(57)【要約】化学組成物およびその合成方法。本明細書に開示され、記載される化合物は、抗血管新生チロインテグリンアンタゴニストを対象とし、抗血管新生チロインテグリンアンタゴニストと分類され、それは、インテグリンαｖβ３受容体ファミリーの１つまたは複数の細胞表面受容体と反応することができる。抗血管新生チロインテグリンアンタゴニストまたはその誘導体は、アミン、ジアミンまたはトリアゾール結合を有する非開裂性リンカーを介して、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、キトサン、アルギン酸またはヒアルロン酸のポリマーにコンジュゲートされ、単一の化学実体を形成する。開示される組成物の用途は、がん（固形腫瘍および液体腫瘍）、眼傷害（糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性症）、炎症性障害（関節炎、変形性関節症）、アテローム性動脈硬化症、病斑、および皮膚科（酒さ、乾癬、皮膚がん）などの血管新生により媒介される傷害を治療することができる。【選択図】図６
2019517591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
2019517591.tif 000024
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ヨウ素、直鎖アルカンおよび分枝アルカンからなる群から独立して選択され、
Ｘは、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）であり、
ｎ１≧０であり、
Ｙ＝
【化２】
2019517591.tif 000025
であり、ここでｎ５＝１〜５、Ａ＝ＣＨまたはＮであり、少なくとも１つのＡはＮであり、
Ｚは、非生分解性ポリマーである）
を含む組成物。
【請求項２】
ｎ１が、０、１または２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｙ＝
【化３】
2019517591.tif 000026
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
非生分解性ポリマーＺが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、アルギン酸、キトサンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４のうちの少なくとも１つが、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基およびそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
以下：
【化４】
2019517591.tif 000027
【化５】
2019517591.tif 000028
（式中、ｎ２≧１であり、ｎ３＝１、２または３であり、ｎ４≧１である）
の化学式を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
一般式：
【化６】
2019517591.tif 000029
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ヨウ素、直鎖アルカンおよび分枝アルカンからなる群から独立して選択され、
Ｘは、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）であり、
ｎ１≧０であり、
ｎ２≧１であり、
Ｙ＝
【化７】
2019517591.tif 000030
である）
を含む組成物。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４のうちの少なくとも１つが、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基およびそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
以下：
【化８】
2019517591.tif 000031
の化学式を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
チロインテグリン受容体アンタゴニストと、
非生分解性ポリマーと、
共有結合により甲状腺アンタゴニストおよび非生分解性ポリマーに共有結合したリンカーと
を含む組成物。
【請求項１１】
前記共有結合が、以下
【化９】
2019517591.tif 000032
に示すような窒素（Ｎ）と炭素（Ｃ）の結合である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記甲状腺アンタゴニストが、テトラヨードチロ酢酸（テトラック）、トリヨードチロ酢酸（トリアック）およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非分解性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
ＰＥＧ−ジアミノテトラック（Ｐ−ＤＡＴ）、ＰＥＧ−モノアミノテトラック（Ｐ−ＭＡＴ）、ＰＥＧ−トリアゾールテトラック（Ｐ−ＴＡＴ）、シクロデキストリン結合ジアミノテトラック（Ｃ−ＤＡＴ）、シクロデキストリン結合モノアミノテトラック（Ｃ−ＭＡＴ）、シクロデキストリン結合トリアゾールテトラック（Ｃ−ＴＡＴ）、シクロデキストリン結合Ｐ−ＤＡＴ、シクロデキストリン結合Ｐ−ＭＡＴ、シクロデキストリン結合Ｐ−ＴＡＴ、キトサン結合ジアミノテトラック、キトサン結合モノアミノテトラック、キトサン結合トリアゾールテトラック、アルギン酸−モノアミノテトラック（Ａ−ＭＡＴ）、アルギン酸−ジアミノテトラック（Ａ−ＤＡＴ）、アルギン酸−トリアゾールテトラック（Ａ−ＴＡＴ）、ヒアルロン酸−モノアミノテトラック（Ｈ−ＭＡＴ）、ヒアルロン酸−ジアミノテトラック（Ｈ−ＤＡＴ）およびヒアルロン酸−トリアゾールテトラック（Ｈ−ＴＡＴ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
ＰＥＧが二官能性または四官能性である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ＰＥＧ−ｂｉ−モノアミノテトラックまたはトリアック（Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴ）、ＰＥＧ−ｂｉ−ジアミノテトラックまたはトリアック（Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ）、ＰＥＧ−ｂｉ−トリアゾールテトラックまたはトリアック（Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ）、ＰＥＧ−テトラ−モノアミノテトラック（Ｐ−テトラ−ＭＡＴ）、ＰＥＧ−テトラ−ジアミノテトラックまたはトリアック（Ｐ−テトラ−ＤＡＴ）、ＰＥＧ−テトラ−トリアゾールテトラックまたはトリアック（Ｐ−テトラ−ＴＡＴ）およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
病的血管新生関連障害を治療するための抗血管新生用途を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記病的血管新生関連障害が、がんを含む、請求項１７に記載の用途。
【請求項１９】
がんが、ヒトまたは哺乳動物における固形腫瘍および液体がんを含む、請求項１８に記載の用途。
【請求項２０】
固形腫瘍が、神経膠芽腫、膵臓、卵巣、乳房、前立腺、膀胱、肺、肝臓を含む、請求項１９に記載の用途。
【請求項２１】
液体がんが、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫および慢性リンパ球性白血病を含む、請求項１９に記載の用途。
【請求項２２】
病的血管新生関連障害が、眼血管障害、糖尿病性網膜症、および加齢性黄斑変性症を含む、請求項１７に記載の用途。
【請求項２３】
病的血管新生関連障害が、酒さ、多形皮膚萎縮症および乾癬からなる群から選択される皮膚血管障害を含む、請求項１７に記載の用途。
【請求項２４】
病的血管新生関連障害が、皮膚がんを含む、請求項１７に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月７日に出願された、「ＮＯＶＥＬ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＯＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳ  ＯＦ  ＮＯＮ−ＣＬＥＡＶＡＢＬＥ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＮＯＶＥＬ  ＡＬＰＨＡ−Ｖ−ＢＥＴＡ−３  ＴＨＹＲＯＩＤ  ＡＮＴＡＧＯＮＩＳＴＳ」という発明の名称の米国特許出願第６２／３４６，６５９号の優先権および利益を主張し、その内容は本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、概して、甲状腺ホルモン受容体アンタゴニスト（「チロインテグリン（ｔｈｙｒｏｉｎｔｅｇｒｉｎ）アンタゴニスト」と称される）に関し、より詳細には、ＰＥＧの短鎖を有するかまたは有さないリンカーの非開裂性結合を介して１つ以上のポリマー（ＰＥＧ以外のポリマーを利用する実施形態において）にコンジュゲートしたα−Ｖ−β−３（αｖβ３）インテグリン−甲状腺ホルモン受容体アンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
インテグリンは、細胞表面接着受容体のスーパーファミリーであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および他の細胞の両方の固体細胞外環境との細胞の付着を制御する。接着は細胞にとって基本的に重要であり、固定、移動についての合図、ならびに成長および分化についてのシグナルを提供する。インテグリンは、多数の正常および病理学的状態に直接関与し、それ自体、治療的介入についての主要な標的である。インテグリンは内在性膜貫通タンパク質、ヘテロ二量体であり、その結合特異性は１４本のα鎖のどれが８本のβ鎖のどれと結合するかに依存する。インテグリンは、β１、β２、β３またはαｖ鎖を含有する４つの重複するサブファミリーに分類される。細胞は、各サブファミリー由来のいくつかの異なるインテグリンを発現し得る。過去数十年において、インテグリンは細胞接着に関与する主要な受容体であり、したがって治療的介入のための適切な標的であり得ることが示されている。インテグリンαｖβ３は細胞の成長および生存を調節する。なぜなら、いくつかの状況下で、この受容体を連結すると腫瘍細胞にアポトーシスを誘発する可能性があるからである。抗αｖβ３抗体、ＲＧＤペプチド、および他のインテグリンアンタゴニストによる細胞接着の破壊は、腫瘍増殖を遅らせることが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の第１の実施形態は、概して、一般式：
【化１】
2019517591.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ヨウ素、直鎖アルカンおよび分枝アルカンからなる群から独立して選択され；Ｘは酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）であり；ｎ１≧０であり；Ｙは非開裂性共有結合であり；Ｚは非生分解性ポリマーである）
を含む組成物に関する。Ｙ＝
【化２】
2019517591.tif 000004
であり、ここで、ｎ５＝１〜５であり、Ａ＝ＣＨまたはＮであり、少なくとも１つのＡはＮである。
【０００５】
本開示の第２の実施形態は、概して、一般式：
【化３】
2019517591.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ヨウ素、直鎖アルカンおよび分枝アルカンからなる群から独立して選択され；Ｘは酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）であり；ｎ１≧０であり；ｎ２≧１であり；Ｙ＝
【化４】
2019517591.tif 000006
である）
を含む組成物に関する。
【０００６】
本開示の第３の実施形態は、概して、甲状腺アンタゴニストと、非生分解性ポリマーと、非開裂性共有結合により甲状腺アンタゴニストおよび非生分解性ポリマーに共有結合したリンカーとを含む組成物に関する。ここで、列挙されたポリマーの１つまたは複数が厳しい環境条件の使用によって開裂され得るいくつかの状況下でさえ、残存するポリマー鎖は依然として、リンカーおよびＭＡＴ、ＤＡＴまたはＴＡＴに共有結合することができ、これにより、コンジュゲートされた甲状腺アンタゴニストの細胞核取り込みを依然として制限することができる。
【０００７】
実施形態のいくつかは、以下の図面を参照して詳細に説明され、同様の指定は同様の部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】甲状腺アンタゴニストおよびその誘導体を示す一般化学式の実施形態を示す。
【図２ａ】テトラヨードチロ酢酸（テトラック（ｔｅｔｒａｃ））誘導体、モノアミノプロピルテトラック（ＭＡＴ：ｍｏｎａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）の実施形態を示す。
【図２ｂ】テトラック誘導体、ジアミノプロピルテトラック（ＤＡＴ：ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ））の実施形態を示す。
【図２ｃ】テトラック誘導体、プロパルギルテトラック（ＰＧＴ：ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  ｔｅｔｒａｃ））の実施形態を示す。
【図２ｄ】図２ａのテトラック誘導体の代替の実施形態を示す。
【図２ｅ】図２ｂのテトラック誘導体の代替の実施形態を示す。
【図２ｆ】図２ｃのテトラック誘導体の代替の実施形態を示す。
【図３ａ】トリヨードチロ酢酸（トリアック（ｔｒｉａｃ））誘導体、モノアミノプロピルトリアック（ＭＡＴｒｉ：ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｒｉａｃ）の実施形態を示す。
【図３ｂ】トリアック誘導体、ジアミノプロピルトリアック（ＤＡＴｒｉ：ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｒｉａｃ）の実施形態を示す。
【図３ｃ】トリアック誘導体、プロパルギルトリアック（ＰＧＴｒｉ：ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  ｔｒｉａｃ）の実施形態を示す。
【図４ａ】チロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図４ｂ】チロインテグリン受容体アンタゴニスト誘導体の代替の実施形態を示す。
【図４ｃ】チロインテグリンアンタゴニスト誘導体の別の代替の実施形態を示す。
【図５】非開裂結合を介してポリマーにコンジュゲートした甲状腺ホルモンアンタゴニスト誘導体を記載する一般化学式の実施形態を示す。
【図６】非開裂結合を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーにコンジュゲートした甲状腺ホルモンアンタゴニスト誘導体の一般式の実施形態を示す。
【図７ａ】ＰＥＧ−モノアミノプロピルテトラック（Ｐ−ＭＡＴ：ＰＥＧ−ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成する非開裂モノアミノ結合を介してＰＥＧポリマーにコンジュゲートした甲状腺ホルモンアンタゴニストの実施形態を示す。
【図７ｂ】ＰＥＧ−ジアミノプロピルテトラック（Ｐ−ＤＡＴ：ＰＥＧ−ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成する非開裂ジアミノ結合を介してＰＥＧポリマーにコンジュゲートした甲状腺ホルモンアンタゴニストの実施形態を示す。
【図７ｃ】ＰＥＧ−トリアゾールテトラック（Ｐ−ＴＡＴ：ＰＥＧ−ｔｒｉａｚｏｌｅ  ｔｅｔｒａｃ）を形成する非開裂Ｎ−Ｃ結合を介してＰＥＧポリマーにコンジュゲートした甲状腺ホルモンアンタゴニストの実施形態を示す。
【図８】メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を使用して開裂および非開裂リンカーを介してαｖβ３甲状腺ホルモンアンタゴニストを合成するためのコンジュゲーション経路の実施形態を示す。
【図９】ＰＥＧポリマーへの非開裂結合を介した２つのコンジュゲーションを含む二官能性チロインテグリンアンタゴニスト誘導体の一般式の実施形態を示す。
【図１０ａ】二官能性チロインテグリンアンタゴニスト誘導体、ポリエチレングリコールビ−モノアミノプロピルテトラック（Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｂｉ−ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）の実施形態を示す。
【図１０ｂ】二官能性チロインテグリンアンタゴニスト誘導体、ポリエチレングリコールビ−ジアミノプロピルテトラック（Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｂｉ−ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）の実施形態を示す。
【図１０ｃ】二官能性チロインテグリンアンタゴニスト誘導体、ポリエチレングリコールビ−トリアゾールテトラック（Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｂｉ−ｔｒｉａｚｏｌｅ  ｔｅｔｒａｃ）の実施形態を示す。
【図１１】Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴ、Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴおよびＰ−ｂｉ−ＴＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１２】テトラポリエチレングリコールを使用して、チロインテグリンアンタゴニスト、ポリエチレングリコールテトラ−モノアミノプロピルテトラック（Ｐ−テトラ−ＭＡＴ（Ｐ−テトラ−ＭＡＴ）、ポリエチレングリコールテトラ−ジアミノプロピルテトラック（Ｐ−テトラ−ＤＡＴ）およびポリエチレングリコールテトラ−トリアゾールテトラック（Ｐ−テトラ−ＴＡＴ）の四官能性誘導体を合成する方法の実施形態を示す。
【図１３ａ】シクロデキストリンにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の一般式の実施形態を示す。
【図１３ｂ】シクロデキストリンモノアミノプロピルテトラック（Ｃ−ＭＡＴ：ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）についての化学構造の実施形態を示す。
【図１３ｃ】シクロデキストリンジアミノプロピルテトラック（Ｃ−ＤＡＴ：ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）についての化学構造の実施形態を示す。
【図１３ｄ】シクロデキストリントリアゾールテトラック（Ｃ−ＴＡＴ：ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｔｒｉａｚｏｌｅ  ｔｅｔｒａｃ）についての化学構造の実施形態を示す。
【図１４ａ】アルファ（α）、ベータ（β）またはガンマ（γ）シクロデキストリンを使用してＣ−ＭＡＴおよびＣ−ＤＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１４ｂ】アルファ（α）、ベータ（β）またはガンマ（γ）シクロデキストリンを使用してＣ−ＴＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１５ａ】アルギン酸モノアミノプロピルテトラック（Ａ−ＭＡＴ：ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成するアルギン酸ポリマーにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図１５ｂ】アルギン酸ジアミノプロピルテトラック（Ａ−ＤＡＴ：ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成するアルギン酸ポリマーにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図１５ｃ】アルギン酸トリアゾールテトラック（Ａ−ＴＡＴ：ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｉａｚｏｌｅ  ｔｅｔｒａｃ）を形成するアルギン酸ポリマーにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図１６ａ】アルギン酸からＡ−ＭＡＴおよびＡ−ＤＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１６ｂ】アルギン酸からＡ−ＴＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１７ａ】ヒアルロン酸−モノアミノプロピルテトラック（Ｈ−ＭＡＴ：ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成する非開裂モノアミノ結合を有するヒアルロン酸ポリマーにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図１７ｂ】ヒアルロン酸−ジアミノプロピルテトラック（Ｈ−ＤＡＴ：ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成する非開裂ジアミノ結合を有するヒアルロン酸ポリマーにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図１７ｃ】ヒアルロン酸−トリアゾールプロピルテトラック（Ｈ−ＴＡＴ：ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｔｒｉａｚｏｌｅ  ｐｒｏｐｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）を形成する非開裂トリアゾール結合を有するヒアルロン酸ポリマーにコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の実施形態を示す。
【図１８ａ】ヒアルロン酸からＨ−ＭＡＴおよびＨ−ＤＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１８ｂ】ヒアルロン酸からＨ−ＴＡＴを合成する方法の実施形態を示す。
【図１９】プロパルギル基を含むリンカーを有するチロインテグリンアンタゴニストを合成する方法の実施形態を示す。
【図２０】プロパルギル化テトラック（ＰＧＴ：ｐｒｏｐａｒｇｙｌａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｃ）を合成する方法の実施形態を示す。
【図２１】マウスにおけるマトリゲル成長因子インプラント媒介性血管新生に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの効果、およびマウスマトリゲル成長因子媒介性血管新生におけるＰ−ｂｉ−ＴＡＴについての用量依存性抗血管新生効果を示す。
【図２２】ヌードマウスにおける卵巣（ＯＶＣＡＲ３）腫瘍血管新生に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴ（１ｍｇ／Ｋｇ、１４日間のＳＣ  ＱＤ）の効果を示す。
【図２３】フローサイトメトリーによるαｖβ３タンパク質の発現を示す。
【図２４】図２４ａ〜２４ｄは、共焦点顕微鏡を使用したＧＢＭ細胞におけるαｖβ３タンパク質の発現を示す。
【図２５】ポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴにより、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有するトランスジェニックマウスの骨髄および肝転移におけるＴＨＰ１−ｌｕｃ細胞の生物発光シグナルが減少したことを示す。
【図２６】腫瘍ＧＢＭ異種移植片（処置終了から２１日）の生物発光シグナルを示し、対照および空隙の平均生物発光シグナル強度は２〜３×１０７光子／秒であり、処置群（１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）は、１〜２×１０４光子／秒未満の生物発光シグナル強度を有する。
【図２７】腫瘍ＧＢＭ異種移植片（処置終了から２１日および２２日後）の生物発光シグナルを示し、対照および空隙の平均生物発光シグナル強度は、２〜３×１０７光子／秒であり、処置群（１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）は、１〜２×１０４光子／秒未満の生物発光シグナル強度を有する。
【図２８】１および３ｍｇ／ｋｇのＤＡＴまたはＴＡＴ等価物での毎日処置（処置日）の２１日後のヌードマウス異種移植片、および２１日の処置日、続いて２２日の非処置日の別の群における、ＧＢＭ腫瘍増殖に対する、ポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴまたはＴＡＴの効果を示す。
【図２９】１および３ｍｇ／ｋｇのＤＡＴまたはＴＡＴ等価物での毎日処置（処置日）の２１日後のヌードマウス異種移植片、および２１日の処置日、続いて２２日の非処置日の別の群における、ＧＢＭ腫瘍増殖に対する、ポリマーがコンジュゲートしたＣ−ＴＡＴおよびＰ−ｂｉ−ＴＡＴの効果を示す。
【図３０】３および１０ｍｇ／ｋｇ、皮下（ＳＣ）での毎日処置の２１日後のヌードマウス異種移植片（それぞれ１および３ｍｇ／ｋｇのＴＡＴ当量）（処置日）、および２１日の処置日、続いて２２日の非処置日の別の群における、ＧＢＭ腫瘍増殖に対する、ポリマーがコンジュゲートしたＰ−ｂｉ−ＴＡＴの効果を示す。
【図３１】ＧＢＭ  Ｕ８７ＭＧマウス異種移植片においてＰ−ｂｉ−ＴＡＴによって誘導された腫瘍細胞生存能の喪失を示す。Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ（３ｍｇ／ｋｇ）およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、それぞれ、３および１０ｍｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ／ｋｇ  ｓ．ｃ．、２１日間の毎日の薬物投与であり、６２％および７２％（組織学的スコアに基づく）の細胞生存率の減少を達成する。エラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。
【図３２】終了前の２１日の処置または２１日の処置および２２日の非処置のＧＢＭ  Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃマウス異種移植片の生物発光シグナルを示す。対照における平均生物発光シグナル強度は２〜３×１０７光子／秒であった。処置群では、シグナル強度は１〜２×１０４光子／秒未満（検出限界）であった。これらのＩＶＩＳ画像では、縦方向の発光カラーバー（左端）が、生存不能（０ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）から完全生存（６ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）までの範囲の生存率を推定する。
【図３３】Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴおよび他のポリマーがコンジュゲートしたＴＡＴ組成物の投与後３０分および４時間でのｉｎ  ｖｉｖｏでの直交異方性脳（ＧＢＭ）腫瘍におけるＣｙ５シグナルを示す（上の画像）。下の画像は、同所性脳ＧＢＭ腫瘍および皮下異種移植ＧＢＭ腫瘍におけるＣＹ５  Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴおよび他のポリマーがコンジュゲートしたＴＡＴについての画像強度を示す。
【図３４】ＧＢＭ脳腫瘍におけるＰ−ｂｉ−ＴＡＴのＣＹ５シグナル強度の動態の実施形態のグラフを示す。
【図３５】皮下異種移植ＧＢＭ腫瘍におけるＰ−ｂｉ−ＴＡＴのＣＹ５シグナル強度の動態の実施形態のグラフを示す。
【図３６】研究の終わり（４時間）に除去された脳および皮下ＧＢＭ腫瘍におけるＣｙ５標識化Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴシグナル強度を示すグラフの実施形態を示す。
【図３７】１、３および１０ｍｇ／ｋｇ、７日間毎日皮下投与でのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ処置動物に対する、対照の脳内のＧＢＭ（Ｕ８７−ｌｕｃ）直交異方性腫瘍の生物発光シグナルを示す。
【図３８】脳内のＧＢＭ（Ｕ８７−ｌｕｃ）の生物発光シグナルに対する、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴおよびＮＴＡＴ（１ｍｇ／ｋｇ、７日間毎日皮下投与でのポリマーがコンジュゲートしたＴＡＴ）の効果を示すグラフを示す。
【図３９】１週間処置後のＧＢＭ皮下腫瘍増殖に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの効果の結果を示すグラフを示す。
【図４０】ＩＶＩＳイメージングを使用したＧＢＭ腫瘍生存率に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの投与効果を示すグラフを示す。
【図４１】図４１ａは、腫瘍重量の関数として、対照と比較した、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでの膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの抗がん効果のグラフを示す。図４１ｂは、細胞生存率の関数として、対照と比較した、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでの膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの抗がん効果のグラフを示す。図４１ｃは、細胞壊死％の関数として、対照と比較した、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでの膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの抗がん効果のグラフを示す。
【図４２】図４２ａは、膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対する、放射線／非放射線曝露のみ（ＰＢＳ）、およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴ（３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）の投与と組み合わせた放射線または非／放射線曝露の効果を示すグラフを示し、その効果は異種移植腫瘍重量の関数として記載される。図４２ｂは、膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対する、放射線／非放射線曝露のみ（ＰＢＳ）、およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴ（３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）の投与と組み合わせた放射線または非／放射線曝露の効果を示すグラフを示し、その効果は細胞生存率％の関数として記載される。図４２ｃは、膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対する、放射線／非放射線曝露のみ（ＰＢＳ）、およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴ（３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）の投与と組み合わせた放射線または非／放射線曝露の効果を示すグラフを示し、その効果は細胞壊死％の関数として記載される。
【図４３】１ＧＹおよび５ＧＹの放射線での、膵臓がん、ＳＵＩＴ２に対する、放射線曝露のみおよびＰ−ｂｉ−ＴＡＴの投与と組み合わせた放射線曝露の効果を示すグラフを示し、結果は異種移植腫瘍重量の関数として記載される。
【図４４】Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴで処置した雄および雌マウスの血漿中の肝臓、心臓および腎臓マーカーのレベルを示すグラフを示す。示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＰ−ｂｉ−ＴＡＴで１４日間毎日皮下投与により処置したマウスにおける肝臓障害（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ））、心筋障害（心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ））および腎機能（クレアチニン）のマーカーのマウス血漿中の測定。エラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
開示される装置および方法の本明細書以下に記載される実施形態の詳細な説明は、図面を参照して例示として本明細書に提示され、限定されるものではない。特定の実施形態が示され、詳細に説明されるが、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更および修飾がなされ得ることは理解されるべきである。本開示の範囲は、構成部品の数、その材料、その形状、その色、その相対配置などに限定されるものではなく、単に本開示の実施形態の例として開示される。本発明の実施形態およびその利点のより完全な理解は、添付の図面と併せて以下の開示を参照することによって獲得され得、同様の参照番号は同様の特徴を示す。
【００１０】
詳細な開示の前置きとして、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「一つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別様を示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００１１】
概要
本開示の実施形態は、新規な化学組成物およびその合成方法を記載する。本明細書に開示され、記載される組成物は、インテグリンαｖβ３受容体ファミリーの１つ以上の細胞表面受容体と反応することができる抗血管新生剤を対象とすることができ、そのような抗血管新生剤として分類することができる。本明細書に記載される組成物は、非開裂リンカーを介してポリマーにコンジュゲートした抗血管新生甲状腺ホルモンまたはその誘導体を含むことができ、（甲状腺ホルモンまたはその誘導体に共有結合したポリマーの大きさに応じて）微小分子または高分子とみなすことができる単一の化学実体を形成する。単一の化学実体の大きさおよび非開裂性共有結合の強度は、甲状腺ホルモンまたはその誘導体がインテグリンαｖβ３種の細胞表面受容体を含む細胞に侵入するのを防ぐのに有益であり得る。付着したポリマーの大きさ、および細胞の周囲環境が甲状腺ホルモンの強力で非開裂性の共有結合をポリマーから開裂できないことに起因して、記載された化学実体の甲状腺ホルモン部分は、甲状腺ホルモンまたはその誘導体が相互作用し得る細胞の核内に内在化できない可能性がある。したがって、記載される化学実体の甲状腺ホルモン部分は、細胞と非ゲノム的に相互作用し得、甲状腺ホルモンまたはその誘導体が細胞に侵入し、細胞核の核内受容体と相互作用することによって引き起こされ得るゲノム相互作用を回避し得る。
【００１２】
本明細書に開示される組成物の実施形態は、限定されないが、ＰＥＧの短鎖（１００〜８００Ｍ．Ｗ．）を有さないアミンまたはトリアゾール結合を含む非開裂性リンカーを介して、αｖβ３甲状腺アンタゴニストにコンジュゲートされた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１，０００〜１５，０００ダルトン、例えば、４，０００〜８，０００ダルトン）、α、β、もしくはγシクロデキストリン、キトサン、アルギン酸またはヒアルロン酸などの非生分解性ポリマーを含む実体を含むように合成することができる。ポリマーにコンジュゲートした甲状腺アンタゴニストの実施形態は、テトラヨードチロ酢酸（テトラック）、トリヨードチロ酢酸（トリアック）、それらの誘導体およびそれらの変化物を含むことができる。テトラックおよびトリアックを含む甲状腺ホルモンアンタゴニストの１つまたは複数の変形例には、いくつかの実施形態において、ジアミノテトラック（ＤＡＴ：Ｄｉａｍｉｎｏｔｅｔｒａｃ）またはジアミノトリアック（ＤＡＴｒｉ：Ｄｉａｍｎｏｔｒｉａｃ）（本明細書以下において「ＤＡＴ」と交換可能に称される場合がある）、モノアミノテトラック（ＭＡＴ：Ｍｏｎｏａｍｉｎｏｔｅｔｒａｃ）またはモノアミノトリアック（ＭＡＴｒｉ：Ｍｏｎｏａｍｉｎｏｔｒｉａｃ）（本明細書以下において「ＭＡＴ」と交換可能に称される場合がある）、トリアゾールテトラック（ＴＡＴ：Ｔｒｉａｚｏｌｅｔｅｔｒａｃ）またはトリアゾールトリアック（ＴＡＴｒｉ：Ｔｒｉａｚｏｌｅｔｒｉａｃ）（本明細書以下において「ＴＡＴ」と交換可能に称される）、それらの誘導体または当業者に公知の他の甲状腺アンタゴニストが含まれ得る。
【００１３】
本明細書に記載される組成物の実施形態は、異なる分子量のポリエチレングリコール（１，０００〜１５，０００ダルトン）にコンジュゲートされたＤＡＴ、ＭＡＴまたはＴＡＴとしてさらに合成され、特徴付けられている。本発明者らは、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ生物系における生物学的特徴付けのために、比較的最も可溶性のＰＥＧ−ＤＡＴ（Ｐ−Ｍｏｎｏ−ＤＡＴ、Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ）およびＰＥＧ−ＴＡＴ（Ｐ−Ｍｏｎｏ−ＴＡＴ、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ）の実施形態をスケールアップした。画像化および細胞動態のためのＤＡＴまたはＴＡＴおよびＰＥＧ−ＤＡＴまたはＰＥＧ−ＴＡＴならびにＣ−ＤＡＴおよびＣ−ＴＡＴの化学的標識化。データは、ＤＡＴまたはＴＡＴとのポリマーコンジュゲーションが、ＤＡＴまたはＴＡＴの強い細胞核取り込みと比較して、これらのポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴまたはＴＡＴの細胞核取り込みの制限をもたらすことを明らかにした。この特有の細胞分布の結果、コンジュゲートしていないものと比較して、ポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴ、ＭＡＴまたはＴＡＴのゲノム作用の欠如が生じる。短鎖ＰＥＧ（１００〜１，０００ダルトン）を有するか、または有さないＤＡＴ、ＭＡＴまたはＴＡＴとコンジュゲートしたヒアルロン酸、アルギン酸、キトサンなどの他のポリマーが記載されている。ＤＡＴ、ＭＡＴまたはＴＡＴとのさらなるポリマーコンジュゲーションは、二官能性または四官能性ＰＥＧを使用して合成することができるが、それはまた、８個までの鎖の他の分枝ＰＥＧも含んでもよい。
【００１４】
本出願に記載される化合物の各々の実施形態は、血管新生またはその阻害によって調節される複数の異なる疾患を治療するための複数の種類の用途であり得る。本開示に記載される組成物の各々は、記載される組成物に存在する甲状腺アンタゴニストの存在を考慮して、ヒトの身体および種々の動物の身体全体にわたって見出される多数の種類の細胞上に位置するインテグリン受容体αｖβ３を標的化するための親和性を各々有し得る。
【００１５】
例えば、本明細書に開示される組成物の用途は、ヒトまたは哺乳動物におけるがん（固形腫瘍および液体腫瘍）などの血管新生媒介性傷害を治療するのに有用であり得る。がんには、神経膠芽腫、膵臓、卵巣、乳房、前立腺、膀胱、肺および肝臓がんが含まれ得る。液体腫瘍はまた、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫および慢性リンパ球性白血病であり得る。本明細書に記載される組成物はさらに、眼障害（糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性症）、炎症性障害（関節炎、変形性関節症）、アテローム性動脈硬化症病変、および皮膚科（酒さ、乾癬、皮膚がん）を治療することができ、これらの各々は、存続するために血管新生を介した新たな血液細胞の生成に媒介され得るか、または依存し得、その治療は、血管新生経路を遅延させるか、または排除するために新たな血管の形成の拮抗に依存し得る。
【００１６】
本開示の実施形態および実施例が、例示の目的のために本明細書に記載されているが、修飾および変更が例示される実施例に基づいて当業者に明らかになるであろう。したがって、添付の実施例は、本開示の真の趣旨および範囲内に含まれる全ての変形ならびにそのような修飾および変更を包含することを意図する。
【００１７】
チロインテグリンアンタゴニスト化合物
図面を参照すると、図１は、ｎ１炭素サブユニットによって定義され得る炭素原子の反復結合を含むリンカーに結合した甲状腺ホルモンアンタゴニストを示す一般式１００の実施形態を示し、「Ｙ」は、一般式１００の甲状腺ホルモンアンタゴニストおよびその誘導体のリンカーに結合した非開裂性共有結合を定義し得る。「甲状腺ホルモンアンタゴニスト」という用語は、当業者に公知の１つまたは複数の甲状腺ホルモン受容体、例えば、甲状腺ホルモン細胞表面受容体αｖβ３などの甲状腺ホルモン受容体のインテグリンファミリーを阻害または拮抗する一般式１００の分子の能力を記載し得る。甲状腺ホルモンアンタゴニストおよびその誘導体がインテグリン受容体を阻害する機能性に起因して、一般式１００によって定義される分子はさらに、チロインテグリンアンタゴニストとして本明細書に記載され得る。
【００１８】
図１の一般式１００の化学構造によって示されるように、化学構造の実施形態は、図１のチロインテグリンアンタゴニストのさらなる特徴を定義する１つまたは複数の可変物を含み得る。例えば、チロインテグリンアンタゴニストのいくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４として示される可変物は、各々独立して、水素、ヨウ素、直鎖アルカン、分枝アルカンおよび環状アルカンの分子に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、可変物「Ｘ」は、酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）として定義することができる。
【００１９】
一般式１００の甲状腺アンタゴニストに結合した炭素リンカーの実施形態は、炭素鎖の長さが可変であってもよい。炭素鎖の長さは、酸素分子と非開裂性共有結合「Ｙ」との間の炭素原子１個ほどの短さであってもよい。チロインテグリンアンタゴニストの代替の実施形態において、リンカーは、ｎ１反復によって定義され得る炭素原子の反復結合を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ｎ１は０以上であってもよいが、一般式１００の代替の実施形態において、ｎ１のリンカーにおける炭素原子の反復の数は、０以上、１以上、２以上または３以上であってもよい。
【００２０】
可変物「Ｙ」によって表される非開裂性共有結合の実施形態は、いくつかの場合、アミン結合であってもよい。例えば、一般式の可変物Ｙは、図２ａ〜２ｂ、２ｄ〜２ｅ、３ａ〜３ｂ、４ａ〜４ｂのチロインテグリンアンタゴニスト２１０、２１５、２２０、２２５、３１０、３２０、４１０、４２０の例によって示されるように、非開裂性共有結合において１つのアミン基を有するモノアミンまたは２つのアミン基を有するジアミンであってもよい。代替の実施形態において、置換される可変物Ｙは、図２ｃ、２ｆ、３ｃおよび４ｃに示されるようなプロパルギル基を含み得る。
【００２１】
図２ａ〜４ｃの実施形態によって実証されるように、一般式１００から形成され得る広範囲の誘導体組成物が存在する。例えば、図２ａにおいて、組成物２１０は、Ｒ１〜Ｒ４の代わりにヨウ素を含んでもよく、その結果、非開裂性共有結合として３炭素リンカーおよびモノアミンを有するテトラヨードチロ酢酸（テトラック）誘導体が形成する。組成物２１０は、モノアミン−テトラック（ＭＡＴ：ｍｏｎｏａｍｉｎｅ−ｔｅｔｒａｃ）と称され得る。同様に、図２ｂにおいて、テトラック分子は、リンカーに結合したジアミノ共有結合をさらに含む。同様に、この組成物２２０は、ジアミノテトラック（ＤＡＴ：ｄｉａｍｉｎｏ  ｔｅｔｒａｃ）と称され得る。図２ｃの代替の実施形態において、組成物２３０は、示されるように、テトラック分子とプロパルギル基との間の１炭素結合に結合したプロパルギル基を含み得る。この誘導体組成物２３０は、プロパルギルテトラック（ＰＧＴ：ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  ｔｅｔｒａｃ）と称され得る。
【００２２】
テトラックからのプロパルギル化テトラック（ＰＧＴ：ｐｒｏｐａｒｇｙｌａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｃ）の合成
以下の実施例は、図１９に記載され、より具体的には図２０の合成図に示されるテトラックに適用されるように一般化学式に従って、テトラックからプロパルギルテトラックまたはその誘導体を調製するためのサンプル方法を提供する。
【００２３】
工程１：エステル化
【化５】
2019517591.tif 000007
【００２４】
表１ａは、テトラックを、Ｏ−メチルテトラック（ＭＲ−２）（メチル−２−（４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジヨードフェノキシ）−３，５−ジヨードフェニル）アセテート）にエステル化するための合成条件を提供する：
【００２５】
【表１】
2019517591.tif 000008
【００２６】
ＭＲ−２を合成するための一実施形態において、組成物は、以前に公開された保護方法に従って合成される。テトラヨードチロ酢酸（１ｇ、１．３３ミリモル、１当量）および三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ）（０．１ｍＬ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液を、窒素下、周囲温度にて２４時間撹拌した。１５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて反応をクエンチし、混合物を１０分間撹拌し、水相を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、９５０ｍｇの粗メチル−２−（４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジヨードフェノキシ）−３，５−ジヨードフェニル）アセテート２を得、これを次いでエタノールにより再結晶させて、純粋な化合物（６３０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を６２％の収率で得た。再結晶溶媒：ＥｔＯＨ；Ｒｆ：ＴＬＣ溶媒（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ／８：２）で０．６２；ｍｐ＝１６２〜４℃；ＦＴＩＲ（νｃｍ−１）：３３７１、３０８２、２９４３、１７１９ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）、１５８６、１５５６、１５３９、１４５５、１４３０、１３９７、１２８３、１２４０、１２２０、１１６０、１２３８、９１２、８４７、８２３、７８２、７００、５９７、５２７。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．７８（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）、７．１２（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）、５．５３（ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ）、３．７５（ｓ，３Ｈ，−ＣＯＯＣＨ３）、３．５８（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１７１．０（−ＣＯＯＭｅ）、１５２．８、１５０．２、１４９．６、１４１．３、１３５．２、１２６．１、９０．９、８１．８、５２．７（−ＣＯＯＣＨ３）、３９．８（−ＣＨ２−ＣＯＯ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：７８５［Ｍ＋Ｎａ］＋；（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ：７６１［Ｍ−Ｈ］−。
【００２７】
工程２：アルキル化
【００２８】
表１Ｂ：ＭＲ−３（メチル｛４−［３，５−ジヨード−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝アセテート）の合成条件
【００２９】
【表２】
2019517591.tif 000009
【００３０】
一実施形態において、アルキル化の工程を実施することができる。２５ｍｌのアセトン中のメチル保護テトラック（１ｅｑ）および臭化プロパルギル（３ｅｑ）および炭酸カリウム（５ｅｑ）の混合物を２４時間加熱還流した。反応物を濾過し、濃縮し、次いでｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル（９：１〜７：３）を使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで粗精製して、メチル｛４−［３，５−ジヨード−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝アセテートを７８〜８５％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．７６（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）、７．１６（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）、４．６（ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ）、３．７５（ｓ，３Ｈ，−ＣＯＯＣＨ３）、３．５６（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ）；２．５４（ｓ，２Ｈ，−−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ）。
【００３１】
工程３：加水分解
【化６】
2019517591.tif 000010
【００３２】
表１Ｃ：ＭＲ−４｛４−［３，５−ジヨード−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸の合成条件
【００３３】
【表３】
2019517591.tif 000011
【００３４】
化合物ＰＧＴ２３０は、ＫＯＨを使用した化合物ＭＲ−３の脱保護によって得ることができる。簡潔に述べると、１００ｍｇの化合物ＭＲ−３を６ｍｌのＴＨＦ／メタノール（１：１）に溶解した。混合物を１５分間撹拌し、次いで２ＭのＫＯＨ６ｍｌを添加し、反応物を室温にて１８時間撹拌した。有機溶媒を完全に蒸発させ、１ＭのＨＣｌによって中和した。沈殿物を真空濾過によって回収し、水で数回洗浄し、一晩乾燥させて、ＴＬＣについての溶媒として使用されるＰＧＴ２３０ジクロロメタン／メタノール（９：１）の白色粉末８３％を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．８５（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）、７．１６（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）、４．６（ｂｒ，１Ｈ）、３．５６（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯＯ）；２．９６（ｓ，２Ｈ，−−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ）。
【００３５】
図面を参照すると、図２ｄ〜２ｆの実施形態は、図２ａ〜２ｃのテトラック誘導体の化学式を示す。しかしながら、酸素を含む可変物Ｘの代わりに、誘導体組成物２１５、２２５および２３５の各々は、可変物Ｘの代わりに置換された硫黄を含む。図２ｄ〜２ｆに示される組成物２１５、２２５、２３５と同様に、誘導体３１０、３２０および３３０は一般式１００の別の変形例を記載する。図３ａ〜３ｃの実施形態において、示されるチロインテグリンアンタゴニストは、Ｒ４を水素で置換し、一方、Ｒ１〜Ｒ３はヨウ素で置換される。したがって、３つのヨウ素および１つの水素の置換のために、図３ａ〜３ｃに示される甲状腺アンタゴニストは、テトラックではなくトリヨードチロ酢酸（トリアック）であり得る。組成物３１０、３２０および３３０は、モノアミノ−トリアック３１０、ジアミノ−トリアック３２０およびプロパルギルトリアック３３０の誘導体としてまとめて同定することができる。チロインテグリンアンタゴニストの実施形態において、甲状腺アンタゴニストの使用の誘導体は、図２ａ〜３ｃに提供される例とは対照的に、ヨウ素を含まなくてもよい。図４ａ〜４ｃの実施形態はチロインテグリンアンタゴニスト４１０、４２０、４３０を示し、ここで、Ｒ１〜Ｒ２の各々は水素で置換され、Ｒ３〜Ｒ４の各々はイソプロピル基で置換される。
【００３６】
下記の表２は、一般式１００の可変物にすることができる複数の異なる置換を記載する：
【００３７】
【表４】
2019517591.tif 000012
【００３８】
【表５】
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【００３９】
【表６】
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【００４０】
【表７】
2019517591.tif 000015
【００４１】
本開示のチロインテグリンアンタゴニストのいくつかの実施形態において、一般式１００のチロインテグリンアンタゴニストは、図５の実施形態５００によって開示される一般式によって示されるように、可変物Ｙの非開裂性共有結合を介して、非生分解性ポリマー（可変物Ｚ）にコンジュゲートされ得る。可変物Ｚに対して置換され得る好適なポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、キトサン、アルギン酸およびヒアルロン酸、それらのポリマーの組み合わせ、または当業者に公知であるか、もしくは使用される任意の他の非開裂性ポリマーが含まれ得るが、これらに限定されない。チロインテグリンアンタゴニストの誘導体６００は、実施形態５００の一般的な実施形態への可変物Ｚに対するＰＥＧポリマーの置換の例を示し、ここで、ＰＥＧポリマーは、可変物ｎ２によって定義される１つまたは複数の反復モノマーサブユニットを有する。例えば、可変物ｎ２は、１以上の任意の数の反復モノマーであってもよい。ＰＥＧのサイズは、ＰＥＧ鎖中のモノマーの反復数の数に依存して変化し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＥＧのサイズはいくつかの実施形態において１，０００〜１５，０００ダルトンであってもよいが、代替の実施形態においてＰＥＧは１，０００〜４，０００ダルトンまたは４，０００〜６，０００ダルトンまたはそれ以上であってもよい。
【００４２】
本出願の例示的な実施形態において、ポリマーにコンジュゲートした甲状腺ホルモンは、上記の表１に示されるように、テトラック、トリアック、またはそれらの誘導体であってもよい。図７ａ〜７ｃは、非開裂性共有結合を介してポリマーＰＥＧにコンジュゲートしたテトラックの例示的な実施形態の化学式を示す。例えば、図７ａにおいて、図面は、非開裂性モノアミン結合（Ｎ−Ｃ結合）によりリンカーを介してＰＥＧポリマーに共有結合したテトラック分子を含むチロインテグリンアンタゴニスト７１０を示す。得られた組成物は、ＰＥＧ−モノアミノプロピルテトラック（Ｐ−ＭＡＴ）として記載され得る。図７ｂの代替の実施形態７２０において、例示的な組成物は、非開裂性ジアミン結合によりリンカーを介してＰＥＧポリマーに結合したテトラック分子であり、その結果、ＰＥＧ−ジアミノプロピルテトラック（Ｐ−ＤＡＴ）と記載され得る組成物が得られる。さらに第３の例示的な実施形態７３０において、テトラックは、非開裂性トリアゾール結合によりＰＥＧポリマーに共有結合してもよい。得られた組成物７３０は、ＰＥＧ−トリアゾールテトラック（Ｐ−ＴＡＴ）と記載され得る。
【００４３】
図８は、ＰＥＧ（１，０００〜１５，０００ダルトン）に結合した非開裂性リンカーを介してＰＥＧポリマーを種々の活性αｖβ３インテグリン甲状腺アンタゴニストにコンジュゲートし、Ｐ−ＭＡＴ、Ｐ−ＤＡＴおよびＰ−ＴＡＴの形成をもたらす、１つまたは複数の工程を例示するフロー図８００を示す。提供される例示的な方法において、本開示の各々の組成物は、ポリマーとしてモノメトキシＰＥＧ、リンカーならびにＤＡＴ、ＭＡＴおよびＴＡＴなどのコンジュゲーション工程の間に提供される、甲状腺アンタゴニストテトラック、トリアックおよび誘導体の複数の可変物を使用して示した。
【００４４】
図８は、モノメトキシＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ−ＯＨ）で開始するＰ−ＭＡＴおよびＰ−ＤＡＴを作製する工程を示す。工程８０１の下で、ｍ−ＰＥＧ−ＯＨをトシル化して、モノトシル化ＰＥＧ８０７（ｍ−ＰＥＧ−ＯＴＳ）およびｍ−ＰＥＧアルデヒド８０６を形成することができる。工程８０２において、モノトシル化ＰＥＧは、工程８０２においてＭＡＴ２１０またはその誘導体に導入されて、クリック化学によってＰ−ＭＡＴ７１０を形成することができる。同様に、モノトシル化ＰＥＧ８０７をＭＡＴ３１０に導入する代わりに、工程８０３において、モノトシル化ＰＥＧ８０７はＤＡＴ２２０に導入されて、示すようにクリック化学によってＰ−ＤＡＴ７２０を形成することができる。
【００４５】
モノメトキシ−ＰＥＧから開始してＰ−ＴＡＴを形成するために、ｍＰＥＧ−ＯＨは、工程８０４を介して、ｍ−ＰＥＧ−ＯＨをモノトシル化ＰＥＧ８０７にトシル化することによってｍ−ＰＥＧ−アジドに変換され、モノトシル化ＰＥＧ８０７をＮａＮ３と合わせることによってモノトシル化ＰＥＧ８０７をｍ−ＰＥＧ−アジド８０８に変換することができる。ｍ−ＰＥＧ−アジド８０８は、工程８０５において、プロパルギルテトラック２３０と混合し、トリアゾール結合を生成し、Ｐ−ＴＡＴ７３０を生じることができる。
【００４６】
図面に提供され、本出願全体にわたって記載される実施例の各々は、さらに精製することなく使用された市販の化学物質を使用して調製されたことに留意されるべきである。全ての溶媒を乾燥し、無水溶媒を、活性化分子篩（溶媒の種類に応じて０．３または０．４ｎｍ）を使用して得た。全ての反応（特に反応物質として水、溶媒または共溶媒を含まない場合）は、オーブン乾燥ガラス製品中で、ＡｒまたはＮ２雰囲気下で実施する。全ての新たな化合物は、満足のいく１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析結果を与えた。融点を、Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｔｈｅｒｍａｌ  ＭＥＬ−ＴＥＭＰ（登録商標）融点装置で測定し、次いでＴｈｏｍａｓ  ＨＯＯＶＥＲ  Ｕｎｉ−ｍｅｌ毛細管融点装置で測定した。赤外スペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ａｖａｔａｒ  ３３０  ＦＴ−ＩＲ装置で記録した。ＵＶスペクトルをＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６５０ＰＣ  ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計から得た。溶液状態ＮＭＲ実験は全て、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＩ、Ｔｒｏｙ、ＮＹ）において、ｚ軸勾配を有する極低温冷却プローブ（ＴＣＩ）（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＩＩ  ８００ＭＨｚ分光光度計で実施した。使用した全てのチューブは５ｍｍの外径であった。ＮＭＲデータは、内部参照としてクロロホルム（ＣＤＣｌ３；７．２７ｐｐｍ  １Ｈ、７７．２０ｐｐｍ  １３Ｃ）またはＤＭＳＯ−ｄ６（δ＝２．５０ｐｐｍ、３８．９２ｐｐｍ  １３Ｃ）を参照した。化学シフトδはｐｐｍで与えられ；多重度はｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｍ（多重項）およびｂｒ（ブロード）として示され；結合定数ＪはＨｚで報告される。薄層クロマトグラフィーは蛍光指示薬を有するシリカゲルプレートで実施した。可視化は、ＵＶ光（２５４および／または３６５ｎｍ）によって、および／またはモリブデン酸アンモニウムセリウムもしくは硫酸溶液中での染色によって達成した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュシリカゲルを用いて、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３、１４、１９７８、２９２３−２９２５に示される手順に従って実施した。高分解能質量スペクトル分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＰＩ４０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱＳＴＡＲ  ＸＬ質量分析計のいずれかで実施した。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本開示全体にわたって記載されるポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストは、二官能性または四官能性組成物であってもよい。「二官能性」という用語は、非開裂性共有結合を介して、一般式５００の同じポリマー（Ｚ）にコンジュゲートした２つの甲状腺アンタゴニストまたはその誘導体を有するポリマーがコンジュゲートした甲状腺アンタゴニストを指すことができる。二官能性組成物の一つを図９に見ることができ、チロインテグリンアンタゴニスト９００は、炭素原子リンカーおよび可変物Ｙによって表される非開裂性結合を介して実施形態９００の両側において甲状腺ホルモンアンタゴニストにコンジュゲートしたＰＥＧポリマーを含む。図１０ａ〜図１０ｃは、図９の実施形態９００に示される可変物の１つまたは複数の特定の置換の例を提供する。
【００４８】
例えば、図１０ａにおいて、可変物ｎ２によって表される１つまたは複数の反復サブユニットを有するＰＥＧポリマーは、２つの異なるアミノ結合およびテトラックまたはテトラック誘導体を含む甲状腺ホルモンアンタゴニストに結合した炭素リンカーを使用してコンジュゲートされ得る。図１０ａに示されるように、チロインテグリン受容体アンタゴニストは２つのＭＡＴ分子を含んでもよく、各々のＭＡＴ分子は非開裂性アミノ結合を介してＰＥＧポリマーの最も外側のＰＥＧ分子にコンジュゲートされ得る。したがって組成物１０１０は、ポリエチレングリコール−ビ−モノアミンプロピルテトラック（Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴ）１０１０と呼ぶことができる。
【００４９】
図１０ａの組成物１０１０と同様に、図１０ｂの組成物は、二官能性Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴにおけるＭＡＴの各々を、ＰＥＧポリマーと甲状腺ホルモンアンタゴニストとの間の結合を形成するコンジュゲーションを形成する非開裂性ジアミノ結合で置換することができる。したがって、ジアミノ結合を含む組成物１０２０は、ポリエチレングリコール−ｂｉ−ジアミノプロピルテトラック（Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ）１０２０としてまとめて記載することができる。１つまたは複数の代替の実施形態において、ＭＡＴ２１０またはＤＡＴ２２０を使用する代わりに、非開裂性結合を介してＰＥＧポリマーにコンジュゲートされるチロインテグリンアンタゴニストは複数のＰＧＴ２３０分子であり得る。図７ｃに示すように、ＰＧＴ分子およびその誘導体は、ポリマー（ＰＥＧ）とＰＧＴとの間に非開裂性トリアゾール結合を形成し、Ｐ−ＴＡＴ７３０を形成し得る。Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴ１０１０およびＰ−ｂｉ−ＤＡＴ１０２０と同様に、Ｐ−ＴＡＴは、各々の甲状腺ホルモンアンタゴニストまたはその誘導体をＰＥＧポリマーにコンジュゲートするトリアゾール結合を含む、図１０ｃに示されるその二官能性の変形を形成し得る。二官能性分子は、ポリエチレングリコール−ｂｉ−トリアゾール−テトラック（Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ）と呼ぶことができる。
【００５０】
図１１は、ＰＥＧ（実施形態１１００においてＯＨ−ＰＥＧ−ＯＨとして示される）を使用して二官能性チロインテグリンアンタゴニストＰ−ｂｉ−ＭＡＴ１０１０、Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴおよびＰ−ｂｉ−ＴＡＴを合成するための１つまたは複数の方法を記載する。方法１１００の第１の工程において、ＰＥＧは、工程１１０１において、トシル化されてｂｉ−トシル化ＰＥＧを形成することができる。以下に記載される１つの例において、ＰＥＧをトシル化するための工程は以下の例に記載されるように実施され得る：
【化７】
2019517591.tif 000016
【００５１】
ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（１．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、ｅｑ＝１）を５０ｍｌのＤＣＭに溶解し、１５分間撹拌した。４−トルエンスルホニルクロリド（０．３８ｇ、２．０２ｍｍｏｌ、ｅｑ＝８）および１ｍｌのＴＥＡを混合物に添加した。反応物を室温にて一晩撹拌した。反応物をＤＣＭ中で希釈し、ＨＣｌ  １Ｎ（２Ｘ）、ブライン  １Ｘによって洗浄した。混合物を濃縮し、ＤＣＭを完全に除去し、酢酸エチルによって一晩再結晶させた。濾過後に白色粉末を回収し、残渣１．４ｇを得た。
【００５２】
方法１１００の第２の工程は、達成されるように見える所望の最終製品に応じて変えることができる。所望の最終チロインテグリンアンタゴニストがＰ−ｂｉ−ＭＡＴ１０１０である場合、ｂｉ−トシル化ＰＥＧは、工程１１０２を介して、ＭＡＴ２１０の存在下で導入されて、ｂｉ−トシル化ＰＥＧにおけるトシル基が、ＰＥＧポリマーの両側にアミノ結合を介して共有結合したＭＡＴ２１０で置換されてＰ−ｂｉ−ＭＡＴを生成することができる。同様に、ｂｉ−トシル−ＰＥＧのトシル基は、工程１１０３において、ＤＡＴ２２０基で置換され得る。ｂｉ−トシルＰＥＧがＤＡＴの存在下で導入されると、ＤＡＴは１つまたは複数の共有ジアミノ結合を介してＰＥＧに結合し、Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ１０２０を形成することができる。
【００５３】
しかしながら、所望の目標がＰ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０を得ることである場合、１つまたは複数のさらなる工程が実施されてもよい。最初に、工程１１０４において、ｂｉ−アジド−ＰＥＧが、工程１１０１のｂｉ−トシル化ＰＥＧから形成され得る。ｂｉ−アジド−ＰＥＧを合成する工程の実施形態の一例は以下に記載され得る：
ｂｉ−アジド−ＰＥＧの合成（ＭＷ＝４０００）
【化８】
2019517591.tif 000017
ｓＴＯ−ＰＥＧ−ＯＴｓ（２５００ｍｇ、約０．５ｍｍｏｌ、ｅｑ．＝１）を２０ｍｌのＤＭＦに溶解し、次いで３０００ｍｇのＮａＮ３を溶液に加え、反応を一晩８０℃に設定する。２００ｍｌの水を溶液に加え、ＤＣＭにより３回抽出する。有機相を合わせ、ブラインにより洗浄し、ＭｇＳＯ４により乾燥した。溶媒を除去し、−２０℃にて酢酸エチルによって再結晶させ、濾過して、１７５０ｍｇのｂｉ−アジド修飾ＰＥＧを得る。
【００５４】
ｂｉ−アジド修飾ＰＥＧが工程１１０４で得られると、ｂｉ−アジド−ＰＥＧを工程１１０５においてＴＡＴ７３０の存在下で反応させて、図１１に示されるＰ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０を形成することができる。以下の例は、ｂｉ−アジド−ＰＥＧからＰ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０への反応の合成をさらに詳細に実証する。
Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴの合成（ＭＷ＝４０００）
【化９】
2019517591.tif 000018
ｂｉ−アジド−ＰＥＧ（Ｎ３−ＰＥＧ−Ｎ３）（２０００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、ｅｑ＝１）を８ｍｌのＤＭＦに溶解し、次いで１５７０ｍｇのＴＡＴ（２ｍｍｏｌ、ｅｑ＝４）を反応物に加えた。２８６ｍｇのＣｕＢｒ（２ｍｍｏｌ、ｅｑ＝４）および８１４μｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）（４ｍｍｏｌ、ｅｑ＝８）を２ｍｌのＤＭＦに溶解し、溶液に添加し、６０〜６５℃にて一晩反応を設定した。反応物を室温に冷却し、反応物を１００ｍｌのＤＣＭ中で希釈した。カルボン酸によって負に活性化した酸化アルミニウムカラムを通過させることによって銅を除去し、ＤＣＭによって数回洗浄し、次いで混合物を１００ｍｌに濃縮した。混合物を２００ｍｌの水（３×）およびブライン（２×）によって洗浄した。５）有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ＤＣＭを除去し、最後に酢酸エチル２００ｍｌを添加することによって最終生成物を再結晶させた。再結晶をさらに２回繰り返し、黄色がかった粉末を濾過により得た。
【００５５】
甲状腺類似体のフェノール性ヒドロキシル基（−ＯＨ）は、それらの修飾にとって重要な部位であり、テトラックのカルボン酸部分を変化させることなく、テトラックをインテグリンアンタゴニストに変換するための標的部位として重要である。分子構造テトラヨードチロ酢酸（テトラック）を臭化プロパルギルにより合成的に修飾して、アルキン修飾テトラック、プロパルギルテトラック（ＰＧＴ）、｛４−［３，５−ジヨード−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸；分子量、７８５ダルトンを調製する。クリック化学によりＰＧＴをＯ，Ｏ’−ビス（アジド）ポリエチレングリコール（分子量、４，０５０ダルトン）にコンジュゲートして、図１１および以下に示すＰ−ｂｉ−ＴＡＴ合成についてのスキームに示すように、分子量５，６２０ダルトンのｐ−ｂｉ−ＴＡＴを得る：
Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ合成：
【化１０】
2019517591.tif 000019
化合物名：Ｏ，Ｏ’−ビス（｛４−［３，５−ジヨード−４−（１−メチレン−１，２，３−トリアゾール−４−イルメトキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸）ポリエチレングリコール。
物理的外観：黄褐色の粉末の溶解性：５０ｍｇ／ｍｌの水；１００ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液；１５０ｍｇ／ｍｌの１０％エタノール；および２００〜３００ｍｇ／ｍｌの５０％プロピレングリコールに可溶。
【００５６】
ポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストのいくつかの実施形態において、組成物は、一般式６００によって示されるように単官能性または一般式９００を有する組成物によって示されるように二官能性であるだけでなく、さらに図１２の例によって示されるように四官能性であってもよい。例えば、図１１および上記に記載されるように、Ｐ−ｂｉ−ＭＡＴ１０１０、Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ１０２０およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴを調製する方法と同様に、Ｐ−テトラ−ＭＡＴ１２１０、Ｐ−テトラ−ＤＡＴおよびＰ−テトラ−ＴＡＴの四官能性誘導体が合成され得る。図１２に示される四官能性チロインテグリンアンタゴニストを調製する合成工程は、図８および１１の例示的な方法に示されるモノコンジュゲートおよびビコンジュゲート誘導体を調製する工程と類似し得る。
【００５７】
例えば、出発材料としてｍ−ＰＥＧまたはＰＥＧを使用する代わりにテトラ−ＰＥＧを使用してもよい。工程１２０１において、テトラ−ＰＥＧをＰ−テトラ−ＯＴＳにトシル化し、続いてＰ−ＭＡＴ７１０またはＰ−ＤＡＴ７２０の存在下で反応させて、それぞれＰ−テトラ−ＭＡＴ１２１０およびＰ−テトラ−ＤＡＴ１２２０を形成することができる。同様に、Ｐ−ＴＡＴ７３０およびｐ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０の合成と類似して、ｐ−テトラ−ＴＡＴ１２３０を、工程１２０４に示されるように、トシル化Ｐ−テトラ−ＯＴＳをＰ−テトラ−アジドに最初に変換することによって合成することができる。続いて、工程１２０５において、ｐ−テトラ−アジド組成物をｐ−ＴＡＴ７３０の存在下で反応させて、ｐ−テトラ−ＴＡＴ１２３０を生成することができる。
【００５８】
チロインテグリンアンタゴニストの代替の実施形態において、ポリマーである一般式５００のＺを、図１３ａの一般式１３００によって示されるように、α、β、またはγシクロデキストリンに置換することができる。式１３００において、可変物ｎ３はシクロデキストリンの１、２または３個の反復モノマーサブユニットであり、反復サブユニットの数は、コンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストにおけるポリマーとして使用されるシクロデキストリンを同定することができる。例えば、ｎ３＝１の場合、シクロデキストリンはα−シクロデキストリンであり、ｎ３＝２の場合、シクロデキストリンはβ−シクロデキストリンであり、ｎ３＝３の場合、シクロデキストリンはγ−シクロデキストリンであり得る。上記の一般式１００および５００によって記載される他のチロインテグリンアンタゴニスト誘導体と同様に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、Ｙおよびｎ１に対する置換は、式１３００において同様に発生し得る。図１３ｂ〜１３ｄは、シクロデキストリンがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストの例を提供する。具体的には、図１３ｂにおいて、シクロデキストリン−モノアミノ−プロピルテトラック（Ｃ−ＭＡＴ）１３１０が提供され、一方、図１３ｃにおいて、シクロデキストリン−ジアミノ−プロピルテトラック（Ｃ−ＤＡＴ）１３２０が例示される。さらに、図１３ｄは、シクロデキストリン−トリアゾールテトラック（Ｃ−ＴＡＴ）１３３０の化学構造の例を示す。
【００５９】
Ｃ−ＭＡＴ１３１０、Ｃ−ＤＡＴ１３２０、およびＣ−ＴＡＴ１３３０を合成する方法は、以前に記載されるＰ−ＭＡＴ７１０、Ｐ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０の代替としてコンジュゲートした変形例と同様の合成工程に従う。図１４ａおよび図１４ｂに示されるように、合成は、シクロデキストリンポリマーをトシル化シクロデキストリンにトシル化することによって工程１４０１において開始することができる。Ｃ−ＭＡＴ１３１０またはＣ−ＤＡＴ１３２０を生成するために、ＭＡＴ２１０またはＤＡＴ２２０は、それぞれ工程１４０２または１４０３においてトシル化シクロデキストリンの存在下で反応させることができる。Ｃ−ＴＡＴ１３３０を合成するために、工程１４０１から得られたトシル化シクロデキストリンを工程１４０４においてさらに反応させてシクロデキストリン−アジド組成物を生成することができ、これを工程１４０５においてＰＧＴ２３０の存在下でさらに反応させて、Ｃ−ＴＡＴ１３３０の合成を生じることができる。
【００６０】
以下の例は、シクロデキストリンがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストの合成をより詳細に記載する：
【００６１】
Ｃ−ＴＡＴの合成  −  合成の概要：甲状腺類似体のフェノール性ヒドロキシル基（−ＯＨ）はそれらの修飾にとって重要な部位であり、テトラックのカルボン酸部分を変化させることなく、テトラックをインテグリンアンタゴニストに変換するための標的部位として重要である。分子構造テトラヨードチロ酢酸（テトラック）を臭化プロパルギルにより合成的に修飾して、アルキン修飾テトラック、プロパルギルテトラック（ＰＧＴ）、｛４−［３，５−ジヨード−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸；分子量、７８５ダルトンを調製する。クリック化学によりＰＧＴをモノ−６−アジド−デオキシ−６−β−シクロデキストリンにコンジュゲートしてβ−Ｃ−ＴＡＴを生成した。
【化１１】
2019517591.tif 000020
【化１２】
2019517591.tif 000021
ベータＣ−ＴＡＴ：分子量：１，９４４．８９ダルトン
化合物名：６−（｛４−［３，５−ジヨード−４−（１−メチレン−１，２，３−トリアゾール−４−イルメトキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸）−６−デオキシ−β−シクロデキストリン
【００６２】
γ−Ｃ−ＴＡＴの合成  −  合成の概要：
甲状腺類似体のフェノール性ヒドロキシル基（−ＯＨ）はそれらの修飾にとって重要な部位であり、テトラックのカルボン酸部分を変化させることなく、テトラックをインテグリンアンタゴニストに変換するための標的部位として重要である。分子構造テトラヨードチロ酢酸（テトラック）を臭化プロパルギルにより合成的に修飾して、アルキン修飾テトラック、プロパルギルテトラック（ＰＧＴ）、｛４−［３，５−ジヨード−４−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸；分子量、７８５ダルトンを調製する。クリック化学によりＰＧＴをモノ−６−アジド−デオキシ−６−γ−シクロデキストリンにコンジュゲートして、２，１０８ダルトンの分子量を有するγ−Ｃ−ＴＡＴを得た。
Ｃ−ＴＡＴの合成についての詳細な概要は以下に示す通りである。
【化１３】
2019517591.tif 000022
Ｃ−ＴＡＴの構造
化合物名：６−（｛４−［３，５−ジヨード−４−（１−メチレン−１，２，３−トリアゾール−４−イルメトキシ）フェノキシ］−３，５−ジヨードフェニル｝酢酸）−６−デオキシ−γ−シクロデキストリン
分子量：２，１０８ダルトン
【００６３】
一般式５００を有するポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストのいくつかの代替の実施形態において、可変物Ｚによって示されるポリマーは、図１５ａ〜１５ｃに示される例によって示されるように、アルギン酸ポリマーで置換することができる。例えば、図１５ａにおいて、アルギン酸ポリマーをＰ−ＭＡＴ７１０にコンジュゲートさせて、アルギン酸−モノアミノ−プロピルテトラック（Ａ−ＭＡＴ）１５１０またはその誘導体を生成させることができ、可変物ｎ４はアルギン酸の反復モノマーサブユニットの数を定義する。可変物ｎ４は１以上の任意の数の反復サブユニットであってもよい。図１５ｂにおいて、ＤＡＴ７２０を使用したアルギン酸ポリマーまたはその誘導体への代替のコンジュゲーションが使用されてもよい。得られたアルギン酸ポリマーとＤＡＴ７２０とのコンジュゲーションは、アルギン酸−ジアミノ−プロピルテトラック（Ａ−ＤＡＴ）１５２０と称され得るが、ＴＡＴ７３０とアルギン酸との間のコンジュゲーションは、アルギン酸−トリアゾールテトラック（Ａ−ＴＡＴ）１５３０またはその誘導体の形成を生じる。
【００６４】
Ａ−ＭＡＴ１５１０、Ａ−ＤＡＴ１５２０およびＡ−ＴＡＴ１５３０の合成は、上記のＰＥＧおよびシクロデキストリンの以前のポリマーコンジュゲーションの合成と比較して、わずかに変更した一連のステップに従う。図１６ａに示すように、合成方法はアルギン酸ポリマーで開始する。ポリマーをトシル化する代わりに、工程１６０１はアルギン酸をＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）をアルギン酸のカルボキシル基に付着させる。工程１６０２および１６０３において、ＭＡＴ２１０（工程１６０２）またはＤＡＴ２２０（工程１６０３）を導入して、アルギン酸のＮＨＳをＭＡＴ２１０と置換し、Ａ−ＭＡＴ１５１０を形成するか、またはＤＡＴ２２０と置換し、Ａ−ＤＡＴ１５２０を形成することによって、ＮＨＳを置換反応において除去することができる。
【００６５】
図１６ｂは、アルギン酸出発物質からＡ−ＴＡＴ１５３０を調製するための方法の工程を示す。工程１６０１において、アルギン酸をＮＨＳと反応させてＮＨＳ−アルギン酸を形成する。工程１６０４において、ＮＨＳ−アルギン酸はアジド化合物との反応を受け、アルギン酸のカルボキシル基に結合したＮＨＳをアジド化合物で置換し、図１６ｂに示されるようにアルギン酸−アジド化合物を生じる。最後に、工程１６０４のために形成されたアルギン酸−アジド化合物を、工程１６０５において、ＰＧＴ２３０の存在下でさらに反応させて、アジド基のＮ３とトリアゾール結合を形成し、Ａ−ＴＡＴ１５３０を生成することができる。
【００６６】
一般式５００を有するポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストのいくつかの代替の実施形態において、可変物Ｚによって示されるポリマーは、図１７ａ〜１７ｃに示される例によって示されるように、ヒアルロン酸ポリマーで置換することができる。例えば、図１７ａにおいて、ヒアルロン酸ポリマーをＰ−ＭＡＴ７１０にコンジュゲートさせて、ヒアルロン酸−モノアミノ−プロピルテトラック（Ｈ−ＭＡＴ）１７１０またはその誘導体を生成させることができ、ここで、可変物ｎ４はヒアルロン酸の反復モノマーサブユニットの数を定義する。可変物ｎ４は１以上の任意の数の反復サブユニットであってもよい。図１７ｂにおいて、ＤＡＴ７２０およびヒアルロン酸ポリマーまたはその誘導体を使用した代替のコンジュゲーションが使用されてもよい。結果として生じるヒアルロン酸ポリマーとＤＡＴ７２０とのコンジュゲーションは、ヒアルロン酸−ジアミノ−プロピルテトラック（Ｈ−ＤＡＴ）１７２０と称され得るが、ＴＡＴ７３０とヒアルロン酸との間のコンジュゲーションは、ヒアルロン酸−トリアゾールテトラック（Ｈ−ＴＡＴ）１７３０またはその誘導体の形成を生じる。
【００６７】
Ｈ−ＭＡＴ１７１０、Ｈ−ＤＡＴ１７２０およびＨ−ＴＡＴ１７３０の合成は、上記の図１６ａ〜１６ｂのポリマーがコンジュゲートしたアルギン酸方法論と同様の一連の合成工程に従う。図１８ａに示すように、合成方法はヒアルロン酸ポリマーで開始する。ポリマーをトシル化する代わりに、工程１８０１は、ヒアルロン酸を、ヒアルロン酸ポリマーのカルボキシル基に対してＮＨＳと反応させる。工程１８０２および１８０３において、ＭＡＴ２１０（工程１８０２）またはＤＡＴ２２０（工程１８０３）を導入して、ヒアルロン酸のＮＨＳをＭＡＴ２１０で置換し、Ｈ−ＭＡＴ１７１０を形成するか、またはＤＡＴ２２０で置換し、Ｈ−ＤＡＴ１７２０を形成することによって、置換反応においてＮＨＳを除去することができる。
【００６８】
図１８ｂは、ヒアルロン酸出発物質からＨ−ＴＡＴ１７３０を調製するための方法の工程を示す。工程１８０１において、ヒアルロン酸をＮＨＳと反応させてＮＨＳ−ヒアルロン酸を形成する。工程１８０４において、ＮＨＳ−ヒアルロン酸はアジド化合物との反応を受け、ヒアルロン酸のカルボキシル基に結合したＮＨＳをアジド化合物で置換し、図１８ｂに示されるように、ヒアルロン酸−アジド化合物を生じる。最後に、工程１８０４のために形成されたヒアルロン酸−アジド化合物は、工程１８０５において、ＰＧＴ２３０の存在下でさらに反応して、アジド基のＮ３とトリアゾール結合を形成し、Ｈ−ＴＡＴ１７３０を生成することができる。
【実施例】
【００６９】
ポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストの使用方法
実施例１  抗血管新生効果：
マウスマトリゲル成長因子インプラント血管新生モデル：
マウスマトリゲルモデルは、動物の安全性および幸福に関する制度のガイドラインに従って実施した。５〜６週齢および２０ｇの体重の雌マウスＣ５６／ＢＬは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。動物を特定の病原体を含まない条件下で維持し、温度（２０〜２４℃）および湿度（６０〜７０％）の制御された条件下、および１２時間の明／暗サイクル下で１つのケージ当たり４匹の動物を収容した。Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ（ＶＡ）Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｌｂａｎｙ、ＮＹの動物施設およびＶＡＩＡＣＵＣによって承認された実験プロトコルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施した。マウスを実験の開始前に５日間馴化させた。血管形成を促進するために成長因子を含むＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎおよびミックスを１００μｌ／動物にて４回皮下注射した。対照群の動物に、１００μｌ容量のマトリゲルを単に注射した。
【００７０】
ポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴ、ＴＡＴまたはＭＡＴ誘導体を３つの異なる用量（１０、３０、１００μｇ／１０μｌ）で試験した。全ての群は１群当たり３匹のマウスを有し、１群当たり１２のマトリゲル皮下注射を行った。プラグ移植後１４日目に、全ての動物を屠殺し、分光光度法を使用してヘモグロビン含有量を定量した。図２１は、成長因子に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴおよびその有効な抗血管新生効力についての代表的なデータを示す。図２１に見られ得るように、この試験の間に測定したＰ−ｂｉ−ＴＡＴおよび他のチロインテグリンアンタゴニストの抗血管新生効果は、測定されたヘモグロビンレベルによって明らかなように、血管新生に対する用量依存反応を示した。
【００７１】
実施例２：ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルの決定（血管新生指数の測定）
マトリゲルプラグヘモグロビン（Ｈｂ）含有量を新たな血管形成の尺度として指標付けした。簡潔に述べると、マトリゲルプラグを、再蒸留水を含有する０．５ｍｌチューブに入れ、次いで５〜１０分間ホモジナイズした。試料を４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離に供し、次いで上清を回収した。５０μｌの体積の上清を５０μｌのＤｒａｂｋｉｎ試薬と混合し、室温にて１５〜３０分間静置させ、その後、１００μｌを９６ウェルプレートに入れ、吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５４０ｎｍにて測定した。Ｈｂ濃度は、標準曲線との比較に基づいてｍｇ／ｍｌとして表した。
【００７２】
実施例３：マウス皮下がん細胞移植
腫瘍血管新生に対する抗血管新生効力を、マトリゲルヌード雌マウスに移植した卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ３）を使用して試験した。ポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴ、ＭＡＴおよびＴＡＴによる毎日の処置（１ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ、ＱＤ）の１４日後、マトリゲル腫瘍移植片を除去し、ヘモグロビンについて分析した。腫瘍媒介性血管新生に対する抗血管新生効果の代表的なデータを、図２２のデータによって示されるヘモグロビン測定値の関数として示す。
【００７３】
実施例４：異なるがん細胞株におけるαｖβ３の発現（フローサイトメトリー分析）／共焦点像
細胞を一晩培養し、細胞をトリプシン処理後に回収した。次いで細胞を、ＦＩＴＣがコンジュゲートした抗αｖβ３と３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、αｖβ３発現を、図２３および以下の表３に示すように、フローサイトメトリーを使用して試験した。さらに、αｖβ３発現レベルを、図２４に示すように、共焦点顕微鏡下で観察した。
【００７４】
【表８】
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【００７５】
実施例５：急性骨髄性白血病モデル：トランスジェニックマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）雄
ＴＨＰ−１−ｌｕｃ細胞を対照（ビヒクル）群に腹腔内注射し（０．１ｍｌ中に５×１０６細胞）、３ｍｇ／ｋｇにてポリマーがコンジュゲートしたジアミノテトラック（Ｐ−ＤＡＴ７２０）またはポリマーがコンジュゲートしたトリアゾールテトラック（Ｐ−ＴＡＴ７３０）を３週間、１日に１回皮下注射した。血液試料を、細胞を注射する前、処置前、および処置後１週間に１回、採取した。３週間後に終了した動物に、ＴＰＨ−１細胞の発光シグナル強度について四肢、肝臓、脾臓、心臓および肺のＩＶＩＳイメージングを実施した。さらに、骨髄塗抹標本を調製し、Ｌｅｉｓｈｍａｎ染色を実施した。図２５は、ポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０と比較して、対照において多くの芽球細胞が観察された白血病モデルの代表的なデータを示す。
【００７６】
実施例６：抗がん有効性：ヌードマウスにおけるＵ８７ＭＧ異種移植片に対するポリマーがコンジュゲートしたＤＡＴおよびＤＡＴの効果
神経膠芽腫の異種移植モデルはＧＢＭの試験のための標準的なモデルである。現在の試験において、５〜６週齢で体重１８〜２０ｇの無胸腺免疫不全ＮＣｒヌードマウスを使用した。動物に水および食物を自由に与えた。動物は試験前に５日間施設に馴化させた。培養したＵ８７ＭＧ−ｌｕｃ細胞を採取し、各々の側腹部に皮下（ｓ．ｃ）移植した（５０％マトリゲル（登録商標）を含有する１００μＬ体積中の５×１０６細胞）。腫瘍は、対照、Ｃ−ＤＡＴ１３２０、Ｃ−ＴＡＴ１３３０、Ｐ−ＴＡＴ７３０、Ｐ−ｂｉ−ＤＡＴ１０２０、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０の投与前に、２日間（１５０〜２５０ｍｍ３の最初の体積まで）増殖させた。移植後２日目に処置を開始する直前に、動物を対照および同様の腫瘍体積分布（カリパスにより測定）を含む処置群に分けた。ポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０（３ｍｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ体重）を、動物の２つの群に２１日間毎日皮下投与し、ビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ８．０／０．５％エタノール）を、対照として動物の１つの群に２１日間毎日皮下投与した。４匹の動物および８個の移植片／処置群が存在した。対照群および薬物で処置した動物の１つの群を２１日目に安楽死させ、薬物で処置したマウスの第２の群は、腫瘍の再増殖を検出するためにさらに２２日間の処置を受けていない期間を観察した。したがって、薬物で処置した第２の群は合計４３日間観察した。腫瘍を採取し、秤量し、次いで固定し、スライスし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に供した。顕微鏡スライドは対照腫瘍の全直径を収容した。種々のポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストで処置したＧＢＭ腫瘍のＩＶＩＳイメージングについての代表的な図２５〜２６を参照のこと。
【００７７】
提示したデータにより、ポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０は、皮下Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫異種移植片において効果的であることが実証される。２１日間の全身投与により、薬物は、血管新生を完全に抑制し、広範な壊死を誘発し、アポトーシスを引き起こすことにより、腫瘍体積を減少させた。ポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０はαｖβ３上に単一の分子標的を有するが、この標的は、細胞内シグナル伝達経路のネットワークおよび特定の遺伝子転写を制御する細胞膜機能ならびにがんおよびがん関連血管形成と高度に関連する細胞表面血管増殖因子受容体機能を異なって調節する。αｖβ３は、非分裂性の非悪性細胞によってほとんど発現されないか、または活性化されないので、ポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０の作用を、腫瘍細胞および腫瘍関連血管細胞に制限する。図２８〜３０におけるデータは、腫瘍の進行および退縮に対する、これらの種々のポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０およびＰ−ＴＡＴ７３０の効果を示す。
【００７８】
図２８〜３０に提示したデータは、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの両方の用量でポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストが腫瘍重量を劇的に減少したことを示す。さらなる薬物曝露なしでさらに２２日間観察した第２群の処置マウスにおける異種移植片（非処置群）は、サイズが減少し続け、３および１０ｍｇ／ｋｇ用量の両方で４３日の研究期間にわたって、腫瘍重量の９５％を超える減少を達成した（＊＊ｐ＜０．０１）。図２８〜３０に提示した観察は、代表的なポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＴＡＴ７３０としてＰ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０を用いて２１日目（図３１）に採取した異種移植片における細胞生存の組織学的評価によってさらに支持される。
【００７９】
パラフィン包埋組織切片の組織学的評価を染色し（ヘマトキシリンおよびエオシン）、各切片をコードした。段階マイクロメーターで測定した切片の面積、ならびに細胞密度の喪失、原形質膜の溶解、および核構造の喪失によって現れる生存腫瘍対壊死腫瘍のパーセンテージは、視覚的に評価した。高倍率視野当たりの有糸分裂およびアポトーシス細胞の数を、生存腫瘍領域の５つの視野について計数し、組織切片当たりに平均した。血管新生の程度は生存領域において変化し、これは１〜４のグレードであった。２１日目までに達成された細胞生存率の低下は、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ投薬量のＰ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０に曝露した異種移植片において６０〜７０％であった（＊＊Ｐ＜０．００１）。これらの所見は、壊死に至る腫瘍の系統的脱血管新生およびポリマーＰ−ＤＡＴ７２０またはＰ−ＴＡＴ７３０が誘導する複数のアポトーシス促進機構と一致する。生存細胞についてのＩＶＩＳイメージング（図３２）および組織学的データ（図３１）は、がん細胞の生存に影響を及ぼす代表的なポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＤＡＴ７２０またはＰ−ＴＡＴ７３０としてのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０の効果を確認する。
【００８０】
実施例７：Ｃｙ５標識化Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴおよび他のポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の動態
動物の各群に直交異方性移植片（ＧＢＭ）を与え、脳内で腫瘍を増殖させた後、ＧＢＭ異種移植片を皮下移植した。ポリマーがコンジュゲートしたＭＡＴ２１０、ＴＡＴ２３０またはＤＡＴ２２０誘導体を、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ−Ｃｙ５および他のポリマーがコンジュゲートしたＴＡＴ２３０またはＤＡＴ２２０誘導体−Ｃｙ５と共に皮下注射した。ＩＶＩＳイメージングを、注射直後および３０分、１時間、２時間、３時間、４時間で実施し、直交異方性脳異種移植片腫瘍部位（脳）および皮下異種移植片腫瘍における蛍光強度を検出した。図３３は、脳または皮下移植腫瘍におけるＧＢＭへの最適かつ同等の送達を示す代表的なＩＶＩＳイメージングとして提供される。図３４および３５に示すグラフは、脳または皮下移植腫瘍におけるＧＢＭ腫瘍へのチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の取り込みの動態を記載する。図３４〜３５は、その二官能性実施形態を含む、ＭＡＴ２１０、ＤＡＴ２２０およびＴＡＴ２３０を含有する、ポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト誘導体の経時的な効果を記載する。
【００８１】
Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０およびポリマーがコンジュゲートしたＰ−ＴＡＴ７３０誘導体−Ｃｙ５のＣｙ５シグナルは３０分で脳内に見られ、ＩＶＩＳによる４時間のモニタリングで持続した。４時間後に動物の処置を終了し、Ｃｙ５シグナルを脳ＧＢＭ腫瘍および皮下ＧＢＭ腫瘍異種移植片において検出した。Ｃｙ５シグナルは脳ＧＢＭ腫瘍および皮下ＧＢＭ腫瘍異種移植片において同等であった。図３６は、脳および皮下移植腫瘍異種移植片におけるＧＢＭへの同等の取り込みを示す。
【００８２】
実施例８：ＧＢＭ（Ｕ８７−ｌｕｃ）異種移植片（直交異方性および皮下）に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの効果：
神経膠芽腫細胞：Ｕ８７−ｌｕｃ細胞をマトリゲル２０μｌ中で０．２×１０６細胞にて同所的に移植し、無胸腺雌マウスにマトリゲルを用いて２×１０６細胞／移植にて皮下異種移植した。動物を、脳腫瘍および皮下腫瘍異種移植片の移植およびＩＶＩＳイメージング後１日にＰ−ＤＡＴ７２０、Ｐ−ＴＡＴ７３０の誘導体およびそれらの二官能性誘導体を含む、ポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストで７日間処置した。図３７は、脳ＧＢＭ腫瘍および皮下ＧＢＭ腫瘍における細胞生存率の抑制を含む、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０を使用した腫瘍の用量依存抑制を記載する。図３８〜４０は、脳におけるＧＢＭの発光シグナル、平均腫瘍重量および生物発光強度に対する効果を含む、脳ＧＢＭ腫瘍および皮下ＧＢＭ腫瘍に対するｐ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０の測定可能な用量依存性効果を示す。
【００８３】
実施例９：膵臓がんＳＵＩＴ２異種移植片に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの効果
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のための雌ＮＣｒマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）を５〜６週齢（２０ｇｍ体重）で得、特定の病原体を含まない条件下で維持し、食物および水を自由に与えた。動物を５日間馴化させた。培養したヒトＳＵＩＴ２細胞を採取し、マウスの各側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。１００μＬ、５０％マトリゲル（登録商標）を含み、２×１０６の腫瘍細胞を含む接種物を調製した。腫瘍を７日間増殖させ、その時点で、動物を対照群およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴ群（６匹の動物／群、１２のがん移植片／群）に無作為化した。０日目から開始して、薬物を３または１０ｍｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ／ｋｇ体重で２０日間（実験１９日目まで）毎日投与した。対照動物には、ビヒクル（ＰＢＳ）を毎日与えた。実験２０日目に動物を屠殺した。腫瘍を採取し、腫瘍の重量を測定した。腫瘍をホルマリン固定し、パラフィンに埋め込み、スライスした。
【００８４】
単独およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴと併用した放射線療法の有効性も評価した。放射線治療は、１０日目および１７日目に右側腹部異種移植片に１Ｇｙを投与した。側腹部曝露の幾何学的形状は、試験動物の左側腹部への放射線曝露を除外したため、左側腹部は放射線試験において対照として与えた。
【００８５】
腫瘍重量、細胞生存率および細胞壊死に対する、代表的なポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト（Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ  １０３０）の効果を調べた。膵臓がんＳＵＩＴ２異種移植片重量、細胞生存率、および細胞壊死に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの抗がん効力を図４１ａ〜４１ｃに示す。２０日後の腫瘍重量減少は３ｍｇ／ｋｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴの投与で５５％であり、１０ｍｇ／ｋｇで６５％であった（各々、＊＊＊Ｐ＜０．００１対対照）（図４１ａ）。図４１ｂに示すように、３ｍｇ／ｋｇの薬物濃度では腫瘍細胞生存率の減少率は有意ではなく、１０ｍｇ／ｋｇでは４３％であった（＊＊＊Ｐ＜０．００１対対照）。組織切片における細胞壊死％の増大は、３ｍｇ／ｋｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴでは有意ではなかったが、図４１Ｃのデータによって示されるように、１０ｍｇ／ｋｇの用量で壊死の倍増以上があった（＊＊＊Ｐ＜０．００１対対照）。したがって、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴを用いたこれらの短期試験では、腫瘍サイズおよび組織学的に推定されるがん細胞の生存率および壊死に望ましい変化が認められた。
【００８６】
放射線曝露およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴ投与の相互作用：
膵臓がんＳＵＩＴ２異種移植片重量、細胞生存率および細胞壊死に対する、放射線曝露単独およびＰ−ｂｉ−ＴＡＴと併用した放射線の効果を図４２ａ〜４２ｃに示す。右側腹部異種移植片への１Ｇｙでの放射線処置単独は、放射線に曝露されなかった左側腹部異種移植片に対して３８％のこれらの異種移植片の腫瘍重量の減少を引き起こした（図４２ａ）。放射線および例示的な実施形態のポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト試験Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ１０３０の組み合わせは、７１％（３ｍｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ／ｋｇ）および７７％（１０ｍｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ／ｋｇ）の腫瘍サイズのさらなる減少をもたらした（各々、＊＊＊Ｐ＜０．００１対非照射対照）。薬物と放射線を併用した場合、腫瘍重量に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの用量効果は認められなかった。
【００８７】
図４２ｂに示されるように、細胞生存率％の減少がＰ−ｂｉ−ＴＡＴなしの１Ｇｙでは統計学的有意性なしで示されたが、放射線と３ｍｇ／ｋｇでの薬物の組み合わせは生存率の５４％の減少をもたらし、６８％の減少が１０ｍｇ／ｋｇでは観察された（各々、＊＊Ｐ＜０．０５対非照射対照異種移植片）。さらに、放射線単独による壊死の増加傾向は、図４２（ｃ）に提示したグラフデータによって示したように、統計的に有意ではなかったが、放射線と３ｍｇ／ｋｇでのＰ−ｂｉ−ＴＡＴの併用は６５％および１０ｍｇ／ｋｇで７０％の壊死の増加をもたらした（各々、＊＊Ｐ＜０．０５対非照射対照）。さらに、図４３は、対照と比較して、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴ（３および１０ｍｇ／Ｋｇ、ＳＣ  ＱＤ）と１および５Ｇｙでの膵臓腫瘍の照射との間の相互作用を示すデータをさらに実証する。
【００８８】
このように、図４２ａ〜４２ｃに提供されるデータに基づいて、腫瘍重量の減少ならびに細胞壊死および生存率に対して重要な相加効果をもたらす予期せぬ併用療法が存在すると結論付けることができる。３ｍｇ／ｋｇ体重での腫瘍質量に対するＰ−ｂｉ−ＴＡＴの例示的な組成物を含む、チロインテグリンアンタゴニスト、ポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト、およびそれらの二官能性実施形態の抗腫瘍有効性は、その薬剤についてほぼ最大であり、すなわち、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量での結果は同等である。しかしながら、放射線照射の有無にかかわらず得られた組織学的変化の調査は、１０ｍｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴ／ｋｇが３ｍｇ／ｋｇよりも有効であることを示唆している。上記の一連の異種移植片の観察は、Ｐ−ｂｉ−ＴＡＴなどの、ポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニストが、標準的な実験的状況における膵臓がん異種移植片における非常に効果的な治療的介入であることを確立する。
【００８９】
実施例１０：安全性試験、Ｃ５７ＢＬ６マウス
代表的なＰ−ｂｉ−ＴＡＴのポリマーがコンジュゲートしたチロインテグリンアンタゴニスト抗血管新生剤の前臨床毒性を、様々な用量のＰ−ｂｉ−ＴＡＴで１４日間処置した５〜６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスで追跡した。処置群は、対照（ビヒクル）、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇおよび３３０ｍｇ／ｋｇのＰ−ｂｉ−ＴＡＴであり、１４日間毎日ｓ．ｃ．投与した。各処置群は５匹の雄および５匹の雌の動物からなり、動物の体重を週２回測定した。１４日後にマウスの処置を終了し、血液試料を眼窩後静脈叢から採取した。血液試料を遠心分離し、採取した血漿を下記の分析に供するまで−８０℃で保存した。
【００９０】
肝機能を、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）活性（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｋｉｔ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）の保存血漿中の測定によって評価し、そのデータを図４４に示す。血漿中の心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベルを、心筋損傷の指標としてＥＬＩＳＡ法（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）によって測定した（図４４）。これはもっぱら心臓に見られるトロポニンであり、他の形態の筋肉には見られない。腎機能を血漿クレアチニン濃度の測定により推定した（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｋｉｔ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）（図４４）。満足のいく標準曲線を肝臓および腎臓アッセイの各々について構築した。体重は薬剤による影響を受けなかった（結果は示さず）。達成した最大（３〜１０ｍｇ／ｋｇ）抗がん治療効果より１００倍多い用量のＰ−ｂｉ−ＴＡＴで２週間曝露した雄または雌の動物において、肝臓、心臓または腎臓毒性の証拠は存在しなかった。
【００９１】
本発明の様々な実施形態の詳細が例示目的のために提示されているが、それらは包括的であるか、または開示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。記載された実施形態の範囲および精神から逸脱することなく、多くの修飾および変形が当業者には明らかであろう。本明細書に使用される用語は、実施形態の原理、市場で見られる技術に対する実際的な応用もしくは技術的改善を最もよく説明するために、または当業者が本明細書に開示される実施形態を理解することを可能にするために選択された。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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