(57)【要約】非ウイルスベクターおよび腫瘍浸潤リンパ球など、消化器がんの処置のための遺伝子改変組成物が開示される。ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、遺伝子改変組成物を作製する方法が、開示される。また、遺伝子改変組成物を作製し、消化器がんの処置のために使用する方法も開示される。本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、対象への少なくとも１つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメン；対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物；およびサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。
2019532080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、前記対象への少なくとも１つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメンと；
ｂ）前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物と；
ｃ）サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、医薬組成物と
を、それを必要とする前記対象に投与するステップ
を含む処置方法。
【請求項２】
抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）対象における免疫応答を抑制するのに十分な量での、前記対象への少なくとも１つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメンと；
ｂ）前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗生物質を含む医薬組成物と；
ｃ）サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、医薬組成物と
を、それを必要とする前記対象に投与するステップ
を含む処置方法。
【請求項４】
抗真菌剤を投与するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ａ）対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物と；
ｂ）前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物と；
ｃ）サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物と
を、それを必要とする前記対象に投与するステップ
を含む処置方法。
【請求項６】
前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物と；
ｂ）前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物と；
ｃ）サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物と
を、それを必要とする前記対象に投与するステップ
を含む処置方法。
【請求項８】
前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
がんを処置するための方法であって、治療有効量のｅｘ  ｖｉｖｏ操作腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、前記ｅｘ  ｖｉｖｏ操作ＴＩＬが、前記ｅｘ  ｖｉｖｏ操作ＴＩＬにおけるサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能の抑制をもたらすＣＩＳＨ遺伝子における破壊を含み、前記破壊が、配列番号６８のガイドポリ核酸が結合した配列において起こる、方法。
【請求項１０】
前記準備レジメンが、前記ＴＩＬ投与の約１４日〜約２４時間前に、前記免疫抑制薬の投与を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記準備レジメンが、前記ＴＩＬ投与の約１０日〜約２４時間前に、前記免疫抑制薬の投与を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記準備レジメンが、前記ＴＩＬ投与の約７日〜約２４時間前に、前記免疫抑制薬の投与を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫抑制薬が、放射線療法剤、生物学的薬剤または化学薬剤を含む、請求項１〜４および１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫抑制薬が、前記化学薬剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学薬剤が、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学薬剤が、前記シクロホスファミドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化学薬剤が、フルダラビンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記シクロホスファミドが、前記対象の約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記シクロホスファミドが、少なくとも約２日間〜約５日間にわたって前記対象に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シクロホスファミドが、前記対象の約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記シクロホスファミドが、少なくとも約７日間〜約１０日間にわたって前記対象に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記シクロホスファミドが、前記対象１ｋｇ当たり約３ｍｇ〜前記対象１ｋｇ当たり約５ｍｇで投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記シクロホスファミドが、前記対象１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記シクロホスファミドが、１ｋｇ当たり５０ｍｇを超えて投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記シクロホスファミドが、１ｋｇ当たり約６０ｍｇで投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２で投与される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約２５ｍｇ／ｍ２で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記準備レジメンが、部分的または完全免疫抑制を含む、請求項１〜４および１０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗真菌薬が、ポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択される、請求項１、２、４および１０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗真菌薬が、前記アゾールである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アゾールが、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、およびボリコナゾールからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アゾールが、フルコナゾールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記フルコナゾールが、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇで投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記フルコナゾールが、４００ｍｇで投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗真菌薬が、前記ＴＩＬと同時にまたは逐次に投与される、請求項１、２、４および１０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗真菌薬が、前記ＴＩＬの約０日後〜約４日後に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗生物質が、細菌壁標的剤、細胞膜標的剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターまたは静菌剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項２〜４および１０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗生物質が、殺菌剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記殺菌剤が、セファロスポリンまたはキノロンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗生物質が、静菌剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記静菌剤が、予防的に投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記静菌剤が、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンである、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンが、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇで投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記トリメトプリムが、１６０ｍｇで投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記スルファメトキサゾールが、８００ｍｇで投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ペンタミジンが、３００ｍｇで投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記静菌剤が、前記ＴＩＬの前に、前記ＴＩＬと同時に、または前記ＴＩＬの後に投与される、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記静菌剤が、前記ＴＩＬの前記投与の約１４日前〜前記ＴＩＬの前記投与の約６カ月後に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記静菌剤が、前記ＴＩＬの約８日前〜前記ＴＩＬの少なくとも４日後に投与される、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与が、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫抑制薬が、注入によって投与される、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記シクロホスファミドが、約６０ｍｇ／ｋｇの用量であり、２５０ｍｌの５％デキストロース水溶液に希釈され、１時間にわたって注入される、請求項１５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記フルダラビンが、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおける２５ｍｇ／ｍ２の用量であり、約１５〜約３０分間にわたって注入される、請求項１５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象における前記ＴＩＬを活性化するのに十分な量での免疫刺激薬を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫刺激薬が、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターまたは免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫刺激薬が、前記インターロイキンを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記インターロイキンが、アルデスロイキンであり、約５５０，０００〜約８００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記アルデスロイキンが、約７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象における感染症を防止するのに十分な量での感染予防剤を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記感染予防剤が、ヘルペスウイルス予防薬剤である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が、ＨＳＶ陽性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヘルペスウイルス予防薬剤が、バラシクロビルまたはアシクロビルである、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記破壊が、ＣＲＩＳＰＲ、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導される、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記系が、ＣＲＩＳＰＲ系である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＲＩＳＰＲ系が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記エンドヌクレアーゼが、前記破壊を行う、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記破壊が、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記破壊が、遺伝子のエクソン中である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約２０塩基対以内である、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約１０塩基対以内である、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約５塩基対以内である、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）から３塩基対である、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記破壊が、配列番号１３のエクソンまたはイントロン中である、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記破壊が、配列番号１３のエクソン中である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドポリ核酸を含む、請求項６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ガイドポリ核酸が、配列番号６８に対して少なくとも約６０％の相同性を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記破壊が、二本鎖切断を含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記二本鎖切断が、配列番号７１または配列番号７７で生じる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＴＩＬが、細胞約１×１０９個、細胞３×１０９個、細胞１×１０１０個、細胞３×１０１０個〜細胞約１×１０１１個の用量で投与される、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＴＩＬが、約３０分間にわたって投与される、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＴＩＬが、静脈内投与される、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記静脈内投与が、注入を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＴＩＬにおいて注入前試験を行うステップをさらに含む、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記注入前試験が、表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも１つを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記表現型試験が、前記ＴＩＬにおけるＣＤ３の存在を検出するステップを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記効力試験が、前記ＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に、ＩＦＮγのレベルを検出するステップを含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記微生物学的試験が、好気培養、嫌気培養、グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記エンドトキシン試験が、リムルスアッセイを行うステップを含む、請求項８５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記生存率試験が、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記腫瘍細胞試験が、細胞病理学アッセイを含む、請求項８５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記注入前試験が、前記微生物学的試験について陰性である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記注入前試験が、前記生存率試験について少なくとも約７０％超の生細胞である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項８４〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記注入前試験が、前記表現型試験について少なくとも約８０％ＣＤ３陽性である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項８４〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記注入前試験が、前記効力試験において前記ＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に細胞１０５個当たり少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγである場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項８４〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記注入前試験が、前記細胞病理学試験において検討された少なくとも約２００個のＴＩＬ当たりで腫瘍細胞について陰性である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項８４〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形と；抗真菌剤の剤形とを含む治療用製品。
【請求項９８】
前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、葉酸合成インヒビターまたは核酸架橋剤の剤形と；サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形とを含む治療用製品。
【請求項９９】
ポリエン、アゾール、アリルアミンまたはエキノキャンディンから選択される抗真菌剤の剤形と；サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形とを含む治療用製品。
【請求項１００】
サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形を含む治療用製品であって、前記ＴＩＬが、約７．０×１０７細胞／ｍＬ〜約２．０×１０８細胞／ｍＬの凍結密度で凍結保存される、治療用製品。
【請求項１０１】
ａ）抗真菌剤の剤形と；
ｂ）免疫抑制薬の剤形と；
ｃ）抗生物質の剤形と；
ｅ）サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形と
を含む治療用製品。
【請求項１０２】
免疫抑制薬の剤形をさらに含む、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１０３】
前記免疫抑制薬が、前記ＴＩＬの投与の約１４日〜約２４時間前に、対象への投与のために製剤化される、請求項１０２に記載の治療用製品。
【請求項１０４】
前記免疫抑制薬が、前記ＴＩＬの前記投与の約１０日〜約２４時間前に、対象への投与のために製剤化される、請求項１０２または１０３に記載の治療用製品。
【請求項１０５】
前記免疫抑制薬が、前記ＴＩＬの前記投与の約７日〜約２４時間前に、対象への投与のために製剤化される、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１０６】
前記免疫抑制薬が、放射線療法剤、生物学的薬剤または化学薬剤を含む、請求項１０２〜１０５のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１０７】
前記免疫抑制薬が、前記化学薬剤を含む、請求項１０６に記載の治療用製品。
【請求項１０８】
前記化学薬剤が、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１０７に記載の治療用製品。
【請求項１０９】
前記化学薬剤が、シクロホスファミドを含む、請求項１０８に記載の治療用製品。
【請求項１１０】
前記化学薬剤が、フルダラビンを含む、請求項１０８に記載の治療用製品。
【請求項１１１】
前記シクロホスファミドが、前記対象の約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１１２】
前記シクロホスファミドが、少なくとも約２日間〜約５日間にわたって前記対象に投与される、請求項１１１に記載の治療用製品。
【請求項１１３】
前記シクロホスファミドが、前記対象の約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１１４】
前記シクロホスファミドが、少なくとも約７日間〜約１０日間にわたって前記対象に投与される、請求項１１３に記載の治療用製品。
【請求項１１５】
前記シクロホスファミドが、前記対象１ｋｇ当たり約３ｍｇ〜前記対象１ｋｇ当たり約５ｍｇで投与される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１１６】
前記シクロホスファミドが、前記対象１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１１７】
前記シクロホスファミドが、１ｋｇ当たり５０ｍｇを超えて投与される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１１８】
前記シクロホスファミドが、１ｋｇ当たり約６０ｍｇで投与される、請求項１１７に記載の治療用製品。
【請求項１１９】
前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２で投与される、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１２０】
前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約２５ｍｇ／ｍ２で投与される、請求項１１９に記載の治療用製品。
【請求項１２１】
前記免疫抑制薬が、部分的または完全免疫抑制を生じる、請求項１０２〜１２０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１２２】
抗真菌剤の前記剤形が、ポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択される、請求項９７〜１２１のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１２３】
前記抗真菌剤が、アゾールである、請求項１２２に記載の治療用製品。
【請求項１２４】
前記アゾールが、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、および、ボリコナゾールからなる群から選択される、請求項１２３に記載の治療用製品。
【請求項１２５】
前記アゾールが、フルコナゾールである、請求項１２４に記載の治療用製品。
【請求項１２６】
前記フルコナゾールが、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇの量で存在する、請求項１２４または１２５に記載の治療用製品。
【請求項１２７】
前記フルコナゾールが、４００ｍｇの量で存在する、請求項１２６に記載の治療用製品。
【請求項１２８】
抗真菌薬の前記剤形が、前記ＴＩＬと同時にまたは逐次に投与される、請求項９７〜１２７のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１２９】
抗真菌薬の前記剤形が、前記ＴＩＬの約０日後〜約４日後に投与される、請求項１２８に記載の治療用製品。
【請求項１３０】
抗生物質の剤形をさらに含む、請求項９７〜１２９のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１３１】
前記抗生物質が、細菌壁標的剤、細胞膜標的剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターおよび静菌剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３０に記載の治療用製品。
【請求項１３２】
前記抗生物質が、殺菌剤を含む、請求項１３１に記載の治療用製品。
【請求項１３３】
前記殺菌剤が、セファロスポリンまたはキノロンである、請求項１３２に記載の治療用製品。
【請求項１３４】
抗生物質の前記剤形が、静菌剤である、請求項１３０〜１３３のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１３５】
前記静菌剤が、予防的投与のために製剤化される、請求項１３４に記載の治療用製品。
【請求項１３６】
前記静菌剤が、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンである、請求項１３４または１３５に記載の治療用製品。
【請求項１３７】
前記トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンが、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの量で存在する、請求項１３６に記載の治療用製品。
【請求項１３８】
前記トリメトプリムが、１６０ｍｇの量で存在する、請求項１３７に記載の治療用製品。
【請求項１３９】
前記スルファメトキサゾールが、８００ｍｇの量で存在する、請求項１３７に記載の治療用製品。
【請求項１４０】
前記ペンタミジンが、３００ｍｇの量で存在する、請求項１３７に記載の治療用製品。
【請求項１４１】
前記静菌剤が、前記ＴＩＬの前に、前記ＴＩＬと同時に、または前記ＴＩＬの後に投与される、請求項１３１〜１４０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１４２】
前記静菌剤が、前記ＴＩＬの前記投与の約１４日前〜前記ＴＩＬの前記投与の約６カ月後に投与される、請求項１４１に記載の治療用製品。
【請求項１４３】
前記静菌剤が、前記ＴＩＬの約８日前〜前記ＴＩＬの少なくとも４日後に投与される、請求項１３１〜１４２のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１４４】
前記剤形を投与するステップをさらに含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１４５】
静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与のために製剤化される、請求項１４４に記載の治療用製品。
【請求項１４６】
免疫抑制薬の前記剤形が、注入による投与のために製剤化される、請求項１０２〜１４５のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１４７】
前記シクロホスファミドが、約６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、２５０ｍｌの５％デキストロース水溶液に希釈され、１時間にわたって注入される、請求項１０８〜１４６のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１４８】
前記フルダラビンが、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおける２５ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、約１５〜約３０分間にわたって注入される、請求項１０８〜１４７のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１４９】
前記免疫刺激薬が、前記対象における前記ＴＩＬを活性化するのに十分な量で存在する、請求項９７〜１４８のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１５０】
前記免疫刺激薬が、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターおよび免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１４９に記載の治療用製品。
【請求項１５１】
免疫刺激薬の前記剤形が、インターロイキンを含む、請求項１５０に記載の治療用製品。
【請求項１５２】
前記インターロイキンが、アルデスロイキンであり、約５５０，０００〜約８００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５１に記載の治療用製品。
【請求項１５３】
前記アルデスロイキンが、約７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５２に記載の治療用製品。
【請求項１５４】
前記対象における感染症を防止するのに十分な量での感染予防剤の剤形をさらに含む、請求項９７〜１５３のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１５５】
前記感染予防剤が、ヘルペスウイルス予防薬剤である、請求項１５４に記載の治療用製品。
【請求項１５６】
前記ヘルペスウイルス予防薬剤が、ＨＳＶ陽性対象の処置に有効な量で存在する、請求項１５５に記載の治療用製品。
【請求項１５７】
前記ヘルペスウイルス予防薬剤が、バラシクロビルまたはアシクロビルである、請求項１５５または１５６に記載の治療用製品。
【請求項１５８】
前記破壊が、ＣＲＩＳＰＲ、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導される、請求項９７〜１５７のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１５９】
前記系が、ＣＲＩＳＰＲ系である、請求項１５８に記載の治療用製品。
【請求項１６０】
前記ＣＲＩＳＰＲ系が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む、請求項１５８または１５９に記載の治療用製品。
【請求項１６１】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１６０に記載の治療用製品。
【請求項１６２】
前記エンドヌクレアーゼが、前記破壊を行う、請求項１６０または１６１に記載の治療用製品。
【請求項１６３】
前記破壊が、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含む、請求項９７〜１６２のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１６４】
前記破壊が、遺伝子のエクソン中である、請求項１６３に記載の治療用製品。
【請求項１６５】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約２０塩基対以内である、請求項９７〜１６４のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１６６】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約１０塩基対以内である、請求項９７〜１６４のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１６７】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約５塩基対以内である、請求項９７〜１６４のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１６８】
前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）から３塩基対である、請求項９７〜１６７のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１６９】
前記破壊が、配列番号１３のエクソンまたはイントロン中である、請求項９７〜１６８のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１７０】
前記破壊が、配列番号１３のエクソン中である、請求項１６９に記載の治療用製品。
【請求項１７１】
前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドポリ核酸を含む、請求項１５８〜１７０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１７２】
前記ガイドポリ核酸が、配列番号６８に対して少なくとも約６０％の相同性を含む、請求項１７１に記載の治療用製品。
【請求項１７３】
前記破壊が、二本鎖切断を含む、請求項９７〜１７２のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１７４】
前記二本鎖切断が、配列番号７１または配列番号７７で生じる、請求項１７３に記載の治療用製品。
【請求項１７５】
前記ＴＩＬが、細胞約１×１０９個、細胞３×１０９個、細胞１×１０１０個、細胞３×１０１０個〜細胞約１×１０１１個の量で存在する、請求項９７〜１７４のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１７６】
前記ＴＩＬが、約３０分間にわたって投与される、請求項９７〜１７５のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１７７】
前記ＴＩＬが、静脈内投与される、請求項９７〜１７６のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１７８】
前記静脈内投与が、注入を含む、請求項１７７に記載の治療用製品。
【請求項１７９】
前記ＴＩＬにおける注入前試験を行うステップをさらに含む、請求項９７〜１７８のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８０】
前記注入前試験が、表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７９に記載の治療用製品。
【請求項１８１】
前記表現型試験が、前記ＴＩＬにおけるＣＤ３の存在を検出するステップを含む、請求項１８０に記載の治療用製品。
【請求項１８２】
前記効力試験が、前記ＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に、ＩＦＮγのレベルを検出するステップを含む、請求項１８０または１８１に記載の治療用製品。
【請求項１８３】
前記微生物学的試験が、好気培養、嫌気培養、グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む、請求項１８０〜１８２のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８４】
前記エンドトキシン試験が、リムルスアッセイを行うステップを含む、請求項１８０〜１８３のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８５】
前記生存率試験が、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む、請求項１８０〜１８４のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８６】
前記腫瘍細胞試験が、細胞病理学アッセイを含む、請求項１８０〜１８５のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８７】
前記注入前試験が、前記微生物学的試験について陰性である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項９７〜１８６のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８８】
前記注入前試験が、前記生存率試験について少なくとも約７０％超の生細胞である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項９７〜１８７のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１８９】
前記注入前試験が、前記表現型試験について少なくとも約８０％ＣＤ３陽性である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項９７〜１８８のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１９０】
前記注入前試験が、前記効力試験において前記ＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に細胞１０５個当たり少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγである場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項９７〜１８９のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１９１】
前記注入前試験が、前記細胞病理学試験において検討された少なくとも約２００個のＴＩＬ当たりで腫瘍細胞について陰性である場合、前記ＴＩＬが投与される、請求項９７〜１９０のいずれか一項に記載の治療用製品。
【請求項１９２】
配列番号６４〜配列番号６９のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列相同性を含む核酸組成物。
【請求項１９３】
前記配列相同性が、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大約１００％である、請求項１９２に記載の核酸組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６２／４０９，６５１号および２０１７年１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／４５２，２４４号の優先権を主張し、当該出願の各々は、全ての目的について全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入は、転移性黒色腫の耐久性がある退縮を媒介することにおいて相当な成功を収めた。このような成功にもかかわらず、他の固形腫瘍の状況下でのＴＩＬ療法の使用は、難度が高かった。これは、腫瘍微小環境によって発揮される抑制効果ならびに受容体シグナル伝達およびエフェクター機能獲得におけるＴ細胞固有の機能障害によるものである可能性がある。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ−４）機能をターゲティングする、モノクローナル抗体に基づく免疫チェックポイントインヒビターは、Ｔ細胞外因性抑制効果を軽減し得る場合もあるが、それらに非腫瘍反応性Ｔ細胞に対して全身性活性があることに起因する潜在的に致死的な自己免疫性副作用のリスクを有する。近年、腫瘍上の分子標的をｉｎ  ｖｉｖｏで認識するためのリンパ球の遺伝子操作が著しく進歩した結果として、腫瘍標的寛解の目覚ましい症例がもたらされている。しかし、これらの成功は、主に、血液学的腫瘍に限定されており、特定の腫瘍内の細胞によって発現される同定可能分子の欠如、および腫瘍破壊を媒介するために腫瘍標的への特異的結合に使用することができる分子の欠如により、固形腫瘍へのより広範な適用は、限定的である。近年におけるいくつかの進歩は、場合によって抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する腫瘍特異的変異の同定に焦点を当てている。例えば、これらの内因性変異は、全エクソームシーケンシング法を使用して同定することができる。Tran  Eら、「Cancer  immunotherapy  based  on  mutation-specific  CD4+  T  cells  in  a  patient  with  epithelial  cancer」、Science  ３４４巻：６４１〜６４４頁（２０１４年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Tran  Eら、「Cancer  immunotherapy  based  on  mutation-specific  CD4+  T  cells  in  a  patient  with  epithelial  cancer」、Science  ３４４巻：６４１〜６４４頁（２０１４年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、対象への少なくとも１つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメン；対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物；およびサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。場合によって、方法は、抗生物質を投与するステップをさらに含み得る。
本明細書では、対象における免疫応答を抑制するのに十分な量での、対象への少なくとも１つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメン；対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗生物質を含む医薬組成物；およびサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。場合によって、方法は、抗真菌剤を投与するステップをさらに含み得る。
【０００５】
本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物；対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物；ならびにサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置方法が開示される。場合によって、方法は、対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。
【０００６】
本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物；前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物；ならびにサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置方法が開示される。場合によって、方法は、対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。
【０００７】
本明細書では、治療有効量のｅｘ  ｖｉｖｏ操作腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がんを処置するための方法であって、ｅｘ  ｖｉｖｏ操作ＴＩＬが、ｅｘ  ｖｉｖｏ操作ＴＩＬにおけるＣＩＳＨタンパク質機能の抑制をもたらすサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子における破壊を含み、破壊が、配列番号６８のガイドポリ核酸が結合した配列において起こる、方法が開示される。場合によって、準備レジメンは、ＴＩＬの投与の約１４日〜約２４時間前の免疫抑制薬の投与を含む。場合によって、準備レジメンは、ＴＩＬの投与の約１０日〜約２４時間前の免疫抑制薬の投与を含む。準備レジメンは、ＴＩＬの投与の約７日〜約２４時間前の免疫抑制薬の投与を含み得る。場合によって、免疫抑制薬は、放射線療法剤、生物学的薬剤または化学薬剤を含む。免疫抑制薬は、化学薬剤を含み得る。化学薬剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロランブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含み得る。化学薬剤は、シクロホスファミドを含み得る。化学薬剤は、フルダラビンであり得る。シクロホスファミドは、対象の約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。シクロホスファミドは、少なくとも約２日間〜約５日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象の約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、少なくとも約７日間〜約１０日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象１ｋｇ当たり約３ｍｇ〜対象１ｋｇ当たり約５ｍｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、１ｋｇ当たり５０ｍｇを超えて投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、１ｋｇ当たり約６０ｍｇで投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２で投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約２５ｍｇ／ｍ２で投与され得る。場合によって、準備レジメンは、部分的または完全免疫抑制を含む。抗真菌薬は、ポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択され得る。抗真菌薬は、アゾールであり得る。アゾールは、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、およびボリコナゾールからなる群から選択され得る。アゾールである抗真菌薬は、フルコナゾールであり得る。場合によって、フルコナゾールは、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇで投与され得る。フルコナゾールは、４００ｍｇで投与され得る。抗真菌薬は、ＴＩＬと同時にまたは逐次投与され得る。抗真菌薬は、ＴＩＬの約０日後〜約４日後に投与され得る。場合によって、抗生物質は、細菌壁ターゲティング剤、細胞膜ターゲティング剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターまたは静菌剤のうちの少なくとも（least）１つを含む。場合によって、抗生物質は、殺菌剤を含む。殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。場合によって、抗生物質は、静菌剤を含む。静菌剤は、予防的に投与され得る。場合によって、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンであり得る。トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンは、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇで投与され得る。場合によって、トリメトプリムは、１６０ｍｇで投与され得る。場合によって、スルファメトキサゾールは、８００ｍｇで投与され得る。場合によって、ペンタミジンは、３００ｍｇで投与され得る。静菌剤は、ＴＩＬの前に、ＴＩＬと同時に、またはＴＩＬの後に投与され得る。静菌剤は、ＴＩＬの投与の約１４日前〜ＴＩＬの投与の約６カ月後に投与され得る。場合によって、静菌剤は、前記ＴＩＬの約８日前〜ＴＩＬの少なくとも４日後に投与され得る。
【０００８】
場合によって、投与は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与を含む。場合によって、免疫抑制薬は、注入によって投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、約６０ｍｇ／ｋｇの用量であり得、２５０ｍｌの５％デキストロース水溶液に希釈され、１時間にわたって注入される。場合によって、フルダラビンは、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおける２５ｍｇ／ｍ２の用量であり得、約１５〜約３０分間にわたって注入され得る。方法は、対象におけるＴＩＬを活性化するのに十分な量の免疫刺激薬を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。免疫刺激薬は、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターまたは免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含み得る。免疫刺激薬は、インターロイキンを含み得る。インターロイキンは、アルデスロイキンであり得、約５５０，０００〜約８００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与され得る。場合によって、アルデスロイキンは、約７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与され得る。場合によって、方法は、対象における感染を防止するのに十分な量の感染予防剤を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。場合によって、感染予防剤は、ヘルペスウイルス予防薬剤であり得る。場合によって、対象は、ＨＳＶ陽性であり得る。場合によって、ヘルペスウイルス予防薬剤は、バラシクロビルまたはアシクロビルであり得る。場合によって、破壊は、ＣＲＩＳＰＲ、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導され得る。系は、ＣＲＩＳＰＲ系であり得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含み得る。エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり得る。場合によって、エンドヌクレアーゼは、破壊を行う。破壊は、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含み得る。破壊は、遺伝子のエクソン中であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約２０塩基対以内であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約１０塩基対以内であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約５塩基対以内であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）から３塩基対であり得る。場合によって、破壊は、配列番号１３のエクソンまたはイントロン中である。破壊は、配列番号１３のエクソン中であり得る。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドポリ核酸を含む。ガイドポリ核酸（polynucleic）は、���列番号６８に対する少なくとも約６０％相同性を含み得る。場合によって、破壊は、二本鎖切断を含む。二本鎖切断は、配列番号７１または配列番号７７で生じ得る。場合によって、ＴＩＬは、細胞約１×１０９個、細胞３×１０９個、細胞１×１０１０個、細胞３×１０１０個〜細胞約１×１０１１個の用量で投与され得る。場合によって、ＴＩＬは、約３０分間にわたって投与され得る。場合によって、ＴＩＬは、静脈内投与され得る。静脈内投与は、注入を含み得る。
【０００９】
場合によって、方法は、ＴＩＬに関する注入前試験を行うステップをさらに含み得る。注入前試験は、表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも１つを含み得る。場合によって、表現型試験は、ＴＩＬにおけるＣＤ３の存在を検出するステップを含む。場合によって、効力試験は、ＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後のＩＦＮγのレベルを検出するステップを含む。場合によって、微生物学的試験は、好気培養、嫌気培養、グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む。エンドトキシン試験は、リムルスアッセイを行うステップを含み得る。場合によって、生存率試験は、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む。場合によって、腫瘍細胞試験は、細胞病理学アッセイを含む。場合によって、注入前試験が微生物学的試験について陰性であり得る場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、前記生存率試験について少なくとも約７０％生細胞を超える場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、表現型試験について少なくとも約８０％ＣＤ３陽性である場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、効力試験においてＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に細胞１０５個当たり少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγである場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、細胞病理学試験において検討された少なくとも約２００個のＴＩＬ当たりで腫瘍細胞について陰性であり得る場合、ＴＩＬは、投与され得る。
【００１０】
本明細書では、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形；および抗真菌剤の剤形を含む治療用製品が開示される。
【００１１】
本明細書では、対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での葉酸合成インヒビターまたは核酸架橋剤の剤形；およびサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形を含む治療用製品が開示される。
【００１２】
本明細書では、ポリエン、アゾール、アリルアミンまたはエキノキャンディンから選択される抗真菌剤の剤形；およびサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形を含む治療用製品が開示される。
【００１３】
本明細書では、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形を含む治療用製品が開示され、ＴＩＬは、約７．０×１０７細胞／ｍＬ〜約２．０×１０８細胞／ｍＬの凍結密度で凍結保存されている。
【００１４】
本明細書では、抗真菌剤の剤形；免疫抑制薬の剤形；抗生物質の剤形；およびサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の剤形を含む治療用製品が開示される。場合によって、治療用製品は、免疫抑制薬の剤形をさらに含み得る。免疫抑制薬は、ＴＩＬの投与の約１４日〜約２４時間前の対象への投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬は、ＴＩＬの投与の約１０日〜約２４時間前の対象への投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬は、ＴＩＬの投与の約７日〜約２４時間前の対象への投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬は、放射線療法剤、生物学的薬剤または化学薬剤を含む。場合によって、免疫抑制薬は、化学薬剤を含む。場合によって、化学薬剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。場合によって、化学薬剤は、シクロホスファミドを含む。場合によって、化学薬剤は、フルダラビンを含む。場合によって、シクロホスファミドは、対象の約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、少なくとも約２日間〜約５日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象の約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、少なくとも約７日間〜約１０日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象１ｋｇ当たり約３ｍｇ〜対象１ｋｇ当たり約５ｍｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、１ｋｇ当たり５０ｍｇを超えて投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、１ｋｇ当たり約６０ｍｇで投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２で投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約２５ｍｇ／ｍ２で投与され得る。場合によって、免疫抑制薬は、部分的または完全免疫抑制を生じる。場合によって、抗真菌剤の剤形は、ポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択され得る。場合によって、抗真菌剤は、アゾールであり得る。アゾールは、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、および、ボリコナゾールからなる群から選択され得る。場合によって、アゾールは、フルコナゾールであり得る。場合によって、フルコナゾールは、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇの量で存在し得る。場合によって、フルコナゾールは、４００ｍｇの量で存在し得る。場合によって、抗真菌薬の剤形は、ＴＩＬと同時にまたは逐次投与され得る。抗真菌薬の剤形は、ＴＩＬの約０日後〜約４日後に投与され得る。場合によって、治療用製品は、抗生物質の剤形をさらに含み得る。抗生物質は、細菌壁ターゲティング剤、細胞膜ターゲティング剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターおよび静菌剤のうちの少なくとも１つを含み得る。場合によって、抗生物質は、殺菌剤を含む。殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。場合によって、抗生物質の剤形は、静菌剤であり得る。静菌剤は、予防的投与のために製剤化され得る。場合によって、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンであり得る。場合によって、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンは、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの量で存在し得る。場合によって、トリメトプリムは、１６０ｍｇの量で存在し得る。場合によって、スルファメトキサゾールは、８００ｍｇの量で存在し得る。場合によって、ペンタミジンは、３００ｍｇの量で存在し得る。場合によって、静菌剤は、ＴＩＬの前に、ＴＩＬと同時に、またはＴＩＬの後に投与され得る。場合によって、静菌剤は、前記ＴＩＬの前記投与の約１４日前〜前記ＴＩＬの前記投与の約６カ月後に投与され得る。場合によって、静菌剤は、前記ＴＩＬの約８日前〜前記ＴＩＬの少なくとも４日後に投与され得る。治療用製品は、剤形の投与をさらに含み得る。
【００１５】
治療用製品は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与による投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬の剤形は、注入による投与のために製剤化され得る。場合によって、シクロホスファミドは、約６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得、２５０ｍｌの５％デキストロース水溶液に希釈され、１時間にわたって注入される。場合によって、フルダラビンは、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおける２５ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得、約１５〜約３０分間にわたって注入され得る。場合によって、免疫刺激薬は、対象におけるＴＩＬを活性化するのに十分な量で存在し得る。免疫刺激薬は、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターおよび免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。場合によって、免疫刺激薬の剤形は、インターロイキンを含む。インターロイキンは、アルデスロイキンであり得、約５５０，０００〜約８００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与され得る。場合によって、アルデスロイキンは、約７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与され得る。場合によって、治療用製品は、対象における感染を防止するのに十分な量での感染予防剤の剤形をさらに含み得る。感染予防剤は、ヘルペスウイルス予防薬剤であり得る。ヘルペスウイルス予防薬剤は、ＨＳＶ陽性対象の処置に有効な（effect）量で存在し得る。場合によって、ヘルペスウイルス予防薬剤は、バラシクロビルまたはアシクロビルであり得る。場合によって、破壊は、ＣＲＩＳＰＲ、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導され得る。系は、ＣＲＩＳＰＲ系であり得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含み得る。場合によって、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり得る。エンドヌクレアーゼは、破壊を行うことができる。破壊は、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含み得る。場合によって、破壊は、遺伝子のエクソン中であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約２０塩基対以内であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約１０塩基対以内であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の約５塩基対以内であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）から３塩基対であり得る。場合によって、破壊は、配列番号１３のエクソンまたはイントロン中であり得る。場合によって、破壊は、配列番号１３のエクソン中であり得る。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドポリ核酸を含む。ガイドポリ核酸（polynucleic）は、配列番号６８に対する少なくとも約６０％相同性を含み得る。破壊は、二本鎖切断を含み得る。場合によって、二本鎖切断は、配列番号７１または配列番号７７に発生する。場合によって、ＴＩＬは、細胞約１×１０９個、細胞３×１０９個、細胞１×１０１０個、細胞３×１０１０個〜細胞約１×１０１１個の量で存在し得る。場合によって、ＴＩＬは、約３０分間にわたって投与され得る。場合によって、ＴＩＬは、静脈内投与され得る。静脈内投与は、注入を含み得る。場合によって、治療用製品は、ＴＩＬに関する注入前試験を行うことをさらに含み得る。場合によって、注入前試験は、表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、表現型試験は、前記ＴＩＬにおけるＣＤ３の存在を検出するステップを含む。場合によって、効力試験は、ＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後にＩＦＮγのレベルを検出するステップを含む。場合によって、微生物学的試験は、好気培養、嫌気培養、グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む。場合によって、エンドトキシン試験は、リムルスアッセイを行うステップを含む。場合によって、生存率試験は、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む。場合によって、腫瘍細胞試験は、細胞病理学アッセイを含む。場合によって、注入前試験が、前記微生物学的試験について陰性である場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、生存率試験について少なくとも約７０％超の生細胞を有する場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、表現型試験について少なくとも約８０％ＣＤ３陽性である場合、ＴＩＬは、投与され得る。注入前試験が、効力試験においてＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に細胞１０５個当たり少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγである場合、ＴＩＬは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、細胞病理学試験において検討された少なくとも約２００個のＴＩＬ当たりで腫瘍細胞について陰性であり得る場合、ＴＩＬは、投与され得る。
【００１６】
本明細書では、配列番号６４〜配列番号６９のいずれか１つに対する少なくとも６０％配列相同性を含む核酸組成物が開示される。場合によって、配列相同性は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大約１００％であり得る。
【００１７】
本明細書では、がんなどの状態を処置する方法であって、腫瘍試料から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を得るステップと、変異反応性ＴＩＬを同定するステップと、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼにより内因性遺伝子またはその部分を破壊するステップとを含む方法が開示される。場合によって、腫瘍試料は、シーケンシング解析にかけることができる。場合によって、シーケンシング解析は、腫瘍試料に存在し、非腫瘍試料には存在しない変異を同定する。場合によって、シーケンシング解析は、全エクソームシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング、またはこれらの組合せを含み得る。シーケンシング解析は、全エクソームシーケンシングであり得る。
【００１８】
場合によって、同定は、変異を含むペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＴＩＬの導入を含み得る。場合によって、同定は、変異を含むペプチドを発現するＡＰＣに導入されたＴＩＬによって分泌されたインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の存在の検出をさらに含み得る。ペプチドは、約１５ｍｅｒ〜最大約３０ｍｅｒの長さを含み得る。ペプチドは、２５ｍｅｒの長さを含み得る。場合によって、同定は、変異を含むポリ核酸を電気穿孔された抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＴＩＬの導入を含み得る。
【００１９】
場合によって、同定は、ＡＰＣに導入されたＴＩＬによって分泌されたインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の存在の検出をさらに含み得る。破壊は、ＴＩＬのゲノムにおける二本鎖切断を含み得る。二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって行われ得る。場合によって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択され得る。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり得る。
【００２０】
場合によって、方法は、ＴＩＬを拡大するステップをさらに含み得る。ＴＩＬは、ヒトであり得る。方法は、抗真菌薬を対象に投与するステップをさらに含み得る。方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含み得る。
【００２１】
本明細書では、それを必要とする対象における消化器がんを処置する方法であって、それを必要とする対象の消化器腫瘍試料から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を得るステップと、変異反応性ＴＩＬを同定するステップと、前記変異反応性ＴＩＬにおいてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによりＣＩＳＨ遺伝子を破壊するステップと、１×１０９〜約２×１０１１の用量まで前記ＴＩＬを拡大するステップとを含み、前記消化器腫瘍試料を、エクソームシーケンシングして、前記腫瘍試料に存在し、健康組織試料には存在しない変異を同定し、前記同定するステップが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面における前記変異の提示、およびＩＦＮ−γのレベルを検出するための前記ＡＰＣと前記ＴＩＬとの培養を含む、方法が開示される。場合によって、提示は、変異を含むポリ核酸を電気穿孔された抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴＩＬとの培養を含み得る。場合によって、提示は、変異を含むペプチドをパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴＩＬとの培養を含み得る。サイトカインは、変異反応性ＴＩＬにおいて検出され得、非変異反応性ＴＩＬにおいては検出され得ない。サイトカインは、非変異反応性ＴＩＬにおけるものよりも高レベルで変異反応性ＴＩＬにおいて検出され得る。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり得る。ＴＩＬは、Ｔ細胞であり得る。
【００２２】
本発明の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において詳細に明示される。本発明の原理が用いられる例示的な実施形態と、付属の図面とを明示する、以下の詳細な記載を参照することにより、本発明の特色および利点のよりよい理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼプラスミド、ＨＰＲＴ  ｇＲＮＡプラスミド、Ａｍａｘａ  ＥＧＦＰｍａｘプラスミド、およびＨＰＲＴ標的ベクターを含む、４つのプラスミドの構造を示す。
【００２４】
【図２】図２は、潜在的な標的部位において、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡにより生じる遺伝子改変の％を示す。
【００２５】
【図３】図３は、刺激Ｔ細胞内のＣＲＩＳＰＲ誘導性ＤＳＢを示す。
【００２６】
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ガイドＲＮＡのトランスフェクション後６日目における、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−２、またはＣＣＲ５、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４の発現を示す。代表的ガイド：ＰＤ−１（Ｐ２、Ｐ６、Ｐ２／６）、ＣＴＬＡ−４（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ２／３）、またはＣＣＲ５（ＣＣ２）である。Ａは、阻害性受容体の発現パーセントを示す。Ｂは、対照ガイドＲＮＡに対して正規化した、阻害性受容体の発現を示す。
【００２７】
【図５】図５Ａは、非染色の、ガイドを伴わない対照と比較した、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＣＴＬＡ−４特異的ガイドＲＮＡである、ガイド＃２および＃３の電気穿孔の後における、初代ヒトＴ細胞内のＣＴＬＡ−４の発現を示す。図５Ｂは、非染色の、ガイドを伴わない対照と比較した、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＰＤ−１特異的ガイドＲＮＡである、ガイド＃２および＃６の電気穿孔の後における、初代ヒトＴ細胞内のＰＤ−１の発現を示す。
【００２８】
【図６】図６は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにマルチプレックス化させたＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡおよびＰＤ−１ガイドＲＮＡの電気穿孔の後における、初代ヒトＴ細胞内のＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の発現についてのＦＡＣＳ結果を示す。
【００２９】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＲＩＳＰＲによる処置後における、初代ヒトＴ細胞内の二重ノックアウトパーセントを示す。図７Ａは、ＣＴＬＡ−４ガイド＃２、＃３、＃２および＃３、ＰＤ−１ガイド＃２およびＣＴＬＡ−４ガイド＃２、ＰＤ−１ガイド＃６およびＣＴＬＡ−４ガイド＃３で処置したＴ細胞内の、ＣＴＬＡ−４ノックアウトパーセントであって、Ｚａｐのみ、Ｃａｓ９のみ、および全てのガイドＲＮＡ対照と比較したノックアウトパーセントを示す。図７Ｂは、ＰＤ−１ガイド＃２、ＰＤ−１ガイド＃６、ＰＤ−１ガイド＃２および＃６、ＰＤ−１ガイド＃２およびＣＴＬＡ−４ガイド＃２、ＰＤ−１ガイド＃６およびＣＴＬＡ−４ガイド＃３で処置したＴ細胞内の、ＰＤ−１ノックアウトパーセントであって、Ｚａｐのみ、Ｃａｓ９のみ、および全てのガイドＲＮＡ対照と比較したノックアウトパーセントを示す。
【００３０】
【図８】図８は、ＣＲＩＳＰＲ、およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはこれらの組合せに特異的なガイドＲＮＡの電気穿孔後における、Ｔ細胞の生存率を示す。
【００３１】
【図９】図９は、ＰＤ−１ガイドＲＮＡのみを導入する条件下、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、またはＣＣＲ５ガイドＲＮＡ、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ、およびＣＬＴＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、Ｚａｐのみによる対照条件下、またはｇＲＮＡのみによる対照条件下における、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ＃２、＃６、＃２および＃６による切断を示す、ＣＥＬ−Ｉアッセイの結果を示す。
【００３２】
【図１０】図１０は、ＣＬＴＡ−４ガイドＲＮＡのみを導入する条件下、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、またはＣＣＲ５ガイドＲＮＡ、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ、およびＣＬＴＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、Ｚａｐのみによる対照条件下、またはｇＲＮＡのみによる対照条件下における、ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡ＃２、＃３、＃２および＃３による切断を示す、ＣＥＬ−Ｉアッセイの結果を示す。
【００３３】
【図１１】図１１は、Ｚａｐのみによる対照条件下、Ｃａｓ９のみによる対照条件下、またはガイドＲＮＡのみによる対照条件下と比較した、ＣＣＲ５ガイドＲＮＡを導入する条件下、ＣＣＲ５ガイドＲＮＡ、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ、またはＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下における、ＣＣＲ５ガイドＲＮＡ＃２による切断を示す、ＣＥＬ−Ｉアッセイの結果を示す。
【００３４】
【図１２】図１２は、２’Ｏ−メチルＲＮＡ修飾を伴う、最適化されたＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、５マイクログラムおよび１０マイクログラムで用いる、初代ヒトＴ細胞内の、ＴＣＲアルファのノックアウトであって、ＦＡＣＳにおけるＣＤ３の発現により測定されるノックアウトを示す。
【００３５】
【図１３】図１３は、ＣＲＩＳＰＲ、およびＣＴＬＡ−４へのガイドＲＮＡによる処置後における、Ｔ細胞の生存率および表現型を測定する方法を示す。表現型は、正常ＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルを呈する処置細胞の頻度であって、電気穿孔単独による対照の頻度に対して正規化された頻度を定量化することにより測定した。生存率はまた、ＦＳＣ／ＳＳＣゲートをかけた集団内の細胞による、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅの除外によっても測定した。Ｔ細胞表現型は、ＣＤ３およびＣＤ６２Ｌにより測定する。
【００３６】
【図１４】図１４は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＰＤ−１へのガイドＲＮＡ、ならびにＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４へのガイドＲＮＡによる処置後における、Ｔ細胞の生存率および表現型を測定する方法を示す。表現型は、正常ＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルを呈する処置細胞の頻度であって、電気穿孔単独による対照の頻度に対して正規化された頻度を定量化することにより測定した。生存率はまた、ＦＳＣ／ＳＳＣゲートをかけた集団内の細胞による、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅの除外によっても測定した。Ｔ細胞表現型は、ＣＤ３およびＣＤ６２Ｌにより測定する。
【００３７】
【図１５】図１５は、初代ヒトＴ細胞およびＪｕｒｋａｔ対照への、ＰＤ−１ガイドＲＮＡまたはＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡのトランスフェクション後４日目における、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を検出する、Ｔ７Ｅ１アッセイの結果を示す。ＮＮとは、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼを伴わない対照である。
【００３８】
【図１６】図１６は、ＴＩＤＥ（tracking  of  indels  by  decomposition）解析の結果を示す。遺伝子編集効率パーセントを、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡについて示す。
【００３９】
【図１７】図１７は、単一のガイドのトランスフェクションについての、ＴＩＤＥ（tracking  of  indels  by  decomposition）解析の結果を示す。欠失または挿入を伴う配列のパーセントを、ＰＤ−１ガイドＲＮＡまたはＣＴＬＡ−１ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした初代ヒトＴ細胞について示す。
【００４０】
【図１８】図１８は、二重ターゲティングによるＰＤ−１配列の欠失を示す。
【００４１】
【図１９】図１９は、二重ターゲティングによるＰＤ−１配列の欠失についての、ＰＣＲ産物のシーケンシング結果を示す。試料６および１４は、介在する１３５ｂｐを切り出した、２つのｇＲＮＡ配列の融合体により示される。
【００４２】
【図２０】図２０は、二重ターゲティングによるＣＴＬＡ−４配列の欠失を示す。二重ガイドによりターゲティングされたＣＴＬＡ−４のシーケンシングにおいてもまた、２つのガイドＲＮＡ配列間の欠失が存在する（試料９および１４）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、ＰＣＲによる欠失を確認する。
【００４３】
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後における、ＣＴＬＡ−４陽性ヒトＴ細胞についてのＣＴＬＡ−４  ＦＡＣＳ解析を示す。Ｂは、抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後における、ヒトＴ細胞内の、パルス対照と比べた、ＣＴＬＡ−４ノックアウト効率を示す。
【００４４】
【図２２】図２２は、ＣＩＳＨ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、およびＡＡＶＳ１のための修飾ｓｇＲＮＡを示す。
【００４５】
【図２３】図２３Ａは、抗ＰＤ−１  ＣＲＩＳＰＲ系のトランスフェクション後における、ＰＤ−１の発現パーセントを示す。図２３Ｂは、Ｃａｓ９のみによる対照と比較した、ＰＤ−１ノックアウト効率パーセントを示す。
【００４６】
【図２４】図２４は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡをトランスフェクトした、ＣＴＬＡ−４染色ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳ解析による定量化データを示す。トランスフェクション後６日目における、ＣＴＬＡ−４の発現パーセントおよびノックアウトパーセントについてのデータを示す。
【００４７】
【図２５】図２５は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡをトランスフェクトした、ＰＤ−１染色ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳ解析を示す。トランスフェクション後１４日目における、ＰＤ−１の発現（抗ヒトＣＤ２７９  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）についてのデータを示す。
【００４８】
【図２６】図２６は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞についての、Ｃａｓ９のみによる対照と比較した、ＰＤ−１の発現パーセントおよびＰＤ−１のノックアウトパーセントを示す。
【００４９】
【図２７】図２７は、ＣＲＩＳＰＲ、抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡ、および抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞の、１４日目における細胞数および生存率を示す。
【００５０】
【図２８】図２８は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびに抗ＰＤ−１ガイド＃２単独、抗ＰＤ−１ガイド＃２および＃６、または抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃３単独の電気穿孔後１４日目における、ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳデータを示す。操作Ｔ細胞を、４８時間にわたり再刺激して、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の発現について評価し、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔した対照細胞と比較した。
【００５１】
【図２９】図２９は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびに抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃２および＃３、抗ＰＤ−１ガイド＃２および抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃３、または抗ＰＤ−１ガイド＃２および＃６、抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃３および＃２の電気穿孔後１４日目における、ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳデータを示す。操作Ｔ細胞を、４８時間にわたり再刺激して、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の発現について評価し、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔した対照細胞と比較した。
【００５２】
【図３０】図３０は、初代ヒトＴ細胞内のＣＩＳＨ遺伝子座の、ＣＲＩＳＰＲを媒介する遺伝子改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を示す。
【００５３】
【図３１】図３１は、体細胞の変異負荷が、腫瘍型間で変動することを示す。腫瘍特異的ネオ抗原の作製および提示は理論的に、変異負荷と正比例する。
【００５４】
【図３２】図３２は、核酸に対して施し得る、シュードウリジン−５’−三リン酸修飾および５−メチルシチジン−５−三リン酸修飾を示す。
【００５５】
【図３３】図３３は、ＣＲＩＳＰＲおよびＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ１、３、４、５、または６をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞についての、密度測定解析の二連の実験を示す。
【００５６】
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、ＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ  １についての二連のＴＩＤＥ解析を示す。
【００５７】
【図３５】図３５Ａおよび３５Ｂは、ＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ  ３についての二連のＴＩＤＥ解析を示す。
【００５８】
【図３６】図３６Ａおよび３６Ｂは、ＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ  ４についての二連のＴＩＤＥ解析を示す。
【００５９】
【図３７】図３７Ａおよび３７Ｂは、ＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ  ５についての二連のＴＩＤＥ解析を示す。
【００６０】
【図３８】図３８Ａおよび３８Ｂは、ＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ  ６についての二連のＴＩＤＥ解析を示す。
【００６１】
【図３９】図３９は、初代Ｔ細胞内のＣＲＩＳＰＲノックアウト後における、ＣＩＳＨタンパク質の喪失を示すウェスタンブロットを示す。
【００６２】
【図４０】図４０Ａおよび４０Ｂは、ヒトＴＩＬの刺激前および刺激後における絶対細胞数を示す。図４０Ａは、刺激前および刺激後における、ＲＰＭＩ培地中またはｅｘ  ｖｉｖｏ培地中で培養された、第１のドナーの細胞数を示す。図４０Ｂは、刺激前および刺激後における、ＲＰＭＩ培地中で培養された、第２のドナーの細胞数を示す。
【００６３】
【図４１】図４１Ａおよび４１Ｂは、ＰＤ−１遺伝子座をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系を電気穿孔したヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または対照細胞の細胞拡大を示す。図４１Ａは自家フィーダーの添加を伴う拡大を示し、図４１Ｂは、自家フィーダーの添加を伴わない拡大を示す。
【００６４】
【図４２】図４２は、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＴＩＬの産生を示す。インターロイキン２で拡大したＴＩＬを、固定化された抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８と共に４日間インキュベーションすることによって刺激する。０日目にＴＩＬを回収し、ＣＩＳＨをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬を電気穿孔によって送達する。電気穿孔後、修飾されたＴＩＬを、後続の急速拡大のために放射線照射した末梢血単核細胞フィーダーおよびＩＬ−２の存在下でＧ−Ｒｅｘフラスコに移す。最初の細胞計数中および（＋）７日目における継代培養の際、細胞の少量のアリコートを回収して、シーケンシングにより挿入／欠失（インデル）頻度を決定する。その後、ＴＩＬを（＋）１４日目に採取し、この時点で品質管理評価のために試料を得、その後、注入準備済みバッグ内で凍結保存する。
【図４３】図４３Ａ、４３Ｂ、および４３Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後のＣＩＳＨ遺伝子座のＴｉＤＥ解析を示す。１４日間の急速拡大の後、ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＤＣＤ１およびＣＩＳＨ内のＣＲＩＳＰＲ標的領域に関してＰＣＲを行った。ＰＣＲアンプリコンをＴｉＤＥ解析にかけた。プロットは、対象ＰＶ１、ＰＶ２、およびＰＶ３に関する、喪失または獲得された塩基対におけるそれらのサイズに基づくインデルの総頻度ならびに挿入および欠失の分布を指し示す。
【００６５】
【図４４】図４４は、対象ＰＶ１、ＰＶ２、およびＰＶ３に関する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後のＣＩＳＨ遺伝子座のＴｉＤＥ解析の概要を示す。
【００６６】
【図４５】図４５Ａおよび４５Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後のＣＩＳＨタンパク質発現の喪失を示す。電気穿孔の１４日後、ＣＩＳＨ発現を誘導するため、４８時間にわたってＰＢ  Ｔ細胞およびＴＩＬを再刺激したか、または再刺激しなかった。対照は、細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を与えなかったことを指し示す。Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと、ＣＩＳＨ遺伝子座のエクソン３をターゲティングするようにデザインされたｇＲＮＡとを与えた細胞を指し示す。
【００６７】
【図４６】図４６Ａ、４６Ｂ、および４６Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ編集後のＴ細胞の増殖および生存率を示す。図４６Ａは、電気穿孔後６日目の生存率を示す。図４６Ｂは、３×１０６個の細胞から始めた電気穿孔後１２日目の総細胞数を示す。細胞＝操作なし、ＺＡＰ＝電気穿孔のみである。図４６Ｃは、各条件で３×１０６個の細胞から始めた標準的な組織培養フラスコにおける１１日間にわたるＴＩＬの総細胞数を示す。
【００６８】
【図４７】図４７Ａおよび４７Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集されたＴ細胞およびＴＩＬにおけるサイトカイン産生のＳＰＩＣＥプロットを示す。電気穿孔の１４日後、プレートに結合した抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８抗体を使用してＴ細胞およびＴＩＬを再刺激し、細胞内染色およびフローサイトメトリーによってサイトカイン産生についてアッセイした。
【００６９】
【図４８】図４８Ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後のＰＤ−１タンパク質発現の喪失を示す。電気穿孔の１４日後、ＰＤ−１発現を誘導するため、７２時間にわたって末梢血Ｔ細胞またはＴＩＬを再刺激した。再刺激されたＴ細胞におけるＰＤ−１発現である。図４８Ｂは、再刺激されたＴＩＬにおけるＰＤ−１発現を示す。喪失パーセントは赤色で示されている。
【００７０】
【図４９】図４９は、対照およびＣＩＳＨが修飾された腫瘍浸潤リンパ球の絶対細胞数を示す。
【００７１】
【図５０】図５０Ａは、ＩＬ−２の存在下で培養した７日目の対照およびＣＩＳＨノックアウトＴＩＬを示す。図５０Ｂは、ＩＬ−２の非存在下で培養した７日目の対照およびＣＩＳＨノックアウトＴＩＬを示す。
【００７２】
【図５１】図５１Ａは、ＰＤＣＤ１のオフターゲット部位を示す。図５１Ｂは、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによって同定されたＣＩＳＨ  ｇＲＮＡを示す。
【００７３】
【図５２】図５２は、ＧＵＩＤＥ−ＳｅｑおよびＧＭＰ  ＰＱの製造試行でのＣＩＳＨ遺伝子座におけるターゲティングされたインデルの頻度を示す（ｎｓ、Ｐ＝０．９３）。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
開示の詳細な説明
以下の記載および実施例は、本発明の実施形態を詳細に例示する。本発明は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって変化し得ることを理解されたい。当業者は、その範囲内に包含される本発明の多数の変形および改変が存在することを認識するであろう。
定義
【００７５】
本明細書で使用される基準数値およびその文法的同等物に関する、「約」という用語およびその文法的同等物は、その値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９〜１１の量を含む。基準数値に関する「約」という用語はまた、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％の範囲の値も含み得る。
【００７６】
本明細書で使用される「活性化」という用語およびその文法的同等物は、細胞が、休眠状態から、活性状態へと移行する過程を指す場合がある。この過程は、抗原への応答、遊走、および／または機能的活性状態への、表現型もしくは遺伝子的変化を含み得る。例えば、「活性化」という用語は、Ｔ細胞活性化の段階的過程を指す場合がある。例えば、Ｔ細胞は、完全に活性化するのに、少なくとも２つのシグナルを要求し得る。第１のシグナルは、抗原−ＭＨＣ複合体の、ＴＣＲへの会合の後で生じることが可能であり、第２のシグナルは、共刺激性分子の会合により生じ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、抗ＣＤ３は、第１のシグナルを模倣することが可能であり、抗ＣＤ２８は、第２のシグナルを模倣し得る。
【００７７】
本明細書で使用される「隣接する」という用語およびその文法的同等物は、基準の対象物のすぐ隣を指す場合がある。例えば、ヌクレオチド配列の文脈における隣接するという用語は、間にヌクレオチドを伴わないことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドＢと隣接するポリヌクレオチドＡとは、ＡとＢとの間にヌクレオチドを伴わないＡＢを意味し得る。
【００７８】
本明細書で使用される「抗原」という用語およびその文法的同等物は、１または複数の受容体が結合することが可能な、１または複数のエピトープを含有する分子を指す場合がある。例えば、抗原は、宿主の免疫系を刺激して、抗原が提示されている場合の、細胞性の抗原特異的免疫応答をもたらす場合もあり、体液性抗体応答をもたらす場合もある。抗原はまた、それ自体により、または別の分子と組み合わせて存在する場合に、細胞性応答および／または体液性応答を誘発する能力も有し得る。例えば、腫瘍細胞抗原は、ＴＣＲにより認識され得る。ネオ抗原など、抗原は、変異負荷が大きな腫瘍と関連し得る（図３１）。
【００７９】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語およびその文法的同等物は、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または操作細胞により認識され得る、抗原の一部を指す場合がある。例えば、エピトープは、ＴＣＲにより認識されるがんエピトープであり得る。また、抗原内の複数のエピトープも認識することができる。エピトープはまた、変異している場合もある。
【００８０】
本明細書で使用される「自家」という用語およびその文法的同等物は、同じ存在に由来することを指す場合がある。例えば、試料（例えば、細胞）を採取し、加工し、後に同じ対象（例えば、患者）へと戻すことができる。自家工程は、ドナーとレシピエントとが異なる対象である、同種工程と区別される。
【００８１】
本明細書で使用される「がん」という用語およびその文法的同等物は、細胞の過剰増殖であって、その固有の形質（正常な制御の喪失）が、調節されていない増殖、分化の欠如、限局的な組織浸潤、および転移を結果としてもたらす過剰増殖を指す場合がある。本発明の方法との関連で、がんは、急性リンパ球がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、眼がん、肝臓内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢がん、または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、または中耳がん、口腔がん、外陰がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化器がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、マスト細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜がん、網がん、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固体腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および／または膀胱がんのうちのいずれかを含む、任意のがんであり得る。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、細胞または組織の異常な増殖であって、例えば、悪性型または良性型の増殖を指す。
【００８２】
本明細書で使用される「がんネオ抗原」または「ネオ抗原」または「ネオエピトープ」という用語およびその文法的同等物は、正常な、変異していない宿主のゲノム内ではコードされない抗原を指す場合がある。「ネオ抗原」は、場合によって、腫瘍形成性のウイルスタンパク質、または体細胞変異の帰結として発生する異常なタンパク質を表し得る。例えば、ネオ抗原は、ウイルスタンパク質の活性を介する、細胞機構の破壊により発生し得る。別の例は、場合によって、体細胞変異をもたらし得る、発がん性化合物への曝露であり得る。この体細胞変異は最終的に、腫瘍／がんの形成をもたらし得る。
【００８３】
本明細書で使用される「細胞傷害作用」という用語は、細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変更を指す。細胞の正常状態とは、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態への細胞の曝露の前に顕在化されるかまたは存在する状態を指す場合がある。一般に、正常状態にある細胞とは、ホメオスタシスにある細胞である。細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変更は、例えば、細胞死（例えば、プログラム細胞死）、複製の潜在能の減殺、膜の完全性などの細胞の完全性の減殺、代謝活性の減殺、発生能の減殺、または本出願で開示される細胞傷害作用のうちのいずれかの形態で顕在化され得る。
【００８４】
「細胞傷害作用を低減すること」または「細胞傷害作用を低減する」という語句は、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態への曝露時における、細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変更の程度または頻度の低減を指す。語句は、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態へと曝露された個々の細胞内の細胞傷害作用の程度を低減することを指す場合もあり、細胞集団を、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態へと曝露した場合に、細胞傷害作用を呈する集団の細胞数を低減することを指す場合もある。
【００８５】
本明細書で使用される「操作された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の、１または複数の変更を指す場合がある。「操作された」という用語は、遺伝子の変更、付加、および／または欠失を指す場合がある。操作細胞とはまた、遺伝子を付加し、欠失させ、かつ／または変更した細胞も指す場合がある。
【００８６】
本明細書で使用される「細胞」または「操作細胞」という用語およびこれらの文法的同等物は、ヒト由来の細胞を指す場合もあり、非ヒト動物由来の細胞を指す場合もある。
【００８７】
本明細書で使用される「チェックポイント遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、免疫応答の振幅を調節するように作用する阻害性過程（例えば、フィードバックループ）、例えば、有害な応答の、制御されない伝播を緩和させる、免疫阻害性フィードバックループに関与する、任意の遺伝子を指す場合がある。これらの応答は、感染症に対する免疫応答時に生じ得る付帯的な組織損傷に対して防御する分子シールド、および／または末梢における自己寛容の維持への寄与を含み得る。チェックポイント遺伝子の非限定的な例は、拡張ＣＤ２８ファミリーの受容体のメンバーおよびそれらのリガンド、ならびに共阻害性経路（例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）に関与する遺伝子を含み得る。「チェックポイント遺伝子」という用語はまた、免疫チェックポイント遺伝子を指す場合がある。
【００８８】
「ＣＲＩＳＰＲ」、「ＣＲＩＳＰＲ系」、または「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系」、およびこれらの文法的同等物は、ＤＮＡに結合する非コードＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）と、ヌクレアーゼの機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を伴うＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）とを含み得る。例えば、Sander,  J.D.ら、「CRISPR-Cas  systems  for  editing,  regulating  and  targeting  genomes」、Nature  Biotechnology、３２巻：３４７〜３５５頁（２０１４年）を参照されたい。例えば、Hsu,  P.D.ら、「Development  and  applications  of  CRISPR-Cas9  for  genome  engineering」、Cell、１５７巻（６号）：１２６２〜１２７８頁（２０１４年）もまた、参照されたい。
【００８９】
本明細書で使用される「〜を破壊すること」という用語およびその文法的同等物は、例えば、切断、欠失、挿入、変異、再配列またはこれらの任意の組合せにより遺伝子を改変または変更する工程を指す場合がある。破壊は、タンパク質発現のノックアウトまたはノックダウンをもたらす場合がある。ノックアウトは、完全または部分的ノックアウトであり得る。例えば、遺伝子は、ノックアウトまたはノックダウンにより破壊することができる。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を部分的に低減することの場合もあり、これを完全に抑制することの場合もある。遺伝子の破壊はまた、異なる遺伝子、例えば、下流における遺伝子の活性化も引き起こし得る。一部の実施形態では、「〜を破壊すること」という用語は、抑制すること、妨害すること、または操作することなどの用語と互換的に使用することができる。
【００９０】
本明細書で使用される「機能」という用語およびその文法的同等物は、意図される目的を果たすか、有するか、またはこれに適う能力を指す場合がある。「機能的」とは、正常機能の、ベースラインから１００％までの任意のパーセントを含み得る。例えば、機能的とは、正常機能の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０，５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および／もしくは１００％を含み得るか、またはほぼこれらの比率を含み得る。場合によって、機能的という用語は、正常機能の１００％またはほぼ１００％を超える、例えば、正常機能の１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００％、および／もしくはこれを上回ることを意味し得る。
【００９１】
本明細書で使用される「遺伝子編集」という用語およびその文法的同等物は、ゲノムにおいて、１または複数のヌクレオチドを挿入するか、置き換えるか、または除去する遺伝子操作を指す場合がある。遺伝子編集は、ヌクレアーゼ（例えば、天然で存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使用して実施することができる。
【００９２】
本明細書で使用される「変異」という用語およびその文法的同等物は、ポリヌクレオチド内の、１または複数のヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）配列内またはポリペプチド配列内で、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多い、ヌクレオチド／アミノ酸を、置換し、欠失させ、かつ／または挿入することができる。変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼし得る。変異はまた、ゲノム配列構造、またはコードされるｍＲＮＡの構造／安定性にも影響を及ぼし得る。
【００９３】
本明細書で使用される「非ヒト動物」という用語およびその文法的同等物は、ヒト以外の全ての動物種であって、天然動物の場合もあり、遺伝子改変された非ヒト動物の場合もある、非ヒト哺乳動物を含む動物種を含み得る。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語、ならびにこれらの文法的同等物は、互換的に使用することができ、直鎖状コンフォメーションまたは環状コンフォメーションにあり、一本鎖形態または二本鎖形態にある、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し得る。本開示の目的では、これらの用語は、長さに関して限定的とはみなされるべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの類似体のほか、塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドも包含し得る。用語の変化形はまた、脱メチル化、ＣｐＧメチル化の付加、細菌性メチル化の除去、および／または哺乳動物性メチル化の付加も包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し得る、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対であり得る。
【００９４】
本明細書で使用される「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）という用語およびその文法的同等物は、血液（例えば、末梢血）中を循環するリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球とは、臓器へと局在化しないリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【００９５】
本明細書で使用される「表現型」という用語およびその文法的同等物は、生物の観察可能な特徴または形質の複合物であって、その形状、発生、生化学的特性または生理学的特性、生物季節学、挙動、および挙動の結果などの複合物を指す場合がある。文脈に応じて、「表現型」という用語は、ある場合には、集団の観察可能な特徴または形質の複合物を指す。
【００９６】
本明細書で使用される「プロトスペーサー」という用語およびその文法的同等物は、ＰＡＭに隣接する核酸配列であって、ガイドＲＮＡのスペーサー配列または操作されたターゲティング部分など、ガイドＲＮＡの部分にハイブリダイズすることが可能な核酸配列を指す場合がある。プロトスペーサーは、遺伝子内、ゲノム内、または染色体内のヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡにターゲティングされるヌクレオチド配列であり得る。天然状態では、プロトスペーサーは、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と隣接する。ＲＮＡにガイドされるヌクレアーゼの切断部位は、プロトスペーサー配列内にある。例えば、ガイドＲＮＡが、特異的プロトスペーサーをターゲティングする場合、Ｃａｓタンパク質は、プロトスペーサー配列内で二本鎖切断を生じ、これにより、プロトスペーサーを切断するであろう。切断後、プロトスペーサーの破壊は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）を結果としてもたらし得る。プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーの欠失を結果としてもたらし得る。加えて、または代替的に、プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーへと挿入されるか、またはこれを置き換える外因性核酸配列を結果としてもたらし得る。
【００９７】
本明細書で使用される「レシピエント」という用語およびその文法的同等物は、ヒトまたは非ヒト動物を指す場合がある。レシピエントはまた、それを必要とするレシピエントでもあり得る。
【００９８】
本明細書で使用される「組換え」という用語およびその文法的同等物は、２つのポリ核酸の間の遺伝情報の交換過程を指す場合がある。本開示の目的では、「相同組換え」または「ＨＲ」とは、例えば、二本鎖切断の修復時において生じ得る、このような遺伝子交換の特化形態を指す場合がある。この過程は、例えば、標的分子（例えば、二本鎖切断を経た分子）を修復するための鋳型として、ドナー分子を使用して、ヌクレオチド配列相同性を要求する場合があり、ある場合には、非交叉型遺伝子変換またはショートトラクト型遺伝子変換として公知である。このような移入はまた、破壊される標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチの是正、および／または標的の一部となりうる遺伝情報を再合成するのにドナーを使用し得る合成依存性鎖アニーリング、および／または関連する過程も伴いうる。このような特化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部を、標的ポリヌクレオチドへと組み込みうるように、標的分子の配列の変更を結果としてもたらし得ることが多い。場合によって、「組換えアーム」という用語と、「相同性アーム」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。
【００９９】
本明細書では、「標的ベクター」という用語と、「ターゲティングベクター」という用語とを、互換的に使用する。
【０１００】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語およびその文法的同等物は、任意の由来のＴ細胞を指す場合がある。例えば、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、自家Ｔ細胞、細胞株などであり得る。Ｔ細胞はまた、ヒトＴ細胞の場合もあり、非ヒトＴ細胞の場合もある。
【０１０１】
本明細書で使用される「ＴＩＬ」または腫瘍浸潤リンパ球という用語およびこれらの文法的同等物は、腫瘍から単離された細胞を指す場合がある。例えば、ＴＩＬは、腫瘍へと遊走した細胞であり得る。ＴＩＬはまた、腫瘍に浸潤した細胞でもあり得る。ＴＩＬは、腫瘍内で見出される任意の細胞であり得る。例えば、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはこれらの任意の組合せであり得る。ＴＩＬは、混合細胞集団であり得る。ＴＩＬ集団は、表現型の異なる細胞、分化程度の異なる細胞、系統の異なる細胞、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【０１０２】
「治療効果」は、処置される状態に変化が見られる場合に生じ得る。変化は、肯定的変化の場合もあり、否定的変化の場合もある。例えば、「肯定的効果」は、対象における活性化Ｔ細胞数の増大に対応し得る。別の例では、「否定的効果」は、対象における腫瘍の量またはサイズの減少に対応し得る。少なくとも１０％の改善、好ましくは、少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも７５％、および最も好ましくは、１００％の改善が見られる場合に、処置される状態には「変化」が見られる。変化は、個体において処置される状態の重症度の改善に基づく場合もあり、本発明の組成物をそれと組み合わせて投与する治療用組成物による処置を伴う個体およびこれを伴わない個体の集団における、状態の改善の頻度の差違に基づく場合もある。同様に、本開示の方法は、対象へと、「治療有効」量の細胞を投与するステップを含み得る。「治療的に有効な」という用語は、「治療効果を及ぼすこと」に対応する定義を有するように理解されるべきである。
【０１０３】
本明細書で使用される「セーフハーバー」および「免疫セーフハーバー」という用語ならびにこれらの文法的同等物は、外因性核酸を組み込むために使用され得るゲノム内の場所であって、組込みが、核酸単独の添加により、宿主細胞の増殖に対して、著名な効果を引き起こさない場所を指す場合がある。セーフハーバーの非限定的な例は、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６を含み得る。
【０１０４】
本明細書で使用される「配列」という用語およびその文法的同等物は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり；直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、分枝状の場合もあり；一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある、ヌクレオチド配列を指す場合がある。配列は、変異させることができる。配列は、任意の長さ、例えば、２〜１，０００，０００の間、またはそれよりも多いヌクレオチドの長さ（またはこれらの間であるか、もしくはこれらを上回る、任意の整数値）、例えば、約１００〜約１０，０００ヌクレオチドの間または約２００〜約５００ヌクレオチドの間であり得る。
【０１０５】
概観
本明細書では、がんなどの疾患または状態の処置に有用な、組成物および方法が開示される。がんなどの様々な疾患または状態の治療法のための処置レジメンも、本明細書に開示される。処置レジメンは、治療適用のための腫瘍浸潤リンパ球などの遺伝子改変細胞の投与を含み得る。効果的な養子細胞移入ベースの免疫療法（ＡＣＴ）は、がん（例えば、転移性がん）患者を処置するのに有用であり得る。例えば、腫瘍浸潤リンパ球は、免疫チェックポイント遺伝子を破壊するように改変され得る。
【０１０６】
細胞
本明細書で開示される組成物は、細胞を用い得る。細胞は、初代細胞であり得る。細胞は、組換え細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から得ることができる。例えば、任意のＴ細胞株を使用することができる。代替的に、細胞は、健常ドナーに由来する場合もあり、がんを伴うと診断された患者に由来する場合もあり、または感染を伴うと診断された患者に由来する場合もある。別の実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を提示する混合細胞集団の一部であり得る。細胞はまた、細胞療法バンクから得ることもできる。免疫抑制処置に対して抵抗性の破壊細胞も得ることができる。所望の細胞集団はまた、改変前に選択することもできる。選択は、磁気分離、フローサイトメトリー選択、抗生物質選択のうちの少なくとも１つを含み得る。１または複数の細胞は、任意の血球細胞、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、単球、またはマクロファージであり得る。１または複数の細胞は、任意の免疫細胞、例えばリンパ球、Ｂ細胞またはＴ細胞であり得る。細胞はまた、自然食品、アフェレーシス、または対象の腫瘍試料から得ることもできる。細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得る。場合によって、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスであり得る。白血球アフェレーシスは、血球が血液から単離される手順であり得る。白血球アフェレーシス中、血液は、対象の腕の針から除去され、全血を赤血球、血漿、およびリンパ球に分ける機械を通って循環し、その後、血漿および赤血球は、他方の腕の針を通して対象に戻され得る。場合によって、細胞は、処置レジメンおよび細胞療法の投与後に単離される。例えば、アフェレーシスは、細胞投与と順に、またはそれと同時に実施することができる。場合によって、アフェレーシスは、細胞生成物の投与前、および投与の最長で約６週間後に実施される。場合によって、アフェレーシスは、細胞生成物の投与の−３週間、−２週間、−１週間、０、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または最長で約１０年後に実施される。場合によって、アフェレーシスにより収集した細胞は、特異的溶解、サイトカイン放出、メタボロミクス研究、生体エネルギー療法研究、サイトカイン産生の細胞内ＦＡＣｓ、ＥＬＩＳＡ−スポットアッセイ、およびリンパ球サブセット解析についての試験を受け得る。場合によって、細胞生成物またはアフェレーシス生成物の試料は、注入細胞の表現型および機能の遡及的解析のために凍結保存され得る。
【０１０７】
ＴＩＬは、がんを患う臓器から単離することができる。１または複数の細胞は、脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口腔、口唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靱帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、腟、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、またはリンパ管であり得る、がんを有する臓器から単離することができる。１または複数のＴＩＬは、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸または膵臓に由来し得る。ＴＩＬは、膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺または心臓に由来し得る。ＴＩＬは、膵臓に由来し得る。１または複数の細胞は、膵島細胞、例えば、膵β細胞であり得る。場合によって、ＴＩＬは、消化器がんに由来し得る。ＴＩＬ培養物は、多数の方式で調製することができる。例えば、腫瘍は、非がん性組織または壊死領域からトリミングされ得る。次に、腫瘍は、約２〜３ｍｍの長さに断片化され得る。場合によって、腫瘍は、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍのサイズ、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約２ｍｍ〜約３ｍｍ、約３ｍｍ〜約４ｍｍまたは約４ｍｍ〜約５ｍｍに断片化され得る。次に、腫瘍断片は、培地およびサイトカインなどの細胞刺激剤を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。場合によって、ＩＬ−２を用いて、腫瘍断片からＴＩＬを拡大することができる。ＩＬ−２の濃度は、約６０００ＩＵ／ｍＬであり得る。ＩＬ−２の濃度は、約２０００ＩＵ／ｍＬ、３０００ＩＵ／ｍＬ、４０００ＩＵ／ｍＬ、５０００ＩＵ／ｍＬ、６０００ＩＵ／ｍＬ、７０００ＩＵ／ｍＬ、８０００ＩＵ／ｍＬ、９０００ＩＵ／ｍＬまたは最大約１００００ＩＵ／ｍＬであり得る。ＴＩＬを拡大したら、これを、腫瘍反応性を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにかけることができる。例えば、ＴＩＬは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５８発現に関するＦＡＣｓによって評価することができる。ＴＩＬは、共培養、細胞毒性、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにかけることもできる。場合によって、ＴＩＬ培養物は、凍結保存され得る、または急速拡大を受けることができる。ＴＩＬなどの細胞は、胎児、新生児、若齢者、および成年者を含むがこれらに限定されない発生段階のドナーから単離することができる。ＴＩＬは、成体ヒトから単離することができる。細胞を単離することができるヒトは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１歳未満であり得る。例えば、細胞は、６歳未満のヒトから単離することができる。ＴＩＬなどの細胞は、３歳未満のヒトから単離することもできる。場合によって、ヒトドナーは、少なくとも約１８歳からの成体であり得る。場合によって、血液産物は保存され得る。例えば、ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ凍結バッグを用いて、血液産物を保存および凍結することができる。
【０１０８】
場合によって、細胞療法において用いることができる細胞、またはゲノム的に破壊することができる細胞は、所与の因子について陽性の場合もあり、所与の因子について陰性の場合もある。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３−細胞、ＣＤ５＋細胞、ＣＤ５−細胞、ＣＤ７＋細胞、ＣＤ７−細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４−細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ８−細胞、ＣＤ１０３＋細胞、ＣＤ１０３−細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｂ−細胞、ＢＤＣＡ１＋細胞、ＢＤＣＡ１−細胞、Ｌ−セレクチン＋細胞、Ｌ−セレクチン−細胞、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５−細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ２７−細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ２８−細胞、ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ４４−細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６−細胞、ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ５７−細胞、ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ６２Ｌ−細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ６９−細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ−細胞、ＣＤ１２７＋細胞、ＣＤ１２７−細胞、ＣＤ１３２＋細胞、ＣＤ１３２−細胞、ＩＬ−７＋細胞、ＩＬ−７−細胞、ＩＬ−１５＋細胞、ＩＬ−１５−細胞、レクチン様受容体Ｇ１陽性細胞、レクチン様受容体Ｇ１陰性細胞、またはこれらの分化細胞もしくは脱分化細胞であり得る。細胞が発現する因子の例は、限定的であることを意図するものではなく、当業者は、細胞が、当技術分野で公知の任意の因子について陽性の場合もあり、陰性の場合もあることを察知するであろう。一部の実施形態では、細胞は、２つまたはそれよりも多い因子について陽性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８であり得る。一部の実施形態では、細胞は、２つまたはそれよりも多い因子について陰性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ２５−、ＣＤ４４−、およびＣＤ６９−であり得る。一部の実施形態では、細胞は、１または複数の因子について陽性であり、かつ、１または複数の因子について陰性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８−であり得る。次いで、選択した細胞を、対象へと注入することができる。一部の実施形態では、細胞を、１または複数の所与の因子を有するかまたは有さないことについて選択することができる（例えば、細胞を、１または複数の因子の有無に基づき分離することができる）。一部の実施形態では、選択した細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することもできる。選択した細胞は、注入の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することができる。本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおいて使用される細胞は、本明細書で開示される細胞のうちのいずれかの混合物（例えば、２つまたはそれよりも多い異なる細胞）であり得ることを理解されたい。例えば、本開示の方法は、細胞を含むことが可能であり、細胞は、ＣＤ４＋細胞と、ＣＤ８＋細胞との混合物である。別の例では、本開示の方法は、細胞を含むことが可能であり、細胞は、ＣＤ４＋細胞と、ナイーブ細胞との混合物である。場合によって、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ−７Ｒα＋から構成される、ステムメモリー（ｓｔｅｍ  ｍｅｍｏｒｙ）ＴＳＣＭ細胞であることが可能であり、ステムメモリー細胞はまた、ＣＤ９５、ＩＬ���２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１を発現することが可能であり、ステムメモリー細胞特有の、多数の機能的な属性を示す。操作細胞はまた、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を含む、セントラルメモリー細胞であるＴＣＭ細胞でもあることが可能であり、この場合、セントラルメモリー細胞は、例えば、ＩＬ−２を分泌し得るが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は分泌しえない。操作細胞はまた、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含む、エフェクターメモリー細胞であるＴＥＭ細胞でもあることが可能であり、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−４など、エフェクターサイトカインを産生し得る。場合によって、細胞集団を、対象へと導入することができる。例えば、細胞集団は、Ｔ細胞とＮＫ細胞との組合せであり得る。他の場合には、集団は、ナイーブ細胞とエフェクター細胞との組合せであり得る。細胞集団は、ＴＩＬであり得る。
【０１０９】
特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定化された、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、あるいは、ある場合には、カルシウムイオノフォアと共に、プロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）と接触させることなどにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用することができる。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激し得る条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。場合によって、４−１ＢＢを使用して、細胞を刺激することができる。例えば、細胞は、４−１ＢＢおよびＩＬ−２１または別のサイトカインで刺激することができる。ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。例えば、シグナルをもたらす薬剤は、溶液中の場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。粒子の細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存し得る。さらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤でコーティングしたビーズと組み合わせることができ、この場合、ビーズと細胞とは、後で分離し、任意選択で、培養することができる。各ビーズは、抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２８抗体、または、場合によって、２つの組合せでコーティングすることができる。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤でコーティングしたビーズと細胞とを分離せず、併せて培養する。細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させうる常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）を、Ｔ細胞へと接触させることにより、ライゲーションすることができる。場合によって、細胞およびビーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ）を、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中で組み合わせる（例えば、カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わずに）。任意の細胞濃度を使用することができる。混合物は、数時間（例えば、約３時間）もしくはほぼこの時間〜１４日間もしくは約１４日間、またはこれらの間の任意の時間整数値にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物は２１日間もしくはほぼこの期間にわたり、または最長で２１日間もしくはほぼこの期間にわたり混合物を培養することもできる。Ｔ細胞を培養するのに適切な条件は、増殖および生存率に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＴＧＦベータ、およびＴＮＦアルファ、または細胞を増殖させるための他の任意の添加剤を含む因子を含有し得る、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ））を含み得る。細胞を増殖させるための他の添加剤は、界面活性物質、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ、ならびにＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加し、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（または血漿）もしくは規定されたセットのホルモン、および／またはＴ細胞を増殖させ、拡大するために十分な量のサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１  Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。場合によって、８６５ｍＬボトルのＲＰＭＩは、１００ｍＬのヒト血清、２５ｍＬのＨｅｐｅｓ（１Ｍ）、１０ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬおよび１０，０００μｇ／ｍＬ）および０．２ｍＬのゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を有し得る。添加剤の添加後に、ＲＰＭＩ培地は、０．２μｍ×１Ｌフィルターを使用して濾過し、４℃で保存することができる。一部の実施形態では、抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験用培養物中に限り組入れうるが、対象へと注入される細胞の培養物中には組み入れることができない。場合によって、ヒト血清は、３７℃ウォーターバス内で解凍し、次いで熱不活化（例えば、１００ｍＬボトルに対して５６℃で３０分間）させることができる。血清は、培地の添加の前に０．８μｍおよび０．４５μｍフィルターを通して濾過することができる。
【０１１０】
標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、５％ＣＯ２を加えた空気）下で維持することができる。場合によって、変動させる刺激時間へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。場合によって、ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、またはこれらの任意の組合せに対する、可溶性で一特異性の、四量体抗体を使用することができる。
【０１１１】
場合によって、破壊を受けるべき細胞は、組織または細胞と共培養することにより、活性化させることもでき、拡大することもできる。細胞は、抗原提示細胞であり得る。人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｔ細胞受容体および共刺激分子に対するリガンドを発現することが可能であり、場合によって、それらの効力および機能を改善しながら、移入のためのＴ細胞を活性化させ、拡大し得る。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように操作することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞拡大のための任意の遺伝子を発現するように操作することができる。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカインまたはこれらの任意の組合せであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を経る可能性がある細胞集団へと、シグナルを送達し得る。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル２、シグナル３、またはこれらの任意の組合せを送達し得る。シグナル１は、抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル１は、ＴＣＲへの、ペプチド−ＭＨＣ複合体のライゲーション、またはＣＤ３に対するアゴニスト抗体であって、ＣＤ３シグナル−形質導入複合体の活性化をもたらし得るアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は、共刺激性シグナルであり得る。例えば、共刺激性シグナルは、それぞれ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ７０、および４−１ＢＢＬに結合する、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得る。シグナル３は、サイトカインシグナルであり得る。サイトカインは、任意のサイトカインであり得る。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはこれらの任意の組合せであり得る。
【０１１２】
場合によって、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用して、細胞集団を活性化させ、かつ／または拡大することができる。場合によって、人工抗原提示細胞は、アロ特異性を誘導しえない。ａＡＰＣは場合によって、ＨＬＡを発現しえない。ａＡＰＣは、活性化および／または刺激のために使用し得る遺伝子を安定的に発現するように、遺伝子改変することができる。場合によって、Ｋ５６２細胞を、活性化のために使用することができる。Ｋ５６２細胞はまた、拡大のために使用することもできる。Ｋ５６２細胞は、ヒト赤白血病細胞株であり得る。Ｋ５６２細胞は、目的の遺伝子を発現するように操作することができる。Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡクラスＩＩ分子、またはＣＤ１ｄ分子を内因的に発現しえないが、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現し得る。Ｋ５６２は、シグナル１を、Ｔ細胞へと送達するように操作することができる。例えば、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作することができる。場合によって、Ｋ５６２細胞は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４−１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３  ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合型ＩＬ−１５、膜結合型ＩＬ−１７、膜結合型ＩＬ−２１、膜結合型ＩＬ−２、切断型ＣＤ１９、または任意の組合せなど、さらなる分子を発現するように操作することができる。場合によって、操作Ｋ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３  ｍＡｂの膜形態である、クローンＯＫＴ３を発現し得る。場合によって、操作Ｋ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３  ｍＡｂの膜形態である、クローンＯＫＴ３、抗ＣＤ２８  ｍＡｂの膜形態を発現し得る。
【０１１３】
場合によって、細胞の再刺激は、抗原、およびフィーダーＰＢＭＣなどの放射線照射された組織適合性抗原提示細胞（ＡＰＣ）により行うことができる。場合によって、細胞は、ＰＨＡなどの非特異的マイトジェンおよび同種間フィーダー細胞を使用して増殖させることができる。フィーダーＰＢＭＣは、４０Ｇｙで放射線照射することができる。フィーダーＰＢＭＣは、約１０Ｇｙ〜約１５Ｇｙ、約１５Ｇｙ〜約２０Ｇｙ、約２０Ｇｙ〜約２５Ｇｙ、約２５Ｇｙ〜約３０Ｇｙ、約３０Ｇｙ〜約３５Ｇｙ、約３５Ｇｙ〜約４０Ｇｙ、約４０Ｇｙ〜約４５Ｇｙ、約４５Ｇｙ〜約５０Ｇｙで放射線照射することができる。場合によって、放射線照射されたフィーダー細胞の対照フラスコのみが、抗ＣＤ３およびＩＬ−２で刺激され得る。
【０１１４】
ａＡＰＣは、ビーズであり得る。球形ポリスチレンビーズを、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコーティングし、Ｔ細胞を活性化させるために使用することができる。ビーズは、任意のサイズであり得る。場合によって、ビーズは、３および６マイクロメートルであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ビーズは、４．５マイクロメートルのサイズであり得るか、またはほぼこのサイズであり得る。ビーズは、任意の細胞対ビーズ比で用いることができる。例えば、１ミリメートル当たり１００万個の細胞で、３対１のビーズ対細胞比を使用することができる。ａＡＰＣはまた、剛性球形粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁性ナノ粒子または磁性マイクロ粒子、ナノサイズ量子ドット、４、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、非球形粒子、５、カーボンナノチューブバンドル、６、楕円体のＰＬＧＡマイクロ粒子、７、ナノワーム、流体脂質二重層含有系、８、２Ｄ支援型脂質二重層（２Ｄ−ＳＬＢ）、９、リポソーム、１０、ＲＡＦＴソーム／マイクロドメインリポソーム、１１、ＳＬＢ粒子、またはこれらの任意の組合せでもあり得る。
【０１１５】
場合によって、ａＡＰＣは、ＣＤ４  Ｔ細胞を拡大し得る。例えば、ａＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４  Ｔ細胞の抗原プロセシングおよび提示経路を模倣するように操作することができる。Ｋ５６２は、ＨＬＡ−Ｄ、ＤＰα．ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはこれらの任意の組合せを発現するように操作することができる。例えば、操作Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡ拘束性抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を拡大するために、ＨＬＡ拘束性ペプチドでパルスすることができる。
【０１１６】
場合によって、ａＡＰＣの使用は、Ｔ細胞の活性化、拡大、または任意の組合せのために外因的に導入されるサイトカインと組み合わせることができる。細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、ゲノム移植された細胞の、対象への投与の後における、対象の血液中で拡大することもできる。
【０１１７】
場合によって、細胞は、標準急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）によって達成される収量へとスケールアップすることができる。遺伝子改変ＴＩＬの平均倍率拡大は、１０７１であり得る。場合によって、平均倍率拡大は、５００〜２０００であり得る。遺伝子改変されたＴＩＬの平均倍率拡大は、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜最大２０００倍であり得る。場合によって、操作細胞投与量は、患者注入のために約１×１０１０個のノックアウトＴＩＬからであり得る。
【０１１８】
投与前、投与後、および／または投与時における細胞（例えば、操作細胞または操作された初代Ｔ細胞もしくはＴＩＬ）は、機能的であり得る。例えば、細胞は、投与後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００日間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。養子移入された細胞は、投与後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。投与された細胞は、注入後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０年間、またはほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。場合によって、投与された細胞は、最長でレシピエントの生涯にわたり機能的であり得る。
【０１１９】
さらに、養子移入された細胞は、その意図される正常な働きの１００％で機能し得る。細胞はまた、その意図される正常な働きの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％でも機能し得る。
【０１２０】
長期培養において、ゲノム的に破壊された細胞は、刺激非依存的増殖または形質転換の特性を示すことができない。例えば、場合によって、ゲノム的に破壊された細胞は、ＩＬ−２などのサイトカインなしで培養された場合、拡大することができない。場合によって、ゲノム的に破壊された細胞は、ＩＬ−２などのサイトカインと接触した後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９日後に生存不能となり得る。
【０１２１】
本明細書に記載されている細胞組成物は、凍結保存することができる。凍結保存は、例えば、５％ＤＭＳＯ最終濃度のＣｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０において行うことができる。凍結保存は、約７．５×１０７細胞／ｍＬ〜約１．５×１０８細胞／ｍＬの凍結密度において行うことができる。凍結密度は、約１×１０７細胞／ｍＬから、１．５×１０７細胞／ｍＬ、２×１０７細胞／ｍＬ、２．５×１０７細胞／ｍＬ、３×１０７細胞／ｍＬ、３．５×１０７細胞／ｍＬ、４×１０７細胞／ｍＬ、４．５×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、５．５×１０７細胞／ｍＬ、６×１０７細胞／ｍＬ、６．５×１０７細胞／ｍＬ、７×１０７細胞／ｍＬ、７．５×１０７細胞／ｍＬ、８×１０７細胞／ｍＬ、８．５×１０７細胞／ｍＬ、９×１０７細胞／ｍＬ、９．５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬ、１．５×１０８細胞／ｍＬ、２×１０８細胞／ｍＬ、２．５×１０８細胞／ｍＬ、３×１０８細胞／ｍＬ、３．５×１０８細胞／ｍＬ、４×１０８細胞／ｍＬ、４．５×１０８細胞／ｍＬ、５×１０８細胞／ｍＬ、５．５×１０８細胞／ｍＬ、６×１０８細胞／ｍＬ、６．５×１０８細胞／ｍＬ、７×１０８細胞／ｍＬ、７．５×１０８細胞／ｍＬまたは最大約８×１０８細胞／ｍＬであり得る。
【０１２２】
例えば、場合によって、ＴＩＬは、収集し、洗浄し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ緩衝剤などの緩衝剤に再懸濁することができる。この調製物は、等しい体積のＣｒｙｏｓｔｏｒｅ  ＣＳ１０と混合することができる。場合によって、細胞組成物は、それを必要とする対象への導入の前に解凍される。
【０１２３】
細胞生存率は、フローサイトメトリーおよびトリパンブルー排除によって決定することができる。場合によって、フローサイトメーターにおける前方散乱および側方散乱は、生細胞パーセントを同定することができる。他の場合では、細胞は、アネキシンＶで染色して、死／生細胞のパーセントを決定することができる。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器により細胞生存率を決定することもできる。場合によって、投与のために少なくとも約５０％細胞が生存可能であり得る。他の場合では、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または最大約１００％の細胞が生存可能であり得る。
【０１２４】
細胞標的
ＴＩＬなどの細胞は、抗原をターゲティングし得る。細胞はまた、エピトープもターゲティングし得る。抗原は、腫瘍細胞抗原であり得る。エピトープは、腫瘍細胞エピトープであり得る。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、対象特異的がんネオ抗原に対する特異的反応性を有するクローナルおよび／またはオリゴクローナル亜集団として選択され得る。特異的反応性は、腫瘍全エクソームシーケンシングおよびタンデムミニ遺伝子／合成長鎖ペプチドスクリーニング法のうちの少なくとも１つを使用して決定することができる、E.  Tranら、Cancer  immunotherapy  based  on  mutation-specific  CD4+  T  cells  in  a  patient  with  epithelial  cancer.、Science  ３４４巻、６４１〜６４５頁（２０１４年）。腫瘍細胞エピトープは、変異から生じる腫瘍に由来する抗原（ネオ抗原またはネオエピトープ）、共有の腫瘍特異的抗原、分化抗原、および腫瘍内で過剰発現する抗原など、多種多様な腫瘍抗原に由来し得る。場合によって、ネオ抗原またはネオエピトープは、５’ＲＡＣＥおよびＴＣＲ−ＰＣＲによって同定することができる。これらの抗原は、例えば、少数を挙げれば、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＰＮＭＢ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２ｄ、ＨＬＡ−Ａｌ  ｌｄ、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、ＭＡＲＴ２、ＭＥ１、ＭＵＭ−１ｆ、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１−もしくは−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−１、２、８、Ｇａｇｅ  ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶｆ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａｌ２、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｍｕｃｉｎｋ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ、ＸＡＧＥ−１ｂ、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、カリクレイン４、マンマグロビン−Ａ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＯＡ１、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、ＥＰ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトタン���ク質、Ｍ−ＣＳＦＴ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＭＰ−２、ＭＵＣ１、ｐ５３、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、セセルニン１、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、スルビビン、テロメラーゼ、ＶＥＧＦおよび／またはＷＴ１に由来し得る。腫瘍関連抗原は、宿主が正常では発現しない抗原の場合もあり；変異しているか、切断されているか、ミスフォールディングしているか、または他の形で、宿主が正常では発現しない分子の異常な兆候の場合もあり；正常でも発現するが、異常な高レベルで発現する分子と同一な場合もあり；異常な関連または環境で発現する場合もある。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合体炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生物学的分子、またはこれらの任意の組合せであり得る。場合によって、標的は、ネオ抗原またはネオエピトープである。例えば、ネオ抗原は、ＥＲＢＢ２ＩＰ内のＥ８０５Ｇ変異であり得る。場合によって、ネオ抗原およびネオエピトープは、全エクソームシーケンシングにより同定することができる。場合によって、ネオ抗原標的およびネオエピトープ標的は、消化器がん細胞が発現し得る。ネオ抗原およびネオエピトープは、上皮癌において発現し得る。
【０１２５】
エピトープは、間質エピトープであり得る。エピトープは、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。抗原は、間質抗原であり得る。このような抗原は、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。これらの抗原およびこれらのエピトープは、少数を挙げれば、例えば、腫瘍内皮細胞、腫瘍血管系、腫瘍線維芽細胞、腫瘍周皮細胞、腫瘍間質、および／または腫瘍間葉細胞において存在し得る。これらの抗原は、例えば、ＣＤ３４、ＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＤ３１、ＰＣＮＡ、ＣＤ１１７、ＣＤ４０、ＭＭＰ４および／またはテネイシンを含み得る。
【０１２６】
ゲノム破壊
ゲノム破壊は、エクソンまたはイントロンを含み得る。場合によって、ゲノム破壊は、遺伝子配列の破壊であり得る。遺伝子の破壊は、任意の特定の遺伝子の破壊であり得る。本出願内の遺伝子の遺伝子相同体（例えば、遺伝子の任意の哺乳動物形）を対象とすることが想定される。当技術分野では、一部の遺伝子相同体は公知であるが、場合によって、相同体は公知ではない。しかし、哺乳動物の間で相同な遺伝子は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴなど、公表されているデータベースを使用して、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列を比較することにより見出すことができる。
【０１２７】
ゲノム破壊は、細胞の機能を改善することができる。例えば、ゲノム破壊は、標的の細胞傷害作用を増強することができる。ゲノム破壊は、細胞の増殖または存続を増強することもできる。例えば、破壊され得る遺伝子は、がん免疫療法の治療可能性を改善し得る。細胞は、１または複数の内因性遺伝子をノックアウトするように操作することができる。ノックアウトされ得る内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含み得る。免疫チェックポイント遺伝子は、刺激性チェックポイント遺伝子の場合もあり、阻害性チェックポイント遺伝子の場合もある。免疫チェックポイント遺伝子の位置は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｉｌｄ  ３８  ｐａｔｃｈ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）アセンブリーを使用して提示することができる。ノックアウトされる遺伝子は、データベースを使用して選択することができる。場合によって、ある特定の内因性遺伝子は、ゲノム操作により適する。データベースは、エピジェネティクスにより許容性の標的部位を含み得る。データベースは、場合によって、ＥＮＣＯＤＥ（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｇｏｖ／１０００５１０７）であり得る。データベースは、ゲノム操作の許容性がより大きい可能性がある、オープンクロマチンを伴う領域を同定し得る。破壊され得る遺伝子は、ＴＣＲシグナル伝達、機能的アビディティー、またはがんに対する免疫の減弱に関与し得る。場合によって、破壊される遺伝子は、ＴＣＲが刺激されると、上方調節される。遺伝子は、細胞の拡大、機能的アビディティー、またはサイトカインの多機能性の阻害に関与し得る。遺伝子は、細胞によるサイトカインの産生を負に調節することに関与し得る。例えば、遺伝子は、例えば、エフェクターサイトカイン、ＩＦＮ−ガンマ、および／またはＴＮＦの産生の阻害に関与し得る。遺伝子はまた、ＴＣＲの刺激の後で、ＩＬ−２など、補助的サイトカインの発現の阻害にも関与し得る。
【０１２８】
細胞は、１または複数の遺伝子の破壊を有し得る。例えば、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、ＰＤ−１またはＣＩＳＨなどのチェックポイント遺伝子であり得る。場合によって、その発現が破壊され得る１または複数の遺伝子を表１に示す。例えば、破壊され得る遺伝子は、表１など、本明細書で開示される遺伝子に対する、一定の同一性および／または相同性を呈し得る。またはほぼこれらの比率の相同性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を呈する遺伝子は、破壊し得ることが想定される。したがって、表１の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相同性を呈するか、またはほぼこれらの比率の相同性（核酸またはタンパク質レベルで）を呈する遺伝子は、破壊し得ることが想定される。表１の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を呈するか、またはほぼこれらの比率の同一性（核酸またはタンパク質レベルで）を呈する遺伝子は、破壊し得ることも想定される。
【表１−１】
2019532080.tif 000003
【表１−２】
2019532080.tif 000004
【表１−３】
2019532080.tif 000005
【表１−４】
2019532080.tif 000006
【表１−５】
2019532080.tif 000007
【０１２９】
細胞は、１または複数の抑制された遺伝子を有することができる。例えば、その発現が抑制されている１または複数の遺伝子は、表１中の遺伝子と共にその相同または修飾形のうちのいずれか１つを含み得る。遺伝子の抑制はまた、多数の方式で行うこともできる。例えば、遺伝子の発現は、ノックアウトにより抑制することもでき、遺伝子のプロモーターを変更することにより抑制することもでき、かつ／または干渉性ＲＮＡを投与することにより抑制することもできる。これは、生物レベルで行うこともでき、組織レベル、臓器レベルおよび／または細胞レベルで行うこともできる。細胞内、組織内、および／または臓器内で、１または複数の遺伝子をノックダウンする場合、１または複数の遺伝子は、ＲＮＡ干渉性試薬、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを投与することにより抑制することができる。例えば、ｓｈＲＮＡを発現させうる核酸を、細胞へと、安定的にトランスフェクトして、発現をノックダウンすることができる。さらに、ｓｈＲＮＡを発現させうる核酸を、Ｔ細胞のゲノへと挿入し、これにより、Ｔ細胞内の遺伝子をノックダウンすることもできる。
【０１３０】
場合によって、破壊または抑制され得る遺伝子は、ＣＩＳＨであり得る。ＣＩＳＨ遺伝子は、ＳＯＣＳ（suppressor  of  cytokine  signaling）タンパク質ファミリーまたはＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴインヒビター（ＳＳＩ）タンパク質ファミリーとしてもまた公知である、サイトカイン誘導性ＳＴＡＴインヒビター（ＣＩＳ）タンパク質ファミリーのメンバーであり得る（例えば、Palmerら、Cish  actively  silences  TCR  signaling  in  CD8+  T  cells  to  maintain  tumor  tolerance、The  Journal  of  Experimental  Medicine、２０２巻（１２号）、２０９５〜２１１３頁（２０１５年）を参照されたい）。遺伝子は、サイトカインによるシグナル伝達を調節し得る、古典的な負のフィードバック系の一部を形成し得る、ＳＯＣＳファミリーのタンパク質の一部であり得る。ＣＩＳＨは、エリスロポエチン、プロラクチン、またはインターロイキン３（ＩＬ−３）受容体など、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ５経路を介してシグナル伝達するサイトカインの負の調節に関与し得る。遺伝子は、そのチロシンリン酸化を抑制することにより、ＳＴＡＴ５のトランス活性化を阻害し得る。ＣＩＳＨファミリーメンバーは、サイトカインによるシグナル伝達の、サイトカイン誘導性の負の制御因子であることが公知である。遺伝子の発現は、造血系細胞内のＩＬ２、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＥＰＯにより誘導することができる。プロテアソームを媒介する、遺伝子のタンパク質の分解は、エリスロポエチン受容体の不活化に関与し得る。場合によって、ターゲティングされる遺伝子は、腫瘍特異的Ｔ細胞内で発現し得る。ターゲティングされる遺伝子は、破壊されると、操作細胞の、抗原に関連する腫瘍への浸潤を増大させることができる。
【０１３１】
エフェクターＴ細胞の機能的アビディティーの改善は、腫瘍微小環境内の阻害因子の克服および腫瘍退縮の誘発において不可欠であり得る。場合によって、サイトカインシグナル伝達サプレッサー（ＳＯＣＳ）ファミリーのメンバーであるＣｉｓｈ（サイトカイン誘導性ＳＨ２タンパク質）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激によって誘導され得、腫瘍常在性Ｔ細胞において発現され得、腫瘍（複数可）に対するその機能的アビディティーを阻害し得る。腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｉｓｈの遺伝子欠失は、その拡大、機能的アビディティーおよびサイトカイン多機能性を増強し、確立された腫瘍の顕著なかつ耐久性がある退縮をもたらすことができる。Ｃｉｓｈは、不可欠なＴＣＲシグナル伝達中間体のホスホリパーゼＣ−γ１（ＰＬＣ−γ１）と物理的に相互作用し、ＴＣＲ刺激後のプロテアソーム分解のためにこれをターゲティングする。これらの知見は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的アビディティーを調節し、ＡＣＴがん免疫療法を改善するように操られ得る、新規のターゲティング可能な相互作用を確立した。場合によって、Ｃｉｓｈノックアウトまたはノックダウンは、サイトカインレベルの増大をもたらすことができる。増大されたサイトカインレベルは、野生型対応物細胞の上清と比較した、上清におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２またはこれらの組合せの増大を含み得る。他の場合では、Ｃｉｓｈなどの遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは、抗原感度の増大を含み得る。抗原感度の増大は、総サイトカイン発現レベルによって測定することができ、場合によって、抗原感度の増大は、４０〜１００倍であり得る。抗原感度の増大は、対照対応物細胞と比較して、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００倍であり得る。
【０１３２】
場合によって、Ｃｉｓｈノックアウトまたはノックダウンは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２レベルによって測定される、サイトカイン放出の最大量の増大をもたらすことができる。場合によって、ＥＬＩＳＡは、上清における総サイトカインレベルを測定することができ、亜集団または細胞レベルでのサイトカイン産生を直接的に測定しなくてよい。異なる亜集団または個々のＴ細胞が、サイトカイン産生の増大の原因となり得るか評価するために、ＣＤ８＋Ｔを選択し、刺激し、細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２について共染色し、フローサイトメトリーにより評価することができる。場合によって、Ｃｉｓｈは、腫瘍特異的Ｔ細胞における総エフェクターサイトカイン産生および多機能性の両方を負に調節することができる。Ｃｉｓｈの遺伝的全身欠失は、機能的アビディティーを増強することができ、持続性腫瘍キラーへとＣＤ８＋Ｔ細胞をライセンス化し、これは、再発腫瘍に対するメモリー応答における意義を有することができる。
【０１３３】
Ｔ細胞内の１または複数の遺伝子は、任意の方法を使用して、ノックアウトまたは破壊することができる。例えば、１または複数の遺伝子のノックアウトは、１または複数の遺伝子を、Ｔ細胞のゲノムから欠失させることを含み得る。ノックアウトはまた、遺伝子配列の全部または一部を、Ｔ細胞から除去することも含み得る。また、ノックアウトは、Ｔ細胞のゲノム内の遺伝子の全部または一部を、１または複数のヌクレオチドで置き換えることを含み得ることも想定される。１または複数の遺伝子のノックアウトはまた、配列を、１または複数の遺伝子内に挿入し、これにより、１または複数の遺伝子の発現を破壊することも含み得る。例えば、配列の挿入は、終止コドンを、１または複数の遺伝子の中央部に作製し得る。配列の挿入はまた、１または複数の遺伝子のオープンリーディングフレームもシフトさせうる。また、ノックアウト技術の任意の組合せを実行し得ることも想定される。例えば、組織特異的ノックアウトまたは細胞特異的ノックアウトを、誘導技術と組み合わせ、組織特異的または細胞特異的な誘導性ノックアウトを創出することができる。さらに、発生特異的プロモーターなどの他の系を、組織特異的プロモーターおよび／または誘導性ノックアウトと組み合わせて使用することもできる。
【０１３４】
ノックアウト技術はまた、遺伝子編集も含み得る。例えば、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびメガヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを使用して実施することができる。ヌクレアーゼは、天然で存在するヌクレアーゼの場合もあり、遺伝子改変ヌクレアーゼの場合もあり、かつ／または組換えヌクレアーゼの場合もある。遺伝子編集はまた、トランスポゾンベースの系（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）を使用して実施することもできる。例えば、遺伝子編集は、トランスポザーゼを使用して実施することができる。
【０１３５】
場合によって、操作された細胞、または破壊された遺伝子もしくはその部分を含有する細胞は、注入前試験を受けることができる。注入前試験は、操作細胞の培養物の表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも１つを含み得る。表現型試験は、数例を挙げると、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＩＬ−７受容体アルファ、ＣＤ２８の存在を検出するステップを含み得る。場合によって、操作細胞におけるマーカーのレベルは、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超える、または最大約１００％である。注入前試験が、表現型試験について少なくとも約８０％ＣＤ３陽性であり得る場合、ＴＩＬは、投与され得る。
【０１３６】
場合によって、ＴＩＬの効力試験は、ＴＩＬ培養物の抗ＣＤ３刺激後にＩＦＮγのレベルを検出するステップを含み得る。場合によって、ＴＩＬ培養物の抗ＣＤ３刺激後のＦＮγのレベルは、同等の対照細胞集団よりも有意に大きい。場合によって、注入前試験が、効力試験においてＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に細胞１０５個当たり少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγを生じる場合、ＴＩＬが投与される。場合によって、注入前試験が、効力試験においてＴＩＬの抗ＣＤ３刺激後に細胞１０５個当たり少なくとも約５０ｐｇ／ｍＬ、細胞１０５個当たり７５ｐｇ／ｍＬ、細胞１０５個当たり１００ｐｇ／ｍＬ、細胞１０５個当たり１５０ｐｇ／ｍＬ、細胞１０５個当たり２００ｐｇ／ｍＬ、細胞１０５個当たり２５０ｐｇ／ｍＬ、細胞１０５個当たり３００ｐｇ／ｍＬまたは細胞１０５個当たり最大約３５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγを生じる場合、ＴＩＬが投与される。
【０１３７】
場合によって、ＴＩＬの集団は、組成物中の腫瘍細胞の存在について試験される。投与され得るＴＩＬは、細胞病理学試験において検討した少なくとも約２００個のＴＩＬ当たりで腫瘍細胞について陰性であり得る。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約２００個のＴＩＬ当たり１％未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約２００個のＴＩＬ当たり２％未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約２００個のＴＩＬ当たり３％未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約２００個のＴＩＬ当たり４％未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約２００個のＴＩＬ当たり５％未満の腫瘍細胞が存在する。
【０１３８】
ＣＲＩＳＰＲ系
本明細書で記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を利用し得る。少なくとも５つの種類のＣＲＩＳＰＲ系が存在し、これらは全て、ＲＮＡタンパク質およびＣａｓタンパク質を包含する。Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型は、ｃｒＲＮＡと相補的な核酸を切断することが可能な、多Ｃａｓタンパク質複合体をアセンブルする。Ｉ型およびＩＩＩ型はいずれも、プロセシングされたｃｒＲＮＡを、多Ｃａｓタンパク質複合体へとアセンブリングする前に、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを要求する。ＩＩ型およびＶ型のＣＲＩＳＰＲ系は、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体化させた、単一のＣａｓタンパク質を含む。
【０１３９】
ＣＲＩＳＰＲ系の一般的な機構および近年における進歩については、Ｃｏｎｇ，  Ｌ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻（６１２１号）：８１９〜８２３頁（２０１３年）；Ｆｕ，  Ｙ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻、８２２〜８２６頁（２０１３年）；Ｃｈｕ，  ＶＴら、「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３巻、５４３〜５４８頁（２０１５年）；Ｓｈｍａｋｏｖ，  Ｓ．ら、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、６０巻、１〜１３頁（２０１５年）；Ｍａｋａｒｏｖａ，  ＫＳら、「Ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、１〜１５頁（２０１５年）において論じられている。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ（また、プロトスペーサーとも呼ばれる）との塩基対合相補性、および２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置において生じる。例えば、操作細胞は、ＣＲＩＳＰＲ系、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を使用して作製することができる。本明細書で開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、または任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用により、２０ヌクレオチドのガイド配列にハイブリダイズし、２０ヌクレオチドの標的配列に後続してプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列において、二本鎖切断を生じることができる。
【０１４０】
場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、変異を導入することができる。変異は、挿入または欠失であり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＩＳＨの少なくとも一部を含む１ｂｐ挿入を導入することができる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系によりＴＩＬを操ることは、ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔後にＴＩＬ拡大に負の効果がない場合がある。場合によって、遺伝的レベルで観察されるノックアウト頻度が、タンパク質の損失と相関するか決定するために、ＣＲＩＳＰＲノックアウト後のＣＩＳＨタンパク質などのタンパク質の発現を評価することができる。例えば、末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞およびＴＩＬは、プレート結合した抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８抗体を使用して、電気穿孔後１４日目に再刺激することができ、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットによりタンパク質、例えば、ＣＩＳＨタンパク質の損失を評価することができる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ修飾されたＰＢ  Ｔ細胞およびＴＩＬは、１４日間拡大させ、次いで４８時間再刺激することができる。ＣＩＳＨは細胞内タンパク質であるため、細胞を回収し、ウェスタンブロットによって抽出物を解析することができる。ゲノム修飾のＴｉＤＥ解析による高い率のノックアウトと整合して、ＣＩＳＨなどのタンパク質は、ノックアウト循環Ｔ細胞およびＴＩＬにおいて基本的に非存在であり得るまたは減少され得る。
【０１４１】
Ｉ．Ｃａｓタンパク質
ベクターは、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）など、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、酵素コード配列に作動可能に連結することができる。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、これらの相同体、またはこれらの修飾形を含み得る。場合によって、触媒不活性なＣａｓタンパク質、例えば、ｄＣａｓ９を使用することができる。Ｃａｓ９など、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内など、標的配列において、一本または両方の鎖の切断を導きうる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれよりも多い塩基対以内、またはほぼこれらの数の塩基対以内において、一本または両方の鎖の切断を導きうる。変異させたＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一本または両方鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に照らして変異させたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ＨｉＦｉなど、高忠実度のＣａｓタンパク質であり得る。場合によって、Ｃａｓタンパク質は修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ７−メチル−Ｇｐｐｐ（２’−Ｏ−メチル−Ａ）であり得る。場合によって、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質は、臨床使用の前にシーケンシングされ得る。例えば、精製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価して、Ｃａｓ９以外の他のいかなるｍＲＮＡ種も臨床産物内に存在しないことを検証することができる。その上、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡは、逆転写に続くシーケンシングによる検証を受けて、ヌクレオチドレベルでの同一性を検証することができる。Ｃａｓ配列は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含有し得る。核局在化配列は、ＳＶ４０に由来し得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０、ヌクレオプラスミン、インポーチンアルファ、Ｃ−ｍｙｃ、ＥＧＬ−１３、ＴＵＳ、ＢＯＲＧ、ｈｎＲＮＰＡ１、Ｍａｔａ２またはＰＹ−ＮＬＳのうちの少なくとも１つに由来し得る。ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に存在し得る。場合によって、Ｃａｓタンパク質は、１〜５個のＮＬＳ配列を含有し得る。Ｃａｓタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個のＮＬＳ配列を含有し得る。Ｃａｓ９などの���ａｓタンパク質は、２個のＮＬＳ配列を含有し得る。Ｃａｓタンパク質は、ＳＶ４０およびヌクレオプラスミン（nuceloplasmin）ＮＬＳ配列を含有し得る。Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１個の非翻訳領域を含有し得る。
【表２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【０１４２】
Ｃａｓ９とは、例示的な野生型のＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または少なくともほぼこれらの比率の配列同一性および／もしくは配列類似性を伴うポリペプチドを指す場合がある。Ｃａｓ９とは、例示的な野生型のＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する）に対して、最大で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または最大でほぼこれらの比率の配列同一性および／もしくは配列類似性を伴うポリペプチドを指す場合がある。Ｃａｓ９とは、欠失、挿入、置換、変異体、変異、融合、キメラまたはこれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得る、Ｃａｓ９タンパク質の野生型または修飾形態を指す場合もある。
【０１４３】
エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞など、特定の細胞内の発現のために、コドン最適化することができる。この種の最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図される宿主生物または宿主細胞のコドン優先性を模倣するように、外来由来の（例えば、組換え）ＤＮＡ変異を伴いうる。
【０１４４】
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０を超えるＮＬＳ、またはほぼこれらの数を超えるＮＬＳなど、１または複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端において、またはこの近傍に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０を超えるＮＬＳ、またはほぼこれらの数を超えるＮＬＳを含む場合もあり、カルボキシル末端において、またはこの近傍に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０を超えるＮＬＳ、またはほぼこれらの数を超えるＮＬＳを含む場合もあり、これらの任意の組合せ（例えば、アミノ末端における１または複数のＮＬＳと、カルボキシル末端における１または複数のＮＬＳとの組合せ）を含む場合もある。１つを超えるＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが、１つを超えるコピーで、かつ／または１もしくは複数のコピーで存在する、他の１もしくは複数のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、各ＮＬＳは、他のＮＬＳから独立に選択することができる。
【０１４５】
ＮＬＳは、１部分からなる（monopartite）場合もあり、２部分からなる（bipartite）場合もある。場合によって、２部分からなるＮＬＳは、１部分からなるＮＬＳとは対照的に、スペーサー配列を有し得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０、ヌクレオプラスミン、インポーチンアルファ、Ｃ−ｍｙｃ、ＥＧＬ−１３、ＴＵＳ、ＢＯＲＧ、ｈｎＲＮＰＡ１、Ｍａｔａ２またはＰＹ−ＮＬＳのうちの少なくとも１つに由来し得る。ＮＬＳは、ポリペプチド鎖内の任意の位置、例えば、Ｎ末端またはＣ末端の近傍に位置し得る。例えば、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、ポリペプチド鎖に沿って、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸以内であるか、またはほぼこれらの数のアミノ酸以内であり得る。ある場合には、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、５０アミノ酸もしくはそれよりも多い数のアミノ酸、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００アミノ酸以内であるか、またはほぼこれらの数のアミノ酸以内であり得る。
【０１４６】
エンドヌクレアーゼは、例示的な野生型の部位指向型ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する由来Ｃａｓ９）のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性、または少なくともほぼこれらの比率のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４７】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（表２）を一般に、ゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして使用するが、どの標的切出し部位にも最良のエンドヌクレアーゼではない場合もある。例えば、ＳｐＣａｓ９のためのＰＡＭ配列（５’ＮＧＧ３’）は、ヒトゲノム全体を通して夥多であるが、ＮＧＧ配列は、修飾に所望される遺伝子を適正にターゲティングするように位置しない場合がある。場合によって、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、ある特定のゲノム標的をターゲティングすることができる。場合によって、ＮＧＧ以外のＰＡＭ配列を伴う、合成ＳｐＣａｓ９由来の変異体を使用することができる。加えて、多様な種に由来する、他のＣａｓ９オーソログも同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、様々なＰＡＭ配列に結合し、これらもまた、本発明に有用であり得るだろう。例えば、ＳｐＣａｓ９の比較的大きなサイズ（約４ｋｂのコード配列）は、ＳｐＣａｓ９  ｃＤＮＡを有するプラスミドは、細胞内で効率的に発現しえないことを意味する。逆に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列はおよそ、ＳｐＣａｓ９より１キロベース短く、おそらく、細胞内の効率的な発現を可能とする。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳動物細胞内、およびマウスのｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、標的遺伝子を修飾することが可能である。
【０１４８】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９への代替法は、Ｃｐｆ１ファミリーに由来する、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼであって、哺乳動物細胞内の切断活性を提示するエンドヌクレアーゼを含み得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼと異なり、Ｃｐｆ１を媒介するＤＮＡの切断の結果は、短い３’突出を伴う二本鎖切断である。Ｃｐｆ１の付着末端型切断パターンは、従来の制限酵素クローニングと類似する指向性遺伝子移入であって、遺伝子編集の効率を増大させる指向性遺伝子移入の可能性を開きうる。上記で記載したＣａｓ９の変異体およびオーソログと同様に、Ｃｐｆ１もまた、ＣＲＩＳＰＲにより、ＳｐＣａｓ９が優先するＮＧＧ  ＰＡＭ部位を欠く、ＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムへとターゲティングし得る部位の数を拡大し得る。
【０１４９】
任意の機能的濃度のＣａｓタンパク質を、細胞へと導入することができる。例えば、１５マイクログラムのＣａｓ  ｍＲＮＡを、細胞へと導入することができる。他の場合には、０．５マイクログラム〜１００マイクログラムのＣａｓ  ｍＲＮＡを導入することができる。０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムのＣａｓ  ｍＲＮＡを導入することができる。
【０１５０】
場合によって、二重ニカーゼ法を使用して、二本鎖切断またはゲノム切断を導入することができる。Ｃａｓタンパク質は、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の公知のアミノ酸において変異させ、これにより、１つのヌクレアーゼドメインの活性を欠失させ、一本鎖切断を生じることが可能な、ニカーゼＣａｓタンパク質を作製することができる。２つの顕著に異なるガイドＲＮＡターゲティング逆鎖を伴うニカーゼは、標的部位内でＤＳＢを作製するのに用いることができる（「二重ニック」ＣＲＩＳＰＲ系または「二重ニカーゼ」ＣＲＩＳＰＲ系と称することが多い）。この手法は、２つのオフターゲットニックが、ＤＳＢを引き起こすのに十分に近接して作製される可能性は小さいので、標的特異性を劇的に増大させうる。
【０１５１】
Ｃａｓ９などのヌクレアーゼは、使用の前に同一性および効力について試験することができる。例えば、同一性および効力は、分光光度解析、ＲＮＡアガロースゲル解析、ＬＣ−ＭＳ、エンドトキシン解析および無菌性試験のうちの少なくとも１つを使用して決定することができる。場合によって、同一性試験は、臨床／治療的使用に許容されるレベルを決定することができる。例えば、許容される分光光度解析結果は、１．０±０．１ｍｇ／ｍＬにおける１０５±１０μＬ／バイアルであり得る。許容される分光光度解析結果はまた、１．０±０．１ｍｇ／ｍＬにおける約９０〜１２０±１０μＬ／バイアルまたは約０．１〜５．０±０．１ｍｇ／ｍＬにおける約９０〜１２０±１０μＬ／バイアルであり得る。
【０１５２】
場合によって、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼは、約１．０±０．１のＵＶ２６０／２８０比を有し得る。ＵＶ２６０−２８０比は、約１．０〜５．０±０．１であり得る。
【０１５３】
場合によって、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼは、ＲＮＡアガロースゲル解析によって測定される完全性／サイズを有することができる。Ｃａｓ９のサイズは、約４５００塩基であり得る。Ｃａｓ９のサイズは、約４０００〜約８０００塩基であり得る。Ｃａｓ９のサイズは、約４０００〜約５０００塩基、約５０００〜約６０００塩基、約６０００〜約７０００塩基、約７０００〜約８０００塩基であり得る。場合によって、バイオアナライザを用いて、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼ配列のサイズを決定することができる。バイオアナライザは、約４０００〜約５０００塩基、約５０００〜約６０００塩基、約６０００〜約７０００塩基、約７０００〜約８０００塩基であり得るＣａｓ９配列のサイズを決定することができる。
【０１５４】
場合によって、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼのエンドトキシンレベルを決定することができる。エンドトキシン試験は、リムルスアッセイであり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、１０ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、８ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、４ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。
【０１５５】
場合によって、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼは、無菌性試験を受けることができる。無菌性試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、０であり得る、または培養物における増殖なしによって表示することができる。無菌性試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、０．５％未満の増殖であり得る。無菌性試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、１％未満の増殖であり得る。
【０１５６】
場合によって、Ｃａｓ９配列などのヌクレアーゼ配列をシーケンシングして、その同一性を確認することができる。例えば、インプットＣａｓ９  ｍＲＮＡ転写鋳型は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡロットの産生の前に、約４倍被覆度でシーケンシングすることができる。精製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物（produce）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって評価して、ｍＲＮＡが、Ｃａｓ９に予想されるサイズであり、他のいかなるｍＲＮＡ種も、臨床または治療用製品内に存在しないことを検証することができる。場合によって、精製されたｍＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）媒介の逆転写に続くＤＮＡシーケンシングによる検証を受けて、ヌクレオチドレベルでの同一性を検証するであろう。
【０１５７】
場合によって、ヌクレアーゼ機能性の効力は、試行的ランにより試験することができる。例えば、Ｃａｓ９は、３名の独立したドナーに由来する初代ヒトＴ細胞において機能的効力について試験することができる。試薬送達は、患者試料と同じ様式で行うことができる。効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて５０％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて６０％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて６５％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて７０％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて７５％を満たすまたはこれを超えうる。
【０１５８】
ＩＩ．ガイドポリ核酸
ガイドポリ核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることが可能である。ガイドポリ核酸は、一本鎖または二本鎖であることが可能である。場合によって、ガイドポリ核酸は、一本鎖領域および二本鎖領域の領域を含有し得る。ガイドポリ核酸はまた、二次構造を形成し得る。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語、およびその文法的同等物は、標的ＤＮＡに特異的であることが可能であり、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し得るＲＮＡを指す場合がある。ガイドＲＮＡは、標的部位を指定し、ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を、切断のために指定される標的ＤＮＡへとガイドする、ガイド配列またはスペーサー配列を含み得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体を、異なる遺伝子へとターゲティングし、ターゲティングされた二本鎖切断を実施し得る。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ（また、プロトスペーサーとも呼ばれる）との塩基対合相補性、および２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置において生じる。場合によって、ｇＲＮＡは、一般的に発現される転写物内の初期エクソンに位置するｇＲＮＡを同定することができるアルゴリズムを使用してデザインすることができる。候補ｇＲＮＡは、次の項目を考慮に入れ得るスコアリングシステムを使用して、オフターゲット可能性によってランク付けすることができる：（ａ）ｇＲＮＡ配列およびいずれかの密接にマッチするゲノム配列の間のミスマッチの総数；（ｂ）ＰＡＭ部位の近くに収まるミスマッチのための活性における負の効果と相関するＰＡＭ部位と比べたミスマッチ位置（複数可）；（ｃ）ガイド−ＤＮＡ相互作用破壊における近接ミスマッチの累積効果を説明するミスマッチ間の距離；ならびにこれらの任意の組合せ。場合によって、ｇＲＮＡおよびゲノム標的部位の間のより多い数のミスマッチは、当該部位のＣＲＩＳＰＲ媒介性切断のより低い可能性を生じ得る。場合によって、ミスマッチ位置は、ＰＡＭ部位に直接隣接する。他の場合では、ミスマッチ位置は、ＰＡＭ部位から１ヌクレオチド〜最大１００キロベース離れていてもよい。ミスマッチを含む候補ｇＲＮＡは、場合によってＰＡＭに隣接していなくてよい。他の場合では、ミスマッチを含む少なくとも２つの候補ｇＲＮＡは、互いから１ヌクレオチド〜最大１００キロベース離れたゲノムに結合し得る。ミスマッチは、ヌクレオチドの置換であり得る。例えば、場合によって、Ｇが、Ｔに代えて置換される。ｇＲＮＡおよびゲノムの間のミスマッチは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集の忠実度減少を可能にすることができる。場合によって、正のスコアリングのｇＲＮＡは、約１１０ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列に対するミスマッチを含有しなくてよい。他の場合では、正のスコアリングのｇＲＮＡは、約１１０ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列に対する最大３個のミスマッチを含有し得る。他の場合では、正のスコアリングのｇＲＮＡは、約１１０ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列に対する最大２０個のミスマッチを含有し得る。ポリ核酸は、表４の配列のいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは最大約１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または少なくともほぼこれらの比率の配列同一性および／または配列類似性を有し得る。場合によって、ガイドポリ核酸は、ホスホロチオエートであり得るヌクレオチド間連結を含有し得る。任意の数のホスホロチオエートが存在してもよい。例えば、１〜約１００個のホスホロチオエートが、ガイドポリ核酸配列に存在し得る。場合によって、１〜１０個のホスホロチオエートが存在する。場合によって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のホスホロチオエートが、ガイドポリ核酸配列に存在する。
【表４−１】
2019532080.tif 000011
【表４−２】
2019532080.tif 000012
【０１５９】
場合によって、上位スコアリングｇＲＮＡをデザインおよび選択し、それぞれのオンターゲット編集効率を、患者由来ＴＩＬおよび末梢血由来Ｔ細胞において実験的に評価することができる。場合によって、ＴｉＤＥ解析によって決定される編集効率は、少なくとも約２０％を超え得る。他の場合では、編集効率は、約２０％〜約５０％、約５０％〜約８０％、約８０％〜約１００％であり得る。場合によって、ＴｉＤＥによって測定される編集効率は、ＰＤ−１については８５％、ＣＩＳＨについては９０％であり得る。場合によって、インデルパーセントは、試行的ＧＭＰランにおいて決定することができる。例えば、最終細胞生成物は、サンガーシーケンシングおよびＴＩＤＥ解析によってオンターゲットインデル形成に関して解析することができる。ゲノムＤＮＡは、対照および実験試料の両方に由来する約１×１０６個の細胞から抽出し、ＣＩＳＨなど、破壊された遺伝子を挟むプライマーを使用したＰＣＲにかけることができる。サンガーシーケンシングクロマトグラム（chromatogramp）は、対照およびノックアウト試料の比較によってインデル頻度およびインデルのサイズ分布を定量化し得るＴＩＤＥソフトウェアプログラムを使用して解析することができる。
【０１６０】
本明細書で開示される方法はまた、細胞または胚へと、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、または少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸、例えば、ＤＮＡを導入するステップも含み得る。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼと相互作用して、エンドヌクレアーゼを、その部位において、ガイドＲＮＡの５’末端が、染色体配列内の特異的プロトスペーサー配列と塩基対合する、特異的標的部位へと導きうる。
【０１６１】
ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、ある場合には、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの部分（例えば、機能的な部分）の融合により形成される、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡはまた、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡでもあり得る。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含むことが可能であり、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠きうる。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズし得る。
【０１６２】
上記で論じた通り、ガイドＲＮＡは、発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡは、細胞または生物に、ガイドＲＮＡをコードする配列およびプロモーターを含む単離ガイドＲＮＡまたは単離プラスミドＤＮＡをトランスフェクトすることにより、細胞または生物へと移入させることができる。ガイドＲＮＡはまた、ウイルスを媒介する遺伝子送達を使用するなど、他の形で、細胞または生物へと移入させることもできる。
【０１６３】
ガイドＲＮＡは、単離ガイドＲＮＡであり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、単離ＲＮＡの形態で、細胞または生物へとトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡは、任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製することができる。ガイドＲＮＡは、細胞へと、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離ＲＮＡの形態で移入させることができる。
【０１６４】
ガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメントおよびタンパク質結合性セグメントを含み得る。ＤＮＡターゲティングセグメント（またはＤＮＡターゲティング配列、またはスペーサー配列）は、標的ＤＮＡ内の特異的配列（例えば、プロトスペーサー）と相補的であり得るヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合性セグメント（またはタンパク質結合性配列）は、部位指向型修飾性ポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質など、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼと相互作用し得る。「セグメント」とは、分子のセグメント／区画／領域、例えば、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続的連なりを意味する。セグメントはまた、セグメントが、１つを超える分子の領域を含み得るように、複合体の領域／区画も意味する。例えば、場合によって、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合性セグメントは、１つのＲＮＡ分子およびタンパク質結合性セグメントであり、したがって、このＲＮＡ分子の領域を含む。他の場合には、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合性セグメントは、相補性領域に沿ってハイブリダイズさせた、２つの個別の分子を含む。
【０１６５】
ガイドＲＮＡは、２つの個別のＲＮＡ分子を含む場合もあり、単一のＲＮＡ分子を含む場合もある。例示的な単一分子のガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメントおよびタンパク質結合性セグメントの両方を含む。
【０１６６】
例示的な２分子型ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ターゲターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ＤＮＡターゲティングセグメント（例えば、スペーサー）を含み得るｃｒＲＮＡ様分子（ターゲターＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡのタンパク質結合性セグメントを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による二重鎖の半分を形成し得る、ヌクレオチドの連なりとであり得る。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡのタンパク質結合性セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成し得る、ヌクレオチドの連なりを含み得る、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーターＲＮＡ）であり得る。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの連なりは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの連なりと相補的であることが可能であり、これとハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合性ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成し得る。したがって、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有するということができる。加えて、ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントまたはスペーサー配列ももたらし得る。したがって、ｃｒＲＮＡ様分子と、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（対応する対としての）とは、ハイブリダイズして、ガイドＲＮＡを形成し得る。対象の２分子型ガイドＲＮＡは、任意の対応する、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの対を含み得る。
【０１６７】
ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントまたはスペーサー配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが、標的部位またはプロトスペーサーと塩基対合し得るように、染色体配列内の標的部位における配列、例えば、プロトスペーサー配列と相補的であり得る。場合によって、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、１０ヌクレオチドまたはほぼこの数のヌクレオチド〜２５もしくはほぼこの数のヌクレオチドまたはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と、染色体配列内の標的部位との塩基対合の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、もしくは２５を超えるヌクレオチドの長さであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ある場合には、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチドの長さであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。
【０１６８】
ガイドＲＮＡは、２０ヌクレオチドの核酸配列またはほぼこの長さの核酸配列をターゲティングし得る。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満またはほぼこの長さ未満であり得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または少なくともほぼこの長さであり得る。標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または最大でほぼこの長さであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐの５’側の２０塩基であり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列をターゲティングし得る。ガイドＲＮＡなど、ガイドポリ核酸は、表５または表６の配列のいずれかに対し少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは最大約１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または少なくともほぼこれらの比率の配列同一性および／もしくは配列類似性を有するゲノム配列に結合し得る。場合によって、ガイドＲＮＡなどのガイドポリ核酸は、ＰＡＭから約１塩基対〜約２０塩基対離れたゲノム領域に結合し得る。ガイドは、ＰＡＭから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または最大約２０塩基対離れたゲノム領域に結合し得る。
【表５】
2019532080.tif 000013
【０１６９】
操作ｇＲＮＡによりターゲティングされるゲノム配列を、表５および表６に示す。図２２は、修飾ｇＲＮＡによる、ＣＩＳＨ遺伝子のターゲティングを示す。
【表６】
2019532080.tif 000014
【０１７０】
ガイド核酸、例えば、ガイドＲＮＡは、別の核酸、例えば、細胞ゲノム内の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズし得る核酸を指す場合がある。ガイド核酸は、ＲＮＡであり得る。ガイド核酸は、ＤＮＡであり得る。ガイド核酸は、核酸部位の配列に特異的に結合するように、プログラムまたはデザインすることができる。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含むことが可能であり、単一のガイド核酸と呼ばれうる。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことが可能であり、二重ガイド核酸と呼ばれうる。
【０１７１】
ガイド核酸は、核酸に新たな特色または増強された特色をもたらす、１または複数の修飾を含み得る。ガイド核酸は、核酸アフィニティータグを含み得る。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０１７２】
ガイド核酸は、例えば、５’末端もしくは３’末端において、またはこの近傍に、標的核酸内の配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を含み得る。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に、標的核酸と相互作用し得る。スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側または３’側に位置する標的核酸にハイブリダイズし得る。スペーサー配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または少なくともほぼこの長さであり得る。スペーサー配列の長さは、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または最大でほぼこの長さであり得る。
【０１７３】
ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成するｄｓＲＮＡ二重鎖領域も含み得る。例えば、ガイドＲＮＡにより形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループおよびステムの長さは、変動し得る。例えば、ループは、約３〜約１０ヌクレオチドの長さの範囲であることが可能であり、ステムは、約６〜約２０塩基対の長さの範囲であり得る。ステムは、１〜約１０ヌクレオチドの、１または複数のバルジを含み得る。第２の領域の全長は、約１６〜約６０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。例えば、ループは、４ヌクレオチドの長さであり得るか、またはほぼこの長さであることが可能であり、ステムは、１２塩基対であり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓタンパク質など、ＲＮＡ結合性タンパク質と複合体を形成し得る、タンパク質結合性セグメントを含み得る。
【０１７４】
ガイドＲＮＡはまた、５’末端または３’末端において、本質的に一本鎖であり得るテール領域も含み得る。例えば、テール領域は、ある場合には、目的の細胞内の任意の染色体配列と相補性ではなく、ある場合には、ガイドＲＮＡの残余部分と相補性ではない。さらに、テール領域の長さは、変動し得る。テール領域は、４ヌクレオチドの長さを超えうるか、またはほぼこの長さを超えうる。例えば、テール領域の長さは、５または約５〜６０または約６０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
【０１７５】
ガイドＲＮＡは、細胞または胚へと、ＲＮＡ分子として導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写することもでき、かつ／または化学的に合成することもできる。次いで、ガイドＲＮＡは、細胞または胚へと、ＲＮＡ分子として導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、細胞または胚へと、ＲＮＡ以外の核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の形態で導入することもできる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞内または胚内のガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列に作動可能に連結することができる。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結することができる。
【０１７６】
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、直鎖状でもあり得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、環状でもあり得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列はまた、ベクターの一部でもあり得る。ベクターの一部の例は、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターを含み得る。例えば、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター内に存在する。適切なプラスミドベクターの、他の非限定的な例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびこれらの変異体を含む。さらに、ベクターは、さらなる発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択用マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。
【０１７７】
ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両方を、細胞へと、ＤＮＡ分子として導入する場合、各々は、個別の分子（例えば、融合タンパク質のコード配列を含有する１つのベクターと、ガイドＲＮＡのコード配列を含有する第２のベクターと）の一部の場合もあり、同じ分子（例えば、融合タンパク質およびガイドＲＮＡの両方のコード（および調節）配列を含有する１つのベクター）の一部の場合もある。
【０１７８】
Ｃａｓ９タンパク質またはその任意の誘導体などのＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するように、ガイドＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。ＲＮＰ複合体は、初代免疫細胞へと導入することができる。ＲＮＰ複合体の導入は、時限的であり得る。細胞は、細胞周期のＧ１期、Ｓ期、および／またはＭ期において、他の細胞と同期し得る。ＲＮＰ複合体は、ＨＤＲを増強するような細胞期において送達することができる。ＲＮＰ複合体は、相同性により導かれる修復を容易とし得る。
【０１７９】
ガイドＲＮＡはまた、修飾することもできる。修飾は、化学的変更、合成修飾、ヌクレオチド付加、および／またはヌクレオチド控除を含み得る。修飾はまた、ＣＲＩＳＰＲゲノムの操作も増強し得る。修飾は、ｇＲＮＡのキラリティーを変更し得る。場合によって、キラリティーは、修飾後において、一様または立体的に純粋であり得る。ガイドＲＮＡは、合成したものであり得る。合成ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲゲノムの操作を増強し得る。ガイドＲＮＡはまた、切断型でもあり得る。切断を使用して、所望されないオフターゲットの変異誘発を低減することができる。切断は、任意の数のヌクレオチド欠失を含み得る。例えば、切断は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡは、任意の長さの標的相補性領域を含み得る。例えば、標的相補性領域は、２０ヌクレオチド未満の長さであり得る。標的相補性領域は、２０ヌクレオチドを超える長さであり得る。標的相補性領域は、ＰＡＭ配列に直接近接した約５ｂｐ〜約２０ｂｐをターゲティングし得る。標的相補性領域は、ＰＡＭ配列に直接近接した約１３ｂｐをターゲティングし得る。
【０１８０】
場合によって、ガイドポリ核酸の効力は、試行的ランにより試験することができる。例えば、ガイドポリ核酸は、３名の独立したドナーに由来する初代ヒトＴ細胞において機能的効力について試験することができる。試薬送達は、患者試料と同じ様式で行うことができる。効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて５０％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて６０％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて６５％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて７０％を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて７５％を満たすまたはこれを超えうる。
【０１８１】
ＣＲＩＳＰＲ系は、任意の手段を使用して、１つの細胞または複数（pluarality）の細胞に導入することができる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、電気穿孔またはヌクレオフェクション（nucleofection）によって導入することができる。例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する電気穿孔もまた、細胞への核酸の送達に使用することもできる。電気穿孔パラメーターは、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するように調整することができる。電気穿孔デバイスは、指数関数的減衰、時定数、および方形波など、複数の電気波形パルスの設定項目を有し得る。あらゆる細胞型は、適用されるパルスパラメータ（例えば、電圧、キャパシタンス、および抵抗）に依存する、固有の最適電界強度（Ｅ）を有する。最適電界強度の適用は、膜貫通電圧の誘導による電気透過化であって、核酸が細胞膜を通過することを可能とする電気透過化を引き起こす。場合によって、電気穿孔パルスの電圧、電気穿孔パルス幅、パルス数、細胞密度、およびチップ型は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するように調整することができる。
【０１８２】
場合によって、Ｎｅｏｎトランスフェクション系を用いることができる。Ｎｅｏｎ系は、中央制御モジュールと、３フィート長の電気コードによって中央制御モジュールに接続され得る電気穿孔チャンバーと、特殊ピペットとを含む３成分電気穿孔装置であり得る。場合によって、特殊ピペットは、交換可能および／または使い捨て滅菌チップを装着することができる。場合によって、電気穿孔チャンバーは、交換可能／使い捨て滅菌電気穿孔キュベットを装着することができる。場合によって、Ｎｅｏｎ系などの系の製造業者によって供給された標準電気穿孔緩衝剤は、ＧＭＰ認定溶液および緩衝剤と置き換えることができる。場合によって、標準電気穿孔緩衝剤は、ＧＭＰグレードリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と置き換えることができる。試料電気穿孔の開始前に、制御モジュールにおいて自己診断系チェックを行って、Ｎｅｏｎ系が適切に機能していることを確実にすることができる。場合によって、トランスフェクションは、ｃＧＭＰ施設におけるクラス１０，０００クリーンルーム内のクラス１，０００バイオセイフティーキャビネットで行うことができる。訓練を受けた医療技術者は、製造プロセス全体を通して無菌的技法を使用することができ、産物は、無菌性について最終的に試験することができる。
【０１８３】
場合によって、電気穿孔パルスの電圧を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔電圧は、約５００ボルト未満であり得る。場合によって、電気穿孔電圧は、少なくとも約５００ボルト、少なくとも約６００ボルト、少なくとも約７００ボルト、少なくとも約８００ボルト、少なくとも約９００ボルト、少なくとも約１０００ボルト、少なくとも約１１００ボルト、少なくとも約１２００ボルト、少なくとも約１３００ボルト、少なくとも約１４００ボルト、少なくとも約１５００ボルト、少なくとも約１６００ボルト、少なくとも約１７００ボルト、少なくとも約１８００ボルト、少なくとも約１９００ボルト、少なくとも約２０００ボルト、少なくとも約２１００ボルト、少なくとも約２２００ボルト、少なくとも約２３００ボルト、少なくとも約２４００ボルト、少なくとも約２５００ボルト、少なくとも約２６００ボルト、少なくとも約２７００ボルト、少なくとも約２８００ボルト、少なくとも約２９００ボルトまたは少なくとも約３０００ボルトであり得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔パルスの電圧は、細胞型に特異的であり得る。例えば、１９００ボルトの電気穿孔電圧は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、約１３５０ボルトの電気穿孔電圧は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、またはＴ細胞などの初代ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔電圧の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、約１０００ボルト〜約１３００ボルトの間の電気穿孔電圧は、ヒト５７８Ｔ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。
【０１８４】
場合によって、電気穿孔パルス幅を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔パルス幅は、約５ミリ秒未満であり得る。場合によって、電気穿孔幅は、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約６ミリ秒、少なくとも約７ミリ秒、少なくとも約８ミリ秒、少なくとも約９ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１１ミリ秒、少なくとも約１２ミリ秒、少なくとも約１３ミリ秒、少なくとも約１４ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約１６ミリ秒、少なくとも約１７ミリ秒、少なくとも約１８ミリ秒、少なくとも約１９ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約２１ミリ秒、少なくとも約２２ミリ秒、少なくとも約２３ミリ秒、少なくとも約２４ミリ秒、少なくとも約２５ミリ秒、少なくとも約２６ミリ秒、少なくとも約２７ミリ秒、少なくとも約２８ミリ秒、少なくとも約２９ミリ秒、少なくとも約３０ミリ秒、少なくとも約３１ミリ秒、少なくとも約３２ミリ秒、少なくとも約３３ミリ秒、少なくとも約３４ミリ秒、少なくとも約３５ミリ秒、少なくとも約３６ミリ秒、少なくとも約３７ミリ秒、少なくとも約３８ミリ秒、少なくとも約３９ミリ秒、少なくとも約４０ミリ秒、少なくとも約４１ミリ秒、少なくとも約４２ミリ秒、少なくとも約４３ミリ秒、少なくとも約４４ミリ秒、少なくとも約４５ミリ秒、少なくとも約４６ミリ秒、少なくとも約４７ミリ秒、少なくとも約４８ミリ秒、少なくとも約４９ミリ秒、または少なくとも約５０ミリ秒であり得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔パルス幅は、細胞型に特異的であり得る。例えば、３０ミリ秒の電気穿孔パルス幅は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、約１０ミリ秒の電気穿孔幅は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔幅の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、約２０ミリ秒〜約３０ミリ秒の間の電気穿孔幅は、ヒト５７８Ｔ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。
【０１８５】
場合によって、電気穿孔パルスの数を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔は、単一のパルスを含み得る。場合によって、電気穿孔は、１つを超えるパルスを含み得る。場合によって、電気穿孔は、２つのパルス、３つのパルス、４つのパルス、５つのパルス、６つのパルス、７つのパルス、８つのパルス、９つのパルス、または１０またはそれよりも多いパルスを含み得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔パルスの数は、細胞型に特異的であり得る。例えば、単一のパルスによる電気穿孔は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、３つのパルスによる電気穿孔は、初代細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔幅の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、約１つ〜約３つの間のパルスによる電気穿孔は、ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。本明細書で記載される核酸送達プラットフォーム、例えば、ヌクレオフェクションまたは電気穿孔のうちのいずれかによる、細胞のゲノム破壊の効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％を超えうるか、またはほぼこれらの比率であり得る。
【０１８６】
場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度は、細胞約１×１０５個未満であり得る。場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度は、細胞少なくとも約１×１０５個、細胞少なくとも約２×１０５個、細胞少なくとも約３×１０５個、細胞少なくとも約４×１０５個、細胞少なくとも約５×１０５個、細胞少なくとも約６×１０５個、細胞少なくとも約７×１０５個、細胞少なくとも約８×１０５個、細胞少なくとも約９×１０５個、細胞少なくとも約１×１０６個、細胞少なくとも約１．５×１０６個、細胞少なくとも約２×１０６個、細胞少なくとも約２．５×１０６個、細胞少なくとも約３×１０６個、細胞少なくとも約３．５×１０６個、細胞少なくとも約４×１０６個、細胞少なくとも約４．５×１０６個、細胞少なくとも約５×１０６個、細胞少なくとも約５．５×１０６個、細胞少なくとも約６×１０６個、細胞少なくとも約６．５×１０６個、細胞少なくとも約７×１０６個、細胞少なくとも約７．５×１０６個、細胞少なくとも約８×１０６個、細胞少なくとも約８．５×１０６個、細胞少なくとも約９×１０６個、細胞少なくとも約９．５×１０６個、細胞少なくとも約１×１０７個、細胞少なくとも約１．２×１０７個、細胞少なくとも約１．４×１０７個、細胞少なくとも約１．６×１０７個、細胞少なくとも約１．８×１０７個、細胞少なくとも約２×１０７個、細胞少なくとも約２．２×１０７個、細胞少なくとも約２．４×１０７個、細胞少なくとも約２．６×１０７個、細胞少なくとも約２．８×１０７個、細胞少なくとも約３×１０７個、細胞少なくとも約３．２×１０７個、細胞少なくとも約３．４×１０７個、細胞少なくとも約３．６×１０７個、細胞少なくとも約３．８×１０７個、細胞少なくとも約４×１０７個、細胞少なくとも約４．２×１０７個、細胞少なくとも約４．４×１０７個、細胞少なくとも約４．６×１０７個、細胞少なくとも約４．８×１０７個、または細胞少なくとも約５×１０７個であり得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔のための出発細胞密度は、細胞型に特異的であり得る。例えば、電気穿孔のための出発細胞密度であって、細胞１．５×１０６個の出発細胞密度は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、電気穿孔のための出発細胞密度であって、細胞５×１０６個の出発細胞密度は、ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、電気穿孔のための出発細胞密度であって、細胞５．６×１０６〜５×１０７個の間の出発細胞密度は、Ｔ細胞などのヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。
【０１８７】
場合によって、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ解析を実施して、操作ガイドＲＮＡの特異性を決定することができる。ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼによる、オフターゲット切断についての、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑプロファイリングの一般的な機構およびプロトコールについては、Tsai,  S.ら、「GUIDE-Seq  enables  genome-wide  profiling  of  off-target  cleavage  by  CRISPR  system  nucleases」Nature、３３巻：１８７〜１９７頁（２０１５年）において論じられている。次世代シーケンシングによってオフターゲット頻度を評価するために、ヒト初代Ｔ細胞に、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび抗ＣＩＳＨ  ｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡをトランスフェクトすることができる。ゲノムＤＮＡは、トランスフェクション約７２時間後からトランスフェクト細胞から単離し、潜在的オフターゲット部位でＰＣＲ増幅することができる。潜在的オフターゲット部位は、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｉｓｕｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇデータベース（ＷＧＥ）アルゴリズムを使用して予測することができる。候補オフターゲット部位は、オンターゲット部位に対する配列相同性に基づき選択することができる。場合によって、ｇＲＮＡおよびゲノム標的部位の間に約４個またはそれに満たないミスマッチを有する部位を用いることができる。候補オフターゲット部位ごとに、２つのプライマー対をデザインすることができる。ＰＣＲアンプリコンは、無処置（対照）およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ処置細胞の両方から得ることができる。ＰＣＲアンプリコンは、プールすることができる。ＮＧＳライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ  Ｎａｎｏ  ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して調製することができる。試料は、２５０ｂｐペアードエンドワークフローを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ機械において解析することができる。場合によって、ｇＲＮＡライブラリー当たり約４千万種からのマッピング可能な（mappable）ＮＧＳリードを獲得することができる。この値は、ｇＲＮＡの候補オフターゲット部位ごとに約４５０，０００種のリードの平均数に等しい場合がある。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊の検出は、ゲノム遺伝子座における１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％もの低さの頻度であり得る。
【０１８８】
計算的予測を使用して、ＰＤ−１および／またはＣＩＳＨ機能的破壊など、ターゲティングされる遺伝子の最も安全な選択である可能性が高い候補ｇＲＮＡを選択することができる。次に、候補ｇＲＮＡは、潜在的オフターゲット部位の計算的予測によって導かれる集中的手法を使用して、経験的に試験することができる。場合によって、ｇＲＮＡオフターゲット安全性の評価は、次世代ディープシーケンシング法を利用して、ｇＲＮＡごとにＣＲＩＳＰＲデザインツールによって予測される潜在的オフターゲット部位を解析することができる。場合によって、ゲノムにおけるいずれかの配列（完全マッチが意図される標的以外の）に対して３個よりも少ないミスマッチを有するｇＲＮＡを選択することができる。場合によって、ゲノムにおけるいずれかの配列に対して５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１個よりも少ないミスマッチを有するｇＲＮＡを選択することができる。場合によって、コンピュータシステムまたはソフトウェアを用いて、低いオフターゲット可能性の予測を有する候補ｇＲＮＡの推奨を提供することができる。
場合によって、潜在的オフターゲット部位は、次のうち少なくとも１つにより同定することができる：ＧＵＩＤＥ−ＳｅｑおよびターゲティングされるＰＣＲ増幅および次世代シーケンシング。加えて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ処置細胞など、修飾された細胞は、核型分析にかけて、任意の染色体再配列または転移を同定することができる。
【０１８９】
ｇＲＮＡは、任意の機能的濃度で導入することができる。例えば、ｇＲＮＡは、１０マイクログラムで細胞に導入することができる。他の場合では、ｇＲＮＡは、０．５マイクログラム〜１００マイクログラムで導入することができる。ｇＲＮＡは、０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００マイクログラムで導入することができる。
【０１９０】
本明細書では、操作ＴＩＬ細胞を作製する方法であって、少なくとも１つの修飾を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップと；少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを導入するステップとを含み、ｇＲＮＡが、少なくとも１つの内因性ゲノムと相補的な、少なくとも１つの配列を含む方法が開示される。場合によって、修飾は、５’末端上の修飾、３’末端上の修飾、５’末端〜３’末端における修飾、単一塩基の修飾、２’−リボース修飾、またはこれらの任意の組合せである。修飾は、塩基の置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。
【０１９１】
場合によって、修飾は、化学修飾である。修飾は、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７−メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ−Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄＳｐａｃｅｒ、ＰＣスペーサー、ｒＳｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ  １８、Ｓｐａｃｅｒ  ９、３’−３’修飾、５’−５’修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ  ＴＥＧ、ＤＮＰ−Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ−ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラーレンＣ２、ソラーレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、ＤＡＢＣＹＬ  ＳＥ、ｄＴ−ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ−２１、ＱＳＹ−３５、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’−０−メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ−メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエート（phosphothioate）ＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート、またはこれらの任意の組合せから選択することができる。
【０１９２】
本明細書で記載されるポリ核酸は、修飾することができる。修飾は、ポリ核酸の任意の位置において施すことができる。単一のポリ核酸に、１つを超える修飾を施すことができる。ポリ核酸は、修飾後に、品質管理を経る場合がある。場合によって、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。修飾は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、またはこれらの任意の組合せであり得る。ポリ核酸はまた、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７−メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ−Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄＳｐａｃｅｒ、ＰＣスペーサー、ｒＳｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ  １８、Ｓｐａｃｅｒ  ９、３’−３’修飾、５’−５’修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ  ＴＥＧ、ＤＮＰ−Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ−ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラーレンＣ２、ソラーレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、ＤＡＢＣＹＬ  ＳＥ、ｄＴ−ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ−２１、ＱＳＹ−３５、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’−０−メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ−メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、またはこれらの任意の組合せにより修飾することもできる。代表的な２’Ｏ−メチルＲＮＡ修飾ｇＲＮＡを、図２２に示す。場合によって、修飾は、永続性であり得る。他の場合には、修飾は、一過性であり得る。場合によって、複数の修飾を、ポリ核酸に施す。ポリ核酸の修飾は、それらのコンフォメーション、極性、疎水性、化学反応性、塩基対合相互作用、またはこれらの任意の組合せなど、ヌクレオチドの物理化学的特性を変更し得る。
【０１９３】
修飾はまた、ホスホロチオエート置換でもあり得る。場合によって、天然のホスホジエステル結合は、細胞内ヌクレアーゼによる急速な分解を受けやすく、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換を使用する、ヌクレオチド間連結の修飾は、細胞内分解による加水分解に対して、より安定であり得る。修飾は、ポリ核酸の安定性を増大させることができる。修飾はまた、生体活性も増強し得る。場合によって、ホスホロチオエート増強型ＲＮＡポリ核酸は、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、仔ウシ血清ヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組合せを阻害し得る。これらの特性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの、ヌクレアーゼへの曝露の可能性が高い適用における、ＰＳ−ＲＮＡポリ核酸の使用を可能とし得る。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ポリ核酸の５’末端または３’末端の、最後の３〜５ヌクレオチドの間に導入し、これにより、エキソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。場合によって、ホスホロチオエート結合は、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減するように、ポリ核酸の全体を通して付加することもできる。
【０１９４】
場合によって、修飾をスクリーニングすることができる。スクリーニングは、免疫原性についての試験、毒性についての試験、転写効率についての試験、翻訳効率についての試験、またはこれらの任意の組合せを含み得るがこれらに限定されない。場合によって、修飾は、免疫原性ではありえない。修飾は、毒性ではありえない。場合によって、候補修飾は、ポリ核酸へと組み込む前にスクリーニングする。他の場合には、異なる修飾を伴うポリ核酸をスクリーニングして、付加される修飾の、免疫原性、毒性、効能、または任意の組合せのレベルを決定する。場合によって、修飾を、ポリ核酸の逆転写を支持するその能力についてスクリーニングする。場合によって、修飾は、シュードウリジン−５’−三リン酸修飾である（例えば、図３２を参照されたい）。他の場合には、修飾は、５−メチルシチジン−５’−三リン酸修飾である（例えば、図３２を参照されたい）。修飾はまた、キラリティーの変化も含み得る。
【０１９５】
ガイドポリ核酸は、様々な方法、例えば、自動式固相合成によりアセンブルすることができる。ポリ核酸は、標準的な固相ＤＮＡ／ＲＮＡ合成を使用して構築することができる。ポリ核酸はまた、合成手順を使用して構築することもできる。ポリ核酸はまた、手作業により合成することもでき、完全に自動式で合成することもできる。場合によって、合成手順は、以下を含み得る；まず、５’−ヒドロキシルオリゴヌクレオチドを、対応する５’−Ｈ−ホスホネートモノエステルへと転換し、続いて、イミダゾールの存在下で、酸化させて、活性化５’−ホスホロイミダゾリデートへと酸化し、最後に、固体支持体上で、ピロリン酸と反応させうる。この手順は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはこれらの任意の組合せなど、合成後の精製ステップを含み得る。
【０１９６】
場合によって、修飾は、「ｍ」として表示される２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加である。ホスホチオエート骨格は、「（ｐｓ）」として表示することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基〜１５０塩基において実施することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基〜４塩基において実施することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、２つの塩基上で実施することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、４つの塩基上で実施することができる。修飾はまた、切断でもあり得る。切断は、５つの塩基の切断であり得る。場合によって、修飾は、Ｃ末端およびＮ末端ヌクレオチドで施され、例えば：
【化１】
2019532080.tif 000015
であり得る。
【０１９７】
ガイドポリ核酸は、任意の塩基頻度を有し得る。例えば、ガイドポリ核酸は、２９個のＡ、１７個のＣ、２３個のＧ、２３個のＵ、３個のｍＧ、１個のｍＣおよび４個のｍＵを有し得る。ガイドポリ核酸は、任意のヌクレオチド塩基比を有し得る。例えば、ガイドポリ核酸は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１〜５％、３〜８％、５〜１２％、１０〜１５％、８〜２０％、１５〜２５％、２０〜３０％、２５〜３５％または最大約３０〜４０％のアデニンのパーセントを有し得る。ガイドポリ核酸は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１〜５％、３〜８％、５〜１２％、１０〜１５％、８〜２０％、１５〜２５％、２０〜３０％、２５〜３５％または最大約３０〜４０％のシトシンのパーセントを有し得る。ガイドポリ核酸は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１〜５％、３〜８％、５〜１２％、１０〜１５％、８〜２０％、１５〜２５％、２０〜３０％、２５〜３５％または最大約３０〜４０％のチミンのパーセントを有し得る。ガイドポリ核酸は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１〜５％、３〜８％、５〜１２％、１０〜１５％、８〜２０％、１５〜２５％、２０〜３０％、２５〜３５％または最大約３０〜４０％のグアニンのパーセントを有し得る。ガイドポリ核酸は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１〜５％、３〜８％、５〜１２％、１０〜１５％、８〜２０％、１５〜２５％、２０〜３０％、２５〜３５％または最大約３０〜４０％のウラシルのパーセントを有し得る。ガイドポリ核酸は、約１〜約１００ヌクレオチドを有し得る。ガイドポリ核酸は、約１〜３０個の単一ポリヌクレオチドを有し得る。ガイドポリ核酸は、約１〜１０、１０〜２０または２０〜３０個の単一ヌクレオチドを有し得る。
【０１９８】
ガイドポリ核酸（guiding  polynucleic  acid）（ガイドポリ核酸（guide  polynucleic  acid）とも称される）は、使用の前に同一性および効力について試験することができる。例えば、同一性および効力は、分光光度解析、ＲＮＡアガロースゲル解析、ＬＣ−ＭＳ、エンドトキシン解析および無菌性試験のうちの少なくとも１つを使用して決定することができる。場合によって、同一性試験は、臨床／治療的使用に許容されるレベルを決定することができる。例えば、許容される分光光度解析結果は、５．０±０．５ｍｇ／ｍＬにおける１４±２μＬ／バイアルであり得る。許容される分光光度解析結果はまた、５．０±０．５ｍｇ／ｍＬにおける約１０〜２０±２μＬ／バイアルまたは約３．０〜７．０±０．５ｍｇ／ｍＬにおける約１０〜２０±２μＬ／バイアルであり得る。ガイドポリ核酸の許容される臨床／治療用サイズは、約１００塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約５塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約２０塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約４０塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約６０塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約８０塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約１００塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約１１０塩基〜約１５０塩基であり得る。ガイドポリ核酸の臨床／治療用サイズは、約１２０塩基〜約１５０塩基であり得る。
【０１９９】
場合によって、ガイドポリ核酸の質量を決定することができる。質量は、ＬＣ−ＭＳアッセイによって決定することができる。質量は、約３２，４６１．０ａｍｕであり得る。ガイドポリ核酸は、約３０，０００ａｍｕ〜約５０，０００ａｍｕの質量を有し得る。ガイドポリ核酸は、約３０，０００ａｍｕ〜４０，０００ａｍｕ、約４０，０００ａｍｕ〜約５０，０００ａｍｕの質量を有し得る。質量は、ガイドポリ核酸のナトリウム塩のものであり得る。
【０２００】
場合によって、ガイドポリ核酸のエンドトキシンレベルを決定することができる。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、１０ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、８ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、４ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。
【０２０１】
場合によって、ガイドポリ核酸は、無菌性試験に供することができる。無菌性試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、０であり得る、または培養物における増殖なしによって表示することができる。無菌性試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、０．５％未満の増殖であり得る。無菌性試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、１％未満の増殖であり得る。
【０２０２】
処置レジメン
処置レジメンにおいて使用される細胞が本明細書に開示される。例えば、対象は、がんまたは疾患の処置のための処置レジメンの一部として操作細胞を受けることができる。処置レジメンは、少数を挙げれば、外科手術、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、免疫刺激性剤、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗生物質または制吐薬を含み得る。場合によって、細胞組成物は、対象へと、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と共に（例えば、これらの前に、これらと同時に、またはこれらの後で）投与することができる。場合によって、拡大された細胞は、手術の前に投与することもでき、手術の後で投与することもできる。手術は、場合によって腫瘍切除であり得る。手術を行って、ＴＩＬを単離することができる。
【０２０３】
本出願を手に取れば、当業者は、投与のための細胞の治療有効量を決定することができる。場合によって、細胞約５×１０１０個を、対象へと投与する。場合によって、細胞約５×１０１０個は、対象へと投与される細胞の量の中央値を表す。一部の実施形態では、細胞約５×１０１０個は、対象において、治療応答をもたらすのに必要である。一部の実施形態では、細胞少なくとも約１×１０６個、細胞少なくとも約２×１０６個、細胞少なくとも約３×１０６個、細胞少なくとも約４×１０６個、細胞少なくとも約５×１０６個、細胞少なくとも約６×１０６個、細胞少なくとも約６×１０６個、細胞少なくとも約８×１０６個、細胞少なくとも約９×１０６個、細胞１×１０７個、細胞少なくとも約２×１０７個、細胞少なくとも約３×１０７個、細胞少なくとも約４×１０７個、細胞少なくとも約５×１０７個、細胞少なくとも約６×１０７個、細胞少なくとも約６×１０７個、細胞少なくとも約８×１０７個、細胞少なくとも約９×１０７個、細胞少なくとも約１×１０８個、細胞少なくとも約２×１０８個、細胞少なくとも約３×１０８個、細胞少なくとも約４×１０８個、細胞少なくとも約５×１０８個、細胞少なくとも約６×１０８個、細胞少なくとも約６×１０８個、細胞少なくとも約８×１０８個、細胞少なくとも約９×１０８個、細胞少なくとも約１×１０９個、細胞少なくとも約２×１０９個、細胞少なくとも約３×１０９個、細胞少なくとも約４×１０９個、細胞少なくとも約５×１０９個、細胞少なくとも約６×１０９個、細胞少なくとも約６×１０９個、細胞少なくとも約８×１０９個、細胞少なくとも約９×１０９個、細胞少なくとも約１×１０１０個、細胞少なくとも約２×１０１０個、細胞少なくとも約３×１０１０個、細胞少なくとも約４×１０１０個、細胞少なくとも約５×１０１０個、細胞少なくとも約６×１０１０個、細胞少なくとも約６×１０１０個、細胞少なくとも約８×１０１０個、細胞少なくとも約９×１０１０個、細胞少なくとも約１×１０１１個、細胞少なくとも約２×１０１１個、細胞少なくとも約３×１０１１個、細胞少なくとも約４×１０１１個、細胞少なくとも約５×１０１１個、細胞少なくとも約６×１０１１個、細胞少なくとも約６×１０１１個、細胞少なくとも約８×１０１１個、細胞少なくとも約９×１０１１個、または細胞少なくとも約１×１０１２個を、対象へと投与する。例えば、細胞約５×１０１０個を、対象へと投与することができる。別の例では、細胞３×１０６個で始めて、細胞を、細胞約５×１０１０個へと拡大し、対象へと投与することができる。場合によって、細胞は、治療に十分な数へと拡大する。例えば、細胞５×１０７個は急速な拡大を経て、治療的使用に十分な数を作製することができる。場合によって、治療的使用に十分な数は、５×１０１０個であり得る。任意の数の細胞を、治療的使用のために注入することができる。例えば、患者に、端点を含む、１×１０６〜５×１０１２個の間の数の細胞を注入することができる。患者に、患者のために作製し得るのみの数の細胞を注入することができる。場合によって、患者へと注入される細胞は、全てが操作細胞であるわけではない。例えば、患者へと注入される細胞のうちの、少なくとも９０％は、操作細胞であり得��。他の場合には、患者へと注入される細胞のうちの、少なくとも４０％は、操作細胞であり得る。患者において治療的に有効であるのに必要な細胞の量は、細胞の生存率と、細胞を遺伝子改変した効率とに応じて変動し得る。場合によって、遺伝子改変後における細胞の生存率の積（例えば、乗算の結果）は、対象への投与に利用可能な細胞の治療用アリコートに対応し得る。場合によって、遺伝子改変後における細胞生存率の増大は、患者において治療的に有効な投与に必要な細胞の量の減少に対応し得る。
【０２０４】
場合によって、方法は、対象へと、対象において治療的応答をもたらすのに必要な量の操作細胞を計算および／または投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、治療的応答をもたらすのに必要な操作細胞の量の計算は、操作細胞の生存率の決定を含む。一部の実施形態では、対象において治療的応答をもたらすために、対象へと投与される細胞は、生細胞である。一部の実施形態では、対象において治療的応答をもたらすために、細胞のうちの、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％は、生細胞である。一部の実施形態では、対象において治療的応答をもたらすために、細胞のうちの、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％は、細胞のゲノムにおける１つまたは複数の内因性遺伝子またはその部分が破壊されている。
【０２０５】
場合によって、養子移植された細胞は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってモニタリングすることができる。養子移植された細胞のｑＰＣＲアッセイは、導入後に対象中に存在する修飾された細胞のレベルを示すことができる。場合によって、養子移入された細胞は、フローサイトメトリーを使用してモニタリングすることができる。例えば、フローサイトメトリーアッセイは、４−１ＢＢ  ｖｓ  ＴＣＲのレベルを決定することができる。場合によって、単一細胞ＴＣＲ  ＰＣＲを行うことができる。養子移入された細胞のレベルは、注入後４０日目に同定することができる。修飾された細胞など、養子移入された細胞のレベルは、注入後５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５日目または最大２００日目に同定することができる。
【０２０６】
Ｉ．免疫刺激薬
場合によって、免疫刺激薬を細胞または対象に導入することができる。免疫刺激薬は、特異的または非特異的であり得る。特異的免疫刺激薬は、ワクチンまたは抗原など、抗原特異性を提供することができる。非特異的免疫刺激薬は、免疫応答を強化する、または免疫応答を刺激することができる。非特異的免疫刺激薬は、アジュバントであり得る。免疫刺激薬は、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターまたは免疫療法剤であり得る。免疫刺激薬は、インターロイキンなどのサイトカインであり得る。１または複数のサイトカインは、本発明の細胞と共に導入することができる。サイトカインは、細胞傷害性Ｔリンパ球（養子移入させる腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含む）をブーストして、腫瘍微小環境内で拡大するのに用いることができる。場合によって、ＩＬ−２を使用して、本明細書で記載される細胞の拡大を容易とすることができる。ＩＬ−１５などのサイトカインもまた、利用することができる。ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはこれらの任意の組合せなど、免疫療法の分野において妥当である、他のサイトカインもまた、用いることができる。場合によって、ＩＬ−２、ＩＬ−７および、ＩＬ−１５を使用して、本発明の細胞を培養する。インターロイキンは、ＩＬ−２またはアルデスロイキン（aldeskeukin）であり得る。アルデスロイキンは、低用量または高用量で投与することができる。高用量アルデスロイキンレジメンは、寛容性を示す限り、最大約１４用量、約０．０３７ｍｇ／ｋｇ（６００，０００ＩＵ／ｋｇ）で、８時間ごとにアルデスロイキンを静脈内投与することを伴い得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、細胞投与後２４時間以内に投与することができる。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、細胞注入後最大約４日間、約８時間ごとの約１５分間にわたる注入として投与することができる。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、約１００，０００ＩＵ／ｋｇ、２００，０００ＩＵ／ｋｇ、３００，０００ＩＵ／ｋｇ、４００，０００ＩＵ／ｋｇ、５００，０００ＩＵ／ｋｇ、６００，０００ＩＵ／ｋｇ、７００，０００ＩＵ／ｋｇ、８００，０００ＩＵ／ｋｇ、９００，０００ＩＵ／ｋｇまたは最大約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与することができる。場合によって、アルデスロイキンは、約１００，０００ＩＵ／ｋｇ〜３００，０００ＩＵ／ｋｇ、３００，０００ＩＵ／ｋｇ〜５００，０００ＩＵ／ｋｇ、５００，０００ＩＵ／ｋｇ〜７００，０００ＩＵ／ｋｇ、７００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与することができる。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、１用量〜約１４用量で投与することができる。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、少なくとも約１用量、２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量、１０用量、１１用量、１２用量、１３用量、１４用量、１５用量、１６用量、１７用量、１８用量、１９用量または最大約２０用量で投与することができる。場合によって、アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、約１用量���３用量、３用量〜５用量、５用量〜８用量、８用量〜１０用量、１０用量〜１４用量、１４用量〜２０用量で投与することができる。場合によって、アルデスロイキン（aldeskeukin）は、２０用量を超えて投与される。場合によって、アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、細胞投与と逐次または同時に投与することができる。例えば、免疫刺激薬は、約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目または最大約１４日目に投与することができる。場合によって、アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、細胞集団の投与後０日目〜４日目に投与される。場合によって、免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、約１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、２時間または最大約３時間の期間にわたって投与される。場合によって、免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、操作細胞投与の約２４時間前〜操作細胞投与の約４日後に投与することができる。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、操作細胞の投与後−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９日目または最大約２０日目に投与することができる。
【０２０７】
アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、約０．１７ｍｇ一塩基性および０．８９ｍｇ二塩基性リン酸ナトリウムでｐＨが７．５（範囲７．２〜７．８）となるように緩衝された、滅菌の白色からオフホワイトの凍結乾燥ケーキとしての２千２百万ＩＵ（−１．３ｍｇ）ＩＬ−２、プラス、５０ｍｇマンニトールおよび０．１８ｍｇドデシル硫酸ナトリウムを含有する使い捨て用バイアルとして提供することができる。このバイアルは、１．２ｍＬの注射用滅菌水、ＵＳＰで復元することができ、その結果としての濃度は、千８百万ＩＵ／ｍｌまたは１．１ｍｇ／ｍＬである。希釈剤は、バイアルの側面に向けて注いで、過剰な起泡を回避するべきである。バイアルは、保存剤を含有しないため、復元された溶液は、２４時間以内に使用するべきである。復元されたアルデスロイキンは、５０ｍＬの５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でさらに希釈することができる。ＲＩＬ−２の添加の前に、ＨＳＡを希釈剤に添加するべきである。１０００倍範囲を上回る復元された溶液の希釈（すなわち、１ｍｇ／ｍＬから１ｍｃｇ／ｍＬ）は、ガラスボトルまたはポリ塩化ビニルバッグのいずれかにおいて許容される。アルデスロイキンは、冷蔵および室温、２℃〜３０℃において４８時間、化学的に安定である。アルデスロイキンの投与は、総体重に基づき計算することができる。アルデスロイキンの最終希釈物を１５分間にわたって注入することができる。
【０２０８】
場合によって、免疫刺激薬は、コロニー刺激因子である。コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）であり得る。フィルグラスチムは、３００ｍｃｇ／ｍｌおよび４８０ｕｇ／１．６ｍｌバイアルで保存することができる。フィルグラスチムは、皮下注射として毎日投与することができる。フィルグラスチム投与は、約５ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得る。フィルグラスチム投与は、約１ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約２ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約３ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約４ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約５ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約６ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約７ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約８ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約９ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得、フィルグラスチム投与は、約１０ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得る。場合によって、フィルグラスチムは、約０．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約１．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約１．０ｍｃｇ／ｋｇ／日〜１．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約２．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約２．０ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約３．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約２．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約３．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、約３．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約４．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約４．０ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約４．５ｍｃｇ／ｋｇ／日に及ぶ用量で投与することができる。フィルグラスチム投与は、好中球数が少なくとも約１．０×１０９／Ｌ×３日間または少なくとも約５．０×１０９／Ｌになるまで毎日続けることができる。フィルグラスチムなどの免疫刺激薬は、操作細胞の投与後−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９日目または最大約２０日目に投与することができる。
【０２０９】
ＩＩ．化学療法剤
化学療法剤または化合物は、がんの処置において有用な化合物であり得る。開示されるＴ細胞と組み合わせて使用され得るがん化学療法剤は、有糸分裂インヒビター（ビンカアルカロイド）を含むがこれらに限定されない。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびＮａｖｅｌｂｉｎｅ（商標）（ビノレルビン、５’−ノルアンヒドロブラスチン（noranhydroblastine））を含む。さらに他の場合には、がん化学療法剤は、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼＩインヒビターを含む。本明細書で使用される「カンプトテシン化合物」は、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商標）（トポテカンＨＣＬ）、ならびにカンプトテシンおよびその類似体に由来する他の化合物を含む。本明細書で開示される方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤の別の類別は、エトポシド、テニポシド、およびミトポドジド（mitopodozide）などのポドフィロトキシン誘導体である。本開示はさらに、アルキル化剤として公知の、他のがん化学療法剤であって、腫瘍細胞内の遺伝子素材をアルキル化するがん化学療法剤も包含する。これらは、限定なしに、シスプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン（belustine）、ウラシルマスタード、クロマファジン（chlomaphazin）、およびダカルバジンを含む。本開示は、化学療法剤としての代謝拮抗剤を包含する。これらの種類の薬剤の例は、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン（azathioprime）、およびプロカルバジンを含む。本明細書で開示される方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤のさらなる類別は、抗生物質を含む。例は、限定なしに、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシン（mytomycin）Ｃ、およびダウノマイシンを含む。これらの化合物のために、多数のリポソーム製剤が市販されている。本開示はさらに、限定なしに、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミド、およびミトキサントロンを含む、他のがん化学療法剤も包含する。
【０２１０】
本明細書で開示されるＴ細胞は、細胞傷害剤／抗新生物剤および抗血管新生剤を含む、他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害剤／抗新生物剤は、がん細胞を攻撃し、死滅させる薬剤と規定することができる。一部の細胞傷害剤／抗新生物剤は、腫瘍細胞内の遺伝子素材をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジン（ｄａｃａｂａｚｉｎｅ）であり得る。他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、腫瘍細胞のための代謝拮抗剤、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンであり得る。他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンであり得る。これらの化合物のために、多数のリポソーム製剤が市販されている。さらに他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、有糸分裂インヒビター（ビンカアルカロイド）であり得る。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびエトポシドを含む。種々の細胞傷害剤／抗新生物剤は、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、およびビンデシンを含む。
【０２１１】
抗血管新生剤もまた、使用することができる。開示される方法および組成物における使用に適する抗血管新生剤は、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の血管新生インヒビターは、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１およびｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）を含む。抗血管新生活性を伴うトポイソメラーゼＩＩインヒビターである、ラゾキサンなどのトポイソメラーゼインヒビターを含む低分子もまた使用することができる。
【０２１２】
開示される操作細胞と組み合わせて使用され得る他の抗がん剤は、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール（acodazole）塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（ambomycin）；アメタントロン（ametantrone）酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（asperlin）；アバスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット；ベンゾデパ（benzodepa）；ビカルタミド；ビサントレン（bisantrene）塩酸塩；ビスナフィドジメシレート（bisnafide  dimesylate）；ビセレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン（cactinomycin）；カルステロン（calusterone）；カラセミド（caracemide）；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン（carzelesin）；セデフィンゴール（cedefingol）；クロラムブシル；シロレマイシン（cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール（crisnatol）；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン（dexormaplatin）；デザ（deza）グアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン（diaziquone）；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン（droloxifene）；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン（elsamitrucin）；エンロプラチン（enloplatin）；エンプロメート（enpromate）；エピプロピジン（epipropidine）；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール（erbulozole）；エソルビシン（esorubicin）塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン（etoprine）；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン（fazarabine）；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルロシタビン（flurocitabine）；フォスキドン（fosquidone）；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン（ilmofosine）；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン（iproplatin）；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール（liarozole）塩酸塩；ロメトレキソール（lometrexol）ナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン（losoxantrone）塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン（metoprine）；メツレデパ（meturedepa）；ミチンドミド（mitindomide）；マイトカルシン��mitocarcin）；マイトクロミン（mitocromin）；マイトギリン（mitogillin）；マイトマルシン（mitomalcin）；マイトマイシン；マイトスペル（mitosper）；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン（ormaplatin）；オキシスラン（oxisuran）；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン（pentamustine）；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド（perfosfamide）；ピポブロマン；ピポスルファン（piposulfan）；ピロキサントロン（piroxantrone）塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン（plomestane）；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン（riboprine）；ログレチミド（rogletimide）；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン（simtrazene）；スパルホセート（sparfosate）ナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン（spiromustine）；スピロプラチン（spiroplatin）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（sulofenur）；タリソマイシン（talisomycin）；テコガラン（tecogalan）ナトリウム；テガフール；テロキサントロン（teloxantrone）塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（teroxirone）；テストラクトン；チアミプリン（thiamiprine）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン（trestolone）；リン酸トリシリビン（triciribine）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール（tubulozole）塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ（uredepa）；バプレオチド（vapreotide）；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン（vinepidine）硫酸塩；硫酸ビングリシネート（vinglycinate）；硫酸ビンレウロシン（vinleurosine）；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン（vinrosidine）；ビンゾリジン（vinzolidine）硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン（zeniplatin）；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩を含むがこれらに限定されない。他の抗がん薬は、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール（adecypenol）；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン（ambamustine）；アミドックス（amidox）；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド（andrographolide）；血管新生インヒビター；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス（antarelix）；ＡＤＭＰ（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１；前立腺癌用の抗アンドロゲン；抗エストロゲン；抗ネオプラストン（antineoplaston）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（asulacrine）；アタメスタン（atamestane）；アトリムスチン（atrimustine）；アキシナスタチン（axinastatin）１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン（alethine）；ベータクラマイシン（betaclamycin）Ｂ；ベツリン酸；ｂＦＧＦインヒビター；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド；ビストラテン（bistratene）Ａ；ビゼレシン；ブレフレート（breflate）；ブロピリミン；ブドチタン（budotitane）；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来インヒビター；カルゼレシン；カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリン（chloroquinoxaline）スルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシン（collismycin）Ａ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン（conagenin）；クランベシジン（crambescidin）８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシン（curacin）Ａ；シクロペントアントラキノン（cyclopentanthraquinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクホスフェート（ocfosfate）；細胞溶解因子；サイトスタチン（cytostatin）；ダクリキシマブ（dacliximab）；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン（deslorelin）；デキサメタゾン；デキシホスファミド（dexifosfamide）；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス（didox）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン（dioxamycin）；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン（ecomustine）；エデルフォシン（edelfosine）；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン（elemene）；エミテフル（emitefur）；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン（flezelastine）；フルアステロン（fluasterone）；フルダラビン；フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin）塩酸塩；フォルフェニメックス（forfenimex）；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン（texaphyrin）；硝酸ガリウム；ガロシタビン（galocitabine）；ガニレリックス；ゼラチナーゼインヒビター；ゲムシタビン；グルタチオンインヒビター；ヘプスルファム（hepsulfam）；��レグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（idramantone）；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体インヒビター；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン（iobenguane）；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール（ipomeanol）；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベンガゾール（isobengazole）；イソホモハリコンドリン（isohomohalicondrin）Ｂ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリド（kahalalide）Ｆ；ラメラリン（lamellarin）−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン（leinamycin）；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン（leptolstatin）；レトロゾール；白血病阻害性因子；白血球アルファインターフェロン；ロイポロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド（lissoclinamide）７；ロバプラチン；ロンブリシン（lombricine）；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン（lurtotecan）；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（lysofylline）；溶解性ペプチド；メイタンシン（maitansine）；マンノスタチン（mannostatin）Ａ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシンインヒビター；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；メノガリル；メルバロン；メテレリン（meterelin）；メチオニナーゼ（methioninase）；メトクロプラミド；ＭＩＦインヒビター；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミト
ナフィド（mitonafide）；マイトトキシン（mitotoxin）である線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン（mofarotene）；モルグラモスチム；ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対するモノクローナル抗体；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム（myobacterium）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子インヒビター；ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  １ベースの治療；マスタード系抗がん剤；ミカペロキシド（mycaperoxide）Ｂ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（myriaporone）；Ｎ−アセチルジナリン（dinaline）；Ｎ−置換ベンザミド；ナファレリン；ナグレスチップ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（napavin）；ナフテルピン（naphterpin）；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン（nemorubicin）；ネリドロン酸（neridronic  acid）；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン（nisamycin）；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物による抗酸化剤；ニトルリン（nitrullyn）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン（okicenone）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン（onapristone）；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（oracin）；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン（osaterone）；オキサリプラチン；オキサウノマイシン（oxaunomycin）；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（palauamine）；パルミトイルリゾキシン（palmitoylrhizoxin）；パミドロン酸；パナキシトリオール（panaxytriol）；パノミフェン（panomifene）；パラバクチン（parabactin）；パゼリプチン（pazelliptine）；ペガスパルガーゼ；ペルデシン（peldesine）；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン（phenazinomycin）；酢酸フェニル；ホスファターゼインヒビター；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（placetin）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソームインヒビター；プロテインＡベースの免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣインヒビター；小型藻類のプロテインキナーゼＣインヒビター；プロテインチロシンホスファターゼインヒビター；プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；プルプリン（purpurin）；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化（pyridoxylated）ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター；ｒａｓインヒビター；ｒａｓ−ＧＡＰインヒビター；脱メチル化レテリプチン（retelliptine）；レニウム（Ｒｅ  １８６）エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン（rohitukine）；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノン（rubiginone）Ｂ１；ルボキシル（ruboxyl）；サフィンゴール；サイントピン（saintopin）；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトー���（sarcophytol）Ａ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老齢由来インヒビター１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達インヒビター；シグナル伝達モジュレーター；単鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテート（borocaptate）ナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン（sonermin）；スパルホス酸（sparfosic  acid）；スピカマイシン（spicamycin）Ｄ；スピロムスチン；スプレノペンチン（splenopentin）；スポンギスタチン（spongistatin）１；スクアラミン；幹細胞インヒビター；幹細胞分裂インヒビター；スチピアミド（stipiamide）；ストロメリシンインヒビター；スルフィノシン（sulfinosine）；過活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（suradista）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン（tallimustine）；タモキシフェンメチオジド（methiodide）；タウロムスチン（tauromustine）；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（tellurapyrylium）；テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（tetrazomine）；タリブラスチン（thaliblastine）；チロコラリン（thiocoraline）；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン（thymotrinan）；甲状腺刺激性ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トプセンチン（topsentin）；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳インヒビター；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド（turosteride）；チロシンキナーゼインヒビター；チルホスチン；ＵＢＣインヒビター；ウベニメクス；尿生殖器洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリン（variolin）Ｂ；赤血球遺伝子治療；ベラレソール（velaresol）；ベラミン（veramine）；ベルジン（verdin）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（vinxaltine）；ビタキシン（vitaxin）；ボロゾール；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチン；ジラスコルブ（zilascorb）；およびジノスタチンスチマラマー（stimalamer）を含むがこれらに限定されない。上述の化学療法薬のいずれかを、臨床有効用量で投与してもよい。化学療法薬は、細胞集団の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目または最大約１４日目に投与することもできる。場合によって、対象は、化学療法薬に対して非応答性の不応性がんを有することがある。
【０２１３】
ＩＩＩ．抗真菌剤
場合によって、抗真菌薬療法が、操作細胞を受ける対象に投与される。抗真菌薬は、真菌を死滅させるまたはその増殖を防止することができる薬物であり得る。抗真菌剤の標的は、ステロール生合成、ＤＮＡ生合成およびβ−グルカン生合成を含み得る。抗真菌薬は、葉酸合成インヒビターまたは核酸架橋剤であり得る。葉酸合成インヒビターは、サルファに基づく薬物であり得る。例えば、葉酸合成インヒビターは、真菌の葉酸合成を阻害する薬剤または競合的インヒビターであり得る。サルファに基づく薬物または葉酸合成インヒビターは、メトトレキサートまたはスルファメトキサゾール（sulfamethaxazole）であり得る。場合によって、抗真菌薬は、核酸架橋剤であり得る。架橋剤は、真菌におけるＤＮＡまたはＲＮＡの過程を阻害することができる。例えば、架橋剤は、シトシンのフッ化アナログとなり得る５−フルオロシトシンであり得る。５−フルオロシトシンは、５−フルオロウラシルへの細胞質内変換によりＤＮＡおよびＲＮＡ合成の両方を阻害することができる。他の抗真菌剤は、グリセオフルビンであり得る。グリセオフルビンは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍによって産生される抗真菌抗生物質である。グリセオフルビンは、真菌における有糸分裂を阻害し、架橋剤と考えられ得る。追加的な架橋剤は、アリルアミン（ナフチフィンおよびテルビナフィン）であり得、これは、スクアレンエポキシダーゼのレベルでエルゴステロール合成を阻害する；ある種のモルフォレン（morpholene）誘導体（アモロルフィン）は、エルゴステロール経路におけるその後のステップを阻害する。
【０２１４】
場合によって、抗真菌剤は、ポリエン、アゾール、アリルアミンまたはエキノキャンディンのクラスに由来し得る。一部の実施形態では、ポリエン抗真菌薬は、アンホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン（hamycin）、ナタマイシン、ニスタチンまたはリモシジン（rimocidin）である。場合によって、抗真菌薬は、アゾールファミリーに由来し得る。アゾール抗真菌薬は、ラノステロール１４α−デメチラーゼを阻害することができる。アゾール抗真菌薬は、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール（sulcoazole）またはチオコナゾールなどのイミダゾールであり得る。アゾール抗真菌薬は、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール（epoxiconazole）、フルコナゾール、イサブボナゾール（isavuvonazole）、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾールまたはボリコナゾールなどのトリアゾールであり得る。場合によって、アゾールは、アバファンギン（abafungin）などのチアゾールであり得る。抗真菌薬は、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィンまたはテルビナフィンなどのアリルアミンであり得る。抗真菌薬はまた、アニデュラファンギン、カスポファンギンまたはミカファンギンなどのエキノキャンディンであり得る。抗真菌薬となり得る追加的な薬剤は、オーロン、安息香酸、シクロピロクス、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸、クリスタル（cystal）バイオレットまたはペルーのバルサムであり得る。
【０２１５】
当業者であれば、個体に感染している真菌に基づき、いずれの公知の抗真菌薬物療法を適用すべきか適切に決定することができる。場合によって、対象は、ＣＩＳＨなどの遺伝子の少なくとも一部のゲノムノックアウトを含む操作ＴＩＬと組み合わせたフルコナゾールを受けるであろう。抗真菌薬療法は、予防的に（prophalaytically）投与することができる。
【０２１６】
フルコナゾールは、２００ｍｇ錠剤において利用することができる。場合によって、フルコナゾールは、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇまたは最大約４００ｍｇ錠剤として投与することができる。経口調製物に寛容を示すことができない対象におけるＩＶ投与のため、フルコナゾールは、２ＭＧ／ＭＬ注射用溶液に入れられる。これは、２００ｍｇ／時間の最大ＩＶ速度で投与されるべきである。場合によって、注入速度は、約５０ｍｇ／時間〜約５００ｍｇ／時間であり得る。注入速度はまた、約２０ｍｇ／時間〜約３０ｍｇ／時間、約３０ｍｇ／時間〜約４０ｍｇ／時間、約４０ｍｇ／時間〜約５０ｍｇ／時間、約５０ｍｇ／時間〜約６０ｍｇ／時間、約６０ｍｇ／時間〜約７０ｍｇ／時間、約７０ｍｇ／時間〜約８０ｍｇ／時間、約８０ｍｇ／時間〜約９０ｍｇ／時間、約９０ｍｇ／時間〜約１００ｍｇ／時間、約１００ｍｇ／時間〜約１２０ｍｇ／時間、約１２０ｍｇ／時間〜約１４０ｍｇ／時間、約１４０ｍｇ／時間〜約１６０ｍｇ／時間、約１６０ｍｇ／時間〜約１８０ｍｇ／時間、約１８０ｍｇ／時間〜約２００ｍｇ／時間、約１８０ｍｇ／時間〜約２２０ｍｇ／時間、約２２０ｍｇ／時間〜約２４０ｍｇ／時間、約２４０ｍｇ／時間〜約２７５ｍｇ／時間であり得る。
【０２１７】
抗真菌薬は、治療有効用量で投与することができる。治療有効用量は、真菌感染症を処置または防止するが、がんの処置に有効ではない用量である。例えば、フルコナゾールなどの抗真菌薬は、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇで投与することができる。フルコナゾールは、約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇまたは最大約１０００ｍｇで投与することができる。フルコナゾールは、４００ｍｇで投与することができる。場合によって、抗真菌薬投与は、細胞療法の前、細胞療法の最中、または細胞療法が投与された後であり得る。例えば、フルコナゾール投与は、細胞療法の投与後約０日目（細胞療法が対象に導入される日）〜約４日目であり得る。抗真菌薬は、細胞療法投与までの約１４日間前から細胞療法が完了してから約１４日後に投与することができる。抗真菌薬は、約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目または最大約１４日目に投与することができる。
【０２１８】
ＩＶ．免疫抑制剤
場合によって、対象は、治療レジメンの一部として免疫抑制剤を受けることができる。免疫抑制剤は、放射線療法剤、生物剤または化学薬剤を指し得る。場合によって、免疫抑制剤は、化学薬剤を含み得る。例えば、化学薬剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群由来の少なくとも１つのメンバーを含み得る。化学薬剤は、シクロホスファミドまたはフルダラビンであり得る。
【０２１９】
その上、免疫抑制剤は、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、抗イムノフィリンまたはこれらの任意の誘導体を含み得る。グルココルチコイドは、アレルギー応答、炎症および自己免疫性状態を抑制することができる。グルココルチコイドは、プレドニゾン、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンであり得る。免疫抑制療法は、免疫系を抑制する任意の処置を含み得る。免疫抑制療法は、レシピエントにおける移植片拒絶を軽減するか、最小化するか、または消失させる一助となりうる。例えば、免疫抑制療法は、免疫抑制薬を含み得る。移植前、移植時、および／または移植後に使用され得る免疫抑制薬は、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０、ＡＳＫＰ１２４０、ＣＣＦＺ５３３Ｘ２２０１）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ）、抗ＩＬ−６抗体（サリルマブ、オロキズマブ（olokizumab））、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、エベロリムス、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ−ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体を含むがこれらに限定されない。さらに、１つまたは１つを超える免疫抑制剤／薬物を、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。１つまたは１つを超える免疫抑制剤／薬物は、誘導療法のために使用することもでき、維持療法のために使用することもできる。同じ薬物または異なる薬物を、誘導期に使用することもでき、維持期に使用することもできる。場合によって、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）は、誘導療法のために使用することができ、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は、維持療法のために使用することができる。ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）はまた、誘導療法のために使用することができ、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は、維持療法のために使用することができる。免疫抑制はまた、全身放射線照射、胸腺放射線照射、ならびに脾臓全摘出および／または脾臓部分摘出を含むがこれらに限定されない非薬物レジメンを使用して達成することもできる。
【０２２０】
場合によって、細胞分裂インヒビターを免疫抑制のために投与することができる。細胞分裂インヒビターは、細胞分裂を阻害することができる。細胞分裂インヒビターは、プリンアナログであり得る。細胞分裂インヒビターは、アルキル化剤や、メトトレキサート、アザチオプリンまたはメルカプトプリンなどの代謝拮抗薬であり得る。細胞分裂インヒビターは、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミスラマイシンのうちの少なくとも１つであり得る。
【０２２１】
場合によって、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、処置レジメンの一部として投与することができる。フルダラビンリン酸塩は、糖部分が、リボースまたはデオキシリボースの代わりにアラビノースであり得るという点において、生理的ヌクレオシドとは異なる合成プリンヌクレオシドであり得る。フルダラビンは、プリンアンタゴニスト代謝拮抗薬であり得る。フルダラビンは、５０ｍｇバイアル内に、白色の凍結乾燥した固体ケーキの形態のフルダラビンリン酸塩粉末として供給することができる。２５ｍｇ／ｍｌの濃度へと２ｍＬの注射用滅菌水により復元した後に、溶液は、７．７のｐＨを有し得る。フルダラビン粉末は、２〜８℃で少なくとも１８カ月間安定であり得る；復元された場合、フルダラビンは、室温で少なくとも１６日間安定である。保存剤は存在しないため、復元されたフルダラビンは、典型的に、８時間以内に投与されるであろう。特異的適合性情報については専門的な参考文献を閲覧するべきである。フルダラビンは、血清中で脱リン酸化され、細胞内輸送され、ヌクレオチドフルダラビン三リン酸に変換され得る；この２−フルオロ−ａｒａ−ＡＴＰ分子は、薬物の細胞傷害性効果に要求されると考えられる。フルダラビンは、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドリダクターゼ、ＤＮＡプライマーゼを阻害し、鎖伸長ならびにＲＮＡおよびタンパク質合成に干渉し得る。フルダラビンは、１５〜３０分間にわたる１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおけるＩＶ注入として投与することができる。用量は、体表面積（ＢＳＡ）に基づくであろう。患者が肥満である場合（ＢＭＩ＞３５）、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算されるであろう。場合によって、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。場合によって、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、対象の体表面積の約５ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約１０ｍｇ／ｍ２〜約１５ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約１５ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約２５ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約３０ｍｇ／ｍ２〜約４０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。場合によって、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、対象の体表面積の約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１１ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、１３ｍｇ／ｍ２、１４ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、１６ｍｇ／ｍ２、１７ｍｇ／ｍ２、１８ｍｇ／ｍ２、１９ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２１ｍｇ／ｍ２、２２ｍｇ／ｍ２、２３ｍｇ／ｍ２、２４ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、２６ｍｇ／ｍ２、２７ｍｇ／ｍ２、２８ｍｇ／ｍ２、２９ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３１ｍｇ／ｍ２、３２ｍｇ／ｍ２、３３ｍｇ／ｍ２、３４ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、３６ｍｇ／ｍ２、３７ｍｇ／ｍ２、３８ｍｇ／ｍ２、３９ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４１ｍｇ／ｍ２、４２ｍｇ／ｍ２、４３ｍｇ／ｍ２、４４ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、４６ｍｇ／ｍ２、４７ｍｇ／ｍ２、４８ｍｇ／ｍ２、４９ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５１ｍｇ／ｍ２、５２ｍｇ／ｍ２、５３ｍｇ／ｍ２、５４ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、５６ｍｇ／ｍ２、５７ｍｇ／ｍ２、５８ｍｇ／ｍ２、５９ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６１ｍｇ／ｍ２、６２ｍｇ／ｍ２、６３ｍｇ／ｍ２、６４ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、６６ｍｇ／ｍ２、６７ｍｇ／ｍ２、６８ｍｇ／ｍ２、６９ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７１ｍｇ／ｍ２、７２ｍｇ／ｍ２、７３ｍｇ／ｍ２、７４ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、７６ｍｇ／ｍ２、７７ｍｇ／ｍ２、７８ｍｇ／ｍ２、７９ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、８１ｍｇ／ｍ２、８２ｍｇ／ｍ２、８３ｍｇ／ｍ２、８４ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、８６ｍｇ／ｍ２、８７ｍｇ／ｍ２、８８ｍｇ／ｍ２、８９ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、９１ｍｇ／ｍ２、９２ｍｇ／ｍ２、９３ｍｇ／ｍ２、９４ｍｇ／ｍ２、９５ｍｇ／ｍ２、９６ｍｇ／ｍ２、９７ｍｇ／ｍ２、９８ｍｇ／ｍ２、９９ｍｇ／ｍ２、最大約１００ｍｇ／ｍ２で投与することができる。場合によって、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおける２５ｍｇ／ｍ２の用量であり、約１５〜約３０分間にわたって注入される。
【０２２２】
場合によって、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、処置レジメンの一部として投与することができる。シクロホスファミドは、窒素マスタード誘導体アルキル化剤であり得る。肝臓における活性代謝物への変換後に、シクロホスファミドは、アルキル化（alkyating）剤として機能する；この薬物も、強力な免疫抑制活性を有する。ＩＶ投与後の血清半減期は、３〜１２時間に及ぶ；薬物および／またはその代謝物は、投与後最大７２時間、血清中で検出することができる。指示通りの注射用滅菌水による復元後に、シクロホスファミドは、室温で２４時間、または２〜８℃で維持された場合は６日間、安定であり得る。シクロホスファミドは、２５０ｍｌ  Ｄ５Ｗに希釈し、１時間にわたって注入することができる。用量は、対象の体重に基づくであろう。対象が肥満である場合（ＢＭＩ＞３５）、薬物投与量は、記載通り、実際の体重を使用して計算されるであろう。場合によって、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。場合によって、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、対象の５０ｍｇ／ｋｇを超えて投与される。場合によって、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、対象の約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６１ｍｇ／ｋｇ、６２ｍｇ／ｋｇ、６３ｍｇ／ｋｇ、６４ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、６６ｍｇ／ｋｇ、６７ｍｇ／ｋｇ、６８ｍｇ／ｋｇ、６９ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７１ｍｇ／ｋｇ、７２ｍｇ／ｋｇ、７３ｍｇ／ｋｇ、７４ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、７６ｍｇ／ｋｇ、７７ｍｇ／ｋｇ、７８ｍｇ／ｋｇ、７９ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８１ｍｇ／ｋｇ、８２ｍｇ／ｋｇ、８���ｍｇ／ｋｇ、８４ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、８６ｍｇ／ｋｇ、８７ｍｇ／ｋｇ、８８ｍｇ／ｋｇ、８９ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９１ｍｇ／ｋｇ、９２ｍｇ／ｋｇ、９３ｍｇ／ｋｇ、９４ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、９６ｍｇ／ｋｇ、９７ｍｇ／ｋｇ、９８ｍｇ／ｋｇ、９９ｍｇ／ｋｇ、最大約１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。場合によって、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、少なくとも約１日間〜約３日間、３日間〜５日間、５日間〜７日間、７日間〜約１０日間、１０日間〜１４日間、１４日間〜約２０日間にわたって投与することができる。場合によって、シクロホスファミドは、約６０ｍｇ／ｋｇの用量であり得、２５０ｍｌの５％デキストロース水溶液に希釈され、１時間にわたって注入される。
【０２２３】
免疫抑制剤は、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンのレジメンであり得る。例えば、シクロホスファミド・フルダラビンレジメンは、操作細胞療法を受ける対象に投与することができる。シクロホスファミド・フルダラビンレジメンは、６０ｍｇ／ｋｇ  ｑｄを２日間、および２５ｍｇ／ｍ２  ｑｄを５日間のレジメンで投与することができる。化学療法薬レジメン、例えば、シクロホスファミド・フルダラビンは、本発明の操作細胞の投与に１時間〜１４日間先行して投与することができる。化学療法レジメンは、異なる用量で投与することができる。例えば、対象は、より高い初回用量に続いてより低い用量を受けることができる。対象は、より低い初回用量に続いてより高い用量を受けることができる。
【０２２４】
場合によって、免疫抑制剤は、抗体であり得る。抗体は、治療有効用量で投与することができる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。投与され得るポリクローナル抗体は、抗リンパ球または抗胸腺細胞抗原であり得る。モノクローナル抗体は、抗ＩＬ−２受容体抗体、抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ３抗体であり得る。抗ＣＤ２０抗体を使用することもできる。ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法を免疫抑制剤として使用することもできる。
【０２２５】
免疫抑制薬は、抗イムノフィリンであり得る。抗イムノフィリンは、シクロスポリン、タクロリムス、エベロリムスまたはシロリムスであり得る。追加的な免疫抑制剤は、ＩＦＮ−ベータなどのインターフェロン、オピオイド（opiod）、抗ＴＮＦ結合剤、ミコフェノール酸塩またはフィンゴリモドであり得る。
【０２２６】
免疫抑制剤はまた、放射線療法を指し得る。放射線療法は、放射線照射を含み得る。全身放射線照射は、１２Ｇｙで投与することができる。放射線量は、健康な組織を含む全身への１２Ｇｙの累積線量を含み得る。放射線量は、５Ｇｙ〜２０Ｇｙを含み得る。放射線量は、５Ｇｙ、６Ｇｙ、７Ｇｙ、８Ｇｙ、９Ｇｙ、１０Ｇｙ、１１Ｇｙ、１２Ｇｙ、１３Ｇｙ、１４Ｇｙ、１５Ｇｙ、１６Ｇｙ、１７Ｇｙ、１８Ｇｙ、１９Ｇｙまたは最大２０Ｇｙであり得る。放射線照射は、全身放射線照射または部分放射線照射であり得る。放射線照射が全身放射線照射である場合、照射は均一であっても均一でなくてもよい。例えば、放射線照射が均一ではなくてよい場合、頸部などのより狭い身体領域は、殿部などのより広い領域よりも高い線量を受けることができる。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法による標準的な処置に続き、末梢血幹細胞移植を経る場合がある。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の拡大された免疫細胞の注入を受ける。患者に投与されるべき上述の処置の投与量は、処置されている状態および処置レシピエントの正確な性質により変動するであろう。ヒト投与のための投与量の縮尺調整は、当技術分野で認容されている実務に従って行うことができる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば一般に、成人患者では、１〜３０日間の間の期間、通常毎日投与される、１〜約１００ｍｇの範囲内となるであろう。好まれる１日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、一部の場合には、より大用量の１日当たり最大４０ｍｇを使用することができる（米国特許第６，１２０，７６６号に記載）。
【０２２７】
Ｖ．抗生物質
抗生物質は、治療レジメンの一部として対象に投与することができる。抗生物質は、治療有効用量で投与することができる。抗生物質は、細菌を死滅させるまたはその増殖を阻害することができる。抗生物質は、広範囲の細菌をターゲティングすることができる広域性抗生物質であり得る。広域性抗生物質は、第３または第４世代のいずれであれ、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。
【０２２８】
抗生物質は、特異的な種類の細菌をターゲティングすることができる狭域性抗生物質であり得る。抗生物質は、ペニシリンおよびセファロスポリンなどの細菌細胞壁をターゲティングすることができる。抗生物質は、ポリミキシンなどの細胞膜をターゲティングすることができる。抗生物質は、抗生物質：リファマイシン、リピアルマイシン（lipiarmycin）、キノロンおよびスルホンアミドなどの必須細菌酵素に干渉し得る。抗生物質はまた、マクロライド、リンコサミドおよびテトラサイクリンなどのタンパク質合成インヒビターであり得る。抗生物質はまた、ダプトマイシンなどの環状リポペプチド、チゲサイクリンなどのグリシルサイクリン（glycylcycline）、リネゾリドなどのオキサゾリジノン（oxazolidione）、およびフィダキソマイシンなどのリピアルマイシンであり得る。
【０２２９】
場合によって、抗生物質は、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代または第５世代であり得る。第１世代抗生物質は、狭域性を有し得る。第１世代抗生物質の例は、ペニシリン（ペニシリンＧまたはペニシリンＶ）、セファロスポリン（セファゾリン（Cephazolin）、セファロチン、セファピリン、セファレチン（Cephalethin）、セフラジンまたはセファドロキシン（Cephadroxin））であり得る。場合によって、抗生物質は、第２世代であり得る。第２世代抗生物質は、ペニシリン（アモキシシリンまたはアンピシリン）、セファロスポリン（セフロキシム、セファマンドール（Cephamandole）、セフォキシチン（Cephoxitin）、セファクロル（Cephaclor）、セフロジル（Cephrozil）、ロラカルベフ）であり得る。場合によって、抗生物質は、第３世代であり得る。第３世代抗生物質は、ペニシリン（カルベニシリンおよびチカルシリン）またはセファロスポリン（セフィキシム（Cephixime）、セフトリアキソン（Cephtriaxone）、セフォタキシム（Cephotaxime）、セフチゾキシム（Cephtizoxime）およびセフタジジム（Cephtazidime））であり得る。抗生物質はまた、第４世代抗生物質であり得る。第４世代抗生物質は、セフィピム（Cephipime）であり得る。抗生物質はまた、第５世代であり得る。第５世代抗生物質は、セフタロリン（Cephtaroline）またはセフトビプロール（Cephtobiprole）であり得る。
【０２３０】
場合によって、抗生物質は、細菌壁標的剤、細胞膜標的剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターまたは静菌剤であり得る。細菌壁標的剤は、ペニシリン誘導体（ペナム系（penams））、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタムおよびカルバペネムであり得る。β−ラクタム抗生物質は、殺菌性または静菌性であり、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することにより作用する。場合によって、抗生物質は、タンパク質合成インヒビターであり得る。タンパク質合成インヒビターは、細菌が細胞壁を作製するのに必要とされる酵素トランスペプチダーゼの不可逆的インヒビターとして作用するアンピシリンであり得る。これは、二分裂における細菌細胞壁合成の第３および最終ステージを阻害し、これにより、最終的に細胞溶解がもたらされる；したがって、アンピシリンは通常、溶菌性である。場合によって、殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。他の場合には、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンである。
【０２３１】
場合によって、ＰＣＰ肺炎の防止のための薬剤を投与することができる。例えば、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを投与して、肺炎を防止することができる。トリメトプリムおよびスルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＭＸ；例示的なサルファ薬物）の用量は、第１の用量の化学療法の際にまたはその後に、非連続日で１日１錠剤ＰＯ、１週間に３回であり得、これを少なくとも約６カ月間、少なくとも２回の連続した実験室研究においてＣＤ４計数が２００を超えるまで続ける。場合によって、トリメトプリムは、１６０ｍｇで投与することができる。トリメトプリムは、約１００〜約３００ｍｇで投与することができる。トリメトプリムは、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇまたは最大約３００ｍｇで投与することができる。場合によって、スルファメトキサゾールは、８００ｍｇで投与される。スルファメトキサゾールは、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇで投与することができる。スルファメトキサゾールは、約５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇまたは最大約１０００ｍｇで投与することができる。場合によって、ＴＭＰ／ＳＭＸレジメンは、治療有効量で投与することができる。ＴＭＰ／ＳＭＸは、１日に約１×〜約１０×投与することができる。ＴＭＰ／ＳＭＸは、１日に１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１６×、１７×、１８×、１９×または最大約２０×投与することができる。場合によって、ＴＭＰ／ＳＭＸは、週ごとの基盤で投与することができる。例えば、ＴＭＰ／ＳＭＸは、１週間に１×、２×、３×、４×、５×、６×または最大約７×投与することができる。ＴＭＰ／ＳＭＸレジメンは、ＴＩＬなどの細胞療法の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目または最大約１４日目に投与することができる。
【０２３２】
前記静菌剤が、ＴＩＬの約８日前〜前記ＴＩＬの少なくとも４日後に投与される、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【０２３３】
場合によって、サルファアレルギーを有する対象は、ペンタミジンを受けることができる。ペンタミジンは、エアロゾルによって投与することができる。入院前の１週間以内のネブライザー当たりペンタミジン３００ｍｇ、これを２回の連続した追跡実験室研究においてＣＤ４計数が２００を上回るまで、また、化学療法後少なくとも６カ月間、毎月続けた。ペンタミジンを使用して、ＰＣＰ感染症の出現を防止することができる。これは、凍結乾燥粉末の３００ｍｇバイアル内に供給することができ、ネブライザーにより投与されるであろう。ペンタミジンは、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇで投与することができる。場合によって、ペンタミジン（petamidine）は、約１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇまたは最大約８００ｍｇで投与することができる。
【０２３４】
場合によって、抗生物質などの静菌剤は、ＴＩＬの前に、前記ＴＩＬと同時に、または前記ＴＩＬの後に投与することができる。場合によって、静菌剤は、前記ＴＩＬの投与の約１４日前〜前記ＴＩＬの前記投与の約６カ月後に投与することができる。
【０２３５】
ＶＩ．抗ウイルス剤
【０２３６】
場合によって、抗ウイルス剤は、処置レジメンの一部として投与することができる。場合によって、ヘルペスウイルス予防法は、処置レジメンの一部として対象に投与することができる。ヘルペスウイルス予防法は、バラシクロビル（バルトレックス）であり得る。バルトレックスを経口使用して、陽性ＨＳＶ血清学を有する対象におけるヘルペスウイルス感染症の出現を防止することができる。これは、５００ｍｇ錠剤中に供給することができる。バラシクロビルは、治療有効量で投与することができる。例えば、バラシクロビルは、約５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇまたは最大約７００ｍｇ錠剤で投与することができる。対象が、経口摂取に寛容を示すことができる場合、バラシクロビルは、毎日経口５００ｍｇの用量で、フルダラビンの最後の用量の翌日に開始することができる。抗ウイルス療法は、ＴＩＬ療法などの細胞療法の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目または最大約１４日目に投与することができる。
【０２３７】
場合によって、対象は、ヘルペスの予防法のための経口薬物療法を服用できない場合がある。そのような場合、アシクロビルを投与することができる。アシクロビルは、５００ｍｇ／バイアルの注射用粉末として供給することができる。場合によって、アシクロビルは、治療有効量で投与することができる。アシクロビルは、約５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇまたは最大約７００ｍｇで経口投与することができる。アシクロビルは、１日当たり１×、２×、３×、４×、５×、６×または最大約７×投与することができる。アシクロビルは、ＴＩＬ療法などの細胞療法の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目または最大約１４日目に投与することができる。場合によって、アシクロビルは、静脈内投与することができる。例えば、アシクロビルは、１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。場合によって、アシクロビルは、５０ｍｇ／ｋｇを超えて投与される。アシクロビルは、５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう１０ｍＬの注射用滅菌水に復元することができる。復元された溶液は、１２時間以内に使用するべきである。ＩＶ溶液は、７ｍｇ／ｍＬまたはそれに満たない濃度となるよう希釈し、１時間にわたって注入して、腎損傷を回避することができる。
【０２３８】
疾患パラメーター
場合によって、疾患のレベルは、処置レジメンまたは細胞投与と逐次または同時に決定することができる。標的病変における疾患のレベルは、次に挙げるものとして測定することができる：完全奏効（ＣＲ）：全標的病変の消失、部分奏効（ＰＲ）：ベースライン和ＬＤを参照として活用した、標的病変の最長直径（ＬＤ）の和の少なくとも３０％低下、進行（ＰＤ）：処置開始から記録された最小和ＬＤを参照として活用した、標的病変のＬＤの和の少なくとも２０％増大、または１つもしくは複数の新たな病変の出現、安定疾患（ＳＤ）：最小和ＬＤを参照として活用した、ＰＲと認定するのに十分な縮小も、ＰＤと認定するのに十分な増大もなし。他の場合には、非標的病変を測定することができる。非標的病変の疾患のレベルは、次に挙げるものであり得る：完全奏効（ＣＲ）：全非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化、非完全奏効：１つまたは複数の非標的病変の持続、進行（ＰＤ）：１つまたは複数の新たな病変の出現。現存する非標的病変の明解な進行。
【０２３９】
場合によって、処置レジメンおよび細胞投与を受ける対象は、最良の全応答について評価することができる。最良の全応答は、処置開始から疾患進行／再発まで記録された最良の応答であり得る（処置開始から記録された最小測定値を、進行性疾患のための参照として活用）。対象の最良の応答割り当ては、測定および確認判断基準の両方の達成に依存することができる。進行までの時間は、ランダム化の日付から測定することができる。
【表７】
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【０２４０】
ＰＲまたはＣＲの状態を割り当てるため、腫瘍測定値の変化は、応答のための判断基準が最初に満たされてから少なくとも約４週間後に行われるべき反復研究によって確認される必要がある。ＳＤの場合、追跡測定値は、６〜８週間の最小間隔で研究参加後に少なくとも１回ＳＤ判断基準を満たしている必要がある。場合によって、全応答の持続時間は、ＣＲ／ＰＲ（どちらが最初に記録されたとしても）のための測定判断基準が満たされた時間から、再発性または進行性疾患が客観的に記述された最初の日付まで測定することができる（処置開始から記録された最小測定値を、進行性疾患のための参照として活用）。全完全奏効の持続時間は、ＣＲのための測定判断基準が最初に満たされた時間から、再発性疾患が客観的に記述された最初の日付まで測定することができる。安定疾患は、処置開始から記録された最小測定値を参照として活用して、処置開始から、進行のための判断基準が満たされるまで測定することができる。
【０２４１】
場合によって、測定可能疾患を撮影し、定規またはノギスを使用して計量記号で記録することができる。全ベースライン評価は、処置の初めに対して可能な限り密接に行うことができる。病変は、表在性であり（例えば、皮膚小結節および触知できるリンパ節）、ノギスを使用して直径が少なくとも約１０ｍｍを超える場合、測定可能と考えることができる。場合によって、カラー写真を撮影することができる。
【０２４２】
他の場合には、コンピュータ断層撮影法スキャン（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を撮影することができる。ＣＴは、５ｍｍまたはそれに満たないスライス厚さで撮影することができる。ＣＴスキャンが、５ｍｍを超えるスライス厚さを有する場合、測定可能病変のための最小サイズは、スライス厚さの２倍となるべきである。場合によって、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンを使用することができる。ＦＤＧ−ＰＥＴを使用して、新たな病変を評価することができる。ベースライン時の陰性ＦＤＧ−ＰＥＴと、追跡時の陽性ＦＤＧ−ＰＥＴは、新たな病変に基づく進行性疾患（ＰＤ）の徴候である。ベースライン時のＦＤＧ−ＰＥＴなし、および追跡時の陽性ＦＤＧ−ＰＥＴ：追跡時の陽性ＦＤＧ−ＰＥＴが、ＣＴによって確認される疾患の新たな部位に対応する場合、これはＰＤである。追跡時の陽性ＰＤＧ−ＰＥＴが、解剖的想像に基づいて進行していない可能性があるＣＴにおける既存の疾患部位に対応する場合、これはＰＤではない可能性がある。場合によって、ＦＤＧ−ＰＥＴを使用して、残存するＸ線試験異常が、線維症または瘢痕を表すと考えられる場合の生検と同様の様式で、ＣＲに応答をアップグレードすることができる。陽性ＦＤＧ−ＰＥＴスキャン病変は、減衰補正された画像において周囲の組織の２倍を超えて取り込まれたＦＤＧ  ａｖｉｄである病変を意味する。
【０２４３】
場合によって、病変の評価を行うことができる。完全奏効（ＣＲ）は、全標的病変の消失であり得る。任意の病理学的リンパ節（標的または非標的）は、短軸が１０ｍｍ未満に減少していてよい。部分奏効（ＰＲ）は、直径のベースライン和を参照として活用した、標的病変の直径の和の少なくとも３０％低下であり得る。進行性疾患（ＰＤ）は、最小和を参照として活用した、標的病変の直径の和の少なくとも２０％増大であり得る。２０％の相対的増大に加えて、和は、少なくとも５ｍｍの絶対的増大を実証する必要もある。安定疾患（ＳＤ）は、直径の最小和を参照として活用した、ＰＲと認定する（quality）のに十分な縮小も、ＰＤと認定するのに十分な増大もなしであり得る。
【０２４４】
場合によって、非標的病変を評価することができる。非標的病変の完全奏効は、腫瘍マーカーレベルの消失および正常化であり得る。全リンパ節は、サイズが非病理学的である必要がある（１０ｍｍ未満の短軸）。腫瘍マーカーは、最初に正常値の上限を上回る場合、完全臨床応答と考えられるべき患者に対して正規化する必要がある。非ＣＲ／非ＰＤは、１つもしくは複数の非標的病変の持続、および／または正常値の限界を上回る腫瘍マーカーレベルの維持である。進行性疾患は、１つもしくは複数の新たな病変の出現、および／または現存する非標的病変の明解な進行であり得る。明解な進行は正常に標的病変状態より勝るべきではない。
【０２４５】
場合によって、最良の全応答は、処置開始から疾患進行／再発までに記録された最良の応答であり得る。
【０２４６】
毒性判断基準
場合によって、処置レジメンまたは細胞投与に対する毒性を決定することができる。毒性決定は、処置レジメンの毒性、免疫性効果および抗腫瘍有効性を包含することができる。毒性研究は、毒性および有害事象報告のためのＣＴＣＡＥバージョン３．０を用いることができる。操作細胞の注入に特に関係する初期毒性（細胞注入の直後およびアルデスロイキン投与前に見られる毒性）は一般に軽度であり、発熱、悪寒、頭痛および倦怠感を含み得る。アルデスロイキンの投与後に発生するが、操作細胞投与に関係すると考えられる毒性は、白斑、一過性ぶどう膜炎、難聴および前庭機能不全などの免疫媒介性事象を含み得る。細胞投与の前の骨髄非破壊的レジメンの使用は、対象において深刻な骨髄抑制が発生するため、処置の毒性を増大させることができる。場合によって、高用量アルデスロイキンの投与の標準手法は、グレード３または４事象が発生するまで投薬を続けることとなり得る。最も一般的に見られるグレード４事象は、肺および腎機能障害ならびに精神状態変化である。これらの毒性は、時に、対象の気道確保のために挿管を要求する場合がある。場合によって、致死的合併症が可能な場合があり、生命を脅かす転移性がんの文脈で処置を行うことが適切となり得る。
【０２４７】
場合によって、本明細書に記載されている処置レジメンまたは細胞生成物で処置される対象は、レジメンまたは細胞生成物に関連する有害事象を経験する可能性がある。事象が、処置に関係するまたは臨床的に有意であると考えられるか考えられないかにかかわらず、有害事象は、ヒトにおける薬物の使用に関連する処置経過において発生する任意の反応、副作用または都合が悪い事象であり得る。場合によって、有害事象は、対象によって報告される事象と共に、身体試験または実験室評価における臨床的に有意な異常所見を含み得る。新たな疾病、症状、徴候もしくは臨床的に有意な実験室異常、または既存の状態もしくは異常の悪化は、有害事象と考えることができる。実験室評価に関する臨床的に有意な異常所見を含むあらゆる有害事象は、重症度に関係なく、リンパ球減少症および脱毛症を除いて、グレード２またはそれ未満に消散するまで追跡されるであろう。有害事象が、グレード２またはそれ未満に消散することが予想されない場合、対象は、治療を終止することができる。
【０２４８】
場合によって、処置レジメンは、毒性低減剤と共に投与することができる。毒性低減剤は、発熱または嘔吐減少剤であり得る。例えば、メスナを投与して、悪心、嘔吐および下痢などの毒性を減少させることができる。
【０２４９】
メスナは、希釈された溶液（１〜２０ｍｇ／ｍＬ）であり得、冷蔵下で少なくとも２４時間、物理的および化学的に安定であり得る。メスナは、室温で、Ｄ５Ｗにおいて４８〜７２時間、Ｄ５Ｗ／０．４５％ＮａＣｌにおいて４８〜７２時間、または０．９％ＮａＣｌにおいて２４時間、化学的に安定であり得る。メスナは、Ｄ５Ｗまたは０．９％ＮａＣｌにおいて２０ｍｇ（メスナ）／ｍｌ（液）未満のまたはこれに等しい濃度に希釈することができ、持続注入として静脈内投与することができる。患者が肥満である場合（ＢＭＩ＞３５）、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算されるであろう。
【０２５０】
他の場合には、追加的な支持薬物療法は、オンダンセトロン塩酸塩を含み得る。化学療法準備的レジメンにおいて、オンダンセトロン塩酸塩を使用して、悪心および嘔吐を制御することができる。これは、頭痛、眩暈、筋肉痛、眠気、倦怠感および脱力を引き起こすことができる。より一般的でない副作用は、胸痛、低血圧、そう痒症、便秘および尿閉を含む。他の場合には、フロセミドを投与することもできる。シクロホスファミドによる化学療法準備レジメンにおいて、フロセミドを使用して、尿量を増強することができる。有害効果は、眩暈、回転性めまい、錯感覚、脱力、起立性低血圧、光線過敏症、発疹およびそう痒を含む。
【０２５１】
投与方法
がんなどの状態を有する対象に治療レジメンを投与するための方法が本明細書に提供され得る。一部の場合には、細胞組成物（例えば、ＣＩＳＨ破壊を有するＴＩＬ（自家ＴＩＬを含む）などのＴＩＬを含む）は、単位剤形で提供することができる。細胞組成物（例えば、ＣＩＳＨ破壊を有するＴＩＬなどのＴＩＬ（自家ＴＩＬを含む）を含む）は、溶液に再懸濁し、注入として投与することができる。免疫刺激薬、免疫抑制薬、抗生物質、抗真菌薬、制吐薬、化学療法薬、放射線療法およびこれらの任意の組合せを含む処置レジメンも本明細書に提供され得る。上述のいずれかを含む処置レジメンを凍結乾燥し、水溶液（例えば、生理食塩水溶液）に復元することができる。一部の場合には、処置（例えば、ＴＩＬ、例えば、ＣＩＳＨ破壊を有するＴＩＬ（自家ＴＩＬを含む）などの細胞処置）は、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮的投与、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与、鼻腔内投与、リンパ内注射および経口投与から選択される経路によって投与される。一部の場合には、対象は、リンパ内マイクロカテーテルによってＴＩＬを含む細胞組成物を注入される。
【０２５２】
多くの薬物は、液体、カプセル、錠剤または咀嚼錠として経口投与することができる。経口経路は、最も簡便であり、通常最も安全で最も安価なため、最も高頻度で使用される経路である。しかし、薬物が典型的に消化管を通って移動する道のりのため、経口経路には限界がある。経口投与される薬物のため、吸収は、口および胃の中で始まることができる。しかし、大部分の薬物は通常、小腸から吸収される。薬物は、血流を経てその標的部位に輸送される前に、腸管壁を通過し、肝臓に移行する。腸管壁および肝臓は、多くの薬物を化学的に変更（代謝）し、血流に達する薬物の量を低下させる。したがって、これらの薬物は、静脈内注射される場合、同じ効果を生じるようにより少ない用量で与えられることが多い。
【０２５３】
皮下経路のため、皮膚直下の脂肪性組織中に針が挿入される。薬物は、注射された後に、小血管（毛細血管）内に移動し、血流によって運び出される。あるいは、薬物は、リンパ管を通って血流に達する。より大きい体積の薬物製品が必要とされる場合、筋肉内経路が、皮下経路よりも好まれる。筋肉は、皮膚および脂肪性組織の下に位置するため、より長い針が使用される。薬物は通常、上腕、大腿または臀部の筋肉内に注射される。薬物が血流中に吸収される速さは、一部には、筋肉への血液供給に依存する：血液供給が僅かであるほど、薬物が吸収されるのにかかる時間は長くなる。静脈内経路のため、針が静脈内に直接的に挿入される。薬物を含有する溶液は、単一用量でまたは持続注入によって与えることができる。注入のため、溶液は、重力によって（折り畳み式のプラスチック袋から）移動される、またはより一般的には、通常、前腕における静脈内に挿入された管（カテーテル）へと細い軟性チューブを通って注入ポンプによって移動される。場合によって、細胞または治療レジメンは、注入として投与される。注入は、ある期間にわたって行われ得る。例えば、注入は、約５分間〜約５時間の期間にわたる細胞または治療レジメンの投与であり得る。注入は、約５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間または最大約５時間の期間にわたって行われ得る。
【０２５４】
一部の実施形態では、静脈内投与は、速くかつ十分に制御された様式で体全体に正確な用量を送達するのに使用される。これは、皮下または筋肉内注射によって与えた場合に疼痛および組織損傷を引き起こしかねない刺激性溶液にも使用される。特に、その者が肥満の場合、静脈への針またはカテーテル挿入は困難になり得るため、静脈内注射は、皮下または筋肉内注射よりも投与が困難になり得る。静脈内に与えた場合、薬物は、血流へと直ちに送達され、他の任意の経路によって与えた場合よりも速く効果を生じる傾向がある。結果的に、医療施術者は、静脈内注射を受ける人を、薬物が働いているまたは望まれない副作用を引き起こしている徴候について密接にモニタリングする。また、この経路によって与えられた薬物の効果は、より短い時間持続する傾向がある。したがって、一部の薬物は、持続注入によって与えて、その効果を一定に維持する必要がある。くも膜下腔内経路のため、下部脊椎における２つの椎骨の間、脊髄周りの間隙中に針が挿入される。次に、薬物は、脊柱管中に注射される。少量の局所麻酔薬が、多くの場合、注射部位を麻痺させるために使用される。薬物が、例えば、それらの構造の感染症を処置するために脳、脊髄、またはこれらを覆う組織の層（髄膜）における急速または局所効果の産生に必要とされる場合、この経路が使用される。
【０２５５】
口を通った吸入によって投与される薬物は、薬物が、気道（気管）を通過して、肺に入ることができるように、経鼻経路によって投与される液滴よりも小さい液滴へと微粒化することができる。薬物がどの程度深く肺内に進むかは、液滴のサイズに依存する。より小さい液滴はより深く進み、これにより、吸収される薬物の量が増大される。肺の内側で、薬物は、血流中に吸収される。皮膚に塗布される薬物は通常、その局所効果に使用されるため、乾癬、湿疹、皮膚感染症（ウイルス、細菌および真菌）、かゆみおよびドライスキンなどの表在性皮膚障害の処置に最も一般的に使用される。薬物は、不活性物質と混合される。不活性物質の整合性に依存して、製剤は、軟膏、クリーム、ローション、溶液、粉末またはゲルであり得る。
【０２５６】
場合によって、対象の体重に従って処置レジメンを投薬することができる。肥満（ＢＭＩ＞３５）と決定された対象において、実際の体重が用いられることを必要とする場合がある。ＢＭＩは、次式によって計算される：ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／［身長（ｍ）］２。
【０２５７】
理想体重は、男性については５０ｋｇ＋２．３＊（６０インチを超えるインチ数）として、または女性については４５．５ｋｇ＋２．３（６０インチを超えるインチ数）として計算することができる。その理想体重の２０％を超える対象に対して、調整された体重を計算することができる。調整された体重は、理想体重＋（０．４×（実際の体重  −  理想体重））の和であり得る。場合によって、体表面積を用いて、投与量を計算することができる。体表面積（ＢＳＡ）は、次式によって計算することができる：ＢＳＡ（ｍ２）＝√身長（ｃｍ）＊体重（ｋｇ）／３６００。
【０２５８】
場合によって、細胞療法を含む医薬組成物は、単独で、または薬学的に許容される担体または賦形剤と併せて、任意の経路により投与され得、このような投与は、単回投与および複数回投与の両方で実行することができる。より特定すると、医薬組成物は、多様な薬学的に許容される不活性の担体であって、錠剤、カプセル、薬用ドロップ、トローチ、ハンド（hand）キャンディー、粉剤、スプレー、水性懸濁液、注射用溶液、エリキシル剤、シロップなどの形態の担体と組み合わせることができる。このような担体は、固体の希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体、および多様な非毒性有機溶媒などを含む。さらに、このような経口医薬製剤は、このような目的で一般に利用される多様な種類の薬剤により、適切に甘味および／または芳香添加することができる。
【０２５９】
場合によって、治療レジメンは、担体または賦形剤と共に投与することができる。例示的な担体および賦形剤は、デキストロース、塩化ナトリウム、スクロース、ラクトース、セルロース、キシリトール、ソルビトール、マリトール（malitol）、ゼラチン、ＰＥＧ、ＰＶＰおよびこれらの任意の組合せを含み得る。
【０２６０】
場合によって、デキストロースまたは塩化ナトリウムなどの賦形剤は、約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％または最大約１５％のパーセントで存在することができる。
【０２６１】
レシピエントにおける疾患（例えば、消化器がんなどのがん）を処置する方法であって、操作細胞を含む１つまたは複数の細胞（臓器および／または組織を含む）をレシピエントに移植するステップを含む方法が、本明細書に記載されている。細胞内ゲノム移植によって調製された細胞を使用して、がんを処置することができる。一部の実施形態では、消化器がんを処置する方法は、ａ）腫瘍試料（例えば、消化器がんを有する対象由来の腫瘍試料）から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を得るステップと；ｂ）変異反応性ＴＩＬを同定するステップと；前記変異反応性ＴＩＬにおいてＣａｓヌクレアーゼにより内因性遺伝子またはその部分を破壊するステップとを含む。一部の実施形態では、腫瘍試料は、全エクソームシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシングまたはそれらの組合せなどのシーケンシング解析にかけられる。一部の実施形態では、同定するステップは、変異を含むペプチド（例えば、２５ｍｅｒ突然変異体ペプチドなどの約１５ｍｅｒ変異体ペプチド〜最大約３０ｍｅｒ変異体ペプチド）をパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）にＴＩＬを導入することを含む。一部の実施形態では、ＴＩＬは、ＴＩＬの反応性を決定するために、ペプチドを発現するＡＰＣと接触される。ペプチドは、ＴＩＬによってターゲティングされ得る腫瘍変異を含み得る。例えば、ＡＰＣは、多数のペプチドを発現することができ、多数のペプチドの一部は、腫瘍反応性ＴＩＬの同定に用いることができる腫瘍変異をコードする。腫瘍反応性を有するとして同定されるＴＩＬは、単離または精製され、ゲノム操作に用いられ得る。場合によって、腫瘍反応性ＴＩＬは、ＣＲＩＳＰＲ系によりゲノム的に操作することができる。ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、腫瘍反応性ＴＩＬにおいてＣＩＳＨなどの内因性遺伝子をノックアウトすることができる。ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、腫瘍反応性ＴＩＬにおいてＰＤ−１などの内因性遺伝子をノックアウトすることができる。一部の実施形態では、同定するステップは、変異を含むポリ核酸を電気穿孔した抗原提示細胞（ＡＰＣ）に前記ＴＩＬを導入することを含む。一部の実施形態では、同定するステップは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−６などのサイトカイン、脱顆粒、細胞増殖その他を検出することをさらに含む。
【実施例】
【０２６２】
（実施例１）
各遺伝子部位において、二本鎖切断（ＤＳＢ）誘導が最高度であるｇＲＮＡを同定する。
ガイドＲＮＡのデザインおよび構築：
遺伝子の所望の領域へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をデザインした。オフターゲット位置により決定される、最高のランク付け値に基づき、ｇＲＮＡを作製するための複数のプライマー（表１に示す）を選び出した。ｇＲＮＡは、オリゴヌクレオチド対：５’−ＣＡＣＣＧ−ｇＲＮＡ配列−３’および５’−ＡＡＡＣ−逆相補体ｇＲＮＡ配列−Ｃ−３’により注文した（オリゴヌクレオチド対の配列を、表１に列挙する）。
【表８−１】
2019532080.tif 000017
【表８−２】
2019532080.tif 000018
【０２６３】
標的配列クローニングプロトコールを使用して、ｇＲＮＡを、併せてクローニングした。略述すると、以下のプロトコール：３７℃で３０分間、９５℃で５分間、次いで、５℃／分で、２５℃へと降下することにより、サーモサイクラー内で、Ｔ４  ＰＮＫ（ＮＥＢ）および１０倍濃度のＴ４  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を使用して、オリゴヌクレオチド対を、併せてリン酸化およびアニールさせた。ｐＥＮＴＲ１−Ｕ６−Ｓｔｕｆｆｅｒ−ｇＲＮＡベクターを、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＢｂｓＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化し、ＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および１０倍濃度のＦａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒを、ライゲーション反応のために使用した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を使用して、消化されたｐＥＮＴＲ１ベクターを、前のステップによる、リン酸化およびアニールさせたオリゴ二重鎖（希釈率を１：２００とする）と併せてライゲーションした。ライゲーション物を、室温で１時間にわたりインキュベートし、次いで、形質転換し、その後、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｍｉｎｉｐｒｅｐした。プラスミドをシーケンシングして、適正な挿入を確認した。
【０２６４】
ｇＲＮＡの検証
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレート内、ウェル１つ当たりの細胞１×１０５個の密度で播種した。１５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を、１．５ｕｇのｇＲＮＡプラスミド、１．５ｕｇのＣａｓ９プラスミドと組み合わせた。別の１５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を、５ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み合わせた。溶液を、併せて組み合わせ、室温で１５分間にわたりインキュベートした。ＤＮＡ−脂質複合体を、滴下により、２４ウェルプレートのウェルへと添加した。細胞を、３７℃で３日間にわたりインキュベートし、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ゲノムＤＮＡを回収した。ｇＲＮＡの活性を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ消化、ゲル電気泳動、および密度測定により定量化した（図６１）（Guschin,  D.Y.ら、「A  Rapid  and  General  Assay  for  Monitoring  Endogenous  Gene  Modification」、Methods  in  Molecular  Biology、６４９巻：２４７〜２５６頁（２０１０年））。
【０２６５】
結果
異なるｇＲＮＡ配列を一助とする、二本鎖切断（ＤＳＢ）の創出におけるＣａｓ９の効率を、表９に列挙する。表９中の百分率数は、試料中の遺伝子改変のパーセントを指し示した。
【表９】
2019532080.tif 000019
【０２６６】
５つ全ての被験標的遺伝子部位において、ＤＳＢを創出した。これらのうちで、ＣＣＲ５、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ４が、最高のＤＳＢ効率をもたらした。本明細書で記載される方法と同じ方法を使用して、ｈＲｏｓａ２６を含む、他の標的遺伝子部位についても調べる。
【０２６７】
ドナー対照およびＣａｓ９のみによる対照と比較した、二本鎖切断のパーセントを列挙する。３つの代表的な標的遺伝子部位（すなわち、ＣＣＲ５、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ４）について調べた。
【０２６８】
（実施例２）
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑライブラリーの調製
ゲノムワイドとして公知のＰＤ−１  ｇＲＮＡのオフターゲット切断について検討するため、二本鎖切断（ＤＳＢ）の不偏の同定が、シーケンシングまたはＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって達成される。これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって作製されたＤＳＢへの二本鎖オリゴヌクレオチドの捕捉に続いて次世代シーケンシングを使用して、遺伝子改変の場所を決定する方法である。
【０２６９】
固相可逆性固定化磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅ）を使用してヒトＴ細胞を単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２００装置により、末端修復され、Ａテールである、平均長５００ｂｐへとせん断処理し、８ヌクレオチドのランダム分子指標が組み込まれた半機能的アダプターへとライゲーションした。標的濃縮のために、オリゴタグと相補的なプライマーによる、２ラウンドのネステッドアンカードＰＣＲを使用した。末端修復サーモサイクラープログラム：１２℃で１５分間、３７℃で１５分間；７２℃で１５分間；４℃で保持する。
【０２７０】
ゲノムへとマッピングし戻されたＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑリードの開始部位は、ＤＳＢの位置特定を、数塩基対以内で可能とする。製造元の指示書に従い、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用してライブラリーを定量化した。各試料について、ｑＰＣＲ試行により与えられる、１ｕＬ当たりの分子数についての平均値推定量を使用して、ライブラリーの総セットを、分子１．２×１０１０個をシーケンシングのために併せてプールされるライブラリーの数で除した分子数へと正規化した。これは、各試料についての分子ごとのインプットを与え、また、各試料について、容量ごとのインプットも与えた。リードは、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑにより評価された切断型ｇＲＮＡにより導かれる３つのＲＧＮのオンターゲット部位およびオフターゲット部位にマッピングした。全ての場合に、標的部位配列は、ｘ軸の左側のプロトスペーサー配列および右側のＰＡＭ配列を有する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ２によるシーケンシングのための、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製の標準的なプロトコールに従い、ライブラリーを変性させ、Ｍｉｓｅｑへとロードした（３００サイクル（２×１５０ｂｐのペアドエンド））。
【０２７１】
第２の実験では、ＰＤ−１  ｇＲＮＡのＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ解析により、再現性のあるオフターゲット修飾が１つだけ明らかに示された。この部位は、予想される部位のディープシーケンシングによって検出された単一のオフターゲット位置と一致し、２つの手法間の相関性を裏付けている。したがって、オフターゲットのＮＧＳ解析は高感度かつ包括的である。ＰＤ−１のｇＲＮＡデザインは高度に特異的であり、ゲノムの不活性区画内に存在し、その修飾がいかなる有害効果ももたらさないと見込まれる検出可能なオフターゲット部位は１つのみであった。ＣＩＳＨのｇＲＮＡデザインは高度に特異的であり、測定可能なオフターゲット活性はなかった。
【０２７２】
（実施例３）
ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＩＳＨをノックアウトするための、ＴＩＬのゲノム操作
適切な腫瘍を、適格性の病期であるＩＩＩｃ−ＩＶ期のがん患者から切除し、３〜５ｍｍ２の小さな断片へと切り刻み、増殖培地および高用量（ＨＤ）ＩＬ−２を伴う培養プレートまたは小型培養フラスコに入れる。まず、ＴＩＬを、この「前急速拡大プロトコール」（前ＲＥＰ）期中の３〜５週間にわたり、少なくとも細胞５０×１０６個へと拡大する。Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（１００ｕＬ  Ｋｉｔまたは１０ｕｌ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＴＩＬを電気穿孔する。ＴＩＬをペレット化させ、Ｔ緩衝液で１回洗浄する。ＴＩＬを、１０ｕｌのチップには、１０ｕＬのＴ緩衝液中の細胞２×１０５個の密度で再懸濁させ、１００ｕｌチップには、１００ｕｌ  Ｔ緩衝液中の細胞３×１０６個の密度で再懸濁させる。次いで、１５ｕｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡ、ならびに１０〜５０ｕｇのＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ−ＲＮＡ（１００ｍｃｌのチップ）を用いて、ＴＩＬを、１４００Ｖ、１０ミリ秒間ずつ、３つのパルスで電気穿孔する。トランスフェクション後、ＴＩＬを、抗生物質非含有培養培地中、細胞１０００個／ｅｆｆｅｃｔｕＬで播種し、５％のＣＯ２中、３０℃で２４時間にわたりインキュベートする。回収の２４時間後、ＴＩＬを、抗生物質含有培地へと移し、５％のＣＯ２中、３７℃で培養することができる。
【０２７３】
次いで、ＰＢＭＣフィーダー細胞およびＩＬ−２の存在下で、抗ＣＤ３を使用して、ＴＩＬを刺激することにより、細胞を、２週間にわたり、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）にかける。拡大されたＴＩＬ（ここでは、細胞数十億個）を洗浄し、プールし、患者へと注入し、１または２サイクルのＨＤ  ＩＬ−２療法を続ける。ＴＩＬを移入させる前に、ＴＩＬの存続を容易とするために、シクロホスファミド（Ｃｙ）およびフルダラビン（fludaribine）（Ｆｌｕ）を使用する準備レジメンであって、宿主リンパ球を一過性に枯渇させ、注入されるＴＩＬに「場所を空け」、サイトカインシンクおよび調節性Ｔ細胞を除去する準備レジメンで、患者を処置することができる。対象は、対象自身の修飾ＴＩＬ細胞の注入を、３０分間にわたり受け、処置から回復するまで、院内にとどまって、有害事象についてモニタリングされる。図４０Ａおよび図４０Ｂは、２例の異なる対象のＴＩＬの細胞拡大を示す。図４１Ａおよび図４１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ系および抗ＰＤ−１ガイドを電気穿孔され、フィーダー細胞の添加を伴うか、またはフィーダー細胞の添加を伴わずに培養されたＴＩＬの細胞拡大を示す。
【０２７４】
（実施例４）
ｇＲＮＡの修飾
修飾ガイドＲＮＡのデザインおよび構築：
遺伝子の所望の領域へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をデザインした。オフターゲット位置により決定される、最高のランク付け値に基づき、複数のｇＲＮＡ（表４に示す）を選び出した。ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＩＳＨの遺伝子配列をターゲティングするｇＲＮＡを、２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加を含有するように修飾した（図２２および図３２）。
【０２７５】
（実施例５）
消化器がんのためのＴＩＬ療法の第Ｉ相臨床試験
評価可能な消化器がんを有する対象は、腫瘍性試料の切除を受けることになる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖および拡大させるであろう。複数の個々の断片または腫瘍浸潤リンパ球の複数の個々の培養物をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる。個々の培養物は別個に拡大し、十分な収率のＴＩＬ（細胞約１０８個）が各培養物から拡大されたら、ＴＩＬを凍結保存し、免疫学的試験のためにアリコートを取る。元の腫瘍のアリコートをエクソームシーケンシングにかけ、可能な場合はトランスクリプトームシーケンシングにもかけて、対象の正常細胞と比較してがんに特有に存在する変異を同定する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性試験を使用して、同定された変異に対する反応性について、培養された各ＴＩＬ調製物のアリコートを試験する。簡潔に述べると、１２個の正常なアミノ酸に挟まれた変異ペプチドを中央に含む２５量体ペプチドで対象の抗原提示細胞をパルスする。代替的に、全ての変異をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを患者の抗原提示細胞に電気穿孔する。次いで、これらの技術の一方または両方を使用し、事前に凍結保存したＴＩＬ培養物を反応性について試験して、認識される正確な変異を同定する。次いで、個々のがん変異に対して高度の反応性を有する培養物に対して、ＣＩＳＨ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを行う。この手順では、最大で５つの異なる培養物を各患者から選択することができる。変異反応性が裏付けられた培養物は、「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」（ＧＭＰ）を満たす細胞産生施設に送られ、ここで、ＣＩＳＨ遺伝子をノックアウトするためにＣＲＩＳＰＲ技術が使用される。ＣＩＳＨ遺伝子のノックアウトは、ＤＮＡシーケンシングに基づくＴＩＤＥ（ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）解析によって決定される。ＣＩＳＨ遺伝子のノックアウトに成功した細胞集団は次いで、ＯＫＴ３およびフィーダー細胞を用いて急速に拡大される。次いで、凍結保存されたリンパ球が患者の処置に用いられる。この臨床試験プロトコールの第１部では、１群当たり１名の対象を用い、対象１名当たりＣＩＳＨノックアウト細胞１０９個から始まる用量漸増を開始する。個々の対象を半対数増分で処置し、細胞注入に起因してグレード２より高い毒性が見られた場合、その群をさらなる患者に拡大する。次の用量を用いる：１）細胞１０９個、２）細胞３×１０９個、３）細胞１０１０個、４）細胞３×１０１０個、５）細胞３×１０１０〜２×１０１１個。患者には、リンパ球を枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）準備レジメンに続いて、操作細胞および高用量ＩＬ−２の注入を施す。細胞産物の投与から約４〜６週間後、細胞の存続についてのほか、臨床応答についても患者を評価する。各患者には単一の処置コースのみを施し、患者を毎月追跡して、免疫学的研究のためにリンパ球および血清を回収する。
【０２７６】
不応性の転移性がん患者における、ＣＩＳＨ遺伝子がノックアウトされた突然変異反応性のある自家リンパ球の投与の安全性を評価する。転移性がん患者における、標準的な非骨髄破壊性前処理レジメンと、ＣＩＳＨ遺伝子がノックアウトされた変異反応性ＴＩＬと、リンパ球を使用した高用量ＩＬ−２との奏効率のほか、転移性消化器がんを有する対象におけるＣＩＳＨノックアウト変異反応性リンパ球の生存および存続も決定する。
【０２７７】
（実施例６）
マウスモデルにおけるＣＩＳＨノックダウン
ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｉｓｈの役割を調査するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞を野生型（ＷＴ）マウスまたはＣｉｓｈ−／−ｐｍｅｌ−１マウスから単離し、ペプチドでパルスしたＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞で刺激し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖およびサイトカイン産生について検討する。ＣＤ８＋Ｔ細胞単離後のフローサイトメトリー解析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化状態がＣｉｓｈの有無を問わず定常状態で変更なしのままであることを明らかに示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるプライミングの１週間後のＣＤ８＋Ｔ細胞の計数は、Ｃｉｓｈの非存在下におけるＴ細胞が著しくより多いことを明らかに示す。アポトーシスの評価により、このｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞拡大の増大が説明され得る。プライミングされたＴ細胞をＴＣＲで刺激し、核染料の７−ＡＡＤおよびアネキシンＶで染色する。アネキシンＶは、アポトーシス前の細胞の細胞表面でホスファチジルセリンに結合する。
【０２７８】
（実施例７）
Ｃｉｓｈ欠損症の黒色腫マウスモデル
Ｃｉｓｈ欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能的意義は、ｐｍｅｌ−１黒色腫モデルを使用することにより決定することができる。Ｃｉｓｈありまたはなしの黒色腫特異的ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を、確立されたＢ１６黒色腫保有Ｃ５７ＢＬ／６宿主に養子移入（ＡＣＴ）し、蛍光標識した腫瘍細胞のＩＶＩＳイメージングおよび移入された操作細胞のフローサイトメトリー解析により、腫瘍成長およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける存続について評価する。Ｃｉｓｈ欠損ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞のＡＣＴは、ＷＴ  Ｔ細胞と比較して、大きな定着腫瘍の著しく恒久的な退縮をもたらす。この顕著な退縮は生存率の改善ももたらし、Ｃｉｓｈ−／−Ｔ細胞のＡＣＴは、腫瘍保有マウスの生存期間を６０日超にわたって延長させる。コンジェニックマーカーで標識された（ｃｏｎｇｅｎｉｃａｌｌｙ−ｍａｒｋｅｄ）ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞のＡＣＴ後の処置マウスの逐次サンプリングは、ＷＴの同腹仔から得られたＴ細胞と比較してＣｉｓｈ欠損Ｔ細胞の明白な拡大および収縮遅延を明らかに示す。
【０２７９】
（実施例８）
Ｒａｇ１−／−におけるＣｉｓｈ欠損症の黒色腫マウスモデル
適応免疫系を欠いている腫瘍保有宿主を使用して、Ｃｉｓｈが調節されたＣＤ８＋Ｔ細胞内因性のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍殺滅を評価する。Ｃｉｓｈありまたはなしの治療量以下の数のｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞（２．５×１０５）を、ワクチン（１×１０７ＰＦＵ）および外因性ＩＬ−２（２×１０４ＩＵ）の低減した投与と共に、「空の」Ｒａｇ１−／−Ｂ１６腫瘍保有宿主に養子移入し、次いで腫瘍成長を評価する。腫瘍特異的Ｃｉｓｈ欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞の治療量以下の投与により、触知できる腫瘍塊が５０日超にわたって増悪しない長期の腫瘍の「維持」または退縮が期待されるが、ＷＴ  ＣＤ８＋Ｔ細胞でこれは期待されない。Ｃｉｓｈ−／−腫瘍特異的Ｔ細胞がそれらのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的アビディティーの増大を維持するかどうかを決定する。この目的のために、コンジェニックマーカーで標識されたｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を移入の７日後に磁気ビーズによって脾細胞からｅｘ  ｖｉｖｏで濃縮し、ペプチドでパルスした標的に対するＩＦＮ−γの放出について評価する。ＷＴ  Ｔ細胞と比較して、ｅｘ  ｖｉｖｏで刺激されたＣｉｓｈ−／−Ｔ細胞の機能的アビディティーの著しい増大がもたらされ得る。この増強された機能的アビディティーの明らかな「維持」は、低レベルの抗原を典型的に発現する腫瘍をターゲティングする際に重要であり得る。Ｃｉｓｈ−／−腫瘍特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８枯渇によりＡＣＴの３５日後でも消失し、その後、長期の腫瘍特異性を評価するために腫瘍成長解析が行われる。
【０２８０】
（実施例９）
ｇＲＮＡ安全性解析
次世代ディープシーケンシングによってオフターゲット部位を評価するため、ＰＤ−１またはＣＩＳＨをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬をヒト末梢血由来Ｔ細胞に電気穿孔し、トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡを採取した。ターゲティングされるＴ細胞のプールからＰＣＲによって各部位を増幅させ（予想されるＣａｓ９切断部位の周囲の２５０ヌクレオチド）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉ−Ｓｅｑ機を使用したディープシーケンシングにかけた。これにより、ＰＣＲ産物プールの配列読み取りデータの驚くほど高深度な解析が可能になり、各オフターゲット部位の検出のために平均４５０，０００の配列読み取りデータが利用可能であった。したがって、この方法を使用すれば、存在量の低いオフターゲット修飾でさえ容易に検出可能である。
【０２８１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬をトランスフェクトしたＴ細胞の各オフターゲット部位のディープシーケンシングによる出力を、無処置のままにしたＴ細胞と比較して、ＣＲＩＳＰＲを媒介する修飾を経た部位を同定した。ＰＤ−１については、７１の候補部位のうち１つのみが、無処置の対照細胞において観察されたものよりも高いオフターゲット修飾頻度の証拠を提示し（表１０を参照されたい）、ＣＩＳＨについて解析した部位のうち、ＣＲＩＳＰＲを媒介する修飾の証拠を示したものはなかった（表１１を参照されたい）。ＰＤ−１  ｇＲＮＡについて明らかになったオフターゲット活性は、１％未満の破壊頻度を示しており、この部位は、公知のコーディング遺伝子のいずれにも含まれず、したがって、修飾された場合にＴ細胞機能に何の影響も及ぼさない可能性が高い、ゲノム内の配列にマッピングされる。
【０２８２】
（実施例１０）
反応性ＴＩＬの同定および単離
ＴＩＬをがん病変から単離する。２４個の個々のＴＩＬ培養物を、無関係のタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）ＲＮＡか、または全エクソームシーケンシングおよびトランスクリプトームシーケンシングによって同定された６１種の変異をコードする、指し示されているＴＭＧ−ＭＣＳＰ構築物をトランスフェクトした自家樹状細胞と共培養した後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定されるＩＦＮ−γ産生、ならびに、無関係のＴＭＧ  ＲＮＡもしくはＴＭＧ−ＭＣＳＰをトランスフェクトした樹状細胞（ＤＣ）との共培養、またはＴＭＧ−ＭＣＳＰによりコードされる突然変異した長いペプチドとの一晩のインキュベーションの後の、ＴＩＬ培養物のＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞における４−１ＢＢまたはＣＤ２８発現のフローサイトメトリー解析。
【０２８３】
ＭＣＳＰに対する反応性を示すＴＩＬ培養物のフローサイトメトリーに基づくＴＣＲ−Ｖβスペクトラタイピングを実施する。５’ＲＡＣＥおよびＴＣＲ−ＰＣＲによって決定される、濃縮されたＴＣＲ−Ｖβ集団のＴＣＲ−アルファ鎖配列およびベータ鎖配列を使用して、磁気ビーズに基づく抗ＭＣＳＰ  ＴＣＲ−Ｖβ集団の濃縮を実施する。
【表１０−１】
2019532080.tif 000020
【表１０−２】
2019532080.tif 000021
【表１０−３】
2019532080.tif 000022
【表１１−１】
2019532080.tif 000023
【表１１−２】
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【０２８４】
（実施例１０）
転移性がん患者における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してＣＩＳＨをコードする遺伝子を不活化させた腫瘍浸潤リンパ球の養子移入の第Ｉ／ＩＩ相試験
目的：
主な目的は、１）不応性の転移性がん患者における、ＣＩＳＨ遺伝子がノックアウトされた変異反応性のある自家リンパ球の投与の安全性を決定すること、および２）転移性がん患者における、標準的な非骨髄破壊性前処理レジメンと、ＣＩＳＨ遺伝子がノックアウトされた変異反応性ＴＩＬの投与と、高用量ＩＬ−２との奏効率を決定することである。二次的な目的は、転移性がん患者におけるＣＩＳＨノックアウト変異反応性リンパ球の生存および存続を評価することである。
【０２８５】
適格性
１８歳またはそれよりも上から７０歳またはそれ未満の年齢の対象が適格である。対象は、標準的な化学療法に対して不応性である評価可能な転移性がんを有し、ＴＩＬの調製のための外科的切除に適切な転移性がん病変を有し、高用量のアルデスロイキン投与に対する禁忌症を有せず、併存する主要な医学的疾病または何らかの形態の免疫不全を有しない。
【０２８６】
組み入れ基準
組み入れ基準は、ＴＩＬの作製のために切除可能である病変が少なくとも１つある測定可能ながん黒色腫に加え、測定され得る他の１つの病変、および転移性がんの診断の確定を含む。直径１ｃｍ未満かつ無症候性である脳転移を３つまたはそれよりも少なく有する患者は適格である。患者が適格となるためには、定位的放射線手術で処置された病変は、処置後１カ月間にわたって臨床的に安定していなければならない。脳転移が外科的に切除された患者は適格である。少なくとも１つの標準的一次療法の後の進行性疾患：抗体レベルを低下させるための準備レジメンを患者が受ける時点で、抗がん免疫応答をもたらし得るこうした過去の抗体療法のうちのいずれからも６週間が経過している必要がある。過去にイピリムマブを受けたことがあり、ＧＩ毒性の記録がある患者は、正常な大腸内視鏡検査と正常な大腸生検を有していなければならない。患者は、１８歳またはそれよりも上から７０歳またはそれ未満であり、ＥＣＯＧ  ０または１の臨床成績ステータスを有する。患者は３カ月超の平均余命を有する。いずれの性別の患者も、この研究への登録時から処置後最長４カ月にわたって、バースコントロールを実施する意思がなければならない。
【０２８７】
血清学
患者は、ＨＩＶ抗体に対して血清陰性である。ＨＩＶ血清陽性である患者は減少した免疫能を有し得るため、実験的処置に対する応答性が低く、その毒性に対する感受性がより高い。患者はＢ型肝炎抗原に対して血清陰性であり、Ｃ型肝炎抗体に対して血清陰性である。Ｃ型肝炎抗体試験が陽性である場合、患者はＲＴ−ＰＣＲによる抗原の存在に関する試験を受け、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性でなければならない。妊娠可能な女性は、妊娠検査結果が陰性でなければならない。
【０２８８】
血液学
フィルグラスチムの支援なしに絶対好中球数１０００／ｍｍ３超、ＷＢＣ≧３０００／ｍｍ３、血小板数≧１００，０００／ｍｍ３、ヘモグロビン＞８．０ｇ／ｄｌ。
【０２８９】
化学
患者は、血清ＡＬＴ／ＡＳＴが正常上限の２．５倍以下、血清クレアチニンが１．６ｍｇ／ｄｌ以下、そして総ビリルビンが１．５ｍｇ／ｄｌ以下でなければならない（総ビリルビンが３．０ｍｇ／ｄｌ未満でなければならないＧｉｌｂｅｒｔ症候群患者を除く）。患者が準備レジメンを受ける時点で、過去の全身療法のいずれからも４週間超が経過しており、患者の毒性がグレード１またはそれ未満まで回復している（脱毛症または白斑などの毒性を除く）。患者は、過去の処置の後に進行性疾患を有する。全ての毒性がグレード１またはそれ未満まで回復している限り、患者は過去３週間以内に軽微な外科手技を受けていてもよい。抗体レベルを低下させるための準備レジメンを患者が受ける時点で、抗ＣＴＬＡ４抗体療法を含め、抗がん免疫応答をもたらし得る抗体療法のいずれの時からも、６週間が経過している。
【０２９０】
除外基準
妊娠中もしくは母乳育児中であるか、または何らかの形態の原発性免疫不全（例えば重症複合型免疫不全症）を有する妊娠可能な女性は除外される。併存する日和見感染症を有する患者は除外される。活動性の全身感染症（例えば、抗感染処置を要求するもの）、凝固障害、あるいは、ストレスタリウム試験もしくは同等の試験の陽性結果、心筋梗塞、心不整脈、閉塞性もしくは拘束性の肺疾患を根拠とする他の心血管系、呼吸器系、または免疫系の活動性の主要な医学的疾病を有する患者は除外される。全身性ステロイド療法を同時に受けている患者、シクロホスファミドもしくはフルダラビンに対する重度の即時過敏症反応の履歴がある患者、または冠血行再建もしくは虚血症状の履歴がある患者は除外される。患者は、４５％またはそれ未満のＬＶＥＦの記録を有する。年齢＞６５歳であり、これらに限定されないが、心房細動、心室頻拍、第２度または第３度の心ブロックを含む、臨床的に有意な心房性不整脈および／または心室性不整脈を有する患者においては、試験が要求される。
【０２９１】
スクリーニング評価
化学療法レジメン開始前４週間以内：
体重、ＥＣＯＧ、およびバイタルサイン、および目の検査を含む、存在するあらゆる病変の正確なサイズおよび場所を詳細に記す全病歴聴取および身体検査を行う（注：患者の履歴は８週間以内に得ることができる）。疾患の状態を評価するための胸部Ｘ線、ＥＫＧ、胸部、腹部、および骨盤のベースラインＣＴ、ならびに脳ＭＲＩ。患者の徴候および症状に基づいて臨床適応があれば、さらなるスキャンおよびＸ線を実施する。長期の喫煙歴（過去２年間に２０パック／年の喫煙）または呼吸機能障害の症状がある患者の肺機能試験（注：処置の８週間以内に実施する）。６０歳もしくはそれより上の患者、あるいは虚血性心疾患、胸部痛、またはこれらに限定されないが心房細動、心室頻拍、心ブロックを含む臨床的に有意な心房性不整脈および／または心室性不整脈の履歴を有する患者の心臓評価（ストレスタリウム、心エコー図、ＭＵＧＡなど）。４５％またはそれ未満のＬＶＥＦを有する患者は不適格となる。心リスク因子を呈する６０歳未満の患者は、上述の心臓評価を受ける場合がある（例えば、糖尿病、高血圧、および肥満）（注：処置の８週間以内に実施され得る）。ＨＩＶ抗体力価およびＨｂｓＡＧの決定、ならびに抗ＨＣＶ（化学療法開始日の３カ月以内に実施され得る）。抗ＣＭＶ抗体力価、ＨＳＶ血清学、およびＥＢＶパネル（注、化学療法開始日の３カ月以内に実施され得る；上記のいずれかについて陽性であることが分かっている患者を再試験する必要はない）。
【０２９２】
化学療法レジメン開始前１４日以内：
ベースライン血液検査、Ｃｈｅｍ  ２０：（ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、塩化物（Ｃｌ）、総ＣＯ２（炭酸水素）、クレアチニン、グルコース、尿素窒素（ＢＵＮ）、アルブミン、総カルシウム、総マグネシウム（Ｍｇ）、無機リン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ／ＧＰＴ、ＡＳＴ／ＧＯＴ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ＬＤ、総タンパク質、総ＣＫ、尿酸）、甲状腺パネル、白血球数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｕｎｔ）および血小板数を含むＣＢＣ、ＰＴ／ＰＴＴ、尿検査および培養（適応がある場合）
【０２９３】
化学療法レジメン開始前７日以内：
妊娠可能でＥＣＯＧ成績ステータスが０または１の全ての女性のβ−ＨＣＧ妊娠検査（血清または尿）
【０２９４】
研究デザイン
評価可能な転移性がんを有する患者は腫瘍の切除を受ける。図４２に示す手順に従って、腫瘍由来のリンパ球（ＴＩＬ）を増殖および拡大させる。複数の個々の断片または腫瘍浸潤リンパ球の複数の個々の培養物を増殖させる。個々の培養物は別個に拡大し、十分な収率のＴＩＬ（細胞約１０８個）が各培養物から拡大されたら、ＴＩＬを凍結保存し、免疫学的試験のためにアリコートを取る。元の腫瘍のアリコートをエクソームシーケンシングにかけ、可能な場合はトランスクリプトームシーケンシングにもかけて、正常細胞と比較してがんに特有に存在する変異を同定する。既に記載されている手法を使用して、これらの変異に対する反応性について、培養された各ＴＩＬ調製物のアリコートを試験する。簡潔に述べると、１２個の正常なアミノ酸に挟まれた変異ペプチドを中央に含む２５量体ペプチドで患者の抗原提示細胞をパルスする。代替的に、全ての変異をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを患者の抗原提示細胞に電気穿孔する。これらの技術の一方または両方を使用し、事前に凍結保存したＴＩＬ培養物を、個々のがん変異に対する反応性について試験し、これらに対してＣＩＳＨ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを行う。この手順では、最大で５つの異なる培養物を各患者から選択する。
【０２９５】
変異反応性が裏付けられた培養物は、ＧＭＰを満たす細胞産生施設に送られ、ここで、ｃＧＭＰ条件下でＣＩＳＨ遺伝子をノックアウトするためにＣＲＩＳＰＲ技術が使用される。ＣＩＳＨ遺伝子のノックアウトは、ＤＮＡシーケンシングに基づくＴＩＤＥ（ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）解析によって決定される。ＣＩＳＨ遺伝子のノックアウトに成功した細胞集団は次いで、ＯＫＴ３およびフィーダー細胞を用いて急速に拡大される。凍結保存されたリンパ球が患者の処置に使用される。
【０２９６】
このプロトコールの第１部では、１群当たり１名の患者を用い、患者１名当たりＣＩＳＨノックアウト細胞１０９個から始まる用量漸増を開始する。個々の患者を半対数増分で処置し、グレード２より高い毒性が見られた場合、その群をさらなる患者に拡大する。したがって、次の用量を用いる：細胞１０９個、細胞３×１０９個、細胞１０１０個、細胞３×１０１０個、および細胞３〜１０×１０１０個。
【０２９７】
患者には、リンパ球を枯渇させる準備レジメンに続いて、細胞および高用量のアルデスロイキンの注入を施す。細胞産物の投与から約４〜６週間後、細胞の存続についてのほか、臨床応答についても患者を評価する。各患者には単一の処置コースのみを施し、患者を毎月追跡して、免疫学的研究のためにリンパ球および血清を回収する。
【０２９８】
薬物投与
シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いる準備レジメン：
時間は例として提示するものであり、薬物投与間で同様の時間的関係が維持される限り変更してよい。１日に１回与えられる薬物の試験薬開始時間は、予定時刻の２時間以内に与えられるべきである。他の薬は全て、予定時刻の＋／−１時間に与えられるべきであり、投与の長さは全て、＋／−１５分である。利尿薬の投与、電解質の補給、および水分補給、ならびに電解質のモニタリングは全て、臨床適応がある場合に実施されるべきである。下記の用量および時間は例として提示するものに過ぎない。注入は、医学的に適応があれば減速または遅延させてもよい。
【０２９９】
−７日目および−６日目
６ＡＭ  水分補給：１０ｍｅｑ／Ｌの塩化カリウムを含有する０．９％塩化ナトリウムの２．６ｍｌ／ｋｇ／時での注射による水分補給を始める（シクロホスファミドの１１時間前に開始し、最後のシクロホスファミド注入の２４時間後まで水分補給を継続する）。準備レジメン中のいずれかの時点において、尿量が１．５ｍｌ／ｋｇ／時未満である場合、または体重がシクロホスファミド投与前の値と比べて２ｋｇ超多い場合、フロセミド１０〜２０ｍｇをＩＶ投与してよい。フロセミドの投与後は血清カリウムをモニタリングし、適応があれば処置すべきである。
【０３００】
４ＰＭ：オンダンセトロン（０．１５ｍｇ／ｋｇ／投与［患者の体重に基づいて８ｍｇから１６ｍｇの間で最近接偶数へ丸めた用量（ｍｇ）］８時間ごとにＩＶ×３日）を悪心のために与える。
【０３０１】
５ＰＭ：１時間にわたる、メスナ１５ｍｇ／ｋｇ／日×２日を併用した、２５０ｍｌのＤ５Ｗ中のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日×２日のＩＶ投与。患者が肥満（ＢＭＩ＞３５）である場合、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算する。
【０３０２】
１０ｐｍ：各シクロホスファミド投与後２３時間にわたる、適切な希釈剤（医薬品のセクションを参照されたい）に希釈したメスナの３ｍｇ／ｋｇ／時での静脈内注入を始める。患者が肥満（ＢＭＩ＞３５）である場合、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算する。
【０３０３】
−７日目から−３日目
５日間にわたる１日当たり３０分間のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日のＩＶＰＢ。患者が肥満（ＢＭＩ＞３５）である場合、薬物投与量は、付録２に記載されるように、実際の体重を使用して計算する（フルダラビンは、−７日目および−６日目のシクロホスファミドおよびメスナの約１〜２時間後に開始する）。
【０３０４】
０日目（最後のフルダラビン投与の２〜４日後）：
非濾過チューブを介し、自家ＴＩＬ注入を２０〜３０分間にわたって静脈内に施し、注入中、細胞の凝集を防止するためにバッグを穏やかに揺り動かす。
【０３０５】
下記に記載されるアルデスロイキン。１〜４日目（０日目は細胞注入の日である）：
【０３０６】
下記に記載されるアルデスロイキン。１日目または２日目から始めて、フィルグラスチムを５ｍｃｇ／ｋｇ／日（３００ｍｃｇ／日を超過しない）の用量で皮下投与してよい。フィルグラスチム投与は、好中球数が＞１．０×１０９／Ｌ×３日または＞５．０×１０９／Ｌになるまで毎日継続する。
【表１２】
2019532080.tif 000025
【０３０７】
アルデスロイキンは、細胞注入の２４時間以内に始まり最長で５日間（最大で１５回の投与）にわたって継続する１５分間の静脈内ボーラスとして、７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量（総体重に基づく）で投与する。投与は、優先的には８時間ごとに施されるが、患者の耐容性に応じて、最長２４時間が投与間で経過してよい。最後のアルデスロイキン投与の２４時間以内に対症手段によって毒性が十分に回復しない場合、アルデスロイキン投与を停止する。患者がアルデスロイキンに起因してグレード３または４の毒性に達した場合は投与を遅延または停止させるが、アルデスロイキンに一般的である可逆的なグレード３の毒性、例えば下痢、悪心、嘔吐、低血圧、皮膚の変化、食欲不振、粘膜炎、嚥下障害、または付録３に詳述される全身症状および検査上の変化を除く。毒性は管理される。これらの毒性が２４時間以内に対症手段によって容易に逆転し得る場合、さらなる用量が与えられる。
【０３０８】
準備レジメン開始前
適応があればアフェレーシス。準備レジメン開始前の１４日以内に、患者の全血球数、電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、肝機能試験、ＴＢＮＫ、および血清化学的試験を実施する。いずれかの結果が適格性について確立された基準を超える場合、異常が解決され得るまでその患者は続行しない。
【０３０９】
準備レジメン中：毎日
全血球数、Ｃｈｅｍ  ２０の同等物：ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、塩化物（Ｃｌ）、総ＣＯ２（炭酸水素）、クレアチニン、グルコース、尿素窒素（ＢＵＮ）、アルブミン、総カルシウム、総マグネシウム（Ｍｇ）、無機リン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ／ＧＰＴ、ＡＳＴ／ＧＯＴ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ＬＤ、総タンパク質、総ＣＫ、尿酸、尿検査。
【０３１０】
細胞注入後
別段の臨床適応がない限り、４時間にわたって１時間ごと（＋／−１５分）に、次いでルーチン的（４〜６時間ごと）に、バイタルサインをモニタリングする。総リンパ球数が２００／ｍｍ３を超えたら、末梢血ＣＤ４数のＴＢＮＫを毎週（患者が入院している間）得る。
【０３１１】
入院中１〜２日ごと
臨床適応があれば全身点検および身体検査、ＣＢＣ、Ｃｈｅｍ  ２０の同等物：ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、塩化物（Ｃｌ）、総ＣＯ２（炭酸水素）、クレアチニン、グルコース、尿素窒素（ＢＵＮ）、アルブミン、総カルシウム、総マグネシウム（Ｍｇ）、無機リン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ／ＧＰＴ、ＡＳＴ／ＧＯＴ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ＬＤ、総タンパク質、総ＣＫ、尿酸、臨床適応があれば他の試験を実施する。
【０３１２】
研究後の評価（フォローアップ）
全ての患者は、細胞産物の投与の６週間後（＋／−２週間）、評価のために病院に戻る。予定される各評価時に患者は次の検査を受ける：身体検査、Ｃｈｅｍ  ２０の同等物：ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、塩化物（Ｃｌ）、総ＣＯ２（炭酸水素）、クレアチニン、グルコース、尿素窒素（ＢＵＮ）、アルブミン、総カルシウム、総マグネシウム（Ｍｇ）、無機リン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ／ＧＰＴ、ＡＳＴ／ＧＯＴ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ＬＤ、総タンパク質、総ＣＫ、尿酸、全血球数、臨床適応があれば甲状腺パネル、ＴＢＮＫ（ＣＤ４＞２００×２になるまで）、毒性評価（全身点検を含む）。臨床適応があれば胸部、腹部、および骨盤のＣＴ。臨床適応があれば、他のスキャンまたはＸ線、例えば脳ＭＲＩ、骨スキャンを実施してよい。第１のフォローアップ来診時に５リットルのアフェレーシスを実施してもよく、患者がアフェレーシスを受けることができなければ、約９６ｍｌの血液を得てもよい。その後、少なくとも３カ月間にわたり、フォローアップ来診時に約６０ｍｌの血液を得る。免疫学的試験を実施することができるように、末梢血単核細胞を凍結保存する。
【０３１３】
感染予防
Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  Ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ肺炎
全ての患者は、−５日から−８日の間に始めて連続しない日に週に３回、１日１回、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾール［ＳＭＸ］の固定された組合せを複効（ＤＳ）錠（ＤＳ錠＝ＴＭＰ  １６０ｍｇ／錠、およびＳＭＸ  ８００ｍｇ／錠）として経口（Ｐ．Ｏ．）摂取する。サルファ剤アレルギーのある患者では、ＴＭＰ／ＳＭＸ−ＤＳの代わりにペンタミジンを用いる。これは、化学療法開始日の１週間以内に、ネブライザー１つ当たり３００ｍｇでエアロゾル化して投与する。
【０３１４】
ヘルペスウイルス予防
ＨＳＶ血清陽性の患者には、化学療法の終了後毎日５００ｍｇの用量でバラシクロビルを経口投与するか、または患者が薬を摂ることができなければ、アシクロビル２５０ｍｇ／ｍ２を１２時間ごとにＩＶ投与する。アシクロビルのＩＶ投与では可逆的な腎不全が報告されているが、経口投与ではこの報告はない。より高用量のアシクロビルでは、せん妄、振戦、昏睡、急性精神障害、およびＥＥＧ異常を含む神経毒性が報告されている。これが起こった場合、投与量の調整を行うか、または薬物を中断する。アシクロビルは、ＤＮＡ合成に干渉する他のヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビルと併用されない。腎疾患では、製品のラベルに従って用量を調整する。ニューモシスティスおよびヘルペスの予防は、化学療法後６カ月にわたって継続することになる。化学療法後６カ月の時点でＣＤ４数が２００未満である場合、２回連続の測定でＣＤ４数が２００超になるまで予防を継続することとする。
【０３１５】
真菌予防（フルコナゾール）
患者は、化学療法が終了した翌日にフルコナゾール４００ｍｇのｐ．ｏ．投与を開始し、絶対好中球数が１０００／ｍｍ３超になるまで継続する。経口摂取することができない患者には、薬物を０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中４００ｍｇの用量で毎日ＩＶ投与してもよい。
【０３１６】
経験的抗生物質
患者は、３８．３℃の発熱が１回、または少なくとも１時間おいた３８．０℃もしくはこれを超える温度の発熱が２回あり、かつＡＮＣ＜５００／ｍｍ３の場合、広域スペクトル抗生物質である第３世代もしくは第４世代のセファロスポリンまたはキノロンのいずれかを開始する。未解明の発熱または何らかの感染合併症がある患者は全て、感染性疾患の診察を受ける。
【０３１７】
血液産物支援
毎日のＣＢＣをガイドとして使用し、患者は必要に応じて血小板および濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）を受ける。全ての血液産物に放射線照射する。輸血されたＷＢＣに対する感作を減少させ、ＣＭＶ感染のリスクを減少させるために、全ての血液および血小板輸血で白血球フィルターを用いる。
【０３１８】
副作用を制御するための他の併用薬
療法の副作用を制御するための併用薬を与えてもよい。重度の悪寒が生じた場合、メペリジン（２５〜５０ｍｇ）を静脈内投与する。要求される場合は他の支持療法が与えられ、これはアセトアミノフェン（６５０ｍｇ  ｑ４ｈ）、インドメタシン（５０〜７５ｍｇ  ｑ６ｈ）、およびラニチジン（１５０ｍｇ  ｇ１２ｈ）を含み得る。患者がステロイド療法を要求する場合は処置から除外する。輸血を要求する患者は、放射線照射した血液産物を受けることになる。悪心および嘔吐のために、オンダンセトロン０．１５ｍｇ／ｋｇ／投与を８時間ごとにＩＶ投与する。オンダンセトロンによって制御されない悪心および嘔吐については、必要に応じてさらなる制吐薬を投与する。中心静脈カテーテルへの抗生物質の適用は、調査者の裁量において行ってよい。
【０３１９】
腫瘍生検
腫瘍組織またはリンパ節の生検を実施してもよいが、治療過程において必須ではない。研究では腫瘍による抗原発現を評価し、またこれらの生検から増殖させたリンパ球の反応性を評価することができる。生検は、ベースラインにおいて、治療過程の後に、そして応答があった場合に実施してよい。これらの生検は、実施される手順ならびに顆粒球および血小板数に基づいて見込まれる疾病率が最小限である場合にのみ実施される。生検は、生検が１日を超える入院を要求しない場合にのみ許可される。
【０３２０】
免疫学的試験：
アフェレーシスは、細胞産物の投与前および投与の６週間（＋／−２週間）後に実施することができる。他の時点では、Ｆｉｃｏｌｌクッション上での遠心分離を使用した精製により、患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を全血から得る。これらのＰＢＭＣのアリコートを、細胞機能の免疫学的モニタリングのために凍結保存する。処置の免疫学的相関性を評価するためには、特異的溶解およびサイトカイン放出の評価、メタボロームおよび生体エネルギー論の研究（タツノオトシゴを使用する）、サイトカイン産生の細胞内ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ−スポットアッセイ、ならびにリンパ球サブセット解析をはじめとする様々な試験を使用することができる。一般に、これらのアッセイにおける２〜３倍の差違は、真の生物学的差違を示す。注入された全ての細胞産物の試料を凍結保存し、注入された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性と相関するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特徴を見出そうという試みのため、注入された細胞の表現型および機能の詳細なレトロスペクティブ解析を実施する。ＴＩＬ試料の解析は、注入されるＴＩＬの活性、特異性、およびテロメア長の評価を含むことになる。この研究プロジェクトの過程において回収される血液および組織検体は、バンクに預けられ、将来、新たな科学的疑問について調査するために使用され得る。
【０３２１】
アルデスロイキン（インターロイキン−２、プロロイキン、組換えヒトインターロイキン２）
製剤化／復元：アルデスロイキンは、約０．１７ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウムおよび０．８９ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウムで７．５のｐＨ（７．２〜７．８の範囲）に緩衝した、無菌の白色〜オフホワイトの凍結乾燥ケークとしての２２００万ＩＵ（１．３ｍｇ）のＩＬ−２と、５０ｍｇのマンニトールおよび０．１８ｍｇのドデシル硫酸ナトリウムを含有する、単回使用バイアルとして提供される。このバイアルは、１．２ｍＬの滅菌注射用水ＵＳＰで復元され、結果として得られる濃度は、１８００万ＩＵ／ｍｌまたは１．１ｍｇ／ｍＬである。希釈剤は、過剰な発泡を避けるためにバイアルの側部に対して方向付けるべきである。内容物が完全に溶解するまで穏やかに回旋させる。振盪しないこと。バイアルは保存剤を含有しないため、復元された溶液は２４時間以内に使用すべきである。
【０３２２】
希釈／安定性：復元されたアルデスロイキンは、５０ｍＬの５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でさらに希釈する必要がある。ＲＩＬ−２の添加前にＨＳＡを希釈剤に添加する。復元された溶液の１０００倍範囲（すなわち、１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｃｇ／ｍＬ）にわたる希釈は、ガラスボトルまたはポリ塩化ビニルバッグのいずれにおいても許容される。アルデスロイキンは、冷蔵温度および室温、２℃〜３０℃において４８時間にわたって化学的に安定である。
【０３２３】
投与：投与量は総体重に基づいて計算する。アルデスロイキンの最終希釈物を１５分間にわたって注入する。アルデスロイキンは入院患者として投与される。
フルダラビン
【０３２４】
投与：フルダラビンは、１５〜３０分間にわたり、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中のＩＶ注入として投与される。用量は体表面積（ＢＳＡ）に基づく。患者が肥満（ＢＭＩ＞３５）である場合、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算する。
【０３２５】
シクロホスファミド
投与：シクロホスファミドを２５０ｍｌのＤ５Ｗに希釈し、１時間にわたって注入する。用量は患者の体重に基づく。患者が肥満（ＢＭＩ＞３５）である場合、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算する。
【０３２６】
メスナ（２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、Ｍｅｓｎｕｍ、Ｍｅｓｎｅｘ、ＮＳＣ−１１３８９１）
投与：Ｄ５Ｗ中で流体１ｍｌ当たりメスナ２０ｍｇもしくは０．９％  ＮａＣｌまたはそれ未満の濃度まで希釈し、持続性注入として静脈内投与する。患者が肥満（ＢＭＩ＞３５）である場合、薬物投与量は、付録２に記載されるように、実際の体重を使用して計算する。毒性としては、悪心、嘔吐、および下痢が挙げられる。
フィルグラスチム（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）
【０３２７】
フィルグラスチムは商業的に得られ、３００ｕｇ／ｍｌバイアルおよび４８０ｕｇ／１．６ｍｌバイアルで供給されている。フィルグラスチムは冷蔵され、許可されてはならない。フィルグラスチムは毎日の皮下注射として与えられる。
【０３２８】
（実施例１４）
ＧＭＰプロセス検証
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の臨床解釈における１つの検討事項は、標準的な急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）によって達成される収率までノックアウトＴＩＬの産生をスケールアップする能力である。改変されたＲＥＰ戦略を用い、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬の電気穿孔の後、３つの独立したｃＧＭＰプロセス検証試行から１０７１の平均拡大倍率が達成された（表１３ならびに図４３Ａ、図４３Ｂ、図４３Ｃ、および図４４）。複数のＲＥＰを同時に開始する能力が可能になったため、この系により、１×１０１０個を超える細胞収率のノックアウトＴＩＬが患者への注入のために一貫して産生される。凍結保存も達成可能である（表１４）。
【表１３】
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【表１４】
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【０３２９】
（実施例１１）
タンパク質レベルにおけるゲノム破壊の検出
遺伝子レベルにおいて観察されるノックアウトの頻度がタンパク質の喪失と相関するかどうかを決定するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト後のＰＤ−１およびＣＩＳＨタンパク質の発現を評価した。電気穿孔後１４日目に、プレートに結合した抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８抗体を使用して末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞およびＴＩＬを再刺激し、ＰＤ−１およびＣＩＳＨタンパク質の喪失を、それぞれフローサイトメトリーおよびウェスタンブロットによって評価した。図４８に示される通り、ＰＤ−１タンパク質は、１４日目のＰＢ  Ｔ細胞およびＴＩＬの＞９０％において喪失している。これらのデータは、ノックアウト細胞が修飾後に標的タンパク質発現を喪失したことを確定し、重要なことに、ノックアウト細胞が保持され、修飾後に拡大し、かつ生存していることを裏付ける（図４６）。
【０３３０】
タンパク質レベルにおけるＣＩＳＨノックアウトの程度を決定するために、同じ戦略を利用した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で修飾したＰＢ  Ｔ細胞およびＴＩＬを１４日間にわたって拡大させ、次いで４８時間にわたって再刺激した。その後、細胞を回収し、ＣＩＳＨは細胞内タンパク質であるため、ウェスタンブロットによって抽出物を解析した。ゲノム修飾のＴｉＤＥ解析による高いノックアウト率と一致して、ノックアウトＰＢ  Ｔ細胞およびＴＩＬにおいてＣＩＳＨタンパク質は本質的に存在しなかった（図４５）。これらのデータは、初代ヒトＴ細胞およびＴＩＬにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子破壊のためのこの戦略が、高い効率でターゲティングされた遺伝子ノックアウトをもたらすことを裏付ける。
【０３３１】
（実施例１２）
ＳＰＩＣＥ（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ）解析
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後の高い細胞生存率および増殖の維持に加えて、ノックアウトＴ細胞が活性化の際にエフェクター機能を保持するかどうかも決定しようとした。細胞内染色およびフローサイトメトリーをＳＰＩＣＥ（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ）解析と併せて使用したところ、ノックアウトＴ細胞は、再刺激時にサイトカインの多機能性を維持することが裏付けられた。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を媒介する遺伝子編集後のＰＢ  Ｔ細胞およびＴＩＬのエフェクター機能が保存されることが指し示された（図４７Ａおよび図４７Ｂ）。
【０３３２】
（実施例１３）
ＩＬ−２ありおよびなしの「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」を満たすＴＩＬの増殖動態
「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」を満たす試行において使用された腫瘍浸潤リンパ球は、腫瘍全エクソームシーケンシングおよびタンデムミニ遺伝子／合成長鎖ペプチドスクリーニングを使用して、患者特異的がんネオ抗原に対する特異的な反応性を有するオリゴクローナルな亜集団として選択された。長期培養では、ＩＬ−２の存在下で細胞拡大が観察された（図５０Ａ）。ＩＬ−２投与中断後７日目のＩＬ−２の非存在下における増殖実験（図５０Ｂ）。ＩＬ−２なしでは、細胞の数および生存率が減少し、７日目までに残っている生細胞はごくわずかであった（図５０Ｂ）。
【０３３３】
（実施例１４）
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによるオフターゲット頻度の検出
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによってオフターゲット頻度を評価するために、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステム、１００μＬのチップを使用し、３×１０６個のヒトＰＢＬ由来Ｔ細胞に、１５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび１０μｇのＣＩＳＨ  ｇＲＮＡの存在下または非存在下で、８ｐｍｏｌまたは１６ｐｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）（５’ＧＴＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴＡＴ−３’）を電気穿孔した（図５２）。トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒシーケンシングの後にＴｉＤＥ解析を行うことにより、ＣＩＳＨ標的部位におけるｄｓＯＤＮの組込み頻度を評価した。Ｃｏｖａｒｔｉｓ  Ｓ２超音波処理器（Ｃｏｖａｒｔｉｓ）を使用し、ゲノムＤＮＡを平均長５００ｂｐへとせん断処理した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ精製キット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し、せん断処理後のＤＮＡを精製した後、粘着性のＤＮＡ末端があれば、Ａｎｚａ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、平滑な５’リン酸化末端に変換した。次いで、ＰＣＲを使用して、バーコードづけされたシーケンシングアダプターをゲノム断片へとライゲーションし、ＮＧＳ解析への準備が整った最終的なライブラリーを作製した。
【０３３４】
（実施例１５）
ＣＩＳＨが破壊されたＴＩＬの細胞遺伝学的解析
ＧＭＰ製造プロセス認定試行中に産生されたＣＩＳＨノックアウト変異反応性ＴＩＬに対して、細胞遺伝学的解析を実施した。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用してＴＩＬを刺激し、その後、Ｎｅｏｎ電気穿孔システムを使用して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１５μｇ）およびＣＩＳＨ  ｇＲＮＡ（１０μｇ）を電気穿孔によって送達した。電気穿孔後、ＣＩＳＨが破壊された変異反応性ＴＩＬを、放射線照射したフィーダーの存在下で１４日間にわたるＲＥＰにかけ、１４日の時点で試料の細胞遺伝学解析を行った。細胞遺伝学的解析は、５つの試料：ＰＱ１  ＣＩＳＨ  ＫＯ変異反応性ＴＩＬ、ＰＱ２  ＣＩＳＨ  ＫＯ変異反応性ＴＩＬ、ＰＱ３処置前、ＰＱ３  ＣＩＳＨ  ＫＯ変異反応性ＴＩＬ、およびＰＱ３対照に対して実施した。
【０３３５】
１３．０ｍＬのＴＩＬ懸濁培養物を２．０時間のコルセミド処置にかけ、細胞を採取し、４００のバンドレベル解像度におけるＧ分染法により、２０個の中期細胞を完全に解析した。さらに３０個の中期細胞を、第４染色体と第９染色体との間の転座についてスクリーニングした。Ｃｙｔｏｇｅｎｏｍｉｃｓ結果が指し示したのは以下の通りであった。
【０３３６】
ＰＱ３対照：４６、ＸＸおよび４６、ＸＸ。所見は正常女性の核型を指し示している。転座は観察されなかった。
【表１５】
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【０３３７】
ＰＱ３処置前：４６、ＸＸおよび４６、ＸＸ、ｔ（４；９）（ｑ３１．３；ｑ１３）［９］／４６、ＸＸ。解析した２１個の中期細胞のうち９個が、バンド４ｑ３１．３における第４染色体の長腕と、バンド９ｑ１３における第９染色体の長腕との間の相互転座を有した。残りの１２個の中期細胞は各々、２つの正常な第４染色体および第９染色体を有する４６、ＸＸの核型を有した。
【表１６】
2019532080.tif 000029
【０３３８】
ＰＱ１変異反応性ＴＩＬ：４６、ＸＸ。４５、Ｘ、−Ｘ、ａｄｄ（１）（ｐ１３）、ｄｅｒ（１４）ｔ（１；１４）（ｐ１３；ｐ１１．１）、＋２１、ｉ（２１）（ｑ１０）。４５、Ｘ、−Ｘ、ａｄｄ（１）（ｐ１３）、−７、＋１１、ｄｅｒ（１４）ｔ（１；１４）（ｐ１３；ｐ１１．１）。４３、Ｘ、ｄｉｃ（ｘ；１２）（ｑ２１；ｐ１３）、−１７、−１９、ｄｅｒ（２１；２２）（ｑ１０；ｑ１０）、＋２２。４６、Ｘ、Ｄｅｌ（ｘ）（ｑ２１）。４５、ＸＸ、−７、−１８、＋ｒ／４６、ＸＸ、ｄｅｌ（８）（ｐ１２）、＋１４、ｉ（１４）（ｑ１０）。解析した２３個の中期細胞のうち６個が、染色体数異常および／または染色体構造異常を有した。これらの細胞のうち１つを除いて全てが、Ｘ染色体（４つの細胞）および末端動原体染色体（１３、１４、１５、２１、２２）の短腕の再配列を優先的に伴う、３つまたはそれよりも多くの異常を有した。これら６つの細胞のうち２つのみが同じ異常を共有し、クローンの基準を満たした。
【表１７】
2019532080.tif 000030
【０３３９】
ＰＱ２変異反応性ＴＩＬ：４６、ＸＸ。４５、ＸＸ  ｄｅｒ（１５；２２）（ｑ１０；ｑ１０）。解析した５０個の中期細胞のうち１個が、第１５染色体と第２２染色体との間の転座を有した。
【表１８】
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【０３４０】
ＰＱ  ３変異反応性ＴＩＬ：４６、ＸＸ。４６、ＸＸ、ｔ（４；９）（ｑ３１．３；ｑ１３）。４６、ＸＸ、Ｄｅｌ（７）（ｐ１１．２）。解析した２０個の中期細胞のうち８個が、バンド４ｑ３１．３における第４染色体の長腕と、バンド９ｑ１３における第９染色体の長腕との間の相互転座を有した。さらに１つの細胞は第７染色体の短腕の欠失を有し、これはおそらくランダムな染色体切断を表す非クローン性事象と解釈された。
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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