(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３およびＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質に関する。本発明はまた、前記抗体様結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんを処置するための前記医薬組成物および抗体様結合タンパク質の使用にも関する。本発明はさらに、前記抗体様結合タンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸、ベクターおよび宿主細胞に関する。
2019531701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む、ヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｌ５−Ｆｃ２［ＩＶ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［ＩＶ］の前記ポリペプチドは：
（ｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１、
・配列番号５６の配列のＬ１、
・配列番号１０の配列のＶＤ２、
・配列番号５６の配列のＬ２、
・配列番号１８の配列のＣＬ、
・０個のアミノ酸からなるＬ５、および
・配列番号７０の配列からなるＦｃ２
を含み、
・ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくは
・ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくは
・ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号７１のアミノ酸配列、
または
（ｉｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号７１におけるアミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記のａ）（ｉ）で定義された通りである、配列番号７１に少なくとも８５％同一な配列からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の前記ポリペプチドは：
（ｉ）
・配列番号９の配列のＶＤ３、
・０個のアミノ酸からなるＬ３、
・配列番号５２の配列のＶＤ４、
・０個のアミノ酸からなるＬ４、
・配列番号１９の配列のＣＨ１、および
・配列番号６８の配列からなるＦｃ、
を含み、ここでＸ１はＹもしくはＣであり、Ｘ２はＳもしくはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳもしくはＷであり、Ｘ４はＡもしくはＬであり、Ｘ５はＶもしくはＹであり、Ｘ６はＨもしくはＲであり、Ｘ７はＹもしくはＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、
または
（ｉｉ）
・配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号６７のアミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記のｂ）（ｉ）で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［ＩＶ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、前記抗体様結合タンパク質。
【請求項２】
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここで
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであるか、または
Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶであり、
Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、または
Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、請求項１に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項３】
ａ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号８１または配列番号８１に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号６０または配列番号６０に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むか、または
ｂ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７３または配列番号７３に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５または配列番号７５に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むか、または
ｃ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７または配列番号７７に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５または配列番号７５に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むか、または
ｄ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７または配列番号７７に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７９または配列番号７９に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含む、請求項１または２に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項４】
ａ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドが、配列番号８０のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号８０のアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号８０に少なくとも８５％同一な配列からなり；
式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号５９のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号５９のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号５９に少なくとも８５％同一な配列からなり；または
ｂ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドが、配列番号７２のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７２のアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７２に少なくとも８５％同一な配列からなり；
式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号７４のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７４のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７４に少なくとも８５％同一な配列からなり；または
ｃ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドが、配列番号７６のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７６におけるアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７６に少なくとも８５％同一な配列からなり；
式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号７４のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７４のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７４に少なくとも８５％同一な配列からなり；または
ｄ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドが、配列番号７６のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７６におけるアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７６に少なくとも８５％同一な配列からなり；
式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号７８のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７８のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７８に少なくとも８５％同一な配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項５】
ｉ）配列番号８０のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号５９のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、
ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド、および
配列番号７４のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、
ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号７４のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、または
ｖｉ）配列番号７６のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号７８のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項６】
２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含む、ヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、
第１のポリペプチドは、式［Ｉ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
によって表される構造を有し、
第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］；
によって表される構造を有し、
第３のポリペプチドＦｃ３は、免疫グロブリンヒンジ領域および免疫グロブリンのＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ここで、
ｃ）式［Ｉ］の前記ポリペプチドは：
（ｉｉｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１、
・配列番号５６の配列のＬ１、
・配列番号１０の配列のＶＤ２、
・配列番号５６の配列のＬ２、
・配列番号１８の配列のＣＬ
を含む配列番号５５のアミノ酸配列、
または
（ｉｖ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号５５に少なくとも８５％同一な配列
からなり；
ｄ）式［ＩＩＩ］の前記ポリペプチドが：
（ｉｉｉ）
・配列番号９の配列のＶＤ３、
・０個のアミノ酸からなるＬ３、
・配列番号５２の配列のＶＤ４、
・０個のアミノ酸からなるＬ４、
・配列番号１９の配列のＣＨ１、および
・配列番号６８の配列のＦｃ
を含み、ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくはＸ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、
または
（ｉｖ）
・配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記のｂ）（ｉ）で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列からなり、
ここで：
−  式［Ｉ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
−  式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、そのＦｃドメインを介して第３のポリペプチドとヘテロ二量体化しており、
−  前記第３のポリペプチドＦｃ３は、配列番号６９または配列番号６９に少なくとも８５％同一な配列からなり、ここで配列番号６９のアミノ酸位置１２９、１４６、１４８、１８７、２１５、２１６が不変である、前記抗体様結合タンパク質。
【請求項７】
−  配列番号５５からなる式［Ｉ］の１つのポリペプチド、
−  配列番号６５からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、および
−  配列番号６９からなるＦｃ３
を含む、請求項６に記載の抗体様結合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
医薬として使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
がんの処置に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
がんが、血液がんである、請求項９に記載の使用のための抗体様結合タンパク質または医薬組成物。
【請求項１２】
疾患または障害を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質または請求項８に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質をコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸によって形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体様結合タンパク質、
ｂ）場合により、包装材、および
ｃ）場合により、前記抗体様結合タンパク質はがんを処置するのに、またはがんの処置に使用するのに有効であることを示す、前記包装材内に含有されるラベルまたは添付文書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３およびＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質に関する。本発明はまた、前記抗体様結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんを処置するための前記医薬組成物および抗体様結合タンパク質の使用にも関する。本発明はさらに、前記抗体様結合タンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸、ベクターおよび宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体の第１世代は、２０年以上前に開発された。それ以来、いくつかの臨床研究によって、がん細胞表面抗原を標的化するように操作された二重特異性抗体が試験されてきた。この抗がん融合タンパク質のグループは、抗がん活性を達成するために、標的化されたがん細胞の近接に免疫学的なエフェクター細胞を局在化する２つまたはそれより多くの機能性ドメインを含有する。
【０００３】
二重特異性抗体技術が開発されたことから、一方の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）は標的化細胞と結合し他方はＴ細胞表面上のＣＤ３と結合する２つの抗体のｓｃＦｖのみを（Ｆｃアミノ酸セグメントは包含させずに）フレキシブルリンカーで接続することによって、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）と命名された融合タンパク質の様々なグループが生成された。ＢｉＴＥの１つであるブリナツモマブは、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性結合活性を有し、Ｂ細胞系統急性リンパ芽球性白血病において微小残存病変を有する患者のフェーズＩＩ臨床試験において有望な結果を示した。
【０００４】
ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体アルファ鎖ＩＬ−３Ｒα）は、様々な血液学的腫瘍で過剰発現される腫瘍抗原である。ＡＭＬ芽球の大部分が表面ＣＤ１２３を発現し、この発現はＡＭＬのサブタイプで異なっていない。診断時においてＡＭＬにおけるＣＤ１２３発現が多いほど、より不良な予後に関連することが報告されている。ＣＤ１２３は白血病幹細胞（ＬＳＣ）で発現されることが報告されている。ＡＭＬが、ＤＮＡ損傷性の化学療法に静止状態であり比較的耐性を有することが示されているこれらの白血病幹細胞（ＬＳＣ）に起因することを示唆する証拠が増えつつある。したがって、造血幹細胞（ＨＳＣ）と比較してＬＳＣでＣＤ１２３の発現が増加することは、ＡＭＬ−ＬＳＣを治療的に標的化するための機会を提供する。
【０００５】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）７Ｇ３は、ＣＤ１２３に対して発生したものであるが、これまでに、白血病細胞株および初代細胞の両方のＩＬ−３が媒介する増殖および活性化を阻害することが示されている（特許文献１）。しかしながら、ＣＤ１２３の標的化がＡＭＬ−ＬＳＣを機能的に損なうことができるかどうかは未だ明らかになっていない。
【０００６】
本発明者らにより本明細書で示されるように、ＣＤ１２３×ＣＤ３抗体様結合タンパク質の使用は、腫瘍細胞を致死させる。
【０００７】
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性結合活性を有する二重特異性抗体様結合タンパク質を産生するという概念はすでに提唱されており、特許文献２に記載されている。
【０００８】
さらに、２０１４年に、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ製のＣＤ１２３×ＣＤ３二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ；Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）二重特異性抗体ベースの分子がフェーズＩ臨床試験に入った。
【０００９】
しかしながら、本発明者らによって示された通り、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ製のＣＤ１２３×ＣＤ３二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）二重特異性抗体ベースの分子は、例えば、標的細胞の非存在下で、ＣＤ４＋発現Ｔ細胞の８２％およびＣＤ８＋発現Ｔ細胞の８３％の活性化を示す。Ｔ細胞の不適切な活性化は、サイトカイン放出症候群などの重度の副作用を引き起こす可能性がある。サイトカイン放出症候群は、重度の感染で見出されるものに類似した、ある種の全身性の炎症性応答を生じる、活性化されたＴ細胞によるサイトカインの放出を指し、低血圧、発熱および悪寒を特徴とする。例えば抗ＣＤ３抗体のＯＫＴ３に関して、サイトカイン放出症候群に起因する死亡が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，１７７，０７８号
【特許文献２】ＷＯ２０１３／１７３８２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質は、本特許出願の優先権の出願日の時点で未公開の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６号に記載されている（欧州特許条約第５４（３）条）。したがって、これらの二重特異性抗体技術における前進にもかかわらず、追加のがん治療薬、特に、直接的または間接的のいずれかでがん細胞を効率的に標的化し致死させるがん治療薬が未だ求められている。さらに、所望の生物活性、優れた代謝、薬物動態学的および安全性プロファイルを有し、さらに産業的実施に見合った大きい規模での製造も可能な新しい抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の状況下で、本発明者らは、ＲＦ突然変異およびノブ−イントゥー−ホール突然変異などの突然変異を含有する抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質の数々のバリアントを開発し、それによって発現中の前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質の凝集を低減することに成功した。凝集体の量を低減することによって、発現および精製中における抗体様結合タンパク質のヘテロ二量体の量の増加を達成でき、したがって精製された抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質の収量を増加させることができる。
【００１３】
したがって本発明は、発現および／または精製中の凝集の低減をもたらす突然変異を含む抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質に言及する。前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質は、ＣＤ１２３を発現する標的細胞、例えばＴＨＰ−１細胞の非存在下で低いＴ細胞活性化能力を有するが、ＣＤ１２３を発現する標的細胞、例えばＴＨＰ−１細胞の存在下で高いＴ細胞活性化能力を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
抗ＣＤ３抗体
「ＣＤ３」は、Ｔ細胞上で多分子のＴ細胞受容体複合体の一部として発現され、少なくとも３つの異なる鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γからなる抗原を意味する。ＣＤ３δおよびＣＤ３γは、ヒトＣＤ３εに低い配列同一性および／または類似性を有する（類似性および同一性は２０％未満である）。ＣＤ３εおよびＣＤＲ３δは、一緒になって、複合体、いわゆる「ＣＤ３ε／δ−複合体」を形成することができる。ＣＤ３εはまた、ＣＤＲ３γとの複合体、いわゆる「ＣＤ３ε／γ−複合体」も形成する。例えば固定された抗ＣＤ３−抗体によるＴ細胞上でのＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の係合に類似した、ただしそのクローンに典型的な特異性から独立したＴ細胞活性化を引き起こす。「ＣＤ３ε」は、３つのドメイン、すなわち細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む。
【００１５】
ほとんどの従来技術の抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３ε鎖を認識する。このような従来技術の抗ＣＤ３抗体の１つは、ＯＫＴ３である。従来技術は、例えば抗体分子ＯＫＴ３を採用することによる、抗体分子を採用するＴ細胞活性化事象を例示している。抗ＣＤ３抗体およびそのバリアントは、従来技術（ＵＳ４，３６１，５４９；ＵＳ４，３６１，５４９；ＵＳ５，８８５，５７３；ＵＳ５，９２９，２１２；およびＷＯ９８／５２９７５またはＵＳ５，９５５，３５８）に記載されている。ＯＫＴ３はさらに、同種移植片拒絶反応を処置するための臨床移植において有力な免疫抑制剤として使用されてきた（Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ  １９８４、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ３８、６９５〜７０１；Ｗｏｏｄｌｅ  １９９１、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５１、１２０７〜１２１２；Ｃｈｏｉ  ２００１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（１）、９４〜１０６）。
【００１６】
この療法の主な欠点は、Ｔ細胞とＦｃγＲを有する細胞との間の架橋およびヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答に起因するサイトカイン放出で証明されたＴ細胞活性化である。これらの副作用を低減するために、ＵＳ５，９２９，２１２；ＵＳ５，８８５，５７３などの数々の公報で、例えばＯＫＴ３のヒト化などの変更が記載されている。一方で、ＯＫＴ３または他の抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞の活性化および増殖を刺激するために免疫強化剤として使用することができる（ＵＳ６，４０６，６９６、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ；ＵＳ６，１４３，２９７、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ；ＵＳ６，１１３，９０１、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ；Ｙａｎｎｅｌｌｙ  １９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１、９１〜１００）。また抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞増殖を誘導するための抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて使用される薬剤としても記載されている（ＵＳ６，３５２，６９４）。ＯＫＴ３はさらに、それ自体で、または二重特異性抗体の構成要素として、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に標的化するために使用されてきた（Ｎｉｔｔａ  １９９０、Ｌａｎｃｅｔ  ３３５、３６８〜３７６；Ｓａｎｎａ、１９９５、Ｂｉｏ／  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３、１２２１〜１２２４；ＷＯ９９／５４４４０）。
【００１７】
これまでのＴ細胞を動員するための薬剤として抗体を使用するアプローチは、数々の発見によって妨げられてきた。第一に、Ｔ細胞に高い結合親和性を有する天然または操作された抗体は、それらが結合するＴ細胞を活性化しないことが多い。第二に、Ｔ細胞に低い結合親和性を有する天然または操作された抗体はまた、Ｔ細胞媒介細胞溶解を開始させるそれらの能力に関して非効果的であることが多い。
【００１８】
シグナルペプチドを含む全長ヒトＣＤ３εタンパク質の参照配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｐ０７７６６（２０１４年１２月１２日に利用可能）で入手可能であり、本明細書では配列番号１に包含される。
【００１９】
シグナルペプチドを含む全長カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３εタンパク質の参照配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｑ９５ＬＩ５で入手可能であり（２０１４年１２月１２日に利用可能）、本明細書では配列番号２に包含される。
【００２０】
本発明者らによってゲノムＤＮＡからクローニングされた成熟ヒトＣＤ３εＨｉｓタグ付きＦｃ融合タンパク質の配列は、配列番号３で開示される。前記成熟ヒトＣＤ３εＨｉｓタグ付きＦｃ融合タンパク質は、全長ヒトＣＤ３εタンパク質のアミノ酸２３から１２６を含み、したがってヒトＣＤ３εの細胞外ドメインを含む。
【００２１】
本発明者らによってゲノムＤＮＡからクローニングされた成熟カニクイザルＣＤ３εＦｃ融合タンパク質の配列は、配列番号４で開示される。前記成熟カニクイザルＣＤ３εＦｃ融合タンパク質は、全長カニクイザルＣＤ３εタンパク質のアミノ酸２３から１１７を含み、したがって、野生型配列のアミノ酸位置５７と比較してアミノ酸位置３５に１つのアラニンからバリンへの交換を含有する、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３εの細胞外ドメインを含む。
【００２２】
ヒトおよびカニクイザルＣＤ３εのドメイン構成は、以下に示す通りである（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０７７６６配列（ヒト）およびＵｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９５ＬＩ５配列（カニクイザル）に基づく）：
【表１】
2019531701.tif 000003
【００２３】
したがって、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号１の位置２３〜１２６におけるアミノ酸からなり、カニクイザルＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号２の位置２２〜１１７におけるアミノ酸からなる。
【００２４】
ヒト化抗ＣＤ３抗体「ｈｚ２０Ｇ６」は、その重鎖および軽鎖可変ドメインの配列が「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の場面で使用されており、
−  配列番号５の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号６の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号７の配列のＣＤＲ３−Ｈを含む、配列
【化１】
2019531701.tif 000004
（配列番号９、ＣＤＲは太字で示される）からなる重鎖可変ドメイン、および
−  配列番号１１の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列「ＫＶＳ」のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号８の配列のＣＤＲ３−Ｈを含む、配列
【化２】
2019531701.tif 000005
（配列番号１０、ＣＤＲは太字で示される）からなる軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００２５】
本発明の場面で使用されるヒト化抗ＣＤ３抗体「ｈｚ２０Ｇ６」は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３タンパク質の両方に高親和性を呈示するが、標的細胞の非存在下で低いＴ細胞活性化を有する。
【００２６】
抗ＣＤ３抗体「ｈｚ２０Ｇ６」は、特に、ヒトＣＤ３の、またはヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ３の細胞外ドメインに結合する。より具体的には、抗体は、ＣＤ３εに結合する。より具体的には、抗ＣＤ３抗体は、ヒトおよびカニクイザルのＣＤ３εの細胞外ドメインに結合する。抗ＣＤ３抗体は、複合体、例えばＣＤ３ε／δ複合体の形態で存在する場合、または単離された形態で発現されるかどうかに関係なく、単一のタンパク質として存在する場合、または例えばＴ細胞中に存在する場合のように可溶性細胞外ドメインまたは全長膜アンカー型ＣＤ３ε中に存在する場合、ＣＤ３εに結合する。
【００２７】
本発明の場面で使用される抗ＣＤ３抗体「ｈｚ２０Ｇ６」は、ヒトＣＤ３タンパク質の、またはヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ３タンパク質の表面、特にＣＤ３εに特異的である。特に、本抗体は、上述のヒトおよびカニクイザルＣＤ３γおよび／またはＣＤ３δタンパク質の細胞外ドメインに結合しないか、またはそれらと有意に交差反応しない。
【００２８】
本発明の場面で使用される抗ＣＤ３抗体「ｈｚ２０Ｇ６」は、抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」のヒト化バージョンである。抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」は、どちらもＢｉａｃｏｒｅによって測定した場合、３．５×１０４（１／Ｍｓ）のｋａ、２．７×１０−４（１／ｓ）のｋｄを有し、結果としてヒトＣＤ３ε／δ複合体に対して７，７×１０−９（Ｍ）のＫＤをもたらし、さらに、２．７×１０４（１／Ｍｓ）のｋａ、２．２×１０−４（１／ｓ）のｋｄを有し、結果としてカニクイザルＣＤ３ε／δ複合体に対して８．２×１０−９（Ｍ）のＫＤをもたらす（データ示さず）。したがって抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」のヒトＣＤ３への親和性に対するカニクイザルＣＤ３への親和性の比率（ＫＤ（カニクイザル）／ＫＤ（ヒト））は、１である。したがって抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」およびそれ由来の抗体様結合タンパク質は、サルで実行される毒物学的研究、すなわちヒトにおいて起こり得る有害作用を予測するために関連するサルで観察された毒性プロファイルで使用することができる。
【００２９】
したがって、本発明の抗体様結合タンパク質の場面で使用される抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」のヒトＣＤ３またはカニクイザルＣＤ３、または両方への親和性（ＫＤ）は、≦１０ｎＭである。
【００３０】
抗ＣＤ１２３抗体
「ＣＤ１２３」（表面抗原分類１２３）はまた、「インターロイキン３受容体、アルファ（ＩＬ３ＲＡ）」または「ＩＬ３Ｒ」、「ＩＬ３ＲＸ」、「ＩＬ３ＲＹ」、「ＩＬ３ＲＡＹ」、「ｈＩＬ−３Ｒａ」としても公知であり、ヘテロ二量体サイトカイン受容体のインターロイキン３特異的サブユニットを意味する。機能的なインターロイキン３受容体は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン５（ＩＬ−５）のための受容体と共通である特異的なアルファ鎖（ＩＬ−３Ａ；ＣＤ１２３）およびＩＬ−３受容体ベータ鎖（β０；ＣＤ１３１）を含むヘテロ二量体である。ＣＤ１２３は、ＩＬ−３結合に関与する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および約５０個のアミノ酸の短い細胞質側尾部を含有する、約４３ｋＤａの推測の分子量を有するＩ型内在性膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは、２つの領域：その配列がＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５受容体アルファ鎖の等価な領域と類似性を示す約１００個のアミノ酸のＮ末端領域；およびこのサイトカイン受容体ファミリーの他のメンバーに共通の４つの保存されたシステイン残基およびＷＳＸＷＳモチーフを含有する膜貫通ドメインの近位にある領域で構成される。ＩＬ−３結合ドメインは、２つのＩｇ様フォールディングドメインで構成された約２００個のアミノ酸残基のサイトカイン受容体モチーフ（ＣＲＭ）を含む。ＣＤ１２３の細胞外ドメインは、高度にグリコシル化されており、Ｎ−グリコシル化は、両方のリガンド結合および受容体シグナル伝達に必要である。タンパク質ファミリーは、３つのメンバー：ＩＬ３ＲＡ（ＣＤ１２３Ａ）、ＣＳＦ２ＲＡおよびＩＬ５ＲＡを集めている。全体構造は３つのメンバー間でよく保存されているが、配列相同性は極めて低い。これまでに、３００アミノ酸長を有する１つのＣＤ１２３のアイソフォームが、まだＲＮＡレベルではあるが発見されており、これは、Ｇｅｔｅｎｔｒｙデータベースにおいて受託番号ＡＣＭ２４１１６．１でアクセス可能である。
【００３１】
シグナルペプチドを含む全長ヒトＣＤ１２３タンパク質の参照配列は、ＮＣＢＩデータベースから受託番号ＮＰ＿００２１７４．１で、さらにＵｎｉｐｒｏｔから受託番号Ｐ２６９５１で入手可能であり、本明細書において配列番号１２で開示される（２０１４年１２月１４日に利用可能）。
【００３２】
シグナルペプチドを含む全長カニクイザルＣＤ１２３タンパク質の参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから受託番号ＥＨＨ６１８６７．１で、さらにＵｎｉｐｒｏｔから受託番号Ｇ８Ｆ３Ｋ３で入手可能であり、本明細書において配列番号１３で開示される（２０１４年１２月１４日に利用可能）。
【００３３】
本発明者らによってゲノムＤＮＡからクローニングされた成熟ヒトＣＤ１２３Ｈｉｓ−ＩＩタグ付きＦｃ融合タンパク質の配列は、配列番号１４で開示される。前記成熟ヒトＣＤ１２３Ｆｃ融合タンパク質は、全長ヒトＣＤ１２３タンパク質のアミノ酸１９から３０５を含み、したがってヒトＣＤ１２３の細胞外ドメインを含む。
【００３４】
本発明者らによってｃＤＮＡからクローニングされた成熟カニクイザルＣＤ１２３Ｈｉｓ−ＩＩタグ付きＦｃ融合タンパク質の配列は、配列番号１５で開示される。前記成熟カニクイザルＣＤ１２３Ｆｃ融合タンパク質は、全長カニクイザルＣＤ１２３タンパク質のアミノ酸１９から３０５を含み、したがってカニクイザルＣＤ１２３の細胞外ドメインを含む。
【００３５】
ヒトおよびカニクイザルＣＤ１２３のドメイン構成は、以下の通りである（ＮＣＢＩデータベースにおいて受託番号ＮＰ＿００２１７４．１（配列番号１２）でアクセス可能なヒトＣＤ１２３配列ベース、およびＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｇ８Ｆ３Ｋ３（配列番号１３）でアクセス可能なカニクイザルＣＤ１２３配列ベース）：
【表２】
2019531701.tif 000006
【００３６】
したがって、ヒトＣＤ１２３の細胞外ドメインは、配列番号１２の位置１９〜３０５におけるアミノ酸からなる。
【００３７】
ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体アルファ鎖ＩＬ−３Ｒα）は、様々な血液学的腫瘍で過剰発現される腫瘍抗原である。ＡＭＬ芽球の大部分が表面ＣＤ１２３を発現し、この発現はＡＭＬのサブタイプによって異なっていない。診断時においてＡＭＬにおけるＣＤ１２３発現が多いほど、より不良な予後に関連することが報告されている。ＣＤ１２３発現は、脊髄形成異常、全身性肥満細胞症、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、ＡＬＬおよびヘアリーセル白血病などの他の血液学的悪性腫瘍で報告されている。
【００３８】
ＣＤ１２３は、ＡＭＬの白血病幹細胞で発現され、ＡＭＬが、ＤＮＡ損傷性の化学療法に静止状態であり比較的耐性を有することが示されているこれらのＬＳＣに起因することを示唆する証拠が増えつつある。ＬＳＣの持続性は、最初の寛解後の再発の基礎となっているという仮説が立てられており、したがってＬＳＣの根絶は、治癒、さらには重要な治療目標にとっての必要条件とみなすことができる。
【００３９】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）７Ｇ３は、ＣＤ１２３に対して発生したものであるが、これまでに、白血病細胞株および初代細胞の両方のＩＬ−３が媒介する増殖および活性化を阻害することが示されている（米国特許第６，１７７，０７８号）。特に、米国特許第６，１７７，０７８号は、抗ＩＬ−３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒα、ＣＤ１２３）モノクローナル抗体７Ｇ３、およびＩＬ−３ＲαのＮ末端ドメイン、具体的にはアミノ酸残基１９〜４９に結合する７Ｇ３の能力を開示している。米国特許第６，７３３，７４３号は、細胞を、抗体および細胞傷害性物質（化学療法剤、毒素またはアルファ放出放射線同位体から選択される）の組成物と接触させること、それにより組成物が、細胞死を引き起こすのに有効な量でＣＤ１２３に選択的に結合することによって、ＣＤ１２３を発現するがＣＤ１３１を有意に発現しない血液がん前駆細胞の機能を損なう方法を開示している。しかしながら、ＣＤ１２３の標的化がＡＭＬ−ＬＳＣを機能的に損なうことができるかどうかは未だ明らかになっていない。
【００４０】
ヒト化抗ＣＤ１２３抗体「ｈｚ７Ｇ３」は、その重鎖および軽鎖可変ドメインの配列が「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の場面で使用されており、
−  配列番号５０の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号５３の配列のＣＤＲ２−Ｈ、および配列番号５１の配列のＣＤＲ３−Ｈを含む、配列
【化３】
2019531701.tif 000007
（配列番号５２、ＣＤＲは太字で示される）からなる重鎖可変ドメイン、および
−  配列番号４８の配列のＣＤＲ１−Ｌ、配列「ＷＡＳ」のＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号４９の配列のＣＤＲ３−Ｌを含む、配列
【化４】
2019531701.tif 000008
（配列番号５４、ＣＤＲは太字で示される）からなる軽鎖可変ドメインを含む。
【００４１】
ヒト化抗ＣＤ１２３抗体「ｈｚ７Ｇ３」は、可能性のある脱アミドの存在を回避するために、配列番号５２の５５位にＮからＳへの突然変異を含む。当業者に公知のように、抗体における脱アミド部位の存在は、抗体サンプルの不均質性を引き起こすことが公知であるため、好ましくは回避される。
【００４２】
定義
本出願にわたり、用語「および／または」は、それが接続する事柄の１つまたはそれ以上が起こる可能性があることを含むものとして解釈される文法上の接続詞である。例えば、表現「このようなネイティブ配列のタンパク質は、標準的な組換え方法および／または合成方法を使用して製造することができる」は、ネイティブ配列のタンパク質は、標準的な組換えおよび合成方法を使用して製造することができること、またはネイティブ配列のタンパク質は、標準的な組換え方法を使用して製造することができること、またはネイティブ配列のタンパク質は、合成方法を使用して製造することができることを示す。
【００４３】
さらに、本出願にわたり、用語「含む」は、全ての具体的に述べられたフィーチャに加えて、任意選択の、追加の、特に明示されていないものも包含するとして解釈されることとする。本明細書で使用される場合、用語「含む」の使用はまた、具体的に述べられたフィーチャ以外フィーチャが存在しない（すなわち「からなる」）実施形態も開示する。さらに不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、複数形を排除しない。特定の測定値が互いに異なる従属項に列挙されているということだけでは、これらの測定値の組合せを有利に使用できないことを示すことにはならない。
【００４４】
「抗体」は、「免疫グロブリン」とも称され、２つの重鎖がジスルフィド結合で互いに連結され、各重鎖がジスルフィド結合で軽鎖に連結された天然の抗体または従来の抗体であり得る。２つのタイプの軽鎖、すなわちラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的な活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を包含する。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、集合的にＣＨと称される）を包含する。軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域は、抗原への結合認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）および重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤の移動、相補結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端の一部であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との構造的な相補性に存在する。抗体結合部位は、主として超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。場合によっては、非超可変またはフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基も、全体的なドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域またはＣＤＲは、一緒になって、ネイティブ免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−Ｌ、およびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈと指定された３つのＣＤＲをそれぞれ有する。したがって、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＶ領域のそれぞれに由来するＣＤＲのセットを含む６つのＣＤＲを包含する。
【００４５】
本発明の場面で、抗体または免疫グロブリンは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥである。
【００４６】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち単一の種における様々な免疫グロブリンのなかでも比較的保存された、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の一部を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌ、およびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと指定された４つのＦＲをそれぞれ有する。したがって、軽鎖可変ドメインは、それに従い（ＦＲ１−Ｌ）−（ＣＤＲ１−Ｌ）−（ＦＲ２−Ｌ）−（ＣＤＲ２−Ｌ）−（ＦＲ３−Ｌ）−（ＣＤＲ３−Ｌ）−（ＦＲ４−Ｌ）のように指定することができ、重鎖可変ドメインは、それに従い（ＦＲ１−Ｈ）−（ＣＤＲ１−Ｈ）−（ＦＲ２−Ｈ）−（ＣＤＲ２−Ｈ）−（ＦＲ３−Ｈ）−（ＣＤＲ３−Ｈ）−（ＦＲ４−Ｈ）のように指定することができる。
【００４７】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌおよび／またはＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈを容易に決定することができる。
【００４８】
「ヒトフレームワーク領域」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一な（約８５％、またはそれより高い、特に９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）フレームワーク領域である。
【００４９】
本発明の場面において、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴの定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、２７（１）：５５〜７７；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づき決定されるものとする。
【００５０】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、従来の抗体およびそのフラグメントに加えて、単一ドメイン抗体およびそのフラグメント、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖、ならびにキメラ、ヒト化、二重特異性または多重特異性抗体を意味する。
【００５１】
用語「ヒト化抗体」は、全体的または部分的に非ヒト起源であり、ヒトにおける免疫応答を回避または最小化するために、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中の特定のアミノ酸を置き換えるように改変されている抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、ほとんどの場合、ヒトＣＨおよびＣＬドメインである。
【００５２】
抗体配列のヒト化のための多数の方法が当技術分野において公知である；例えばＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎによる総論（２００８）Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３を参照されたい。１つの一般的に使用される方法は、ドナー抗体、一般的にマウス抗体のＣＤＲ配列を異なる特異性を有するヒト抗体のフレームワーク足場にグラフト化することを含む、ＣＤＲグラフティング、または抗体再形成（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）である。ＣＤＲグラフティングは結合特異性および親和性、したがってＣＤＲグラフト化非ヒト抗体の生物活性を低減させることができるため、親抗体の結合特異性および親和性を保持するために、ＣＤＲグラフト化抗体の選択された位置に復帰突然変異を導入することができる。可能性のある復帰突然変異のための位置の同定は、文献および抗体データベースで入手可能な情報を使用して実行することができる。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的には、抗体分子の表面に配置されているアミノ酸残基であるが、埋め込まれているかまたは表面露出の程度が低い残基は、通常変更されないと予想される。ＣＤＲグラフティングおよび復帰突然変異の代わりとなるヒト化技術は、非ヒト起源の表面に露出していない残基が保持され、一方で表面残基がヒト残基に変更されるリサーフェイシングである。別の代替技術は、「ガイド付き選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」として公知であり（Ｊｅｓｐｅｒｓら．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２、８９９）、例えばマウスまたはラット抗体から親抗体のエピトープおよび結合特徴を保存する完全ヒト抗体を誘導するのに使用することができる。さらなるヒト化方法は、いわゆる４Ｄヒト化である。４Ｄヒト化プロトコールは、特許出願ＵＳ２０１１００２７２６６号Ａ１（ＷＯ２００９０３２６６１Ａ１）に記載されており、以下のラット抗体可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）ドメインをヒト化するための４Ｄヒト化の適用で例示される。一例において、ラット抗体相同性モデルを、典型的にはＭＯＥソフトウェア（ｖ．２０１１．１０−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、テンプレートとしてＰＤＢ構造（Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、２８：２３５〜２４２）を使用して実行し、その後、ＭＯＥに実装された標準的手順を使用してエネルギーを最小化した。次いで分子動力学（ＭＤ）シミュレーションをラット抗体の最小化した３Ｄ相同性モデル（ＭＯＥソフトウェアでなされた）に実行し、例えば、ＬＧＣＲ／ＳＤＩによって設計された７つの代表的な軽鎖（ｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖラムダ１、ｖラムダ２、ｖラムダ３）および７つの代表的な重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）由来のＭＯＥ内で利用可能な４９種のヒトモデルと比較した。例えば、どちらも最良の疎水性、静電性の構成要素およびＣＤＲの外側における配列同一性を有する鎖のカップリング（Ｖｋｘ−Ｖｈｘ）の１つのモデルを、「４Ｄヒト化」に選択した。ラット抗体可変ドメインと選択されたモデルとの２つ一組の会合の場合、配��を、典型的には対応する相同性モデルのアルファ炭素の最適な３Ｄの重ね合わせに基づき並べた。次いで不要なモチーフを検討し、突然変異させた。最終的に、得られたヒト化配列を、配列類似性に関して、例えばＩＥＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ；バージョン２０１２／０１／３０、ローカルアクセス可能）に対してＢＬＡＳＴ処理して、その配列が、列挙された公知のＢまたはＴ細胞エピトープをまったく含有しないことを確認した。
【００５３】
キメラ抗体の場合、ヒト化は、典型的には、可変領域配列のフレームワーク領域の改変を含む。
【００５４】
ＣＤＲの一部であるアミノ酸残基は、典型的にはヒト化に伴い変更されないと予想されるが、ある特定の場合では、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変更すること、例えばグリコシル化部位、脱アミド部位または望ましくないシステイン残基を除去することが望ましい場合がある。Ｎ−連結グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中Ｘは、Ｐｒｏを除くいずれかのアミノ酸であり得る）中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の付着によって起こる。Ｎ−グリコシル化部位の除去は、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に特に保存的置換によって突然変異させることによって達成することができる。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミドは、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて行うことができる。アスパラギン残基は、主として配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、特に脱アミドを受けやすく、それより低い程度ではあるがＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列中に存在する場合も脱アミドを受けやすい。したがって、このような脱アミド部位、特にＡｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合、そのような部位を除去すること、典型的には、保存的置換によって関連する残基の１つを除去することが望ましい場合がある。関連する残基の１つを除去するためのＣＤＲ配列における置換も、本発明に包含されることが意図される。
【００５５】
（従来の）抗体の「フラグメント」は、無傷の抗体の一部、特に無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、抗体フラグメントから形成された二重特異性および多重特異性抗体が挙げられる。また従来の抗体のフラグメントも、単一ドメイン抗体、例えば重鎖抗体またはＶＨＨであり得る。
【００５６】
用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理することによって得られたフラグメントのなかでも、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合を介して一緒に結合しているものを意味する。
【００５７】
用語「Ｆｃドメイン」は、本発明の場面で使用される場合、ネイティブＦｃおよびＦｃバリアントならびに上記で定義された配列を包含する。ＦｃバリアントおよびネイティブＦｃ分子と同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化により得られたかまたは他の手段によって産生されたかにかかわらず、単量体または多量体の形態の分子を包含する。
【００５８】
用語「ネイティブＦｃ」は、本明細書で使用される場合、単量体または多量体の形態かどうかにかかわらず、抗体の消化によって得られた、または他の手段によって産生された非抗原結合フラグメントの配列を含む分子を指し、ヒンジ領域を含有していてもよい。ネイティブＦｃの元の免疫グロブリンの源は、特にヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれであってもよいが、ＩｇＧｌおよびＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合の会合によって二量体または多量体の形態に連結できる単量体ポリペプチドで構成される。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間のジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡｌ、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１から４の範囲である。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合した二量体である。用語「ネイティブＦｃ」は、本明細書で使用される場合、単量体、二量体、および多量体の形態に対する総称である。
【００５９】
用語「Ｆｃバリアント」は、本明細書で使用される場合、ネイティブＦｃから改変されているが、それでもなおサルベージ受容体であるＦｃＲｎ（新生児のＦｃ受容体）のための結合部位を含む分子または配列を指す。例示的なＦｃバリアント、およびそれとサルベージ受容体との相互作用は、当技術分野において公知である。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化された分子または配列を含み得る。さらに、ネイティブＦｃは、除去することができる領域を含むが、これは、そのような領域が、本発明の抗体様結合タンパク質に必要ではない構造的な機能または生物活性を提供するためである。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、１つまたはそれ以上のネイティブＦｃ部位または残基が欠如している分子もしくは配列、または（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合、（３）選択された宿主細胞中で発現されたときのＮ末端の不均質性、（４）グリコシル化、（５）相補物との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えるかまたはそれらに関与する１つまたはそれ以上のＦｃ部位または残基が改変された分子もしくは配列を含む。
【００６０】
用語「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」は、典型的には、単一分子内に２つの抗体の抗原結合部位を組み合わせた抗体を意味する。したがって、ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原と同時に結合することができる。例えばＥＰ２０５０７６４Ａ１に記載されるような所望の一連の結合特性およびエフェクター機能を有する抗体または抗体誘導体を設計する、改変する、産生するために、遺伝子工学が高い頻度で使用されてきた。
【００６１】
用語「抗体様結合タンパク質」は、本明細書において、二重特異性抗体のように２つの異なる抗原に同時に結合することができるポリペプチドまたは結合タンパク質を指す。しかしながら、本明細書において定義される従来の抗体と異なり、抗体様結合タンパク質は、６つより多くのＣＤＲを含む。本発明の抗体様結合タンパク質は、本明細書の以下で定義されるようなＣＯＤＶフォーマットであり、本明細書において以下の「抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質」の章でさらに定義される通りである。
【００６２】
「ＣＯＤＶフォーマット」は、本発明の場面において、二重特異性抗体または多重特異性抗体のクロスオーバー二重可変（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ；ＣＯＤＶ）立体配置を指す。ＣＯＤＶフォーマットは、フォールディングおよび最大の結合親和性を保持しながらの可変ドメインの交換可能性をもたらす。
【００６３】
これまでに、ＣＯＤＶフォーマットは、国際特許出願ＷＯ２０１２／１３５３４５に記載され、さらにＳｔｅｉｎｍｅｔｚら（ＭＡｂｓ．２０１６年７月；８（５）：８６７〜７８）によっても記載されている。
【００６４】
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、軽鎖および重鎖のドメインがクロスオーバー二重可変領域を有する免疫グロブリンにフォールディングされるのに十分な移動度を提供するために、免疫グロブリンドメイン間に挿入された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。一部の実施形態において、リンカーは、０個のアミノ酸からなり、これは、リンカーが存在しないことを意味する。リンカーは、可変ドメイン間のトランジション、または可変ドメインと定常ドメインとの間のトランジションのときにそれぞれ配列レベルで挿入される。接近したサイズの免疫グロブリンドメインはよく理解されているため、ドメイン間のトランジションは同定することができる。実験データによって実証された場合、またはモデリングまたは２次構造予測の技術によって仮定できる場合、ベータシートまたはアルファヘリックスなどの二次構造エレメントを形成しないペプチドストレッチを配置することによって、ドメイントランジションの正確な配置を決定することができる。本発明の場面で記載されるリンカーは、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５である。Ｌ１は、Ｎ末端ＶＤ１ドメインとＶＤ２ドメインとの間に配置され；Ｌ２は、ＶＤ２とＣ末端ＣＬドメインとの間に配置される。リンカーＬ３およびＬ４は、抗体様タンパク質の式［ＩＩＩ］に従って定義されたポリペプチド上に配置される。より正確に言えば、Ｌ３は、Ｎ末端ＶＤ３とＶＤ４ドメインとの間に配置され、Ｌ４は、ＶＤ４とＣ末端ＣＨ１−Ｆｃドメインとの間に配置される。Ｌ５は、ＣＬとＮ末端Ｆｃ２との間に配置される。リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、独立しているが、一部の実施形態において、これらは同じ配列および／または長さを有する。リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、本明細書の上記で本発明の抗体様結合タンパク質の場面において定義された通りである。本発明の抗体様結合タンパク質のバリアントに存在し得る代替のリンカーは、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質のバリアント」の章でさらに記載される。
【００６５】
「ＲＦ突然変異」は、一般的に、アミノ酸ＨＹのＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるＲＦへの突然変異を指し、例えば、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．ら（１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．、２０１：２５〜３４）に記載されているような、ＣＨ３ドメインにおける突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆであり、プロテインＡへの結合が無効になることから精製目的で有利であることが記載されている。
【００６６】
本発明の場面において、ＲＦ突然変異は、例えば、配列番号６７、６８、７１または７０のＸ６位およびＸ７位を指し、この場合、ＲＦ突然変異は、Ｘ６がアミノ酸Ｒであり、Ｘ７がアミノ酸Ｆである場合に存在する。一例において、ＲＦ突然変異は、本明細書における以下の「抗体様結合タンパク質」の章でさらに記載されるように、配列番号６９のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）（抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦのＦｃ３）の２１５〜２１６位におけるアミノ酸ＨＹのＲＦでの置換、または配列番号７９の配列のＦｃ領域（抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦのＦｃ領域）の２２０〜２２１位におけるＨＹのＲＦへの突然変異を指す。
【００６７】
「ノブ−イントゥー−ホール」またはいわゆる「ノブ−イントゥー−ホール」技術は、ヘテロ多量体形成を促進するための、どちらもＣＨ３−ＣＨ３境界中にある突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（ホール）、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ノブ）を指し、とりわけ参照により本明細書に組み入れられる特許ＵＳ５７３１１６８およびＵＳ８２１６８０５に記載されている。
【００６８】
本発明の場面において、「ノブ」突然変異は例えば、例えば配列番号６６または６２のＸ２位およびＸ３位を指し、この場合、ノブ突然変異は、Ｘ２がＣであり、Ｘ３がＷである場合に存在する。一例において、ノブ突然変異は、配列番号６６のＦｃ（抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦのＦｃ）における置換Ｓ１３９ＣおよびＴ１５１Ｗを指す。本発明の場面において、「ホール」突然変異は例えば、例えば配列番号７５のＸ１位、Ｘ３位、Ｘ４位およびＸ５位を指し、この場合、「ホール」突然変異は、Ｘ１がＣであり、Ｘ３がＳであり、Ｘ４がＡであり、Ｘ５がＶである場合に存在する。一例において、ホール突然変異は、配列番号７５のＦｃ（抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールのＦｃ）における置換Ｙ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ，Ｙ１９２Ｖを指す。
【００６９】
「ＬＡＬＡ突然変異」は、Ｆｃエフェクター機能を壊滅する二重突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを指す。Ｆｃ二重突然変異体Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａは、ＦｃγＲまたはＣ１ｑと結合せず、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインのＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の両方が壊滅される（Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００１年１２月；７５（２４）：１２１６１〜１２１６８）。
【００７０】
しかしながら、本発明の場面において、二重突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａに言及される場合、対応する位置は、本明細書で定義されるように、Ｆｃドメイン中で異なっていてもよい。しかしながら、当業者は、Ｆｃドメイン（すなわち式［ＩＩＩ］におけるＦｃ、式［ＩＶ］におけるＦｃ２および／またはＦｃ３）中の対応する位置を容易に同定することができる。一例において、二重突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａは、配列番号６０の配列のＦｃの二重突然変異Ｌ１９ＡおよびＬ２０Ａ、または言い換えれば、配列番号５９のＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦの式［ＩＶ］のポリペプチド中の突然変異Ｌ３５９ＡおよびＬ３５８Ａに対応する。
【００７１】
「精製された」および「単離された」は、ポリペプチド（すなわち本発明の抗体）またはヌクレオチド配列に対して言及される場合、示された分子が、同じタイプの他の生物学的な巨大分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、特に、同じタイプの生物学的な巨大分子の少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、または９８重量％が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかしながら、このような分子は、組成物の基礎的な特徴に有害な影響を与えない一部の追加の塩基または部分を包含していてもよい。
【００７２】
用語「抗原」または「標的抗原」は、本明細書で使用される場合、抗体または抗体様結合タンパク質と結合することが可能な分子または分子の一部を指す。この用語はさらに、その抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を産生させる動物で使用することが可能な分子または分子の一部を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有していてもよい。抗体または抗体様結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、抗体様結合タンパク質は、標的抗原を認識する無傷の抗体と競合することが可能である。
【００７３】
「親和性」は、理論上、全抗体と抗原との平衡な会合によって定義される。親和性は、例えば半最大有効濃度（ＥＣ５０）または平衡解離定数（ＫＤ）で表すことができる。
【００７４】
「半最大有効濃度」は、「ＥＣ５０」とも称され、特定された曝露時間後にベースラインから最大までの半分の応答を誘導する、薬物、抗体または毒性物質の濃度を指す。ＥＣ５０と親和性は反比例しており、ＥＣ５０値が低いほど抗体の親和性はより高くなる。
【００７５】
「ＫＤ」は、平衡解離定数であり、抗体とその抗原とのｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率である。ＫＤと親和性は反比例する。ＫＤ値は、抗体濃度に関し、ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性はより高くなる。親和性は、表面プラズモン共鳴で会合および解離速度を測定すること、または免疫化学アッセイ（ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー）でＥＣ５０を測定することなどの様々な公知の方法によって実験的に査定することができる。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、固相酵素免疫検査法を使用して、液体サンプルまたは湿潤したサンプル中の物質、通常は抗原の存在を検出する生化学的アッセイである。サンプルからの抗原を、表面に付着させる。次いでさらなる特異的な抗体を、それが抗原に結合できるように表面上に適用する。この抗体を酵素に連結させて、最終工程で、酵素の基質を含有する物質を添加する。それに続く反応により、検出可能なシグナル、最も一般的には基質における色の変化が生じる。フローサイトメトリーは、各細胞の特異的な光散乱および蛍光特徴または特異的な蛍光標識に基づき、生物学的な細胞のヘテロジニアスな混合物を単一細胞レベルで分析するための方法を提供する。これらのアッセイにおいて、ＥＣ５０は、抗原の規定濃度でＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって、または抗原を発現する細胞の規定濃度でフローサイトメトリーによって、いくつかの特定された曝露時間の後にベースラインから最大までの半分の応答を誘導する抗体の濃度である。表面プラズモン共鳴は、標識を用いない方法であり、センサー表面に固定された「リガンド」分子への可溶性相中の分子（「分析物」）の結合が直接測定される。センサーデバイスで、リガンドの結合は、表面プラズモンと称される光学現象によってモニターされる。特に、「分析物」分子が「リガンド」分子から解離すると、ＳＰＲシグナル（共鳴単位、ＲＵで表される）の減少が観察される。会合（「オンレート」、ｋａ）および解離速度（「オフレート」、ｋｄ）は、会合および解離中に得られたシグナルから得られ、それから平衡解離定数（「結合定数」、ＫＤ）を計算することができる。共鳴単位（ＲＵ）で示されたシグナルは、分析物中に存在するリガンドのサイズに依存するが、実験条件が同じである場合、すなわち同じ条件でリガンドが同じ分子である場合では、得られたＲＵは、親和性を示すことができ、ここで得られたＲＵでのシグナルが高いほど、より多くの結合が起こっている。
【００７６】
抗原１（Ａｇ１）に結合するモノクローナル抗体は、ＥＣ５０が両方の抗原の類似の範囲内である場合、抗原２（Ａｇ２）に対して「交差反応性」を有する。本出願において、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、Ａｇ１の親和性に対するＡｇ２の親和性の比率が等しいかまたは１０未満（特に５、２、１または０．５）である場合、Ａｇ２に対して交差反応性を有し、親和性は、両方の抗原で同じ方法により測定される。
【００７７】
Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、２つの抗原への親和性が非常に異なっている場合、Ａｇ２に「有意な交差反応性」を有さない。Ａｇ２への親和性は、結合応答が低すぎる場合、測定できないことがある。本出願において、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、同じ実験設定および同じ抗体濃度でモノクローナル抗体のＡｇ２に対する結合応答が同じモノクローナル抗体のＡｇ１に対する結合応答の５％未満である場合、Ａｇ２に対して有意な交差反応性を有さない。実際には、使用される抗体濃度は、Ａｇ１で達成された飽和プラトーに達するのに必要なＥＣ５０または濃度であり得る。
【００７８】
「特異性」は、本明細書で使用される場合、抗体が結合する標的ペプチド配列（「エピトープ」）を、密接に関連した高度に相同なペプチド配列から識別する抗体の能力を意味する。
【００７９】
モノクローナル抗体は、Ａｇ２に有意な交差反応性を有さない場合、Ａｇ１に「特異的に結合する」。
【００８０】
用語「Ｔ細胞の活性化」または「Ｔ細胞活性化」は、本明細書において、細胞傷害性の顆粒の融合、一過性のサイトカイン放出、および増殖を含むＣＤ３シグナル伝達を開始させることを指す。本発明の抗体様結合タンパク質はＣＤ３εを標的化し、標的細胞の存在下でＴ細胞を活性化する；この活性はまた、「Ｔ細胞係合作用（T-cell engaging effect）」とも称される。Ｔ細胞係合作用は、標的細胞において細胞傷害性を誘導する。
【００８１】
当業者に公知のように、Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ６９およびＣＤ２５などの表面マーカーの発現を誘導する。したがってＴ細胞の活性化は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ６９＋、ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋、またはＣＤ８＋／ＣＤ６９＋Ｔ細胞の発現を検出および測定することによって測定することができる。Ｔ細胞活性化を測定する方法は、当業者に公知である。
【００８２】
Ｔ細胞活性化を測定する方法は、実施例の章（実施例２．９）でさらに開示される。したがって、本発明の場面において、Ｔ細胞活性化は、ＣＤ６９を発現する細胞のパーセンテージとして細胞総数に対する％で、またはＣＤ４およびＣＤ６９を発現する細胞のパーセンテージとして細胞総数に対する％で、またはＣＤ８およびＣＤ６９を発現する細胞のパーセンテージとして細胞総数に対する％でのいずれかで測定される。
【００８３】
「低いＴ細胞活性化」は、本発明の抗体様結合タンパク質の場面において、２０％未満、１８％未満、１６％未満、１４％未満、１２％未満、１０％未満のＴ細胞活性化を指す。
【００８４】
「標的細胞」は、本明細書において、第２の抗原を発現する細胞を指し、一例において、標的細胞は、本明細書において、ＣＤ１２３を発現する細胞、例えばＴＨＰ−１細胞を指す。
【００８５】
「高いＴ細胞活性化」は、本明細書において、５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６２％より高い、６４％より高い、６６％より高い、６８％より高い、７０％より高いＴ細胞活性化を指す。「細胞傷害性」は、本明細書において、化合物の、例えば本発明の抗体様結合タンパク質の、細胞にとって毒性である性質を指す。細胞傷害性は、様々な作用メカニズムにより誘導され、細胞媒介細胞傷害性、アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に分けることができる。
【００８６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、免疫系のエフェクター細胞が活発に標的細胞を溶解させ、その膜表面抗原が特異的な抗体または本発明の抗体様結合タンパク質と結合する、細胞媒介免疫防御のメカニズムを指す。
【００８７】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、本発明の場面において、補体系タンパク質の存在下における標的細胞の溶解を指す。
【００８８】
「細胞媒介細胞傷害性」は、エフェクターリンパ球、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞による標的細胞の細胞崩壊を指し、したがってＴ細胞媒介細胞傷害性とＮＫ細胞細胞傷害性に区別することができる。
【００８９】
「ドメイン」は、一般的に配列相同性に基づき定義されるタンパク質のあらゆる領域であってもよく、しばしば特異的な構造的または機能的な実体に関する。
【００９０】
「組換え」分子は、組換え手段によって製造された、発現された、作り出された、または単離された分子である。
【００９１】
用語「遺伝子」は、１つまたはそれ以上のタンパク質または酵素の全てまたは一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするかまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列を包含する場合もあるし、または包含しない場合もある。一部の遺伝子は構造遺伝子ではなく、ＤＮＡからＲＮＡに転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子のレギュレーターとして、またはＤＮＡ転写のレギュレーターとして機能し得る。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、すなわちレギュレーター、プロモーター、イントロンおよびエクソン配列を含む配列に対して用いられる場合もある。
【００９２】
「参照配列に少なくとも８５％同一な」配列は、その全長において、参照配列の全長と、８５％、またはそれより高い、特に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列である。
【００９３】
本出願の場面において、「同一性のパーセンテージ」は、グローバルペアワイズアライメントを使用して計算される（すなわち２つの配列がそれらの全長で比較される）。２つまたはそれより多くの配列の同一性を比較するための方法は当技術分野において周知である。例えば「ニードル」プログラムを使用してもよく、これは、ニードルマン−ウンシュのグローバルアライメントのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）を使用して、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを包含する）をそれらの全長を考慮して発見するものである。ニードルプログラムは、例えばワールドワイドウェブサイトｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで利用可能である。２つのポリペプチド間の同一性のパーセンテージは、本発明に従って、ＥＭＢＯＳＳ：ニードル（グローバル）プログラムを、１０．０に等しい「ギャップオープン」パラメーター、０．５に等しい「ギャップ伸長」パラメーター、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスで使用して計算される。
【００９４】
参照配列に「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な」アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して欠失、挿入および／または置換などの突然変異を含んでいてもよい。置換の場合、参照配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは別の種由来の相同配列に対応していてもよい。
【００９５】
「アミノ酸置換」は、保存的であってもよいし、または非保存的であってもよい。好ましくは、置換は、１つのアミノ酸が類似の構造的および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置換されている保存的置換である。置換は、好ましくは、以下の表に示される保存的置換に対応する。
【００９６】
【表３】
2019531701.tif 000009
【００９７】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換させ、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる運搬体を意味する。
【００９８】
用語「形質転換」は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によってコードされたタンパク質または酵素を産生するように、宿主細胞に「外来」（すなわち外因性）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を導入することを意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け入れ、それを発現する宿主細胞は、「形質転換されている」。
【００９９】
用語「発現系」は、例えばベクターによって運搬され宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされたタンパク質の発現に好適な条件下にある宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
【０１００】
用語「医薬組成物」または「治療用組成物」は、本明細書で使用される場合、患者に適切に投与されたときに所望の治療作用を誘導することが可能な化合物または組成物を指す。
【０１０１】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトに投与されたときに、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を起こさない分子の実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」または賦形剤は、非毒性の固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、封入材料またはあらゆるタイプの調合助剤を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類を意味する。特に、本発明に係る対象は、ヒトである。
【０１０３】
用語「対象」または「個体」は、同義的に使用され、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。例えば、対象は、コウモリ；フェレット；ウサギ；ネコ科動物（ネコ）；イヌ科動物（イヌ）；霊長類（サル）、ウマ科動物（ウマ）；ヒト、例えばヒト、女性および子供などである。
【０１０４】
本発明の場面において、用語「処置する」または「処置」は、治療的使用（すなわち所与の疾患を有する対象に対する）を指し、このような障害または状態の１つまたはそれ以上の症状を、回復させること、軽減すること、その進行を妨げることを意味する。したがって、処置は、疾患の完治をもたらす処置だけでなく、疾患の進行を遅延させる、および／または対象の生存を延長する処置も指す。
【０１０５】
「予防する」は、予防的使用（すなわち所与の疾患を発症させやすい対象に対する）を意味する。
【０１０６】
用語「処置が必要な」は、すでに障害を有する対象、加えて、障害を予防しようとする対象を指す。
【０１０７】
抗体様結合タンパク質またはその医薬組成物の「治療有効量」は、あらゆる薬物療法に適用可能な適度なベネフィット／リスク比で前記がん疾患を処置するのに十分な抗体様結合タンパク質の量を意味する。しかしながら、本発明のポリペプチドおよび組成物の合計の１日使用量は、主治医により確実な医療的判断の範囲内で決定されることが理解されるものとする。いずれか特定の患者にとっての具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；採用される具体的なポリペプチドの活性；採用される具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食物；採用される具体的なポリペプチドの投与の時間、投与経路、および排出の頻度；処置の持続時間；採用される具体的なポリペプチドと組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物；ならびに医療分野において周知の同様な要因因子などの様々な要因に依存すると予想される。例えば、所望の治療作用を達成するのに必要な用量より低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の作用が達成されるまで投薬量を徐々に増やすことが、当技術分野の技術範囲内で周知である。
【０１０８】
「再発」は、完全寛解後のＡＭＬ再発と定義される。
【０１０９】
「完全寛解」または「ＣＲ」は、以下のように定義される：正常値の好中球（＞１．０×１０９／Ｌ）、１０ｇ／ｄＬのヘモグロビンレベルおよび血小板数（＞１００×１０９／Ｌ）、ならびに赤血球輸血を必要としないこと；骨髄検査において、芽細胞が５％未満、芽球のクラスター化または集合がないこと、およびアウエル小体がないこと；ならびに血液細胞の正常な成熟（形態学；脊髄造影像）、および髄外性白血病がないこと。
【０１１０】
「白血病幹細胞（ＬＳＣ）」は、正常幹細胞に関連する特徴、すなわち自己再生能および複数の系統に発達する能力を有するがん細胞である。このような細胞は、ＡＭＬなどの血液がんにおいて別個の集団として残存することが提唱されている。ＡＭＬ患者に存在するＬＣＳは、いわゆる「ＡＭＬ−ＬＣＳ」である。
【０１１１】
「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」は、ヘテロジニアスで未分化の骨髄性芽球の増殖が増大することで臨床的に発症するクローン性の障害である。白血病の階層は、ＬＳＣの小集団（ＡＭＬ−ＬＣＳ）によって維持されており、これは、明確な自己再生能を有し、白血病前駆細胞に分化することができる。これらの前駆細胞は、診断および再発時に患者において容易に検出可能な膨大な数の白血病性芽球を生成し、最終的には死に至る。ＡＭＬ−ＬＳＣは、一般的に休止状態の細胞として報告されており、これは迅速に分割するクローン産生性の前駆細胞とは対照的である。このＡＭＬ−ＬＳＣの特性は、増殖中の細胞を標的化する従来の化学療法剤の効果をより少なくすることから、これが、高い比率のＡＭＬ患者が完全寛解になるがほぼ必ず再発し、４年より長く生存した成人の＜３０％が再発するという現状の説明になる可能性がある。加えて、微小残存病変の出現および低い生存率は、ＡＭＬ患者において診断時にＬＳＣ頻度が高いことが原因であった。結果として、長期にわたるＡＭＬ（および同様に上述した他の血液がんの状態）の管理のために、ＬＳＣを特異的になくすような新しい処置を開発することが不可避である。ＡＭＬ芽球およびＣＤ３４＋／ＣＤ３８ＡＭＬ−ＬＳＣにおいて、正常な造血細胞に比べてＣＤ１２３が過剰発現されることが報告されている。
【０１１２】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質
簡潔化の目的で、本出願にわたり、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質」または「本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質」は、「抗体様結合タンパク質」または「本発明の抗体様結合タンパク質」と称する場合がある。
【０１１３】
これらの抗体様結合タンパク質は、ＣＯＤＶ設計を有する。
【０１１４】
したがって、一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願ＷＯ２０１２／１３５３４５でこれまでに記載されたようなＣＯＤＶフォーマットである。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、国際特許出願ＷＯ２０１２／１３５３４５でこれまでに記載されたような、軽鎖が追加のＦｃドメインで延長されたＣＯＤＶフォーマットである。各軽鎖および重鎖は、Ｆｃドメインを含む。このような本発明の抗体様結合タンパク質は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質である。
【０１１６】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、国際特許出願ＷＯ２０１２／１３５３４５でこれまでに記載されたような、追加のＦｃドメインを有するＣＯＤＶフォーマットである。重鎖は、Ｆｃドメインを含むが、軽鎖を含まない。このような本発明の抗体様結合タンパク質は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質である。
【０１１７】
一実施形態において、本発明は、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む、ヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［Ｉ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［Ｉ］の１つのポリペプチドが、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬを含む配列番号５５のアミノ酸配列、または
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号５５に少なくとも８５％同一な配列
からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹもしくはＣであり、Ｘ２はＳもしくはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳもしくはＷであり、Ｘ４はＡもしくはＬであり、Ｘ５はＶもしくはＹであり、Ｘ６はＨもしくはＲであり、Ｘ７はＹもしくはＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列からなり、前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りであり、
ここで式［Ｉ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１１８】
一実施形態において、本明細書の上記で定義される抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹである、配列番号６７のアミノ酸配列からなる抗体様結合タンパク質を含まず、および／または
本明細書の上記で定義される抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、またはＸ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号６７のアミノ酸配列からなる抗体様結合タンパク質を含まない。
【０１１９】
したがって、一実施形態において、本明細書の上記で定義される抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドが配列番号５９のアミノ酸配列からなる抗体様結合タンパク質を含まず、および／または
本明細書の上記で定義される抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドが配列番号６１または配列番号６５のアミノ酸配列からなる抗体様結合タンパク質を含まない。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は：
ａ）配列番号５７のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号５９のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、ならびに／または
ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列からなる式［Ｉ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号６１のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、および配列番号６３のポリペプチドＦｃスタンプ（Ｆｃ３）；ならびに／または
ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列からなる式［Ｉ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号６５のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、および配列番号６４のポリペプチドＦｃスタンプ（Ｆｃ３）
を含まない。
【０１２１】
抗体様結合タンパク質は、いわゆる「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質であり、これはなぜなら、ポリペプチド［Ｉ］が、ヒト化抗ＣＤ１２３抗体「７Ｇ３」（「ｈｚ７Ｇ３」とも称される）およびヒト化抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」（「ｈｚ２０Ｇ６」とも称される）それぞれの軽鎖の可変ドメインであるＶＤ１およびＶＤ２を含み、ポリペプチド［ＩＩＩ］が、ヒト化抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」（「ｈｚ２０Ｇ６とも称される）およびヒト化抗ＣＤ１２３抗体「７Ｇ３」（「ｈｚ７Ｇ３」とも称される）それぞれの重鎖の可変ドメインであるＶＤ３およびＶＤ４を含むためである。
【０１２２】
より具体的には、抗体様結合タンパク質は、いわゆる「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質であり、これはなぜなら、式［Ｉ］によって表される構造を有するポリペプチド鎖は、ヒト化抗ＣＤ１２３抗体「７Ｇ３」（「ｈｚ７Ｇ３」とも称される）の軽鎖可変ドメインである配列番号５４の配列のＶＤ１、およびヒト化抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列ＶＬ１ｃである配列番号１０の配列のＶＤ２を含み、式［ＩＩＩ］によって表される構造を有するポリペプチド鎖は、ヒト化抗ＣＤ３抗体「２０Ｇ６」の重鎖可変ドメインバリアントＶＨ１ｄである配列番号９の配列のＶＤ３、およびヒト化抗ＣＤ１２３抗体「７Ｇ３」（「ｈｚ７Ｇ３」とも称される）のバリアント重鎖可変ドメインである配列番号５２の配列のＶＤ４を含むためである。
【０１２３】
上記で定義された通り、式［ＩＩＩ］によって表される構造を有するポリペプチド鎖は、配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹまたはＣであり、Ｘ２はＳまたはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳまたはＷであり、Ｘ４はＡまたはＬであり、Ｘ５はＶまたはＹであり、Ｘ６はＨまたはＲであり、Ｘ７はＹまたはＦである。
【０１２４】
当業者であれば、
−  Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹである配列番号６８のＦｃの配列は、配列番号６０のいわゆる野生型Ｆｃ配列であること、および
−  Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである配列番号６８のＦｃの配列は、ＲＦ突然変異を含むＦｃ配列であること、および
−  Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹである配列番号６８のＦｃの配列は、本明細書の上記の「定義」の章で定義されるようなホール突然変異を含むＦｃ配列であり、配列番号７５のＦｃドメインを生じること、および
−  Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである配列番号６８のＦｃの配列は、すでに本明細書の上記で定義されるようなホール突然変異およびＲＦ突然変異を含むＦｃ配列であり、配列番号７９のＦｃドメインを生じること、および
−  Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹである配列番号６８のＦｃの配列は、すでに本明細書の上記の「定義」の章で定義されるようなノブ突然変異を含むＦｃ配列であり、配列番号６６のＦｃドメインを生じること、および
−  Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである配列番号６８のＦｃの配列は、すでに本明細書の上記の「定義」の章で定義されるようなノブ突然変異およびＲＦ突然変異を含むＦｃ配列であり、配列番号６２のＦｃドメインを生じること
を理解していると予想される。
【０１２５】
Ｆｃドメインのいずれかにおいて、すなわち配列番号６８のＦｃおよびＦＣおよび配列番号７０のＦｃ２ドメイン（本明細書の以下では、配列番号７０のＦｃ２ドメインが導入される）において、Ｘ１はＹまたはＣであり、Ｘ２はＳまたはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳまたはＷであり、Ｘ４はＡまたはＬであり、Ｘ５はＶまたはＹであり、Ｘ６はＨまたはＲであり、Ｘ７はＹまたはＦであるという一般的な定義は、Ｘ１はＹまたはＣであり、Ｘ２はＳまたはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳまたはＷであり、Ｘ４はＡまたはＬであり、Ｘ５はＶまたはＹであり、Ｘ６はＨまたはＲであり、Ｘ７はＹまたはＦである全ての実施形態において、以下
−  Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹである定義（野生型に対応）、または
−  Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶである定義（「ホール」突然変異に対応）、または
−  Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹである定義（「ノブ」突然変異に対応）、および
−  Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹである定義（野生型に対応する）、または
−  Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである定義（「ＲＦ」突然変異に対応）
に従って置き換えることができることがさらに理解されると予想される。
【０１２６】
したがって、さらなる例証のために、一実施形態において、本発明は、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む、ヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［Ｉ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［Ｉ］の１つのポリペプチドが、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬを含む配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号５５に少なくとも８５％同一な配列からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここで
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであるか、もしくは
Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶであるか、もしくは
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、
Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくは
Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［Ｉ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１２７】
さらなる実施形態において、第２のＦｃドメイン（Ｆｃ２と称される）は、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂの式［Ｉ］のポリペプチドに付加される。
【０１２８】
したがって、一実施形態において、式［Ｉ］のポリペプチドは、Ｆｃドメイン（Ｆｃ２）をさらに含む。同じ実施形態において、リンカーＬ５が、ＣＬと式［Ｉ］のポリペプチド鎖のＦｃ２ドメインとの間に存在し、式［ＩＶ］のポリペプチド鎖が生じる。
【０１２９】
１つの特定の実施形態において、式［Ｉ］のポリペプチドは、Ｘ１はＹまたはＣであり、Ｘ２はＳまたはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳまたはＷであり、Ｘ４はＡまたはＬであり、Ｘ５はＶまたはＹであり、Ｘ６はＨまたはＲであり、Ｘ７はＹまたはＦである配列番号７０のＦｃ２ドメインをさらに含む。
【０１３０】
したがって、本発明はさらに、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｌ５−Ｆｃ２［ＩＶ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドが、式［Ｉ］によって表されるポリペプチド鎖に関して上記で定義された通りのＶＤ１、Ｌ１、ＶＤ２、Ｌ２およびＣＬ、ならびに０個のアミノ酸からなるＬ５、ならびに配列番号７０の配列のＦｃ２を含み、ここでＸ１はＹもしくはＣであり、Ｘ２はＳもしくはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳもしくはＷであり、Ｘ４はＡもしくはＬであり、Ｘ５はＶもしくはＹであり、Ｘ６はＨもしくはＲであり、Ｘ７はＹもしくはＦである、配列番号７１のアミノ酸配列、または
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変であり、式［ＩＶ］によって表される前記ポリペプチド鎖中の配列番号７１の前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号７１に少なくとも８５％同一な配列からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹもしくはＣであり、Ｘ２はＳもしくはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳもしくはＷであり、Ｘ４はＡもしくはＬであり、Ｘ５はＶもしくはＹであり、Ｘ６はＨまたはＲであり、Ｘ７はＹもしくはＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、配列番号６７における前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［ＩＶ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１３１】
このＣＯＤＶフォーマットは、式［ＩＩＩ］および［ＩＶ］によって表されるポリペプチド鎖がそれらそれぞれのＦｃ２およびＦｃ領域を介して二量体化しているものであり、本明細書ではＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬと称される。
【０１３２】
関連する実施形態において、本明細書の上記で定義される抗体様結合タンパク質は、
ａ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、式［Ｉ］によって表されるポリペプチド鎖に関して上記で定義された通りのＶＤ１、Ｌ１、ＶＤ２、Ｌ２およびＣＬ、ならびに０個のアミノ酸からなるＬ５、ならびに配列番号７０の配列のＦｃ２を含み、ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号７１のアミノ酸配列からなり、
ｂ）式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹである、配列番号６７のアミノ酸配列からなる、抗体様結合タンパク質を含まない。
【０１３３】
したがって、一実施形態において、本明細書の上記で定義される抗体様結合タンパク質は、
ａ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号５７のアミノ酸配列からなる抗体様結合タンパク質、および
ｂ）式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号５９のアミノ酸配列からなる抗体様結合タンパク質
を含まない。
【０１３４】
さらなる関連する実施形態において、本発明は、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む、ヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｌ５−Ｆｃ２［ＩＶ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［ＩＶ］の前記ポリペプチドは：
（ｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１、
・配列番号５６の配列のＬ１、
・配列番号１０の配列のＶＤ２、
・配列番号５６の配列のＬ２、
・配列番号１８の配列のＣＬ、
・０個のアミノ酸からなるＬ５、および
・配列番号７０の配列からなるＦｃ２
を含み、
・ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、または
・ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、または
・ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号７１のアミノ酸配列、
または
（ｉｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・  配列番号７１におけるアミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記のａ）（ｉ）で定義された通りである、配列番号７１に少なくとも８５％同一な配列からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の前記ポリペプチドは：
（ｉ）
・配列番号９の配列のＶＤ３、
・０個のアミノ酸からなるＬ３、
・配列番号５２の配列のＶＤ４、
・０個のアミノ酸からなるＬ４、
・配列番号１９の配列のＣＨ１、および
・配列番号６８の配列からなるＦｃ
を含み、ここでＸ１はＹもしくはＣであり、Ｘ２はＳもしくはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳもしくはＷであり、Ｘ４はＡもしくはＬであり、Ｘ５はＶもしくはＹであり、Ｘ６はＨもしくはＲであり、Ｘ７はＹもしくはＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、
または
（ｉｉ）
・配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号６７のアミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記のｂ）（ｉ）で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［ＩＶ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１３５】
さらなる関連する実施形態において、本発明は、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｌ５−Ｆｃ２［ＩＶ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドは、上記で定義された通りのＶＤ１、Ｌ１、ＶＤ２、Ｌ２およびＣＬ、ならびに０個のアミノ酸からなるＬ５、ならびに配列番号７０の配列のＦｃ２を含み、ここで
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくは
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくは
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号７１のアミノ酸配列、または
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変であり、配列番号７１の前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号７１に少なくとも８５％同一な配列からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここでＸ１はＹもしくはＣであり、Ｘ２はＳもしくはＣであり、Ｘ３はＴ、ＳもしくはＷであり、Ｘ４はＡもしくはＬであり、Ｘ５はＶもしくはＹであり、Ｘ６はＨもしくはＲであり、Ｘ７はＹもしくはＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、前記配列番号６７のアミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［ＩＶ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１３６】
当業者であれば、一方のＦｃドメインが野生型配列であるかまたはノブ突然変異を有する場合、他方のＦｃドメインは、野生型であるかまたはホール突然変異を有するかのいずれかであることを理解していると予想される。
【０１３７】
したがって、１つのさらなる関連する実施形態において、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、
ａ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドであって、上記で定義された通りのＶＤ１、Ｌ１、ＶＤ２、Ｌ２およびＣＬ、ならびに０個のアミノ酸からなるＬ５、ならびに配列番号７０の配列のＦｃ２を含む配列番号７１のアミノ酸配列からなり、ここで
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、または
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、または
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、ポリペプチド、および
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含む配列番号６７のアミノ酸配列からなり、ここで
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであるか、または
Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶであり、
Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、または
Ｘ６はＲであり、Ｘ７はＦである、ポリペプチド
を含む。
【０１３８】
したがって、１つの特定の実施形態において、本発明はさらに、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含む抗体様結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｌ５−Ｆｃ２［ＩＶ］
によって表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、ここで：
ａ）式［ＩＶ］の１つのポリペプチドが、式［Ｉ］によって表されるポリペプチド鎖に関して上記で定義された通りのＶＤ１、Ｌ１、ＶＤ２、Ｌ２およびＣＬ、ならびに０個のアミノ酸からなるＬ５、ならびに配列番号７０の配列のＦｃ２を含み、ここで
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくはＸ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号７１のアミノ酸配列、または
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変であり、式［ＩＶ］によって表される前記ポリペプチド鎖中の配列番号７０における前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号７１に少なくとも８５％同一な配列からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここで
Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＡであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくはＸ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、配列番号６７における前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［ＩＶ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１３９】
したがって、一実施形態において、抗体様結合タンパク質は、以下を含む：
ａ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号８１または配列番号８１に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号６０または配列番号６０に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むこと、または
ｂ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７３または配列番号７３に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５または配列番号７５に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むこと、または
ｃ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７または配列番号７７に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５または配列番号７５に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むこと、または
ｄ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７または配列番号７７に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７９または配列番号７９に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むこと。
【０１４０】
したがって、１つのさらなる実施形態において、抗体様結合タンパク質は、以下を含む：
ｉ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７３または配列番号７３に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５または配列番号７５に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むこと、または
ｉｉ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７または配列番号７７に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７９または配列番号７９に少なくとも８５％同一な配列のＦｃドメインを含むこと。
【０１４１】
さらなる実施形態において、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、
ａ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号８１のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号６０のＦｃドメインを含む抗体様結合タンパク質、または
ｂ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７３のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５のＦｃドメインを含む抗体様結合タンパク質、または
ｃ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５のＦｃドメインを含む抗体様結合タンパク質、または
ｄ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７９のＦｃドメインを含む抗体様結合タンパク質
からなる群から選択される。
【０１４２】
さらなる実施形態において、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、
ｉ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７３のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、
式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７５のＦｃドメインを含む抗体様結合タンパク質、または
ｉｉ）式［ＩＶ］のポリペプチドが、配列番号７７のＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含み、式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、配列番号７９のＦｃドメインを含む抗体様結合タンパク質
からなる群から選択される。
【０１４３】
さらなる実施形態において、抗体様結合分子は：
ａ）配列番号８０のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号８０のアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号８０に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号５９のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号５９のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号５９に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド；または
ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７２のアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７２に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号７４のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７４のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７４に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド；または
ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７６におけるアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７６に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号７４のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７４のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７４に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド；または
ｄ）配列番号７６のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７６におけるアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７６に少なくとも８５％同一な配列からなる、式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号７８のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７８のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７８に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド
を含む。
【０１４４】
さらなる実施形態において、抗体様結合分子は：
ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７２のアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７２に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号７４のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７４のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７４に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド；または
ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７６におけるアミノ酸位置４８１、４８６、４９８、５００、５３９、５６７、５６８が不変である、配列番号７６に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；ならびに
配列番号７８のアミノ酸配列、もしくは
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号７８のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５５９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号７８に少なくとも８５％同一な配列
からなる、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド
を含む。
【０１４５】
さらなる実施形態において、抗体様結合タンパク質は：
ｉ）配列番号８０のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号５９のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、
ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド、および
配列番号７４のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、
ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号７４のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、ならびに
ｉｖ）配列番号７６のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号７８のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド
を含む。
【０１４６】
さらなる実施形態において、抗体様結合タンパク質は：
ａ）配列番号７２のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド、および
配列番号７４のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、
ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列からなる式［ＩＶ］の１つのポリペプチド；および
配列番号７８のアミノ酸配列からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド
を含む。
【０１４７】
一実施形態において、本明細書の上記で定義される式［Ｉ］によって表される構造を有する１つのポリペプチド鎖および式［ＩＩＩ］によって表される構造を有する１つのポリペプチドを含む抗体様結合タンパク質は、Ｆｃドメイン（と称されるＦｃ３）を含む第３のポリペプチド鎖をさらに含む。
【０１４８】
当業者であれば、式［ＩＩＩ］によって表される構造を有する第２のポリペプチドは第１のＦｃドメインを含むため、前記ＦＣ３ドメインは、第２のＦｃドメインと称される場合もあることを理解していると予想される。
【０１４９】
したがって、一実施形態において、本発明は、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含む、ヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤ１２３に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、
第１のポリペプチドは、式［Ｉ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
によって表される構造を有し、
第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］；
によって表される構造を有し、
第３のポリペプチドＦｃ３は、免疫グロブリンヒンジ領域および免疫グロブリンのＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ここで、
ａ）式［Ｉ］の前記ポリペプチドは、
（ｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１、
・配列番号５６の配列のＬ１、
・配列番号１０の配列のＶＤ２、
・配列番号５６の配列のＬ２、
・配列番号１８の配列のＣＬ
を含む配列番号５５のアミノ酸配列、
または
（ｉｉ）
・配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号５５に少なくとも８５％同一な配列
からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の前記ポリペプチドは、
（ｉ）
・配列番号９の配列のＶＤ３、
・０個のアミノ酸からなるＬ３、
・配列番号５２の配列のＶＤ４、
・０個のアミノ酸からなるＬ４、
・配列番号１９の配列のＣＨ１、および
・配列番号６８の配列のＦｃ
を含み、ここでＸ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、もしくはＸ６はＲであり、Ｘ７はＦである、
配列番号６７のアミノ酸配列、
または
（ｉｉ）
・配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、
・アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記のｂ）（ｉ）で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで：
−  式［Ｉ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
−  式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、そのＦｃドメインを介して第３のポリペプチドとヘテロ二量体化しており、
−  前記第３のポリペプチドＦｃ３は、配列番号６９または配列番号６９に少なくとも８５％同一な配列からなり、ここで配列番号６９のアミノ酸位置１２９、１４６、１４８、１８７、２１５、２１６が不変である、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１５０】
したがって、一実施形態において、本発明は、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含む抗体様結合タンパク質であって、
第１のポリペプチドは、式［Ｉ］：
ＶＤ１−Ｌ１−ＶＤ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
によって表される構造を有し、第２のポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］：
ＶＤ３−Ｌ３−ＶＤ４−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ  ［ＩＩＩ］；
によって表される構造を有し、第３のポリペプチドＦｃ３（「Ｆｃスタンプ」とも称される）は、免疫グロブリンヒンジ領域および免疫グロブリンのＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ここで、
ａ）式［Ｉ］の１つのポリペプチドが、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬを含む配列番号５５のアミノ酸配列、または
配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号５５に少なくとも８５％同一な配列
からなり；
ｂ）式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドが、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸からなるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４、０個のアミノ酸からなるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６８の配列のＦｃを含み、ここで、
Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、Ｘ６はＨであり、Ｘ７はＹであるか、またはＸ６はＲであり、Ｘ７はＦである、配列番号６７のアミノ酸配列、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲが不変であり、前記アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は上記で定義された通りである、配列番号６７に少なくとも８５％同一な配列
からなり、ここで式［Ｉ］のポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖−重鎖対を形成し、
ここで式［ＩＩＩ］のポリペプチドが、そのＦｃドメインを介して第３のポリペプチドとヘテロ二量体化する、抗体様結合タンパク質を指す。
【０１５１】
したがって、前記実施形態において、いわゆる「Ｆｃスタンプ」（Ｆｃ３）は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ領域とヘテロ二量体化する。このＣＯＤＶフォーマットは、本明細書においてＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬと称される。このコンストラクトは、ＣＯＤＶ−Ｆａｂが凝集体を形成することを回避する。
【０１５２】
したがって、１つの特定の実施形態において、上記で定義された抗体様結合タンパク質のＦｃ３ドメインは、配列番号６９からなる。
【０１５３】
関連する実施形態において、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、
−  配列番号５５からなる、または配列番号５４の配列のＶＤ１の配列番号４８、「ＷＡＳ」および配列番号４９の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号１０の配列のＶＤ２の配列番号１１、「ＫＶＳ」および配列番号８の配列の３つのＣＤＲが不変である、配列番号５５に少なくとも８５％同一な配列からなる、式［Ｉ］のポリペプチド；および
配列番号６６の配列のＦｃドメインを含む式［ＩＩＩ］のポリペプチド、または
配列番号５２の配列のＶＤ４の配列番号５０、配列番号５３、および配列番号５１の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号９の配列のＶＤ３の配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列の３つのＣＤＲ、ならびに配列番号６６のアミノ酸位置４７３、４９２、５３１、５３９、５６０、４７８、４９０が不変である、配列番号５９に少なくとも８５％同一な配列；および
−  配列番号６９または配列番号６９に少なくとも８５％同一な配列からなり、配列番号６９のアミノ酸位置１２９、１４６、１４８、１８７、２１５、２１６  が不変である、Ｆｃスタンプ（Ｆｃ３）
を含む。
【０１５４】
さらなる関連する実施形態において、抗体様結合タンパク質は、
−  配列番号５５からなる式［Ｉ］の１つのポリペプチド、
−  配列番号６５からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、および
−  配列番号６９または配列番号６９に少なくとも８５％同一な配列からなり、配列番号６９のアミノ酸位置１２９、１４６、１４８、１８７、２１５、２１６が不変である、Ｆｃスタンプ（Ｆｃ３）
を含む。
【０１５５】
さらなる関連する実施形態において、抗体様結合タンパク質は、
−  配列番号５５からなる式［Ｉ］の１つのポリペプチド、
−  配列番号６５からなる式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、および
−  配列番号６９または配列番号６９に少なくとも８５％同一な配列からなるＦｃスタンプ（Ｆｃ３）
を含む。
【０１５６】
一部の実施形態において、抗体様結合タンパク質が、２つのＦｃドメインを含有する場合、すなわちＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質（ＦｃおよびＦｃ２）、およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質（ＦｃおよびＦｃ３）の形態である場合、２つのＦｃドメインは、同じ免疫グロブリンアイソタイプまたはアイソタイプサブクラスに属する。したがって、一部の実施形態において、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１のＦｃおよびＦｃ２の両方、またはＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１のＦｃおよびＦｃ３の両方が、ＩｇＧ１サブクラスに属するか、またはＩｇＧ２サブクラスに属するか、またはＩｇＧ３サブクラスに属するか、またはＩｇＧ４サブクラスに属する。
【０１５７】
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６ｘ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質において、Ｆｃ配列およびＦｃ２配列は、ＩｇＧ１骨格由来である。これらのＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１バリアントは、式［ＩＶ］の１つのポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドを含有するかまたはそれからなる。本明細書に記載される全ての抗体様結合タンパク質は、エフェクター機能を有さない。これは、抗体様結合タンパク質が、ＩｇＧ１サブクラスの１つまたはそれ以上のＦｃドメイン（すなわち式［ＩＩＩ］においてＦｃ、式［
ＩＶ］においてＦｃ２および／またはＦｃ３）を含有する場合、ＩｇＧ１骨格の前記１つまたはそれ以上のＦｃドメインは、Ｆｃエフェクター機能を壊滅する二重突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（いわゆる「ＬＡＬＡ突然変異」）を含有することを意味する。
【０１５８】
上述したように、本発明の抗体様タンパク質の全てのＦｃドメインは、二重突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含有することから、前記突然変異は、本発明の抗体様タンパク質を含む文脈でさらに述べられることはないし、本発明の抗体様タンパク質の配列においてさらに示されることもない。
【０１５９】
一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、本明細書の上記で定義されたＲＦおよび／または「ノブ−イントゥー−ホール」突然変異をさらに含む。
【０１６０】
本発明の一実施形態によれば、式［Ｉ］または式［ＩＶ］のポリペプチドのＶＤ１およびＶＤ２はどちらも、軽鎖の可変ドメイン、または重鎖の可変ドメインのいずれかであり、ポリペプチド［ＩＩＩ］のＶＤ３およびＶＤ４はどちらも、重鎖または軽鎖の可変ドメインである。この交換可能性はまた、「スワップ可能性」とも称され、したがって本発明の抗体様結合タンパク質のクロスオーバー二重可変（ＣＯＤＶ）立体配置を決定する。上記の定義に従って、ＶＤ１およびＶＤ４は、第１の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインであり、ＶＤ２およびＶＤ３は、第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインであることから、ＶＤ１およびＶＤ４は、同源のドメインとみなされることになり、ＶＤ２およびＶＤ３も同様である。
【０１６１】
したがって、用語「クロスオーバー」は、その同源の可変ドメインである式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＶＤ４またはＶＤ３に対する、式［Ｉ］または式［ＩＶ］のポリペプチドのＶＤ１またはＶＤ２のスワップされたアライメントを指す。１つの特定の実施形態において、ＶＤ１およびＶＤ２は軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ３およびＶＤ４は重鎖可変ドメインである。
【０１６２】
本発明の場面において、数々の抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質、いわゆる「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質を生成し、特に：
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール、
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし
を生成した。
【０１６３】
１つの特定の実施形態において、本発明は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール、より具体的には、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦに言及する。これらの抗体様結合タンパク質は全て、ノブ−イントゥー−ホール突然変異を含有し、ここでノブ突然変異は、軽鎖の、すなわちポリペプチドＩＶのＦｃ領域に配置され、ホール突然変異は、重鎖、すなわちポリペプチドＩＩＩに配置される。前記抗体様結合タンパク質は、ＲＦ突然変異をさらに含んでいてもよい。本明細書の上記で述べられた通り、ノブ−イントゥー−ホール突然変異は、抗体様結合タンパク質のヘテロ二量体の量を増加させる。
【０１６４】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は：
−  式［ＩＶ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬ、０個のアミノ酸を含有するＬ５、および配列番号７３の配列のＦｃ２（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化５】
2019531701.tif 000010
（配列番号７２、リンカーは太字と下線で示される）であるポリペプチド、および
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックで）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、およびＦｃ（下線で示される）の配列番号７５の配列を含むアミノ酸配列
【化６】
2019531701.tif 000011
（配列番号７４）であるポリペプチド
を含む。
【０１６５】
前記抗体様結合タンパク質は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬのフォーマットであり、すなわち、式［ＩＶ］の１つのポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドを含有するかまたはそれからなる。
【０１６６】
配列番号５８の配列の式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２配列は、アミノ酸位置１１６および１１７（上記において太字）にＲＦ突然変異を含有する。
【０１６７】
さらに、そのＦｃおよびＦｃ２配列は、「ノブ−イントゥー−ホール」技術に従って操作されており、Ｆｃ２ドメインは、これまでにノブ突然変異として記載された配列番号７３におけるＳ１３４ＣおよびＴ１４６Ｗ突然変異をさらに含有し（太字で示される）、Ｆｃは、これまでにホール突然変異として記載された配列番号７５におけるＹ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ、Ｙ１９２Ｖをさらに含有する。
【０１６８】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は：
−  式［ＩＶ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬ、０個のアミノ酸を含有するＬ５、および配列番号７７の配列のＦｃ２（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化７】
2019531701.tif 000012
（配列番号７６、リンカーは太字と下線で示される）である、ポリペプチド；および
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックで）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号７９の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化８】
2019531701.tif 000013
（配列番号７８）である、ポリペプチド
を含む。
【０１６９】
式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２配列は、その配列番号７７の配列におけるＳ１３４ＣおよびＴ１４６Ｗ突然変異を含有する。式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ配列は、その配列番号７９の配列に、突然変異Ｙ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ、Ｙ１９２Ｖ（ホール突然変異）およびＲＦ突然変異を含有する。
【０１７０】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は：
−  式［ＩＶ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬ、０個のアミノ酸を含有するＬ５、および配列番号８１の配列のＦｃ２（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化９】
2019531701.tif 000014
（配列番号８０、リンカーは太字と下線で示される）である、ポリペプチド；および
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックで）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６０の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化１０】
2019531701.tif 000015
（配列番号５９）である、ポリペプチド
を含む。
【０１７１】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は：
−  式［ＩＶ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬ、０個のアミノ酸を含有するＬ５、および配列番号７７の配列のＦｃ２（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化１１】
2019531701.tif 000016
（配列番号７６、リンカーは太字と下線で示される）である、ポリペプチド；および
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックで）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号７５の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化１２】
2019531701.tif 000017
（配列番号７４）である、ポリペプチド
を含む。
【０１７２】
式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２配列は、その配列番号７７の配列におけるＳ１３４ＣおよびＴ１４６Ｗ突然変異を含有する。ポリペプチドＩＩＩのＦｃドメインは、配列番号７５においてホール突然変異Ｙ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ、Ｙ１９２Ｖを含有する。
【０１７３】
新たに開発された分子であるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（ｗｏＧＳ）は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａと比較して、Ｆｃスタンプ（Ｆｃ３）のＮ末端に配置されたアミノ酸「ＧＳ」を含まない。
【０１７４】
タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（ｗｏＧＳ）は、精製が簡単であり、プロテインＡ精製の後に多量のヘテロ二量体を有する（すなわち、図４では８８％のヘテロ二量体が示されている）。
【０１７５】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は：
−  式［Ｉ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、および配列番号１８の配列のＣＬを含むアミノ酸配列
【化１３】
2019531701.tif 000018
（配列番号５５）である、ポリペプチド；
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックと下線で示される）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６６の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列：
【化１４】
2019531701.tif 000019
（配列番号６５）である、ポリペプチド
を含み、
−ここでいわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ領域とヘテロ二量体化するアミノ酸配列：
【化１５】
2019531701.tif 000020
（配列番号６９）のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）をさらに含む。
【０１７６】
配列番号６６の配列のＦｃは、２２０〜２２１位にＨＹ残基（上記において太字）およびノブ突然変異Ｓ１３９ＣおよびＴ１５１Ｗを含み、一方で配列番号６９の配列のＦｃスタンプは、２１７〜２１８位にＲＦ残基（上記において太字）およびホール突然変異Ｙ１３１Ｃ、Ｔ１４８Ｓ、Ｌ１５０ＡおよびＹ１８９Ｖを含む。
【０１７７】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質、いわゆる「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質：
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ、
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１および
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ
は、本特許出願の優先権の出願日の時点で未公開の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６号に記載されている（欧州特許条約第５４（３）条）。
【０１７８】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は、これまでに、本特許出願の優先権の出願日の時点で未公開の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６号でＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１という名称で記載されており（欧州特許条約第５４（３）条）：
−  式［ＩＶ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、配列番号１８の配列のＣＬ、０個のアミノ酸を含有するＬ５、および配列番号５８の配列のＦｃ２（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化１６】
2019531701.tif 000021
（配列番号５７、リンカーは太字と下線で示される）である、ポリペプチド；および
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックで）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６０の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化１７】
2019531701.tif 000022
（配列番号５９）である、ポリペプチド
を含む。
【０１７９】
前記抗体様結合タンパク質は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬのフォーマットであり、すなわち、式［ＩＶ］の１つのポリペプチドおよび式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドを含有するかまたはそれからなる。配列番号５８の配列の式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２配列はさらに、１１６および１１７位に、ＨＹ残基の代わりにＲＦ残基（上記において太字）が含有されるように設計されているが、そうでなければＦｃ領域の１１６および１１７位にＨＹ残基が存在していたと予想される。ＨＹからＲＦへの突然変異（すなわち、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．ら．１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．、２０１：２５〜３４によって説明されているような、ＣＨ３ドメインにおけるＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ）は、プロテインＡへの結合を壊滅させるため、精製目的にとって有利である。
【０１８０】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質はこれまでに、本特許出願の優先権の出願日の時点で未公開の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６号に記載されており（欧州特許条約第５４（３）条）：
−  式［Ｉ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、および配列番号１８の配列のＣＬを含むアミノ酸配列
【化１８】
2019531701.tif 000023
（配列番号５５、リンカーは太字と下線で示される）である、ポリペプチド；および
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックと下線で示される）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６２の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列
【化１９】
2019531701.tif 000024
（配列番号６１）である、ポリペプチド
を含み、
ここでいわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ領域とヘテロ二量体化するアミノ酸配列：
【化２０】
2019531701.tif 000025
（配列番号６３）のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）をさらに含む。
【０１８１】
前記抗体様結合タンパク質は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬのフォーマットであり、すなわち、式［Ｉ］の１つのポリペプチド、式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチド、および１つのＦｃスタンプを含有するかまたはそれからなる。そのＦｃおよびＦｃ３配列は、「ノブ−イントゥー−ホール」技術に従って操作されており、Ｆｃドメインは、これまでにノブ突然変異として記載された配列番号６２におけるＳ１３９ＣおよびＴ１５１Ｗ突然変異をさらに含有し（太字で示される）、Ｆｃ３は、これまでにホール突然変異として記載された配列番号６３におけるＹ１３１Ｃ、Ｔ１４８Ｓ、Ｌ１５０ＡおよびＹ１８９Ｖをさらに含有する。配列番号６２の配列のＦｃ配列はさらに、２２０〜２２１位にＲＦ突然変異（上記において太字）が含有されるように設計されている。
【０１８２】
いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は、これまでに、本特許出願の優先権の出願日の時点で未公開の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６号に記載されており（欧州特許条約第５４（３）条）：
−  式［Ｉ］の１つのポリペプチドであって、配列番号５４の配列のＶＤ１、配列番号５６の配列のＬ１、配列番号１０の配列のＶＤ２、配列番号５６の配列のＬ２、および配列番号３１０の配列のＣＬを含むアミノ酸配列
【化２１】
2019531701.tif 000026
（配列番号５５）である、ポリペプチド；
−  式［ＩＩＩ］の１つのポリペプチドであって、配列番号９の配列のＶＤ３、０個のアミノ酸であるＬ３、配列番号５２の配列のＶＤ４（イタリックと下線で示される）、０個のアミノ酸であるＬ４、配列番号１９の配列のＣＨ１、および配列番号６６の配列のＦｃ（下線で示される）を含むアミノ酸配列：
【化２２】
2019531701.tif 000027
（配列番号６５）である、ポリペプチド
を含み、
−  ここでいわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質は、式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ領域とヘテロ二量体化するアミノ酸配列：
【化２３】
2019531701.tif 000028
（配列番号６４）のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）をさらに含む。
【０１８３】
配列番号６６の配列のＦｃは、２２０〜２２１位にＨＹ残基（上記において太字）およびノブ突然変異Ｓ１３９ＣおよびＴ１５１Ｗを含み、一方で配列番号６４の配列のＦｃスタンプは、２１７〜２１８位にＲＦ残基（上記において太字）およびホール突然変異Ｙ１３１Ｃ、Ｔ１４８Ｓ、Ｌ１５０ＡおよびＹ１８９Ｖを含む。
【０１８４】
本発明者らは、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦの数々の代替分子、例えばＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールを開発した。さらに本発明者らは、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａの代替として、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦａｓを開発した。
【０１８５】
これらのＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１バリアントは、精製を簡単にする、凝集を低減する、したがって本発明の抗体様結合タンパク質のヘテロ二量体の収量を増加させるために、ノブ−イントゥー−ホール突然変異および／またはＲＦ突然変異を含有する。プロテインＡ精製の後に得られた抗体様結合タンパク質は、例えば、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦの場合、５２％のヘテロ二量体を含有し、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールの場合、７２から８５％のヘテロ二量体を含有し、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦの場合、５５％のヘテロ二量体を含有し、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦの場合、８８％のヘテロ二量体を含有する。さらに、抗体様結合タンパク質の融点は、５６〜５７℃で非常に類似していることが見出された（実施例２．７．１）。
【０１８６】
本明細書の上記で述べられた通り、本発明の抗体様結合タンパク質は、ＣＤ３およびＣＤ１２３に結合する。
【０１８７】
したがって、本発明の一態様において、本発明の抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に結合する。別の実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質はさらに、カニクイザルＣＤ３に結合する。特に、本発明の抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ３の、またはヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ３の細胞外ドメインに結合する。より具体的には、抗体は、ＣＤ３εに結合する。より具体的には、抗体様結合タンパク質は、ヒトの、またはヒトおよびカニクイザルのＣＤ３εの細胞外ドメインに結合する。抗体様結合タンパク質は、複合体、例えばＣＤ３ε／δ複合体の形態で存在する場合、または単離された形態で発現されるかどうかに関係なく、単一のタンパク質として存在する場合、または例えばＴ細胞中に存在する場合のように可溶性細胞外ドメインまたは全長膜アンカー型ＣＤ３ε中に存在する場合、ＣＤ３εに結合する。本発明に係る抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ３タンパク質の、またはヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ３タンパク質の表面、特にＣＤ３εに特異的である。
【０１８８】
本発明に係る抗体様結合の、ヒトＣＤ３の親和性に対するカニクイザルＣＤ３の親和性の比率（ＫＤ（カニクイザル）／ＫＤ（ヒト）は、≦１０、特に≦６、≦５、≦４、≦３、≦２、≦１または≦０．５である。したがって、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、サルで実行される毒物学的な研究、すなわちヒトにおいて起こり得る有害作用を予測するために関連するサルで観察された毒性プロファイルで使用することができる。
【０１８９】
さらに、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ３もしくはカニクイザルＣＤ３または両方への親和性（ＫＤ）を有し、その親和性は、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、または≦３０ｎＭ、例えば≦２０ｎＭであり、例えば、０．１ｎＭから３０ｎＭ、特に０．４ｎＭから２５ｎＭ、または１０ｎＭから２５ｎＭの親和性である。
【０１９０】
本発明のさらなる態様において、抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ１２３に結合する。別の実施形態において、抗体様結合タンパク質はさらに、カニクイザルＣＤ１２３に結合する。特に、本発明の抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ１２３の、またはヒトおよびカニクイザルＣＤ１２３の両方の細胞外ドメインに結合する。より具体的には、抗体様結合タンパク質は、ＣＤ１２３の遠位部分に結合し、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列のヒトＣＤ１２３の１９位から開始して４９位までのアミノ酸に結合する。抗体様結合タンパク質は、単離された形態で発現されるかどうかに関係なく、ＣＤ１２３に結合するか、または可溶性細胞外ドメインまたは全長膜アンカー型ＣＤ１２３中に存在し、例えば、ＣＤ１２３を発現する細胞、例えばＡＭＬ細胞またはＣＤ１２３でトランスフェクトされた細胞中に存在する。本発明に係る抗体様結合タンパク質は、それらの表面にヒトまたはヒトおよびカニクイザルのＣＤ１２３タンパク質を発現する細胞、例えばＣＤ１２３を発現するがん細胞に特異的である。
【０１９１】
したがって、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、ヒトＣＤ１２３もしくはカニクイザルＣＤ１２３または両方への親和性（ＫＤ）を有し、その親和性は、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、または≦１０ｎＭ、例えば≦５ｎＭであり、例えば０．０１ｎＭから５ｎＭ、具体的には０．０１ｎＭから２ｎＭ、より具体的には０．０５ｎＭから２ｎＭの親和性である。
【０１９２】
一実施形態において、抗体様結合タンパク質は、ＣＤ１２３の機能を阻害することが可能である。
【０１９３】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、５０から７０℃、好ましくは、５０から６５℃、より好ましくは、５５から６０℃の熱変性温度を有する。熱変性温度を測定する方法は当業者に公知であり、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）などがある。当業者に公知のように、これらの実験に使用される実験条件、例えば使用される緩衝液、タンパク質濃度は、結果に強く影響を与える可能性がある。したがって、一例において、５０から７０℃、好ましくは、５０から６５℃、より好ましくは、５５から６０℃の変性温度は、例えば実施例（実施例２．７．１）で例示されるような白色のセミスカート９６−ウェルプレート（ＢＩＯＲＡＤ）中における、典型的にはＤ−ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で例えば０．２μｇ／μｌの最終濃度に希釈された、典型的にはＤ−ＰＢＳ中のＳＹＰＲＯ−オレンジ色素の４×濃縮溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＭＳＯ中の５０００×ストック）を包含する抗体様結合タンパク質に対して言及される。
【０１９４】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、標的細胞の非存在下で、２０％未満、１８％未満、１６％未満、１４％未満、１２％未満、１０％未満のＴ細胞活性化を有する。
【０１９５】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、標的細胞の存在下で、５５％より高い、６０％より高い、６２％より高い、６４％より高い、６６％より高い、６８％より高い、７０％より高いＴ細胞活性化を有する。
【０１９６】
本発明の抗体様結合タンパク質は、Ｔ細胞係合作用を有する。このＴ細胞係合作用は、標的細胞を発現するＣＤ１２３において細胞傷害性を誘導する。
【０１９７】
本発明の抗体様結合タンパク質の標的細胞は、ＣＤ１２３を発現する細胞、例えばＣＤ１２３を発現するがん細胞、例えばＴＨＰ−１またはＴＦ−１である。
【０１９８】
したがって、一実施形態において、本発明に係る抗体様結合タンパク質は、インビトロで初代Ｔ細胞を係合し、標的細胞を溶解させることができ、（ＥＣ５０）は、≦４０ｐＭ、≦３５ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１０ｐＭ、≦５ｐＭ、例えば≦２ｐＭである。
【０１９９】
一実施形態において、細胞傷害性は、本明細書において、細胞媒介細胞傷害性、例えばＴ細胞媒介細胞傷害性を指す。
【０２００】
さらに、一実施形態において、細胞媒介細胞傷害性は、Ｔ細胞による細胞媒介細胞傷害性を指す。
【０２０１】
したがって、本発明の抗体様結合タンパク質は、Ｔ細胞によって媒介される、ＣＤ１２３を発現する標的細胞における細胞媒介細胞傷害性を誘導する。
【０２０２】
細胞傷害性を測定する方法は当業者に公知であり、例えば、５１−クロム（Ｃｒ）放出アッセイ、ヨウ化プロピジウム、７−ＡＡＤ、および当業者に公知の他の染料などの標的細胞の生／死細胞染色、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡによる、グランザイムおよびパーフォリンなどのＴ細胞によって放出される溶解性分子の検出、細胞細胞傷害性および細胞崩壊のバイオマーカーとしての、傷害を受けた細胞から培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の検出、ＣＤ１０７ａの細胞表面動員の検出、アポトーシス性の標的細胞のアネキシンＶ（カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質）染色、および例えば活性化されたカスパーゼ−３（ＣＡＳＰ３）の検出を使用することなどが挙げられる。さらに、当業者は、選択された試験に基づいて、さらに実験の組み立てに基づいて、細胞傷害性の異なるメカニズムを区別することができる。
【０２０３】
一例において、細胞媒介細胞傷害性は、例えば実施例１．８で記載されるように、例えば標的細胞を標識するのにＣＦＳＥを使用し、死んだ細胞を標識するのに７−ＡＡＤを使用して測定することができる。
【０２０４】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質のバリアント
本明細書に記載される抗体様結合タンパク質のバリアントが企図され、本明細書の上記で定義された抗体様結合タンパク質の定義で行われたように、明示的に表現「参照配列と少なくとも８５％同一な」の使用で言及される。当業者であれば認識していると予想されるが、参照配列は、式［Ｉ］、［ＩＩＩ］または［ＩＶ］のポリペプチドであり、「参照配列に少なくとも８５％同一な」バリアントは、抗体「ｈｚ２０Ｇ６」および「ｈｚ７Ｇ３」のＣＤＲ、ならびに異なるＦｃ領域におけるＲＦ突然変異、ノブ突然変異およびホール突然変異に対応するアミノ酸位置が不変になるような方法で定義される。
【０２０５】
したがって、参照配列と比較した欠失、挿入および／または置換は、ループ領域Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および場合によりＬ５、フレームワーク領域（ＦＲ）、ＣＬおよびＣＨ１ならびにＦｃ領域のいずれに導入されてもよいことがさらに当業者によって理解されると予想される。フレームワーク領域（ＦＲ）は上記の「定義」の章で定義された通りであり、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。ＣＤＲは定義されているため、当業者は、フレームワーク領域を容易に配置することができる。
【０２０６】
本発明の抗体様結合タンパク質のＣＨドメインは、ヒト免疫グロブリンの重鎖に属するあらゆるＣＨ領域であってもよいが、ＩｇＧクラスに属するものが好適であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラスのいずれか１つ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４も使用することができる。また、本発明の抗体様結合タンパク質のＣＬは、ヒト免疫グロブリン軽鎖に属するあらゆる領域であってもよく、カッパクラスまたはラムダクラスに属するものを使用することができる。
【０２０７】
したがって、本明細書の上記で定義されるようなＣＨまたはＣＬ領域は、別のサブクラスの免疫グロブリン由来のＣＨまたはＣＬドメインによって置換されていてもよいことが当業者によって理解されると予想される。
【０２０８】
本明細書において定義されるようにバリアントを作り出すためのさらなる指針に関して、リンカー領域Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５に関する一部の例を記載する。
【０２０９】
一例において、Ｌ３の長さは、Ｌ１の長さ少なくとも２倍である。さらなる例において、Ｌ４の長さは、Ｌ２の長さの少なくとも２倍である。一部の例において、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍である。他の例において、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。
【０２１０】
一例において、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、０から２０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、Ｌ５は、０から１０個のアミノ酸を含む。
【０２１１】
一部の例において、Ｌ１は、長さが３から１２個のアミノ酸残基であり、Ｌ２は、長さが３から１４個のアミノ酸残基であり、Ｌ３は、長さが１から８個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は、長さが１から３個のアミノ酸残基である。他の例において、Ｌ１は、長さが５から１０個のアミノ酸残基であり、Ｌ２は、長さが５から８個のアミノ酸残基であり、Ｌ３は、長さが１から５個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は、長さが１から２個のアミノ酸残基である。さらなる例において、Ｌ１は、長さが７個のアミノ酸残基であり、Ｌ２は、長さが５個のアミノ酸残基であり、Ｌ３は、長さが１個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は、長さが２個のアミノ酸残基である。
【０２１２】
一部の例において、Ｌ１は、長さが１から３個のアミノ酸残基であり、Ｌ２は、長さが１から４個のアミノ酸残基であり、Ｌ３は、長さが２から１５個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は、長さが２から１５個のアミノ酸残基である。他の例において、Ｌ１は、長さが１から２個のアミノ酸残基であり、Ｌ２は、長さが１から２個のアミノ酸残基であり、Ｌ３は、長さが４から１２個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は、長さが２から１２個のアミノ酸残基である。好ましい例において、Ｌ１は、長さが１個のアミノ酸残基であり、Ｌ２は、長さが２個のアミノ酸残基であり、Ｌ３は、長さが７個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は、長さが５個のアミノ酸残基である。
【０２１３】
一部の例においてＬ１、Ｌ３、またはＬ４は、ゼロに等しくてもよい。しかしながら、Ｌ３またはＬ４がゼロに等しい抗体様結合タンパク質において、可変領域と定常領域の間または他の鎖の二重可変ドメイン間の対応するトランジションリンカーは、ゼロであってはならない。一部の例において、Ｌ１はゼロに等しく、Ｌ３は２個またはそれ以上のアミノ酸残基であるか、Ｌ３はゼロに等しく、Ｌ１は１に等しいかまたはそれ以上のアミノ酸残基であるか、またはＬ４は０に等しく、Ｌ２は３個またはそれ以上のアミノ酸残基である。
【０２１４】
一部の例において、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４からなる群から選択されるリンカーの少なくとも１つは、少なくとも１つのシステイン残基を含有する。
【０２１５】
本発明の抗体様結合タンパク質のバリアントに使用可能な好適なリンカーの例としては、単一のグリシン、スレオニンまたはセリン残基；ジペプチド、例えば、ジグリシンペプチド、ヒスチジン−スレオニンペプチドまたはグリシン−セリンジペプチドなど；３つのグリシンを有するトリペプチド、トリペプチドＴｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ、トリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ；４つのグリシン残基を有するペプチド；５つのグリシン残基を有するペプチド；６つのグリシン残基を有するペプチド；７つのグリシン残基を有するペプチド；８つのグリシン残基を有するペプチドが挙げられる。アミノ酸残基の他の組合せ、例えば、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２７）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２０）、ペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２８）、ペプチドＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２９）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３０）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３１）、およびペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２１）などを使用してもよい。他の好適なリンカーとしては、単一のＳｅｒ、およびＶａｌ残基；ジペプチドＡｒｇ−Ｔｈｒ、Ｇｉｎ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、およびＳｅｒ−Ｌｅｕ；Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号３２）；Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３３）；Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３４）；Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号３５）；Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号３６）；Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号３７）；Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３８）；Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３９）；Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号４０）；Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号４１）；Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４２）；Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４３）；Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４４）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４５）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４６）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４７）；Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号２２）、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号２３）、Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号２４）；Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号２５）、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号２６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号１６）、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１７）、Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（配列番号３５１）、およびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５６）が挙げられる。上記で列挙した例は、どのような形でも本発明の範囲を限定することを意図しておらず、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択されるランダムに選択されたアミノ酸を含むリンカーは、本発明の抗体様結合タンパク質において好適であることが示されている。
【０２１６】
リンカーにおけるアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカーにおいて達成するのに必要な二次構造エレメントのタイプに応じて変更することができる。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンは、最大のフレキシビリティーを有するリンカーにとって最良である。より高い硬く伸長したリンカーが必要な場合、グリシン、プロリン、スレオニン、およびセリンの一部の組合せが有用である。所望の特性における必要に応じてより大きいペプチドリンカーを構築するために、他のアミノ酸残基と組み合わせたあらゆるアミノ酸残基もリンカーとみなすことができる。
【０２１７】
一例において、リンカーＬ１は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号１６）を有し、リンカーＬ２は、配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１７）を有し、リンカーＬ３は、配列「Ｓ」を有し、リンカーＬ４は、配列「ＲＴ」を有する。
【０２１８】
さらなる例において、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４の配列は、スレオニン；ジペプチド、例えばヒスチジン−スレオニンペプチド；トリペプチドＴｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号３２）；Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３３）；Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３４）；Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号３５）；Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号３６）；Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号３７）；Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３８）；Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３９）；Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号４０）；Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号４１）；Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４２）；Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４３）；Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４４）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４５）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４６）およびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４７）からなる群から選択される。一例において、リンカーＬ５の配列は、単一のセリン残基、ジペプチド、例えばグリシン−セリンジペプチド；トリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２７）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２０）、ペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２８）、ペプチドＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２９）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３０）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３１）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２１）、およびペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５６）からなる群から選択される。
【０２１９】
「参照配列に少なくとも８５％同一な」配列を産生するために抗体様結合タンパク質に適用可能なさらなる改変は、本明細書において以下の「本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質の改変」の章に記載される。
【０２２０】
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質の改変
本明細書に記載される抗体様結合タンパク質のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体様結合タンパク質の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。例えば、ヒト化抗体が、非ヒト動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬにおけるＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単にグラフト化することによって産生される場合、抗原結合活性は、非ヒト動物由来の元の抗体の活性と比較して低減される可能性があることが公知である。ＣＤＲ中だけでなくＦＲ中における非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの数々のアミノ酸残基が、抗原結合活性に直接的または間接的に関連する可能性があると考えられている。したがって、これらのアミノ酸残基をヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ由来の異なるアミノ酸残基で置換することは、結合活性を低減させると予想される。この問題を解決するために、非ヒトＣＤＲでグラフト化されたヒト抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列のなかから、抗体の結合に直接関連する、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用する、または抗体の３次元構造を維持する、および抗原への結合に直接関連するアミノ酸残基を同定する試みがなされてきた。同定されたアミノ酸を、非ヒト動物由来の元の抗体のアミノ酸残基で置き換えることによって、低減された抗原結合活性を増加させることができた。本発明の抗体様結合タンパク質は、ヒト化抗体の可変領域「２０Ｇ６」およびヒト化抗体の可変領域「７Ｇ３」を含み、したがって本明細書で述べられた考察は、等しく本発明の抗体様結合タンパク質に適用される。
【０２２１】
改変および変化は、本発明の抗体様結合タンパク質の構造中に、さらにそれらをコードするＤＮＡ配列中になすことができ、それでもなお所望の特徴を有する機能的な抗体様結合タンパク質またはポリペプチドが生じる。
【０２２２】
ポリペプチドのアミノ配列を変化させることにおいて、アミノ酸の疎水性指標を考慮に入れてもよい。タンパク質に相互作用の生物学的機能を付与することにおける疎水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水性特徴は、生じるタンパク質２次構造に寄与し、これが順に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが認められている。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特徴に基づき割り当てられた疎水性指標を有し、以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０２２３】
本発明のさらなる目的はまた、本発明の抗体様結合タンパク質のポリペプチドの機能保存的バリアントも包含する。
【０２２４】
例えば、タンパク質構造中で、特定のアミノ酸を、明らかな活性の損失を起こすことなく、他のアミノ酸で置換することもできる。タンパク質の相互作用能力および性質はその生物学的な機能活性を定義するため、タンパク質配列に、当然ながらそのＤＮＡコード配列にも特定のアミノ酸置換をなすことができ、それにもかかわらず類似の特性を有するタンパク質が得られる。したがって、本発明の抗体配列、または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、それらの生物活性の明らかな損失を起こすことなく様々な変化をなし得ることが企図される。
【０２２５】
特定のアミノ酸が、類似の疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換されていてもよく、それでもなお類似の生物活性を有するタンパク質が生じ、すなわちそれでもなお生物学的な機能的に同等なタンパク質が得られることが当技術分野において公知である。また、本発明の抗体様結合タンパク質において、抗原への結合の有意な損失を起こすことなく置換できる全てのアミノ酸を同定するために、アラニンスキャニングアプローチなどの十分に確立された技術を使用することも可能である。このような残基は、抗原結合または抗体構造の維持に関与しないため、中性として認定することができる。これらの中性位置の１つまたはそれ以上は、アラニンで置換してもよいし、または本発明の抗体様結合タンパク質の主要な特徴を変化させない可能性がある別のアミノ酸で置換してもよい。
【０２２６】
したがって、上記で概説したように、アミノ酸置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。考慮される様々な前述の特徴をもつ例示的な置換は当業者周知であり、例えば、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【０２２７】
また、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が強化または低減されるように、本発明の抗体様結合タンパク質を、エフェクター機能に関して改変することも望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができ、このようなＦｃ領域はまた、本発明の抗体様結合タンパク質の文脈ではＦｃ−バリアントとも称される。代替として、またはそれに加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基が導入されてもよく、それにより、この領域において、鎖間のジスルフィド結合形成が可能になる。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善または低減された内在化能力および／または増加した補体媒介細胞致死および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有していてもよい（Ｃａｒｏｎ  ＰＣ．ら．１９９２；およびＳｈｏｐｅｓ  Ｂ．１９９２）。
【０２２８】
抗体様結合タンパク質の元のグリコシル化パターンを変更するために、本発明の抗体様結合タンパク質の別のタイプのアミノ酸改変が有用な場合があり、すなわち、抗体様結合タンパク質に見出される１つまたはそれ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体様結合タンパク質中に存在しない１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を付加することによるアミノ酸改変が有用な場合がある。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、およびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中Ｘはプロリンを除くあらゆるアミノ酸である）のいずれかの存在が、可能性のあるグリコシル化部位を作り出す。抗体様結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加または欠失は、上述したトリペプチド配列の１つまたはそれ以上を含有するように（Ｎ−結合型グリコシル化部位の場合）アミノ酸配列を変更することによってうまく達成される。
【０２２９】
別のタイプの改変は、インシリコまたは実験的のいずれかで同定された配列の除去を含むが、その結果として、抗体様結合タンパク質調製物の分解産物または不均質性を引き起こす可能性がある。例として、アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミドは、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて起こる可能性がある。アスパラギン残基は、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、特に脱アミドを受けやすく、それより程度は低いがＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列でも脱アミドを受けやすい。したがって、このような脱アミド部位、特にＡｓｎ−Ｇｌｙが本発明の抗体様結合タンパク質中に存在する場合、典型的には関連する残基の一方を除去する保存的置換によって、その部位を除去することが望ましい場合がある。このような関連する残基の１つまたはそれ以上を除去するための配列中の置換も、本発明に包含されることが意図される。
【０２３０】
別のタイプ共有結合の改変は、配糖体を抗体様結合タンパク質に化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、それらがＮ−またはＯ結合型グリコシル化のグリコシル化性能を有する宿主細胞における抗体様結合タンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用されるカップリング様式に応じて、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのスルフヒドリル基、（ｄ）遊離のヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。例えば、このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
【０２３１】
抗体様結合タンパク質に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成することができる。化学的な脱グリコシルは、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価な化合物への抗体様結合タンパク質の曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断を引き起こすが、抗体は無傷のまま残る。化学的な脱グリコシルは、Ｓｏｊａｈｒ  Ｈ．ら（１９８７）およびＥｄｇｅ，ＡＳ．ら（１９８１）によって記載されている。抗体の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ＮＲ．ら（１９８７）によって記載されるような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０２３２】
抗体様結合タンパク質の別のタイプの共有結合の改変は、米国特許第４，６４０、８３５号；４，４９６、６８９号；４，３０１、１４４号；４，６７０、４１７号；４，７９１、１９２号または４，１７９，３３７号に記載の方式で、様々な非タンパク質様ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結することを含む。
【０２３３】
核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、上記で定義された抗体様結合タンパク質をコードする配列を含むかまたはそれからなる核酸配列に関する。
【０２３４】
典型的には、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、これらは、あらゆる好適なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターに含めることができる。
【０２３５】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【０２３６】
このようなベクターは、対象に投与されたら前記ポリペプチドの発現を引き起こすかまたはそれを指示するための、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含んでいてもよい。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ら．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ  Ｙら．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ  ＪＯら．１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤら．１９８３）などが挙げられる。
【０２３７】
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入して発現させることができる限り、動物細胞のためのあらゆる発現ベクターを使用することができる。好適なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈら．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔら．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ  Ｇら．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋら．１９８１）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈら．１９９０）などが挙げられる。プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または組込プラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。
【０２３８】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルスの、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術によって、例えばパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドまたはウイルスとの一過性トランスフェクションによって産生することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えばＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８で見出すことができる。
【０２３９】
本発明のさらなる目的は、本発明に係る核酸および／またはベクターによってトランスフェクトされた、それに感染した、またはそれで形質転換された細胞に関する。
【０２４０】
本発明の核酸は、好適な発現系で本発明の組換え抗体を産生するのに使用することができる。
【０２４１】
一般的な発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、これらに限定されないが、原核細胞（例えば細菌）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。具体的な例としては、大腸菌、クルイベロマイセス属またはサッカロマイセス属の酵母、哺乳類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、同様に、初代または確立された哺乳類細胞培養（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経系細胞、脂肪細胞などから産生された）が挙げられる。また例としては、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠失したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇら；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」と称される）なども挙げられる。ＹＢ２／０細胞が、この細胞中で発現されるとキメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が強化されるため好ましい。
【０２４２】
特に、本発明の抗体様結合タンパク質の発現に関して、発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子とが別個のベクターに存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクターに存在するタイプ（タンデムタイプ）のどちらでもよい。抗体様結合タンパク質発現ベクター構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、および動物細胞における抗体Ｈ鎖とＬ鎖との発現レベル間のバランスの観点で、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋら．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４年１月３日；１６７（１〜２）：２７１〜８）。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
【０２４３】
また本発明は、本発明に係る抗体様結合タンパク質を発現する組換え宿主細胞を産生する方法であって、（ｉ）インビトロまたはエクスビボで上述したような組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞に導入すること、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養すること、および（ｉｉｉ）、場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択することからなる工程を含む、前記方法にも関する。
【０２４４】
このような組換え宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの抗体様結合タンパク質の産生に使用することができる。
【０２４５】
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質を産生する方法
本発明の一実施形態は、本明細書の上記の「抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質」の章で定義された抗体様結合タンパク質を作製するための方法を提供する。
【０２４６】
本発明の抗体様結合タンパク質は、当技術分野において公知のあらゆる技術、例えば、これらに限定されないが、あらゆる化学的、生物学的、遺伝学的または酵素による技術などを単独で、または組合せのいずれかで用いることによって産生することができる。
【０２４７】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることで、当業者は、ポリペプチド産生のための標準的な技術によって前記抗体または免疫グロブリン鎖を容易に産生することができる。例えば、当業者は、周知の固相方法を使用して、特に、市販のペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって製造されたもの）を製造業者の説明書に従って使用して合成することができる。代替として、本発明の抗体、免疫グロブリン鎖および抗体様結合タンパク質は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、これらのフラグメントは、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに取り込み、このようなベクターを所望のポリペプチドを発現すると予想される好適な真核性または原核性宿主に導入した後、ＤＮＡ発現生成物として得ることができ、このような生成物は、後で周知の技術を使用して単離することができる。
【０２４８】
特に、本発明はさらに、本発明の抗体様結合タンパク質を産生する方法であって、（ｉ）本発明に係る形質転換宿主細胞を培養すること；（ｉｉ）前記抗体様結合タンパク質または対応するポリペプチドを発現させること；および（ｉｉｉ）発現された抗体様結合タンパク質またはポリペプチドを回収することからなる工程を含む、前記方法に関する。
【０２４９】
本発明の抗体様結合タンパク質は、好適には、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培養培地から分離される。
【０２５０】
一実施形態において、発現された抗体様結合タンパク質またはポリペプチドを回収することは、本明細書において、プロテインＡクロマトグラフィー、カッパ選択クロマトグラフィー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーを実行すること、好ましくはプロテインＡクロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーを実行すること、より好ましくはプロテインＡクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを実行することを指す。
【０２５１】
本発明の抗体様結合タンパク質を産生するための方法は、従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含み、これらは当技術分野において周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ら．（１９８４）ならびに特許文書ＵＳ５，２０２，２３８；およびＵＳ５，２０４、２４４を参照）。
【０２５２】
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術に基づきヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知であり（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら．１９８８；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ．ら．１９８５を参照）、抗体様結合タンパク質の産生と同様に、容易な移行が可能である。
【０２５３】
一例において、本明細書において以下の２．５章で記載されるように、典型的には、例えば、Ｆ１７血清非含有懸濁液媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞を、等しい比率の軽鎖および重鎖プラスミドでトランスフェクトし、この場合、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質において、抗体情報は、典型的には１つの軽および１つの重鎖にコードされていたが、それに対してＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質、例えばＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなしの場合、例えば、製造業者により説明されたようなポリエチレンイミントランスフェクション試薬を使用して、１つの軽鎖および２つの重鎖プラスミドがトランスフェクトされた。
【０２５４】
典型的には、細胞を、Ｋｕｈｎｅｒ  ＩＳＦ１−Ｘ振盪インキュベーター中、１１０ｒｐｍで８％ＣＯ２と共に３７℃で培養した。例えば７日の培養後、遠心分離によって細胞を除去し、典型的には１０％Ｖｏｌ／Ｖｏｌの１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加し、例えば０．２μＭのボトルトップフィルターを介して上清をろ過して、粒子を除去した。ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質、加えてＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって、典型的にはプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。例えば０．１Ｍのクエン酸塩、ｐＨ３．０を用いてカラムから溶出させた後、典型的には、ＣＯＤＶ−Ｆａｂコンストラクトを、例えば、典型的にはＰＢＳ中に配合されたＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（Ｇｉｂｃｏ  １４１９０−１３６）を使用して脱塩した。
【０２５５】
凝集体から単量体を分離するために、典型的には、両方のコンストラクト、すなわちＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質のための、例えばＰＢＳ中での高分解能の精留工程（Ｇｉｂｃｏ  １４１９０−１３６）を、典型的にはＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０  ３２０ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号：２９−９８９３−３６）を使用して実行した。単量体の画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０遠心分離カラム（ＶＳ２００２  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して例えば１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、典型的には０．２２μｍの膜（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）シリンジフィルターＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を使用してろ過した。
【０２５６】
医薬組成物
本発明の抗体様結合タンパク質は、治療用組成物を形成するために、薬学的に許容される賦形剤、および場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせてもよい。
【０２５７】
したがって、本発明の別の目的は、本発明の抗体様結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０２５８】
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明に係る抗体様結合タンパク質にも関する。本発明はまた、医薬として使用するための、本発明の医薬組成物にも関する。
【０２５９】
このような治療用組成物または医薬組成物は、投与様式との適性に応じて選択された薬学的または生理学的に許容される調合剤と混和した状態の、治療有効量の抗体様結合タンパク質またはそれらの薬物コンジュゲートを含んでいてもよい。
【０２６０】
本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤などが挙げられる。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては、水、アミノ酸、塩類溶液、リン酸緩衝塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つまたはそれ以上、加えてそれらの組合せが挙げられる。多くの場合において、組成物および調合物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいと予想され、さらに、抗酸化剤、例えばトリプタミンおよび安定化剤、例えばＴｗｅｅｎ  ２０を含有していてもよい。
【０２６１】
医薬組成物の形態、投与経路、投薬量およびレジメンは、通常、処置しようとする状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別などによって決まる。
【０２６２】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼球内投与などのために製剤化することができる。
【０２６３】
特に、医薬組成物は、注射可能な調合物のために薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張の滅菌された塩類溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）であってもよいし、または場合に応じて滅菌水または生理的塩類溶液を添加すると注射用溶液の構成が可能な、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であってもよい。
【０２６４】
投与に使用される用量は、様々なパラメーターに応じて、特に、使用される投与様式、関連する病理学、または代替として処置の所望の持続時間に応じて適合させることができる。
【０２６５】
医薬組成物を製造するために、有効量の本発明の抗体またはイムノコンジュゲートは、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させることができる。
【０２６６】
注射可能な使用に好適な剤形としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを包含する調合物；および滅菌注射用溶液または分散液の即時製造のための滅菌粉末が挙げられる。いずれのケースにおいても、剤形は、滅菌されていなければならず、さらに、簡単にシリンジ操作できる程度の流動性を有していなければならない。剤形は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、さらに、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から保護されていなければならない。
【０２６７】
遊離塩基または薬理学的に許容できる塩としての活性化合物の溶液は、好適には界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと混合された水中で製造することができる。また分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、さらには油中で製造することができる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含有する。
【０２６８】
本発明の抗体様結合タンパク質は、中性または塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基と形成される）が挙げられ、酸付加塩は、例えば塩化水素酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基と形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、グリシン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０２６９】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物性油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散液のケースでは必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを包含することが好ましいと予想される。注射用組成物の持続性の吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することによって達成することができる。
【０２７０】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙された様々な他の成分と共に、活性化合物を必要な量で取り込み、続いてろ過滅菌することによって製造される。一般的に、分散液は、基本の分散媒および上記で列挙されたものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌した活性成分を取り込むことによって製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末のケースにおいて、好ましい製造方法は、活性成分に加えてあらゆる追加の所望の成分の予め滅菌ろ過した溶液からそれらの粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０２７１】
直接の注射のための、さらに濃縮された、または高度に濃縮された溶液の製造も企図され、その場合、極めて迅速な浸透、小さい腫瘍領域への高濃度の活性薬剤の送達をもたらすために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。
【０２７２】
調合されたら、投薬調合物に適合した方式で、さらに治療上有効になるような量で溶液が投与されると予想される。調合物は、上述したタイプの注射用溶液などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。
【０２７３】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、このような溶液は、必要に応じて、好適には緩衝化され、最初に液体希釈剤が十分な塩類溶液またはグルコースで等張にされると予想される。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹膜内投与にとって特に好適である。これに関して、採用できる滅菌水性媒体は、本発明の開示の観点において当業者に公知であると予想される。例えば、１回分の投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させて、１０００ｍｌの皮下注入用流体に添加するか、または提示された注入部位に注射するかのいずれでもよい（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照）。処置される対象の状態に応じて、投薬量を必然的に多少変更することが予想される。いずれの場合においても、投与に関わる人が個々の対象に対して適切な用量を決定することになる。
【０２７４】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、１用量当たり約０．０１から１００ミリグラムほどが含まれるように治療混合物中に配合される。
【０２７５】
非経口投与、例えば静脈内または筋肉内注射のために製剤化された抗体様結合タンパク質に加えて、他の薬学的に許容される形態としては、例えば錠剤または他の経口投与のための固体；徐放性カプセル；および現在使用される他のあらゆる形態が挙げられる。
【０２７６】
ある特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１２３抗体または抗体様結合タンパク質などのポリペプチドを宿主細胞に導入するために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が企図される。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者に公知である。
【０２７７】
ナノカプセルは、一般的に、安定で再現可能な方法で化合物を閉じ込めることができる。細胞内にポリマーが過剰蓄積することによる副作用を回避するために、このような超微細な粒子（およそ０．１μｍのサイズを有する）は、一般的に、インビボで分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明で使用するのに企図され、このような粒子は容易に作製することができる。
【０２７８】
リポソームは、水性媒体中に分散されると自発的に多層の同軸の二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波破砕すると、コアに水溶液を含有する２００から５００Åの範囲の直径を有する小型単層小胞（ＳＵＶ）の形成が起こる。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度および２価カチオンの存在によって決まる。
【０２７９】
医薬組成物は、製剤化されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水粉末または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で貯蔵することができる。このような調合物は、すぐ使用できる形態、または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで貯蔵することができる。
【０２８０】
治療方法および使用
本発明者らは、インビボで、本発明の数々の二重特異性化合物、例えばｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１およびｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３  ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１に関して、ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞株モデルに対するＴ細胞媒介性細胞傷害を示した。さらに本発明者らは、腫瘍細胞の細胞傷害性を引き起こす標的細胞の存在下でＴ細胞を活性化する数々の本発明の二重特異性化合物の能力を実証した。本発明者らはさらに、Ｔ細胞活性化の非存在下、標的細胞の非存在における、Ｔ細胞の低い活性化を実証した。
【０２８１】
したがって、一実施形態において、本発明は、疾患または障害を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、上記の「医薬組成物」の章で定義された本発明の抗体様結合タンパク質または医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０２８２】
本発明はさらに、対象において疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造のための、本発明の抗体様結合タンパク質または医薬組成物の使用に言及する。一実施形態において、本発明は、対象において疾患または障害を処置または予防するための、抗体様結合タンパク質または医薬組成物の使用に言及する。
【０２８３】
一実施形態において、「対象」は、ヒトを指す。
【０２８４】
一実施形態において、「疾患」または「障害」は、本発明の抗体様結合タンパク質での処置によって利益を得ると予想されるあらゆる状態である。一実施形態において、これには、対象を問題の障害に罹りやすくする病理学的な状態を含めた、慢性および急性の障害または疾患が包含される。
【０２８５】
別の実施形態において、障害は、がんを指す。
【０２８６】
さらなる実施形態において、がんは、血液がん、特にＣＤ１２３発現に関連する血液がんに関する。
【０２８７】
一実施形態において、がん細胞によるＣＤ１２３の発現は、例えば抗ＣＤ１２３抗体を使用することによって容易にアッセイされる。抗ＣＤ１２３抗体を使用してＣＤ１２３を発現するがんを同定する方法は、当業者に公知である。
【０２８８】
「ＣＤ１２３発現に関連する血液がん」としては、白血病（例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病および骨髄異形成症候群）および悪性のリンパ増殖性状態、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、全身性肥満細胞症、例えばリンパ腫など（例えば多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞および大細胞型濾胞性リンパ腫）が挙げられる。
【０２８９】
上記の「定義」の章に記載したように、ＬＳＣは、ＣＤ１２３を発現する。
【０２９０】
したがって、関連する実施形態において、がんは、白血病幹細胞に関連する血液がんを指す。
【０２９１】
本発明に従って処置しようとする白血病幹細胞（ＬＳＣ）に関連する血液がん状態としては、白血病（例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群）および悪性のリンパ増殖性状態、例えばリンパ腫など（例えば多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞および大細胞型濾胞性リンパ腫）が挙げられる。
【０２９２】
本発明の一態様において、血液がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【０２９３】
一実施形態において、対象は、ＡＭＬに罹っていると診断されている。
【０２９４】
さらなる実施形態において、対象は、すでに完全寛解まで化学療法で処置されているが再発している。
【０２９５】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質は、単独で、またはあらゆる好適な成長阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２９６】
一実施形態において、本発明の抗体様結合タンパク質での処置の効能は、例えばがんのマウスモデルで、さらに処置された群と対照群との間での例えば腫瘍体積の変化を測定することによって、インビボで容易にアッセイされる。
【０２９７】
キット
最終的に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体様結合タンパク質を含むキットも提供する。
【０２９８】
一実施形態において、キットは、
ａ）本明細書の上記の「抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質」の章で定義されるような、少なくとも１つの本発明の抗体様結合タンパク質、
ｂ）場合により、包装材、および
ｃ）場合により、前記抗体様結合タンパク質はがんを処置するのに、またはがんの処置に使用するのに有効であることを示す、前記包装材内に含有されるラベルまたは添付文書を含む。
【０２９９】
関連する実施形態において、少なくとも１つの本発明の抗体様結合タンパク質は、単一のおよび／または複数に仕切られたプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））に含有される。
【０３００】
一実施形態において、本発明は、単回用量の投与単位を生産するキットを包含する。
【０３０１】
したがって、一実施形態において、本発明のキットのａ）で述べられたような少なくとも１つの本発明の抗体様結合タンパク質は、第１の容器に含有された本発明の乾燥させた抗体様結合タンパク質である。次いでキットは、水性製剤を有する第２の容器をさらに含有する。
【０３０２】
したがって、一実施形態において、キットは、
ａ）本明細書の上記の「抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質」の章で定義されるような、少なくとも１つの本発明の乾燥させた抗体様結合タンパク質を含む第１の容器、
ｂ）水性製剤を含む第２の容器；
ｃ）場合により、包装材、および
ｄ）場合により、前記抗体様結合タンパク質はがんを処置するのに、またはがんの処置に使用するのに有効であることを示す、前記包装材内に含有されるラベルまたは添付文書を含む。
【０３０３】
水性製剤は、典型的には、本明細書の上記の「医薬組成物」の章で定義されるような薬学的に許容される担体を含む水溶液である。
【０３０４】
関連する実施形態において、「第１の容器」および「第２の」容器は、複数に仕切られたプレフィルドシリンジ（例えば、分散シリンジ）の区画を指す。
【０３０５】
ここで、以下の図面および実施例を参照しながら本発明をより詳細に説明する。本明細書において引用された全ての文献および特許文書は、参照により本明細書に組み入れられる。前述の記載において本発明を例示し詳細に説明したが、実施例は、説明的または例示的なものであり、限定的ではないとみなされるものとする。
【０３０６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｐ０７７６６で入手可能な、シグナルペプチドを含む全長ヒトＣＤ３εタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０３０７】
配列番号２は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｑ９５ＬＩ５で入手可能な、シグナルペプチドを含む全長カニクイザルＣＤ３εタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０３０８】
配列番号３は、全長野生型ヒトＣＤ３εタンパク質のアミノ酸２３から１２６を含む、成熟ヒトＣＤ３εＨｉｓタグ付きＦｃ−融合体のアミノ酸配列を示す。
【０３０９】
配列番号４は、野生型配列のアミノ酸位置５７と比較してアミノ酸位置３５に１つのＡｌａからＶａｌへの交換を含有する全長野生型カニクイザルＣＤ３εタンパク質（配列番号２）のアミノ酸２３から１１７を含む成熟カニクイザルＣＤ３εＦｃ−融合体のアミノ酸配列を示す。
【０３１０】
配列番号５、６および７は、いわゆる「ｈｚ２０Ｇ６」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−ＨおよびＣＤＲ３−Ｈのアミノ酸配列を示す。
【０３１１】
配列番号８は、いわゆる「ｈｚ２０Ｇ６」抗体のＣＤＲ３−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【０３１２】
配列番号９は、ヒト化「２０Ｇ６」抗ＣＤ３抗体のＶＨバリアントであるアミノ酸配列ＶＨ１ｄを示す。
【０３１３】
配列番号１０は、ヒト化「２０Ｇ６」抗ＣＤ３抗体のＶＬバリアントであるアミノ酸配列ＶＬ１ｃを示す。
【０３１４】
配列番号１１は、配列番号１０のヒト化「２０Ｇ６」抗ＣＤ３抗体のＶＬ１ｃバリアントのＣＤＲ１−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【０３１５】
配列番号１２は、ＮＣＢＩデータベースからＮＰ＿００２１７４．１で、およびＵｎｉｐｒｏｔデータベースからＰ２６９５１で入手可能なものとしての、シグナルペプチドを含む全長ヒトＣＤ１２３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０３１６】
配列番号１３は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからＥＨＨ６１８６７．１で、およびＵｎｉｐｒｏｔデータベースからＧ８Ｆ３Ｋ３で入手可能なものとしての、シグナルペプチドを含む全長カニクイザルＣＤ１２３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０３１７】
配列番号１４は、全長ヒトＣＤ１２３タンパク質（配列番号１２）のアミノ酸２２から３０５を含む、成熟ヒトＣＤ１２３Ｈｉｓ−ＩＩタグ付きＦｃ−融合体のアミノ酸配列を示す。
【０３１８】
配列番号１５は、全長カニクイザルＣＤ１２３タンパク質（配列番号１３）のアミノ酸２２から３０５を含む、成熟カニクイザルＣＤ１２３Ｈｉｓ−ＩＩタグ付きＦｃ−融合体のアミノ酸配列を示す。
【０３１９】
配列番号１６は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のリンカーＬ１のアミノ酸配列を示す。
【０３２０】
配列番号１７は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のリンカーＬ２のアミノ酸配列を示す。
【０３２１】
配列番号１８は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のアミノ酸配列ＣＬを示す。
【０３２２】
配列番号１９は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のアミノ酸配列ＣＨ１を示す。
【０３２３】
配列番号２０は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３２４】
配列番号２１は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３２５】
配列番号２２は、リンカー配列（Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を示す。
【０３２６】
配列番号２３は、リンカー配列（Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ）のアミノ酸配列を示す。
【０３２７】
配列番号２４は、リンカー配列（Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３２８】
配列番号２５は、リンカー配列（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３２９】
配列番号２６は、リンカー配列（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３０】
配列番号２７は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３１】
配列番号２８は、リンカー配列（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３２】
配列番号２９は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３３】
配列番号３０は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３４】
配列番号３１は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３５】
配列番号３２は、リンカー配列（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３６】
配列番号３３は、リンカー配列（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３７】
配列番号３４は、リンカー配列（Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３８】
配列番号３５は、リンカー配列（Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を示す。
【０３３９】
配列番号３６は、リンカー配列（Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４０】
配列番号３７は、リンカー配列（Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４１】
配列番号３８は、リンカー配列（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４２】
配列番号３９は、リンカー配列（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４３】
配列番号４０は、リンカー配列（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４４】
配列番号４１は、リンカー配列（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４５】
配列番号４２は、リンカー配列（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４６】
配列番号４３は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４７】
配列番号４４は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４８】
配列番号４５は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３４９】
配列番号４６は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３５０】
配列番号４７は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３５１】
配列番号４８および４９は、いわゆる「ｈｚ７Ｇ３」抗体のＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【０３５２】
配列番号５０および５１は、配列番号５２のいわゆるヒト化「７Ｇ３」抗体のＣＤＲ１−ＨおよびＣＤＲ３−Ｈのアミノ酸配列を示す。
【０３５３】
配列番号５２は、いわゆるヒト化「７Ｇ３」抗体の重鎖可変ドメインのさらなるバリアントのアミノ酸配列を示す。
【０３５４】
配列番号５３は、配列番号５２のいわゆるヒト化「７Ｇ３」抗体の１つのＣＤＲ２−Ｈのアミノ酸配列を示す。
【０３５５】
配列番号５４は、いわゆるヒト化「７Ｇ３」抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０３５６】
配列番号５５は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（ｗｏＧＳ）「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［Ｉ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３５７】
配列番号５６は、リンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列を示す。
【０３５８】
配列番号５７は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３５９】
配列番号５８は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のＦｃ２領域のアミノ酸配列を示す。
【０３６０】
配列番号５９は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３６１】
配列番号６０は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ領域のアミノ酸配列を示す。
【０３６２】
配列番号６１は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３６３】
配列番号６２は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のＦｃ領域のアミノ酸配列を示す。
【０３６４】
配列番号６３は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）のアミノ酸配列を示す。
【０３６５】
配列番号６４は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）のアミノ酸配列を示す。
【０３６６】
配列番号６５は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３６７】
配列番号６６は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃドメインのアミノ酸配列を示す。
【０３６８】
配列番号６７は、いわゆる本発明の抗体様結合タンパク質（すなわちＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（ｗｏＧＳ））の式［ＩＩＩ］のポリペプチドの一般化されたアミノ酸配列を示す。
【０３６９】
配列番号６８は、いわゆる本発明の抗体様結合タンパク質（すなわちＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（ｗｏＧＳ））の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃドメインの一般化されたアミノ酸配列を示す。
【０３７０】
配列番号６９は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（ｗｏＧＳ）「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のＦｃスタンプ（Ｆｃ３）のアミノ酸配列を示す。
【０３７１】
配列番号７０は、いわゆる抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールの式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃドメイン（Ｆｃ２）の一般化されたアミノ酸配列を示す。
【０３７２】
配列番号７１は、いわゆる抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールの式［ＩＶ］のポリペプチドの一般化されたアミノ酸配列を示す。
【０３７３】
配列番号７２は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３７４】
配列番号７３は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２のアミノ酸配列を示す。
【０３７５】
配列番号７４は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３７６】
配列番号７５は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質のＦｃの式［ＩＩＩ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３７７】
配列番号７６は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３７８】
配列番号７７は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０３７９】
配列番号７８は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３８０】
配列番号７９は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃのアミノ酸配列を示す。
【０３８１】
配列番号８０は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０３８２】
配列番号８１は、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」抗体様結合タンパク質の式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃ２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０３８３】
配列番号８２は、ＷＯ２０１５０２６８９２で示されたような配列番号１のアミノ酸配列を示す。
【０３８４】
配列番号８３は、ＷＯ２０１５０２６８９２で示されたような配列番号３のアミノ酸配列を示す。
【０３８５】
配列番号８４は、Ｓｔｒｅｐタグのアミノ酸配列を示す。
【０３８６】
配列番号８５は、Ｈｉｓタグのアミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０３８７】
【図１】Ａ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦの概略図、Ｂ）ＳＤＳ−ゲル、Ｃ）ＳＥＣプロファイル（１７８，１７ｍＬにおけるピークは、ヘテロ二量体画分を表す）。プロテインＡ後の収量＝１２ｍｇ／Ｌ、５２％のヘテロ二量体を示す図である。
【図２】Ａ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールの概略図、Ｂ）ＳＤＳ−ゲル、Ｃ）ＳＥＣプロファイル（１７７，９０ｍＬにおけるピークは、ヘテロ二量体画分を表す）。プロテインＡ後の収量＝２０ｍｇ／Ｌ、８５％のヘテロ二量体を示す図である。
【図３】Ａ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦの概略図、Ｂ）ＳＤＳ−ゲル、Ｃ）ＳＥＣプロファイル（１８０，５４ｍＬにおけるピークは、ヘテロ二量体画分を表す）。プロテインＡ後の収量＝９ｍｇ／Ｌ、５５％のヘテロ二量体を示す図である。
【図４】ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ＿ｗｏＧＳ（ＧＳなし）、Ｂ）ＳＤＳ−ゲル、Ｃ）ＳＥＣプロファイル（１８０，５９ｍＬにおけるピークは、ヘテロ二量体画分を表す）の概略図を示す図である。プロテインＡ後の収量＝５ｍｇ／Ｌ、８８％のヘテロ二量体。
【図５】本発明の抗体結合タンパク質の安定性を実証するグラフである。加速ストレス条件後の凝集の性質（２週間、４０℃）をＳＥＣによって査定した。比較における、−８０℃または４℃で貯蔵された同じタンパク質のＳＥＣプロファイル。Ａ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦＢ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールＣ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦＤ）ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳ。
【図６】ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量で全身におけるＭｏｌｍ１３腫瘍成長を阻害することを示す図である。
【図７】ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量で長骨における腫瘍退縮に関連する。
【図８】ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量で全身におけるＭｏｌｍ１３腫瘍成長を阻害することを示す図である。
【図９】ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量で長骨における腫瘍退縮に関連する。
【図１０】ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬおよびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬの構造の図表示である（ＬＡＬＡ突然変異（ＩｇＧ１骨格のＦｃが使用される場合）およびノブ−イントゥー−ホール突然変異をさらに示す）。
【図１１】抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールおよびそれらの一般化されたアミノ酸配列を表す配列番号７０の、式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃドメイン（Ｆｃ２）の配列アライメントを示す図である。抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６に記載されている。このアライメントから、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールの式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃドメイン（Ｆｃ２）は、「ノブ」突然変異の存在のために、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦの式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃドメイン（Ｆｃ２）と区別され、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１の式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃドメイン（Ｆｃ２）は、ＲＦ突然変異の非存在のために、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦの式［ＩＶ］のポリペプチドのＦｃドメイン（Ｆｃ２）とは異なることがわかる。
【図１２】抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールおよびそれらの一般化されたアミノ酸配列を表す配列番号６８の、式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃドメインの配列アライメントを示す図である。このアライメントから、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホールの式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃドメインは、「ホール」突然変異の存在のために抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦと区別されることがわかる。
【図１３】抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳの式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃドメインの配列アライメントを示す図である。
【図１４】抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａ、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳの式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ３ドメインの配列アライメントを示す図である。抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５１３８６に記載されている。このアライメントから、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳの式［ＩＩＩ］のポリペプチドのＦｃ３ドメインは、アミノ酸ＧＳの非存在のために、抗体様結合タンパク質ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１ａと区別されることがわかる。
【図１５】ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量で全身におけるＭｏｌｍ１３腫瘍成長を阻害することを示す図である。
【図１６】ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量で長骨における腫瘍退縮に関連することを示す図である。
【０３８８】
以下の実施例で示されるように、これらの抗ＣＤ３／抗ＣＤ１２３抗体様結合タンパク質は、精製の簡易化ならびに発現および精製中の凝集の低減をもたらし、したがって、ＣＤ１２３を発現する標的細胞、例えばＴＨＰ−１細胞の非存在下で低いＴ細胞活性化を有するが、ＣＤ１２３を発現する標的細胞、例えばＴＨＰ−１細胞の存在下で高いＴ細胞活性化を有しながら、ヘテロ二量体の量を増加させる突然変異を含む。
【実施例】
【０３８９】
実施例１：ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ、ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１およびＤＡＲＴ
１．１  ＣＤ１２３×ＣＤ３ＣＯＤＶまたはＤＡＲＴのＴ細胞を活性化する作用
安全性の読み出しとしてのＴ細胞の活性化状態に対する抗体様結合タンパク質の作用を、２．９に記載したように、初代ヒトＴ細胞の表面における活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現のフローサイトメトリーベースの検出によって分析した。比較には、ＷＯ２０１５０２６８９２において、互いにジスルフィド結合による共有結合で結合した配列番号８２の配列の第１のポリペプチド鎖（ＷＯ２０１５０２６８９２に示された配列番号１）および配列番号８３の配列の第２のポリペプチド鎖（ＷＯ２０１５０２６８９２に示された配列番号３）を含むと記載されたＤＡＲＴフォーマットの単鎖ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（本明細書では「ＭＧＤ００６」と称される）を用いた。ＣＯＤＶを単離されたＴ細胞単独と共にインキュベートしたところ、後期活性化マーカーＣＤ２５の発現における有意な増加は、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の表面において検出できなかった（データは示されない）。同様に、Ｔ細胞サブセットの両方において、早期活性化マーカーＣＤ６９の発現レベルにおいて濃度依存性の増加もなかった（表１）。したがって、このコンストラクトを活性ではない（ＮＡ）と評価した。対照的に、ＴＨＰ−１標的細胞を添加した場合、両方のマーカーの発現レベルにおける莫大な増加を測定することができた（ＣＤ２５データは示されない、ＣＤ６９データは表２）。
【０３９０】
【表４】
2019531701.tif 000029
【０３９１】
表１に示される結果によれば、単鎖抗体（ＤＡＲＴ）が、試験された条件下で、標的細胞の非存在下でより有意に高いＴ細胞活性化を引き起こすことが示される。
【０３９２】
【表５】
2019531701.tif 000030
【０３９３】
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」および単鎖ＤＡＲＴ  ＭＧＤ００６の細胞傷害作用を査定した。各二重特異性コンストラクトのＣＤ３ε／δ−複合体およびＣＤ１２３への親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した。さらに、細胞傷害アッセイを、２．８に記載されたようにして実行した（表３）。
【０３９４】
【表６】
2019531701.tif 000031
【０３９５】
分子が標的細胞の存在下（所望）および非存在下（不要）でＴ細胞活性化を開始させる可能性を査定するために、新しいアッセイを実行した。３８４ウェルプレートで、２ｇ／Ｌ（１１ｍＭ）グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０中、３７℃および５％ＣＯ２で、１：３のエフェクター対標的の比率で、ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２  Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ番号ＣＳ１７６４０１）をＴＨＰ−１標的細胞と共にインキュベートした。５時間後、インキュベーションを止め、発光マイクロプレートリーダーでＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｇ７９４０を使用して発光を測定した。
【０３９６】
【表７】
2019531701.tif 000032
【０３９７】
表４に示される結果から、全ての抗体様結合タンパク質が、標的細胞の存在下においてｎＭより低いＥＣ５０値でレポーター細胞活性化を誘導することが示される。Ｔ細胞係合アプローチのために、Ｔ細胞活性化は標的細胞の存在に制限されるべきである。これは、標的細胞の非存在下で有意な発光シグナルがないため、ＣＯＤＶ分子の場合でみられる。対照的に、単鎖ＤＡＲＴ分子は、標的細胞の非存在下で、より高いレポーター細胞株活性化を誘導する。これらの結果は、初代Ｔ細胞で得られた結果と一致する。
【０３９８】
１．２  インビボにおけるＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦおよびＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴの抗腫瘍活性
材料および方法
全血からのヒトＰＢＭＣおよびＴ細胞の単離
ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離を用いて健康なヒトドナーの全血から単離した。全血を滅菌リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で１：１に希釈した。次いで、３５ｍＬの希釈した血液の２つ分を、１５ｍＬのフィコールパック存在下で２本の５０ｍＬファルコンチューブに入れた。チューブを、室温、２００ｇで４０分ブレーキをかけずに遠心分離した。２つの軟膜層を回収し、６本の５０ｍＬファルコンチューブに４５ｍＬの滅菌ＰＢＳと共に入れ、室温で１０分間、１００ｇで３回、ブレーキをかけずに遠心分離した（各遠心分離の間に、上清を捨て、４５ｍＬのＰＢＳを添加した）。最後の遠心分離の後、５０ｍＬファルコンチューブ中で２つのペレットを一緒にして、ＰＢＳで最終容量を５０ｍＬにした。合計の生存可能なＰＢＭＣの数は、Ｖｉｃｅｌｌの計数によって定義された。次いでペレットを、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（１３０−０９１−２２１）からのＡｕｔｏｍａｃｓランニング緩衝液中に回収し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈからの陰性選択キット（１３０−０９１−１５６）およびＡｕｔｏｍａｃｓを製造業者の説明書に従って使用して、Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。精製されたＴ細胞を回収し、Ｘｖｉｖｏ−１５  ５％ＨＩＳ＋ｐｅｎｉ−ｓｔｒｅｐｔｏ１×培地中の培養物に細胞２．５×１０Ｅ＋６個／ｍＬの濃度で入れた。
【０３９９】
ヒトＴ細胞増幅
ヒト濃縮Ｔ細胞集団を活性化し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＴ細胞活性化／増殖キット（１３０−０９１−４４１）を使用してインビトロで１４日間増殖させた。
【０４００】
インビボでの投与のためのヒトＴ細胞調製物
細胞および細胞培養培地を４００ｇで１０分遠心分離した。滅菌ＰＢＳ中にペレットを細胞２×１０Ｅ＋７個／ｍｌの濃度で回収した。増幅されたＴ細胞からの活性化ビーズの除去を、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＭＡＣｓｉＭＡＧセパレーター（１３０−０９２−１６８）を製造業者の説明書に従って使用して実行した。濃縮されたＴ細胞集団をＶｉｃｅｌｌ計数によって計数し、５０ｍＬファルコンチューブ中の２５ｍＬの滅菌ＰＢＳ中に回収した。室温、４００ｇで１０分間の遠心分離工程後、十分な体積の滅菌ＰＢＳ中に細胞ペレットを回収して、細胞５×１０Ｅ＋７個／ｍＬの最終濃度を得た。
【０４０１】
腫瘍モデル
ＣＤ１２３を発現するＭｏｌｍ−１３ヒト急性骨髄性白血病細胞を、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｌｅｉｂｎｉｚ−ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ  Ｂｒａｕｎｓｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＲＰＭＩ１６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（ウシ胎児血清２０％を入れて完成させた）中での培養（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）で、細胞を成長させた。Ｍｏｌｍ−１３細胞を、複製能がないレンチウイルスによって運搬されたルシフェラーゼベクター（ＳＶ４０−ＰＧＬ４−Ｐｕｒｏ、すなわちルシフェラーゼ２に連結したシミアンウイルス４０プロモーターおよびピューロマイシン耐性カセット配列からなるルシフェラーゼベクター）に感染させた。
【０４０２】
Ｍｏｌｍ１３−ｌｕｃ＋腫瘍細胞を、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ  ＮＳＧマウス（動物１匹当たり２００μｌのＰＢＳ懸濁液中１０Ｅ＋６個の細胞）に静脈内（ＩＶ）注射した。２４時間後、同じマウスに０．２ｍＬの滅菌ＰＢＳの体積で１０Ｅ＋７個のヒトＴ細胞を腹腔内（ＩＰ）投与した。
【０４０３】
腫瘍埋め込み後３日目におけるベースラインの生物発光イメージングを、ＩＶＩＳ１００イメージャー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ３．２捕捉ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍ、ＵＳＡ）と共に使用して実行した。動物に、イメージングの１５分前に、ビートルルシフェリンカリウム塩（バッチ３１６０１９、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）のＰＢＳ中の１２０ｍｇ／ｋｇ溶液をＩＰ注射した。マウスを、イメージングの５分前に、ｋｅｔａｍｉｎｅ（登録商標）／ｋｅｔａｍｉｎｅ（登録商標）（１２０ｍｇ／ｋｇ；６ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ、５ｍｌ／ｋｇ）で麻酔した。
【０４０４】
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」およびＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ競合物（単鎖抗体であるＤＡＲＴフォーマットのＭＧＤ００６、または本明細書において「ＤＡＲＴツール」と称される近い類似体）または静脈内経路（ＩＶ）によるＰＢＳ処置を、表５で概説したように、腫瘍埋め込み後４日目に、すでに骨で検出可能な確立された腫瘍に開始した。
【０４０５】
【表８】
2019531701.tif 000033
【０４０６】
データ収集および効能の基準
療法の影響を追跡するために、動物の体重を３日目からアッセイの最後までモニターした。連続した３日間で２０％の体重減少または１５％の体重減少をもたらした、または１０％またはそれより多くの薬物に関連する死を引き起こした投薬量を、過剰に毒性の投薬量とみなした。動物の体重は腫瘍の重量を含んでいた。
【０４０７】
非侵襲的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって腫瘍量を追跡した。腫瘍埋め込み後３日目に、処置開始の２４時間前にベースラインＢＬＩを実行した。動物を、全身生物発光シグナルに基づく異なる群に分けた。腫瘍の埋め込み後の７、１０および１４日目に、ＢＬＩシグナル測定によって、全身および後肢の長骨における腫瘍成長を追跡した。長骨のシグナルを、セグメンテーションによって測定したが、すぐ近くの局所領域的なシグナル（例えば後続のタイムポイントの軟部組織における残留シグナル）によって影響を受ける可能性があった。処置群を、Ｍｏｌｍ１３−ｌｕｃ＋播種性腫瘍およびヒトＴ細胞を有する対照動物と比較した。
【０４０８】
一次効能評価項目は、処置された群と対照群とにおける腫瘍シグナルのベースラインからの変化の比率（ｄＴ／ｄＣ）、一部腫瘍退縮（ＰＲ）の数および完全腫瘍退縮（ＣＲ）の数であった。
【０４０９】
時間に対する生物発光シグナル曲線（フォトン／秒で表される）に基づく腫瘍成長を、各処置群の各動物につきモニターし、全身および骨のセグメント化シグナルの両方に関して中央値曲線±ＭＡＤとして示した。１回目の処置の日（分類日）の腫瘍シグナルを、特定された観察日の腫瘍シグナルから引くことによって、腫瘍生物発光シグナルの変化を対照（Ｃ）または処置（Ｔ）動物それぞれにつき毎日計算した。中央値Ｔは、処置群で計算され、中央値Ｃは、対照群で計算される。
【０４１０】
次いで比率Ｔ／Ｃを計算し、パーセンテージとして表す：
ｄＴ／ｄＣ＝［（観察日の中央値Ｔ−３日目の中央値Ｔ）／（観察日の中央値Ｃ−３日目の中央値Ｃ）］×１００。
【０４１１】
用量は、実験の最後（１４日目）におけるｄＴ／ｄＣが４２％より低い場合、治療活性を有するとみなされ、ｄＴ／ｄＣが１０％より低い場合、非常に活性であるとみなされる。
【０４１２】
腫瘍退縮パーセントは、特定された観察日の処置群における腫瘍シグナルの、その１日目の処置におけるシグナルと比較した減少の％と定義される。具体的なタイムポイントで、各動物につき、退縮％は、以下のように計算される：
【数１】
2019531701.tif 000034
【０４１３】
ルシフェリンの反応速度および起こり得るＩＰ注射のミスに起因するシグナル変動のリスクを考慮して、動物ごとのシグナル退縮は、少なくとも２つの連続したタイムポイントで観察された場合のみ真の腫瘍退縮とみなされる。
【０４１４】
部分退縮（ＰＲ）：２つの連続したタイムポイントで腫瘍シグナルが処置の開始時のシグナル未満に減少し、一方のみがベースラインシグナルの５０％より優れている場合、退縮は、部分的と定義される。
【０４１５】
完全退縮（ＣＲ）：２つの連続したタイムポイントで腫瘍シグナルが処置開始時のシグナルより５０％より大きく減少する場合、退縮は、完全と定義される。
【０４１６】
統計的分析
ＩＶ経路の化合物の評価
１日当たり繰り返しの測定を用いた二元配置ａｎｏｖａに続きペアワイズ多重比較のためのボンフェローニ−ホルムの補正を使用して、各処置群の個々の生物発光シグナルを他のものと比較した：ｐ＞０．０５：ＮＳ、０．０５＞ｐ＞０．０１：＊、ｐ＜０．０１：＊＊。統計的分析は、全身の生物発光シグナルと長骨の生物発光シグナルの両方に対して実行される。
【０４１７】
結果
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶ
ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量でＭｏｌｍ１３腫瘍成長を阻害し（１．３、０．１３および０．０１３ｎｍｏｌ／Ｋｇ  Ｑ３ｄ）、ｄＴ／ｄＣは、全身でそれぞれ２０％、１４％および３８％であり（図６および８）、全ての試験された用量で長骨における腫瘍退縮と関連しており、それぞれ４／７がＣＲ、６／８がＣＲ、２／６がＣＲであった（図７および９）。
【０４１８】
全身および骨において、完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」の最大反応が０．１３ｎｍｏｌ／ｋｇ  Ｑ３ｄで得られた。この用量で、活性は、ＤＡＲＴ  １．３ｎｍｏｌ／ｋｇ  ＩＶＱｄと統計学的に異なっていなかった（全身においてｄＴ／ｄＣ２９％、１／７ＣＲ、長骨において１／７ＰＲ）。データは、最後の組織病理学分析（示されていない）によって確認された。
【０４１９】
全身と長骨とで観察された差は、ＩＶ注射後の、卵巣および腹部の脂肪における残留した腫瘍の成長とそれに続く髄外の腫瘍播種に関連する。
【０４２０】
１．３  インビボにおけるＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦおよびＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦの抗腫瘍活性
材料および方法
ヒトＴ細胞の単離および増幅は段落１．２に記載された通りである。
【０４２１】
腫瘍モデル
腫瘍モデルは段落１．２に記載した通りである。ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」または静脈内経路（ＩＶ）によるＰＢＳ処置を、表６で概説したように、腫瘍埋め込み後４日目に、すでに骨で検出可能な確立された腫瘍に開始した。
【０４２２】
統計的分析
ＩＶ経路の化合物評価は、段落１．２に記載された通りである。
【０４２３】
【表９】
2019531701.tif 000035
【０４２４】
結果
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶ
ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量でＭｏｌｍ１３腫瘍成長を阻害し（１．３、０．１３および０．０１３ｎｍｏｌ／Ｋｇ  Ｑ３ｄ）、δＴ／δＣは、全身でそれぞれ７％、５％および１５％であり、全ての試験された用量で長骨における腫瘍退縮と関連しており、それぞれ５／８がＣＲ、８／８がＣＲ、４／６がＣＲであった（図１５および１６）。
【０４２５】
全身および骨において、完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」の最大反応が０．１３ｎｍｏｌ／ｋｇ  Ｑ３ｄで得られた。
【０４２６】
ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶ
ヒトＴ細胞の存在下における完全ヒトＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」ＩＶＱ３ｄは、全ての試験された用量でＭｏｌｍ１３腫瘍成長を阻害し（１．３、０．１３および０．０１３ｎｍｏｌ／Ｋｇ  Ｑ３ｄ）、δＴ／δＣは、全身でそれぞれ１２％、６％および４％であり、全ての試験された用量で長骨における腫瘍退縮と関連しており、それぞれ８／８がＣＲ、５／７がＣＲ、７／７がＣＲであった（図１５および１６）。
【０４２７】
全ての試験された用量で、ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」活性は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ「ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３」と統計学的に異なっていなかった。データは、最後の組織病理学分析によって確認された。
【０４２８】
全身と長骨とで観察された差は、ＩＶ注射後の、卵巣および腹部の脂肪における残留した腫瘍の成長とそれに続く髄外の腫瘍播種に関連する。
【０４２９】
実施例２：ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３  ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１、ｈｚ２０Ｇ６×ｈｚ７Ｇ３  ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１のバリアント
２．１  ｈＣＤ３ε／δ−ｈＦｃ融合発現プラスミド（ＣＤ３ｅｄ−Ｆｃ）の構築
ｃＤＮＡを含有するプラスミドをテンプレートとして使用して、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３εおよびＣＤδ融合タンパク質を、本明細書の以下で詳細に説明したようにして、リーディングフレーム中に、ヒンジ領域、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを包含し、加えて任意選択のタンデム精製のための８×ＨｉｓまたはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグを有する重鎖定常領域と共に生成した。
【０４３０】
ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、シグナル配列を包含するヒトＣＤ３εおよびヒトＣＤδサブユニット細胞外ドメインを増幅した。得られた増幅、切断、精製されたＰＣＲ産物を、ライゲーションＰＣＲによって組み合わせ、哺乳類発現ベクターｐＸＬに、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用した注入方法によってライゲートした。各サブユニットを、１つのプラスミドにクローニングした。得られた成熟ヒトＣＤ３εＨｉｓタグ付きＦｃ融合タンパク質の配列は、本明細書において配列番号３で開示される。配列番号３のアミノ酸１から１０４は、野生型全長ヒトＣＤ３ε（本明細書において配列番号１で開示された、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｐ０７７６６で入手可能）タンパク質のアミノ酸２３から１２６、したがってヒトＣＤ３εの細胞外ドメインに対応する。
【０４３１】
カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、シグナル配列を包含するカニクイザルＣＤ３εおよびＣＤ３δ細胞外ドメインを増幅した。得られた増幅、切断、精製されたＰＣＲ産物を、ライゲーションＰＣＲによって組み合わせ、哺乳類発現ベクターｐＸＬに、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用した注入方法によってライゲートした。各サブユニットを、１つのプラスミドにクローニングした。成熟カニクイザルＣＤ３εＦｃ融合タンパク質に関して得られた配列は、配列番号４で開示される。配列番号３のアミノ酸１から９５は、全長カニクイザルＣＤ３εタンパク質のアミノ酸２３から１１７に対応し、したがって、野生型全長カニクイザルＣＤ３εの細胞外ドメインを含む（本明細書において配列番号２で開示された、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｑ９５ＬＩ５で入手可能）。クローニングされた融合タンパク質は、野生型配列のアミノ酸位置５７と比較してアミノ酸位置３５に１つのアラニンからバリンへの交換をさらに含有する。
【０４３２】
２．２  ヒトおよびカニクイザルＣＤ３ε／δ−Ｆｃの発現および精製
Ｆ１７血清非含有懸濁培養液（Ｌｉｆｅ）中で成長するＦｒｅｅｓｔｙｌｅＨＥＫ２９３細胞を、発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした。ＣＤ３εおよびＣＤ３δ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）サブユニットを示す両方のプラスミドのコトランスフェクションを、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ）を使用して実行した。細胞を３７℃で７日間培養した。組換えタンパク質を含有する培養上清を遠心分離によって回収し、ろ過（０．２２μｍ）によって透明化した。
【０４３３】
精製のために、Ｆｃ融合タンパク質バリアントをプロテインＡマトリックス（ＧＥ）上で捕獲し、ｐＨのシフトによって溶出させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と最終的な限外ろ過濃縮工程によってタンパク質を洗練させた後、タンパク質をさらなるアッセイに使用した。
【０４３４】
ヒトヘテロ二量体をプロテインＡで捕獲して脱塩した後にＨｉｓ−Ｔｒａｐカラム（ＧＥ）上にさらに適用した。溶出したタンパク質をストレプトアビジンカラム（ＧＥ）に適用し、ｄ−デスチオビオチンで溶出させ、その後、最終的にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を使用したＳＥＣによって洗練させた。この戦略を使用して、ホモ二量体からヘテロ二量体を単離した。
【０４３５】
２．３  ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）−ｈＦｃ融合発現プラスミド（ＣＤ１２３−Ｆｃ−Ｈｉｓ）の構築
ｃＤＮＡを含有するプラスミドをテンプレートとして使用して、リーディングフレーム中に、重鎖定常領域、ヒンジ領域、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有し、追加でヘキサヒスチジンタグを有するヒトＣＤ１２３融合タンパク質を生成した。
【０４３６】
ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、シグナル配列を包含するヒトＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）細胞外ドメインを増幅した。得られた増幅、切断、精製されたＰＣＲ産物を、ライゲーションＰＣＲによって組み合わせ、哺乳類発現ベクターｐＸＬに、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用した注入方法によってライゲートした。得られた成熟ヒトＣＤ１２３Ｈｉｓ−ＩＩタグ付きＦｃ融合タンパク質の配列は、配列番号１４で開示される。アミノ酸１から２８４は、全長野生型ヒトＣＤ１２３タンパク質（本明細書において配列番号１２で開示され、ＮＣＢＩデータベースから受託番号ＮＰ＿００２１７４．１で入手可能）のアミノ酸２２から３０５、したがってヒトＣＤ１２３の細胞外ドメインに対応する。
【０４３７】
２．４  ヒトＣＤ１２３−Ｆｃ−Ｈｉｓの発現および精製
Ｆ１７血清非含有懸濁培養液（Ｌｉｆｅ）中で成長するＦｒｅｅｓｔｙｌｅＨＥＫ２９３細胞を、発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションを、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ）を使用して実行した。細胞を３７℃で７日間培養した。組換えタンパク質を含有する培養上清を遠心分離によって回収し、ろ過（０．２２μｍ）によって透明化した。
【０４３８】
精製のために、Ｆｃ融合タンパク質バリアントをプロテインＡマトリックス（ＧＥ）上で捕獲し、ｐＨのシフトによって溶出させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を使用したＰＢＳ中のＳＥＣと最終的な限外ろ過濃縮工程によってタンパク質を洗練させた後、タンパク質をさらなるアッセイに使用した。
【０４３９】
本発明のポリペプチドのそれぞれ、例えば２．１章から２．４章に記載されるものは、Ｈｉｓ−タグまたはＳｔｒｅｐタグなどのタグを含んでいてもよく、このようなものとして、タグは、例えば精製をより簡単にすることができる。タグは、例えば、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、また配列番号８５）またはＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、また配列番号８４）に相当していてもよく、これらの２つのタグは互いに置き換え可能である。代替として、本発明のポリペプチドは、いかなるタグも含まない。本明細書に記載されるあらゆるポリペプチドのタグを有さない形態とタグを有する形態はどちらも、本発明の範囲内に含まれる。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、それらの分泌をより簡単におよび／またはより効率的にするシグナルペプチドおよび／またはプロペプチドを含む。代替として、本発明のポリペプチドは、成熟ポリペプチド、すなわちシグナルペプチドおよびプロペプチドを欠いたポリペプチドに相当する。本明細書に記載されるあらゆるポリペプチドの成熟および全長形態はどちらも、本発明の範囲内に含まれる。
【０４４０】
２．５  ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質の発現および精製
モノクローナル抗体「ｈｚ２０Ｇ６」および「ｈｚ７Ｇ３」の配列を使用した二重特異性ＣＤ３×ＣＤ１２３ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質を、発現させ精製した。
【０４４１】
Ｆ１７血清非含有懸濁培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長するＦｒｅｅＳｔｙｌｅＨＥＫ２９３細胞を、等しい比率の軽鎖および重鎖プラスミドでトランスフェクトした。ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質について、抗体情報は１つの軽鎖および１つの重鎖にコードされており（図１〜３）、それに対して、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質、例えばＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ  ＧＳなし（図４）について、１つの軽鎖および２つの重鎖プラスミドを、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を製造業者の説明の通りに使用してトランスフェクトした。細胞を、３７℃で、１１０ｒｐｍのＫｕｈｎｅｒ  ＩＳＦ１−Ｘ振盪インキュベーター中、８％ＣＯ２で培養した。７日の培養後、遠心分離によって細胞を除去し、１０％Ｖｏｌ／Ｖｏｌの１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加し、０．２μＭボトルトップフィルターを介して上清をろ過して、粒子を除去した。全てのＣＯＤＶ分子、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質、加えてＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって、プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。０．１Ｍのクエン酸塩、ｐＨ３．０を用いてカラムから溶出させた後、ＣＯＤＶコンストラクトを、ＰＢＳ中に配合されたＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（Ｇｉｂｃｏ  １４１９０−１３６）を使用して脱塩した。
【０４４２】
凝集体から単量体を分離するために、両方のコンストラクト、すなわちＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１抗体様結合タンパク質およびＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１抗体様結合タンパク質のための、ＰＢＳ中での高分解能の精留工程（Ｇｉｂｃｏ  １４１９０−１３６）を、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０  ３２０ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号：２９−９８９３−３６）を使用して実行した。単量体の画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０遠心分離カラム（ＶＳ２００２  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２２μｍの膜（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）シリンジフィルターＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を使用してろ過した。
【０４４３】
タンパク質濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。各バッチを、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、各サブユニットおよび単量体の純度および分子量を決定した。
【０４４４】
Ｃｈａｒｌｅｓ  ｒｉｖｅｒからのＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステムを用いて定量的なＬＡＬアッセイを実行して、内毒素非含有のサンプルを確認した。
【０４４５】
【表１０】
2019531701.tif 000036
【０４４６】
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールの発現は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦと比較して、より高い収量でより多くの量の正しいヘテロ二量体画分をもたらした。驚くべきことに、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦの場合でみられるように、ＲＦ突然変異の位置の変化が、この陽性作用を逆転させた。ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳの立体配置は、ヘテロ二量体画分の量に陽性作用を与えたが、収量には影響を与えなかった（表６）。
【０４４７】
２．６  ＳＰＲを使用したＣＤ３×ＣＤ１２３ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質のヒトＣＤ３ε／δおよびヒトＣＤ１２３に対する親和性の査定
ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質のヒトＣＤ３ε／δおよびヒトＣＤ１２３に対する結合親和性を、アッセイ緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＢｉａｃｏｒｅ３０００またはＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ＣＤ３ε／δ−ＦｃまたはＣＤ１２３−Ｆｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質の捕獲は、Ｈｉｓ捕獲キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して達成された。捕獲抗体を、アミンカップリングキット（ＢＲ−１００−５０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におよそ１２．０００ＲＵまでカップリングした。ＣＤ３εδ−ＦｃまたはＣＤ１２３−Ｆｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質を１０μｌ／分で捕獲して、３０ＲＵのＲｍａｘ値を得た。ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質との結合反応速度を３０μｌ／分で測定した。アッセイ緩衝液での３から２００ｎＭのＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質の２倍希釈液を使用した。二重の参照のために２連の緩衝液ブランクと共に、全てのＦａｂ濃度を２連で試行した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を３０μｌ／分で１分間の注入することにより捕獲表面の再生を実行した。データ分析のために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。物質移動を用いた１：１のラングミュアモデルを使用して、データを全体的にフィッティングした。
【０４４８】
【表１１】
2019531701.tif 000037
【０４４９】
異なるＣＤ３×ＣＤ１２３ＣＯＤＶ、いわゆるＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホール、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦ”、ＣＯＤＶ−ＦａｂＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳで得られたｈｕＣＤ３εδおよびｈｕＣＤ１２３への結合反応速度は、全ての試験されたコンストラクトで類似している。
【０４５０】
２．７  ＣＤ３×ＣＤ１２３ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質の安定性の査定
２．７．１  示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）によって測定された熱安定性
示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）を使用して融点Ｔｍを決定した。白色のセミスカート９６−ウェルプレート（ＢＩＯＲＡＤ）中で、Ｄ−ＰＢＳ中のＳＹＰＲＯ−オレンジ色素の４×濃縮溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＭＳＯ中の５０００×ストック）を包含する０．２μｇ／μｌの最終濃度に、サンプルをＤ−ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した。全ての測定を、ＭｙｉＱ２リアルタイムＰＣＲ機器（ＢＩＯＲＡＤ）を使用して２連で行った。ｉＱ５ソフトウェアｖ２．１（ＢＩＯＲＡＤ）で融解曲線の負の一次関数曲線（−ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ）を作成した。次いでＴｍ決定とデータの図式的な表示のためにデータをＥｘｃｅｌにエクスポートした。５６〜５７℃で全ての試験したＣＯＤＶコンストラクトの融点（表８）は非常に類似していることが見出された。
【０４５１】
【表１２】
2019531701.tif 000038
【０４５２】
２．７．２  加速温度ストレスにおける安定性
加速温度ストレス下でのＣＯＤＶコンストラクトの安定性を査定するために、タンパク質を、０．５ｍＬの安全ロックチューブ（エッペンドルフＢＩＯＰＵＲ）中で、Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中１ｍｇ／ｍｌで、４０℃で２週間インキュベートした。対照サンプルを、−８０℃および４℃で同じ期間維持した。ストレス処理後、ＢｉｏＳＥＣｃｕｒｉｔｙ  ＨＰＬＣシステム（ＰＳＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いた分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、サンプルを凝集体含量に関して分析した。５μｌのタンパク質溶液を使用して、ランニング緩衝液として２５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ６．７を０．２５ｍｌ／分で用いたＴＳＫゲルＳＷ−タイプガードカラム（４μｍ、４，６×３５ｍｍ、東ソーバイオサイエンス）を備えたＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４μｍ、４，６×３００ｍｍ、東ソーバイオサイエンス）で、クロマトグラフィーを行った。データをＷｉｎＧＰＣソフトウェア（ＰＳＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて分析した。加速温度ストレス後に分析された全てのＣＯＤＶコンストラクトは、対照サンプルと比較して凝集体含量の増加を示した（図５）。ストレス後の凝集体含量は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦ（ＰＢ０５１２６）では６％、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールでは４．１％、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦでは６．６％、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＯＬ１−ノブ×ホール−ＲＦｗｏＧＳでは３．４％であった。
【０４５３】
２．８  ＣＯＤＶ  ＣＤ１２３×ＣＤ３によって媒介されたＴＨＰ−１細胞に対する細胞傷害作用
ＣＯＤＶ  ＣＤ１２３×ＣＤ３のＴ細胞係合作用を、フローサイトメトリーベースの細胞傷害アッセイによって分析した。
【０４５４】
エフェクター細胞は、健康なドナーの全血から単離した初代Ｔ細胞であった。ＴＨＰ−１細胞を、ＣＤ１２３を発現する標的細胞として使用した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＥＤＴＡで処置された健康なドナーの２００ｍｌの末梢血液からフィコール比重遠心分離によって単離した。１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、５０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に事前にローディングした。血液をａｕｔｏＭＡＣＳリンス緩衝液＋１％ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で希釈し、合計１０個の用意されたチューブの膜にローディングした。チューブを、１０００×ｇで１０分間ブレーキをかけずに遠心分離した。ＰＢＭＣを収集し、ａｕｔｏＭＡＣＳリンス緩衝液＋１％ＢＳＡで３回洗浄した。最終的に、ａｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ技術によって、汎用Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の説明書に従って使用してＴリンパ球を単離するために、ＰＢＭＣをａｕｔｏＭＡＣＳランニング緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に再懸濁した。分離されたＴ細胞の純度を、ヒト用の７色免疫表現型検査キット（７−Ｃｏｌｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメトリーによって分析した。
【０４５５】
標的細胞（すなわちＴＨＰ−１細胞株）を、１ｍｌのＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ＋１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１μＭのＣＦＳＥを用いて、３７℃で１５分間染色した。２．５Ｅ４個の標的細胞を、９６−ウェルのＵ底懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に、培地５０μｌ／ウェルでシーディングした。
【０４５６】
単離された初代ヒトＴリンパ球をＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、示されたエフェクター対標的の比率（一般的にＥ：Ｔ＝１０：１）で、標的細胞に５０μｌ／ウェルで添加した。
【０４５７】
二重特異性抗体様結合タンパク質を、１ｍｌのＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ＋１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＰＢＳで連続的に１：３に希釈し、それぞれ５μｌを、３０００ｎｇ／ｍｌまでの最終的な最大濃度で細胞に添加した。アッセイを、５％ＣＯ２、３７℃で２０時間インキュベートした。
【０４５８】
死んだ標的細胞を検出するために、全ての細胞を７−ＡＡＤで染色した。したがって、ＦＢＳを含む染料緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で希釈した５μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤを各ウェルに添加し、暗所で、４℃で３０分までインキュベートした。それぞれＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）またはＬＳＲＩＩもしくはＶｅｒｓｅ（両方ともＢＤ）フローサイトメーターを使用して細胞を測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してさらなるデータ分析を実行した。読み出しは、ＣＦＳＥおよび７−ＡＡＤの二重陽性細胞のパーセンテージであった。ＸＬｆｉｔ（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ２０５）によって曲線を計算した。
【０４５９】
表９で示されるように、二重特異性抗体様結合タンパク質は、インビトロで初代Ｔ細胞を係合し、ＴＨＰ−１標的細胞を溶解させることができた。２０時間のコインキュベーション後、抗体濃度依存性の死んだ標的細胞の増加を検出することができた。ここで示された抗体様結合タンパク質に関して、０．８から１．２ｐＭの間の範囲のＥＣ５０値が計算された。
【０４６０】
【表１３】
2019531701.tif 000039
【０４６１】
ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦまたはＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールにおける骨格の突然変異の導入は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦと比較して、これらの分子に関する機能的なパラメーターを変更しないことから、これらのＣＯＤＶ改変は、Ｔ細胞係合における活性のいかなる損失も引き起こさないことが示される。
【０４６２】
２．９  標的細胞の存在下（活性の読み出し）および非存在下（安全性の読み出し）におけるＴ細胞活性化に対するＣＤ１２３×ＣＤ３ＣＯＤＶ抗体様結合タンパク質の作用
活性または安全性の読み出しとしてのＴ細胞の活性化状態に対する二重特異性抗体様結合タンパク質の作用を、標的細胞の存在下（条件は２．８．を参照）または非存在下のいずれかにおける、初代ヒトＴ細胞の表面における活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現のフローサイトメトリーベースの検出によって分析した。単離された初代ヒトＴリンパ球を、ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、２．５Ｅ５個の細胞を、９６−ウェルのＵ底懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に５０μｌ／ウェルでシーディングした。
【０４６３】
どちらのＴ細胞も排他的に試験し、ウェルを５０μｌのＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ＋１０％ＦＣＳで充填するか、または標的細胞（すなわちＴＨＰ−１細胞株）を５０μｌのＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ＋１０％ＦＣＳ中細胞２．５Ｅ４個／ウェルで添加した。
【０４６４】
二重特異性抗体様結合タンパク質を、ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸＩ＋１０％ＦＣＳまたはＰＢＳで連続的に１：３または１：１０に希釈し、それぞれ５μｌを、３０００００ｎｇ／ｍｌまでの最終的な最大濃度で細胞に添加した。アッセイを、５％ＣＯ２、３７℃で２０時間インキュベートした。
【０４６５】
インキュベーション時間後、細胞を遠沈させ、ウェル１つ当たり、ＦＢＳ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む、続いて標識抗体：ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ６９−ＰＥ−Ｃｙ７を含む１００μｌの染料緩衝液中で４℃で１５分間染色した。
【０４６６】
蛍光マイナスワン（ＦＭＯ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ）対照として、活性化されたＴ細胞を上述したようにして染色し、ただし１つのチューブにおいてＣＤ２５をそのアイソタイプ（アイソタイプＡＰＣ−ＩＧ１ｋ）で置き換え、第２のチューブにおいてＣＤ６９をそのアイソタイプ（アイソタイプＰＥ−Ｃｙ７−ＩＧ１ｋ）で置き換えた。
【０４６７】
細胞を染色後に２回洗浄し、ＦＢＳを含む１５０μｌの染料緩衝液に再懸濁し、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）フローサイトメーターを使用して１００００個の細胞を測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してさらなるデータ分析を実行した。読み出しは、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ６９陽性、ＣＤ８陽性ＣＤ２５陽性、およびＣＤ８陽性ＣＤ６９陽性Ｔ細胞のパーセンテージであった。ＦＭＯ対照に従ってゲートを設定した。
【０４６８】
表１０は、標的細胞の存在下（活性の読み出し）におけるＴ細胞活性化の結果を示す。標的細胞の発現のＥＣ５０値は、細胞傷害アッセイで観察されたＥＣ５０値に非常に類似している。ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ−ＲＦ×ホールまたはＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ノブ×ホール−ＲＦにおける骨格への突然変異の導入は、ＣＯＤＶ−Ｆａｂ−ＴＬ１−ＲＦと比較して、この分子に関する機能的なパラメーターを変更しないことから、これらのＣＯＤＶ−Ｆａｂ改変は標的アプローチに適合することが示される。
【０４６９】
【表１４】
2019531701.tif 000040
【０４７０】
表１０および１１は、高濃度（１００ｎＭ、ＥＣ５０より５ｌｏｇ高い）のＣＤ４＋（表１１）およびＣＤ８＋（表１２）Ｔ細胞に対する二重特異性抗体における、標的細胞の非存在下（安全性の読み出し）および存在下（活性の読み出し）でのＴ細胞活性化の結果（ＣＤ６９発現に基づく）を示す。標的細胞の非存在下で極めてわずかなパーセンテージのＴ細胞がＣＤ６９陽性になるが、分子間で、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞間で大きな差はない。表１０にも示されるように、全てのＣＯＤＶが、標的細胞の存在下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導する。したがって、ＣＯＤＶ分子における骨格への突然変異の導入は、標的細胞の非存在下でＴ細胞活性化に関する不要な作用を誘導しない。
【０４７１】
【表１５】
2019531701.tif 000041
【０４７２】
【表１６】
2019531701.tif 000042
【図１】
2019531701.tif 000043
【図２】
2019531701.tif 000044
【図３】
2019531701.tif 000045
【図４】
2019531701.tif 000046
【図５】
2019531701.tif 000047
【図６】
2019531701.tif 000048
【図７】
2019531701.tif 000049
【図８】
2019531701.tif 000050
【図９】
2019531701.tif 000051
【図１０】
2019531701.tif 000052
【図１１】
2019531701.tif 000053
【図１２】
2019531701.tif 000054
【図１３】
2019531701.tif 000055
【図１４】
2019531701.tif 000056
【図１５】
2019531701.tif 000057
【図１６】
2019531701.tif 000058
【配列表】
2019531701000001.app
【国際調査報告】
2019531701.tif 000059
2019531701.tif 000060
2019531701.tif 000061
2019531701.tif 000062
2019531701.tif 000063
2019531701.tif 000064
2019531701.tif 000065