(57)【要約】以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：（i）トランス-2-メチル2-ペンテン酸、広域HDAC阻害物質キシノスタット（Quisinostat）、および亜型特異的HDAC阻害物質ロミデプシンからなる群より選択される化合物を含む培養培地において、該ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに（ii）該細胞または該培養培地から該ポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞において該ポリペプチドを作製する工程。2019503675.tif 000026
2019503675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法：
− トランス-2-メチル2-ペンテン酸、広域HDAC阻害物質キシノスタット（Quisinostat）、および亜型特異的HDAC阻害物質ロミデプシンからなる群より選択される化合物を含む培養培地において、該ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 該細胞または該培養培地から該ポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞において該ポリペプチドを作製する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法：
− トランス-2-メチル2-ペンテン酸、亜型特異的HDAC阻害物質、および古典的NFκB活性化物質および非古典的NFκB活性化物質からなる化合物の群より選択される第1の化合物および第2の化合物を含む培養培地において、該ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 該細胞または該培養培地から該ポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞において該ポリペプチドを作製する工程。
【請求項３】
前記古典的NFκB活性化物質が、TNFα、IL-1R/TLRのリガンド、リポ多糖、およびIL-1bからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記非古典的NFκB活性化物質が、EGF、PMA、およびベツリン酸からなる群より選択される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
前記亜型特異的HDAC阻害物質が、HDAC-1および/またはHDAC-2および/またはHDAC-3の阻害物質である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記亜型特異的HDAC阻害物質が、ピメリックジフェニルアミド（pimelic diphenylamide）106、アピシジン、およびロミデプシンからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記第1の化合物がトランス-2-メチル2-ペンテン酸であり、かつ前記第2の化合物がフラジェリンである、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第1の化合物がトランス-2-メチル2-ペンテン酸であり、かつ前記第2の化合物がキシノスタットである、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第1の化合物がロミデプシンであり、かつ前記第2の化合物がトランス-2-メチル2-ペンテン酸またはフラジェリンである、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物または前記第1の化合物が、前記細胞のトランスフェクションの1時間〜5時間後に添加される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物または前記第1の化合物が、前記細胞のトランスフェクションの約3時間後に培養物に添加される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記第2の化合物が、前記細胞のトランスフェクションの21時間〜30時間後に培養物に添加される、請求項2〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第2の化合物が、前記細胞のトランスフェクションの約24〜27時間後に培養物に添加される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
トランス-2-メチル2-ペンテン酸が、前記培養培地中の最終濃度 約6〜7mMまで添加される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
フラジェリンが最終濃度 2ng/mLまで添加され、かつロミデプシンが最終濃度 15nMまで添加される、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞がCHO細胞またはHEK細胞である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞における異種ポリペプチドの組換え体作製の分野にある。より詳細には、産生増強物が培養培地に添加される、ポリペプチドの作製のための方法が、本明細書において報告される。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療用抗体は、薬物開発における重要な治療モダリティになっている。抗体工学における新テクノロジーは、広範囲の種々の抗体をもたらす、結合価、特異性、および親和性の改変のような、抗体設計における多様な可能性を可能にする。抗体を同定し、選択するためには、初期薬物開発中に、有望な候補を同定するため、多数の可能性のある治療薬を評価しなければならない。この理由のため、研究および初期薬物開発のための組換えタンパク質の迅速で効率的な作製は、極めて興味深い。
【０００３】
抗体は、完全な生理活性を獲得するためにグリコシル化および正確な折り畳みのような翻訳後修飾を必要とする複雑な生体分子であり、従って、哺乳動物細胞は、組換え体作製のために主に用いられている細胞である。これらの細胞において抗体を作製する方法には、安定的遺伝子発現および一過性遺伝子発現という2種類の方法がある。安定的遺伝子発現は、コードする核酸が宿主細胞のゲノムへ組み込まれることによって、連続的な発現が可能になるため、組換え抗体を作製するための極めて有効な方式である。しかしながら、抗体を安定的に発現する細胞株の生成は、極めて多くの労力および時間を要する。従って、必要な材料の迅速な作製という必要性を解決するため、一過性遺伝子発現が、初期薬物開発における最良の方法である。この方法では遺伝子発現が連続的でないとはいえ、数日以内に組換え抗体を作製することが可能である。
【０００４】
バルプロ酸（VPA）は、抗痙攣剤および気分安定薬として臨床で使用されている短鎖脂肪酸である（Blaheta et al.;2005）。それは、てんかん、双極性障害、または片頭痛を処置するために主として適用される。VPAは、多様な腫瘍細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、分化を誘導するため、しばしば、癌の処置に関係付けられる。最近の研究は、PKC阻害、Wntシグナリング活性化、およびERK活性化のような、VPAによって影響を受けるいくつかの付加的な細胞経路を同定した（Fujiki et al.;2013）。VPAの別の興味深い特色は、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を阻害する能力である（Gottlicher et al.;2001）。
【０００５】
バルプロ酸（VPA）は、一過性遺伝子発現（TGE）増強のために一般的に使用されている。VPAについてヒストン阻害活性が発見されたため、TGEに対する効果は、ヒストンテールの脱アセチルの阻害によって媒介されることが提唱された。一過性にトランスフェクトされたプラスミドは、クロマチン構造へ組み込まれ、従って、ヒストン修飾による遺伝子発現のエピジェネティック制御の基礎となると仮定されるため、この仮説が生じた。
【０００６】
しかしながら、VPA処理は、生細胞密度（VCD）および細胞生存度も減少させる。従って、VPAは、細胞周期停止を誘導するのみならず、その後に、外因性アポトーシス経路および内因性アポトーシス経路もそれぞれ誘導することが示された（Xu et al.;2007）。従って、VPAとカスパーゼ阻害物質との組み合わせ処理は、VPAによって誘導されるアポトーシス細胞死を有意に防止した（Han et al.;2013）。
【０００７】
Backliwal,G.ら（Biotechnol.Bioeng.(2008)）は、バルプロ酸が、哺乳動物細胞培養物におけるタンパク質発現を増強するための酪酸ナトリウムの実行可能な代替物であることを報告した。バルプロ酸の効果はヒストンデアセチラーゼ阻害（HDACi）に基づくことが、本明細書において示唆される。
【０００８】
ヒト胎児由来腎臓（HEK）293細胞を含む様々な細胞株において、VPAがヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を直接阻害することが示された（Gottlicher,Minucci et al.2001）。この観察を確認するように、ヒストンH4の過剰アセチル化がVPA処理の後に観察された（Phiel,Zhang et al.2001）。
【０００９】
US 2009/023186においては、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の作製を増強するためのバルプロ酸の使用が報告されている。
【００１０】
WO 2015/000624においては、ヒツジb細胞を使用して抗体を作製する方法およびそれらの使用が報告されている。
【００１１】
WO 2010/050903においては、ワクチンのためのキメラフラジェリンが報告されている。
【００１２】
WO 2015/036583においては、骨髄性白血病の処置における、エピジェネティック因子とCD33およびCD3を標的とする二重特異性化合物との組み合わせが報告されている。
【００１３】
WO 2014/022758においては、単一の作用物質である抗PD-L1・PD-L2二重結合性抗体および使用法が報告されている。
【００１４】
R.Furumaiは、クラスIヒストンデアセチラーゼを阻害する天然プロドラッグとしてのFK228（デプシペプチド）を報告した（Cancer Res.62(2002)4916）。
【発明の概要】
【００１５】
本明細書において、例えば公知の産生増強物バルプロ酸と比較して低下した細胞傷害性を有する産生増強物を使用して一過性遺伝子発現収率を増加させる方法が、報告される。
【００１６】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− （古典的）NFκB活性化物質を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００１７】
一つの態様において、（古典的）NFκB活性化物質は、TNFα、インターロイキン1/トール様受容体（IL-1R/TLR）ファミリーのメンバーのリガンド、例えば、フラジェリン、リポ多糖、およびインターロイキン1βからなる群より選択される。
【００１８】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− 2M2Pまたはキシノスタット（Quisinostat）またはロミデプシンを含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００１９】
一つの態様において、2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンは、細胞のトランスフェクションの1時間〜24時間後に培養物に添加される。一つの態様において、2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンは、細胞のトランスフェクションの約3時間後に培養物に添加される。従って、一つの態様において、培養は、トランスフェクション後に2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンが添加された培養培地においてなされる。
【００２０】
一つの態様において、2M2P（トランス-2-メチル2-ペンテン酸）は、培養培地中の最終濃度 約6〜7mM（少なくとも3mM）まで添加される。
【００２１】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− 非定型/非古典的NFκB活性化物質を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００２２】
一つの態様において、非古典的NFκB活性化物質は、EGF、PMA、およびベツリン酸からなる群より選択される。
【００２３】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− 亜型特異的HDAC阻害物質を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００２４】
一つの態様において、亜型特異的HDAC阻害物質は、HDAC-1および/またはHDAC-2および/またはHDAC-3の阻害物質である。一つの態様において、亜型特異的HDAC阻害物質は、ピメリックジフェニルアミド（pimelic diphenylamide）106、アピシジン、およびロミデプシンからなる群より選択される。
【００２５】
前記の方法において、一過性遺伝子発現収率を増加させるため、異なる機能経路が修飾される。異なる作用モードを使用する、即ち、異なる機能経路を修飾する産生増強物が組み合わせられた場合、一過性遺伝子発現収率のさらなる増加が可能であることが、本発明において見出された。同一の機能経路を修飾する産生増強物の組み合わせは、一過性遺伝子発現収率の有意なさらなる増加をもたらさなかった。
【００２６】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− 古典的NFκB活性化物質、非古典的NFκB活性化物質、トランス-2-メチル2-ペンテン酸、および亜型特異的HDAC阻害物質からなる群の2種類のメンバーを含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００２７】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− トランス-2-メチル2-ペンテン酸、および単鎖脂肪酸誘導体とは化学的に異なるHDAC阻害物質からなる群より選択される化合物を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００２８】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− フラジェリンおよびトランス-2-メチル2-ペンテン酸を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００２９】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− キシノスタットおよびトランス-2-メチル2-ペンテン酸を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００３０】
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法である：
− ロミデプシンとトランス-2-メチル2-ペンテン酸およびフラジェリンのうちの一つとを含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００３１】
一つの態様において、2M2Pは、（トランスフェクションの約3時間後に）培養溶媒中の最終濃度 約6〜7mMまで添加される。
【００３２】
一つの態様において、フラジェリンまたはロミデプシンは、トランスフェクションの27時間後に、それぞれ2ng/mLおよび15nMの濃度で添加される。
【００３３】
一つの態様において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。一つの好ましい態様において、哺乳動物細胞は、HEK293細胞である。
【００３４】
一つの態様において、発現は、安定的発現または一過性発現である。一つの好ましい態様において、発現は、一過性発現である。
【００３５】
一つの態様において、培養は、3〜16日間である。一つの態様において、好ましくは、細胞がHEK細胞である場合、培養は、3〜10日間である。一つの好ましい態様において、培養は、約7日間である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】様々なVPA濃度によって処理されたHEK293細胞の相対細胞特異的産生量（relative cell specific productivity）；各処理についてN＝2；y軸：相対細胞特異的産生量［％］；1：対照、2：0.5mMバルプロ酸、3：1mMバルプロ酸、4：2mMバルプロ酸、5：3mMバルプロ酸、6：4mMバルプロ酸、7：6mMバルプロ酸。
【図２Ａ】力価に対する異なるヒストンデアセチラーゼ阻害物質の効果；y軸：相対細胞特異的産生量［％］。最も有効な濃度の決定；JNJ＝キシノスタット；PXD＝ベリノスタット；SAHA＝スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ボリノスタット）。
【図２Ｂ】力価に対する異なるヒストンデアセチラーゼ阻害物質の効果；y軸：相対細胞特異的産生量［％］。各処理についてN＝2（5：N＝1を除く）；y軸：相対細胞特異的産生量［％］；1：対照、2：バルプロ酸、3：ピメリックジフェニルアミド106、4：TMP269、5：ブフェキサマク、6：ベリノスタット、7：エンチノスタット、8：モセチノスタット、9：キシノスタット。
【図３】A：異なる化合物のHDAC阻害活性；HEK293F細胞を、示された分子および脱アセチルの後に蛍光色素へ変換される基質と共にインキュベートした；HDAC阻害活性を、蛍光シグナルの強度に基づき算出した；基質なしでインキュベートされたHEK293F細胞が、陰性対照として示される；基質および10μMの広域HDAC阻害物質トリコスタチンAと共にインキュベートされたHEK293F細胞が、陽性対照として示される；各処理についてN＝3；有意水準：n.s.：p≧0.05；アステリスク1個：p≦0.05；アステリスク2個、p≦0.01；アステリスク3個、p≦0.001；y軸：相対HDAC阻害［％］；1：対照、2：10μM TSA（陽性対照）、3：3mMバルプロ酸、4：3mMバルノクタミド、5：3mM 2M2P、6：20μMピメリックジフェニルアミド106、7：300nMキシノスタット。B：VPAおよび類似体およびHDAC阻害物質を使用した異なる処理についての相対細胞特異的産生量；各処理についてN＝3；有意水準：アステリスク2個：p≦0.01；アステリスク3個、p≦0.001；y軸：相対細胞特異的産生量［％］；1：対照、トランスフェクションなし、2：対照、トランスフェクションあり、3：3mMバルプロ酸、4：3mMバルノクタミド、5：3mM 2M2P、6：20μMピメリックジフェニルアミド106、7：300nMキシノスタット。
【図４】細胞特異的産生量に対するVPA類似体の効果；各処理についてN＝2；y軸：相対細胞特異的産生量［％］；1：対照、2：バルプロ酸− 4mM、3：バルプロミド− 2mM、4：バルプロミド− 3mM、5：バルノクタミド− 2mM、6：バルノクタミド− 3mM、7：2M2P− 2mM、8：2M2P− 3mM。
【図５】細胞特異的産生量に対する様々なNFκB活性化物質の効果；各処理についてN＝2；y軸：相対細胞特異的産生量［X］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：50ng/mL TNFα、3：50ng/mL EGF、4：10ng/mLフラジェリン、5：10μMベツリン酸、6：100nMホルボールミリステートアセテート。
【図６】2M2Pおよびフラジェリンによる処理の後の細胞特異的産生量（A）およびIgG濃度（B）に対する効果；各処理についてN＝3；有意水準：n.s.：p≧0.05；アステリスク3個、p≦0.001；全ての処理が陰性対照と比較して有意な増大を示した、p≦0.001。A：y軸：相対細胞特異的産生量［％］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：3mM 2M2P、3：2ng/mLフラジェリン、4：3mM 2M2P＋2ng/mLフラジェリン。B：y軸：相対IgG濃度［％］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：4mMバルプロ酸、2：3mM 2M2P、4：2ng/mLフラジェリン、5：3mM 2M2P＋2ng/mLフラジェリン。
【図７】差異的なクラスI HDACアイソフォーム阻害；各処理についてN＝1；y軸：相対IgG濃度［％］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：10nMロミデプシン、3：200nMアピシジン、4：1μM RGFP966、5：5μM PCI34051。
【図８】NFκB活性化ならびにHDAC 1および2の阻害のTGE速度に対する効果；各処理についてN＝3；有意水準：n.s.：p≧0.05；アステリスク3個、p≦0.001；全ての処理が陰性対照と比較して有意な増大を示した、p≦0.01。A：y軸：相対細胞特異的産生量［％］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：2ng/mLフラジェリン、3：15μMロミデプシン、4：2ng/mLフラジェリン＋15nMロミデプシン。B：y軸：相対IgG濃度［％］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：4mMバルプロ酸、3：2ng/mLフラジェリン、4：15μMロミデプシン、5：2ng/mLフラジェリン＋15nMロミデプシン。
【図９】VPA誘導体とHDAC 1および2の阻害との組み合わせの効果；各処理についてN＝3；有意水準：n.s.：p≧0.05；アステリスク3個、p≦0.001；全ての処理が陰性対照と比較して有意な増大を示した、p≦0.01。A：y軸：相対細胞特異的産生量；1：対照（トランスフェクションあり）、2：3mM 2M2P、3：15nMロミデプシン、4：3mM 2M2P＋15nMロミデプシン。B：y軸：相対IgG濃度［％］；1：対照（トランスフェクションあり）、2：4mMバルプロ酸、3：3mM 2M2P、4：15nMロミデプシン、5：3mM 2M2P＋15nMロミデプシン。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
略語の説明
2M2P：        トランス-2-メチル2-ペンテン酸
EGF：         上皮増殖因子
ERK：         細胞外シグナル制御キナーゼ
FITC：        フルオレセインイソチオシアネート
GAPDH：       グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素
HDAC：        ヒストンデアセチラーゼ
IκB：         NFκBの阻害物質
IKK：          IκBキナーゼ
NEMO：         NFκB必須修飾因子
NFκB：        活性化B細胞のκ軽鎖エンハンサーである核内因子
PD：           ピメリックジフェニルアミド106
PEI：          ポリエチレンイミン
TGE：          一過性遺伝子発現
TNF：          腫瘍壊死因子
VCM：          バルノクタミド
VPA：          バルプロ酸、2-プロピル吉草酸、2-プロピルペンタン酸
VPM：          バルプロミド
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、NFκBが一過性遺伝子発現（TGE）増強のための制御因子であるという所見に少なくとも一部分基づく。NFκBのこの役割は、NFκBを活性化し、TGE増強を観察することによって確認され、VPA処理後にNFκBを阻害し、TGE増強が低下し得ることを証明することによっても確認された。
【００３９】
本発明は、さらに、HDAC阻害物質キシノスタットによって媒介されるTGE増強も、NFκB阻害によって弱められ得るという所見に少なくとも一部分基づく。HDAC阻害によるTGE増強は、NFκBによって媒介される。
【００４０】
本発明は、さらに、ロミデプシンによるHDAC 1アイソフォームおよびHDAC 2アイソフォームの特異的な阻害が、TGE収率の強力な増加をもたらすという所見に少なくとも一部分基づく。これらのHDACアイソフォームは、HDACによって媒介されるTGE増強を担う。
【００４１】
本発明は、さらに、HDAC阻害とNFκB活性化との組み合わせが、TGEに対する相加効果を示さなかったという所見に少なくとも一部分基づき、そのことは、同一の機序が影響を受けていることをさらに示す。
【００４２】
本発明は、さらに、HDAC阻害活性を欠く化学的なVPA類似体2M2Pも、特定の濃度で、TGEを増大させるという所見に少なくとも一部分基づく。さらに、VPAおよびHDAC阻害物質とは対照的に、NFκBの阻害は、2M2Pによって媒介されるTGE増強の低下をもたらさなかった。2M2PとNFκB活性化またはHDAC阻害との組み合わせは、両方のケースにおいて、相加効果をもたらした。
【００４３】
本発明は、さらに、VPAを2M2PまたはHDAC阻害物質と組み合わせた場合に、組み合わせ効果が観察されなかったという所見に少なくとも一部分基づく。
【００４４】
NFκBは一過性遺伝子発現（TGE）増強のための制御因子であることが見出された。さらに、HDAC阻害による増強は、NFκB活性化によって媒介されることが見出された。HDACアイソフォーム1および2の特異的な阻害は、広域HDAC阻害物質VPAおよびキシノスタットによって媒介される増強に匹敵するTGE増強を得るために十分であることが、さらに見出された。さらに、ロミデプシンが、新規のTGE増強物として同定された。さらに、2M2Pが、新規のTGE増強物として同定された。2M2Pは、HDAC阻害およびNFκB活性化とは無関係の作用モードを有する。2M2PとNFκB活性化との組み合わせは、VPAに匹敵するTGE増大をもたらすことが見出された。HDAC阻害はTGE速度を増強するための唯一の方式ではないことが見出された。VPAと2M2Pまたはキシノスタットとの組み合わせ研究は、VPAが、2M2Pの未知の効果およびHDAC阻害効果を統合すると考えられる証拠を提供した。最後に、2M2Pと、ロミデプシンによるアイソフォーム特異的なHDAC阻害との組み合わせは、VPAより高い有効性を有する増強物の組み合わせを提供することが見出された。
【００４５】
定義
バルプロ酸（VPA）とは、2-プロピル吉草酸（2-プロピルペンタン酸）を示し、短鎖脂肪酸である。
【００４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」には、前後関係がそうでないことを明白に指示しない限り、複数の言及が含まれる。従って、例えば、「細胞（a cell）」との言及には、複数のそのような細胞および当業者に公知のその等価物等が含まれる。同様に、「1つの（a）」（または「1つの（an）」）、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。それとは対照的に、「1個の細胞（one cell）」との言及は、複数のそのような細胞を含まず、単一の（単離された）細胞に限定される。
【００４７】
「含む（comprising）」、「含む（including）」、および「有する（having）」という用語は、交換可能に使用され得ることにも注意すべきである。
【００４８】
「含む（comprising）」という用語には、限定としての「からなる（consisting of）」という用語が包含されることにも注意すべきである。
【００４９】
「抗体」という用語は、本明細書において、最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な抗体構造を包含する。
【００５０】
「抗体断片」とは、完全抗体が結合する抗原に結合する完全抗体の一部分を含む完全抗体以外の分子をさす。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ（diabody）；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５１】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の起源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りが異なる起源または種に由来する抗体をさす。
【００５２】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有している定常ドメインまたは定常領域の型をさす。抗体の五つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2へさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００５３】
「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有している免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために、本明細書において使用される。この用語には、ネイティブ配列Fc領域およびバリアントFc領域が含まれる。一つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在してもよいかまたは存在しなくてもよい。本明細書中にそうでないことが明示されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242に記載されたような、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムによる。
【００５４】
「全長抗体」、「インタクト抗体」、および「完全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似している構造を有するか、または本明細書において定義されるFc領域を含有している重鎖を有する抗体をさすために、本明細書において交換可能に使用される。
【００５５】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含め、さす。宿主細胞には、初代の形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸内容に関して親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたかまたは選択されたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書において含まれる。
【００５６】
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト起源に由来する抗体のものに相当するアミノ酸配列を保有するものである。非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は、ヒト抗体のこの定義から特別に除外される。
【００５７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基とヒトFR由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体をさす。ある特定の態様において、ヒト化抗体は、HVR（例えば、CDR）の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに相当し、FRの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに相当する少なくとも1個、典型的には、2個の可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体をさす。
【００５８】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィ（例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC）によって決定されるような、95％または99％を超える純度にまで精製される。抗体純度の査定の方法の概説については、例えば、Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87を参照すること。
【００５９】
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子をさす。単離された核酸には、通常核酸分子を含有している細胞に含有されているが、染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
【００６０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、実質的に均一な抗体の集団から入手される抗体をさす。即ち、例えば、天然に存在する変異を含有しているかまたはモノクローナル抗体調製物の作製中に発生する可能性のあるバリアント抗体を除き、集団を構成する個々の抗体が、同一でありかつ／または同一のエピトープに結合する。そのようなバリアントは、一般に、微量に存在する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から入手されるという抗体の特徴を示すのであって、特定の方法による抗体の作製を必要とするものと解釈されてはならない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しているトランスジェニック動物を用いる方法を含むが、これらに限定されない、多様な技術によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法およびその他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
【００６１】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原との結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインをさす。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は、一般に、類似した構造を有しており、各ドメインが、4個の保存されたフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（HVR）を含む（例えば、Kindt,T.J.et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page 91を参照すること）。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分である場合もある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングするため、抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインをそれぞれ使用して単離され得る。例えば、Portolano,S.et al.,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.et al.,Nature 352(1991)624-628を参照すること。
【００６２】
「ベクター」という用語は、本明細書において使用されるように、連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子をさす。その用語には、自己複製性の核酸構造としてのベクターも含まれるし、導入された宿主細胞のゲノムへ組み込まれたベクターも含まれる。ある特定のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００６３】
本明細書において報告される方法
NFκBは一過性遺伝子発現の制御因子として機能することが見出された。NFκB阻害は、力価に対するバルプロ酸の効果を減じた。様々な分子によるNFκB活性化は、力価増大をもたらした。NFκB阻害は、この効果に対抗することができる。
【００６４】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− 古典的NFκB活性化物質を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００６５】
「化合物を含む培養培地」という用語は、培養中のある時点において、この化合物が培養培地中に添加される/添加されている/存在することを示す。この時点は、トランスフェクションの直後、培養の最初、または培養の接種（＝培養の開始）後の定義された時点であり得る。一つの態様において、時点は、細胞のトランスフェクションの後である。一つの態様において、時点は、細胞のトランスフェクションの1時間〜約30時間後である。一つの態様において、時点は、細胞のトランスフェクションの約3時間後である。従って、一つの態様において、培養は、細胞のトランスフェクションの後にNFκB活性化物質が添加された培養培地においてなされる。
【００６６】
一つの態様において、（古典的）NFκB活性化物質は、TNFα、インターロイキン-1/トール様受容体（IL-1R/TLR）ファミリーのメンバーのリガンド、例えば、フラジェリン、リポ多糖、およびインターロイキン1βからなる群より選択される。
【００６７】
培養培地へのトランス-2-メチル2-ペンテン酸（2M2P）の添加は、一過性遺伝子発現力価増大をもたらすことが見出された。2M2Pは、NFκB活性化ともHDAC阻害とも無関係の機序を介してTGEを増強することが見出された。IKKの阻害によって、2M2PによるTGEの増強を低下させることはできず、従って、NFκBと無関係の機序によって特異的産生量が改善されることが見出された。
【００６８】
キシノスタットまたはロミデプシンの培養培地への添加は、一過性遺伝子発現力価増大をもたらすことがさらに見出された。
【００６９】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− 2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンを含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００７０】
一つの態様において、2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンは、細胞のトランスフェクションの1時間後〜24時間後に培養物に添加される。一つの態様において、2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンは、細胞のトランスフェクションの約3時間後に培養物に添加される。従って、一つの態様において、培養は、トランスフェクションの後に2M2Pまたはキシノスタットまたはロミデプシンが添加された培養培地においてなされる。
【００７１】
一つの態様において、2M2Pは、培養培地中の最終濃度 約6〜7mMまで添加される。
【００７２】
一つの態様において、非古典的または非定型NFκB活性化物質は、増殖因子、PKC活性化物質、またはベツリン酸のような活性酸素種誘導試薬からなる群より選択されるが、これらに限定されるわけではない。
【００７３】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− 非定型/非古典的NFκB活性化物質を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００７４】
NFκBは、例えば、PI3キナーゼ活性化を介してEGFによって、PKC活性化を介してPMAによって、またはベツリン酸によるミトコンドリア膜の撹乱の後に活性酸素種によって、活性化され得る（Lallena,Diaz-Meco et al.1999；Biswas,Cruz et al.2000；Gloire,Legrand-Poels et al.2006）。
【００７５】
一つの態様において、非定型/非古典的NFκB活性化物質は、EGF、PMA、およびベツリン酸からなる群より選択される。
【００７６】
亜型特異的ヒストンデアセチラーゼ阻害物質（HDACi）は一過性遺伝子発現の制御因子として機能することが見出された。HDAC-1、HDAC-2、および/またはHDAC-3の選択的な阻害は、一過性遺伝子発現の増大をもたらした。
【００７７】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− 亜型特異的HDAC阻害物質を含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、および
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００７８】
一つの態様において、亜型特異的HDAC阻害物質は、HDAC-1および/またはHDAC-2および/またはHDAC-3の阻害物質である。一つの態様において、亜型特異的HDAC阻害物質は、ピメリックジフェニルアミド106、アピシジン、およびロミデプシンからなる群より選択される。
【００７９】
前記の方法において、異なる機能経路が、一過性遺伝子発現収率を増加させるために修飾される。異なる作用モードを使用する、即ち、異なる機能経路を修飾する産生増強物が組み合わせられた場合、一過性遺伝子発現収率のさらなる増加が可能であることが、本発明において見出された。同一の機能経路を修飾する産生増強物の組み合わせは、一過性遺伝子発現収率の有意なさらなる増加をもたらさなかった。
【００８０】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− 古典的NFκB活性化物質、非古典的NFκB活性化物質、トランス-2-メチル2-ペンテン酸、および亜型特異的HDAC阻害物質からなる群の2種類のメンバーを含む培養培地において、ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００８１】
「古典的NFκB活性化物質、非古典的NFκB活性化物質、トランス-2-メチル2-ペンテン酸、および亜型特異的HDAC阻害物質からなる群の2種類のメンバーを含む培養培地」という用語は、培養中のある時点において、これらの2種類の化合物が培養培地中に存在する/添加されていることを示す。この時点は、トランスフェクション、培養の最初、または培養の接種（＝培養の開始）後の定義された時点であり得る。これは、化合物が逐次添加されること、即ち、1種類の化合物が細胞のトランスフェクションの後の第1の時点で添加され/添加されており、それぞれの他方の化合物が細胞のトランスフェクションの後の第2の時点で添加され/添加されていることも含む。一つの態様において、時点は、細胞のトランスフェクションの1時間〜30時間後である。一つの態様において、第1の時点は、細胞のトランスフェクションの約1〜5時間後であり、第2の時点は、細胞のトランスフェクションの約21〜30時間後である。一つの態様において、第1の時点は、細胞のトランスフェクションの約3時間後であり、第2の時点は、細胞のトランスフェクションの約24〜27時間後である。従って、一つの態様において、培養は、培養の接種の後に、または細胞のトランスフェクションの後の定義された時点において2種類の化合物が添加された培養培地においてなされる。
【００８２】
フラジェリンはTLR5アゴニストである。フラジェリンと2M2Pとの組み合わせは、バルプロ酸を用いて得られたものに匹敵する産生収率の増加をもたらすことが見出された。
【００８３】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− フラジェリンおよびトランス-2-メチル2-ペンテン酸を含む培養培地においてポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００８４】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− キシノスタットおよびトランス-2-メチル2-ペンテン酸を含む培養培地においてポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００８５】
2M2Pとロミデプシン（HDACi）との組み合わせは、バルプロ酸と比較して増加した産物収率をもたらすことが見出された
【００８６】
従って、以下の工程を含む、真核細胞におけるポリペプチドの組換え体作製のための方法が、本明細書において報告される：
− ロミデプシンとトランス-2-メチル2-ペンテン酸およびフラジェリンのうちの一つとを含む培養培地においてポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、ならびに
− 細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、真核細胞においてポリペプチドを作製する工程。
【００８７】
一つの態様において、2M2Pは、（トランスフェクションの約3時間後に）培養培地中の最終濃度 約6〜7mMまで添加される。
【００８８】
一つの態様において、フラジェリンまたはロミデプシンは、トランスフェクションの27時間後に、それぞれ2ng/mLおよび15nMの濃度で添加される。
【００８９】
一つの態様において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。一つの好ましい態様において、哺乳動物細胞は、HEK293細胞である。
【００９０】
一つの態様において、発現は、安定的発現または一過性発現である。一つの好ましい態様において、発現は、一過性発現である。
【００９１】
一つの態様において、培養は、3〜16日間である。一つの態様において、好ましくは、細胞がHEK細胞である場合、培養は、3〜10日間である。一つの好ましい態様において、培養は、約7日間である。
【００９２】
これらの所見および局面は以下に概説される。
【００９３】
バルプロ酸
単独の産生増強物としてのバルプロ酸の異なる濃度を、0.5mM〜6mMの範囲において試験した（結果については以下の表および図1を参照すること；各濃度についてN＝2）。最も高い特異的産生量は、3mM VPAで観察されたが、4mM VPAとの特異的産生量の顕著な違いはなかった。さらに、細胞特異的産生量は、より高い濃度およびより低い濃度で減少した。
2019503675.tif 000003
【００９４】
従って、一つの態様において、バルプロ酸は、2.5mM〜5mMの濃度で使用される。一つの好ましい態様において、バルプロ酸は、3mM〜4mMの濃度で使用される。上述の濃度は、バルプロ酸が、本明細書において報告される方法において単独の産生増強物として使用されるか、それとも他の産生増強物と組み合わせて混合物として使用されるか、と無関係である。従って、バルプロ酸は、記述された濃度で使用される。
【００９５】
バルプロ酸以外のヒストンデアセチラーゼ阻害物質
ジメチルスルホキシド（DMSO）が、ストック溶液を作製するための全ての適用されたHDAC阻害物質の溶媒であったが、一過性にトランスフェクトされた細胞培養物にトランスフェクションの3時間後に添加された0.1vol％DMSOで、未処理の対照と比較して特異的産生量の違いは見られなかった（データ示さず）。
【００９６】
ある特定のHDACサブクラスに制限されるHDAC阻害物質および広域HDAC阻害物質を、細胞特異的産生量に対するそれらの効果について試験した。
− ピメリックジフェニルアミド106は、HDAC 1および3に対して最も高い親和性を有し、HDAC 2に対して高い親和性を有し、HDAC 8に対して中程度の親和性を有するクラスI HDAC阻害物質である（Chou,Herman et al.2008）；この阻害物質は、0.2〜20μMの濃度範囲で添加された。
− TMP269は、クラスIIa HDAC 4、5、7、および9に対して優先性を有するHDAC阻害物質として記載されている（Burli,Luckhurst et al.2013）；この阻害物質は、0.6〜15μMの濃度範囲で添加された。
− ブフェキサマクは、選択的なクラスIIb HDAC阻害物質として記載されている（Bantscheff,Hopf et al.2011）；この阻害物質は、2〜50μMの濃度範囲で添加された。
− ヒドロキサメートベリノスタットは、HDAC 6およびHDACに対して最も高い優先性を有する広域阻害物質である（Khan,Jeffers et al.2008；Atadja 2009）；ベンズアミドエンチノスタットは、クラスIIaメンバーHDAC 9に対する付加的な阻害活性を有するクラスI HDAC阻害物質である（Bertrand 2010）；モセチノスタットは、HDAC 1および2に対して最低のIC50値を有し、HDAC 3およびHDAC 11に対して中程度の阻害活性を有するベンズアミドである（Arts,King et al.2009）；キシノスタットは、ピリミジルヒドロキサム酸であり、HDAC 1、2、4、および11に対して最も高い有効性を有する極めて強力な広域HDAC阻害物質である（Arts,King et al.2009）；広域HDAC阻害物質ベリノスタット、エンチノスタット、モセチノスタット、およびキシノスタットは、それぞれ、1μM、300nM、2μM、および300nMの濃度で添加された。
【００９７】
Backliwalら（前記）によって立てられた仮説とは対照的に、バルプロ酸よりはるかに強力なヒストンデアセチラーゼ阻害物質が、産生増強効果を示さないことが、本発明者らによって見出された（図2および以下の表を参照すること；N＝2（ブフェキサマク：N＝1を除く））。
2019503675.tif 000004
【００９８】
従って、バルプロ酸の効果は、HDACiによって得られることができない。他のHDACiとは対照的に、バルプロ酸およびキシノスタットは、増殖阻害および細胞死を誘導した。
【００９９】
HDAC特異的阻害物質
クラスIIaおよびクラスIIbの阻害物質とは対照的に、クラスI HDAC阻害物質ピメリックジフェニルアミド106は、TGEに対する増強効果を示すことが見出された（図2を参照すること）。
【０１００】
さらなる異なるクラスIアイソフォーム選択的HDAC阻害物質を試験した。
− 二環式デプシペプチドロミデプシンは、強力で選択的なHDAC 1およびHDAC 2の阻害物質である（Furumai,Matsuyama et al.2002）。ロミデプシンは、10nM〜1μMの濃度範囲で使用された。
− 環式テトラペプチドであるアピシジンは、HDAC 2およびHDAC 3に対して最も高い親和性を有する強力なクラスI HDAC阻害物質として記載されている（Khan,Jeffers et al.2008）；この阻害物質は、20nM〜2μMの濃度範囲で試験された。
− RGFP966は特異的なHDAC 3阻害物質である。それは、1μM〜100μMの濃度範囲で使用された（Malvaez,McQuown et al.2013）。
− HDAC 8特異的阻害物質PCI34051は、500nM〜50μMの範囲の濃度で添加された（Balasubramanian,Ramos et al.2008）。
【０１０１】
結果は、以下の表に示される（図7を参照すること；N＝1）。
2019503675.tif 000005
【０１０２】
バルプロ酸類似体
いくつかの化学的VPA類似体をそれらの効果について試験した。
− バルプロミド（VPM）およびトランス-2-メチル-2-ペンテン酸（2M2P）は、極めて弱いHDAC阻害活性を有する〜HDAC阻害活性を有しない、構造的VPA類似体である（Phiel,Zhang et al.2001；Gurvich,Tsygankova et al.2004；Eyal,Yagen et al.2005）。
− バルノクタミド（VCM）のHDAC阻害活性は、文献中に直接記載されていないが、VCMのカルボン酸、バルノクチン酸（valnoctic acid）は、弱いHDAC阻害活性を有することが公知である（Eyal,Yagen et al.2005）。
【０１０３】
HDACiを、ある特定の化合物について決定した。結果は、以下の表ならびに図3AおよびBに示される（N＝3）。
2019503675.tif 000006
【０１０４】
3〜11mMの2M2P濃度を、対照（2M2Pなし）と比較して、力価の増大に関して試験した（N＝2）。
2019503675.tif 000007
【０１０５】
前記の評価されたVPA濃度に基づき、その類似体を、2mM〜4mMの濃度範囲で使用した。4mMで、全ての分子が高い毒性を示した。VPMは、3mMで既に細胞傷害性であった。弱いTGE増強が、2mMでVPMおよびVCMによって観察された。2M2Pは、3mMで、陰性対照と比較してタンパク質発現収率を明白に増加させた（以下の表；図4を参照すること；N＝2）。
2019503675.tif 000008
【０１０６】
いくつかの化合物を用いて得られた結果を、以下の表に示す。
2019503675.tif 000009
2019503675.tif 000010
【０１０７】
NFκB活性化物質
NFκB転写の修飾によって産生収率（力価）に対する陽性作用が得られることができることが見出された。
【０１０８】
古典的経路および非古典的経路を介したNFκBの活性化が産生収率の増加をもたらすことが、さらに見出された。
【０１０９】
NFκBは、異なる経路を介して活性化され得る。以下のNFκB活性化物質を、効果について試験した。
− 腫瘍壊死因子（TNF）αならびに上皮増殖因子（EGF）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）由来のフラジェリンを、2ng/mL〜50ng/mLの濃度範囲で添加した（Osborn,Kunkel et al.1989；Sun and Carpenter 1998；Hayashi,Smith et al.2001）。
− ベツリン酸およびホルボールミリステートアセテート（PMA）は、それぞれ、2.5μM〜40μMおよび10nM〜500nMの濃度範囲で補足された（Kasperczyk,La Ferla-Bruhl et al.2005；Holden,Squires et al.2008）。
【０１１０】
試験された全ての化合物が、陰性対照と比較して、細胞特異的産生量の増強を示した（以下の表；図5を参照すること；N＝2）。
2019503675.tif 000011
【０１１１】
さらに、NFκBの阻害を調査した。NFκBの直接阻害物質は、入手可能でないため、IκB分解を促進するIκBキナーゼは、BAY11-7082の投与によって阻害された（Pierce,Schoenleber et al.1997）。
【０１１２】
NFκBは、NFκBの内因性阻害物質IκBとの持続的な結合によって阻害され得る。BAY11-7082を、5μM〜15μMの濃度範囲で、3mM VPAと組み合わせた。高い毒性をVPAとBAY11-7082との組み合わせによって観察した後、BAY11-7082添加についてのいくつかの時点を試験した。高い効果および最低の毒性を有するBAY11-7082添加の時点は、トランスフェクションの24時間後であった。BAY11-7082の効果は、約4日間継続する。BAY11-7082を、VPA、2M2P、またはキシノスタットによる処理の後に、最適の濃度（15μM）および時点（トランスフェクションの24時間後）で添加した。VPAおよびキシノスタットによる処理の後のBAY11-7082添加によって、それぞれの単一の処理と比較して、細胞特異的産生量を有意に低下させることができる。2M2PとBAY11-7082との組み合わせでは、単一の処理と比較して、細胞特異的産生量の低下は観察されなかった。要約すると、BAY11-7082は、HDACを阻害する分子による処理の後にのみ、TGE増強を低下させることができた。
【０１１３】
同様に、記載されたNFκB活性化物質によるTGE増強を、BAY11-7082によって戻すことができるか否かを調査した。HEK293F細胞を、それぞれの最適濃度で、TNF、EGF、またはフラジェリンによって処理した。さらに、刺激の24時間後に同様に処理されたHEK293F細胞に、BAY11-7082を添加した。BAY11-7082処理の後に、対応する単一の処理と比較して、TGE増強が有意に低下したことが、以下の表に含有されるデータから理解され得る。
【０１１４】
結果は以下の表に提示される（N＝3）。
2019503675.tif 000012
【０１１５】
BAY 11-7082は、HDACiによって媒介される産生収率の増加を低下させるが、2M2Pによるものは低下させないことが理解され得る。BAY 11-7082は、NFκB活性化物質によって媒介される産生収率の増加を低下させることが、さらに理解され得る。
【０１１６】
組み合わせ
（i）ヒストンデアセチラーゼ阻害なし
2M2PによるTGEの増強が、IKKの阻害によって低下し得ないこと、従って、特異的産生量が、NFκBとは無関係なさらなる機序によって改善されることが見出された。
【０１１７】
効果の増大のため、2M2PおよびNFκB活性化物質を組み合わせることができることが、見出された。
【０１１８】
フラジェリンはTLR5アゴニストである。フラジェリンと2M2Pとの組み合わせは、バルプロ酸を用いて得られたものに匹敵するな産生収率の増加をもたらした。
【０１１９】
一例において、HEK293F細胞を2M2Pによって処理した。さらに、2M2P処理の24時間後に、フラジェリンによって細胞を刺激した。フラジェリンは、NFκB活性化物質の中で最も温和な毒性を示した。個々の単一の処理と比較して、組み合わせによって、細胞特異的産生量をさらに増加させることができた。2M2Pおよびフラジェリンによる処理の後のIgG濃度を、VPA処理の後の収率と比較した。結果は、以下の表および図6に示される（N＝3）。
2019503675.tif 000013
【０１２０】
この効果はHDAC阻害なしで媒介される。
【０１２１】
（ii）ヒストンデアセチラーゼ阻害あり
VPA、キシノスタット、および2M2Pの相互の組み合わせ研究を実施した。VPAの細胞傷害性を低下させるため、やはり毒性である分子キシノスタットおよび2M2Pと組み合わせるため、濃度を2mMに低下させた。結果は以下の表に示される（N＝3）。
2019503675.tif 000014
【０１２２】
（iii）HDAC阻害物質、NFκB活性化物質、およびVPA誘導体の組み合わせ
温和な毒性およびTGE増強に対する強力な効果を有する特異的HDAC阻害物質の同定によって、NFκB活性化物質フラジェリンおよびVPA類似体2M2Pと組み合わせられたロミデプシンは、極めて有効なTGE増強物の組み合わせをもたらす。フラジェリンおよびロミデプシンは、それぞれ、トランスフェクションの3時間後および24時間後に、それぞれ2ng/mLおよび15nMの濃度で添加された。結果は、以下の表および図8に示される（N＝3）。
2019503675.tif 000015
【０１２３】
ロミデプシンを2M2Pとも組み合わせた。2M2Pは、トランスフェクションの3時間後に3mMの濃度で添加され、ロミデプシンは、15nMの濃度で2M2P処理の24時間後に添加された。一過性に発現した抗体の収率において、相乗効果が観察された。さらに、組み合わせは、VPA単独による処理と比較して、より高い抗体収率をもたらした（以下の表および図9を参照すること；N＝3）。
2019503675.tif 000016
【０１２４】
組換え方法
任意のポリペプチド（例えば、抗体、scFv、scFab、もしくはdarpinのような単鎖抗原結合ポリペプチド、またはdsFvもしくはFabのような多鎖抗原結合ポリペプチド）を発現させ、真核細胞（例えば、HEK293細胞、CHO細胞）の上清から精製することができる。ポリペプチドが、単離されたポリペプチドであるか、それとも多量体またはヘテロマーのエンティティに含まれているかは、重要ではない。
【０１２５】
ポリペプチドをコードするベクターのクローニングまたは発現/分泌のために適した宿主細胞には、本明細書に記載された真核細胞が含まれる。発現の後、ポリペプチドを細胞または培養上清から単離することができる。その後、ポリペプチドをさらに精製することができる。
【０１２６】
脊椎動物細胞を宿主として使用することができる。例えば、懸濁培養に適した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、COS-7細胞株（SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1細胞）；HEK293細胞株（ヒト胎児由来腎臓）；BHK細胞株（ベビーハムスター腎臓）；TM4マウスセルトリ細胞株（例えば、Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251に記載されているようなTM4細胞）；CV1細胞株（サル腎臓細胞）；VERO-76細胞株（アフリカミドリザル腎臓細胞）；HELA細胞株（ヒト子宮頚癌細胞）；MDCK細胞株（イヌ腎臓細胞）；BRL-3A細胞株（バッファローラット肝臓細胞）；W138細胞株（ヒト肺細胞）；HepG2細胞株（ヒト肝臓細胞）；MMT 060562細胞株（マウス乳房腫瘍細胞）；（例えば、Mather,et al.,Anal.N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載されている）TRI細胞株；MRC5細胞株；およびFS4細胞株である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR陰性CHO細胞株（例えば、Urlaub,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216を参照すること）を含むCHO細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ならびにY0細胞株、NS0細胞株、およびSp2/0細胞株のような骨髄腫細胞株が含まれる。ポリペプチド作製のために適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,and Wu,Methods in Molecular Biology,Antibody Engineering 248(2004)255-268(B.K.C.Lo,(ed.),Humana Press,Totowa,NJ)を参照すること。
【０１２７】
抗体断片
ある特定の態様において、本明細書において提供される方法によって作製される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Fab断片、Fab'断片、Fab'-SH断片、F(ab')2断片、Fv断片、およびscFv断片、ならびに下記のその他の断片が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある特定の抗体断片の概説については、Hudson.et al.,Nat.Med.9(2003)129-134を参照すること。scFv断片の概説については、例えば、Plueckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)を参照し；WO 93/16185；ならびにUS 5,571,894およびUS 5,587,458も参照すること。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、延長されたインビボ半減期を有するFab断片およびF(ab')2断片の考察については、US 5,869,046を参照すること。
【０１２８】
ダイアボディとは、二価または二重特異性であり得る、2個の抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134；およびHolliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照すること。トリアボディ（triabody）およびテトラボディ（tetrabody）も、Hudson,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134に記載されている。
【０１２９】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis,Inc.,Waltham,MA；例えば、US 6,248,516 B1を参照すること）。
【０１３０】
抗体断片は、インタクト抗体のタンパク質分解、および本明細書に記載される組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（E.coli）またはファージ）による産生を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な技術によって作製され得る。
【０１３１】
多重特異性抗体
ある特定の態様において、本明細書において報告される方法によって作製される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2種類の異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【０１３２】
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2種類の免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein,C.and Cuello,Nature 305(1983)537-540、WO 93/08829、およびTraunecker,A.et al.,EMBO J.10(1991)3655-3659を参照すること）ならびに「ノブインホール」エンジニアリング（例えば、US 5,731,168を参照すること）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電的ステアリング効果の改変（WO 2009/089004A1）；2種もしくはそれ以上の抗体または断片の架橋（例えば、US 4,676,980およびBrennan,M.et al.,Science 229(1985)81-83を参照すること）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny,S.A.,et al.,J.Immunol.148(5)(1992)1547-1553を参照すること）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」テクノロジーの使用（例えば、Holliger,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照すること）；ならびに単鎖Fv（sFv）二量体の使用（例えば、Gruber,M.,et al.,J.Immunol.152(1994)5368-5374を参照すること）、ならびに、例えば、Tutt,A.,et al.J.Immunol.147(1991)60-69に記載されたような三重特異性抗体の調製によっても作製され得る。
【０１３３】
「オクトパス抗体」を含む、3個またはそれ以上の機能性抗原結合部位を有する改変された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、US 2006/0025576 A1を参照すること）。
【０１３４】
本明細書における抗体または断片には、CD19に結合し、別の異なる抗原にも結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab」または「DAF」も含まれる（例えば、US 2008/0069820を参照すること）。
【０１３５】
本明細書における抗体または断片には、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、およびWO 2010/145793に記載された多重特異性抗体も含まれる。
【０１３６】
本発明の方法における抗体は、二重特異性抗体でありえる。二重特異性抗体は、多重特異性抗体の群のメンバーである。二重特異性抗体は、異なる抗原または同一抗原上の異なるエピトープに結合する、1対の抗体重鎖可変ドメイン（VH）および抗体軽鎖可変ドメイン（VL）によって各々形成された結合部位を少なくとも2個含む。そのような二重特異性抗体は、1＋1フォーマットである。他の二重特異性抗体フォーマットは、（第1の抗原またはエピトープのための2個の結合部位、および第2の抗原またはエピトープのための1個の結合部位を含む）2＋1フォーマット、または（第1の抗原またはエピトープのための2個の結合部位、および第2の抗原またはエピトープのための2個の結合部位を含む）2＋2フォーマットである。
【０１３７】
全ての局面の一つの態様において、本発明の抗体は、
（i）任意で、変異P329G、L234A、およびL235Aを含む、ヒトIgG1サブクラスのホモ二量体Fc領域、または
（ii）任意で、変異P329G、S228P、およびL235Eを含む、ヒトIgG4サブクラスのホモ二量体Fc領域、または
（iii）任意で、変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを含むか、もしくは任意で、変異P329G、L234A、L235A、H310A、H433A、およびY436Aを含む、ヒトIgG1サブクラスのホモ二量体Fc領域、または
（iv）（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、およびY407Vを含むか、もしくは
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、もしくは
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含む、ヘテロ二量体Fc領域、または
（v）両方のFc領域ポリペプチドが変異P329G、L234A、およびL235Aを含み、かつ
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、およびY407Vを含むか、もしくは
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、もしくは
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含む、ヒトIgG1サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（vi）両方のFc領域ポリペプチドが変異P329G、S228P、およびL235Eを含み、かつ
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、およびY407Vを含むか、もしくは
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、もしくは
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、かつ他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含む、ヒトIgG4サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（vii）（i）、（ii）、および（iii）のうちの一つと、（vi）、（v）、および（vi）のうちの一つとの組み合わせ
を含む（全て、カバットのEUインデックスによる位置）。
【０１３８】
全ての局面の一つの態様において、本発明の方法の抗体は、
（a）第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
（b）抗体が第2の抗原に特異的に結合し、第2の軽鎖および第2の重鎖の可変ドメインVLおよびVHが相互に交換されている、該抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。
【０１３９】
（a）の抗体は、（b）において報告される修飾を含有しておらず、（a）の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。
【０１４０】
（b）の抗体においては、
軽鎖内で、
可変軽鎖ドメインVLが、該抗体の可変重鎖ドメインVHに交換されており、
かつ重鎖内で、
可変重鎖ドメインVHが、該抗体の可変軽鎖ドメインVLに交換されている。
【０１４１】
全ての局面の一つの態様において、本発明の方法の抗体は、
（a）第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
（b）抗体が第2の抗原に特異的に結合し、第2の軽鎖および第2の重鎖の可変ドメインVLおよびVHが相互に交換されており、第2の軽鎖および第2の重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が相互に交換されている、該抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。
【０１４２】
（a）の抗体は、（b）において報告される修飾を含有しておらず、（a）の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。
【０１４３】
（b）の抗体においては、
軽鎖内で、
可変軽鎖ドメインVLが、該抗体の可変重鎖ドメインVHに交換されており、定常軽鎖ドメインCLが、該抗体の定常重鎖ドメインCH1に交換されており、
かつ重鎖内で、
可変重鎖ドメインVHが、該抗体の可変軽鎖ドメインVLに交換されており、定常重鎖ドメインCH1が、該抗体の定常軽鎖ドメインCLに交換されている。
【０１４４】
全ての局面の一つの態様において、本発明の方法の抗体は、
（a）第1の抗原に特異的に結合する抗体の第1の軽鎖および第1の重鎖、ならびに
（b）抗体が第2の抗原に特異的に結合し、第2の軽鎖および第2の重鎖の定常ドメインCLおよびCH1が相互に交換されている、該抗体の第2の軽鎖および第2の重鎖
を含む、二価二重特異性抗体である。
【０１４５】
（a）の抗体は、（b）において報告される修飾を含有しておらず、（a）の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。
【０１４６】
（b）の抗体においては、
軽鎖内で、
定常軽鎖ドメインCLが、該抗体の定常重鎖ドメインCH1に交換されており、
かつ重鎖内で、
定常重鎖ドメインCH1が、該抗体の定常軽鎖ドメインCLに交換されている。
【０１４７】
全ての局面の一つの態様において、本明細書において報告される抗体は、少なくとも2種類の重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化を必要とする多重特異性抗体である。
【０１４８】
ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を支持するためのCH3修飾のための数種類のアプローチが、例えば、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、およびWO 2013/096291に記載されている。典型的には、当技術分野において公知のアプローチにおいて、1個の改変されたCH3ドメインを含む重鎖が、同一の構造のもう1本の重鎖とホモ二量体化し得なくなるよう（例えば、CH3が改変された第1の重鎖が、もう1本のCH3が改変された第1の重鎖とホモ二量体化し得なくなり；CH3が改変された第2の重鎖が、もう1本のCH3が改変された第2の重鎖とホモ二量体化し得なくなるよう）相補的に、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインの両方が改変される。それによって、1個の改変されたCH3ドメインを含む重鎖は、相補的に改変されたCH3ドメインを含むもう1本の重鎖とヘテロ二量体化することを強いられる。この態様について、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインは、第1の重鎖と第2の重鎖とがヘテロ二量体化することを強いられ、第1の重鎖および第2の重鎖が（立体的な理由のため）ホモ二量体化し得なくなるようなアミノ酸置換によって相補的に改変される。
【０１４９】
前記に引用され含まれた当技術分野において公知の重鎖ヘテロ二量体化を支持するための異なるアプローチは、前記の特定のアミノ酸置換と組み合わせて、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する「非交差（non-crossed）Fab領域」および第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する「交差（crossed）Fab領域」を含む、本明細書において報告される多重特異性抗体の提供において使用される異なる代替物として企図される。
【０１５０】
本明細書において報告される多重特異性抗体のCH3ドメインは、例えば、WO 96/027011,Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；およびMerchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681に、いくつかの例と共に詳細に記載されている「ノブイントゥホール」テクノロジーによって改変され得る。この方法においては、2個のCH3ドメインの相互作用表面が、これらの2個のCH3ドメインを含有している両重鎖のヘテロ二量体化を増大させるために改変される。（2本の重鎖の）2個のCH3ドメインの各々は「ノブ」であってよいが、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35）、収率を増加させる。
【０１５１】
一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメインに変異T366S、L368A、Y407V（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む。例えば、「ノブ鎖」のCH3ドメインへY349C変異を導入し、「ホール鎖」のCH3ドメインへE356C変異もしくはS354C変異を導入することによる、CH3ドメインの間の付加的な鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681）。従って、別の好ましい態様において、多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方に変異Y349CおよびT366Wを含み、かつ2個のCH3ドメインの他方に変異E356C、T366S、L368A、およびY407Vを含むか、または多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方に変異Y349CおよびT366Wを含み、かつ2個のCH3ドメインの他方に変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含む（一方のCH3ドメインにおける付加的なY349C変異、および他方のCH3ドメインにおける付加的なE356C変異またはS354C変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（カバットEUインデックスによるナンバリング）。
【０１５２】
しかし、EP 1 870 459によって記載されているような他のノブインホールテクノロジーが、代替的にまたは付加的に使用されてもよい。一つの態様において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメインに変異R409DおよびK370Eを含み、「ホール鎖」のCH3ドメインに変異D399KおよびE357Kを含む（カバットEUインデックスによるナンバリング）。
【０１５３】
一つの態様において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメインに変異T366S、L368A、およびY407Vを含み、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインに変異R409DおよびK370Eを含み、「ホール鎖」のCH3ドメインに変異D399KおよびE357Kを含む（カバットEUインデックスによるナンバリング）。
【０１５４】
一つの態様において、多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方に変異Y349CおよびT366Wを含み、かつ2個のCH3ドメインの他方に変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含むか、または多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方に変異Y349CおよびT366Wを含み、かつ2個のCH3ドメインの他方に変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつさらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインに変異R409DおよびK370Eを含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインに変異D399KおよびE357Kを含む（カバットEUインデックスによるナンバリング）。
【０１５５】
「ノブイントゥホールテクノロジー」とは別に、ヘテロ二量体化を強制するために多重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを修飾する他の技術が、当技術分野において公知である。これらのテクノロジー、特に、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、およびWO 2013/096291に記載されたものは、多重特異性抗体と組み合わせて、「ノブイントゥホールテクノロジー」の代替物として本明細書において企図される。
【０１５６】
本明細書において報告される全ての局面および態様の一つの態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
【０１５７】
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、抗体は、二価または三価の抗体である。一つの態様において、抗体は、二価抗体である。
【０１５８】
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、多重特異性抗体は、IgG型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1のもの、または変異L234AおよびL235Aを有するヒトサブクラスIgG1のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG2のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG3のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG4のものまたは付加的な変異S228Pを有するヒトサブクラスIgG4のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1のものまたはヒトサブクラスIgG4のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異L234AおよびL235A（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG1のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異L234A、L235A、およびP329G（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG1のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異S228PおよびL235E（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG4のものである。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異S228P、L235E、およびP329G（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG4のものである。
【０１５９】
本明細書において報告される方法における抗体は、一つの態様において、変異PVA236、L234A/L235A、および/もしくはGLPSS331（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG1のもの、またはサブクラスIgG4のものである。さらなる態様において、抗体は、E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331、および/またはP329（カバットのEUインデックスによるナンバリング）に少なくとも1個の変異を含有している、IgGクラス、一つの態様において、サブクラスIgG1またはIgG4のものである。さらに、一つの態様において、抗体は、IgG4サブクラスのものであり、変異S228P、または変異S228PおよびL235E（Angal,S.,et al.,Mol.Immunol.30(1993)105-108）（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を含有している。
【０１６０】
本明細書において報告される方法における抗体の重鎖のC末端は、アミノ酸残基PGKで終わる完全なC末端であり得る。重鎖のC末端は、C末端アミノ酸残基のうちの1個または2個が除去された、短縮されたC末端であり得る。一つの好ましい態様において、重鎖のC末端は、PGで終わる短縮されたC末端である。
【０１６１】
一つの態様において、抗体は、C末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む本明細書に明示されるC末端CH3ドメインを含む重鎖を含む。一つの態様において、抗体は、C末端グリシン残基（G446、カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む本明細書に明示されるC末端CH3ドメインを含む重鎖を含む。
【実施例】
【０１６２】
以下の実施例、図面、および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の本旨から逸脱することなく、示された手法に修飾が施されてもよいことが理解される。
【０１６３】
材料および方法
使用した化学物質
2019503675.tif 000017
【０１６４】
キットおよびマスターミックス
2019503675.tif 000018
【０１６５】
組換えDNA技術
Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されるような標準的な方法が、DNAを操作するために使用された。分子生物学的試薬は、製造業者の説明に従って使用された。
【０１６６】
遺伝子およびオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントを化学合成によって調製した。合成された遺伝子断片を、増殖/増幅のため、大腸菌プラスミドへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、またはPCRを介して、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH（Planegg-Martinsried,Germany）によって調製された。
【０１６７】
基本的/標準的な哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子/タンパク質（例えば、全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはN末端にオリゴグリシンを含有しているFc鎖）の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位が使用される：
− イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター（P-CMV）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域（5'UTR）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 発現する遺伝子/タンパク質（例えば、全長抗体重鎖）、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル配列（BGH pA）。
【０１６８】
発現する所望の遺伝子を含む発現単位/カセットの他に、基本的/標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
− 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
− 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子
を含有している。
【０１６９】
細胞培養
HEK293F細胞は、シェーカーインキュベーター（Kuhner,Mytron）において、36.5℃、7.0％CO2、および80％の湿度で、シェーカーフラスコ中のF17培地（Life Technologies）中で培養された。細胞は3〜4日毎に分割され、5週を超えずに培養された。過剰増殖を回避し、対数増殖期に維持するため、生細胞密度（VCD）は、細胞 60＊105個/mLを上回ることはなかった。
【０１７０】
一過性遺伝子発現（TGE）
一過性遺伝子発現は、5〜7日にわたる手法である。この発現系の標準的な操作手法は、80mL〜2Lの範囲の細胞培養物の様々な体積で、シェーカーフラスコに適用可能である。最初に、細胞培養物の半分の体積を、細胞 8＊105個/mLの生細胞密度（VCD）で播種する。2日間の培養の後、細胞を細胞 約12＊105個/mLのVCDに分割する。翌日、細胞は、ポリエチレンイミン（PEI）に基づくトランスフェクション試薬を用いて、細胞 20＊105個/mL〜細胞 25＊105個/mLのVCDでトランスフェクトされる。トランスフェクションの3時間後に、（もしあれば）産生増強物を添加する。トランスフェクションの24時間後、栄養素の制限を回避するため、フィーディング溶液およびグルコースボーラスを補足する。50％未満に減少するべきでない細胞生存度に依って、トランスフェクションの5〜7日後に上清を採集し、抗体精製に供する。
【０１７１】
一過性遺伝子発現速度を比較するため、1種類の異なる抗体をコードする同一のプラスミドを常にコトランスフェクトした。
【０１７２】
2種類のプラスミドを等モルでコトランスフェクトするため、1種類のプラスミドの塩基対数の全塩基対数に対する比を算出し、DNAの全量（0.5mg/L）を掛けた。プラスミド1は、10530bpのサイズを有し、プラスミド2は、7184bpのサイズを有し、最終濃度 1mg/mLまで水に溶解させた。細胞培養物1リットルのトランスフェクションのため、297μLのプラスミド1および203μLのプラスミド2を、室温で、40mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解させた。1.25mLのJetPEI（登録商標）溶液を添加し、溶液を十分に混合した。10〜15分間のインキュベーションの後、混合物を細胞に添加した。異なるトランスフェクション効率から発生するばらつきを回避するため、全ての実験に必要な完全細胞培養物を含有しているバッチにおいて細胞はトランスフェクトされた。
【０１７３】
80mLのトランスフェクトされた細胞培養バッチを、125mlのシェーカーフラスコに添加した。全ての実験のため、2個または3個の125mLシェーカーフラスコを生物学的複製として使用し、同様に処理した。トランスフェクションの3時間後に、細胞を125mLシェーカーフラスコへ分割し、低分子またはリガンドによる細胞処理を開始した。基礎タンパク質発現量を、未処理の対照試料によって決定した。試料を標準的な操作手法と比較するため、細胞をまたVPAによって最終濃度 4mMまたは3mMまで処理した。VPAおよびその類似体は、再蒸留水に溶解させた。HDAC阻害物質およびBAY 11-7082は、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、最終濃度の1000倍超の濃度でストック溶液が調製された。上皮増殖因子（EGF）は、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）が補足された10mM無菌酢酸で再生された。腫瘍壊死因子（TNF）αは、0.1％BSAが補足されたPBSで再生された。フラジェリンは、滅菌再蒸留水に溶解させた。適用された分子は、培養物に直接添加されるのではなく、36.5℃に予め温められた16mLの培地で希釈され、その後、培養物へ添加された。
【０１７４】
トランスフェクションの24時間後に、36.5℃のフィーディング溶液および3mg/mLグルコースを培養物へ添加した。
【０１７５】
細胞密度および生存度の決定
細胞生存度および生細胞密度（VCD）を決定するため、1mLの培養培地（細胞懸濁物）を、Cedex低ファウリングサンプルカップへ移した。カップをVicell装置（Beckman Coulter）に置いた。この装置は、死細胞を染色するため、細胞をトリパンブルーと混合する。50個の画像の分析の後、VCDを算出し、全細胞数に対する生細胞数の百分率の算出によって、生存度を決定した。
【０１７６】
IgG濃度の決定
一過性に発現された抗体の全濃度を、濁度測定試験によって決定した。1mLの細胞懸濁物をエッペンドルフカップに移し、10,000rpm（9,300g）で10分間遠心分離した。上清を新しいカップに移し、Cobas Integra 400 plus（Roche）分析に供した。内部標準との比較によって、絶対濃度を算出した。
【０１７７】
細胞特異的産生量
細胞特異的産生量は、細胞1個当たりの1日当たりのタンパク質産生である。その算出は、経過時間（Δt）当たりの産物濃度の変化（ΔP）を算出するための式：
2019503675.tif 000019
に基づく。
Pr＝特異的産生量速度；c(t)＝産生バイオマス。
【０１７８】
産生量は1個の細胞に関するため、生産バイオマスは、平均生細胞密度
2019503675.tif 000020
である。細胞特異的産生量を算出するために変換すると、式は、
2019503675.tif 000021
となる。
【０１７９】
単位を［pg/(細胞＊d)］に変換するため、式を以下のように改変した。
2019503675.tif 000022
【０１８０】
その後、全培養時間における平均特異的産生量を算出した。最後に、トランスフェクトされた陰性対照と比べた平均特異的産生量の値を決定した。
【０１８１】
HDAC活性の決定
HDAC活性は、製造業者の説明に従って、インサイチューHDAC活性蛍光測定アッセイキット（Biovision）によって決定された。HEK293F細胞を、細胞 5＊105個/mLの細胞密度でF17培地（Life Technologies）に懸濁させた。1ウェル当たり100マイクロリットルの培養物を、黒色ELISAプレートへピペットで移した。プレートを1000gで5分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、F17培地、1％HDAC基質、およびHDAC阻害活性について試験される分子を含有している反応ミックスに再懸濁させた。10μMトリコスタチンAを陽性対照として使用し、1％HDAC基質を含むF17培地に細胞を再懸濁させることによって、基礎HDAC活性を決定した。さらに、細胞をバックグラウンド対照としてHDAC基質なしのF17培地に再懸濁させた。HDAC活性アッセイを、全ての試料についても全ての対照についても三つ組みで実施した。96ウェルプレートを、1時間、36.5℃、80％の湿度、および7％CO2でインキュベートした。この時間の間に、活性HDACが、HDAC基質を脱アセチルし、それが基質の消光した蛍光シグナルを放出する。インキュベーションの後、蛍光シグナルをインフィニット（infinite）蛍光プレートリーダー（TECAN）によって分析した。試料および対照の蛍光シグナルを、バックグラウンド対照の蛍光シグナルを差し引くことによって標準化した。基質の脱アセチルから発生する蛍光シグナルは、HDAC活性と直接相関すると仮定される。HDAC阻害を、陽性対照（100％阻害）および陰性対照（0％阻害）と比べて算出した。
【０１８２】
フローサイトメトリー
蛍光RNAのトランスフェクションの後、トランスフェクション効率を決定するため、FACS Canto II（BD）を使用して、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した。細胞懸濁物（2mL）を、2mLエッペンドルフカップに移し、1,500rpm（200g）で10分間遠心分離した。バックグラウンド蛍光を低下させるため、上清を廃棄し、細胞を2mLのF17培地に再懸濁させた。細胞懸濁物を14mL丸底ポリスチレンチューブ（Falcon）へ移し、暗所で維持した。1万個の細胞を、488nmの励起波長および525nmの放射波長で分析した。生存集団をFlowJoソフトウェアを使用してさらに分析した。シグナル強度を、トランスフェクトされていない対照試料と比較し、トランスフェクション効率を決定した。
【０１８３】
蛍光顕微鏡法
FITC標識RNAによってトランスフェクトされた細胞の核を、細胞懸濁物1mL当たり2滴のHoechst33343溶液（Life Technologies）を添加し、20分間インキュベートすることによって対比染色した。トランスフェクション効率を定性的に決定するため、蛍光顕微鏡（Zeiss）によって細胞を画像化した。
【０１８４】
細胞生物学的実験および分子生物学的実験の統計
細胞特異的産生量、相対増強、および相対IgG濃度を、有意性について一元配置のANOVAによって最初に分析した。有意水準（p値）を決定するため、スチューデントt検定によって処理を比較した。有意水準はアステリスクとして示される。アステリスク1個は、p値≦0.05に相当し、アステリスク2個は、p値≦0.01に相当し、アステリスク3個は、p≦0.001に相当する。
【０１８５】
参照文献
2019503675.tif 000023
2019503675.tif 000024
2019503675.tif 000025
【図１】
2019503675.tif 000027
【図２Ａ】
2019503675.tif 000028
【図２Ｂ】
2019503675.tif 000029
【図３】
2019503675.tif 000030
【図４】
2019503675.tif 000031
【図５】
2019503675.tif 000032
【図６】
2019503675.tif 000033
【図７】
2019503675.tif 000034
【図８】
2019503675.tif 000035
【図９】
2019503675.tif 000036
【国際調査報告】
2019503675.tif 000037
2019503675.tif 000038
2019503675.tif 000039