(57)【要約】  心血管疾患の治療における、機能性チラコイド抽出物の、詳細には生理的に許容可能な担体と混合しての医薬用途での使用及びその治療方法が提供される。心血管疾患（ＣＶＤ）は、心臓又は動脈の炎症と関連するいくつかの疾患を含み得、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、例えば狭心症及び心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている）、アテローム性動脈硬化症、卒中、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症を含み得る。
2019533691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心血管疾患（ＣＶＤ）の発症を予防するか又は遅延させるための組成物であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含む有効量のチラコイド抽出物を、任意選択で生理的に許容可能な賦形剤と混合して含む組成物。
【請求項２】
１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
経口投与のために製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非経口投与のために製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
心臓発作の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
心臓発作の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抽出物の有効量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抽出物の有効量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抽出物は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量におけるものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
対象の心血管疾患（ＣＶＤ）の発症を予防するか又は遅延させるための医薬品の製造における、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用。
【請求項１４】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬品は、経口投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬品は、非経口投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬品は、心臓発作（心筋梗塞）の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
前記抽出物は、心臓発作（心筋梗塞）の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記抽出物は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇを達成する量で存在する、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記抽出物の量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量で製造される、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を治療するか又はその発症を遅延させるための、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用。
【請求項２６】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抽出物は、経口投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
前記抽出物は、非経口投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項３０】
前記抽出物は、心臓発作の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項３１】
前記抽出物は、心臓発作の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３３】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記抽出物は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇを達成する量で存在する、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記抽出物の量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記抽出物は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量におけるものである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を生理的及び経口的に許容可能な担体と混合して含む、経口投与のための製剤。
【請求項３８】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
心血管疾患（ＣＶＤ）の治療を、それを必要としている対象において行う方法であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含む有効量のチラコイド抽出物を、詳細には生理的に許容可能な担体と混合して前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４１】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抽出物は、経口投与のためのものである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抽出物は、非経口投与のために製剤化されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記抽出物は、心臓発作の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記抽出物は、心臓発作の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抽出物は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇを達成する量で存在する、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抽出物の量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抽出物は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量におけるものである、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳類の血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰのベースラインレベルを１４日後に少なくとも約２５％だけ低減するための組成物であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物を含み、前記組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示す、組成物。
【請求項５３】
前記抽出物は、生理的に許容可能な担体と混合されている、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ベースラインレベルは、少なくとも約２ｍｇ／Ｌである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
対象の血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰを低減するための医薬品の製造における、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用であって、前記低減は、ベースラインの少なくとも２５％であり、及び前記組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示す、使用。
【請求項５６】
前記抽出物は、生理的に許容可能な担体と混合されている、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記ベースラインレベルは、少なくとも約２ｍｇ／Ｌである、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰのベースラインレベルの低減を、それを必要としている対象において行う方法であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含む有効量のチラコイド抽出物を前記対象に投与することを含み、前記組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示し、及び前記有効量は、１４日後に少なくとも約２５％だけ低減された前記ベースラインレベルを含む、方法。
【請求項５９】
前記抽出物は、生理的に許容可能な担体と混合されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ベースラインレベルは、約２ｍｇ／Ｌ以上である、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１１月４日出願の米国仮特許出願第６２／４１７，４１５号明細書からの優先権を主張し、この出願の内容は、その全体が参照により援用される。
【０００２】
本発明は、詳細にはチラコイドの完全性、安定性及び官能性を確実にする特定の製剤中における、機能性チラコイドを含む組成物（即ち機能性チラコイド抽出物）、並びに心血管疾患、例えば卒中又はアテローム性動脈硬化症を予防及び／又は治療するための使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、生物医学分野において急性及び慢性疾患及び障害への関与が周知の過程である。炎症は細胞及び組織の防御及び再生に関連する自然の過程であるが、無秩序な炎症は細胞及び組織にとって有害な多くの過程に寄与し得る（又はそれに関与している）。
【０００４】
炎症は、感染病原体、抗原誘発又は物理的、化学的若しくは外傷性傷害に対する体の反応である。炎症の主な目的は、体液、タンパク質及び細胞を血液から損傷組織に運び込むことである。炎症反応の主な特徴は、（ｉ）血管拡張（血流を増加させようと血管が広がる）、（ｉｉ）組織への拡散性成分の侵入を可能にする血管透過性の増加、（ｉｉｉ）走化性による細胞浸潤、即ち炎症細胞が血管壁を通り抜けて傷害部位に入る方向付けられた動き、（ｉｖ）罹患組織の生合成、代謝及び異化プロファイルの変化、並びに（ｖ）免疫系並びに血漿酵素系の細胞の活性化である。
【０００５】
一般に、炎症反応は、傷害又は感染病原体によって引き起こされた損傷の管理及び修復に極めて有効である。これらの現象が起こる程度は、通常、傷害の重症度又は誘発の範囲に比例する。しかしながら、炎症は、それが無秩序な、不均衡な又は望ましくない方法で発生するときに組織にとって有害となることもあり、慢性疾患又は障害を引き起こし得る。
【０００６】
国際公開第０１／４９３０５号パンフレットは、抗酸化性組成物及びその抽出方法を開示している。国際公開第０３／０４０４２号パンフレットは、他の抗炎症性化合物とのその併用を開示している。国際公開第２００５／０２７９４４号パンフレットは、抗炎症性化合物としての投与のための経口製剤を開示している。
【０００７】
慢性炎症反応は、長期にわたる炎症として見られ得、催炎物質が絶えず存在する。しかしながら、催炎物質が存在しない場合に慢性炎症が見られることも多く、心血管疾患の場合もそうである。この場合、１つ以上の炎症性成分が炎症の病因及び永続化に寄与している。
【０００８】
特定のマーカーレベルでの介入により、その誘発された疾患が予防され得ることが示されてきた。好例として、ＬＴＢ４の阻害が内皮損傷を予防し、且つ肺高血圧を回復に向かわせることが示されてきた（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。同様に、アテローム性動脈硬化症の伝播及び心血管系事象の罹病性における炎症の役割は、十分に確立されている。炎症は、アテローム性血栓症の開始及び進行並びに心血管疾患事象のトリガにとって中心的である（Ｙｏｕｓｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００９】
研究されてきた広範囲にわたる炎症バイオマーカーのうち、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）がスクリーニング及びリスク再分類におけるその使用について最も注目されてきた。複数の研究は、アテローム発生中の低レベルの慢性炎症の関連を示唆しており、且つＣＲＰが心血管疾患のリスク予測子であることを実証している（Ａｌｂｅｒｔ，２０１１，Ｙｏｕｓｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。高感度Ｃ反応性タンパク質は、冠状動脈におけるコレステロール及び他の脂肪質の蓄積と関連している。ＣＲＰは、肝臓によって生成される急性期反応物質であり、ＩＬ−６濃度によって強く調節される（Ａｌｂｅｒｔ，２０１１）。
【００１０】
２００３年に、疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）及び米国心臓協会（ＡＨＡ）は、ＣＲＰが心血管リスクの総合評価として用いられ得ると推奨した（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。他の国家機関及び医療機関は、心血管系事象について中等度のリスクがある患者において、このＣＲＰ評価に追従してこれを推奨してきた（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｇｅｎｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９）について２００９年、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ−ＡＨＡについて２０１０年（Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０））。
【００１１】
同様に、スーパーオキシドは、高血圧及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる多くの心血管疾患の病因において重大な役割を果たしている（Ｆｕｋａｉ  ａｎｄ  Ｆｕｋａｉ，２０１１）。ＳＯＤは、生物が利用可能なＮＯの酸化経路を阻害することにより、内皮及びミトコンドリアの機能でも重大な役割を果たしている（Ｆｕｋａｉ  ａｎｄ  Ｆｕｋａｉ，２０１１）。ＳＯＤの発現は、心筋梗塞（ＭＩ）誘導心不全において低下する（ｖａｎ  Ｄｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００１２】
更に、ＮＯは、一連の酸化還元反応を通して４つの一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）によって合成される。これらは、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、ニューロン一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）及びミトコンドリア一酸化窒素シンターゼである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｅＮＯＳ及びｎＮＯＳは、心筋細胞において構成的に発現される（Ａｒｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。誘導型ｉＮＯＳは、正常な心筋中に不在である一方、この酵素は、炎症誘発性メディエータによって発現される（Ａｒｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。高血圧と関連する冠状動脈疾患の患者による症例研究において、有害なＮＯがｉＮＯＳ活性の増大に起因して生成されることが実証された（Ｂｅｓｅｄｉｎａ，２０１６）。ｉＮＯＳは、心不全患者の心筋でも高められる（ＭｃＮｅｉｌ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｏｎ，２０１２）。ｉＮＯＳは、アテローム性動脈硬化性のプラーク進行及び虚血−再灌流障害において有害であることが報告されてきた（ＭｃＮｅｉｌ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｏｎ，２０１２）。ＮＯは、免疫応答を調節することによる免疫の重要なメディエータである。活性酸素種（ＲＯＳ）と関連して、ＮＯは、病原体の根絶をトリガする。ＮＯの生成又は活性の異常は、冠状動脈性心疾患の主な機構として提唱されてきた（Ｂｅｓｅｄｉｎａ，２０１６）。肺動脈高血圧は、おそらくＮＯ／ＯＮＯＯ−サイクル疾患であり、他のタイプの心血管疾患も、ｉＮＯＳの上昇によって引き起こされる候補であり得ることを示唆していると主張されてきた（Ｐａｌｌ，２０１３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、慢性炎症、詳細には主に慢性炎症によって引き起こされる心血管疾患の予防及び／又は治療のための新しい組成物及び製剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、機能性チラコイド抽出物を含む組成物（本明細書中で組成物Ａと呼ぶ）又はその医薬製剤及び哺乳類の血中ＣＲＰ若しくはｈｓＣＲＰのレベルを低減するためのその使用が提供され、ここで、本組成物の投与前のＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのレベルは、慢性炎症を示す。
【００１５】
従って、機能性チラコイド抽出物を含む組成物（本明細書中で組成物Ａと呼ぶ）又はその医薬製剤並びに心血管疾患の予防及び／若しくは治療でのその使用も提供される。
【００１６】
第１の態様において、対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を治療するための組成物が提供され、この組成物は、有効量の機能性チラコイド抽出物を、詳細には生理的に許容可能な担体と混合して含む。
【００１７】
第２の態様において、対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を予防又は治療するための医薬品の製造における、機能性チラコイド抽出物の使用が提供される。
【００１８】
更なる態様において、対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を予防又は治療するための、機能性チラコイド抽出物の使用が提供される。
【００１９】
代替の態様において、機能性チラコイド抽出物を、経口的に許容可能な賦形剤及び任意選択で防腐剤と混合して含む、心血管疾患の経口予防又は経口治療のための製剤が提供される。
【００２０】
更なる態様において、心血管疾患（ＣＶＤ）の予防又は治療を、それを必要としている対象において行う方法であって、有効量の機能性チラコイド抽出物を、任意選択で生理的に許容可能な担体と混合して前記対象に投与することを含む方法も提供される。
【００２１】
更なる態様において、哺乳類の血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰのベースラインレベルを１４日後に少なくとも約２５％だけ低減するための組成物であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物を含む組成物も提供され、ここで、本組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示す。
【００２２】
更なる態様において、対象の血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰを低減するための医薬品の製造における、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用も提供され、ここで、前記低減は、ベースラインの少なくとも２５％であり、及び本組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示す。
【００２３】
更なる態様において、血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰのベースラインレベルの低減を、それを必要としている対象において行う方法であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含む有効量のチラコイド抽出物を前記対象に投与することを含む方法が提供され、ここで、本組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示し、及び前記有効量は、１４日後に少なくとも約２５％だけ低減された前記ベースラインレベルを含む。
【００２４】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付の図面を参照してあくまでも例として提供されるその好ましい実施形態についての以下の非限定的な説明を読めば、更に明らかになるであろう。
【００２５】
本開示に引用される文献の内容は、それらを参照することによって援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】組成物Ａの製造プロセスのフロー図である。
【図２】組成物Ａの色素プロファイルを示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３Ａ】投薬後最長３６時間までのＡ）収縮期血圧についてのバイタルサインの平均経時変化（安全性集団）である。
【図３Ｂ】投薬後最長３６時間までのＢ）拡張期血圧についてのバイタルサインの平均経時変化（安全性集団）である。
【図３Ｃ】投薬後最長３６時間までのＣ）脈拍数についてのバイタルサインの平均経時変化（安全性集団）である。
【図３Ｄ】投薬後最長３６時間までのＤ）呼吸数についてのバイタルサインの平均経時変化（安全性集団）である。
【図３Ｅ】投薬後最長３６時間までのＥ）体温についてのバイタルサインの平均経時変化（安全性集団）である。
【図４】軽度から中等度の活動性遠位潰瘍性大腸炎の患者における、炎症バイオマーカーのレベルのベースラインからの平均変化である。
【図５】組成物Ａ（２５０ｍｇ）による治療（１４日間１日１回）の終了から７日後における、炎症性大腸炎及び潰瘍性大腸炎のバイオマーカー（ｈｓＣＲＰ、Ｍ３０アポトソーム、ＬＴＢ４等）のレベルのベースラインからの平均変化である。ＣＲＰ：血清Ｃ反応性タンパク質；ｈｓＣＲＰ：血清高感度ＣＲＰ；ＥＳＲ：赤血球沈降速度；ＦＣ；便中カルプロテクチン；ＦＬ：便中ラクトフェリン；ＬＴＢ：血清ロイコトリエンＢ；Ｍ３０：生検組織中のＭ３０アポトソームレベルの、ベースラインから１４日目までの変化。
【図６】ｉＮＯＳ経路を通じた機能性チラコイド抽出物によるＮＯの阻害である。ＡＣ：活性化ＲＡＷｂ２６４．７細胞（対照）、ＮＡＣ：非活化細胞、ＡＣＴ：チラコイドで０．２５ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬにおいて前処理した活性化細胞、ＮＡＣＴ：チラコイドで０．２５ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬにおいて前処理した非活化細胞。
【図７】ＯＲＡＣＦＬ試験によって得られた機能性チラコイド抽出物の抗酸化剤能力である。
【図８】本発明の機能性チラコイド抽出物によるスーパーオキシドの阻害である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
略語及び定義
略語
ＡＥ：有害事象；ＳＡＥ：重大な有害事象；Ｃｐ  Ａ：本発明の組成物Ａ；ＣＲＰ：血清Ｃ反応性タンパク質；ｈｓ  ＣＲＰ：血清高感度ＣＲＰ；ＥＳＲ：赤血球沈降速度；ＦＣ；便中カルプロテクチン；ＦＬ：便中ラクトフェリン；ＬＴＢ：血清ロイコトリエンＢ；Ｍ３０：生検組織中のＭ３０アポトソームレベルの、ベースラインから１４日目までの変化。
【００２８】
定義
用語「約」は、本明細書で使用されるとき、示される数の±１０％の許容差を指す。正確を期せば、約という用語は、例えば９０％と併せて用いられるとき、９０％±９％、即ち８１％〜９９％を意味する。より正確には、約という用語は示される数の±５％を指し、ここで、例えば９０％は、９０％±４．５％、即ち８６．５％〜９４．５％を意味する。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「細胞」という表現は複数のかかる細胞を含み、「その培養物」という表現は、１つ以上の培養物及び当業者に公知のその均等物を含むなどである。本明細書で使用される全ての科学技術用語は、特に明確な指示がない限り、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００３０】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、語句「含んでいる」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）など、「含んでいる」の任意の形態、「有している」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」など、「有している」の任意の形態）、「包含している」（並びに「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」など、「包含している」の任意の形態）又は「含有している」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」など、「含有している」の任意の形態）は、包含的又はオープンエンドであり、追加の記載されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【００３１】
本明細書中で用いられる用語：「チラコイド」、「チラコイド抽出物」、「機能性チラコイド抽出物」若しくは「機能性チラコイド」又は「活性チラコイド／抽出物」は、チラコイド膜環境にある（即ち、これらが依然として活性であり得るか、又は活性化され得るような一体となった天然の状態にある）、詳細にはその元のチラコイド環境にある、精製された機能性光合成色素を意味する。より詳細には、これらの用語は、本明細書中に記載されるプロセスにより、且つ／又はＢｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）若しくは国際公開第０１／４９３０５号パンフレットに開示される手順により抽出される機能性チラコイド膜を指す。
【００３２】
特に、本チラコイド抽出物の態様に関連して、分子複合体の機能品質は、当該技術分野において周知のとおり及び／又はＭａｘｗｅｌｌ（２０００）に記載されるとおり、蛍光により、光と反応してそのエネルギーを放散するその能力（Ｆｖ／Ｆｍ比）に基づき計測することができる。
【００３３】
予想外にも、本出願人らは、高レベルのｈｓＣＲＰが潰瘍性大腸炎の患者において活性チラコイド抽出物の投与直後に減少することを発見した。
【００３４】
高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）は、アテローム発生中の低レベルの慢性炎症、冠状動脈中のコレステロール及び他の脂肪質の蓄積と関連する。そのため、ＣＲＰは、循環器疾患のリスク予測子を構成する。２００３年に、ＣＲＰを心血管リスクの総合評価として用いられることが推奨され、このＣＲＰは、心血管系事象について中等度のリスクがある患者における評価に推奨されている。
【００３５】
従って、主要な態様に従い、機能性チラコイド抽出物を含む組成物（本明細書中で組成物Ａ又は（Ｃｐ  Ａ）と呼ぶ）又はその医薬製剤及び哺乳類の血中ＣＲＰ若しくはｈｓＣＲＰのレベルを低減するためのその使用が提供され、ここで、組成物の投与前のＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのレベルは、慢性炎症を示す。
【００３６】
そのため、本発明に従い、機能性チラコイド抽出物を含む組成物（又はその医薬製剤）の、心血管疾患の予防及び／又は治療における使用が提供される。
【００３７】
組成物
特定の態様に従い、本発明は、有効量の活性チラコイド抽出物を、詳細には生理的に許容可能な担体と混合して含む、対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を治療するための組成物を記載する。詳細には、チラコイド抽出物は、ホウレンソウチラコイド抽出物であり、より詳細にはホウレンソウ葉から抽出される。
【００３８】
詳細には、本組成物は、精製された機能性光合成色素をチラコイド膜環境において含む。更に詳細には、本抽出物は静止状態であり、光合成で活性化させることができる。より詳細には、本抽出物は、いかなる電子供与体（水など）も欠いていることにより、その基本状態で安定化されている（即ち安定である）。
【００３９】
最も詳細には、本組成物は組成物Ａと呼ばれ、生の有機栽培ホウレンソウの活性チラコイド抽出物として定義され、ここで、全色素に対するクロロフィルａの比は少なくとも０．４、詳細には少なくとも０．５、より詳細には少なくとも０．６である。
【００４０】
詳細には、チラコイド抽出物に含まれる色素は、クロロフィルａ、クロロフィルｂ及びカロテノイド類からなる群から選択される。より詳細には、チラコイド抽出物に含まれる色素は、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、ルテイン、並びに任意選択でβ−カロチン及び／又はフェオフィチンからなる群から選択される。更に最も詳細には、チラコイド抽出物に含まれる色素は、クロロフィルａ（４０％超）、次にクロロフィルｂ（約１０〜１５％）、ルテイン（約１０％以下）、β−カロチン（約３％）及びフェオフィチン（１％未満）から本質的になる。
【００４１】
安定化抽出物
詳細には、本抽出物は、いかなる電子供与体（水など）も欠いていることにより、その基本状態で安定化されている（即ち安定である）。より詳細には、本抽出物は、１０％以下の水（又は他の電子供与体）、詳細には１０％未満の水を含有することにより安定化されている。
【００４２】
本組成物は、凍結乾燥組成物などの粉末形態であり得、又は本組成物が電子供与体（水など）を含まないか又は実質的に含まないままであることにより機能性色素の活性を維持している限り、ＰＥＧ又はＤＭＳＯなどの生理学的に許容可能な固体又は液体賦形剤と混合されて懸濁液の安定化溶液を形成し得る。
【００４３】
詳細には、安定化抽出物は、固体形態であり、より詳細には粉末としての固体形態である。更により詳細には、本抽出物は、粉末１グラム当たり少なくとも２５ｍｇの色素の粉末形態である。より詳細には、生の粉末は、錠剤に圧縮され、カプセル化され、又はアリコートのパケット若しくはパウチに包装され得る。或いは、粉末は坐薬賦形剤と混合され、成形されて坐薬を形成し得る。
【００４４】
或いは、本安定化抽出物は、例えば、ＰＥＧ又はＤＭＳＯなど、水又は電子供与体を欠いている液体賦形剤中にある溶液又は懸濁液などの液体形態である。詳細には、安定化溶液又は懸濁液は、投与のわずかに前又は直前に液体中に希釈され得る。最も詳細には、経口投与について、液体は水、ジュース、シロップ等であり得る。或いは、直腸投与について液体は浣腸製剤であり得る。
【００４５】
使用
特定の態様に従い、精製された機能性光合成色素をチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の、対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を治療するか又はその発症を遅延させるための医薬品の製造における使用が提供される。
【００４６】
或いは、精製された機能性光合成色素をチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の、対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を治療するか又はその発症を遅延させるための使用が提供される。
【００４７】
詳細には、組成物Ａの使用は、ＣＶＤが以下から選択される状況において提供される：狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、静脈血栓症、不安定狭心症及び動脈管再生。
【００４８】
治療方法
特定の実施形態に従い、心血管疾患（ＣＶＤ）の治療を、それを必要としている対象において行う方法であって、精製した機能性光合成色素をチラコイド膜環境において、詳細には生理的に許容可能な担体と混合して含む有効量のチラコイド抽出物を対象に投与することを含む方法が提供される。
【００４９】
詳細には、治療方法は、以下を治療する状況で提供される：狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、静脈血栓症、不安定狭心症及び動脈管再生。
【００５０】
治療適応
詳細には、心血管疾患（ＣＶＤ）は、心血管系の炎症と関連するいくつかの疾患、例えば、非限定的な例として、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、静脈血栓症、不安定狭心症及び動脈管再生を含み得る。
【００５１】
詳細には、ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である。
【００５２】
対象
特に、本使用及び方法は、哺乳類対象、詳細にはペット又はヒト、より詳細にはネコ、イヌ、ウマ又はヒト、最も詳細にはヒトの治療に適応され得る。
【００５３】
製剤
特定の態様に従い、本明細書中で定義される使用又は治療方法が提供され、組成物は、経口投与のために製剤化される。
【００５４】
詳細には、経口製剤は、タブレット、カプセル、カプレット、粉末、ペレット、シロップ等の形態である。
【００５５】
より詳細には、組成物は、非経口投与のために製剤化される。最も詳細には、組成物は、心臓発作（心筋梗塞）の直後又は心臓発作（心筋梗塞）の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化される。
【００５６】
投薬量
本明細書中で用いられる用語「有効量」は、ＣＶＤ徴候の低減又はＣＶＤと関連する炎症マーカーの低減を誘導するのに十分な用量を意味し、治療される対象、病歴及び／又は徴候の重症度に依存し得る。特に、表現「有効量」は、ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰを、慢性炎症を示すベースラインレベルと比較して１４日後に少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約４０％、約５０％、約６０％だけ低減するのに十分な用量を意味する。詳細には、２ｍｇ／Ｌ以上のＣＲＰ又はｈｓＣＲＰベースラインレベルが慢性炎症を示す。
【００５７】
特定の実施形態に従い、抽出物は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇ、より詳細には対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００１〜２０ｍｇ、なお詳細には対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜１５ｍｇ、最も詳細には対象の体重１Ｋｇ当たり０．５〜１０ｍｇの有効量を含む。
【００５８】
特定の実施形態に従い、抽出物は、約２５０〜約１０００ｍｇ／日、より詳細には約２５０、約３７５、約５００、約７５０、約１０００又は約１５００ｍｇ／日、最も詳細には約２５０、５００又は１０００ｍｇ／日の投薬量で提供される。
【００５９】
以下の例は、本発明をどのように作製し及び使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らがその発明であると見なすものの範囲を限定する意図はなく、また、それらの例によって以下の実験が実施された全ての又は唯一の実験であることが表明されるように意図するものでもない。用いられる数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するように努めているが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されなければならない。特に指示がない限り、部数は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は百分度であり、及び圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【実施例】
【００６０】
実施例１  −  チラコイド抽出物（組成物Ａ）の調製
組成物Ａは、葉緑体が豊富なベビーホウレンソウ（スピナシア・オレラセア・Ｌ．（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．））葉の葉肉組織に由来する。チラコイドとして知られる構造に組織化された葉緑体の内膜をベビーホウレンソウから抽出し、濃縮し、及び安定化させて固体粉末形態にする。チラコイド膜の主成分は色素、タンパク質及び脂質である。
【００６１】
【表１】
2019533691.tif 000003
【００６２】
製造プロセス
組成物Ａの製造プロセスを図１のフロー図に概略的に提供する。
【００６３】
光合成色素の活性を最大限保つため、処理ステップは最小限の露光且つ冷温条件下で実施する。ステップは以下の順序で行う：ホウレンソウ葉の検査及び次亜塩素酸ナトリウム溶液による洗浄、機械的破壊及びホモジナイゼーション、遠心によるろ過、凍結乾燥及びガンマ線照射。
【００６４】
ホウレンソウ葉の検査及び次亜塩素酸ナトリウム溶液による洗浄。目視検査を実施して寸法及び識別属性（例えば、葉が緑色であり、変色した領域又は黄化したペック（ｐｅｃｋｓ）（クロロシス）がないこと）を確かめた後、ホウレンソウ葉は、初めに、ｐＨ７．０〜８．０（目標ｐＨ：７．４）に調整した次亜塩素酸ナトリウム溶液によって一定の比の溶液対葉（４４ｋｇ：５．４ｋｇ）でまとめて洗浄し、生鮮食品の葉に天然に見られる微生物叢を低減する。
【００６５】
機械的破壊及びホモジナイゼーション。過剰な次亜塩素酸ナトリウム溶液を除去した後、葉を機械的カッター／ミキサーに７．０〜８．０（目標ｐＨ：７．４）の一定容積のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝溶液と共に一定の比の溶液対葉（５．４ｋｇ：３．７ｋｇ）でまとめて移し入れる。このステップを用いると、葉がカット及びホモジナイズされて粗懸濁液になる一方、葉緑体に由来するチラコイド膜の断片が遊離する。
【００６６】
遠心によるろ過。次に、この懸濁液をバスケット遠心機でろ過する。遠心は３１００ｒｐｍの目標速度（範囲：２８００〜３２００ｒｐｍ）で実施する。このステップにより、スクリーン上に残留する繊維、屑片及び粗粒材料を除去することが可能になり、廃棄されることになる副産物ケーキが生じる。活性成分である組成物Ａは遠心分離物中に存在し、回収されて、更なる処理のために１０℃未満の温度で保管される。
【００６７】
凍結乾燥。次に、この材料を浅いステンレス鋼プレートの一面に広げ、暗所において≦−３０℃の温度で少なくとも２時間凍結させる。次に、１０℃の目標温度に保たれたプレートを凍結乾燥器に移し、生成物を凍結乾燥する。
【００６８】
ガンマ線照射。最終ガンマ線照射ステップを行う。照射後、密封性のねじ蓋が装着されたジャーに組成物Ａを移し入れる。
【００６９】
色素組成及び他の特性
ホウレンソウは、天然抗酸化剤（例えば、フラボノイド類）及び光合成色素（クロロフィル類及びカロテノイド類）を含有する。葉緑体の内膜は、チラコイドとして知られる構造に組織化されている。チラコイド膜の主成分は色素、タンパク質及び脂質である。
【００７０】
組成物Ａは、葉緑体に富むホウレンソウ葉の葉肉組織に由来する。これまでに、組成物ＡではＨＰＬＣ分析を用いて以下の色素が同定されている：ルテイン、クロロフィルｂ、クロロフィルａ、フェオフィチン及びβ−カロチン。組成物Ａの色素プロファイル（面積％）を示す典型的なクロマトグラムを図２に提供する。この分析は、組成物Ａの主成分がクロロフィルａ（６２．５％）であり、それにクロロフィルｂ（１３．１％）、ルテイン（９．４％）、β−カロチン（２．９８％）及びフェオフィチン（０．４５％）が続くことを示している。
【００７１】
好ましくは、アメリカ合衆国農務省（ＵＳＤＡ）の全米オーガニック基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に従う認証を受けた栽培者から生のベビーホウレンソウを得て、肥料又は農薬からの可能性のある化学残留物が組成物Ａに存在するリスクを最小限に抑えた。
【００７２】
規格の正当化
組成物Ａは、粉末抽出物１グラム当たりの色素のミリグラム数で表されるその色素含有量によって特徴付けられる。工程能力に基づき、及び植物出発物質における季節変動を考慮して、２５ｍｇ色素／ｇ抽出物以上の規格を設定した。安定性データに基づき、初期色素含有量の８０％の限度を有効期間に設定した。
【００７３】
色素プロファイルは、組成物Ａに存在する様々な色素及び面積パーセント単位でのそれらの比の同定も可能にする。バッチで決定されたプロファイルを所与として、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、ルテイン及びβ−カロチンが存在しなければならないこと、及び総ピーク面積応答に対するクロロフィルａの比の平均が０．４０以上でなければならないことを確立した。
【００７４】
この製造プロセスでは水を抽出溶媒として使用するため、組成物Ａの含水量を決定する試験を含めている。水分調節のため、１０％ｗ／ｗ以下の水という規格を設定した。
【００７５】
ミニブタにおける複合直腸内単回投与及び１４日間反復投与毒性試験において、第１相臨床バッチに存在する不純物レベルの安全性が適格となった。表２に示されるとおり、第２相臨床バッチにも同様の不純物レベルが存在した。反復投与毒性試験で投与した最大用量（２００ｍｇ／ｋｇ）は、１日１回１４日間投与した第２相臨床試験の最大用量（１０００ｍｇ又は１４．３ｍｇ／ｋｇ）よりも１４倍高かった。この試験では、毒性学的に重要な毒性所見は観察されなかった。ゲッチンゲンミニブタにおける既報告の自然発生の顕微鏡的病変と一致した、腎臓における顕微鏡的な最小限の尿細管変性に基づき、有意事象のＮＯＡＥＬは２００ｍｇ／ｋｇとして正当に定義された。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
安定性
現在まで、密封性のねじ蓋付きのジャーに包装された組成物Ａ医薬品の２つのバッチは、以下の条件下：５℃±３℃（現行推奨される保管条件）に安定に置かれている。これまでに利用可能なデータは、組成物Ａが冷蔵条件下で少なくとも１８ヵ月間保管した後にも安定であることを示している。
【００７８】
実施例２  −  試験医薬品
医薬品の詳細及び組成
試験医薬品は、患者が投与前に再構成した直腸浣腸剤である。直腸浣腸剤は、組成物Ａ原薬又は対応プラセボ粉末を再構成溶液で再構成することにより調製した。
【００７９】
そのために、各患者が各投与用量につき以下の材料を受け取った：
−  ６０ｇの再構成溶液を含むボトル１本、及び
−  組成物Ａ物質又は対応プラセボ粉末のいずれかを含むボトル１本。
【００８０】
この試験では３用量の組成物Ａを投与した：
−  ６０ｇの再構成溶液中２５０ｍｇの組成物Ａ、
−  ６０ｇの再構成溶液中５００ｍｇの組成物Ａ、又は
−  ６０ｇの再構成溶液中１０００ｍｇの組成物Ａ。
【００８１】
プラセボ直腸浣腸剤は、６０ｇの再構成溶液に再構成した５００ｍｇの対応プラセボ粉末で構成された。再構成溶液の組成を表３に提供する。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
対応プラセボ粉末の組成を表４に記載する。
【００８４】
【表４】
2019533691.tif 000006
【００８５】
再構成溶液の配合は、停留直腸浣腸剤に典型的であり、送達部位で適切な接触特性が確保されるように好適な粘度の成分が含まれた。４つのパラベンで構成される保存剤系により、バイオバーデンが許容限度の範囲内に留まることを確実にした。オスモル濃度を調節するため塩化ナトリウムが存在した。この配合は、第１相試験で使用した再構成溶液と比べて、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９８０が加わった点、並びに物理的及び化学的特性を長期間維持するため推奨される保管が室温から冷蔵に変更された点がわずかに修正された。再構成溶液のバッチ配合を表５に提供する。
【００８６】
【表５】
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【００８７】
また、スクロース及びアルファ化コーンスターチを増量剤として使用して、組成物Ａの対応プラセボ粉末も製剤化した。組成物Ａの濃緑色に合わせて着色料を添加した。この混合物を凍結乾燥して組成物Ａの顆粒状の外観を模倣した。スクロースは凍結保護物質としても作用し、保管時のアルファ化コーンスターチによる過度の水分吸収を防止した。対応プラセボ粉末のバッチ配合を表６に提供する。
【００８８】
【表６】
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【００８９】
第２相研究において投与した直腸浣腸剤のバッチ配合を表７に記載する。
【００９０】
【表７】
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【００９１】
再構成溶液
４×２０ｋｇバルク溶液をプールすることにより、８０ｋｇの再構成溶液を調製した。この調製物（２０ｋｇバルク溶液及びプール）の製造プロセスを以下に提供する。
【００９２】
ステップ＃１  ｐＨ２．５  ＵＳＰ精製水の調製：機械的スターラが取り付けられた２０Ｌステンレス鋼容器に２０ｋｇのＵＳＰ精製水を充填した。ＵＳＰ精製水にＨＣｌ  １Ｎの溶液を撹拌下でゆっくりと加えてｐＨを２．５±０．０５に調整する。
【００９３】
ステップ＃２  キサンタンガム／Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）溶液の調製：機械的スターラが取り付けられた２０Ｌステンレス鋼ダブルジャケット付き容器にステップ＃１のｐＨ２．５  ＵＳＰ精製水１１．１ｋｇを充填し、温度を４０℃に調整した。温度が４０℃に達したところで、キサンタンガム（１２２．０ｇ）、塩化ナトリウム（１５０．０ｇ）及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９８０（２４．０ｇ）を添加し、この溶液を８００ｒｐｍの速度で６０分間混合した。
【００９４】
ステップ＃３  保存剤溶液の調製：１０００．０ｇのプロピレングリコールを含む１Ｌガラスボトルを５０℃の温度に達するように温水浴に入れた。温度が５０℃に達したところで、４つの保存剤：
−  メチルパラベン：３．２８ｇ
−  プロピルパラベン：０．６１ｇ
−  エチルパラベン：０．６１ｇ
−  ブチルパラベン：０．６１ｇ
を添加し、この溶液を上記の保存剤が溶解するまで５０℃の温度で撹拌下に置いた。
【００９５】
ステップ＃４  バルク溶液の調製：ステップ＃２で調製し、且つ４０℃の温度に維持したキサンタンガム／Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）溶液を含む２０Ｌステンレス鋼容器に、ステップ＃３の保存剤溶液を混合しながら加えた。この容器にステップ＃１のＵＳＰ精製水  ｐＨ２．５を２０．０ｋｇのバルク溶液に達するのに十分な量で加えた。加熱を中止し、バルク溶液を撹拌下で６０分間放冷した。２５℃の温度に達したところでｐＨを測定し、必要に応じてＨＣｌ  １Ｎ又はＮａＯＨ  １Ｎのいずれかの溶液を使用して６．５±０．０５に調整した。
【００９６】
ステップ＃１〜＃４を３回繰り返して３×２０ｋｇの更なるバルク溶液を作成した。
【００９７】
プールに進む前に２０ｋｇバルク溶液の各々に関して粘度試験を実施した。粘度が１０００〜１２００ｃｐである場合、プールを進めた（ステップ＃５）。
【００９８】
ステップ＃６  再構成溶液の包装：カニューレが取り付けられた蓋を有するボトルに定量式ポンプを使用して６０ｇ以上の再構成溶液を充填した。
【００９９】
対応プラセボ粉末
ステップ＃１  着色溶液の調製：この溶液は、６６５７．８ｇのＵＳＰ精製水を含むマグネチックスターラ付き風袋秤量済み１Ｌビーカーに２ｇのＵＳグリーン３  Ｓｈａｄｅ及び６．２ｇのＦＤ＆Ｃ黄色６号を加えることにより調製した。この溶液を２００ｒｐｍで５分間撹拌下に置いた。
【０１００】
ステップ＃２  バルク粉末分散体の調製：１６５９．８ｇのスクロース及び３３２．０ｇのアルファ化デンプンを５０００ｍＬビーカーに共に混合した。次に、この混合物を、８００ｒｐｍでの撹拌下において、ステップ＃１で調製した着色溶液にゆっくりと移し、完全に分散するまで撹拌を維持した。
【０１０１】
ステップ＃３  凍結乾燥：ステップ＃２から得られたバルク粉末分散体を凍結乾燥トレイに移し、初めに−５０℃で２４時間乾燥させた。次に、この生成物をフリーズドライした。
【０１０２】
組成物Ａ直腸浣腸剤
各投与用量について、患者は２本のボトル：再構成溶液を含むボトル１本と組成物Ａ活性物質又は対応プラセボ粉末を含むボトル１本とを受け取った。これらのボトルは冷蔵下に置かれた。
【０１０３】
再構成のため、患者は冷蔵庫から上記に記載される２本のボトルを取り出し、室温で２時間放置した。次に、患者は、再構成溶液を含むボトルの内容物を、組成物Ａ活性物質又は対応プラセボ粉末を含むボトルに移すことにより直腸浣腸剤を再構成した。患者は直腸浣腸剤を再構成から１時間以内に自己投与した。再構成した浣腸剤は、投与直前に少なくとも３０秒間手で振盪した。
【０１０４】
実施例３  −  前臨床結果概要
前臨床試験
多くの前臨床試験が実施されており、組成物Ａの抗炎症、抗酸化及び免疫調節特性が実証された。前臨床試験には（ｉ）インビトロ及びインビボ薬理試験、及び（ｉｉ）安全性薬理試験及び毒性試験が含まれ、以下の表８及び表９にまとめる。
【０１０５】
【表８】
2019533691.tif 000010
【０１０６】
【表９】
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【０１０７】
【表１０】
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【０１０８】
実施例４  −  潰瘍性大腸炎における第１相臨床試験
前臨床研究において組成物Ａで得られた好ましい結果を受けて、軽度から中等度の活動性遠位潰瘍性大腸炎の治療としてそれを開発した。これが、正常ヒトボランティアにおける第Ｉ相安全性臨床試験である独国でのファーストインヒューマン臨床試験の実施につながった。従って、本出願人らは、必要な規制当局の承認を得た。
【０１０９】
第１相試験は、４つの異なるコホートに割り付けた２４人の健常ヒトボランティアで実施した無作為化、二重盲検、並行群間、単回漸増投与、プラセボ対照安全性及び忍容性試験であった。用量は、１８７．５ｍｇ／６０ｇ〜１５００ｍｇ／６０ｇの範囲の直腸浣腸剤又はプラセボであった。
【０１１０】
この試験では、バイタルサイン（血圧、脈拍数、体温及び呼吸数）又は心電図（ＥＣＧ）の臨床的に関連性のある変化は示されず、臨床的に重要な異常は示されず、試験医薬品に関係すると見なされる有害事象は示されず、及び投薬８〜１０時間後にＳ状結腸鏡検査を実施したとき直腸粘膜における潰瘍、びらん又は浮腫の徴候は示されなかった。
【０１１１】
この試験からの本発明者らの結論は、以下のとおりであった：最大１５００ｍｇ／６０ｇの組成物Ａ直腸浣腸剤の投与が安全であり、極めて良好に忍容された。いずれの測定値にも臨床的に重要な所見はなく、及び投与前の検査から投与後の検査にかけて臨床的に関連性のある変化は観察されなかった。加えて、試験した投薬量範囲に最大耐容量は同定されなかった。
【０１１２】
安全性評価
曝露の程度
この試験に組み入れられた２４人全ての対象が組成物Ａ直腸浣腸剤又はプラセボの単回投与を受けた：８人の対象はプラセボで治療された。４人の対象は、それぞれ１８７．５ｍｇ、３７５ｍｇ、７５０ｍｇ又は１５００ｍｇの組成物Ａ直腸浣腸剤の単回投与を受けた。
【０１１３】
有害事象の概要
いずれの対象についてもベースラインＡＥの報告はなく、この試験に組み入れられた対象２４人のうちの１人の対象のみ（４．２％）が治療後に１つのＡＥを報告した。
【０１１４】
有害事象の分析
対象００４（プラセボ）について軽度の血栓性静脈炎が報告され、これは３日目から始まり、８日以内に完全に回復した。試験医薬との関連性は治験責任医師によって無関係と評価された。
【０１１５】
死亡、他の重篤な有害事象及び他の重要な有害事象
死亡、又は他のＳＡＥ、又は他の重要なＡＥはなかった。ＡＥに起因してこの試験からドロップアウトした対象はいなかった。
【０１１６】
臨床検査値の評価
対象毎の個別検査室測定値及び各異常検査値の一覧。
【０１１７】
各臨床検査パラメータの評価
経時的臨床検査値
ほとんどの臨床検査値が正常範囲内であった。いくつものパラメータについて正常範囲からの個別的な偏差が見られた。これらの偏差のほとんどが、健常な対象で通常観察される正常な変動であった（正常範囲からのごくわずかな偏差、ほとんどは本方法の精度の範囲内であり、被験薬投与前に既に存在することも多い）。
【０１１８】
数人の対象でヘモグロビン及びヘマトクリットの低下が観察された。これは、この試験で実施された多数の採血が原因であり得る。
【０１１９】
血球分画を調べると、正常範囲を上回る異常値及び下回る異常値が見られ、治療に関係する一貫した変化はなかった。しかしながら、血球分画はアーチファクトの影響を非常に受け易いことが知られている点を考慮すべきである。
【０１２０】
対象０２４（１５００ｍｇ）は、スクリーニング時の２８．６Ｕ／Ｌ及び１日目チェックイン時の３４．２Ｕ／Ｌから最高３日目の７２．８Ｕ／Ｌへの（正常範囲≦４８Ｕ／Ｌ）のＡＳＴの独立した増加を示した。その後、ＡＳＴは低下し、８日目に再び正常範囲内になった（４７．０Ｕ／Ｌ）。他の肝機能パラメータはいかなる増加も示さなかった。この増加は正常範囲の上限の２倍未満であり、治験責任医師により臨床的に重要でないと見なされた。他の対象で肝機能パラメータに顕著な変化を示した者はいなかった。
【０１２１】
寄生虫、卵子、細菌培養物及び毒素に関する便検査はいずれも陰性であった。全ての潜血試験が陰性であった。
【０１２２】
個々の臨床的に重要な異常
臨床的に重要な臨床検査結果はなかった。
【０１２３】
バイタルサイン、身体的所見及び安全性に関連する他の観察項目
血圧及び脈拍数
平均バイタルサイン測定値を図３Ａ〜図３Ｅに示す。
【０１２４】
バイタルサイン平均値に臨床的に重要な時間関連又は用量関連変化はなかった。総じて、全ての治療群で投薬後にバイタルサイン平均値が低下したが、これは日内変化が原因であり得る（投与は夜就寝前に実施された）。
【０１２５】
正常範囲外の異常な個別値がいくつかあったが、用量に伴い異常値の頻度が増加することはなかった。ほとんどのパラメータについて、正常範囲を下回る値と上回る値とが見られた。最も高用量の組成物Ａの投与後に最も低頻度の異常値が観察され、但し脈拍数は例外であり、他の治療群において投与前値からの変化が０〜１拍／分であるのに対し、１５００ｍｇ群の対象に４つの低い値が検出された（全て対象０１９に観察された：投薬０．２５〜１時間後に４０〜４３拍／分、この対象はチェックイン時に既に４２拍／分を有した）。ほとんどの異常値が呼吸数について観察されたが、若年の健常対象について、安静時に１５回／分未満の呼吸数は珍しいものではない。
【０１２６】
実施例５  −  潰瘍性大腸炎における第２ａ相臨床試験
次に、規制当局からファーストインペイシェント（第２ａ相）試験の承認を得た後、本発明者らは、軽度から中等度の活動性遠位潰瘍性大腸炎患者において組成物Ａ直腸浣腸剤の２週間、探索的無作為化、二重盲検、並行群間、用量範囲探索、プラセボ対照安全性、忍容性、バイオマーカー及び有効性臨床試験を実施した。
【０１２７】
この短期の２週間試験の所見は、以下のとおり要約することができる。この試験の主要目的は達成された。軽度から中等度の活動性遠位潰瘍性大腸炎を有する対象において２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１０００ｍｇ用量の組成物Ａ直腸浣腸剤の１日１回投与は安全であり、良好に忍容された。これらの結果は、１８７．５から１５００ｍｇまでの組成物Ａ直腸浣腸剤の単回漸増投与が健常ボランティアに安全且つ忍容されて投与され、及び最大耐容量が観察されなかった先行する第１相試験の結果と一致している。
【０１２８】
以下の節は、第２ａ相試験で観察されたとおりの、軽度から中等度の活動性遠位潰瘍性大腸炎患者における組成物Ａ治療の一部の重要な結果を提供する。
【０１２９】
安全性の結果
３用量の組成物Ａ直腸浣腸剤（２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１０００ｍｇ）の１日１回の投与の全ては、軽度から中等度の活動性遠位潰瘍性大腸炎の対象において安全であり且つ良好に忍容された。全体として、研究中、治療に関連した又は重大な有害事象も死亡もなく、有害事象に起因する中止もなく、ラボパラメータ、ＥＣＧ及びバイタルサインの臨床的に関連した時間変化も治療に関連した変化もなかった。
【０１３０】
バイオマーカーの結果
図４に示すように、２週の組成物Ａ  ２５０ｍｇの治療に（エンドポイントにおいて）応じた、血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、高感度−ＣＲＰ（ｈｓ−ＣＲＰ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、便中カルプロテクチン（ＦＣ）及び便中ラクトフェリン（ＦＬ）の２９〜６３．６％の著しい一貫したバイオマーカーの低下は、２１日目までのＣＲＰ、ｈｓ−ＣＲＰ及びＦＬレベルにおけるそれぞれ７７．６、８０．９及び８２．９％への更なる低下（２５０ｍｇ：ｐ＜０．０３；１０００ｍｇ：ｐ＜０．０４）（２１日にわたるプラセボ群における１８．８〜１２０％の全体的な増大と比較）と共に、潰瘍性大腸炎の腸管炎症に対する薬物の生物学的活性の客観的な証拠である。
【０１３１】
潰瘍性大腸炎における腸炎症に対する組成物Ａ直腸浣腸剤の生物学的活性の更なる客観的エビデンスには、組成物Ａ  ２５０ｍｇ治療群における血清ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）レベルの顕著な低下が含まれた。１４日目のビジットでこのレベルは３１．４％低下し、一方でプラセボ群では２９％上昇していた（２１日目までに、組成物Ａ−２５０ｍｇ治療群のレベルは８５．０％低下していた）。５００ｍｇ及び１０００ｍｇ組成物Ａ治療群では、血清ＬＴＢ４レベルの低下がより小さいことも観察された（それぞれ２８．０％及び２２．２％）。これらの所見は、組成物Ａがプロスタグランジン類及びロイコトリエン類を含めた脂質炎症メディエータの産生及び放出を低下させることを実証した前出の動物薬理試験の結果と一致している。
【０１３２】
組成物Ａの生物学的活性の更にもう１つの客観的エビデンスは、プラセボ群における２８．６％の増加と比較した、組成物Ａの２５０ｍｇ及び５００ｍｇ治療の投与を受けている患者からの結腸粘膜生検組織におけるＭ３０アポトソーム（アポトーシスのバイオマーカー）の濃度の４２．５％の低下であった（図５）。
【０１３３】
有効性及びバイオマーカーパラメータ測定値から得られた結果における用量反応の欠如は、同様に一貫した用量反応関係を実証しなかった、軽度から中等度の遠位ＵＣに対する承認済みの第一選択治療薬  −  直腸及び経口５−アミノサリチル酸塩並びに生物学的製剤（中等度から重度のＵＣに対するもの）−  で実施した試験で先に得られた結果と一致している。
【０１３４】
本明細書中で提示されるデータは、本発明のチラコイド抽出物（組成物Ａ医薬品）が潰瘍性大腸炎に対して活性であったことを示している。
【０１３５】
興味深いことに、腸管特異的マーカーに加えて、便中ラクトフェリン、２つの一般炎症バイオマーカー、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲ）及び高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓ  ＣＲＰ）も治療の直後に著しく低下した（図５を参照されたい）。
【０１３６】
実施例６  −  心血管疾患に対するチラコイド
アテローム性動脈硬化症の伝播及び心血管系事象の罹病性における炎症の役割は、十分に確立されている。炎症は、アテローム性血栓症の開始及び進行並びに心血管疾患事象のトリガにとって中心的である。研究されてきた広範囲にわたる炎症バイオマーカーのうち、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）がスクリーニング及びリスク再分類におけるその使用について最も注目されてきた。
【０１３７】
詳細には、ｈｓＣＲＰは、種々の心血管疾患及び末梢動脈疾患、例えば卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術又は虚血再灌流障害に関係してきた。
【０１３８】
複数の研究は、アテローム発生中の低レベルの慢性炎症の関連を示唆しており、且つＣＲＰが心血管疾患のリスク予測子であることを実証している。高感度Ｃ反応性タンパク質は、冠状動脈におけるコレステロール及び他の脂肪質の蓄積と関連している。ＣＲＰは、肝臓によって生成される急性期反応物質であり、ＩＬ−６濃度によって強く調節される。
【０１３９】
２００３年に、疾病管理予防センター及び米国心臓協会（ＡＨＡ）は、ＣＲＰが心血管リスクの総合評価として用いられ得ると推奨した。他の国家機関及び医療機関は、心血管系事象について中等度のリスクがある患者において、このＣＲＰ評価に追従してこれを推奨してきた（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｅｄｅｃｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓについて２００９年、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ−ＡＨＡについて２０１０年）。
【０１４０】
Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ（２０１２）は、５２のプロスペクティブコホート研究（心血管疾患の病歴のない人々の２４５０００を超える個々の記録を含む）を評価して、ＣＲＰ又はフィブリノゲンの循環評価を、標準リスクスコアに用いたリスク因子の評価に加えた場合の第１の心血管系事象の予測の向上を定量化している。それは、心血管系事象について中等度のリスクがある人々において、ＣＲＰ又はフィブリノゲンの更なる評価が、そのようにスクリーニングした４００〜５００人全員について１０年間にわたって１つの更なる事象の予防を促進し得ると結論した。
【０１４１】
ＦＤＡは、ＦＤＡ諮問委員会の推奨（Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ  ２０１２）に基づいて、心血管疾患の主な予防にクレストール（ロスバスタチン）を承認している（ＦＤＡ  Ｎｅｗｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０）。クレストールは、この表示を受ける第１のスタチンとなり、バイオマーカー高感度Ｃ反応性タンパク質に基づく表示を含む第１のスタチンとなった。クレストールは、食事及び運動と組み合わせた、ＬＤＬコレステロールトリグリセリドを、この物質を血中に高量有する患者において低くするための使用について既に承認されている。医薬品もアテローム性動脈硬化症の進行を遅らせるために承認されている（Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ  ２０１２）。
【０１４２】
ＦＤＡ諮問委員会は、Ｊｕｓｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ａｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ（ＪＵＰＩＴＥＲ）と呼ばれる治験から得た結果について、クレストールのこの新しい表示を推奨した。ＪＵＰＩＴＥＲ治験は、炎症バイオマーカーＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルが高められた場合、スタチン療法がより大きい臨床利益をもたらすこと、及びスタチンがＬＤＬコレステロールレベルから大きく独立してＣＲＰレベルを低くすることが観察されたことから実行された。これらの発見は、基礎となるラボ証拠と共に、スタチンも予後及び治療にとって重要である抗炎症特性を有し得るという仮説を導いた。その場合、スタチン療法の結果として達成されるＣＲＰのレベルは、類似した臨床的意義を有し得る（Ｒｉｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１４３】
ＪＵＰＩＴＥＲ治験は、心血管系事象の第１の発生（心血管死、非致死性の心臓発作、非致死性の卒中、不安定狭心症のための入院及び動脈管再生）時、クレストール２０ｍｇの安全性及び有効性をプラセボに対して比較した。この治験は、心臓疾患が臨床的に明らかでなく、且つ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルが１３０ｍｇ／ｄＬ未満であるおよそ１８０００人を含んだ。治験全体の結果は、クレストール治療個体の主要な心血管系事象を患うリスクが、プラセボを受けている個体と比較してより低く、リスクが４４％（Ｐ＜０．００００１）相対的に低下することを示した。これらの結果に基づいて、ＪＵＰＩＴＥＲ治験は、３又は４年の治験のために設計されたものの、わずか２年後の早い段階で止められた（Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ  ２０１２）。
【０１４４】
クレストールの新しい表示は、空腹時ＬＤＬが１３０ｍｇ／ｄＬ未満、高感度ＣＲＰが２．０ｍｇ／Ｌ以上、トリグリセリドが５００ｍｇ／ｄＬ未満であり、心臓発作又は卒中の以前の病歴も冠状動脈性心疾患のリスクもない５０歳以上の男性及び６０歳以上の女性についてのものであった。
【０１４５】
従って、慢性炎症の疾患又は障害を発症するリスクのある（即ち高レベルのｈｓＣＲＰマーカーを示す）個体は、急性的な徴候への進行のリスクを減弱させるか又は疾患の発症を遅延させるために、組成物Ａの予防レジメンを役立てることができると予測することが適切であるようである。
【０１４６】
実施例７  −  ｉＮＯＳによって生成される一酸化窒素（ＮＯ）の阻害によるチラコイド抽出物中の抗炎症活性のインビトロ検出
チラコイド抽出物のインビトロ抗炎症活性を、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）によって生成される一酸化窒素（ＮＯ）を阻害する能力を試験することによって評価した。ＮＯは、一連の酸化還元反応を通して４つの一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）によって合成される。これらは、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、ニューロン一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）及びミトコンドリア一酸化窒素シンターゼである。酵素ｅＮＯＳ及びｎＮＯＳは、心筋細胞において構成的に発現される一方、ｉＮＯＳは、心不全患者の心筋において高められる。従って、ｉＮＯＳは、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症プラーク進行及び虚血−再灌流障害と関連する。
【０１４７】
チラコイド抽出物で実現したインビトロ研究は、ｉＮＯＳを阻害することで有害なＮＯ活性を低減し得ることを示した（図６）。
【０１４８】
実験条件
チラコイド
チラコイドを、ｉＮＯＳ経路を通じてＮＯ生成に及ぼす作用について試験した。チラコイド粉末をＨａｎｋバッファ中に５ｍｇ／ｍｌで懸濁させた。
【０１４９】
マウス細胞の培養
マウスマクロファージ様ＲＡＷ  ２６４．７細胞は、種々の炎症性メディエータに応じた単球及びマクロファージの機能及び分化を調査するために最も広く用いられている細胞株の１つである。ＲＡＷ  ２６４．７は、ＩＮＦγ、ＴＮＦαに応じて、ｉＮＯＳ経路を通じて大量のＮＯを生成するマクロファージ様細胞モデルである（Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈｅｓ，２００１；Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１５０】
この実験では、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する１０％熱不活化ウシ血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。細胞を、５％ＣＯ２を含有する水飽和雰囲気内で３７℃において維持した。
【０１５１】
グリース試薬法によるｉＮＯＳ経路を通じたＮＯ生成の評価：
ＲＡＷ２６４．７細胞（２５×１０３細胞／ウェル）を０．２５ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬの濃度の種々の再構成チラコイド抽出物で２４時間前処理した。前処理後、細胞を１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄してから、ｉＮＯＳを１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬのサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）による活性化によって刺激して、ＮＯを２４時間生じさせた。生理的条件下でのＮＯの自然酸化によって形成される亜硝酸イオン（ＮＯ２−）の検出を含むグリース試薬法を用いて、ＮＯの生成を測定した。スルファニル酸及びＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンを等容量で一緒に混合して、グリース試薬を形成した。反応は、以下のように説明される：ＮＯ２−の存在下でスルファニル酸がジアゾニウム塩に変換され、これが次にＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンに結合して、５４８ｎｍで測定してピンクの色合いが生じる。ＮＯ濃度をμＭで表す。
【０１５２】
図６において、活性化された細胞は、ｉＮＯＳによって誘導されるＮＯを１５０μＭ生成することを観察することができる。この生成は、細胞を０．２５ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌのチラコイドで処理した場合、それぞれ８０μＭ（４７％低減）及び１５μＭ（９０％低減）のＮＯに低減される。対照として、活性化されていない細胞の前処理は、いかなるチラコイド抽出物濃度でも何ら影響を示さなかった。
【０１５３】
チラコイド抽出物の抗酸化能の測定
最近の２０年にわたり、活性酸素種（ＲＯＳ）（フリーラジカルを含む）が心血管疾患に関与することが実証されてきた（Ｊａｗａｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。心筋の酸化還元不均衡がこの症候群の特徴である。なぜなら、活性酸素種及び活性窒素種が肥大及び心不全の病因においてシグナル伝達分子として挙動して、細胞のカルシウムハンドリング（収縮機構）の調節不全が起こり得る（Ａｒｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）からである。ＲＯＳの重要性は、いくつかの研究において強調されてきた。
【０１５４】
ＲＯＳは、過剰な交感神経興奮と関連するアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）関連神経−心血管疾患（高血圧及び心不全が挙げられる）において重大な神経細胞内シグナル伝達中間体である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ２０１１）。
【０１５５】
酸化脂質損傷のレベルは、心血管疾患（ＣＶＤ）の進行の初期の予測子である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。平衡が細胞レベル以下でフリーラジカル寄りに変化すると、酸化ストレスが増大して、心筋症、心臓発作又は心臓機能不全の原因となり得る（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。
【０１５６】
心血管疾患の患者による臨床研究において総抗酸化能が低減されることが実証された（Ｊａｗａｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。この結果は、酸化ストレスに対する抗酸化防御機構の不全が心血管疾患の病因における重大な要因であり得ることを支持している。
【０１５７】
チラコイドの総抗酸化能をＯＲＡＣＦＬアッセイによって評価した（図７）。
【０１５８】
ＯＲＡＣＦＬアッセイ：
フルオレセインを蛍光プローブとして、及び２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）をペルオキシルラジカルのジェネレータとして用いた（Ｗｕ  ａｎｄ  ａｌ，２００４）。抗酸化能の結果を参照分子トロロックスの抗酸化能に対して定義する。
【０１５９】
サンプルの調製
２つのアッセイにおいて、１グラムのチラコイドをヘキサン／ジクロロメタン（１：１  Ｈｅｘ／Ｄｃ）に続いてアセトン／水／酢酸（７０／２９．５／０．５）と混合した。画分Ｈｅｘ／Ｄｅｃを３０℃の水浴内で窒素雰囲気下において乾燥させて、残留物を、Ｂ−シクロデキストリンを含有する１０ｍｌのアセトン：水で再構成した。遠心分離後、上清を用いて、必要に応じてアッセイバッファによる更なる希釈後にＯＲＡＣＦＬを測定した。親水性画分を２５ｍｌのメスフラスコ中に移して、２５ｍｌのアセトン／水／酢酸（７０／２９．５／０．５）で希釈して、ＯＲＡＣＦＬを実行した。各サンプルを抽出して、２反復で試験した。
【０１６０】
ＯＲＡＣアッセイをＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙプレートリーダで実行した。ＯＲＡＣＦＬの最終値を、トロロックス濃度又はサンプル濃度と、正味のフルオレセイン崩壊曲線下面積との二次回帰式（ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ）を用いて算出した。データをサンプルの１グラム当たりのマイクロモル当量トロロックス（ＥＴ）（μｍｏｌ  ＥＴ／ｇ）で表した。
【０１６１】
結果（図７）は、ＯＲＡＣＦＬアッセイによるチラコイド抽出物の２つのサンプルの総抗酸化能を実証している。結果は、両方の抽出物において、１グラムのチラコイドが３００μｍｏｌのトロロックスと同じ抗酸化能を有することを示している。
【０１６２】
チラコイドのスーパーオキシドジスムターゼ活性
活性酸素種（ＲＯＳ）は、酸素のフリーラジカル誘導体である。最もよく知られているＲＯＳとして、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びヒドロキシルラジカル（ＯＨ−）が挙げられる。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、反応終了時にスーパーオキシド（Ｏ２−）を除去してＨ２Ｏ２を生成する抗酸化酵素である。
【０１６３】
スーパーオキシドは、高血圧及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる多くの心血管疾患の病因において重大な役割を果たしている（Ｆｕｋａｉ  ａｎｄ  Ｆｕｋａｉ，２０１１）。ＳＯＤは、生物が利用可能なＮＯの酸化経路を阻害することにより、内皮及びミトコンドリアの機能でも重大な役割を果たしている（Ｆｕｋａｉ  ａｎｄ  Ｆｕｋａｉ，２０１１）。ＳＯＤの発現は、心筋梗塞（ＭＩ）誘導心不全において低下する（ｖａｎ  Ｄｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１６４】
ＳＯＤの経路の調節不全により、内皮機能不全、血管緊張の変化、血管炎症、血管リモデリング、血管透過性の増進及び血小板凝集の増大に至り、これらが多くの心血管疾患に寄与する。ＳＯＤは、酸化ストレス及び心筋梗塞からの心臓の保護において重大な役割を果たしている。従って、活性ＳＯＤの回復又は提供も心血管疾患において重大な役割を果たし得る。
【０１６５】
従って、チラコイド抽出物をそのＳＯＤ活性について評価した。
【０１６６】
チラコイド中のＳＯＤ活性についての実験条件
ＳＯＤ活性を、ＲＯＳ生成試薬としてのリボフラビンの光酸化を用いてアッセイした。この活性を、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の光化学還元を阻害するチラコイドの能力により、５６０ｎｍでアッセイした（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ａｎｄ  Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，１９７１）。ＮＢＴの青色ホルマザンへの還元は、中間体ラジカル（ＮＢＴＨ）を介して起こり、ここから着色化合物がスーパーオキシドによって生成される（リボフラビンが加えられて光が点灯する場合）。スーパーオキシドを除去することにより、ＳＯＤがこの反応を阻害して、色合いが低下する。
【０１６７】
２つのチラコイド抽出物（０．１ｇ）を１０ｍＬのバッファ（５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２％（ｗ／ｖ）ＰＶＰＰ）中に懸濁させた。懸濁液を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心分離した。上清をＳＯＤアッセイのために採った。
【０１６８】
ＳＯＤアッセイのための反応混合物は、以下を含有した：２０μＬの上清、１．３ｍＬのアッセイバッファ（５０ｍＭ  Ｋ−ＰＯ４バッファ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＮＢＴ、５００ｍＭ  Ｌ−メチオニン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２．５％（ｖ／ｖ）トリトン）。この混合物を、アッセイ基質リボフラビン（０．２ｍＭ）を加えるまで暗所内で維持した。リボフラビンを含有する反応混合物を発光ランプで室温において５分照らすことにより、反応を開始した。次に、サンプルを５６０ｎｍで読んだ。ウシＳＯＤによる標準曲線を用いて（％活性に対するＳＯＤ酵素単位）、様々なチラコイド抽出物のＳＯＤ活性を判定した。チラコイド中のタンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法で判定した。
【０１６９】
図８に示す結果は、スーパーオキシド（Ｏ２−）の生成を阻害するチラコイド抽出物の能力を示している。試験した両方の抽出物において、残りのスーパーオキシド生成活性は、対照に対して５５及び４５％であった。Ｏ２−のこの阻害は、それぞれ１，２５３５及び１，５９７ｍＵ  ＳＯＤ／タンパク質ｇに対応する。
【０１７０】
心血管疾患に関係するチラコイドの抗炎症活性と抗酸化活性との関係
ｉＮＯＳを阻害することで有害なＮＯレベルを低減することにより、本データは、チラコイド抽出物が抗炎症特性を有することを実証する。更に、データは、チラコイド抽出物が、心血管疾患に関連する抗酸化防御の低下を回復し得ることも実証した。従って、チラコイド抽出物は、心血管疾患と関連する抗酸化緩衝能の低下を回復する能力を有する。
【０１７１】
結論
本明細書中で提示されるデータは、本発明のチラコイド抽出物（組成物Ａ医薬品）が潰瘍性大腸炎に対して活性であることを示す。興味深いことに、腸管特異的マーカーに加えて、便中ラクトフェリン、２つの一般炎症バイオマーカー、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲ）及び高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓ  ＣＲＰ）も治療の直後に著しく低下した（図４及び図５を参照されたい）。これは、炎症が、炎症を起こした腸のレベルで単純に対処されるよりも広く対処され得ることを示す。
【０１７２】
実施した相１研究及び相２ａ研究の両方の研究における組成物Ａの直腸浣腸剤の現在までの優れた安全性プロファイル、直腸出血（潰瘍性大腸炎の主徴）及び便中ラクトフェリンレベルの有意な低下、炎症の確立された他のバイオマーカー（炎症及びアポトーシスの探索バイオマーカー（ロイコトリエンＢ４及びＭ３０アポトソーム））のレベルにおける統計学的に有意でないが著しい低下、並びに潰瘍性大腸炎の他の重要な徴候の緩和において観察されたプラセボに対して優位となる傾向の全ては、組成物Ａが心血管疾患の治療において又はその発症の遅延において活性であるはずであることを示唆している。
【０１７３】
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、更なる改良形態が可能であり、本願は、概して本発明の原理に従い、且つ本発明が関係する技術分野の公知の又は慣習的な実施の範囲内に入るような、且つ以上に示される、及び以下の添付の特許請求の範囲にあるとおりの本質的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形形態、使用又は適合形態を包含するように意図されることは理解されるであろう。
【０１７４】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願及び刊行物は、各独立した特許、特許出願又は刊行物が具体的且つ個別的に参照により本明細書に援用されることが示されたものとするのと同程度に本明細書において参照により援用される。
【０１７５】
参考文献
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Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｅ３ｌｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｌｏｗｅｒ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  ｖｅｉｎ  ｂｙｐａｓｓ  ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，ｖｏｌ  ４３，ｎｏ．１，２−９．
Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｈｅａｒｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｕｔ  ｐｏｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓａｂａｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１１５；１５２８−１５３６．
Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｆｒｏｍ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｂｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ  ５４，Ｎｏ．２３，２１２９−２１３６，ｄｏｉ：１０．１０１６．
Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｅｏ，２０１２，Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４２，３，１５１．
Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｙｏｎｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，５７：６７２−６７３．
Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ−２  ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｓｏｉｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｃａｒｅ，ｖｏｌ．２９．Ｎｏ．２，３２９−３３３．
Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｏｓｅ  ｗｉｔｈ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．
Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｓ−ＣＲＰ  ａｓ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｇｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．；１２（８）：６１３−６１７．
Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｅ．Ｇｉｌｇｕｎ−Ｓｈｅｒｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．；１２（２７）：３５０９−１９．
Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．；１５（２９）：３０６８−８０．
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ＦＤＡ  ＮＥＷＳ  ＲＥＬＥＡＳＥ  Ｆｅｂ．９，２０１０．ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｓ  Ｎｅｗ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ：Ｃｒｅｓｔｏｒ．
Ｇｅｎｅｓｔ  Ｊ，Ｒｕｔｈ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊｉｒｉ  Ｆｒｏｈｌｉｃｈ，Ｔｏｄｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｏｒｍ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａｎｄｒｅ  Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｄｕｆｏｕｒ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆｏｄｏｒ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ａ．Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｇｒｏｖｅｒ，Ｍｉｌａｎ  Ｇｕｐｔａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｈｅｇｅｌｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｃ．Ｌａｕ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｅｉｔｅｒ，Ｇａｒｙ  Ｆ．Ｌｅｗｉｓ，Ｅｖａ  Ｌｏｎｎ，Ｇ．Ｂ．Ｊｏｈｎ  Ｍａｎｃｉｎｉ，Ｄｏｍｉｎｉｃ  Ｎｇ，Ｇｌｅｎ  Ｊ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ａｌｌａｎ  Ｓｎｉｄｅｒｍａｎ，Ｊａｍｅｓ  Ａ．Ｓｔｏｎｅ，Ｅｈｕｄ  Ｕｒ．２００９  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ／Ｃａｎａｄｉａｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ−−２００９  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００９；２５：５６７−５７９．
Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ．Ａｌｐｅｒｔ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ａ．Ｂｅｌｌｅｒ，Ｅｍｅｌｉａ  Ｊ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．Ｂｕｄｏｆｆ，Ｚａｈｉ  Ａ．Ｆａｙａｄ，Ｅｌｙｓｅ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ｍａｒｋ．Ａ．Ｈｌａｔｋｙ，Ｊｏｈｎ  ＭｃＢ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｇ．Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｌａｕｅｒ，Ｌｅｓｌｅｅ  Ｊ．Ｓｈａｗ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｌｌｅｎ  Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ａｎｄ  Ｎａｎｅｔｔｅ  Ｋ．ＷｅｎｇｅｒＧｒｅｅｎｌａｎｄ  Ｐ，Ａｌｐｅｒｔ  ＪＳ，Ｂｅｌｌｅｒ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．２０１０  ＡＣＣＦ／ＡＨＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ａｄｕｌｔｓ：ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２０１０；５６：ｅ５０−ｅ１０３．
ＭＥＭＯＲＡＮＤＵＭ−ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＨＥＡＬＴＨ  ＡＮＤ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＶＩＣＥＳ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＤＡＴＥ：１２  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９  ＦＲＯＭ：Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＤＭＥＰ）Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ＩＩ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＳＵＢＪＥＣＴ：１５  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８，Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ（ＣｒｅｓｔｏｒＴＭ）．
Ｍｙｅｒｓ  Ｇａｒｙ  Ｌ．，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈ．Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，Ｍａｒｙ  Ｃｕｓｈｍａｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  Ｍ．Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ，Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｍ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｓｃｏｔｔ  Ｍ．Ｇｒｕｎｄｙ，Ｄａｒｗｉｎ  Ｒ．Ｌａｂａｒｔｈｅ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｅｖｙ，Ｎａｄｅｒ  Ｒｉｆａｉ，Ｐｅｔｅｒ  Ｗ．Ｆ．Ｗｉｌｓｏｎ．２００９．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００９；５５：３７８−３８４．
Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｔ．Ａ，，Ｇｅｏｒｇｅ  Ａ．Ｍｅｎｓａｈ，Ｒ．Ｗａｙｎｅ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｏ．Ｃａｎｎｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｒｉｑｕｉ，Ｙａｚｉｄ  Ｙ．Ｆａｄｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｐ．Ｆｏｒｔｍａｎｎ，Ｙｕｌｉｎｇ  Ｈｏｎｇ，Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｍｙｅｒｓ，Ｎａｄｅｒ  Ｒｉｆａｉ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔａｕｂｅｒｔ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ．Ｔｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ  Ｖｉｎｉｃｏｒ（２００３）．Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｐｒａｃｔｉｃｅ：ａ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００３；１０７：４９９−５１１．
Ｒｉｄｋｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｃａｎｎｏｎ  Ｃ．Ｐ．，Ｍｏｒｒｏｗ  Ｄ．，Ｒｉｆａｉ  Ｎ．，Ｒｏｓｅ  Ｌ．Ｍ．，ＭｃＣａｂｅ  Ｃ．Ｈ，，．Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．Ａ，ａｎｄ  Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ．，２００５．Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｔａｔｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００５；３５２：２０−２８．
Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ＊（２０１２）．Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６７：１３１０−１３２０．
Ｙｏｕｓｕｆ  Ｏ．，Ｍｏｈａｎｔｙ  Ｂ．Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎ  Ｓ．Ｓ．，Ｊｏｓｈｉ  Ｐ．Ｈ．，Ｂｌａｋａ  Ｍ．Ｊ．，Ｎａｓｉｒ  Ｋ．，Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  Ｒ．Ｓ．，Ｂｕｄｏｆｆ  Ｍ．Ｊ．２０１３．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏ．６２（５）：３９７−４０８．
Ａｒｃａｒｏ  Ａ．，Ｐｉｒｏｚｚｉ  Ｆ．，Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ａ．，Ｃｈｉｍｅｎｔｉ  Ｃ．，Ｃｒｏｔｔｉ  Ｌ．，Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｃ．，Ｍａｎｃａｒｄｉ  Ｄ．，Ｔｏｒｅｌｌａ  Ｄ．，Ｔｏｃｃｈｅｔｔｉ  Ｃ．Ｇ．（２０１５）．Ｎｏｖｅｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｄｏｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆａｉｌｉｎｇ  Ｍｙｏｃｙｔｅｓ：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｒｅｄｏｘ  Ｍｉｌｉｅｕ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｔａｌｉａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６３５３４６９，１３  ｐａｇｅｓ  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１６／６３５３４６９．
Ａｓａｄａ  Ｋ．（２００６）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４１，ｐｐ．３９１−３９６．
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月27日(2019.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心血管疾患（ＣＶＤ）の発症を予防するか又は遅延させるための使用のための組成物であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含む有効量のチラコイド抽出物を、任意選択で生理的に許容可能な賦形剤と混合して含む組成物。
【請求項２】
１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
経口投与のために製剤化されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
非経口投与のために製剤化されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
心臓発作の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
心臓発作の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記抽出物の有効量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記抽出物の有効量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記抽出物は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量におけるものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
対象の心血管疾患（ＣＶＤ）の発症を予防するか又は遅延させるための医薬品の製造における、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用。
【請求項１４】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬品は、経口投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬品は、非経口投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬品は、心臓発作（心筋梗塞）の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
前記抽出物は、心臓発作（心筋梗塞）の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記抽出物は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇを達成する量で存在する、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記抽出物の量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量で製造される、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
対象の心血管疾患（ＣＶＤ）を治療するか又はその発症を遅延させるための、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用。
【請求項２６】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抽出物は、経口投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
前記抽出物は、非経口投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項３０】
前記抽出物は、心臓発作の直後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項３１】
前記抽出物は、心臓発作の最大２４時間後の心臓内投与のために製剤化されている、請求項２５に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋／脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、バイパス手術、虚血、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、弁膜性心疾患、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患及び静脈血栓症から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３３】
前記ＣＶＤは、狭心症、卒中、心筋梗塞、虚血、静脈血栓症及びアテローム性動脈硬化症である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記抽出物は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．００００５〜５００ｍｇを達成する量で存在する、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記抽出物の量は、対象の体重１Ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記抽出物は、１日当たり約１２５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００及び１０００ｍｇから選択される投薬量におけるものである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を生理的及び経口的に許容可能な担体と混合して含む、経口投与のための製剤。
【請求項３８】
前記抽出物は、１０％未満の電子供与体を含む媒体中で安定化されている、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
前記媒体は、１０％未満の水を含む、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
哺乳類の血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰのベースラインレベルを１４日後に少なくとも約２５％だけ低減するための組成物であって、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物を含み、前記組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示す、組成物。
【請求項４１】
前記抽出物は、生理的に許容可能な担体と混合されている、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ベースラインレベルは、少なくとも約２ｍｇ／Ｌである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
対象の血中ＣＲＰ又は血中ｈｓＣＲＰを低減するための医薬品の製造における、精製された機能性光合成色素をそのチラコイド膜環境において含むチラコイド抽出物の使用であって、前記低減は、ベースラインの少なくとも２５％であり、及び前記組成物の投与前の前記ＣＲＰ又はｈｓＣＲＰのベースラインレベルは、慢性炎症を示す、使用。
【請求項４４】
前記抽出物は、生理的に許容可能な担体と混合されている、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記ベースラインレベルは、少なくとも約２ｍｇ／Ｌである、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
ＣＲＰレベルの少なくとも５０％の低減又はｈｓＣＲＰレベルの少なくとも５０％の低減を達成する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４７】
ＣＲＰレベルの少なくとも６０％の低減又はｈｓＣＲＰレベルの少なくとも６０％の低減を達成する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
２１日の治療に応答してＣＲＰレベルの少なくとも７７％の低減又はｈｓＣＲＰレベルの少なくとも８０％の低減を達成する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記医薬品は、ＣＲＰレベルの少なくとも５０％の低減又はｈｓＣＲＰレベルの少なくとも５０％の低減を達成する、請求項４３に記載の使用。
【請求項５０】
前記組成物は、ＣＲＰレベルの少なくとも６０％の低減又はｈｓＣＲＰレベルの少なくとも６０％の低減を達成する、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記組成物は、２１日の治療に応答してＣＲＰレベルの少なくとも７７％の低減又はｈｓＣＲＰレベルの少なくとも８０％の低減を達成する、請求項５０に記載の使用。
【国際調査報告】
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