(57)【要約】近赤外光開裂性ヘプタメチンシアニン系コンジュゲート、特に、式Ｉの標的剤−薬物コンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の実施形態を開示する。開示の標的剤−薬物コンジュゲートは、薬物の標的化された送達および放出に有用である。コンジュゲートおよび前駆体の作製方法および使用方法も開示する。開示のコンジュゲートの実施形態は、近赤外光を照射した場合に光分解を経て、それにより、分子内開裂および薬物の放出が引き起こされる。2019524798.tif 000111
2019524798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化７５】
2019524798.tif 000088
の化学構造を有するコンジュゲートまたはその薬学的に許容され得る塩であって、
式中、ｍは、１、２、３、４、または５であり；
各ｎは、独立して、１、２、または３であり；
Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルであり；
Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルであり；
Ｒ３は−Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物であり、ここで、Ｌ１は存在しないかリンカー部分であり、Ｘ２はＯ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）であり；
Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−ＳＲｂ、
【化７６】
2019524798.tif 000089
であり、ここで、ｙは１以上の整数であり、Ｒｂは標的剤、
【化７７】
2019524798.tif 000090
であり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｎ、またはＣＨ２であり；
Ｇ１は、
【化７８】
2019524798.tif 000091
であり；
Ｇ２は、
【化７９】
2019524798.tif 000092
であり；
Ｒ６およびＲ７は、独立して、アルキルスルホナート、Ｈ、アルキル、アルコキシ、または置換アミノアルキルであり；
Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートであり；
各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、アルキルまたはＨであり；
各Ａ環は、独立して、縮合されている６員のアリール環、脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、またはヘテロアリール環である、コンジュゲートまたはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ４は、独立して、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−ＲＯＨ、−ＲＣＯＯＨ、または−ＲＣＦ３であり、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、任意選択的に、Ｒ１およびＲ４は、独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
Ａ環が、任意選択的に置換されたスルホナートで置換された縮合フェニル環である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
Ｇ１は
【化８０】
2019524798.tif 000093
であり、かつＧ２は
【化８１】
2019524798.tif 000094
であり；または
Ｇ１は
【化８２】
2019524798.tif 000095
であり、かつＧ２は
【化８３】
2019524798.tif 000096
であり；または
Ｇ１は
【化８４】
2019524798.tif 000097
であり、かつＧ２は
【化８５】
2019524798.tif 000098
であり、
ここで、各Ｙは同一であり、
Ｒ６およびＲ７は同一であり、
Ｒ８〜Ｒ１１およびＲ１６〜Ｒ１７は、Ｒ１２〜Ｒ１５およびＲ１８〜Ｒ１９とそれぞれ同一である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
（ｉ）各ＹはＣ（ＣＨ３）２であり；
（ｉｉ）Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５であり；
（ｉｉｉ）Ｒ８〜Ｒ１９はＨであり；または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
式ＩＩ
【化８６】
2019524798.tif 000099
の構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
Ｒ３は、
【化８７】
2019524798.tif 000100
であり、ここで、Ｒ２０〜Ｒ２７は、独立して、Ｈ、アルキル、−ＮＯ２、−ＮＲｅ２、−ＮＲｅ３、アルコキシ、またはスルホナートであり、ここで、各Ｒｅは、独立して、Ｈ、ハロ、またはアルキルであり、任意選択的に、ここで、Ｒ２０〜Ｒ２５はＨである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
−Ｘ２−薬物は、
【化８８】
2019524798.tif 000101
であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはアルキルスルホナートである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｒ５は、
【化８９】
2019524798.tif 000102
であり、ここで、ｑおよびｒは、独立して、１、２、３、４、または５である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｒｂは標的剤であり、任意選択的に、ここで、Ｒｂは抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、または−ＳＲｂであり、ここで、Ｒｂは標的剤であり、前記コンジュゲートは、１つまたは複数の、Ｒｂに結合したさらなる部分をさらに含み、前記さらなる部分の各々は、独立して、式ＩＩＩ
【化９０】
2019524798.tif 000103
の化学構造を有し、
ここで、ｍ、ｎ、ｘ、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ１、Ｇ１、Ｇ２、およびＬ２は、請求項１に定義のとおりであり、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｈ）−、または−Ｓ−である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｒｂは抗体であり、Ｒ３は
【化９１】
2019524798.tif 000104
であり、ここで、−Ｘ２−薬物は
【化９２】
2019524798.tif 000105
である、請求項１〜１１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記コンジュゲートは、
【化９３】
2019524798.tif 000106
であり、式中、Ｒ１およびＲ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）４ＳＯ３−または−（ＣＨ２）４Ｎ（ＣＨ３）３＋であり；
Ｒｂは抗体であり、任意選択的に、ここで、前記抗体は、パニツムマブまたはトラスツズマブである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物であって、Ｒｂは標的剤である、薬学的組成物。
【請求項１５】
式ＩＶ
【化９４】
2019524798.tif 000107
の構造を有する前駆体化合物またはその塩であって、
式中、ｍは、１、２、３、４、または５であり；
各ｎは、独立して、１、２、または３であり；
Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルであり；
Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｎ、またはＣＨ２であり；
Ｇ１は、
【化９５】
2019524798.tif 000108
であり；
Ｇ２は、
【化９６】
2019524798.tif 000109
であり；
Ｒ６およびＲ７は、独立して、アルキルスルホナート、Ｈ、アルキル、アルコキシ、または置換アミノアルキルであり；
Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートであり；
各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、アルキルまたはＨであり；
各Ａ環は、独立して、縮合されている６員のアリール環、脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、またはヘテロアリール環であり；
Ｒ２８は、水素または保護基であり；
Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ≡ＣＨであり、ここで、ｕは、１、２、３、４、または５である、前駆体化合物またはその塩。
【請求項１６】
前記前駆体化合物は、
【化９７】
2019524798.tif 000110
であり、
式中、Ｒ１およびＲ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５である、請求項１５に記載の前駆体化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートを提供する工程であって、Ｒｂは標的剤である、工程；および
その後に、近赤外範囲の選択された波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用により前記コンジュゲートに照射して開裂反応を誘起し、前記コンジュゲートから薬物を放出させる、工程
を含む、方法。
【請求項１８】
光の標的化利用により前記コンジュゲートに照射する工程が、波長が６５０〜９００ｎｍの光を生じるレーザーを前記コンジュゲートに照射することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コンジュゲートの蛍光レベルをモニタリングする工程；および
前記蛍光レベルが標的レベル未満に低下した場合に照射を停止する工程
をさらに含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的分子を含むか、または含むと疑われる生物試料を提供する工程；
前記生物試料を前記コンジュゲートと接触させる工程であって、前記コンジュゲートの標的剤が前記標的分子を認識して、前記標的分子に結合することができる、工程；および
その後に、前記光の標的化利用により前記生物試料に照射する工程
をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬物で処置することができる状態を有すると被験体を同定する工程；
治療有効量の前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を前記被験体に投与する工程；および
その後に、前記被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する前記有効量の光の標的化利用によって前記コンジュゲートに照射し、それにより、前記コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から前記薬物を放出する工程であって、任意選択的に、前記標的化部分に利用された光の前記有効量が５〜２５０Ｊ／ｃｍ２である、工程
をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が腫瘍を有し、前記被験体の前記標的化部分が腫瘍位置に隣接する領域を含み、任意選択的に、治療有効量の前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を前記被験体に投与する前に、前記被験体から腫瘍の少なくとも一部を切除する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療有効量の前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を、前記薬物で処置することができる状態を有すると疑われる被験体に投与する工程；
その後に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する光量の前記被験体の標的化部分への標的化利用によって前記コンジュゲートに照射する工程であって、前記光量が、前記コンジュゲートの蛍光を生じさせるのに十分であるが、前記コンジュゲートの開裂を誘起し、前記コンジュゲートから前記薬物を放出させるには不十分である、工程；
前記被験体の前記標的化部分中の前記コンジュゲートから任意の蛍光を検出する工程；および
その後に、蛍光が検出された場合に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する前記有効量の光の前記被験体の前記標的化部分への標的化利用によって前記コンジュゲートに照射し、それにより、前記コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から前記薬物を放出する、工程
をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記状態が、前記薬物で処置することができる腫瘍であり、前記被験体の前記標的化部分が前記腫瘍部位を含み、前記方法が、
治療有効量の前記コンジュゲートを投与する前に前記被験体から前記腫瘍の少なくとも一部を切除する工程
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）前記状態が前記薬物で処置することができる腫瘍であり、（ｉｉ）前記被験体の前記標的化部分が前記腫瘍部位を含み、（ｉｉｉ）前記被験体の前記標的化部分中に蛍光が検出され、前記方法が、
前記被験体の前記標的化部分中の前記蛍光を検出した後に前記被験体から前記腫瘍の少なくとも一部を切除する工程；および
その後に、前記有効量の光の前記被験体の前記標的化部分への標的化利用によって前記コンジュゲートに照射する工程
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年８月１１日に出願された米国仮出願第６２／３７３，６６６号の利益を主張し、この米国仮出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、コンジュゲート、特に、ヘプタメチンシアニンフルオロフォアを含む標的剤−薬物コンジュゲート、コンジュゲート前駆体、ならびにコンジュゲートの作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
近年の抗体−薬物コンジュゲートの臨床での成功により、高分子治療と小分子治療の組み合わせが有利であることが実証されてきた。この刺激的な分野において残された課題は、部位特異的に薬物が送達される改善された開裂選択性を提供するリンカーストラテジーを特定することである。部位特異的様式で利用することができる外部刺激に頼る抗体−薬物開裂の化学的性質を開発することが魅力的な解決法となるであろう。
【０００４】
近赤外範囲（例えば、６５０〜９００ｎｍ）の光は、この文脈において固有の可能性を有する。これらの波長は、有意な組織透過性、最低毒性を示し、さらに、診断および治療の両方の用途について臨床的に実証されている。近赤外蛍光画像化は一定の臨床的状況における日常業務であり、革新的応用（例えば、手術中の腫瘍境界を光学的に画定する方法など）が開発中である。光毒性小分子を使用した光に基づく治療法は、がんおよび皮膚障害の処置において多様な歴史がある。
【０００５】
しかし、既存のアプローチは、固有の腫瘍選択性がほとんど無い、多くの場合酵素による内因性の反応を使用した細胞内プロセスに依存する。結果として、抗原特異的機序または抗原非依存性機序のいずれかによって良性組織が抗体を取り込むことにより的外れの薬物放出が、特に抗体−薬物コンジュゲートの異化を担う器官において、起こり得、用量制限毒性をもたらし得る。さらに、循環系への不完全な放出が重要な問題であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示は、ヘプタメチンシアニンフルオロフォアを含む標的剤−薬物コンジュゲート、前記コンジュゲートの前駆体、ならびに前記コンジュゲートおよび前駆体の作製方法および使用方法の実施形態に関する。標的剤は、標的部位への薬物の優先的送達または標的化送達を促進する。開示のコンジュゲートの実施形態は、近赤外光を照射した場合に光分解を経て、それにより、分子内開裂および薬物の放出が引き起こされる。好都合なことに、コンジュゲートのいくつかの実施形態はフルオロフォアであり、光分解および薬物放出のすぐ後に蛍光は消失する。開示の標的剤−薬物コンジュゲートの実施形態は、併用薬の放出を伴う部位特異的送達および選択的活性化に有用である。被験体内のコンジュゲートの位置を視覚化するためかつ／または薬物放出の指標として、投与されたコンジュゲートの蛍光レベルをモニタリングすることができる。
【０００７】
標的剤−薬物コンジュゲートならびに薬物および反応性基を含む中間体コンジュゲートは、式Ｉ
【化１】
2019524798.tif 000003
の化学構造を有するコンジュゲートまたはその薬学的に許容され得る塩である。
【０００８】
式Ｉに関して、ｍは、１、２、３、４、または５であり；各ｎは、独立して、１、２、または３である。Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルである。Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルである。Ｒ３は−Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物であり、ここで、Ｌ１は存在しないかリンカー部分であり、Ｘ２はＯ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）である。Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、
【化２】
2019524798.tif 000004
（式中、ｙは１以上の整数である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂまたは−ＳＲｂであり、Ｒｂは標的剤、
【化３】
2019524798.tif 000005
であり、Ｇ１は、
【化４】
2019524798.tif 000006
であり、Ｇ２は、
【化５】
2019524798.tif 000007
である。Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルである。Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートである。各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルである。各Ａ環は、独立して、縮合されている６員の脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、アリール環、またはヘテロアリール環である。
【０００９】
Ｇ１およびＧ２は、実質的に同じであってもよいし、互いに異なってもよい。いくつかの実施形態では、各Ｙは同一であり、Ｒ６およびＲ７は同一であり、Ｒ８〜Ｒ１１およびＲ１６〜Ｒ１７は、Ｒ１２〜Ｒ１５およびＲ１８〜Ｒ１９とそれぞれ同一である。上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、Ｙは、Ｃ（ＣＨ３）２であり得る。上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり得、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５である。上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ１およびＲ４は、独立して、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−ＲＯＨ、−ＲＣＯＯＨ、または−ＲＣＦ３であり得、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、式ＩＩの構造を有し、式中、Ｒ１〜Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１３、ｍ、Ｘ１、およびＹは、前に定義したとおりである。
【化６】
2019524798.tif 000008
【００１１】
上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ３は、
【化７】
2019524798.tif 000009
であり得、ここで、Ｒ２０〜Ｒ２７は、独立して、Ｈ、アルキル、−ＮＯ２、−ＮＲｅ２、−ＮＲｅ３、アルコキシ、またはスルホナートであり、ここで、各Ｒｅは、独立して、Ｈ、ハロ、またはアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２０〜Ｒ２５はＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、
【化８】
2019524798.tif 000010
である。上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、薬物は抗がん薬であり得る。１つの実施形態では、薬物は、デュオカルマイシン（例えば、デュオカルマイシンＤＭなど）である。
【００１２】
上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ５は、
【化９】
2019524798.tif 000011
であり得、ここで、ｑおよびｒは、独立して、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態では、Ｒｂは、抗体などの標的剤である。
【００１３】
上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり得、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、または−ＳＲｂであり、ここで、Ｒｂは標的剤であり、コンジュゲートは、１つまたは複数の、Ｒｂに結合したさらなる部分をさらに含み、さらなる部分の各々は、独立して、式ＩＩＩ
【化１０】
2019524798.tif 000012
の化学構造を有し、ここで、ｍ、ｎ、ｘ、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ１、Ｇ１、Ｇ２、およびＬ２は、前に定義したとおりであり、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｈ）−、または−Ｓ−である。
【００１４】
薬学的組成物は、式Ｉに従うコンジュゲート（ここで、Ｒｂは標的剤である）および薬学的に許容され得るキャリアを含む。
【００１５】
開示の標的剤−薬物コンジュゲートを調製するための前駆体化合物の実施形態は、式ＩＶ：
【化１１】
2019524798.tif 000013
の化学構造またはその塩を有する。
【００１６】
式ＩＶに関して、ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｇ１、Ｇ２、およびＸ１は、前に定義したとおりであり；Ｒ２８は、水素または保護基であり；Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ≡ＣＨであり、ここで、ｕは、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態では、Ｒ２８は水素である。
【００１７】
本明細書に開示されるコンジュゲートを使用する方法は、式Ｉに従うコンジュゲートを提供する工程であって、Ｒｂは標的剤である、工程；およびその後に、近赤外範囲の選択された波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によりコンジュゲートに照射して開裂反応を誘起し、コンジュゲートから薬物を放出させる、工程を含む。いくつかの実施形態では、光の標的化利用によりコンジュゲートに照射する工程は、波長が６５０〜９００ｎｍの光を生じるレーザーをコンジュゲートに照射することを含む。上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、本方法は、コンジュゲートの蛍光レベルをモニタリングする工程、および蛍光レベルが標的レベル未満に低下した場合に照射を中止する工程をさらに含み得る。
【００１８】
上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、本方法は、（ｉ）標的分子を含むか、または含むと疑われる生物試料を提供する工程；（ｉｉ）生物試料を前記コンジュゲートと接触させる工程であって、コンジュゲートの標的剤が標的分子を認識して、標的分子に結合することができる、工程；および（ｉｉｉ）その後に、光の標的化利用により生物試料に照射する工程をさらに含み得る。
【００１９】
上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、本方法は、（ｉ）薬物で処置することができる状態を有すると被験体を同定する工程；（ｉｉ）治療有効量のコンジュゲートまたはコンジュゲートを含む薬学的組成物を被験体に投与する工程；および（ｉｉｉ）その後に、被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によってコンジュゲートに照射し、それにより、コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から前記薬物を放出する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、被験体は腫瘍を有し、被験体の標的化部分が腫瘍位置に隣接する領域を含む。上記実施形態のいずれかまたは全てにおいて、標的化部分に利用された光の有効量は５〜２５０Ｊ／ｃｍ２であり得る。
【００２０】
本明細書に開示される通りのコンジュゲートを使用する別の方法は、（ｉ）治療有効量のコンジュゲートまたはコンジュゲートを含む薬学的組成物を、薬物で処置することができる状態を有すると疑われる被験体に投与する工程；（ｉｉ）その後に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する光量の被験体の標的化部分への標的化利用によってコンジュゲートに照射する工程であって、光量が、コンジュゲートの蛍光を生じさせるのに十分であるが、コンジュゲートの開裂を誘起し、コンジュゲートから薬物を放出させるには不十分である、工程；（ｉｉｉ）被験体の標的化部分中のコンジュゲートから任意の蛍光を検出する工程；および（ｉｖ）その後に、蛍光が検出された場合に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の被験体の標的化部分への標的化利用によってコンジュゲートに照射し、それにより、コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出する、工程を含む。
【００２１】
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照することにより、以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、例示的なヘプタメチンシアニン−薬物コンジュゲートからの薬物の光誘起開裂を示す反応スキームである。
【００２３】
【図２】図２は、本明細書中に開示の前駆体化合物についての合成スキームである。
【００２４】
【図３】図３は、薬物を含む中間体コンジュゲートについての合成スキームである。
【００２５】
【図４】図４は、標的剤へのコンジュゲーションのための調製における図３の中間体コンジュゲートへの反応性部分の付加についての合成スキームである。
【００２６】
【図５】図５は、パニツムマブへのヘプタメチンシアニン−デュオカルマイシンＤＭコンジュゲート（ＣＹ（Ｍｅ）−ＤｕｏＤＭ）のコンジュゲーションについての合成スキームである。
【００２７】
【図６】図６は、パニツムマブへのヘプタメチンシアニン−デュオカルマイシンＤＭコンジュゲート（ＣＹ（Ｅｔ）−ＤｕｏＤＭ）のコンジュゲーションについての合成スキームである。
【００２８】
【図７】図７は、コンジュゲートの注射およびその後の皮膚外面への所望の波長の光の標的化送達による、腫瘍を有する被験体を処置するための開示の標的剤−薬物コンジュゲートの使用法の１つの実施形態を例示する概要図である。
【００２９】
【図８】図８は、図５および６のコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００３０】
【図９】図９は、ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭおよびＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭの暗所での安定性を示すグラフである。
【００３１】
【図１０】図１０は、ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）にて氷上で１時間、３７℃で６時間、そして３７℃で２４時間処置したＭＤＡ−ＭＢ−４６８生細胞およびＭＣＦ−７生細胞の蛍光および明視野顕微鏡画像を示す。近赤外蛍光を、Ｃｙ７チャネルを使用して画像化した。
【００３２】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（各光照射量（light  dose）での第１のバー）またはＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（各光照射量での第２のバー）の常駐下でのＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の近赤外光依存性成長阻害に及ぼす光照射量および波長の影響を示す。各コンジュゲートの標識度は４であった。
【００３３】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、時間の関数としてのＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスにおけるＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）の生体内分布および腫瘍局在を示す。連続蛍光画像を、背側（１２Ａ）および腹側（１２Ｂ）から撮影した。
【００３４】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、注射後の時間の関数としての図１２Ａおよび１２Ｂにおけるマウスの腫瘍および肝臓の正規化蛍光強度（１３Ａ）および標的対バックグラウンド比（１３Ｂ）のグラフである。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）を示す。
【００３５】
【図１４】図１４は、ＣＹ（Ｅｔ）−ＰａｎＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）の注射から４日後に、６９０ｎｍの光の照射量を上昇させながら腫瘍を照射する前および照射した後のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスの連続蛍光画像を示す。
【００３６】
【図１５】図１５は、０Ｊ照射量点と比較した近赤外光照射量の関数としての平均腫瘍蛍光強度を示すグラフである。各時点での第１のバーは、照射なしの蛍光である。各時点での第２のバーは、表示の光照射量後の蛍光である。
【００３７】
【図１６】図１６は、腫瘍成長に及ぼすＣＹ（Ｅｔ）−ＰａｎＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
本開示は、ヘプタメチンシアニンフルオロフォアを含む標的剤−薬物コンジュゲート、コンジュゲートの前駆体、ならびにコンジュゲートおよび前駆体の作製方法および使用方法の実施形態に関する。近赤外脱ケージ化ストラテジーは、ケージ化成分としてヘプタメチンシアニンフルオロフォア足場を使用する。有効量の近赤外光での照射により、標的剤−薬物コンジュゲートからの薬物の開裂が誘起される。
【００３９】
このアプローチにより、種々の臨床背景で既に使用されている近赤外光学ツールを使用して生物活性小分子を標的特異的に送達することが可能となる。有利な特徴は、コンジュゲートの蛍光特性を使用して標的剤−標的の結合を評価することができるという点である。さらに、治療的光照射量の投与後、そのシグナルの喪失により、薬物放出のリアルタイムでの評価が可能となる。
【００４０】
開示のコンジュゲートのある特定の実施形態は、抗体および抗がん剤を含み、腫瘍への抗がん剤の部位特異的送達に有用である。薬物の有効搭載量（drug  payload）の放出過程を細胞内在化と分離することにより、細胞外の標的剤−薬物コンジュゲートの一部分は薬物カーゴを局所腫瘍環境内に放出する。好都合なことに、この局在化放出は、抗原陽性細胞から近接する抗原陰性細胞へ分子を効果的に移動させるはずであり、治療有効性に重要であり得るバイスタンダー効果を達成するはずである。
【００４１】
Ｉ．定義
以下の用語および略語の説明は、本開示をより的確に説明し、本開示の実施において当業者をガイドするために提供される。本明細書中で使用される場合、文脈上そうでないと明確に示されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、複数の参照事項を含む。用語「または」は、文脈上そうでないと明確に示されない限り、記述された代替の要素のうちの単一要素または２つもしくはそれより多くの要素の組み合わせをいう。
【００４２】
別段説明が無い限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するかまたはそれらと等価である方法および材料を、本開示の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、単なる例示に過ぎず、制限するものであることを意図していない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００４３】
別段の指示が無い限り、明細書または特許請求の範囲で使用される成分、分子量、百分率、温度、および時間などの量を表す全ての数値は、用語「約」で修飾されていると理解すべきである。したがって、別段の指示が無い限り、暗示的または明示的に、記載される数値パラメーターは近似値であり、その近似値は、求められる所望の特性および／または標準的な試験条件／方法下での検出限度に依存し得る。実施形態を考察した先行技術と直接的かつ明示的に区別する場合、用語「約」を記載しない限り、実施形態の数値は近似値ではない。
【００４４】
化学分野の一般用語の定義を、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ，Ｓｒ．（ｅｄ．），Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版，１９９７（ＩＳＢＮ  ０−４７１−２９２０５−２）に見出すことができる。分子生物学における共通用語の定義を、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００（ＩＳＢＮ  ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；ならびに他の類似の参考文献に見出すことができる。
【００４５】
本開示の種々の実施形態の再検討を容易にするために、特定の用語を以下に説明する。
【００４６】
脂肪族：実質的に炭化水素系の化合物、またはそのラジカル（例えば、ヘキサンラジカルについてはＣ６Ｈ１３）であり、脂肪族としては、アルカン、アルケン、アルキンが挙げられ、それらは、その環式バージョンを含み、さらに、直鎖および分枝鎖配置を含み、ならびに全ての立体異性体および位置異性体も含む。明確な別段の記載が無い限り、脂肪族基は、１〜２５個の炭素原子（例えば、１〜１５個、１〜１０個、１〜６個、または１〜４個の炭素原子）を含む。用語「低級脂肪族」は、１〜１０個の炭素原子を含む脂肪族基をいう。脂肪族鎖は、置換されていても、非置換であってもよい。「非置換脂肪族」と明確に言及しない限り、脂肪族基は、非置換であるまたは置換されているのいずれかであり得る。脂肪族基は、１つまたは複数の置換基（脂肪族鎖中の各メチレン炭素に対して最大２個までの置換基、または、脂肪族鎖中の−Ｃ＝Ｃ−二重結合の各炭素に対して最大１個までの置換基、または、末端メチン基の炭素に対して最大１個までの置換基）で置換されてよい。例示的な置換基には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、ヘテロ環状脂肪族、ヒドロキシル、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオアルコキシ、または他の官能基が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
アルコキシ：構造−ＯＲ（式中、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。メトキシ（−ＯＣＨ３）は、例示的なアルコキシ基である。置換アルコキシでは、Ｒは、非干渉性の置換基で置換されたアルキルである。
【００４８】
アルコキシカルボニル：構造−（Ｏ）Ｃ−Ｏ−Ｒ（式中、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。
【００４９】
アルキル：飽和炭素鎖を有する炭化水素基。前記鎖は、分岐鎖、非分岐鎖、または環状鎖（シクロアルキル）であり得る。低級アルキルという用語は、鎖が１〜１０個の炭素原子を含むことを意味する。別段の指定が無い限り、アルキルという用語は、置換および非置換のアルキルを含む。
【００５０】
アルキルカルボニル：構造−（Ｏ）Ｃ−Ｒ（式中、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。
【００５１】
アルキルスルホナート：構造−Ｒ−ＳＯ３−（式中、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。
【００５２】
アミノ：構造−Ｎ（Ｒ）Ｒ’（式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素、ハロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール（例えば、任意選択的に置換されたフェニルまたはベンジルなど）、ヘテロアリール、アルキルスルファノ、または他の官能基である）を有する基。「一級アミノ」基は、−ＮＨ２である。「一置換アミノ」は、上記のように置換されたラジカル−Ｎ（Ｈ）Ｒを意味し、一置換アミノには、例えば、メチルアミノ、（１−メチルエチル）アミノ、およびフェニルアミノなどが含まれる。「二置換アミノ」は、上記のように置換されたラジカル−Ｎ（Ｒ）Ｒ’を意味し、二置換アミノには、例えば、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、およびジ（１−メチルエチル）アミノなどが含まれる。アミノという用語はまた、荷電三置換アミノ基、例えば、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ’）Ｒ’’＋（式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、独立して、水素、ハロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール（例えば、任意選択的に置換されたフェニルまたはベンジルなど）、ヘテロアリール、アルキルスルファノ、または他の官能基である）を含む。
【００５３】
アミノアルキル：化学官能基−ＲＮＨ２または−ＲＮＨ３＋（式中、Ｒはアルキル基である）。「置換アミノアルキル」は、アミノ基が置換されていることを意味する（例えば、−ＲＮ（Ｒ’）Ｒ’’または−ＲＮ（Ｒ’）（Ｒ’’）Ｒ’’’＋（式中、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、独立して、水素、ハロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール（例えば、任意選択的に置換されたフェニルまたはベンジルなど）、ヘテロアリール、アルキルスルファノ、または他の官能基である））。
【００５４】
抗体：イムノグロブリン遺伝子またはイムノグロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされている１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識されているイムノグロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらに基づいて順に、イムノグロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥがそれぞれ定められる。鳥類および爬虫類では、ＩｇＹ抗体は、哺乳動物のＩｇＧと同等である。
【００５５】
イムノグロブリン（抗体）の基本構造単位は、一般に、四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う、約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を定める。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００５６】
ＩｇＹ抗体の構造は、哺乳動物ＩｇＧの構造と類似し、２つの重鎖（「ν」鎖；およそ６７〜７０ｋＤａ）および２つの軽鎖（２２〜３０ｋＤａ）を有する。ＩｇＹ分子の分子量は約１８０ｋＤａであるが、しばしば、ゲル上では約３％の炭水化物の存在に起因してスメアとして泳動される。ＩｇＹ抗体の重鎖（Ｈ）は、４つの定常ドメインと、抗原結合部位を含む１つの可変ドメインから構成される。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」には、完全な（intact）イムノグロブリンおよびいくつかの十分に特徴づけられたフラグメントが含まれる。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質もしくは融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂ、Ｆｖ、および一本鎖Ｆｖ（ＳＣＦｖ）もまた、前述のタンパク質（またはエピトープ）への特異的結合剤であろう。これらの抗体フラグメントを、以下のように定義する：（１）Ｆａｂ、抗体全体を酵素パパインで消化して完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることによって生成された、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント；（２）Ｆａｂ’、抗体全体をペプシンで処理し、その後に還元して、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生成することによって得た抗体分子のフラグメント；１抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を行わないことによって得た抗体のフラグメント；（４）Ｆ（ａｂ’）２、２つのジスルフィド結合によって相互に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体；（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント；および（６）単鎖抗体、遺伝的に融合した一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子。これらのフラグメントの作製方法は、ルーティンである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」には、部位特異的コンジュゲーションを容易にするための１つまたは複数の非天然（すなわち、天然に存在しない）アミノ酸（例えば、ｐ−アセチル−フェニルアラニン）を含む抗体が含まれる。
【００５８】
本開示の方法で用いる抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル工程であり得、例えば、標的抗原などの標的に特異的に結合する。単なる例として、モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの古典的方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７，１９７５）またはその派生的方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成の詳細な手順は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００５９】
抗原：動物内での抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質（動物内に注射または吸収される組成物が含まれる）。抗原は、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する（異種免疫原によって誘導される生成物が含まれる）。本明細書中で使用される場合、「標的抗原」は、標的剤によって認識および結合される抗原（抗原のエピトープを含む）である。「特異的結合」は、排他的結合を必要としない。いくつかの実施形態では、抗原を、細胞または組織の抽出物から得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上の抗原である。抗原は、全長タンパク質である必要はない。使用が意図される抗原には、タンパク質の任意の免疫原性フラグメント（例えば、抗体が特異的に結合することができる少なくとも１つのエピトープを有する任意の抗原など）が含まれる。
【００６０】
アリール：別段の指定が無い限り、単一の環（例えば、フェニル）または少なくとも１つの環が芳香族である縮合多環（multiple  condensed  rings）（例えば、キノリン、インドール、およびベンゾジオキソールなど）（但し、結合点がアリール基の芳香族部分の原子を介し、且つ、結合点の芳香族部分がその芳香環内に炭素のみを含むことを条件とする）を有する６〜１５個の炭素原子の一価の芳香族炭素環式基。任意の芳香環部分がヘテロ原子を含む場合、前記基はヘテロアリールであり、アリールではない。アリール基は、単環式、二環式、三環式、または四環式である。別段の指定が無い限り、アリールという用語は、置換および非置換アリールを含む。
【００６１】
生物試料：本明細書中で使用される場合、「生物試料」は、被験体（例えば、ヒト被験体または動物被験体など）または他のタイプの生物（例えば、植物、細菌、または昆虫など）から得た試料をいう。被験体由来の生物試料には、細胞、組織、血清、血液、血漿、尿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、または他の体液が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に開示の方法の特定の例では、生物試料は組織試料である。
【００６２】
コンジュゲート：直接または間接的に相互に連結されている２つまたはそれより多くの部分。例えば、第１の部分は、第２の部分に共有結合により連結されていてもよい。間接的な結合が、例えば、「リンカー」（２つの部分の間に配置された分子または原子群）の使用などによって、可能である。
ＤＭＰ：デス−マーチンペルヨージナン
【化１２】
2019524798.tif 000014
【００６３】
薬物：本明細書中で使用される場合、用語「薬物」は、被験体に投与した場合に生理学的効果があり、疾患の処置、緩和、治癒、予防、または診断での使用が意図されているか、そうでなければ、身体または精神の幸福を向上させるために使用される物質をいう。用語「小分子薬物」は、分子量が１，０００ダルトン未満の薬物をいう。
【００６４】
抗がん薬は、悪性腫瘍を処置するために使用される薬物である。例示的な抗がん薬には、アビラテロン、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル  シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コンブレタスタチンＡ４、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、デガレリクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、デュオカルマイシンＤＭ、エピルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エキセメスタン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フォリン酸、フルベストラント、ゲムシタビン、ゴセレリン、イバンドロン酸、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ランレオチド、レナリドミド、レトロゾール、リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メスナ、メトトレキサート、オクトレオチド、パミドロナート、ペメトレキセド、マイトマイシン（ｍｉｔｏｃｍｙｃｉｎ）、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン（ｐｅｎｔａｓｔａｔｉｎ）、ピポブロマン（ｐｉｐｂｒｏｍａｎ）、プリカマイシン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、スチルベストロール、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、トポテカン、トリプトレリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびゾレドロン酸（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
有効量または治療有効量：被験体または所与の割合の被験体に有益または治療的な効果をもたらすのに十分な量。
【００６６】
エピトープ：抗原決定基。エピトープは、抗原性である、すなわち、特異的な免疫応答を惹起する、分子上の特定の化学基または連続もしくは不連続なペプチド配列である。抗体は、抗体の三次元構造および適合する（または同族）エピトープに基づいて、特定の抗原性エピトープに結合する。
【００６７】
ハロゲン：ハロゲンおよびハロという用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、およびそのラジカルをいう。
【００６８】
ヘテロ脂肪族：少なくとも１つのヘテロ原子を有する（すなわち、１つまたは複数の炭素原子が少なくとも１つの孤立電子対を有する原子（典型的には、窒素、酸素、リン、ケイ素、または硫黄）に置き換えられている）脂肪族の化合物または基。ヘテロ脂肪族の化合物または基は、置換または非置換、分枝鎖状または非分枝鎖状、環式または非環式であり得、「ヘテロ環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロ環状脂肪族（heterocycloaliphatic）」、または「複素環式」の基が含まれる。
【００６９】
ヘテロアルキル：少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓなど）またはＳ（Ｏ）ｎ（式中、ｎは１または２である）を含む上記定義のアルキル基。別段の指定が無い限り、ヘテロアルキルという用語は、置換および非置換のヘテロアルキルを含む。
【００７０】
ヘテロアリール：少なくとも１つのヘテロ原子を有する（すなわち、環内の１つまたは複数の炭素原子が少なくとも１つの孤立電子対を有する原子（典型的には、窒素、酸素、リン、ケイ素、または硫黄）に置き換えられている）芳香族の化合物または基。別段の指定が無い限り、ヘテロアリールという用語は、置換および非置換のヘテロアリールを含む。
【００７１】
リガンド：受容体に結合する分子であって、生物学的効果を有する分子。
【００７２】
リンカー：２つの部分の間に配置された分子または原子群。本明細書中で使用される場合、用語「リンカー」は、シアニンフルオロフォアと標的剤または反応性基との間に配置された原子群、またはシアニンフルオロフォアと薬物との間に配置された原子群をいう。
【００７３】
近赤外（近ＩＲ、ＮＩＲ）：６５０〜２５００ｎｍの範囲内の波長。別段の指定が無い限り、本明細書中で使用される用語「近赤外」および「ＮＩＲ」は、６５０〜９００ｎｍの範囲内の波長をいう。
【００７４】
薬学的に許容され得るキャリア：本開示において有用な薬学的に許容され得るキャリア（ビヒクル）は従来存在する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００５）は、本明細書中に開示される１つまたは複数の標的剤−薬物コンジュゲートの薬学的送達に適切な組成物および製剤（formulation）を記載している。
【００７５】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして薬学的におよび生理学的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）を含む注射用流体を含む。いくつかの例では、薬学的に許容され得るキャリアは、被験体への投与（例えば、非経口、筋肉内、または皮下注射による）に適切なように無菌であり得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助剤（湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラート））を含むことができる。
【００７６】
薬学的に許容され得る塩：開示のコンジュゲートの生物学的に適合可能な塩であり、この塩は、当該分野で周知の種々の有機および無機の対イオンに由来し、例に過ぎないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウムなどが挙げられ；分子が塩基性官能基を含む場合、有機酸または無機酸の塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、およびシュウ酸塩など）の塩が挙げられる。薬学的に許容され得る酸付加塩は、生物学的にも他の点でも望ましくない酸パートナーにより形成されている一方で、遊離塩基の生物学的有効性を保持している塩（例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸など）および有機酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸など））である。薬学的に許容され得る塩基付加塩には、無機塩基由来の塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、およびアルミニウム塩など）が含まれる。例示的な塩は、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。薬学的に許容され得る非毒性有機塩基に由来する塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、およびポリアミン樹脂など）の塩が含まれるが、これらに限定されない。例示的な有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７；６６：１−１９（本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。
【００７７】
保護基：有機化合物の合成を合成するとき、しばしば、特定の官能基は、必要とされる試薬または化学的環境を切り抜けることができない。これらの基は保護されなければならない。保護基または保護用の基を、その後の化学反応における化学選択性を得るために官能基の化学修飾によって分子内に導入する。種々の例示的な保護基または保護用の基は、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｙ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ３０，２００６）（本明細書において参考として援用される）に開示されている。
【００７８】
特異的結合パートナー：関与する分子の三次元構造に依存する特異的な非共有結合性相互作用によって相互作用する一対の分子のメンバー。特異的結合パートナーの例示的な対には、抗原／抗体、ハプテン／抗体、受容体／リガンド、核酸鎖／核酸相補鎖、基質／酵素、インヒビター／酵素、炭水化物／レクチン、ビオチン／アビジン（例えば、ビオチン／ストレプトアビジンなど）、およびウイルス／細胞受容体が含まれる。
【００７９】
置換基：反応の結果として分子内の別の原子と置き換わる、原子または原子群。用語「置換基」は、典型的には、親炭化水素鎖または親炭化水素環上の１つの水素原子または置換基が二重結合を介して結合する場合に２つの水素原子と置き換わる、原子または原子群をいう。用語「置換基」はまた、分子に対して複数の結合点を有する原子群を包含し得る（例えば、親炭化水素鎖または親炭化水素環上の２つまたはそれより多くの水素原子と置き換わる）。かかる例では、置換基を、別段の指定が無い限り、親炭化水素鎖または親炭化水素環に対して任意の空間的配向で結合させることができる。例示的な置換基には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アシル基、アルデヒド基、アミド基、アミノ基、アミノアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アリールアミノ基、カルボナート基、カルボキシル基、シアノ基、シクロアルキル基、ジアルキルアミノ基、ハロ基、ハロ脂肪族基（例えば、ハロアルキル基）、ハロアルコキシ基、ヘテロ脂肪族基、ヘテロアリール基、ヘテロ環状脂肪族基、ヒドロキシル基、イソシアノ基、イソチオシアノ基、オキソ基、スルホンアミド基、スルフヒドリル基、チオ基、およびチオアルコキシ基が含まれる。
【００８０】
置換された：１つまたは複数の置換基が基本化合物に連結されている、基本化合物（例えば、アリールまたは脂肪族化合物など）またはそのラジカルであって、各置換基が典型的には基本化合物上の水素原子と置き換えられている、基本化合物またはそのラジカル。単なる例示であり、制限ではないが、置換されたアリール化合物は、アリール基礎の閉じられた環に連結されている脂肪族基を有し得る（例えば、トルエンなど）。さらに、単なる例示であり、制限ではないが、長鎖炭化水素は、この炭化水素に結合したヒドロキシル基を有し得る。
【００８１】
スルホナート含有基：ＳＯ３−を含む基。スルホナート含有基という用語には、−ＳＯ３−基および−ＲＳＯ３−基（式中、Ｒは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである）が含まれる。
【００８２】
標的：開示の標的剤−薬物コンジュゲートが特異的に結合することができる目的分子。標的の例には、組織試料中に存在するタンパク質および核酸配列が含まれる。標的領域は、標的分子が位置するか、または位置する可能性がある領域である。
【００８３】
標的剤：標的部位（例えば、被験体の体内の標的にされた位置（例えば、特定の器官、オルガネラ、生理学的系、組織、または病変部位（例えば、腫瘍、感染領域、または組織損傷領域など）など））への優先的または標的化された送達を促進する剤。標的剤は、種々の機序（例えば、標的部位内の選択的濃度など）または特異的結合パートナーへの結合により機能する。適切な標的剤には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質および他のグリコシル化分子、オリゴヌクレオチド、リン脂質、リポタンパク質、アルカロイド、およびステロイドが含まれるが、これらに限定されない。例示的な標的剤には、抗体、抗体フラグメント、アフィボディ、アプタマー、アルブミン、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、ホルモン、酵素、免疫調節薬、受容体タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アビジン、およびナノ粒子などが含まれる。標的剤のうち特に有用なものは、抗体、核酸配列、および受容体リガンドであるが、特異的結合パートナーの任意の対をこの目的で容易に使用することができる。
【００８４】
処置する／処置：本明細書中で使用される場合、用語「処置する」および「処置」は、状態（すなわち、障害または疾患）に関連する少なくとも１つの徴候または症状を阻害または軽減することを意味する。腫瘍に関して、処置は、腫瘍成長の阻害および／または腫瘍容積の低下を意味し得る。処置は、例えば、腫瘍のいくつかまたは全ての臨床症状の重症度の低下、腫瘍のより遅い進行（例えば、腫瘍を有する被験体を延命させることによる）、腫瘍再発数の減少、被験体の健康全般もしくは幸福の改善、または特定の障害もしくは疾患に特異的な当該分野で周知の他のパラメーターによる改善をもたらし得る。
【００８５】
ＩＩ．コンジュゲート
ヘプタメチンシアニンフルオロフォア、薬物、および標的剤、またはさらなるコンジュゲーションに適切な反応性基を含むコンジュゲートの実施形態を本明細書中に開示する。図１は、例示的な先行技術のヘプタメチンシアニン−薬物コンジュゲート（式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルであり、「ケージ化」部分は薬物を含む）を示す。図１に示すように、コンジュゲートは、近赤外光を照射した場合に光分解を経て、それにより、Ｃ４’−Ｎ結合が加水分解に対して不安定になる。これによってＣ４’−窒素の脱ケージ化が引き起こされ、Ｃ４’−窒素が自発的にペンダント（pendant）カルバマート基へ向かって環化し、薬物の有効搭載量（drug  payload）が排出される。光分解は、ジオキセタン中間体を介して進行する一重項酸素媒介位置選択的シアニンポリエン開裂プロセスを含む。図１の例示的なコンジュゲートは標的剤を含まないが、光分解機序は、本明細書中に開示のコンジュゲートと同一である。
【００８６】
ヘプタメチンシアニン発色団、薬物、および標的剤、またはさらなるコンジュゲーションに適切な反応性基を含むコンジュゲートは、式Ｉ
【化１３】
2019524798.tif 000015
の化学構造を有するコンジュゲートまたはその薬学的に許容され得る塩である。
【００８７】
式Ｉに関して、ｍは、１、２、３、４、または５であり；各ｎは、独立して、１、２、または３である。Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルである。Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルである。Ｒ３は−Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物であり、ここで、Ｌ１は存在しないかリンカー部分であり、Ｘ２はＯ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）である。Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、
【化１４】
2019524798.tif 000016
（式中、ｙは１以上の整数である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂまたは−ＳＲｂであり、Ｒｂは標的剤、
【化１５】
2019524798.tif 000017
であり、Ｇ１は、
【化１６】
2019524798.tif 000018
であり、Ｇ２は、
【化１７】
2019524798.tif 000019
である。Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルである。Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートである。各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルである。各Ａ環は、独立して、縮合されている６員の脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、アリール環、またはヘテロアリール環である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ４は、独立して、低級アルキル、−ＲＯＨ、−ＲＣＯＯＨ、または−ＲＣＦ３であり、ここで、Ｒは低級アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ４は、独立して、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたは−ＲＯＨであり、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである。例えば、Ｒ１およびＲ４は、独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ４は同一である。１つの実施形態では、Ｒ１およびＲ４はエチルである。別の実施形態では、Ｒ１およびＲ４はメチルである。Ｒ１およびＲ４の同一性は、その後の薬物放出を伴う環化を誘起するのに適切な波長に影響を及ぼす。例えば、Ｒ１およびＲ４のメチル基をエチル基で置き換えることにより、一例を挙げれば、有効波長が５０ｎｍだけレッドシフトする（すなわち、６９０ｎｍから７４０ｎｍへシフトする）ことを示された。したがって、Ｒ１およびＲ４を、コンジュゲートからの薬物放出を誘起するのに有効な波長に「調整する」ために使用することができる。当業者は、波長が長いほど被験体の組織内のより深部まで透過し得ることを理解する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は−ＣＨ２−であり、ｍは１、２、または３である。ある特定の例では、ｍは２であり、（Ｒ２）ｍは−ＣＨ２ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、各ｎは１である。
【００９０】
Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、独立して、アルキルスルホナートまたは置換アミノアルキル（例えば、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、式中、ｐは、１、２、３、４、または５である）である。１つの実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）４ＳＯ３−である。別の実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）４Ｎ（ＣＨ３）３＋である。ある特定の実施形態では、Ｒ８〜Ｒ１９は水素である。各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルである。いくつかの例では、各Ｙは、独立して、Ｃ（ＣＨ３）２またはＳである。Ｒｂが標的剤であり、ＹがＣ（Ｒｄ）２である場合、少なくとも１つのＲｄは、アルキルであり得る。ある特定の実施形態では、各ＹはＣ（ＣＨ３）２である。
【００９１】
各Ａ環は、独立して、縮合されている６員の脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、アリール環、またはヘテロアリール環である。Ａ環は、置換されていても、非置換であってもよい。いくつかの実施形態では、Ａ環は、任意選択的に置換されたスルホナートで置換された縮合フェニル環である。例えば、Ａ環は、−ＳＯ３−で置換された縮合フェニル環であり得る。ある特定の例では、スルホン化Ａ環（例えば、スルホン化フェニルなど）を含めることにより、コンジュゲートをｉｎ  ｖｉｖｏで投与した場合に生体内分布が改善され、そして／または、開裂を誘起してコンジュゲートから薬物を放出させるのに有効な波長のレッドシフトが起きる。
【００９２】
２つのヘテロ環部分、Ｇ１およびＧ２は、実質的に類似であってもよいし、互いに異なってもよい。いくつかの実施形態では、Ｇ１は、
【化１８】
2019524798.tif 000020
であり、Ｇ２は、
【化１９】
2019524798.tif 000021
であるか、またはＧ１は、
【化２０】
2019524798.tif 000022
であり、Ｇ２は、
【化２１】
2019524798.tif 000023
であるか、またはＧ１は、
【化２２】
2019524798.tif 000024
であり、Ｇ２は、
【化２３】
2019524798.tif 000025
であり、ここで、各Ｙは同一であり、Ｒ６およびＲ７は同一であり、Ｒ８〜Ｒ１１およびＲ１６〜Ｒ１７は、Ｒ１２〜Ｒ１５およびＲ１８〜Ｒ１９とそれぞれ同一である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、式ＩＩの構造を有し、式中、Ｒ１〜Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１３、ｍ、Ｘ１、およびＹは、前に定義したとおりである。
【化２４】
2019524798.tif 000026
【００９４】
ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、式ＩＩ（式中、Ｒ６およびＲ７は同一であり、Ｒ８およびＲ１２は同一であり、Ｒ９およびＲ１３は同一である）の構造を有する。
【００９５】
Ｒ３は−Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物であり、ここで、Ｌ１はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｘ２は、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）である。１つの実施形態では、Ｌ１は存在しない。１つの独立した実施形態では、Ｌ１は、置換または非置換の脂肪族部分またはヘテロ脂肪族部分を含む少なくとも１つの置換基で置換されたアリールまたはヘテロアリールであり、ここで、アリール環またはヘテロアリール環は、窒素原子への結合部位であり、置換基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物部分に結合する。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、
【化２５】
2019524798.tif 000027
であり、ここで、Ｘ２は、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）であり、Ｒ２０〜Ｒ２７は、独立して、Ｈ、アルキル、−ＮＯ２、−ＮＲｅ２、−ＮＲｅ３、アルコキシ、またはスルホナートであり、ここで、各Ｒｅは、独立して、Ｈ、ハロ、またはアルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２０〜Ｒ２５はＨである。いくつかの例では、Ｒ３は、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物である。
【００９６】
薬物は、Ｒ３部分の残部へのコンジュゲーションが可能な任意の薬物であり得る。いくつかの実施形態では、薬物は、小分子薬物（例えば、分子量が１，０００ダルトン未満の薬物）である。ある特定の実施形態では、薬物部分は抗がん薬である。１つの実施形態では、薬物は、抗乳がん薬である。いくつかの実施形態では、薬物は、デュオカルマイシン（例えば、デュオカルマイシンＤＭまたはデュオカルマイシンＳＡなど）である。デュオカルマイシンは、ＤＮＡ副溝結合アルキル化剤である細胞傷害性抗生物質であり、固形腫瘍に対する使用に適切である。別の例示的な薬物は、ヘミアステルリン（微小管動態を破壊し、いくらかの用量で微小管を脱重合させる、天然物）である。
【００９７】
例示的な−Ｘ２−薬物部分には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【化２６】
2019524798.tif 000028
【化２７】
2019524798.tif 000029
式中、Ｒ’は、低級アルキルまたはアルキルスルホナート（例えば、メチルまたは−（ＣＨ２）４ＳＯ３−など）である。
Ｒ１１は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、
【化２８】
2019524798.tif 000030
（ここで、ｙは１以上の整数である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、または−ＳＲｂであり、ここで、Ｒｂは標的剤、
【化２９】
2019524798.tif 000031
である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、またはヘテロアリール−脂肪族である。１つの実施形態では、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂまたは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂである。１つの独立した実施形態では、Ｒｂは標的剤である。例示的な標的剤には、抗体、リガンド、および核酸鎖などが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の例では、標的剤は抗体である。１つの実施形態では、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂまたは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂであり、Ｒｂは抗体である。１つの独立した実施形態では、Ｒｂはリガンド（例えば、細胞表面上の受容体に結合することができるリガンド）である。
【００９８】
例示的な抗体には、標的分子（例えば、疾患、感染、または環境への曝露に関連するバイオマーカーなど）を認識して結合することができる抗体が含まれる。バイオマーカーには、タンパク質、ペプチド、脂質、代謝産物、および核酸が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍バイオマーカー（例えば、腫瘍細胞内もしくは腫瘍細胞上でのみ見出されるタンパク質、または１つまたは複数のがんに関連する細胞表面受容体に対するタンパク質など）を認識して結合することができる。例えば、パニツムマブは、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）を認識して結合するヒトモノクローナル抗体であり；ＨＥＲ１は、多数の腫瘍型で過剰発現され、いくつかの炎症性疾患にも関連する。トラスツズマブおよびペルツズマブは、いくつかの乳がんで過剰発現される、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に結合するモノクローナル抗体である。ブレンツキシマブは、古典的ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫で発現される細胞膜タンパク質ＣＤ３０を標的とするモノクローナル抗体である。
【００９９】
例示的なＲ５基には、以下が含まれ、
【化３０】
2019524798.tif 000032
式中、ｑおよびｒは、独立して、１、２、３、４、または５である。ある特定の例では、Ｒ５は、
【化３１】
2019524798.tif 000033
であり、式中、ｑおよびｒは、独立して、１、２、３、４、または５である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＲａまたはＲｂは、
【化３２】
2019524798.tif 000034
であり、式Ｉまたは式ＩＩのコンジュゲートは、さらなるコンジュゲーション反応（例えば、標的剤へのコンジュゲーションなど）に使用することができる中間体コンジュゲートである。
【０１０１】
好都合なことに、Ｒ５の位置は、複数のヘプタメチンシアニン−薬物部分の、単一の標的剤（例えば、抗体など）へのコンジュゲーションを容易にする。そのような実施形態において、Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、または−ＳＲｂであり、ここで、Ｒｂは標的剤であり、コンジュゲートは、１つまたは複数の、Ｒｂに結合したさらなる部分をさらに含み、さらなる部分の各々は、独立して、式ＩＩＩ
【化３３】
2019524798.tif 000035
の化学構造を有し、ここで、ｍ、ｎ、ｘ、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ１、Ｇ１、Ｇ２、およびＬ２は、前に定義したとおりであり、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｈ）−、または−Ｓ−である。いくつかの実施形態では、１〜５個のさらなる部分（例えば、１〜３個のさらなる部分など）が標的剤に結合している。したがって、１〜６個のヘプタメチンシアニン−薬物部分は、単一の標的剤に結合していてよい。ある特定の実施形態では、１〜４個のヘプタメチンシアニン−薬物部分は、単一の標的剤に結合している。単一の標的剤に結合しているヘプタメチンシアニン−薬物部分の数を増加させることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲート由来の蛍光を増大させることができ、そして／またはコンジュゲートに有効量の近赤外光を照射した場合に放出される薬物の濃度を増加させることができる。１つの実施形態では、各部分は同一の薬物を含む。１つの独立した実施形態では、薬物は、ヘプタメチンシアニン−薬物部分を介して２つまたはそれより多くの薬物を標的剤に結合させることができるように異なっていてもよい。
【０１０２】
例示的なコンジュゲートおよび中間体コンジュゲートを表１に示し、表１において、Ｒ１およびＲ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり；Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５であり；Ｑは、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂまたは
【化３４】
2019524798.tif 000036
である。Ｒｂは標的剤、特に、抗体（例えば、パニツムマブまたはトラスツズマブなど）である。
【表１−１】
2019524798.tif 000037
【表１−２】
2019524798.tif 000038
【表１−３】
2019524798.tif 000039
【表１−４】
2019524798.tif 000040
【０１０３】
ＩＩＩ．前駆体化合物
式Ｉ〜ＩＩＩのコンジュゲートを作製するのに有用な前駆体化合物の実施形態は、式ＩＶ
【化３５】
2019524798.tif 000041
の構造またはその塩を有する。
【０１０４】
式ＩＶに関して、ｍは、１、２、３、４、または５であり；各ｎは、独立して、１、２、または３である。Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルである。Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルである。Ｘ１は、Ｏ、Ｎ、またはＣＨ２である。Ｇ１は、
【化３６】
2019524798.tif 000042
である。Ｇ２は、
【化３７】
2019524798.tif 000043
である。Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルである。Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートである。各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルである。各Ａ環は、独立して、縮合されている６員の脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、アリール環、またはヘテロアリール環である。Ｒ２８は、水素または保護基である。Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ≡ＣＨであり、ここで、ｕは、１、２、３、４、または５である。
【０１０５】
適切な保護基には、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ２８は水素である。
【０１０６】
２つのヘテロ環部分Ｇ１およびＧ２は、実質的に同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、２つのヘテロ環部分は、前述のように実質的に同一である。Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、独立して、アルキルスルホナートまたは置換アミノアルキル（例えば、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋などであり、式中、ｐは、１、２、３、４、または５である）である。１つの実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）４ＳＯ３−である。別の実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）４Ｎ（ＣＨ３）３＋である。ある特定の実施形態では、Ｒ８〜Ｒ１９は水素である。各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルである。いくつかの例では、各Ｙは、独立して、Ｃ（ＣＨ３）２またはＳである。ある特定の実施形態では、各ＹはＣ（ＣＨ３）２である。いくつかの実施形態では、各Ａ環は、縮合アリール環（例えば、任意選択的に置換されたスルファートで置換された縮合フェニル環など）である。
【０１０７】
ある特定の例では、前駆体化合物は、
【化３８】
2019524798.tif 000044
であり、式中、Ｒ１およびＲ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり；Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５である。
【０１０８】
ＩＶ．合成
開示のコンジュゲートおよび前駆体化合物の実施形態を、シアニンフルオロフォアから合成する。式ＩＶの１つの前駆体化合物の例示的な合成を、スキーム１（図２）に示す。インドレニン１を１，４−ブタンスルトンと反応させてスルホン化インドレニン２を生成する。スルホン化インドレニン２を塩化物３と反応させて、中心環上にアルキニル基を含むヘプタメチンシアニン４を生成する。Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンリンカーを化合物４と反応させて、式ＩＶの前駆体化合物５を得る。式ＩＶの他の前駆体化合物を、所望どおりの化合物１の異型およびジアミンリンカーを使用して合成することができる。インドレニン（ｉｎｄｏｌｅｎｅ）１を−（ＣＨ２）４Ｎ（ＣＨ３）３＋で置換するために、ブロモ−ブチル−アンモニウムブロミドまたはＴｆＯ−ブチル−アンモニウムトリフラートを使用することができる。
【０１０９】
スキーム２（図３）に示すように、薬物（例えば、デュオカルマイシンＤＭ７）を、アシル化反応によって前駆体化合物５にコンジュゲートして中間体コンジュゲート８を生成することができる。中間体コンジュゲート８は、標的剤（例えば、抗体またはリガンド）へのさらなるコンジュゲーションに適切である。
【０１１０】
銅触媒クリック反応を使用して、ＮＨＳエステルを形成することができる。第１の反応では、アジド基およびカルボン酸部分を含むリンカーを、８のアルキニル基と反応させる。その後に、スキーム３（図４）に示すように、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラートを反応物に添加して、ＮＨＳエステル１３（この例では、Ｒ＝メチル）を生成する。第１の工程では、標的剤（例えば、抗体など）をＮＨＳエステルにコンジュゲートして、式ＩおよびＩＩのコンジュゲートを生成することができる（図５および６）。
【０１１１】
Ｖ．薬学的組成物
本開示はまた、本明細書中に開示の少なくとも１つのコンジュゲートを含む薬学的組成物を含む。薬学的組成物のいくつかの実施例は、薬学的に許容され得るキャリアおよび少なくとも１つのコンジュゲートを含む。有用な薬学的に許容され得るキャリアおよび賦形剤は、当該分野で公知である。
【０１１２】
１つまたは複数のコンジュゲートを含む薬学的組成物を、例えば、投与様式および／または画像化すべき位置に応じた種々の方法で製剤する（formulate）ことができる。非経口製剤は、薬学的および生理学的に許容され得る流体ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）である注射用流体を含み得る。賦形剤には、例えば、非イオン性可溶化剤（例えば、クレモフォール（登録商標）など）またはタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物など）が含まれ得る。所望する場合、投与すべき薬学的組成物はまた、非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラート）など）を含み得る。
【０１１３】
薬学的組成物の形態は、選択される投与様式によって決定される。開示の薬学的組成物の実施形態は、実質的に任意の投与様式（例えば、局所、眼球、経口、口内、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、膣などが含まれる）に適切な形態または吸入もしくはガス注入による投与に適切な形態を取り得る。一般に、開示の薬学的組成物の実施形態は、注射、全身、または経口で投与される。
【０１１４】
有用な注射用調製物には、水性または油性ビヒクル中の活性化合物の無菌の懸濁液、溶液、または乳濁液が含まれる。組成物はまた、製剤用剤（formulating  agent）（例えば、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤など）を含み得る。注射用製剤は、単位剤形（例えば、アンプルまたは複数回用量容器）で与えられてよく、また、添加された保存剤を含んでいてよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態を取ってよく、また、製剤用剤（formulatory  agent）（例えば、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤など）を含んでいてよい。例えば、ボーラス注射または連続注入によって非経口投与を行うことができる。あるいは、コンジュゲートは、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌水）で再構成するための粉末形態であり得る。
【０１１５】
全身用製剤には、注射（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内への注射）による投与のためにデザインされた製剤および経皮、経粘膜、経口、または肺への投与のためにデザインされた製剤が含まれる。
【０１１６】
経口用製剤は、液体（例えば、シロップ、溶液、または懸濁液）または固体（例えば、散剤、錠剤、またはカプセル）であり得る。経口用製剤を、内皮バリアを横断するための標的化リガンドと連結することができる。いくつかのコンジュゲート製剤を、例えば、ジサッカリドを使用した噴霧乾燥によって乾燥させて、コンジュゲートの粉末を形成することができる。固体組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤（例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など）を使用した従来の手段によって調製される。錠剤を、当該分野で周知の方法によって、例えば、糖、薄膜、または腸溶コーティングを使用してコーティングすることができる。かかる剤形の実際の調製方法は、当業者に公知であるか、明らかである。
【０１１７】
経口投与のための液体調製物は、例えば、エリキシル、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取り得る。かかる液体調製物を、薬学的に許容され得る添加物（例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、クレモフォール（登録商標）、または分別植物油（fractionated  vegetable  oils））；および保存剤（例えば、メチルｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）など）を使用した従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、緩衝塩、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤、および甘味剤を適宜含むことができる。経口投与用調製物を、周知のとおりに、フルオロフォアの制御放出をもたらすように適切に製剤することができる。
【０１１８】
直腸および膣の投与経路のために、コンジュゲートを、溶液（停留浣腸用）の坐剤または従来の坐剤基剤（例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなど）を含む軟膏として製剤することができる。
【０１１９】
経鼻投与または吸入もしくはガス注入による投与のために、コンジュゲートを、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フッ化炭素、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した圧縮パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーまたはミストの形態で都合よく送達することができる。圧縮エアロゾルの場合、投薬単位を、定量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。
【０１２０】
本明細書中に記載のコンジュゲートを含む薬学的組成物のある特定の実施形態を、正確な投薬量の個別投与に適切な単位剤形で製剤することができる。薬学的組成物は、所望する場合、１つまたは複数の、コンジュゲートを含む単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで与えられてよい。パックは、例えば、金属またはプラスチックの箔（例えば、ブリスターパックなど）を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与のための説明書を添付することができる。コンジュゲートの投与量は、少なくとも一部が、処置される被験体、標的（例えば、腫瘍のサイズ、位置、および特徴）、および投与様式に依存し、これは当業者に公知である。これらの範囲内で、投与すべき製剤は、コンジュゲートにＮＩＲ光を照射してコンジュゲートから薬物を放出させる場合に、処置される被験体に治療有効用量の薬物を提供するのに有効な量で、本明細書中に開示のコンジュゲートのある量を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、コンジュゲート以外の第２の治療剤を含む。前記第２の剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管形成インヒビターであり得る。
【０１２２】
ＶＩ．光誘起開裂
開示の式Ｉのコンジュゲートの実施形態は、予め選択した標的領域へのある有効な期間にわたる所望の波長、強度、および／または表面積を有する光の利用によって光活性化される。光活性化により、コンジュゲートからの薬物の開裂が生じる。波長は、近赤外範囲内で選択される（例えば、６５０ｎｍ〜２５００ｎｍ、例えば６５０〜９００ｎｍなど）。いくつかの実施形態では、光源は、６５０〜８００ｎｍまたは６８０〜７５０ｎｍの範囲内の波長を有する光を生じるレーザーである。適切な光強度は、標的部位および利用方法に応じて、１ｍＷ／ｃｍ２〜１０００ｍＷ／ｃｍ２（例えば、１〜７５０ｍＷ／ｃｍ２または３００〜７００ｍＷ／ｃｍ２など）の範囲であり得る。近赤外光源を、商業的供給元（Ｔｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）、Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＵＳＡ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ）、およびＰｒｏＰｈｏｔｏｎｉｘ（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）などが含まれる）から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＮＩＲ光の有効量は、１０〜２５０Ｊ（例えば、１０〜２００Ｊ、１０〜１５０Ｊ、または１０〜１００Ｊなど）である。標的領域（例えば、腫瘍に隣接する領域）に照射する場合、ＮＩＲ光の有効量は、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２（例えば、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２など、５〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２００Ｊ／ｃｍ２、１０〜１５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜１００Ｊ／ｃｍ２、または３０〜１００Ｊ／ｃｍ２など）であり得る。
【０１２３】
いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態では、被験体の標的化領域への光の外部利用によって照射が実施される。ＮＩＲ光は、組織内を深さ数ｃｍまで経皮的に透過することができる。他の実施形態では、光の内部利用によって（例えば、内視鏡、光ファイバーカテーテル、または埋め込み型蛍光デバイスの使用などによって）照射が実施されてよい。標的組織（例えば、腫瘍など）が外部光利用に不適切な深さに位置する場合、内部利用を使用することができる。例えば、内視鏡を、肺内、胃内、または膀胱内への光送達のために使用することができる。ある特定の実施形態では、標的領域を、光の利用前に外科的に露呈する。
【０１２４】
光利用のための表面積を、一般に標的組織（例えば、腫瘍または腫瘍の一部）または標的組織に対して外部の皮膚領域を含むように選択する。ｉｎ  ｖｉｖｏ生物試料のために外部光の標的化利用を所望する場合、表面積を、適切な光アプリケーター（例えば、マイクロレンズ、フレネルレンズ、またはディヒューザー装置など）の使用によって調節することができる。標的化内部光利用のために、所望の内視鏡または光ファイバーカテーテルの直径を選択することができる。いくつかの利用では、光散乱溶液を充填した留置カテーテルを標的組織に隣接して、内部で配置することができ、光ファイバー光源をカテーテル中に挿入することができる（例えば、Ｍａｄｓｅｎら，Ｌａｓｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００１，２９，４０６−４１２を参照のこと）。
【０１２５】
コンジュゲートの少なくともいくつかの分子からの薬物の開裂を誘起するのに有効な照射量を送達するのに十分な時間にわたって照射を実施する。いくつかの実施形態では、照射有効量は、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２（例えば、少なくとも３０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２など）である。照射有効量は、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２の範囲（例えば、５〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２００Ｊ／ｃｍ２、１０〜１５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜１００Ｊ／ｃｍ２、または３０〜１００Ｊ／ｃｍ２など）であり得る。
【０１２６】
ＶＩＩ．使用方法
式Ｉまたは式ＩＩのコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に適切である。いくつかの実施形態では、Ｒｂが標的剤であり、ＹがＣ（Ｒｄ）２である場合、少なくとも１つのＲｄはＨ以外である。１つを超えるヘプタメチンシアニン−薬物部分を、各標的剤にコンジュゲートすることができる。例えば、コンジュゲートは、１〜６（例えば、１〜４または２〜４など）の標識度（ＤＯＬ）を有してよく、ここで、ＤＯＬは、標的剤にコンジュゲートしているヘプタメチンシアニン−薬物部分の数である。１つの実施形態では、各ヘプタメチンシアニン−薬物部分は、同一の薬物を含む。１つの独立した実施形態では、ヘプタメチンシアニン−薬物部分は異なる薬物を含み、それにより、単一のコンジュゲートが複数の薬物を送達することが可能となる。
【０１２７】
開裂反応を誘起し、コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出させるための近赤外範囲の選択された波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によりコンジュゲートに照射する。例えば、コンジュゲートに有効量の光を照射する場合、コンジュゲート分子の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、または少なくとも８０％から薬物を放出することができる。いくつかの実施形態では、薬物の１０〜１００％（例えば、２０〜１００％、４０〜１００％、６０〜１００％、または８０〜１００％など）が放出される。コンジュゲートが１を超えるＤＯＬを有する場合、コンジュゲートに有効量の光を照射したとき、ＤＯＬが１のコンジュゲートと比較して、より多くの量の薬物をコンジュゲートから放出させることができる。１つの実施形態では、近赤外光を照射した場合に特定のコンジュゲートが光分解を経ることを確認するために、生物試料の非存在下でコンジュゲートを評価する。
【０１２８】
好都合なことに、コンジュゲートは、照射前に蛍光性であり、開裂反応後に蛍光性を喪失する。コンジュゲートが１を超えるＤＯＬを有する場合、ＤＯＬが１のコンジュゲートと比較して、蛍光が有利に増加する。照射中にコンジュゲートの蛍光レベルをモニタリングすることができ、蛍光レベルが標的レベル未満に低下した場合に照射を停止することができる。コンジュゲートから薬物が放出されるにつれて、蛍光が減少する。したがって、所望のまたは十分な比率のコンジュゲートが開裂および薬物放出を経た時を決定するために、蛍光レベルをモニタリングする場合がある。
【０１２９】
生物試料を、式Ｉまたは式ＩＩのコンジュゲートと、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることができる。コンジュゲートとの接触後、開裂反応を誘起してコンジュゲートから薬物を放出させるために、生物試料に近赤外線を照射する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの投与と近赤外照射の利用との間にある期間の時間を経過させ、それにより、コンジュゲートが標的部位に蓄積して標的部位に結合する時間を提供する。前記期間の時間は、数時間から数日（例えば、１〜７日間または１２時間〜２日間など）であり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、式ＩまたはＩＩのコンジュゲートは、生物試料中に存在するか、または存在すると疑われる標的（例えば、抗原または受容体）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで直接または間接的に認識して結合することができる標的剤を含む。１つの実施形態では、生物試料を、コンジュゲートが生物試料中に存在する場合に近赤外蛍光を生じさせるのに適切な条件下で視覚化する。蛍光により、生物試料中の標的の存在も確認される。蛍光を検出するために試料を視覚化する前に、過剰な、結合していないコンジュゲートを、（例えば、組織試料を洗浄することによって）生物試料から除去することができる。
【０１３１】
１つの非限定的な例では、標的を含み得る生物試料（例えば、組織試料）を、標的を認識して結合することができる抗体を含む式ＩまたはＩＩのコンジュゲートと接触させる。別の非限定的な例では、標的を含み得る生物試料を、標的を認識して結合することができる第１の抗体と合わせ；その後に、生物試料を、抗抗体抗体（anti-antibody  antibody）を含むコンジュゲートと接触させる。別の非限定的な例では、生物試料を、受容体に結合することができるリガンドを含むコンジュゲートと接触させる。例えば、置換基Ｒｂは、細胞表面上の受容体に結合することができる受容体リガンドであり得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、被験体は、薬物で処置することができる状態を有すると同定される。薬物を含む式ＩもしくはＩＩのコンジュゲート、または該コンジュゲートを含む薬学的組成物の治療有効量を被験体に投与する。コンジュゲートの治療有効量は、被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によって照射した場合に、治療有効用量の薬物を放出させるのに十分な量である。照射した場合に各コンジュゲートが１つを超える薬物分子を放出することができるので、コンジュゲートが１を超えるＤＯＬを有する場合に、コンジュゲートの治療有効量を減少させることができる。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、光源は、６５０〜９００ｎｍの範囲内の波長（例えば、６５０〜８００ｎｍまたは６８０〜７５０ｎｍの波長など）および１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２の強度（例えば、３００〜７００ｍＷ／ｃｍ２など）を有する光を提供する。１つの実施形態では、光は、６９０ｎｍの波長および５００ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する。別の実施形態では、光は、７４０ｎｍの波長および５００ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する。有効量は、１０〜２５０Ｊの範囲（例えば、１０〜２００Ｊ、１０〜１５０Ｊ、または１０〜１００Ｊなど）であり得る。標的領域（例えば、腫瘍に隣接する領域）に照射する場合、ＮＩＲ光の有効量は、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２（例えば、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２など、例えば、５〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２００Ｊ／ｃｍ２、１０〜１５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜１００Ｊ／ｃｍ２、または３０〜１００Ｊ／ｃｍ２など）であり得る。
【０１３４】
１つの実施形態では、被験体は腫瘍を有し、式ＩまたはＩＩのコンジュゲートは、腫瘍の抗原またはリガンド結合受容体を認識して結合することができる標的剤を含む。適切な腫瘍には、固形腫瘍塊（例えば、腹腔内腫瘍（例えば、卵巣、前立腺、結腸直腸）、乳房腫瘍、または頭頸部腫瘍など）が含まれるが、これらに限定されない。標的剤は、例えば、腫瘍抗原を認識して結合する抗体であり得る。治療有効量のコンジュゲート、その薬学的に許容され得る塩、または前記コンジュゲートを含む薬学的組成物は、任意の適切な手段（非経口投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣投与、または局所投与が含まれるが、これらに限定されない）によって被験体に投与される。投与されたコンジュゲートに、腫瘍の位置に隣接する領域へのＮＩＲ光の標的化利用によって照射する。
【０１３５】
図７を参照して、腫瘍１１０を有する被験体１００を、抗腫瘍薬および腫瘍細胞表面上の抗原または受容体を認識して結合することができる抗体またはリガンドを含むコンジュゲートで処置することができる。コンジュゲートの被験体への投与が、腫瘍成長を損なわせ得、そして／または腫瘍退縮を引き起こし得る。
【０１３６】
図７に示す例では、コンジュゲート１２０が、静脈内注射によって投与される。ある期間の時間を経過させ、その間に、抗体部分またはリガンド部分が腫瘍に結合するので、コンジュゲートが腫瘍部位に優先的に蓄積する。その後、被験体の標的部分に、外部光アプリケーター１３０を使用して、有効量の所望の波長のＮＩＲ光エネルギーを選択的に照射する。光アプリケーター１３０は、腫瘍１１０の領域に限定された標的領域に光活性化エネルギーを当てて、それにより、腫瘍１１０内および腫瘍１１０周囲のコンジュゲート分子の開裂を選択的に誘起し、コンジュゲートから放出された抗腫瘍薬の送達を標的化する。
【０１３７】
開示のコンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物の実施形態は、セラノスティックな（theranostic）用途（すなわち、状態を診断し、次いで、処置すること）に適切である。いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書中に開示のコンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を、薬物で処置することができる状態を有すると疑われる被験体に投与する。コンジュゲートは、その後に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する光量の被験体の標的化部分への標的化利用によって照射され、光量は、シアニン発色団を励起し、コンジュゲートの蛍光を誘起するのに十分であるが、コンジュゲートから薬物を放出させるには不十分である。被験体の標的化部分中のコンジュゲートから任意の蛍光が検出され、それによって状態を有する被験体を診断する。蛍光が検出された場合に、コンジュゲートは、その後に、近赤外範囲の波長およびコンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出し状態を処置するのに十分な選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によって照射されてもよい。
【０１３８】
いくつかのセラノスティックな実施形態では、状態は、腫瘍であり、被験体の標的化された部分は、腫瘍部位を含む。ＮＩＲ光の標的化利用の前に、投与したコンジュゲートを、コンジュゲートの蛍光を誘起するのに十分であるが、開裂を誘起するには不十分な波長および強度を有する光に腫瘍を曝露することによって視覚化する。いくつかの例では、光へ腫瘍を曝露する前に外科的切除によって腫瘍部位を露出させる。ガイダンスとして蛍光の領域を使用して、腫瘍を切除する。次いで、残存するコンジュゲートおよび／または腫瘍組織に、上記のＮＩＲ光の標的化利用によって照射して、コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出させ、任意の非切除がん組織を処置する。
【０１３９】
１つの実施形態では、前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物の治療有効量を被験体に投与する前に、腫瘍の少なくとも一部を被験体から切除する。１つの独立した実施形態では、前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物の治療有効量が、腫瘍またはその一部の外科的切除前に被験体に投与される。
【０１４０】
治療有効量の第２の剤を、コンジュゲートまたはその塩と共投与することができる。コンジュゲート（またはその塩）および第２の剤を、個別に、または単一の組成物中で一緒に投与することができる。第２の剤を、同一の経路または異なる経路によって投与することができる。同時に投与する場合、コンジュゲート（またはその塩）および第２の剤を、単一の薬学的組成物中で組み合わせてもよく、２つの薬学的組成物として同時に投与してもよい。第２の剤は、例えば、化学療法剤（例えば、抗腫瘍剤または血管形成インヒビターなど）、抗炎症剤、抗感染症剤、抗酸化剤、またはその任意の組み合わせであり得る。
【０１４１】
別の実施形態では、式ＩまたはＩＩの標的剤−薬物コンジュゲートが薬物によって処置または回復することができる状態を有するか、または有すると疑われる被験体から得た組織試料に有効に結合するかどうかを決定し、そして／または薬物が被験体の状態に有効であり得るかどうかを決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ評価を実施することができる。コンジュゲートは、薬物と、標的分子に結合することまたは標的分子と会合することができると考えられるＲｂにおいて部分とを含む。１つの非限定的な例では、Ｒｂは、標的受容体に結合することができる受容体リガンドまたは抗体である。コンジュゲートを組織試料と合わせ、その後に試料に有効量の近赤外光を照射する。１つの実施形態では、組織試料を洗浄して過剰な、結合していないコンジュゲートを除去し、組織試料の蛍光を評価する。蛍光は、コンジュゲートが組織試料に結合していることを示す。近赤外光での照射後、蛍光を再度評価することができる。蛍光の減少（または停止）は、薬物の放出を示す。例えば、細胞傷害性を評価することによって薬物の有効性を評価することもできる。
【０１４２】
式Ｉまたは式ＩＩ（式中、ＲａまたはＲｂは、スクシンイミジル基、マレイミジル基、またはジベンゾシクロオクチニル基を含む）のコンジュゲートの実施形態は、最適な標的剤へのカスタマイズされたコンジュゲーションに適切である。１つの非限定的な例では、腫瘍試料を被験体から得、腫瘍に対して有効であり得る薬物を含むコンジュゲートを選択する。腫瘍上の抗原を特異的に認識して結合する抗体または腫瘍上の受容体を特異的に認識して結合するリガンドを、当業者に公知の方法によって調製する。次いで、調製した抗体またはリガンドを、選択されたコンジュゲートのＲｂと反応させて、被験体への投与に適切なカスタマイズされたコンジュゲートを得る。
【０１４３】
式ＩＶの前駆体化合物は、選択された薬物および選択された標的剤へのカスタマイズされたコンジュゲーションに適切である。１つの実施形態では、前駆体化合物を製薬会社が使用して、薬物と標的剤との所望の組み合わせを有するコンジュゲートが開発される。別の実施形態では、前駆体化合物を研究者または臨床研究者が使用して、研究目的で、または被験体を処置するためのカスタマイズされたコンジュゲートを開発するのに有用な薬物と標的剤との所望の組み合わせを有するコンジュゲートが開発される。
【０１４４】
ＶＩＩＩ．キット
キットも本開示の特徴である。キットの実施形態は、少なくとも１つの、一般式ＩもしくはＩＩのコンジュゲートまたは一般式ＩＶの前駆体化合物を含む。１つの実施形態では、キットは、式ＩまたはＩＩ（式中、Ｒｂは標的剤（例えば、抗体）である）のコンジュゲートを含む。別の実施形態では、キットは、ＲａまたはＲｂが
【化３９】
2019524798.tif 000045
（ここで、ｙは１以上の整数である）である中間体コンジュゲートを含み、キットを、所望の標的剤を含むさらなるコンジュゲートを調製するために使用することができ、ここで、前述の標的剤は中間体化合物と反応して、標的剤を含むコンジュゲートを提供することができる。さらに別の実施形態では、キットは式ＩＶの前駆体化合物を含み、キットは、所望の標的剤および所望の薬物を有するコンジュゲートを調製するために使用される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、キットはまた、コンジュゲートまたは前駆体化合物を溶解または懸濁させることができる少なくとも１つの溶液を含む。キットはまた、１つまたは複数の容器（例えば、使い捨ての試験管またはキュベットなど）を含み得る。キットは、ＲａまたはＲｂが反応性基である場合の所望の標的剤をコンジュゲートするために、および／または所望の標的剤および式ＩＶの前駆体化合物由来の所望の薬物を含むコンジュゲートを調製するために、式ＩまたはＩＩのコンジュゲートを使用するための説明書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＶの化合物を標的剤へコンジュゲートするためおよび／または式ＩＶの化合物を薬物へコンジュゲートするために適切な試薬をさらに含む。
【０１４６】
キットのいくつかの実施形態では、コンジュゲートまたは前駆体化合物を固体として提供し、溶液を液体形態で提供する。１つの実施形態では、溶液は、溶解したコンジュゲートを被験体に投与することができるように、または、ＲａもしくはＲｂが反応性基である溶解したコンジュゲート（薬物および反応性基を含む中間体化合物）を標的剤にコンジュゲートすることができるように式ＩまたはＩＩのコンジュゲートを溶解させるのに適切である。１つの独立した実施形態では、溶液は、薬物および／または標的剤へのその後のコンジュゲーションのために式ＩＶの前駆体化合物を溶解させるのに適切である。意図する用途に適切な濃度で溶液を提供することができる。あるいは、後で使用前に希釈される濃縮液として溶液を提供することができる。ある特定の実施形態では、コンジュゲートまたは前駆体化合物を、１つまたは複数の容器（例えば、試験管またはキュベット）中に予め計量して入れる。
【実施例】
【０１４７】
ＩＸ．実施例
実施例１
合成
【化４０】
2019524798.tif 000046
（２）：インドレニン１（７５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）が入っているマイクロ波バイアルに、１，４−ブタンスルトン（１．５ｍＬ）を添加した。上部空間にアルゴンをフラッシュし、淡褐色懸濁液をマイクロ波反応器中にて１７５℃で７時間加熱した。ジエチルエーテル（１０ｍＬ）をバイアルに入れ、濃厚なスラリーを遠心分離して褐色ペレットを得た。粗固体を水に溶解させ、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８Ａｑゴールドカラム、０−２０％ＭｅＣＮ／水）によって精製した。溶媒を真空中で除去して、２（８５ｍｇ、収率７９％）を黄褐色固体として得た。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO-d6)  δ  8.41  (d,  J  =  1.8  Hz,  1H),  8.36  (d,  J  =  8.9  Hz,  1H),  8.33  (d,  J  =  8.8  Hz,  1H),  8.20  (d,  J  =  8.9  Hz,  1H),  7.94  (dd,  J  =  8.7,  1.7  Hz,  1H),  4.59  (t,  J  =  8.0  Hz,  2H),  2.94  (s,  3H),  2.55  (t,  J  =  7.3  Hz,  2H),  2.02  (p,  J  =  7.6  Hz,  2H),  1.80  (p,  J  =  7.6  Hz,  2H),  1.75  (s,  6H);  Ｃ１９Ｈ２２ＮＯ６Ｓ２（Ｍ）−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値４２４．１、実測値４２４．１．
【０１４８】
【化４１】
2019524798.tif 000047
（４）：マイクロ波バイアルに、インドレニン２（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および塩化物３（１２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）、トリエチルアミン（３９μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）、および無水酢酸（５３μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）を連続して添加した。黄色溶液を９５℃に７５分間加熱し、その間に反応物が深緑色に移行した。反応物を冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中へ入れて希釈して黄褐色沈殿を得た。粗固体を水に溶解させ、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８Ａｑゴールドカラム、０−３０％ＭｅＣＮ／水）によって精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、４（１５ｍｇ、収率４８％）を綿毛様緑色固体として得た。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO-d6)  δ  8.39  (d,  J  =  14.1  Hz,  2H),  8.32  -  8.23  (m,  4H),  8.16  (d,  J  =  8.8  Hz,  2H),  7.88  -  7.78  (m,  4H),  6.45  (d,  J  =  14.2  Hz,  2H),  4.54  -  4.24  (m,  6H),  4.12  (m,  1H),  3.50  (t,  J  =  2.3  Hz,  1H),  3.11  -  2.99  (m,  2H),  2.86  (dd,  J  =  15.8,  6.9  Hz,  2H),  2.54  (t,  J  =  7.3  Hz,  4H),  1.96  (s,  6H),  1.95  (s,  6H),  1.93  -  1.85  (m,  4H),  1.86  -  1.77  (m,  4H);  MS  (ESI)  calculated  for  C49H50ClN2O13S4  (M/3z)3-  345.7,  observed  346.0.
【０１４９】
【化４２】
2019524798.tif 000048
（５）：１ドラムバイアルに、塩化物４（１５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．８ｍＬ）を添加した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（５．０μＬ、０．０４７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を７５℃に１０分間加熱し、その間に反応物の色は緑色から暗青色に移行した。反応物を冷却し、Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８ゴールドカラム、０□３０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、５（１２ｍｇ、収率７６％）を綿毛様青色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  Methanol-d4)  δ  8.43  (d,  J  =  1.8  Hz,  2H),  8.28  (d,  J  =  8.9  Hz,  2H),  8.09  (d,  J  =  8.8  Hz,  2H),  8.00  (dd,  J  =  8.9,  1.6  Hz,  2H),  7.89  (d,  J  =  13.6  Hz,  2H),  7.66  (d,  J  =  8.9  Hz,  2H),  6.20  (d,  J  =  13.7  Hz,  2H),  4.34  (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  4.32  -  4.26  (m,  4H),  4.24  -  4.16  (m,  1H),  4.02  -  3.92  (m,  2H),  3.49  (s,  3H),  3.42  -  3.33  (m,  4H),  2.99  -  2.83  (m,  5H),  2.84  -  2.67  (m,  5H),  2.15  -  2.03  (m,  4H),  2.00  (s,  6H),  1.99  (s,  6H),  1.98  -  1.90  (m,  4H);  MS  (ESI)  calculated  for  C53H66N4O13S4  (M+5H)2+  547.2,  observed  547.5.
【０１５０】
【化４３】
2019524798.tif 000049
（６）：１ドラムバイアルに、塩化物４（２２ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１．５ｍＬ）を添加した。Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン（１４μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（７．０μＬ、０．０４０ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１１０℃に２０分間加熱し、その間に反応物の色は緑色から暗青色に移行した。反応物を冷却し、Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８ゴールドカラム、０〜３０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、５（１４ｍｇ、収率５９％）を綿毛様の青みがかった緑色固体として得た。1H  NMR  (500  MHz,  Methanol-d4)  δ  8.42  (d,  J  =  1.8  Hz,  2H),  8.29  (d,  J  =  9.0  Hz,  2H),  8.09  (d,  J  =  8.9  Hz,  2H),  8.00  (dd,  J  =  8.9,  1.9  Hz,  2H),  7.94  (d,  J  =  13.7  Hz,  2H),  7.66  (d,  J  =  8.9  Hz,  2H),  6.20  (d,  J  =  13.8  Hz,  2H),  4.34  (d,  J  =  2.4  Hz,  2H),  4.28  (t,  J  =  7.3  Hz,  4H),  4.22  -  4.16  (m,  1H),  3.94  -  3.85  (m,  2H),  3.81  (q,  J  =  7.0  Hz,  2H),  3.20  -  3.11  (m,  2H),  2.99  -  2.86  (m,  9H),  2.75  (dd,  J  =  15.3,  6.1  Hz,  2H),  2.16  -  1.90  (m,  20H),  1.44  (t,  J  =  6.9  Hz,  3H),  1.23  (t,  J  =  7.2  Hz,  3H);  MS  (ESI)  calculated  for  C55H70N4O13S4  (M+5H)2+  561.2,  observed  561.4.
【０１５１】
【化４４】
2019524798.tif 000050
（８）：１ドラムバイアルに、デュオカルマイシンＤＭ（１．０ｍｇ、０．００１７ｍｍｏｌ）およびＭｅＣＮ（０．１５ｍＬ）を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（０．９μＬ、０．００５ｍｍｏｌ）、および４−ニトロフェニル−クロロホルマート（０．７０ｍｇ、０．００３５ｍｍｏｌ）を含むＭｅＣＮ（０．１ｍＬ）の溶液を連続的に添加した。透明な淡黄色溶液を室温で４０分間撹拌し、その後のＨＰＬＣで、混合カルボナート７への８０％変換が示された。別の容器中でジアミン５（２．５ｍｇ、０．００２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）にアルゴン下で溶解させ、これにジイソプロピルエチルアミン（１．２μＬ、０．００７０ｍｍｏｌ）を添加した。このＤＭＦ溶液を混合カルボナート７と合わせ、暗青色混合物を４０℃に６０分間加熱した。反応物を冷却し、Ｈ２Ｏ（７ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８ゴールドカラム、０→４０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、８（２．２ｍｇ、収率７７％）を綿毛様青色固体として得た。Ｃ８０Ｈ８６ＣｌＮ７Ｏ１７Ｓ４（Ｍ＋Ｈ）２−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値７９０．２、実測値７９０．３．
【０１５２】
【化４５】
2019524798.tif 000051
（９）：１ドラムバイアルに、デュオカルマイシンＤＭ（４．９ｍｇ、０．００８５ｍｍｏｌ）およびＭｅＣＮ（０．２ｍＬ）を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（３．７μＬ、０．０２１ｍｍｏｌ）、および４−ニトロフェニル−クロロホルマート（２．５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を含むＭｅＣＮ（０．２５ｍＬ）の溶液を連続的に添加した。透明な淡黄色溶液を室温で４０分間撹拌し、その後のＨＰＬＣで、混合カルボナート７への８０％変換が示された。別の容器中でジアミン６（６．７ｍｇ、０．００５６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）にアルゴン下で溶解させ、これにジイソプロピルエチルアミン（８．０μＬ、０．０４６ｍｍｏｌ）を添加した。このＤＭＦ溶液を混合カルボナート７と合わせ、暗青色混合物を６５℃に６０分間加熱した。反応物を冷却し、Ｈ２Ｏ（７ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８ゴールドカラム、０→３５％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、９（５．５ｍｇ、収率５９％）を綿毛様の青みがかった緑色固体として得た。Ｃ８２Ｈ９０ＣｌＮ７Ｏ１７Ｓ４（Ｍ＋Ｈ）２−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値８０４．３、実測値８０４．２.
【０１５３】
【化４６】
2019524798.tif 000052
（１１）：８（２．１ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）および１０（０．５ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）が入っている１ドラムバイアルに、水／ｔ−ブタノール混合物（１．０ｍＬ、３：１  ｖ／ｖ）を添加した。深青色溶液に、撹拌しながらアルゴンを１分間注入した。硫酸銅（０．０３ｍｇ、０．０００２ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．０２ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を、５ｍｇ／ｍＬのストック水溶液から添加した。反応物を２２℃で３０分間撹拌し、撹拌終了時点でＬＣ／ＭＳにより８の消費が示された。反応物を水（４ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相分取ＨＰＬＣ（５−９０％ＭｅＣＮ／０．１％（ＮＨ４）２ＣＯ３水溶液）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、１１（１．０ｍｇ、収率４０％）を綿毛様青色固体として得た。Ｃ９１Ｈ１０７ＣｌＮ１０Ｏ２３Ｓ４（Ｍ＋Ｈ）２−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値９３５．８、実測値９３６．１．
【０１５４】
【化４７】
2019524798.tif 000053
（１２）：９（５．５ｍｇ、０．００３３ｍｍｏｌ）および１０（１．３ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ）が入っている１ドラムバイアルに、水／ｔ−ブタノール混合物（１．２ｍＬ、１：１  ｖ／ｖ）を添加した。深青色溶液に、撹拌しながらアルゴンを１分間注入した。硫酸銅（０．０８ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．４５ｍｇ、０．００２３ｍｍｏｌ）を、５ｍｇ／ｍＬのストック水溶液から添加した。反応物を２２℃で３０分間撹拌し、撹拌終了時点でＬＣ／ＭＳにより９の消費が示された。反応物を水（４ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相分取ＨＰＬＣ（５−９０％ＭｅＣＮ／０．１％（ＮＨ４）２ＣＯ３水溶液）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥して、１２（３．５ｍｇ、収率５５％）を綿毛様青色固体として得た。Ｃ９３Ｈ１１１ＣｌＮ１０Ｏ２３Ｓ４（Ｍ＋Ｈ）２−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値９４９．８、実測値９５０．５．
【０１５５】
【化４８】
2019524798.tif 000054
（１３）：１ドラムバイアルに、１１（１．０ｍｇ、０．０００４６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（０．２ｍｇ、０．０００６ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）をバイアルに入れ、その後にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１μＬ、０．０００６ｍｍｏｌ）を入れた。深青色溶液を２２℃で３０分間撹拌し、撹拌終了時点でＬＣ／ＭＳにより１１の消費が示された。反応物を酢酸エチル（１．０ｍＬ）中に沈殿させた。微細懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、ペレットをジエチルエーテル（０．５ｍＬ）に再度懸濁させた。ジエチルエーテルを使用して手順を２回繰り返し、ペレットを真空下（０．１Ｔｏｒｒ未満）に１時間置いて、１３（０．９ｍｇ、収率８５％）を暗青色固体として得た。Ｃ９５Ｈ１１０ＣｌＮ１１Ｏ２５Ｓ４（Ｍ＋Ｈ）２−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値９８４．３、実測値９８４．４．
【０１５６】
【化４９】
2019524798.tif 000055
（１４）：１ドラムバイアルに、１２（２．０ｍｇ、０．００１０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（０．６ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）をバイアルに入れ、その後にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３μＬ、０．００２ｍｍｏｌ）を入れた。深青色溶液を２２℃で３０分間撹拌し、撹拌終了時点でＬＣ／ＭＳにより１２の消費が示された。反応物をジエチルエーテル（１．０ｍＬ）中に沈殿させた。微細懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを酢酸エチル（０．５ｍＬ）に再度懸濁させた。次に、ジエチルエーテルを使用して手順を２回繰り返し、ペレットを真空下（０．１Ｔｏｒｒ未満）に１時間置いて、１４（１．７ｍｇ、収率８２％）を暗青色固体として得た。Ｃ９７Ｈ１１４ＣｌＮ１１Ｏ２５Ｓ４（Ｍ＋Ｈ）２−のＭＳ（ＥＳＩ）計算値９９８．３、実測値９９８．４．
【０１５７】
実施例２
パニツムマブへのコンジュゲーションおよび特徴づけ
化合物１２および１４を、パニツムマブと１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８．５）中にて２２℃で１時間合わせて、ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭコンジュゲートおよびＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭコンジュゲートをそれぞれ得た（図５および６）。コンジュゲートを、ＰＤ１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムでのゲルクロマトグラフィおよび５０ｍＭ  ＰＢＳ中での４℃で１６時間の透析（交換１回）によって精製した。１〜４の標識度（ＤＯＬ；すなわち、１抗体あたりのＣＹ−薬物コンジュゲートの数）を得た。
【０１５８】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って、抗体コンジュゲートの純度を評価した。ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、５μｇのＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ３）、ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ３および４）、およびＰａｎ（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液および５０ｍＭ（ｐＨ７．４）ＰＢＳの１：４（ｖ／ｖ）溶液中）をロードし、非還元条件下、１×ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液中にて２００Ｖで３５分間泳動した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ染色済みタンパク質標準（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、分子量比較のために使用した。蛍光画像を、赤色ｅｐｉ光（６３０ｎｍ）励起を使用したＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および６７０ｎｍロングパス発光フィルターを使用して得た。曝露時間は３００秒であった。ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間染色し、白色透視（１秒の曝露時間）によって画像化した。図８は、ＤＯＬ３のＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（１）、ＤＯＬ４のＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（２）、ＤＯＬ３のＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（３）、Ｐａｎ（４）、および分子量標準（５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０１５９】
ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭコンジュゲートおよびＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭコンジュゲートを、安定性について評価した。両コンジュゲートは安定であったが、ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭは、７５時間にわたって暗所で、１．５分の１倍のより少ない薬物を放出した（図９）。
【０１６０】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞またはＭＣＦ−７細胞（２×１０４細胞／皿）を、＃１．５カバーガラスボトムディッシュ（Ｃｅｌｌｖｉｓ）上にプレートし、一晩接着させた。細胞を１μＭのＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）と氷上で１時間インキュベートし、培地を置換し、画像化した。あるいは、細胞をコンジュゲートと氷上で１時間インキュベートし、培地を置換し、３７℃で６時間または２４時間インキュベートし、画像化した。蛍光顕微鏡法を、プラン−フルオリート油浸対物レンズを使用したＥｖｏｓ  ＦＬ自動細胞画像化システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を倍率１００×で使用して行った。近赤外蛍光を、Ｃｙ７ＬＥＤライトキューブ（λｅｘ７１０±２０ｎｍ、λｅｍ７７５±２３ｎｍ）を使用して得た。ＩｍａｇｅＪを使用して画像処理を行った。図１０は、コンジュゲートはＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）細胞に結合したが、ＭＣＦ−７（ＥＧＦＲ−）細胞には結合しなかったことを示す。
【０１６１】
実施例３
細胞光分解および細胞傷害性
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ過剰発現）ヒト乳がん細胞株およびＭＣＦ−７（正常なＥＧＦＲ発現）ヒト乳がん細胞株を、ＮＣＩ  ＤＴＰ，ＤＣＴＤ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１１ｍＭ  Ｄ−グルコース、２４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢを補足したＲＰＭＩ中で培養した。ＭＣＦ−７を、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  Ｄ−グルコース、４４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢを補足したＤＭＥＭ中で培養した。両細胞株を、２０％Ｏ２および５％ＣＯ２雰囲気下にて３７℃で成長させた。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（０．９ｍＭ）を含むＰＢＳでのトリプシン処理後に適切な細胞数を毎週継代することによって、保存培養を、持続的な指数関数的成長の中で維持した。
【０１６２】
ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭは、６９０ｎｍに吸収極大を有すると判断した。メチル置換基のエチル基への置き換えにより約５０ｎｍのレッドシフトが引き起こされ、ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭは、７４０ｎｍに吸収極大を有すると判断した。
【０１６３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞またはＭＣＦ−７細胞を、９６ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）に播種し、一晩接着させた。初期播種密度は、アッセイ期間中に細胞が指数関数的成長の中で維持されることを確実にするような密度であった。連続投与アッセイのために、培地を、ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ３）、ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ３）、ＤｕｏＤＭ、またはＤＭＳＯを含む培地と置換した。細胞を、６９０ｎｍまたは７４０ｎｍのＬＥＤ（２０ｍＷ／ｃｍ２）による表示の線量の照射に曝露した、または暗所に保持した。照射時間を、以下の式にしたがって計算することができる。
【数１】
2019524798.tif 000056
【０１６４】
プレインキュベーションアッセイのために、培地を、試験化合物を含む培地と置換し、暗所にて３７℃で２４時間インキュベートし、培地を新鮮なインヒビターを含まない培地と置換し、上記のように照射した。３７℃で７２時間のインキュベーション後、５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳストック溶液由来の２０μＬのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去し、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加してＭＴＴホルマザンを可溶化し、マイクロプレートリーダーを使用して５５０ｎｍの吸光度を記録した。薬物効果を、ＤＭＳＯ（インヒビターなし）コントロールに対する細胞生存率（％）として表した。半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用した生存率（％）対濃度データのＳ字状曲線フィッティングから得た。全ての実験を４連で行い、エラーバーは標準偏差を表す。
【０１６５】
表２は、ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭまたはＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭの存在下でのＥＧＦＲ陽性細胞およびＥＧＦＲ陰性細胞の近赤外光依存性成長阻害を示す。
【表２】
2019524798.tif 000057
ａ光分解前に培地を交換した；ｂ３０Ｊ／ｃｍ２、６９０ｎｍ；ｃ平均ＩＣ５０値±標準偏差（ｎ＝４）；ｄ比−ｈν／＋ｈν
【０１６６】
図１１Ａ（６９０ｎｍ）および１１Ｂ（７４０ｎｍ）は、ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（各光照射量での第１のバー）またはＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（各光照射量での第２のバー）の常駐下での（すなわち、アッセイ中の培地交換なし）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の近赤外光依存性成長阻害に及ぼす光照射量および波長の影響を示す。両コンジュゲートのＤＯＬは３であった。５０％成長阻害を達成するために必要な光線量（light  dosage）（ｈν１／２（細胞生存率５０％を達成するために必要な光照射量））を、非線形カーブフィッティングによって計算した。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝４）を表す。ＣＹ（Ｍｅ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭについては、ｈν１／２は６９０ｎｍで１０．５±２．２Ｊ／ｃｍ２であり、７４０ｎｍで１７．０±３．５Ｊ／ｃｍ２であった。ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭについては、ｈν１／２は６９０ｎｍで８．０±２．５Ｊ／ｃｍ２であり、７４０ｎｍで４．４±２．６Ｊ／ｃｍ２であった。
【０１６７】
実施例４
生体内分布およびＩｎ  Ｖｉｖｏでの光分解
全てのｉｎ  ｖｉｖｏ手順を、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（１９９６），米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌにしたがって実施し、国立がん研究所／ＮＩＨ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。６〜８週齢の雌性ホモ接合体無胸腺ヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）から購入した。処置中、マウスをイソフルランで麻酔した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（６×１０６）を、各マウスの右背側に皮下注射した。細胞注射の８〜９日後に実験を行った。およそ５〜７ｍｍに到達した腫瘍を、研究のために選択した。
【０１６８】
生体内分布：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスの腹側および背側の蛍光連続画像を、尾静脈を経由する１００μｇのＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）のｉ．ｖ．注射前ならびに０、１、３、６、９、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間後に得た。８００ｎｍ蛍光チャネルを使用したＰｅａｒｌ  Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、画像を収集した。関心領域（ＲＯＩ）を、白色光を参照して蛍光画像上に配置して、腫瘍、肝臓、および左背側（すなわち、標的の反対側のバックグラウンド組織）の蛍光強度を測定した。Ｐｅａｒｌ  Ｃａｍソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、各ＲＯＩ内の平均蛍光強度を計算した。標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）を、以下の式を使用して計算した（ｎ＝５）。
【数２】
2019524798.tif 000058
【０１６９】
図１２Ａおよび１２Ｂは、時間の関数としてのＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）の生体内分布および腫瘍局在を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスの連続蛍光画像を、背側（１２Ａ）および腹側（１３Ｂ）から取得した。ｎ＝５。図１３Ａおよび１３Ｂは、注射後の時間の関数としての図１２Ａおよび１２Ｂ由来のマウスの腫瘍および肝臓の正規化された蛍光強度（１３Ａ）および標的対バックグラウンド比（１３Ｂ）のグラフである。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）を表す。さらなる研究（データ示さず）により、蛍光が標識度（すなわち、単一の抗体にコンジュゲートされたＣＹ（Ｅｔ）−ＤｕｏＤＭ部分の数）に比例すること、および、注射後少なくとも７日間は相違が持続することが証明された。
【０１７０】
ｉｎ  Ｖｉｖｏ近赤外照射：ＣＹ（Ｅｔ）−Ｐａｎ−ＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４、１００μｇ）を、尾静脈を経由してＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウス（ｎ＝５マウス／状態）にｉ．ｖ．投与した。注射から４日後に、腫瘍を、レーザーシステム（ＢＷＦ５−６９０−８−６００−０．３７；Ｂ＆Ｗ  Ｔｅｋ，Ｉｎｃ．）を使用して０、１０、２０  ３０、５０、および１００Ｊ／ｃｍ２照射量の６９０ｎｍ光（０．５Ｗ／ｃｍ２）に曝露した。第２のコホートを照射せずに維持した。腫瘍を表示の照射量に曝露した直後に、照射マウスおよび対応する非照射マウスの背側蛍光連続画像を、８００ｎｍ蛍光チャネルを使用したＰｅａｒｌ  Ｉｍａｇｅｒを使用して取得した。関心領域（ＲＯＩ）を腫瘍上に配置し、０Ｊ照射量点の強度を１００％に設定したＰｅａｒｌ  Ｃａｍソフトウェアを使用して平均蛍光強度を決定した。図１４および１５は、近赤外照射の関数としてのＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍の蛍光シグナルを示す。図１４は、ＣＹ（Ｅｔ）−ＰａｎＤｕｏＤＭ（ＤＯＬ４）の注射から４日後に６９０ｎｍ光の照射量の増加を伴う腫瘍の照射前および照射後のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスの連続蛍光画像である。照射コホート由来の画像を示す；非照射コホートは、０Ｊ／ｃｍ２照射量点に類似する；ｎ＝５。図１５は、０Ｊ／ｃｍ２照射量点と比較した近赤外光照射量の関数としての平均腫瘍蛍光強度を示すグラフである。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。各時点での第１のバーは、照射なしの蛍光である。各時点での第２のバーは、表示の光照射量後の蛍光である。図１４および１５は、コンジュゲートの腫瘍特異的局在および標的化照射の際の蛍光の喪失を明確に証明している。
【０１７１】
図１６は、腫瘍成長に及ぼすコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（６×１０６）を、マウスの右背側に皮下注射した。腫瘍担持マウスを、以下の処置のために無作為に抽出して３群（ｎ＝４〜５）に分けた：（１）処置なし（コントロール、
【化５０−１】
2019524798.tif 000059
）；（２、
【化５０−２】
2019524798.tif 000060
）１０μｇのＣＹ（Ｅｔ）−ＰａｎＤｕｏＤＭ  ＤＯＬ４  ｉ．ｖ．、４日目に１００Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光を施した；（３、
【化５０−３】
2019524798.tif 000061
）３０μｇのＣＹ（Ｅｔ）−ＰａｎＤｕｏＤＭ  ＤＯＬ４  ｉ．ｖ．、４日目に１００Ｊ／ｃｍ２のＮＩＲ光を施した。腫瘍成長は、コントロール群と比較して、３０μｇ  ｉ．ｖ．の照射群で有意に阻害された。
【０１７２】
実施例５
開示のコンジュゲートでの腫瘍の処置
腫瘍を有する被験体を処置のために同定し、選択する。被験体を、臨床所見に基づき、そして／または腫瘍の存在を証明するための試験を行うことによって選択することができる。
【０１７３】
式Ｉまたは式ＩＩのコンジュゲート、その薬学的に許容され得る塩、またはその薬学的組成物を臨床医によって治療に有効であると判断された用量で投与することによって被験体を処置する。コンジュゲートを、任意の適切な手段（例えば、非経口注射、静脈内注射、または皮下注射など）によって投与する。いくつかの例では、コンジュゲートを、腫瘍内に直接注射する。いくつかの例では、コンジュゲートの位置を、シアニンフルオロフォアの蛍光を誘起するのに適切な波長を有する光に曝露し、それにより、シアニンフルオロフォアを励起させ、コンジュゲートの蛍光を検出することによってモニタリングする。コンジュゲートの腫瘍への結合を可能にするのに十分な期間を経た後にモニタリングを実施することができる。
【０１７４】
投与したコンジュゲートは、その後に、被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によって照射され、それにより、コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出する。好都合なことに、被験体の標的化部分は、腫瘍に隣接する。コンジュゲートの腫瘍への結合を可能にするのに十分な期間を経た後に照射を実施することができる。例えば、コンジュゲートの投与から数時間後〜数日後（例えば、コンジュゲートの投与から１〜７日後など）に照射を実施することができる。いくつかの例では、薬物の放出を、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲートの蛍光放射の減少をモニタリングすることによって評価する。
【０１７５】
いくつかの例では、腫瘍の少なくとも一部を、近赤外光の標的化利用前に外科的に切除し、その後にコンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出させる。蛍光よって導かれる手術を使用して、組織切除の位置および範囲を決定する。
【０１７６】
いくつかの場合、被験体は腫瘍を有すると疑われ、腫瘍の存在を、被験体へのコンジュゲートの投与および疑われる腫瘍部位でのコンジュゲートの蛍光のモニタリングによって確認する。疑われる腫瘍部位でのコンジュゲートおよび蛍光の蓄積により、腫瘍が存在すると診断される。その後、投与されたコンジュゲートは、上記のように照射されて、コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から薬物を放出する。
【０１７７】
治療有効量の第２の剤を、コンジュゲートまたはその塩と共投与することができる。コンジュゲート（またはその塩）および第２の剤を、個別にまたは単一の組成物中で一緒に投与することができる。第２の剤を、同一の経路または異なる経路によって投与することができる。同時に投与する場合、コンジュゲート（またはその塩）および第２の剤を、単一の薬学的組成物中で組み合わせてもよく、２つの薬学的組成物として同時に投与してもよい。第２の剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管形成インヒビターであり得る。
【０１７８】
代表的な実施形態を、以下の番号をつけた項目に記載する。
【０１７９】
１．式Ｉ
【化５０−４】
2019524798.tif 000062
の化学構造を有するコンジュゲートまたはその薬学的に許容され得る塩であって、
式中、ｍは、１、２、３、４、または５であり；
各ｎは、独立して、１、２、または３であり；
Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルであり；Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルであり；Ｒ３は−Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−薬物であり、ここで、Ｌ１は存在しないかリンカー部分であり、Ｘ２はＯ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）であり；Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、
【化５１】
2019524798.tif 000063
（式中、ｙは１以上の整数である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、または−ＳＲｂであり、ここで、Ｒｂは標的剤、
【化５２】
2019524798.tif 000064
であり；Ｘ１は、Ｏ、Ｎ、またはＣＨ２であり；Ｇ１は、
【化５３】
2019524798.tif 000065
であり；Ｇ２は、
【化５４】
2019524798.tif 000066
であり；Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルであり；Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートであり；各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルであり；各Ａ環は、独立して、縮合されている６員の脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、アリール環、またはヘテロアリール環である、コンジュゲートまたはその薬学的に許容され得る塩。
【０１８０】
２．Ｒ１およびＲ４は、独立して、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−ＲＯＨ、−ＲＣＯＯＨ、または−ＲＣＦ３であり、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである、項目１に記載のコンジュゲート。
【０１８１】
３．Ｒ１およびＲ４は、独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨである、項目１に記載のコンジュゲート。
【０１８２】
４．Ｒ１およびＲ４は、エチルである、項目１に記載のコンジュゲート。
【０１８３】
５．Ａ環が、任意選択的に置換されたスルホナートで置換された縮合フェニル環である、項目１〜４のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【０１８４】
６．Ｇ１は
【化５５】
2019524798.tif 000067
であり、かつＧ２は
【化５６】
2019524798.tif 000068
であり；または
Ｇ１は
【化５７】
2019524798.tif 000069
であり、かつＧ２は
【化５８】
2019524798.tif 000070
であり；または
Ｇ１は
【化５９】
2019524798.tif 000071
であり、かつＧ２は
【化６０】
2019524798.tif 000072
であり、
ここで、各Ｙは同一であり、Ｒ６およびＲ７は同一であり、Ｒ８〜Ｒ１１およびＲ１６〜Ｒ１７は、Ｒ１２〜Ｒ１５およびＲ１８〜Ｒ１９とそれぞれ同一である、項目１〜５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１８５】
７．各ＹはＣ（ＣＨ３）２である、項目１〜６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１８６】
８．Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５である、項目１〜７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１８７】
９．Ｒ８〜Ｒ１９はＨである、項目１〜８のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１８８】
１０．式ＩＩ
【化６１】
2019524798.tif 000073
の構造を有する、項目１〜１０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１８９】
１１．Ｒ３は、
【化６２】
2019524798.tif 000074
であり、ここで、Ｒ２０〜Ｒ２７は、独立して、Ｈ、アルキル、−ＮＯ２、−ＮＲｅ２、−ＮＲｅ３、アルコキシ、またはスルホナートであり、ここで、各Ｒｅは、独立して、Ｈ、ハロ、またはアルキルである、項目１〜１０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９０】
１２．Ｒ２０〜Ｒ２５はＨである、項目１１に記載のコンジュゲート。
【０１９１】
１３．Ｒ３は、
【化６３】
2019524798.tif 000075
である、項目１〜１２のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９２】
１４．−Ｘ２−薬物は、
【化６４−１】
2019524798.tif 000076
【化６４−２】
2019524798.tif 000077
であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはアルキルスルホナートである、項目１〜１３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９３】
１５．Ｒ５は、
【化６５】
2019524798.tif 000078
であり、ここで、ｑおよびｒは、独立して、１、２、３、４、または５である、項目１〜１４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９４】
１６．Ｒ５は、
【化６６】
2019524798.tif 000079
であり、ここで、ｑおよびｒは、独立して、１、２、３、４、または５である、項目１〜１４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９５】
１７．Ｒｂは標的剤である、項目１〜１６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９６】
１８．Ｒｂは抗体である、項目１〜１７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９７】
１９．Ｒ５は−（ＣＨ２）ｘ−Ｌ２−Ｒａであり、ここで、ｘは１以上の整数であり、Ｌ２はリンカー部分であるかまたは存在せず、Ｒａは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｂ、または−ＳＲｂであり、ここで、Ｒｂは標的剤であり、前記コンジュゲートは、１つまたは複数の、Ｒｂに結合したさらなる部分をさらに含み、前記さらなる部分の各々は、独立して、式ＩＩＩ
【化６７】
2019524798.tif 000080
の化学構造を有し、
ここで、ｍ、ｎ、ｘ、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ１、Ｇ１、Ｇ２、およびＬ２は、項目１に定義のとおりであり、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｈ）−、または−Ｓ−である、項目１〜１８のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
【０１９８】
２０．Ｒｂは抗体であり、Ｒ３は
【化６８】
2019524798.tif 000081
であり、ここで、−Ｘ２−薬物は
【化６９】
2019524798.tif 000082
である、項目１〜１９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【０１９９】
２１．前記コンジュゲートは、
【化７０】
2019524798.tif 000083
であり、式中、Ｒ１およびＲ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり；Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）４ＳＯ３−または−（ＣＨ２）４Ｎ（ＣＨ３）３＋であり；Ｒｂは抗体である、項目１に記載のコンジュゲート。
【０２００】
２２．前記抗体は、パニツムマブまたはトラスツズマブである、項目２１に記載のコンジュゲート。
【０２０１】
２３．項目１〜２２のいずれか１つに記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物であって、Ｒｂは標的剤である、薬学的組成物。
【０２０２】
２４．式ＩＶ
【化７１】
2019524798.tif 000084
の構造を有する前駆体化合物またはその塩であって、
式中、ｍは、１、２、３、４、または５であり；各ｎは、独立して、１、２、または３であり；Ｒ１およびＲ４は、独立して、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、−ＲＯＨ、−ＲＣ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり、ここで、Ｒはアルキルであり；Ｒ２はＣ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、またはアリールであり、または（Ｒ２）ｍは、集合的に、フェニルであり；Ｘ１は、Ｏ、Ｎ、またはＣＨ２であり；
Ｇ１は、
【化７２】
2019524798.tif 000085
であり；Ｇ２は、
【化７３】
2019524798.tif 000086
であり；Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アルキルスルホナート、または置換アミノアルキルであり；Ｒ８〜Ｒ１９は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アルコキシ、またはアルキルスルホナートであり；各Ｙは、独立して、Ｃ（Ｒｄ）２、Ｓ、Ｏ、Ｓｅ、またはＮ（Ｒｄ）であり、ここで、各Ｒｄは、独立して、Ｈまたはアルキルであり；各Ａ環は、独立して、縮合されている６員の脂肪族環、ヘテロ脂肪族環、アリール環、またはヘテロアリール環であり；Ｒ２８は、水素または保護基であり；Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ≡ＣＨであり、ここで、ｕは、１、２、３、４、または５である、前駆体化合物またはその塩。
【０２０３】
２５．Ｒ２８は、水素である、項目２４に記載の前駆体化合物。
【０２０４】
２６．前記前駆体化合物は、
【化７４】
2019524798.tif 000087
であり、
式中、Ｒ１およびＲ４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、または−（ＣＨ２）２ＯＨであり；Ｒ６およびＲ７は、−（ＣＨ２）ｐＳＯ３−または−（ＣＨ２）ｐＮ（ＣＨ３）３＋であり、ここで、ｐは、１、２、３、４、または５である、項目２４に記載の前駆体化合物。
【０２０５】
２７．項目１〜２２のいずれか１つに記載のコンジュゲートを提供する工程であって、Ｒｂは標的剤である、工程；およびその後に、近赤外範囲の選択された波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用により前記コンジュゲートに照射して開裂反応を誘起し、前記コンジュゲートから薬物を放出させる、工程を含む、方法。
【０２０６】
２８．光の標的化利用により前記コンジュゲートに照射する工程が、波長が６５０〜９００ｎｍの光を生じるレーザーを前記コンジュゲートに照射することを含む、項目２７に記載の方法。
【０２０７】
２９．前記コンジュゲートの蛍光レベルをモニタリングする工程；および前記蛍光レベルが標的レベル未満に低下した場合に照射を停止する工程をさらに含む、項目２７または項目２８に記載の方法。
【０２０８】
３０．標的分子を含むか、または含むと疑われる生物試料を提供する工程；前記生物試料を前記コンジュゲートと接触させる工程であって、前記コンジュゲートの標的剤が前記標的分子を認識して、前記標的分子に結合することができる、工程；およびその後に、前記光の標的化利用により前記生物試料に照射する工程をさらに含む、項目２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
３１．前記薬物で処置することができる状態を有すると被験体を同定する工程；治療有効量の前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を前記被験体に投与する工程；およびその後に、前記被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する前記有効量の光の標的化利用によって前記コンジュゲートに照射し、それにより、前記コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から前記薬物を放出する工程をさらに含む、項目２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
３２．前記被験体が腫瘍を有し、前記被験体の前記標的化部分が腫瘍位置に隣接する領域を含む、項目３１に記載の方法。
【０２１１】
３３．治療有効量の前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を前記被験体に投与する前に、前記被験体から腫瘍の少なくとも一部を切除する工程をさらに含む、項目３２に記載の方法。
【０２１２】
３４．前述の標的化部分に利用された光の有効量が５〜２５０Ｊ／ｃｍ２である、項目３１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１３】
３５．前述の被験体が過去に状態の処置に失敗している、項目３１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
３６．項目１〜２２のいずれか１項に記載の治療有効量のコンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を、前記薬物で処置することができる状態を有すると疑われる被験体に投与する工程；その後に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する光量の前記被験体の標的化部分への標的化利用によって前記コンジュゲートに照射する工程であって、前記光量が、前記コンジュゲートの蛍光を生じさせるのに十分であるが、前記コンジュゲートの開裂を誘起し、前記コンジュゲートから前記薬物を放出させるには不十分である、工程；前記被験体の前記標的化部分中の前記コンジュゲートから任意の蛍光を検出する工程；およびその後に、蛍光が検出された場合に、近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の前記被験体の前記標的化部分への標的化利用によって前記コンジュゲートに照射し、それにより、前記コンジュゲートの少なくともいくつかの分子から前記薬物を放出する、工程を含む、方法。
【０２１５】
３７．前記状態が、前記薬物で処置することができる腫瘍であり、前記被験体の前記標的化部分が前記腫瘍部位を含み、前記方法が、治療有効量の前記コンジュゲートを投与する前に前記被験体から前記腫瘍の少なくとも一部を切除する工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
【０２１６】
３８．（ｉ）前記状態が前記薬物で処置することができる腫瘍であり、（ｉｉ）前記被験体の前記標的化部分が前記腫瘍部位を含み、（ｉｉｉ）前記被験体の前記標的化部分中に蛍光が検出され、前記方法が、前記被験体の前記標的化部分中の前記蛍光を検出した後に前記被験体から前記腫瘍の少なくとも一部を切除する工程；およびその後に、前記有効量の光の前記被験体の前記標的化部分への標的化利用によって前記コンジュゲートに照射する工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
【０２１７】
開示の発明の原理を適用することができる実施形態が多数存在する可能性を考慮して、例示の実施形態は本発明の好ましい例であることのみを目的とし、本発明の範囲を制限すると解釈されないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明の全てがこれらの特許請求の範囲の範囲および意図に帰属すると主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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