(57)【要約】  B型肝炎治療ワクチンとしての使用のための融合蛋白質を開示する。前記融合蛋白質は下記(a)〜(c)を含む。(a)抗原提示細胞（APC）結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメイン、(b)蛋白質形質導入ドメイン、(c)少なくとも21〜50のアミノ酸を欠くB型肝炎ウィルスX蛋白質欠失変異体を含む抗原、上記蛋白質形質導入ドメインは、T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー、及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドである。上記APC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインは融合蛋白質のN末端に位置し、上記抗原は蛋白質形質導入ドメインのC末端に位置する。
2019531292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合蛋白質であって、
(a)前記融合蛋白質のN末端に位置する、抗原提示細胞（APC）結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメイン、
(b)前記APC結合ドメイン又は前記CD91受容体結合ドメインのC末端に位置する、蛋白質形質導入ドメイン、
ここで、前記蛋白質形質導入ドメインは下記(1)〜(3)を含む融合ポリペプチドであり、
(1)配列番号28のアミノ酸配列を含む、28〜53アミノ酸残基長からなるT細胞感作シグナル伝達ペプチド、
ここで、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIであり、前記融合ポリペプチドのN末端に位置する、
(2)配列番号3、4、20、又は30に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、34〜112アミノ酸残基長からなるトランスロケーションペプチド、及び
(3)前記T細胞感作シグナル伝達ペプチド及び前記トランスロケーションペプチドを連結するリンカー、及び
(c)少なくともアミノ酸残基21からアミノ酸残基50を欠き、前記蛋白質形質導入ドメインのC末端に位置する、B型肝炎ウィルスX蛋白質欠失変異体（△HBx）を含む、抗原、
を含む、融合蛋白質。
【請求項２】
前記APC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインは、配列番号5、9、6、7、及び8からなるグループより選ばれる配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記融合蛋白質のC末端に位置する、小胞体保持配列をさらに含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記抗原が10以上のエピトープを含む場合、前記融合蛋白質はそのC末端において小胞体保持配列を含まない、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
前記蛋白質形質導入ドメインは、配列番号27のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記APC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインは、配列番号5、9、6、7、及び8からなるグループより選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号1及び2からなるグループより選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
前記トランスロケーションペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
前記抗原は、配列番号23のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
前記欠失変異体△HBxは、1〜50、又は5〜50、又は10〜50、又は15〜50又は18〜50のアミノ酸の欠失を有する、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
(a)治療有効量の請求項1に記載の融合蛋白質、及び
(b)アジュバント、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントは、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを含む、請求項11に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
必要とする対象において、B型肝炎ウィルスX蛋白質（HBx）特異的T細胞応答の誘導、B型肝炎ウィルスに起因する感染の治療、B型肝炎ウィルス感染に起因する症状の最小化、肝細胞におけるB型肝炎ウィルスの増殖阻害、及び/又はB型肝炎ウィルス感染の抑制をするための医薬の生産における、請求項1に記載の融合蛋白質の使用。
【請求項１４】
(a)請求項1に記載の融合蛋白質を発現するためのプラスミドを生成する工程、
(b)前記プラスミドに宿主細胞内で前記融合蛋白質を発現させる工程、及び
(c)前記宿主細胞から前記融合蛋白質を回収する工程、
を含む、B型肝炎ウィルスX蛋白質欠失変異体融合蛋白質の調製方法。
【請求項１５】
前記蛋白質形質導入ドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項1〜10いずれかに記載の融合蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してB型肝炎に関し、より具体的にはB型肝炎ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
2017年のWHO世界肝炎報告によると、世界中でB型肝炎ウィルス（HBV）を有する人は2億5,700万人である。HBV感染は、HBV X蛋白質（HBx）が重要な役割を果たす、肝炎、肝硬変、及び肝細胞がん（HCC）などを含む一連の肝臓疾患を引き起こすことが知られている。
【０００３】
細菌中で発現されたときのHBxは不溶性である。Dong Liuらは、マルトース結合蛋白質タグ（MBPタグ）を使用することによって可溶性HBxを取得する方法を開発し、変性及び再生の必要性を排除した（Biotechnol. Appl. Biochem. 2009, 54: 141-147）。彼らの方法の不利な点はその複雑さである。精製のためにアミロース樹脂及びQセファロースクロマトグラフィーを必要とし、そしてMBPタグを除去するために48時間の第Xa因子酵素消化を必要とする。これらの工程は精製工程の複雑さを増し、費用と時間を増やしそして大規模生産におけるその使用を制限する。他のケースでは、封入体を変性及び再生し、次いで金属アフィニティークロマトグラフィー（Ni2+セファロースカラム）によってHBx蛋白質を調製した。この方法はニッケル毒性の問題（Forgacs Z et al. (2012), J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng, 47(9): 1249-60）を抱えているので、製薬プロセスにおけるその使用は制限される。
【０００４】
米国特許第9,481,714号(B2)は、凝集体形成に関して同様の問題を抱えている融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-HBx1-154-K3を開示している。封入体内の組み換え蛋白質を変性及び可溶化するために蛋白質内の水素結合を破壊するために、RAP1-CD28convPEt-HBx1-154-K3を作製するプロセス中に高濃度の尿素が必要であった。しかしながら、RAP1-CD28convPEt-HBx1-154-K3をリフォールディングするために尿素を最終的に除去すると、容易に凝集体の形成、ひいては沈殿を引き起こし、収率を低下させ得た。
【０００５】
従って、新規治療用HBVワクチン及びそれを調製する新規方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
蛋白質構造及び機能に影響を与えることなく、DNA工学技術によるHBxのアミノ酸残基21からアミノ酸残基50までの範囲のフラグメントの欠失が、蛋白質リフォールディングの間の容易な凝集及び沈殿の問題を解決し、最終的な蛋白質生産収率を増やし得ることを発見した。
【０００７】
一態様では、本発明は下記(a)〜(c)を含む融合蛋白質に関する。
(a)上記融合蛋白質のN末端に位置する、抗原提示細胞（APC）結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメイン、
(b)上記APC結合ドメイン又は上記CD91受容体結合ドメインのC末端に位置する、蛋白質形質導入（transduction）ドメイン、
ここで、上記蛋白質形質導入ドメインは下記(1)〜(3)を含む融合ポリペプチドであり、
(1)配列番号28のアミノ酸配列を含む、28〜53アミノ酸残基長からなるT細胞感作シグナル伝達ペプチド、
ここで、X8はI又はLであり、X10はV、F又はAであり、X11はM又はLであり、X17はL又はIであり、融合ポリペプチドのN末端に位置する、
(2)配列番号3、4、20、又は30に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、34〜112アミノ酸残基長からなるトランスロケーションペプチド、及び
(3)上記T細胞感作シグナル伝達ペプチド及び上記トランスロケーションペプチドを連結するリンカー、及び
(c)少なくともアミノ酸残基21からアミノ酸残基50を欠き、上記蛋白質形質導入ドメインのC末端に位置する、B型肝炎ウィルスX蛋白質欠失変異体（△HBx）を含む、抗原。
【０００８】
他の様態では、本発明は(a)治療有効量の本発明の融合蛋白質、及び(b)アジュバント、を含むワクチン組成物に関する。上記アジュバントは、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０００９】
さらに他の様態では、必要とする対象において、B型肝炎ウィルスX蛋白質（HBx）特異的T細胞応答の誘導、B型肝炎ウィルスに起因する感染の治療、B型肝炎ウィルス感染に起因する症状の最小化、肝細胞におけるB型肝炎ウィルスの増殖阻害、及び/又はB型肝炎ウィルス感染の抑制をするための医薬の生産における、本発明の融合蛋白質の使用に関する。
【００１０】
さらに他の様態では、必要とする対象での、B型肝炎ウィルスX蛋白質（HBx）特異的T細胞応答の誘導、B型肝炎ウィルスに起因する感染の治療、B型肝炎ウィルス感染に起因する症状の最小化、肝細胞におけるB型肝炎ウィルスの増殖阻害、及び/又はB型肝炎ウィルス感染の抑制における使用のための本発明の融合蛋白質に関する。
【００１１】
もしくは、本発明は、必要とする対象における、B型肝炎ウィルスX蛋白質（HBx）特異的T細胞応答の誘導、B型肝炎ウィルスに起因する感染の治療、B型肝炎ウィルス感染に起因する症状の最小化、肝細胞におけるB型肝炎ウィルスの増殖阻害、及び/又はB型肝炎ウィルス感染の抑制の方法にも関する。
【００１２】
別の様態では、(a)本発明の融合蛋白質を発現するためのプラスミドを生成する工程、(b)上記プラスミドに宿主細胞内で上記融合蛋白質を発現させる工程、及び(c)上記宿主細胞から上記融合蛋白質を回収する工程、を含む、B型肝炎ウィルスX蛋白質欠失変異体融合蛋白質の調製方法に関する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、上記APC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインは、配列番号5、9、6、7、及び8からなるグループより選ばれる配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
他の実施形態では、上記融合蛋白質は、融合蛋白質のC末端に位置する小胞体保持配列をさらに含んでいてもよい。  他の実施形態では、上記抗原が10以上のエピトープを含む場合、上記融合蛋白質はそのC末端において小胞体保持配列を含まない。他の実施形態では、上記蛋白質形質導入ドメインは、配列番号27のアミノ酸配列を含む。上記蛋白質形質導入ドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含んでいてもよい。他の実施形態では、上記APC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインは、配列番号5、9、6、7、及び8からなるグループより選ばれるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号1及び2からなるグループより選ばれるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、上記トランスロケーションペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、上記抗原は、配列番号23のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、上記欠失変異体△HBxは、1〜50、又は5〜50、又は10〜50、又は15〜50、又は18〜50のアミノ酸の欠失を有する。他の実施形態では、上記欠失変異体△HBxは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21〜50のアミノ酸の欠失を有する。他の実施形態では、上記抗原は、21番目のアミノ酸から50番目のアミノ酸の欠失を有するB型肝炎ウィルスX蛋白質欠失変異体（△HBx）を含む。
【００１５】
これら及び他の態様は、以下の図面に関連する好適な実施形態に関する以下の記述から明らかになるだろう。但し、その中の変更形態及び修正形態は、開示する新規の概念の精神と範囲から逸脱することなく作用し得るものである。
【００１６】
添付の図面は、本発明の1又は複数の実施形態を例示して、明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。可能限り、同じ参照番号を図面の全体にわたって使用して、実施形態における同一又は類似の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、プラスミドRAP1-CD28conv-PEt-△HBx-K3-pTacを示すベクターマップである。
【図２】図2は、ゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】図3は、免疫とサンプル採取スケジュールを示す。
【図４】図4は、C57BL/6マウスにおいてワクチンRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826によって誘導された抗原特異的体液性免疫応答のELISA分析の結果を示すチャートである。精製組換えHBx蛋白質を用いて血清HBx特異的抗体を捕捉し、450nmの波長での光透過の吸光度を比較するために色を表示した。
【図５】図5は、ELISPOTによって分析された、C57BL/6マウスにおけるワクチンRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826によって誘導された特異的Th1細胞免疫応答を示す。異なるHBx特異的ペプチドライブラリー（プール1、プール2）による刺激後にIL-2（上）、IFNγ（中）、及びTNFα（下）を分泌した脾臓免疫細胞の数を比較した。
【図６】図6は、B型肝炎ウィルス（HBV）キャリアマウスモデル、サンプリングプロセス、及び投与スケジュールの確立を示す。
【図７】図7は、ワクチン接種後のHBVキャリアマウスにおける体重変化を示す。
【図８】図8は、ワクチン接種後のHBVキャリアマウスにおける総ビリルビン変化を示す。
【図９】図9は、ワクチン接種後のHBVキャリアマウスにおける血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）値の変化を示すチャートである。
【図１０】図10は、最初のワクチン接種後82日目のHBVキャリアマウスにおける肝臓（上）及び脾臓（下）の重量比を示す。
【図１１】図11は、ワクチン接種後のHBVキャリアマウスにおける血清ウィルスDNAロード（×1000コピー/ml）（上）DNA及び陽性率（>1000コピー/ml）（下）の変化を示す。アジュバント群とワクチン群との間の統計的に有意な差（P<0.05）は*によって示される。各群のマウスの数は以下の通りである。対照群（n=7）、アジュバント群（n=10）、ワクチン群（n=10）。
【図１２】図12は、ワクチン接種後のHBVキャリアマウスにおける血清表面抗原数（×100IU/ml）（上）及び陽性率（>0.05IU/ml）（下）の変化を示す。アジュバント群とワクチン群との間の統計的に有意な差（P<0.05）は*によって示される。
【図１３】図13は、最初のワクチン接種後82日目のHBVキャリアマウスにおける肝臓コア抗原発現のウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
この明細書において使用する用語は、本発明の文脈の中で、及び、それぞれの用語が使われている特定の文脈において、一般的な従来技術での通常の意味を有する。本発明を記述するために用いるある種の用語は、明細書の以下に、又は他の箇所に記述して、本発明の記述に関して実践者に追加のガイダンスを提供する。便宜上、ある種の用語は、強調することができ、例えばイタリックおよび/または引用符を使用することができる。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に影響を及ぼすものではなく、それが強調されようとも、用語の範囲及び意味は、同じ文脈において、同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、他の言葉及び同義語は、任意の1又は複数の用語として用いてもよく、用語が本願明細書に詳しく述べられているか記載されているかにかかわらず特別な意味は有さない。ある種の用語の同義語が提供される。1又は複数の同義語の記述は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書中に記載されている任意の用語の例を含む例の使用は、例示的なものに過ぎず、決して本発明または例示される用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書において与えられている様々な実施形態に限定されない。
【００１９】
別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的および科学的な用語は一般的に、本発明が関係する当業者が理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本書を優先する。
【００２０】
本明細書において「前後」、「約」又は「およそ」は、所定の値又は範囲の20パーセント以内、好ましくは10パーセント以内、より好ましくは5パーセント以内を一般的に意味する。本明細書に記載の数量は概数であり、これは、明示的に述べられていない限り、「前後」、「約」又は「およそ」という用語が推測され得ることを意味する。
【００２１】
免疫原性蛋白質（例えば、抗原特異的T細胞反応を誘導するための免疫原エンハンサーとして使用するための融合蛋白質）は、米国特許第9,481,714号(B2)、第9,339,536 号(B2)及び第20160250324号(A1)に開示されており、それぞれはその全体が参照により本明細書に援用される。
【００２２】
「抗原提示細胞（APC）結合ドメイン」という用語は、抗原提示細胞（APC）に結合することができるドメイン（ポリペプチドである）を指す。一実施形態では、APC結合ドメインは、受容体関連蛋白質-1（RAP1）ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連蛋白質（A2M）、HIV-Tat、及びヒートショック蛋白質、及びシュードモナスエキソトキシンA（PE）結合ドメインIからなる群から選択される。別の実施形態では、APC結合ドメインは、配列番号5、6、7、8、及び9からなる群から選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００２３】
分化抗原群91（CD91）は、細胞のプラズマメンブレンに見出される受容体を形成し、受容体依存性エンドサイトーシスに関与する蛋白質である。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、APC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインは、樹状細胞、単核細胞、B細胞及びリンパ球からなる群より選択される抗原提示細胞（APC）上の受容体を認識してそれに結合する特性を示す。
【００２５】
分子量が39kDaの受容体関連蛋白質（RAP1）は、LDL受容体関連蛋白質のための小胞体蛋白質及び分子シャペロンである。それは、CD91に対する高結合親和性（Kd〜3nM）を有し、3つの機能的に類似したドメインによって構成されている。
【００２６】
「蛋白質形質導入ドメイン」という用語は、ポリペプチドであって、その機能は、T細胞を感作して、抗原特異的T細胞反応を向上する、及び/又は抗原提示のクラスI主要組織適合複合体（MHC-I）経路（即ち、細胞障害性T細胞経路）に抗原をガイド又は向ける（即ち、標的にする）機能である。
【００２７】
「T細胞を感作」という用語は一般に、CD8＋及びCD4＋T細胞が感作され、その結果、抗原チャレンジに対するCD8＋（CTL）及びCD4＋T細胞の応答が増強されることを意味する。抗原特異的細胞傷害性細胞（CTL）応答は、抗原に応答した抗原特異的誘導γ-インターフェロンの生産を定量することによって測定される。例えば、感作シグナルがない場合は、抗原単独では弱い又は全くCTL応答を誘導しない可能性がある、即ち抗原特異的γ-インターフェロンの生産を弱い又は全く誘導しない可能性があるが、感作シグナルの存在下では抗原は増強されたCTL応答を誘導し得る。 従って、感作シグナルの機能は、宿主が後に抗原によってチャレンジされたときに、抗原が以前のCD8+T細胞感作に起因した増強された抗原特異的CTL応答を誘導できるように宿主中のCD8+T細胞を感作することである。
【００２８】
さらに、CD4＋T細胞応答もまた、以前のT細胞感作によって増強される。抗原特異的CD4+T細胞応答は、B細胞からの抗体（IgG）力価生産によって間接的に測定される。
【００２９】
蛋白質形質導入ドメインは、以下からなるグループより選ばれるペプチド及び/又は融合蛋白質であってもよい。
(i)配列番号1に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、28〜53アミノ酸残基長のT細胞感作シグナル伝達ペプチド、
(ii)配列番号3に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、34〜112アミノ酸残基長のトランスロケーションペプチド。
【００３０】
T細胞感作シグナル伝達ペプチド及びトランスロケーションペプチドを含む、融合ポリペプチド。ここで、T細胞感作シグナル伝達ペプチドは融合ポリペプチドのN末端に位置する。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、蛋白質形質導入ドメインは「融合ポリペプチド」であってもよく、ここで融合ポリペプチドはT細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー、及びトランスロケーションペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、「CD28conv」と「PEt」の間にリンカーを含むポリペプチド「CD28convPEt」であってもよい。
【００３２】
「CD28conv」という用語は、「T細胞感作シグナル伝達ペプチド」であるCD28保存領域を指す。それはCD28アゴニスト抗体を誘導するためのエピトープである。
【００３３】
「PEt」又は「PEtコア」という用語は、34アミノ酸残基長を有するPEトランスロケーションドメインコアを指す。
【００３４】
融合ポリペプチド「CD28convPEt」の配向又は配置は、「CD28conv」（又は、T細胞感作シグナル伝達ペプチド）がPEt（又は、トランスロケーションペプチド）に対して上流に位置していなければならない、即ち、PEtは、増強したT細胞反応を得るために、「CD28conv」のC末端でなければならない点が重要である。「CD28convPEt」は、逆配向融合ペプチドPEtCD28convよりも、CD28conv特異的IgG力価（CD28-特異的アゴニスト抗体と呼ばれる）を高めることができる。CD28特異的アゴニスト抗体は、CD4+及びCD8+T細胞を感作することができる。適切な配向融合ポリペプチドCD28convPEtは、CD28convとPEtドメインとの間にリンカー(R1X2R3X4K5R6)を含む。リンカーは、Lys-Arg（KR）サイトを切断する抗原提示細胞（APC）特異的プロテアーゼ（カテプシンL）を含む。従って、融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-抗原-K3は、2つの断片、RAP1-CD28conv及びPEt-抗原-K3に消化することができる。RAP1-CD28conv断片は、リソソームにおいて更に消化され得る。そして、CD28convのエピトープは、MHC II経路を介してAPC細胞表面に提示され、液性免疫反応を誘導しCD28アゴニスト抗体を生産する。従って、CD28アゴニスト抗体は、B細胞によって生産される。このCD28アゴニスト抗体は、T細胞表面上のCD28に結合することができ、T細胞（CD4+及びCD8+T細胞）をプレ活性化することができる。
【００３５】
「T細胞感作シグナル伝達ペプチド」は、28-53アミノ酸残基長を有し、配列番号28と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、X8はI又はL、X10はV、F又はA、X11はM又はL、X17はL又はIである。
【００３６】
T細胞感作シグナル伝達ペプチドはクリティカル領域K1x2E3X4X5Y6P7P8P9Y10（配列番号29）を含み、ここで、X2はI又はL、X4はV、F又はA、X5はM又はLである。
【００３７】
マウス特異的T細胞感作シグナル伝達ペプチド（TDIYFCKIEFMYPPPYLDNEKSNGTIIH：配列番号28、ここでX8はI、X10はF、X11はM、X17はLである）は米国特許第9,481,714号(B2)に説明されている。
【００３８】
PEトランスロケーションペプチドは、配列番号3、4、20又は30と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、PEトランスロケーションペプチドのアミノ酸配列は、全長PE（配列番号10）の280〜313アミノ酸（配列番号3）、268〜313アミノ酸（配列番号20）、253〜313アミノ酸（配列番号30）、253〜364アミノ酸（配列番号4）であってもよい。即ち、PEトランスロケーションペプチドのアミノ酸配列は、それが280〜313アミノ酸（配列番号3）の必須フラグメントを含む限り、PEドメインII（253〜364アミノ酸：配列番号4）の任意の領域を含んでいてもよい。
【００３９】
小胞体（ER）保持配列の機能は、エンドサイトーシス区画からERへの抗原の移動を助け、それを内腔に保持することである。それは配列Lys Asp Glu Leu（KDEL）又はRDELを含む。例えば、ER保持配列は、KKDLRDELKDEL（配列番号16）、KKDELRDELKDEL（配列番号17）、KKDELRVELKDEL（配列番号18）又はKDELKDELKDEL（配列番号19）の配列を含んでいてもよい。
【００４０】
欠失HBx変異体を有する2つの融合蛋白質（1つは1番目から50番目のアミノ酸が欠失し、他方は21番目から50番目のアミノ酸が欠失している）が生成された。本発明による融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3は、融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-HBx-K3（全長HBxを有する）と同等に有効であったが、前者は後者よりもはるかに良好な安定性を示した。一定期間（例えば、1年間）貯蔵した後、液体形態の融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-HBx-K3は100％の凝集を示し、一方で融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3はより少ない凝集を示した。
【００４１】
CpGモチーフを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド（CpG ODN）は免疫細胞の活性化に広く用いられている。
【００４２】
「対象」という用語は、ヒト又はヒト以外の動物を指す。
【００４３】
「治療」又は「処置」という用語は、それを必要とする、癌もしくは感染症、又はそのような疾患に対する症状もしくは素因を有する対象への、疾患、その症状、又はそれに対する素因を治療、軽減、緩和、修復、改善、又は予防する目的での、有効量の融合蛋白質の投与を指す。そのような被験体は、任意の適切な診断方法からの結果に基づいてヘルスケア専門家によって同定され得る。
【００４４】
「有効量」という用語は、治療対象に治療効果を与えるのに必要とされる活性化合物の量を指す。当業者に認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療的処置との併用の可能性に応じて、有効量は変わり得る。
【００４５】
略称：CD28、分化抗原群28。
【実施例】
【００４６】
本発明の範囲を制限する意図なしに、本発明の実施形態による例示的な機器、装置、方法及びそれらの関連結果を以下に示す。表題又は副題は、読者の便宜のために実施例に使用しているが、本発明の範囲を決して制限してはならないことに注意されたい。さらに、ある種の理論が提唱されており、本願明細書に開示している。しかしながら、正しいか間違っているかどうかに関係なく、任意の特定の理論又は作用のスキームに関係なく本発明によって実施される限り、本発明の範囲を決して制限してはならない。
【００４７】
方法
融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3の調製
1. プラスミドRAP1-CD28-PEt-△HBx-K3-pTacのコンストラクション
下記のプライマーを使用した。
HBV1-F'-EcoRI: GAATTCATGGCTGCTCGTATGTGCTGC (配列番号31)、
HBV20.51-S: CTGCGTCCGTCTCACCTGTCTCTGCGTGG (配列番号32)、
HBV20.51-A: GTTCTGTGCCTGCGTCCGTCTCACCTGTCGACAGGTGAGACGGACGCAGGCACAGAAC (配列番号33)、
HBV154-R'-XhoI: CTCGAGGGCAGAGGTGAAGAAGTTGCAC (配列番号34)
【００４８】
米国特許出願番号9,481,714号(B2)に開示されている融合蛋白質RAP1-CD28convPEt-HBx1-154-K3-pTacをDNA鋳型として使用し（図10及び11、No.8参照）、配列番号31〜34のプライマーを、それぞれポリメラーゼ連鎖反応によるHBx1-20及びHBx51-154フラグメントの合成に使用した。プライマーHBV20.51-S及びHBV20.51-Aは、オーバーラップ相補配列を形成する配列部分を有するように設計され、従って、HBx1-20及びHBx51-154フラグメントはオーバーラップし、互いに相補的になってポリメラーゼ鎖中の鋳型を形成し得た。プライマーHBV1-F'-EcoRI及びHBV154-R'-XhoIを連鎖反応の増幅に使用し、最終的にEcoRI、XhoI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む△HBx(1-20, 51-154)フラグメントを生成した。△HBx(1-20, 51-154)フラグメント上のEcoRI及びXhoI切断部位により、△HBxフラグメント(1-20, 51-154)をRAP1-K3-pTacプラスミド（米国特許第9,481,714号(B2)、図10参照）に挿入してコンストラクトRAP1-△HBx-K3-pTacを得た。MfeI及びEcoRI切断部位を含有するフラグメントmCD28conv及びhCD28convを遺伝子合成の使用により得た。
【００４９】
MfeI及びEcoRI切断部位を利用して、フラグメントmCD28conv及びhCD28convを別々にRAP1-△HBx-K3-pTacプラスミドのEcoRI部位に挿入してコンストラクトRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3-pTacとRAP1-hCD28convPEt-△HBx-K3-pTacをそれぞれ生成した。
【００５０】
2. RAP1-CD28convPEt-△HBx-K3はRAP1、CD28conv、PEt、△HBx等の構成要素を含む。
表1は、本発明の融合蛋白質を調製するために使用され得る様々な構成要素の配列を示す。
【表１】
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2019531292.tif 000004
【００５１】
3. 融合蛋白質の生産
簡潔に説明すると、マスターセルバンクからの目的のプラスミドを含む大腸菌BL21細胞を解凍し、培地で100倍希釈し、250rpmで15時間撹拌しながら30℃で培養した。その後、培地を含む発酵槽にOD600=0.5に希釈したBL21細胞を入れ、37℃、pH7.0、40％溶存酸素の条件下で4時間培養し、70％グルコース溶液を供給した。OD600が20に達したとき、0.2Mのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して4時間蛋白質発現を誘導した。誘導した大腸菌を4℃、7000rpmで15分間遠心分離し、細胞ペレットを集めて-80℃で保存した。
【００５２】
融合蛋白質を回収するために、細胞ペレットを再懸濁し、超音波処理して細胞を破壊し、9500rpm、4℃で15分間遠心分離して封入体を分離、沈殿させた。封入体を数回洗浄し、8M尿素及び10mM DTTを含有する緩衝液を加え、次いで4℃で一晩静置して封入体内の組換え蛋白質を可溶化した。可溶化蛋白質を含有する緩衝液を9500rpm、4℃で2分間遠心分離し、上清を0.2μmフィルターを通して濾過し、濾液を回収した。濾液をイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。このとき、DEAEセファロースを固相として使用し、溶出バッファー(pH 8.8)は8M尿素、1mM DTT、30〜200mM NaClを含有していた。
【００５３】
イオン交換クロマトグラフィーから精製された溶出液を回収し、続いて尿素を除去するための透析（pH 5.0の尿素を含まない8倍容量の緩衝液を使用）により組換え蛋白質の再生（リフォールディング）を可能にした。この液を9500rpm、4℃で15分間遠心して上清と沈殿物（ペレット）を形成させ、上清を回収することにより目的の可溶性融合蛋白質を得た。
【００５４】
△HBx融合蛋白質の比較有効性データ及び検証
封入体中の組換え蛋白質の調製プロセスにおける既存の技術は、蛋白質の水素結合を破壊するために尿素を使用し、次に変性された組換え蛋白質は再生される。再生中、不適切な配列は融合蛋白質RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3のミスフォールディングを促し、不可逆的な凝集及び沈殿を引き起こす可能性がある。組換えDNA技術を用いてHBxの21〜50番目のアミノ酸領域を除去することにより、融合蛋白質RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3は蛋白質リフォールディング中の容易な凝集及び沈降の問題を解決し、そのために、最終蛋白質回収率が向上した。
【００５５】
蛋白質再生条件は、透析及び精製した融合蛋白質RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3及びRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3について試験した。蛋白質再生後、より多くの量のRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3（HBXの21〜50番目のアミノ酸残基の欠失を有する）（図2、レーン5及び6）がRAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3（HBxの21〜50番目のアミノ酸残基の欠失を有さない）（図2、レーン1及び2）よりも上清で可溶性を保持していることが見られた。
【００５６】
画像解析ソフトウェアを使用して、40kDaの蛋白質バンドを定量した（図2、レーン1〜8）。リフォールディング後に上清中に残っているRAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3の割合（レーン1/（レーン1+レーン3）で計算）は、約2.31％と計算された。リフォールディング後、上清に保持されているRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3は約12.93％と計算された（レーン5/（レーン5+レーン7）の比で計算）。これは、HBxの21〜50番目のアミノ酸を除去することにより、リフォールディングプロセス中の標的蛋白質の凝集及び沈殿を減少させ、リフォールディング後の回収率を10％超向上させることができることを示している。
【００５７】
図2は、RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3及びRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3の間の蛋白質リフォールディング比較を示す。蛋白質リフォールディングは、同じ蛋白質濃度及び透析条件下で行われた。蛋白質のリフォールディング後、上清及び沈殿物をそれぞれ還元剤（DTT）を用いて又は用いずに処理し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析した。M：蛋白質マーカーラダー。レーン1：リフォールディング後、上清中のRAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3リフォールディングを還元剤で処理した。レーン2：RAP1-mCD28conv-PEt-HBx1-154-K3のリフォールディング後、上清を還元剤で処理しなかった。レーン3：RAP1-mCD28conv-PEt-HBx1-154-K3のリフォールディング後、沈殿物を還元剤で処理した。レーン4：RAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3のリフォールディング後、沈殿物を還元剤で処理しなかった。レーン5：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3のリフォールディング後、上清を還元剤で処理した。レーン6：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3のリフォールディング後、上清を還元剤で処理しなかった。レーン7：RAP1-mCD28convPEt-△HBx K3のリフォールディング後、沈殿物を還元剤で処理した。レーン8：RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3のリフォールディング後、沈殿物は還元剤で処理されなかった。
【００５８】
表2は、蛋白質リフォールディング後のRAP1-mCD28convPEt-HBx1-154-K3及びRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3の電気泳動像の蛋白質バンドの定量分析の結果を示す。
【表２】
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【００５９】
RAP1-hCD28convPEt-HBx1-154-K3及びRAP1-hCD28convPEt-△HBx-K3の間での蛋白質リフォールディング比較を同様に行った。RAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3と類似して、RAP1-hCD28convPEt-△HBx-K3のリフォールディング後の回収率もRAP1-hCD28convPEt-HBx1-154-K3と比較して10％増加した（データは示されない）。この結果は、HBx 21〜50番目のアミノ酸を除去することにより、凝集を抑制し、目的蛋白質の回収率を向上させることができることを確認するものである。
【００６０】
△HBx融合蛋白質のワクチンとしての有効性
(1)ワクチン免疫原性試験
投与スケジュール、方法、及び動物群
C57BL/6雌マウス（4〜5週齢）を0、7、14日目に皮下注射により週に1回の頻度で3回免疫し、0、7、14、21日目に血液試料を採取し、血清抗HBx特異的抗体をELISAで分析した。マウスを屠殺して脾臓を採取した。脾臓中の免疫細胞を2つのHBx特異的ペプチドライブラリー（HBxスモールペプチドプール1、HBxスモールプール2）で刺激した。Th1特異的免疫細胞の数及びサイトカイン類の分泌をELISpotで分析した。
【００６１】
図3は、C57BL/6マウスへの3回のワクチン接種、並びに血液及び脾臓試料の収集のスケジュールを示す。動物を各群5匹のマウスで2つの群に分けた。対照群にはPBS緩衝液を投与し、ワクチン群にはRAP1- mCD28convPEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826を投与した。表3は、各群への投与量と動物数を示す。
【表３】
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【００６２】
結果
57BL/6マウスを、RAP1-mCD28conv-PEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826で免疫した。0、7、14、21日目に集めた血清試料をELISAによりHBx特異的抗体で分析した（図4）。ワクチン群における7日目及び14日目の血清HBx特異的抗体レベルは有意な変化を示さず、21日目ではわずかな増加を示したが、これは対照群と比較して統計的に有意ではなかった。この結果は、RAP1-mCD28conv-PEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826での3回の免疫が有意な抗原特異的体液性免疫応答を誘導しなかったことを示した。
【００６３】
マウスを21日後に屠殺した。それらの脾臓免疫細胞を、異なるHBx特異的ショートペプチドの2つのプール（HBxスモールペプチドプール1、HBxスモールペプチドプール2）によって刺激した。特異的細胞性免疫応答をELISPOT（ELISpot）によって分析した。ワクチン群においてIL-2（上）、IFNγ（中）、及びTNFα（下）を分泌したマウス脾臓免疫細胞数の有意な増加があった（図5）。対照的に、2つの異なるHBx特異的ペプチドで刺激した後、マウス対照群においてIL-2、IFNγ、及びTNFαを分泌した特異的脾臓免疫細胞数の増加はなかった。
【００６４】
まとめると、図4及び5は、RAP1-mCD28conv-PEt-△HBx-K3+CpG ODN1826を週1回で3回皮下へワクチン接種することにより、HBx特異的Th1細胞媒介免疫応答が効果的に誘導できたことを示す。但し、ワクチン接種したC57BL/6マウスにおいて、HBx特異的体液性免疫応答を誘導することはできなかった。
【００６５】
(2)ワクチン治療効果試験
動物実験モデル
CBA系の雄マウス（5〜6週齢）を用いて、長期B型肝炎ウィルスを保有する動物モデル（HBVキャリアマウス）を確立した。pAAV/HBV1.2プラスミドと生理食塩水との混合物（マウス重量の約8％の量）をマウスの尾静脈に高圧（水圧注入、HDI）で高速モード（5〜10秒）で静脈内注射した。これによりプラスミドは細胞膜を貫通し、肝細胞に侵入した。プラスミドを保有する肝細胞はB型肝炎ウィルス蛋白質を発現する。ウィルスは肝細胞内に集まり、そこから放出され得る。表面抗原（HBsAg）もまた血中に放出される。この動物モデルは慢性B型肝炎の症状に苦しんでいるヒト患者を模倣する。
【００６６】
投与スケジュール、方法、及び動物群
高圧注射の28日後、CBAマウスを0日目、7日目、14日目に、1週間に1回の皮下注射により3回治療用ワクチンで処置した（図6）。体重は、高圧注射の同日、0日目、7日目、14日目、21日目、32日目、及び42日目に測定した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、ビリルビン、ウィルスDNA、及び表面抗原（HBsAg）の分析のために血液を採取した。マウスを最初のワクチン接種の82日後に屠殺し、肝臓コア抗原（HBcAg）量をウエスタンブロットにより分析した。
【００６７】
マウスを以下のように3つの実験群に分けた。対照群にはPBS緩衝液を投与した。アジュバント群にはCpG ODN1826を投与した。ワクチン群にはRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826を投与した。表4は、各群の動物群、投与量、及び動物数を示す。
【表４】
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【００６８】
結果
体重（図7）及び総ビリルビン（図8）は、ワクチン群において異常な変化を示さず、対照及びアジュバント群との間に有意差を示さなかった。これは、ワクチンがHBVキャリアマウスにおいて高い耐性を示したことを示している。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルはわずかに高く、ワクチン群において経時的に有意な変動を示した（図9）。ワクチン群の10匹のマウスのうち8匹は血清ALTレベルが正常範囲（40U/L以下）を上回っていたが、その後の採血時点で血清ALTレベルは正常値に戻った。
【００６９】
アジュバント群に関しては、血清ALTレベルもわずかに増加し、わずかな変動を示した。但し、平均値は正常範囲を超えなかった。対照群の血清ALTレベルは正常であり、有意な変動はなかった。この結果は、ワクチン及びアジュバントをHBVキャリアマウスに使用した場合、特異的免疫応答を誘導し、感染した肝細胞を排除し、軽度の肝炎を引き起こし、その結果血清ALTレベルの増加及び変動をもたらす可能性があることを示す。
【００７０】
最初の投与から82日後にマウスを屠殺した。体重に対する肝臓及び脾臓の重量比を測定した（それぞれ図10上及び下）。3つのグループ間で肝臓重量比に差はなく、このことはアジュバントとワクチンが肝臓に明らかな影響を及ぼさなかったことを示している。しかしながら、アジュバント群における脾臓重量比は、対照群よりわずかに高く、そしてワクチン群における脾臓重量比は、アジュバント群よりもさらにわずかに高かった。差は統計的に有意ではなかったが、免疫応答がアジュバント及びワクチンによって誘導され、その結果脾臓重量比のわずかな増加をもたらしたことを示すかもしれない。
【００７１】
血清試料中のウィルスマーカー（即ちHBV DNAとHBsAg）の変化は実験群間で有意差を示した。対照群における血清ウィルスDNAロードの平均値は42日まで100％の陽性率で40,000〜120,000コピー/mlに維持され（図11、上と下）、これはHBVキャリアCBAマウスモデル（HBVキャリアマウス）がうまく確立されたことを示す。各群における陽性率は以下のように計算した。1000コピー/ml（検出限界、LOD）を超える血清ウィルスDNAロードを有する動物の数を動物の総数で割った。
【００７２】
アジュバント群におけるウィルスDNAロードの平均値は、0日目の約80,000コピー/mlから7日目（初回投与後7日）の約15,000コピー/mlまで減少し、陽性率は60％まで減少した（図11、下）。2回目及び3回目の投与後のウィルスDNAロードの平均値はそれ以上の変化を有意に示さず、42日目を通して安定かつ持続性を維持した。
【００７３】
対照的に、ワクチン群におけるウィルスDNAロードの平均値は、0日目で約80,000コピー/mlのレベルで始まり、7日目（初回投与後7日）で著しく減少したが、依然として90％の陽性率であった（図11、下）。ウィルスDNAは、ワクチン群の全てのマウスにおいて14日目（2回目の投与から7日後）にはもはや検出されず、アジュバント群との統計的に有意な差を示した（図11、上）。ウィルスDNAは42日まで検出不能な状態で維持された（図11、下）。
【００７４】
表面抗原の平均値と陽性率の変化は血清ウィルスDNAロードと正の相関を示した。対照群は、血清表面抗原（HBsAg）レベルが、42日目を通してずっと100％の陽性率で600〜800IU/mlで安定なままであることを示した（図12、上及び下）。各群における陽性率は以下のように計算した。0.05IU/mlを超える血清表面抗原レベルを有する動物の数を動物の総数で割った。
【００７５】
アジュバント群は、血清表面抗原（HBsAg）レベルの平均値が0日目に約1200IU/mlを示し、7日目（初回投与後7日）に約500IU/mlに低下し、14日目（2回目の投与から7日後）に約400IU/mlに低下し、3回目の投与後はさらに有意な減少は示さなかった（図12、上）。その後、血清表面抗原レベルは42日目を通して同じ値を維持した。アジュバント群における表面抗原陽性率は、7日目に90％、14日目に80％、及び32日目に70％に低下し、緩やかな下降傾向を示した（図12、下）。
【００７６】
ワクチン群は、0日目の血清表面抗原（HBsAg）の平均値が約800IU/mlを示した。14日目（2回目の投与から7日後）に約2IU/mlに急落し、21日目、32日目、及び42日目ではさらに1IU/ml未満に低下した。ワクチン群とアジュバント群との間で血清表面抗原レベルに統計的に有意な差があり、この差は安定していて42日目までずっと続いていた（図12、上）。ワクチン群における表面抗原陽性率は、14日目（2回目の投与から7日後）には実質的に30％に下し、さらに21日目及び32日目にはそれぞれ20％及び10％に低下した（図12、下）。
【００７７】
この結果は、ワクチンRAP1-mCD28convPEt-△HBx-K3 + CpG ODN1826の投与がHBx特異的免疫応答を誘導し、感染した肝細胞を排除し、マウス体内でのウィルス複製を抑制し、そしてまた表面抗原の生産及び放出をほぼ停止することを示す。HBVキャリアマウスに対するワクチンの効果は、部分的にはアジュバントの抗ウィルス効果から、又はワクチンと抗ウィルス効果を増強するアジュバントとの相乗作用からであり得る。
【００７８】
ウエスタンブロットを用いて、最初のワクチン接種の82日後の動物群間の肝臓組織におけるコア抗原（HBcAg）の発現量を比較した。対照群から得られた全ての肝臓組織においてコア抗原の発現が検出され、5匹のマウスがより高い量のHBcAg発現を示し、そして2匹のマウス（R4、ML4）がより少ない発現を示した（図13、上）。アジュバント群におけるコア抗原発現は、3匹のマウス（L2、L3、ML3）において高く、他の3匹のマウス（R1、R2、L4）において中程度であり、他の4匹のマウス（R3、R5、L1、ML2）において弱かった（図13、中央）。対照的に、ワクチン群におけるコア抗原発現は、ワクチン群由来のほとんど全ての肝臓組織において弱いか又は検出不可能であった（図13、下）。
【００７９】
ウエスタンブロットの結果は、免疫組織化学的染色の結果と一致し（データは示されない）、血清ウィルスDNAロード及びウィルス表面抗原陽性率（図11、下、及び図12、下）と正に相関した。これは、ワクチン接種後に、ウィルス抗原を発現した肝細胞が免疫系によって破壊されたか、又はウィルス抗原の発現が抑制された可能性があることを示している。
【００８０】
HBcAgに対して特異的なコア抗体を用いて肝臓組織中のコア抗原（HBcAg）を検出し、マウス肝臓中のコア抗原（HBcAg）発現を定量し、対照、アジュバント、及びワクチン群の間で比較した（図13、それぞれ上、中央、及び下）。βアクチン：インターナルコントロール。Nc：ネガティブコントロール（ブランク、CBAマウス肝細胞）。Pc：ポジティブコントロール（HepG2.2.15細胞株）。
【００８１】
他の△HBx融合蛋白質
上記に開示されたものと同様のデザインを使用して、以下の△HBx融合蛋白質が生成される。(1)RAP1-CD28convPEt-△HBx、(2)PE1-252-CD28convPEt-△HBx、(3)A2MMinimum-CD28convPEt-△HBx、(4)HIV-TatMinimum-CD28convPEt-△HBx、(5)HSPsMinimum-CD28convPEt-△HBx、(6)PE1-252-CD28convPEt-△HBx-K3、(7)A2MMinimum-CD28convPEt-△HBx-K3、(8)HIV-TatMinimum-CD28convPEt-△HBx-K3、(9)HSPsMinimum-CD28convPEt-△HBx-K3。
【００８２】
これらの△HBx融合蛋白質の免疫原性は、上記及び図3及び図6に記載されたものと同様の実験デザイン、投与、及びサンプリングスケジュールを用いて試験される。これらの融合蛋白質は、自身のAPC結合ドメイン又はCD91受容体結合ドメインを介して抗原提示細胞（APC）に入ると予想される。抗原△HBxのエピトープはAPCの膜表面に提示され、B型肝炎ウィルスX蛋白質（HBx）特異的T細胞応答の誘導を導き得る。従って、これらの融合蛋白質もまた、肝細胞におけるB型肝炎ウィルスの増殖の阻害及び/又はHBV患者におけるB型肝炎ウィルス感染の抑制に有効である。本発明による融合蛋白質は、米国特許第9,481,714号に開示されている融合蛋白質と同じ作用機序を有する。
【００８３】
本発明の例示的な実施形態に関する前述の説明は、図示及び説明の目的のためだけに示しており、網羅的であったり開示される厳密な形態に本発明を制限したりすることを意図するものではない。上記説明の観点から多くの修正形態及び変更形態が可能である。
【００８４】
代替実施形態は、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲内で、本発明が関係する当業者にとって明らかになるだろう。従って、本発明の範囲は、ここで記載されている前述の記述及び例示的な実施形態よりは、むしろ添付の特許請求の範囲によって規定される。特許、特許出願及び様々な刊行物を含んでいてもよいいくつかの参考文献は、本発明の説明において引用され論じられている。本明細書において引用及び議論された全ての参考文献は、各参考文献が個別に参照として援用されるのと同程度に、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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