(57)【要約】  腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）であって、患者由来の生きた腫瘍細胞を含む、構築物を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、（ａ）生きた腫瘍細胞からなるコアと、（ｂ）コアを囲む（例えば、被包する）シェルとを含み、シェルが生きた良性細胞（例えば、組織細胞、良性型または分化型腫瘍細胞等）からなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物を提供する。また、このような構築物を作製および使用する方法を本明細書に記載する。さらに、（ａ）チャンバー、およびチャンバーと流体連通するチャネルを有するマイクロ流体デバイスと、（ｂ）チャンバー中の生きた腫瘍細胞構築物（例えば、オルガノイド）と、（ｃ）チャンバーおよびチャネル中の増殖培地と、（ｄ）チャンバーおよびチャネルと作動的に結合し、チャンバーからチャネルを通り、チャンバーへ戻って培地を循環させるように構成したポンプと、（ｅ）チャネル中の微孔膜（例えば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）微孔膜）とを備え、それを通して培地が流動するように位置決めした、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用なデバイスを提供する。
2019524128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生きた腫瘍細胞からなるコアと、
（ｂ）前記コアを囲む（例えば、被包する）シェルと
を含み、前記シェルが、生きた良性細胞（例えば、組織細胞、良性型または分化型腫瘍細胞等）からなる、腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）。
【請求項２】
前記生きた腫瘍細胞が、悪性細胞を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記生きた腫瘍細胞が、結腸直腸がん細胞（例えば、ＨＣＴ１１６細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｃｏ２細胞等）、中皮腫がん細胞（例えば、高分化型乳頭状中皮腫細胞）、虫垂がん細胞（例えば、低悪性度虫垂（ＬＧＡ）細胞）、および／または肉腫がん細胞を含む、またはからなる、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
前記腫瘍細胞および前記良性細胞が、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル等）を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５】
前記生きた良性細胞が、上皮細胞を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６】
前記生きた良性細胞が、Ｃａｃｏ−２細胞を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項７】
前記腫瘍細胞が、検出可能な化合物（例えば、蛍光化合物）を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項８】
前記コアおよび／または前記シェルが、ヒドロゲルを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
１日もしくは２日、または１週から２週、またはそれ以上の期間、培地中で増殖させた、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１０】
対象由来の生きた腫瘍細胞を含む、腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）。
【請求項１１】
前記生きた腫瘍細胞のコアを囲む（例えば、被包する）シェルをさらに含み、前記シェルが、生きた良性細胞（例えば、組織細胞、良性または分化腫瘍細胞等）からなり、前記生きた良性細胞が、任意選択的に前記対象由来である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
前記生きた腫瘍細胞が、悪性細胞を含む、請求項１０または１１に記載の構築物。
【請求項１３】
前記生きた腫瘍細胞が、結腸直腸がん細胞（例えば、ＨＣＴ１１６細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｃｏ２細胞等）、中皮腫がん細胞（例えば、高分化型乳頭状中皮腫細胞）、虫垂がん細胞（例えば、低悪性度虫垂（ＬＧＡ）細胞）、および／または肉腫がん細胞を含む、またはからなる、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞および前記良性細胞が、存在する場合、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル等）を含む、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１５】
前記生きた良性細胞が、上皮細胞を含む、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】
前記生きた良性細胞が、Ｃａｃｏ−２細胞を含む、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞が、検出可能な化合物（例えば、蛍光化合物）を含む、請求項１０から１６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１８】
前記コアおよび／または前記シェルが、ヒドロゲルを含む、請求項１０から１７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１９】
１日もしくは２日、または１週から２週、またはそれ以上の期間、培地中で増殖させた、請求項１０から１８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞および／または良性細胞が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の生着率を有する方法を使用して調製される、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２１】
１、２、３、または４週培養した構築物中の細胞の平均数に基づいて少なくとも７５％、８０％、８５％、または９０％の生細胞を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２２】
抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの構築物を提供するステップと、
（ｂ）前記化合物を前記構築物にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、次いで、
（ｃ）目的の前記化合物の抗腫瘍活性を示す、（例えば、前記化合物と接触していない少なくとも１つの同様の構築物の腫瘍細胞と比較した、および／または前記シェルの前記生きた良性細胞と比較した）前記生きた腫瘍細胞の増殖、前記生きた腫瘍細胞の減少（例えば、前記腫瘍細胞の増殖の欠如、前記腫瘍細胞の死滅、前記腫瘍細胞による前記シェルへの浸潤の減少等）を判定するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記腫瘍細胞が、腫瘍に侵されている患者から採取される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞が、患者の腫瘍から採取される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの追加のオルガノイド（例えば、脳、結腸、肺、内皮、心臓、上皮、および／または肝臓オルガノイド）を提供するステップをさらに含み、少なくとも１つの前記追加のオルガノイドが、少なくとも１つの前記構築物と異なる細胞を含む、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの前記追加のオルガノイドが、良性細胞を含み、任意選択的に、良性細胞が、前記腫瘍細胞と同一の患者から採取される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記良性細胞および／または前記腫瘍細胞が、前記患者由来の生検から得られ、前記化合物が、前記生検後約１週間以内に、少なくとも１つの前記構築物および／または少なくとも１つの追加のオルガノイドに接触する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの前記追加のオルガノイドが、肝臓オルガノイドである、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞を検出可能な化合物で標識するステップをさらに含む、請求項２２から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物が、前記腫瘍細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させると判定される場合、前記化合物を前記患者に治療有効量投与するステップをさらに含む、請求項２２から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍細胞についての遺伝子スクリーニング情報に基づいて、目的の前記化合物を同定するステップをさらに含む、請求項２２から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍細胞に対して遺伝子スクリーニング分析を実施するステップをさらに含む、請求項２２から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、プロドラッグである、請求項２２から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）チャンバー、および前記チャンバーと流体連通するチャネルを有するマイクロ流体デバイスと、
（ｂ）前記チャンバー中の生きた腫瘍細胞構築物（例えば、オルガノイド）と、
（ｃ）前記チャンバーおよび前記チャネル中の増殖培地と、
（ｄ）前記チャンバーおよびチャネルと作動的に結合し、前記チャンバーから前記チャネルを通り前記チャンバーへ戻って前記培地を循環させるように構成したポンプと、
（ｅ）前記チャネル中の微孔膜（例えば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）微孔膜）と
を備え、それを通して前記培地が流動するように位置決めした、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用な（例えば、腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞の遊走および／もしくは浸潤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞を含む構築物の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、ならびに／または目的の化合物に対する応答を評価するのに有用な）デバイス。
【請求項３５】
前記腫瘍細胞構築物が、ヒドロゲルを含む、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記腫瘍細胞構築物が、単一細胞型からなる、請求項３４または３５に記載のデバイス。
【請求項３７】
前記腫瘍細胞構築物が、結腸直腸がん細胞（例えば、ＨＣＴ１１６細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｃｏ２細胞等）、中皮腫がん細胞（例えば、高分化型乳頭状中皮腫細胞）、虫垂がん細胞（例えば、低悪性度虫垂（ＬＧＡ）細胞）、および／または肉腫がん細胞を含む、またはからなる、請求項３４から３６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記マイクロ流体デバイスの少なくとも一部が透明であり、前記デバイスが、前記微孔膜と作動的に結合し、前記微孔膜上で腫瘍細胞を検出する（例えば、撮像する）ように構成した検出器（例えば、カメラ）をさらに含む、請求項３４から３７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記生きた腫瘍細胞構築物が、請求項１から２１のいずれか１項に記載の構築物である、請求項３４から３８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４０】
転移活性について腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか１項に記載のデバイスを提供するステップと、
（ｂ）前記デバイス内に前記培地を循環させるステップと、
（ｃ）前記微孔膜上で捕捉した腫瘍細胞を検出するステップと
を含み、捕捉した腫瘍細胞が多数であるほど（例えば、同様の条件下の他の腫瘍細胞、および／または同様の条件下の非転移性細胞と比較して）、前記腫瘍細胞の転移活性が高くなることを示す、方法。
【請求項４１】
転移活性について腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む一次チャンバー、および前記生きた腫瘍細胞オルガノイドと異なる細胞を含む少なくとも１つのオルガノイドを含む少なくとも１つの二次チャンバーを備える、デバイスを提供するステップと、
（ｂ）前記デバイス内に前記培地を循環させるステップと、
（ｃ）少なくとも１つの前記二次チャンバー中の腫瘍細胞を検出するステップと
を含み、少なくとも１つの前記二次チャンバー中に存在する腫瘍細胞が多数であるほど（例えば、同様の条件下の他の腫瘍細胞、および／または同様の条件下の非転移性細胞と比較して）、前記腫瘍細胞の転移活性が高くなることを示す、方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの前記オルガノイドが、肝臓、結腸、脳、肺、内皮、心臓、または上皮オルガノイドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つの前記オルガノイドが、肝臓オルガノイドおよび追加のオルガノイドを含み、前記肝臓オルガノイドおよび前記追加のオルガノイドが、流体連通する別々の二次チャンバー中に存在する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか１項に記載のデバイスを提供するステップと、
（ｂ）前記デバイス内に前記培地を循環させるステップと、
（ｃ）前記化合物を前記腫瘍細胞に（例えば、前記化合物を前記培地に加えることにより）投与するステップと、次いで、
（ｄ）前記微孔膜上で捕捉した腫瘍細胞を検出するステップと
を含み、捕捉した腫瘍細胞が少数であるほど（例えば、同様の条件下であるが、目的の前記化合物を投与していない他の腫瘍細胞と比較して）、目的の前記化合物の抗転移活性および／または抗腫瘍活性が高くなることを示す、方法。
【請求項４５】
抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）肝臓オルガノイドを含む第１のチャンバー、および生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む第２のチャンバーを備えるデバイスを提供するステップと、
（ｂ）前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーへ増殖培地を循環させるステップと、
（ｃ）目的の化合物を前記肝臓オルガノイドおよび／または前記生きた腫瘍細胞オルガノイドに（例えば、前記化合物を前記増殖培地に加えることにより）投与するステップと、
（ｄ）前記試験化合物を投与しない場合の前記生きた腫瘍細胞オルガノイド中に存在する腫瘍細胞数と比較して、前記第２のチャンバー中の腫瘍細胞の存在の減少（例えば、数または密度の変化）を判定するステップと
を含む、方法。
【請求項４６】
前記試験化合物を投与しない場合の前記第１のチャンバー中に存在する腫瘍細胞数と比較して、前記第１のチャンバー中の腫瘍細胞の存在の減少（例えば、数または密度の変化）を判定するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記デバイスが、前記生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび肝臓オルガノイドと異なる細胞を有する少なくとも１つのオルガノイドを含む、少なくとも１つの追加のチャンバーをさらに備える、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法であって、
（ａ）生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む一次チャンバー、および前記生きた腫瘍細胞オルガノイドと異なる細胞を含む追加のオルガノイドを含む、少なくとも１つの二次チャンバーを備えるデバイスを提供するステップと、
（ｂ）前記デバイス内に培地を循環させるステップと、
（ｃ）前記化合物を前記腫瘍細胞に（例えば、前記化合物を前記培地に加えることにより）投与するステップと、
（ｄ）前記試験化合物を投与しない場合の前記生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび／または少なくとも１つの前記二次チャンバー中に存在する腫瘍細胞数と比較して、前記生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび／または少なくとも１つの前記二次チャンバー中の腫瘍細胞の存在の減少（例えば、数または密度の変化）を判定するステップと
を含む、方法。
【請求項４９】
前記追加のオルガノイドが、脳、結腸、肺、内皮、心臓、上皮、および／または肝臓オルガノイドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍細胞が、前記腫瘍に侵されている患者から採取される、請求項４０から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記化合物が前記腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、構築物のサイズをｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、腫瘍細胞数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、および／または腫瘍細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導すると判定される場合、前記化合物を前記患者に治療有効量投与するステップをさらに含む、請求項４０から５０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、２０１６年８月３日出願の米国仮特許出願第６２／３７０，３２０号、および２０１７年６月２０日出願の米国仮特許出願第６２／５２２，３１３号の利点を主張し、各開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号１Ｕ５４ＴＲ００１３６２−０１および５ＵＬ１ＴＲ００１４２０−０３の下、政府の支援により行った。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本出願は、腫瘍モデルとして使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）ならびにその作製および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
高精度医療は、がん患者の治療の向上に素晴らしく有望である。現在、遺伝子プロファイリングを腫瘍生検において実施して、鍵となる重要な変異に基づいた薬物選択の範囲を絞り込むことができるが、特定の患者に絶対的に最良な薬物を選択することは困難なままである。患者自身の細胞で作製した腫瘍モデルにより薬物選択をスクリーニングすると、遺伝子スクリーニングを補完して、最も有効な薬物を決定し得る。このような患者特異的がんモデルは、腫瘍の増殖およびその転移能に対する薬物の効果についての個別化した予測的データをもたらし得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第１の態様は、（ａ）生きた腫瘍細胞からなるコアと、（ｂ）コアを囲む（例えば、被包する）シェルとを含み、シェルが、生きた良性細胞（例えば、組織細胞、良性または分化腫瘍細胞等）からなる、腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）である。生きた腫瘍細胞および／または生きた良性細胞は、対象から、例えば、対象から採取した生検（例えば、腫瘍生検および／または組織生検）等から得ることができる。
【０００６】
本発明の第２の態様は、対象由来の生きた腫瘍細胞を含む、腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）である。いくつかの実施形態では、生きた腫瘍細胞は、対象から採取した生検（例えば、腫瘍生検）由来である。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、（ａ）チャンバー、およびチャンバーと流体連通するチャネルを有するマイクロ流体デバイスと、（ｂ）チャンバー中の生きた腫瘍細胞構築物（例えば、オルガノイド）と、（ｃ）チャンバーおよびチャネル中の増殖培地と、（ｄ）チャンバーおよびチャネルと作動的に結合し、チャンバーからチャネルを通りチャンバーへ戻って培地を循環させるように構成したポンプと、（ｅ）チャネル中の微孔膜（例えば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）微孔膜）とを備え、それを通して培地が流動するように位置決めした、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用な（例えば、腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞の遊走および／もしくは浸潤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞を含む構築物の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、ならびに／または目的の化合物、例えば、薬物もしくはプロドラッグ等に対する応答を評価するのに有用な）デバイスである。
【０００８】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用な（例えば、腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞の遊走および／もしくは浸潤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞を含む構築物の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、ならびに／または目的の化合物、例えば、薬物もしくはプロドラッグ等に対する応答を評価するのに有用な）デバイスであり、このデバイスが、各チャンバーに少なくとも１つのオルガノイドを有する２つ以上のチャンバーを備える。デバイス内に存在する、この１つまたは複数のオルガノイドは、単一の対象から得た細胞から作製してもよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、第１のチャンバー中に生きた腫瘍細胞オルガノイドを、第２のチャンバー中に肝臓オルガノイドを含む。生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび肝臓オルガノイドは、同一の対象から得た細胞から形成してもよく、これにより個別化した分析を提供することができる。
【０００９】
前述および他の本発明の目的および態様を以下に、より詳細に説明する。本発明を様々な形態で具体化することができることが理解されるべきであり、本明細書に記載する実施形態に制限するものとして解釈されるべきではない。むしろ、このような実施形態は、この開示が漏れなく完全であり、この開示により本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】改変された３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル使用して、高精度医療治療レジメンの情報を個々の患者に応じて、よりよく提供するための概念を示す図である。実線矢印は、現行技術の高精度医療のパイプラインであり、この場合、治療は、患者の腫瘍遺伝子プロファイルに基づいて患者のために判定される。しかし、実際には、鍵となる重要な変異の同定後であっても、腫瘍専門医は、可能性のある薬物のいくつかの選択肢を押しつけられることが多く、結果として、最適な治療は何かについての最も妥当とされる推測または見込みが生じることとなる。破線矢印は、患者の細胞で作製したオルガノイドを導入することにより、生検した腫瘍細胞の遺伝子スクリーニングを補完し、最終的に、患者にとって最適な療法を予測することができることを示す。
【図２Ａ】マイクロ流体デバイス層の組立を示す模式図である。上から下の順に、チューブ、流体出入口を有するポリスチレン（ＰＳ）スライド、オルガノイド用チャンバーおよび対応する流体出入口を有する接着フィルム、スライドガラス、ならびにフォトマスク層である。
【図２Ｂ】ｉｎ  ｓｉｔｕパターニング技術を示す模式図である。マイクロ流体チャンバー（ｉ）をＨＡヒドロゲル、光開始剤および腫瘍細胞を含有するヒドロゲル混合物で満たし（ｉｉ）、次いで、フォトマスクを通してＵＶ照明に曝露する（ｉｉｉ）。曝露したヒドロゲルを架橋し（ｉｖ）、その後、清浄な緩衝液を使用して非架橋ゲルを洗い流す（ｖ）。最後に、インキュベーションのために、洗い流した緩衝液を培地と置き換える（ｖｉ）。
【図２Ｃ】コンピュータ制御蠕動ポンプにより流動が促進される、各オルガノイド用の低容量、閉ループ流体回路を特徴とする測定装置全体を示す模式図である。
【図２Ｄ】７日目および１４日目のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ後のデバイス上の腫瘍構築物の最大投影共焦点画像および分割画像である。それぞれ９３．３％および８６．４％のパーセント生存率を示す。
【図３Ａ−３Ｆ】パネルａ〜ｆ（ｉ）は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ後の腫瘍構築物の最大投影共焦点画像であり、パネルａ〜ｆ（ｉｉ）は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用した分割画像である。中灰色は死細胞を表し、明灰色は生細胞を表す。パネルａ）は、＞９０％の生存率を有する１週目の対照の画像である。パネルｂ）は、２週目の対照の画像である。パネルｃ）は、７日間カルボプラチンおよびペメトレキセド薬物の影響下にあった構築物を示す。パネルｄ）は、７日間カルボプラチンおよびペメトレキセド薬物の影響下にあった構築物を示す。パネルｅ）は、７日間シスプラチンおよびペメトレキセド薬物の影響下にあった構築物を示す。パネルｆ）は、７日間シスプラチンおよびペメトレキセド薬物の影響下にあった構築物を示す。
【図３Ｇ】対照および薬物で処置したオルガノイドの分割画像から得た生存率（生細胞／死細胞）測定値を示すグラフである。薬物曝露は７日目に開始した。有意性：＊ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０１
【図４Ａ．４Ｂ】患者由来の腫瘍構築物における、バイオマーカーによる治療薬スクリーニングを示す図である。パネルＡ）では、腫瘍生検試料の遺伝子分析により、ＰＢＲＭ１およびＢＡＰ１の２つの変異を同定した。ＥＺＨ２阻害剤であるＤＺＮｅｐにより標的とし得るものとしてＢＡＰ１変異を同定した。パネルＢ）では、ＭＴＳミトコンドリア代謝アッセイにより、ＤＺＮｅｐ薬物で処置したオルガノイドと比較して、対照オルガノイドが最も増殖性であり、細胞数の減少に比例してミトコンドリア代謝の低下が生じたことが示された。反対に、ＨＣＴ１１６オルガノイドは、ＤＺＮｅｐに対して負に応答するようには見えない。
【図４Ｃ−４Ｆ】患者由来の腫瘍構築物における、バイオマーカーによる治療薬スクリーニングを示す図である。パネルＣ）では、さらに、アネキシンＶおよびＫｉ６７バイオマーカー画像を使用して分析を行ったところ、すべての薬物処置物が、アネキシンＶをＫｉ６７に対して高い割合で有し、アポトーシス細胞量の増加を示した。アネキシンＶおよびＫｉ６７蛍光バイオマーカーの代表的画像を、ＤＺＮｅｐ処置物について示す。赤色染色（白黒画像中の中灰色）は、アネキシンＶであり、緑色染色（白黒画像中の明灰色）は、Ｋｉ６７である。スケールバーは、１００ｕｍを示す。パネルＤ）では、さらに、アネキシンＶおよびＫｉ６７バイオマーカー画像を使用して分析を行ったところ、すべての薬物処置物が、アネキシンＶをＫｉ６７に対して高い割合で有し、アポトーシス細胞量の増加を示した。アネキシンＶおよびＫｉ６７蛍光バイオマーカーの代表的画像を、ＤＺＮｅｐ処置物について示す。赤色染色（白黒画像中の中灰色）は、アネキシンＶであり、緑色染色（白黒画像中の明灰色）は、Ｋｉ６７である。スケールバーは、１００ｕｍを示す。パネルＥ）では、中皮腫オルガノイドにおいてＤＺＮｅｐ濃度が上昇するにつれて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したオルガノイド切片が正常形態を失い、核のないゴースト細胞が出現することを示す。パネルＦ）では、Ｅの中皮腫オルガノイドとは反対に、ＨＣＴ１１６細胞は、Ｅの中皮腫オルガノイドのような用量依存的変化を示さず、ＤＺＮｅｐが中皮腫オルガノイドにおいて、ＨＣＴ１１６オルガノイドよりも効果的に細胞死を誘導することを示唆する。
【図５Ａ】培養することが難しい腫瘍由来の生存可能なオルガノイドを示す図である。パネルＡ）低悪性度虫垂（ＬＧＡ）を示す。
【図５Ｂ】培養することが難しい腫瘍由来の生存可能なオルガノイドを示す図である。パネルＢ）高分化型乳頭状腹膜中皮腫を示す。
【図５Ｃ】培養することが難しい腫瘍由来の生存可能なオルガノイドを示す図である。パネルＣ）臨床診療において既に疑われているように、ＬＧＡオルガノイドは、療法に応答しないが、高悪性度虫垂腫瘍オルガノイドは、療法に応答することを示す。
【図５Ｄ】培養することが難しい腫瘍由来の生存可能なオルガノイドを示す図である。パネルＤ）希少な肉腫からの生存可能な腫瘍オルガノイドの構築を示す。
【図６】図６Ａは、２Ｄ薬物試験プロトコルを示す図である。図６Ｂは、種々の濃度の抗がん剤で処置後の２次元微小環境におけるＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＣＡＣＯ２、およびＳＷ４８０結腸直腸がん細胞株のパーセント相対細胞生存率の値を示すグラフである。Ａ＝レゴラフェニブ（μＭ）Ｂ＝ソラフェニブ（μＭ）Ｃ＝トラメチニブ（ｎＭ）Ｄ＝５−ＦＵ（ｍＭ）Ｅ＝ダブラフェニブ（μＭ）。
【図７】図７Ａは、３Ｄ薬物試験プロトコルを示す図である。図７Ｂは、種々の濃度の抗がん剤で処置後の３次元微小環境におけるＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＣＡＣＯ２、およびＳＷ４８０結腸直腸がん細胞株のパーセント相対細胞生存率の値を示すグラフである。Ａ＝レゴラフェニブ（μＭ）Ｂ＝ソラフェニブ（μＭ）Ｃ＝トラメチニブ（ｎＭ）Ｄ＝５−ＦＵ（ｍＭ）Ｅ＝ダブラフェニブ（μＭ）。
【図８】ＨＣＴ１１６およびＣＡＣＯ２結腸直腸細胞株についてレゴラフェニブ、ソラフェニブ、および５−ＦＵを用いた、２Ｄおよび３Ｄ薬物スクリーニングの結果を比較したグラフである。ｐ値により判定した有意差を再度表示する（＜０．１０＝＊  ＜０．０５＝＊＊  ＜０．０１＝＊＊＊）。
【図９Ａ】環状オルガノイド薬物試験プロトコルを示す図である。
【図９Ｂ】レゴラフェニブによるＨＣＴ１１６の標的細胞死、ならびに５−ＦＵによるＨＣＴ１１６およびＣＡＣＯ２の両方の普遍的細胞死を詳細に示す７日目の顕微鏡画像である。緑色（白黒画像中の明灰色）蛍光色素（カルセインＡＭ）は、生細胞を示し、一方、赤色（白黒画像中の中灰色）蛍光色素（エチジウムホモダイマー１）は、死細胞を示す（スケールバー＝２００μｍ）。
【図９Ｃ】各濃度のレゴラフェニブおよび５−ＦＵの比率、ならびにそれに対する無処置の場合の比率である対照の比率を示すグラフである。
【図１０】デバイスを通して培地を循環させる、マイクロ流体デバイスの内部構成要素および外部構成要素を表す図である。
【図１１】カペシタビンを５−ＦＵの薬物活性形態へ代謝して、心臓および肺オルガノイドにおいて細胞死の増加を誘導するのに肝臓オルガノイドを必要とすることを示すＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの結果を示す画像である。
【図１２】小型化したシステムにおけるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの結果を示す画像であり、肝臓が存在すると、カペシタビンが毒性薬物である５−ＦＵに代謝されて、心臓および肺に毒性を生じることを示す。肝臓なしでは、この代謝は発生せず、心臓および肺オルガノイド生存率は低下しない。
【図１３】標準サイズのシステムおよび小型化したシステムにおける最初のバイオマーカー分析のグラフである。
【図１４】テープ流体工学と接着フィルムおよび／または両面テープ（ＤＳＴ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ならびにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）構成要素を組み込むハイブリッドマイクロリアクター作製戦略の図である。
【図１５Ａ】本発明の態様による２つのチャンバーを有するデバイス例の異なる構成要素および／または図である。
【図１５Ｂ】本発明の態様による２つのチャンバーを有するデバイス例の異なる構成要素および／または図である。
【図１５Ｃ】本発明の態様による２つのチャンバーを有するデバイス例の異なる構成要素および／または図である。
【図１５Ｄ】本発明の態様による２つのチャンバーを有するデバイス例の異なる構成要素および／または図である。
【図１６】本発明の態様による６つのチャンバーを有するデバイス例を示す図である。
【図１７】本発明の態様によるデバイス構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
これより本発明を、本発明の実施形態を示す添付の図面を参照して、以下、より詳細に記載する。ただし、本発明は、多様な形態で具体化することができ、本明細書に記載する実施形態に制限されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、このような実施形態は、この開示が、漏れなく完全であり、この開示により本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供するものである。
【００１２】
本明細書において使用する用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明を制限することを意図するものではない。本明細書において使用する場合、文脈上明白に他に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数形をも含むことを意図する。用語「含む」または「含んでいる」は、本明細書において使用する場合、記述した特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分および／または、その群もしくは組合せの存在を明示するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分および／または、その群もしくは組合せの存在または追加を排除しないことが、さらに理解される。
【００１３】
他に定義しない限り、本明細書において使用する、すべての用語（技術的および科学的用語を含む）は、本発明の属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。一般に使用される辞書において定義されるもの等の用語が、その意味と本明細書および特許請求の範囲との関連において一致した意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書において、そのように明示的に定義しない限り、理想的な、または過度に形式的な意味に解釈されるべきではないことが、さらに理解される。公知の機能または構造は、簡潔性および／または明確性のため、詳細に記載しない場合がある。本明細書において言及する、すべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。用語において矛盾する場合は、本明細書が支配する。
【００１４】
また、本明細書において使用する場合、「および／または」は、関連する列挙した項目のうちの１つまたは複数の、任意またはすべての可能な組合せ、ならびに選択的に解釈する場合（「または」）、組合せが不足していることを言及および包含する。
【００１５】
文脈上他に指示しない限り、本明細書において記載する本発明の種々の特徴は、任意の組合せで使用し得ることを特に意図する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載する、いかなる特徴または特徴の組合せも除外または省略し得ることを意図する。例示すると、本明細書が、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むことを示す場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはその組合せは、省略および排除し得ることを特に意図する。
【００１６】
本明細書において使用する場合、移行句「本質的にからなる」（および文法的変化形）は、主張する本発明の列挙した材料またはステップ「ならびに基本的および新規の特徴に実質的に影響しないもの」を包含するものとして解釈されるべきである。したがって、本明細書において使用する用語「本質的にからなる」は、「含んでいる」と等価であると解釈されるべきではない。
【００１７】
本明細書において使用する用語「約」は、量または濃度等の測定可能な値を指す場合、限定されないが、特定の値の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％等、特定の値の±２０％までの変動、ならびに特定の値を指すことを意味する。例えば、「約Ｘ」は、Ｘが測定可能な値である場合、ＸならびにＸの±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を含むことを意味する。本明細書において提供する、測定可能な値の範囲は、他の任意の範囲および／またはその範囲内のそれぞれの値を含んでもよい。
【００１８】
本発明において使用する「細胞」は、一般に、動物細胞、特に哺乳動物および霊長類の細胞であり、その例は、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、またはヤギを含むが、それに限定されない。細胞は、肝臓、腸、膵臓、リンパ節、平滑筋、骨格筋、中枢神経、末梢神経、皮膚、免疫系等の特定の細胞または組織型に少なくともある程度分化していることが好ましい。いくつかの細胞は、下記にさらに考察するように、がん細胞であってもよく、この場合、いくつかの細胞は、また下記にさらに考察するように、任意選択的にあるが、好ましくは、検出可能な化合物を（天然に、または組換え技術により）発現する。
【００１９】
本明細書において使用する「対象」は、一般に、ヒト対象であるが、本発明の態様では、他の動物対象、特に獣医科用の哺乳動物対象（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）を用いて実行し得る。対象は、男性または女性および乳児、若年、青年、成年、ならびに老年を含む、いかなる年齢の対象であってもよい。
【００２０】
「オルガノイド」は、本明細書において「細胞構築物」および「３次元組織構築物」と互換的に使用し、３次元または多層構造（単層とは対照的な）に作製した、典型的には担体培地中の生細胞の組成物を指す。適した担体培地は、下記に記載するような、架橋したヒドロゲル等のヒドロゲルを含む。ヒドロゲルのさらなる例として、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５６９９に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。オルガノイドは、モデルまたは模倣とする特定の組織または臓器に応じて、１つの分化細胞型、または２つ以上の分化細胞型を含むことができる。いくつかのオルガノイドは、下記にさらに考察するように、がん細胞を含むことができる。オルガノイドが、がん細胞を含む場合、オルガノイドは、組織細胞を含むことができ、かつ／または細胞外マトリックス（または、それに由来するタンパク質またはポリマー）、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸他、その組合せを含むもの等の細胞を含まない組織模倣体を含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス、または架橋したマトリックスと共に細胞を混合して、オルガノイドまたは構築物を形成するが、他の実施形態では、スフェロイドまたはオルガノイド等の細胞凝集体を予備形成し、次いで、細胞外マトリックスと混合してもよい。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、腫瘍性オルガノイドおよび／または非腫瘍性オルガノイドである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、オルガノイドは、ヒト由来細胞である細胞を含み、いくつかの実施形態では、オルガノイドは、ヒト由来細胞からなる細胞を含む。本発明のオルガノイドは、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞により産生されたバイオマーカーと同一の、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）のバイオマーカーを発現および／または産生し得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏの肝臓細胞は、アルブミンを産生し、肝臓細胞を含む本発明のオルガノイドは、アルブミンを発現し得る。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、ｉｎ  ｖｉｖｏの相当する細胞が産生および／または発現する、同一の量または平均量の±２０％、±１０％、もしくは±５％の量のバイオマーカーを発現し得る。バイオマーカーの例として、アルブミン、尿素、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（例えば、α−ＧＳＴ）、ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１β等）、プロスタサイクリン、ＳＢ１００Ｂ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ホルモン（例えば、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン等）、インヒビンＡ／Ｂ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドは、直径が約２００μｍ〜約３５０μｍであり、例えば、約２００、２５０、３００、または３５０μｍである。オルガノイドは、合計で約１，５００または２，０００〜約３，０００または３，５００個の細胞を含むことができる。本発明のオルガノイドは、例えば、任意の３次元形状または多層形状等、任意の適した形状であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドは、スフェロイドの形態である。いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドは、懸濁液または培地（例えば、架橋したヒドロゲル）中に自己組織化させてもよい。
【００２３】
本明細書において使用する「増殖培地」は、本発明を実行するのに使用する細胞を維持する、任意の天然または人口の増殖培地（典型的には水性液体）であってもよい。例としては、必須培地もしくは最小必須培地（ＭＥＭ）、またはその変形、例えば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ならびに血液、血清、血漿、リンパ液他、その合成模倣体を含むもの等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ｐＨ変色指示薬（例えば、フェノールレッド）を含む。
【００２４】
本明細書において使用する「候補化合物」または「目的の化合物」は、原発部位から第２の部位へのがん細胞拡大の阻害活性を判定する、または、がん細胞生存率の低下における活性および／もしくは抗腫瘍活性を判定する、任意の化合物であってもよい。実証のために、マリマスタット（Ｎ−［２，２−ジメチル−１−（メチルカルバモイル）プロピル］−２−［ヒドロキシ−（ヒドロキシカルバモイル）メチル］−４−メチル−ペンタンアミド）を、試験化合物として使用する。しかし、任意の化合物が使用可能であり、一般的には、タンパク質、ペプチド、核酸、および低分子の有機化合物（脂肪族、芳香族、および混合脂肪族／芳香族化合物）等の有機化合物が使用可能である。候補化合物は、組合せ技術によりランダムに生成する技術、および／または特定の標的に基づいて合理的にデザインする技術を含む、任意の適した技術により生成することができる。例えば、Ａ．Ｍ．Ｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１９（２８）：５１２７−３４（２０１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、候補化合物は、本発明の試験および／または方法の実施中に活性薬物に変換可能な、プロドラッグである。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、肝臓オルガノイドにより活性薬物に変換される。
【００２５】
本明細書において使用する「検出可能な化合物」は、蛍光タンパク質（例えば、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質等）；酵素、蛍光、もしくは放射性基、または他の標識と結合した抗体が特異的に結合する抗原タンパク質またはペプチド；あるいは他の任意の適した検出可能な化合物であってもよい。検出可能な化合物は、がん細胞において天然発生するもの（例えば、非がん細胞よりも、がん細胞において高レベルで発現する細胞マーカータンパク質）、または遺伝子工学／組換えＤＮＡ技術によりがん細胞中に挿入される（すなわち、異種性の）ものであってもよい。
【００２６】
本発明を実行するのに使用する細胞は、動物細胞（例えば、トリ、爬虫類、両生類等）であることが好ましく、いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、類人猿、ヒト）であることが好ましい。細胞は、分化または未分化の細胞であってもよいが、いくつかの実施形態では、組織細胞（例えば、肝実質細胞等の肝臓細胞、膵臓細胞、心筋細胞、骨格筋細胞等）である。
【００２７】
細胞の選択は、作製する特定のオルガノイドに依存する。例えば、肝臓オルガノイドでは、肝臓実質細胞を使用し得る。末梢または中枢神経オルガノイドでは、末梢神経細胞、中枢神経細胞、グリア細胞、またはその組合せを使用し得る。骨オルガノイドでは、骨芽細胞、破骨細胞、またはその組合せを使用し得る。肺オルガノイドでは、肺気道上皮細胞を使用し得る。リンパ節オルガノイドでは、濾胞樹状リンパ細胞、線維芽細網リンパ細胞、白血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはその組合せを使用し得る。平滑または骨格筋オルガノイドでは、平滑筋細胞、骨格筋細胞、またはその組合せを使用し得る。皮膚オルガノイドでは、皮膚ケラチノサイト、皮膚メラノサイト、またはその組合せを使用し得る。細胞は、組成物へ最初に組み込む際に分化していてもよく、またはその後に分化する未分化細胞を使用してもよい。上記の組成物のうちのいずれかに追加の細胞を加えてもよく、また下記のように、一次または「第１」のオルガノイドに下記のがん細胞を加えてもよい。
【００２８】
本発明において使用するがん細胞は、メラノーマ、癌腫、肉腫、芽細胞種、神経膠腫、および星状細胞種の細胞等を含むが限定されない、任意の型のがん細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明において使用するがん細胞は、本明細書で教示する方法においてＮ−カドヘリンを発現し、かつ／または上皮間葉転換を示す。がん細胞は、腸（小腸、大腸、結腸）、肺、乳房、前立腺、皮膚、骨、脳、肝臓、膵臓、子宮、子宮頸部、精巣、および卵巣がん細胞等を含むが限定されない、任意の原発組織由来のがん細胞であってもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、がん治療を受けている対象もしくは患者、および／または、がんを有する対象もしくは患者、および／または免疫不全を有する対象等の対象から得ることが可能である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、生検から得た腫瘍細胞等の腫瘍細胞であり、このような細胞から作製したオルガノイドを使用して、潜在的に有効な薬物および／または治療をスクリーニングすることができる。生検から得た腫瘍オルガノイドの例としては、中皮腫、結腸直腸、虫垂、肺、メラノーマ、および肉腫オルガノイドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、組織生検から得た良性細胞を含む。細胞は、脳、肝臓、腸、膵臓、リンパ節、平滑筋、骨格筋、中枢神経、末梢神経、皮膚、免疫系等の特定の細胞または組織型に少なくともある程度分化していてもよい。生検から得た細胞（例えば、腫瘍および／または良性）を使用して、本発明のオルガノイドを形成および／または作製することができ、生じたオルガノイドを本発明の方法および／またはデバイスにおいて、生検後約１、２、３、４、５、６、７、もしくは８日の間に作製および／または使用することができる。いくつかの実施形態では、限定されないが、蛍光化合物（例えば、色素、タンパク質他）で等、検出可能な化合物で細胞を標識してもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドは、不死化細胞株由来の細胞から作製せず、かつ／または不死化細胞株由来の細胞を含まない。本発明のオルガノイドは、腫瘍細胞ならびに／または限定されないが、初代細胞および／もしくは幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞および／または分化型ｉＰＳ由来細胞）等の高機能細胞を含み、かつ／あるいは使用して作製してもよい。
【００３１】
本明細書に記載する本発明の態様および特徴は、本発明の属する分野の当業者に自明である既知の材料、方法および技術、またはその変形に従って実行することができる。例えば、Ｓｋａｒｄａｌ  Ａ、Ｄｅｖａｒａｓｅｔｔｙ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｓｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１３（９）、２０２０〜３２（２０１６）；Ｓｋａｒｄａｌ  Ａ、Ｄｅｖａｒａｓｅｔｔｙ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｂｉｏｉｎｋ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｎａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ２５、２４〜３４（２０１５）；Ｂｈｉｓｅ  Ｎ、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ｖ、ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｌｉｖｅｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ．Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ８（１）；０１４０１０（２０１６）を参照されたい。
【００３２】
上述のように、本発明は、（ａ）生きた腫瘍細胞からなるコアと、（ｂ）コアを囲む（例えば、被包する）シェルとを含み、シェルが、生きた良性細胞（例えば、組織細胞、良性または分化腫瘍細胞等）からなる、腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）を提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、生きた腫瘍細胞は、悪性細胞を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、生きた腫瘍細胞は、結腸直腸がん細胞（例えば、ＨＣＴ１１６細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｃｏ２細胞等）を含む、またはからなる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞および良性細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル等）を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、生きた良性細胞は、上皮細胞を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、生きた良性細胞は、Ｃａｃｏ−２細胞を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、検出可能な化合物（例えば、蛍光化合物）を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、コアおよび／またはシェルは、ヒドロゲルを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、構築物は、１日もしくは２日、または１週から２週、またはそれ以上の期間、培地中で増殖させる。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、対象由来の生きた腫瘍細胞を含む腫瘍モデルとして有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞構築物（または「オルガノイド」）を提供する。いくつかの実施形態では、生きた腫瘍細胞は、例えば、対象の腫瘍等の対象から採取および／または由来する。生きた腫瘍細胞は、腫瘍生検から採取および／または由来し得る。いくつかの実施形態では、生きた腫瘍細胞は、オルガノイドのコアを形成し、オルガノイドは、生きた良性細胞のシェルを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、対象由来の生きた良性細胞を含むオルガノイドを提供する。良性細胞は、例えば、対象の組織等の対象から採取および／または由来し得る。いくつかの実施形態では、生きた良性細胞は、組織生検から採取および／もしくは由来し得、かつ／または組織特異的であり得る。生きた良性細胞を含むオルガノイドは、生きた腫瘍細胞を含むオルガノイドから分離（例えば、デバイスの異なるチャンバー中で別々に形成および／または存在）することができる。いくつかの実施形態では、単一の対象から採取および／または由来する細胞を用いて（例えば、対象由来の１つまたは複数の生検を使用して）、対象由来の腫瘍生検から得た生きた腫瘍細胞を含む少なくとも１つのオルガノイド、および対象由来の生きた肝臓細胞を含む少なくとも１つの別のオルガノイドを有する、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれ以上）の異なるオルガノイドを形成する。いくつかの実施形態では、単一の対象から採取および／または由来する細胞を用いて（例えば、対象由来の１つまたは複数の生検を使用して）、対象由来の腫瘍生検から得た生きた腫瘍細胞を含む少なくとも１つのオルガノイド、および肝臓腫瘍細胞と同一の組織型である、対象由来の生きた良性細胞を含む少なくとも１つの別のオルガノイドを有する、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれ以上）のオルガノイドを形成する。
【００４３】
本発明のオルガノイドは、療法および／または治療の開始前に任意選択的に、患者の治療を決定するのに使用可能な患者特異的モデル系を提供することができる。いくつかの実施形態では、限定されないが、遺伝子バイオマーカー評価および／または遺伝子プロファイリング等の追加のスクリーニング方法に加えて任意選択的に、抗腫瘍活性について目的の化合物をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドおよび／または方法により、細胞バイオマーカー認識、バイオマーカー発現の定量、および／もしくは化学療法薬物有効性のリアルタイム試験が可能となり、かつ／または提供され得る。
【００４４】
抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法を（ａ）本明細書に記載の生きた腫瘍細胞を含む少なくとも１つの構築物を提供するステップと、（ｂ）化合物を構築物にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、次いで（ｃ）目的の化合物の抗腫瘍活性を示す、（例えば、化合物に接触していない少なくとも１つの同様の構築物の腫瘍細胞と比較した、および／または構築物を囲むシェル中に存在し、かつ／もしくは別のオルガノイド中に存在する生きた良性細胞と比較した）生きた腫瘍細胞の増殖、生きた腫瘍細胞の増殖の減少（例えば、腫瘍細胞の増殖の欠如、腫瘍細胞の死滅、腫瘍細胞によるシェルへの浸潤の減少等）を判定するステップとにより実行することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍に侵されている患者から腫瘍細胞を採取する。いくつかの実施形態では、目的の化合物は、プロドラッグである。いくつかの実施形態では、化合物が腫瘍細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させると判定される場合、本発明の方法は、化合物を患者に治療有効量投与するステップをさらに含むことができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象（例えば、患者）から腫瘍生検を得るステップ、およびこの細胞を使用して本発明のオルガノイドを調製するステップを含む。腫瘍生検は、変異を同定するために一部または全部を遺伝子配列決定することができ、同定した任意の変異が、対象の治療（例えば、抗腫瘍活性）のための目的の化合物の１つまたは複数を指示および／または示唆することができる。本発明の方法は、遺伝子配列決定において同定した目的の化合物の１つまたは複数をスクリーニングするステップ、ならびに目的の化合物の１つまたは複数のそれぞれ、および／またはその組合せを、腫瘍生検由来の細胞を使用して作製したオルガノイドと接触させるステップを含むことができる。本発明の方法は、目的の化合物の１つまたは複数が腫瘍細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させると判定される場合、目的の化合物の１つまたは複数を、腫瘍生検を採取した対象に治療有効量投与するステップをさらに含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象由来の腫瘍生検から得た生きた腫瘍細胞から腫瘍細胞オルガノイドを調製するステップ、および同一の対象または異なる源から得た生きた肝臓細胞から肝臓オルガノイドを調製するステップを含む。いくつかの実施形態では、生きた腫瘍細胞および生きた肝臓細胞を同一の対象から得る。生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび肝臓オルガノイドは、相互に流体連通して（例えば、デバイス、例えば、本明細書に記載のデバイスで）作製することができ、生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび／または肝臓オルガノイドと目的の化合物を接触させることができる。さらに、生きた腫瘍細胞オルガノイドにおける生きた腫瘍細胞の増殖を判定することができる。いくつかの実施形態では、目的の化合物は、肝臓オルガノイドが代謝して活性薬物を生成することができ、活性薬物の活性が判定可能となる（例えば、生きた腫瘍細胞および／または肝臓細胞の増殖がプロドラッグおよび／または活性薬物の影響を受ける場合、この活性を判定することができる）プロドラッグである。１つまたは複数の追加のオルガノイドを本発明の方法において使用してもよい。いくつかの実施形態では、化合物１つまたは複数の追加のオルガノイドは、同一の対象から得ることができ、対象の同一の組織または異なる組織由来であってもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および／またはデバイスは、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上）の目的の化合物の平行スクリーニングを提供および／または可能とすることができる。いくつかの実施形態では、目的の化合物の２つ以上のうちの少なくとも１つは、プロドラッグである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および／またはデバイスは、その細胞を使用して本発明の方法および／またはデバイスにおいて使用した本発明のオルガノイドを作製した、対象由来の生検（例えば、腫瘍生検）を得た後、約１週または２週以内に（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日以内に）、結果（例えば、薬物スクリーニング結果および／または治療分析）を提供および／または可能とすることができる。
【００４９】
また、（ａ）チャンバー、およびチャンバーと流体連通するチャネルを有するマイクロ流体デバイスと、（ｂ）チャンバー中の生きた腫瘍細胞構築物（例えば、オルガノイド）と、（ｃ）チャンバーおよびチャネル中の増殖培地と、（ｄ）チャンバーおよびチャネルと作動的に結合し、チャンバーからチャネルを通り、チャンバーへ戻って培地を循環させるように構成したポンプと、（ｅ）チャネル中の微孔膜（例えば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）微孔膜）とを備え、それを通して培地が流動するように位置決めした、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用なデバイスを本明細書において記載する。いくつかの実施形態では、デバイスは、腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞の遊走および／もしくは浸潤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞を含む構築物の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、ならびに／または目的の化合物に対する応答を評価するのに有用である。いくつかの実施形態では、デバイスは、構築物のサイズをｉｎ  ｖｉｔｒｏで、腫瘍細胞数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ／または腫瘍細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用であり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用なデバイスは、各チャンバー中に少なくとも１つのオルガノイドを有し、相互に流体連通する２つ以上のチャンバーを備える。デバイスは、腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞の遊走および／もしくは浸潤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、腫瘍細胞を含む構築物の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに、ならびに／または目的の化合物に対する応答を評価するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、デバイスは、構築物のサイズをｉｎ  ｖｉｔｒｏで、腫瘍細胞数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ／または腫瘍細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するのに有用であり得る。デバイス内に存在する１つまたは複数のオルガノイドを、単一の対象から得た細胞から作製してもよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、第１のチャンバー中に生きた腫瘍細胞オルガノイドを、および第２のチャンバー中に肝臓オルガノイドを含む。生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび肝臓オルガノイドは、同一の対象から得た細胞から形成してもよく、これにより個別化した分析を提供することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、デバイスは、生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む一次チャンバー；異なるオルガノイドを含む少なくとも１つの二次チャンバー；一次および二次チャンバーに接続し、それらの間に流体連通（例えば、増殖培地の流動等）を可能とする少なくとも１つの一次導管；ならびに任意選択的に、一次チャンバー、各二次チャンバー、および一次導管中に増殖培地を備えることができる。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８つまたはそれ以上）の二次チャンバーを備え、それぞれが他と異なる細胞を含むオルガノイドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの二次チャンバーは、肝臓オルガノイドを含み、任意選択的に、この同一の対象から得た細胞から生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび肝臓オルガノイドを作製する。追加のデバイスの例としては、その全内容を本明細書に組み込む、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４６１１に記載のものが挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
２つのチャンバーを備えるデバイスの例を図１５に示す。５つのチャンバーを有するデバイスの別の例を、異なる段階で培地がデバイスのチャンバーを通してどのように流動し得るかと共に図１６に示す。図１７は、本発明の態様に従って検出可能な化合物で標識した細胞（例えば、腫瘍細胞）を追跡するのに使用可能なデバイス構造の模式図を示す。
【００５３】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞構築物は、ヒドロゲルを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞構築物は、単一細胞型からなる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞構築物は、結腸直腸がん細胞（例えば、ＨＣＴ１１６細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｃｏ２細胞等）を含む、またはからなる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも一部は透明であり、このデバイスは、微孔膜と作動的に結合し、微孔膜上で腫瘍細胞を検出する（例えば、撮像する）ように構成した検出器（例えば、カメラ）をさらに備える。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用するデバイスは、組織容量の割合に対して生理的または超生理的な流体を供給するように構成することができる。例えば、デバイスのチャンバーの１つまたは複数は、約２μＬ〜約１０μＬの範囲の平均的容量を有することができる。いくつかの実施形態では、デバイスのチャンバーの１つまたは複数は、約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μＬの平均的容量を有することができる。いくつかの実施形態では、デバイス（例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のチャンバーを備える装置）では、例えば、約９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０μＬもしくはそれ以下等、約１００μＬ未満の量の液体を使用し、かつ／または約１００μＬ未満の容量を有してもよい。本明細書において使用するデバイスの容量は、デバイスのチャンバーおよびチャネルを満たす容量を指す。いくつかの実施形態では、デバイスは、約５０μＬ未満の量の液体を使用し、かつ／または約５０μＬ未満の容量を有してもよい。
【００５８】
本発明のオルガノイドは、少なくとも１、２、３、４週間、またはそれ以上、生存可能であり得る。いくつかの実施形態では、デバイス内の、かつ／または本発明の方法において使用するオルガノイドは、少なくとも１、２、３、４週間、またはそれ以上、生存可能であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のオルガノイドは、生存可能であってもよく、１、２、３、４週、またはそれ以上、オルガノイド中に存在する細胞の平均数に基づいて、少なくとも約７５％以上（例えば、約８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上）生存する細胞を含むことができる。
【００５９】
本明細書に記載する場合、細胞および／または細胞試料を本発明の方法において使用して、本発明のオルガノイドを形成することができる。本発明の方法では、生存可能なオルガノイドを作製することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上等の少なくとも５０％以上の生着率を達成することができる。例えば、９０％の生着率は、生存可能なオルガノイドまたは複数のオルガノイド（例えば、オルガノイドのセット）を本発明の方法により獲得および／または作製する回数の９０％を意味する。つまり、９０％の生着率では、本発明の方法に従って作製した場合、１０細胞試料のうちの９細胞試料（例えば、腫瘍細胞試料）により、生存可能なオルガノイドまたは複数のオルガノイドが得られることとなる。オルガノイドまたは複数のオルガノイドを本発明の別の方法および／または診断において使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞および／または細胞試料は、例えば、中皮腫生体試料および／またはＧＩ腫瘍生体試料等の腫瘍由来であり得る。
【００６０】
転移活性について腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法は、（ａ）本明細書に上述のように、デバイスを提供するステップと、（ｂ）デバイス内に培地を循環させるステップと、（ｃ）微孔膜上で捕捉した腫瘍細胞を定量的または定性的に検出するステップとにより実行することができ、この場合、捕捉した腫瘍細胞が多数であるほど（例えば、同様の条件下の他の腫瘍細胞、および／または同様の条件下の非転移性細胞と比較して）、腫瘍細胞の転移活性が高くなることを示す。
【００６１】
転移活性について腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法は、（ａ）本明細書に上述のように、デバイス（例えば、生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む一次チャンバー、および少なくとも１つの二次チャンバーを備えるデバイス）を提供するステップと、（ｂ）デバイス内に培地を循環させるステップと、（ｃ）二次チャンバーのうちの１つまたは複数の中に存在する（例えば、任意選択的に、二次チャンバー中に存在するオルガノイド上または／および中の）腫瘍細胞を定量的または定性的に検出するステップとにより実行することができ、この場合、二次チャンバーのうちの１つまたは複数の中に存在する腫瘍細胞が多数であるほど（例えば、同様の条件下の他の腫瘍細胞、および／または同様の条件下の非転移性細胞と比較して）、腫瘍細胞の転移活性が高くなることを示す。抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法は、（ａ）本明細書に上述のように、デバイスを提供するステップと、（ｂ）デバイス内に培地を循環させるステップと、（ｃ）化合物を腫瘍細胞に（例えば、化合物を培地に加えることにより）投与するステップと、次いで（ｄ）微孔膜上で捕捉した腫瘍細胞を定量的または定性的に検出するステップとにより実行することができ、この場合、捕捉した腫瘍細胞が少数であるほど（例えば、同様の条件下であるが、目的の化合物を投与していない他の腫瘍細胞と比較して）、目的の化合物の抗転移活性が高くなることを示す。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍に侵されている患者から採取する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、化合物が腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、構築物のサイズをｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、腫瘍細胞数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、および／または腫瘍細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導すると判定される場合、化合物を患者に治療有効量投与するステップをさらに含む。
【００６２】
抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法は、（ａ）本明細書に上述のように、デバイスを提供するステップと、（ｂ）デバイス内に培地を循環させるステップと、（ｃ）化合物を腫瘍細胞に（例えば、化合物を培地に加えることにより）投与するステップと、次いで（ｄ）一次チャンバーおよび／または二次チャンバー中に存在する腫瘍細胞を定量的または定性的に検出するステップとにより実行することができ、この場合、チャンバー中に存在する腫瘍細胞が少数であるほど（例えば、同様の条件下であるが、目的の化合物を投与していない他の腫瘍細胞と比較して）、目的の化合物の抗転移活性および／または抗腫瘍活性が高くなることを示す。いくつかの実施形態では、腫瘍に侵されている患者から腫瘍細胞を採取する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、化合物が腫瘍細胞の転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、構築物のサイズをｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、腫瘍細胞数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、および／または腫瘍細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導すると判定される場合、化合物を患者に治療有効量投与するステップをさらに含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングするステップを含むことができ、この方法は、（ａ）本明細書に上述のように、デバイスを提供するステップと、（ｂ）肝臓オルガノイドを含む第１のチャンバーから生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む第２のチャンバーへ増殖培地を循環させるステップと、（ｃ）肝臓オルガノイドおよび／または生きた腫瘍細胞オルガノイドに目的の化合物を（例えば、増殖培地に化合物を加えることにより）投与するステップと、（ｄ）試験化合物を投与しない場合の生きた腫瘍細胞オルガノイド中に存在する腫瘍細胞数と比較して、第２のチャンバー中の腫瘍細胞の存在の減少（例えば、数または密度の変化）を判定するステップとを含む。良性および／または腫瘍細胞を任意選択的に含む、１つまたは複数の追加のオルガノイド、例えば、限定されないが、脳、結腸、肺、内皮、心臓、上皮等のオルガノイドは、デバイスの追加のチャンバーの１つまたは複数中に存在してもよく、このチャンバーは、相互に流体連通する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗転移活性および／または抗腫瘍活性について目的の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングするステップを含むことができ、この方法は、（ａ）本明細書に上述のように、デバイス（例えば、生きた腫瘍細胞オルガノイドを含む一次チャンバー、および異なるオルガノイド（例えば、良性細胞を含むオルガノイド）を含む少なくとも１つの二次チャンバーを備えるデバイス）を提供するステップと、（ｂ）デバイス内に培地を循環させるステップと、（ｃ）化合物を腫瘍細胞に（例えば、化合物を培地に加えることにより）投与するステップと、（ｄ）試験化合物を投与しない場合の生きた腫瘍細胞オルガノイドおよび／または二次チャンバー中に存在する腫瘍細胞数と比較して、一次チャンバー（例えば、生きた腫瘍細胞オルガノイドと関連する）および／または二次チャンバー中の腫瘍細胞の存在の減少（例えば、数または密度の変化）を判定するステップとを含む。１つまたは複数の二次チャンバー中の異なるオルガノイドの例は、良性および／または腫瘍細胞を含むことができ、脳、結腸、肺、内皮、心臓、上皮、肝臓等のオルガノイドを含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の方法は、限定されないが、蛍光化合物（例えば、色素、タンパク質他）等の検出可能な化合物を含む標識細胞（例えば、腫瘍細胞）を含むことができる。本発明の前述および他の態様を以下の実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【００６６】
［実施例１］
本プロジェクトの第１の目的は、正常な宿主組織に囲まれた結腸直腸がん腫瘍の３Ｄモデルを評価することであった。改変した同心円状の環状構築物は、結腸直腸腫瘍コアおよび結腸上皮の外輪から構成されており、還元主義的であるが、生理的に適切な環境下の腫瘍をモデル化する。この構築物を使用して、腫瘍コアの増殖、観察された任意の腫瘍細胞の上皮層への浸潤、および薬物の有効性を測定した。ヒアルロン酸およびゼラチンベースのヒドロゲル中に懸濁した細胞で構築物を作製した。４つの結腸直腸がん細胞型のうちの１つを使用して腫瘍コアを作製し、これにより４レベルの悪性度のモデルを作製した。ＨＣＴ１１６細胞は、最も悪性であり、次いでＨＴ２９、ＳＷ４８０、およびＣａｃｏ２細胞であった。Ｃａｃｏ２細胞が健常な上皮細胞に最も類似しているため、Ｃａｃｏ２細胞をまた、外輪に使用した。腫瘍コアを蛍光標識し、蛍光造影を使用して、７〜１４日の経過を通じて腫瘍コアを監視した。この期間の後、腫瘍コアは、高密度となることが示されたが、浸潤は、ほとんど見られなかった。Ｃａｃｏ２外輪およびＳＷ４８０コアで作製した環状構築物をまた、化学療法剤であるレゴラフェニブで処置した。ＭＴＳアッセイにより、処置後、生存可能な細胞の量の減少が確認され、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により、レゴラフェニブが、より腫瘍原性が低いＣａｃｏ２細胞よりも構築物の内輪を選択的に標的としたことが示された。
【００６７】
第２の目的は、３Ｄ結腸直腸がん腫瘍構築物から転移する細胞数を定量化するシステムを開発することであった。マイクロ流体灌流デバイスをデザインして、循環する転移細胞を、デバイス内のチャネル中に封着したＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で捕捉した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のソフトリソグラフィーを使用してデバイスを作成した。ヒドロゲル中に懸濁した単一腫瘍細胞型からなる腫瘍構築物を適切なチャンバー中に配置し、デバイスを密封、固定した。デバイス内を通して培地を循環させ、約２週間、２〜３日毎に画像を取得した。２週間後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で細胞を観察したところ、デバイスが、腫瘍構築物から循環に入った腫瘍細胞の定量化を支援することが可能であることを示した。さらなる試験を実行して、悪性度の異なるレベルの腫瘍細胞が、異なる遊走数を定量的に示すかどうかを確認する。
【００６８】
要約すれば、このような２つのモデル、３Ｄ同心円環状腫瘍モデルおよびマイクロ流体循環腫瘍細胞定量デバイスは、腫瘍細胞の増殖、腫瘍細胞応答に対する薬物の効果、および循環する細胞の定量化を試験する新規の方法をもたらす。
【００６９】
［実施例２］
３Ｄ腫瘍オルガノイドを新鮮腫瘍生検から直接マイクロエンジニアリングにより作製して、療法の開始前の治療最適化の実施を可能とする、患者特異的モデルシステムを作成した。ここで、患者から摘出した中皮腫腫瘍生体試料を使用して、このプラットフォームの初期導入を実証する。ｔｕｍｏｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐマイクロ流体デバイス内で、生存可能な３Ｄ腫瘍構築物を生物学的に作製および維持する能力について示す。次いで、ｏｎ−ｃｈｉｐ化学療法スクリーニングにより、薬物のシスプラチンおよびペメトレキセドに対する患者の応答を模倣することを実証する。最後に、遺伝子バイオマーカー評価により同定した候補化合物の有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証する。
【００７０】
方法
薄膜マイクロ流体デバイスの作製
マイクロ流体デバイス作製方法は、他で既に公表されている方法に基づく。カッティングプロッター（ＧｒａｐｈＴｅｃ−ＣＥ６０００−４０）を使用して、両面接着フィルムにチャネルを形成し、パターン層の底表面を清浄な顕微鏡スライドガラスに接着した。チャネルへの流体送達のための出入口として作用するようにボール盤で空けた穴を特徴とするポリスチレンスライド（Ｔｅｄｐｅｌｌａ．Ｉｎｃ）を上表面に接着した。デバイス構築の後、ＰＴＦＥチューブを各ポートに接続し、ＵＶ硬化ポリエステル樹脂を使用して固定した。
【００７１】
患者の病歴
患者は、衰弱性悪液質、ＥＣＯＧ２機能ステータスおよび腹部膨満を呈している５０歳男性である。組織診断について診断的腹腔鏡検査を実施し、これにより類上皮悪性腹膜中皮腫の診断が確定した。彼の腫瘍の高精度医療分析により、利用可能な標的薬物または臨床試験が存在しない、２つのゲノム変化（ＢＡＰ１スプライス部位１７２９＋１Ｇ＞ＡおよびＰＢＲＭ１  Ｎ２５８ｆｓ×６）が明らかとなった。ｉｖ造影剤を用いたコンピュータ断層撮影（ＣＴ）により、腹膜腔外に疾患の徴候なくして、多量の悪性腹水が示された。彼は、腹腔内温熱化学療法（ＨＩＰＥＣ）を併用した腫瘍縮小術（ＣＲＳ）について検査を受けた。腫瘍の体積が過度であるため、その時点で完全なＣＲＳを達成する見込みはなかった。したがって、彼には、腫瘍体積の縮小を目指して、最新の全身化学療法が勧められた。シスプラチン−ゲムシタビンを６サイクル、その後シスプラチンに伴う聴器毒性の懸念のため、カルボプラチン−ゲムシタビンを単一サイクル用いることにより彼を治療した。彼は、シスプラチンベースの化学療法に対して良好な臨床応答を示し、反復病期診断ＣＴとカルボプラチンベースの化学療法前に実施する臨床検査との両方において、その悪性腹水が、ほとんど完全に消失した。続いて、彼を手術室へ誘導し、ＣＲＳ／シスプラチンベースのＨＩＰＥＣを施術したところ、術後経過に特筆すべきことはなかった。外科的診査の間およびＨＩＰＥＣ前に、その大網疾患の区域を剪刀で切除し、氷中に置き、腫瘍オルガノイドを構築するために研究室へ直ちに移した。
【００７２】
腫瘍生体試料の入手および細胞処理
細胞処理のために摘出から１時間以内に腫瘍を研究室へ運んだ。受け取るとすぐに、２％のペニシリン−ストレプトマイシンを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で５分間３サイクル腫瘍を洗浄し、次いで、２％のペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５分間２サイクル洗浄した。腫瘍をそれぞれ刻み、３７℃のシェーカープレート上で、２％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％のコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼを含むＤＭＥＭ中に入れて１８時間置いた（１０Ｘ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｚｅ／ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｉｎ  ＤＭＥＭ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）。次いで、消化分解された腫瘍を１００μｍの細胞フィルターによりろ過し、遠心分離してペレットを生成する。血漿および非細胞物質を除去し、９ｍＬの脱イオン水を含む１ｍＬのＢＤ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ中に５分間、ペレットを再懸濁した（ＢＤ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。コニカルビーカーを５０ｍＬまで脱イオン水で満たし、遠心分離した、細胞を溶解した溶解緩衝液を吸引し、細胞ペレットを使用可能なものとした。
【００７３】
細胞外マトリックスヒドロゲルの調製および基本的オルガノイド形成
ＥＣＭ模倣ＨＡ／ゼラチンベースヒドロゲル（ＨｙＳｔｅｍ−ＨＰ、ＥＳＩ−ＢＩＯ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を上述のように調製した１５、１８、２７。簡潔には、チオール化ＨＡ成分（Ｇｌｙｃｏｓｉｌ）およびチオール化ゼラチン成分（Ｇｅｌｉｎ−Ｓ）を０．０５％ｗ／ｖの光開始剤２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む滅菌水中に溶解して、１％ｗ／ｖの溶液を調製した。ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）架橋剤（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ、ＥＳＩ−ＢＩＯ）を光開始剤溶液中に溶解して、２％ｗ／ｖの溶液を調製した。次いで、Ｇｌｙｃｏｓｉｌ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、およびＥｘｔｒａｌｉｎｋをそれぞれ２：２：１の容量比で混合した。腫瘍構築物形成では、調製した溶液を、ボルテックスを細胞の再懸濁に使用することにより完全に混合し（２，０００万細胞／ｍＬ）、その後、１秒間の紫外線曝露（３６５ｎｍ、１８Ｗｃｍ−２）により架橋およびオルガノイド形成を開始する。
【００７４】
Ｔｕｍｏｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐバイオファブリケーション
発明者らの以前の研究に類似のフォトパターニング技術を使用して、マイクロ流体デバイス内で腫瘍構築物を生物学的に作製した１５。ここで、チャネル形成に使用した同一のカッティングプロッター技術により１〜３ｍｍの開口を特徴とするフォトマスクをアルミ箔で作製し、適合するパターニングした接着フィルムでマイクロ流体デバイスの底表面に接着した。次いで、ヒドロゲル前駆物質の溶液を、密度２，０００万細胞／ｍＬの患者の中皮腫生検由来の細胞と混合した。混合物を各デバイスチャネルに入口から導入し、オルガノイド構築物を１秒間、接着したフォトマスクを通して紫外光に曝露することにより（３６５ｎｍ、１８Ｗｃｍ−２）明確化した。このように曝露することによってチオレンの段階的架橋反応を迅速に開始し、これにより３Ｄカラム中で細胞を被包した。最後に、曝露しない前駆物質／細胞混合物をリン酸緩衝食塩水でデバイスから洗い流して、各チャネル中に３Ｄ患者由来中皮腫構築物を残した。細胞構築物を有するデバイスの各チャネルを、ＤＭＥＭを有する別々のリザーバーに接続した。ＭＰ２  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏ−ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐ（Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｏｍａｈａ、ＮＥ）に接続したシラスティックチューブにより、チャネルを通してリザーバーから培地を流した。流動を開始し、１０μＬ／分に維持した。
【００７５】
組織学的評価
５μｍ厚のオルガノイド切片をパラフィンで包埋した構築物から作製し、次いで、染色するために脱パラフィンした。ＩＨＣを使用してバイオマーカーであるサイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）、カルレチニン、およびトロンボモジュリンを可視化した。Ｄａｋｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ存在下で１５分間のインキュベーションによりブロッキングを実施した。一次抗体ＣＫ５／６（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７１３３、マウス中で産生）およびカルレチニン（Ａｂｃａｍ、ａｂ７０２、ウサギ中で産生）またはＣＫ５／６およびトロンボモジュリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０９１８９、ウサギ中で産生）をＤａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：２００に希釈して、スライド上の切片に適用し、室温で１時間インキュベートした。次に、適切な種反応性を有するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４二次抗体をＤａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：２００に希釈して、すべての試料に適用し、室温で１時間放置した（抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８および抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ａ−１１０７０）。次いで、カバースリップで覆う前にＤａｐｉで５分間、切片をインキュベートした。後続のバイオマーカーによる実験では、アネキシンＶおよびＫｉ６７染色（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、それぞれａｂ１４１９６およびａｂ１６６６７）に同一プロトコルを使用した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ４００Ｂ複合顕微鏡を使用して蛍光画像を取得し、分析のためにオーバーレイした。
【００７６】
シスプラチン、カルボプラチン、およびペメトレキセド薬物試験
第１週の終わりに、２つの構築物について後述のようにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を実施して、薬物の添加前に細胞が生きていたことを確かめた。薬物の２つの組合せを考えて、このがんモデルについて試験した。ＤＭＥＭ中に混合した０．１μｍおよび１０μｍの２つの異なる濃度のシスプラチン＋ペメトレキセドおよびカルボプラチン＋ペメトレキセドである。ＤＭＥＭリザーバーを２ｍＬの容量のこの薬物混合物に置き換えた。
【００７７】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（哺乳動物細胞用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を薬物曝露期間の終わりの７日目に実施した。はじめに、循環する培地を清浄なＰＢＳでデバイスチャネルから洗い流し、次いで、２μＭのカルセインＡＭおよび２μＭのエチジウムホモダイマー１を含有する、ＰＢＳとＤＭＥＭ（１：１）の混合物１ｍＬを導入した。構築物を６０分間インキュベートし、その後、チャネルを清浄なＰＢＳで再び洗い流した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏ  Ｖｉｅｗ（商標）ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用してｉｎ  ｓｉｔｕ造影を実施した。赤色および緑色蛍光の両方に適したフィルターを使用して、各構築物について５μｍのｚスタックを取得し、次いで、オーバーレイした。
【００７８】
Ｉｍａｒｉｓ  ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＰｒｏ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）を使用して共焦点画像を処理した。このソフトウェアにより、各カラーチャネルの画像を細胞のサイズ、形状、および蛍光強度について分析し、細胞の位置を標識した。整合性のために、各画像の４５０μｍ×９００μｍの面積を考慮した。赤色チャネル（死（ＤＥＡＤ））で識別した細胞の総数と比較して、緑色チャネル（生（ＬＩＶＥ））で識別した細胞の総数の定量化により細胞生存率を算出した。
【００７９】
バイオマーカーによる実験薬物試験
腫瘍生体試料を採取した患者は、ウェイクフォレストバプテストメディカルセンター（Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｂａｐｔｉｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の総合がんセンター（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）における高精度医療プログラムに参加し、生検の一部は、腫瘍中の潜在的なアクショナブル変異の同定のために送られることとなった。匿名化したデータは、ＢＡＰ１遺伝子に陽性の変異を示し、ｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）阻害剤を実験的な標的療法として試験するのに有利な条件を示した。
【００８０】
腫瘍構築物をもう一度生物学的に作製し、その後、薬物スクリーニング前に３日間、これを維持した。次いで、患者のオルガノイドを、細胞培養培地中で０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭの濃度のヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤である薬物３−デアザネプラノシンＡ（３−ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ）（ＤＺＮｅｐ）に９６時間のインキュベーション期間、曝した。ＥＺＨ２阻害に応答することがわかっている結腸直腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６細胞を使用して生物学的に作製したオルガノイドを、陽性対照として並行して試験した。ＭＴＳアッセイおよび免疫組織化学的検査により薬物の効果を定量化した。ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、ミトコンドリア代謝を定量化して相対的細胞数を判定した。波長４９０ｎｍの調節可能なプレートリーダーシステムであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で吸光度値を測定した。
【００８１】
５μｍ厚のオルガノイド切片についてバイオマーカーアネキシンＶおよびＫｉ６７を使用して免疫組織化学染色を実施した。パラフィンに包埋し、薄片にし、次いで、ＩＨＣ染色のために脱パラフィンした、以前に染色しなかったオルガノイドから切片を採取した。一次抗体アネキシンＶをＤａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：２００の濃度に希釈してスライドに適用し、室温で６０分間放置した（アネキシンＶ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ａｂ１４１９６）。平行して、別の試料について、一次抗体Ｋｉ６７をＤａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：２００の濃度に希釈して適用した（Ｋｉ６７、Ａｂｃａｍ、ａｂ１６６６７）。Ａｌｅｘａ４８８二次抗体をＤａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：２００の濃度に希釈して、すべての試料に適用し、室温で１時間放置した（Ａｌｅｘａ  ４８８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ａ−１１０７０）。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ４００Ｂ複合顕微鏡を使用して蛍光画像を取得し、アネキシンＶおよびＫｉ６７についてＧＦＰの隣り合う切片の画像を取り、分析のためにオーバーレイした。アネキシンＶの画像を赤色に着色し（白黒画像中の中灰色）、Ｋｉ６７の画像を緑色に着色した（白黒画像中の明灰色）。
【００８２】
結果
高精度医療による腫瘍オルガノイド戦略
発明者らの目的は、有効性について抗がん剤を試験し、次いで、治療最適化の情報を提供することが可能な、患者特異的腫瘍からなるプラットフォームを開発することであった。個別化した高精度医療の概念は、以下のように働く。腫瘍生検を患者から採取する場合、生体試料のうちのいくつかまたはすべては、ドラッガブルな標的を示し得る変異を同定するために、一部または全部を遺伝子配列決定する。続いて、このようなバイオマーカーのうち１つを標的とする、ＦＤＡが認可した薬物が利用可能であるか、または臨床試験が進行中である場合、患者が受ける、その薬物または試験のための療法は、それに応じて調整することとなる（図１−実線矢印）。至適条件下では、この戦略は、標準的化学療法において、より有効な療法をもたらす。しかし、実際には、頻繁に多重変異が同定され、明確で最良な治療がないことにより可能性のある薬物の一連の選択肢が生じ、このような薬物ならびに可能性のある実験薬物を試験する追加手段が必要となる。発明者らの方法は、遺伝子プロファイリングのために送られた同一の生体試料材料を使用して形成した、患者由来の腫瘍オルガノイドを組み込むことである。この方法では（図１−破線矢印）、生体試料の一部を採用して、細胞を支持する細胞外マトリックスヒドロゲル生体材料を用いた多数のマイクロスケール３Ｄ腫瘍オルガノイドを生物学的に作製する。次いで、遺伝子スクリーニングで同定した薬剤を試験するようにデザインした薬物スクリーニングに、このようなオルガノイドを使用し、これによって、その患者にどの薬剤が最も有効かを判定する。
【００８３】
患者特異的ｔｕｍｏｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐバイオファブリケーション
図２のパネルＡ〜Ｃは、薄膜マイクロ流体デバイスの生物学的作製、腫瘍オルガノイドのｉｎ  ｓｉｔｕ組込み、および一般的デバイス操作のプロセスを表す。６つの独立した腫瘍オルガノイドを収容することが可能なデバイスは、流体チャネルおよびオルガノイドチャンバーを遮断する接着フィルムからなり、これは、出入口を有するポリスチレンスライドとフォトマスクを接着したスライドガラスとの間に挟まれている（図２、パネルＡ）。患者の腫瘍由来の細胞を含有するヒドロゲル前駆物質溶液を使用して腫瘍オルガノイドをパターン形成し、この腫瘍オルガノイドを６チャネルそれぞれの中に導入し、フォトマスクの開口を通してオルガノイドとして光重合した（図２、パネルＢ）。オルガノイドを生物学的に作製した後、マイクロ蠕動ポンプおよび培地リザーバーにチューブを介してデバイスを接続し、その後、オルガノイド培地の流動を開始した（図２、パネルＣ）。
【００８４】
はじめに、循環するＤＭＥＭ存在下で７日間または１４日間、各腫瘍構築物を放置した。生存可能な患者由来腫瘍モデルを維持するプラットフォームの能力を検証するために、発明者らは、７日目および１４日目に、オルガノイドについてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ分析を実施した（図２、パネルＤ）。結果は、７日目には９０％より高く、１４日目には８５％より高い、高細胞生存率を示し、これによって、発明者らのデバイス構造およびその支持ヒドロゲルマトリックスにより、実験法の拡張のために、患者由来細胞を支持することが可能であることを実証した。
【００８５】
Ｔｕｍｏｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐが患者の薬物応答と相関する生存可能な患者由来モデルおよび化学療法薬試験を支持する
７日目に、腫瘍構築物のサブセットを、２つの異なる用量である、カルボプラチン／ペメトレキセドおよびシスプラチン／ペメトレキセドの各化学療法薬混合物のうちの１つ、または薬物なしに曝露した。７日の治療の後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ分析をすべてのオルガノイドについて実施した（図３、パネルａ（ｉ）〜ｆ（ｉ）およびａ（ｉｉ）〜ｆ（ｉｉ））。対照（薬物なし）条件下では、腫瘍構築物を観察して高生存率に維持したところ、デバイス内で合計１４日後、８７％までの統計学的に有意な低下を示した。しかし、薬物混合物に曝露したオルガノイドは、生細胞率の大幅な低下を示した。カルボプラチン／ペメトレキセドで処置した試料では、０．１μＭの循環濃度の場合は生存率が５２．１％に、１０μＭの場合は３９．８％に低下したことを発明者らは確認した。高用量では、低用量よりも２桁高い濃度であったが、認められた生存率の変化は、低い有意性しか有さず（ｐ＜０．１）、潜在的に中等度の薬物効果を示した。対照的に、シスプラチン／ペメトレキセドで処置したオルガノイドでは、０．１μＭの濃度の場合は３９．０％、１０μＭの場合は１１．８％までの生存率の低下がもたらされた。これらは、相互（ｐ＜０．０５）と対照測定（それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）の両方と比較して有意な低下を示した。したがって、シスプラチン／ペメトレキセドは、発明者等のデバイスにおいて、カルボプラチン／ペメトレキセドよりも有意に有効であった。このような結果を図３、パネルｇに纏める。
【００８６】
このようなデータは、２つの中心的な成果を有する。第一に、このデータは、広範な試験のために、生体工学により作製したオルガノイド系において長期的に、患者の腫瘍生検由来の細胞を持続することが可能であることを実証する。発明者らの知るところでは、本発明は、この能力を初めて報告したものである。第二に、このデータは、このようなオルガノイドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで薬物スクリーニングすることが実行可能であり、細胞生存率の薬物依存的低下をもたらすことを示す。治療の施行前に患者特異的方法で薬物有効性を原理的に確立することができるため、これは、療法デザインに対して有望な利点となる。例えば、このような測定において、発明者らの結果は、シスプラチン／ペメトレキセドを、カルボプラチン／ペメトレキセドよりも優れた治療選択肢として提案する。個別化医療の性質として、患者において２つの薬剤の有効性を体系的に比較することができない。しかし、決定的には、患者をシスプラチン／ペメトレキセドで治療して、良好な応答を得た。これは、患者特異的薬物の有効性が、発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムにおいて正確に再現可能であることを示唆する。
【００８７】
遺伝子バイオマーカー同定による実験薬物スクリーニング
高精度医療試験により、腫瘍生体試料において既知の２つの変異を同定した。ＢＡＰ１スプライス部位１７２９＋１Ｇ＞ＡおよびＰＢＲＭ１  Ｎ２５８ｆｓ×６である。ＢＡＰ１（ＢＲＣＡ１関連タンパク質１）は、脱ユビキチン化酵素２８であり、一方、ＰＢＲＭ１は、いくつかのがんと関連する腫瘍抑制遺伝子２９である。試験時には、中皮腫または他の任意の腫瘍型において、いずれの変異もＦＤＡ認可療法と関連しなかった。
【００８８】
しかし、さらなる調査において、発明者らは、動物モデルおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、ＤＮＡのメチル化および転写抑制に関与する酵素であるＥＺＨ２を阻害することにより３０、ＢＡＰ１の変異を標的として成功してきたことを確認した（図４、パネルＡ）。したがって、発明者らは、ＥＺＨ２阻害剤であるＤＺＮｅｐを使用して、薬物スクリーニング実験を実施した。対照集団として、広範に研究されている結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を使用して、オルガノイドを作製した。重要なことには、ＨＣＴ１１６細胞は、ＤＺＮｅｐ３１で処置すると、細胞周期が停止するが、必ずしも顕著なレベルの細胞死を受けないことがわかっており、したがって、発明者らは、ＨＣＴ１１６細胞が、この試験に適切な対照であると考えた。
【００８９】
発明者らの結果は、薬物治療後、ＨＣＴ１１６の増殖の有意な減少は無かったが、中皮腫の増殖の有意な減少があったことを示す（図４、パネルＢ）。ＨＣＴ１１６および中皮腫の対照は類似していたが、ＤＺＮｅｐで処置した中皮腫は、薬物濃度の上昇とともに、対照と比較して増殖が減少したことを示した。ＤＺＮｅｐ濃度が上昇するにつれて、細胞増殖は減少した。さらに、ＨＣＴ１１６と中皮腫とで比較すると、すべての治療薬濃度について、中皮腫細胞増殖が有意に減少することが示される。両方の細胞型について、すべての条件にわたってアネキシンＶおよびＫｉ６７免疫組織化学的検査を実行した。アネキシンＶでは、ＤＺＮｅｐ濃度の上昇とともに中皮腫が増加するように見え、これは、アポトーシス細胞の増加を表す（図４、パネルＣ）。しかし、すべてのＨＣＴ１１６条件にわたって増殖の微小変化が見られ、これは、ＤＺＮｅｐが増殖に大きく影響しなかったことを示す（図４、パネルＤ）。各オルガノイドについてヘマトキシリンおよびエオシン染色を行ったところ、中皮腫の代表的な画像では、ＤＺＮｅｐで処置した場合、ゴースト細胞および核のないゴースト細胞を示す（図４、パネルＥ）。この応答は、中皮腫またはＨＣＴ１１６対照では見られず、ＨＣＴ１１６のいかなる処置物においても存在しない（図４、パネルＦ）。中皮腫のみが応答したことにより、ＤＺＮｅｐが患者試料の増殖を測定可能に減少させ、ＨＣＴ１１６が応答を示さない適切な陽性対照として作用したことが、さらに示される。
【００９０】
考察
腫瘍ＤＮＡを配列決定してアクショナブルな遺伝子変異を同定する高精度腫瘍学が、がん治療の療法決定における標準的な臨床診療となる態勢は整っている。しかし、現在、いかなる既報の遺伝子変異と可能性のある薬物との相関性も治療開始前には確認できず、その上、たった１１％の高精度医療を試験した患者のみが、高精度医療が導く治療に従うこととなる。さらに、組織型、悪性度および腫瘍体積に基づく、がんの生物学的挙動には多変性がある。
【００９１】
研究では、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を使用して患者の腫瘍の進行および薬物治療応答を試験してきた。このようなモデルは、マウス由来細胞が浸潤する原因となる生検または腫瘍試料を留置する、免疫不全マウスを必要とすることがない。細胞はまた、その新たな環境に適応し、初期試料から遺伝的浮動を示しており、これにより、やはり理想的とは言えないものとなっている。ＰＤＸ技術の広範な採用における１つのさらなる制限要因は、免疫不全マウス中に導入した場合、最も悪性の腫瘍生体試料のみが「生着」に成功することである。一般的に２５〜３３％のパーセント成功率範囲であると認められる、その乏しい生着率により、大多数のがん患者に対するＰＤＸ技術の適応性およびその予測的応用が制限されている。本明細書に記載の研究、および平行して進行中の試験の初期では、発明者らの方法に対する主要な批評は、ＰＤＸの生着率の割合を発明者らが改善することができたかというものであった。注目すべきことには、これは、発明者らのプラットフォームにおいては、驚くほど簡単なものであった。図２に示すように、発明者らは、培養の７日目および１４日目に高い細胞生存率を確認している。さらに、発明者らが、他の中皮腫生体試料および他のＧＩ腫瘍生体試料を用いて同様の試験を実施する場合、発明者らは、９０％より高い生着率を観察した。１０％の非生着率が、低悪性度虫垂粘液性腫瘍患者から得た無細胞試料を反映している可能性があることに言及することは重要である。上記は、現時点ですべての高悪性度の試料が、オルガノイドを増殖させたという知見から生じる。これは、意味のあることであり、３Ｄ、ＥＣＭ微小環境支持オルガノイド技術を使用することによって、ＰＤＸ技術により可能なものよりも、より多くの患者にとって採用可能なモデルを作製することが可能であり得ることを我々に示す。非常に見込みのある一方で、生着効率のさらなるこの証拠のため、有意なさらなる確認試験が必要とされる。
【００９２】
この一連の実験では、生着率および生存率評価を越えて、発明者らは、１）患者と腫瘍オルガノイドとの相関性および２）実験薬物のバイオマーカーによる試験、の２つのさらなる概念実証のシナリオの実現可能性を実証する。第一に、発明者らは、中皮腫オルガノイドプラットフォームを使用して、この型のがんに臨床的に使用する、一般的な化学療法レジメンのうちの２つをスクリーニングした。特に、発明者らは、シスプラチンおよびペメトレキセド対カルボプラチンおよびペメトレキセドの組合せに対するオルガノイドの応答を試験した（図３）。マイクロ流体システムを介して循環する培地中へ注入することにより７日間、薬物に曝露すると、シスプラチン−ペメトレキセド治療が、より有効であったことを示す、明確な結果がもたらされた。生細胞に対する死細胞の比率は、相対的濃度のカルボプラチンおよびペメトレキセドと比較して、１０μＭのシスプラチンおよびペメトレキセドの治療においてより高かった。発明者らが、そのプラットフォームにより薬物スクリーニング試験の実施に成功することができるという点では、この結果は、それ自体で、発明者らのプラットフォームを立証する。しかし、より重要なことには、このようなオルガノイドを導出した患者はまた、そのシスプラチンベース化学療法の終わりに実施したＣＴ造影において、その多量の腹水が、ほとんど完全に消失したことにより実証されたように、シスプラチンベースの化学療法に対して劇的に応答した。実際には、この患者は、その腫瘍がシスプラチンベースの治療に応答しなければ、有効な対象ではなかった。これは、重要なことであり、患者と発明者らのオルガノイド技術との、このような相関的結果は、臨床適用を目的としたこの方法を実証するために、発展し続ける上で重要なデータセットである。
【００９３】
第二に、発明者らは、患者の腫瘍生体試料の一部を使用した遺伝子試験結果を確認した。この報告は、この腫瘍に特異的な２つの変異が同定されたことを示した。ＢＡＰ１スプライス部位１７２９＋１Ｇ＞ＡおよびＰＢＲＭ１  Ｎ２５８ｆｓ×６である。上記のように、ＢＡＰ１は、脱ユビキチン化酵素２８であり、一方、ＰＢＲＭ１は、いくつかのがんと関連する腫瘍抑制遺伝子２９である。このような試験時には、中皮腫または他の任意の腫瘍型において、いずれの変異もＦＤＡ認可療法と関連せず、進行中のいずれの適切な臨床試験とも関連しなかった。しかし、発明者らは、動物モデルおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、ＥＺＨ２を阻害することにより３０、ＢＡＰ１の変異を標的としてきたことを確かに確認した。したがって、発明者らは、遺伝子分析において示される、このようなバイオマーカーが、アクショナブルな標的として確かに使用され得たかどうかを問う試験シナリオとして、ＥＺＨ２阻害剤であるＤＺＮｅｐを使用して、薬物スクリーニング実験を実施した（図４）。実際に、この化合物による治療において、発明者らは、一般的には細胞数に比例する一測定基準である、ミトコンドリア代謝の低下を認めた。その上、発明者らは、アポトーシスを示す、アネキシンＶの発現の増加傾向に対して、増殖細胞を示す、Ｋｉ６７の発現の減少傾向を認めた。さらに、Ｈ＆Ｅ染色により、細胞形態および損傷のない細胞核が、化合物により用量依存的に損傷を受けることが示される。広範に使用されているＨＣＴ１１６結腸直腸がん細胞株から同一の方法で作製したオルガノイドは、同様に応答しなかった。むしろ、ＤＺＮｅｐは、濃度にかかわらず、その間でほとんど効果を有さないように見えた。
【００９４】
循環系を有する平行化したマイクロ流体プラットフォームにおいて、このような３Ｄ腫瘍モデルを導入することによって、発明者らは、単一デバイス上で複数の薬物の種類および用量を評価する能力を有するだけでなく、発明者らは、遠隔部位への転移前に発生する、腫瘍の進行、遊走、および循環系への血管内浸潤の動態を可視化し、追跡する有利な条件をも得る。
【００９５】
［実施例３］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで９０％より高い生着率で（対して２Ｄ細胞培地では１０％未満）、患者腫瘍由来オルガノイドの複数のセットが作製されており、これは、最も高悪性度の生体試料のみが増殖する、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける既報の生着率２５〜３３％と比較して有利である。この乏しい生着率により、多くのがん患者のための予測診断へＰＤＸ技術を応用することが制限されている。発明者らの腫瘍オルガノイド系を薬物スクリーニングに引き続き使用して、患者と同様に、その腫瘍オルガノイドが異なる薬物に対する選択的応答を維持することを実証している。現在までに、結腸直腸がん、高および低悪性度虫垂転移部位から網、卵巣および肝臓まで、腹膜中皮腫、ならびに四肢の肉腫を含む、一次細胞の多様な群と、その転移部位から患者特異的オルガノイドのセットが作製されている。１）腫瘍オルガノイド薬物応答とオルガノイドを導出する患者の薬物応答との相関性、２）患者の腫瘍におけるドラッガブルな変異の同定に基づいてデザインした療法の有効性を試験する能力、および３）培養することが難しい腫瘍集団から、生存可能なオルガノイドを構築することを実証する、いくつかの例を本明細書に記載する。
【００９６】
発明者らは、希少で単離および培養することが難しいがん型から、生存可能な腫瘍オルガノイドモデルを作製する能力を実証した。例えば、発明者らは、低悪性度虫垂（ＬＧＡ）腫瘍（図５、パネルＡ）、および従来から「良性」中皮腫と呼ばれる、高分化型乳頭状中皮腫（図５、パネルＢ）から生存可能な患者特異的腫瘍オルガノイドを作製した。この両方は、緩慢な増殖パターンおよび予測できない形質転換能力を有する。現在まで、一次細胞から低い増殖指数で細胞培養物を構築することは、本質的に不可能であった。重要なことには、治療によく応答する高悪性度オルガノイドおよび２Ｄ培養物と比較して、発明書らのＬＧＡオルガノイドは、化学療法剤に応答しない（図５、パネルＣ）。このようなデータは、ＬＧＡが確かに化学療法抵抗性の腫瘍であり、したがって、化学療法を用いたＬＧＡ患者の治療は有益ではなく、その治療に無用の毒性を残すという初めての有用で確実な証拠となり得る。さらに、発明者らは最近に四肢の肉腫を処理し、発明者らのプラットフォームにおいて高生存率をも示す患者特異的肉腫オルガノイドのセットを作製した（図５、パネルＤ）。このような肉腫オルガノイドは、薬物スクリーニング試験において現在、採用されている。
【００９７】
［実施例４］
悪性腫瘍細胞に対する正常細胞型の制限は、細胞間相互作用の変化により、および物理的障壁により維持される（Ｌｏｄｉｓｈ  Ｈ、Ｂｅｒｋ  Ａ、Ｚｉｐｕｒｓｋｙ  ＳＬ、ｅｔ  ａｌ．２０００）。抗がん剤は、循環系を介して腫瘍へ移動し、血管外組織を貫通して、臓器の内部に存在する、がん細胞を標的とすることに成功しなければならない（Ｔａｎｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。環状オルガノイドモデルでは、異なる細胞型に囲まれる浸潤性のがん型を含む単純な３Ｄ微小臓器、またはオルガノイドを作製し、次いで、特異的抗がん剤を使用して内部の浸潤性細胞株を標的とすることにより、抗がん剤送達のｉｎ  ｖｉｖｏプロセスを再現することを試みる。さらに、本明細書に記載の実験を実施して、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる環境と同様の３Ｄ微小環境に外部および内部の細胞型の両方が存在する場合、抗がん剤が、外部の細胞型とは対照的に、内部の、より浸潤性の細胞株を標的とすることに成功するかどうかを判定した（前述の３Ｄ薬物スクリーニングにより有効性を判定した）。
【００９８】
抗がん剤の有効性について細胞外微小環境の影響を調査するために、種々の濃度の抗がん剤（レゴラフェニブ、ソラフェニブ、トラメチニブ、５−フルオロウラシル、およびダブラフェニブ）を４つの結腸直腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＳＷ４８０、およびＣＡＣＯ２）に投与し、さらに、これをヒアルロン酸ベースのヒドロゲルに包埋、またはウェルプレートのウェル中に直接播種した。ヒアルロン酸ベースのヒドロゲルに包埋した結腸直腸がん細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３次元微小環境中のがん細胞を模擬し、ウェル中に直接播種した細胞は、従来の２次元微小環境中で増殖したがん細胞とした。
【００９９】
２Ｄ腫瘍構築物薬物スクリーニング
単層培地中に存在する結腸直腸がん細胞株を用いた２Ｄ薬物スクリーニングを行って、ｉｎ  ｖｉｖｏの悪性腫瘍に典型的に見られる細胞ＥＣＭ間相互作用を欠く、従来の薬物スクリーニングの実践において抗がん剤の有効性を判定した。
【０１００】
ウェル中に直接播種したがん細胞に４〜５時間を与えて、ウェル底部に再接着させた。その後、抗がん剤溶液を培地の代わりに投与し（図６、パネルＡ）、２日後にＭＴＳアッセイを実行して細胞生存率を判定した。抗がん剤のＭＴＳ吸光度の結果を、薬物なしの対照のＭＴＳ値の結果と比較して示す（図６、パネルＢ）。１００μＭの濃度のレゴラフェニブおよびソラフェニブ、ならびに１００ｍＭの濃度の５−ＦＵでは、細胞生存率は、使用した結腸直腸がん細胞株の４つすべてについて、対照の生存率の２０％未満に留まった。しかし、ダブラフェニブおよびトラメチニブによるスクリーニングでは、高濃度の他の３つの抗がん剤と異なる結果がもたらされた。１００μＭの濃度のダブラフェニブは、ＨＣＴ１１６細胞について約３６％からＳＷ４８０細胞について約９３％の範囲の相対細胞生存率の値を生じ、１００ｎＭの濃度のトラメチニブは、ＣＡＣＯ２細胞について約３９％〜ＳＷ４８０細胞について約５８％の範囲の相対細胞生存率の値を生じた。１ｍＭの濃度の５−ＦＵで処置した場合、相対細胞生存率は、ＳＷ４８０細胞については約３９％であり、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、およびＣＡＣＯ２細胞については１０％〜２２％未満に留まった。このような値は、最も低い濃度の他の抗がん剤の相対細胞生存率の値よりも、かなり低かった。
【０１０１】
３Ｄ腫瘍構築物薬物スクリーニング
結腸直腸がん細胞株について３Ｄ薬物スクリーニングを行い、さらに、ヒアルロン酸ベースのヒドロゲル構築物に包埋して、ヒアルロン酸の存在下での細胞ＥＣＭ間相互作用が、抗がん剤の有効性にどのように影響するかを観察した。
【０１０２】
ポリジメチルシロキサン、すなわちＰＤＭＳを使用してウェル底部をコートした。ヒアルロン酸ベースのヒドロゲルで細胞を包埋し、５日を与えて、その３次元環境に順化させ、５日目に異なる抗がん剤溶液を投与した（図７、パネルＡ）。７日目にＭＴＳアッセイを行い、結果は、対照値の結果と比較して示した（図７、パネルＢ）。１００μＭの濃度のレゴラフェニブおよびソラフェニブでは、細胞生存率は、使用した結腸直腸がん細胞株の４つすべてについて、対照の生存率の２５％未満に留まった。この唯一の例外は、１００μＭのレゴラフェニブをＣＡＣＯ２細胞に投与した場合であり、パーセント相対細胞生存率は、約４８％まで上昇した。１００ｍＭの５−ＦＵを用いてスクリーニングすると、ＳＷ４８０細胞に使用した場合の４８％からＨＣＴ１１６細胞に投与した場合の８１％の間の相対細胞生存率の値が生じた。しかし、１０ｍＭの濃度の５−ＦＵのみが、４つの細胞株すべてについて、ＳＷ４８０細胞の９％からＨＴ２９細胞の５０％の間の範囲の細胞生存率の値を生じた。１００μＭの濃度では、ダブラフェニブは、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞株を標的とする上で高い有効性を示し、３８％および４３％の相対細胞生存率の値を示した。これは、ＨＴ２９およびＣＡＣＯ２細胞株と対照的であり、９３％および７５％のより高い細胞生存率の値を示した。１００μＭの濃度のトラメチニブでは、４つの結腸直腸がん細胞株について、狭い範囲内に収まる相対細胞生存率の結果がもたらされ、ＳＷ４８０細胞で５４％およびＨＴ２９細胞で７４％の値であった。
【０１０３】
２Ｄおよび３Ｄ薬物スクリーニングの比較
２Ｄおよび３Ｄ薬物スクリーニングについて有意差統計を実行して、いずれかの環境にある場合、結腸直腸がん細胞が抗がん剤に異なって反応したかどうかを確かめた。このような薬物スクリーニングにおける薬物に対する細胞応答の有意差は、細胞とヒアルロン酸との間の細胞ＥＣＭ間相互作用が原因であることを示唆する。レゴラフェニブ、ソラフェニブ、および５−フルオロウラシルに対するＨＣＴ１１６およびＣＡＣＯ２の応答は、このような細胞型間の形態学的相違および類似のためである。この試験の後の部分において、このような細胞および薬物を使用する。
【０１０４】
同一の細胞株に同一の濃度の抗がん剤溶液を与えても、２次元対３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小環境に置いた場合、細胞が薬物治療に異なって応答したことは明白である。ＨＣＴ１１６およびＣＡＣＯ２にレゴラフェニブ、ソラフェニブ、および５−フルオロウラシルを使用した、２次元薬物スクリーニングの結果と３次元薬物スクリーニングの結果との間に細胞生存率における有意差が認められた（図８）。ＨＣＴ１１６細胞では、両者の結果は、レゴラフェニブを用いた、２Ｄスクリーニングと３Ｄスクリーニングとの間で有意に異なり（両方＜０．０５）、ソラフェニブについて１つが有意に異なり（＜０．１０）、２つが５−ＦＵについて有意に異なった（両方＜０．０１）。ＣＡＣＯ２細胞では、両者の結果は、レゴラフェニブを用いた、２Ｄスクリーニングと３Ｄスクリーニングとの間で有意に異なり（両方＜０．０１）、ソラフェニブについて３つが有意に異なり（２つは＜０．０１および１つは＜０．０５）、５−ＦＵについて３つが有意に異なった（２つは＜０．０１および１つは＜０．１０）。
【０１０５】
ＨＣＴ１１６細胞では、ソラフェニブの１０μＭ溶液および５−ＦＵの１０ｍＭ溶液を除いて、３Ｄ薬物スクリーニングを行うと、相対細胞生存率の値は２Ｄ薬物スクリーニングよりも高かった。ＣＡＣＯ２細胞では、レゴラフェニブおよびソラフェニブの１０μＭ溶液ならびに５−ＦＵの１０ｍＭ溶液を除いて、３Ｄ薬物スクリーニングを行うと、相対細胞生存率の値は２Ｄ薬物スクリーニングよりもやはり高かった。２Ｄおよび３Ｄ薬物スクリーニング（図８）の結果を比較すると、レゴラフェニブが、ＣＡＣＯ２細胞よりもＨＣＴ１１６細胞の細胞生存率の変化に対して、より有意な影響を与えたこと、ソラフェニブが、ＨＣＴ１１６細胞よりもＣＡＣＯ２細胞の細胞生存率の変化に対して、より有意な影響を与えたこと（ＨＣＴ１１６は、両方のスクリーニングにおいて既に大きく影響されていたが）、および５−ＦＵが、ＨＣＴ１１６細胞とＣＡＣＯ２細胞の両方の細胞生存率を有意に変化させたことがわかる。３Ｄ薬物スクリーニングの間、１００μＭの濃度のレゴラフェニブおよびソラフェニブでは、ＣＡＣＯ２細胞と比べてＨＣＴ１１６細胞は、４８％に対して２１％、および２５％に対して１５％と低いパーセント相対細胞生存率の値を示した。１００ｍＭの濃度の５−ＦＵにより、１０ｍＭの５−ＦＵの薬物スクリーニングの間の生存率よりもはるかに高い生存率の値が生じたため、３Ｄ微小環境におけるＨＣＴ１１６細胞およびＣＡＣＯ２細胞の両方についての１０ｍＭの濃度の５−ＦＵの結果に注目した場合、これらの相対細胞生存率は、１８％および２２％と、ほぼ同様の値まで低下したことが明らかである。
【０１０６】
環状オルガノイド薬物スクリーニング
環状オルガノイド試験では、３Ｄヒアルロン酸ベースヒドロゲル微小環境での異なる細胞型間の細胞ＥＣＭ間相互作用または細胞間相互作用が、特定のがん細胞を標的とする上で、抗がん剤の有効性および特異性に影響するかどうかを、３Ｄ薬物スクリーニングにおいて、これまでに観察したように試験した。
【０１０７】
ポリジメチルシロキサン、すなわちＰＤＭＳを再度使用してウェル底部をコートした。ＨＣＴ１１６細胞をヒアルロン酸ヒドロゲルに包埋し、ＰＤＭＳ表面上に構築物を作製した。ヒアルロン酸ゲルに同様に包埋したＣＡＣＯ２細胞を使用して、ＨＣＴ１１６内輪構築物を囲む外輪を作製した（図９、パネルＡ）。１００μＭの濃度のレゴラフェニブを投与した場合、３Ｄ微小環境において、ＨＣＴ１１６細胞が、ＣＡＣＯ２細胞と比較して低い相対細胞生存率の値を示したため（２１％対４８％）、また５−ＦＵが、３Ｄ微小環境において、相対細胞生存率の低下に対して同様の効果を示したため、このような薬物を当量濃度（１μＭ、１０μＭ、および１００μＭ）で環状構築物に投与して、比較のため２つの細胞株について、このような薬物の有効性を観察、定量化した。
【０１０８】
７日目にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を環状構築物に行い、Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡上で撮像した（図９、パネルＢ）。画像ソフトウェア、ＭＡＴＬＡＢを使用して、環状構築物について％死滅：％生存（または％赤色（白黒画像中の中灰色）対％緑色（白黒画像中の明灰色））の比率を導いた。次いで、値をグラフ化して、各濃度のレゴラフェニブおよび５−ＦＵの比率、ならびにそれに対する無処置の場合の比率である対照の比率を示した（図９、パネルＣ）。１００μＭでは、レゴラフェニブおよび５−ＦＵは共に、０．９８の％死滅：％生存率を示した。これは、ＨＣＴ１１６およびＣＡＣＯ２細胞のおよそ半数が生存しており、半数が抗がん剤により標的とされたことを意味する。１μＭおよび１０μＭの濃度のレゴラフェニブおよび５−ＦＵを投与した場合に相対細胞生存率を分析すると、％死滅：％生存率は、５−ＦＵ溶液について、レゴラフェニブ溶液についてよりも大幅に高くなる。１μＭでの％死滅：％生存率は、レゴラフェニブについての０．４８とは対照的に、５−ＦＵについては０．９５であり、１０μＭでの％死滅：％生存率は、レゴラフェニブについての０．０８とは対照的に、５−ＦＵについては０．７８である。３濃度のレゴラフェニブおよび５−ＦＵの％死滅：％生存率は、たった０．０３である対照の％死滅：％生存率の値よりも実質的に高かった。
【０１０９】
パネルＢのｌｉｖｅ−ｄｅａｄ画像に注目すると、赤色（白黒画像中の中灰色）の細胞の大部分が外輪（画像の左側）ではなく内輪（画像の右側）中に現れるため、内部のＨＣＴ１１６細胞は、ＣＡＣＯ２細胞よりも大幅にレゴラフェニブに影響されたように見える。対照的に、赤色（白黒画像中の中灰色）エチジウムホモダイマー１色素で染色されていた死細胞が内部（ＨＣＴ１１６）および外部（ＣＡＣＯ２）の輪の両方に現れるため、５−ＦＵは、両方の細胞型を同程度、標的としているように見える。さらに、抗がん剤の濃度を１０倍に上昇させると、薬物による標的細胞死が観察可能に増加する。
【０１１０】
転移を定量化するマイクロ流体デバイス
ＰＤＭＳベースマイクロ流体デバイス（図１０）を開発して、がん細胞を３Ｄヒアルロン酸ベース構築物に包埋し、簡易循環系を流動する抗がん剤溶液を投与した場合、がん細胞転移の比率がどのように変化するかを判定した。さらに、マイクロ流体デバイスによって、抗がん剤が、「一次」腫瘍構築物およびｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で捕捉した「二次」がん細胞中で、がん細胞生存率にどのように影響するかの判定を目指した。
【０１１１】
７日実行して、培地循環に入った細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で捕捉する上でのデバイスの実現可能性を観察することを意図して、２つのマイクロ流体デバイスを設定した。ＨＣＴ１１６細胞を包埋した３Ｄ構築物を両方のデバイスの「構築チャンバー」中に留置した。一方のデバイスの流体リザーバーに無処置の培地を加え（対照）、他方のデバイスの流体リザーバーにソラフェニブの１０μＭ溶液を加えた。１日目および７日目にＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ  ４８７−１顕微鏡を用いて、対照デバイスの構築物およびｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜の画像を取得した。１日目から７日目の間に対照デバイスのｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で捕捉した細胞の増加が、緑色膜色素であるＤｉＯが示すように認められた。デバイスを解体した後、７日目にｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を共焦点顕微鏡上で撮像し、また、このデバイスにより、３Ｄ構築物外に遊走し循環に入った細胞の捕捉に成功したことを確認した。デバイスの流量は、０．２０ｍＬ／分と記録された。
【０１１２】
ソラフェニブ１０μＭの薬物培地溶液を循環させるデバイスは、３日目に内部の真菌感染の徴候を示したため、この観察の後、解体、廃棄した。結果として、このデバイスから収集することができたはずのいかなるデータも失われた。デバイスの出口からの微量な漏出が、真菌混入の原因であると特定された。
【０１１３】
考察
このような試験は、３Ｄ細胞外微小環境が、抗がん剤の有効性を判定する上で重要な役割を果たすことを確立した。４つの結腸直腸がん細胞株は、ヒアルロン酸ベースヒドロゲルに包埋および被包し、５つの抗がん剤を投与した後、細胞生存率において有意差を示した。環状オルガノイドは、３Ｄヒドロゲル環境に包埋した場合、異なるがん細胞を標的とする薬物の定性的比較を可能とし、環状オルガノイドが、細胞の遊走を測定する方法をもたらし得ることを示した。開発したマイクロ流体デバイスは、転移性がん細胞を捕捉する能力を示し、３Ｄ構築物および補足した細胞の継続的顕微鏡観察を可能とし、個別化化学療法薬物スクリーニングのためのモデルおよびプラットフォームとしての使用を提案する。
【０１１４】
材料および方法
がん細胞株の由来
使用するＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＳＷ−４８０、およびＣＡＣＯ−２結腸直腸がん細胞株は、ウェイクフォレスト大学医学部（Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに由来した。１５ｃｍの細胞培養プレートで細胞を培養し、ＤＭＥＭ高グルコース溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）、１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含む標準ＤＭＥＭ−１０（ダルベッコ改変イーグル培地）を細胞増殖培地として使用した。
【０１１５】
２Ｄ薬物スクリーニング
滅菌および細胞継代：培地を細胞培養プレートから吸引し、１０ｍＬのＰＢＳ（２５℃）を各プレート中にピペットで滴下した。細胞培養プレートを操作して、プレート中の細胞全体をＰＢＳで覆い、次いで、このＰＢＳをプレート外に吸引した。０．０５％のトリプシン５ｍＬ（３７℃）を各細胞培養プレート中にピペットで滴下した。次いで、細胞培養プレートを３７℃のインキュベーターに約８分間置いた。この後、５ｍＬのＤＭＥＭ−１０培地を各プレートに加えた。次いで、１０ｍＬの細胞および培地の成分を４つの清浄な１５ｍＬの遠心管に入れた。
【０１１６】
血球計数器上での細胞の計数およびローディング：１０００μＬの単一チャネルピペットで１５ｍＬ遠心管中に細胞を再懸濁し、各細胞株のチューブから新たな１５ｍＬ遠心管中へ１００μＬを移した。次いで、４００μＬのＤＭＥＭ−１０培地および５００μＬのＧｉｂｃｏトリパンブルー染色（０．４％）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）色素をそれぞれの遠心管中にピペットで滴下した。その第２の遠心管を１：１０に希釈して細胞計数を促進し、トリパンブルー染色を加えることにより、細胞計数対象から死細胞を除外した。１０μＬの１：１０に希釈した試料を２〜２０μＬの単一チャネルピペットで滴下し、予め消毒した血球計数器の血球計算盤内に載せた。生細胞を計数し、計算を実行して各がん細胞株の存在する細胞の総数を確定した。
【０１１７】
細胞播種：１０ｍＬのＤＭＥＭ−１０、細胞、およびトリプシンを含む最初の１５ｍＬ遠心管を遠心分離機に入れた。遠心分離設定は、１５００ＲＰＭおよび最大加速度で５分間であった。その後、培地とトリプシンの混合物をチューブから吸引して、細胞ペレットを未損傷のままで放置した。次いで、５ｍＬのＤＭＥＭ−１０を各チューブ中にピペットで滴下して、そのプロセス中に細胞を再懸濁した。算出した５ｍＬの細胞培地溶液の体積を確定して、それぞれ４つの結腸直腸がん細胞株の２５，０００細胞を、ポリスチレン製透明底９６ウェルプレートの各ウェル中に直接播種したことを確認した。次いで、１００μＬのＤＭＥＭ−１０培地をウェル中に直接ピペットで滴下した。９６ウェルプレートを３７℃および５％のＣＯ２で５時間インキュベートして、培地を吸引し抗がん剤溶液を加えるまで、ウェル底部に細胞を再接着させた。
【０１１８】
スクリーニングのための抗がん剤の添加：このスクリーニングで使用する抗結腸直腸がん薬物は、５−ＦＵ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、トラメチニブ、およびダブラフェニブ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を含んだ。高濃度の薬物原液の溶液を、ＤＭＳＯを用いて調製した。低濃度の薬物原液の溶液は、抗がん剤原液をＤＭＥＭ−１０培地と混合することにより調製した。５−ＦＵについては、１ｍＭ、１０ｍＭ、および１００ｍＭの薬物溶液を調製し、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、およびダブラフェニブについては、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの薬物溶液を調製し、トラメチニブについては、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの薬物溶液を調製した。培地をウェルから注意深く吸引し、２００μＬの種々の薬物−培地溶液を、細胞を含むウェル中に入れた。各抗がん剤濃度について、異なる細胞型のそれぞれを有する、３つの複製を作製して、平均値を算出し、得たデータについて統計を行った。次いで、ウェルプレートを３７℃および５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１１９】
細胞生存率アッセイ：抗がん剤溶液への曝露から４８時間後、細胞生存率を判定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（ＭＴＳ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により細胞の生存率を調べた。抗がん剤−培地溶液をウェルから吸引し、２００μＬのＭＴＳ試薬をウェル中に注意深くピペットで滴下した。ＭＴＳ試薬を含んだ細胞のインキュベーション時間は、約４５分であった。別の９６ウェルプレート上で細胞生存率アッセイを実施し、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）により吸光度を定量化した。
【０１２０】
薬物スクリーニング用３Ｄがんオルガノイド
ＰＤＭＳによるウェルコーティングおよび細胞単離：ポリジメチルシロキサン、すなわちＰＤＭＳ（ＤＯＷ  Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）を１：１０の硬化剤比率で使用して９６ウェルプレートの底部をコートし、次いで、プレートを８０℃のオーブンに少なくとも１時間入れた。４つの結腸直腸がん細胞型すべてについて、それぞれ１００，０００細胞を含む（１０，０００，０００／μＬ）３Ｄヒアルロン酸ベースヒドロゲル構築物１０μＬを９６ウェルプレートのウェル中に入れるために、上述のもの（Ａ）と同一の方法で細胞を継代した。細胞数に応じて、細胞−培地溶液として新たな１５ｍＬ遠心管中で所望の数の細胞を単離し、遠心分離に供した。
【０１２１】
単一細胞型構築物のヒドロゲル成分：ヒアルロン酸ベースヒドロゲル（ＥＳＩ  ＢＩＯ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）をＨｅｐｒａｓｉｌ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、およびＥｘｔｒａｌｉｎｋ  ＰＥＧＤＡ  ２−ＡＲＭアクリレート架橋剤の３つの成分の混合物を使用して作製した。２：２：１の容量比で、このような成分を混合した。その混合前に、０．１％のＩｒｇａｃｕｒｅ光開始剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を３つの成分のそれぞれに加え、３つの成分を３７℃のインキュベーター中に約３０分間置いて可溶化した。
【０１２２】
オルガノイド構築物の形成：可溶化してすぐに、１５ｍＬ遠心管から培地を吸引し（遠心分離後）、細胞をペレットとして単離した。細胞を含む遠心管中にヒドロゲル成分を直接加え、細胞をその混合物中に注意深く再懸濁した。１０μＬのゲル−細胞溶液をＰＤＭＳでコートしたウェルの中央に置いた。細胞を含むすべてのウェルについて、これを継続し、各細胞型について繰り返した。この時点の後、Ｂｌｕｅ  Ｗａｖｅ  ２００スポットライト（Ｄｙｍａｘ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、ＵＳＡ）からのＵＶ光にゲルを曝露して、ヒドロゲルを凝固させることができる。または、ゲルがそのままで形成するのを約３０分待つことが可能である。次いで、ＤＭＥＭ−１０培地をウェル中に置き、構築物を５日間インキュベートした。
【０１２３】
抗がん剤スクリーニングおよび細胞生存率：５日目に同じ５つの抗がん剤を加え、７日目に細胞生存率アッセイを行った。
【０１２４】
抗がん剤効果比較用環状オルガノイド
環状オルガノイド構築物のヒドロゲル成分：環状オルガノイドの作製に使用したヒアルロン酸ベースヒドロゲルは、Ｈｅｐｒａｓｉｌ、Ｇｅｌｉｎ−Ｓ、およびＰＥＧＤＡ  ２−ＡＲＭアクリレート架橋剤（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ）、およびアルキン−ＰＥＧ−アルキン  ２−ＡＲＭ架橋剤（ＥＳＩ  ＢＩＯ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の４つの成分の混合物であった。４：４：１：１の容量比で、このような成分を混合した。その混合前に、０．１％のＩｒｇａｃｕｒｅ光開始剤を４つの成分のそれぞれに加え、３つの成分を３７℃のインキュベーター中に約３０分間置いて可溶化した。ＨＣＴ１１６およびＣＡＣＯ２細胞を上述の継代方法で単離し、ＰＤＭＳを使用して９６ウェルプレート底部をコートした。
【０１２５】
環状オルガノイド構築物の形成：ＨＣＴ１１６細胞ペレットを含む１５ｍＬ遠心管にヒドロゲルの４つの成分を加え、細胞をこの混合物中に再懸濁した。ヒドロゲルを含む１０μＬのＨＣＴ１１６をウェルの中央に置き、９６ウェルプレートをアルミ箔で覆って約３５分間そのままにしておいた。この間、ＰＥＧＤＡ  ２−ＡＲＭアクリレートは、ゲルを架橋し、一方、ＵＶ感受性２−ＡＲＭアルキン−ＰＥＧ−アルキンは、架橋されずに留まる。
【０１２６】
ＰＥＧＤＡが架橋するのを待つ間に、単離したＣＡＣＯ２細胞を含む１５ｍＬ遠心管に４つのヒドロゲル成分を加え、細胞をゲル中に再懸濁する。９６ウェルプレート上を覆うアルミ箔を除去し、構築物を検査して、これらが既に凝固したかどうかを見る。凝固した場合、ＣＡＣＯ２を包埋したヒドロゲルを２５μＬ採取し、ＨＣＴ１１６構築物の周辺に注意深く置く。ピペットの先端を使用して、四方の構築物周辺のＣＡＣＯ２ゲルを物理的に移動する。Ｂｌｕｅ  Ｗａｖｅ  ２００スポットライトからのＵＶ光を使用して、両方のゲルを共に架橋し、融合した環状構築物を形成する。ＤＭＥＭ−１０培地を加えて、ウェルを満たす。
【０１２７】
抗がん剤スクリーニング：５日目に、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの５−ＦＵの薬物溶液を環状構築物に加え、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭのレゴラフェニブの薬物溶液を別の環状構築物に加えた。各薬物濃度について３つの複製を作製し、また薬物なしの対照も維持した。
【０１２８】
Ｌｉｖｅ−Ｄｅａｄ染色および顕微鏡検査：７日目に、環状構築物をＬｉｖｅ−Ｄｅａｄ染色に供し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ  ４８７−１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で構築物を撮像した。カルセインＡＭおよびエチジウムホモダイマー１染色（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を１．０μｌ／ｍＬの当量濃度で含む培地に環状構築物を曝露した。Ｌｉｖｅ−Ｄｅａｄ染色溶液への曝露前後に構築物をＰＢＳで２回洗浄した。ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）ソフトウェアを使用してパーセント赤色対パーセント緑色率を算出し、レゴラフェニブおよび５−ＦＵの存在下で、ＨＣＴ１１６−ＣＡＣＯ２環状構築物について薬物の有効性を判定した。％赤色対％緑色率は、％死滅：％生存細胞率を表す。
【０１２９】
マイクロ流体デバイス
構築：Ｇｒａｐｈｔｅｃ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを利用して、新規のマイクロ流体デバイスの型を作成した。デバイスの型は、Ｇｒａｐｈｔｅｃ  ｃｅ６０００−６０プロッター（Ｇｒａｐｈｔｅｃ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、アルミ箔を片面に接着した両面テープにエッチングし、次いで、この型を細胞培養プレートと物理的に接着した。２０ｍＬのＰＤＭＳ（１：１０の硬化剤比率）をプレート中に入れ、次いで、ＰＤＭＳを８０℃のオーブンに一晩入れて凝固させた。翌日すぐに、このＰＤＭＳ型をプレートから切断した。
【０１３０】
８．０μｍのＩｓｏｐｏｒｅ  Ｔｒａｓｎｗｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を切断して、細胞捕捉のためにｔｒａｓｎｗｅｌｌ膜を備えるデバイス区画のサイズに特別に適合させた。Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒ  ＰＤＣ−３２Ｇ（Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を使用して、ＰＤＭＳ層に結合するプラズマによって２つのＰＤＭＳ層間にｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を仕掛けた。その使用前に実験室フード内で、７０％のエタノール溶液を用いてデバイスのＰＤＭＳ層を消毒した。
【０１３１】
実行：ＨＣＴ１１６細胞を継代し、ＤｉＯ膜色素（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いて、５μＬ／ｍＬのＤＭＥＭ−１０培地で約２０分間、細胞を処置した。１００，０００個のＨＣＴ１１６細胞を含む（１０，０００，０００／μＬ）ヒアルロン酸ベースヒドロゲル構築物１０μＬをオルガノイドチャンバーに入れた。ＰＤＭＳ層を共にプレスし、プラスチッククランプをデバイスのいずれかの面に使用して、ＰＤＭＳ層を４本のネジで適所に固定した。無処置の培地３ｍＬを流体リザーバーに加えた。Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ  ４８７−１顕微鏡を使用して、構築物およびｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜について撮像を行い、７日目に、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜について共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｃａｍｅｒａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮像した。
【０１３２】
［実施例５］オルガノイドに組み込んだ５つの薬物のスクリーニング
実験の目的：肝臓オルガノイド代謝機能についての複合オルガノイド毒性の依存性を評価する。一例として、肝臓の代謝活性は、いくつかの薬物の結果および有効性に重度に影響し得る。例えば、一般的に第１に選択されるがん治療薬である５ＦＵは、腫瘍だけでなく、体内の多くの細胞に対して細胞傷害性である。したがって、５ＦＵは、通常、プロドラッグであるカペシタビンの形態で投与され、これは、肝臓を通過するまで基本的に不活性であり、その活性形態へと代謝される。
【０１３３】
実験のデザインおよび結果：肝臓、心臓、肺、精巣、および脳オルガノイドを含む、５つの組織プラットフォームの作製を開始し、薬物試験の開始前に７日間維持した。この時点で、肝臓モジュールをプラットフォームの半分から除去した。カペシタビン（２０ｕＭ）をすべてのプラットフォームに投与し、その後、曝露から７日後（全試験のうちの１４日目）にｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色または心拍挙動により生存率を評価した。
【０１３４】
結果は、肝臓が存在すると、カペシタビンが毒性薬物である５−ＦＵに代謝されて、心臓および肺に毒性を生じることを実証した（図１１）。肝臓なしでは、この代謝は発生せず、心臓および肺オルガノイド生存率は低下しない。驚くべきことに、脳オルガノイドは、両方の群において損傷を受けた（図１１）。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの結果は、カペシタビンを５−ＦＵの薬物活性形態に代謝して、心臓および肺オルガノイドにおいて細胞死の増加を誘導するのに肝臓オルガノイドを必要とすることを示す。
【０１３５】
１、３、５、７、９、１１、１３、および１５日目に、尿素、アルブミン、α−ＧＳＴ、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βを含む可溶性バイオマーカーを培地のアリコットから定量化した（図１３）。培地のアリコットを質量分析に送って、カペシタビンの５−ＦＵへの代謝を検証した。
【０１３６】
［実施例６］小型化したマイクロ流体プラットフォームにおけるオルガノイドに組み込んだ５つの薬物のスクリーニング
設置面積および流体量を小型化したマイクロ流体プラットフォームを作成し、このプラットフォーム上で同一の複合的な薬物試験が可能かどうかを評価した。流体量を最小化すると、システム循環における関連バイオマーカーの信号対雑音比を増加させることができる。
【０１３７】
実験のデザインおよび結果：接着フィルムをベースとしたマイクロ流体プラットフォームを下記のように作製した。実施例４に記載のフルスケールのプラットフォームと同様に、肝臓、心臓、肺、精巣、および脳オルガノイドを含む、５つの組織構築物作製を開始し、薬物試験の開始前に７日間維持した。この時点で、肝臓モジュールをプラットフォームの半分から除去した。カペシタビン（２０ｕＭ）をすべてのプラットフォームに投与し、その後、曝露から７日後（全試験のうちの１４日目）にｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色または心拍挙動により生存率を評価した。
【０１３８】
小型化したシステムでは、肝臓が存在すると、カペシタビンが毒性薬物である５−ＦＵに代謝されて、心臓および肺に毒性を生じる（図１２）。肝臓なしでは、この代謝は発生せず、心臓および肺オルガノイド生存率は低下しない。重要なことには、このプラットフォームにおいて、脳オルガノイド生存率は高い（図１２）。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの結果は、カペシタビンを５−ＦＵの薬物活性形態に代謝して、心臓および肺オルガノイドにおいて細胞死の増加を誘導するのに肝臓オルガノイドを必要とすることを示す。さらに、脳オルガノイドは生存可能であり、このことは、特定の理論に拘束されることは望まないが、おそらくシステムの容量をスケールダウンすると、培地がより良く調製され、脳オルガノイド生存率を支持することを示唆する。これは、他のオルガノイドタイプと共に、このシステムにおいて、脳オルガノイドを維持することが可能であることを実証する。
【０１３９】
７日目および１５日目に、尿素、アルブミン、α−ＧＳＴ、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βを含む可溶性バイオマーカーを培地のアリコットから定量化した（図１３）培地のアリコットを質量分析に送って、カペシタビンの５−ＦＵへの代謝を検証した。
【０１４０】
小型化したシステムのデザイン
このシステムは、標準サイズのシステム等、他のシステムと比較して、培地に曝露されるＰＤＭＳの表面積を削減または除去し、これにより薬物化合物、毒素、可溶性タンパク質、および分泌化合物が、デバイス壁上またはデバイス壁中へ吸着または吸収される機会を減少させる。デバイス製造戦略は、テープマイクロ流体工学、レーザー切断ＰＭＭＡ、およびいくつかのＰＤＭＳ成型をベースとしており、これによりデバイスの培地と接触するＰＤＭＳ表面積の量を著しく最小化する。図１４は、この作製方法の概要を提示する。
【０１４１】
前述は、本発明の説明であり、その制限として解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲に含まれる、その等価物と共に、以下の特許請求の範囲により定義する。本明細書に引用する出版物、特許出願、特許、特許公開、ＧｅｎＢａｎｋにより認められた配列および／またはＳＮＰ受託番号、ならびに他の参考文献はすべて、参照を示す文章および／または段落に関する教示のため、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ．４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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