(57)【要約】  本発明により、ＴｒｋＢシグナル伝達活性を特異的に増強するＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片を提供する。また、本発明により、網膜神経節細胞の生存および再生を促進させるため、ならびに種々の神経変性性のコキシディション（ｃｏｘｉｄｉｔｉｏｎ）、例えば緑内障に罹っているか、またはその発症リスクがある被験体を処置または予防するためにかかる抗体を用いる治療方法を提供する。【選択図】図１
2019517787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する抗体または抗原結合断片であって、第２の抗体のものと同じ結合特異性を有し、前記第２の抗体が、それぞれ（１）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＳＳＲＤＳＳＲＳＨＨＬＬ（配列番号：７３）；（２）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＲＱＧＡＳＳＴＳＹＤＹ（配列番号：４８）、ＱＳＩＳＳＹ（配列番号：４９）、ＡＡＳおよびＱＱＡＮＳＦＰＶＡ（配列番号：５０）；（３）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（４）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＴＤＳＤＫ（配列番号：５８）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（５）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（６）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＣＶ（配列番号：５９）；（７）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＡＲＱＬＬＹ（配列番号：６０）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：６１）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（８）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＴＲＶＬＰＡＧＨＦ（配列番号：６２）、ＮＩＧＤＫＦ（配列番号：６３）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＳＳＮＱＧＶ（配列番号：６４）；（９）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＮＳＲＤＧＳＧＮＮＶＶ（配列番号：６９）；または（１０）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号：７０）、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号：７１）、ＡＳＲＬＡＡＡＧＦＤＹ（配列番号：７２）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）と同一である重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む、抗体または抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変領域の配列と軽鎖可変領域の配列を含み、その一方または両方が、それぞれ（１）配列番号：３８と配列番号：３９；（２）配列番号：１４と配列番号：１５；（３）配列番号：１６と配列番号：１７；（４）配列番号：１８と配列番号：１９；（５）配列番号：２０と配列番号：２１；（６）配列番号：２２と配列番号：２３；（７）配列番号：２４と配列番号：２５；（８）配列番号：２６と配列番号：２７；（９）配列番号：２８と配列番号：２９；（１０）配列番号：３０と配列番号：３１；（１１）配列番号：３２と配列番号：３３；（１２）配列番号：３４と配列番号：３５；または（１３）配列番号：３６と配列番号：３７に示す重鎖可変領域の配列および軽鎖可変領域の配列と同一である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
それぞれ（１）配列番号：３８と配列番号：３９；（２）配列番号：１４と配列番号：１５；（３）配列番号：１６と配列番号：１７；（４）配列番号：１８と配列番号：１９；（５）配列番号：２０と配列番号：２１；（６）配列番号：２２と配列番号：２３；（７）配列番号：２４と配列番号：２５；（８）配列番号：２６と配列番号：２７；（９）配列番号：２８と配列番号：２９；（１０）配列番号：３０と配列番号：３１；（１１）配列番号：３２と配列番号：３３；（１２）配列番号：３４と配列番号：３５；または（１３）配列番号：３６と配列番号：３７に示す重鎖可変領域の配列および軽鎖可変領域の配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
それぞれ（１）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＳＳＲＤＳＳＲＳＨＨＬＬ（配列番号：７３）；（２）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＲＱＧＡＳＳＴＳＹＤＹ（配列番号：４８）、ＱＳＩＳＳＹ（配列番号：４９）、ＡＡＳおよびＱＱＡＮＳＦＰＶＡ（配列番号：５０）；（３）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（４）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＴＤＳＤＫ（配列番号：５８）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（５）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（６）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＣＶ（配列番号：５９）；（７）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＡＲＱＬＬＹ（配列番号：６０）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：６１）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（８）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＴＲＶＬＰＡＧＨＦ（配列番号：６２）、ＮＩＧＤＫＦ（配列番号：６３）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＳＳＮＱＧＶ（配列番号：６４）；（９）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＮＳＲＤＧＳＧＮＮＶＶ（配列番号：６９）；または（１０）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号：７０）、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号：７１）、ＡＳＲＬＡＡＡＧＦＤＹ（配列番号：７２）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）と実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号：４６〜４８、５１〜５３、６０、６２、６５〜６７および７０〜７２からなる群より選択される重鎖ＣＤＲの配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号：４９、５０、５４〜５９、６１、６３、６４、６８、６９および７３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの配列をさらに含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
それぞれ（１）配列番号：７０〜７２、（２）配列番号：４６〜４８、（３）配列番号：５１〜５３、（４）配列番号：５１、５２、６０、（５）配列番号：４６、４７および６２、または（６）配列番号：６５〜６７と同一である重鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
それぞれ（１）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３；（２）配列番号：４６〜４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０；（３）配列番号：５１〜５６；（４）配列番号：５１〜５３、５７、５８および５６；（５）配列番号：５１〜５３、５７、５５および５６；（６）配列番号：５１〜５５および５９；（７）配列番号：５１、５２、６０、５７、６１および５６；（８）配列番号：４６、４７、６２、６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４；（９）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９；または（１０）配列番号：７０〜７２および５４〜５６に示す重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む、請求項７に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号：４９、５０、５４〜５９、６１、６３、６４、６８、６９および７３ならびに配列ＡＡＳ、ＹＤＳおよびＧＫＮからなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号：４６〜４８、５１〜５３、６０、６２、６５〜６７および７０〜７２からなる群より選択される重鎖ＣＤＲの配列をさらに含む、請求項９に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
それぞれ（１）配列番号：６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３；（２）配列番号：４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０；（３）配列番号：５４〜５６；（４）配列番号：５７、５８および５６；（５）配列番号：５７、５５および５６；（６）配列番号：５４、５５および５９；（７）配列番号：５７、６１および５６；（８）配列番号：６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４；または（８）配列番号：６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９と同一である軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む、請求項９に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６または３８と実質的に同一である重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１３】
ｓｃＦｖ断片であり、重鎖と軽鎖の可変領域の配列がリンカー配列によって連結されている、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
リンカー配列が、配列番号：４０〜４５のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号：１〜１３のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１６】
ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、非枯渇性ＩｇＧ、ダイアボディおよび二価抗体である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１７】
ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および合成ＩｇＧからなる群より選択されるＩｇＧである、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１８】
Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓＦｖである、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１９】
合成分子にコンジュゲートさせた、請求項１６に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２０】
治療有効量の請求項１に記載の抗体または抗原結合断片および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の抗体または抗原結合断片を含む二重特異性化合物。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体または抗原結合断片を備えたキット。
【請求項２３】
請求項１に記載の抗体または抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項２５】
被験体の網膜神経節細胞、運動ニューロンまたは中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンの生存、シナプス機能または再生を促進させるための方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１に記載のＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくは抗原結合断片または請求項２４に記載のベクターを含む医薬組成物を投与し、それにより前記被験体の網膜神経節細胞の生存または再生を促進させることを含む方法。
【請求項２６】
前記医薬組成物が被験体の片目または両目に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記医薬組成物が薬学的に許容され得る担体をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が目の変性障害、運動ニューロン疾患または中枢神経系（ＣＮＳ）の変性疾患に罹っているか、またはその発症リスクがある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記目の変性障害が緑内障、視神経損傷、視神経炎、視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性ニューロパチー、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）または糖尿病性網膜症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記運動ニューロン疾患がＡＬＳ、特発性運動ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）および偽球麻痺、ベル麻痺または脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記中枢神経系（ＣＮＳ）の変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
被験体の目の変性性の病的状態を処置または予防するための方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項２４に記載の前記ベクターを含む医薬組成物を投与し、それにより前記被験体の視神経症を処置または予防することを含む方法。
【請求項３３】
前記医薬組成物が前記被験体の片目または両目に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物が薬学的に許容され得る担体をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体が目の変性性の病的状態に冒されているか、またはその発症リスクがある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記目の変性性の病的状態が緑内障、視神経損傷、視神経炎、視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性ニューロパチー、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）または糖尿病性網膜症である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、本出願は、米国特許仮出願第６２／３３１，０４６号（２０１６年５月３日出願）の優先権の利益を主張するものである。この優先権出願の全開示内容は、引用によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｒｋ受容体ファミリーは、ニューロン組織および非ニューロン組織の両方の生理的過程および疾患過程において重要である。このような受容体キナーゼの中でも、ＴｒｋＢは、末梢神経系および中枢神経系の両方のニューロンの分化、生存および機能に不可欠である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）およびニューロトロフィン−４（ＮＴ４）のシグナル伝達において枢要な役割を果たしている。ニューロトロフィンがＴｒｋ受容体の細胞外ドメインに結合するとシグナル伝達経路が起始され、これは該受容体の二量体化および自己リン酸化をもたらす。ＴｒｋＢの自己リン酸化により、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホリパーゼＣ−γおよびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）を含むシグナル伝達経路の活性化がもたらされる。
【０００３】
ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢはどちらも、網膜内の網膜神経節細胞の生存に極めて重要な役割を果たしていることが示されている。異常なＴｒｋＢシグナル伝達およびその抑制が種々の神経障害および変性性の病的状態、例えば緑内障の発症に寄与していることが示唆されている。緑内障は、２番目に多い目の疾患であり、失明に至り、世界中で６０Ｍより多くの人々が冒されており、米国で診断された有病数はおよそ２．３Ｍ例である。主に、眼圧（ＩＯＰ）上昇に至る「プラミング（ｐｌｕｍｂｉｎｇ）」問題で、緑内障により、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）およびその軸索（すべての視覚的刺激を脳に伝える）に対する損傷がもたらされる。ＩＯＰを下げるための数多くの薬物およびデバイスが承認されているが、ＲＧＣまたは他の網膜のニューロンの細胞委縮および減少を抑制、遅滞または逆転させ、１０％より多くの緑内障患者において最終的に起こる失明が食い止められるであろう薬物はまだ開発されていない。ＴｒｋＢシグナル伝達を特異的にモジュレートできることは、この経路と関連している種々の病理学的シナリオにおいて極めて重要であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当該技術分野では、種々の網膜の疾患および障害、特に緑内障などの神経障害の処置においてＴｒｋＢおよびＢＤＮＦシグナル伝達活性を促進させるための手段が強く必要とされている。例えば、現在行われている緑内障の処置選択肢ではＩＯＰは下がるがＲＧＣ変性は逆転しない。本発明は、このようなおよび他の必要性に取り組むことに関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明により、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合するＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片であって、第２の抗体のものと同じ結合特異性を有するＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片を提供する。第２の抗体は、それぞれ（１）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＳＳＲＤＳＳＲＳＨＨＬＬ（配列番号：７３）；（２）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＲＱＧＡＳＳＴＳＹＤＹ（配列番号：４８）、ＱＳＩＳＳＹ（配列番号：４９）、ＡＡＳおよびＱＱＡＮＳＦＰＶＡ（配列番号：５０）；（３）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（４）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＴＤＳＤＫ（配列番号：５８）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（５）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（６）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＣＶ（配列番号：５９）；（７）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＡＲＱＬＬＹ（配列番号：６０）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：６１）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（８）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＴＲＶＬＰＡＧＨＦ（配列番号：６２）、ＮＩＧＤＫＦ（配列番号：６３）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＳＳＮＱＧＶ（配列番号：６４）；（９）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＮＳＲＤＧＳＧＮＮＶＶ（配列番号：６９）；または（１０）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号：７０）、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号：７１）、ＡＳＲＬＡＡＡＧＦＤＹ（配列番号：７２）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）と同一である重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む。
【０００６】
本発明の一部の抗体または抗原結合断片は重鎖可変領域の配列と軽鎖可変領域の配列を有し、その一方または両方が、それぞれ（１）配列番号：３８と配列番号：３９；（２）配列番号：１４と配列番号：１５；（３）配列番号：１６と配列番号：１７；（４）配列番号：１８と配列番号：１９；（５）配列番号：２０と配列番号：２１；（６）配列番号：２２と配列番号：２３；（７）配列番号：２４と配列番号：２５；（８）配列番号：２６と配列番号：２７；（９）配列番号：２８と配列番号：２９；（１０）配列番号：３０と配列番号：３１；（１１）配列番号：３２と配列番号：３３；（１２）配列番号：３４と配列番号：３５；または（１３）配列番号：３６と配列番号：３７に示す重鎖可変領域の配列および軽鎖可変領域の配列と同一である。一部の抗体または抗原結合断片は、それぞれ（１）配列番号：３８と配列番号：３９；（２）配列番号：１４と配列番号：１５；（３）配列番号：１６と配列番号：１７；（４）配列番号：１８と配列番号：１９；（５）配列番号：２０と配列番号：２１；（６）配列番号：２２と配列番号：２３；（７）配列番号：２４と配列番号：２５；（８）配列番号：２６と配列番号：２７；（９）配列番号：２８と配列番号：２９；（１０）配列番号：３０と配列番号：３１；（１１）配列番号：３２と配列番号：３３；（１２）配列番号：３４と配列番号：３５；または（１３）配列番号：３６と配列番号：３７に示す重鎖可変領域の配列および軽鎖可変領域の配列を含む。
【０００７】
本発明の一部の抗体または抗原結合断片は、それぞれ（１）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＳＳＲＤＳＳＲＳＨＨＬＬ（配列番号：７３）；（２）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＲＱＧＡＳＳＴＳＹＤＹ（配列番号：４８）、ＱＳＩＳＳＹ（配列番号：４９）、ＡＡＳおよびＱＱＡＮＳＦＰＶＡ（配列番号：５０）；（３）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（４）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＴＤＳＤＫ（配列番号：５８）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（５）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（６）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＣＶ（配列番号：５９）；（７）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＡＲＱＬＬＹ（配列番号：６０）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：６１）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（８）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＴＲＶＬＰＡＧＨＦ（配列番号：６２）、ＮＩＧＤＫＦ（配列番号：６３）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＳＳＮＱＧＶ（配列番号：６４）；（９）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＮＳＲＤＧＳＧＮＮＶＶ（配列番号：６９）；または（１０）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号：７０）、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号：７１）、ＡＳＲＬＡＡＡＧＦＤＹ（配列番号：７２）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）と実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む。一部の抗体または抗原結合断片は配列番号：４６〜４８、５１〜５３、６０、６２、６５〜６７および７０〜７２からなる群より選択される重鎖ＣＤＲの配列を有する。このような分子の一部のものは、配列番号：４９、５０、５４〜５９、６１、６３、６４、６８、６９および７３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの配列をさらに含む。このような分子の一部のものは、それぞれ（１）配列番号：７０〜７２、（２）配列番号：４６〜４８、（３）配列番号：５１〜５３、（４）配列番号：５１、５２、６０、（５）配列番号：４６、４７および６２、または（６）配列番号：６５〜６７と同一である重鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む。このような抗体または抗原結合断片の一部のものは、それぞれ（１）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３；（２）配列番号：４６〜４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０；（３）配列番号：５１〜５６；（４）配列番号：５１〜５３、５７、５８および５６；（５）配列番号：５１〜５３、５７、５５および５６；（６）配列番号：５１〜５５および５９；（７）配列番号：５１、５２、６０、５７、６１および５６；（８）配列番号：４６、４７、６２、６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４；（９）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９；または（１０）配列番号：７０〜７２および５４〜５６に示す重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を有する。
【０００８】
本発明の一部の抗体または抗原結合断片は、配列番号：４９、５０、５４〜５９、６１、６３、６４、６８、６９および７３ならびに配列ＡＡＳ、ＹＤＳおよびＧＫＮからなる群より選択される軽鎖ＣＤＲの配列を含む。このような分子の一部のものはさらに、配列番号：４６〜４８、５１〜５３、６０、６２、６５〜６７および７０〜７２からなる群より選択される重鎖ＣＤＲの配列を含む。このような分子の一部のものは、それぞれ（１）配列番号：６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３；（２）配列番号：４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０；（３）配列番号：５４〜５６；（４）配列番号：５７、５８および５６；（５）配列番号：５７、５５および５６；（６）配列番号：５４、５５および５９；（７）配列番号：５７、６１および５６；（８）配列番号：６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４；または（８）配列番号：６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９と同一である軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を含む。
【０００９】
本発明の一部の抗体または抗原結合断片は、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６または３８と実質的に同一である重鎖可変領域を含む。一部の抗体または抗原結合断片はｓｃＦｖ断片であり、これは、重鎖と軽鎖の可変領域の配列を連結しているリンカー配列を含む。一部の例示的なリンカー配列を配列番号：４０〜４５に示す。本発明の一部のｓｃＦｖ断片は、配列番号：１〜１３のいずれか１つに示す配列を含む。
【００１０】
本発明の抗体または抗原結合断片は任意の抗体構造形式、例えば、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、非枯渇性（ｎｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）ＩｇＧ、ダイアボディおよび二価抗体であり得る。また該分子を合成分子にコンジュゲートさせてもよい。一部の実施形態では、本発明により、本明細書に記載のＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片を含む二重特異性化合物（例えば、二重特異性抗体）を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明により、本発明の抗体または抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードしているポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチドを有するベクターを提供する。別の態様において、本発明により、治療有効量の本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合断片または該抗体を発現するポリヌクレオチドもしくはベクターを含む医薬組成物またはキットを提供する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明により、被験体の網膜神経節細胞、運動ニューロンまたは中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンの生存、シナプス機能または再生を促進させるための方法を提供する。また、被験体の目の変性性の病的状態、運動ニューロン疾患または中枢神経系（ＣＮＳ）の変性疾患を処置または予防するための方法も提供する。このような本発明の治療方法は、被験体に治療有効量の本明細書に記載のＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくは抗原結合断片または該抗体をコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを含む医薬組成物を投与することを伴う。種々の実施形態において、医薬組成物は被験体の片目または両目に投与され得る。典型的には、投与される医薬組成物は薬学的に許容され得る担体をさらに含む。該方法に適した被験体は、目の変性障害、運動ニューロン疾患または中枢神経系（ＣＮＳ）の変性疾患に罹っているか、またはその発症リスクがある被験体であり得る。本発明の方法に適した目の変性障害は、例えば、緑内障、視神経損傷、視神経炎、視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性ニューロパチー、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）または糖尿病性網膜症であり得る。本発明の方法での処置に適した運動ニューロン疾患の例としては、例えば、ＡＬＳ、特発性運動ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）および偽球麻痺、ベル麻痺または脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）が挙げられる。本発明の方法で処置され得るＣＮＳの変性疾患の例としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病が挙げられる。
【００１３】
本発明の本質および利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することにより実現され得よう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＴｒｋＢアゴニストＡｂを選択するためのヒトＴｒｋＢレポーターの構築のためのスキームを示す。
【図２】図２は、ＴｒｋＢレポーター細胞株によって調べた培養上清み中のいくつかの未精製のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＴｒｋＢアゴニスト抗体の活性を示す。
【図３】図３は、ＴｒｋＢレポーター細胞アッセイでのいくつかのＴｒｋＢアゴニストＩｇＧ抗体の活性を示す。
【図４】図４は、同定されたＴｒｋＢアゴニスト抗体の選択性（ＴｒｋＡに対する効果なし）を示す。
【図５】図５は、ＴｒｋＢアゴニストＡｂのシグナル伝達によりＴｒｋＢレポーター細胞においてＰ−ＰＬＣγ、Ｐ−ＡｋｔおよびＰ−ＭＡＰＫの活性化がもたらされたことを示す。
【図６】図６は、培養マウス皮質ニューロンにおけるアゴニストＡｂ誘導性ＴｒｋＢリン酸化を示す。
【図７】図７は、ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢアゴニストＡｂ  ＮＦＡＴ−８５によって誘導されたＡｒｃの発現を示す。
【図８】図８は、マウス胚性幹細胞においてアゴニスト抗体ＮＦＡＴ−８５によって誘導されたＴｒｋＢリン酸化を示す。
【図９】図９は、ＴｒｋＢアゴニストＡｂ  ＮＦＡＴ−８５がＲＧＣ樹状突起の退縮を抑制することを示す。
【図１０】図１０は、緑内障のラットモデルでのＴｒｋＢアゴニスト抗体の効果の有効性試験の実験パラダイムである。
【図１１】図１１は、ＯＨＴラットモデルのＩＯＰの特徴を示す。
【図１２】図１２は、ＯＨＴラットにおけるＴｒｋＢアゴニストＡｂ８５およびＢＤＮＦの効果のショールプロット解析を示す。
【図１３】図１３は、図１２に示すショール解析のデンドリティックメトリクス（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｍｅｔｒｉｃｓ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．概論
本発明では、一部において、網膜の障害、例えば緑内障の神経保護的および神経再生的処置における有用性が示されたＴｒｋＢ活性化抗体の本発明者らによる開発に関して記載する。ＢＤＮＦの神経保護活性および神経再生活性を本明細書において、ＢＤＮＦがＲＧＣの樹状突起の退縮を大きく遅滞させること、およびＢＤＮＦがＲＧＣ樹状突起の変性を逆転させ得ることによって示した。重要なことに、本発明者らは、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体がＲＧＣの神経保護薬としてＢＤＮＦと等しいかまたはより良好な特性を示すことを実証した。
【００１６】
本明細書において詳述するように、本発明者らは、コンビナトリアルライブラリーからｒａｒｅ活性化アゴニスト抗体を選択することによって完全ヒトアゴニスト抗体ファミリーを作製した。例示した試験において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＲＧＣの樹状突起樹（ａｒｂｏｒ）の維持または再生において軸索切断した成体哺乳動物の網膜において速やかに反応するＢＤＮＦの有効性を模倣できることが示された。具体的には、ＢＤＮＦと比べて、該抗体は、ＴｒｋＢ細胞株およびＢＤＮＦ応答性一次ニューロン培養物の両方において強力で選択的であることが示された。また、該抗体は、ＴｒｋＢシグナル伝達の活性化においてＢＤＮＦと同等であり、また、異種間活性（例えば、ヒトとマウス）を有することもわかった。インサイチュでは、該抗体は、成体マウスの網膜外植片アッセイでＲＧＣ変性の遅滞および回復において活性であることがわかった。さらに、高眼圧緑内障のラットモデルによる評価時、ＴｒｋＢアゴニストＡｂは、網膜神経節ニューロンの樹状突起樹に対して再生効果を示した。
【００１７】
ＢＤＮＦと比較すると、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体はまた、ヒト被験体においてＢＤＮＦそのものよりも大きく改善された生物理学的特性を有し（例えば、ＢＤＮＦとは異なり、この抗体は「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）」のタンパク質ではない）、ずっと長い半減期（例えば、より良好な薬物動態）を有する。また、緑内障に対して現在承認されているすべての処置は目の前眼房内の眼圧（ＩＯＰ）を下げることに重点がおかれている。しかしながら、このような処置単独では疾患の進行を止めるのに不充分である。対照的に、本明細書に開示のＴｒｋＢアゴニスト抗体の疾患修飾性神経保護活性は、ＲＧＣの樹状突起および細胞体の委縮または減少を低減させ得、したがって疾患の進行が遅滞され得る。また、該抗体神経再生活性により、障害されたＲＧＣの機能的完全性が回復され得る
このような試験に従い、本発明により、ＴｒｋＢチロシンキナーゼ受容体を特異的に活性化し、ＲＧＣの生存または再生を促進させるモノクローナル抗体および関連する抗原結合断片を提供する。また、本発明において、このような抗体薬剤を、ＲＧＣの死滅もしくは変性と関連している種々の神経変性疾患、例えば網膜変性障害、または異常もしくは障害されたＴｒｋＢシグナル伝達活性によって媒介される眼疾患、例えば緑内障を処置するための治療用途に使用する方法を提供する。
【００１８】
ＩＩ．定義
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が関する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で用いている用語の多くの一般的な定義を示すものである：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。また、以下の定義は、読み手の本発明の実施を補助するために示している。
【００１９】
用語「抗体」または「抗原結合断片」は、所与の抗原、エピトープ（１つまたは複数）に対して強い一価、二価または多価の結合を示す（１または複数の）ポリペプチド鎖をいう。特に記載のない限り、本発明において使用される抗体または抗原結合断片は、任意の脊椎動物種、例えばラクダ科、鳥類または魚類の種に由来する配列を有するものであり得る。これは、任意の適当な技術、例えばハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成もしくは完全合成のライブラリーまたはその組合せを用いて作製され得る。特に記載のない限り、用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、インタクトな抗体、抗原結合ポリペプチド断片および後述するか、または当該技術分野でよく知られた他のデザイナー抗体（例えば、Ｓｅｒａｆｉｎｉ，Ｊ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：５３３−６，１９９３参照）を包含している。
【００２０】
インタクトな「抗体」は典型的には、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤ）と２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤ）を含む。抗体鎖をコードしている認知された免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域の遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域の遺伝子が挙げられる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、ｍｕ、α、δまたはεに分類され、これらはさらに、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
【００２１】
抗体の各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成されている。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが宿主の組織または因子、例えば免疫機構の種々の細胞および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）に結合するのを媒介し得る。
【００２２】
抗体のＶＨおよびＶＬ領域は超可変領域にさらに細分され得、これは相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、より保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）とともに散在している。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置ならびにナンバリングシステムは、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９８７および１９９１）によって規定されている。
【００２３】
結合親和性は一般的に、平衡の結合定数または解離定数（それぞれＫａまたはＫｄ）で表示され、これらはさらに、解離速度定数および結合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の逆比である。したがって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性が異なる速度定数に相当し得る。
【００２４】
用語「保存的修飾バリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。具体的な核酸配列に関して、保存的修飾バリアントは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードしている核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は本質的に同一である配列をいう。遺伝コードの縮重のため、任意の所与のタンパク質は、大量数の機能的に同一である核酸にコードされている。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードしている。したがって、コドンによってアラニンが指定される位置はどこも、該コドンは、コードされたポリペプチドが改変されることなく記載のいずれかの対応するコドンに改変され得る。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、これは、保存的修飾変異である種の１つである。また、ポリペプチドをコードしている本明細書における核酸配列はどれも、該核酸の考えられ得るどのサイレント変異をも示している。当業者には、核酸内の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一である分子が得られるように修飾され得ることが認識されよう。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸の各サイレント変異は記載の各配列に黙示的である。
【００２５】
ポリペプチド配列では、「保存的修飾バリアント」は、同様の電荷を有する側鎖を有する他のアミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸残基である保存的アミノ酸置換体を有するバリアントをいう。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当該技術分野で規定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００２６】
用語「接触させること」はその通常の意味を有し、２種類以上の薬剤（例えば、ポリペプチドもしくはファージ）を合わせること、薬剤と細胞を合わせること、または２つの異なる細胞集団を合わせることをいう。接触させることは、インビトロで、例えば、抗体と細胞を混合して、または抗体集団を細胞集団と試験管内もしくは増殖培地中で混合して行なわれ得る。また、接触させることを、細胞内またはインサイチュで、例えば、２種類のポリペプチドを、細胞内で該２種類のポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドの該細胞内での共発現によって、または細胞ライセート中で接触させて行なってもよい。また、接触させることを、被験体内でインビボにて、例えば、薬剤を被験体に該薬剤の標的細胞への送達のために投与することによって行なってもよい。
【００２７】
用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する対象であり、１つ以上のアミノ酸セグメントで構成された抗原上の任意の抗原決定基をいう。エピトープは、線状エピトープであっても立体的エピトープであってもよく、連続的であっても不連続的であってもよい。典型的には、線状エピトープは連続的である、すなわち１つの連続的なアミノ酸鎖で構成されている。立体的エピトープは不連続的であり得る、すなわち、抗原が折り畳まれている場合に一緒になってエピトープを形成する２つ以上の不連続アミノ酸セグメントで構成されたものであり得る。抗体が同じエピトープに結合するかどうかを調べるための方法は当該技術分野で知られている。エピトープは、当該技術分野でよく知られた標準的な方法によって規定またはマッピングされ得る。例えば、エピトープは、ＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイを用いて、ペプチドライブラリーを用いて、または抗原の部位特異的変異誘発（例えば、抗原のアラニンスキャニング）でマッピングされ得る。
【００２８】
本明細書で用いる場合、２種類以上の抗体に関して「同じエピトープに結合する」とは、該抗体が、抗原に対する結合について競合し、重複するか、または網羅的な連続または不連続の同じアミノ酸セグメントに結合することを意味する。当業者には、語句「同じエピトープに結合する」ことが、必ずしも抗体が全く同じアミノ酸に結合することを意味しているのではないことは理解されよう。抗体が結合する対象の厳密なアミノ酸は異なっていてもよい。例えば、第１の抗体は、第２の抗体が結合するアミノ酸セグメントに完全に包含される該アモニ（ａｍｏｎｉ）酸のセグメントに結合し得る。別の例では、第１の抗体が、第２の抗体が結合する１つ以上のアミノ酸セグメントと有意に重複する該１つ以上のセグメントに結合する。本明細書における解釈上、かかる抗体は「同じエピトープに結合する」とみなされる。
【００２９】
抗体競合アッセイは、抗体が別の抗体と「同じエピトープに結合する」かどうかを調べるために使用され得る。かかるアッセイは当該技術分野でよく知られている。典型的には、エピトープと相互作用することがわかっている抗体の、第２の抗体が過剰でありすべての部位が第１のもので飽和されている条件下での該第２の抗体による７０％またはそれ以上、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の競合は、該抗体が「同じエピトープに結合する」ことを示す。２種類の抗体間の競合レベルを評価するためには、例えば、ラジオイムノアッセイまたは抗体用の他の標識、例えばビオチンを使用するアッセイが使用され得る。例えば、抗原は、標識化合物（例えば、３Ｈ、１２５Ｉまたはビオチン）にコンジュゲートさせた飽和量の第１の抗体またはその抗原結合断片とともに、同じ量の第２の非標識抗体の存在下でインキュベートされ得る。次いで、非標識ブロッキング抗体の存在下で抗原に結合した標識された抗体の量を評価し、非標識ブロッキング抗体の非存在下での結合と比較する。競合は、ブロッキング抗体なしと比べたときの非標識ブロッキング抗体の存在下におけるシグナル結合の変化パーセンテージによって測定する。したがって、ブロッキング抗体の非存在下での結合と比べてブロッキング抗体の存在下において標識抗体の結合の７０％阻害がみられる場合、この２種類の抗体間に７０％の競合が存在する。したがって、第１の抗体と第２の抗体間の７０％またはそれ以上、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の競合に対する言及は、第１の抗体が抗原に対する第２の抗体の結合（またはその逆）を７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上（第１の抗体の非存在下での第２の抗体による抗原結合と比べて）を阻害することを意味する。したがって、抗原に対する第１の抗体の結合の第２の抗体による７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の阻害は、この２種類の抗体が同じエピトープに結合することを示す。用語「同一である」または「同一性」パーセントは、２種類以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況において、２種類以上の配列または部分配列が同じであることを示す。２つの配列は、比較ウィンドウにおいて、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つ用いて、もしくは手作業のアラインメントと目視検査によって測定する場合は指定された領域において、最大限の一致で比較し、アラインメントしたとき、この２つの配列が指定された領域において指定されたパーセンテージの同じのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合（すなわち、６０％の同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性であってもよく、あるいは指定されていない場合は、配列全体において）、「実質的に同一である」。任意に、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長である領域において、またはより好ましくは１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）長である領域において存在する。
【００３０】
比較のための配列アラインメントの方法は当該技術分野でよく知られている。比較のための至適配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ，１９７０の局所相同性アルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ  ）；または手作業のアラインメントと目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）参照）によって行なうことができる。配列同一性および配列類似性のパーセントを調べるのに適したアルゴリズムの２つの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。
【００３１】
本明細書で用いる場合、目の変性性の病的状態または障害は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性もしくは死滅を特徴とするか、もしくは該変性もしくは死滅と関連している目の疾患、またはＴｒｋＢシグナル伝達活性によって媒介されるか、もしくはその障害と関連している眼障害をいう。これには、種々の臨床像および病因が包含される。このような障害の例としては、緑内障、視神経損傷、視神経炎、視神経症、網膜中心動脈閉塞症および網膜中心静脈閉塞症が挙げられる。
【００３２】
緑内障は、視神経の病理学的変化、視神経円板における可視および対応する視野欠損、未処置の場合は失明に至ることを特徴とする例示的な目の変性性の病的状態である。緑内障は高い眼圧と関連しているが、他の要素も関与している。緑内障には、より一般的な型の開放隅角緑内障およびあまり一般的でない型、例えば閉塞隅角緑内障ならびに正常眼圧緑内障が包含される。緑内障に対して現在使用されている治療は眼圧降下に関するものである。薬物療法としては、経表面点眼薬または経口投薬物（これは、眼内液の流出の発生もしくは増大を低減させる）が挙げられる。しかしながら、緑内障に対するこのような薬物治療は、場合によっては有意な副作用、例えば頭痛、霧視、アレルギー反応、心肺合併症による死亡および他の薬物との相互作用の可能性を伴う。また、外科的治療も使用されるが、これも数多くの不都合点を有し、成功率は低めである。
【００３３】
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、身体の随意筋を制御する細胞である運動ニューロンが選択的に冒されるいくつかの神経系の障害の任意のものである。該疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）および偽球麻痺が挙げられる。また、場合によっては脊髄筋萎縮症もこのグループに含められる。運動ニューロン疾患は、性質が神経変性性であり、次第に身体障害、最終的には死が引き起こされる。本明細書に開示のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、このような障害の任意のもの、例えばＡＬＳの症状を処置するため、または寛解させるために使用され得る。
【００３４】
用語「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物（特に、非ヒト哺乳動物）をいう。用語「被験体」は本明細書において、例えば、治療方法および診断方法との関連においてヒト被験体または動物被験体を示すために用いている。動物被験体としては、限定されないが、網膜神経節細胞の変性または死滅と関連している病的状態または障害の動物モデル、例えば哺乳動物モデルが挙げられる。非ヒト被験体の他の具体例としては、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルが挙げられる。
【００３５】
用語「標的」、「標的分子」または「標的細胞」は、解析対象または検出対象の目的の分子または生体細胞、例えば、その死滅をモジュレートする真核生物細胞をいう。
【００３６】
本明細書で用いている用語「処置する」、「処置すること」、「処置」および「治療上有効な」は、必ずしも１００％または完全な処置を含意しているのではない。そうではなく、潜在的有益性または治療効果を有すると当業者によって認識されるさまざまな度合の処置が存在する。これとの関連において、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの処置をもたらすものであり得る。さらに、本発明の方法によってもたらされる処置には、処置対象の疾患の１つ以上の病的状態または症状の処置が包含され得る。
【００３７】
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）は、チロシン受容体キナーゼＢ、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３成長因子受容体または２型神経栄養性受容体型チロシンキナーゼとしても知られており、ヒトではＮＴＲＫ２遺伝子にコードされたタンパク質である。ＴｒｋＢは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の受容体である。Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：６４７−５６，１９９０；およびＳｑｕｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６５：８８５−９３，１９９１。ＴｒｋＢは、相違する細胞集団の生存および分化を誘導する小型タンパク質の成長因子であるであるいくつかの「ニューロトロフィン」の高親和性触媒性受容体である。ＴｒｋＢを活性化するニューロトロフィンは：ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）およびニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）である。そのため、ＴｒｋＢは、このような神経栄養因子の複数の効果（ニューロンの分化および生存が挙げられる）を媒介する。研究により、ＴｒｋＢ受容体の活性化によってＣＮＳの細胞内のＫＣＣ２クロライドトランスポーターの下方調節がもたらされ得ることが示されている。
【００３８】
「ベクター」はレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであり、これに別のポリヌクレオチドセグメントが、結合された該セグメントの複製がもたらされるように結合され得る。１種類以上のポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を指令し得るベクターは「発現ベクター」と称される。
【００３９】
ＩＩＩ．ＴｒｋＢアゴニスト抗体および関連する抗原結合分子
本発明により、ＴｒｋＢ（例えば、ヒトＴｒｋＢ）に特異的に結合してＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化する抗体または抗原結合断片を提供する。好ましくは、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、本明細書に例示したＴｒｋＢアゴニスト抗体（例えば、表１に示す抗体ＮＦＡＴ−８５または抗体ＣＲＥ−３０）のものと同じ結合特異性を有する。したがって、本発明には、それぞれ（１）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＳＳＲＤＳＳＲＳＨＨＬＬ（配列番号：７３）；（２）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＲＱＧＡＳＳＴＳＹＤＹ（配列番号：４８）、ＱＳＩＳＳＹ（配列番号：４９）、ＡＡＳおよびＱＱＡＮＳＦＰＶＡ（配列番号：５０）；（３）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（４）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＴＤＳＤＫ（配列番号：５８）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（５）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（６）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＶＲＱＭＬＦ（配列番号：５３）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＣＶ（配列番号：５９）；（７）ＧＦＩＦＳＲＹＮ（配列番号：５１）、ＩＮＴＤＧＳＶＩ（配列番号：５２）、ＡＲＱＬＬＹ（配列番号：６０）、ＳＧＩＮＶＧＡＹＲ（配列番号：５７）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：６１）、ＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）；（８）ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号：４６）、ＩＹＰＧＤＳＤＴ（配列番号：４７）、ＡＴＲＶＬＰＡＧＨＦ（配列番号：６２）、ＮＩＧＤＫＦ（配列番号：６３）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＳＳＮＱＧＶ（配列番号：６４）；（９）ＶＳＤＮＳＧＡＷＮ（配列番号：６５）、ＹＲＳＫＷＹＴ（配列番号：６６）、ＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩ（配列番号：６７）、ＳＬＲＴＹＹ（配列番号：６８）、ＧＫＮおよびＮＳＲＤＧＳＧＮＮＶＶ（配列番号：６９）；または（１０）ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号：７０）、ＩＮＴＮＴＧＮＰ（配列番号：７１）、ＡＳＲＬＡＡＡＧＦＤＹ（配列番号：７２）、ＳＧＩＮＶＧＴＹＲ（配列番号：５４）、ＹＫＳＤＳＤＫ（配列番号：５５）およびＡＩＷＨＳＳＡＷＶ（配列番号：５６）と同一である重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を有する抗体のものと同じ結合特異性を有する抗体または抗原結合断片が包含される。
【００４０】
本発明の一部の抗体は、ＴｒｋＢに対する結合について、例示した抗体と競合し得る。本発明の一部の抗体は、本明細書に例示したＴｒｋＢ抗体のうちの１つによって認識されるものと同じエピトープに結合する。本発明の一部の抗体は、本明細書に例示したＴｒｋＢ抗体のうちの１つのものと同じかまたは同様の親和性で、ＴｒｋＢ上の同じエピトープに結合する。ＴｒｋＢに結合したら、本発明の一部の抗体は、本明細書に例示したＴｒｋＢ抗体のうちの１つによるものと同じかまたは同様の様式でＴｒｋＢの生物学的活性の１つ以上をモジュレートし得るか、あるいは細胞応答（例えば、ＭＡＰＫ、ホスホリパーゼＣ−γおよび／またはＰＩ３−Ｋシグナル伝達経路の活性化）を生じさせ得る。
【００４１】
本発明の抗体には、インタクトな抗体（例えば、ＩｇＧ１抗体）、インタクトな抗体の抗原結合部分を含んでおり、コグネイト抗原に対する結合能を保持しているインタクトな抗体断片または抗原結合断片（例えば、本明細書に例示したｓｃＦｖ抗体）が包含される。典型的なインタクトな抗体は標的抗原と、主に、重鎖および軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して相互作用する。本発明の機能性ＴｒｋＢアゴニスト抗体には、例示したＴｒｋＢアゴニスト抗体の対応するＣＤＲ配列と同じかまたは実質的に同一である重鎖ＣＤＲの配列および軽鎖ＣＤＲの配列のうちの少なくとも１つを有する抗体または抗原結合断片が包含される。一部の実施形態では、本発明のＴｒｋＢアゴニストは、例示した抗体に由来する抗体断片または抗原結合分子である。かかる抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）インタクトな抗体の片方のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）構造的に保存されたフレームワーク領域間で操作された鎖間ジスルフィド結合を有するジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）；（ｖｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９参照）；ならびに（ｖｉｉ）線状または環状ペプチドとしての単独の相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００４２】
また、本発明の抗体には一本鎖抗体も包含される。用語「一本鎖抗体」は、ポリペプチド鎖内に、一般的にスペーサーペプチドまたはリンカー配列によって連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、さらなるドメインまたはアミノ酸配列をアミノ−および／またはカルボキシル−末端に含んでいてもよいポリペプチドをいう。例えば、一本鎖抗体は、コードポリヌクレオチドと連結するためのテザリングセグメントを含むものであり得る。一例として、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は一本鎖抗体である。別々の遺伝子にコードされたＦｖ断片のＶＬおよびＶＨドメインと比較すると、ｓｃＦｖは、合成リンカーによって連接された（例えば、組換え方法によって）２つのドメインを有する。これにより、ＶＬおよびＶＨ領域のペアが一価の分子を形成した単一のタンパク質鎖とすることが可能になる。本発明のｓｃＦｖ  ＴｒｋＢアゴニスト抗体のいくつかを表１に列挙して示す。これらのｓｃＦＶ抗体のＶＬおよびＶＨ配列ならびに連結リンカー配列を表２に示す。
【００４３】
本明細書に例示したように、ｓｃＦｖ  ＴｒｋＢアゴニスト抗体をＩｇＧのＦｃドメインと融合させてｓｃＦｖ−Ｆｃ融合分子を得てもよい。Ｆｃ−ドメインとの融合により、いくつかの有益な生物学的および薬理学的特性がもたらされる。例えば、Ｆｃドメインの存在によって、サルベージ新生児（ｓａｌｖａｇｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃ−受容体との相互作用により、ならびに分子サイズが大きくなるため腎クリアランスが遅くなることにより、このハイブリッド分子の血漿中半減期が顕著に増大し得、これにより治療活性が長引く。さらに、Ｆｃ領域の付加によりまた、融合されたパートナーの可溶性および安定性が改善され得、製造時においてプロテイン−Ｇ／Ａアフィニティクロマトグラフィーによる費用効果のある容易な精製が可能になる。ｓｃＦｖ抗体断片と融合パートナー、例えばＦｃドメインを含むハイブリッド分子または融合分子は、標準的な組換え手法、常套的に実施されているタンパク質合成法または本明細書に記載のプロトコルに従って容易に作製され得る。
【００４４】
また、本発明の抗体には、ラクダ科骨格を有するシングルドメイン抗原結合単位も包含される。ラクダ科の動物としてはラクダ、リャマおよびアルパカが挙げられる。ラクダ科により、軽鎖がない機能性抗体が作製される。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自発的にフォールディングし、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面にはＣＤＲが３つしかないのに対して、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）には６つのＣＤＲが含まれている。ラクダ科由来の抗体では、慣用的な抗体のものと同等の結合親和性が得られ得る。
【００４５】
機能スクリーニングによって最初に同定された本明細書に例示したＴｒｋＢアゴニスト抗体に加えて、本発明の種々の他の抗体または抗原結合断片もまた、インタクトな抗体の酵素による修飾もしくは化学修飾によって作製され得る、または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成され得る、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定され得る。例示として、表１に示す具体的なｓｃＦｖ抗体は標準的な組換え手法によって、例えば、本明細書に記載のｐＦＵＳＥ  ＩｇＧ骨格  ベクター内にクローニングすることによって容易にｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体に変換することができる。本発明のその他のＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合分子を作製するために使用され得るさらなる方法はすべて、当該技術分野でよく知られている。例えば、一本鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリーを用いて同定され得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０；および米国特許第４，９４６，７７８号参照）。特に、ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８に記載の方法を用いて得ることができる。Ｆｖ抗体断片は、Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−４１，１９８８に記載のようにして作製することができる。ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）は、例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：１１３−２３，１９９６に記載の方法を用いて作製することができる。同様に、シングルドメイン抗体（ｄＡｂ）は、例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９；およびＣａｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６２８０−８５，１９９６に記載のさまざまな方法によって作製され得る。ラクダ科由来のシングルドメイン抗体は、当該技術分野でよく知られた方法、例えば、Ｄｕｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：５００−５１５，２００２；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５２１−５２６，１９９７；およびＢｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：６４３−５５，２００３を用いて作製することができる。また、他の型の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｄ断片）も、常套的に実施されている免疫学の方法を用いて容易に作製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照のこと。
【００４６】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、表１に示す抗体のものと実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列および／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を有する。例示した抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲの配列をすべて表２に示す。このような実施形態の一部のものでは、抗体または抗原結合断片が、（１）配列番号：４６〜４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０；（２）配列番号：５１〜５６；（３）配列番号：５１〜５３、５７、５８および５６；（４）配列番号：５１〜５３、５７、５５および５６；（５）配列番号：５１〜５５および５９；（６）配列番号：５１、５２、６０、５７、６１および５６；（７）配列番号：４６、４７、６２、６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４；（８）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９；（９）配列番号：７０〜７２および５４〜５６；または（１０）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３と実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１〜３の配列および軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を有する。このような実施形態の一部のものでは、配列同一性のパーセンテージが少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％またはさらには１００％であり得る。したがって、本発明の一部の抗体または抗原結合断片は、例示した抗体のうちの１つの対応するＣＤＲとそれぞれ少なくとも９０％同一である重鎖ＣＤＲ１〜３および／または軽鎖ＣＤＲ１〜３の配列を有する。このような抗体の一部のものは、例示した抗体の対応するＣＤＲとそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖ＣＤＲの配列および／または軽鎖ＣＤＲの配列を含む。本発明の他の一部の抗体または抗原結合断片では、重鎖ＣＤＲの配列および／または軽鎖ＣＤＲの配列が、例示した抗体のうちの１つの対応するＣＤＲとそれぞれ少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、抗体の重鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の配列はそれぞれ、（１）配列番号：４６〜４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０；（２）配列番号：５１〜５６；（３）配列番号：５１〜５３、５７、５８および５６；（４）配列番号：５１〜５３、５７、５５および５６；（５）配列番号：５１〜５５および５９；（６）配列番号：５１、５２、６０、５７、６１および５６；（７）配列番号：４６、４７、６２、６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４；（８）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９；（９）配列番号：７０〜７２および５４〜５６；または（１０）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３に示す配列と同一である。
【００４７】
他の実施形態では、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６または３８と実質的に同一である重鎖可変領域、（ｂ）配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７もしくは３９と実質的に同一である軽鎖可変領域、または（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域と（ｂ）の軽鎖可変領域の両方を含む。一部の実施形態では、抗体は（ａ）の重鎖と（ｂ）の軽鎖の両方を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン、（ｂ）配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、または（ｃ）（ａ）の重鎖と（ｂ）の軽鎖の両方を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。このような実施形態の一部のものでは、配列同一性のパーセンテージが少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％またはさらには１００％であり得る。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９のうちのいずれか１つと１００％の同一性を有する。他の一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、同一性のパーセンテージが少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％またはさらには１００％であり得る。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８のうちのいずれか１つと１００％の同一性を有する。
【００４８】
上記の重鎖に加えて、本発明の抗体または抗原結合断片は、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）鎖の逐次シャッフリングを用いてＦａｂライブラリーから選択される軽鎖をさらに含むものであってもよい。同様に、上記の軽鎖に加えて、本発明の抗体は、ナイーブ鎖の逐次シャッフリングを用いてＦａｂライブラリーから選択される重鎖をさらに含むものであってもよい。一部の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書に記載のいずれかの重鎖（例えば、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８に示す重鎖）を、任意の適当な軽鎖、例えば本明細書に例示したものとの組合せで含むものであり得る。同様に、抗体は、上記のいずれか軽鎖（例えば、１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９に示す軽鎖）を、任意の適当な重鎖、例えば本明細書に例示したものとの組合せで含むものであり得る。例えば、一部の好ましい実施形態では、抗体は、配列番号：１４と１５、配列番号：１６と１７、配列番号：１８と１９、配列番号：２０と２１、配列番号：２２と２３、配列番号：２４と２５、配列番号：２６と２７、配列番号：２８と２９、配列番号：３０と３１、配列番号：３２と３３、配列番号：３４と３５、配列番号：３６と３７または配列番号：３８と３９とそれぞれ少なくとも９０％同一である重鎖可変領域の配列および軽鎖可変領域の配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号：１４と１５、配列番号：１６と１７、配列番号：１８と１９、配列番号：２０と２１、配列番号：２２と２３、配列番号：２４と２５、配列番号：２６と２７、配列番号：２８と２９、配列番号：３０と３１、配列番号：３２と３３、配列番号：３４と３５、配列番号：３６と３７または配列番号：３８と３９にそれぞれ示す重鎖配列および軽鎖配列を含むものであり得る。その種々の実施形態では、ペプチド配列の同一性パーセント（％）は、例えば、１００×［（同一である位置）／ｍｉｎ（ＴＧＡ，ＴＧＢ）］として計算され得、式中、ＴＧＡおよびＴＧＢは、アラインメントされているペプチド配列ＡおよびＢの残基と内部ギャップの位置の数の和であり、アラインメントはＴＧＡおよびＴＧＢが最小となるようにする。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４４：３３２−３５０（１９９４）を参照のこと。
【００４９】
本発明の抗体または抗原結合断片は、ＴｒｋＢ（例えば、ヒトＴｒｋＢ）の細胞外ドメインに本明細書に例示したＴｒｋＢアゴニスト抗体（表１）のものと同じ特異性で特異的に認識または結合する任意の抗体、例えば完全長抗体または抗体断片であり得る。本発明のＴｒｋＢ抗体は好ましくはモノクローナルである。該抗体は、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であってもよい。さらに、該抗体は、任意のアイソタイプ、例えば限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭのものであり得る。したがって、例えば、該抗体は、任意のＩｇＡ、例えばＩｇＡｌもしくはＩｇＡ２または任意のＩｇＧ、例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４あるいは合成ＩｇＧであり得る。また、該抗体は、ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインに対する特異性を有する任意の抗体断片、例えばＦ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディおよび二価抗体であり得る。該抗体は、任意の修飾型または合成の抗体、例えば限定されないが、非枯渇性ＩｇＧ抗体、ＣＡＲまたは抗体の他のＦｃもしくはＦａｂバリアントであり得る。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明により、本明細書に例示した抗ＴｒｋＢ抗体の保存的修飾バリアントである抗体または抗原結合断片を提供する。典型的には、このようなバリアントの可変領域は、例示したこれらの配列のうちの１つと１個以上のアミノ酸残基の保存的置換以外は同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片はＴｒｋＢに特異的に結合し、（ａ）配列番号：４６〜４８、５１〜５３、６０、６２、６５〜６７および７０〜７２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＨＣＤＲ；および／または（ｂ）配列番号：４９、５０、５４〜５９、６１、６３、６４、６８、６９および７３ならびに配列ＡＡＳ、ＹＤＳおよびＧＫＮからなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＬＣＤＲを含む。また、本発明により、ＴｒｋＢに特異的に結合し、前述のＣＤＲの配列または実質的に同一のＣＤＲの配列の１つ以上のバリアントを含むＴｒｋＢアゴニスト抗体を提供する。このような抗体のバリアントＣＤＲの配列は、１、２または３つの置換、挿入、欠失またはその組合せを、配列番号：４６〜７３ならびに配列ＡＡＳ、ＹＤＳおよびＧＫＮからなる群より選択される配列内に含むものであり得る。例えば、組換えのキメラもしくはヒト化抗体（またはその断片）は、前述のＣＤＲの配列のうちの１、２、３、４、５または６つを含むものであり得る。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片は、表１の抗体の同じ軽鎖または重鎖の３つのＣＤＲの配列を含むものである。これらとしては、例えば、（１）配列番号：４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０、（２）配列番号：５４〜５６、（３）配列番号：５７、５８および５６、（４）配列番号：５７、５５および５６、（５）配列番号：５４、５５および５９、（６）配列番号：５７、６１および５６、（７）配列番号：６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４、（８）配列番号：６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９ならびに（９）配列番号：６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３に示す軽鎖ＣＤＲ；または（１）配列番号：４６〜４８、（２）配列番号：５１〜５３、（３）配列番号：５１、５２、６０、（４）配列番号：４６、４７および６２、（５）配列番号：６５〜６７ならびに（６）配列番号：７０〜７２に示す重鎖ＣＤＲが挙げられる。一部の実施形態では、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片は、同じ抗体の６つのＣＤＲの配列、例えば、（１）配列番号：４６〜４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０（抗体ＣＲＥ−６）；（２）配列番号：５１〜５６（抗体ＣＲＥ−３０もしくはＣＲＥ−８３）；（３）配列番号：５１〜５３、５７、５８および５６（抗体ＣＲＥ−３１もしくはＣＲＥ−５３）；（４）配列番号：５１〜５３、５７、５５および５６（抗体ＣＲＥ−３９もしくはＮＦＡＴ−７９）；（５）配列番号：５１〜５５および５９（抗体ＣＲＥ−８７）；（６）配列番号：５１、５２、６０、５７、６１および５６（抗体ＣＲＥ−９３）；（７）配列番号：４６、４７、６２、６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４（抗体ＮＦＡＴ−２７）；（８）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９（抗体ＮＦＡＴ−４０）；（９）配列番号：７０〜７２および５４〜５６（抗体ＮＦＡＴ−４４）；または（１０）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３（抗体ＮＦＡＴ−８５）を含むものであり得る。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明により、ＴｒｋＢに対して約１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下または２００ｎＭ以下のアビディティを有する抗体または抗原結合断片を提供する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＴｒｋＢに、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下または約５ｎＭ以下のアビディティで結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＴｒｋＢに、約１ｎＭ以下、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下、約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下または約１００ｐＭ以下のアビディティで結合する。アビディティは、当該技術分野で知られた手法、例えばＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。
【００５３】
本発明の抗体は、任意の適当な手法によって、例えば、任意の適当な真核生物発現系または非真核生物発現系を用いて産生させることができる。一部の特定の実施形態では、抗体を哺乳動物発現系を用いて産生させる。本発明の抗体または抗原結合断片を産生させるための具体的な手法の一例を本明細書に例示する。一部の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、適当な非真核生物発現系、例えば細菌発現系を用いて作製することができる。細菌発現系は、断片、例えばＦ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２およびダイアボディを作製するために使用され得る。ＤＮＡコード配列を改変してかかる断片を生成させるための手法は当該技術分野で知られている。
【００５４】
本発明の抗体または抗原結合断片は合成分子に、任意の型の適当なコンジュゲーションを用いてコンジュゲートさせ得る。組換え操作およびセレノシステインの組み込み（例えば、２０１４年１２月２３日に発行された米国特許第８，９１６，１５９号に記載のもの）を使用して合成分子にコンジュゲートさせることができる。他のコンジュゲーション法としては、天然または操作されたリシン側鎖アミンまたはシステイン側鎖チオールとの共有結合性カップリングが挙げられ得る。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１  １３７−１  １４６（２００５）を参照のこと。合成分子は任意の分子、例えば、目的の分子（例えば、細胞表面受容体）を標的化するものであり得る。一部の実施形態では、抗体とのコンジュゲーションのための合成分子はタンパク質（例えば、抗体）またはＲＮＡもしくはＤＮＡアプタマーである。一部の実施形態では、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体（例えば、ｓｃＦｖ分子）は、二重特異性分子または多重特異性分子の成分として存在する。典型的には、本発明の二重特異性または多重特異性化合物は、目的の標的（例えば、ＴｒｋＣまたはＴＮＦα）を特異的に認識する少なくとも１つの他の結合部分に共有結合または非共有結合によりコンジュゲートさせたＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片を含むものである。該結合部分は、任意の化学的性質の分子、例えば、別の抗体もしくは抗原結合断片、ポリペプチドもしくはペプチド薬剤、または小分子薬剤であり得る。一部の実施形態では、本発明の多重特異性分子は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体と、当該技術分野でよく知られた別の抗体または抗原結合断片、例えば本明細書に例示したＴＮＦα抗体アダリムマブとを含む二重特異性抗体である。種々の実施形態では、このような二重特異性または多重特異性分子の該他の結合部分はエドレコロマブ、カプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｂ）、イブリツモマブ、ブリナツモマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、インフリキシマブ、セツキシマブ、ブレンツキシマブ、シルツキシマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、エクリズマブ、セルトリズマブ、ペルツズマブ、オビヌツズマブ、ペムブロリズマブ、ベドリズマブ、エロツズマブ、イダルシズマブ、メポリズマブ、アダリムマブ、パニツムマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、ウステキヌマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ラキシバクマブ、ニボルマブ、ラムシルマブ、アリロクマブ、ダラツムマブ、エボロクマブ、ネシツムマブおよびセクキヌマブであり得る。他の一部の実施形態では、本発明の多重特異性分子は二重特異性小分子−抗体コンジュゲートである。単一特異性抗体と比べて、二重特異性化合物では、薬物の有効性の増強および／または所望の標的化操作がもたらされ得る。
【００５５】
ＩＶ．ＴｒｋＢ抗体を作製するためのポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明により、本明細書に記載の抗体鎖または抗原結合分子のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードしている配列と同一であるか、または該配列に相補的な実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、表１に示す重鎖および／または軽鎖のドメインの配列をコードしている。適切な発現ベクターで発現させると、このようなポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドは抗原結合能を示し得る。また、本発明において、本明細書に記載の抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域、通常、３つすべてのＣＤＲ領域をコードしているポリヌクレオチドを提供する。他の一部のポリヌクレオチドは、例示した抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列のすべてまたは実質的にすべてをコードしている。例えば、このようなポリヌクレオチドの一部のものは、配列番号：１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６もしくは３８のうちのいずれか１つに示す重鎖可変領域のアミノ酸配列および／または配列番号：１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７もしくは３９のうちのいずれか１つに示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしている。コードの縮重のため、免疫グロブリンのアミノ酸配列の各々はさまざまな核酸配列にコードされている。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、例示した抗体の可変領域の配列のみをコードしているものであってもよい。また、該ポリヌクレオチドは、該抗体の可変領域と定常領域の両方をコードしているものであってもよい。本発明の核酸の一部のポリヌクレオチド配列は、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６または３８のうちのいずれか１つに示す成熟した重鎖可変領域の配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％）同一である成熟した重鎖可変領域の配列をコードしている。他の一部のポリヌクレオチド配列は、配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９のうちのいずれか１つに示す成熟した軽鎖可変領域の配列と実質的に同一である成熟した軽鎖可変領域の配列をコードしている。該ポリヌクレオチド配列の一部のものは、例示した抗体のうちの１つの重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードしている。他の一部のポリヌクレオチドは、例示した抗体のうちの１つの重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２種類のポリペプチドセグメントをコードしている。
【００５７】
該ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、または例示した機能性抗体をコードしている既存の配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のＰＣＲ変異誘発によって作製され得る。核酸の直接化学合成は、当該技術分野で知られた方法、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法によって行なわれ得る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；およびＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１に記載のようにして行なわれ得る。
【００５８】
また、本発明において、本明細書に記載の機能性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。該抗体を発現させるためのレンチウイルス系ベクターの具体例を以下の実施例に記載する。また、種々の他の発現ベクターが、該機能性抗体鎖または結合断片をコードしているポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る。ウイルス系発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの両方が、該抗体を哺乳動物宿主細胞内で産生させるために使用され得る。非ウイルスのベクターおよび系としては、プラスミド、エピソームベクター（典型的には、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを有する）およびヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞内での該抗体  ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための当該技術分野で知られた数多くの他のベクターが挙げられる。他の有用な非ウイルスベクターとしては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃｋおよび他のトランスポゾン系が挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レンチウイルスまたは他のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスをベースにしたベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バールウイルスをベースにしたベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照のこと。
【００５９】
発現ベクターの選択は、該ベクターを発現させることが意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、機能性抗体鎖または断片をコードしているポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含む。一部の実施形態では、誘導条件下以外での挿入配列の発現を抑制するために誘導性プロモーターが使用される。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたはヒートショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物体の培養物は、非誘導条件下で、発現産物が宿主細胞によってより耐容性であるコード配列に対して該集団をバイアスすることなく拡大培養され得る。また、プロモーターに加えて、機能性抗体鎖または断片の効率的な発現のために他の調節エレメントが必要とされる、または所望される場合もあり得る。このようなエレメントとしては典型的には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列が挙げられる。また、発現の効率は、使用される細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強され得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；およびＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞内での発現を増大させるために使用され得る。
【００６０】
また、発現ベクターは、挿入される機能性抗体の配列にコードされたポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を供給するものであってもよい。たいていは、挿入される機能性抗体の配列は、ベクター内に含める前にシグナル配列に連結させる。また、場合によっては、機能性抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードしている配列を受容するために使用されるベクターは定常領域またはその一部分もコードしている。かかるベクターでは、可変領域を、定常領域を有する融合タンパク質として発現させることが可能であり、それによりインタクトな抗体またはその断片の作製がもたらされる。典型的には、かかる定常領域はヒト由来である。
【００６１】
機能性抗体鎖を収容して発現させるための宿主細胞は原核生物系または真核生物系のいずれかであり得る。一部の好ましい実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドを発現および産生させるために哺乳動物宿主細胞が使用される。例えば、該細胞は、内在性免疫グロブリン遺伝子発現するハイブリドーマ細胞株または外来性発現ベクターを収容する哺乳動物の細胞株のいずれかであり得る。このようなものとしては、任意の通常の死に至る、または通常もしくは異常な不死の動物細胞またはヒト細胞が挙げられる。本明細書に例示した細胞株に加えて、インタクトな免疫グロブリンを分泌し得るいくつかの他の適当な宿主細胞株もまた当該技術分野で知られている。このようなものとしては、例えば、ＣＨＯ細胞株、種々のＨＥＫ  ２９３細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織の細胞培養の使用は一般的に、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に論考されている。哺乳動物宿主細胞用の発現ベクターには、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要なプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列が含まれ得る。このような発現ベクターは通常、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、期特異的および／またはモジュレーション可能もしくは調節可能なものであり得る。有用なプロモーターとしては、限定されないが、本明細書に例示したＥＦ１αおよびヒトＵｂＣプロモーター、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト最初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、ならびに当該技術分野で知られたプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
【００６２】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するための方法は細胞宿主の型に応じてさまざまである。例えば、原核生物細胞には塩化カルシウム形質転換が一般的に使用されるが、他の細胞宿主ではリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（第３版，２００１）参照）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、注入およびマイクロインジェクション、弾道飛行方式の方法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、ＤＮＡの薬剤増強性取込み、ならびにエキソビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期間の高収量産生のためには、安定な発現が多くの場合で所望される。例えば、該抗体鎖または結合断片を安定的に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内在性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて調製され得る。ベクターの導入後、細胞は富栄養培地中で１〜２日間培養され得、その後、培地を選択培地に交換する。選択可能マーカーの目的は選択のための耐性を付与することであり、その存在により、導入された配列を成功裡に発現する細胞の選択培地中での増殖が可能になる。安定的にトランスフェクトされた耐性細胞は、細胞型に適切な組織培養手法を用いて増殖され得る。
【００６３】
Ｖ．治療用途
本明細書に開示のＴｒｋＢ抗体は種々の治療用途に使用され得る。本発明の一部の方法は、ＴｒｋＢ発現細胞、例えば網膜神経節細胞におけるＴｒｋＢシグナル伝達経路の活性化を誘導するため、または該経路のシグナル伝達活性を増強するために指示される。このような方法は、細胞のインビトロまたはインビボでの修飾のために使用され得る。このような方法では、治療有効量の本発明のＴｒｋＢアゴニストを典型的には細胞と接触させる。本発明の他の一部の方法は、哺乳動物被験体における網膜神経節細胞の再生または生存の促進に関するものである。例えば、このような方法は、目の変性性の病的状態に冒されているか、またはその発症リスクがある被験体の目の視覚機能を回復、改善または保持するために使用され得る。本発明の他の一部の方法は、目の変性性の病的状態を有するか、またはその発症リスクがある被験体の処置または予防に関するものである。このような方法では、治療有効量の本発明のＴｒｋＢアゴニストを含む医薬組成物が被験体に投与される。また、本発明のＴｒｋＢ抗体を含む医薬組成物に加えて、本発明の治療用途では、該抗体をコードしており該抗体を発現する本明細書において論考したポリヌクレオチドまたはベクターも使用され得る。例えば、本発明の抗体コードポリヌクレオチドまたはベクターを有する組成物が、本明細書に記載の種々の神経変性疾患ための遺伝子療法において使用され得る。
【００６４】
多くの目の変性性の病的状態が本発明の治療方法での治療的または予防的処置に適している。このようなものとしては、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性もしくは死滅を特徴とするか、または該変性もしくは死滅と関連している任意の眼疾患または眼障害が挙げられる。かかる疾患または病的状態の具体例としては、例えば、緑内障、視神経損傷、視神経炎、視神経症、網膜中心動脈閉塞症および網膜中心静脈閉塞症が挙げられる。本発明の治療用抗体組成物での処置に適したものであり得る他の眼障害としては、例えば、糖尿病性ニューロパチー、ウェット型およびドライ型の両方の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む黄斑変性、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、虚血性網膜症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症ならびに網膜変性が挙げられる。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明により、ＴｒｋＢを発現する細胞（例えば、網膜神経節細胞）内でのＴｒｋＢシグナル伝達活性を、該細胞を本発明の抗体または抗原結合断片と接触させることによって向上させるための方法を提供する。関連する一部の実施形態では、本発明のＴｒｋＢアゴニストは、被験体の網膜神経節細胞の生存または再生を促進させるために使用され得る。このような実施形態では、投与されたＴｒｋＢアゴニスト薬剤によって誘起されるＴｒｋＢシグナル伝達活性の更新の結果、網膜神経節細胞の機能的完全性が保持または回復され得る。種々の実施形態において、投与されるＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合断片は、裸の（非コンジュゲート）分子であってもよく、合成分子、例えば標的化部分または別の治療用薬剤にコンジュゲートさせた抗体分子であってもよい。該方法は、細胞においてインビトロで、または被験体において（すなわちインビボで）ＴｒｋＢシグナル伝達を上方調節するために使用され得る。接触させたＴｒｋＢ発現細胞は、例えば、異常なもしくは障害されたＴｒｋＢシグナル伝達の活性化もしくはシグナル伝達活性と関連している障害または網膜神経節細胞の変性もしくは死滅を特徴とする疾患の細胞培養物中または動物モデル内に存在するものであり得る。
【００６６】
他の一部の実施形態では、本発明により、ＴｒｋＢシグナル伝達の増強を必要とする被験体を処置するための方法を提供する。このような被験体としては、ＴｒｋＢシグナル伝達活性の障害と関連している疾患またはＴｒｋＢシグナル伝達の増強によって処置され得る疾患、例えば運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有するか、該疾患を有する疑いがあるか、またはその発症リスクがある被験体が挙げられる。一部の実施形態では、本発明により、運動ニューロンの生存、再生およびシナプス機能を促進させるための方法を提供する。このような方法は、種々の運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳ、特発性運動ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）および偽球麻痺、ベル麻痺または脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）に冒されている被験体を処置するために使用され得る。他の一部の実施形態では、本発明により、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンの生存、再生およびシナプス機能を促進させるための方法を提供する。このような方法は、ＣＮＳの変性疾患に罹っている被験体を処置するために容易に使用され得る。多くのＣＮＳの変性疾患または障害が本発明の治療用組成物での処置に適している。このようなものとしては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびトゥレット照応群が挙げられる。
【００６７】
本発明の一部の治療方法は具体的には、網膜神経節細胞の変性または死滅を特徴とする眼障害を有するか、またはその発症リスクがある被験体の処置に関するものである。このようなものとしては、いくつかの目の変性性の病的状態、例えば、緑内障、視神経損傷、視神経炎、視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性ニューロパチー、ウェット型およびドライ型の両方の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む黄斑変性、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）ならびに糖尿病性網膜症が挙げられる。
【００６８】
一般に、本明細書に記載の種々の治療方法は、被験体に、治療有効量の本発明の単離または精製されたＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくは抗原結合断片（または該抗体を発現するポリヌクレオチドもしくはベクター）を含む医薬組成物を投与することを伴う。抗体は、本明細書において表１に記載の本発明の任意の抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその誘導体、例えば、抗体ＮＦＡＴ−８５から誘導された抗体および／またはＮＦＡＴ−８５のものと同じ結合特異性を有する抗体であり得る。したがって、投与される抗体は、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体または抗原結合断片であり得る。これは、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖまたは（ｓｃＦｖ）２であり得る。一部の実施形態では、該方法は、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディまたは二価抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、投与される抗体または抗原結合断片は、別の治療用薬剤（例えば、目の変性性の病的状態を処置するための既知の薬物もしくは化合物）または他の薬剤（例えば、標的化剤）にコンジュゲートさせたものであり得る。
【００６９】
本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体を他の既知の薬剤との組合せで、ＴｒｋＢシグナル伝達を促進させるため、および目の変性性の病的状態を処置するために使用してもよい。かかる既知のＴｒｋＢアゴニスト化合物としては、例えば、神経栄養因子ＢＤＮＦおよび神経栄養因子模倣物が挙げられる。既知のＴｒｋＢアゴニスト化合物の具体例としては、例えば、Ｌ−７８３，２８１アデノシン、ＣＧＳ  ２１６８０などが挙げられる。例えば、Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇ−ＣＮＳ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １：５９−８０  ２００２を参照のこと。また、ＴｒｋＢアゴニスト化合物は、ニューロトロフィンの極めて重要な領域を模倣する小分子であり得る。例えば、該小分子はＢＤＮＦのβ−ターンループの模倣物であり得る。本発明に従って使用され得るかかる小分子模倣物の具体例は、例えば米国特許出願公開第２００７／００６０５２６号に記載されている。好ましくは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体および本発明の方法において使用されるその他の既知のＴｒｋＢアゴニスト化合物はＴｒｋＢに対して選択的であり、ＴｒｋＢをＴｒｋＡまたはＴｒｋＣより大きな程度に活性化させるものである。一部の実施形態では、使用される該薬剤はＴｒｋＢに特異的であり、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣを活性化させないものである。
【００７０】
一部の治療用途では、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、視神経症または網膜変性障害、例えば緑内障を処置するための他の既知の投薬物またはレジメンとの組合せで使用され得る。例えば、該抗体は、既存の任意のＩＯＰ降下薬と一緒に使用され得る。このような既知の薬物としては、例えば、プロスタグランジンアナログ、例えばキサラタン（ラタノプロスト）ならびにルミガン（ビマトロプロスト）、β遮断薬、例えばチモロール、ベタキソロールおよびメチプラノロールが挙げられる。治療用ＩＯＰ降下薬に加えて、本発明の抗体との組合せで使用され得る多くの承認済の排液デバイスが存在する。
【００７１】
一部の実施形態では、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合分子は、本明細書に記載の治療方法で使用する場合、標的化部分にコンジュゲートさせ得る。標的化部分は、身体の特定の部分、例えば脳またはその区画への局在を指令するタンパク質またはペプチドであり得る。一部の実施形態では、ＴｒｋＢ抗体アゴニストは脳標的化部分と結合または融合され得る。脳標的化部分は共有結合によって（例えば、直接、翻訳による融合、または直接もしくはスペーサー分子（これは切断可能であってもよい）を介してのいずれかによる化学結合によって）結合させてもよく、非共有結合によって結合させてもよい（例えば、可逆的相互作用、例えばアビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧなどによって）。本発明のＴｒｋＢ抗体アゴニストにコンジュゲートさせる脳標的化部分によってＴｒｋＢアゴニストの脳送達が増強され得る。いくつかの薬剤が、本発明の実施における脳標的化部分として使用され得る。このようなものとしては、融合タンパク質または治療用薬剤を血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して送達することができるポリペプチドまたは抗体断片が挙げられる。かかる薬剤の例としては、シングルドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４，２００５）；ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体ｍＡＢ  ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６，１９９５）；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６およびＢ８ペプチド（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６，２０００）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０，１９９１）；ならびに米国特許第６，３０６，３６５号に記載のいくつかのポリペプチドが挙げられる。
【００７２】
ＶＩ．医薬組成物およびコンビネーション
本発明により、目の変性障害、例えば緑内障を処置するための医薬の製造において本発明のＴｒｋＢアゴニストを使用する方法を提供する。かかる病的状態の処置または緩和を必要とする被験体に本発明のＴｒｋＢアゴニストが単独で投与され得る。しかしながら、ＴｒｋＢアゴニストおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物の投与がより好ましい。医薬組成物に使用され得る本発明のＴｒｋＢアゴニストの例としては、本明細書に記載の任意のＴｒｋＢアゴニスト抗体または抗原結合分子が挙げられる。例示的な組成物は、それぞれ配列番号：１４と１５、配列番号：１６と１７、配列番号：１８と１９、配列番号：２０と２１、配列番号：２２と２３、配列番号：２４と２５、配列番号：２６と２７、配列番号：２８と２９、配列番号：３０と３１、配列番号：３２と３３、配列番号：３４と３５、配列番号：３６と３７または配列番号：３８と３９に示す成熟した重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する抗体のうちの１種類以上を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号：１４と１５、配列番号：１６と１７、配列番号：１８と１９、配列番号：２０と２１、配列番号：２２と２３、配列番号：２４と２５、配列番号：２６と２７、配列番号：２８と２９、配列番号：３０と３１、配列番号：３２と３３、配列番号：３４と３５、配列番号：３６と３７または配列番号：３８と３９にそれぞれ示す重鎖配列および軽鎖配列を含むものであり得る。本発明の医薬組成物に適した他の抗体としては、配列番号：１４、１６、１８，２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６もしくは３８に示す成熟した鎖の配列および／または配列番号：１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７もしくは３９に示す成熟した軽鎖の配列を有するものが挙げられる。
【００７３】
本発明のさらなる例示的な治療用組成物は、配列番号：４６〜７３ならびに配列ＡＡＳ、ＹＤＳおよびＧＫＮからなる群より選択される１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを有する抗体を含むものであり得る。しかしながら、一部の実施形態では、抗体は、表１に示して例示した同じ軽鎖または重鎖の３つのＣＤＲの配列を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、表１に例示した同じ抗体の６つのＣＤＲの配列、例えば、（１）配列番号：４６〜４９、ＡＡＳおよび配列番号：５０（抗体ＣＲＥ−６）；（２）配列番号：５１〜５６（抗体ＣＲＥ−３０もしくはＣＲＥ−８３）；（３）配列番号：５１〜５３、５７、５８および５６（抗体ＣＲＥ−３１もしくはＣＲＥ−５３）；（４）配列番号：５１〜５３、５７、５５および５６（抗体ＣＲＥ−３９もしくはＮＦＡＴ−７９）；（５）配列番号：５１〜５５および５９（抗体ＣＲＥ−８７）；（６）配列番号：５１、５２、６０、５７、６１および５６（抗体ＣＲＥ−９３）；（７）配列番号：４６、４７、６２、６３、ＹＤＳおよび配列番号：６４（抗体ＮＦＡＴ−２７）；（８）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：６９（抗体ＮＦＡＴ−４０）；（９）配列番号：７０〜７２および５４〜５６（抗体ＮＦＡＴ−４４）；または（１０）配列番号：６５〜６８、ＧＫＮおよび配列番号：７３（抗体ＮＦＡＴ−８５）を有する抗体を含む。さらに別の例示的な医薬組成物はｄｓＦｖ断片を含み、該断片はそのアミノ酸配列に適宜、当業者によって理解されるように、１つ以上の修飾を含むものであってもよい。
【００７４】
また、本発明により、医薬品たるコンビネーション製品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、例えばキットを提供する。かかる医薬品たるコンビネーション製品は、本開示のＴｒｋＢアゴニストであり遊離形態または組成物状態の活性薬剤、１種類以上の不活性な薬剤または他の成分ならびに該薬剤の投与のための使用説明書を含むものであり得る。一部の実施形態では、本発明の治療用キットは、本明細書に記載の医薬組成物中に存在させた１回以上の用量のＴｒｋＢアゴニスト（例えば、抗体ＮＦＡＴ−８５）、該医薬組成物の硝子体内注射のための適当なデバイスならびに好適な被験体および該注射を行なうためのプロトコルを詳述した使用説明書を含むものであり得る。
【００７５】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む医薬組成物は種々の形態に調製され得る。好適な固形または液状の医薬調製物形態は、例えば顆粒剤、散剤、錠剤、コート錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、エーロゾル剤、アンプル形態の滴剤または注射用液剤、また、活性化合物の長時間放出を伴う調製物である。また、本発明の抗体組成物を、界面活性剤の形態で調製し、被験体に投与してもよい。本発明の医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた標準的なプロトコル、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（第２０版，２００３）に従って調製され得る。医薬組成物は、典型的には、目の変性障害の症状を軽減または寛解させるのに充分な有効量のＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む。ＴｒｋＢアゴニスト抗体に加えて、医薬組成物にはまた、該組成物を増強もしくは安定化させるか、または該組成物の調製を容易にする特定の薬学的に許容され得る担体も含めてもよい。例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、投与前に、安定性または薬理学的特性を増強するために担体タンパク質、例えばオボアルブミンまたは血清アルブミンと複合体形成され得る。また、種々の形態の医薬組成物にも賦形剤ならびに添加剤および／または補助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑沢剤、着香料、甘味料、および当該技術分野で一般的に使用されている不活性希釈剤（精製水など）を含むエリキシル剤が含められ得る。
【００７６】
薬学的に許容され得る担体は、一部において、投与される具体的な組成物ならびに該組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。また、該担体は、その他の成分と適合性であり被験体に有害でないという意味において薬学的および生理学的の両方で許容され得るものであるのがよい。担体は、投与に所望される調製物の形態、例えば、経口、舌下、経直腸、経鼻、静脈内または非経口に応じて多種多様な形態であり得る。例えば、非水性溶媒の例はプロピレングルコール、ポリエチレングルコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。閉鎖包帯用の担体は、皮膚透過性を増大させて吸収を増強するために使用され得る。経口投与のための液状投薬形態は、一般的に、該液状投薬形態を含むリポソーム液剤に構成され得る。
【００７７】
治療用途または予防用途のために、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む医薬組成物は、局所または全身に治療有効量または治療有効用量で投与され得る。例えば、該組成物は、非経口、経腸、注射、急速輸液、鼻咽腔吸収、皮膚吸収および経口で投与され得る。しかしながら、好ましい実施形態では、意図された治療効果を得るために該組成物の局所投与が所望される。このような実施形態の一部のものでは、該組成物は、硝子体内注射による処置を必要とする被験体に投与され得る。これは、当該技術分野で知られた標準的な手順に従って行なわれ得る。例えば、Ｒｕｓｓｅｌａｋｉｓ−Ｃａｒｎｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１９６−２０６，１９９９；およびＷｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３：１８３−５，１９７６を参照のこと。本発明の医薬組成物を被験体の目に送達するために使用され得る他の局所投与経路としては、例えば眼内、眼窩内、結膜下、網膜下または経強膜経路が挙げられる。局所投与様式では、全身投与の際に起こり得る副作用（例えば、全身毒性）の発生の可能性が低減または解消され得ることが想定される。他の一部の実施形態では、本発明の医薬組成物はまた、患者に、例えば経口または非経口経路によって全身投与され得る。非経口経路としては、例えば静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内および腹腔内経路が挙げられる。
【００７８】
治療有効量は、被験体の処置対象の障害または病的状態の症状が低減または抑止されるのに充分な量を意味する。本発明の実施において、投与されるＴｒｋＢアゴニスト抗体の量は、眼変性、例えばＲＧＣの変性または死滅の遅滞、停止または逆転のために有効なものであるのがよい。かかる有効量は、被験体が冒されている眼障害、障害の病期および重症度、被験体の一般的な体調（例えば、身長、体重、年齢および健康状態）、投与される具体的な化合物ならびに他の要素に応じて被験体ごとに異なる。所与のＴｒｋＢアゴニスト抗体について、当業者は、常套的に実施されている調剤法を使用することによって該化合物の有効量を容易に特定することができよう。典型的には、インビトロで使用される投薬量が、医薬組成物のインサイチュ投与に有用な量の有用な手引きをもたらし得、ヒト被験体の具体的な障害の処置のための有効投薬量を決定するために動物モデルが使用され得る。たいていは、適当な治療用量は臨床試験により、哺乳動物種で最大耐用量を調べ、正常ヒト被験体で安全な投薬量を調べることで決定され得る。
【００７９】
一般に、高投薬量が必要とされ得る特定の状況下を除き、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の好ましい投薬量は通常、１日あたり約０．００１〜約１０００ｍｇ、より通常には約０．０１〜約５００ｍｇの範囲内である。一般的な法則として、投与されるＴｒｋＢアゴニスト抗体の量は、被験体の病的状態が有効に確実に抑制または最小限にされる最小投薬量である。また、投与される投薬量および投与頻度は、処置が予防的か治療的かに応じて異なり得る。予防用途では、相対的に低投薬量が相対的に低頻度の間隔で長期間にわたって投与され得る。一部の被験体は、死ぬまで処置を受けることが継続され得る。治療用途では、相対的に短い間隔で相対的に高投薬量が、疾患の進行が低減または停止するまで、好ましくは被験体が眼球血管疾患の症状の一部または完全寛解を示すまで必要とされ得る。その後、被験体に予防体制を施してもよい。容易にわかるように、上記の投薬量範囲は、本明細書における教示に対する一般手引きを示してサポートすることを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。また、本発明の医薬組成物の調製および投与のためのさらなる手引きは当該技術分野において報告されている。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（第１０版，２００１）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（第２０版，２００３）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（第７版，１９９９）を参照のこと。
【００８０】
［実施例］
以下の実施例は、本発明のさらなる実例を示すために示しており、本発明の範囲を限定するために示したものではない。本発明の他の変形例は当業者に容易にわかり、添付の特許請求の範囲に包含される。
【００８１】
［実施例１］
ＴｒｋＢアゴニストＡｂの開発
細胞株：本明細書に例示した特異的ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ｓｃＦｖ抗体のコンビナトリアルライブラリーの機能ベースのスクリーニングによって選択し、同定した。このスクリーニングを行なうための詳細な手順はＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：１５７２８−３３，２０１２；およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０：７３４−４１，２０１３に記載されている。簡単には、二段階法を使用した。第１に、ヒトＴｒｋＢをＣＨＯ細胞内にレンチウイルスベクターを用いてトランスフェクトすることによりレポーター細胞株を作製した。また、ＧＦＰレポーターに連結させたＮＦＡＴプロモーターを使用し、コグネイトリガンドＢＤＮＦで活性化されたら蛍光シグナルが発生するように細胞にレポーターカセットもトランスフェクトした。第２に、１０１１個のｓｃＦｖファージのライブラリーを使用し、ヒトＴｒｋＢのエクトドメインをパニングした。パニングプロセスでの陽性のもの（ヒット）をレンチウイルスベクター内にクローニングし、クローンをレポーター細胞に感染多重度（ＭＯＩ）約１で感染させた（図１）。第２のスクリーニングでは、読み出し情報としてＮＦＡＴ活性化を使用するのではなく、ＣＲＥプロモーターをＧＦＰレポーターに連結させたレポーターカセットを使用した。
【００８２】
機能でのこの選択でヒットしたものを収集し、３回の感染／選択によりディープシークエンシングで多数のｓｃＦｖクローンを得た。このｓｃＦｖ配列をｐＦＵＳＥ  ＩｇＧ骨格（ヒトＩｇＧ１）内にクローニングし、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体を作製した。選択されたＴｒｋＢ抗体の活性の予備試験では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ構築物をＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。２日間の培養後、各培養クローンの上清みを用いて、ＴｒｋＢレポーター細胞株の活性化に対する効果を調べた。この試験の結果を図２に示す。図に示されるように、同定されたＴｒｋＢ  ｓｃＦｖアゴニスト抗体（例えば、ｓｃＦｖ  ＣＲＥ−３０）は、ＴｒｋＢレポーター細胞株の活性化においてさまざまな度合の活性を示した。
【００８３】
同定された抗体の活性をさらに特性評価するため、選択されたｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を、プロテインＧアフィニティカラムを用いて精製し、レポーター細胞アッセイで試験して効力をＢＤＮＦと比べて測定した（図３）。図に示されるように、いくつかのＡｂはＢＤＮＦと比較すると完全アゴニストであったが、他のものは一部アゴニスト作用を示した。精製して試験したＡｂ内でも、効力は０．３〜３０ｎＭと異なっていた。Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５は最も高い効力（ＥＣ５０＝１ｎＭ）を示し、完全な有効性を示した。すべてのＴｒｋＢアゴニストＡｂをＴｒｋＡレポーター細胞内での選択性について試験した。図４は、ＢＤＮＦもいずれのＡｂも  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＴｒｋＡを活性化しなかったが、ＮＧＦでは予測されたロバストな応答が得られたことを示し、選択性が確認される。
【００８４】
選択されたＴｒｋＢアゴニストｓｃＦｖ抗体の一部のもののアミノ酸配列を表１に示す。「ＣＲＥ」レポーターでのスクリーニングで同定された抗体クローンには表中に「ＣＲＥ−」と示し、「ＮＦＡＴ」レポーターでのスクリーニングで同定された抗体には「ＮＦＡＴ−」と表示している。ｓｃＦｖ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列ならびに他の配列エレメント（例えば、ＣＤＲ）を、表２に示した配列識別子で表示している。
【００８５】
表１．機能スクリーニングで同定されたＴｒｋＢアゴニストｓｃＦＶ抗体
2019517787.tif 000003
2019517787.tif 000004
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各ｓｃＦＶ配列は、ＧＳリッチリンカー（イタリック体）によって軽鎖可変領域の配列に連結された重鎖可変領域の配列を含む。重鎖ＣＤＲの配列に下線を付し、軽鎖ＣＤＲの配列に二重下線を付している。
【表１】
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【００８６】
［実施例２］
シグナル伝達におけるＴｒｋＢアゴニスト抗体の機能
アゴニストＡｂによるＴｒｋＢシグナル伝達のさらなる特性評価をＣＨＯレポーター細胞において行ない、ＢＤＮＦのものと比較した。アゴニストＡｂは、度合は異なるが、５分と３０分の時点でＰ−ＰＬＣγ、Ｐ−ＡｋｔおよびＰ−ＭＡＰＫのリン酸化のシグナル伝達を刺激した（図Ｂ５）；レベルおよび時間的推移はＢＤＮＦと比べてさまざまであったが、シグナル強度はレポーター細胞内の蛍光シグナルに対する効果と相関している傾向にあった（図５参照）。
【００８７】
ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢの古典的シグナル伝達は、Ａｋｔ、ＭＡＰＫおよびＰＬＣγ経路によるリン酸化カスケードを伴う。ＢＤＮＦの機能、例えば生存、分化、神経突起伸長およびシナプス可塑性は、これらの経路の種々の側面に帰するものである。また、同定されたＴｒｋＢアゴニストＡｂを、一次ニューロンにおける栄養活性およびシグナル伝達についても試験した。Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５、ＮＦＡＴ−４４およびＮＦＡＴ−２７は、３日間にわたる培養状態においてＢＤＮＦ（図示せず）と同様にマウス感覚ニューロンの生存を維持することがわかった。Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５とのマウス皮質ニューロンのインキュベーションにより、時間依存性のＴｒｋＢのチロシンリン酸化がもたらされた。しかしながら、ＴｒｋＢホスホ−タンパク質のパターンはＢＤＮＦのものと相違しており、おそらくＴｒｋＢの切断産物を示していた（図６）。ＴｒｋＢアゴニストＡｂによるシグナル伝達が相違する可能性は現在調査中である。
【００８８】
ＢＤＮＦ活性化の下流標的を調べるため、シナプスタンパク質Ａｒｃをマウスの一次皮質ニューロンにおいてＡｂまたはＢＤＮＦでの処理後に測定した。Ａｒｃは、最初は細胞骨格関連タンパク質として同定された。最近の試験により、樹状突起スパインにおいてＡｒｃ発現の一過性増大が、シナプスの形態的拡大および安定なＬＴＰの下地となっていると考えられているＦ−アクチンネットワークの安定な拡張と関連づけられている。ＢＤＮＦ（長く、シナプス可塑性および記憶保持に関与してきた）は、Ａｒｃ依存性の固定化を活性化し、アクチン依存性のスパイン伸長に必要である。現時点での証拠により、Ｆ−アクチン形成、ＡｒｃおよびＬＴＰ固定化時の変換の互恵的相互作用の可能性がさらに示唆される。この試験の結果を図７に示す。ＢＤＮＦと同様、抗体ＮＦＡＴ−８５は２〜４時間のインキュベーション後、Ａｒｃを刺激した。
【００８９】
抗ＴｒｋＢアゴニストＡｂをヒトＴｒｋＢ受容体を用いたパニングおよび選択によって見出したため、本発明者らは、今後のインビトロおよびインビボ試験のために齧歯類細胞に対するＡｂの相対効力を調べた。これを調べるため、本発明者らは、ＢＤＮＦに応答することが以前に示されたマウス胚性幹細胞株の細胞を使用し、Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５およびＢＤＮＦによって刺激されたＴｒｋＢリン酸化を比較した。Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５はリン酸化を濃度依存的様式で増大させることがわかった。しかしながら、効力は、ヒトレポーター細胞に対する効果よりも少なくとも２桁小さかった（約１ｎＭ）。マウス細胞およびヒト細胞の両方において、ＢＤＮＦでは約２ｎＭでロバストなシグナル伝達がもたらされた（図８）。
【００９０】
総合すると、シグナル伝達および下流マーカーの試験は、アゴニストＡｂによる選択的な様式でのＴｒｋＢ結合と整合する。マウス細胞における濃度−応答により、さらなる齧歯類試験のためのＡｂ  ＮＦＡＴ−８５の相対効力を規定する。
【００９１】
［実施例３］
網膜培養系におけるＴｒｋＢアゴニストＡｂの効果
インビトロでの網膜の生理機能に対するＴｒｋＢアゴニストの効果に関する試験を開始するため、マウス網膜外植片培養系を確立した。簡単には、成体マウスの網膜を切除分離し、培養培地中に（ＲＧＣ層を上に向けて）０〜１４日の期間入れた。規定によりＲＧＣを軸索切断し；この期間中、種々の網膜層およびＲＧＣ樹状突起領域（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ）の進行性の減少がみられる。ＲＧＣ樹状突起の退縮は、ショール解析（これは、樹状突起領域パラメータを細胞体からの距離の関数として測定する）による評価時、培養状態で６時間という早期に明白になる。培養状態で３日目までに、樹状突起の交差および樹状突起の分岐の有意な減少がみられる。
【００９２】
３日間の培養期間により、ＲＧＣの樹状突起樹に対するＢＤＮＦおよびＴｒｋＢアゴニストＡｂの神経保護効果または神経再生効果について試験するための良好なダイナミックレンジが得られる。外植片を１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦとともにインキュベーションすると樹状突起の退縮が有意にブロックされ、その結果、培養状態で３日後のショール曲線下面積および樹状突起の分岐が時間点ゼロの外植片のものと同様になるということが観察され、軸索切断に対する樹状突起の退縮応答の完全な保護が示唆された。ＢＤＮＦが軸索切断誘導性樹状突起の退縮を逆転させ得るかどうかを調べるため、外植片を培養状態で３日間維持し、この時点でＢＤＮＦを添加し、ショール解析を行なった。特筆すべきことに、ＢＤＮＦの遅延適用でもパラメータに対する退縮応答は逆転され、この場合も時間点ゼロの外植片のものと同様であり、ＢＤＮＦは損傷ニューロンにおいて神経再生の出芽応答を誘導することが示唆された。
【００９３】
このパラダイムにより、ＴｒｋＢアゴニストＡｂが網膜外植片において、ＢＤＮＦで観察されたものと同様に樹状突起の退縮を抑制できるかどうかを試験するための土台が確立される。図９は、Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５が、軸索切断したＲＧＣ樹状突起の樹状突起パラメータをＢＤＮＦと同一の大きさで維持したことを示し、他の細胞型においてＡｂ  ＮＦＡＴ−８５で観察された生化学パラメータおよびシグナル伝達パラメータが確証された。今後の実験で、Ａｂ  ＮＦＡＴ−８５の遅延投与の効果、ならびにこの培養系におけるアゴニストＡｂの効果の持続性を調べる。
【００９４】
上記の未発表の結果の確証において、最近の２例の報告で、ＲＧＣに対するＢＤＮＦの栄養性効果が示されている。第１に、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５７：２５３−２６４，２０１６）により、ＢＤＮＦ＋ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）をマウス網膜外植片に投与すると、７日目にＲＧＣの分岐セグメント、接合部および末端分岐の数が改善され得ることが示された。また、Ｄｏｍｅｎｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ９（１２）：ｅ１１５５７９，２０１４）により、ＢＤＮＦの硝子体内適用または経表面適用すると、自然発生緑内障のＤＢＡ／２Ｊマウスモデルでの電気生理学的評価時（図示せず）、視覚機能が改善されることが示された。興味深いことに、このような効果はＩＯＰの上昇とは無関係に生じた。
【００９５】
［実施例４］
緑内障のラットモデルにおけるＴｒｋＢアゴニストＡｂの有効性．
緑内障の高眼圧症（ＯＨＴ）モデル作製をＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットにおいて、滅菌した５μｍの磁気マイクロビーズを前眼房内に注入することによって行なった。実験手順は本質的に、Ｓａｍｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．５２：１６７１，２０１１；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｔｒｉｂｂｌｅ，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１４１：９−１４，２０１５に記載のとおりに行なった。磁石を用いてビーズを虹彩角膜管に誘引し、小柱網を破壊し、ガラス質の流出を抑制し、続いて眼圧（ＩＯＰ）を上昇させた。ＩＯＰの上昇をリバウンドトノメータで定期的に測定した。ビーズ注入は左目に行ない、右目は対照として使用した。
【００９６】
ビーズ注入後５週目に、ラット左目に、硝子体内注射によってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５００ｎｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体ＮＦＡＴ−８５（Ａｂ８５）または５００ｎｇのＢＤＮＦを１μｌの容量で投与した。一部の動物では、Ａｂ８５またはＢＤＮＦの効果を正常眼圧（ＮＴ）の目（磁気マイクロビーズ注入を受けていない）において調べた。２週間後（マイクロビーズ注入後７週目）、ラットを致死させ、網膜を取り出し、網膜神経節細胞およびその樹状突起樹のＤｉｏｌｉｓｔｉｃ標識のために調製した。樹部の形態学（樹状突起の分岐指数、樹状突起の長さおよび樹状突起の交差）をショール解析によって定量した。網膜１つあたり平均６〜１０個の細胞を分析した。実験パラダイムの概要を図１０に示す。
【００９７】
図１１は、ＰＢＳ、Ａｂ８５またはＢＤＮＦで処置したＯＨＴ群およびＮＴ群のラットの平均ＩＯＰおよびピークＩＯＰレベル（単位：ｍｍＨｇ）を示す。この方法では、ＩＯＰはマイクロビーズ注入後、早期に上昇し、約３週間高値のままであり、４週間までに正常レベルに戻った。
【００９８】
図１２は、ショール解析による評価時の樹状突起樹の交差の平均の定量を示す。上のグラフは、正常眼圧（ＮＴ）の目である対照と比較した種々の薬剤で処置したＯＨＴラットの比較である。ＢＤＮＦおよびＡｂ８５（この方が度合がより大きい）は、ともに、ＰＢＳ処理した目と比べて交差の増大を示し、ＮＴの目とは異なっていない。下のプロットは、ＮＴの目をＢＤＮＦまたはＡｂ８５で処置すると平均交差は有意に改変されなかったことを示す（ＯＨＴを比較点としてプロット）。
【００９９】
図１３は、図１２に示すショール解析での曲線下面積（ＡＵＣ）、分岐指数および樹状突起の長さの統計的比較を示す。すべての測定値で、ＯＨＴ＋ＰＢＳラットでは、ＮＴの目と比べて有意に低かった。また、ＯＨＴ＋Ａｂ８５またはＢＤＮＦのいずれかでは、これらの測定値はＮＴの目に等しい値まで寛解した。Ａｂ８５処置もＢＤＮＦ処置のなしのＮＴの目はＮＴ対照と異なっていた。
【０１００】
この試験の結果により、高眼圧緑内障のモデルのラットの網膜神経節ニューロンの樹状突起樹に対するＴｒｋＢアゴニストＡｂの再生性のプラスの効果が示された。重要なことに、この再生効果は、緑内障に対して臨床的に実施されている病変後処置パラダイムと同様、眼圧上昇によって引き起こされる損傷の誘導後に生じる。
【０１０１】
［実施例５］
ＴｒｋＢとＴＮＦを標的化する二重特異性抗体
本発明らは、次いで、本明細書に記載のＴｒｋＢアゴニスト抗体Ａｂ８５およびよく知られた抗ＴＮＦ抗体ヒュミラ（アダリムマブ）から二重特異性抗体を作製することを試み、概念実証の二重特異性抗体構造物を作製した。この二重特異性分子構造物は、Ａｂ８５（ＴｒｋＢ抗体）の一方のアームとアダリムマブの他方のアームを含む。簡単には、Ａｂ８５  ｓｃＦｖ断片を、Ｙ４０７Ｔ変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片と融合させた。得られた融合タンパク質を配列番号：７４（Ａｂ８５−Ｆｃ（４０７））に示す。一方で、アダリムマブのＦａｂ重鎖を、Ｔ３６６Ｙ変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片と融合させた。得られた融合タンパク質を配列番号：７５（アダリムマブ−重鎖−Ｆｃ（３６６））に示す。
【０１０２】
二重特異性抗体の発現および合成のため、これらの２つの融合配列（Ａｂ８５−Ｆｃ（４０７）、アダリムマブ−重鎖−Ｆｃ（３６６））を、アダリムマブの軽鎖コードコード（ｃｏｄｉｎｇ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ）ベクターとともに一緒にＥｘｐｉ  ２９３細胞内にトランスフェクトする。合成された抗体は、次いで、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって精製され得る。
【０１０３】
配列番号：７４（Ａｂ８５−Ｆｃ（４０７）
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＶＩＳＧＤＳＶＳＤＮＳＧＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＴＤＹＡＤＳＶＫＳＲＩＴＩＩＰＤＩＰＫＮＱＦＳＬＨＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＹＹＹＡＦＨＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＧＳＧＧＧＧＳＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＴＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＡＡＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＡＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＲＤＳＳＲＳＨＨＬＬＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧＧＬＧＧＬＡＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：７５（アダリムマブ−重鎖−Ｆｃ（３６６））
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＹＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
前述の発明は、明瞭な理解の目的で実例および一例として、ある程度詳細に説明しているが、当業者には、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対していくつかの変更および修正が行なわれ得ることが容易にわかるであろう。
【０１０４】
本明細書において挙げた刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願はすべて、引用により、あたかも各々が具体的に個々に示されて引用により組み込まれているかのごとく本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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