(57)【要約】  特定の態様において、IL4Rα、TRPA1、および／またはF2RL1発現を阻害し、その結果アトピー性皮膚炎または喘息の治療に有用となる、RNA複合体（たとえば、asiRNAまたは細胞透過性asiRNAなどの非対称RNA複合体）が本明細書において提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL4Rα mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端とが平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項２】
TRPA1 mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端とが平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項３】
F2RL1 mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端とが平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項４】
前記アンチセンス鎖が19〜21nt長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が19nt長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が20nt長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖が21nt長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖が少なくとも24nt長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項９】
前記センス鎖が15nt長である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項１０】
前記センス鎖が16nt長である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項１１】
前記センス鎖が17nt長である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項１２】
前記センス鎖が、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9及び表10に列挙されているアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、請求項１〜１１のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖が、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9及び表10に列挙されているアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、請求項１〜１１のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１４】
前記RNA複合体が細胞によるIL4Rα発現を抑制することができる、請求項１及び４〜１３のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１５】
前記RNA複合体が細胞によるTRPA1発現を抑制することができる、請求項２及び４〜１３のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１６】
前記RNA複合体が細胞によるF2RL1発現を抑制することができる、請求項３〜１３のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１７】
前記細胞が上皮細胞である、請求項１４〜１６のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１８】
前記細胞がケラチノサイト細胞である、請求項１４〜１６のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１９】
前記細胞が肺胞細胞である、請求項１４〜１６のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項２０】
前記細胞がA549細胞である、請求項１４〜１６のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項２１】
前記RNA複合体がIL4Rα#5のアンチセンスおよびセンス鎖を含有する、請求項１に記載のRNA複合体。
【請求項２２】
前記RNA複合体がTRPA1 #81のアンチセンスおよびセンス鎖を含有する、請求項３に記載のRNA複合体。
【請求項２３】
前記RNA複合体がF2RL1 #22のアンチセンスおよびセンス鎖を含有する、請求項５に記載のRNA複合体。
【請求項２４】
前記RNA複合体が化学修飾を含む、請求項１〜２３のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項２５】
前記化学修飾が2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合又は疎水性部分である、請求項２４に記載のRNA複合体。
【請求項２６】
前記RNA複合体が疎水性部分を有する、請求項２５に記載のRNA複合体。
【請求項２７】
前記疎水性部分がコレステロール部分である、請求項２６記載のRNA複合体。
【請求項２８】
前記コレステロール部分が、前記センス鎖の3'末端に結合している、請求項２７に記載のRNA複合体。
【請求項２９】
前記RNA複合体が2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項２４又は２５に記載のRNA複合体。
【請求項３０】
前記2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖の3'末端に位置する、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３１】
前記センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項３０に記載のRNA複合体。
【請求項３２】
前記2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記アンチセンス鎖の3'末端に位置する、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３３】
前記アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項３２に記載のRNA複合体。
【請求項３４】
2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖の3'末端及び前記アンチセンス鎖の3'末端に位置する、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３５】
前記センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含み、前記アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項３４に記載のRNA複合体。
【請求項３６】
前記RNA複合体がホスホロチオエート結合を含む、請求項２４〜３５のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項３７】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオエート結合である、請求項３６に記載のRNA複合体。
【請求項３８】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオエート結合である、請求項３６に記載のRNA複合体。
【請求項３９】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオエート結合である、請求項３６に記載のRNA複合体。
【請求項４０】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項３６に記載のRNA複合体。
【請求項４１】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオエート結合である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項４２】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオエート結合である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項４３】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオエート結合である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項４４】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項３６〜４０のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項４５】
前記RNA複合体が、表2、表3、表5、表6、表8、表9又は表10に記載されている修飾RNA複合体である、請求項４４に記載のRNA複合体。
【請求項４６】
前記RNA複合体が送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過できる、請求項３６〜４５のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項４７】
前記RNA複合体が細胞毒性ではない、請求項1〜４６のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項４８】
細胞によるIL4Rα、TRPA1、又はF2RL1発現を抑制する方法であって、前記細胞と、請求項1〜４７のいずれか１項に記載のRNA複合体とを接触させることを含む方法。
【請求項４９】
前記細胞がA549、上皮細胞又はケラチノサイトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞がヒト対象の皮膚又は気道に存在する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
対象におけるアトピー性皮膚炎又は喘息を治療する方法であって、請求項１〜４７のいずれか1項に記載のRNA複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５２】
前記RNA複合体を、対象の皮膚に投与することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記RNA複合体を、対象の気道に投与することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記RNA複合体が静脈内投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記RNA複合体が非経口投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記RNA複合体が局所投与される、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記RNA複合体が吸入により投与される、請求項５１又は５３に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜４７のいずれか1項に記載のRNA複合体及び製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項５９】
前記医薬組成物が吸入用に製剤化される、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記医薬組成物が吸入器用に製剤化される、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記医薬組成物が局所投与用に製剤化される、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記組成物がクリームまたはローションである、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
請求項５８〜６２のいずれか1項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体においてアトピー性皮膚炎または喘息を治療する方法。
【請求項６４】
被験体がアトピー性皮膚炎を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
被験体が喘息を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
被験体の気道に医薬組成物を投与することを含む、請求項６３〜６５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６７】
前記医薬組成物が吸入器に入っている、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
被験体の皮膚に医薬組成物を投与することを含む、請求項６３〜６５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６９】
前記医薬組成物がクリームまたはローションである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記医薬組成物を非経口で、または静脈内に投与することを含む、請求項６３〜６５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７１】
前記医薬組成物を経口で投与することを含む、請求項６３〜６５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７２】
前記医薬組成物が被験体により自己投与される、請求項６３〜７１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７３】
さらに、アトピー性皮膚炎治療用の第２の薬剤を投与することを含む、請求項６３〜７２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
さらに、喘息治療用の第２の薬剤を投与することを含む、請求項６３〜７２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７５】
前記の第２の薬剤がステロイドまたは免疫調節剤である、請求項７３または７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2016年2月2日に出願された米国仮特許出願第62/290,298号の優先権の利益を主張し、この仮出願は完全な形で参考として本明細書に組み入れられる。
本発明はＩＬ４Ｒα、ＴＲＰＡ１、またはＦ２ＲＬ１を標的とするＲＮＡ複合体を用いたアトピー性皮膚炎および喘息の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の調節異常は、アトピー性皮膚炎および喘息などの自己免疫疾患をもたらす可能性がある。湿疹とも呼ばれるアトピー性皮膚炎は、かゆみのある敏感肌、浮腫、および紅斑の存在を特徴とする炎症性疾患である。アトピー性皮膚炎は、子供や幼児において一般的であるが、どの年齢でも発症する可能性がある。
【０００３】
アトピー性皮膚炎患者の約70%が「アトピーマーチ」により喘息を発症するが、それは、アトピー性皮膚炎が喘息およびアレルギー性鼻炎に進行することを特徴とする。喘息は、やはり免疫系の調節異常に関連する呼吸障害である。より具体的には、喘息は気管支のアレルギー性炎症による呼吸痙攣および障害を特徴とする慢性呼吸器疾患であり、繰り返される反復性の息切れ、喘鳴および咳を引き起こす。喘息の罹患率は、全世界で300万人に達すると推定され、主要先進国の人口の約8%が喘息に罹患している。
【０００４】
IL4Rα、F2RL1およびTRPA1遺伝子は、アトピー性皮膚炎および/または喘息の症状の発症および進行において重要な役割を果たす。外来抗原に暴露されると、アトピー性皮膚炎患者の樹状細胞はTh2細胞を活性化し、活性化されたTh2細胞によるサイトカイン（たとえばIL-4、IL-5、IL-10、およびIL-13）の分泌をもたらす。サイトカインの中で、IL-4およびIL-13は、アトピー性皮膚炎の発症に重要な役割を果たしていることが知られる一方、ヒトβディフェンシン-3およびフィラグリンの阻害によりアトピー性皮膚炎の症状を悪化させることが報告されているが、この2つはいずれも皮膚バリアを維持するものである。IL-4およびIL-13の受容体はヘテロダイマーであって、IL4Rα(インターロイキン4受容体α、IL4Rαとしても知られる)を含む。したがって、IL4RαのダウンレギュレーションはIL-4およびIL-13のシグナルを遮断することができる。
【０００５】
アトピー性皮膚炎患者が経験する痒み症状の主な原因は、ケラチノサイトにおける胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)の過剰発現であり、それによって、TRPV1およびTRPA1などの一過性受容体電位(TRP)イオンチャネルのTRPが上昇する。したがって、アトピー性皮膚炎の症状はTRPA1の阻害によって治療される可能性がある。
【０００６】
凝固第II因子(トロンビン)受容体様1(F2RL1、プロテアーゼ活性化受容体2、PAR2、としても知られる)は、皮膚において、ケラチノサイト、活性化された内皮細胞、および感覚神経により発現され、さまざまな炎症反応、色素沈着形成、および皮膚バリア機能に関与する。F2RL1は、プロテイナーゼの活性化にきわめて重要な役割を果たすが、プロテイナーゼは炎症反応、ならびにアトピー性皮膚炎患者に見られる悪化した皮膚状態を引き起こす。
【０００７】
したがって、アトピー性皮膚炎または喘息治療用の、IL4Rα、TRPA1およびF2RL1を標的とする新規で改善された治療薬の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
特定の態様において、IL4Rα、TRPA1もしくはF2RL1を標的とし、アトピー性皮膚炎および/または喘息を治療および/または予防するのに有用である、RNA複合体が本明細書に記載される。特定の態様において、このようなRNA複合体を含む医薬組成物、ならびにそのようなRNA複合体および医薬組成物を使用する方法が本明細書に記載される。
【０００９】
特定の態様において、IL4Rα、TRPA1もしくはF2RL1 mRNA配列に対して配列相補性を有するアンチセンス鎖、ならびにアンチセンス鎖に対して配列相補性を有するセンス鎖を含むRNA複合体が本明細書に記載される。一部の実施形態において、RNA複合体は、細胞（たとえばケラチノサイト）によるIL4Rα、TRPA1もしくはF2RL1の発現を阻害することができる。一部の実施形態において、RNA複合体は、非対称のより短い二本鎖の小分子干渉RNA（非対称二本鎖低分子干渉RNA）（asiRNA）である。一部の実施形態において、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、もしくは表10に記載のRNA複合体である。一部の実施形態において、RNA複合体は、IL4RA#5のアンチセンスおよびセンス鎖を含む。一部の実施形態において、RNA複合体は、TRPA1♯81のアンチセンスおよびセンス鎖を含む。一部の実施形態において、RNA複合体は、F2RL1#22のアンチセンスおよびセンス鎖を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるRNA複合体は化学修飾を含んでおり、その修飾は、デリバリー媒体の非存在下での細胞膜の透過を容易にする。一部の実施形態において、修飾は、2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合または疎水性部分である。一部の実施形態において、本明細書に記載のRNA複合体は、疎水性部分を含む。一部の実施形態において、疎水性部分は、疎水性を有する任意の化学構造とすることができる。たとえば、一部の実施形態において、疎水性部分は脂質、親油性ペプチドおよび／または親油性タンパク質である。一部の実施形態において、疎水性部分は、コレステロール、トコフェロールなどの脂質、または炭素原子数が10以上の長鎖脂肪酸(たとえば、ステアリン酸もしくはパルミチン酸)である。一部の実施形態において、疎水性部分はコレステロールである。一部の実施形態において、RNA複合体は、表2、表3、表5、表6、表8、表9、または表10に記載の修飾されたRNA複合体である。特定の実施形態において、RNA複合体は細胞傷害性でない。
【００１１】
特定の態様において、本明細書に記載のRNA複合体および製薬上許容される基剤を含有する医薬組成物が本明細書に記載される。特定の実施形態において、医薬組成物は、局所投与用に製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物はクリームまたはローションである。一部の実施形態において、医薬組成物は、非経口、静脈内または経口投与用に製剤化される。他の実施形態において、医薬組成物は、吸入用に製剤化される。
【００１２】
特定の態様において、細胞によるIL4Ra、TRPA1またはF2RL1の発現を阻害する方法が本明細書に記載され、その方法は、細胞を本明細書に記載のRNA複合体と接触させることを含む。
【００１３】
特定の態様において、本明細書に記載されるのは、ヒト被験体においてIL4Rα、TRPA1またはF2RL1遺伝子発現を阻害する方法であって、その方法は、本明細書に記載のRNA複合体または医薬組成物を被験体に投与することを含む。特定の態様において、アトピー性皮膚炎および/または喘息を治療する方法が本明細書に記載され、その方法は、本明細書に記載のRNA複合体または医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、IL4Rαを標的とする73の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図２】図2は、IL4Rαを標的とする15の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図３】図3は、IL4Rαを標的とする2の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効果を示す。
【図４】図4は、さまざまな化学修飾が施された、代表的な、IL4Rαを標的とする細胞透過性asiRNA（IL4Rα cp-asiRNA）の遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図５】図5は、代表的なcp-asiRNAによるIL4Rαタンパク質発現の阻害を示す。
【図６】図6は、異なるアンチセンス鎖長(19または21ヌクレオチド)の4つのcp-asiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図７】図7は、4の例示的なcp-asiRNAによるIL4Rαタンパク質発現の阻害を示す。
【図８−１】図8は、ヒトIL4Rα mRNA配列を示す。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】図9は、TRPA1を標的とする102の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図１０】図10は、TRPA1を標的とする14の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効果を示す。
【図１１】図11は、TRPA1を標的とする14の例示的なasiRNAによるTRPA1タンパク質発現の阻害を示す。
【図１２】図12は、さまざまな化学修飾が施された、代表的な、TRPA1を標的とする細胞透過性asiRNA（TRPA1 cp-asiRNA）の遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図１３】図13は、代表的なcp-asiRNAによるTRPA1タンパク質発現の阻害を示す。
【図１４】図14は、異なるアンチセンス鎖長(19または21ヌクレオチド)および異なるセンス鎖化学修飾(3または4ホスホロチオエート結合)を有する8つのcp-asiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図１５】図15は8の例示的なcp-asiRNAによるTRPA1タンパク質発現の阻害を示す。
【図１６】図16は、4の例示的なcp-asiRNAによるTRPA1タンパク質発現の阻害を示す。A549細胞は、トランスフェクション試薬の非存在下で、1μMおよび3μM cp-asiRNAと共にインキュベートされた。
【図１７−１】図17は、ヒトTRPA1 mRNA配列を示す。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−１の続きである。
【図１７−４】図１７−１の続きである。
【図１８】図18は、F2RL1を標的とする100の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図１９】図19は、F2RL1を標的とする29の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図２０】図20は、2'-0-メチル化修飾を含有する32の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図２１】図21は、F2RL1を標的とする12の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効果を示す。
【図２２】図22は、F2RL1を標的とする12の例示的なasiRNAによるF2RL1タンパク質発現の阻害を示す。
【図２３】図23は、さまざまな化学修飾が施された、代表的な、F2RL1を標的とする細胞透過性asiRNA（cp-asiRNAまたはcp-asiF2RL1）の遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図２４】図24は、代表的なcp-asiRNAによるF1RL1 mRNA発現の阻害を示す。
【図２５】図25は、代表的なcp-asiRNAによるF2RL1タンパク質発現の阻害を示す。
【図２６】図26は、異なるアンチセンス鎖長(19または21ヌクレオチド)の8つのcp-asiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す。
【図２７】図27は、8の例示的なcp-asiRNAによるF2RL1タンパク質発現の阻害を示す。
【図２８−１】図28は、ヒトF2RL1のmRNA配列を示す。
【図２８−２】図２８−１の続きである。
【図２９】図29は、アトピー性皮膚炎の誘導モデルにおけるcp-asiRNA治療の実験タイムラインを示す。
【図３０】図30は、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）虫体抽出物(Df)クリームで処理されたサンプルにおいて観察されるひっかき行動時間を示す。
【図３１】図31は、アトピー性皮膚炎のげっ歯類における、クリームcp-asiRNA塗布と皮内注射を対比して示す。
【図３２−１】図32は、アトピー性皮膚炎の齧歯類モデルの、皮膚切片画像分析による、皮膚切片のH&E染色および数値化された表皮面積を示す。
【図３２−２】図３２−１の続きである。
【図３３−１】図33は、治療された皮膚領域のマスト細胞浸潤分析を示す。
【図３３−２】図３３−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
総論
特定の態様において、本明細書に記載されるのは、IL4Rα、TRPAl、および／またはF2RL1を阻害し、その結果アトピー性皮膚炎および／または喘息の治療に有用となる、非対称RNA複合体（たとえば、asiRNAまたはcp-asiRNA）である。いくつかの実施形態において、RNA複合体は、トランスフェクション媒体を必要とせずに、細胞に透過できるように化学的に修飾される。いくつかの実施形態では、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、または表10に記載のRNA複合体である。特定の態様において、このようなRNA複合体を含む医薬組成物、ならびにそのようなRNA複合体および医薬組成物を使用する方法が本明細書に記載される。
【００１６】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体はasiRNAまたはcp-asiRNAである。本明細書中で用いるasiRNAなる語は、19〜21nt(ヌクレオチド)のアンチセンス鎖と13〜17ntのセンス鎖とを有する二本鎖非対称短鎖干渉RNA分子を意味する。asiRNAに関する追加的情報は、米国特許公開第2012/0238017号およびChangら, Mol. Ther. 17:725-732(2009)(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に見ることができる。
【００１７】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、送達ビヒクル、例えばリポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマーを使用して細胞に送達される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、細胞におけるIL4Rα、TRPA1及び/又はF2RL1の抑制を媒介するのに、そのような送達ビヒクルの使用を必要としないよう化学修飾される。そのようなRNA複合体は、本明細書において細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA)と称される。
【００１８】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここに集める。
【００１９】
本明細書で用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の対象物の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例えば、「an」要素は1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２０】
本明細書中で用いる「投与する」なる語は、医薬物質または医薬組成物を対象に与えることを意味し、医療従事者による投与および自己投与を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本明細書中で用いる「免疫調節剤（免疫調節薬）」とは、免疫系を弱める、刺激する、又は他の態様で調節する化合物又は組成物をいう。例としては、ロイコトリエン受容体アゴニスト、免疫抑制剤（例えばFK-506）、又はサイトカインが挙げられるがこれに限らない。
【００２２】
本明細書中で用いる「干渉核酸」及び「抑制性核酸」は互換的に用いられる。干渉核酸は、一般に、一連の環状サブユニットを含み、それらサブユニットはそれぞれが塩基対形成部分を有し、ワトソン-クリック塩基対形成により核酸(典型的にはRNA)中の標的配列にその塩基対形成部分がハイブリダイズして標的配列内で核酸:オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にするサブユニット間結合により、連結されている。干渉RNA分子には、アンチセンス分子、siRNA分子、asiRNA分子、cp-asiRNA分子、一本鎖siRNA分子、miRNA分子およびshRNA分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような干渉核酸は、mRNAの翻訳を遮断または阻害するように、あるいは天然プレmRNAスプライスプロセシングを阻害するように、あるいは標的化mRNAの分解を誘導するように設計してもよく、それがハイブリダイズする標的配列に対して「指向性である」または「標的化されている」と称されうる。干渉核酸には、例えば、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、2'-O-メチルオリゴヌクレオチドおよびRNA干渉物質(siRNA物質)が含まれうる。RNAi分子は、一般に、標的分子とヘテロ二重鎖を形成することによって作用し、それは選択的に分解又は「ノックダウン」され、それにより標的RNAを不活性化する。幾つかの条件下、干渉RNA分子は、転写物の翻訳を抑止することおよび/または転写物の転写を阻害することにより、標的転写物を不活性化することも可能である。干渉核酸は、より一般的には、前記のようにして標的の核酸に対して標的化されている場合、タンパク質のような生体関連標的に対して「標的化されている」と言われる。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」なる語は互換的に用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれであれ、任意の組合せおよび任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を果たしうる。以下のものはポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定められる遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合には、重合体の構築の前または後で施されうる。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合(コンジュゲート化)によって、さらに修飾されうる。本明細書に記載されている全ての核酸配列において、U核酸塩基はT核酸塩基と交換可能である。
【００２４】
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体（製薬上許容される担体）」なる語は、医薬上許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化材を意味する。
【００２５】
オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」と言えるのは、そのオリゴマーが、生理的条件下で、45℃より実質的に高い、または少なくとも50℃、または少なくとも60℃〜80℃またはそれを超えるTmで標的にハイブリダイズする場合である。そのようなハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に相当する。所与のイオン強度およびpHにおいて、Tmは、標的配列の50%が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。さらに、そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対してアンチセンスオリゴマーの厳密な相補性を有する場合だけでなく、「近い」または「実質的な」相補性を有する場合にも生じうる。
【００２６】
本明細書中で用いる「対象」なる語は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる「治療的有効量」および「有効量」なる語は、いずれかの医学的治療に適用可能な合理的な利益/リスク比で対象中の細胞の少なくとも亜集団において所望の治療効果を得るのに有効な物質の量を意味する。
【００２８】
対象における疾患の「治療」または疾患を有する対象の「治療」は、疾患の少なくとも1つの症状を軽減させ、またはその悪化を防止するように、医薬的治療、例えば薬物の投与、を対象に対して施すことを意味する。
【００２９】
本明細書中で用いる、障害又は状態を「予防する」治療薬とは、障害又は状態の発症前に統計サンプルに投与されると、未治療の対照サンプルと比較して治療サンプルにおける障害又は状態の発生を低減するか、あるいは発症を遅延させるか、あるいは未治療の対照サンプルと比較して障害又は状態の1つ以上の症状の重症度を低減する化合物を指す。
【００３０】
RNA複合体
特定の態様において、IL4Rα、TRPA1、及び／又はF2RL1 mRNAを標的とし、細胞によるIL4Rα、TRPA1、及び／又はF2RL1発現を抑制するRNA複合体を本発明において提供する。ヒトIL4Rα、TRPA1、及びF2RL1 mRNAの核酸配列は、それぞれ、図８、図１７及び図２８に提供する。
【００３１】
特定の態様において、IL4Rα、TRPA1、又はF2RL1 mRNA配列(例えば、ヒトIL4Rα、TRPA1、又はF2RL1 mRNA配列)に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖及びアンチセンス鎖と配列相補性を有するセンス鎖を含むRNA複合体を、本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、細胞によるIL4Rα、TRPA1、又はF2RL1発現を抑制することができる。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNA(asiRNA)である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8または表10に列挙されているRNA複合体である。本明細書に記載されているRNA複合体はRNA塩基、非RNA塩基またはRNA塩基と非RNA塩基との混合を含有しうる。例えば、本発明で提供する特定のRNA複合体は主にRNA塩基から構成されうるが、DNA塩基または非天然ヌクレオチドをも含有しうる。
【００３２】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は少なくとも19ヌクレオチド(nt)長である。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は19〜21nt長(すなわち、19、20または21ntの長さ)である。幾つかの実施形態においては、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20又は21ntのアンチセンス鎖は、IL4Rα、TRPA1、又はF2RL1 mRNA配列と相補的である。完全な相補性は必要ではない。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、IL4Rα、TRPA1、又はF2RL1 mRNA配列と完全に相補的である。
【００３３】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は少なくとも24nt長(例えば、少なくとも25nt長、少なくとも26nt長、少なくとも27nt長、少なくとも28nt長、少なくとも29nt長、少なくとも30nt長または少なくとも31nt長)である。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は124nt長以下(例えば、100nt長以下、90nt長以下、80nt長以下、70nt長以下、60nt長以下、50nt長以下または40nt長以下)である。幾つかの実施態様においては、アンチセンス鎖は31nt長である。幾つかの実施形態においては、少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、29、30又は31ntのアンチセンス鎖は、IL4Rα、TRPA1、又はF2RL1 mRNA配列と相補的である。完全な相補性は必要ではない。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、IL4Rα、TRPA1又はF2RL1 mRNA配列と完全に相補的である。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、センス鎖は15〜17nt長(すなわち、15nt長、16nt長または17nt長)である。幾つかの実施形態においては、センス鎖の少なくとも15nt、少なくとも16ntまたは少なくとも17ntがアンチセンス鎖の配列に相補的である。幾つかの実施形態においては、センス鎖はアンチセンス鎖の配列に完全に相補的である。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖の3'末端が平滑末端を形成している複合体を形成している。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端がセンス鎖の3'末端に(例えば、1、2、3、4または5nt)突出している複合体を形成している。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、センス鎖の5'末端がアンチセンス鎖の3'末端に(例えば、1、2、3、4または5nt)突出している複合体を形成している。
【００３６】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖及び/又はセンス鎖は、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表8又は表10に列挙されている配列から選択されるセンス鎖配列及び/又はアンチセンス鎖配列を有する。
【００３７】
幾つかの実施形態においては、本発明において提供するRNA複合体は化学修飾を含み、該修飾は送達ビヒクルの非存在下、細胞膜の透過を促進する。幾つかの実施形態においては、該修飾は2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合または疎水性部分である。一部の実施形態において、化学修飾は、疎水性部分である。一部の実施形態において、疎水性部分はコレステロール部分である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表2、表3、表5、表6、表8、表9又は表10に列挙されている修飾RNA複合体である。特定の実施形態においては、RNA複合体は細胞毒性ではない。
【００３８】
本明細書に記載されているRNA複合体は種々のオリゴヌクレオチド化学物質を用いうる。オリゴヌクレオチド化学物質の例には、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、ホスホロチオエート、2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドおよびモルホリノ化学(前記のいずれかの組合せを含む)が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、PNA化学はより短い標的化配列を用いることが可能である。なぜなら、それらは、2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドと比べて比較的高い標的結合強度を有するからである。ホスホロチオエート骨格を有する2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドを作製するために、しばしば、ホスホロチオエートと2'O-Me-修飾化学物質とが組み合わされる。例えば、PCT公開番号WO/2013/112053およびWO/2009/008725(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)を参照されたい。
【００３９】
ペプチド核酸(PNA)は、ピリミジンまたはプリン塩基が結合しているN-(2-アミノエチル)グリシン単位からなる、デオキシリボース骨格と構造的に同形の骨格を有するDNAの類似体である。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含有するPNAは、ワトソン-クリック塩基対形成規則に従い、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識の点でDNAを模倣する。PNAの骨格はホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により形成されており、これにより、それらはアンチセンス用途に好適なものとなる(後記の構造を参照されたい)。骨格は非荷電であるため、通常より大きな熱安定性を示すPNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖が生じる。PNAはヌクレアーゼまたはプロテーゼによっては認識されない。
【００４０】
天然構造に対する根本的な構造変化にかかわらず、PNAはヘリックス形態でのDNAまたはRNAへの配列特異的結合が可能である。PNAの特徴には、相補的DNAまたはRNAに対する高い結合アフィニティ、一塩基ミスマッチによって引き起こされる不安定化効果、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する抵抗性、塩濃度に無関係なDNAまたはRNAとのハイブリダイゼーション、ならびにホモプリンDNAとの三重鎖形成が含まれる。PANAGENE.TMは、それが独占所有するBts PNAモノマー(Bts; ベンゾチアゾール-2-スルホニル基)、および独占所有するオリゴマー化法を開発している。Bts PNAモノマーを使用するPNAオリゴマー化は脱保護、カップリングおよびキャッピングの反復サイクルから構成される。PNAは、当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて合成的に製造される。例えば、米国特許第6,969,766号、第7,211,668号、第7,022,851号、第7,125,994号、第7,145,006号および第7,179,896号を参照されたい。また、PNAの製造に関しては、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号を参照されたい。PNA化合物の更なる教示はNielsenら, Science, 254:1497-1500, 1991に見出されうる。前記のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００４１】
干渉核酸は「ロックド核酸」サブユニット(LNA)をも含みうる。「LNA」は、架橋核酸(BNA)と称される修飾クラスのメンバーである。BNAは、C3-エンド(ノーザン)糖パッカー(pucker)中のリボース環のコンホメーションを固定する共有結合により特徴づけられる。LNAの場合、架橋は2'-Oおよび4'-C位間のメチレンから構成される。LNAは骨格の予備構成および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増強する。
【００４２】
LNAの構造は、例えば、Wengelら, Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54:3607およびAccounts of Chem. Research (1999) 32:301; Obikaら, Tetrahedron Letters (1997) 38:8735; (1998) 39:5401およびBioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230に見出されうる。本発明で提供する化合物は1以上のLNAを含むことが可能であり、幾つかの場合には、該化合物はもっぱらLNAから構成されうる。個々のLNAヌクレオシドサブユニットの合成およびオリゴヌクレオチド内へのそれらの組込みのための方法は、例えば、米国特許第7,572,582号、第7,569,575号、第7,084,125号、第7,060,809号、第7,053,207号、第7,034,133号、第6,794,499号および第6,670,461号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。典型的なサブユニット間リンカーはホスホジエステルおよびホスホロチオエート部分を含み、あるいは、非リン含有リンカーが使用されうる。1つの実施形態は、各LNAサブユニットがDNAサブユニットによって分離されているLNA含有化合物である。ある化合物は、交互LNAおよびDNAサブユニットから構成され、この場合、サブユニット間リンカーはホスホロチオエートである。
【００４３】
特定の実施形態においては、RNA複合体はコレステロール部分に連結されている。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はセンス鎖の3'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はアンチセンス鎖の3'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はセンス鎖の5'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はアンチセンス鎖の5'末端に結合している。
【００４４】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体は2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。2'-O-メチル化ヌクレオシドはリボース分子の2'-OH残基にメチル基を含む。2'-O-Me-RNAはRNAと同じ(または類似した)挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解に対して保護されている。2'-O-Me-RNAは更なる安定化のためにホスホチオアートオリゴヌクレオチド(PTO)とも組み合わされうる。2'-O-Me-RNA(ホスホジエステルまたはホスホチオアート)は当技術分野における通常の技術に従い合成されうる(例えば、参照により本明細書に組み入れるYooら, Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004を参照されたい)。
【００４５】
幾つかの実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドはセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内の2、3、4、5または6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドはアンチセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内の2、3、4、5または6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域とアンチセンス鎖の3'末端領域との両方が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2、3、4、5、6、7または8個の2'-O-メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2、3、4、5、6、7または8個の2'-O-メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体はホスホロチオエート結合を含む。「ホスホロチオエート」(またはS-オリゴ)は、非架橋酸素の1つが硫黄により置換されている通常のDNAのバリアントである。ヌクレオチド結合間の硫化は、5'から3'へのおよび3'から5'へのDNA POL 1エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼS1およびP1、RNアーゼ、血清ヌクレアーゼならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドおよびエキソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは2つの基本的経路により、すなわち、ホスホン酸水素に対する二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用により、またはテトラエチルチウラムジスルフィド(TETD)または3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド(BDTD)のいずれかで亜リン酸トリエステルを硫化する方法により得られる(例えば、Iyerら, J. Org. Chem. 55, 4693-4699, 1990を参照されたい)。後者の方法はほとんどの有機溶媒における元素硫黄の不溶性および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。また、TETDおよびBDTD法はより高い純度のホスホロチオエートを与える。
【００４７】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%はホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００４８】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%はホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００４９】
本明細書に記載されているRNA複合体を細胞と接触させ、または生物(例えば、ヒト)に投与することが可能である。あるいは、RNA複合体をコードする構築物および/またはベクターを細胞または生物と接触させ、あるいは細胞または生物内に導入することが可能である。ある実施形態においては、ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用する。
【００５０】
本明細書に記載されているRNA複合体は、当技術分野で公知の任意の適当な方法により製造されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は化学合成またはインビトロ転写により製造される。
【００５１】
特定の態様において、本明細書に記載のRNA複合体および製薬上許容される基剤を含有する医薬組成物が本明細書に与えられる。特定の実施形態において、医薬組成物は、皮膚への投与用に（たとえばクリームもしくはローションとして）製剤化される。特定の実施形態において、医薬組成物は、肺への投与用に(たとえば吸入剤として)製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物は、経口または非経口投与用に製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物は、アトピー性皮膚炎または喘息治療用の第2の薬剤をさらに含有する。一部の実施形態において、第2の薬剤は、ステロイド(たとえばコルチコステロイド)、長時間作用型β刺激薬(たとえば、サルメテロールまたはフォルモテロール)、または免疫調節薬である。ステロイドの例としては、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、ムデソニド、モメタゾン、ベクロメタゾン、シクレソニドまたはフルニソリドが挙げられる。免疫調節薬の例としては、モンテルカスト、ザフィルルカスト、またはザイリュートン（zileuton）が挙げられる。2種以上のステロイド、長時間作用型β刺激薬、および免疫調節薬を医薬組成物と共に摂取することができる。
【００５２】
一部の実施形態において、医薬組成物は、皮膚への投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、エマルション、クリーム、ローション、ゲル、油、軟膏、エアゾールスプレー、または半固形製剤である。一部の実施形態において、局所製剤は、トレハロース、マルトデキストリン、米粉、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、イノシトール、フラクトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、デキストロース、スクロース、タルク、水、生理食塩水、尿素、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、ミリスチン酸イソプロピル、ラノリン、ラノリンアルコール、鉱油、ラベンダー油、オランダガラシエキス、ソルビタンモノオレエート、セチルステアリルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、界面活性剤、ステアリン酸スクロース、ヤシ脂肪酸スクロース、ジステアリン酸スクロース、2-エチル-l、3-ヘキサンジオール、ポリオキシプロピレン-15-ステアリルエーテル、ステアリン酸グリセリル、グリセリン、合成鯨ろう、セチルアルコール、ブチルパラベン、プロピルパラベン、およびメチルパラベンから選択される基剤を含有する。
【００５３】
特定の実施形態においては、医薬組成物はトランスフェクションビヒクルを含まない。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマー)を含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、本明細書に記載されている複数(例えば、2以上)のRNA複合体の組合せを含む。
【００５４】
これらの製剤または組成物の製造方法は、本明細書に記載されているRNA複合体を担体と、そして所望により1以上の補助成分と一緒にする工程を含む。一般に、製剤は、本明細書に記載されている物質を液体担体と均一かつ密に一緒にすることにより製造される。
【００５５】
治療方法
特定の態様において、細胞によるIL4Rα、TRPA1、又はF2RL1発現を抑制する方法であって、本発明において提供するRNA複合体と細胞を接触させることを含む方法を本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、修飾RNA複合体であり、トランスフェクションビヒクルの非存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体及び/又はアプタマー)の存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、細胞は、ヒト対象の気道に存在する。一部の実施形態において、細胞はヒト被験体の皮膚内に存在する。一部の実施形態において、被験体はアトピー性皮膚炎を有する。一部の実施形態において、被験体は喘息を有する。一部の実施形態において、被験体は女性である。一部の実施形態において、被験体は男性である。
【００５６】
特定の態様において、アトピー性皮膚炎及び／又は喘息に対するヒト対象の治療方法であって、本発明において提供するRNA複合体又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法を本発明において提供する。特定の実施形態においては、RNA複合体又は医薬組成物は、対象の気道に投与される。特定の実施形態では、RNA複合体又は医薬組成物は、被験体の皮膚に投与される。幾つかの実施形態においては、RNA複合体又は医薬組成物は、対象によって自己投与される。
【００５７】
本方法においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、例えば、送達ビヒクルを使用しない核酸として(例えば、cp-asiRNAの場合)、送達試薬と併用して、および/または本明細書に記載されているRNA複合体を発現する配列を含む核酸として、対象に投与されうる。幾つかの実施形態においては、当技術分野で公知の任意の核酸送達方法が、本明細書に記載されている方法において用いられうる。適当な送達試薬には、例えば、Mirus Transit TKO親油性試薬; リポフェクチン; リポフェクタミン; セルフェクチン; ポリカチオン(例えば、ポリリシン)、アテロコラーゲン、ナノプレックスおよびリポソームが含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸分子用送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用はMinakuchiら, Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanaiら, Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); およびKawataら, Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。例示的な干渉核酸送達システムは米国特許第8,283,461号、第8,313,772号、第8,501,930号、第8,426,554号、第8,268,798号および第8,324,366号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)で提供されている。
【００５８】
本明細書に記載されている方法の幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体を対象に送達するためにリポソームを使用する。本明細書に記載されている方法における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成性脂質(これは、一般には、中性または負荷電リン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む)から形成されうる。脂質の選択は、一般には、所望のリポソームのサイズおよび血流内のリポソームの半減期のような要因を考慮することによって導かれる。リポソームの製造のための種々の方法が公知であり、例えば、Szokaら, (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; ならびに米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号および第5,019,369号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。
【００５９】
本方法に使用されるリポソームはまた、単核マクロファージ系(「MMS」)および細網内皮系(「RES」)によるクリアランスを回避するために修飾されうる。そのような修飾リポソームは表面上のまたはリポソーム構造内に取り込まれたオプソニン化抑制部分を有する。
【００６０】
本明細書に記載されているリポソームの製造に使用するためのオプソニン化抑制部分は、典型的には、リポソーム膜に結合した大きな親水性重合体である。本明細書中で用いるオプソニン化抑制部分がリポソーム膜に「結合」していると言えるのは、それが化学的または物理的に、例えば、膜自体の内部への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接結合により、該膜に結合している場合である。これらのオプソニン化抑制性親水性重合体は、例えば米国特許第4,920,016号(その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されているとおり、MMSおよびRESによるリポソームの取り込みを有意に減少させる保護表面層を形成する。
【００６１】
幾つかの実施形態においては、リポソームの修飾に適したオプソニン化抑制部分は、約500〜約40,000ダルトンまたは約2,000〜約20,000ダルトンの数平均分子量を有する水溶性重合体である。そのような重合体には、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体; 例えばメトキシPEGまたはPPG、およびPEGまたはPPGステアラート; 合成重合体、例えばポリアクリルアミドまたはポリN-ビニルピロリドン; 直鎖状、分枝状またはデンドリマー状ポリアミドアミン; ポリアクリル酸; カルボキシルまたはアミノ基が化学結合している多価アルコール、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドGM1が含まれる。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGまたはそれらの誘導体の共重合体も好適である。また、オプソニン化抑制性重合体はPEGおよびポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドのいずれかのブロック共重合体でありうる。また、オプソニン化抑制重合体は、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン; アミノ化多糖またはオリゴ糖(直鎖状または分枝状); あるいはカルボキシル化多糖またはオリゴ糖、例えば、炭酸誘導体と反応してカルボキシル基が結合したものでありうる。幾つかの実施形態においては、オプソニン化抑制部分はPEG、PPGまたはそれらの誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは「PEG化リポソーム」と称されることがある。
【００６２】
本明細書中で開示されている医薬組成物は、任意の適切な投与経路、例えば、局所的、吸入により、経口的及び非経口的に送達されうる。特定の実施形態においては、医薬組成物は、(例えば、経口又は非経口投与により)全身送達される。他の特定の実施形態においては、医薬組成物は肺への吸入により、又は局所的に皮膚上へ局所的（局部的）に送達される。一部の実施形態において、医薬組成物は皮膚内注射により投与される。
【００６３】
医薬組成物中のRNA複合体の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴うことなく個々の患者、組成物および投与方法に関して所望の治療応答を得るのに有効なRNA複合体の量が得られるように変動可能である。
【００６４】
選択される投与量レベルは、使用される個々の物質の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用される個々の化合物と併用される他の薬物、化合物および/または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態および過去の病歴ならびに医学分野でよく知られている同様の要因を含む種々の要因に依存する。
【００６５】
当技術分野における通常の技量を有する医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することが可能である。例えば、医師または獣医は、医薬組成物中で使用される物質の用量を、所望の治療効果を達成する必要レベルより低いレベルで処方および/または投与し、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることが可能である。
【００６６】
一般に、本明細書に記載されているRNA複合体の適当な1日量は、治療効果を得るのに有効な最低用量であるRNA複合体の量である。そのような有効量は、一般に、前記の要因に依存する。
【実施例】
【００６７】
実施例１  IL4Rα特異的な非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNAについてのスクリーニング
高い効率でIL4Rαを阻害する非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNA(asiRNA)を同定するために、73のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングしたasiRNAの核酸配列を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2019503199.tif 000002
2019503199.tif 000003
2019503199.tif 000004
2019503199.tif 000005
【００６９】
表1に挙げたasiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、アニーリングバッファー(Bioneer Inc. Korea)中でインキュベートした。紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco)、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、5x103個のA549細胞を96ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen Inc.)を用いて、A549細胞を0.1 nMのasiRNAでトランスフェクトした。
【００７０】
トランスフェクションの24時間後に、qRT-PCRによって、トランスフェクトされた細胞のIL4RαmRNAレベルを測定した。具体的には、qPCR用のSuperPrep Cell Lysis & RT キット（TOYOBO）をメーカーの説明書にしたがって使用して、全RNAを抽出し、cDNAを合成した。IL4Rα TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00166237_m1)を用いてIL4Rα遺伝子の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【００７１】
73のasiRNAのそれぞれによるIL4Rα阻害のレベルを図1に示す。asiRNA配列のうち15個、#5、#6、#20、#32、#38、#40、#41、#44、#48、#56、#58、#59、#64、#67および#72を、追跡調査に使用するために選択した。
【００７２】
実施例２  IL4Rα標的化asiRNAによるIL4RαmRNA発現の阻害
実施例1で選択されたasiRNA配列がIL4RαmRNA発現を阻害する能力を調べた。
【００７３】
asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、アニーリングバッファー(Bioneer Inc. Korea)中でインキュベートした。紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)および100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen Inc.)を用いて、A549細胞をasiRNAでトランスフェクトした。
【００７４】
asiRNAトランスフェクションの24時間後に、qRT-PCRによって、A549細胞のIL4RαmRNAレベルを測定した。具体的には、RNAiPlus（登録商標）（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAのうち500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。IL4Rα TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00166237_m1)を用いてIL4Rαの増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18S RNAを内部標準として増幅した。
【００７５】
15のasiRNAのIL4Rα阻害のレベルを図2に示す。IL4RαmRNAの40-50%阻害を示したasiRNA #5および#6を、追跡調査に使用するために選択した。
【００７６】
実施例３  IL4Rα標的化asiRNAによるIL4Rαタンパク質発現の阻害
実施例2で選択された2つのasiRNA配列がIL4Rαタンパク質発現を阻害する能力を調べた。
【００７７】
asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、アニーリングバッファー(Bioneer Inc. Korea)中でインキュベートした。紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen Inc.)を用いて、A549細胞を１μMのasiRNAでトランスフェクトした。
【００７８】
asiRNAトランスフェクションの48時間後に、ウエスタンブロットによりIL4Rαタンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100mM Tris pH8.0)で溶解した。全タンパク質抽出物の15μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗IL4Rα抗体（Acris）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、IL4RαおよびGAPDHバンドを、ChemiDoc装置(Bio-rad)を用いて画像化した。ウェスタンブロットの結果を図3に示す。
【００７９】
実施例４  セルフデリバリーのためのasiRNAの化学修飾
asiRNAに化学修飾を施し、修飾されたasiRNAの細胞デリバリーを、他のデリバリー試薬の非存在下で調べた。下記のように、ある種の修飾は、asiRNAのエンドサイトーシスおよび安定性を改善した。このような細胞透過性asiRNA（cp-asiRNA）は、デリバリー試薬の非存在下で細胞内に送達可能である。
【００８０】
A549細胞において、cp-asiRNA候補（表2）をIL4RαmRNAおよびタンパク質の阻害についてスクリーニングした。cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMおよび3μMとして、デリバリー試薬なしでa549細胞と共にインキュベートし、IL4Rα発現レベルをqRT-PCRおよびウェスタンブロットにより測定した。
【００８１】
【表２】
2019503199.tif 000006
【００８２】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）および100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養しておいた。
【００８３】
表2に記載のcp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEM(Gibco)中でインキュベートした。cp-asiRNA候補の適正なストランドアニーリングは、紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により確認された。
【００８４】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、各時点で、cp-asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【００８５】
RNAiPlus(登録商標)(TaKaRa)を用いて、cp-asiRNA処理の48時間後に全RNAを抽出した後、抽出されたRNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。IL4Rαの増幅は、IL4RαTaqMan(登録商標)プローブ(Hs00166237_ml)を用いて検出した。18S TaqMan(登録商標)プローブ(h03928985_gl)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【００８６】
cp-asiRNA処理の72時間後に、ウエスタンブロットによりIL4Rαタンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100 mM Tris pH 8.0)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物15μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120 Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を、3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗IL4Rα抗体（Acris）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、IL4RαおよびGAPDHバンドを、ChemiDoc 装置(Bio-rad)を用いて画像化した。
【００８７】
3つのcp-asiRNA候補のIL4Rα阻害のレベルを図4および図5に示す。結果として、cp-asiRNA#5_21(2、4)およびcp-asiRNA#6_21(2、4)を、さらに検討するために選択した。
【００８８】
実施例５  cp-asiRNA構造のさらなる化学修飾
異なる鎖長を有する他のIL4Rαcp-asiRNA構造の候補を合成し、それがIL4Rα発現を阻害する能力を調べた（表3）。
【００８９】
【表３】
2019503199.tif 000007
【００９０】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）および100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養しておいた。
【００９１】
表3に記載のcp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEM(Gibco)中でインキュベートした。cp-asiRNA候補の適正なストランドアニーリングを、紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により確認した。
【００９２】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、各時点で、cp-asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【００９３】
RNAiPlus(登録商標)(TaKaRa)を用いて、cp-asiRNA処理の48時間後に全RNAを抽出した後、抽出されたRNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。IL4Rαの増幅は、IL4RαTaqMan(登録商標)プローブ(Hs00166237_ml)を用いて検出した。18S TaqMan(登録商標)プローブ(Hs03928985_gl)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【００９４】
cp-asiRNA処理の72時間後に、ウエスタンブロットによりIL4Rαタンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100 mM Tris pH 8.0)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物15μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120 Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗IL4Rα抗体（Acris）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、IL4RαおよびGAPDHバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
【００９５】
図6および図7に示すように、異なるアンチセンス鎖長(21または19ヌクレオチド)を有するcp-asiRNAは、同様のIL4RαのmRNAレベルの阻害を示した。
【００９６】
実施例６  TRPA1特異的な非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNAのスクリーニング
TRPA1を高効率で阻害する非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNA(asiRNA)を同定するために、102のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングされたasiRNAの核酸配列を表4に示す。
【００９７】
【表４】
2019503199.tif 000008
2019503199.tif 000009
2019503199.tif 000010
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【００９８】
表4に挙げたasiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、アニーリングバッファー(Bioneer Inc. Korea)中でインキュベートした。紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco)および100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で培養しておいた5x103個のA549細胞を96ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen Inc.)を用いて、A549細胞を0.1 nMのasiRNAでトランスフェクトした。
【００９９】
トランスフェクションの24時間後に、qRT-PCRによって、トランスフェクトされた細胞のTRPA1 mRNAレベルを測定した。具体的には、qPCR用のSuperPrep Cell Lysis & RT キット（TOYOBO）をメーカーの説明書にしたがって使用して、全RNAを抽出してcDNAを合成した。qRT-PCRは、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix (TOYOBO)をメーカーの説明書にしたがって使用して実行した。TRPA1の増幅は、TRPA1 TaqMan(登録商標)プローブ(Hs00175798_ml)を用いて検出した。18S TaqMan(登録商標)プローブ(Hs03928985_gl)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１００】
102のasiRNAのそれぞれによるTRPA1阻害のレベルを図9に示す。asiRNA配列のうち14個、asiRNA (#32)、asiRNA (#34)、asiRNA (#35)、asiRNA (#38)、asiRNA (#40)、asiRNA (#41)、asiRNA (#50)、asiRNA (#64)、asiRNA (#66)、asiRNA (#69)、asiRNA (#71)、asiRNA (#72)、asiRNA (#78)およびasiRNA (#81)を、追跡調査に使用するために選択した。
【０１０１】
実施例７  TRPA1標的化asiRNAによるTRPA1 mRNAおよびタンパク質発現の阻害
実施例6で選択されたasiRNA配列、asiRNA (#32)、asiRNA (#34)、asiRNA (#35)、asiRNA (#38)、asiRNA (#40)、asiRNA (#41)、asiRNA (#50)、asiRNA (#64)、asiRNA (#66)、asiRNA (#69)、asiRNA (#71)、asiRNA (#72)、asiRNA (#78)およびasiRNA (#81)がTRPA1 mRNAおよびタンパク質発現を阻害する能力を調べた。
【０１０２】
asiRNAを95℃にて5分間、37℃にて1時間、アニーリングバッファー(Bioneer Inc. Korea)中でインキュベートした。紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)および100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen Inc.)を用いて、A549細胞を1nM asiRNAでトランスフェクトした。
【０１０３】
asiRNAトランスフェクションの24時間後に、RNAiPlus（登録商標）（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがって、抽出RNAの500 ngをcDNA合成に使用した。TRPA1 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00175798_m1)を用いてTRPA1の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１０４】
asiRNAトランスフェクションの48時間後に、ウエスタンブロットによりTRPA1タンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100mM Tris pH8.0)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物の30μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を5%スキムミルク（Seoul Milk）および1% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗TRPA1抗体（Novus）および抗βアクチン抗体（Santa Cruz）を含有する5%スキムミルクおよび1% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、TRPA1およびβアクチンバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
【０１０５】
14のasiRNAのTRPA1阻害レベルを図10に示す。ウェスタンブロットの結果を図11に示す。asiRNA (#71)およびasiRNA (#81)を追跡調査に使用するために選択した。
【０１０６】
実施例８  セルフデリバリーのためのasiRNAの化学修飾
asiRNAに化学修飾を施し、修飾されたasiRNAの細胞デリバリーを、他のデリバリー試薬の非存在下で調べた。下記のように、ある種の修飾は、asiRNAのエンドサイトーシスおよび安定性を改善した。このような細胞透過性asiRNA（cp-asiRNA）は、デリバリー試薬の非存在下で細胞内に送達可能である。
【０１０７】
A549細胞において、cp-asiRNA候補（表5）を、TRPA1 mRNAおよびタンパク質の阻害についてスクリーニングした。cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMおよび3μMとして、デリバリー試薬なしでA549細胞と共にインキュベートし、TRPA1発現レベルをqRT-PCRおよびウェスタンブロットにより測定した。
【０１０８】
【表５】
2019503199.tif 000013
【０１０９】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養しておいた。
【０１１０】
表2に記載のcp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEM(Gibco)中でインキュベートした。cp-asiRNA候補の適正なストランドアニーリングを、紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により確認した。
【０１１１】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、各時点で、cp-asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１１２】
RNAiPlus(登録商標)(TaKaRa)を用いて、cp-asiRNA処理の48時間後に全RNAを抽出した後、抽出されたRNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。TRPA1の増幅は、TRPA1 TaqMan(登録商標)プローブ(Hs00175798_ml)を用いて検出した。18S TaqMan(登録商標)プローブ(h03928985_gl)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１１３】
asiRNAトランスフェクションの72時間後に、ウエスタンブロットによりTRPA1タンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100 mM Tris pH 8.0)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物30μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120 Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を5%スキムミルク（Seoul Milk）および1% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗TRPA1抗体（Novus）および抗βアクチン抗体（Santa Cruz）を含有する5%スキムミルクおよび1% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、TRPA1およびβアクチンバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
【０１１４】
6つのcp-asiRNA候補のTRPA1阻害のレベルを図12および図13に示す。cp-asiRNA #71_21(4, 4) およびcp-asiRNA #81_21(4, 4)を、さらに検討するために選択した。
【０１１５】
実施例９  cp-asiRNA構造のさらなる化学修飾
異なる鎖長、ならびに異なる数のホスホロチオエート結合および2’-O-メチル化修飾を有する、さまざまなTRPA1 cp-asiRNA構造の候補を合成し、それがTRPA1発現を阻害する能力を調べた（表6）。
【０１１６】
【表６】
2019503199.tif 000014
【０１１７】
表6に挙げたcp-asiRNA候補のそれぞれ1μMまたは3μMがA549細胞においてTRPA1 mRNAおよびタンパク質発現を阻害する能力を調べた。
【０１１８】
A549細胞(ATCC)は、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養しておいた。表3に記載のcp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEM(Gibco)中でインキュベートした。適正なストランドアニーリングは、紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により確認された。
【０１１９】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をDMEM(Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEM培地中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、その時点で、cp-asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１２０】
RNAiPlus(登録商標)(TaKaRa)を用いて、cp-asiRNAトランスフェクションの48時間後に全RNAを抽出した後、抽出されたRNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。TRPA1の増幅は、TRPA1 TaqMan(登録商標)プローブ(Hs00175798_ml)を用いて検出した。18S TaqMan(登録商標)プローブ(h03928985_gl)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１２１】
asiRNAトランスフェクションの72時間後に、ウエスタンブロットによりTRPA1タンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100 mM Tris pH 8.0)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物30μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120 Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を5%スキムミルク（Seoul Milk）および1% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗TRPA1抗体（Novus）および抗βアクチン抗体（Santa Cruz）を含有する5%スキムミルクおよび1% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、TRPA1およびβアクチンのバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
図14および図15に示すように、記載のTRPA1 cp-asiRNAは、類似したTRPA1 mRNAレベルの阻害を示した。
【０１２２】
実施例１０  TRPA1特異的cp-asiRNAによるTRPA1タンパク質発現の阻害
TRPA1タンパク質レベルの阻害に対するcp-asiRNAの有効性を調べた。
【０１２３】
cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMおよび3μMでA549細胞とともに、デリバリー試薬なしでインキュベートし、TRPA1タンパク質レベルをウェスタンブロットで測定した。
【０１２４】
A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)および100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)で培養しておいた。cp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEM(Gibco)中でインキュベートした。紫外線トランスイルミネーターを用いて、ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。
【０１２５】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をDMEM（Gibco)で洗浄してから、Opti-MEM培地中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、その時点で、cp-asiRNA含有Opti-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１２６】
asiRNAトランスフェクションの72時間後に、ウエスタンブロットによりTRPA1タンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞を1% SDS溶解バッファー(1% SDS、100 mM Tris pH 8.0)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物30μgを8% SDS-PAGEゲル上にロードし、120 Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を5%スキムミルク（Seoul Milk）および1% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗TRPA1抗体（Novus）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する5%スキムミルクおよび1% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに5%スキムミルク中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECL基質（Thermo scientific）で1分間処理した。次に、TRPA1およびGAPDHのバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
【０１２７】
ウェスタンブロットアッセイの結果を図16に示す。結果として、センス鎖上に3つのホスホロチオエート結合を有し、4つのホスホロチオエート結合および4つの2’-O-メチル化を有する19ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有する、TRPA1 cp-asiRNA #81（TRPA1 cp-asiRNA #81_PS3/19(4,4)）が、最高レベルのTRPA1阻害を示した。
【０１２８】
実施例１１  F2RL1を標的化する非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNAのスクリーニング
F2RL1を高効率で阻害する非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNA (asiRNA)を同定するために、100のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングされたasiRNAの核酸配列を表7に示す。
【０１２９】
【表７】
2019503199.tif 000015
2019503199.tif 000016
2019503199.tif 000017
2019503199.tif 000018
2019503199.tif 000019
【０１３０】
表7に挙げたasiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。ゲル電気泳動によって適正なストランドアニーリングを確認した。
【０１３１】
スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、5x103個のA549細胞を96ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen Inc.)を用いて、A549細胞を0.1 nMのasiRNAでトランスフェクトした。
【０１３２】
トランスフェクションの24時間後に、リアルタイムPCRによって、トランスフェクトされた細胞のF2RL1 mRNAレベルを測定した。具体的には、qPCR用のSuperPrep Cell Lysis & RT キット（TOYOBO）をメーカーの説明書にしたがって使用して、全RNAを抽出してcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix (TOYOBO)をメーカーの説明書にしたがって使用して行った。F2RL1 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00608346_m1)を用いてF2RL1の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１３３】
100のasiRNAのそれぞれによるF2RL1阻害のレベルを図18に示す。asiRNA配列のうち29個、asiF2RL1#1、#22、#25、#26、#28、#29、#31、#34、#35、#45、#50、#51、#55、#57、#59、#64、#65、#67、#69、#73、#76、#77、#81、#84、#86、#87、#88、#92および#100が、追跡調査に使用するために選択された。
【０１３４】
実施例１２  F2RL1標的化asiRNAによるF2RL1 mRNA発現の阻害
実施例12で選択された29のasiRNA、asiF2RL1#1、#22、#25、#26、#28、#29、#31、#34、#35、#45、#50、#51、#55、#57、#59、#64、#65、#67、#69、#73、#76、#77、#81、#84、#86、#87、#88、#92および#100がF2RL1発現を阻害する能力を調べた。
【０１３５】
asiRNAを95℃にて5分間、37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、A549細胞をasiRNAでトランスフェクトした。
【０１３６】
具体的には、RNAiPlus（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAのうち500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。F2RL1 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00608346_m1)を用いてF2RL1の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１３７】
29のasiRNAのF2RL1阻害のレベルを図19に示す。12のasiRNA; asiF2RL1 #1、#22、#29、#50、#64、#67、#76、#77、#87、#88、#92、および#100を、追跡調査に使用するために選択した。
【０１３８】
実施例１３  asiRNAの化学修飾
32のasiRNAに化学修飾を施した。下記のように、ある種の修飾は、asiRNAのエンドサイトーシスおよび安定性を改善した。
【０１３９】
32のasiRNA（表2）のF2RL1 mRNAの阻害を、A549細胞において調べた。
【０１４０】
【表８】
2019503199.tif 000020
2019503199.tif 000021
【０１４１】
表8に記載のasiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。適正なストランドアニーリングを、ゲル電気泳動により確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、A549細胞を0.3 nMのasiRNAでトランスフェクトした。
【０１４２】
トランスフェクションの24時間後に、リアルタイムPCRを用いて、トランスフェクトされた細胞のF2RL1 mRNAレベルを測定した。具体的には、RNAisoPlus（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。合成されたcDNAを希釈した後、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix (TOYOBO)をメーカーの説明書にしたがって使用して、リアルタイムPCRを行った。F2RL1 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00608346_m1)を用いてF2RL1の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１４３】
32のasiRNAのF2RL1阻害のレベルを図20に示す。
【０１４４】
実施例１４  F2RL1標的化asiRNAによるF2RL1 mRNA発現の阻害
実施例12で選択された12のasiRNA、asiF2RL1#1、#22、#29、#50、#64、#67、#76、#77、#87、#88、#92、および#100がF2RL1発現を阻害する能力を調べた。
【０１４５】
asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、A549細胞を1 nM asiRNAでトランスフェクトした。
【０１４６】
具体的には、RNAisoPlus（登録商標）（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。F2RL1 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00608346_m1)を用いてF2RL1の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【０１４７】
12のasiRNAのF2RL1阻害のレベルを図21に示す。
【０１４８】
実施例１５  F2RL1標的化asiRNAによるF2RL1タンパク質発現の阻害
F2RL1タンパク質の阻害に対するasiRNAの有効性を調べた。
【０１４９】
asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。
【０１５０】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(invitrogen)を用いて、A549細胞を１μMのasiRNAでトランスフェクトした。
【０１５１】
asiRNAトランスフェクションの72時間後に、ウエスタンブロットによりF2RL1タンパク質レベルを測定した。概略を述べると、トランスフェクトしたA549細胞をTX-100溶解バッファー(1% TX-100、150 mM NaCl、100mM Tris pH8.8)で溶解した。A549細胞の全タンパク質抽出物の10μgを10% SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗F2RL1抗体（Abcam）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに1x TBST中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECLで1分間処理した。次に、F2RL1およびGAPDHバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
ウェスタンブロットアッセイの結果を図22に示す。asiF2RL1#22、#50、#77、および#92を化学修飾のために選択した。
【０１５２】
実施例１６  セルフデリバリーのためのasiRNAの化学修飾
実施例15で選択された12のasiRNAに化学修飾を施し、修飾されたasiRNAの細胞デリバリーを、他のデリバリー試薬の非存在下で調べた。下記のように、ある種の修飾は、asiRNAのエンドサイトーシスおよび安定性を改善した。このような細胞透過性asiRNA（cp-asiRNA）は、デリバリー試薬の非存在下で細胞内に送達可能である。
【０１５３】
A549細胞においてF2RL1 mRNA阻害について、12のcp-asiRNA候補（表9）をスクリーニングした。cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMおよび3μMで、デリバリー試薬なしでA549細胞と共にインキュベートし、F2RL1 mRNAレベルをリアルタイムPCRにより測定した。
【０１５４】
【表９】
2019503199.tif 000022
【０１５５】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（Gibco）100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で培養しておいた。
【０１５６】
表9に記載のcp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEMバッファー(Gibco)中でインキュベートした。適正なストランドアニーリングを、ゲル電気泳動により確認した。
【０１５７】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で8時間および24時間培養し、各時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１５８】
asiRNA処理の48時間後、リアルタイムPCRによって、F2RL1 mRNA発現レベルを測定した。cp-asiRNAのF2RL1阻害レベルを図23に示す。
【０１５９】
実施例１７  F2RL1標的化cp-asiRNAによるF2RL1 mRNA発現の阻害
F2RL1 RNAの阻害に対するcp-asiRNAの有効性を調べた。
【０１６０】
cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMおよび3μMで、デリバリー試薬なしでA549細胞と共にインキュベートし、F2RL1 mRNAレベルをリアルタイムPCRにより測定した。
【０１６１】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（Gibco）、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で培養しておいた。
【０１６２】
cp-asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、OPTI-MEMバッファー(Gibco)中でインキュベートした。適正なストランドアニーリングを、ゲル電気泳動により確認した。
【０１６３】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Gibco）で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１６４】
asiRNA処理の48時間後に、リアルタイムPCRにより、F2RL1 mRNA発現レベルを測定した。RNAisoPlus（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。F2RL1 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs00608346_m1)を用いてF2RL1の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
cp-asiRNAによるF2RL1阻害レベルを図24に示す。
【０１６５】
実施例１８  F2RL1標的化cp-asiRNAによるF2RL1タンパク質の阻害
TRPA1タンパク質の阻害に対するcp-asiRNAの有効性を調べた。
【０１６６】
cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMおよび3μMとしてA549細胞とともに、デリバリー試薬なしでインキュベートし、F2RL1タンパク質レベルをウェスタンブロットで測定した。
【０１６７】
100 mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。
【０１６８】
cp-asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEMバッファー(Gibco)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。
【０１６９】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１７０】
asiRNAトランスフェクションの72時間後に、ウエスタンブロットによりF2RL1タンパク質発現のレベルを測定した。概略を述べると、処理されたA549細胞をTX-100溶解バッファー(1% TX-100、150 mM NaCl、100 mM Tris pH 8.8)で溶解した。全タンパク質抽出物の10μgを10% SDS-PAGEゲル上にロードし、120 Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗F2RL1抗体（Abcam）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに1x TBST中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECLで1分間処理した。次に、F2RL1およびGAPDHのバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
ウェスタンブロットアッセイの結果を図25に示す。
【０１７１】
実施例１９  追加のF2RL1標的化cp-asiRNAによるF2RL1 mRNA発現の阻害
異なる鎖長、ならびに異なる数の2’-O-メチル化修飾およびホスホロチオエート結合を有する、さまざまなcp-asiF2RL1#22および#50構造物の候補を合成し、それがF2RL1発現を阻害する能力を調べた（表10）。
【０１７２】
【表１０】
2019503199.tif 000023
表10に挙げたそれぞれのcp-asiRNA候補の1μMまたは3μMがA549細胞においてF2RL1 mRNAを阻害する能力を調べた。
【０１７３】
100 mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。
【０１７４】
表4に記載のcp-asiRNA候補を95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、Opti-MEMバッファー(Gibco)中でインキュベートした。適正なストランドアニーリングをゲル電気泳動により確認した。
【０１７５】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１７６】
asiRNA処理の48時間後にF2RL1 mRNA発現レベルを測定した。
【０１７７】
8のcp-asiRNAによるF2RL1阻害のレベルを図26に示す。
【０１７８】
実施例２０  追加のF2RL1標的化cp-asiRNAによるF2RL1タンパク質発現の阻害
F2RL1タンパク質の阻害に対するcp-asiRNAの有効性を調べた。
【０１７９】
cp-asiRNA候補をそれぞれ1μMまたは3μMとして、デリバリー試薬なしでA549細胞とともにインキュベートし、F2RL1タンパク質レベルをウェスタンブロットにより測定した。
【０１８０】
100mm細胞培養皿内で、A549細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で培養しておいた。
【０１８１】
cp-asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、OPTI-MEMバッファー（Gibco）中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。
【０１８２】
処理の1日前に、2.5x104個のA549細胞を24ウェルプレートに播種した。処理の直前に、A549細胞をダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)で洗浄してから、OPTI-MEMバッファー中、cp-asiRNA候補の存在下で24時間培養し、その時点で、asiRNA含有OPTI-MEM培地を血清含有培地で置き換えた。
【０１８３】
asiRNA処理の72時間後に、ウエスタンブロットによりF2RL1タンパク質発現レベルを測定した。概略を述べると、処理されたA549細胞をTX-100溶解バッファー(1% TX-100、150 mM NaCl、100mM Tris pH8.8)で溶解した。全タンパク質抽出物の10μgを10% SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、あらかじめメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗F2RL1抗体（Abcam）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに1x TBST中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECLで1分間処理した。次に、F2RL1およびGAPDHバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
【０１８４】
ウェスタンブロットアッセイの結果を図27に示す。
【０１８５】
実施例２１  in vivo有効性（効力）の検討
NC/Ngaマウスの背部を剃毛した後、アトピー性皮膚炎を誘発するために、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）虫体抽出物（Df）クリームを提示されたスケジュールで塗布した。11、14および18日目に、ビオスタ（登録商標）AD軟膏塗布の前に、cp-asiRNAを皮内注射により投与するか、またはクリーム乳化cp-asiRNAを塗布することによって投与した（図29）。皮内注射の用量は、1匹につき80μg/50μl * 4部位、クリーム乳化cp-asiRNAの用量は1匹当たり800μgとした。マウスの行動を記録し、480秒間のひっかき行動を分析した。コナヒョウヒダニ虫体抽出物（Df）クリーム処理サンプル（lXPBS+Df）では、ひっかき行動時間の増加が認められた。皮内注射(図30、パートA)およびクリーム乳化cp-asiRNA塗布(図30、パートB)条件のいずれにおいても、IL4RA#5-PS3/19(4,4)、TRPA1#81-PS3/19(4,4)、F2RL1#22-PS4/19(4,4)治療サンプルは、溶媒対照 (lXPBS+Df)と比較して、ひっかき行動時間の減少を示した。結果を、棒グラフ(平均±S.D)として図30に示す。スチューデントt検定法によって結果を統計分析した(n=5)。
【０１８６】
手で持てるサイズの水分蒸発量測定器（VapoMeter, Delfin Technologies Ltd, Kuopio, Finland）を用いて経表皮水分喪失量（TEWL）を測定した。コナヒョウヒダニ虫体抽出物（Df）クリーム処理サンプル（1xPBS +Df）において、TEWLの増加が観察された。皮内注射(図31、パートA)およびクリーム乳化cp-asiRNA塗布(図31、パートB)条件のいずれにおいても、IL4RA#5-PS3/19(4,4)、TRPA1#81-PS3/19(4,4)、F2RL1#22-PS4/19(4,4)治療サンプルは、溶媒対照 (lXPBS+Df)と比較して、TEWLの減少を示した。データは、平均±S.E.Mとして表される。スチューデントt検定法によって結果を統計分析した(n=5)。
【０１８７】
処理された皮膚部位の組織学的分析を行った。上のパネルは、皮膚切片のH&E染色を示し、下のパネルは皮膚切片画像の分析によって数値化された表皮面積を示す。コナヒョウヒダニ虫体抽出物（Df）クリーム処理サンプル（+Df）において、表皮部位の厚さの増加、角質増殖、および表皮肥厚が認められた。皮内注射(図32、パートA)およびクリーム乳化cp-asiRNA塗布(図32、パートB)条件のいずれにおいても、IL4RA#5-PS3/19(4,4)、TRPA1#81-PS3/19(4,4)、F2RL1#22-PS4/19(4,4)で治療されたサンプルは、溶媒対照 (+Df)と比較して、Df処理によって引き起こされる症状の軽減を示した。皮内注射(図32、パートA)およびクリーム乳化cp-asiRNA塗布(図32、パートB)条件のいずれにおいても、IL4RA#5-PS3/19(4,4)、TRPA1#81-PS3/19(4,4)、F2RL1#22-PS4/19(4,4)で治療されたサンプルは、溶媒対照 (lXPBS+Df)と比較して、表皮の厚さのレベルの減少を示した。データは、平均±S.E.Mとして表される。スチューデントt検定法によって結果を統計分析した(n=5)。
【０１８８】
処理された皮膚部位のマスト細胞浸潤の分析を行った。図33は、皮膚切片のトルイジンブルー染色、および染色された皮膚片画像の数値化の結果を示す。コナヒョウヒダニ虫体抽出物（Df）クリーム処理サンプル（+Df）において、マスト細胞浸潤の増加が認められた。皮内注射(図33、パートA)およびクリーム乳化cp-asiRNA塗布(図33、パートB)条件のいずれにおいても、IL4RA#5-PS3/19(4,4)、TRPA1#81-PS3/19(4,4)、F2RL1#22-PS4/19(4,4)で治療されたサンプルは、溶媒対照 (+Df)と比較して、マスト細胞浸潤の減少を示した。皮内注射およびクリーム乳化cp-asiRNA塗布条件のいずれにおいても、IL4RA#5-PS3/19(4,4)、TRPA1#81-PS3/19(4,4)、F2RL1#22-PS4/19(4,4)で治療されたサンプルは、溶媒対照 (1xPBS +Df)と比較して、マスト細胞浸潤領域のレベルの減少を示した。データは、平均±S.E.Mとして表される。スチューデントt検定法によって結果を統計分析した(n=5)。
【０１８９】
文献の援用
本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許および特許出願を、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、それらの全体を参照により本明細書に組み入れる。矛盾する場合には、本明細書における定義を含め本出願が優先する。
【０１９０】
均等物
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識し、または通常の実験のみを行ってそれらを確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019503199.tif 000065
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