(57)【要約】  本発明の技術は、病原体を防除するための新規のトランストランスジェニック戦略に関する。本発明の技術には、具体的には、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を病原体／疾患伝播生物に送達するように構成された新規のパラトランスジェニックシステムを含み得る。好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上の干渉ＲＮＡ分子を病原体／疾患伝播性蚊に送達するように構成されている１つ以上の遺伝子操作された腸内細菌を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蚊の病原体を防除する方法であって、
−ウイルス病原体中の必須遺伝子に向けられたｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを発現する蚊の腸にコロニーを形成するように構成された遺伝子組み換え腸内細菌を導入することと、
−前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを発現することと、
−ｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡ干渉機構を介して前記必須遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ウイルス病原体がジカウイルスを含む、請求項１に記載の蚊の病原体を防除する方法。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び／又は配列番号５からなる群から選択され、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、かつ前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、請求項１に記載の蚊の病原体を防除する方法。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は食作用を介して前記蚊の腸内の前記上皮細胞によって取り込まれる遺伝子組み換え腸内細菌から分泌され、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊においてＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項１に記載の蚊の病原体を防除する方法。
【請求項５】
病原体保有蚊を生物的防除するためのシステムであって、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え細菌を生成することと、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記病原性感染蚊を防除する前記病原体遺伝子の前記下方制御を引き起こすＲＮＡ干渉機構を誘導するように、インビボで有効量の前記遺伝子組み換え細菌を蚊に投与することと、を含む、システム。
【請求項６】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項７】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項６に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項８】
請求項７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステムであって、有効量の前記遺伝子組み換え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ｄｉｓｂｕｒｓｅｍｅｎｔ）、環境エアロゾル化により分配すること（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ｄｉｓｂｕｒｓｅｍｅｎｔ）、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること（ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項９】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される内共生腸内であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／又は自己栄養性内共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌である内共生細菌、及び表２で同定され、ヘルパー遺伝子と称されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、パラトランスジェニック細菌、及び内共生細菌を含む、請求項５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１０】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチド分子を含む、請求項５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１１】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項１０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１２】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項１１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１３】
前記病原体遺伝子が、ウイルス性病原体遺伝子、細菌性病原体遺伝子、プラスモジウム病原体遺伝子、線虫病原体遺伝子を含む、請求項５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１４】
前記ウイルス病原体遺伝子が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカ遺伝子を含む、請求項１３に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１５】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号６内の配列を標的化し、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、請求項１４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１６】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び／又は配列番号５においてコードされ、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、かつ、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１７】
前記蚊が病原体に感染した蚊を含む、請求項７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１８】
前記病原体感染蚊が、ウイルス感染症、線虫感染症、原虫感染症及び細菌感染症からなる群から選択される感染症を有する蚊を含む、請求項１７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項１９】
前記ウイルス感染が、ジカウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ブルータング病ウイルス、シンドビスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、オロプーシェウイルス、及びフロックハウスウイルスからなる群から選択されるアルボウイルスなど、アルボウイルスによって引き起こされる、請求項１８に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項２０】
前記原虫感染症が、マラリアを引き起こすマラリア原虫によって引き起こされる、請求項１８に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項２１】
前記線虫感染症が、犬糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）又はバンクロフト糸状虫によって引き起こされ、前記線虫感染症が犬糸状虫病を引き起こす、請求項１８に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項２２】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡを含む、請求項１８に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項２３】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は貪食作用を介して前記蚊の腸内の前記上皮細胞によって取り込まれた前記遺伝子組み換え細菌から分泌され、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊においてＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのシステム。
【請求項２４】
病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された小型干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換えされた内共生腸内細菌を生成することであって、
前記内共生腸内細菌が、蚊とパラトランスジェニックであるように構成されるように、生成することと、
−前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊においてＲＮＡ干渉機構を誘導する少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御し、それにより、前記病原体遺伝子の前記下方制御を引き起こすように構成されている、インビボで有効量の前記遺伝的内共生腸内組み換え細菌を蚊に投与することと、を含む、システム。
【請求項２５】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項２４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項２６】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項２５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項２７】
請求項２６に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、有効量の前記遺伝子組み替え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること、環境エアロゾル化により分配すること、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項２８】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される遺伝子組み換え内共生腸内細菌であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／もしくは自己栄養性内共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌、ならびに表２（表題「ヘルパー遺伝子」）において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、を含む、請求項２４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項２９】
前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチド分子を含む、請求項２４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３０】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項２９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３１】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項３０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３２】
前記病原体遺伝子が、ウイルス性病原体遺伝子、細菌性病原体遺伝子、マラリア原虫病原体遺伝子、線虫病原体遺伝子を含む、請求項２４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３３】
前記ウイルス病原体遺伝子が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカ遺伝子を含む、請求項３２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択されるｓｉＲＮＡを含み、
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、前記ｓｉＲＮＡが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、請求項３３に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３５】
前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５においてコードされ、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、からなる群から選択される阻害性ｓｉＲＮＡを含む配列番号６内の配列を標的化する、請求項３４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３６】
前記蚊が病原体に感染した蚊を含む、請求項２６に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３７】
前記病原体感染蚊が、ウイルス感染症、線虫感染症、原虫感染症及び細菌感染症からなる群から選択される感染症を有する蚊を含む、請求項３６に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３８】
前記ウイルス感染が、ジカウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ブルータング病ウイルス、シンドビスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、オロプーシェウイルス、及びフロックハウスウイルスからなる群から選択されるアルボウイルスなど、アルボウイルスによって引き起こされる、請求項３７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項３９】
前記原虫感染症が、マラリアを引き起こすマラリア原虫によって引き起こされる、請求項３７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４０】
前記線虫感染症が、犬糸状虫又はバンクロフト糸状虫によって引き起こされ、前記線虫感染症が、犬糸状虫病を引き起こす、請求項３７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４１】
前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが、前記遺伝的組み換え内共生腸内細菌によって発現され、分泌され、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は貪食を介して前記蚊の腸内の前記上皮細胞によって取り込まれ、かつ前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊においてＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項２４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４２】
病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え内共生腸内細菌を生成することであって、前記内共生腸内細菌が、蚊とパラトランスジェニックであるように構成される、生成することと、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊においてＲＮＡ干渉機構を誘導し、
これにより、前記病原体遺伝子の前記下方制御を引き起こすように、インビボで有効量の前記遺伝子内共生腸内組み換え細菌を蚊に投与することと、を含む、システム。
【請求項４３】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項４２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４４】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項４３に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４５】
請求項４４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、有効量の前記遺伝子組み換え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること、環境エアロゾル化により分配すること、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項４６】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される遺伝子組み換え内共生腸内細菌であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／もしくは自己栄養性内共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌、ならびに表２（表題「ヘルパー遺伝子」）において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、を含む、請求項４２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４７】
前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチド分子を含む、請求項４２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４８】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項４７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項４９】
前記病原体遺伝子が、ウイルス性病原体遺伝子、細菌性病原体遺伝子、マラリア原虫病原体遺伝子、線虫病原体遺伝子を含む、請求項４２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５０】
前記ウイルス病原体遺伝子が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカ遺伝子を含む、請求項４９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５１】
前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択される阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化する、請求項５０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５２】
前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５においてコードされ、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、
配列番号６内の配列を標的化し、かつ
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、及び
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有する阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、からなる群から選択される阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５３】
前記蚊が病原体に感染した蚊を含む請求項４４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５４】
前記病原体感染蚊が、蚊を含み、ウイルス感染症、線虫感染症、原虫感染症及び細菌感染症からなる群から選択される感染症を保持する、請求項５３に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５５】
前記ウイルス感染が、ジカウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ブルータング病ウイルス、シンドビスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、オロプーシェウイルス、及びフロックハウスウイルスからなる群から選択されるアルボウイルスなど、アルボウイルスによって引き起こされる、請求項５４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５６】
前記原虫感染症が、マラリアを引き起こすマラリア原虫によって引き起こされる、請求項５４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５７】
前記線虫感染症が、犬糸状虫又はバンクロフト糸状虫によって引き起こされ、前記線虫感染症が、犬糸状虫病を引き起こす、請求項５４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５８】
前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、前記内共生腸内細菌から分泌され、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は食作用を介して前記上皮細胞によって取り込まれ、かつ前記蚊において、ＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項４２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項５９】
病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え内共生腸内細菌を生成することであって、前記内共生腸内細菌が、蚊とパラトランスジェニックであるように構成される、生成することと、
−前記阻害性内共生腸内組み換え細菌が前記蚊の腸に感染するように、有効量の前記遺伝的内共生腸内細菌をインビボで蚊に投与することと、
−前記内共生腸内細菌における少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを発現することと、
−前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを前記内共生腸内細菌から前記蚊の腸に分泌することであって、前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊の腸の前記上皮細胞においてＲＮＡ干渉機構を誘導し、これにより前記病原体遺伝子の前記下方制御を引き起こす、分泌することと、を含む、システム。
【請求項６０】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項５９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６１】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項６０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６２】
請求項６１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、有効量の前記遺伝子組み換え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること、環境エアロゾル化により分配すること、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項６３】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される遺伝子組み換え内共生腸内細菌であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／もしくは自己栄養性内共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌、ならびに表２（表題「ヘルパー遺伝子」）において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、を含む、請求項５９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６４】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項５９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６５】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項６４に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６６】
前記病原体遺伝子が、ウイルス性病原体遺伝子、細菌性病原体遺伝子、マラリア原虫病原体遺伝子、線虫病原体遺伝子を含む、請求項５９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６７】
前記ウイルス病原体遺伝子が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカ遺伝子を含む、請求項６６に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６８】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、かつ前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、請求項６７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項６９】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５においてコードされ、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、かつ、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項６８に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７０】
前記蚊が病原体に感染した蚊を含む請求項６１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７１】
前記病原体感染蚊が、ウイルス感染症、線虫感染症、原虫感染症及び細菌感染症からなる群から選択される感染症を保持する蚊を含む、請求項７０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７２】
前記ウイルス感染が、ジカウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ブルータング病ウイルス、シンドビスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、オロプーシェウイルス、及びフロックハウスウイルスからなる群から選択されるアルボウイルスなど、アルボウイルスによって引き起こされる、請求項７１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７３】
前記原虫感染症が、マラリアを引き起こすマラリア原虫によって引き起こされる、請求項７１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７４】
前記線虫感染症が、犬糸状虫又はバンクロフト糸状虫によって引き起こされ、前記線虫感染症が、犬糸状虫病を引き起こす、請求項７１に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７５】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項５９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７６】
前記内共生腸内細菌由来の前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、分泌され、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は貪食を介して前記上皮細胞によって取り込まれ、かつ前記蚊において、ＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項５９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項７７】
病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え内共生腸内細菌を生成することであって、前記内共生腸内細菌が、蚊とパラトランスジェニックであるように構成される、生成することと、
−前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記蚊においてＲＮＡ干渉機構を誘導する少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御し、それにより、前記病原体遺伝子の前記下方制御を引き起こすように構成されている、インビボで有効量の前記遺伝的内共生腸内組み換え細菌を蚊に投与することと、を含む、システム。
【請求項７８】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項７７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項７９】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項７８に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８０】
請求項７９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステムであって、有効量の前記遺伝子組み換え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること、環境エアロゾル化により分配すること、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項８１】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される遺伝子組み換え内共生腸内細菌であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／もしくは自己栄養性内共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌、ならびに表２（表題「ヘルパー遺伝子」）において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、を含む、請求項７７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８２】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチド分子を含む、請求項７７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８３】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項８２に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８４】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項８３に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８５】
前記病原体遺伝子が、ウイルス性病原体遺伝子、細菌性病原体遺伝子、マラリア原虫病原体遺伝子、線虫病原体遺伝子を含む、請求項７７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８６】
前記ウイルス病原体遺伝子が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカ遺伝子を含む、請求項８５に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８７】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、請求項８６に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８８】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５内においてコードされ、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、及び
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項８７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項８９】
前記蚊が病原体に感染した蚊を含む、請求項７９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項９０】
前記病原体感染蚊が、ウイルス感染症、線虫感染症、原虫感染症及び細菌感染症からなる群から選択される感染症を保持する蚊を含む、請求項８９に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項９１】
前記ウイルス感染が、ジカウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ブルータング病ウイルス、シンドビスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、オロプーシェウイルス、及びフロックハウスウイルスからなる群から選択されるアルボウイルスなど、アルボウイルスによって引き起こされる、請求項９０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項９２】
前記原虫感染症が、マラリアを引き起こすマラリア原虫によって引き起こされる、請求項９０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項９３】
前記線虫感染症が、犬糸状虫又はバンクロフト糸状虫によって引き起こされ、前記線虫感染症が、犬糸状虫病を引き起こす、請求項９０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項９４】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項９０に記載の病原体保有蚊を生物的防除するためのパラトランスジェニックシステム。
【請求項９５】
前記内共生腸内細菌由来の前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は貪食を介して前記上皮細胞によって取り込まれ、かつ前記蚊において、ＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項８７に記載の病原体保有蚊を生物的防除するための分泌されたパラトランスジェニックシステム。
【請求項９６】
ジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つのジカ遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを発現する遺伝的組み換え内共生腸内細菌を生成することであって、前記内共生腸内細菌は、蚊とパラトランスジェニックであるように構成され、前記阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号６内の配列を標的化する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｄｓＲＮＡ）をコードし、前記阻害性ポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、生成することと、
−前記蚊の腸に感染するのに十分な有効量の前記遺伝的組み換え内共生腸内細菌をインビボで蚊に投与することと、
−前記内共生腸内細菌から前記発現された阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を前記蚊の腸に分泌することであって、これにより、前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子は、前記蚊の腸の前記上皮細胞においてＲＮＡ干渉機構を誘導し、前記少なくとも１つのジカ遺伝子の前記下方制御を引き起こす、分泌することと、を含む、システム。
【請求項９７】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項９６に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項９８】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項９７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項９９】
請求項９８に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、有効量の前記遺伝子組み換え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること、環境エアロゾル化により分配すること、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項１００】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される遺伝子組み換え内共生腸内であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／もしくは自己栄養性内共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌、ならびに表２（表題「ヘルパー遺伝子」）において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、を含む、請求項９６に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０１】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチド分子を含む、請求項９６に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０２】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項１０１に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０３】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項１０２に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０４】
前記病原体遺伝子が、ウイルス性病原体遺伝子、細菌性病原体遺伝子、プラスモジウム病原体遺伝子、線虫病原体遺伝子を含む、請求項９６に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０５】
前記ウイルス病原体遺伝子が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカ遺伝子を含む、請求項１０４に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０６】
請求項９６に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５においてコードされ、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、
及び
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有する阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド、からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、システム。
【請求項１０７】
ジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つのジカ遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え内共生腸内細菌を生成することであって、前記内共生腸内細菌は、蚊とパラトランスジェニックであるように構成され、前記阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号６内の配列を標的化する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｄｓＲＮＡ）をコードし、前記阻害性ポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、生成することと、
−前記蚊の腸に感染するのに十分な有効量の前記遺伝子組み換え内共生腸内細菌をインビボで蚊に投与することであって、前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、前記ジカ遺伝子のうちの少なくとも１つの前記下方制御を引き起こすＲＮＡ干渉機構を誘導し、前記ジカ遺伝子は、配列番号６の保存された領域から選択される、投与することと、を含む、システム。
【請求項１０８】
前記蚊が、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種の蚊である、請求項１０７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１０９】
前記蚊が、哺乳類の生物に疾患を伝播させることができる雌蚊、蚊の幼虫、３齢幼虫、蛹、及び成虫の蚊からなる群から選択される蚊を含む、請求項１０８に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１０】
請求項１０９に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、有効量の前記遺伝子組み換え細菌をインビボで蚊に投与する工程であって、浸漬すること、噴霧すること、注射すること、食餌すること、エアロゾル化により分配すること、環境エアロゾル化により分配すること、水源における環境エアロゾル化により分配すること、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すること、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）すること、マイクロカプセル化すること、乾燥すること、水性担体中において、溶液中において、ブラッシングすること、ドレッシングすること、点滴注入すること、及びコーティングすることからなる群から選択される方法のうちの１つ以上を介して、有効量の前記遺伝子組み換え細菌を投与する工程を含む、システム。
【請求項１１１】
前記遺伝子組み換え細菌は、図２、表１（表題「例示的パラトランスジェニック細菌株」）において同定されている群から選択される遺伝子組み換え内共生腸内であって、大腸菌株ＪＣ８０３１、及び／又は自己栄養性共生腸内細菌、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損腸内細菌、及び表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現するかつ／又は過剰発現する腸内細菌、を含む、請求項１０７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１２】
前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ポリヌクレオチド分子を含む、請求項１０７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１３】
前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子が、プロモーターに作動可能に連結された形質転換可能プラスミド中にコードされている二本鎖ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項１１２に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１４】
前記形質転換可能なプラスミドが、表２の表題「ヘルパー遺伝子」において同定されている１つ以上のヘルパー遺伝子を発現する形質転換可能なプラスミドを含む、請求項１１３に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１５】
配列番号６の前記保存された領域が、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、及びＮＳ４からなる群から選択されるジカα遺伝子を含む、請求項１０７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１６】
請求項１０７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５においてコードされ、前記阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化し、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と５０％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と６０％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７０％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と７５％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８０％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と８５％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９０％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９５％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、及び
−配列番号１〜５のうちの１つ以上と９９％の相同性を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子、からなる群から選択される阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、システム。
【請求項１１７】
前記蚊がジカに感染した蚊である、請求項１０９に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１８】
前記内共生腸内細菌由来のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが、エンドサイトーシス、小胞輸送、及び／又は貪食を介して前記上皮細胞によって取り込まれ、かつ前記蚊において、ＲＮＡ干渉機構を誘導する、請求項１０７に記載のジカ保有蚊を生物的防除するための二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステム。
【請求項１１９】
病原体保有蚊を生物的防除するための分泌された二本鎖ＲＮＡ媒介パラトランスジェニックシステムであって、
−少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え内共生腸内細菌を生成することであって、前記内共生腸内細菌が、蚊とパラトランスジェニックであるように構成され、前記阻害性ポリヌクレオチドが、前記少なくとも１つの病原体遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｄｓＲＮＡ）をコードし、かつ前記阻害性ポリヌクレオチドは転写されて前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、生成することと、
−前記蚊の腸に感染するのに十分な有効量の前記遺伝子組み換え内共生腸内細菌をインビボで蚊に投与することと、
−前記内共生腸内細菌から前記発現された阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を前記蚊の腸に分泌することであって、これにより、前記阻害性ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子は、前記蚊の腸の前記上皮細胞においてＲＮＡ干渉機構を誘導し、前記少なくとも１つの病原体遺伝子の前記下方制御を引き起こす、分泌することと、を含む、システム。
【請求項１２０】
インビボでジカ感染に感受性の高い蚊細胞におけるジカウイルス感染を防除するための方法であって、
−ジカ遺伝子抑制カセットを含む有効量のベクターを蚊細胞にインビボで投与することであって、前記遺伝子抑制カセットは、プロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号６内の配列を標的化する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｄｓＲＮＡ）をコードし、前記阻害性ポリヌクレオチドが、転写されて、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、投与することを含む、方法。
【請求項１２１】
少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを含む核酸剤を有する、蚊及び／又は蚊の幼虫が食餌する、遺伝子組み換え内共生腸内細菌を含む、蚊摂取可能化合物。
【請求項１２２】
蚊及び／又は蚊の幼虫が食餌する細胞において、少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを含む核酸剤を有する遺伝子組み換え細胞を含む、蚊摂取可能化合物。
【請求項１２３】
蚊が食餌する血粉中の少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを含む核酸剤を有する遺伝子組み換え細胞を含む、蚊摂取可能化合物。
【請求項１２４】
少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を下方制御するように構成された阻害性ポリヌクレオチドを含む核酸剤を有する、蚊及び／又は蚊の幼虫が食餌する遺伝子組み換え藻類細胞を含む、蚊摂取可能化合物。
【請求項１２５】
ジカウイルスを生物的防除するために構成された阻害性ポリヌクレオチドであって、
−配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び／又は配列番号５からなる群から選択される少なくとも１つの阻害性ポリヌクレオチドであって、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｄｓＲＮＡ）をコードし、前記阻害性ポリヌクレオチドが、転写されて、蚊内のジカウイルスを阻害する前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、阻害性ポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
ジカウイルスを生物的防除するために構成された遺伝子組み換え細菌であって、
−配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び／又は配列番号５からなる群から選択される少なくとも１つの阻害性ポリヌクレオチドを発現する遺伝子組み換え内共生腸内細菌であって、前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６内の配列を標的化する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｄｓＲＮＡ）をコードし、前記阻害性ポリヌクレオチドが、転写されて、蚊内のジカウイルスを阻害する前記ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を産生する、遺伝子組み換え細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，７９１号の利益及び優先権を主張する。上記で参照した出願の明細書及び図全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一般に、本発明の技術は、蚊媒介性疾患を防除するための新規のパラトランスジェニック戦略に関する。具体的には、本発明は、疾患を伝播する蚊及び／又は蚊の幼虫の生物的防除のための新規の技術、システム、及び方法を含み得る。
【背景技術】
【０００２】
発現を増加させること又は発現を減少させることのいずれかによって遺伝子発現を調節することは、ヒト疾患の治療にとって有益であると考えられる。これは、マスター調節遺伝子が同定されているこれらの疾患において特に重要である。大部分の努力は遺伝子発現を増強することに向けて広げられてきたが、特異的遺伝子発現を下方制御することも同様に重要である。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって引き起こされる天然に存在する遺伝子サイレンシングメカニズムは、多くの系において遺伝子発現を抑制又はノックダウンするための非常に重要なツールとして現れている。ＲＮＡ干渉は、ＲＮａｓｅ−ＩＩＩ様酵素ダイサーによって、特徴的な５’末端及び３’末端を有する２１〜２５のヌクレオチド断片に切断されるｄｓＲＮＡによって引き起こされる。これらのｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断するタンパク質Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２を含むＰＡＺ／ＰＩＷＩドメインを含む多タンパク質複合体のガイドとして機能する。これらの遺伝子サイレンシングメカニズムは、非常に特異的かつ強力であり、生物全体に遺伝子発現の阻害を潜在的に誘導し得る。
【０００３】
これまでの２０年の間に、非ウイルスベクター及びウイルスベクター双方の継続的な開発を含む、遺伝子発現技術の飛躍的な進歩も見られた。遺伝子発現への非ウイルス的アプローチは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の使用を伴うものであり、これは、使用及び調製の容易さ、安定性及び耐熱性、ならびに無制限のサイズなど、多くの利点を有する。プラスミドは、哺乳動物宿主中で複製することはなく、また宿主ゲノム中に組込まれることはないが、数週間から数ヶ月間の期間、宿主細胞中に存続し、クローン化遺伝子を発現することができる。
【０００４】
阻害性ＲＮＡ分子の使用において新たな関心が認められるようになった１つの分野は、感染症、特に蚊媒介感染症である。例えば、５００を超える節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）が同定されており、そのうち約１００は、ヒトに有害である。このような疾患は、通常蚊によって広がり、世界の人口のほぼ半分に影響を及ぼし、年間１００万人以上の死者を出し、結果的に、疾患負荷に関連して相当額の経済的損失となる。重要なことに、米国は、世界的な旅行の加速、地球温暖化、及び蚊の生息地の拡大により、ジカウイルスなど、既存の及び新興の蚊感染疾患による脅威の増大に直面している。さらに、マラリア、デング熱、ジカなど、多くの蚊媒介性疾患については、現在いかなるワクチンもない。これらの疾患では、蚊の防除が依然として病気の蔓延を制限するための最良の選択肢である。
【０００５】
蚊又は他の疾患ベクター集団を防除するための伝統的な方法としては、農薬の使用及びベクター防除方法が挙げられる。既存の伝統的な殺虫剤防除方法では、現場技術者（ｆｉｅｌｄ  ｔｅｃｈｎｉｃｉａｎ）に依存しているが、現場技術者では、多くの飼育場所を見つけること、及び処理することは、数多くあり、ときに奥地にあることもあるため、不可能である場合もある。追加の方法は、航空機により区域全体を処理すること、又はトラックに搭載した噴霧器から風力により散布することからなる。残念なことに、噴霧器では多くの飼育場所を処理することができず、変動する環境条件によって複雑になっている。さらに、天然及び人工の水容器の調査により、蚊及び他の節足動物が、地上レベルよりも高い木の穴及び溝など、さまざまなサイズの隠蔽色水プールにおいて卵が見つかり、生息し、産卵するのに非常に効率的であることが実証されている。結果として、これらの伝統的な方法は、病気を運ぶ蚊の集団を効果的に防除し、かつそれらが運ぶ病原体が人間の宿主に伝播するのを最終的に防ぐには十分ではない。
【０００６】
ある特定の例では、前世紀におけるベクター防除戦略の大部分は、ジクロロ−ジフェニル−トリクロロエタン（ＤＤＴ）などの化学薬剤がベースであった。殺虫剤は、ヤブカ属及びハマダラカ属の蚊を防除するために首尾よく使用されてきたが、現在の生態学的及び環境保護基準では、ヒトなどの非標的種に対する多くの殺虫剤の悪影響、環境への影響、土壌及び水の汚染、ならびに選択的プロセスの開発、及びその後の殺虫剤に対する蚊の抵抗性などの理由により、こうしたアプローチは許可されていない。したがって、殺虫剤の使用に代わる新しい戦略を作り出す必要があった。
【０００７】
特に、蚊の高い生殖能力及び高いゲノムの柔軟性が、これらの昆虫の管理を非常に困難なものにしている。それらのゲノムの柔軟性が高いことは、化学的及び生物学的殺虫剤に対する蚊集団の抵抗性、ならびに異なる環境条件及び気候変動に適応するそれらの能力によって実証されている。したがって、大規模に使用することができ、かつ環境に優しい、有効な代替的な防除形態が早急に必要とされている。
【０００８】
上記のように、ヒト病原体の担体として作用する蚊は、特に防除が困難である。ベクター感染の典型的なプロセスは、一部が上皮に確実に遭遇するのに十分な数の病原体を含む血粉中で、病原体が蚊に入るときに始まる。血液は、節足動物の中腸に沈着している。病原体は、中腸感染バリア（ＭＩＢ）と呼ばれる上皮を通過できる必要がある。上皮内に入ると、病原体は必ず複製し、上皮を横断し、中腸回避バリア（ＭＥＢ）と呼ばれるプロセスにおいて、中腸から血体腔に入る。次いで、病原体は、様々な蚊の組織で必ず増殖するが、最終的にはある程度十分な量の病原体が唾液腺感染バリア（ＳＩＢ）を克服するプロセスにおいて、蚊の唾液腺に侵入する必要がある。そこで病原体は複製し、感染サイクルを完了するために感受性動物宿主に注射されるときのその後の血液供給時に、唾液腺回避バリア（ＳＥＢ）として記載されているプロセスにおいて、最終的に、その病原体が唾液腺を回避する必要がある。この全体のプロセスは、外因性潜伏期間（ＥＩＰ）と呼ばれる期間中に、蚊内において完了するまでに数日を要する場合もある。その過程で、病原体及び節足動物のベクターの反応能にも影響を与え得る病原体に対するさまざまなバリアなど、節足動物に関連する他の要因がある。病原体は、節足動物の消化酵素及び消化プロセス、細胞内プロセス、ならびに節足動物の免疫システムに遭遇する。
【０００９】
ベクターの水平アルボウイルス感染は、ウイルス性脊椎動物宿主上での感受性のある雌性蚊の吸血時に確立し得る。媒介昆虫内では、アルボウイルスは中腸内での複製、その後、血リンパを介した全身伝播及び唾液腺内での複製を含む複雑なライフサイクルを有する。吸血中のナイーブ脊椎動物宿主へのアルボウイルスの伝播は、唾液中において高いウイルス力価を必要とする。解剖学的及び免疫学的バリアは、ウイルスがこうした力価に到達し、したがって、首尾よくナイーブ宿主に対する伝播を達成する能力に影響を与える。効率よく複製されるにもかかわらず、アルボウイルスが病状を引き起こすことはなく、このことは、昆虫免疫系がウイルス感染を非病原性レベルに制限していることを示唆している。自然免疫は、微生物侵入者に対して第一線の防御をもたらし、かつ生殖細胞系にコードされた受容体による病原体の認識後に、迅速に活性化することによって定義される。これらの受容体は、微生物のクラス間で保存されているが、細菌細胞壁成分及びウイルス二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡなどの、宿主には存在しない小分子モチーフを認識する。これらのモチーフは、まとめて、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と称される。
【００１０】
例えば、ＲＮＡｉは、一般にＲＮＡサイレンシングとして公知である遺伝子発現の調節のための分子機構のうちの１つであり、昆虫の抗ウイルス免疫において中心的な役割を果たす。特に、ＲＮＡｉ応答、メカニズム又は経路は、感染細胞の死を引き起こすことなくウイルス複製を阻害する。例えば、ＲＮＡｉは、逆位反復ＲＮＡを発現するトランスジェニック蚊からデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ２）を排除して、ウイルスに対するＲＮＡｉ経路を引き起し得ることが示されている。しかしながら、アルボウイルスは、ＲＮＡｉ機構によって標的化されているにもかかわらず、アルボウイルス感染伝播能力のある媒介蚊中において、２１ｎｔのウイルス由来低分子干渉ＲＮＡ（ｖｉＲＮＡ）が存在することによって示されるように、ベクターに持続的に感染し得る（非特許文献１、２）。
【００１１】
特に、いくつかの昆虫病原性ウイルスは、複製中にＲＮＡｉのウイルスコードタンパク質サプレッサー（ＶＳＲ）を発現する。昆虫ウイルス感染細胞におけるＶＳＲの発現は、結果的にウイルス産生の増大をもたらすが、ほとんどの場合、これらはウイルス感染の病原性を大幅に増加させる病原性因子である。例えば、ネッタイシマカにおけるＲＮＡｉ機構の一時的に誘発されたサイレンシングにより、ＳＩＮＶ（シンドビスウイルス）及びＤＥＮＶ２（デング熱ウイルス）の力価が有意に増加し、それと共に中腸感染及び播種率が増加し、外因性潜伏期間が短縮した（非特許文献３、４、５）。昆虫に関与する研究において、インビトロで合成されたｄｓＲＮＡを、実質的にあらゆる発育段階に投与する（例えば直接注射による）ことで、機能喪失突然変異体を生じ得る（非特許文献６，７，８，９）。
【００１２】
ｄｓＲＮＡの摂食に関する研究により、カメムシ類、甲虫類、及び鱗翅目の昆虫など、多くの昆虫において効果的な遺伝子ノックダウン効果が明らかになった。エピフィアス・ポストビタナ（Ｅ．ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）幼虫にｄｓＲＮＡを給餌することで、幼虫中腸内におけるカルボキシルエステラーゼ遺伝子ＥｐｏｓＣＸＥ１の発現を阻害し、また成虫アンテナにおけるフェロモン結合タンパク質ＥｐｏｓＰＢＰ１の発現も阻害することが示されている（非特許文献１０）。また、ｄｓＲＮＡを給餌することで、ロドニウスプロリクサス（Ｒ．ｐｒｏｌｉｘｕｓ）の唾液腺におけるニトロフォリン２（ＮＰ２）遺伝子の発現を阻害し、血漿の凝固時間が短縮した（非特許文献１１）。
【００１３】
同様に、新たに孵化したアワノメイガの幼虫へｄｓＲＮＡを直接噴霧することが報告されている（非特許文献１２）。研究では、ＤＳ１０遺伝子及びＤＳ２８遺伝子のｄｓＲＮＡ（５０ｎｇ／ｐＬ）（すなわち、それぞれキモトリプシン様セリンプロテアーゼＣ３（ＤＳ１０）及び未知のタンパク質（ＤＳ２８））を、濾紙上に置いた新たに孵化した幼虫に噴霧した後の幼虫の死亡率は約４０〜５０％であったが、１０の遺伝子のｄｓＲＮＡを人工飼料と共に幼虫に噴霧した後のその死亡率は７３〜１００％の範囲まで有意に高かったことを示した。これらの結果から、鱗翅目昆虫では、ｄｓＲＮＡが外皮を貫通して、幼虫の発育を遅らせることができ、最終的には死に至らせることが提唱された（非特許文献１３）。
【００１４】
蚊において、アフリカのマラリア蚊（ガンビエハマダラカ）では、幼虫の食餌による遺伝子サイレンシングを仲介するために、キトサン／ｄｓＲＮＡ自己集合ナノ粒子を使用するＲＮＡｉ法が示された（非特許文献１４）。黄熱病蚊ネッタイシマカの幼虫へｄｓＲＮＡを経口送達することも、殺虫性であることが示された。ＲＮＡｉを誘導するには、トランスフェクション試薬又はｄｓＲＮＡ担体を使用することなく、ｄｓＲＮＡに比較的短時間浸漬するのみで十分であり、成長を妨げるか、又は蚊の幼虫を殺すことができることが判明した（非特許文献９）。さらに、ＲＮＡｉ経路遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、ネッタイシマカにおいてデングウイルス（ＤＥＮＶ）の複製を増加させること、及びウイルス伝播に必要な外因性潜伏期間を短縮することが記載されていた（非特許文献４）。
【００１５】
ＤＥＮＶ感染時の蚊の転写プロファイルを記述している近年発表されたＲＮＡ配列分析では、中腸サンプルにおいて、特質的な蓄積を伴う免疫関連遺伝子を表す全ての転写産物が、ＤＥＮＶ蚊よりも防除が常に高いことを示しており、これは、感染後に昆虫免疫系の抑制が存在するという結論を裏付けている。この結果は、観察された一般的な「ＤＥＮＶ下方制御傾向」を反映している可能性がある。感染後の早い時点での死体サンプルにおいて同様のパターンが見られたが、感染後１４日目（ｄｐｉ）にはその反対が観察された。これは、感染の経過中に免疫調節が変化する可能性を反映したものである（非特許文献１５）。
【００１６】
ベクター媒介性病原体の生物的防除のための別の方法としては、パラトランスジェネシスが挙げられる。パラトランスジェネシスは、一般に共生細菌が遺伝的に組み換えられ、蚊などの病原体保有ベクターに再導入され、これらがエフェクター分子を発現するシステムを指す。しかし、パラトランスジェネシスはいくつかの技術的制限を有する。例えば、パラトランスジェネシスに使用される細菌は、一般的に３つの重要な構成成分、所望の効果を達成するエフェクター分子、細菌の表面にエフェクター分子を提示するか、又は排出するメカニズム、及び予想される量のエフェクター分子を産生し、それによって蚊において所望の効果を達成するのに十分な長さで蚊内において生存することができる細菌を有している必要がある。したがって、これらの基準のすべてに適合する、こうした好適な細菌を見つけることは非常に困難である。
【００１７】
パラトランスジェネシスは、一般に、ベクターの共生体のトランスジェネシスを介する、ベクター集団からの病原体の排除を試みる技術として理解されている。この技術の目的は、ベクター媒介性疾患を防除することである。第１の工程は、ベクター種による病原体の伝播を妨げるタンパク質を同定することである。次いで、これらのタンパク質をコードする遺伝子が、共生体に導入され、その結果、それらはベクター中で発現し得る。この戦略の最後の工程は、野生のベクター集団にこれらのトランスジェニック共生体を導入することである。パラトランスジェネシスを実行するための成功したｎ次の特徴として、以下を挙げることができる：
−共生細菌は、インビトロで容易に成長させ得る、
−それらの細菌は、所望の遺伝子を含むプラスミドを用いた形質転換などによって、遺伝的に組み替えさせ得る。
−操作された共生体は、安定しており、かつ安全である。
−ベクターと共生体との関連付けを弱めることはできない。
−現場での送達は、扱いが容易である。
【００１８】
パラトランスジェニックシステムとは、標的生物においてパラトランスジェネシスを達成できるシステムである。
【００１９】
昆虫が棲息する多くの生物の中で、特にそれらの消化系において、ヒト又は動物に対して非病原性である好適な共生細菌を同定することは、パラトランスジェニックシステムの成功にとって、最も重要である。蚊では、これらの細菌は主に中腸内において消化に関連するさまざまな生物学的機能に関与している。血液依存性の昆虫と、卵黄形成及び卵形成の同化プロセスを助ける共生微生物との間には密接な関係がある。これらの細菌が根絶すると、生殖能が低下し、かつ成長速度が遅くなる。蚊の血粉中におけるタンパク質の消化に干渉することは、生殖能を低下させる可能性があり、かつ蚊の集団を防除し、かつ病原体の伝播を防ぐための新しいアプローチを提示し得る。
【００２０】
例えば、選択された細菌は、それらが異なる種及び分離された株に展開され得るように、多種多様な蚊種のコロニーを形成することができなければならない。さらに、血液の摂取後に細菌の数が劇的に増加し（１００倍〜１０００倍）、結果として、ＧＭ細菌によって発現され、分泌されるエフェクター分子の量が比例的に増加し、病原体の伝播を妨害する、蚊のベクター能力を低下させる、卵の受精を妨げる、胚形成に干渉する、蚊の死を引き起こすなど、様々な結果がもたらされる。これらの技術的及び生理学的課題は、パラトランスジェニックシステムの開発を極めて困難にしている。重要なことに、これらの技術的問題は、多くのパラトランスジェニックシステムが効果的でもなく、また有効な生物的防除戦略としても適切ではないということである。これらの困難な点はまた、多くのパラトランスジェニックシステムが、環境配置に有効であるように適切に拡大されることを妨げる可能性がある。一般に、生物的防除は、選択された病原体の感染、発現及び／又は伝播を排除、防除又は予防するために疾患を抑制する微生物を利用することを意味する。
【００２１】
これらの伝統的な防除方法の欠点に取り組むために、野外での適応度及び不妊雄の放飼を操作することなど、蚊の細菌感染など、成虫の蚊集団を防除するためのいくつかの他の生物学的又は非化学的防除戦略が開発された。これらの技術は、蚊集団を制御する可能性を有しているが、現場での飼育の必要性、及びかなりのコストで何百万もの操作された蚊又は感染蚊の局所的放飼などの制限も有する。さらに、これらの戦略は、各々が、防除戦略の導入及び播種のために飼育しなければならない（血粉を必要とする）成虫の蚊集団の防除に焦点を当てている。したがって、頑強で、長期間にわたって効果的であり、かつ環境への悪影響を最小限に抑える、新しく効果的な生物的防除戦略が必要とされている。これらの目的を達成するために、ベクターを防除するための戦略は、１）病原体（ウイルス）に特異的であり、かつ標的外生物を殺さないこと、２）作用機序において頑強であるか、又は触媒作用であること、３）安定しており、蚊の発生を通して容易に失われないこと、４）効率的に送達されること、５）管理が簡単であり、低コストであること、及び６）自立的又は再生的であること、を必要とする。
【００２２】
病気を伝播する蚊集団の生物的防除に関する前述の問題は、それに対する効果的で、かつ経済的な解決策に対する長年にわたる必要性を表している可能性がある。実装エレメントが利用可能であった可能性もあるが、この必要性を満たす実際の試みがある程度欠けていた可能性がある。これは、当業者が、問題の本質及び関与する課題を十分に認識又は理解していなかったためであり得る。こうした理解の欠如の結果として、これらの長年にわたる必要性を満たすための試みは、ここで特定された問題又は課題のうちの１つ以上を効果的に解決できなかった可能性がある。これらの試みは、本発明の技術によって取られる技術的な方向から遠ざかってさえいる可能性があり、本発明の技術の成果がある程度、当分野の一部で行われているアプローチの予想外の結果と見なされることさえあり得る。以下により詳細に論じるように、現在の本発明の技術は、真に効果的で拡張性のあるベクターの生物的防除戦略の目的を満たしながら、伝統的な蚊防除システム、特にパラトランスジェニック生物的防除システムの限界を克服する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｓｃｏｔｔら（２０１０））、ＰＬＯＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ４：ｅ８４８
【非特許文献２】Ｈｅｓｓら、（２０１１）ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１：４５
【非特許文献３】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（２００８）ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：４７
【非特許文献４】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｖａｒｇａｓら、（２００９）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ５：ｅｌ０００２９９
【非特許文献５】Ｋｈｏｏら、（２０１０）ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１０：１３０
【非特許文献６】Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔら、（２００２）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：２６７−２７１
【非特許文献７】Ａｍｄａｍら、（２００３）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１
【非特許文献８】Ｔｏｍｏｙａｓｕ  ａｎｄ  Ｄｅｎｅｌｌ（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２１４：５７５−５７８
【非特許文献９】Ｓｉｎｇｈら、（２０１３）Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｓｃｉ．１３：６９
【非特許文献１０】Ｔｕｒｎｅｒら、（２００６）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：３８３−３９１
【非特許文献１１】Ａｒａｕｊｏら、（２００６）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：６８３−６９３
【非特許文献１２】Ｗａｎｇら、（２０１１）ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅｌ８６４４
【非特許文献１３】Ｋａｔｏｃｈ（２０１３）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７１（４）：８４７−７３
【非特許文献１４】Ｚｈａｎｇら、（２０１０）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）１９（５）：６８３−６９３
【非特許文献１５】Ｂｏｎｉｚｚｏｎｉら、（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（１１）：ｅ５０５１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、蚊及び／又は幼虫の健康を標的とする操作された微生物を導入することによって蚊及びその幼虫の機能を不能にし、かつ潜在的に死滅させるための新規のこの界におけるメカニズム（ｃｒｏｓｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を使用して、蚊媒介性疾患を防除する新規システム及び戦略を含み得る。
【００２５】
本発明の１つの目的には、新規のパラトランスジェニック生物的防除戦略を含み得る。この実施形態において、本発明の技術は、幼虫から成虫までの蚊の全ての発育段階において、必須ウイルス遺伝子をノックダウンするための様々なこの界におけるメカニズムを含む。これは、選択されたウイルス及び／又は宿主遺伝子を下方制御及び／又は抑制し得る特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現する蚊集団へ操作された微生物を導入することにより、達成され得る。
【００２６】
本発明の別の目的は、重要なウイルス遺伝子を下方制御し得る特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現し得る新規な遺伝子操作された微生物を蚊に感染させることを含んでもよい。１つの好ましい実施形態では、死亡率を増加させ、かつ耐性機序が進化する可能性を低下させるために、複数の必須ウイルス遺伝子を同時に抑制し得るｄｓＲＮＡを発現するように１つ以上の微生物を遺伝子操作してもよい。本発明の１つの目的は、１つ以上の病原体ウイルス遺伝子を標的とし、抑制し得るｄｓＲＮＡを発現するための１つ以上の微生物の形質転換を含み得る新規のパラトランスジェニックシステムを生成することを含み得る。このシステムは、１つ以上の病原体ウイルス遺伝子を標的とし、かつ抑制し得る選択ｄｓＲＮＡを発現するようにさらに形質転換され得る病原体保有蚊の腸にコロニーを形成することができる適切な腸内細菌のスクリーニング及び選択を行うことを含み得る。このような標的としては、ビリオン複製に必要な構造的及び／又は必須の遺伝的要素を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の別の特定の目的は、蚊におけるジカウイルスの発現及び生殖を抑制し得る新規のトランストランスジェニックシステムを提供することである。このシステムは、１つ以上の病原体ウイルス遺伝子を標的とし、かつ抑制し得る選択ｄｓＲＮＡを発現するようにさらに形質転換され得るジカ保有蚊の腸にコロニーを形成することができる適切な腸内細菌のスクリーニング及び選択を行うことを含み得る。このような標的としては、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３及びＮＳ４遺伝子をコードするジカゲノムの一般的に保存された領域を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の生物的防除システムの別の目的は、取り込み、安定化、及び細胞間転移を増強し得るヘルパー遺伝子の同時発現及び／又は蚊におけるｄｓＲＮＡの動員によって、ｄｓＲＮＡの生存及び／又は蚊などの疾患保有ベクターへの送達を最適化することであり得る。このようなヘルパー遺伝子の例は、以下の表２に提供する。例えば、蚊の腸にコロニーを形成し得る、又は蚊の腸内で内共生し得る１つ以上の微生物は、ｄｓＲＮＡなどの選択された干渉ＲＮＡ分子を発現するように遺伝子組み換えされてもよい。こうして遺伝子操作された内共生細菌は、例えば経口送達及び／又は幼虫の感染を通じて、様々な蚊集団に導入され得る。ジカウイルスを防除するために、１つ以上の遺伝子組み換えされた腸内細菌は、構造的及び／又は非構造的遺伝子標的をコードする単一の転写物を標的とするｄｓＲＮＡを発現し得る。
【００２９】
本発明の別の目的は、成虫の蚊においてヒトウイルス病原体を選択的に減少させることが可能であり得るように、サイレンシングのために多数の必須ウイルス特異的遺伝子標的を標的とする方法を含み得る。ｓｉＲＮＡは活性において触媒であり得るので、それらの潜在的な有効性及び安全性は、広域スペクトル化学殺虫剤よりも十分に高く、それによって上記で概説した制限のいくつかが克服され得る。さらに、特定の実施形態では、阻害性ＲＮＡは非免疫原性であり、そのためこれらのＲＮＡは、非標的生物を害することがないように、種特異的であるように設計することができる。最後に、細菌ベースのｄｓＲＮＡ送達システムは、自立的かつ長期的であり得るので、空中散布など、より少量の塗布が必要とされ得る。
【００３０】
本発明の別の目的は、これらの遺伝子操作された微生物の環境的拡散方法を提供することである。こうした方法は、最も低いコストで最も広い土地を網羅するために、空中散布（例えば、クロップダスター）を利用してもよい。当分野で公知の追加の分散方法もまた、本発明の技術の範囲内で企図され得る。重要なことに、多くの微生物は数年間土壌中で乾燥状態を維持することができ、そのため、沈殿後の乾燥地域の再集団化が可能になる。これは、乾季と雨季との間に交互に幼生の生息地が出現し、消滅する地域に特に適している。また、こうした属性は、以前に概説した伝統的な蚊防除システムの限界を克服するものである。
【００３１】
本発明の技術の別の目的には、成虫の蚊における、また、成虫の蚊の組織及び／又は幼虫におけるｄｓＲＮＡの分布における、生物工学による腸内種などの改変微生物の獲得及び持続性を評価するための試験手順を含み得る。１つの好ましい実施形態では、蚊におけるジカに対するｓｉＲＮＡの腸内細菌送達、又は他の病原体の持続性及び複製の有効性を決定することができる。この実施形態では、操作された腸内細菌を保有する蚊及び対照蚊は、生きたジカウイルスを含有する人工血粉を与えられ、指定された期間インキュベートされ、殺され、ウイルスの存在についてアッセイされ得る。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
一実施形態では、野生から捕獲された蚊の幼虫及び成虫（複数の場所としては、ブラジル、米国、及びボルネオ島などを挙げることができる）からの蚊の腸のサンプルを回収することができる。これらのサンプルをさらに分析して、幼虫が好む食物微生物（藻類、シアノバクテリア、細菌）、ならびに成虫及び幼虫の両方に存続する微生物を同定するためのそれらの関連メタゲノムを決定することができる。次いで、目的１で確認されたｄｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡ送達及びｄｓＲＮＡ媒介殺傷を増大するために遺伝的に形質転換可能である微生物に下方選択及び導入することが可能であり得る。先に論じたように、特定の幼虫の腸内微生物は、虫齢の発育を通して成虫期まで存続し得る。これらの微生物は、蚊を標的とするｓｉＲＮＡ、及び成虫の蚊によって伝播されるヒト病原体を標的とするｓｉＲＮＡの長期送達において特に魅力的であり、したがって別の層の疾病管理をもたらす。
【００３３】
本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本明細書に組み込まれてその一部を形成する添付の図面は、本発明の１つ以上の実施形態を例解しており、その説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。これらの図面は、本発明の１つ以上の好ましい実施形態を例解する目的のためのみのものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】ｄｓＲＮＡ−デング熱を発現するＨＩ  １５大腸菌に感染した蚊の腸におけるｄｓ−ＲＮＡ−デング熱の検出を示す図である。
【図２】ＭＡＬＤＩバイオタイピング及び１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングに基づいて、事前に同定された標的細菌のリストを示す図である。
【図３】ｅＹＦＰ送達ベクターの概略図及びその一実施形態におけるｅＹＦＰ細菌を発現する細菌内共生生物のサンプル画像を示す図である。Ｔｎ７送達プラスミドは、プラスミドｐＡＣｏｍｅｇａＧｍからのアセチルトランスフェラーゼ−３−１をコードするａａｃＣｌによって提供されるゲンタマイシン耐性遺伝子（ＧｍＲ）と共に示す。送達プラスミドは、ｐＵＣ１９をベースにし、かつアンピシリン耐性を保有している。Ωは、耐性遺伝子が転写及び翻訳ターミネーターに隣接しており、蛍光タンパク質がＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入したものであることを示す。全ての構築物は、蛍光遺伝子及びターミネーターＴ０及びＴ１の前にリボソーム結合部位、ＲＢＳＩ１を含む。有用な既知の制限部位が示されており、図は一定の縮尺で描かれたものではない。
【図４】その一実施形態において、ｅＹＦＰ細菌を発現している代表的な内共生株を示す図である。
【図５】その一実施形態における選択された内共生細菌による蚊の代表的な成長促進を示す図である。具体的には、細菌の内共生生物で飼育された代表的な幼虫（左パネル、細菌分離株Ａｅｌ６５を示す）は、蚊飼育溶液に細菌を添加しなかったものよりも早く成長する（右パネル、陰性対照）。
【図６】その一実施形態における選択された内共生細菌に感染した蚊の代表的な蛹化率を示す図である。具体的には、ｅＹＦＰを発現するように操作された細菌株を幼虫に与えた。シュードモナス種（Ａｅ０７６、Ａｅｌ４２、及びＡｅｌ７１）、ならびにパントエア／エンテロバクター種（Ａｅ０５３、Ａｅ０９０、及びＡｅｌ６５）を対数中央値まで増殖し、５００μＬの滅菌肝臓粉末を添加した５０ｍＬの滅菌ミリＱ水中で最終濃度ＯＤ０．３に希釈した。孵化後２４時間幼虫をペン／連鎖球菌で処理し、次いで洗浄し、細菌株を含有する給餌溶液に移した。陰性対照幼虫を、５００μＬの滅菌肝臓粉末を含む５０ｍＬの滅菌ミリＱ水に入れた（細菌を添加しなかった）。上のグラフは、ｅＹＦＰで標識された細菌を与えられた６つの幼虫群及び陰性対照の幼虫の推定蛹化率を示している。各細菌株について、１１日目に、２ｍＬの一晩培養物をｅＹＦＰ幼虫給餌溶液に添加したところ、蛹化が増加した。
【図７】成虫の蚊の細菌の内共生コロニーを形成するために、シュードモナス・プチダ特異的／Ｔｎ７  ＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ検出を示す図である。この実施形態では、成虫の蚊には、シュードモナス・プチダの３つの細菌内共生株（Ａｅ０７６、Ａｅｌ４２、及びＡｅｌ７１）を与え、陰性対照の蚊には、エンテロバクター株（Ａｅｌ６５）を与えた。蚊を、滅菌乳棒を用いて１００μｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で均質化した。Ａｅ０７６については、陽性対照用に４つの対照Ａｅｌ６５蚊を均質化し、様々な量の一晩培養物を添加して、ＰＣＲ反応の潜在的検出限界を決定した。均質化された蚊は、ヒートブロック中において９９℃で２０分間煮沸した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の陰性対照も含む。
【図８】細菌からのｄｓＲＮＡの分泌を示す図である。
【図９Ａ】ＺＩＫＶの約１１ｋｂゲノムのゲノム構成を示す図である。赤い線は、ｓｉ−ＲＮＡ媒介サイレンシングの標的領域を示す。６つの異なる標的領域に由来する配列（長さ５２０〜５８０ｎｔ）は、主要な血管拡張性ペプチドを生成するネッタイシマカのシアロキニン１遺伝子の小さなイントロンによって分離されたセンス及びアンチセンスの配向に配置されて、配列相同性依存性ＲＮＡｉトリガーとして作用するＩＲ構築物を形成する。
【図９Ｂ】ジカウイルスゲノム構成を示す図である。ジカは、一本鎖の、約１０．８キロベースのプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。Ｃ＝キャプシド、ｐｒＭ＝前駆体膜、Ｅ＝エンベロープ、Ｎ＝ビリオンの一部ではない非構造タンパク質、ＵＴＲ＝非翻訳領域。
【図１０】例示的な感染性クローン、ｐＪＷ２３２のマッピング、及びその一実施形態におけるＮＳ２Ｂ−ＮＳ４Ａ領域に由来する５つのｄｓＲＮＡ（それぞれ＞５３０ｂｐ）を示す図である。
【図１１】その一実施形態において、蚊内在性ダイサーがｄｓＲＮＡを処理した後に生成されたｓｉＲＮＡを検出するために使用されたＤＥＮＶ２ゲノム及びプローブ（緑色及び赤色）を標的とするｄｓＲＮＡのスキームを示す図である。
【図１２】糖を給餌した蚊（対照）及びｄｓＲＮＡを産生する糖＋細菌（ｄｓＤＥＮＶ２）からの小型ＲＮＡを検出するためのノーザンブロットを示す図である。矢印は、ＤＥＮＶ２に対する前駆体ｄｓＲＮＡから生成されたｓｉＲＮＡ（２１〜２３ｎｔ）を示す。Ａｅ−ｍｉＲ−１は、内在性のマイクロＲＮＡネッタイシマカであり、小型ＲＮＡの陽性対照として使用する。
【図１３】ＭＲＥ１６のみを注射した蚊と比較して、２つの異なる大腸菌株に予め感染させ、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現し、次いで血粉中のＭＲＥ１６ウイルスに感染させた成虫の蚊、又は大腸菌に予め感染させ、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現せずに、ＭＲＥ１６ウイルスを注射した成虫の蚊において、ｅＧＦＰ蛍光レベルにおいて、無細菌対照に対して、５対数倍、又は１００，０００倍の減少が観察されたことを実証するデータである。大腸菌に予め感染させ、再び株ＨＴ１１５及びＨＴ２７に感染させ、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現し、かつｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ（４００ｎｇ）に感染させた蚊には、ＭＲＥ１６ウイルスの注射も行い、ｅＧＦＰの発現を抑制する最大可能範囲を決定した。これらの蚊が、ｅＧＦＰを発現することはなかった。
【図１４Ａ】ウイルスがコードする遺伝子のサイレンシングを行うためのｄｓＲＮＡの腸内細菌送達を実証する図である。
【図１４Ｂ】本発明の細菌で処理した蚊の中の残りのウイルスを小さな点として示している図である。全てのウイルスが原因で示されている場合、対照（ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ発現細菌はない）は濃い緑色である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、様々な態様を含み、それらは異なる方法で組み合わせてもよい。以下の説明は、要素を列挙し、本発明の実施形態のいくつかを説明するために提供される。これらの要素は、最初の実施形態と共に列挙されているが、それらは任意の様式及び任意の数で組み合わせて、追加の実施形態を作り出すことができることを理解されたい。様々に記載された例及び好ましい実施形態は、明確に記載されたシステム、技術、及び用途のみに本発明を限定すると解釈されるものではない。さらに、この説明は、開示された要素を任意の数で、各要素を単独で、この用途又はこれ以降の用途におけるすべての様々な要素の順列及び組み合わせで、あらゆる様々な実施形態、システム、技法、方法、装置、及び用途のすべての説明及び特許請求の範囲を支持し、かつ包含するものと理解されたい。
【００３６】
上記のとおり、一実施形態では、本発明は、ＲＮＡｉをベースとした戦略を実施するための新規な方法をさらに含み得る新規なパラトランスジェニックシステムを含み、天然の蚊の共生細菌が、ネッタイシマカの中腸又は腸で特定のアルボウイルスゲノム由来のｄｓＲＮＡを発現するプラスミドで形質転換されて、アルボウイルスの伝播を減少するか、又は消失させる。
【００３７】
上記のように、ネッタイシマカ種などのような蚊は、天然の抗アルボウイルス防御機構ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を保有する。簡単に言うと、エキソｓｉＲＮＡ  ＲＮＡｉ経路を使用することにより、ネッタイシマカはウイルス複製中に生成されたアルボウイルスの長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを認識し、それをダイサー２と呼ばれるＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリー酵素で２１ｂｐの短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）セグメントに消化し、複製するウイルスゲノムを同定し、切断し、不活性化するためのエフェクターとして使用する。
【００３８】
したがって、本発明の一態様によれば、病原性感染蚊を防除する方法が提供され、この方法は、蚊の少なくとも１つの蚊病原体耐性遺伝子産物の発現を特異的に下方制御する核酸配列を含む単離された核酸剤を蚊の幼虫に投与することを含み、幼虫における少なくとも１つの蚊病原体耐性遺伝子の発現を下方制御することにより、蚊の成虫期を病原体に対して、致死的に感受性にし、それによって病原性感染蚊を防除する。好ましい一実施形態では、そのような核酸剤は、配列番号１〜５を含んでもよい。追加の実施形態は、病原体の様々な株のゲノム間の平均相同性よりも高い相同領域に及ぶ任意の核酸を含み得る。好ましい一実施形態では、ジカウイルス又はデング熱ウイルスの様々な株のゲノム間の平均相同性よりも高い相同領域に及ぶ任意の核酸を含み得る。ジカゲノムの例では、これは、以下に一般的に示されるように、とりわけ非構造タンパク質ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４をコードする領域を含み得る。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、病原体−ベクターの生物的防除のための新規パラトランスジェニックシステムを生成することを含む。本発明は、具体的には、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を病原体／疾患伝播性生物に送達するように構成されたパラトランスジェニックシステムを含み得る。一実施形態では、本発明は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を病原体／疾患伝播性蚊に送達するように構成された１つ以上の遺伝子操作された微生物を含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上のｄｓＲＮＡ分子を病原体／疾患伝播性蚊に送達するように構成されている１つ以上の遺伝子操作された腸内細菌を含んでもよい。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、標的の疾患伝播性生物、この場合は蚊と内共生し得る１つ以上の腸内細菌を生成することを含む。これらの内共生腸内細菌は、蚊の発育のすべての段階を通して腸内に存続し得る。この好ましい実施形態は、標的疾患伝播性生物（この場合は蚊）と内共生することができ、かつ標的疾患伝播性生物の腸又は中腸にコロニーを形成することができる１つ以上の腸内細菌を生成することを含んでもよい。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、１つ以上のｄｓＲＮＡ（二本鎖）分子を生成するために、さらに遺伝的に組み換え又は形質転換される、標的疾患伝播性生物（この場合は蚊）と内共生することができ、かつ標的疾患伝播性生物の腸又は中腸にコロニーを形成することができる１つ以上の腸内細菌を生成することを含む。これらのｄｓＲＮＡ分子は、１つ以上の病原体遺伝子に対応し得る。さらに、ｄｓＲＮＡ分子は、選択されたウイルス遺伝子のＲＮＡ媒介下方制御又は抑制を生じさせ得る。選択されたウイルス遺伝子のこうしたＲＮＡ媒介下方制御又は抑制は、本明細書に概して記載される干渉ＲＮＡプロセスを介してもよい。
【００４２】
別の実施形態は、標的疾患伝播性生物と内共生することができ、かつジカ感染蚊の腸又は中腸にコロニーを形成することができ、また、本明細書で同定されたものの中でも特に、ジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）又はデング熱ウイルス（ＤＥＮＧＶ）のうちの１つ以上の病原体遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ分子を連続的に送達するようにさらに構成され、また、標的ウイルス遺伝子の抑制を引き起こす干渉ＲＮＡ媒介反応をさらに誘発し得る１つ以上の腸内細菌を生成することを含む。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、標的疾患伝播性生物と内共生することができ、かつジカ感染蚊の腸又は中腸にコロニーを形成することができ、ジカウイルスなどの蚊媒介性病原体を標的とする致死的ｓｉＲＮＡを連続して送達するようにさらに構成された１つ以上の腸内細菌を生成することを含む。ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、センス領域及びアンチセンス領域を含むＲＮＡ二本鎖であり、アンチセンス領域は、標的遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ配列に相補的な複数の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、標的病原体遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ配列は、平均相同性がより高い領域に位置する遺伝子、すなわち、換言すれば、遺伝子の病原体の他の株の配列と比較すると、病原体ゲノムが最も保存された領域に完全に又は部分的に位置する遺伝子を含み得る。１つの特定の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５は、配列番号６中の非構造タンパク質コード領域に対応する。当然のことながら、こうした配列は、それらが代替的に、１つ以上の異なる遺伝子コードセグメントにおいて重複しているか、又は重なっている可能性があるので例示的なものである。
【００４４】
本発明は、複数の病原体遺伝子を調節するための１つ以上のベクターをさらに含み得、１つ又は複数のｄｓＲＮＡを含むベクターは、１つ以上の選択された病原体遺伝子に対応し得る。この実施形態は、プラスミド発現系の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、このプラスミドは、プロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子抑制カセットなど、１つ以上の発現カセットを有することができ、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子、又は引き続いて、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子を生成し、ＲＮＡ干渉によって標的病原体遺伝子の発現を減少させる分子をコードする。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態は、複数の宿主遺伝子を調節するためのベクターを含み、１つ、又は複数のｄｓＲＮＡを含むベクターが１つ以上の選択された宿主遺伝子に対応し得る。この実施形態は、プラスミド発現系の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、このプラスミドは、プロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子抑制カセットなど、１つ以上の発現カセットを有することができ、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子、又は引き続いて、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子を生成し、ＲＮＡ干渉によって標的宿主遺伝子の発現を減少させる分子をコードする。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、宿主及び病原体遺伝子を調節するためのベクターを含み、このベクターは、１つ以上の選択された宿主及び病原体遺伝子に対応し得る１つ、又は複数のｄｓＲＮＡを含む。この実施形態は、プラスミド発現系の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、このプラスミドは、プロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子抑制カセットなど、１つ以上の発現カセットを有することができ、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子、又は引き続いて、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子を生成し、ＲＮＡ干渉によって標的宿主遺伝子の発現を減少させる分子をコードする。この遺伝子カセットは、プロモーター配列に作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドをさらに含んでもよく、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子、又は引き続いて、ｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子を生成し、ＲＮＡ干渉によって標的病原体遺伝子の発現を減少させる分子をコードする。
【００４７】
別の態様において、本発明は、本発明のベクターを宿主に投与することによって宿主内の１つ以上の病原体遺伝子の発現を調節する方法を含み、第１のポリヌクレオチド配列は宿主において発現し、この第１のポリヌクレオチドを転写して、ＲＮＡ分子を産生し、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を減少させることができる。さらなる実施形態は、他の場所に記載されるようにヘルパー遺伝子を発現し得る第２のポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００４８】
本発明はまた、宿主におけるウイルス又は細菌性遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含み、ベクターは、プロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子抑制カセットを含み、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉による宿主内での標的病原体遺伝子の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子をコードする。一実施形態では、ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
同様に、本発明のベクターは、複数の遺伝子抑制カセットを含むことができ、各遺伝子抑制カセットは、同じｍＲＮＡ配列又は異なるｍＲＮＡ配列を標的とするｄｓＲＮＡなどのｓｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、各遺伝子抑制カセットは、２つ以上の異なる遺伝子のｍＲＮＡ配列を標的とするｄｓＲＮＡ分子をコードし得る。さらに、本発明の各ベクターは、複数の遺伝子促進カセット及び複数の遺伝子抑制カセットを含み得る。
【００５０】
遺伝子抑制カセットのための好適なプロモーターの例としては、Ｔ７プロモーター、ｂｌａプロモーター、Ｕ６プロモーター、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、Ｅｌｌプロモーター、及びＣＭＶプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。任意により、遺伝子促進カセット及び遺伝子抑制カセットのプロモーター配列の各々は、誘導性及び／又は組織特異的であり得る。
【００５１】
本発明のベクターは、プラスミドなどの非ウイルス性、又はアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポリオウイルス、レンチウイルス、ＦＩＳＶ、又はマウスマロニー系ウイルスなどのウイルスベクターであり得る。任意の病原体遺伝子が、干渉の標的となり得る。一実施形態では、ウイルス遺伝子は、アルファウイルス病原体（例えば、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、及びチクングニアウイルス）、フラビウイルス病原体（例えば、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ウエストナイル熱ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイ脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス）、ブニヤウイルス病原体（例えば、ラクロス脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス）、オルソブニヤ病原体（例えば、オロプーシェウイルス）、オルビウイルス（例えば、ブルータング病ウイルス）などのアルボウイルス病原体のウイルス遺伝子であり得る。
【００５２】
さらなる病原体遺伝子が、干渉の標的となり得る。一実施形態では、虫病原体遺伝子は、蚊に感染し得る線虫のウイルス遺伝子、又は他の生物、例えばフィラリア線虫、例えばバンクロフト糸状虫、Ｂｍｇｉａ  ｍａｌａｙｉ、Ｂｍｇｉａ  ｐａｈａｎｇｉ、Ｂｒｕｇｉａ  ｔｉｍｏｒｉ及び犬糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）であり得る。
【００５３】
さらなる病原体遺伝子が、干渉の標的となり得る。一実施形態では、細菌遺伝子は、蚊又は他の生物（ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ボレリア属（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、及びエルビニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）など）に感染するグラム陰性菌及びグラム陽性菌のウイルス遺伝子であり得る。
【００５４】
さらなる病原体遺伝子が、干渉の標的となり得る。一実施形態では、細菌遺伝子は、マラリア属のマラリア原虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、ネズミマラリア原虫、ニワトリマラリア原虫、及びサルマラリア原虫など、蚊によって伝播され得る病原体のウイルス遺伝子であってもよい。
【００５５】
標的遺伝子は、遺伝子の発現に重要な複製、転写、翻訳又は他のプロセスを調節するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をコードする配列を含み得る。標的遺伝子は必ずしもポリペプチドをコードする必要はないが、リボソームＲＮＡ、スプライソソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡなどの他の細胞成分をコードしてもよい。例えば、ジカウイルスなどの病原体の調節配列を標的とすることができる。標的配列は、標的遺伝子の全配列、又は好ましくは標的遺伝子の一部のみであり得る。
【００５６】
好ましい実施形態では、ジヌクレオチド３‘オーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞において抗ウイルス応答を回避し、かつ遺伝子特異的サイレンシングを誘導することが実証されている。好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス領域及びアンチセンス領域は、連結している。好ましくは、センス領域及びアンチセンス領域は、ポリヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子（本明細書では「スペース」とも呼ばれる）を介して共有結合している。ポリヌクレオチドリンカーは、様々な長さであり得る。好ましくは、リンカーは、約６〜１２ヌクレオチド長の範囲内である。
【００５７】
好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は部分的に自己相補的であり、したがってステム及びループ構造を形成する。ＲＮＡ二本鎖のセンス領域及びアンチセンス領域は、バルジ（ｂｕｌｇｅ）又は二次構造（ヘアピン構造など）が形成されるように、１つ以上のミスマッチを含む。好ましくは、ＲＮＡ二本鎖は、約４〜約２３ヌクレオチド塩基対ミスマッチの範囲内を含む。より好ましくは、ＲＮＡ二本鎖は、約７〜約９ヌクレオチド塩基対ミスマッチの範囲内を含む。代替の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、適切な条件が与えられたときに二本鎖を形成するように実質的に相補的である２本の別々の鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）を含む。
【００５８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のベクターを宿主に投与することによって宿主内の１つ以上の病原体遺伝子の発現を調節する方法を含み、第１のポリヌクレオチド配列は宿主において発現し、この第１のポリヌクレオチドを転写して、ｄｓＲＮＡ分子を産生し、ｄｓＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を減少させることができる。さらなる実施形態は、他の場所に記載されるようにヘルパー遺伝子を発現し得る第２のポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００５９】
本発明はまた、宿主におけるウイルス又は細菌性遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含むことができ、ベクターはプロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子抑制カセットを含み、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉による宿主内での標的ウイルス又は細菌性遺伝子の発現を減少させるように構成され得るｓｉＲＮＡ分子をコードする。いかなるウイルス性又は細菌性遺伝子も、干渉の標的となり得る。一実施形態では、ウイルス遺伝子はデング熱ウイルス（ＤＶ）遺伝子である。デング熱ウイルスゲノムの任意の遺伝子（約１１，０００ヌクレオチド）を標的とすることができる。標的遺伝子は、例えば、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードし得る。典型的には、標的デング遺伝子は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、及びＮＳ５からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードするであろう。遺伝子領域はまた、いくつかの実施形態では、様々なデング株での保存された配列相同性に基づいて標的化されてもよい。任意により、ベクターは、プロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子促進カセットをさらに含む。別の態様では、本発明は、宿主にベクターを投与することによって宿主内の細菌性又はウイルス遺伝子（デングウイルス遺伝子など）の発現を阻害する方法を含み、ポリヌクレオチド配列は転写されてｓｉＲＮＡ分子を産生し、またｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉によって宿主内の標的細菌又はウイルス遺伝子（デング熱ウイルスなど）の発現を減少させることができる。したがって、本発明は、そのようなベクターを宿主に投与することによって、細菌感染症又はウイルス感染症（デング熱ウイルスなど）を阻害する方法を含む。
【００６０】
本発明はまた、宿主におけるウイルス又は細菌性遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含むことができ、ベクターはプロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子抑制カセットを含み、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉による宿主内での標的ウイルス又は細菌性遺伝子の発現を減少させるように構成され得るｓｉＲＮＡ分子をコードする。いかなるウイルス性又は細菌性遺伝子も、干渉の標的となり得る。一実施形態では、ウイルス遺伝子はジカウイルス遺伝子である。ジカウイルスゲノムの任意の遺伝子（約１１，０００ヌクレオチド）を標的とすることができる。標的遺伝子は、例えば、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードし得る。典型的には、標的デング遺伝子は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、２Ｋ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードするであろう。遺伝子領域はまた、いくつかの実施形態では、様々なジカ株での保存された配列相同性に基づいて標的化されてもよい。任意により、ベクターは、プロモーター配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの遺伝子促進カセットをさらに含む。別の態様では、本発明は、宿主にベクターを投与することによって宿主内の細菌性又はウイルス遺伝子（ジカウイルス遺伝子など）の発現を阻害する方法を含み、ポリヌクレオチド配列は転写されてｓｉＲＮＡ分子を産生し、またｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉によって宿主内の標的細菌又はウイルス遺伝子（ジカウイルスなど）の発現を減少させることができる。したがって、本発明は、そのようなベクターを宿主に投与することによって、細菌感染症又はウイルス感染症（ジカウイルスなど）を阻害する方法を含む。
【００６１】
さらなる態様では、本発明は、治療上有効量の本発明の任意のベクター及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。
【００６２】
本発明の別の目的は、標的細菌における阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）の発現のレベル及びタイミングを制御するための新規な方法であり得る。好ましい一実施形態では、１つ以上のａｓＲＮＡ分子の発現は、プラスミドベクターに組み込まれ得る新規遺伝子スイッチの制御下にあってもよい。この遺伝子スイッチは、スイッチ分子によって制御することができ、この分子は、宿主生物の環境又は食料供給に加えることができる水溶性及び食品グレードの分子であり得る。こうしたスイッチ分子の存在は、例えばｄｓＲＮＡの産生を活性化し得る。スイッチ分子が存在しない場合、ｄｓＲＮＡの産生は起こらないか、又はごくわずかなレベルでのみ起こり得る。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、蚊の中腸にコロニーを形成し、ウイルス性病原体が中腸から周囲の上皮に逃げるのを防ぐように構成され得る、遺伝子操作された腸内細菌を提供するための新規方法を含み得る。より具体的には、本発明の目的の１つは、遺伝子操作された腸内細菌を蚊の中腸に導入し、中腸内にｄｓＲＮＡを産生及び分泌するようにさらに構成することであり得る。これらのｄｓＲＮＡ分子は、周囲の上皮細胞によって取り込まれ、ウイルスの複製を妨げる強力なＲＮＡｉカスケードを引き起こし、かつ／又は病原体レベルを抑制して、有意な数のビリオンが蚊の中腸周囲の上皮細胞から蚊の唾液腺に移動できないようにする。
【００６４】
本発明の１つの好ましい実施形態は、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｄｓＲＮＡのヘアピンループに位置する標的生物由来のイントロンを含み得る）、ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子を発現するようにさらに遺伝子操作され得る細菌を提供し得る。これらの阻害性ＲＮＡ分子は、宿主のダイサー／ＲＩＳＣ複合体によって媒介される約２１〜２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの生成を通じて、病原体中の標的遺伝子の発現を不活性化及び／又はノックダウンすることができる。このプロセスは一般に、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれることがある。
【００６５】
上記のように、一実施形態では、新規のパラトランスジェニックシステムは、病原性、必須又は他の遺伝子を選択的に不活性化することによって、特定の病原体の毒性を制御するためのシステム及び方法を含み得る。この標的遺伝子の不活性化は、ウイルスの複製が起こり得る標的宿主細胞への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は小型ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）などの阻害性ＲＮＡ分子の発現及び送達によって達成することができる。好ましい実施形態では、蚊の腸内において現在コロニーを形成した遺伝子組み換え細菌によって生成されたｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを認識し得、ウイルスの複製を防ぎ、かつ／又は病原体を抑制するＲＮＡ媒介干渉カスケードを開始し得る周囲の上皮細胞によって取り込まれ得る。これにより、有意な数のビリオンが蚊の中腸の周囲の上皮細胞から蚊の唾液腺に移動することができないようにする。
【００６６】
具体的には、標的宿主の上皮細胞において、ｄｓＲＮＡは、酵素であるダイサーの作用を介して約２１ヌクレオチド長の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされ得る。これらのｓｉＲＮＡは、Ａｇｏ及びＲＩＳＣタンパク質複合体とさらに相互作用して、標的病原体特異的ｍＲＮＡ配列に結合し得る。最後に、ＲＩＳＣ複合体は、病原体特異的ｍＲＮＡのサイレンシングを切断するか、又は標的病原性もしくは他の標的遺伝子の発現をノックダウンし、病原体の毒性、複製及び／もしくは増殖を遮断してもよい。
【００６７】
標的動物／細胞／組織への阻害性ＲＮＡ分子の送達は、生物界間接合経送達システムを介して達成され得る。好ましい実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子の送達は、腸内細菌又は他の細菌などの遺伝的に組み換えされた宿主特異的微生物の導入を介して達成され得る。これらはダイサー／ＲＩＳＣ機構を欠いているために、細菌はｓｉＲＮＡに対してｄｓＲＮＡを処理することはできないことから、標的宿主に送達されたｄｓＲＮＡは、標的ウイルス遺伝子を不活性化し得るｓｉＲＮＡに宿主によって処理されなければならない。このような遺伝的に組み換えされた宿主特異的微生物としては、１）標的動物の正常な内部又は外部細菌微生物叢の一部である微生物、２）標的動物、組織、細胞又は宿主環境にコロニーを形成することができるように組み換えされている微生物、３）標的宿主によって食物又はエネルギー源として利用される微生物、又は４）特定の動物、組織、細胞又は宿主環境にコロニーを形成するように組み換えされている微生物を挙げることができる。この実施形態では、コロニー形成した細菌は、宿主のダイサー／ＲＩＳＣ複合体によってさらにプロセシングされ得るｄｓＲＮＡ／ｓｈＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子を発現し得、これにより、病原体特異的ｍＲＮＡサイレンシング／必須病原体遺伝子の不活性化が可能になり得る。さらに、宿主の天然の微生物叢の一部となったこれらのコロニー形成した腸内細菌は、初期の幼虫期から成虫期まで、腸を介してｄｓＲＮＡ分子を連続的に送達することができ、これにより、宿主の全ライフサイクルで、必須病原体遺伝子の病原体特異的ｍＲＮＡサイレンシング／不活性化をもたらす。さらに、腸内細菌ベクターは、宿主の微生物叢のすでに天然に存在する部分である可能性があるので、その存在は生物、環境又は最終消費者にいかなる危険ももたらすことはあり得ない。
【００６８】
さらなる実施形態では、標的上皮細胞は、エンドサイトーシス、小胞輸送、貪食、及び／又は他の能動的又は受動的ポリヌクレオチド輸送プロセスを介して、蚊の腸に位置する形質転換パラトランスジェニック細菌によって分泌されるｄｓＲＮＡを取り込むことができる。
【００６９】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離された核酸剤に関し、より具体的には、排他的ではないが、病原体に感染した蚊を防除するためのその使用に関する。昆虫は、ウイルス、細菌、原生動物、線虫などの多数の病原体のためのベクターである。
【００７０】
本発明の技術の別の態様は、病原体の生物的防除のための新規パラトランスジェニックシステムを含み得る。本発明の技術は、蚊媒介性病原体、特に、それぞれデング又はジカウイルスなどの、ヒトに対して病原性であり得る蚊媒介性ウイルス病原体の生物的防除のための新規のパラトランスジェニックシステムをさらに含み得る。例えば、病原体遺伝子を下方制御することの作用はまた、転写されることからの病原体遺伝子の下方制御を具体的に包含し得ることに留意すべきである。それは単なる転写又は翻訳の下方制御のいずれかに限定されると考えられるべきではなく、明らかにその両方である。
【００７１】
本発明の技術の別の態様は、例えばｄｓＲＮＡの蚊内在性ダイサープロセシングの作用を通して、ｓｉＲＮＡ阻害カスケード反応を誘導することができる１つ以上のｄｓＲＮＡを送達するように構成された遺伝子組み換え微生物を生成するための新規方法及びシステムを含み得る。それによって、病原体コード遺伝子の発現を減少させるか、又はある場合にはそのサイレンシングを行う。本発明は、蚊がネッタイシマカ、ヒトスジシマカ及びガンビエハマダラカからなる群から選択される種である、蚊内の病原体を抑制することを目的としたパラトランスジェニックシステムを生成することができる。このパラトランスジェニックシステムは、ウイルス感染、線虫感染、原虫感染及び細菌感染の生物的防除のために使用することができる。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、アルボウイルスがアルファウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス及びオルビウイルスからなる群から選択され得る、アルボウイルス病原体を抑制することを目的とするパラトランスジェニックシステムを生成する新規方法を含み得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、アルボウイルスは、ラクロス脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ブルータング病ウイルス、シンドビスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、オロプーシェウイルス、フロックハウスウイルス、及びジカウイルス、などからなる群から選択される。
【００７３】
本発明の別の態様は、マラリア原虫によって引き起こされる感染症などの原虫病原体を抑制することを目的としたパラトランスジェニックシステムを生成するための新規方法を含み得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、原虫感染症はマラリアを引き起こす。本発明の別の実施形態は、線虫病原体を抑制することを目的としたパラトランスジェニックシステムを生成することである。本発明のいくつかの実施形態によれば、線虫感染は、犬糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）又はバンクロフト糸状虫によって引き起こされる。
【００７４】
本発明の別の発明的態様は、単離された核酸剤と、蚊及び微生物中の少なくとも１つの蚊病原体遺伝子の発現を特異的に下方制御するｄｓＲＮＡとしての核酸配列とを含む蚊幼虫摂取可能化合物、又は蚊の幼虫が摂取する藻類を提供することであり得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の蚊幼虫摂取可能化合物は、溶液として配合され得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、蚊幼虫摂取可能化合物は、固形又は半固形配合物に配合される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、遺伝子は、病原性、コートタンパク質、代謝活性、感染経路及び／又はエネルギー産生などに必須である１つ以上の標的病原体遺伝子からなる群から選択される。標的遺伝子は、病原性、又は宿主内に疾患状態を引き起こす能力に関与する１つ以上の遺伝子を含み得る。このような標的遺伝子の例はまた、１つ以上の病原性因子を含んでもよい。このような病原性因子の例としては、これらに限定するものではないが、以下を挙げることができる：
−付着因子：この群には、細菌性病原体が特定の細胞に付着するのを助ける遺伝子が含まれ得る；
−侵入因子：この群には、細菌が宿主細胞に侵入できるようにする表面成分の遺伝子が含まれ得る；
−カプセル：この群には、オプソニン作用及び貪食から細菌を保護し得る構造カプセルのための遺伝子が含まれ得る；
−エンドトキシン：この群には、免疫反応を誘発し得る数種類の毒性リポ多糖の遺伝子が含まれ得る；
−エキソトキシン：この群には、病原菌から産生及び／又は分泌される数種類のタンパク質毒素及び酵素の遺伝子が含まれ得る。主なカテゴリーとしては、細胞毒素、神経毒素、及びエンテロトキシンが挙げられる。
−シデロホア：この群には、ヘモグロビン、トランスフェリン、及びラクトフェリンに結合している、いくつかの細菌を鉄の宿主と競合できるような数種類の鉄結合因子の遺伝子を含み得る。
−宿主転換因子：この群には、病原体の利益のために宿主の代謝を改変する遺伝子が含まれてもよく、これには、宿主防御を回避することを含むが、これに限定されない。
【００７６】
本発明の１つの好ましい実施形態は、少なくとも１つの病原体遺伝子の発現を特異的に下方制御する核酸配列を発現するポリヌクレオチドを含む単離された核酸剤を含んでもよい。好ましい実施形態では、この単離された核酸剤は、ｓｉＲＮＡプロセスを通して少なくとも１つの蚊病原体の発現を特異的に下方制御するｄｓＲＮＡ配列を発現するポリヌクレオチドを含んでもよい。本発明の別の実施形態は、本発明のいくつかの実施形態の、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡを形成し得る核酸剤などの単離された核酸剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物を含んでもよい。
【００７７】
細菌性ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩは、ｄｓＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子を分解し得る。一実施形態では、本発明の技術は、減少したＲＮａｓｅ  ＩＩＩ発現、又は不活性化されたＲＮａｓｅ  ＩＩＩ機能もしくは活性を有するように以前に同定された宿主特異的細菌を改変することを含んでもよい。ＲＮＡａｓｅ  ＩＩＩの発現及び／又は活性におけるこうした減少又は不活性化は、より小さなＲＮＡ種へのｄｓＲＮＡのＲＮａｓｅ  ＩＩＩ媒介性プロセシングを阻害又は減少させ得る。１つの好ましい実施形態において、以前に同定された宿主特異的細菌は、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ欠損バックグラウンドにおいて阻害性ＲＮＡ分子を効率的に発現するように遺伝子組み換えされ得る。この好ましい実施形態において、宿主特異的細菌のＲＮＡｓｅＩＩＩ遺伝子は、相同組換え又は他の適切な方法によってノックアウトされ得る。
【００７８】
本発明の技術の別の実施形態は、阻害性ＲＮＡ分子の安定化及び／又は動員を増強することが知られている宿主特異的細菌遺伝子の過剰発現を促進するためのシステム及び方法を含み得る。この好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡを安定化させることが知られている１つ以上の遺伝子を過剰発現させてその寿命を延ばし、宿主生物／細胞／組織内でのその移動を容易にすることができる。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡを安定化することが知られている遺伝子を調節又は抑制する１つ以上の遺伝子をノックアウトし、結果として、それらの上方制御をもたらし、それによってｄｓＲＮＡの寿命を延ばして、宿主生物内でのその移動を容易にし、ウイルス遺伝子阻害を高めてもよい。さらなる実施形態はまた、ｄｓＲＮＡ動員及び宿主生物への送達を容易にするための膜小胞輸送の上方制御をもたらし得る遺伝子を過剰発現させ得るか、又は遺伝子ノックアウトを標的化し得る。
【００７９】
前述のシステムのそれぞれは、プロモーター、ターミネーター、コアクチベーター及びコリプレッサーなどの転写調節エレメント、ならびに原核生物系及び真核生物系において調節され得る他の制御エレメントを含み得る遺伝子構築物において具体化され得る。そのようなシステムは、システム内で発現される阻害性ＲＮＡ分子又は他のタンパク質の種類、タイミング及び量の制御を可能にする。追加の実施形態は、病原体（タンパク質であっても）に応答して生成されるストレス関連タンパク質、病原体などによって生成される他の前駆体化合物などの特定のタンパク質又は化合物の存在など、追加の外部因子及び／又は環境因子によって誘導され得る遺伝子構築物を含んでもよい。このような有益な共発現ポリペプチドは一般に、「ヘルパー」遺伝子又は「ヘルパー」タンパク質と呼ばれることがある。
【００８０】
本発明の別の目的は、本発明のいくつかの実施形態の、ｄｓＲＮＡなどの単離された核酸剤、又はプラスミドなどの核酸構築物を含む細胞を含み得る。本発明は、病原体遺伝子の抑制、ｄｓＲＮＡの生存、ｄｓＲＮＡの取り込み、ｄｓＲＮＡの分泌などを助け得る１つ以上の「ヘルパー」遺伝子をさらに含み得る、本発明のいくつかの実施形態の、ｄｓＲＮＡなどの単離された核酸剤、又はプラスミドなどの核酸構築物を含む細胞をさらに含んでもよい。本発明の別の目的は、核酸剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）伝播ベクターとして、自己栄養性細菌、ならびにＲＮａｓｅ  ＩＩＩ欠損細菌株を使用することを含み得る。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、本発明のいくつかの実施形態の、ｄｓＲＮＡなどの単離された核酸剤、又はプラスミドなどの核酸構築物を含む細胞を含み得、この細胞は、細菌細胞、藻類細胞、腸内細菌、水面微生物の細胞からなる群から選択される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の細胞を含む蚊幼虫摂取可能化合物が提供される。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸剤はｄｓＲＮＡである。本発明のいくつかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される。本発明の他の実施形態によれば、核酸剤は、ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子抑制を開始するポリヌクレオチドである。本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は１５〜５３０塩基対の長さである。本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は、１５〜２６５０塩基対の長さである。本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は、２６５０塩基対を超える長さである。本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は、５３０塩基対の長さである。
【００８３】
本発明の代替の実施形態によれば、核酸配列は、病原体遺伝子と直接対応するが、代替の実施形態では、核酸配列は１つ以上の病原体遺伝子と対応するか又は重なっている。本発明のいくつかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ核酸配列は、病原体遺伝子と直接対応するが、代替の実施形態では、ｄｓＲＮＡ核酸配列は、１つ以上の病原体遺伝子と対応するか又は重なっている。
【００８４】
上記のように、本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は、ジカウイルス遺伝子（例えば、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、又はＮＳ４遺伝子）と直接対応するが、代替的実施形態では、核酸配列は、１つ以上のジカウイルス遺伝子（例えば、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４遺伝子にわたる配列決定の１つ以上の部分）と対応しているか、又は重なっている。本発明のいくつかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ核酸配列は、ジカウイルス遺伝子と対応するが、代替の実施形態では、ｄｓＲＮＡ核酸配列は、１つ以上の病原体遺伝子と対応するか又は重なっている。
【００８５】
本発明の追加の実施形態によれば、核酸配列は、他の対応するゲノム部分と比較して、病原体の他の株における同じゲノムセグメントに対してより高い程度の相同性を有するゲノム配列と直接対応する。本発明のいくつかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ核酸配列は、他の対応するゲノム部分と比較して、病原体の他の株における同じゲノムセグメントに対してより高い程度の相同性を有するジカウイルスのゲノム配列と一致する。
【００８６】
本発明の一実施形態は、異なる株間の相同性に基づいて病原体ゲノムの選択された部分に対して、最適化されたｄｓＲＮＡ配列を選択するための新規のインビトロ及び／又はインビボ方法を含み得る。最適化されたｄｓＲＮＡ配列は、インビトロ及び／又はインビボでより高い割合の遺伝子及び／又は病原体の抑制をもたらし得る。
【００８７】
本発明の代替の実施形態は、病原体遺伝子抑制の効果的なパラトランスジェニックシステムにおいて利用され得る内共生細菌を選択するための新規のインビトロ及び／又はインビボ方法を含み得る。特に、本発明の別の目的は、病原体遺伝子抑制の効果的なパラトランスジェニックシステムにおいて利用され得る内共生蚊腸内細菌を選択するための新規のインビトロ及び／又はインビボ方法を含み得る。これらの内共生蚊腸内細菌は、ヒトにおいて非病原性であり得、培養性、形質転換性、プラスミド動員性であり得、ｄｓＲＮＡなどの標的核酸を分泌することができ、野生型蚊集団において固有のものであるか、又は固有のものになり得、標的蚊が必要とする摂取量の制限された曝露及び給餌で、生活のあらゆる段階において、その環境中で生存し、かつ蚊に食べられること、又は取り込まれることが可能になる。
【００８８】
別の態様では、本発明は、本発明のベクターを産生するための方法を含む。なお別の態様において、本発明は、例えば、図１０に示されるもののような組換えプラスミドでの形質転換を介して、本発明の形質転換又は遺伝子組み換え微生物を産生するための方法を含む。
【００８９】
本明細書で使用される用語「蚊（複数可）」は、蚊科の昆虫を指す。本発明の蚊は、成虫の蚊、蚊の幼虫、蛹又はそれらの卵を含み得る。典型的には、蚊のライフサイクルは、卵、幼虫、蛹、成虫という４つの異なる段階を含む。したがって、蚊のライフサイクルは、卵が水面（例：イエカ、ハボシカ、及びハマダラカの種）又は水に浸水している湿った土壌（例：ヤブカの種）に置かれると始まる。ほとんどの卵は４８時間以内に幼虫に孵化する。幼虫は水中に生息し、微生物及び有機物を食べ、表面に来て呼吸する。これらの幼虫は、４回脱皮して、それぞれの脱皮後に成長し、４回目の脱皮で幼虫は蛹に変わる。蛹期は、約２日の休息、非摂食期である。この時点で、蚊は、成虫に変わる。発育が完了すると、蛹の皮膚が分裂し、蚊が成虫として出現する。
【００９０】
一実施形態によれば、蚊は、ハマダラカ亜科及びナミカ亜科の蚊である。一実施形態によれば、蚊は、イエカ属、ハボシカ属、ハマダラカ属、及びヤブカ属である。例示的な蚊としては、これらに限定されるものではないが、ヤブカ属（例えば、ネッタイシマカ、ヒトスシマカ、ポリネシアヤブカ、  Ａｅｄｅｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ａｅｄｅｓ  ｃａｎｔａｔｏｒ、Ａｅｄｅｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｒｕｓｔｉｃｕｓ、キンイロヤブカ（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）、ハマダラカ属（例えば、ガンビエハマダラカ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｆｒｅｅｂｏｒｎｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｒａｂｉｅｎｓｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｆｕｎｅｓｔｕｓ、ガンビアハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｍｏｕｃｈｅｔｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｂａｌａｂａｃｅｎｓｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｂａｉｍａｉｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｃｕｌｉｃｉｆａｃｉｅｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｄｉｍｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｌａｔｅｎｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｌｅｕｃｏｓｐｈｙｒｕｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ、コガラハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｍｉｎｉｍｕｓ）、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ．ｓｄ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｕｎｄａｉｃｕｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｕｐｅｒｐｉｃｔｕｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｆａｒａｕｔｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｅｒｇｅｎｔｉｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｔｒｏｐａｒｖｕｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｐｕｎｃｔｉｐｅｎｎｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｂｅｌｌａｔｏｒ及びＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｃｒｕｚｉｉ）、イエカ属（例えば、Ｃ．ａｎｎｕｌｉｒｏｓｔｒｉｓ、Ｃ．ａｎｔｅｎｎａｔｕｓ、Ｃ．ｊｅｎｓｅｎｉ、Ｃ．ｐｉｐｉｅｎｓ、Ｃ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｃ．ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｃ．ｒａｊａｈ、Ｃ．ｒｅｓｔｕａｎｓ、Ｃ．ｓａｌｉｎａｒｉｕｓ、Ｃ．ｔａｒｓａｌｉｓ、Ｃ．ｔｅｒｒｉｔａｎｓ、Ｃ．ｔｈｅｉｌｅｒｉ及びＣ．ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）、ならびにハボシカ属（例えば、  Ｃｕｌｉｓｅｔａ．ｉｎｃｉｄｅｎｓ、  Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｉｍｐａｔｉｅｎｓ、Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｉｎｏｒｎａｔａ及びＣｕｌｉｓｅｔａ  ｐａｒｔｉｃｅｐｓ）が挙げられる。
【００９１】
一実施形態によれば、蚊は、疾患を引き起こす病原体を伝播させ得る。蚊によって伝播する病原体としては、ウイルス、原虫、虫及び細菌が挙げられる。
【００９２】
本明細書で使用される句「宿主」又は「病原性感染蚊」は、疾患を引き起こす病原体を保有する蚊を指す。典型的には、蚊は病原体に感染し（例えば、血粉を介して）、病原体のためのベクターとして働き、病原体の複製（例えば、蚊の中腸及び唾液腺における）及び病原体の宿主への伝播が可能になる。
【００９３】
蚊及びこれらの蚊が伝播する病原体の非限定例としては、マラリア原虫及びミクロフィラリアを伝播するハマダラカ属（例えば、ガンビエハマダラカ）、アルボウイルス（脳炎ウイルスなど）及びまたバンクロフト糸状虫を伝播するいくつかの種；ウエストナイルウイルス、フィラリア症、日本脳炎、セントルイス脳炎及びトリマラリアを感染させるイエカ属の種（例えば、アカイエカ）；線虫病原体（例：犬糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ））を伝播するヤブカ属の種（例えば、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ、及びポリネシアヤブカ）、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎、チクングニア病などの疾患を引き起こすアルファウイルス病原体などのアルボウイルス病原体；日本脳炎、マレーバレー脳炎、ウエストナイル熱、黄熱病、デング熱などの疾患を引き起こすフラビウイルス病原体、及びラクロス脳炎、リフトバレー熱、及びコロラドダニ熱などの疾患を引き起こすブニヤウイルス病原体が挙げられる。
【００９４】
一実施形態によれば、ネッタイシマカによって伝播し得る病原体は、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、チクングニアウイルス及び糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）である。一実施形態によれば、ヒトスジシマカによって伝播し得る病原体としては、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、チクングンヤ熱ウイルスが挙げられる。一実施形態によれば、ガンビエハマダラカによって伝播し得る病原体としては、これらに限定するものではないが、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、ネズミマラリア原虫、ニワトリマラリア原虫及びサルマラリア原虫などのマラリア属のマラリア原虫が挙げられる。
【００９５】
本明細書で使用される用語「防除すること」及び／又は「生物的防除すること」とは、病原体／疾患の進行及び／又は伝播を減少させること、及び／又は調節することを指す。
【００９６】
本明細書で使用される用語「核酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。典型的には、「核酸」又は「核酸剤」ポリマーは、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態で発生するが、三本以上の鎖を含む構造を形成することも知られている。用語「核酸」としては、天然核酸ポリマー、ならびに既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸が挙げられ、これらは、合成、天然及び非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。例示的な類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、及び「単離された核酸断片」は、本明細書では同義的に用いられる。
【００９７】
本明細書で使用される用語「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で、又は材料が産生されるとき、材料に通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。例示的な実施形態では、純度及び均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種である核酸又は特定の細菌は、実質的に精製されている。例示的な実施形態において、用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中に本質的に１つのバンドを生じさせることを意味する。典型的には、単離された核酸又はタンパク質は、範囲で表されるレベルの純度を有する。成分の純度の範囲の下限は、約６０％、約７０％又は約８０％であり、純度の範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％以上である。
【００９８】
例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して用いられる場合の用語「組換え」は、細胞、生物、核酸、タンパク質もしくはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、又は天然核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、又は細胞がそのように修飾された細胞に由来していることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然型（非組換え型又は野生型）内には見られない遺伝子を発現し得るか、そうでなければ異常発現、過剰発現、過少発現又はまったく発現しない天然遺伝子を発現し得る。
【００９９】
「遺伝子操作された」、「バイオ形質転換された」、「トランスジェニック」、「形質転換された」、「形質転換」、及び「トランスフェクション」という用語は、「組換え」と意味が類似している。「形質転換」、「トランスジェニック」、及び「トランスフェクション」は、宿主生物のゲノム又は細胞へポリヌクレオチドを移入することを指す。このようなポリヌクレオチドの移入は、ポリヌクレオチドの遺伝的に安定な継承、又は染色体外に残存する（細胞の染色体に組み込まれていない）ポリヌクレオチドをもたらし得る。遺伝的に安定な継承は、トランスジェニック生物又は細胞が生存及び／又は成長するために、移入されたポリヌクレオチドの一部又は全部の転写を必要とする１つ以上の状態にある期間、トランスジェニック生物又は細胞をさらすことを潜在的に必要とし得る。細胞に形質転換されるが宿主の染色体に組み込まれないポリヌクレオチドは、細胞内に発現ベクターとして残る。発現ベクターが細胞内又は細胞の子孫内に留まるためには、特定の成長又は環境条件下で細胞を成長させる必要があり得る。さらに、発現が起こるためには、生物又は細胞を特定の条件下で維持する必要があり得る。組換えポリヌクレオチドを含有する宿主生物又は細胞は、「トランスジェニック」又は「形質転換」生物又は細胞、あるいは単に「形質転換体」、ならびに組換え生物又は細胞と称し得る。
【０１００】
遺伝的に組み換えされた生物とは、核又は細胞質（オルガネラ）内であるかにかかわらず、その遺伝物質に何らかの変化があるあらゆる生物である。そのため、遺伝的に組み換えされた生物は、組換え生物又は形質転換生物であり得る。遺伝的に組み換えされた生物はまた、野生型生物（すなわち、突然変異原にさらされていない生物）と比較して、１つ以上の突然変異原にさらされた生物、又は１つ以上の変異原にさらされ、かつ１つ以上の突然変異原によって引き起こされたそのＤＮＡの変化を有する生物の子孫であり得る。また、その遺伝物質に突然変異を組み入れるために繁殖された生物は、遺伝的に組み換えされた生物である。
【０１０１】
用語「ベクター」は、それによってＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又はポリペプチドを宿主に導入することができるいくつかの手段を指す。宿主に導入されるポリヌクレオチド、タンパク質、及びポリペプチドは、本来は治療用又は予防用であり得、抗原をコードするか、又は抗原であり得る。また本来は調節性であり得る。ウイルス、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、及び細菌など、さまざまな種類のベクターが存在する。
【０１０２】
「発現ベクター」は、選択された宿主細胞又は生物中で複製することができる核酸である。発現ベクターは自律構造として複製することができるか、あるいは宿主細胞の染色体又はオルガネラの核酸に全体的又は部分的に組み込むことができるか、あるいは外来ＤＮＡを細胞に送達するためのシャトルとして使用され、このため宿主細胞ゲノムと共に複製する。したがって、発現ベクターは、選択された宿主細胞、オルガネラ、又は生物、例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体、核酸断片中で複製することができるポリヌクレオチドであり、発現ベクター上の特定の遺伝子（目的の遺伝子を含む）が細胞、オルガネラ又は生物内でポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される。又は発現ベクターは、「発現カセット」を含む、又は当技術分野において公知の任意の適切な構築物であり得る。対照的に、本明細書の実施例に記載されるように、「カセット」は、本発明の発現ベクターのある部分を含むポリヌクレオチドである。カセットを使用することで、発現ベクターの組み立てを助ける発現ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、キメラウイルス、又はコスミドなどのレプリコンであり、発現制御配列（複数可）に作動可能に連結された所望のポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０３】
ポリヌクレオチド配列は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するときに、「発現制御配列（複数可）に作動可能に連結している」（例えば、プロモーター及び任意によりエンハンサー）。本明細書で使用される句「遺伝子産物」は、ＲＮＡ分子又はタンパク質を指す。
【０１０４】
本発明では、分子生物学の分野における日常的な技術を利用する。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的なテキストとしては、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，第４版、２０１２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９３）、及びＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４−ｃｕｒｒｅｎｔ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓが挙げられる。特に断りのない限り、技術用語は従来の用法に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発行、２００７年）（ＩＳＢＮ  ０７６３７４０６３２）、Ｋｒｅｂｓら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．発行、１９９４年）（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．，発行１９９５年、）（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【０１０５】
本教示は、選択された蚊種に従って相同体及びオルソログを標的化することを企図している。相同配列は、オルソロガス配列及びパラロガス配列の両方を含む。用語「パラロガス」は、パラロガス遺伝子を導く種のゲノム内の遺伝子重複に関する。用語「オルソロガス」は、祖先関係が原因で異なる生物における相同遺伝子に関する。このように、オルソログは、所与の２つの種の最後の共通の祖先における単一の祖先遺伝子から派生した進化的対応物であり（Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ  ａｎｄ  Ｇａｌｐｅｒｉｎ  ＭＹ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ；２００３）、Ｃｈａｐｔｅｒ２，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｎｃｂｉ(ｄｏｔ)ｎｌｍ(ｄｏｔ)ｎｉｈ(ｄｏｔ)ｇｏｖ/ｂｏｏｋｓ/ＮＢＫ２０２５５)より入手可能）、したがって、同じ機能を有する可能性が非常に高い。そのため、オルソログは通常、他の種において、元の種の役割と同様の役割を果たす。
【０１０６】
相同性（例えば、相同性パーセント、配列同一性＋配列類似性）は、ペアワイズ配列アライメントを計算する任意の相同性比較ソフトウェアを使用して決定することができる。本明細書で使用される、２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、整列したときに同じである２つの配列中の残基への言及を含む。タンパク質に関して配列同一性パーセンテージを使用する場合、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって、同一でない残基位置が異なることが理解される。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的性質が変わることはない。配列が保存的置換において異なる場合、置換の保存的性質を補正するために配列同一性パーセントを上方に調整してもよい。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するものとする。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。典型的には、これには、完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換を採点することを含み、これによって配列同一性パーセントを上昇させる。したがって、例えば、同一のアミノ酸がスコア１を付与され、また非保存的置換がスコア０を付与される場合、保存的置換は、０と１との間のスコアが付与される。保存的置換の採点は、例えば、アルゴリズムＨｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＪＧ．［Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５−９］に従って計算される。
【０１０７】
特定の実施形態によれば、相同配列は、本明細書で提供される配列（核酸又はアミノ酸配列）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらには同一である。５０％〜９９％の間の配列番号１〜６の相同配列は、本発明の特定の実施形態に含まれ得る。
【０１０８】
蚊の病原体抵抗性遺伝子産物の発現の下方制御は、例えば、遺伝子転写物を直接検出することによって（例えば、ＰＣＲによって）、遺伝子によってコードされるポリペプチド（複数可）の検出により（例えば、ウエスタンブロット又は免疫沈降により）、遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性の検出により（例えば、触媒活性、リガンド結合など）、又は蚊の変化の監視により（例えば、蚊の運動性の低下など）、監視できる。追加的又は代替的に、病原体抵抗性遺伝子産物の発現の下方制御は、本発明の剤によって処置されていない野生型（すなわち対照）蚊と比較して、蚊の病原体レベル（例えばウイルスレベル、細菌レベルなど）を測定することによって監視され得る。
【０１０９】
上記に概して記載しているように、本発明のいくつかの態様によれば、少なくとも１つの蚊病原体抵抗性遺伝子産物の発現を特異的に下方制御する核酸配列を含む単離された核酸剤が提供される。一実施形態によれば、剤は、ＲＮＡサイレンシング剤などのポリヌクレオチド剤である。好ましい実施形態では、剤は、ＲＮＡ干渉を誘導するように構成されたｄｓＲＮＡなどのポリヌクレオチド剤である。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「干渉ＲＮＡ分子」又は「干渉ＲＮＡ」は、標的遺伝子の発現を阻害又は「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシングメカニズムを介してｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全翻訳及び／又は発現）を妨げることができる。ＲＮＡサイレンシング剤は、非コードＲＮＡ分子、例えば、対鎖を含むＲＮＡ二本鎖、ならびにそのような小さい非コードＲＮＡを生成することができる前駆体ＲＮＡを含む。例示的なＲＮＡサイレンシング剤として、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態では、核酸剤は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。本明細書で使用される用語「ｄｓＲＮＡ」は、塩基対合によって一緒に保持されている２本の逆平行ポリリボ核酸に関する。例としては、配列番号１〜５が挙げられる。二本鎖構造が、全長にわたって少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％）、９５％又は１００％相補で形成される二本鎖間で十分な配列相同性があるという条件で、二本鎖は同一の長さ又は異なる長さであり得る。本発明の一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ分子のオーバーハングはない。本発明の他の実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ分子はオーバーハングを含む。他の実施形態によれば、鎖が整列しない（すなわち、反対側の鎖に相補的塩基が生じない）鎖の末端に少なくとも１、２、又は３の塩基が存在するように鎖を整列させ、鎖がアニーリングされると、１、２又は３の残基のオーバーハングが二本鎖の一方又は両方の末端に生じるようになる。
【０１１２】
ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子転写物をコードするＤＮＡの核酸配列に関して、定義することができることに留意されたい。また遺伝子のコード配列に対応するｄｓＲＮＡ配列は、その遺伝子のコード配列のＲＮＡ相補体、又はＲＮＡに転写される遺伝子の他の配列を含むことが理解されよう。
【０１１３】
阻害性ＲＮＡ配列は、標的遺伝子転写物のある部分に対して９０％超同一、さらには１００％同一であり得る。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域は、緊縮条件下（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６０℃で１２ポンド／時間の交配、その後洗浄））で標的遺伝子転写物の一部分と交配することができるヌクレオチド配列として機能的に定義され得る。標的遺伝子転写物に相補的な二本鎖ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１８、１９、２１、２５、５０、１００、２００、３００、４００、４９１、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００以上の塩基であってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ヌクレオチド配列の長さは、約１８から約５３０、又はそれより長いヌクレオチド長である。
【０１１４】
本教示は、様々な長さのｄｓＲＮＡに関し、これによって、より短いもの（すなわちｘは５０ｂｐ以下（例えば１７〜５０））は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡと呼ばれる。より長いｄｓＲＮＡ分子（５１〜６００ｂｐ）は、本明細書中でｄｓＲＮＡと呼ばれ、これはｓｉＲＮＡ分子のためにさらに処理され得る。いくつかの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡの核酸配列は１５塩基対を超える長さである。さらに他の実施形態によれば、ｄｓＲＮＡの核酸配列は、長さ１９〜２５塩基対、長さ３０〜１００塩基対、長さ１００〜２５０塩基対又は長さ１００〜５００塩基対である。さらに他の実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、長さ５００〜８００塩基対、長さ７００〜８００塩基対、長さ３００〜６００塩基対、長さ３５０〜５００塩基対、又は長さ４００〜４５０塩基対である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、長さが４００塩基対である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、長さが７５０塩基対である。
【０１１５】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小さい阻害性ＲＮＡ二本鎖（一般に１７〜３０塩基対の間であるが、より長い、例えば３１〜５０ｂｐでもある）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央に１９ｂｐの二本鎖領域及び末端に対称的な２塩基３’−オーバーハングを有する２１ｍｅｒとして化学合成されるが、近年では、２５〜３０塩基長の化学合成ＲＮＡ二本鎖が、同じ場所での２１ｍｅｒと比較して、１００倍ほどの力価の増加を有し得ることが記載されている。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを使用して得られる観察された効力の増加は、産生物（２１ｍｅｒ）の代わりに基質（２７ｍｅｒ）をダイサーに提供することに起因し、これにより、ｓｉＲＮＡ二本鎖がＲＩＳＣへ取り込まれる速度又は効率を改善することが理論付けられている。３’−オーバーハングの位置はｓｉＲＮＡの効力に影響を及ぼし、アンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称二本鎖は、一般にセンス鎖上に３’−オーバーハングを有するものよりも効力が高いことが見出された（Ｒｏｓｅら，２００５）。アンチセンス転写物を標的とするときには、反対の効力パターンが観察されるため、このことは、ＲＩＳＣへの非対称鎖負荷に起因し得る。
【０１１６】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは２つの供給源に由来し得る。１つは、反対側のＤＮＡ鎖上の対向する遺伝子プロモーターから生成された遺伝子転写物に由来し、もう１つは、単一の遺伝子プロモーターから産生されるが内部相補性を有するフォールドバックヘアピン構造に由来する。例えば、二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、ヘアピン又はステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成するために連結されてもよい。したがって、前述のとおり、ＲＮＡサイレンシング剤は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）でもあり得る。本明細書で使用される用語「ｓｈＲＮＡ」は、相補配列の第１及び第２の領域を含むステムループ構造を有するＲＮＡ剤を指し、その領域の相補性の程度及び配向は、その領域間で塩基対合が起こるのに十分であり、第１及び第２の領域は、ループ領域によって接合され、ループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合が欠如していることから生じる。ループ中のヌクレオチドの数は、３〜２３、又は５〜１５、又は７〜１３、又は４〜９、又は９〜１１の間の数である。ループ内のヌクレオチドのいくつかは、ループ内の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用され得るオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、Ｔ．Ｒ．ら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０、配列番号３０２）及び５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ら、（２００２）ＲＮＡ  ８：１４５４、配列番号３０３）が挙げられる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用し得る二本鎖領域を含むステムループ又はヘアピン構造を形成することは、当業者には理解されよう。
【０１１７】
本明細書で使用されるとき、句「マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」とも同義的に称される）又はその前駆体は、転写後調節因子として作用するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を指す。典型的には、ｍｉＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣ複合体にロードされ得、別のＲＮＡ分子の切断を指向する、約２０〜２２ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であり、他のＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に対して本質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。典型的には、ｍｉＲＮＡ分子は、ＤＣＬタンパク質などのタンパク質により、「プレｍｉＲＮＡ」、又は本明細書で使用されるとおり、「プレｍｉＲＮＡ分子」の前駆体からプロセシングされ、標的ＲＮＡ分子の切断を誘導し得るＲＩＳＣ複合体にロードされる。プレマイクロＲＮＡ分子は、典型的には、プリマイクロＲＮＡ分子（一次転写物）からプロセシングされる。プレマイクロＲＮＡに隣接する一本鎖ＲＮＡセグメントは、プリｍｉＲＮＡからプレｍｉＲＮＡへのプロセシングにとって重要である。切断部位は、ステム−ｓｓＲＮＡ接合部からの距離によって決定されると考えられる（Ｈａｎら、２００６，Ｃｅｌｌ  １２５，８８７−９０１，８８７−９０１）。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「プレｍｉＲＮＡ」分子とは、約１００〜約２００ヌクレオチド、好ましくは約１００〜約１３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子であり、不完全な二本鎖ＲＮＡステム及び一本鎖ＲＮＡループを含み（「ヘアピン」とも呼ばれる）、さらに二本鎖ＲＮＡステム中のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列（及びその相補配列）を含む二次構造をとることができる。特定の実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ及びその相補体は、ｍｉＲＮＡ二本鎖ＲＮＡステムの遊離末端から約１０〜約２０ヌクレオチドに位置する。一本鎖ループ領域の長さ及び配列は重要ではなく、例えば、３０〜５０ヌクレオチド長など、かなり異なる可能性がある。ｍｉＲＮＡとその相補体との間の相補性は完全である必要はなく、約１〜３個の不対ヌクレオチドのバルジが許容され得る。ＲＮＡ分子がとる二次構造は、ｍＦＯＬＤなどの当技術分野において従来のコンピュータアルゴリズムによって予測することができる。ＤＣＬ活性によって放出されてＲＩＳＣ複合体にロードされるプレｍｉＲＮＡからの二本鎖ＲＮＡステムの特定の鎖は、５‘末端の相補性の程度によって決定され、それによって、その鎖は、５‘末端では、切断されたｄｓＲＮＡステムの異なる鎖のヌクレオチド間の水素結合への関与が最も少なく、その鎖がＲＩＳＣ複合体にロードされ、標的ＲＮＡ分子分解の配列特異性を決定する。しかし、経験的に特定の合成プレｍｉＲＮＡ分子由来のｍｉＲＮＡ分子が機能的でない（「誤った」鎖がＲＩＳＣ複合体にロードされているため）場合、この問題は、プレｍｉＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡステムのそれぞれの鎖上のｍｉＲＮＡ分子及びその相補体の位置を交換することによって解決できることは即時に明らかであろう。当技術分野で知られているように、２つの水素結合を含むＡとＵ、又は２つの水素結合を含むＧとＵの間の結合は、３つの水素結合を含むＧとＣの間の結合よりも弱い。
【０１１９】
天然に存在するｍｉＲＮＡ分子は、それらの天然に存在するプレｍｉＲＮＡ分子内に含まれてもよいが、このような既存のプレｍｉＲＮＡ分子から通常プロセシングされるｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を、目的の別のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列に交換することによって、既存のプレｍｉＲＮＡ分子スキャフォールドに導入することもできる。プレｍｉＲＮＡのスキャフォールドもまた完全に合成的であり得る。同様に、合成ｍｉＲＮＡ分子は、既存のプレｍｉＲＮＡ分子スキャフォールド又は合成プレｍｉＲＮＡスキャフォールド内に含まれ得、そこからプロセシングされてもよい。いくつかのプレｍｉＲＮＡスキャフォールドは、設計されたマイクロＲＮＡに正しくプロセシングされる効率については、特に、キメラ遺伝子として発現する場合、他よりも好ましい場合がある。ここでは、非翻訳リーダー配列又は転写終結領域及びポリアデニル化領域などの他のＤＮＡ領域が、プレマイクロＲＮＡに加えて転写一次産物に組み込まれている。
【０１２０】
本教示によれば、ｄｓＲＮＡ分子は、天然のものであっても、合成のものであってもよい。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ＋ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ＋ｍｉＲＮＡ、又はそれらの組み合わせなどの長い及び短いｄｓＲＮＡ分子の混合物であり得る。
【０１２１】
好ましい実施形態では、目的の標的遺伝子（例えば、病原体非構造遺伝子）を特異的に標的化するために、１つ以上の核酸剤が設計されている。核酸剤は、１つ以上の標的遺伝子を下方制御するために使用され得る（例えば、上に詳細に記載したように）ことは理解されよう。いくつかの標的遺伝子を標的化する場合、いくつかの標的遺伝子を標的化するための複数の核酸剤を含む異種遺伝子組成物を使用する。あるいは、複数の核酸剤は別々に配合される。特定の実施形態によれば、単一の標的に対するいくつかの異なる核酸剤分子が使用され、それらは別々に又は同時（すなわち、共配合物）に使用されてもよい。
【０１２２】
例えば、目的のｍＲＮＡの発現のサイレンシングのために、本発明のいくつかの実施形態と共に使用するのに好適であるｄｓＲＮＡの合成は、以下のように選択することができる。第一に、３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ配列をスキャンする。第二に、ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩサーバーから入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗｄｏｔｎｃｂｉｄｏｔｎｌｍｄｏｔｎｉｈｄｏｔｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）などの任意の配列アライメントソフトウェアを使用して適切なゲノムデータベースと比較する。他のコード配列に対して有意な相同性を呈するｍＲＮＡ配列中の推定領域は、フィルターにより除去される。適格な標的配列は、ｄｓＲＮＡ合成のための鋳型として選択される。好ましい配列は、「オフターゲット」作用を減少させるためにゲノム中の他の遺伝子とほとんど相同性がないものである。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定する必要はないが、化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含することを理解されたい。
【０１２４】
一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、配列番号１〜５からなる群から選択される遺伝子を特異的に標的とする。さらに、用語アンプリコンは、ＤＮＡ片又はＲＮＡ片を意味する。
【０１２５】
特定の実施形態によれば、核酸剤は、ｄｓＲＮＡの組換え発現を駆動するための異種プロモーター（外因性）を欠く配置で蚊に提供され、本発明の核酸分子を裸の分子にする。核酸剤は、その安定性及びバイオアベイラビリティに影響を及ぼし得る修飾をなお含み得る（例えば、ＰＮＡ）。
【０１２６】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の発現は、ｄｓＲＮＡを転写するシス作用調節配列（例えば、異種）を必要としない。本明細書で使用される用語「異種」とは、蚊の天然細胞内で、又はｄｓＲＮＡが幼虫又は蚊に給餌される細胞（例えば、組み込み位置によって、又は細胞内で天然には見つからないもの）において、天然には存在しない外因性であることを指す。
【０１２７】
核酸剤は、追加の調節エレメントを含む核酸構築物内にさらに含むことができる。例えば、発現カセット、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リーダー、イントロン及びポリアデニル化）からの転写を用いて、ＲＮＡ鎖（複数可）の転写を調節してもよい。したがって、一実施形態では、核酸剤を含む核酸構築物が提供される。核酸構築物は、蚊細胞において機能的である１つ以上のプロモーター配列に作動可能に連結された本発明のＲＮＡ分子の転写を容易にするために構築されたポリヌクレオチド配列を有し得る。ポリヌクレオチド配列は、蚊のゲノムに通常存在する内因性プロモーターの制御下に置かれてもよい。本発明のポリヌクレオチド配列は、作動可能に連結されたプロモーター配列の制御下で、その転写及び／又は得られる転写物の安定性に有利に影響する追加の配列がさらに隣接していてもよい。このような配列は一般に、プロモーターの上流及び／又は発現構築物の３‘末端の下流に位置する。調節配列及び構造ヌクレオチド配列に関して使用される用語「作動可能に連結された」は、調節配列が連結された構造ヌクレオチド配列の調節された発現を引き起こすことを意味する。
【０１２８】
遺伝的「制御エレメント」とは、構造ヌクレオチド配列の上流、その内部又は下流に位置するヌクレオチド配列を指し、関連する構造ヌクレオチド配列の転写のタイミング及びレベルもしくは量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終結配列、休止配列、ポリアデニル化認識配列などを挙げることができる。
【０１２９】
核酸剤は、様々な方法で蚊及び／又は蚊の幼虫に送達できることが認識されるだろう。一実施形態によれば、いくつかの実施形態の組成物は、核酸剤を含む細胞を含む。本明細書で使用される、蚊に関する用語「細胞（複数可）」は、幼虫摂取可能細胞又は成虫などの、そのライフサイクルの任意の段階にある蚊細胞を指し得る。ある実施形態では、パラトランスジェニックシステムは、蚊の全ライフサイクルを通して内因性であり得る遺伝子組み換え細菌を確立し得る。
【０１３０】
細菌ベクターの具体例としては、細菌（例えば球菌及び桿菌）、糸状藻類及び砕屑が挙げられる。蚊の全ライフサイクルを通して内因性であり得る形質転換可能な細菌ベクター細胞の具体的な実施形態は、図１に列挙されるもの全てを含み得る。追加の実施形態は、以下の表１から選択される１つ以上の細菌株を含み得る。当然のことながら、こうしたリストは排他的なものではなく、パラトランスジェニック細菌株の特定の好ましい実施形態の単なる例示である。
【０１３１】
特定の実施形態によれば、細胞は藻類細胞である。種々の藻類種は、微生物ならびにワムシなどの小型水生動物に日和見的に餌を与える多くの種類の蚊幼虫にとって、食餌の重要な部分であるので、本発明の教示に従って使用することができる。本教示に従って使用することができる藻類の例としては、藍藻類及び緑藻類が挙げられるが、これらに限定されない。特に、アクチナストルム属（Ａｃｔｉｎａｓｔｒｕｍ  ｈａｎｔｚｓｃｈｉｉ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｆａｌｃａｔｕｓ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、Ａｐｈａｎｏｃｈａｅｔｅ  ｅｌｅｇａｎｓ、コナミドリムシ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｇａｔｅ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｈｙｐｎｏｓｐｏｒｕｍ）、コダテラ属（Ｃｈｏｄａｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓｐｉｎａ）、ミカヅキモ属（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｒｏｓｕｍ）、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ  ａｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｃｏｃｃｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｐｅｎｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｕｃｉｇｅｎｉａ  ｌａｕｔｅｒｂｏｍｉｉ、Ｃｒｕｃｉｇｅｎｉａ  ｔｅｔｒａｐｅｄｉａ、Ｃｏｒｏｎａｓｔｒｕｍ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｍ、Ｃｏｓｍａｒｉｕｍ  ｂｏｔｒｙｔｉｓ、チリモ属（Ｄｅｓｍｉｄｉｕｍ  ｓｗａｒｔｚｉｉ）、ユードリナ属（Ｅｕｄｏｒｉｎａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ  ｇｉｇａｓ、ゴレンキニア属（Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、Ｇｏｎｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｃｃｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、オーキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｍａｒｓｓｏｎｉｉ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｍｉｎｕｔａ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）、Ｐａｌｍｅｌｌａ  ｔｅｘｅｎｓｉｓ、クワノミモ属（Ｐａｎｄｏｒｉｎａ  ｍｏｒｕｍ）、Ｐａｕｌｓｃｈｕｌｚｉａ  ｐｓｅｕｄｏｖｏｌｖｏｘ、クンショウモ属（Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｃｌａｔｈｒａｔｕｍ、Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｄｕｐｌｅｘ、Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、プランクトスフェリア属（Ｐｌａｎｋｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、Ｐｏｌｙｅｄｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｉｎｕｌｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ａｄｈａｅｒａｎｓ、Ｑｕａｄｒｉｇｕｌａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｉｄｅｓ、Ｒａｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｉｍｂａｔｕｓ、イカダモ属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｂａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アオミドロ属（Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、ホシガタモ属（Ｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ  ｇｌａｄｉｏｓｕｍ）、テトラエドロン属（Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ  ｂｉｔｒｉｄｅｎｓ）、Ｔｒｏｃｈｉｓｃｉａ  ｈｙｓｔｒｉｘである。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃａｔｅｎｕｌａ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐｉｒｏｉｄｅｓ）、クロオコックス属（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｕｒｇｉｄｕｓ）、キリンドロスペルマム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｅ）、Ｂｕｃａｐｓｉｓ  ｓｐ．（Ｕ．Ｔｅｘａｓ  Ｎｏ．１５１９）、サヤユレモ属（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、ミクロキスチス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｌｉｎｃｋｉａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｕｔｅａ、フォルミジウム属Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍｆａｖｅｏｌａｒｕｍ）、Ｓｐｉｎｉｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ。
【０１３２】
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡを発現するように構成された遺伝子組み換え細菌を含む組成物は、環境中に分散されるようにさらに構成され得る水分散性顆粒又は粉末として配合され得る。なおさらなる実施形態では、本発明の組成物はまた、水和剤、スプレー、エマルジョン、コロイド、水性もしくは有機溶液、ダスト、ペレット、又はコロイド濃縮物を含み得る。組成物の乾燥形態は、湿潤すると直ちに溶解するように、あるいは制御放出、持続放出、又は他の時間依存的様式で溶解するように配合されてもよい。代替的にあるいは追加的に、組成物は水溶液を含んでもよい。このような水溶液又は懸濁液は、適用前に希釈された濃縮ストック溶液として、あるいは適用する準備が整った希釈溶液として提供されてもよい。こうした組成物は、様々な方法で配合され得る。これらは、無機鉱物（シリコン又はケイ素誘導体、層状ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）又は植物性物質（粉末トウモロコシの穂軸、もみ殻、クルミ殻粉など）などの様々な不活性物質と混合することによって、水和剤、顆粒又は粉剤として使用できる。パラトランスジェニック細菌を含む配合物又は組成物は、スプレッダ−ステッカーアジュバント、安定化剤、他の農薬添加物、又は界面活性剤を含み得る。液体配合物は、気泡、懸濁液、乳化性濃縮物などとして使用され得る。成分は、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、又はポリマーを含み得る。
【０１３３】
上述のとおり、本発明のｄｓＲＮＡは裸のｄｓＲＮＡとして投与されてもよい。あるいは、本発明のｄｓＲＮＡは、当業者に公知である担体、例えばＰＥＩもしくはキトサンなどのトランスフェクション剤もしくはタンパク質／脂質担体などにコンジュゲート結合されてもよく、又はナノ粒子に連結してもよい。組成物は、投与前に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙ）、マイクロカプセル化、乾燥保存（ｄｅｓｉｃｃａｔｅ）などの適切な手段で、又は水性担体、媒体、又は食塩水もしくは他の緩衝液などの好適な希釈剤中において配合され得る。好適な農業用担体は、固体、半固体又は液体であってもよく、また当該分野において周知されている。このような組成物は、殺虫配合物技術において通常使用される全てのアジュバント、例えば不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤などを網羅し得る「農業上許容される担体」と見なすことができる。
【０１３４】
言及したように、核酸剤は様々な方法で蚊幼虫に送達することができる。したがって、蚊の幼虫への組成物の投与は、これらに限定するものではないが、噴霧、浸漬、ブラッシング、ドレッシング、滴下、及びコーティング、拡散、小滴としての塗布、ミスト又はエアロゾルなど、核酸剤を含む組成物を適用するための任意の好適な又は所望の手動もしくは機械的技術を使用して実施することができる。一実施形態によれば、組成物は、浸漬又は噴霧によって幼虫に投与される。
【０１３５】
一実施形態によれば、組成物は給餌によって幼虫に投与される。組成物を幼虫に給餌することは、約２時間〜１２０時間、約２時間〜１０８時間、約２時間〜９６時間、約２時間〜８４時間、約２時間〜７２時間、約２時間〜６０時間、約２時間〜４８時間、約２時間〜３６時間、約２時間〜２４時間、約２時間〜１２時間、１２時間〜２４時間、約２４時間〜３６時間、約２４時間〜４８時間、約３６時間〜４８時間、約４８時間〜６０時間、約６０時間〜７２時間、約７２時間〜８４時間、約８４時間〜９６時間、約９６時間〜１０８時間、又は約１０８時間〜１２０時間行うことができる。特定の実施形態によれば、組成物は、４８〜９６時間以上にわたって給餌することによって幼虫に投与される。複数回の給餌は、規則的又は不規則的な間隔であることも企図される。
【０１３６】
一実施形態では、キトサンナノ粒子などのナノ粒子を使用してｄｓＲＮＡを送達することができる。この実施形態では、１５〜２０匹の３齢蚊幼虫の群を、５０〜１０００ｍｌ、例えば１００ｍｌの脱イオン水を含む容器（例えば５００ｍｌのガラスビーカー）に移す。ｄｓＲＮＡ（例えば３２ｐｇのｄｓＲＮＡ）から調製されたゲルスライスの１／６を各ビーカーに加える。１日に１回、合計２〜５日間、例えば４日間、ほぼ同量のゲルスライスを使用して幼虫に給餌する（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０  １９（５）：６８３−９３を参照されたい）。
【０１３７】
ｄｓＲＮＡの経口送達：一齢幼虫（２４時間齢未満）を、１０〜１００、例えば５０の群において、例えば２ｍＬの微量遠心管などの管中、様々な濃度で（０．０１〜５ｐｇ／ｐｌ、例えば０．０２〜０．５ｐｇ／ｐｌ−ｄｓＲＮＡ）、最終容量２５〜１００ｐｉのｄｓＲＮＡ、例えば７５ｐｉのｄｓＲＮＡで、処理する（Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｓｃｉ．２０１３；１３：６９を参照されたい）。ｄｓＲＮＡを含有する食餌：幼虫に、単一濃度１ｍＬあたり１〜２０００ｎｇのｄｓＲＮＡ、例えば１ｍＬあたり１０００ｎｇのｄｓＲＮＡを、１〜１０日の期間、例えば５日間の食餌オーバーレイバイオアッセイにおける食餌において給餌する（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（１０）：ｅ４７５３４を参照されたい）。ｄｓＲＮＡを含有する食餌：新しく出現した幼虫を１〜１２時間、例えば２時間飢餓状態にし、次いで１〜２０ｐｇ、例えば４ｐｇのｄｓＲＮＡを含む０．５〜１０ｐｉ、例えば１ｐｉを一滴給餌する（１〜２０ｐｇのｄｓＲＮＡ／幼虫、例えば４ｐｇのｄｓＲＮＡ／幼虫）（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３  ８月；７９（１５）：４５４３−５０を参照されたい）。幼虫への給餌は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて影響を受ける可能性がある。したがって、例えば、幼虫にはアガロースキューブ、キトサンナノ粒子、経口送達、又はｄｓＲＮＡを含む食餌を給餌してもよい。一実施形態によれば、幼虫に組成物を給餌することは、幼虫が蛹期に達するまで影響を受ける。したがって、特定の実施形態によれば、組成物を静水に適用してもよい。蚊の幼虫は、トランスフェクション試薬又はｄｓＲＮＡ担体の使用の有無にかかわらず、数時間（１、２、３、４、５、６時間以上）から数日（１、２、３、４日以上）水に浸漬させてもよい。
【０１３８】
あるいは、蚊の幼虫に有効量の組成物を噴霧することができる（例えば水溶液を介して）。必要であれば、使用前に組成物を好適な溶液に溶解、懸濁及び／又は希釈してもよい（上記に詳述）。追加として、本発明の核酸組成物は、単独で、又はこれらに限定されないが、天然、合成、有機もしくは無機であり得る不活性担体、保湿剤、摂食刺激剤、誘引剤、カプセル化剤（例えば、藻類、細菌及び酵母、ナノ粒子）、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質、結合剤、乳化剤、染料、糖、糖アルコール、デンプン、加工デンプン、分散剤、又はそれらの組み合わせと組み合わせて、本発明の方法において使用してもよい。また、本発明のいくつかの実施形態の組成物と組み合わせて使用されてもよい。
【０１３９】
本発明の組成物は、病原体保有蚊の生物学的防除を行うために使用することができる。このような適用には、蚊の成虫期を病原体に対して致死的に感受性にする有効量の組成物を蚊の幼虫に投与し、それによって蚊を防除（例えば駆除）することを含む。
【０１４０】
本発明の組成物は、病原体保有蚊の生物学的防除を行うために使用することができる。このような適用には、そのライフサイクルのいずれかの他の段階で蚊の幼虫又は蚊に、蚊によって保有される病原体を抑制し、病原体を例えばヒト宿主に移送できないようにする有効量の組成物を投与することを含む。したがって、適用方法にかかわらず、活性成分（複数可）の量は、蚊の成虫期が病原体に対して致死的に感受性となるのに有効な量で適用され、又は病原体の発現の抑制は、例えば、防除する特定の蚊、病原体の種類（細菌、ウイルス、原生動物など）、処理する水源、環境条件、ならびに組成物の方法、速度、適用量などの因子によって変化する。環境、体系又は葉への適用に使用される組成物の濃度は、特定の配合物の性質、適用手段、環境条件、及び殺菌活性の程度に応じて大きく異なるであろう。
【０１４１】
組成物中のｄｓＲＮＡの例示的な濃度（例えば、浸漬のため）としては、これに限定するものではないが、１ｐｌあたり約１ｐｇ〜１０ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約１ｐｇ〜１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約１ｐｇ〜０．１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約１ｐｇ〜０．０１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約１ｐｇ〜０．００１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．００１ｐｇ〜１０ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．００１ｐｇ〜５ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．００１ｐｇ〜１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．００１ｐｇ〜０．１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．００１ｐｇ〜０．０１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．０１ｐｇ〜１０ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．０１ｐｇ〜５ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．０１ｐｇ〜１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．０１ｐｇ〜０．１ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．１ｐｇ〜１０ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．１ｐｇ−５ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．５ｐｇ〜５ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約０．５ｐｇ〜１０ｐｇのｄｓＲＮＡ、１ｐｌあたり約１ｐｇ〜５ｐｇのｄｓＲＮＡ、又は１ｐｌあたり約１ｐｇ〜１０ｐｇのｄｓＲＮＡ、又はそれ以上が挙げられる。
【０１４２】
食餌として配合された場合、ｄｓＲＮＡは、１ｐｇ／幼虫〜１０００ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜５００ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜１００ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜１０ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜１ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜０．１ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜０．０１ｐｇ／幼虫、１ｐｇ／幼虫〜０．００１ｐｇ／幼虫、０．００１〜１０００ｐｇ／幼虫、０．００１〜５００ｐｇ／幼虫、０．００１〜１００ｐｇ／幼虫、０．００１〜５０ｐｇ／幼虫、０．００１〜１０ｐｇ／幼虫、０．００１〜１ｐｇ／幼虫、０．００１〜０．１ｐｇ／幼虫、０．００１〜０．０１ｐｇ／幼虫、０．０１〜１０００ｐｇ／幼虫、０．０１〜５００ｐｇ／幼虫、０．０１〜１００ｐｇ／幼虫、０．０１〜５０ｐｇ／幼虫、０．０１〜１０ｐｇ／幼虫、０．０１〜１ｐｇ／幼虫、０．０１〜０．１ｐｇ／幼虫、０．１〜１０００ｐｇ／幼虫、０．１〜５００ｐｇ／幼虫、０．１〜１００ｐｇ／幼虫、０．１〜５０ｐｇ／幼虫、０．１〜１０ｐｇ／幼虫、０．１〜１ｐｇ／幼虫、１〜１０００ｐｇ／幼虫、１〜５００ｐｇ／幼虫、１〜１００ｐｇ／幼虫、１〜５０ｐｇ／幼虫、１〜１０ｐｇ／幼虫、１０〜１０００ｐｇ／幼虫、１０〜５００ｐｇ／幼虫、１０〜１００ｐｇ／幼虫、１０〜５０ｐｇ／幼虫、５０〜１０００ｐｇ／幼虫、５０〜５００ｐｇ／幼虫、５０〜４００ｐｇ／幼虫、５０〜３００ｐｇ／幼虫、１００〜５００ｐｇ／幼虫、１００〜３００ｐｇ／幼虫、２００〜５００ｐｇ／幼虫、２００〜３００ｐｇ／幼虫、又は３００〜５００ｐｇ／幼虫、又はそれ以上の用量でもたらされ得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、核酸剤は、少なくとも１つの蚊病原体抵抗性遺伝子産物の発現を減少又は抑制するのに有効な量で提供される。本明細書で使用される「抑制量」又は「有効量」又は「治療有効量」とは、標的遺伝子を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上、すなわち６０％、７０％、８０％、９０％以上、さらには１００％下方制御する（発現を減少させる）のに十分なｄｓＲＮＡの量を指す。
【０１４４】
遺伝子サイレンシングの有効性を試験することは、当該分野で公知の任意の方法を使用して影響され得る。例えば、遺伝子ノックダウンを測定する定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用する。従って、例えば、各処置群からの１０〜２０匹の幼虫を集めて一緒にプールすることができる。そこからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を実施することができる。次いで、ｃＤＮＡを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現レベルを測定することによって、ＲＮＡｉの程度を評価することができる。本発明の試薬は、核酸剤（例えばｄｓＲＮＡ）、蚊の幼虫への核酸剤、構築物又は組成物を投与するための説明書を含むキットに詰めることができる。
【０１４５】
本明細書で使用される用語「遺伝子」又は「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さの単一ヌクレオチド又は核酸残基のポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらの類似体を含み得、また、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、修飾核酸（例えば、メチル化）、核酸類似体又は天然に存在しない核酸を含み得、また、非核酸残基により中断され得る。例えば、ポリヌクレオチドとしては、遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、単離されたＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、プラスミド、及びベクターが挙げられる。定義内に含まれるものは、天然又は介入であっても、修飾されている核酸ポリマーである。
【０１４６】
本発明の構築物は、当技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための技術、例えば固相ホスホラミダイト化学合成など、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を合成するための当技術分野で公知の任意の方法によって調製できる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって生成され得る。こうしたＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んでいる多種多様なベクターに組み込まれてもよい。あるいは、使用されるプロモーターに応じて、構成的に又は誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞株に安定的に導入することができる。さらに、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として、核酸分子に対する様々な周知の修飾を導入することができる。可能な修飾としては、これらに限定されないが、分子の５‘及び／もしくは３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、又はオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート又は２’Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
【０１４７】
本明細書で使用されるとき、用語「およそ」又は「約」は、±１０％を指す。本明細書で数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の任意の引用数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の指示番号と第２の指示番号と「の間の範囲」及び第１の指示番号「から」第２の指示番号「まで」の範囲は、本明細書では同義的に使用され、第１及び第２の指示番号、ならびにそれらの間のすべての小数及び整数の数字を含むことを意味する。
【０１４８】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。「からなる」という用語は、「を含み、限定される」ことを意味する。「本質的になる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び／又は部分を含み得るが、それらの追加の成分、工程及び／又は部分が特許請求された組成物、方法又は構造の基本的及び新規な特徴を実質的に変えない場合に限る。
【０１４９】
本明細書で使用されるとき、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物などの複数の化合物を含み得る。
【０１５０】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値のみでなくすべての可能な部分範囲を具体的に開示していると見なされるものとする。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、及びその範囲内の個々の数字、例えば１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示しているものとみなすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１５１】
本明細書で使用されるとき、用語「方法」は、これらに限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の専門家にとって既知であるか、又は既知の様式、手段、技法、及び手順から容易に開発できるこれらの様式、手段、技法、及び手順など、所与のタスクを達成するための様式、手段、技法、及び手順を指す。本明細書で使用される用語「治療すること」は、病状の進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは元に戻すこと、状態の臨床的もしくは審美的症状を実質的に改善すること、又は状態の臨床的もしくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【０１５２】
（表１）例示的パラトランスジェニック細菌株
2019533477.tif 000002
（表２）ヘルパー遺伝子
2019533477.tif 000003
（表３）ジカウイルス標的遺伝子
2019533477.tif 000004
【０１５３】
例示的モデルとして、ジカゲノムは、５‘−Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ−ＮＳｌ−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５−３‘を含み、キャプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）、及び非構造タンパク質（ＮＳ）に実質的に切断されるポリタンパク質をコードする。
【０１５４】
現在一般的に記載されている本発明は、単に本発明の実施形態の特定の態様を例解する目的のために含まれる以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。当業者であれば、上記の教示及び以下の実施例から、他の技術及び方法が特許請求の範囲を満たすことができること、及び特許請求された発明の範囲から逸脱することなく使用できることを認識するため、実施例は、本発明を限定することを意図するものではない。実際に、本発明をその好ましい実施形態を参照して特に示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の請求項に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えることができることを理解するであろう。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：ｄｓＲＮＡ−デングを発現する細菌（大腸菌株Ｈ１１５）に感染した蚊におけるｄｓＲＮＡ産生の実証。
【０１５６】
図１に示されるように、本発明者らは、蚊の感染に使用される大腸菌は、腸内でｄｓＲＮＡを産生し得ることを実証する。より具体的には、この実施形態において、本発明者らは、ｄｓＲＮＡデングを活発に発現する大腸菌の遺伝子改変株に蚊が感染したことを実証した。ＬＵＣ又はＤＥＮＶ細菌ＤＮＡを陽性対照として使用した。全ＲＮＡをＤＮａｓｅ処理し、ＤＥＮＶ又はＬＵＣリバースプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーに変換した。
【０１５７】
実施例２：ｄｓＲＮＡ−デングを発現し、血粉中においてデングウイルスに感染した大腸菌Ｈ１１５を有する蚊は、頭内のデングウイルス量の有意な減少を有する。
【０１５８】
本発明者らは、ＤＥＮＶ−２（ＮＧＣ株）によるネッタイシマカ（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ株）の感染に対する、ＤＥＮＶ−２（ＪＡＭ１４０９株）に相補的なｄｓＲＮＡを産生するｐＴａｃプラスミドによって形質転換された大腸菌の運搬の効果を試験した。このプラスミドにおいて、設計により構成的にｄｓＲＮＡを発現させる。感染後５日目では、ＤＥＮＶ−２感染率、平均身体力価及び頭部力価、ならびに感染体からの播種に関して、以下の４つの治療群の間に有意差は認められなかった。
（ｉ）無菌糖を給餌した対照蚊、
（ｉｉ）ＧＦＰインサートを有するｐＴａｃプラスミドを保有する大腸菌を添加した糖を給餌した対照蚊（ＧＦＰ対照）、
（ｉｉｉ）無関係な標的であるルシフェラーゼに対するｄｓＲＮＡを産生するｐＴａｃプラスミドを保有する大腸菌を添加した糖を給餌した対照蚊（ＬＵＣ対照）、
（ｉｖ）ＤＥＮＶ−ＪＡＭ−１４０９に相補的なｄｓＲＮＡを産生するｐＴａｃプラスミドを保有する大腸菌を添加した糖を給餌した蚊。
【０１５９】
以下の表４〜６に示すように、本発明者らは、５日目の処置間で身体力価及び頭部力価のいずれも有意に異なることはないことを実証した。血粉の１０日後、感染した蚊の身体力価はすべての群で同様であったが、ｄｓＤＥＮＶ−２で処理した蚊の頭部力価は、ｄｓＬｕｃ又は糖対照と比較して２１％有意に減少した（ｒ＝０．０５）。この結果は、デング熱ウイルスの不活性化を標的とするためのｄｓＲＮＡの細菌送達を実証するものである。
【０１６０】
（表４）デングウイルスの不活性化を標的とするｄｓＲＮＡの細菌送達。
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（表５）デングウイルスの不活性を標的とするｄｓＲＮＡの細菌送達のデータ解釈
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（表６）１０日目の蚊頭部ウイルス力価
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【０１６１】
太字の結果は、ＤＥＮＶ処置群においてウイルス力価が最大力価より高いことを示す。Ｌｕｃ及び糖対照群の両方において、大部分のサンプルがｄｓＤＥＮＶ処置群における最大ウイルス力価よりも高いウイルス力価を有することは重要である。
【０１６２】
実施例３：ライフステージ全体にわたって存続する新しい蚊腸内細菌の同定
【０１６３】
本発明者らは、捕獲した野生のヤブカ属からセラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の菌株ＡｅＳ１を単離した。本発明者らは、実験室で新たに出現させたネッタイシマカＲｏｃｋ株の腸内細菌をさらにスクリーニングし、セラチア・フォンティコーラの新株ＭＳ５を単離した。ＭＳ５株とＡｅＳ１株のゲノム配列はほぼ同一であり、このことは、セラチア・フォンティコーラがヤブカ属の蚊と永続的に自然に関連していることを示唆するものである。さらに、セラチア属の分類群は、異なる地理的場所における様々な集団内のネッタイシマカと関連していることが判明した。ＡｅＳ１株及びＭＳ５株は両方とも経発育期の継代が可能であり、細菌株は１つの生活段階から次の段階、この場合は幼虫から成虫までベクターにとどまり、血液供給腸内でよく増殖する。
【０１６４】
本発明者らは、ゲノムの注釈付けを行い、ＭＳ５及びＳ１のゲノムがほぼ同一であることを実証した。ＳＩは、フロリダの捕獲された野生のヒトスジシマカ蚊から単離されたものであり、ＭＳ５は、ネッタイシマカ株の実験室株から単離されたものである。この徴候は、このセラチア菌株がヤブカ属の蚊と持続的に関連していることを示している。さらに、ＳＩ及びＭＳ５の両方が幼虫から成虫へと通過することができ、成虫の腸の中で血粉によって濃縮される。ｄｓＲＮＡ、ならびに他のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ阻害分子を蚊に送達するために、腸内での有病率及び幼虫から成虫への経発育期継代能力により、野外での持続可能な用途、ならびに水生幼虫の生息地及び糖ステーションでの用途において、ｄｓＲＮＡの媒体として作用する新規な候補としてこの株を同定する。追加の候補としては、上で同定されたものの中でも、パントエア種、Ａｅｌ６、セデセア・ネテリ、Ａｇｌ、及びＪＣ８０３１が挙げられる。これらの株は、本発明者らによって蚊から単離されたものであり、主に腸内で見つかる。本発明者らはまた、上記で言及した菌株の全てが血粉後に腸内で有利に増殖することを実証した。ＡｅＳ１と同様に、これらの株は幼虫期から成虫期へ、さらに垂直伝播を介して継代することができる。
【０１６５】
実施例４：発見、培養性、及び形質転換の可能性など、内共生体微生物の同定。
【０１６６】
上記のように、細菌の内共生体は、卵が孵化して幼虫になり、蛹になり、成虫として出現した後の蚊の適切な発育及び成熟に有益であり得る。細菌の内共生体を同定し遺伝的に改変するという目的に向かって、元来Ｃｄ．Ｈｉｄａｌｇｏから入手し、実験室で繁殖させたネッタイシマカの卵は、表面殺菌し、卵の殻の内部及びおそらく卵の内部に存在する細菌を培養するために調製した。次に本発明者らは、純粋な培養物を得るために伝統的な三方ストリーク法を用いて細菌を継代し、機械的に希釈した。精製コロニーからの分離株を一晩増殖させ、最後に２０％グリセロール（ｖ／ｖ）に入れ、−８０℃で貯蔵した。次いで、分離株をＬＢ培地中で増殖させ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ  ＬＲＦを使用してＭＡＬＤＩバイオタイピングによる同定のために調製した。本発明者らは、表面殺菌されたネッタイシマカ卵から誘導された２６１の細菌分離株及び採血中に繁殖すると思われる成虫蚊からの２つの細菌分離株を貯蔵してカタログに登録した。ＭＡＬＤＩバイオタイピング手順によって決定された株のリスト及び同定が含まれる（表７参照）。
【０１６７】
約２６１株のうち４７株は、バイオタイピングでは一般に識別できず、本発明者らは、同一性に関するさらなる情報を提供するために１６Ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングを利用した。さらに、本発明者らは、環境放出のための潜在的な候補であると考えられるため、推定上の２３のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａｌ）エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）分離株及び１０の推定シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）及びシュードモナス・モッセリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｓｓｅｌｌｉ）分離株の同一性に関するより多くの情報を得るために１６ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングを使用した。パントエア属は、以前はエンテロバクター属として分類されていた比較的新しい細菌の再分類であるので、本発明者らは、正確に同定するために、より洗練された遺伝子型決定方法を採用した。６つのゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）分離株及び成虫蚊由来の２つの追加の細菌分離株も、１６ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングのために選択した。合計９０の分離株が１６ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングのために提出された。偶発的な（Ｃｏｎｔｉｇｅｄ）全長（約１．３〜１．６ｋｂ）１６ｓ  ｒＤＮＡ配列が含まれる（図示せず）。
【０１６８】
本発明者らは、パラトランスジェネシスのために操作されるように選択された細菌分離株をさらに特徴付けて、検証した。組換え操作のためのこれらの細菌分離株の予備的な選択は、ヒトにおける病原性のエビデンスの欠如と予備的な同定結果に基づく可能性がある（図２を参照されたい）。１０のエンテロバクター／パントエア属の分離株及び１２のシュードモナス属の分離株は、プラスミドの取り込み、プラスミドの複製、及びＴｎ７挿入（抗生物質感受性プロファイリング、交配能力、プラスミド複製、プラスミド安定性、及び蛍光マーカーのＴｎ７挿入など）などの追加の特徴を決定するために評価した。本発明者らは、ｍｉｎｉＴｎ７−ｅＹＦＰの使用に組換え介在遺伝子工学アプローチを集中させた。当業者によって認識されるように、これは、様々なグラム陰性菌株において発現するＹＦＰ蛍光マーカーを送達する広く使用されているＴｎ７挿入プラスミドである（送達プラスミドの説明については図３を参照されたい）。発達の様々な段階の間の蚊の細菌のコロニー形成を追跡するのに使用するために、図２に列挙された株のすべてが蛍光を発現していることに留意されたい（図４参照）。
【０１６９】
本発明者らは、細菌の内共生体が蚊の成長及び発達を助長することを示す初期食餌実験を行った。これは、蛹に成長して成虫として出現するのに必要な時間の長さの短縮として視覚的に観察することができる（図５〜６）。Ｔｎ７ベクターの合成部分及びシュードモナス・プチダ染色体を標的とするＰＣＲもまた、個々の蚊にコロニーを形成する３つの株の可能性を評価するために使用した。染色体Ａｅ０７６、Ａｅｌ４２、及びＡｅｌ７１に挿入されたｅＹＦＰを含む内共生細菌株によるコロニー形成について調査された８匹中のうち７匹の蚊において陽性シグナルが検出された（図７参照）。
【０１７０】
選択された内共生細菌による蚊の代表的な成長促進は、その一実施形態において実証される。具体的には、細菌の内共生体で飼育された代表的な幼虫（図５、パネル左、細菌分離株Ａｅｌ６５を示す）は、蚊の飼育溶液に細菌が添加されていない場合（図５、パネル右、陰性対照）よりも早く成長する。その一実施形態における、選択された内共生細菌に感染した蚊の代表的な蛹化率。具体的には、ｅＹＦＰを発現するように操作された細菌株を幼虫に給餌した。シュードモナス属（Ａｅ０７６、Ａｅｌ４２、及びＡｅｌ７１）、ならびにパントエア／エンテロバクター属（Ａｅ０５３、Ａｅ０９０、及びＡｅｌ６５）を対数中央値まで増殖させ、５００ｍＬの滅菌肝臓粉末を添加した５０μＬの滅菌ミリＱ水中で最終濃度ＯＤ０．３に希釈した。孵化後２４時間幼虫をペン／連鎖球菌で処理し、次いで洗浄し、細菌株を含有する給餌溶液に移した。陰性対照幼虫を、５００μＬの滅菌肝粉末を含む５０ｍＬの滅菌ミリＱ水に入れた（細菌を添加しなかった）。ｅＹＦＰ標識細菌及び陰性対照幼虫に給餌した６つの幼虫群の推定蛹化率。１１日目に、各細菌株について、ｅＹＦＰ幼虫給餌溶液に、２ｍＬの一晩培養物を添加したところ、蛹化が増加した。
【０１７１】
（表７）カタログ化された内部共生株とバイオタイプ同定のリスト
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【０１７２】
実施例５：細菌の単離、濃縮の方法、バイオタイピング法
【０１７３】
蚊の卵からの細菌の分離には、以下の方法及び手順が含まれてもよい：
１．２５０ｍＬフィルター滅菌器の内側のコーヒーフィルターに蚊の卵（Ｃｄ  Ｈｉｄａｌｇｏの卵）を加える。
２．卵を１％Ｔｗｅｅｎ  ８０及び２％漂白剤溶液に３分間浸して表面を殺菌し、次に真空にして溶液を取り除く。
３．滅菌蒸留水で３回すすぎ洗いし、毎回３０秒間放置した後真空をオンにする。
４．大きなペトリ皿内のフードで乾燥させる。
５．乾燥した卵を１．５ｍＬの無菌微量遠心チューブに移す。
６．１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の入った１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブ中で滅菌組織グラインダーを用いて卵を均質化する。異なる濃度のトリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）プレート（０．１％ＴＳＡ、１％ＴＳＡ、及び１０％ＴＳＡ）、溶原性ブロス（ＬＢ）、及びＴＳＡ＋５％ヒツジ血液寒天上にプレーティングした卵の最初のセットにはＰＢＳｐＨ７．４を使用。グリセロール増殖培地（ＧＬＹ）プレートにプレーティングされている２セット目の卵には、ＰＢＳｐＨ５を使用。
７．均質化したサンプルをＰＢＳで４５秒間超音波処理する。
８．ホモジネートについては、２００μＬのホモジネートを９６ウェルプレートの最初の列に添加し、次いでその後の列のために２０μＬを１８０μＬのＰＢＳに移すことによって、希釈系列を３連で行う（希釈は１０−７まで純粋になる）。
９．１００μＬの全希釈液をプレーティングし、２８℃でインキュベートする。
１０．コロニーは、インキュベーションの２４、４８、及び７２時間後に計数し、分類する。
１１．各コロニー形態の２つの代表分離株を精製し、保存し、貯蔵する。
【０１７４】
蚊の卵からの濃縮による細菌の分離は、以下の方法及び手順を含んでもよい：
１．上記の工程１〜１１。
２．１ｍＬの濃縮培地を残りの卵に加え、２８℃で一晩インキュベートする（濃縮媒体は、ｐＨをＨＣｌで３．５に調整した滅菌ミリＱ水中の１．５％ペプトン、０．８％酵母抽出物、１％Ｄ−グルコース、０．５％エタノール、０．３％酢酸、及び０．０１％シクロヘキサミドである）。
３．翌日、濃縮卵子について、１５０μＬのホモジネートを９６ウェルプレートの最初の列に添加し、次いで次の列に、２０μＬを１８０μＬのＰＢＳ（ｐｈ−５）に移すことによって、５回反復希釈を行う（希釈は１０−７まで純粋になる）。
４．１０−１〜１０−４のブレインハートインフュージョン寒天培地（ＢＨＩ）、ミュラーヒントンＩＩ寒天培地（ＭＨＢ）、溶原ブロス寒天培地（ＬＢ）、トリプシン大豆寒天培地＋０．５％ヒツジ血液、及び炭酸カルシウム寒天培地（ＣａＣＯ３）プレートをプレーティングし、２８℃でインキュベートする。
５．各コロニー形態の２つの代表分離株を精製し、保存し、貯蔵する。
【０１７５】
細菌バイオタイピングは、以下の方法及び手順を含んでもよい。
１．最良の結果を得るために、ＭＡＬＤＩに取り組む前日に細菌を発育させる（３０℃で発育させた細菌については２日間）。
２．滅菌ピペットチップを使用して、サイズに応じて細菌の１〜３コロニーを捕捉し（寒天培地を捕捉しないように留意のこと）、所望の標的に塗抹する（特大コロニーの場合は、１／２コロニーのみを掴む）。すべてのサンプルについて同じように完了させる。各サンプルを二連又は三連で完了させる。
３．すべてのスポット（ＢＴＳスポットを除く）に１μｌの７０％ギ酸（ＦＡ）を塗布し、細菌に少し混ぜる。完全に乾燥させる（バイオタイププレートの外枠は使用しないものとする）。
４．プレートを介してランダムに分散した標的近くの２〜３のスポットに１μｌの標準（ＢＴＳ）を塗布する。
５．１μｌのマトリックスＨＣＣＡ（冷蔵ＨＣＣＡ部分及び２５０μｌの５０％ＡＣＮ、２．５％ＴＦＡから生成され、完全に溶解するまでボルテックスしたもの）をすべての標的（ＢＴＳ標的など）に塗布する。プレートをバイオタイパーに入れる前に完全に乾燥させる。
６．ＭＡＬＤＩが使用されていないことを確認して、［Ｏｕｔ／Ｉｎ］を押す。バイオタイパープレートを空いているスロットに挿入し、ゆっくりとドアを閉じる。
７．コンピュータで「Ｆｌｅｘ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」プログラムを開く。選択した方法が「ＭＢＴ  ＦＣ．ｐａｒ」であることを確認し、ＢＴＳスポットを選択して「較正する」をクリックする。
８．ＢＴＳスポットが受け入れ可能である場合、「Ｍａｌｄｉ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ  ＲＴＣ」プログラムを開く。９．「ファイル」、「新しい分類」、「次へ」の順に選択し、プロジェクトＩＤを検索するか、又は新しいプロジェクトＩＤを作成する（日付プロジェクト番号）。
１０．次に、サンプルを載せているバイオタイパープレート上のスポットを選択する。「分析物の追加」をクリックし、「Ｂｒｕｋｅｒ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ」、「終了」の順に選択する。
１１．１サンプルあたり約２分を要する。
１２．終了したら「Ｏｕｔ／Ｉｎ」を押し、プレートを取り出して、「Ｏｕｔ／Ｉｎ」をもう一度押す。
１３．バイオタイパープレートを洗浄するときは、厳しいプロトコールを使用する。
１４．ＭＡＬＤＩを較正する。
【０１７６】
実施例６：ネッタイシマカ成虫にＤＥＮＶ  ｐｒＭ由来ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌を給餌することにより、ＤＥＮＶ−２に対するベクターの反応能を低下させる。
【０１７７】
本発明者らは、成虫ネッタイシマカへのｄｓＲＮＡ形質転換細菌（本実施形態では、大腸菌）の経口導入を行い、その結果、ベクターの反応能を阻害することを実証した。具体的には、この実施形態では、本発明者らは、新たに出現した成虫ネッタイシマカには、抗生物質及び形質転換大腸菌を含む食塩水（ＢＦＳ＝１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＡＴＰ）を給餌してもよいと判断した。本実施形態では、蚊が４８時間を超えて生存するのを助けるために、溶液は３％スクロースを含んでもよい。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現する細菌は、生理食塩水−糖のみを含む溶液を給餌した解剖蚊の中腸及び作物の両方に確認され得る。その結果、本発明者らは、ネッタイシマカは、形質転換大腸菌を含む血粉を摂取し得ることを実証したが、ＧＦＰの発現は、給餌後わずか２４時間中腸内で維持され、給餌後４日目には可視化されず、追加のＤＥＮＶ含有血粉を待つ。
【０１７８】
本実施形態では、本発明者らは、Ｒｅａｒ  Ｐｏｚａ  Ｒｉｃａ蚊を飼育して、成虫にした。閉鎖後１日目（蛹ケースから出現する、又は卵から孵化する行為）に、本発明者らは、全ての蚊に、それぞれ２４時間、３％スクロースを含むＢＦＳ、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ  １００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌを給餌し、次に、蚊の集団を１００匹の雌の蚊の６つの群に分け、さらに次のように４８時間給餌した：
対照１：給餌溶液のみ、
対照２：給餌溶液＋ＨＴ１１５＿ＧＦＰｕｖ、
対照３：給餌溶液＋ＨＴ  １１５−ＧＦＰｕｖ＿Ｐｔａｃ＿ｄｓＲＮＡ−Ｌｕｃ給餌、
対照４：給餌溶液＋ＨＴ１１５−ｐＧＦＰｕｖ−Ｔ７−ｄｓＲＮＡＬｕｃ、
処置１：給餌溶液＋ＨＴ１１５−ｐＧＦＰ  Ｔ７−ｄｓＲＮＡＤＥＮＶ２（Ｔ７プロモーターの制御下にあるＤＥＮＶ２  ｄｓＲＮＡ）、
処置２：給餌溶液＋ＨＴ１１５−ｐＧＦＰｕｖ  Ｐｔａｃ  ｄｓＲＮＡＤＥＮＶ２（Ｐｔａｃプロモーターの制御下にあるＤＥＮＶ２  ｄｓＲＮＡ）。
【０１７９】
４８時間の連続給餌の後、本発明者らは全ての蚊にＤＥＮＶ−２感染性血粉を与えた。代替の実施形態には、感染性血粉中にそれぞれの大腸菌株を含むこと、及び実験期間中毎日それぞれの大腸菌に給餌溶液を提供し続けることを含んでもよい。本発明者らは、ＤＥＮＶの複製を可能にするために、無作為に番号を付けた処置蚊群及び対照蚊群を２週間インキュベートした。次に、本発明者らは、３６時間、７２時間、７日、及び１４日のプラークアッセイで感染性ＤＥＮＶ−２を測定するために、６つの群の各々から生存している個々の全成虫蚊の１／４を採取及び均質化した。（以下の表８〜９には、完全なプラークアッセイ結果を示す）。
【０１８０】
（表８）プラークアッセイ結果のまとめ
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（表９）個々のＤＥＮＶ感染蚊に関する感染性ウイルス力価の結果
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【０１８１】
本発明者らは、ＤＥＮＶ  ｄｓＲＮＡ発現形質転換大腸菌を給餌した／給餌しなかった試験１の６つの無作為に番号を付けた各群から個々の全成虫ネッタイシマカを得て、感染性ウイルス含量についてアッセイした。各蚊を１ｍｌの細胞培養増殖培地中で均質化し、濾過した。１０倍希釈液を１００〜１０−５まで調製し、プラークアッセイのために０．１５ｍｌの各希釈液を３連でベロ細胞単層上にプレーティングした。
【０１８２】
生存している蚊は、１群あたり１５匹〜３６匹まで様々であった。群番号は無作為に割り当てた。血粉直後の１６の蚊ホモジネート中の感染性ウイルスの検出：（陽性１１／１６、及び陰性５／１６）。
【０１８３】
実施例７：ＲＮＡｉ標的化のためのＺＩＫＶ  ＲＮＡ由来ｄｓＲＮＡの同定
【０１８４】
一実施形態において、本発明者らは、ゲノム配列アラインメントによるジカウイルスゲノム上のＲＮＡｉ標的に対するｄｓＲＮＡの同定を実証する。形質転換された細菌の内共生体によって発現させたときに、ネッタイシマカにおけるジカウイルスの複数の株（ＺＩＫＶ）による感染及び伝播を阻害するための特異的なｄｓＲＮＡエフェクター分子（複数可）を同定するために、本発明者は、２１個のＺＩＫＶゲノムの全長ヌクレオチド配列のアライメントを最初に行った。コード領域間の平均多様性は１３．９％であることがわかった。配列多様性は、遺伝子ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａにわたる２６８０塩基対領域の平均よりも低い（表１０参照）。
【０１８５】
アフリカ、アジア、及び米国からの２１のＺＩＫＶ（ジカウイルス）分離株の全長ゲノムのヌクレオチド配列アラインメントは、コード領域間の平均多様性が１３．９％であることを示している。配列多様性は、Ｃ、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａの平均よりも低い（表１０）。キャプシド（Ｃ）は比較的短いコード領域であり、高度に構造化された５‘非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接して位置するため、理想的なＲＮＡｉ標的ではない。代わりに、本発明者らは、比較的低い配列多様性を有する、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａにわたる２６８０ｎｔ領域由来のｄｓＲＮＡ配列を最適なウイルス阻害標的として同定及び試験した（図９Ａ〜Ｂを参照されたい）。
【０１８６】
（表１０）アフリカ系統及びアジア系統からの２１のゲノムコード配列に基づくＺＩＫＶゲノム配列多様性。Ｃ＝キャプシド、ｐｒＭ／Ｍ＝前駆体膜／膜、Ｅ＝エンベロープ、ＮＳ１−５＝非構造タンパク質１〜５
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【０１８７】
この配列同一性に基づいて、本発明者らは、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ４Ａ由来の５つのｄｓＲＮＡ（それぞれ＞５３０ｂｐ）の蚊（ネッタイシマカＰｏｚａ  Ｒｉｃａ）における抗ウイルス活性を試験した。（図９Ａ〜９Ｂ）。具体的には、この実施形態において、本発明者らは、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域に由来する５つのｄｓＲＮＡ（それぞれ＞５３０ｂｐ）の蚊（ネッタイシマカＰｏｚａ  Ｒｉｃａ）における抗ウイルス活性を試験した（表１０、図１０）。注記：Ｃａｒｂｌ０９Ｍ蚊において発現するｄｓＲＮＡによって標的化されたＤＥＮＶ２のｐｒＭ  Ｍ配列は、ＺＩＫＶ  ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域由来のｄｓＲＮＡよりもＤＥＮＶ２遺伝子型の間でより高い配列多様性を有する（＞１３％）。
【０１８８】
本発明者らは、ＺＩＫＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９感染性ｃＤＮＡクローンの保存されたＮＳ２Ｂ−ＮＳ４Ａ遺伝子から増幅されたｄｓＲＮＡのインビトロ転写のためのｃＤＮＡ鋳型を作製した。各５‘末端にバクテリオファージＴ７プロモーター配列を組み込んだ特異的プライマーは、ＰＣＲによって５３０〜５８０ｂｐの５つのＤＮＡ断片を増幅するように設計した。ｄｓＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、このＤＮＡのインビトロ転写によって生成した。ウイルス感染の抑制における有効性について、首尾よく生成したｄｓＲＮＡを分析した。本発明者らは、出現後５日目に４０匹のネッタイシマカ雌に各ｄｓＲＮＡ  ２５０ｎｇを胸腔内注射したことを示した。２日後、注射した雌に５ｘ１０６ＰＦＵ／ｍｌのＺＩＫＶを含む血粉を与えた。蚊の全身のウイルス力価を、感染性血粉の７日後及び１４日後（ｐｂｍ）にベロ細胞中でプラークアッセイにより測定した。非注射又はｄｓＲＮＡのβ−Ｇａｌ（非標的対照）注射蚊を対照として使用した（下記表１１参照）。
【０１８９】
（表１１）血粉後７日目及び１４日目のウイルス力価及びＺＩＫＶ感染蚊の割合。
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【０１９０】
処置群：１）非注射対照、２）ＰＢＳ注射、３〜７）ＺＩＫＶゲノム領域１〜５からのｄｓＲＮＡ（表１１、及び図参照）８）β−ｇａｌ  ｄｓＲＮＡ。５つのＺＩＫＶ  ｄｓＲＮＡ処置の各々は、ＺＩＫＶ−ＰＲＶＡＢＣ５９感染性ｃＤＮＡクローンの保存されたＮＳ２Ｂ−ＮＳ４Ａ遺伝子のわずかに重複する約５００ｂｐ領域を標的とした。本発明者らは、試験したすべてのｄｓＲＮＡが、感染したネッタイシマカ中のＺＩＫＶ力価を低下させるのに有効であることを実証し、ＲＮＡ２（５５７ｂｐ）が最大の効果を示した。代替の実施形態では、すべてのｄｓＲＮＡが、追加のＺＩＫＶ株における力価を低下させるために適用されてもよい。
【０１９１】
実施例８：プラスミドコードｄｓＲＮＡの細菌分泌
【０１９２】
本発明者らは、プラスミドコードｄｓＲＮＡが、選択された形質転換細菌から分泌されることを実証した。この実施形態では、様々なｄｓＲＮＡ構築物をコードするプラスミドを含む大腸菌株又は含まない大腸菌株を、ルリア培地中で増殖させ、ｄｓＲＮＡの分泌についてスクリーニングした。この実施形態では、以下の例示的な細菌株を、増殖培地への特定のｄｓＲＮＡの分泌について試験した。
−ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰのＴ７プロモーターによる発現をコードするｐｕｃｌ９プラスミドを有するＨＴ１１５、
−ｄｓＲＮＡ−ＬｕｃのＴ７プロモーターによる発現をコードするｐｕｃｌ９プラスミドを有するＨＴ１１５（Ｌｕｃ＝ルシフェラーゼ；陰性対照）、
−プラスミドを有さないＨＴ１１５。
【０１９３】
さらなる実施形態は、様々な形質転換細菌種、株などを利用してもよい。増殖後、０．２μｍフィルターを用いて濾液から細菌を除去し、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｉｅｓから提供された５分間のｄｓＲＮＡ抽出キットを用いてｄｓＲＮＡを濾液から抽出した。ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰを、ＧＦＰ特異的ＰＣＲプライマーを用いる、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として用いた。Ｔ７−ＧＦＰ株及び分離されたプラスミドＤＮＡをＰＣＲ陽性対照として使用した。ＨＴ１１５−Ｔ７−ｄｓＧＦＰ由来の濾液においては、予想されたサイズ（４１ｂｐ）のＰＣＲ産物が検出されたが、空のベクター株ＨＴ１１５又はＨＴ１１５−ｐｕｃｌ９−ＤＬ濾液では、いずれにおいても検出されなかった（図８参照）。これらの結果は、細菌からｄｓＲＮＡが分泌されていることを実証したものである。この分泌されたｄｓＲＮＡは、例えば、エンドサイトーシス、小胞輸送、食作用、及び／又は他のプロセスを介して他の細胞によって摂取されてもよい。
【０１９４】
実施例９：ｄｓＲＮＡ  ＤＥＮＶ２を発現する細菌を給餌されている蚊におけるｓｉＲＮＡ−ＤＥＮＶ２の検出
【０１９５】
本発明者らは、蚊へのｄｓＲＮＡ−デングの送達及びｓｉＲＮＡへのそのプロセシングを実証する。追加の実施形態には、様々な蚊媒介性病原体由来のｄｓＲＮＡを含んでもよい。この実施形態では、本発明者らは、蚊に、糖及びｄｓＤＥＮＶ２を発現するＨＴ１１５細菌、又は糖のみ（対照）を蚊に与えた。ＨＴ１１５−ｄｓＤＥＮＶ２細菌もまた、水カップ中において、蚊に提供された。各処置からの２０匹の蚊を３日後に殺し、凍結した。
【０１９６】
小型ＲＮＡの濃縮手順に従って、ｍｉｒＶＡＮＡ  ｍｉＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、２０匹の蚊の全身から小型ＲＮＡを分離した。具体的には、蚊に給餌した対照及びＨＴ１１５−ｄｓＤＥＮＶ２細菌の両方由来の１〜２μｇの濃縮小型ＲＮＡサンプルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、正に荷電したメンブレンに移した。メンブレンを、ｄｓＲＮＡ  ＤＥＮＶ２前駆体の両方の鎖に相同な３‘末端ＤＩＧ標識４５ｎｔ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含むＰｅｒｆｅｃｔ（登録商標）Ｈｙｂ＋緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中、３８℃で一晩ハイブリダイズさせた（図１１）。非常に厳重な洗浄の後、メンブレンを抗ＤＩＧ  ＡＰ抗体と共に（１：１０，０００）室温で１時間インキュベートした。ＣＤＰ−ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＭＰシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行われる検出及び画像化のために、化学発光基質として使用した。対照として、複製メンブレンを、蚊ｍｉＲ−１に対するＤＩＧ標識オリゴアンチセンスとハイブリダイズさせた。
【０１９７】
本発明者らは、２１〜２４ｎｔの範囲の不連続なバンドがｄｓＤＥＮＶ２サンプル中に観察されたことを実証し、これは、細菌の転写されたｄｓＲＮＡ  ＤＥＮＶ２が蚊に移され、宿主蚊におけるダイサー媒介切断の基質であることを示している。対照サンプルでは、ハイブリダイゼーションシグナルはいずれも観察されなかった（図１２）。
【０１９８】
実施例１０：ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現する大腸菌に感染した蚊におけるウイルス発現緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の抑制
【０１９９】
本発明者らは、緑色蛍光タンパク質、ｅＧＦＰ（ＭＲＥ１６ウイルス）を発現させるための例示的なシンドビスウイルスを生成した。シンドビスウイルスは、二十面体キャプシドを有するエンベロープ粒子である。そのゲノムは、長さ約１１．７ｋｂの一本鎖ＲＮＡであり、５‘キャップ及び３’ポリアデニル化テールを有しており、したがって宿主細胞中でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として直接作用する。ゲノムは、５‘末端に４つの非構造タンパク質、及び３’末端にキャプシド及び２つのエンベロープタンパク質をコードする。
【０２００】
本発明者らは、細菌にコードされたｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰは、成虫蚊に送達することができ、かつＭＲＥ１６ウイルスにコードされたｅＧＦＰのサイレンシングを行うことができ、蚊は、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現する大腸菌で予め感染させたか、又はＭＲＥ１６ウイルスを注射したもの、又は血粉中においてＭＲＥ１６ウイルスを給餌したものでもなく（力価＝８．３７ｌｏｇ）、得られたｅＧＦＰ蛍光、又はその欠如を定量化できることを実証した。
【０２０１】
ここで、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ構築物を発現しないか、又はＭＲＥ１６をコードしたｅＧＦＰのサイレンシングを行うように設計されたｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ構築物を発現する大腸菌は、ＭＲＩ１６ウイルスを注射する、又はＭＲＩ１６ウイルスを含む血粉を給餌する５日前に与えた。次いで、ウイルスによる感染の４日後（ｄｐｉ）にｅＧＦＰ蛍光レベルの採点を行った。細菌を用いた処置により、ｅＧＦＰを発現するＭＲＥ１６ウイルスを含む血粉後には、結果として、蚊に合計約５〜５０個のウイルスが残った。対照においては、１００，０００個のウイルスであった。ウイルス量のこうした変動（細菌に予め感染させた蚊においては、５〜５０個のウイルス）は、各蚊における異なる細菌感染レベルを反映したものであり、１匹の蚊あたりの細菌は、３２０〜１４５０個の範囲であった。
【０２０２】
本発明者らは、ＭＲＥ１６ウイルスのみを注射した蚊（図１３の１行目）、又は大腸菌に予め感染させて、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰが発現しておらず（図１３の２行目）、ＭＲＥ１６ウイルスを注射した蚊と比較して、２つの異なる大腸菌株（図１３を参照されたい：ＨＴ１１５＝ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ突然変異体；ＨＴ２７＝ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ突然変異体及びアミノ酸栄養要求性突然変異体）に予め感染させて、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現し（図１３の５行目及び６行目を参照）、血粉中においてＭＲＥ１６ウイルスに感染させた成虫蚊において、ｅＧＦＰ蛍光レベルにおける５対数倍、又は無細菌対照に対して１００，０００倍の減少が観察されたことを実証したものである。再び大腸菌株ＨＴ１１５及びＨＴ２７に予め感染させ、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現し、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ（４００ｎｇ）を注射した蚊にも、ＭＲＥ１６ウイルスを注射して、ｅＧＦＰ発現を抑制する考えられる最大範囲を決定した（ＦＦＵなし）。これは、図１３の３行目及び４行目に示されている。これらの蚊は、ｅＧＦＰを発現しなかった。
【０２０３】
図１４Ａ〜図１４Ｂに示す別の実験では、血粉直後にＭＲＥ１６ウイルスを蚊に注射した裸のｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ（４００ｎｇ）が、非標的ｄｓＲＮＡ−Ｂｇａｌ（４００ｎｇ）の注射とは異なり、ｅＧＦＰの発現を抑制できることが実証されている。全体として、これらの結果は、ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰを発現する大腸菌（ＨＴ１１５又はＨＴ２７）から蚊へｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰが送達され、その結果、ＭＲＥ１６をコードしたｅＧＦＰ遺伝子のサイレンシングがもたらされることを実証している。図１４Ａの写真は、本発明者らの細菌で処置された蚊内に残っているウイルスを小さな点として示している。全てのウイルスが存在しているために示されている場合、対照（ｄｓＲＮＡ−ｅＧＦＰ発現細菌はない）は濃い緑色である。１つの好ましい実施形態では、これらの結果は、ウイルスコード遺伝子のサイレンシングを行うためのｄｓＲＮＡの腸内細菌の送達を実証したものである。
【０２０４】
参考文献：
以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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[５７]Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｓ,Ｉｏｋａ  Ｄ,Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｈ,Ｅｎｄｏ  Ｈ,Ｉｓｈｉｉ  Ａ.Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ.Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ.２００１；１１３：ｐ.８９−９６
[５８]Ａｋｓｏｙ  Ｓ,Ｗｅｉｓｓ  Ｂ,Ａｔｔａｒｄｏ  Ｇ.Ｐａｒａｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｓｅｔｓｅ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｓｉｃｋｎｅｓｓ.Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ.２００８；６２７：ｐ.３５−４８
[５９]Ｃｏｕｔｉｎｈｏ−Ａｂｒｅｕ  ＩＶ,Ｚｈｕ  ＫＹ,Ｒａｍａｌｈｏ−Ｏｒｔｉｇａｏ  Ｍ.Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｓｅｃｔ−ｂｏｒｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ.Ｐａｒａｓｉｔｏｌｌｎｔ.２００９；５９：ｐ.１−８
[６０]Ｐｕｍｐｕｎｉ  ＣＢ,Ｄｅｍａｉｏ  Ｊ,Ｋｅｎｔ  Ｍ,Ｄａｖｉｓ  ＪＲ,Ｂｅｉｅｒ  ＪＣ.Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ａｎｏｐｈｅｌｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ.１９９６；５４：ｐ.２１４−８
[６１]Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃｅｒｏｎ  Ｌ,Ｓａｎｔｉｌｌａｎ  Ｆ,Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＭＨ,Ｍｅｎｄｅｚ  Ｄ,Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａ  ｖｉｌ  ａ  ＪＥ.Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｍｉｄｇｕｔｓ  ｏｆ  ｆｉｅｌｄ−ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｌｂｉｍａｎｕｓ  ｂｌｏｃｋ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｓｐｏｒｏｇｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｊ  Ｍｅｄ  Ｅｎｔｏｍｏｌ.２００３；４０：ｐ.３７１−４
[６２]Ｌｉｎｄｈ  ＪＭ,Ｔｅｒｅｎｉｕｓ  Ｏ,Ｆａｙｅ  ｉ.１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｆｉｅｌｄ−ｃａｕｇｈｔ  Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ  ａｎｄ  Ａ.ｆｉｍｅｓｔｕｓ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｗ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｋｎｏｗｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ.Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.２００５；７１ ：ｐ.７２１７−２３
[６３]Ｄａｍｉａｎｉ  Ｃ,Ｒｉｃｃｉ  ｉ,Ｃｒｏｔｔｉ  Ｅ,Ｒｏｓｓｉ  Ｐ,Ｒｉｚｚｉ  Ａ,Ｓｃｕｐｐａ  Ｐ,Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｆ,Ｂａｎｄｉ  Ｃ,Ｄａｆｆｏｎｃｈｉｏ  Ｄ,Ｆａｖｉａ  Ｇ.Ｐａｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｖｅｃｔｏｒｓ.Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ.２００８；１８：ｐ.１０８７−８
[６４]Ｔｅｒｅｎｉｕｓ  Ｏ,ｄｅ  Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ＣＤ,Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ＷＤ,Ｔａｄｅｉ  ＷＰ,Ｊａｍｅｓ  ＡＡ,Ｍａｒｉｎｏｔｔｉ  Ｏ.１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｕｌｔ  Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｄａｒｌｉｎｇｉ(Ｄｉｐｔｅｒａ：Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ)ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ.Ｊ  Ｍｅｄ  Ｅｎｔｏｍｏｌ.２００８；４５：ｐ.１７２−５
[６５]Ｒａｎｉ  Ａ,Ｓｈａｒｍａ  Ａ,Ｒａｊａｇｏｐａｌ  Ｒ,Ａｄａｋ  Ｔ,Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ＲＫ.Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｖａｅ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｄｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ｕｓｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｌａｂ−ｒｅａｒｅｄ  ａｎｄ  ｆｉｅｌｄ−ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ−ｍ  Ａｓｉａｎ  ｍａｌａｒｉａｌ  ｖｅｃｔｏｒ.ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.２００９；ｐ.１９：９−９６
[６６]Ｈｉｌｌｅｓｌａｎｄ  Ｈ,Ｒｅａｄ  Ａ,Ｓｕｂｈａｄｒａ  Ｂ,Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｉ,ＭｃＫｅｌｖｅｙ  Ｒ,Ｇｈｏｓｈ  Ｋ,Ｄａｓ  Ｐ,Ｄｕｒｖａｓｕｌａ  Ｒ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｋａｌａ  ａｚａｒ  ｖｅｃｔｏｒ,Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ  ａｒｇｅｎｔｉｐｅｓ：ａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐａｒａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｎｄ  ｆｌｉｅｓ.Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ.２００８；７９：ｐ.８８１−６
[６７]Ｇａｉｏ  ＡＯ,Ｇｕｓｍａｏ  ＤＳ,Ｓａｎｔｏｓ  ＡＶ,Ｂｅｒｂｅｒｔ−Ｍｏｌｉｎａ  ＭＡ,Ｐｉｍｅｎｔａ  ＰＦ,Ｌｅｍｏｓ  ＦＪ.Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｇｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ(Ｄｉｐｔｅｒａ：ｃｕｌｉｃｉｄａｅ)Ｐａｒａｓｉｔ  Ｖｅｃｔｏｒs.２０１１；ｐ.１４：４−１０５
[６８]Ｓａｙｌｅｒ  ＧＳ,Ｒｉｐｐ  Ｓ.Ｆｉｅｌｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ.Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.２０００；１１ ：ｐ.２８６−９
[６９]Ｂｒｉｏｎｅｓ  ＡＭ,Ｓｈｉｌｉｌｕ  Ｊ,Ｇｉｔｈｕｒｅ  Ｊ,Ｎｏｖａｋ  Ｒ,Ｒａｓｋｉｎ  Ｌ.Ｔｈｏｒｓｅｌｌｉａ  ａｎｏｐｈｅｌｉｓ  ｔｈｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎ  ａ  Ｋｅｎｙａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ.ＩＳＭＥ  Ｊ.２００８；２：ｐ.７４−８２
[７０]Ｗａｎｇ  Ｓ,Ｇｈｏｓｈ  ＡＫ,Ｂｏｎｇｉｏ  Ｎ,Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ  ＫＡ,Ｌａｍｐｅ  ＤＪ,Ｊａｃｏｂｓ−Ｌｏｒｅｎａ  Ｍ.Ｆｉｇｈｔｉｎｇ  ｍａｌａｒｉａ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ.Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ.２０１２；１０９：ｐ.１２７３４−９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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