(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの特定の位置における残基の少なくとも１つの変異を含む、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアント、およびとりわけ３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドを含む核酸分子を合成するための上記バリアントの使用に関する。一局面において、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントが提供され、上記バリアントは、Ｅ４５７、Ｔ３３１、Ｇ３３２などからなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントであって、前記バリアントが、Ｅ４５７、Ｔ３３１、Ｇ３３２、Ｇ３３３、Ｆ３３４、Ｒ３３６、Ｋ３３８、Ｈ３４２、Ｄ３４３、Ｖ３４４、Ｄ３４５、Ｆ３４６、Ａ３９７、Ｄ３９９、Ｄ４３４、Ｖ４３６、Ａ４４６、Ｌ４４７、Ｌ４４８、Ｇ４４９、Ｗ４５０、Ｇ４５２、Ｒ４５４、Ｑ４５５、Ｆ４５６、Ｒ４５８、Ｒ４６１、Ｎ４７４、Ｅ４９１、Ｄ５０１、Ｙ５０２、Ｉ５０３、Ｐ５０５、Ｒ５０８、Ｎ５０９、およびＡ５１０からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、バリアント。
【請求項２】
ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖を合成することができる、請求項１に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項３】
Ｐｏｌ  ＩＶ、Ｐｏｌ  μ、または末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）のバリアントである、請求項１または２に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項４】
配列番号１の配列と少なくとも６０％の同一性、優先的には配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項５】
少なくとも１つの変異が、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加からなる、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項６】
前記バリアントが、Ｔ３３１、Ｇ３３２、Ｇ３３３、Ｆ３３４、Ｒ３３６、Ｄ３４３、Ｌ４４７、Ｌ４４８、Ｇ４４９、Ｗ４５０、Ｇ４５２、Ｒ４５４、Ｑ４５５、Ｅ４５７、Ｒ４６１、およびＲ５０８からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異、優先的には、Ｒ３３６、Ｒ４５４、およびＥ４５７からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項７】
Ｒ３３６、Ｒ４５４、およびＥ４５７からなる群より選択される少なくとも２つの位置における残基の少なくとも１つの変異、優先的には、前記３つの位置Ｒ３３６、Ｒ４５４、およびＥ４５７における残基の変異を含む、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項８】
配列
（ｉ）Ｘ１Ｘ２ＧＧＦＲ１Ｒ２ＧＫＸ３Ｘ４（配列番号４）
（式中、
Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌから選択される残基を表し、
Ｘ２は、Ｔ、Ａ、Ｍ、Ｑから選択される残基を表し、
Ｘ３は、Ｍ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｄから選択される残基を表し、
Ｘ４は、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｙ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｒ、Ｄから選択される残基を表す）、
（ｉｉ）Ｘ１Ｘ２ＬＧＸ３Ｘ４ＧＳＲ１Ｘ５Ｘ６ＥＲ２（配列番号５）
（式中、
Ｘ１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓから選択される残基を表し、
Ｘ２は、Ｌ、Ｔ、Ｒから選択される残基を表し、
Ｘ３は、Ｗ、Ｙから選択される残基を表し、
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｉから選択される残基を表し、
Ｘ５は、Ｑ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、またはφから選択される残基を表し、
Ｘ６は、Ｆ、Ｙから選択される残基を表す）、
（ｉｉｉ）ＬＸ１ＹＸ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５ＲＮＡ（配列番号６）
（Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ａ、Ｋから選択される残基を表し、
Ｘ２は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｔから選択される残基を表し、
Ｘ３は、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｇ、Ｎから選択される残基を表し、
Ｘ４は、Ｗ、Ｓ、Ｖ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｋ、Ｈから選択される残基を表し、
Ｘ５は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｌから選択される残基を表す）
の少なくとも１つの半保存領域における残基の少なくとも１つの変異を有する、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項９】
−  配列番号４の配列の前記半保存領域の少なくとも１つの位置Ｒ１、Ｒ２、および／またはＫにおける残基の少なくとも１つの置換、ならびに／または
−  配列番号５の配列の前記半保存領域の少なくとも１つの位置Ｓ、Ｒ１、および／またはＥにおける残基の少なくとも１つの置換、ならびに／または
−  配列番号６の配列の前記半保存領域のＸ１位における残基の欠失ならびに／またはＲ位および／もしくはＮ位における少なくとも１つの置換
を有する、請求項８に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項１０】
前記バリアントが、Ｒ３３６、Ｋ３３８、Ｈ３４２、Ａ３９７、Ｓ４５３、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｒ４６１、Ｎ４７４、Ｄ５０１、Ｙ５０２、Ｉ５０３、Ｒ５０８、およびＮ５０９からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、優先的には、Ｒ３３６、Ａ３９７、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｒ４６１、Ｎ４７４、Ｄ５０１、Ｙ５０２、およびＩ５０３からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、より優先的には、Ｒ３３６、Ｒ４５４、およびＥ４５７からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、さらにより優先的には、Ｅ４５７位における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの置換を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項１１】
Ｒ３３６位、Ｋ３３８位、Ｈ３４２位、Ａ３９７位、Ｓ４５３位、Ｒ４５４位、Ｅ４５７位、Ｒ４６１位、Ｎ４７４位、Ｄ５０１位、Ｙ５０２位、Ｉ５０３位、Ｒ５０８位、およびＮ５０９位における前記置換が、Ｒ３３６Ｋ／Ｈ／Ｎ／Ｇ／Ｄ、Ｋ３３８Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ、Ｈ３４２Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ．Ｎ、Ａ３９７Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ、Ｓ４５３Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｒ４５４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ａ、Ｅ４５７Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｎ４７４Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ、Ｄ５０１Ａ／Ｇ／Ｘ、Ｙ５０２Ａ／Ｇ／Ｘ、Ｉ５０３Ａ／Ｇ／Ｘ、Ｒ５０８Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｎ５０９Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔからなる群より選択される、請求項１０に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項１２】
前記バリアントが、表１に列挙される置換、欠失、置換および／または欠失の組合せを含むかまたは有し、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項１３】
前記バリアントが、配列番号１の配列のＴｄＴのバリアントであり、Ｃ３７８位からＬ４０６位の間の残基または機能的に同等な残基の、配列番号２の配列のポリメラーゼＰｏｌμの残基Ｈ３６３〜Ｃ３９０または機能的に同等な残基による置換をさらに含む、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項１４】
前記バリアントが、Ｒ３３６Ｇ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｇ、Ｒ３３６Ｎ−Ｅ４５７Ｇ、Ｒ３３６Ｇ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｇ−Ｅ４５７Ｎから選択される置換の組合せを含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント。
【請求項１５】
請求項１から１４の一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸のための発現カセット。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸または請求項１６に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１５に記載の核酸、または請求項１６に記載の発現カセット、または請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するための、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載の発現カセット、請求項１７に記載のベクター、または請求項１８に記載の細胞の使用。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するためのプロセスであって、前記バリアントをコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養し、任意選択で、そのように発現した前記バリアントを培養培地または前記宿主細胞から回収する、プロセス。
【請求項２１】
３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドから鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの使用。
【請求項２２】
ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を合成するための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの存在下で、少なくとも１つのヌクレオチド、優先的には３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドにプライマー鎖を接触させる、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのプロセス。
【請求項２４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのバリアントと、ヌクレオチド、優先的には３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドと、任意選択で少なくとも１つのヌクレオチドプライマーとを含む、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素増強の分野に属する。本発明は、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの増強されたバリアント、前記バリアントをコードする核酸、宿主細胞における前記バリアントの産生、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するためのその使用、および鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸断片の化学合成は、研究室で広く使用されている技術である（Ａｄａｍｓら、１９８３年、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０５巻：６６１頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８３年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２４巻：３１７１頁）。これにより、所望のヌクレオチド配列を含む核酸分子の迅速な産生が可能になる。５’から３’の方向に合成する酵素とは異なり、化学合成は３’から５’の方向で起こる。しかしながら、化学合成はある特定の制限を有する。実際、複数の溶媒および試薬の使用が必要とされる。加えて、短い核酸断片しか得ることができず、所望の最終的な核酸鎖を得るためにはこれを次にアセンブルしなければならない。
【０００３】
最初の核酸断片（プライマー）から、鋳型鎖の非存在下で、ヌクレオチド間のカップリング反応を行うことができる酵素を使用した、代替的な解決策が開発された。いくつかのポリメラーゼ酵素はそのような合成方法に好適であると思われる。
【０００４】
鋳型鎖の有無にかかわらず、核酸鎖の合成を触媒することができるＤＮＡポリメラーゼが極めて多数存在する。例えば、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼは、広範な生物学的プロセス、特にＤＮＡ修復機構またはＤＮＡ配列に現れるエラーの補正機構に関与する。これらの酵素は、配列内のエラーが特定された後に切除を受けた核酸鎖にヌクレオチドを導入することができる。ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼβ（Ｐｏｌ  β）、λ（Ｐｏｌ  λ）、μ（Ｐｏｌ  μ）、酵母由来のＩＶ（Ｐｏｌ  ＩＶ）、および末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が含まれる。特にＴｄＴは、核酸分子の酵素的合成プロセスで広く使用されている。
【０００５】
しかしながら、これらのＤＮＡポリメラーゼは通常、天然ヌクレオチドの取り込みしか可能にしない。あらゆる場合において、天然ＤＮＡポリメラーゼは、天然ヌクレオチドよりも大きな立体容積を有する非天然ヌクレオチド、特に３’ＯＨ修飾ヌクレオチドの存在下で、その触媒活性を失う。
【０００６】
しかしながら、修飾ヌクレオチドの使用は、ある特定の適用には有用であり得る。したがって、そのようなヌクレオチドを組み込むことにより核酸鎖の合成を触媒することができる酵素を開発する必要があった。したがって、顕著な構造修飾を含むヌクレオチドを用いた研究を目的として、ＤＮＡポリメラーゼのバリアントが開発された。
【０００７】
しかしながら、現在利用可能なバリアントは、それらの活性が低く研究室規模の酵素的合成としか適合性がないことをとりわけ理由として、完全に満足のいくものとはいえない。したがって、鋳型鎖の非存在下で、かつ修飾ヌクレオチドを使用し、可能であれば工業規模で、核酸を合成することができるＤＮＡポリメラーゼが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８３年）１０５巻：６６１頁
【非特許文献２】Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９８３年）２４巻：３１７１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸の酵素的合成のためにＤＮＡポリメラーゼを工業規模で使用することを妨げる、ある特定の技術的障壁を取り除く。
【００１０】
したがって本発明は、鋳型鎖の非存在下で核酸を合成することができ、かつ修飾ヌクレオチドを使用することができる、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを提案する。開発されたバリアントは、バリアントが由来する天然ＤＮＡポリメラーゼのものよりもはるかに優れた修飾ヌクレオチド取り込み能力を有する。特に、本発明に関係するＤＮＡポリメラーゼのバリアントは、糖修飾のあるヌクレオチドの取り込みに特に有効である。実際、本発明者らは、バリアントが由来するＤＮＡポリメラーゼのものと比較して触媒ポケット容積が増加したことで天然ヌクレオチドよりも嵩高な修飾ヌクレオチドの取り込みを促進するバリアントを開発した。より詳細には、本発明に関係するｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントは、酵素の触媒キャビティに直接介在するか、またはヌクレオチドに存在する修飾に起因する立体容積に適応するためにこのキャビティの輪郭を変形させる、アミノ酸の少なくとも１つの変異を含む。例えば、導入された変異は、修飾ヌクレオチドの３’−ＯＨ末端が嵌る酵素の触媒キャビティを拡大することを可能にする。代替的または付加的に、作られた変異は、３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドによる触媒ポケットへのアクセスを増大させ、かつ／または、酵素の構造に必要な柔軟性を与えて３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドの立体的に大幅な修飾に適応できるようにするために、触媒キャビティの膨張または容積増加を行うことを可能にする。そのような変異により、伸長すべき核酸断片にポリメラーゼが結合すると、アクセスが拡大され最適な空間的コンフォメーションを採る触媒ポケットのコアに修飾ヌクレオチドが進入し、核酸鎖の最後のヌクレオチドの３’−ＯＨ末端と修飾ヌクレオチドの５’−三リン酸末端との間にホスホジエステル結合が作出される。
【００１１】
したがって本発明は、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント、またはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントであって、前記バリアントが、Ｔ３３１、Ｇ３３２、Ｇ３３３、Ｆ３３４、Ｒ３３６、Ｋ３３８、Ｈ３４２、Ｄ３４３、Ｖ３４４、Ｄ３４５、Ｆ３４６、Ａ３９７、Ｄ３９９、Ｄ４３４、Ｖ４３６、Ａ４４６、Ｌ４４７、Ｌ４４８、Ｇ４４９、Ｗ４５０、Ｇ４５２、Ｒ４５４、Ｑ４５５、Ｆ４５６、Ｅ４５７、Ｒ４５８、Ｒ４６１、Ｎ４７４、Ｅ４９１、Ｄ５０１、Ｙ５０２、Ｉ５０３、Ｐ５０５、Ｒ５０８、Ｎ５０９、およびＡ５１０からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、バリアントに関する。
【００１２】
特定の実施形態では、バリアントは、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を合成することができる。
【００１３】
本発明は特に、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼ、特に酵母Ｐｏｌ  ＩＶ、Ｐｏｌ  μ、または野生型ＴｄＴの、選択された変異を含む、バリアントに関する。特定の実施形態では、本発明によるバリアントは、配列番号１の配列または配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する相同配列のＴｄＴのバリアントであり、選択された変異を保有する。
【００１４】
本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントをコードする核酸、本発明による核酸を含む発現カセット、および本発明による核酸または発現カセットを含むベクターにも関する。本発明のバリアントをコードする核酸は、本発明によるＤＮＡポリメラーゼの成熟型または前駆体型のものであってもよい。
【００１５】
本発明は、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うための、本発明による核酸、発現カセット、またはベクターの使用にも関する。本発明はさらに、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸、発現カセット、またはベクターを含む、宿主細胞に関する。本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するための、そのような核酸、発現カセット、ベクター、または宿主細胞の使用に関する。
【００１６】
本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するためのプロセスであって、本発明による核酸、発現カセット、またはベクターで宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うことと、前記バリアントをコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で、形質転換／トランスフェクトされた宿主細胞を培養することと、任意選択で、宿主細胞により産生されたｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを回収することとを含む、プロセスにも関する。
【００１７】
宿主細胞は、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。特に、宿主細胞は、微生物、好ましくは細菌、酵母、または真菌であり得る。一実施形態では、宿主細胞は、細菌、好ましくはＥ．ｃｏｌｉである。別の実施形態では、宿主細胞は、酵母、好ましくはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓである。別の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＯＳ７またはＣＨＯ細胞である。
【００１８】
本発明は、３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドから鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するための、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの使用にも関する。当然ながら、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントは、本発明の文脈においては、未修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドおよび未修飾ヌクレオチドの混合物から、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するために使用することもできる。
【００１９】
本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの存在下で、少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドにプライマー鎖を接触させる、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのプロセスも提案する。本プロセスは特に、精製されたバリアント、前記バリアントを発現するように形質転換された宿主細胞の培養培地、および／またはそのような宿主細胞の細胞抽出物を使用して実施してもよい。
【００２０】
本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのバリアントと、ヌクレオチド、好ましくは３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドと、任意選択で少なくとも１つのプライマー鎖もしくはヌクレオチドプライマー、および／または反応バッファーとを含む、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのキットにも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のある実施形態によるＴｄＴバリアントの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｍ：分子量マーカー、１：ロード前の遠心分離物、２：ロード後の遠心分離物、３：ロード後の洗浄バッファー、４：溶出画分３ｍＬ、５：溶出画分３０ｍＬ、６：溶出ピークアセンブリ、７：濃縮）。
【図２】Ｍｕｔａｌｉｎオンラインアラインメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ）を用いて得られた、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＰｏｌ  μ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９ＮＰ８７）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ由来のＰｏｌ  μ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｈ２ＱＵＩ０）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のＰｏｌ  μ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９２４Ｗ４）、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ由来のＴｄＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｆ１Ｐ６５７）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のＴｄＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ３ＵＺ８０）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ由来のＴｄＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ３６１９５）、およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＴｄＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０４０５３）の各ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアラインメント。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の、事前に５’放射性標識されたプライマーおよび３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸修飾ヌクレオチド（ＯＮＨ２ゲル）または３’−ｂｉｏｔ−ＥＤＡ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸修飾ヌクレオチド（Ｂｉｏｔ−ＥＤＡゲル）の存在下における、配列番号３の配列の切断型野生型ＴｄＴおよび表１に示される様々な置換を含むこの切断型ＴｄＴのいくつかのバリアントの活性の比較（なし：酵素の存在なし、ｗｔ：配列番号３の配列の切断型野生型ＴｄＴ、ＤＳｉ：表１で定義するバリアントｉ）。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の、事前に５’放射性標識されたプライマーおよび３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸で修飾された様々なヌクレオチドの存在下における、本発明によるバリアントＤＳ１２４（表１参照）の活性の研究。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の、事前に５’放射性標識されたプライマーおよび３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸で修飾された様々なヌクレオチドの存在下における、バリアントＤＳ２２、ＤＳ２４、ＤＳ１２４、ＤＳ１２５、ＤＳ１２６、ＤＳ１２７、およびＤＳ１２８の活性の研究。
【図６】Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｇの置換の組合せを有する本発明によるＴｄＴのバリアント（ＤＳ１２５）を用いた、配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ−３’（配列番号１４）のプライマーの後に配列５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＴ−３’（配列番号１５）が続くＤＮＡ鎖の合成。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本文書において、アミノ酸は、次の命名法による１文字または３文字のコード：Ａ：Ａｌａ（アラニン）、Ｒ：Ａｒｇ（アルギニン）、Ｎ：Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｄ：Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｃ：Ｃｙｓ（システイン）、Ｑ：Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｅ：Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇ：Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈ：Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉ：Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌ：Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｋ：Ｌｙｓ（リシン）、Ｍ：Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｆ：Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｐ：Ｐｒｏ（プロリン）、Ｓ：Ｓｅｒ（セリン）、Ｔ：Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｗ：Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｙ：Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖ：Ｖａｌ（バリン）によって表される。
【００２３】
本発明の目的では、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性百分率」とは、最良のアラインメントの後に得られた、比較される２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味し、この百分率は純粋に統計的なものであり、２つの配列間の差はランダムに、またそれらの全長にかけて分布している。最良のアラインメントまたは最適なアラインメントとは、比較される２つの配列間の同一性百分率が、下記のように計算した場合に最も高いアラインメントである。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適なアラインメント後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を特定し比較するためのセグメントまたは比較ウィンドウによって行われる。比較のための最適な配列アラインメントは、手作業に加えて、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）（Ａｄ．  Ａｐｐ．  Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁）の局所相同性アルゴリズムを用いて、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁）の局所相同性アルゴリズムを用いて、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁）の類似性検索法を用いて、これらのアルゴリズムを使用したコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）を用いて、Ｍｕｔａｌｉｎオンラインアラインメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻（２２号）、１０８８１〜１０８９０頁）を用いて、達成することができる。２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性百分率は、これらの最適にアラインメントされた２つの配列を、これら２つの配列間の最適なアラインメントのための参照配列に対する付加または欠失が、比較される核酸またはアミノ酸配列の領域に含まれ得る比較ウィンドウによって比較することにより、決定される。同一性百分率は、２つの配列間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一位置数を決定し、この同一位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性百分率を得ることにより計算される。
【００２４】
本発明に関係するバリアントは、それらの特定の残基上の変異に従って記載され、この残基の位置は、配列番号１の酵素配列とのアラインメントにより、またはそれを参照して決定される。本発明の文脈においては、これらの同じ変異を機能的に同等な残基に保有する任意のバリアントも関係する。「機能的に同等な残基」とは、配列番号１と相同であり同一の機能的役割を有する配列のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの配列内の残基を意味する。機能的に同等な残基は、配列アラインメントを使用して、例えばＭｕｔａｌｉｎオンラインアラインメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻（２２号）、１０８８１〜１０８９０頁）を使用して特定される。アラインメント後、機能的に同等な残基は、問題の異なる配列上で相同な位置にある。配列アラインメントおよび機能的に同等な残基の特定は、任意のｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼと、種間のバリアントを含むその天然バリアントとの間で行われ得る。例として、ヒトＴｄＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０４０５３）の残基Ｌ４０は、ニワトリＴｄＴ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ３６１９５）の残基Ｍ４０およびＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  Ｐｏｌμ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｈ２ＱＵＩ０）の残基Ｖ４０と機能的に同等であり、前記残基は配列アラインメント後のものとみなされる（図２）。
【００２５】
「機能的断片」とは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの断片を意味する。この断片は、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの、１００、２００、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０個、またはそれよりも多くの連続したアミノ酸を含み得る。優先的には、この断片は、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの、前記酵素の触媒断片からなる３８０個の連続したアミノ酸を含む。
【００２６】
「変異体」および「バリアント」という用語は、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼに由来するか、またはそのようなＤＮＡポリメラーゼ、とりわけ配列番号１の配列によるマウスＴｄＴなどのＴｄＴの機能的断片に由来し、かつ１つまたは複数の位置に変化、すなわち置換、挿入、および／または欠失を含み、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを指すように、互換的に使用される場合がある。バリアントは、当技術分野で周知である種々の技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を修飾するための例示的な技術としては、定方向変異誘発、ランダム変異誘発、および合成オリゴヌクレオチドの構築が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
アミノ酸の位置または残基に関して本明細書で使用される「修飾」または「変異」という用語は、問題の位置におけるアミノ酸が、参照の野生型タンパク質のアミノ酸と比べて修飾されていることを意味する。そのような修飾は、１つまたは複数のアミノ酸、とりわけ１〜５、１〜４、１〜３、１〜２つのアミノ酸の、１つまたは複数の位置、とりわけ１、２、３、４、５、またはそれよりも多くの位置における、置換、欠失、および／または挿入を含む。
【００２８】
アミノ酸の位置または残基に関する「置換」という用語は、特定の位置におけるアミノ酸が、野生型または親ＤＮＡポリメラーゼにおけるそれ以外のアミノ酸に置き換えられていることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、１つのアミノ酸残基を、２０種の標準的な天然アミノ酸残基、稀な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、６−Ｎ−メチルリシン（６−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｙｓｉｎｅ））、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン）、および合成的に産生されることが多い稀な非天然アミノ酸残基（例えば、ノルロイシン、ノルバリン、およびシクロヘキシル−アラニン）から選択される別のものに置き換えることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、１つのアミノ酸残基を、２０種の標準的な天然に存在するアミノ酸残基（Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、およびＴ）から選択される別のものに置き換えることを意味する。置換は、保存的であっても非保存的であってもよい。保存的置換は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、および小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、およびスレオニン）の中の同じ群のアミノ酸内で行われる。本文書中では、置換の表記には次の用語法が使用される：Ｒ４５４Ｆは、配列番号１の４５４位におけるアミノ酸残基（アルギニン、Ｒ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置き換えられることを示す。Ｎ４７４Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑは、４７４位のアミノ酸残基（アスパラギン、Ｎ）が、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）に置き換えられ得ることを意味する。「＋」の記号は置換の組合せを示す。
【００２９】
本発明は、核酸分子、とりわけＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を、鋳型鎖を用いずに合成することができる、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．７；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７１巻、４０１〜４４０頁）のバリアントに関する。ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼは、とりわけ、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌβ（ヒトではＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０６７４６；マウスではＱ８Ｋ４０９）、Ｐｏｌδ、Ｐｏｌλ（ヒトではＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＵＧＰ５；マウスではＱ９ＱＵＧ２およびＱ９ＱＸＥ２）およびＰｏｌμ（ヒトではＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＰ８７；マウスではＱ９ＪＩＷ４）、Ｐｏｌ４（酵母Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒａではＵｎｉＰｒｏｔ  Ａ７ＴＥＲ５；酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＰ２５６１５）、ならびに末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼすなわちＴｄＴ（ＥＣ  ２．７．７．３１；ヒトではＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０４０５３；マウスではＰ０９８３８）を含む。
【００３０】
より詳細には、本発明は、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント、またはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントであって、前記バリアントが、Ｔ３３１、Ｇ３３２、Ｇ３３３、Ｆ３３４、Ｒ３３６、Ｋ３３８、Ｈ３４２、Ｄ３４３、Ｖ３４４、Ｄ３４５、Ｆ３４６、Ａ３９７、Ｄ３９９、Ｄ４３４、Ｖ４３６、Ａ４４６、Ｌ４４７、Ｌ４４８、Ｇ４４９、Ｗ４５０、Ｇ４５２、Ｒ４５４、Ｑ４５５、Ｆ４５６、Ｅ４５７、Ｒ４５８、Ｒ４６１、Ｎ４７４、Ｅ４９１、Ｄ５０１、Ｙ５０２、Ｉ５０３、Ｐ５０５、Ｒ５０８、Ｎ５０９、およびＡ５１０からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異を含み、示された位置は配列番号１の配列とのアラインメントにより、またはそれを参照して決定される、バリアントに関する。
【００３１】
一実施形態では、バリアントは、ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖が可能である。
【００３２】
「少なくとも１つの変異を含む」または「少なくとも１つの変異を含むこと」という表現は、バリアントが、配列番号１のポリペプチド配列と比べて示される１つまたは複数の変異を有するが、他の修飾、とりわけ置換、欠失、または付加を有してもよいことを意味する。
【００３３】
一般に、上記の位置における１つまたは複数の残基の変異は、触媒ポケットを拡大し（例えばＷ４５０位、Ｄ４３４位、Ｄ４３５位、Ｈ３４２位、Ｄ３４３位、Ｔ３３１位、Ｒ３３６位、Ｄ３９９位、Ｒ４６１位、および／またはＲ５０８位を標的とすることによる）、触媒ポケットへのアクセス可能性を高め（例えばＲ４５８位、Ｅ４５５位、Ｒ４５４位、Ａ３９７位、Ｋ３３８位、および／またはＮ５０９位を標的とすることによる）、かつ／または酵素の構造により大きな柔軟性を与えて、それが相当な立体容積を有する修飾ヌクレオチドを受容することができるようにする（例えばＶ４３６位、Ｆ３４６位、Ｖ３４４位、Ｆ３３４位、Ｍ３３０位、Ｌ４４８位、Ｅ４９１位、Ｅ４５７位、および／またはＮ４７４位を標的とすることによる）。
【００３４】
本発明に関係するバリアントは、Ｐｏｌ  ＩＶ、Ｐｏｌ  μ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、またはＴｄＴのバリアント、優先的にはＰｏｌ  ＩＶ、Ｐｏｌ  μ、またはＴｄＴのバリアントであり得る。代替的に、バリアントは、例えば、少なくとも２つのｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの異なる配列の部分を組み合わせたキメラ酵素のバリアントであってもよい。
【００３５】
特定の実施形態では、バリアントは、配列番号１の配列と少なくとも６０％の同一性、優先的には配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％未満の同一性を有する。
【００３６】
本発明によれば、変異は、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加からなる場合がある。欠失の場合は、Ｘの注記が使用され、これは、問題の残基をコードするコドンが終止コドンに置き換えられ、したがって、問題の残基のみならず続くアミノ酸の全てが欠失することを示す。したがって、変異Ｄ５０１Ｘとは、その酵素が、５０１位のアスパラギン酸（Ｄ）に先行する残基、すなわち５００位のロイシン（Ｌ）で終わり、それ以降の残基は全て欠失していることを意味する。一方で、φの注記は、考慮されている残基の単純な点欠失を示す。したがって、変異Ｄ５０１φとは、５０１位のアスパラギン酸（Ｄ）が欠失していることを意味する。
【００３７】
優先的には、本発明によるバリアントは、Ｔ３３１、Ｇ３３２、Ｇ３３３、Ｆ３３４、Ｒ３３６、Ｄ３４３、Ｌ４４７、Ｌ４４８、Ｇ４４９、Ｗ４５０、Ｇ４５２、Ｒ４５４、Ｑ４５５、Ｅ４５７、およびＲ５０８からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異、優先的には、Ｒ３３６、Ｒ４５４、Ｅ４５７からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの変異を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される。
【００３８】
特定の実施形態では、前記バリアントは、Ｒ３３６、Ｒ４５４、およびＥ４５７からなる群より選択される少なくとも２つの位置における残基の少なくとも１つの変異、優先的には、前記３つの位置Ｒ３３６、Ｒ４５４、およびＥ４５７における残基または機能的に同等な残基の変異を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される。
【００３９】
特定の実施形態では、バリアントは、配列Ｘ１Ｘ２ＧＧＦＲ１Ｒ２ＧＫＸ３Ｘ４（配列番号４）（式中、
Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌから選択される残基を表し、
Ｘ２は、Ｔ、Ａ、Ｍ、Ｑから選択される残基を表し、
Ｘ３は、Ｍ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｄから選択される残基を表し、
Ｘ４は、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｙ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｒ、Ｄから選択される残基を表す）
の少なくとも半保存領域における残基の少なくとも１つの変異をさらに含む。
【００４０】
優先的には、前記バリアントは、配列番号４の配列の半保存領域の少なくとも１つの位置Ｒ１、Ｒ２、および／またはＫにおける残基の少なくとも１つの置換を有する。
【００４１】
別の特定の実施形態では、バリアントは、配列Ｘ１Ｘ２ＬＧＸ３Ｘ４ＧＳＲ１Ｘ５Ｘ６ＥＲ２（配列番号５）（式中、
Ｘ１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓから選択される残基を表し、
Ｘ２は、Ｌ、Ｔ、Ｒから選択される残基を表し、
Ｘ３は、Ｗ、Ｙから選択される残基を表し、
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｉから選択される残基を表し、
Ｘ５は、Ｑ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、またはφから選択される残基を表し、
Ｘ６は、Ｆ、Ｙから選択される残基を表す）
の少なくとも１つの半保存領域における残基の少なくとも１つの変異をさらに含む。
【００４２】
優先的には、前記バリアントは、配列番号５の配列の半保存領域の少なくとも１つの位置Ｓ、Ｒ１、および／またはＥにおける残基の少なくとも１つの置換を有する。
【００４３】
別の特定の実施形態では、バリアントは、配列ＬＸ１ＹＸ２Ｘ３ＰＸ４Ｘ５ＲＮＡ（配列番号６）（式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ａ、Ｋから選択される残基を表し、
Ｘ２は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｔから選択される残基を表し、
Ｘ３は、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｇ、Ｎから選択される残基を表し、
Ｘ４は、Ｗ、Ｓ、Ｖ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｋ、Ｈから選択される残基を表し、
Ｘ５は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｌから選択される残基を表す）
の少なくとも１つの半保存領域における残基の少なくとも１つの変異をさらに含む。
【００４４】
優先的には、前記バリアントは、配列番号６の配列の半保存領域のＸ１位における残基の少なくとも１つの欠失ならびに／またはＲ位および／もしくはＮ位における少なくとも１つの置換を有する。
【００４５】
特定の実施形態では、バリアントは、Ｒ３３６、Ｋ３３８、Ｈ３４２、Ａ３９７、Ｓ４５３、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｎ４７４、Ｄ５０１、Ｙ５０２、Ｉ５０３、Ｒ５０８、およびＮ５０９からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、優先的には、Ｒ３３６、Ａ３９７、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｎ４７４、Ｄ５０１、Ｙ５０２、およびＩ５０３からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、より優先的には、Ｒ３３６、Ｒ４５４、Ｅ４５７からなる群より選択される少なくとも１つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも１つの置換を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される。
【００４６】
本発明は、好ましくは、Ｒ３３６Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｎ／Ｄ、Ｋ３３８Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ、Ｈ３４２Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ、Ａ３９７Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ、Ｓ４５３Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｒ４５４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ａ、Ｅ４５７Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｎ４７４Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ、Ｄ５０１Ａ／Ｇ／Ｘ、Ｙ５０２Ａ／Ｇ／Ｘ、Ｉ５０３Ａ／Ｇ／Ｘ、Ｒ５０８Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｎ５０９Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｓ／Ｔからなる群よりの少なくとも１つの置換を含む、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントに関する。特定の実施形態では、バリアントは、Ｒ３３６、Ｒ４５４、Ｅ４５７からなる群より選択される少なくとも２つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、優先的には、前記３つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換を含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される。とりわけ、置換は、Ｒ３３６Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｎ／Ｄ、Ｒ４５４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ａ、およびＥ４５７Ｎ／Ｄ／Ｇ／Ｓ／Ｔからなる群より、優先的には、Ｒ３３６Ｎ／Ｇ、Ｒ４５４Ａ、およびＥ４５７Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔからなる群より選択される。
【００４７】
一実施形態では、バリアントは、Ｅ４５７Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔによる少なくとも１つの置換を含む。
【００４８】
有利なことには、バリアントは、上記に挙げた群から選択される置換の組合せを含む。この組合せは、前記群から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１の置換からなることができる。
【００４９】
本発明は、より特定すると、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖などの核酸分子を鋳型鎖を用いずに合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼまたはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントであって、前記バリアントが、表１に記載の変異の少なくとも１つの組合せを含み、示された位置は配列番号１とのアラインメントにより決定される、バリアントに関する。
【００５０】
一実施形態では、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントは、Ｒ３３６Ｇ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｇ、Ｒ３３６Ｎ−Ｅ４５７Ｇ、およびＲ３３６Ｇ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｎのうちの置換の組合せを含む。
【表１−１】
2019517799.tif 000002
【表１−２】
2019517799.tif 000003
【表１−３】
2019517799.tif 000004
【表１−４】
2019517799.tif 000005
【００５１】
特定の実施形態では、バリアントは、ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのキメラ構築物である。「キメラ構築物」とは、考慮されているＤＮＡポリメラーゼのバリアントにおける１つまたは複数の相同配列の代わりの、ｐｏｌＸファミリーに属する酵素の１つまたは複数の規定の配列の結合、とりわけ融合またはコンジュゲーションからなるキメラ酵素を意味する。
【００５２】
したがって本発明は、上記の位置のうちの１つおよび／またはその他における１つまたは複数の点変異に加えて、Ｃ３７８位からＬ４０６位の間に含まれる残基または機能的に同等な残基の、配列番号２の配列のポリメラーゼＰｏｌμの残基Ｈ３６３〜Ｃ３９０または機能的に同等な残基による置換を含む、配列番号１の配列のＴｄＴのバリアントを提案する。
【００５３】
代替的または付加的に、本発明に関係するバリアントは、Ｎ末端部分における１つまたは複数の連続したアミノ酸残基の欠失を有し得る。これらの欠失は、とりわけ、他のタンパク質との結合に関与し、かつ／または細胞局在に関与する、１つまたは複数の酵素ドメインを標的とし得る。例えば、ＴｄＴポリペプチド配列は、Ｋｕ７０／８０などの他のタンパク質との相互作用のためのＮ末端ＢＲＣＴドメイン、および核局在化ドメイン（ＮＬＳ）を含む。
【００５４】
本発明の特定の実施形態では、バリアントは、上記の変異のうちの１つまたは複数に加えて、野生型ＴｄＴのＮ末端に対応する残基１〜１２９の欠失を有する、配列番号１の配列のＴｄＴのバリアントである。
【００５５】
ある特定の特定事例では、変異誘発の方策は、天然バリアントの配列、同様のタンパク質との配列比較、物理的特性、三次元構造またはいくつかの実体が関わるコンピュータシミュレーションの研究などの公知の情報によってガイドされ得る。
【００５６】
本発明は、本発明による鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントをコードする核酸に関する。本発明は、本発明による核酸のための発現カセットにも関する。本発明はさらに、本発明による核酸または発現カセットを含むベクターに関する。ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターから選択することができる。
【００５７】
ＤＮＡポリメラーゼのバリアントをコードする核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、これら両方の混合物であってもよい。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖の形態、またはこれら両方の混合物であってもよい。核酸は、例えば修飾された結合、修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾された糖を含む、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。核酸は、化学合成、組換え、変異誘発などを含む、当業者に公知のあらゆる方法によって調製することができる。
【００５８】
発現カセットは、本発明による鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの発現に必要な全てのエレメント、とりわけ、宿主細胞における転写および翻訳に必要なエレメントを含む。宿主細胞は、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。特に、発現カセットは、プロモーターおよびターミネーター、任意選択で増幅因子を含む。プロモーターは、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。好ましい原核生物プロモーターの例は、Ｌａｃｌ、ＬａｃＺ、ｐＬａｃＴ、ｐｔａｃ、ｐＡＲＡ、ｐＢＡＤ、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ラムダファージプロモーターＰＲまたはＰＬである。好ましい真核生物プロモーターの例は、ＣＭＶ初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーター、およびある特定のレトロウイルスのＬＴＲ領域である。一般に、好適なプロモーターの選択に関して、当業者は有利なことに、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）の研究あるいはＦｕｌｌｅｒら（１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）により記載された技術を参照することができる。
【００５９】
本発明は、本発明による鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントをコードする核酸または発現カセットを保有するベクターに関する。ベクターは、好ましくは発現ベクターであり、すなわち、ベクターは、宿主細胞におけるバリアントの発現に必要なエレメントを含む。宿主細胞は、原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ、または真核生物であってもよい。真核生物は、酵母（例えば、Ｐ．ＰａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓ）もしくは真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のもの）などの下等真核生物、または昆虫細胞（例えばＳｆ９またはＳｆ２１）、哺乳動物細胞、もしくは植物細胞などの高等真核生物であってもよい。細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ（ミドリザル細胞株）（例えば、ＣＯＳ  １（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ  ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（ＵＳ４，８８９，８０３；ＵＳ５，０４７，３３５、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１））、マウス細胞、およびヒト細胞であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、非ヒトかつ非胚性である。ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐＴｉプラスミドなどであり得る。ベクターは、好ましくは、複製起点、多重クローニング部位、および選択可能な遺伝子から選択される１つまたは複数のエレメントを含み得る。好ましい実施形態では、ベクターはプラスミドである。原核生物ベクターのいくつかの非包括的な例は、次のとおりである：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプト（ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）。真核生物ベクターのいくつかの非包括的な例は、次のとおりである：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；およびｐＱＥ−３０（ＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ）。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、レンチウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
【００６０】
本発明によるバリアントをコードする配列は、任意選択でシグナルペプチドを含み得る。これを含まない場合、メチオニンを任意選択でＮ末端に付加してもよい。別の代替形態では、異種シグナルペプチドを導入してもよい。この異種シグナルペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物に由来しても、真核生物、とりわけ哺乳動物、昆虫、または酵母細胞に由来してもよい。
【００６１】
本発明は、細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うための、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターの使用に関する。本発明は、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントをコードする核酸、発現カセット、またはベクターを含む宿主細胞、および本発明による組換え鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するためのその使用に関する。「宿主細胞」という用語は、前記細胞の培養または増殖から生じる娘細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、非ヒトかつ非胚性である。本発明は、本発明による組換え鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するための方法であって、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターを用いて細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うことと、トランスフェクト／形質転換された細胞を培養することと、細胞により産生された、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを収集することとを含む方法にも関する。代替的な実施形態では、本発明による組換え鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを産生するための方法は、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターを含む細胞を提供することと、トランスフェクト／形質転換された細胞を培養することと、細胞により産生された、鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントを収集することとを含む。特に、細胞は、バリアントをコードする核酸で一過的または安定に形質転換／トランスフェクトされてもよい。この核酸は、エピソームまたは染色体として細胞に含まれていてもよい。組換えタンパク質を産生するための方法は、当業者には周知である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生に関しては、ＵＳ５，００４，６８９、ＥＰ４４６５８２、Ｗａｎｇら（Ｓｃｉ．  Ｓｉｎ．  Ｂ、２４巻：１０７６〜１０８４頁、１９９４年、およびＮａｔｕｒｅ、２９５巻、５０３頁）、哺乳動物細胞における産生に関してはＪＡＭＥＳら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）、５巻：３３１〜３４０頁）に記載されている、特定の方法を挙げることができる。
【００６２】
本発明によるＤＮＡポリメラーゼのバリアントは、鋳型鎖を用いない核酸の合成を特に目的とする。より特定すると、本発明によるバリアントは、天然ヌクレオチドよりも大きな嵩を有する修飾ヌクレオチドを使用した核酸合成に特に適した、拡大された触媒ポケットを有する。本発明によるバリアントは、とりわけ、ＷＯ２０１６／０３４８０７の出願に記載されているような核酸鎖修飾ヌクレオチドへの取り込みを可能にすることができる。
【００６３】
上記の特定の変異または変異の組合せを有する、本発明によるＤＮＡポリメラーゼのバリアント、特にＴｄＴのバリアントの取り込みの動態は、野生型ＤＮＡポリメラーゼの取り込みの動態と比較して大きく増強されている。これらのバリアントは、有利なことに、高性能酵素ＤＮＡ合成法の文脈において使用され得る。
【００６４】
したがって本発明は、とりわけＷＯ２０１６０３４８０７の出願に記載されているような３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドから鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するための、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの使用にも関する。
【００６５】
本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの存在下で、少なくとも１つのヌクレオチド、優先的には３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドにプライマー鎖を接触させる、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのプロセスにも関する。
【００６６】
有利なことには、本発明によるバリアントは、ＷＯ２０１５／１５９０２３の出願に記載されている合成プロセスを実施するために使用することができる。
【００６７】
本発明は、本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのバリアントと、ヌクレオチド、優先的には３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドと、任意選択で少なくとも１つのヌクレオチドプライマーとを含む、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのキットにも関する。
【００６８】
本明細書において引用される参考文献は全て、参照により本出願に組み込まれる。本発明の他の特色および利点は、当然ながら例証的かつ非限定的である以下の実施例を読むことによって、より容易に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００６９】
（実施例１−本発明によるｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアントの生成、産生、および精製）
産生株の生成
その構築が［Ｂｏｕｌｅら、１９９８年、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻、１９９〜２０８頁］に記述されているプラスミドｐＥＴ２８ｂから、切断型マウスＴｄＴ遺伝子を生成した。次のプライマー：
【化１】
2019517799.tif 000006
を使用し、従来のＰＣＲ増幅および分子生物学技術を使用して、対応する配列番号３の配列（配列番号１の最初の１２０個のアミノ酸が切断されたものに対応する）を増幅した。これをプラスミドｐＥＴ３２にクローニングして、ベクターｐＥＴ３２−配列番号３を得た。
【００７０】
プラスミドｐＥＴ３２−配列番号３の配列決定をまず行い、次に市販のＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。カナマイシン／クロラムフェニコールプレートで増殖することができたコロニーを単離し、Ｅｃ−配列番号３とマークした。
【００７１】
バリアントの生成
ベクターｐＥＴ３２−配列番号３を出発ベクターとして使用した。点変異を含むプライマー（またはそれらが十分に近ければ、ある特定の場合では複数の点変異）を、Ａｇｉｌｅｎｔのオンラインツール：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）から生成した。
【００７２】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、所望の変異を有するバリアントのプラスミドを生成した。プラスミドｐＥＴ３２−ＤＳｉ（ｉは、表１に示される問題のバリアントの番号である）を得るために、製造元により与えられた変異誘発プロトコールに忠実に従った。手順の最後に、プラスミドｐＥＴ３２−ＤＳｘの配列決定をまず行い、次に市販のＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。カナマイシン／クロラムフェニコールプレートで増殖することができたコロニーを単離し、Ｅｃ−ＤＳｘとマークした。
【００７３】
産生
カナマイシンおよびクロラムフェニコールを適量添加した５０ｍＬのＬＢ培地を含む２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内で、Ｅｃ−配列番号３およびＥｃ−ＤＳｘ細胞を前培養した。この培養物を振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。次にこの前培養物を使用して、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを適量補充した２ＬのＬＢ培地を含む５Ｌのエルレンマイヤーフラスコに播種した。初期の光学密度（ＯＤ）は０．０１であった。この培養物を振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＯＤが０．６から０．９の間の値に達するまでこれを定期的に測定した。この値に達したら、１ｍＬの１Ｍイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを培養培地に添加した。この培養物を翌日まで再度３７℃でインキュベートした。次に、５０００ｒｐｍを超えずに遠心分離によって細胞を収集した。得られた種々のペレットを、溶解バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた洗浄中に単一のペレットに組み合わせた。細胞ペレットを−２０℃で冷凍した。細胞ペレットはこのようにして数か月間保存することができる。
【００７４】
抽出
先のステップ中に冷凍した細胞ペレットを２５〜３７℃の水浴中で解凍した。完全に解凍されたら、約１００ｍＬの溶解バッファーにこれを再懸濁した。再懸濁は、非常に均質な溶液をもたらし、特に凝集物が全く存在しないことが必要であるため、特に注意した。このように再懸濁した細胞を、１４０００ｐｓｉの圧力下でフレンチプレスを使用して溶解した。収集したライセートを、１００００ｇで１時間〜１時間３０分にわたり高速で遠心分離した。遠心分離物を０．２μＭフィルタで濾過し、十分な容積の管に収集した。
【００７５】
精製
ＴｄＴをアフィニティカラムで精製した。５ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ  Ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を蠕動ポンプ（ＭＩＮＩＰＵＬＳ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｇｉｌｓｏｎ）と共に使用した。まず、２〜３ＣＶ（カラム容積）の溶解バッファーを使用してカラムを平衡化した。次に、先のステップの遠心分離物を約０．５〜５ｍＬ／分の速度でカラムにロードした。遠心分離物の全体をロードしたら、３ＣＶの溶解バッファーおよび３ＣＶの洗浄バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄した。このステップの最後に、約０．５〜１ｍｌ／分で総容積３ＣＶにわたり溶出バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍイミダゾール）をカラムに注入した。溶出段階全体を通して、カラム出力を１ｍＬの画分に収集した。これらの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、どの画分が溶出ピークを含むかを決定した。決定されたら、これらを単一の画分に組み合わせ、透析バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ  ［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析した。次にＴｄＴを５〜１５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで濃縮した（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−３０  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ、Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。濃縮されたＴｄＴに５０％グリセロールを添加した後、長期間保存のため−２０℃で冷凍した。精製段階全体を通して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析のために種々の試料のアリコート（約５μＬ）を収集した。分析の結果を図１に提示する。
【００７６】
（実施例２−本発明によるバリアントの作出に使用される可能性が高いＰｏｌＸファミリーの種々のポリメラーゼ間の配列アラインメント）
Ｍｕｔａｌｉｎオンラインアラインメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ、アクセス日：２０１６年４月４日）を使用し、ＰｏｌＸファミリーの種々のＤＮＡポリメラーゼのアラインメントを行った。
【表２】
2019517799.tif 000007
【００７７】
結果として得られたアラインメントを図２に示す。
【００７８】
（実施例３−非天然基質の存在下におけるバリアントの活性の研究）
本発明による様々なバリアントの活性を、以下の試験によって決定した。結果を、各バリアントが由来する天然酵素で得られたものと比較した。
活性試験
【表３】
2019517799.tif 000008
【００７９】
使用した配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ−３’（配列番号１４）のプライマーは、酵素ＰＮＫ（ＮＥＢ）および放射性ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用し、標準的な標識プロトコールを用いて事前に５’放射性標識した。
【００８０】
２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、８０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ  ＺｎＳＯ４からなる１０×バッファーを使用した。
【００８１】
使用した修飾ヌクレオチドは、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または３’−ｂｉｏｔ−ＥＤＡ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸（Ｂｉｏｔ−ＥＤＡ、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、例えば３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸または３’−ｂｉｏｔ−ＥＤＡ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸などである。３’−Ｏ−アミノ基は、３’−ＯＨ末端に結合した、より容積の大きい基である。３’−ｂｉｏｔ−ＥＤＡ基は、３’−ＯＨ末端に結合した、極めて容積が大きく柔軟性のない基である。
【００８２】
天然ＴｄＴ（配列番号３）と比べた、表１に列挙されるバリアントにより行われる修飾ヌクレオチドの取り込み性能を、酵素のみを変更した同時の活性試験を行うことによって評価した。
【００８３】
上記の表３に示した順序で試薬を添加し、次に３７℃で９０分間インキュベートした。次に、ホルムアミドブルー（１００％ホルムアミド、１〜５ｍｇのブロモフェノールブルー；Ｓｉｍｇａ）を添加することによって反応を停止させた。
【００８４】
ゲルおよびＸ線撮影
先の活性試験の分析のために、１６％変性ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した。ゲルは事前に注ぎ、放置して重合させた。これを次に、ＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ）で満たした好適なサイズの電気泳動槽に載置した。種々の試料を前処理せずにゲルに直接ロードした。
【００８５】
次にこのゲルを、３〜６時間５００〜２０００Ｖの電位差に供した。泳動が満足のいくものになったら、ゲルを取り外し、次にインキュベーションカセットに移した。適切な検出モードを予め設定したＴｙｐｈｏｏｎ機器（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った可視化のため、蛍光スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を１０〜６０分間使用した。
【００８６】
結果
使用した２つの酵素の比較結果を図３に提示する。
【００８７】
より詳細には、第１のゲル（ＯＮＨ２の取り込み）では、天然ＴｄＴ（ｗｔの列）は、陰性対照（「なし」の列）との比較により示されるように、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸修飾ヌクレオチドを取り込むことができない。
【００８８】
様々なバリアントの中で、３つの異なる群を観察することができる。
第１の群のバリアント（ＤＳ７〜ＤＳ３４の列）は、約５０％の取り込みが可能である。
第２の群のバリアント（ＤＳ４６〜ＤＳ７３の列）は、９５％超、場合によっては９８％超の取り込みが可能である。
第３の群のバリアント（ＤＳ８３〜ＤＳ１０６の列）は、６０〜８０％の取り込みが可能である。
【００８９】
第２のゲル（Ｂｉｏｔ−ＥＤＡの取り込み）では、天然ＴｄＴ（ｗｔの列）は、陰性対照（「なし」の列）との比較により示されるように、３’−ｂｉｏｔ−ＥＤＡ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸修飾ヌクレオチドを同様に取り込むことができない。
【００９０】
様々なバリアントの中で、３つの異なる群を観察することができる。
第１の群のバリアント（ＤＳ７〜ＤＳ３４の列）は、約５〜１０％の取り込みが可能である。
第２の群のバリアント（ＤＳ４６〜ＤＳ７３の列）は、３０％超、場合によっては４０％超の取り込みが可能である。
第３の群のバリアント（ＤＳ８３〜ＤＳ１０６の列）は、１０〜２５％の取り込みが可能である。
【００９１】
これらの結果は、本発明によるＴｄＴのバリアントが全て、野生型酵素とは異なり、基質として、修飾ヌクレオチド、とりわけ３’−ＯＨ修飾ヌクレオチドを使用することができることを確認する。特に有利なことには、ある特定のバリアントは非常に高い取り込み率を有し、これは、修飾を保有するヌクレオチドの存在下でさえも、前記ヌクレオチドの立体容積を大きく増加させる傾向がある。
【００９２】
（実施例４−本発明によるバリアントの動態の研究）
先行する実施例１に従い、Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｎの置換の組合せを有する変異体（ＤＳ１２４）を生成し、産生した。
【００９３】
活性試験
活性試験では、酵素をＯＮＨ２修飾ヌクレオチドの存在下におき、種々の長さの時間にわたって３７℃でインキュベートする。反応を停止させてＤＳ１２４の取り込み動態を観察し、これを天然のＷＴ酵素（配列番号３）の動態と比較する。
【表４】
2019517799.tif 000009
【００９４】
使用するプライマーおよびバッファーは実施例３と同一である。
【００９５】
使用した修飾ヌクレオチドは、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）：３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシグアノシン−５’−三リン酸、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシシチジン−５’−三リン酸、および３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リン酸である。３’−Ｏ−アミノ基は、３’−ＯＨ末端に結合した、より容積の大きい基である。
【００９６】
プライマー以外の全ての試薬（表４に示した順序で添加した）を含むプレミックスを調製した活性試験を行うことにより、酵素ＤＳ１２４によるヌクレオチド混合物の取り込み性能を評価した。これらを様々な反応ウェルに分配する。初期時間ｔ＝０において、プライマーを全てのウェルに同時に加える。ｔ＝２分、ｔ＝５分、ｔ＝１０分、ｔ＝１５分、ｔ＝３０分、およびｔ＝９０分の異なる時間において、ホルムアミドブルー（１００％ホルムアミド、１〜５ｍｇのブロモフェノールブルー；Ｓｉｍｇａ）を添加することによって反応を停止させる。
【００９７】
ゲルおよびＸ線撮影
実施例３に記載したプロトコールに従い、ポリアクリルアミドゲル中の種々の試料の泳動により、活性試験の分析を行う。
【００９８】
結果
２つの酵素（ＤＳ１２４およびＷＴ）の比較結果を図４に提示する。
【００９９】
より詳細には、このゲルでは、使用するプライマーが伸長されていない場合、すなわちヌクレオチドが取り込まれていない場合、陰性対照（「なし」の列）は、予想されるサイズのプライマーをもたらす。天然のＴｄＴ（ＷＴの列）は、修飾ヌクレオチド（ここではＯＮＨ２−ｄＧＴＰ）を取り込むことができない：「なし」の列と同じレベルのバンドが観察される。
【０１００】
試験した全てのヌクレオチド、そして９０分間（ここでは陽性対照として使用した）から２分間の範囲の全ての時間、すなわちインキュベーション時間の４５分の１への低減に関して、バリアントＤＳ１２４は、１００％の見かけの効率で修飾ヌクレオチドを取り込むことができる。
【０１０１】
これらの結果は、本発明によるＴｄＴのバリアントが、取り込み効率および取り込み率の両方の観点から、天然ＴｄＴのものよりも大幅に高い取り込み性能を有し得ることを確認する。本発明によるＴｄＴのバリアントの動態は、本発明により記載される特定の変異または変異の組合せによって大きく増強される。
【０１０２】
（実施例５−本発明によるバリアントの特異性の研究）
実施例１に従い、以下の表５による置換の組合せを有する変異体を生成し、産生した。
【表５】
2019517799.tif 000010
【０１０３】
活性試験
この活性試験では、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの高度に濃縮された混合物と、様々なバリアントを合わせた。インキュベーション時間を短縮するため、また定量的な添加を達成するため（実施例４参照）、酵素濃度も増加させる。
【０１０４】
生成した様々なバリアントの活性を以下の試験によって決定した。
【０１０５】
各バリアントを、（１）ヌクレオチドの非存在下（Ｈ２Ｏに置き換える）または（２）ヌクレオチド混合物の存在下の、２つの条件下で試験する。様々なバリアントの結果を互いと比較する。ヌクレオチドも酵素も含まない（Ｈ２Ｏに置き換えられた）対照試料を添加した。
【表６】
2019517799.tif 000011
【０１０６】
使用するプライマーおよびバッファーは実施例３と同一である。
【０１０７】
存在する場合、ヌクレオチド混合物は、天然の２’−デオキシヌクレオチド５’−三リン酸ヌクレオチド（Ｎｕｃ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、例えば２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、および３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸修飾ヌクレオチド（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、例えば３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシグアノシン−５’−三リン酸などからなる。３’−Ｏ−アミノ基は、３’−ＯＨ末端に結合した、より容積の大きい基である。この混合物は、９０％のＯＮＨ２−ｄＧＴＰ修飾ヌクレオチドおよび１０％の天然ｄＧＴＰヌクレオチドからなる。
【０１０８】
互いと比べた、表５に列挙されるバリアントによるヌクレオチド混合物の取り込み性能を、酵素のみを変更した同時の活性試験を行うことによって評価した。
【０１０９】
上記の表６に示した順序で試薬を添加し、次に３７℃で１５分間インキュベートした。次に、ホルムアミドブルー（１００％ホルムアミド、１〜５ｍｇのブロモフェノールブルー；Ｓｉｍｇａ）を添加することによって反応を停止させた。
【０１１０】
ゲルおよびＸ線撮影
実施例３に記載したプロトコールに従い、ポリアクリルアミドゲル中の種々の試料の泳動により、活性試験の分析を行った。
【０１１１】
結果
使用した酵素の比較結果を図５に提示する。
【０１１２】
より詳細には、このゲルでは、使用するプライマーが伸長されていない場合、すなわちヌクレオチドが取り込まれていない場合、陰性対照（「なし」の列）は、予想されるサイズのプライマーをもたらす。以下の試料はペアになっており、各ペアは、同じ酵素バリアントをヌクレオチドの非存在下および存在下（それらが存在する場合は混合物の形態）の２つの条件下で試験したものに対応する。
【０１１３】
試験した様々なバリアントの中で、３つの異なる群を観察することができる。
【０１１４】
第１の群は、陰性対照を構成するバリアントＤＳ１２８である。このバリアントは、極めて低いヌクレオチド取り込み率を有する：ヌクレオチド混合物が存在する場合、混合物中に存在する天然ヌクレオチドの割合に対応する５％から１０％の間の取り込みが観察される。
【０１１５】
第２の群は、バリアントＤＳ１２７およびＤＳ２２からなる。これらのバリアントは、高いヌクレオチド取り込み率を有する：ヌクレオチド混合物が存在する場合、５０％から６０％の間の取り込みが観察される。この場合でも、これら２つのバリアントに関して、２つのヌクレオチドの連続的な取り込みに対応する過剰添加バンド（ｕｎｅ  ｂａｎｄｅ  ｄｅ  ｓｕｒ−ａｄｄｉｔｉｏｎ）が観察される。このバンドの強度は、ヌクレオチド混合物中に存在する天然ヌクレオチドの割合に対応する。
【０１１６】
最後の群は、バリアントＤＳ１２４、ＤＳ２４、ＤＳ１２５、およびＤＳ１２６からなる。これらのバリアントは、ヌクレオチド混合物が存在する場合、ＤＳ１２４およびＤＳ１２５については８０％から１００％の間の極めて高いヌクレオチド取り込み率を有する。この場合、過剰添加バンドは存在しない。バリアントＤＳ２４およびＤＳ１２６の場合、非取り込みの割合は、混合物中に存在する天然ヌクレオチドの割合と同様である。
【０１１７】
これらの結果は、本発明によるＴｄＴのバリアントが、修飾ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドの混合物の中でも修飾ヌクレオチドを優先的に使用することができることを確認する。特に有利なことには、これらのバリアントは、修飾ヌクレオチドの極めて高い取り込み率を有し、天然ヌクレオチドを取り込まないようにそれらを区別することができ、したがって、過剰添加を回避することによりＤＮＡ合成の質を大きく向上させる。
【０１１８】
（実施例６−鋳型鎖を用いないＤＮＡ鎖の合成の例）
実施例１に従い、Ｒ３３６Ｎ−Ｒ４５４Ａ−Ｅ４５７Ｇの置換の組合せを有するＴｄＴのバリアント（ＤＳ１２５）を生成し、産生した。
【０１１９】
バリアントＤＳ１２５を使用して、配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ−３’（配列番号１４）のプライマーの後に５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＴ−３’（配列番号１５）が続く配列を合成する。このプライマーは、酵素ＰＮＫ（ＮＥＢ）および放射性ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用し、標準的な標識プロトコールを用いて事前に５’放射性標識した。
【０１２０】
このプライマーは、配列５’−ＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１６）の相補的な捕捉断片との相互作用により、固体支持体に結合する。捕捉断片は、その３’末端に、それが、表面に結合した反応基と共有結合性に反応することができるようにする基を有する。例えば、この基は、ＮＨ２、反応基のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、および磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の表面であってもよい。捕捉断片とプライマーの相互作用は、標準的なＤＮＡ断片ハイブリダイゼーション条件下で行われる。
【０１２１】
使用した修飾ヌクレオチドは、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸（ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、例えば３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシグアノシン−５’−三リン酸、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシシチジン−５’−三リン酸、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−三リン酸、または３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸である。３’−Ｏ−アミノ基は、３’−ＯＨ末端に結合した、より容積の大きい基である。
合成
【表７】
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【０１２２】
２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、８０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ  ＺｎＳＯ４からなる１０×バッファーを使用した。
【０１２３】
使用した洗浄バッファーＷは、ｐＨ７．２の２５ｍＭトリス−ＨＣｌからなる。
【０１２４】
使用した脱保護バッファーＤは、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下でｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムからなる。
【０１２５】
合成の開始前、総当量３５ｐｍｏｌのプライマーに対し、プライマーをハイブリダイズさせる固体支持体を構成するビーズを、バッファーＷで数回洗浄した。これらの洗浄の後、ビーズを磁石上に保持し、上清の全体を除去した。
【０１２６】
表７に示した順序で添加した様々な試薬からなる、いくつかのプレミックスを調製した。これらのプレミックスのそれぞれは、以下の表８に示されるように、異なるヌクレオチドを含む。
【表８】
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【０１２７】
事前に洗浄し上清を取り除いたビーズにプレミックス１を添加すると、合成が始まる。以下の表９に提示される合成ステップは、新たな配列５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＴ−３’を産生するために、示されている順序で行われる。
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１２８】
試料採取ステップを除く各ステップ間で、磁石を用いてビーズを収集し、上清の全体を除去する。
【０１２９】
ホルムアミドブルー（１００％ホルムアミド、１〜５ｍｇのブロモフェノールブルー；Ｓｉｍｇａ）の１５μＬ溶液に各試料を添加して、反応を停止させ、分析を作成する。
【０１３０】
ゲルおよびＸ線撮影
実施例３に記載したプロトコールに従い、ポリアクリルアミドゲル中の種々の試料の泳動により、活性試験の分析を行う。
【０１３１】
結果
この合成の結果を図６に提示する。
【０１３２】
０の列（「なし」、ヌクレオチドなし）は、使用するプライマーが伸長されていない場合、すなわちヌクレオチドが取り込まれてない場合、予想されるサイズのプライマーをもたらす。
【０１３３】
１〜１０の列は、合成中の試料１〜１０に対応する。ヌクレオチドの取り込みはそれぞれ、最大の性能を有する酵素によって行った。さらなる精製ステップは行わない。
【０１３４】
天然のＴｄＴを用い、同様の合成実験を行った。後者は修飾ヌクレオチドを取り込むことができず、所望の配列を合成することは不可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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