(57)【要約】  FOXP3を発現した遺伝子組換え細胞を作製する方法および治療方法を開示する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；ヌクレアーゼを提供すること；および前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含んでいてもよい。さらに、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法、および臓器移植の副作用を起こした対象を治療する方法を提供する。
2019533463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法であって、
１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；
ヌクレアーゼを提供すること；および
前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うこと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のヌクレオチド配列が標的遺伝子座を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子座が、内在性の第１のコーディングエクソンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子座が、前記１つ以上の制御因子に存在する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的遺伝子座が、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記FOXP3遺伝子またはその一部が、内在性の第１のコーディングエクソンを含む、請求項３、５および６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼが、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子編集が、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターが、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロモーターが、誘導型プロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記誘導型エフェクターが、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記異種プロモーターを挿入することにより、第１のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターが、前記コード鎖上の該第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖が、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む、請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記コード鎖上の内在性の第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖が、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む、請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する、請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法で作製された、FOXP3を発現させるための核酸。
【請求項２５】
異種制御因子を含むコード鎖；および
第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部に作動可能に連結された異種プロモーター
を含む核酸。
【請求項２６】
前記異種プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
前記構成的プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
前記異種プロモーターが、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２９】
前記プロモーターが、誘導型プロモーターである、請求項２６に記載の核酸。
【請求項３０】
前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
前記異種プロモーターが、前記第１のコーディングエクソンの上流に存在する、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３２】
異種転写エンハンサー領域をさらに含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３３】
異種転写活性化領域をさらに含む、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３４】
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３５】
前記コード鎖上の１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３６】
前記１つ以上の制御因子が遺伝子組換えされている、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項３７】
遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、
１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；
ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および
前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うこと
を含む方法。
【請求項３８】
前記遺伝子編集が、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記コード鎖が第１のコーディングエクソンを含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のヌクレオチド配列が標的遺伝子座を含む、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的遺伝子座が、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的遺伝子座が、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子編集が、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヌクレアーゼが、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記異種プロモーターが構成的プロモーターである、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記異種プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記異種プロモーターが、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記異種プロモーターが誘導型プロモーターである、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばＴＣＲαエンハンサー）を挿入することをさらに含む、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が前駆・幹細胞である、請求項３７〜５５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項３７〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞がＣＤ４＋発現細胞である、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞がＣＤ８＋発現細胞である、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
請求項３７〜６１のいずれか１項に記載の方法によって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞。
【請求項６３】
第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞。
【請求項６４】
前記異種プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項６３に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項６５】
前記構成的プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項６４に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項６６】
前記異種プロモーターが、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である、請求項６３に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項６７】
前記異種プロモーターが、誘導型プロモーターである、請求項６３に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項６８】
前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項６７に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項６９】
前記異種プロモーターが、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７０】
前記核酸が異種転写エンハンサー領域をさらに含む、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７１】
前記核酸が異種転写活性化領域をさらに含む、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７２】
前記核酸が遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む、請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７３】
前記コード鎖上の１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている、請求項６３〜７２のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７４】
前記１つ以上の制御因子が遺伝子組換えされている、請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７５】
前駆・幹細胞である、請求項６３〜７４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７６】
造血幹細胞である、請求項６３〜７５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７７】
ＣＤ４＋発現細胞である、請求項６３〜７６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７８】
ＣＤ８＋発現細胞である、請求項６３〜７６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項７９】
制御性Ｔ細胞である、請求項６３〜７８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞。
【請求項８０】
請求項６２〜７９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物。
【請求項８１】
対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項６２〜７９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞または請求項８０に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項８２】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象が、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項６２〜７９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞または請求項８０に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項８５】
対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項６２〜７９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細胞または請求項８０に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項８６】
対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、
自己免疫疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；
ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；
前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および
前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うこと
を含む方法。
【請求項８７】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象が、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；
ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；
前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および
前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うこと
を含む方法。
【請求項９０】
対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；
ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；
前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および
前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うこと
を含む方法。
【請求項９１】
前記細胞が前駆・幹細胞である、請求項８１〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項８１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞がＣＤ４＋発現細胞である、請求項８１〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞がＣＤ８＋発現細胞である、請求項８１〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項８１〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
自己免疫疾患を治療する方法および移植臓器に対する免疫寛容を誘導する方法について述べる。これらの方法は、重症自己免疫疾患および臓器移植のための細胞療法にも使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
末梢における免疫自己寛容は、免疫応答に対する様々な細胞によるネガティブ制御によって達成することができるが、このような機能を有する細胞の中でも、最も特徴的な細胞集団として制御性Ｔ細胞（Treg）が挙げられる。Tregは、エフェクターＴ細胞（Teff）の活性化を抑制し、抗炎症活性を発揮することによって、自己寛容と同種抗原に対する免疫寛容を媒介している。たとえば、CD4+CD25+Foxp3+Tregは、自己免疫疾患および臓器移植に関して最も詳しく研究および評価されているＴ細胞のうちの１種である。
【０００３】
Tregは「サプレッサーＴ細胞」としても知られている。特に、CD4+CD25+制御性Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボにおいて制御機能を発揮し、インビトロにおいてCD4+TeffおよびCD8+Teffの増殖を抑制することが報告されている。CD4+CD25+制御性Ｔ細胞は、自己免疫、アレルギー、炎症、胎児に対する母体の免疫寛容の維持、感染症およびがんにおいても重要な役割を果していることが示されている。さらに、Tregは免疫応答を抑制することが知られている。がんでは、Tregの過剰な細胞活性によって、免疫系によるがん細胞の破壊が阻害されることがある。また、自己免疫疾患では、制御性Ｔ細胞の活性が欠如していることから、自己免疫細胞が生体自身の組織を攻撃してしまう。
【０００４】
Treg細胞には、胸腺で発生する内在性（n）Tregと、末梢で発生する誘導性Treg（iTreg）とが含まれる。nTregは胸腺で発生し、フォークヘッド／ウィングドヘリックス転写因子（FOXP3）を発現することができ、この転写因子によってnTregの分化が制御される。一方、iTregは、末梢のメモリーCD4+TeffおよびナイーブCD4+Teffが、IL-4、IL-10、TGF-βおよびIL-2の存在下で自己抗原または異種抗原によって刺激されることにより発生する。
【０００５】
FOXP3は、免疫系の応答に関与するタンパク質であり、１１個のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子によってコードされる。改訂された命名法によれば、第１のコーディングエクソンはエクソン２と呼ばれる。FOXP3は、制御性Ｔ細胞の発生および機能において、制御性経路のマスター制御因子として機能することが明らかになっている。動物研究では、FOXP3を発現するTregが、自己寛容などの免疫寛容の移入において重要であることが示されている。さらに、FOXP3陽性細胞を誘導または投与すると、糖尿病モデル、多発性硬化症モデル、喘息モデル、炎症性腸疾患モデル、甲状腺炎モデルまたは腎臓病モデルにおいて自己免疫疾患の重症度が低下することが示されている。
【０００６】
疾患の治療のためにTregを使用すること、または臓器移植を行った場合に免疫系を抑制するためにTregを使用することが過去に提案されている。しかし、自己免疫疾患の治療法においてtTregまたはpTregを使用する際の最も重要な障壁の１つは、FOXP3発現がエピジェネティックな制御を受けることである。tTregでは、FOXP3遺伝子の「胸腺特異的脱メチル化領域」として知られている上流領域が完全に脱メチル化されており、これによって、FOXP3が安定に発現すると考えられている。通常、完全な脱メチル化はpTregでは観察されない。FOXP3は、炎症状態のpTregにおいてエピジェネティックにサイレンシングされていると考えられ、恐らくはtTregにおいてもエピジェネティックにサイレンシングされており（しかし、tTregは完全に安定であると考えている研究者もいる）、この結果、pTregが炎症促進性CD4+Ｔ細胞に変化する場合があると考えられている。炎症性の表現型に戻ってしまうpTregを点滴に使用すると、自己免疫疾患の症状を悪化させる可能性があるため、pTregの安定性の欠如は重大な問題である。したがって、TregにおいてFOXP3を誘導できる安全な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
制御性Ｔ細胞は、抗原特異的免疫寛容を誘導できる可能性があることから、制御性Ｔ細胞による自己免疫疾患の治療に興味を持っている研究グループは多い。制御性Ｔ細胞（「Treg」）には様々な形態があり、現在の命名法によれば、Ｔ細胞の発生過程において胸腺で生じる制御性Ｔ細胞（胸腺由来制御性Ｔ細胞または「tTreg」と呼ばれる）と、末梢で誘導される制御性Ｔ細胞（末梢由来制御性Ｔ細胞または「pTreg」と呼ばれる）とに分類される。
【０００８】
制御性Ｔ細胞の生態の重要な一面として、転写因子であるFOXP3の発現がある。FOXP3は、制御性Ｔ細胞系の分化の誘導に必要であると考えられている。この概念は、FOXP3を欠損したヒトでは新生児期に重症自己免疫疾患が発症するという観察に基づくものである。しかし、自己免疫疾患の治療法においてtTregまたはpTregを使用する際の最も重要な障壁は、FOXP3発現がエピジェネティックな制御を受けることである。tTregでは、FOXP3遺伝子の「胸腺特異的脱メチル化領域」として知られている上流領域が、完全に脱メチル化されており、これによって、FOXP3が安定に発現すると考えられている。通常、完全な脱メチル化はpTregでは観察されない。FOXP3は、炎症状態のpTregにおいてエピジェネティックにサイレンシングされていると考えられ、恐らくはtTregにおいてもエピジェネティックにサイレンシングされていると考えられる。この結果、pTregが炎症促進性CD4 Ｔ細胞に変化する場合があると考えられる。炎症性の表現型に戻ってしまうpTregを点滴に使用すると、自己免疫疾患の症状を悪化させる可能性があるため、pTregの安定性の欠如は重大な問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
バルクCD4 Ｔ細胞集団においてFOXP3の発現を増強するための、本明細書において提案された方法は、炎症性Ｔ細胞集団が持つTCRレパトアを制限することができることから、内在性制御性Ｔ細胞集団を単離する他の方法よりも優れている。自己免疫疾患の患者または臓器移植片の拒絶反応を起こした患者の炎症性Ｔ細胞集団の内在性TCRレパトアには、臓器中の炎症を起こした組織または外来組織を認識し、正確に結合する特異性を備えたTCRが見られる。このようなＴ細胞は、自己炎症反応または臓器拒絶を媒介すると考えられている。バルクCD4 Ｔ細胞集団の一部を制御性の表現型に変換することによって、炎症促進性集団中のTCR特異性を、治療効果のある細胞集団において利用することができる。この点において、本発明の方法は、胸腺由来制御性Ｔ細胞（炎症性Ｔ細胞と重複することのない異なるTCRレパトアを有すると考えられている）を利用した他の治療法よりも優れている。さらに、自己免疫疾患の患者または臓器拒絶を起こした患者では、恐らく、生体内のtTreg集団は、炎症の回避に必要な免疫寛容の誘導に失敗していると考えられる。
【００１０】
したがって、本明細書に記載の本発明の態様のいくつかは、内在性FOXP3遺伝子を安定に発現するように遺伝子組換えされたCD4 T細胞を使用して、自己免疫疾患を治療または緩和する方法に関する。本明細書に記載のアプローチのいくつかは遺伝子組換え技術を利用しており、たとえば、遺伝子組換えによりCD4 Ｔ細胞におけるFOXP3の発現を安定化させることによって、抑制機能に関与するエピジェネティックな修飾に感受性を示さなくなった抑制性Ｔ細胞の増殖集団を作製することを可能としている。このようにして得られた細胞は、治療に適用可能な特性が改善している。
【００１１】
第１の態様において、FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；ヌクレアーゼを提供すること；および前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記１つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する。いくつかの実施形態において、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターを挿入することにより、第１のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターは、前記コード鎖上の該第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の内在性の第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿���する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
【００１２】
第２の態様において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法で作製された、FOXP3を発現させるための核酸を提供する。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；ヌクレアーゼを提供すること；および前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記１つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する。いくつかの実施形態において、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターを挿入することにより、第１のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターは、前記コード鎖上の該第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の内在性の第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上���制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
【００１３】
第３の態様において、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部に作動可能に連結された異種制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に存在する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。
【００１４】
第４の態様において、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入す��か、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００１５】
第５の態様において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。遺伝子組換え細胞を作製する前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００１６】
第６の態様において、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００１７】
第７の態様において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。遺伝子組換え細胞を作製する前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロ���チンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００１８】
第８の態様において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。また、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。さらに、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記自己免���疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である。
【００１９】
第９の態様において、対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。また、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。さらに、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００２０】
第１０の態様において、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。また、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。さらに、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態���おいて、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００２１】
第１１の態様において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、自己免疫疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００２２】
第１２の態様において、対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００２３】
第１３の態様において、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】FOXP3はTreg系を促進する。図に示すように、ナイーブＴ細胞は、IL-12、IL-18、IFNγ、IL-6、TGF-β、IL-4およびIL-2を発現し、これらのサイトカインによって、TH1、TH17、TH2およびiTregが制御される。また、Tregは、様々な自己免疫疾患（IPEX、T1D、SLE、RA、EAEなど）において重要な役割を果たしている。ヒトTreg細胞の数またはその機能を増強するための様々なアプローチは、現在臨床試験段階にあり、たとえば、低用量のIL-2と増殖培養した自己由来Tregの養子移入とを組み合わせた治療法が臨床試験中である。IL-2療法は、その多面的活性と、炎症を増強しうる潜在的な「オフターゲット」効果を有することから、その有効性は限定的である。また、養子移入Treg療法も、増殖培養したTregはインビボでの安定性と生存能力に問題があり、治療に有用な抗原特異性が欠如していることから、恐らく限定的にしか利用できない。
【００２５】
【図２】Ｔ細胞編集ツールを示す。図に示すように、ヌクレアーゼおよび修復テンプレートを効率的に共送達できる既存の方法を利用して、本発明の様々な実施形態による方法を実施することができる。図に示すように、Ｔ細胞を活性化して増殖させる。CD3/CD28ビーズでＴ細胞を刺激した後、ビーズを除去する。次に、mRNAエレクトロポレーションによりTALENを送達する。遺伝子編集テンプレートはアデノ随伴ウイルスにより送達する。
【００２６】
【図３】遺伝子編集によるFOXP3発現の増強を示す。本発明の実施形態で述べるように、遺伝子編集によりFOXP3を発現させることで、エピジェネティックな制御をバイパスすることができる。FOXP3のコード領域の上流にプロモーターを安定かつ部位特異的に組み込んだ設計によって、従来の制御を無効化することができた。Foxp3の発現は、通常、第１のコーディングエクソン（エクソン２）の上流のイントロン領域（イントロン１）によるエピジェネティックな制御によって制御される。休止状態のナイーブＴ細胞では、FOXP3遺伝子座はエピジェネティックに「閉じた状態」である（FOXP3−）。胸腺に由来する内在性TregのFOXP3遺伝子座は「開いた状態」（FOXP3+）である。誘導性Treg（iTreg）のFOXP3遺伝子座は部分的に開いた状態である（FOXP3+；不安定）。
【００２７】
【図４】相同組換え修復ターゲティングによる安定なFOXP3+細胞の作製を示す。図に示すように、FOXP3遺伝子のエピジェネティックな制御部位は、FOXP3遺伝子の上流に位置する。安定なFOXP3+Ｔ細胞を作製するため、Ｔ細胞を提供し、まずCD3/CD28で活性化する。遺伝子編集テンプレートはアデノ随伴ウイルスにより送達し、ヌクレアーゼをコードするmRNAをＴ細胞に導入して遺伝子編集Ｔ細胞を作製する。
【００２８】
【図５】遺伝子編集テンプレートの設計は、非常に柔軟に行うことができる。図に示すように、５種の構築物、すなわち、GOXP3［GFP-ex2］、FOXP3［MND-GFP-ex2］、FOXP3［MND-EGFRt.t2A-ex2］、FOXP3［MND-IL10.t2A.GFP-ex2］およびFOXP3［del-intron1.GFP］を構築した。
【００２９】
【図６】遺伝子編集によるFOXP3遺伝子の効率的な標的化および導入外来遺伝子の高発現誘導を示す。図に示すように、MNDプロモーターの制御下で、内在性FOXP3遺伝子のＮ末端に融合したGFPを発現するように遺伝子組換えした細胞は、TALENヌクレアーゼを導入しなかったＴ細胞よりも、GFP-FOXP3融合タンパク質の発現量が多かった。
【００３０】
【図７】遺伝子編集細胞では、シームレスな相同組換えにより標的部位への組み込みが行われたことが示されている。図に示したプライマーセット（すなわち、図の赤色の矢印で示す位置に対応するプライマー）を使用してPCRを実施し、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的化された組み込みが正確に起こった場合、標的テンプレートの外側の１種のプライマー（プライマー１またはプライマー２）と内側の１種のプライマー（プライマー３またはプライマー４）とを使用したPCRを実施することによって、正確な大きさのバンドが示される。左側のゲル片は、mock遺伝子編集細胞において標的が組み込まれていないことを示し、右側のゲル片は、遺伝子編集細胞において正確な大きさのバンドが見られることを示す。
【００３１】
【図８】GFP/FOXP3融合遺伝子からは、Foxp3が一貫して高レベルに発現される。図に示すように、MNDプロモーターの制御下のGFP/FOXP3融合遺伝子は、mock遺伝子編集細胞と比べてFOXP3の発現を誘導した。FOXP3の発現についてmock遺伝子編集細胞と遺伝子編集細胞を比較したフローサイトメトリー解析を示す。FOXP3の発現をＹ軸に示し、前方散乱光をＸ軸に示す。
【００３２】
【図９】GFP/FOXP3融合遺伝子からは、Foxp3が一貫して高レベルに発現される。図に示すように、MNDプロモーターの制御下のGFP/FOXP3融合遺伝子は、mock遺伝子編集細胞と比べてFOXP3の発現を誘導した。FOXP3の発現およびGFPの発現についてmock遺伝子編集細胞と遺伝子編集細胞を比較したフローサイトメトリー解析を示す。各プロットにおいてFOXP3の発現をＹ軸に示し、GFPをＸ軸に示す。
【００３３】
【図１０】Treg細胞の表面マーカーの表現型とサイトカインの表現型を示す模式図を示す。
【００３４】
【図１１】遺伝子編集細胞の表面表現型を示す。図に示すように、フローサイトメトリーを使用して、FOXP3を安定に発現した遺伝子組換えＴ細胞におけるCD25、CD127、CTLA4およびLAG3の発現を分析した。内在性制御性Ｔ細胞と同様に、遺伝子組換え細胞は、CD25を高発現し、CD127を低発現し、CTLA4およびLag3を高発現する。
【００３５】
【図１２】遺伝子編集細胞のサイトカイン発現プロファイルを示す。図に示すように、mock遺伝子編集Ｔ細胞と比較して、遺伝子組換え細胞は、Tregと同様に、IL-2、IL-4およびIFN-γの低発現を示す細胞内サイトカイン発現プロファイルを示す。
【００３６】
【図１３】遺伝子編集細胞のサイトカイン発現プロファイルを示す。棒グラフに示すように、FOXP3を安定に発現する遺伝子組換えＴ細胞は、mock遺伝子編集細胞と比べて、IL-10の発現量が高かった。
【００３７】
【図１４】IL-2/STAT5シグナル伝達の感受性を示す。内在性Tregは、CD25を高発現していることから、IL-2に対して非常に高い感受性を有する。mock遺伝子編集細胞および遺伝子編集細胞を、インビトロにおいて様々な濃度のIL-2に暴露することによって、IL-2のシグナル伝達に対する感受性を比較した。IL-2に対する応答は、STAT5のリン酸化の程度によって測定した。図に示すように、遺伝子編集細胞は、mock遺伝子編集細胞よりも大幅に低いIL-2濃度でstat5がリン酸化され、IL-2のシグナル伝達が起こったことが示された。各グラフのプロファイルは、上パネルから下パネルの順に、0.1ng/ml IL-2、1ng/ml IL-2、10ng/ml IL-2、100ng/ml IL-2、および刺激なしである。
【００３８】
【図１５】IL-2/STAT5シグナル伝達の感受性（FOXP3+サブセット）を示す。内在性Tregは、CD25を高発現していることから、IL-2に対して非常に高い感受性を有する。mock遺伝子編集細胞および遺伝子編集細胞を、インビトロにおいて様々な濃度のIL-2に暴露することによって、IL-2のシグナル伝達に対する感受性を比較した。IL-2に対する応答は、STAT5のリン酸化の程度によって測定した。図に示すように、遺伝子編集細胞は、mock遺伝子編集細胞よりも大幅に低いIL-2濃度でstat5がリン酸化され、IL-2のシグナル伝達が起こったことが示された。各グラフのプロファイルは、上パネルから下パネルの順に、0.1ng/ml IL-2、1ng/ml IL-2、10ng/ml IL-2、100ng/ml IL-2、および刺激なしである。
【００３９】
【図１６】制御性Ｔ細胞の抑制活性を測定するためのアッセイの概要を示す。CFSEで標識した応答細胞を、遺伝子編集Tregまたはmock遺伝子編集細胞と混合し、ビーズで刺激する。９６時間後のCFSEの希釈度からアッセイの結果を読み取る。
【００４０】
【図１７】遺伝子編集Ｔ細胞がTeffの増殖を抑制することができることを示す。mock遺伝子編集細胞と共にインキュベートした応答細胞は、細胞増殖によりCFSE標識を実質的に希釈することができたが、遺伝子組換えGFP+細胞と共にインキュベートした応答細胞は、その大部分が細胞分裂しなかった（標識色素は高濃度のまま変化しなかった）。
【００４１】
【図１８】遺伝子編集細胞の機能活性を示し、IPEX症候群を有する対象から得たＴ細胞を遺伝子編集して使用すると、Teffの増殖が抑制されないことを示す。図１７と同じアッセイを使用し、正常患者コントロール細胞またはIPEX症候群患者由来細胞を、mock遺伝子編集するか、または遺伝子編集して内在性FOXP3遺伝子の発現を増強した。遺伝子編集した健常者コントロール細胞を応答細胞と共にインキュベートしたところ、mock遺伝子編集細胞と比べて応答細胞によるCFSEの希釈が抑制されたが、遺伝子編集したIPEX症候群患者由来細胞を応答細胞と共にインキュベートすると、mock遺伝子編集細胞と比べて細胞増殖の抑制は認められなかった。
【００４２】
【図１９】FOXP3遺伝子編集による抗原特異的Treg表現型細胞の作製を示す。図に示すように、本発明の編集技術は、様々な自己免疫疾患において発生する病原性Ｔ細胞クローンにも適用することができる。インフルエンザ抗原に特異的なテトラマーを使用して単離したＴ細胞クローンを遺伝子編集したところ、FOXP3を安定に発現するＴ細胞を得ることに成功した。
【００４３】
【図２０】遺伝子編集Ｔ細胞の表現型を示す。図に示すように、FOXP3を安定に発現するＴ細胞は、CTLA4およびLAG3を発現していた。
【００４４】
【図２１】GFP-FOXP3発現遺伝子編集Ｔ細胞の表現型および機能を示す。図に示すように、FOXP3を安定に発現するＴ細胞は、表現型の変化（CD25+、CD45RO+、CCR7およびCD38/CTLA-4/LAP）を示した。また、このFOXP3安定発現Ｔ細胞は、Tregと同様の細胞内サイトカイン発現プロファイル（IL-2、IFN-γおよびIL-4）を示す。さらに、10ng〜100ngのIL-2を投与したところ、pSTAT5シグナル伝達はIL-2に感受性を示した。
【００４５】
【図２２】インビボGvHD実験を示す。インビボGvHD実験を実施するためのスケジュールを図に示す。まず、マウスに放射線を照射し、骨髄細胞を破壊する。次に、FOXP3を安定に発現する遺伝子組換えTregをマウスに輸注し、次いでTeff細胞を輸注する。輸注の１〜５０日後に、マウスの体重をモニタリングし、末梢血および様々な臓器におけるＴ細胞の割合（％）を調べる。
【００４６】
【図２３】インビボGvHD実験を示す。エフェクター細胞（ET）（赤色の丸印）、エフェクター細胞とmock遺伝子編集Ｔ細胞（青色の正方形）、またはエフェクター細胞とFOXP3安定発現遺伝子編集Treg（緑色の三角形）を投与したマウスの生存率（％）を図に示す。foxp3安定発現遺伝子編集Tregは、顕著な生存率の延長を示し、エフェクター細胞によって引き起こされた異種GvHDを緩和する能力を有することが示された。
【００４７】
【図２４】遺伝子編集Ｔ細胞の胸腺特異的脱メチル化領域（TSDR）におけるCpGメチル化を示す。FOXP3遺伝子が、どのようにして第１のコーディングエクソン（エクソン２）の上流の制御領域のメチル化によって制御されるのかを示す概略図である。
【００４８】
【図２５】メチル化についてのクローンの分析を示す。黒色の各ドットは、Ｔ細胞クローンのTSDR全体にわたってメチル化CpGジヌクレオチドが見られたPCR断片クローンを示す。図から分かるように、CD25陰性細胞は、TSDRが高度にメチル化しており、FOXP3遺伝子座が閉じられており、不活性であり、発現されていないことが示されているが、CD25高発現細胞（内在性Treg）では、TSDRがほぼ完全に均一に脱メチル化されていることが示されている。
【００４９】
【図２６】遺伝子編集Ｔ細胞におけるTSDRのメチル化を示す。TSDRが完全にメチル化されると、FOXP3が高発現されることが知られているが、遺伝子編集Ｔ細胞では、TSDRが完全にメチル化されたことが示され、このことから、TSDRの下流にプロモーターを組み込むことによって、FOXP3遺伝子座における通常のエピジェネティックな制御を効果的にバイパスできることが示された。
【００５０】
【発明を実施するための形態】
【００５１】
内在性FOXP3遺伝子を安定に発現するように遺伝子組換えされたCD4 Ｔ細胞を使用して、自己免疫疾患を治療または緩和する方法のいくつかについて本明細書で述べる。これらの方法は、移植片対宿主病（GVHD）の副作用を緩和するために使用することもできる。
【００５２】
用語の定義
本明細書において「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られた断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、エキソヌクレアーゼ作用および合成のいずれかにより得られた断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNA、RNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合またはホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
【００５３】
本明細書において「コード鎖」は、産生されるRNA転写物と同じ塩基配列を有するDNA鎖である（ただし、チミンはウラシルで置換される）。コード鎖はコドンを含み、非コード鎖はアンチコドンを含む。
【００５４】
本明細書において「制御因子」は、生物体内において特定の遺伝子の発現を増加または減少させることが可能な核酸分子のセグメントを指す。遺伝子発現の制御は、あらゆる生物およびウイルスの基本的な機能である。制御因子としては、CAATボックス、CCAATボックス、プリブノーボックス、TATAボックス、SECISエレメント、mRNAポリアデニル化シグナル、Ａボックス、Ｚボックス、Ｃボックス、Ｅボックス、Ｇボックス、インスリン遺伝子制御配列などのホルモン応答エレメント、DNA結合領域、活性化領域および／またはエンハンサー領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書において「FOXP3」は、免疫系の応答に関与するタンパク質である。FOXP3遺伝子は１１個のコーディングエクソンを含んでいる。Foxp3は、内在性制御性Ｔ細胞（nTreg（Ｔ細胞系））および養子移入／誘導性制御性Ｔ細胞（a/iTreg）の特異的マーカーである。動物研究では、Foxp3陽性Ｔ細胞を誘導または投与すると、糖尿病モデル、多発性硬化症モデル、喘息モデル、炎症性腸疾患モデル、甲状腺炎モデルまたは腎臓病モデルにおいて疾患（自己免疫疾患）の重症度が顕著に低下することが示されている。しかし、過去の研究ではＴ細胞は可塑性を示すことが報告されている。したがって、患者に移入された制御性Ｔ細胞は、制御性細胞ではなく炎症促進性のヘルパーT17（Th17）細胞に変化する可能性があるため、制御性Ｔ細胞の治療への使用にはリスクがある。これを踏まえ、制御性細胞から炎症促進性細胞への変化に起因するリスクを回避するための方法を本明細書において提供する。図１に示すように、iTregから発現されたFOXP3は、免疫系のマスター制御因子として利用されるとともに、免疫寛容および免疫抑制にも利用される。また、Tregは、様々な自己免疫疾患（IPEX、T1D、SLE、RA、EAEなど）において重要な役割を果たしている。ヒトTreg細胞の数またはその機能を増強するための様々なアプローチは、現在臨床試験段階にあり、たとえば、低用量のIL-2と増殖培養した自己由来Tregの養子移入とを組み合わせた治療法が臨床試験中である。IL-2療法は、その多面的活性と、炎症を増強しうる潜在的な「オフターゲット」効果を有することから、その有効性は限定的である。また、養子移入Treg療法も、増殖培養したTregはインビボでの安定性と生存能力に問題があり、治療に有用な抗原特異性が欠如していることから、恐らく限定的にしか利用できない。
【００５６】
本明細書において「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断することができるタンパク質または酵素である。本明細書に記載のヌクレアーゼは「遺伝子編集」に使用される。遺伝子編集とは、１種類のヌクレアーゼもしくは遺伝子組換えヌクレアーゼまたは複数の種類のヌクレアーゼを使用して、生物のゲノムにおいてDNAの挿入、欠失または置換を行う遺伝子工学技術の１種である。ヌクレアーゼとしては、CRISPR/CAS9システムで使用されるヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびTALENヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼは、遺伝子座または核酸配列中の標的遺伝子座を標的化するために使用することができる。
【００５７】
本明細書において「コーディングエクソン」は、RNAスプライシングによってイントロンが除去された後の遺伝子により産生される最終的な成熟RNAの一部をコードする遺伝子の一部を指す。「エクソン」は、遺伝子内のDNA配列と、これに対応するRNA転写物配列の両方を指す。RNAスプライシングによってイントロンが除去され、残されたエクソン同士が互いに共有結合で連結し、成熟メッセンジャーRNAの一部を構成する。
【００５８】
本明細書において「Cas9」は、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）獲得免疫系と関連したRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素である。
【００５９】
本明細書において「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインとDNA分解ドメインを融合させることにより作製された人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望とする特定のDNA配列を標的とするように改変することができ、これによって、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、複雑なゲノム内のユニークな配列を標的とすることが可能となる。
【００６０】
本明細書において「TALEN」すなわち「transcription activator-like effector nuclease」は、特定のDNA配列を切断するように改変することができる制限酵素である。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインを、DNA分解ドメイン（DNA鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。transcription activator-like effector（TALE）は、事実上、所望とするあらゆるDNA配列に結合するように改変することができることから、ヌクレアーゼと組み合わせることによって、特定の位置でDNAを切断することができる。制限酵素は、インサイチューで遺伝子編集またはゲノム編集を行うことを目的として細胞に導入することができ、この技術は、遺伝子組換えヌクレアーゼを使用したゲノム編集技術として知られている。TALENは、ジンクフィンガーヌクレアーゼやCRISPR/Cas9と並んで、ゲノム編集分野における卓越したツールの１つである。
【００６１】
本明細書において「ノックイン」は、遺伝子座内の野生型コピーを持つDNA配列情報を１対１で置換したり、遺伝子座内に存在しない配列情報を挿入したりするための遺伝子工学的方法を指す。
【００６２】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に存在し、構造遺伝子の転写開始点の近傍に位置する。転写を開始させるプロモーター配列のエレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始させるDNA領域である。プロモーターは、同じDNA鎖内の上流（センス鎖の５’領域方向）の遺伝子転写開始部位の近傍に位置する。プロモーターの長さは、約100塩基対、約200塩基対、約300塩基対、約400塩基対、約500塩基対、約600塩基対、約700塩基対、約800塩基対もしくは約1000塩基対、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲内の長さである。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制可能なプロモーター、誘導可能なプロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導可能なプロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による制御を受けない。抑制可能なプロモーターも公知である。プロモーターの例としては、構成的プロモーター、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）、または誘導型プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、プロモーターの例として、EF1αプロモーター、PGKプロモーター、MNDプロモーター、KIプロモーター、Ki-67遺伝子プロモーター、ならびに／またはタモキシフェンおよび／もしくはその代謝産物などの薬物によって誘導可能なプロモーターが挙げられる。一般的に使用される構成的プロモーターとしては、哺乳動物系において使用されるSV40、CMV、UBC、EF1A、PGKおよび／またはCAGGが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
弱いプロモーターと強いプロモーターによって同じコード配列を発現させた場合、弱いプロモーターは、強いプロモーターよりもmRNAの発現が低くなる。これは、たとえば、アガロースゲルで分析することによって比較することができる。近接するクロマチンによる制御を受けるプロモーターの一例としては、短いEF1αプロモーターが挙げられ、このプロモーターは、いくつかの遺伝子座において非常に活性であるが、その他の遺伝子座においてはほぼ不活性である（Eyquem, Biotechnol Bioeng. 2013 Aug;110(8):2225-35. doi: 10.1002/bit.24892.）。
【００６４】
本明細書において「転写エンハンサー領域」は、タンパク質（アクチベーター）が結合することができる短いDNA領域（50〜1500bp）であり、アクチベーターが転写エンハンサー領域に結合することによって特定の遺伝子の転写が起こる可能性やその転写量を高めたり、促進したり、増強させたりすることができる。このようなアクチベータータンパク質は、通常、転写因子と呼ばれる。エンハンサーは、通常、シス作用性であり、標的遺伝子から最大で１Ｍｂｐ（1,000,000bp）離れて位置し、転写開始部位の上流または下流に存在し、順方向または逆方向である。エンハンサーは、制御対象の遺伝子の上流または下流に位置していてもよい。いくつかの実施形態において、転写量を増加させるために複数のエンハンサー領域を使用してもよく、たとえば、多量体化した活性化結合ドメインを使用して、転写量をさらに増強または増加させることができる。さらに、エンハンサーは、転写開始部位から数十万塩基対離れた上流または下流に位置することが何人かの研究者によって見出されたことから、転写に影響を与えるためにエンハンサーを転写開始部位の近傍に置く必要はない。エンハンサーは、プロモーター領域自体には作用しないが、アクチベータータンパク質と結合する。アクチベータータンパク質は、メディエーター複合体と相互作用し、ポリメラーゼIIおよび基本転写因子を動員し、遺伝子の転写を開始する。エンハンサーもイントロン内に存在しうる。エンハンサーの方向は、逆方向であってもよく、逆方向であることによってその機能は影響を受けない。さらに、エンハンサーは、切断されてもよく、染色体の任意の位置に挿入されてもよく、このような処理を行っても遺伝子の転写に効果を発揮することができる。いくつかの実施形態において、FOXP3遺伝子の転写を阻止する抑制機構をサイレンシングするためにエンハンサーを使用する。エンハンサー結合領域の一例として、TCRαエンハンサーが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のエンハンサー領域は、TCRαエンハンサーである。いくつかの実施形態において、エンハンサー結合領域をプロモーターの上流に配置し、これによってプロモーターを活性化して、タンパク質の転写を増加させる。いくつかの実施形態において、エンハンサー結合領域をプロモーターの上流に配置し、これによってプロモーターを活性化して、FOXP3遺伝子の転写を増加させる。
【００６５】
本明細書において「転写活性化因子領域」または「転写活性化領域」は、転写因子が結合することができる特定のDNA配列を指し、転写因子が転写活性化領域に結合することによって、DNAからメッセンジャーRNAへの遺伝子情報の転写の速度を制御することができる。転写因子の具体例としては、SP1、AP1、C/EBP、熱ショック因子、ATF/CREB、c-Myc、Oct-1およびNF-1が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アクチベーター領域を利用して、FOXP3遺伝子の転写を阻止する抑制機構をサイレンシングする。
【００６６】
本明細書において「遍在性クロマチンオープニングエレメント」（UCOE）は、ハウスキーピング遺伝子由来の非メチル化CpGアイランドに存在し双方向に転写されるデュアルプロモーターを特徴とするエレメントを指す。UCOEは、細胞株、多能性造血幹細胞、PSC、これらから分化した子孫細胞などの様々な細胞モデルにおいて、導入外来遺伝子のサイレンシングを阻止し、かつ発現を維持するための有望なツールである。また、本明細書に記載の「作動可能に連結される」は、制御配列と異種核酸配列との間の機能的な連結を指し、これは該異種核酸配列の発現を可能とする。
【００６７】
本明細書において「自己免疫疾患」は、免疫系の活性が異常に低くなっているか、あるいは免疫系が過剰に活性化されている状態を指す。免疫系が過剰に活性化されている場合、自己組織が攻撃され、損傷を受ける（自己免疫疾患）。免疫不全疾患では、侵入物に対する生体の攻撃力が弱まるため、感染に対して抵抗性が低くなる。自己免疫障害または自己免疫疾患としては、たとえば、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群および／または毛細血管拡張性運動失調症が挙げられるが、これらに限定されない。免疫疾患は、たとえば、患者の血清または脳脊髄液において神経特異的自己抗体またはその他のバイオマーカーが検出された場合、これらの神経特異的自己抗体またはその他のバイオマーカーのプロファイルを調べることによって分析することができる。本発明の様々な実施形態により提供される方法のいくつかにおいて、該方法は、自己免疫障害を治療、緩和または抑制するための方法である。いくつかの実施形態において、前記自己免疫障害は、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群および／または毛細血管拡張性運動失調症である。
【００６８】
本明細書において「臓器移植」は、１つの体から別の体へと臓器を移動させたり、患者自身の体内のドナー部位から別の部位に臓器を移動させることによって、レシピエントの損傷臓器を置き換えたり、レシピエントの体内に存在しない臓器を移すことを指す。同一人物の体内における臓器および／または組織の移植は自家移植と呼ばれる。近年実施されているような、同じ生物種に属する２つの対象間での移植は同種移植と呼ばれる。同種移植では、生体または死体から得た臓器または組織が移植される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法を提供する。
【００６９】
移植可能な臓器としては、たとえば、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸管および胸腺が挙げられる。移植可能な組織としては、たとえば、骨および腱（これらを筋骨格移植片と呼ぶ）、角膜、皮膚、心臓弁、神経ならびに静脈が挙げられる。腎臓、肝臓および心臓は、最も一般的に移植が行われている臓器である。角膜および筋骨格移植片は、最も一般的に移植が行われている組織である。
【００７０】
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、前記対象は、本発明の実施形態に記載の遺伝子組換え細胞を使用した抑制、緩和または治療を実施すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗炎症薬または抗拒絶反応薬に対して副作用を起こしている。したがって、本発明の様々な実施形態により提供される細胞または組成物を、前記選択された対象に提供する。抗拒絶反応薬の副作用としては、他の薬物との相互作用による血中タクロリムス量の上昇または低下、腎毒性、高血圧、神経毒性（振戦、頭痛、刺痛および不眠）、糖尿病（高血糖）、下痢、悪心、脱毛および／または高カリウム血症が挙げられる。したがって、本明細書に記載の治療方法、抑制方法または緩和方法を実施するために前記患者を選択する。
【００７２】
本明細書において「臓器拒絶」または「移植拒絶反応」は、レシピエントの免疫系によって移植組織が拒絶されて、該移植組織が破壊されることを指す。
【００７３】
本明細書において「移植片対宿主病」（GVHD）は、遺伝学的に異なるヒトからの組織移植を受けた後に起こる医学的合併症を指す。GvHDは、幹細胞移植または骨髄移植に付随して起こることが多いが、GvHDという用語は、その他の形態の移植組織片による合併症を指す場合にも使用される。ドナーから提供された組織中の免疫細胞は、レシピエントを「自己」ではなく異物として認識する。本発明の実施形態のいくつかにおいて、本発明の方法は、GVHDに起因する合併症を予防または緩和するために使用することができる。
【００７４】
本明細書において「医薬賦形剤」は、細胞を添加して組成物を得るための不活性物質である。
【００７５】
本明細書において「キメラ抗原受容体」（CAR）は、キメラＴ細胞受容体としても知られており、人工Ｔ細胞受容体または遺伝子組換え受容体を指し、エフェクター免疫細胞に所望の特異性を移植することができる。キメラ抗原受容体を使用して、たとえば、モノクローナル抗体またはその結合部分の特異性をＴ細胞に移植することができる。本発明の実施形態のいくつかにおいて、本発明の遺伝子組換え細胞は、キメラ抗原受容体をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞上の分子に特異的である。Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子組換え細胞またはキメラ抗原受容体を使用して、FOXP3の発現を必要とする特定の組織を標的化することができる。本発明の実施形態のいくつかにおいて、特定の組織を標的化することによってFOXP3を提供および送達する方法を含む。いくつかの実施形態において、前記組織は移植組織である。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、移植組織上の標的分子に特異的である。
【００７６】
本明細書で述べるように、本発明の遺伝子組換え細胞は、FOXP3を発現するように遺伝子組換えされた細胞であり、したがって、本発明の実施形態において、これらの細胞を「Treg表現型」細胞とも呼ぶ。
【００７７】
発明の詳細な説明
制御性Ｔ細胞は、抗原特異的免疫寛容を誘導できる可能性があることから、制御性Ｔ細胞による自己免疫疾患の治療に興味を持っている研究グループは多い。制御性Ｔ細胞（「Treg」）には様々な形態があり、現在の命名法によれば、Ｔ細胞の発生過程において胸腺で生じる制御性Ｔ細胞（胸腺由来制御性Ｔ細胞または「tTreg」と呼ばれる）と、末梢で誘導される制御性Ｔ細胞（末梢由来制御性Ｔ細胞または「pTreg」と呼ばれる）とに分類される。
【００７８】
制御性Ｔ細胞の生態において重要な一面として、転写因子であるFOXP3の発現がある。FOXP3は、制御性Ｔ細胞系の分化の誘導に必要であると考えられている。この概念は、FOXP3を欠損したヒトでは新生児期に重症自己免疫疾患が発症するという観察に基づくものである。自己免疫疾患の治療法においてtTregまたはpTregを使用する際の最も重要な障壁の１つは、FOXP3発現がエピジェネティックな制御を受けることである。tTregでは、FOXP3遺伝子の「胸腺特異的脱メチル化領域」として知られている上流領域が、完全に脱メチル化されており、これによって、FOXP3が安定に発現すると考えられている。通常、完全な脱メチル化はpTregでは観察されない。炎症状態では、FOXP3は、pTregにおいてエピジェネティックにサイレンシングされていると考えられ、恐らくはtTregにおいてもエピジェネティックにサイレンシングされていると見られ（しかし、tTregは完全に安定であると考えている研究者もいる）、この結果、pTregが炎症促進性CD4+Ｔ細胞に変化する場合があると考えられる。炎症性の表現型に戻ってしまうpTregを点滴に使用すると、自己免疫疾患の症状を悪化させる可能性があるため、pTregの安定性の欠如は重大な問題である。
【００７９】
遺伝子組換え技術によりCD4 Ｔ細胞におけるFOXP3の発現を安定化させることによって、抑制機能に関与するエピジェネティックな修飾に感受性を示さなくなった抑制性Ｔ細胞の増殖集団を作製することが可能であることを本明細書において実証する。このようにして得られた細胞は、治療に適用可能な特性が改善していると考えられる。
【００８０】
本明細書に記載の実施形態において、遺伝子編集ヌクレアーゼを使用してFOXP3遺伝子座の制御因子を改変することによりFOXP3を安定に発現させて、FOXP3を安定に発現する治療用細胞を作製する。本明細書において提供した代表的なデータでは、FOXP3のコーディングエクソンの上流に構成的プロモーター（構成的プロモーターの例としては、EF1αプロモーター、PGKプロモーターおよび／またはMNDプロモーターなどが挙げられる）を配置してFOXP3の発現を誘導したが、その他の様々なアプローチを使用して制御因子を改変することにより、FOXP3を安定に発現させることも可能であると想定される。いくつかのアプローチを使用して内在性制御因子を改変することによって、本発明の治療用細胞において内在性FOXP3遺伝子を構成的に発現させることができ、この結果、FOXP3遺伝子のサイレンシングや非抑制性細胞表現型への転換を引き起こす制御に対して感受性を示さなくなる。したがって、本発明の様々な実施形態による方法では、内在性制御配列および内在性プロモーターに対するエピジェネティックな作用によってFOXP3の発現が欠失するという問題が解決されている。
【００８１】
バルクCD4 Ｔ細胞集団においてFOXP3の発現を増強するための、本明細書において提案された方法は、炎症性Ｔ細胞集団が持つTCRレパトアを制限する手段を提供することができることから、内在性制御性Ｔ細胞集団を単離する他の方法よりも優れている。自己免疫疾患の患者または臓器移植片の拒絶反応を起こした患者の炎症性Ｔ細胞集団の内在性TCRレパトアには、臓器中の炎症を起こした組織または外来組織を認識し、正確に結合する特異性を備えたTCRが見られる。このようなＴ細胞は、自己炎症反応または臓器拒絶を媒介すると考えられている。バルクCD4 Ｔ細胞集団の一部を制御性の表現型に変換することによって、炎症促進性集団中のTCR特異性を、治療効果のある細胞集団において利用することができる。この点において、本発明の方法は、胸腺由来制御性Ｔ細胞（炎症性Ｔ細胞とは重複することのない異なるTCRレパトアを有すると考えられている）を利用した他の治療法よりも優れている。さらに、自己免疫疾患の患者または臓器拒絶を起こした患者では、恐らく、生体内のtTreg集団は、炎症の回避に必要な免疫寛容の誘導に失敗していると考えられる。本明細書に記載の方法は、自己免疫疾患の治療、および移植臓器に対する免疫寛容の誘導に使用することができる。
【００８２】
顕著な欠点としては、FOXP3遺伝子座において効率的に組換えを行うことができる遺伝子編集ツールを使用する必要があることが挙げられる。本明細書で提供する方法では、TALENヌクレアーゼを使用してこの反応を効率的に行うことができることを示したが、原則として、どのようなヌクレアーゼプラットフォームであっても同様かつ良好に組換えを行うことができると考えられる。
【００８３】
制御性Ｔ細胞療法は、移植および自己免疫疾患において免疫寛容を誘導するために使用することができる。現在、Treg輸液はエクスビボで増殖培養されている。第１相試験では、１型糖尿病（T1D）に対して限定的な有効性しか認められていないが、移植後のGvHDに対してベネフィットが認められたケースもいくつかあった。いくつかの実施形態において、次世代の遺伝子組換え制御性Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）によって指向性を付与した内在性Tregであってもよい。FOXP3を発現させることによって、エフェクターＴ細胞をTregに変換することもできる。
【００８４】
しかし、治療方法で使用する場合、遺伝子組換えTregと内在性Tregでは、なんらかの差異があると考えられる。内在性Treg療法は安全であると考えられてきたが、内在性Tregの数が少なすぎるため、自己免疫を引き起こしてしまう。また、Tregは、様々な自己免疫疾患（IPEX、T1D、SLE、RA、EAEなど）において重要な役割を果たしている。ヒトTreg細胞の数またはその機能を増強するための様々なアプローチは、現在臨床試験段階にあり、たとえば、低用量のIL-2と増殖培養した自己由来Tregの養子移入とを組み合わせた治療法が臨床試験中である。IL-2療法は、その多面的活性と、炎症を増強しうる潜在的な「オフターゲット」効果を有することから、その有効性は限定的である。また、養子移入Treg療法も、増殖培養したTregはインビボでの安定性と生存能力に問題があり、治療に有用な抗原特異性が欠如していることから、恐らく限定的にしか利用できない。
【００８５】
内在性Treg（nTreg）の使用には潜在的な欠点もある。たとえば、自己免疫疾患患者は、Tregが不安定であるという遺伝的素因を有する。たとえば、CAR発現nTregからCAR発現エフェクターＴ細胞への変換が起こりうる。さらに、nTregでは、FOXP3がエピジェネティックな制御を受けることから、FOXP3の誘導がダウンレギュレートされることがあり、これは、nTregの機能または細胞数を完全に予測することはできないことを意味する。さらに、内在性Tregは、TCR（Ｔ細胞受容体）に対する正確な特異性を有していない場合がある。Tregの機能は選択マーカーとも関連しており、増殖した内在性Treg細胞集団には、炎症性細胞が常に混在していると考えられる。したがって、本明細書において提供する方法は、CARの発現と制御性Ｔ細胞の機能と組み合わせることによって、炎症促進性CAR Ｔ細胞に変換する能力を備えたCAR Tregが移入されてしまうことを回避できることから、遺伝子組換え細胞を使用しているという点において、内在性Tregの移入よりも優れている。
【００８６】
Ｔ細胞の遺伝子編集により、特定のタンパク質を発現するＴ細胞を作製するツールはよく知られている（たとえば図２を参照されたい）。たとえば、Ｔ細胞を活性化して増殖させ、mRNAエレクトロポレーションによりTALENを送達し、アデノ随伴ウイルスを送達してテンプレートを編集することができる（高いMOIでの一過性発現、すなわち組換えAAVは組み込まれない）。
【００８７】
次に、遺伝子編集プロセスにより、第１のコーディングエクソンの上流かつエピジェネティックな制御機構によって制御される内在性制御因子の下流にプロモーターを挿入することによって、FOXP3を発現させることができる。第１のプロモーターの上流に別のプロモーターを挿入することによる発現制御は、過去に報告されておらず、FOXP3を構成的にアップレギュレートすることができ、このアップレギュレーションは、エピジェネティックな制御によってダウンレギュレートされないという驚くべき結果が得られた。図３に、FOXP3遺伝子へのプロモーター（MNDプロモーターなど）の挿入を示す。図に示すように、Foxp3の発現は、通常、第１のコーディングエクソンの上流のイントロン領域（イントロン１）によるエピジェネティックな制御によって制御される。
【００８８】
図４に示すように、相同組換え修復ターゲティングを利用して安定なFOXP3+Ｔ細胞を作製することができ、強い構成的発現が得られる。図５は、本明細書に記載の実施形態において使用した遺伝子構築物のテンプレートを示す。
【００８９】
さらに、FOXP3の発現を制御する方法も提供する。いくつかの実施形態において、FOXP3のコーディングエクソンの上流に挿入されるプロモーターは、誘導型受容体である。いくつかの実施形態において、本発明のシステムは合成転写制御因子を使用し、該合成転写制御因子が、タモキシフェンの存在下において導入外来遺伝子の上流の合成プロモーターに結合し、FOXP3の発現を誘導する。タモキシフェンの存在下では、TamR-tfが7xHBD/EF1αpプロモーターに結合することによって導入外来遺伝子の発現が「オン」の状態になる。いくつかの実施形態において、この転写制御因子は、導入外来遺伝子の発現を様々なレベルで制御できるように改変される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）もしくはTCR（Ｔ細胞受容体）またはその他の標的指向性部分を発現するようにさらに遺伝子組換えすることができる。また、本発明の細胞は、特定の組織または細胞を標的化するCARを発現するように遺伝子組換えすることもできる。いくつかの実施形態において、前記CARはリガンド結合領域を含み、該リガンドは、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、または標的細胞集団上で発現される別の分子である。いくつかの実施形態において、標的組織は、FOXP3を低発現している組織である。Ｔ細胞上にCARまたはTCRを発現させることによって、FOXP3発現細胞の送達を必要とする特定の組織部位に該Ｔ細胞を標的化することができると考えられる。
【００９１】
実施形態１：遺伝子編集によるFOXP3遺伝子の効率的な標的化および導入外来遺伝子の高発現誘導
図６に示すように、MNDプロモーターの制御下で、内在性FOXP3遺伝子のＮ末端に融合したGFPを発現するように遺伝子組換えした細胞は、TALENヌクレアーゼを導入しなかったＴ細胞よりも、GFP-FOXP3融合タンパク質の発現量が多かった。図７に示すように、遺伝子編集細胞では、シームレスな相同組換えにより標的部位への組み込みが行われたことが示されている。図７に示した実験では、図に示したプライマーセット（すなわち、図の赤色の矢印で示す位置に対応するプライマー）を使用してPCRを実施し、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的化された組み込みが正確に起こった場合、標的テンプレートの外側の１種のプライマー（プライマー１またはプライマー２）と内側の１種のプライマー（プライマー３またはプライマー４）とを使用したPCRを実施することによって、正確な大きさのバンドが示される。左側のゲル片は、mock遺伝子編集細胞において標的が組み込まれていないことを示し、右側のゲル片は、遺伝子編集細胞において正確な大きさのバンドが見られることを示す。
【００９２】
GFP/FOXP3融合遺伝子からは、Foxp3が一貫して高レベルに発現される。図に示すように、MNDプロモーターの制御下のGFP/FOXP3融合遺伝子は、mock遺伝子編集細胞と比べてFOXP3の発現を誘導した。FOXP3の発現についてmock遺伝子編集細胞と遺伝子編集細胞を比較したフローサイトメトリー解析を示す。FOXP3の発現をＹ軸に示し、前方散乱光をＸ軸に示す（図８）。
【００９３】
GFP/FOXP3融合遺伝子からは、Foxp3が一貫して高レベルに発現される。図９に示すように、MNDプロモーターの制御下のGFP/FOXP3融合遺伝子は、mock遺伝子編集細胞と比べてFOXP3の発現を誘導した。FOXP3の発現およびGFPの発現についてmock遺伝子編集細胞と遺伝子編集細胞を比較したフローサイトメトリー解析を示す。各プロットにおいてFOXP3の発現をＹ軸に示し、GFPをＸ軸に示す（図９を参照されたい）。
【００９４】
これらの代表的な実施形態の実験で示したように、遺伝子編集によりFOXP3遺伝子を効率的に標的化することができ、導入外来遺伝子の高発現を誘導することができる。
【００９５】
本実施形態に示した実験はインビトロで行われるため、インビボ試験、細胞または対象においても、FOXP3の発現を同程度に高レベルで維持することができると予測するのは難しい。したがって、治療に使用する細胞が対象において維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、対象において該細胞をモニタリングする必要がある。遺伝子組換え細胞を対象に投与した後に、該対象において該遺伝子組換え細胞を試験する方法は、当業者によく知られている。たとえば、Adaptive Biotech Technology社に委託可能な商用技術では、免疫細胞であるＢ細胞およびＴ細胞の配列を解析可能なシステムを利用して、遺伝子組換え細胞などの特定の細胞を検出し、この特定の細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認することができる。また、コーディングエクソンの上流の様々な位置において前記細胞の遺伝子を編集してもよく、この遺伝子編集位置によって、インビボでのFOXP3の発現が影響を受けることから、インビボのデータからインビボ実験におけるアウトカムを予測することはできない。さらに、別のプロモーター、エフェクター領域および活性化領域を使用した場合、アウトカムが異なることがある。
【００９６】
実施形態２：FOXP3の発現を増強することによって、Tregの表面表現型とサイトカイン表現型を有するＴ細胞が得られる
図１０は、Treg細胞の表面マーカーの表現型とサイトカインの表現型を示す模式図を示す。遺伝子編集細胞が特定の表面マーカーの表現型を有しているかどうかを確認することが望ましい。図１１に示すように、フローサイトメトリーを使用して、FOXP3を安定に発現した遺伝子組換えＴ細胞におけるCD25、CD127、CTLA4およびLAG3の発現を分析した。内在性制御性Ｔ細胞と同様に、遺伝子組換え細胞は、CD25を高発現し、CD127を低発現し、CTLA4およびLag3を高発現することが示された。
【００９７】
遺伝子編集細胞のサイトカイン発現プロファイルを図１２に示す。図１２に示すように、mock遺伝子編集したＴ細胞と比較して、遺伝子組換え細胞は、Tregと同様に、IL-2、IL-4およびIFN-γの低発現を示す細胞内サイトカイン発現プロファイルを示す。また、図１３の棒グラフに示すように、FOXP3を安定に発現する遺伝子組換えＴ細胞は、mock遺伝子編集細胞と比べて、IL-10の発現量が高かった。
【００９８】
さらに、遺伝子編集細胞は、IL-2/STAT5シグナル伝達に感受性を有することが示された（図１４）。内在性Tregは、CD25を高発現していることから、IL-2に対して非常に高い感受性を有する。mock遺伝子編集細胞および遺伝子編集細胞を、インビトロにおいて様々な濃度のIL-2に暴露することによって、IL-2のシグナル伝達に対する感受性を比較した。IL-2に対する応答は、STAT5のリン酸化の程度によって測定した。図に示すように、遺伝子編集細胞は、mock遺伝子編集細胞よりも大幅に低いIL-2濃度でstat5がリン酸化され、IL-2のシグナル伝達が起こったことが示された。
【００９９】
図１５に示すように、内在性Tregは、CD25を高発現していることから、IL-2に対して非常に高い感受性を有する。mock遺伝子編集細胞および遺伝子編集細胞を、インビトロにおいて様々な濃度のIL-2に暴露することによって、IL-2のシグナル伝達に対する感受性を比較した。IL-2に対する応答は、STAT5のリン酸化の程度によって測定した。図に示すように、遺伝子編集細胞は、mock遺伝子編集細胞よりも大幅に低いIL-2濃度でstat5がリン酸化され、IL-2のシグナル伝達が起こったことが示された。
【０１００】
この代表的な実施形態で示したように、FOXP3の発現を増強することによって、Tregの表面表現型とサイトカイン表現型を有するＴ細胞が得られる。
【０１０１】
本実施形態に示した実験のいくつかはインビトロで行われるため、インビボ試験、細胞または対象においても、FOXP3の発現を細胞において同程度に高レベルで維持することができると予測するのは難しく、また、細胞でのこのような高レベルのFOXP3の発現が、たとえば自己免疫疾患やGVHDなどにおいて、病原性Ｔ細胞および／または病原性Ｂ細胞の応答の緩和に十分であるかどうかを予測することも難しい。さらに、このような細胞が、インビボにおいて制御性Ｔ細胞の特性を維持できると予測することも難しい。したがって、治療、抑制または緩和に使用する細胞が維持されるのか、増加するのか、または減少するのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に対象において該細胞をモニタリングすると有利な場合がある。遺伝子組換え細胞を対象に投与した後に、該対象において該遺伝子組換え細胞を試験する方法は、当業者によく知られている。たとえば、Adaptive Biotechnologies社などに委託可能な商用技術では、Ｂ細胞およびＴ細胞の配列を解析可能なシステムを利用して、遺伝子組換え細胞または病原性Ｂ細胞や病原性Ｔ細胞などの特定の種類の免疫細胞を検出し、この特定の細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認することができる。また、コーディングエクソンの上流の様々な位置において前記細胞の遺伝子を編集してもよく、この遺伝子編集位置によって、インビボでのFOXP3の発現が影響を受けることから、インビボのデータからインビボ実験におけるアウトカムを予測することはできない。さらに、別のプロモーター、エフェクター領域および活性化領域を使用した場合、アウトカムが異なることがある。
【０１０２】
本明細書に記載の治療方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。
【０１０３】
前記細胞が、インビボにおいても、制御性Ｔ細胞と類似のマーカーを発現するかどうかを確認するために試験を行う必要があると考えられる。
【０１０４】
実施形態３：遺伝子編集細胞の機能活性：遺伝子編集細胞はTeffの増殖を抑制することができる
制御性Ｔ細胞の抑制活性を測定するためのアッセイの概要を図１６に示す。CFSEで標識した応答細胞を、遺伝子編集Tregまたはmock遺伝子編集細胞と混合し、ビーズで刺激する。９６時間後のCFSEの希釈度からアッセイの結果を読み取る。
【０１０５】
図１７は、遺伝子編集Ｔ細胞がTeffの増殖を抑制することができることを示す。mock遺伝子編集細胞と共にインキュベートした応答細胞は、細胞増殖によりCFSE標識を実質的に希釈することができたが、遺伝子組換えGFP+細胞と共にインキュベートした応答細胞は、その大部分が細胞分裂しなかった（標識色素は高濃度のまま変化しなかった）。
【０１０６】
図１８は、遺伝子編集細胞の機能活性を示し、IPEX症候群を有する対象から得たＴ細胞を遺伝子編集して使用すると、Teffの増殖が抑制されないことを示す。図１７と同じアッセイを使用し、正常患者コントロール細胞またはIPEX症候群患者由来細胞を、mock遺伝子編集するか、または遺伝子編集して内在性FOXP3遺伝子の発現を増強した。遺伝子編集した健常者コントロール細胞を応答細胞と共にインキュベートしたところ、mock遺伝子編集細胞と比べて応答細胞によるCFSEの希釈が抑制されたが、遺伝子編集したIPEX症候群患者由来細胞を応答細胞と共にインキュベートすると、mock遺伝子編集細胞と比べて細胞増殖の抑制は認められなかった。
【０１０７】
FOXP3遺伝子編集により抗原特異的Treg細胞も作製した。図１９に示すように、本発明の編集技術は、様々な自己免疫疾患において発生する病原性Ｔ細胞クローンにも適用することができる。インフルエンザ抗原に特異的なテトラマーを使用して単離したＴ細胞クローンを遺伝子編集したところ、FOXP3を安定に発現するＴ細胞を得ることに成功した。
【０１０８】
この代表的な実施形態で示したように、遺伝子編集細胞は、Teffの増殖を抑制することができる。
【０１０９】
本実施形態に示した実験のいくつかはインビトロで行われるため、インビボ試験、細胞または対象においても、FOXP3の発現を細胞において同程度に高レベルで維持することができると予測するのは難しく、また、細胞でのこのような高レベルのFOXP3の発現が、たとえば自己免疫疾患やGVHDなどにおいて、病原性Ｔ細胞および／または病原性Ｂ細胞の応答の緩和に十分であるかどうかを予測することも難しい。さらに、このような細胞が、インビボにおいて制御性Ｔ細胞の特性を維持できると予測することも難しい。したがって、治療、緩和または抑制に使用する細胞が維持されるのか、増加するのか、または減少するのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に対象において該細胞をモニタリングすると有利な場合がある。遺伝子組換え細胞を対象に投与した後に、対象において該遺伝子組換え細胞を試験する方法は、当業者によく知られている。たとえば、Adaptive Biotechnologies社などに委託可能な商用技術では、Ｂ細胞およびＴ細胞の配列を解析可能なシステムを利用して、遺伝子組換え細胞または病原性Ｂ細胞や病原性Ｔ細胞などの特定の種類の免疫細胞を検出し、この特定の細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認することができる。また、コーディングエクソンの上流の様々な位置において前記細胞の遺伝子を編集してもよく、この遺伝子編集位置によって、インビボでのFOXP3の発現が影響を受けることから、インビボのデータからインビボ実験におけるアウトカムを予測することはできない。さらに、別のプロモーター、エフェクター領域および活性化領域を使用した場合、アウトカムが異なることがある。
【０１１０】
本明細書に記載の治療方法、緩和方法または抑制方法の実施形態のいくつかにおいて、これらの方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、該細胞の投与前、投与中および／または投与後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、緩和または抑制を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。
【０１１１】
前記遺伝子組換え細胞が、インビボにおいて、エフェクターＴ細胞に対して効果を発揮するのかどうか、あるいはエフェクターＴ細胞を抑制するのかどうかは、インビトロ実験を使用して予測することはできないため、前記遺伝子組換え細胞がインビボにおいてエフェクターＴ細胞に対して効果を発揮するのかどうかを確認するために試験を行う必要があると考えられる。
【０１１２】
結論
遺伝子編集により強いプロモーターを初代ヒトＴ細胞に導入することによって、Foxp3の発現を増強することができ、安定なTreg表現型を得ることができる。CD4+Ｔ細胞における遺伝子編集は効率的に行うことができ、Foxp3を安定に高発現させることができる。遺伝子発現は、内在性遺伝子座に制限されることも示された。遺伝子編集細胞は、Tregの機能特性（pSTAT5および細胞内サイトカイン産生）、Tregの表面表現型およびインビトロにおけるTregの機能性（エフェクターＴ細胞の抑制）を示した。抗原特異的Ｔ細胞を使用して、FOXP3発現を誘導するための遺伝子編集を行うこともできる。GvHDマウスモデルを確立することができれば、FOXP3発現遺伝子編集Ｔ細胞のインビボにおける機能性試験を行うことが可能であろう。
【０１１３】
実施形態４：GFP FOXP3発現遺伝子編集細胞の表現型および機能
図２１に示すように、FOXP3を安定に発現するＴ細胞は、表現型の変化（CD25+、CD45RO+、CCR7、CD38/CTLA-4/LAP）を示した。また、このFOXP3安定発現Ｔ細胞は、Tregと同様の細胞内サイトカイン発現プロファイル（IL-2、IFN-γおよびIL-4）を示す。さらに、10ng〜100ngのIL-2を投与したところ、pSTAT5シグナル伝達はIL-2に感受性を示した。したがって、FOXP3安定発現Ｔ細胞は、Tregと同様の細胞内サイトカイン発現プロファイルを示す。
【０１１４】
本実施形態に示した実験のいくつかはインビトロで行われるため、インビボ試験、細胞または対象においても、FOXP3の発現を細胞において同程度に高レベルで維持することができると予測するのは難しく、また、細胞でのこのような高レベルのFOXP3の発現が、たとえば自己免疫疾患やGVHDなどにおいて、病原性Ｔ細胞および／または病原性Ｂ細胞の応答の緩和に十分であるかどうかを予測することも難しい。さらに、このような細胞が、インビボにおいて制御性Ｔ細胞の特性を維持できると予測することも難しい。したがって、治療、抑制または緩和に使用する細胞が維持されるのか、増加するのか、または減少するのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に対象において該細胞をモニタリングすると有利な場合がある。遺伝子組換え細胞を対象に投与した後に、該対象において該遺伝子組換え細胞を試験する方法は、当業者によく知られている。たとえば、Adaptive Biotechnologies社などに委託可能な商用技術では、Ｂ細胞およびＴ細胞の配列を解析可能なシステムを利用して、遺伝子組換え細胞または病原性Ｂ細胞や病原性Ｔ細胞などの特定の種類の免疫細胞を検出し、この特定の細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認することができる。また、コーディングエクソンの上流の様々な位置において前記細胞の遺伝子を編集してもよく、この遺伝子編集位置によって、インビボでのFOXP3の発現が影響を受けることから、インビボのデータからインビボ実験におけるアウトカムを予測することはできない。さらに、別のプロモーター、エフェクター領域および活性化領域を使用した場合、アウトカムが異なることがある。
【０１１５】
本明細書に記載の治療方法、抑制方法または緩和方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。
【０１１６】
実施形態５：インビボGVHD実験
インビボGvHD実験を実施するためのスケジュールを図２２に示す。まず、マウスに放射線を照射し、骨髄細胞を破壊する。次に、FOXP3を安定に発現するTreg表現型遺伝子組換え細胞をマウスに輸注し、次いでTeff細胞を輸注する。輸注の１〜５０日後に、マウスの体重をモニタリングし、末梢血および様々な臓器におけるＴ細胞の割合（％）を調べる。
【０１１７】
図２３のグラフは、エフェクター細胞（丸印）、エフェクター細胞とmock遺伝子編集Ｔ細胞（正方形）、またはエフェクター細胞とTregの表現型を有するFOXP3安定発現遺伝子編集細胞（三角形）を投与したマウスの生存率（％）を示す。Tregの表現型を有するfoxp3安定発現遺伝子編集細胞は、顕著な生存率の延長を示し、エフェクター細胞によって引き起こされた異種GvHDを緩和する能力を有することが示された。
【０１１８】
実施形態６：遺伝子組換え免疫寛容誘導性Ｔ細胞と内在性胸腺Tregの分子的類似性／差異
遺伝子編集Ｔ細胞の胸腺特異的脱メチル化領域（TSDR）におけるCpGメチル化の概要を図２４に示す。FOXP3遺伝子は、第１のコーディングエクソン（エクソン２）の上流の制御領域のメチル化によって制御される。
【０１１９】
次に、メチル化についてクローンを分析した（図２５）。黒色の各ドットは、Ｔ細胞クローンのTSDR全体にわたってメチル化CpGジヌクレオチドが見られたPCR断片を示す。図から分かるように、CD25陰性細胞は、TSDRが高度にメチル化しており、FOXP3遺伝子座が閉じられており、不活性であり、発現されていないことが示されているが、CD25高発現細胞（内在性Treg）では、TSDRがほぼ完全に均一に脱メチル化されていることが示されている。
【０１２０】
TSDRが完全にメチル化されると、FOXP3が高発現されることが知られているが、遺伝子編集Ｔ細胞では、TSDRが完全にメチル化されたことが示され、このことから、TSDRの下流にプロモーターを組み込むことによって、FOXP3遺伝子座における通常のエピジェネティックな制御を効果的にバイパスできることが示された（図２６）。
【０１２１】
本実施形態に示した実験のいくつかはインビトロで行われるため、インビボ試験、細胞または対象においても、FOXP3の発現を細胞において同程度に高レベルで維持することができると予測するのは難しく、また、細胞でのこのような高レベルのFOXP3の発現が、たとえば自己免疫疾患やGVHDなどにおいて、病原性Ｔ細胞および／または病原性Ｂ細胞の応答の緩和に十分であるかどうかを予測することも難しい。さらに、このような細胞が、インビボにおいて制御性Ｔ細胞の特性を維持できると予測することも難しい。したがって、治療、抑制または緩和に使用する細胞が維持されるのか、増加するのか、または減少するのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に対象において該細胞をモニタリングすると有利な場合がある。遺伝子組換え細胞を対象に投与した後に、該対象において該遺伝子組換え細胞を試験する方法は、当業者によく知られている。たとえば、Adaptive Biotechnologies社などに委託可能な商用技術では、Ｂ細胞およびＴ細胞の配列を解析可能なシステムを利用して、遺伝子組換え細胞または病原性Ｂ細胞や病原性Ｔ細胞などの特定の種類の免疫細胞を検出し、この特定の細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認することができる。また、コーディングエクソンの上流の様々な位置において前記細胞の遺伝子を編集してもよく、この遺伝子編集位置によって、インビボでのFOXP3の発現が影響を受けることから、インビボのデータからインビボ実験におけるアウトカムを予測することはできない。さらに、別のプロモーター、エフェクター領域および活性化領域を使用した場合、アウトカムが異なることがある。
【０１２２】
核酸の作製方法
いくつかの実施形態において、タンパク質の発現に対するエピジェネティックな制御をバイパスすることができる核酸を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はFOXP3である。いくつかの実施形態において、FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法を提供する。該方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；ヌクレアーゼを提供すること；および前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、第１の標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行った後の前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記１つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在し、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該遺伝子編集によって該第１のコーディングエクソンがエクソンを生じ、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以���の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
【０１２３】
FOXP3を安定に発現させるための核酸
いくつかの実施形態において、タンパク質の発現に対するエピジェネティックな制御をバイパスするための核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はFOXP3である。いくつかの実施形態において、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部に作動可能に連結された異種制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。
【０１２４】
タンパク質を安定に発現させるための遺伝子組換え細胞を作製する方法
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな制御をバイパスすることができる遺伝子組換え細胞を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第１のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第１のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。い���つかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１２５】
細胞
いくつかの実施形態において、タンパク質の発現に対するエピジェネティックな制御をバイパスするための遺伝子組換え細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はFOXP3である。いくつかの実施形態において、本発明に記載の方法のいずれか１つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第１のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第１のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子組換えすることができる。
【０１２７】
組成物
本発明の開示は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行うための組成物を利用または使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む。前記細胞は、本発明に記載の方法のいずれか１つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞である。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コー��鎖上の第１のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第１のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子組換えすることができる。
【０１２９】
治療方法または緩和方法
いくつかの実施形態において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、本明細書において提供する実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本明細書において提供する実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む。前記細胞は、本発明に記載の方法のいずれか１つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞である。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第１のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第１のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子組換えすることができる。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症および／または毛細血管拡張性運動失調症である。いくつかの実施形態において、前記自己免疫障害は、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群および／または毛細血管拡張性運動失調症である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。前記特定または選択は、臨床的評価または診断的評価に基づいて行うことができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬または抗炎症薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前記抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞の投与前、投与中および／または投与後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、初回にボーラス投与された遺伝子組換え細胞に対する１回目の応答に応じて、該遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。
【０１３２】
本明細書に記載の治療方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む。前記細胞は、本発明に記載の方法のいずれか１つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞である。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第１のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第１のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む。前記細胞は、本発明に記載の方法のいずれか１つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞である。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第１のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に１つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第１のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第１のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。本明細書に記載の治療方法、抑制方法または緩和方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、前記細胞の投与前、投与中および／または投与後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、自己免疫疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、強皮症、溶血性貧血、血管炎、１型糖尿病、グレーヴス病、関節リウマチ、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、筋疾患、重症複合免疫不全、ディ・ジョージ症候群、高IgE症候群、分類不能型免疫不全、慢性肉芽腫症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、高IgM症候群、白血球接着不全症、NF-κB必須モジュレーター（NEMO）変異、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖症および／または毛細血管拡張性運動失調症である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。前記特定または選択は、診断的評価および／または臨床的評価に基づいて行うことができる。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うことを含む方法を提供する。本明細書に記載の治療方法、抑制方法または緩和方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、前記細胞の投与前、投与中および／または投与後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して治療を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１４０】
さらなる実施形態
いくつかの実施形態において、FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；ヌクレアーゼを提供すること；および前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記１つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する。いくつかの実施形態において、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターを挿入することにより、第１のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターは、前記コード鎖上の該第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の内在性の第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモー���ーを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法で作製された、FOXP3を発現させるための核酸を提供する。前記方法は、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を提供すること；ヌクレアーゼを提供すること；および前記１つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第１のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記１つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する。いくつかの実施形態において、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、内在性の第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターを挿入することにより、第１のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターは、前記コード鎖上の該第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の内在性の第１のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記���つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部に作動可能に連結された異種制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に存在する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーター��挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。また、遺伝子組換え細胞を作製する前記方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。また、遺伝子組換え細胞を作製する前記方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記���１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。また、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。さらに、遺伝子組換え細胞を作製する前記方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記���己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患を抑制する薬物と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、治療中の前記対象において、インビボでのFOXp3+Treg表現型細胞集団の変化をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬または抗炎症薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前記抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、治療、抑制または緩和を行う前、その最中および／またはその後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、治療、抑制または緩和に対する１回目の応答に応じて、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。また、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。さらに、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、抗拒���反応薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、治療中の前記対象において、インビボでのFOXp3+Treg表現型細胞集団の変化をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応療法または抗炎症療法を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記治療、抑制または緩和を必要とする対象における前記遺伝子組換え細胞のシーケンシングを行うことによって、該遺伝子組換え細胞が、該対象において維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬または抗炎症薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前記抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、治療、抑制または緩和を行う前、その最中および／またはその後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、治療、抑制または緩和に対する１回目の応答に応じて、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。本明細書に記載の治療方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少し��いる場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。また、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物を提供する。前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製することができる。さらに、遺伝子組換え細胞を作製する前記方法であって、１つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；および前記第２のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、前記第１のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性コーディングエクソンまたは前記第１のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第１のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第１のコーディングエクソンの上流の１０塩基対以内に存在するか、２０塩基対以内に存在するか、３０塩基対以内に存在するか、４０塩基対以内に存在するか、５０塩基対以内に存在するか、６０塩基対以内に存在するか、７０塩基対以内に存在するか、８０塩基対以内に存在するか、９０塩基対以内に存在するか、１００塩基対以内に存在するか、もしくは１１０塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第１のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列中の前記１つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域（たとえばTCRαエンハンサー）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第１のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第１のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第１のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第１のコーディングエクソンの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記１つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞は、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター（たとえば、内在性プロモーターおよび／または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第１のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記１つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施���態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、治療中の前記対象において、インビボでのFOXp3+Treg表現型細胞集団の変化をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応療法または抗炎症療法を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記治療、抑制または緩和を必要とする対象における前記遺伝子組換え細胞のシーケンシングを行うことによって、該遺伝子組換え細胞が、該対象において維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前記抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、治療、抑制または緩和を行う前、その最中および／またはその後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、治療、抑制または緩和に対する１回目の応答に応じて、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。本明細書に記載の治療方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、１回目の前記細胞の投与前、投与中および／または投与後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、自己免疫疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、Ｘ連鎖（IPEX）症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患の症状を緩和する薬物と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、治療中の前記対象において、インビボでのFOXp3+Treg表現型細胞集団の変化をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応療法または抗炎症療法を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記治療、抑制または緩和を必要とする対象における前記遺伝子組換え細胞のシーケンシングを行うことによって、該遺伝子組換え細胞が、該対象において維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前���抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、治療前、治療中および／または治療後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、治療に対する１回目の応答に応じて、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。本明細書に記載の治療方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して治療を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、治療、抑制または緩和を行っている最中の前記対象において、インビボでのFOXp3+Treg表現型細胞集団の変化をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応療法または抗炎症療法を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記治療、抑制または緩和を必要とする対象における前記遺伝子組換え細胞のシーケンシングを行うことによって、該遺伝子組換え細胞が、該対象において維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前記抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、治療、抑制または緩和を行う前、その最中および／またはその後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、治療に対する１回目の応答に応じて、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。本明細書に記載の治療方法、抑制方法または緩和方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、治療前、治療中および／または治療後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第１のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と１つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第１のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること；ヌクレアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること；前記第２のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第１のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと；および前記対象に前記細胞を導入して治療を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬と前記遺伝子組換え細胞とを組み合わせて前記対象に投与する併用療法を実施する。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、治療中の前記対象において、インビボでのFOXp3+Treg表現型細胞集団の変化をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応療法または抗炎症療法を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記治療、抑制または緩和を必要とする対象における前記遺伝子組換え細胞のシーケンシングを行うことによって、該遺伝子組換え細胞が、該対象において維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗拒絶反応薬を投与すべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、抗拒絶反応薬は、プレドニゾン、イムラン（アザチオプリン）、セルセプト（ミコフェノール酸モフェチル（MMF））、Myfortic（ミコフェノール酸）、ラパミューン（シロリムス）、ネオーラル（シクロスポリン）、またはプログラフ（タクロリムス）を含む。いくつかの実施形態において、前記抗炎症薬は、タイサブリ（登録商標）、ステロイド、免疫抑制薬、NSAID、免疫グロブリン、パラセタモール、セレコキシブ、インドメタシンまたはジクロフェナクを含む。いくつかの実施形態において、治療、抑制または緩和を行う前、その最中および／またはその後に、インビボにおけるFOXp3+発現遺伝子組換えＴ細胞の変化、ならびにインビボにおけるTreg表現型を発現する遺伝子組換え細胞の数または病原性Ｔ細胞数または病原性Ｂ細胞数について前記対象をモニタリングする。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記遺伝子組換え細胞の初回投与に対する１回目の応答に応じて、該遺伝子組換え細胞の追加の投与を受けるべき対象として選択される。いくつかの実施形態において、初回投与から１週間以内、２週間以内または１ヶ月以内に前記細胞の追加の用量を前記対象に投与する。本明細書に記載の治療方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、前記遺伝子組換え細胞が維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認するために、前記細胞の投与前、投与中および／または投与後に前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象から細胞試料を採取して、前記遺伝子組換え細胞を検出し、該遺伝子組換え細胞が、維持されているのか、増加しているのか、または減少しているのかを確認する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞が前記対象において減少している場合、治療、抑制または緩和を必要とする該対象への該遺伝子組換え細胞の投与を追加する。いくつかの実施形態において、前記対象は、自己免疫疾患の標準的な治療法または炎症の標準的な治療法に対して抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、標準的な抗拒絶反応薬または標準的な抗拒絶療法に対して抵抗性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、前記対象は、FOXP3を発現する遺伝子組換え細胞を投与すべき対象として選択される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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