(57)【要約】  蛍光プローブ及びその製造方法と使用を開示し、前記蛍光プローブは、粘度応答に敏感かつ特異的であり、タンパク質の特異的蛍光標識に使用でき、タンパク質の定量、検出又は運動学的研究、及び細胞、組織と生体の画像にも使用できる。【選択図】図１
2019531462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド部分Ａと、任意の連結体部分Ｃと、蛍光染料部分とを含み、前記蛍光染料部分は、粘度応答性蛍光染料基であり、電子ドナー部分Ｄ、共役系Ｂ及び電子受容体部分を含み、前記リガンド部分Ａは、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質を特異的に識別し標識することができる基であり、前記リガンド部分Ａは、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質を特異的に識別し共有標識することができる基であってもよい、蛍光プローブにおいて、前記リガンド部分Ａは、蛍光染料部分の電子ドナー部分Ｄに直接共役結合している、あるいは、連結体部分Ｃを介して蛍光染料部分の電子ドナー部分Ｄに共役結合していることを特徴とする蛍光プローブ。
【請求項２】
式（Ｉ）に示される構造を有し、
【化１】
2019531462.tif 000151
式中、連結体部分Ｃは存在してもよい基であり、アルキレン基、変性アルキレン基から選択され、
式（Ｉ）中の式（Ｉ−Ｒ）に示される構造部分は蛍光染料部分であり、
【化２】
2019531462.tif 000152
式中、
電子ドナー部分−Ｄ−は、−ＮＸ１−Ｘ２−であり、Ｘ１は、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、Ｘ２は、アルキレン基又は変性アルキレン基から選択され、Ｘ１、Ｘ２は、互いに結合して、Ｎ原子とともに脂肪族複素環を形成してもよく、
共役系Ｂは、二重結合、三重結合、芳香族環、芳香族複素環から選択される少なくとも１種の共役結合で形成されたものであり、下式（Ｉ−１）に示される構造であり、含まれる各水素原子は独立して、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基及び変性アルキル基から選択される置換基で置換されてもよく、前記置換基は互いに結合して脂肪族環又は脂肪族複素環を形成してもよく、
【化３】
2019531462.tif 000153
前記式（Ｉ−１）の構造はＸ１、Ｘ２と互いに結合して脂肪族複素環を形成してもよく、
電子受容体部分は、下式（Ｉ−２）に示される構造を有し、
【化４】
2019531462.tif 000154
式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン原子、ニトロ基、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、親水性基又は変性アルキル基から選択され、
Ｒ２は、シアノ基、カルボキシル基、ケトン基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホン酸エステル基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｒ３は、シアノ基であり、
電子受容体部分は、下式（Ｉ−２−ａ）、（Ｉ−２−ｂ）の環状構造を形成してもよく、
【化５】
2019531462.tif 000155
式中、Ｒａ、Ｒｂは独立して、水素、親水性基、アルキル基及び変性アルキル基から選択され、Ｒａ及びＲｂは、互いに結合して脂肪族環又は脂肪族複素環を形成してもよく、
Ｙ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｓ＝Ｏ）−及び−（ＮＲｉ）−から選択され、ただし、Ｒｉは、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｙ２は、＝Ｏ、＝Ｓ,＝Ｓ＝Ｏ及び＝ＮＲｉから選択され、ただし、Ｒｉは、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｙ３は、＝Ｏ、＝Ｓ,＝Ｓ＝Ｏ及び＝ＮＲｉから選択され、ただし、Ｒｉは、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
あるいは、Ｙ３は、＝Ｃ（Ｒｅ）（ＣＮ）であり、
Ｒｅは、シアノ基、カルボキシル基、ケトン基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホン酸エステル基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｒ２又はＲｅがアリール基又はヘテロアリール基である場合、環中の水素原子は独立して、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基又は変性アルキル基から選択される置換基で置換されてもよく、前記置換基は、互いに結合して飽和もしくは不飽和の脂肪族環又は脂肪族複素環を形成してもよく、
ただし、
前記アルキル基は、１〜３０個の炭素原子を有する飽和脂肪族直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、
前記アルキレン基は、１〜３０個の炭素原子を有する飽和脂肪族直鎖又は分岐鎖のアルキレン基であり、
前記変性アルキル基は、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＣＯ−、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−（Ｓ＝Ｏ）−、
【化６】
2019531462.tif 000156
フェニル基、フェニレン基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アンモニウム基、飽和もしくは不飽和の単環又は二環シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環から選択される少なくとも１種の基で置換された基であり、前記変性アルキル基は、１〜３００個の炭素原子を有し、その炭素−炭素単結合が独立して炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合で置換されてもよく、
前記変性アルキレン基は、アルキレン基の任意の炭素原子がハロゲン原子、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＣＯ−、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−（Ｓ＝Ｏ）−、
【化７】
2019531462.tif 000157
フェニル基、フェニレン基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アンモニウム基、飽和もしくは不飽和の単環又は二環シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環から選択される少なくとも１種の基で置換された基であり、前記変性アルキレン基は、１〜３０個の炭素原子を有し、その炭素−炭素単結合が独立して炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合で置換されてもよく、
前記脂肪族環は、飽和もしくは不飽和の４〜１０員の単環又は多環脂肪族環であり、
前記脂肪族複素環は、環中にＮ、Ｏ、Ｓ又はＳｉから選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する飽和もしくは不飽和の４〜１０員の単環又は多環脂肪族複素環であり、前記脂肪族複素環中にＳ原子を有する場合、−ＳＯ−又は−ＳＯ２−であってもよく、前記脂肪族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ基、アルキル基、アリール基、親水性基及び変性アルキル基で置換されてもよく、
前記アリール基又は芳香族環は、５〜１０員の単環又は縮合二環であり、
前記ヘテロアリール基又は芳香族複素環は、環中にＮ、Ｏ、Ｓ又はＳｉから選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する５〜１０員の単環又は縮合二環であり、
前記ハロゲン原子はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択され、
前記親水性基は、ヒドロキシル基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、一級アミノ基、二級アミノ基又は三級アミノ基及びその置換された基であり、
前記単環シクロアルキレン基は、４〜７員のシクロアルキレン基であり、
前記二環シクロアルキレン基は、５〜７員の二環シクロアルキレン基であり、
前記架橋脂肪族複素環は、環中にＮ、Ｏ、又はＳから選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する５〜２０員の架橋脂肪族複素環である、
請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
前記タンパク質タグは、精製品、未精製品又は細胞もしくは組織に存在する原位置状態であり、
前記タンパク質タグは、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＳＮＡＰ−ｔａｇ）又はその変異体、アルキルシトシントランスフェラーゼ（ＣＬＩＰ−ｔａｇ）又はその変異体であってもよく、
前記Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの変異体は、ＳＮＡＰ  Ｆ３３Ｇ又はＳＮＡＰ  Ｖ１６４Ｅから選択でき、
前記タンパク質タグは、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＳＮＡＰ−ｔａｇ）又はその変異体であってもよく、
前記リガンド部分Ａは、Ｏ６−アルキルグアニン誘導体、アルキル４−クロロピリミジン誘導体又はアルキルシトシン誘導体に由来し、
ＳＮＡＰ−ｔａｇに適用するリガンド部分Ａは、Ｏ６−アルキルグアニン誘導体又はアルキル４−クロロピリミジン誘導体に由来してもよく、
ＣＬＩＰ−ｔａｇに適用するリガンド部分Ａは、アルキルシトシン誘導体に由来してもよく、
前記リガンド部分Ａ−は、下式の構造から選択でき、
【化８】
2019531462.tif 000158
前記変性アルキル基又は変性アルキレン基はそれぞれ独立して、−ＯＨ、−Ｏ−、エチレングリコール単位（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ８アシルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル基、単糖単位、二糖単位、多糖単位、−Ｏ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−（−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−）ｎ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、                                                  、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ｏ−ニトロフェニル基、フェナシル基、リン酸エステル基又はホスホン酸エステル基から選択される少なくとも１種の基を有する基であったもよく、ただし、ｎは１〜１００であり、ＲはＨ又はα−アミノ酸の残基であり、
前記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であってもよく、前記Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ基は、メトキシ基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であってもよく、Ｃ１〜Ｃ８アシルオキシ基は、アセトキシ基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であってもよく、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル基は、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基であってもよく、
前記脂肪族複素環は、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリン、チオモルホリンから選択でき、
前記芳香族複素環は、チオフェン、フラン、ピロールから選択でき、
前記連結体部分は、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択でき、ただし、ｎは１〜２０であり、
任意に、Ｘ１は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−５０直鎖又は分岐鎖アルキル基であるか、スルホン酸基、カルボキシル基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよい１〜１０個の酸素原子を有するＣ２−５０エーテル鎖基であり、Ｘ２は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−５０直鎖又は分岐鎖アルキレン基であるか、スルホン酸基、カルボキシル基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよい１〜１０個の酸素原子を有するＣ２−５０エーテル鎖であり、あるいは、−ＮＸ１−Ｘ２−は、下式（Ｉ−１−１）〜（Ｉ−１−２）から選択されるいずれかの基を形成し、
【化９】
2019531462.tif 000159
任意に、Ｘ１は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−１０直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、Ｘ２は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−１０直鎖又は分岐鎖アルキレン基である、
ことを特徴とする請求項２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
前記共役系Ｂ中の２個の隣り合う置換基は、互いに結合して飽和もしくは不飽和の脂肪族環又は脂肪族複素環を形成し、
前記共役系Ｂ中のＣＨ上のＨは、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されてもよく、
前記共役系Ｂ中にＮＨを有してもよく、前記ＮＨ上のＨはアルキル基又は変性アルキル基で置換されてもよく、
前記共役系Ｂは、下式（Ｉ−１−１）〜（Ｉ−１−２８）に示される構造から選択でき、
【化１０】
2019531462.tif 000160
前記共役系ＢはＸ１と互いに結合して下記に示される脂肪族複素環を形成してもよく、
【化１１】
2019531462.tif 000161
式中、Ｘ２は、請求項２又は３に記載のとおりである、
ことを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
式中、式（Ｉ−２−ａ）中のＲａ、Ｒｂは結合されている炭素原子とともに、
【化１２】
2019531462.tif 000162
を形成し、
前記Ｒ２及びＲｅは独立して、以下の構造から選択される基、又は、以下の構造が自分自身又は互いと縮合して形成された二環もしくは多環縮合芳香族環又は縮合芳香族複素環であってもよく、好ましくは、二環もしくは三環縮合芳香族環又は縮合芳香族複素環であり、
【化１３】
2019531462.tif 000163
Ｒ２又はＲｅの上記構造中のＣＨ上のＨは、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されてもよく、Ｒ２又はＲｅは、上記構造から選択されるＮＨ含有基であってもよく、前記ＮＨ上のＨは、アルキル基又は変性アルキル基で置換されてもよく、
あるいは、前記Ｒ２及びＲｅは独立して、変性アルキル基であり、前記変性アルキル基は、ケトン基、エステル基又はアミド基を含み、かつ、ケトン基、エステル基又はアミド基中のカルボニル基を介して式（Ｉ−２）又は式（Ｉ−２−ａ）のアルケニル基の炭素に結合され、
前記式（Ｉ−２）の構造は、下式（Ｉ−２−１）〜（Ｉ−２−１８）から選択される１種であってもよい、
請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【化１４】
2019531462.tif 000164
【請求項６】
前記蛍光プローブは下式化合物から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【化１５】
2019531462.tif 000165
2019531462.tif 000166
2019531462.tif 000167
2019531462.tif 000168
2019531462.tif 000169
2019531462.tif 000170
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブの製造方法であって、式（ＩＩ）に示される蛍光染料をリガンド及び任意の連結体と反応させる工程を含み、
【化１６】
2019531462.tif 000171
式中、Ｄ’は反応後にＤ−基を形成して連結基又はリガンドと結合することができることを特徴とする製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブを、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質と接触させ、前記蛍光プローブのリガンド部分はタンパク質タグと標識反応して、蛍光プローブをタンパク質タグに標識する工程を含み、前記蛍光プローブをタンパク質タグに共有標識として標識してもよく、
前記標識反応の反応媒体は、純粋なタンパク質溶液、細胞ライセート又はタンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質が存在する原位置媒体から選択でき、前記原位置媒体は、細胞内の媒体、オルガネラ内媒体、生体組織媒体、血液又は体液から選択できることを特徴とする蛍光活性化型タンパク質特異的標識方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブの、タンパク質蛍光標識、タンパク質の定量、検出又は運動学的研究、及び細胞、組織、生体の画像での使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブを含むプローブキットであって、
前記プローブキットは、生体適合性媒体を更に含んでもよく、前記生体適合性媒体は、ジメチルスルホキシド、バッファー、生理食塩水から選択される少なくとも１種であってもよく、前記バッファーは、リン酸塩緩衝液を含んでもよいことを特徴とするプローブキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光プローブ及びその製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光特異的標識は、タンパク質の機能を研究・定量する上での重要手段である。他の研究方法に比べて、蛍光標識は、敏感で、原位置で、即時で、可視的であるなどのかけがえのない利点を有する。現在、タンパク質の特異的蛍光標識の最も慣用の方法は、遺伝子融合技術によって蛍光タンパク質を原位置で目的タンパク質に発現させることによって、目的タンパク質に対する特異的活性化を実現するとともに、蛍光顕微鏡下で細胞又は組織内のターゲットタンパク質を追跡・研究することができる。蛍光タンパク質技術は、長い間の発展を経て、技術は比較的成熟しているが、依然として欠陥が少なからず存在し、例えば、蛍光タンパク質の成熟・折りたたみが比較的遅く、凝集しやすく、また、一旦発現されたら、後で修飾するのが難しく、なお、多くの蛍光タンパク質には光安定性に劣るなどの欠点もある。これらの欠陥によって、蛍光タンパク質の使用がある程度制限されている。
【０００３】
実際には、蛍光タンパク質の発色団の分子構造が比較的単一であり、異なる種類又は機能化の蛍光タンパク質を構築するには、利用できる規則がほとんどなく、ランダム突然変異の方法によって多くある中から選別するしかない。対して、有機小分子蛍光染料の分子構造がかなり豊富であるが、小分子蛍光プローブはタンパク質の特異的標識において依然として多くの欠陥が存在している。最近、化学タグ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔａｇ）技術が現れて、小分子蛍光プローブによるタンパク質の特異的標識の課題を効果的に解決した。この技術では、特異的識別機能を有するポリペプチド又はタンパク質タグ（ｔａｇ）をターゲットタンパク質と融合させ、このタグが基質と高度に特異的に結合する特徴を利用して、小分子蛍光プローブの特異的タンパク質標識を実現したため、化学タグ技術は、遺伝子融合技術の優位性を受け継いでいるだけでなく、蛍光タンパク質に比べて、有機染料プローブの各方面の優位性を十分受け継いでいる。現在、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（Ｋ．Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．ＷＯ  ２００４０３１４０５．）、ＣＬＩＰ−ｔａｇ（Ｋ．Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．ＷＯ  ２００８０１２２９６．）、Ｈａｌｏ−ｔａｇ（Ｗｏｏｄ．Ｋｅｉｔｈ  Ｖ  ｅｔ．ａｌ．ＷＯ  ２００４０７２２３２）などのタンパク質タグ技術はビジネス化しており、特に、ＳＮＡＰ−ｔａｇ及びＣＬＩＰ−ｔａｇの使用が最も広く、市場で高く評価されている。
【０００４】
ＳＮＡＰ−ｔａｇ及びＣＬＩＰ−ｔａｇなどの化学タグ技術は、対応するタンパク質の標識に特異的であるが、実際には、標識過程において、遊離したプローブでも標識したプローブでも同様な蛍光放射がある。つまり、標識したプローブでも標識していないプローブでもこの系内で蛍光を放射する。このような特徴的ではない蛍光放射は、明らかに現在の化学タグ技術の重大な欠陥である。そのため、厳密に言えば、このような方法は、依然として蛍光タンパク質と同等の特異性を達成できていない。標識していないプローブを洗浄の方法によって除去することは、今の所、上述の課題を解決する唯一の効果的な方法である。明らかに、スピードを求める場合、あるいは洗浄できない場合では、この技術の使用は厳しく制限される。
【０００５】
仮に、標識する前に暗いか、もしくは非常に弱い蛍光を放射するが、一旦タンパク質に標識した後、染料の蛍光が急激に増強する、ＳＮＡＰ−ｔａｇ及びＣＬＩＰ−ｔａｇに適用できる蛍光活性化型タンパク質特異的標識の方法を設計すれば、間違いなく、このような設計されたプローブは、蛍光タンパク質に等しい特異性を実現する可能性があり、遊離プローブを洗浄する必要がない上、遊離プローブのバックグラウンド干渉を大幅に軽減し、ＳＮＡＰ−ｔａｇ及びＣＬＩＰ−ｔａｇ技術の使用範囲を拡大できる。この技術に適用できる蛍光活性化型タンパク質特異的標識の方法を設計するには、適切な蛍光消光／活性化メカニズムを見出さなければならない。ＦＲＥＴメカニズムをまず、この面の設計に適用し、リガンドに蛍光消光基を追加し、通常の場合では、小分子蛍光は結合されている基により消光されるが、一旦リガンドが化学タグと結合すれば、消光基が離れ、蛍光活性化を実現する（Ｔ．Ｋｏｍａｔｓｕ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，６７４５−６７５１．）。しかし、消光基の導入により、プローブの分子体積が大きく増大し、標識速度が大幅に低下して、プローブの細胞、組織中でのタンパク質のリアルタイム追跡と検出を厳しく制限し、かつ、蛍光プローブと消光基の間には比較的に良いエネルギーレベルマッチングを有する必要があり、これにより、長波長、例えば、赤光発生染料のＦＲＥＴ設計が非常に困難となる。なお、一部の蛍光が極性に敏感な染料も活性化型プローブの設計に使用され（Ｔ．Ｋ．Ｌｉｕ．ｅｔ．ａｌ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，９，２３５９−２３６５．）、染料が細胞液などの極性の大きい溶媒に位置し、プローブは蛍光を有しないか、あるいは比較的弱い蛍光を有し、リガンドがタンパク質と結合したら、プローブがタンパク質の非極性の袋に位置し、プローブが比較的強い蛍光を発生する。しかし、タンパク質は表面自体に極性の大きい水和層が存在して、プローブの蛍光増強幅を制限する一方、細胞又は組織自体は非常に複雑な系であり、各オルガネラの極性の変化が非常に大きく、これにより、極性に敏感なプローブが細胞又は組織造影において非常に高いバックグラウンドを有する。最近、文献（Ｔ．Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２０１６，７，３０１−３０７．）には、タンパク質リガンドがタンパク質と共有結合した後、タンパク質立体障害の作用により分子ローターの自由度を低下させることによって、プローブの蛍光を活性化する、粘度応答性を有する分子ローター蛍光プローブが報告された。しかし、この文献に記載のプローブは分子蛍光活性化後の蛍光輝度が高くなく、蛍光量子収率が非常に低い。そのため、この文献で報告された方法は、合格な蛍光タンパク質タグとして、ターゲットタンパク質の標識、追跡、位置検出及び定量に使用することができない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者は、リガンド部分を粘度応答性蛍光染料の電子ドナー部分と結合させて、リガンドがタグタンパク質と結合して蛍光を活性化させた後の蛍光輝度を大幅に高められることを見出したことで、真新しい構造の蛍光プローブが得られ、前記蛍光プローブは、粘度応答性を有し、タンパク質の特異的標識に使用でき、標識速度が早く、蛍光活性化輝度が高く、適用範囲が広く、ターゲットタンパク質の標識、追跡、位置検出及び定量に効果的に使用できる。
【０００７】
このことに鑑みて、リガンド部分Ａと、任意の連結体部分Ｃと、蛍光染料部分とを含み、前記蛍光染料部分は、粘度応答性蛍光染料グループであり、電子ドナー部分Ｄ、共役系Ｂ及び電子受容体部分を含み、前記リガンド部分Ａは、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質を特異的に識別し標識することができる基であり、前記リガンド部分Ａは、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質を特異的に識別し共有標識することができる基であってもよい、蛍光プローブにおいて、前記リガンド部分Ａは、蛍光染料部分の電子ドナー部分Ｄに直接共役結合している、あるいは、連結体部分Ｃを介して蛍光染料部分の電子ドナー部分Ｄに共役結合していることを特徴とする蛍光プローブを提供する。
【０００８】
任意に、上記蛍光プローブにおいて、式（Ｉ）に示される構造を有し、
【化１】
2019531462.tif 000003
式中、連結体部分Ｃは存在してもよい基であり、アルキレン基、変性アルキレン基から選択され、
式（Ｉ）中の式（Ｉ−Ｒ）に示される構造部分は蛍光染料部分であり、
【化２】
2019531462.tif 000004
式中、
電子ドナー部分−Ｄ−は、−ＮＸ１−Ｘ２−であり、Ｘ１は、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、Ｘ２は、アルキレン基又は変性アルキレン基から選択され、Ｘ１、Ｘ２は、互いに結合して、Ｎ原子とともに脂肪族複素環を形成してもよく、
共役系Ｂは、二重結合、三重結合、芳香族環、芳香族複素環から選択される少なくとも１種の共役結合で形成されたものであり、下式（Ｉ−１）に示される構造であり、含まれる各水素原子は独立して、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基及び変性アルキル基から選択される置換基で置換されてもよく、前記置換基は互いに結合して脂肪族環又は脂肪族複素環を形成してもよく、
【化３】
2019531462.tif 000005
任意に、前記式（Ｉ−１）の構造与Ｘ１、Ｘ２互いに結合して脂肪族複素環を形成し、
電子受容体部分は、下式（Ｉ−２）に示される構造を有し、
【化４】
2019531462.tif 000006
式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン原子、ニトロ基、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、親水性基又は変性アルキル基から選択され、
Ｒ２は、シアノ基、カルボキシル基、ケトン基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホン酸エステル基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｒ３は、シアノ基であり、
電子受容体部分は、下式（Ｉ−２−ａ）、（Ｉ−２−ｂ）の環状構造を形成してもよく、
【化５】
2019531462.tif 000007
式中、Ｒａ、Ｒｂは独立して、水素、親水性基、アルキル基及び変性アルキル基から選択され、Ｒａ及びＲｂは、互いに結合して脂肪族環又は脂肪族複素環を形成してもよく、
Ｙ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｓ＝Ｏ）−及び−（ＮＲｉ）−から選択され、ただし、Ｒｉは、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｙ２は、＝Ｏ、＝Ｓ,＝Ｓ＝Ｏ及び＝ＮＲｉから選択され、ただし、Ｒｉは、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｙ３は、＝Ｏ、＝Ｓ,＝Ｓ＝Ｏ及び＝ＮＲｉから選択され、ただし、Ｒｉは、水素、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
あるいは、Ｙ３は、＝Ｃ（Ｒｅ）（ＣＮ）であり、
Ｒｅは、シアノ基、カルボキシル基、ケトン基、エステル基、アミド基、ホスホン酸基、ホスホン酸エステル基、スルホン酸基、スルホネート基、スルホン基、スルホキシド基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキル基又は変性アルキル基から選択され、
Ｒ２又はＲｅがアリール基又はヘテロアリール基である場合、環中の水素原子は独立して、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基又は変性アルキル基から選択される置換基で置換されてもよく、前記置換基は、互いに結合して飽和もしくは不飽和の脂肪族環又は脂肪族複素環を形成してもよく、
ただし、
前記アルキル基は、１〜３０個の炭素原子を有する飽和脂肪族直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、
前記アルキレン基は、１〜３０個の炭素原子を有する飽和脂肪族直鎖又は分岐鎖のアルキレン基であり、
前記変性アルキル基は、アルキル基の任意の炭素原子がハロゲン原子、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＣＯ−、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−（Ｓ＝Ｏ）−、
【化６】
2019531462.tif 000008
フェニル基、フェニレン基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アンモニウム基、飽和もしくは不飽和の単環又は二環シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環から選択される少なくとも１種の基で置換された基であり、前記変性アルキル基は、１〜３００個の炭素原子を有し、その炭素−炭素単結合が独立して炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合で置換されてもよく、
前記変性アルキレン基は、アルキレン基の任意の炭素原子がハロゲン原子、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＣＯ−、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−（Ｓ＝Ｏ）−、
【化７】
2019531462.tif 000009
フェニル基、フェニレン基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、四級アンモニウム基、飽和もしくは不飽和の単環又は二環シクロアルキレン基、架橋脂肪族複素環から選択される少なくとも１種の基で置換された基であり、前記変性アルキレン基は、１〜３０個の炭素原子を有し、その炭素−炭素単結合が独立して炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合で置換されてもよく、
前記脂肪族環は、飽和もしくは不飽和の４〜１０員の単環又は多環脂肪族環であり、
前記脂肪族複素環は、環中にＮ、Ｏ、Ｓ又はＳｉから選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する飽和もしくは不飽和の４〜１０員の単環又は多環脂肪族複素環であり、前記脂肪族複素環中にＳ原子を有する場合、−ＳＯ−又は−ＳＯ２−であってもよく、前記脂肪族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ基、アルキル基、アリール基、親水性基及び変性アルキル基で置換されてもよく、
前記アリール基又は芳香族環は、５〜１０員の単環又は縮合二環であり、
前記ヘテロアリール基又は芳香族複素環は、環中にＮ、Ｏ、Ｓ又はＳｉから選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する５〜１０員の単環又は縮合二環であり、
前記ハロゲン原子はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択され、
前記親水性基は、ヒドロキシル基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、一級アミノ基、二級アミノ基又は三級アミノ基及びその置換された基であり、
前記単環シクロアルキレン基は、４〜７員のシクロアルキレン基であり、
前記二環シクロアルキレン基は、５〜７員の二環シクロアルキレン基であり、
前記架橋脂肪族複素環は、環中にＮ、Ｏ、又はＳから選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する５〜２０員の架橋脂肪族複素環である。
【０００９】
任意に、上記蛍光プローブにおいて、
前記タンパク質タグは、精製品、未精製品又は細胞もしくは組織に存在する原位置状態であり、
任意に、前記タンパク質タグは、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＳＮＡＰ−ｔａｇ）又はその変異体、アルキルシトシントランスフェラーゼ（ＣＬＩＰ−ｔａｇ）又はその変異体であり、
任意に、前記Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの変異体は、ＳＮＡＰ  Ｆ３３Ｇ又はＳＮＡＰ  Ｖ１６４Ｅから選択され、
任意に、前記タンパク質タグは、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＳＮＡＰ−ｔａｇ）又はその変異体であり、
前記リガンド部分Ａは、Ｏ６−アルキルグアニン誘導体、アルキル４−クロロピリミジン誘導体又はアルキルシトシン誘導体に由来し、
任意に、ＳＮＡＰ−ｔａｇに適用するリガンド部分Ａは、Ｏ６−アルキルグアニン誘導体又はアルキル４−クロロピリミジン誘導体に由来し、任意に、ＣＬＩＰ−ｔａｇに適用するリガンド部分Ａは、アルキルシトシン誘導体に由来し、
任意に、前記リガンド部分Ａ−は、下式の構造から選択され、
【化８】
2019531462.tif 000010
任意に、前記変性アルキル基又は変性アルキレン基はそれぞれ独立して、−ＯＨ、−Ｏ−、エチレングリコール単位（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ８アシルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル基、単糖単位、二糖単位、多糖単位、−Ｏ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−（−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−）ｎ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、                                                  、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ｏ−ニトロフェニル基、フェナシル基、リン酸エステル基又はホスホン酸エステル基から選択される少なくとも１種の基を有する基であり、ただし、ｎは１〜１００であり、ＲはＨ又はα−アミノ酸の残基であり、
任意に、前記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であり、前記Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基であり、Ｃ１〜Ｃ８アシルオキシ基は、アセトキシ基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であり、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル基は、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基であり、
任意に、前記脂肪族複素環は、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリン、チオモルホリンから選択され、
任意に、前記芳香族複素環は、チオフェン、フラン、ピロールから選択され、
任意に、前記連結体部分は、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−から選択され、ただし、ｎは１〜２０であり、
任意に、Ｘ１は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−５０直鎖又は分岐鎖アルキル基であるか、スルホン酸基、カルボキシル基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよい１〜１０個の酸素原子を有するＣ２−５０エーテル鎖基であり、Ｘ２は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−５０直鎖又は分岐鎖アルキレン基であるか、スルホン酸基、カルボキシル基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよい１〜１０個の酸素原子を有するＣ２−５０エーテル鎖であり、あるいは、−ＮＸ１−Ｘ２−は、下式（Ｉ−１−１）〜（Ｉ−１−２）から選択されるいずれかの基を形成し、
【化９】
2019531462.tif 000011
任意に、Ｘ１は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−１０直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、Ｘ２は、ヒドロキシル基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、四級アンモニウム基から選択される１個又は複数個の基で置換されてもよいＣ１−１０直鎖又は分岐鎖アルキレン基であることを特徴とする。
【００１０】
任意に、上記蛍光プローブにおいて、前記共役系Ｂ中の２個の隣り合う置換基は、互いに結合して飽和もしくは不飽和の脂肪族環又は脂肪族複素環を形成し、
任意に、前記共役系Ｂ中のＣＨ上のＨは、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されており、
任意に、前記共役系Ｂ中にＮＨを有し、任意に、前記ＮＨ上のＨはアルキル基又は変性アルキル基で置換されており、
任意に、前記共役系Ｂは、下式（Ｉ−１−１）〜（Ｉ−１−２８）に示される構造から選択され、
【化１０】
2019531462.tif 000012
任意に、前記共役系ＢはＸ１と互いに結合して下記に示される脂肪族複素環を形成し、
【化１１】
2019531462.tif 000013
式中、Ｘ２は、請求項２又は３に記載のとおりであることを特徴とする。
【００１１】
任意に、上記蛍光プローブにおいて、式（Ｉ−２−ａ）中のＲａ、Ｒｂは結合されている炭素原子とともに、
【化１２】
2019531462.tif 000014
を形成し、
任意に、前記Ｒ２及びＲｅは独立して、以下の構造から選択される基、又は、以下の構造が自分自身又は互いと縮合して形成された二環もしくは多環縮合芳香族環又は縮合芳香族複素環であり、好ましくは、二環もしくは三環縮合芳香族環又は縮合芳香族複素環であり、
【化１３】
2019531462.tif 000015
任意に、Ｒ２又はＲｅの上記構造中のＣＨ上のＨは、ハロゲン原子、ニトロ基、親水性基、アルキル基又は変性アルキル基で置換されており、任意に、Ｒ２又はＲｅは、上記構造から選択されるＮＨ含有基であり、任意に、前記ＮＨ上のＨは、アルキル基又は変性アルキル基で置換されており、
あるいは、前記Ｒ２及びＲｅは独立して、変性アルキル基であり、前記変性アルキル基は、ケトン基、エステル基又はアミド基を含み、かつ、ケトン基、エステル基又はアミド基中のカルボニル基を介して式（Ｉ−２）又は式（Ｉ−２−ａ）のアルケニル基の炭素に結合され、
任意に、前記式（Ｉ−２）の構造は、下式（Ｉ−２−１）〜（Ｉ−２−１８）から選択される１種である。
【化１４】
2019531462.tif 000016
【００１２】
任意に、上記蛍光プローブにおいて、前記蛍光プローブは下式化合物から選択されることを特徴とする。
【化１５】
2019531462.tif 000017
2019531462.tif 000018
2019531462.tif 000019
2019531462.tif 000020
2019531462.tif 000021
2019531462.tif 000022
【００１３】
別の側面では、上記蛍光プローブの製造方法であって、式（ＩＩ）に示される蛍光染料をリガンド及び任意の連結体と反応させる工程を含み、
【化１６】
2019531462.tif 000023
式中、Ｄ’は反応後にＤ−基を形成して連結基又はリガンドと結合することができることを特徴とする製造方法を更に提供する。
【００１４】
別の側面では、前記蛍光プローブを、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質と接触させ、前記蛍光プローブのリガンド部分はタンパク質タグと標識反応して、蛍光プローブをタンパク質タグに標識する工程を含み、任意に、前記蛍光プローブをタンパク質タグに共有標識として標識し、
任意に、前記標識反応の反応媒体は、純粋なタンパク質溶液、細胞ライセート又はタンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質が存在する原位置媒体から選択され、任意に、前記原位置媒体は、細胞内の媒体、オルガネラ内媒体、生体組織媒体、血液又は体液から選択されることを特徴とする蛍光活性化型タンパク質特異的標識方法を更に提供する。
【００１５】
別の側面では、上記蛍光プローブの、タンパク質蛍光標識、タンパク質の定量、検出又は運動学的研究、及び細胞、組織、生体の画像での使用を更に提供する。
【００１６】
別の側面では、上記蛍光プローブを含むことを特徴とするプローブキットを更に提供する。
【００１７】
任意に、前記プローブキットは、生体適合性媒体を更に含み、任意に、前記生体適合性媒体は、ジメチルスルホキシド、バッファー、生理食塩水から選択される少なくとも１種であり、任意に、前記バッファーは、リン酸塩緩衝液を含む。
【００１８】
上記タンパク質タグ（ｔａｇ）又はこのタグを融合したターゲットタンパク質部分は、従来の遺伝子工程技術によって製造できる。
【００１９】
上記の粘度応答性を有する蛍光染料とは、染料分子の蛍光強度が溶液粘度に応答し、溶液の粘度が増大するに連れて、蛍光強度が増強するものである。任意に、上記の粘度応答性を有する蛍光染料は、２５℃で、同様な濃度と励起波長の条件で、染料の最大蛍光放射強度に関して、グリセリンでの蛍光強度とメタノールでの蛍光強度の比が２より大きく、好ましくは５より大きく、更に好ましくは１０より大きい有機染料分子である。上記粘度応答性染料の濃度の範囲は、１×１０−７Ｍ〜１×１０−５Ｍである。
【００２０】
具体的な状況によって、当業者は必要に応じて対応するタグとリガンドを選択する事ができる。
【００２１】
当業者は、対応する構成を有する計器機器を利用して、タンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質を追跡・モニタリングすることができ、必要に応じて、用いられる計器機器は、蛍光を測定又は表示できる機器と設備を含み、例えば、蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、マイクロプレートリーダー、フローサイトメーター、及び生体画像化装置などの機器がある。
【００２２】
必要に応じて、オペレーターは異なる種類又は放射／励起波長の染料を選択できる。
【００２３】
本発明の一側面の実施形態によれば、蛍光プローブは蛍光放射波長の範囲が広い。
【００２４】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは蛍光強度が環境粘度の増大に連れて増強し、粘度応答に敏感であり、粘度応答性を有する。
【００２５】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブはタンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質の特異的標識に使用でき、蛍光プローブはタンパク質タグと結合した後に蛍光を活性化でき、良好な蛍光分子スイッチ性質を有し、かつ蛍光活性化倍率が高く、蛍光活性化輝度が高い。
【００２６】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは蛍光強度がタンパク質タグ濃度  と非常に良い線形関係を有し、目的タンパク質の定量的検出に使用できる。
【００２７】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは、細胞内のタンパク質タグの特異的標識を実現でき、かつ蛍光の特異的活性化を実現できると同時に、プローブ蛍光は細胞内の環境による影響を受けない。
【００２８】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは、細胞内小器官を標識する有力なツールとして、例えば、細胞核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体ネットワーク、全細胞、細胞骨格、細胞外膜、リソソーム、細胞内膜などを標識することができる。
【００２９】
本発明の別の側面の実施形態によれば、異なる蛍光プローブの蛍光基のスペクトルは互いに干渉せず、本発明の異なる色系列の蛍光プローブは、サンプルを多色標識することができ、同時に直交標識画像化を行うことができる。
【００３０】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは蛍光が動物体内環境による影響を受けず、生体動物体内に適用でき、例えば、肝臓部位で発現するＳＮＡＰタンパク質タグを特異的に標識して、比較的強い蛍光シグナルを発生する。
【００３１】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは目的タンパク質の分解過程の追跡、モニタリングに使用できる。
【００３２】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは哺乳動物細胞内の生体高分子の組み立てと分解過程をリアルタイムモニタリングする。
【００３３】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブは組織、生体などの洗浄に適さないサンプルを速やかに造影画像化することができる。
【００３４】
本発明の別の側面の実施形態によれば、蛍光プローブはタンパク質タグ又は融合タンパク質タグのターゲットタンパク質を標識していない時に測定シグナルをほとんど生じず、サンプルの検出を干渉せず、複雑なサンプルの速やかな定量的検出を実現できる上、標識反応過程の動的過程を追跡できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】異なるプローブがタンパク質タグと結合した後に異なる波長の蛍光を活性化させた蛍光放射図である。
【図２】プローブ１の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図３】プローブ１４の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図４】プローブ２１の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図５】プローブ３０の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図６】プローブ４３の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図７】プローブ４８の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図８】プローブ５６の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図９】プローブ６３の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図１０】プローブ７０の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図１１】プローブ８８の蛍光強度が異なるＳＮＡＰタンパク質タグ濃度に対する標準曲線である。
【図１２】異なるプローブで細胞を標識した蛍光スペクトルであり、（１）〜（８）のそれぞれはプローブ１、プローブ１５、プローブ２１、プローブ３０、プローブ５６、プローブ６０、プローブ６３、プローブ８８であり、Ａグループはタンパク質タグを発現するＨｅｌａ細胞であり、ＢグループはＨｅｌａ−ＷＴ細胞（Ｈｅｌａ原始細胞、タンパク質タグを発現していない）である。
【図１３】異なるプローブで異なるオルガネラを標識し、Ａグループ〜Ｆグループのそれぞれはプローブ１、プローブ２１、プローブ４８、プローブ６０、プローブ６６、プローブ７７であり、（１）〜（９）のそれぞれは細胞核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体ネットワーク、全細胞、細胞骨格、細胞外膜、リソソーム、細胞内膜である。
【図１４】異なるプローブで同じ細胞を２色標識し、Ａはプローブ１で標識したミトコンドリアであり、Ｂはプローブ４３で標識した細胞核であり、ＣはＡとＢのオーバーレイ画像である。
【図１５】プローブ８８を生体マウスの標識に使用し、Ａグループはブランクグループ、Ｂグループは対照グループ、Ｃグループはサンプルグループであり、（１）は肝臓、（２）は腎臓である。
【図１６】プローブ２１の哺乳動物細胞内での蛍光がタンパク質の分解に伴う変化である。
【図１７】異なるプローブで細胞間隙の組み立て過程をトレースし、Ａはプローブ２１の蛍光チャネル、Ｂはプローブ１の蛍光チャネル、Ｃはプローブ２１とプローブ２１とのオーバーレイ蛍光チャネルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳しく説明する。ここで説明される具体的な実施形態は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明を限定するものではないと理解されるべきである。
【００３７】
実施例１
【００３８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用するプローブ１を構築した。
【化１７】
2019531462.tif 000024
【００３９】
化合物１：
Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−アミノベンズアルデヒド（０．３５８ｇ、２ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチルシアノアセテート（０．３３８ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの無水エタノールに溶解して、触媒量の無水塩化亜鉛を加えて、Ａｒで保護された条件でオイルバスで５ｈ加熱して、反応を終え、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーションして一部の溶媒を除去し、系に大量の固形分が析出し、ろ過して、ろ過ケーキを冷エタノールで２回洗浄し、真空乾燥して、純粋な黄色化合物１（０．４９ｇ、８１％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），４．７９（ｂｔ，１Ｈ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００４０】
化合物２：
合成方法は、文献Ａｎｔｊｅ  Ｋｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００２，２１，８６−８９．に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．８２（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｍ，４Ｈ），６．２７（ｓ，２Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ）．
【００４１】
プローブ１：
化合物１（０．３０２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．１４６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解して、アルゴンガスで保護された条件でｐ−ニトロクロロギ酸フェニル（０．２４２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の１０ｍＬの無水ジクロロメタン溶液をゆっくり滴下し、滴下完了後に、室温で１ｈ撹拌し、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を１０ｍＬの無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して、化合物２（０．３２４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えて、無水トリエチルアミン（０．１６ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えて、Ａｒで保護された条件で室温で３０ｍｉｎ撹拌し、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムに通過させて分離し、純粋なプローブ１を０．４２ｇ得て、収率は７０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．７９（ｂｔ，１Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９０Ｈｚ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００４２】
実施例２
【００４３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用するプローブ２を構築した。
【化１８】
2019531462.tif 000025
【００４４】
化合物３：
合成方法は、文献Ｊ．Ｄａｓ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５，１５，３３７−３４３．に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），４．１２（ｓ，２Ｈ）．
【００４５】
化合物４の合成：
化合物１の合成方法を参照した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．１１−８．０７（ｍ，２Ｈ），８．０１−７．９７（ｍ，３Ｈ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４６−７．４３（ｍ，１Ｈ），６．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２、１．６Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００４６】
プローブ２：
プローブ１の合成方法に従い、収率は７５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４１（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．１１−８．０７（ｍ，２Ｈ），８．０１−７．９７（ｍ，３Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４６−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，４Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），６．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２、１．６Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００４７】
実施例３
【００４８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３を構築した。
【化１９】
2019531462.tif 000026
【００４９】
化合物５：
化合物１の合成方法を参照して合成し、収率は９５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０９（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ），６．７３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００５０】
プローブ３：
プローブ１の合成方法を参照して合成し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４０（ｓ，１Ｈ），１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ），６．７３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００５１】
実施例４
【００５２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４を構築した。
【化２０】
2019531462.tif 000027
【００５３】
化合物６：
文献（Ｓｒｉｋｕｎ  Ｄ  Ｋ  ｅｔ．ａｌ．ＪＡＣＳ  ２０１０，１３２，４４５５−４４６５．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１０（ｂｒｓ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），３．６８（ｓ，２Ｈ）．
【００５４】
プローブ４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．３９（ｄ，２Ｈ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．７９（ｂｔ，１Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００５５】
実施例５
【００５６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５を構築した。
【化２１】
2019531462.tif 000028
【００５７】
プローブ５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９７（ｓ，１Ｈ），８．１１−８．０７（ｍ，２Ｈ），８．０１−７．９７（ｍ，３Ｈ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４６−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．１０（ｓ，２Ｈ），６．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２、１．６Ｈｚ），６．１０（ｓ，１Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００５８】
実施例６
【００５９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６を構築した。
【化２２】
2019531462.tif 000029
【００６０】
プローブ６：
化合物１の合成方法を参照し、収率は５５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．７３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００６１】
実施例７
【００６２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７を構築した。
【化２３】
2019531462.tif 000030
【００６３】
化合物７：
文献に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ＝７．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０）、５．２９（ｓ，２Ｈ），３．７８（ｓ，２Ｈ）．
【００６４】
プローブ７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００６５】
実施例８
【００６６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８を構築した。
【化２４】
2019531462.tif 000031
【００６７】
プローブ８：
プローブ１の合成を参照し、収率は６０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．１１−８．０７（ｍ，２Ｈ），８．０１−７．９７（ｍ，３Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４６−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２、１．６Ｈｚ），６．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００６８】
実施例９
【００６９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９を構築した。
【化２５】
2019531462.tif 000032
【００７０】
プローブ９：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０９（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ）．
【００７１】
実施例１０
【００７２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０を構築した。
【化２６】
2019531462.tif 000033
【００７３】
化合物８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），４．７９（ｂｔ，１Ｈ），３．８５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００７４】
プローブ１０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は３５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．７９（ｂｔ，１Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９０Ｈｚ），３．８７（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｍ，４Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ）．
【００７５】
実施例１１
【００７６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１１を構築した。
【化２７】
2019531462.tif 000034
【００７７】
プローブ１１：
化合物１（０．６２９ｇ、１．０ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．１４６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンガスで保護された条件でｐ−ニトロクロロギ酸フェニル（０．２４２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の１０ｍＬの無水ジクロロメタン溶液をゆっくり滴下し、滴下完了後に、室温で１ｈ撹拌し、反応を終了し、３−アミノ−プロパンスルホン酸（０．１６８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えて、無水トリエチルアミン（０．１６ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えて、Ａｒで保護された条件で室温で３０ｍｉｎ撹拌し、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を逆相カラムで分離して、純粋なプローブ０．３９７ｇを得て、収率は５０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．７９（ｂｔ，１Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９０Ｈｚ），３．８１（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．６０（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．２１（ｔ，２Ｈ，５．６Ｈｚ），２．７１（ｔ，２Ｈ，５．６Ｈｚ），２．３１（ｍ，２Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ）．
【００７８】
実施例１２
【００７９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１２を構築した。
【化２８】
2019531462.tif 000035
【００８０】
化合物９：
文献（Ｔｅｔｓｕａｋｉ  Ｆｕｊｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍ，２０１５，５１，１７３８２−１７３８５．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．１１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５２−３．６５（ｍ，１６Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ）．
【００８１】
化合物１０：
化合物８（０．６６４ｇ、２ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解して、Ａｒで保護された条件で０℃まで冷却し、６０％のＮａＨ（０．０８８ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を加えて５ｍｉｎ撹拌し、化合物９（０．７８１ｇ、２ｍｍｏｌ）を加えて、ゆっくり室温に戻して３．５ｈ撹拌し、反応を終了し、水を加えて０．５ｍＬ反応を中止し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して淡黄色油状物０．３９６ｇを得て、収率は３６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．５６−３．６８（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００８２】
プローブ１２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５６−３．６８（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【００８３】
実施例１３
【００８４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１３を構築した。
【化２９】
2019531462.tif 000036
【００８５】
化合物１１：
文献（Ｙａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ａ．２０１１，２２２，２２８−２３５．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝９．４３（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ），３．０３（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【００８６】
化合物１２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ），３．０３（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【００８７】
プローブ１３：
化合物１２（０．３３ｇ、１ｍｍｏｌ）ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウム（０．６２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）及び化合物２（０．３２４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの丸形フラスコに取り、無水ジメチルホルムアミド１５ｍＬを加えて、０．３ｍＬのトリエチルアミンを加えて、Ａｒで保護された条件で室温で０．５ｈ撹拌し、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して淡黄色固体０．５２４ｇを得て、収率は９０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝１２．４３（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ），３．０３（ｓ，３Ｈ），２．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【００８８】
実施例１４
【００８９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１４を構築した。
【化３０】
2019531462.tif 000037
【００９０】
化合物１３：
文献（Ｌ．Ｘ．Ｗｕ，Ｋ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，４０８９−４０９６．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．６３−７．４８（ｍ，５Ｈ），４．２７（ｓ，２Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【００９１】
化合物１４：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），４．２７（ｓ，２Ｈ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【００９２】
プローブ１４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６３−７．４８（ｍ，５Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．２７（ｓ，２Ｈ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ），３．０３（ｓ，３Ｈ）．
【００９３】
実施例１５
【００９４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１５を構築した。
【化３１】
2019531462.tif 000038
【００９５】
化合物１５：
文献（Ｌ．Ｘ．Ｗｕ，Ｋ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，４０８９−４０９６．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝３．９８（ｑ、２Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）。
【００９６】
化合物１６：
化合物１の方法を参照して合成し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．９８（ｑ、２Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）．
【００９７】
化合物１７：
化合物１７（０．５４６ｇ、２ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（０．５３０ｇ、５ｍｍｏｌ）及び無水塩化亜鉛（０．５４５ｇ、４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの無水トルエンに溶解して、Ａｒで保護された条件でオイルバスで４８ｈ加熱還流し、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解して、水で３回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーで分離して、赤褐色固体０．１８１ｇを得て、収率は２５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５−７．３８（ｍ，３Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【００９８】
プローブ１５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４５−７．３８（ｍ，７  Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【００９９】
実施例１６
【０１００】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１６を構築した。
【化３２】
2019531462.tif 000039
【０１０１】
プローブ１６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５−７．３９（ｍ，３Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．０９（ｓ，２Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１０２】
実施例１７
【０１０３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１７を構築した。
【化３３】
2019531462.tif 000040
【０１０４】
プローブ１７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４５−７．３８（ｍ，３Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１０５】
実施例１８
【０１０６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１８を構築した。
【化３４】
2019531462.tif 000041
【０１０７】
化合物１８：
文献（Ｗａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａ  Ｌｅｔ．２００７，４８，３４７１−３４７４．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０５（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｍ，２Ｈ），１．８３（ｓ，６Ｈ）．
【０１０８】
化合物１９：
化合物１８（０．２７９ｇ、１ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ピリジンに溶解して、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル１ｍＬを加えて、Ａｒで保護された条件で４０℃のオイルバスで一晩加熱して、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して赤色生成物０．１８７ｇを得て、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０５（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｓ，６Ｈ）．
【０１０９】
プローブ１８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．４０（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．０１（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｓ，６Ｈ）．
【０１１０】
実施例１９
【０１１１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１９を構築した。
【化３５】
2019531462.tif 000042
【０１１２】
プローブ１９：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９０（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），７．０１（ｍ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｓ，６Ｈ）．
【０１１３】
実施例２０
【０１１４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２０を構築した。
【化３６】
2019531462.tif 000043
【０１１５】
プローブ２０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０５（ｍ，２Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０１（ｍ，２Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｓ，６Ｈ）．
【０１１６】
実施例２１
【０１１７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２１を構築した。
【化３７】
2019531462.tif 000044
【０１１８】
プローブ２０：
（ＷＯ  ２０１３１４２８４１（Ａ１）、２０１３．０９．２６．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９２（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）。
【０１１９】
化合物２１：
化合物２０（０．４３８ｇ、２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＮ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミンに溶解して、銅粉末（６．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅（１９ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、リン酸三カリウム（０．８５０ｇ、４ｍｍｏｌ）を加えて、Ａｒで保護された条件で８０℃のオイルバスで一晩加熱して、反応を終了し、室温まで冷却し、系を５０ｍＬの水に注いで、ジクロロメタンで３回×５０ｍＬ抽出し、有機相を合併し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーで分離して黄色生成物０．３６２ｇを得て、収率は８５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９２（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１２０】
化合物２２：
化合物２１（０．４２６ｇ、２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解して、１ｍＬのトリエチルアミンを加えて、氷浴条件で無水酢酸（０．３ｍＬ、３ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、滴下完了後に、系を室温までゆっくり昇温し、３ｈ撹拌し、反応を終了し、水を加えて１００ｍＬ、有機相を分離し、水相をジクロロメタン５０ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を更に精製する必要がなく、そのまま次の工程に用いた。
【０１２１】
上記残分を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解して、ジメチルホルムアミド５ｍＬを加えて、氷浴条件でオキシ塩化リン２ｍＬを加えて、Ａｒで保護された条件で０．５ｈ撹拌し、系を室温までゆっくり昇温し、引き続き５ｈ撹拌し、反応を終了し、飽和炭酸ナトリウム溶液を加えてｐＨ＝１０．０に調整し、室温条件で一晩撹拌し、翌日に有機相を分離し、水相をジクロロメタン５０ｍＬで３回抽出し、有機相を合併し、飽和食塩水で２回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して黄色固体０．２８５ｇを得て、収率は５９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ）３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１２２】
化合物２３：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１２３】
プローブ２１：
プローブ１の方法を参照して合成し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．２２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｓ，２Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１２４】
実施例２２
【０１２５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２２を構築した。
【化３８】
2019531462.tif 000045
【０１２６】
化合物２４：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１２７】
プローブ２２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．０２（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，６Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｓ，２Ｈ），５．４５（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１２８】
実施例２３
【０１２９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２３を構築した。
【化３９】
2019531462.tif 000046
【０１３０】
化合物２５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１３１】
プローブ２３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．３２（ｓ，１Ｈ），１０．０３（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１３２】
実施例２４
【０１３３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２４を構築した。
【化４０】
2019531462.tif 000047
【０１３４】
プローブ２４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１３５】
実施例２５
【０１３６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２５を構築した。
【化４１】
2019531462.tif 000048
【０１３７】
プローブ２５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１３８】
実施例２６
【０１３９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２６を構築した。
【化４２】
2019531462.tif 000049
【０１４０】
プローブ２６：
化合物１の合成方法を参照し、収率は５８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１４１】
実施例２７
【０１４２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２７を構築した。
【化４３】
2019531462.tif 000050
【０１４３】
プローブ２７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１４４】
実施例２８
【０１４５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２８を構築した。
【化４４】
2019531462.tif 000051
【０１４６】
プローブ２８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７７（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１４７】
実施例２９
【０１４８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ２９を構築した。
【化４５】
2019531462.tif 000052
【０１４９】
プローブ２９：
化合物１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１５０】
実施例３０
【０１５１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３０を構築した。
【化４６】
2019531462.tif 000053
【０１５２】
化合物２６：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は８７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０２（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４４−７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１５３】
化合物２７：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝９．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０１５４】
化合物２８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
【０１５５】
プローブ３０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝９．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ）．
【０１５６】
実施例３１
【０１５７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３１を構築した。
【化４７】
2019531462.tif 000054
【０１５８】
化合物２９:
化合物４の合成方法を参照し、収率は９３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．４５（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ）．
【０１５９】
プローブ３１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は７１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，５Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ）．
【０１６０】
実施例３２
【０１６１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３２を構築した。
【化４８】
2019531462.tif 000055
【０１６２】
化合物３０:
化合物１の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝９．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．２１（ｓ，３Ｈ）．
【０１６３】
プローブ３２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．８１（ｓ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，５Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝９．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ）．
【０１６４】
実施例３３
【０１６５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３３を構築した。
【化４９】
2019531462.tif 000056
【０１６６】
プローブ３３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
【０１６７】
実施例３４
【０１６８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３４を構築した。
【化５０】
2019531462.tif 000057
【０１６９】
プローブ３４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
【０１７０】
実施例３５
【０１７１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３５を構築した。
【化５１】
2019531462.tif 000058
【０１７２】
化合物２９：
化合物２６の合成方法を参照し、収率は４２％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．６２（ｄ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝９．０Ｈｚ，Ｊ２＝２．４Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ）．
【０１７３】
化合物３０：
化合物２９（０．９６５ｇ、５ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの丸形フラスコに取り、アセトニトリル５０ｍＬで溶解し、炭酸カリウム（１．３８ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ブロモデカン（１．３３ｇ、６ｍｍｏｌ）を加えて、Ａｒで保護された条件で加熱還流オイルバスで加熱還流し、反応を終了し、ろ過して、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を１００ｍＬの酢酸エチルに溶解して、それぞれ、水、飽和食塩水で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離してワックス状固体１．１８２ｇを得て、収率は７１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１２−３．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９−１．６５（ｍ，２４Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）。
【０１７４】
化合物３１:
化合物２７の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１２−３．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９−１．６５（ｍ，２４Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）。
【０１７５】
化合物３２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１２−３．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９−１．６５（ｍ，３３Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）。
【０１７６】
プローブ３５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１２−３．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９−１．６５（ｍ，３３Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）。
【０１７７】
実施例３６
【０１７８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３６を構築した。
【化５２】
2019531462.tif 000059
【０１７９】
化合物３３：
化合物２９（０．５８０ｇ、３ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの丸形フラスコに取り、６０ｍＬのトルエンを加えて溶解し、１ｍＬのアクリロニトリル、１ｍＬの酢酸を加えて、Ａｒで保護された条件でオイルバスで２４ｈ加熱還流し、反応を終了し、系を１００ｍＬの水に注いで、有機相を分離し、水相を５０ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して０．４８７ｇを得て、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．６２（ｄ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝９．０Ｈｚ，Ｊ２＝２．４Ｈｚ），３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），２．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【０１８０】
化合物３４：
化合物２７の合成方法を参照し、収率は４３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９７（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝９．０Ｈｚ，Ｊ２＝２．４Ｈｚ），３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），２．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【０１８１】
化合物３５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝９．０Ｈｚ，Ｊ２＝２．４Ｈｚ），３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），２．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１８２】
プローブ３６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．６０（ｄ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），２．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１８３】
実施例３７
【０１８４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３７を構築した。
【化５３】
2019531462.tif 000060
【０１８５】
化合物３６：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は６７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．０８−７．０１（ｍ，２Ｈ），６．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），３．６２（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３５（ｔ，４Ｈ  、Ｊ＝８．０Ｈｚ）．
【０１８６】
化合物３７：
化合物２７の合成方法を参照し、収率は６７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３５（ｔ，４Ｈ  、Ｊ＝８．０Ｈｚ）．
【０１８７】
化合物３８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３５（ｔ，４Ｈ  、Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１８８】
プローブ３７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４４％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），９．９９（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３５（ｔ，４Ｈ  、Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１８９】
実施例３８
【０１９０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３８を構築した。
【化５４】
2019531462.tif 000061
【０１９１】
化合物３９：
化合物１０の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６８（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１９２】
プローブ３８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５６−３．６８（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１９３】
実施例３９
【０１９４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ３９を構築した。
【化５５】
2019531462.tif 000062
【０１９５】
プローブ３９：
化合物１１の合成方法を参照し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），９．９９（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８１（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６２（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３５（ｔ，４Ｈ  、Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．２１（ｔ，２Ｈ，５．６Ｈｚ），２．７１（ｔ，２Ｈ，５．６Ｈｚ），２．３１（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１９６】
実施例４０
【０１９７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４０を構築した。
【化５６】
2019531462.tif 000063
【０１９８】
化合物４１：
化合物２７の合成方法を参照し、収率は６８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．６２（ｄ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝９．０Ｈｚ，Ｊ２＝２．４Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），１．２４（ｍ，２Ｈ）．
【０１９９】
プローブ４０：
化合物１３の合成方法を参照し、収率は８８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８２（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），１．２４（ｍ，２Ｈ）．
【０２００】
実施例４１
【０２０１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４１を構築した。
【化５７】
2019531462.tif 000064
【０２０２】
化合物４４：
化合物１４の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），３．００（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
【０２０３】
プローブ４１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），３．００（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
【０２０４】
実施例４２：
【０２０５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４２を構築した。
【化５８】
2019531462.tif 000065
【０２０６】
化合物４５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．６３−７．６８（ｍ，５Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１５（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２０７】
プローブ４２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６３−７．６８（ｍ，５Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１５（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２０８】
実施例４３：
【０２０９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４３を構築した。
【化５９】
2019531462.tif 000066
【０２１０】
化合物４６：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は７８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０７（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２１１】
化合物４７：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９９（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２１２】
化合物４８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２１３】
プローブ４３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｍ，５Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２１４】
実施例４４：
【０２１５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４４を構築した。
【化６０】
2019531462.tif 000067
【０２１６】
プローブ４４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２１７】
実施例４５：
【０２１８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４５を構築した。
【化６１】
2019531462.tif 000068
【０２１９】
プローブ４５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２２０】
実施例４６：
【０２２１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４６を構築した。
【化６２】
2019531462.tif 000069
【０２２２】
化合物４９：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，３Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２２３】
プローブ４６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．３２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３２−７．３７（ｍ，３Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２２４】
実施例４７：
【０２２５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４７を構築した。
【化６３】
2019531462.tif 000070
【０２２６】
化合物５０：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２２７】
プローブ４７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，５Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２２８】
実施例４８：
【０２２９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４８を構築した。
【化６４】
2019531462.tif 000071
【０２３０】
プローブ４８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２３１】
実施例４９：
【０２３２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ４９を構築した。
【化６５】
2019531462.tif 000072
【０２３３】
化合物５１：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２３４】
プローブ４９：
プローブ１の合成を参照し、収率は３１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．３２（ｓ，１Ｈ），１０．０５（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４０（ｍ，５Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２３５】
実施例５０：
【０２３６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５０を構築した。
【化６６】
2019531462.tif 000073
【０２３７】
化合物５２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９８（ｓ，１Ｈ），７．６４−７．４８（ｍ，７  Ｈ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２３８】
プローブ５０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６４−７．４８（ｍ，７  Ｈ），７．４０（ｍ，５Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ）．
【０２３９】
実施例５１：
【０２４０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５１を構築した。
【化６７】
2019531462.tif 000074
【０２４１】
化合物５３：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．６７（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝８．８Ｈｚ，Ｊ２＝２．４Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０２４２】
化合物５４：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０２４３】
化合物５５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２４４】
プローブ５１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２４５】
実施例５２：
【０２４６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５２を構築した。
【化６８】
2019531462.tif 000075
【０２４７】
プローブ５２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．１９（ｓ，２Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２４８】
実施例５３：
【０２４９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５３を構築した。
【化６９】
2019531462.tif 000076
【０２５０】
プローブ５３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２５１】
実施例５４：
【０２５２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５４を構築した。
【化７０】
2019531462.tif 000077
【０２５３】
化合物５６：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０２５４】
プローブ５４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０２５５】
実施例５５：
【０２５６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５５を構築した。
【化７１】
2019531462.tif 000078
【０２５７】
化合物５７：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０２５８】
プローブ５５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０２５９】
実施例５６：
【０２６０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５６を構築した。
【化７２】
2019531462.tif 000079
【０２６１】
化合物５８：
Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン（１．８８ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（１．５７ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を４８ｍＬのジクロロメタンと３６ｍＬの水に溶解して、０℃まで冷却し、Ｉ２（３．０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）をゆっくり加えて、添加完了後に、系を室温までゆっくり昇温し、３０ｍｉｎ撹拌し、系に３００ｍＬのジクロロメタンと４０ｍＬの水を加えて希釈し、有機相を分離し、有機相をそれぞれ、水、チオ硫酸ナトリウム溶液、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後にロータリーエバポレーションして、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して、純粋化合物２２（２．４６ｇ、９２％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ），６．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），２．９４（ｓ，３Ｈ）．
【０２６２】
化合物５９：
化合物５８（５．５４ｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（２１３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅（３８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのトリエチルアミンに溶解して、Ａｒで保護された条件で室温で３０分間撹拌し、プロパルギルアルコール（１．５３ｍＬ、２６ｍｍｏｌ）を加えて、系を室温で２４ｈ撹拌し、反応を終了し、ろ過し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して、褐色固体３．２０ｇを得て、収率は７８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２６３】
化合物６０：
化合物５９（２．０５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解して、活性二酸化マンガン１０ｇを加えて、Ａｒで保護された条件で室温で２４ｈ撹拌し、反応を終了し、ろ過し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して褐色固体１．４２ｇを得て、収率は７０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．３７（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２６４】
化合物６１：
化合物１の合成を参照し、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２６５】
プローブ５６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２６６】
実施例５７：
【０２６７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５７を構築した。
【化７３】
2019531462.tif 000080
【０２６８】
プローブ５７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２６９】
実施例５８：
【０２７０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５８を構築した。
【化７４】
2019531462.tif 000081
【０２７１】
化合物６２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２７２】
プローブ５８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２７３】
実施例５９：
【０２７４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ５９を構築した。
【化７５】
2019531462.tif 000082
【０２７５】
化合物６３：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９０％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２７６】
プローブ５９：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２７７】
実施例６０：
【０２７８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６０を構築した。
【化７６】
2019531462.tif 000083
【０２７９】
化合物６４：
文献ＷＯ  ２００９１５２１６５（Ａ２）、２００９．１２．１７．に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．８４（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ）．
【０２８０】
化合物６５：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は８５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．８４（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２８１】
化合物６６：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１０．０４（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２８２】
化合物６７：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２８３】
プローブ６０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０２８４】
実施例６１：
【０２８５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６１を構築した。
【化７７】
2019531462.tif 000084
【０２８６】
化合物６８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．７４（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（２Ｈ，ｍ）、７．２４（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２８７】
プローブ６１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（６Ｈ，ｍ）、７．２４（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２８８】
実施例６２：
【０２８９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６２を構築した。
【化７８】
2019531462.tif 000085
【０２９０】
化合物６８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０７（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９０（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．５３（１Ｈ，ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２４（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２９１】
プローブ６２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０７（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９０（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５３（１Ｈ，ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２９２】
実施例６３：
【０２９３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６３を構築した。
【化７９】
2019531462.tif 000086
【０２９４】
化合物７０：
６−ブロモ−１−ベンゾチオフェン（０．４３ｇ、２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの乾燥ジハロメタンに溶解して、酢酸カリウム（０．４ｇ、４ｍｍｏｌ）を加えて、氷浴条件で臭素（０．３２ｇ、２ｍｍｏｌ）を加えて、室温までゆっくり昇温し、反応を終了し、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液１００ｍＬを加えて、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで３回抽出し、有機相を合併し、ロータリーエバポレーションした後にカラムに通過させて、黄色生成物０．６４ｇを得て、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）．
【０２９５】
化合物７１の合成：
化合物７０（１．２７ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの乾燥トリエチルアミンに溶解して、ジクロロビステトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１２０．２ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅（６５．２ｍｇ、０．３４３ｍｍｏｌ）及びトリメチルシリルアセチレン（３４４ｍｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を加えて、Ａｒで保護された条件でオイルバスで２４ｈ加熱して、反応を終了し、水５ｍＬを加えて反応を中止し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をエチルエーテルに溶解して、ろ過し、ロータリーエバポレーションして粗生成物を得て、精製する必要がなく、そのまま次の工程に用いた。
【０２９６】
粗生成物を３０ｍＬのＮＭＰに溶解して、硫化ナトリウム九水和物（０．８７ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）を加えて、Ａｒで保護された条件で１９０℃のオイルバスで１２ｈ加熱して、室温まで冷却し、２０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液を加えて、ジクロロメタンで３回抽出し、有機相を合併し、無水Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥し、ろ過してＮａ２ＳＯ４を除去し、ロータリーエバポレーションした後にカラムに通過させて、白色固体０．８５ｇを得て、収率は４９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）．
【０２９７】
化合物７２：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は７５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８６（ｍ，１Ｈ），７．７３（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２９８】
化合物７３：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．７１（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０２９９】
化合物７４：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０３００】
プローブ６３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０３０１】
実施例６４：
【０３０２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６４を構築した。
【化８０】
2019531462.tif 000087
【０３０３】
化合物７５：
化合物７５の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０３０４】
プローブ６４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０３０５】
実施例６５：
【０３０６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６５を構築した。
【化８１】
2019531462.tif 000088
【０３０７】
化合物７６：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．７１（ｍ，１Ｈ），）、７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０３０８】
プローブ６５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．８７（ｍ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．７１（ｍ，１Ｈ），）、７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３６−７．４２（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０２（ｓ，３Ｈ）．
【０３０９】
実施例６６：
【０３１０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６６を構築した。
【化８２】
2019531462.tif 000089
【０３１１】
化合物７７：
化合物５８（０．５５４ｇ、２ｍｍｏｌ）及び５−アルデヒド−２−チオフェンボロン酸（０．３７４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのトルエン、１０ｍＬのエタノールに溶解して、２ｍＬの２ＮのＫ２ＣＯ３溶液を加えて、アルゴンガスで保護された条件で８５℃のオイルバスで５ｈ加熱して、反応を終了し、室温まで冷却し、水１０ｍＬを加えて反応を中止し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで抽出し、有機相を合併し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションしてカラムに通過させて、純粋化合物０．３３９ｇを得て、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），６．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３１２】
化合物７８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），６．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０３１３】
プローブ６６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５４％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），６．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０３１４】
実施例６７：
【０３１５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６７を構築した。
【化８３】
2019531462.tif 000090
【０３１６】
化合物７９：
シアノ酢酸（１．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの丸形フラスコに入れて、２−メトキシエチルアミンを加えて、Ａｒで保護された条件で室温で撹拌し、反応を終了し、１０ｍＬの無水エチルエーテルを加えて、超音波で分散し、ろ過して、真空乾燥して白色固体を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝６．５（ｓ，１Ｈ），３．４８−３．５２（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）．
【０３１７】
化合物８０：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．３１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｂｔ，１Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），４．７４（ｂｔ，１Ｈ），３．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．４１−３．４８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ）．
【０３１８】
プローブ６７：
化合物１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｂｔ，１Ｈ），７．８２（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．７４（ｂｔ，１Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．４１−３．４８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ）．
【０３１９】
実施例６８：
【０３２０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６８を構築した。
【化８４】
2019531462.tif 000091
【０３２１】
プローブ６８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．９９（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｂｔ，１Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，２Ｈ），６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），４．７４（ｂｔ，１Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．４１−３．４８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ）．
【０３２２】
実施例６９：
【０３２３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６８を構築した。
【化８５】
2019531462.tif 000092
【０３２４】
プローブ６９：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．３１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｂｔ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．７４（ｂｔ，１Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．４１−３．４８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２０Ｈｚ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ）．
【０３２５】
実施例７０：
【０３２６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ６９を構築した。
【化８６】
2019531462.tif 000093
【０３２７】
化合物８１：
文献（ＷＯ  ２０１３１４２８４１（Ａ１）、２０１３．０９．２６．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８７（ｓ，２Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）．
【０３２８】
化合物８２：
化合物２１の合成を参照し、収率は７６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８７（ｓ，２Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３２９】
化合物８３：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は６２％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．９９（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３３０】
化合物８４：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８９（ｓ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），７．０５（ｓ，１Ｈ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３３１】
プローブ７０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５４％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．２２（ｓ，１Ｈ），１０．１１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，２Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），７．０５（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３３２】
実施例７１：
【０３３３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７１を構築した。
【化８７】
2019531462.tif 000094
【０３３４】
化合物８５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９８（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４８−３．５０（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３３５】
プローブ７１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．９２（ｓ，１Ｈ），１０．２１（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，２Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４８−３．５０（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３３６】
実施例７２：
【０３３７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７２を構築した。
【化８８】
2019531462.tif 000095
【０３３８】
プローブ７２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９８（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．８９（ｓ，２Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２７（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４８−３．５０（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０３３９】
実施例７３：
【０３４０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７３を構築した。
【化８９】
2019531462.tif 000096
【０３４１】
化合物８７：
文献（Ｔａｋｕｙａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＲＳＣ  Ａｄｖ．２０１５．５．５５４０６−５５４１０．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．２０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．０７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），０．４１（ｓ，６Ｈ）．
【０３４２】
化合物８８：
化合物８７（０．４ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解して、−３０℃まで冷却し、Ｎ−ブロモスクシンイミドを加えて、Ａｒで保護された条件で２ｈ撹拌し、水５ｍＬを加えて反応を中止し、室温に戻して、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解して、水で３回洗浄し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過してＮａ２ＳＯ４を除去し、ロータリーエバポレーションした後にカラムに通過させて、白色固体０．３１ｇを得て、収率は５７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７３（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３４３】
化合物８９：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は７６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７３（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３４４】
化合物９０：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．８７（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３４５】
化合物９１：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８３（ｓ，１Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３４６】
プローブ７３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．８２（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３４７】
実施例７４：
【０３４８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７４を構築した。
【化９０】
2019531462.tif 000097
【０３４９】
化合物９２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８３（ｓ，１Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），０．４２（ｓ，６Ｈ）．
【０３５０】
プローブ７４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１０．９２（ｓ，１Ｈ），９．８４（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３５１】
実施例７５：
【０３５２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７５を構築した。
【化９１】
2019531462.tif 000098
【０３５３】
化合物９３：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８３（ｓ，１Ｈ），７．７４（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（２Ｈ，ｍ）、７．１１（ｓ，１Ｈ），４．１２（２Ｈ，ｓ）、３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４２（ｓ，６Ｈ）．
【０３５４】
プローブ７５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．２２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．６３−７．４８（ｍ，５Ｈ），７．４６（ｍ，４Ｈ），７．３６−７．４２（２Ｈ，ｍ）、７．１１（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．１２（２Ｈ，ｓ）、３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３５５】
実施例７６：
【０３５６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７６を構築した。
【化９２】
2019531462.tif 000099
【０３５７】
化合物９４：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３５８】
プローブ７６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）．
【０３５９】
実施例７７：
【０３６０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７７を構築した。
【化９３】
2019531462.tif 000100
【０３６１】
化合物９５：
文献（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２．１０．３８９２−３８９８．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．２４（ｄｄ，Ｊ１＝５．２Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝３．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），７．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝５．２Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）。
【０３６２】
化合物９６：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は７８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．２５（ｄｄ，Ｊ１＝５．２Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝３．６Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），７．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝５．２Ｈｚ，Ｊ２＝１．２Ｈｚ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０３６３】
化合物９７：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．７５（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３６４】
化合物９８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０３６５】
プローブ７７：
プローブ１の合成を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．５２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．２７（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０３６６】
実施例７８：
【０３６７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７８を構築した。
【化９４】
2019531462.tif 000101
【０３６８】
化合物９９：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．４８−３．５２（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３６９】
プローブ７８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．４８−３．５２（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３７０】
実施例７９：
【０３７１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ７９を構築した。
【化９５】
2019531462.tif 000102
【０３７２】
化合物１００：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３７３】
プローブ７９：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．８２（ｓ，１Ｈ），１０．２１（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３７４】
実施例８０：
【０３７５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８０を構築した。
【化９６】
2019531462.tif 000103
【０３７６】
プローブ８０：
プローブ１の合成方法に従い、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）．
【０３７７】
実施例８１：
【０３７８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８１を構築した。
【化９７】
2019531462.tif 000104
【０３７９】
化合物９９：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３８０】
プローブ８１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７９（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，４Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３８１】
実施例８２：
【０３８２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８２を構築した。
【化９８】
2019531462.tif 000105
【０３８３】
プローブ８２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．００Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０３８４】
実施例８３：
【０３８５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８３を構築した。
【化９９】
2019531462.tif 000106
【０３８６】
化合物１０１：
文献（ＷＯ  ２００２０２０４９９（Ａ１）、２００２．０４．１４．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝６．９１（ｍ，２Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ）４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ）．
【０３８７】
化合物１０２：
化合物２２の合成を参照し、収率は５７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝９．８９（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ）４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ）．
【０３８８】
化合物１０３：
化合物１の合成を参照し、収率は８８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ）４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０３８９】
プローブ８３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０３９０】
実施例８４：
【０３９１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８４を構築した。
【化１００】
2019531462.tif 000107
【０３９２】
プローブ８４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２１（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０３９３】
実施例８５：
【０３９４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８５を構築した。
【化１０１】
2019531462.tif 000108
【０３９５】
化合物１０４：
化合物１の合成を参照し、収率は８８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ）４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ）．
【０３９６】
プローブ８５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．８２（ｓ，１Ｈ），１０．５１（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４７（ｍ，４Ｈ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ）．
【０３９７】
実施例８６：
【０３９８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８６を構築した。
【化１０２】
2019531462.tif 000109
【０３９９】
プローブ８６：
化合物１の合成を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５０（ｍ，１Ｈ）４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ）．
【０４００】
実施例８７：
【０４０１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８７を構築した。
【化１０３】
2019531462.tif 000110
【０４０２】
化合物１０６：
文献（Ｈａｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２０１２．６８．５５２−５５８．）に開示された方法を参照した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈ），６．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），５．１９（ｓ，１Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４０３】
化合物１０７：
化合物１０６（１．７３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬの丸形フラスコに入れて、炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０ｍｏｌ）、ブロモエタノール（２．４８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加えて、１２０ｍＬのアセトニトリルを加えて、Ａｒで保護された条件でオイルバスで４８ｈ加熱還流し、反応を終了し、ろ過し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解して、水で５０ｍｌ×３回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して褐色生成物１．７６ｇを得て、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈ），６．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４０４】
化合物１０８：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．８９（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４０５】
化合物１０９：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４０６】
プローブ８７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．８２（ｓ，１Ｈ），９．７３（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４０７】
実施例８８：
【０４０８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８８を構築した。
【化１０４】
2019531462.tif 000111
【０４０９】
化合物１１０：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４１０】
プローブ８８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．７２（ｓ，１Ｈ），９．５６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４９（ｍ，４Ｈ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４１１】
実施例８９：
【０４１２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ８９を構築した。
【化１０５】
2019531462.tif 000112
【０４１３】
化合物１１１：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４１４】
プローブ８９：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は６１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．７６（ｓ，１Ｈ），９．８６（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４１５】
実施例９０：
【０４１６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９０を構築した。
【化１０６】
2019531462.tif 000113
【０４１７】
プローブ９０：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５２％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０３（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４１８】
実施例９１：
【０４１９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９１を構築した。
【化１０７】
2019531462.tif 000114
【０４２０】
プローブ９１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）、７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４２１】
実施例９２：
【０４２２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９２を構築した。
【化１０８】
2019531462.tif 000115
【０４２３】
化合物１１２：
文献（Ｐｉｎｇ  Ｙａｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００８，７３，６５８７−６５９４．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４２４】
化合物１１３：
化合物２１の合成方法を参照し、収率は７６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４２５】
化合物１１４：
化合物２２の合成方法を参照し、収率は６６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．８９（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４２６】
化合物１１５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８９（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｍ，１５Ｈ）．
【０４２７】
プローブ９２：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｍ，１５Ｈ）．
【０４２８】
実施例９３：
【０４２９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９３を構築した。
【化１０９】
2019531462.tif 000116
【０４３０】
化合物１１６：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４３１】
プローブ９３：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，６Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４３２】
実施例９４：
【０４３３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９４を構築した。
【化１１０】
2019531462.tif 000117
【０４３４】
化合物１１７：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．２４（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４３５】
プローブ９４：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は４５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１２．４２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．２４（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４３６】
実施例９５：
【０４３７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９５を構築した。
【化１１１】
2019531462.tif 000118
【０４３８】
プローブ９５：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｍ，１５Ｈ）．
【０４３９】
実施例９６：
【０４４０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９６を構築した。
【化１１２】
2019531462.tif 000119
【０４４１】
プローブ９６：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は５５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．３６−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１８（ｍ，３Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４４２】
実施例９７：
【０４４３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＣＬＩＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９７を構築した。
【化１１３】
2019531462.tif 000120
【０４４４】
プローブ９７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．９３（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｓ，２Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．２４（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ），１．５０（ｓ，６Ｈ）．
【０４４５】
実施例９８：
【０４４６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ９８を構築した。
【化１１４】
2019531462.tif 000121
【０４４７】
化合物１１８：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８９（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４４８】
プローブ９８：
プローブ１の合成方法を参照し、収率３３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．１２（ｓ，１Ｈ），１０．０５（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４４９】
比較実施例９９：
【０４５０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ９９を構築した。
【化１１５】
2019531462.tif 000122
【０４５１】
リファレンスプローブ９９：
化合物１１２（０．３７５ｇ、１ｍｍｏｌ）、化合物２（０．２９７ｇ、１．１ｍｍｏｌ）及びヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウム（０．６２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解して、トリエチルアミン０．２ｍＬを加えて、Ａｒで保護された条件で室温で２ｈ撹拌し、反応を終了し、ロータリーエバポレーションして溶媒を除去し、残分をカラムクロマトグラフィーで分離して黄色固体０．４５８ｇを得て、収率７３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．１２（ｓ，１Ｈ），１０．０５（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４５２】
比較実施例１００：
【０４５３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１００を構築した。
【化１１６】
2019531462.tif 000123
【０４５４】
化合物１１９：
文献（Ｓｈｉｒｉｓｈａｇｕｒｒａｐｕ  ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１５．６．５５８−５６１．）に開示された方法を参照して合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．１１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．２０（ｓ，６Ｈ）．
【０４５５】
リファレンスプローブ１００：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照し、収率は８１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．５２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．２０（ｓ，６Ｈ）．
【０４５６】
実施例１０１：
【０４５７】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０１を構築した。
【化１１７】
2019531462.tif 000124
【０４５８】
化合物１２０：
化合物１の合成方法を参照して、収率９５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ）．
【０４５９】
プローブ１０１：
プローブ１の合成方法を参照し、収率３５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．２２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ）．
【０４６０】
比較実施例１０２：
【０４６１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１０２を構築した。
【化１１８】
2019531462.tif 000125
【０４６２】
リファレンスプローブ１０２：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照し、収率６５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．２２（ｓ，１Ｈ），１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．５５−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ）．
【０４６３】
実施例１０３：
【０４６４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０３を構築した。
【化１１９】
2019531462.tif 000126
【０４６５】
化合物１２２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０９（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４６６】
プローブ１０３：
プローブ１の合成を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．２２（ｓ，１Ｈ），９．８７（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４６７】
比較実施例１０４：
【０４６８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１０４を構築した。
【化１２０】
2019531462.tif 000127
【０４６９】
リファレンスプローブ１０４：
リファレンスプローブ９９の合成を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．２２（ｓ，１Ｈ），９．８７（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．４６（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４７０】
実施例１０５：
【０４７１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０５を構築した。
【化１２１】
2019531462.tif 000128
【０４７２】
化合物１２３：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０３（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），３．１１（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４７３】
プローブ１０５：
プローブ９９の合成方法を参照し、収率は９５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．７２（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．１１（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４７４】
比較実施例１０６：
【０４７５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０６を構築した。
【化１２２】
2019531462.tif 000129
【０４７６】
リファレンスプローブ１０６：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照し、収率は９５％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．７２（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，７．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．１１（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ）．
【０４７７】
実施例１０７：
【０４７８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０７を構築した。
【化１２３】
2019531462.tif 000130
【０４７９】
化合物１２４：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４８０】
プローブ１０７：
プローブ１の合成方法を参照し、収率は３９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．７２（ｓ，１Ｈ），９．７９（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４８１】
比較実施例１０８：
【０４８２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１０８を構築した。
【化１２４】
2019531462.tif 000131
【０４８３】
リファレンスプローブ１０８：
プローブ９２の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．７２（ｓ，１Ｈ），９．７９（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．４３（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４８４】
実施例１０９：
【０４８５】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１０９を構築した。
【化１２５】
2019531462.tif 000132
【０４８６】
化合物１２５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４８７】
プローブ１０９：
プローブ９９の合成方法を参照し、収率は９３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．５１（ｓ，１Ｈ），９．７２（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４８８】
比較実施例１１０：
【０４８９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１０を構築した。
【化１２６】
2019531462.tif 000133
【０４９０】
リファレンスプローブ１１０：
プローブ９９の合成方法を参照し、収率は９３％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．５１（ｓ，１Ｈ），９．７２（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４９１】
実施例１１１：
【０４９２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１１１を構築した。
【化１２７】
2019531462.tif 000134
【０４９３】
化合物１２７：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０）、６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４９４】
プローブ１１１：
プローブ９９の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．１２（ｓ，１Ｈ），１０．０９（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０）、６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４９５】
比較実施例１１２：
【０４９６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１２を構築した。
【化１２８】
2019531462.tif 000135
【０４９７】
リファレンスプローブ１１２：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１２．１２（ｓ，１Ｈ），１０．０９（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０）、６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０４９８】
比較実施例１１３：
【０４９９】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１３を構築した。
【化１２９】
2019531462.tif 000136
【０５００】
化合物１２８：
文献（Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，１７，７００２−７００７．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５０１】
化合物１２９：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５０２】
リファレンスプローブ１１３：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．４２（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５０３】
実施例１１４：
【０５０４】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１１４を構築した。
【化１３０】
2019531462.tif 000137
【０５０５】
化合物１３０：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５０６】
プローブ１１４：
プローブ９２の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．４２（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５０７】
比較実施例１１５：
【０５０８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１５を構築した。
【化１３１】
2019531462.tif 000138
【０５０９】
リファレンスプローブ１１５：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照し、収率は８９％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．４２（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５１０】
比較実施例１１６：
【０５１１】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１６を構築した。
【化１３２】
2019531462.tif 000139
【０５１２】
化合物１３１：
文献（Ｍａｒｉａｎ．Ｚ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．２００８，６４，１０６０５−１０６１８．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．８９（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．０３（ｓ，６Ｈ）．
【０５１３】
化合物１３２：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．０３（ｓ，６Ｈ）．
【０５１４】
リファレンスプローブ１１６：
プローブ９２の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．０２（ｓ，１Ｈ），９．５６（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．０３（ｓ，６Ｈ）．
【０５１５】
実施例１１７：
【０５１６】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１１７を構築した。
【化１３３】
2019531462.tif 000140
【０５１７】
化合物１３３：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．００（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５１８】
プローブ１１７：
プローブ９９の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．０２（ｓ，１Ｈ），９．５６（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５１９】
比較実施例１１８：
【０５２０】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１８を構築した。
【化１３４】
2019531462.tif 000141
【０５２１】
リファレンスプローブ１１８：
プローブ９２の合成方法を参照し、収率は９７％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１１．０２（ｓ，１Ｈ），９．５６（ｓ，１Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５２２】
比較実施例１１９：
【０５２３】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１１９を構築した。
【化１３５】
2019531462.tif 000142
【０５２４】
化合物１３４：
文献（ＵＳ  ２００９００４２２２７（Ａ１）、２００９．１２．１２．）に開示された方法に従って合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．７５（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
【０５２５】
化合物１３５：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９４％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
【０５２６】
リファレンスプローブ１１９：
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．３２（ｓ，１Ｈ），９．７５（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
【０５２７】
実施例１２０：
【０５２８】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光プローブ１２０を構築した。
【化１３６】
2019531462.tif 000143
【０５２９】
化合物１３６：
化合物１の合成方法を参照し、収率は９４％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９９（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５３０】
プローブ１２０：
プローブ９９の合成方法を参照した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．３２（ｓ，１Ｈ），９．７５（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５３１】
比較実施例１２１：
【０５３２】
分子ローターを粘度応答性蛍光染料として、ＳＮＡＰタンパク質タグの蛍光活性化型共有標識に適用する蛍光リファレンスプローブ１２１を構築した。
【化１３７】
2019531462.tif 000144
【０５３３】
リファレンスプローブ１２１:
リファレンスプローブ９９の合成方法を参照した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１１．３２（ｓ，１Ｈ），９．７５（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．２９（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５３４】
実施例１２２
【０５３５】
文献（Ｔ．Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２０１６，７，３０１−３０７．）に報告された方法を用いてリファレンスプローブＢＧ−ＣＣＶＪ及びＢＧ−Ｇｌｙ−ＣＣＶＪを製造した。
【０５３６】
プローブ１−９８、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１４、１１７と１２０、及びリファレンスプローブ９９、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１５、１１６、１１８、１１９、１２１、ＢＧ−ＣＣＶＪ及びＢＧ−Ｇｌｙ−ＣＣＶＪのそれぞれを、ジメチルスルホキシドに溶解して、濃度がいずれも１×１０−２Ｍの母液を調製し、それぞれをグリセリンとメタノールに加えて、均一に混合し、最終濃度が１×１０−５Ｍの溶液を調製し、プローブに応じて、順次に各プローブの最大励起波長を用いて同じ条件でその蛍光放射スペクトルを検出し、結果を表１に示した。
【０５３７】
表１から分かるように、実施例のプローブは蛍光放射波長範囲が広く、かつグリセリンとメタノールでの蛍光強度の差異が大きく、粘度変化に対する応答が敏感であり、粘度応答性を有する。
【０５３８】
実施例１２３
【０５３９】
プローブを対応するタンパク質タグと混合して混合サンプルを得て、混合サンプル中のプローブ最終濃度が５μＭ、タンパク質タグ最終濃度が１０μＭであり、混合サンプルを３７℃のインキュベータに１時間置き、蛍光分光光度計でサンプルの蛍光強度変化を検出、結果を表１に示した。
【０５４０】
表１に記載の遊離プローブ量子収率から分かるように、実施例のプローブ及びリファレンスプローブがタンパク質タグと反応していない時に蛍光が極めて弱く、ＰＢＳ緩衝液のバックグラウンド蛍光レベルに近いことから、タンパク質タグと反応していない時に、粘度応答性蛍光プローブの蛍光が活性化されていないことが分かり、タンパク質タグの量子収率を合わせて見ると、実施例のプローブがタンパク質タグと反応した後に、対応する励起放射チャネルで明らかな蛍光シグナルの増強が検出され、蛍光活性化倍数が数百倍から一千倍以上に達し、かつ比較的高い輝度を有することから、実施例のプローブはタンパク質タグと結合した後に蛍光を活性化でき、良好な蛍光分子スイッチ性質を有することが分かる。一方、リファレンスプローブも蛍光活性化の性質を有するが、活性化後に蛍光量子収率が非常に低く、輝度に劣り、特に、表１のプローブ９８とリファレンスプローブ９９、プローブ１０１とリファレンスプローブ１０２、プローブ１０３とリファレンスプローブ１０４、プローブ１０５とリファレンスプローブ１０６、プローブ１０７とリファレンスプローブ１０８、プローブ１０９とリファレンスプローブ１１０、プローブ１１１とリファレンスプローブ１１２、プローブ１１４とリファレンスプローブ１１５、プローブ１１７とリファレンスプローブ１１８、プローブ１２０とリファレンスプローブ１２１の比較結果から、同じ蛍光染料でも、リガンドが蛍光染料の電子ドナー部分に結合された場合、プローブの蛍光活性化輝度は、リガンドが蛍光染料の電子受容体部分に結合されたリファレンスプローブよりも遥かに高いことが分かる。
【０５４１】
以上のことから、実施例のプローブはタンパク質タグと結合した後に蛍光を活性化でき、良好な蛍光分子スイッチ性質を有し、リガンドが蛍光染料の電子受容体と結合したリファレンスプローブに比べて、実施例のリガンドが蛍光染料の電子ドナーと結合したプローブは明らかに向上した蛍光活性化輝度を有することが分かる。
【表１】
2019531462.tif 000145
2019531462.tif 000146
2019531462.tif 000147
2019531462.tif 000148
【０５４２】
実施例１２４
【０５４３】
ＳＮＡＰタンパク質タグのそれぞれを、３０μＭのプローブ１、プローブ１４、プローブ２１、プローブ３０、プローブ４３、プローブ４８、プローブ５６、プローブ６３、プローブ７０、プローブ８８の溶液に加えて、ＳＮＡＰタンパク質タグの最終濃度が０．１μＭ、０．５μＭ、０．７μＭ、１．２μＭ、４．５μＭ、８．１μＭ、１３．１μＭ、１４．８μＭの混合サンプル溶液を調製し、混合サンプル溶液を３７℃に置いて１時間反応させて、蛍光分光光度計を用いてサンプルの励起発光スペクトルの変化を検出し、発光スペクトル強度に基づいて、ＳＮＡＰタンパク質タグの濃度と蛍光強度の関係図を作成し、結果をそれぞれ図２〜図１１に示した。
【０５４４】
図２から分かるように、ＳＮＡＰタンパク質タグの濃度が０．１μＭ〜１４．８μＭの範囲内でいずれもプローブの蛍光強度と比較的良い線形関係を有するため、標準曲線に準じてタンパク質タグを定量的に検出することができる。
【０５４５】
実施例１２５
【０５４６】
Ｈｅｌａ細胞を例に、化合物の哺乳動物細胞内での標識効果について調べた。安定してタンパク質タグを発現するＨｅｌａ細胞、Ｈｅｌａ−ＷＴ細胞（Ｈｅｌａ原始細胞、タンパク質タグを発現していない）を、１４ｍｍのガラス底９６穴細胞培養プレートに接種し、１０時間安定サせた。プローブ１、プローブ１５、プローブ２１、プローブ３０、プローブ５６、プローブ６０、プローブ６３、プローブ８８のそれぞれを、培地に加えて５μＭまで希釈した。細胞を３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて２時間インキュベーションし、Ｌｅｉｃａ  ＴＰＳ−８共焦点顕微鏡を用いて画像化し標識細胞の蛍光変化を検出した。図１２のＢグループの結果は、上記プローブを加えた後、Ｈｅｌａ−ＷＴ細胞には対応する蛍光シグナルが検出されなかったことを示し、プローブ蛍光は細胞内の環境による影響を受けていないことが分かる。一方、図１２のＡグループにおいて、タンパク質タグを発現するＨｅｌａ細胞には強烈な蛍光シグナルが検出され、蛍光シグナルが３００倍近く強くなった。
【０５４７】
上述の実験から、プローブは、細胞内のタンパク質タグの特異的標識を実現でき、蛍光の特異的活性化を実現できると同時に、プローブ蛍光は細胞内の環境による影響を受けないことが分かる。
【０５４８】
実施例１２６
【０５４９】
プローブ１、プローブ２１、プローブ４８、プローブ６０、プローブ６６、プローブ７７を、異なるオルガネラ位置づけ目的タンパク質の標識に適用できることを検証するために、Ｈｅｌａ細胞を例に、プローブによる異なる細胞レベル下のタンパク質タグの標識効果について調べた。Ｈｅｌａ細胞を５０００細胞／穴で９６穴ガラス底細胞培養プレートに接種し、１４時間後にｌｉｐｏ２０００キットを用いてタンパク質タグの異なるオルガネラ位置づけプラスミドにトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、元の培地を除去し、フェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、０．２μＭのプローブを含むフェノールレッド無しの培地を用いて細胞を２時間インキュベーションし、ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−８共焦点顕微鏡を用いて画像化し細胞の標識効果について調べた。その結果、図１３に示されるように、プローブは、洗浄なしの場合に複数種の細胞内小器官の構造をはっきりと示し、具体的には、細胞核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体ネットワーク、全細胞、細胞骨格、細胞外膜、リソソーム、細胞内膜を含むが、これらに限定されない。
【０５５０】
以上の結果から、プローブは細胞内小器官を標識する有力なツールとして使用できることが分かる。
【０５５１】
実施例１２７
【０５５２】
Ｈｅｌａ細胞を５０００細胞／穴で９６穴ガラス底細胞培養プレートに接種し、１４時間後にｌｉｐｏ２０００キットを用いて、ｐｃｄｎａ３．１−ＣＬＩＰ−ＮＬＳ（ＣＬＩＰタンパク質タグの細胞核位置づけプラスミド）、ｐｃｄｎａ３．１−ｍｉｔｏ−ＳＮＡＰ（ＳＮＡＰタンパク質タグのミトコンドリア位置づけプラスミド）を、１穴あたり０．１μｇで同時トランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、元の培地を除去し、フェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、０．２μＭのプローブ１及びプローブ４３を含むフェノールレッド無しの培地をそれぞれ用いて細胞を２時間インキュベーションし、ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−８共焦点顕微鏡を用いて画像化し細胞の標識効果について調べた。その結果、図１４に示されるように、プローブ１とプローブ４３は同時に、洗浄なしの場合にミトコンドリア及び細胞核の構造をそれぞれはっきりと示し、かつプローブ４３で標識した細胞核蛍光とプローブ１で標識したミトコンドリア蛍光とのチャネル共局在係数が０．１未満であることから、２つの蛍光チャネルは互いに干渉しないことが分かる。
【０５５３】
以上の実験から、異なるプローブの蛍光基のスペクトルは互いに干渉せず、同時に直交標識画像化を行えることが分かる。
【０５５４】
実施例１２８
【０５５５】
まず、ＳＮＡＰタンパク質タグを発現するプラスミドｐｃｄｎａ３．１−ＳＮＡＰ（サンプルグループ）及びＳＮＡＰタンパク質タグを発現していない対照プラスミドｐｃｄｎａ３．１−ＣＡＴ（対照グループ）を、マウスの体内に導入した。この方法は、プラスミドを非常に体積の大きい溶液に溶解して尾静脈注射によってマウスの体内に速やかに注射し、マウスの肝臓と腎臓がＤＮＡを吸収した上で、目的タンパク質を発現させるものである。プラスミド注射２０時間後、２００μｌのＰＢＳに溶解した０．４μＭのプローブ８８を、尾静脈注射の方法によってマウスの体内に注射してＳＮＡＰタンパク質タグを標識した。６時間後にマウスを解剖し、コダックのマルチスペクトルイメージングシステムによって異なるマウスサンプルの肝臓部位の蛍光差異を検出した。その結果、図１５に示されるように、プローブ８８を注射した対照プラスミドｐｃｄｎａ３．１−ＣＡＴのマウスの肝臓の蛍光が非常に低く、プローブを注射していないブランク肝臓のバックグラウンド蛍光レベルに近いが、プローブ８８を注射したＳＮＡＰプラスミドｐｃｄｎａ３．１−ＳＮＡＰのマウスの肝臓は比較的強い蛍光を有し、シグナル強度は対照グループ蛍光の２０倍以上であった。
【０５５６】
以上の実験から、プローブは蛍光が動物体内環境による影響を受けず、生体動物体内に適用でき、かつ肝臓部位で発現するＳＮＡＰタンパク質タグを特異的に標識して、比較的強い蛍光シグナルを発生することができることが分かる。
【０５５７】
実施例１２９：
【０５５８】
ファージディスプレイの指向進化方法によって、ＳＮＡＰ−ｔａｇに対する６回のスクリーニングを経て、２種類のＳＮＡＰ−ｔａｇ変異体をクローンし、それぞれがＳＮＡＰ  Ｆ３３ＧとＳＮＡＰ  Ｖ１６４Ｅであり、実施例１２３に記載の方法を用いて、プローブ１、２１、４０のそれぞれで前記２種類のＳＮＡＰ−ｔａｇ変異体を標識し、その結果、同じ条件において、文献（Ｂｒｉｇｈｔｍｏｌｌｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１２，５１，９８６−９９４．）に開示された配列に比べて、プローブ蛍光活性化後の量子収率は当初の２．１〜１．６倍であった。
【０５５９】
なお、ＳＮＡＰ  Ｆ３３Ｇ及びＳＮＡＰ  Ｖ１６４ＥのＤＮＡ配列を記載する。
ＳＮＡＰ  Ｆ３３ＧのＤＮＡ配列：
2019531462.tif 000149
ＳＮＡＰ  Ｖ１６４ＥのＤＮＡ配列：
2019531462.tif 000150
【０５６０】
実施例１３０：
【０５６１】
本発明のプローブの蛍光活性化はタンパク質の存在と関連性を有することを検証するために、哺乳動物細胞のＳＮＡＰタンパク質を例に、Ｈｅｌａ細胞においてＡＩＤ分解システムを例に、ＳＮＡＰタンパク質と結合したプローブのタンパク質分解後の蛍光変化を検出した。まず、Ｈｅｌａ細胞を２００００／ｃｍ２で２０ｍｍのガラス底細胞培養皿に接種し、１４時間後にｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ社のｌｉｐｏｆｅｃｔｍａｉｎ２０００トランスフェクション試薬によってｐｃｄｎａ３．１−ＴＩＲ１とｐｃｄｎａ３．１−ＳＮＡＰ−ＩＡＡ１７−Ｈ２Ｂプラスミドをトランスフェクションした。細胞トランスフェクション２４時間後、１μＭのプローブ２１を含むフェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地で元の細胞培地を置き換えて細胞を標識し、細胞サンプルを３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて１時間インキュベーションした。標識完了後、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８レーザー共焦点顕微鏡を用いて画像化し細胞標識の蛍光シグナルを検出するとともに、インドール酢酸（ＩＡＡ）を加えて、ＳＮＡＰ−ＩＡＡ１７−Ｈ２Ｂタンパク質の分解を誘発し、タンパク質分解過程での細胞蛍光の変化状況を検出した。その結果、図１６に示されるように、ＳＮＡＰ−ＩＡＡ１７−Ｈ２Ｂタンパク質が細胞核に位置し（０ｍｉｎ）、インドール酢酸を加えてタンパク質の分解を誘発し、時間が経つに連れて、ＳＮＡＰ−ＩＡＡ１７−Ｈ２Ｂタンパク質の蛍光シグナルが次第に低下し、インドール酢酸を加えた１２０ｍｉｎ後、蛍光シグナルがほぼ見られず、タンパク質の分解速度は文献の報告結果と一致している。以上の実験から、プローブの蛍光性質は哺乳動物細胞において同様にタンパク質の存在に依存し、タンパク質が存在する場合に蛍光が活性化され、タンパク質が分解された以降、蛍光が消光し、目的タンパク質の分解過程の追跡、モニタリングに使用できることが分かる。
【０５６２】
実施例１３１：
【０５６３】
本発明のプローブは哺乳動物細胞内の生体高分子の組み立てと分解過程のリアルタイムモニタリングに使用できることを検証するために、Ｈｅｌａ細胞を例に、プローブが哺乳動物細胞内で細胞間隙タンパク質ＣＸ４３が細胞間隙チャンネルを組み立てて形成する過程をトレースすることについて検討した。ＣＸ４３遺伝子Ｃ末端をＳＮＡＰ遺伝子と融合させるとともに、レンチウイルス感染技術によって融合タンパク質ＣＸ４３−ＳＮＡＰを安定して発現するＨｅｌａ細胞株を構築し得られた。プローブ標識する１０時間前、Ｈｅｌａ−ＣＸ４３−ＳＮＡＰ細胞株を、２０ｍｍのガラス底細胞培養皿に接種した。標識する際に、まず、フェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地でプローブ２１を２μＭに希釈して元の細胞培地を置き換えた。細胞を３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて１時間インキュベーションした。その後、新しいフェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄し、結合していないプローブ２１を除去し、間隔を２分間とした。その後、１μＭのプローブ１を含むＤＭＥＭフェノールレッド無しの培地を加えて細胞を標識し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いて、標識細胞サンプルがプローブ２１、プローブ１の２つのプローブの対応する蛍光チャネルでの蛍光強度及び位置変化過程について、長時間に亘ってモニタリングし、それぞれ図１７Ａと１７Ｂに示した。プローブ２１の蛍光チャネルは、図１７Ａに示されるように、２個の細胞の間に長い柱状の特異的な蛍光シグナルが見られ、文献（Ｇｕｉｄｏｇａｉｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６，５０３−５０７．）で報告された結果と一致している。プローブ１の添加直後は、図１７Ｂに示されるように、対応する蛍光チャネルで蛍光シグナルを検出できなかったことから、プローブ２１は細胞内に存在するすべてのＣＸ４３タンパク質を標識したことが分かる。培養時間が長くなるに連れて、絶え間なく新しいＣＸ４３−ＳＮＡＰタンパク質が合成され、プローブ１により標識された。標識２時間後、プローブ２１で標識された元の細胞間隙チャンネルのエッジにプローブ１の蛍光シグナルが現れ次第に強くなるが、古い細胞間隙チャンネルのプローブ２１の蛍光シグナルが次第に低下することから、細胞間隙チャンネルに新たに合成されたＣＸ４３−ＳＮＡＰタンパク質は周囲から中央に向かって元のＣＸ４３−ＳＮＡＰタンパク質を代替していくことが分かり、オーバーレイチャンネルを図１７Ｃに示し、文献で報告された結果と一致している。以上の実験結果から、ＳＮＡＰの一連の化合物を細胞内の生体高分子の組み立てと分解過程のリアルタイムモニタリングに適用できることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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