(57)【要約】本発明は、アルファコノトキシン（α-コノトキシン）ペプチドおよびそれらの調製法に関する。また、アルファコノトキシン（α-コノトキシン）ペプチドを含む薬学的組成物、ならびにニコチン性アセチルコリン受容体および/または電位開口型カルシウムチャネルと関連する適応症の治療または予防におけるそれらの使用も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチド：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7  SEQ ID NO: 1
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa3は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa2およびXaa7は、独立して選択されたアミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成し、
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【請求項２】
Xaa3が、セリン、グルタミン酸およびバリンから選択される、請求項1記載のペプチド。
【請求項３】
Xaa3がセリンである、以下の配列を含むかまたはそれからなる請求項1または請求項2記載のペプチド：
Xaa1 Xaa2 S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 1a
式中
Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Xaa6およびXaa7は、請求項1に定義される通りである。
【請求項４】
Xaa2が、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびオルニチンから選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
Xaa7が、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびオルニチンから選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項６】
Xaa2およびXaa7が、各々システインであり、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにその側鎖が一緒になってリンカーを形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項７】
リンカーがジスルフィド結合である、請求項6記載のペプチド。
【請求項８】
Xaa1が、グリシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在しない、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項９】
Xaa4が、セリン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸およびトレオニンから選択される、請求項1〜8のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１０】
Xaa5が、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１１】
Xaa6が、アルギニン、プロリン、およびアラニンから選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１２】
以下の配列を含むかまたはそれからなる、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド：
G C S S D P R C      SEQ ID NO: 4。
【請求項１３】
1つまたは複数の追加のアミノ酸をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１４】
以下の配列を含むかまたはそれからなる、請求項9記載のペプチド：
G G C S S Y P P C    SEQ ID NO: 29。
【請求項１５】
リンカーが、結合、ジスルフィドリンカー、アミドリンカー、チオエーテルリンカー、チオールリンカー、アシルチオリンカー、エステルリンカー、アルキルリンカー、アルケニルリンカーおよびアルキニルリンカーから選択される、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１６】
ペプチドのC末端がカルボキシル基もしくは第一級アミドであるか、または、C末端がリンカーによってN末端に連結されている、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１７】
ペプチドのC末端が第一級アミドである、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１８】
以下からなる群より選択される配列を含むかまたはそれからなる、請求項1記載のペプチド：
2019508419.tif 000027
2019508419.tif 000028
2019508419.tif 000029
。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドと、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む、組成物。
【請求項２０】
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらす方法であって、それを必要とする人に、請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項19記載の組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
ペプチドが、経口的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または直腸に投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらすのに使用するための、請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドおよび薬学的に許容し得る担体または希釈剤。
【請求項２３】
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらすための医薬の製造における、請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規アルファコノトキシン（α-コノトキシン）ペプチド、薬理学的ツールとしてのそれらの使用、ならびに、ニコチン性アセチルコリン受容体および/または電位開口型カルシウムチャネルの阻害が有益となり得る任意の適応症におけるそれらの使用、例えば、鎮痛をもたらすことにおける、オピエート鎮痛の増強における、薬物関連効果もしくは挙動の調節における、または神経障害性疼痛、内臓慢性疼痛もしくは炎症の処置における、それらの使用に関する。本発明はまた、これらのペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
コノトキシンペプチド（コノトキシン）は、典型的には、直線的に連続してつながっている10〜40アミノ酸を含有する。これらのペプチドは、多種多様なイオンチャネルまたは受容体を標的とすることによって神経伝達に干渉し、そして、魚、蠕虫または他の軟体動物の捕食者であるイモガイ（Conus）属の海生巻貝（イモガイ（cone snail））の毒液中に見いだされる。任意の単独のイモガイ（Conus）種由来の毒液は、100を超える異なるペプチドを含有し得る。
【０００３】
コノトキシンペプチドは、典型的には、2個またはそれを超えるジスルフィド結合をそれぞれ形成するように対になって結合した、4個またはそれを超えるシステイン残基を含有する。α-コノトキシンは、例えば、典型的には、4個の特徴的なシステイン置換を伴う10〜40アミノ酸、および、あるジスルフィド結合パターンを有する。そのジスルフィド結合パターンおよびシステイン残基の分布は、α-コノトキシンが、酸化的フォールディングの間に3個のジスルフィド異性体を潜在的に形成することができることを意味する（システイン残基1と3との間、およびシステイン残基2と4との間（CysI-CysIIIおよびCysII-CysIV）にジスルフィド結合を含む球状異性体；システイン残基1と4との間およびシステイン残基2と3との間（CysI-CysIVおよびCysII-CysIII）にジスルフィド結合を含むリボン異性体；ならびにシステイン残基1と2との間およびシステイン残基3と4との間（CysI-CysIIおよびCysIII-CysIV）にジスルフィド結合を含むビーズ異性体を含む）。α-コノトキシンのネイティブな形態は、典型的には、球状異性体である。
【０００４】
コノトキシンは、それらの公知の生理学的標的に基づいてクラスに分けられる。α-コノトキシンは、そのようなクラスの1つであり、これらのペプチドは、ニューロンまたは筋肉のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）アンタゴニストと認識されている。天然に存在するα-コノトキシンおよび合成変異体の両方を含む異なるα-コノトキシンの研究は、これらのペプチドが、ニコチン性アセチルコリン受容体以外にも、またはそれに加え、電位開口型カルシウムチャネル（VGCC）などの受容体を含む種々の受容体サブタイプに対して、様々な親和性および選択性を呈することを実証している。
【０００５】
VGCCのサブタイプについてのアルファベット順の命名法は、Ca2+電流のクラスの違いによって進化してきており、そして、これらは、3つの主要なファミリーと多数のサブタイプに分けられる。L型VGCCは、活性化のために強い脱分極を必要とし、かつ、筋肉および内分泌細胞（そこでこれらが収縮および分泌を開始させる）において記録される主要なCa2+電流である。また、N型、P/Q型およびR型VGCCも活性化のために強い脱分極を必要とするが、これらのサブタイプは大部分がニューロンにおいて見いだされ、そこで、これらは神経伝達を開始する。T型VGCCは、弱い脱分極によって活性化されかつ一過性であり、そして、これらは幅広い細胞タイプにおいて見いだされる。
【０００６】
VGCCは、大きな孔形成α1サブユニットを含むマルチサブユニット複合体である。異なるカルシウムチャネルα1サブユニットが、異なるサブタイプのVGCCにおいて見いだされる。特に、L型VGCCは、α1C、α1D、α1Fおよびα1S（Cav1.1〜1.4）サブユニットによって表される。P/Q型、N型およびR型VGCCは、それぞれ、α1A（Cav2.1）、α1B（Cav2.2）およびα1E（Cav2.3）サブユニットによって表される。T型VGCCは、α1G、α1Hおよびα1Iサブユニット（それぞれ、Cav3.1〜3.3）によって形成される。治療物質の開発において、P/Q型チャネルの遮断は死を導き得ると示唆されているので、P/Q型チャネルよりもN型VGCCに対する選択性が重要である。
【０００７】
ニコチン性アセチルコリン受容体活性に加えて、いくつかのα-コノトキシンは、N型および/またはR型VGCCに対して選択性を示す。例えば、α-コノトキシンVc1.1およびRgIAは、α9α10 nAChRサブタイプアンタゴニストとして、さらには、ガンマアミノ酪酸B受容体（GABAB受容体またはGABABRとも称される）を介したN型（Cav2.2）およびR型（Cav2.3）カルシウムチャネルの阻害剤として同定されている。GABAB受容体アゴニストは、神経障害性疼痛および慢性疼痛を軽減すると示されている。異なるサブタイプのVGCCに対して異なる結合プロファイルおよび親和性を示す新たなα-コノトキシンは、VGCCのサブタイプをさらに定義する上で有用であり得る。
【０００８】
研究ツールとしてのそれらの使用に加えて、N型またはR型カルシウムチャネルの活性を調節するα-コノトキシンは、治療薬として有用である。N型VGCCは、ニューロン興奮性および侵害受容伝達を調整する際に重要な役割を果たしており、かつ、急性および慢性の疼痛知覚の伝達に深く関与している。これらのチャネルは、慢性、内臓および神経障害性の疼痛の管理のための重要な薬物標的となり、新たな鎮痛剤の開発において調査されている。
【０００９】
疼痛知覚の伝達における関与およびそれらの強力な生物学的活性を考慮すると、コノトキシンは、薬理学的関心の対象である。上に述べた通り、N型またはR型カルシウムチャネルを標的とするα-コノトキシンは、鎮痛をもたらすことにおける、オピエート鎮痛の増強における、薬物関連効果もしくは挙動の調節における、または神経障害性疼痛、慢性疼痛、内臓痛、炎症、痙攣、およびアルコール依存の処置におけるなどの状態のための治療薬として有用であり得る。したがって、本発明の化合物は、ニコチン性アセチルコリン受容体、N型またはR型カルシウムチャネル、およびその組み合わせの阻害が有益となり得る任意の適応症において有用であり得る。
【００１０】
最近の研究は、いくつかのα-コノトキシン、例えばVc1.1、Vc1.2、RgIA、PeIAおよびAuIBが、Gタンパク質共役GABAB受容体を介して、N型カルシウムチャネル電流を調節することを示唆している。GABAB受容体は、中枢および末梢神経系に広く分布している。選択的GABAB受容体アゴニストであるバクロフェンは、痙縮、慢性疼痛、およびアルコール中毒症を含む種々の神経障害を処置するために使用されている。しかしながら、バクロフェンは、複数のGABAB受容体シグナル伝達経路のその無差別な活性化に起因して、多数の副作用を引き起こす。対照的に、ネイティブなα-コノトキシンVc1.1は、例えば、固有の電位非依存性GABAB受容体-Cav2.2シグナル伝達経路を活性化し、最終的にCav2.2チャネルを阻害する。このGABAB受容体偏向性シグナル伝達機序は、ネイティブなVc1.1の優れた選択性および鎮痛特性に寄与している可能性が高い。
【００１１】
したがって、α-コノトキシンによるGABAB受容体の選択的活性化およびその後のCav2.2（N型）カルシウムチャネルの阻害が、鎮痛特性を提供し、かつ/または調節し得ると考えられる。よって、新たなα-コノトキシンは、神経障害性疼痛、慢性疼痛、および内臓痛を含む種々の病態のための高度に選択的かつ/または特異的な治療薬としての潜在的有用性を有する。
【００１２】
さらに、アルファ7 nAChR（α7 nAChR）サブタイプは、統合失調症、双極性障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病、薬物依存、炎症を含む様々な神経疾患に関係している。α7 nAChRを標的とするα-コノトキシンもまた、1つまたは複数のこれらの病態の処置のための治療薬として有用であり得る。
【００１３】
N型VGCCを選択的に阻害する他のコノトキシン、例えばω-コノトキシンMVIIA（Prialt、SNX-111、Ziconotideとしても公知）は、癌、AIDSおよびニューロパシーと関連する重度の慢性疼痛の処置用に、世界中の多数の政府機関によって規制当局の承認を受けている。意義深いことに、MVIIAは、耐性を誘導することなく、そして、それはまた、もはやオピオイド薬に応答しない患者にも作用する。最近になって、経口で利用可能な環化形態のα-コノトキシンVc1.1も開発されている。
【００１４】
これらの進展にもかかわらず、現在利用可能な化合物の多くは、理想的な治療薬ではない。ペプチド系分子の薬物としての主な制限は、それらの比較的短い血漿内半減期である。ペプチドの急速なタンパク質分解は、多くのコノトキシンのインビボ有効性を低減し、臨床環境におけるそれらの適用を制限する。さらに、そのような化合物の合成は、簡単ではなく、しばしば複数の異性体を生じる。加えて、いくつかのコノトキシンに由来する治療薬は、起立性低血圧などの有害な副作用をもたらすことが知られている。N末端とC末端との間にアミド結合を形成する骨格環化が数種のコノトキシンに適用されている。様々なオリゴペプチドのN末端−C末端リンカーを含むそのような環式類似体は、薬理学的標的でのそれらの活性を犠牲にすることなく、模擬インビボ環境におけるタンパク質分解に対して改善された安定性を示した。
【００１５】
したがって、N型、R型VGCCおよび/またはα7 nAChRもしくはα9α10 nAChRサブタイプに対する選択性、好ましい結合、および/または可逆性の特徴のうちの1つまたは複数を有し、かつ/あるいは、N型、R型VGCCおよび/またはα7 nAChRもしくはα9α10 nAChRサブタイプに関連する病態の処置において有用であり得る、新たな治療物質に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【００１６】
概要
N型またはR型カルシウムチャネルの活性を調節するα-コノトキシンが治療薬として有用であり得ると認識される。いくつかのα-コノトキシン、例えばVc1.1、Vc1.2、RgIA、PeIAおよびAuIBは、GABAB受容体を介してCav2.2チャネルを阻害する。選択的GABAB受容体アゴニストであるバクロフェンは、種々の神経障害を処置するために使用されているが、多数の副作用を引き起こす。反対に、ネイティブなα-コノトキシンVc1.1は、例えば、固有の電位非依存性GABAB受容体-Cav2.2シグナル伝達経路を活性化し、バクロフェンなどの公知のGABAB受容体アゴニストと比較して優れた選択性および鎮痛特性を実証する。
【００１７】
本発明者等は、驚くべきことに、いくつかのα-コノトキシンの短縮型類似体が完全長ネイティブペプチドに匹敵し得る生物学的活性および効力を示すことができることを見いだした。さらに、α-コノトキシンのある特定の短縮型類似体は、上に挙げた欠陥の1つまたは複数に対処し得る。よって、新たなα-コノトキシンは、神経障害性疼痛、慢性疼痛、および内臓痛を含む種々の病態のための強力な特異的かつ/または選択的治療薬としての潜在的有用性を有する。
【００１８】
中でも特に関心が高いのは、ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害することに加えて電位非依存性GABAB受容体-Cav2.2シグナル伝達経路を活性化することが知られているα-コノトキシンの短縮型類似体、例えばα-コノトキシンVc1.1、Vc1.2、RgIA、PeIAおよびAuIBである。
【００１９】
したがって、第一の局面において、本発明は、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドを提供する：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 1
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa3は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa2およびXaa7は、各々独立して、アミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにその側鎖がリンカーを形成し、
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００２０】
種々の態様において、Xaa1〜Xaa7は、以下のうちの1つまたは複数の組み合わせから選択される：
Xaa1は、小型アミノ酸であるかまたは存在しない；
Xaa2は、小型アミノ酸、極性アミノ酸から選択され、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する；
Xaa3は、小型アミノ酸、極性アミノ酸、または非極性アミノ酸から選択される；
Xaa4は、小型アミノ酸または極性アミノ酸から選択される；
Xaa5は、小型アミノ酸または極性アミノ酸から選択される；
Xaa6は、小型アミノ酸または極性アミノ酸から選択される；および
Xaa7は、小型アミノ酸、または極性アミノ酸から選択され、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する。
【００２１】
いくつかの態様において、Xaa1〜Xaa7は、以下のうちの1つまたは複数の組み合わせから選択され得る：
Xaa1は、グリシン、アラニンであるかまたは存在しない；
Xaa2は、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、またはオルニチンであり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する；
Xaa3は、セリン、グルタミン酸またはバリンである；
Xaa4は、セリン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸およびトレオニンである；
Xaa5は、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンである；
Xaa6は、アルギニン、プロリン、またはアラニンである；および
Xaa7は、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、またはオルニチンであり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する。
【００２２】
いくつかの態様において、Xaa2およびXaa7は、各々システインであり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにシステイン残基の側鎖がリンカーを形成する。好ましい態様において、形成されるリンカーは、ジスルフィド結合である。
【００２３】
本発明のペプチドは、N型、R型VGCCおよび/またはα7 nAChRもしくはα9α10 nAChRサブタイプに関連する病態の処置において有用であり得る。本発明はまた、これらのペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【００２４】
任意の先行刊行物（またはそれから派生する情報）へのまたは公知である任意の事項への本明細書における言及は、その先行刊行物（またはそれから派生する情報）または公知の事項が、本明細書が関する試みの分野における共通の一般知識の一部をなすという承認または容認でもいかなる形態の示唆でもなく、またそのように解釈されるべきでもない。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などの変形物は、明言された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の包含を意図するが、任意の他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の排除を意図しないものと理解されよう。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語句「から本質的になる（consisting essentially of）」、および「から本質的になる（consists essentially of）」などの変形物は、列挙された要素が必須、すなわち、本発明の必要な要素であることを示すものと理解されよう。この語句は、本発明の特徴に実質的に影響を及ぼさない他の列挙されていない要素の存在を許容するが、定義される本発明の基礎的かつ新規な特徴に影響を及ぼすであろう追加の特定されていない要素は排除する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ラットDRGニューロン内のICaにおけるα-コノトキシンPn1.2、Pu1.2およびVc1.1の対応するネイティブな完全長ジスルフィド異性体の活性および/または物理化学的特性。ビーズ（青色）、球状（緑色）およびリボン（赤色）。各α-コノトキシン（1μM）の存在下でのICa振幅の平均相対ピーク（I/I対照）±SEMを示す。実験数は丸括弧内である。特異的GABABRアゴニストバクロフェン（bac、50μM、橙色）を陽性対照として使用した。点線は、α-コノトキシンの非存在下で記録される最大電流を表示する（対照）。
【図２】ラットおよびマウスDRGニューロン内のHVAカルシウム電流におけるPu1.2およびVc1.1の短縮型類似体の活性および/または物理化学的特性。（A）[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）の短縮型類似体の配列。ジスルフィド結合は、実線で表示される。星印は、アミド化されたC末端を表示し、セリンで置換されているシステインの位置に下線を引いている。（C）マウスDRGニューロン内のICa阻害のピークの平均I/I対照データ（±SEM）。ICaは、23.5±4%（1μM [Ser4]Pu1.2（1-9））、30.2±3.9%、31.6±4%および20.6±3.3%（それぞれ、1〜3μM、30nMおよび100pM [Ser3]Vc1.1（1-8））、または41.5±2.7%（50μMバクロフェン）阻害された。実験数は丸括弧内である。
【図３】(A）[Ser4]Pu1.2（1-9）は、健康なマウス由来の内臓の結腸侵害受容器を有意に阻害する。ベースラインと比較して、1000nMでの[Ser4]Pu1.2（1-9）は、結腸侵害受容器の機械的感受性を有意に低減した（*P<0.05、n=7 求心路、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、ボンフェローニのポストホック）。（B）[Ser3]Vc1.1（1-8）もまた、結腸侵害受容器の機械的感受性を低減し、1000nMの濃度で機械的応答の有意な低減が観察された（*P<0.05、n=9 求心路、一元配置分散分析、ボンフェローニのポストホック）。（C）マウスにおける結腸直腸拡張に対するVMRの代表的なトレーシング。上のパネルは、拡張シーケンスを示す（期間20秒、4分間隔）。ビヒクルおよび1000nM [Ser3]Vc1.1（1-8）後の対応するEMG記録を、それぞれ中央および下のパネルに図示する。結腸直腸拡張に対するVMRは、[Ser3]Vc1.1（1-8）によって著しく低減された。（D）[Ser3]Vc1.1（1-8）での結腸内処置は、健康な対照（HC）マウスにおいてVMRを60および80mmHgの拡張まで有意に低減した。データは、n=4/群についての対応するEMGシグナルの曲線下面積として表した。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）とそれに続くボンフェローニのポストホック検定；* p<0.05、*** p<0.001。
【図４】ラットDRGニューロン内のHVACCでの[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体の効力差。バクロフェン（bac）によるIBa阻害はウォッシュアウトに対して可逆的であるが、大部分の[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体はIBaを不可逆的に阻害することに留意されたい。A、1μMの[D5A]Vc1.1（1-8）（D5A）、[R7A]Vc1.1（1-8）（R7A）、[Ser3]Vc1.1（2-8）（Vc1.1（2-8））、Vc1.1（1-8）-アミド（c-（1-8）アミド））、および特異的GABAB受容体アゴニストバクロフェン（bac；50μM）存在下でのIBaピークの時間経過。バーは、ペプチドまたはバクロフェン適用の期間を表示する。0.066Hzでの電圧ステップによって、それぞれ保持電位-90mVから0または-9mVに内向きIBaが誘発された（上部挿入図）。ペプチドまたは50μMバクロフェンの非存在（対照）、および存在下で得られた重ね合わせた代表的なIBaトレース（挿入図）を、小文字で表示した時間で示す；点線は、ゼロ電流レベルを表示する。B、1μM [Ser3]Vc1.1（1-8）もしくは[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体、または50μMバクロフェンによるICa振幅の平均相対ピーク（I/I対照±SEM）の棒グラフの概説。実験数nは丸括弧内である。
【図５】神経障害性疼痛のためのラットモデルにおける代表的なペプチド[Ser3]Vc1.1（1-8）の投与。単回皮下（s.c.）ボーラス用量の[Ser3]Vc1.1（1-8）を、座骨神経の片側の慢性絞扼損傷（CCI）を有する雄のSprague-Dawleyラット（広く利用されている神経障害性疼痛のラットモデル）において、陽性対照（ガバペンチン）およびビヒクル（注射用滅菌水；WFI）に対して調べた。
【図６】神経障害性疼痛のためのラットモデルにおける代表的なペプチド [Ser3]Vc1.1（1-8）の投与。単回皮下（s.c.）ボーラス用量の[Ser3]Vc1.1（1-8）を、座骨神経の片側の慢性絞扼損傷（CCI）を有する雄のSprague-Dawleyラット（広く利用されている神経障害性疼痛のラットモデル）において、陽性対照（ガバペンチン）およびビヒクル（注射用滅菌水；WFI）に対して調べた。
【図７】3μMの種々の[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体とのインキュベーション後の、α7（青色）およびα9α10（橙色）nAChRでの相対的なアセチルコリン誘導性の電流振幅。
【図８】[Ser3]Vc1.1（1-8）のインビトロ安定性プロファイル；（A）ヒト血清中の[Ser3]Vc1.1（1-8）（緑色）の安定性；（B）模擬胃液（U.S.P.仕様に製造）中の[Ser3]Vc1.1（1-8）の安定性；および（C）模擬腸液（U.S.P.仕様に製造）中の[Ser3]Vc1.1（1-8）の安定性。注記：全ての実験を3回反復した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は、完全長ネイティブペプチドに匹敵する生物学的活性および/または効力を示す、Vc1.1の類似体を含むα-コノトキシンの短縮型類似体に関する。本発明のペプチドは、N型、R型VGCCおよび/またはα7 nAChRもしくはα9α10 nAChRサブタイプに関連する病態の処置において有用であり得る。本発明はまた、これらのペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【００２９】
上に記載した通り、本発明の第一の局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 1
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa3は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa2およびXaa7は、各々独立して、アミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにその側鎖がリンカーを形成し、
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００３０】
種々の態様において、Xaa1〜Xaa7は、以下のうちの1つまたは複数の組み合わせから選択される：
Xaa1は、小型アミノ酸であるかまたは存在しない；
Xaa2は、小型アミノ酸および極性アミノ酸から選択され、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する；
Xaa3は、小型アミノ酸、極性アミノ酸、および非極性アミノ酸から選択される；
Xaa4は、小型アミノ酸および極性アミノ酸から選択される；
Xaa5は、小型アミノ酸および極性アミノ酸から選択される；
Xaa6は、小型アミノ酸および極性アミノ酸から選択される；および
Xaa7は、小型アミノ酸および極性アミノ酸から選択され、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する。
【００３１】
いくつかの態様において、Xaa1〜Xaa7は、以下のうちの1つまたは複数の組み合わせから選択される：
Xaa1は、グリシン、アラニンであるかまたは存在しない；
Xaa2は、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、またはオルニチンであり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する；
Xaa3は、セリン、グルタミン酸またはバリンである；
Xaa4は、セリン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸およびトレオニンである；
Xaa5は、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンである；
Xaa6は、アルギニン、プロリン、またはアラニンである；および
Xaa7は、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、またはオルニチンであり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成する。
【００３２】
Xaa3がセリンである別の局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
Xaa1 Xaa2 S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 1a
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa2およびXaa7は、独立して選択されたアミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成し；
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００３３】
いくつかの態様において、Xaa2およびXaa7は、各々システインであり、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにその側鎖が一緒になってリンカーを形成する。好ましい態様において、リンカーは、ジスルフィド結合である。
【００３４】
用語「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においてそれらの最も広い意味で互換的に使用され、単離ペプチド、合成ペプチドまたは組換えペプチドを含む2つまたはそれ以上のアミノ酸のオリゴマーを指す。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在しない合成のアミノ酸（例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体）であるアミノ酸ポリマーにも、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを排除しない。対象のペプチドの可溶性形態が特に有用である。その定義には、例えば、アミノ酸の1つまたは複数の類似体を含有するペプチド（例えば、置換された連結を有する非天然アミノ酸またはペプチドを含む）が含まれる。
【００３５】
用語「アミノ酸」は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、アミノ基およびカルボン酸基を有する化合物を指し得る。本発明のペプチドに組み込まれるアミノ酸は、タンパク質構成または天然に存在するアミノ酸のD型またはL型であっても、非タンパク質構成または天然に存在しないアミノ酸のD型またはL型であってもよい。本明細書において言及される場合、その用語は、合成アミノ酸およびその類似体（塩、異性体、互変異性体、エステルおよびN-メチル化アミノ酸を含む）まで拡張される。
【００３６】
用語「選択的」および「選択性」は、本明細書において使用される場合、1つまたは複数の他のイオンチャネルサブタイプの有意な調節を呈することなく、関心対象のイオンチャネルサブタイプを調節する（例えば、活性化する）作用物質を指す。したがって、例として、α7 nAChRに選択的である作用物質は、1つまたは複数の他のサブタイプの調節に対して、約2倍、5倍、10倍、20倍、50倍を超えるまたは約100倍を超えるα7 nAChR選択性を示す。
【００３７】
天然に存在するタンパク質構成アミノ酸を、それらの3文字コードおよび1文字コードと一緒に表1に示す。L-アミノ酸は、大文字または大文字の頭文字を使用して言及されるが、D-アミノ酸は、小文字を使用して言及される。
【００３８】
特に断りのない限り、異なるアミノ酸を表すために単一文字コードが本明細書において使用される。天然に存在するタンパク質構成アミノ酸を、それらの3文字コードおよび1文字コードと一緒に表1に示す。L-アミノ酸は、大文字または大文字の頭文字を使用して言及されるが、D-アミノ酸は、小文字を使用して言及される。
【００３９】
（表１）通常アミノ酸のコード
2019508419.tif 000002
【００４０】
本発明において有用であるペプチドのアミノ酸配列は、ある特定の特徴またはサブクラスのアミノ酸の観点から定義され得る。アミノ酸残基は、一般に、酸性、塩基性、荷電、疎水性または中性/酸性残基を含む主要サブクラスへと細分類される。酸性残基は、典型的には、生理学的pHで負電荷を有し、グルタミン酸およびアスパラギン酸などの酸性側鎖を有するアミノ酸を含む。塩基性残基は、典型的には、生理学的pHで正電荷を有し、アルギニン、リシンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む。用語「荷電 残基」は、生理学的pHで荷電しているアミノ酸を包含し、したがって、酸性または塩基性のいずれかの側鎖を有するアミノ酸を含む。疎水性残基は、水性環境と反発する傾向があり、典型的には、ペプチドのコンフォメーションの内部の位置に見られる。そのようなアミノ酸は、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンなどの疎水性側鎖を含む。疎水性残基とは異なり、中性/極性残基は、典型的には、水溶液と反発することなく、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンなどの中性/極性側鎖を有するアミノ酸を含む。それらの構造的特性に応じて、アミノ酸残基は2つまたはそれ以上のクラスに分類され得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、このスキームに従った細分類を表2に提示する。アミノ酸残基を、残基の側鎖置換基に関する自明の分類である環式または非環式および芳香族または非芳香族として、また小型または大型として、さらに細分類することができる。
【００４１】
（表２）アミノ酸の細分類
2019508419.tif 000003
【００４２】
非天然または非タンパク質構成アミノ酸の例は、限定されないが、オルニチン、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸および2-チエニルアラニンの使用を含む。本明細書において企図される好適な非タンパク質構成または天然に存在しないアミノ酸の例を表3に示す。
【００４３】
（表３）非通常アミノ酸のコード
2019508419.tif 000004
2019508419.tif 000005
2019508419.tif 000006
【００４４】
特に指定のない限り、表3に列挙される非タンパク質構成または天然に存在しないアミノ酸は、L-立体配置である。しかしながら、対応するD-立体配置を有する非タンパク質構成または天然に存在しないアミノ酸の使用も想定される。
【００４５】
L-ペプチドは、L-アミノ酸およびD-アミノ酸から構築された3個の追加の対応する類似体配列を有し得ることが認められている：i）同じ配列であるがD-アミノ酸から構成され、鏡像立体配置を有する、D-エナンチオマーまたはインベルソ-ペプチド；L-アミノ酸の同じ配列からなるが逆の順序のレトロ-ペプチド；および逆配列のD-アミノ酸からなるレトロ-インベルソまたはD-レトロ-エナンチオマーペプチド。例えば、L-アミノ酸を含みかつ以下の配列を有するペプチドは、以下に概説の通りの3個の対応する類似体を有し得る。
G C S S D P R C      L-エナンチオマー
g c s s d p r c      D-エナンチオマーまたはインベルソ-ペプチド
C R P D S S C G      L-エナンチオマー レトロ-ペプチド
c r p d s s c g      D-レトロ-インベルソ-ペプチド
【００４６】
特に指定のない限り、本明細書において言及されるペプチドは、L-立体配置である。しかしながら、対応するD-エナンチオマーまたはインベルソ-ペプチド、L-エナンチオマー（enatiomer）レトロ-ペプチドおよびD-レトロ-インベルソ-ペプチドも想定される。
【００４７】
ジスルフィド結合は、コノトキシンの構造および機能の一次決定因子であるが、これらの結合は、インビボで容易に還元されて、生物活性を損ない得るジスルフィド異性化（または「シャッフリング」）を導く。ある態様において、本発明のペプチドは、2個のシステイン残基を有し得る。好ましくは、該ペプチドは、システイン残基を2個だけ有する。好ましい態様において、2個のシステイン残基の側鎖は、一緒になってジスルフィド結合を形成し得る。ジスルフィド結合を1個だけ含むSEQ ID No. 1または1aの短縮型ペプチドは、有利なことに、効果的かつ/または改善された合成、および唯一のジスルフィド異性体の生産を提供する。
【００４８】
したがって、Xaa3がセリンであり、そして、Xaa2およびXaa7が各々システインであり、その側鎖が一緒になってリンカーを形成する、本発明の別の局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
Xaa1 C S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 C      SEQ ID NO: 2
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００４９】
Xaa1がグリシンであり、Xaa3がセリンであり、そして、Xaa2およびXaa7が各々システインであり、その側鎖が一緒になってリンカーを形成する、本発明のさらなる局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
G C S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 C      SEQ ID NO: 3
式中
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００５０】
ペプチドがSEQ ID NO. 3のペプチドであるいくつかの態様において、Xaa4、Xaa5およびXaa6は、小型アミノ酸または極性アミノ酸から各々独立して選択される。いくつかの態様において、Xaa4は、セリン、アラニン、リシン、アスパラギン、トレオニン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択される。さらに他の態様において、Xaa5は、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択される。他の態様において、Xaa6は、アルギニン、プロリン、およびアラニンである。
【００５１】
SEQ ID NO: 3の代表的なペプチドは、限定されないが、以下を含む。
2019508419.tif 000007
【００５２】
Xaa2およびXaa7が各々システインであり、その側鎖が一緒になってリンカーを形成し、そして、Xaa3およびXaa4が各々セリンである、本発明の別の局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
Xaa1 C S S Xaa5 P Xaa6 C      SEQ ID NO: 17
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００５３】
ペプチドがSEQ ID NO. 17のペプチドであるいくつかの態様において、Xaa1は、小型アミノ酸であるかまたは存在せず、そして、Xaa5およびXaa6は、小型アミノ酸または極性アミノ酸から各々独立して選択される。いくつかの態様において、Xaa1は、グリシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在しない。他の態様において、Xaa5は、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択される。なおさらなる態様において、Xaa6は、アルギニン、プロリンおよびアラニンから選択される。
【００５４】
上に列挙した例に加えて、SEQ ID NO: 17の他の代表的なペプチドは、限定されないが、以下を含む。
2019508419.tif 000008
【００５５】
Xaa1がグリシンであり、そして、Xaa2およびXaa7が各々システインであり、その側鎖が一緒になってリンカーを形成し、そして、Xaa4がセリンである、本発明のさらなる局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
G C Xaa3 S Xaa5 P Xaa6 C      SEQ ID NO: 20
式中
Xaa3は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００５６】
ペプチドがSEQ ID NO. 20のペプチドであるいくつかの態様において、Xaa3は、小型アミノ酸、極性アミノ酸、または非極性アミノ酸から選択され、そして、Xaa5およびXaa6は、小型アミノ酸または極性アミノ酸から各々独立して選択される。いくつかの態様において、Xaa3は、セリン、グルタミン酸およびバリンから選択される。さらに他の態様において、Xaa5は、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択される。他の態様において、Xaa6は、アルギニン、プロリン、およびアラニンである。
【００５７】
上に列挙した例に加えて、SEQ ID NO: 20の他の代表的なペプチドは、限定されないが、以下を含む。
2019508419.tif 000009
【００５８】
別の局面において、2つまたはそれ以上のシステイン残基は、対になって結合してリンカーを形成するアミノ酸残基または官能基に置き換わっていてよい。リンカーは、任意の好適なリンカーであり得る。一態様において、リンカーは、ネイティブペプチド中の2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーであり得る。リンカーは、例えば、ネイティブペプチドと比較して改善されたまたは増強された安定性、物理化学的特性、生物学的または治療活性を提供し得る。リンカーは、ペプチド性リンカーおよび非ペプチド性リンカーを含む、当技術分野において公知の任意の適切なリンカーから選択され得る。
【００５９】
したがって、本発明の別の局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
Xaa1 Xaa2 S S Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 23
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa2およびXaa7は、アミノ酸残基から選択され、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成し；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【００６０】
いくつかの態様において、Xaa2およびXaa7は、各々システインであり、その側鎖が一緒になってリンカーを形成する。好ましい態様において、リンカーは、ジスルフィド結合である。
【００６１】
他の態様において、リンカーは、2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーであり、そのようなリンカーは、例えば、ペプチド骨格中の2個のアミノ酸を共有結合させる多価基を含み得る。特定の態様において、リンカーは、ペプチド骨格中の1つまたは複数のアミノ酸残基の官能性側鎖から少なくとも部分的に形成され得る。
【００６２】
用語「側鎖」または［官能性側鎖」は、通常の意味で使用され、アミノ酸上の側鎖を指し、そして、骨格は、太字の炭素が側鎖を持つ、構成要素
2019508419.tif 000010
（式中、x=1、2または3）を指す（側鎖は、プロリンの場合と同様に、アミノ窒素に連結され得る）。「アミノ酸」および「アミノ酸残基」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００６３】
ある態様において、該連結基または各連結基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、カルボシクリル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリールオキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリールオキシ、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、およびアリールヘテロアリールチオから選択される基の多価形態である。
【００６４】
ある態様において、該連結基または各連結基は、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、C5〜C18アリール、C1〜C12ヘテロアルキル、C3〜C18ヘテロアリール、C3〜C18カルボシクリル、C1〜C12ヘテロアルキル、C2〜C18ヘテロシクリル、C6〜C18アルキルアリール、C4〜C18アルキルヘテロアリール、C4〜C18アルキルカルボシクリル、およびC3〜C18アルキルヘテロシクリル、C1〜C18アルキルオキシ、C2〜C18アルケニルオキシ、C2〜C18アルキニルオキシ、アシル、アシルオキシ、C1〜C18アルキルチオ、C2〜C18アルケニルチオ、C2〜C18アルキニルチオ、C5〜C18アリールチオ、アシルチオ、スルホニル、スルホキシル、C1〜C18アルキルアミノ、C2〜C18アルケニルアミノ、C2〜C18アルキニルアミノ、C5〜C18アリールアミノ、およびアシルアミノから選択される基の多価形態である。
【００６５】
ある態様において、該連結基または各連結基は、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、C5〜C18アリール、C1〜C12ヘテロアルキル、C3〜C18ヘテロアリール、C3〜C18カルボシクリル、C1〜C12ヘテロアルキル、C2〜C18ヘテロシクリル、C6〜C18アルキルアリール、C4〜C18アルキルヘテロアリール、C4〜C18アルキルカルボシクリル、およびC3〜C18アルキルヘテロシクリル、C1〜C18アルキルオキシ、C2〜C18アルケニルオキシ、C2〜C18アルキニルオキシ、アシル、アシルオキシ、C1〜C18アルキルチオ、C2〜C18アルケニルチオ、C2〜C18アルキニルチオ、C5〜C18アリールチオ、アシルチオ、スルホニル、スルホキシル、C1〜C18アルキルアミノ、C2〜C18アルケニルアミノ、C2〜C18アルキニルアミノ、C5〜C18アリールアミノ、およびアシルアミノから選択される基の多価形態である。
【００６６】
本明細書全体を通して使用されているような用語「場合により置換されている」は、該基が1つまたは複数の水素以外の置換基でさらに置換または縮合（縮合多環式系を形成するように）されていてもされていなくてもよいことを表す。ある特定の態様において、置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アシル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキルヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアミノ、シクロアルケニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アミノアリールアミノ、アミノヘテロアリールアミノ、アミノヘテロシクリルアミノ、テトラヒドロピリジニルアミノ、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、アゼチジニルアミノ、ピロリジニルアミノ、ピペリジニルアミノ、ピペラジニルアミノ、アゼチジニルカルボニルアミノ、ピロリジニルカルボニルアミノ、ピペリジニルカルボニルアミノ、ピペラジニルカルボニルアミノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、シクロアルコキシ、シクロアルケニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノアルコキシ、アミノアルケニルオキシ、アミノアルキニルオキシ、アミノシクロアルコキシ、アミノシクロアルケニルオキシ、アミノアリールオキシ、アミノヘテロアリールオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、またはピペラジニルオキシからなる群より独立して選択される1つまたは複数の基である。
【００６７】
「アシル」は、R-C(=O）-基を指し、式中、R基は、本明細書に定義される通りのアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール基であり得る。アシルの例は、アセチルおよびベンゾイルを含む。
【００６８】
基としてまたは基の一部としての「アルキル」は、特に断りのない限り、C1〜C18アルキルを含み、C1〜C8アルキルを含み、またC1〜C6アルキルを含む、直鎖または分岐の脂肪族炭化水素基を指す。
【００６９】
「アルキレン」は、1〜10個の炭素原子（1〜6個の炭素原子を含み、また1〜3個の炭素原子を含む）を有する二価アルキル基を指す。そのようなアルキレン基の例は、メチレン（-CH2-）、エチレン（-CH2CH2-）、およびプロピレン異性体（例えば、-CH2CH2CH2-および-CH(CH3）CH2-）などを含む。
【００７０】
「アルケニル」は、C2〜C10アルケニルを含み、C2〜C8アルケニルを含み、好ましくはC2〜C6アルケニルを含む、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含有しかつ直鎖または分岐であり得る、脂肪族炭化水素基を指す。該基は、その直鎖に複数の二重結合を含有してよく、そして、その各々の周囲の配向は独立してEまたはZである。例示的なアルケニル基は、限定されないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルおよびノネニルを含む。
【００７１】
「アルキニル」は、C2〜C10アルキニルを含み、C2〜C8アルキニルを含み、C2〜C6アルキニルを含む、炭素-炭素三重結合を含有しかつ直鎖または分岐であり得る、脂肪族炭化水素基を指す。
【００７２】
基としてまたは基の一部としての「アルコキシ」は、アルキル-O-基を指し、式中、アルキルは、本明細書に定義される通りである。ある態様において、アルコキシは、C1〜C10アルコキシである。例は、限定されないが、メトキシおよびエトキシを含む。
【００７３】
「アリール」は、6〜14個の炭素原子を含む、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合した環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する不飽和の芳香族炭素環式基を指す。アリール基の例は、フェニル、ナフチルなどを含む。
【００７４】
「アリールオキシ」は、アリール-O-基を指し、式中、アリールは、本明細書に定義される通りである。ある態様において、アリールオキシは、C6〜C10アリールオキシである。
【００７５】
「シクロアルキル」は、特に指定のない限り、1環当たり3〜10個の炭素を含む、飽和の単環式または縮合またはスピロ多環式炭素環、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを指す。それは、シクロプロピルおよびシクロヘキシルなどの単環式系、デカリンなどの二環式系、ならびにアダマンタンなどの多環式系を含む。
【００７６】
「シクロアルケニル」は、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含有しかつ1環当たり5〜10個の炭素原子を含む、非芳香族の単環式または多環式環系を指す。例示的な単環式シクロアルケニル環は、シクロペンテニル、シクロヘキセニルまたはシクロヘプテニルを含む。
【００７７】
「シクロアルコキシ」は、シクロアルキル-O-基を指し、式中、シクロアルキルは、本明細書に定義される通りである。ある態様において、シクロアルコキシは、C3〜C10シクロアルコキシである。例は、限定されないが、シクロプロパノキシおよびシクロブタノキシを含む。
【００７８】
基としてまたは基の一部としての「ヘテロアルキル」は、特に断りのない限り、C1〜C10ヘテロアルキルを含み、C1〜C8ヘテロアルキルを含み、C1〜C6ヘテロアルキルを含む、直鎖または分岐の脂肪族炭化水素基を指し、ここで、脂肪族鎖中の1つまたは複数の炭素は、S、O、PおよびNから選択されるヘテロ原子に置き換わっている。例示的なヘテロアルキルは、アルキルエーテル、第二級および第三級アルキルアミン、アミド、アルキルスルフィドなどを含む。
【００７９】
「ヘテロアルケニル」は、C2〜C10アルケニルを含み、C2〜C8ヘテロアルケニルを含み、C2〜C6ヘテロアルケニルを含む、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含有しかつ直鎖または分岐であり得る、脂肪族炭化水素基を指し、ここで、脂肪族鎖中の1つまたは複数の炭素は、S、O、PおよびNから選択されるヘテロ原子に置き換わっている。該基は、その直鎖に複数の二重結合を含有してよく、そして、その各々の周囲の配向は独立してEまたはZである。例示的なアルケニル基は、限定されないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルおよびノネニルを含む。
【００８０】
「ヘテロアルキニル」は、C2〜C10ヘテロアルキニルを含み、C2〜C8ヘテロアルキニルを含み、C2〜C6ヘテロアルキニルを含む、炭素-炭素三重結合を含有しかつ直鎖または分岐であり得る、脂肪族炭化水素基を指し、ここで、脂肪族鎖中の1つまたは複数の炭素は、S、O、PおよびNから選択されるヘテロ原子に置き換わっている。
【００８１】
「ヘテロアリール」は、単独または基の一部のいずれかで、芳香環中の環原子として1つまたは複数のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素原子である、芳香環（5、6、9、10または11員芳香環を含む）を含有する基を指す。好適なヘテロ原子は、窒素、酸素および硫黄を含む。ヘテロアリール基の例は、トリアゾール、チオフェン、フラン、イソインドリジン、キサントレン、フェノキサチン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、テトラゾール、インドール、イソインドール、1H-インダゾール、プリン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、シンノリン、カルバゾール、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、オキサゾール、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジン、2-、3-または4-ピリジル、2-、3-、4-、5-、または8-キノリル、1-、3-、4-、または5-イソキノリニル、1-、2-、または3-インドリル、および2-、または3-チエニルを含み、かつ、ベンゾ縮合ヘテロアリール、例えばベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、およびナフト[2,3-b]チオフェンを含む。
【００８２】
「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、少なくとも1個の環中に窒素、硫黄、酸素から選択される少なくとも1個のヘテロ原子（1〜3個のヘテロ原子を含む）を含有する、飽和の単環式、二環式、または多環式環を指す。各環は、3〜11員環を含み、4〜7員環および9〜11員環を含む。好適なヘテロシクリル置換基の例は、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チイスタニル（thistanyl）、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロチオフラニル、ピペリジニル、チアゾリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、モルホリノ、チオモルホリニル、1,3-ジアザパン、1,4-ジアザパン、1,4-オキサゼパン、および1,4-オキサチアパン（oxathiapane）を含み、かつ、ベンゾ縮合化合物、例えばインジニル（inddinyl）、イソインドリニル、オキソイソインドリニル、イソキノリニル、およびキノリニルを含む。
【００８３】
用語「ジカルバ」、「ジカルバ結合」または「ジカルバリンカー」は、互換的に使用され、かつ、側鎖二重結合を共に有する2個のアミノ酸残基が互いに反応して、各側鎖由来の炭素原子間に共有結合を生じ、-CH=CH-または-CH2-CH2-結合を形成することを指す。特定の態様において、閉環メタセシスによって共有結合が形成されて、-CH=CH-結合を形成し、次いでこれが場合により還元されて、単結合-CH2-CH2-を提供し得る。
【００８４】
ある態様において、該連結基または各連結基は、結合、ジスルフィドリンカー、アミドリンカー、チオエーテルリンカー、チオールリンカー、アシルチオリンカー、エステルリンカー、アルキルリンカー、アルケニルリンカーおよびアルキニルリンカーから選択される基の多価形態である。
【００８５】
リンカーが2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーである一態様において、リンカーは、アミド部分を含み得る。例えば、1つまたは複数のシステイン残基が、ジスルフィド結合の構造を模倣するアミド結合を含むループを形成するアミノ酸残基に置き換わり得る。したがって、ある態様において、Xaa2およびXaa7は、カルボキシル基またはアミノ基を有する官能基側鎖を含むアミノ酸残基から独立して選択される。一態様において、Xaa2がアミノ基を含む官能基側鎖を有するとき、Xaa7は、カルボキシル基を含む官能基側鎖を有するだろう。さらに別の態様において、Xaa2およびXaa7は、逆の官能性側鎖を含み得る。例えば、Xaa2は、カルボキシル基を含む官能基側鎖を含み得、そして、Xaa7は、カルボキシル基を含む官能基側鎖を含み得る。一緒になったとき、Xaa2およびXaa7は、2個のシステイン残基間のジスルフィド結合を模倣するアミドを含むループまたは結合を形成し得る。
【００８６】
一態様において、Xaa2が、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選択されるとき、Xaa7は、リシン、ヒスタジン（histadine）、オルニチン、およびジアミノ酪酸から選択され得る。さらに他の態様において、Xaa2が、リシン、ヒスタジン、オルニチン、およびジアミノ酪酸から選択されるとき、Xaa7は、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選択され得る。
【００８７】
したがって、SEQ ID No. 23のペプチドにおいてXaa2がグルタミン酸であり、そして、Xaa7がリシンであるとき、以下の配列を含むかまたはそれからなる、Vc1.1（1-8）アミド 8員と表されるペプチドが提供される：
G E S S D P R K      SEQ ID NO: 24
式中、グルタミン酸およびリシン残基Xaa2およびXaa7の側鎖は、一緒になってアミドリンカーを形成する。
【００８８】
さらに、SEQ ID No. 23のペプチドにおいてXaa2がアスパラギン酸であり、そして、Xaa7がリシンであるとき、以下の配列を含むかまたはそれからなる、Vc1.1（1-8）アミド 7員と表されるペプチドが提供される：
G D S S D P R K      SEQ ID NO: 25
式中、アスパラギン酸およびリシン残基Xaa2およびXaa7の側鎖は、一緒になってアミドリンカーを形成する。
【００８９】
さらに、SEQ ID No. 23のペプチドにおいてXaa2がアスパラギン酸であり、そして、Xaa7がオルニチンであるとき、以下の配列を含むかまたはそれからなる、Vc1.1（1-8）アミド 6員と表されるペプチドが提供される：
G D S S D P R X      SEQ ID NO: 26
式中、アスパラギン酸およびオルニチン残基Xaa2およびXaa7の側鎖は、一緒になってアミドリンカーを形成する。SEQ ID NO: 26中のXは、オルニチンを表すことに注意。
【００９０】
リンカーが2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーである別の態様において、リンカーは、アシルリンカーを含み得る。アシルリンカーは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって形成され得る。
【００９１】
リンカーが2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーである一態様において、リンカーは、アシルチオリンカーを含み得る。例えば、Xaa2およびXaa7が、各々システインであり、そして、システイン残基がアセトンリンカーなどのアシル基によって一緒に連結されるとき、以下の式を含むかまたはそれからなる、Vc1.1（1-8）DCAと表されるペプチドが提供される。
2019508419.tif 000011
【００９２】
リンカーが2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーを含む別の態様において、リンカーは、ヘテロアルキルリンカーを含み得る。ヘテロアルキルリンカーは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって形成され得る。一態様において、ヘテロアルキルリンカーは、アルキルエーテルまたはアルキルチオエーテルである。
【００９３】
例えば、Xaa2がシステインであり、そして、Xaa7がアラニンであるとき、かつ、官能性側鎖が一緒になってアルキルチオエーテルを形成する場合、以下の配列を含むかまたはそれからなる、Vc1.1（1-8）チオエーテル（1）と表される単離ペプチド、合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたはその誘導体が提供される。
G C S S D P R A      SEQ ID NO: 27
【００９４】
あるいは、Xaa2がアラニンであり、そして、Xaa7がシステインであり、かつ、官能性側鎖が一緒になってアルキルチオエーテルを形成する場合、以下の配列を含むかまたはそれからなる、Vc1.1（1-8）チオエーテル（2）と表される単離ペプチド、合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたはその誘導体が提供される。
G A S S D P R C      SEQ ID NO: 28
【００９５】
別の態様において、1つまたは複数のシステイン残基は、セレノシステインで置き換わっていてよい。この態様において、システインのスルフヒドリル（sulphydryl）基は、セレン等価体で置き換わっている。ペプチド鎖中の2個のセレノシステイン残基の存在は、ジスルフィド結合に類似するジセレニド結合の形成を可能にする。ジスルフィドおよびジセレニドは共に、類似の結合幾何学を示し、ジセレニドは、セレン原子のより大きなサイズに起因してわずかに長い結合長を示す。
【００９６】
有利なことに、いくつかの態様において、本発明のペプチドは、メチオニンを含まなくてよい。メチオニン残基は酸化を起こし易く、その結果、純度の低下、および溶液中の活性または選択性の喪失をもたらし得る。これは、ポンプ装置のリザーバーから送達される製剤化されたペプチドの場合のように、ペプチドを長期間保存するという観点において、特定の問題を引き起こし得る。
【００９７】
化学的特性の違いがあるにもかかわらず、セレノシステインでのシステインの置換は、両方が非常に類似した物理的特性を示すので、ペプチドに導入することができる最も保存的な置換の1つに相当する。ペプチド鎖中の2個のセレノシステイン残基の存在は、ジスルフィド結合に類似するジセレニド結合の形成を可能にする。ジスルフィドおよびジセレニドは共に、類似の結合幾何学を示し、ジセレニドは、セレン原子のより大きなサイズに起因してわずかに長い結合長を示す。セレノシステインを調製する方法は、当業者に公知であろう。
【００９８】
リンカーが2個のシステイン残基間のジスルフィド結合の物理化学的構造および/または生物学的活性を模倣するリンカーである別の態様において、リンカーは、アルキルリンカー、アルケニルリンカーまたはアルキニルリンカーから選択され得る。リンカーがアルキルリンカー、アルケニルリンカーまたはアルキニルリンカーから選択される1つまたは複数の態様において、リンカーは、「ジカルバリンカー」または「ジカルバ結合」と称され得る。リンカーがジカルバリンカーであるいくつかの態様において、リンカーは、2つまたはそれ以上のアミノ酸の側鎖由来の炭素原子間に1つまたは複数の共有結合を含み、-CH=CH-または-CH2-CH2-結合を形成し得る。
【００９９】
リンカーがジカルバ結合であるいくつかの態様において、Xaa2およびXaa7は共にアリルグリシン残基であり、そして、ジカルバ結合は、アリル基の二重結合間の閉環メタセシスによって形成される二重結合である。
【０１００】
リンカーでのジスルフィドの置換は、本発明の化合物の特性に影響を及ぼし得る。例として、いくつかのリンカーは、細胞質ゾルなどの還元性環境中で増加した安定性を示し得る。多くの薬物の作用機序はしばしば還元性環境で生じるので、代替リンカーを形成するアミノ酸でのシステインの系統的置換は、増加した安定性をもたらし得る。
【０１０１】
別の局面において、非天然または非タンパク質構成アミノ酸を含むペプチドが提供される。一態様において、逆配列のD-アミノ酸からなるレトロ-インベルソまたはD-レトロ-エナンチオマーペプチドが提供される。例えば、L-アミノ酸を含むペプチドVc1.1（1-8）は、以下の配列を含むかまたはそれからなるD-レトロ-エナンチオマーを有し得る。
c r p d s s c g      D-レトロ-インベルソ-ペプチド
【０１０２】
1つまたは複数のアミノ酸または他の置換基が本発明のペプチドのN末端またはC末端に付加され得る。例えば、本発明のペプチドは、1つまたは複数の追加のアミノ酸がN末端およびC末端のいずれかまたは両方に付加されたより長い配列の一部を形成し得る。いくつかの態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、N末端に1つまたは複数の追加のアミノ酸を含む。一態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、N末端に追加のアミノ酸、例えば追加のグリシン残基を含む。該ペプチドがN末端に追加のグリシン残基を含み、そして、Xaa1がグリシンであり、Xaa2およびXaa7が各々システインであり、その側鎖が一緒になってリンカーを形成し、Xaa3およびXaa4が各々セリンであり、Xaa5がチロシンであり、そして、Xaa6がプロリンであるとき、以下の配列を含むかまたはそれからなる、[Ser4]Pu1.2（1-9）または[C4S]Pu1.2と表される単離ペプチド、合成ペプチドもしくは組換えペプチドまたはその誘導体が提供される。
G G C S S Y P P C      SEQ ID NO: 29
【０１０３】
他の態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、C末端に1つまたは複数の追加のアミノ酸を含む。一態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、C末端に1個の追加のアミノ酸、例えば、C末端に追加のアラニン、追加のトリプトファン、追加のアルギニン、追加のリシンまたは追加のアスパラギン酸残基を含む。さらに別の態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、C末端に2個の追加のアミノ酸、例えば追加のアルギニンおよび追加のチロシンを含む。さらなる態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、C末端に3個の追加のアミノ酸を含む。なお別の態様において、該ペプチドまたはその誘導体は、C末端に4個の追加のアミノ酸、例えば、C末端に追加のアスパラギン、チロシン、アスパラギン酸およびヒスチジン残基を含む。
【０１０４】
代表的な例は、限定されないが、以下を含む。
2019508419.tif 000012
【０１０５】
追加のアミノ酸を含む他のペプチドの例は、限定されないが、以下の式のうちの1個を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。
2019508419.tif 000013
【０１０６】
別の例では、種々の非ペプチド性置換基がN末端およびC末端のいずれかまたは両方に付加され得る。そのような追加の置換基は、必ずしも本発明のペプチドの主要標的に結合するまたはそれを妨害するとは限らないので、N末端およびC末端は、物理化学的特性を変更するように、任意の副作用を潜在的に低減するように、またはそうでなければ、例えば安定性を改善することによってペプチドの治療的使用を改善するように修飾され得る。一例では、N末端またはC末端での修飾は、膜透過または溶解性を改善し得る。
【０１０７】
一態様において、本発明のペプチドのC末端に第一級、第二級もしくは第三級アミドまたはエステルが存在し得る。該ペプチドは、C末端でアミド化されるかまたは遊離カルボキシル基を有する。さらなる態様において、該ペプチドは、C末端に第一級アミドまたは遊離カルボキシル基を含む。さらに他の態様において、該ペプチドは、C末端に第一級アミドを含む。
【０１０８】
同様に、置換アミンまたは置換アミドをN末端に有する化合物もまた、本発明の範囲内であると見なされる。さらなる態様において、該ペプチドのN末端は、第一級アミン、ピログルタミドまたはアセトアミドである。さらに他の態様において、該ペプチドのN末端は、第一級アミンである。
【０１０９】
一態様において、該ペプチドのC末端は第一級アミドであり、そして、N末端は非置換である。
【０１１０】
本発明のペプチドはまた、固体支持体に結合され得る。これは、該配列をN末端またはC末端のいずれかを介して支持体に連結することによって達成され得る。ペプチド性リンカーを含む種々のリンカーを使用して、該配列が固体支持体に連結され得る。
【０１１１】
さらなる態様において、コノトキシンペプチドのC末端は、N末端にさらに連結され得る。N末端およびC末端は、一般に連結部分を介して連結されるだろうが、いくつかの場合では、コノトキシンペプチドのN末端およびC末端を、そのような連結部分を必要とすることなく直接接続することが可能であり得る。連結部分は、存在するならば、環化によってアミド-環化ペプチド骨格がもたらされるようなペプチドリンカーであり得る。これらのペプチドは、遊離N末端またはC末端を有さないだろう。
【０１１２】
アミド-環化ペプチド骨格を含むペプチドの例は、限定されないが、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。
C S S D P R C S S D P R      SEQ ID NO: 37
G C S S D P R C T K S I P P      SEQ ID NO: 38
G G C S S D P R C F D      SEQ ID NO: 39
【０１１３】
SEQ ID No. 37、38または39のペプチドのXaa2およびXaa7におけるシステインの側鎖が一緒になってジスルフィド結合を形成するある特定の態様において、それぞれのペプチドは、以下の式を有し得る。
2019508419.tif 000014
【０１１４】
この連結部分のペプチド配列の大幅な変動が可能である。この連結領域は、必ずしも本発明のペプチドの主要活性部位に結合するまたはそれを妨害するとは限らないので、連結領域を、生理化学的特性を変更するように、ペプチドの副作用を潜在的に低減するように、またはそうでなければ、例えば安定性を改善することによってペプチドの治療的使用を改善するように修飾することができる。
【０１１５】
連結部分は、必然的に、コノトキシンペプチドのN末端とC末端との間の距離にわたるのに十分な長さであろう。ペプチドリンカーの場合、その長さは、一般に、2〜10アミノ酸のオーダーであろう。いくつかの場合には、より長いまたはより短いペプチドリンカーが必要であり得る。一例では、連結部分は、線状ペプチド中に既に存在する任意のアミノ酸残基に加えてグリシンおよび/またはアラニン残基から構成され得る。
【０１１６】
それ故、本発明のペプチドの一態様によれば、該ペプチドのC末端は、カルボキシル基もしくは第一級アミドであるか、または、C末端はリンカーによってN末端に連結されている。
【０１１７】
本明細書に開示される化合物に関して、以下の（i）〜（vii）のうちの任意の1つまたは複数の組み合わせが企図される：
(i)  Xaa1は、グリシンであるか；または
Xaa1は、アラニンであるか；または
Xaa1は、存在しない。
(ii) Xaa2は、システインであるか；または
Xaa2は、アラニンであるか；または
Xaa2は、グルタミン酸であるか；または
Xaa2は、アスパラギン酸である。
(iii)Xaa3は、セリンであるか；または
Xaa3は、アスパラギン酸であるか；または
Xaa3は、バリンである。
(iv) Xaa4は、セリンであるか；または
Xaa4は、アラニンであるか；または
Xaa4は、リシンであるか、または
Xaa4は、アスパラギンであるか、または
Xaa4は、トレオニンであるか、または
Xaa4は、ヒスチジンであるか、または
Xaa4は、アルギニンである。
(v)  Xaa5は、アスパラギン酸であるか；または
Xaa5は、チロシンであるか；または
Xaa5は、アスパラギンであるか；または
Xaa5は、ヒスチジンある。
(vi) Xaa6は、アルギニンであるか；または
Xaa6は、プロリンであるか；または
Xaa6は、アラニンある。
(vii)Xaa7は、システインであるか；または
Xaa7は、アラニンであるか；または
Xaa7は、リシンであるか；または
Xaa7は、オルニチンある。
【０１１８】
本発明の化合物の代表的な例は、以下を含む。
2019508419.tif 000015
2019508419.tif 000016
2019508419.tif 000017
2019508419.tif 000018
注記：（*）は、アミド化されたC末端を表示する。
【０１１９】
本発明に係るペプチドは、塩の形態であり得る。本発明の化合物の塩は、好ましくは薬学的に許容し得るが、薬学的に許容し得ない塩もまた、薬学的に許容し得る塩の調製における中間体として有用であるかまたはプローブもしくはアッセイなどのいくつかの用途に有用であり得るので、本発明の範囲内に入ると認識されるだろう。
【０１２０】
薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩、塩基付加塩、薬学的に許容し得るエステルの塩ならびに第四級アミンおよびピリジニウムの塩を含む。酸付加塩は、本発明の化合物と、薬学的に許容し得る無機酸または有機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、クエン酸、マロン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、サリチル酸、スルファミン酸、または酒石酸を非限定的に含む）とから形成される。第四級アミンおよびピリジニウムの対イオンは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、クエン酸、酢酸、マロン酸、フマル酸、スルファミン酸、および酒石酸を含む。塩基付加塩は、限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどの塩を含む。塩は、公知の様式、例えば、該化合物を好適な溶媒の存在下で適切な酸または塩基で処理することによって作製され得る。
【０１２１】
本発明に係る有用なペプチドは、結晶形態および/または溶媒和物（例えば、水和物）の形態であってよく、そして、これらの形態の全てが本発明の範囲内であると意図される。用語「溶媒和物」は、溶質（本発明では、本発明の化合物）および溶媒によって形成される可変化学量論の複合体である。そのような溶媒は、溶質の生物学的活性に干渉すべきではない。溶媒和の方法は、一般に、当技術分野内で公知である。
【０１２２】
本発明の化合物は、薬剤として使用され得る。したがって、別の局面において、本発明は、本発明に係るペプチドと、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む組成物を提供する。
【０１２３】
当業者によって容易に認識される通り、投与経路および薬学的に許容し得る担体の性質は、処置されるべき病態の性質および哺乳動物に依存するだろう。当業者であれば特定の担体または送達系の選択、および投与経路を容易に決定できると考えられる。該ペプチド活性物を含有する任意の製剤の調製において、該ペプチドの活性がそのプロセスにおいて破壊されず、かつ、該ペプチドが破壊されることなくその作用部位に到達できることが確実になるように注意しなければならない。いくつかの状況では、例えばマイクロカプセル化などの当技術分野において公知の手段によって、該ペプチドを保護することが必要であり得る。同様に、選択される投与経路は、該ペプチドがその作用部位に到達するような投与経路であるべきである。
【０１２４】
いくつかの態様において、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドを含む組成物は、経口的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または直腸に投与され得る。
【０１２５】
注射用途に好適な薬学的形態は、滅菌注射用溶液または分散液、および滅菌注射用溶液の即時調製のための滅菌粉剤を含む。これらは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、かつ、還元または酸化、および細菌または真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。
【０１２６】
当業者は、慣用のアプローチを使用して、本発明のペプチドのための適切な製剤を容易に決定し得る。好ましいpH範囲および好適な賦形剤（例えば、酸化防止剤）の同定は、当技術分野においてルーチンである（例えば、Cleland et al, 1993を参照のこと）。所望の範囲のpH値を提供するために緩衝剤系がルーチンに使用され、これは、カルボン酸緩衝剤、例えば酢酸、クエン酸、乳酸およびコハク酸を含む。BHTまたはビタミンEなどのフェノール化合物、メチオニンまたは亜硫酸塩などの還元剤、およびEDTAなどの金属キレート剤を含む多種多様な酸化防止剤が、そのような製剤のために利用可能である。
【０１２７】
注射用溶液または分散液のための溶媒または分散媒体は、ペプチド活性物用の慣用の溶媒または担体系のいずれかを含有し得、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、必要に応じて、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの包含によってもたらすことができる。多くの場合、浸透圧を調整する作用物質、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。好ましくは、注射用製剤は、血液と等張である。注射用組成物の延長された吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。注射用途に好適な薬学的形態は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、脳内、髄腔内および硬膜外注射または注入を含む任意の適切な経路によって送達され得る。一態様において、該組成物は、腹腔内、皮下または静脈内投与、とりわけ腹腔内または皮下投与用である。
【０１２８】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙したような種々の他の成分と共に、適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒体と上に列挙した成分の中からの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに、種々の滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉剤の場合、好ましい調製法は、活性成分と任意の追加の所望の成分との予め滅菌濾過した溶液の真空乾燥または凍結乾燥である。
【０１２９】
他の薬学的形態は、活性ペプチドが不活性希釈剤で、または吸収され得る食用の担体で製剤化されていても、活性ペプチドが硬また軟外皮ゼラチンカプセル中に封入されていても、活性ペプチドが錠剤に圧縮されていても、活性ペプチドが食事療法の食物に直接組み込まれていてもよい、本発明の経口製剤および経腸製剤を含む。経口の治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠または舌下錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態で使用され得る。口腔錠および舌下錠などのこれらの経口製剤タイプのいくつかは、肝臓代謝を回避する可能性を有することが理解されよう。しかしながら、本発明のペプチドはまた、肝臓代謝が関わる可能性が高い胃にも送達され得る。そのような組成物および調製物は、好ましくは、少なくとも1%（重量）の活性化合物を含有する。組成物および調製物の百分率は、当然ながら変動してよく、かつ、都合よく単位の重量の約5〜約80%であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な投与量が得られるような量である。
【０１３０】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下に列挙される通りの成分を含有し得る：ガム、アラビアガム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料、あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香味料などの香味料を加えてもよい。単位剤形がカプセル剤であるとき、それは、上記タイプの材料に加えて、液体担体を含有し得る。コーティング剤としてまたはそうでなければ投与量単位の物理的形態を改変するために、種々の他の材料が存在し得る。例として、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、セラック、糖または両方でコーティングされ得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてスクロース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびにチェリーまたはオレンジ香味料などの香味料を含有し得る。当然ながら、任意の単位剤形の調製において使用される任意の材料は、薬学的に純粋で、かつ、採用される量で実質的に非毒性であるべきである。加えて、活性化合物は、消化管の特定領域への活性ペプチドの特異的送達を可能にするものを含む、持続放出性の調製物および製剤に組み込まれ得る。
【０１３１】
液体製剤はまた、胃または食道管を通って経腸的に投与され得る。
【０１３２】
経腸製剤は、乳化基材または水溶性基材などの適切な基材と混合することによって坐剤の形態で調製され得る。また、必ずしも必要ではないが、本発明のペプチドが局所、鼻腔内、膣内、眼内などに投与されることも可能である。
【０１３３】
本発明はまた、投与（例えば、クリーム剤、ローション剤およびジェル剤のような局所適用）に好適な任意の他の形態、または、吸入もしくは鼻腔内送達に好適な組成物（例えば液剤、乾燥粉剤、懸濁剤または乳剤）にまで及ぶ。本発明はまた、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、および脳内または硬膜外送達に好適なものを含む非経口剤形にまで及ぶ。
【０１３４】
本発明に係る有用なコノトキシンは、噴射剤、例えば二酸化炭素ガス、ジクロロジフルオロメタン、窒素、プロパンもしくは他の好適なガスまたはガスの組み合わせを含有する加圧式の噴射器（dispenser）または容器からのエアロゾルスプレーの形態の吸入によって投与され得る。該化合物はまた、噴霧器を使用して投与され得る。
【０１３５】
薬学的に許容し得るビヒクルおよび/または希釈剤は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質用のそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。慣用の媒体または作用物質が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。また、補助的な活性成分を組成物に組み込むことができる。
【０１３６】
投与の容易さおよび投与量の均一性のため、組成物を単位剤形で製剤化することがとりわけ有利である。単位剤形は、本明細書において使用される場合、処置されるべき哺乳動物対象用の単位投与量（unitary dosages）として適する物理的に分離した単位を指す；各単位は所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性材料を、必要な薬学的に許容し得るビヒクルと組み合わせて含有する。本発明の新規単位剤形の仕様は、（a）活性材料特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（b）本明細書において詳細に開示される身体上の健康が損なわれた疾患状態を有する生存している対象の疾患の処置のための活性材料を配合する技術における本来的な制限によって定められ、かつそれらに直接依存する。
【０１３７】
上に述べた通り、主要活性成分は、有効量での簡便で有効な投与のために好適な薬学的に許容し得るビヒクルと単位剤形で配合される。単位剤形は、例えば、主要活性化合物を0.25μg〜約2000mgの範囲の量で含有することができる。比率で表すと、活性化合物は、一般に、約0.25μg〜約2000mg/ml（担体）で存在する。補助的な活性成分を含有する組成物の場合では、投与量は、前記成分の通常の用量および投与様式を参照することによって決定される。
【０１３８】
本発明の別の局面において、N型またはR型カルシウムチャネルの活性の調節が有効な処置と関連する疾患または病態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に本発明のペプチドの有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【０１３９】
好ましくは、対象は、そのような処置を必要とする対象であるが、該ペプチドは、予防的意味で投与され得る。
【０１４０】
さらなる局面において、本発明は、N型またはR型カルシウムチャネルの阻害が有効な処置と関連する病態または疾患の処置のための医薬の製造における本発明のペプチドの使用を提供する。
【０１４１】
N型またはR型カルシウムチャネルの活性の調節が関連する疾患または病態は、虚血後のニューロン損傷の低減、鎮痛の提供、オピエート鎮痛の増強、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、痙攣、高血圧、炎症および気管支収縮を引き起こす疾患の処置、ならびに慢性および神経障害性疼痛の進行の阻害におけるなどの広範な病態および疾患を含む。また、N型およびR型VGCCが、神経障害性および炎症性疼痛と関連する痛覚過敏および異痛症を含む病態に関与することが見いだされている。さらに、N型またはR型VGCCの遮断は、急性、慢性、炎症性および神経障害性疼痛、内臓痛ならびに突出痛の処置において有用であり得る。
【０１４２】
アルファ7 nAChR（α7 nAChR）サブタイプは、統合失調症、双極性障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病、薬物依存、炎症を含む、様々な神経疾患に関係している。α7 nAChRを標的とする化合物は、1つまたは複数のこれらの病態の処置のための治療薬として有用であり得る。
【０１４３】
N型およびR型カルシウムチャネルの阻害と関連している他の病態は、過活動膀胱、薬物関連効果または挙動の調節、非炎症性消化管障害、および急性外傷性または急性虚血性イベントから生じる網膜または視神経頭損傷の予防または治療を含む。消化管障害は、例えば、裂孔ヘルニア、狭窄、食道膜、シャッキー輪、食道憩室、食道強皮症、食道の運動障害、例えば無弛緩症およびびまん性食道痙攣、ならびに過敏性腸症候群を含み得る。薬物関連効果もしくは挙動は、例えば、エタノール、カンナビノイド類およびオピオイド類からの作用、例えば刺激、鎮静、催眠および失調作用、そしてまた薬物報酬を含む。
【０１４４】
本発明の別の局面において、虚血後のニューロン損傷を低減するための、鎮痛をもたらすための、オピエート鎮痛の増強のための、薬物関連効果もしくは挙動の調節のための、または疼痛、統合失調症、刺激誘発性精神病、高血圧、炎症、過活動膀胱、非炎症性消化管障害、もしくは気管支収縮を引き起こす疾患の処置のための方法であって、それを必要とする対象に本発明のペプチドの有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【０１４５】
本発明はまた、虚血後のニューロン損傷を低減するための、鎮痛をもたらすための、オピエート鎮痛の増強のための、薬物関連効果もしくは挙動の調節のための、または疼痛、統合失調症、刺激誘発性精神病、高血圧、炎症、過活動膀胱、非炎症性消化管障害、もしくは気管支収縮を引き起こす疾患の処置のための医薬の製造における本発明のペプチドの使用を提供する。
【０１４６】
本発明の別の局面において、虚血後のニューロン損傷の処置、鎮痛の提供、オピエート鎮痛の増強、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、痙攣、高血圧、炎症および気管支収縮を引き起こす疾患の処置のための、ならびに、急性、慢性、炎症性および神経障害性疼痛、内臓痛ならびに突出痛、双極性障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病、または薬物依存の進行の阻害における方法であって、それを必要とする対象に本発明のペプチドの有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【０１４７】
本発明の別の局面において、慢性、内臓または神経障害性疼痛を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に本発明に係るペプチドの有効量を投与する工程を含む方法が提供される。さらなる局面において、本発明は、神経障害性疼痛、炎症性疼痛または突出痛の処置のための方法であって、それを必要とする対象に本発明に係るペプチドの有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１４８】
別の局面において、本発明は、慢性、内臓または神経障害性疼痛の処置のための医薬の製造における本発明に係るペプチドの使用を提供する。さらなる局面において、神経障害性疼痛、炎症性疼痛または突出痛の処置のための医薬の製造における本発明に係るペプチドの使用が提供される。
【０１４９】
本発明に係るペプチドは、対象に投与される唯一の活性成分であり得るが、前記ペプチドと共に他の活性成分を投与することも本発明の範囲内である。例えば、該ペプチドを、他のVGCCアゴニストまたはアンタゴニストを含む1つまたは複数の治療物質と共に投与することもできる。
【０１５０】
本発明の別の局面において、鎮痛を増強するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明に係るペプチドの有効量を、鎮痛活性を有する化合物の有効量と組み合わせて投与する工程を含む方法が提供される。さらなる局面において、鎮痛を増強するための医薬の製造における本発明に係るペプチドの使用であって、該ペプチドが鎮痛活性を有する化合物と共に投与するためのものである使用が提供される。
【０１５１】
鎮痛活性を有する好適な化合物は、モルヒネ、ガバペンチン、モノアミントランスポーター阻害剤、Cymbalta（登録商標）（デュロキセチン塩酸塩）または非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）を含む。
【０１５２】
本発明のペプチドは、経口、静脈内、脳室内、筋肉内、腹腔内、皮下、脳内、髄腔内および硬膜外投与、とりわけ静脈内、腹腔内および皮下投与を含む、任意の適切な経路によって投与され得る。
【０１５３】
一態様において、本発明のペプチドは、疼痛の処置において使用される。これは、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、慢性疼痛、内臓痛ならびに突出痛を含む。該ペプチドは、中枢神経系（例えば、経口、髄腔内、脳室内または脳内投与による）または末梢神経系（例えば、皮下、腹腔内または静脈内投与による）を標的とするために投与され得る。
【０１５４】
さらなる局面において、本発明は、N型またはR型カルシウムチャネルの活性を調節する方法であって、N型またはR型カルシウムチャネルと本発明に係るペプチドとを接触させる工程を含む方法を提供する。この方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。好ましい態様において、該方法は、インビトロで実施される。この方法は、限定されないが、化合物ライブラリーをスクリーニングしてN型またはR型カルシウムチャネルに結合する化合物を同定すること、N型またはR型カルシウムチャネルに結合する化合物の生物学的活性を決定するアッセイ、あるいはN型またはR型カルシウムチャネルの生理学または薬理学を調査する実験を含む。この方法はまた、ヒトなどの動物における病態または疾患の治療または予防をもたらし得る。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、N型またはR型カルシウムチャネルの調節は、N型またはR型カルシウムチャネルの選択的阻害、N型またはR型カルシウムチャネルのサブユニットの選択的阻害を含む。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、用語「N型VGCC」または「N型カルシウムチャネル」は、N型VGCCの任意のサブタイプまたはサブユニットを含む。該用語はまた、微生物および動物（ヒトを含む）において天然に見いだされるN型VGCCにも、また組換えおよび合成受容体にも関する。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、用語「R型VGCC」または「R型カルシウムチャネル」は、R型VGCCの任意のサブタイプまたはサブユニットを含む。該用語はまた、微生物および動物（ヒトを含む）において天然に見いだされるR型VGCCにも、また組換えおよび合成受容体にも関する。
【０１５８】
本発明に係るペプチドは、P/Q型VGCCよりもN型またはR型VGCCに対して選択性を有すると示されている。試験濃度で、本発明のペプチドは、L型およびT型VGCCを含む他の種類のVGCCでは効果を有さないと示されている。用語「選択的」および「選択性」は、本明細書において使用される場合、所与の濃度の該ペプチドについてのN型またはR型VGCCにおける結合活性が、典型的には、例えばP/Q型VGCCにおける結合活性よりも大きいことを意味する。当業者は、標準的な技術を使用してこれらのVGCCに対する該ペプチドの選択性を容易に決定できるだろう。
【０１５９】
本発明のペプチドはまた、N型またはR型VGCCにおいて異なるサブユニットが存在するとき、異なる結合および可逆性の特徴を発揮すると示されている。これは、異なる組織においておよび/または病態もしくは疾患状態において異なる活性を有する本発明のペプチドをもたらし、潜在的に処置においてより大きな選択性を可能にし得る。この理由は、N型またはR型VGCCの変異体が種々の組織において異なる発現レベルを示すことが示されており、また、N型またはR型VGCCのサブユニットが異なる病態または疾患状態においてアップレギュレーションされ得ることも示されているからである。例えば、β2aサブユニットを含むN型カルシウムチャネルは、脊柱上に位置すると考えられる。さらに、神経障害性疼痛の特徴が、後根神経節における、VGCCと関連するα2δ1サブユニットのアップレギュレーションであることも示されている。
【０１６０】
用語「可逆的」および「可逆的に」は、本明細書において使用される場合、N型またはR型VGCCの阻害の後に、N型またはR型VGCCがその阻害の前の状態に実質的に戻ることを意味する。当業者は、標準的な技術を使用してVGCCにおける本発明のペプチドの可逆性を容易に決定できるだろう。
【０１６１】
本発明はまた、所望の活性を有する化合物を同定するためのアッセイおよびスクリーニングにおける本発明のペプチドの使用まで及ぶ。そのようなアッセイおよびスクリーニングでは、本発明のペプチドは、標識されていなくても、放射性標識または蛍光標識を含んでいてもよい。
【０１６２】
一局面において、本発明は、電位開口型カルシウムチャネルの活性を調節する能力について化合物をアッセイする方法であって、a）N型またはR型カルシウムチャネルと本発明に係るペプチドとを該化合物の存在下で接触させる工程；およびb）該ペプチドとN型またはR型カルシウムチャネルとの間の相互作用を検出する工程を含み、結合の置換がN型またはR型カルシウムチャネルの活性を調節する化合物の指標となる、方法を提供する。
【０１６３】
用語「接触させる」は、前記コノトキシンペプチド、前記化合物および前記電位開口型カルシウムチャネルを溶液中で混合または組み合わせることを指す。これは、室温であっても、室温より低いまたは高い温度であってもよい。一態様において、溶液は、結合を促進するよう設計された緩衝溶液であり得る。溶液は、撹拌されてもされなくてもよい。溶液はまた、静的様式または連続灌流で適用され得る。
【０１６４】
本明細書において使用される場合、当業者が化合物とN型またはR型カルシウムチャネルとの間の相互作用を決定できるとき、該化合物は、該チャネルの活性を調節すると見なされる。この文脈において、「相互作用する（interact）」またはその変形物、例えば「相互作用する（interacting）」または「相互作用（interaction）」は、カルシウムチャネル結合部位における相互作用、アロステリック相互作用、そしてまたN型またはR型カルシウムチャネルの1つまたは複数のサブユニットにおける相互作用を含め、最も広い意味で使用される。好ましくは、この相互作用は、該受容体を阻害するのに十分であろう。
【０１６５】
したがって、別の局面において、本発明は、試験ペプチドまたは化合物のN型またはR型カルシウムチャネル結合活性を試験する方法であって、（1）前記試験ペプチドまたは化合物の非存在下でのN型カルシウムチャネルへの本発明に係るペプチドの結合レベルを決定する工程、（2）前記試験ペプチドまたは化合物の存在下でのN型またはR型カルシウムチャネルへの前記本発明のペプチドの結合レベルを決定する工程、および（3）工程（1）で決定されたレベルと工程（2）で決定されたレベルとを比較する工程を含む方法を提供する。
【０１６６】
さらなる局面において、本発明は、N型またはR型カルシウムチャネルに結合する化合物を同定するためのスクリーニングの方法であって、（1）試験化合物の非存在下でのN型またはR型カルシウムチャネルへの本発明に係るペプチドの結合レベルを決定する工程、（2）前記試験化合物の存在下でのN型またはR型カルシウムチャネルへの前記本発明のペプチドの結合レベルを決定する工程、および（3）工程（1）で決定されたレベルと工程（2）で決定されたレベルとを比較し、それによってN型またはR型カルシウムチャネルに結合する化合物を同定する工程を含む方法を提供する。
【０１６７】
これらの方法を通して、N型またはR型カルシウムチャネルの活性を調節する化合物を同定し、かつ/または、これらの化合物の活性を決定してよい。試験される化合物を、合成によって生産することも、生物学的プロセスを通して生産することもできる。化合物の混合物を試験してもよく、これは、例えば、粗イモガイ毒液またはその抽出物を試験することを含む。これらの化合物を、N型カルシウムチャネルを標的とする新たな薬剤として使用しても、それを開発するために使用してもよい。例えば、新たな薬剤は、新たなリード化合物を同定することを通して開発しても、本発明のペプチドとN型またはR型カルシウムチャネルとの間の結合相互作用を研究することを通して開発してもよい。
【０１６８】
N型またはR型カルシウムチャネルおよび/またはそのようなチャネルの特定のサブユニットと相互作用する化合物を同定するために、本発明のペプチドを、おそらく標識された形態、例えば放射標識された形態で使用して、アッセイおよび/またはスクリーニングを実行してよい。当業者は、そのようなアッセイおよび/またはスクリーニングを容易に確立できる。
【０１６９】
したがって、本発明のさらなる態様は、アミノ酸の少なくとも1個が放射標識を組み込んだ本発明のペプチドを提供する。放射標識は、例えば、125I、131I、14C、15N、35Sまたは3Hを含み得る。125Iが使用される場合、例えば、ヨウ素を、チロシンまたは別の適切な残基に結合させることもできる。そのような残基が存在しない場合、アミノ酸の組み込み/置換スキャンを実行して、そのような残基を組み込む/置換する好適な位置を確立することもできる。他の例では、該ペプチド内で、1つまたは複数の水素が125I、131Iまたは3Hで置き換わっていても；1つまたは複数の炭素が14Cで置き換わっていても；1つまたは複数の窒素が15Nで置き換わっていてもよい。標準的な方法によって本発明の化合物の多種多様な標識バージョンを容易に調製し、標準アッセイにおいてN型またはR型VGCCへのそれらの結合能力の保持を評価してよい。次いで、N型もしくはR型VGCCまたはそのようなチャネルの結合部分の活性を調節する能力を保持する化合物の標識バージョンを、アッセイおよび/またはスクリーニングにおいて使用することができる。
【０１７０】
放射性リガンド結合アッセイを、N型またはR型カルシウムチャネルおよび標識コノトキシンペプチドを使用して実施してよい。カルシウムチャネルを、標識ペプチドおよびN型またはR型カルシウムチャネルにおける活性について試験される化合物とインキュベートしてよい。一態様において、これらの成分は、公知の濃度の別々の溶液として使用するために調製される。結合が完了した後、カルシウムチャネルが、標識ペプチドおよび化合物から、例えば濾過を通して分離される。生じた結合の量が次いで決定され、かつ/または結合が次いで検出される。
【０１７１】
非特異的結合を、カルシウムチャネルと過剰な未標識コノトキシンペプチドとを標識ペプチドの存在下でインキュベートすることによって決定してよい。例えば、標識コノトキシンをアッセイで使用した場合、未標識コノトキシンを使用して非特異的結合が決定されよう。インキュベーション後、上記と同様にアッセイが実行される。各試験化合物についての特異的結合を計算するときに、全結合から非特異的結合が減算されるべきである。必要ならば、洗浄、濾過、振盪および撹拌などの他の工程を必要に応じてアッセイ手順に含めてもよい。通常、溶液中に残った化合物から膜結合化合物を分離した後に洗浄工程を含めることで、結合している化合物の量の定量（例えば、放射性同位体を計数するなどによる）が可能となる。特異的結合を、カルシウムチャネルが標識ペプチド単独の存在下でインキュベートされたときに得られた結合と比較することで、試験化合物が標識ペプチドと置き換わった程度が決定される。
【０１７２】
これらのアッセイを実施するときにアーティファクトを回避するよう注意すべきである。そのようなアーティファクトは、試験される化合物が、そうでないときも、カルシウムチャネルに結合していると見せる場合がある（逆もまた同様）。例えば、アッセイではカルシウムチャネルへの化合物の結合に影響を及ぼさない緩衝溶液が選択されるべきである。同様に、試験化合物の調製物は、タンパク質分解活性を有するべきではない。また、カルシウムチャネルに結合すると同定された化合物が、結果についてスキャチャード解析が可能となるのに十分な濃度範囲で検査されることが望ましい。このタイプの解析は、当技術分野において周知であり、コンピュータープログラムを使用して補助することができる。
【０１７３】
また、蛍光標識を本発明のペプチドに組み込んでもよい。蛍光標識化合物は、シアニン3（Cy3）、シアニン5（Cy5）、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン（BODIPY）、ニトロベンゾオキサジアゾール（NBD）、4-ニトロ-O-フェニレンジアミン（NPD）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、メチルローダミン、テトラメチルローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタアルデヒド（o-phthaldehyde）およびフルオレスカミンを含み得る。蛍光ストレプトアビジンをビオチンと共に使用してもよい。そのような蛍光標識は、本発明のペプチドのN末端またはC末端に組み込まれても、これらのペプチドの選択されたループに組み込まれてもよい。例えば、標識は、既存の化学的に反応性のアミノ酸を通して、該ペプチドとVGCCとの間の結合に実質的な有害作用を有さない位置に結合され得る。
【０１７４】
それ故、本発明のペプチドのさらなる態様によれば、該ペプチド中のアミノ酸の少なくとも1個は、放射標識または蛍光標識を組み込む。
【０１７５】
該方法はまた、電気生理学的研究、例えばパッチクランプ、細胞内記録および細胞外記録研究を含み得る（Purves 1991; Brock and Cunnane 1987; Smith and Cunnane 1997; Hamill et al., 1981）。そのような研究では、膜電位、全細胞および単一チャネル電流が測定され、神経末端からの神経伝達物質放出ならびにイオン電流および膜電位の変化についての情報が提供され得る。該研究は、以下の細胞に対して行うことができ、これは限定されないが、アフリカツメガエル卵細胞、培養ニューロン（例えば感覚ニューロン（例えば、後根神経節）、副交感神経ニューロン（例えば、顎下腺および心内膜神経節）、交感神経ニューロン（例えば、骨盤神経節）および中枢ニューロン）を含む。該研究はまた、全神経調製物、例えばCNSもしくは末梢神経節調製物、または末梢神経効果器組織（モルモットの輸精管、ラットの肛門尾骨筋（anococcygeus）、モルモットの回腸、ラットの膀胱、哺乳動物の結腸、哺乳動物の動脈、哺乳動物の心房およびラットの気管を非限定的に含む）に対して行うことができる。例えば、候補化合物が誘発した細胞中のカルシウム電流の変化を、細胞を電気的に刺激したときの対照と比較して測定してよい。
【０１７６】
VGCCは、実施されるアッセイまたはスクリーニングに好適な技術を使用して活性化され得る。細胞ベースのアッセイでは、これは、膜を脱分極することによって、例えば高濃度のカリウムイオンを適用することによってまたは膜に電流を通すことによって達成され得る。細胞を浸している生理学的塩溶液中の細胞外カリウム濃度を変化させることによって、細胞を脱分極させることができる。例えば、生理学的塩溶液中の正常なカリウム濃度は、4.0〜5.0mM（好ましくは、およそ4.5〜4.7mM）である。5mM超にカリウム濃度を増加すると、細胞の脱分極が開始する。20mM超〜150mMに濃度を増加すると、細胞が最も確実に脱分極し、150mMによって最大の脱分極が誘発される。臓器ベースのアッセイでは、電位依存性カルシウムチャネルを活性化するのに電場刺激が必要となるだろう（Smith and Cunnane 1997; Smith and Cunnane 1996）。
【０１７７】
候補化合物が誘発したカルシウムチャネル電流の変化を測定するとき、効果を観察するためにチャネルは刺激されなければならない。カルシウムチャネル電流の阻害を観察するのに刺激の周波数が重要である。例えば、2〜10秒間隔で2〜20Hzのパルスを約1〜20分間使用することができる。平滑筋細胞または節後神経または脳切片などの調製物からの組織浴研究ならびに細胞内および細胞外記録においてそのような周波数が使用されるだろう。刺激（脱分極パルス）の継続が短時間、低周波数に過ぎると、阻害は観察されない。一方で、刺激（脱分極パルス）の期間または周波数のいずれかが増加すると、カルシウムチャネル電流を阻害する効果は増強される。
【０１７８】
試験ペプチドまたは化合物の存在下でのカルシウムチャネル電流の遮断率は、激痛において生じ得るように刺激（脱分極パルス）の周波数が高くなると増加し得る。そのようなアッセイおよびスクリーニングを実行する上で、カルシウムチャネルの活性化の周波数は、好ましくは、0.1Hz以上であるべきである。VGCCの活性化の方法は、-80mVから0mVの脱分極電圧ステップを適用することによる。電圧ステップ（またはパルス）の期間および電圧ステップを適用する周波数は共に、試験ペプチドまたは化合物の存在下でのカルシウム電流の阻害（遮断）率に影響を及ぼし、それによって、期間または周波数のいずれかを増加すると、電位依存性ナトリウムチャネルの局所麻酔薬による使用依存性遮断と同じく、遮断率が増加する（Hile et al. 1975を参照のこと）。
【０１７９】
別の態様において、該方法は、組織または臓器浴研究を含んでもよい。神経が誘発した筋肉の収縮または弛緩をコノトキシンペプチドの存在下または非存在下で測定して、コノトキシンが組織の収縮または弛緩を阻害できるかどうかを調査してよい（Neumann et al. 1999; Bettler et al. 2004; Bowery et al. 2002）。そのような研究に好適な組織は、回腸、動脈、膀胱、肛門尾骨筋、心房、心室筋肉、輸精管、横隔膜、気管および結腸を含む。
【０１８０】
該方法はまた、実施例に記載される通り他のアッセイを含んでもよい。
【０１８１】
上で考察した方法のいくつかでは、組換えカルシウムチャネルを生産する必要があり得る。組換えカルシウムチャネルを生産するために、カルシウムチャネルのDNA配列を得て、次いで、適切なプロモーターを備えた発現ベクターに組み込んでよい。発現ベクターが構築されたら、次いで、これを、CaCl2、CaPO4、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム導入、ウイルス導入または粒子媒介性遺伝子導入を含む方法を使用して、適切な細胞株に導入してよい。
【０１８２】
宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞またはより高等な真核生物細胞を含み得る。好適な原核生物は、限定されないが、真正細菌、例えばグラム陰性菌またはグラム陽性菌（腸内細菌科を含む）を含み得る。そのような腸内細菌科は、バシラス属（例えば、B.スブチリス（B. subtilis）およびB.リケニフォルミス（B. licheniformis））、エシェリキア属（例えば、大腸菌（E. coli））、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、シュードモナス属（例えば、緑膿菌（P. aeruginosa））、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium））、セラチア属（例えば、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens））、赤痢菌属、およびストレプトマイセス属を含み得る。好適な真核微生物は、限定されないが、カンジダ属、クリベロマイセス属（例えば、K.ラクティス（K. lactis）、K.フラギリス（K. fragilis）、K.ブルガリクス（K. bulgaricus）、K.ウィッケラミー（K. wickeramii）、K.ワルティー（K. waltii）、K.ドロソフィラルム（K. drosophilarum）、K.サーモトレランス（K. thermotolerans）およびK.マルキシアヌス（K. marxianus））、アカパンカビ（Neurospora crassa）、ピキア酵母（Pichia pastoris）、トリコデルマ・リーシア（Trichoderna reesia）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、シュワンニオマイセス属（例えば、シュワンニオマイセス・オグシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis））、および糸状菌（filamentous fungi）（例えば、ニューロスポーラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、およびアスペルギルス属（例えば、A.ニデュランス（A. nidulans）およびA.ニガー（A. niger）））ならびにメチロトローフ酵母（例えば、ハンゼヌラ属、カンジダ属、クロエッケラ属、ピキア属、サッカロマイセス属、トルロプシス属、およびロドトルラ属）を含む。好適な多細胞生物は、限定されないが、無脊椎動物細胞（例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）およびヨトウガ（Spodoptera）を含む昆虫細胞）、植物細胞、および哺乳動物細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）、サル腎臓系、ヒト胎児腎臓系、マウスセルトリ細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞およびマウス乳腺腫瘍細胞）を含む。当業者であれば、過度な実験なしに適切な宿主細胞を選択できる。
【０１８３】
次いで、細胞株を、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために改変された慣用の栄養培地中で培養してよい。当業者であれば、過度な実験なしに培地、温度、pHなどの培養条件を選択できる（一般原理、プロトコルおよび実践技術については、Butler, M. 1991; Sambrook 1989を参照のこと）。次いで、細胞を選択し、標準的な手順を使用してカルシウムチャネルの発現についてアッセイしてよい。
【０１８４】
特に記載のない限り、これらの受容体に対する任意のアッセイを、インビボまたはインビトロで実施してよい。前記アッセイ用のカルシウムチャネルが細胞プロセスを通して産生される場合、無傷細胞または該細胞のために調製された膜のいずれを使用してもよい。
【０１８５】
本発明に係るペプチドは、標準的なペプチド合成法とそれに続く酸化的ジスルフィド結合形成を使用して、例えば実施例に考察される通り調製され得る。例えば、線状ペプチドは、Schnolzer et al., 1992に記載されている通り、BOC化学を使用した固相法によって合成され得る。脱保護および固体支持体からの切断に続いて、還元されたペプチドが分取クロマトグラフィーを使用して精製される。精製された還元ペプチドは、緩衝化された系において酸化される。酸化されたペプチドは、分取クロマトグラフィーを使用して精製される。還元/アルキル化技術を使用して、ジスルフィド結合接続性を十分に立証された手順を使用して決定することができる（Shon et al. 1997; Bures et al. 1998）。また、該ペプチドを、Kent et al. 1998に概説される手順を使用した選択的な酸化的ジスルフィド結合形成を使用して作製することができる。
【０１８６】
コノトキシンの合成を記載している一般的な参考文献は、Sato et al. 1991; Lew et al. 1997; Flinn et al. 1995およびWO 91/07980を含む。
【０１８７】
該ペプチドのC末端に非置換アミドが望まれる場合、BHAまたはMBHA樹脂が切断時に直接非置換アミドを提供するので、これらの樹脂が好ましい。該ペプチドのC末端にN-メチルアミドが望まれる場合、N-メチルBHA樹脂を使用してよい。他のN-置換アミドが望まれるならば、米国特許第4,569,967号に開示されているような技術に従ってもよく、あるいは、液相法を介してC末端を官能化することが好ましい場合もある。
【０１８８】
あるいは、コノトキシンペプチドのC末端をリンカーによってN末端に連結させることが望ましい場合がある。例えば、オーストラリア特許出願第2006236006号に概説されている通り、線状コノトキシンが環化され得る数種の手法がある。
【０１８９】
第一のアプローチでは、伸長された線状ペプチドが、固相ペプチド合成法を使用して「樹脂上に」最初に合成される。この伸長された線状ペプチドは、N末端にあるまたはN末端に最も近いシステイン残基から始まるネイティブ配列を含み、そして、C末端伸張は、新たな連結部分を含む。固相ペプチド合成は、Schnolzer et al., 1992に記載されている通り、BOC化学を使用して合成され得る。別の態様において、Fmoc化学を使用してよい。脱保護および切断に続いて、伸長されたコノトキシンペプチドは、チオエステル中間体に環化され、その後、アミン環化ペプチドに転移する。次いで、この還元されたペプチドは酸化されて、ジスルフィド結合を形成する。
【０１９０】
別のアプローチでは、前の通り固相ペプチド合成法を使用して該ペプチドが構築される。追加の残基をN末端および/またはC末端に加えてよく、そして、合成に続いて、該ペプチドが脱保護されて樹脂から切断される。好ましくは、この態様において、合成されたペプチドのN末端およびC末端は、グリシン残基である。該ペプチドは次いで折り畳まれる。環化に続いて、N末端およびC末端が一緒にカップリングされる。しかしながら、このアプローチは、配列中に多数のリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基が存在する場合、複雑となり得る。
【０１９１】
第三のアプローチは、酸化された成熟コノトキシンから開始することである。次いで、ペプチドリンカーを合成して、そして、ペプチドのライゲーションについて公表されている手順を使用してコノトキシンとライゲーションしてよい。次いで、伸長されたペプチドが環化される。
【０１９２】
生成物が、必要なジスルフィド結合を有する環化されたコノトキシンペプチドであるという条件で、他のアプローチもまた可能である。例えば、液相法を使用して該ペプチドが合成されても、システイン残基の選択的脱保護が採用されてもよい。
【０１９３】
本発明のペプチドはまた、組換えDNA技術を使用して調製されてもよい。組換えカルシウムチャネルについて先に考察されている通り、所望のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を好適なベクターに挿入し、そして、適切な発現系でタンパク質を発現させてよい。いくつかの事例では、発現されたペプチドのさらなる化学修飾、例えばC末端アミド化が適切であり得る。いくつかの状況下では、ペプチド発現に続く化学工程として、発現されたペプチドの酸化的結合形成に着手することが望ましい場合がある。これに先立って、還元工程を行い、折り畳まれていないペプチドを提供してよい。当業者は、該ペプチドの還元および酸化の適切な条件を容易に決定し得る。
【０１９４】
さらなる局面において、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする配列をコードするかまたはそれに相補的なヌクレオチドの配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０１９５】
本発明の核酸分子は、DNAであってもRNAであってもよい。核酸分子がDNA形態であるとき、それはゲノムDNAであってもcDNAであってもよい。本発明の核酸分子のRNA形態は、一般に、mRNAである。
【０１９６】
本発明の核酸分子は、一般に、単離形態であるが、これらは、他の遺伝分子、例えばベクター分子、特に発現ベクター分子（上で考察されたものなど）に組み込まれるか、またはライゲーションされるか、またはそうでなければ、それと融合または会合され得る。
【０１９７】
さらなる局面において、本発明は、本発明に係るペプチドをコードすることができる核酸を含む遺伝子構築物を企図する。好ましくは、核酸部分は、プロモーターが適切な細胞中で核酸の発現を指令することができるように、プロモーターに機能的に連結される。
【０１９８】
別の局面において、本発明は、本発明に係るペプチドの全てまたは一部をコードする配列をコードするかまたはそれに相補的なヌクレオチドの配列を含む、核酸プローブを提供する。
【０１９９】
本明細書において使用される場合、「プローブ」への言及は、増幅において使用されるプライマーまたは直接ハイブリダイゼーションにおいて使用するためのプローブへの言及を含む。
【０２００】
本発明のさらに別の局面は、本発明に係るペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に関する。そのような抗体は、本発明のペプチドに対する天然に存在する抗体から選択してもよく、標準的な技術を使用して該ペプチドに対して特異的に生じさせてもよい。後者の場合では、該ペプチドは最初に担体分子と会合される必要があり得る。本発明の抗体は、治療物質または診断物質として特に有用であり得る。
【０２０１】
これに関して、特異的抗体を使用して、本発明に係るペプチドをスクリーニングすることができる。そのようなアッセイのための技術は、当技術分野において周知であり、例えば、サンドイッチアッセイおよびELISAを含む。ペプチドレベルに関する知識は、ある特定の治療プロトコルをモニタリングするために重要であり得る。
【０２０２】
本発明のある特定の態様は、ここで、以下の実施例を参照して説明されるが、それは、単に例示の目的を意図したものであって、本明細書上記の一般性の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０２０３】
2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（HBTU）および9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル（Fmoc）で保護されたL-アミノ酸をIris Biotech（Germany）から得た。N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）およびHPLC等級のアセトニトリルは、VWRからであった。ペプチド合成等級のトリフルオロ酢酸（TFA）およびジエチルエーテルをHalocarbon, USAから購入した。GABAおよびR-(+）-バクロフェン塩酸塩をSigma-Aldrich Pty. Ltd.（Sydney, Australia）から購入し、CGP55845塩酸塩をTocris Bioscience（Bristol, UK）から購入し、そして、ω-コノトキシンCVIEは、Paul F. Alewood教授（The University of Queensland, Australia）からの寄贈であった。ペプチド濃度を、Direct Detect（登録商標）IR spectrometer（Merck Millipore）を使用して決定した。
【０２０４】
動物実験は、科学的目的のための動物の管理および使用のためのオーストラリア実施規範第8版（2013年）（Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes, 8th edition, 2013）に提示されているガイドラインに準拠して実行し、そして、動物倫理承認（animal ethics approval）は、クイーンズランド大学動物実験委員会（University of Queensland Animal Ethics Committee）から得た。
【０２０５】
データは、平均±SEM（n、実験数）である。統計分析は、2つの群ではスチューデントのt検定（Student’s t-test）を、多重比較では一元配置分散分析または二元配置分散分析を使用して実施した；p<0.05である場合に、差は有意であると見なした。
【０２０６】
実施例1：ペプチド合成のための一般手順
特に断りのない限り、手動の固相ペプチド合成（SPPS）[2]によって、またはSymphony synthesizer（Protein Technologies, Inc）を使用して、リンクアミドメチルベンヒドリルアミン（MBHA）樹脂上にペプチドを構築した。全てのペプチドを、インサイチュー中和/HBTUプロトコルを使用してFmoc化学で合成した。
【０２０７】
ランダム酸化試験で使用されるペプチドについて、Cys(trt）を4つの位置全てに組み込んだ。捕捉剤としてのトリイソプロピルシラン（TIPS）および水と共に、トリフルオロ酢酸（TFA）を使用して（9:0.5:0.5 TFA:TIPS:水）、室温（21〜23℃）で2時間、ペプチドを樹脂から切断した。TFAを真空下で除去し、そして、ペプチドを氷冷エーテル中に沈殿させ、濾過し、0.05%TFAを含有する50%アセトニトリルに溶解し、次いで凍結乾燥させた。B 0〜80%の勾配（緩衝液A：H2O/0.05%TFA；緩衝液B：90%CH3CN/10%H2O/0.045%TFA）を使用した、C18カラムでの逆相HPLC（RP-HPLC）によって80分で粗ペプチドを精製した。エレクトロスプレー質量分析法（ES-MS）によって合成したペプチドの分子質量を確認し、これを凍結保存した後、2工程酸化プロトコルを使用した。
【０２０８】
短縮型ペプチド、例えば[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）を、上に記載した通りFmoc化学を使用してリンクアミドMBHA樹脂上で合成した。捕捉剤としてのTIPSおよび水と共に、TFAを使用して（9:0.5:0.5 TFA:TIPS:水）、室温で2時間、ペプチドを樹脂から切断した。粗ペプチドをRP-HPLCによって精製した。適切な場合には、α-コノトキシンに対するジスルフィド結合性を作るためにAcm保護基を使用することを伴う、選択的ジスルフィド結合戦略を使用した。第一のジスルフィド結合を形成するために、還元されたペプチドを0.1M NH4HCO3緩衝液（pH 8.2）に0.2mg/mLの濃度で溶解し、室温で一晩撹拌し、次いで、RP-HPLCによって精製した。該ペプチドが第二のジスルフィドを含む事例では、酸性条件下にてペプチドをヨウ素で処理することによって第二のジスルフィド結合を形成した。該ペプチドを緩衝液A（0.5mg/mL）に溶解し、次いで、溶液が黄色になるまでCH3CN中のI2をゆっくり加えた。反応混合物を37℃で15分間撹拌し、次いで、混合物が無色になるまでアスコルビン酸を加えることによってクエンチした。完全に酸化されたペプチドを、RP-HPLCによって0.5%緩衝液B/分の勾配で精製した。分析用RP-HPLCおよびES-MSによって、ペプチド純度および分子質量を確認した。
【０２０９】
実施例2：電気生理学アッセイ緩衝液中での安定性試験
ペプチドを、150mM塩化テトラエチルアンモニウム（TEA-Cl）、2mM CaCl2、10mM D-グルコース、10mM HEPES、pH 7.4（NaOHで調整した）中、0.5mg/mLで、22℃で24時間インキュベートした。0、1、4および24時間の時点に、100μLのアリコートを取り出し、100μLの水中4%TFAでクエンチした。次いで、RP-HPLCによってC18カラムでB 5〜50%の勾配を使用して40分間にわたり試料を分析した。
【０２１０】
実施例3：電気生理学のための一般手順
アフリカツメガエル卵細胞
アフリカツメガエル（Xenopus）卵細胞からの二電極電位クランプ記録を、GeneClamp 500B amplifier（Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）を使用して、-80mVの保持電位（HP）で室温にて行った。電圧記録電極および電流注入電極をホウケイ酸ガラス（GC150T-7.5, Harvard Apparatus Ltd., Holliston MA）から作り出し、これは、3M KClで満たしたときに0.3〜1MΩの抵抗を有した。連続プッシュ/プル型シリンジポンプ灌流システムを使用し、ND96溶液を用いて約2ml/分の速度で卵母細胞を灌流した。100または50μMアセチルコリン（ACh）をそれぞれ適用することによって、α7またはα9α10 nAChRを通る内向き電流を誘発させた。AChの適用の間に3分間のウォッシュアウト期間を用いた。卵母細胞をペプチドとともに5分間インキュベートした後、AChを共適用した。全ての溶液は、0.1%ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）を含有した。AChが誘発した電流振幅のピークを、ペプチドインキュベーションの前後にpClamp 9 software（Molecular Devices Corp.）を使用して記録した。
【０２１１】
後根神経節（DRG）ニューロンの調製および培養
ロイヤルメルボルン工科大学動物実験委員会（Animal Ethics Committee of RMIT University）によって承認されている通り、ウィスターラットを頚椎脱臼によって屠殺した。過去に記載されている通り、3〜14日齢のウィスターラットの神経節からDRGニューロンを酵素によって解離させた（Callaghan et al., 2008）。細胞を、ポリ-D-リシン/ラミニンでコーティングされた12mm円形カバースリップ（BD Biosciences, Bedford, MA, USA）上にプレーティングし、高い相対湿度（95%）および制御されたCO2レベル（5%）中37℃でインキュベートし、そして、16〜36時間以内に使用した。
【０２１２】
DRGニューロンにおいて、高電位活性型カルシウムチャネル（HVACC）を通る膜電流を、全細胞構成のパッチクランプ技術で、Axopatch 700B amplifier（Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）を用いて室温で（22〜24℃）記録した。DRGニューロンを少容量（約200μl）記録チャンバーに移し、これを、150 テトラエチルアンモニウム（TEA）-Cl、2 BaCl2、10 D-グルコースおよび10 HEPES、pH 7.4（mM単位）を含有する細胞外（浴）溶液で常時灌流した。浴溶液中で実験の直前に、種々の薬物および毒素をストック溶液から終濃度に希釈して調製し、灌流によって適用した。記録の間、自然流下灌流システムを使用して、約600μl/分の流速でDRGニューロンを細胞外溶液で常時灌流した。先端抵抗値が1.5〜2.2MΩの先端熱加工されたホウケイ酸（GC150TF-7.5, Harvard Apparatus Ltd.）パッチピペットを、140 CsCl、1 MgCl2、4 MgATP、0.1 Na-GTP、5 1,2-ビス（O-アミノフェノキシ）エタン-N,N,N’,N’-四酢酸四セシウム塩（BAPTA）-Cs4、および10 HEPES-CsOH、pH 7.3（mM単位）を含有する細胞内溶液で満たした。Ba2+電流（IBa）を3kHzでフィルターにかけ、10kHzでサンプリングした。-P/4パルスプロトコルを使用してリーク電流および容量性電流を差し引いた。データを、さらなる分析用にコンピューターにデジタル保存した。
【０２１３】
DRGニューロンにおいて、[Ser3]Vc1.1（1-8）、その類似体、またはバクロフェン（bac）の非存在下（I対照）および存在下（I）で記録された電流振幅から電流振幅値の相対ピーク（I/I対照）を決定した。データは、平均±SEM（n、実験数）である。統計分析は、Sigma Plot 11.0（Systat Software, Inc.）で、2つの群ではスチューデントのt検定を、または多重比較では一元配置分散分析とボンフェローニのポストホック検定を使用して実施した。p<0.05で、差は統計的に有意であると見なした。
【０２１４】
実施例4：インビトロのマウス結腸一次求心路記録調製物のための一般手順
活動電位放電のインビトロでの単一ユニット細胞外記録を、内臓の結腸求心路から得た。これらの記録を、標準的なプロトコルを使用して健康なまたはCVHのC57BL/6マウスから行った。機械的感受性ベースラインを、2gのvfhプローブの求心性受容野への3秒間の適用に応答して決定した。このプロセスを0.1Hzで3〜4回繰り返した。次いで、漸増濃度（1、10、100および1000nM）の[Ser3]Vc1.1（1-8）または[Ser4]Pu1.2（1-9）のいずれかの適用後に機械的感受性を再試験した。ペプチドを、関心対象の受容野上に置かれた小さい金属リングを介して、結腸の粘膜表面に各濃度で10分間適用した。
【０２１５】
実施例5：ペプチドのNMR解析のための一般手順
ペプチドを、90% H2O/10% D2Oまたは99.96% D2O（Cambridge Isotope Laboratories）に1mMの濃度およびpH約3.6で溶解した。Bruker Avance-600にて280Kでスペクトルを記録し、4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸を0ppmの基準とした。標準的なBrukerパルスプログラムを全ての二次元スペクトルに使用した。TOCSYおよびNOESY実験についての水抑制を達成するために、勾配付き励起スカルプティングを使用した[4]。NMR実験には、混合時間80msのMLEV-17スピンロックシーケンスを使用したTOCSY[5]、混合時間200msのNOESY[6]、DQF-COSY[7]、E.COSY[8]、1H-13C HSQC[9]および1H-15N HSQC[9]を含めた。TOCSY、NOESY、DQF-COSYおよびE.COSY実験ではF2次元の4096データポイントおよびF1次元の512増分、そして、1H-13C HSQCでは2048×240、1H-15N HSQCでは2048×128のF2次元のデータポイントおよびF1次元の増分を用いてスペクトルを記録した。t1次元を1024の実データ点にゼロフィリングし、そして、フーリエ変換の前にF1およびF2次元にサイン二乗関数を乗じた。
【０２１６】
実施例6：対照および標準
適切な場合には、ペプチドの活性および/または物理化学的特性を、対応するネイティブな完全長ペプチドPu1.2、Vc1.1、Pn1.2およびRgIAと比較した。以下の式を有するこれらのネイティブペプチドを上記の一般手順に従って調製した。
G C C S D P R C N Y D H P E I C      SEQ ID No. 37（ネイティブな完全長Vc1.1）
G G C C S Y P P C I A N N P L C      SEQ ID No. 38（ネイティブな完全長Pu1.2）
G C C S H P P C F L N N P D Y C      SEQ ID No. 39（ネイティブな完全長Pn1.2）
G C C S D P R C R Y R C R C      SEQ ID No. 40（ネイティブな完全長RgIA）
【０２１７】
また、適切な場合には、特異的GABABRアゴニストのバクロフェンを陽性対照として使用した。
【０２１８】
完全長ペプチドPn1.2、Pu1.2およびVc1.1の球状、リボンおよびビーズ異性体を調製し（位置選択的ジスルフィド戦略を使用して）、全てがラットDRGニューロン内のHVAカルシウム電流を阻害することが見いだされた（図1、α-コノトキシンのビーズ（青色）、球状（緑色）およびリボン（赤色）異性体を参照のこと）。バクロフェン（bac）を陽性対照として使用した（図1：bac、50μM、橙色）。
【０２１９】
実施例7：ペプチドの調製
以下の式を有する代表的なペプチドを上記の一般手順に従って調製した。
2019508419.tif 000019
2019508419.tif 000020
2019508419.tif 000021
【０２２０】
実施例8：ラットおよびマウスDRGニューロン内のHVAカルシウム電流における完全長および短縮型α-コノトキシンの比較
2つの代表的なペプチド[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）の活性を、ラットおよび/またはマウスDRGニューロン内でHVAカルシウム電流において調べた。[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）は共に、ラットまたはマウスDRGニューロン内でHVAカルシウム電流を阻害した（図2を参照のこと）。マウスDRGニューロン内のICa阻害のピークの平均I/I対照データ（±SEM）である図2に概説する通り、ICaは、1μM [Ser4]Pu1.2(1-9）で23.5±4%、1〜3μM、30nMおよび100pM [Ser3]Vc1.1（1-8）でそれぞれ30.2±3.9%、31.6±4%および20.6±3.3%、または50μMバクロフェンで41.5±2.7%阻害された。バクロフェン（bac）を陽性対照として使用した。結果は、対応する完全長ペプチドに匹敵するものであった。
【０２２１】
具体的には、[Ser4]Pu1.2（1-9）は、ICaピークを約20%一過性に阻害した。[Ser4]Pu1.2（1-9）の効果は、CGP55845（1μM）が可逆的に拮抗することができた。マウスDRGニューロンでは、[Ser3]Vc1.1（1-8）（100pM）は、ICaを約20%阻害し、1μM [Ser3]Vc1.1（1-8）は、より早い（約3〜5分）時間で約30%の阻害をもたらした（図2）。[Ser3]Vc1.1（1-8）（1μM）はまた、ラットDRGニューロン内でHVAカルシウム電流を25.1±6%阻害した。
【０２２２】
（表４）齧歯動物DRGニューロン内のHVAカルシウムチャネルでの完全長および短縮型α-コノトキシンならびにバクロフェン活性の比較 
2019508419.tif 000022
値は、電流振幅の平均相対ピーク（I/I対照）±SEM；nは、実験数；NDは、未決定を表す。
【０２２３】
実施例9：ラットDRGニューロン内の[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体によるBa2+電流の調節
新たに単離されたDRGニューロン内での、9種のα-コノトキシン[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体によるHVACCを通るBa2+電流（IBa）の調節を調べた。1μM濃度では、レトロ-インベルソ-Vc1.1（1-8）、[S4A]Vc1.1（1-8）、および[D5A]Vc1.1（1-8）は、IBa振幅ピークを不可逆的に約10%阻害した（図4および表4）。Vc1.1（1-8）類似体のうちの2種である[R7A]Vc1.1（1-8）（1μM）およびVc1.1（1-8）-アミド（1μM）は、約20%のIBa振幅ピークの阻害をもたらした。[Ser3]Vc1.1（1-8）（対照）と同様に、[Ser3]Vc1.1（2-8）（1μM）もIBaピークを約25%阻害したが（表5）、その効果は一過性であり、IBaの阻害された分の約60%が比較的早い時間経過で元に戻った（図4）。これらの実験では、GABAB受容体アゴニストバクロフェン（50μM）を陽性対照として使用した。Vc1.1（1-8）類似体への曝露後にIBa阻害が減少したかまたは阻害がないことを示した細胞では、その後のバクロフェンの適用が、総IBaの比較的大きな部分（約35%）を抑制した。しかしながら、このIBaのバクロフェン感受性の部分は、[R7A]Vc1.1（1-8）、Vc1.1（1-8）、Vc1.1（1-8）-アミド、[Ser3]Vc1.1（2-8）、または[Ser3]Vc1.1（1-8）への曝露後に低減し（約10%）、このことは、これらの2つの化合物によって誘導される細胞内シグナル伝達機序間の重複と整合した（Callaghan et al., 2008; Berecki et al., 2014）（図4）。
【０２２４】
（表５）ラットDRGニューロン内のHVACCを通るIBaにおける、[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体およびバクロフェン活性の比較
2019508419.tif 000023
値は、電流振幅の平均相対ピーク（I/I対照）±SEM；nは、実験数を表す。本発明者等の過去の研究では、マウスおよびラットDRGニューロンにおいて[Ser3]Vc1.1（1-8）（1μM）について類似のI/I対照が見いだされたことに留意されたい（Carstens et al, 2015）。
【０２２５】
実施例10：ヒトα7およびα9α10 nAChRでのPn1.2、Pu1.2、[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）の完全長および短縮型α-コノトキシン活性の比較
上に記載した通り、α-コノトキシンは、様々な程度の親和性および効力でニューロン型nAChRを標的とする。ネイティブな完全長α-コノトキシンVc1.1は、ラットおよびヒトα9α10 nAChRを濃度依存的にそれぞれ64nM［46］および765nM［47］の半最大阻害濃度（IC50）値で阻害し、α7 nAChR（IC50≒7.1μM）では阻害効果が弱いことが実証されている。α-コノトキシンPn1.2（3μM）、Pu1.2（3μM）、[Ser4]Pu1.2（1-9）（3μM）、および[Ser3]Vc1.1（1-8）（1μM）の効果を、ヒトα7またはα9α10 nAChRを発現するアフリカツメガエル卵細胞において、ACh誘導電流に対して調べた（および表6）。[Ser3]Vc1.1（1-8）は、α9α10 nAChRには影響を及ぼさなかったが、α7 nAChRを通じた電流を止めた。
【０２２６】
（表６）アフリカツメガエル卵細胞におけるヒトα7およびα9α10 nAChRでのPn1.2、Pu1.2、ならびに短縮型α-コノトキシン[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）活性の比較
2019508419.tif 000024
値は、電流振幅の平均相対ピーク（I/I対照）±SEM；nは、実験数を表す。α7 nAChRでは100μM AChまたはα9α10 nAChRでは50μM AChでデータを取得した。
【０２２７】
実施例11：アフリカツメガエル卵母細胞において発現されるヒトα7 nAChR（A）およびヒトα9α10 nAChR（B）での[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体の活性
実験は、上に概説した一般手順に従って実行した。結果を表7にまとめる。
【０２２８】
（表７）アフリカツメガエル卵細胞におけるヒトα7およびα9α10 nAChRでのVc1.1、cVc1.1、[E14DapAc]cVc1.1、短縮型α-コノトキシン [Ser3]Vc1.1（1-8）および[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体の活性の比較
2019508419.tif 000025
値は、電流振幅の平均相対ピーク（I/I対照）±SEM；nは、実験数を表す。データは、α7 nAChRでは100μM AChまたはα9α10 nAChRでは6.5μM AChで取得した。N.D.、未決定。
【０２２９】
実施例12：結腸侵害受容器機能
上に概説した一般手順に従い、限局性の圧迫および侵害性の伸縮/拡張に応答するマウス内臓の高閾値侵害受容器からのエクスビボ求心路記録を使用して、代表的なペプチド[Ser4]Pu1.2（1-9）または[Ser3]Vc1.1（1-8）が結腸侵害受容器機能を改変する能力について調べた。侵害受容器の機械的感受性を、各ペプチドの用量を増加させる前後に評価した。結果を図3にまとめる。[Ser4]Pu1.2（1-9）は、結腸侵害受容器の機械的感受性を用量依存的に阻害し、1000nMの濃度の[Ser4]Pu1.2（1-9）で最大の阻害が観察された（図3A）。[Ser3]Vc1.1（1-8）もまた、1000nMの濃度で侵害受容器の機械的感受性を阻害した（図3B）。全体として、[Ser4]Pu1.2（1-9）および[Ser3]Vc1.1（1-8）は共に、1000nMで類似のレベルの侵害受容器阻害を誘導した。[Ser3]Vc1.1（1-8）の効果を内臓痛のマウスモデルでも調べた。結腸直腸の侵害性の拡張は、腹部筋肉の収縮からなる侵害受容脳幹反射である内臓運動応答（VMR）をトリガーする。腹部筋電図検査（EMG）を使用して、この技術は、完全に目が覚めた動物においてインビボ内臓感受性を評価することを可能にする。このモデルにおいて、[Ser3]Vc1.1（1-8）での結腸内処置は、ビヒクル処置マウスと比較して結腸直腸拡張に応答するVMRを有意に低減した（図3CおよびD）。
【０２３０】
実施例13：神経障害性疼痛の処置
代表的なペプチド[Ser3]Vc1.1（1-8）を、神経障害性疼痛のラットモデルにおいて評価した。[Ser3]Vc1.1（1-8）の単回皮下（s.c.）ボーラス用量を、座骨神経の片側の慢性絞扼損傷（CCI）を有する雄のSprague-Dawleyラット（広く利用されている神経障害性疼痛のラットモデル）において、陽性対照（ガバペンチン）およびビヒクル（注射用滅菌水；WFI）に対して調べた。
【０２３１】
6〜8週齢の体重200〜225gの32匹の雄のSprague-Dawleyラットに対して実験を実施した。ラットに、過去に記載されている通り（Ekberg et al., 2006）、左座骨神経の部分結紮（PNL）を行った（Seltzer et al., 1990）。連続投薬間のウォッシュアウト期間が最小48時間の「ウォッシュアウト」プロトコルに従って、試験アイテムまたは対照の単回ボーラス用量をラットに与えた。
【０２３２】
（表８）用量の概略（n≧6/用量レベル）
2019508419.tif 000026
【０２３３】
研究は、以下のプロトコルに従って実行した。実験開始の前に動物を少なくとも3日間順化させた。
・0日目
・フォンフライ（von Frey）足逃避閾値（PWT）ベースラインの決定
・慢性絞扼損傷手術
・術後回復
・1〜13日目
・週一回のPWTベースラインの決定
・14〜28日目（48時間のウォッシュアウトプロトコル；n≧6/用量/化合物またはビヒクル）
・皮下経路を介した単回ボーラス用量の試験アイテムまたは対照アイテムの投与
・投薬前および投薬後時間15、30、45、60、75、90、120および180分でのPWTの測定
【０２３４】
2mL/kgの注射用水（WFI；n=7）、1、3もしくは10mg/kgのVc1.1（1-8）（n=2）または100mg/kgのガバペンチン（n=7）の単回皮下ボーラス用量の投与後の、0時点（投薬前）ならびに15、30、45、60、75、90、120および180分後の、投与に応答したCCIラットの同側後足についての足逃避閾値を図5にまとめる。Vc1.1（1-8）またはガバペンチンの投与後に、平均PWTベースラインと比較して、任意の試験時間点で≧4gを誘発したCCIラットを、応答動物として定義した。
【０２３５】
Vc1.1（1-8）で処置したラットは、水ビヒクル（WFI）と比較して、試験した全ての用量で神経障害性疼痛の低下を示した（図5）。
【０２３６】
2mL/kgのWFI（n=7）、1、3もしくは10mg/kgのVc1.1（1-8）（n=2）または100mg/kgのガバペンチン（n=7）の単回皮下ボーラス用量の投与後の、投与に応答したCCIラットの同側（損傷を受けた側）後足についての平均（±SEM）ΔPWT対時間曲線下面積（ΔPWT AUC値）として定量される平均（±SEM）作用程度および作用継続期間を図6にまとめる。応答体は、Vc1.1（1-8）またはガバペンチンの投与後に、平均PWTベースラインと比較して、任意の試験時間点で≧4gを誘発したCCIラットとして定義された。
** p≦0.01 *** p≦0.001 **** p≦0.0001
注記：n数（n=2）が低いため、Vc1.1（1-8）に対して実施された統計分析は、単なる表示のためのものである。
【０２３７】
実施例14：α7およびα9α10 nAChRアセチルコリンにおける活性比較
アセチルコリン（ACh）が誘導した電流振幅を、3μMの種々の[Ser3]Vc1.1（1-8）類似体とのインキュベーション後にα7およびα9α10 nAChRにおいて評価した。結果を図7にまとめる。
【０２３８】
ヒトα7およびα9α10 nAChRをステージV〜VIのアフリカツメガエル卵母細胞で発現させ、そして、二電極電位クランプ記録をpH 7.4にて21〜24℃で実行した。アセチルコリン（ACh）適用は、対応するEC50であり；α7 nAChRでは200μMおよびα9α10 nAChRでは6μMであった。3回のACh適用の間に卵母細胞を3分間洗浄した後、ペプチドとともに5分間インキュベーションした。
【０２３９】
続いて、AChをペプチドに共適用し、そして、得られた振幅を最初のアセチルコリンのみでの振幅で割った。試料数は、平均値の標準誤差を伴う対応するバーより上である。対応のないスチューデントのt検定を用いてGraphpad Prismでデータを解析し、そこで、短縮型Vc1.1類似体（S3X、S4X、N9X）を[Ser3]Vc1.1（1-8）に対して比較し、[Ser3]Vc1.1(1-12）および[Ser3]Vc1.1（1-8）をVc1.1に対して、そして、RgIA(1-10）をRgIAに対して、α9α10 nAChRにおいて比較した。*=p値<0.05、**=p値<0.0001、他は有意でない。
【０２４０】
実施例15：[Ser3]Vc1.1（1-8）のインビトロ安定性プロファイル
ヒト血清（図8A）、模擬胃液（SGF）（図8B）および模擬腸液（SIF）（図8C）中での[Ser3]Vc1.1（1-8）の安定性を、LC/MSを使用して複数の時点にわたって評価した。結果を図8にまとめる。
【０２４１】
ヒト血清安定性アッセイを、ペプチド分解の速度を低減する25%血清で実行して、生成物の同定を可能にした。ヒト男性のAB血清（H4522 Sigma-Aldrich）を14000gで10分間遠心分離して、脂質成分を除去した。1×PBS中25%血清の複製物3つおよび対照2つ（1×PBSを1つ、25%血清を1つ）を調製し、37℃で10分間インキュベートした。その後、超純水に溶解した[Ser3]Vc1.1（1-8）を25%血清の複製物3つおよびPBS対照の管に加えて、終濃度20μMにした。同じ容量の超純水を25%血清対照の管に加えた。これらを37℃でインキュベートし、0、1、5、10、15、30、60、180、360および1440分に40μLのアリコートを採取した。各アリコートを6M尿素でクエンチし、5℃で10分間インキュベートした。その後、20%トリクロロ酢酸（TCA）40μLを加え、5℃でさらに10分間インキュベートした。次いで、これらを14000gで10分間遠心分離し、上清をLC/MSのために取り出した。各ピーク下面積をAnalyst（登録商標）Softwareから抽出し、合わせた0時点に対する百分率と見なした。Graphpad Prismで、非線形回帰を用い、各時点の平均値および平均値の標準誤差（SEM）エラーバーを示してデータをグラフ化した。
【０２４２】
模擬胃液および模擬腸液を米国薬局方に従って調製した。HCl 70μL中のNaCl 20mgおよびペプシン（Sigma Aldrich 3200〜4500ユニット/タンパク質mg）16mgを、超純水10mLでpH 1.2にして、SGFを調製した。SGFの複製物4つおよび超純水対照1つを、37℃で10分間インキュベートした。[Ser3]Vc1.1（1-8）を3つの複製物および超純水対照に加えて、終濃度100μg/mLにし、一方で、同じ容量の超純水を最後のSGF複製物に加えた。これらを37℃でインキュベートし、50μLのアリコートを0、5、15、30、60、180、360、1440および2880分で採取した。各アリコートを0.5M NaHCO3 50μLでクエンチし、ヒト血清安定性アッセイに従ってLC/MSで分析した。
【０２４３】
KH4PO4 68mg（水250μL中）、0.2N NaOH 770μL、超純水5mLおよびブタパンクレアチン（Sigma Aldrich 8×U.S.P仕様と等価な活性）100μgを用いてSIFを調製した。複製物および対照をSGFのように調製し、37℃で10分間インキュベーションした後、[Ser3]Vc1.1（1-8）を添加した。50μLのアリコートをSGFにおいて使用した同じ時点で採取したが、これらを4%TFA 50μLでクエンチした後、ヒト血清安定性アッセイに従ってLC/MSを行った。
【０２４４】
図8にまとめた通り、ヒト血清安定性アッセイにおいては、[Ser3]Vc1.1（1-8）（緑色）のN末端残基が<2時間で切断されて、[Ser3]Vc1.1(2-8）（橙色）が形成された（図8A）。模擬胃液中では、[Ser3]Vc1.1（1-8）は、24時間にわたり良好な安定性を示した（図8B）。加えて、模擬腸液中では、少量の[Ser3]Vc1.1（1-8）だけがアッセイの過程で失われた。全ての実験を3回反復した。
【図１】
2019508419.tif 000030
【図２】
2019508419.tif 000031
【図３】
2019508419.tif 000032
【図４】
2019508419.tif 000033
【図５】
2019508419.tif 000034
【図６】
2019508419.tif 000035
【図７】
2019508419.tif 000036
【図８】
2019508419.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月6日(2018.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチド：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7  SEQ ID NO: 1
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa3は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa2およびXaa7は、独立して選択されたアミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成し、
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【請求項２】
Xaa3が、セリン、グルタミン酸およびバリンから選択される、請求項1記載のペプチド。
【請求項３】
Xaa3がセリンである、以下の配列を含むかまたはそれからなる請求項1または請求項2記載のペプチド：
Xaa1 Xaa2 S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 44
式中
Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Xaa6およびXaa7は、請求項1に定義される通りである。
【請求項４】
Xaa2が、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびオルニチンから選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
Xaa7が、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびオルニチンから選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項６】
Xaa2およびXaa7が、各々システインであり、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにその側鎖が一緒になってリンカーを形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項７】
リンカーがジスルフィド結合である、請求項6記載のペプチド。
【請求項８】
Xaa1が、グリシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在しない、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項９】
Xaa4が、セリン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸およびトレオニンから選択される、請求項1〜8のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１０】
Xaa5が、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１１】
Xaa6が、アルギニン、プロリン、およびアラニンから選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１２】
以下の配列を含むかまたはそれからなる、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド：
G C S S D P R C      SEQ ID NO: 4。
【請求項１３】
1つまたは複数の追加のアミノ酸をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１４】
以下の配列を含むかまたはそれからなる、請求項9記載のペプチド：
G G C S S Y P P C    SEQ ID NO: 29。
【請求項１５】
リンカーが、結合、ジスルフィドリンカー、アミドリンカー、チオエーテルリンカー、チオールリンカー、アシルチオリンカー、エステルリンカー、アルキルリンカー、アルケニルリンカーおよびアルキニルリンカーから選択される、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１６】
ペプチドのC末端がカルボキシル基もしくは第一級アミドであるか、または、C末端がリンカーによってN末端に連結されている、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１７】
ペプチドのC末端が第一級アミドである、先行請求項のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１８】
以下からなる群より選択される配列を含むかまたはそれからなる、請求項1記載のペプチド：
2019508419.tif 000038
2019508419.tif 000039
2019508419.tif 000040
。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドと、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む、組成物。
【請求項２０】
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらす方法であって、それを必要とする人に、請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項19記載の組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
ペプチドが、経口的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または直腸に投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらすのに使用するための、請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドおよび薬学的に許容し得る担体または希釈剤。
【請求項２３】
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらすための医薬の製造における、請求項1〜18のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語句「から本質的になる（consisting essentially of）」、および「から本質的になる（consists essentially of）」などの変形物は、列挙された要素が必須、すなわち、本発明の必要な要素であることを示すものと理解されよう。この語句は、本発明の特徴に実質的に影響を及ぼさない他の列挙されていない要素の存在を許容するが、定義される本発明の基礎的かつ新規な特徴に影響を及ぼすであろう追加の特定されていない要素は排除する。
[本発明1001]
以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチド：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7  SEQ ID NO: 1
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa3は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa2およびXaa7は、独立して選択されたアミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成し、
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
[本発明1002]
Xaa3が、セリン、グルタミン酸およびバリンから選択される、本発明1001のペプチド。
[本発明1003]
Xaa3がセリンである、以下の配列を含むかまたはそれからなる本発明1001または本発明1002のペプチド：
Xaa1 Xaa2 S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO: 1a
式中
Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Xaa6およびXaa7は、本発明1001に定義される通りである。
[本発明1004]
Xaa2が、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびオルニチンから選択される、本発明1001〜1003のいずれかのペプチド。
[本発明1005]
Xaa7が、システイン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびオルニチンから選択される、本発明1001〜1004のいずれかのペプチド。
[本発明1006]
Xaa2およびXaa7が、各々システインであり、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにその側鎖が一緒になってリンカーを形成する、本発明1001〜1005のいずれかのペプチド。
[本発明1007]
リンカーがジスルフィド結合である、本発明1006のペプチド。
[本発明1008]
Xaa1が、グリシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在しない、本発明1001〜1007のいずれかのペプチド。
[本発明1009]
Xaa4が、セリン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸およびトレオニンから選択される、本発明1001〜1008のいずれかのペプチド。
[本発明1010]
Xaa5が、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択される、本発明1001〜1009のいずれかのペプチド。
[本発明1011]
Xaa6が、アルギニン、プロリン、およびアラニンから選択される、本発明1001〜1010のいずれかのペプチド。
[本発明1012]
以下の配列を含むかまたはそれからなる、先行本発明のいずれかのペプチド：
G C S S D P R C      SEQ ID NO: 4。
[本発明1013]
1つまたは複数の追加のアミノ酸をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのペプチド。
[本発明1014]
以下の配列を含むかまたはそれからなる、本発明1009のペプチド：
G G C S S Y P P C    SEQ ID NO: 29。
[本発明1015]
リンカーが、結合、ジスルフィドリンカー、アミドリンカー、チオエーテルリンカー、チオールリンカー、アシルチオリンカー、エステルリンカー、アルキルリンカー、アルケニルリンカーおよびアルキニルリンカーから選択される、先行本発明のいずれかのペプチド。
[本発明1016]
ペプチドのC末端がカルボキシル基もしくは第一級アミドであるか、または、C末端がリンカーによってN末端に連結されている、先行本発明のいずれかのペプチド。
[本発明1017]
ペプチドのC末端が第一級アミドである、先行本発明のいずれかのペプチド。
[本発明1018]
以下からなる群より選択される配列を含むかまたはそれからなる、本発明1001のペプチド：
2019508419.tif 000041
2019508419.tif 000042
2019508419.tif 000043
。
[本発明1019]
本発明1001〜1018のいずれかのペプチドと、薬学的に許容し得る担体または希釈剤とを含む、組成物。
[本発明1020]
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらす方法であって、それを必要とする人に、本発明1001〜1018のいずれかのペプチドまたは本発明1019の組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
[本発明1021]
ペプチドが、経口的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または直腸に投与される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらすのに使用するための、本発明1001〜1018のいずれかのペプチドおよび薬学的に許容し得る担体または希釈剤。
[本発明1023]
虚血後のニューロン損傷、統合失調症、刺激誘発性精神病、アルコール中毒症、薬物依存、痙攣、高血圧、炎症、気管支収縮を引き起こす疾患、慢性疼痛、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、内臓痛、突出痛、双極性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病を治療もしくは予防する、鎮痛をもたらす、またはオピエート鎮痛の増強をもたらすための医薬の製造における、本発明1001〜1018のいずれかのペプチドの使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
Xaa3がセリンである別の局面において、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドが提供される：
Xaa1 Xaa2 S Xaa4 Xaa5 P Xaa6 Xaa7      SEQ ID NO:44
式中
Xaa1は、任意のアミノ酸から選択されるかまたは存在せず；
Xaa2およびXaa7は、独立して選択されたアミノ酸残基であり、ここで、Xaa2およびXaa7が一緒になったときにアミノ酸の側鎖がリンカーを形成し；
Xaa4は、任意のアミノ酸から選択され；
Xaa5は、任意のアミノ酸から選択され；かつ
Xaa6は、任意のアミノ酸から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
L-ペプチドは、L-アミノ酸およびD-アミノ酸から構築された3個の追加の対応する類似体配列を有し得ることが認められている：i）同じ配列であるがD-アミノ酸から構成され、鏡像立体配置を有する、D-エナンチオマーまたはインベルソ-ペプチド；L-アミノ酸の同じ配列からなるが逆の順序のレトロ-ペプチド；および逆配列のD-アミノ酸からなるレトロ-インベルソまたはD-レトロ-エナンチオマーペプチド。例えば、L-アミノ酸を含みかつ以下の配列を有するペプチドは、以下に概説の通りの3個の対応する類似体を有し得る。
G C S S D P R C      L-エナンチオマー
g c s s d p r c      D-エナンチオマーまたはインベルソ-ペプチド
C R P D S S C G (SEQ ID NO:45)    L-エナンチオマー レトロ-ペプチド
c r p d s s c g      D-レトロ-インベルソ-ペプチド
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ジスルフィド結合は、コノトキシンの構造および機能の一次決定因子であるが、これらの結合は、インビボで容易に還元されて、生物活性を損ない得るジスルフィド異性化（または「シャッフリング」）を導く。ある態様において、本発明のペプチドは、2個のシステイン残基を有し得る。好ましくは、該ペプチドは、システイン残基を2個だけ有する。好ましい態様において、2個のシステイン残基の側鎖は、一緒になってジスルフィド結合を形成し得る。ジスルフィド結合を1個だけ含むSEQ ID No. 1または44の短縮型ペプチドは、有利なことに、効果的かつ/または改善された合成、および唯一のジスルフィド異性体の生産を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
SEQ ID NO: 3の代表的なペプチドは、限定されないが、以下を含む。
2019508419.tif 000044
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
アミド-環化ペプチド骨格を含むペプチドの例は、限定されないが、以下の配列を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。
C S S D P R C S S D P R      SEQ ID NO: 37
G C S S D P R C T K S I P P      SEQ ID NO: 38
G G C S S D P R C F P D      SEQ ID NO: 39
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
本発明の化合物の代表的な例は、以下を含む。
2019508419.tif 000045
2019508419.tif 000046
2019508419.tif 000047
2019508419.tif 000048
注記：（*）は、アミド化されたC末端を表示する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
実施例6：対照および標準
適切な場合には、ペプチドの活性および/または物理化学的特性を、対応するネイティブな完全長ペプチドPu1.2、Vc1.1、Pn1.2およびRgIAと比較した。以下の式を有するこれらのネイティブペプチドを上記の一般手順に従って調製した。
G C C S D P R C N Y D H P E I C      SEQ ID No. 40（ネイティブな完全長Vc1.1）
G G C C S Y P P C I A N N P L C      SEQ ID No. 41（ネイティブな完全長Pu1.2）
G C C S H P P C F L N N P D Y C      SEQ ID No. 42（ネイティブな完全長Pn1.2）
G C C S D P R C R Y R C R C      SEQ ID No. 43（ネイティブな完全長RgIA）
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019508419000001.app
【国際調査報告】
2019508419.tif 000049
2019508419.tif 000050
2019508419.tif 000051
2019508419.tif 000052
2019508419.tif 000053