(57)【要約】HLAクラスI発現のレベルを減少させるためにNK-92細胞におけるβ2ミクログロブリン（B2M）の発現を低下させる遺伝的変更を含む改変型NK-92細胞；そのような細胞を作製する方法；およびB2M改変型NK-92細胞を用いて、例えばがんを有する対象を治療する方法が、本明細書に記載される。2019532640.tif 000043
2019532640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β2ミクログロブリンの発現を阻害するためのβ2ミクログロブリンを標的とした遺伝的改変を含む、β2ミクログロブリン改変型（B2M改変型）NK-92細胞。
【請求項２】
NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンをノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、請求項1に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項３】
B2Mを標的としかつその発現を阻害する干渉RNAを含む、請求項2に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項４】
前記細胞によって発現されるβ2ミクログロブリンの量が、β2ミクログロブリンを標的とした変更を有しないNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、請求項1に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項５】
NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンをノックアウトすることによって作製される、請求項1に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項６】
HLA-E結合ペプチド、B2M、およびHLA-E重鎖を含む単鎖三量体を発現するように改変される、請求項2に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項７】
前記単鎖三量体が、B2M（β2ミクログロブリン）シグナルペプチド、Cw*0304リーダーペプチド、成熟B2Mポリペプチドおよび成熟HLA-Eポリペプチドを含む、請求項6に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項８】
Cw*0304リーダーペプチドが可動性リンカーによって成熟B2Mポリペプチドに連結され、かつ/または成熟B2Mポリペプチドが可動性リンカーによって成熟HLA-Eポリペプチドに連結される、請求項7に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項９】
C2*0304リーダーペプチドを成熟B2Mポリペプチドに連結する可動性リンカーおよび/または成熟B2Mポリペプチドを成熟HLA-Eポリペプチドに連結する可動性リンカーが、GlyおよびSerを含む、請求項8に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１０】
HLA-E重鎖が成熟HLA-EGアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１１】
単鎖三量体がSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１２】
B2M改変型NK細胞が、少なくとも1つのFc受容体もしくは少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARを細胞表面に発現する、請求項1に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１３】
前記少なくとも1つのFc受容体が、ヒトCD16、またはヒトCD16ポリペプチドの成熟型の158位に対応する位置にバリンを有するヒトCD16ポリペプチドである、請求項12に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１４】
前記少なくとも1つのFc受容体が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ158位にバリンを含む、請求項12に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１５】
前記少なくとも1つのFc受容体がFcγRIIIである、請求項12に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１６】
前記CARがFcεRIγの細胞質ドメインを含む、請求項12に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１７】
前記CARが腫瘍関連抗原を標的とする、請求項12に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１８】
サイトカインを発現するようにさらに改変される、請求項1に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項１９】
サイトカインがインターロイキン-2またはその変異体である、請求項18に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項２０】
サイトカインが、小胞体に対して標的化される、請求項19に記載のB2M改変型NK-92細胞。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む、組成物。
【請求項２２】
生理学的に適切な賦形剤をさらに含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の複数の改変型NK-92細胞を含む、改変型NK-92細胞株。
【請求項２４】
前記細胞が10未満の集団倍加を受けている、請求項23に記載の細胞株。
【請求項２５】
前記細胞が10U/ml未満のIL-2を含有する培養液中で培養される、請求項23に記載の細胞株。
【請求項２６】
それを必要とする患者におけるがんを治療する方法であって、請求項23に記載の細胞株の治療有効量を該患者に投与し、それによってがんを治療する段階を含む、方法。
【請求項２７】
抗体を投与する段階をさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
患者の体表面積1m2あたり約1×108〜約1×1011個の細胞が患者に投与される、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
対照NK-92細胞と比較して低下したレベルのβ2ミクログロブリンを発現するNK-92細胞を作製するための方法であって、β2ミクログロブリンの発現を阻害するようにNK-92細胞を遺伝的に改変する段階を含む、方法。
【請求項３０】
β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階が、β2ミクログロブリン遺伝子の発現を排除または減少させるように、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いてβ2ミクログロブリン遺伝子を改変することを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階が、β2ミクログロブリン遺伝子の発現を排除または減少させるように、CRISPR/Casシステムを用いてβ2ミクログロブリン遺伝子を改変することを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階が、改変すべきNK-92細胞を、β2ミクログロブリンを標的とする干渉RNAと接触させることを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
β2ミクログロブリンを標的とする干渉RNAが、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞によって発現されるβ2ミクログロブリンの量が、β2ミクログロブリンを標的とした変更を有しないNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、請求項29に記載の方法。
【請求項３５】
β2ミクログロブリン遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階が、
（i）NK-92細胞に、CRISPR関連（Cas）タンパク質を導入すること；および
（ii）改変すべきNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入すること
を含み、
該リボ核酸が、β2ミクログロブリン配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、ここで該標的モチーフが切断される、
請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
Casタンパク質が、タンパク質の形態でNK-92細胞に導入される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
Casタンパク質が、CasをコードするポリヌクレオチドをNK-92細胞に導入することによってNK-92細胞に導入される、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
Casタンパク質がCas9である、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的モチーフがβ2ミクログロブリン遺伝子の第1エクソン内にある、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的モチーフが20ヌクレオチドのDNA配列である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記1つまたは複数のリボ核酸がSEQ ID NO：1〜4からなる群より選択される、請求項35に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年9月29日に出願された米国仮特許出願第62/401,653号の優先権の恩典を主張するものであり、本出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞ベースの免疫療法はがん治療のための強力なツールである。キメラ抗原受容体を発現する遺伝子操作された初代T細胞（CAR-T細胞）を使用する、リンパ系腫瘍患者の治療における初期の成功は、この分野をがん免疫療法の最前線に押し上げた。CAR-T細胞に加えて、NK細胞の使用に基づく免疫療法もまた開発されつつある。
【０００３】
NK-92は、非ホジキンリンパ腫に罹患した患者の血液中で発見され、その後エクスビボで不死化された、細胞溶解性のがん細胞株である。NK-92細胞は、NK細胞に由来するが、活性化受容体の大部分を保持する一方で、正常なNK細胞によって提示される主要な抑制性受容体を欠いている。しかしながら、NK-92細胞は正常な細胞を攻撃せず、またヒトにおいて許容できない免疫拒絶反応を誘発することもない。NK-92細胞株の特徴付けは、WO 1998/49268および米国特許出願公開第2002-0068044号（特許文献1および2）に開示されている。NK-92細胞はまた、ある種のがんの治療において有望な治療剤としても評価されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO 1998/49268
【特許文献２】米国特許出願公開第2002-0068044号
【発明の概要】
【０００５】
発明の局面の概要
本発明は、HLAクラスI発現が減少した改変型NK-92細胞、そのような細胞の作製方法、および疾患、例えばがんを治療するための改変型NK-92細胞の使用方法を提供する。
【０００６】
一局面では、本開示は、したがって、β2ミクログロブリン（B2M）の発現を阻害するB2Mを標的とした変更を含むβ2ミクログロブリン（B2M）改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞のβ2ミクログロブリン遺伝子は、B2Mの発現を阻害するように遺伝的に変更されている。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞は、B2Mを標的とし、かつその発現を阻害する1つまたは複数の干渉RNAを含む。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞によって発現されるβ2ミクログロブリンの量は、β2ミクログロブリンを標的とした変更を有しないNK-92細胞と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、または少なくとも80％減少する。いくつかの態様では、請求項1に記載のB2M改変型NK-92細胞は、例えばCRISPRを用いて、NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンをノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される。いくつかの態様では、該細胞は、例えばCRISPRを用いて、NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンをノックアウトすることによって作製される。いくつかの態様では、該NK-92細胞は、HLA-E結合ペプチド、B2M、およびHLA-E重鎖を含む単鎖三量体（single chain trimer）を発現するようにさらに改変される。いくつかの態様では、その単鎖三量体は、B2M（β2ミクログロブリン）シグナルペプチド、Cw*03リーダーペプチド、例えばCw*0304リーダーペプチド、成熟B2Mポリペプチド、および成熟HLA-Eポリペプチドを含む。いくつかの態様では、Cw*03リーダーペプチドは可動性リンカー（flexible linker）によって成熟B2Mポリペプチドに連結され、かつ/または成熟B2Mポリペプチドは可動性リンカーによって成熟HLA-Eポリペプチドに連結される。一方または両方の可動性リンカーはGlyおよびSerを含むことができる。いくつかの態様では、HLA-E重鎖は成熟HLA-EGアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、上記の単鎖三量体はSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
いくつかの態様では、例えば本明細書および前の段落に記載されるような、B2M改変型NK-92細胞は、少なくとも1つのFc受容体または少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）を発現する。いくつかの態様では、例えば本明細書および前の段落に記載されるような、B2M改変型NK-92細胞は、細胞表面に少なくとも1つのFc受容体および少なくとも1つのCARを発現する。いくつかの態様では、そのFc受容体はCD16である。いくつかの態様では、そのCD16ポリペプチドは、天然シグナルペプチドを含むヒトCD16配列の176位に対応する、成熟型の158位にバリンを有するヒトCD16ポリペプチドである。いくつかの態様では、該少なくとも1つのFc受容体は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつSEQ ID NO:5の158位に対応する位置にバリンを含む。いくつかの態様では、該Fc受容体はFcγRIIIである。いくつかの態様では、該CARはFcεRIγの細胞質ドメインを含む。いくつかの態様では、該CARは腫瘍関連抗原を標的とする。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞はサイトカインをさらに発現するように改変される。いくつかの態様では、サイトカインはインターロイキン-2またはその変異体である。いくつかの態様では、サイトカインは小胞体に対して標的化される。
【０００８】
別の局面において、本開示は、β2ミクログロブリンのレベルを低下させるように遺伝的に改変されていない対照NK-92細胞と比較して低下したレベルのβ2ミクログロブリンを発現するNK-92細胞を作製する方法を提供し、その方法は、NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階を含む。いくつかの態様では、β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階は、改変すべきNK-92細胞を、β2ミクログロブリンを標的とする干渉RNAと接触させることを含む。いくつかの態様では、β2ミクログロブリンを標的とする干渉RNAは、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである。
【０００９】
いくつかの態様では、β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて、β2ミクログロブリン遺伝子を改変することを含む。いくつかの態様では、β2ミクログロブリン遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階は、（i）NK-92細胞に、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連（Cas）タンパク質を導入すること、および（ii）改変すべきNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入することを含み、ここで、該リボ核酸は、β2ミクログロブリン配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、ここで該標的モチーフが切断される。いくつかの態様では、Casタンパク質は、タンパク質の形態でNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas核酸コード配列を導入することによってNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質はCas9である。いくつかの態様では、該標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。いくつかの態様では、該標的モチーフはβ2ミクログロブリン遺伝子の第1エクソン内にある。いくつかの態様では、該1つまたは複数のリボ核酸はSEQ ID NO：1〜4からなる群より選択される。
【００１０】
さらなる局面において、本開示は、複数個の上に開示したB2M改変型NK-92細胞を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、該組成物は生理学的に許容される賦形剤をも含む。
【００１１】
さらなる局面において、本開示は、複数個の上に開示したいずれかのB2M改変型NK-92細胞を含む改変型NK-92細胞株を提供する。いくつかの態様では、該細胞株の細胞は10未満の集団倍加（population doubling）を受けている。いくつかの態様では、該細胞株の細胞は、10U/ml未満のIL-2を含有する培養液中で培養される。
【００１２】
別の局面では、本開示は、それを必要とする患者におけるがんを治療する方法を提供し、その方法は、該患者に、治療有効量の上記B2M改変型NK-92細胞株のいずれかを投与し、それによってがんを治療することを含む。いくつかの態様では、該方法は抗体を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、患者の体表面積m2あたり約1×108〜約1×1011個の細胞を患者に投与する。
【００１３】
さらなる局面では、本開示は、がんを治療するためのキットを提供し、該キットは、(a)上に開示したような、B2M改変型NK-92細胞の組成物または細胞株のいずれか、および(b)使用説明書を含む。いくつかの態様では、該キットは生理学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００１４】
前述の概要および後述の詳細な説明は例示的かつ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載された本発明のさらなる説明を提供するためのものである。他の目的、利点および新規な特徴は、以下の発明の詳細な説明から当業者には容易に明らかとなろう。
【００１５】
本発明の例示的な態様には、限定するものではないが、以下が含まれる。
態様１：
β2ミクログロブリンの発現を阻害するためのβ2ミクログロブリンを標的とした遺伝的改変を含む、β2ミクログロブリン改変型（B2M改変型）NK-92細胞。
態様２：
NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンをノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、態様1のB2M改変型NK-92細胞。
態様３：
B2Mを標的としかつその発現を阻害する干渉RNAを含む、態様2のB2M改変型NK-92細胞。
態様４：
前記細胞によって発現されるβ2ミクログロブリンの量が、β2ミクログロブリンを標的とした変更を有しないNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、態様1〜3のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様５：
NK-92細胞においてβ2ミクログロブリンをノックアウトすることによって作製される、態様1のB2M改変型NK-92細胞。
態様６：
HLA-E結合ペプチド、B2M、およびHLA-E重鎖を含む単鎖三量体を発現するように改変される、態様1〜5のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様７：
前記単鎖三量体が、B2M（β2ミクログロブリン）シグナルペプチド、Cw*0304リーダーペプチド、成熟B2Mポリペプチドおよび成熟HLA-Eポリペプチドを含む、態様6のB2M改変型NK-92細胞。
態様８：
Cw*0304リーダーペプチドが可動性リンカーによって成熟B2Mポリペプチドに連結され、かつ/または成熟B2Mポリペプチドが可動性リンカーによって成熟HLA-Eポリペプチドに連結される、態様7のB2M改変型NK-92細胞。
態様９：
C2*0304リーダーペプチドを成熟B2Mポリペプチドに連結する可動性リンカーおよび/または成熟B2Mポリペプチドを成熟HLA-Eポリペプチドに連結する可動性リンカーが、GlyおよびSerを含む、態様8のB2M改変型NK-92細胞。
態様１０：
HLA-E重鎖が成熟HLA-EGアミノ酸配列を含む、態様6〜9のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様１１：
単鎖三量体がSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む、態様6〜10のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様１２：
B2M改変型NK細胞が、細胞表面上の少なくとも1つのFc受容体もしくは細胞表面上の少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または細胞表面上の少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARを発現する、態様1〜11のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様１３：
前記少なくとも1つのFc受容体が、ヒトCD16ポリペプチドの成熟型の158位にバリンを有するヒトCD16ポリペプチドである、態様12のB2M改変型NK-92細胞。
態様１４：
前記少なくとも1つのFc受容体が、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつSEQ ID NO:5の158位に対応する位置にバリンを含む、態様12のB2M改変型NK-92細胞。
態様１５：
前記少なくとも1つのFc受容体がFcγRIIIである、態様12のB2M改変型NK-92細胞。
態様１６：
前記CARがFcεRIγの細胞質ドメインを含む、態様12〜15のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様１７：
前記CARが腫瘍関連抗原を標的とする、態様12〜16のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様１８：
サイトカインをさらに発現する、態様1〜17のいずれか一つのB2M改変型NK-92細胞。
態様１９：
サイトカインがインターロイキン-2またはその変異体である、態様18のB2M改変型NK-92細胞。
態様２０：
サイトカインが、小胞体に対して標的化される、態様19のB2M改変型NK-92細胞。
態様２１：
態様1〜20のいずれか一つの複数の細胞を含む、組成物。
態様２２：
生理学的に適切な賦形剤をさらに含む、態様21の組成物。
態様２３：
態様1〜20のいずれか一つの複数の改変型NK-92細胞を含む、改変型NK-92細胞株。
態様２４：
前記細胞が10未満の集団倍加を受けている、態様23の細胞株。
態様２５：
前記細胞が10U/ml未満のIL-2を含有する培養液中で培養される、態様23の細胞株。
態様２６：
それを必要とする患者におけるがんを治療する方法であって、態様23の細胞株の治療有効量を該患者に投与し、それによってがんを治療する段階を含む、方法。
態様２７：
抗体を投与する段階をさらに含む、態様26の方法。
態様２８：
患者の体表面積1m2あたり約1×108〜約1×1011個の細胞が患者に投与される、態様26または27の方法。
態様２９：
対照NK-92細胞と比較して低下したレベルのβ2ミクログロブリンを発現するNK-92細胞を作製するための方法であって、β2ミクログロブリンの発現を阻害するようにNK-92細胞を遺伝的に改変する段階を含む、方法。
態様３０：
β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階が、β2ミクログロブリン遺伝子の発現を排除または減少させるように、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いてβ2ミクログロブリン遺伝子を改変することを含む、態様29の方法。
態様３１：
β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階が、β2ミクログロブリン遺伝子の発現を排除または減少させるように、CRISPR/Casシステムを用いてβ2ミクログロブリン遺伝子を改変することを含む、態様30の方法。
態様３２：
β2ミクログロブリンの発現を遺伝的に改変する段階が、改変すべきNK-92細胞を、β2ミクログロブリンを標的とする干渉RNAと接触させることを含む、態様29の方法。
態様３３：
β2ミクログロブリンを標的とする干渉RNAが、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである、態様32の方法。
態様３４：
前記細胞によって発現されるβ2ミクログロブリンの量が、β2ミクログロブリンを標的とした変更を有しないNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、態様29〜33のいずれか一つの方法。
態様３５：
β2ミクログロブリン遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階が、
（i）NK-92細胞に、CRISPR関連（Cas）タンパク質を導入すること；および
（ii）改変すべきNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入すること
を含み、
該リボ核酸が、β2ミクログロブリン配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、ここで該標的モチーフが切断される、
態様29の方法。
態様３６：
Casタンパク質が、タンパク質の形態でNK-92細胞に導入される、態様35の方法。
態様３７：
Casタンパク質が、CasをコードするポリヌクレオチドをNK-92細胞に導入することによってNK-92細胞に導入される、態様35の方法。
態様３８：
Casタンパク質がCas9である、態様35〜37のいずれか一つの方法。
態様３９：
前記標的モチーフがβ2ミクログロブリン遺伝子の第1エクソン内にある、態様35〜38のいずれか一つの方法。
態様４０：
前記標的モチーフが20ヌクレオチドのDNA配列である、態様39の方法。
態様４１：
前記1つまたは複数のリボ核酸がSEQ ID NO：1〜4からなる群より選択される、態様35〜40のいずれか一つの方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、混合リンパ球反応におけるNK-92細胞の免疫原性の分析を示す例示的なデータを提供する。自家のまたは未刺激のPBMCは陰性対照として用い、一方でブドウ球菌（Staphylococcal）エンテロトキシンBスーパー抗原（SEB）は増殖の陽性対照として用いた。NK-92細胞を6,000 radで照射し、そして1:1の比で9例の健康な対照由来の500,000個のPBMCを刺激するために用いた。CD4+（左）またはCD8+（右）T細胞のIFN-g産生（上）および増殖（下）は、それぞれ1日後および5日後に測定した。
【図２】図2は、Cas9-NK-92およびCas9-haNK細胞株が高レベルのCas9タンパク質を発現したことを示す例示的なデータを提供する。
【図３】図3は、トランスフェクト無しのCas9-NK-92細胞、またはインビトロ転写B2M sgRNA-1 RNAを10 μgトランスフェクトした細胞における、ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）発現を分析する、例示的なフローサイトメトリーデータを提供する。
【図４】図4のパネルAおよびBは、野生型およびB2M-KO Cas9-NK-92細胞における、B2MおよびHLAクラスIの発現の分析を示す、例示的なフローサイトメトリーデータを提供する。結果は、B2M-KO Cas9-NK-92細胞が古典的HLAクラスI（A、B、C）および非古典的HLA-Eの発現を欠くことを実証した。
【図５】図5は、B2M-KO NK-92細胞が同種異系NK細胞による溶解に対して感受性であることを示す例示的なデータを提供する。新鮮単離した（左）または活性化した（右）初代NK細胞の、親（NK-92およびCas9-NK-92）またはB2M-KO（クローン番号27および番号37）NK-92細胞のいずれかを溶解する能力は、エフェクター対標的（E:T）の異なる比での4時間の細胞傷害性アッセイにおいて評価した。NK細胞溶解に対して高度に感受性の、HLA-I欠損赤白血病細胞であるK562を、陽性対照として含める。「n」は試験されたドナーの数を表す。
【図６】図6は例示的なHLA-E-SCT（単鎖三量体）分子の図解を示す。キメラHLA-E-SCT分子はB2M（β2ミクログロブリン）シグナルペプチド、Cw*03ペプチド、(G4S)3リンカー、成熟B2M鎖、(G4S)4リンカー、および成熟HLA-E鎖から構成される。
【図７】図7は、HLA-I欠損NK-92細胞におけるHLA-E-SCTの効率のよい発現を示す例示的なデータを提供する。親B2M-KO NK-92細胞、およびHLA-E-SCT発現B2M-KO NK-92細胞における、B2M、HLA-I（A、B、およびC）、ならびにHLA-Eの発現のフローサイトメトリー分析。
【図８】図8は、HLA-I欠損NK-92細胞におけるHLA-E-SCTの強制発現が、同種異系NK細胞による溶解に対する部分的な保護を付与することを示す、例示的なデータを提供する。親（NK-92およびNK-92-Cas9）、B2M-KO（クローン番号27および番号37）、ならびにHLA-E-SCT発現B2M-KO NK-92細胞の、同種異系NK細胞による溶解への感受性は、新鮮単離した（左）または活性化した（右）初代NK細胞のいずれかを用いた、エフェクター対標的（E:T）の異なる比での4時間の細胞傷害性アッセイにおいて評価した。親およびHLA-E-SCT発現K562細胞を、参照として含める。「n」は試験されたドナーの数を表す。
【図９】図9は、HLA-I欠損NK-92細胞がNK-92特異的同種異系CD8+ T細胞による溶解に耐性であることを示す例示的なデータを提供する。NK-92特異的同種異系CD8+ T細胞の、親（NK-92およびNK-92-Cas9）、B2M-KO（クローン番号27および番号37）、またはHLA-E-SCT発現B2M-KO NK-92細胞のいずれかを溶解する能力は、エフェクター対標的（E:T）の二つの異なる比での4時間の細胞傷害性アッセイにおいて評価した。1B9（左）および2H6（右）は、親NK-92細胞に対して作製された二つの異なるオリゴクローナルCD8+ T細胞集団に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
一局面では、本発明は、疾患の治療のために投与される治療用NK-92細胞の免疫原性を低減し、かつ投与されたNK-92細胞が患者のT細胞の標的になるという望ましくない結果を回避するための方法および組成物を提供する。したがって、本発明は、HLAクラスI発現が減少したB2M改変型NK-92細胞、およびそのような細胞の作製方法を提供する。本開示によるB2M改変型NK-92細胞は、B2Mを標的とした変更をNK-92細胞内に有する。そのような改変は、レシピエント自身の免疫系によってNK-92細胞が攻撃される危険性を最小限にし、それゆえにNK-92細胞療法の効率を高める。
【００１８】
専門用語
特に他で定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲では以下の意味を有すると定義される、いくつかの用語について言及することにする。
【００２０】
本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を説明することを目的としたにすぎず、本発明を限定することを意図したものではない。本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形をも含むことが意図される。
【００２１】
本明細書で使用する用語「約」および「およそ」は、数値または範囲で特定された量を変更するために使用する場合、その数値ならびに当業者に知られた該値からの妥当な偏差、例えば±20％、±10％、または±5％が、記載された値の意図した意味の範囲内であることを示す。
【００２２】
用語「含む」は、前記組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味するものである。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」とは、指定された材料またはステップ、ならびに特許請求の範囲に記載の本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを指す。「からなる」とは、痕跡量よりも多量の他の成分を排除し、記載された実質的な方法ステップを意味するものとする。これらの移行語（transition term）の各々によって定義される態様は、本発明の範囲内である。
【００２３】
用語「ナチュラルキラー（NK）細胞」とは、特定の抗原刺激の非存在下で、かつMHCクラスによる制限なしに、標的細胞を死滅させる免疫系の細胞を指す。標的細胞は腫瘍細胞またはウイルス保有細胞であり得る。NK細胞は、CD56表面マーカーの存在およびCD3表面マーカーの非存在によって特徴付けられる。
【００２４】
用語「NK-92細胞」は、本開示の実施例セクションでは「aNK細胞」とも呼ばれ、元来は非ホジキンリンパ腫の患者から得られたNK細胞株、NK-92を指す。本発明において、別段の指示がない限り、用語「NK-92」は、元のNK-92細胞株、ならびに（例えば、外因性遺伝子の導入により）改変されているNK-92細胞株、NK-92細胞のクローン、およびNK-92細胞を指すことを意図している。NK-92細胞ならびにその例示的かつ非限定的な改変型は、米国特許第7,618,817号、第8,034,332号、および第8,313,943号、ならびに米国特許出願公開第2013/0040386号に記載されており（これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、野生型NK92、NK92-CD16、NK92-CD16-γ、NK92-CD16-ζ、NK92-CD16(F176V)、NK92MI、およびNK92CIを含む。NK92細胞は公知であり、NantKwest社から当業者には容易に入手可能である。
【００２５】
用語「B2Mを標的とした変更」とは、NK-92細胞中のB2MのDNAまたはRNAの構造もしくは特性の変化、例えば、B2Mタンパク質のレベルの低下をもたらすB2M発現のノックアウトまたはノックダウンを指す。したがって、B2Mを標的とした変更は、B2M遺伝子またはB2M遺伝子転写産物を標的とし得る。ヒトB2Mタンパク質配列（ヒトB2M前駆体）の例は、アクセッション番号NP_004039で入手可能である。ヒトB2Mは15番染色体上にあり、位置15q21-q22.2にマッピングされる。Unigeneアクセッション番号はHs.534255であり、Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 7 (GRCh38.p7), Annotation Release 108によれば、15番染色体の44.71-44.72 Mbに位置する。用語「B2M」はまた、B2M染色体座位の遺伝子によってコードされる例示的な参照配列のアレル変異体も包含する。
【００２６】
用語「B2M改変型NK-92細胞」は、B2M発現量の低下をもたらすB2Mを標的とした変更を有するNK-92細胞を指す。遺伝的に改変されたNK-92細胞は、HLA-Eおよび/または他のトランスジーン、例えばFc受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、IL-2、もしくは自殺遺伝子など、をコードするベクターをさらに含み得る。
【００２７】
用語「B2M非改変型NK-92細胞」は、B2M発現を低下させるB2Mを標的とした変更を有しないNK-92細胞を指す。
【００２８】
用語「非照射NK-92細胞」は、照射されていないNK-92細胞を指す。照射は該細胞を成長および増殖できないようにする。いくつかの態様では、患者の治療に先立って、投与用のNK-92細胞を治療施設またはどこか他の場所で照射することができ、いくつかの態様では、照射と注入の間の時間は、最適な活性を維持するために4時間を超えないようにする。あるいは、NK-92細胞を別の機構によって不活性化することもできる。
【００２９】
本発明を説明するために使用される、NK-92細胞の「不活性化」は、それらが増殖できないようにする。不活性化はまた、NK-92細胞の死滅にも関連し得る。NK-92細胞は、それらが治療応用において病理に関連した細胞の生体外サンプルを効果的にパージした後で、あるいはそれらが哺乳動物の体内に存在する多くのまたは全ての標的細胞を効果的に殺傷するのに十分な時間体内に存在した後で、不活性化され得ることが想定される。不活性化は、非限定的な例として、NK-92細胞が感受性を示す不活性化剤を投与することによって誘導することができる。
【００３０】
本発明を説明するために使用される用語「細胞傷害性」および「細胞溶解性」とは、NK細胞のようなエフェクター細胞の活性を記述するために使用する場合、同義であることが意図される。一般に、細胞傷害活性は、様々な生物学的、生化学的、または生物物理学的機構のいずれかによって標的細胞を死滅させることに関係する。細胞溶解は、より具体的には、該エフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによってその物理的完全性を破壊するという活性を指す。それは結果的に標的細胞の死滅をもたらす。理論に拘束されるものではないが、NK細胞の細胞傷害効果は細胞溶解によるものであると考えられる。
【００３１】
細胞/細胞集団に関しての用語「殺傷する」または「死滅させる」は、その細胞/細胞集団の死につながるであろうあらゆる種類の操作を含むことが意図される。
【００３２】
用語「Fc受容体」は、Fc領域として知られる抗体の一部に結合することによって免疫細胞の防御機能に寄与する、特定の細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の表面上に見出されるタンパク質を指す。細胞のFc受容体（FcR）への抗体のFc領域の結合は、抗体媒介食作用または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ADCC）を介して細胞の食作用または細胞傷害活性を刺激する。FcRは、それらが認識する抗体のタイプに基づいて分類される。例えば、Fcガンマ受容体（FCγR）はIgGクラスの抗体に結合する。FCγRIII-A（CD16とも呼ばれる）は、IgG抗体に結合してADCCを活性化する低親和性Fc受容体である。FCγRIII-Aは典型的にはNK細胞上に見出される。天然型のCD16をコードする代表的なポリヌクレオチド配列をSEQ ID NO:5に示す。
【００３３】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかのヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造をとることができ、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には非ヌクレオチド成分が介在してもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、さらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。他に指定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られるまたは予測される2本の相補的一本鎖形態の各々との両方を包含する。他に指示がない限り、核酸配列は5'から3'に示される。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、4種のヌクレオチド塩基、例えば天然に存在する塩基アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；チミン(T)；ポリヌクレオチドがRNAである場合はチミンに代えてウラシル(U)、の特定の配列から構成される。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。
【００３５】
用語「同一性パーセント」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列同一性を指す。同一性パーセントは、比較のためにアライメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。本明細書で使用する語句「変異型」ヌクレオチド配列、または「変異型」アミノ酸配列とは、少なくとも特定のパーセンテージの、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの、同一性により特徴付けられる配列を指す。変異型ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の天然に存在するアレル変異体および突然変異体をコードする配列を含む。変異型ヌクレオチド配列は、ヒト以外の哺乳動物種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。変異型アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含みかつそのポリペプチドが同じ結合および/または活性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、変異型ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、参照配列と少なくとも60％以上の同一性、例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％以上の同一性を有する。いくつかの態様では、変異型ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、参照配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有する。いくつかの態様では、変異型アミノ酸配列は、15個以下、10個以下、5個以下または3個以下の保存的アミノ酸置換を有する。同一性パーセントは、公知のアルゴリズム、例えば、Smith-Watermanアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用する、Gapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.）により、デフォルト設定を用いて、決定することができる。
【００３６】
用語「に対応する」または「を参照して決定された」は、ポリペプチド配列中の所与のアミノ酸残基の同定に関連して使用される場合、所与のアミノ酸配列が最大限にアライメントされて参照配列と比較されるときの特定の参照配列の該残基の位置を指す。
【００３７】
用語「発現する」は、RNAまたはタンパク質であり得る遺伝子産物が産生されることを指す。
【００３８】
用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞に影響を与える一般的なクラスの生物学的分子を指す。本発明を実施する際に使用される例示的なサイトカインとしては、限定するものではないが、インターフェロンおよびインターロイキン（IL）、特にIL-2、IL-12、IL-15、IL-18およびIL-21が挙げられる。好ましい態様では、サイトカインはIL-2である。
【００３９】
用語「ベクター」は、例えば形質転換のプロセスによって、許容細胞内に配置されたときにベクターが複製され得るように、インタクトなレプリコンを含む非染色体性の核酸を指す。ベクターは、細菌などの、ある細胞型で複製することができるが、哺乳動物細胞などの、別の細胞で複製する能力は限られている。ベクターはウイルス性または非ウイルス性であり得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、以下が含まれる：裸のDNA；単独でまたはカチオン性ポリマーとの組み合わせで、カチオン性脂質と複合体を形成したDNA；アニオン性およびカチオン性リポソーム；不均一なポリリシン、一定の長さのオリゴペプチド、ポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと縮合したDNAを含むDNA-タンパク質複合体および粒子であって、場合によっては、リポソーム内に含まれるもの；ならびにウイルスおよびポリリシン-DNAを含む三元複合体の使用。
【００４０】
用語「標的モチーフ」は、結合に必要な十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合するであろう核酸の一部を規定する核酸配列を指す。
【００４１】
用語「干渉RNA」は、標的遺伝子の発現をノックダウンすることを目的としたRNA干渉機構の誘導を生じさせることができる、二本鎖または一本鎖のRNA核酸分子を指す。
【００４２】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書では交換可能に使用され、本明細書に記載の方法に適している、インビトロまたはインサイチュを問わない任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な態様では、患者、対象、または個体はヒトである。
【００４３】
用語「レシピエント」は、治療中に、改変型または非改変型に関わらず、NK-92細胞を投与される患者を指す。
【００４４】
用語「治療する」または「治療」は、ヒトなどの対象における本明細書に記載の疾患または障害の治療を包含し、(i)疾患または障害を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること；(ii)疾患または障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと；(iii)障害の進行を遅らせること；および/または(iv)疾患または障害の1つまたは複数の症状を抑制する、軽減する、またはその進行を遅らせること；を含む。対象にモノクローナル抗体またはナチュラルキラー細胞を「投与する」またはそれらの「投与」という用語は、意図した機能を果たすために該抗体または細胞を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、該細胞またはモノクローナル抗体の送達に適したどのような経路で行ってもよい。したがって、送達経路は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下送達を含み得る。いくつかの態様では、NK-92細胞は、例えば腫瘍への注入によって、腫瘍に直接投与される。
【００４５】
用語「接触させる」（すなわち、ポリヌクレオチド配列を、CRISPR関連（Cas）タンパク質および/またはリボ核酸と接触させる）は、細胞内でCasタンパク質および/またはリボ核酸を一緒にインビトロでインキュベートすること（例えば、培養中の細胞にCasタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸を添加すること）を含むことを意図している。いくつかの態様では、用語「接触させる」は、微生物（すなわち、細菌）中に天然に存在し得る本明細書に開示のCasタンパク質および/またはリボ核酸への細胞のインビボ曝露を含むことを意図しない。標的ポリヌクレオチド配列を、本明細書に開示のCasタンパク質および/またはリボ核酸と接触させる段階は、任意の適切な方法で実施することができる。例えば、細胞を接着培養で、または懸濁培養で処理することができる。本明細書に開示のCasタンパク質および/またはリボ核酸と接触させた細胞は、同時に、またはその後、増殖因子もしくは分化誘導剤などの別の作用物質と、または細胞を安定化させるもしくは細胞をさらに分化させる環境と、接触させることもできることが理解されよう。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチドによってコードされるRNAおよび/またはタンパク質産物が発現されないように標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げるやり方で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失することを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能性ドメイン（例えば、DNA結合ドメイン）にインデル（indel）を誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成することができる。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトするために、例えばCRISPR/Casシステム、ZFN、TALEN、TgAgoなどの、様々な遺伝的アプローチを使用する方法を容易に理解するであろう。
【００４７】
本明細書で使用する用語「ノックダウン」とは、発現を低下させる遺伝的改変を含まない対照細胞における標的mRNAまたは対応タンパク質の発現と比較したときの、遺伝的に改変された細胞における標的mRNAまたは対応タンパク質の発現の測定可能な低下を指す。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックダウンするために、例えばsiRNA、shRNA、マイクロRNA、アンチセンスRNA、または他のRNA媒介阻害技術などの、様々な遺伝的アプローチを使用する方法を容易に理解するであろう。
【００４８】
用語「減少」または「低下」とは、本明細書では交換可能に使用され、基準レベル、例えばB2M発現を低下させる遺伝的改変を有しない対照細胞と比較して、少なくとも10％の減少をいう。いくつかの態様では、発現は、基準レベルと比較して、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、もしくは最大100％（すなわち、基準サンプルと比較して、存在しないレベル）減少するか、または10〜100％の間で減少する。
【００４９】
用語「がん」は、白血病、がん腫および肉腫を含めて、哺乳動物に見られるあらゆる種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、頭頸部がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がん、および髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵臓内分泌腺および外分泌腺の新生物、前立腺がんなどがある。
【００５０】
NK-92細胞
NK-92細胞株は、インターロイキン-2（IL-2）の存在下で増殖することが発見されたユニークな細胞株である。Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994)。これらの細胞は、様々ながんに対して高い細胞溶解活性を有する。NK-92細胞株は、広範な抗腫瘍細胞傷害性を有する均質ながん性NK細胞集団であり、増殖後に予測可能な収量で得られる。第I相臨床試験ではその安全性プロファイルが確認されている。
【００５１】
NK-92細胞株は、CD56bright、CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、およびCD54表面マーカーを示すことが見出されている。さらに、それはCD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23およびCD34マーカーを提示しない。培養下のNK-92細胞の増殖は、組換えインターロイキン-2（rIL-2）の存在に依存しており、1IU/mL程度の低用量でも増殖を維持するのに十分である。IL-7およびIL-12は長期増殖を支持しないし、IL-1α、IL-6、腫瘍壊死因子α、インターフェロンαおよびインターフェロンγを含めて、試験した他のサイトカイン類も支持しない。NK-92は、1：1の低いエフェクター：標的（E：T）比でさえも高い細胞傷害性を有する。Gong, et al., 前掲。
【００５２】
これまで、内因性NK細胞に関する研究では、輸送中のNK細胞活性化にとってIL-2（1000IU/mL）が重要であること、しかし該細胞を37℃、5％二酸化炭素で維持する必要はないことが示されている。Koepsell, et al., Transfusion 53:398-403 (2013)。
【００５３】
HLAクラスI
ヒト白血球抗原（HLA）系は、ヒトでは主要組織適合性複合体（MHC）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。HLAクラスIタンパク質は全て、長いアルファ鎖と短いベータ鎖B2Mとを有する。HLAクラスIはB2Mの非存在下ではほとんど発現されず、また、HLAクラスIタンパク質が細胞内からペプチドを提示するためにはB2Mの発現が必要である。本開示は、非B2M改変型NK-92細胞と比較して、減少した量のB2Mを発現するB2M改変型NK-92細胞を提供する。したがって、これらの細胞は免疫学的監視および細胞傷害性T細胞による攻撃を回避する。一態様では、B2MはSEQ ID NO:6である。
【００５４】
本開示は、B2Mの発現を阻害するB2Mを標的とした変更を含むB2M改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞は、CRISPR/Cas9により媒介されるB2Mの遺伝的除去（genetic ablation）によって作製される。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞は、B2Mをノックダウンすることによって作製される。本開示はまた、患者におけるがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量のB2M改変型NK-92細胞を含む細胞株を投与することを含む方法を提供する。
【００５５】
NK-92細胞におけるβ2ミクログロブリンのノックアウト
いくつかの態様では、B2Mを標的とした変更を含むB2M改変型NK-92細胞は、NK-92細胞内のB2Mをノックアウトすることによって作製される。標的遺伝子の発現をノックアウトするための方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR/Casシステムがあるが、これらに限らない。そのような方法は、典型的には、1つまたは複数のヌクレアーゼをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを該細胞に投与することを含み、結果として、該ヌクレアーゼは、例えば1つまたは複数のドナー配列の存在下で、該ドナーがヌクレアーゼによって標的とされた内因性遺伝子に組み込まれるような、内因性遺伝子の改変を媒介する。1つまたは複数のドナー分子の組み込みは、相同組換え修復（homology-directed repair：HDR）を介して、または非相同末端結合（non-homologous end joining：NHEJ）関連修復によって起こる。特定の態様では、1対以上のヌクレアーゼが使用され、これらのヌクレアーゼは同じまたは異なる核酸によってコードされ得る。
【００５６】
CRISPR
いくつかの態様では、B2Mのノックアウトまたはノックダウンは、CRISPR/Casシステムを用いて行われる。CRISPR/Casシステムは、Casタンパク質と、B2M配列中の標的モチーフへとCasタンパク質を誘導しかつ標的モチーフにハイブリダイズすることができる少なくとも1〜2つのリボ核酸とを含む。その後、Casタンパク質は標的モチーフを切断して、二本鎖切断または一本鎖切断の結果をもたらす。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができるCRISPR/Casシステムであれば、どれを使用してもよい。ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプIシステムであり、ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプIIシステムである。ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプVシステムである。
【００５７】
本発明で使用されるCasタンパク質は、天然に存在するCasタンパク質またはその機能性誘導体であり得る。「機能性誘導体」は、それらが対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図される生物学的活性は、DNA基質を断片へと加水分解する機能性誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾体、およびその融合体、例えばCasタンパク質誘導体を包含する。Casポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Casタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合修飾体などがあるが、これらに限定されない。
【００５８】
いくつかの態様では、本発明で使用するCasタンパク質はCas9またはその機能性誘導体である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来である。Cas9は、crRNAに相補的でない標的DNAを切断するRuvC様ドメインと、crRNAに相補的な標的DNAを切断するHNHヌクレアーゼドメインとを含む、2つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。Cas9の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性はまた、プロトスペーサー関連モチーフ（protospacer-associated motif：PAM）として知られる短い保存された配列（2〜5ヌクレオチド）が標的配列中の標的モチーフのすぐ3'側に続くことが必要である。
【００５９】
いくつかの態様では、Casタンパク質はポリペプチドの形態でNK-92細胞に導入される。特定の態様では、Casタンパク質は、当技術分野において周知の細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。細胞透過性ペプチドの非限定的な例には、Milletti F, Cell-penetrating peptides: classes, orgin and current landscape. Drug Discov. Today 17: 850-860 (2012)に記載のものが含まれ、その関連する開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。場合によっては、B2M非改変NK-92細胞がCasタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【００６０】
いくつかの態様では、Casタンパク質がガイドRNAによって誘導されるB2M遺伝子中の標的モチーフは、長さが17〜23bpである。いくつかの態様では、標的モチーフは少なくとも20bpの長さである。いくつかの態様では、標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。いくつかの態様では、標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列であり、かつCasタンパク質によって認識されるプロトスペーサー関連モチーフ（PAM）として知られる短い保存配列のすぐ前にある。いくつかの態様では、PAMモチーフはNGGモチーフである。いくつかの態様では、B2M遺伝子の標的モチーフは第1エクソン内にある。
【００６１】
いくつかの態様では、標的モチーフは、本発明のCRISPR/Casシステムのオフターゲット作用を最小にするように選択され得る。いくつかの態様では、標的モチーフは、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、それが少なくとも2つのミスマッチを含むように選択される。いくつかの態様では、標的モチーフは、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、それが少なくとも1つのミスマッチを含むように選択される。当業者には理解されるように、オフターゲット作用を最小にするために、様々な技術を使用して適切な標的モチーフを選択することが可能である（例えば、バイオインフォマティクス解析）。
【００６２】
Casタンパク質をB2M配列中の標的モチーフに誘導しかつその標的モチーフにハイブリダイズすることができるリボ核酸は、シングルガイドRNA（「sgRNA」）と呼ばれる。sgRNAは、当業者には理解されるように、使用する特定のCRISPR/Casシステムおよび標的ポリヌクレオチドの配列に応じて選択することができる。いくつかの態様では、該1〜2つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小にするように選択され得る。いくつかの態様では、該1〜2つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様では、該1〜2つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様では、該1〜2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの態様では、該1〜2つのリボ核酸のそれぞれは、標的モチーフ間に位置する変異アレルに隣接するCasタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。ガイドRNAはまた、例えばhttp://crispr.mit.eduで、容易に入手可能なソフトウェアを用いて設計することもできる。1つまたは複数のsgRNAは、Casタンパク質が存在するNK-92細胞に、当技術分野で公知の方法に従って、トランスフェクションにより導入され得る。いくつかの態様では、sgRNAはSEQ ID NO:1〜4からなる群より選択される。
【００６３】
遺伝子発現を低下させるためにCRISPR/Casシステムを使用する方法は、種々の刊行物、例えば米国特許公開第2014/0170753号に記載されており、その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６４】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
いくつかの態様では、B2Mを標的とした変更を含むB2M改変型NK-92細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いて、NK-92細胞中のB2Mをノックアウトすることによって作製される。ZFNは、FokIエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（N）とジンクフィンガータンパク質（ZFP）を含む融合タンパク質である。標的遺伝子中の特定の座位を認識するためには1対のZNFが関わっており、一方は改変される部位の上流の配列を認識し、他方は下流の配列を認識する。そしてZFNのヌクレアーゼ部分がその特定の座位で切断して、標的遺伝子のノックアウトを引き起こす。遺伝子発現を低下させるためにZFNを使用する方法は周知であり、例えば、米国特許第9,045,763号に、さらにDurai et al., 「Zinc Finger Nucleases: Custom-Designed Molecular Scissors for Genome Engineering of Plant and Mamalian cells」 Nucleic Acid Research 33 (18):5978-5990 (2005)にも開示されており、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
いくつかの態様では、B2Mを標的とした変更を含むB2M改変型NK-92細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いて、NK-92細胞中のB2Mをノックアウトすることによって作製される。TALENは、それがゲノム部位付近に1対として結合し、同じ非特異的ヌクレアーゼFoKIを特定の部位でゲノムを切断するように誘導するという点でZFNと類似するが、DNAトリプレットを認識する代わりに、各ドメインは単一のヌクレオチドを認識する。遺伝子発現を低下させるためにZFNを使用する方法もまた周知であり、例えば、米国特許第9,005,973号に、さらにChristian et al. 「Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nulceases」 Genetics 186(2): 757-761 (2010)にも開示されており、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６６】
NK-92細胞におけるβ2ミクログロブリンのノックダウン
いくつかの態様では、B2Mを標的とした改変を含むB2M改変型NK-92細胞は、干渉RNAでB2Mをノックダウンすることによって作製される。干渉RNAは、インビボで導入されると、他のタンパク質とRNA誘導サイレンシング複合体（「RISC」）を形成して、RNA干渉（RNAi）として知られるプロセスを開始する。RNAiプロセスの間、RISCは一本鎖干渉RNAまたは二本鎖干渉RNAの一方の鎖を取り込む。取り込まれた鎖は、RISCが相補的mRNA転写産物を認識する鋳型として作用する。相補的mRNAが同定されると、RISCのタンパク質成分が活性化してmRNAを切断し、その結果、標的遺伝子発現のノックダウンが生じる。B2Mの発現をノックダウンするために使用される干渉RNA分子の非限定的な例には、siRNA、短鎖ヘアピン型RNA（shRNA）、一本鎖干渉RNA、およびマイクロRNA（miRNA）が含まれる。これらの干渉RNAを使用する方法は当業者に周知である。
【００６７】
一態様では、干渉RNAはsiRNAである。siRNAは、典型的には30ヌクレオチド長未満の二本鎖RNAである。siRNAによる遺伝子サイレンシングは、siRNAの一方の鎖がRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれることから開始する。RISCに取り込まれた鎖は、取り込まれたsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的なmRNA分子を同定し、その後RISCはこれらの標的mRNAを切断するか、またはそれらの翻訳を阻害する。
【００６８】
一態様では、干渉RNAはマイクロRNAである。マイクロRNAは小さな非コードRNA分子であり、それはmRNA分子内の相補的配列とハイブリダイズすることができ、その結果、mRNAの切断、またはそのポリ（A）テールの短縮によるmRNAの不安定化をもたらす。
【００６９】
一態様では、干渉RNAは一本鎖干渉RNAである。この一本鎖もまた、二本鎖siRNAより効率は劣るものの、二本鎖siRNAと同様の方法でmRNAサイレンシングをもたらすことができる。一本鎖干渉RNAは、典型的には、上記の二本鎖siRNAの場合と同様に、約19〜約49ヌクレオチドの長さを有する。
【００７０】
短鎖ヘアピン型RNAまたは低分子ヘアピン型RNA（shRNA）は、細胞内で生成されるsiRNAを介した標的遺伝子発現のサイレンシングに使用することができる、タイトなヘアピンターンをもつ人工RNA分子である。細胞内でのshRNAの発現は、典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスもしくは細菌のベクターを介して達成される。適切な細菌のベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。shRNAは、それが比較的低い分解速度および代謝回転を有するという点で、siRNAの有利なメディエーターである。
【００７１】
本発明で使用される干渉RNAは、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって天然のRNAとは異なり得る。非ヌクレオチド材料が5'末端、3'末端、または内部のいずれかで干渉RNAに結合していてもよい。天然に存在するRNAと比較して干渉RNAが含み得る修飾の非限定的な例は、米国特許第8,399,653号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。そうした修飾は一般に、以下を目的として設計される：干渉RNAのヌクレアーゼ耐性を増大させる；細胞への取り込みを改善する；細胞ターゲティングを高める；干渉RNAの追跡を助ける；安定性をさらに改善する；またはインターフェロン経路の活性化の可能性を低減させる。例えば、干渉RNAはオーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含み得る。ピロリジンリンカーによるsiRNA分子のセンス鎖の3'末端へのコレステロールのコンジュゲーションもまた、例えば、siRNAに安定性を付与する。
【００７２】
本発明で使用される干渉RNAは、典型的には約10〜60、10〜50、または10〜40（二本鎖）ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約8〜15、10〜30、10〜25、または10〜25（二本鎖）ヌクレオチドの長さ、約10〜24（二本鎖）ヌクレオチドの長さである（例えば、二本鎖siRNAの各相補的配列は10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜25、または10〜25ヌクレオチドの長さ、約10〜24、11〜22、または11〜23ヌクレオチドの長さであり、二本鎖siRNAは約10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜25、または10〜25塩基対の長さである）。
【００７３】
RNAiの対象となる遺伝子中の標的モチーフを選択するための技術は、当業者に公知であり、例えば、2004年5月6日に改訂されたTuschl, T. et al.,「The siRNA User Guide」に開示されており、ロックフェラー大学ウェブサイト；Technical Bulletin #506, 「siRNA Design Guidelines,」Ambion社, Ambionウェブサイト；および他のウェブベースの設計ツール、例えばInvitrogen、Dharmacon、Integrated DNA Technologies、Genscript、またはProligoウェブサイトで入手可能である。初期検索パラメータは、G/C含有量35〜55％およびsiRNA長さ19〜27ヌクレオチドを含み得る。標的配列は、mRNAのコード領域または5'もしくは3'非翻訳領域に位置し得る。その標的配列を使用して、本明細書に記載のものなどの干渉RNA分子を誘導することができる。
【００７４】
ノックアウトまたはノックダウンの効率は、当技術分野において周知の方法、例えば、定量的PCR、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーなどを用いて、B2M mRNAまたはタンパク質の量を測定することによって評価することができる。いくつかの態様では、ノックアウトまたはノックダウン効率を評価するために、B2Mタンパク質のレベルが評価される。特定の態様では、B2M発現低下の効率は、B2M非改変型NK-92細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、または少なくとも80％である。特定の態様では、該低下の効率は約10％〜約90％である。特定の態様では、該低下の効率は約30％〜約80％である。特定の態様では、該低下の効率は約50％〜約80％である。いくつかの態様では、該低下の効率は約80％以上である。
【００７５】
HLA-E改変
いくつかの態様では、本開示は、細胞表面にHLA-Eをも発現するB2M改変型NK-92細胞を提供する。患者の内因性NK細胞は、受容体CD94/NKG2AまたはCD94/NKG2Bを介してHLA-Eを認識するだろう。理論に拘束されるものではないが、該受容体とHLA-Eとの相互作用は内因性NK細胞の細胞傷害活性の阻害をもたらす。したがって、本発明は、B2Mを標的とした変更および上記のさらなる改変のいずれか1つまたは複数を有し、さらにHLA-Eリーダーペプチド（通常HLA-Eによって結合される）、成熟型のB2M、および成熟HLA-E重鎖を含む単鎖三量体を発現するように改変された、B2M改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、該三量体は、HLA結合ペプチド、B2M、およびHLA-E重鎖のコード配列の間にリンカー配列を含む。HLA-E結合ペプチドは、他のHLAクラスI分子、例えばHLA-A、HLA-B、またはHLA-Cのリーダー配列に由来する。例えば、一態様では、HLA-E結合ペプチドはHLA-A*0201のリーダー配列であり、VMAPRTLVL (SEQ ID NO:20)の配列を有する。一態様では、該三量体ペプチドに含まれるHLA-E重鎖ポリペプチドは、SEQ ID NO:7の成熟ポリペプチド領域に対応するアミノ酸配列を含み、すなわち、SEQ ID NO:7のアミノ酸22-358を含む。代替の態様では、該三量体ペプチドに含まれるHLA-E重鎖ポリペプチドは、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
三量体単鎖HLA-E分子は、ブタの内皮細胞をヒトNK細胞による殺傷から保護するための異種移植実験において成功裏に使用された（Crew et al Mol Immunol 2005およびLilienfelde et al Xenotransplantation 2007）。これらの研究で使用されたペプチドは、ヒトHLA-Cw*0304のリーダーペプチドに対応する。上記のように、他のHLAクラスI分子からのリーダーペプチドもまた使用され得る。なぜなら、それらはHLA-Eに結合しかつCD94/NKG2A+ NK細胞クローンにより媒介される殺傷を阻害することが示されているからである（例えば、Braud et al Nature 1998およびEur. J. Immunol. 1997を参照されたい）。
【００７７】
上述したように、いくつかの態様では、該三量体はリンカー配列を含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは、例えばGly、Asn、Ser、Thr、Alaなどのアミノ酸を含む、可動性リンカーである。そのようなリンカーは公知のパラメータを用いて設計される。例えば、リンカーは、Gly-Serリピートのような繰り返しを有し得る。
【００７８】
さらなる改変
Fc受容体
いくつかの態様では、B2Mを標的とした変更を含むB2M改変型NK-92細胞は、細胞表面上にFc受容体を発現するようにさらに改変される。例えば、B2M改変型NK-92細胞がモノクローナル抗体と共に投与されるいくつかの態様では、Fc受容体は、ADCCを介して標的細胞を殺傷する抗体と協調してNK細胞が機能するようにする。いくつかの態様では、Fc受容体はIgG Fc受容体FcγRIIIである。いくつかの態様では、Fc受容体は、膜貫通免疫グロブリンγFc領域受容体III-A（CD16）の高親和性形態であり、そのような形態では成熟型の該ポリペプチドの158位にバリンが存在する。
【００７９】
Fc受容体の非限定的な例を以下に提供する。これらのFc受容体は、それらの好ましいリガンド、親和性、発現、および抗体に結合した後の効果の点で異なっている。
【００８０】
（表１）例示的なFc受容体
2019532640.tif 000003
2019532640.tif 000004
【００８１】
いくつかの態様では、Fc受容体はCD16である。典型的な態様では、NK-92細胞は、成熟型のタンパク質、例えばSEQ ID NO:5、の158位にバリンを有するヒトCD16の高親和性形態を発現するように改変される。成熟タンパク質の158位は、天然のシグナルペプチドを含むヒトCD16配列の176位に対応する。
【００８２】
いくつかの態様では、該CD16は、SEQ ID NO:5に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の同一性を有し、かつSEQ ID NO:5を参照して確定されるように158位にバリンを含む。
【００８３】
キメラ抗原受容体
いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞は、細胞表面にキメラ抗原受容体（CAR）を発現するようにさらに操作される。任意で、CARは腫瘍特異的抗原に対して特異的である。腫瘍特異的抗原は、非限定的な例として、US 2013/0189268、WO 1999024566 A1、US 7098008、およびWO 2000020460 A1に記載されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。腫瘍特異的抗原としては、NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19およびCD33が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる非限定的な腫瘍関連抗原およびそれらに関連する悪性腫瘍は、表2に見出すことができる。
【００８４】
（表２）腫瘍特異的抗原および関連する悪性腫瘍
2019532640.tif 000005
2019532640.tif 000006
2019532640.tif 000007
【００８５】
いくつかの態様では、CARはCD19、CD33またはCSPG-4を標的とする。いくつかの態様では、CARは特定のがんの種類に関連する抗原を標的とする。例えば、そのがんは、以下からなる群より選択することができる：白血病［例えば、急性白血病（例：急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例：骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病））および慢性白血病（例：慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、および慢性リンパ性白血病）］、真性赤血球増加症、リンパ腫（例：ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば、限定するものではないが、肉腫およびがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽腫。
【００８６】
CARは、例えば、特許公開番号WO 2014039523、US 20140242701、US 20140274909、US 20130280285、およびWO 2014099671に記載されるように操作され得る；それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。任意で、該CARはCD19 CAR、CD33 CARまたはCSPG-4 CARである。
【００８７】
サイトカイン
いくつかの態様では、本発明は、少なくとも1つのサイトカインを発現するようにさらに改変されたB2M改変型NK-92細胞を提供する。そのような細胞では、細胞内のサイトカインの発現は典型的には小胞体に向けられる。この特徴は、サイトカインの全身投与の望ましくない影響、例えば、心血管系、胃腸系、呼吸器系および神経系に影響を及ぼす毒性を防ぐ。いくつかの態様では、少なくとも1つのサイトカインは、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21またはそれらの変異体である。好ましい態様では、サイトカインはIL-2、例えばヒトIL-2である。
【００８８】
特定の態様では、IL-2は小胞体に標的とされる変異体である。したがって、例えば、IL-2は、IL-2を小胞体に向けるシグナル配列と共に発現される。いくつかの態様では、IL-2はヒトIL-2である。理論に拘束されるべきではないが、IL-2を小胞体に向けることは、オートクリン活性化に十分なレベルでのIL-2の発現を可能にするが、IL-2を細胞外に放出することはない。Konstantinidis et al 「Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells」 Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64を参照されたい。
【００８９】
いくつかの態様では、自殺遺伝子をB2M改変型NK-92細胞に挿入する、例えば、IL-2を発現するB2M改変型NK-92細胞に挿入して、未制御のIL-2の内因性発現を防止することもでき、これは自律的増殖を有する突然変異体の開発につながる可能性がある。いくつかの態様では、自殺遺伝子は誘導型カスパーゼ9（iCas9）である。
【００９０】
トランスジーン発現
本開示には、上記のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、例えば、Casタンパク質、HLA-E、CD16、Fc受容体、CAR、および/またはIL-2と顕著な配列同一性を共有する配列も含まれる。こうした配列もまた、B2M非改変型NK-92細胞に導入することができる。いくつかの態様では、該配列は、それらのそれぞれの天然配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも88％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。
【００９１】
トランスジーン（例えば、Casタンパク質、HLA-E、CD16、Fc受容体、CAR、および/またはIL-2）は、当業者に公知のいずれかの機構によって発現プラスミドに導入され得る。トランスジーンは同じまたは異なる発現プラスミドに導入することができる。好ましい態様では、これらのトランスジーンは同じプラスミドで発現される。
【００９２】
トランスジーンは、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、または「遺伝子銃」などの、当技術分野で公知の一過性トランスフェクション法を用いてNK-92細胞に導入することができる。
【００９３】
これらのトランスジーンを発現させるために、いくつものベクターを使用することができる。ある態様では、ベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様では、ベクターはプラスミドベクターである。使用できる他のウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなどが含まれる。
【００９４】
併用療法
いくつかの態様では、本開示のB2M改変型NK-92細胞は、治療用抗体および/または他の抗がん剤と組み合わせて使用される。治療用抗体を用いて、感染している細胞またはがん関連マーカーを発現している細胞を標的とすることができる。がん治療用のモノクローナル抗体の例を表3に示す。
【００９５】
（表３）例示的な治療用モノクローナル抗体
2019532640.tif 000008
2019532640.tif 000009
【００９６】
抗体は多くの作用機序を通してがんを治療し得る。FcRをも発現する本開示のB2M改変型NK細胞などの免疫細胞が、CD16のようなFc受容体を介して、標的細胞に結合している抗体に結合すると、抗体依存性細胞傷害（ADCC）が起こる。したがって、いくつかの態様では、FcRを発現するB2M改変型NK-92細胞は、特定のがん関連タンパク質に対する抗体と一緒に患者に投与される。このようなNK-92細胞の投与は、モノクローナル抗体の投与と同時に、または逐次的に実施することができる。いくつかの態様では、対象をモノクローナル抗体で治療した後に、その対象に該NK-92細胞を投与する。あるいは、B2M改変型NK-92細胞を、モノクローナル抗体と同時に、例えば24時間以内に、投与することができる。
【００９７】
いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞は静脈内に投与される。いくつかの態様では、FcRを発現するNK-92細胞は骨髄に直接注入される。
【００９８】
治療
本明細書に記載のB2M-NK-92細胞で患者を治療する方法も提供される。いくつかの態様では、患者はがんまたは感染症に罹患している。上述したように、B2M-NK-92細胞は、患者のがん細胞の表面に発現される抗原を標的とするCARを発現するようにさらに改変され得る。いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞はまた、Fc受容体、例えばCD16、を発現させることもできる。いくつかの態様では、患者はB2M改変型NK-92細胞で治療され、さらには抗体でも治療される。
【００９９】
B2M改変型NK-92細胞は細胞の絶対数で個体に投与され得る；例えば、該個体は約1000個/注入から約100億個/注入までの細胞を投与され、例えば、注入1回あたり約、少なくとも約、または多くとも約、1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103個（など）のNK-92細胞、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）で投与され得る。
【０１００】
他の態様では、前記個体は約1000個/注入/m2から約100億個/注入/m2までの細胞を投与され、例えば、注入1回あたり約、少なくとも約、または多くとも約、1×108個/m2、1×107個/m2、5×107個/m2、1×106個/m2、5×106個/m2、1×105個/m2、5×105個/m2、1×104個/m2、5×104個/m2、1×103個/m2、5×103個/m2（など）のNK-92細胞、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）で投与され得る。
【０１０１】
他の態様では、B2M改変型NK-92細胞は細胞の相対数で前記個体に投与され得る；例えば、該個体は個体1キログラムあたり約1000個から約100億個までの細胞を投与され、例えば、個体1キログラムあたり約、少なくとも約、または多くとも約、1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103個（など）のNK-92細胞、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）で投与され得る。
【０１０２】
他の態様では、総用量は、体表面積1m2によって計算され、例えば、1m2あたり約1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107個、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）を含む。平均的な人は約1.6〜約1.8m2である。好ましい態様では、約10億〜約30億個のNK-92細胞が患者に投与される。他の態様では、1回あたりに注入されるNK-92細胞の量は、体表面積m2によって計算され、例えば、1m2あたり1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107個を含む。平均的な人は1.6〜1.8m2である。
【０１０３】
B2M改変型NK-92細胞と、任意で他の抗がん剤は、がん患者に1回投与することができ、治療の間に複数回、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23時間ごとに1回、または1、2、3、4、5、6もしくは7日ごとに1回、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週もしくはそれ以上ごとに1回、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）ごとに1回投与することができる。
【０１０４】
いくつかの態様では、B2M改変型NK-92細胞は、B2M改変型NK-92細胞および媒体、例えばヒト血清またはその同等物、を含む組成物として投与される。いくつかの態様では、媒体はヒト血清アルブミンを含む。いくつかの態様では、媒体はヒト血漿を含む。いくつかの態様では、媒体は約1％〜約15％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。いくつかの態様では、媒体は約1％〜約10％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。いくつかの態様では、媒体は約1％〜約5％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。好ましい態様では、媒体は約2.5％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。いくつかの態様では、血清はヒトAB血清である。いくつかの態様では、ヒト治療薬での使用を容認できる代用血清がヒト血清の代わりに使用される。そのような代用血清は当技術分野で公知であるか、または将来開発される可能性がある。15％を上回る濃度のヒト血清を使用することができるが、約5％を超える濃度は桁違いの費用がかかると考えられる。いくつかの態様では、NK-92細胞は、NK-92細胞および細胞の生存を支持する等張液を含む組成物として投与される。いくつかの態様では、NK-92細胞は、凍結保存サンプルから再調製されている組成物として投与される。
【０１０５】
薬学的に許容される組成物は、様々な担体および賦形剤を含み得る。様々な水性担体、例えば緩衝生理食塩水など、を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に望ましくない物質を含まない。適切な担体および賦形剤ならびにそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, David B. Troy編, Lippicott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。薬学的に許容される担体とは、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれる薬学的組成物の他の成分と有害な方法で相互作用することなく、対象に投与される。対象に投与する場合、担体は、活性成分の分解を最小限に抑え、かつ対象において有害な副作用を最小限にするように任意選択される。本明細書で使用するとき、薬学的に許容されるという用語は、生理学的に許容されるおよび薬理学的に許容されると同義に用いられる。薬学的組成物は、一般に緩衝化および貯蔵中の保存のための作用剤を含み、また、投与経路に応じて、適切な送達のための緩衝剤および担体を含み得る。
【０１０６】
インビボまたはインビトロで使用するためのこれらの組成物は、細胞に用いられる滅菌技術によって滅菌され得る。該組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて許容される補助物質を含むことができ、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムのようなpH調整・緩衝剤、毒性調整剤などを含み得る。これらの製剤および/または他の薬剤中の細胞の濃度は様々であり得、選択される特定の投与方法および対象のニーズに従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。
【０１０７】
一態様では、B2M改変型NK-92細胞は、治療下のがんに対する1つまたは複数の他の治療と組み合わせて患者に投与される。いくつかの態様では、治療下のがんに対する2つ以上の他の治療には、例えば、抗体、放射線、化学療法、幹細胞移植、またはホルモン療法が含まれる。
【０１０８】
一態様では、B2M改変型NK-92細胞は、患部細胞を標的とする抗体と組み合わせて投与される。一態様では、B2M改変型NK-92細胞と抗体は、患者に一緒に、例えば同じ製剤で、別々に、例えば別個の製剤で、同時に投与されるか、または別々に、例えば異なる服薬スケジュールでもしくは1日の異なる時間に、投与され得る。別々に投与する場合は、抗体を静脈内または経口投与などの任意の適切な経路で投与することができる。
【０１０９】
いくつかの態様では、FcR、例えばFcRを表す高親和性CD16、をも発現するB2M改変型NK-92細胞は、モノクローナル抗体の投与と同時に、または逐次的に投与することができる。いくつかの態様では、FcR発現NK-92細胞は、対象がモノクローナル抗体で治療されてから24時間以内に該対象に投与される。
【０１１０】
キット
本明細書に記載されるような、ある量のB2M改変型NK-92細胞を含む組成物を用いて、がんまたは感染症を治療するためのキットも開示される。いくつかの態様では、本開示のキットはまた、少なくとも1つのモノクローナル抗体を含み得る。
【０１１１】
特定の態様では、前記キットは、B2M改変型NK-92細胞の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与されることになっている、治療活性化合物または薬物などの追加の化合物を含み得る。そのような化合物の例には、抗体、ビタミン、ミネラル、フルドロコルチゾン、イブプロフェン、リドカイン、キニジン、化学療法剤などが含まれる。
【０１１２】
様々な態様では、キットの使用説明書は、がんまたは感染症の治療においてキットの構成要素を使用するための指示を含むであろう。該説明書は、B2M改変型NK-92細胞の扱い方（例えば、解凍および/または培養）に関する情報をさらに含んでもよい。該説明書は、投与量および投与頻度に関するガイドラインをさらに含み得る。
【０１１３】
開示された方法および組成物に使用され得るか、それと組み合わせて使用され得るか、その調製において使用され得るか、またはその産物である、材料、組成物、および成分が開示される。これらおよび他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物の様々な個々のおよび集合的な組み合わせと順列の具体的な言及は、明示的に開示されていないことがあるが、それぞれは本明細書で具体的に企図されて説明されていることが理解されよう。例えば、ある方法が開示されて論じられ、その方法を含むいくつかの分子に対してなされ得る多くの改変が論じられる場合、その方法および可能な改変のありとあらゆる組み合わせと順列は、そうでないと具体的に示されない限り、具体的に企図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図されて開示されている。この概念は、本開示の全ての局面、例えば、限定するものではないが、開示された組成物を使用する方法のステップ、に適用される。したがって、実施できる様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせと共に実施することができ、そしてそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれは具体的に企図されて開示されていると見なされるべきであることが理解されよう。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は例示的な目的のみのためのものであり、かつそれらは請求される発明の限定として解釈されるべきではない。意図された発明を当業者が成功裏に実施することを同様に可能にする、当業者が利用可能な多様な代替技術および手順が存在する。
【０１１５】
実施例1: NK-92細胞の免疫原性の分析
NK-92細胞の免疫原性の初期評価を、混合リンパ球反応（MLR）実験において実施し、ここで健康なドナー由来のPBMC（末梢血単核細胞）を、照射された同種異系PBMCまたはNK-92細胞と混合した。図1に示すように、CD8+ T細胞の増殖応答は同種異系PBMCおよびNK-92細胞に対して観察された。ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）スーパー抗原は増殖の陽性対照として用いた。
【０１１６】
実施例2: CAS9-NK-92細胞株およびCAS9-haNK細胞株の作製
Cas9タンパク質を安定的に発現する細胞株は、NK-92およびhaNK親細胞にEdit-R Cas9レンチウイルスを感染させることによって作製した。手短に言えば、Edit-R Cas9レンチウイルスストックは、10 cmペトリ皿1枚につき7x106個の293T細胞に以下の量のプラスミドをトランスフェクトすることによって製造した: 7.5 μgのEdit-R-Cas9（Dharmacon、カタログ番号CAS10138）、5 μgのpCMV-ΔR8.2、および2.5 μgのpCMV-VSV.G。トランスフェクションは、Lipofectamine 3000（Life Technologies、カタログ番号L3000-008）を用いて製造元の使用説明書にしたがって実施した。ウイルス上清はトランスフェクションの48時間後に回収し、そしてSystem BiosciencesのPEG-it Virus Precipitation Solution（カタログ番号LV810A-1）を用いて10倍に濃縮した。5x105個のNK-92またはhaNK親細胞（高親和性CD16を発現するNK-92細胞）は、TransDux（System Biosciences、カタログ番号LV850A-1）の存在下、24ウェルプレートにおける1 mlの最終培地での100 μlの濃縮ウイルスを用いたスピノキュレーション（840 g、99分間、35℃）によって感染させた。形質導入の48時間後、Cas9発現細胞は、15 μg/mlのブラストサイジン（InvivoGen、カタログ番号ant-bl-1）の存在下で細胞を生育することにより選択した。
【０１１７】
NK-92細胞はDNAトランスフェクションに対し完全に不応性である。リポソームに基づくものまたはエレクトロポレーションのいずれかである大多数のトランスフェクションの方法は効率が悪く、かつ乏しい細胞回収をもたらす。DNAトランスフェクションとは対照的に、エレクトロポレーションを用いたRNAトランスフェクションは高度に効率が良く、かつ一貫して90%またはそれより高い細胞生存率をもたらす（データは示さない）。そのよりよい実績にもかかわらず、大きなRNA分子の効率のよいトランスフェクションは難題となりうる。それゆえに、この実験の目的のため、Cas9を安定的に発現するNK-92およびhaNK細胞を上述のように作製した。細胞溶解物は、1 mM PMSF、1 μg/mlアプロチニン、1 μg/mlロイペプチンを追加したRIPA溶解バッファー（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS）中に調製した。タンパク質濃度はBCA Protein Assay（Pierce）によって測定した。総タンパク質（10 μg）は、10% SDS-PAGEにおいて分離し、iBlot2装置（Life Technologies）を用いてニトロセルロース膜（Life Technologies、カタログ番号IB23002）に転写し、そしてCas9に対する一次抗体（Cell Signaling、カタログ番号14697）または抗αチューブリン一次抗体（Santa Cruz Biotechnology、sc-23948）をプローブとして調べ、その後西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヒツジ抗マウスまたは抗ウサギIg（Amersham）とともにインキュベーションした。シグナルはSuperSignal West Femto（Pierce）を用いて生じさせた。
【０１１８】
図2はCas9-NK-92細胞およびCas9-haNK細胞が高レベルのCas9タンパク質を発現することを示す。より重要なことに、これらの細胞株は遺伝子ノックアウトを効率よく作製するために使用することができる。図3に示すように、NK-92細胞へのB2M sgRNA-1のトランスフェクションは、B2M発現陰性NK-92細胞をおよそ30%もたらす。フローサイトメトリー分析は、インビトロ転写B2M sgRNA-1 RNAをトランスフェクトしたCas9-NK-92細胞におけるノックアウトに効率の良いトランスフェクション後48時間で実施した。
【０１１９】
実施例3: pT7-Guide-IVT B2M（ベータ-2-ミクログロブリン）sgRNA構築物の作製
ガイドRNAはMITのウェブツール http://crispr.mit.edu. を用いて設計した。sgRNAはヒトB2M、NM_004048の第一エクソンを標的とする。
2019532640.tif 000010
【０１２０】
B2M標的部位はpT7-Guide-IVTプラスミド（Origene、カタログ番号GE100025）中にクローニングした。オリゴは、pT7-Guide-IVTにおける二つのBsmBI部位を用い、かつ製造元の使用説明書にしたがってクローニングした。インビトロ転写B2M sgRNAは、製造元の使用説明書にしたがって、MEGAshortscript（商標）T7キット（Life Technologies、カタログ番号AM1354）を用いて作製した。
【０１２１】
実施例4: B2M-KO NK-92細胞の作製および特徴付け
B2M-KO NK-92細胞は、MaxCyte GTエレクトロポレーターを用いてB2M sgRNA-1 RNAをCas9-NK-92細胞にトランスフェクトすることにより作製した。簡潔に言えば、NK-92-3-OCプロトコルを用いて、5x106個のCas9-NK-92細胞に10 μgのインビトロ転写B2M sgRNA-1 RNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、限界希釈により細胞を平板培養した。細胞を15日間生育させたのち、個々のクローンを選択し、拡大させ、そしてB2M発現についてフローサイトメトリーにより試験した。図4のパネルAおよびBは、二つの代表的なB2M-KO NK-92クローンの、B2MおよびHLAクラスIの発現を示す。図4に示すように、NK-92細胞におけるB2M遺伝子の遺伝学的除去は、細胞表面上でのHLAクラスI発現の完全な喪失を導く。
【０１２２】
抗B2M-PE抗体（カタログ番号316306）、抗HLA-I-PE抗体（カタログ番号311406）、およびIgG1-PEコントロール抗体（カタログ番号400114）はBioLegendから取得した。細胞蛍光測定法的分析はMACSQuant 10フローサイトメーター（Miltenyi）において実施し、そしてFlowJoソフトウェアを用いて分析した。
【０１２３】
実施例5: HLAクラスI欠損NK-92細胞は同種異系NK細胞による溶解に感受性である
より免疫原性の低い、NK-92のHLAクラスI陰性変異体を作製することの潜在的な危険とは、これら細胞が、レシピエントのNK細胞による溶解に対して感受性となるかもしれない、という点である。NK細胞の細胞傷害活性は、複数の細胞表面受容体によって媒介される活性化シグナルおよび抑制シグナルの間のバランスによって決定される。NK細胞は、HLAクラスI分子の認識の際に抑制シグナルを変換しかつNK細胞が媒介する溶解を阻止する細胞表面受容体（KIRおよびCD94/NKG2A）の使用により、HLAクラスI発現をモニターすることで知られている。したがって、HLAクラスI発現の喪失は、受容体が媒介するNK細胞の抑制の欠如をもたらし、これはそれらの活性化およびHLAクラスI陰性標的の溶解を導きうる。
【０１２４】
本発明者らは、HLA-I欠損NK-92細胞の、同種異系NK細胞による溶解への感受性を、精製したばかりの（非活性化）または活性化した（IL-2刺激）いずれかの、複数のドナー由来のNK細胞をエフェクターとして用いる細胞傷害性実験において評価した。図7に示すように、HLAクラスI分子を発現しないNK-92細胞は、親NK-92細胞と比べ、同種異系NK細胞による溶解に対して高度に感受性となる。それらの感受性は、NK細胞による殺傷に対して高度に感受性の、HLA-I欠損細胞株であるK562のそれに匹敵する。
【０１２５】
実施例6: 単鎖三量体としてのHLA-Eの発現による、HLAクラスI欠損NK-92細胞の保護
この実施例は、HLAクラスI欠損NK-92細胞においてHLA-E単鎖三量体を発現させることの保護効果を評価する。例示的なHLA-E単鎖三量体の設計は図6に示す。
【０１２６】
HLA-E-SCTは、同種異系NK細胞溶解に対する部分的な保護を付与する
HLA-Eは他の古典的HLA-I分子のシグナル配列に由来するペプチドに結合し、かつNK受容体CD94/NKG2A、CD94/NKG2B、およびCD94/NKG2Cのリガンドである。単一の分子として発現される、抗原性ペプチド、β2ミクログロブリン、およびHLA-I重鎖からなるキメラHLA-I分子は、細胞表面上に効率よく提示され得、かつそれらの抗原受容体に認識され得ることが示されている（Yu, et al., J Immunol 168:3145-9, 2002）。特に、単鎖三量体（SCT）としてのHLA-Eの強制発現は、異種移植におけるブタ内皮細胞のNK細胞溶解、および同種異系多能性幹細胞（PSCs）のNK細胞溶解を阻害するために用いられている（Crew, et al., Mol Immunol 42:1205-14, 2005; Gornalusse, et al., Nat Biotechnol, 25:765-772, 2017）。単鎖三量体としてのHLA-Eの発現を、発現がHLA-I欠損NK-92細胞を同種異系NK細胞溶解から保護するかどうかを評価するために、HLA-I欠損NK-92細胞において回復させた。キメラHLA-E-SCT分子は以下の要素を包含する:β2mシグナルペプチド、Cw*0304ペプチド（VMAPRTLIL、SEQ ID NO:12）、(G4S)3リンカー、成熟2βm鎖、(G4S)4リンカー、および成熟HLA-E鎖（図6）。このキメラタンパク質は前記Crewらのものに基づいているが、重要な差異は、この実施例で用いられた設計物が、107位にGlyを含み、かつ多くのペプチドに対するより高い親和性およびより高い熱安定性を示すことが示されている（Strong, et al., J Biol Chem: 278:5082-90, 2003）、HLA-EG（E*0101対立遺伝子）対立遺伝子に対応する点である。図7に示すように、二つの異なるHLA-I欠損NK-92クローンにおけるHLA-E-SCTの強制発現は、HLA-E発現を、親細胞のそれよりも高いレベルまで回復させた。重要なことに、β2m鎖は成熟HLA-E鎖と共有結合しているので、細胞は古典的HLA-A、-B、および-C分子の発現を欠損したままである（図7）。HLA-E-SCT発現B2M-KO NK-92細胞におけるHLA-Eの高レベルの発現にもかかわらず、本実施例ではHLA-Eは、非活性化または活性化同種異系NK細胞による溶解に対して部分的な保護を付与した（図8）。理論によって拘束されるものではないが、これは、NK細胞のサブセットによる、抑制型CD94/NKG2A受容体の制限された発現に起因するようである。同種異系NK細胞溶解に対するより高度な保護と、CD94/NKG2A陽性NK細胞のより高いパーセンテージとの間の正の相関が実際に観察された（データは示さない）。
【０１２７】
HLA-I欠損NK-92細胞は、同種異系CD8+ T細胞の応答を誘発しない
NK-92細胞は標準的な混合リンパ球反応（MLR）実験においてCD8+ T細胞またはCD4+ T細胞の増殖を誘発し（図1）、これらの細胞が免疫原性であることを表す。加えて、NK-92細胞によって発現されるHLA分子に対する抗体が、NK-92細胞の注入を受けた患者において検出されている。したがって、現在の臨床プロトコルが、照射されたNK-92細胞の複数回の注入をともなうことから、一部の患者がNK-92細胞に対する免疫応答を引き起こし、そして有効性を弱めうるリスクがある。
【０１２８】
HLA-I欠損NK-92細胞はCD8+ T細胞によって認識されないはずであり、これはそれらが、CD8+ T細胞へとそれらのTCR（T細胞受容体）への結合を介して抗原性ペプチドを提示する、古典的HLA-A、-B、および-C分子を欠くためである。HLA-I欠損NK-92細胞の免疫原性の潜在性の欠如を正式に証明するため、本発明者らは親NK-92細胞に対して反応性の、ポリクローナルCD8+ T細胞を作製した（材料と方法において記載のとおり）。注目すべきことに、これらのNK-92特異的CD8+ T細胞は親NK-92細胞を認識して殺傷することができたが、HLA-I欠損NK-92細胞を溶解することはできなかった（図9）。
【０１２９】
材料と方法
細胞培養
NK-92細胞は、5%ヒト血清（Valley Biomedical、カタログ番号HP1022）、および組み換えヒトIL-2（500 IU/ml; Prospec、カタログ番号Cyt-209）を追加したX-VIVO 10培地（Lonza、カタログ番号BE04-743Q）中で維持した。K562細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC、Rockville、MD）から購入し、そして10% FBS（Gibco、カタログ番号10438026）および1%ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号15070-063）を追加したRPMI-1640培地（Thermo Scientific、カタログ番号61870-127）中で維持した。
【０１３０】
HLA-E-SCT（単鎖三量体）の設計および配列
HLA-E単鎖三量体（SCT）は以下の配列を包含する: B2M（β2ミクログロブリン）シグナルペプチド−Cw*0304リーダーペプチド−リンカー(G4S)3−成熟B2M配列−リンカー(G4S)4−成熟HLA-E配列（図6）。
HLA-E-SCTのDNA配列およびタンパク質配列は以下に対応する:
B2Mシグナルペプチド
B2M、ベータ-2-ミクログロブリン→Gene ID: 567。
タンパク質: UniProt→P61769
B2Mシグナルペプチドのアミノ酸配列:
2019532640.tif 000011
B2Mシグナルペプチドのヌクレオチド配列:
2019532640.tif 000012
リンカー
リンカー(G4S)3のヌクレオチド配列:
2019532640.tif 000013
リンカー(G4S)4のヌクレオチド配列:
2019532640.tif 000014
Cw*0304ペプチド
Cw*0304ペプチドは、HLAクラスI組織適合性抗原Cw-3アルファ鎖（UniProt: P04222）のリーダーペプチドに対応する
アミノ酸配列:
2019532640.tif 000015
Cw*0304ペプチドをコードするヌクレオチド配列:
2019532640.tif 000016
B2M成熟鎖
アミノ酸配列:
2019532640.tif 000017
B2M成熟鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列:
2019532640.tif 000018
HLA-E成熟鎖
HLA-E→Gene ID: 3133。mRNAアクセッション番号NM_005516
タンパク質: UniProt→P13747
HLA-E成熟鎖はシグナルペプチド（最初の21アミノ酸）を含まない。それは、HLA-EG（E*0101対立遺伝子）に対応する、107位でのGlyを含む。
アミノ酸配列:
2019532640.tif 000019
SEQ ID NO:16のHLA-E成熟ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列:
2019532640.tif 000020
全長HLA-E-SCTアミノ酸配列:
2019532640.tif 000021
SEQ ID NO:18のポリペプチド配列をコードする全長HLA-E-SCT DNA配列:
2019532640.tif 000022
【０１３１】
レンチウイルスの製造および感染
HLA-E-SCT遺伝子は、制限部位BamHIおよびSalIを用いてレンチウイルスベクターpCDH-EF1-MCS-PGK-Puro（System Biosciences、カタログ番号CD810A-1）中にクローニングした。HLA-E-SCTをコードするレンチウイルスストックは、10 cmペトリ皿1枚につき7x106個の293T細胞に、以下の量のプラスミドをトランスフェクトすることによって製造した: 7.5 μgの、HLA-E-SCTを発現するpCDH-EF1-MCS-PGK-Puroレンチウイルスベクター、5 μgのpCMV-ΔR8.2、および2.5 μgのpCMV-VSV.G。トランスフェクションはLipofectamine 3000（Life Technologies、カタログ番号L3000-008）を用い、製造元の使用説明書にしたがって実施した。ウイルス上清はトランスフェクションの48時間後に回収し、そしてSystem BiosciencesのPEG-it Virus Precipitation Solution（カタログ番号LV810A-1）を用いて10倍に濃縮した。
【０１３２】
HLA-E-SCTを安定的に発現する細胞株は、HLA-I欠損NK-92細胞またはK562細胞にHLA-E-SCTをコードするレンチウイルスを感染させることによって作製した。手短に言えば、5x105個のNK-92またはK562細胞を、TransDux（System Biosciences、カタログ番号LV850A-1）の存在下、24ウェルプレートにおける1 mlの最終培地での100 μlの濃縮ウイルスを用いたスピノキュレーション（840 g、99分間、35℃）によって感染させた。形質導入の48時間後、HLA-E-SCT発現細胞は、2 μg/mlのピューロマイシン（SIGMA、カタログ番号P9620）の存在下で細胞を生育することにより選択した。
【０１３３】
フローサイトメトリー
細胞蛍光測定法的分析はMACSQuant 10フローサイトメーター（Miltenyi）において実施し、そしてFlowJoソフトウェアを用いて分析した。抗体はBioLegendから購入したものであって、かつ：抗B2M-PE（カタログ番号316306）、抗HLA-I-PE（カタログ番号311406）、抗HLA-E-APC（カタログ番号342606）、抗CD3-PE（カタログ番号300408）、抗CD8-AF647（カタログ番号300918）、IgG1-APCコントロール（カタログ番号400122）、IgG1-AF647コントロール（カタログ番号400136）、およびIgG1-PEコントロール（カタログ番号400114）を含む。
【０１３４】
細胞傷害性アッセイ
標的細胞は、製造元の使用説明書にしたがって、蛍光色素PKH67-GL（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MO）で染色した。標的およびエフェクターは、96ウェルプレート（Falcon BD、Franklin Lakes、NJ）においてエフェクター対標的（E:T）の異なる比で組み合わせ、短く遠心し、そして37℃で4時間、5% CO2インキュベーター内で、5%ヒト血清を追加したX-VIVO 10（Lonza、カタログ番号04-743Q）培養培地でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、1% BSA/PBSバッファー中10 μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI、Sigma-Aldrich）で染色し、そしてフローサイトメトリーでただちに分析した。死滅標的細胞はPKH67-GLおよびPIの二重陽性として同定した。標的細胞およびエフェクター細胞はまた、自発的な細胞溶解を決定するため、PIで別々に染色した。NK媒介細胞傷害性のパーセンテージは、エフェクターを有する試料におけるPKH(+)/PI(+)細胞のパーセンテージから、標的細胞のみのPKH(+)/PI(+)細胞のパーセンテージ（自発的な溶解）を差し引くことによって取得した。
【０１３５】
NK細胞の精製
健康なドナー由来のPBMCを、Research Blood Components（ウェブサイトアドレス  http researchbloodcomponents.com）から購入したバフィーコートを用いたficoll hypaque勾配遠心分離によって精製した。NK細胞は、製造元の使用説明書にしたがって、CD56 MicroBeads（Miltenyi、130-050-401）およびLSカラム（Miltenyi、130-042-401）を用いて精製した。CD56+/CD3- NK細胞の純度は抗CD3-FITC（BD Pharmingen、カタログ番号555332）および抗CD56-PE（BD Pharmingen、カタログ番号555516）抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認し、かつ一貫して80%以上のCD56+/CD3-であった。精製したNK細胞は、精製直後に（非活性化NK細胞）、または103 U/mlのIL2を加えたX-VIVO 10/5%ヒト血清において6〜9日間生育させた（活性化NK細胞）いずれかで使用した。
【０１３６】
NK-92特異的同種異系CD8+ T細胞の作製
CD8+ T細胞は、製造元の使用説明書にしたがって、MiltenyiのCD8+ T Cell Isolation Kit（カタログ番号130-096-495）を用いてPBMCから精製した。CD8+ T細胞の純度は抗CD3-FITC抗体（BD Pharmingen、カタログ番号555332）および抗CD8-AF647（BioLegend、カタログ番号300918）抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認し、かつ一貫して80%以上のCD3+/CD8+であった。NK-92特異的同種異系CD8+ T細胞を作製するため、5x104個の精製したCD8+ T細胞を、「U」底の96ウェルプレートにおいて、5x104個の照射した（10 Gy）NK-92細胞とともに（1:1の比）平板培養した。細胞は、サイトカイン無しで、5%ヒト血清を追加したX-VIVO 10培地において平板培養した。CD8+ T細胞は、照射したばかりのNK-92細胞で、培養の9〜12日後に再刺激した。刺激されたCD8+ T細胞の増殖を示したウェルは、5%ヒト血清および0.5 μg/mlのPHA-Lを追加し500 IU/mlのIL-2を加えたX-VIVO 10培地中で細胞を生育することにより、さらに拡大させた。
【０１３７】
本明細書において記載される実施例および態様は例示的な目的のみのためであること、かつそれらを考慮したさまざまな改変または変更が当業者に示唆され、かつ本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の中に含まれるものであることが、理解される。本明細書において言及されたすべての刊行物、配列アクセッション番号、特許、および特許出願は、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
例示的な配列の表
SEQ ID NO:1  実施例3におけるガイドRNA番号1
2019532640.tif 000023
SEQ ID NO:2  実施例3におけるガイドRNA番号2
2019532640.tif 000024
SEQ ID NO:3  実施例3におけるガイドRNA番号3
2019532640.tif 000025
SEQ ID NO:4  実施例3におけるガイドRNA番号4
2019532640.tif 000026
SEQ ID NO: 5  CD 16高親和性変異体F158V免疫グロブリンガンマFc領域受容体III-Aのアミノ酸配列（成熟型）:
2019532640.tif 000027
SEQ ID NO: 6  ヒトベータ-2-ミクログロブリン（B2M）前駆体ポリペプチド配列（NP_004039）
2019532640.tif 000028
SEQ ID NO:7  アクセッション番号NM_005516によってコードされるヒトHLA-E配列
2019532640.tif 000029
SEQ ID NO:8  B2Mシグナルペプチドのアミノ酸配列
2019532640.tif 000030
SEQ ID NO:9  B2Mシグナルペプチドのヌクレオチド配列
2019532640.tif 000031
SEQ ID NO:10  リンカー(G4S)3のヌクレオチド配列
2019532640.tif 000032
SEQ ID No:11  リンカー(G4S)4のヌクレオチド配列
2019532640.tif 000033
SEQ ID NO:12  HLAクラスI組織適合性抗原Cw-3アルファ鎖（UniProt: P04222）のリーダーペプチドに対応するCw*0304ペプチドのアミノ酸配列
2019532640.tif 000034
SEQ ID NO:13  SEQ ID NO:12のCw*0304ペプチドをコードするヌクレオチド配列
2019532640.tif 000035
SEQ ID NO:14  B2M成熟鎖のアミノ酸配列
2019532640.tif 000036
SEQ ID NO:15  B2M成熟鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列
2019532640.tif 000037
SEQ ID NO:16  シグナルペプチドを欠くHLA-E成熟ポリペプチド配列HLA-EG（E*0101対立遺伝子）
2019532640.tif 000038
SEQ ID NO:17  SEQ ID NO:16をコードする核酸配列
2019532640.tif 000039
SEQ ID NO:18  全長HLA-E-SCTのアミノ酸配列:
2019532640.tif 000040
SEQ ID NO:19  SEQ ID NO:18をコードする核酸配列
2019532640.tif 000041
SEQ ID NO:20  HLA-A*0201のリーダーアミノ酸配列
2019532640.tif 000042
【図１】
2019532640.tif 000044
【図２】
2019532640.tif 000045
【図３】
2019532640.tif 000046
【図４】
2019532640.tif 000047
【図５】
2019532640.tif 000048
【図６】
2019532640.tif 000049
【図７】
2019532640.tif 000050
【図８】
2019532640.tif 000051
【図９】
2019532640.tif 000052
【配列表】
2019532640000001.xml
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月29日(2019.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019532640000001.app
【国際調査報告】
2019532640.tif 000073
2019532640.tif 000074
2019532640.tif 000075