(57)【要約】  本開示の実施形態は、ＨＰＶ以外のウイルスまたは非ウイルス関連疾患および悪性腫瘍に関連する疾患および悪性腫瘍の免疫療法のための方法および組成物に関し、例えば、ＶＳＴが非ウイルス癌に特異的なＣＡＲをコードし、ＶＳＴがウイルス、ウイルスワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスを用いてインビトロまたはインビボで刺激され得る。特定の実施形態では、方法はＩＬ−７およびＩＬ−１５を使用するが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、または両方を使用しない刺激ステップを伴う方法を含む、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶの１つ以上の抗原を標的とする免疫細胞の産生に関する。他の特定の実施形態は、共刺激細胞および特定の抗原提示細胞などの特定の細胞の存在下での刺激を利用する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、末梢血Ｔ細胞集団を抗原提示細胞で刺激するステップを含み、抗原提示細胞がペプチドライブラリーに曝露されているか、予め曝露されており、ペプチドがＨＰＶではない１つ以上のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、以下の項目の１つ以上を含む、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法:
(ａ)この方法はＩＬ−４の非存在下で起こる；
(ｂ)ＩＬ−１５の濃度は≧１００ｎｇ／ｍＬである；
(ｃ)この方法は、末梢血Ｔ細胞からのＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の枯渇を含む。
【請求項２】
前記刺激が、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、またはそれらの組み合わせの非存在下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記末梢血Ｔ細胞の集団が、正常なレベルと比較して、以下のうちの１つ以上の低下したレベルを有する、請求項１または２に記載の方法：１)ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。
【請求項４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはそれから得られる末梢血Ｔ細胞が、以下のうちの１つ以上のレベルを低下させるステップを受ける、請求項３に記載の方法：１)ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；３）制御性Ｔ細胞および／または４）抑制性骨髄細胞。
【請求項５】
前記ウイルスがヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）由来であるか、またはポックスウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、レンチウイルス、ラブドウイルスもしくは他の腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスが、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／または水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＨＩＶ、インフルエンザ、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および腫瘍溶解ウイルスからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記末梢血Ｔ細胞が、ＰＢＭＣの集団中に存在するか、ＰＢＭＣの集団から得られるか、またはＰＢＭＣの集団から単離される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＢＭＣまたはアフェレシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）産物から、以下のうちの１つ以上が枯渇している、請求項４または７に記載の方法：１）ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。
【請求項９】
前記集団中のＰＢＭＣが非接着性ＰＢＭＣである、請求項４または７〜８のいずれか一項に記載の方法
【請求項１０】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞またはＰＢＭＣである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記刺激ステップが、共刺激細胞の存在下で起こる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記共刺激細胞がＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、またはそれらの組み合わせである、または、前記共刺激細胞がＨＬＡ陰性リンパ芽球様細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記刺激が、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、ＰＢＭＣ、またはＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下で起こる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記刺激が活性化Ｔ細胞、樹状細胞、ＰＢＭＣ、またはＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下で起こる場合、前記刺激ステップは第１の刺激ステップではない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化Ｔ細胞が個体に対して自己のものである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記刺激が、ペプミックス、ペプミックスパルスで自己活性化したＴ細胞の存在下、ＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下、またはその両方で起こる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記刺激が、ペプミックスパルスで自己活性化したＴ細胞の存在下、ＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下、またはその両方で起こる場合、前記刺激ステップは第１の刺激ステップではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドライブラリーが、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくはそれ以上のアミノ酸を含む、またはこれらの長さ以下のペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドライブラリーが、１５アミノ酸長のペプチドを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライブラリー中のペプチドが、他のペプチドと配列において１１アミノ酸だけ重複する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の刺激ステップによって産生されるＴ細胞が、１つ以上の後続の刺激ステップに供される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記後続の刺激ステップがＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記後続の刺激ステップが、活性化Ｔ細胞、共刺激細胞、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で起こる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法は、前記方法によって産生されたＴ細胞を、ペプチドのライブラリーに予め曝露された活性化Ｂ細胞に曝露することなしに起こる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、発現ベクターから遺伝子産物を発現するように改変される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、キメラ抗原受容体、αβＴ細胞受容体、またはそれらの組合せを発現するように改変される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに曝露されたか、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに対して血清陽性であるか、またはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに関連する疾患を有する個体に、本方法により産生されるＴ細胞の治療有効量を提供する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記個体が、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに関連する医学的状態を有すると決定されることを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法の１つ以上のステップが、外来的に添加されたＩＬ−４、ＩＬ−２、または両方の存在を欠く、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＨＰＶ以外のウイルスに特異的なＴ細胞を刺激する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、ＩＬ−４の非存在下、ならびに共刺激細胞の存在下で、ウイルスに特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、前記抗原提示細胞は１以上のペプチドに予め曝露され、前記ペプチドはＨＰＶ以外のウイルスの１以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、前記抗原提示細胞はＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇している、方法。
【請求項３１】
ウイルス関連疾患または非ウイルス関連疾患の治療用Ｔ細胞を産生する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の１つ以上の存在下、ＩＬ−４の非存在下ならびに共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶ以外のウイルスに特異的なＴ細胞を抗原提示細胞と共に刺激するステップを含み、前記抗原提示細胞が１つ以上のペプチドに予め曝露されており、前記ペプチドがＨＰＶ以外のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、前記刺激が前記ウイルス関連疾患の治療用Ｔ細胞を産生し、前記抗原提示細胞はＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇している、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，４３８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（研究または開発を主宰する連邦政府の声明）
本発明は、National Institutes of Health/National Cancer Instituteにより授与された３３０００２８３１１および３３０００２８３１２に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
本開示は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、および癌医学を含む医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗原特異的Ｔ細胞の活性化と増殖には３つのシグナルが必要である。シグナル１は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）がその同族ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合することを必要とする。シグナル２はＴ細胞表面の共刺激受容体の刺激を必要とし、シグナル３はサイトカインに由来する。シグナルは抗原特異的Ｔ細胞の増殖をインビトロで維持するために、約７〜１４日毎に１回必要である。これらのシグナルのいずれか１つが存在しない場合、Ｔ細胞は増殖できず、そしてアネルギーになるか、または死滅し得る。これらの要件は特に腫瘍抗原特異的Ｔ細胞が通常はアネルギー性（活性化に反応しない）であるか、そうでなければ機能不全である、癌患者由来の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を活性化する場合に、いくつかの課題をもたらす。
【０００５】
対処されてきた抗原特異的Ｔ細胞の活性化および増殖に関する主要な課題には、以下が含まれる:
【０００６】
１．腫瘍誘発性Ｔ細胞アネルギー。循環Ｔ細胞は腫瘍によってアネルギー化され、癌患者の血液から増殖させることは困難である。
【０００７】
２．抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のみを増殖させるには、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方に腫瘍抗原を発現する自己抗原提示細胞、ならびに共刺激分子による抗原特異的Ｔ細胞の反復刺激が必要である。刺激が強すぎる場合、抗原特異的Ｔ細胞を希釈しながら非特異的バイスタンダー細胞を増殖させる。
【０００８】
自己樹状細胞（ＤＣ）は強力な抗原提示細胞であるが、その数は限定されている；それらは分裂せず、それらの単球前駆体は血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の１０％未満である。Ｔ細胞増殖に十分なＤＣを得るには、大量の血液が必要であろう（３００ｍｌ〜１リットルの血液）。
【０００９】
自己ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）も優れた抗原提示細胞であるが、患者からＬＣＬを確立するのに少なくとも６週間かかり、ＬＣＬは弱いＥＢＶおよび非ＥＢＶ抗原と競合する高免疫原性ＥＢＶ抗原を発現する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本開示は抗原特異的Ｔ細胞の活性化および増殖に関連する種々の問題に対処し、有効な免疫療法でウイルス関連疾患および悪性腫瘍を処置するための当該分野における長年の必要性に対する解決手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、特定の標的を免疫原的に認識する免疫系細胞に関する方法および組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明が個体において免疫応答を誘発する生物学的部分を標的とする、ウイルス特異的Ｔ細胞（ＶＳＴ）（ウイルス抗原特異的Ｔ細胞または抗原特異的Ｔ細胞とも呼ばれ得る）の開発に関する。特定の実施形態では、本開示がウイルス疾患関連抗原を含むウイルス抗原を標的とするＶＳＴの開発に関する。本開示の実施形態は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および殺傷しないが１つ以上のサイトカインを産生する細胞、の産生を含む。いくつかの場合において、細胞傷害性Ｔ細胞の混合物が産生され、混合物は場合によっては、複数のウイルス由来の抗原を含む、複数のウイルス抗原を標的とする。特定の実施形態では、ウイルスはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ではない。本開示の実施形態は、非ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の生成および／または拡大に関する。
【００１２】
本開示の実施形態は、非ＨＰＶウイルスに感染した個体、または特定のウイルスに関連する癌を含む、ＨＰＶに関連しないウイルス関連疾患および悪性腫瘍を有する個体に治療を提供するための方法および組成物に関する。特定の実施形態において、本開示は、ウイルス関連の医学的状態を標的とし得、そのために治療的である養子細胞免疫療法のための方法および組成物に関する。
【００１３】
特定の局面において、本開示は例えば、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶ由来の抗原を標的とする複数のＴ細胞の開発に関する。本開示は例えば、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶ由来の抗原（ここで、ウイルスはＨＰＶではない）に対して特異性を有する、Ｔ細胞株を生成するための方法について、有意かつ非自明な改善を提供する。
【００１４】
本開示のいくつかの実施形態において、個体は、本発明の方法および／または組成物を必要としている。特定の実施形態では、個体が、例えばＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ（これらの存在は個体にとって知られていても、知られていなくてもよい）に既に曝露されているか、または個体が、例えば、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに曝露されたか曝露されるリスクがあると疑われる。特定の実施形態では、個体が例えば、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶに関連する疾患を有するか、有することが疑われるか、または有する危険性があるか、またはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＶＺＶ、もしくはワクシニアウイルスでワクチン接種されている。
【００１５】
方法の少なくとも一部の特定の実施形態において、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶに関連する特定の抗原は、特定の抗原のいくつかまたは全てにわたる１つ以上のペプチドの形態でＡＰＣに提示される。抗原性ペプチドは、ペプチド混合物のライブラリー中のＡＰＣに提供され得、これはペプミックスと呼ばれ得る。本開示の特定の局面において、ＡＰＣへの曝露のための種々のペプミックスのプール化が存在する。ＭＨＣ分子上に抗原を提示するＡＰＣは、特定の条件下で末梢血Ｔ細胞に曝露されて、特定のウイルス抗原に特異的なＴ細胞の刺激を生じ得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、末梢血Ｔ細胞などの末梢血細胞を刺激する方法であって、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、ならびに少なくともいくつかの場合において、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２などの１つまたは複数の他のサイトカインの非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞がＨＰＶではないウイルスの１つまたは複数のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、１つまたは複数のペプチドに予め曝露された、方法が存在する。
【００１７】
非ＨＰＶウイルスまたは非ＨＰＶウイルス由来の抗原に特異的なＴ細胞を刺激する方法はＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、および場合によっては共助刺激細胞の存在下で、ウイルスまたは抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、ここで、抗原提示細胞は、ウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む１つ以上のペプチドに予め曝露されている。
【００１８】
場合によっては非ＨＰＶウイルス関連疾患のための治療用Ｔ細胞を産生する方法があり、この方法はインターロイキンＩＬ−７およびＩＬ−１５の１つ以上の存在下、ならびに少なくともいくつかの場合において、場合によっては１つ以上の他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２）の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激するステップを包含し、ここで、抗原提示細胞は１つ以上のペプチドに予め曝露され、ここで、ペプチドはＨＰＶでないウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を包含し、刺激するステップはウイルス関連疾患およびＨＰＶ関連疾患ではない悪性腫瘍のための治療用Ｔ細胞を産生する。
【００１９】
特定の実施形態では、ウイルス関連疾患およびＨＰＶ関連疾患以外の悪性腫瘍のための治療用Ｔ細胞を産生する方法であって、ウイルスまたはウイルス抗原に特異的なＴ細胞を、インターロイキンＩＬ−７およびＩＬ−１５の１つ以上の存在下、および場合によっては共刺激細胞の存在下で抗原提示細胞で刺激するステップを含み、抗原提示細胞がＨＰＶではないウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含むペプチドによって刺激され、刺激することによって１つ以上のウイルス関連疾患および悪性腫瘍のための治療用Ｔ細胞を産生する、方法がある。
【００２０】
場合によっては刺激される末梢血Ｔ細胞がＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、および少なくともいくつかの場合にはＩＬ−６および／またはＩＬ−１２などの１つまたは複数の他のサイトカインの存在下で、末梢血細胞を抗原提示細胞で刺激することなどの末梢血細胞の事前の刺激から得られる。ここで、抗原提示細胞はＨＰＶではないウイルスの１つまたは複数のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、１つまたは複数のペプチドに事前に曝露されている。このように、末梢血Ｔ細胞を刺激する前に、本方法はさらに、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、および少なくともいくつかの場合にはＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み得、ここで、抗原提示細胞は、１つ以上のペプチドに予め曝露される。ここで、ペプチドは末梢血Ｔ細胞を産生するために、ＨＰＶではないウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、１つ以上のペプチドは、ＨＰＶではないウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のペプチドはペプチドのライブラリーであり得、これはペプチドのコレクションとも呼ばれ得る。特定の実施形態では、方法がＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ、またはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ由来の抗原に特異的なＴ細胞を産生し得る。いくつかの実施形態において、方法は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ、またはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ由来の抗原に特異的な、末梢血Ｔ細胞に存在するＴ細胞の集団を拡大し得る。
【００２２】
本開示の１つ以上の方法において使用されるＡＰＣは例えば、単球、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ芽細胞（ＢＢ）、および／またはＰＢＭＣを含む。特定の実施形態では、抗原提示細胞は活性化Ｔ細胞である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＨＰＶ以外のウイルスまたはＨＰＶ由来の抗原以外の抗原に特異的なＴ細胞の刺激が第１の刺激ステップではない。刺激された細胞であるＴ細胞は、以前の刺激の産物であり得る。特定の実施形態では、ＨＰＶ以外のウイルスまたはＨＰＶ以外の抗原に特異的なＴ細胞の刺激がインターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５の存在下、および１つ以上のタイプの共刺激細胞の存在下で、ウイルスまたはウイルス抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、方法は、非ＨＰＶウイルスまたはＨＰＶ抗原ではない抗原に特異的なＴ細胞を産生し得る。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルスまたはＨＰＶ以外の抗原に特異的なＴ細胞の集団を拡大し得る。
【００２５】
特定の実施形態では、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での末梢血Ｔ細胞の刺激が、場合によってＩＬ−２の非存在下で起こる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での末梢血Ｔ細胞の刺激は場合により、少なくともＩＬ−４の非存在下で起こる。ただし場合によっては、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を増加させるためにＩＬ−４が添加される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での末梢血Ｔ細胞の刺激が場合によってはＩＬ−６の非存在下で起こる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での末梢血Ｔ細胞の刺激が、代わりに、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５の非存在下で起こり得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での末梢血Ｔ細胞の刺激が、場合により、ＩＬ−１２の非存在下で起こる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での末梢血Ｔ細胞の刺激が、場合により、ＩＬ−２１の非存在下で起こる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本開示の方法において利用される末梢血Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団中に存在し得るか、またはそこから得られるかまたは単離される。集団中のＰＢＭＣは非接着性ＰＢＭＣであってもよく、またはＣＤ４５ＲＡ枯渇ＰＢＭＣ（例えば、Ｔｒｅｇｓ、ＮＫ細胞およびナイーブＴ細胞の組み合わせを排除するために）であってもよい。抗原提示細胞は例えば、樹状細胞、Ｂ芽細胞、またはＰＢＭＣであり得る。
【００２７】
本開示の方法は、ＨＰＶではないウイルス関連疾患および悪性腫瘍のための治療用Ｔ細胞を産生する方法を含む。細胞の刺激は、ウイルス関連疾患およびＨＰＶ関連疾患ではない悪性腫瘍に対して治療的であるＴ細胞を産生し得る。いくつかの実施形態において、ＨＰＶ関連疾患のための治療用Ｔ細胞を産生する方法が提供される:
【００２８】
(ｉ)末梢血細胞を刺激することであって、本方法がインターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下、および場合によりＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激するステップを含み、ここで、抗原提示細胞は、非ＨＰＶウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む１つ以上のペプチドに予め曝露されている；または、
【００２９】
(ｉｉ)（ｉ）から得られるＴ細胞を、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下、および場合によってはＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、抗原提示細胞で刺激することであって、抗原提示細胞は１つ以上のペプチドに予め曝露され、ここで、ペプチドはウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉ）は場合によっては１回以上繰り返される;
【００３０】
(ｉｉｉ)（ｉｉ）から得られるＴ細胞を、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、および場合により共刺激細胞の存在下で、抗原提示細胞で刺激することであって、抗原提示細胞は１以上のペプチドに予め曝露され、ここで、ペプチドはウイルスの１以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、ここで（ｉｉｉ）は場合により１回以上繰り返される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞が単球、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ芽細胞（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞が活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞が（ｉ）および／または（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞とは異なる。好ましい実施形態において、（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞である。
【００３２】
特定の実施形態では、刺激が共刺激細胞の存在下で起こる。いくつかの実施形態において、共刺激細胞は、ＣＤ８０＋細胞、ＣＤ８６＋細胞、ＣＤ８３＋細胞、４−１ＢＢＬ＋細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の細胞型である。共刺激細胞は、ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋／ＣＤ８３＋／４−１ＢＢＬ＋細胞であり得る。共刺激細胞は、ＨＬＡ陰性リンパ芽球様細胞であり得る。
【００３３】
いくつかの特定の実施形態では、本開示の方法がＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶに特異的なＴ細胞を産生するためのものである。いくつかの特定の実施形態において、本開示の方法は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶに関連する疾患および悪性腫瘍に特異的なＴ細胞を産生するためのものである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、末梢血Ｔ細胞は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶに感染していることが知られているか、または感染していることが疑われる個体から得ることができる。抗原提示細胞は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに感染していることが知られているか、または感染しているかまたはワクチン接種されていることが疑われる個体から得ることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本方法は、本方法によって産生されたＴ細胞を、ペプチドのライブラリーに予め曝露された活性化Ｂ細胞に曝露することなく、起こり得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、得られる治療用Ｔ細胞で処置されることが意図される個体に対して自己由来または同種異系であり得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、１つ以上のペプチドがＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶの１つ以上のタンパク質の配列に少なくとも部分的に対応する配列を含む。ペプチドは、ウイルスタンパク質内に存在する連続したアミノ酸配列に対応し得る。ペプチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長、または１５アミノ酸長以下、の長さを有し得る。ペプチドのコレクションは、ライブラリーを形成し得、そしてライブラリー中のペプチドは例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４アミノ酸を含む任意の適切な量で、他のペプチドと配列において重複し得る。ペプチドは、ウイルスタンパク質に対応する配列を含んでもよい。
【００３８】
本開示の方法によって産生されるＴ細胞は単離および／または精製（例えば、他の細胞からの単離／精製）され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって産生されるＴ細胞の治療有効量は、ＨＰＶではないウイルスに曝露された個体、またはＨＰＶに由来しないウイルス関連疾患を有する個体に提供される。関連する局面において、本開示の方法によって産生されるＴ細胞は、ＨＰＶに由来しないウイルス関連疾患の処置における使用のために提供される。別の関連する局面において、本開示の方法によって産生されるＴ細胞の使用は、ＨＰＶではないウイルス関連疾患の処置における使用するための医薬の製造における使用のために提供される。
【００４０】
特定の実施形態において、本開示の方法は１つ以上の操作されたレセプター（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ））で改変されたＶＳＴの拡大を促進するためのウイルスの使用を包含する。例えば、ウイルスがＶＺＶであり、ＶＳＴがＶＺＶ特異的（ＶＺＶＳＴ）である場合、ＶＺＶワクチン（例えば、ＺＯＳＴＡＶＡＸまたはＶＡＲＩＶＡＸ）を使用して、注入後のＣＡＲ修飾ＶＺＶＳＴの増殖を刺激し得る。ＶＳＴがアデノウイルス、マラバウイルスまたはワクシニアまたはＶＳＶなどの腫瘍溶解性ウイルスに特異的である場合、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は腫瘍細胞を殺傷できるだけでなく、その腫瘍溶解性ウイルスに特異的なＣＡＲ修飾Ｔ細胞を刺激することもできる。ＣＡＲ修飾ＯＶ特異的Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＯＶＳＴ）は、ＣＡＲを介して非感染または転移性腫瘍細胞を死滅させることができた。
【００４１】
処置される個体はヒトであり得る。個体は患者であり得る。個体は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに曝露されているか、またはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに関連する疾患を有し得る。この疾患は新生物（例えば、任意の種類の癌）であり得る。
【００４２】
個体は、必要に応じて、手術、放射線、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組み合わせなどの追加の癌療法を含む、疾患の追加の療法を受けていてもよく、受けていてもよく、または受けるのであろう。
【００４３】
個体は、ＨＰＶに由来しないウイルス関連癌を有すると決定され得る。
【００４４】
細胞刺激のステップを含む本開示による方法は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で行うことができる。用語「インビトロ」は、実験室条件または培養における材料、生物学的物質、細胞および／または組織を用いた研究を包含することが意図される。「エクスビボ」は生物の外側、例えば、ヒトまたは動物の体外に存在し、または起こっているものを指し、組織（例えば、器官全体）または生物から採取された細胞上にあってもよい。
【００４５】
一実施形態では、末梢血細胞を刺激する方法であって、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞が、ＨＰＶではない１つ以上のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、１つ以上のペプチドに予め曝露されている、方法を提供する。
【００４６】
特定の実施形態ではウイルス抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５（例えば、≧１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、末梢血Ｔ細胞の集団を抗原提示細胞で刺激するステップを包含し、ここで、抗原提示細胞はペプチドのライブラリーに予め曝露され、ペプチドはＨＰＶではない１つ以上のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を包含する、方法が存在する。
【００４７】
本方法の特定の実施形態では、末梢血Ｔ細胞の集団が正常レベルと比較して、以下のうちの１つ以上のレベルが低下している：１）ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞が出発ＰＢＭＣまたはアフェレシス産物から枯渇した場合、制御性Ｔ細胞。特定の場合において、ＰＢＭＣまたはそれから得られる末梢血Ｔ細胞は、以下のうちの１つ以上のレベルを低下させるステップを受ける：１）ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。末梢血Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団中に存在してもよく、またはそこから得られるか、もしくは単離される。ＰＢＭＣまたはアフェレシス産物は、以下のうちの１つ以上が枯渇され得る：１）  ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。ＰＢＭＣは、ＣＤ４５ＲＡ枯渇ＰＢＭＣであってもよい。集団中のＰＢＭＣは、非接着性ＰＢＭＣであり得る。特定の実施形態では、ＰＢＭＣが例えば接着または他の枯渇法によって、抑制性骨髄細胞である骨髄細胞を枯渇してもよい。
【００４８】
本開示によって包含されるウイルスは、ヘルペスウイルス科由来のものを含むか、またはポックスウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、レンチウイルス、ラブドウイルスもしくは他の腫瘍溶解性ウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスがエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／または水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＨＩＶ、インフルエンザ、マラバウイルス水疱性口内炎ウイルス、または任意の他の腫瘍溶解ウイルスからなる群より選択される。
【００４９】
本開示の方法において利用される抗原提示細胞は、特定の実施形態において、樹状細胞またはＰＢＭＣであり得る。
【００５０】
本開示によって包含される方法において、刺激ステップは、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、またはそれらの組み合わせの非存在下で起こる。特定の実施形態では、刺激ステップがＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、またはそれらの組み合わせである共刺激細胞などの共刺激細胞の存在下で起こるか、または共刺激細胞がＨＬＶ陰性リンパ芽球様細胞である。刺激は、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、ＰＢＭＣ、またはＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下で起こり得る。刺激は、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、ＰＢＭＣ、またはＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下で起こり得、刺激ステップは第１の刺激ステップではない。活性化されたＴ細胞は、個体に対して自己であり得る。刺激は、ペプミックス、ペプミックスパルスで自己活性化されたＴ細胞の存在下、ＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下、またはその両方で起こりうる。特定の場合において、刺激がペプミックスパルスで自己活性化されたＴ細胞の存在下、ＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下、またはその両方で起こる場合、刺激ステップは、第１の刺激ステップではない。このような場合、２つの刺激が行われ、第２の刺激は、共刺激細胞およびペプミックスパルス（自己活性化Ｔ細胞（ａＡＴＣ））の存在下で起こる。
【００５１】
本開示の方法において利用されるペプチドライブラリーは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上のアミノ酸長以下のペプチドを含み得る。特定の場合において、ペプチドライブラリーは、長さが１５アミノ酸のペプチド、および／またはライブラリー中のペプチドが他のペプチドと配列が１１アミノ酸重複しているペプチドを含む。
【００５２】
特定の実施形態では、第１の刺激ステップによって産生されたＴ細胞がＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で起こる後続の刺激ステップなどの、１つまたは複数の後続の刺激ステップを受ける。その後の刺激ステップは、活性化Ｔ細胞、共刺激細胞、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５の存在下で起こり得る。特定の場合、この方法は、本方法により産生されたＴ細胞を、ペプチドのライブラリーに予め曝露された活性化Ｂ細胞に曝露することなく、起こる。
【００５３】
いくつかの場合において、本方法によって産生された細胞は、キメラ抗原レセプター、αβＴ細胞レセプター、またはそれらの組み合わせを発現するように改変されるなどの、発現ベクターからの遺伝子産物を発現するように改変される。
【００５４】
特定の場合において、この方法によって産生されたＴ細胞の治療有効量は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに曝露された個体、あるいは、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに対して血清陽性である個体、あるいはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに関連する疾患を有する個体、に提供される。特定の局面において、個体は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに関連する医学的状態を有すると決定される。特定の実施形態では、癌は非ウイルス性癌である。
【００５５】
特定の場合において、本方法の１つ以上のステップは、外因的に添加されたＩＬ−４、ＩＬ−２、または両方の存在を欠く。
【００５６】
一実施形態では、ＨＰＶ以外のウイルスに特異的なＴ細胞を刺激する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、ならびに共刺激細胞の存在下で、ウイルスに特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞がＨＰＶ以外のウイルスの１つまたは複数のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む１つまたは複数のペプチドに予め曝露されている、方法がある。
【００５７】
別の実施形態ではウイルス関連疾患または非ウイルス関連疾患のために治療的Ｔ細胞を産生する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の１つまたは複数の存在下、ならびに共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶ以外のウイルスに特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激するステップを含み、ここで抗原提示細胞は１つまたは複数のペプチドに事前に曝露され、ここで、ペプチドはＨＰＶ以外のウイルスの１つまたは複数のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、刺激はウイルス関連疾患または悪性のために治療的なＴ細胞を産生する、方法がある。
本開示は、少なくとも以下のものを包含する:
１．末梢血細胞を刺激する方法であって、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、前記抗原提示細胞は１つ以上のペプチドに予め曝露され、前記ペプチドはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ではない１つ以上のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、方法。
２．ウイルス抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、末梢血Ｔ細胞の集団を抗原提示細胞で刺激するステップを含み、前記抗原提示細胞はペプチドのライブラリーに曝露されるか予め曝露されており、前記ペプチドはＨＰＶではない１つ以上のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、方法。
３．ＩＬ−１５の濃度が１ｍＬ当たり１００ｎｇ以上である、項１または２に記載の方法。
４．前記刺激が、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、またはそれらの組み合わせの非存在下で起こる、項１、２、または３の方法。
５．前記末梢血Ｔ細胞の集団が、正常レベルと比較して、以下のうちの１つ以上の低下したレベルを有する、項１〜４のいずれか一項に記載の方法：１）ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。
６．そこから得られたＰＢＭＣまたは末梢血Ｔ細胞が、以下の１つまたは複数のレベルを低下させるステップを受ける、項５に記載の方法：１）ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。
７．ウイルスがヘルペスウイルス科由来であるか、またはポックスウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、レンチウイルス、ラブドウイルスまたは他の腫瘍溶解性ウイルスで項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
８．ウイルスが、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ワクシニア、および／または水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＨＩＶ、インフルエンザ、マラバウイルス水疱性口内炎ウイルス、および腫瘍溶解ウイルスからなる群より選択される、項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．末梢血Ｔ細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団中に存在するか、ＰＢＭＣの集団から得られるか、またはＰＢＭＣの集団から単離される、項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
１０．ＰＢＭＣまたはアフェレシス産物から、以下のうちの１つ以上が枯渇している、項６または９に記載の方法：１）ＮＫ細胞；２）バイスタンダー細胞として増殖することができるナイーブ細胞；および／または３）制御性Ｔ細胞。
１１．ＰＢＭＣがＣＤ４５ＲＡ枯渇ＰＢＭＣおよび／またはＣＤ４５ＲＯ枯渇ＰＢＭＣである、項１０に記載の方法。
１２．前記集団中のＰＢＭＣが非接着性ＰＢＭＣである、項６または９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．前記抗原提示細胞が、樹状細胞またはＰＢＭＣである、項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．前記刺激ステップが、共刺激細胞の存在下で起こる、項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記共刺激細胞がＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、またはそれらの組み合わせである、または共刺激細胞がＨＬＶ陰性リンパ芽球様細胞である、項１４に記載の方法。
１６．前記刺激が、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、ＰＢＭＣ、またはＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下で起こる、項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．前記刺激が活性化Ｔ細胞、樹状細胞、ＰＢＭＣ、またはＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下で起こる場合、前記刺激ステップは第１の刺激ステップではない、項１６記載の方法。
１８．前記活性化Ｔ細胞が個体に対して自己のものである、項１６または１７に記載の方法。
１９．前記刺激が、ペプミックス、ペプミックスパルスで自己活性化したＴ細胞の存在下、ＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下、またはその両方で起こる、項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記刺激が、ペプミックスパルス自己活性化Ｔ細胞の存在下、ＨＬＡ陰性共刺激細胞の存在下、またはその両方で起こる場合、前記刺激ステップは第１の刺激ステップではない、項１９に記載の方法。
２１．前記ペプチドライブラリーが、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくはそれ以上のアミノ酸を含む、またはこれらの長さ以下のペプチドを含む、項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．ペプチドライブラリーが、長さが１５アミノ酸のペプチドを含む、項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．前記ライブラリー中のペプチドが１１アミノ酸だけ他のペプチドと配列が重複している、項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記第１の刺激ステップによって産生されるＴ細胞が、１つ以上の後続の刺激ステップに供される、項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記後続の刺激ステップが、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で起こる、項２４に記載の方法。
２６．前記後続の刺激ステップが、活性化Ｔ細胞、共刺激細胞、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５の存在下で起こる、項２４または２５に記載の方法。
２７．方法が、前記方法によって産生されたＴ細胞を、ペプチドのライブラリーに予め曝露された活性化Ｂ細胞に曝露することなしに起こる、項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．細胞が発現ベクターから遺伝子産物を発現するように改変される、項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．前記細胞が、キメラ抗原受容体、γδＴ細胞受容体、またはそれらの組合せを発現するように改変される、項２９に記載の方法。
３０．前記方法によって産生される治療有効量のＴ細胞が、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに曝露された個体、あるいはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに対して血清陽性である個体、あるいはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに関連する疾患を有する個体、に提供される、項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
３１．  前記個体が、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、および／またはＶＺＶに関連する医学的状態を有すると決定されることを含む、項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記方法の１つ以上のステップが、外来的に添加されたＩＬ−４、ＩＬ−２、または両方の存在を欠く、項１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．ＨＰＶ以外のウイルスに特異的なＴ細胞を刺激する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、ならびに共刺激細胞の存在下で、ウイルスに特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、前記抗原提示細胞は１以上のペプチドに予め曝露され、前記ペプチドはＨＰＶ以外のウイルスの１以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、方法。
３４．ウイルス関連疾患または非ウイルス関連疾患の治療用Ｔ細胞を産生する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の１つ以上の存在下、および共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶ以外のウイルスに特異的なＴ細胞を抗原提示細胞と共に刺激するステップを含み、前記抗原提示細胞が１つ以上のペプチドに予め曝露されており、前記ペプチドがＨＰＶ以外のウイルスの１つ以上のタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、前記刺激が、前記ウイルス関連疾患の治療用Ｔ細胞を産生する、方法。
【００５８】
上記は以下の本発明の詳細な説明がよりよく理解され得るように、本発明の特徴および技術的利点をかなり広く概説した。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明の追加の特徴および利点を以下に説明する。開示される概念および特定の実施形態は本発明の同じ目的を実行するための他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。当業者なら、添付の特許請求で説明したような本発明の精神および範囲から、このような等価な構成が、逸脱しないことも認識すべきである。本発明の特徴であると考えられる新規な特徴はその構成および動作方法の両方に関して、更なる目的および利点と共に、添付の図面と関連して考慮されるとき、以下の説明からより良く理解されるのであろう。しかしながら、図面の各々は、例示および説明の目的のみのために提供され、本発明の限定の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
本発明をより完全に理解するために、添付の図面と共に以下の説明を参照する。
【００６０】
【図１】本開示のウイルス特異的Ｔ細胞（ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ）（ＶＳＴ）生成方法の一般的な実施形態を図示する。
【００６１】
【図２】ＩＬ−４およびＩＬ−７を使用する既知の方法と比較して、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を使用する本開示の方法の改善された特異性を実証する。
【００６２】
【図３】ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で増殖したリンパ腫患者のＥＢＶＳＴの改善された特異性を示す。
【００６３】
【図４】高用量のＩＬ−１５がＶＳＴの特異性を高めることを実証する。
【００６４】
【図５】高用量のＩＬ−１５がセントラルメモリーＥＢＶＳＴを増加させることを示す。
【００６５】
【図６】一部の患者からのＥＢＶＳＴにおける過剰なＮＫ細胞成長を示す。
【００６６】
【図７】ＣＤ４５ＲＡ枯渇ＰＢＭＣからのペプミックス活性化ＥＢＶＳＴの生成を示す。
【００６７】
【図８】ＣＤ４５ＲＡ枯渇が健康なドナーから拡大したＥＢＶＳＴにおけるＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の頻度を減少させることを実証する。
【００６８】
【図９】ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の除去がＥＢＶＳＴの増殖を増加させることを示す。
【００６９】
【図１０】ＣＤ４５ＲＡ枯渇がＥＢＶＳＴの倍率拡大を増強したことを示す。
【００７０】
【図１１】ＣＤ４５ＲＡの枯渇が第２の刺激の終わり（１６日目）にＥＢＶＳＴの抗原特異性を増強することを示す。
【００７１】
【図１２】ＣＤ４５ＲＡ枯渇がＥＢＶＳＴの抗原特異性を高めることを実証する。
【００７２】
【図１３】第３の刺激後に持続したＣＤ４５ＲＡ欠乏ＥＢＶＳＴの抗原特異性の増加を示す。
【００７３】
【図１４】ＣＤ４５ＲＡ枯渇がリンパ腫患者のＥＢＶＳＴにおけるＮＫ細胞集団成長を減少させることを実証する。
【００７４】
【図１５】ＣＤ４５ＲＡ枯渇がリンパ腫患者のＥＢＶＳＴにおける抗原特異的Ｔ細胞の頻度を増加させたことを示す。
【００７５】
【図１６】ＣＤ４５ＲＡ枯渇がリンパ腫患者由来のＥＢＶＳＴにおける抗原特異性を高めたことを示す。
【００７６】
【図１７】リンパ腫患者のＥＢＶＳＴの増殖に対するＣＤ４５ＲＡ枯渇の効果を示す。
【００７７】
【図１８】ＣＤ４５ＲＡ枯渇がぺプミックスパルスで自己活性化されたＴ細胞（ａＡＴＣ）に対する細胞溶解活性を増強したことを示す。
【００７８】
【図１９】ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、およびＨＨＶ６に特異的なＴ細胞（マルチウイルス特異的Ｔ細胞）の生成の実施形態を示す。
【００７９】
【図２０】マルチウイルス特異的Ｔ細胞の拡大を示す。
【００８０】
【図２１】マルチウイルス特異的Ｔ細胞の抗原特異性を示す。
【００８１】
【図２２】第１の刺激後のＶＺＶ特異的ＶＳＴの増殖を示す。
【００８２】
【図２３】第２の刺激後のＶＺＶＳＴの拡大を示す。
【００８３】
【図２４】最初の刺激後（８日目）のＶＺＶＳＴの特異性を実証したものである。
【００８４】
【図２５】２回目の刺激後（１６日目）のＶＺＶＳＴの特異性を実証したものである。
【００８５】
【図２６】ＨＩＶ血清陽性ドナーからのＨＩＶ特異的Ｔ細胞の製造を例示する。
【００８６】
【図２７】第２の刺激におけるＫ５６２細胞による最適な拡大を示す。
【００８７】
【図２８】Ｋ５６２の存在下で、ＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞（ＨＩＶＳＴ）がわずか２回の刺激後に臨床的に関連のある数に拡大したことを示す。
【００８８】
【図２９】ＨＩＶＳＴが複数のＨＩＶ抗原に特異的であることを示す。
【００８９】
【図３０】ＨＩＶＳＴが混合ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことを実証したものである。
【００９０】
【図３１】ＨＩＶＳＴが抗原パルス標的およびＨＩＶ感染標的を溶解し得ることを実証したものである。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
本出願の範囲は、明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。
【００９２】
長年にわたる特許法の慣例に従い、「ａ」および「ａｎ」という用語は、特許請求の範囲を含む単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と一緒に本明細書で使用される場合、「１つまたは複数」を意味する 本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法ステップ、および／または方法からなるか、または本質的にそれらからなることができる。本明細書中に記載されるいずれの方法または組成物も、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して使用され得ることが意図される。
【００９３】
本開示はＥＢＶ特異的、ＣＭＶ特異的、アデノウイルス特異的、ワクシニアウイルス特異的、および／またはＶＺＶ特異的Ｔ細胞を必要とする個体のための治療用Ｔ細胞の産生および使用に関し、個体におけるこれらのウイルスの１つ以上に関連する医学的状態を処置することを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、非ウイルス性癌のための治療用Ｔ細胞の産生および使用に関する；このような場合、１つ以上のＣＡＲがＶＳＴにおいて発現され、そしてワクチン接種または腫瘍溶解性ウイルスがそれらのＴ細胞受容体を介してＣＡＲ−ＶＳＴを刺激するために使用される。特定の実施形態では治療用Ｔ細胞がＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下でのＡＰＣの刺激によって生成され、ここで、ＡＰＣは１つ以上のウイルス抗原に向けられたペプチドライブラリーに予め曝露されている。
【００９４】
特定の態様において、本開示は、養子Ｔ細胞移入に関連する課題に対処する。例えば、腫瘍誘発性Ｔ細胞アネルギーに対処するために、本発明者らはサイトカインの種々の組み合わせを評価し、そして少なくともいくつかの場合において、ＩＬ−７と組み合わせた高用量のＩＬ−１５が、アネルギー性抗原特異的Ｔ細胞の拡大を促進することを決定した（図２）。したがって、第１の刺激では、ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ１５（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、重複ペプチドライブラリー（例えば、１１アミノ酸が重複し、目的のタンパク質に及ぶ１５マーアミノ酸を含むペプミックス）でＰＢＭＣをパルスすることによって、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する。ここで、本発明者らは、いくつかの異なるウイルス由来の抗原を評価して、ウイルス特異的Ｔ細胞（ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ）（ＶＳＴ）を作製した。
【００９５】
抗原提示細胞の１つの問題に対処するために、本発明者らはペプチドでパルスされた自己活性化Ｔ細胞がシグナル１（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のその対応するペプチド−ＭＨＣ複合体への結合）を提供し、ＨＬＡ陰性ＬＣＬが共刺激（シグナル２）を提供する抗原提示細胞複合体を評価した。代替の人工共刺激細胞系は例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３および４−１ＢＢリガンドを発現するように遺伝的に改変されたＨＬＡ陰性Ｋ５６２細胞系である。この場合、共刺激は、異なる細胞型に対してトランスで提供される。このような場合、ＨＬＡ抗原は強力な抗原であり、同種特異性Ｔ細胞を活性化することができ、ＥＶ−ＬＣＬは自然に一連の共刺激分子を発現するので、ＨＬＡ抗原は存在しないはずである。
【００９６】
このストラテジーは、刺激抗原に対して特異性でＶＳＴの対数倍の拡大を誘導することができる。いくつかのドナーにおいて、このストラテジーはＮＫ細胞を強力に拡大するので、本発明者らはまた、枯渇ステップを導入した。例えば、ＰＢＭＣからＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を枯渇させることができる。これは、ＮＫ細胞のみならず、ナイーブＴ細胞および天然制御性Ｔ細胞も枯渇させる。ＣＤ４５ＲＡ欠乏ＰＢＭＣから増殖したＶＳＴはより高い抗原特異性を有し、より大きな倍率拡大を示し、そして最小のＮＫ細胞を有する。さらに、いくつかの個体から、本発明者らはそれらが最初にＰＢＭＣからＲＡ＋Ｔ細胞を枯渇させた場合にのみ、ＶＳＴを増殖させることができた。
【００９７】
（Ｉ．ウイルス抗原およびペプミックスの生成）
本開示の方法は、ペプチドの混合物をＴ細胞に提示する抗原提示細胞を利用する。そのような「負荷された」ＡＰＣは刺激のために末梢血Ｔ細胞に曝露する前に生成され、負荷されたＡＰＣの生成は末梢血Ｔ細胞に対して刺激ステップを実行する個体または実体によって実行されてもされなくてもよい。従って、いくつかの実施形態において、有効量のペプチドライブラリーは、治療的ウイルス特異的Ｔ細胞（ＶＳＴ）または抗原特異的Ｔ細胞を最終的に生成する方法の一部としてＡＰＣに提供される。本開示の方法では、刺激ステップの前に、ＡＰＣを十分な量のペプチドライブラリーに曝露する。ライブラリーは、特定の場合、同じ抗原の一部または全部にわたるペプチドの混合物（「ペプミックス」）を含む。特定の実施形態では、ＡＰＣのペプチドは非天然である。
【００９８】
１つ以上の抗原由来のペプチドの混合物のライブラリーを利用する場合、種々のペプチドは所与のタンパク質の任意の部分由来であり得るが、特定の場合において、ペプチドはタンパク質の大部分または全ての長さにわたり、ここで、ペプチドの配列は特定の抗原の所望の領域全体の容易にカバーするために、少なくとも部分的に重複する。場合によっては、ペプチドは、ペプチドが対応するそれぞれの抗原の長さ、または１つ以上の既知のエピトープもしくはドメインに及ぶ。特定の領域は例えば、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、細胞外ドメイン、または細胞内ドメインなどの領域を含む、領域の長さにわたるペプチドによって覆われてもよい。
【００９９】
ペプチドが由来する抗原は任意の種類であり得るＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに対する抗原であるが、特定の実施形態では抗原がそれぞれ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶ感染に関連する医学的状態に対して細胞傷害性Ｔ細胞を標的化することを可能にするようなものである。特定の実施形態では、ペプチドが少なくとも１つのタイプのＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、またはＶＺＶの１つ以上の抗原に由来するか、またはその少なくとも一部に対応する配列を有する。場合によってはぺプミックスライブラリーが単一のウイルス由来の１つ以上の抗原に対応するペプチドを含み、これらのペプチドは問題の抗原全体にわたって配列カバレッジを提供してもしなくてもよい。他の場合にはペプミックスライブラリーが複数のウイルス由来の１つ以上の抗原に対応するペプチドを含み、これらのペプチドは問題の抗原全体にわたって配列カバレッジを提供しても、提供しなくてもよい。ペプミックスは、１つ以上の特定の抗原の１つ以上の特定の領域に対応するペプチド、または１つ以上の特定の抗原の全体に対応するペプチド、に対して濃縮されてもされなくてもよい。
【０１００】
本開示において利用されるペプミックスは、市販のペプチドライブラリー由来であり得、および／または合成的に生成され得る。利用可能なライブラリーの例としては、ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）からのライブラリーが挙げられる。ウイルス抗原の公知の配列に基づく当業者は、例えばそれらの例示的なそれぞれの配列に対応するペプチドを生成することができるのに十分な情報を有するのであろう。当業者はこれらの周知のウイルス由来の抗原の公知の配列に基づいて、例えば、それらの例示的なそれぞれの配列に対応するペプチドを生成できるのに十分な情報を有するのであろう。
【０１０１】
特定の実施形態において、ライブラリーはそれらのそれぞれの抗原に対応する特定の長さのペプチドから構成されるが、いくつかの場合において、ライブラリーは２つ以上の異なる長さを有するペプチドの混合物から構成される。ペプチドは一定の長さであってもよく、ある量の配列において重複していてもよいが、いくつかのライブラリーにおいては重複の長さにばらつきがあってもよい。特定の実施形態では、ペプチドが例えば、長さが少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５またはそれ以上のアミノ酸である。特定の実施形態では、例えば、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４アミノ酸のペプチドの間に重複が存在する。特定の実施形態では、ペプチドが１５アミノ酸長であり、１１アミノ酸だけ互いに重複する。異なるペプチドの混合物は任意の比の異なるペプチドを含み得るが、いくつかの実施形態において、各特定のペプチドは別の特定のペプチドと実質的に同じ量で混合物中に存在する。ペプチドの配列における抗原のカバレッジはランダムであってもよく、抗原の所与の領域にわたって実質的に均一であってもよいが、いくつかの実施形態ではライブラリーが例えば、エピトープまたはその一部をコードすることが知られている１つ以上のペプチドなどの、１つ以上の特定のペプチドについて富化されてもよい。
【０１０２】
特定の実施形態では、特定の抗原タンパク質のペプミックスが例えば、８〜１０アミノ酸長である全ての可能なＨＬＡクラスＩエピトープを含む。特定の実施形態では、より長いペプチドを利用して、特定のペプチドについてのすべてのクラスＩＩエピトープをカバーする。場合によっては、エピトープの長さの範囲は１２〜２５アミノ酸である。
【０１０３】
（治療用ＶＳＴの製造および使用方法）
（治療用ＶＳＴの製造）
特定の局面において、本開示は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶのうちの少なくとも１つ由来の１つ以上の抗原を標的とするＶＳＴの開発に関する。
【０１０４】
Ｔ細胞を産生する方法において、末梢血Ｔ細胞は、最初、少なくとも１つのウイルス抗原のいくつかまたは全てにわたる１つ以上のペプチドに曝露されたＡＰＣで刺激される。抗原性ペプチドはペプチド混合物のライブラリーとしてＡＰＣに提供されてもよく、ペプミックスの複数のライブラリーはＡＰＣの同じコレクションに提供されてもよい。いくつかの実施形態において、このコレクションは、免疫優性抗原および亜優性抗原の両方を含む。
【０１０５】
本開示の実施形態において、治療用Ｔ細胞が生成され、ウイルス感染を有するか、またはウイルス感染から間接的もしくは直接的に生じるウイルス関連医学的状態を有する危険性がある個体に提供され得るか、または非ウイルス感染腫瘍を有する個体に提供される。治療用Ｔ細胞を産生する方法では、特定の条件下で、末梢血Ｔ細胞を、１つ以上のウイルス由来の１つ以上のウイルス抗原の一部または全部にわたるペプチドのライブラリーをロードしたＡＰＣと混合する。特定の実施形態では刺激ステップのために、Ｔ細胞はＰＢＭＣの集団内に存在する。
【０１０６】
したがって、末梢血Ｔ細胞の供給源は任意の種類であり得るが、特定の実施形態では供給源はＰＢＭＣであり、いくつかの場合において、複数のＰＢＭＣが本方法において利用され、複数のＰＢＭＣは末梢血Ｔ細胞を含む。末梢血Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから少なくとも部分的に単離または精製され得る。場合によってはＰＢＭＣは非接着性であり、場合によってはＰＢＭＣはＣＤ４５ＲＡ枯渇である（ここで、枯渇はＡＰＣへのＰＢＭＣの暴露の前に生じる）。特定の実施形態では、末梢血Ｔ細胞が正常標準と比較して、減少した数のＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を有する。末梢血Ｔ細胞またはＰＢＭＣは例えば、磁気標識および分離（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）ＢｉｏｔｅｃカラムまたはＳｔｅｍＳｅｐ（ＴＭ）磁気ビーズを使用する）を含む当該分野における通常の手段を使用することによって、特定の細胞について枯渇され得る。本明細書で使用する「枯渇した」という用語は、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を実質的に含まない末梢血Ｔ細胞またはＰＢＭＣを指す。場合によっては、「枯渇した」とは末梢血Ｔ細胞またはＰＢＭＣの最初のコレクション中のこれらの細胞の数と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の特定の割合の減少が存在することをいう。ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の数は、末梢血Ｔ細胞またはＰＢＭＣの最初のコレクションから減少する。なぜなら、それらは、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を除去するために特異的に操作されるからである。場合によっては、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を除去するための最初のコレクションの操作の後に、末梢血Ｔ細胞またはＰＢＭＣの最初のコレクションからのＣＤ４５ＲＡ陽性および／またはＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の減少は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態において、骨髄性細胞は、磁気ビーズまたはプラスチック接着を用いて除去され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態ではＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ由来の少なくとも１つの抗原を標的とするＴ細胞を生成する方法があり、これは一般に、複数のＰＢＭＣを、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニア、および／またはＶＺＶ由来の１つまたは複数の特定のウイルス抗原に対応するペプチドのライブラリー由来のペプチドのためにロードされた複数のＡＰＣと接触させることによって行われる。特定の実施形態では、２つの細胞集団の曝露がＴ細胞の拡大を可能にする。特定の実施形態では、刺激ステップが１つ以上の特定のサイトカインの存在下で起こる。特定の実施形態では１つ以上のサイトカインはＩＬ−７および／またはＩＬ−１５であるが、代替の実施形態ではサイトカインがＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では本方法の１つ以上のステップがＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２１の存在下では起こらないが、代わりに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２１を利用してもよい。サイトカインの存在への言及は外因的に添加されたサイトカインの存在、すなわち、細胞の培養物内に存在するかまたは細胞培養物によって分泌されるサイトカインを排除することである。いくつかの実施形態では、ペプチドがＨＰＶ抗原ではないウイルス抗原の一部または全部にわたって配列が重複するペプチドとしてさらに定義される。例えば、特定の局面において、ペプチドは少なくとも１０アミノ酸、特に１１アミノ酸だけ重複し、そしていくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも１２以上のアミノ酸長、特に１５アミノ酸長である。
【０１０８】
細胞培養物に含めるための所与のサイトカインの適切な量または濃度の選択は、当業者または当業者の能力の範囲内である。例として、以下は、特定のインターロイキンおよび使用され得る適切な濃度の例のリストである:
【０１０９】
インターロイキン６（ＩＬ−６）：５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌまたは１５０ｎｇ／ｍｌのうちのいずれか;
【０１１０】
インターロイキン７（ＩＬ−７）：５〜１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌのうちのいずれか;
【０１１１】
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）： ５〜１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ;
【０１１２】
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）： ５〜１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ。
【０１１３】
以下の表１は、本開示の方法の特定の実施形態の例を提供する。
【０１１４】
【表１】
2019531722.tif 000003
【０１１５】
したがって、特定の実施形態では、Ｔ細胞集団（集団がいくつか、大部分、または実質的にすべてのＴ細胞を含み得る、またはＴ細胞集団がＰＢＭＣ内などの細胞の別の集団内にある）をＡＰＣ集団に曝露して、少なくとも以下のいずれかを含む特定の特徴を有するＴ細胞株を生成する：ａ）ウイルス抗原の標的化における有効性；ｂ）多クローン性；ｃ）ＴＨ１バイアス；ｄ）最小限の分化した記憶型；またはｅ）それらの組み合わせ。特定の実施形態では細胞は最小限に分化してもよいが、場合によってはすべてが分化していなくてもよく、あるいは大部分がいくぶん分化してもよい。
【０１１６】
いくつかの場合において、Ｔ細胞は２回以上刺激され、そして異なる刺激ステップは細胞の集団を同じ条件に曝露してもしなくてもよい。特定の実施形態では、第１の刺激が第２の刺激および／または第３の刺激を含む、後続の刺激とは異なる条件を有する。特定の実施形態では、本方法の第１の刺激ステップは、ペプミックス負荷ＤＣまたはペプミックス負荷ＰＢＭＣであるＡＰＣを利用し、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を利用するが、代替の実施形態ではステップがＩＬ１５、ＩＬ−７、ＩＬ２１、ＩＬ１２、ＩＬ−６および／またはＩＬ−４から選択される１つ以上のサイトカインを利用する。この刺激ステップは、場合によっては１回以上繰り返すことができる。
【０１１７】
本方法の特定の実施形態では末梢血Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）のペプミックスまたはＡＰＣへの最初の曝露後８日目から１０日目の間に、８日目、９日目、または１０日目にＰＢＭＣの再刺激があり得るが、その後であることはめったにないが、その後の再刺激は１５日目、１６日目、または１７日目に生じ得る（１つの具体的な実施形態の一例として図７を参照のこと）。
【０１１８】
場合によっては、第１の刺激ステップに続く刺激ステップ（第１の刺激ステップの任意の反復を含む）、第１の刺激後に得られる（細胞の不均一な集団に存在し得る）Ｔ細胞が、ぺプミックス負荷ＤＣまたはぺプミックス負荷ＰＢＭＣおよび／またはぺプミックスパルスで自己活性化したＴ細胞および／またはＨＬＡ陰性共刺激細胞に曝露され得る。一般に、ＨＬＡ−ｖｅ共刺激細胞と組み合わせたぺプミックスパルスしたＡＡＴＣを用いて、８〜１０日目の２回目の刺激後に、十分な細胞が産生される。場合によっては、同じ抗原提示複合体を用いて第３の刺激が必要となることがある。任意の刺激段階において利用され得る共刺激細胞は、少なくとも、ＣＤ８６、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ８３を発現する細胞、および／またはＨＬＡ陰性リンパ芽球様細胞である細胞、を含む。特定の場合において、共刺激細胞は、遺伝子改変Ｋ５６２細胞であり得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本方法のステップの間に、培養物中の細胞が改変される。特定の実施形態において、細胞は特定の目的または機能（例えば、特定の標的を標的化するために有効またはより効果的、および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害性のための機能が増強される）のために細胞を有効またはより効果的にする遺伝子産物を発現するポリヌクレオチドを有するように改変される。特定の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞が特定の抗原を発現する細胞のような所望の標的細胞を効果的に、またはより効果的に標的化することを可能にする特定の非天然受容体を発現するように改変される。特定の実施形態において、細胞は、キメラ抗原レセプター（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＡＲ）などを発現するように改変される。細胞は発現ベクター（ウイルス（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等を含み得る）または非ウイルス（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃのようなトランスポゾン）であり得る）を発現するように、例えば、ベクターが長期再増殖ポテンシャルを有するＴ細胞中で発現されるように、培養の２日目から５日目の間に導入されるベクターのような特定の時点で、改変されてもよい。特定の実施形態では細胞が各刺激後約３日以内に発現ベクターに曝露されるが、このような場合、修飾はより長期の可能性の少ない場合（例えば、導入遺伝子が潜在的毒性を有する場合のように、遺伝子修飾細胞の長期発現が望ましくない場合など、特定の状況が望ましい場合）、より分化したＴ細胞において起こる。
【０１２０】
具体的な実施形態では、細胞がＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２，ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２リガンド，ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、および／またはフィブロネクチン、テネイシンのような、腫瘍の細胞外マトリックスに存在する他の模範的な抗原、または、腫瘍の壊死領域およびその他の腫瘍関連抗原、または腫瘍のゲノム解析または差次的発現研究によって同定された対処可能な変異、などが挙げられる。
【０１２１】
（Ｂ．治療用ＶＳＴの使用）
特定の実施形態では、本開示の方法によって産生される細胞は、医学的状態の処置を必要としている個体に、または医学的状態の症状が検出可能または発現していないウイルス感染またはウイルス関連癌もしくは非ウイルス関連癌を標的にするために提供される。本明細書中で使用される場合、「処置」または「処置すること」は疾患もしくは病理学的状態の症状または病理学に対する任意の有益な効果もしくは望ましい効果を含み、そして処置される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーにおける最小の減少さえ含み得る。処置は場合により、疾患または状態の症状の軽減または改善、または疾患または状態の進行の遅延のいずれかを含み得る。「処置」は、必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【０１２２】
本開示によって包含される方法において、治療用Ｔ細胞は単一の非ＨＰＶウイルスによって直接または間接的に引き起こされるウイルス関連疾患を処置するために利用されるか、またはそうでなければ、単一の非ＨＰＶウイルスに対して血清陽性である個体に提供される。他の場合において、治療用Ｔ細胞は２つ以上のウイルスによって直接的または間接的に引き起こされる疾患を処置するために利用される。治療用Ｔ細胞のコレクションにおいて、各Ｔ細胞およびその子孫は１つのウイルス由来の１つの抗原における１つのペプチドのみに対して特異性を有し、そして治療用Ｔ細胞のコレクションの産生の際に、例えば、各ウイルス抗原における複数のエピトープなどに対して一緒に多重特異性を有するＴ細胞クローンの集団を拡大する。
【０１２３】
本開示の少なくともいくつかの方法において、それにより生成されるＶＳＴの治療有効量は個体、例えば、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに関連する疾患を有するか、またはＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに関連する疾患に罹患しやすいことが知られている個体に投与される。特定の実施形態では、細胞が例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内などの注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ＶＳＴは、ポリクローナルＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＶＳＴであり得る。ＰＢＭＣは、個体に対して同種異系または個体に対して自己であってもよい。
【０１２４】
特定の場合において、新生物は本開示の細胞で処置され、そして新生物は良性、悪性、または癌をもたらし得る前癌病変であり得る。従って、個体は前癌病変段階で、および／または病変が悪性になった後に、本開示の方法によって産生された細胞で処置され得る。個体は初期または後期の癌を有し得、そして当業者は細胞を産生する方法が例えば、初期および後期の癌に関連する抗原に由来するＡＰＣのためのペプチドを利用することによって、癌のこのような異なる段階のために調整され得ることを認識する。特定の実施形態において、癌は、原発性、転移性、再発性、難治性などであり得る。
【０１２５】
場合によっては細胞の投与前に医学的状態に関連するウイルス（単数または複数）を決定することができるが、場合によってはウイルスタイプ（単数または複数）は決定されない。特定の実施形態ではＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに特異的な細胞はそれぞれ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶに対して陽性である個体に対して活性を有する。いくつかの場合において、本明細書中に包含されるウイルスの１つに特異的な細胞は、非ウイルス性腫瘍に対する受容体で遺伝子改変され、次いで、その非ウイルス性腫瘍を処置するために注入され、その結果、ウイルスまたはウイルス性抗原は、例えば、ワクチン接種によって、または腫瘍溶解性ウイルスもしくは内因性ウイルスを使用することによって、インビボでＴ細胞の拡大を刺激するために使用され得る。
【０１２６】
本方法の刺激ステップのＡＰＣが異なるウイルス抗原のペプミックスを一緒にロードされる場合、このようなＡＰＣを通じて拡大されたＴ細胞の投与の結果は、個体がウイルスに曝露されたかどうかによって決定される。例えば、特定の態様において、個体があるウイルスに感染した場合、そのウイルスに特異的なＴ細胞のみが応答し、これは、感染が最初にそのウイルスに対するＴ細胞応答を刺激したためである。これらのＴ細胞は個体内で増殖し、次いで、記憶Ｔ細胞になり、活性化されていない別のウイルスに特異的なＴ細胞よりも高い数となるだろう。
【０１２７】
治療される個体は、ウイルス関連疾患を有すること、ウイルス関連疾患を有することが疑われること、またはウイルス関連疾患のリスクがあることが知られていてもよい。処置される個体はウイルスの存在を有し得るが、ウイルス関連の医学的状態のいかなる有害な症状もまだ存在しない。個体は、それらを非ＨＰＶウイルスに曝露する環境または事象を与えられた場合、非ＨＰＶウイルス関連疾患のリスクがあり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって産生される細胞の１回以上の投与は、それを必要とする個体に提供される。複数回の投与の間の期間の長さは、その後の投与が癌に対して有効である限り、任意の適切な期間であり得、数日、数週間、数ヶ月、または数年のオーダーを含む。細胞の２回以上の投与が個体に提供される場合、細胞が標的とされる抗原は、先の投与（単数または複数）において利用される細胞と同じ抗原であってもなくてもよい。例えば、細胞の最初の投与において、それらは１つのウイルス抗原を標的とし得るが、細胞の別の投与において、細胞は少なくともいくつかの場合において、異なるウイルス由来を含む異なる抗原を標的とする。
【０１２９】
場合によっては、個体が当該分野における任意の好適な手段によって、ウイルス感染を有することが任意に決定される。ＰＣＲ、サザンブロットハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用するＤＮＡ試験などの感染診断方法を用いることができ、これらの方法は例えば、他の方法と併用してもしなくてもよい。
【０１３０】
特定の実施形態では、個体は免疫無防備状態にある（例えば、感染性疾患または癌と免疫系で戦う能力が損なわれているか、または全く無い個体と定義することができる）。特定の実施形態では、免疫無防備状態の個体が例えば、幹細胞移植（造血幹細胞移植を含む）を受けており、臓器移植を受けており、および／または化学療法もしくは放射線を含む１つ以上の癌処置を受けており、またはＨＩＶに感染している。場合によっては、個体が後天性または遺伝性の免疫不全障害を有する。いくつかの実施形態において、それらの疾患および／またはその処置によって免疫不全であるものは、本開示の方法および／または組成物が提供される。
【０１３１】
（Ａ．エプスタイン−バーウイルス）
ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒトヘルペスウイルス科で知られている８種類のウイルスの１つである。ＥＢＶは、伝染性単核球症、いくつかの形態の癌（ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、胃癌、上咽頭癌、ＮＫ／Ｔリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および平滑筋肉腫を少なくとも含む）、ならびに有毛白板症および中枢神経系リンパ腫を含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連する特定の状態を引き起こす。本開示の方法において、ＥＢＶ感染または１つ以上のＥＢＶ関連の医学的状態は、細胞を使用して処置される。
【０１３２】
ＥＢＶは約９０のタンパク質をコードするが、これらの限られた画分はＥＢＶ関連悪性腫瘍において発現される。約８０個の遺伝子がウイルス溶解サイクルに関与し、約９個の遺伝子がウイルス潜伏に関連する。いくつかの腫瘍では４つのＥＢＶ遺伝子のみが発現され、他の腫瘍では２つのＥＢＶ遺伝子のみが発現される。最近、いくつかの腫瘍は不完全ウイルス複製を受け、初期ウイルスタンパク質を発現することが示されており、それらはまた、溶解サイクルからの予期しない転写物を発現することも示されている。これらの全ての提供された転写物は、ＶＳＴの潜在的な標的抗原をコードし得る。一般に、ＥＢＶ２型潜伏抗原と考えられるＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＡＲＦ１およびＥＢＮＡ１を標的とすることができる。しかし、場合によっては、初期ウイルスタンパク質、例えば、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１によってコードされるもの、またはＢＸＬＦ１／２などの予期せぬ転写産物を標的とすることもできる。
【０１３３】
（Ｂ．サイトメガロウイルス）
ヒトヘルペスウイルス−５としても知られるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科のウイルスである。ＣＭＶ感染は感染個体が乳児または免疫不全（例えば、臓器または組織または細胞移植レシピエント（同種骨髄移植後を含む））でない限り、通常は疾患をもたらさない。ＣＭＶの任意の抗原は本開示の方法によって産生される細胞で標的化され得るが、特定の実施形態では抗原が即時初期抗原ＩＥ１、およびテグメントタンパク質ｐｐ６５である。
【０１３４】
（Ｃ．アデノウイルス）
アデノウイルスは、感冒、のどの痛み（咽頭炎）、気管支炎、肺炎、下痢、ピンクアイ（結膜炎）、発熱、膀胱炎、胃腸炎、および神経疾患を引き起こしうる。健康な個体は、アデノウイルス関連の重篤な疾患または死に罹患しにくい。しかし、乳児や免疫機能が低下している人、あるいは呼吸器疾患や心臓疾患が存在している人は、アデノウイルス感染によって重篤な疾患を発症するリスクが高くなる。
【０１３５】
本開示の細胞は任意のアデノウイルス抗原を標的とすることができるが、特定の実施形態では抗原はヘキソンおよび／またはペントンである。
【０１３６】
（Ｄ．ワクシニアウイルス）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶまたはＶＶとも呼ばれる）は牛の牛痘を引き起こすポックスウイルスであるが、天然痘に対する有効なワクチンを提供しており、本開示の方法によって産生された細胞で治療することができる。ワクシニアウイルスの任意の抗原は本開示の方法によって産生される細胞で標的化され得るが、特定の場合において、抗原はＥ３Ｌ、Ａ１０Ｌ／１２１Ｌ、Ｈ３Ｌ／０９３Ｌ、Ｇ５Ｒ／０７４Ｒ、Ｃ７Ｌ／０１８Ｒ、Ｂ２２Ｒ／１８９Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｅ５Ｒ、Ｅ４Ｌ、ｆ１７Ｒ、Ａ１７Ｌ、および／またはＬ４Ｒである。
【０１３７】
（Ｅ．水痘帯状疱疹ウイルス）
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、ヒトおよび脊椎動物に感染することが知られている８種類のヘルペスウイルスの１つである。ＶＺＶは小児、１０代および若年成人に水痘を引き起こし、成人および一部の小児に帯状疱疹（帯状疱疹）を引き起こす。ＶＺＶは、水痘ウイルス、水痘ウイルス、帯状疱疹ウイルス、およびヒトヘルペスウイルス３型（ＨＨＶ−３）を含む多くの名前で知られている。
【０１３８】
ペプチド（またはその配列）の供給源として利用され得るＶＺＶ抗原は、キャプシド、エンベロープ、または可溶性抗原のいずれかを含む。具体的な例としては、Ｖ抗原、Ｓ抗原、ＩＥ６１、ＩＥ６２、ＩＥ６３、ｇＥおよびＯＲＦ１０が挙げられる。
【０１３９】
ＶＺＶのワクチン（ＶＡＲＩＶＡＸ（登録商標）およびＺＯＳＴＡＶＡＸ（登録商標））は、ヒトにおいて限定された感染を引き起こす生弱毒化ウイルスを含む。
【０１４０】
（ＩＩＩ．医薬組成物）
本開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体に投与するための組成物に関する。好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内または静脈内投与のための、または癌への直接注射のための治療用免疫細胞を含む組成物を含む。医薬組成物は、注入または注射によって個体に投与されることが特に想定される。適切な組成物の投与は異なる方法によって、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内投与によって行うことができる。
【０１４１】
本開示の医薬組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。適切な医薬担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水を含み、細胞は、注入用のヒト血清アルブミンなどのタンパク質を注入するのに適した滅菌緩衝液中にあってもよい。
【０１４２】
投与用量レジメンは、適切な地方および連邦の規制当局によって承認された臨床プロトコルによって決定される。医療分野で周知のように、任意の１人の患者に対する投薬量は例えば、患者のサイズおよび体表面積を含む多くの因子に依存する。特定の投与量は、５×１０６／ｍ２〜５×１０９／ｍ２であり得る。過程は、定期的な評価によってモニターすることができる。
【０１４３】
ウイルス抗原に対して生成されるＶＳＴに関する本開示の特定の実施形態において、臨床的側面のための本開示の方法は、ウイルスが関連する１つ以上の医学的状態の処置において有効な他の薬剤と組み合わされる。
【０１４４】
（ＩＶ．開示のキット）
本明細書に記載の組成物のいずれも、キットに含めることができる。非限定的な例では、ペプミックスのライブラリーをキットに含めることができ、任意のタイプの細胞をキットに提供することができ、および／またはペプミックスの操作のための試薬および／または細胞をキットに提供することができる。サイトカインまたはサイトカインを産生する手段（それらをコードするベクターなど）をキットに含めることができる。細胞培養試薬および／または装置が含まれてもよい。構成要素は、適切な容器手段で提供される。
【０１４５】
キットは、本開示の適切に分注された組成物を含み得る。キットの構成要素は、水性媒質中または凍結乾燥形態にある状態でパッケージ化することができる。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含み、その中に構成要素を配置し、好ましくは適切に等分することができる。キット中に２つ以上の成分がある場合、キットは一般に、第２、第３、または他の追加の容器も含み、その中に追加の成分を別々に配置することができる。しかし、成分のさまざまな組み合わせが１つのバイアル中に含まれてもよい。また、本発明のキットは、典型的には商業的販売のために成分を密閉して収容するための手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。
【０１４６】
しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末を適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が別の容器手段の中に同じく提供されることが想定されている。
【０１４７】
いくつかの場合において、ウイルス感染を検出するための試薬および／またはデバイスが、キットに含まれ得る。例としては、スワブ、スパチュラ、サイトブラシ、スライド、カバーガラス、細胞学試料収集容器などが挙げられる。ウイルス感染症のためのさらなる薬物が、キットに含まれ得る。
【実施例】
【０１４８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１４９】
［治療用Ｔ細胞の産生］
本開示のいくつかの実施形態において、ポリクローナル（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８+)ＶＳＴを含む、Ｔ細胞の単一の調製物を迅速に生成し得る機構が存在し、これは、致命的であることが証明され得る１つ以上のヒトウイルスに由来する種々の抗原に対して一貫して特異的である。本開示は臨床実施に容易に適合可能であり、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、および／またはＶＺＶを含む「既製の」抗ウイルス剤として使用することができる。本方法および組成物は臨床実施に容易に適合可能であり、個体にとって安全かつ有効な抗ウイルス剤として有用である。
【０１５０】
特定の実施形態では、末梢血Ｔ細胞が特異的なアクセサリーサイトカインの存在下または非存在下で、抗原タンパク質にまたがるペプミックス（１１個のアミノ酸（ａａ）が重複する１５量体のペプチドライブラリー）を負荷した単球由来樹状細胞で刺激される。得られたＴ細胞株は、ペプミックス負荷活性化細胞でさらに増殖させることができる。
【０１５１】
サイトカインＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在は、本方法の特定の実施形態において有用である。これらのＴ細胞株は多クローン性、複数のＴ細胞サブセット表現（記憶コンパートメントを含む）およびＴＨ１バイアスの望ましい特性を有し、ウイルス標的を排除する。本開示は、ウイルス関連癌を有する患者からウイルス指向性Ｔ細胞株をロバストに産生することが可能であることを提供する。この技術は拡張性があり、良好な製造手順に準拠しているので、これらの系は、ウイルス関連の医学的状態を有する患者の養子細胞免疫療法に有用である。
【０１５２】
方法の詳細を見ると、特定の場合において、ＤＣは、ウイルス抗原ぺプミックスライブラリーをロードされる。このような場合、細胞株は、１つ以上のウイルス抗原を認識し得る。少なくとも特定の場合において、Ｔ細胞の拡大はＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で起こるが、ＩＬ−２の存在下では起こらない。本方法の条件におけるＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在は、刺激および拡張の各ステップにあってもなくてもよい。いくつかの態様において、ＤＣによる最初の生成／増殖後のウイルス特異的Ｔ細胞の増殖は、共刺激細胞（ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＣＤ８３／４−１ＢＢＬまたはその他）、およびＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ペプミックスを負荷した自己ポリクローナル活性化Ｔ細胞を利用する。これらの条件を用いると、Ｔ細胞増殖は、このような条件がない場合よりも速い速度で起こり、特異性を失うことなく起こる。
【実施例２】
【０１５３】
［非ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞の産生］
本開示の特定の実施形態に目を向けると、ＨＰＶ以外のウイルスに特異的である抗原特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を生成するための方法が、本明細書中に記載される。特定の実施形態ではこの方法が少なくともＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＶＺＶ、ワクシニアウイルス、ＨＩＶ、ＢＫおよびＨＨＶ６に有効であるが、この方法は他のウイルスに有効であり得る。当技術分野で公知の方法と比較したこれらの方法の改変は、例えばいくつかのウイルス特異的抗原特異的Ｔ細胞株における低頻度のウイルス特異的抗原特異的Ｔ細胞および／または高頻度のＮＫ細胞などの欠損に対処する。
【０１５４】
第１の刺激では、特定の実施形態では当該技術分野における他の方法と同様に、ＤＣは存在しない。本方法のステップにおいてＴ細胞の供給源として利用されるＰＢＭＣは特定の細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇）について枯渇され得る。
【０１５５】
本方法の任意のステップにおける細胞の培養は、特定のサイトカインまたはそれらの組み合わせの存在下で起こり得、そしてこれらのサイトカイン（単数または複数）の特定のレベルが達成される必要があり得る。特定の実施形態では、本方法の１つ以上のステップが高用量（１００ｎｇ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）のＩＬ１５およびＩＬ−７において生じる。特定の場合において、本方法の１つ以上のステップにおいて、共刺激細胞が利用される。種々の共刺激細胞が有用であり得るが、特定の実施形態では細胞はＨＬＡ陰性ＬＣＬである。
【０１５６】
図１は、ウイルス特異的Ｔ細胞を生成するための本開示の方法のステップを記載する。そこに例示されるように、０日目に、ＰＢＭＣ（ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞などの特定の細胞については枯渇していてもいなくてもよい）をウイルスペプチドでパルスする。ＥＢＶの例として、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１、および／またはＢＡＲＦ１の一部または全部を包含するペプチドを利用する。任意の種類のＰＢＭＣがペプチドでパルスされるこの第１のステップにおいて、サイトカインの特定の組み合わせを含む、特定の１つ以上のサイトカインを含むサイトカインが存在し得る。一例として、元のパルスステップでは、ヒトＩＬ１５（ＩＬ１５Ｈ）を含むＩＬ７および／またはＩＬ１５が用いられる。この第１のステップでは、照射されたＨＬＡ−ｖｅ  ＬＣＬを含む共刺激細胞があってもなくてもよい。第２の刺激において、細胞は、ペプチドパルス照射自己抗原Ｔ細胞に曝露され、そして少なくともいくつかの場合において、ＨＬＡ−ｖｅ  ＬＣＬなどの共刺激性細胞にも曝露される。このステップは、ＩＬ７および／またはＩＬ１５（ＩＬ１５Ｈを含む）などの特定の組み合わせを含む、１つ以上のサイトカインの存在下で起こっても、起こらなくてもよい。適切な期間（例えば、日数）培養を続けた後、細胞を使用してもよく、または凍結保存してもよい。
【０１５７】
上述のように、本開示の実施形態は、当技術分野で利用される特定の方法に対する改善を提供する。図２は、ＩＬ−４およびＩＬ−７の代わりにＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で開発されたＥＢウイルス特異的Ｔ細胞（ＥＢＶＳＴ）の改善された特異性の結果を示す。
【０１５８】
単なる一例として、本開示の方法は、そのＴ細胞がその腫瘍細胞において発現されるウイルス抗原に対してアネルギー性であるリンパ腫患者に対して開発される。本開示の方法の特定の実施形態はリンパ腫患者ＥＢＶＳＴの抗原特異性を改善し、１つ以上のステップにおいて少なくともＩＬ−１５を利用することによってアネルギーが克服されることを可能にする（図３）。従って、ＩＬ−４の代わりにＩＬ−１５を使用すると、患者ＥＢＶＳＴにおける抗原特異的Ｔ細胞の頻度を増加させる。しかし、少なくともいくつかの場合において、ＩＬ−１５が培養において利用された患者におけるＥＢＶＳＴは特異性を欠いたため、用量またはＩＬ−１５が最適化された。例えば、ＩＬ−１５用量が高すぎて、非特異的Ｔ細胞の増殖を誘導するかどうかが疑問視された。実際、最適化研究（図４）は、より高用量のＩＬ−１５が特異性を増加させるためにより優れていることを明らかにした（５ｎｇ／ｍＬの標準用量と比較して、１００ｎｇ／ｍＬ）。図５は、高用量のＩＬ−１５がセントラルメモリーＥＢＶＳＴを増加させることを実証する。
【０１５９】
一部の患者および健康なドナー由来のＥＢＶＳＴにおける過剰なＮＫ細胞増殖に対処した。ＮＫ細胞の優先的成長が存在する場合、特定の場合において、それは、ＩＬ−１５（ＮＫ細胞集団がＩＬ−１５およびＩＬ−７において成長した系統において悪化するように思われる）の存在に起因し得るか、および／またはＫ５６２ｃｓ（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６および４−１ＢＢＬを発現するように遺伝的に改変された照射ＨＬＡ陰性Ｋ５６２細胞）（図６）の使用、またはＩＬ１５およびＫ５６２細胞の組み合わせに起因し得る。これに対処するために、過剰なＮＫ細胞の成長を避けるための条件を開発した。特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の前に、ＰＢＭＣからのＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇を利用した。ＣＤ４５ＲＡは天然の制御性Ｔ細胞およびＮＫ細胞上でも発現されるナイーブなＴ細胞マーカーであり、したがって、このような枯渇は、ＮＫ細胞を除去することはずである。他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇を介して富化される。さらに、このステップは特に癌患者において、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を阻害し得る制御性Ｔ細胞を除去するはずであり、そしてまた、バイスタンダー細胞として増殖し得、そして抗原特異的Ｔ細胞を希釈し得るナイーブな細胞を除去するはずである。枯渇は任意の適切な方法によって生じ得るが、特定の実施形態では枯渇が磁気標識および分離（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカラムを使用する）を使用して生じる。磁気ビーズまたはナノバブルを用いて細胞を枯渇させるための抗体の使用も起こり得る。
【０１６０】
ＣＤ４５ＲＡ枯渇ＰＢＭＣからのペプミックス活性化ＥＢＶＳＴの生成を図７に示す。そこに示されるように、全ＰＢＭＣからＣＤ４５ＲＡが枯渇し、開始０日目または１日目に第１の刺激（Ｓ１)のＥＢＶｐｅｐｍｉｘを、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で枯渇した細胞に添加して、ＥＢＶＳＴを産生する。Ｓ１の最後および第２の刺激Ｓ２の開始時（例えば、８日目と１０日目の間）に、ＥＢＶＳＴを、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下、しかしＩＬ−２の非存在下で、十分な量のＥＢＶ−ぺプミックスパルスＡＴＣおよび十分な量の共刺激細胞（Ｋ５６２ｃｓ細胞など）に曝露して、所望のぺプミックス活性化ＥＢＶＳＴを産生する。図８は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇（健康なドナー由来のＣＤ４５ＲＡ＋ＰＢＭＣがＭｉｌｔｅｎｙｉカラムおよびＧＭＰグレードＣＤ４５ＲＡ結合ビーズを使用して枯渇した）がＥＢＶＳＴにおけるＣＤ３−ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞の頻度を減少させる結果を実証する。これに続いて、ＥＢＶＳＴの増殖が増加する（図９）。図１０は、第２の刺激ステップの終わりにおける健康なドナーからのＣＤ４５ＲＡ枯渇後のＥＢＶＳＴの増強された倍数拡大を示す。さらに、ＣＤ４５ＲＡ枯渇は第２の刺激の終わり（例えば、１６日目）にＥＢＶＳＴの抗原特異性を増強する（両方とも健康なドナーについてのデータを示す、図１１および１２）。ＣＤ４５ＲＡ枯渇ＥＢＶＳＴの増加した抗原特異性は、第３の刺激後に維持される（図１３）。
【０１６１】
ＣＤ４５ＲＡ枯渇の効果は、枯渇なしに増殖したＥＢＶＳＴが高頻度のＮＫ細胞を示したため、またはＥＢＶＳＴが増殖または抗原特異性を示さなかったために選択された、リンパ腫患者において特徴づけられた。図１４は５人のリンパ腫患者における第２の刺激ステップの終わりにおける全ＮＫ細胞集団を示し、ＣＤ４５ＲＡ枯渇がリンパ腫患者ＥＢＶＳＴにおけるＮＫ細胞集団成長を減少させ、この枯渇が抗原特異的Ｔ細胞の頻度を増加させたことを示す（第２の刺激の終わりにおけるＩＦＮ−γ放出ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって例示される）（図１５）。この実験は、最初の刺激については樹状細胞の非存在下で行った。健康なドナーにおける結果と同様に、ＣＤ４５ＲＡ枯渇は、リンパ腫患者由来のＥＢＶＳＴにおける抗原特異性を増加させた（図１６）。リンパ腫患者のＥＢＶＳＴの増殖を図１７に示す。さらに、ＣＤ４５ＲＡ枯渇は、ぺプミックスパルス自己活性化Ｔ細胞（ａＡＴＣ）に対する細胞溶解活性を増強した。溶解パーセンテージは、２０：１のエフェクター対標的比で観察された（図１８）。
【０１６２】
図１９は、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫＧウイルス、およびＨＨＶ６に特異的なマルチウイルス特異的Ｔ細胞の生成を例示する。単なる例として、ペプミックスには、ＥＢＶについてはＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２、およびＢＺＬＦ１からのペプチド；ＣＭＶについてはＩＥおよびｐｐ６５；アデノウイルスについてはヘキソンおよびペントン、ＢＫについてはＬＴおよびＶＰ１、ならびにＨＨＶ６についてはＵ１１、Ｕ１４、およびＵ９０が含まれる。そこに例示されるように、これらのウイルス抗原の各々の一部または全部にわたるペプチドを含むペプミックスを、ＩＬ７および高用量ＩＬ１５の存在下で０日目にＰＢＭＣに曝露する。９日目に始まる２回目の刺激時に、ペプミックス活性化ＡＴＣおよび共刺激細胞（Ｋ５６２ｃｓ細胞など）を、ＩＬ７および高用量ＩＬ１５の存在下で細胞に曝露する。第３刺激ステップ（例えば、１６日目に始まる）において、別のラウンドのぺプミックス活性化ＡＴＣおよび共刺激細胞（例えば、Ｋ５６２ｃｓ細胞）を、ＩＬ７およびＩＬ１５Ｈの存在下で細胞に曝露し、最終的にマルチウイルス（ｍ）ＶＳＴ（Ｄ２３）細胞を産生する。
【０１６３】
図２０は、本方法の実施形態の後続の刺激ステップにおける、および後続の刺激ステップの後の総拡張倍率を示す。マルチウイルス特異的Ｔ細胞の抗原特異性を調べ、５つ全てのウイルスに対する特異性を有するＴ細胞が増殖した（図２１）。
【０１６４】
特定の実施形態において、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、本開示の方法を用いて生成され得る。図２２は第１の刺激後のＶＺＶ特異的ＶＳＴの増殖を示し、再び、本開示の方法を樹状細胞を使用する方法と比較している。ＤＣ開始ＶＳＴとＰＢＭＣ開始ＶＳＴとの間の増殖、または第２の刺激後のＶＺＶＳＴの拡大において有意な差異はなかった（図２３）。図２４および２５は、８日目の第１の刺激後（図２４）および１６日目の第２の刺激後（図２５）のＶＺＶ特異的ＶＳＴの特異性を示す。特定の場合において、理論に束縛されるものではないが、そのような結果は、抗原が腫瘍細胞において発現されない場合、それらはアネルギー性ではないからである。
【０１６５】
要約すると、本実施例における特定の実証では、ＩＬ４／７において樹状細胞を用いて増殖させたＥＢＶＳＴと、本明細書に包含される方法との比較が本明細書において提供される。実証されるように、高用量のＩＬ−１５およびＩＬ−７は、最初の刺激における樹状細胞の必要性を排除することに加えて、健康なドナーおよび患者におけるＥＢＶＳＴの増加倍数を増大させ、ならびに健康なドナーおよび患者におけるＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の頻度を増加させた。この戦略は複数のウイルス（ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ＨＨＶ６およびＶＺＶ）に対して有効であり、レトロウイルスで形質導入されたウイルス特異的Ｔ細胞に対して有効であった。最後に、ＣＤ４５ＲＡの枯渇が、例えばＥＢＶＳＴにおいてより広範かつより高い抗原特異性および減少したＮＫ細胞集団をもたらすことを示すためのデータが、本明細書中で実証される。
【実施例３】
【０１６６】
［ＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞の産生］
１つの実施形態において、ＨＩＶ抗原に特異的なＴ細胞は、本開示の方法を用いて産生される。図２６は、ＨＩＶ血清陽性ドナーからのＨＩＶ特異的Ｔ細胞の製造の一実施形態を図示する。図２７は、第２の刺激におけるＫ５６２細胞による細胞の最適な拡大を示す。その中で、結果は、ＤＣについて２回の刺激（１５〜１６日）＋１週間後のみを示す。Ｋ５６２の存在下での拡張は、第２の刺激の間、Ｋ５６２を用いない場合よりも高い。図２８は、Ｋ５６２の存在下で、ＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞（ＨＩＶＳＴ）がわずか２回の刺激後に臨床的に関連のある数に拡大したことを示す。
【０１６７】
図２９は、ＨＩＶＳＴが複数のＨＩＶ抗原に特異的であることを示す。ＨＩＶＳＴの特異性は、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける各ＨＩＶ抗原の個々のペプミックスに応答したインターフェロン（ＩＦＮ）−γ分泌によって評価した。ＨＩＶＳＴの特異性は、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける各ＨＩＶ抗原に対する個々のペプミックスに応答したインターフェロン（ＩＦＮ）−γ分泌によって評価した。全ての系統は、３つの全ての抗原に対して多重特異性であった。最初の検証において、同等の抗原特異性が最初の刺激後に観察された。特異性は、第２の刺激の間にＫ５６２を添加することによって失われなかった。２回目の刺激の終了までに、高用量ＩＬ−１５が有利であった。２回目の検証では、最初の刺激後に高いバックグラウンドがあった。ＡＲＭ２（高ＩＬ−１５）では、ＡＲＭ１（低ＩＬ−１５）よりもＧＡＧ、ＰＯＬおよびＮＥＦに対して高い特異性が観察された。陰性対照は、１ｅ５個のＨＩＶＳＴ当たり１０個未満のスポットを含んだ。
【０１６８】
図３０は、ＨＩＶＳＴが混合ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含むことを示す。系統は主にＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であったが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合があった。Ｔ細胞株は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞の亜集団を含んでいた。最初の検証では、ＡＲＭ１において、より多くのＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋  ＮＫ細胞およびより少ないＣＤ３＋Ｔ細胞を有する類似の表現型が存在した。２回目の検証では、ＡＲＭ２（高ＩＬ−１５）ではＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の比率が高かった（よりバランスがとれており、ＮＫ細胞が少ない）。ＣＤ４  Ｔ細胞は、記憶、持続、およびエフェクター機能を補助し、ＣＤ８  Ｔ細胞を補助することが知られているので、ＨＩＶのための任意のＴ細胞免疫療法アプローチがＣＤ４  Ｔ細胞を利用していることは重要である。少量のＣＤ４Ｔ細胞の注入は直観に反するように思われるが、非ＣＤ４枯渇Ｔ細胞は過去に注入されており、ウイルス量の有意な増加は観察されなかった。
【０１６９】
図３１は、ＨＩＶＳＴが抗原パルス標的およびＨＩＶ感染標的を溶解することを実証する。ＨＩＶＳＴの細胞溶解特異性を評価するために、本発明者らは、５１クロム（５１Ｃｒ）標識自己由来ペプミックス−ＡＴＣ標的細胞の一群と共にＨＩＶＳＴをインキュベートした。重要なことに、活性化された自己標的細胞のみの溶解は観察されなかったため、ＨＩＶＳＴは特異的であった。ＨＩＶＳＴの抗原発現標的を溶解する能力を、４時間の５１クロム放出アッセイを用いて測定した。標的細胞は、培地またはＧａｇ、Ｐｏｌ、またはＮｅｆ  ＰｅｐＭｉｘｓのいずれかでパルスした自己由来ＰＨＡ芽細胞からなり、クロムを負荷した。ＨＩＶＳＴを、ＩＦＮ−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって予め決定された、特異的な抗原のみでパルスされた標的細胞と共に培養した。
【０１７０】
本発明およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、および変更を本明細書で行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者は本発明の開示から容易に理解するように、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、または後に開発されるプロセス、機械、製造、物質、手段、方法、またはステップが、本発明に従って利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップをそれらの範囲内に含むことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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