(57)【要約】  1つ以上の補助部分を有する部分に連結している鎖を有するポリヌクレオチド構築物が開示されている。同様に、糖アナログにより割り込まれているポリヌクレオチド構築物、及び立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを有するポリヌクレオチド構築物が開示されている。本ポリヌクレオチド構築物は、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物として提供されてもよい。同様に、細胞を開示されているポリヌクレオチド構築物又はハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物と接触させることにより、ポリヌクレオチド構築物を細胞に送達する方法、及び細胞におけるタンパク質の発現を低減する方法を特徴とする。【選択図】図１
2019532027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの式(I)の基:
【化１】
2019532027.tif 000210
に結合している鎖を含むポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、少なくとも1つの多価リンカーは、Tに結合している-C(O)-N(H)-を含み、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である)。
【請求項２】
少なくとも1つの式(I)の基:
【化２】
2019532027.tif 000211
に結合している鎖を含むポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立にO、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0であり、
鎖は、2位において、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ、置換されていてもよいC2〜12アルコキシアルキル、ハロゲン又はシアノにより置換されている少なくとも1つのヌクレオシドを含む)。
【請求項３】
少なくとも1つの-LinkA(-T)pが、式(II):
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p
(II)
(式中、
各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
Q1は、コンジュゲートリンカーであり、
Q2は、pが1である場合は直鎖基であり、又はpが2〜6の整数である場合は分岐基であり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC6〜10アリーレン、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する)
である、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４】
各-LinkA(-T)pが、独立に、式(II)である、請求項3に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５】
Q1が、-O-QL-QC-であり、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC1〜12アルキレン又は-(置換されていてもよいC1〜6アルキレン)-(置換されていてもよいC6〜10アリーレン)-であり、QCは、(i)-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-又は-N(H)-S(O)2-を含む、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、(ii)置換されていてもよいC1〜12ヘテロシクリレン;(iii)置換されていてもよいC1〜12チオヘテロシクリレン;(iv)シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル;又は(v)ピリド-2-イルヒドラゾンである、請求項3又は4に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６】
Q1が、
【化３】
2019532027.tif 000212
を含む、請求項3又は4に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７】
pが1であり、Q2が式-[Q3-Q4-Q5]s-である直鎖基である、請求項3から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項８】
pが2〜6の整数であり、Q2が、式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2である分岐基であり、Q7は、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
p1は、0又は1であり、
p2は、0、1、2又は3であり、
p1が0である場合、LinkAは三価又は四価リンカーであり、
p1が1である場合、LinkAは四価、五価又は六価リンカーである、
請求項3から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項９】
少なくとも1つのTが、標的指向性部分である、請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０】
少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド、マンノース、フォレート、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、又は抗体若しくはその抗原結合性フラグメントである、請求項1から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１１】
少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、請求項10に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１２】
少なくとも1つのTが、N-アセチルガラクトサミンである、請求項11に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１３】
N-アセチルガラクトサミンが、LinkAに結合しているアノマー炭素を含み、アノマー炭素が、ヘミアミナール基の一部である、請求項12に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１４】
N-アセチルガラクトサミンのアノマー炭素が、アミド窒素原子に結合している、請求項13に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１５】
少なくとも1つのTが、細胞膜透過ペプチドである、請求項1から14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１６】
少なくとも1つのTが、エンドソーム脱出部分である、請求項1から15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１７】
少なくとも1つの式(I)の基が、5つの5'又は5つの3'末端ヌクレオシドのうちの1つであるヌクレオシドに連結している、請求項1から16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１８】
鎖が、式(I)の1つ、2つ、3つ又は4つの基に結合しており、式(I)の基が、同一又は異なる、請求項1から17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１９】
鎖が、少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項1から18のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２０】
少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルが、置換されていてもよいC2〜16アルキル;置換されていてもよいC3〜16アルケニル;置換されていてもよいC3〜16アルキニル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルケニル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び以下の構造の基:
【化４】
2019532027.tif 000213
(式中、
Lは、C2〜6アルキレンであり、
Rbは、置換されていてもよいC2〜6アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び-OH、C1〜6アルコキシ又は-COOHが末端であるポリ(エチレングリコール)であり、
Rcは、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から独立に選択される置換基により置換されているホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートである、
請求項19に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２１】
少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルが、
C2〜16アルキル、
【化５】
2019532027.tif 000214
又は
【化６】
2019532027.tif 000215
とアジド含有基質との環化付加反応によって形成される基である置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートであり、
式中、
tは、1〜6の整数であり、
Rdは、置換されていてもよいC6アリール;1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である置換されていてもよいC4〜5ヘテロアリール;又は1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である、置換されていてもよいC4〜5ヘテロシクリルであり、
Reは、H又はC1〜6アルキルであり、
X3は、ハロゲン、-COOR5又は-CONR62であり、各R5及びR6は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール又は置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであり、
アジド含有基質は、
【化７】
2019532027.tif 000216
である、請求項20に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２２】
鎖が、1〜5つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項19から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２３】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の2番目のヌクレオシド及び3番目のヌクレオシドを接続している、請求項19から22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２４】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の5番目のヌクレオシド及び6番目のヌクレオシドを接続している、請求項19から23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２５】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の17番目のヌクレオシド及び18番目のヌクレオシドを接続している、請求項19から24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２６】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の19番目のヌクレオシド及び20番目のヌクレオシドを接続している、請求項19から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２７】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の20番目のヌクレオシド及び21番目のヌクレオシドを接続している、請求項19から26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２８】
少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルが、鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している、請求項19から22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項２９】
鎖が、1つ以上のヌクレオシド間ホスホネートを含む、請求項19から28のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３０】
1つ以上のヌクレオシド間ホスホネートが、鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している、請求項29に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３１】
鎖が、19個以上のヌクレオシドを含む、請求項1から30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３２】
鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、請求項1から31のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３３】
鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、請求項32に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３４】
鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、請求項33に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３５】
鎖が、少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、請求項1から34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３６】
鎖が、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含む、請求項1から35のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３７】
鎖中のすべてのヌクレオシドが、独立に、2'-修飾ヌクレオシドである、請求項36に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項３８】
RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、パッセンジャー鎖が、請求項1から37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体であり、少なくとも1つの式(I)の基が、パッセンジャー鎖の5'末端、3'末端のヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物。
【請求項３９】
RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つのホスホロジチオエート又は少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含み、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの式(I)の基:
【化８】
2019532027.tif 000217
に結合している、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立にO、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である)。
【請求項４０】
RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含み、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの式(I)の基:
【化９】
2019532027.tif 000218
に結合している、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立にO又はSであり、
各X2は、独立にO、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である)。
【請求項４１】
少なくとも1つの-LinkA(-T)pが、式(II):
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p
(II)
であり、
式中、
各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
Q1は、コンジュゲートリンカーであり、
Q2は、pが1である場合は直鎖基であり、又はpが2〜6の整数である場合は分岐基であり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC6〜10アリーレン、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する、請求項39又は40に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４２】
Q1が、-O-QL-QC-であり、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜12アルキレンであり、QCは、(i)-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-又は-N(H)-S(O)2-を含む、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、(ii)置換されていてもよいC1〜12ヘテロシクリレン;(iii)置換されていてもよいC1〜12チオヘテロシクリレン;(iv)シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル;又は(v)ピリド-2-イルヒドラゾンである、請求項41に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４３】
Q1が、
【化１０】
2019532027.tif 000219
を含む、請求項41に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４４】
pが1であり、Q2が式-[Q3-Q4-Q5]s-である直鎖基である、請求項41から43のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４５】
pが2〜6の整数であり、Q2が、分岐基-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、Q7は、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
式中、
p1は、0又は1であり、
p2は、0、1、2又は3であり、
p1が0である場合、LinkAは三価又は四価リンカーであり、
p1が1である場合、LinkAは四価、五価又は六価リンカーである、
請求項41から44のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４６】
各-LinkA(-T)pが、独立に、式(II)である、請求項39から45のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４７】
少なくとも1つのTが、標的指向性部分である、請求項39から46のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４８】
少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド、マンノース、フォレート、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、又は抗体若しくはその抗原結合性フラグメントである、請求項39から47のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項４９】
少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、請求項48に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５０】
少なくとも1つのTが、N-アセチルガラクトサミンである、請求項49に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５１】
N-アセチルガラクトサミンが、LinkAに結合しているアノマー炭素を含み、アノマー炭素が、ヘミアミナール基の一部である、請求項50に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５２】
N-アセチルガラクトサミンのアノマー炭素が、アミド窒素原子に結合している、請求項51に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５３】
少なくとも1つのTが、細胞浸透性ペプチドである、請求項39から52のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５４】
少なくとも1つのTが、エンドソーム脱出部分である、請求項39から53のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５５】
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物が、式(I)の基を1〜6つ含み、この式(I)の基が同一又は異なる、請求項39から54のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５６】
パッセンジャー鎖が、少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項39から55のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５７】
ガイド鎖が、少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項39から56のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５８】
少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルが、置換されていてもよいC2〜16アルキル;置換されていてもよいC3〜16アルケニル;置換されていてもよいC3〜16アルキニル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルケニル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び以下の構造の基:
【化１１】
2019532027.tif 000220
(式中、
L1は、C1〜6アルキレンであり、
Rbは、置換されていてもよいC2〜6アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び-OH、C1〜6アルコキシ又は-COOHが末端であるポリ(エチレングリコール)であり、
Rcは、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から独立に選択される置換基により置換されているホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートである、請求項56又は57に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項５９】
生物非可逆性ホスホトリエステルのそれぞれが、
C2〜16アルキル、
【化１２】
2019532027.tif 000221
又は
【化１３】
2019532027.tif 000222
とアジド含有基質との環化付加反応によって形成される基である置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートであり、
式中、
tは、1〜6の整数であり、
Rdは、置換されていてもよいC6アリール;1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である置換されていてもよいC4〜5ヘテロアリール;又は1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である、置換されていてもよいC4〜5ヘテロシクリルであり、
Reは、H又はC1〜6アルキルであり、
X3は、ハロゲン、-COOR5又は-CONR62であり、各R5及びR6は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール又は置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであり、
アジド含有基質は、
【化１４】
2019532027.tif 000223
である、請求項56又は57に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６０】
ガイド鎖が、1〜5つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項57から59のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６１】
少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルが、ガイド鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している、請求項57から60のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６２】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の2番目のヌクレオシド及び3番目のヌクレオシドを接続している、請求項57から61のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６３】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の5番目のヌクレオシド及び6番目のヌクレオシドを接続している、請求項57から62のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６４】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の17番目のヌクレオシド及び18番目のヌクレオシドを接続している、請求項57から63のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６５】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の19番目のヌクレオシド及び20番目のヌクレオシドを接続している、請求項57から64のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６６】
生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の20番目のヌクレオシド及び21番目のヌクレオシドを接続している、請求項57から65のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６７】
パッセンジャー鎖が、1〜5つの生物非可逆性ホスホトリエステルを含む、請求項56から66のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６８】
少なくとも1つの生物非可逆性のヌクレオシド間ホスホトリエステルが、パッセンジャー鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している、請求項56から67のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項６９】
パッセンジャー鎖又はガイド鎖が、少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、請求項39から68のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７０】
ガイド鎖が、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、請求項69に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７１】
パッセンジャー鎖が、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、請求項69又は70に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７２】
ガイド鎖又はパッセンジャー鎖が、1つ以上のホスホネートを含む、請求項38から71のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７３】
ガイド鎖が、19個以上のヌクレオシドを含む、請求項38から72のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７４】
ガイド鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、請求項38から73のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７５】
ガイド鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、請求項74に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７６】
ガイド鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、請求項75に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７７】
パッセンジャー鎖が、19個以上のヌクレオシドを含む、請求項38から76のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７８】
パッセンジャー鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、請求項38から77のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項７９】
パッセンジャー鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、請求項78に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項８０】
パッセンジャー鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、請求項79に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項８１】
パッセンジャー鎖の3'末端が、ガイド鎖の5'末端にハイブリッド化されて、ブラントを形成する、請求項38から79のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項８２】
R1及びR2が、MOIETYの同一原子に結合している、請求項1から37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくは請求項38から81のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物、又はそれらの塩、或いはそれらの立体異性体。
【請求項８３】
MOIETY、R1及びR2が、合わさって、
【化１５】
2019532027.tif 000224
を形成し、
式中、
R7は、R4に近位の酸素原子への結合であり、
R8は、鎖に近位の酸素原子への結合であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれは、独立に、0〜6の整数であり、
但し、式(Ia)中の四級炭素が、0個の原子、又は炭素及び水素以外の1個の原子に結合しており、m1、m2、m3及びm4の合計は10未満である、
請求項82に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物、又はその塩、或いはその立体異性体。
【請求項８４】
ポリヌクレオチド構築物を細胞に送達する方法であって、細胞を請求項1から37、82及び83のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体、或いは請求項38から83のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体と接触させるステップを含み、接触後にポリヌクレオチド構築物が細胞内部に存在している、方法。
【請求項８５】
細胞におけるタンパク質の発現を低減する方法であって、細胞を請求項1から37、82及び83のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体、或いは請求項38から83のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体と接触させるステップを含み、接触後の細胞中のタンパク質の発現が低減される、方法。
【請求項８６】
式(IV)の化合物:
【化１６】
2019532027.tif 000225
(式中、
各R1及びR2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル又はコンジュゲート部分であり、
各R16は、独立に、ジアルキルアミノ、2-シアノエチル又はコンジュゲート部分であり、但し、少なくとも1つのR16はジアルキルアミノであり、
R17はヒドロキシル保護基であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれは、独立に、0〜6の整数であり、但し、m1及びm2の合計が0ではなく、
R1及びR2のどちらも、置換されていてもよいC2〜16アルキニルを含むコンジュゲート部分であり、R16はジアルキルアミノ又はコンジュゲート部分である)。
【請求項８７】
m1が0又は1である、請求項86に記載の化合物。
【請求項８８】
m2が0又は1である、請求項86又は87に記載の化合物。
【請求項８９】
R1が、H又はコンジュゲート部分であり、コンジュゲート部分が、[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
QC1は、-COOR21又は-CHOを含む置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化１７】
2019532027.tif 000226
又はそのN-保護変形体、
【化１８】
2019532027.tif 000227
であり、
各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲンであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である、
請求項86から88のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９０】
R1中のQ3が-O-である、請求項89に記載の化合物。
【請求項９１】
R1中のQ4が、存在しない又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、R1中のQ5が存在しない、請求項89又は90に記載の化合物。
【請求項９２】
R2が、H又はコンジュゲート部分であり、コンジュゲート部分が、[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
QC1は、-COOR21又は-CHOを含む置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化１９】
2019532027.tif 000228
又はそのN-保護変形体、
【化２０】
2019532027.tif 000229
であり、各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲンであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である、
請求項86から91のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９３】
R2中のQ3が-O-である、請求項92に記載の化合物。
【請求項９４】
R2中のQ4が、存在しない又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、R2中のQ5が存在しない、請求項92又は93に記載の化合物。
【請求項９５】
少なくとも1つの式(III)のヌクレオシド間脱塩基スペーサー:
【化２１】
2019532027.tif 000230
(式中、
Lは糖アナログであり、
各X4は、独立に、O又はSであり、
各X5は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)
により割り込まれた鎖を含むポリヌクレオチド構築物。
【請求項９６】
tが1である、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項９７】
R9がHである、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項９８】
X4がOである、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項９９】
X4がSである、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１００】
X5がOである、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０１】
(x)が2、3、4又は5である、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０２】
(x)が13、14、15又は16である、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０３】
構築物が、1つのみ又は2つのみのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含む、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０４】
鎖が、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含む、請求項95に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０５】
鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドのうちの少なくとも1つが、2'-フルオロヌクレオシドである、請求項104に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０６】
鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドがすべて独立に、2'-フルオロヌクレオシドである、請求項105に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０７】
鎖を含むポリヌクレオチド構築物であって、鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドがすべて、独立に、2'-フルオロヌクレオシドである、ポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０８】
残りのヌクレオシドが2'-アルコキシヌクレオシドである、請求項107に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１０９】
ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドを含むシード領域を含む鎖を含むポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１１０】
ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドが、鎖中の2番目、3番目、4番目、5番目又は6番目のヌクレオシドである、請求項109に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【請求項１１１】
鎖の6つの5'末端ヌクレオシドの2つである2つの連続するヌクレオシド間、又は鎖の6つの3'末端ヌクレオシドの2つである2つの連続するヌクレオシド間に位置する、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む鎖を含む、ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞をトランスフェクトするための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞への核酸送達は、インビトロとインビボのどちらでも、様々な組換えウイルスベクター、脂質送達システム及び電気穿孔法を使用して行われてきた。このような技法は、遺伝子発現をノックアウトすることにより、及び遺伝子治療に対する遺伝的構築物を提供することにより様々な疾患及び障害を処置するため、又は様々な生物学的システムを検討するために探求されてきた。
【０００３】
mRNAを選択的に分解する細胞機構としてのRNA干渉(RNAi)の発見により、細胞培養物における細胞表現型の標的操作と指向性の高い治療剤を開発する可能性の両方が可能となる(Behlke、Mol. Ther. 13巻、644〜670頁、2006年;Xieら、Drug Discov. Today 11巻、67〜73頁、2006年)。しかし、それらのサイズ及び負(陰イオン性)の帯電性質のために、siRNAsは、細胞に進入することができないマクロ分子である。実際に、siRNAは、一般に、500Da未満までのサイズに限定される膜拡散性分子の細胞送達に関すると、リピンスキーの「ルールオブファイブ」を超える25Xとなる。したがって、送達用ビヒクル又はトランスフェクト剤の非存在下では、裸のsiRNAは、ミリモル濃度でさえも細胞に進入しない(Barquineroら、Gene Ther. 11巻、Suppl 1、S3〜9頁、2004年)。siRNA送達の問題を解決するため、siRNAを縮合すること及び細胞膜に穴を空けることの両方を行う陽イオン性脂質を使用することに多大な関心が集められてきた。トランスフェクト試薬が、広く使用されたが、多くの細胞タイプ、とりわけ一次細胞及び造血細胞血統(T及びB細胞、マクロファージ)への効率的な送達を達成することはできない。さらに、リポフェクション試薬は、腫瘍細胞における軽度から一次細胞における重度までの範囲の、様々な程度の細胞毒性をもたらすことが多い。
【０００４】
したがって、細胞にトランスフェクトする能力の向上したポリヌクレオチド構築物が必要とされている。特に、所定の細胞集団を標的とすることができる、ポリヌクレオチド構築物が望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
一般に、本発明は、ポリヌクレオチド構築物を提供する。ある種の構築物は、1つ以上の補助部分(例えば、標的指向性部分(targeting moieties))を有する、分岐部分に連結されているポリヌクレオチドを有する。本ポリヌクレオチド構築物は、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物として提供されてもよい。他の構築物が、本明細書に記載されている。
【０００６】
一態様では、本発明は、ポリヌクレオチド構築物を提供する。
【０００７】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つの式(I)の基:
【０００８】
【化１】
2019532027.tif 000003
若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立にO又はSであり、
各X2は、独立にO、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
LinkAはそれぞれ、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-(例えば、Tに結合している-C(O)-N(H)-を含む少なくとも1つの多価リンカー)を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数である)
に結合しているポリヌクレオチドを含有することができる。
【０００９】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つの式(III)のヌクレオシド間脱塩基スペーサー:
【００１０】
【化２】
2019532027.tif 000004
(式中、
Lは糖アナログであり、
各X4は、独立にO又はSであり、
各X5は、独立にO、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)
により割り込まれた鎖を含むことができる。
【００１１】
一部の実施形態では、tは1である。さらなる実施形態では、R9はHである。さらなる実施形態では、X4は、O又はSである。さらなる実施形態では、X5はOである。特定の実施形態では、(x)は、2、3、4又は5である。ある種の実施形態では、(x)は、13、14、15又は16である。他の実施形態では、本構築物は、1つのみ又は2つのみのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有する。ある種の実施形態では、糖アナログは、置換されていてもよいC2〜6アルキレン、置換されていてもよいC2〜6アルケニレン、置換されていてもよいC5シクロアルカン-1,3-ジイル、置換されていてもよいC5シクロアルケン-1,3-ジイル、置換されていてもよい複素環-1,3-ジイル(例えば、置換されていてもよいピロリジン-2,5-ジイル、置換されていてもよいテトラヒドロフラン-2,5-ジイル又は置換されていてもよいテトラヒドロチオフェン-2,5-ジイル)又は置換されていてもよい(C1〜4アルキル)-(C3〜8シクロアルキレン)(例えば、置換されていてもよい(C1アルキル)-(C3シクロアルキレン))である。ある種の実施形態では、糖アナログは、
【００１２】
【化３】
2019532027.tif 000005
(式中、
R12は、式(III)中の-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合であり、
R13は、式(III)中の別の-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合であり、
各R14及びR15は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル又は-(CH2)t1-ORZであり、nは、1〜6の整数であり、RZは、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル又は置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキルである)
からなる群から選択される。
【００１３】
一部の実施形態では、R14及びR15の少なくとも1つは、Hではない。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含有する鎖を含有してもよい。
【００１５】
他の実施形態では、鎖中のヌクレオシドはすべて、独立に2'-修飾ヌクレオシドである。ある種の実施形態では、鎖中のヌクレオシドの少なくとも80%は、2'-修飾ヌクレオシドである。さらなる実施形態では、各2'-修飾ヌクレオシドは、独立に、2'-アルコキシヌクレオシド(例えば、2'-メトキシヌクレオシド)である。さらなる実施形態では、鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドのうちの少なくとも1つは、2'-フルオロヌクレオシドである。さらなる実施形態では、鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシド又は12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドは、すべて独立に、2'-フルオロヌクレオシドである。さらなる実施形態では、鎖中の7番目、9番目及び/又は11番目のヌクレオシドは、2'-フルオロヌクレオシドである。一部の実施形態では、残りのヌクレオシドは、2'-アルコキシヌクレオシド(例えば、2'-メトキシヌクレオシド)である。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドを含むシード領域(例えば、イノシン)を含む鎖を含有してもよい。ある種の実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の2番目のヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の3番目のヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の4番目のヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の5番目のヌクレオシドである。特定の実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の6番目のヌクレオシドである。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む鎖を含有してもよい。一部の実施形態では、鎖は、1つ、2つ、3つ又は4つのみの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む。さらなる実施形態では、少なくとも1つ(例えば、1つ又は2つ)の立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖の6つの5'末端ヌクレオシドのうちの2つである、2つの連続するヌクレオシド間に位置する。さらなる実施形態では、少なくとも1つ(例えば、1つ又は2つ)の立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖の6つの3'末端ヌクレオシドのうちの2つである、2つの連続するヌクレオシド間に位置する。さらなる実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。さらなる実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の2番目のヌクレオシドと3番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。一部の実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の21番目のヌクレオシドと22番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。ある種の実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の22番目のヌクレオシドと23番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。特定の実施形態では、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、RPの立体化学的アイデンティティを有する。ある種の実施形態では、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、SPの立体化学的アイデンティティを有する。
【００１８】
さらなる実施形態では、鎖は、19個以上のヌクレオシドを含有する。さらなる実施形態では、鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個未満又は32個未満のヌクレオシド)を含む。
【００１９】
本発明はまた、RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含有するハイブリッド化ポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
ハイブリッド化ポリヌクレオチドでは、鎖の少なくとも1つは、式(I)である少なくとも1つの基に結合していてもよい。一部の実施形態では、パッセンジャー鎖は、本発明のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体であり、少なくとも1つの式(I)の基が、パッセンジャー鎖の5'末端、3'末端のヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している。他の実施形態では、鎖の少なくとも1つは、少なくとも1つの式(I)の基:
【００２１】
【化４】
2019532027.tif 000006
若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立にO又はSであり、
各X2は、独立にO、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数である)
に結合している。
【００２２】
式(I)の基は、本発明のポリヌクレオチド構築物又は本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物中の鎖(例えば、パッセンジャー鎖)の、5'末端、3'末端、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート及び/又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合していてもよい。一部の実施形態では、式(I)の基は、パッセンジャー鎖の3'末端に結合している。式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0とすることができる。
【００２３】
ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含む。同様に、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含む。
【００２４】
ある種の実施形態では、R1及びR2は、MOIETY中の同一原子に結合している。さらなる実施形態では、MOIETY、R1及びR2は、一緒になって、
【００２５】
【化５】
2019532027.tif 000007
を形成し、
式中、
R7は、R4に近位の酸素原子への結合であり、
R8は、鎖に近位の酸素原子への結合であり、
各m1、m2、m3及びm4は、独立に、0〜6の整数であり、
但し、式(Ia)中の四級炭素が、0個の原子、又は炭素及び水素以外の1個の原子に結合しており、m1、m2、m3及びm4の合計は10未満である。
【００２６】
一部の実施形態では、各X2は、独立に、O、S又はNHである(例えば、各X2は、独立に、O又はSである)。
【００２７】
特定の実施形態では、少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である。
【００２８】
ある種の実施形態では、鎖は、2位において、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ、置換されていてもよいC2〜12アルコキシアルキル、ハロゲン又はシアノにより置換されている少なくとも1つのヌクレオシドを含む。
【００２９】
本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの式(III)のヌクレオシド間脱塩基スペーサー:
【００３０】
【化６】
2019532027.tif 000008
(式中、
Lは糖アナログであり、
各X4は、独立にO又はSであり、
各X5は、独立にO、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)
により割り込まれた鎖を含むことができる。
【００３１】
一部の実施形態では、tは1である。さらなる実施形態では、R9はHである。さらなる実施形態では、X4は、O又はSである。さらなる実施形態では、X5はOである。特定の実施形態では、(x)は、2、3、4又は5である。ある種の実施形態では、(x)は、13、14、15又は16である。他の実施形態では、本構築物は、1つのみ又は2つのみのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有する。ある種の実施形態では、糖アナログは、置換されていてもよいC2〜6アルキレン、置換されていてもよいC2〜6アルケニレン、置換されていてもよいC5シクロアルカン-1,3-ジイル、置換されていてもよいC5シクロアルケン-1,3-ジイル、置換されていてもよい複素環-1,3-ジイル(例えば、置換されていてもよいピロリジン-2,5-ジイル、置換されていてもよいテトラヒドロフラン-2,5-ジイル又は置換されていてもよいテトラヒドロチオフェン-2,5-ジイル)又は置換されていてもよい(C1〜4アルキル)-(C3〜8シクロアルキレン)(例えば、置換されていてもよい(C1アルキル)-(C3シクロアルキレン))である。ある種の実施形態では、糖アナログは、
【００３２】
【化７】
2019532027.tif 000009
(式中、
R12は、式(III)中の-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合であり、
R13は、式(III)中の別の-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合であり、
各R14及びR15は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル又は-(CH2)t1-ORZであり、nは、1〜6の整数であり、RZは、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル又は置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキルである)
からなる群から選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、R14及びR15の少なくとも1つは、Hではない。
【００３４】
本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含有する鎖を含有してもよい。他の実施形態では、鎖中のヌクレオシドはすべて、独立に2'-修飾ヌクレオシドである。ある種の実施形態では、鎖中のヌクレオシドの少なくとも80%は、2'-修飾ヌクレオシドである。さらなる実施形態では、各2'-修飾ヌクレオシドは、独立に、2'-アルコキシヌクレオシド(例えば、2'-メトキシヌクレオシド)である。さらなる実施形態では、鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドのうちの少なくとも1つは、2'-フルオロヌクレオシドである。さらなる実施形態では、鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシド又は12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドは、すべて独立に、2'-フルオロヌクレオシドである。さらなる実施形態では、鎖中の7番目、9番目及び/又は11番目のヌクレオシドは、2'-フルオロヌクレオシドである。一実施形態では、ある鎖において、該鎖中の2番目、12番目、14番目及び/又は16番目のヌクレオシドは、2'-フルオロヌクレオシドであり、他の鎖において、該鎖中の7番目、9番目及び/又は11番目のヌクレオシドは、2'-フルオロヌクレオシドである。一部の実施形態では、残りのヌクレオシドは、2'-アルコキシヌクレオシド(例えば、2'-メトキシヌクレオシド)である。
【００３５】
本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチドは、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドを含むシード領域(例えば、イノシン)を含む鎖を含有してもよい。ある種の実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の2番目のヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の3番目のヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の4番目のヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の5番目のヌクレオシドである。特定の実施形態では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の6番目のヌクレオシドである。
【００３６】
本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む鎖を含有してもよい。一部の実施形態では、鎖は、1つ、2つ、3つ又は4つのみの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む。さらなる実施形態では、少なくとも1つ(例えば、1つ又は2つ)の立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖の6つの5'末端ヌクレオシドのうちの2つである、2つの連続するヌクレオシド間に位置する。さらなる実施形態では、少なくとも1つ(例えば、1つ又は2つ)の立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖の6つの3'末端ヌクレオシドのうちの2つである、2つの連続するヌクレオシド間に位置する。さらなる実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。さらなる実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の2番目のヌクレオシドと3番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。一部の実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の21番目のヌクレオシドと22番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。ある種の実施形態では、1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、鎖内の22番目のヌクレオシドと23番目のヌクレオシドとの間で共有結合している。特定の実施形態では、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、RPの立体化学的アイデンティティを有する。ある種の実施形態では、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートは、SPの立体化学的アイデンティティを有する。
【００３７】
さらなる実施形態では、鎖は、19個以上のヌクレオシドを含有する。さらなる実施形態では、鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個未満又は32個未満のヌクレオシド)を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、鎖は、1〜5つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。ある種の実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の2番目のヌクレオシド及び3番目のヌクレオシドを接続している。特定の実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の5番目のヌクレオシド及び6番目のヌクレオシドを接続している。さらなる実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の17番目のヌクレオシド及び18番目のヌクレオシドを接続している。さらなる実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の19番目のヌクレオシド及び20番目のヌクレオシドを接続している。さらなる実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の20番目のヌクレオシド及び21番目のヌクレオシドを接続している。他の実施形態では、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している。さらに他の実施形態では、鎖は、1つ以上のヌクレオシド間ホスホネートを含有する。さらに他の実施形態では、1つ以上のヌクレオシド間ホスホネートは、鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している。
【００３９】
特定の実施形態では、鎖は、10個以上のヌクレオシド(例えば、15個以上のヌクレオシド又は19個以上のヌクレオシド)を含有する。ある種の実施形態では、鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個以下のヌクレオシド、40個以下のヌクレオシド又は32個以下のヌクレオシド)を含有する。さらなる実施形態では、鎖は、15〜50個のヌクレオシド(例えば、15〜40個のヌクレオシド、19〜40個のヌクレオシド、15〜32個のヌクレオシド又は19〜32個のヌクレオシド)を含有する。
【００４０】
一部の実施形態では、鎖は、少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている。
【００４１】
ある種の実施形態では、鎖は、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含有する(例えば、鎖中のヌクレオシドはすべて、独立に2'-修飾ヌクレオシドである)。
【００４２】
一部の実施形態では、少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である。
【００４３】
特定の実施形態では、鎖の少なくとも1つは、少なくとも1つのホスホロジチオエート、又は少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有する。ある種の実施形態では、鎖の少なくとも1つは、少なくとも1つのヌクレオシドを含有し、2'-修飾ヌクレオシドである。
【００４４】
さらなる実施形態では、少なくとも1つの-LinkA(-T)pは、式(II)(例えば、各-LinkA(-T)pは、独立に、式(II)である):
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p
(II)
(式中、
各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
Q1は、コンジュゲートリンカーであり、
Q2は、pが1である場合は直鎖基であり、又はpが2〜6の整数である場合は分岐基であり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC6〜10アリーレン、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖である)
である。
【００４５】
ある種の実施形態では、各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンである。特定の実施形態では、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは、式(II)中に存在する。他の実施形態では、Q1は-O-QL-QC-であり、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC1〜12アルキレン又は-(置換されていてもよいC1〜6アルキレン)-(置換されていてもよいC6〜10アリーレン)-(例えば、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜12アルキレン)であり、QCは、(i)-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-又は-N(H)-S(O)2-を含む、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、(ii)置換されていてもよいC1〜12ヘテロシクリレン;(iii)置換されていてもよいC1〜12チオヘテロシクリレン;(iv)シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル;又は(v)ピリド-2-イルヒドラゾンである。さらに他の実施形態では、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC1〜12アルキレンである。さらに他の実施形態では、Q1は、以下:
【００４６】
【化８】
2019532027.tif 000010
を含む。
【００４７】
さらに他の実施形態では、pは1であり、Q2は、式-[Q3-Q4-Q5]s-である直鎖基である。
【００４８】
一部の実施形態では、pは2〜6の整数であり、Q2は、式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2である分岐基であり、Q7は、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
式中、
p1は、0又は1であり、
p2は、0、1、2又は3であり、
p1が0である場合、LinkAは三価又は四価リンカーであり、
p1が1である場合、LinkAは四価、五価又は六価リンカーである。
【００４９】
ある種の実施形態では、少なくとも1つのTは、標的指向性部分である。特定の実施形態では、少なくとも1つのTは、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド、マンノース、フォレート、前立腺特異的膜抗原(PSMA)又は抗体又はその抗原結合性フラグメントである。さらなる実施形態では、少なくとも1つのTは、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである(例えば、少なくとも1つのTは、N-アセチルガラクトサミンである)。さらなる実施形態では、N-アセチルガラクトサミンは、LinkAに結合しているアノマー炭素を含み、アノマー炭素は、ヘミアミナール基の一部である。さらなる実施形態では、N-アセチルガラクトサミンのアノマー炭素は、アミド窒素原子に結合している。一部の実施形態では、少なくとも1つのTは、細胞膜透過ペプチド（cell penetrating peptide）である。ある種の実施形態では、少なくとも1つのTは、エンドソーム脱出部分である。
【００５０】
特定の実施形態では、少なくとも1つの式(I)の基は、5つの5'又は5つの3'末端ヌクレオシドの1つであるヌクレオシドに連結している。他の実施形態では、鎖は、1つ、2つ、3つ又は4つの式(I)の基に結合しており、式(I)の基は、同一である又は異なる。
【００５１】
さらなる実施形態では、鎖は、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有している。
【００５２】
一部の実施形態では、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、置換されていてもよいC2〜16アルキル;置換されていてもよいC3〜16アルケニル;置換されていてもよいC3〜16アルキニル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルケニル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び以下の構造の基:
【００５３】
【化９】
2019532027.tif 000011
(式中、
Lは、C2〜6アルキレンであり、
Rbは、置換されていてもよいC2〜6アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び-OH、C1〜6アルコキシ又は-COOHが末端であるポリ(エチレングリコール)であり、
Rcは、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から独立に選択される、置換基により置換されているホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートである。
【００５４】
他の実施形態では、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、
C2〜16アルキル、
【００５５】
【化１０】
2019532027.tif 000012
又は
【００５６】
【化１１】
2019532027.tif 000013
とアジド含有基質との環化付加反応によって形成される基である置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートであり、
式中、
tは、1〜6の整数であり、
Rdは、置換されていてもよいC6アリール;1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である置換されていてもよいC4〜5ヘテロアリール;又は1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である置換されていてもよいC4〜5ヘテロシクリルであり、
Reは、H又はC1〜6アルキルであり、
X3は、ハロゲン、-COOR5又は-CONR62であり、各R5及びR6は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール又は置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであり、
アジド含有基質は、
【００５７】
【化１２】
2019532027.tif 000014
である。
【００５８】
一部の実施形態では、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1〜6つの式(I)の基を含有しており、式(I)の基は、同一である又は異なる。ある種の実施形態では、パッセンジャー鎖は、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。特定の実施形態では、ガイド鎖は、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。さらなる実施形態では、ガイド鎖は、1〜5つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。さらなる実施形態では、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、ガイド鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している。さらなる実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の2番目のヌクレオシド及び3番目のヌクレオシドを接続している。他の実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つは、ガイド鎖の5番目及び6番目のヌクレオシドを接続している。さらに他の実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の17番目のヌクレオシド及び18番目のヌクレオシドを接続している。さらに他の実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つは、ガイド鎖の19番目のヌクレオシド及び20番目のヌクレオシドを接続している。ある種の実施形態では、生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つは、ガイド鎖の20番目のヌクレオシド及び21番目のヌクレオシドを接続している。特定の実施形態では、パッセンジャー鎖は、1〜5つの生物非可逆性ホスホトリエステルを含有する。一部の実施形態では、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、パッセンジャー鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している。
【００５９】
さらなる実施形態では、パッセンジャー鎖又はガイド鎖は、少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている。さらなる実施形態では、ガイド鎖は、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている。さらなる実施形態では、パッセンジャー鎖は、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている。
【００６０】
一部の実施形態では、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖は、1つ以上のホスホネートを含有する。
【００６１】
特定の実施形態では、ガイド鎖は、10個以上のヌクレオシド(例えば、15個以上のヌクレオシド又は19個以上のヌクレオシド)を含有する。ある種の実施形態では、ガイド鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個以下のヌクレオシド、40個以下のヌクレオシド又は32個以下のヌクレオシド)を含有する。さらなる実施形態では、ガイド鎖は、15〜50個のヌクレオシド(例えば、15〜40個のヌクレオシド、19〜40個のヌクレオシド、15〜32個のヌクレオシド又は19〜32個のヌクレオシド)を含有する。
【００６２】
さらなる実施形態では、パッセンジャー鎖は、10個以上のヌクレオシド(例えば、15個以上のヌクレオシド又は19個以上のヌクレオシド)を含有する。さらなる実施形態では、パッセンジャー鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個以下のヌクレオシド、40個以下のヌクレオシド又は32個以下のヌクレオシド)を含有する。さらなる実施形態では、パッセンジャー鎖は、15〜50個のヌクレオシド(例えば、15〜40個のヌクレオシド、19〜40個のヌクレオシド、15〜32個のヌクレオシド又は19〜32個のヌクレオシド)を含有する。
【００６３】
ある種の実施形態では、パッセンジャー鎖の3'末端は、ガイド鎖の5'末端にハイブリッド化されて、ブラントを形成する。
【００６４】
本発明は、細胞を本発明のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体、或いは本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体と接触させることにより、ポリヌクレオチド構築物を細胞に送達する方法であって、接触後にポリヌクレオチド構築物が細胞内部に存在している方法がさらに提供される。
【００６５】
本発明はまた、細胞を本発明のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体、或いは本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物又はその立体異性体と接触させることにより、細胞におけるタンパク質の発現を低減する方法であって、接触後に細胞中のタンパク質の発現が低減される方法が提供される。
【００６６】
本発明は、式(IV)の化合物:
【００６７】
【化１３】
2019532027.tif 000015
(式中、
各R1及びR2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、又はコンジュゲート部分であり、
各R16は、独立に、ジアルキルアミノ、2-シアノエチル又はコンジュゲート部分であり、但し、少なくとも1つのR16はジアルキルアミノであり、
R17はヒドロキシル保護基であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれが、独立に、0〜6の整数であり、但し、m1及びm2の合計が0ではなく、
R1及びR2のどちらも、置換されていてもよいC2〜16アルキニルを含有するコンジュゲート部分である場合、R16は、ジアルキルアミノ又はコンジュゲート部分である)
を提供する。
【００６８】
ある種の実施形態では、R1及びR2の少なくとも1つは、コンジュゲート部分である。
【００６９】
一部の実施形態では、m1は、0又は1である。さらなる実施形態では、m2は、0又は1である。
【００７０】
特定の実施形態では、R1は、H又はコンジュゲート部分であり、
コンジュゲート部分は、[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
式中、
QC1は、-COOR21又は-CHOを含有する置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【００７１】
【化１４】
2019532027.tif 000016
若しくはそのN-保護変形体(N-protected version)
【００７２】
【化１５】
2019532027.tif 000017
であり、各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲンであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である。
【００７３】
ある種の実施形態では、R1中のQ3は-O-である。さらなる実施形態では、R1中のQ4は、存在しない又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、R1中のQ5は存在しない。
【００７４】
さらなる実施形態では、R2は、H又はコンジュゲート部分であり、コンジュゲート部分は、[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
QC1は、-COOR21又は-CHOを含有する置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【００７５】
【化１６】
2019532027.tif 000018
若しくはそのN-保護変形体
【００７６】
【化１７】
2019532027.tif 000019
であり、各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲンであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である。
【００７７】
さらなる実施形態では、R2中のQ3は-O-である。特定の実施形態では、R2中のQ4は、存在しない又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、R2中のQ5は存在しない。
【００７８】
定義
用語「約」は、本明細書で使用する場合、列挙された値の±10%となる値を表す。
【００７９】
用語「活性化カルボニル」とは、本明細書で使用する場合、-C(O)RAの式を有する官能基を表し、RAは、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ、置換されていてもよいC6〜10アリールオキシ、置換されていてもよいC2〜9ヘテロアリールオキシ(例えば、1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)、置換されていてもよいC2〜C9ヘテロシクリルオキシ(例えば、-OSu)、置換されていてもよいピリジニウム(例えば、4-ジメチルアミノピリジニウム)又は-N(OMe)Meである。
【００８０】
用語「活性化リン中心」は、本明細書で使用する場合、三価のリン(III)中心又は五価のリン(V)中心を表し、置換基の少なくとも1つは、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ、置換されていてもよいC6〜10アリールオキシ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、テトラホスフェート、置換されていてもよいピリジニウム(例えば、4-ジメチルアミノピリジニウム)又は置換されていてもよいアンモニウムである。
【００８１】
用語「活性化ケイ素中心」は、本明細書で使用する場合、四置換ケイ素中心を表し、置換基の少なくとも1つは、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ又はアミノである。
【００８２】
用語「活性化硫黄中心」は、本明細書で使用する場合、四価硫黄を表し、置換基の少なくとも1つは、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ、置換されていてもよいC6〜10アリールオキシ、ホスエート、ジホスフェート、トリホスフェート、テトラホスフェート、置換されていてもよいピリジニウム(例えば、4-ジメチルアミノピリジニウム)又は置換されていてもよいアンモニウムである。
【００８３】
用語「アルカン-テトライル」とは、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、1〜16個の炭素を有する、四価の非環式、直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルカン-テトライルは、アルキルについて記載される通り、場合により置換されていてもよい。
【００８４】
用語「アルカン-トリイル」とは、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、1〜16個の炭素を有する、三価の非環式、直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルカン-トリイルは、アルキルについて記載される通り、場合により置換されていてもよい。
【００８５】
用語「アルカノイル」は、本明細書で使用する場合、カルボニル基から親分子の基に結合しており、ホルミル(すなわち、カルボキシアルデヒド基)、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリルなどにより例示される水素又はアルキル基(例えば、ハロアルキル基)を表す。例示的な無置換アルカノイル基は、1〜7個の炭素を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載されている通り、1つ、2つ、3つ又は4つの置換基によりさらに置換されている。
【００８６】
用語「(Cx1〜y1アリール)-Cx2〜y2-アルキル」は、本明細書で使用する場合、X2〜y2個の炭素原子からなるアルキレン基を介して親分子基に結合している、x1〜y1個の炭素原子からなるアリール基を表す。例示的な無置換(Cx1〜y1アリール)-Cx2〜y2-アルキル基は、7〜16個の炭素である。一部の実施形態では、各アルキレン及びアリールは、個々の基に関して、本明細書で定義されている通り、1つ、2つ、3つ又は4つの置換基によりさらに置換され得る。「アルキル」が後続する他の基は、同じ方法で定義され、「アルキル」とは、特に明記されていない限り、C1〜6アルキレンを指し、結合している化学構造は、本明細書で定義されている通りである。
【００８７】
用語「アルケニル」は、本明細書で使用する場合、1つ、2つ又は3つの炭素-炭素二重結合を含有する、一価の直鎖又は分岐鎖非環式炭化水素基を表す。アルケニル基の非限定例には、エテニル、プロパ-1-エニル、プロパ-2-エニル、1-メチルエテニル、ブタ-1-エニル、ブタ-2-エニル、ブタ-3-エニル、1-メチルプロパ-1-エニル、2-メチルプロパ-1-エニル及び1-メチルプロパ-2-エニルが含まれる。アルケニル基は、本明細書で定義されているアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、及びアルキルに関して記載されている置換基からなる群から独立に選択される、1つ、2つ、3つ又は4つの置換基により場合により置換されていてもよい。
【００８８】
用語「アルケニレン」とは、本明細書で使用する場合、1個の水素が除去され、これによりこの基を二価にする、直鎖又は分岐鎖アルケニル基を指す。本明細書において定義されているアルケニレンの原子価は、任意選択の置換基を含まない。アルケニレン基の非限定例には、エテン-1,1-ジイル;エテン-1,2-ジイル;プロパ-1-エン-1,1-ジイル、プロパ-2-エン-1,1-ジイル;プロパ-1-エン-1,2-ジイル、プロパ-1-エン-1,3-ジイル;プロパ-2-エン-1,1-ジイル;プロパ-2-エン-1,2-ジイル;ブタ-1-エン-1,1-ジイル;ブタ-1-エン-1,2-ジイル;ブタ-1-エン-1,3-ジイル;ブタ-1-エン-1,4-ジイル;ブタ-2-エン-1,1-ジイル;ブタ-2-エン-1,2-ジイル;ブタ-2-エン-1,3-ジイル;ブタ-2-エン-1,4-ジイル;ブタ-2-エン-2,3-ジイル;ブタ-3-エン-1,1-ジイル;ブタ-3-エン-1,2-ジイル;ブタ-3-エン-1,3-ジイル;ブタ-3-エン-2,3-ジイル;ブタ-1,2-ジエン-1,1-ジイル;ブタ-1,2-ジエン-1,3-ジイル;ブタ-1,2-ジエン-1,4-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,1-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,2-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,3-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,4-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-2,3-ジイル;ブタ-2,3-ジエン-1,1-ジイル;及びブタ-2,3-ジエン-1,2-ジイルが含まれる。アルケニレン基は、アルケニル基に関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)アルケニレン)。
【００８９】
用語「アルコキシ」は、本明細書で使用する場合、式-ORである化学置換基を表し、Rは、別段の指定がない限り、C1〜6アルキル基である。一部の実施形態では、アルキル基は、アルキル基に関して記載されている方法でさらに置換され得る。
【００９０】
用語「アルキル」とは、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、1〜16個の炭素を有する、非環式、直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルキル基は、メチル;エチル;n-及びイソ-プロピル;n-、sec-、イソ-及びtert-ブチル;ネオペンチルなどにより例示され、(1)アルコキシ;(2)アルキルスルフィニル;(3)アミノ;(4)アリールアルコキシ;(5)(アリールアルキル)アザ;(6)アジド;(7)ハロ;(8)(ヘテロシクリル)オキシ;(9)(ヘテロシクリル)アザ;(10)ヒドロキシ;(11)ニトロ;(12)オキソ;(13)アリールオキシ;(14)スルフィド;(15)チオアルコキシ;(16)チオール;(17)アルカノイル;(18)-CO2RA(RAは、(a)アルキル、(b)アリール、(c)水素及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される);(19)-C(O)NRBRC(RB及びRCのそれぞれは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリール-アルキレンからなる群から独立に選択される);(20)-SO2RD(RDは、(a)アルキル、(b)アリール及び(c)アリール-アルキレンからなる群から選択される);(21)-SO2NRERF(RE及びRFのそれぞれは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から独立に選択される);(22)シリル;(23)シアノ;及び(24)-S(O)RH(RHは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される)からなる群から独立に選択される、1つ、2つ若しくは3つの置換基、又は2個以上の炭素からなるアルキル基の場合、4つの置換基により場合により置換されていてもよい。一部の実施形態では、これらの各基は、本明細書に記載されている通り、さらに置換され得る(例えば、無置換置換基による)。
【００９１】
用語「アルキルアミノ」とは、本明細書で使用する場合、-N(RN1)2を指し、各RN1は、独立に、H又はアルキルであり、但し、少なくとも1つのRN1はアルキルである。アルキルアミノは、場合により置換されていてもよい。置換されていてもよいアルキルアミノ中の各アルキルは、アルキルについて記載されている通り、独立に置換されていてもよい。
【００９２】
用語「アルキレン」とは、本明細書で使用する場合、2個の水素原子の除去によって直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素から誘導される、二価の飽和炭化水素基を指す。本明細書において定義されているアルキレンの原子価は、任意選択の置換基を含まない。アルキレン基の非限定例には、メチレン、エタン-1,2-ジイル、エタン-1,1-ジイル、プロパン-1,3-ジイル、プロパン-1,2-ジイル、プロパン-1,1-ジイル、プロパン-2,2-ジイル、ブタン-1,4-ジイル、ブタン-1,3-ジイル、ブタン-1,2-ジイル、ブタン-1,1-ジイル及びブタン-2,2-ジイル、ブタン-2,3-ジイルが含まれる。用語「Cx〜yアルキレン」は、x個とy個の間の炭素を有する、アルキレン基を表す。xに関する例示的な値は、1、2、3、4、5及び6であり、yに関する例示的な値は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12である。一部の実施形態では、アルキレンは、アルキル基に関して本明細書で定義されている通り、1つ、2つ、3つ又は4つの置換基によりさらに置換され得る。同様に、接尾語「エン」は、本明細書で定義されている、対応する一価ラジカルの二価ラジカルを表す。例えば、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アリールアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、シクロアルケニレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロシクリレン及びヘテロシクリルアルキレンは、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル及びヘテロシクリルアルキルの二価形態である。アリールアルキレン、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアリールアルキレン及びヘテロシクリルアルキレンの場合、これらの基中の2つの原子価は、非環式部分だけに位置していてもよく、又は環式部分に1つ及び非環式部分に1つ位置していてもよい。例えば、アリール-C1-アルキレン又はヘテロシクリル-C1-アルキレンのアルキレン基は、オキソ基によりさらに置換されて、それぞれ、アリールオイル及び(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
【００９３】
用語「アルキレンオキシ」とは、本明細書で使用する場合、二価の基-R-O-を指し、Rはアルキレンである。アルキレンオキシ中のアルキレンは、アルキルに関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)アルキレンオキシ)。
【００９４】
用語「アルキニル」は、本明細書で使用する場合、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含有する、2〜16個の炭素原子からなる一価の直鎖又は分岐鎖炭化水素基を表し、エチニル、1-プロピニルなどにより例示される。アルキニル基は、本明細書で記載されている通り、アリール、アルケニル、シクロアルキル及びヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、並びにアルキルに関して記載されている置換基から独立に選択される、1つ、2つ、3つ又は4つの置換基により場合により置換されていてもよい。
【００９５】
用語「アルキニレン」とは、本明細書で使用する場合、1つ又は2つの炭素-炭素三重結合を含み、かつ無置換の場合、C及びHのみを含有する、二価の直鎖又は分岐鎖置換基を指す。無置換アルキニレンは、別段の指定がない限り、2〜16個の炭素原子を含有する。本明細書において定義されているアルキニレンの原子価は、任意選択の置換基を含まない。アルケニレン基の非限定例には、エチン-1,2-ジイル;プロパ-1-イン-1,3-ジイル;プロパ-2-イン-1,1-ジイル;ブタ-1-イン-1,3-ジイル;ブタ-1-イン-1,4-ジイル;ブタ-2-イン-1,1-ジイル;ブタ-2-イン-1,4-ジイル;ブタ-3-イン-1,1-ジイル;ブタ-3-イン-1,2-ジイル;ブタ-3-イン-2,2-ジイル;及びブタ-1,3-ジイン-1,4-ジイルが含まれる。アルキニレン基は、アルキニル基に関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)アルキニレン)。
【００９６】
用語「アミノ」は、本明細書で使用する場合、-N(RN1)2を表し、アミノが無置換である場合、RN1はどちらもHであるか、又はアミノが置換されている場合、各RN1は、独立に、H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル又はヘテロシクリルであり、但し、少なくとも1つのRN1はHではなく、各RN2は、独立に、H、アルキル又はアリールである。置換基の各々は、それ自体無置換であってもよく、又はそれぞれ個々の基に関して本明細書に定義されている無置換置換基により置換されていてもよい。一部の実施形態では、アミノは、無置換アミノ(すなわち、-NH2)又は置換アミノ(例えば、-NHRN1)であり、RN1は、独立に、-OH、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、置換されていてもよいアルキル又は置換されていてもよいアリールであり、各RN2は、置換されていてもよいアルキル又は置換されていてもよいアリールとすることができる。一部の実施形態では、置換アミノは、アルキルアミノであってもよく、アルキル基は、アルキルに関して本明細書に記載されている通り、置換されていてもよい。ある種の実施形態では、アミノ基は-NHRN1であり、RN1は、置換されていてもよいアルキルである。RN1が置換されていてもよいアルキルである、-NHRN1の非限定例には、置換されていてもよいアルキルアミノ、タンパク質構成アミノ酸、非タンパク質構成アミノ酸、タンパク質構成アミノ酸のC1〜6アルキルエステル及び非タンパク質構成アミノ酸のC1〜6アルキルエステルが含まれる。
【００９７】
用語「アミノアルキル」は、本明細書で使用する場合、式-R'-R"である化学置換基を表し、R'はアルキレンであり、R"はアミノである。アミノアルキルは、2つの部分の各々に関して定義されている通り、場合により置換されていてもよい。
【００９８】
用語「アレーン-テトライル」は、本明細書で使用する場合、アリール基中の3個の水素原子が原子価により置き換えられることにより形成される四価の基を表す。アレーン-テトライルは、アリールについて記載される通り、場合により置換され得る。
【００９９】
用語「アリール」とは、本明細書で使用する場合、1つ又は2つの芳香族環を有する、単環式、二環式又は多環式炭素環式環系を表し、フェニル、ナフチル、1,2-ジヒドロナフチル、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどによって例示され、(1)アルカノイル(例えば、ホルミル、アセチルなど);(2)アルキル(例えば、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アミノアルキル、アジドアルキル、アシルアルキル、ハロアルキル(例えば、パーフルオロアルキル)、ヒドロキシアルキル、ニトロアルキル又はチオアルコキシアルキル);(3)アルケニル;(4)アルキニル;(5)アルコキシ(例えば、パーフルオロアルコキシ);(6)アルキルスルフィニル;(7)アリール;(8)アミノ;(9)アリールアルキル;(10)アジド;(11)シクロアルキル;(12)シクロアルキルアルキル;(13)シクロアルケニル;(14)シクロアルケニルアルキル;(15)ハロ;(16)ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール);(17)(ヘテロシクリル)オキシ;(18)(ヘテロシクリル)アザ;(19)ヒドロキシ;(20)ニトロ;(21)チオアルコキシ;(22)-(CH2)qCO2RA(qは、0〜4の整数であり、RAは、(a)アルキル、(b)アリール、(c)水素及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される);(23)-(CH2)qCONRBRC(qは、0〜4の整数であり、RB及びRCは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から独立に選択される);(24)-(CH2)qSO2RD(qは0〜4の整数であり、RDは、(a)アルキル、(b)アリール及び(c)アリールアルキルからなる群から選択される);(25)-(CH2)qSO2NRERF(qは、0〜4の整数であり、RE及びRFのそれぞれは、独立に、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される);(26)チオール;(27)アリールオキシ;(28)シクロアルコキシ;(29)アリールアルコキシ;(30)ヘテロシクリルアルキル(例えば、ヘテロアリールアルキル);(31)シリル;(32)シアノ;及び(33)-S(O)RH(RHは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される)からなる群から独立に選択される、1つ、2つ、3つ、4つ又は5つの置換基により場合により置換されていてもよい。一部の実施形態では、これらの各基は、本明細書に記載されている通り、さらに置換され得る(例えば、無置換置換基による)。
【０１００】
用語「アリールアルキル」は、本明細書で使用する場合、アリール基により置換されているアルキル基を表す。各アリール部分及びアルキル部分は、個々の基に関して記載されている通り、独立に無置換であってもよく、又は置換(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)アリールアルキル)されていてもよい。
【０１０１】
用語「補助部分」とは、本明細書で使用する場合、標的指向性部分(例えば、細胞-表面受容体リガンド)、ペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正に帯電しているポリマー又はエンドソーム脱出部分である部分を指し、これらは、本明細書において開示されているポリヌクレオチド構築物にコンジュゲートされ得る。特定の補助部分に関する名称は、遊離分子を意味することがあるが、特定の補助部分の名称が一価の基を含むことが理解されよう。当業者は、ポリヌクレオチド構築物への特定の補助部分の結合の適切な結合点を容易に理解するであろう。
【０１０２】
用語「アザ」は、本明細書で使用する場合、二価の-N(RN1)-基又は三価の-N=基を表す。アザ基は無置換であってもよく、RN1はHである、若しくは存在しない、又は置換されており、RN1は、「アミノ」に関して定義されている通りである。アザはまた、「N」、例えば「置換されていてもよいN」と称することができる。2つのアザ基が接続して「ジアザ」を形成してもよい。
【０１０３】
用語「アジド」とは、本明細書で使用する場合、N3基を表す。
【０１０４】
用語「炭素環式」は、本明細書で使用する場合、置換されていてもよいC3〜12単環式、二環式又は三環式構造を表し、この場合、これらの環は、芳香族又は非芳香族であってもよく、炭素原子により形成される。炭素環式構造には、シクロアルキル基、シクロアルケニル基及びアリール基が含まれる。
【０１０５】
用語「炭水化物」は、本明細書で使用する場合、各炭素原子に結合している、酸素原子、窒素原子、ハロゲン原子又は硫黄原子を含む、1〜7個の炭素原子(これは、直鎖状、分岐状又は環式とすることができる)を有する、単糖を表す。炭水化物の非限定例には、マンノース、ガラクトース、ガラクトサミン及びN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)が含まれる。
【０１０６】
用語「カルボニル」とは、本明細書で使用する場合、C(O)基を表す。「カルボニル」を含有する官能基の例には、エステル、ケトン、アルデヒド、無水物、アシル塩化物、アミド、カルボン酸及びカルボン酸エステルが含まれる。
【０１０７】
ポリヌクレオチドを参照する用語「相補性」とは、本明細書で使用する場合、ワトソンクリック相補性を意味する。
【０１０８】
用語「環化付加反応」は、本明細書で使用する場合、活性化されていない、化学触媒により活性化されている、又は熱的エネルギーを使用して活性化されている場合のいずれかの時に、[4n+2]個のπ電子(nは、1、2又は3である)が結合形成に関与する、2つの構成成分の反応を表す。環化付加反応はまた、光化学的活性化される、[4n]個のπ電子(nは、1、2又は3である)が関与する、2つの構成成分の反応でもある。望ましくは、[4n+2]個のπ電子が、結合形成に関与し、n=1である。代表的な環化付加反応は、アルケンと1,3-ジエンとの反応(ディールスアルダー反応)、アルケンとα,β-不飽和カルボニルとの反応(ヘテロディールスアルダー反応)、及びアルキンとアジド化合物との反応(例えば、Huisgen環化付加)が含まれる。
【０１０９】
用語「シクロアルカン-テトライル」は、本明細書で使用する場合、シクロアルキル基中の3個の水素原子が原子価により置き換えられていることにより形成される四価の基を表す。シクロアルカン-テトライルは、シクロアルキルについて記載される通り、場合により置換され得る。
【０１１０】
用語「シクロアルケニル」とは、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、3〜10個の炭素を有する非芳香族炭素環式基(例えば、C3〜C10シクロアルキレン)を指す。シクロアルケニルの非限定例には、シクロプロパ-1-エニル、シクロプロパ-2-エニル、シクロブタ-1-エニル、シクロブタ-1-エニル、シクロブタ-2-エニル、シクロペンタ-1-エニル、シクロペンタ-2-エニル、シクロペンタ-3-エニル、ノルボルネン-1-イル、ノルボルネン-2-イル、ノルボルネン-5-イル及びノルボルネン-7-イルが含まれる。シクロアルケニル基は、シクロアルキルに関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)シクロアルケニル)。
【０１１１】
用語「シクロアルケニレン」とは、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、3〜10個の炭素を有する二価の炭素環式非芳香族基(例えば、C3〜C10シクロアルケニレン)を指す。シクロアルケニレンの非限定例には、シクロプロパ-1-エン-1,2-ジイル;シクロプロパ-2-エン-1,1-ジイル;シクロプロパ-2-エン-1,2-ジイル;シクロブタ-1-エン-1,2-ジイル;シクロブタ-1-エン-1,3-ジイル;シクロブタ-1-エン-1,4-ジイル;シクロブタ-2-エン-1,1-ジイル;シクロブタ-2-エン-1,4-ジイル;シクロペンタ-1-エン-1,2-ジイル;シクロペンタ-1-エン-1,3-ジイル;シクロペンタ-1-エン-1,4-ジイル;シクロペンタ-1-エン-1,5-ジイル;シクロペンタ-2-エン-1,1-ジイル;シクロペンタ-2-エン-1,4-ジイル;シクロペンタ-2-エン-1,5-ジイル;シクロペンタ-3-エン-1,1-ジイル;シクロペンタ-1,3-ジエン-1,2-ジイル;シクロペンタ-1,3-ジエン-1,3-ジイル;シクロペンタ-1,3-ジエン-1,4-ジイル;シクロペンタ-1,3-ジエン-1,5-ジイル;シクロペンタ-1,3-ジエン-5,5-ジイル;ノルボルナジエン-1,2-ジイル;ノルボルナジエン-1,3-ジイル;ノルボルナジエン-1,4-ジイル;ノルボルナジエン-1,7-ジイル;ノルボルナジエン-2,3-ジイル;ノルボルナジエン-2,5-ジイル;ノルボルナジエン-2,6-ジイル;ノルボルナジエン-2,7-ジイル;及びノルボルナジエン-7,7-ジイルが含まれる。シクロアルケニレンは、シクロアルキルに関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)シクロアルケニレン)。
【０１１２】
用語「シクロアルキル」とは、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、3〜10個の炭素を有する環式アルキル基(例えば、C3〜C10シクロアルキル)を指す。シクロアルキル基は、単環式又は二環式とすることができる。二環式シクロアルキル基は、ビシクロ[p.q.0]アルキルタイプとすることができ、この場合、各p及びqは、独立に、1、2、3、4、5、6又は7であり、但し、p及びqの合計は、2、3、4、5、6、7又は8である。代替的に、二環式シクロアルキル基は、架橋シクロアルキル構造、例えばビシクロ[p.q.r]アルキルを含むことができ、この場合、rは1、2又は3であり、各p及びqは、独立に、1、2、3、4、5又は6であり、但し、p、q及びrの合計は、3、4、5、6、7又は8である。シクロアルキル基は、スピロ環式基、例えば、スピロ[p.q]アルキルとすることができ、各p及びqは、独立に、2、3、4、5、6又は7であり、但し、p及びqの合計は、4、5、6、7、8又は9である。シクロアルキルの非限定例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、1-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、2-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、5-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、7-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル及びデカリニルが含まれる。シクロアルキル基は、本明細書で定義されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)シクロアルキル)。本開示のシクロアルキル基は、以下:(1)アルカノイル(例えば、ホルミル、アセチルなど);(2)アルキル(例えば、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アミノアルキル、アジドアルキル、アシルアルキル、ハロアルキル(例えば、パーフルオロアルキル)、ヒドロキシアルキル、ニトロアルキル又はチオアルコキシアルキル);(3)アルケニル;(4)アルキニル;(5)アルコキシ(例えば、パーフルオロアルコキシ);(6)アルキルスルフィニル;(7)アリール;(8)アミノ;(9)アリールアルキル;(10)アジド;(11)シクロアルキル;(12)シクロアルキルアルキル;(13)シクロアルケニル;(14)シクロアルケニルアルキル;(15)ハロ;(16)ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール);(17)(ヘテロシクリル)オキシ;(18)(ヘテロシクリル)アザ;(19)ヒドロキシ;(20)ニトロ;(21)チオアルコキシ;(22)-(CH2)qCO2RA(qは、0〜4の整数であり、RAは、(a)アルキル、(b)アリール、(c)水素及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される);(23)-(CH2)qCONRBRC(qは、0〜4の整数であり、RB及びRCは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から独立に選択される);(24)-(CH2)qSO2RD(qは0〜4の整数であり、RDは、(a)アルキル、(b)アリール及び(c)アリールアルキルからなる群から選択される);(25)-(CH2)qSO2NRERF(qは、0〜4の整数であり、RE及びRFのそれぞれは、独立に、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される);(26)チオール;(27)アリールオキシ;(28)シクロアルコキシ;(29)アリールアルコキシ;(30)ヘテロシクリルアルキル(例えば、ヘテロアリールアルキル);(31)シリル;(32)シアノ;及び(33)-S(O)RH(RHは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリールアルキルからなる群から選択される)により場合により置換され得る。一部の実施形態では、これらの各基は、本明細書に記載されている通り、さらに置換され得る(例えば、無置換置換基による)。
【０１１３】
用語「シクロアルキレン」とは、本明細書で使用する場合、1個の水素原子が1つの価数により置き換えられている、本明細書で定義されている、シクロアルキルである二価の基を指す。シクロアルキレンは、シクロアルキルに関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)シクロアルキレン)。
【０１１４】
用語「シクロアルキルアルキル」は、本明細書で使用する場合、シクロアルキル基により置換されているアルキル基を表す。各シクロアルキル部分及びアルキル部分は、個々の基に関して記載されている通り、独立に無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)シクロアルキルアルキル)。
【０１１５】
用語「ジアルキルアミノ」とは、本明細書で使用する場合、基-N(RN1)2を指し、各RN1は、独立に、アルキルである。ジアルキルアミノは、場合により置換されていてもよい。置換されていてもよいジアルキルアミノ中の各アルキルは、アルキルについて記載されている通り、独立に置換されていてもよい。
【０１１６】
用語「求電子剤」又は「求電子性基」は、本明細書で使用する場合、電子が豊富な中心に結合している官能基であって、1つ以上の共有結合を形成するよう、1つ以上の求核剤から一対の電子を受容することが可能な官能基を表す。求電子剤には、以下に限定されないが、陽イオン、極性中性分子、アジド、活性化ケイ素中心、活性化カルボニル、ハロゲン化アルキル、アルキル擬似ハロゲン化物、エポキシド、電子不足アリール、活性化リン中心、及び活性化硫黄中心が含まれる。通常、遭遇した求電子剤には、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、カルボニル含有化合物(アルデヒドなど)、及び良好な脱離基に接続している原子(メシレート、トリフレート及びトシレートなど)が含まれる。
【０１１７】
用語「エンドソーム脱出部分」は、本明細書で使用する場合、エンドソーム脱出部分を欠如している点のみが異なる上記の参照分子と比べて、エンドソーム含有物の放出を増強する、又は細胞内区画(例えば、エンドソーム)からの分子の脱出を促進する部分を表す。
【０１１８】
用語「ハロ」は、本明細書で使用する場合、臭素、塩素、ヨウ素及びフッ素から選択されるハロゲンを表す。
【０１１９】
用語「ハロアルキル」とは、本明細書で使用する場合、ハロゲン基(すなわち、F、Cl、Br又はI)により置換されている、本明細書で定義されているアルキル基を表す。ハロアルキルは、1個、2個、3個のハロゲンによって、又は2個以上の炭素からなるアルキル基の場合、4個のハロゲンによって置換されていてもよく、又はハロゲン基がFである場合、ハロアルキル基は、パーフルオロアルキルとすることができる。一部の実施形態では、ハロアルキル基は、アルキル基に関して本明細書に記載されている通り、1つ、2つ、3つ又は4つの置換基によりさらに場合により置換され得る。
【０１２０】
用語「ヘテロアルカン-テトライル」とは、本明細書で使用する場合、1度、1個のヘテロ原子により;2度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により;3度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により、又は4度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により割り込まれているアルカン-テトライル基を指す。各ヘテロ原子は、独立に、O、N又はSである。一部の実施形態では、ヘテロ原子はO又はNである。無置換CX〜Yヘテロアルカン-テトライルは、X〜Y個の炭素原子、及び本明細書で定義されているヘテロ原子を含有する。ヘテロアルカン-テトライル基は、ヘテロアルキルに関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)ヘテロアルカン-テトライル)。
【０１２１】
用語「ヘテロアルカン-トリイル」とは、本明細書で使用する場合、1度、1個のヘテロ原子により;2度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により;3度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により、又は4度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により割り込まれているアルカン-トリイル基を指す。各ヘテロ原子は、独立に、O、N又はSである。一部の実施形態では、ヘテロ原子はO又はNである。無置換CX〜Yヘテロアルカン-トリイルは、X〜Y個の炭素原子、及び本明細書で定義されているヘテロ原子を含有する。ヘテロアルカン-トリイル基は、ヘテロアルキルに関して記載されている通り、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)ヘテロアルカン-トリイル)。
【０１２２】
用語「ヘテロアルキル」とは、本明細書で使用する場合、1度、1個のヘテロ原子により;2度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により;3度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により、又は4度、毎回独立に、1個のヘテロ原子により割り込まれているアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を指す。各ヘテロ原子は、独立に、O、N又はSである。一部の実施形態では、ヘテロ原子はO又はNである。無置換CX〜Yヘテロアルキルは、X〜Y個の炭素原子、及び本明細書で定義されているヘテロ原子を含有する。ヘテロアルキル基は、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)ヘテロアルキル)。ヘテロアルキルが置換されており、置換基が、ヘテロ原子に結合している場合、この置換基は、ヘテロ原子の性質及び原子価に従い選択される。したがって、置換基は、存在する場合、=O、-N(RN2)2、-SO2ORN3、-SO2RN2、-SORN3、-COORN3、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル又はシアノからなる群から選択される、原子価が許容するヘテロ原子に結合し、各RN2は、独立に、H、アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール又はヘテロシクリルであり、各RN3は、独立に、アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール又はヘテロシクリルである。これらの各置換基は、これ自体、無置換であってもよく、又はそれぞれ個々の基に関して本明細書に定義されている無置換置換基により置換されていてもよい。ヘテロアルキルが置換されており、置換基が炭素に結合している場合、置換基は、アルキルに関して記載されているものから選択され、但し、ヘテロ原子に結合している炭素原子上の置換基は、Cl、Br又はIではない。炭素原子は、ヘテロアルキル基の末端に見出されることが理解される。
【０１２３】
用語「ヘテロアリール」は、本明細書で使用する場合、本明細書で定義されている、ヘテロシクリルの部分集合を表し、少なくとも1個のヘテロ原子を含有する、芳香族環系を含む。したがって、ヘテロアリールは、単環式又は多環式環系内に、4n+2個のパイ電子を含む。ヘテロアリールは、ヘテロシクリルに関して定義されている通り、無置換とすることができるか、又は1つ、2つ、3つ若しくは4つの置換基により置換され得る(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)ヘテロアリール)。
【０１２４】
用語「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で使用する場合、ヘテロアリール基により置換されているアルキル基を表す。したがって、ヘテロアリールアルキルは、ヘテロシクリルが、ヘテロ原子を含む少なくとも1つの芳香族環系を含む、ヘテロシクリルアルキル基である。各ヘテロアリール部分及びアルキル部分は、個々の基に関して記載されている通り、独立に、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)ヘテロアリールアルキル)。
【０１２５】
用語「複素環-テトライル」は、本明細書で使用する場合、ヘテロシクリル基中の3個の水素原子が原子価により置き換えられることにより形成される四価の基を表す。複素環-テトライルは、ヘテロシクリルについて記載される通り、場合により置換され得る。
【０１２６】
用語「ヘテロシクリル」は、本明細書で使用する場合、2つ、3つ又は4つの環からなる5員、6員若しくは7員の環系又は縮合環系を表し、これらはそれぞれ、別段の指定がない限り、独立に、5員環、6員環又は7員環であり、但し、これらの環の少なくとも1つは、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立に選択される、1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子を含有する。5員環は、0〜2つの二重結合を有しており、6員環及び7員環は、0〜3つの二重結合を有する。無置換ヘテロシクリルは、特に指定しない限り、1〜12個の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、無置換ヘテロシクリルは、少なくとも2個の炭素原子を含有する。ある種の実施形態では、無置換ヘテロシクリルは、最大で9個の(nice)炭素原子を含有する。縮合「ヘテロシクリル」は、1個以上の炭素及び/又はヘテロ原子が、例えば、キヌクリニジル基において見られる通り、単環式環の2つの非隣接メンバーを架橋している、架橋多環式構造である。一部の実施形態では、縮合「ヘテロシクリル」は、環の少なくとも1つが、本明細書において定義されている1個以上のヘテロ原子を含み、残りの環が炭素環式環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環である、二環式、三環式及び四環式基を含む。このような縮合ヘテロシクリルの非限定例には、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、トロパン及び1,2,3,5,8,8a-ヘキサヒドロインドリジンが含まれる。ヘテロシクリルの非限定例には、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソインダゾリイル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、プリニル、チアジアゾリル(例えば、1,3,4-チアジアゾール)、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニルなどが含まれる。さらに他の例示的なヘテロシクリルは、以下:2,3,4,5-テトラヒドロ-2-オキソ-オキサゾリル;2,3-ジヒドロ-2-オキソ-1H-イミダゾリル;2,3,4,5-テトラヒドロ-5-オキソ-1H-ピラゾリル(例えば、2,3,4,5-テトラヒドロ-2-フェニル-5-オキソ-1H-ピラゾリル);2,3,4,5-テトラヒドロ-2,4-ジオキソ-1H-イミダゾリル(例えば、2,3,4,5-テトラヒドロ-2,4-ジオキソ-5-メチル-5-フェニル-1H-イミダゾリル);2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1,3,4-オキサジアゾリル(例えば、2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-5-フェニル-1,3,4-オキサジアゾリル);4,5-ジヒドロ-5-オキソ-1H-トリアゾリル(例えば、4,5-ジヒドロ-3-メチル-4-アミノ5-オキソ-1H-トリアゾリル);1,2,3,4-テトラ��ドロ-2,4-ジオキソピリジニル(例えば、1,2,3,4-テトラヒドロ-2,4-ジオキソ-3,3-ジエチルピリジニル);2,6-ジオキソ-ピペリジニル(例えば、2,6-ジオキソ-3-エチル-3-フェニルピペリジニル);1,6-ジヒドロ-6-オキソピリジミニル;1,6-ジヒドロ-4-オキソピリミジニル(例えば、2-(メチルチオ)-1,6-ジヒドロ-4-オキソ-5-メチルピリミジン-1-イル);1,2,3,4-テトラヒドロ-2,4-ジオキソピリミジニル(例えば、1,2,3,4-テトラヒドロ-2,4-ジオキソ-3-エチルピリミジニル);1,6-ジヒドロ-6-オキソ-ピリダジニル(例えば、1,6-ジヒドロ-6-オキソ-3-エチルピリダジニル);1,6-ジヒドロ-6-オキソ-1,2,4-トリアジニル(例えば、1,6-ジヒドロ-5-イソプロピル-6-オキソ-1,2,4-トリアジニル);2,3-ジヒドロ-2-オキソ-1H-インドリル(例えば、3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-2-オキソ-1H-インドリル及び2,3-ジヒドロ-2-オキソ-3,3'-スピロプロパン-1H-インドール-1-イル);1,3-ジヒドロ-1-オキソ-2H-イソ-インドリル;1,3-ジヒドロ-1,3-ジオキソ-2H-イソ-インドリル;1H-ベンゾピラゾリル(例えば、1-(エトキシカルボニル)-1H-ベンゾピラゾリル);2,3-ジヒドロ-2-オキソ-1H-ベンゾイミダゾリル(例えば、3-エチル-2,3-ジヒドロ-2-オキソ-1H-ベンゾイミダゾリル);2,3-ジヒドロ-2-オキソ-ベンゾオキサゾリル(例えば、5-クロロ-2,3-ジヒドロ-2-オキソ-ベンゾオキサゾリル);2,3-ジヒドロ-2-オキソ-ベンゾオキサゾリル;2-オキソ-2H-ベンゾピラニル;1,4-ベンゾジオキサニル;1,3-ベンゾジオキサニル;2,3-ジヒドロ-3-オキソ,4H-1,3-ベンゾチアジニル;3,4-ジヒドロ-4-オキソ-3H-キナゾリニル(例えば、2-メチル-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-3H-キナゾリニル);1,2,3,4-テトラヒドロ-2,4-ジオキソ-3H-キナゾリル(例えば、1-エチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-2,4-ジオキソ-3H-キナゾリル);1,2,3,6-テトラヒドロ-2,6-ジオキソ-7H-プリニル(例えば、1,2,3,6-テトラヒドロ-1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-7H-プリニル);1,2,3,6-テトラヒドロ-2,6-ジオキソ-1H-プリニル(例えば、1,2,3,6-テトラヒドロ-3,7-ジメチル-2,6-ジオキソ-1H-プリニル);2-オキソベンゾ[c,d]インドリル;1,1-ジオキソ-2H-ナフト[1,8-c,d]イソチアゾリル;及び1,8-ナフチレンジカルボキサミドである。複素環式基はまた、以下の式の基
【０１２７】
【化１８】
2019532027.tif 000020
を含み(式中、
F'は、-CH2-、-CH2O-及び-O-からなる群から選択され、G'は、-C(O)-及び-(C(R')(R"))v-からなる群から選択され、各R'及びR"は、水素、又は1〜4個の炭素原子からなるアルキルからなる群から独立に選択され、vは、1〜3である)、1,3-ベンゾジオキソリル、1,4-ベンゾジオキサニルなどの基を含む。本明細書において言及されているヘテロシクリル基のいずれも、(1)アルカノイル(例えば、ホルミル、アセチルなど);(2)アルキル(例えば、アルコキシアルキレン,アルキルスルフィニルアルキレン、アミノアルキレン、アジドアルキレン、アシルアルキレン、ハロアルキレン(例えば、パーフルオロアルキル)、ヒドロキシアルキレン、ニトロアルキレン又はチオアルコキシアルキレン);(3)アルケニル;(4)アルキニル;(5)アルコキシ(例えば、パーフルオロアルコキシ);(6)アルキルスルフィニル;(7)アリール;(8)アミノ;(9)アリール-アルキレン;(10)アジド;(11)シクロアルキル;(12)シクロアルキル-アルキレン;(13)シクロアルケニル;(14)シクロアルケニル-アルキレン;(15)ハロ;(16)ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール);(17)(ヘテロシクリル)オキシ;(18)(ヘテロシクリル)アザ;(19)ヒドロキシ;(20)オキソ;(21)ニトロ;(22)スルフィド;(23)チオアルコキシ;(24)-(CH2)qCO2RA(qは、0〜4の整数であり、RAは、(a)アルキル、(b)アリール、(c)水素及び(d)アリール-アルキレンからなる群から選択される);(25)-(CH2)qCONRBRC(qは、0〜4の整数であり、RB及びRCは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリール-アルキレンからなる群から独立に選択される);(26)-(CH2)qSO2RD(qは、0〜4の整数であり、RDは、(a)アルキル、(b)アリール及び(c)アリール-アルキレンからなる群から選択される);(27)-(CH2)qSO2NRERF(qは、0〜4の整数であり、RE及びRFのそれぞれは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリール-アルキレンからなる群から独立に選択される);(28)チオール;(29)アリールオキシ;(30)シクロアルコキシ;(31)アリールアルコキシ;(31)ヘテロシクリル-アルキレン(例えば、ヘテロアリール-アルキレン);(32)シリル;(33)シアノ;及び(34)-S(O)RH(RHは、(a)水素、(b)アルキル、(c)アリール及び(d)アリール-アルキレンからなる群から選択される)からなる群から独立に選択される、1つ、2つ、3つ、4つ又は5つの置換基により場合により置換されていてもよい。一部の実施形態では、これらの各基は、独立に無置換とすることができるか、又は列挙されている基のそれぞれに対して、本明細書に記載されている無置換置換基により置換され得る。例えば、アリール-C1-アルキレン又はヘテロシクリル-C1-アルキレンのアルキレン基は、オキソ基によりさらに置換されて、それぞれ、アリールオイル及び(ヘテロシクリル)オイル置換基を与えることができる。
【０１２８】
用語「ヘテロシクリルアルキル」は、本明細書で使用する場合、ヘテロシクリル基により置換されているアルキル基を表す。各ヘテロシクリル部分及びアルキル部分は、個々の基に関して記載されている通り、独立に、無置換であってもよく、又は置換されていてもよい(例えば、置換されていてもよい(optionally substituted)ヘテロシクリルアルキル)。
【０１２９】
本明細書において互換的に使用される、用語「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は、-OH基を表す。
【０１３０】
用語「ヌクレオシド間脱塩基スペーサー(internucleoside, abasic spacer)」は、本明細書で使用する場合、核酸塩基を欠如しており、こうして、塩基対による相互作用に関わる能力が欠如している、二価の基を表す。
【０１３１】
用語「割り込まれている(interrupted)」とは、本明細書で使用する場合、1つ以上のヌクレオシドがヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより置き換えられている、鎖に対する構造的な修飾を指し、但し、置き換えられているヌクレオシドは、鎖の最初のヌクレオシドでも最後のヌクレオシドでもなく、ヌクレオシド間脱塩基スペーサー中の糖アナログの数は、置き換えられたヌクレオシドの数と同数である。用語「LNA」とは、本明細書で使用する場合、固定されている核酸を指し、これは、当分野において公知である。例えば、WO1999/014226を参照されたい。
【０１３２】
用語「RISC複合体に取り込み可能な(loadable into a RISC complex)」は、本明細書で使用する場合、ガイド鎖がRISC複合体に取り込まれる能力、及びガイド鎖にハイブリッド化されたパッセンジャー鎖のRISC媒介性分解を指す。例えば、このポリヌクレオチドは、天然のRISC媒介性開裂部位を含めた、3つの連続するヌクレオチド間の、無置換のホスフェート基又は生物学的に可逆に置換されているホスフェート基を含む。RISC複合体に取り込み可能なある種のガイド鎖は、5'末端ホスフェート若しくはヌクレオシド間ホスフェート、或いは無置換であるか又は生物学的に可逆に置換されているホスホロチオエートに結合している5'末端ヌクレオシドを含む。好ましい天然のRISC媒介性開裂部位は、ガイド鎖の10番目及び11番目のヌクレオチドに相補性の2つのヌクレオシド間のパッセンジャー鎖に位置している。
【０１３３】
用語「多価リンカー」は、本明細書で使用する場合、2以上(例えば、2〜7の原子価又は2〜4の原子価)の原子価を含む、連結基を表す。
【０１３４】
用語「ニトロ」とは、本明細書で使用する場合、-NO2基を表す。
【０１３５】
用語「生物非可逆性リンカー(non-bioreversible linker)」とは、本明細書で使用する場合、生物可逆性ではなく、したがって、ジスルフィド又はチオエステルを含まない多価部分を指す。したがって、第2の基に生物非可逆的に連結されている第1の基は、生物非可逆性リンカーにより連結されている。
【０１３６】
「非タンパク質構成アミノ酸(non-proteinogenic amino acid)」は、天然に存在しない、又は哺乳動物に見られないアミノ酸である。非タンパク質構成アミノ酸は、当分野において公知である。非タンパク質構成アミノ酸は、例えば、Merck KGaA(Darmstadt、ドイツ)から市販されている。
【０１３７】
用語「核酸塩基」は、本明細書で使用する場合、ヌクレオチド又はヌクレオシドの糖部分の1'位に見出される、窒素含有複素環式環を指す。核酸塩基は、修飾され得ない、又は修飾され得る。本明細書で使用する場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)を含む。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシン(5-me-C又はm5c)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル並びに他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル並びに他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(擬似ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン並びにグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル並びにシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの;The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz、J. I.(編)John Wiley & Sons、1990年に開示されているもの;Englischら、Angewandte Chemie、International Edition、1991年、30巻、613頁により開示されているもの;及びSanghvi,Y.S.、15章、Antisense Research and Applications、289 302頁(Crookeら(編)、CRC Press、1993年)により開示されているものを含む。ある種の核酸塩基は、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びにN-2、N-6及びO-6置換プリンを含む、本発明のポリマー化合物の結合親和性を向上させるのに特に、有用である。5-メチルシトシン置換は、0.6〜1.2℃の核酸二本鎖安定性を増大することが示されている(Sanghviら(編)、Antisense Research and Applications 1993年、CRC Press、Boca Raton、276〜278頁)。これらは、特定の実施形態では、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせされてもよい。ある種のこれらの修飾核酸塩基及び他の修飾核酸塩基の調製を教示している米国特許には、以下に限定されないが、上記の米国特許第3,687,808;4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;及び5,681,941号が含まれる。この開示の目的のため、「修飾されている核酸塩基」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている1つ以上の保護基を含む、天然又は非天然の核酸塩基をさらに表す。
【０１３８】
用語「求核剤」は、本明細書で使用する場合、電子対又はπ結合から電子を供与することにより、共有結合の形成に関わる、置換されていてもよい官能基を表す。求核剤は、アルケン、アルキン、アリール、ヘテロアリール、ジアザ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、チオ基及びチオフェノキシ基から選択され得る。
【０１３９】
用語「ヌクレオシド」は、本明細書で使用する場合、糖-核酸塩基の組合せを表す。糖は、アノマー炭素における核酸塩基、又はアノマー炭素において核酸塩基、並びに3位及び5位のそれぞれにおいて別の基への結合を含有する場合により修飾されている3,5-ジデオキシペンタフラノースを含む修飾糖である。ペンタフラノースは、3,5-ジデオキシリボース、又は2,3,5-トリデオキシリボース、又はその2修飾型であって、2位が、OR、R、ハロ(例えば、F)、SH、SR、NH2、NHR、NR2又はCNにより置換されており、Rが、置換されていてもよいC1〜6アルキル(例えば、(C1〜6アルコキシ)-C1〜6-アルキル)又は置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキルである、2修飾型とすることができる。修飾糖は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、4-チオリボース、及び他の糖、複素環又は炭素環などの非リボース糖である。一部の実施形態では、用語「ヌクレオシド」は、以下の構造:
【０１４０】
【化１９】
2019532027.tif 000021
(式中、B1は、核酸塩基であり、Yは、H、ハロゲン(例えば、F)、ヒドロキシル、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ(例えば、メトキシ又はメトキシエトキシ)、又は保護ヒドロキシル基であり、Y1は、H又はC1〜6アルキル(例えば、メチル)であり、各3'及び5'は、別の基への結合位置を示す)を有する二価の基を指す。ヌクレオシドはまた、ロックド核酸(LNA)、グリセロール核酸、モルホリノ核酸、及びトレオース核酸を含む。
【０１４１】
用語「ヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホロアミデート、又はヌクレオシド間生物非可逆性基をさらに含む、ヌクレオシドを指す。ある種のヌクレオチド(例えば、場合により修飾されている3,5-ジデオキシペンタフラノースをベースとするもの)では、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホロアミデート、又はヌクレオシド間生物非可逆性基は、ヌクレオシドの3位又は5位に結合している。
【０１４２】
本明細書において互換的に使用される、用語「オキサ」及び「オキシ」は、2つの基に接続している、二価の酸素原子を表す(例えば、オキシの構造は、-O-として示すことができる)。
【０１４３】
用語「オキソ」は、本明細書で使用する場合、1つの基に接続している、二価の酸素原子を表す(例えば、オキソの構造は、=Oとして示すことができる)。
【０１４４】
用語「ホスホネート」とは、本明細書で使用する場合、構造-O-P(=O)(-A)-O-Bを有する一価の基若しくは二価の基(Aはアルキル又はアリールであり、Bは、ホスホネートが二価である場合、原子価であるか、又はホスホネートが一価である場合、Hである)、又はそれらの塩を指す。
【０１４５】
用語「ホスホロアミデート」とは、本明細書で使用する場合、構造-O-P(=X)(-A)-O-Bを有する一価の基若しくは二価の基(Aはアミノであり、XはO又はSであり、Bは、ホスホロアミデートが二価である場合、原子価であるか、又はホスホロアミデートが一価である場合、Hである)、又はそれらの塩を指す。
【０１４６】
用語「ホスホトリエステル」とは、本明細書で使用する場合、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートを指し、3つの原子価はすべて置換されている。
【０１４７】
用語「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、ペプチド結合によって連結されている2つ以上のアミノ酸残基を表す。さらに、本開示の目的の場合、用語「ペプチド」及び用語「タンパク質」は、すべての文脈において、本明細書において互換的に使用される。様々なペプチドが、本明細書において提示される、方法及び組成物の範囲内で使用されてもよい。合成的に作製されたペプチドは、DNAによって天然ではコードされない、当分野において公知のアミノ酸(例えば、非天然アミノ酸)の置換を含むことができる。
【０１４８】
用語「光分解活性化」又は「光分解」とは、本明細書で使用する場合、光を用いて反応を照射することによる、化学反応の促進又は開始を表す。光分解活性化に好適な光の波長は、200〜500nmの間の範囲であり、200〜260nm及び300〜460nmの範囲となる波長を含む。他の有用な範囲には、200〜230nm、200〜250nm、200〜275nm、200〜300nm、200〜330nm、200〜350nm、200〜375nm、200〜400nm、200〜430nm、200〜450nm、200〜475nm、300〜330nm、300〜350nm、300〜375nm、300〜400nm、300〜430nm、300〜450nm、300〜475nm及び300〜500nmが含まれる。
【０１４９】
用語「保護基」は、本明細書で使用する場合、化学合成(例えば、ポリヌクレオチド合成)の間に、官能基(例えば、ヒドロキシル、アミノ又はカルボニル)が1つ以上の望ましくない反応に関与することを保護するよう意図される基を表す。用語「O-保護基」は、本明細書で使用する場合、化学合成の間に、酸素含有(例えば、フェノール、ヒドロキシル又はカルボニル)基が1つ以上の望ましくない反応に関与することから保護するよう意図される基を表す。用語「N-保護基」は、本明細書で使用する場合、化学合成の間に、窒素含有(例えば、アミノ又はヒドラジン)基が1つ以上の望ましくない反応に関与することから保護するよう意図される基を表す。一般に使用されるO-及びN-保護基は、参照により本明細書に組み込まれている、Greene、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第3版(John Wiley & Sons、New York、1999年)に開示されている。例示的なO-及びN-保護基には、アルカノイル、アリールオイル又はカルバミル基、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、t-ブチルアセチル、2-クロロアセチル、2-ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o-ニトロフェノキシアセチル、α-クロロブチリル、ベンゾイル、4-クロロベンゾイル、4-ブロモベンゾイル、t-ブチルジメチルシリル、トリ-イソ-プロピルシリルオキシメチル、4,4'-ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノ及び4-ニトロベンゾイルなどが含まれる。核酸塩基中のアミンの保護に有用なN-保護基は、フェノキシアセチル及び(4-イソプロピル)フェノキシアセチルを含む。
【０１５０】
用語「ピリド-2-イルヒドラゾン」は、本明細書で使用する場合、以下の構造:
【０１５１】
【化２０】
2019532027.tif 000022
を表し、各R'は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルである。ピリド-2-イルヒドラゾンは、無置換であってもよい(すなわち、各R'は、Hである)。
【０１５２】
カルボニル含有基を保護するための例示的なO-保護基には、以下に限定されないが、アセタール、アシラル(acylal)、1,3-ジチアン、1,3-ジオキサン、1,3-ジオキソラン及び1,3-ジチオランが含まれる。
【０１５３】
他のO-保護基には、以下に限定されないが、置換アルキル、アリール及びアリール-アルキレンエーテル(例えば、トリチル;メチルチオメチル;メトキシメチル;ベンジルオキシメチル;シロキシメチル;2,2,2,-トリクロロエトキシメチル;テトラヒドロピラニル;テトラヒドロフラニル;エトキシエチル;1-[2-(トリメチルシリル)エトキシ]エチル;2-トリメチルシリルエチル;t-ブチルエーテル;p-クロロフェニル、p-メトキシフェニル、p-ニトロフェニル、ベンジル、p-メトキシベンジル及びニトロベンジル);シリルエーテル(例えば、トリメチルシリル;トリエチルシリル;トリイソプロピルシリル;ジメチルイソプロピルシリル;t-ブチルジメチルシリル;t-ブチルジフェニルシリル;トリベンジルシリル;トリフェニルシリル;及びジフェニルメチルシリル(diphenymethylsilyl));カーボネート(例えば、メチル、メトキシメチル、9-フルオレニルメチル;エチル;2,2,2-トリクロロエチル;2-(トリメチルシリル)エチル;ビニル、アリル、ニトロフェニル;ベンジル;メトキシベンジル;3,4-ジメトキシベンジル;及びニトロベンジル)が含まれる。
【０１５４】
他のN-保護基には、以下に限定されないが、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなどの保護又は未保護D、L又はD,L-アミノ酸などのキラル補助基;ベンゼンスルホニル、p-トルエンスルホニルなどのスルホニル含有基;ベンジルオキシカルボニル、p-クロロベンジルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、2-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5-トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1-(p-ビフェニリル)-1-メチルエトキシカルボニル、α,α-ジメチル-3,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t-ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2,-トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4-ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル-9-メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなどのカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなどのアリール-アルキレン基、及びトリメチルシリルなどのシリル基が含まれる。有用なN-保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t-ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)及びベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。
【０１５５】
用語「立体化学的に濃縮された(stereochemically enriched)」とは、本明細書で使用する場合、同一基の反対の鏡像異性体よりも、列挙されている基の1つの鏡像異性体に対して、部分的(local)に立体化学的に優位であることを指す。したがって、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含有する鎖は、所定の立体化学のホスホロチオエートが、この所定の立体化学と反対の立体化学であるホスホロチオエートよりも優位に存在している、鎖である。この優位性は、所定の立体化学のホスホロチオエートに対して、ジアステレオマー比を使用して、数により表現され得る。所定の立体化学のホスホロチオエートに対するジアステレオマー比は、この所定の立体化学を有すると特定されるホスホロチオエートを有するジアステレオマーと所定の立体化学と反対である立体化学を有すると特定されるホスホロチオエートを有するジアステレオマーとのモル比である。所定の立体化学のホスホロチオエートに対するジアステレオマー比は、1.1以上であってもよい(例えば、4以上である、9以上である、19以上である、又は39以上である)。
【０１５６】
用語「鎖」は、本明細書で使用する場合、ホスフェート;ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート(phoshorodithioate);ホスホネート;ホスホロアミデート;ヌクレオシド間脱塩基スペーサー;及び/又はヌクレオシド間生物非可逆性基;及びそれらの組合せにより、一緒に共有結合している、11以上の連続するヌクレオシドを含有する構造を表し、但し、2つの連続するヌクレオシドは、ホスフェート;ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;ホスホネート;ホスホロアミデート;ヌクレオシド間脱塩基スペーサー;及びヌクレオシド間生物非可逆性基からなる群から選択される、1つの基及び1つだけの基により連結されている。鎖は、5'末端及び3'末端を含む。本明細書において開示されている鎖内のヌクレオシドは、鎖の5'末端から始めて番号付けする。ヌクレオシドが、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーの部分として、糖アナログにより置き換えられると、番号が付けられたヌクレオシドは、このような番号が付けられたヌクレオシドを置き換えた糖アナログを指す。鎖は、5'末端及び/又は3'末端において、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホスホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホロアミデート、又は式(I)の基により場合によりキャップされていてもよい。鎖は、0〜4つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有する。通常、鎖は、6つの末端ヌクレオシドの配列内に、ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;ホスホネート;ホスホロアミデート;及びヌクレオシド間生物非可逆性基からなる群から選択される、1つ以上のヌクレオシド間基を含有することができる。鎖は、11〜100(例えば、19〜50又は19〜32)のヌクレオシドを含むことができる。
【０１５７】
用語「対象」は、本明細書で使用する場合、ヒト又は非ヒト動物(例えば、哺乳動物)を表す。
【０１５８】
用語「糖アナログ(sugar analogue)」は、本明細書で使用する場合、式(III)中の基-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合により、2つのヒドロキシル基が置き換えられるように修飾されている、C3〜6単糖又はC3〜6アルジトール(例えば、グリセロール)である、二価又は三価の基を表す。糖アナログは、相補性鎖中の核酸塩基との水素結合に関与することができる核酸塩基を含有していない。糖アナログは、環式又は非環式である。糖アナログに含まれる、さらなる任意選択的な修飾は、残留ヒドロキシル基又は炭素が結合している水素原子の1つ、2つ又は3つの、Hによる;置換されていてもよいC1〜6アルキルによる;-LinkA(-T)pによる;コンジュゲート部分による;-(CH2)t1-ORZ(t1は、1〜6の整数であり、RZは、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル又は置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキルである)による置き換え;1つ又は2つの不飽和(例えば、1つ又は2つの二重結合)の導入;及び1個、2個若しくは3個の水素又はヒドロキシル基の、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はヘテロシクリルに関して定義されている置換基による置き換えである。糖アナログの非限定例は、置換されていてもよいC2〜6アルキレン、置換されていてもよいC2〜6アルケニレン、置換されていてもよいC5シクロアルカン-1,3-ジイル、置換されていてもよいC5シクロアルケン-1,3-ジイル、置換されていてもよい複素環-1,3-ジイル(例えば、置換されていてもよいピロリジン-2,5-ジイル、置換されていてもよいテトラヒドロフラン-2,5-ジイル又は置換されていてもよいテトラヒドロチオフェン-2,5-ジイル)又は置換されていてもよい(C1〜4アルキル)-(C3〜8シクロアルキレン)(例えば、置換されていてもよい(C1アルキル)-(C3シクロアルキレン))である。
【０１５９】
用語「スルフィド」は、本明細書で使用する場合、二価の-S-又は=S基を表す。
【０１６０】
用語「標的指向性部分(targeting moiety)」は、本明細書で使用する場合、受容体、若しくは所与の標的細胞集団に結合している他の受容性部分に特異的に結合する、又はこれらと反応して結合する、又はこれらと複合体を形成する、部分(例えば、低分子、例えば炭水化物)を表す。本発明のポリヌクレオチド構築物又はハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以上のリガンド(例えば、1〜6つのリガンド、1〜3つのリガンド又は1つのリガンド)を含有する。リガンドは、抗体若しくは抗原結合性フラグメント、又はその操作された誘導体とすることができる(例えば、Fcab又は融合タンパク質(例えば、scFv))。代替的に、リガンドは、低分子(例えば、N-アセチルガラクトサミン、マンノース又はフォレート)である。1つ以上のリガンドを含む本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、リガンドが結合する標的に対して、100nM未満のKdを示すことができる。Kdは、当分野において公知の方法を使用して、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、例えば、Biacore(商標)システム(GE Healthcare、Little Chalfont(英国))を使用して測定される。
【０１６１】
用語「末端ヌクレオシド」は、本明細書で使用する場合、ホスフェート;ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;ホスホネート;ホスホロアミデート;ヌクレオシド間脱塩基スペーサー;又はヌクレオシド間生物非可逆性基を介して、1つのヌクレオシドを別のヌクレオシドに連結させる1つだけの結合を含有する1つのヌクレオシドを含む6つの連続するヌクレオシド内に位置している、ヌクレオシドを指す。
【０１６２】
用語「治療有効用量」は、本明細書で使用する場合、疾患又は障害を改善する、処置する、又はこれらの症状を少なくとも部分的に抑止する(例えば、細胞増殖を阻害する)のに必要な、本発明による、siRNA又はポリヌクレオチドの量を表す。この使用に有効な量は、当然ながら、疾患の重症度、並びに対象の体重及び一般的な状態に依存するであろう。通常、インビトロで使用される投与量は、医薬組成物のインビボ投与に有用な量で有用な助言をもたらすことができ、動物モデルは、特定の障害の処置のための有効投与量を決定するために使用することができる。
【０１６３】
用語「チオカルボニル」は、本明細書で使用する場合、C(=S)基を表す。「チオカルボニル」を含有する官能基の非限定例には、チオエステル、チオケトン、チオアルデヒド、チオ無水物、塩化チオアシル、チオアミド、チオカルボン酸及びチオカルボキシレートが含まれる。
【０１６４】
用語「チオヘテロシクリレン」は、本明細書で使用する場合、二価の基である-S-R'-を表し、R'は、本明細書で定義されているヘテロシクリレンである。
【０１６５】
用語「チオール」とは、本明細書で使用する場合、-SH基を表す。
【０１６６】
用語「障害」は、本明細書で使用する場合、正常な機能を損なっており、かつ兆候及び症状を見分けることにより通常現れる、対象によって呈される状態異常又はその部分の1つにすべて影響を及ぼすという点で、用語「疾患」、「症候群」及び「状態」(医療的状態と同様に)と一般に同義であることが意図されており、これらと互換的に使用される。
【０１６７】
用語「処置すること」は、対象における障害を参照して使用される場合、対象への治療剤(例えば、本発明のヌクレオチド構築物)を投与することによる、障害の少なくとも1つの症状を軽減することが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】マウスへの試験組成物の単回0.7mg/kg皮下投薬の6日後に測定されたマウスにおけるmTTR血清中レベルを示すチャート図である。データは、生理食塩水の皮下投与後に観察されたmTTR血清中レベルに対して正規化する。
【図２】マウスへの試験組成物の単回0.7mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるmTTR血清中レベルを示すチャート図である。データは、生理食塩水の皮下投与後に観察されたmTTR血清中レベルに対して正規化する。
【図３】マウスへの所定量の試験組成物の皮下投与後所定の期間で測定されたマウスにおけるmTTR血清中レベルを示すチャート図である。データは、生理食塩水の皮下投与後に観察されたmTTR血清中レベルに対して正規化する。このチャート図において、投与量は、(a)、(b)及び(c)と識別され、ここで、(a)は、0.5mg/kg投薬を表し、(b)は、1.0mg/kg投薬を表し、(c)は、0.25mg/kg投薬を表す。
【図４】マウスへの試験組成物の単回0.4mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。データは、生理食塩水の皮下投与後にマウスにおいて観察されたAT3活性に対して正規化する。
【図５】マウスへの試験組成物の単回0.5mg/kg皮下投薬後の所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。データは、生理食塩水の皮下投与後にマウスにおいて観察されたAT3活性に対して正規化する。
【図６】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬の7日後に測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図７】マウスへの試験組成物の単回0.125mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図８Ａ】Z40、Z52、Z53及びZ54におけるパッセンジャー鎖のコンジュゲート部位の構造を示すチャート図である。
【図８Ｂ】P1、p2、P3及びp4の構造並びにリガンドコンジュゲート前のX1、X2、X3、X4、X5及びX2-NH2の構造を示すチャート図である。
【図９】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１０】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１１】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１２】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１３】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１４】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１５】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg又は0.5mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１６】マウスへの試験組成物の単回0.5mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１７】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg又は0.5mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。
【図１８】マウスへの試験組成物の単回0.25mg/kg皮下投薬後所定の期間で測定されたマウスにおけるAT3活性を示すチャート図である。Z92-2は、2当量のNAG40を使用して調製した。Z92-3は、3当量のNAG40を使用して調製した。
【図１９】Z67、Z237又はZ238と共にインキュベーション後のHeb3b肝細胞の生存率を示すチャート図である。
【図２０】Z67、Z237又はZ238と共にインキュベーション後の初代マウス肝細胞におけるTTR発現を示すチャート図である。Z67に関するIC50=2.020×10-12M。Z237に関するIC50=2.196×10-12M。Z238に関するIC50=2.286×10-12M。TTR発現レベルは、PPIB発現レベルに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【０１６９】
一般に、本発明は、例えば、1つ以上の補助部分を有する分岐状部分に連結しているポリヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド構築物を提供する。本ポリヌクレオチド構築物は、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物として提供されてもよい。
【０１７０】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、優れた活性、作用期間の延長、及び/又は標的外作用の低減(例えば、標的外細胞毒性の低減)を示すことができる。特に、本発明のポリヌクレオチド構築物中に、少なくとも1つの式(I)の基;1つ以上のヌクレオシド間脱塩基スペーサー;立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエート;及び/又は2'-置換パターンを含ませると、これらの作用の1つ以上を実現することができる。
【０１７１】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つの式(I)の基:
【０１７２】
【化２１】
2019532027.tif 000023
若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立にO又はSであり、
各X2は、独立にO、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-(例えば、Tに結合している-C(O)-N(H)-を含む少なくとも1つの多価リンカー)を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数である)
に結合している鎖を含有することができる。
【０１７３】
少なくとも1つの式(I)の基は、ポリヌクレオチドの5'末端、3'末端、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合することができる。少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である。ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含む。
【０１７４】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有することができる。ヌクレオシド間脱塩基スペーサーは、式(III)とすることができる:
【０１７５】
【化２２】
2019532027.tif 000024
(式中、
Lは糖アナログであり、
各X4は、独立に、O又はSであり、
各X5は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)。
【０１７６】
ヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有するポリヌクレオチド構築物は、ポリヌクレオチド構築物が、siRNA中のガイド鎖である場合、標的外作用の低減を示すことができる。特に、ヌクレオシド間脱塩基スペーサー(例えば、tが1である、式(III)のヌクレオチド間脱塩基スペーサー)は、ガイド鎖中(例えば、ガイド鎖のシード領域内)に含まれ得る。一部の実施形態では、ヌクレオシド間脱塩基スペーサー(例えば、tが1である、式(III)のヌクレオチド間脱塩基スペーサー)は、ガイド鎖の2番目、3番目、4番目又は5番目のヌクレオシドの3'炭素原子に結合し得る。ある種の実施形態では、ヌクレオシド間脱塩基スペーサー(例えば、tが1である、式(III)のヌクレオチド間脱塩基スペーサー)は、ガイド鎖の13番目、14番目、15番目又は16番目のヌクレオシドの3'炭素原子に結合し得る。
【０１７７】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、高い含有量の2'-アルコキシヌクレオシドを含むことができる(例えば、ポリヌクレオチド構築物中に少なくとも80%のヌクレオシドが、独立に、2'-アルコキシヌクレオシドとすることができる)。本発明のこのようなポリヌクレオチド構築物は、2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドのうちの少なくとも1つが、2'-フルオロヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドが、独立に、2'-アルコキシヌクレオシドである、2'-置換パターンを含むことができる。一部の実施形態では、2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシド又は12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドは、独立に、2'-フルオロヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドは、独立に、2'-アルコキシヌクレオシドである。他の実施形態では、鎖中の7番目、9番目及び/又は11番目のヌクレオシドは、2'-フルオロヌクレオシドである。高い含有量の2'-アルコキシヌクレオシドを有する、本発明のポリヌクレオチド構築物(例えば、本明細書に記載の2-置換パターンを有するもの)は、ポリヌクレオチド構築物がsiRNA中のガイド鎖である場合、優れた効力及び/又は作用期間の延長を示すことができる。
【０１７８】
組成物では、本発明のポリヌクレオチド構築物は、1つ以上(例えば、1〜20、1〜10、又は1〜5)の立体化学的に濃縮された(例えば、ヌクレオシド間)ホスホロチオエート(例えば、P-ステレオジェン中心(P-stereogenic center)に関して、少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%、例えば最大約99%過剰なジアステレオマーを有する)を含有することができる。本発明のポリヌクレオチド構築物は、1つ以上(例えば、1〜20、1〜10、又は1〜5;例えば、ヌクレオシド間)のホスホロジチオエートを含有することができる。ホスホロジチオエートは、本発明のポリヌクレオチド構築物において、非Pステレオジェニックであってもよい。ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートは、血清のエクソヌクレアーゼ活性に対して、ポリヌクレオチド構築物の安定性を増強することができる。非Pステレオジェニック(non-P-stereogenic)なホスホロジチオエートは、可能なジアステレオマーの数を低下させることにより、本発明のポリヌクレオチド構築物の合成を単純化することができる。通常、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートは、本発明のポリヌクレオチド構築物の6つの3'末端ヌクレオシド及び6つの5'末端ヌクレオシド内に2つの連続するヌクレオシドを接続することができる。ポリヌクレオチド構築物において、鎖は、19個以上のヌクレオシドを有することができる。鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個未満のヌクレオシド又は32個未満のヌクレオシド)を有することがある。本ポリヌクレオチド構築物が、ガイド鎖である場合、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエート(例えば、RP濃縮ホスホロチオエート)は、1番目のヌクレオシド(例えば、1番目のヌクレオシドの3'-炭素原子)及び2番目のヌクレオシド(例えば、2番目のヌクレオシドの5'-炭素原子)に共有結合により結合することができる。さらに又は代替的に、本ポリヌクレオチド構築物が、ガイド鎖である場合、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエート(例えば、RP濃縮ホスホロチオエート)は、2番目のヌクレオシド(例えば、2番目のヌクレオシドの3'-炭素原子)及び3番目のヌクレオシド(例えば、3番目のヌクレオシドの5'-炭素原子)に共有結合により結合することができる。さらに又は代替的に、本ポリヌクレオチド構築物が、ガイド鎖である場合、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエート(例えば、SP濃縮ホスホロチオエート)は、21番目のヌクレオシド(例えば、21番目のヌクレオシドの3'-炭素原子)及び22番目のヌクレオシド(例えば、22番目のヌクレオシドの5'-炭素原子)に共有結合により結合することができる。さらには、さらに又は代替的に、本ポリヌクレオチド構築物が、ガイド鎖である場合、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエート(例えば、SP濃縮ホスホロチオエート)は、22番目のヌクレオシド(例えば、22番目のヌクレオシドの3'-炭素原子)及び23番目のヌクレオシド(例えば、23番目のヌクレオシドの5'-炭素原子)に共有結合により結合することができる。ガイド鎖中の、5'RP濃縮ホスホロチオエート(例えば、1番目のヌクレオシド(例えば、1番目のヌクレオシドの3'-炭素原子)及び2番目のヌクレオシド(例えば、2番目のヌクレオシドの5'-炭素原子)に共有結合しているRP濃縮ホスホロチオエート)と3'SP濃縮ホスホロチオエート(例えば、21番目のヌクレオシド(例えば、21番目のヌクレオシドの3'-炭素原子)及び22番目のヌクレオシド(例えば、22番目のヌクレオシドの5'-炭素原子)に共有結合している、SP濃縮ホスホロチオエート)との組合せは、例えば、5'RP濃縮ホスホロチオエートと3'SP濃縮ホスホロチオエートとの組合せを欠如している、参照ガイド鎖と比べて、標的の活性の低下によって測定される通り、優れた効力及び/又は作用期間を生じることができる。本発明はまた、RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含有するハイブリッド化ポリヌクレオチドを提供する。鎖の少なくとも1つは、式(I)の基に結合していてもよい。このようなポリヌクレオチド構築物は、同数の補助部分を有するポリヌクレオチド構築物よりも、一層強力な活性を示し得る。例えば、図1に例示されるように、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物Z18及びZ19は、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物Z7及びZ9と比べて、投与単位あたりの遺伝子発現をより効率的に抑制する。このようなポリヌクレオチド構築物はまた、同数の補助部分を有するポリヌクレオチド構築物よりも、活性の延長を示し得る。例えば、図1に例示されるように、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物Z18及びZ19は、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物Z7及びZ9と比べて、投与単位あたり、より長い期間、遺伝子発現を抑制する。
【０１７９】
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、19個以上のヌクレオシドを有するガイド鎖を含むことができる。ガイド鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個未満のヌクレオシド又は32個未満のヌクレオシド)を有することがある。ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、19個以上のヌクレオシドを有するパッセンジャー鎖を含むことができる。パッセンジャー鎖は、100個未満のヌクレオシド(例えば、50個未満のヌクレオシド又は32個未満のヌクレオシド)を有することがある。一部の実施形態では、各パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、19〜50個のヌクレオシド(例えば、19〜32個のヌクレオシド)を独立に含むであろう。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、少なくとも8個の連続するヌクレオシドにわたり(例えば、少なくとも12個の連続するヌクレオシドにわたり、又は少なくとも15個の連続するヌクレオシドにわたり)、互いに相補性となり得る。
【０１８０】
ポリヌクレオチド構築物は、上に記載されている部分に加えて、生物非可逆性ホスホトリエステル、生物可逆性ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、ホスホネートのうちの1つ以上を含むことができる。本ポリヌクレオチド構築物において使用することができる生物可逆性ホスホトリエステルは、例えばWO2015/188197に記載されている。
【０１８１】
MOIETRY
本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、3つ又は4つ)の式(I)の基を含有することができ、式(I)の基は、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であるMOIETYを含み、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルである。式(I)において、MOIETY、R1及びR2は、一緒になって、
【０１８２】
【化２３】
2019532027.tif 000025
を形成してもよく、
式中、
R7は、R4に近位の酸素原子への結合であり、
R8は、鎖に近位の酸素原子への結合であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれは、独立に、0〜6の整数であり、
但し、式(Ia)中の四級炭素が、0個の原子、又は炭素及び水素以外の1個の原子に結合しており、m1、m2、m3及びm4の合計は10未満である。
【０１８３】
特に、MOIETY、R1及びR2は、一緒になって、
【０１８４】
【化２４】
2019532027.tif 000026
を形成してもよい。
【０１８５】
MOIETY、R1及びR2の組合せにより形成される基の非限定例は、以下:
【０１８６】
【化２５】
2019532027.tif 000027
である。
【０１８７】
補助部分及びLinkA
本発明のポリヌクレオチド構築物は、MOIETYに生物非可逆的に連結されている、補助部分(例えば、標的指向性部分)を含むことができる。この補助部分は、基-LinkA(-T)p中のTである。基-LinkA(-T)pは、MOIETY又は-X2P(X1)(-)2に結合していてもよく、X1は、O又はSであり、X2は、O、S、NH又は結合である。一部の実施形態では、X1はOである。ある種の実施形態では、X2は、O又はSである(例えば、X2はOである)。
【０１８８】
基-LinkA-は、0〜3つの多価モノマー(例えば、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、又は三価の窒素原子)、及び1つ以上の二価モノマー(例えば、1〜40)を含むことができ、各二価モノマーは、独立に、置換されていてもよいC1〜6アルキレン;置換されていてもよいC2〜6アルケニレン;置換されていてもよいC2〜6アルキニレン;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキレン;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニレン;置換されていてもよいC6〜14アリーレン;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレン;イミノ;置換されていてもよいN;O;又はS(O)m(mは、0、1又は2である)である。一部の実施形態では、各モノマーは、独立に、置換されていてもよいC1〜6アルキレン;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキレン;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニレン;置換されていてもよいC6〜14アリーレン;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレン;イミノ;置換されていてもよいN;O;又はS(O)m(mは、0、1又は2である(例えば、mは2である))である。ある種の実施形態では、各モノマーは、独立に、置換されていてもよいC1〜6アルキレン;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキレン;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニレン;置換されていてもよいC6〜14アリーレン;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレン;置換されていてもよいN;O;又はS(O)m(mは、0、1又は2である(例えば、mは2である))である。コンジュゲート部分又はその反応生成物に補助部分を接続する生物非可逆性リンカーは、このようなモノマーを2〜500(例えば、2〜300又は2〜200)含むことができる。基-LinkA-は、ポリ(アルキレンオキシド)(例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ(トリメチレンオキシド)、ポリブチレンオキシド、ポリ(テトラメチレンオキシド)、及びそれらのジブロック又はトリブロックコポリマー)を含むことができる。一部の実施形態では、生物非可逆性リンカーは、ポリエチレンオキシド(例えば、1kDa未満の分子量を有するポリ(エチレンオキシド))を含む。
【０１８９】
式(I)中の基-LinkA(-T)pは、以下の項目において記載されている方法により調製することができる。一部の例では、-LinkA(-T)pは、式(II):
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p
(II)
(式中、
各sは、独立に、0〜20(例えば、0〜10)の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
Q1は、コンジュゲートリンカー(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-QC-であり、QCは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-又は-N(H)-S(O)2-を含有するヘテロアルキレン)、置換されていてもよいC1〜12チオヘテロシクリレン(例えば、
【０１９０】
【化２６】
2019532027.tif 000028
)、置換されていてもよいC1〜12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイル、又は
【０１９１】
【化２７】
2019532027.tif 000029
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル又はピリド-2-イルヒドラゾン)であり、
Q2は、pが1である場合は直鎖基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-)であり、pが2〜6の整数である場合は分岐基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、ここで、p1は、0又は1であり、p2は、0、1、2又は3である)であり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC6〜10アリーレン、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Q7は、独立に、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する)
である。
【０１９２】
一部の実施形態では、各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンである。ある種の実施形態では、sは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20である。
【０１９３】
したがって、式(II)において、LinkAは、各p1が0である場合、単一分岐点を含むことができ、又は少なくとも1つのp1が1である場合、複数の分岐点を含むことができる。
【０１９４】
式(II)において、Q1は、-O-QL-QC-とすることができ、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC1〜12アルキレン又は-(置換されていてもよいC1〜6アルキレン)-(置換されていてもよいC6〜10アリーレン)-である。一部の実施形態では、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜12アルキレンである。式(II)において、QCは、以下:
【０１９５】
【化２８】
2019532027.tif 000030
とすることができる。
【０１９６】
式(II)において、Q2は、式[-Q3-Q4-Q5]s-である直鎖基とすることができ、Q3、Q4及びQ5は、式(II)に関して定義されている通りである。代替的に、Q2は、分岐基[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2とすることができ、各Q7は、独立に、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
p1は、0又は1であり、
p2は、0、1、2又は3であり、
p1が0である場合、LinkAは三価又は四価リンカーであり、
p1が1である場合、LinkAは四価、五価又は六価リンカーである。
【０１９７】
ある種の実施形態では、p1は0である。
【０１９８】
一部の実施形態では、Q7は、以下:
【０１９９】
【化２９】
2019532027.tif 000031
である。
【０２００】
式(I)中の基-LinkA(-T)pの調製において使用することができる化合物は、本明細書、及びWO2015/188197に記載されている。-LinkAの非限定例には、以下:
【０２０１】
【化３０】
2019532027.tif 000032
2019532027.tif 000033
2019532027.tif 000034
(式中、
R18は、MOIETYへの結合であり、
各R19は、独立に、補助部分への結合であり、
各m5は、独立に、1〜20の整数であり、
各m6は、独立に、1〜10の整数であり、
m7は、1〜6の整数であり、
各X6は、独立に、O又はSである)
が含まれる。
【０２０２】
式(II)において、コンジュゲートリンカーが式[-Q3-Q4-Q5]s-QC-である場合、-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)pは、以下:
【０２０３】
【化３１】
2019532027.tif 000035
2019532027.tif 000036
(式中、
R20は、Q1中のQCへの結合であり、
各R19は、独立に、補助部分への結合であり、
各m5は、独立に、1〜20の整数であり、
各m6は、独立に、1〜10の整数であり、
m7は、1〜6の整数であり、
各X6は、独立に、O又はSである)とすることができる。
【０２０４】
様々な補助部分が、本発明のポリヌクレオチド構築物にコンジュゲートすることができ、補助部分は、所望の生物学的作用又は化学的作用をもたらすことができる。生物学的作用には、以下に限定されないが、細胞内内在化の誘発、細胞表面への結合、特定の細胞タイプへの標的化が含まれ、これにより、エンドソームの脱出、インビボでのポリヌクレオチドの半減期の改変、及び治療効果の実現を可能にする。化学的作用には、以下に限定されないが、溶解度、電荷、サイズ及び反応性の改変が含まれる。式(I)中の基-LinkA(-T)pの調製において使用することができる補助部分は、本明細書、及びWO2015/188197に記載されている。
【０２０５】
標的指向性部分
本発明のポリヌクレオチド構築物及び本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、補助部分として、1つ以上の標的指向性部分を含んでもよい。標的指向性部分は、選択された標的指向性部分に対する、対応する結合パートナー(例えば、対応する受容体又はリガンドのどちらか)を発現する、所望の又は選択された細胞集団に本発明の構築物を標的にするその能力に基づいて選択される。例えば、本発明の構築物は、標的指向性部分としてN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を含有する標的指向性部分を選択することにより、アシアロ糖タンパク質(ASGP-R)を発現する肝細胞に標的化され得る。細胞(例えば、小胞体、ゴルジ装置、核又はミトコンドリア)内の所望の部位を標的とする標的指向性部分(すなわち、細胞内標的指向性部分)は、本明細書に開示されているハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物に含まれ得る。細胞内標的指向性部分の非限定例は、WO2015/069932及びWO2015/188197に提示されている。WO2015/069932及びWO2015/188197における細胞内標的指向性部分の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０６】
したがって、本発明の構築物は、細胞内標的指向性部分、細胞外標的指向性部分及びそれらの組合せからなる群から選択される、1つ以上の標的指向性部分を含むことができる。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物中に1つ以上の標的指向性部分(例えば、フォレート、マンノース、N-アセチルガラクトサミン及び前立腺特異的膜抗原からなる群から独立に選択される標的指向性部分を含めた、細胞外標的指向性部分)、及び1つ以上の細胞内標的指向性部分(例えば、小胞体、ゴルジ装置、核又はミトコンドリアを標的とする部分)を含ませると、特定の細胞集団内の特定部位へのポリヌクレオチドの送達を促進することができる。一部の実施形態では、標的指向性部分は、1つ以上のマンノース炭水化物を含有する。マンノースは、類洞肝臓細胞及び抗原提示細胞(例えば、マクロファージ及び樹状細胞)に発現する175KDaの膜関連受容体である、マンノース受容体を標的とする。それは、マンノシル化病原体及びタンパク質に結合して内在化する、非常に有効なエンドサイトーシス性受容体/再利用受容体である(Lennartzら  J. Biol. Chem. 262巻:9942〜9944頁,1987年;Taylorら  J. Biol. Chem. 265巻:12156〜62頁、1990年)。
【０２０７】
本発明の標的指向性部分の一部は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、標的指向性部分は、インスリン、インスリン様成長因子受容体1(IGF1R)、IGF2R、インスリン様成長因子(IGF;例えば、IGF1又は2)、間様上皮移行因子受容体(c-met;肝細胞成長因子受容体(HGFR)としても知られている)、肝細胞成長因子(HGF)、上皮成長因子受容体(EGFR)、上皮成長因子(EGF)、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)、血小板由来成長因子(PDGF)、血管内皮細胞成長因子受容体(VEGFR)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、TNF-β、葉酸受容体(FOLR)、葉酸、トランスフェリン、トランスフェリン受容体(TfR)、メソテリン、Fc受容体、c-キット受容体、c-キット、インテグリン(例えば、α4インテグリン又はβ-1インテグリン)、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸受容体-1(S1PR)、ヒアルロン酸受容体、リンパ球機能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受容体)、CD106(血管細胞接着分子1(VCAM1)、CD166(活性化白血球細胞接着分子(ALCAM))、CD178(Fasリガンド)、CD253(TNF-関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL))、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(間質細胞由来因子1(SDF-1))、インターロイキン1(IL-1)、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン(Eph)受容体、粘膜アドレシン細胞接着分子1(MAdCAM-1)、癌胎児性抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮細胞接着分子(EpCAM)、がん抗原125(CA125)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原及びそのフラグメントを含めた群から選択されるタンパク質を含む、又は特異的に結合する。さらなる実施形態では、標的指向性部分は、赤芽球性白血病ウイルス発がん遺伝子ホモログ(ErbB)受容体(例えば、ErbB1受容体;ErbB2受容体;ErbB3受容体;及びErbB4受容体)を含有する。一部の実施形態では、標的指向性部分は、1つ以上(例えば、1〜6つ)のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を含有する。ある種の実施形態では、標的指向性部分は、1つ以上(例えば、1〜6つ)のマンノースを含有する。他の実施形態では、標的指向性部分は、葉酸リガンドを含有する。葉酸リガンドは、以下の構造:
【０２０８】
【化３２】
2019532027.tif 000037
を有する。
【０２０９】
ある種の標的指向性部分は、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、腫瘍成長因子(TGF)(例えば、TGF-α又はTGF-β)又はワクシニアウイルス成長因子(VVGF)を含むことができる。非ペプチジル標的指向性部分もまた、標的指向性部分に使用することができ、例えば、ステロイド、炭水化物、ビタミン及びレクチンを含むことができる。一部の標的指向性部分は、ソマトスタチン又はソマトスタチンアナログ(例えば、オクトレオチド又はランレオチド)、ボンベシン、又は抗体若しくはその抗原結合性フラグメントなどのポリペプチドを含んでもよい。抗体は、任意の認識されているクラス又は部分クラス、例えば、IgG、IgA、IgM、IgD又はIgEとすることができる。典型的なものは、IgGクラス内にある、そのような抗体である。抗体は、当分野で公知の技法に従い、任意の種から誘導することができる。しかし、通常、抗体はヒト、マウス又はウサギを起源とする。さらに、抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルとすることができるが、通常、モノクローナルである。ヒト又はキメラ(例えば、ヒト化)抗体が、標的指向性部分において使用することができる。標的指向性部分とは、抗体の抗原結合性フラグメントを含むことができる。このような抗体フラグメントは、例えば、Fab'、F(ab')2、Fv若しくはFabフラグメント、単一ドメイン抗体、ScFv、又は他の抗原結合性フラグメントを含むことができる。Fcフラグメントも、標的指向性部分に使用されてもよい。このような抗体フラグメントは、例えば、タンパク質分解性酵素の消化により、例えばペプシン又はパパイン消化、還元的アルキル化又は組換え技法により調製することができる。抗体フラグメントを調製するための物質及び方法は、当業者に周知である。例えば、Parham、J. Immunology、131巻:2895頁、1983年;Lamoyiら、J. Immunological Methods、56巻:235頁、1983年を参照されたい。
【０２１０】
本発明のヌクレオチド構築物中の標的補助部分として使用するための他のペプチドは、KiSSペプチド及びアナログ、ウロテンシンIIペプチド及びアナログ、GnRH I及びIIペプチド並びにアナログ、デプレオチド、バプレオチド、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、コレシストキニン(CCK)、RGD含有ペプチド、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)ペプチド、ニューロテンシン、カルシトニン、グルタチオン、YIGSR(白血球結合性ペプチド、例えば、P483H(これは、血小板因子-4(PF-4)のヘパリン結合性領域及びリシンリッチ配列を含有する))、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、β-アミロイドペプチド、デルタ-オピオイドアンタゴニスト(ITIPP(psi)など)、アネキシン-V、エンドセリン、ロイコトリエンB4(LTB4)、走化性ペプチド(例えば、N-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン-リシン(fMLFK)、GP IIb/IIIa受容体アンタゴニスト(例えば、DMP444)、ヒト好中球エラスターゼ阻害剤(EPI-HNE-2及びEPI-HNE-4)、プラスミン阻害剤、抗微生物ペプチド、アプチシド(apticide)(P280及びP274)、トロンボスポンジン受容体(TP-1300などのアナログを含む)、ビチスタチン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼI型受容体(PAC1)、フィブリンα-鎖、ファージディスプレイライブラリに由来するペプチド及びそれらの保存置換体から選択され得る。
【０２１１】
1つ以上(例えば、1〜6)の標的指向性部分が、-LinkA-を介して、式(I)中のMOIETY又はX2に連結され得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、標的指向性部分は、1つ以上(例えば、1〜6又は1〜3)のアシアロ糖タンパク質受容体リガンド(例えば、GalNAc)を含む。一部の実施形態では、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド(例えば、GalNAc)リガンドは、アノマー炭素を介して、-LinkA-に結合している(例えば、アノマー炭素が、アセタール又はヘミアミナール中の炭素原子である場合)。ヘミアミナールを介してリンカーに結合しているアシアロ糖タンパク質受容体リガンド(例えば、GalNAc)は、アセタールを介してリンカーに結合しているアシアロ糖タンパク質受容体リガンド(例えば、GalNAc)を有するハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物と比べると、遺伝子サイレンシングにおいて優れた効力を有する、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物を生成することができる。
【０２１３】
エンドソーム脱出部分
1つ以上のエンドソーム脱出部分(例えば、1〜6又は1〜3)が、補助部分として、本明細書において開示されているポリヌクレオチド構築物又はハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物に結合され得る。例示的なエンドソーム脱出部分には、本明細書に記載されている、化学治療剤(例えば、クロロキンなどのキノロン);融合性脂質(例えば、ジオレオイルホスファチジル-エタノールアミン(DOPE));及びポリエチレンイミン(PEI)などのポリマー;ポリ(ベータ-アミノエステル);ポリアルギニン(例えば、オクタアルギニン)及びポリリシン(例えば、オクタリシン)などのポリペプチド;プロトンスポンジ、ウイルスキャプシド、及びペプチド形質導入ドメインが含まれる。例えば、融合ペプチドは、インフルエンザAウイルスのM2タンパク質;インフルエンザウイルスヘマグルチニンのペプチドアナログ;インフルエンザCウイルスのHEFタンパク質;フィロウイルスの膜貫通糖タンパク質;狂犬病ウイルスの膜貫通糖タンパク質;水泡性口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質(G);センダイウイルスの融合タンパク質;セムリキ森林熱ウイルスの膜貫通糖タンパク質;ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質;麻疹ウイルスの融合タンパク質;ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質;ビスナウイルスの融合タンパク質;マウス白血病ウイルスの融合タンパク質;HTLウイルスの融合タンパク質;及びサル免疫不全ウイルス(SIV)の融合タンパク質から誘導され得る。エンドソーム脱出を促進するために使用することができる他の部分は、Dominskaら、Journal of Cell Science、123巻(8号):1183〜1189頁、2010年に記載されている。本明細書に開示されているハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物へのコンジュゲートに好適な部分を含むエンドソーム脱出部分の具体例は、例えばWO2015/188197に提示されている。これらのエンドソーム脱出部分の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１４】
1つ以上のエンドソーム脱出部分(例えば、1〜6又は1〜3)が、本明細書において記載されている通り、-LinkA-を介して、式(I)中のMOIETY又はX2に結合され得る。
【０２１５】
細胞浸透性ペプチド
1つ以上の細胞浸透性ペプチド(例えば、1〜6又は1〜3)が、補助部分として、本明細書において開示されているポリヌクレオチド構築物又はハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物に結合され得る。CPPは、本明細書において開示されている通り、ジスルフィド連結基によって、生物可逆的にハイブリッド化ポリヌクレオチドに連結することができる。したがって、細胞への送達に際して、CPPは、例えば、細胞内酵素(例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン又はチオエステラーゼ)により細胞内で開裂され得、それによりポリヌクレオチドが放出される。
【０２１６】
CPPは、当分野で公知である(例えば、TAT又はArg8)(Snyder及びDowdy、2005年、Expert Opin. Drug Deliv. 2巻、43〜51頁)。本明細書に開示されているハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物へのコンジュゲートに好適な部分を含むCPPの具体例は、例えばWO2015/188197に提示されている。これらのCPPの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１７】
CPPは、細胞への生物学的カーゴの送達を促進することが可能な、正に帯電したペプチドである。CPPの陽イオン性電荷は、それらの機能にとって不可欠であると考えられている。さらに、これらのタンパク質の形質導入は、細胞タイプによって影響を受けるようには思われず、これらのタンパク質は、培養物中に、明白な毒性なしに、ほとんどすべての細胞を効率よく形質導入することができる(Nagaharaら、Nat. Med. 4巻:1449〜52頁、1998年)。完全長タンパク質に加えて、CPPは、DNA(Abu-Amer、上記)、アンチセンスポリヌクレオチド(Astriab-Fisherら、Pharm. Res、19巻:744〜54頁、2002年)、低分子(Polyakovら、Bioconjug. Chem. 11巻:762〜71頁、2000年)、及び無機物である40nmの鉄粒子(Doddら、J. Immunol. Methods 256巻:89〜105頁、2001年;Wunderbaldingerら、Bioconjug. Chem. 13巻:264〜8頁、2002年;Lewinら、Nat. Biotechnol. 18巻:410〜4頁、2000年;Josephsonら、Bioconjug. Chem. 10巻:186〜91頁、1999年)の細胞内への取り込みを誘発するために首尾良く使用されており、この方法における粒子サイズの大きな順応性があることを示唆している。
【０２１８】
一実施形態では、本発明の方法及び組成物において有用なCPPは、実質的にアルファらせん構造であることを特徴とするペプチドを含む。CPPが、重要なアルファらせん構造を示す場合、トランスフェクトが、最適化されることが発見されている。別の実施形態では、CPPは、ペプチドの少なくとも1つの面に沿って実質的に整列している塩基性アミノ酸残基を含有する配列を含む。本発明において有用なCPPは、天然ペプチド又は合成ペプチドとすることができる。
【０２１９】
1つ以上の細胞浸透性ペプチド(例えば、1〜6又は1〜3)が、本明細書において記載されている通り、-LinkA-を介して、式(I)中のMOIETY又はX2に結合され得る。
【０２２０】
ポリマー
本明細書に開示されているポリヌクレオチド構築物及びハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物はまた、共有結合により結合している中性ポリマーをベースとする補助部分を含むことができる。中性ポリマーには、ポリ(C1〜6アルキレンオキシド)、例えば、ポリ(エチレングリコール)及びポリ(プロピレングリコール)並びにそれらのコポリマー、例えば、ジブロックコポリマー及びトリブロックコポリマーが含まれる。ポリマーの他の例には、エステル化ポリ(アクリル酸)、エステル化ポリ(グルタミン酸)、エステル化ポリ(アスパラギン酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(アルキルアクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(N-アルキルアクリルアミド)、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(カプロラクトン)、スチレン-マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L-ラクチド-co-グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリウレタン、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー及びポリ(N,N-ジアルキルアクリルアミド)が含まれる。例示的なポリマー補助部分は、100、300、500、1000又は5000Da(例えば、100Da超)未満の分子量を有することができる。他のポリマーが、当分野において公知である。
【０２２１】
1つ以上のポリマー(例えば、1〜6又は1〜3)が、本明細書において記載されている通り、-LinkA-を介して、式(I)中のMOIETY又はX2に結合され得る。
【０２２２】
固体支持体
本明細書に開示されているポリヌクレオチド構築物又はハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、基-Solを含むことができ、Solは固体支持体である。ポリヌクレオチド構築物と共に使用することができる開裂可能な固体支持体は、当分野において公知である。固体支持体の非限定例には、例えば、当分野で公知の開裂可能なリンカー(例えば、スクシネートをベースとするリンカー)(例えば、UnyLinker(商標))を介して鎖に結合している細孔制御ガラス又はマクロ多孔性ポリスチレンが含まれる。
【０２２３】
コンジュゲート部分
本明細書に開示されているポリヌクレオチド構築物又はハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、-LinkA(-T)p前駆体と反応することができる、コンジュゲート部分を含むことができる。コンジュゲート部分は、コンジュゲート化反応(例えば、環化付加反応(例えば、双極子環化付加)、アミド化反応、求核性芳香族置換)を受けることが可能な少なくとも1つの官能基を含む。例えば、コンジュゲート部分は、アジド、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、-COOR21、-CHO、N-マレイミド、S-保護チオール、
【０２２４】
【化３３】
2019532027.tif 000038
又はそれらのN-保護変形体、
【０２２５】
【化３４】
2019532027.tif 000039
又は-NHRN1を含むことができ、式中、RN1は、H、N-保護基又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲン(例えば、F)である。コンジュゲート部分は、補助部分がポリヌクレオチド構築物にコンジュゲートされるまで、保護されていてもよい。例えば、保護されているコンジュゲート部分は、-COORPGO又は-NHRPGNを含むことができ、RPGOは、O-保護基(例えば、カルボキシル保護基)であり、RPGNは、N-保護基である。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、基[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
QC1は、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【０２２６】
【化３５】
2019532027.tif 000040
又はそれらのN-保護変形体、
【０２２７】
【化３６】
2019532027.tif 000041
、-NHRN1、又は-COOR21若しくは-CHOを含有する置換されていてもよいC1〜16アルキルであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数であり、
RN1は、H、N-保護基又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、
各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、
R22は、ハロゲン(例えば、F)である。
【０２２８】
ヌクレオシド間脱塩基スペーサー
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物が、siRNAとして使用するために企図されているそのような場合、miRNAのような標的外作用の低減が望ましい。ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物に1つ以上(例えば、1つ又は2つ)のヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含ませると、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーは、塩基対相互作用に関与することが可能な核酸塩基を欠如して、立体障害を軽減するので、miRNAのような標的外作用を軽減することができるか、又はなくすことさえできる。したがって、本明細書に開示されているポリヌクレオチド構築物及びハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以上(例えば1つ又は2つ)のヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含むことができる。ポリヌクレオチド構築物が、2つ以上のヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含む場合、それらの構造は同一であってもよく、又は異なっていてもよい。ある種の実施形態では、パッセンジャー鎖は、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有する(例えば、ガイド鎖は、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含まなくてもよい)。他の実施形態では、ガイド鎖は、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有する(例えば、パッセンジャー鎖は、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含まなくてもよい)。さらに他の実施形態では、ガイド鎖は、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有し、パッセンジャー鎖は、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含有する。さらなる実施形態では、パッセンジャー鎖は、ヌクレオシド数(x)とヌクレオシド数(x+t+1)との間に、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含み、xは2〜7の整数である。さらなる実施形態では、ガイド鎖は、ヌクレオシド数(x)とヌクレオシド数(x+t+1)との間に、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含み、xは2〜7の整数である。
【０２２９】
ヌクレオシド間脱塩基スペーサーは、式(III):
【０２３０】
【化３７】
2019532027.tif 000042
(式中、
Lは、糖アナログであり、
各X4は、独立に、O又はSであり、
各X5は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)
とすることができる。
【０２３１】
一部の実施形態では、各X4は、Oである。特定の実施形態では、各X5は、Oである。ある種の実施形態では、各R9は、Hである。他の実施形態では、糖アナログは、-LinkA(-T)p及びコンジュゲート部分からなる群から独立に選択される、1つ又は2つの基により置換されている。
【０２３２】
糖アナログ
糖アナログは、式(III)中の基-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合により、2つのヒドロキシル基が置き換えられるように修飾されている、C3〜6単糖又はC3〜6アルジトール(例えば、グリセロール)である、二価又は三価の基である。糖アナログは、環式又は非環式である。糖アナログに含まれるさらなる任意選択的な修飾は、残留ヒドロキシル基又は炭素が結合した水素原子の1つ、2つ又は3つの、Hによる;置換されていてもよいC1〜6アルキルによる;-LinkA(-T)pによる;コンジュゲート部分による;-(CH2)t1-ORZ(t1は、1〜6の整数であり、RZは、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル又は置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキルである)による置き換え;1つ又は2つの不飽和(例えば、1つ又は2つの二重結合)の導入;及び1個、2個若しくは3個の水素又はヒドロキシル基の、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はヘテロシクリルに関して定義されている置換基による置き換えである。糖アナログの非限定例は、置換されていてもよいC2〜6アルキレン、置換されていてもよいC2〜6アルケニレン、置換されていてもよいC5シクロアルカン-1,3-ジイル、置換されていてもよいC5シクロアルケン-1,3-ジイル、置換されていてもよい複素環-1,3-ジイル(例えば、置換されていてもよいピロリジン-2,5-ジイル、置換されていてもよいテトラヒドロフラン-2,5-ジイル又は置換されていてもよいテトラヒドロチオフェン-2,5-ジイル)又は置換されていてもよい(C1〜4アルキル)-(C3〜8シクロアルキレン)(例えば、置換されていてもよい(C1アルキル)-(C3シクロアルキレン))である。糖アナログの非限定例は、以下:
【０２３３】
【化３８】
2019532027.tif 000043
(式中、
R12は、式(III)中の-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合であり、
R13は、式(III)中の別の-P(X4)(-X5R9)-に結合している酸素原子への結合であり、
各R14及びR15は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル又は-(CH2)t1-ORZであり、nは、1〜6の整数であり、RZは、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル又は置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキルである)
である。
【０２３４】
一部の実施形態では、R14及びR15の少なくとも1つは、Hではない。
【０２３５】
生物非可逆性ホスホトリエステル
本発明のポリヌクレオチド構築物はまた、生物非可逆性ホスホトリエステル(例えば、ジスルフィド又はチオエステルを含まない基により置換されているホスフェート又はホスホロチオエート)を含んでもよい。生物非可逆性ホスホトリエステルは、ヌクレオシド間生物非可逆性ホスホトリエステル(例えば、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物のシード領域の外側に置かれている、生物非可逆性ホスホトリエステル)とすることができる。ガイド鎖中のヌクレオシド間生物非可逆性ホスホトリエステルにとって好ましい位置は、2番目及び3番目のヌクレオシド、5番目と6番目のヌクレオシド、17番目と18番目のヌクレオシド、19番目と20番目のヌクレオシド、又は20番目と21番目のヌクレオシドの間のものである(ガイド鎖の5'末端から計数を開始する)。パッセンジャー鎖中の生物非可逆性ホスホトリエステルにとって好ましい位置は、天然RISC媒介性開裂部位において、2つの連続するヌクレオシドを接続しないものである。
【０２３６】
生物非可逆性ホスホトリエステルは、置換されていてもよいC2〜16アルキル;置換されていてもよいC3〜16アルケニル;置換されていてもよいC3〜16アルキニル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルケニル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び以下の構造の基:
【０２３７】
【化３９】
2019532027.tif 000044
からなる群から独立に選択される、置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートとすることができ、
式中、
Lは、C1〜6アルキレンであり、
Rbは、置換されていてもよいC2〜6アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び-OH、C1〜6アルコキシ又は-COOHが末端であるポリ(エチレングリコール)であり、
Rcは、H又はC1〜6アルキルである。
【０２３８】
生物非可逆性ホスホトリエステルは、C2〜16アルキル、
【０２３９】
【化４０】
2019532027.tif 000045
又は
【０２４０】
【化４１】
2019532027.tif 000046
とアジド含有基質との環化付加反応によって形成される基である置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートとすることができ、
式中、
tは、1〜6の整数であり、
Rdは、置換されていてもよいC6アリール、1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である置換されていてもよいC4〜5ヘテロアリール、又は1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である置換されていてもよいC4〜5ヘテロシクリルであり、
Reは、H又はC1〜6アルキルであり、
X3は、ハロゲン、-COOR5又は-CONR62であり、R5及び各R6は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール又は置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであり、
アジド含有基質は、
【０２４１】
【化４２】
2019532027.tif 000047
である。
【０２４２】
ポリヌクレオチド構築物の調製
本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築物を製造する方法をさらに提供する。ヌクレオチド及びポリヌクレオチドを調製する方法は、当分野において公知である。例えば、ポリヌクレオチドを調製するためのホスホロアミダイト化学の実施は、Caruthers及びBeaucageなどの公開されている研究から公知である。例えば、米国特許第4,458,066;4,500,707;5,132,418;4,415,732;4,668,777;4,973,679;5,278,302、5,153,319;5,218,103;5,268,464;5,000,307;5,319,079;4,659,774;4,672,110;4,517,338;4,725,677;及びRE34,069号を参照されたい。これらの各々が参照により本明細書に組み込まれており、ポリヌクレオチドの合成法を記載している。さらに、ホスホロアミダイト化学の実施は、Beaucageら、Tetrahedron、48巻:2223〜2311頁、1992年及びBeaucageら、Tetrahedron、49巻:6123〜6194頁、1993年、並びにそれらに言及されている参照文献により系統的に概説されており、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれている。本発明のポリヌクレオチド構築物の合成において有用な合成原理は、PCT/US2014/064401及びPCT/US2015/034749に開示されている。PCT/US2014/064401及びPCT/US2015/034749における、ポリヌクレオチド構築物の合成の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４３】
核酸合成装置が市販されており、その使用は、所望となり得る妥当な長さのほとんどいかなるポリヌクレオチドの生成に有効なものとして、当業者により一般に理解されている。
【０２４４】
ホスホロアミダイト化学の実施の際には、有用な5'OH糖ブロック基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル及びトリメトキシトリチル、とりわけジメトキシトリチル(DMTr)である。ホスホロアミダイト化学の実施の際には、有用なホスファイト活性基は、ジアルキル置換窒素基及び窒素複素環である。手法の1つは、ジ-イソプロピルアミノ活性基の使用を含む。
【０２４５】
ポリヌクレオチドは、Mermade-6固相自動化ポリヌクレオチド合成装置、又は任意の一般に入手可能な自動化ポリヌクレオチド合成装置により合成することができる。トリエステル、ホスホロアミダイト又は水素ホスホネートのカップリング化学(例えば、M. Caruthers、Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression、7〜24頁、J. S. Cohen(編)(CRC Press、Inc. Boca Raton、Fla.、1989年);Oligonucleotide synthesis, a practical approach、(編)M. J. Gait、IRL Press、1984年;及びOligonucleotides and Analogues, A Practical Approach、(編)F. Eckstein、IRL Press、1991年に記載されている)が、これらの合成装置によって使用されて、所望のポリヌクレオチドが得られる。例えば、Journal of American Chemical Society、112巻:1253〜1255頁、1990年に記載されているBeaucage試薬、又はBeaucageら、Tetrahedron Letters 22巻:1859〜1862頁、1981年に記載されている元素硫黄をホスホロアミダイト又はホスホン酸水素の化学と共に使用して、置換ホスホロチオエートポリヌクレオチドが得られる。
【０２４６】
例えば、本明細書において列挙されている保護基を含有する試薬は、保護が望ましい多数の用途に使用することができる。このような用途には、以下に限定されないが、固相及び溶液相の両方でのポリヌクレオチド合成などが含まれる。
【０２４７】
例えば、リボース上の2'-O位におけるメチル基、プロピル基若しくはアリル基、又はリボヌクレオシド塩基上の2'-O基又はブロモ基を置換するフルオロ基などの構造基が、ポリヌクレオチドに組み込むために、リボース、又はヌクレオシドの塩基に場合により付加される。ホスホロアミダイト化学と使用する場合、2'-デオキシホスホロアミダイト、2'-O-メチルホスホロアミダイト及び2'-O-ヒドロキシルホスホロアミダイトを含めた、様々なホスホロアミダイト試薬が市販されている。このような合成に関する任意の他の手段も使用されてもよい。ポリヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の裁量内にある。ホスホロチオエート、メチルホスホネート及びアルキル化誘導体などの他のポリヌクレオチドを調製するための類似の技法を使用することがやはり周知である。類似の技法、並びにビオチン、Cy3、フルオレセイン、アクリジン又はソラレン修飾ホスホロアミダイト及び/又はCPG(Glen Research、Sterling Va.から入手可能)などの市販の修飾済みホスホロアミダイト及び細孔制御ガラス(CPG)製品を使用して、蛍光標識されているビオチン化又は他のコンジュゲート化ポリヌクレオチドを合成することもやはり周知である。
【０２４８】
本発明のポリヌクレオチド構築物の合成において使用されるホスホロアミダイトは、式(IV):
【０２４９】
【化４３】
2019532027.tif 000048
(式中、
各R1及びR2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル又はコンジュゲート部分(例えば、置換されていてもよいN-保護アミノ、-COOR21又は-CHOを含有する置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【０２５０】
【化４４】
2019532027.tif 000049
又はそれらのN-保護変形体、
【０２５１】
【化４５】
2019532027.tif 000050
であり、
各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲン(例えば、F)である)であり、
各R16は、独立に、ジアルキルアミノ、2-シアノエチル又はコンジュゲート部分であり、但し、少なくとも1つのR16はジアルキルアミノであり、
R17はヒドロキシル保護基であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれが、独立に、0〜6の整数であり、但し、m1及びm2の合計が0ではない)
とすることができる。
【０２５２】
式(IV)の一部の例では、R1及びR2は双方とも、置換されていてもよいC2〜16アルキニルを含むコンジュゲート部分である場合、残りのR16は、ジアルキルアミノ又はコンジュゲート部分である。
【０２５３】
式(IV)のある種の場合、R1及びR2のそれぞれが、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル又は[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
式中、
QC1は、置換されていてもよいC2〜12アルキニル又は置換されていてもよいN-保護アミノであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である。
【０２５４】
コンジュゲート
本発明のポリヌクレオチド構築物の調製は、ポリヌクレオチド構築物中のホスフェート又はホスホロチオエートに生物非可逆的に結合されている補助部分をコンジュゲートすることを含むことができる。補助部分及びリンカーは、相補性コンジュゲート部分を含む。ポリヌクレオチド構築物中の結合の位置は、リンカーを有するホスフェート又はホスホロチオエートの位置決めによって決定される。したがって、もう1つのコンジュゲート部分を含有するポリヌクレオチド構築物は、適切な条件下で、補助部分上の1つ以上の相補性コンジュゲート部分と反応するであろう。補助部分は、コンジュゲート部分、例えば、ペプチド中の末端又はリシンアミン基、及びチオール基を元々有していることがある、又はコンジュゲート部分を導入するための小さな連結基を含むように修飾されていることがある。このような連結基の導入は、当分野で周知である。本発明のヌクレオチド構築物に結合している補助部分は、いかなる必要な連結基も含むことが理解されよう。
【０２５５】
多様な結合形成法を使用して、本明細書に記載されているヌクレオチド構築物に補助部分をコンジュゲートすることができる。例示的な反応には、アジドとアルキンとの間の環化付加によるトリアゾールの形成、ジエノフィルとジエン/ヘテロジエンとの間のディールスアルダー反応、エン反応などの他のペリ環化反応による結合形成、アミド又はチオアミド結合形成、スルホンアミド結合形成、アルコール又はフェノールのアルキル化(例えば、ジアゾ化合物による)、縮合反応によるオキシム基、ヒドラゾン基又はセミカルバジド基の形成、求核剤(例えば、アミン及びチオール)による共役付加反応、ジスルフィド結合形成、及びカルボン酸官能基における求核置換(例えば、アミン、チオール又はヒドロキシル求核剤による)が含まれる。結合形成の他の例示的な方法は、本明細書に記載されており、当分野で公知である。
【０２５６】
求核剤/求電子剤反応
求核剤及び求電子剤は、非限定的に、求電子剤によるC-H結合への正味の挿入、求電子剤によるO-H結合への正味の挿入、求電子剤によるN-H結合への正味の挿入、求電子剤のアルケンへの付加、求電子剤のアルキンへの付加、求電子性カルボニル中心への付加、求電子性カルボニル中心における置換、ケテンへの付加、イソシアネートへの求核付加、イソチオシアネートへの求核付加、活性化ケイ素中心における求核置換、ハロゲン化アルキルの求核置換、アルキル擬似ハロゲン化物における求核置換、活性化ルボニルにおける求核付加/脱離、求核剤のα,β-不飽和カルボニルへの1,4-共役付加、エポキシドの求核的開環、電子不足芳香族化合物の求核芳香族置換、活性化リン中心への求核付加、活性化リン中心における求核置換、活性化硫黄中心への求核付加、及び活性化硫黄中心における求核置換から選択される結合形成反応に関与することができる。
【０２５７】
求核性コンジュゲート部分は、置換されていてもよいアルケン、置換されていてもよいアルキン、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基及びチオ基から選択することができる。
【０２５８】
求電子性コンジュゲート部分は、アジド、活性化ケイ素中心、活性化カルボニル、無水物、イソシアネート、チオイソシアネート、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、ハロゲン化アルキル、アルキル擬似ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、電子不足アリール、活性化リン中心及び活性化硫黄中心から選択することができる。
【０２５９】
例えば、コンジュゲートは、縮合反応により行われ、ヒドラゾン結合である、連結基を形成することができる。別の非限定例では、コンジュゲートは、Pictet-Spengler反応によって行われてもよい。代替的に、コンジュゲートは、スクワレート、2-スルホニル-1,3-ベンゾチアゾール、5-スルホニル-1,2,3,4-テトラゾール、2-スルホニル-1,3,4-オキサジアゾール又は4-ハロベンゾフラザン中の脱離基を置換することにより行うことができる。
【０２６０】
アミド結合の形成によるコンジュゲートは、カルボキシルに基づくコンジュゲート部分の活性化と、その後の一級アミンに基づくコンジュゲート部分との反応により媒介され得る。活性化剤は、以下のような様々なカルボジイミド:EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)、EDAC(1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)、CMC(1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド)、DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)又はWoodward試薬であるK(N-エチル-3-フェニルイソオキサゾリウム-3'-スルホネート)とすることができる。活性化NHS-エステルに基づくコンジュゲート部分と一級アミンに基づくコンジュゲート部分との反応は、アミド結合の形成をやはりもたらす。
【０２６１】
エーテル形成も、本発明のヌクレオチド構築物に補助部分をコンジュゲートするために使用することができる。エーテル連結基によるコンジュゲートは、エポキシドに基づくコンジュゲート部分とヒドロキシに基づくコンジュゲート部分との反応により媒介され得る。
【０２６２】
チオエーテル連結基の形成によるコンジュゲートは、スルフヒドリルに基づくコンジュゲート部分をマレイミドに基づくコンジュゲート部分と反応させることにより、又はエポキシドに基づくコンジュゲート部分と反応させることにより行うことができる。マレイミドに基づくコンジュゲート部分は、SMCC(スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、スルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、スルホ-MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-スルホヒドロキシスクシンイミドエステル)、SMPB(スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、スルホ-SMPB(スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、GMBS(N-α-マレイミドブツリル-オキシスクシンイミドエステル)又はスルホGMBS(N-α-マレイミドブツリル-オキシスルホスクシンイミドエステル)によって導入することができる。
【０２６３】
カルバメート連結基の形成によるコンジュゲートは、ヒドロキシに基づくコンジュゲート部分をCDI(N,N'-カルボニルジイミダゾール)又はDSC(N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート)又はN-ヒドロキシスクシンイミジルクロロギ酸エステルと反応させて、続くアミンに基づくコンジュゲート部分との反応により行うことができる。
【０２６４】
光分解及び熱分解コンジュゲート
代替的に、コンジュゲート部分は、所望の共有結合を形成するため、光分解又は熱分解による活性化を使用することができる。アジド官能基を含むコンジュゲート部分が一例である。したがって、コンジュゲートはまた、光反応性コンジュゲート部分の導入によって達成することができる。光反応性コンジュゲート部分は、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ある種のジアゾ化合物及びジアジリン誘導体である。それらは、アミノに基づくコンジュゲート部分と、又は活性化水素結合を有するコンジュゲート部分と反応する。
【０２６５】
アジドに基づくコンジュゲート部分は、UV分解性であり、光分解時に、アリールに基づくコンジュゲート部分又はアルケニルに基づくコンジュゲート部分などの求核性コンジュゲート部分と反応することができる、ナイトレン求電子剤の形成をもたらすことができる。代替的に、これらのアジド化合物を加熱すると、ナイトレン形成をやはりもたらすことができる。
【０２６６】
環化付加反応
環化付加反応は、所望の共有結合を形成するために使用することができる。代表的な環化付加反応には、以下に限定されないが、アルケンに基づくコンジュゲート部分と1,3-ジエンに基づくコンジュゲート部分との反応(ディールスアルダー反応)、アルケンに基づくコンジュゲート部分とα,β-不飽和カルボニルに基づくコンジュゲート部分との反応(ヘテロディールスアルダー反応)、及びアルキンに基づくコンジュゲート部分とアジドに基づくコンジュゲート部分との反応(Huisgen環化付加)が含まれる。環化付加反応のための反応剤を含むコンジュゲート部分の選択される非限定例は、アルケン、アルキン、1,3-ジエン、α,β-不飽和カルボニル及びアジドである。例えば、アジドとアルキンとの間のHuisgen環化付加(クリック反応)は、多様な生物学的実体の官能基化に使用されている。
【０２６７】
医薬組成物
本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物の送達は、当業者に公知の様々な方法を使用して、細胞を構築物と接触させることにより達成することができる。特定の実施形態では、本発明のヌクレオチド構築物は、本明細書のいずれかに一層十分に記載されている通り、様々な賦形剤、ビヒクル及び担体と共に製剤化される。
【０２６８】
本発明による医薬組成物は、担体、賦形剤及びビヒクルを使用して、本明細書において開示されているハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物を含ませて、対象に投与するのに好適な形態に調製することができる。高い頻度で使用される賦形剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース及びその誘導体、動物油及び植物油、ポリエチレングリコール、並びに溶媒、例えば滅菌水、アルコール、グリセロール及び多価アルコールが含まれる。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養素補助物を含む。保存剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスを含む。他の薬学的に許容されるビヒクルは、水溶液、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版、Gennaro(編)、Lippencott Williams & Wilkins(2005年)及び2013年に出版された、The United States Pharmacopeia: The National Formulary(USP36 NF31)に記載されている、塩、保存剤、緩衝剤などを含む非毒性賦形剤を含む。当分野における定型的技術に準拠して、医薬組成物の様々な構成成分のpH及び正確な濃度が調節される。Goodman及びGilmanのThe Pharmacological Basis for Therapeuticsを参照されたい。
【０２６９】
本発明による医薬組成物は、局所又は全身に投与され得る。治療有効量は、対象における感染の程度、個体の年齢、性別及び体重などの因子に応じて様々となろう。投与量レジメンを調節して、最適治療応答を実現することができる。例えば、いくつかの分割用量分を毎日、投与することができ、又はこの用量を、治療状況の緊急性によって示される通り、比例して減量することができる。
【０２７０】
本医薬組成物は、注射(例えば、皮下、静脈内、眼窩内など)、経口投与、眼適用、吸入、局所施用又は直腸投与などによって、都合のよい方法で投与することができる。本医薬組成物は、投与経路に応じて、本医薬組成物を不活性化する恐れのある酵素、酸及び他の天然条件の作用から本医薬組成物を保護するための物質によりコーティングされ得る。本医薬組成物はまた、非経口的に又は腹腔内に投与され得る。グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中で分散液も調製することができる。保管及び使用という通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するため保存剤を含有していることがある。
【０２７１】
注射用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液(この場合、水溶性)又は分散液、及び注射用滅菌溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。組成物は、通常、滅菌されて、注射が容易な程度の流動性がある。通常、本組成物は、製造及び保管の条件下で安定であり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護される。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多数の場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムが、本組成物に使用される。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含ませることによりもたらすことができる。
【０２７２】
注射用滅菌溶液は、適切な溶媒中に必要量の医薬組成物を、必要な場合、上で列挙した成分の1つ又は組合せ物と共に配合し、次いで滅菌濾過することにより調製することができる。一般に、分散液は、基剤となる分散媒体、及び上で列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに本医薬組成物を配合することにより調製される。
【０２７３】
投与の容易さ及び投与量の均質性のため、投与単位形態の非経口組成物を製剤化するのがとりわけ有利である。投与単位形態とは、本明細書で使用する場合、処置される対象に対する単位投与量として適切な、物理的に個別の単位を指す。所定量の医薬組成物を含有する各単位は、必要な医薬品用ビヒクルと一緒に、所望の治療効果を生じるよう算出される。本発明の投与単位形態に関する規格は、本医薬組成物の特徴及び実現される特定の治療効果に関連する。主な医薬組成物は、都合よくかつ効果的な投与となるよう、許容可能な投与量単位中に好適な薬学的に許容されるビヒクルと共に、有効量で配合される。補助活性成分を含有する組成物の場合、投与量は、該成分の通常の用量及び投与方法を参照することにより決定される。
【０２７４】
局所製剤の場合、基礎組成物は、米国食品医薬品局(FDA)により一般に安全と認められているもの(Generally Regarded as Safe: GRAS)などの任意の溶媒系を用いて調製することができる。GRAS溶媒系には、局所使用向けにFDAにより承認を受けている送達用ビヒクルとして、ブタン、プロパン、n-ブタンなどの多数の短鎖炭化水素、又はそれらの混合物が含まれる。局所用組成物は、任意の皮膚科学的に許容可能なビヒクルも使用して製剤化することができる。例示的なビヒクルには、アルミナ、クレイ、マイクロクリスタリンセルロース、シリカ若しくはタルクなどの固体ビヒクル、及び/又はアルコール、グリコール若しくは水-アルコール/グリコールブレンドなどの液体ビヒクルが含まれる。本化合物はまた、化合物が皮膚に進入することを可能にする、リポソーム製剤中で投与されてもよい。このようなリポソーム製剤は、米国特許第5,169,637号、同第5,000,958号、同第5,049,388号、同第4,975,282号、同第5,194,266号、同第5,023,087号、同第5,688,525号、同第5,874,104号、同第5,409,704号、同第5,552,155号、同第5,356,633号、同第5,032,582号、同第4,994,213号、及びPCT公開番号WO96/40061に記載されている。他の適切なビヒクルの例は、米国特許第4,877,805号、米国特許第4,980,378号、米国特許第5,082,866号、米国特許第6,118,020号、及びEP出願番号0586106(A1)に記載されている。本発明の好適なビヒクルはまた、鉱物油、ワセリン、ポリデセン、ステアリン酸、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸ポリオキシル40、ステアリルアルコール又は植物油を含んでもよい。
【０２７５】
局所用組成物は、任意の有用な形態で提供され得る。例えば、本発明の組成物は、担体と一緒に、例えば、溶液剤、エマルション剤(マイクロエマルション剤を含む)、懸濁液剤、クリーム剤、フォーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、バーム剤、又は本組成物が使用され得る皮膚若しくは他の組織に塗布するために使用される他の典型的な固形、半固形若しくは液状組成物として製剤化され得る。このような組成物は、このような製品に通常、使用される他の賦形剤、例えば、着色剤、フレグランス、増粘剤、抗菌剤、溶媒、界面活性剤、洗剤、ゲル化剤、抗酸化剤、充填剤、染料、粘度制御剤、保存剤、保湿剤、エモリエント(例えば、天然油又は合成油、炭化水素油、ワックス又はシリコーン)、水和剤、キレート剤、鎮痛剤、可溶化賦形剤、アジュバント、分散剤、皮膚浸透促進剤、可塑化剤、保存剤、安定剤、解乳化剤、湿潤剤、日焼け防止剤、乳化剤、うるおい剤、収斂薬、脱臭剤を含んでもよく、かつ場合により、麻酔剤、抗掻痒剤、植物抽出物、コンディショニング剤、黒化剤若しくは美白剤、輝き剤(glitter)、保湿剤、雲母、ミネラル、ポリフェノール、シリコーン又はその誘導体、日焼け止め剤、ビタミン及び生薬(phytomedicinal)を含む。
【０２７６】
一部の製剤では、本組成物は眼用途に製剤化される。例えば、眼用途向け医薬製剤は、水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理学的に許容される眼科用ビヒクル媒体と混合した、例えば最大99重量%となる量で、本明細書に記載されているポリヌクレオチド構築物を含むことができる。眼への送達の場合、本明細書に記載されているポリヌクレオチド構築物は、眼科学的に許容される保存剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム又は水と一緒にされて、水性の滅菌眼科用懸濁液剤又は溶液剤を形成することができる。眼用溶液製剤は、生理学的に許容される等張性水性緩衝液中にポリヌクレオチド構築物を溶解することにより調製することができる。さらに、眼科用溶液剤は、阻害剤の溶解を支援する、眼科学的に許容される界面活性剤を含んでもよい。本化合物の保持を改善するため、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの粘度向上剤(viscosity building agent)が、本発明の組成物に添加されてもよい。
【０２７７】
局所用組成物は、眼の表面に、例えば1日当たり1〜4回、又は熟練臨床医の決まった手順による判断に従い、毎日、毎週、二週毎、毎月又はそれより長い期間などの長い送達計画で送達され得る。製剤のpHは、約4〜約9又は約4.5〜約7.4の範囲とすることができる。
【０２７８】
本医薬組成物は、例えば、担体中、例えば、腸溶コーティングされている単位剤形で、経口投与され得る。本医薬組成物及び他の成分はまた、硬質又は軟質シェルゼラチンカプセル中に封入され得るか、又は錠剤に圧縮され得る。経口による治療的投与の場合、本医薬組成物は、賦形剤と共に配合されて、及び摂取可能な錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ウェハ剤などの形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、活性化合物を少なくとも1重量%含有するべきである。本組成物及び調製物の割合は、当然ながら、様々とすることができ、単位重量の約5%〜約80%の間とするのが好都合となり得る。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下:ガムトラガカント、アカシア、トウモロコシデンプン又はゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及びスクロース、ラクトース又はサッカリンなどの甘味剤、又はペパーミントなどの着香剤、ウインターグリーン油又はチェリー着香料を含有することができる。投与単位形態が、カプセル剤である場合、この形態は、上記のタイプの物質の他に、液体担体を含有することができる。様々な他の物質が、コーティング剤として、又は他には投与量単位の物理的形態を修飾するために提供され得る。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤が、シェラック、糖、又はそれらの両方でコーティングされ得る。シロップ剤又はエリキシル剤は、作用剤、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、染料、並びにチェリー又はオレンジ風味剤などの着香料を含有することができる。任意の投与単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、使用される量で、薬学的に許容される純度及び実質的に非毒性であるべきである。さらに、本医薬組成物は、持続放出調製物及び製剤に配合され得る。
【０２７９】
本発明のヌクレオチド構築物の場合、好適な薬学的に許容される塩には、(i)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミン及びスペルミジンなどのポリアミンと共に形成される塩、(ii)無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などと共に形成される酸付加塩、(iii)例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸と共に形成される塩が含まれる。
【０２８０】
本明細書に記載されているハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、標的細胞への送達のための賦形剤の使用を必要としないことがあるが、賦形剤の使用は、一部の実施形態において有利となることがある。したがって、標的細胞への送達の場合、本発明のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、賦形剤に非共有結合により結合して、複合体を形成することができる。賦形剤を使用して、送達後の生体分布を改変する、取り込みを増強する、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物中の鎖の半減期又は安定性を向上させる(例えば、ヌクレアーゼ耐性を改善する)、及び/又は特定の細胞若しくは組織タイプに対する標的指向性を向上させることができる。
【０２８１】
例示的な賦形剤には、凝集剤(condensing agent)(例えば、イオン性相互作用又は静電気的相互作用により、核酸を誘引する又は結合することができる作用剤)、融合剤(例えば、細胞膜を融合する、及び/又は細胞膜を介して輸送することが可能な作用剤)、特定の細胞又は組織タイプを標的とするタンパク質(例えば、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインA又は任意の他のタンパク質)、脂質、リポポリサッカライド、脂質ミセル又はリポソーム(例えば、ホスホチジルコリンなどのリン脂質、脂肪酸、糖脂質、セラミド、グリセリド、コレステロール又はそれらの任意の組合せから形成されるもの)、ナノ粒子(例えば、シリカ、脂質、炭水化物又は他の薬学的に許容されるポリマーナノ粒子)、陽イオン性ポリマー及び陰イオン性剤(例えば、CRO)から形成されるポリプレックス(例示的な陽イオン性ポリマーには、ポリアミン(例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアミドアミン及びポリエチレンイミンが含まれる))、コレステロール、デンドリマー(例えば、ポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマー)、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)又は低密度リポタンパク質(LDL))、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸)、脂質、合成ポリマー(例えば、ポリリシン(PLL)、ポリエチレンイミン、ポリ-L-アスパラギン酸、ポリ-L-グルタミン酸、スチレン-マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L-ラクチド-co-グリコール酸)コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸)、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、偽ペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣薬ポリアミン又はポリアミン)、陽イオン性部分(例えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はアルファらせんペプチド)、多価糖(例えば、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、多価マンノース又は多価フコース);ビタミン(例えば、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンB、葉酸、ビタミンB12、リボフラビン、ビオチン又はピリドキサール)、補因子又は取り込み向上するための細胞骨格を撹乱させる薬物(例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン又はミオセルビン)が含まれる。
【０２８２】
本明細書に記載されている他の治療剤は、本発明のヌクレオチド構築物と組み合わされて、本発明の医薬組成物に含まれてもよい。
【０２８３】
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物の細胞内活性
本発明は、本明細書に開示されているハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物を送達する組成物及び方法を提供する。したがって、本発明は、RNA干渉(RNAi)によって遺伝子又はタンパク質発現に及ぼす調節作用を発揮する非コードヌクレオチド構築物の送達に有用な方法及び組成物を提供する。RNA干渉(RNAi)は、メッセンジャーRNA(mRNA)が、サイレンシングされる標的遺伝子のヌクレオチド配列と同一の又は非常に類似しているヌクレオチド配列を含有する、二本鎖RNA(dsRNA)から誘導される、短い干渉RNA(siRNA)によって分解する過程である。この過程は、転写後で翻訳前の操作により、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を阻止する。したがって、優性疾患遺伝子又は他の標的遺伝子のサイレンシングを行うことができる。
【０２８４】
インビボでのRNAiは、dsRNAが、Dicerと呼ばれる酵素である、dsRNAエンドリボヌクレアーゼによって、短い干渉RNA(siRNA)に開裂される過程によって進行し(Bernsteinら、2001年;Hamilton & Baulcombe、1999年、Science 286巻:950号;Meister及びTuschl、2004年、Nature 431巻、343〜9頁)、こうして、元々の単一dsRNAから複数の分子が生成する。siRNAは、多量体のRNAiサイレンシング複合体(RISC)にロードされて、触媒による活性化及びmRNA標的特異性の両方をもたらす(Hannon及びRossi、Nature 431巻、371〜378頁、2004年;Novina及びSharp、Nature 430巻、161〜164頁、2004年)。RISCにsiRNAがロードする間、アンチセンス鎖又はガイド鎖は、siRNAから分離されて、RISC触媒サブユニットであるアルゴナウト-2(Ago2)にドックされたままとなる(Leuschnerら、EMBO Rep.7、314〜320頁、2006年)。小胞体(ER)、ゴルジ装置、ER-ゴルジ中間区画(ERGIC)、P-ボディ、及び初期エンドソームなどのある種の細胞区画は、Ago2において富化されている。核から細胞質にエクスポートされたmRNAは、リボソームに到達する前に、活性化RISCを通過し、これにより、遺伝子発現の指向された転写後で翻訳前の調節を可能にすると考えられている。理論では、あらゆる細胞のmRNAが、選択的RNAi応答の誘発によって調節され得る。
【０２８５】
siRNAが哺乳動物細胞において、インビトロでRNAi応答を効率的に誘発する能力が知られている(Sontheimer、Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6巻、127〜138頁、2005年)。通常、siRNAに関するIC50は、10〜100pMの範囲と、1〜10nMの範囲のIC50値を有する最良の薬物よりかなり低い。したがって、この優れた選択性のために、RNAiは、細胞表現型の指向的操作、遺伝経路のマッピング、治療標的の発見及び正当性に対する礎石となり、大きな治療可能性を有する。
【０２８６】
RNAiの態様は、(1)dsRNAが干渉剤であること、(2)この過程は配列特異的となり得、驚くほど強力であること(効果的な干渉に、細胞あたりわずか数個のdsRNA分子を必要とする)、(3)干渉活性(及び、恐らくは、dsRNA)は、導入部位からかなり離れた細胞及び組織において干渉を引き起こすことができるということを含む。しかし、dsRNAの有効な送達は困難である。例えば、13,860ダルトンの分子量を有する21bp dsRNAは、(1)サイズ、及び(2)生理学的に関連するpHレベルでのRNA分子上の負電荷の蓄積により、細胞膜を横切って細胞質に進入することができない。本発明の方法及び組成物は、電荷の中和及び取り込みの改善により、dsRNAなどのヌクレオチド構築物の細胞への送達を実現する。
【０２８７】
標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補性であるsiRNA配列を含むdsRNAは、任意の多数の方法、例えば本明細書に記載されている方法で調製することができる。siRNA配列を特定する方法及び技法は、当分野において公知である。siRNAヌクレオチド配列は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)のウェブサイト(World Wide Web上でncbi.nlm.nih.govで入手可能)から、受託番号又はGI番号を提示した後に、siRNA選択プログラム、Whitehead Institute for Biomedical Research、Massachusetts Institute of Technology、Cambridge、Mass.(現在は、http:[//]sirna.wi.mit.eduで入手可能;括弧は、ハイパーリンクしないように付け加えていることに留意されたい)から得ることができる。代替的に、適切なsiRNA配列を含有するdsRNAは、Miyagishi及びTaira(2003年)の戦略を使用して確認することができる。市販のRNAi設計者アルゴリズムもまた存在する(http:[//]rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)。注文に応じたRNAの調製物が市販されている。
【０２８８】
本発明のヌクレオチド構築物はまた、mRNAの開裂を誘発するmiRNAとして働くことがある。代替的に、本発明のヌクレオチド構築物は、アンチセンス剤として働き、mRNAに結合し、RNアーゼによる開裂の誘発又は翻訳の立体的遮断のどちらかを行うことができる。
【０２８９】
本発明のヌクレオチド構築物が細胞に輸送され得る例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【０２９０】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図されている。それらは、本発明を決して限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２９１】
前駆体
本発明のポリヌクレオチドの調製において有用な前駆体は、WO2015/188197中で提供される(例えば、ホスホルアミダイト、標的指向性部分、及びPEG鎖を含む生物可逆性基)。
【０２９２】
ホスホルアミダイト及び他のモノマー
本発明のポリヌクレオチドの合成において有用なヌクレオシド含有中間体は、WO2015/188197中で開示される(例えば、WO2015/188197中の化合物U1-U54、A1-A15、C1-9及びG1-G12)。
【０２９３】
市販のホスホルアミダイトは、グレンリサーチ(Glen Research)(Sterlingヴァージニア州)又はケムジーンズ(ChemGenes)(Wilmingtonマサチューセッツ州)から購入した。必要な場合、他のホスホロアミダイトは、適切に保護されたヌクレオシドから、本明細書中又は他の箇所に記載の標準的な反応条件を使用して調製した。
【０２９４】
[実施例1]
中間体の合成
X1及びX2リンカー合成-スキーム1:
【０２９５】
【化４６】
2019532027.tif 000051
【０２９６】
化合物S110
【０２９７】
【化４７】
2019532027.tif 000052
アルゴン下0℃のNaH(13.2g、ミネラルオイル中60%、230.0mmol)のTHF(40mL)中懸濁液に、ジオール(S109、4.92g、22.0mmol)のTHF(20mL)中溶液を適加し、生じた混合物を室温に温め、1時間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、臭化プロパルギル(18.6g、158.4mmol)のTHF(25mL)中溶液を徐々に添加し、生じた混合物を室温に温め、40℃で終夜撹拌した。TLCによって観察されるように、生成物が消費された後、0℃の水の適加によって反応を止め、生じた混合物をジクロロメタン(50mL×2)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、残留物を得て、これを、ISCOコンパニオン(ISCO companion)を使用するフラッシュシリカゲルカラム(ヘキサン/酢酸エチル、0〜30%)で精製して、5.92g(89.5%)の化合物S110を油として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.49-7.47 (dd, J 8.0, 1.5 Hz, 2H), 7.38-7.34 (m, 3H), 5.43 (s, 1H), 4.21 (d, J 2.5 Hz, 2H), 4.12 (t, J 2.5 Hz, 4H), 4.10 (s, 1H), 3.91 (s, 1H), 3.89 (s, 1H), 3.37 (s, 2H); ESI MS: C18H20O4の計算値  300.34,  実測値  [M+H]+ 301.3
【０２９８】
化合物S111
【０２９９】
【化４８】
2019532027.tif 000053
ビス-プロパルギル化合物S110(5.9g、19.64mmol)を酢酸/水混合物(60mL、75:25)に溶解し、反応を50℃で2時間続けた。反応の完了後、溶液を蒸発させ、トルエン(2×20mL)と共蒸発させた。残留物をワークアップなしでISCOコンパニオンを使用するフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル、20〜80%)で直接精製して、3.02g(72.5%)の化合物S111を油として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ4.15 (d, J 2.5 Hz, 4H), 3.68 (s, 4H), 3.59 (s, 4H), 2.44 (t, J 2.5 Hz, 2H), 2.30-2.40 (br, 2H); ESI MS: C11H16O4の計算値  212.24,  実測値  [M+H]+ 213.2
【０３００】
化合物S112
【０３０１】
【化４９】
2019532027.tif 000054
ジオールS111(3.0g、14.2mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(3.15mL、17.0mmol)及びDMAP(0.36g、2.83mmol)の0℃のジクロロメタン(25mL)中溶液に、ジメトキシトリチルクロリド(4.8g、14.2mmol)のジクロロメタン(40mL)中溶液を適加し、反応を室温で終夜続けた。混合物をジクロロメタンで希釈し、水、続いてブラインで洗浄し、有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。生じた残留物を、ISCOコンパニオンを使用するフラッシュシリカゲルカラム(ヘキサン/酢酸エチル、0〜40%)で精製して、5.29g(73%)のモノDMT保護化合物S112を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.4-7.42 (m, 2H), 7.32-7.31 (m, 4H), 7.28-7.25 (m, 2H), 6.84-6.81 (m, 4H), 4.09 (d, J 2.5 Hz, 4H), 3.79 (s, 6H), 3.67 (d, J 6.0 Hz, 2H), 3.64-3.56 (m, 4H), 3.13 (s, 2H), 2.39 (t, J 2.5 Hz, 2H);  ESI MS: C32H34O6の計算値  514.6,  実測値  [M+Na]+ 537.4
【０３０２】
化合物S113
【０３０３】
【化５０】
2019532027.tif 000055
DMT保護化合物S112(0.5g、0.98mmol)のジクロロメタン(4mL)中溶液に、2'-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホルアミダイト(0.58g、1.95mmol)のジクロロメタン(3mL)中溶液を室温で、続いて5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(BTT、アセトニトリル中0.25M溶液、0.78mL、0.18mmol)をアルゴン雰囲気下で適加した。出発原料が消失するまで(2時間)反応を続け、粗混合物を20mLのジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3溶液(10mL)及びブライン(10mL)で逐次的に洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗混合物を、共溶媒として酢酸エチル/3%トリエチルアミンを有するヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー(コンビフラッシュ(Combi Flash)Rf装置での0〜30%グラジエント)で精製して、0.53gの化合物S113(75%)を油として得た。ESI MS: C41H51N2O7Pの計算値  714.82,  実測値  715.6 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ147.89
【０３０４】
化合物S114
【０３０５】
【化５１】
2019532027.tif 000056
アルゴン雰囲気下、DMT保護化合物S112(0.98g、1.9mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.39mL、2.09mmol)の、8.0mLの乾燥ジクロロメタン中-78℃溶液に、ビス-(N,N-ジイソプロピルアミノ)-クロロホスフィン(0.56g、2.09mmol)のジクロロメタン(4.0mL)溶液を適加した。撹拌を1時間継続しながら、反応混合物を室温に温めた。3-ブチン-1-オール(0.14g、1.9mmol)の2.0mLの乾燥ジクロロメタン中溶液を室温で添加し、生じた混合物を10分間撹拌し、その時点で、ETTのアセトニトリル中0.25M溶液(4.6mL、1.15mmol)を添加し、撹拌を追加で3時間続けた。反応の完了後、TLCによる出発原料の消失によって観察されるように、粗混合物を20mLのジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3溶液(10mL)及びブライン(10mL)で逐次的に洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥した。揮発性物質を真空下で蒸発させ、粗混合物を、溶媒系として酢酸エチル/3%トリエチルアミンを加えたヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー(コンビフラッシュRf装置上での0〜40%グラジエント)で精製して、0.33gの化合物S114(25%)を油として得た。ESI MS: C42H52NO7Pの計算値  713.83,  実測値  714.7 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ146.89
【０３０６】
X3及びX4リンカー合成-スキーム2:
【０３０７】
【化５２】
2019532027.tif 000057
【０３０８】
化合物S116
【０３０９】
【化５３】
2019532027.tif 000058
化合物S116は、化合物S110のために記載されたプロトコールを使用して、油として91%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.51 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.37-7.32 (m, 3H), 5.56 (s, 1H), 3.37-3.35 (m, 4H), 4.10-4.07 (dd, J 13.0 Hz, J 2.5 Hz, 2H), 3.65-3.64 (m, 1H), 2.43-2.42 (t, J 6.5 Hz, 1H); ESI MS: C13H14O3の計算値  218.24,  実測値  [M+H]+ 219.2
【０３１０】
化合物S117
【０３１１】
【化５４】
2019532027.tif 000059
化合物S117は、化合物S111のために記載されたプロトコールを使用して、油として91%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ4.33 (s, 2H), 3.83-3.70 (m, 5H), 2.48 (s, 1H), 2.04 (br, 2H); ESI MS: C6H10O3の計算値  130.14,  実測値  [M+Na]+ 153.0
【０３１２】
化合物S118
【０３１３】
【化５５】
2019532027.tif 000060
化合物S118は、化合物S112のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として54%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.43 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.37-7.27 (m, 5H), 7.23-7.16 (m, 2H), 6.83 (d, J 9.0 Hz, 3H), 6.78-6.76 (dd J 8.5 Hz, 1H), 4.35-4.22 (m, 2H), 3.77 (s, 6H) 3.76-3.72 (m, 2H), 3.71-3.64 (m, 1H), 3.27-3.19 (m, 2H), 2.48 (t, J 4.5 Hz, 1H), 2.03-1.96 (m, 1H); ESI MS: C27H28O5の計算値  432.50,  実測値  [M+Na]+ 455.4
【０３１４】
化合物S119
【０３１５】
【化５６】
2019532027.tif 000061
化合物S119は、化合物S113のために記載されたプロトコールを使用して、油として86%の収率で調製された。ESI MS: C36H45N2O6Pの計算値  632.7,  実測値  633.5 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ149.05, 148.96.
【０３１６】
化合物S120
【０３１７】
【化５７】
2019532027.tif 000062
化合物S120は、化合物S114のために記載されたプロトコールを使用して、油として47%の収率で調製された。ESI MS: C37H46NO6Pの計算値  631.73,  実測値  632.5 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ147.80, 147.71
【０３１８】
リンカーX5及びX6の合成
【０３１９】
【化５８】
2019532027.tif 000063
【０３２０】
化合物S121
【０３２１】
【化５９】
2019532027.tif 000064
S115(4.0g、22.2mmol)のジオキサン(25mL)中溶液に、最小量の水に溶解されたKOH(0.12g、2.2mmol)の溶液を添加し、生じた混合物を室温で少なくとも30分間撹拌した。混合物を0℃に冷却し、アクリロニトリル(2.35g、44.4mmol)のジオキサン(15mL)中溶液を適加し、生じた混合物を室温で終夜反応させた。揮発性物質を真空下で蒸発させ、残留物を水で希釈し、pHを中性付近に調整した。粗生成物を酢酸エチル(2×50mL)で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、残留物を得て、これを、ISCOコンパニオンを使用するフラッシュシリカゲルカラム(ジクロロメタン/メタノール、0〜5%)で精製して、3.1g(60%)の化合物S121を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.49 (d, J 7.0 Hz, 2H), 7.36-7.34 (m, 3H), 5.56 (s, 1H), 3.36 (d, J 13.0 Hz 2H), 4.10-4.07 (dd, J 13.0 Hz, J 2.0 Hz, 2H), 3.84 (t, J 6.5 Hz, 2H), 3.42 (m, 1H), 3.69 (t, J 6.5 Hz, 2H); ESI MS: C13H15NO3の計算値  233.2,  実測値  [M+Na]+ 256.3
【０３２２】
化合物S122
【０３２３】
【化６０】
2019532027.tif 000065
水素化アルミニウムリチウム(0.83g、4.0mmol)の0℃のTHF(10mL)中懸濁液に、化合物S121(1.28g、5.5mmol)のTHF(15mL)中溶液を適加し、生じた混合物を室温に温め、撹拌を3時間続けた。反応の完了後、反応混合物を0℃に冷却し、必要なら、氷冷水の適加(およそ2〜3mL)によって反応を止めた。追加のおよそ8mLの水を添加し、粗生成物を酢酸エチル(2×25mL)中に抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、化合物S122を得て、これを、さらなる精製なしにその後のステップにおいて使用した。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.49 (d, J 7.0 Hz, 2H), 7.40-7.32 (m, 3H), 5.55 (d, J 5.0 Hz, 1H), 4.34 (d, J 13.0 Hz, 1H), 4.20-4.11 (dd, J 12.0 Hz 4H), 4.05-4.03 (d, J 13.0 Hz, J 2.0 Hz, 1H), 3.66-3.62 (m, 2H), 3.27 (m, 1H), 2.86 (t, J 6.5 Hz, 1H), 2.16 (br, 2H); ESI MS: C13H19NO3の計算値  237.2,  実測値  [M+H]+ 238.2
【０３２４】
化合物S123
【０３２５】
【化６１】
2019532027.tif 000066
0℃のジクロロメタン(8mL)中の化合物S122(1.0g、4.2mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.3mL、12.6mmol)に、Fmoc-OSuの溶液(1.7g、5.0mmol)を適加し、生じた混合物を室温で3時間反応させた。完了後、反応混合物をジクロロメタン(10mL)で希釈し、水、続いてブラインで洗浄した。有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、残留物を得た。残留物を、ISCOコンパニオンを使用するフラッシュシリカゲルカラム(ヘキサン/酢酸エチル、0〜50%)で精製して、0.65g(35%)の化合物S123を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.75 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.51 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.37 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.31-7.26 (m, 5H), 5.57 (s, 1H), 5.48 (br, 1H), 4.46-4.32 (m, 4H), 4.15 (d, J 7.0 Hz, 1H), 4.06 (t, J 12.5 Hz 2H), 3.67 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.41 (s, 1H), 1.88 (t, J 6.0 Hz, 2H); ESI MS: C28H29NO5の計算値  459.5,  実測値  [M+Na]+ 482.5
【０３２６】
化合物S124
【０３２７】
【化６２】
2019532027.tif 000067
化合物S124は、化合物S111のために記載されたプロトコールを使用して、油として定量的収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.76 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.32 (t, J 7.5 Hz, 2H), 5.18 (br, 1H), 4.44 (d, J 6.5 Hz, 2H), 4.21 (t, J 6.5 Hz, 1H), 4.76-4.73 (dd, J 11.5, 3.5 Hz 2H), 3.67-60 (m, 4H), 3.42 (m, 1H), 3.37 (br, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.75 (br, 2H); ESI MS: C21H25NO5の計算値  371.4,  実測値  [M+Na]+ 394.3
【０３２８】
化合物S125
【０３２９】
【化６３】
2019532027.tif 000068
化合物S125は、化合物S112のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として48%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.75 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.58 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.40-7.38 (m, 3H), 7.32-27 (m, 7H), 7.18-7.16 (m, 3H), 6.83 (t, J 7.0 Hz, 4H),  5.16 (br, 1H), 4.44 (d, J 6.5 Hz, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.74 (m, 2H), 3.66-3.62 (m, 4H), 3.43-3.37 (m, 2H), 2.31 (br, 1H), 1.76 (br, 2H); ESI MS: C42H43NO7の計算値  673.7,  実測値  [M+Na]+ 696.7
【０３３０】
化合物S126a
【０３３１】
【化６４】
2019532027.tif 000069
化合物S126aは、化合物S131のために記載されたプロトコールを使用して、油として40%の収率で調製された。ESI MS: 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ147.19. ESI MS: C66H74N3O10Pの計算値  1100.2,  実測値  [M+H]+ 1101.4.
【０３３２】
化合物S126
【０３３３】
【化６５】
2019532027.tif 000070
化合物S126は、化合物S113のために記載されたプロトコールを使用して、油として78%の収率で調製された。ESI MS: C51H60N3O8Pの計算値  874.0,  実測値  896.9 [M+Na]+, 913.0 [M+K]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3; ppm):δ148.90, 148.76
【０３３４】
リンカーS131及びS131aの合成-一般的なスキーム:
【０３３５】
【化６６】
2019532027.tif 000071
【０３３６】
化合物S127
【０３３７】
【化６７】
2019532027.tif 000072
アルゴン下のS109(10.0g、44.6mmol)のジクロロメタン(180mL)中溶液に、ブロモアセトニトリル(13.0g、108.4mmol)、酸化銀(I)(20.7g、89.2mmol)及びヨウ化テトラブチルアンモニウム(3.3g、8.92mmol)を添加し、生じた混合物を終夜撹拌した。混合物をCelite(登録商標)上で濾過し、濾液を蒸発させて、黒色残留物を得て、これを、ISCOコンパニオン上でのフラッシュシリカゲルカラム精製(ヘキサン/酢酸エチル、15〜90%)に供して、5.55g(41%)の所望化合物S127を粘性油として得た。ESI MS: C16H18N2O4の計算値  302.3,  実測値  [M+H]+ 303.3.
【０３３８】
化合物S128
【０３３９】
【化６８】
2019532027.tif 000073
化合物S127(5.55g、18.4mmol)のTHF(80mL)中溶液に、LiAlH4のTHF中溶液(2M、37.0mL、74.0mmol)をアルゴン下で添加し、混合物を55℃に5時間加熱した。反応の完了後、混合物を0℃に冷却し、酒石酸カリウムナトリウムの水溶液(1M、20mL)で慎重に反応を止めた。この混合物に、ジクロロメタン(30mL)を添加し、続いてFmoc-OSu(18.6g、55.2mmol)及びDIEA(9.6mL、55.0mmol)を添加した。混合物を1時間激しく撹拌し、次いでジクロロメタン(3×30mL)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。混合物を濾過し、次いで蒸発させて、残留物を得て、これを、ISCOコンパニオン上でのフラッシュシリカゲルカラム精製(ヘキサン/酢酸エチル、20〜90%)に供して、5.04g(36%)のS128を白色の発泡体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.75 (4H, dd, J 7.5, 4.5 Hz), 7.58 (4H, t, J 7.0 Hz), 7.48 (2H, d, J 7.0 Hz), 7.41-7.34 (7H, m), 7.32-7.26 (4H, m), 5.44 (1H, s), 5.15-5.05 (2H, m), 4.44 (2H, d, J 5.5 Hz), 4.38 (2H, d, J 6.0 Hz), 4.25-4.15 (2H, m), 4.10 (2H, d, J 11.5 Hz), 3.82 (2H, d, J 11.5 Hz), 3.78 (2H, s), 3.53 (2H, s), 3.42 (2H, s), 3.36-3.27 (4H, m), 3.25 (2H, s); ESI MS: C46H46N2O8の計算値  754.9,  実測値  [M+H]+ 755.3.
【０３４０】
化合物S129
【０３４１】
【化６９】
2019532027.tif 000074
化合物S128(1.1g、1.51mmol)をAcOH/H2O混合物(10mL、3:1)に溶解し、反応を55℃で5時間続けた。反応の完了後、揮発性物質を蒸発させ、トルエン(2×20mL)と共蒸発させ、残留物を、ISCOコンパニオン上でのフラッシュシリカゲルカラム精製(ヘキサン/酢酸エチル、30〜100%)に供して、0.54g(54%)のS129を白色の発泡体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.75 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.58 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.39 (4H, t, J 7.5 Hz), 7.30 (4H, t, J 7.5Hz), 5.20-5.05 (2H, m), 4.41 (4H, d, J 6.5 Hz), 4.21 (4H, t, J 6.5 Hz), 3.64 (4H, s), 3.48 (8H, s), 3.36 (4H, s); ESI MS: C39H42N2O8の計算値  666.7,  実測値  [M+H]+ 667.3.
【０３４２】
化合物S130
【０３４３】
【化７０】
2019532027.tif 000075
ジオールS129(0.73g、1.1mmol)、DIPEA(0.19mL、1.1mmol)及びDMAP(0.013g、0.11mmol)の0℃のジクロロメタン(6mL)中溶液に、DMTrCl(0.34g、0.99mmol)のジクロロメタン(1.0mL)中溶液を適加した。生じた混合物を室温に温め、終夜撹拌した。混合物を蒸発させて、残留物を得て、これを、ISCO上でのフラッシュシリカゲルカラム精製(ヘキサン/酢酸エチル、20〜100%)に供して、0.47g(44%)のモノジメトキシトリチル保護化合物S130を白色の発泡体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.75 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.58 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.39 (4H, t, J 7.5 Hz), 7.32-7.25 (8H, m), 7.17 (4H, d, J 6.5 Hz), 6.83 (4H, d, J 6.5 Hz), 5.20-5.05 (2H, m), 4.41 (4H, d, J 6.5 Hz), 4.21 (4H, t, J 6.5 Hz), 3.82 (6H, s), 3.64 (4H, s), 3.48 (8H, s), 3.36 (4H, s); ESI MS: C60H60N2O10の計算値  969.1,  実測値  [M+Na]+ 991.3.
【０３４４】
化合物S131
【０３４５】
【化７１】
2019532027.tif 000076
ビス-(N,N-ジイソプロピルアミノ)-クロロホスフィン(0.085g、0.32mmol)の乾燥CH2Cl2(1.0mL)中溶液を、3-Fmoc-アミノ-プロパン-1-オール(0.090g、0.30mmol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.18mL、1.05mmol)との-78℃の乾燥CH2Cl2 (3.0mL)中溶液に適加した。反応混合物を室温に温め、1.5時間撹拌した。化合物S130(0.30g、0.30mmol)の1.0mLの乾燥CH2Cl2中溶液を添加し、生じた混合物を10分間撹拌した。ETTの溶液(0.72mL、アセトニトリル中0.25M、0.18mmol)を反応混合物に添加し、生じた混合物を3時間撹拌した。混合物をCH2Cl2(20mL)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾液を真空下で蒸発させて、残留物を得て、これを、共溶媒系として酢酸エチル/3%トリエチルアミンを加えたヘキサンを使用するISCOコンパニオン上でのフラッシュシリカゲルカラム精製(0〜30%グラジエント)に供して、0.12gの生成物S131(32%)を白色の発泡体として得た。ESI MS: C84H91N4O13Pの計算値  1395.6,  実測値  1395.7[M]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ146.41.
【０３４６】
キラルX-リンカー-化合物S138、S139、S146及びS147:
【０３４７】
【化７２】
2019532027.tif 000077
【０３４８】
リンカーS138及びS139の合成-一般的なスキーム:
【０３４９】
【化７３】
2019532027.tif 000078
【０３５０】
化合物S133
【０３５１】
【化７４】
2019532027.tif 000079
(R)-3-ベンジルオキシ-1,2-プロパンジオール(S132、4.88g、26.78mmol)、イミダゾール(3.64g、53.56mmol)の0℃のDCM(30mL)中溶液に、TBDMSCl(TBS-Cl、4.44g、29.46mmol)のDCM(15mL)中溶液を適加した。反応を室温で2時間続け、TLCによる反応の完了後、DCMで希釈し、水で洗浄した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、残留物を得て、ISCOコンパニオンを使用するフラッシュシリカゲルカラム(ヘキサン/酢酸エチル、0〜20%)で精製して、5.42g(71%)の所望化合物S133を半固体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.35-7.7.32 (m, 5H), 4.55 (s, 2H), 3.86-3.84 (m, 1H), 3.69-3.65 (m, 2H), 3.64-3.50 (m, 2H), 2.44 (br, 1H), 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 6H). ESI MS: C16H28O3Siの計算値  296.4,  実測値  [M+H]+ 297.3.
【０３５２】
化合物S135
【０３５３】
【化７５】
2019532027.tif 000080
TBDMS保護化合物(S133、5.6g、18.84mmol)と触媒量のPdとのMeOH(40mL)中溶液を、H2雰囲気下、室温で終夜撹拌した。TLCによる反応の完了後、反応混合物をセライトベッドに通して迅速に濾過し、メタノールで洗浄し、溶媒を蒸発させ、真空で乾燥して、S134を得て、これを、さらなる精製なしで次のステップにおいて定量的粗収量で使用した。
【０３５４】
化合物S135は、化合物S112のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として84%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.42 (d, 2H, J = 7.5), 7.33-7.28 (m, 5H), 7.26-7.18 (m, 2H), 6.84-6.80 (m, 4H), 4.14-4.10  (m, 2H), 3.82 (s, 6H), 3.79-3.66 (m, 2H), 3.20-3.14 (m, 1H), 2.41 (d, 1H, J = 5.5), 0.85 (s, 9H), 0.038 (d, 6H, J = 3.5). ESI MS: C30H40O5Siの計算値  508.7,  実測値  [M+Na]+ 531.7.
【０３５５】
化合物S137
【０３５６】
【化７６】
2019532027.tif 000081
化合物S137は、2ステップ手順で調製された。中間体プロパルギル保護化合物(S136)は、化合物S110のために報告された同様のプロトコールを使用して、半固体として88%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.46 (d, 2H, J = 7.5), 7.34-7.33 (m, 3H), 7.32 (m, 2H),  7.28-7.26 (m, 2H), 6.82 (d, 4H, J = 7.0) 4.33 (t, 2H, J = 2.5), 3.80 (s, 6H), 3.77 (m, 1H), 3.68-3.67 (d, 2H, J = 5.5), 3.20-3.18 (m, 2H), 2.38 (m, 1H), 0.83 (s, 9H), 0.02 (d, 6H, J = 4.0). ESI MS: C33H42O5Siの計算値  546.7,  実測値  [M+Na]+ 569.8.
【０３５７】
S136(1.3g、2.38mmol)のTHF(10mL)中溶液に、TBAFの1M溶液(3.56mL、3.56mmol)を0℃で徐々に添加し、反応を室温で3時間続けた。TLCによる反応の完了後、溶媒を蒸発させ、酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。合わせた有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、残留物を得て、これを、ISCOコンパニオンを使用するフラッシュシリカゲルカラム(ヘキサン/酢酸エチル、0〜40%)で精製して、0.82g(80%)の所望化合物S137を半固体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.42 (d, 2H, J = 7.5), 7.32-7.28 (m, 5H), 7.18-7.16 (m, 2H), 6.84 (d, 4H, J = 7.0) 4.33 (m, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.79-3.74 (m, 4H), 2.28-3.20 (m, 1H), 2.69 (s, 1H), 2.48-2.42 (dt, 1H, J = 2.5). ESI MS: C27H28O5の計算値  432.5,  実測値  [M+Na]+ 455.5.
【０３５８】
化合物S138
【０３５９】
【化７７】
2019532027.tif 000082
化合物S138は、化合物S113のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として80%の収率で調製された。31P NMR (202MHz, CDCl3):δ149.00, 148.91. ESI MS: C36H45N2O6Pの計算値  632.7,  実測値  [M+H]+ 633.6.
【０３６０】
リンカーS146及びS147の合成-一般的なスキーム:
【０３６１】
【化７８】
2019532027.tif 000083
【０３６２】
化合物S141
【０３６３】
【化７９】
2019532027.tif 000084
化合物S141は、(S)-3-ベンジルオキシ-1,2-プロパンジオール(S140)から、化合物S133のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として75%の収率で調製された。ESI MS: C16H28O3Siの計算値  296.4,  実測値  [M+H]+ 297.3.
【０３６４】
化合物S143
【０３６５】
【化８０】
2019532027.tif 000085
化合物S143は、化合物S135のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として76%の収率で調製された。ESI MS: C30H40O5Siの計算値  508.7,  実測値  [M+Na]+ 531.6.
【０３６６】
化合物S145
【０３６７】
【化８１】
2019532027.tif 000086
化合物S145は、2ステップ手順で調製された。最初に、中間体プロパルギル保護化合物(S144)は、化合物S136のために報告されたプロトコールを使用して、半固体として84%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.46 (d, 2H, J = 7.5), 7.34-7.33 (m, 3H), 7.32 (m, 2H),  7.28-7.26 (m, 2H), 6.82 (d, 4H, J = 7.0) 4.33 (t, 2H, J = 2.5), 3.80 (s, 6H), 3.78 (m, 1H), 3.68-3.67 (m, 2H), 3.20-3.18 (m, 2H), 2.39 (t, 1H, J = 2.5), 0.83 (s, 9H), 0.02 (d, 6H, J = 4.0). ESI MS: C33H42O5Siの計算値  546.7,  実測値  [M+Na]+ 569.6.
【０３６８】
化合物S145は、化合物S137のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として86%の収率で調製された。1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm):δ7.44 (d, 2H, J = 7.5), 7.31-7.26 (m, 5H), 7.18-7.16 (m, 2H), 6.84-6.82 (d, 4H, J = 7.0) 4.33 (m, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.77-3.72 (m, 4H), 2.26-3.22 (m, 1H), 2.69 (s, 1H), 2.48-2.42 (dt, 1H, J = 2.5). ESI MS: C27H28O5の計算値  432.5,  実測値  [M+Na]+ 455.4.
【０３６９】
化合物S146
【０３７０】
【化８２】
2019532027.tif 000087
化合物S146は、化合物S113のために記載されたプロトコールを使用して、白色固体として86%の収率で調製された。31P NMR (202MHz, CDCl3): 31P NMR (202MHz, CDCl3):δ149.00, 148.90. ESI MS: C36H45N2O6Pの計算値  632.7,  実測値  [M+H]+ 633.7.
【０３７１】
リンカーS151及びS152の合成-一般的なスキーム:
【０３７２】
【化８３】
2019532027.tif 000088
【０３７３】
リンカーS156及びS157-一般的なスキーム:
【０３７４】
【化８４】
2019532027.tif 000089
リンカーS151、S152、S156及びS157は、本明細書に記載の当技術分野で公知でもある反応条件を使用して調製することができる。例えば、化合物S140及びS132を、選択的TBS保護、アクリロニトリル添加、ニトリル還元、Fmoc保護、続いてベンジル基除去及びDMT保護、TBS除去に供して、S150及びS155をそれぞれ得ることができる。これらの化合物は、上記で示すように、それぞれアミダイトS151、S152及びS156、S157に変換することができる。
【０３７５】
ホスホルアミダイト合成
方法1
【０３７６】
【化８５】
2019532027.tif 000090
-78℃で、適切に保護されたヌクレオシド(20.7mmol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(22.7mmol)との、アルゴン下、100mLの乾燥ジクロロメタン中溶液に、ビス-(N,N-ジイソプロピルアミノ)-クロロホスフィン(22.7mmol)の20mLのジクロロメタン中溶液を徐々に添加した。撹拌を継続しながら、反応混合物を室温に1時間にわたって温めた。この混合物に、適切なアルコール(20.7mmol)の15mLの乾燥ジクロロメタン中溶液を添加し、生じた混合物を10分間撹拌し、その時点で、アセトニトリル中0.25M ETT溶液(12.42mmol)を適加した。反応混合物を室温にて追加で16時間撹拌した。粗混合物を200mLのジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3溶液(50mL)及びブライン(50mL)で逐次的に洗浄し、次いで無水Na2SO4上で乾燥した。溶媒を真空下で蒸発させ、生じた混合物を、酢酸エチル/ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー(コンビフラッシュRf装置で0〜30%グラジエント)で精製して、ホスホルアミダイトのジアステレオマー混合物を白色粉末として得た。
【０３７７】
方法2
【０３７８】
【化８６】
2019532027.tif 000091
-78℃で、適切なアルコール(7.46mmol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.78mmol)との、アルゴン下の乾燥ジクロロメタン(15mL)中溶液に、ビス-(N,N-ジイソプロピルアミノ)-クロロホスフィン(7.78mmol)のジクロロメタン(5.0mL)中溶液を添加した。反応混合物を室温に1時間にわたって温め、生じた溶液を、適切に保護されたヌクレオシド(3.73mmol)とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(7.46mmol)とのジクロロメタン(15mL)懸濁液に適加した。反応を室温にて追加で16時間続けた。反応混合物を15mLのジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3溶液(10mL)及びブライン(10mL)で逐次的に洗浄し、次いで無水Na2SO4上で乾燥した。溶媒を真空下で蒸発させ、混合物を、酢酸エチル/ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー(コンビフラッシュRf装置での0〜60%グラジエント)で精製して、ホスホルアミダイトのジアステレオマー混合物を白色粉末として得た。
【０３７９】
種々のホスホルアミダイトは、本明細書に記載の標準的な合成手順を使用して合成した。調製されたホスホルアミダイトを表1に示す。
【０３８０】
【表１】
2019532027.tif 000092
2019532027.tif 000093
2019532027.tif 000094
2019532027.tif 000095
2019532027.tif 000096
2019532027.tif 000097
2019532027.tif 000098
2019532027.tif 000099
2019532027.tif 000100
2019532027.tif 000101
2019532027.tif 000102
【０３８１】
標的指向性部分の合成
GalNAc (NAG)リガンド合成
【０３８２】
【化８７】
2019532027.tif 000103
D-ガラクトサミンペンタアセテート(NAG2)の調製。D-ガラクトサミン(25.0g、116mmol)を無水ピリジン(250mL)に懸濁し、不活性雰囲気下で0℃に冷却した。無水酢酸(120mL、1160mmol)を、2時間の過程にわたって添加した。終夜撹拌した後、反応混合物を真空下で濃縮した。メタノールを添加すると、白色固体が沈殿し、濾過を介して収集して、所望生成物(42.1g、収率93%)を提供した。1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ5.69 (d, 1H, J 9.0 Hz), 5.40 (m, 1H), 5.37 (d, 1H, J 3.0 Hz), 5.08 (dd, 1H, J 3.0 Hz, 11 Hz), 4.44 (dt, 1H, J 9.5 Hz, 11 Hz), 4.17 (dd, 1H, J 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.11 (dd, 1H, , J 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.01 (t, 1H, J 7.0 Hz), 2.17 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.57 (s, 3H)
【０３８３】
ベンジル5-ヒドロキシペンタノエート(NAG5)の調製。デルタ-バレロラクトン(10.0g、100mmol)とNaOH(4.00g、100mmol)との水(100mL)中溶液を、70℃で終夜撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、真空下で濃縮して、白色固体NAG4を得た。この固体をアセトン(100mL)に懸濁し、臭化ベンジル(20.5g、120mmol)及び臭化テトラブチルアンモニウム(1.61g、0.50mmol)と共に終夜還流させた。アセトンを真空下で除去して、油状残留物を得て、これを、EtOAcに溶解し、飽和NaHCO3(水溶液)及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮して、油状生成物としてNAG5を得た(17.1g、収率82%)。1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ7.35 (m, 5H), 3.64 (q, 2H, J 6 Hz, 11.5 Hz), 2.41 (t, 2H, J 7.5 Hz), 1.75 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.44 (t, 1H, J 6 Hz)
【０３８４】
ベンジルオキシカルボニルブチル2-デオキシ-2-N-アセチル-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG7)の調製-方法A。不活性雰囲気下、TMSOTf(8.56g、38.4mmol)を、NAG2(10.0g、25.6mmol)の1,2-ジクロロエタン(100mL)中溶液に外界温度で添加した。混合物を55℃で2時間撹拌し、熱から除去し、終夜撹拌した。反応混合物を氷冷飽和NaHCO3(水溶液)上に注ぎ、CH2Cl2で抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮して、シロップとしてNAG6を得た。NAG6の1,2-ジクロロエタン中溶液(60mL)に、アルコールNAG5(8.00g、38.4mmol)及び分子篩を投入した。混合物を不活性雰囲気下に置き、TMSOTf(2.85g、12.8mmol)で処理し、室温で終夜撹拌した。混合物を氷冷飽和NaHCO3(水溶液)上に注ぎ、CH2Cl2で抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮して、シロップを得た。この粗材料をSiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、グリコシドNAG7(3.3g、収率24%)を得た。1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ7.35 (m, 5H), 5.98 (d, 1H, J 7.0 Hz), 5.57 (m, 1H), 5.34 (d, 1H, J 3.0 Hz), 5.25 (dd, 1H, J 3.0 Hz, 11 Hz), 5.10 (s, 2H), 4.63 (d, 1H, J 8.5 Hz), 4.11 (m, 2H), 3.95 (m, 1 H), 3.88 (m, 2H), 3.49 (m, 1H), 2.37 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.70 (m, 2H), 1.61 (m, 2H)
【０３８５】
ベンジルオキシカルボニルブチル2-デオキシ-2-N-アセチル-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG7)の調製-方法B。NAG2(5.00g、12.8mmol)とアルコールNAG5(5.33g、25.6mmol)との1,2-ジクロロエタン(50mL)中溶液に、Sc(OTf)3(0.44g、0.90mmol)を一度に添加した。混合物を不活性雰囲気下に置き、3時間還流させた。冷却したら、混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3(水溶液)で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、真空下で濃縮した。SiO2ゲルクロマトグラフィーによる精製により、グリコシドNAG7(5.53g、収率80%)を得た。
【０３８６】
カルボキシブチル2-デオキシ-2-N-アセチル-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG8)の調製。グリコシドNAG7(1.50g、2.41mmol)のEtOH(25mL)中溶液を、真空下で脱気し、アルゴンでパージした。パラジウム触媒(活性炭上10%wt.、0.50g)を一度に添加し、混合物を真空下で脱気し、アルゴンでパージした。不均一混合物にシクロヘキセン(25mL)を投入し、6時間還流させた。冷却したら、触媒を濾過によって除去し、母液を真空下で濃縮した。粗生成物をSiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、白色の発泡体としてNAG8を得た(0.76g、収率70%)。1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ5.72 (d, 1H, J 8.5 Hz), 5.35 (d, 1H, J 3.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, J 3.5 Hz, 11.5 Hz), 4.67 (d, 1H, J 8.5 Hz), 4.17 (dd, 1H, J 6.5 Hz, 11.5 Hz), 4.12 (dd, 1H, 6.5 Hz, 11.5 Hz), 4.00 (dt, 1H, J 8.5 Hz, 11.5 Hz), 3.92 (m, 2H), 3.53 (m, 1H), 2.39 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.71 (m, 2H), 1.65 (m, 2H)
【０３８７】
【化８８】
2019532027.tif 000104
アミノプロピル6-ヒドラジノニコタミドアセトンヒドラゾン(NAG11)の調製。ジクロロメタン(20mL)中のBoc-6-ヒドラジノニコチン酸(520mg、2.1mmol)を、EDCI(440mg、2.3mmol)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS、260mg、2.3mmol)、Boc-ジアミン(650mg、2.6mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.1mL、6.2mmol)で3時間処理した。反応物を真空下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、NAG10を得た(364mg、収率43%)。1H NMR (CDCl3, 500 MHz):δ8.55 (br, 1H), 7.93 (d, 2H, J 7.5 Hz), 7.45 (br, 1H), 7.12 (br, 1H), 6.62 (d, 1H, J 8.5 Hz), 5.17 (br, 1H), 3.42 (m, 2 H), 3.13 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.41 (s, 18H).HyNicアセトンヒドラゾンは、NAG10(160mg、0.4mmol)をトリフルオロ酢酸(9mL)及びアセトン(1mL)で1時間処理することによって形成された。反応混合物を真空下で濃縮し、高真空に置いて、NAG11を得た。
【０３８８】
【化８９】
2019532027.tif 000105
トリス-(カルボキシエトキシメチル)-メチルアミド-ドデカンジオエートメチルエステル(NAG14)の調製。HATU(122mg、0.50mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(218μL、1.25mmol)で活性化させたドデカン二酸メチルエステル(211mg、0.42mmol)のDMF(2mL)中溶液に、トリス-リンカーNAG12を添加した。1時間後、反応混合物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、NAG13を得た(214mg、収率70%)。MALDI-TOF質量: C38H69NO12の計算値: 731.48,  実測値: 755.10 [M+Na].トリス-t-ブチルエステルNAG13を、TFA:TIPS:DCM(9:0.25:1)カクテル(10.25mL)で4時間加水分解し、真空下で濃縮して、トリス酸NAG14を得た。MALDI-TOF質量: C26H45NO12の計算値: 563.29,  実測値: 565.33 [M+H].
【０３８９】
トリス-(アミノプロパンアミド-エトキシメチル)-メチルアミド-ドデカンジオエートメチルエステル(NAG16)の調製。HATU(557mg、1.35mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(470μL、2.70mmol)で活性化させたトリス酸NAG14(230mg、0.41mmol)のDMF(4mL)中溶液に、モノBoc-1,3-ジアミノプロパン(250mg、1.44mmol)を添加した。1時間後、反応混合物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、NAG15を得た(335mg、収率79%)。MALDI-TOF質量: C50H93N7O15の計算値: 1031.67,  実測値: 1056.40 [M+Na].化合物NAG15を、TFA:TIPS:DCM(9:0.25:1)カクテル(10.25mL)で1時間処理し、真空下で濃縮して、トリス-アミンNAG16を得た。MALDI-TOF質量: C35H69N7O9の計算値: 731.51,  実測値: 733.18 [M+H].
【０３９０】
トリス-GalNAc(NAG18)の調製。単糖NAG8(192mg、0.43mmol)を、DMF(2mL)中のHATU(163mg、0.43mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(150μL、0.86mmol)で処理した。30分後、NAG16(80mg、0.11mmol)のDMF(1mL)中溶液を添加し、混合物を1時間撹拌した。粗混合物をSiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、NAG17を得た(82mg、収率37%)。質量計算値C92H150N10O39: 2019.00,  実測値: 2041.85 [M+Na].過アセチル化三量体GalNAc(82mg、0.04mmol)を、THF:H2O(3:1)溶液(8mL)中のLiOH・H2O(34mg、0.81mmol)での処理によって加水分解して、NAG18を得た。MALDI-TOF質量: C73H130N10O30の計算値: 1626.89,  実測値: 1634.52 [M+Li].
【０３９１】
HyNic三量体GalNAc(NAG19)の調製。GalNAc三量体NAG18(32mg、0.02mmol)とHyNicアミンNAG11(20.0mg、0.08mmol)とのDMF(1mL)中溶液を、EDCI(16.2mg、0.08mmol)、NHS(2.5mg、0.02mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(28μL、0.16mmol)で処理し、4時間撹拌した。真空下で濃縮したら、粗製物をDMSOに溶解し、逆相HPLCで精製して、NAG19を得た(12.6mg、収率35%)。MALDI-TOF質量: C85H147N15O30の計算値: 1858.04,  実測値: 1859.83 [M+H].
【０３９２】
【化９０】
2019532027.tif 000106
アジド-Peg3-三量体GalNAc(NAG21)の調製。GalNAc三量体カルボン酸NAG18(60mg、0.03mmol)、アジド-Peg3-アミンNAG20(45.6mg、0.21mmol)、TBTU(23.8mg、0.07mmol)、HOBt(11.5mg、0.03mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(34μL)を、DMSO(0.5mL)に溶解し、2時間撹拌した。塩基を真空下で除去し、粗製物を逆相HPLCで精製して、NAG21を得た(24mg、44%)。AP-ESI+質量: C81H146N14O32の計算値: 1827.02,  実測値: 914.8 [M+2H]2+
【０３９３】
【化９１】
2019532027.tif 000107
1-ブロモ-2-デオキシ-2-アセトアミド-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG22)の調製。アルゴンバルーン下、氷浴中の0℃のDCM(90ml)中D-ガラクトサミンペンタアセテート(NAG2、10.0g、1当量、25.8mmol)懸濁液に、ブロモトリメチルシラン(4.1mL、1.2当量、31mmol)を撹拌しながら適加した。10分後に氷浴を除去し、反応物を室温で終夜撹拌させた。75%ヘキサン/酢酸エチル移動相を使用するTLC(ハネシアン染色)によって反応進行をモニターした。反応混合物を真空下で濃縮し、シクロヘキサン(3×50mL)と共沸させ、高真空下で終夜乾燥し、そのまま使用した。
【０３９４】
1-アジド2-デオキシ-2-アセトアミド-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG23)の調製。NAG22(10.6g、1.0当量、25.8mmol)をDCM(100mL)に溶解した。この溶液に、水(100mL)中のアジ化ナトリウム(4.86g、2.9当量、74.8mmol)及びテトラブチルアンモニウム重硫酸塩(8.32g、0.95当量、24.5mmol)を添加した。反応混合物を1時間激しく撹拌した。75%ヘキサン/酢酸エチル移動相を使用するTLC(ハネシアン染色)によって反応進行をモニターした。反応混合物をDCM(2×50mL)で抽出した。有機層を無水MgSO4上で乾燥し、真空下で濃縮した。次いで、生じた残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(3:1  ヘキサン:酢酸エチル)で精製した。収集された材料の1H NMRは、発表済の構造と一致していた。実測値  [M+H] = 373.0
【０３９５】
1-アミノ-2-アセトアミド-1,2-ジデオキシ-3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノース(NAG24)の調製。NAG23(1.18g、3.17mmol)の酢酸エチル(100mL)中溶液を、排気及びアルゴンガスでパージすること(2回繰り返した)によって脱気した。この混合物に、パラジウム触媒(活性炭上10%wt.、1/2マイクロスパチュラ)を添加した。撹拌均一反応混合物を排気し、H2でパージし(g)(2回繰り返した)、室温で終夜撹拌した。HPLC-MSにより、生成物の形成を確かめた。この時点で、触媒を濾過によって除去した。流出物の濃縮により、NAG24を得て、これを、次のステップにおいてそのまま使用した。実測値[M+H] = 346.6.
【０３９６】
1-アミノ(15'-アジド-テトラエトキシ-プロプリオンアミド)-2-アセトアミド-1,2-ジデオキシ-β-D-ガラクトピラノシド(NAG26)の調製。NAG24(3.17mmol)のジクロロメタン(15mL)中溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.55mL、3.17mmol)及びアジド-PEG4-NHS(1.00g、2.57mmol)を添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌した。逆相HPLCは、加水分解されたNHSエステルの存在を明らかにした。HATU(0.49g、1.28mmol)とDIEA(0.55mL、3.17mmol)とのDMF(2mL)中溶液を添加して、アシル化を助けた。1時間後、反応物をジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3(水溶液)及びブラインで洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し、真空下で濃縮して、NAG25を得た。NAG25(約2.57mmol)のMeOH(50mL)中溶液を、Ar(g)下に置き、NaOMe(0.5mL、MeOH中25%(w/v))を添加した。2時間後、HPLC-MSが所望生成物を示した後、ダウエックス(Dowex)H+樹脂で反応を止めた。樹脂を濾過除去し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗生成物を逆相HPLCで精製して、NAG26を得た(481mg、収率39%)。M+H=493.7.
【０３９７】
Peg2、Peg6及びPeg8を有するNAG26のPeg変形形態は、同様の方式で合成した。表2を参照されたい。
【０３９８】
【表２】
2019532027.tif 000108
【０３９９】
1-アミノ(3'-プロピオンアミド-トリス-エトキシ-プロピオニル-ペンタフルオロフェニルエステル)-2-アセトアミド-1,2-ジデオキシ-3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノース(NAG40)の調製。NAG24(1.56mmol)のDMSO(4mL)中溶液に、ビス-PFP-PEG4(1.00g、1.59mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.28mL、2.34mmol)を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、逆相HPLCにより、所望生成物NAG40の形成を確かめた。粗生成物を逆相HPLCで精製して、NAG40を得た(0.33g、収率27%)。ESI MS+質量: C32H41F5N2O15の計算値: 788.2,  実測値: 789.3 [M+H].
【０４００】
【化９２】
2019532027.tif 000109
【０４０１】
[5-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチルアミノ)-5-オキソペンタノイル]-2-デオキシ-2-N-アセチル-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG27)の調製。NAG8(1.00g、2.24mmol)のTHF(8mL)中溶液に、N,N'-ジイソプロイルカルボジイミド(diisoproylcarbodiimide)(0.56g、4.48mmol)及びHOBt(0.25g、2.17mmol)を添加した。1時間後、白色沈殿物が形成され、反応物を0℃に冷却した。アジド-Peg3-アミン(0.63g、2.91mmol)のTHF(2mL)中溶液を添加し、反応物を追加で1時間撹拌した。逆相HPLC-MSは、化合物NAG27の形成を示した。ESI MS+質量: C27H45N5O13の計算値: 647.7,  実測値: 647.8 [M+H].沈殿物を濾過によって除去し、反応混合物を真空下で濃縮して、濃厚なシロップを得た。
【０４０２】
[5-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチルアミノ)-5-オキソペンタノイル]-2-デオキシ-2-N-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG28)の調製。粗NAG27を無水メタノール(10mL)に溶解し、MeOH中NaOMe(25wt%、250μL)で処理した。反応物を室温で終夜撹拌した。この時点で、逆相HPLC-MSは、化合物NAG27の消費及び化合物NAG28の形成を示した。ESI MS+質量: C21H31N5O10の計算値: 521.6,  実測値: 522.3 [M+H].ダウエックスH+樹脂を添加して、塩基を中和し、樹脂を濾過除去し、液を真空下で濃縮して、粗生成物を得て、これを、逆相HPLCで精製して、化合物NAG28を得た(2ステップにわたって0.42g、収率36%)。
【０４０３】
([3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロピルアミノ])-5-オキソペンタノイル]-2-デオキシ-2-N-アセチル-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG29)の調製。NAG8(0.29g、0.65mmol)のDMF(3mL)中溶液を、HATU(0.25g、0.65mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.34mL、1.95mmol)で処理した。10分後、NH-Boc-1,3-ジアミノプロパン(0.13g、0.72mmol)を添加し、生じた混合物を2時間撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、SiO2クロマトグラフィーで精製して、化合物NAG29を提供した(0.30g、収率77%)。ESI MS+質量: C27H45N3O12の計算値: 603.7,  実測値: 626.8 [M+Na].
【０４０４】
([3-(アミノ)プロピルアミノ])-5-オキソペンタノイル]-2-デオキシ-2-N-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG31)の調製。NAG29(0.30g、0.50mmol)の無水メタノール中溶液を、MeOH中NaOMe(25wt%、50μL)で処理した。20分後、TLCは、NAG29の完全消費を示した。ダウエックス強H+樹脂を添加して、反応物を酸性化し、30分間撹拌した。樹脂を濾過除去し、MeOH中1%TEA及び1M NaOH(水溶液)で洗浄した。濾液を1M HCl(水溶液)で中和し、真空下で濃縮して、NAG31を得た(0.052g、収率28%)。ESI MS+質量: C16H31N3O7の計算値: 377.4,  実測値: 377.6 [M+H].
【０４０５】
({3-[6-(イソプロピリデンヒドラジノ)-ニコチノイルアミノ]プロピルアミノ}-5-オキソペンタノイル)-2-デオキシ-2-N-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド(NAG32)の調製。NAG31(0.009g、22μmol)のDMSO(1mL)中溶液を、HyNic-スルホ-NHS(0.007g、18μmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(9.4μL、54μmol)で1時間処理し、逆相HPLCで精製して、NAG32 TFA塩を得た(0.010g、収率68%)。ESI MS+質量: C25H40N6O8の計算値: 552.6,  実測値: 554.0 [M+H].
【０４０６】
【化９３】
2019532027.tif 000110
1-アミノ-(15'-アジド-ジエチレングリコールプロパノイル)2-アセトアミド1,2-ジデオキシ3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシド(NAG33)の調製。NAG24(2.3g、6.7mmol)の酢酸エチル(90mL)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.7mL、9.9mmol)中溶液に、酢酸エチル(10mL)中のアジド-PEG2-NHS(1.0g、3.3mol)を、アルゴンバルーン下で撹拌しながら適加した。反応混合物を室温で終夜撹拌させた。反応の完了をLC-MSで確認した。ESI MS+.  粗生成物を逆相HPLCで精製して、NAG33を得た(1.2g)。質量  C21H33N5O11の計算値: 531.22,  実測値: 532.3 [M+H]+.
【０４０７】
1-アミノ-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロピオニル]-2-アセトアミド-1,2-ジデオキシ-3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノース(NAG34)の調製。酢酸エチル(25mL)に溶解されたNAG33(1.2g、2.3mmol)に、パラジウム(活性炭上10%Pd、122mg)を添加した。次に、水素バルーン及び真空ラインを挿入した。反応容器を排気し、水素ガスでパージした(3サイクル)。室温で1時間撹拌した後、逆相HPLC-MSにより、生成物の形成を確かめた。反応物をCelite(登録商標)のベッド上で濾過し、EtOAc(3×10mL)で洗浄した。真空下での濃縮により、NAG34を定量的収率で得た。ESI MS+質量: C21H35N3O11の計算値: 505.23,  実測値: 506.3 [M+H] +.
【０４０８】
過アセチル化アジド-Peg2-N-GalNAc三量体(NAG36)の調製。三酸のリンカーM13(52.5mg、0.07mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(73.2μL、0.42mmol)のDMF(2mL)中溶液に、DMF(2mL)中のHATU(119.8mg、0.32mmol)を添加した。反応物を室温で10分間撹拌させた。次に、DMF(1mL)中のNAG34(159mg、0.32mmol)を添加し、混合物を室温で終夜撹拌した。LC-MSにより、18時間後、生成物の形成を確かめた。水(10mL)を添加し、生じた混合物をDCM(3×5mL)で洗浄した。合わせた有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、揮発性物質を真空下で除去して、NAG35を得た(155mg)。ESI MS+質量: C96H158N14O44の計算値: 2210.5,  実測値: 1106.8 [M+2H]2+.NAG35(155mg、70μmol)のMeOH(5mL)中溶液に、ナトリウムメトキシド(25%wt MeOH、100μL)を添加した。反応混合物を、アルゴンバルーン下、室温で1時間撹拌した。LC-MSは、1時間後、生成物の形成及び出発原料の消失を示した。ダウエックスH+樹脂を添加して、反応混合物を中和した。樹脂を濾過除去し、揮発性物質を真空下で除去した。粗生成物を逆相HPLCで精製して、NAG36を得た(10mg)。ESI MS+質量: C78H140N14O35の計算値: 1832.96,  実測値: 917.7 [M+2H]2+.
【０４０９】
フォレートリガンドの合成
【０４１０】
【化９４】
2019532027.tif 000111
N-Boc-Peg11フォレート(F2)の調製。葉酸(225mg、0.51mmol)のDMSO(4mL)中溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド(80μL、0.51mmol)を添加した。1.5時間撹拌した後、Boc-Peg11-ジアミン(220mg、0.34mmol)のDMSO(1mL)中溶液を添加し、反応物を終夜撹拌した。水(35mL)を添加すると、固体が沈殿した。沈殿物を濾過によって収集し、逆相HPLCで精製して、F2を得た(364mg、収率67%)。MALDI-TOF質量: C48H77N9O18の計算値: 1067.54,  実測値: 1069.89 [M+H].
【０４１１】
フォレート-peg11-HyNicアセトンヒドラゾン(F3)の調製。MonoBoc F2(210mg、0.2mmol)を、TFA(9mL)及びアセトン(1mL)で1.5時間処理し、真空下で濃縮し、高真空下で乾燥した。MALDI-TOF質量: C43H69N9O16の計算値: 967.48,  実測値: 969.86 [M+H].黄色がかった粗製固体をDMSO(200μL)に溶解し、HyNic-NHSエステル(10.0mg、0.03mmol)とDIEA(40μL、0.23mmol)との溶液で1.5時間処理した。粗製物をRP-HPLCで精製して、F3を得た(1.2mg、収率3.5%)。MALDI-TOF質量: C52H78N12O17の計算値: 1142.56,  実測値: 1144.03 [M+H].
【０４１２】
一価のフォレートアジドの合成
【０４１３】
【化９５】
2019532027.tif 000112
アジド-Peg4-アミド-Peg11フォレート(F6)の調製。DMSO(1.0mL)中のアミノ-Peg11フォレートF4(115mg、0.12mmol)を、TBTU(42mg、0.13mmol)、HOBt(20mg、0.13mmol)及びDIEA(63μL、0.36mmol)で活性化させたアジド-Peg4酸(38mg、0.13mmol)のDMSO(1.0mL)中溶液に添加した。2時間後、塩基を真空下で除去し、粗製物をRP-HPLCで精製して、F6を得た(75mg、50%)。AP-ESI+質量: C54H88N12O21の計算値: 1240.61,  実測値: 1241.7 [M+H]+, 621.5 [M+2H]2+
【０４１４】
PSMAリガンドの合成
【０４１５】
【化９６】
2019532027.tif 000113
Cbz-LysウレイドGluトリス-t-ブチルエステル(PSMA4)の調製。グルタミン酸ジ-tert-ブチルエステル(1.06g、3.58mmol)、DMAP(27mg)及びTEA(1.25mL、8.95mmol)のCH2Cl2(10.0mL)中氷冷溶液に、CDI(638mg、3.94mmol)を一度に添加した。30分後、反応物を氷浴から除去し、終夜撹拌した。反応物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3(水溶液)、水及びブラインで洗浄した。Na2SO4上で乾燥した後、有機層を真空下で濃縮し、高真空下で乾燥して、PSMA2を得た。PSMA2のDCE中溶液(10mL)を0℃に冷却し、MeOTf(0.59g、3.58mmol)及びTEA(1.00mL、7.16mmol)で逐次的に処理した。45分後、DCE(2mL)中のCbz-Lys t-ブチルエステルPSMA3(1.34g、3.58mmol)を添加し、混合物を40℃で加熱した。2時間後、反応物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3(水溶液)、水及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮して、濃厚なシロップを得た。粗材料をSiO2ゲルクロマトグラフィーに通して精製して、白色の発泡体としてPSMA4を得た(1.73g、78%)。AP-ESI+質量: C32H51N3O9の計算値: 621.36,  実測値: 622.4 [M+H]+, 644.4 [M+Na]+
【０４１６】
LysウレイドGluトリス-t-ブチルエステル(PSMA5)の調製。PSMA4(1.73g、2.79mmol)のEtOAc(100mL)中溶液を、真空の適用及びアルゴンの再充填によって脱気した。パラジウム(活性炭上10%wt、0.15g)を一度に添加し、混合物を、真空の適用及びH2(g)の再充填によって脱気し、6時間撹拌した。触媒を濾過によって除去し、母液を真空下で濃縮して、PSMA5を定量的に得た。AP-ESI+質量: C24H45N3O7の計算値: 487.32,  実測値: 488.4 [M+H]+
【０４１７】
一価のPSMAアジド(PSMA7)の合成
【０４１８】
【化９７】
2019532027.tif 000114
アジドPeg4 LysウレイドGluトリス-t-ブチルエステル(PSMA6)の調製。アジドPeg4酸(133mg、0.45mmol)を、DMF(3.0mL)中のTBTU(146mg、0.45mmol)、HOBt(69mg、0.45mmol)及びDIEA(216μL、1.24mmol)で活性化させた。15分後、PSMA5の溶液(202mg、0.41mmol)を送達し、反応物を室温で1.5時間撹拌した。RP-HPLCMSは、所望生成物の形成を示した。反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーに通して精製して、PSMA6を得た(257mg、83%)。AP-ESI+質量: C35H64N6O12の計算値: 760.46,  実測値: 761.5 [M+H]+, 783.5 [M+Na]+
【０４１９】
アジドPeg4 LysウレイドGlu(PSMA7)の調製。トリス-tert-ブチルエステルPSMA6(257mg、0.34mmol)を、TFA:TIPSの溶液(10mL、97.5:2.5、v/v)で30分間処理した。RP-HPLCMSは、所望生成物への完全変換を示した。反応物を真空下で濃縮し、RP-HPLCで精製して、PSMA7を得た(112mg、56%)。AP-ESI+質量: C23H40N6O12の計算値: 592.27,  実測値: 593.3 [M+H]+
【０４２０】
一価のPSMA HyNic(PSMA10)の合成
【０４２１】
【化９８】
2019532027.tif 000115
N-Boc 4-ヒドラジノ-ニコチンアミドPeg4酸(PSMA8)の調製。N-Boc 4-ヒドラジノニコチン酸NAG9(137mg、0.54mmol)を、DMF中のTBTU(124mg、0.49mmol)、HOBt(83mg、0.54mol)及びDIEA(128μL、0.74mmol)で20分間処理した。活性化エステルに、アミノ-Peg4-酸の溶液(130mg、0.49mmol)を添加し、混合物を2時間撹拌した。反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーに通して精製して、PSMA8を得た(107mg、44%)。AP-ESI+質量: C22H36N4O9の計算値: 500.25,  実測値: 501.3 [M+H]+
【０４２２】
N-Boc 4-ヒドラジノ-ニコチンアミドPeg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-gluトリ-t-ブチルエステル(PSMA9)の調製。PSMA8(107mg、0.21mmol)を、アミンPSMA5(104mg、0.21mmol)の存在下にDMF中のHATU(81mg、0.21mmol)及びDIEA(93μL、0.53mmol)で1時間処理し、その後、反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーに通して精製して、PSMA9を得た(85mg、42%)。AP-ESI+質量: C46H79N7O15の計算値: 969.46,  実測値: 760.6 [M+H]+
【０４２３】
ジメチル4-ヒドラゾノニコチンアミドPeg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-glu(PSMA10)の調製。トリス-t-ブチルエステルPSMA9(85mg、0.09mmol)を、TFA:アセトンの溶液(10mL、97.5:2.5、v/v)で30分間処理した。RP-HPLCMSは、所望生成物への完全変換を示した。反応物を真空下で濃縮し、RP-HPLCで精製して、PSMA10を得た(55mg、84%)。AP-ESI+質量: C32H51N7O13の計算値: 741.35,  実測値: 742.4 [M+H]+
【０４２４】
二価のPSMAアジド(PSMA18)の合成
【０４２５】
【化９９】
2019532027.tif 000116
N-Fmocビス-イミノ-(アセトアミド-Peg4 t-ブチルエステル)(PSMA13)の調製。N-Fmocイミノ二酢酸、PSMA11(107mg、0.30mmol)を、DMF中のPSMA12(212mg、0.66mmol)、TBTU(193mg、0.60mmol)、HOBt(92mg、0.60mmol)及びDIEA(209μL、1.20mmol)で2時間処理した。反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーに通して精製して、PSMA13を得た(250mg、91%)。AP-ESI+質量: C49H75N3O16の計算値: 961.51,  実測値: 962.6 [M+H]+, 984.6 [M+Na]+
【０４２６】
N-Fmocビス-イミノ-(アセトアミド-Peg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-gluトリ-t-ブチルエステル)(PSMA15)の調製。DCM(1mL)中のジ-t-ブチルエステルPMSA13(250mg、0.26mmol)を、TFA(10mL)及びTIPS(111μL、0.54mmol)で処理した。30分後、反応物を真空下で濃縮して、シロップを得て、これを、ヘキサンで洗浄して、濃厚なシロップとして二酸PSMA14を得た。PSMA14を、DMF中のHATU(198mg、0.54mmol)、PSMA5(292mg、0.57mmol)及びDIEA(362μL、2.08mmol)で1時間処理した。反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーに通して精製して、PSMA15を得た(408mg、88%)。PSMA14: AP-ESI+質量: C41H59N3O16の計算値: 849.39,  実測値: 850.5 [M+H]+, 872.5 [M+Na]+.PSMA15: AP-ESI+質量: C89H145N9O28の計算値: 1788.02,  実測値: 895.3 [M+2H]2+, 917.2 [M+2Na] 2+
【０４２７】
ビス-イミノ-(アセトアミド-Peg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-gluトリ-t-ブチルエステル)(PSMA16)の調製。アセトニトリル(10mL)中のN-Fmoc PMSA15(408mg、0.22mmol)を、ピペリジンで30分間処理した。反応物を真空下で濃縮し、PhMe(3×10mL)と共沸させ、ヘキサン(3×20mL)で洗浄し、高真空下で乾燥して、PSMA16を得た。AP-ESI+質量: C74H135N9O26の計算値: 1565.95,  実測値: 895.3 [M+2H]2+, 917.2 [M+2Na] 2+
【０４２８】
アジド-Peg4-イミド-ビス-(アセトアミド-Peg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-gluトリ-t-ブチルエステル)(PSMA17)の調製。アミンPMSA16(172mg、0.11mmol)を、DMF(2mL)中のHATU(52mg、0.14mmol)及びDIEA(116μL、0.66mmol)で活性化させたN3-Peg4-COOH(40mg、0.14mmol)に添加した。1時間後、反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、PSMA17を得た(194mg、91%)。AP-ESI+質量: C85H154N12O31の計算値: 1839.08,  実測値: 895.3 [M+2H]2+, 917.2 [M+2Na] 2+
【０４２９】
アジド-Peg4-イミド-ビス-(アセトアミド-Peg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-glu)(PSMA18)の調製。ヘキサ-t-ブチルエステルPSMA17(194mg、0.10mmol)を、TFA:アセトンの溶液(10mL、97.5:2.5、v/v)で30分間処理した。RP-HPLCMSは、所望生成物への完全変換を示した。反応物を真空下で濃縮し、RP-HPLCで精製して、PSMA18を得た(69.4mg、44%)。AP-ESI+質量: C61H106N12O31の計算値: 1502.70,  実測値: 752.5 [M+2H]2+
【０４３０】
二価のPSMA HyNic (PSMA20)の合成
【０４３１】
【化１００】
2019532027.tif 000117
N-Boc 4-ヒドラジノ-ニコチンアミドPeg4-イミド-ビス-(アセトアミド-Peg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-gluトリ-t-ブチルエステル)(PSMA19)の調製。アミンPMSA16(172mg、0.11mmol)を、DMF(2mL)中のHATU(46mg、0.12mmol)及びDIEA(116μL、0.66mmol)で活性化させたPSMA8(61mg、0.12mmol)に添加した。1時間後、反応物を真空下で濃縮し、SiO2ゲルクロマトグラフィーで精製して、PSMA19を得た(201mg、89%)。AP-ESI+質量: C96H169N13O34の計算値: 2048.19,  実測値: 1025.3 [M+2H]2+, 684.0 [M+3H]3+
【０４３２】
ジメチル4-ヒドラゾノ-ニコチンアミド-Peg4-イミド-ビス-(アセトアミド-Peg4-イプシロン-アミドlys-アルファ-ウレイド-glu)(PSMA20)の調製。ヘキサ-t-ブチルエステルPSMA19(201mg、0.10mmol)を、TFA:アセトンの溶液(10mL、9:1、v/v)で60分間処理した。RP-HPLCMSは、所望生成物への完全変換を示した。反応物を真空下で濃縮し、RP-HPLCで精製して、PSMA20を得た(69.4mg、44%)。AP-ESI+質量: C70H117N13O32の計算値: 1651.79,  実測値: 827.1 [M+2H]2+
【０４３３】
マンノースリガンドの合成:
【０４３４】
【化１０１】
2019532027.tif 000118
Lys6-Peg24-HyNic(M5)の調製。ペプチド骨格は、Rinkアミド樹脂(0.61mmol/g)上での標準的なFmoc化学を、HCTUカップリング及び20%ピペリジン脱保護と共に使用して合成した。要するに、ペプチドM1は、自動合成装置で25μmol尺度により調製された。Lys(Mtt)の脱保護後、Peg24アミノ(Mtt)酸をカップリングして、M3を提供した。Mtt基の除去及びその後のBocHyNicのカップリングにより、M4を提供した。トリフルオロ酢酸:トリイソプロピルシラン:水:アセトン:ジチオトレイトール(90:2:2:3:3)を使用する樹脂からのペプチドの放出及びRP-HPLCによる精製により、M5(7.0mg)を得た。AP-ESI+質量: C96H185N17O32の計算値: 2088.33,  実測値: 1046 m/2z, 698 m/3z, 524 m/4z.
【０４３５】
Man6-Lys6-Peg24-HyNic(M6)の調製。DMSO(1mL)中のペプチド骨格M5(7.0mg)を、マンノースイソチオシアネート(8.0mg)及びN-メチルモルホリン(NMM、200μL)で処理した。反応物を37℃で4時間撹拌し、RP-HPLCで精製して、M6を得た(1.2mg)。MALDI-TOF質量: C174H275N23O68S6の計算値: 3966.70,  実測値: 3987.39 [M+Na].
【０４３６】
六価のマンノースアジド(M9)の合成
【０４３７】
【化１０２】
2019532027.tif 000119
Lys6-Peg24-アジド(M8)の調製。ペプチド骨格は、Rinkアミド樹脂(0.61mmol/g)上での標準的なFmoc化学を、HCTUカップリング及び20%ピペリジン脱保護と共に使用して合成した。要するに、ペプチドM1は、自動合成装置で100μmol尺度により調製された。Lys(Mtt)の脱保護後、アジドPeg24酸をカップリングして、M7を提供した。カクテルTFA:TIPS:H2O(92.5:2.5:5)を使用する樹脂からのペプチドの放出により、M8を得た(167.0mg)。MALDI-TOF質量: C87H174N16O31の計算値: 1940.4,  実測値: 1941.1
【０４３８】
Man6-Lys6-Peg24-アジド(M9)の調製。DMSO(2mL)中のペプチド骨格M4(167.0mg)を、マンノースイソチオシアネート及びNMM(500μL)で処理した。反応物を37℃で撹拌し、所望生成物への総変換が達成されるまで、MALDI-TOFによってモニターした(合計58mgのマンノースイソチオシアネート(isothyocyanate)を添加した)。最終生成物をRP-HPLCで精製して、M9を得た(22mg)。MALDI-TOF質量: C165H264N22O67S6の計算値: 3820.37,  実測値: 3843.79 [M+Na].
【０４３９】
三価のマンノースアジド(M15)の合成
【０４４０】
【化１０３】
2019532027.tif 000120
アジドトリ-マンノース(M15)の調製:D-マンノースを、ピリジン中のAc2Oによって終夜過アセチル化した。回転蒸発による濃縮、続いてPhMeと共沸させることにより、ペンタ-アセテート(M8)を定量的収率で提供した。市販のアジドPeg2アルコールの存在下、M8のSc(OTf)3による活性化により、アジド-Peg2マンノシド(M9)を得て、これを、定量的に水素化して、アミン(M10)とした。一方で、トリスリンカー(NAG13)のメチルエステルを選択的に加水分解して、酸(M11)を得た。TBTU活性化による市販のアジドPeg3アミンのM11とのカップリングにより、アジドトリスリンカー(M12)を提供した。トリt-ブチルエステルM12のTFAでの処理により、三酸M13を得た。M10のM13とのカップリングは、HATUによって仲介され、粗混合物を全体的に脱アセチル化して、アジドトリ-マンノース(M15)を得た。
【０４４１】
一価のマンノースホスホルアミダイト(M21)の合成
【０４４２】
【化１０４】
2019532027.tif 000121
マンノースジスルフィド2-フルオロウリジンホスホルアミダイト(M21)の調製:標準的な保護/脱保護化学により、M9の酢酸塩を、脱アセチル化中間体M16を経由してt-ブチルシリル(TBS)M17に変換した。水素化によるアジドM17のアミンM18への還元は、ヒンダードチオラクトンによるN-アシル化を促進して、チオールM19を得た。ジスルフィドM20がアリールメルカプト-チオピリジンの添加により手際よく形成され、これを、MeOTfで予め活性化させた。ホスホルアミダイトM21は、標準的な2ステップワンポット方式で、2-フルオロウリジンのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンによる処理、続いて糖ジスルフィドM20の添加により、形成されることになっていた。
【０４４３】
六価のマンノースアジド(M30)の合成
【０４４４】
【化１０５】
2019532027.tif 000122
N-カルボベンジルオキシトリス-(t-ブトキシカルボエトキシメチル)-メチルアミド(M22)の調製:NAG12(3.55g、7.02mmol)の、氷浴中で冷却したCH2Cl2(12mL)中溶液に、Cbz-Cl(PhMe中35%、7.3mL)及びTEA(3.9mL)を添加した。反応物を室温に温め、終夜撹拌した。混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3(水溶液)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮した。粗油をSiO2クロマトグラフィーで精製して、M22を得た(0.98g、収率22%)。AP-ESI+質量: C33H53NO11の計算値: 639.4,  実測値: 662.4 [M+Na]+
【０４４５】
N-カルボベンジルオキシトリス-((2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-1-O-α-D-マンノピラノシル)-Peg3-アミドエトキシメチル)-メチルアミド(M24)の調製:CH2Cl2(5mL)中のトリス-t-ブチルエステルM22(0.97g、1.51mmol)及びTIPS(0.93mL、4.55mmol)を、TFA(20mL)で5時間処理した。混合物を真空下で濃縮し、油状残留物をヘキサンで洗浄し、高真空下で乾燥して、M23を提供した。AP-ESI+質量: C21H29NO11の計算値: 471.2,  実測値: 493.9 [M+Na]+
【０４４６】
DMF中の粗M23(5mL)を氷浴で冷却し、HATU(0.62g、1.63)及びDIEA(0.65mL、3.71mmol)で処理した。20分間撹拌した後、M10(0.89g、1.86mmol)のDMF(5mL)中溶液を添加し、混合物を室温に温め、3時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗製物をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3(水溶液)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮した。SiO2クロマトグラフィーによる精製により、M24を得た(0.49g、収率62%)。MALDI-TOF質量: C81H122N4O44の計算値: 1854.74,  実測値: 1850.14
【０４４７】
トリス-((2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-1-O-α-D-マンノピラノシル)-Peg3-アミドエトキシメチル)-メチルアミン(M25)の調製:M24の溶液(0.49g、0.26mmol)を、HOAc(0.2mL)を加えたEtOAc(50mL)に溶解し、真空の適用及びAr(g)の再充填によって脱気した。活性炭上Pd(0.16g)を添加し、混合物を排気し、H2(g)を三回再充填した。反応物を2日間撹拌し、触媒を濾過によって除去し、母液を真空下で濃縮して、M25を得た。AP-ESI+質量: C73H116N4O42の計算値: 1720.7,  実測値: 1723.42
【０４４８】
【化１０６】
2019532027.tif 000123
アジド-Peg4-イミド-ビス-(アセトアミド-Peg4-t-ブチルエステル)(M27)の調製:CH2Cl2中のN-Fmoc PSMA13(0.72g、0.75mmol)を、ピペリジン(0.75mL)で1時間処理した。HPLCMSは、M26への完全変換を示した。AP-ESI+質量: C34H65N3O14の計算値: 739.4,  実測値: 740.5 [M+H]+.
【０４４９】
混合物を真空下で濃縮し、PhMeと共沸させた。粗M26を、アジドPeg4酸(0.44g、1.51mmol)、HATU(0.57g、1.51mmol)及びDIEA(0.52mL)のDMF(5mL)中溶液と、1時間反応させた。真空下での溶媒除去後、粗製物をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3(水溶液)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮した。SiO2クロマトグラフィーによる精製により、M27を得た(0.71g、収率93%、2ステップ)。AP-ESI+質量: C45H84N6O19の計算値: 1012.6,  実測値: 1013.6 [M+H]+
【０４５０】
アジド-Peg4-イミド-ビス-(三量体マンノース)(M30)の調製:イミドリンカーM27(0.69g、0.68mmol)を、TIPS(0.28mL、1.36mmol)及びTFA(10mL)で処理して、三酸M28を得た; AP-ESI+質量計算値C37H68N6O19: 900.5,  実測値:900.9 [M+H]+, 922.9 [M+Na]+.  揮発性物質を真空下で除去し、M28を高真空下で乾燥した。二酸M28(82.0mg、0.09mmol)を、DMF(2mL)中のHATU(75mg、0.2mmol)及びDIEA(0.28mL)で0℃にて活性化させた。30分後、M25(0.26mmol)のDMF(2mL)中溶液を添加し、混合物を室温に温め、2時間撹拌した。RP-HPLCMSは、M29への完全変換を示した。質量: C183H296N14O101の計算値: 4305.84. MALDI-TOF  実測値: 4303.36 AP-ESI+  実測値: 1436.1 [M+3H]3+, 1077.3 [M+4H]4+.反応物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3(水溶液)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、真空下で濃縮した。粗M29油(538mg)をMeOH(20mL)に溶解し、NaOMe(MeOH中25wt%、0.5mL)で1時間処理した。RP-HPLCMSは、M30への完全変換を示した。ダウエックスH+樹脂での中和によって反応を止めた。粗材料をHPLCで精製して、M30を得た(3ステップにわたって38.1mg、収率13%)。質量: C135H248N14O77の計算値: 3297.59, MALDI-TOF  実測値: 3318.61 [M+Na]+ AP-ESI+  実測値: 1100.0 [M+3H]3+, 825.3 [M+4H]4+.
【０４５１】
[実施例2]
ポリヌクレオチド構築物及びハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物の合成
【０４５２】
【化１０７】
2019532027.tif 000124
【０４５３】
実験の詳細:
合成されたすべてのポリヌクレオチド構築物を、2'-リボース糖位置において2'-F及び2'-OMe修飾で修飾して、血清安定性を改善し、オフターゲット効果(off-target effect)を低減した。自動ポリヌクレオチド合成(1μmol尺度)は、次の試薬/溶媒を用いて実施した:
酸化剤- THF/ピリジン/H2O中0.02M I2(1サイクル当たり60秒の酸化)
非ブロック化- 3%トリクロロ酢酸(1サイクル当たり2×40秒の非ブロック化)
キャップミックス(Cap Mix)A- THF/ピリジン/Pac2O(1サイクル当たり60秒のキャッピング)
キャップミックスB- THF中16%メチルイミダゾール(1サイクル当たり60秒のキャッピング)
硫化- 0.05M硫化試薬、60%ピリジン/40%アセトニトリル中3-((N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(DDTT)(1サイクル当たり360秒の硫化)
【０４５４】
標準的なオリゴヌクレオチド合成条件の例外は、次の通りであった:
- より穏やかな脱保護のためにQ-リンカー(ヒドロキノン-O,O'-二酢酸リンカーアーム)を有するCPG支持体を使用した。
- すべてのジスルフィドホスホルアミダイトを、合成前に無水アセトニトリル中100mMの濃度に再懸濁した。
- ホスホルアミダイト活性化は、2.5倍モル過剰の5-ベンジルチオ-1-H-テトラゾール(BTT)を用いて実施した。活性化ホスホルアミダイトを、挿入1回当たり2×3分のカップリングステップのためにカップリングした。
【０４５５】
ポリヌクレオチド脱保護及び精製プロトコール:
- 自動ポリヌクレオチド合成に続いて、ホスホトリエステルポリヌクレオチドを開裂し、1mLのメタノール中10%ジイソプロピルアミン(10%DIA/MeOH)中、室温で4時間脱保護した。4時間の脱保護に続いて、ポリヌクレオチド試料を遠心蒸発で乾燥した。
- ホスホトリエステルポリヌクレオチドが標準的な核酸塩基保護基(例えば、A-Bz、C-Ac及びG-iBuなど)を含む場合、次の開裂及び脱保護条件を使用した:ホスホトリエステルポリヌクレオチドを開裂し、1.0mLのAMA(メタノール中1:1比の36%アンモニア水溶液及び40%メチルアミン)中、室温で2時間脱保護し、続いて遠心蒸発した。
- 粗ポリヌクレオチドペレットを100μLの50%アセトニトリルに再懸濁し、65℃に手短に加熱し、徹底的にボルテックスした。合計100μLの粗ポリヌクレオチド試料を、次の緩衝剤/グラジエントを用いる逆相HPLCに注入した:
・  緩衝剤A=50mM酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(TEAA)
・  緩衝剤B=90%アセトニトリル
・  流速=1mL/分
・  グラジエント:
・    0〜2分(100%緩衝剤A/0%緩衝剤B)
・    2〜42分(0%〜60%緩衝剤B)
・    42〜55分(60%〜100%緩衝剤B)
- 主要な逆相HPLCピークにわたって、0.5mLの画分を収集し、MALDI-TOF質量分光法で分析して、所望の質量ピークを有する化合物の存在を確かめた。正しい質量ピークを有する精製画分含有化合物を凍結し、凍結乾燥した。乾燥したら、画分を再懸濁し、対応する画分と組み合わせ、凍結し、凍結乾燥して、最終生成物を得た。
【０４５６】
追加の脱保護を必要とするトリエステル挿入片は、最初に上記のように単離し、続いて必要な二次脱保護ステップ(以下を参照)を行った。
【０４５７】
アセタール基を有するホスホトリエステルポリヌクレオチドの二次脱保護
逆相HPLCにより精製したポリヌクレオチド生成物を、100μLの80%ギ酸に再懸濁した。アルデヒド修飾1回当たり反応を室温で約1時間進めさせた。反応をMALDI-TOF質量分光法でモニターして、完全な脱保護を確かめた。脱保護が完了したら、試料を凍結し、乾燥するまで凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥した試料を1mLの20%アセトニトリル水溶液に再懸濁し、最終ポリヌクレオチド構築物の単離のためにゲル濾過した。
【０４５８】
TBDMS保護を有するホスホトリエステルポリヌクレオチドの二次脱保護
逆相HPLCにより精製したポリヌクレオチド生成物を、219μLの無水DMSOに再懸濁し、65℃に手短に加熱し、徹底的にボルテックスした。DMSO溶液に、31μLの6.1Mトリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA.3HF)を添加して、0.75Mの最終濃度を得た。TBDMS保護されたヒドロキシル修飾1回当たり反応を室温で約1時間進めさせた。反応をMALDI-TOF質量分光法でモニターして、完全な脱保護を確かめた。脱保護が完了したら、35μLの3M酢酸ナトリウム及び1mLのブタノールを逐次的に添加した。試料を徹底的にボルテックスし、-80℃で2時間置いた。2時間後、試料を遠心分離して、ポリヌクレオチドをペレット化した。ブタノール層を除去し、ポリヌクレオチドペレットを1mLの20%アセトニトリル水溶液に再懸濁した。試料を、最終ポリヌクレオチド構築物の単離のためにゲル濾過した。
【０４５９】
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物の調製
等比のパッセンジャー及びガイド鎖を、標準的な条件を使用してアニールして、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物を、ゲル電気泳動で確かめられるように、約90%の良好な純度で提供した。
【０４６０】
立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエート
立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含むポリヌクレオチド構築物は、本明細書に記載のように、立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートの調製のための当技術分野で公知である方法を利用して、例えば、Okaら、Chem.Soc.Rev.,40:5829〜5843,2011;Okaら、Org.Lett.,11:967〜970,2009;並びに米国付与前公開第2013/0184450号及び2015/0197540号中に記載の原理により、調製され得る。1つ以上の立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを有するハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物の非限定的例を表3に示す。
【０４６１】
【表３】
2019532027.tif 000125
2019532027.tif 000126
2019532027.tif 000127
【０４６２】
ホスホロジチオエート
ポリヌクレオチドを含むホスホロジチオエートは、当技術分野で公知の及び本明細書中で開示される標準的なポリヌクレオチド合成プロトコールを使用して合成することができる(例えば、Yangら、ACS Chem.Biol.,7:1214〜1220,2012;Wuら、Nat.Commun.,5:3459,2013を参照)。合成は、例えば、市販のチオホスホルアミダイト(例えば、グレンリサーチから入手可能)を用いて実施され得る。チオホスホルアミダイトの非限定的例は、
【０４６３】
【化１０８】
2019532027.tif 000128
を含む。
【０４６４】
本発明のポリヌクレオチド構築物の代表例:
以下のスキームにおいて、合成で使用される具体的なヌクレオシドホスホルアミダイトは、明瞭さのために省略されている。
【０４６５】
リンカーX1及びX2
【０４６６】
【化１０９】
2019532027.tif 000129
【０４６７】
リンカーX3及びX4
【０４６８】
【化１１０】
2019532027.tif 000130
【０４６９】
リンカーX5及びX6
【０４７０】
【化１１１】
2019532027.tif 000131
【０４７１】
リンカーX7及びX8
【０４７２】
【化１１２】
2019532027.tif 000132
【０４７３】
リンカーX9及びX10
【０４７４】
【化１１３】
2019532027.tif 000133
【０４７５】
リンカーX11及びX12
【０４７６】
【化１１４】
2019532027.tif 000134
【０４７７】
リンカーX13及びX14
【０４７８】
【化１１５】
2019532027.tif 000135
【０４７９】
リンカーX15及びX16
【０４８０】
【化１１６】
2019532027.tif 000136
【０４８１】
リンカーX17及びX18
【０４８２】
【化１１７】
2019532027.tif 000137
【０４８３】
リンカーX11、X12、X13及びX14は、当技術分野で公知の反応条件を使用して調製することができる。例えば、化合物X1aを、選択的TBS保護、ベンジル基除去、続いてアルキル化及びTBS基除去に供して、アルコールX1dを得ることができ、次いでこれを、ホスホルアミダイトの調製のために当技術分野で公知の反応条件下で化合物X11及びX12に変換することができる。同じ実験条件を使用して、化合物X2aを化合物X13及びX14に変換することができる。X3a及びX4aを使用する若干修正された方法により、化合物X15、X16、X17及びX18を得ることができる。
【０４８４】
それらを含む他のリンカー及びポリヌクレオチド構築物は、当技術分野で公知の方法及び技術を使用して調製することができる。例えば、次の構造を調製することができる。
【０４８５】
【化１１８】
2019532027.tif 000138
【０４８６】
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物
調製されたハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物の一覧を表4に示す。
【０４８７】
【表４】
2019532027.tif 000139
2019532027.tif 000140
2019532027.tif 000141
2019532027.tif 000142
2019532027.tif 000143
2019532027.tif 000144
2019532027.tif 000145
2019532027.tif 000146
2019532027.tif 000147
2019532027.tif 000148
2019532027.tif 000149
2019532027.tif 000150
2019532027.tif 000151
2019532027.tif 000152
2019532027.tif 000153
2019532027.tif 000154
2019532027.tif 000155
2019532027.tif 000156
2019532027.tif 000157
2019532027.tif 000158
2019532027.tif 000159
2019532027.tif 000160
【０４８８】
表4において、下線は、コンジュゲート部位を表し、大文字は、2'-フルオロ-2'-デオキシリボースを表し、小文字は、2'-メトキシ-2'-デオキシリボースを表し、pは、ホモプロパルギルホスホトリエステルを表し、斜字体は、2-(t-ブチル-ジチオ)フェニル-エチルホスホトリエステルを表し、sは、ホスホロチオエートを表し、nは、3' C3-OH基を表し、bは、n-ブチルホスホトリエステルを表し、eは、2-アミノエチル-ジエチレングリコールホスホトリエステルを表し、kは、2-アミノエチルホスホトリエステルを表し、k1は、2-アミノプロピルホスホトリエステルを表し、Uは、2-(t-ブチル-ジチオ)フェニル-エチルホスホトリエステルに結合している3'-炭素を有するウリジンを表し、Pは、フェネチルホスホトリエステルを表し、R*は、RPキラルヌクレオシド間ホスホロチオエートであり、S*は、SPキラルヌクレオシド間ホスホロチオエートであり、Iは、2'-OMeイノシンヌクレオシドであり、P1、p2、P3及びp4の構造を図8Bに示し、リガンドコンジュゲート前のX1、X2、X3、X4、X5及びX2-NH2の構造を図8Bに示す。
【０４８９】
コンジュゲート方法
クリック反応
銅-THPTA複合体調製
硫酸銅五水和物(CuSO4-5H2O)の5mM水溶液及びトリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)の10mM水溶液を1:1(v/v)(1:2モル比)で混合し、室温で1時間静置させた。この複合体を使用して、例えば、以下の一般的なコンジュゲートスキーム中で示すように、Huisgen付加環化を触媒することができる。
【０４９０】
一般的な手順(100nM尺度):
1.7mLのエッペンドルフチューブ中の710μLの水及び100μLのtert-ブタノールの溶液(10%の最終体積)に、60μLの銅-THPTA複合体、続いて50μLのオリゴの2mM溶液、60μLの20mMアスコルビン酸ナトリウム水溶液及び20μLのGalNAc-アジドの10mM溶液を添加した。徹底的に混合した後、溶液を室温で1時間静置させた。反応の完了をゲル分析によって確かめた。
【０４９１】
反応混合物を、5〜10倍モル過剰のSiliaMetS(登録商標)TAAcONa(樹脂に結合したEDTAナトリウム塩)を含むスクリューキャップバイアルに添加した。混合物を1時間撹拌した。次いで、この混合物をillustra(商標)Nap(商標)-10カラムSephadex(商標)に通して溶離した。次いで、生じた溶液を凍結し、終夜凍結乾燥した。
【０４９２】
アミド化
アミド化によるコンジュゲートは、当技術分野で公知のアミド化反応条件下で実施され得る。例えば、Aaronsonら、Bioconjugate Chem.22:1723〜1728,2011を参照されたい。
【０４９３】
一般的な手順(100nmol尺度):
100μLのX2-NH2 ssRNAの50%アセトニトリル中1mMストック溶液を、9μLのGalNAc-PFPの100mMストック溶液と混合した。溶液を水で195μLの全体積に希釈し、5μLのジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応を室温で30分間進めさせ、続いて尿素変性ゲル分析及びMALDI-TOF質量分光法により、完全なコンジュゲートを確かめた。コンジュゲート化反応の完了を確かめたら、200μLの反応溶液を水で1mLに希釈し、illustra(商標)NAP-10カラム上で精製した。次いで、NAP-10溶離液を凍結し、凍結乾燥し、続いて定量化及びsiRNAの二本鎖化をした。
【０４９４】
一般的なコンジュゲートスキーム
クリック反応によるコンジュゲート1
【０４９５】
【化１１９】
2019532027.tif 000161
(式中、
n及びqのそれぞれは、独立に、0又は1であり、
mは、0〜5の整数であり、
Rは、H又は-(CH2)3-OHであり、
各R'は、独立に、H又はプロパルギルであり、
各R"は、独立に、H又は-(CH2)-(1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイル)-(リンカー)-(AM)pであり、
各RAは、H又はプロパルギルであり、但し、少なくとも1つのRAは、プロパルギルであり、
各RBは、H又は-(CH2)-(1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイル)-(リンカー)-(AM)pであり、
各AMは、独立に、補助部分(例えば、GalNAc又はマンノース)であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
各リンカーは、独立に、多価リンカー(例えば、-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)pであり、ここで、
Q2は、pが1である場合は直鎖基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-)であり、pが2〜6の整数である場合は分岐基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、ここで、p1は、0又は1であり、p2は、0、1、2又は3である)であり、
各Q3及びQ6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖である)。
【０４９６】
クリック反応によるコンジュゲート2
【０４９７】
【化１２０】
2019532027.tif 000162
(式中、
nは、1〜6の整数であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
各AMは、独立に、補助部分(例えば、標的指向性部分(例えば、GalNAc又はマンノース))であり、
Rは、H又は-(CH2)3-OHであり、
各リンカーは、独立に、多価リンカー(例えば、-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)pであり、ここで、
Q2は、pが1である場合は直鎖基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-)であり、pが2〜6の整数である場合は分岐基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、ここで、p1は、0又は1であり、p2は、0、1、2又は3である)であり、各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
各Q3及びQ6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する)。
【０４９８】
アミド化によるコンジュゲート1
【０４９９】
【化１２１】
2019532027.tif 000163
(式中、
n及びqのそれぞれは、独立に、0又は1であり、
mは、0〜5の整数であり、
Rは、H、-(CH2)3-OH又は-(CH2)3-O-Solであり、ここで、Solは固体支持体であり、
各R'は、独立に、H又は-(リンカー1)-NHRPGであり、
各R"は、独立に、H又は-(リンカー1)-NH-C(O)-(リンカー)-(AM)qであり、
各RAは、H又は-(リンカー1)-NHRPGであり、但し、少なくとも1つのRAは-(リンカー1)-NHRPGであり、
各RBは、H又は-(リンカー1)-NH-C(O)-(リンカー)-(AM)qであり、
各RPGは、独立に、H又はN-保護基であり、
各AMは、独立に、補助部分(例えば、GalNAc又はマンノース)であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
各リンカーは、独立に、多価リンカー(例えば、-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)pであり、ここで、
Q2は、pが1である場合は直鎖基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-)であり、pが2〜6の整数である場合は分岐基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、ここで、p1は、0又は1であり、p2は、0、1、2又は3である)であり、各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在し、
各リンカー1は、[-Q3-Q4-Q5]s-であり、但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する)。
【０５００】
アミド化によるコンジュゲート1
【０５０１】
【化１２２】
2019532027.tif 000164
(式中、
nは、1〜6の整数であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
RPGは、H又はN-保護基(例えば、Fmoc)であり、ここで、すべてのRPG基は、-C(O)-(リンカー)-(AM)pで置き換えられており、
Rは、H、-(CH2)3-OH又は-(CH2)3-O-Solであり、ここで、Solは、固体支持体であり、
各AMは、独立に、補助部分(例えば、GalNAc又はマンノース)であり、
各リンカーは、独立に、多価リンカー(例えば、-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)pであり、ここで、
Q2は、pが1である場合は直鎖基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-)であり、又はpが2〜6の整数である場合は分岐基(例えば、[-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、ここで、p1は、0又は1であり、p2は、0、1、2又は3である)であり、各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖である)。
【０５０２】
アミド化によるコンジュゲートは、溶液相中及び固体支持体上の両方で実施してよい。RPGがN-保護基(例えば、Fmoc)である場合、保護アミンを、RPGであるN-保護基の脱保護のために当技術分野で公知のN-保護基除去剤で処理して、中間体を得ることができ、ここで、RPGは、Hである。
【０５０３】
補助部分は、GalNAcであってよい。GalNAcとリンカーとの間の結合は、GalNAcのアノマー炭素原子を介してよい。特に、GalNAcのアノマー炭素原子は、環式酸素原子と共に、ヘミアミナールの一部であってよい(例えば、GalNAcのアノマー炭素原子が、リンカー中に存在するアミド官能基の窒素原子に結合している場合)。
【０５０４】
GalNAc-リンカー-COOHは、次の構造:
【０５０５】
【化１２３】
2019532027.tif 000165
を有してよく、式中、xは、0〜20の整数である(例えば、xは、0〜10又は2〜10の整数である(例えば、xは、2、4、6又は8である))。
【０５０６】
アミド化による別の例示的なコンジュゲートにおいて、PFPエステル、例えば、NAG40は、本発明のポリヌクレオチド構築物中のコンジュゲート部分とコンジュゲートされ得る。
【０５０７】
[実施例3]
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物のインビトロ及びインビボ活性を評価する実験
インビトロ実験
初代マウス肝細胞を、標準的な2ステップコラゲナーゼ灌流技術(Liら、Methods Mol.Biol.,633:185〜196;2010)を使用して単離した。手短に、6〜10週齢の雌C57/Bl6マウスに、ケタミン(80〜100mg/kg)/キシラジン(5〜10mg/kg)の混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけた。次いで、腹腔を露出させ、22G針を使用して内臓大静脈にカニューレを挿入した。肝静脈を切断し、0.5mM ETDAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の溶液を使用して、肝臓を直ちに5〜10分間灌流した。この溶液を直ちにコラゲナーゼ(100IU/mL)のダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、ギブコ(Gibco))中溶液にもう5〜10分間切り替えた。灌流の終わりに、肝臓を除去し、肝細胞を、10%ウシ胎児血清を含むDMEM中に4℃で収集した。次いで、細胞を70μmの滅菌フィルターに通して濾過し、同じ溶液中で3回洗浄し、トリパンブルー染色を使用して細胞生存率を評価した。次いで、細胞を、0.1%ラット尾コラーゲン又は2%マトリゲルでコーティングした96ウェルプレートに播種し、5%CO2インキュベーター内、37℃で3〜4時間インキュベートした。次いで、試験化合物を細胞に添加し、5%CO2インキュベーター内、37℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞を溶解し、mRNAを単離し、標的遺伝子の発現をqPCRで測定し、標準的なプロトコールを使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。この実験に関するデータは表5中にある。
【０５０８】
トランスフェクション実験
siRNA二本鎖のインビトロ活性を評価するために、示された細胞型を、推奨される培地条件(すなわち、10%ウシ胎児血清(FBS)、100μg/mlのストレプトマイシン及び100U/mlのペニシリンを補充したDMEM又は類似の培地)中、5%CO2下37℃で成長させた。トランスフェクションの前に、細胞を、96ウェルマイクロタイタープレート中、1ウェル当たり1×104細胞の密度で平板培養し、終夜付着させた。細胞を、リポフェクタミン(Lipofectamine)RNAiMax(ライフテクノロジー(Life Technologies))によって梱包され送達されたsiRNAで、製造業者の推奨に従い、100nMの濃度にて、完全対数降順用量応答(full-log descending dose response)で処理した。インキュベーション期間の終わりに、細胞を溶解し、mRNAを単離し、標的遺伝子の発現をqPCRで測定し、標準的なプロトコールを使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。この実験に関するデータは表8中にある。
【０５０９】
自由取り込み(Free-Uptake)実験
バイオレクラメーション(Bioreclamation)IVT製の初代非ヒト肝細胞を解凍し、コラーゲンでコーティングした96ウェルプレート上において1ウェル当たり70,000細胞の密度で平板培養し、5%CO2インキュベーター内、37℃で4時間付着させた。4時間後、肝細胞を、トランスフェクション試薬の不在下、コンジュゲートされたsiRNAで処理した(自由取り込み)。細胞を、完全対数降順希釈を用いて1μMから出発する化合物濃度で処理した。インキュベーション期間の終わりに、細胞を溶解し、mRNAを単離し、標的遺伝子の発現をqPCRで測定し、標準的なプロトコールを使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。この実験に関するデータは表6及び表8中にある。
【０５１０】
インビボ実験
試験化合物を、雌C57Bl6マウスに、皮下又は静脈内(外側尾静脈)注射(200μL、3匹のマウス/処置)のいずれかを介して投与した。注射後の適切な時点で、マウスを屠殺し、血液試料を心臓穿刺で収集した。ほぼ50〜100mgの肝臓試料片を収集し、直ちに液体窒素中で凍結した。全mRNAを肝臓ホモジネートから標準的なプロトコールを使用して単離し、標的遺伝子の発現をqPCRで定量化し、標準的なプロトコールを使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
【０５１１】
別のフォーマットで、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを使用して、投薬後異なる時点で血液をマウスから収集した。抗Xa因子法を使用してAT3のヘパリン補因子活性を評価する市販の発色アッセイを使用し、血漿AT3タンパク質を測定した。
【０５１２】
インビトロ及びインビボ実験結果を、図1〜7及び9〜20並びに表5〜8に示す。
【０５１３】
【表５】
2019532027.tif 000166
2019532027.tif 000167
2019532027.tif 000168
2019532027.tif 000169
2019532027.tif 000170
2019532027.tif 000171
【０５１４】
【表６】
2019532027.tif 000172
2019532027.tif 000173
2019532027.tif 000174
【０５１５】
【表７】
2019532027.tif 000175
2019532027.tif 000176
2019532027.tif 000177
【０５１６】
【表８】
2019532027.tif 000178
2019532027.tif 000179
【０５１７】
【表９】
2019532027.tif 000180
【０５１８】
表9からのデータを図10に示す。
【０５１９】
【表１０】
2019532027.tif 000181
2019532027.tif 000182
【０５２０】
表10からのデータを図11に示す。
【０５２１】
【表１１】
2019532027.tif 000183
【０５２２】
表11からのデータを図12に示す。
【０５２３】
【表１２】
2019532027.tif 000184
【０５２４】
表12からのデータを図13に示す。
【０５２５】
【表１３】
2019532027.tif 000185
【０５２６】
表13からのデータを図14に示す。
【０５２７】
【表１４】
2019532027.tif 000186
【０５２８】
表14からのデータを図17に示す。
【０５２９】
他の実施形態
本発明は、次の列挙される項目によってさらに記載される。
【０５３０】
1.少なくとも1つの式(I)の基:
【０５３１】
【化１２４】
2019532027.tif 000187
に結合している鎖を含むポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、少なくとも1つの多価リンカーは、Tに結合している-C(O)-N(H)-を含み、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である)。
【０５３２】
2.少なくとも1つの式(I)の基:
【０５３３】
【化１２５】
2019532027.tif 000188
に結合している鎖を含むポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0であり、
鎖は、2位において、置換されていてもよいC1〜6アルコキシ、置換されていてもよいC2〜12アルコキシアルキル、ハロゲン又はシアノにより置換されている少なくとも1つのヌクレオシドを含む)。
【０５３４】
3.少なくとも1つの-LinkA(-T)pが、式(II):
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p
(II)
(式中、
各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
Q1は、コンジュゲートリンカーであり、
Q2は、pが1である場合は直鎖基であり、又はpが2〜6の整数である場合は分岐基であり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC6〜10アリーレン、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり(例えば、各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり)、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する)
である、項目1又は2に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５３５】
4.各-LinkA(-T)pが、独立に、式(II)である、項目3に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５３６】
5.Q1が、-O-QL-QC-であり、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜12アルキレンであり、QCは、(i)-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-又は-N(H)-S(O)2-を含む、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、(ii)置換されていてもよいC1〜12ヘテロシクリレン、(iii)置換されていてもよいC1〜12チオヘテロシクリレン、(iv)シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、又は(v)ピリド-2-イルヒドラゾンである、項目3又は4に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５３７】
6.Q1が、
【０５３８】
【化１２６】
2019532027.tif 000189
を含む、項目3又は4に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５３９】
7.pが1であり、Q2が式-[Q3-Q4-Q5]s-である直鎖基である、項目3から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４０】
8.pが2〜6の整数であり、Q2が、式-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2の分岐基であり、Q7は、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
p1は、0又は1であり、
p2は、0、1、2又は3であり、
p1が0である場合、LinkAは三価又は四価リンカーであり、
p1が1である場合、LinkAは四価、五価又は六価リンカーである、
項目3から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４１】
9.少なくとも1つのTが、標的指向性部分である、項目1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４２】
10.少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド、マンノース、フォレート、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、又は抗体若しくはその抗原結合性フラグメントである、項目1から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４３】
11.少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、項目10に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４４】
12.少なくとも1つのTが、N-アセチルガラクトサミンである、項目11に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４５】
13.N-アセチルガラクトサミンが、LinkAに結合しているアノマー炭素を含み、アノマー炭素が、ヘミアミナール基の一部である、項目12に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４６】
14.N-アセチルガラクトサミンのアノマー炭素が、アミド窒素原子に結合している、項目13に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４７】
15.少なくとも1つのTが、細胞浸透性ペプチドである、項目1から14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４８】
16.少なくとも1つのTが、エンドソーム脱出部分である、項目1から15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５４９】
17.少なくとも1つの式(I)の基が、5つの5'又は5つの3'末端ヌクレオシドのうちの1つであるヌクレオシドに連結している、項目1から16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５５０】
18.鎖が、式(I)の1つ、2つ、3つ又は4つの基に結合しており、式(I)の基が、同一又は異なる、項目1から17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５５１】
19.鎖が、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、項目1から18のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５５２】
20.少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルが、置換されていてもよいC2〜16アルキル;置換されていてもよいC3〜16アルケニル;置換されていてもよいC3〜16アルキニル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルケニル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び以下の構造の基:
【０５５３】
【化１２７】
2019532027.tif 000190
(式中、
Lは、C2〜6アルキレンであり、
Rbは、置換されていてもよいC2〜6アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び-OH、C1〜6アルコキシ又は-COOHが末端であるポリ(エチレングリコール)であり、
Rcは、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から独立に選択される置換基により置換されているホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートである、項目19に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５５４】
21.少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルが、
C2〜16アルキル、
【０５５５】
【化１２８】
2019532027.tif 000191
又は
【０５５６】
【化１２９】
2019532027.tif 000192
とアジド含有基質との環化付加反応によって形成される基である置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートであり、
式中、
tは、1〜6の整数であり、
Rdは、置換されていてもよいC6アリール;1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である、置換されていてもよいC4〜5ヘテロアリール;又は1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である、置換されていてもよいC4〜5ヘテロシクリルであり、
Reは、H又はC1〜6アルキルであり、
X3は、ハロゲン、-COOR5又は-CONR62であり、R5及びR6のそれぞれは、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール又は置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであり、
アジド含有基質は、
【０５５７】
【化１３０】
2019532027.tif 000193
である、項目20に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５５８】
22.鎖が、1〜5つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、項目19から21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５５９】
23.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の2番目のヌクレオシド及び3番目のヌクレオシドを接続している、項目19から22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６０】
24.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の5番目のヌクレオシド及び6番目のヌクレオシドを接続している、項目19から23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６１】
25.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の17番目のヌクレオシド及び18番目のヌクレオシドを接続している、項目19から24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６２】
26.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の19番目のヌクレオシド及び20番目のヌクレオシドを接続している、項目19から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６３】
27.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、鎖の20番目のヌクレオシド及び21番目のヌクレオシドを接続している、項目19から26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６４】
28.少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルが、鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している、項目19から22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６５】
29.鎖が、1つ以上のヌクレオシド間ホスホネートを含む、項目19から28のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６６】
30.1つ以上のヌクレオシド間ホスホネートが、鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドを接続している、項目29に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６７】
31.鎖が、19個以上のヌクレオシドを含む、項目1から30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６８】
32.鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、項目1から31のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５６９】
33.鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、項目32に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７０】
34.鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、項目33に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７１】
35.鎖が、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含む、項目1から34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７２】
36.鎖中のすべてのヌクレオシドが、独立に、2'-修飾ヌクレオシドである、項目35に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７３】
37.鎖が、少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、項目1から36のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７４】
38.少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーが、式(III):
【０５７５】
【化１３１】
2019532027.tif 000194
(式中、
Lは糖アナログであり、
各X4は、独立に、O又はSであり、
各X5は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)
である、請求項37に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７６】
39.少なくとも1つの式(III)のヌクレオシド間脱塩基スペーサー:
【０５７７】
【化１３２】
2019532027.tif 000195
(式中、
Lは糖アナログであり、
各X4は、独立に、O又はSであり、
各X5は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
各R9は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜6アルケニル、置換されていてもよいC2〜6アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、-LinkA(-T)p又はコンジュゲート部分であり、
各LinkAは、独立に、多価リンカー(例えば、-C(O)-N(H)-を含む)であり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
R10は、鎖中のヌクレオシド(x)の3'-炭素原子への結合であり、
R11は、鎖中のヌクレオシド(x+t+1)の5'-酸素原子への結合であり、
pは、1〜6の整数であり、
tは、1〜6の整数である)
により割り込まれた鎖を含む、ポリヌクレオチド構築物。
【０５７８】
40.tが1である、項目39に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５７９】
41.R9がHである、項目39又は40に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８０】
42.X4がOである、項目39から41のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８１】
43.X4がSである、項目39から41のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８２】
44.X5がOである、項目39から43のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８３】
45.(x)が2、3、4又は5である、項目39から44のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８４】
46.(x)が13、14、15又は16である、項目39から45のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８５】
47.構築物が、1つのみ又は2つのみのヌクレオシド間脱塩基スペーサーを含む、項目39から46のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８６】
48.鎖が、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含む、項目39から47のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８７】
49.鎖中のすべてのヌクレオシドが、独立に、2'-修飾ヌクレオシドである、項目48に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８８】
50.鎖中のヌクレオシドの少なくとも80%が、2'-修飾ヌクレオシドである、項目48に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５８９】
51.各2'-修飾ヌクレオシドが、独立に、2'-アルコキシヌクレオシドである、項目50に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９０】
52.鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドのうちの少なくとも1つが、2'-フルオロヌクレオシドである、項目48に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９１】
53.鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドがすべて、独立に、2'-フルオロヌクレオシドである、項目52に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９２】
54.鎖を含むポリヌクレオチド構築物であって、鎖中の2番目、12番目、14番目及び16番目のヌクレオシドがすべて、独立に、2'-フルオロヌクレオシドである、ポリヌクレオチド構築物。
【０５９３】
55.残りのヌクレオシドが2'-アルコキシヌクレオシドである、項目52から54のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９４】
56.残りのヌクレオシドが2'-メトキシヌクレオシドである、項目52から55のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９５】
57.鎖が、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドを含むシード領域(例えば、イノシン)を含む、項目39から56のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９６】
58.ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドを含むシード領域(例えば、イノシン)を含む鎖を含む、ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９７】
59.ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドが、鎖中の2番目のヌクレオシドである、項目57又は58に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９８】
60.ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドが、鎖中の3番目のヌクレオシドである、項目57又は58に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０５９９】
61.ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドが、鎖中の4番目のヌクレオシドである、項目57又は58に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６００】
62.ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドが、鎖中の5番目のヌクレオシドである、項目57又は58に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０１】
63.ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドが、鎖中の6番目のヌクレオシドである、項目57又は58に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０２】
64.鎖が、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む、項目39から63のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０３】
65.少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む鎖を含む、ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０４】
66.鎖が、1つ、2つ、3つ又は4つのみの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含む、項目64又は65に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０５】
67.少なくとも1つ(例えば、1つ又は2つ)の立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、鎖の6つの5'末端ヌクレオシドの2つである2つの連続するヌクレオシド間に位置する、項目64から66のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０６】
68.少なくとも1つ(例えば、1つ又は2つ)の立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、鎖の6つの3'末端ヌクレオシドの2つである2つの連続するヌクレオシド間に位置する、項目64から67のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０７】
69.(i)1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、鎖中の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドとの間で共有結合している、項目64から68のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０８】
70.(i)1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、鎖中の2番目のヌクレオシドと3番目のヌクレオシドとの間で共有結合している、項目64から68のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６０９】
71.1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、鎖中の21番目のヌクレオシドと22番目のヌクレオシドとの間で共有結合している、項目64から70のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１０】
72.1つの立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、鎖中の22番目のヌクレオシドと23番目のヌクレオシドとの間で共有結合している、項目64から71のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１１】
73.立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、RP立体化学的アイデンティティを有する、項目64から72のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１２】
74.立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートが、SP立体化学的アイデンティティを有する、項目64から73のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１３】
75.鎖が、19個以上のヌクレオシドを含む、項目39から74のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１４】
76.鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、項目39から75のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１５】
77.鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、項目76に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１６】
78.鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、項目77に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６１７】
79.RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、ガイド鎖が、項目39から78のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体である、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物。
【０６１８】
80.RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、パッセンジャー鎖が、項目1から38のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体である、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物。
【０６１９】
81.RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つのホスホロジチオエート又はなくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含み、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの式(I)の基:
【０６２０】
【化１３３】
2019532027.tif 000196
に結合している、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である)。
【０６２１】
82.RISC複合体に取り込み可能なパッセンジャー鎖及びガイド鎖を含むハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物であって、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの2'-修飾ヌクレオシドを含み、鎖の少なくとも1つが、少なくとも1つの式(I)の基:
【０６２２】
【化１３４】
2019532027.tif 000197
に結合している、ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体
(式中、
各X1は、独立に、O又はSであり、
各X2は、独立に、O、S、NH又は結合であり、
MOIETYは、置換されていてもよいC2〜10アルカン-テトライル又は基-M1-M2-M3-であり、各M1及び各M3は、独立に、存在しない又は置換されていてもよいC1〜6アルキレンであり、M2は、置換されていてもよいC3〜9複素環-テトライル、置換されていてもよいC6〜10アレーン-テトライル又は置換されていてもよいC3〜8シクロアルカン-テトライルであり、
各R1及び各R2は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、但し、少なくとも1つのR1又は少なくとも1つのR2は、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
各R3は、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル、置換されていてもよいC2〜16アルケニル、置換されていてもよいC2〜16アルキニル、置換されていてもよい(C1〜9ヘテロシクリル)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C6〜10アリール)-C1〜6-アルキル、置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜6-アルキル、コンジュゲート部分又は-LinkA(-T)pであり、
R4は、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、-LinkA(-T)p又は-Solであり、
各LinkAは、独立に、多価リンカーであり、
各Tは、独立に、補助部分であり、
Solは、固体支持体であり、
mは、1〜6の整数であり、
各nは、独立に、0又は1であり、
各pは、独立に、1〜6の整数であり、
qは、0〜3の整数であり、
ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物は、1つ以下のSolを含み、
少なくとも1つの式(I)の基が、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合している場合、qは0である)。
【０６２３】
83.少なくとも1つの-LinkA(-T)pが、式(II):
-Q1-Q2([-Q3-Q4-Q5]s-Q6-T)p
(II)
であり、
式中、
各sは、独立に、0〜20の整数であり、繰り返し単位は同一であるか又は異なり、
Q1は、コンジュゲートリンカーであり、
Q2は、pが1である場合は直鎖基であり、又はpが2〜6の整数である場合は分岐基であり、
各Q3及び各Q6は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、置換されていてもよいC6〜10アリーレン、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリーレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり(例えば、各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり)、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各Raは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり、
但し、Q3、Q4及びQ5のうちの少なくとも1つは存在する、項目81又は82に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６２４】
84.Q1が、-O-QL-QC-であり、QLは、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜12アルキレンであり、QCは、(i)-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-又は-N(H)-S(O)2-を含む、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン、(ii)置換されていてもよいC1〜12ヘテロシクリレン、(iii)置換されていてもよいC1〜12チオヘテロシクリレン、(iv)シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、又は(v)ピリド-2-イルヒドラゾンである、項目83に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６２５】
85.Q1が、
【０６２６】
【化１３５】
2019532027.tif 000198
2019532027.tif 000199
を含む、項目83に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６２７】
86.pが1であり、Q2が式-[Q3-Q4-Q5]s-である直鎖基である、項目83から85のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６２８】
87.pが2〜6の整数であり、Q2が、分岐基-[Q3-Q4-Q5]s-Q7(-[Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2であり、Q7は、置換されていてもよいC1〜6アルカン-トリイル、置換されていてもよいC1〜6アルカン-テトライル、置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-トリイル又は置換されていてもよいC2〜6ヘテロアルカン-テトライルであり、
式中、
p1は、0又は1であり、
p2は、0、1、2又は3であり、
p1が0である場合、LinkAは三価又は四価リンカーであり、
p1が1である場合、LinkAは四価、五価又は六価リンカーである、
項目83から86のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６２９】
88.各-LinkA(-T)pが、独立に、式(II)である、項目81から87のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３０】
89.少なくとも1つのTが、標的指向性部分である、項目81から88のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３１】
90.少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド、マンノース、フォレート、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、又は抗体若しくはその抗原結合性フラグメントである、項目81から89のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３２】
91.少なくとも1つのTが、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである、項目90に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３３】
92.少なくとも1つのTが、N-アセチルガラクトサミンである、項目91に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３４】
93.N-アセチルガラクトサミンが、LinkAに結合しているアノマー炭素を含み、アノマー炭素が、ヘミアミナール基の一部である、項目92に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３５】
94.N-アセチルガラクトサミンのアノマー炭素が、アミド窒素原子に結合している、項目93に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３６】
95.少なくとも1つのTが、細胞浸透性ペプチドである、項目81から94のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３７】
96.少なくとも1つのTが、エンドソーム脱出部分である、項目81から94のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３８】
97.ハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物が、式(I)の基を1〜6つ含み、この式(I)の基が同一又は異なる、項目81から96のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６３９】
98.パッセンジャー鎖が、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、項目81から97のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６４０】
99.ガイド鎖が、少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、項目81から98のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６４１】
100.少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルが、置換されていてもよいC2〜16アルキル;置換されていてもよいC3〜16アルケニル;置換されていてもよいC3〜16アルキニル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルケニル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルケニル)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び以下の構造の基:
【０６４２】
【化１３６】
2019532027.tif 000200
(式中、
L1は、C1〜6アルキレンであり、
Rbは、置換されていてもよいC2〜6アルキル;置換されていてもよいC6〜14アリール;置換されていてもよい(C6〜14アリール)-C1〜4-アルキル;置換されていてもよいC3〜8シクロアルキル;置換されていてもよい(C3〜8シクロアルキル)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C1〜9ヘテロアリール)-C1〜4-アルキル;N、O及びSからなる群から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであって、S-S結合を含まないC2〜9ヘテロシクリル;N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する置換されていてもよい(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキルであって、ヘテロシクリルがS-S結合を含まない(C2〜9ヘテロシクリル)-C1〜4-アルキル;及び-OH、C1〜6アルコキシ又は-COOHが末端であるポリ(エチレングリコール)であり、
Rcは、H又はC1〜6アルキルである)
からなる群から独立に選択される置換基により置換されているホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートである、項目98又は99に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６４３】
101.生物非可逆性ホスホトリエステルのそれぞれが、
C2〜16アルキル、
【０６４４】
【化１３７】
2019532027.tif 000201
又は
【０６４５】
【化１３８】
2019532027.tif 000202
とアジド含有基質との環化付加反応によって形成される基である置換基により置換されている、ホスフェート、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートであり、
式中、
tは、1〜6の整数であり、
Rdは、置換されていてもよいC6アリール;1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である、置換されていてもよいC4〜5ヘテロアリール;又は1個若しくは2個の窒素原子を含む6員環である、置換されていてもよいC4〜5ヘテロシクリルであり、
Reは、H又はC1〜6アルキルであり、
X3は、ハロゲン、-COOR5又は-CONR62であり、R5及びR6のそれぞれは、独立に、H、置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC6〜14アリール、置換されていてもよいC1〜9ヘテロアリール又は置換されていてもよいC2〜9ヘテロシクリルであり、
アジド含有基質は、
【０６４６】
【化１３９】
2019532027.tif 000203
である、項目98又は99に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６４７】
102.ガイド鎖が、1〜5つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、項目99から101のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６４８】
103.少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルが、ガイド鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドに接続している、項目99から102のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６４９】
104.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の2番目のヌクレオシド及び3番目のヌクレオシドに接続している、項目99から103のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５０】
105.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の5番目のヌクレオシド及び6番目のヌクレオシドに接続している、項目99から104のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５１】
106.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の17番目のヌクレオシド及び18番目のヌクレオシドに接続している、項目99から105のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５２】
107.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の19番目のヌクレオシド及び20番目のヌクレオシドに接続している、項目99から106のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５３】
108.生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルの1つが、ガイド鎖の20番目のヌクレオシド及び21番目のヌクレオシドに接続している、項目98から106のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５４】
109.パッセンジャー鎖が、1〜5つの生物非可逆性ホスホトリエステルを含む、項目97から108のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５５】
110.少なくとも1つの生物非可逆性ヌクレオシド間ホスホトリエステルが、パッセンジャー鎖の6つの5'又は6つの3'末端ヌクレオシドの2つである、2つの連続するヌクレオシドに接続している、項目97から109のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５６】
111.パッセンジャー鎖又はガイド鎖が、少なくとも1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、項目81から110のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５７】
112.ガイド鎖が、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、項目111に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５８】
113.パッセンジャー鎖が、1つのヌクレオシド間脱塩基スペーサーにより割り込まれている、項目111又は112に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６５９】
114.ガイド鎖又はパッセンジャー鎖が、1つ以上のホスホネートを含む、項目79から113のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６０】
115.ガイド鎖が、19以上のヌクレオシドを含む、項目79から114のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６１】
116.ガイド鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、項目79から115のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６２】
117.ガイド鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、項目116に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６３】
118.ガイド鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、項目117に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６４】
119.パッセンジャー鎖が、19個以上のヌクレオシドを含む、項目79から118のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６５】
120.パッセンジャー鎖が、100個未満のヌクレオシドを含む、項目79から119のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６６】
121.パッセンジャー鎖が、50個未満のヌクレオシドを含む、項目120に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６７】
122.パッセンジャー鎖が、32個未満のヌクレオシドを含む、項目121に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６８】
123.パッセンジャー鎖の3'末端が、ガイド鎖の5'末端にハイブリッド化されて、ブラントを形成する、項目79から122のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体。
【０６６９】
124.R1及びR2が、MOIETYの同一原子に結合している、項目1から38のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくは項目80から122のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物、又はそれらの塩、或いはそれらの立体異性体。
【０６７０】
125.MOIETY、R1及びR2が、合わさって、
【０６７１】
【化１４０】
2019532027.tif 000204
を形成し、
式中、
R7は、R4に近位の酸素原子への結合であり、
R8は、鎖に近位の酸素原子への結合であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれは、独立に、0〜6の整数であり、
但し、式(Ia)中の四級炭素が、0個の原子、又は炭素及び水素以外の1個の原子に結合していること、及びm1、m2、m3及びm4の合計は10未満である、
項目124に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物、又はその塩、或いはその立体異性体。
【０６７２】
126.ポリヌクレオチド構築物を細胞に送達する方法であって、細胞を項目1から78、124及び125のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体、或いは項目79から123のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体と接触させるステップを含み、接触後にポリヌクレオチド構築物が細胞内部に存在している、方法。
【０６７３】
127.細胞におけるタンパク質の発現を低減する方法であって、細胞を項目1から78、124及び125のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体、或いは項目79から123のいずれか一項に記載のハイブリッド化ポリヌクレオチド構築物若しくはその塩、又はその立体異性体と接触させるステップを含み、接触後に細胞中のタンパク質の発現が低減される、方法。
【０６７４】
128.式(IV)の化合物:
【０６７５】
【化１４１】
2019532027.tif 000205
(式中、
R1及びR2のそれぞれは、独立に、H、置換されていてもよいC1〜16アルキル、置換されていてもよいC2〜16ヘテロアルキル又はコンジュゲート部分であり、
各R16は、独立に、ジアルキルアミノ、2-シアノエチル又はコンジュゲート部分であり、但し、少なくとも1つのR16はジアルキルアミノであり、
R17はヒドロキシル保護基であり、
m1、m2、m3及びm4のそれぞれは、独立に、0〜6の整数であり、但し、m1及びm2の合計が0ではなく、
R1及びR2が双方とも、置換されていてもよいC2〜16アルキニルを含むコンジュゲート部分である場合、R16はジアルキルアミノ又はコンジュゲート部分である)。
【０６７６】
129.m1が0又は1である、項目128に記載の化合物。
【０６７７】
130.m2が0又は1である、項目128又は129に記載の化合物。
【０６７８】
131.R1が、H又はコンジュゲート部分であり、コンジュゲート部分が、[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
QC1は、-COOR21又は-CHOを含む置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【０６７９】
【化１４２】
2019532027.tif 000206
又はそのN-保護変形体、
【０６８０】
【化１４３】
2019532027.tif 000207
であり、各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルあり、R22はハロゲンであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である、
項目128から130のいずれか一項に記載の化合物。
【０６８１】
132.R1中のQ3が-O-である、項目131に記載の化合物。
【０６８２】
133.R1中のQ4が、存在しない又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、R1中のQ5が存在しない、項目131又は132に記載の化合物。
【０６８３】
134.R2が、H又はコンジュゲート部分であり、コンジュゲート部分が、[-Q3-Q4-Q5]s-QC1であり、
QC1は、-COOR21又は-CHOを含む置換されていてもよいC1〜6アルキル、置換されていてもよいC2〜12アルキニル、置換されていてもよいN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【０６８４】
【化１４４】
2019532027.tif 000208
又はそのN-保護変形体、
【０６８５】
【化１４５】
2019532027.tif 000209
であり、各R21は、独立に、H又は置換されていてもよいC1〜6アルキルであり、R22はハロゲンであり、
各Q3は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-又は-OCH2-であり、
各Q4は、独立に、存在しないか、置換されていてもよいC1〜12アルキレン、置換されていてもよいC2〜12アルケニレン、置換されていてもよいC2〜12アルキニレン、置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレン又は置換されていてもよいC1〜9ヘテロシクリレンであり、
各Q5は、独立に、存在しないか、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり、
各sは、独立に、0〜20の整数である、
項目128から133のいずれか一項に記載の化合物。
【０６８６】
135.R2中のQ3が-O-である、項目134に記載の化合物。
【０６８７】
136.R2中のQ4が、存在しない又は置換されていてもよいC2〜12ヘテロアルキレンであり、R2中のQ5が存在しない、項目134又は135に記載の化合物。
【０６８８】
記載の発明の、本発明の範囲及び精神から逸脱しない種々の修正形態及び変形形態は、当業者にとって明らかであろう。本発明を特定の実施形態と関連させて説明してきたが、本発明は、特許を請求する際、このような特定の実施形態に不相応に限定されるものではないことを理解されたい。実際、当業者にとって明らかである、本発明を実施するために記載された方式の種々の修正形態は、本発明の範囲に包含されると解釈される。
【０６８９】
他の実施形態は、請求項内にある。
【図１】
2019532027.tif 000231
【図２】
2019532027.tif 000232
【図３】
2019532027.tif 000233
【図４】
2019532027.tif 000234
【図５】
2019532027.tif 000235
【図６】
2019532027.tif 000236
【図７】
2019532027.tif 000237
【図８Ａ】
2019532027.tif 000238
【図８Ｂ】
2019532027.tif 000239
【図９】
2019532027.tif 000240
【図１０】
2019532027.tif 000241
【図１１】
2019532027.tif 000242
【図１２】
2019532027.tif 000243
【図１３】
2019532027.tif 000244
【図１４】
2019532027.tif 000245
【図１５】
2019532027.tif 000246
【図１６】
2019532027.tif 000247
【図１７】
2019532027.tif 000248
【図１８】
2019532027.tif 000249
【図１９】
2019532027.tif 000250
【図２０】
2019532027.tif 000251
【配列表】
2019532027000001.app
【国際調査報告】
2019532027.tif 000252
2019532027.tif 000253
2019532027.tif 000254
2019532027.tif 000255