(57)【要約】  本出願は、マーカーのインテグリンα１０β１の発現に基づいて神経幹細胞（ＮＳＣ）または神経前駆細胞（ＮＰＣ）の集団を検出し単離するための方法、ならびに中枢神経系の疾患および損傷の治療、診断と予後のためにＮＳＣまたはＮＰＣの上記集団の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０サブユニットを含むマーカーの哺乳類神経幹細胞および哺乳類神経前駆細胞のためのマーカーとしての使用。
【請求項２】
哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するための方法であって、
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）前記ａ）の試料に含まれる細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）前記ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）前記ｃ）でのスコア付けに従って前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を単離するための方法であって、
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）前記ａ）の試料に含まれる細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）前記ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）前記ｃ）でのスコア付けに従って前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項４】
前記インテグリンα１０サブユニットが前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞表面で発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記インテグリンα１０サブユニットが哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞において細胞内で発現される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項６】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１サブユニットとの組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項７】
前記ｂ）の検出の前にインテグリンα１０サブユニットを特異的に結合する抗体と前記試料を接触させるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項８】
Ｎｅｓｔｉｎ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ、ＰＤＦＧＲα、ＳＯＸ−２、ＣＤ１３３（プロミニン−１）、ＣＤ１５、ＣＤ２４、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＥＧＦＲ、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）、Ｐａｘ６、ＦＡＢＰ７、ＬｅＸ、ＶｉｍｅｎｔｉｎおよびＧＬＡＳＴからなる群から選択される第２のマーカーの発現を検出することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項９】
前記方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経組織が神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経組織が脳組織から得られるまたは脳組織に由来する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経組織が成体脳組織である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経組織が胎仔脳組織である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経組織が脳室下帯（ＳＶＺ）もしくは顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）もしくは髄膜に由来する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経組織がヒト、イヌ、ウマ、ウシ、ネコ、マウス、ヒツジまたはブタの神経組織からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出がフローサイトメトリーによって決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出がインテグリンα１０タンパク質発現を測定することによって決定される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出がインテグリンα１０ｍＲＮＡ発現を測定することによって決定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出が免疫測定法、免疫沈降法、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、およびウエスタンブロット法からなる群から選択される方法によって決定される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の検出のために用いられる前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体またはそれらのフラグメントである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がフルオロフォア、酵素または放射性トレーサーもしくは放射性同位体からなる群から選択される検出可能部分などの、検出可能部分に共有結合される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が
ａ）受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３のもとでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって生成される、モノクローナル抗体、または
ｂ）受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３のもとでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマによって生成されるモノクローナル抗体により結合されるエピトープと同じエピトープへの結合について競合する抗体、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）のフラグメントであって、前記フラグメントがインテグリンα１０サブユニット鎖の細胞外Ｉ−ドメインに特異的に結合できる、フラグメント
である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が固体支持体に結合される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が１または複数のフルオロフォアで標識される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記フルオロフォアがフィコエリトリン、アロフィコシアニン、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓレッド、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ブリリアント染料である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が検出に適した部分をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出に適した部分がナノ粒子、および放射性同位体から選択される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子がミセル、非弾性シェル、ナノチューブ粒子、リポソーム、金ナノ粒子およびポリマーからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記放射性同位体がβ放射体、オージェ放射体、転換電子放射体、α放射体、および低光子エネルギー放射体からなる群から選択される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出可能部分が常磁性同位体を含むまたは常磁性同位体からなる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記常磁性同位体が１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅからなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出可能部分がＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光画像診断または超音波画像診断などの画像化技術によって検出できる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
試験化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の分化を調節するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）インテグリンα１０サブユニットを発現する、または発現する能力を有する神経幹細胞および／または神経前駆細胞を用意するステップと、
ｂ）前記神経幹細胞および／または前記神経前駆細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｃ）前記試験化合物が神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化を調節する指標として前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化の速度またはパターンにおける変化を検出するステップと
を含み、前記分化の速度またはパターンが請求項２〜３５のいずれか１項に記載の方法に従って細胞によるインテグリンα１０発現を検出することによって決定される、方法。
【請求項３７】
基準集団と比較して神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮されている哺乳類細胞の単離集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するための方法であって、
ａ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、細胞集団の少なくとも一部、または基準集団の一部を用意するステップと、
ｂ）前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０サブユニットを同定する化合物を上記ａ）の細胞集団に導入するステップと、
ｃ）上記ｂ）の細胞集団から前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択し単離する、もしくは単離し選択する、もしくは単離する、もしくは選択するステップと
を含み、それによって神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮された細胞集団を生成する、方法。
【請求項３８】
前記神経幹細胞および／または前記神経前駆細胞が請求項２〜３５のいずれか１項に記載の方法によって同定されるおよび／または単離される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップｃ）における選択が蛍光細胞選別または磁気ビーズ選別によって行われる、請求項３７および３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
インテグリンα１０サブユニットを発現する未分化哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、前記細胞が神経組織に由来しかつ
ａ）培養中の細胞が（ｂ）に記載の血清および増殖誘導成長因子の両方を実質的に含まない培地中で分化される場合にニューロンおよび／またはオリゴデンドサイトおよび／またはアストロサイトに分化する能力を有して少なくとも１０％ニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトの細胞培養物を生成し、
ｂ）前記細胞培養物がＢ２７などの血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含有する培地中で分裂し、
ｃ）培養中の細胞が前記血清代替物および増殖誘導成長因子の両方を取り除くとニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトに分化する、
細胞培養物。
【請求項４１】
ａ）Ｂ２７などの血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含む培地と、
ｂ）哺乳類の中枢神経系に由来する未分化哺乳類細胞であって、前記細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、未分化哺乳類細胞と
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物。
【請求項４２】
インテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類未分化細胞の浮遊培養物であって、前記細胞が実質的に細胞凝集体に形成され、かつ前記細胞凝集体が増殖誘導成長因子を含有する培地中で維持される、浮遊培養物。
【請求項４３】
請求項３〜２８のいずれか１項に記載の方法によって得られる細胞培養物。
【請求項４４】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１鎖との組み合わせでてヘテロ二量体として発現される、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４５】
前記インテグリンα１０サブユニットが未分化哺乳類細胞の細胞表面で発現される、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４６】
前記インテグリンα１０サブユニットが未分化哺乳類細胞において細胞内で発現される、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４７】
前記未分化哺乳類細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％がインテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞である、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４８】
前記未分化哺乳類細胞が神経幹細胞または神経前駆細胞である、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４９】
前記培養中の細胞の一部がｎｅｓｔｉｎ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、ＰＤＧＦＲα、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ２４、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＥＧＦＲ、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）、Ｐａｘ６、ＦＡＢＰ７およびＧＬＡＳＴからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現する、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの増殖誘導成長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＰＤＧＦαまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５１】
前記培養中の細胞が哺乳類脳の脳室下帯（ＳＶＺ）もしくは顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）もしくは髄膜から得られるまたは生じる、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５２】
前記培養中の細胞がネズミである、請求項４０〜５１のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５３】
前記培養中の細胞がヒトである、請求項４０〜５２のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５４】
前記培養中の細胞がヒト胎児もしくはヒト成体の神経幹細胞および／または神経前駆細胞に由来する、請求項４０〜５３のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５５】
前記培養中の細胞がヒト胚細胞またはヒト胎児に由来しない、請求項４０〜５４のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項５６】
それを必要とする対象において神経系の疾患もしくは損傷を治療する及び/または神経系の損傷を防止するおよび損傷から保護する方法であって、
ａ）哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）前記対象に哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の単離集団の治療的有効量を投与することと
を含み、それによって中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する、方法。
【請求項５７】
それを必要とする対象において精神および行動の障害を治療する方法であって、
ａ）哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）前記対象に哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の単離集団の治療的有効量を投与することと
を含み、それによって精神症状を伴う神経障害を治療する、方法。
【請求項５８】
それを必要とする対象において神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または神経系の損傷を防止するおよび損傷から保護する方法であって、
ａ）哺乳類間葉系幹細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）前記対象に哺乳類間葉系幹細胞の単離集団の治療的有効量を投与することと
を含み、それによって中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する、方法。
【請求項５９】
それを必要とする対象において精神障害または行動障害を治療する方法であって、
ａ）哺乳類間葉系幹細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）前記対象に哺乳類間葉系幹細胞の単離集団の治療的有効量を投与することと
を含み、それによって精神症状を伴う神経障害を治療する、方法。
【請求項６０】
前記哺乳類間葉系幹細胞が骨髄もしくは脂肪組織もしくは臍帯血もしくはワルトン膠質もしくは歯髄もしくは脊髄組織もしくは血液もしくは羊水もしくは羊膜もしくは子宮内膜もしくは肢芽もしくは唾液腺もしくは皮膚もしくは包皮もしくは滑膜から単離される、請求項５８〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
それを必要とする患者においてＣＮＳの損傷部位または患部の特性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ）対象に抗インテグリンα１０サブユニットを投与するステップと、
ｂ）前記対象のＣＮＳの損傷部位または患部におけるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）ＣＮＳの前記損傷部位または患部の位置および大きさなどの特性を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項６２】
前記神経組織が神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記特性が脳卒中後のＣＮＳ組織の再生の程度を予測するために用いられる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
インテグリンα１０サブユニット発現の高い値が修正ランキンスケール（ｍＲＳ）の低い値に対応する、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記インテグリンα１０サブユニットがバイオマーカーパネルで用いられる、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または神経系の損傷を防止するおよび損傷から保護するためのおよび／または精神障害と行動障害を治療するための、あるいは前記疾患もしくは損傷を診断するおよび／または特徴づけるための方法での使用のための、前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０鎖サブユニットを含む、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類前駆細胞のためのマーカー。
【請求項６７】
神経系の疾患もしくは損傷および／または精神障害と行動障害を治療する方法での使用のためのインテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の単離された集団を含む組成物。
【請求項６８】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１鎖との組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項５６〜６７のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項６９】
前記インテグリンα１０サブユニットが哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞表面に発現する、請求項５６〜６８のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７０】
前記インテグリンα１０サブユニットが哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞において細胞内で発現される、請求項５６〜６９のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７１】
前記細胞集団がインテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞に関して濃縮される、請求項５６〜７０のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７２】
前記神経系の疾患もしくは損傷が中枢神経系または末梢神経系の傷害もしくは神経変性疾患である、請求項５６〜７１のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７３】
前記神経系の傷害が脊髄傷害（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、末梢神経損傷、脳卒中および脳癌からなる群から選択される、請求項５６〜７２のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７４】
前記神経系の傷害が脳卒中である、請求項５６〜７３のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７５】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）および多系統萎縮症からなる群から選択される、請求項５６〜７３のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項７６】
前記精神障害または行動障害がレット症候群、統合失調症、うつ病、自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）および双極性障害（ＢＰＤ）からなる群から選択される、請求項５６〜７３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカーまたは組成物。
【請求項７７】
前記神経幹細胞が請求項２〜５５のいずれか１項に定義されるような方法を用いて単離される、または前記神経幹細胞が請求項２〜５５のいずれか１項に定義されるようである、請求項５６〜７３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカーまたは組成物。
【請求項７８】
前記神経幹細胞が同種神経幹細胞である、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカー、または組成物。
【請求項７９】
前記神経幹細胞が自家神経幹細胞である、請求項１〜７８のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカー、または組成物。
【請求項８０】
前記神経前駆細胞が同種神経前駆細胞である、請求項１〜８１のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカー、または組成物。
【請求項８１】
前記神経前駆細胞が自家神経前駆細胞である、請求項１〜８０のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカー、または組成物。
【請求項８２】
前記間葉系幹細胞が同種間葉系幹細胞である、請求項１〜８１のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカー、または組成物。
【請求項８３】
前記間葉系幹細胞が自家間葉系幹細胞である、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の方法、使用のためのマーカー、または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の神経幹細胞および神経前駆細胞の同定および単離のためのマーカー、ならびに神経幹細胞および神経前駆細胞を濃縮した細胞集団を調製するためのその使用に関する。本発明はさらに、神経系の疾患および損傷を治療するため、ならびに神経系損傷を防止し、損傷から保護するための神経幹細胞、神経前駆細胞および間葉系幹細胞の使用に関する。さらに、本発明は、損傷を検出し診断するための、および予後マーカーとしてのこのマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経系（脳、脊髄および末梢神経）を構成する複雑で繊細な構造は、外傷から進行性悪化を起こす神経変性疾患にわたる種々の種類の傷害に影響されやすい。残念ながら、傷害後、自然な再生、修復または治癒が生じるのはごくわずかである。したがって、脳損傷、脊髄傷害による麻痺および末梢神経の損傷は、永続的で機能不能であることが多い。重度の神経系傷害または重篤な脳卒中の患者は、生涯にわたる支援を必要とすることが多い。脳卒中は、特に先進国において、最も多い死因および成人能力障害の一つである。しかし、現在までのところ治療の選択肢は、極めて限定されている。したがって、神経損傷および脳卒中の治療を進めるために、革新的で、新しい戦略が必要とされる。
【０００３】
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、かなりの数のニューロンとグリアとの両方の前駆細胞を増殖し、自己複製し、生成する能力を有する中枢神経系（ＣＮＳ）中の細胞である。成体神経発生の過程で、ＮＳＣは、ＮＳＣの自己複製、一過性の増幅する前駆細胞、神経芽細胞、および最終的に成熟したニューロン、アストロサイト、ならびにオリゴデンドロサイトを含む、多数の段階を経る（Ｇａｇｅ  Ｆ．Ｈ．とＴｅｍｐｌｅ  Ｓ．，２０１３）。ＮＳＣは、胚マウス、ラットおよびヒトＣＮＳのほぼすべての領域で確認されている。成体のＣＮＳにおいて、神経幹細胞および神経前駆細胞は、特殊化した幹細胞ニッチで神経発生に寄与することが示されている。ＮＳＣはこのように、疾患および損傷後の神経組織の再生に有用である。
【０００４】
神経幹細胞（ＮＳＣ）および前駆細胞（ＮＰＣ）は、それらを脳損傷および神経変性障害での細胞療法の候補にする中枢神経系のすべての主要な細胞型を形成する能力を有する。しかし、２つの理由から、臨床適用のための細胞療法の開発が妨げられてきた。理由の１つは、ヒト組織からＮＳＣを単離し療法用の十分な量で細胞を増やすことが困難なことである。もう１つの理由は、さらに分化した細胞型、および他の細胞が混入している細胞からＮＳＣを精製することができないことである。したがって、神経幹細胞／神経前駆細胞（ＮＳＣ）の特異的細胞マーカーが、治療的応用のためのヒトＮＳＣの同定、単離および選択にとって重要である。
【０００５】
いくつかのマーカーが長年にわたって、異なる細胞型および分化段階を確認するのに使用されてきた。
【０００６】
Ｓｏｘ２（ＳＲＹ  ｂｏｘ２）（転写因子のＳｏｘファミリーのメンバー）およびＮｅｓｔｉｎ（細胞内フィラメントタンパク質）は、胚脳および成熟脳の両方においてＮＳＣのマーカーとして頻繁に利用されている。しかし、両マーカーは細胞内に存在するので、機能性ＮＳＣを単離し選択するためにそれらを容易に用いることができない。
【０００７】
ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ポリシアル酸付加神経細胞接着分子）は、脳の発達期に神経前駆細胞内で高度に発現する。しかし、それは分化した神経細胞中でも見いだされる（Ｋｉｍ  ＨＳら，２０１４；Ｂｕｔｅｎｓｃｈｏｎ  Ｊら，２０１６）。
【０００８】
ＧＦＡＰ（中間フィラメントタンパク質である、グリア線維酸性タンパク質）は、神経前駆細胞に見いだされるが、成熟アストロサイト中の主要な中間フィラメントタンパク質としても主に見いだされる（Ｚｈａｎｇ  ＱＢら，２００６）。
【０００９】
ＣＤ１３３（プロミニン−１）は、ＮＳＣを含む様々な幹細胞型に存在するが、分化細胞上にも発現する（Ｋａｎｉａ  Ｇ，  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｄ，  Ｆｕｃｈｓ  Ｊら，２００５；Ｚｈａｎｇ  ＱＢら，２００６）。
【００１０】
ＰＤＧＦＲ−αは成体中枢神経系全体にわたり見いだされ、心室壁にそって均一に分布している（Ｃｈｏｊｎａｃｋｉら，２０１１）。成体脳室下帯（ＳＶＺ）内で、ＰＤＧＦＲ−αは、Ｂ型神経幹細胞であり（Ｊａｃｋｓｏｎら，２００６）主にオリゴデンドロサイトを産生する（Ｃｈｏｊｎａｃｋｉら，２０１１）細胞の特定の集団を標識することが見いだされている。複数の研究は、ＰＤＧＦＲ−αがニューロン生成とオリゴデンドロサイト生成の間のバランスを調節することを示唆している（ＦａｒａｈａｎｉとＸａｙｍａｒｄａｎ  ２０１５）。ＰＤＧＦＲ−αはこのように、いくつかの分化した神経細胞によって発現されるが、主にオリゴデンドロサイト前駆細胞で見いだされる。
【００１１】
Ｍｕｓａｓｈｉ−１（Ｍｓｉ−１）（ＲＮＡ結合タンパク質）は、ＣＮＳ幹細胞および前駆細胞中で発現され、そこで増殖と維持を調節すると推定される（概説については、ＭａｃＮｉｃｏｌら，２００８を参照されたい）。しかし、Ｍｓｉ−１は、細胞質および細胞核に、すなわち細胞内に局在し、したがって機能性ＮＳＣを単離し選択するために容易に用いることができない。
【００１２】
ＣＤ２４は、免疫細胞と中枢神経系細胞に見いだされる細胞接着分子である。脳内で、ＣＤ２４は若年成体マウスの神経原性帯内に見いだされＰＳＡ−ＮＣＡＭと共局在するので、神経芽細胞（Ａ型ＮＳＣ）マーカーとして認識される（Ｃａｌａｏｒａら，１９９６）。ＣＤ２４は、フローサイトメトリーによりマウス脳からＮＳＣを単離するために用いられており（Ｒｉｅｔｚｅら，２００１；Ｐａｎｃｈｉｓｉｏｎら，２００９）、他の細胞表面マーカー（例えばＣＤ１５およびＣＤ２９）と組み合わせて、ニューロン培養物を濃縮するのに用いられる（Ｐｒｕｓｚａｋら，２００９）。しかし、ＣＤ２４のレベルはニューロン細胞が成熟すると増加するので、ＣＤ２４は初期のニューロン分化のマーカーとも考えられる（Ｐｒｕｓｚａｋら，２００９）。
【００１３】
ＬｅＸ（別名ＳＳＥＡ−１またはＣＤ１５）は、成体中枢神経系の室の内側を覆っている未成熟の神経上皮細胞のマーカーであり、かつ分化する有糸分裂後のニューロンのマーカーである（Ｃａｌａｏｒａら，１９９６；ＣａｐｅｌａとＴｅｍｐｌｅ，２００２）。その発現はＧＦＡＰと重複するが、ＳＶＺから単離されるほんのわずかな（４％）細胞がＬｅＸ陽性である。ＬｅＸが細胞外ニッチにおいてＳＶＺ細胞によって取り除かれるという事実は、遊離ＬｅＸのレベルがそのように低いことを説明し得る。さらに、ＬｅＸは成体マウスＳＶＺのＢ型細胞とＣ型細胞の両方によって発現されるが、Ａ型（神経芽細胞）によっては発現されない（ＣａｐｅｌａとＴｅｍｐｌｅ，２００６）。
【００１４】
Ｖｉｍｅｎｔｉｎは、初期の脳の発達中に放射状神経膠と未熟なアストロサイトによって主に発現される主な中間径フィラメントタンパク質の１つである。
【００１５】
β−ＩＩＩチューブリンまたはＴｕｊ１は、未熟なニューロンの細胞内フィラメントマーカーである。β−ＩＩＩは、軸索ガイダンスと維持に関与する。
【００１６】
最後に、インテグリンファミリーのいくつかのメンバーがヒト神経幹細胞のマーカーとして提案されており、１２の異なるインテグリンからなり異なるαサブユニットがインテグリンβ１と結合されて異なる機能をもつ独特の受容体を形成するβ１サブファミリーのいくつかのインテグリンを含む。インテグリンサブユニットβ１は、胎児脳組織からＮＳＣを選択するために用いられてきたが、しかし、β１サブファミリーのインテグリンは分化細胞を含むほとんどの細胞に存在しているので、β１サブユニットに基づく選択は特異的ではない。β１と組むのはＮＳＣ上のどのαインテグリンかは不明である。α２、α３、α５、α６およびα７の発現はＮＳＣ上ですべて検出されている（Ｆｌａｎａｇａｎら，２００６）が、これらのインテグリンは種々の細胞型上にも存在する。Ｈａｌｌ  ＰＥら（２００６）は、ヒトＮＳＣの可能性のあるマーカーとして二量体インテグリンα６β１を用いることを提案した。このインテグリンは血管ラミニンの受容体であり、血小板粘着、活性化および動脈血栓症で役割を果たすことが知られている。
【００１７】
結論として、神経幹細胞および神経前駆細胞の同定と単離に適した特異的なマーカーに対する未だ対処されていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１８】
インテグリンα１０β１は、軟骨細胞で見つかるＩＩ型コラーゲン結合受容体である（Ｃａｍｐｅｒら，１９９８）。インテグリンα１０β１は、軟骨細胞上の主要なコラーゲン結合インテグリンであり、発達期および成体組織の両方において軟骨で高度に発現される（Ｃａｍｐｅｒら，２００１）。インテグリンα１０β１は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によっても発現される（Ｖａｒａｓら，２００７）。線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）がインテグリンα１０β１の発現を増加させＭＳＣの軟骨形成の可能性を向上させることがさらに示されている（Ｖａｒａｓら，２００７）。Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら（２００５）は、インテグリンα１０β１欠如マウスが軟骨成長板に欠損を有し、結果として、長骨の成長遅延を発症することを示した。最近の研究は、イヌα１０インテグリン遺伝子の自然発生変異が猟犬類の軟骨発育不全に関与することを明らかにし（Ｋｙoｏｓｔｉｌaら，２０１３）、骨格発達におけるα１０β１の重要な役割を裏づけている。
【００１９】
本発明者らは意外にも、神経組織由来の神経幹細胞および神経前駆細胞上でヘテロ二量体α１０β１の発現を検出し、哺乳類神経幹細胞および神経前駆細胞の同定と単離のための選択マーカーとしてその用途を本明細書に開示する。上述のＮＳＣ表面マーカーとは対照的に、インテグリンα１０β１は、共局在の調査（図３、６、７、８、９、１０、１１および１２）が示すように成体マウスＳＶＺ幹細胞ニッチの３種類のＮＳＣ／ＮＰＣ細胞型（以下の表１を参照されたい）のすべてに存在し、インテグリンα１０β１が、他の既存のマーカーと比較して、幹細胞と前駆細胞の幅広いマーカーであり、脳幹細胞ニッチの種々の細胞亜型を包含することを示唆する。
【００２０】
【表１】
2019533429.tif 000003
【００２１】
本開示の一態様は、哺乳類神経幹細胞および哺乳類神経前駆細胞のためのマーカーとしての神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０サブユニットを含むマーカーの使用に関する。
【００２２】
本開示の別の態様は、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するための方法に関し、方法は
ａ）神経組織、例えば神経細胞を含む試料を用意するステップと、
ｂ）インテグリンα１０サブユニットの発現をａ）の試料に含まれる細胞によって検出するステップと、
ｃ）ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）ｃ）でのスコア付けに従って哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を同定するステップと
を含む。
【００２３】
本開示の別の態様は、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を単離するための方法に関し、方法は
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）インテグリンα１０サブユニットの発現をａ）の試料に含まれる細胞によって検出するステップと、
ｃ）ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）ｃ）でのスコア付けに従って哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択するステップと
を含む。
【００２４】
本開示の別の態様は、試験化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の分化を調節するかどうかを決定するための方法に関し、方法は、
ａ）インテグリンα１０サブユニットを発現する神経幹細胞および／または神経前駆細胞を用意するステップと、
ｂ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｃ）試験化合物が神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化を調節する指標として神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化の速度またはパターンの変化を検出するステップと
を含み、分化の速度またはパターンは、本明細書に記載の方法に従って細胞によるインテグリンα１０発現を検出することにより決定される。
【００２５】
本開示の別の態様は、基準集団と比較して神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮される哺乳類細胞の単離集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するための方法に関し、方法は、
ａ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、ＣＮＳ由来の細胞集団の少なくとも一部、または基準集団の一部を用意するステップと、
ｂ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されたインテグリンα１０サブユニットを同定する化合物を上記ａ）の細胞集団に導入するステップと、
ｃ）上記ｂ）の細胞集団から神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択し単離するステップと
を含み、それによって、神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮された細胞集団を生成する。
【００２６】
本開示の別の態様は、インテグリンα１０サブユニットを発現する未分化哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物に関し、細胞は神経組織に由来し、および
ａ）培養中の細胞は血清および増殖誘導成長因子の両方を実質的に含まない培地中で分化されるとニューロンおよび／またはオリゴデンドサイトおよび／またはアストロサイトに分化する能力を有し、
ｂ）培養中の細胞はＢ２７などの血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含有する培地中で増殖し、
ｃ）培養中の細胞は血清代替物Ｂ２７および増殖誘導成長因子の両方を取り除くとニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトに分化する。
【００２７】
本開示の別の態様は、
ａ）Ｂ２７などの血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含む培地と、
ｂ）哺乳類の中枢神経系に由来する未分化哺乳類細胞であって、上記細胞の少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、未分化哺乳類細胞と
を含むｉｎ  Ｖｉｔｒｏ細胞培養物に関する。
【００２８】
本開示の別の態様は、インテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類未分化細胞の浮遊培養物に関し、細胞は実質的に細胞凝集体に形成され、および細胞凝集体は増殖誘導成長因子を含有する培地で維持される。
【００２９】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象において神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／またはＣＮＳ損傷を防止するおよび損傷から保護する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する。
【００３０】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象において精神障害および行動障害を治療する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって精神症状を伴う神経障害を治療する。
【００３１】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象において神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類間葉系幹細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類間葉系幹細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する。
【００３２】
本開示の別の態様は、それを必要とする対象において精神障害および行動障害を治療する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類間葉系幹細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類間葉系幹細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって精神症状を伴う神経障害を治療する。
【００３３】
本開示の別の態様は、神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する方法におけるおよび／または精神障害と行動障害を治療する方法における使用のための、神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０鎖サブユニットを含む、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類前駆細胞のためのマーカーに関する。
【００３４】
本開示の別の態様は、神経系の疾患もしくは損傷および／または精神障害と行動障害を治療する方法での使用のためのインテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の単離集団を含む組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】インテグリンα１０β１は成体マウス脳の脳室下帯から単離された細胞の亜集団によって発現される。図は、フローサイトメトリーによって評価された、成体マウス脳の脳室下帯から単離された細胞上でのインテグリンα１０β１の発現を示す。非染色細胞の分析（Ａ）。インテグリンα１０サブユニットに対するモノクローナル抗体で染色された細胞（Ｂ）、および対象マウスＩｇＧ２ａ抗体で染色された細胞（Ｃ）および陽性細胞のパーセンテージを続いて分析した。結果は、単離細胞の亜集団がインテグリンα１０β１を発現することを示す。
【図２】インテグリンα１０β１は、脳室下帯から単離されニューロスフェアとしてまたは単層として培養された細胞の亜集団によって発現される。図は、フローサイトメトリーによって評価した、単層（Ａ〜Ｄ）およびニューロスフェア（Ｅ〜Ｈ）として培養された細胞によるインテグリンα１０β１、ＰＤＦＧＲα、ＬｅｘおよびＣＤ２４の発現を示す。細胞を、インテグリンα１０サブユニットに対するモノクローナル抗体（Ａ、Ｅ）、ＰＤＦＧＲαに対するモノクローナル抗体（Ｂ、Ｆ）、ＣＤ２４に対する抗体（Ｃ、Ｇ）およびＬｅｘに対する抗体（Ｄ、Ｈ）で染色し、陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーで分析した。結果は、単層で、またはニューロスフェアとして培養された細胞の亜集団がインテグリンα１０β１、ＰＤＧＦＲα、ＬｅｘおよびＣＤ２４を発現することを示す。
【図３】ニューロスフェアはインテグリンα１０β１および他の神経幹／前駆幹細胞のマーカーを発現する。図は、マウスのＳＶＺから単離され、次いでインテグリンα１０β１および他の神経幹細胞／神経前駆細胞のマーカーについて免疫染色された、ニューロスフェアにおける細胞の二重免疫標識を示す。染色を可視化し、共焦点顕微鏡観察によって画像を取得した。全てのニューロスフェアは、α１０と、神経幹／前駆細胞のマーカーのＮｅｓｔｉｎ（Ａ）、ＰＤＧＦＲα（Ｂ）、ＧＦＡＰ（Ｃ）、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（Ｄ）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（Ｅ）との両方の発現を示す。Ｏｌｉｇ２染色（Ｆ）で示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＶＺの細胞組成物（Ｄｏｅｔｓｃｈら，１９９７）と一致して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのニューロスフェアも少量のＣ型細胞を示す。
【図４】ＳＶＺから単離され幹細胞条件下で培養された神経幹／前駆細胞はニューロン細胞とグリア細胞に分化する可能性を保持する。神経幹／前駆細胞を分化させ、ニューロン遺伝子（Ｍａｐ２、β−ＩＩＩ  Ｔｕｂ）およびグリア遺伝子（Ｇｆａｐ、Ｏ４）についての発現を測定した。Ｇａｐｄｈを正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。遺伝子発現を、三つ組試料の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表す。
【図５】インテグリンα１０β１は成体マウス脳の脳室下帯（ＳＶＺ）の細胞によって発現される。図は、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡観察によって評価した、成体マウス組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１の発現を示す。脳組織をインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ａ）と細胞核ＤＮＡを可視化するためのＤＡＰＩ（Ｂ）とで染色した。ＡとＢの合成画像をＣに示す。
【図６】インテグリンα１０β１および神経幹／前駆細胞マーカーのＮｅｓｔｉｎは成体マウス脳の脳室下帯（ＳＶＺ）において部分的に共局在する。図は、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡観察によって評価した、成体マウス組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＮｅｓｔｉｎの発現を示す。脳細胞をインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ａ）、Ｎｅｓｔｉｎに対するマウスモノクローナル抗体（Ｂ）および細胞核ＤＮＡを可視化するためのＤＡＰＩ（Ｃ）で染色した。
【図７】インテグリンα１０β１および神経芽細胞マーカーのＰＳＡ−ＮＣＡＭは成体マウス脳の脳室下帯（ＳＶＺ）の細胞上に部分的に共局在する。図は、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡観察によって評価した、成体マウス組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＰＳＡ−ＮＣＡＭの発現を示す。脳細胞をインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃ）、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対するマウスモノクローナル抗体（Ｂ）および細胞核ＤＮＡを可視化するためのＤＡＰＩ（Ａ）で染色した。Ａ、ＢおよびＣの合成画像をＤに示す。
【図８】インテグリンα１０β１およびグリア細胞マーカーのＧＦＡＰは成体マウス脳の脳室下帯（ＳＶＺ）の細胞上に部分的に共局在する。図は、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡観察によって評価した、成体マウス組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＧＦＡＰの発現を示す。脳細胞をインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ａ）、ＧＦＡＰに対するヤギポリクローナル抗体（Ｂ）で染色した。ＡとＢの合成画像をＣに示す。
【図９】インテグリンα１０β１および神経幹細胞マーカーのＳＯＸ２は新生仔マウス脳の脳室下帯（ＳＶＺ）の細胞上に部分的に共局在する。図は、免疫蛍光染色と落射蛍光顕微鏡観察によって評価した、新生仔マウス組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１および神経幹細胞マーカーのＳＯＸ２の発現を示す。細胞核ＤＮＡを可視化するために、脳細胞をＤＡＰＩ（Ａ）、ＳＯＸ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂ）およびインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃ）で染色した。Ａ、ＢおよびＣの合成画像をＤに示す。
【図１０】インテグリンα１０β１およびＰＤＦＧＲαは成体マウス脳の脳室下帯から単離された細胞の亜集団上に部分的に共局在する。図は、フローサイトメトリーによって評価した、成体マウス脳の脳室下帯から単離された細胞によるインテグリンα１０β１およびＰＤＦＧＲαの発現を示す。細胞をインテグリンα１０サブユニットに対するモノクローナル抗体（Ａ）とＰＤＦＧＲαに対するモノクローナル抗体（Ｂ）とで染色し、陽性細胞のパーセンテージを分析した。フローサイトメトリー分析は、単離細胞の亜集団がインテグリンα１０β１およびＰＤＦＧＲαの両方を発現することを示す（Ｃ）。
【図１１】インテグリンα１０β１は新生仔マウス脳の海馬の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）で発現され、神経幹細胞マーカーのＳＯＸ２と部分的に共局在する。図は、免疫蛍光染色と落射蛍光顕微鏡観察によって評価した、新生仔マウス脳組織のＳＧＺにおけるインテグリンα１０β１および神経幹細胞マーカーのＳＯＸ２の発現を示す。脳細胞を、細胞核ＤＮＡを可視化するためのＤＡＰＩ（Ａ）、ＳＯＸ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂ）およびインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃ）で染色した。Ａ、ＢおよびＣの合成画像をＤに示す。
【図１２】インテグリンα１０β１は新生仔マウス脳の髄膜内で発現され、グリア細胞／オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであるＰＤＧＦＲαと部分的に共局在する。図は、免疫蛍光染色と落射蛍光顕微鏡観察によって評価した、新生仔マウス脳組織の髄膜におけるインテグリンα１０β１およびＰＤＧＦＲαの発現を示す。脳細胞を、細胞核ＤＮＡを可視化するためのＤＡＰＩ（Ａ）、ＰＤＧＦＲαに対するヤギポリクローナル抗体（Ｂ）およびインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃ）で染色した。Ａ、ＢおよびＣの合成画像をＤに示す。
【図１３】インテグリンα１０β１は脳卒中後のマウス脳において増加される。図は、免疫蛍光染色と落射蛍光顕微鏡観察によって評価した、マウス脳において損なわれていない部位に対して脳卒中部位でのインテグリンα１０β１のより高い発現を示す。脳卒中部位は、破線の右側である。
【図１４】インテグリンα１０β１、ニューロンマーカーのＮｅｕＮ、およびアストロサイトマーカーのＧＦＡＰの発現。図は、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡観察によって評価した、マウス脳におけるインテグリンα１０β１、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、およびＩｂａ１の発現を示す。脳組織をインテグリンα１０サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体、ＮｅｕＮに対するモルモットポリクローナル抗体、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１（ミクログリアマーカー）に対するヤギポリクローナル抗体で染色した。対照マウス脳の合成画像をＡ、Ｄに示し、かつインテグリンα１０β１およびＮｅｕＮの発現（ＢおよびＣ）、インテグリンα１０β１およびＧＦＡＰの発現（ＥおよびＦ）ならびにインテグリンα１０β１およびＩｂａ１の発現（ＨおよびＩ）に関する脳卒中脳の合成画像を示す。共局在を矢印で示す。結果は、インテグリンα１０β１が、それぞれニューロンおよびアストロサイト上で発現が増加したＮｅｕＮおよびＧＦＡＰ（再生応答）と共局在するが、ミクログリアマーカーのＩｂａ１とは共局在しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本明細書で用いる場合、「齧歯類」および「齧歯動物」という用語は、系統学的齧歯目のすべてのメンバーを指す。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「インテグリンα１０」または「インテグリンα１０サブユニット」は、ヘテロ二量体タンパク質インテグリンα１０β１のα１０サブユニットを指す。この指示的意味は、α１０サブユニットに結合され、したがってインテグリンα１０β１ヘテロ二量体の四次構造を形成するβ１サブユニットの存在を除外するものではない。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「抗インテグリンα１０抗体」または「抗インテグリンα１０サブユニット抗体」は、ヘテロ二量体タンパク質インテグリンα１０β１の少なくともα１０サブユニットを認識しそれに結合できる抗体を指す。これらの抗体はヘテロ二量体タンパク質インテグリンα１０β１のエピトープを認識する抗体であってよく、このエピトープはα１０およびβ１の両サブユニットのアミノ酸残基を含む。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「同定すること」という用語は、細胞をある特定の細胞型、例えば神経幹細胞または神経前駆細胞として認識する行為を指す。同定することへの代替用語は「検出すること」であり、これは本明細書では同じ意味で使用される。ある細胞は、例えばその細胞による特異的マーカーの発現を検出することによって、神経幹細胞または神経前駆細胞と同定される。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「単離すること」、「選別すること」および「選択すること」という用語は、細胞をある特定の細胞型と同定する行為、および同じ細胞型または分化状態に属していない細胞からその細胞を分離する行為を指す。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「スコア化する」という用語は、インテグリンα１０サブユニット発現をスコア付けすることを指す。スコア化するとは、インテグリンα１０サブユニット発現を例えば、試料集団における免疫測定法、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、ウエスタンブロットまたは免疫沈降法により測定すること、およびこの測定を、インテグリンα１０サブユニットを発現する基準細胞集団で行った測定と、ならびにインテグリンα１０サブユニットを発現しない細胞集団と比較することであり得る。インテグリンα１０を発現する基準細胞の例は、インテグリン配列でトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞、ＨＥＫ２９３細胞である。インテグリンα１０を発現しない基準細胞の例は、トランスフェクトされていないＣ２Ｃ１２細胞およびＨＥＫ２９３細胞である。
【００４２】
「マウス」という用語は、ラットおよびマウスを含む、ネズミ科の任意およびすべてのメンバーを指す。
【００４３】
本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、用いられるアッセイの検出限界未満を意味し、それによって陰性、すなわち含まないように見えることを意味すると意図される。
【００４４】
本明細書では「コミットした」という用語は、専用である、または特化されることを意味する。したがって、コミットした細胞は、特定の分化経路に専用である、または特化される細胞である。このことから、コミットされていない細胞は、いかなる特定の分化経路にも専用でない、または特化されず、かついくつかの選択肢を有することになる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「対象」という用語は任意の哺乳類を意味するために使われ、それに対し、細胞表面または細胞内でのインテグリンα１０発現の検出に基づく、本明細書に開示される方法に従って同定および／または単離された神経幹細胞および／または神経前駆細胞および／または間葉系幹細胞が投与され得る。本開示の方法による治療のために具体的に意図される対象としては、ヒト、ならびに非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラットとマウス、ならびにこれらの宿主から得られるまたは生じる器官、腫瘍、および細胞が挙げられる。
【００４６】
発明の詳細な説明
神経幹細胞および神経前駆細胞のマーカーとしてのインテグリンα１０
本発明者らは、意外にもインテグリンα１０β１がヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）および／または神経前駆細胞（ＮＰＣ）に存在することを見いだした。したがって、このインテグリンは、混合細胞集団から神経幹細胞および神経前駆細胞を同定し、選択しおよび特異的に単離するために使用でき、例えば神経系傷害の結果としてまたは神経変性疾患の治療のために、損傷した組織を修復する細胞治療において有用なツールである。上述のＮＳＣ表面マーカーと比較して、インテグリンα１０β１は成体マウスＳＶＺの３つの細胞型（上記表１を参照されたい）すべてを同定し、インテグリンα１０β１が他の既知のマーカーと比較して、脳幹細胞ニッチの種々の細胞亜型を包含する、幹細胞と前駆細胞の幅広いマーカーであることを示唆する。
【００４７】
ヒトインテグリンα１０鎖配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）／ＥＢＩ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ受入番号ＡＦ０７４０１５で一般公開されている。このように、インテグリンα１０鎖の新規用途および方法は、本発明で開示される。
【００４８】
上で明らかにしたように、本開示の一態様は、哺乳類神経幹細胞および哺乳類神経前駆細胞のためのマーカーとして神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０サブユニットを含むマーカーの使用に関する。
【００４９】
一実施形態において、インテグリンα１０サブユニットはインテグリンβ１鎖と組み合わされてヘテロ二量体として発現される。
【００５０】
一実施形態において、インテグリンα１０サブユニットは哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの細胞表面で発現される
【００５１】
一実施形態において、インテグリンα１０サブユニットは哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの細胞内で発現される。
【００５２】
神経幹細胞（ＮＳＣ）および神経前駆細胞（ＮＰＣ）を同定するための方法
本開示の一態様は、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するための方法に関する。方法は、
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）ａ）の試料に含まれる細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）ｃ）でのスコア付けに従って哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を同定するステップと
を含む。
【００５３】
本開示のさらなる態様は、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を単離するための方法に関する。方法は、
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）ａ）の試料に含まれる細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）ｃ）でのスコア付けに従って哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択するステップと
を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを同定する方法ならびに哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを単離する方法は、ｂ）のインテグリンα１０サブユニトの発現を検出する前に、インテグリンα１０サブユニットを特異的に結合する抗体と試料を接触させるステップをさらに含む。
【００５５】
さらに詳細に、本開示による哺乳神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するおよび／または単離するための方法は、
ｅ）ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを含む細胞懸濁液を用意するステップと、
ｆ）モノクローナル抗体またはそのフラグメントがインテグリンα１０β１の細胞外ドメインと抗体−抗原複合体を形成する条件下で、ｅ）における細胞懸濁液をインテグリンα１０β１に結合する上記モノクローナル抗体またはそのフラグメントと接触させるステップと、
ｇ）ｆ）における上記モノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合している細胞を分離するステップと
をさらに含み、それによって、哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの純粋集団を生成する。
【００５６】
本開示のいくつかの実施形態において、本開示による哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するおよび／または単離するための方法は、抗体もしくはそのフラグメントから上記モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントに結合している細胞を回収することをさらに含み得る。
【００５７】
哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを含む、上記ｅ）において用意される細胞懸濁液は、以下の「神経組織」の節で詳細に説明するように、神経組織から単離されてよい。
【００５８】
本開示のいくつかの実施形態において、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するおよび／または単離するための方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００５９】
神経組織
哺乳類ＮＳＣおよびＮＰＣの主要なソースは、神経組織である。実際に、ＮＳＣおよびＮＰＣは、胎児または成体哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）中のニッチで、および神経発生が起こる胎児または成体哺乳類の脳または脊髄から見つかる。
【００６０】
脳内の神経幹細胞ニッチは、神経前駆細胞を受け入れ維持できる組織微小環境である。最近まで、哺乳類においてわずかに２つの脳ニッチ、前外側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）と海馬歯状回の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）、が確認された。増加するエビデンスは、特に傷害後の、成体脳の他の部位でも神経発生およびグリア新生を明らかにし、さらなる幹細胞ニッチが成体脳に存在することを示唆する（ＬｉｎとＩａｃｏｖｉｔｔｉ，２０１５）。軟髄膜が、ＮｅｓｔｉｎおよびＳＯＸ２を示す未分化型の、増殖するおよび分化する神経前駆細胞のマーカーを発現する細胞のサブセットを提供し、この細胞のセットは成人期に存続することが最近示された。このように、髄膜は、胚発生期および成人期に前駆細胞のための別の機能的ニッチであり得る。
【００６１】
したがって、本開示のいくつかの実施形態において、神経組織はＮＳＣおよびＮＰＣを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、神経組織は脳組織から得られる、または由来する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、神経組織は成体脳組織である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、神経組織は胎児脳組織である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、神経組織は哺乳類の脳室下帯（ＳＶＺ）、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）または髄膜に由来する、またはこれらから得られる。
【００６６】
すべての哺乳類は神経組織を得るのに適している。いくつかの実施形態において、神経組織はヒト、イヌ、ウマ、ウシ、ネコ、マウス、ヒツジまたはブタの神経組織からなる群から選択される。他の哺乳類神経細胞も、それを必要とする場合、入手されてよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、哺乳類ＮＳＣおよびＮＰＣは、ヒトＮＳＣおよびヒトＮＰＣである。
【００６８】
さらに一実施形態において、哺乳類ＮＳＣおよびＮＰＣは、マウスＮＳＣおよびＮＰＣである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、神経組織はヒト胎児に由来しない。
【００７０】
インテグリンα１０発現の検出
哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の同定のための、ならびにそれらの単離のための方法において重要なステップは、インテグリンα１０タンパク質発現の検出ステップである。
【００７１】
一実施形態において、細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現の検出は、フローサイトメトリーによって決定される。例えば、α１０の発現は、フローサイトメトリー、または特異性が高い他の任意の方法によって分析されてよい。多色分析を、特に簡便である、フローサイトメトリーで利用してもよい。ＮＳＣおよび／またはＮＰＣは、このように、特定の抗原に対する染色のレベルに基づいて、他の細胞から分離され得る。
【００７２】
一実施形態において、細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現の検出は、インテグリンα１０タンパク質発現を測定することによって決定される。例えば、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、免疫沈降法および／またはウエスタンブロット法を用いることができる。
【００７３】
一実施形態において、細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現の検出は、インテグリンα１０ｍＲＮＡ発現を測定することによって決定される。特定のタンパク質のｍＲＮＡの発現の検出は、当技術分野の当業者には周知であり、一般的に、そのプローブが他のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件下で、目的のｍＲＮＡに特異的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いてｍＲＮＡを探索することによって行われる。種々のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いてもよく、これは当業者には明白である。
【００７４】
適切なＰＣＲ方法を以下に示す。手短に言えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いることができる。
【００７５】
ＲＮＡは、標準方法によって、例えば、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）によってヒト神経幹細胞または神経前駆細胞から調製できる。
【００７６】
ｃＤＮＡは、オリゴｄ（Ｔ）−プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを用いてメーカー推奨に従い逆転写酵素反応、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）により生成できる。
【００７７】
ＰＣＲをその後に行ってｃＤＮＡを増幅する。α１０のための特定のプライマー、順方向５’ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＴＧ  ３’および逆方向５’ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ３’、をｃＤＮＡに加え、特異的産物を、メーカー推奨に従いＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）によって６５℃で４０サイクル増幅させる。
【００７８】
マーカー発現の検出についていくつかの方法が当業者に知られている。したがって、本開示の一実施形態において、細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現の検出は、免疫測定法、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、免疫沈降法およびウエスタンブロット法からなる群から選択される方法によって決定される。
【００７９】
さらにさらなる実施形態において、インテグリン鎖α１０の発現は、本発明による方法において、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの細胞表面で、あるいはＮＳＣおよび／またはＮＰＣの細胞内で検出される。上記の方法、例えばフローサイトメトリーおよび免疫沈降法を用いてもよい。フローサイトメトリーを用いることが好ましい。
【００８０】
さらにさらなる実施形態において、インテグリンα１０サブユニットの発現は、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌプロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ）に記載の方法などの、任意の免疫測定法によって検出される。検出は、種々の方法、例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリー方法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの、当業者に既知の任意の免疫方法によって行われてもよい。
【００８１】
したがって、いくつかの実施形態において、細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現は抗体を介して検出され、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体またはそれらのフラグメントである。
【００８２】
抗体、例えばモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、特定の細胞系列および／または分化段階に関連した、マーカー、細胞表面タンパク質ならびに細胞内マーカーを同定するのに特に有用である。したがって、抗体はインテグリンα１０の同定に適している。
【００８３】
一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００８４】
さらなる実施形態において、抗体は非ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００８５】
さらに、同定は、インテグリンα１０分子に特異的に結合するタンパク質またはペプチドなどの、任意の特異的分子によって行われてもよい。そのようなタンパク質またはペプチドの例は、インテグリンα１０分子に結合する天然リガンドである。そのような天然リガンドは、組換えで生成され、化学的に合成され、または天然源から精製されてよい。
【００８６】
インテグリンα１０分子に特異的に結合する抗体、タンパク質またはペプチドが検出可能部分に結合される場合、検出は容易になる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、抗体は、インテグリンα１０サブユニットの発現を検出するために用いられ、かつこの抗体は、フルオロフォア、酵素または放射性トレーサーもしくは放射性同位体からなる群から選択される検出可能部分などの、検出可能部分に共有結合される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、抗体はフルオロフォアに結合され、フルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリンとフィコエリトリン複合体、アロフィコシアニンとアロフィコシアニン複合体、ＴｅｘａｓレッドとＴｅｘａｓレッド複合体、Ａｌｅｘａシリーズの蛍光色素、ブリリアントバイオレットおよびブリリアントブルーのシリーズの蛍光色素からなる群から選択される。
【００８９】
多くの他のフルオロフォアを用いることが可能であり、当業者は、特定の検出方法によって、および使用する抗体の特性によっても最適なものを選択するであろう。
【００９０】
さらなる実施形態において、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプを有する。
【００９１】
さらにさらなる実施形態において、抗体は、
ａ）受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３のもとでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨで寄託されたハイブリドーマ細胞株によって生成されるモノクローナル抗体、または
ｂ）受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３のもとでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨで寄託されたハイブリドーマによって生成されるモノクローナル抗体により結合されるエピトープと同じエピトープへの結合について競合する抗体、または
ｃ）インテグリンα１０サブユニト鎖の細胞外Ｉ−ドメインに特異的に結合できる、ａ）もしくはｂ）のフラグメント
である。
【００９２】
検出はまた、インテグリンα１０分子に特異的に結合する抗体、タンパク質またはペプチドが固体支持体に結合されると、容易に行われる。したがって、一実施形態において、抗体は、インテグリンα１０サブユニットの発現を検出するために用いられ、かつこの抗体は固体支持体に結合される。
【００９３】
ＮＳＣおよびＮＰＣの単離および培養
本開示の方法による哺乳類の神経幹細胞（ＮＳＣ）および／または哺乳類神経前駆細胞（ＮＰＣ）の単離は、特定の培養条件の下でプラスチック培養皿に付着し、コロニーを形成する細胞能力に基づいて行うことができる。哺乳類神経幹細胞および神経前駆細胞の単離に適したプロトコルは、本発明によるマーカーを含まないが、Ｇｉａｃｈｉｎｏら，２００９，  Ｇｕｏ  Ｗら，（２０１２）およびＯｌｉｖｅｒ−Ｄｅ  ｌａ  ＣｒｕｚとＡｙｕｓｏ−Ｓａｃｉｄｏ（２０１２）にさらに詳細に記載されている。このように、既知の方法は、本発明によるマーカーの導入を伴い、使用できる。
【００９４】
分離のための方法は、例えば抗体被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合させた薬剤もしくはモノクローナル抗体と組み合わせて用いられる薬剤、例えば補体と細胞毒、および固体マトリックス、例えばプレートに結合された抗体による「パニング」、または他の簡便な手法を含み得る。正確な分離をもたらす手法としては、蛍光活性化細胞選別装置が挙げられ、これは、例えば、当業者には既知の複数のカラーチャネル、光散乱検出チャネル、インピーダンスチャンネルなど、種々の程度の精巧さを有し得る。
【００９５】
本発明による方法で用いるのに適した分離方法のためのさらなるプロトコルは、Ｏｒｆａｏ，  ＡとＲｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｅｓ，  Ａ（（１９９６）  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（１）：５−９），およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，  ＬＡ，  Ｄｅ  Ｒｏｓｅ，  ＳＣ  とＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，  ＬＡ  （（２０００）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＦＡＣＳ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．２１（８）：３８３−３９０）に記載される。
【００９６】
哺乳類ＮＳＣおよびＮＰＣは、神経組織から収集された細胞の混合物から最初に精製される。一般的に、陰性マーカーが、分化細胞からＮＳＣとＮＰＣを分離するのに用いられる。
【００９７】
神経組織に存在する他の細胞、例えばコミットした神経細胞からのＮＳＣおよびＮＰＣの単離は、ＮＳＣとＮＰＣをまず同定し次いで他の細胞から分離する、選択および選別のステップを含む。当業者には既知の種々の手法を用いて、ＮＳＣおよびＮＰＣよりも他の系列専用の細胞を最初に除去することによって細胞を分離できる。
【００９８】
第１の分離において、他のマーカーのための抗体は、１または複数の蛍光色素で標識して使用してもよい。
【００９９】
ＮＳＣおよびＮＰＣは、死細胞と結合する色素（ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ）を使用することによって、死細胞に対して選択されてよい。これらの細胞は、それらの培地中でまたは、好ましくは緩衝された、任意選択でウシ胎児血清（ＦＣＳ１％）もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ１％）が存在する、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの、任意の生理食塩水中で回収されてよい。
【０１００】
ＮＳＣおよびＮＰＣ上で発現されないマーカーは、例えば、ＣＤ３２６、ＣＤ３４およびＣＤ４５であり、それらの発現または発現の欠如は、特定の実施形態において、ＮＳＣまたはＮＰＣでない細胞の負の選択のマーカーとして用いることができる。
【０１０１】
ＮＳＣまたはＮＰＣでないさらなる系列または細胞集団が１ステップで除去される場合、そのような系列−特異的マーカーに対する種々の抗体は含まれてよい。
【０１０２】
本開示のいくつかの実施形態において、それほど特異的でなく、かつ非ユニークな他の哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣマーカーが本発明によるマーカーと平行して分析されてよい。実際に、ＣＮＳ発達の種々の段階で検出されるＮＳＣおよびＮＰＣのサブセットは、Ｎｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、ＣＤ１５、ＣＤ２４、Ｓｏｘ２、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）、Ｐａｘ６、ＦＡＢＰ７およびＧＬＡＳＴなどのマーカーを発現することが示されている。実施例で示すように、これらのマーカーは、インテグリンα１０サブユニットを発現するいくつかの細胞により同時発現される。しかし、これらのマーカーのいずれもＮＳＣによっておよび／またはＮＰＣによって独自に発現されず、多くは実際に、神経分化細胞および他の非神経細胞型によって発現される。
【０１０３】
対照的に、単離および増殖のプロトコルにおける本発明によるインテグリンα１０マーカーの使用は、神経幹細胞および／または神経前駆細胞の同種集団に脳および脊髄の異なる細胞に分化する能力を与えることになり、したがって脳組織または脊髄組織の再生に有用である。
【０１０４】
したがって、本発明に従うマーカーを含むこと、既知の単離および増殖のプロトコルでインテグリンα１０サブユニットを含むこと、ならびにマーカー（複数可）を単独で使用することは、神経幹細胞および神経前駆細胞の集団のさらなる評価および濃縮のために極めて有用である。特に、哺乳類神経幹細胞および神経前駆細胞のための本発明によるマーカーのような他の特異的かつユニークなマーカーは知られていない。
【０１０５】
ＮＳＣおよびＮＰＣは、本発明による方法を用いる同定と組み合わせて、光散乱特性および種々の細胞表面抗原のそれらの発現に基づいて選択されてもよい。
【０１０６】
一般的に、細胞表面または細胞内に存在するマーカーは、蛍光色素の助けにより検出される。多色分析に用途を見出すことができる蛍光色素としては、フィコビリンタンパク質、例えばフィコエリトリンとアロフィコシアニン、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓレッド、およびすべて当業者に周知であり、市販される他の多くの蛍光色素が挙げられる。
【０１０７】
それらの細胞表面に存在するマーカーの使用に基づく細胞の検出と選択のために一般的に用いられる手法は、フローサイトメトリーと免疫沈降法である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＮＳＣおよびＮＰＣは、フローサイトメトリーまたは免疫沈降法によって分析されてよく、それによってインテグリンα１０サブユニット発現を検出し同定する。当業者は、細胞の検出および／または選択のために使われるフローサイトメトリーと免疫沈降法のための好適なプロトコルに精通している。
【０１０９】
細胞の集団がマウス全脳から収集される場合、わずかな部分、例えば、細胞の総数の２％未満がＮＳＣまたはＮＰＣである。
【０１１０】
抗体またはそのフラグメントを用いる場合、抗体は、非常に特異的な分離を可能にするよう固体支持体に結合されてよい。使用する分離のための特定の方法、例えば遠心分離、カラム分離、膜分離または磁気分離などの機械的分離は、収集される画分の生存度を最大にしなければならない。当業者に知られている効力が異なる種々の手法を用いることができる。使用される特定の手法は、分離の効率、方法の細胞毒性、実施の容易さと速度、ならびに精巧な装置および／または技術的熟練の必要性に依存する。
【０１１１】
本発明による方法によって助けられる細胞懸濁液からのＮＳＣおよび／またはＮＰＣの分離のための方法としては、例えば抗体被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、本発明による抗体もしくはそのフラグメントに基づくアフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリックス、例えばプレートに結合された抗体もしくはそのフラグメントによる「パニング」、または他の簡便な手法を挙げることができる。
【０１１２】
正確な分離をもたらす手法としては、蛍光活性化細胞選別装置、磁気ビーズ選別、および当業者に既知の任意の適切な方法が挙げられる。
【０１１３】
さらなる実施形態において、本開示の方法の第１の濃縮ステップは、所望の純度のＮＳＣまたはＮＰＣが得られるまで繰り返されるＮＳＣまたはＮＰＣの正の選択である。
【０１１４】
哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣに関して濃縮された単離細胞集団を生成するための方法
本開示の一態様は、基準集団と比較して神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮されている哺乳類細胞の単離集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するための方法に関し、方法は、
ａ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、細胞集団の少なくとも一部、または基準集団の一部を用意するステップと、
ｂ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されたインテグリンα１０サブユニットを同定する化合物を上記ａ）の細胞集団に導入するステップと、
ｃ）上記ｂ）の細胞集団から神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択し単離するステップと
を含み、それによって神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮された細胞集団を生成する。
【０１１５】
集団を用意することは、上に詳述したＮＳＣおよびＮＰＣの同定のための方法と同様に行うことができる。細胞の集団は、少なくとも１つのＮＳＣおよび／または少なくとも１つのＮＰＣを含んでよく、またはＮＳＣもしくはＮＰＣのいずれでもない細胞だけを含み得る。例えば、神経組織から得られた、または由来する細胞の集団を用意でき、またはインテグリンα１０をトランスフェクトされたＨＥＫ細胞またはＣ２Ｃ１２細胞などの、細胞の基準集団を用意してもよい。
【０１１６】
ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを同定するために導入される化合物は、タンパク質、ペプチド、モノクロ−ナル抗体、もしくはその一部、またはＮＳＣおよび／またはＮＰＣを同定するポリクローナル抗体であってよい。
【０１１７】
ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを同定するために導入される化合物は、タンパク質、ペプチド、モノクロ−ナル抗体、もしくはその一部、またはインテグリンα１０を検出できるポリクローナル抗体であってよい。
【０１１８】
一実施形態において、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣは、上述のＮＳＣおよび／またはＮＰＣを同定する方法によって、上記ＮＳＣのおよび／または上記ＮＰＣの細胞表面でのインテグリン鎖α１０の発現を検出することによってＮＳＣとしておよび／またはＮＰＣとして同定される。
【０１１９】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、もしくはその一部は、マーカー、例えば無傷の生存細胞の細胞表面に発現されるマーカーを同定するのに特に有用である。ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを同定するために用いられる化合物は、分離ステップのために用いることもできる。したがって、抗体またはその一部などの、上記化合物（複数可）は、第１の粗分離を可能にするよう固体支持体に結合されてよい。固体支持体の例は、ビーズ、例えば、磁気ビーズ、アガロースまたは当業者に既知の他の同様の種類のビーズである。細胞の分離に好適な任意の手段を、分離が細胞の生存度に過度に有害でない条件で用いてよい。
【０１２０】
使用する分離手法は、回収される部分の生存度の保持を最大にしなければならない。生存度の評価を以下に記載する。
【０１２１】
手短に言えば、細胞生存度の評価は、例えばフローサイトメトリーを用いて行うことができる。適切な細胞生存性の染色のために色素が添加されて、生存細胞と、非生存細胞とを識別できる。多数のそのような色素が存在し、それについての例および一般的な使用方法を記述する。原則は、ほとんどのこれらの色素について同じである。細胞膜が損なわれている場合これらの色素は細胞に入るので、これらの色素で染色する細胞は、生存可能でなく、染色しない細胞は生存可能とみなされる。
【０１２２】
色素の例は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）、Ｔｏ−Ｐｒｏ３、およびエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）である。他の方法は、Ａ．  ＲａｄｂｒｕｃｈによるＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，第２版，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００）に記載されている。
【０１２３】
収集される画分の細胞生存率は一般的に＞９０％、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに１００％である。
【０１２４】
本発明による方法において細胞分離のために用いられる特定の手法は、分離の効率、方法の細胞毒性、実施の容易さと速度、ならびに精巧な装置および／または技術的熟練の必要性に依存する。
【０１２５】
本発明による方法の一実施形態において、哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣを濃縮する少なくとも１ステップが含まれる。
【０１２６】
本発明による方法の一実施形態において、哺乳類ＮＳＣを濃縮する少なくとも１ステップが含まれる。
【０１２７】
本発明による方法の一実施形態において、哺乳類ＮＰＣを濃縮する少なくとも１ステップが含まれる。
【０１２８】
さらにさらなる実施形態において、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの第１の濃縮ステップはＮＳＣおよび／またはＮＰＣの負の選択であり、すなわち他の系列にコミットした細胞が初期の細胞集団から枯渇される、または除去される。例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ３２６などのマーカーを発現する細胞は、負に選択される。
【０１２９】
さらにさらなる実施形態において、本開示の方法は、インテグリンα１１サブユニットの発現の検出に基づく負の選択をさらに含み、例えば、マーカーインテグリンα１１を発現する細胞を細胞集団から枯渇させる、または除去する。
【０１３０】
さらにさらなる実施形態において、第１の濃縮は、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの所望の純度が達成されるまで繰り返すことができるＮＳＣおよび／またはＮＰＣの正の選択である。正または負の選択に関して、タンパク質、ペプチド、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が、上述のインテグリンα１０分子を同定するための化合物として使用できる。上記の段落で例示した特定の細胞型の分離を容易にするために、化合物は、分離のための手段、例えば、直接分離を可能にする磁気ビーズ；アビジンとともに除去できるビオチン；または支持体に結合されるストレプトアビジン；蛍光活性化細胞選別装置とともに用いることができる蛍光色素など、に結合されてよい。関心の細胞、すなわちＮＳＣおよびＮＰＣ、の生存度に過度に有害でない任意の手段を用いてよい。
【０１３１】
一実施形態において、選択は蛍光細胞選別によって、例えば、ＦＡＣＳ（登録商標）などの細胞選別装置に基づくフローサイトメトリー、または特異性が高い任意の他の方法を用いることによって行われる。特に簡便でありフローサイトメトリーの分野で当業者に周知の手法である多色分析をフローサイトメトリーとともに用いてよい。細胞は、特定の抗原についての染色レベルに基づいて分離されてよい。第１の分離において、他のマーカーに対する抗体が１種の蛍光色素で標識されて用いられ、一方で専用の系列、すなわちインテグリンα１０に対する抗体が異なる蛍光色素（複数可）に結合されてよい。さらなる実施形態における他のマーカーは、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣが発現し得るＮｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、ＣＤ１５、ＣＤ２４、Ｓｏｘ２、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）、Ｐａｘ６、ＦＡＢＰ７およびＧＬＡＳＴである。ＮＳＣおよびＮＰＣで発現されないマーカーの例は、ＣＤ３２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびインテグリンα１１であり、それらの発現、または欠如はまた、さらなる実施形態において、本発明によるマーカー、例えばインテグリンα１０発現、とともに評価されてよい。
【０１３２】
さらなる系統または細胞集団がこのステップで除去される場合、そのような系統特異的なマーカーに対する種々の抗体が含まれ得る。多色分析に用途を見出すことができる蛍光色素としては、フィコビリンタンパク質、例えばフィコエリトリンとアロフィコシアニン、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓレッド、および当業者に知られている任意の適切な蛍光色素が挙げられる。
【０１３３】
細胞は、死細胞に結合する色素、例えばヨウ化プロピジウムまたはＬＤＳ−７５  １（レーザー色素スチリル−７５  １（６−ジメチルアミノ−２−１４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１，３−ブタジエニル］−１−エチルキノリニウムペルクロラート））を使用することによって、死細胞に対して選択されてよい。細胞は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）などの、任意の適切な細胞培地中で、または好ましくは緩衝される、任意選択でウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が存在する、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの、任意の生理食塩水中で収集されてもよい。正確な分離を可能にする、アフィニティーカラムなどの、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  Ｆ，  Ｗｕｎｄｅｒ  Ｅ，  Ｓｏｖａｌａｔ  Ｈ，  Ｈｅｎｏｎ  Ｐ，  Ｓｅｒｋｅ  Ｓ  ｉｎ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３４＋ｃｅｌｌｓ：実験および臨床用途のために現在利用できる免疫吸着方法についてのショートレビュー（“２ｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ”，Ｍｕｌｈｏｕｓｅ，  Ｆｒａｎｃｅ，  Ｍａｙ  ３−７，１９９３．  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  １９９３  Ｗｉｎｔｅｒ；２（４）：４７３−８１に掲載のレポート）によって、およびＢａｓｃｈ  ＲＳ，  Ｂｅｒｍａｎ  ＪＷ，  Ｌａｋｏｗ  Ｅ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９８３  Ｆｅｂ  １１；５６（３）：２６９−８０）によってさらに記載される、正の選択または負の選択についての他の手法を用いてもよい。
【０１３４】
細胞は、光散乱特性ならびに種々の細胞表面抗原のそれらの発現に基づいて選択されてよい。
【０１３５】
分離の特定の順序は本発明にとって重要ではないと思われるが、表示した順序は、本発明を実施する１つの方法であり、機能することが知られている。このように、示唆的に、細胞は粗分離によって、好ましくはＣＤ３２６、ＣＤ３４およびＣＤ４５などの負の細胞マーカーを用いるＮＳＣおよびＮＰＣにコミットしていない細胞を除去する負の選択によって最初に分離される。負の選択の後に一般的に正の選択が続き、正の選択はＮＳＣおよび／またはＮＰＣと関連するマーカーの選択であり、負の選択は系列にコミットした細胞、ならびにＮＳＣおよび／またはＮＰＣでない他の幹細胞集団と関連するマーカーについてである。この分離の後に次いで、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣとして多系列の可能性と増強された自己再生能力とを有する細胞集団、または上記集団を含む細胞組成物の選択が続く。組成物をさらに後述する。
【０１３６】
さらなる実施形態において、そのような集団の濃縮は、約７０、８０、９０、９５、９８、９９、９９．９、またはさらに１００％である。そのような細胞の生存度は、上で詳述される。
【０１３７】
濃縮された細胞をさらに増殖し、次いで特徴付けられた因子、例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）で誘導して特定の神経細胞に分化させてよい。例えば、ＦＧＦ−２は一般にヘパリンと組み合わせて用いられ、それはその受容体への成長因子の結合を媒介する。細胞培養物を支持することが報告されている他の成長因子は、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、白血球抑制因子（ＬＩＦ）およびそれに相当する毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。ＰＤＧＦαは、オリゴデンドロサイト前駆細胞のための維持培地中で頻繁に用いられる。代替物として、または特定の成長因子を使用することに加えて、ＮＰＣおよびＮＳＣは、物理的な接触により増殖されるＮＰＣおよびＮＳＣを好むように見えるアストロサイト、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生により細胞増殖を増強できる内皮細胞のような他の支持細胞の存在下で共培養できる。
【０１３８】
ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの調節
本開示のさらなる態様は、試験化合物が哺乳類ＮＳＣおよび／または哺乳類ＮＰＣの分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節するかどうかを決定するための方法に関する。そのような方法は、
ａ）インテグリンα１０サブユニットを発現する神経幹細胞および／または神経前駆細胞を用意するステップと、
ｂ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｃ）試験化合物が神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化を調節する指標として神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化の速度またはパターンの変化を検出するステップと
を含み、分化の速度またはパターンは、本明細書に開示される方法に従って細胞によるインテグリンα１０の発現を検出することによって決定される。上記「インテグリンα１０発現の検出」の節も参照されたい。
【０１３９】
用意されるＮＳＣおよびＮＰＣは、本明細書に開示される方法のいずれかによって達成される濃縮細胞集団、本発明に従って単離されるＮＳＣおよび／またはＮＰＣ、または本発明による細胞組成物であり得る。
【０１４０】
試験化合物は、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣに影響を及ぼすことが知られている、または影響を及ぼすと推測される任意の化合物、例えば、医薬組成物、薬物、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらの一部、例えばＮＳＣおよび／またはＮＰＣ上でインテグリンα１０または任意の他の分子に結合する抗体、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣの増殖を促進するために用いられる因子、例えばＰＤＧＦＲα、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２であってよい。
【０１４１】
試験化合物がＮＳＣおよび／またはＮＰＣの分化を調節する指標としての例えばＮＳＣおよび／またはＮＰＣの分化の速度またはパターンにおける変化の検出は、本明細書に開示される方法による上記神経幹細胞および／または神経前駆細部の細胞表面でまたは神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞内でインテグリンα１０発現を検出することによって行なわれてよい。
【０１４２】
試験化合物がＮＳＣおよび／またはＮＰＣの分化を調節する指標としての例えばＮＳＣおよび／またはＮＰＣの分化の速度またはパターンにおける変化の検出は、フローサイトメトリーまたは任意の他の適切な方法、例えば当業者に知られている任意の免疫方法によって行われてよい。分化の速度またはパターンにおける変化は、無処置のまたは擬似処置されるＮＳＣおよび／またはＮＰＣ集団と比較して、試験化合物で調節されるＮＳＣおよび／またはＮＰＣの動態研究、機能的研究または表現型研究によって検出できる。
【０１４３】
細胞組成物
本開示の一態様は、インテグリンα１０サブユニットを発現する未分化哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉtｒｏ細胞培養物に関し、細胞は神経組織に由来し、および
ａ）培養中の細胞は、少なくとも１０％ニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトの細胞培養物を生成するために（ｂ）に定めた血清および増殖誘導成長因子の両方を実質的に含まない培地中で分化させると、ニューロンおよび／またはオリゴデンドサイトおよび／またはアストロサイトに分化する能力を有し、
ｂ）細胞培養物はＢ２７などの血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含有する培地中で分裂し、
ｃ）培養中の細胞は血清代替物および増殖誘導成長因子の両方を取り除くとニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトに分化する。
【０１４４】
一実施形態において、ステップｃ）はウシ胎児血清の添加を含む。
【０１４５】
本開示のさらなる態様は、
ａ）Ｂ２７などの血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含む培地と、
ｂ）哺乳類の中枢神経系に由来する未分化哺乳類細胞であって、細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、未分化哺乳類細胞と
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物に関する。
【０１４６】
本開示のさらにさらなる態様は、インテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類未分化細胞の浮遊培養物に関し、上記細胞は実質的に細胞凝集体に形成され、かつ細胞凝集体は増殖誘導成長因子を含有する培地で維持される。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０発現は、上記「神経幹細胞および神経前駆細胞のマーカーとしてのインテグリンα１０」の節に記載の通りである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、未分化哺乳類細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％は、インテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞である。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、未分化哺乳類細胞は神経幹細胞または神経前駆細胞である。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、未分化哺乳動物細胞は、成体哺乳類または胎児哺乳類、例えばヒトもしくはマウスの神経組織から得られる、またはこれらに由来し、それは、上記「神経組織」の節に詳細に記載されている。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、未分化哺乳類細胞はヒト胚細胞またはヒト胎児から得られない、またはそれに由来しない。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、未分化哺乳類細胞の一部は、Ｎｅｓｔｉｎ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２およびＰＤＧＦＲαからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現する。
【０１５３】
５０％を超える、例えば６０％を超える、例えば７０％を超える、例えば８０％を超える、例えば９０％を超える、例えば９５％を超える、例えば９６％、９７％、９８％、または９９.９％のヒトＮＳＣ細胞またはＮＰＣ細胞を有する組成物は、ＮＳＣまたはＮＰＣの濃縮について開示される方法に従って達成できる。そのようなＮＳＣおよび／またはＮＰＣは、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトならびに他の細胞などの、ＮＳＣの種々の系列のすべてのメンバーの細胞再生と発達をもたらすことができる。
【０１５４】
最終的に、単一細胞型はＮＳＣまたはＮＰＣの組成物から得ることができ、哺乳類神経組織の再構成または再生のために用いることができる。ＮＳＣまたはＮＰＣの組成物は、治療的有効量で投与されることが好ましく、治療的有効量は上記哺乳類、例えばヒトに生息できる特定の細胞数である。細胞数はドナー間で異なることがあり、症例によって当業者が経験的に決定できる。
【０１５５】
細胞増殖誘導因子は各細胞型に特異的であり、当業者には既知である。本開示のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの増殖誘導成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＰＤＧＦα、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１５６】
神経系傷害および神経変性疾患の治療
哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣ、例えば本明細書に開示される方法によって同定され単離されるヒトまたはマウスのＮＳＣおよび／またはＮＰＣは、それを必要とする対象において損傷と傷害を治療するため、および／または神経系の損傷を防止し損傷から保護するため、および／または神経変性疾患を治療するために用いることができる。神経変性障害に関しては、これは、ニューロン組織の損失または損傷と関連する神経変性疾患に特に適用される。本発明は、欠失組織または損傷組織を再生することによって、そのような神経変性疾患を治療する。
【０１５７】
さらに、例えば国際公開第０３／１０６４９２号に開示される方法によって同定され単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）も、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｇ．Ｋ．ら（２０１６）Ｓｔｒｏｋｅ  ４７：１８１７−１８２４によって証明されたように、中枢神経系の欠失したまたは損傷された組織を再生するために使用できる。したがって、一態様において、本開示は、中枢神経系の欠失組織または損傷組織を再生する方法と、それを必要とする対象において中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療する、および／または損傷を防止するおよび損傷から保護する方法とに関し、方法は、
ａ）哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療し、および／または損傷を防止し、および損傷から保護する。
【０１５８】
本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象において精神障害および行動障害を治療する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の単離集団の治療的有効量を上記対象に投与することと
を含み、それによって精神症状を伴う神経障害を治療する。
【０１５９】
本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象において神経系の疾患もしくは損傷を治療する、および／または神経系の損傷を防止するおよび損傷から保護する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類間葉系幹細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類間葉系幹細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって中枢神経系の疾患もしくは損傷を治療し、および／または損傷を防止し、および損傷から保護する。
【０１６０】
本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象において精神障害および行動障害を治療する方法に関し、方法は、
ａ）哺乳類間葉系幹細胞が濃縮された集団を含む組成物を用意することであって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現する、組成物を用意することと、
ｂ）哺乳類間葉系幹細胞の単離集団の治療的有効量を対象に投与することと
を含み、それによって精神症状を伴う神経障害を治療する。
【０１６１】
上記間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、臍帯血、ワルトン膠質、歯髄、羊水、羊膜、歯系組織、子宮内膜、肢芽、血液、胎盤膜と胎膜、唾液腺、皮膚と包皮、羊膜下臍帯内膜または滑膜から単離されてよい。
【０１６２】
本開示のさらなる態様は、神経系の疾患もしくは損傷を治療するおよび／または損傷を防止するおよび損傷から保護する方法において、および／または精神障害と行動障害を治療する方法における使用のための、神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０鎖サブユニットを含む、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞のマーカーに関する。
【０１６３】
本開示のさらなる態様は、神経系の疾患もしくは損傷および／または精神障害および行動障害を治療する方法での使用のための、インテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の単離集団を含む組成物に関する。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０発現は、上の「神経幹細胞および神経前駆細胞のためのマーカーとしてのインテグリンα１０」の節に記述される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、例えば、上の「細胞組成物」および「哺乳類ＮＳＣおよび／またはＮＰＣに関して濃縮された単離細胞集団を生成する方法」の節に記述されるように、インテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞に関して濃縮される。
【０１６６】
神経幹細胞、例えば、本明細書に開示される方法に従って上記細胞の細胞表面のインテグリンα１０サブユニット発現を検出することによって単離される間葉系幹細胞などの神経前駆細胞、は対象の神経系の損傷部位に埋め込まれてよく、その結果、神経組織の増殖を促進し神経系傷害および神経変性疾患を修復できる。
【０１６７】
神経幹細胞、例えば、本明細書に開示される方法に従って上記細胞の細胞表面のインテグリンα１０サブユニット発現を検出することによって単離され、かつそれを必要とする対象に埋め込まれるまたは移植される間葉系幹細胞などの神経前駆細胞、は神経幹細胞の遊走と分化および損傷細胞に栄養サポートを提供する細胞外マトリックス因子の産生を促進できる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、神経幹細胞、例えば、本明細書に開示される方法に従って上記細胞の細胞表面でインテグリンα１０サブユニット発現を検出することによって単離される間葉系幹細胞などの神経前駆細胞、はそれを必要とする対象に脳内、動脈内、静脈内、または脳室内の経路を介して投与される。
【０１６９】
細胞は、上記対象に１または複数の機会で投与されてよい。
【０１７０】
細胞が対象に投与されるまたは移植されると、それらは、移入先の環境によって異なってふるまい、およびすべての型の神経細胞に分化できる。
【０１７１】
特性が明らかにされ治療される疾患、損傷および障害
いくつかの疾患および障害は、本開示のマーカーおよび／または細胞ならびに方法を用いて特性が明らかにされ、治療され得る。
【０１７２】
本開示の一実施形態において、神経系の疾患もしくは損傷は、中枢神経系または末梢神経系の傷害もしくは神経変性疾患である。上記疾患、損傷または傷害は、神経細胞の欠失もしくは損傷を伴うこともある。
【０１７３】
本開示のいくつかの実施形態において、神経系の傷害は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経への傷害を含み、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脊髄傷害（ＳＣＩ）、びまん性軸索損傷（ＤＡＩ）、てんかん、神経障害、末梢神経障害、およびこれらの症候群が引き起こし得る随伴疼痛、ならびに他の症状などの病態をもたらす。
【０１７４】
脳卒中は、脳への不十分な血流が細胞死をもたらす病状である。主に２つの種類の脳卒中：虚血性脳卒中および出血性脳卒中がある。脳虚血症（別名：脳虚血、脳血管虚血）は、代謝要求を満たすための脳への血流が不十分な状態である。これは、酸素供給不足または脳低酸素、したがって脳組織の壊死または脳梗塞／虚血性脳卒中を引き起こす。局所脳虚血は特定の脳領域への血流を減少させ、その特定部位の細胞死のリスクを増加させるのに対して、全脳虚血は全般的に脳に影響を及ぼす。局所脳虚血のげっ歯類モデルは、実験的脳卒中研究で頻繁に用いられる。
【０１７５】
（Ｆａｉｒｂａｉｒｎら，２０１５）に記載のように、ＮＳＣは、急性末梢神経傷害の結果としての末梢神経傷害部位に埋め込まれ得る。ＮＳＣはまた、形態学的および電気生理学的な回復を向上させるために、慢性的に除神経された神経に埋め込まれ得る。
【０１７６】
本発明者らは、インテグリンα１０β１を発現する神経幹細胞が脳卒中に罹患した部位に補充されることを示した（例えば図１３〜１４）。一実施形態において、本発明はこのように、脳卒中などの虚血性損傷によって悪影響を受けている部位の大きさおよび位置の特性を明らかにするために有用である。本発明はこのように、ＣＮＳの疾患または損傷後の診断および予後ツールとして、医療専門家にとって有用である。例えば、脳卒中の特性を評価するためのナノ粒子結合抗体の用途を示す、Ｐａｎａｇｉｏｔｏｕら（２０１５）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．９，  Ａｒｔｉｃｌｅ  １８２を参照されたい。さらに、神経幹細胞（例えば自家神経幹細胞または前駆細胞）はドナー、例えば患者自身から取得され、神経幹細胞または前駆細胞として特性を明らかにされ、増殖されＣＮＳの損傷部位または疾患部位に移植され得る。このように、本発明は、多数のＣＮＳ疾患および障害、ならびに神経組織の損失または損傷を含む傷害および外傷を治療するのに有用である。
【０１７７】
別の実施形態において、神経系の疾患または損傷は、脳、脳幹、脊髄および／または末梢神経におけるニューロンの変性と、それらのプロセスとを含む神経変性疾患であり、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）に付随する神経／軸索損傷、および随伴症状を含むがこれらに限定されない。
【０１７８】
他の実施形態において、神経系の傷害および／または神経変性疾患は、脳、脳幹、脊髄および／または末梢神経における機能障害、および／またはニューロンの損傷、例えば代謝疾患、栄養欠乏、毒性傷害、悪性腫瘍および／または遺伝的もしくは特発性状態に起因する機能傷害および／または損傷を含み、糖尿病、腎機機能障害、アルコール依存症、化学療法、化学物質、薬物乱用、ビタミン欠乏、感染、および随伴症状を含むがこれらに限定されない。
【０１７９】
他の実施形態において、神経系の傷害および／または神経変性疾患は、脳、脳幹、脊髄および／または末梢神経におけるオリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびシュワン細胞などのグリアの変性または硬化症を含み、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎とてんかん、および随伴症状を含むがこれらに限定されない。
【０１８０】
他の実施形態において、神経系の傷害および／または神経変性疾患は、網膜、光受容体および関連する神経を含み、網膜色素変性症、黄斑変性、緑内障および随伴する症状を含むがこれらに限定されない。
【０１８１】
他の実施形態において、神経系の傷害および／または神経変性疾患は、聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節を含み、騒音性難聴、聴覚消失、耳鳴、耳炎、内耳炎、遺伝性委縮と蝸牛前庭萎縮、メニエール病、および随伴症状を含むがこれらに限定されない。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、神経系の傷害は、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中および脳癌からなる群から選択される。好ましい実施形態において、神経系の傷害は脳卒中である。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、神経組織の損傷を含む精神障害および行動障害は、本発明のＮＣＳまたはＮＰＣによって治療できる。例えば、Ｌａｄｒａｎら（２０１３）Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．５（６）：７０１−７１５およびＫaｌｍaｎら（２０１６）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ．７９０９１７６を参照されたい。
【０１８４】
特定の実施形態において、精神障害および行動障害は、レット症候群、統合失調症、うつ病、自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）および双極性障害（ＢＰＤ）からなる群から選択される。実際に、いくつかの精神障害および行動障害は、形態および／または機能が変化した神経細胞と関連する。したがって、正常なＮＳＣおよび／またはＮＰＣの移植は、形態学的かつ機能的に正常にコミットした神経細胞の生成、および精神および行動の障害の退行をもたらし得る。
【０１８５】
本発明による細胞組成物は、遺伝性疾患の治療でも用いることができる。ＮＳＣおよび／またはＮＰＣと関連する遺伝性疾患は、遺伝子異常を修正するために、自家または同種のＮＳＣの遺伝子修飾によって治療されてよい。例えば、ハンチントン病（ＨＤ）は遺伝病であり、親が罹患している子供はこの疾患を引き起こす遺伝子障害を受け継ぐ５０％の可能性を有する。この障害は、ハンチンチンと呼ばれるタンパク質のコードを保持する遺伝子に起こる。この欠陥遺伝子により、身体がハンチンチンタンパク質の不完全な毒性のバージョンを作り、これが最終的に中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）および他のニューロンの損失をもたらす。正常なＮＳＣおよび／またはＮＰＳを含む細胞組成物の、欠陥遺伝子を含む細胞を有する対象への投与の結果、対象は正常なハンチンチンを産生できるようになり得る。
【０１８６】
同種のＮＳＣおよび／またはＮＰＣとともに、正常細胞は、遺伝子欠陥なしに同じ種の哺乳類を形成し、療法として用いられ得る。
【０１８７】
ＮＳＣおよび／またはＮＰＣおよび／またはＭＳＣ、ならびにＮＳＣおよび／またはＮＰＣおよび／またはＭＳＣを含む組成物を移入し固定するために、単離細胞を欠損部位、例えば脳への損傷部位、または骨髄に注射すること、単離細胞を適切なゲル中でインキュベートし埋め込むこと、生体吸収性足場とともにインキュベートすること、または全身注入によるなどを含む、種々の方法が検討されてよい。さまざまな方法が当業者に知られている。
【０１８８】
任意選択でＮＳＣおよび／またはＮＰＣおよび／またはＭＳＣは、所定位置に細胞を保持するために、インテグリンα１０に対する抗体とインキュベートされてよい。このように、抗体は、損傷部位または欠損部位への、例えば神経欠損の部位への埋め込みの前に細胞の固定を可能にする生体吸収性足場に結合されてよい。足場は、ＮＳＣおよび／またはＮＰＣおよび／またはＭＳＣの３次元の固定を可能にする。好適な生体用材料足場を、以下に例示する。示される例は、特定の用途に対しより好適である場合に選択することが当業者にとって明らかである、適切な他の足場の使用を限定するものではない。
【０１８９】
足場の種類としては、生体吸収型ポリ（α−ヒドロキシエステル）足場、例えばポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびコポリマー（ＰＬＧＡ）が挙げられる。
【０１９０】
さらなる実施形態は、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルギン酸およびキトサンなどのポリマーゲルに由来する足場を包含する。
【０１９１】
実施例
実施例１：マウス脳室下帯（ＳＶＺ）からの細胞の単離およびフローサイトメトリー分析
ＳＶＺ単離
神経幹細胞／前駆細胞を、仔マウスおよび成体マウスのＳＶＺから単離した。マウスを断頭して、脳を摘出し、抗生物質を含む氷冷ＰＢＳに入れ、ＳＶＺを含有する切片（厚さ１ｍｍ）を収集した。側脳室の前角の側壁からＳＶＺを切除した。組織を３７℃で２０分間ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液中で消化した。Ｐ２００およびＰ２０チップでの粉砕後、細胞懸濁液を（５０μｍフィルタ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）濾過し、３７℃にて５％ＣＯ２でＮＳＰ培地：１×Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬ抗真菌性抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｗ／ＧｌｕｔａｍａｘおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（１：１）（Ｇｉｂｃｏ）中に播種した。スフェアは、約５日後に出現し始めた。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて５〜７日毎に継代培養した。
【０１９２】
フローサイトメトリー手順
１．抗体：インテグリンα１０サブユニットに対するモノクローナル抗体を用いた。細胞を遠心分離し、エッペンドルフチューブあたり１００μＬのアリコートを加えた。１μｇ／ｍＬの対照マウスＩｇＧ２ａ抗体を０．２ｍｇ／ｍＬのストックから対照として使用した。
２．細胞を一次抗体と氷上で６０分間インキュベートした。
３．細胞を５００μＬの染色緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ＋／＋）で２回洗浄した。
４．二次抗体を加え、細胞を氷上で４５分間インキュベートした。
５．細胞を５００μＬの染色緩衝液で２〜３回洗浄した。
６．５００μＬの染色緩衝液を最終ペレットに加え、細胞を再懸濁した。
７．細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１９３】
結論：本実施例は、成体マウス脳の脳室下帯から単離された細胞がインテグリンα１０β１を発現することを示す。図１Ｂを参照されたい。
【０１９４】
実施例２：免疫蛍光法によるマウス脳組織におけるインテグリンα１０β１と他のマーカーとの同時発現の分析
新鮮凍結マウス脳組織をＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（（Ｓａｋｕｒａ，Ｊａｐａｎ）に包埋した。１０μｍの切片（ＭＩＣＲＯＭ  ＨＭ  ５００ＯＭクリオスタットで作製）をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌaｓｅｒ，ＧｍｂＨ）上に収集した。切片をアセトンで固定（１００％、−２０℃で１０分間）した後、免疫標識で用いた。
【０１９５】
凍結切片を３７℃で約２０分間風乾した。切片が室温に達した時にそれらをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で５分間、２回リンスした。シリコーンバリアー（ＰＡＰペン）を切片の周りに塗布した。切片を０．０５％（０．１〜０．００１）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で室温にて３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで１回２分間リンスした。切片を、異なる抗原（最初に特異性および最適な作業希釈について個々に評価した）に対して異なる種で作製された一次抗体の混合物とインキュベートした。インキュベーションは、α１０一次抗体１．２μｇ／ｍＬ（０．６〜１．２μｇ／ｍＬ）（０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した）と、４〜８℃で、１６〜１８時間行った。２つのエピトープの同時蛍光可視化のために、それぞれ一次および二次抗体を混合物（「カクテル」）として適用した。切片を、ＰＢＳで１分間、続いて５分間２回リンスし、次いで、１：１５０で希釈したフルオロフォア結合二次抗体／複数抗体の混合物と室温で、３０〜４５分間インキュベートした。
【０１９６】
多重標識（高度にアフィニティー精製された、主にＦａｂ２フラグメント）用の二次抗体をウサギ、マウスもしくはヤギＩｇＧに対して、またはニワトリＩｇＹ（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＵＳＡまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に対してロバまたはヤギで作製し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した。２つのエピトープの同時蛍光可視化のために、一次および二次抗体を混合物「カクテル」として適用した。切片をまずＰＢＳ−ＴｒｉｔｏｎＸ  １００で２分間リンスし、次いでＰＢＳで５分間１回リンスした。切片を、ＰＢＳで希釈された、細胞小器官（核）染色ＤＡＰＩ、０．１μＭ中でインキュベートし、ＰＢＳで希釈し、ＰＢＳで５分間２回リンスした。切片を「抗退色溶液」ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中でマウントし、カバーをそっと載せた。本研究で使用した抗体を表２に示す。
【０１９７】
【表２】
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【０１９８】
分析：
分析を、共焦点レーザー走査顕微鏡観察と落射蛍光顕微鏡観察によって行った。
【０１９９】
試料を、３０５ｎｍと６３３ｎｍの間の励起用レーザーおよび４２０ｎｍと６５０ｎｍの間の発光検出用レーザーを利用して、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡で調べた。画像を、３つの免疫蛍光チャネル、１つのＤＡＰＩチャネルおよび１つの明視野ＤＩＣチャネルを用いて、２０×／０．８プランアポクロマート対物レンズと、４０×／１．３油浸漬プランアポクロマート対物レンズにより取得した。
【０２００】
連続した共焦点面のＺ−スタック（ＤＩＣなし）を、４０×／１．３対物レンズと、１０２４×１０２４ｐｘフレームサイズ（画素幅０．２２μｍ）または「ズーム」（小面積を走査）のいずれかと、最大分解能のためのナイキスト最適サンプリング周波数（画素幅０．１１５μｍ）とにより取得した。連続した共焦点面間のステップサイズは、ナイキスト最適サンプリング周波数（０．４８μｍ）に従った。
【０２０１】
結果：免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡観察からの画像は、成体マウス組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１の発現（図５）；成体マウス脳組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびｎｅｓｔｉｎの発現と共局在（図６）；成体マウス脳組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＰＳＡ−ＮＣＡＭの発現と部分的な共局在（図７）；成体マウス脳組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＧＦＡＰの発現と部分的な共局在（図８）；ならびに新生仔マウス脳組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＳＯＸ２の発現と部分的な共局在（図９）を示す。図１０に示すように、成体マウス脳組織のＳＶＺにおけるインテグリンα１０β１およびＰＤＦＧＲαの部分的な共局在もフローサイトメトリーを使用して認められた。
【０２０２】
免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡観察および落射蛍光顕微鏡観察からの画像は、新生仔マウス脳組織の顆粒細胞下帯におけるインテグリンα１０β１およびＳＯＸ２の発現と部分的な共局在（図１１）、ならびに新生仔マウス脳組織の髄膜におけるインテグリンα１０β１およびＰＤＦＧＲαの発現と部分的な共局在（図１２）を示す。
【０２０３】
結論：本実施例では、種々のマーカーが成体マウス脳細胞の脳室下帯において発現されかつインテグリンα１０β１と部分的に共局在すると示される。
【０２０４】
実施例３：単離されたマウスＮＳＰ／ＮＳＰ細胞の分化および遺伝子発現分析
特定の神経細胞系列を確認するために、定量的ＰＣＲアッセイを用いて遺伝子発現を測定した。
【０２０５】
ＲＮＡ抽出および定量的ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞または組織から抽出し、次いでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量的ＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。標的遺伝子のサイクル閾値をハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈの幾何平均に正規化してΔＣｔを得た。最終分析のために２の−ΔＣｔ（２−ΔＣｔ）乗を算出した。図４を参照されたい。ｑＰＣＲ分析のために用いたＴａｑｍａｎプローブを表３に示す。
【０２０６】
【表３】
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【０２０７】
結論：結果は、Ｍａｐ２、β−Ｔｕｂｕｌｉｎ  ＩＩＩ、ＧｆａｐおよびＯ４について遺伝子発現の増加を示した（図４）。これは、単離されたＮＳＣ／ＮＳＰがニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに効果的に分化することを示す。
【０２０８】
実施例４：インテグリンα１０サブユニット陽性神経幹細胞をニューロスフェアとして培養する
神経幹細胞／前駆細胞を出生後マウスおよび成体マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）のＳＶＺから単離した。脳を単離し、側面の心室壁を切除し、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃にて２０分間消化した。Ｐ２００およびＰ２０チップで組織を粉砕し、細胞懸濁液を濾過し（５０μｍフィルタ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＮＳＰ培地（Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬ抗真菌性抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充した（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｗ／ＧｌｕｔａｍａｘおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（１：１）（Ｇｉｂｃｏ））に播種した。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して５日毎に継代培養した。
【０２０９】
結果：フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色からの画像に続いて、共焦点顕微鏡観察は、ニューロスフェアとして培養された細胞の亜集団が他の幹細胞マーカーとともにインテグリンα１０β１を発現することを示す（図２および図３）。
【０２１０】
実施例５：インテグリンα１０サブユニット発現を検出することによって同定され単離されたＮＳＣの濃縮集団を投与することによるマウスにおける脳卒中の治療
マウスＮＳＣの単離および培養
インテグリンα１０サブユニットを発現する神経幹細胞を、実施例１に記載の方法に従ってマウス全脳から単離する。
【０２１１】
単離後、神経幹細胞を実施例４に記載のニューロスフェア形態で培養する。
【０２１２】
継代培養を１：３の分割比で、４〜６日毎に行う。通常、継代３の細胞は、実験にすぐに使用できる。継代３のＮＳＣを特徴づけでも用いる。神経幹細胞マーカーＣＤ１３３およびＰＤＦＧＲα、ならびにインテグリンα１０β１をフローサイトメトリーによって調べる。
【０２１３】
中大脳動脈永久閉塞（ｐＭＣＡＯ）
マウスにおけるｐＭＣＡＯを、例えばＥｎｇｅｌら（２０１１）に記述される方法に従って、外科的に生成する。
【０２１４】
α１０β１細胞を安定して発現する異なる数のＮＳＣの、脳卒中を罹患したマウス脳への移植
２．５×１０６、５×１０６または１０×１０６のＮＳＣ−α１０細胞の単一用量をマウスに投与する。残存脳卒中体積の周りの標的部位を明確にするために、磁気共鳴画像定位技術を用いてインテグリンα１０β１陽性ＮＳＣを埋め込む。
【０２１５】
結論として、本研究は、脳卒中の治療のためのＮＳＣ−α１０発現細胞を用いる脳内幹細胞移植は一般的に安全であり、マウスによる忍容性が高く、神経機能の改善をもたらすことを示す。
【０２１６】
マウスＢＭ−ＭＳＣの単離および培養
４週齢または８週齢のマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、１００ｍｍ細胞培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に入れ、そこでマウスの全身を７０ｖ／ｖ％のエタノールに２分間浸し、次いでマウスを新しい皿に移す。４つの鉤爪を足首関節と手根関節で切断し、後肢と体幹の間の接合部、前肢および躯幹の周辺を切開した。皮膚全体を続いて、爪の切断部位に向かって引っ張ることにより後肢および前肢から取り除く。筋肉、靭帯と腱を、顕微解剖ハサミおよび外科用メスを使用して、脛骨、大腿骨、および上腕骨から慎重に分離する。脛骨、大腿骨、および上腕骨を、関節で切断して切開し、骨を滅菌ガーゼ上に移す。骨を注意深くこすって残留する軟組織を取り除き、１０ｍＬの完全α−ＭＥＭ培地を含む、氷上の１００−ｍｍ滅菌培養皿に移す。すべての試料を動物の死後３０分以内に処理して、高い細胞生存率を確保する。軟組織を骨から完全に分離して混入を避ける。
【０２１７】
バイオセイフティキャビネット中で、骨を１％ＰＳＮ含有ＰＢＳで２回洗浄して血球および残留する軟組織を洗い流し、次いで骨を１０ｍＬの完全α−ＭＥＭ培地を含む新しい１００−ｍｍ滅菌培養皿に移す。骨を鉗子で保持し、顕微解剖ハサミを使用して、骨の両端を髄腔端部の真下で切除する。５ｍＬシリンジに取り付けられた２３ゲージの針を使用して、培養皿から５ｍＬの完全α−ＭＥＭ培地を引き出す。次いで、針を骨空洞に挿入する。出てきた骨髄をゆっくりと洗い流し、骨空洞を骨が青白くなるまで再び２回洗浄する。全ての骨片を、鉗子を用いて培養皿から取り除き、固体塊を培地中に残し、次いで培養皿を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５日間インキュベートする。十分な骨髄細胞を得るために、骨空洞を骨が青白く見えるまで繰り返し洗い流す。
【０２１８】
位相差顕微鏡観察において３日目に最初の紡錘形細胞が出現し、次いで培養物はよりコンフルエントになり、わずか２日以内に７０〜９０％コンフルエントに達する。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２．５ｍＬの０．２５％トリプシンで３７℃にて２分間消化し、次いでトリプシンを７．５ｍＬの完全α−ＭＥＭ培地で中和する。プレートの底部を、ピペットエイドを用いて洗い流し、細胞を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、これを８００ｇで５分間遠心分離し、細胞を７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に１：３の分割比で再懸濁する。
【０２１９】
継代培養を１：３の分割比で、４〜６日毎に行う。通常、継代３での細胞は、継代１と２の細胞よりも少ないマクロファージと血液細胞、および少ない脂肪を含み、したがってすぐに実験で使用できる。
【０２２０】
継代３のＢＭ−ＭＳＣを特徴づけで用いる。間葉系幹細胞マーカーＣＤ４４とＣＤ９０、内皮細胞マーカーＣＤ３１、および造血マーカーＣＤ４５を、フローサイトメトリーによって調べる。
【０２２１】
ＢＭ−ＭＳＣへのインテグリンα１０β１のレンチウイルス形質導入
１日目：新鮮な培地中の１．６×１０４ＢＭ−ＭＳＣ細胞を、９６ウェルプレートで各構築物について必要とされる数のウェルに加える。各レンチウイルス構造物および対照に対して２重または３重のウェルを使用しなければならない。３７℃、５〜７％ＣＯ２雰囲気下の加湿インキュベーターで、１８〜２０時間インキュベートする。
【０２２２】
２日目：ウェルから培地を取り除く。１１０μＬの培地および臭化ヘキサジメトリン（最終濃度８μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加える。プレートを穏やかに回して混合する。２〜１５μＬのα１０β１または対照レンチウイルス粒子を適切なウェルに加える。プレートを穏やかに回して混合する。３７℃、５〜７％ＣＯ２雰囲気下の加湿インキュベーターで、１８〜２０時間インキュベートする。
【０２２３】
３日目：レンチウイルス粒子を含有する培地をウェルから取り除く。１２０μＬ量の新鮮な培地を各ウェルに加える。
【０２２４】
４日目：培地をウェルから取り除く。新鮮なピューロマイシン含有培地を加える。
【０２２５】
５日目およびそれ以降：培地を、耐性コロニーが確認されるまで３〜４日毎に新鮮なピューロマイシン含有培地と取り替える。
【０２２６】
中大脳動脈永久閉塞（ｐＭＣＡＯ）
マウスにおけるｐＭＣＡＯを、例えばＥｎｇｅｌら（２０１１）に記述される方法に従って、外科的に生成する。
【０２２７】
α１０β１細胞を安定して過剰発現する異なる数のＢＭ−ＭＳＣの、マウス脳の脳卒中障害部位への移植
２．５×１０６、５×１０６または１０×１０６のＢＭ−ＭＳＣ−α１０細胞の単一用量をマウスに投与する。残存脳卒中体積の周りの標的部位を明確にするために、磁気共鳴画像定位技術を用いてＮＳＣ−α１０β１を埋め込む。
【０２２８】
結論：結論として、本研究は、脳卒中の治療のためのＢＭ−ＭＳＣ−α１０発現細胞を用いる脳内幹細胞移植が一般的に安全であり、マウスによる忍容性が高く、神経機能の改善をもたらすことを示す。
【０２２９】
実施例６：脳卒中マウスモデルにおけるインテグリンα１０β１の発現
脳卒中モデル
手順を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２５〜３０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行した。手短に言えば、光血栓（ＰＴ）による永久局所虚血モデルを用いた。手術中の体温を３７℃に維持した。マウスにイソフルラン（自発呼吸下のＯ２中２％）で麻酔をかけた。感光性ローズベンガル染料（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を尾静脈から静脈内注射した。頭蓋骨上の皮膚を切開した。脳を、定位的に定めた位置（横方向に１ｍｍおよびブレグマの前方／後方＋２／−２ｍｍ）で冷光（Ｋｌ  １５００  ＬＣＤ，Ｓｃｈｏｔｔ）および緑色フィルター（５１０ｎｍ）を用いて、露出した頭蓋骨を通して照射した。対照として、マウス脳を摘出し凍結した。
【０２３０】
脳卒中に応答して、インテグリンα１０β１の発現は、７日目までに顕著に増加した（図１３）。共焦点分析は、脳卒中部位においてニューロン上でのＮｅｕＮ発現も増加し、かつインテグリンα１０β１とＮｅｕＮの部分的な共局在が存在した（図１４ＢおよびＣ）ことを示す。加えて、成熟アストロサイト上でのＧＦＡＰの発現は、脳卒中部位において増加し（図１４ＥおよびＦ）、インテグリンα１０β１と共局在することがわかった。ミクログリアマーカーＩｂａ１も脳卒中部位内で認められた（図１４ＨおよびＩ）が、対照脳組織中では認められなかった（図１４Ｇ）。しかし、それはインテグリンα１０β１と共局在しなかった。これは、インテグリンα１０β１が、脳卒中後の脳組織を再生することに関与し得る細胞型を同定することを示唆している。
【０２３１】
結論：脳卒中への応答として、単独でまたは他のマーカー（ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１）とともにインテグリンα１０β１の発現の増加をバイオマーカーとして用いて、脳卒中患者における脳卒中部位を決定し、かつ損傷の重症度および予後を予測できる。
【０２３２】
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Ｐｒｕｓｚａｋら（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７（１２）：２９２８−４０．
Ｒｉｅｔｚｅら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  １６；４１２（６８４８）：７３６−９．
Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（２０１６）Ｓｔｒｏｋｅ  ４７：１８１７−１８２４
Ｖａｒａｓら（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１６（６）：９６５−７８．
Ｚｈａｎｇら（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：９０９−１５．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
2019533429.tif 000014
【図５Ａ】
2019533429.tif 000015
【図５Ｂ】
2019533429.tif 000016
【図５Ｃ】
2019533429.tif 000017
【図６Ａ】
2019533429.tif 000018
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019533429000001.app
【国際調査報告】
2019533429.tif 000042
2019533429.tif 000043
2019533429.tif 000044
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