(57)【要約】本開示は概して、心血管系疾患の処置のためのアペリンのペグ化リポソーム製剤を含む組成物に関する。アペリンは、Ｇタンパク質共役ＡＰＪ受容体に対する内因性リガンドであり、体液恒常性、血圧、心臓の発生および機能、ならびに多血管リモデリングを含む種々の生物学的機能を調整する。ｉｎ  ｖｉｖｏで生理活性ペプチドが急速に代謝されてから血漿半減期が顕著に短いため、アペリンペプチドの治療的使用は制限されてきた。本開示はこの課題を解決する手段を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定量の少なくとも１つのポロキサマー、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリポソームに少なくとも部分的に封入された、有効量の治療剤を含む組成物。
【請求項２】
前記治療剤が、アペリンペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのポロキサマーが、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー３３１、およびポロキサマー４０７、またはこれらの任意の組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧが、約２００〜約２００００ダルトンの平均分子量を有する（ＰＥＧ２００〜ＰＥＧ２００００）、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＥＧが、約８０００ダルトンの平均分子量を有する（ＰＥＧ８０００）、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記アペリンペプチドが、約１５重量％〜約６０重量％を構成する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポロキサマーが、約１重量％〜約２０重量％を構成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＤＳＰＣが、約５重量％〜約３０重量％を構成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＤＰＰＣが、約５重量％〜約３０重量％を構成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＰＥＧが、約１０重量％〜約２０重量％を構成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
コレステロールをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記コレステロールが、約１重量％〜約１０重量％を構成する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される賦形剤に可溶性である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、リラキシン、ナトリウム利尿ペプチド、グレリン、または他の生理活性ペプチドからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
約２５重量％のアペリンペプチド、約１７重量％のポロキサマー１８８、約２５重量％のＤＳＰＣ、約２５重量％のＤＰＰＣ、および約８重量％のＰＥＧ８０００を含む、組成物。
【請求項１８】
約４５重量％のアペリンペプチド、約１５重量％のポロキサマー１８８、約１０重量％のＤＳＰＣ、約１０重量％のＤＰＰＣ、約１５重量％のＰＥＧ８０００、および約５重量％のコレステロールを含む、組成物。
【請求項１９】
心血管系疾患を治療または予防することを必要とする対象における心血管系疾患を治療または予防する方法であって、治療有効量の先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記心血管系疾患が、肺高血圧症、心不全、心筋梗塞、糖尿病性腎症、慢性腎疾患、急性腎疾患、勃起不全、糖尿病、または代謝系障害である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、静脈内、皮下、経口、または吸入により投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＳＰＣおよび前記ＤＰＰＣをエタノールに溶解し、溶解するまで超音波処理して第１の組成物を形成するステップと、
前記ＰＥＧおよび前記ポロキサマーをメタノールに溶解し、溶解するまで超音波処理して第２の組成物を形成するステップと、
前記第１の組成物および前記第２の組成物から脂質膜を形成するステップと、
前記治療剤を前記脂質膜と混合して、リポソームを形成するステップと
を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
【請求項２３】
前記リポソームが、凍結乾燥されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
心血管系の疾患または障害を処置または予防するための、請求項１に記載の組成物および説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／４１０，１６０号および２０１７年２月２８日に出願された米国仮出願番号第６２／４６４，５９４号からの優先権を主張しており、これらの仮出願は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
分野
本開示は、アペリンの組成物、例えば、アペリンのペグ化リポソーム製剤、ならびに心血管系の疾患および障害を処置する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アペリンは、Ｇタンパク質共役ＡＰＪ受容体に対する内因性リガンドであり、体液恒常性、血圧、心臓の発生および機能、ならびに多血管リモデリングを含む種々の生物学的機能を調整する。ｉｎ  ｖｉｖｏで生理活性ペプチドが急速に代謝されてから血漿半減期が顕著に短いため、アペリンペプチドの治療的使用は制限されてきた。
【０００４】
このため、安定性および治療効果が増強されたアペリン製剤が依然として求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
一部の態様では、所定量の少なくとも１つのポロキサマー、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリポソームに少なくとも部分的に封入された、有効量の治療剤を含む組成物を本明細書において提供する。
【０００６】
一部の態様では、治療有効量の本開示の実施形態による組成物を投与するステップを含む、心血管系疾患を治療または予防することを必要とする対象において心血管系疾患を処置または予防する方法を本明細書において提供する。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示の実施形態による組成物を調製する方法であって、ＤＳＰＣおよびＤＰＰＣをエタノールに溶解し、溶解するまで超音波処理して第１の組成物を形成するステップと、ＰＥＧおよびポロキサマーをメタノールに溶解し、溶解するまで超音波処理して第２の組成物を形成するステップと、第１の組成物および第２の組成物から脂質膜を形成するステップと、治療剤を脂質膜と混合して、リポソームを形成するステップとを含む、方法を本明細書において提供する。
【０００８】
一部の態様では、心血管系の疾患または障害を処置または予防するための、本開示の実施形態による組成物および説明書を含むキットを本明細書において提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、治療剤は、アペリンペプチドである。
【００１０】
一部の実施形態では、少なくとも１つのポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー３３１、およびポロキサマー４０７、またはこれらの任意の組合せである。
【００１１】
一部の実施形態では、ＰＥＧは、約２００〜約２００００ダルトンの平均分子量を有する（ＰＥＧ２００〜ＰＥＧ２００００）（例えば、ＰＥＧ８０００）。
【００１２】
一部の実施形態では、アペリンペプチドは、約１５重量％〜約６０重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１重量％〜約２０重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約５重量％〜約３０重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約５重量％〜約３０重量％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量％〜約２０重量％を構成する。
【００１３】
一部の実施形態では、組成物は、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、コレステロールは、約１重量％〜約１０重量％を構成する。
【００１４】
一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、リラキシン、ナトリウム利尿ペプチド、グレリンまたは他の生理活性ペプチドをさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態では、組成物は、約２５重量％のアペリンペプチド、約１７重量％のポロキサマー１８８、約２５重量％のＤＳＰＣ、約２５重量％のＤＰＰＣ、および約８重量％のＰＥＧ８０００を含む。他の実施形態では、組成物は、約４５重量％のアペリンペプチド、約１５重量％のポロキサマー１８８、約１０重量％のＤＳＰＣ、約１０重量％のＤＰＰＣ、約１５重量％のＰＥＧ８０００、および約５重量％のコレステロールを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、心血管系疾患は、肺高血圧症、心不全、心筋梗塞、糖尿病性腎症、慢性腎疾患、急性腎疾患、勃起不全、糖尿病、または代謝系障害である。
【００１７】
一部の実施形態では、組成物は、静脈内、皮下、経口、または吸入により投与される。
【００１８】
一部の実施形態では、リポソームは、凍結乾燥されている。
【００１９】
本開示の多くの態様は、以下の図を参照して、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、シャム（ＰＢＳ）、対照（アペリンなし）、製剤Ｂ（アペリン単独）、または製剤Ｃ（アペリンリポソーム）を毎週投与した場合（２週；１日目および７日目）の手術前ならびに手術１日、７日、および１４日後の駆出率（ＥＦ）の変化を示す。
【００２１】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、シャム（ＰＢＳ）、対照（アペリンなし）、製剤Ｂ（アペリン単独）、または製剤Ｃ（アペリンリポソーム）を毎週投与した場合（２週；１日目および７日目）の手術前ならびに手術１日、７日、および１４日後の左室内径短縮率（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＦＳ）の変化を示す。
【００２２】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、シャム（ＰＢＳ）、対照（アペリンなし）、製剤Ｂ（アペリン単独）、または製剤Ｃ（アペリンリポソーム）を毎週投与した場合（２週；１日目および７日目）の手術前ならびに手術１日、７日、および１４日後の左室収縮期内径（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ：ＬＶＩＤｓ）の変化を示す。
【００２３】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、シャム（ＰＢＳ）、対照（アペリンなし）、製剤Ｂ（アペリン単独）、または製剤Ｃ（アペリンリポソーム）を毎週投与した場合（２週；１日目および７日目）の手術前ならびに手術１日、７日、および１４日後の左室拡張期内径（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ：ＬＶＩＤｄ）の変化を示す。
【００２４】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、シャム（ＰＢＳ）、対照（アペリンなし）、製剤Ｂ（アペリ単独）、または製剤Ｃ（アペリンリポソーム）を毎週投与した場合（２週；１日目および７日目）の手術前ならびに手術１日、７日、および１４日後の左室拡張終期壁厚（ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ：ＬＶＰＷｄ）の変化を示す。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａは、心臓超音波検査の１日目の変化（１日目／ベースライン（％））を示す。
【００２６】
【図６Ｂ】図６Ｂは、心臓超音波検査の７日目の変化（７日目／ベースライン（％））を示す。
【００２７】
【図６Ｃ】図６Ｃは、心臓超音波検査の１４日目の変化（１４日目／ベースライン（％））を示す。
【００２８】
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、心臓の構造的完全性を示す代表的Ｈ＆Ｅ染色画像を示す。
【００２９】
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、心臓の構造的完全性を示す代表的ＭＡＳＳＯＮ染色画像を示す。
【００３０】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、代表的生理活性ペプチドを示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、代表的生理活性ペプチドを示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、代表的生理活性ペプチドを示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、代表的生理活性ペプチドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本開示は、心血管系疾患を治療する方法、およびこのような方法における使用のための組成物を対象とする。
【００３２】
範囲を含む、すべての数値の指定、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、近似値であり、適切な場合、（＋）または（−）０．１または１．０ずつ変化する。必ずしも常に明示的に記述されてはいないが、すべての数値の指定には用語「約」が先行することが理解される。必ずしも常に明示的に記述されてはいないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、このような試薬の等価物は当分野において公知であることもさらに理解される。
【００３３】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明白に指示しない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「リポソーム（ａ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）」への言及は、複数のリポソームを含む。
【００３４】
本明細書において使用する場合、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００３５】
用語「約」は、範囲を含む数値の指定、例えば、温度、時間、量、濃度、およびその他の前に使用する場合、近似値を示し、（＋）または（−）２０％、１０％、５％または１％で変化し得る。
【００３６】
さらに本明細書において使用する場合、「および／または」は、関連する記載の項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せ、ならびに選択肢（「または（ｏｒ）」）により解釈される場合、組合せの不足を指示および包含する。
【００３７】
用語「投与すること」、「投与する」等は、薬剤（例えば、アペリン）を対象に導入することを指す。一般的には、有効量が投与され、この量は、処置担当医師等により決定され得る。任意の投与経路、例えば、局所、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、吸入、膣内、直腸内、頬側、脳脊髄液への導入、または体内区画への滴下が使用され得る。用語および句「投与すること」および「〜の投与」はともに、組成物（および文法的等価物）に関して使用する場合、医療従事者による、もしくは患者の自己投与による患者への投与であり得る直接投与、ならびに／または薬物を処方する行為であり得る間接投与の両方を指す。例えば、薬剤（例えば、アペリン）を自己投与するように患者を指導、および／または薬物の処方箋を患者に提供する医師が、薬剤を患者に投与する。「定期的投与」または「定期的に投与する」は、毎日、毎週、または毎月行う複数回の処置を指す。定期的投与はまた、１日に１回、２回、３回またはそれよりも多い回数の薬剤の投与を指示し得る。
【００３８】
「有効量」は、有益な、または所望の効果をもたらすのに十分な薬剤または化合物（例えば、アペリン）の量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または用量であり得る。このようなパラメータの決定については、当業者において周知である。このような考察、ならびに有効な処方および投与手順は、当分野において周知であり、標準的テキストに記載されている。
【００３９】
「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書において互換的に使用し、脊椎動物、例えば、霊長類、哺乳動物または好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、ウマ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、競技用動物およびペットを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
タンパク質またはアミノ酸配列（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列）に関する用語「配列同一性」は、候補配列におけるアミノ酸残基（またはヌクレオチド残基）の割合を指し、これは、必要に応じて、配列をアライメントしギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後、配列同一性をなすものとしていかなる保存的置換も考慮せずに、特定のタンパク質またはアミノ酸配列中のアミノ酸残基（または特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列中のヌクレオチド残基）と同一であるとする。アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＥＭＢＯＳＳ等の公的に使用可能なプログラムを使用することによって、当業者に公知の任意の方法により達成することができる。当業者は、比較する完全長配列を超える最大アライメントの達成に必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントの測定に適切なパラメータを決定することができる。
【００４１】
句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症もなく、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に適し、合理的なベネフィット／リスク比に見合う化合物、物質、組成物、および／または剤形を指示するために本明細書において使用する。
【００４２】
組成物および製剤
リポソームに少なくとも部分的に封入された、治療剤の少なくとも１つを含む、組成物および製剤を本明細書において提供する。
【００４３】
一部の実施形態では、治療剤は、アペリンペプチドである。一部の実施形態では、アペリンペプチドは、以下の表１に記載の配列番号１〜７、またはそれに対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。適したアペリンペプチドアイソフォームの非限定的な例としては、アペリン−１２、アペリン−１３、ピログルタミルアペリン−１３（［Ｐｙｒ１］−アペリン−１３）、アペリン１７、アペリン−１９およびアペリン３６が挙げられる。一部の実施形態では、アペリンペプチドは、ピログルタミルアペリン−１３である。適したアペリンペプチドおよび生理活性変異体は、米国特許出願公開第２０１６／００５８７０５号に記載されており、その全体は、参照により組み込まれる。
【表１】
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【００４４】
一部の実施形態では、治療剤（例えば、アペリンペプチド）および／または少なくとも１つの追加の治療剤は、約１５重量％〜約６０重量％を構成する。
【００４５】
一部の実施形態では、治療剤は、約５重量％〜約３０重量％、約１０重量％〜約２５重量％、または約１５重量％〜約２０重量％を構成する。一部の実施形態では、治療剤は、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、または約３０重量％を構成する。一部の実施形態では、治療剤は、約３０重量％未満、約２９重量％未満、約２８重量％未満、約２７重量％未満、約２６重量％未満、約２５重量％未満、約２４重量％未満、約２３重量％未満、約２２重量％未満、約２１重量％未満、約２０重量％未満、約１９重量％未満、約１８重量％未満、約１７重量％未満、約１６重量％未満、約１５重量％未満、約１４重量％未満、約１３重量％未満、約１２重量％未満、約１１重量％未満、約１０重量％未満、約９重量％未満、約８重量％未満、約７重量％未満、約６重量％未満、約５重量％未満、約４重量％未満、約３重量％未満、約２重量％未満、または約１重量％未満を構成する。
【００４６】
一部の実施形態では、治療剤は、約３５重量％〜約６０重量％、約３５重量％〜約５５重量％、約３５重量％〜約５０重量％、約３５重量％〜約４５重量％、または約３５重量％〜約４０重量％を構成する。一部の実施形態では、治療剤は、約４０重量％〜約６０重量％、約４０重量％〜約５５重量％、約４０重量％〜約５０重量％、または約４０重量％〜約４５重量％を構成する。一部の実施形態では、治療剤は、約３５重量％、約３６重量％、約３７重量％、約３８重量％、約３９重量％、約４０重量％、約４１重量％、約４２重量％、約４３重量％、約４４重量％、約４５重量％、約４６重量％、約４７重量％、約４８重量％、約４９％、約５０重量％、約５１重量％、約５２重量％、約５３重量％、約５４重量％、約５５重量％、約５６重量％、約５７重量％、約５８重量％、約５９％、または約６０重量％を構成する。一部の実施形態では、治療剤は、約３５重量％超（more  than  about  35  wt%）、約３６重量％超、約３７重量％超、約３８重量％超、約３９重量％超、約４０重量％超、約４１重量％超、約４２重量％超、約４３重量％超、約４４重量％超、約４５重量％超、約４６重量％超、約４７重量％超、約４８重量％超、約４９重量％超、約５０重量％超、約５１重量％超、約５２重量％超、約５３重量％超、約５４重量％超、約５５重量％超、約５６重量％超、約５７重量％超、約５８重量％超、約５９重量％超、または約６０重量％超を構成する。
【００４７】
一部の実施形態では、治療剤は、所定量の少なくとも１つのポロキサマー、少なくとも１つの脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリポソームに少なくとも部分的に封入される。
【００４８】
適したポロキサマーの非限定的な例としては、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー３３１、およびポロキサマー４０７またはこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。
【００４９】
一部の実施形態では、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）は、約１重量％〜約２０重量％を構成する。
【００５０】
一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１重量％〜約１４重量％、約２重量％〜約１２重量％、約４重量％〜約１０重量％、または約６重量％〜約８重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、または約１４重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１４重量％未満、約１３重量％未満、約１２重量％未満、約１１重量％未満、約１０重量％未満、約９重量％未満、約８重量％未満、約７重量％未満、約６重量％未満、約５重量％未満、約４重量％未満、約３重量％未満、約２重量％未満、または約１重量％未満を構成する。
【００５１】
一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１２重量％〜約２０重量％、約１２重量％〜約１８重量％、約１２重量％〜約１６重量％、または約１２重量％〜約１４重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１２重量％超、約１３重量％超、約１４重量％超、約１５重量％超、約１６重量％超、約１７重量％超、約１８重量％超、約１９重量％超、または約２０重量％を構成する。
【００５２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの脂質（例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＳＣ）および／または１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ））は、約５重量％〜約３０重量％を構成する。適した脂質の非限定的な例としては、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）が挙げられる。
【００５３】
一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約２０重量％〜約３０重量％、約２２重量％〜約２８重量％、または約２４重量％〜約２６重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、または約３０重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約２０重量％超、約２１重量％超、約２２重量％超、約２３重量％超、約２４重量％超、約２５重量％超、約２６重量％超、約２７重量％超、約２８重量％超、約２９重量％超、または約３０重量％超を構成する。
【００５４】
一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約５重量％〜約１５重量％、約７重量％〜約１３重量％、または約９重量％〜約１１重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、または約１５重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＳＰＣは、約１５重量％未満、約１４重量％未満、約１３重量％未満、約１２重量％未満、約１１重量％未満、約１０重量％未満、約９重量％未満、約８重量％未満、約７重量％未満、約６重量％未満、または約５重量％未満を構成する。
【００５５】
一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約５重量％〜約３０重量％を構成する。
【００５６】
一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約２０重量％〜約３０重量％、約２２重量％〜約２８重量％、または約２４重量％〜約２６重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、または約３０重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約２０重量％超、約２１重量％超、約２２重量％超、約２３重量％超、約２４重量％超、約２５重量％超、約２６重量％超、約２７重量％超、約２８重量％超、約２９重量％超、または約３０重量％超を構成する。
【００５７】
一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約５重量％〜約１５重量％、約７重量％〜約１３重量％、または約９重量％〜約１１重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、または約１５重量％を構成する。一部の実施形態では、ＤＰＰＣは、約１５重量％未満、約１４重量％未満、約１３重量％未満、約１２重量％未満、約１１重量％未満、約１０重量％未満、約９重量％未満、約８重量％未満、約７重量％未満、約６重量％未満、または約５重量％未満を構成する。
【００５８】
一部の実施形態では、ＰＥＧは、約２００〜約２００００ダルトンの平均分子量を有する。適したＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ７０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ９０００またはＰＥＧ１００００が挙げられる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ８０００である。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量％〜約２０重量％、約１２重量％〜約１８重量％、約１２重量％〜約１６重量％、または約１２重量％〜約１４重量％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１０重量％超、約１１重量％超、約１２重量％超、約１３重量％超、約１４重量％超、約１５重量％超、約１６重量％超、約１７重量％超、約１８重量％超、約１９重量％超、または約２０重量％超を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約２０重量％未満、約１９重量％未満、約１８重量％未満、約１７重量％未満、約１６重量％未満、約１５重量％未満、約１４重量％未満、約１３重量％未満、約１２重量％未満、約１１重量％未満、または約１０重量％未満を構成する。
【００５９】
一部の実施形態では、組成物は、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、コレステロールは、約１重量％〜約１０重量％、約２重量％〜約８重量％、または約４重量％〜約６重量％を構成する。一部の実施形態では、コレステロールは、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、または約１０重量％を構成する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１０重量％未満、約９重量％未満、約８重量％未満、約７重量％未満、約６重量％未満、約５重量％未満、約４重量％未満、約３重量％未満、約２重量％未満、または約１重量％未満を構成する。
【００６０】
一部の実施形態では、組成物は、治療剤（例えば、アペリン）を約５重量％〜約３０重量％、約１０重量％〜約２５重量％、または約１５重量％〜約２０重量％の間の量；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を約１重量％〜約１４重量％、約２重量％〜約１２重量％、約４重量％〜約１０重量％、または約６重量％〜約８重量％の間の量；ＤＳＰＣを約２０重量％〜約３０重量％、約２２重量％〜約２８重量％、または約２４重量％〜約２６重量％の間の量；ＤＰＰＣを約２０重量％〜約３０重量％、約２２重量％〜約２８重量％、または約２４重量％〜約２６重量％の間の量；およびＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ８０００）を約１０重量％〜約２０重量％、約１２重量％〜約１８重量％、約１２重量％〜約１６重量％、または約１２重量％〜約１４重量％の間の量含む。一部の実施形態では、組成物は、約２５重量％のアペリンペプチド、約１７重量％のポロキサマー１８８、約２５重量％のＤＳＰＣ、約２５重量％のＤＰＰＣ、および約８重量％のＰＥＧ８０００を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、組成物は、治療剤（例えば、アペリン）を約３５重量％〜約６０重量％、約３５重量％〜約５５重量％、約３５重量％〜約５０重量％、約３５重量％〜約４５重量％、または約３５重量％〜約４０重量％の間の量；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を約１２重量％〜約２０重量％、約１２重量％〜約１８重量％、約１２重量％〜約１６重量％、または約１２重量％〜約１４重量％の間の量；ＤＳＰＣを約５重量％〜約１５重量％、約７重量％〜約１３重量％、または約９重量％〜約１１重量％の間の量；ＤＰＰＣを約５重量％〜約１５重量％、約７重量％〜約１３重量％、または約９重量％〜約１１重量％の間の量；ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ８０００）を約１０重量％〜約２０重量％、約１２重量％〜約１８重量％、約１２重量％〜約１６重量％、または約１２重量％〜約１４重量％の間の量；およびコレステロールを約１重量％〜約１０重量％、約２重量％〜約８重量％、または約４重量％〜約６重量％の間の量含む。一部の実施形態では、組成物は、約４５重量％のアペリンペプチド、約１５重量％のポロキサマー１８８、約１０重量％のＤＳＰＣ、約１０重量％のＤＰＰＣ、約１５重量％のＰＥＧ８０００、および約５重量％のコレステロールを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、組成物は、治療剤（例えば、アペリンペプチド）およびポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含む。
【００６３】
一実施形態では、組成物は、以下に記載する「製剤１」である。別の実施形態では、組成物は、以下に記載する「製剤２」である。他の実施形態では、組成物は、製剤１または２と同一の成分および重量％であるが、異なる重量の成分を含む。
【表２】
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【００６４】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む。適した追加の治療剤は、変力物質、ベータアドレナリン受容体遮断剤、ＨＭＧ−Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、カルシウムチャネル遮断剤（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗剤、レニン阻害剤、利尿剤、ＡｐｏＡ−１模倣剤、抗糖尿病剤、抗肥満剤（ｏｂｅｓｉｔｙ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、アルドステロン受容体遮断剤、エンドセリン受容体遮断剤、アルドステロン合成酵素阻害剤（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害剤、抗凝血剤、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）および／またはＮＥＰ阻害剤を含む。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＡＣＥ阻害剤、リラキシン、ナトリウム利尿ペプチド、グレリン、または他の生理活性ペプチドである。適した生理活性ペプチドの非限定的な例としては、図９Ａ〜Ｄに記載の生理活性ペプチドのうちの任意の１つが挙げられる（例えば、Erdmann  ２００８年、Chakrabarti  ２０１６年もまた参照されたい）。
【００６５】
一実施形態では、追加の治療剤は、変力物質、ベータアドレナリン受容体遮断剤、ＨＭＧ−Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、カルシウムチャネル遮断剤（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗剤、レニン阻害剤、利尿剤、ＡｐｏＡ−１模倣剤、抗糖尿病剤、抗肥満剤、アルドステロン受容体遮断剤、エンドセリン受容体遮断剤、アルドステロン合成酵素阻害剤（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害剤、抗凝血剤、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、ＮＥＰ阻害剤、およびアンジオテンシン変換酵素−２（ＡＣＥ−２）から選択される。第２の薬剤または処置「と組み合わせて」の用語は、本明細書に開示および記載の組成物（例えば、アペリンリポソーム）と第２の薬剤または処置との同時投与、本明細書に開示および記載の組成物と、その後、第２の薬剤または処置の投与、ならびに初めに第２の薬剤または処置を、その後、本明細書に開示または記載の組成物の投与を含む。本明細書において使用する変力物質は、例えば、ドブタミン、イソプロテレノール、ミルリノン、アムリノン（amirinone）、レボシメンダン、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノールおよびジゴキシンを含む。本明細書において使用するベータアドレナリン受容体遮断剤は、例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロールおよびチモロールを含む。本明細書において使用する抗凝血剤は、ダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、およびワルファリンを含む。用語「ＨＭＧ−Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤」（ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルグルタリル−ｃｏ−エンザイム−Ａ還元酵素阻害剤とも呼ばれる）は、血中コレステロールを含む脂質レベルを低下させるのに使用され得る活性剤を含む。例としては、アトルバスタチン、セリバスタチン、コンパクチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、フルインドスタチン（fluindostatin）、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、リバスタチン（rivastatin）、シンバスタチン、ベロスタチン（velostatin）、および薬学的に許容されるこれらの塩が挙げられる。用語「ＡＣＥ阻害剤」（アンジオテンシン変換酵素阻害剤とも呼ばれる）は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの酵素分解を妨害する分子を含む。このような化合物は、血圧の調節およびうっ血性心不全の処置に使用することができる。例としては、アラセプリル、ベナゼプリル、ベナゼプリラート、カプトプリル、セロナプリル（ceronapril）、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート（enaprilat）、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、モベルトプリル（moveltopril）、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、テモカプリル、およびトランドラプリル、ゾフェノプリル、または薬学的に許容されるこれらの塩が挙げられる。用語「エンドセリン拮抗剤」は、ボセンタン、テゾセンタン、および薬学的に許容されるこれらの塩を含む。許容される追加の治療剤のさらなる例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１３／１１１１１０に記載されており、この全体は、その引用文献とともに参照により組み込まれる。
【００６６】
一部の実施形態では、追加の治療剤は、バルサルタン、カンデサルタン、またはロサルタンを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、またはこれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤に可溶性である。一部の実施形態では、組成物は、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月、またはそれよりも長い期間、薬学的に許容される賦形剤に可溶性であり、薬学的に許容される賦形剤中で沈殿しない。
【００６８】
組成物は、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、ビヒクルおよび当業者に周知のその他の不活性剤を含むことができる。医薬調製物に一般に使用されるビヒクルおよび賦形剤は、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコール等を含む。溶液は、水または生理学的に適合する有機溶媒、例えば、エタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステル等を使用して調製することができる。組成物は、無菌等張食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水と混合したポリグリコール、リンゲル液等を含み得る従来の技術を使用して調製することができる。一実施形態では、着色剤を加えて、組成物を目的の処置部位へ位置決めし、適切に配置することを容易にする。
【００６９】
組成物は、保存剤および／または安定剤を含むことができる。保存剤の非限定的な例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル水銀塩（phenylmercurate  salt）、クロルヘキシジン、フェノール、３−クレゾール、第四級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）、クロロブタノール（chlorbutanol）、２−エトキシエタノール、およびイミドウレア（imidurea）が挙げられる。
【００７０】
等張性を調節するために、組成物は、生理的な塩、例えば、ナトリウム塩を含むことができる。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得ることが好ましい。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物（disodium  phosphate  dehydrate）、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムを含む。
【００７１】
組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含むことができる。一般的な緩衝液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、５〜２０ｍＭの範囲の濃度で一般に含まれる。組成物のｐＨは、一般的に５〜８の間、より一般的には６〜８の間、例えば６．５〜７．５または７．０〜７．８の間となる。
【００７２】
一部の実施形態では、組成物は、凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ  ａｇｅｎｔ）を含むことができる。凍結防止剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【００７３】
組成物は、埋め込み型装置に含まれ得る。本発明により想定される、適した埋め込み型装置は、血管内ステント（例えば、自己拡張型ステント、バルーン拡張型ステント、およびステントグラフト）、スキャフォールド、グラフト等を含む。このような埋め込み型装置は、本明細書に開示または記載の実施形態による組成物で少なくとも１つの表面を被覆または含浸してもよい。
【００７４】
治療方法
心血管系疾患を治療または予防することを必要とする対象における心血管系疾患を治療または予防する方法を本明細書において提供する。一部の実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に開示または記載する組成物を対象に投与するステップを含む。
【００７５】
適した心血管系疾患の非限定的な例としては、心疾患、血管疾患、および代謝疾患が挙げられる。本明細書に開示および記載する組成物による処置に有用な他の適した症状は、水貯留および熱傷を含む。心疾患の非限定的な例としては、慢性心不全、急性非代償性心不全、心筋梗塞後症候群、心房細動、ブルガダ症候群、心室頻拍、アテローム性動脈硬化症、虚血性心血管疾患、心筋症、心線維症、心虚血／再灌流傷害、不整脈、およびアミロイドーシスが挙げられる。血管疾患の非限定的な例としては、高血圧症、治療抵抗性高血圧症、肺高血圧症、末梢動脈疾患、勃起不全、再狭窄、および子癇前症が挙げられる。代謝疾患の非限定的な例としては、２型糖尿病、１型糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、慢性腎疾患、急性腎疾患、腎線維症、腎虚血／再灌流傷害、多発性嚢胞腎疾患、血液透析、および肥満が挙げられる。
【００７６】
一部の実施形態では、心血管系疾患は、肺高血圧症、心不全、心筋梗塞、糖尿病性腎症、慢性腎疾患、急性腎疾患、勃起不全、糖尿病、および代謝系障害からなる群から選択される。
【００７７】
組成物は、任意の適した様式および経路により対象に投与することができる。非限定的な例としては、内部、肺、直腸、膣内、舌、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下経路が挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、静脈内または皮下投与される。組成物はまた、クリーム剤、ゲル剤、またはパッチ剤の一部として経皮送達に適し得る。他の剤形は、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、エアロゾル剤、坐剤、非経口剤、ならびに懸濁剤、液剤および乳濁液剤を含む経口液剤を含む。徐放剤形または加速度的放出剤形もまた、使用することができる。
【００７８】
一実施形態では、約２５重量％の量のＤＳＰＣ、約２５重量％の量のＤＰＰＣ、約８．３３重量％の量のポロキサマー１８８、約１６．６７重量％の量のＰＥＧ８０００、および約２５重量％の量の［Ｐｙｒ１］−アペリン−１３を含む治療有効量の組成物を、心血管系疾患を患う対象に投与する。
【００７９】
一実施形態では、約１０重量％の量のＤＳＰＣ、約１０重量％の量のＤＰＰＣ、約１５重量％の量のポロキサマー１８８、約１５重量％の量のＰＥＧ８０００、約４５重量％の量の［Ｐｙｒ１］−アペリン−１３、および約５重量％の量のコレステロールを含む治療有効量の組成物を、心血管系疾患を患う対象に投与する。
【００８０】
一実施形態では、約２５重量％の量のＤＳＰＣ、約２５重量％の量のＤＰＰＣ、約８．３３重量％の量のポロキサマー１８８、約１６．６７重量％の量のＰＥＧ８０００、および約２５重量％の量の［Ｐｙｒ１］−アペリン−１３を含む治療有効量の組成物を、心血管系疾患を患う対象に静脈内、皮下、経口、または吸入により投与する。
【００８１】
一実施形態では、約１０重量％の量のＤＳＰＣ、約１０重量％の量のＤＰＰＣ、約１５重量％の量のポロキサマー１８８、約１５重量％の量のＰＥＧ８０００、約４５重量％の量の［Ｐｙｒ１］−アペリン−１３、および約５重量％の量のコレステロールを含む治療有効量の組成物を、心血管系疾患を患う対象に静脈内、皮下、経口、または吸入により投与する。
【００８２】
一実施形態では、本開示の組成物は、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約７５ｍｇ〜約２５００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０２５ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１０７５ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１０２５ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１０７５ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２２５ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１２７５ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３２５ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１３７５ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４２５ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１４７５ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５２５ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１５７５ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６２５ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１６７５ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７２５ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１７７５ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８２５ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１８７５ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９２５ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約１９７５ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０２５ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２０７５ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２１２５ｍｇ、約２１５０ｍｇ、約２１７５ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２２５ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２２７５ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３２５ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２３７５ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４２５ｍｇ、約２４５０ｍｇ、約２４７５ｍｇ、または約２５００ｍｇの一日用量の治療剤を提供するのに十分な量で対象に投与される。
【００８３】
一実施形態では、本開示の組成物は、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約７５ｍｇ〜約２５００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０２５ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１０７５ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１０２５ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１０７５ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２２５ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１２７５ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３２５ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１３７５ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４２５ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１４７５ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５２５ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１５７５ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６２５ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１６７５ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７２５ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１７７５ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８２５ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１８７５ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９２５ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約１９７５ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０２５ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２０７５ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２１２５ｍｇ、約２１５０ｍｇ、約２１７５ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２２５ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２２７５ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３２５ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２３７５ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４２５ｍｇ、約２４５０ｍｇ、約２４７５ｍｇ、または約２５００ｍｇの毎週および／または二週間毎の用量の治療剤を提供するのに十分な量で対象に投与される。
【００８４】
一実施形態では、本開示の組成物は、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約７５ｍｇ〜約２５００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０２５ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１０７５ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１０２５ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１０７５ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２２５ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１２７５ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３２５ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１３７５ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４２５ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１４７５ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５２５ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１５７５ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６２５ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１６７５ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７２５ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１７７５ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８２５ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１８７５ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９２５ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約１９７５ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０２５ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２０７５ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２１２５ｍｇ、約２１５０ｍｇ、約２１７５ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２２５ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２２７５ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３２５ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２３７５ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４２５ｍｇ、約２４５０ｍｇ、約２４７５ｍｇ、または約２５００ｍｇの毎月の用量の治療剤を提供するのに十分な量で対象に投与される。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）
心筋肥大および心不全のマウスモデルにおけるアペリン製剤の薬力学
動物。６〜８週齢および８〜１０週齢の間のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）誘発心肥大および心不全の薬力学的動物モデルとして使用した。以下の表３に定めるように、マウスを処置群に適切にグループ分けした。１００μＬのＰＢＳ（シャム群）、賦形剤（リポソーム）単独（対照群）、アペリン単独（製剤Ｂ群）、またはアペリンリポソーム（製剤Ｃ群）のいずれかをマウスに腹腔内注射により投与した。
【表３】
2019532087.tif 000005
【００８６】
ＴＡＣ手術手順。双眼実体顕微鏡手術（ｂｉｎｏｃｕｌａｒ  ｓｔｅｒｅｏｓｃｏｐｉｃ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）のために手術部位を消毒した。切開を行って心臓および左心耳を見えるようにした。次いで、遊離の腕頭動脈（ｈｅａｄ  ａｒｍ  ｓｔｅｍ）と左総頸動脈との間の大動脈弓部を実体顕微鏡下で慎重に観察した。大動脈を腕頭動脈と左総頸動脈との間で４ゲージ針（直径０．４ｍｍ）に掛けて、大動脈弁狭窄を生じさせた。手術部位を縫合し、マウスの胸部振動が正常であることを観察した。マウスを上記の表に概説する４つの群に無作為に分けた。簡潔には、対照群（薬物を含まない空の賦形剤の腹腔内注射）、製剤Ｂ群（アペリン単独）、製剤Ｃ（アペリンリポソーム）であり、他の群は、対応する外科手術を受けるが、大動脈狭窄のないマウスのシャム群である。
【００８７】
心エコー機能の評価。初回投与の１時間前、初回投与の１時間後、ならびに手術の１週および２週後にマウスを評価した。簡潔には、Ｍモード心エコーを使用して、術後のマウスの心機能の変化を検出した。左室前壁および後壁の変化を２Ｄ画像によるＭモード超音波によって記録した。Ｍ曲線は、収縮および拡張終期の左室前後径を測定する心内膜の位置および動態を示す。左室収縮期内径（ＬＶＩＤｓ）、左室拡張期内径（ＬＶＩＤｄ）、左室駆出率（ＥＦ）、左室内径短縮率（ＦＳ）、左室拡張終期壁厚（ＬＶＰＷｄ）を算出し、他のパラメータを測定した。
【００８８】
病理学的評価。試験終了時に、動物を犠死させ、開胸を実施して心臓を摘出した。心臓を通常の生理食塩水ですすぎ、新鮮な４％のパラホルムアルデヒド中に固定した。試料をＭａｓｓｏｎ染色で処理した後、パラフィン包埋し、顕微鏡観察を実施した。ＨＥ染色を用いて同様の手順を実施した。評価指標：病理学的記述、肥厚に関する主試験。
【００８９】
統計学的分析。各群の実験データを平均値±標準偏差により記載した。Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して正規群と分散群との差を比較した。ＬＳＤ検定を使用して２群間の差を比較した。Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓのＨ検定（ＫＷ）を使用して２群間および正規分布または分散の差を試験した。Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定法を群間の多重比較に使用した。ｐ＜０．０５の差は、統計的に有意であるとした。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ソフトウェア用ＳＰＳＳ２２．０を使用して、すべての統計学的分析を実施した。
【００９０】
上記の方法の後、心機能の変化を判定するために、超音波ガイドＭモード超音波検査を使用して、胸骨の左縁のＥＦ、ＦＳ、ＬＶＩＤｓ、ＬＶＩＤｄおよびＬＶＰＷｄを測定した。
【００９１】
駆出率（ＥＦ）は、心拍毎に心室から駆出した血液の割合である。ＥＦは、拡張終期容積で１回拍出量を割ることによって算出される、心臓のポンプ効率の固有の容積測定である。駆出率は、心機能の重要な指標である。図１Ａおよび１Ｂに示すように、シャム群では、手術後１日目（１Ｄ）、おそらく胸部損傷のため、ＥＦ値がわずかに低減したが、手術後７日目（７Ｄ）、ＥＦ値は回復し、その後、比較的安定な状態を維持した。対照群では、ＥＦ値は、７日後に低下を続け、この低下は７日後により深刻となった。これは、大動脈狭窄の直後に心損傷が生じ、その後も損傷が継続して損傷７Ｄ後の代償作用がより明白となったためであると推定される。２つの投与群では、ＥＦレベルの低下は、１Ｄ後に徐々に軽減した。
【００９２】
左室内径短縮率（ＦＳ）は、ＥＦと同様であり、心収縮機能の重要な指標である。図２Ａおよび２Ｂに示すように、１Ｄ後、シャム群では、おそらく胸部損傷のため、ＦＳ値がわずかに低減した。７Ｄに、ＦＳ値は回復し、その後、安定状態を維持した。対照群では、ＦＳ値は、７Ｄ後に低下を続け、この低下は７Ｄ後により深刻となった。これは、大動脈狭窄の直後に心損傷が生じ、さらなる損傷が生じて損傷７Ｄ後の代償作用がより明白となったためであると推定される。２つの投与群では、ＦＳレベルの低下は、１Ｄ後に徐々に減弱した。
【００９３】
左室収縮期内径（ＬＶＩＤｓ）の変化は、心臓のリモデリングを反映し得る。図３Ａおよび３Ｂに示すように、１Ｄ後、シャム群のＬＶＩＤｓが、おそらく胸部損傷のため、わずかに増加した。７Ｄに、ＬＶＩＤｓは回復し、その後、安定状態を維持した。対照群のＬＶＩＤｓは、７日後に増加を続けた。これは、大動脈狭窄の直後に心損傷が生じ、さらなる損傷が生じて損傷７Ｄ後の代償作用がより明白となったためであると推定される。２つの投与群では、術後１ＤにおいてＬＶＩＤｓの増加が認められたが、この増加は１４Ｄの間に鎮静した。
【００９４】
左室拡張期内径（ＬＶＩＤｄ）の変化は、心臓のリモデリングを反映し得る。図４Ａおよび４Ｂに示すように、７Ｄ後、シャム群のＬＶＩＤｄは、おそらく胸部損傷のため、わずかに増加した。７Ｄ後、ＬＶＩＤｄは低下し始めた。対照群のＬＶＩＤｄは、術後、継続して増加し、大動脈狭窄の直後に損傷が生じ、さらなる損傷が生じたことを示唆した。２つの投与群では、１ＤにＬＶＩＤｄレベルが増加したが、その後、このレベルの上昇は鎮静した。
【００９５】
左室拡張終期壁厚（ＬＶＰＷｄ）の変化は、心臓のリモデリングを反映し得る。図５Ａおよび５Ｂに示すように、１Ｄ後、シャム群のＬＶＰＷｄ値は、比較的安定したが、これは７Ｄに、おそらく開胸損傷に起因して、わずかに上昇した。対照群のＬＶＰＷｄは、術後、増加した。２つの投与群では、ＬＶＰＷｄは１Ｄに増加したが、この増加は後に鎮静した。
【００９６】
ＬＶＩＤｓ、ＬＶＩＤｄ、およびＬＶＰＷｄは、手術１Ｄ後、すべての群において増加し、ＥＦおよびＦＳ値は、手術１Ｄ後、すべての群において低下した（図６Ａ参照）。これは、損傷が主に大動脈狭窄によって起こることが推定される。さらに、シャム群と製剤Ｃ群との間で最小の変化が認められ、製剤Ｃ（アペリンリポソーム）が、損傷の処置において製剤Ｂ（アペリン単独）よりも有効であることを示唆した。図６Ｂは、７Ｄ後、ＬＶＩＤｓ、ＬＶＩＤｄ、ＬＶＰＷｄが各群において増加し、シャム群では最小の増加を示したことを示す。これは、手術による外傷が、投与群において次第に回復し、製剤Ｃ群ではそれほど増加しなかったことを示唆する。この結果はまた、７Ｄにアペリンが作用し続けていることを示唆する。シャム群のＥＦおよびＦＳは、ベースラインに対して平坦であり、手術による外傷に起因する心機能の低下が回復したことを示唆した。最終的には、図６Ｃに見られるように、１４Ｄに、シャム群のＬＶＩＤｓ、ＬＶＩＤｄ、ＬＶＰＷｄ、ＥＦ、およびＦＳは、ベースラインに対して平坦であり、手術による外傷に起因する心機能不全が回復したことを示唆した。変化は、予想どおり対照群において最大であった。２つの処置群において、すべての指標により、薬物が有効であり、製剤Ｃ群の変化がシャム群に最も近かったことが示された。この結果は、アペリンリポソームが、損傷の処置においてアペリン単独よりも優れていることを示唆する。
【００９７】
実験終了時に、すべてのマウスを犠死させ、組織学的分析を行った。図７Ａ〜７Ｄに示すように、ＨＥ染色により、シャム群は、心筋および薄い血管壁の整然かつ均一な分布を有した（図７Ａ）。対照的に、対照群は、心臓の構造的完全性の損傷、心筋の不整脈、血管壁の腫脹および肥厚を有した（図７Ｂ）。製剤Ｂで処置したマウスは、完全性が維持され心筋が整然と配置された心構造を示したがまた、複数の心筋梗塞または出血を示す肥大した心筋間質も示した（図７Ｃ）。製剤Ｃで処置したマウスはまた、完全性が維持され心筋が整然と配置された心構造を示し、複数の心筋梗塞または出血を示した（図７Ｄ）。心筋梗塞または出血の量は、製剤Ｃ群（アペリンリポソーム）では、製剤Ｂ（アペリン単独）と比較してより少なかった。図８Ａ〜８Ｄに示すように、Ｍａｓｓｏｎ三重染色により、シャム群は、規則正しく配置された心筋−完全、緻密、かつ薄い血管壁を有する心筋細胞を有した（図８Ａ）。ここでは、少量のコラーゲン沈着があった。対照的に、対照群は、広範囲のコラーゲン沈着があった（図８Ｂ）。製剤Ｂで処置したマウスは、顕著な心筋のコラーゲン沈着を示した（図８Ｃ）が、対照群で認められたほどではなかった。製剤Ｃで処置したマウスは、製剤Ｂと比較して少量のコラーゲン沈着のみを示した（図８Ｄ）。アペリンリポソームは、アペリン単独よりも大幅に線維化を減少させた。
【００９８】
製剤Ｂ（アペリン単独）と製剤Ｃ（アペリンリポソーム）の両投与により、心不全誘発後、収縮性（ＥＦおよびＦＳ）が回復した。さらに、これらは、大動脈狭窄後のＬＶＩＤｓ、ＬＶＩＤｄ、およびＬＶＰＷｄの増加の減弱により明らかなように、肥大の発達を阻害した。直接比較では、製剤Ｃ（アペリンリポソーム）は、製剤Ｂ（アペリン単独）と比較して、より良好な治療的有用性をもたらした。
【００９９】
まとめると、このようなデータは、アペリンリポソームが、心肥大および心不全の処置に使用可能であることを示唆する。
【０１００】
（実施例２）
心筋梗塞の処置におけるアペリン製剤
動物実験プロトコール。１８０〜２２０ｇの体重の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（年齢、８歳）を標準的供給元から入手した。温度管理された（２０〜２２℃）環境において１２時間の明暗サイクル下でマウスを維持する。ラットを次のように３つの群（ｎ＝６匹／群）に分ける。シャム群、左前下行枝（ＬＡＤ）結紮群、およびＬＡＤ＋アペリン群である。以下の表４に記載の配合によるアペリンリポソームをアペリン群に投与する。
【表４】
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【０１０１】
ＬＡＤ群のラットにＬＡＤ結紮手術を行う（Patten  １９９８年；Ahn  ２００４年）。簡潔には、ラットを１０％の抱水クロラール（３．５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内注射により麻酔する。仰臥位では、気管内挿管を実行し、げっ歯類用人工呼吸器を使用して（呼吸数、８０呼吸／分；換気量、６〜８ｍｌ／ｋｇ）ラットに人工呼吸を行う。次いで、胸腔を開き、心臓を曝露した。７−０シルクを使用してＬＡＤを結紮する。心筋の脱色によりＬＡＤ結紮の成功を確認し、胸腔を一層ずつ閉じる。ＬＡＤ結紮手術の後、ラットは２．５×１０４Ｕのペニシリンの筋肉内注射を受ける。シャム群のラットは同等であるが結紮のない手術を受ける。ＬＡＤ＋アペリン群のラットはアペリンの腹腔内注射を受け、ＬＡＤ結紮手術後に４週間毎日投薬する。シャム群およびＬＡＤ群のラットは等量の通常の生理食塩水を受ける。４週間後、各群のラットを１０％の抱水クロラールで麻酔する。左室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、左室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、左室圧最大上昇率（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍａｘｉｍａｌ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｒｉｓｅ）（ＬＶ＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）および左室圧最大減退率（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍａｘｉｍａｌ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ）（ＬＶ−ｄｐ／ｄｔｍａｘ）のレベルを測定する。ラットを１０％の抱水クロラール（３．５ｍｌ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔する。血液を採取し、室温で２〜４時間保存し、４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。上清を採取し、血清を入手する。実験動物の飼育および使用に関するガイド（ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って、すべての動物実験を実行する。
【０１０２】
アペリンリポソームで処置することにより、次のアウトカムのうちの１つまたは複数がもたらされることが想定される：心筋梗塞により誘発される左室機能不全（例えば、ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰ）を緩和する；心筋梗塞により誘発される心筋線維症を減弱する（Ｍａｓｓｏｎの三重染色により測定される）；線維症マーカー（例えば、ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ、Ｃｏｌ−Ｉ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）を減少する；ならびにアンジオテンシンＩＩおよびＮＦ−κＢレベルを低減する。
【０１０３】
（実施例３）
肺高血圧症（ＰＡＨ）の処置におけるアペリン製剤
ＰＡＨを患う２０人の患者が、右心カテーテル処置（Vestbo  ２０１３年、Vestbo  ２０１５年）の間、アペリンリポソームおよび対応する生理食塩水プラセボを注入する無作為化二重盲検プラセボ対照試験に参加する。アペリン群は、上記の表４に記載の同一の配合によるアペリンリポソームを受ける。
【０１０４】
肺動脈圧、肺動脈楔入圧および心拍出量の平均値を測定する。アペリンリポソームで処置することにより心拍出量が増加することが想定される。
【０１０５】
（実施例４）
糖尿病の処置におけるアペリン製剤
健常な過体重の男性を無作為化二重盲検プラセボ対照交差試験に登録し、これにより２つの用量のアペリンリポソームについて有効性および耐性を連続的に検討する。対象の第１の群はアペリンリポソーム投薬を受け、安全データ試験の後、第２の群はより高用量を受ける（ｎ＝８匹）。アペリン群は、表４に記載の配合によるアペリンリポソームを受ける。
【０１０６】
各ボランティアは２つの高インスリン−正常血糖クランプに供し、この場合、グルコース注入率（ＧＩＲ）の基礎レベルを９０分値〜１２０分値（レベル１）について測定する。次いで、２時間のアペリンまたはプラセボの持続静脈内投与を開始し、ＧＩＲを２１０分値〜２４０分値（レベル２）について最終的に評価する。主要評価項目は、レベル２とレベル１との間のＧＩＲの差（ΔＧＩＲ）である。アペリンリポソームで処置することによりΔＧＩＲ対対照の増加をもたらすことが想定される。
【０１０７】
（実施例５）
糖尿病性腎症の処置におけるアペリン製剤
Ｃ５７ＢＬ／６に由来するＡｋｉｔａ（インスリン２＋／−）マウスのつがいを入手する。
【０１０８】
温度管理した室内（２２±２℃）で水および食餌を自由に摂取可能とした換気型マイクロアイソレーターケージ中に１２時間の明暗サイクルで動物を飼育する。雄のＡｋｉｔａマウス（インスリン２＋／−）および非糖尿病のこれらの同腹仔（インスリン２＋／＋、野生型（ＷＴ））を本試験において使用する。
【０１０９】
マウスを４つの群に分ける。ＰＢＳ処置ＷＴマウス（ＷＴ）、アペリン処置ＷＴマウス（ＷＴ＋Ａｐ）、ＰＢＳ処置Ａｋｉｔａマウス（ＡＫ）、およびアペリン処置Ａｋｉｔａマウス（ＡＫ＋Ａｐ）である。雄のＡｋｉｔａマウスが４〜７週齢で高血糖を示し始めるため、９週齢で実験を開始する。したがって、実験開始時の動物の徴候は、初期糖尿病患者の徴候と同様である。アペリンリポソームをＡｋｉｔａマウスに尾静脈注射により１日２回投与する。アペリン群は、上記の表４に記載の配合によるアペリンリポソームを受ける。
【０１１０】
本試験では、アペリンリポソームまたはＰＢＳを尾の最遠の末端から根元までの尾静脈を介して注射する。１９週目に動物に抱水クロラール（ＩＰ、５００ｍｇｋｇ−１）による終末麻酔を行って腎臓および血清を採取可能とし、その後、失血により致死させる。
【０１１１】
アペリンリポソームで処置することにより、次のアウトカムのうちの１つまたは複数がもたらされることが想定される：Ａｋｉｔａマウスにおける、糖尿病により誘発される腎機能不全（例えば、腎重量、腎臓病の指標（ＫＩ）、タンパク尿、アルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）および糸球体濾過率（ＧＦＲ））および腎臓の組織学的変化を阻害する；腎臓における糖尿病により誘発されるヒストンの高アセチル化（例えば、ａｃ−Ｈ３Ｋ９、ａｃ−Ｈ３Ｋ１８およびａｃ−Ｈ３Ｋ２３）のＨＤＡＣの上方制御によって阻害する；糖尿病により誘発される腎炎症（例えば、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１およびｉＮＯＳ）を阻害する。アペリンリポソームで処置することにより、次のアウトカムのうちの１つまたは複数がもたらされることがさらに想定される：腎肥大を阻害する、糸球体肥大を阻害する；アルブミン尿を低減、単球浸潤を低減、腎炎症を低減（例えば、ＭＣＰ１およびＶＣＡＭ１量の減少）、および抗酸化カタラーゼレベルを回復する。
【０１１２】
（実施例６）
慢性腎疾患の処置におけるアペリン製剤
７週齢の雄のＣ５７Ｂ１／６ｊマウス（体重約２０〜２２ｇ）を入手する。動物を無作為に４つの群に割り当てる（ｎ＝５匹）。（１）シャム＋ビヒクル、（２）ＵＵＯ（一側尿管閉塞）＋ビヒクル、（３）ＵＵＯ＋アペリンリポソーム、および（４）シャム＋アペリンリポソームである。確立されたプロトコール（Jones  ２００９年）を使用してＵＵＯを行う。
【０１１３】
簡潔には、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）でマウスを麻酔し、左尿管を二重に結紮する。シャム処置マウスは、その尿管を露出させるが、結紮しない。手術日から開始して、マウスはアペリンリポソームまたはビヒクル単独を腹腔内注射により２４時間毎に受ける。アペリン群は、上記の表４に記載の配合によるアペリンリポソームを受ける。
【０１１４】
２週間後、マウスを犠死させ、種々の分析のために腎臓組織を摘出する。アペリンリポソームで処置することにより、次のアウトカムのうちの１つまたは複数がもたらされることが想定される：間質性腎線維症を改善する（Ｍａｓｓｏｎの三重染色による線維化領域の減少、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩ沈着の減少）；上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーの発現を阻害する（ラミニンを維持する、上皮Ｅ−カドヘリンを保持する、およびα−ＳＭＡ（平滑筋アクチン）発現を阻害する）；ＴＧＦ−β１およびＳＭＡＤ２経路を阻害する（ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β受容体レベルならびにｐ−ＳＭＡＤ２レベルを減少する）。
【０１１５】
（実施例７）
急性腎疾患の処置におけるアペリン製剤
動物および腎虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）モデルの雄のＷｉｓｔａｒラットを入手し、水および食餌を自由に摂取可能とした換気型マイクロアイソレーターケージ中に飼育する。１８０±２０ｇの体重のラットを使用し、次の群のうちの１つに割り当てる：ビヒクル投与の未損傷ラットのＣＴ群；ビヒクル投与のＩ／Ｒ損傷を受けたラットのＩ／Ｒ群；アペリンリポソーム投与のＩ／Ｒ損傷を受けたラットのＩ／Ｒ＋Ａｐ群。アペリン群は、上記の表４に記載の配合によるアペリンリポソームを受ける。
【０１１６】
前述のように（Supavekin  ２００３年）Ｉ／Ｒ損傷を実施する。簡潔には、ラットを麻酔し、腹部の正中切開を行って、クランプにより３０分間、その左腎茎を鈍的に固定する（一側腎閉塞）。クランプを除去した後、創傷を縫合し、屠殺前に３日間、動物を回復させる。対象動物は、シャム処置した。
【０１１７】
アペリンリポソームで処置することにより、次のアウトカムのうちの１つまたは複数がもたらされることが想定される：腎臓Ｉ／Ｒ損傷により誘発される形態学的および機能的変化から保護する（ＨＥ染色による形態学的変化；尿量の増加、タンパク尿（proteinurea）、およびクレアチニン放出を含む腎機能不全）；腎臓におけるＩ／Ｒ損傷により誘発される炎症およびアポトーシスを抑制する（炎症マーカーであるＭＣＰ−１およびＩＣＡＭ−１を減少する、アポトーシスマーカーであるカスパーゼ−３およびカスパーゼ−８を減少する）；腎臓におけるヒストンの高メチル化を阻害する（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２およびＨ３Ｋ７９ｍｅ１を減少する）；およびＩ／Ｒにより誘発されるＴｇｆ−β１の上方制御を阻害する（Ｔｇｆ−β１レベルを減少する）。
【０１１８】
（実施例８）
勃起不全（ＥＤ）の処置におけるアペリン製剤
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを本試験において使用する。２つの異なる血管性ＥＤモデルを使用して、海綿体組織におけるアペリンおよびＡＰＪの差次的遺伝子発現を調査することができる。１つのモデルは、内腸骨動脈の両側閉塞により誘発された急性海綿体虚血モデルである。他のモデルは、慢性血管性ＥＤモデルであり、これは、高コレステロール血症または糖尿病のいずれかを高コレステロール食餌の給餌により、またはＳＴＺの腹腔内注射によりそれぞれ誘発した。
【０１１９】
急性海綿体虚血モデルでは、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内投与により麻酔し、恒温手術台上に仰臥位に配置する。下腹部の正中切開を行った後、内腸骨動脈をクランプし、総腸骨動脈の分岐部のすぐ遠位を両側的に結紮する。
【０１２０】
慢性血管性ＥＤモデルでは、前述のように（例えばJin  ２００９年、Ryu  ２００９年を参照）、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに４％のコレステロールおよび１％のコール酸を含有する食餌を３ヶ月間与えるか、または複数回低用量のＳＴＺ（０．１Ｍ、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液中５０ｍｇ／ｋｇ体重）を５日間断続的に腹腔内注射する。
【０１２１】
高コレステロール食を開始して３ヶ月後に血清総コレステロールレベルを市販のキット（例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍＢＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および自動分析器（例えばＨＩＴＡＣＨＩ７６００、日立工機株式会社、ひたちなか市、日本）を用いて判定する。ＳＴＺの腹腔内注射前および２ヶ月後に空腹時および摂食後の血糖値を標準的血糖測定器（例えばＡｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定する。各血管性ＥＤモデルの海綿体組織において、および同齢対照においてアペリンおよびＡＰＪのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用することにより決定する（内腸骨動脈の両側閉塞から０、１、３、６、１２、２４および７２時間後、高コレステロール食の開始から３ヶ月後、およびＳＴＺの腹腔内注射から２ヶ月後）。
【０１２２】
高コレステロール血症ＥＤマウスモデルの勃起機能回復におけるアペリンタンパク質の有効性をまた、判定する。高コレステロール食の開始から３ヶ月後、アペリンで処置した高コレステロール血症マウスにおいて、アペリンリポソームの単回海綿体内注射１日後の勃起機能回復について、至適用量のアペリンを勃起機能回復が最も高い用量に基づいて判定する。
【０１２３】
この初期試験に基づいて、動物を３つの群に分ける：群１、同齢対照；群２、ＰＢＳ（２０ｍＬ）の単回海綿体内注射を受ける高コレステロール血症マウス；および群３、アペリンリポソームの単回海綿体内注射を受ける高コレステロール血症マウス。アペリン群は、上記の表４に記載の配合によるアペリンリポソームを受ける。
【０１２４】
処置１日後の海綿体神経（１群当たりＮ＝６匹）および陰茎の電気刺激による勃起機能を判定し、次いで、組織学的検査のために検体を採取する。個別の動物群由来の海綿体検体をウエスタンブロット分析に使用する（１群当たりＮ＝４匹）。
【０１２５】
アペリンリポソームで処置することにより、次のアウトカムのうちの１つまたは複数がもたらされることが想定される：アペリンリポソームを受けた高コレステロール血症マウスにおける海綿体神経刺激に対する勃起応答率は、ＰＢＳを受けた高コレステロール血症マウス（または他の対照）における応答率と比較して顕著に増大する；スーパーオキシドアニオン等の活性酸素種（ＲＯＳ）産生の低減によって海綿体ｅＮＯＳリン酸化が増加、および海綿体内皮細胞アポトーシスが減少する。
【０１２６】
（実施例９）
アペリン製剤
以下のプロトコールを使用してアペリンリポソームを形成した。リポソーム成分を以下の表５に概説する。
【表５】
2019532087.tif 000007
【０１２７】
簡潔には、ＤＳＰＣ（４５０ｍｇ）およびＤＰＰＣ（４５０ｍｇ）をエタノール（最小量）に溶解し、完全に溶解するまで超音波処理した。ＰＥＧ８０００（３００ｍｇ）およびポロキサマー１８８（１５０ｍｇ）をメタノール中に採り、完全に溶解するまで超音波処置した。２つの溶液を１つのバイアル中に混合した。次いで、窒素を吹き込んで溶媒を除去した。固体の最終産物を３時間、真空中で乾燥した。脂質膜をクエン酸（３００ｍｍｏｌ）溶液中に溶解した。膜を１５分間懸濁し、０．２ｎｍサイズのポリカーボネートで濾過した。混合物は、透析により蒸留水と交換し、次いで、凍結乾燥した。次いで、アペリン（１８０ｍｇ）を蒸留水に溶解し、脂質膜に加え、約３０分から１時間、ゆっくり混合する間にさらなる水を加えた。次いで、３７℃で９０分間リポソームをインキュベートし、その後、凍結乾燥した。
【０１２８】
本技術の詳細な上記実施例は、網羅的であることを意図せず、または上記開示の詳細な形態に本技術を制限することを意図していない。本技術の特定の実施形態および実施例は、例示目的のために上記に記載するが、関連する当業者が認める場合、本技術の範囲内で種々の等価な改変が可能である。本明細書に記載の種々の実施形態は、組み合わせて、さらなる実施形態を提供することも可能である。
【０１２９】
上記のことから、例示目的のために本技術の特定の実施形態を本明細書に記載したが、本技術の実施形態の記載を不必要にあいまいにすることを回避するために、周知の構造および機能は、詳細に示されないかまたは記載されないことが理解されるものとする。文脈によっては、単数形または複数形の用語はまた、複数形または単数形の用語をそれぞれ含むことが可能である。
【０１３０】
特定の実施形態は、例示目的のために本明細書において記載されているが、種々の改変が、本技術から逸脱せずになされ得ることもまた理解される。さらに、本技術のある特定の実施形態と関連する利点が、そのような実施形態と関連して記載されているが、他の実施形態もまた、このような利点を提示し得、すべての実施形態が、本技術の範囲内にあるように、このような利点の提示を必ずしも必要とするわけではない。したがって、本開示および関連の技術は、本明細書において明示的には提示または記載されない他の実施形態をも包含し得る。
参照文献
1.  Ahn  et  al.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  286(3):H1201-1207  (2004)
2.  Chakrabarti  et  al.  Food  Sci  Human  Wellness  5(1):1-7  (2016)
3.  Erdmann  et  al.  J  Nutr  Biochem  19(10):643-654  (2008)
4.  Jin  et  al  J  Sex  Med  6(12):3289-3304  (2009)
5.  Jones  et  al  Nephrol  Dial  Transplant  24(10):3024-3032  (2009)
6.  Patten  et  al.  Am  J  Physiol  274(5  Pt  2):H1812-H1820  (1998)
7.  Ryu  et  al  J  Sex  Med  6(7):1893-1907  (2009)
8.  Supavekin  et  al.  Kidney  Int  63(5):1714-1724  (2003
9.  Vestbo  et  al.  Eur  Respir  J  41(5):1017-1022  (2013)
10.  Vestbo  et  al.,  "Study  to  understand  mortality  and  morbidity  in  COPD  (SUMMIT),"  Eur  Respir  J  46:  Suppl.  59  (2015)
【図１】
2019532087.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2019532087.tif 000016
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2019532087.tif 000018
【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2019532087.tif 000021
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2019532087.tif 000023
【図９Ａ】
2019532087.tif 000024
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2019532087.tif 000026
【図９Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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