(57)【要約】本発明は、好熱性真菌が、高温で及び酸性ｐＨで、発酵性の炭素豊富な供給原料に成長する、単一細胞タンパク質を生産する方法に関する。これは、非滅菌条件下で及び追加の冷却を要求することなく実施することができる、費用効果がある発酵方法を可能にする。方法は、農業又は食物生産からの副産物又は廃棄物、又は都市ゴミの有機物画分を、ヒトの食物又は動物飼料中のタンパク質又はタンパク質サプリメントの食餌供給源として適用することができる、価値のある単一細胞タンパク質に変換するため使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞タンパク質（ＳＣＰ）を生産する方法であって、
ａ）好熱性真菌を、発酵性の炭素豊富な供給原料を含有する培地中で成長させるステップであって；前記真菌を、４５℃より高い温度及び３．８未満のｐＨで、非滅菌条件下の液中培養で成長させる、ステップ；及び、
ｂ）ステップａ）で成長させた前記好熱性真菌のバイオマスの形態で、前記培地からＳＣＰを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記炭素豊富な供給原料の濃度が、前記供給原料中の毒性化合物が前記真菌の成長速度を低減させる濃度未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炭素豊富な供給原料が、前記炭素豊富な供給原料の濃度が、前記供給原料中の毒性化合物が前記真菌の成長速度を低減させる濃度未満に保たれる割合で前記培地に供給され、好ましくは、前記供給原料中の毒性化合物が前記真菌の成長速度を低減させる濃度が、前記真菌によるＣＯ２産生の割合及びＯ２消費の割合の少なくとも１つにおける低減の原因とならない、前記炭素豊富な供給原料の最高濃度として規定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地中の前記炭素豊富な供給原料が、５％（ｗ／ｖ）乾物の濃度未満であるか、又は５％（ｗ／ｖ）乾物の濃度未満を維持する割合で前記培地に供給される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の発酵槽の使用を含み、少なくとも第１の発酵槽が、収穫及び任意選択の清浄化のために空にされ、その間少なくとも第２の発酵槽中で、前記真菌の成長が継続し、好ましくは収穫及び任意選択の清浄化後、空の第１の発酵槽が、前記第２の発酵槽の内容物の少なくとも一部で満たされ、成長が、前記第１の発酵槽の収穫及び任意選択の清浄化の期間に継続される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フェドバッチ法、反復フェドバッチ法又は連続法であり、好ましくは炭素制限法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記好熱性真菌が、ラサムソニア属、タラロミセス属、ペニシリウム属、アクレモニウム属、フミコラ属、ペシロミセス属、カエトミウム属、リゾムコール属、サーモミセス属、マセリオフトーラ属、サーモアスカス属、ムコール属、リゾプス属、サーモムコール属、チエラビア属、スチベラ属、メラノカルプス属、マルブランケア属、ダクチロミセス属、カナリオミセス属、スキタリジウム属、ミリオコッカム属、コリナスカス属、及びクーネメリア属からなる群から選択される真菌属の株であり、好ましくは、前記好熱性真菌が、ラサムソニア・コンポスティコラ、ラサムソニア・エメルソニイ、タラロミセス・エメルソニイ、サーモムコール・インディカセウダチカ、リゾムコール・ミエヘイ、リゾプス属種、リゾムコール・プシルス、チエラビア・テリコラマイナー変種及びサーモアスカス・サーモフィラスからなる群から選択される真菌種の株であり、そのうちの株、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４、サーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５及びリゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０がより好ましく、そのうちの株、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９、ＣＢＳ１４３１６０及びＣＢＳ１４３０２８が最も好ましい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵性の炭素豊富な供給原料が、農業又は食物生産、サイレージ、都市ゴミ（ＭＳＷ）の有機物画分及び食物用途に適合する植物由来の生産物からの副産物又は廃棄物のうちの１つ又は複数であり、好ましくは、前記発酵性の炭素豊富な供給原料が、サトウダイコンパルプ、穀粒加工からの液体Ｃ−デンプン、皮をむいた野菜、カットした野菜又は選別外の野菜の生産からの野菜廃棄物、パーム油廃液（ＰＯＭＥ）、空果房（ＥＦＢ）、シュロの葉を含むパームミル残留物、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、コメ、キャッサバ、サトウキビ又はサトウキビジュース、サトウダイコン又はサトウダイコンジュース又は高濃度のジュース、廃糖蜜、甘蔗廃糖蜜、グルコースシロップ、フルクトースシロップ及び野菜油のうちの１つ又は複数である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、窒素源を含有する及び／又は供給され、好ましくは、前記窒素源が、アンモニア、尿素及び硝酸塩のうちの１つ又は複数を含み、より好ましくは、前記窒素源が、廃糖蜜、サトウダイコン又はキビ残渣、ワイン産業からの残渣、ブドウ残留物、ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ）、コーンスティープ液（ＣＳＬ）、動物農場排出ガス清浄化スクラバーからのアンモニア、及び肥料加工からの希薄な画分の、濃縮物から得られる、負荷濃縮物に存在するアミンのうちの１つ又は複数である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマスが、篩分け、濾過及びデカンテーションのうちの少なくとも１つによって前記培地から回収され、それによって、好ましくは、篩分け、濾過又はデカンテーションされたバイオマス（ケーキ）の乾物濃度が、少なくとも１２％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは、前記バイオマスが、回転ドラム濾過、フィルタープレス、ベルトフィルター、スクリーン、篩、篩ベルト、ＤＳＭスクリーン、ベルトプレス、スクリュープレス及びデカンター遠心分離機のうちの少なくとも１つによって前記培地から回収され、それによって、より好ましくは、前記バイオマスケーキが、例えば、プレスして、残留する水を除去することによって更に乾燥させることができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマス（ケーキ）の篩分け、濾過、デカンテーション、及び／又は更なるプレスの後に得られる水画分が、発酵に戻して再利用されるか、及び／又は更に発酵バッチのために使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵槽が、エネルギーの入力が必要ないずれの冷却装置も用いずに操作される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株からなる群から選択される、好熱性真菌株。
【請求項１４】
少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含むＳＣＰ生産物であって、前記好熱性真菌株は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０及びサーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９、ＣＢＳ１４３１６０及びＣＢＳ１４３０２８株が好ましく、好ましくは、前記バイオマス中のタンパク質が、ダイズタンパク質中の総必須アミノ酸の合計よりも少なくとも１０％高い総必須アミノ酸の合計を有し、より好ましくは、前記バイオマス中のタンパク質が、総アミノ酸の少なくとも８．５％のリジン含有量及び総アミノ酸の少なくとも１０％のフェニルアラニン含有量の少なくとも１つを有する、ＳＣＰ生産物。
【請求項１５】
少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含む食物又は飼料生産物であって、前記好熱性真菌は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０及びサーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９、ＣＢＳ１４３１６０及びＣＢＳ１４３０２８株が好ましい、食物又は飼料生産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学及び発酵技術の分野に関する。特に、本発明は、食品及び動物飼料における使用のための、好熱性真菌による炭素及びエネルギー豊富な供給原料の発酵による単一細胞タンパク質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口や豊かさの増加は、肉、乳製品、昆虫及び魚などのタンパク質豊富な食物に対する需要の急速な増加につながる。結果として、ブラジルなどの国々におけるダイズ生産の増加は、他の世界に輸出される莫大な規模のダイズ生産を実現するために、熱帯雨林を失うことにつながる。したがって、タンパク質豊富な動物飼料を、より局地的に生産する必要性がある。タンパク質豊富な動物飼料を生産する１つの方法は、発酵の手段により「単一細胞タンパク質」（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＣＰ）を生産することである（Ｓｕｍａｎら、２０１５、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ  ４．、Ｎｏ  ９．、ｐｐ  ２５１〜２６２）。この点において、発酵は、細菌、酵母又は真菌などの微生物の細胞からなるタンパク質豊富な生産物への炭水化物豊富な供給原料の微生物的な変換として理解されている。動物飼料及び食物成分としてのＳＣＰの使用により、微生物細胞が多量の必須アミノ酸を有し、例えばサプリメント穀粒に基づく食餌に適用される場合に、全てが多量の抗栄養性化合物フィチン酸塩、難消化性繊維などを有する複合飼料の消化性に陽性の効果を有しうる、フィターゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼなどの有用な酵素を産生するという更なる利点がもたらされる。さらに、特に真菌細胞は、発酵性飼料素材を非常に栄養のあるものにする、微量元素及びビタミンが非常に豊富であることがある。キノコなどの真菌は、野菜が生産できないビタミンＢ１２を含有することにおいて独特である。ビタミンＢ１２は主に動物由来であることから、その欠乏は、一般に菜食主義者の食事に関連する。キノコは、１グラム当たり０．３２〜０．６５ｍｇのビタミンＢ１２を含有することが見出されており、ちょうど３ｇの新鮮なキノコが、このビタミンの推奨されている１日許容量を提供することが可能である。菜食主義者は、この重要な栄養分を得る有用な方法をそれに見出すことができる。
【０００３】
Ｏｕｔｉｌａら（１９９９  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、６９：  ９５〜９８）は、キノコ中のエルゴカルシフェロールが、補助剤がするのと同等に効果的に血清２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度を増加させ、キノコが天然ビタミンＤ供給源として確実に推奨されることを可能にすることを見出した。プロビタミンＤは、一部のキノコ、特にシイタケ中に存在し、太陽光中の紫外線照射によってビタミンＤに変換されうる。いくつかのキノコがβカロテン均等物として測定される、検出可能な量のプロビタミンＡを含有するが、ビタミンＡは一般的ではない。最も栽培されているキノコは、低量の脂溶性ビタミンＫ及びＥを含有すると考えられており、ビタミンＣの毎日の要求に対してわずかな寄与をなす。
【０００４】
Ｑｕｏｒｎ（商標）は、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）によって産生されるマイコプロテインであり、ビタミンＢ１（サイアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）及びビオチンを含有する（ｗｗｗ．ｍｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）。最適化の目的のため、魚、昆虫、ニワトリ、ウシ、ブタなどの飼料の用途のみならず、食物用途における代替物を置き換える肉の生産のためにも要求される、ビタミンが多い、このプロセス中に適用される特定の好熱性真菌を選択することができる。
【０００５】
ＳＣＰ生産における１つの問題は、特に細菌又は酵母での液中発酵の場合の発酵ブロス中に産生されるＳＣＰバイオマスの濃度である。別の問題は、安価なポリマー炭素源をモノマー発酵糖に変換する高価な酵素の必要性である。さらに、ＳＣＰ生産のために中温性微生物を使用する場合の感染を回避するため、滅菌発酵条件を適用する必要性があり、これが高い資本投資及びエネルギー要求に起因する、ひどく高額な操作上のコストにつながる（Ｂａｊｐａｉ及びＢａｊｐａｉ、１９８７、Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６５、３：  ３４９〜３５１）。これらの問題の一部は、好熱性真菌での固体発酵を使用することによって取り組まれている（Ｇｒａｊｅｋ、１９８７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．  ３２：  ２５５〜２６０；及びＧｒａｊｅｋ、１９８８、Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６６、６：  ６７５〜６７９）。しかしながら、そのような固体プロセスの規模拡大は、通気及び冷却の問題を提起する。
【０００６】
米国特許第８，４８１，２９５号Ｂ２は、エタノール精製機からの希薄な蒸留廃液（ｓｔｉｌｌａｇｅ）におけるバッチ発酵を使用する動物飼料成分としての好熱性真菌の生産を開示する。しかしながら、そこで使用される真菌株は、４未満のｐＨ及び４５℃より高い温度では良好に行われなく、プロセスを細菌及び酵母混入の影響を受けやすくしている。
【０００７】
Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｋ．Ｆら（１９７７、Ａｎｉｍ．  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２：７〜１９）は、キャッサバの変換のための熱耐性真菌の使用の試みを開示しており、その過程で多くの熱耐性真菌が単離された。しかしながら、これらの試みは、それらの生物の混入問題が残り又は望ましくないヒト病原体（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））が使用されたことから、生産物の商品化につながらず、それらムコール属（Ｍｕｃｏｒ）株は、ラット研究では消化が不十分であることが見出された。
【０００８】
いくつかの著者は、ＳＣＰの生産のための、熱耐性真菌セパロスポリウム・エイコルニア（Ｃｅｐａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｅｉｃｈｏｒｎｉａ）を報告している。Ｅ．ｇ．Ｓｔｅｖｅｎｓら（１９８７、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５３（２）：２８４〜２９１）は、ｐＨ３．７５及び４５℃でのＣ．エイコルニアの使用を開示しており、その条件下で、彼らは細菌混入を頻繁に観察している。さらに、これらの著者は、沈澱タンクスラッジ試料（ｓｅｔｔｌｉｎｇ  ｔａｎｋ  ｓｌｕｄｇｅ  ｓａｍｐｌｅ）において成長を得ることができなかった。Ｖａｒａｖｉｎｉｔら（１９９６、Ｓｔａｒｃｈ  ４８：  ３７９〜３８０）は、ｐＨ３．８及び４５℃でのエアリフト発酵槽中で非常に希釈したキャッサバ（２％乾物）からＣ．エイコルニアＳＣＰを生産したが、それを商品化することはできなかった。Ｍｉｋａｍｉら（１９８２、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３（２）：４０３〜１１）は、Ｃ．エイコルニア発酵も実施し、４５℃超の温度又はｐＨ３．８未満のｐＨで成長させることは可能ではなかったことを示している。
【０００９】
Ｒｅａｄｅ及びＧｒｅｇｏｒｙ（１９７５、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：８９７〜９０４）は、アスペルギルス・フミガーツスと同定された好熱性真菌を使用するＳＣＰの生産を開示しており、もはや４７℃の温度でのケースではなく、４５℃の温度で酵母混入がなおも発生し、４７℃の温度ではもはやその状況ではなかったことを実証した。しかしながら、アスペルギルス・フミガーツスはヒト病原体であるので、食物又は飼料における使用のためのＳＣＰを生産することに関して不適切である。
【００１０】
単一細胞タンパク質の生産における、これらの問題に取り組むことが本発明の課題である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＳＣＰを生産する方法を提供することを探求する。方法は、好ましくは：ａ）好熱性真菌を、発酵性の炭素豊富な供給原料を含有する培地中で成長させるステップであって；前記真菌を、４５℃より高い温度及び３．８未満のｐＨで、非滅菌条件下の液中培養で成長させる、ステップ；及び、ｂ）ステップａ）で成長させた前記好熱性真菌のバイオマスの形態で、前記培地からＳＣＰを回収するステップを含む。方法では、炭素豊富な供給原料の濃度は、供給原料中の毒性化合物が、真菌の成長速度を低減させる濃度未満であるか、及び／又は炭素豊富な供給原料は、炭素豊富な供給原料の濃度が、供給原料中の毒性化合物が、真菌の成長速度を低減させる濃度未満に保たれる割合で培地に供給されることが好ましい。供給原料中の毒性化合物が、真菌の成長速度を低減させない濃度が、真菌によるＣＯ２産生の割合及びＯ２消費の割合の少なくとも１つにおける低減の原因とならない、炭素豊富な供給原料の最高の濃度として、規定及び／又は決定されることが理解される。したがって、本発明の方法では、培地中の炭素豊富な供給原料が、５、４、３若しくは２％（ｗ／ｖ）の乾物濃度であるか、又はそれ未満の濃度が維持される割合で培地に供給されることが好ましい。
【００１２】
一実施形態では、本発明による方法は、２つ又はそれ以上の発酵槽を含む方法であって、少なくとも第１の発酵槽が、収穫及び任意選択で清浄化のために空であり、少なくとも第２の発酵槽中で、真菌の成長が継続し、好ましくは収穫及び任意選択で清浄化後、空の第１の発酵槽が、第２の発酵槽の内容物の少なくとも一部で満たされ、成長が、第１の発酵槽の収穫及び任意選択で清浄化の期間に継続される。
【００１３】
本発明の好ましい方法は、フェドバッチ法、反復フェドバッチ法又は連続法であり、更に好ましくは炭素制限法、又は少なくとも窒素を制限しない方法である。
【００１４】
本発明による方法において成長させる真菌は、好ましくは、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、カエトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、マセリオフトーラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、サーモムコール属（Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ）、ムコール属、スチベラ属（Ｓｔｉｂｅｌｌａ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、マルブランケア属（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）、ダクチロミセス属（Ｄａｃｔｙｌｏｍｙｃｅｓ）、カナリオミセス属（Ｃａｎａｒｉｏｍｙｃｅｓ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、ミリオコッカム属（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、及びクーネメリア属（Ｃｏｏｎｅｍｅｒｉａ）からなる群から選択される真菌属の株である好熱性真菌である。好熱性真菌は、ラサムソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、サーモムコール・インディカセウダチカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ  ｉｎｄｉｃａ−ｓｅｕｄａｔｉｃａｅ）、チエラビア・テリコラ（Ｔｈｉｅｌａｖａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、サーモアスカス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びリゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、そのうちの株、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ  ｉｎｄｉｃａｅ−ｓｅｕｄａｔｉｃａｅ）ＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４及びサーモセロミセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＣＢＳ１１７．６５からなる群から選択される真菌種の株であることがより好ましく、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０がより好ましく、そのうちの株、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９、ＣＢＳ１４３１６０及びＣＢＳ１４３０２８が最も好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい方法では、例えば、動物飼料に適用される場合、発酵性の炭素豊富な供給原料は、農業又は食物生産、サイレージ、都市ゴミ（ＭＳＷ）の有機物画分からの副産物又は廃棄物のうちの１つ又は複数である。発酵性の炭素豊富な供給原料は、サトウダイコンパルプ、穀粒加工からの液体Ｃ−デンプン、皮をむいた野菜、カット野菜又は選別外の野菜の生産からの野菜廃棄物、パーム油ミル廃液（ＰＯＭＥ）、及び空果房（ＥＦＢ）及びシュロの葉を含むパームミル残留物のうちの１つ又は複数であることが好ましい。食品の製造のためのＳＣＰの生産について、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、コメ、キャッサバ、サトウキビ又はサトウキビジュース、サトウダイコン又はサトウダイコンジュース又は高濃度のジュース、グルコースシロップ、又は食物用途に適切な任意の他の野菜生産物も使用することができる。
【００１６】
本発明による方法において、培地は、窒素源を含有する、及び／又は窒素源を供給されることが更に好ましい。窒素源は、アンモニア、尿素及び硝酸塩のうちの１つ又は複数を含むことが好ましい。窒素源は、廃糖蜜、サトウダイコン又はキビ残渣、ワイン産業からの残渣、ブドウ残留物、ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ）、コーンスティープ液（ＣＳＬ）、動物農場排出ガス清浄化スクラバーからのアンモニア、及び肥料加工からの希薄な画分の、濃縮物（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）から得られる負荷濃縮物（ｂｕｒｄｅｎ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ）に存在するアミンのうちの１つ又は複数であることがより好ましい。
【００１７】
本発明による方法では、バイオマスは、篩分け、濾過及びデカンテーションのうちの少なくとも１つによって培地から回収されることが好ましく、それによって、濾過された又は破壊されたバイオマス（ケーキ）の乾物濃度が、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５％、５０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。バイオマスが、回転ドラム濾過、フィルタープレス、ベルトフィルター、篩又はＤＳＭスクリーン、回転篩、ベルトプレス及びデカンター遠心分離機のうちの少なくとも１つによって培地から回収されることが好ましく、それによって、バイオマスケーキが、例えば、残留する水をプレスして除去して更に乾燥させることができることがより好ましい。
【００１８】
本発明による好ましい方法では、バイオマス（ケーキ）の篩分け、濾過、デカンテーション、及び／又は更なるプレスの後に得られる水画分は、発酵に戻して再利用されるか、及び／又は更に発酵バッチのために使用される。発明の更に好ましい方法では、発酵槽は、エネルギーの入力が必要ないずれの冷却装置も用いずに操作される。
【００１９】
一態様では、本発明は、好熱性真菌株に関する。真菌株は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８及びリゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０である株からなる群から選択されることが好ましい。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ＳＣＰ生産物に関する。ＳＣＰ生産物は、少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含むことが好ましく、ここで好熱性真菌は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４及びサーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５及びリゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９及びＣＢＳ１４３０２８及びＣＢＳ１４３１６０株が好ましい。バイオマス中のタンパク質が、ダイズタンパク質中の総必須アミノ酸の合計よりも少なくとも１０％高い総必須アミノ酸の合計を有することが好ましく、バイオマス中のタンパク質が、総アミノ酸の少なくとも８．５％のリジン含有量及び総アミノ酸の少なくとも１０％のフェニルアラニン含有量の少なくとも１つを有することがより好ましい。
【００２１】
本発明の更なる態様は、少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含む食物又は飼料生産物であって、ここで好熱性真菌株は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４、サーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５及びリゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９及びＣＢＳ１４３０２８及びＣＢＳ１４３１６０株が好ましい、食物又は飼料生産物に関する。
【００２２】
本発明は、添付される図面を参照して、以下でより詳細に議論される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明による方法についての概略の全体のプロセスを説明している図であり、ここで、サトウダイコンパルプは、動物飼料の顧客又は産業的な使用のため直接販売することができるが、市場の要求次第で発酵槽に供給することもできる、単一細胞タンパク質（ＢＥＴＵＦＥＥＤ）及び調製真菌加水分解酵素（ＢＥＴＵＺＹＭ）及び液体サトウダイコンパルプの流れを生み出すための好熱性真菌を成長させるための発酵性の炭素豊富な供給原料として使用される。
【実施形態の説明】
【００２４】
本発明は、単一細胞タンパク質の生産に関する。特に、本発明は、好熱性真菌のバイオマスが、単一細胞タンパク質として生産される、単一細胞タンパク質を生産する方法に関する。
【００２５】
用語「単一細胞タンパク質」は、「ＳＣＰ」と省略され、本明細書で、単細胞の細菌、酵母、真菌又は藻類を含む、単細胞（又は単一細胞）状態で存在する生物の細胞から本質的になるバイオマスを指すと理解され、そのバイオマスは、乾燥形態にあり、ヒトの食物又は動物飼料中のタンパク質又はタンパク質サプリメントの食餌供給源として適切であることが好ましい。
【００２６】
本発明では、新規の方法概念が開発され、これは高温及び低ｐＨ、及び好熱性真菌を使用し、この真菌が自分自身の細胞外加水分解酵素を産生し、これにより方法が非滅菌条件下で実施することが可能になる、その理由は、４５℃より高い温度及び３．８未満のｐＨで、他の（微）生物が真菌に対して侵襲及び／又は競合できないからである。したがって、好熱性真菌が使用され、これは、両方の単純糖、例えばスクロース及びグルコース、フルクトース、並びにポリマー糖、例えばデンプン、イヌリン、セルロース、ヘミセルロース、キチン、ペクチン、並びに有機酸、例えば乳酸、酢酸、蟻酸、並びにエタノール及びメタノール（これらの代謝物は、多くの場合、サイレージプロセス中に又はそれらをペクチン及びヘミセルロースから分離することから形成される）、並びにトリグリセリド又はリン脂質の形態で存在する脂質を含む、高エネルギー炭素優性供給原料（ｅｎｅｒｇｙ−ｒｉｃｈ  ｃａｒｂｏｎ−ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）中で成長することができる。ヘミセルロース；ラムノース、フコース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクツロン酸、グルクロン酸などに存在するものなどの他の糖の変換も必要であり、加えてラフィノース、メリビオース、スタキオースなどは、飼料成分のタンパク質生産物を増強するため好ましく、廃水処理／バイオガス設備へと進行しなければならない濾過物からの炭素負荷を最小限にする。真菌によるベタイン、フェルラ酸及びクマル酸の変換も、収量を最大化するため好ましい。コンポスト化のようなプロセスにおいて発生する多くの好熱性真菌の利点は、これらが、非常に過酷な条件をもちこたえることができ、炭水化物などのポリマー基質を単量体糖に分割し、それらを変換する酵素を産生することができることである。
【００２７】
第１の態様では、本発明は、ＳＣＰを生産する方法に関する。方法は、好ましくは：ａ）好熱性真菌を、発酵性の炭素豊富な供給原料を含有する培地中で成長させるステップを含む。ステップａ）では、真菌を液中培養で成長させることが好ましい。ステップａ）では、真菌が、非滅菌条件下で成長させることが好ましい。ステップａ）では、真菌が、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４若しくは５５℃又はそれ以上の温度で成長させることが好ましい。ステップａ）では、真菌が、３．８、３．７５、３．７４、３．７３、３．７２、３．７１、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１若しくは３．０又はそれ未満のｐＨにあることが好ましい。方法は、ｂ）ステップａ）で成長させた前記好熱性真菌のバイオマスの形態で、前記培地からＳＣＰを回収する更なるステップを含むことが好ましい。
【００２８】
低ｐＨでのＳＣＰの生産において解決される１つの問題は、多くの発酵性の炭素豊富な供給原料の毒性である。特に加水分解されたバイオマス又はサイレージ生産物は、有機酸、例えば、酢酸、乳酸、フェルラ酸、クマル酸、蟻酸を含む、ほとんどの微生物に毒性がある化合物を含有する可能性がより高い。これらの酸は、これらが非解離性の形態にある場合、低ｐＨで特に毒性があり、それ自体が細胞壁に容易に浸透し、細胞の内部を酸性化することができる。そのような発酵性の炭素豊富な供給原料が低ｐＨ及び２、５又は１０％超の乾物濃度（ｗ／ｖ）で発酵に適用される場合、毒性が真菌の成長を妨げる。
【００２９】
したがって、本発明の方法では、ステップａ）において、炭素豊富な供給原料の濃度は、供給原料中の毒性化合物が、真菌の成長速度を低減させないレベルであることが好ましい。炭素豊富な供給原料は、供給原料中の毒性化合物が、真菌の成長速度を低減させない割合で培地に供給されることがより好ましい。例えば、本発明による方法では、培地中の炭素豊富な供給原料が、５、４、３若しくは２％（ｗ／ｖ）の乾物濃度であるか、又はそれ未満の濃度が維持される割合で培地に供給される。供給原料の発酵性は、発酵槽の排出ガスのＣＯ２含有量及びＯ２含有量の少なくとも１つを測定することによって適宜チェック又はモニターすることができる。したがって、供給原料が真菌の成長速度に負の影響を及ぼさずに使用することができる最大濃度は、培地中の供給原料が、ＣＯ２産生の割合及び酸素消費の割合の少なくとも１つの減少に濃度が達する場合まで、濃度を増加させることによって決定することができる。したがって、本発明の方法では、供給原料中の毒性化合物が真菌の成長速度を低減させない濃度が、真菌による、ＣＯ２産生の割合及びＯ２消費の割合の少なくとも１つにおける低減の原因とならない、炭素豊富な供給原料の最高の濃度として、決定及び／又は規定されることが好ましい。良好に発酵する供給原料は、呼吸（発酵からのオフガス中のＣＯ２濃度の増加又は酸素濃度の減少）によって決定することができるような、ＣＯ２産生又は酸素消費の割合の急速な増加を可能にする。ＣＯ２放出割合が低い場合、成長は、遅延する、また成長の開始が始まり、ＣＯ２産生が加速するまで、水で希釈することによって増強させることができる。
【００３０】
実施例では、本発明者らは、例えば、接種前に加水分解されたバイオマスを＜２％乾物に希釈することによるフェドバッチ技術を適用し、バッチ段階を完了し、有機酸及び糖が消費される際、グルコース制限条件（例えば、グルコース＝＜２ｇ／Ｌ）で遅い速度で加水分解されたバイオマスで供給を開始して真菌に発酵槽に供給された全ての毒性がある有機酸を消費させた。
【００３１】
したがって、本発明の好ましい方法は、フェドバッチ法、反復フェドバッチ法（反復して、発酵ブロスの一部が収穫される）又は連続法である。そのような方法では、希釈割合（すなわち、供給原料が発酵槽に供給される割合）は、できる限り高くすることが好ましいが、真菌の流出を防止するために、真菌の最大比成長速度以下であることが好ましい。本発明の方法では、希釈割合は、好ましくは、０．０５〜０．２  １／時間の範囲にあり、これは、発酵槽における５〜２０時間の発酵槽中の滞留時間を意味する。したがって、希釈割合は、好ましくは、少なくとも０．０５又は０．１  １／時間、好ましくは、０．２  １／時間以下である。
【００３２】
本発明の更に好ましい方法では、方法は、２つ又はそれ以上の発酵槽の使用を含み、少なくとも第１の発酵槽が、収穫及び任意選択で清浄化のために空であり、少なくとも第２の発酵槽中で、真菌の成長が継続する。空の発酵槽の清浄化は、例えば、酸（例えば、硫酸又はリン酸）、アルカリ（例えば、ＮａＯＨ又はＫＯＨ）、消毒剤（例えば、過酸化水素又は過酢酸）ですすぐこと又は熱（例えば、蒸気）による消毒を含み、例えば、細菌又は酵母による発酵の感染を制御することが好ましい。清浄化は、好ましくは、ＣＩＰ設備を使用して行われる。一実施形態では、方法は、１、２又は３日当たり１回、収穫及び任意選択で清浄化のために交互に空になる、少なくとも一対の発酵槽中で実施される。この操作は、方法の改善バージョンであり、これにより、非滅菌条件が方法の不安定性又は質若しくは方法の安定性における偏りがなく実施されることを可能にする。方法の更なる好ましい実施形態では、収穫及び任意選択で清浄化後、空の第１の発酵槽が、第２の発酵槽の内容物の少なくとも一部で満たされ、成長が、第１の発酵槽の収穫及び任意選択で清浄化の期間に継続される。方法の次のラウンドでは、第２の発酵槽が、収穫及び任意選択で清浄化され、次に第１の発酵槽の内容物の少なくとも一部で満たされ、成長が、第２の発酵槽等の収穫及び任意選択で清浄化の期間に継続される。方法の更に別の実施形態では、収穫された発酵バッチが、更なる連続的な発酵段階において収集されて、より高い生産物収量及び／又はＤＳＰ領域の安定な供給を可能にする。
【００３３】
本発明の方法では、（供給原料の）乾物濃度は、酸素消費速度が、発酵槽の酸素移動能力を超えないように管理されることが好ましく、これは、不十分な通気及び不完全な基質酸化につながるであろう。
【００３４】
本発明の方法では、培地中の供給原料の乾物濃度は、下流のプロセスが、最もコスト効率の高いように、最適化されることが更に好ましい。濾過及び／又はデカンテーションされる収穫される発酵性培地の量を最小化するため及び蒸発させる水の量を最小化するため（例えば、ミネラル肥料を販売する場合において濾過物から由来する水）、培地中の供給原料の乾物濃度はできる限り高いことが好ましい。他方、培地中の供給原料の乾物濃度が高過ぎる場合、真菌ブロスの粘性は増加し、酸素移動が問題となる。発明者らは、発酵槽における培地中の供給原料の至適な乾物濃度が、使用された原料、塩ストレス、毒性代謝産物に応じて、２〜１５％乾物（ｗ／ｖ）の範囲にあることを見出した。加えて、ブロスのレオロジーが、真菌の成長形態によって部分的に決定された。本発明の方法において真菌の好ましい成長形態は、容易な酸素移動及び混合を可能にするブロスの低い粘性を与えるため十分に短いが、低いｇ値で容易な濾過又はデカンテーションを可能にするため十分に長い、菌糸（ｈｙｐｈａｌ）の長さである。したがって、菌糸の長さが１０〜５００μｍ（マイクロメートル）の範囲にあることが好ましく、菌糸があまり多く分枝していないことが好ましい。菌糸の長さが３０〜３００μｍの範囲にあることがより好ましい。菌糸体が、篩又はスクリーン（好ましくは、０．１、０．５、１又は２ｍｍ直径の孔を有する）に保持されることによって容易に収穫できることが好ましい。
【００３５】
本発明の方法では、窒素制限が、回避されることが好ましい。したがって、真菌は、炭素制限下で成長させることが好ましい。それにより、生産されたバイオマスのタンパク質含有量を最大化することができ、炭素過剰の結果としての、炭素を保持及び／又は貯蔵する化合物、例えばトレハロース、グリコーゲン及び／又は脂質の蓄積を回避することができる。
【００３６】
本発明の方法において使用される真菌（すなわち、方法で成長させる真菌）は、好ましくは好熱性真菌である。本発明において使用する好熱性真菌は、好ましくは、少なくとも４５、４６、４７、４８、５０、５１、５２、又は５５℃、時々は、さらに５６℃超の温度で成長させる真菌である。本発明において使用する好熱性真菌はまた、好ましくは、低い（すなわち、酸性のｐＨ）で成長させる真菌である。好ましい好熱性真菌は、３．８、３．７５、３．７４、３．７３、３．７２、３．７１、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１若しくは３．０又はそれ未満のｐＨで成長させる。本発明において使用する好熱性真菌は、好ましくは、セルロース分解性及び／又はヘミセルロース分解性真菌である。
【００３７】
「真菌」には、真核生物の微生物として本明細書に規定され、真菌亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の全ての種が含まれる（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓら、１９６２、Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。したがって、用語「真菌」には、糸状菌及び酵母の両方が含まれる。「糸状真菌」は、真菌亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）及び卵菌亜門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての糸状形態を含む真核生物の微生物として本明細書に規定される（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ら、１９８３、Ｉｎ：  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｒｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ．  ７ｔｈ  ｅｄ．  Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｗ、Ｓｕｒｒｅｙによる規定）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖から構成される菌糸体壁によって特性決定される。栄養成長は菌糸の伸長により、炭素カタボリズムは、偏性的（ｏｂｌｉｇａｔｅｌｙ）に好気性である。
【００３８】
本発明において使用する好熱性真菌は、好ましくは、糸状菌である。本発明における使用のための好ましい好熱性真菌は、ラサムソニア属、タラロミセス属、ペニシリウム属、アクレモニウム属、フミコラ属、ペシロミセス属、カエトミウム属、リゾムコール属、リゾプス属、サーモミセス属、マセリオフトーラ属、サーモアスカス属、チエラビア属、ムコール属、スチベラ属、メラノカルプス属、マルブランケア属、ダクチロミセス属、カナリオミセス属、スキタリジウム属、ミリオコッカム属、コリナスカス属、及びクーネメリア属からなる群から選択される真菌属の株である。好熱性真菌は、ラサムソニア・コンポスティコラ、タラロミセス・エメルソニイ、ラサムソニア・エメルソニイ、サーモムコール・インディカセウダチカ、リゾムコール・ミエヘイ、リゾムコール・プシルス、チエラビア・テリコラマイナー変種（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ  ｖａｒ  ｍｉｎｏｒ）、リゾプス属種及びサーモアスカス・サーモフィラスからなる群から選択される真菌種の株であることがより好ましい。これらの好熱性真菌の適切な株は、例えばＤｕｔｃｈコンポストから単離することができ、本発明者らによって首尾よく使用されて、これらの好熱性真菌が、高温及び低ｐＨで複合栄養素（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ）において良好に成長することが実証されている。この次に、本発明における使用のための多くの好熱性株は、例えば、チエラビア・テリコラマイナー変種及びサーモアスカス・サーモフィラスであり、これも高温及び低ｐＨで良好に成長する。リゾプス属種は、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・クラミドスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）又はムコール・インディカス（Ｍｕｃｏｒ  ｉｎｄｉｃｕｓ）のいずれかであり得る。或いは、リゾプス属種は、今までのところ未同定のリゾプス属又はムコール属種（リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０に対応する）であり得る。リゾプス属種は食物における使用に安全であることが好ましく、リゾプス属種はテンペスターターであることがより好ましい。
【００３９】
本発明における使用のための上記で言及した好熱性真菌の好ましい株には、ｔｈｅ  Ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  （以前にＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＣＢＳと称された）でブダペスト条約の規則に従って寄託され、示された日付が付され、示された受託番号が割り当てられた以下の株が含まれる：ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５（２０１６年７月２９日）、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７（２０１７年７月２１日）、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９（２０１７年７月２１日）、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８（２０１７年７月２１日）、ラサムソニア・エメルソニイ株ＣＢＳ１４３０３０（２０１７年７月３０日）及びリゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０（２０１７年８月１１日）。本発明における使用のための更に好ましい株には、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１０４．７５、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４及びサーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５が含まれる。本発明における使用のための特に好ましいものは、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株である。
【００４０】
本発明における使用のための好熱性真菌は、更に好ましくは、バイオマスを高いタンパク質含有量で得ることができる真菌である。バイオマスのタンパク質含有量は、乾物ベースで少なくとも３０、３５、４０、４５、５０又は５５％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。高タンパク質株は、より低量の炭素を保持及び／又は貯蔵する化合物、例えば、トレハロース、グリコーゲン及び／又は脂質を有する可能性が最も高い。
【００４１】
本発明における使用のための好熱性真菌は、更に好ましくは、バイオマス中のタンパク質が、必須アミノ酸のうちの１つ又は複数を含有する真菌である。タンパク質が、そのような必須アミノ酸が豊富であることが好ましい。必須アミノ酸には、本明細書で、リジン、フェニルアラニン、トレオニン、メチオニン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、イソロイシン及びロイシンのうちの少なくとも１つ又は複数が含まれ、そのうちのリジン、トレオニン、メチオニンが最も好ましいと理解される。
【００４２】
ＳＣＰ生産物はヒトが消費する動物の食物又は飼料における使用のため意図されているので、適用される好熱性真菌によるオクラトキシンＡ及びフモニシンなどのマイコトキシンの産生は望ましくない。したがって、本発明において使用する好熱性真菌は、好ましくは、いかなるマイコトキシンも産生しないものが選択される。このスクリーニングは、好ましくは、マイコトキシン経路中の遺伝子の存在又は非存在を、例えば、ＰＣＲで又は全ゲノムシークエンシングで検証することによる、並びに、そのような遺伝子が存在する場合、使用されたプロセス条件下で、これらの遺伝子が発現されない及び／又はこれらの毒性化合物が産生されないことを検証することによる、遺伝的な手段によって行われる。
【００４３】
或いは、本発明の方法に使用される好熱性真菌は、遺伝的に改変されて、増加した量の加水分解酵素を産生し、好ましくは、インベルターゼ（例えば、ラサムソニア属について）、セルロース分解性及び／又はリグノセルロース分解性酵素が、本発明において使用される（例えば、国際公開第２０１１／０００９４９号に記載される）。増強した酵素産生は低減した加水分解時間につなげることができ、次に小さなタンクを使用することができ、酵素含有濾過物／デカンテーション物（ｄｅｃａｎｔａｔｅ）を二次生産物として商品化することができる。
【００４４】
本発明の方法において使用される発酵性の炭素豊富な供給原料は、好熱性真菌の炭素及びエネルギー源として機能することができる任意の供給原料であり得る。そのような炭素豊富な供給原料は、食物糖、例えばトウモロコシ、サトウダイコン、希薄なジュース、高濃度のジュース、サトウキビジュースの一次生産から新たに収穫される作物であり得る。しかしながら、ＳＣＰが動物飼料に適用されることが意図される場合、供給原料として、農業及び／又は食物生産からの炭素豊富な副生物又は副産物又は廃棄物の流れ、例えばサトウダイコンパルプ、穀粒加工からの液体Ｃ−デンプン、皮をむいた又はカットした野菜の生産物からの又は選別外の野菜からの野菜廃棄物、例えばジャガイモの皮からの皮及びフレンチフライ生産物からのカットした残留物、商取引から拒否されたジャガイモ、及びまた、例えばパーム油及びパーム油脂肪酸を主に含有するパーム油ミル廃液（ＰＯＭＥ）及び空果房（ＥＦＢ）又はシュロの葉を含むパームミル残留物を使用することがより道理に適っており、好ましい。また、サイレージとして保存された供給原料を考慮することができ、そのため、１年中ＳＣＰにプロセスすることができるが、供給原料は、例えばサトウダイコンパルプ又はジャガイモ若しくはサトウダイコンの葉の場合では一連の作業で収穫される。また、飼料用ビート全体からのサイレージを、例えば、トウモロコシ若しくはトウモロコシ全体又はそのエンシレージ形態と組み合わせて使用することができるが、リグニン豊富なトウモロコシの茎葉は好ましくなく、サトウキビの絞りかすも好ましくない。例えば、リグノセルロース加水分解物からのペントースも、使用することができる。これらのシロップは、主にグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース及びガラクトースを含有する。本発明の方法のための発酵性の炭素豊富な供給原料としての原料の別の厖大な供給源は、都市ゴミ（ＭＳＷ）の有機物画分である。また、嫌気性廃水からのスラッジを、使用することができ、例えば、トイレットペーパーが含まれる。また、この方法は、脱水嫌気性スラッジに対する凝集剤の使用を省くことができる、その理由は、この方法における真菌は、篩にかけ、凝集剤なしでプレスすることができるからである。これは、回収業務が改善されると、より重要になることがあり、十分に清浄化した有機物の流れを、更に加工することなく収穫することができる。
【００４５】
（ヒトが消費する）食品の製造のためのＳＣＰの生産について、食物における適用に適合する又は許容できる植物由来の任意の生産物を、例えば、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、コメ、キャッサバ、サトウキビ又はサトウキビジュース、サトウダイコン又はサトウダイコンジュース又は高濃度のジュース、廃糖蜜、甘蔗廃糖蜜、グルコースシロップ、フルクトースシロップ、又は食物用途に適切な任意の他の野菜生産物を含む、炭素豊富な供給原料として、本発明に適用することができる。脂質豊富な画分、例えば、野菜油又はそれらからの画分はまた、炭素豊富な供給原料として本発明に適用することができる、その理由は、選択された生物はまた、例えばダイズ油又はヒマワリ油などを含むトリグリセリドを消費するからである。
【００４６】
本発明の方法では、培地は、更に好ましくは窒素の供給源を含有する及び／又は供給される。窒素源が、アンモニア、尿素及び硝酸塩（の供給源）のうちの１つ又は複数を含むことが好ましい。窒素源としては、還元型、例えば尿素及びアンモニウムであることがより好ましい。ＮＨ３又はＨ２ＮＯ３は、発酵槽中のｐＨをさらに制御することができる又は尿素は、窒素源のｐＨ非依存性供給源として使用することができる。廃棄物の流れからの窒素源も好ましい。これらには、例えば、廃糖蜜、サトウダイコン又はキビ残渣、ワイン産業からの残渣、ブドウ残留物、ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ）、コーンスティープ液（ＣＳＬ）、動物農場排出ガス清浄化スクラバーからのアンモニア、及び肥料加工からの希薄な画分の、濃縮物から得られる、負荷濃縮物に存在するアミンのうちの１つ又は複数が含まれる。
【００４７】
本発明の方法のｂ）の任意選択の更なるステップでは、ＳＣＰは、ステップａ）で成長させた好熱性真菌のバイオマスの形態で培地から回収される。バイオマスは、篩分け、濾過及びデカンテーションのうちの少なくとも１つによって培地から回収されることが好ましい。バイオマスが、回転ドラム濾過、フィルタープレス、ベルトフィルター、デカンター遠心分離機及び篩分けのうちの少なくとも１つによって培地から回収されることがより好ましい。バイオマスは、０．１、０．５、１又は２ｍｍ直径の孔を有する篩又はスクリーンで篩分けすることによって回収されることが好ましい。バイオマスは、篩又はスクリーンにおいて少なくとも２、３又は４回の連続的なラウンドの篩分けを行うことによって回収され、それによって、より小さい直径の孔が、各々の引き続くラウンドの篩分けに適用されることがより好ましい。例えば、２ｍｍ孔直径を使用する最初のラウンドの篩分け、続いて、１、０．５及び／又は０．１ｍｍの引き続くラウンド。
【００４８】
篩分け、濾過又はデカンテーションしたバイオマス（ケーキ）の乾物濃度は、少なくとも１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％、５３％、５４％又は５５％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。任意選択で、篩分け、濾過又はデカンテーションしたバイオマス（ケーキ）の乾物濃度は、水の更なる除去（すなわち、乾燥）によって更に増加する。
【００４９】
バイオマスケーキは、例えば、ニューマプレスを使用する圧縮空気及び／又は例えば、ベルトプレス若しくはスクリュープレスを使用する機械的なプレスを使用して（いっそう多くの）残留する水をプレスすることによって、例えば更に乾燥することができる。より暖かい気候では、バイオマス（ケーキ）は、空気乾燥（天日干し）へと単純に乾燥することができる。バイオマスをケーキにプレスした後、任意選択でケーキは、ミルにかける又は押出すことができ、例えば乾燥、好ましくは風乾を可能とする。プレスした菌糸体バイオマスケーキの粒子サイズは、物理的な手段によって低減されて、プレスしたケーキの（より効率的な）乾燥が可能とされることが好ましい。これは、任意選択で、押出機（それ自体は当技術分野において公知）を使用して、直径０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８又は２ｍｍを有する穴を通して菌糸体ケーキの押出によって行うことができる。しかしながら、プレスした後のプレスしたケーキの乾物濃度が、プレスしたケーキの押出が、もはや可能ではない程に高い場合（例えば、ケーキが、押出を可能にするには堅過ぎる場合）、ケーキの粒子サイズは、ミルにかけること及び篩分けの組合せによって低減させることができる。ミルにかけるステップとして、任意のタイプの、それ自体は当技術分野において公知のミル、例えば、ナイフミル又はハンマーミルなどを使用することができる。ミルにかけ、プレスしたケーキの均質な粒子サイズを得るため、ミルにかけた後になお存在するより大きな粒子は、０．５、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５又は３ｍｍの篩における孔直径サイズで篩分けすることによって乾燥させる前に除去することができる。得られるミルにかけたケーキは、好ましくは、乾燥前に、１〜３ｍｍの間の粒子サイズを有するであろう。粒子サイズを低減させることにより、プレスしたケーキからの水の蒸発は、より効率的で、より速い。
【００５０】
ケーキの乾燥は、植物からなどの廃棄熱を使用することによって行われるのが好ましく、熱水は、ガスの凝縮後に得られる（例えば、エタノール蒸留、ジャガイモ調理、ジャガイモの蒸気皮むきなど）。空気を熱交換体を使用して加熱して、乾いた空気を熱供給源からの熱水で加熱することができる。
【００５１】
押出した又はミルにかけたケーキの乾燥は、好ましくは、３０〜７０℃の温度で行われる。次に、熱い空気により、ベルト乾燥機又は流動床乾燥機において穏やかに費用効果がある手段でケーキを乾燥させることができる。高い温度（例えば、＞８０℃）での蒸気乾燥は回避されないことが好ましく、その理由は、変性及びベーキング及び更にメイラード反応によるアミノ酸の化学分解によってタンパク質の消化性に負の影響を及ぼしうるからである。
【００５２】
したがって、本発明の方法に適用される好熱性真菌は、好ましくは、良好な濾過特性（上記を参照）を有し、タンパク質豊富な動物飼料ケーキが、回転ドラム濾過、スクリーンストラップ、フィルタープレス、ベルトフィルターなど又は低いｇ力で操作されるデカンター遠心分離機（Ｓｕｍａｎら、２０１５上記）、篩、ＤＳＭスクリーン、ベルト篩、ベルトプレス、スクリュープレスなどの単純な濾過によって得ることができる。湿性の生産物は、微生物の劣化を防ぐため、ｐＨ≦４．５を保つことによって、任意選択で組み合わせて、有機酸、例えば蟻酸、酢酸、安息香酸を加えることによって安定化することができる。液体飼料の生産のコストは一般により低いが、任意選択で、例えば、流動床乾燥、ドラム乾燥、ベルト乾燥又は乾燥の任意の他の手段を使用する動物飼料ケーキの乾燥を、輸送、ロジスティックス及び／又は貯蔵安定性がそのように要求する場合、考慮してもよい。特に好ましい方法では、バイオマスの濃縮は、以下の複数のステップ及び組合せにおいて行われる：例えば、２ｍｍ、１ｍｍ、０．１ｍｍ及び５０ｕｍの少なくとも２つから選択される孔径を通して引き続いて篩分けし；次にスクリーンストラップ、スクリュープレス、ベルトプレス及びニューマプレスを使用するプレスの少なくとも１つによって濃縮される。バイオマスを濃縮する最も好ましい方法は、ＤＳＭスクリーン（最適化した直径スクリーンでの）、スクリーンストラップ及びベルトプレスの単純な組合せであり得る。
【００５３】
本発明の方法の一実施形態では、水及び真菌によって生産される酵素を含有する濾過物は、再利用し、次の発酵ラウンドに使用することができる。全プロセス中で水利用は、最小限に抑えられることが好ましい。したがって、方法では、バイオマス（ケーキ）の篩分け、濾過、デカンテーション、及び／又は更なるプレスの後に得られる水画分（濾過物）は、発酵に戻して再利用されるか、及び／又は更に発酵バッチのために（再）使用されることが好ましい。これは、発酵が、低い乾物（例えば、１０、５、又は２％乾物未満）で実施される場合に特に好ましい。回収プロセスからの濾過物の少なくとも１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％が、再利用されることが好ましい。再利用の結果として、塩及び非消耗物が高過ぎる濃度に蓄積する場合、濾過物の一部は、廃水処理に流出させてもよい及び／又は肥料生産に使用してもよい。したがって、方法中に滴定液を選択して、適切な肥料組成物が、濾過物から得られうることが好ましく、組成物は、Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｓ、Ｍｇ及びＣａのうちの１つ又は複数を含むことが好ましい。水画分の再利用は、廃水処理能力及び／又は淡水利用を低減させることによって方法の全体的な経済状況を改善させる。任意選択で、第１の発酵の濾過物は、第２の生物に第１の生物によって消耗性ではない炭素源を消費させることを可能にする第２の発酵において使用することができる。一発酵における２つ又はそれ以上の生物の適用も、可能であろう。２つ又はそれ以上の発酵の実施における、２つの異なる好熱性真菌の同時に又は引き続くどちらかの適用は、収量、アミノ酸プロファイル、食味、身体的な行動及びより多くの最適化を可能にするであろう。好ましい実施形態では、好熱性真菌の株のうちの１つ又は複数での第１の発酵から得られる濾過物は、好熱性真菌の株のうちの１つ又は複数での第２の発酵に使用され、第２の発酵における少なくとも１つの好熱性真菌株は、第１の発酵に使用される株と異なる。第１及び第２の発酵のための株は、それらのバイオマスのアミノ酸プロファイル及び／又は炭素豊富な供給原料の画分を消費する能力の観点から補足的であるよう選択されることが好ましい。第１及び第２の並びに任意選択で更なる発酵に使用される好熱性真菌の株は、先に言及した好熱性真菌及び株から選択されることが好ましい。引き続いて使用することができる２つの補足的な好熱性真菌の例は、例えば、本明細書の実施例１１に例示されるように、例えば、サーモムコール属の株及びラサムソニア属の株である。
【００５４】
或いは、酵素を回収して、動物の飼料又は洗剤での洗浄、工業的なクリーニングなどで使用するための酵素調製物として販売することもできる。
【００５５】
好熱性真菌の使用の別の利点は、発酵槽が、まったく冷却せずに（Ｓｕｍａｎら、２０１５上記）、例えばエネルギーの入力が必要ないずれの（有効な）冷却装置も用いずに操作できることである。したがって、発酵槽中の内部冷却コイルも撹拌した発酵槽のバッフル中の冷却コイルも発酵槽壁中の冷却コイルもＲｉｅｓｅｌ冷却も、冷却塔も要求しない。熱交換体を使用する外部冷却ループもまた必要とされない。これにより植物における投資が低減される、その理由は、冷却が、水の蒸発にのみ依存するからであり、これは、ＣＯ２が換気される発酵槽の排出ガス排出口及び／又は発酵槽の環境で受動的に交換させた熱を介して発酵槽を離れる。
【００５６】
発酵槽は、滅菌空気を導入して（外来の真菌スポア又は酵母が侵襲するのを防止する）手段を有することが好ましく、例えば、ＮＨ３及び／又はＨ２ＳＯ４若しくはＨ２ＮＯ３でｐＨを制御する手段を有することが好ましい。一部の例では、リン酸塩の必要性も明らかであることがあり、そのような場合では、リン酸アンモニウムの使用が、本発明の方法では好ましい。
【００５７】
本発明の方法が実施される発酵槽は、原則的には、任意のタイプの当技術分野において公知の発酵槽であり得る。発酵槽は単純な気泡塔であり、これを、＞１００ｍ３、＞２００ｍ３、＞５００ｍ３、＞１０００ｍ３、＞２０００ｍ３又は＞３０００ｍ３など非常に大規模で操作することができ、それによって、工場当たりの発酵槽の数、総投資及び操作上のコストが低減されることが有利である。
【００５８】
本発明による方法において得られるＳＣＰは、例えば、ブタ、家禽、反芻動物家畜並びに水生の魚及び甲殻類種を含む、種々の異なる家畜動物タイプのための飼料に対するサプリメントに使用することができる。魚飼料としてのＳＣＰの適用について、好ましくは、飼料は、魚油、又は脂質が豊富な藻類、例えば、クリプトコディニウム（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、又はトラウストキトリウムアウレウム（Ｔｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）などのオメガ脂肪酸の供給源で富化される。本発明による方法において得られるＳＣＰの追加の利点は、ＳＣＰが生産される酸性のｐＨが、他の方法において生産されるＳＣＰに存在しうる、問題の細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の混入を防止することである。
【００５９】
或いは、本発明による方法において得られるＳＣＰは、食物又は食物成分として使用することができる。
【００６０】
例えば、ダイズは総アミノ酸のおよそ６％のリジン含有量を有するが、現存する真菌のＳＣＰは、フザリウム・ベネナツムバイオマス（Ｑｕｏｒｎ（商標））に関して８．３％又はＰｅｋｉｌｏタンパク質（ペシロミセスバリオッティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉ））に関して５．６％の総アミノ酸のリジン含有量を有する。本発明者らは、ここで、ラサムソニア・コンポスティコラタンパク質の総必須アミノ酸の合計は、ダイズタンパク質のものよりも１６％高く、サーモムコール・インディカセウダチカに関して、さらにダイズタンパク質のものよりも２５％高いと思われることを見出した。さらに、本発明者らは、サーモムコール・インディカセウダチカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ  ｉｎｄｉｃａｅ−ｓｅｕｄａｔｉｃａ）（例えば、株ＣＢＳ１４３０２７）からのＳＣＰが、総アミノ酸の８．５％超及びさらに１０％超のリジン含有量並びに総アミノ酸の少なくとも１０％のフェニルアラニン含有量を有することを見出した。したがって、サーモムコール株からのＳＣＰは、高いタンパク質含有量を有するだけでなく、高いリジン及びフェニルアラニン含有量も有する。したがって、サーモムコールＳＣＰは、驚くべきことに、高い栄養価を有する。
【００６１】
したがって、一態様では、本発明は、本発明者らによって単離された好熱性真菌株に関する。好熱性真菌株は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株からなる群から選択されることが好ましい。
【００６２】
更なる態様では、本発明は、本明細書の上記のような方法において入手可能な又は生産されるバイオマスからのタンパク質を含むＳＣＰ生産物に関する。ＳＣＰ生産物が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％、５３％、５４％又は５５％（ｗ／ｖ）の乾物濃度を有する乾燥バイオマスを含む又はからなり、これが１〜３ｍｍの範囲の平均粒子サイズにミルにかける又は押出されることが好ましい。この生産物をパックするため運搬して、次の加工ステップに運搬することができる。タンパク質豊富な生産物は、次に引き続いて乾燥することができる。
【００６３】
本発明によるＳＣＰ生産物は、少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含むことが好ましく、ここで好熱性真菌株は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４、サーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５及びリゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９、ＣＢＳ１４３１６０及びＣＢＳ１４３０２８株が好ましい。したがって、ＳＣＰ生産物は、上記のように、回収され、プレスされ、乾燥され、ミルにかけられ及び／又は押出されたバイオマス若しくはバイオマスケーキであり得る。ＳＣＰ生産物（又はバイオマス中のタンパク質）が、ダイズタンパク質中の総必須アミノ酸の合計よりも少なくとも１０％高い総必須アミノ酸の合計を有することが好ましい。ＳＣＰ生産物（又はバイオマス中のタンパク質）が、総アミノ酸の少なくとも８．５％のリジン含有量及び総アミノ酸の少なくとも１０％のフェニルアラニン含有量の少なくとも１つを有することがより好ましい。
【００６４】
更なる態様では、本発明は、少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含む食物又は飼料生産物であって、好熱性真菌株は、ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５、ラサムソニア・エメルソニイＣＢＳ１４３０３０、Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ  ｉｎｄｉｃａｅ−ｓｅｕｄａｔｉｃａｅＣＢＳ１４３０２７及びＣＢＳ１０４．７５、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９、リゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８、サーモアスカス・サーモフィラスＣＢＳ５２８．７１、チエラビア・テレストリスＣＢＳ５４６．８６、タラロミセス・エメルソニイＣＢＳ３９３．６４、リゾプス属種ＣＢＳ１４３１６０及びサーモセロミセス・サーモフィラＣＢＳ１１７．６５である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４１６９５、ＣＢＳ１４３０３０、ＣＢＳ１４３０２７、ＣＢＳ１４３０２９、ＣＢＳ１４３１６０及びＣＢＳ１４３０２８株が好ましい、食物又は飼料生産物に関する。
【００６５】
別記しない限り、全てのパーセンテージ乾物は、体積当たりの重量パーセンテージとして示される。
【００６６】
本文書及びその特許請求の範囲では、「含む」という動詞及びその活用は、その単語の次に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されるものではないということを意味する、非限定的な意味で使用されている。加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素の参照により、僅か１つの要素が存在することを明らかに要求する文脈がない限り１を超える要素が存在する可能性が除外されない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００６７】
本明細書に引用される全ての特許及び文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
本発明は、図面に示され、以下の実施例に記載される幾つかの例示的な実施形態を参照して上に説明されている。幾つかの一部又は要素の修飾及び代替となる実行が、可能であり、添付される特許請求の範囲に規定される保護の範囲に含まれる。
【実施例】
【００６９】
実施例１  サトウダイコンパルプからのタンパク質豊富な動物飼料の生産
ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５の１ｍｌの凍結した菌糸体（−８０℃、グリセロール貯蔵物）を解凍し、１２１℃で２０分間滅菌した２５０ｍｌのバッフル付き好気性エルレンマイヤーフラスコ中で、ｐＨ４．５で３５ｍｌの酵母抽出物／グルコース培地（各々２０ｇ／Ｌ）に接種し、２２０ｒｐｍ、２５ｍｍの偏心距離で、４５℃で４８時間インキュベートした。
この４８時間の前培養物の１０ｍｌを、以下のサトウダイコンパルプ培地に移動した：
２５０ｍｌの培地を、真菌の成長に良い十分なＫ、Ｐ、Ｓ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｕを含有するミネラル溶液（米国特許出願公開第２００２００３９７５８号）、１．７５グラム／ＬのＮａＮＯ３、１．７５グラム／Ｌの硫酸二アンモニウム、０．１グラム／Ｌの酵母抽出物及び２０グラム／ＬのＦｉｂｒｅｘ５００（ミルにかけて微細なマッシュにした市販のサトウダイコンパルプであるＮｏｒｄｉｃ  Ｓｕｇａｒ）を含有する２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中に調製した。培地に１０滴のダイズ油を補充して泡立ちを防止し、１２１℃で２０分間滅菌した。
【００７０】
発酵後、発酵したマッシュを、ワットマンフィルターに対して濾過し、次にケーキを、分析前に凍結乾燥によって試料ＦＳＢＰ−１（発酵性サトウダイコンパルプ）へと乾燥した。サトウダイコンパルプは乾物ベースで１０〜１１％タンパク質を有するが、発酵性サトウダイコンパルプ試料ＦＳＢＰ−１は１ｇ乾物当たり２３０ｇ粗タンパク質のタンパク質含有量（Ｎ＊６．２５）及び表１に提供される以下のアミノ酸プロファイルを有していた。
【００７１】
【表１】
2019531058.tif 000002
【００７２】
実施例２．フェドバッチ法におけるＳＣＰの生産
サトウダイコンパルプを、２７％乾物でのサイレージプロセスからの糖パルプ１グラム当たり０．０２ｇのＶｉｓｃｏ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ＡＣ１００（Ｗｅｉｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して４５℃で液化した。サトウダイコンパルプを、水で希釈して８％の乾物濃度とし、振盪インキュベーター中で１５０ＲＰＭ、２５ｍｍ偏心距離で振盪した。サイレージのｐＨは、液化の開始時に３．８であった、３時間後、液化サトウダイコンパルプを加水分解反応器に加え、水で希釈して５．２％乾物とし、１５Ｌの撹拌タンク反応器中で４００ｒｐｍで撹拌し、温度をさらに６時間６０℃とし、その間、ｐＨを滴定液として８％アンモニアを使用してｐＨ４に制御した。次に、加水分解産物を、収穫し、発酵に供給して使用するまで凍結した。
【００７３】
ラサムソニア・コンポスティコラ株ＣＢＳ１４１６９５の１ｍｌの凍結したバイアル（−８０℃でのグリセロールストック）を解凍し、１２１℃で２０分間滅菌し、ｐＨ４．５で酵母抽出物２０ｇ／Ｌ及びグルコース（２０ｇ／Ｌ）培地を含有する、２５０ｍｌのバッフル付き振盪フラスコ中の３５ｍｌの培地に加えた。培養物を、４５℃で２４時間インキュベートし、次に２Ｌエルレンマイヤー中の同じ組成の２５０ｍｌの培地に移動し、別に２４時間、１８０ＲＰＭ、２５  ｍｍ偏心距離、４５℃で成長させた。
【００７４】
総計で、４４０ｍｌのそのような接種培養物（２フラスコの２５０ｍｌ、蒸発により約１００ｍｌの水を失う）を、以下の培地組成を有する１５Ｌ発酵槽に移動した：７４０ｇサトウダイコンパルプ加水分解産物を５．２％（上記の通り）、２Ｌ水道水、１４０グラムの適切なミネラルストック溶液（十分なリン酸塩、カリウム、マグネシウム、及び微量元素を提供する）、１４グラムの硫酸二アンモニウム。ｐＨを、硫酸を使用して３．５にセットした。温度を４５℃に制御し、酸素を空気スパージングを使用して高く（＞１０％）保ち、撹拌機速度を増加させた。２１時間後、供給を、液化サトウダイコンパルプで開始した。７．４ｋｇを、２４時間で加えた。次に、ブロスを、ワットマン４２カタログ番号１４４２０９０濾紙を使用してＢｕｃｈｎｅｒ漏斗で２５０ｍｂａｒ減圧で濾過したところ、ブロスは、＞３００Ｌ／ｍ２／時間の流量で非常に容易に濾過された。バイオマスケーキの乾物含有量は、３３％乾物であった。
【００７５】
加水分解されたサトウダイコンパルプ（エンシレージされたサトウダイコン貯蔵物由来）の発酵は、５％乾物でｐＨ３．５及び４８℃で可能ではなかった。発酵の開始は、低ｐＨの酸の毒性に起因して４８時間後に観察されなかった。
【００７６】
実施例３．乾燥ＳＣＰからの魚の生産
実施例２から得られた５２５ｇの３３％乾物バイオマスケーキを、１ｍｍ押出機を通して押出されたコムギグルテン１２．４グラム、市販の魚飼料（２７グラム）及び３．５ｇ炭酸カルシウムと混合し、流動床乾燥機中で３０℃で乾燥させた。１４５ｇの乾燥ＳＣＰは、乾物ベースでおよそ３０．８％タンパク質で得られた。この食餌中の全タンパク質の８０％は、ＳＣＰからである。乾燥したケーキを、ミルにかけ、０．５ｍｍの篩に対して篩分けした。
【００７７】
総計１５．４グラムの生体重の７尾のティラピアフィッシュは、この実験飼料を毎日供給され、２７〜２８℃で３０日後に、５８．７ｇの魚が得られ、その間に、総計１０９．５ｇの飼料が加えられ、１グラム飼料当たり０．５４ｇの新鮮な魚が得られることが実証された。魚は、非常に活発及び健康であり、食物を好み、糞便は正常であった。
【００７８】
実施例４．ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ）からの単一細胞タンパク質の生産
ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ、５３％乾物、乾物において３１．４％粗タンパク質、乾物において１５．１％カリウム）を、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｌｔ（ＥＭＳＬＡＮＤファクトリー）から得られた。
【００７９】
ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５の１ｍｌの凍結した菌糸体（−８０℃、グリセロール貯蔵物）を解凍し、１２１℃で２０分間滅菌した２５０ｍｌのバッフル付き好気性エルレンマイヤーフラスコ中でｐＨ４．５で３５ｍｌの酵母抽出物／グルコース培地（各々２０ｇ／Ｌ）に接種し、２２０ｒｐｍ  ２５ｍｍ偏心距離で４５℃で４８時間インキュベートした。
この４８時間の前培養物の２５ｍｌを、以下の成長培地に移動した：
２５０ｍｌの培地を、ｐＨ４．５で酵母抽出物／グルコース培地（各々２０ｇ／Ｌ）を含有する、２Ｌのバッフル付き好気性エルレンマイヤーフラスコ中に調製した。培地に１０滴のダイズ油を補充して泡立ちを防止し、１２１℃で２０分間滅菌した。第２ステージの接種物段階の栽培を、１８０ＲＰＭ、２５ｍｍ偏心距離、４５℃で行った。
【００８０】
２５０ｍｌの非常によく成長した培養を、３Ｌの水を含有するＳａｒｔｏｒｉｕｓの１５Ｌ  Ｃｐｌｕｓ発酵槽に接種し、１．２５グラム／Ｌの硫酸二アンモニウム及びＰＰＬ（それ自体、非滅菌）を、１０００ｇのＰＰＬが供給された場合、ｔ＝０に１０グラム／時間で開始し、１０時間に１００グラム／時間に上げ、それを１５時間まで保つ供給割合で発酵槽に供給した。ｐＨを、２５％硫酸を滴定液として使用して３．５＋／−０．１で制御した（ＰＰＬは５．６のｐＨを有する）。温度を４５℃に制御し、通気を１００ｍｂａｒ超過圧力での０．５ｖｖｍ通気及び７５０ｒｐｍでの撹拌によって行い、撹拌速度を調整することによって酸素を４０％又はそれ以上に保った。ＰＰＬにおけるｐＨ３．５及び４５℃でのＣＯ２放出に基づいた生物の最大比成長速度は、０．３５  １／時間であり、２．９時間の倍加時間を有していた。
【００８１】
次に、試料を、採取し、濾過後に分析し、ＦＰＰＬ−１（ＦＰＰＬ発酵性ジャガイモタンパク質液）として凍結乾燥した。オフガス中に測定されたＣＯ２産生が最大の３０％に低減した後、細胞を、３８８０ｇで２分間遠心分離することによって収穫し、次にペレットを水で１回洗浄し、凍結乾燥機中で乾燥した。ＦＰＰＬ−１粉末は３５．５％のタンパク質含有量を有し、タンパク質はＤｕｍａｓ法で決定された。総計で、１１５ｇのＦＰＰＬ乾物が、５３％乾物でＰＰＬの１ｋｇ当たり生産された。追加のグルコースを炭素と窒素の比において培地をバランスするため加えた場合、追加の２０ｇのＦＰＰＬ乾物を生産することができ、これが上清のアンモニウム含有量をゼロにまで低減させた。これはカリウム肥料の価値を最大化するため重要であり、その理由は、カリウム肥料の窒素含有量は、最高の価値を有するため、できる限り低くすべきであるからである。
【００８２】
実施例５．濾過物再利用での反復フェドバッチ
ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５を、５０ｇ／Ｌマルトデキストリン及び２０ｇ／Ｌ酵母抽出物及び０．５グラム／Ｌヒマワリ油を含み、ｐＨを４．５にセットし、１２１℃で２０分間滅菌した、培地において１Ｌ発酵槽中で前培養した。これに接種材料の２ｍｌ凍結バイアルを接種した。通気は０．５Ｌ／ｍであり、撹拌は１２００ｒｐｍ、温度は４５℃であった。
５．１第１の発酵（ジャガイモ廃棄物）
４８時間後、１Ｌの培養物を、２Ｌの水道水、０．５Ｌのジャガイモ液化物（１０Ｌのジャガイモ洗浄水を０．８％の固形物と組み合わせることによって調製される）、１１％固形物での０．８ｋｇの蒸気皮むきの皮（ジャガイモの蒸気皮むきの皮）及び蒸気鍋の低気圧から由来する０．８ｋｇのジャガイモスラッジ（６．５％固形物）を有する１５ＬのＣｐｌｕｓ発酵槽に移動し、これを、アンモニアを加えｐＨを４．３に増加させ、１ｇのαアミラーゼＦｕｅｌｚｙｍｅ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）を加えることによって液化し、引き続いて１時間、９５℃で加熱し、その間、ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＣｐｌｕｓ発酵槽中で５００ｒｐｍで撹拌し、１時間後、培地を、使用前に７０℃に冷却した。組み合わせ供給原料を混合した際、平均１ｋｇ当たり１９ｇ乾物（１．９％  ｄｍ）が、液化供給原料中に存在した。１０ｇの規定した培地ミネラル溶液を加えてミネラル不足を防止し、１０ｇ／のリン酸二アンモニウムを加えて過剰アンモニウムが存在してタンパク質を構築されることを確実にした。滴定液として、１２．５％アンモニウム及び７％のＨＮＯ３を、ｐＨ制御ポンプに連結した。温度は４８℃であり、ｐＨ設定点は３．６＋／−０．１であり、発酵槽は１分当たり２．５Ｌ（ＬＰＭ）で通気され、ｐＯ２は＞１０％であり、撹拌機は８００〜１５００ｒｐｍであった。
【００８３】
バッチの１６時間後、成長を完了した、これは、Ｂｌｕｅｓｅｎｓｅ  Ｏ２  ＣＯ２メーターを使用して発酵槽の出口ガス中で測定されるようなＣＯ２産生の安定化及び低減によって観察できた。
【００８４】
供給を、１時間当たり２Ｌの割合で開始し、２．５Ｌの培地を加えた後、発酵は、毒性液化物（主にジャガイモ副産物の貯蔵の期間に形成される酢酸及び乳酸のような有機酸の存在に起因して毒性である）の付加によって完全にブロックされた。毒性を克服するため、培地を３Ｌの水で希釈し、ｐＨを４．０に増加した（有機酸の毒性をより低くする）。次に４Ｌ超の水を、３Ｌを収穫した後に加え、ｐＨを再度３．６に低減させて細菌の成長の大発生を防止した。
【００８５】
４０時間後、菌糸体を培地に適応させ、１Ｌ／時間で液化物を供給することを可能とし、その結果、本発明者らは、全ての液化物を真菌バイオマスに変換できた。菌糸体を２ｍｍ篩、１ｍｍ篩及び０．３１５ｍｍ篩に対して収穫したところ、８０％のバイオマスが２ｍｍ篩に、１８％が１ｍｍ篩に、２％が０．３１５ｍｍ篩に対して収穫できた。篩からのバイオマスを、合わせ、１５．５％乾物のケーキにプレスし、アミノ酸乾物及び粗タンパク質における分析のためＢＳＺ０１７４と標識した。１２００ｇのジャガイモの発酵ブロスの最終物を使用して、赤カブを使用する第２の実施に播種した。
【００８６】
混入は、これまでのところ顕微鏡下で視認されていない。
５．２第２の発酵（調理した赤カブ）
篩からのジャガイモ透過液（２８４０グラム）を、収集及び使用して、３５００グラムのミルにかけ、調理した赤カブ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｈｅｉｊｎから）（サトウダイコンのバルガリス亜種ルバ変種（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｒｕｂａ））を懸濁し、６３４０グラムのマッシュした赤カブを、ジャガイモ発酵からの１２００グラムブロスで接種し、４０００ｇの水を加えて、マッシュを希釈し、３．５％の乾物濃度を有する１１５４０ｇの開始重量を得た。発酵条件は、再度４８℃、ｐＨ３．６（ＨＮＯ３及びＮＨ３）、２．５Ｌ空気／分、ｐＯ２＞１０％、撹拌機８００〜１５００ｒｐｍであった。
【００８７】
２４時間後、ブロスを、次の発酵のための１Ｌ以外を篩分けし、そして気泡流出問題に起因して２Ｌのブロスが失われた。５００ｇのケーキが、２１．７％乾物で得られ、ＢＳＺ０１７５とコードされた。
【００８８】
混入は、これまでのところ顕微鏡下で視認されていない。
５．３第３の発酵（生の赤カブ）
第３の連続的な発酵を、希釈水として赤カブにおける発酵からの２９７７ｇの透過液を使用してキッチンマシン中で赤カブをマッシュした後に、３０００ｇの生の赤カブ（サトウダイコンのバルガリス亜種ルバ変種）を加えることによって実施した。１０００ｇの赤カブパルプを、２０００ｇの水道水及び１０００ｇの第２の発酵からの菌糸体を有するブロスとともに第３の発酵槽に加えた。１０ｇの新鮮なパン酵母をインベルターゼを投薬するため加えた、その理由は、ラサムソニア・コンポスティコラが、スクロースにおいて成長できなく（少なくとも全ての状況においてではない）、そういうわけで、これらの酵素活性が原料から由来する必要があるからである。ｐＨ設定点は再度３．６、温度４８℃、通気２．５Ｌ／分、ｐＯ２＞１０％、撹拌機８００〜１５００ｒｐｍであった。１０時間のバッチ段階後、残りの５０００ｇの赤カブパルプを、第２の発酵からの透過液を使用して更に希釈し、７０００ｇの希釈した飼料を、１時間内に供給した。
【００８９】
２４時間後、発酵したマッシュを、２ｍｍ篩に対して篩分けした（９５％の乾物が２ｍｍ篩に、４％が１ｍｍ篩に収穫された）。プレスしたケーキは、ＢＳＺ０１７６をコードし、１８．０％乾物を有していた。
【００９０】
混入は、視認されていない。
５．４第４の発酵
第４の発酵を実施して、乳清発酵を調製した。
【００９１】
バッチ培地は、第３の発酵からの１０００ｇのブロス、第３の発酵からの４Ｌの透過液であった。
【００９２】
ｐＨ３．６（ＨＮＯ３／ＮＨ３）、ｐＯ２＞１０％、撹拌機８００〜１５００ｒｐｍ、通気２．５Ｌｐｍ、４８℃。
飼料：
ラクトース４０ｇ／Ｌ、規定した培地ミネラル混合物３０ｇ／Ｌ、硫酸二アンモニウム４ｇ／Ｌ、ｐＨ３．３（硫酸）
８０ｇ／時間で供給。
【００９３】
５０供給時間後、４３００ｇのブロスを収穫し、細胞を一連の篩に対して篩分けし、低い成長速度下で、より短い菌糸体が観察され、９０％の菌糸体が１ｍｍ篩にあり、細胞は唯一の炭素源としてラクトースを有する規定した培地において成長し、培養は純粋のままであり、混入はこれまでのところ視認されていない。
【００９４】
菌糸体ケーキは、更にプロセスされなかった。
５．５第５の発酵
第４の発酵からの残りの５０００ｇのブロスに、第３の発酵からの４．１Ｌの濾過物においてミルにかけた２ｋｇの全サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）を供給し、１０ｇの新鮮なパン酵母をスクロース変換を確実にするため加えた。
【００９５】
発酵を５０℃で実施した、その理由は、本発明者らが、一部の酵母が第４の発酵に出現すると考えたからである。ｐＨ３．６＋／−０．１（ＨＮＯ３／ＮＨ３）、通気２．５Ｌｐｍ、ｐＯ２＞１０％、撹拌機８００〜１５００ｒｐｍ、３ｍｌの消泡剤Ｂａｓｉｌｄｏｎを加えた。
【００９６】
発酵の２０時間後に１Ｌの水を加えた後、１０Ｌのマッシュを、部分的（４ｋｇブロスが残る）に収穫し、マッシュを篩分けし、８０％は２ｍｍ篩に、１９％は１ｍｍ篩にあった。ケーキを、１７．９％ｄｍにプレスし、ＢＳＺ０１７７とコードした。
【００９７】
乳酸菌及び乳酸を有する、地方のチーズファクトリーからの新鮮なチーズ乳清の供給を、１９供給時間後、２００ｇ／時間で開始し、溶存酸素が低かったので、供給割合を１００ｇ／時間に低減させた。
【００９８】
アンモニウムが＜３００ｐｐｍになった場合、本発明者らは、リン酸水素二アンモニウムを加えＮＨ３を＞５００ｐｐｍにした。
【００９９】
温度を５２℃に増加して菌糸体長における効果を調べた。
【０１００】
乳清供給を２ｘ希釈して、菌糸体濃度を低減させた。
【０１０１】
６００ｇ／時間での供給及び２ｘ希釈した乳清の収穫の９６時間後、９０％の全ての菌糸体が、１ｍｍ篩に収穫できた。
【０１０２】
次に、本発明者らは、乳清が、４Ｌの未希釈の乳清を、ｐＨ３．６で４Ｌのブロスに加えることによってバッチ式で発酵できるかどうかを再度試験し、発酵が停止し、これはオフガス中のＣＯ２産生において認められた。明らかに、乳酸及び酢酸は、毒性が強過ぎた。本発明者らは、その時点で、ブロス中に３．２ｇ／Ｌの乳酸及び０．０５ｇ／Ｌの酢酸を測定した。８〜１２Ｌに水で希釈した際に、発酵が回復し、２ｘ希釈した乳清での供給を再度開始した。乳清中で成長させた後に収穫された菌糸体を、ＢＳＺ０１７８とコードし、プレス後の乾物濃度は１９．９％であった。
【０１０３】
混入は、もはや顕微鏡下で視認されない。
５．６第６の発酵
第５の発酵からの１Ｌブロスを使用し、５Ｌの水中に、ミネラル塩培地及び１２ｇのリン酸水素二アンモニウムと３００ｇのスクロースを希釈した。発酵を、５２℃、ｐＨ３．６＋／−０．１（ＨＮＯ３／ＮＨ３）、通気２．５Ｌｐｍ、ｐＯ２＞１０％、撹拌機８００〜１５００ｒｐｍで実施した。
【０１０４】
１６時間後、成長速度は、スクロースにおいて非常に低かった（１０時間の倍加時間）。４ｇの新鮮なパン酵母を加え、成長をスピードアップした。
【０１０５】
４０時間後、ブロスを、篩分け及びプレスすることによって収穫し、試料をＢＳＺ０１７９とコードした、乾物は１７．９％であった。
【０１０６】
混入は、顕微鏡下で視認されない。
５．７第７の発酵
第６の発酵からの１Ｌブロスを使用して、この発酵に播種し、３Ｌの水を使用して、ブロスを希釈し、マルトデキストリンを、２２．７ｇ／Ｌのマルトデキストリン及びミネラル塩培地ストック溶液及び０．５４ｇ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム、ｐＨ３．４（硫酸）で供給した。
【０１０７】
供給流速は、６０  ｇ／時間であった。発酵を、５２℃、ｐＨ３．６＋／−０．１（ＨＮＯ３／ＮＨ３）、通気２．５Ｌｐｍ、ｐＯ２＞１０％、撹拌機８００〜１５００ｒｐｍで実施した。
【０１０８】
１６供給時間後、供給流速を８０ｇ／時間に増加し、供給を５日間継続した。
【０１０９】
５日後、発酵槽ブロス体積を、大きい収穫物を１５．５％パック菌糸体体積（３８８０ｒｐｍでの遠心分離１５分後のペレット画分）にすることによって３．７５Ｌに低減させた。
【０１１０】
次に本発明者らは、ブタ肥料を取り、肥料を２ｍｍ篩に対して篩分けして固形物を除去した。４．６ｋｇのブタ肥料を、１．６ｋｇの高濃度の肥料（使用しない）と３Ｌの肥料の希薄な画分（８９３３ｐｐｍ  ＮＨ３を含有）とに分離した。ブタ肥料を使用して、発酵槽に供給した。
【０１１１】
肥料の希薄な画分を９０ｇ／時間で供給する場合、発酵を継続してＣＯ２を高い割合で産生させた。しかし、２２．５時間後、残りの１Ｌの希薄な肥料を１時間内にポンプしたところ、発酵が完全に停止し、低ｐＨで高濃度において適用される場合の肥料の毒性を示した。肥料中の毒性要素は、酢酸のような有機酸であり得るが、吉草酸、酪酸、プロピオン酸でもあり得、これは、低ｐＨで極度に毒性があることが公知であり、供給が速すぎる場合、消費することができず、真菌成長を阻害する。
５．８菌糸体組成の分析
上の７で説明した発酵において収穫された菌糸体を、アミノ酸プロファイル及び粗タンパク質含有量について分析した。結果を表２に示す。
【０１１２】
表２は、生産物のアミノ酸プロファイルが、１）使用された原料に依存しないこと及び２）必須アミノ酸の合計が、全てラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５のものであること、試料（ＢＳＺ１７４からＢＳＺ１７９）が、ダイズタンパク質のものよりも１６％高いが、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７（以下の実施例７において説明される発酵）の全ての必須アミノ酸の合計が、さらにダイズタンパク質よりも２９％高く、また＞９％の例外的に高いリジン含有量であり、フェニルアラニンは、総アミノ酸の＞１０％で特に高かったことを明らかに示している。
【０１１３】
【表２−１】
2019531058.tif 000003
【表２−２】
2019531058.tif 000004
【０１１４】
実施例６．ＰＰＬ発酵
ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ）は、ジャガイモ加工産業からの副産物であり、大量の窒素、カリウム及びタンパク質及びデンプン抽出の期間の様々な加工ステップにおける乳酸菌の成長から得られる乳酸を含有し、その後に、希釈したタンパク質液は、褐色の液へと蒸発する。ＰＰＬは、高い灰分が理由で動物飼料において適していない、また土壌において嫌気性につながる高い濃度の容易に消耗される有機物に起因して肥料としては好ましくない。
【０１１５】
アイデアは、最初に炭素及び窒素及びリン酸塩中でタンパク質豊富な供給原料を生産すること、次にバイオマスを濾過し、発酵性ＰＰＬを蒸発させて、肥料としてより適切（容易に消耗する有機物をより低く含有する）な生産物を生産することであった。
【０１１６】
ラサムソニア・コンポスティコラを、滅菌培地（１２１℃、２０分）においてマルトデキストリン（２０ｇ／Ｌ及び酵母抽出物２０ｇ／Ｌ、ヒマワリ油０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ４．５）を使用する振盪フラスコ中で繁殖させ、４５℃、２２０ｒｐｍで３日間、高濃度の菌糸体培養ブロスに栽培し、次に発酵槽に加えた（グルコース．１ａｑ  ２００グラム／Ｌ及び３Ｌの水を有する４Ｌの培地に対して２５０ｍｌの接種培養物）。ＰＰＬでの供給を１０ｇ／時間で開始し、１０時間で１００ｇ／時間まで直線的に増加させた。ｐＨを２５％硫酸で３．５に制御し、温度を４５℃に維持し、その間、２．５Ｌｐｍで通気すること及び撹拌機速度を増加させること（必要とされる場合）によってｐＯ２を＞１０％の飽和に維持した。供給開始１９時間が過ぎたところで、供給を停止し、１２８１ｇのＰＰＬを加えた。その後、発酵を、全てのアンモニアがブロスから除去されるまで継続させた。
【０１１７】
【表３】
2019531058.tif 000005
ＰＰＬを発酵させ、発酵後、全てのバイオマスを、篩分けし、動物飼料ケーキにプレスし、その組成を、決定し、上記の実施例５の表２に提供した、乾物において３０％粗タンパク質及び非常に満足のいくアミノ酸プロファイルを有している。
【０１１８】
表３は、発酵前のＰＰＬの組成と有機カリウム肥料（ＦＰＰＬ＝発酵性ジャガイモタンパク質液）の比較を示し、後者が、カリウム含有量が倍を超えて改善し、乾物含有量当たりのカリウムを２．５倍改善したことを示す。
【０１１９】
グルコース、乳酸、デキストリン及びＤＰ２（重合度＝２、例えば、マルトース及びイソマルトースを含む）のレベルを、発酵の期間に決定した（データ示さず）。結果は、ラサムソニア・コンポスティコラが、乳酸をグルコースと共消費（ｃｏ−ｃｏｎｓｕｍｅ）でき、ｐＨ３．５で１５ｇ／Ｌ乳酸以下の濃度を穏やかに供給することによって生存することを実証している。対照的に、ｐＨ３．５、４５℃で純粋なＰＰＬでバッチ発酵を開始する場合、本発明者らは、成長をまったく観察しなかった。
【０１２０】
実施例７．間欠的な清浄化での反復フェドバッチ
サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７を、５０ｇ／Ｌマルトデキストリン及び２０ｇ／Ｌ酵母抽出物及び０．５グラム／Ｌヒマワリ油を有し、ｐＨを４．５にセットし、１２１℃で２０分間滅菌した、２５０ｍｌ培地で２Ｌバッフル付き振盪フラスコ中で前培養した。この前培養を、次に、２０ｇ／Ｌグルコース及び２ｇ／Ｌ硝酸アンモニウムを有する５Ｌの規定したミネラル培地を有する発酵槽Ａと呼ばれるＳａｒｔｏｒｉｕｓの１５Ｌ  Ｃｐｌｕｓ発酵槽に移動した。温度は４６℃であり、ｐＨは３．７＋／−０．１（７．５％ＮＨ３  ４ＮＨ３ＰＯ４）であり、ｐＯ２は９００ｒｐｍで撹拌すること及び２．５Ｌ／分で通気することによって制御された。
【０１２１】
一晩成長させた後、供給を、廃糖蜜を４０ｇ／Ｌ糖の濃度及び２ｇ／Ｌリン酸水素二アンモニウム及び２０８ｇ／時間の供給割合で開始した。５Ｌを供給した後、１０Ｌ培養を、発酵槽Ａ及びＢ中に５Ｌの二部に分割した。両方の発酵に対して、廃糖蜜（前と同じ）供給を、３５７ｇ／時間で開始した。両方の発酵槽を、２．５Ｌｐｍ及び９００ｒｐｍ、４６℃で通気し、ｐＨをｐＨ３．７＋／−０．１（７．５％ＮＨ３  ４Ｎ  Ｈ３ＰＯ４）に制御した。供給を加えた後、発酵槽Ａの全てのバイオマスを、２ｍｍ、１ｍｍ及び０．３１５ｍｍ篩及び０．０８μｍ篩に対して引き続いて篩分けすることによって収穫した。ケーキの分布は、これらの篩に対してそれぞれ８０％、１８％、１％、及び１％であった。ケーキを、プレスし、流動床乾燥機中で５０℃で乾燥して、アミノ酸分析のため試料ＢＳＺ０２０９（実施例５を参照）を産した。濾過物は、透明であった。本発明者らは、顕微鏡下で一部の細菌性の球菌を見つけたので、本発明者らは、ブロスを有するＢ発酵槽を、２５％硫酸を使用してｐＨ２．２に３０分間酸性化し、一方、本発明者らは、リン酸を有する７０％の熱水で発酵槽Ａを２０分間すすいで、ｐＨ２．２で発酵槽Ａ中の細菌を殺菌し、次に発酵槽Ａ及びＢに発酵槽Ｂを分割し、そのため、５Ｌが再度両方の発酵槽にあり、本発明者らは、３５７ｇ／時間での供給を再開し、その間、ｐＨをｐＨ３．３及び温度を４８℃に制御した。１４時間後に全体積まで供給した後、全ての残留する糖を消費するまでさらに４時間発酵槽を更に通気し、有機酸を消費し、発酵槽Ｂを収穫し、篩分けした。
【０１２２】
ケーキの３５％が篩２ｍｍにあり、７０％が篩１ｍｍにあり、５％がより小さい篩にあったことから、菌糸体が、ｐＨ３．３及び４８℃での第２の実施中により短くなることを示しており、これをプレスし、５０℃で乾燥して、アミノ酸分析のため試料ＢＳＺ０２１０が得られた（実施例５の表２を参照）。
【０１２３】
発酵槽Ｂをここで清浄化し、酸ですすぎ、発酵槽ＡをｐＨ２．２に３０分間酸性化し、次に発酵槽Ａ及びＢに５０％−５０％で分割し、引き続いて、第３の発酵をｐＨ３．３及び４８℃で実行し、次にプレスし、乾燥して、アミノ酸分析のための試料ＢＳＺ０２１１を得た（実施例５の表２を参照）。
【０１２４】
この手段で、本発明者らは、操作し、原則的には無制限に混入を制御下に保つことができるが、一般に、維持管理の停止のための工業規模での停止又は３、６若しくは１２月毎の大規模な清浄化を唯一しなければならない。
【０１２５】
実施例８．菌糸体ケーキの機械的な脱水及び空気乾燥
実施例７の最初の２サイクルの篩（すなわち、篩２ｍｍ及び１ｍｍ）から収穫されるような、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７の菌糸体は、１１〜１５％の乾物濃度を有し、引き続いて手で研究用ナイロンクロス（ｌａｂ  ｎｙｌｏｎ  ｃｌｏｔｈ）を通して２０〜３０％乾物並びに調整可能な時間及び圧力で研究室規模の空気プレス（Ｍａｒｅｃｏ  Ｍｉｎｉ  Ｐｅｒｓ  ＭＭＰ３）を使用して４５〜５０％乾物へとプレスした。
【０１２６】
プレスの後の乾物パーセンテージは、表４に提供される（当初のケーキ投入量が、２８．０％乾物で７５ｇであった場合）。表５は、廃糖蜜又はトウモロコシ全体において成長させた後のサーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７のプレス後の乾物を示す。初期乾物は２５％であり、７５グラムバッチを２バールでプレスした。
【０１２７】
表６は、廃糖蜜又はミルにかけたトウモロコシにおいて成長させた場合に２バールで濃縮した７５ｇのラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５のプレス後の乾物を示す。手でプレスした２６．２％乾物から開始した。菌糸体を、トウモロコシにおいて成長させる場合、０．２グラム／ｋｇトウモロコシ乾物でアミラーゼであるアルファＦｕｅｌｚｙｍｅ（Ｗｅｉｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を使用してコーンミール全体（ｗｈｏｌｅ  ｃｏｒｎ  ｍｅａｌ）を液化することによって生産し、トウモロコシを、水中に５％投薬量の濃度で懸濁し、ｐＨを１０％硫酸及び４Ｎ  ＮａＯＨを使用して４．３に調整し、次に１時間９０℃に加熱し、接種前に４６℃に冷却した。１０％リン酸を使用して接種前にｐＨを３．６に更に調整し、２ｇ／Ｌ硫酸二アンモニウムを加え、発酵槽に２％の完全に成長させたサーモムコール・インディカセウダチカ接種物ＣＢＳ１４３０２７培養物を接種した。発酵の期間に１２．５％アンモニアを使用して３．６＋／−０．１にｐＨを制御し、０．５ｖｖｍでの空気のスパージング及び８００ｒｐｍ又はそれ以上での撹拌によって全時間で＞２０％にｐＯ２を維持した、温度は４６℃であった。２４時間後、培養物を、１ｍｍ篩に対して篩分けすること及びプレスすること及びチーズクロスに対して手動で３３％乾物にプレスすることによって収穫した。
【０１２８】
ラサムソニア・コンポスティコラ（５０℃で成長）及びサーモムコール・インディカセウダチカ（４６℃で成長）の機械的な脱水は、非常に有望であり、非常に高いレベルの乾物が、コーンミール（５％コーンミール、２グラム／Ｌリン酸二アンモニウム）中で成長させた場合のように、糖蜜（１０Ｌブロス中の２％最終的な糖）中で成長させた場合の両方で得ることができた。非常に乾いたケーキを、８０００ｒｐｍで篩なしでＲｅｔｃｈミルによって顆粒状生産物へとミルにかけることができた。顆粒は新鮮な動物飼料成分として使用することができるが、５０℃で流動床乾燥機中で容易に乾燥することができる。研究室規模の流動床乾燥機では、３０分間内で＞９０％の乾燥であった。
【０１２９】
【表４】
2019531058.tif 000006
【０１３０】
【表５】
2019531058.tif 000007
【０１３１】
【表６】
2019531058.tif 000008
【０１３２】
実施例９．代替株
一連の代替株を、高温及び低ｐＨでＳＣＰを作製するための適切な代替であるかについて試験した。株の一部を、Ｖａｎ  Ｉｅｒｓｅｌ  Ｂｉｅｚｅｎｍｏｒｔｅｌ  ＢＶから得られたＤｕｔｃｈコンポストから単離した。１Ｌの水に対して１００ｇのコンポストを加えること、それを徹底的に３０分間混合すること、それを２ｍｍ篩に対して篩分けすること、次に０．５％  Ｆｉｂｒｅｘ  ５００（サトウダイコンパルプ繊維）、０．５％コムギ糠、０．５％、セルロースＢＨ２００  ０．５％及びマルトデキストリン０．５％及び２ｇ／Ｌ硫酸二アンモニウムを有するＣｐｌｕｓ発酵槽中の６Ｌの培地に加えることによる。良好な真菌成長のため十分なＫ、Ｐ、Ｓ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｕを含有するミネラル培地（米国特許出願公開第２００２００３９７５８号）及び発酵槽を、１分当たり３Ｌ及び１００ｍｂａｒｒ超過圧力で通気した（５００ｒｐｍ、５０℃、ｐＨ３．６（希釈したリン酸及び１２．５％アンモニウムで制御））。発酵槽を１週間実施し、様々な組合せで、温度及びｐＨを改変して、５０〜６０℃の間、ｐＨを２．７〜３．２の間で変化させた。真菌を、１０−６までの連続希釈にプレートし、ＥｉｎｄｈｏｖｅｎにおけるＴｒｉｔｉｕｍ微生物学から得たＯＧＹＥ寒天培地にプレートした。４８℃で２日間プレートを成長させた後、最大希釈において最も顕著な真菌を採取し、コロニーを再ストリークし、同一性をＰＣＲ増幅及びＢａｓｅ  Ｃｌｅａｒからのシークエンシングサービスを、それらのＩＴＳ真菌同一性決定を使用して決定した。ゲノムＤＮＡを、ＺＲ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｄ６００７）を使用して抽出した。１回の単一ＰＣＲ増幅反応を、プライマー  セットＩＴＳ１−ＰＣＲ、ＩＴＳ５−ＰＣＲ、ＩＴＳ１−Ｆ−ＰＣＲ、ＳＲ６Ｒ−ＰＣＲ及びｆｕｎｇｉ−２８ｓ−ＵＮＩＲで実施した（表７）。得られた単位複製配列を、各反応を異なるプライマーを用いて、６つの異なる反応においてシークエンシングした。サンガーシークエンシングのため使用されるプライマーは、表８に記載される。１株当たり６つのシークエンシングした鎖を、対応する配列についてＮＣＢＩデータベースにおいてヌクレオチドＢＬＡＳＴで処理した。
【０１３３】
【表７】
2019531058.tif 000009
【０１３４】
【表８】
2019531058.tif 000010
【０１３５】
６単離体が、得られ：
ラサムソニア・エメルソニイ（１７０１−３−７）
サーモムコール・インディカセウダチカ（単離体１１）
サーモムコール・インディカセウダチカ（１７０１−１−２）
リゾムコール・ミエヘイ（１７０１−１−９）
リゾムコール・プシルス単離体１３
リゾムコール・プシルス単離体１２
のように決定された。
【０１３６】
次に、この番号の好熱性真菌株を、高温及び低ｐＨでの成長、篩分け可能な形態及び多量のタンパク質の産生（グルコース１％、酵母抽出物４％を有している培地中で４２℃、３日間、振盪２２０ｒｐｍ、濾過、水で菌糸体を洗浄することによって収穫、及び＞９８％乾物に凍結乾燥）に関して、ＣＢＳに注文して株を（いくつかの本発明者ら自身の単離体と共に）スクリーニングした。結果を表９に要約する。
【０１３７】
【表９−１】
2019531058.tif 000011
【表９−２】
2019531058.tif 000012
【０１３８】
一部の株を、バイオマス収量、タンパク質含有量及びアミノ酸プロファイルの評価に関して１５Ｌ規模の発酵槽において再試験した。甘蔗廃糖蜜を、飼料中に２ｇ／Ｌリン酸二アンモニウムを有するＣ制限（グルコース＜２ｇ／Ｌ、ＮＨ３＞５００ｐｐｍ）に補充される炭素源として使用し、様々なｐＨ及び温度で成長させる場合、甘蔗廃糖蜜を、２％糖の終濃度まで発酵槽に供給した。ｐＯ２を＞１０％に制御し、ｐＨを４Ｎ  Ｈ３ＰＯ４及び１２．５％  ＮＨ３を使用して制御した。ラサムソニア・コンポスティコラの場合（甘蔗廃糖蜜における発酵）、０．５グラム／Ｌの活動的な乾燥した酵母を、バッチ培地に加えた、その理由は、ラサムソニア・コンポスティコラが、インベルターゼ活性を欠くことから、スクロースにおいて速く成長せず、スクロースの酸加水分解が、緩徐すぎることがあるからである。糖におけるバイオマス乾物の典型的な収量は１ｇ糖当たりおよそ０．５ｇ乾物であり、＞９９％のバイオマスを１ｍｍ篩に対して篩分けすることによって収穫することができた。結果を表１０に要約する。
【０１３９】
【表１０】
2019531058.tif 000013
【０１４０】
実施例１０．廃水スラッジにおける好熱性真菌の成長及び凝集剤なしの脱水
ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５を、唯一の炭素源としてトイレットペーパーに基づく２５０ｍｌ培地（１０グラム／Ｌ及び硫酸アンモニウム２グラム／Ｌに当技術分野において公知のミネラル培地を補充し、ｐＨを４に調整し、培地を１２１℃で２０分間滅菌した）を有する２Ｌエルレンマイヤー中で研究室規模で前成長させた。冷却後、フラスコに接種し、２日間４８℃でインキュベートした。次に、完全に成長させた培養物を、８グラム／Ｌ乾物で７Ｌの一次廃水スラッジを有する７Ｌ気泡塔に移動し、気泡塔を０．３ｖｖｍで通気し、温度を４８℃及びｐＨ３（リン酸４Ｎ）に維持した。培地を２週間栽培し、１日当たり２Ｌを収穫し、新鮮なスラッジを補充した。次に、２Ｌの発酵スラッジを、１ｍｍ篩に対して濾過し、ケーキを、ｄｅ  Ｍａｒｅｃｏ  ｍｉｎｉｐｒｅｓｓ  ＭＭＰ３でプレスした。４５％乾物を有するケーキを、この手段で、凝集剤を加えることなく得ることができた。
【０１４１】
実施例１１．サーモムコール属でのトウモロコシの発酵、菌糸体の収穫及び濾過物の第２の生物ラサムソニア属での発酵での収量の増加
【０１４２】
前培養条件
−８５℃での、サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７株及びラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９株の凍結した真菌培養物を解凍し、２５０ｍＬのＹＧ液体培地（２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、Ｈ２ＳＯ４／ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整）を有し、１２１℃で１５分間滅菌した、バッフル付き振盪フラスコに播種するため使用した。培養物を、４２℃で１８０ｒｐｍで振盪して、完全に成長（およそ３日間）するまでインキュベートした。
【０１４３】
成長培地
トウモロコシにおける株ＣＢＳ１４３０２７の成長について、５００ｇのコーンミールを９５００ｇの水に溶解した（５％ｗ／ｗ）。この溶液のデンプン液化について、０．２ｍＬの市販のエンド−α−アミラーゼＦｕｅｌＺｙｍｅ（登録商標）ＬＦ（ＷｅｉｓｓＢｉｏＴｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、加えた。液化を、ｐＨ４．５（Ｈ３ＰＯ４で調整）及び９０℃で３時間実施した。この後、温度を４６℃に減少し、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を２ｇ／Ｌの終濃度まで加えた。次に、ｐＨを、Ｈ３ＰＯ４を使用してｐＨ３．５に調整した。
【０１４４】
株ＣＢＳ１４３０２７の栽培
株サーモムコール・インディカセウダチカＣＢＳ１４３０２７の４８７ｇの完全に成長させた前培養を使用して、トウモロコシ培地に播種した。栽培を、１５リットルＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｃｐｌｕｓ発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、Ｉｎｄｉａ）で１００バールの圧力、５００ｒｐｍの撹拌、５Ｌ／分の空気流入（ｖｖｍ＝０．５）及び４６℃で実施した。ｐＨを、発酵の期間にｐＨ３．５０に１２．５％アンモニア及び２０％ｗ／ｗのＨ３ＰＯ４を使用して、継続的に調整した。Ｏ２及びＣＯ２の濃度を、オフガス中で継続的に測定した。溶存酸素が飽和値の３０％より低い場合、撹拌速度を自動的に増加させて、この閾値よりも高く保った。消泡剤（ヒマワリ油）を、栽培の全持続時間の期間に１ｇ／時間の割合で加えた。
【０１４５】
Ｔ．インディカセウダチカバイオマスの収穫及びＲ．ポスティコラでの次の発酵の接種
栽培の４６時間後、反応器の内容物を収穫し、２、１、０．３１５及び０．１８０ｍｍの孔直径を有する金属篩を使用して篩分けした。篩の各々におけるケーキは、重量を計られ、チーズクロスフィルターを使用して手でプレスされた。両ステップの濾過物は、重量を計られ、株ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５を使用する次の栽培サイクルのため保たれた。この栽培を開始する前に、発酵槽の壁を、水で洗浄して、標準的な収穫を介して初めに除去することができないバイオマスを除去した。
【０１４６】
１．１％での第１の栽培サイクルの濾過物を、発酵槽に戻し、株ラサムソニア・コンポスティコラＣＢＳ１４１６９５の４７９ｇの完全に成長させた前培養物を接種した。栽培条件は、１００バール、空気流入５Ｌ／分、撹拌１０００ｒｐｍ、４８℃及びｐＨ３．２０であった。消泡剤も、１ｇ／時間で継続的に加えた。発酵槽の全内容物を、成長の４５時間後に収穫した。
【０１４７】
結果
サーモムコール・インディカセウダチカは、５％乾物で非毒性のトウモロコシ全体培地中で良好に成長した。トウモロコシ培地における栽培の４６時間後、１０．０５ｋｇの培養物を収穫し、篩分けした。篩分けすることにより、２２５２ｇの湿性ケーキがもたらされ、そのほとんど９８％が１（１８％）及び２ｍｍ（８０％）金属篩で分離された。このケーキから、より液体を除去するため、それをチーズクロスを使用して濾過した。これにより、３２．０％の乾物含有量で６８２ｇのケーキがもたらされた。総計で、２１８．２グラムの乾いた菌糸体が、収穫された。
【０１４８】
８９９４ｇの濾過物を篩分け及びチーズクロス濾過から回収した、乾物含有量は１．１０％±０．１８％であった。この濾過物は、ｐＨ３．１２及びアンモニア濃度４３０ｐｐｍを有していた。濾過物が１．１％乾物を有していたとの事実は、一部の糖及び／又は他の可溶性基質が効率的に消費されないことを示唆している。この場合、方法の改善は、第１の発酵からの、この濾過物における広範囲又は異なる基質範囲の株の成長によって達成することができた。
【０１４９】
サーモムコール発酵からの８３３６ｇの濾過物を、ラサムソニア・コンポスティコラの成長のための培地として使用した。栽培の４５時間後、８．０３ｋｇの培養物を、収穫した。それぞれ２ｍｍ、１ｍｍ、０．３１５ｍｍ及び０．１８ｍｍの４つの篩に対して篩分けを行い、収穫されたものを収集し、９１１ｇの湿性ケーキを５．６９％  ｄｍでもたらした。バイオマス収量は、５１．９グラム乾物であった。濾過物は、ここで０．８６％  ｄｍを含有していた。
【０１５０】
全プロセスの総計バイオマス収量は、ここで２１８．２グラムのサーモムコール＋５１．９グラムのラサムソニアであり、これは、総計で、５００＊０．８８＝４４０グラムのトウモロコシ乾物から総計２７０．１グラムの乾いた菌糸体が、プロセスに入れるトウモロコシ乾物のグラム当たり高いタンパク質で０．６１グラムの乾いたＳＣＰの収量を与えることを意味する。
【０１５１】
第２のステップを加えることにより、バイオマス収量を２４％増加させ、濾過物中の乾物は２２％低減される。
【０１５２】
実施例１２．酸性条件及び高温に対するリゾプス属種の単離及び適応
リゾプス株は、ＯＧＹＥ寒天にプレーティングし、フード中で３７℃でインキュベーションすることによって、市販のテンペスターターから単離された。株の分類学的な同定について、ゲノムＤＮＡを単離し、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域を増幅し、シークエンシングした。ＩＴＳ断片を、プライマー５’−ＴＧＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴ’３（Ｅｕｋ２０ｆ；フォワード）及び５’−ＡＣＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＴ−’３（リバース）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して増幅した。サンガーシークエンシングを、ＩＴＳの増幅に使用した同じプライマーを使用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって実施した。フォワードプライマーで得られたシークエンシング結果は、配列番号１３として示され、リバースプライマーで得られるものは、配列番号１４として示される。これらの配列がＮＣＢＩデータベースに対してＢＬＡＳＴで処理した場合、単一のリゾプス属種は１００％同一性及び１００％カバレッジで見出されなかった。９６〜９８％カバレッジでの９９〜１００％のパーセンテージ同一性が、リゾプスオリゼー、リゾプスクラミドスポラス、リゾプスミクロスポラス、リゾプスストロニファー及びムコールインディカスに関して見出された。
【０１５３】
株を、２ｇ／ＬのＮＨ４ＮＯ３、１．７ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（窒素源なし）及び２０ｇ／Ｌグルコースを加え、十分なＫ、Ｐ、Ｓ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｕを有する、真菌の成長のための培地（米国特許出願公開第２００２００３９７５８号）を含有する振盪フラスコ中で引き続いて成長させた。ｐＨを、Ｈ２ＳＯ４及び／又はＮａＯＨを加えることによってｐＨ３．５に調整した。３５ｍｌのこの培地を、バッフル付き三角フラスコに加え、１２１℃で１５分間滅菌した。
【０１５４】
次に、単離体を、すべて連続的に移動（１ｍｌを次の３５ｍｌ培地）させた後、成長温度を増加させることによってより高い温度に適応させた。移動は、２２０ｒｐｍ、２．５ｃｍストロークで振盪するとき、視覚的な点検（通常２〜３日後）によって高濃度の培養物を得た後に行われた。１５時間未満の倍加時間でｐＨ３．５及び４６℃で成長させた後、株をＣＢＳ１４３１６０として寄託した。
【図１】
2019531058.tif 000014
【配列表】
2019531058000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月8日(2019.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞タンパク質（ＳＣＰ）を生産する方法であって、
ａ）リゾムコール属の好熱性真菌を、発酵性の炭素豊富な供給原料を含有する培地中で成長させるステップであって；前記真菌を、４５℃より高い温度及び３．８未満のｐＨで、非滅菌条件下の液中培養で成長させる、ステップ；及び、
ｂ）ステップａ）で成長させた前記好熱性真菌のバイオマスの形態で、前記培地からＳＣＰを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記炭素豊富な供給原料の濃度が、前記供給原料中の毒性化合物が前記真菌の成長速度を低減させる濃度未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炭素豊富な供給原料が、前記炭素豊富な供給原料の濃度が、前記供給原料中の毒性化合物が前記真菌の成長速度を低減させる濃度未満に保たれる割合で前記培地に供給され、好ましくは、前記供給原料中の毒性化合物が前記真菌の成長速度を低減させる濃度が、前記真菌によるＣＯ２産生の割合及びＯ２消費の割合の少なくとも１つにおける低減の原因とならない、前記炭素豊富な供給原料の最高濃度として規定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地中の前記炭素豊富な供給原料が、５％（ｗ／ｖ）乾物の濃度未満であるか、又は５％（ｗ／ｖ）乾物の濃度未満を維持する割合で前記培地に供給される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の発酵槽の使用を含み、少なくとも第１の発酵槽が、収穫及び任意選択の清浄化のために空にされ、その間少なくとも第２の発酵槽中で、前記真菌の成長が継続し、好ましくは収穫及び任意選択の清浄化後、空の第１の発酵槽が、前記第２の発酵槽の内容物の少なくとも一部で満たされ、成長が、前記第１の発酵槽の収穫及び任意選択の清浄化の期間に継続される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フェドバッチ法、反復フェドバッチ法又は連続法であり、好ましくは炭素制限法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記好熱性真菌が、真菌種の株であるリゾムコール・ミエヘイ又はリゾムコール・プシルスであり、そのうちのリゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株が好ましく、そのうちのＣＢＳ１４３０２８株が最も好ましい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵性の炭素豊富な供給原料が、農業又は食物生産、サイレージ、都市ゴミ（ＭＳＷ）の有機物画分及び食物用途に適合する植物由来の生産物からの副産物又は廃棄物のうちの１つ又は複数であり、好ましくは、前記発酵性の炭素豊富な供給原料が、サトウダイコンパルプ、穀粒加工からの液体Ｃ−デンプン、皮をむいた野菜、カットした野菜又は選別外の野菜の生産からの野菜廃棄物、パーム油廃液（ＰＯＭＥ）、空果房（ＥＦＢ）、シュロの葉を含むパームミル残留物、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、コメ、キャッサバ、サトウキビ又はサトウキビジュース、サトウダイコン又はサトウダイコンジュース又は高濃度のジュース、廃糖蜜、甘蔗廃糖蜜、グルコースシロップ、フルクトースシロップ及び野菜油のうちの１つ又は複数である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、窒素源を含有する及び／又は供給され、好ましくは、前記窒素源が、アンモニア、尿素及び硝酸塩のうちの１つ又は複数を含み、より好ましくは、前記窒素源が、廃糖蜜、サトウダイコン又はキビ残渣、ワイン産業からの残渣、ブドウ残留物、ジャガイモタンパク質液（ＰＰＬ）、コーンスティープ液（ＣＳＬ）、動物農場排出ガス清浄化スクラバーからのアンモニア、及び肥料加工からの希薄な画分の、濃縮物から得られる、負荷濃縮物に存在するアミンのうちの１つ又は複数である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマスが、篩分け、濾過及びデカンテーションのうちの少なくとも１つによって前記培地から回収され、それによって、好ましくは、篩分け、濾過又はデカンテーションされたバイオマス（ケーキ）の乾物濃度が、少なくとも１２％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは、前記バイオマスが、回転ドラム濾過、フィルタープレス、ベルトフィルター、スクリーン、篩、篩ベルト、ＤＳＭスクリーン、ベルトプレス、スクリュープレス及びデカンター遠心分離機のうちの少なくとも１つによって前記培地から回収され、それによって、より好ましくは、前記バイオマスケーキが、例えば、プレスして、残留する水を除去することによって更に乾燥させることができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマス（ケーキ）の篩分け、濾過、デカンテーション、及び／又は更なるプレスの後に得られる水画分が、発酵に戻して再利用されるか、及び／又は更に発酵バッチのために使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵槽が、エネルギーの入力が必要ないずれの冷却装置も用いずに操作される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株からなる群から選択される、好熱性真菌株。
【請求項１４】
少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含むＳＣＰ生産物であって、前記好熱性真菌株は、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株からなる群から選択され、そのなかでもＣＢＳ１４３０２８株が好ましく、好ましくは、前記バイオマス中のタンパク質が、ダイズタンパク質中の総必須アミノ酸の合計よりも少なくとも１０％高い総必須アミノ酸の合計を有し、より好ましくは、前記バイオマス中のタンパク質が、総アミノ酸の少なくとも８．５％のリジン含有量を有する、ＳＣＰ生産物。
【請求項１５】
少なくとも１つの好熱性真菌株のバイオマスからのタンパク質を含む食物又は飼料生産物であって、前記好熱性真菌株は、リゾムコール・ミエヘイＣＢＳ１４３０２９及びリゾムコール・プシルスＣＢＳ１４３０２８である株からなる群から選択され、そのなかでも、ＣＢＳ１４３０２８株が好ましい、食物又は飼料生産物。
【国際調査報告】
2019531058.tif 000015
2019531058.tif 000016
2019531058.tif 000017
2019531058.tif 000018
2019531058.tif 000019