(57)【要約】少なくともトリクロロエタノールおよび／またはその誘導体を含み、屈折率が約１．３８１０以上である、顕微鏡検査用の透明化剤および封入液が開示されている。また、顕微鏡検査用の標本を調製する方法についても開示されている。
2019536005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５％〜９７％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；
１６．５％〜３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに
１２．５％〜５０％  グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、および／またはそれらの誘導体；ならびに任意に水
を含む、透明化剤および封入液。
【請求項２】
３６％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；
３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および
２７％（ｖ／ｖ）  グリセロール
を含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項３】
３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；
３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および
３３％（ｖ／ｖ）  グリセロール
を含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項４】
３３％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；
３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および
１７％（ｖ／ｖ）  グリセロール；
を含み、ならびに以下：
１７％（ｖ／ｖ）安息香酸ベンジル
をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項５】
２９％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；
２９％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および
１７％（ｖ／ｖ）  グリセロール；
を含み、ならびに以下：
１３％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジル；および
１３％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル
をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項６】
４２％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；
１６．５％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および
１６．５％（ｖ／ｖ）  グリセロール；
を含み、ならびに以下：
２５％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル
をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項７】
３６％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；
３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに
２７％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはそれらの誘導体
を含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項８】
３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；
３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに
３３％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはそれらの誘導体
を含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項９】
３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；
３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに
１７％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはその誘導体；
を含み、ならびに以下：
１７％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジル
をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１０】
２９％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；
２９％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに
１７％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはその誘導体；
を含み、ならびに以下：
１３％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジル；および
１３％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル
をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１１】
４２％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；
１６．５％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに
１６．５％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはその誘導体；
を含み、ならびに以下：
２５％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル
をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１２】
前記トリクロロエタノール誘導体が、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、この際、分岐が、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル（carbamyl）、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそれらのポリマーを含有する、任意のモノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１３】
Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１４】
ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む、請求項１に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１５】
５％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および
５％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール
を含む、透明化剤および封入液。
【請求項１６】
５％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および
５％〜９０％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジル
を含む、透明化剤および封入液。
【請求項１７】
５％〜９０％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；および
５％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル
を含む、透明化剤および封入液。
【請求項１８】
３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；および
３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル；
を含み、ならびに以下：
３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール
をさらに含む、請求項１７に記載の透明化剤および封入液。
【請求項１９】
前記トリクロロエタノール誘導体が、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、この際、分岐が、ヒドロキシル；アミノエーテル；カルボキシル；カルボキシアミド；カーボネート；カルバミル（carbamyl）；カルボニルクロリド；ポリエチレングリコール；またはアミノエタノール基；およびそれらのポリマーを含有する、モノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される、請求項１７に記載の透明化剤および封入液。
【請求項２０】
ＰＥＧ、ＥＧ、ＰＧ、および／またはその誘導体をさらに含む、請求項１７に記載の透明化剤および封入液。
【請求項２１】
Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む、請求項１７に記載の透明化剤および封入液。
【請求項２２】
ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む、請求項１７に記載の透明化剤および封入液。
【請求項２３】
顕微鏡検査用の標本を調製する方法であって、染色剤（stain）または染料（dye）を前記標本に塗布し、前記染色剤を塗布された（stained）または染料を塗布された（dyed）標本を透明化液中でインキュベートすること；前記透明化された、染色剤を塗布された（stained）または染料を塗布された（dyed）標本を顕微鏡スライド、キュベット、またはウェルにつけることを有する、方法。
【請求項２４】
前記スライド、キュベット、またはウェル上の前記標本をカバーガラスで覆う工程をさらに有する、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年９月２７日に出願された米国特許出願第１５／２７７，１１８号の優先権を主張するものであり、これは、２０１６年９月２７日に出願された米国特許出願第１５／２５８，４７４号の一部継続であり、および２０１４年１０月７日に出願された米国特許出願第１４／３９１，１０６号の一部継続である；米国特許出願第１５／２５８，４７４号は、２０１４年１０月７日に出願された米国特許出願第１４／３９１，１０６号の一部継続であり、これは２０１３年４月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３５７６１の３７１国際段階であり、これは２０１２年４月１０日に出願された米国特許出願第６１／６２２，２１０号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（本発明の技術分野）
本出願は顕微鏡検査に関し、より詳細には、顕微鏡検査用の透明化剤（clearing agent）および封入媒体（mounting media）に関する。
【背景技術】
【０００３】
材料の同定にはさまざまな方法がある。とりわけ、巨視的（macroscopic）、化学的および微視的（microscopic）同定を含む。微視的同定は、顕微鏡を使用して、生物、生物の一部、細胞または細胞内器官、ならびに鉱物または他の非生物材料の特徴を同定する技術である。顕微鏡検査の重要性は、特定の特徴または診断構造に焦点を当てることによって、生物間またはこれらの部分の違いを明確に識別できることにある。顕微鏡検査は、スライドの下の材料を視覚化するために、任意に染色剤と組み合わせて使用される透明化剤および封入液としての信頼でき、容易に入手可能な試薬に依存する。
【０００４】
生物由来の標本の一般的な顕微鏡検査の手順は、分析される組織の小さなサンプルを溶媒溶液中に封入し、それを顕微鏡下で観察することを含む。多くの場合、細胞内容物は組織を覆い隠し、特徴的な機能を特定することを困難にする。標本内の屈折率の差は、より深い視覚平面の視覚化を妨げ、観察から細部を隠す。これらの場合、標本の透明度を向上させるために透明化液を塗布することで、慎重な選択または再封入の必要なく標本の複数の垂直層を視覚化することができる。この透明度の向上および明瞭度の向上により、顕微鏡ユーザーはサンプル内の垂直面の全範囲にわたって視覚化することができ、ユーザーは焦点を調整することによって興味のある焦点面を選択することができる。
【０００５】
顕微鏡検査用にほぼ普遍的に使用されている透明化剤は、酸性化抱水クロラール（chloral hydrate）グリセロール溶液（塩酸で酸性化された抱水クロラール溶液）であり、ハートウィック溶液としても知られる。酸性化抱水クロラール溶液は、植物の顕微鏡検査、菌学、昆虫学、組織学、鉱物学、食品科学、品質管理、法医学、線虫学、考古学、古生物学、ウイルス学、免疫学、限定はされないが微分干渉コントラスト顕微鏡、電子顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡などの顕微鏡検査、ならびに他の関連する顕微鏡検査および光学の用途に使用される。抱水クロラールを植物試料に塗布すると、細胞内容物および細胞間物質が溶解するため、細胞壁および細胞の形状を容易に観察することができる。その結果、抱水クロラールは、ハーブ製品の品質評価に重点を置いた多くの研究所の業界標準となっている。
【０００６】
残念なことに、酸性化抱水クロラール溶液の主要成分である抱水クロラールは、米国法の下では麻薬性催眠薬とみなされており、それ自体がＤＥＡ（Drug Enforcement Administration）指定物質であり、購入および／または所有するにはＤＥＡの承認および順守を必要とする。これにより科学者がこの試薬を購入できないようにしている。さらに、ＤＥＡ順守の維持は、費用がかかり、面倒であり、時間がかかるプロセスである。
【０００７】
したがって、顕微鏡検査用透明化剤および封入剤として、費用効果が高く、容易に入手可能であり、規制されていない、酸性化抱水クロラール溶液の代替品が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
他の添加剤の有無にかかわらず、トリクロロエタノールまたはその誘導体もしくは類似体の水溶液が、顕微鏡検査用の透明化および封入媒体としての酸性化抱水クロラール溶液を効果的に置き換えることができることが、今発見された。
【０００９】
この発見は、本開示を開発するために利用されてきた。本開示は、一態様では、１０％〜９７％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体を含む透明化剤および封入液である。いくつかの実施形態では、封入液および透明化剤は、１６．５％〜３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール、１２．５％〜５０％  グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）および／またはその誘導体、ならびに任意に水をさらに含む。
【００１０】
さらに別の態様では、透明化剤および封入液は、５％〜９７％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体、１６．５％〜３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１２．５％〜５０％  グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、および／またはそれらの誘導体；ならびに任意に水をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、透明化剤および封入液は、３６％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体、３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および２７％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および３３％（ｖ／ｖ）  グリセロールを含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、３３％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１７％（ｖ／ｖ）  グリセロール；および１７％（ｖ／ｖ）安息香酸ベンジルを含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、２９％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；２９％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１７％（ｖ／ｖ）  グリセロール；１３％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジル；および１３％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテルを含む。
【００１２】
ある実施形態では、透明化剤および封入液は、４２％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；１６．５％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１６．５％（ｖ／ｖ）  グリセロール；および２５％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテルを含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、３６％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；３６％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに２７％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはそれらの誘導体を含む。さらに別の実施形態では、透明化剤および封入液は、３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；ならびに３３％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはそれらの誘導体を含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１７％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはその誘導体；ならびに１７％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、透明化剤および封入液は、２９％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；２９％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１７％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはその誘導体；１３％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジル；ならびに１３％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテルを含む。ある実施形態では、透明化剤および封入液は、４２％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；１６．５％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；１６．５％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ、ＰＧ、ＥＧ、および／またはその誘導体；ならびに２５％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテルを含む。他の実施形態では、トリクロロエタノール誘導体は、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびこれらのポリマーを含有する、任意のモノハロゲン化もしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む。
【００１４】
別の態様では、本開示は、５％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および５％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコールを含む透明化剤および封入液を提供する。いくつかの実施形態では、透明化剤および封入液は、１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコールを含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ＰＥＧ、ＥＧ、ＰＧ、および／またはそれらの誘導体をさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む。ある実施形態では、トリクロロエタノール誘導体は、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびこれらのポリマーを含む、モノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖である。
【００１５】
さらに別の態様では、本開示は、５％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および５％〜９０％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む透明化剤および封入液を提供する。いくつかの実施形態では、透明化剤および封入液は、１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ＰＥＧ、ＥＧ、ＰＧ、および／またはそれらの誘導体をさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む。ある実施形態では、トリクロロエタノール誘導体は、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそれらのポリマーを含む、モノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖である。
【００１６】
さらに別の態様では、本開示は、５％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；５％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および５％〜９０％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む透明化剤および封入液を提供する。いくつかの実施形態では、透明化剤および封入液は、１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および１０％〜９０％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、２５％〜５０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；２５％〜５０％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および３３％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、３３％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および３３％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルを含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ＰＥＧ、ＥＧ、ＰＧ、および／またはそれらの誘導体を含む。ある実施形態では、透明化剤および封入液は、Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む。いくつかの実施形態では、透明化剤および封入液は、ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む。他の実施形態では、トリクロロエタノール誘導体は、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそれらのポリマーを含む、モノハロゲン化もしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖である。
【００１７】
別の態様において、本開示は、５％〜９０％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；および５％〜９０％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテルを含む透明化剤および封入液を提供する。いくつかの実施形態では、透明化剤および封入液は、２５％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；および２５％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテルを含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、５０％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；および５０％（ｖ／ｖ）ベンジルエーテルを含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、２５％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール；および２５％（ｖ／ｖ）  安息香酸ベンジルをさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、３３％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールまたはその誘導体；３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルエーテル；および３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコールを含む。ある実施形態では、透明化剤および封入液は、ＰＥＧ、ＥＧ、ＰＧ、および／またはそれらの誘導体をさらに含む。他の実施形態では、透明化剤および封入液は、Ｃ１〜Ｃ６アルコールをさらに含む。さらに他の実施形態では、透明化剤および封入液は、ポリエチレングリコール、ポリアミド樹脂、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物を含む固化助剤をさらに含む。さらに他の実施形態において、トリクロロエタノール誘導体は、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含み、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそれらのポリマーを含む、モノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖である。
【００１８】
別の態様では、本開示は、顕微鏡検査用の標本の調製方法を提供し、当該方法は、標本を十分量の本開示に係る透明化液に少なくとも約１分〜約１２ヶ月間浸漬して、透明化された標本を提供すること；前記透明化された標本を、観察のために顕微鏡スライド、キュベット、またはウェルにつけること；および必要に応じて、カバーガラスを当てることを有する。
【００１９】
さらに別の態様では、標本を浸漬した後、透明化された標本を固化する樹脂に塗布し、次いで試験または無期限保管のために固体にキャストする。
【００２０】
別の態様では、標本を浸漬した後、５％〜２０％  ポリビニルピロリドンメタノール溶液を透明化された標本に塗布し、これを任意に硬化するまで５０℃〜９０℃で乾燥させる。
【００２１】
さらに別の態様では、標本を浸漬した後、染色剤または染料を透明化された標本に塗布して、透明化された染色標本が提供され、それによって標本の特徴が選択的に強調される。透明化され、染色された標本は、観察のために顕微鏡検査スライド、キュベット、またはウェルにつけられ、および必要に応じて、カバーガラスで覆われる。染色剤または染料は、蛍光および／または落射蛍光および／または共焦点顕微鏡を使用して可視化することができるよう、蛍光染色剤または染料であってもよい。
【００２２】
別の態様は、標本をキュベットにつけること；ならびに十分量の本開示に係る透明化剤および封入液を添加して、前記標本を封入することを有する、分光光度分析のための標本を調製する方法に関する。
【００２３】
別の態様では、本開示は、十分量の本開示に係る透明化剤および封入液に標本を少なくとも約１分〜約１２ヶ月間浸漬し、透明化された標本を提供すること；透明化された標本を、観察のために顕微鏡スライド、キュベット、またはウェルに塗布すること；ならびに必要に応じて、カバーガラスを当てることを有する、顕微鏡検査用の標本の調製方法を提供する。
【００２４】
あるいは、別の態様では、本開示に係る透明化剤に標本を浸漬した後、透明化された標本を固化する樹脂に塗布し、次いで試験または無期限保管のために固体にキャストする。
【００２５】
さらに別の態様では、本開示に係る透明化剤に標本を浸漬した後、５％〜２０％のポリビニルピロリドンメタノール溶液を透明化された標本に塗布し、任意にこれを硬化するまで５０℃〜９０℃で乾燥させる。
【００２６】
さらに別の態様では、本開示に係る透明化剤および封入液に標本を浸漬した後、透明化された標本に染色剤または染料を塗布して、透明化された染色標本を提供し、それによって標本の特徴が選択的に強調される。透明化され、染色された標本は、観察のために顕微鏡スライド、キュベット、またはウェルにつけられ、および必要に応じてカバーガラスで覆われる。染色剤または染料は、蛍光および／または落射蛍光および／または共焦点顕微鏡を使用して可視化することができるよう、蛍光染色剤または染料であってもよい。
【００２７】
本出願の別の態様は、標本をキュベットにつけること；十分量の本開示に係る透明化剤および封入液を前記標本に塗布することを有する、分光光度分析用の標本の調製方法に関する。
【００２８】
また、本開示は、標本を透明化剤および封入液に浸漬する前に、標本に染色剤または染料を塗布して染色標本を提供し、これにより標本の特徴を選択的に強調する、分光光度分析のための標本の調製方法を提供する。次いで、染色された標本を本開示に係る透明化液に少なくとも約１分〜約１２ヶ月間浸漬して、透明化された染色標本を得る。透明化され、染色された標本は、観察のために顕微鏡スライド、キュベット、またはウェルにつけられ、および必要に応じて、カバーガラスで覆われる。染色剤または染料は、蛍光および／または落射蛍光および／または共焦点顕微鏡を使用して可視化することができるよう、蛍光染色剤または染料であってもよい。
【００２９】
さらに別の態様では、本開示は、標本から顔料、染料、染色剤、または色を除去するための、本開示に係る透明化剤および封入液の使用に関する。
【００３０】
本出願のさらなる態様は、過剰な染色剤または染料を除去し、ならびに標本内の特定の構造および／または有機体のコントラストを高めるための、本開示に係る透明化剤および封入液の使用に関する。
【００３１】
本出願の別の態様は、標本の透明度を高め、標本を切断する、再封入する、またはさらに修飾する必要なく複数の垂直面を視覚化することを可能にするための、透明化剤および封入液の使用に関する。
【００３２】
本開示のまた別の態様は、顕微鏡的分析および／または視覚的分析のために標本を同時に脱水し、脱色し、および透明化するための、透明化剤および封入液の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本開示の上記および他の目的、その様々な特徴は本発明自体同様、添付の図面と併せて読むと、以下の説明からより完全に理解されるであろう。
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ショウガ（ginger）、ショウガ（Zingiber officinale Roscoe）（ショウガ科）の特徴的な環紋導管要素および線維の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ショウガ（ginger）、ショウガ（Zingiber officinale Roscoe）（ショウガ科）の豊富なデンプン粒の顕微鏡写真の表示である。実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ショウガ（Zingiber officinale Roscoe）（ショウガ科）  ショウガ表皮および柔組織細胞の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、マテ（Mate）（葉）、イェルバ・マテ（Ilex paraguariensis）（モチノキ科）  葉脈上表皮の断片の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、マテ（葉）、イェルバ・マテ（Ilex paraguariensis）（モチノキ科）  柵状細胞の下にある表皮上層の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、マテ（葉）、イェルバ・マテ（Ilex paraguariensis）（モチノキ科）  繊維周縁部の断片または群の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、マテ（葉）、イェルバ・マテ（Ilex paraguariensis）（モチノキ科）  特徴的な不規則型気孔を示す表皮下層の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ベニバナ（花）、ベニバナ（Carthamus tinctrius L）（キク科）  ３つの胚芽孔を有する円形または楕円形の花粉粒、外膜（花粉粒の最も外側の細胞壁）歯状のとげの顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ベニバナ（花）、ベニバナ（Carthamus tinctrius L）（キク科）の導管要素の隣の赤褐色の分泌物を有する乳管（laticiferous ducts）（ラテックス流体を含む管状細胞）の顕微鏡写真の表示である；実施例１の溶液に対する酸性化抱水クロラール溶液の比較。
【図１０】図１０は、本出願の透明化剤および封入液の調製に有用な２，２，２−トリクロロエタノールの類似体の化学構造の概略図である。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｈは、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、新鮮な全体封入標本を示す顕微鏡写真の表示である。Ａ〜Ｂ：バジルの葉；Ｃ〜Ｆ：オレガノの葉；Ｇ〜Ｈ：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の根。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｈは、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、新鮮な全体封入標本を示す顕微鏡写真の表示である。Ａ〜Ｂ：バジルの葉；Ｃ〜Ｆ：オレガノの葉；Ｇ〜Ｈ：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の根。
【図１２】図１２は、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、主軸を外れて形成している二次分岐を示す紅藻類Polysiphonia sp配偶体の顕微鏡写真の表示である。
【図１３】図１３は、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、内部構造を示す自由生活性線虫Panagrellus redivivus（動物界）の前端の顕微鏡写真の図である。
【図１４】図１４は、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、内部構造を示す小型水生甲殻類ミジンコ（Daphnia sp）（動物界）の前端の顕微鏡写真の表示である。
【図１５】図１５は、実施例１の透明化剤および封入液を用いて透明化された、特徴的なキイロショウジョウバエ（動物界）の複眼の顕微鏡写真の表示である。
【図１６】図１６は、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、複眼、触覚および口の部分を示すキイロショウジョウバエ（動物界）の頭部の背面図の顕微鏡写真の表示である。
【図１７】図１７は、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、末端に分生子鎖（無性胞子）を有する真菌ペニシリウム属の分生子柄の顕微鏡写真の表示である。
【図１８】図１８は、ヨウ素溶液および硫酸で染色され、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、バジルべと病（Peronospora belbahrii）の顕微鏡写真の表示である。
【図１９】図１９は、フクシンで染色され、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、回虫Panagrellus redivivus（動物界）の顕微鏡写真の表示である。
【図２０】図２０は、ヨウ素溶液で染色され、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、ショウガ（Zingiber officinale）の特徴的なデンプン粒の顕微鏡写真の表示である。
【図２１】図２１は、フロログルシノール／ ＨＣｌ溶液で染色され、実施例１の透明化剤および封入液で透明化された、アフリカプルーン（Prunus africana）の特徴的な木質化繊維の顕微鏡写真の表示である。
【図２２】図２２は、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ（登録商標）５１５／５３５黄色蛍光ニッスル染色で標識されたマウス脳薄片の顕微鏡写真の表示である。および
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、（ａ）ＴＯ−ＰＲＯ−３で標識されたヒト胎盤組織；（ｂ）抗Ｋｉ６７抗体で標識され、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体で検出された胎盤組織；および（ｃ）両方で標識されたヒト胎盤組織の顕微鏡写真の表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本出願を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物が参照されている。これらの特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明細書に記載および特許請求されている発明の日付において当業者に知られている最新技術をより完全に説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、特許、特許出願、および刊行物と本開示との間に何らかの矛盾がある場合に支配するであろう。
【００３５】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集約する。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の基または用語について与えられた最初の定義は、特にことわりが無い限り、本明細書を通して個々にまたは別の基の一部としてその基または用語に適用される。
【００３６】
本開示の目的のために、用語「染色剤(stain)」または「染色（staining）」は、これに限定されないが、着色または蛍光染料と組織の選択された部分との間の化学的相互作用を含む；蛍光分子または着色分子に化学的に結合した抗体、アプタマー、アフィボディ、タンパク質、ペプチド、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、多糖、グルコサミン、デキストラン、レクチン、またはリガンドを、組織に相互作用および結合させることを可能にする、任意の方法；（これに限定されないが、ビオチンなどの）結合部位リガンドに化学的に結合した抗体、アプタマー、アフィボディ、タンパク質、ペプチド、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、多糖、グルコサミン、デキストラン、レクチン、またはリガンドを、組織と相互作用および結合させることを可能にし、次いで、（これに限定されないが、ストレプトアビジンなどの）結合リガンドと高い親和性で結合する着色または蛍光分子に結合したタンパク質で処理する、任意の方法；反応性酵素に化学的に結合した抗体、アプタマー、アフィボディ、タンパク質、ペプチド、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、多糖、グルコサミン、デキストラン、レクチン、またはリガンドを、組織と相互作用および結合させることを可能にし、次いで、着色または蛍光分子に結合した反応性酵素の基質で処理することで当該組織が光学的に活性になる、任意の方法；（これに限定されないが、１−エチニルなどの）反応性分子部分に化学的に結合した抗体、アプタマー、アフィボディ、タンパク質、ペプチド、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、多糖、グルコサミン、デキストラン、レクチン、またはリガンドを、組織と相互作用および結合させることを可能にし、（これに限定されないが、アジドなどの）結合と反応しうる分子部分に結合した着色または蛍光分子で処理して共有結合を形成することで当該組織が光学的に活性になる、任意の方法；一本鎖またはＤＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ誘導体に化学的に結合した抗体、アプタマー、アフィボディ、タンパク質、ペプチド、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、多糖、グルコサミン、デキストラン、レクチン、またはリガンドを、組織と相互作用および結合することを可能にし、次いで、着色または蛍光分子と結合したアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ誘導体で処理することで当該組織を光学的に活性になる、任意の方法。
【００３７】
トリクロロエタノールおよび／またはその誘導体もしくは類似体ならびにある他の添加剤を有する水溶液が、生体および非生体の両方の顕微鏡検査のための透明化剤および封入媒体として、酸性化抱水クロラール溶液を効果的に置き換えることができることが、今発見された。これらの溶液は、顕微鏡検査における新規な用途のための適切な屈折率の非抱水クロラール透明化および封入化合物として使用することができる。市販の普遍的に使用される透明化剤（酸性化抱水クロラール）へのアクセスの現在の不足および制限の下、本開示は消費者および一般市民に現在使用されている透明化剤を置き換えることができる方法を提供し、かつ規制化合物の抱水クロラールを購入できなくなった者がアクセスできる方法を提供する。すなわち、科学者および製造業者の両方が顕微鏡検査および他の光学用途において抱水クロラールの代替品を見つけようとしていることから、本開示の透明化試薬および方法は即時の商業的価値および重大な影響を有する。本開示の透明化試薬および方法は、それらが多くの染色剤と共に、半永久的および恒久的な封入のために使用され得るので、即座の商業的価値および重大な影響を有する。
【００３８】
本開示は、酸性化抱水クロラールグリセロール溶液の代替品を提供する。ここで、溶液成分（例えばトリクロロエタノール）は安価であり、入手が容易であり、所有および使用するためにＤＥＡ免許を必要とせず、以前は抱水クロラールの使用に依存していた操作において関連するリスクを大幅に低減する。本開示に係る溶液は、高い屈折率（約１．３８１０以上；約１．３８１０〜約１．４８８０、または約１．４３１５〜約１．４８８０）を有する。例えば、溶液は酸性化抱水クロラール溶液（１．４２８０）より高くてもよく、これにより顕微鏡下で、より明瞭で、同等またはより高品質の観察が得られる。高屈折率の材料はより透明であるため、顕微鏡検査において対物をはっきりと見るために高屈折率が必要とされる。参考として、ホウケイ酸（パイレックス）ガラスの屈折率は１．４７０である。より多くの例では、本開示の透明化剤および封入液は、ガラスの屈折率よりも高い屈折率を有する。トリクロロエタノール、またはその誘導体もしくは類似体が、抱水クロラールの代替品として上記の基準を見事に満たすことが発見された。
【００３９】
本開示の透明化剤および封入液の使用は、細胞材料のクラスターを浸軟および消化するのを助け、かつ顕微鏡スライド中の興味のある組織、鉱物、要素を明確化させ、透明性を高めるのを助ける。この溶液は有効な浸漬媒体であり、かつあらゆる種類の封入剤調製物においておよび有効な脱水剤として有用である。また、透明化化合物および／またはその誘導体は、半永久的または恒久的な封入として使用することもでき、数日後または数ヶ月後であっても標本を視覚化することを可能にする。また、この透明化化合物および／またはその誘導体は、多くの染色剤とともに使用することができ、これにより標本および標本内の成分をさらに視覚化することが可能になる。
【００４０】
１．透明化剤および封入液
本開示は、顕微鏡検査用途にこれまで使用されたことがない化合物およびそれらの組み合わせの特定を包含する。代表的な一例では、本開示の透明化剤および封入液は、顕微鏡検査／光学用途のための透明化および／または封入媒体を目的として混合された、任意の濃度の２，２，２−トリクロロエタノール、もしくはその誘導体もしくは類似体、および／または２，２，２−トリクロロ酢酸、もしくはその誘導体もしくは類似体の水および／またはグリセロールおよび／またはアルコール溶液を含む。
【００４１】
あるいは、透明化剤および封入液は、ＴＣＥおよび／またはその誘導体に加えて、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、および／またはベンジルエーテルを含みんでもよい。さらに、上記の透明化剤および封入液は、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および／もしくはプロピレングリコール（ＰＧ）、ならびに／またはその誘導体、例えば、これらに限定されないが、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、２（２−エトキシエトキシ）エタノール、ビス（２−メトキシエチル）エーテル、２（２−ブトキシエトキシ）エタノール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、および／またはＰＥＧ６００などのグリコールエーテル、アルキルジオール、アルキルトリオール、アルキルポリオール、ならびに他のポリ−アルコキシ−ヒドロキシエーテルを含んでもよい。
【００４２】
本開示の目的のために、「誘導体（derivative）」という用語は、サブ構造として親構造を依然として保持し、親（例えば、トリクロロエタノールまたはトリクロロ酢酸）から化学的に誘導されうる化合物を包含する。例えば、親として２，２，２−トリクロロエタノールを用いると、対応するアセテート（１−アセトキシ−２，２，２−トリクロロエタン、あるいは２，２，２−トリクロロエチルアセテートと名付けられる）またはメチルエーテル（１−メトキシ−２，２，２−トリクロロエタン）誘導体に見られるように、誘導体は２，２，２−トリクロロエトキシサブ構造を保持するであろう。
【００４３】
また本開示の目的のために、用語「類似体（analog）」は、医薬化学分野で一般に知られているように、親のコア構造が変化しているか、またはさらに置換されている化合物を包含する。たとえば、変更には、原子または基を他の原子または基（等量式（isostere））で置き換えることが含まれる。２，２，２−トリクロロエタノールの類似体の非限定的な例を図１０に示す。
【００４４】
本開示の透明化剤および封入液は、トリクロロエタノールおよび／またはその類似体もしくは誘導体を含む。また、それは、トリクロロエタノールおよび／またはその誘導体もしくは類似体、ならびにトリクロロ酢酸および／または誘導体もしくは類似体の両方を含み得る。例えば、透明化剤および封入液は、約５％〜約９７％（ｖ／ｖ）  トリクロロエタノールまたはその誘導体；０％〜約５０％（ｖ／ｖ）  トリクロロ酢酸；０％〜約５０％（ｖ／ｖ）  グリセロール；および任意に、水を含み、前記透明化剤および封入液の屈折率は、約１．３８１０以上、または約１．３８１０〜約１．４８８０、または約１．４３１５〜約１．４８８０である。透明化剤および封入液は、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、塩酸などの他の酸、および／または標本の種々の成分を視覚化するための染料もしくは染色剤をさらに含有することができる。一態様では、トリクロロエタノールは、約３４．５％〜約９７％で存在する。別の非限定的な例では、トリクロロ酢酸は、０％〜約５％で存在する。例えば、グリセロールは、約０％〜約１２．５％で存在し得る。グリセロールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび／もしくはそれらの誘導体からなる群より選択される１種以上の化合物で補足され、または完全に置き換えられてもよい。
【００４５】
他の例では、透明化剤および封入液は、約３４．５％〜約９７％  トリクロロエタノール、０％〜約５％  トリクロロ酢酸、および０％〜約１２．５％  グリセロール、または約５６．２５％（ｖ／ｖ）のトリクロロ酢酸、約１．２５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、約１２．５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、約２５％のメタノール、および約５％（ｖ／ｖ）の水を含む。
【００４６】
本開示の透明化剤および封入液のさらなる例は、トリクロロエタノールおよび／またはその誘導体なしで、トリクロロ酢酸および／またはその誘導体を含む。透明化剤および封入液の一例は、トリクロロエタノールおよびトリクロロ酢酸のグリセリン水溶液（aqueous glycerol solution）からなる（実施例１）。トリクロロ酢酸は、塩酸および／もしくは硫酸で補足され、または完全に置き換えられてもよい。透明化剤および封入液の一例は、トリクロロエタノールおよび塩酸のグリセリン水溶液からなる。また、図１０の２，２，２−トリクロロエタノール類似体、２−クロロアセトアルデヒドジメチルアセタールは、効果的な透明化剤として機能する。透明化剤および封入液は、緩衝剤の濃度および／もしくは液のｐＨもしくは塩濃度を変えるための酸性／塩基性添加剤を添加／調整することによって生成された、２，２，２−トリクロロエタノールおよび／もしくは２，２，２−トリクロロ酢酸の誘導体;ならびに／または試薬の消化能力を増加／減少させるための化合物;ならびに／または試料／試料を保存することを目的とした添加剤;ならびに／または染色（dying）もしくは染色（staining）用途のための添加剤を含んでもよい。
【００４７】
（トリクロロエタノールまたは誘導体以外の）アルコールに関しては、透明化剤および封入液は、１種以上のＣ１〜Ｃ６アルコール（例えばエタノール、１−プロパノール、２−プロパノールまたはｔ−ブタノール）を含むことができる。
【００４８】
また、透明化剤および封入液は、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリアミドなどの溶解プラスチックポリマー；ならびに／または封入媒体および／もしくは試料を安定化させるために次いで重合されるモノマー単位；ならびに／またはギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸、没食子酸、安息香酸、トルイル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしくはクエン酸などのＣ１〜Ｃ１２有機酸；ならびに／または化学防腐剤；ならびに／またはリン酸、クエン酸、酢酸、トリス、または他の水溶性バッファーの塩；水溶液として添加されうるバッファー；ならびに／または水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムまたは水酸化リチウムなどのアルカリ水酸化物塩基；水溶液として添加されうる塩基をさらに含んでもよい。また、本発明の透明化剤および封入液ならびに／またはその誘導体および／もしくはその類似体は、現在の透明化剤と同程度に効果的な市販および非市販の染色剤と共に使用することができる。
【００４９】
また、本開示は、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナールを含む、２，２，２−トリクロロエタノールの様々な誘導体ならびに／または類似体を包含し、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそのような誘導体の任意のポリマー成分を含む、モノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される。２，２，２−トリクロロ酢酸の誘導体および類似体には、モノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、カルボン酸、カルバメート、アミド、およびカーボネートが含まれ、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそのような誘導体の任意のポリマー実施形態を含む、任意のモノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される。
【００５０】
透明化剤および封入液の他の例は、約１０％〜約９７％（ｖ／ｖ）のトリクロロエタノールの誘導体または類似体；０％〜約５０％（ｖ／ｖ）のトリクロロ酢酸の誘導体または類似体；０％〜約５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール；および任意に、水を含み、この際、溶液の屈折率は約１．３８１０以上であり、トリクロロエタノール誘導体または類似体は、モノおよびポリハロゲン化分岐ならびに非分岐の、少なくとも２炭素単位を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、およびヘミアミナール、およびそのような誘導体の任意のポリマー実施形態であり、この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基を含有する、任意のモノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される。
【００５１】
２．溶液の光学的性質
本開示は、対象が懸濁／浸漬されている媒体の屈折率を上昇させることによって、顕微鏡検査／光学技術における対象の見かけの透明度を向上させる解決手段を提供する。材料の屈折率は、光が材料を通って伝播する方法を表す無次元量である。当該屈折率は、真空中での放射の波長および速度による係数として定義される。材料の屈折率は、その誘電率と密接に関係しており、したがってその透明度と密接に関係している。材料の屈折率ｎは下記式で与えられる。
【００５２】
【数１】
2019536005.tif 000003
【００５３】
ここで、ε１およびε２は、誘電率の実数部および虚数部をそれぞれ表す。高誘電率を有する材料は多数の孤立電子対および／または電気陰性元素を含み、それらは当該材料に高い分極率を与え、その性質は誘電率によって表される。高い分極率によって電磁波が材料を通って伝播することが可能となり、これは局所的な電磁場を誘導する。液体を通過する波の類似性を使用することは有用であり、液体がより低い粘性を有し、かつ（より高い分極率に関連する類似性によって）移動が容易であるほど、吸収からエネルギーを失うことなく波がより容易に伝播できる。電磁波において、高い分極率は、材料を通過する波のこの「より容易な移動」に対応し、これによって材料による波の吸収がより少なくなる。ゆえに、高い誘電率を有する材料は、低い吸収度、従って高い透過度を有するであろう。なぜなら、対物光（objective light）は吸収損失なしにそれを透過させるからである。事実上、光の光子は、より低い誘電率を有する材料の場合に比べて、より無傷で脱出することができる。また、上記のように誘電率は屈折率に関連しているため、高屈折率の材料もまた非常に透明であり、ゆえに顕微鏡検査／光学技術において非常に有用である。
【００５４】
本開示の例示的な透明化剤および封入液の屈折率を表１に開示する。
【００５５】
【表１】
2019536005.tif 000004
【００５６】
トリクロロエタノールの代わりとして使用できる多くの類似体の構造が提供されている（図１０）。２−クロロアセトアルデヒドジメチルアセタールは、トリクロロエタノールと同じ濃度で効果的であることが示されているが、所望の範囲の下限では、屈折率は１．３８１０しかない。所望の屈折率を達成するための１つの方法は、水素結合可能な水可溶化基をも含む炭素骨格中に１以上のハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を有する透明化剤を組み込むことである。例えば、炭素骨格は、任意のモノもしくはポリハロゲン化分岐または非分岐の、Ｃ１〜Ｃ２０族を有する、アルコール、ジオール、グリコール、アルデヒド、アルデヒド−水和物、ヘミアセタール、アセタール、ケタール、アミナール、またはヘミアミナールから選択することができる。この際、分岐は、ヒドロキシル、アミノ、エーテル、カルボキシル、カルボキシアミド、カーボネート、カルバミル、カルボニルクロリド、ポリエチレングリコール、またはアミノエタノール基、およびそのような誘導体の任意のポリマー配置を含む、任意のモノもしくはポリハロゲン化脂肪族または芳香族側鎖として定義される。
【００５７】
比較定性試験では、本開示の透明化剤および封入液は、酸性化抱水クロラールと同等以上に機能する。定性試験において、本開示の透明化剤および封入液は、抱水クロラール系溶液に匹敵するかまたはそれを上回り、かつ普遍的な標準である抱水クロラール溶液よりも高い屈折率を示した。したがって、透明化剤および封入液は、目的の構造の明確さ、定義または分解能を損なうことなく、異なる植物、微生物、動物、および地球科学材料の同定のために使用される同一の解剖学的特徴または診断的特徴を同定するために使用することができる。
【００５８】
３．方法
本開示の透明化剤および封入液は、植物、植物部分、動物および微生物材料の顕微鏡による同定に有用である。透明化剤および封入液は、血液や血漿サンプルであっても、顕微鏡検査ならびに／または法医学、および生物学および地球科学における用途を伴う他の光学技術における封入剤として、動物、真菌、原生生物、および細菌などのあらゆる生物の視覚化のために使用することができる。これらの溶液は、標本を透明化し、透明にするために使用することができる。これらの透明化された標本は、次いで別個に染色され、そして高品質の画像が得られる。あるいは、不透明な標本を最初に染色してから透明化することができる。また、本発明の透明化剤および封入液および半永久的封入媒体は、これらに限定されないが、土壌粒子および地質学的サンプルなどを含む非生物材料と共に使用することができる。
【００５９】
本発明の透明化剤および封入液は、植物の顕微鏡検査だけでなく、菌学、昆虫学、組織学、食品科学、品質管理（医薬品、賦形剤、ダイエット製品の製造、粗悪品（adulterations）、誤認（misidentifications）、コンタミネーションのための生物有機体の同定）、法医学、線虫学、ウイルス学、免疫学、鉱物学、そしてこれらに限定されないが、微分干渉コントラスト顕微鏡、電子顕微鏡、ならびにその他の顕微鏡検査および光学の関連用途を含む顕微鏡検査にも有用である。
【００６０】
例えば、本発明の透明化および封入液の１つの用途は、市販のハーブ製品の品質評価にある。本発明の溶液は、全体が乾燥した、部分的に乾燥した、そして新鮮な材料を透明化するのに有用であることも判明した。例えば、バジルでは、脂腺、気孔を有する表皮およびその下にある柵状細胞が観察され得る（図１１Ａ、Ｂ）。オレガノでは、毛状突起、毛細血管および脂腺を覆っている静脈上の表皮が識別された（図１１Ｃ〜Ｆ）。シロイヌナズナの根端分裂組織の細胞組織の詳細は、この塗布で透明化した後に観察することができる（図１１Ｇ〜Ｈ）。加えて、多くの他のハーブおよびスパイス（乾燥サンプルおよび全組織）を、透明化試薬としての本開示を続けて使用して分析し、匹敵する結果を得た。
【００６１】
本開示の溶液は、酸性化抱水クロラール溶液と同様に、組織に浸透し、それらをより透明化する。本開示の透明化剤で処理した後、サンプルは透明化され、それによって表面の詳細と同様に内部の詳細を容易に同定することが可能になる。この特徴は、切片化または再封入を必要とせずに透明組織の異なる層が観察される全体封入組織に対して有用である。また、透明化された組織は、染色技術が、組織の脱水または組織の前処理を必要とせずに、ただ１つの単一工程で診断機能をより効果的に強調することを可能にする（図１１Ａ〜Ｈ）。
【００６２】
本発明の溶液は、原生生物、これらに限定されないが、紅藻類（図１２）、ミミズ（Panagrellus redivivus、図１３）、ノミ、ミジンコ（Daphnia sp）（図１４）およびショウジョウバエ（Drosophila melanogaster、図１５および１６）を含む動物を透明化するのにも有効である。
【００６３】
細胞中の異なる成分を同定するために、組織を染色することができる。細胞の異なる成分間の細部を強調するために利用可能ないくつかの染色の組み合わせがある。染色剤は、それらの化学組成に基づいて特定の構造間の最大のコントラストを提供するように選択される。染色後に得られた画像の成功の多くは、前処理として使用された透明化剤による。また、本開示の溶液は、特定の構造体に使用される主要な染色剤と干渉しない。例として、ペニシリウム種を最初に透明化剤で透明化し、次いでアニリンブルーの乳酸溶液で染色し（図１７）、べと病はヨウ素溶液および硫酸で染色した後暗褐色になり（図１８）、丸虫Pangrellus redivivusはフクシンでピンク／赤に染色され（図１９）、ショウガ根茎乾燥サンプルはデンプン粒子はヨウ素溶液で黒く染色され（図２０）、厚膜細胞繊維はフロログルシノール／ＨＣｌ溶液で赤く染色された（図２１）。
【００６４】
また、本開示は、顕微鏡検査用の生物学的標本（例えば、植物、動物など）を調製する方法に関する。そのような方法の一例は、検査される標本を顕微鏡スライド、ウェル、またはキュベットにつけること；十分量の透明化剤および封入液を塗布して前記標本を透明化および封入すること；ならびに必要に応じて、カバーガラスを当てることを有する。例えば、標本を固定／封入するために、スライド上の標本に約１滴から約１００滴、または約２滴の透明化剤および封入液を塗布する。標本はカバーガラスでさらに保護してもよい。
【００６５】
また、本開示は、分光光度分析用の標本を調製する方法を提供する。この方法では、標本がキュベットまたはウェルにつけられ、および十分量の本開示係る透明化剤および封入液（たとえば、サンプルの約１倍〜１０倍体積）が標本を透明化するために塗布される。
【００６６】
別の方法では、標本は透明化される前に染色される。より具体的には、標本を透明化剤に浸漬する前に、染色剤または染料が標本に塗布されて染色された標本が提供され、これにより標本の特徴が選択的に強調される。次いで、染色された標本は、透明化された染色標本を提供するのに十分な時間（例えば、少なくとも約１分〜約１２ヶ月間）、本開示に係る透明化液に浸漬される。透明化された染色標本は、観察のために顕微鏡スライド、キュベット、またはウェルにつけられ、必要に応じてカバーガラスで覆われる。蛍光および／または落射蛍光および／または共焦点顕微鏡を使用して透明化された染色標本を視覚化できるよう、染色剤または染料は、蛍光染色剤または染料であり得る。
【００６７】
ここで、本開示を説明する特定の実施例が参照されるであろう。実施例は例示的な実施形態を説明するために提供されており、それによって本開示の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【実施例】
【００６８】
実施例１
植物標本の準備
植物材料を乾燥させるか、または新鮮に使用した。市販のコーヒーグラインダーを使用して、乾燥植物材料を微粉末に粉砕した。
【００６９】
顕微鏡スライド上に少量の微粉末材料を広げ、そして酸性化抱水クロラール溶液（コントロール）を２滴載せるか、または実施例１の透明化剤および封入液を２滴載せ、そしてカバーガラスを装着した。次に、透明化剤および封入液が沸騰するまで、スライドをホットプレート上（中温）で３０秒〜６０秒間加熱した。顕微鏡分析は、イメージングソフトウェアＮＩＳ  Ｄ  ３．００  ＳＰ７を搭載したニコン  エクリプス  ８０ｉ顕微鏡を用いて行った。各サンプルについての診断的特徴または特性における相違点または類似点を記録した。新鮮な標本を透明になるまで透明化剤および封入液に浸漬した。材料の厚さにもよるが、通常約２０〜３０分かかる。大きなサンプルでは２〜３日かかる場合がある。材料が透明になったら、それを本開示の１〜２滴とともに顕微鏡スライド上に載せ、カバーガラスを当てた。新鮮な標本は透明化され（cleared）、かつ透明であり（transparent）、明瞭さを損なうことなく組織のより深い層の視覚化を可能にした。
【００７０】
材料を染色するために、最初に上記のように材料を透明化し、カバーガラスを取り除き、１滴または２滴の染色剤を加え、数分後にカバーガラスを再度当てた。
【００７１】
実施例２
透明化剤および封入液の調製
４．５ｍＬの２，２，２−トリクロロエタノール（シグマアルドリッチ、９９％、試薬級）を１．０ｍＬのグリセロールと十分に混合した。この均一な溶液に２．５ｍＬの４％（ｍ／ｖ）２，２，２−トリクロロ酢酸水溶液を加えたところ、その時点で濁りが観察された。溶液を完全に透明になるまで（約５分）完全に混合した。
【００７２】
実施例３
ショウガ（根茎）、Zingiber officinale Roscoe（ショウガ科）
粉末ショウガサンプルは、デンプン粒；斜めスリット状のくぼみを有する薄肉繊維の断片；スカラー状、網状、およびらせん状の導管、コルク化した放射状に配置された壁（suberized  radial walls）の断片；そのような単純な、平らな、楕円形の、末端の突起を持つ長円形のような様々な形の多数のデンプン粒を含む等直径薄肉実質細胞の多数の断片によって特徴付けられる。
【００７３】
ショウガ試料の粉砕物、実質細胞の断片、円状の線条（コルク細胞）、導管を伴う繊維および豊富なデンプン粒において、本開示の透明化剤および封入液を使用して、鋭いエッジを有するコンパクトな表皮細胞を観察することができる。本発明ならびに標準的の透明化剤および封入液の間で、観察された構造には違いはなかった。
【００７４】
図１Ａ〜Ｂは、ショウガ特有の環紋導管要素および繊維の顕微鏡写真を示す。図１Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を用いたショウガ特有の環紋導管要素および繊維である。図１Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を用いた、繊維および繊維に付着した豊富なデンプン粒子を有するショウガ特有の環紋導管要素である。
【００７５】
図２Ａ〜Ｂは、ショウガの豊富なデンプン粒の顕微鏡写真を示す。実施例１の透明化剤および封入液を用いると、酸性化抱水クロラール溶液に比べて、より多くのデンプン粒を観察することができる。図２Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を使用した、大部分は単純な、特徴的な豊富なデンプン粒を有するショウガサンプルである。図２Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を用いた、豊富なデンプン粒を有するショウガサンプルである。
【００７６】
図３Ａ〜Ｂは、ショウガの表皮および実質細胞の顕微鏡写真を示す。本発明の溶液を使用して観察された構造は、酸性化抱水クロラール水和物溶液に対して違いが無い。図３Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を用いた、コンパクトな表皮細胞の群である。図３Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を使用した、コンパクトな表皮細胞の群である。
【００７７】
実施例４
マテ（葉）、イェルバ・マテ（モチノキ科）
粉末のモチノキの葉は、不均一に肥厚した壁を有する多形性細胞によって構成される表皮上層を特徴とする。表皮下層細胞は表皮上層細胞よりも小さく、細胞壁が薄いほど、クチクラ線条がよく目立つ。不規則型気孔（孔辺細胞対を取り囲む表皮細胞は他の表皮細胞と形態学的に区別されない）。木質化繊維の群が見える。
【００７８】
図４Ａ〜Ｂは、葉脈上の表皮の断片の顕微鏡写真を示す。表皮上層は、不均一に肥厚した壁を有する多形性細胞で構成されている。気孔は表皮上層には存在しない。本発明の溶液を使用して観察された構造は、酸性化抱水クロラール溶液に対して違いが無い。図４Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を使用した、静脈上の表皮上層の多形性細胞の断片である。図４Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を使用した、静脈上の表皮上層の多形性細胞の断片である。
【００７９】
図５Ａ〜Ｂは、大きく、密に詰まった、柵状細胞の基礎となる表皮上層の顕微鏡写真を示す。円形の線条が観察されうる。本発明の溶液で処理した細胞は、酸性化抱水クロラール溶液で処理した細胞と比べて目立たない。図５Ａの酸性化抱水クロラール溶液を使用した実質細胞の基礎となる表皮上層の断片では、キューティクルが不規則な線条である。図５Ｂの実施例１の透明化剤および封入液を使用した実質細胞の基礎となる表皮上層の断片では、キューティクルが不規則な線条である。
【００８０】
図６Ａ〜Ｂは、繊維の周縁部の断片または群の顕微鏡写真を示す。繊維は、木質化し、適度に肥厚し、そしてくぼみを有する壁（細胞壁の内部二次肥厚における間隙）を有する。図６Ａおよび図６Ｂにおいて、繊維からのくぼみは、透明化剤および封入液の両方で明確に観察されうる。図６Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を使用した、円形状またはスリット状のくぼみ（細胞壁の内部二次肥厚における間隙）を有する肥厚した壁を有する繊維を示す、静脈部分の縦断面図である。図６Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を使用した、円形状またはスリット状のピットくぼみ（細胞壁の内部二次肥厚における間隙）を有する肥厚した壁を有する繊維を示す、静脈部分の縦断面図である。
【００８１】
図７Ａ〜Ｂは、特徴的な不規則型気孔を示す表皮下層の顕微鏡写真を示す。透明化剤および封入液の間で、明瞭さおよび機能において違いは無かった。図７Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を用いた、不規則型気孔および円形状のクチクラ線条を示す表皮下層表面である。図７Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を使用した、不規則型気孔および円形状のクチクラ線条を示す表皮下層表面である。
【００８２】
実施例５
ベニバナ（花）、Carthamus tinctorius L.（キク科）
ベニバナ由来の花の粉末サンプルは、３つの顕著な発芽孔を持つ豊富な花粉粒を持っている。外膜（花粉の外側の層）は歯状でとげが多い。導管の隣に赤褐色の分泌物を有する乳管の存在が観察された。ベニバナの粉砕サンプルでは、３つの発芽孔を有する花粉粒、外膜および血管の隣に赤褐色の分泌物を有する乳管が観察できた。
【００８３】
図８Ａ〜Ｂは、３つの発芽孔、外膜（花粉粒の最も外側の細胞壁）歯状のとげを有する、円形または楕円形の花粉粒の顕微鏡写真を示す。図８Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を用いた、３つの発芽孔を有する歯状を有する、特徴的な花粉粒である。図８Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を使用した、３つの発芽孔を有する歯状の特徴的な花粉粒である。
【００８４】
図９Ａ〜９Ｂは、導管要素の隣に赤褐色の分泌物を有する、乳管（ラテックス液を含む管状細胞）の顕微鏡写真を示す。本発明の溶液を使用して観察された構造は、酸性化抱水クロラール溶液に対して、違いは無い。図９Ａは、酸性化抱水クロラール溶液を使用した、導管要素の隣のより濃い分泌物を有する２つの乳管である。図９Ｂは、実施例１の透明化剤および封入液を使用して、導管要素の隣のより濃い分泌物で充填された乳管である。
【００８５】
図１１Ａ〜Ｈは、実施例１の透明化剤および封入剤で透明化した、新鮮な全体封入植物標本を示す。図Ａ〜Ｂ：バジルの葉。図Ａは、直交型気孔（diacytic stomata）、頭状および楯形腺（capitate and peltate glands）を有する表皮である。図Ｂは、葉緑体を有する葉肉細胞である。図Ｃ〜Ｆは：オレガノの葉。図Ｃは、葉脈および頭状腺を覆う厚い細胞壁で毛状突起を覆っている。図Ｄは、頭状腺のクローズアップ（矢印）である。図Ｅは、表皮および脂腺を描いている。図Ｆは、葉肉細胞である。図Ｇ〜Ｈは、シロイヌナズナの根である。図Ｇは、根端細胞分化である。図Ｈは、根における木部分化である。
【００８６】
また、透明化および封入液ならびにその誘導体および／または類似体は、これらに限定されないが、原生生物、カビ、真菌、細菌、その他の微生物家禽、ヒト、家畜、爬虫類、両生類、昆虫および動物を含む動物の細胞または組織と同じまたは類似の様式で、効果的に使用され得る。哺乳動物、脊椎動物、および無脊椎動物については、脳、脊髄、骨格系などの特定の部分を視覚化のために調製することができる。
【００８７】
図１２〜２１に表示されている標本は、実施例１の透明化剤および封入液を用いて、上記のものと同様に調製した。
【００８８】
図１２は主軸から外れて形成している二次分岐を示す紅藻類Polysiphonia sp配偶体を示す。
【００８９】
図１３は、内部構造（口腔および内部で孵化した幼虫）を示す回虫の自由生活線虫Panagrellus redivivus（動物界）の前端を示す。
【００９０】
図１４は、前部を示す小型水生甲殻類のミジンコ（Daphnia sp.）（動物界）を示す。
【００９１】
図１５は、多数の個眼（光検出器）を示す特徴的なキイロショウジョウバエ（動物界）の複眼を示す。
【００９２】
図１６は、複眼、触角および口の部分を示すキイロショウジョウバエ（動物界）の頭部の背面図を示す。
【００９３】
図１７は、末端に分生子鎖（無性胞子）を有する真菌ペニシリウム種分生子柄を示す。
【００９４】
図１８は、植菌１週間後の特徴的な分岐状の分生子柄および分生子の明確な染色を伴う、バジルべと病（Peronospora belbahri）、原生生物を示す。ヨウ素溶液および硫酸で染色した。
【００９５】
図１９は、フクシンで染色された回虫Panagrellus redivivus（動物界）を示す。
【００９６】
図２０は、ヨウ素溶液で染色されたショウガの特徴的なデンプン粒を示す。
【００９７】
図２１は、フロログルシノール／ＨＣｌ溶液で染色したアフリカプルーンPrunus africanaの特徴的な木質化繊維を示す。
【００９８】
実施例６
マウス標本
マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、直ちに剖検のために処理した。脳を取り出し、直ちに１０％中性緩衝ホルマリンに入れた。次に、それを室温で約３時間放置し、さらに４℃で２日間貯蔵した。次に、脳を約３ｍｍ厚の冠状切片にスライスし、さらに１切片を室温で０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入れた。５日後、切片を約３ｍＬのＰＢＳに移し、１０分毎に２回洗浄した。次に切片を１．０ｍＬのＰＢＳに移し、３０μＬのＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ（登録商標）５１５／５３５黄色蛍光ニッスル染色剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）および１μＬのＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を加えた。次に、標本をこの溶液中でオービタルシェーカー上で室温で約４８時間培養した。培養後、切片を２．０ｍＬのＰＢＳに約１時間移した。次に、切片を新しい２．０ｍＬのＰＢＳに移し、５日間保存した。貯蔵後、切片をＰＢＳから取り出し、余分な溶液を低リントワイプで除去した。乾燥した切片を５６．２５％（ｖ／ｖ）ＴＣＥ、１．２５％（ｖ／ｖ）ＴＣＡ、１２．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、３０％（ｖ／ｖ）メタノールの溶液に移した後、３７℃で振とう培養器に入れた。約４８時間後、切片を１００％グリセロールに移し、撮像するまで２日間保存した。ＨＣ  ＰＬ  ＡＰＯ  １０倍／０．４０対物（objective）および４８８ｎｍ、５３４ｎｍ、５９４ｎｍ、および６３３ｎｍでの励起のためのアルゴンクリプトンレーザーを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰＩＩ共焦点顕微鏡で画像を収集した。
【００９９】
画像を図２２に示す。
【０１００】
実施例７
ヒトの標本
１０％中性緩衝ホルマリンで封入し、封入液中で１年間以上保存したヒト胎盤子葉組織を、小片に加工するために、０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳに移した。組織片をＰＢＳ中で３回、さらに０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２回、それぞれ室温で約１５分間洗浄した。次いで、組織を２０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および０．３Ｍグリシン含有ＰＢＳＴに移し、さらに３７℃で約３０分間培養した。次いで、組織を０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび６％（ｖ／ｖ）ロバ血清を含有するＰＢＳで、３７℃で約３０分間ブロックした。次いで、組織を、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０および１０ｍｇ／ｍｌヘパリンを含有するＰＢＳ（ＰＴｗＨ）中で、３７℃で約１５分間３回洗浄した。洗浄後、次に、組織を、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび３％（ｖ／ｖ）ロバ血清含有ＰＢＳ  ５００μＬ中に２．５μＬの抗Ｋｉ６７抗体（ａｂ１５５８０）（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）を含有する溶液中、３７℃で約１時間インキュベートした。一次抗体処理の後、次いで組織をＰＴｗＨで室温で１０回、それぞれ５分間洗浄した。次いで、組織を、１μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ａｂ１５００８１）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と１０００μＬの３％（ｖ／ｖ）ロバ血清含有ＰＴｗＨとを混合した溶液中で、３７℃で約１時間培養した。二次抗体処理の後、次いで組織を、ＰＴｗＨで室温で１０回、それぞれ約５分間洗浄した。その後、組織を、ＰＢＳＴ中で、３７℃で１５分間、３回洗浄した。次いで、組織を、１：１０００希釈のＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）ＰＢＳと共に、３７℃で約３０分間培養した。次に、組織を、５０％（ｖ／ｖ）無水エタノール含有ＰＢＳで、それぞれ３７℃で約１５分間、３回洗浄した。次に、組織を、７０％（ｖ／ｖ）無水エタノール含有ＰＢＳで、それぞれ３７℃で約１５分間、３回洗浄した。次に、組織を、無水エタノールで、それぞれ３７℃で約１５分間、３回洗浄した。表面に残っているエタノールを低リントワイプで乾燥させ、さらに組織を３３％（ｖ／ｖ）  ＴＣＥ、３３％（ｖ／ｖ）  ベンジルアルコール、および３３％（ｖ／ｖ）  グリセロールを含有する溶液に、透明になるまで１時間移した。撮像する準備が整うまで、組織をこの溶液中に保存した。ＨＣ  ＰＬ  ＡＰＯ  １０倍／０．４０対物および４８８ｎｍ、５３４ｎｍ、５９４ｎｍ、および６３３ｎｍでの励起のためのアルゴンクリプトンレーザーを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰＩＩ共焦点顕微鏡で画像を収集した。
【０１０１】
結果を図２３Ａ〜Ｃに示す。
【０１０２】
等価物
当業者は、本明細書に記載されている特定の組成物および手順に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、または確かめることができるであろう。そのような同等物は、本開示の範囲内にあるとみなされ、そして添付の特許請求の範囲によって包含される。
【図１】
2019536005.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
2019536005.tif 000029