剤は、抗体と高性能低分子薬剤から連結体の共役で形成される抗体薬物共役体であり、高毒性低分子薬剤に癌細胞におけるターゲットタンパク質を特異的に認識させ、癌細胞を特異的死滅することができる。過去百年間、抗体に基づく免疫療法と化学薬剤に基づく化学療法は、ずっと臨床上癌治療に関して2つの治療対策になっている。抗体は、腫瘍細胞の過剰発現した抗原をターゲットとするものであり、多種類の治療的モノクローナル抗体は、既に臨床上莫大な成功を遂げた。臨床実践において、治療的抗体は、良いターゲット指向性があるものの、傷害作用に限界性が存在する。低分子化学薬剤は、癌細胞への高性能傷害作用を有するが、非癌細胞にも同様に傷害する。従って、臨床上、抗体薬剤および低分子薬剤がそれぞれ限界性を有するため、薬剤の研究開発が新たに求められている。新世代の抗体薬物共役体は、抗体のターゲット細胞への特異的結合能を利用し、細胞毒素の高い化学薬剤を搬送し、癌細胞へのターゲット指向の高性能傷害を達成する。新型化学連結技術の登場につれて、抗体薬剤共役薬は、80年代末から臨床研究に進み、現在2つのADC薬剤が既にFDAから許可をもらって発売されている。
【０００５】
ADC薬剤の開発は、薬剤ターゲットの選別、組換え抗体の調製、連結体技術開発および高細胞毒性化合物の選別最適化などに関わる。TPBGは、癌細胞特異的発現のタンパク質として、ADC薬剤の候補ターゲットになっている。
［発明の概要］
本発明が解決しようとする課題は、現在TPBG抗体の不足を克服するために、ヒト、マウス或いはカニクイザルのTPBGタンパク質と高い親和力を持つ親和力が高く特異性が強いTPBG抗体およびその調製方法、並び用途を提供する。本発明はさらに、前記TPBG抗体、それと共役し抗腫瘍機能を持つ低分子化合物を含有し、細胞に侵入し、TPBG陽性細胞を細胞毒素で傷害し、腫瘍を治療するような薬剤の調製に用いられる薬剤活性成分の共役体を提供する。
【０００６】
本発明は、ヒトTPBGタンパク質又は過剰発現ヒトTPBGタンパク質の組換え細胞株を免疫原とし、伝統的なハイブリドーマ調製技術（Kohler and Milstein、Nature、1975、256: 495）を採用し、一連の調整や改進により、TPBG抗体のリード抗体を得た。さらに、リード抗体の初期生産、精製及び検定により、ヒトTPBGタンパク質などの蛋白と高度な親和力を有するTPBG抗体を得た。当該TPBG抗体とMMAFのような低分子化合物とを共役させて共役体を得、前記共役体は細胞に入り込め、TPBG陽性細胞に対して優れた細胞毒性傷害作用を有する。そして、分子生物学方法でシーケンシングを行うことにより、得られたTPBG抗体の重鎖可変領域とTPBG抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が分かる。
【０００７】
本発明は、TPBG抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2及び重鎖CDR3の1又は複数の種類、及び/又は、TPBG抗体の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2及び軽鎖CDR3の1又は複数の種類を含む分離したタンパク質を提供し、ここで、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66又はSEQ ID No.74に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67又はSEQ ID No.75に示され、前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68又はSEQ ID No.76に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70又はSEQ ID No.78に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71又はSEQ ID No.79に示され、前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72又はSEQ ID No.80に示され、又は、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66又はSEQ ID No.74に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67又はSEQ ID No.75に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列に示され、前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68又はSEQ ID No.76に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70又はSEQ ID No.78に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71又はSEQ ID No.79に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列に示され、前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72又はSEQ ID No.80に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列に示された。
【０００８】
好ましくは、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.2に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.3に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.4に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.10に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.11に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.12に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.18に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.19に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.20に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.26に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.27に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.28に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.34に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.35に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.36に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.42に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.43に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.44に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.50に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.51に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.52に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.58に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.59に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.60に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.66に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.67に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.68に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.74に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.75に示され、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.76に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.6に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.7に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.8に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.14に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.15に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.16に示され、又は、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.22に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.23に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.24に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.30に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.31に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.32に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.38に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.39に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.40に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.46に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.47に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.48に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.54に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.55に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.56に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.62に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.63に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.64に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.70に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.71に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.72に示され、又は、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.78に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.79に示され、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.80に示された。
【０００９】
本発明はまた、TPBG抗体の重鎖可変領域及び/又はTPBG抗体の軽鎖可変領域を含む分離したタンパク質を提供し、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33、SEQ ID No.41、SEQ ID No.49、SEQ ID No.57、SEQ ID No.65又はSEQ ID No.73に示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37、SEQ ID No.45、SEQ ID No.53、SEQ ID No.61、SEQ ID No.69又はSEQ ID No.77に示された。
【００１０】
好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.1に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.5に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.9に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.13に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.17に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.21に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.25に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.29に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.33に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.37に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.41に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.45に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.49に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.53に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.57に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.61に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.65に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.69に示され、又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.73に示され、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.77に示された。
【００１１】
以上をまとめると、前記アミノ酸配列の番号は表1に示された。
【００１２】
【表１】
2019508023.tif 000002
ここで、表1中の数字は配列表における配列番号であり、例えば、12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域のアミノ酸配列が、SEQ ID No.1であり、12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域のCDR1のアミノ酸配列が、SEQ ID No.2である。
【００１３】
好ましくは、前記のタンパク質はさらに、抗体重鎖定常領域及び/又は抗体軽鎖定常領域を含み、前記の抗体重鎖定常領域は、本分野において通常のことであり、好ましくはマウス抗体重鎖定常領域又はヒト抗体重鎖定常領域であり、より好ましくはヒト抗体重鎖定常領域である。前記抗体軽鎖定常領域は本分野において通常のことであり、好ましくはマウス軽鎖抗体定常領域又はヒト抗体軽鎖定常領域であり、より好ましくはヒト抗体軽鎖定常領域である。
【００１４】
前記タンパク質は本分野における通常のタンパク質であり、好ましくはTPBG抗体であり、より好ましくは抗体全長タンパク、抗原抗体結合領域タンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体（single chain antibody fragment、scFv）、単一ドメイン抗体（single domain antibody、sdAb）又は単一領域抗体（Signle-domain antibody）の1又は複数の種類、及び前記抗体から得られたモノクローナル抗体又はマルチクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、ファージディスプレイ、単一リンパ球遺伝子クローニングなどを含む、多種類の経路や技術により開発して作製されることができ、ハイブリドーマにより野生型又はトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を調製するのは主流となる。
【００１５】
前記抗体全長タンパクは、本分野における通常の抗体全長タンパクであり、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む。前記タンパク質の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域とから、全ヒト抗体全長タンパクが構成される。好ましくは、前記抗体全長タンパクはIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である。
【００１６】
前記一本鎖抗体は、本分野における通常の一本鎖抗体であり、重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び15〜20個のアミノ酸の短ペプチドを含む。
前記抗原抗体結合領域タンパク質断片は、本分野における通常の抗原抗体結合領域タンパク質断片であり、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のFd段を含む。好ましくは、前記抗原抗体結合領域タンパク質断片はFab及びF(ab’)2である。
【００１７】
前記単一ドメイン抗体は、本分野における通常の単一ドメイン抗体であり、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含む。
前記単一領域抗体は本分野における通常の単一領域抗体であり、重鎖可変領域のみを含む。
【００１８】
ここで、前記タンパク質の調製方法は、本分野における通常の調製方法である。前記調製方法は、当該タンパク質を組換え発現する発現形質転換体から分離して得る、又はタンパク質配列を人工で合成して得ることが好ましい。前記当該タンパク質を組換え発現する発現形質転換体から分離して得ることは、前記タンパク質をコードする、やや突然変異した核酸分子を組換えベクターにクローンし、得られる組換えベクターを転換体に転換させ、組換え発現形質転換体を得、得られる組換え発現形質転換体を培養することにより、分離、精製して前記タンパク質を得ることが好ましい。
【００１９】
本発明はさらに、前記タンパク質をコードする核酸を提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81、配列表SEQ ID No.83、配列表SEQ ID No.85、配列表SEQ ID No.87、配列表SEQ ID No.89、配列表SEQ ID No.91、配列表SEQ ID No.93、配列表SEQ ID No.95、配列表SEQ ID No.97又は配列表SEQ ID No.99に示され、及び/又は、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82、配列表SEQ ID No.84、配列表SEQ ID No.86、配列表SEQ ID No.88、配列表SEQ ID No.90、配列表SEQ ID No.92、配列表SEQ ID No.94、配列表SEQ ID No.96、配列表SEQ ID No.98又は配列表SEQ ID No.100に示された。
【００２０】
より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.91に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.92に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98に示され、又は、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99に示され、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100に示された。
【００２１】
以上をまとめると、前記ヌクレオチド配列の番号は表2に示された：
【００２２】
【表２】
2019508023.tif 000003
ここで、表2中の数字は配列表における配列番号であり、例えば12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域をコードするヌクレオチド配列が、SEQ ID No.81である。
【００２３】
ここで、12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81中の91位〜105位であり、
12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81中の151位〜198位であり、
12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81中の295位〜327位であり、
12B12C7C3の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82中の70位〜114位であり、
12B12C7C3の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82中の157位〜180位であり、
12B12C7C3の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82中の277位〜303位であり、
5G4H10G5の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83中の91位〜105位であり、 
5G4H10G5の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83中の148位〜198位であり、
5G4H10G5の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83中の295位〜330位であり、
5G4H10G5の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84中の70位〜102位であり、
5G4H10G53の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84中の148位〜168位であり、
5G4H10G5の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84中の265位〜288位であり、
37H9C5G2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85中の91位〜105位であり、
37H9C5G2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85中の151位〜198位であり、
37H9C5G2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85中の295位〜327位であり、
37H9C5G2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86中の70位〜102位であり、
37H9C5G2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86中の148位〜168位であり、
37H9C5G2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86中の265位〜291位。
【００２４】
39A11G5F2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87中の91位〜105位であり、
39A11G5F2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87中の151位〜198位であり、
39A11G5F2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87中の295位〜315位であり、
39A11G5F2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88中の70位〜102位であり、
39A11G5F2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88中の148位〜168位であり、
39A11G5F2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88中の265位〜291位。
【００２５】
52C9E9F6の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89中の91位〜105位であり、
52C9E9F6の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89中の151位〜198位であり、
52C9E9F6の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89中の295位〜315位であり、
52C9E9F6の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90中の70位〜102位であり、
52C9E9F6の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90中の148位〜168位であり、
52C9E9F6の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90中の268位〜291位。
【００２６】
28D4E6A9の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.91中の91位〜105位であり、
28D4E6A9の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.91中の148位〜198位であり、
28D4E6A9の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.91中の295位〜327位であり、
28D4E6A9の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.92中の70位〜102位であり、
28D4E6A9の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.92中の148位〜168位であり、
28D4E6A9の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.92中の265位〜291位である。
【００２７】
36A10D8B12の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93中の91位〜108位であり、
36A10D8B12の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93中の154位〜198位であり、
36A10D8B12の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93中の295位〜324位であり、
36A10D8B12の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94中の70位〜102位であり、
36A10D8B12の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94中の148位〜168位であり、
36A10D8B12の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94中の265位〜291位である。
【００２８】
99E12C7H1の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95中の91位〜105位であり、
99E12C7H1の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95中の151位〜198位であり、
99E12C7H1の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95中の295位〜318位であり、
99E12C7H1の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96中の70位〜102位であり、
99E12C7H1の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96中の148位〜168位であり、
99E12C7H1の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96中の265位〜291位である。
【００２９】
103E2E9C2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97中の91位〜105位であり、
103E2E9C2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97中の151位〜198位であり、
103E2E9C2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97中の295位〜324位であり、
103E2E9C2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98中の70位〜105位であり、
103E2E9C2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98中の151位〜171位であり、
103E2E9C2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98中の268位〜294位である。
【００３０】
106D5G3D10の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99中の91位〜105位であり、
106D5G3D10の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99中の151位〜198位であり、
106D5G3D10の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99中の295位〜318位であり、
106D5G3D10の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100中の70位〜99位であり、
106D5G3D10の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100中の145位〜165位であり、
106D5G3D10の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100中の262位〜294位である。
【００３１】
前記核酸の調製方法は、本分野における通常の調製方法であり、遺伝子クローニングにより前記タンパク質をコードする核酸分子を得ること、又は人工全配列合成により前記タンパク質をコードする核酸分子を得ることを含む。
【００３２】
当業者にとって、前記タンパク質をコードするアミノ酸配列の塩基配列は、適宜置換、欠失、変更、挿入又は増加によりポリヌクレオチドの同体を提供できることが分かる。本発明にかかるポリヌクレオチドの同体は、当該蛋白配列遺伝子をコードする1又は複数の塩基を、抗体活性が保持できる範囲で、置換、欠失又は増加により得られる。
【００３３】
本発明はさらに、前記核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
ここで、前記組換え発現ベクターは、本分野における通常の方法により得られる。すなわち、本発明に記載の核酸分子を各種の発現ベクターに共役させて構築することができる。前記発現ベクターは、本分野における通常の各種のベクターであり、前記核酸分子を搭載できるものであれば良い。前記ベクターは、各種のプラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスベクターなどを含むことが好ましい。
【００３４】
本発明はさらに、前記組換え発現ベクターを含む組換え発現形質転換体を提供する。
ここで、前記組換え発現形質転換体の調製方法は、本分野における通常の調製方法であり、好ましくは、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に転換させることに得られる。前記宿主細胞は、本分野における通常の各種の宿主細胞であり、前期組換え発現ベクターを安定して自己複製させ、且つそれが持つ前記核酸を効果的に発現させるものであれば良い。好ましくは、前記宿主細胞は、E.coli TG1又はBL21細胞（一本鎖抗体又はFab抗体を発現）、又はCHO-K1細胞（全長IgG抗体を発現）である。前記組換え発現プラスミドを宿主細胞に転換させることにより、本発明の好ましい組換え発現形質転換体が得られる。ここで、前記転換方法は、本分野における通常の転換方法であり、好ましくは化学的転換法、熱激法又は電気転換法である。
【００３５】
本発明はさらに、前記組換え発現形質転換体を培養し、培養物からTPBG抗体を得る工程を含む、TPBG抗体の調製方法を提供する。
本発明は、細胞毒性薬に共有付着される前記タンパク質を含む、免疫共役体を提供する。
【００３６】
好ましくは、前記免疫共役体において、1当量の前記タンパク質は、x当量のアダプターによりy当量の細胞毒性薬と連結し、式1に示された構造を有する。
Ab-(L)x-(D)y
式 1
ここで、Abが上述したタンパク質であり；Lがアダプターであり；Dが細胞毒性薬であり；前記xが本分野における通常の架橋度であり、xが自然数であり、好ましくは1〜20の整数であり；yが0又は自然数であり、好ましくは0〜20の整数であり；x及びyがそれぞれ独立して、1〜2、又は2〜4、又は4〜8、又は8〜20の整数であることが好ましく；xとyの比が、1：1であることが好ましい。
【００３７】
前記Lは、本分野における通常のアダプター（又は架橋剤やカップリング剤と称する）である。前記Lは、2個の官能基、すなわち、抗体と反応する基及び薬物と反応する基（例えば、アルデヒド又はケトン）を含む。
【００３８】
薬物は、アダプター分子を介して上記タンパク質とカップリングする。前記Lは、細胞に入って放出され、それが、活性エステル、炭酸塩系、カルバメート系、イミノホスフェート、オキシム系、ヒドラゾン系、アセタール系、オルトエステル系、アミノ系、小ペプチド断片又はヌクレオチド断片を含むが、これらの官能基に限定されない。
【００３９】
好ましくは、前記Lは、主として式2に示された構造を含有し、それは、L中の脱離基が脱離した残り部分である。
（CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp）
式 2
ここで、Alk1及びAlk2は独立して、結合手又は分岐もしくは非分岐の（C1-C10）アルキレン鎖であり；Sp1は、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR’-、-N(CH2CH2)2N-、又は-X-Ar’-Y-（CH2）n-Zであり、ただしX、Y及びZが独立した結合手、-NR’-、-S-又は-O-であり、n＝0である条件であれば、YとZとの少なくとも一方が結合手である必要があり、且つ、Ar’が（C1-C5）アルキル基、（C1-C4）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-（CH2）nCOOR’、S（CH2）nCOOR’、-O（CH2）nCONHR’又は-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2又は3個の基で置換された1，2-、1，3-又は1，4-フェニレン基であり、nは0-5の整数であり、Alk1が結合手である条件であれば、Sp1が結合手であり；R’は、-OH、（C1-C4）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、（C1-C3）ジアルキルアミノ基、又は（C1-C3）トリアルキルアンモニウム-Aから任意に選択された1又は2個の基で置換された分岐もしくは非分岐の（C1-C5）鎖であり、ただしAが塩を完成させる薬学的に許容可能なアニオンであり；Arが（C1-C6）アルキル基、（C1-C5）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-O（CH2）nCOOR’、-S（CH2）nCOOR’、-O（CH2）nCONHR’’又は-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2又は3個の基で置換された1,2-、1,3-又は1,4-フェニレン基であり、ただしn及びR’が上述した定義のとおりであり、又はArが1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-又は2,7-ナフチリデン基であり、ただしナフチリデン基又はフェノチアジンがそれぞれ、（C1-C6）アルキル基、（C1-C5）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-O（CH2）nCOOR’、-S（CH2）nCOOR’、又は-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2、3又は4個の基で置換され、ただしn及びR’が上述した定義のとおりであり、Arがフェノチアジンである条件であれば、Sp1が窒素のみと結合する結合手であり；
Sp2が結合手、-S-又は-O-であり、Alk2が結合手である条件であれば、Sp2が結合手であり；
Z1がH、（C1-C5）アルキル基、又は（C1-C5）アルキル基、（C1-C5）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-O（CH2）nCOOR’、-S（CH2）nCOOR’、-O（CH2）nCONHR’或いは-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2、又は3個の基で置換されたフェニル基であり、ただしn及びR’が上述した定義のとおりであり；
Spが直鎖もしくは分岐鎖の二価もしくは三価の（C1-C18）基、二価もしくは三価のアリール基又はヘテロアリール基、二価もしくは三価の（C3-C18）シクロアルキル基又はヘテロシクロアルキル基、二価もしくは三価のアリール基又はヘテロアリール-アリール（C1-C18）基、二価もしくは三価のシクロアルキル基又はヘテロシクロアルキル-アルキル（C1-C18）基、或いは、二価もしくは三価の（C2-C18）不飽和アルキル基であり、ただしヘテロアリール基が好ましくはフラニル基、チエニル基、N-メチルピロリル基、ピリジル基、N-メチルイミダゾリル基、オキサゾリル基、ピリミジニル基。キノリル基、イソキノリル基、N-メチルカルバゾリル基、アミノクマリニル基、又はフェナジニル基であり、且つSpが三価の基であれば、Spがさらに低級（C1-C5）ジアルキルアミノ基、低級（C1-C5）アルコキシ基、水酸基、又は低級（C1-C5）アルキルチオ基で任意に置換されていてもよく；且つ、Qが＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-又は＝NHO-である。
【００４０】
好ましくは、Alk1が分岐もしくは非分岐の（C1-C5）アルキレン鎖であり、Sp1が結合手、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-又は-NR’であり、ただしR’が上述した定義のとおりであり、Alk1が結合手である条件であれば、Sp1が結合手であり；
Arが（C1-C6）アルキル基、（C1-C5）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-O（CH2）nCOOR’、-S（CH2）nCOOR’、-O（CH2）nCONHR’又は-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2又は3個の基で置換された1,2-、1,3-又は1,4-フェニレン基であり、ただしn及びR’が上述した定義のとおりであり、又はArがそれぞれ（C1-C6）アルキル基、（C1-C5）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-O（CH2）nCOOR’、-S（CH2）nCOOR’、-O（CH2）nCONHR’又は-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2、3又は4個の基で置換された1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-又は2,7-ナフチリデン基である。
【００４１】
Z1は、（C1-C5）アルキル基、又は（C1-C5）アルキル基、（C1-C4）アルコキシ基、（C1-C4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、-COOR’、-CONHR’、-O（CH2）nCOOR’、-S（CH2）nCOOR’、-O（CH2）nCONHR’或いは-S（CH2）nCONHR’から任意に選択された1、2、又は3個の基で置換されたフェニル基であり；Alk2及びSp2がいずれも結合手であり；かつ、Sp及びQが前文のみで定義されたとおりである。また、上述した結合手とは、共有結合のことを意味する。
【００４２】
前記Lは、マレイミドカプロイル（maleimidocaproyl、MC）、マレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリン-p-アミノベンジルアルコール（MC-VC-PAB）又はスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキしレート（SMCC）であることが好ましい。
【００４３】
前記Dは、本分野における通常の細胞毒性薬であり、細胞毒素、化学療法剤、放射性同位元素、治療的核酸、免疫調節剤、血管新生阻害剤、抗増殖・プロアポトーシス剤又は溶菌酵素から好ましく選択される。
【００４４】
ここで、前記細胞毒素は、本分野における通常の細胞毒素であり、一般的には、細胞の機能を抑制又は阻止する、及び/又は細胞を破壊する活性剤のことをいう。好ましくは、抗生物質、チューブリン重合阻害剤、アルキル化剤、タンパク合成阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ又はサイクリンから選択される。より好ましくは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピラルビシン、バルルビシン、シタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロクスウリジン、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、グーゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフリン、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ナイトロジェンマスタード、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、エトポシド、タキソール、タキソール類似体、プラチン系（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ダウノルビシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、タモキシフェン、ドラスタチン、アウリスタチン及びその誘導体、ヘミアスタリン、エスペラミシン又はメイタンシン系化合物から選択され、最も好ましくは、メチルアウリスタチンE（MMAE）、メチルアウリスタチンF（MMAF）又はN2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1オキソプロピル-メイタンシン（DM1）から選択される。
【００４５】
ここで、前記化学療法剤は、本分野における通常の化学療法剤であり、好ましくはアルキル化剤、スルホン酸アルキル系化学療法剤、アジリジン系化学療法剤、ビニルアミド系やメチルメラミン系化学療法剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロ尿素系化学療法剤、抗生物質、代謝拮抗物、葉酸系化学療法剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、アンドロゲン、抗アドレナリン薬、葉酸補充剤、メイタンシノール、多糖複合体、タキサン、プラチン類似体又はレチノイド、又は、その薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体から選択される。
【００４６】
前記アルキル化剤は、本分野における通常のアルキル化剤であり、好ましくはチオテパや、シクロホスファミドから選択される。前記スルホン酸アルキル系化学療法剤は、本分野における通常のスルホン酸アルキル系化学療法剤であり、好ましくはブスルファン、インプロスルファンや、ピポスルファンから選択される。前記アジリジン系化学療法剤は、本分野における通常のアジリジン系化学療法剤であり、好ましくはアジリジン、カルボコン、メツレデパや、ウレデパから選択される。前記エチレンイミン系及びメチルメラミン系化学療法剤は、本分野における通常のエチレンイミン系及びメチルメラミン系化学療法剤であり、好ましくはアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドや、トリメチローロメラミンから選択される。前記ナイトロジェンマスタードは、本分野における通常のナイトロジェンマスタードであり、好ましくはクロラムブシル、クロルナファジン、エストラムスチン（estramustine）、イホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミドや、ウラシルマスタードから選択される。前記ニトロ尿素系化学療法剤は、本分野における通常のニトロ尿素系化学療法剤であり、好ましくはカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンや、ラニムスチンから選択される。前記抗生物質は、本分野における通常の抗生物質であり、好ましくはアクラルビシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンc、カリケアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンや、ゾルビシンから選択される。前記代謝拮抗物は、本分野における通常の代謝拮抗物であり、好ましくはメトトレキサートや、5-フルオロウラシル（5-FU）から選択される。前記葉酸系化学療法剤は、本分野における通常の葉酸系化学療法剤であり、好ましくはデノプテリン、プテロプテリンや、トリメトレキサートから選択される。前記プリン類似体は、本分野における通常のプリン類似体であり、好ましくはフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリンや、チオグアニンから選択される。前記ピリミジン類似体は、本分野における通常のピリミジン類似体であり、好ましくはアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンや、5-EUから選択される。前記アンドロゲンは、本分野における通常のアンドロゲンであり、好ましくはカルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンや、テストラクトンから���択される。前記抗アドレナリン薬は、本分野における通常の抗アドレナリン薬であり、好ましくはアミノグルテチミド、ミトタンや、トリロスタンから選択される。前記葉酸補充剤は、本分野における通常の葉酸補充剤であり、好ましくはフロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、アトリムスチン、ビサントレン、エダトレキサート、デホスファミド、デメコルチン、ジアジクオン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、ガリウム硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナンや、ロニダミンから選択される。前記メイタンシノールは、本分野における通常のメイタンシノールであり、好ましくはメイタンシン、アンサマイトシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジドや、プロカルバジンから選択される。前記多糖複合体は、本分野における通常の多糖複合体であり、好ましくはラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テニュアゾン酸、トリアジコン、2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、シタラビン、シクロホスファミド又はチオテパから選ばれる。より好ましくは、T-2トキシン、ベラキュリンA、ロリジンA又はアングイジンから選択される。前記タキサンは、本分野における通常のタキサンであり、好ましくはパクリタキセル、ABRAXANE（登録商標）（クレモホール不使用）、パクリタキセルのアルブミン加工ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners、Schaumberg、Illinois）、ドキセタキセル、クロラムブシル、ゲムシタビン、6-チオグアニン、メルカプトプリンや、メトトレキサートから選択される。前記白金類似体は、本分野における通常の白金類似体であり、好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、カペシタビン、イバンドロネート、CPT-11、トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000や、ジフルオロメチルオルニチンから選択される。前記レチノイドは、本分野におけるレチノイドであり、好ましくはレチノイン酸である。
【００４７】
ただし、前記放射性同位元素は、本分野における通常の放射性同位元素であり、好ましくは、前記タンパク質に直接的に結合し、もしくはキレート剤によって前記タンパク質に結合するものである。より好ましくは、前記タンパク質のシステイン残基に直接的に結合するものである。好ましくは、前記放射性同位元素は、放射線治療に適するα-放射体、β-放射体、及びオージェ電子、並びに診断に適する陽電子放射体又はγ-放射体から選択される。より好ましくは、前記放射性同位元素は、フルオロ-18、銅64、銅65、ガリウム-67、ガリウム-68、ブロモ-77、ブロモ-80m、ルテニウム-95、ルテニウム-97、ルテニウム-103、ルテニウム-105、テクニチウム-99m、水銀107、水銀203、ヨウ素-123、ヨウ素-124、ヨウ素-125、ヨウ素-126、ヨウ素-131、ヨウ素-133、インジウム-111、インジウム-113、レニウム-99m、レニウム-105、レニウム-101、レニウム-186、レニウム-188、テルル-121m、テクニチウム-99、テルル-122m、テルル-125m、ツリウム-165、ツリウム-167、ツリウム-168、イットリウム-90、ビスマス-213、鉛213や、アクチニウム-225、又はそれらから誘導される窒化物や、酸化物から選択される。
【００４８】
ここで、前記治療的核酸は、本分野における通常の核酸であり、好ましくは免疫調節剤、血管新生阻害剤、抗増殖剤又はプロアポトーシス剤をコードする遺伝子である。前記治療剤は、前記治療剤、その誘導体、及び、前記治療剤の薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体を含む。
【００４９】
ここで、前記免疫調節剤は、本分野における通常の免疫調節剤であり、すなわち体液免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の発生）及び細胞媒介免疫応答（例えばリンパ球の増殖）を含む免疫応答を誘発する試薬である。好ましくはサイトカイン、成長因子、ホルモン、抗ホルモン薬、免疫阻害剤又はコルチコステロイドから選択される。前記サイトカインは、本分野における通常のサイトカインであり、好ましくはキサンチン、インターロイキン又はインターフェロンから選択される。前記成長因子は、本分野における通常の成長因子であり、好ましくはTNF、CSF、GM-CSF又はG-CSFから選択される。前記ホルモンは、本分野における通常のホルモンであり、好ましくはエストロゲン、アンドロゲン又はプロゲステロンから選択される。前記エストロゲンはジエチルスチルベストロール又はエストラジオールであることがより好ましい。前記アンドロゲンはテストステロン又はフルオキシメステロンであることがより好ましい。前記プロゲステロンは酢酸メゲストロール又は酢酸メドロキシプロゲステロンであることがより好ましい。前記コルチコステロイドは、本分野における通常のコルチコステロイドであり、好ましくはプレドニゾン、デキサメタゾン又はヒドロコルチゾンから選択される。前記抗ホルモン薬は、本分野における通常の抗ホルモン薬であり、ホルモンの腫瘍に対する作用を遮断し、サイトカインの発生を抑制し、自己抗原の発現を低下させ、またMHC抗原の免疫阻害剤をマスキングすることができる。好ましくは抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬又は抗アドレナリン薬から選択される。前記抗エストロゲン薬は、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ抑制性4（5）-イミダゾール類、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン又はトレミフェンから選択されることがより好ましい。前記抗アンドロゲン薬はフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロレリン又はゴセレリンから選択される。前記免疫阻害剤は、本分野における通常の免疫阻害剤であり、好ましくは2-アミノ-6アリール-5置換のピリミジン類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、MHC抗原及びMHC断片の抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンA、グルココルチコイドなどのステロイド、ストレプトキナーゼ、TGFb、ラパマイシン、T細胞受容体、T細胞受容体断片、サイトカイン受容体拮抗薬又はT細胞受容体抗体から選択される。前記サイトカイン受容体拮抗薬は、抗インターフェロン抗体、抗IL10抗体、抗TNFa抗体又は抗IL2抗体から選択されることがより好ましい。
【００５０】
ここで、前記血管新生阻害剤は、本分野における通常の血管新生阻害剤であり、好ましくはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、COX-2阻害剤、VEGF阻害剤、bFGF阻害剤、ステロイドサルファターゼ阻害剤、インターロイキン-24、トロンボスポンジン、メタロスポンジンタンパク質、クラスIインターフェロン、インターロイキン12、プロタミン、アンギオスタチン、ラミニン、エンドスタチン又はプロラクチン断片から選択される。より好ましくは2-メトキシエストラジオールビススルファメート（2-MeOE2bisMATE）である。
【００５１】
ここで、前記抗増殖・プロアポトーシス剤は、本分野における通常の抗増殖・プロアポトーシス剤であり、好ましくはPPAR-γ活性化剤、レチノイド、トリテルペノイド、EGF受容体阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレート剤、アポプチン、Bcl-2及びBcl-X（L）の阻害剤、TNF-α/FASリガンド/TNF関連アポトーシス誘発性リガンド及びそのシグナル伝達の活性化剤、又はPI3K-Akt生存経路シグナル伝達阻害剤から選択される。前記PPAR-γ活性化剤は、本分野における通常のPPAR-γ活性化剤であり、好ましくはシクロペンテノンプロスタグランジン（cyPGs）である。前記トリテルペノイドは、本分野における通常のトリテルペノイドであり、好ましくはシクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリエデラン、ダンマラン、ククルビタシン、リモノイド又はトリテルペノイドから選択される。前記EGF受容体阻害剤は、本分野における通常のEGF受容体阻害剤であり、好ましくはHER4、ラパマイシン又は1，25-ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンD）から選択される。前記鉄キレートは、本分野における通常の鉄キレートであり、好ましくは3-アミノピリジン-2-カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾンである。前記アポプチンは、本分野における通常のアポプチンであり、好ましくは鶏貧血ウイルス由来のウイルスタンパク質3-VP3である。前記PI3K-Akt生存経路シグナル伝達阻害剤は、本分野における通常のPI3K-Akt生存経路シグナル伝達阻害剤であり、好ましくはUCN-01又はゲルダナマイシンである。
【００５２】
ここで、前記溶菌酵素は、本分野における通常の溶菌酵素であり、好ましくは、RNA酵素である。
本発明は、好ましくは、式1において、x=y=nである。よって、
好ましい実施例では、-（L）x-（D）yは、
【００５３】
【化１】
2019508023.tif 000004
である。
【００５４】
ここで、mは1〜10であり、好ましくは5である。
好ましい実施例では、-（L）x-（D）yは、
【００５５】
【化２】
2019508023.tif 000005
である。
【００５６】
好ましい実施例では、-（L）x-（D）yは、
【００５７】
【化３】
2019508023.tif 000006
最も好ましくは、前記Dは、チューブリン合成酵素阻害剤−メチルアウリスタチンF（MMAF）であり、前記つなぎLは、マレイミドカプロイル（maleimidocaproyl、MC）であり、前記免疫共役体の構造は、式3で示される。
【００５８】
【化４】
2019508023.tif 000007
又は、前記Lは、スクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートであり、Dは、N2'-デアセチル-N2'-3-メルカプト-1オキソプロピル）-メイタンシン（DM1）であり、前記免疫共役体の構造は、式4で示される。
【００５９】
【化５】
2019508023.tif 000008
又は、Lは、マレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリンp-アミノベンジルアルコールであり、Dは、メチルアウリスタチンE（MMAE）であり、前記免疫共役体の構造は、式5で示される。
【００６０】
【化６】
2019508023.tif 000009
ここで、nは自然数であり、好ましくは1〜20の整数であり、より好ましくは1〜2、又は2-4、又は4〜8、又は8〜20の整数である。
【００６１】
前記免疫共役体の調製方法は本分野における通常の方法であり、好ましくは、Doronina,2006,BioconjugateChem.17,114-124に記載の調製方法を採用する。好ましくは、前記調製方法は、最小限を有する低共役画分（LCF）が10%よりも小さい免疫共役体を生成する。
【００６２】
より好ましくは、前記調製方法は、前記タンパク質をpH6.5〜8.5のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を加え（ただし、前記タンパク質に対するTCEPのモル比率が2〜10）、室温で1〜4時間還元して、反応液Aを得る、工程を含む。反応液Aに対して溶出を行い、不要の前記タンパク質を除去して反応液Bを得た。反応液Bに、MC-MMAFを加え（ただし、精製されたTPBG抗体に対するMC-MMAFのモル比率が5〜20）、10〜37℃で4時間反応した。
【００６３】
前記免疫共役体は、当該分野にて公知のいずれの物理的形態として存在してもよい。好ましくは、清澄液である。
本発明は、さらに、前記免疫共役体と薬学的に許容可能なベクターとを備える医薬組成物を提出する。
【００６４】
前記薬学的に許容可能なベクターは、本分野における通常のベクターであり、前記ベクターは、いずれの適当な生理学的又は薬学的に許容可能な医薬助剤であってもよい。前記医薬助剤は、本分野における通常の医薬助剤であり、薬学的に許容可能な付形剤、充填剤や希釈剤などを含むことが好ましい。より好ましくは、前記医薬組成物は、前記タンパク質0.01〜99.99%と、薬用ベクター0.01〜99.99%とを含み、前記百分率は、前記医薬組成物に占める質量百分率である。
【００６５】
好ましくは、前記医薬組成物は、抗腫瘍薬であり、より好ましくは、扁平上皮/腺肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頸癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、絨毛癌、気管支癌、乳癌、子宮頸癌、膵臓癌又は精嚢癌に対する医薬である。
【００６６】
本発明に記載の医薬組成物の投与経路は、好ましくは、胃腸外投与、注射投与や経口投与である。前記注射投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射や皮下注射などの経路を含むことが好ましい。前記医薬組成物の剤形は、本分野における通常の各種の剤形であり、固体、半固体又は液体のいずれの形式であることが好ましく、即ち、水溶液、非水溶液又は懸濁液、より好ましくは、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤又は輸液剤などであってよい。より好ましくは、血管内、皮下、腹膜内又は肌内経路を介して投与する。好ましくは、前記医薬組成物は、さらに、エアゾール剤又は粗噴霧剤として、即ち、経鼻投与、または鞘内、髄内あるいは心室内経路を介して投与することが可能である。より好ましくは、前記医薬組成物は、さらに、透皮投与、経皮投与、局所投与、腸内投与、膣内投与、舌下投与又は経直腸投与が可能である。
【００６７】
本発明に記載の医薬組成物の投与量のレベルは、所望の診断又は治療結果に達する組成物の量に応じて調整することができる。投与方案は、単回注射であっても複数回注射であってもよく、調整してもよい。選択された用量レベル及び方案は、前記医薬組成物の活性と安定性（即ち、半減期）、製剤、投与経路、他の医薬又は治療との組み合わせ、検査及び/又は治療する疾患又は病症、ならびに治療する被験者の健康状態と病歴などを含む、各種の要因に応じて適当に調整する。
【００６８】
本発明による前記医薬組成物の治療に対する有効量は、最初に、細胞培養実験又は動物モデル、例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ及び/又は霊長類を用いて予測することができる。動物モデルはまた、適当な投与濃度範囲と投与経路を測定するのに用いられてもよい。その後、ヒトにおける有効投与量と投与経路を確定するのに用いられてもよい。一般に、有効投与量又は用量の確定や調整、ならびに調整のタイミングと方法に関する評価は、当業者には知られている。
【００６９】
併用療法については、前記タンパク質、前記免疫共役体及び/又は他の治療又は診断剤は、それぞれ単一薬剤として、所望の治療又は診断を実施するのに適合する任意の時間範囲内で使用することが可能であるため、これらの単一薬剤は、ほぼ同時に（即ち、単一製剤として、または数分間又は数時間内に）、又は順次連続して投与することが可能である。例えば、これらの単一薬剤は、一年以内、又は10、8、6、4、2ヶ月以内、又は4、3、2、1週間以内、又は5、4、3、2、1日以内に投与することが可能である。
【００７０】
製剤、用量、投与方案および計測できる治療結果に関する他の指導は、Berkowら（2000）The Merck Manual of Medical Information（Merck医学情報マニュアル）とMerck&Co.Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi （1998）CRC Desk Reference ofClinical Pharmacology（臨床薬理学マニュアル）などの著作を参照のこと。
【００７１】
本発明は、前記タンパク質の抗腫瘍薬の調製における用途を提供する。
本発明は、前記免疫共役体の抗腫瘍薬の調製における用途を提供する。
本発明は、前記医薬組成物の抗腫瘍薬の調製における用途を提供する。
【００７２】
本発明は、前記タンパク質の腫瘍の治療における用途を提供する。
本発明は、前記免疫共役体の腫瘍の治療における用途を提供する。
本発明は、前記医薬組成物の腫瘍の治療における用途を提供する。
【００７３】
本発明は、さらに、前記タンパク質を、検査試料とインビトロで接触させ、前記タンパク質と前記検査試料の結合を検出すれば良い工程、を含むTPBGタンパク質を過剰発現する細胞の検出方法を提出する。
【００７４】
前記過剰発現とは、本分野における通常の意味であり、好ましくは、検査試料では、フローサイトメトリーを経た細胞における前記タンパク質の平均蛍光強度（MFI）値は、サブクラスIgGのMFI値の3倍以上である。
【００７５】
前記結合の検出方式は、本分野における通常の検出方式であり、好ましくは、FACSによる検出である。
本発明に記載の「TPBG陽性」細胞は、即ち、TPBGタンパク質を過剰発現する細胞である。例えば、NCI-H1568細胞株がある。逆には、「TPBG陰性」細胞と称される。例えば、腫瘍細胞系のNCI-H1770がある。
【００７６】
当該分野における常識に合わせれば、上述した各々の好ましい条件は、任意に組み合わせて本発明の各々の好ましい実施例を得ることが可能である。
本発明で使用する試薬と原料は、いずれも市販されているものを使用することが可能である。
【００７７】
本発明の進歩性及び効果は、本発明に記載のTPBG抗体はキメラ抗体であり、TPBGタンパク質に高い親和性を有し、タンパク質レベルおよび細胞レベルで、TPBGタンパク質共役型受容体の細胞外領域に結合することができる。前記TPBG抗体とMC-MMAFのような低分子化合物とを共役した後、共役体が得られた。前記共役体は、TPBG陽性細胞に細胞傷害作用を効果的に発揮することができる。その他、TPBG抗体は、MMAFのような低分子化合物をエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれて、細胞内において低分子化合物を分解し放出して、細胞傷害作用を発揮することができる。したがって、前記TPBG抗体で調製した抗体共役薬剤は、腫瘍細胞を効果的に傷害し、腫瘍を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図1は、ヒトTPBGタンパク質でトランスフェクトされたHEK293細胞のFACS選別検出結果である。
【図２】図2は、ヒトTPBGタンパク質でトランスフェクトされたCHOK1細胞のFACS選別検出結果である。
【図３】図3は、カニクイザルTPBGタンパク質でトランスフェクトされたCHOK1細胞のFACS選別検出結果である。
【図４】図4は、マウスTPBGタンパク質でトランスフェクトされたCHOK1細胞のFACS選別検出結果である。
【図５】図5は、ELISAによるTPBG免疫後のマウス血清の抗体力価の検出である。
【図６Ａ】図6Aは、ELISAによるTPBG抗体とヒトTPBG-hFcタンパク質との結合反応の検出である。
【図６Ｂ】図6Bは、ELISAによるTPBG抗体とヒトTPBG-hFcタンパク質との結合反応の検出である。
【図７Ａ】図7Aは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1-hTPBGとの結合反応の検出である。
【図７Ｂ】図7Bは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1-hTPBGとの結合反応の検出である。
【図８Ａ】図8Aは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1-cTPBGとの結合反応の検出である。
【図８Ｂ】図8Bは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1-cTPBGとの結合反応の検出である。
【図９Ａ】図9Aは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1-mTPBGとの結合反応の検出である。
【図９Ｂ】図9Bは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1-mTPBGとの結合反応の検出である。
【図１０Ａ】図10Aは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1との結合反応の検出である。
【図１０Ｂ】図10Bは、FACSによるTPBG抗体とCHOk1との結合反応の検出である。
【図１１Ａ】図11Aは、TPBG発現陽性非小肺癌細胞株NCI-H1568に対するTPBG抗体-MMAF抗体架橋剤の細胞傷害作用である。
【図１１Ｂ】図11Bは、TPBG発現陽性非小肺癌細胞株NCI-H1568に対するTPBG抗体-MMAF抗体架橋剤の細胞傷害作用である。
【図１１Ｃ】図11Cは、TPBG発現陽性非小肺癌細胞株NCI-H1568に対するTPBG抗体の細胞傷害作用である。
【図１２Ａ】図12Aは、TPBG発現陰性非小肺癌細胞株NCI-H1770に対するTPBG抗体-MMAF抗体架橋剤の細胞傷害作用である。
【図１２Ｂ】図12Bは、TPBG発現陰性非小肺癌細胞株NCI-H1770に対するTPBG抗体-MMAF抗体架橋剤の細胞傷害作用である。
【図１３】図13は、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1299に対するTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１４Ａ】図14Aは、TPBGキメラ抗体12B12の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、腫瘍体積変化図である。
【図１４Ｂ】図14Bは、TPBGキメラ抗体5G4の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、腫瘍体積変化図である。
【図１４Ｃ】図14Cは、TPBGキメラ抗体39A11の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、腫瘍体積変化図である。
【図１４Ｄ】図14Dは、TPBGキメラ抗体28D4の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、腫瘍体積変化図である。
【図１４Ｅ】図14Eは、TPBGキメラ抗体36A10の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、腫瘍体積変化図である。
【図１５Ａ】図15Aは、TPBGキメラ抗体12B12の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、マウス体重変化図である。
【図１５Ｂ】図15Bは、TPBGキメラ抗体5G4の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、マウス体重変化図である。
【図１５Ｃ】図15Cは、TPBGキメラ抗体39A11の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、マウス体重変化図である。
【図１５Ｄ】図15Dは、TPBGキメラ抗体28D4の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、マウス体重変化図である。
【図１５Ｅ】図15Eは、TPBGキメラ抗体36A10の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、マウス体重変化図である。
【図１６Ａ】図16Aは、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1299に対するTPBGキメラ抗体12B12及びその異なる低分子薬を共役した抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１６Ｂ】図16Bは、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1299に対するTPBGキメラ抗体12B12及びその異なる低分子薬を共役した抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１６Ｃ】図16Cは、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1568に対するTPBGキメラ抗体12B12及びその異なる低分子薬を共役した抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１６Ｄ】図16Dは、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1568に対するTPBGキメラ抗体12B12及びその異なる低分子薬を共役した抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１７Ａ】図17Aは、TPBG陽性のTPBGを発現する293-hTPBG安定発現細胞株に対するTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１７Ｂ】図17Bは、TPBG陽性のTPBGを発現する293-hTPBG安定発現細胞株に対するTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１７Ｃ】図17Cは、TPBGを発現しない293細胞株に対するTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【図１７Ｄ】図17Dは、TPBGを発現しない293細胞株に対するTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害作用である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
以下に、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に制限するものではない。以下の実施例では、具体的な条件が注記されていない実験方法は、通常の方法や条件、または製品説明に応じて選択する。
【００８０】
実施例に記載の室温は、本分野における通常の室温であり、一般に、10〜30℃である。
特に言及しない限り、実施例に記載のPBSは、pH7.2のPBSリン酸緩衝液である。
【００８１】
実施例1 TPBG抗体の調製
ヒトTPBGタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列32-355（Ser32-Ser355）（ただし、ヒトTPBGタンパク質をコードするヌクレオチド配列のGenebankにおける番号はGenebank ID:AAH37161.1）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をヒトIgG Fc断片（hFc）を有するpCpCベクター（Invitrogenから購入、V044-50）にクローリングし、既知の標準分子生物学方法により、プラスミドを調製した。具体的な方法はSambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.（1989）. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition（Plainview, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照のこと。HEK293細胞（Invitrogenから購入）に対して、一過性トランスフェクト（Transient transfection）（ポリエーテルイミド、PEI、Polysciencesから購入）を行い、FreeStyle TM 293（Invitrogenから購入）を使用して、37℃で拡大培養した。4日後、細胞培養液を回収し、遠心分離して細胞成分を除去して、TPBGタンパク質細胞外領域を含む培養上澄を得た。培養上澄をタンパク質Aアフィニティーカラム（Mabselect Sure、GE Healthcareから購入）に仕込みし、同時に紫外線（UV）検出計により紫外線吸収値（A280nm）の変化を検出する。仕込み後、タンパク質Aアフィニティーカラムを、PBSリン酸塩緩衝液（pH7.2）で、紫外線吸収値が基準線に戻るまで洗淨した。そして、0.1Mグリシン塩酸（pH2.5）で溶出し、タンパク質AアフィニティーカラムからhFcタグ付きTPBGタンパク質（即ち、ヒトTPBG-hFc）を溶出し回収した。PBSリン酸塩緩衝液（pH7.2）により、4℃冷蔵庫で一晩透析した。透析した後のタンパク質を、0.22ミクロンで無菌濾過してから分注して-80℃に保存して、精製された免疫原Aを得た。
【００８２】
免疫原Aは使用前に、そのタンパク質の濃度、純度、分子量、生物活性などの検出のような一連のQC検出が必要である。その結果、免疫原Aは、各指標が良好であり、抗原として次のTPBG抗体調製試験を行うことが可能である。
【００８３】
（二）、免疫原Bの調製
ヒトTPBGの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ただし、ヒトTPBGタンパク質をコードするヌクレオチド配列のGenebankにおける番号は、Genebank ID:AAH37161.1）は、pIRESベクター（Clontechから購入）にクローリングされ、プラスミドは調製された。HEK293細胞系とCHOK1細胞系（いずれもInvitrogenから購入）に対して、プラスミドトランスフェクション（PEI、Polysciencesから購入）をした後、10%（w/w）ウシ胎児血清を0.5μg/ml含むDMEM培地において、選択的に2週間培養して、限界希釈法で96ウェル培養プレートでサブクローニングし、37℃、5%（v/v）CO2で培養し、約2週間後、一部のモノクローナルウェルを選択して6ウェルプレートに増幅した。増幅後のクローンに対して、既知のTPBG抗体（Sigmaから購入、カタログ番号#SAB1404485）で、フローサイトメトリーで選別した。成長が良好で、蛍光強度が高いモノクローナル細胞系を選択して、拡大培養を継続し、液体窒素により凍結して、免疫原Bを得た。具体的な選択結果は、表3と図1に示される。対照IgGサブクラスは対照マウスIgGである。表3から、一連のTPBG発現陽性HEK293細胞系が作成されたことが明らかになる。図1では、横座標は細胞蛍光強度で、縦座標は細胞数である。図1の結果から分かるように、5E5E9はTPBGが高レベルで発現する細胞株である。ここで、抗TPBG抗体で標識された細胞は、平均細胞蛍光密度が216であり、移動度が98.5%である。
【００８４】
【表３】
2019508023.tif 000010
（三）、ハイブリドーマ細胞の調製及び抗体選別
A、免疫原Aによる免疫
6〜8週齢のBALB/cAnNCrlマウス又はSJL/JorllcoCrlマウス（いずれも上海SLAC会社から購入）を採用し、マウスをSPF条件で飼育した。初回の免疫に際しては、免疫原Aをフロイント完全アジュバントで乳化した後、0.25mL腹腔内注射し、すなわちマウス1匹毎に、免疫原Aタンパク50μgを注射した。強化免疫に際しては、免疫原Aをフロイント不完全アジュバントで乳化した後、0.25mL腹腔内注射し、すなわちマウス1匹毎に、免疫原Aを50マイクログラム注射した。初回免疫と一回目の強化免疫との間は2週間を隔て、それから毎回の強化免疫を3週間を隔てて行った。毎回の強化免疫から1週間後に採血し、ELISA及びFACSにて血清における免疫原Aの抗体力価及び特異性を測定し、その結果を図5及び表4に示した。表4から明らかなように、免疫原Aで免疫されたマウスの免疫後血清はいずれも、免疫原Aに対して異なる程度で結合しており、抗原抗体反応を示し、そのうちの最高希釈度が百万程度であった。ここで、ブランク対照は1%（w/w）BSAであり、バッチとは二回目の強化免疫後から七日目のマウス血清のことを指し、表中のデータはOD450nm値である。
【００８５】
【表４】
2019508023.tif 000011
B、免疫原Bによる免疫
6〜8週齢のBALB/cAnNCrlマウス又はSJL/JorllcoCrlマウス（いずれも上海SLAC会社から購入）を採用し、マウスをSPF条件で飼育した。ヒトTPBGの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するpIRESプラスミド[実施例1の工程（二）を参照]でHEK293細胞系をトランスフェクトすることによって、ヒトTPBGを含有するHEK293安定細胞系を得た（トランスフェクトにはX-treme GENE HP DNA Transfection Reagentを使用し、Roche会社から購入し、品番号Cat #06 366 236 001、明細書に従って操作する）。T-75細胞培養ボトルで凝集度90%になるまで拡大培養を行い、培地をなくなるまで吸引して除去し、DMEM基礎培地（Invitrogenから購入）で2回洗浄し、その後、細胞がシャーレ壁から脱落可能になるまで、37℃で無酵素細胞解離液（Invitrogenから購入）を用いて処理し、細胞を回収した。DMEM基礎培地で2回洗浄し、細胞をカウントした後、リン酸塩緩衝液にて2×107cell/mLになるまで希釈した。免疫のたびに、マウス1匹毎に0.5mL細胞懸濁液を腹腔内注射した。一回目と二回目の免疫の間は2週間を隔て、それから毎回の免疫を3週間を隔てて行った。一回目の免疫以外、毎回の免疫から1週間後に採血し、FACSにて血清における抗体力価及び特異性を測定した。二回目の強化免疫の後、FACSによる血清の抗体力価が1:1000以上になった。
【００８６】
工程A〜Bを完成する前、最後の免疫のために、選ばれたマウス1匹毎に精製された免疫原A（免疫原Aに対して免疫反応を行うマウス）又はヒトTPBGを含有するHEK293安定細胞系（免疫原Bに対して免疫反応を行うマウス）を100マイクログラム腹腔内注射し、5日間後にマウスを殺死し、脾細胞を回収した。終濃度が1%（w/w）になるまでNH4OHを加え、脾細胞にドープされた赤血球を分解し、脾細胞懸濁液を得た。DMEM基礎培地を用いて1000rpmで細胞を3回遠心洗浄し、その後活細胞数の比が5:1でマウス骨髄腫細胞SP2/0（ATCCから購入）と混合させ、高効率電気融合方法（METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220を参照）を用いて細胞融合を行った。融合後の細胞を20%（w/w）ウシ胎児血清、1×HATを含有するDMEM培地に希釈した。その後、1×105/200μL/wellで96ウェル細胞培養プレートに添加し、5%（v/v）CO2、37℃のインキュベーターに入れて培養した。14日間後、ELISA及びAcumen（マイクロウェルプレート細胞測定法）にて細胞融合プレートの上澄みを選別し、ELISAにおけるOD450nm＞1.0の、及びAcumenにおけるMFI値＞100の陽性クローンを24ウェルプレートに増幅し、10%（w/w）HTウシ胎児血清を含有するDMEM（invitrogen）で、37℃、5%（v/v）CO2の条件で拡大培養した。3日間培養した後、24ウェルプレートで拡大培養した培養液を遠心し、上澄み液を回収し、上澄み液に対して抗体サブクラス分析を行い、ELISA、FACSを用いてTPBGタンパク及びTPBG陽性細胞に対する結合活性を確認し（結合活性の測定方法はそれぞれ実施例3Aと実施例3B中の関連内容を参照）、またマウスTPBG抗体-MMAFによる間接的細胞傷害実験を行った（間接的細胞傷害活性の測定方法は実施例4中の関連内容を参照）。
【００８７】
24ウェルプレートの選別結果から、ELISA実験中のOD450nm＞1.0、FACS実験中のMFI値＞50、及び間接的細胞傷害実験中のハイブリドーマ細胞を培養した上澄みのTPBG陽性細胞に対する傷害率50%になったハイブリドーマ細胞を選別して条件を満たす陽性クローンとし、条件を満たすハイブリドーマ細胞を選んで限界希釈法を利用して96ウェルプレートでサブクローニングを行い、10%（w/w）FBSを含有するDMEM培地（invitrogenから購入）で37℃、5%（v/v）CO2の条件で培養した。サブクローニングから10日目にELISA及びAcumenで初期選別を行い、単一の陽性モノクローンを24ウェルプレートに増幅して培養を続いた。3日間後、FACSにより抗原結合陽性を確認し、マウスTPBG抗体-MMAFによる間接的細胞傷害実験により生体活性を評価し、評価基準は、ELISA実験においてOD450nm＞1.0、FACS実験においてMFI値＞50、並びに間接的細胞傷害実験においてハイブリドーマ細胞を培養した上澄みのTPBG陽性細胞に対する傷害率が50%及びそれ以上になることである。
【００８８】
24ウェルプレートの試料測定結果から、最適なクローンを選別し、10%（w/w）FBSを含有するDMEM培地（invitrogenから購入）で37℃、5%（v/v）CO2の条件で当該最適なクローンを拡大培養し、液体窒素で冷凍保管して本発明に係るハイブリドーマ細胞を得、次のリード抗体の獲得、抗体の生産及び精製に用いられる。
【００８９】
実施例2  リード抗体の生産及び精製
ハイブリドーマ細胞による抗体濃度は、約1-10μg/mLと低く、濃度変化が大きく。また培地での細胞培養による多種類のタンパクや培地に含まれるウシ胎児血清は、多くの生体活性分析方法に対して異なる程度で障害するので、小規模（1-5mg）の抗体の生産精製を行う必要がある。
【００９０】
実施例1で得られたハイブリドーマ細胞をT-75細胞培養ボトルに播種して生産培地（Hybridoma serum free medium、Invitrogen会社から購入）で適応させて3代継代培養した。その成長状態が良好になったら、細胞培養ローラーボトルに播種した。2Lの培養ローラーボトル毎に生産培地200mLを添加し、播種細胞の密度が1.0×105/mLであった。蓋を固く締めて、ローラーボトルを37℃のインキュベーター中のセルローラーに置き、回転数を3rpmとした。14日間連続して回転培養した後、細胞培養液を回収し、細胞をろ過して除去し、0.45μmのろ過膜で培養上澄み液が澄んだまでろ過し、澄んだハイブリドーマ細胞の培養上澄み液を得た。澄んだハイブリドーマ細胞の培養上澄み液は直ちに精製してもよく、或いは-30℃で冷凍保管してもよい。
【００９１】
得られた培養上澄み液（200mL）におけるTPBG抗体を、2mLタンパクAカラム（GE Healthcareから購入）で精製した。タンパクGカラムを、まず平衡緩衝液（PBSリン酸緩衝液、pH7.4）で平衡化し、その後培養上澄み液をタンパクAカラムにロードし、流速を3mL/分に制御した。ロードが完了した後、平衡緩衝液によりタンパクGカラムを洗浄し、平衡緩衝液の体積がタンパクAカラムベッド体積の4倍であった。溶出液（0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH3.5）でタンパクAカラムに結合したTPBG抗体を溶出させ、紫外検出器を用いて溶出状況（A280nm紫外吸収ピーク）をモニタリングした。溶出させた抗体を回収し、10%（v/v）1.0M Tris-HCl緩衝液を加えてpHを中和した直後、PBSリン酸緩衝液により一晩透析し、翌日液を1回換えて透析を3時間続いた。透析されたTPBG抗体を回収し、0.22μmのフィルターで無菌ろ過し、無菌保管することにより、精製されたTPBG抗体を得た。
【００９２】
精製されたTPBG抗体については、タンパク濃度（A280nm/1.4）、純度、エンドトキシン（Lonzaキット）などの検出分析を行い、結果を表5に示した。表5から明らかなように、抗体の最終製品におけるエンドトキシン濃度が1.0EU/mg以下であった。
【００９３】
【表５】
2019508023.tif 000012
実施例3  リード抗体の検定
A、酵素結合免疫吸着実験（ELISA）によるTPBG抗体とTPBGタンパクとの結合測定
実施例2で得られた精製されたTPBG抗体をヒトTPBG-hFcタンパク（免疫原A）と反応させた。
【００９４】
実施例1で得られた精製された免疫原A（その調製方法は実施例1の工程（一）を参照）をPBSで終濃度1.0μg/mLになるまで希釈し、その後100μL/wellで96ウェルELISAプレートに加えた。プラスチックフィルムにより密閉して4℃で一晩インキュベートし、翌日プレート洗浄液[0.01%（v/v）Tween20を含有するPBS]で2回洗浄し、遮断液[0.01%（v/v）Tween20及び1%（w/w）BSAを含有するPBS]を加えて室温で2時間遮断した。遮断液を流し、100μL/wellで実施例2で得られた精製されたTPBG抗体を加えた。37℃で2時間インキュベートした後、プレート洗浄液[0.01%（v/v）Tween20を含有するPBS]で3回洗浄した。HRP（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）標識二次抗体（Sigmaから購入）を加え、37℃で2時間インキュベートした後、プレート洗浄液[0.01%（v/v）Tween20を含有するPBS]で3回洗浄した。100μL/wellでTMB基質を加え、室温で30分間インキュベートした後、100μL/wellで停止液（1.0N HCl）を加えた。ELISAプレートリーダー（SpectraMax 384plus、Molecular Deviceから購入）でA450nmの数値を読み、結果を図6及び表6に示した。表6から明らかなように、精製されたTPBG抗体とTPBG組換えタンパクとはELISAレベルで結合した。表6におけるIgG対照は、対照マウスIgGであり、表中のデータはOD450nm値であり、BlankとはプレートでPBS緩衝液のみがあるときのOD450nm値である。
【００９５】
【表６】
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B、フローサイトメトリー実験（FACS）によるTPBG抗体とTPBG発現細胞との結合測定
実施例1の工程（二）で記載のヒトTPBGの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するpIRESプラスミドでCHOK1細胞株をトランスフェクトしてヒトTPBGを含有するCHOK1安定細胞株（ここで、CHOk1-hPD1安定細胞株という）を得た。同様に、サルTPBG全長遺伝子を含有するpIRESプラスミド（その調製方法は、実施例1の工程（一）“免疫原Aの調製”におけるヒトIgG Fc断片（hFc）を含有するpCpCベクターの調製方法と同じである。蟹食猿TPBGの全長アミノ酸配列（Genebank ID: BAE00432.1））でCHOK1細胞株をトランスフェクトしてサルTPBGを含有するCHOK1安定細胞株（ここで、CHOk1-cTPBG安定細胞株という）を得た。マウスTPBG全長遺伝子を含有するpIRESプラスミド（その調製方法は、実施例1の工程（一）“免疫原Aの調製”におけるヒトIgG Fc断片（hFc）を含有するpCpCベクターの調製方法と同じである。マウスTPBG全長アミノ酸配列（Genebank ID: CAA09931.1））でCHOK1細胞株をトランスフェクトしてマウスTPBGを含有するCHOK1安定細胞株（ここで、CHOk1-mTPBG安定細胞株という）を得た。
【００９６】
FACSにより血清におけるTPBG抗体の力価及び特異性を測定し、測定方法は実施例1の工程（二）“免疫原Bの調製”におけるHEK293-hTPBG安定細胞株の同定方法を参照した。測定結果を表7及び図2〜4に示し、図2〜4は横座標が細胞蛍光強度で、縦座標が細胞数である。ここで、CHOK1-hTPBG 3A2F1は選別のためのヒトTPBG発現細胞株であり、そのFACS選別測定結果を図2に示し、CHOK1-cTPBG 3F13G4は選別のための蟹食猿TPBG発現細胞株であり、そのFACS選別測定結果を図3に示し、CHOK1-mTPBG 3A3は選別のためのマウスTPBG発現細胞株であり、そのFACS選別測定結果を図4に示した。表7の結果から明らかなように、CHOk1-hTPBG安定細胞株、CHOk1-cTPBG安定細胞株及びCHOk1-mTPBG安定細胞株の細胞膜ではそれぞれヒト、サル又はマウスのTPBGタンパクを過剰発現し、TPBG抗体の選別に用いられる。
【００９７】
【表７】
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CHOk1-hTPBG安定細胞株、CHOk1-cTPBG安定細胞株、CHOK1-mTPBG安定細胞株（すなわち表7に示されたCHOk1-hTPBG 3A2F1、CHOk1-cTPBG 3F13G4及びCHOk1-mTPBG 3A3）及びCHOK1細胞をそれぞれT-75細胞培養ボトルで凝集度90%になるまで拡大培養を行い、培地をなくなるまで吸引して除去し、HBSS緩衝液（Hanks Balanced Salt Solution）（Invitrogenから購入）で2回洗浄し、その後、無酵素細胞解離液（Versene solution：Life technology会社から購入）を用いて処理し、細胞を回収した。HBSS緩衝液で細胞を2回洗浄し、細胞をカウントした後、HBSS緩衝液で2×106cell/mLになるまで希釈し、10%ヤギ血清遮断液を加え（前記パーセントが質量パーセントである）、氷で30分間インキュベートした後、HBSS緩衝液で2回遠心洗浄した。回収された細胞をFACS緩衝液（HBSS+1%BSA、前記パーセントが質量パーセントである）で2×106cell/mLになるまで懸濁させ、100μL/wellで96ウェルFACS反応板に加え、100μL/wellで実施例2で得られた精製されたTPBG抗体検査試料を加え、氷で2時間インキュベートした。FACS緩衝液で2回遠心洗浄し、100μL/wellで蛍光（Alexa 488）標識二次抗体（Invitrogenから購入）を加え、氷で1時間インキュベートした。FACS緩衝液で3回遠心洗浄し、100μL/wellで固定液[4%（v/v）パラホルムアルデヒド]を加えて細胞を再懸濁させ、10分間後にFACS緩衝液で2回遠心洗浄した。100μLのFACS緩衝液により細胞を懸濁させ、FACS（FACS Calibur、BD会社から購入）を用いて結果を測定して分析した。ソフトウェア（CellQuest）でデータ解析を行い、細胞の平均蛍光強度（MFI）を得た。さらに、ソフトウェア（GraphPad Prism5）で解析、データフィッティングを行い、EC50値を算出した。分析結果を表8及び図7〜10に示し、図7〜10のデータが細胞の平均蛍光強度（MFI）である。表8におけるデータはMFIから算出したEC50値であった。表8から明らかなように、TPBG抗体は細胞表面のTPBGタンパクと結合できた。
【００９８】
【表８】
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実施例4 TPBG抗体薬物共役体の細胞傷害活性実験
実施例2で得られた精製されたTPBG抗体をpH6.5〜8.5のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を加え（ただし、TCEPと精製されたTPBG抗体とのモル比率は2である）、室温で1時間還元して、反応液Aを得た。反応液AをG25カラム（GEから購入）にて脱塩し、不要なTCEPを除去して、反応液Bを得た。反応液BにMC-MMAF（南京聯寧から購入）を加え（ただし、MC-MMAFと精製されたTPBG抗体とのモル比率は5である）、室温で4時間反応した。更に、不要なMC-MMAFを中和するようにシステインを加え、G25カラム脱塩によって不要な低分子を除去して、精製されたTPBG抗体薬物共役体を得た（共役方法はDoronina、2006、BioconjugateChem.17,114〜124を参照）。HICにより薬物の架橋率、純度などのパラメータを分析した後、細胞毒性活性分析を行った。抗体共役体の薬物架橋率（DAR）は、いずれも8である。ここで、DAR（drugAntibody ratio）とは、抗体共役後の一つの抗体分子が有する低分子薬の平均数をいう。
【００９９】
得られた精製されたTPBG抗体薬物共役体をそれぞれFull培地を使用して段階希釈し、96ウェル細胞培養プレートに、2000cells/wellでTPBG陽性NCI-H1568細胞株の（ATCCから購入、カタログ番号#CRL5876）細胞懸濁液100μｌを加え、一晩培養した後、ウェルごとに、濃度の異なる精製されたTPBG抗体薬物共役体の希釈液10μｌを加え、続いて5日間培養した後、CellTiter-Gloキット（Promegaから購入、使用方法は製品説明を参照）を使用して、細胞活力を検出した。同時に、TPBG陰性腫瘍細胞系NCI-H1770（ATCCから購入、カタログ番号#CRL5893）を選択して、上述したように、細胞傷害活性を検出した。結果は表9及び図11〜12に示される。ここで、表9におけるEC50とは、医薬が作用した後、細胞の活性が抑えられた半数効果用量であり、細胞の活性を検出することで細胞傷害活性を反映することができる。ここで、図11Aと11Bは、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1568に対する精製されたTPBG抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出であり、図12Aと12Bは、TPBG陰性腫瘍細胞系NCI-H1770に対する精製されたTPBG抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出である。その結果から、精製されたTPBG抗体薬物共役体は、TPBG陽性細胞に対する傷害作用を有することが明らかになる。
【０１００】
それ他、実施例4におけるTPBG抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出方法と同じ方法で、実施例2で得られた精製されたTPBG抗体を単独で使用した場合の細胞に対する傷害作用を検出した。結果は、表9及び図11Cに示される。その結果から、単独で使用した精製されたTPBG抗体はTPBG陽性細胞に対して著しい傷害作用を有していないことが明らかになる。
【０１０１】
【表９】
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実施例5 競合ELISAによるTPBG抗体と抗原のエピトーププロフィールの検出分析
抗原対する抗体の結合部位を検証するために、ELISA競合法でTPBG抗体をグルーピングした。
【０１０２】
精製された検出抗体を、PBSで1μg/mLに希釈し、50μL/wellで96ウェル酵素高吸着酵素標記プレートを被覆し、4℃で一晩被覆した後、250μｌブロッキング液[0.01%（v/v）Tween20と1%（w/w）BSAを含むPBS]で、室温で一時間ブロッキングし、ウェルごとに、0.05μg/mLのビオチンで標記された組換えTPBGタンパク質を加えた。同時に、5μg/mLの競合抗体を加え、実施例2で得られた精製されたTPBG抗体を得た。そのクローン番号は、それぞれ12B12C7C3、5G4H10G5、37H9C5G2、39A11G5F2、52C9E9F6、28D4E6A9、36A10D8B12、99E12C7H1、103E2E9C2、106D5G3D10である。そして、25〜37℃で1〜2時間インキュベートした。プレート洗浄液[0.01%（v/v）Tween20を含むPBS]でプレートを3回洗浄し、HRP（ホースラディシュペルオキシダーゼ）で標記されたストレプトアビジン（Sigmaから購入）を加えた。37℃で0.5時間インキュベートした後、プレート洗浄液[0.01%（v/v）Tween20を含むPBS]でプレートを3回洗浄した。TMB基質を100μL/well加え、室温で30分間インキュベートした後、停止液（1.0N HCl）を100μL/well加えた。ELISAプレートリーダー（SpectraMax 384plus、Molecular Deviceから購入）でA450nm値を読み取り、結果を図6に示す。A450nm値から、互いの、抗体同士の競合率を算出し、結果を表10に示す。競合率の値が高いほど、二つの抗体同士の抗原表面が近いことを表している。
【０１０３】
【表１０】
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ここで、Aとは、各行が被覆抗体であり、濃度が1μg/mLであることをいう。Bとは、各行が競合抗体であり、濃度が5μg/mLであることをいう。
【０１０４】
結果から、12B12C7C3と106D5G3D10とは互いに競合できる類似するエピトープであり、5G4H10G5と99E12C7H1とは互いに競合できる類似するエピトープであり、37H9C5G2と36A10D8B12とは互いに競合できる類似するエピトープであり、39A11G5F2と52C9E9F6とは互いに競合できる類似するエピトープであり、28D4E6A9と103E2E9C2とは互いに競合できる類似するエピトープであることが明らかになる。
【０１０５】
実施例6 軽鎖重鎖可変領域のアミノ酸配列の測定
total RNA分離：遠心遠心分離によって実施例1で得られたハイブリドーマを5×107個回収し、1mL Trizolを加え、均一に混合して1.5mL遠心チューブに移し、室温で5分間静置した。クロロホルム0.2mLを加え、15秒振とうして、10分間静置してから4℃、12000gで5分間遠心した。上清を取り、新しい1.5mL遠心チューブに移した。イソプロパノ−ルを0.5mL加え、チューブ内の液を軽く均一に混合して、室温で10分間静置した後、4℃、12000gで15分間遠心し、上澄を廃棄した。75%（v/v）エタノールを1mL加え、軽く沈殿物をリンスし、4℃、12000gで5分間遠心してから上澄を廃棄した。沈殿物を乾してからDEPCで処理したH2Oを加え、溶解（10分間の55℃水浴で溶解を促進）して、total RNAを得た。
【０１０６】
逆転写とPCR：total RNAを1μg取り、20μLシステムを配置し、逆転写酵素を加え、42℃で60分間反応し、7℃で10分間反応して反応を停止した。1μLCDNA、各種のプライマー25pmol、1μL DNAポリメラ−ゼ及び対応する緩衝システム、250μmol dNTPsを含む50μL PCRシステムを配置し、PCRプログラムを設置し、95℃で3分間予変性して、95℃で30秒変性し、55℃で30秒アニーリングし、72℃で35秒伸ばし、35個のサイクルをした後、72℃でさらに5分間伸ばして、PCR生成物を得た。ここで、逆転写に使用するキットはPrimeScript RT Master Mix（Takaraから購入、カタログ番号はRR036）である。PCRに使用するキットは、Q5ハイパフォーマンス酵素（NEBから購入、カタログ番号M0492）を含んでいる。
【０１０７】
クローンとシーケンシング：PCR生成物を5μL取り、アガロースゲル電気泳動を行った。検出した陽性試料をカラム回収キットを使用して精製した。ここで、回収キットはNucleoSpin（登録商標）Gel & PCR Clean-up（MACHEREY-NAGELから購入、カタログ番号740609）である。架橋反応（試料50ng、Tベクター50ng、架橋酵素0.5μL、緩衝液1μL、反応システム10μL）を行い、16℃で半時間反応して、架橋生成物を得た。ここで、架橋キットは、T4 DNA架橋酵素（NEBから購入、カタログ番号M0402）である。架橋生成物を5μL取り、100μLのコンピテント細胞（Ecos 101competentCells、Yeasternから購入、カタログ番号FYE607）に加え、5分間氷浴してから、42℃で1分間水浴熱激し、再び氷上に置いて、1分間後、抗生物質のないSOC培地を650μL加え、37℃でシェーカー上に200RPMのスピードで30分間蘇生した。200μLを取り出し、抗生物質を含むLB固体培地に塗布してから37℃でインキュベータで一晩培養した。翌日、Tベクター上プライマーM13FとM13Rを使用して、30μLPCRシステムを配置し、コロニーPCRをして、ピペットのヘッドにより、コロニーをディップしてPCR反応システムにおいて吹出吸込し、0.5μLを吸込してもう一つの100nMアンピシリンを含むLB固体培養皿に点在して、菌株を保存した。PCR反応終了した後、5μLを取り出し、アガロースゲル電気泳動を行い、陽性試料に対してシーケンシングと分析[Kabat、「Sequences of Proteins of Immunological Interest、」National Institutes of Health、Bethesda、Md.（1991）を参照]を行った。シーケンシング結果は、表11〜12に示される。
【０１０８】
【表１１】
2019508023.tif 000018
ここで、表11における数は、配列表における配列番号である。例えば、12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID No.1であり、12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1のアミノ酸配列はSEQ ID No.2である。
【０１０９】
【表１２】
2019508023.tif 000019
ここで、表12における数は、配列表における配列番号である。例えば、12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域をコードするヌクレオチド配列はSEQ ID No.81である。
【０１１０】
ここで、12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.81における91位から105位までであり；
12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.81における151位から198位までであり；
12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.81における295位から327位までであり；
12B12C7C3の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.82における70位から114位までであり；
12B12C7C3の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.82における157位から180位までであり；
12B12C7C3の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.82における277位から303位までであり；
5G4H10G5の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.83における91位から105位までであり； 
5G4H10G5の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.83における148位から198位までであり；
5G4H10G5の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.83における295位から330位までであり；
5G4H10G5の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.84における70位から102位までであり；
5G4H10G53の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.84における148位から168位までであり；
5G4H10G5の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.84における265位から288位までであり；
37H9C5G2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.85における91位から105位までであり；
37H9C5G2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.85における151位から198位までであり；
37H9C5G2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.85における295位から327位までであり；
37H9C5G2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.86における70位から102位までであり；
37H9C5G2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.86における148位から168位までであり；
37H9C5G2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.86における265位から291位までである。
【０１１１】
39A11G5F2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.87における91位から105位までであり；
39A11G5F2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.87における151位から198位までであり；
39A11G5F2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.87における295位から315位までであり；
39A11G5F2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.88における70位から102位までであり；
39A11G5F2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.88における148位から168位までであり；
39A11G5F2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.88における265位から291位までである。
【０１１２】
52C9E9F6の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.89における91位から105位までであり；
52C9E9F6の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.89における151位から198位までであり；
52C9E9F6の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.89における295位から315位までであり；
52C9E9F6の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.90における70位から102位までであり；
52C9E9F6の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.90における148位から168位までであり；
52C9E9F6の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.90における268位から291位までである。
【０１１３】
28D4E6A9の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.91における91位から105位までであり；
28D4E6A9の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするのヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.91における148位から198位までであり；
28D4E6A9の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.91における295位から327位までであり；
28D4E6A9の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.92における70位から102位までであり；
28D4E6A9の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.92における148位から168位までであり；
28D4E6A9の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.92における265位から291位までである。
【０１１４】
36A10D8B12の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.93における91位から108位までであり；
36A10D8B12の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.93における154位から198位までであり；
36A10D8B12の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.93における295位から324位までであり；
36A10D8B12の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.94における70位から102位までであり；
36A10D8B12の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.94における148位から168位までであり；
36A10D8B12の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.94における265位から291位までである。
【０１１５】
99E12C7H1の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.95における91位から105位までであり；
99E12C7H1の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.95における151位から198位までであり；
99E12C7H1の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.95における295位から318位までであり；
99E12C7H1の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.96における70位から102位までであり；
99E12C7H1の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.96における148位から168位までであり；
99E12C7H1の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.96における265位から291位までである。
【０１１６】
103E2E9C2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.97における91位から105位までであり；
103E2E9C2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.97における151位から198位までであり；
103E2E9C2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.97における295位から324位までであり；
103E2E9C2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.98における70位から105位までであり；
103E2E9C2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.98における151位から171位までであり；
103E2E9C2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.98における268位から294位までである。
【０１１７】
106D5G3D10の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.99における91位から105位までであり；
106D5G3D10の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.99における151位から198位までであり；
106D5G3D10の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.99における295位から318位までであり；
106D5G3D10の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.100における70位から99位までであり；
106D5G3D10の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.100における145位から165位までであり；
106D5G3D10の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.100における262位から294位までである。
【０１１８】
実施例7 マウス-ヒトキメラ抗体の構築、並びに抗体の生産及び精製
1.プラスミドの構築と準備
実施例6にかかるシーケンシングの結果に応じて、TPBG抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の配列を明らかにした。実施例2と実施例3で得られたリード抗体の重鎖可変領域の配列を、信号ペプチド及びヒト抗体重鎖IgG1定常領域を含む発現ベクターに組み換え（ただし、発現ベクターが、Invitrogenから購入され、組換え工程も、上海睿智化学会社によってなされる）、TPBG抗体の軽鎖可変領域の配列を、信号ペプチド及びヒト抗体軽鎖kappaの定常領域を含む発現ベクターに組み換え、組換えプラスミドを取得し、シーケンシングによって検証した（シーケンシング方法は、実施例6におけるシーケンシング方法と同じである）。アルカリ溶菌法によって、キット（MACHEREY-NAGELから購入）から、純度が向上した組換えプラスミドを質量500μg以上量り取り、0.22μmのろ過膜（Milloporeから購入）によって濾過し、トランスフェクションに供する。
【０１１９】
2.細胞のトランスフェクション
培地Freestyle 293 expression medium（Invitrogenから購入）に、293E細胞（Invitrogenから購入）を培養する。シェーカーは、37℃、130RPM、及び8%CO2（v/v）とされる。Freestyle 293 expression mediumは、トランスフェクション時に、10%（v/v）F68（Invitrogenから購入）が、F68終濃度が0.1%（v/v）になるまで加えられることによって、0.1%（v/v）F68を含むFreestyle 293発現培地、即ち、培地Aを得た。培地A 5mLとPEI（Sigmaから購入）200μg/mLとを取り均一に混合することで、培地Bを得た。培地A 5mLと、工程（1）で得られた組換えプラスミド100μg/mLとを均一に混合することで、培地Cを得た。5分間後、培地Bと培地Cとを合わせて均一に混合し、15分間静置し、混合液Dを得た。10mLの混合液Dを、293Eの細胞密度が1.5×106個/mLになるまで、100mLの293E細胞を含む培地Freestyle 293 expression mediumに徐々に加えるながら、振動することで、PEIが集中しすぎることを回避し、そして、シェーカーに入れて培養を行った。翌日、ペプトンを、終濃度が0.5%（w/v）になるまで加えた。5〜7日目、培養液抗体力価を測定した。6〜7日目、上澄を遠心（3500RPM、30分間）収集し、0.22μmろ過膜によって濾過することで、濾過した細胞上澄液を取得し、精製に供する。
【０１２０】
3.抗体精製
連続して生産した内毒素のないカラム及びProtein Aフィラーに対して、0.1MのNaOHで30分間処理し、もしくは5つのカラム容量が0.5MのNaOHで洗い流した。また、長期間に亘り使用していないカラム材とカラムに対して、少なくとも1MのNaOHで1時間含浸し、内毒のない水で中性になるまで洗い流し、10倍カラム容量の1%Triton X100でカラム材を洗浄した。5つのカラム容量のPBSで平衡し、濾過した細胞上澄をカラムにロードし、必要に応じてフロースルーを収集した。カラムロードが完成した後、5倍カラム容量のPBSで洗浄した。5倍カラム容量の0.1MのpH3.0のGlycine-HClによって溶離して、溶離液を収集し、1/10容量のpH8.5の1M Tris-HCl（1.5M NaCl）によって中和した。抗体を取得した後、1×PBSに一晩透析し、内毒素汚染を回避した。透析が終了した後、分光光度又はキットで濃度を測定し、HPLC-SECで抗体純度を測定し、内毒素検出キット（Lonzaから購入）によって抗インビボ毒素含有量を検出した。
【０１２１】
下記の実施例において、キメラ抗体の名付けでは、前段の文字は、対応するリード抗体のクローン番号の頭3〜5桁の文字を使用し、例えば、キメラ抗体12B12-MMAFが対応するリード抗体のクローン番号は、12B12C7C3であり、キメラ抗体5G4-MMAFが対応するリード抗体のクローン番号は、5G4H10G5である。
【０１２２】
実施例8 キメラ抗体のインビトロ薬効実験
実施例7で得られた精製されたTPBGキメラ抗体とMC-MMAFとを共役し、方法は実施例4と同じであり、pH6.5〜8.5のホウ酸ナトリウムバッファーで透析した後、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）を加え（ただし、TCEPと精製されたTPBG抗体とのモル比率は2である）、室温で1時間還元して、反応液Aを得た。反応液AをG25カラム（GEから購入）にて脱塩し、不要なTCEPを除去して、反応液Bを得た。反応液Bに、MC-MMAF（ただし、MC-MMAFと精製されたTPBG抗体とのモル比率は5である）を加え、室温で4時間反応した。さらに、不要なMC-MMAFを中和するように、システインを加え、G25カラム脱塩によって不要な低分子を除去した。精製されたTPBG抗体薬物共役体を得た（共役方法は、Doronina,2006,Bioconjugate Chem.17,114-124を参照）。HICにより薬物架橋率を分析し、SECにより抗体薬物共役体の純度等のパラメータを分析した後、細胞毒性活性の分析を行った。抗体共役体の全ての薬物架橋率（DAR）は3.0〜5.0である。ここで、DAR（drug antibody ratio）とは、抗体共役後の一つの抗体分子が有する低分子薬の平均数をいう。
【０１２３】
得られた精製されたTPBG抗体薬物共役体を、それぞれ完全培地で段階希釈し、96ウェル細胞培養用プレートに、2000細胞/ウェルでTPBG陽性NCI-H1299細胞株（ATCCから購入、カタログ番号#CRL5803）細胞懸濁液100μlを加え、一晩培養した後、ウェルごとに、濃度の異なる精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の希釈液10μlを加え、続いて5日間培養した後、CellTiter-Gloキット（Promegaから購入、使用方法参は製品説明を参照）を使用して、細胞活力を検出した。結果は表13及び図13に示される。ここで、表13におけるIC50とは、薬物が作用した後、細胞の活性が抑えられた半数効果用量であり、細胞の活性を検出することで細胞傷害活性を反映することができる。図13は、TPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1299に対する精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出である。その結果から、精製されたTPBG抗体薬物共役体は、TPBG陽性細胞に対する傷害作用を有することが明らかになる。
【０１２４】
【表１３】
2019508023.tif 000020
実施例9 キメラ抗体のインビボ薬効実験
NCI-H1299（非小細胞肺癌細胞株、ATCC、CRL-5803）（5×106個）200μlをBalb/c nudeマウスの右脇の皮下に接種し、7〜10日を経過し腫瘍が200mm3まで成長した後、体重、腫瘍における多すぎるもの、及び小さすぎるものを除き、腫瘍体積に応じて、マウスをランダムにいくつかのグループに分け、グループごとに7匹がある。D0から抗体を尾静脈注射し、4日あたりに1回、計4回で薬物を投与し、1周あたりに腫瘍体積を2回計測し、マウスの体重を量り、データを記録した。腫瘍体積（V）の算出式は、V＝1/2×a×b2であり、ただし、a、bは、それぞれ長さ、幅を表す。表14のようにグループ分けを行う。
【０１２５】
【表１４】
2019508023.tif 000021
2019508023.tif 000022
結果は、治療後の腫瘍の体積変化図である図14、及び治療後のマウス体重変化図である図15に示される。そのうち、図14A〜Eは、それぞれキメラ抗体12B12、キメラ抗体5G4、キメラ抗体39A11、キメラ抗体28D4、キメラ抗体36A10の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、腫瘍体積変化図である。図15A〜Eは、ぞれぞれキメラ抗体12B12、キメラ抗体5G4、キメラ抗体39A11、キメラ抗体28D4、キメラ抗体36A10の抗体薬物共役体及びその裸抗体による治療後の、マウス体重変化図である。その結果から、このいくつかの種類のADCは、腫瘍NCI-H1299の成長を好ましく抑制することができるとともに、マウスの体重に顕著な影響を与えないことが明らかになる。
【０１２６】
実施例10 異なるリンカー・毒素を共役した抗体共役体のインビトロ薬効実験
実施例7で得られた精製されたTPBGキメラ抗体12B12及び28D4を、それぞれMC-MMAF及びMC-VC-PAB-MMAEと共役し、方法は、実施例8と同じであり、pH6.5〜8.5のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）を加え（ただし、TCEPと精製されたTPBG抗体とのモル比率は2である）、室温で1時間還元して、反応液Aを得た。反応液Aを、G25カラム（GEから購入）にて脱塩し、不要なTCEPを除去して、反応液Bを得た。反応液BにMC-MMAF又はMC-VC-PAB-MMAE（南京聯寧から購入）を加え（ただし、MC-MMAF又はMC-VC-PAB-MMAEと精製されたTPBG抗体とのモル比率は5である）、室温で4時間反応した。さらに、不要なMC-MMAF又はMC-VC-PAB-MMAEを中和するように、システインを加え、G25カラム脱塩によって不要な低分子を除去して、精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体、即ち、表に記載されたキメラ抗体12B12-MMAF、12B12-MMAE、28D4-MMAF、28D4-MMAEを得た（共役方法は、Doronina,2006,Bioconjugate Chem.17,114-124を参照）。HICにより薬物の架橋率を分析し、SECにより抗体薬物共役体の純度等のパラメータを分析した後、細胞毒性活性の分析を行った。
【０１２７】
実施例7で得られた精製されたTPBGキメラ抗体12B12及び28D4をそれぞれSMCCと共役した。実施例7で得られた精製されたTPBGキメラ抗体12B12及び28D4を、pH6.5〜7.4のリン酸塩緩衝液で透析した後、体積比が30%のDMA（ジメチルアセトアミド）の存在下でスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）を加え（ただし、SMCCと精製されたTPBGキメラ抗体とのモル比率は8である）、室温で1時間反応して、反応液Aを得た。反応液AをG25カラム（GEから購入）にて脱塩し、不要な低分子を除去して、反応液Bを得た。反応液Bに終体積が10%のDMAを加え、そして、DM1（化学名は、N2'-デアセチル-N2'-3-メルカプト-1オキソプロピル-メイタンシンである）を加え（ただし、DM1と精製されたTPBG抗体とのモル比率は9である）、室温で3.5時間反応し、反応液Cを得た。反応液CをG25カラム（GEから購入）にて脱塩し、不要な低分子を除去し、精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体、即ち、表に記載されたキメラ抗体12B12-DM1、28D4-DM1を得た（共役方法は、US5208020を参照）。LC-MSにより薬物の架橋率を分析し、SECにより抗体薬物共役体の純度等のパラメータを分析した後、細胞毒性活性の分析を行い、キメラ抗体共役体の全ての薬物架橋率（DAR）は3.0〜5.0である。ここで、DAR（drug antibody ratio）とは、抗体共役後の一つの抗体分子が有する低分子薬の平均数をいう。
【０１２８】
得られた精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体を、それぞれ完全培地で段階希釈し、96ウェル細胞培養用プレートに、2000細胞/ウェルでTPBG陽性NCI-H1299細胞株（ATCCから購入、カタログ番号#CRL5803）、又はNCI-H1568細胞株（ATCCから購入、カタログ番号#CRL-5876）細胞懸濁液100μlを加え、一晩培養した後、ウェルごとに、濃度の異なる精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の希釈液10μlを加え、続いて5日間培養した後、CellTiter-Gloキット（Promegaから購入、使用方法は製品説明を参照）を使用して、細胞活力を検出した。結果は表15及び図16に示される。ここで、表15におけるIC50とは、薬物が作用した後、細胞の活性が抑えられた半数効果用量であり、細胞の活性を検出することで細胞傷害活性を反映することができる。そのうち、図16Aと16Bは、それぞれTPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1299に対する精製されたTPBGキメラ抗体12B12及びその異なる低分子薬を共役した抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出である。図16Cと16Dは、それぞれTPBG陽性腫瘍細胞系NCI-H1568に対する精製されたTPBGキメラ抗体12B12及びその異なる低分子薬を共役した抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出である。その結果から、異なる低分子毒素を共役した精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体は、いずれもTPBG陽性細胞に対して異なる程度の傷害作用を有するとともに、MC-MMAFを共役したTPBGキメラ抗体薬物共役体は、低いIC50を有し、その細胞傷害能力が最も強いことが明らかになる。
【０１２９】
【表１５】
2019508023.tif 000023
得られた精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体を、それぞれ完全培地で段階希釈し、96ウェル細胞培養用プレートに、2000細胞/ウェルでTPBGを発現する293-hTPBG安定発現細胞株（構築方法は、実施例1：免疫原Bの調製を参照）、及びTPBGを発現しない293細胞株（ATCCから購入、カタログ番号#CRL-1573）細胞懸濁液を100μl加え、一晩培養した後、ウェルごとに、濃度の異なる精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の希釈液10μlを加え、続いて5日間培養した後、CellTiter-Gloキット（Promegaから購入、使用方法は製品説明を参照）を使用して、細胞活力を検出した。結果は表16及び図17に示される。ここで、表16におけるIC50とは、薬物が作用した後、細胞の活性が抑えられた半数効果用量であり、細胞の活性を検出することで細胞傷害活性を反映することができる。図17Aと17Bは、TPBG陽性のTPBGを発現する293-hTPBG安定発現細胞株に対する精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出である。図17Cと17Dは、TPBGを発現しない293細胞株に対する精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の細胞傷害活性の検出である。その結果から、異なる低分子毒素を共役した精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体は、TPBG陽性細胞に対して異なる程度の傷害作用を有し、TPBG陰性の293細胞に対して細胞傷害作用を有していないことが認められ、TPBG陽性細胞に対する精製されたTPBGキメラ抗体薬物共役体の傷害が特異的であるとともに、MC-MMAFを共役したTPBGキメラ抗体薬物共役体は、低いIC50を有し、その細胞傷害能力が最も強いことが明らかになる。
【０１３０】
【表１６】
2019508023.tif 000024
本発明の前述した内容を読んだ後、当業者は、本発明に対して、種々の変形、又は補正を行うことができ、これらの等価な形式も、同様に本願の特許請求の範囲に限定された範囲に含まれることを理解すべきである。
【図１】
2019508023.tif 000028
【図２】
2019508023.tif 000029
【図３】
2019508023.tif 000030
【図４】
2019508023.tif 000031
【図５】
2019508023.tif 000032
【図６Ａ】
2019508023.tif 000033
【図６Ｂ】
2019508023.tif 000034
【図７Ａ】
2019508023.tif 000035
【図７Ｂ】
2019508023.tif 000036
【図８Ａ】
2019508023.tif 000037
【図８Ｂ】
2019508023.tif 000038
【図９Ａ】
2019508023.tif 000039
【図９Ｂ】
2019508023.tif 000040
【図１０Ａ】
2019508023.tif 000041
【図１０Ｂ】
2019508023.tif 000042
【図１１Ａ】
2019508023.tif 000043
【図１１Ｂ】
2019508023.tif 000044
【図１１Ｃ】
2019508023.tif 000045
【図１２Ａ】
2019508023.tif 000046
【図１２Ｂ】
2019508023.tif 000047
【図１３】
2019508023.tif 000048
【図１４Ａ】
2019508023.tif 000049
【図１４Ｂ】
2019508023.tif 000050
【図１４Ｃ】
2019508023.tif 000051
【図１４Ｄ】
2019508023.tif 000052
【図１４Ｅ】
2019508023.tif 000053
【図１５Ａ】
2019508023.tif 000054
【図１５Ｂ】
2019508023.tif 000055
【図１５Ｃ】
2019508023.tif 000056
【図１５Ｄ】
2019508023.tif 000057
【図１５Ｅ】
2019508023.tif 000058
【図１６Ａ】
2019508023.tif 000059
【図１６Ｂ】
2019508023.tif 000060
【図１６Ｃ】
2019508023.tif 000061
【図１６Ｄ】
2019508023.tif 000062
【図１７Ａ】
2019508023.tif 000063
【図１７Ｂ】
2019508023.tif 000064
【図１７Ｃ】
2019508023.tif 000065
【図１７Ｄ】
2019508023.tif 000066
【配列表】
2019508023000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TPBG抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2及び重鎖CDR3の1又は複数の種類、及び/又は、TPBG抗体の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2及び軽鎖CDR3の1又は複数の種類を含む分離したタンパク質であって、
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66又はSEQ ID No.74に示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67又はSEQ ID No.75に示され、前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68又はSEQ ID No.76に示され、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70又はSEQ ID No.78に示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71又はSEQ ID No.79に示され、前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72又はSEQ ID No.80に示され、あるいは、
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66又はSEQ ID No.74に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67又はSEQ ID No.75に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68又はSEQ ID No.76に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70又はSEQ ID No.78に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71又はSEQ ID No.79に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であり、前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72又はSEQ ID No.80に示されたアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列であることを特徴とする、分離したタンパク質。
【請求項２】
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.2に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.3に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.4に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.10に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配が、配列表SEQ ID No.11に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.12に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.18に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.19に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.20に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.26に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.27に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.28に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.34に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.35に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.36に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.42に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.43に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.44に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.50に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.51に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.52に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.58に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.59に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.60に示され、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.66に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.67に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.68に示され、あるいは、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.74に、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.75に、且つ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.76に示され、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.6に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.7に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.8に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.14に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.15に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.16に示され、あるいは、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.22に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.23に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.24に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.30に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.31に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.32に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.38に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.39に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.40に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.46に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.47に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.48に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.54に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.55に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.56に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.62に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.63に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.64に示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.70に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.71に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.72に示され、あるいは、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.78に、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.79に、且つ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.80に示されたことを特徴とする、請求項1に記載の分離したタンパク質。
【請求項３】
TPBG抗体の重鎖可変領域及び/又はTPBG抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33、SEQ ID No.41、SEQ ID No.49、SEQ ID No.57、SEQ ID No.65又はSEQ ID No.73に示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表におけるSEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37、SEQ ID No.45、SEQ ID No.53、SEQ ID No.61、SEQ ID No.69又はSEQ ID No.77に示されたことを特徴とする、分離したタンパク質。
【請求項４】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.1に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.5に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.9に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.13に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.17に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.21に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.25に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.29に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.33に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.37に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.41に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.45に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.49に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.53に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.57に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.61に示され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.65に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.69に示され、あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.73に、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列表SEQ ID No.77に示されたことを特徴とする、請求項3に記載の分離したタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、抗体重鎖定常領域及び/又は抗体軽鎖定常領域をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離したタンパク質。
【請求項６】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト又はマウス抗体重鎖定常領域であり、前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト又はマウス抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする、請求項5に記載の分離したタンパク質。
【請求項７】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト抗体重鎖定常領域であり、前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする、請求項6に記載の分離したタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質は、TPBG抗体、モノクローナル抗体、抗体全長タンパク、抗原抗体結合領域タンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体又は単一領域抗体であることを特徴とする、請求項1又は3に記載の分離したタンパク質。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81、配列表SEQ ID No.83、配列表SEQ ID No.85、配列表SEQ ID No.87、配列表SEQ ID No.89、配列表SEQ ID No.91、配列表SEQ ID No.93、配列表SEQ ID No.95、配列表SEQ ID No.97又は配列表SEQ ID No.99に示され、及び/又は、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82、配列表SEQ ID No.84、配列表SEQ ID No.86、配列表SEQ ID No.88、配列表SEQ ID No.90、配列表SEQ ID No.92、配列表SEQ ID No.94、配列表SEQ ID No.96、配列表SEQ ID No.98又は配列表SEQ ID No.100に示されたことを特徴とする、請求項9に記載の核酸。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.91に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.92に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96に示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98に示され、あるいは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99に、且つ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100に示されたことを特徴とする、請求項10に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項9〜11のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項12に記載の組換え発現ベクターを含む、組換え発現形質転換体。
【請求項１４】
請求項13に記載の組換え発現形質転換体を培養し、培養物からTPBG抗体を得る工程を含む、TPBG抗体の調製方法。
【請求項１５】
細胞毒性薬に共有付着される請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質を含むことを特徴とする、免疫共役体。
【請求項１６】
1当量の請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質が、x当量のアダプターによりy当量の細胞毒性薬と連結し、式1に示された構造を有することを特徴とする、請求項15に記載の免疫共役体。
Ab-(L)x-(D)y
式1
ただし、Abは、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質であり、Lはアダプターであり、Dは細胞毒性薬であり、xは自然数であり、yは0又は自然数である。
【請求項１７】
前記Lは、活性エステル、炭酸塩系、カルバメート系、イミノホスフェート、オキシム系、ヒドラゾン系、アセタール系、オルトエステル系、アミノ系、小ペプチド断片又はヌクレオチド断片であり、及び/又は、
前記Dは、細胞毒素、化学療法剤、放射性同位元素、治療的核酸、免疫調節剤、血管新生阻害剤、抗増殖・プロアポトーシス剤又は溶菌酵素から選択されることを特徴とする、請求項16に記載の免疫共役体。
【請求項１８】
前記式1において、x＝y＝nであり、前記免疫共役体の構造は、式3、式4又は式5に示されることを特徴とする、請求項17に記載の免疫共役体。
【化１】
2019508023.tif 000067
式3中、mは1〜10であり、DはメチルアウリスタチンFであり、
【化２】
2019508023.tif 000068
式4中、Lはスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートであり、DはN2'-デアセチル-N2'-3-メルカプト-1オキソプロピル-メイタンシン（DM1）であり、
【化３】
2019508023.tif 000069
式5中、Lはマレイミドカプロイル-L-バリン-L-シトルリンp-アミノベンジルアルコールであり、DはメチルアウリスタチンE（MMAE）であり、
ただし、nは自然数である。
【請求項１９】
請求項15〜18のいずれか一項に記載の免疫共役体と、薬学的に許容可能なベクターとを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２０】
前記医薬組成物は、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質0.01〜99.99%と、薬用ベクター0.01〜99.99%とを含み、前記%は、前記医薬組成物に占める質量百分率であることを特徴とする、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍の予防及び治療に用いられる請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質。
【請求項２２】
請求項15〜18のいずれか一項に記載の免疫共役体であって、前記免疫共役体に含まれる分離したタンパク質が腫瘍の予防及び治療に用いられる免疫共役体。
【請求項２３】
請求項19又は20に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物に含まれる分離したタンパク質が腫瘍の予防及び治療に用いられる免疫共役体。
【請求項２４】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質を、検査試料とインビトロで接触させ、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離したタンパク質と前記検査試料の結合を検出すれば良い工程を含むことを特徴とする、TPBGタンパク質を過剰発現する細胞の検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
ここで、12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81中の91位〜105位であり、
12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81中の148位〜198位であり、
12B12C7C3の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.81中の295位〜327位であり、
12B12C7C3の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82中の70位〜114位であり、
12B12C7C3の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82中の160位〜180位であり、
12B12C7C3の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.82中の277位〜303位であり、
5G4H10G5の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83中の91位〜105位であり、 
5G4H10G5の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83中の148位〜198位であり、
5G4H10G5の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.83中の295位〜330位であり、
5G4H10G5の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84中の70位〜102位であり、
5G4H10G53の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84中の148位〜168位であり、
5G4H10G5の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.84中の265位〜288位であり、
37H9C5G2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85中の91位〜105位であり、
37H9C5G2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85中の148位〜198位であり、
37H9C5G2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.85中の295位〜327位であり、
37H9C5G2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86中の70位〜102位であり、
37H9C5G2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86中の148位〜168位であり、
37H9C5G2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.86中の265位〜291位。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
39A11G5F2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87中の91位〜105位であり、
39A11G5F2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87中の148位〜198位であり、
39A11G5F2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.87中の295位〜315位であり、
39A11G5F2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88中の70位〜102位であり、
39A11G5F2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88中の148位〜168位であり、
39A11G5F2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.88中の265位〜291位。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
52C9E9F6の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89中の91位〜105位であり、
52C9E9F6の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89中の148位〜198位であり、
52C9E9F6の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.89中の295位〜315位であり、
52C9E9F6の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90中の70位〜102位であり、
52C9E9F6の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90中の148位〜168位であり、
52C9E9F6の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.90中の265位〜291位。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
36A10D8B12の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93中の91位〜108位であり、
36A10D8B12の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93中の151位〜198位であり、
36A10D8B12の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.93中の295位〜324位であり、
36A10D8B12の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94中の70位〜102位であり、
36A10D8B12の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94中の148位〜168位であり、
36A10D8B12の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.94中の265位〜291位である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
99E12C7H1の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95中の91位〜105位であり、
99E12C7H1の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95中の148位〜198位であり、
99E12C7H1の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.95中の295位〜318位であり、
99E12C7H1の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96中の70位〜102位であり、
99E12C7H1の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96中の148位〜168位であり、
99E12C7H1の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.96中の265位〜291位である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
103E2E9C2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97中の91位〜105位であり、
103E2E9C2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97中の148位〜198位であり、
103E2E9C2の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.97中の295位〜324位であり、
103E2E9C2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98中の70位〜105位であり、
103E2E9C2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98中の151位〜171位であり、
103E2E9C2の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.98中の268位〜294位である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
106D5G3D10の重鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99中の91位〜105位であり、
106D5G3D10の重鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99中の148位〜198位であり、
106D5G3D10の重鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.99中の295位〜318位であり、
106D5G3D10の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100中の70位〜99位であり、
106D5G3D10の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100中の145位〜165位であり、
106D5G3D10の軽鎖蛋白可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列が、配列表SEQ ID No.100中の262位〜294位である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
実施例1 TPBG抗体の調製
（一）、免疫原Aの調製
ヒトTPBGタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列32-355（Ser32-Ser355）（ただし、ヒトTPBGタンパク質をコードするヌクレオチド配列のGenebankにおける番号はGenebank ID:AAH37161.1）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をヒトIgG Fc断片（hFc）を有するpCpCベクター（Invitrogenから購入、V044-50）にクローリングし、既知の標準分子生物学方法により、プラスミドを調製した。具体的な方法はSambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.（1989）. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition（Plainview, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照のこと。HEK293細胞（Invitrogenから購入）に対して、一過性トランスフェクト（Transient transfection）（ポリエーテルイミド、PEI、Polysciencesから購入）を行い、FreeStyle TM 293（Invitrogenから購入）を使用して、37℃で拡大培養した。4日後、細胞培養液を回収し、遠心分離して細胞成分を除去して、TPBGタンパク質細胞外領域を含む培養上澄を得た。培養上澄をタンパク質Aアフィニティーカラム（Mabselect Sure、GE Healthcareから購入）に仕込みし、同時に紫外線（UV）検出計により紫外線吸収値（A280nm）の変化を検出する。仕込み後、タンパク質Aアフィニティーカラムを、PBSリン酸塩緩衝液（pH7.2）で、紫外線吸収値が基準線に戻るまで洗淨した。そして、0.1Mグリシン塩酸（pH2.5）で溶出し、タンパク質AアフィニティーカラムからhFcタグ付きTPBGタンパク質（即ち、ヒトTPBG-hFc）を溶出し回収した。PBSリン酸塩緩衝液（pH7.2）により、4℃冷蔵庫で一晩透析した。透析した後のタンパク質を、0.22ミクロンで無菌濾過してから分注して-80℃に保存して、精製された免疫原Aを得た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
（二）、免疫原Bの調製
ヒトTPBGの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ただし、ヒトTPBGタンパク質をコードするヌクレオチド配列のGenebankにおける番号は、Genebank ID:AAH37161.1）は、pIRESベクター（Clontechから購入）にクローリングされ、プラスミドは調製された。HEK293細胞系（Invitrogenから購入）に対して、プラスミドトランスフェクション（PEI、Polysciencesから購入）をした後、10%（w/w）ウシ胎児血清を0.5μg/ml含むDMEM培地において、選択的に2週間培養して、限界希釈法で96ウェル培養プレートでサブクローニングし、37℃、5%（v/v）CO2で培養し、約2週間後、一部のモノクローナルウェルを選択して6ウェルプレートに増幅した。増幅後のクローンに対して、既知のTPBG抗体（Sigmaから購入、カタログ番号#SAB1404485）で、フローサイトメトリーで選別した。成長が良好で、蛍光強度が高いモノクローナル細胞系を選択して、拡大培養を継続し、液体窒素により凍結して、免疫原Bを得た。具体的な選択結果は、表3と図1に示される。対照IgGサブクラスは対照マウスIgGである。表3から、一連のTPBG発現陽性HEK293細胞系が作成されたことが明らかになる。図1では、横座標は細胞蛍光強度で、縦座標は細胞数である。図1の結果から分かるように、5E5E9はTPBGが高レベルで発現する細胞株である。ここで、抗TPBG抗体で標識された細胞は、平均細胞蛍光密度が216であり、移動度が98.5%である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
【表１】
2019508023.tif 000070
B、フローサイトメトリー実験（FACS）によるTPBG抗体とTPBG発現細胞との結合測定
実施例1の工程（二）で記載のヒトTPBGの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するpIRESプラスミドでCHO-K1細胞株をトランスフェクトしてヒトTPBGを含有するCHO-K1安定細胞株（ここで、CHO-k1-hPD1安定細胞株という）を得た。同様に、サルTPBG全長遺伝子を含有するpIRESプラスミド（その調製方法は、実施例1の工程（一）“免疫原Aの調製”におけるヒトIgG Fc断片（hFc）を含有するpCpCベクターの調製方法と同じである。蟹食猿TPBGの全長アミノ酸配列（Genebank ID: BAE00432.1））でCHO-K1細胞株をトランスフェクトしてサルTPBGを含有するCHO-K1安定細胞株（ここで、CHO-k1-cTPBG安定細胞株という）を得た。マウスTPBG全長遺伝子を含有するpIRESプラスミド（その調製方法は、実施例1の工程（一）“免疫原Aの調製”におけるヒトIgG Fc断片（hFc）を含有するpCpCベクターの調製方法と同じである。マウスTPBG全長アミノ酸配列（Genebank ID: CAA09931.1））でCHO-K1細胞株をトランスフェクトしてマウスTPBGを含有するCHO-K1安定細胞株（ここで、CHO-k1-mTPBG安定細胞株という）を得た。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
FACSにより血清におけるTPBG抗体の力価及び特異性を測定し、測定方法は実施例1の工程（二）“免疫原Bの調製”におけるHEK293-hTPBG安定細胞株の同定方法を参照した。測定結果を表7及び図2〜4に示し、図2〜4は横座標が細胞蛍光強度で、縦座標が細胞数である。ここで、CHO-K1-hTPBG 3A2F1は選別のためのヒトTPBG発現細胞株であり、そのFACS選別測定結果を図2に示し、CHO-K1-cTPBG 3F13G4は選別のための蟹食猿TPBG発現細胞株であり、そのFACS選別測定結果を図3に示し、CHO-K1-mTPBG 3A3は選別のためのマウスTPBG発現細胞株であり、そのFACS選別測定結果を図4に示した。表7の結果から明らかなように、CHO-k1-hTPBG安定細胞株、CHO-k1-cTPBG安定細胞株及びCHO-k1-mTPBG安定細胞株の細胞膜ではそれぞれヒト、サル又はマウスのTPBGタンパクを過剰発現し、TPBG抗体の選別に用いられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
【表２】
2019508023.tif 000071
CHO-k1-hTPBG安定細胞株、CHO-k1-cTPBG安定細胞株、CHO-K1-mTPBG安定細胞株（すなわち表7に示されたCHO-k1-hTPBG 3A2F1、CHO-k1-cTPBG 3F13G4及びCHO-k1-mTPBG 3A3）及びCHO-K1細胞をそれぞれT-75細胞培養ボトルで凝集度90%になるまで拡大培養を行い、培地をなくなるまで吸引して除去し、HBSS緩衝液（Hanks Balanced Salt Solution）（Invitrogenから購入）で2回洗浄し、その後、無酵素細胞解離液（Versene solution：Life technology会社から購入）を用いて処理し、細胞を回収した。HBSS緩衝液で細胞を2回洗浄し、細胞をカウントした後、HBSS緩衝液で2×106cell/mLになるまで希釈し、10%ヤギ血清遮断液を加え（前記パーセントが質量パーセントである）、氷で30分間インキュベートした後、HBSS緩衝液で2回遠心洗浄した。回収された細胞をFACS緩衝液（HBSS+1%BSA、前記パーセントが質量パーセントである）で2×106cell/mLになるまで懸濁させ、100μL/wellで96ウェルFACS反応板に加え、100μL/wellで実施例2で得られた精製されたTPBG抗体検査試料を加え、氷で2時間インキュベートした。FACS緩衝液で2回遠心洗浄し、100μL/wellで蛍光（Alexa 488）標識二次抗体（Invitrogenから購入）を加え、氷で1時間インキュベートした。FACS緩衝液で3回遠心洗浄し、100μL/wellで固定液[4%（v/v）パラホルムアルデヒド]を加えて細胞を再懸濁させ、10分間後にFACS緩衝液で2回遠心洗浄した。100μLのFACS緩衝液により細胞を懸濁させ、FACS（FACS Calibur、BD会社から購入）を用いて結果を測定して分析した。ソフトウェア（CellQuest）でデータ解析を行い、細胞の平均蛍光強度（MFI）を得た。さらに、ソフトウェア（GraphPad Prism5）で解析、データフィッティングを行い、EC50値を算出した。分析結果を表8及び図7〜10に示し、図7〜10のデータが細胞の平均蛍光強度（MFI）である。表8におけるデータはMFIから算出したEC50値であった。表8から明らかなように、TPBG抗体は細胞表面のTPBGタンパクと結合できた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
【表３】
2019508023.tif 000072
実施例4 TPBG抗体薬物共役体の細胞傷害活性実験
実施例2で得られた精製されたTPBG抗体をpH6.5〜8.5のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を加え（ただし、TCEPと精製されたTPBG抗体とのモル比率は2である）、室温で1時間還元して、反応液Aを得た。反応液AをG25カラム（GEから購入）にて脱塩し、不要なTCEPを除去して、反応液Bを得た。反応液BにMC-MMAF（南京聯寧から購入）を加え（ただし、MC-MMAFと精製されたTPBG抗体とのモル比率は5である）、室温で4時間反応した。更に、不要なMC-MMAFを中和するようにシステインを加え、G25カラム脱塩によって不要な低分子を除去して、精製されたTPBG抗体薬物共役体を得た（共役方法はDoronina、2006、BioconjugateChem.17,114〜124を参照）。HICにより薬物の架橋率、純度などのパラメータを分析した後、細胞毒性活性分析を行った。抗体共役体の薬物架橋率（DAR）は、いずれも8である。ここで、DAR（drugAntibody ratio）とは、抗体共役後の一つの抗体分子が有する低分子薬の平均数をいう。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
ここで、12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.81における91位から105位までであり；
12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.81における148位から198位までであり；
12B12C7C3の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.81における295位から327位までであり；
12B12C7C3の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.82における70位から114位までであり；
12B12C7C3の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.82における160位から180位までであり；
12B12C7C3の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.82における277位から303位までであり；
5G4H10G5の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.83における91位から105位までであり； 
5G4H10G5の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.83における148位から198位までであり；
5G4H10G5の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.83における295位から330位までであり；
5G4H10G5の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.84における70位から102位までであり；
5G4H10G53の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.84における148位から168位までであり；
5G4H10G5の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.84における265位から288位までであり；
37H9C5G2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.85における91位から105位までであり；
37H9C5G2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.85における148位から198位までであり；
37H9C5G2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.85における295位から327位までであり；
37H9C5G2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.86における70位から102位までであり；
37H9C5G2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.86における148位から168位までであり；
37H9C5G2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.86における265位から291位までである。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
39A11G5F2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.87における91位から105位までであり；
39A11G5F2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.87における148位から198位までであり；
39A11G5F2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.87における295位から315位までであり；
39A11G5F2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.88における70位から102位までであり；
39A11G5F2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.88における148位から168位までであり；
39A11G5F2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.88における265位から291位までである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
52C9E9F6の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.89における91位から105位までであり；
52C9E9F6の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.89における148位から198位までであり；
52C9E9F6の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.89における295位から315位までであり；
52C9E9F6の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.90における70位から102位までであり；
52C9E9F6の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.90における148位から168位までであり；
52C9E9F6の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.90における265位から291位までである。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
36A10D8B12の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.93における91位から108位までであり；
36A10D8B12の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.93における151位から198位までであり；
36A10D8B12の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.93における295位から324位までであり；
36A10D8B12の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.94における70位から102位までであり；
36A10D8B12の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.94における148位から168位までであり；
36A10D8B12の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.94における265位から291位までである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
99E12C7H1の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.95における91位から105位までであり；
99E12C7H1の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.95における148位から198位までであり；
99E12C7H1の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.95における295位から318位までであり；
99E12C7H1の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.96における70位から102位までであり；
99E12C7H1の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.96における148位から168位までであり；
99E12C7H1の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.96における265位から291位までである。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
103E2E9C2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.97における91位から105位までであり；
103E2E9C2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.97における148位から198位までであり；
103E2E9C2の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.97における295位から324位までであり；
103E2E9C2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.98における70位から105位までであり；
103E2E9C2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.98における151位から171位までであり；
103E2E9C2の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.98における268位から294位までである。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
106D5G3D10の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.99における91位から105位までであり；
106D5G3D10の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.99における148位から198位までであり；
106D5G3D10の重鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.99における295位から318位までであり；
106D5G3D10の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR1をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.100における70位から99位までであり；
106D5G3D10の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR2をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.100における145位から165位までであり；
106D5G3D10の軽鎖タンパク質可変領域におけるCDR3をコードするヌクレオチド配列は配列表SEQ ID No.100における262位から294位までである。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
【表４】
2019508023.tif 000073
本発明の前述した内容を読んだ後、当業者は、本発明に対して、種々の変形、又は補正を行うことができ、これらの等価な形式も、同様に本願の特許請求の範囲に限定された範囲に含まれることを理解すべきである。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019508023000001.app
【国際調査報告】
2019508023.tif 000074
2019508023.tif 000075
2019508023.tif 000076
2019508023.tif 000077
2019508023.tif 000078
2019508023.tif 000079
2019508023.tif 000080
2019508023.tif 000081