(57)【要約】  合成口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）モザイクポリペプチド、及びこのモザイクポリペプチドをコードする核酸分子を開示する。本モザイクポリペプチドは、天然のＦＭＤＶポリペプチドよりも大きなＴ細胞エピトープカバレージを有し、通常のＦＭＤＶエピトープは含むが、希なＦＭＤＶエピトープは含まない。本モザイクポリペプチドがＦＭＤＶゲノムの一部として含まれる場合、モザイクポリペプチドは、ウイルスの複製及びＦＭＤＶ粒子への集合を可能とする。本モザイクポリペプチド及び核酸の組成物は、広範な血清型ＡのＦＭＤＶ株に対する防御を提供する免疫応答を惹起するのに用いることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、合成ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ポリペプチド。
【請求項３】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１又は２に記載の合成ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を含む第１の合成ポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の合成ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを含む、組換え口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）。
【請求項７】
配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドを含む、請求項６に記載の組換えＦＭＤＶ。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である合成ポリペプチドを含む第１の組換えＦＭＤＶと、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である合成ポリペプチドを含む第２の組換えＦＭＤＶと、薬学的に許容される担体とを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の合成ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号１又は配列番号３の塩基配列を含む、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項９に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターであって、ＦＭＤＶのＬタンパク質、ＶＰ４タンパク質、Ｐ２タンパク質及びＰ３タンパク質のコード配列を更に含み、許容宿主細胞に前記ベクターをトランスフェクトすることにより、感染性ＦＭＤＶが生産される、ベクター。
【請求項１３】
被験体において血清型Ａの口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対する免疫応答を惹起する方法であって、配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９８％同一である合成ポリペプチドを含む組成物を前記被験体に投与し、血清型ＡのＦＭＤＶに対する免疫応答を惹起することを含む方法。
【請求項１４】
前記合成ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４の配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記合成ポリペプチドを含む前記組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記合成ポリペプチドを含む前記組成物は、アジュバントを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である合成ポリペプチドを含む第１の組成物と、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である第２の合成ポリペプチドを含む第２の組成物とを、前記被験体に投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１及び第２の組成物を前記被験体の異なる解剖学的部位に投与する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の合成ポリペプチド及び核酸、並びに血清型ＡのＦＭＤＶに対して広範な免疫応答を誘導するためのこれらの使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、米国特許法第１１９（ｅ）の下で、２０１６年１０月３１日出願の米国特許仮出願第６２／４１５，１２４号の優先権を主張するものであり、本参照をもって、当該仮出願の内容全体を本願の一部を構成するものとして援用する。
【０００３】
［政府支援に関する承認］
本発明は、米国エネルギー省による契約番号ＤＥ−ＡＣ５２−０６ＮＡ２５３９６の下、米国政府支援によりなされたものである。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ＦＭＤＶは家畜疾病をもたらし、ＦＭＤＶ流行地域に深刻な経済的影響を及ぼす。更に、ＦＭＤＶが流行していない地域でＦＭＤＶが発病すれば、大きな経済的損害となる可能性がある。現在、アウトブレイク（outbreak）のコントロール戦略としての「殺処分、焼却、埋める」は、経済、動物への慈悲及び戦略に関する理由から満足いくものではない（Breeze, Biosecur Bioterro 2(4): 254-264, 2004）。ワクチン接種はアウトブレイクの管理に不可欠な要素となり得るが、入手可能なワクチンは不活化ウイルスに基づくため、費用、製造安全性、免疫期間、防御の程度に関して満足いくものではない（Rodriguez and Gay, Expert Rev Vaccines 10(3):377-387, 2011; Robinson et al., Transbound Emerg Dis 63(Suppl 1):30-41, 2016）。北米以外では、ＥＵ、オーストラリア及びニュージーランドでＦＭＤＶは広く流行している。ＦＭＤＶは自然環境に耐性があり、感染力が高い。米国におけるＦＭＤＶのアウトブレイクの直接の経済的影響は数百億ドルから数千億ドルと見積もられるが、迅速かつ広範なワクチン接種によりこのコストを半分に減らせる可能性がある（Schroeder et al., Journal of Agricultural and Applied Economics 47:47-76, 2015）。
【０００５】
ＦＭＤＶには７種の主たる血清型があり、うち４種（Ａ、Ｏ、Ｃ及びＡｓｉａ−１)は広く分布し、３種（ＳＡＴ−１、ＳＡＴ−２及びＳＡＴ−３）は主にサハラ以南のアフリカで見出される。血清型内での多様性が高いため、同一血清型の単離体の間ですらクロス防御性は低い。この多様性の観点から、個々のアウトブレイクについて、多くのワクチン株の内の一株をフィールドに適合させる必要がある。ＦＭＤＶワクチンの最近の発展により、多くの分野で改善がなされたものの（Robinson et al., Transbound Emerg Dis 63(Suppl 1):30-41, 2016）、防御の程度は限定的である。即ち、多くのワクチンは、そのワクチン株に密接に関連するアウトブレイクのみを防御するものであり、全ての起こり得るアウトブレイクの防御に対しては莫大なワクチンの備蓄が必要となるであろう。
【０００６】
従って、異なるＦＭＤＶ株に対するワクチン誘導型防御の程度を改善する必要が未だ存在する。
【発明の概要】
【０００７】
天然のＦＭＤＶポリペプチドに比べ、高レベルのＴ細胞エピトープカバレージを提供し、且つ最小限の非天然エピトープやレアエピトープしか有さないＦＭＤＶモザイクポリペプチドを開示する。ここに開示されるモザイクポリペプチドと核酸組成物は、広範な血清型ＡのＦＭＤＶ株に対する防御を提供する免疫応答の惹起に使用することができる。
【０００８】
モザイクポリペプチドＶＰ４．２．１（配列番号２）又はモザイクポリペプチドＶＰ４．２．２（配列番号４）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する合成ＦＭＤＶポリペプチドを提供する。前記モザイクポリペプチドを含む組換えＦＭＤＶも提供する。
【０００９】
更に、モザイクＶＰ４．２．１ポリペプチド及びＶＰ４．２．２ポリペプチドをコードする核酸分子及びベクターを提供する。幾つかの実施形態において、前記ベクターは、前記ベクターが許容宿主細胞にトランスフェクトされた際に感染性ＦＭＤＶが生産されるよう、残りのＦＭＤＶタンパク質をコードする配列を含む。
【００１０】
本開示により、一種若しくは両種のモザイクＦＭＤＶポリペプチド、又は一種若しくは両種のモザイクＦＭＤＶポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物も提供される。幾つかの実施例において、前記組成物は、前記モザイクポリペプチドを含む、或いはそれぞれが異なるモザイクＦＭＤＶポリペプチドを有する２種の組換えＦＭＤＶを含む。
【００１１】
また、被験体においてＦＭＤＶに対する免疫応答を惹起する方法、及び本明細書に開示するモザイクＦＭＤＶポリペプチド、核酸分子、ベクター、組換えＦＭＤＶ又は組成物を被験体に投与することにより、前記被験体をＦＭＤＶに対し免疫化する方法を提供する。
【００１２】
本発明の前述及びそれ以外の目的、特徴及び利点は、添付の図面に参照する次の詳細な説明により一層明らかとなろう。
【００１３】
［参照による援用］
本明細書で言及する刊行物、特許及び特許出願の全てを、参照をもって本願に援用するが、それぞれの刊行物、特許及び特許出願が特定的且つ個別に本明細書の一部を構成するものとして援用すると記載されているがごとく、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【００１４】
本特許出願は一以上のカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許公報及び特許出願公報のコピーは、米国特許商標庁に請求の上、必要な費用を支払うことにより提供される。
【００１５】
本発明の新規な特徴は、それらの詳細と共に請求の範囲に示される。本発明の特徴と利点は、次の詳細な説明および添付の図面において言及される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１はモザイク免疫原の設計方法の概略図である。図１は本方法を概念的に表したものである。これにより、天然のタンパク質配列が（検査による）選択され、Fischer et al. (Nat Med 13:100-106, 2007）に記載されるモザイクアルゴリズムによる処理がなされて、高カバレージの合成配列が創出される。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる候補ワクチンによる潜在的ＦＭＤＶカプシドエピトープのカバレージを示す。（図２Ａ）同サイズの天然配列カクテルと比較した１−、２−及び３−モザイクカクテルのカバレージ。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる候補ワクチンによる潜在的ＦＭＤＶカプシドエピトープのカバレージを示す。（図２Ｂ）ＦＭＤＶ血清型Ａのカプシドタンパク質の系統発生分布であって、天然株Ａ２４／クルゼイロによるカバレージ（左）、又は本明細書に開示する２−配列モザイクカクテルによるカバレージ（右）。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、異なる候補ワクチンによる潜在的ＦＭＤＶカプシドエピトープのカバレージを示す。（図２Ｃ）単離年毎のウイルス変異体のカバレージ。天然株Ａ２４ワクチンに比べ、モザイクは最近の単離体をより良好にカバーする。青線は１０年平均値を示す。
【図３】図３は感染性核酸モザイク構築物の組織培養増殖及びプラークモルフォロジーを表す。ウイルスプラーク（ウイルス複製の中心）は、プレート中の未感染細胞の暗背景において明スポットとして視認される。
【図４】図４はＡ型モザイクＦＭＤＶワクチンの誘導を示す。ＦＭＤＶゲノム構成及びＡ型モザイクＦＭＤＶ突然変異体のダイアグラムを示す。ウイルスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされるタンパク質の位置と５’及び３’未翻訳領域（ＵＴＲ）にコードされる要素の位置を示した、基本的なＦＭＤＶゲノムの構成を示す。モザイク突然変異ウイルスは、Rieder et al.（J Virol. 79:12989-12998, 2005）に記載される、ＦＭＤＶアウトブレイク株Ａ２４クルゼイロの全長クローンｐＡ２４Ｃｒｕをバックボーンとして用いるＤＮＡ合成により創出された。
【００１７】
[配列]
【００１８】
配列番号１はモザイクＦＭＤＶ−ＶＰ４．２．１カプシドの塩基配列である。
GGGGCCGGCCAATCCAGTCCGGCGACCGGCTCGCAGAACCAATCTGGCAACACTGGCAGCATAATTAACAACTACTACATGCAGCAATACCAGAACTCCATGGACACACAGTTGGGAGACAATGCCATCAGTGGAGGCTCCAACGAGGGCTCCACGGACACAACTTCAACACACACAACCAACACTCAAAACAATGACTGGTTCTCGAAGCTCGCCAGTTCAGCTTTTACCGGTCTGTTCGGTGCACTGCTCGCCGACAAGAAGACAGAGGAAACGACACTTCTTGAGGACCGCATCCTCACCACCCGCAACGGGCACACCACCTCGACGACCCAATCGAGTGTGGGTGTCACATACGGGTACTCCACAGGGGAGGACCACGTTTCTGGGCCCAACACATCGGGCCTGGAGACGCGAGTGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAAAAGTTCTTGTTTGACTGGACAACGGACAAGCCATTTGGACACCTGGAAAAGCTGGAGCTCCCGACCGACCACAAGGGTGTCTACGGACACTTGGTGGACTCGTTCGCCTATATGAGAAATGGCTGGGATGTTGAGGTGTCCGCTGTTGGCAACCAGTTCAACGGCGGGTGCCTCCTGGTGGCCATGGTACCTGAATGGAAGAAATTTACAACACGGGAGAAATACCAACTCACCCTTTTCCCGCACCAGTTTATTAACCCCAGAACTAACATGACTGCCCACATCGTGGTCCCCTACCTTGGTGTGAACAGGTATGATCAGTACAAGAAGCATAAGCCCTGGACATTGGTTGTCATGGTCGTGTCGCCACTTACGACCACAAGCATTGGTGCGACACAAATCAAGGTCTACGCCAACATAGCTCCGACCTATGTTCACGTGGCCGGTGAACTCCCCTCGAAAGAGGGGATTGTCCCGGTTGCATGTGCGGACGGTTACGGAGGATTGGTGACGACAGACCCGAAGACAGCTGACCCTGTTTATGGCATGGTGTACAACCCGCCTAGGACTAACTTCCCTGGGCGCTTCACCAACCTGTTGGACGTGGCCGAAGCGTGTCCCACTTTCCTCTGCTTTGACAACGGGAAACCGTACGTCGTCACGCGGACGGATGAACAGCGACTTTTGGCCAAGTTTGACCTTTCCCTTGCCGCAAAACATATGTCCAACACATACCTGTCAGGGATTGCTCAGTACTACGCACAGTACTCTGGCACCATCAATTTGCATTTCATGTTCACAGGTTCCACTGATTCAAAGGCCCGATACATGGTGGCCTACGTCCCACCTGGGGTGGAGACACCACCGGACACACCTGAAAGGGCTGCCCACTGCATTCACGCTGAATGGGACACTGGACTAAACTCCAAATTCACTTTCTCAATCCCGTACATGTCCGCCGCGGATTACGCGTACACAGCGTCTGACACGGCAGAAACAACCAACGTACAGGGATGGGTCTGCGTCTACCAAATTACACACGGGAAGGCTGAAAATGACACCTTGGTCGTGTCGGCCAGCGCCGGCAAAGACTTTGAGTTGCGCCTCCCGATTGACCCCCGCGCGCAGACCACCGCTACCGGGGAATCAGCAGACCCGGTCACCACCGCCGTGGAGAACTACGGCGGTGAGACACAAGTCCAGAGACGTCACCACACGGACGTTAGTTTCATCATGGACAGATTTGTGAAGATCGGAACCACTAACCCAACACATGTCATTGACCTCATGCAGACTCACCAACACGGTCTGGTGGGTGCCTTGCTGCGTGCAGCCACGTACTACTTTTCTGACCTGGAAATTGTTGTACGGCACGAAGGCAATCTGACCTGGGTGCCCAACGGCGCCCCTGAAGCAGCCCTGTCCAACACAGGAAACCCCACTGCCTACAACAAGGCACCATTCACGAGACTCGCTCTCCCCTACACTGCGCCGCACCGTGTGCTGGCAACAGTGTACAACGGGACGAACAAGTACTCCGCGGCCAGTGGGCGCACAAGAGGCGACTTGGGGCAACTCGCGGCGCGAATCGCGGCACAGCTTCCTGCTTCATTTAACTTCGGTGCAATCAAGGCCGACGCCATCCACGAACTTCTCGTGCGCATGAAACGGGCCGAGCTCTACTGCCCCAGACCGCTGTTGGCAATAGAGGTGTCTTCGCAAGACAGGTACAAGCAAAAGATCATTGCACCAGCAAAGCAG
【００１９】
配列番号２はモザイクＦＭＤＶ−ＶＰ４．２．１カプシドのアミノ酸配列である。
GAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFTGLFGALLADKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTYGYSTGEDHVSGPNTSGLETRVVQAERFFKKFLFDWTTDKPFGHLEKLELPTDHKGVYGHLVDSFAYMRNGWDVEVSAVGNQFNGGCLLVAMVPEWKKFTTREKYQLTLFPHQFINPRTNMTAHIVVPYLGVNRYDQYKKHKPWTLVVMVVSPLTTTSIGATQIKVYANIAPTYVHVAGELPSKEGIVPVACADGYGGLVTTDPKTADPVYGMVYNPPRTNFPGRFTNLLDVAEACPTFLCFDNGKPYVVTRTDEQRLLAKFDLSLAAKHMSNTYLSGIAQYYAQYSGTINLHFMFTGSTDSKARYMVAYVPPGVETPPDTPERAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYMSAADYAYTASDTAETTNVQGWVCVYQITHGKAENDTLVVSASAGKDFELRLPIDPRAQTTATGESADPVTTAVENYGGETQVQRRHHTDVSFIMDRFVKIGTTNPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEIVVRHEGNLTWVPNGAPEAALSNTGNPTAYNKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTNKYSAASGRTRGDLGQLAARIAAQLPASFNFGAIKADAIHELLVRMKRAELYCPRPLLAIEVSSQDRYKQKIIAPAKQ
【００２０】
配列番号３はモザイクＦＭＤＶ−ＶＰ４．２．２カプシドの塩基配列である。
GGGGCCGGCCAATCCAGTCCGGCGACCGGCTCGCAGAACCAATCTGGCAACACTGGCAGCATAATTAACAACTACTACATGCAGCAATACCAGAACTCCATGGACACACAGTTGGGAGACAATGCCATCAGTGGAGGCTCCAACGAGGGCTCCACGGACACAACTTCAACACACACAACCAACACTCAAAACAATGACTGGTTCTCGAAGCTCGCCAGTTCAGCTTTTACCGGTCTGTTCGGTGCACTGCTCGCCGACAAGAAGACAGAGGAAATCACACTTCTTGAGGACCGCATCCTCACCACCCGCAACGGGCACACCATCTCGACGACCCAATCGAGTGTGGGTGTCACATACGGGTACTCCACAGAGGAGGACCACGTTGCTGGGCCCAACACATCGGGCCTGGAGACGCGAGTGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAAAAGCACTTGTTTGACTGGACAACGGACAAGGCATTTGGACACCTGGAAAAGCTGGAGCTCCCGACCGAACACAAGGGTGTCTACGGACACTTGGTGGACTCGTACGCCTATATGAGAAATGGCTGGGATGTTGAGGTGACCGCTGTTGGCAACCAGTTCAACGGCGGGTGCCTCCTGGTGGCCATGGTACCTGAATGGAAGGAATTTACCCCACGGGAGAAATACCAACTCACCCTTTTCCCGCACCAGTTTATTAGCCCCAGAACTAACATGACTGCCCACATCACGGTCCCCTACCTTGGTGTGAACAGGTATGATCAGTACAAGCAGCATAAGCCCTGGACATTGGTTGTCATGGTCGTGTCGCCACTTACGACCAGCAGCATTGGTGCGTCACAAATCAAGGTCTACGCCAACATAGCTCCGACCCATGTTCACGTGGCCGGTGAACTCCCCTCGAAAGAGGGGATTGTCCCGGTTGCATGTTCGGACGGTTACGGAGGATTGGTGACGACAGACCCGAAGACAGCTGACCCTGCTTATGGCAAGGTGTACAACCCGCCTAGGACTAACTACCCTGGGCGCTTCACCAACCTGTTGGACGTGGCCGAAGCGTGTCCCACTTTCCTCTGCTTTGACGACGGGAAACCGTACGTCGTCACGCGGACGGATGACCAGCGACTTTTGGCCAAGTTTGACGTTTCCCTTGCCGCAAAACATATGTCCAACACATACCTGGCAGGGCTTGCTCAGTACTACACACAGTACTCTGGCACCATCAATTTGCATTTCATGTTCACAGGTTCCACTGAGTCAAAGGCCCGATACATGGTGGCCTACATCCCACCTGGGGTGGAGACACCACCGGACACACCTGAAAAGGCTGCCCACTGCATTCACGCTGAATGGGACACTGGACTAAACTCCAAATTCACTTTCTCAATCCCGTACGTATCCGCCGCGGATTACGCGTACACAGCGTCTGACGTGGCAGAAACAACCAACGTACAGGGATGGGTCTGCATCTACCAAATTACACACGGGAAGGCTGAACAAGACACCTTGGTCGTGTCGGTTAGCGCCGGCAAAGACTTTGAGTTGCGCCTCCCGATTGACCCCCGCACGCAGACCACCACTGCCGGGGAATCAGCAGACCCGGTCACCACCACCGTGGAGAACTACGGCGGTGAGACACAAGCCCAGAGACGTCACCACACGGACGTTGGTTTCATCATGGACAGATTTGTGAAGATCGGAAACACGAGCCCAACACATGTCATTGACCTCATGCAGACTCACCAACACGCTCTGGTGGGTGCCTTGCTGCGTGCAGCCACGTACTACTTTTCTGACCTGGAAATTGTTGTACGGCACGACGGCAATCTGACCTGGGTGCCCAACGGCGCCCCTGTAGAAGCTCTGGCGAACACCAGCAACCCCACTGCCTACCACAAGCAACCATTCACGAGACTCGCTCTCCCCTACACTGCGCCGCACCGTGTGCTGGCAACAGTGTACAACGGGACGAGTAAGTACTCCGCGCCTGCTACAAGAAGAGGCGACTTGGGGTCTCTCGCGGCGCGAGTCGCGGCACAGCTTCCTTCTTCATTTAACTTCGGTGCAATCAGGGCCACCACCATCCACGAACTTCTCGTGCGCATGAGACGGGCCGAGCTCTACTGCCCCAGACCGCTGTTGGCAGTAGAGGTGTCTTCGCAAGACAGGCACAAGCAAAAGATCATTGCACCAGCAAGGCAG
【００２１】
配列番号４はモザイクＦＭＤＶ−ＶＰ４．２．２カプシドのアミノ酸配列である。
GAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFTGLFGALLADKKTEEITLLEDRILTTRNGHTISTTQSSVGVTYGYSTEEDHVAGPNTSGLETRVVQAERFFKKHLFDWTTDKAFGHLEKLELPTEHKGVYGHLVDSYAYMRNGWDVEVTAVGNQFNGGCLLVAMVPEWKEFTPREKYQLTLFPHQFISPRTNMTAHITVPYLGVNRYDQYKQHKPWTLVVMVVSPLTTSSIGASQIKVYANIAPTHVHVAGELPSKEGIVPVACSDGYGGLVTTDPKTADPAYGKVYNPPRTNYPGRFTNLLDVAEACPTFLCFDDGKPYVVTRTDDQRLLAKFDVSLAAKHMSNTYLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGSTESKARYMVAYIPPGVETPPDTPEKAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYVSAADYAYTASDVAETTNVQGWVCIYQITHGKAEQDTLVVSVSAGKDFELRLPIDPRTQTTTAGESADPVTTTVENYGGETQAQRRHHTDVGFIMDRFVKIGNTSPTHVIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPVEALANTSNPTAYHKQPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMRRAELYCPRPLLAVEVSSQDRHKQKIIAPARQ
【００２２】
配列番号５はＳａｎＤＩフォワードプライマーの塩基配列である。
AGCGGAGCATGACGGCCGTGGGACCC
【００２３】
配列番号６はＶＰ４リバースプライマーの塩基配列である。
TGTTCGGTGCACTGCTCGCCG
【００２４】
配列番号７はＶＰ４フォワードプライマーの塩基配列である。
TGTTCGGTGCACTGCTCGCCG
【００２５】
配列番号８はＮｈｅＩリバースプライマーの塩基配列である。
TCAACGTCTCCGGCTAGCTTAAGCAGGTCAAAATTC
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の好ましい実施形態を説明する。この種の実施形態が例示的に示されることは当業者にとって明白であろう。当業者は、本発明を逸脱することなく種々の変形、変更及び置換をなし得る。本発明の実施にあたり、本明細書に記載する実施形態の種々の変更例を採用することができる。請求項は本発明の範囲を定義し、これら請求項の範囲に属する方法及び構造並びにこれらの等価物も本発明の範囲にあることを意図している。
【００２７】
略語
ＢＥＩ        バイナリーエチレンイミン
ＦＭＤＶ      口蹄疫ウイルス
ＩＣ          感染性ｃＤＮＡクローン
ＯＲＦ        オープンリーディングフレーム
ＰＦＵ        プラーク生成ユニット
ＵＴＲ        未翻訳領域
ＶＰ          ウイルスタンパク質
ＷＴ          野性型
【００２８】
用語及び方法
特段に断らない限り、各技術用語は通常の用法にて使用する。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)を参照することができる。
【００２９】
本開示における様々な実施形態の説明を容易とするため、具体的用語について次に説明する。
【００３０】
アジュバント：抗原に対する免疫応答を非特異的に向上させる物質又は溶媒。アジュバントは、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム又はホスフェート）のサスペンジョン、或いは抗原溶液が鉱物油に乳化した油中水型（ＷＯ）乳剤（例えば、フロイントの不完全アジュバント）、場合によっては死菌マイコバクテリアを加えて抗原性を更に高めたＷＯ乳剤（フロイントの完全アジュバント）を含んでもよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド等）をアジュバントとすることもできる（例えば米国特許番号第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号、第6,339,068号、第6,406,705号、及び第6,429,199号）。アジュバントは共刺激分子等の生物学的分子も含む。生物学的アジュバントの例としては、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ及び４１ＢＢＬが挙げられる。
【００３１】
投与：被験体に治療剤（例えば組換えウイルス）等の試薬をを有効ないずれかの経路で供与すること。投与経路の例としては、注射（皮下、筋内、皮内、腹腔内、静注等)、経口、管内、舌下、直腸内、経皮、鼻腔内、経膣、吸引の各径路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
抗体：Ｂ型リンパ球から生産され、特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子。抗体は、ヒト又は他の動物中、特異的な抗原（免疫原）によって発生する。抗体は、明確な様式で抗原と特異的なに反応することを特徴とし、抗体と抗原のそれぞれが互いに定義される。「抗体応答の惹起」とは、抗原又は他の分子が抗体生産を誘起する能力を意味する。
【００３３】
縮重変種：本開示の文脈において「縮重変種」とは、遺伝情報により縮重した配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。２０の天然アミノ酸が存在するが、多くは２以上のコドンによって特定される。従って、塩基配列によりコードされるペプチドのアミノ酸配列が変わらない限り、そのペプチドをコードする全ての縮重塩基配列が含まれる。
【００３４】
異種：異種タンパク質又は異種ポリペプチドとは、異なる原料又は種から誘導したタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００３５】
免疫応答：抗原又はワクチン等の刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、多核白血球等の免疫系細胞の応答。免疫応答は、例えば、インターフェロンやサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、ホストの防衛的応答に関連するいかなる生体細胞をも含むことができる。免疫応答には、先天免疫応答や炎症が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において、防御的免疫応答とは、被験体を感染から防御する（感染を防ぐ、或いは感染関連の疾病の進行を防ぐ）免疫応答を意味する。免疫応答の測定方法は当技術分野でよく知られており、例えばリンパ球（Ｂ細胞又はＴ細胞等）の増殖及び／又は活性、サイトカインやケモカインの分泌、炎症、抗体の産生等を測定することを含む。
【００３６】
免疫原：適切な条件下で動物において、抗体の産生又はＴ細胞の応答といった免疫応答を刺激することができる化合物、組成物又は物質。動物に注入又は吸収される組成物も含まれる。
【００３７】
免疫化：ワクチン接種等により被験体を感染性疾患から防御すること。
【００３８】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸分子、タンパク質、ウイルス又は細胞等）は、生物の細胞や組織中の生物学的成分、または生物そのものから実質的に分離精製されるものであり、上記成分とは、他の染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質、細胞等の自然に存在しているものである。「単離された」核酸分子及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え体の発現によって調製された核酸分子及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子及びタンパク質も包含する。
【００３９】
発現可能に連結：第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係にある場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列に発現可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼすとすれば、そのプロモーターはコード配列に発現可能に連結されている。通常、発現可能に連結されたＤＮＡ配列は連続し、必要な場合には、２個のタンパク質コード領域は同一のリーディングフレーム内で連結されている。
【００４０】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（賦形剤・溶媒）は通常のものである。Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、１以上の治療化合物、分子又は試薬（例えば、本明細書に開示されるモザイクポリペプチドや組換えウイルス）の医薬送達に適した組成物及び処方を記載している。
【００４１】
通常、担体の性質は、使用する個々の投与形式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的且つ生理学的に許容される液体である、水、生理食塩水、緩衝化塩類溶液、デキストロースやグリセロールの水溶液等をベヒクルとして含む、注射可能な液体を含む。固形組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、カプセル剤等）については、通常の無毒性固体担体、例えば薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウム等が含まれ得る。投与される医薬組成物は、生物学的中性担体に加え、湿潤剤又は乳化剤、保存料、ｐＨ緩衝剤等（酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート等）の無毒補助物質を少量含むことができる。
【００４２】
ポリペプチド、ペプチド又はタンパク質：モノマーがアミノ酸残基であり、アミド結合で結合しているポリマー。アミノ酸がα−アミノ酸の場合、Ｌ光学異性体もＤ光学異性体も用いることができる。本明細書において「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」の各用語は交換可能に用いられる。これら用語は、１以上のアミノ酸残基が、天然のアミノ酸に対応する人工的化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーにも、また、天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。用語「残基」又は「アミノ酸残基」は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに組み込まれたアミノ酸への言及を含む。
【００４３】
ポリペプチドにおける保存的置換とは、タンパク質配列内の１アミノ酸残基の、同様の生化学的性質を有する他のアミノ酸残基への置換である。典型的な保存的置換では、置換後に得られるポリペプチドの活性への影響は少ないか、又影響は無い。例えば、１以上の保存的置換（例えば１、２、３、４又は５以下の置換）を含むタンパク質又はペプチドにおいて、野性型タンパク質又はペプチドの構造と機能は保持される。ポリペプチドをコードする塩基配列を、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ等の標準的の手段を利用して操作する事により、ポリペプチドに１以上の保存的置換が含まれるように製造することができる。一例において、このような変異体は、抗体交差反応性又は免疫応答誘起能を試験することにより容易に選択することができる。保存的置換の例を以下に示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
保存的置換では通常、（ａ）例えばシート配座又はらせん状配座等の、置換領域のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、或いは（ｃ）側鎖の大きさが保存される。
【００４６】
通常、タンパク質の性質に最大の変化をもたらすと期待される置換は非保存的であろう。これらの例としては、（ａ）親水性残基（セリルやスレオニル等）の疎水性残基（ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、アラニル等）との置換；（ｂ）システイン又はプロリンの他の残基との置換；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（リシル、アルギニル、ヒスチジル（histadyl）等）の負電荷を有する残基（グルタミル、アスパルチル等）との置換；或いは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（フェニルアラニン等）と側鎖を持たない残基（グリシン等）との置換が挙げられる。
【００４７】
疾病の予防、治療又は改善：疾病を「予防」するとは、疾病の完全な発症を防ぐことを意味する。「治療する」とは、一旦発症した疾病や病態の兆候や症状を改善する治療的介入を意味する。「改善する」とは、疾病の兆候や症状の数や程度を減じることを意味する。
【００４８】
精製された：用語「精製された」は、必ずしも絶対的な純度を必要とせず、相対的な用語を意図している。例えば、精製されたポリペプチド、タンパク質、核酸、ウイルス又は他の活性化合物の各々は、天然の関連タンパク質及び他の不純物からその全体又は一部が単離されたものである。幾つかの実施形態において、用語「実質的に精製された」とは、細胞、細胞培養物又は他の粗調製物から単離され、初期の調製物に含まれていた種々の成分（タンパク質、細胞残片及び他の成分等）を除去するために分画化に付されたポリペプチド、タンパク質、核酸、ウイルス又は他の活性化合物について用いる。
【００４９】
組換え：組換え核酸分子、組換えタンパク質又は組換えウイルスとは、天然ではない配列、或いは組換えなければ分離している２つの配列セグメントの人工的な組み合わせによる配列である。この人工的な組み合わせは、化学合成又は核酸分子の単離セグメントの人工的操作（遺伝子工学的技法等）により達成し得る。用語「組換え体」は、天然の核酸分子、タンパク質又はウイルスの一部の付加、置換、欠失のみによる変更を受けた核酸分子、タンパク質又はウイルスも含む。
【００５０】
配列の同一性：２以上の核酸配列の間、或いは２以上のアミノ酸配列の間の同一性又は類似性を、配列間の同一性又は類似性として表現する。配列の同一性は、同一度（％）として測定することができ、同一度が高いほど、配列同士はより同一である。配列の類似性は類似度（％）（これにはアミノ酸の保存的置換も考慮に入れる）として測定することができ、類似度が高いほど、配列同士はより類似している。核酸配列やアミノ酸配列のホモログやオルソログは、標準的方法でアラインされた場合、比較的高い配列の同一性／類似性を有する。オルソロガスなタンパク質やｃＤＮＡが、より近縁な種（ヒト配列やマウス配列等）から誘導される場合、疎遠な種（ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）の場合と比べて、この相同性はより顕著となる。
【００５１】
比較のために配列をアラインする方法は、当技術分野でよく知られている。種々のプログラムとアラインメント用アルゴリズムが次の文献に記載されている。Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994。Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アラインメント方法とホモロジー計算についての詳細な考察を提供する。
【００５２】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、国立生物工学情報センター（National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ）を含む複数のソース及びインターネットから入手可能であり、配列分析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用することができる。付加情報についてはＮＣＢＩのウェブサイトを参照することができる。
【００５３】
血清型：特徴的な抗原セットによって区別される、近い関係にある微生物（ウイルス等）のグループ。
【００５４】
被験体：生きている多細胞脊椎生物であって、ヒトとヒト以外の哺乳類を含むカテゴリーである。本明細書のいくつかの実施形態において、被験体はウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、レイヨウ、スイギュウ、バイソン等の双蹄類であるが、これらに限定されない。
【００５５】
合成の：実験室において人工的手段によって製造されるものである。例えば、合成核酸や合成タンパク質は、実験室において化学的に合成することができる。
【００５６】
ワクチン：感染性疾病等の疾病の予防、改善又は治療のために投与して、免疫応答を刺激することができる免疫原材料の調製物。免疫原材料としては、例えば、弱毒化微生物や死微生物（弱毒化ウイルス等）や、感染性微生物から誘導された抗原性のタンパク質、ペプチド又はＤＮＡが挙げられる。ワクチンは予防的応答及び治療的応答の両方を惹起することができる。投与方法はワクチンにより異なるが、注入、摂取、吸入及び他の投与形態が挙げられる。注入は、非経口（静注、皮下又は筋内等）を含む多くの投与経路のいずれかによって行うことができる。ワクチンは、アジュバントと共に投与して、免疫応答を促進することができる。
【００５７】
ベクター：ベクターは、ベクターが宿主細胞において複製する及び／又は統合される能力を妨げることなく、異種の核酸を挿入可能な核酸分子である。ベクターは、宿主細胞においてその複製を可能とする核酸配列（複製源等）を含むことができる。ベクターは１以上の選択可能なマーカ−遺伝子及び他の遺伝子要素も含むことができる。発現ベクターとは、挿入される遺伝子の転写及び翻訳を可能とするのに必要な調節配列を含むベクターである。
【００５８】
特に説明しない限り、本明細書に用いられる全ての技術的・科学的用語は、本開示が属する技術分野における通常の知識を有する者に共通して理解されるのと同様の意味を有する。単数を示す語“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上特に示さない限り、複数の指示対象を包含する。“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ”は「Ａ」、「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」を意味する。更に、核酸又はポリペプチドについて示した、全ての塩基数とアミノ酸数、及び全ての分子量と分子質量値は概算であり、説明のために提供したものと解釈されたい。本明細書に記載の方法及び材料と類似又は等価なものを本開示の実施又は試験に利用することができるが、適切な方法と材料は以下に記載する。本明細書で参照される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献の内容全体を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。相反が生じた際は、用語の説明を含む本明細書が支配する。更に、これら材料、方法及び実例は説明に過ぎず、本発明を限定することを意図しない。
【００５９】
序論
ウイルスワクチンの開発にとって、「多様性」は大きな問題である（Gaschen et al., Science 296(5577):2354-2360, 2002）。免疫原の設計のための「モザイク」という概念は、ＨＩＶ−１ワクチンへの応答度を改善するために開発された（Fischer et al., Nat Med 13:100-106, 2007）。この方法は、例えば共投与のための、合成ウイルスタンパク質配列の最適なカクテルを創出することを含み、こうすることで、ワクチン中に、集団頻度で加重した最大数の潜在的エピトープが存在するようにする。（図１）。この方法で設計されたＨＩＶ−１ワクチンは動物実験では実質的に有望な結果を示し（Kong et al., J Virol 83(5):2201-2215, 2009; Barouch et al., Nat Med 16(3):319-323, 2010; Santra et al., Virology 428(2):121-127, 2012）、これには悪性サルヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）の攻撃からの防御（Barouch et al., Cell 155(3):531-539, 2013）も含まれる。モザイクＨＩＶ−１ワクチンを評価するために、ヒトにおける幾つかの第I相臨床試験が進行中である。モザイクワクチンは他のウイルスに対する効果も約束するものであり、これにはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（Yusim et al., J Gen Virol 91:1194-1206, 2010; Yusim et al., Clin Vaccine Immunol 20(2):302-305, 2013）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス等）(Fenimore et al., PLoS ONE 7(10):e44769, 2012）及びインフルエンザウイルス（Kamlangdee et al., J Virol 88(22):13300-13309, 2014）が含まれる。この方法で設計された免疫原は直鎖状エピトープのカバレージに最適化されるが、多くの場合、高次構造エピトープを維持する。
【００６０】
本明細書に開示されるＦＭＤＶモザイクポリペプチド組成物及び核酸組成物は、非天然エピトープ及びレアエピトープの発生を最小としつつ、天然ＦＭＤＶポリペプチド配列及びコンセンサスＦＭＤＶ配列に比べ、高レベルのＴ細胞エピトープカバレージを提供する。
【００６１】
幾つかの実施形態の概観
本明細書が開示する合成ＦＭＤＶモザイクポリペプチドは、天然ＦＭＤＶポリペプチドよりも、Ｔ細胞エピトープカバレージが大きい。この合成ＦＭＤＶモザイクポリペプチドは、天然ウイルスの変異性を取り込み、通常のＦＭＤＶエピトープは含むが、ＦＭＤＶのレアエピトープは排除する。このモザイクポリペプチドは、ＦＭＤＶゲノムの一部として含まれる場合、ウイルスの複製及び、本来のＦＭＤＶ粒子に非常に類似した構築物又は同一な構築物へのウイルスの集合を可能とする。本明細書に開示されるモザイクポリペプチド組成物及び核酸組成物は、広範な血清型ＡのＦＭＤＶ株に対しての防御を提供する免疫応答を惹起するため使用することができる。
【００６２】
モザイクポリペプチドＶＰ４．２．１（配列番号２）又はモザイクポリペプチドＶＰ４．２．２（配列番号４）に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する合成ＦＭＤＶポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、この合成ＦＭＤＶポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む。具体例では、合成ＦＭＤＶポリペプチドは配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００６３】
ここで、モザイクポリペプチドを含む組換えＦＭＤＶも提供する。幾つかの実施形態において、この組換えＦＭＤＶは、モザイクポリペプチドＶＰ４．２．１（配列番号２）又はモザイクポリペプチドＶＰ４．２．２（配列番号４）に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する合成ＦＭＤＶポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、この組換えＦＭＤＶは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドを含む。具体例では、組換えＦＭＤＶは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列からなる合成ＦＭＤＶポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、この組換えＦＭＤＶは、野性型ＦＭＤＶ株から得られるＦＭＤＶのＬタンパク質、ＶＰ４タンパク質、Ｐ２タンパク質及びＰ３タンパク質を含む。非限定的な一具体例では、野性型ＦＭＤＶ株はＡ２４クルゼイロである。
【００６４】
ここで更に、モザイクＦＭＤＶポリペプチドをコードする核酸分子も提供する。幾つかの実施形態において、この核酸は、モザイクポリペプチドＶＰ４．２．１（配列番号２）又はモザイクポリペプチドＶＰ４．２．２（配列番号４）に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する合成ＦＭＤＶポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、この核酸分子は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む合成ＦＭＤＶポリペプチドをコードする。具体例では、この核酸分子は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列からなる合成ＦＭＤＶポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、この核酸分子は、配列番号１又は配列番号３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な塩基配列を有する。幾つかの具体例において、この核酸分子は配列番号１又は配列番号３を含む塩基配列を有する。特定の非限定的な一例で、この核酸分子は配列番号１又は配列番号３からなる塩基配列を有する。
【００６５】
本開示は、モザイクＦＭＤＶポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターをも提供する。幾つかの実施形態において、このベクターはＦＭＤＶのＬタンパク質、ＶＰ４タンパク質、Ｐ２タンパク質及びＰ３タンパク質のコード配列を更に含み、許容宿主細胞にこのベクターをトランスフェクトすることにより、感染性ＦＭＤＶが生産される。幾つかの実例において、ＦＭＤＶのＬタンパク質、ＶＰ４タンパク質、Ｐ２タンパク質及びＰ３タンパク質は野性型ＦＭＤＶのアミノ酸配列を有する。特定の非限定的な一例では、野性型ＦＭＤＶはＡ２４クルゼイロである。
【００６６】
ここでまた、少なくとも１種のモザイクＦＭＤＶポリペプチド、少なくとも１種の組換えＦＭＤＶ又は少なくとも１種のモザイクＦＭＤＶポリペプチドをコードする核酸若しくは少なくとも１種のベクターを含む組成物を提供する。
【００６７】
幾つかの実施形態において、モザイクポリペプチドＶＰ４．２．１（配列番号２）に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するモザイクＦＭＤＶポリペプチド、配列番号２を含むモザイクＦＭＤＶポリペプチド、又は配列番号２からなるモザイクＦＭＤＶポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。幾つかの実施形態において、モザイクポリペプチドＶＰ４．２．２（配列番号４）に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するモザイクＦＭＤＶポリペプチド、配列番号４を含むモザイクＦＭＤＶポリペプチド、又は配列番号４からなるモザイクＦＭＤＶポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。幾つかの実例においては、配列番号２（又は配列番号２に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な配列）を含むか、からなるモザイクＦＭＤＶポリペプチド、配列番号４（又は配列番号４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な配列）を含むか、上記配列からなるモザイクＦＭＤＶポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００６８】
幾つかの実施形態において、配列番号２（又は配列番号２に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な配列）を含むか、或いは上記配列からなるアミノ酸配列を有するモザイクＦＭＤＶポリペプチドを含む組換えＦＭＤＶと、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。幾つかの実施形態において、配列番号４（又は配列番号４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な配列）を含むか、上記配列からなるアミノ酸配列を有するモザイクＦＭＤＶポリペプチドを含む組換えＦＭＤＶと、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。幾つかの実例においては、配列番号２の（又は配列番号２に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な）アミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを含む第１の組換えＦＭＤＶと、配列番号４の（又は配列番号４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な）アミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを含む第２の組換えＦＭＤＶと、及び薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００６９】
更にここで、開示されるモザイクＦＭＤＶポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、配列番号１の（又は配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な）配列を有する核酸分子を含むベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。幾つかの実施形態において、配列番号３の（又は配列番号３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な）配列を有する核酸分子を含むベクターと、及び薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。幾つかの実例では、本組成物は、配列番号１の（又は配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な）配列を有する核酸分子を含む第１のベクターと、配列番号３の（又は配列番号３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一な）配列を有する核酸分子を含む第２のベクターと、薬学的に許容される担体とを含む。
【００７０】
本明細書の幾つかの実施形態において、この組成物はアジュバントを更に含む。
【００７１】
ここで更に、被験体における血清型ＡのＦＭＤＶに対する免疫応答を惹起する方法を提供する。幾つかの実施形態において、この方法は、本明細書に開示される合成ＦＭＤＶモザイクポリペプチド、組換えＦＭＤＶ、核酸分子、ベクター又は組成物を被験体に投与することを含む。幾つかの実例で、被験体はウシである。
【００７２】
また、被験体を血清型ＡのＦＭＤＶに対して免疫化する方法も提供する。幾つかの実施形態において、本方法は本明細書に開示される合成ＦＭＤＶモザイクポリペプチド、組換えＦＭＤＶ、核酸分子、ベクター又は組成物を被験体に投与することを含む。組換えＦＭＤＶを投与する幾つかの実例では、組換えＦＭＤＶは投与前に不活化（ＢＥＩ等にて）される。
【００７３】
本明細書に開示される方法の幾つかの実施形態において、被験体は双蹄類である。幾つかの実例で、この双蹄類はウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、レイヨウ、スイギュウ又はバイソンである。
【００７４】
モザイクＦＭＤＶワクチン組成物の投与
本明細書に開示するＦＭＤＶモザイクポリペプチド組成物及びポリヌクレオチド組成物は、適切な送達手段のいずれかにより被験体に投与することができる。例えば、ＦＭＤＶポリヌクレオチド又はポリペプチドは、注射、皮下、筋内又は経皮により非経口投与することができる。ある種のアジュバント、例えばＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２又はＰＬＧ製剤を鼻腔内投与又は経口投与することができる。他の投与形態に適した更なる製剤としては座薬が挙げられる。座薬用の通常のバインダーや担体には、例えばポリアルキレングリコールやトリグリセリドが含まれ、このような座薬は、有効成分の値が０．５％〜１０％（例えば１％〜２％）の混合物から形成することができる。他の経口製剤は通常使用される賦形剤を含み、例としては医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。これら組成物の剤形は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤又は粉末であり、当該組成物は有効成分を１０％〜９５％（例えば２５％〜７０％）含む。
【００７５】
本明細書に開示されるＦＭＤＶモザイクワクチンは通常、液体又は懸濁液として注射可能に調製される。注射前に溶液や懸濁液とするための固形剤も調製できる。このような製剤は、乳化することやリポソームカプセルとすることができる。幾つかの場合、ワクチンは薬学的に許容される担体も含む。薬学的に許容される担体は当技術分野で良く知られたものであり、特に限定されない。例としては、嵩高な低速代謝性高分子（タンパク質等）、多糖類、官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ等、更にポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー（ポリグルタミン酸、ポリリシン等）等が挙げられる。
【００７６】
本明細書に開示されるＦＭＤＶモザイクワクチンは、中性又は塩の形態の免疫原性化合物に処方することができる。薬学的に許容される塩の例としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と生成）、無機酸（塩酸、リン酸等）塩及び有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、リンゴ酸等）塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と生成した塩は、無機塩基（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄等）及び有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等）からも誘導できる。
【００７７】
ワクチン組成物は液体又は賦形剤も含むことができ、これらの例としては水、食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノール等が挙げられ、これらは単独或いは組み合わせる。更に、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤も挙げられる。本開示の組成物には、リポソームを担体とすることもできる。
【００７８】
種々の共刺激分子をワクチン調製物又は送達プロトコールに含ませることができる。この分子はリンパ球への免疫原の提示を改善することができ、これにはタンパク質（Ｂ７−１、Ｂ７−２等）及びサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２等）が含まれる。アジュバントも任意で組成物に含ませることができる。種々のアジュバントを使用することができ、これらには次のものが含まれる。（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）ＯＷエマルジョン製剤（場合によって、他の特定のムラミルペプチド等の免疫刺激剤又は微生物細胞壁成分を含む）；（３）サポニンアジュバント、又は免疫刺激コンプレックス（ＩＳＣＯＭ）等のサポニンアジュバントから得られる粒子；（４）フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）及びフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７又はＩＬ−１２）、インターフェロン（例えばγ−インターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）等のサイトカイン類；（６）コレラトキシン（ＣＴ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  熱活性トキシン（ＬＴ）等のバクテリアＡＤＰリボシル化トキシンの無毒化変異体；（７）組成物の効力を向上させる免疫刺激剤として作用する他の物質；及び（８）吸着高分子を有する微粒子。
【００７９】
本明細書に開示されるＦＭＤＶモザイクワクチン組成物は、投与製剤に適合した方法で投与することができ、予防及び／又は治療に有効となる量を投与する。投与量は治療対象の被験体、被験体の免疫系の能力、所望の防御程度に依存する。投与に必要とされる有効成分の正確な量は医師の判断とし、各被験体に特定的とすることができる。
【００８０】
ワクチン製剤は単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールで導入することができる。複数回投与スケジュールでは、第１コースのワクチン接種を１〜１０回の別々な用量で行うことができ、続いて免疫応答を維持及び／又は強化するのに必要な時間間隔で他の用量を提供する。例えば、第２回目の投与を１〜４ヶ月で行い、必要であれば数ヶ月後に次の投与を行う。
【００８１】
投与は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの同時の投与か、或いは連続的投与（例えば、ポリヌクレオチド組成物を初期免疫とし、ポリペプチド組成物を追加免疫とする）を含むことができる。投与計画（少なくとも一部分）は個体における必要性により決定されるか、医師の判断に従うことになる。
【００８２】
ＦＭＤＶモザイクタンパク質コードする発現可能なポリヌクレオチドを含む核酸分子及びベクターは、ＤＮＡワクチン調剤薬として処方・利用することができる。このようなＦＭＤＶモザイクＤＮＡワクチンは、標準的な遺伝子デリバリープロトコールを利用したＦＭＤＶ特異的Ｔ細胞の活性化に利用することができる。遺伝子デリバリーの方法は当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号明細書（これら全体を本明細書の一部を構成するものとして援用する）参照）。遺伝子は脊椎動物被験体に直接送達できる。或いはｅｘ ｖｉｖｏで被験体から得られた細胞に送達し、その細胞を被験体に再移植することもできる。例えば、この構成物は、プラスミドＤＮＡ又はウイルスベクターＤＮＡとして送達することができる。
【００８３】
ＤＮＡワクチンは、種々の異なる方法で導入することができる。これら方法には、標準的な皮下注射針でＤＮＡの塩水溶液を注射することが含まれる。通常、塩水注射は骨格筋への筋内注射か皮内注射で行われ、ＤＮＡが細胞外スペースに到達される。この操作は、エレクトロポレーション、ミオトキシン（例えばブピヴァカイン）による筋繊維の一時的損傷、或いは食塩水又はスクロースの高張液を用いることにより促進することができる。この送達方法における免疫応答は多くの要因により影響を受ける。これらには、注射針のタイプ、注射針のアラインメント、注射速度、注射体積、筋肉の種類、及び注射対象の個体の年齢、性別、生理的状態が含まれる。
【００８４】
遺伝子銃は、圧縮ヘリウムを加速媒体として用い、金微粒子又はタングステン微粒子の吸着されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の標的細胞への送達を弾丸様に加速する。他の送達方法としては、鼻粘膜や肺粘膜等の粘膜表面の裸の（ネイキッド）ＤＮＡのエアロゾル点滴や、ｐＤＮＡの眼や膣粘膜への局所投与が挙げられる。粘膜表面送達は、カチオン性リポソームＤＮＡ調製物、生分解性ミクロスフェアー、腸粘膜への経口投与用の弱毒化Ｓｈｉｇｅｌｌａベクター又はＬｉｓｔｅｒｉａベクター、及びアデノウイルスベクター等の組換えウイルスベクターを用いることによって達成される。
【００８５】
有効な免疫応答を上昇させるのに必要なＤＮＡ用量は送達方法により決定される。有効な免疫応答を上昇させるために、塩水注射では１０μｇ〜１ｍｇの種々のＤＮＡ量が必要であるが、遺伝子銃による送達では、筋内塩水注射に比べ１００倍〜１０００倍少ないＤＮＡ量でよい。最低１６ｎｇの量が使われるが、通常０．２μｇ〜２０μｇが必要とされる。塩水注射では、ＤＮＡが標的組織（通常、筋肉組織）の細胞外スペースに送達されるため、より多くのＤＮＡを必要とする。ここでは、ＤＮＡが細胞に取り込まれる前に基底層及び大量の結合組織等の物理的バリアを弱めなくてはならない。一方、遺伝子銃ではボンバードのＤＮＡが直接細胞に送達される。
【００８６】
ＦＭＤＶモザイク核酸ワクチンは細胞に送達される前にリポソームでパッケージすることができる。通常、脂質によるカプセル化は、核酸に安定的に結合して補足・保持できるリポソームを使用して達成される。脂質調製物に対するカプセル化（condensed）ＤＮＡの比は変化し得るが、脂質に対し通常およそ１：１（ｍｇＤＮＡ：μｍｏｌ脂質）以上である。
【００８７】
開示されるＦＭＤＶワクチンと共に使用するリポソーム調製物には、カチオン性（正帯電）、アニオン性（負帯電）及び中性の各調製物がある。
【００８８】
ＦＭＤＶモザイク核酸ワクチンはまた、カプセル化したり、粒子状担体に吸着又は会合させたりすることができる。このような担体は、選択された分子の多数のコピーを免疫系に対して提示し、局所リンパ節中の分子の補足と保持を促進する。この粒子はマクロファージにより食細胞化され、サイトカインの放出による抗原提示を向上させることができる。粒子状担体の例としては、ポリメチルメタクリレート重合体から誘導された粒子状担体や、ポリ（ラクチド）やＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコシド）から誘導された微粒子状担体が挙げられる（例えば、Jeffery et al., Pharm Res 10:362-368, 1993を参照）。
【００８９】
ＦＭＤＶモザイクワクチンの効果の評価
特定のモザイクタンパク質又はワクチン組成物が細胞を介しての免疫応答を刺激する能力は、各種アッセイのいずれかにより決定することができる。このアッセイは、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、サイトトキシックＴリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、感作被験体における抗体に特異的なＴリンパ球のアッセイ等である。この種のアッセイは当技術分野で良く知られている（Erickson et al., J Immunol 151:4189-4199, 1993; Doe et al., Eur J Immunol 24:2369-2376, 1994）。従って、免疫応答はＣＴＬの産生及び／又はヘルパーＴ細胞の産生又は活性化を刺激する免疫応答であることができる。目的とする抗原は、防御的免疫性を誘起するのに重要な、抗体を介しての免疫応答を惹起することもできる。このようなアッセイはＯＩＥマニュアルに良く記載されている（Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals, 2004 (5thedition)), Office International des Epizooties, Paris (2004))及び文献（例えばTekleghiorghis et al., Clin Vaccine Immunol 21(5): 674-683, 2014)）。従って、免疫応答は、Ｂ細胞による抗体の産生及び／又はサプレッサーＴ細胞の活性化の一以上の効果を含むことができる。
【００９０】
開示されるＦＭＤＶモザイクワクチン調製物によってもたらされる防御的免疫応答の推算或いは実測のために種々の手段が利用できる。この手段には、特定のモザイクタンパク質により提供されるＴ細胞エピトープカバレージの程度を決定するためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析法又はこれらの組み合わせ、及び畜牛等の動物におけるＦＭＤＶモザイクワクチン調製物評価のｉｎ  ｖｉｖｏ方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
ＦＭＤＶ活性化Ｔ細胞においてＴ細胞レセプターにより認識されるエピトープは、例えば５１Ｃｒ放出アッセイやリンパ球増殖アッセイ等、当技術分野で良く知られた方法で同定することができる。５１Ｃｒ放出アッセイにおいては、目的のエピトープを提示する標的細胞は、例えば、エピトープをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、この発現ベクターで標的細胞を形質転換することにより調製される。標的細胞はラベルとなる５１Ｃｒと共にインキュベートし、被験体から誘導されたＴ細胞と混合する。その後、Ｔ細胞の細胞溶解能を、５１Ｃｒ結合タンパク質の培地への放出に基づき測定する。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例によって、特定の性質及び／又は実施形態を説明するが、これら実施例は本開示を明細書記載の特定の性質や態様に限定するとは解釈されない。
【００９３】
実施例１：ワクチン免疫原の設計と構築
配列１、２及び３のモザイクカクテルを、異なる血清型ＡのＦＭＤＶ天然配列データセットに対して構築した。ＦＭＤＶカプシド配列は、国立生物光学情報センター（ＮＣＢＩ）によって維持される、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースから得た。得られた配列は、標準的方法（Edgar, BMC Bioinformatics 5:113, 2004; Katoh et al., Nucleic Acids Res 33(2):511-518, 2005; Larsson, Bioinformatics 30(22):3276-3278, 2014)）によって互いにアラインされ、Fischer et al（Nat Med 13:100-106, 2007）に基づくモザイク設計ウェブツール（Thurmond et al., Bioinformatics 24(14):1639-1640, 2008）への入力データとして使用した。この結果として得られたアミノ酸配列を精査し、そのカバレージ度を調べた。モザイク核酸をコードする配列は、新規な配列にコードされるアミノ酸がモザイク配列に適合するよう、ＦＭＤＶのＡ２４クルゼイロ株の配列に対して塩基変化を適用することによって誘導した。
【００９４】
カバレージの比較では、配列１と配列２のカクテル間では実質的な増加、配列２と配列３のカクテル間ではより少ない増加がみられた。従って、更なる検討は配列２について進めた。エピトープのカバレージに関しては、モザイクタンパク質の利用の利点は顕著である。ワクチン学的に見れば、これらカクテルは天然配列や天然配列のカクテルに比べはるかに優れていた（図２Ａ）。更に、これらカクテルは系統学的多様性に対して広範なカバレージを有しており（図２Ｂ）、更に最近のＦＭＤＶ単離物に対するカバレージが良好であった（図２Ｃ）。モザイクワクチンの塩基配列は商業ベースで合成され、実施例２に記載のようにＡ２４クルゼイロの主鎖に基づきｃＤＮＡ構築物にクローニンングされた（図４）。モザイク配列はＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ１各遺伝子に使用され、ゲノム残部（５’ＵＴＲ、レーダー配列、ＶＰ４及び非構造タンパク質）はＡ２４主鎖から誘導した。感染性ウイルスが得られるまで、これらｃＤＮＡ構築物をウシ組織培養（数代に亘る）において増殖させた（図３）。
【００９５】
実施例２：モザイクウイルスのクローンニングと増殖
テンプレートとして、アウトブレイク株Ａ２４クルゼイロ（ｐＡ２４Ｃｒｕ、Rieder et al., J Virol 79(2):12989-12998, 2005）の感染性ｃＤＮＡの全長クローン（ＩＣ）を用いた。Ａ２４クルゼイロのカプシドコード領域を、対応するモザイクカプシド配列で置換した。モザイクＰ１−２Ａ配列はバイオベーシックカナダ社が合成した。ＰＣＲを連続して２回行い、野性型ＦＭＤＶＡ２４クルゼイロ由来のＶＰ４及び２Ａと、モザイクデザイン由来のＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１とを含むモザイクウイルスを創出した。第１のＰＣＲにおいては、ＳａｎＤＩフォワードプライマーAGCGGAGCATGACGGCCGTGGGACCC（配列番号５）とＶＰ４リバースプライマーTGTTCGGTGCACTGCTCGCCG（配列番号６）とを用いて、野性型ＦＭＤＶＡ２４クルゼイロから５’ＵＴＲ−ＶＰ４フラグメントを増幅した。また、ＶＰ４フォワードプライマーTGTTCGGTGCACTGCTCGCCG（配列番号７）とＮｈｅＩリバースプライマーTCAACGTCTCCGGCTAGCTTAAGCAGGTCAAAATTC（配列番号８）を用いて、モザイク２．１及び２．２の各構築物のモザイクＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２ＡＰＣＲフラグメントを創出した。続いて、これら２フラグメントをエンドオーバラップＰＣＲで結合した。このアンプリコンをゲルから抽出し、５’ＵＴＲ及び２Ａ各コード領域にそれぞれ存在するＳａｎＤＩ制限部位及びＮｈｅＩ制限部位を利用して、野性型（ＷＴ）感染性ｃＤＮＡクローンＤＮＡプラスミド（ｐＡ２４ＷＴ）にクローニングした（図４）。モザイクウイルスＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．２の各配列（配列番号１及び配列番号３）はシーケンシングにより確認した。親ＦＭＤＶＡ２４クルゼイロ及びＦＭＤＶタイプＯ１ＢＦＳカプシドに対するＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．２カプシドタンパク質配列のアラインメントを図５Ａおよび５Ｂに示す。
【００９６】
モザイクウイルスｃＤＮＡクローンはＳｗａＩ酵素による消化で直線化し、ウイルスのポジティブセンスゲノムを表すＲＮＡ転写産物を、ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）キット（アンビオン）を用いて、製造社の使用説明書に従い創出した。ＲＮＡ転写反応の汚染物質は、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キットヴァイラルＲＮＡピューリフィケーションを用い、製造社の使用説明書に従って除去した。約１０μｇのＲＮＡを用いて、成長直後（ｌｏｇフェーズ）のＢＨＫ−２１細胞のエレクトロポレーションを行った。サンプルを一晩インキュベートした後冷凍し、１／１０接種源を次代に用いる継代培養を続けた。細胞変性効果を記録した後、各モザイクウイルスの大バッチを作り、生育の特性化及びこれらウイルスとＷＴＦＭＤＶＡ２４クルゼイロとの比較のため前述のようなプラークアッセイを行った（Rieder et al., J Virol 67(9):5139-5145, 1993）。即ち、ウイルスの系列希釈液をＢＨＫ−２１細胞単層に吸着させた後、０．６％トラガカントゴムの上掛けを添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。プレートを固定し、クリスタルバイオレット（０．３％／ヒストチョイス；オハイオ州、ソロン、アムレスコ社）で染色し、プラーク数をカウントした。力価はミリリットル当たりのプラーク生成単位（ＰＦＵ／ｍｌ）で表し、本実験は２群で実施した（図３）。
【００９７】
実施例３：ウイルスの中和力価とｒ１値
２種のモザイクウイルス（ＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．２）を試験した。ワクチン接種動物又はＦＭＤＶ回復期動物から得られたウシ血清により中和される能力を計算することによって抗原カバレージを求めた。前述（Rweyemamu et al., J Hyg (Lond) 81(1):107-123, 1978）のように、５０％のウエルの同種ＦＭＤＶの１００組織培養感染量を中和する最後の血清希釈液の逆数（ＴＣＩＤ）５０として中和力価を報告する。Ａ２４  ＦＭＤＶ  ＷＴ親ウイルスに対するモザイクウイルスの一方向抗原関係（ｒ１値）を、異種及び同種の血清力価の間の比として計算し、Samuel et al. (Vaccine 8(4):390-396, 1990)）の記載に従って解釈した。ウイルス中和は、ＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．２モザイクワクチンを接種された動物から得た血清を用いて、種々の異種のＡ型ＦＭＤＶについて行い、本ワクチンと標的ウイルスとの抗原的関係を推測するためにｒ１値を計算した。
【００９８】
実施例４：抗原産生とワクチン処方
ＢＨＫ−２１単層をＡ２４  ＷＴ、モザイクＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．１ウイルスに感染させた。完全な細胞変性効果を観察した後、ウイルスを凍結融解にて細胞から遊離した。ＳＯＲＶＡＬＬ（登録商標）で短時間８０００ｇ及び４℃で遠心して、細胞残渣のワクチン抗原を除去した。ワクチン抗原を含む上清を５ｍＭＢＥＩ（ｐＨ：８．０±０．２）で２５℃、２４時間不活化した。続いて、この不活化抗原を濃縮し、部分的に８％のポリエチレングリコール８０００で精製した。このワクチンを、モンタニド  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧ（フランス国、パリ、セピック社）を用い、製造社の使用説明書に従いウオーター・イン・オイル・イン・ウオーター（ＷＯＷ）エマルジョンとして調製した。具体的には、油性アジュバントを水性抗原相に３０℃で１５分間混合（５０：５０）し、４℃で２４時間保存し、更に１０分の短時間混合サイクルを繰り返した。１４０Ｓ粒子の完全性（Grubman et al., J. Virol., (1985) 56:120-26）及び実験に供したワクチンの抗原濃度（１５μｇ／化学的不活化抗原量）を、１５〜４５％のショ糖密度勾配による分画、その画分の２５９ｎｍでの吸光度、及び酢酸ウラニルで染色した１４０Ｓプレパレーションの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察に従って決定した。
【００９９】
実施例５：動物への攻撃
ＦＭＤＶモザイクウイルスＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．２を、野性型ウイルスの攻撃に対する防御を提供する能力に関して畜牛にて試験した。この検討では畜牛２１頭を３つの治療群に用いて、ワクチンの効力を評価した。この検討では、３種の異なる血清型ＡのＦＭＤＶ攻撃ウイルス（Ａ２４クルゼイロ（１９９５）、野性型単離Ａ（サウジアラビア９５；A/Sau/16/95；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５５３８７４）及び野性型単離Ｂ（イラン０５；A/IRN/1/2005；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号EF208769)）のそれぞれに対するプラシーボ／ワクチン動物ペアを対象とした。各動物にＦＭＤＶモザイクワクチン（ＶＰ４．２．１及びＶＰ４．２．２モザイクウイルスから誘導し、ＢＥＩで不活化したタンパク質。首左右それぞれに筋内投与で用量１０μｇ／２ｍＬ）又はプラシーボを投与した。２１日後、１動物群をＡ２４クルゼイロで攻撃し、残り２動物群に第２回免疫（ブースト）を施した。追加ブースト１４日目の動物群をＦＭＤＶＡサウジアラビア９５又はＦＭＤＶＡイラン０５で攻撃した。全ての攻撃は舌皮内投与で行い、攻撃ウイルスのウシ舌感染用量５０（ＢＴＩＤ５０）を１×１０４とした。
【０１００】
攻撃材料（ＦＭＤＶ血清型Ａ２４クルゼイロ；ＦＭＤＶＡサウジアラビア９５；ＦＭＤＶＡイラン０５）。ウイルスのストックをＤＭＥＭ／１ｘ抗生物質で希釈し、最終濃度を１ｘ１０４ＢＩＤ５０／０．４ｍＬとした。接種後１４日目、又ブースト後、各動物に攻撃ウイルスを舌皮内（ＩＤＬ）投与した。一ヶ所あたり０．１ｍＬで計四ヶ所接種した（計０．４ｍＬ／動物）。接種、ブースト及び攻撃スケジュールを表１に示す。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
まず（０日目）、各動物からベースライン血清サンプルを採取した。表１に示すように、子牛全頭にワクチンを接種した。攻撃後３日目、７日目、１０日目及び１４日目（ｄｐｃ）、畜牛全頭を鎮静させ、ＦＭＤ全身疾患の臨床的兆候（足病変）を検査した。足病変の臨床スコアを標準的臨床スコアリングシステム（陰性＝足の小水疱性病変が見られない、陽性＝一ヶ所以上の足の小水疱性病変が見られる。障害陽性足の数と舌病変の有無も記録した）。ＦＭＤＶ攻撃後の発熱を、攻撃後のいずれかの時点（攻撃後１〜１０日目）の直腸体温が１０３．５°Ｆ以上と定義した。各治療群について、発熱に対する防御程度を次の式から計算した：（発熱陰性の数）／（攻撃対象畜牛数）×１００％。
【０１０３】
抗体価
ＦＭＤＶ血清型Ａ２４クルゼイロ、Ａサウジアラビア９５及びＡイラン０５に対する抗体価を、０日目、７日目、１４日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目及び５０日目に採取した血清サンプルについてウイルス中和をすることによって決定した。ＢＨＫ−２１細胞培養物において定常的ウイルス減少血清中和アッセイにより、ＦＭＤＶ血清ウイルス中和（ＳＶＮ）抗体価を決定した。この際、ＦＭＤＶ血清型Ａ２４クルゼイロ、Ａサウジアラビア９５及びＡイラン０５の１００〜１５０ＴＣＩＤ５０を利用した。ＳＶＮ力価は、細胞変性効果（ＣＰＥ）を基にシュピアマン−ケルバー（Spearman-Kaerber）の方法を利用して計算した。このアッセイの検出下限は０．６ｌｏｇ１０であった。
【０１０４】
各治療群について、ＦＭＤＶ血清型Ａ２４クルゼイロ、Ａサウジアラビア９５及びＡイラン０５に対する、個々のＳＶＮ力価及び治療群の平均ＳＶＮ力価（幾何平均力価［ＧＭＴ］）±標準偏差（Ｓ．Ｄ．））を血清採取の各日について決定した。ワクチン接種前の畜牛は全頭ＦＭＤＶＳＶＮ陰性であった。対照の全ては、攻撃の前にＦＭＤＶＳＶＮ陰性であった。
【０１０５】
ＦＭＤＶのＥＬＩＳＡ
ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＦＭＤＶＮＳＥＬＩＳＡ（サーモフィッシャー）を用い、製作者の使用説明書に従い、ＦＭＤＶ３ＡＢＣ非構造タンパク質に対する抗体を検出した。阻害率が５０％以上であれば、そのサンプルは陽性と考えられた。
【０１０６】
ウイルスの単離
畜牛全頭から０〜５ｄｐｃに採取した血漿サンプルを試験した。ＬＦＢＫαｖβ６細胞単層を含む２４ウエルプレートの各ウエルに、未希釈サンプル（２０μＬ）を加えた。この細胞系は、ＦＭＤＶの単離に最も良く使われる親ＬＦＢＫ細胞系に比べ、ＦＭＤＶの複製により許容性を示した。ウエル（１代目）は３〜４日目にＣＰＥで評価した。ＣＰＥを示さないウエルは全て更に試験した。試験では、陰性の各ウエルから細胞ライゼートを調製し、続いて新たなＬＦＢＫαｖβ６細胞単層を含む２４ウエルプレートに接種（２０μＬ）した。ウエル（２代目）は３〜４日目にＣＰＥで評価した。ＣＰＥを示さないウエルは全て上述のように更に試験した。試験では、新たな細胞に接種した。ウエル（３代目）は３〜４日目にＣＰＥで評価した。同様の分析を行うことにより、０〜５日目（ｄｃｐ）の鼻腔用綿棒による採取物における生存ＦＭＤＶを検出した。［鼻腔用綿棒（ダクロンポリエステル）は冷やした輸送媒体に入れ、混合し、除去した後、−７０℃でサンプルを冷凍した。サンプルは解凍後に遠心し、清澄したサンプル（スピン−Ｘ遠心管フィルター）を試験した］。
【０１０７】
ウイルスのｒＲＴ−ＰＣＲによる検出
畜牛全頭から０〜５ｄｐｃに採取したヘパリン血（血漿）サンプルを、ＦＭＤＶ核酸の存在下又は非存在下、ｒＲＴ−ＰＣＲで分析した。アプライドバイオシステムズＡＢＩ７５００プラットフォームを利用したｒＲＴ−ＰＣＲの熱プロファイルは、６０℃で１０分間保持、９５℃で３０秒の変性を４５サイクルの後、６０℃で１分のポリメリゼーションサイクル、であった。治療群それぞれについて、０〜５ｄｐｃの個々のｒＲＴ−ＰＣＲＣｔ値を決定した。このアッセイにおいて、４０以下のＣｔ値をもって陽性（ＰＯＳ）とし、４０超のＣｔ値をもって陰性（ＮＥＧ）とした。
【０１０８】
ウイルス血症
各治療群について、ＦＭＤＶ攻撃後のウイルス血症の陽性又は陰性を決定した。陽性：細胞培養物中のＣＰＥ、及び／又は採取・試験した（攻撃後１〜５日目）攻撃後サンプルのいずれかにおいてｒＲＴ−ＰＣＲのＣｔ値が４０以下。陰性：細胞培養物中のＣＰＥ未検出、及び採取・試験した（攻撃後１〜５日目）攻撃後サンプルの全てにおいてｒＲＴ−ＰＣＲのＣｔ値が４０超。鼻腔用綿棒からのウイルス単離については、培養物中のＣＰＥの有無のみを決定し、その後上に挙げた分析を行った。各治療群について、ウイルス血症に対する防御程度を次の式から計算した：（ウイルス陰性の畜牛数）／（攻撃対象畜牛数）×１００％。
【０１０９】
まとめ
各治療群について、ＦＭＤ全身疾患（足の小水疱性病変）に対する防御の程度を決定した。評価４時点でのＦＭＤ臨床的疾患スコア（足の小水疱性病変）を、各動物毎、各治療毎にまとめた。各治療群について、全身ＦＭＤ（足病変）対する防御率を次の式から計算した：（足病変陰性の畜牛数）／（攻撃対象畜牛数）×１００％。ワクチン接種の畜牛の７５％以上が全身疾患を示さない一方、プラシーボ対照の１００％がＦＭＤＶ血清型Ａの攻撃後に全身疾患を発症した場合、ＶＰ４．２．１／ＶＰ４．２．２ビバレントワクチンが有効であると考えた。全ての分析結果を表２にまとめる。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
プラシーボ動物２頭が、攻撃５日後に死亡した（心筋炎と推定）。他、上にまとめたように、全プラシーボ動物が疾患を発症した。しかし、本モザイクワクチンで免疫化した動物はいずれも疾患を示さなかった（カウントデータについてのフィッシャーの正確検定ｐ値：１．３２３×１０−５）。これらの結果、本ＦＭＤＶモザイクワクチンが広範な野性型血清型ＡのＦＭＤＶ株に対して非常に有効であることがわかる。
【０１１２】
具体的な実施形態の詳細に参照しながら本発明を説明したが、これら詳細は、請求の範囲によって定義される発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の実施形態の内、独占的所有権又は独占権を主張するものは請求の範囲で定義した。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１：  化学合成物
配列番号２：  化学合成物
配列番号３：  化学合成物
配列番号４：  化学合成物
配列番号５：  化学合成物
配列番号６：  化学合成物
配列番号７：  化学合成物
配列番号８：  化学合成物
【図１】
2019533465.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019533465.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2019533465000001.app
【国際調査報告】
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