(57)【要約】がんを処置するための組成物が開示される。組成物は、レンチウイルス粒子およびアミノビスホスホネート薬物を含む。レンチウイルス粒子は、がん細胞などの標的細胞に感染することができ、そのような標的細胞を標的化するために最適化されたエンベロープタンパク質、およびウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列を標的化するために最適化されたスモールＲＮＡを含む。アミノビスホスホネート薬物としては、ゾレドロン酸が挙げられる。
2019508045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療カーゴ部分を含むウイルスベクターであって、前記治療カーゴ部分が、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含み、前記少なくとも１つの相補的ｍＲＮＡ配列が、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列を含む、ウイルスベクター。
【請求項２】
前記治療カーゴ部分が、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第２のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、前記第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列が、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記少なくとも１つのスモールＲＮＡが、第１のプロモーターの制御下にあり、前記第２のスモールＲＮＡ配列が、第２のプロモーターの制御下にある、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記治療カーゴ部分が、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、前記第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列が、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記第３のスモールＲＮＡ配列が、第３のプロモーターの制御下にある、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記スモールＲＮＡ配列が、単一のプロモーターの制御下にある、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記スモールＲＮＡ配列が、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
前記スモールＲＮＡ配列が、
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；または
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）
を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記スモールＲＮＡ配列が、配列番号１、２、３、または４から選択される、請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記第２のスモールＲＮＡ配列が、
ＧＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴ（配列番号５）；
ＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号６）；
ＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴ（配列番号７）；
ＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号８）；または
ＧＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴ（配列番号９）を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列、あるいは
ＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号１０）；
ＧＣＧＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＴ（配列番号１１）；
ＧＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１２）；
ＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１３）；または
ＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号１４）
を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記第２のスモールＲＮＡ配列が、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される、請求項１０に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記第３のスモールＲＮＡ配列が、配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記第３のスモールＲＮＡ配列が、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される、請求項１２に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
レンチウイルスベクターである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子であって、
ａ．前記標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および
ｂ．請求項１から１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター
を含む、レンチウイルス粒子。
【請求項１６】
ａ．請求項１５に記載のレンチウイルス粒子、および
ｂ．アミノビスホスホネート薬物
を含む組成物。
【請求項１７】
前記アミノビスホスホネート薬物が、ゾレドロン酸である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
治療有効量の請求項１６または１７に記載の組成物を被験体に投与することを含む、前記被験体におけるがんを処置する方法。
【請求項１９】
ａ．治療有効量の請求項１５に記載のレンチウイルス粒子、および
ｂ．治療有効量のアミノビスホスホネート薬物
を被験体に投与することを含む、前記被験体におけるがんを処置する方法。
【請求項２０】
ａ．有効量の請求項１５に記載のレンチウイルス粒子、および
ｂ．有効量のアミノビスホスホネート薬物
を被験体に投与することを含む、前記被験体におけるがんを予防する方法。
【請求項２１】
前記アミノビスホスホネート薬物が、ゾレドロン酸である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が同時に実行される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
規定された長さの期間が、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間に経過する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
治療有効量の前記レンチウイルス粒子が、複数の単回用量の前記レンチウイルス粒子を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２５】
治療有効量の前記アミノビスホスホネート薬物が、単回用量の前記アミノビスホスホネート薬物を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年３月９日に出願され、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」との表題の米国仮特許出願第６２／３０５，９４４号（これは、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本開示の態様は、ベクターを使用して、がんを処置することに関する。より具体的には、本開示の態様は、組み合わせベクターなどのベクターを使用して、がんを処置することに関する。
【背景技術】
【０００３】
がんは、世界中の人々にとって重大な健康管理上の問題である。一例としては、成人男性において肝臓がんは世界中で五番目に多く診断されるがんであり、世界のがん関連死における二番目に多い原因である。がんを効果的に処置するための努力において、多数の治療戦略が用いられてきた。従来の治療アプローチは、化学療法および放射線療法の使用を中心に展開されてきた。
【０００４】
化学療法とは、様々な方法によって１つまたは複数の抗がん薬および／またはその他の薬剤をがん患者に投与することをいう。大まかに言えば、ほとんどの化学療法薬は、有糸分裂（細胞分裂）を阻害して、急速に分裂する細胞を効果的に標的化することによって作用する。しかしながら、毛の成長に関与する細胞および腸上皮（裏打ち）の交換に関与する細胞などのその他の急速に分裂する細胞もまた影響を受ける。化学療法は細胞分裂に影響を及ぼすので、正常細胞およびがん性細胞の両方が化学療法剤の細胞毒性効果に影響されやすい。
【０００５】
放射線療法とは、Ｘ線、ガンマ線、および中性子などの高エネルギー放射線に患者を曝露することをいう。この種の療法としては、外部ビーム療法、内部放射線療法、組織内照射法（ｉｍｐｌａｎｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）、近接照射療法、全身放射線療法、および放射線療法が非限定的に挙げられる。外部ビーム照射としては、三次元原体照射、強度変調放射線療法、および原体プロトンビーム照射療法を挙げることができる。放射線の細胞傷害性効果から近くの正常組織を遮蔽しながらも治療線量を照射することは実際上困難である。放射線に付随するさらなる問題は、処置過程中に放射線抵抗性細胞を誘導することである。そのため、最良の放射線療法技術でさえ、不完全な腫瘍減少およびその後の再発を生じることが多い。
【０００６】
より最近では、宿主の免疫系の力を利用してがんを処置しようとする免疫療法のアプローチが用いられている。例えば、がん関連抗原を特異的に認識する宿主ベースのＴ細胞を用いてそのような抗原を標的化する戦略が用いられている。例えば、最近のアプローチは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞としても公知である）の開発および使用に集中している。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に関連して起こり得る副作用としては、ケモカイン放出症候群、Ｂ細胞無形成、および腫瘍崩壊症候群が挙げられる。これらのアプローチの開発にもかかわらず、がんは依然として重大な健康管理上の問題である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の一態様では、治療カーゴ部分を含むウイルスベクターが開示される。治療カーゴ部分は、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）配列を含み、少なくとも１つの相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、治療カーゴ部分は、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第２のスモールＲＮＡ配列をさらに含み得、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、第２のスモールＲＮＡ配列は、第２のプロモーターの制御下にある。実施形態では、治療カーゴ部分は、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み得、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、第２のスモールＲＮＡ配列は、第２のプロモーターの制御下にあり、第３のスモールＲＮＡ配列は、第３のプロモーターの制御下にある。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、単一のプロモーターの制御下にある。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）である。
【０００８】
別の態様では、スモールＲＮＡ配列は、
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；または
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）
を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、または４から選択される。
【０００９】
別の態様では、第２のスモールＲＮＡ配列は、
ＧＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴ（配列番号５）；
ＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号６）；
ＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴ（配列番号７）；
ＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号８）；またはＧＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴ（配列番号９）
を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列または
ＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号１０）；
ＧＣＧＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＴ（配列番号１１）；
ＧＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１２）；
ＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号１３）；または
ＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号１４）
を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００１０】
別の態様では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００１１】
別の態様では、治療カーゴ部分を含むウイルスベクターが開示される。治療カーゴ部分は、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含み、少なくとも１つの相補的ｍＲＮＡ配列は、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、治療カーゴ部分は、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第２のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、第２のスモールＲＮＡ配列は、第２のプロモーターの制御下にある。実施形態では、治療カーゴ部分は、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。スモールＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、第２のスモールＲＮＡ配列は、第２のプロモーターの制御下にあり、第３のスモールＲＮＡ配列は、第３のプロモーターの制御下にある。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、単一のプロモーターの制御下にある。
【００１２】
別の態様では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、または９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、または９から選択される。
【００１３】
別の態様では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００１４】
別の態様では、第３のスモールＲＮＡは、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００１５】
別の態様では、治療カーゴ部分を含むウイルスベクターが開示される。治療カーゴ部分は、第１の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第１のスモールＲＮＡ配列、および第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つの追加のスモールＲＮＡ配列を含み、第１の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含み、第２の予め定められた相補的配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を含む。
【００１６】
別の態様では、治療カーゴ部分は、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。実施形態では、第１のスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、第２のスモールＲＮＡ配列は、第２のプロモーターの制御下にあり、第３のスモールＲＮＡ配列は、第３のプロモーターの制御下にある。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、単一のプロモーターの制御下にある。
【００１７】
別の態様では、第１のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第１のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００１８】
別の態様では、少なくとも１つの追加のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、少なくとも１つの追加のスモールＲＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９から選択される。
【００１９】
別の態様では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９から選択される。
【００２０】
別の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。別の態様では、標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および本明細書中に記載するウイルスベクターを含む。実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。
【００２１】
別の態様では、本明細書中に記載するレンチウイルス粒子、およびアミノビスホスホネート薬物を含む組成物が開示される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。
【００２２】
別の態様では、被験体におけるがんを処置する方法が開示される。方法は、本明細書中に詳述する治療有効量の組成物を被験体に投与することを含む。
【００２３】
別の態様では、被験体におけるがんを処置する方法が開示される。方法は、本明細書中に詳述する治療有効量のレンチウイルス粒子、および治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を被験体に投与することを含む。別の態様では、被験体におけるがんを予防する方法が開示される。方法は、本明細書中に詳述する治療有効量のレンチウイルス粒子、および治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を被験体に投与することを含む。実施形態では、上記のステップは、同時に実行される。実施形態では、規定された長さの期間が、上記のステップの間に経過する。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。実施形態では、治療有効量のレンチウイルス粒子は、複数の単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態では、治療有効量のアミノビスホスホネート薬物は、単回用量のアミノビスホスホネート薬物を含む。
【００２４】
本明細書中に記載する発明のその他の態様および利点は、本発明の態様を例により説明する添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、例示的な環状の３ベクターレンチウイルス系を示す。
【００２６】
【図２】図２は、例示的な環状の４ベクターレンチウイルス系を示す。
【００２７】
【図３】図３は、（Ａ）ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ標的化配列をコードするレンチウイルスベクターの線形マップ、（Ｂ）ＦＤＰＳ標的化配列を有する合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするレンチウイルスベクターの線形マップ、および（Ｃ）ｃＭｙｃ、ＦＤＰＳ、およびＣＤ４７の発現を対象とする標的配列を有する合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするレンチウイルス組み合わせベクターの線形マップを示す。
【００２８】
【図４】図４は、（Ａ）本明細書中に記載する様々なｓｈＲＮＡ構築物に応答した、ヒトＦＤＰＳのｍＲＮＡの相対発現レベル、および（Ｂ）レンチウイルスで送達されたｍｉＲに基づくＲＮＡ干渉がＦＤＰＳの発現を阻害することを示す。
【００２９】
【図５Ａ】図５は、ＦＤＰＳを抑制するようにレンチウイルスを用いて形質導入した（Ａ）ＴＨＰ１細胞への曝露後の、ヒト末梢血ガンマデルタＴ細胞のサイトカイン発現レベルを示す。
【図５Ｂ】図５は、ＦＤＰＳを抑制するようにレンチウイルスを用いて形質導入した（Ｂ）ＨｅｐＧ２細胞への曝露後の、ヒト末梢血ガンマデルタＴ細胞のサイトカイン発現レベルを示す。
【００３０】
【図６】図６は、ＦＤＰＳを抑制するためのレンチウイルスでの形質導入による改変後、本明細書中に記載する様々な実験条件下で正常ヒトガンマデルタＴ細胞と混合したＴＨＰ−１腫瘍細胞株の比溶解パーセントを示す。
【００３１】
【図７】図７は、（Ａ）本明細書中に記載する様々なｓｈＲＮＡ構築物に応答した、ヒトＣＤ４７のｍＲＮＡの相対発現レベル、（Ｂ）レンチウイルスで送達されたｍｉＲに基づくＲＮＡ干渉がＣＤ４７の発現を阻害することを示す。
【００３２】
【図８】図８は、（Ａ）本明細書中に記載する様々なｓｈＲＮＡ構築物に応答した、ヒトｃＭｙｃの相対発現レベル、および（Ｂ）レンチウイルスで送達されたｍｉＲに基づくＲＮＡ干渉がｃＭｙｃの発現を阻害することを示す。
【００３３】
【図９】図９は、本明細書中の実施例６において使用したＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ標的化配列をコードするレンチウイルスベクターの線形マップを示す。
【００３４】
【図１０】図１０は、本明細書中に記載するＬＶ−ｓｈＦＤＰＳまたは対照ＬＶを用いて形質導入したＰＣ３細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対するゾレドロン酸処置の効果を示す。（Ａ）は８日目の写真データを示し、（Ｂ）は８日目の光子強度のデータを示し、（Ｃ）は２２日目の写真データを示し、（Ｄ）は２２日目の光子強度のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
開示の概要
本開示は、治療ベクター、および細胞へのその送達に関する。実施形態では、治療ベクターは、１つより多くのｍＲＮＡ標的を標的化する。実施形態では、治療ベクターは、ＦＤＰＳを標的化することによりこの酵素の発現レベルを低下させる、短鎖相同ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのスモールＲＮＡを備えている。治療ベクターとしては、レンチウイルスベクターが挙げられる。本開示は、アミノビスホスホネート薬物での処置と組み合わせたＦＤＰＳの標的化により、がんを効果的に処置し得ることを実証する。
【００３６】
定義および解釈
本明細書中で別様に定義しない限り、本開示との関連で使用する科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上別様に要求されない限り、単数の語は複数を包含し、複数の語は単数を包含する。一般に、本明細書中に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用する学術用語およびそれらの技術は周知であり、当該技術分野において一般に使用されている。本開示の方法および技術は、別段の記載がなければ、当該技術分野において周知の、本明細書全体で引用し議論する様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載される従来の方法にしたがって一般に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００３年）を参照。あらゆる酵素反応または精製技術は、当該技術分野において一般に遂行されるように、または本明細書中に記載するように、製造業者の仕様にしたがって行われる。本明細書中に記載する分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学との関連で使用する学術用語、ならびに実験の手順および技術は、当該技術分野において周知であり一般に使用されるものである。
【００３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は交換可能に使用し、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数形も包含すること、およびそれぞれの意味の範囲内に包含されることを意図する。また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、挙げた項目の１つまたは複数のあらゆる全ての可能な組み合わせ、ならびに、選択肢（「または」）として解釈する場合には組み合わせないことを指し、およびこれらを包含する。
【００３８】
例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量といった、範囲などの数値による全ての指定は、０．１の増分で（＋）または（−）に変動する近似値である。必ずしも明示的には述べないが、数値による全ての指定には「約」という用語が先行することを理解するべきである。「約」という用語は、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ−０．１」などの「Ｘ」の小さな増分に加えて、「Ｘ」という正確な値も包含する。必ずしも明示的には述べないが、本明細書中に記載する試薬は単に例示的なものであり、そのようなものの同等物が当該技術分野で公知であることも理解するべきである。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、また、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。使用されている文脈を考慮すると当業者に明確でない用語が使用されている場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００４０】
活性剤の「投与」または活性剤を「投与する」という用語は、処置を必要とする被験体に対して活性剤を、治療的に有用な形態かつ治療有効量でその個体の体内に導入できる形態で与えることを意味すると理解するべきである。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「組み合わせベクター」という用語は、１つより多くのｍＲＮＡを標的化する治療ベクターを意味する。例えば、２つの異なるｍＲＮＡを対象とする２つのｓｈＲＮＡまたは２つのｍｉＲＮＡを含有する治療ベクターは、「組み合わせベクター」と称され得る。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「含む」という用語は、組成物および方法が、記載した要素を含むが、他のものを除外しない意味であることを意図する。組成物および方法を定義するために使用する場合、「から本質的になる」は、組成物または方法に対して何らかの本質的な重要性を持つその他の要素を除外することを意味する。「からなる」は、特許請求される組成物および実体的な方法ステップにとって軽微ではないその他の成分の要素を除外することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。したがって、方法および組成物は、追加のステップおよび成分を含み得るか（含む）、あるいは重要でないステップおよび組成物を含むか（から本質的になる）、あるいは記載した方法ステップまたは組成物のみを意図する（からなる）ことが意図される。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「発現」、「発現される」、または「コードする」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程をいう。発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシング、または転写後修飾もしくは翻訳後修飾というその他の形態を包含し得る。
【００４４】
「ファルネシル二リン酸合成酵素」という用語は、本明細書中でＦＤＰＳとも称され得、また、本明細書中でファルネシルピロリン酸合成酵素またはＦＰＰＳとも称され得る。
【００４５】
「ガンマデルタＴ細胞」という用語は、本明細書中でγδＴ細胞とも称され得、またはさらにＧＤＴ細胞とも称され得る。「ガンマデルタＴ細胞活性化」という用語は、活性化されているガンマデルタＴ細胞の代表的な、そのようなＴ細胞と関連する任意の測定可能な生物学的現象を指す。そのような生物学的現象の非限定的な例としては、サイトカイン産生の増加、細胞表面タンパク質の質的または量的な組成の変化、Ｔ細胞増殖の増加、および／または、標的細胞を殺傷するもしくは別のエフェクター細胞が標的細胞を殺傷するのを援助するなどのＴ細胞エフェクター機能の増加が挙げられる。標的細胞は、がん細胞であり得る。
【００４６】
「個体」、「被験体」、および「患者」という用語は本明細書中では交換可能に使用され、任意の個体である哺乳動物被験体（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒト）を指す。
【００４７】
「ＬＶ」という用語は一般に「レンチウイルス」を指す。一例として、「ＬＶ−ｓｈＦＤＰＳ」への言及は、ＦＤＰＳを標的化するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスへの言及である。
【００４８】
「ｍｉＲＮＡ」という用語はマイクロＲＮＡを指し、本明細書中で「ｍｉＲ」とも称され得る。
【００４９】
「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現するために使用できる任意の細胞株を指す。
【００５０】
２つまたはそれより多くの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一性パーセント」という用語は、下記する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能なその他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査によって測定されるように、最大の一致のために比較およびアラインメントした時に同一となるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を特定のパーセンテージで有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較されている配列の一領域にわたり（例えば、機能ドメインにわたり）存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較のために、通常は１つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列の役目を持つ。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、必要であれば配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００５１】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、または目視検査（一般には後述のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）によって実行することができる。
【００５２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公開されている。
【００５３】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。また、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁、（１９８９年））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティーとして１２、およびギャップペナルティーとして４を使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。
【００５４】
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示中に提供される核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝１００、ワード長＝１２で用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝５０、ワード長＝３で用いて行うことができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される」とは、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合うように、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を起こすことなくヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液との接触に使用するために好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを指す、およびそれらを包含する。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６巻：１〜１９頁を参照）。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」という用語は、「配列ＩＤ番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ  Ｎｏ．）」という用語と同義である。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「スモールＲＮＡ」とは、一般に約２００ヌクレオチドまたはそれ未満の長さの、サイレンシング機能または干渉機能を持つノンコーディングＲＮＡをいう。その他の実施形態では、スモールＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１５０ヌクレオチドまたはそれ未満、約１２５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１００ヌクレオチドまたはそれ未満、あるいは約７５ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである。そのようなＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。本開示の「スモールＲＮＡ」は、一般に、標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊を生じさせる経路を通じて、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害することまたはノックダウンすることができるべきである。
【００５９】
「治療有効量」という用語は、所与の病気、傷害、疾患、または状態に罹患した患者に見られる症状、進行、または合併症の発症を処置し、または防止するために好適な組成物中および好適な剤形中の本開示の活性剤の十分な量を指す。治療有効量は、患者の状態の状況またはその重篤度、および処置される被験体の年齢、体重などに応じて変化する。治療有効量は、例えば、投与経路、被験体の状態などのいくつかの要因、ならびに当業者によって理解されるその他の要因のいずれかに応じて変化し得る。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「治療ベクター」という用語には、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターへの言及が非限定的に包含される。さらに、レンチウイルスベクター系に関して本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、「プラスミド」という用語と同義である。例えば、２ベクターおよび３ベクターのパッケージング系を含む３ベクター系および４ベクター系は、３プラスミド系および４プラスミド系とも称され得る。
【００６１】
「処置」は、疾患状態を標的化し、それと戦うこと、すなわち、疾患状態を改善し、または予防することを意図する。よって、特定の処置は、標的化される疾患状態、ならびに医薬療法および治療アプローチの現在または将来の状況に依存する。処置は、関連する毒性を有し得る。
【００６２】
「処置」または「処置すること」という用語は、一般に、処置されている被験体の自然経過を変えようとする介入を指し、予防のため、または臨床病理の経過の間に行われ得る。望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の抑制、減少、または阻害、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善の惹起が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本開示の態様および実施形態の説明
本開示の一態様では、治療カーゴ部分を含むウイルスベクターが開示される。治療カーゴ部分は、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含み、少なくとも１つの相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、治療カーゴ部分は、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第２のスモールＲＮＡ配列をさらに含み得、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、治療カーゴ部分は、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み得、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。スモールＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
【００６４】
別の態様では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、または４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、または４から選択される。
【００６５】
別の態様では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性を有する配列を含む。実施形態では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００６６】
別の態様では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性を有する配列を含む。実施形態では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００６７】
別の態様では、治療カーゴ部分を含むウイルスベクターが開示される。治療カーゴ部分は、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含み、少なくとも１つの相補的ｍＲＮＡ配列は、ＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、治療カーゴ部分は、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第２のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、治療カーゴ部分は、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００６８】
別の態様では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、または９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、配列番号５、６、７、８、または９から選択される。
【００６９】
別の態様では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、第２のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００７０】
別の態様では、第３のスモールＲＮＡは、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号１０、１１、１２、１３、もしくは１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性を有する配列を含む。実施形態では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００７１】
別の態様では、治療カーゴ部分を含むウイルスベクターが開示される。治療カーゴ部分は、第１の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第１のスモールＲＮＡ配列、および第２の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる少なくとも１つの追加のスモールＲＮＡ配列を含み、第１の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ｃＭｙｃのｍＲＮＡ配列を含み、第２の予め定められた相補的配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を含む。
【００７２】
別の態様では、治療カーゴ部分は、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合することができる第３のスモールＲＮＡ配列をさらに含み、第３の予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＦＤＰＳのｍＲＮＡ配列またはＣＤ４７のｍＲＮＡ配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００７３】
別の態様では、第１のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４を含むｃＭｙｃのスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性を有する配列を含む。実施形態では、第１のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。
【００７４】
別の態様では、少なくとも１つの追加のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、少なくとも１つの追加のスモールＲＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９から選択される。
【００７５】
別の態様では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、もしくは４を含むＦＤＰＳのスモールＲＮＡ配列または配列番号５、６、７、８、もしくは９を含むＣＤ４７のスモールＲＮＡ配列と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性を有する配列を含む。実施形態では、第３のスモールＲＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、または９から選択される。
【００７６】
別の態様では、本明細書中で言及するスモールＲＮＡ配列は、ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５３）、ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃２（配列番号５４）、ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃３（配列番号５５）、ｍｉＲ１５５  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５６）、ｍｉＲ２１  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５７）、ｍｉＲ１８５  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５８）、ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７配列＃１（配列番号８２；ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃２（配列番号６６）、ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃３（配列番号６７）、ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃４（配列番号６８）、ｍｉＲ２１  ｃＭｙｃ配列（配列番号８３）、またはｍｉＲ１５５  ｃＭｙｃ配列（配列番号７０）などの本明細書中で詳述されるｍｉＲＮＡ配列のいずれかと少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、またはそれより高い同一性を有する配列を含み得る。
【００７７】
実施形態では、スモールＲＮＡ配列は、ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５３）、ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃２（配列番号５４）、ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃３（配列番号５５）、ｍｉＲ１５５  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５６）、ｍｉＲ２１  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５７）、ｍｉＲ１８５  ＦＤＰＳ配列＃１（配列番号５８）、ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７配列＃１（配列番号８２；ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃２（配列番号６６）、ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃３（配列番号６７）、ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃４（配列番号６８）、ｍｉＲ２１  ｃＭｙｃ配列（配列番号８３）、またはｍｉＲ１５５  ｃＭｙｃ配列（配列番号７０）などの本明細書中で詳述するｍｉＲＮＡ配列のいずれかを含み得る。
【００７８】
別の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。本開示の別の態様では、標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および本明細書中に記載するウイルスベクターを含む。実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。
【００７９】
別の態様では、本明細書中に記載するレンチウイルス粒子、およびアミノビスホスホネート薬物を含む組成物が開示される。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。
【００８０】
本開示の別の態様では、被験体におけるがんを処置する方法が開示される。方法は、本明細書中に詳述する治療有効量の組成物を被験体に投与することを含む。
【００８１】
別の態様では、被験体におけるがんを処置する方法が開示される。方法は、本明細書中に詳述する治療有効量のレンチウイルス粒子、および治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を被験体に投与することを含む。実施形態では、上記のステップは、同時に実行される。実施形態では、規定された長さの期間が、上記のステップの間に経過する。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。実施形態では、治療有効量のレンチウイルス粒子は、複数の単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態では、治療有効量のアミノビスホスホネート薬物は、単回用量のアミノビスホスホネート薬物を含む。
【００８２】
本発明のさらなる態様は、がんの処置用の複数遺伝子標的化ベクターの開発を記載し、非限定的な例としては、これは肝細胞癌（「ＨＣＣ」）の処置用である。これらのベクターは、ＨＣＣの療法に関する３つの懸念に対処する。第一に、治療ベクターは、ｃＭｙｃがん遺伝子タンパク質の発現を低下させるための阻害性ＲＮＡ構築物を含み得る。ｃＭｙｃがん遺伝子タンパク質は、腫瘍形成、腫瘍成長、および免疫回避に関与する。治療ベクターは、ただ１つよりも多くの、ｃＭｙｃの発現を低下させるための阻害性ＲＮＡ構築物を含み得る。例えば、実施形態では、ｃＭｙｃがベクターの標的である場合の組み合わせベクターが具体的に想定されている。第二に、（例えば、阻害性ＲＮＡ構築物を通じて）ファルネシル二リン酸合成酵素（「ＦＤＰＳ」）の発現を低下させるためのベクターを開発した。ＦＤＰＳのレベルを低下させることにより、腫瘍細胞は、例えば、ガンマデルタＴ細胞を刺激するように改変される。これらのガンマデルタＴ細胞は、腫瘍細胞の細胞傷害性殺傷が可能である。第三に、（例えば、阻害性ＲＮＡ構築物を通じて）少なくとも１つのその他の遺伝子産物の発現を低下させるためのベクターを開発した。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのその他の遺伝子産物は、免疫チェックポイント調節因子であり得る。免疫チェックポイント調節因子の例としては、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ガラクトシダーゼ結合性可溶性レクチン９（ＬＧＡＬＳ９Ａ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＨＶＥＭ）、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害因子１（Ｂ７−Ｈ４）、ＣＤ２７６分子（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ８０分子（ＣＤ２８ＬＧ１）、およびＣＤ８６分子（ＣＤ２８ＬＧ２）が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、ＰＤ−Ｌ１である。ｃＭｙｃはＰＤ−Ｌ１の発現、および腫瘍細胞中で発現されるＣＤ４７などのその他の免疫回避遺伝子の発現の正の調節因子であるので、ｃＭｙｃ発現を低下させることにより、結果的にＰＤ−Ｌ１のレベルは減少する。ＣＤ４７のレベルを減少させることにより、腫瘍細胞食作用は増加し、抗原提示細胞上の腫瘍抗原の交差提示を通じてＴ細胞応答の向上に繋がる。ＰＤ−Ｌ１および潜在的にその他の免疫チェックポイント阻害分子を減少させることにより、ガンマデルタＴ細胞の刺激などのＴ細胞の免疫刺激の効率は向上され得る。ｃＭｙｃはＰＤ−Ｌ１レベルを調節するが、ＰＤ−Ｌ１またはその他の免疫チェックポイント調節因子を特異的に対象とするｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを生成することにより、本明細書中に記載する治療ベクターを使用してＰＤ−Ｌ１またはその他の免疫チェックポイント調節因子を直接的に標的化することができる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのその他の遺伝子産物は、食作用に影響を及ぼす遺伝子産物であり得る。例えば、食作用に影響を及ぼす少なくとも１つのその他の遺伝子産物は、ＣＤ４７であり得る。ＣＤ４７の発現を低下させることにより、マクロファージの腫瘍細胞食作用への障害が取り除かれる。これら２つの機構が組み合わさって、ＨＣＣの処置または除去に必要とされる獲得免疫または自然免疫の効率および活性を増加させる。
【００８４】
本明細書中に開示する組み合わせベクターは、ＲＮＡプロセシング系の要件に最もよく合致する正しいプロモーターが選択されるように最適化される。さらに、治療カーゴ部分は、ｍｉＲＮＡ（複数可）がクラスターとなり、第１のｍｉＲＮＡのプロセシングが第２のｍｉＲＮＡのプロセシングを促進するなどとなるように設計されている。ｍｉＲＮＡの順序は、プロセシングの忠実度および関連する速度を向上させることによって、レンチウイルス粒子中へのパッケージング用のゲノムＲＮＡがプロセシングされてレンチウイルスの製造効率を低下させるほどにはプロセシングが急速でないことを確実にするために重要であり得る。さらに、組み合わせベクターは、治療カーゴ部分が、別個のプロモーターの制御下にある複数のｓｈＲＮＡを含むように設計され得る。
【００８５】
がん
本明細書中に提供する組成物および方法は、がんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞であり得、がん性組織であり得、がん性組織を有し得、あるいは疾患または状態を発症していると診断されたまたはそのリスクがある被験体または患者であり得る。ある特定の態様では、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、グリア細胞、間質細胞、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、脳細胞、神経細胞、血液細胞、子宮内膜細胞、髄膜細胞、食道細胞、肺細胞、心臓血管細胞、肝細胞、リンパ細胞、乳房細胞、骨細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、結腸細胞、前立腺細胞、子宮細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、脾臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、または横紋筋細胞を含み得るが、これらに限定されない。他のさらなる態様では、がんとしては、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、胚芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、骨髄性白血病、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽腔癌、神経芽腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、シュワン細胞腫（Ｓｃｈｗａｎｏｍｍａ）、小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書中に提供する組成物および方法は、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、小児悪性疾患、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって惹起または助長される子宮頸部およびその他の腫瘍、黒色腫、バレット食道（前悪性症候群）、副腎がん、および皮膚がん、ならびに自己免疫疾患、腫瘍性皮膚疾患を処置するためにも使用される。
【００８７】
治療ベクター
治療ベクターは、以下に限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどの公知のトランスフェクションベクターおよび／または形質導入ベクター、タンパク質および／または脂質複合体、リポソーム、ミセルなどを介して送達され得る。
【００８８】
ウイルスベクターは、本開示の方法のために有用な細胞種（すなわち、腫瘍細胞または骨髄性細胞）に優先的に標的化され得る。ウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ−宿主細胞受容体の特異的相互作用およびウイルスの遺伝子発現機構によって標的細胞中に遺伝子を形質導入するために使用され得る。結果として、ウイルスベクターは、全胚、受精卵、単離された組織試料、ｉｎ  ｓｉｔｕの組織標的、および培養細胞株などの多くの異なる細胞種中に遺伝子を導入するためのビヒクルとして使用されている。細胞中に外来遺伝子を導入し、発現させる能力は、遺伝子発現の研究および細胞系列の解明、ならびに遺伝子療法などの治療的介入の可能性の提供、人工多能性幹細胞の体細胞再プログラミング、および様々な種類の免疫療法において有用である。パポーバウイルス科（例えば、ウシパピローマウイルスまたはＢＰＶ）、またはヘルペスウイルス科（例えば、エプスタインバーウイルスまたはＥＢＶ）、またはヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＨＢＶ）、またはワクシニアなどのポックスベクターのようなウイルス由来のウイルス構成成分は、本開示のベクターにおいて使用され得る。
【００８９】
本開示はレンチウイルスベクターに特に限定されるものではないが、レンチウイルスベクターは、本開示の組成物および方法にとって好ましい種類のベクターである。レンチウイルスは、有意な量のウイルス核酸を宿主細胞中に送達できるウイルスの属である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染し／それに形質導入する独特の能力を有するものとして特徴付けられ、形質導入後にレンチウイルスはその核酸を宿主細胞の染色体中に組み込む。
【００９０】
感染性レンチウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖという毒性タンパク質をコードする３つの主要遺伝子、ならびにｔａｔおよびｒｅｖを含む２つの調節遺伝子を有する。特定の血清型およびウイルスに応じて、ウイルス核酸の調節、合成、および／またはプロセシング、ならびにその他の複製機能に関与するタンパク質をコードする追加のアクセサリー遺伝子が存在し得る。
【００９１】
さらには、レンチウイルスは、末端反復配列（ＬＴＲ）領域を含有し、これは約６００ｎｔの長さであり得る。ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域に分けられ得る。ＬＴＲは、インテグラーゼの作用を介して宿主染色体中へのレトロウイルスＤＮＡの組込みを媒介し得る。あるいは、インテグラーゼの機能なしに、ＬＴＲは、ウイルス核酸を環状化するために使用され得る。
【００９２】
レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質としては、逆転写酵素およびインテグラーゼが挙げられる。逆転写酵素は、ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、相補的ＤＮＡコピーの合成のための鋳型としてウイルスＲＮＡゲノムを使用する。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型の破壊のためにＲＮａｓｅＨ活性も有する。インテグラーゼは、逆転写酵素によって生成されたウイルスｃＤＮＡおよび宿主ＤＮＡの両方に結合する。インテグラーゼは、宿主ＤＮＡ中にウイルスゲノムを挿入する前にＬＴＲをプロセシングする。Ｔａｔは、転写の際に開始および伸長を増進するトランス活性化因子として働く。ｒｅｖ応答エレメントは転写後に働き、ｍＲＮＡのスプライシングおよび細胞質への輸送を調節する。
【００９３】
ウイルスベクターは、一般に糖タンパク質を含み、様々な糖タンパク質は、特異的親和性を提供し得る。例えば、ＶＳＶＧペプチドは、骨髄細胞中へのトランスフェクションを増加させ得る。あるいは、ウイルスベクターは、その殻ペプチドに取り付けられた、抗体などの標的化部分も有し得る。標的化抗体は、例えば、ＨＥＲ−２、ＰＳＡ、ＣＥＡ、Ｍ２−ＰＫ、およびＣＡ１９−９のような腫瘍で過剰発現される抗原に特異的であり得る。ウイルスベクターのその他の特異性もまた当該技術分野で公知であり、特定の細胞集団を標的化するために使用され得る。例えば、ポックスウイルスベクターは、マクロファージおよび樹状細胞を標的化する。
【００９４】
本明細書中で詳述する治療ベクターに関して、本開示の態様では、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、単一のプロモーターの制御下にある。実施形態では、複数のｍｉＲＮＡが同一の治療ベクター中に存在する場合、ｍｉＲＮＡは、単一のプロモーター（例えば、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター）の制御下にある。実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターは、ＥＦ１−アルファプロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。
【００９５】
実施形態では、複数のｓｈＲＮＡが同一の治療ベクター中に存在する場合、ｓｈＲＮＡは、複数のプロモーターの制御下にある。例えば、第１のｓｈＲＮＡは第１のプロモーターの制御下にあり、第２のｓｈＲＮＡは第２のプロモーターの制御下にあり、第３のｓｈＲＮＡは第３のプロモーターの制御下にあるなどである。非限定的な実施形態では、プロモーターは、Ｈ１（配列番号１５）、Ｕ６（配列番号１６）、または７ＳＫ（配列番号１７）から選択され得る。
【００９６】
図３Ｃに示すように、治療ベクターの非限定的な例は、ｃＭｙｃ、ＦＤＰＳ、およびＣＤ４７のｍＲＮＡを標的化する３つのｍｉＲＮＡの治療カーゴを含む。本明細書中の表１に示す通り、治療ベクターが組み合わせベクターとなるように、１つから３つのｍｉＲＮＡ配列の交互の組み合わせを治療ベクターの最終形態において使用することができる。１つから３つのｍｉＲＮＡ配列の組み合わせが最終的な治療ベクターにおいて使用され得るが、４つまでの、５つまでの、または６つまでの、または７つまでの、または８つまでの、またはそれより多くのｍｉＲＮＡ配列が最終的な治療ベクターにおいて使用され得ることが具体的に想定される。さらに、ｍｉＲＮＡ配列は、順次にまたは無作為に並べられ得る（すなわち、第１のｍｉＲＮＡは第２のｍｉＲＮＡに先行する必要はないなど）。選択した組み合わせに加えて、センス鎖の５’末端から３’末端への全ての可能なｍｉＲＮＡの順序がこれらのレンチウイルスベクターのために利用され得る。ベクター構成成分は、ｍｉＲＮＡの各組み合わせのために繰り返されない。ｍｉＲＮＡを含有するベクターの開発において、最初に目的の遺伝子用のｓｈＲＮＡを使用して、目的の遺伝子がレンチウイルス構築物中で機能することを証明し、そしてその後、ｓｈＲＮＡが機能することが証明されたら（以下に記載）、例えば本願の図３Ｃに示すように、ｍｉＲＮＡクラスターに組み立てる。ｍｉＲＮＡは標的化配列を保存するが、ｍｉＲＮＡプロセシング経路によりよく適するための全体構造の変化を有する。
【表１】
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【００９７】
組み合わせベクターは、ｓｈＲＮＡを使用して生成することもできる。しかしながら、これらの状況では、本明細書中に記載するように、各標的配列用に別個のプロモーターを利用する必要がある。
【００９８】
レンチウイルスベクター系
レンチウイルスのビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。プロモーターに作動可能に連結された、逆転写および組込みに必要なレンチウイルスのｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する少なくとも１つのベクターがある。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。プロモーターに作動可能に連結された、ウイルスカプシドを形成するために必要なレンチウイルスのｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターもある。一実施形態では、このｇａｇの核酸配列は、ｐｏｌの核酸配列の少なくとも一部とは別のベクター上にある。別の実施形態では、ｇａｇの核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌの核酸配列とは別のベクター上にある。
【００９９】
野生型復帰変異体を得る機会をさらに最小化するための粒子の作製に使用される多数の改変を、ベクターに対して行うことができる。これらとしては、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔの欠失、およびマトリックス（ＭＡ）の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と称される、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
【０１０１】
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別のベクターが使用される。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖの核酸配列は、レンチウイルスのエンベロープタンパク質をコードする。
【０１０２】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来のものではなく、異なるウイルスに由来する。生じる粒子は、シュードタイプ化粒子と称される。エンベロープの適切な選択により、実質的にあらゆる細胞に「感染」することができる。例えば、エンドサイトーシス区画を標的化するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができ、これらは、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎または麻疹）、およびオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）などのものである。好ましく使用され得るその他のエンベロープとしては、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、およびＧＡＬＶなどのモロニー白血病ウイルス由来のものが挙げられる。これら後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。その他のエンベロープタンパク質は、所望の宿主細胞に応じて選択され得る。例えば、ドーパミン受容体などの特定の受容体の標的化は、脳への送達のために使用され得る。別の標的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスのエンベロープを使用して標的化され得る。例えば、転写後修飾によってＧＰとなるエボラのＧＰ、およびＧＰ２糖タンパク質である。別の実施形態では、シュードタイプ化エンベロープを有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶシュードタイプ化ベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。
【０１０３】
本明細書中に詳述するように、レンチウイルスベクター系は、通常、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子のそれぞれが個々のプラスミド上に提供されてもよいし、あるいは１つまたは複数の遺伝子が一緒に同一のプラスミド上に提供されてもよい。一実施形態では、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子は、同一のプラスミド上に提供される（例えば、図１）。別の実施形態では、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は第１のプラスミド上に提供され、ｒｅｖ遺伝子は第２のプラスミド上に提供される（例えば、図２）。したがって、３ベクター系および４ベクター系の両方が、本明細書中の実施例セクションおよびその他の箇所に記載するようなレンチウイルスを製造するために使用され得る。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子が最終的に生産される。
【０１０４】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書中に記載するレンチウイルスベクター、細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド、ならびにｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって生産され、レンチウイルス粒子は、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡによって標的化された遺伝子を阻害することができる。
【０１０５】
別の態様では、治療ベクターは、以下のエレメントを含み得る：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号７４〜７５）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号７６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号７７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号７８）、Ｈ１プロモーター（配列番号１５）、ＦＤＰＳのｓｈＲＮＡ（例えば、配列番号１、２、３、４、またはそのバリアント）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号７９）、および３’デルタＬＴＲ（配列番号８０）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【０１０６】
別の態様では、本明細書中に詳述するように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＡＧプロモーター（配列番号１９）、ＨＩＶ構成成分ｇａｇ（配列番号２１）、ＨＩＶ構成成分ｐｏｌ（配列番号２２）、ＨＩＶのＩｎｔ（配列番号２３）、ＨＩＶのＲＲＥ（配列番号２４）、およびＨＩＶのＲｅｖ（配列番号２５）。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を発現するための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現するための第２の別のプラスミドを含むように改変され得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【０１０７】
別の態様では、本明細書中に詳述するように、エンベローププラスミドは、左から右に以下のエレメントを含むように設計されている：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号２７）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号２９）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【０１０８】
別の態様では、レンチウイルスのパッケージングのために使用されるプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であり得る。例えば、以下のエレメントは、パッケージング系を構成するプラスミド中の類似のエレメントの代わりとなり得る：伸長因子−１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターの代わりとなり得る。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡの代わりとなり得る。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築され得る。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｆｏｗｌ  ｐｌａｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）由来の膜糖タンパク質で置換することができる。
【０１０９】
なお、レンチウイルスパッケージング系は市販のものを入手でき（例えば、Ｌｅｎｔｉ−ｖｐａｋ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、また本明細書中に記載するように設計することもできる。さらに、レンチウイルスパッケージング系の態様を置換または改変して、レンチウイルス粒子の生産効率などのいくつもの関連因子を向上させることは当業者の技術的範囲内である。
【０１１０】
用量および剤形
本開示のベクター組成物は、目的の遺伝子または配列の短期、中期、または長期の発現、ならびに本開示のベクターのエピソームの維持を可能とする。したがって、投薬レジメンは、処置されている状態および投与方法に基づいて変化し得る。
【０１１１】
実施形態では、ベクター組成物は、必要とする被験体に様々な用量で投与され得る。具体的には、被験体は、約１０６以上の感染用量（１標的細胞への形質導入に平均で１用量が必要）を投与され得る。より具体的には、被験体は、約１０７以上、約１０８以上、約１０９以上、または約１０１０以上の感染用量、あるいはこれらの値の間の任意の数の用量を投与され得る。投薬の上限は、特定のがん種などの各疾患適応症について決定され、各個々の製品および製品ロットの毒性／安全性プロファイルに依存する。
【０１１２】
さらに、本開示のベクター組成物は、１日に１回または２回、あるいは任意のその他の好適な期間で定期的に投与され得る。例えば、ベクター組成物は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎、９カ月毎、１年に１回、１８カ月毎、２年毎、３０カ月毎、または３年毎に、必要とする被験体に投与され得る。
【０１１３】
実施形態では、本開示のベクター組成物は、医薬組成物として投与される。実施形態では、医薬組成物は、多様な剤形に製剤化され得、これらの剤形としては、臨床適用のための経鼻、経肺、経口、局所、または非経口の剤形が挙げられるが、これらに限定されない。各剤形は、様々な可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤などの希釈剤、またはその他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。医薬組成物は、注射、ガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）、注入、または皮内曝露用にも製剤化され得る。例えば、注射製剤は、好適なｐＨおよび張度の水性または非水性の溶液中に本開示のベクターを含み得る。
【０１１４】
本開示のベクター組成物は、腫瘍部位中へのまたは感染部位における直接の注射を介して被験体に投与され得る。一部の実施形態では、ベクターは、全身投与され得る。一部の実施形態では、ベクター組成物は、腫瘍または感染の部位のすぐ周囲の組織へのガイドされたカニューレ挿入を介して投与され得る。
【０１１５】
本開示のベクター組成物は、例えば、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）投与、経肺投与、腟内投与、局所投与、局部投与、乱切後の局部投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースまたはゼラチンなどの半固体媒体中で、あるいは口腔内または経鼻噴霧製剤を介してなど、任意の薬学的に許容される方法を使用して投与され得る。
【０１１６】
さらに、本開示のベクター組成物は、例えば、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カプセル剤、液体分散物、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤などの任意の薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、制御放出製剤、徐放製剤、即時放出性製剤、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、医薬組成物は、経皮送達システムであり得る。
【０１１７】
実施形態では、医薬組成物は、経口投与用の固体剤形として製剤化され得、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、または丸剤であり得る。実施形態では、固体剤形は、例えば、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含み得る。加えて、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出形態または調節放出形態であり得る。調節放出剤形としては、制御放出または持続放出、腸管での放出などが挙げられる。調節放出剤形において使用される賦形剤は、当業者に一般に公知である。
【０１１８】
実施形態では、医薬組成物は、舌下剤形または口腔内剤形として製剤化され得る。そのような剤形は、舌下に投与される舌下錠または舌下溶液組成物、および頬と歯茎との間に置かれる口腔錠を含む。
【０１１９】
実施形態では、医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得る。そのような本発明の剤形としては、経鼻送達用の溶液組成物、懸濁物組成物、およびゲル組成物が挙げられる。
【０１２０】
実施形態では、医薬組成物は、懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤などの経口投与用の液体剤形として製剤化され得る。実施形態では、液体剤形は、水および液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、保湿剤、甘味剤、芳香剤、または防腐剤などの様々な賦形剤を含み得る。実施形態では、組成物は、小児患者への投与のために好適となるように製剤化され得る。
【０１２１】
実施形態では、医薬組成物は、滅菌水性液剤、懸濁剤、乳剤、非水性液剤、または坐剤などの非経口投与用剤形として製剤化され得る。実施形態では、液剤または懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルを含み得る。
【０１２２】
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および様式、排泄速度、ならびに疾患の重篤度に応じて変化し得る。
【０１２３】
実施形態では、がんの処置は、針を使用した腫瘍中への本開示のベクター構築物のガイド下の直接注射、または血管内カニューレ挿入によって達成される。実施形態では、ベクター組成物は、静脈もしくは動脈へのカニューレ挿入または注射、皮内送達、筋肉内送達、または疾患部位近くの排液臓器（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｏｒｇａｎ）中への注射によって、脳脊髄液、血液、またはリンパ循環中に投与される。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の態様の実例を挙げるために与えたものである。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載する特定の条件または詳細に限定されないことを理解するべきである。本明細書中で参照する全ての出版物は、参照することにより具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１２５】
（実施例１：レンチウイルスベクター系の開発）
図１に要約するように、レンチウイルスベクター系を開発した（環状形態）。治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡより購入）中でレンチウイルス粒子を生産した。２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞のトランスフェクションにより、機能的なウイルス粒子が生産された。このトランスフェクションには、プラスミドＤＮＡの取込み効率を増加させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を用いた。最初に、血清を含まない培養培地中にプラスミドおよびＤＮＡを３：１の比（ＤＮＡに対するＰＥＩの質量比）で別々に加えた。２〜３日後、細胞培地を回収し、高速遠心分離および／または濾過とその後の陰イオン交換クロマトグラフィーによってレンチウイルス粒子を精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ  ｐ２４レベルの測定（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子中に組み込まれる）、定量ＰＣＲによる形質導入された細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数の測定、または細胞の感染および光の使用（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）によって達成した。
【０１２６】
上記の通り、３ベクター系（すなわち、２ベクターのレンチウイルスパッケージング系を含む）をレンチウイルス粒子の生産用に設計した。３ベクター系の概略図を図１に示す。図１に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含む。図１の中央に見られるベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書中に記載する治療ベクターである。
【０１２７】
図１に関して、ヘルパープラスＲｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号１８）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１９）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２０）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２１）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２２）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２３）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２４）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１２８】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２７）、ベータグロビンイントロン（配列番号２８）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２９）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３０）を含む。
【０１２９】
ヘルパー（プラスＲｅｖ）プラスミドおよびエンベローププラスミドからなる２ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む３ベクター系の合成
【０１３０】
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４−３  ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  Ａｉｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）由来のＤＮＡ断片の初期ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に挿入するために使用され得るＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーを設計した。フォワードプライマーは（５’−ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号３１）であり、リバースプライマーは（５’−ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号３２）であった。
【０１３１】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼの断片の配列は以下の通りであった：
【化１】
2019508045.tif 000004
【化２】
2019508045.tif 000005
【０１３２】
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位と共にＲｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡの配列を含有するＤＮＡ断片は、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化３】
2019508045.tif 000006
【０１３３】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターをＣＡＧエンハンサー／プロモータープラスニワトリベータアクチンイントロン配列で置換した。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位と共にＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片は、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化４】
2019508045.tif 000007
【０１３４】
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列は、隣接ＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを使用するシークエンシングによって正しい配向であることを決定した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化５】
2019508045.tif 000008
【０１３５】
本明細書中に記載する方法および材料を使用して、３ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む４ベクター系も設計し、生産した。４ベクター系の概略図を図２に示す。図２に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含まない。上から２つ目のベクターは別個のＲｅｖプラスミドである。下から２つ目のベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書中に記載する治療ベクターである。
【０１３６】
図２に関して、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号１８）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１９）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２０）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２１）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２２）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２３）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２４）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１３７】
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号８０）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１３８】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２７）、ベータグロビンイントロン（配列番号２８）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２９）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３０）を含む。
【０１３９】
ヘルパープラスミド、Ｒｅｖプラスミド、およびエンベローププラスミドからなる３ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む４ベクター系の合成
【０１４０】
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。この配列は、隣接ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いてＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列をヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りである：
【化６】
2019508045.tif 000009
【０１４１】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列は、隣接ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって単一のＤＮＡ断片として合成された。次いで、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターで置換されたＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位において、ＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化７】
2019508045.tif 000010
【０１４２】
パッケージング系において使用されるプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であり得る。例えば、以下のエレメントは、パッケージング系中の類似のエレメントの代わりとなり得る：
【０１４３】
プロモーター：伸長因子−１（ＥＦ−１）（配列番号３７）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号３８）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号３９）は、ＣＭＶプロモーター（配列番号２７）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１９）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１４４】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号４０）およびｂＧＨポリＡ（配列番号４１）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１４５】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築することができる。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号２１）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２２）、およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２３）を、本明細書中に概説したように、ヘルパー／ヘルパープラスＲｅｖプラスミド中に含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１４６】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号４２）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号４３）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号４４）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号４５）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号４６）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号４７）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号８１）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号４８）由来の膜糖タンパク質と置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書中の配列部分として特定される。さらに、これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１４７】
要約すると、３ベクター系と４ベクター系とを以下の通りに比較および対比することができる。３ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および３．治療ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’δ  ＬＴＲ。４ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および４．治療ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲ。上記エレメントと対応する配列は、本明細書中の配列表の部分として特定される。
【０１４８】
（実施例２．治療ベクター）
例えば図３に示すように、例示的な治療ベクターを設計し、開発した。
【０１４９】
最初に図３Ａに関して、左から右に、鍵となる遺伝子エレメントは以下の通りである：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、Ｈ１プロモーター、本明細書中で詳述するＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列を含むＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびＵ３領域に欠失を有するＬＴＲ。
【０１５０】
次に図３Ｂに関して、左から右に、鍵となる遺伝子エレメントは以下の通りである：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、ＥＦ−１アルファ（遺伝子転写のＥＦ−１アルファプロモーター）、本明細書中で詳述するＦＤＰＳ  ｍｉＲＮＡ配列を含むＦＤＰＳ  ｍｉＲ（ｍｉＲＮＡ）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびＵ３領域に欠失を有するＬＴＲ。
【０１５１】
図３Ａおよび図３Ｂに概説するベクターを生産するために、以下の方法および材料を用いた。
【０１５２】
阻害性ＲＮＡの設計：ホモサピエンスファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００２００４．３）を使用して、ヒト細胞においてＦＤＰＳレベルをノックダウンするための潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが主催するＧＰＰ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）などのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって選択された候補から潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＨ１（配列番号１５）のすぐ３’側において、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞への形質導入を行い、特定のｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルの低下のために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込むことで、ＥＦ−１アルファまたはＣＭＶ  ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能とした。マイクロＲＮＡ骨格はｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇから選択した。ＲＮＡ配列を合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターを使用せずに細胞内に直接導入した。
【０１５３】
ベクターの構築：ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡのため、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温へと冷却しながらアニーリングさせた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴに混合し（３：１の比）、アニーリングおよびライゲートさせた。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショック後に形質転換を達成した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物抵抗性コロニー（アンピシリン抵抗性プラスミドの存在を指し示す）を回収し、ＬＢ培地中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用されるプロモーター用の特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。以下の標的配列を使用して、ＦＤＰＳをノックダウンするための例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した：
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴ（ＦＤＰＳ標的配列；配列番号４９）；
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列＃１；配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴ（ＦＤＰＳ標的配列＃２；配列番号５０）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列＃２；配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴ（ＦＤＰＳ標的配列＃３；配列番号５１）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列＃３；配列番号３）；
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴ（ＦＤＰＳ標的配列＃４；配列番号５２）；および
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列＃４；配列番号４）。
【０１５４】
次いで、ｓｈＲＮＡ配列を、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下にある合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に組み立てた。簡潔に述べれば、以下に詳述するようなｍｉＲ３０、ｍｉＲ２１、またはｍｉＲ１８５などのｍｉＲヘアピン配列をｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇから得た。１９〜２２ｍｅｒのｓｈＲＮＡ標的配列を使用して、合成ｍｉＲ配列を構築した。ｍｉＲ配列をアンチセンス−標的配列−ヘアピンループ配列（各マイクロＲＮＡに特異的）−センス標的配列と並べた。
【０１５５】
以下のｍｉＲ配列を開発した：
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃１；配列番号５３）
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃２；配列番号５４）
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ（ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃３；配列番号５５）
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（ｍｉＲ１５５  ＦＤＰＳ配列＃１；配列番号５６）
ＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡ（ｍｉＲ２１  ＦＤＰＳ配列＃１；配列番号５７）
ＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＧＡＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧ（ｍｉＲ１８５  ＦＤＰＳ配列＃１；配列番号５８）
【０１５６】
図３Ｃに一般に示すような組み合わせベクターは、上記に概説した単一標的ベクターの開発に基づいても生産することができる。例示的な治療的組み合わせベクターを図３Ｃに示し、これは左から右に以下のものを含む：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、ＥＦ−１アルファ（遺伝子転写のＥＦ−１アルファプロモーター）、ｍｉＲ３０−ＦＤＰＳ、ｍｉＲ１５５−ＣＤ４７、ｍｉＲ２１−ｃＭｙｃ、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびＵ３領域に欠失を有するＬＴＲ。図３Ｃに詳述する治療ベクターは、以下の標的配列を使用し、記載する材料および方法を使用して生産することができる：
ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃１：
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号５３）
ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃１：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（配列番号８２）
ｍｉＲ２１  ｃＭｙｃ配列：
ＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡ（配列番号８３）
【０１５７】
（実施例３．ＦＤＰＳ用の材料および方法）
阻害性ＲＮＡの設計：ホモサピエンスファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）転写物バリアント１のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００２００４．３）を使用して、ヒト細胞においてＦＤＰＳレベルをノックダウンするための潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのもの、またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ  ＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって選択された候補から潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの後ろにおいて、ｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入し得る。また、ＲＮＡ配列をマイクロＲＮＡ骨格内に埋め込んで、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによる発現を可能とし得る。ＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターとは独立して利用してもよい。
【０１５８】
ベクターの構築：ＦＤＰＳのｓｈＲＮＡのため、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列は、ＭＷＧ  ｏｐｅｒｏｎによって合成された。７０℃でのインキュベートおよび室温への冷却によって、オリゴヌクレオチド配列をアニーリングさせた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを消化した後、７０℃で２０分間、酵素を熱不活化させた。並行して、３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴ配列に３：１の挿入物対ベクター比でライゲートした。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショックによって形質転換を実行した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を塗り付けた後、コロニーをＬＢ培地中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するためにあらゆるプロモーターが使用される特異的プライマーを使用して、ＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、正しいＦＤＰＳ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ＦＤＰＳをノックダウンする能力を試験するためにレンチウイルス粒子をパッケージングした。ポリブレンの存在下または非存在下のいずれかで、レンチウイルス粒子を用いて哺乳動物細胞への形質導入を行った。２〜４日後に細胞を回収し、ＦＤＰＳの発現についてタンパク質およびＲＮＡを分析した。
【０１５９】
ｍＲＮＡの低下についての機能アッセイ：ＦＤＰＳの発現に対する異なるＦＤＰＳ短鎖相同ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）標的化配列の効果をｍＲＮＡ発現の測定によって決定した。ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクターを用いて、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞への形質導入を行った。４８時間後、細胞を溶解し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを抽出した。次いで、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯを使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｔｅｐＯｎｅ  ＰＣＲ装置を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによって試料を分析した。ポリメラーゼ連鎖反応の分析用の標準的な条件でフォワードプライマー（５’−ＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号５９）およびリバースプライマー（５’−ＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡ−３’）（配列番号６０）を使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いてＦＤＰＳの発現を検出した。ポリメラーゼ連鎖反応の分析用の標準的な条件でフォワードプライマー（５’−ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’）（配列番号６１）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号６２）を使用して、ベータアクチン遺伝子発現についてのｍＲＮＡに対して試料を正規化した。各試料のアクチンレベルに対して正規化したＣｔ値によって、ＦＤＰＳの相対発現を決定した。
【０１６０】
ＬＶ−ＦＤＰＳによって改変され、かつヒトガンマデルタＴ細胞におけるサイトカイン産生を活性化させるために使用される腫瘍細胞の機能アッセイ：ＬＶ−ＦＤＰＳベクターも使用して腫瘍細胞を処理し、次いでそれを健常ドナー由来の初代ヒトガンマデルタＴ細胞に曝露した。アミノビスホスホネート、およびファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）を抑制するベクターの両方を用いた腫瘍細胞株の組み合わせ処理は、ガンマデルタＴ細胞のＴＮＦ−アルファ産生に対して相乗効果を有する。ＴＨＰ１単球様腫瘍細胞株（Ａ）またはＨｅｐＧ２単球様腫瘍細胞株（Ｂ）をレンチウイルス対照ベクター（ＬＶ対照）、ＦＤＰＳを下方調節するためのｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＦＤＰＳ）、ゾレドロン酸（Ｚｏｌ）、ゾレドロン酸プラスレンチウイルス対照（Ｚｏｌ＋ＬＶ対照）、またはゾレドロン酸プラスＦＤＰＳを下方調節するためのｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（Ｚｏｌ＋ＬＶ−ＦＤＰＳ）で処理した。処理した細胞を１：１の比で４時間、ガンマデルタＴ細胞と混合した。ガンマデルタＴ細胞によるＴＮＦ−アルファ産生を細胞内染色およびフローサイトメトリーによって検出した。
【０１６１】
ＬＶ−ＦＤＰＳによって改変され、かつヒトガンマデルタＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を活性化させるために使用される腫瘍細胞の機能アッセイ：ＦＤＰＳのｍＲＮＡを抑制するレンチウイルスベクターを用いて、単球様腫瘍細胞（ＴＨＰ−１）への形質導入を行った後、この細胞を、正常ヒトガンマデルタＴ細胞における腫瘍細胞傷害性を活性化させるために使用した。形質導入したＴＨＰ−１細胞への４時間の曝露の後、活性化されたガンマデルタＴ細胞を回収した後、未改変のＴＨＰ−１を殺傷するための細胞傷害性アッセイにおいてそれを使用した。形質導入したＴＨＰ−１細胞と１０マイクロモル濃度のゾレドロン酸との組み合わせを用いてガンマデルタＴ細胞を刺激した場合、１つのＴＨＰ−１細胞に対して４つのガンマデルタＴ細胞の比で、７０％を超えるＴＨＰ−１の殺傷が観察された。
【０１６２】
ＦＤＰＳの実験データ
表２に示すＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列を本明細書中に記載する実験において利用した。さらに、表２に詳述する配列は、本明細書中で詳述する治療ベクターにおいて使用することができる。
【表２】
2019508045.tif 000011
【０１６３】
図４Ａに示すように、４つの異なるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列の投与後のヒトＦＤＰＳの相対発現レベルを決定した。ヒトＦＤＰＳの発現の最も顕著な阻害は、ＦＤＰＳ−２試料およびＦＤＰＳ−４試料において見られた（本願の図４Ａに示す）。
【０１６４】
さらに、図４Ｂに示すように、レンチウイルスに基づく送達系を使用して、ＦＤＰＳの発現を標的化した。ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞を、Ｈ１プロモーターおよびＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ（配列番号４）配列またはＥＦ−１アルファプロモーターおよび以下のｍｉＲ３０に基づくＦＤＰＳ配列のいずれかを含有するレンチウイルスベクターに感染させた：
ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃１：
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号５３）
ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ配列＃２：
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号５４）
【０１６５】
４８時間後、細胞を溶解し、抗ＦＤＰＳ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびタンパク質ローディングコントロール用の抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して免疫ブロットを行った。図４Ｂに示すように、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡでの処理は、ＦＤＰＳタンパク質の発現を有意に減少させた。ｍｉＲ３０に基づくＦＤＰＳ配列での処理は、ＦＤＰＳの発現を減少させた。
【０１６６】
図５に示すように、ＦＤＰＳのｍＲＮＡを抑制できるｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスを用いて形質導入した単球様（ＴＨＰ−１）（図５Ａ）または肝細胞（ＨｅｐＧ２）（図５Ｂ）のがん細胞は、ヒトガンマデルタＴ細胞においてサイトカインの発現を活性化した。
【０１６７】
本実施例のこの部分は、図５Ａに示すように、レンチウイルス（ＬＶ）が発現するＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ（配列番号４；本明細書中、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ＃４とも称する）によるＴＨＰ１単球性白血病細胞におけるＦＤＰＳのノックダウンは、ガンマデルタＴ細胞においてＴＮＦ−αの発現を刺激することを指し示す。
【０１６８】
３日間、ＬＶ対照またはＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ＃４を用いてＴＨＰ１細胞（１×１０５細胞）への形質導入を行った。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、丸底の９６ウェルプレート中で４時間、形質導入されたＴＨＰ−１細胞を５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を増殖させた。フルオロフォアにコンジュゲート化させた抗ＴＣＲ−Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ−α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ−α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照はＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の３．１１％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ＃４は５％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ対照はＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の７．２％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ＃４は５６．１７％を刺激した。
【０１６９】
ＨｅｐＧ２細胞に対して同じ条件を使用して、以下のデータを得た。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照はＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の２．５％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ＃４は３．３３％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ対照はＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の９．１％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ＃４は４５．７％を刺激した。
【０１７０】
さらに図６に示すように、ＦＤＰＳのｍＲＮＡを抑制できるレンチウイルスを用いて形質導入した単球様（ＴＨＰ−１）腫瘍細胞は、正常ヒトガンマデルタＴ細胞において腫瘍細胞傷害性を活性化する。
【０１７１】
本実施例のこの部分は、図６に示すように、処理したＴＨＰ−１単球様腫瘍細胞と培養ヒトＧＤ  Ｔ細胞との混合の結果を実証している。
【０１７２】
対照レンチウイルスベクター（ＬＶ）、ファルネシル二リン酸合成酵素の遺伝子発現を抑制するＬＶ（ＬＶ−ＦＤＰＳ）、ゾレドロン酸（Ｚｏｌ）、または組み合わせで単球様細胞株ＴＨＰ−１を処理した。図６に示すように、説明文は以下の通りであった：レンチウイルス対照ベクター（ＬＶ対照）、ＦＤＰＳを下方調節するマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＦＤＰＳ）、ゾメタ（Ｚｏｌ）、ゾメタプラスレンチウイルス対照（Ｚｏｌ＋ＬＶ対照）、またはゾメタプラスＦＤＰＳを下方調節するマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（Ｚｏｌ＋ＬＶ−ＦＤＰＳ）。
【０１７３】
匿名のドナー由来のヒトＧＤ  Ｔ細胞を培養し、４：１、２：１、または１：１の比（ＧＤ  Ｔ：ＴＨＰ−１）で４時間、処理したＴＨＰ−１細胞に加えた。蛍光アッセイによって細胞殺傷を測定した。ＬＶ−ＦＤＰＳとＺｏｌとの組み合わせでＴＨＰ−１細胞を処理した場合、いずれか単独での処理と比べて、ＧＤ  Ｔ細胞による細胞傷害性Ｔ細胞殺傷は大きく増加した。ＬＶ−ＦＤＰＳ単独での処理をＺｏｌ単独での処理と比べると、ＬＶ−ＦＤＰＳはより大きな殺傷に繋がるが、組み合わせ処理後の腫瘍細胞殺傷の三分の一未満であった。ＬＶ−ＦＤＰＳプラスＺｏｌの組み合わせ処理は、４：１の比で、７０％近い腫瘍細胞殺傷を引き起こし、これは２番目によい処理（ＬＶ−ＦＤＰＳ単独）の３倍を超えていた。
【０１７４】
（実施例４．ＣＤ４７用の材料および方法）
阻害性ＲＮＡの選択：ホモサピエンスＣＤ４７分子（ＣＤ４７）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００１７７７）を使用して、ヒト細胞においてＣＤ４７レベルを低下させることができる潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのもの、またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ  ＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって選択された候補から潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。最初に、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのすぐ３’側において、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞への形質導入を行い、特定のｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルの低下のために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込むことで、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能とした。ＲＮＡ配列を合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターを使用せずに細胞内に直接導入した。
【０１７５】
ベクターの構築：ＣＤ４７のｓｈＲＮＡのため、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ，ＬＬＣによって合成された。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃でのインキュベーションの間にアニーリングさせ、その後に室温へと冷却し、対形成していない末端をＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させた後に室温へと冷却した。伸長反応により、制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを含有するオリゴヌクレオチドの各末端において二本鎖配列が作られた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて二本鎖オリゴヌクレオチドを消化し、７０℃で２０分間、酵素を熱不活化させた。並行して、３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴに混合し（３：１の比）、アニーリングおよびライゲートさせた。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショック後に形質転換を達成した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物抵抗性コロニー（アンピシリン抵抗性プラスミドの存在を指し示す）を回収し、精製し、ＬＢ培地中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用されるプロモーター用の特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。
【０１７６】
機能アッセイ：ＣＤ４７の発現に対する異なるＣＤ４７  ｓｈＲＮＡ標的化配列の効果をｍＲＮＡ発現の測定によって決定した。ＣＤ４７  ｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクターを用いて、Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞癌細胞への形質導入を行った。４８時間後、細胞を溶解し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを抽出した。次いで、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯを使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｔｅｐＯｎｅ  ＰＣＲ装置を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによって試料を分析した。フォワードプライマー（５’−ＣＡＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＣＴ−３’）（配列番号６３）およびリバースプライマー（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣ−３’）（配列番号６４）を使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いてＣＤ４７の発現を検出した。フォワードプライマー（５’−ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’）（配列番号６１）およびリバースプライマー（５’−ＡＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧ−３’）（配列番号６５）を使用してアクチンの発現を測定することにより、試料を正規化した。各試料のアクチンレベルに対して正規化したＣｔ値によって、ＣＤ４７の相対発現を決定した。
【０１７７】
ＣＤ４７についての実験データ
表３に示すＣＤ４７  ｓｈＲＮＡ標的配列の非限定的な例を本明細書中に記載する実験において利用した。さらに、表３に詳述する配列は、本明細書中で詳述する治療ベクターにおいて使用することができる。
【表３】
2019508045.tif 000012
【０１７８】
図７Ａに示すように、４つの異なるＣＤ４７  ｓｈＲＮＡ配列の投与後のヒトＣＤ４７の相対発現レベルを決定した。ヒトＣＤ４７の発現の最も顕著な阻害は、ｓｈＣＤ４７−１試料およびｓｈＣＤ４７−３試料において見られた（本願の図７Ａに示す）。
【０１７９】
さらに、図７Ｂに示すように、レンチウイルスに基づく送達系を使用して、ＣＤ４７の発現を標的化した。ＳＮＵ４４９ヒト肝細胞癌細胞を、以下のｍｉＲ１５５に基づくＣＤ４７配列を含有するレンチウイルスベクターに感染させた：
ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃１：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（配列番号８２）
ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃２：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（配列番号６６）
ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃３：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（配列番号６７）
ｍｉＲ１５５  ＣＤ４７標的配列＃４：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴＡＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（配列番号６８）
【０１８０】
図７Ｂに示すように、ＣＤ４７  ｓｈＲＮＡでの処理は、ＦＤＰＳタンパク質の発現を有意に減少させた。ｍｉＲ１５５に基づくＣＤ４７配列での処理は、ＣＤ４７の発現を有意に減少させた。
【０１８１】
（実施例５．ｃＭｙｃ用の材料および方法）
阻害性ＲＮＡの設計：ｖ−ｍｙｃ鳥類骨髄球腫症ウイルス性がん遺伝子のホモサピエンスホモログ（ＭＹＣ）のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００２４６７．４）を使用して、肝細胞の細胞株においてＭＹＣの発現をノックダウンするための潜在的なｓｈＲＮＡ候補をスクリーニングした。ＭＹＣの発現を低下させることができる５つのＭＹＣ  ｓｈＲＮＡ配列を得た。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのもの、またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ  ＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって選択された候補から潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの後ろにおいて、ｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入し得る。また、ＲＮＡ配列をマイクロＲＮＡ骨格内に埋め込んで、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによる発現を可能とし得る。ＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターとは独立して利用してもよい。
【０１８２】
ベクターの構築：ｃＭｙｃのｓｈＲＮＡのため、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列は、ＭＷＧ  ｏｐｅｒｏｎによって合成された。７０℃でのインキュベートおよび室温への冷却によって、オリゴヌクレオチド配列をアニーリングさせた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを消化した後、７０℃で２０分間、酵素を熱不活化させた。並行して、３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴ配列に３：１の挿入物対ベクターの比でライゲートした。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショックによって形質転換を実行した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を塗り付けた後、コロニーをＬＢ培地中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するためにあらゆるプロモーターが使用される特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、正しいｃＭｙｃ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ＦＤＰＳをノックダウンする能力を試験するためにレンチウイルス粒子をパッケージングした。ポリブレンの存在下または非存在下のいずれかで、レンチウイルス粒子を用いて哺乳動物細胞への形質導入を行った。２〜４日後に細胞を回収し、ｃＭｙｃの発現についてタンパク質およびＲＮＡを分析した。
【０１８３】
機能アッセイ：ｃＭｙｃの発現に対する異なるｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡ標的化配列の効果をｍＲＮＡ発現の測定によって決定した。ｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクターを用いて、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞への形質導入を行った。４８時間後、細胞を溶解し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを抽出した。次いで、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯを使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｔｅｐＯｎｅ  ＰＣＲ装置を使用する定量ＰＣＲによって試料を分析した。フォワードプライマー（５’−ＧＧＡＣＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＡ−３’）（配列番号６９）およびリバースプライマー（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣ−３’）（配列番号６４）を使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いてｃＭｙｃの発現を検出した。フォワードプライマー（５’−ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’）（配列番号６１）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号６２）を使用してアクチンの発現を測定することにより、試料を正規化した。各試料のアクチンレベルに対して正規化したＣｔ値によって、ｃＭｙｃの相対発現を決定した。
【０１８４】
ｃＭｙｃについての実験データ
下記表４に示すｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡ配列の非限定的な例を本明細書中に記載する実験において利用した。
【表４】
2019508045.tif 000013
【０１８５】
図８Ａに示すように、５つの異なるｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡ配列の投与後のヒトｃＭｙｃの相対発現レベルを決定した。ヒトｃＭｙｃの発現の最も顕著な阻害は、ｍｙｃ−２試料において見られた（本願の図８Ａに示す）。
【０１８６】
さらに、図８Ｂに示すように、ＳＮＵ４４９ヒト肝細胞癌細胞を、以下のｍｉＲに基づくｃＭＹＣ配列またはｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡのいずれかを含有するレンチウイルスベクターに感染させた：
ｍｉＲ１５５  ｃＭｙｃ配列：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡ（配列番号７０）
ｍｉＲ２１  ｃＭｙｃ配列：
ＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡ（配列番号８３）
【０１８７】
上記２つのｃＭｙｃ配列は、以下の標的配列を使用して生成した：
ｃＭｙｃ標的配列：
ＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡ（配列番号７１）
ｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡ配列：
ＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴ
（配列番号１３）
【０１８８】
４８時間後、細胞を溶解し、抗ｃＭｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、およびタンパク質ローディングコントロール用の抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して免疫ブロットを行った。図８Ｂに示すように、ｃＭｙｃ  ｓｈＲＮＡでの処理は、ｃＭｙｃタンパク質の発現を有意に減少させた。ｍｉＲに基づくｃＭｙｃ配列での処理も、ｃＭｙｃの発現を減少させた。
【０１８９】
（実施例６．ＦＤＰＳ−ｓｈＲＮＡおよびゾレドロン酸でのｉｎ  ｖｉｖｏ処置）
ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ３を移植したマウスにおける、ゾレドロン酸ありまたはなしでのＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳ（ファルネシル二リン酸合成酵素）の共投与のプロトコールの概要。腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養後、スクランブル配列の（機能しない）ｓｈＲＮＡ挿入物およびホタルルシフェラーゼ用発現カセットを有するレンチウイルスベクター対照、またはＦＤＰＳ  ｍＲＮＡの発現を低下させることができるｓｈＲＮＡおよびホタルルシフェラーゼ用発現カセットを有するＬＶ−ＦＤＰＳを用いて形質導入した。形質導入された腫瘍細胞を皮下注射により免疫欠損マウスの脇腹に移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３の体積に達したら、全てのマウスに食塩水中の単回用量のゾレドロン酸（キログラム体重あたり１００マイクログラム；これは標準的なヒトでの用量に類似する）を与える。ゾレドロン酸注射の７日後、画像検査を繰り返して、個々の腫瘍の体積および光子強度を測定した。
【０１９０】
本実施例で設計し、開発し、そして利用したＬＶ−ＦＤＰＳベクターを図９に図式的に示す。本明細書中に記載する方法および材料を使用してＬＶ−ＦＤＰＳベクターを開発した。以下の配列を使用し、以下に記載するように、ＣＭＶ  ＧＦＰ  Ｔ２Ａルシフェラーゼ配列を生成し、治療ベクター中に導入した。
【化８】
2019508045.tif 000014
【化９】
2019508045.tif 000015
【化１０】
2019508045.tif 000016
【０１９１】
ＬＶ  ＦＤＰＳ  ＧＦＰ  Ｔ２Ａ  Ｌｕｃの構築：
ＣＭＶ  ＧＦＰ  Ｔ２Ａルシフェラーゼ配列を含有するｐＧＦ−１プラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＣｌａＩおよびＫＰＮ１を用いて消化し、ＬＶ−Ｈ１−ｓｈＦＤＰＳプラスミドをＢｓｔＢＩおよびＫｐｎＩ制限酵素（ＮＥＢ）を用いて消化した。ＤＮＡを１％アガロースゲル上の電気泳動にかけ、ＤＮＡゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＤＮＡ断片を抽出した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて２つの断片をライゲートし、ＳＴＢＬ３細菌（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の形質転換を行った。プラスミドＤＮＡミニプレップキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプラスミドＤＮＡを細菌から抽出し、ＤＮＡシークエンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって配列を検証した。
詳細な実験プロトコール：
−１９日目：１７５ｍｌのフラスコでのコンフルエントな生育は１．８７×１０７ｍｌのＰＣ３細胞を生じ、７５ｍｌのフラスコでのコンフルエントな生育は７．５×１０６ｍｌのＰＣ３細胞を生じる。
−７日目：ＰＣ３細胞を解凍し、生育する。
−４日目：材料の調製および送達。レンチベクター対照およびレンチ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳで形質導入したＰＣ３細胞を調製する。
１．  ７５ｍｌのフラスコ中、５０％コンフルエントのＰＣ３細胞に１２μｌのレンチ対照＋８μｌのポリブレンを加え、５分間インキュベートした後、４ｍｌのＲＰＭＩ−１０と混合し、ＰＣ３細胞の表面を覆う。
２．  ７５ｍｌのフラスコ中、５０％コンフルエントのＰＣ３細胞に２０μｌのレンチ−ＦＤＰＳ＋８μｌのポリブレンを加え、５分間インキュベートした後、４ｍｌのＲＰＭＩ−１０と混合し、ＰＣ３細胞の表面を覆う。
３．  形質導入した細胞を３７℃で８時間インキュベートする。終夜培養のために６ｍｌのＲＰＭＩ−１０を加える。
−２日目：７５ｍｌの形質導入したＰＣ３細胞（コンフルエントの７．５×１０６細胞）をトリプシン処理し、１７５ｍｌのフラスコに移す。
０日目：材料の調製および送達
１．  ８０％コンフルエントのレンチベクターで形質導入したＰＣ３細胞およびレンチ−ＦＤＰＳで形質導入したＰＣ３細胞を別々にトリプシン処理し、細胞をカウントする。
レンチベクター：１．５×１０８細胞（５０×３×１０６／５ｍｌ）１５フラスコ
レンチ−ＦＤＰＳ：１．５×１０８細胞（５０×３×１０６／５ｍｌ）２０フラスコ
２．  ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ中に、レンチベクターで形質導入したＰＣ３細胞およびレンチ−ＦＤＰＳで形質導入したＰＣ３細胞を再懸濁し、３×１０６細胞／１００μｌの最終濃度とする。
【０１９２】
材料：Ｉ）ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ中の５ｍｌのＰＣ３−レンチベクター細胞（合計１５０×１０６細胞）、ＩＩ）ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ中の５ｍｌのＰＣ３−レンチ−ＦＤＰＳ細胞（合計１５０×１０６細胞）。
【０１９３】
０日目：ＰＣ３細胞の皮下注射。群Ｉ（２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）：０．１５ｍｌのＰＣ３−レンチベクター細胞（ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ中の０．１ｍＬの３×１０６のレンチベクター＋０．０５ｍＬのマトリゲル）をマウスの右または左のいずれかの脇腹に皮下接種する（５０匹のマウスに対して合計５ｍｌで十分）。群ＩＩ（３匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）：０．１５ｍｌのＰＣ３−レンチ−ＦＤＰＳ  ＫＤ（ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中の０．１ｍＬの３×１０６のレンチベクター＋０．０５ｍＬのマトリゲル）をマウスの右または左のいずれかの脇腹に皮下接種する（５０匹のマウスに対して合計５ｍｌで十分）。
【０１９４】
８日目：腫瘍をモニタリングする。腫瘍は移植後の最初の数日、触知できる。カリパスで腫瘍の直交する直径を測定することによって腫瘍サイズを決定する。腫瘍サイズは以下の測定法により算出する：腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｄ２（ｄ＝最短の直径）×Ｄ／２（Ｄ＝最長の直径）。生物発光のイメージングを行い、腫瘍の位置、サイズ、およびホタルルシフェラーゼ遺伝子のレンチウイルス発現の尺度としての光子強度を実証する。
【０１９５】
１４日目：腫瘍サイズが２００〜３００ｍｍ３に達した時に、マウスに１００μｇ／ｍｌのゾレドロン酸（Ｚｏｌ）またはＰＢＳを腹腔内注射する。
【０１９６】
２２日目：画像検査により腫瘍サイズを測定する。
【０１９７】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ３腫瘍の成長に対する、ゾレドロン酸ありまたはなしでのＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳの効果。マウスをＳｃｒ（スクランブルのベクター対照について）、またはＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳについてＫＯと呼称する。本研究のために使用するＬＶは全て、形質導入された細胞およびその成長の直接的な視覚化を可能とするために生物発光マーカーホタルルシフェラーゼを発現する。８日目の生物発光画像検査により、ゾレドロン酸処置の前の平均腫瘍サイズを決定した（図１０Ａ）。ＣＣＤ光捕捉システムを用いて腫瘍の光子強度を測定した。Ｓｃｒ動物における腫瘍の平均サイズは、ＫＯ動物で見出されたものよりわずかに大きいが（図１０Ｂ）、差は有意でなかった。
【０１９８】
ゾレドロン酸での処置（全ての動物に腹腔内注射によりゾレドロン酸を与えた）の６日後、画像検査を繰り返した。Ｓｃｒ動物での腫瘍のサイズおよび位置（図１０Ｃ）は、以前の観察に類似していたが、ＫＯ群の動物について腫瘍サイズの著明な違いがあった。ＫＯ＃１およびＫＯ＃３において腫瘍体積は大きく減少しており、ＫＯ＃２には腫瘍はもはや存在しなかった。Ｓｃｒ群およびＫＯ群についての平均光子強度の比較により（図１０Ｄ）、大幅な違いが明らかとなり、最大の変化はＫＯ群で見られた。
【０１９９】
ＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ３腫瘍の成長に対して、小さいが検出可能な影響を持つことをこれらのデータは示している。単回用量のゾレドロン酸と組み合わせた時に効果は増大し、ＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳ形質導入細胞の根絶が１つの事例で達成された。よって、発光性形質導入細胞は、ＬＶがｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳを発現した場合に限ってゾレドロン酸によって減少した。スクランブルの対照ＬＶを用いて形質導入した腫瘍を有する動物はゾレドロン酸処置の後に腫瘍量の変化をほとんどまたは全く示さなかったので、腫瘍量の減少はゾレドロン酸処置に帰せられるものではなかった。
【０２００】
腫瘍減少の鍵となるのは、ＦＤＰＳ酵素の発現レベルを低下させるＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳとあらゆる残りのＦＤＰＳ活性を阻害するゾレドロン酸との組み合わせた効果であった。予想の通り、ゾレドロン酸はマウスへの毒性はなく、ＬＶ−ｓｈＲＮＡ−ＦＤＰＳと組み合わせた時に腫瘍量を低下させる以外の効果は持たないようであった。ゾレドロン酸は、高ボーラス用量で与えられる場合、または骨粗しょう症などの骨鉱物質消失障害のための長期的療法として、ヒトにおいて安全かつ有効な処置である。
【０２０１】
実施例の実施形態の開示は、例示的であることを意図し、以下の特許請求の範囲およびその均等物により示される本発明の範囲を限定するものではない。明確な理解を与える目的で一部の詳細において本発明の実施例の実施形態を記載したが、以下の特許請求の範囲内で、ある特定の変更および改良が行われ得ることは明らかであろう。以下の特許請求の範囲において、特許請求の範囲に明示的に記載されているか、または本開示により暗黙的に要求されない限り、要素および／またはステップは、いかなる特定の操作順序も暗示するものではない。
【０２０２】
配列
以下の配列を本明細書において参照する：
【表５−１】
2019508045.tif 000017
【表５−２】
2019508045.tif 000018
【表５−３】
2019508045.tif 000019
【表５−４】
2019508045.tif 000020
【表５−５】
2019508045.tif 000021
【表５−６】
2019508045.tif 000022
【表５−７】
2019508045.tif 000023
【表５−８】
2019508045.tif 000024
【表５−９】
2019508045.tif 000025
【表５−１０】
2019508045.tif 000026
【表５−１１】
2019508045.tif 000027
【表５−１２】
2019508045.tif 000028
【表５−１３】
2019508045.tif 000029
【表５−１４】
2019508045.tif 000030
【表５−１５】
2019508045.tif 000031
【表５−１６】
2019508045.tif 000032
【表５−１７】
2019508045.tif 000033
【表５−１８】
2019508045.tif 000034
【表５−１９】
2019508045.tif 000035
【表５−２０】
2019508045.tif 000036
【表５−２１】
2019508045.tif 000037
【表５−２２】
2019508045.tif 000038
【表５−２３】
2019508045.tif 000039
【表５−２４】
2019508045.tif 000040
【表５−２５】
2019508045.tif 000041
【表５−２６】
2019508045.tif 000042
【表５−２７】
2019508045.tif 000043
【表５−２８】
2019508045.tif 000044
【表５−２９】
2019508045.tif 000045
【表５−３０】
2019508045.tif 000046
【表５−３１】
2019508045.tif 000047
【０２０３】
本発明の好ましい実施形態のある特定の一部分を上記し、具体的に例示したが、本発明がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。本発明の範囲および精神から離れることなく、それに対して様々な改変がなされ得る。
【図１】
2019508045.tif 000048
【図２】
2019508045.tif 000049
【図３】
2019508045.tif 000050
【図４】
2019508045.tif 000051
【図５Ａ】
2019508045.tif 000052
【図５Ｂ】
2019508045.tif 000053
【図６】
2019508045.tif 000054
【図７】
2019508045.tif 000055
【図８】
2019508045.tif 000056
【図９】
2019508045.tif 000057
【図１０】
2019508045.tif 000058
【配列表】
2019508045000001.app
【国際調査報告】
2019508045.tif 000059
2019508045.tif 000060
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2019508045.tif 000062
2019508045.tif 000063