(57)【要約】  本発明は、改善された血管新生抑制用ペプチドＡｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥおよびこれを有効成分として含有する血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物に関し、具体的に、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＮ−末端のＡｒｇがアセチル化したことを特徴とする血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制用ペプチドと、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＬ−ＡｒｇがＤＡｒｇで置換されたことを特徴とする血管新生抑制用ペプチド、およびこれらのペプチドを有効成分として含有する組成物を過多な血管新生による疾患（癌、糖尿網膜病症または老人性黄斑変性）の予防および治療用に使用する技術に関する。 本発明のペプチドは、長い半減期を有し、ＶＥＧＦにより誘導される血管新生抑制効果に非常に優れている。したがって、本発明で開発したペプチドは、過多な血管新生に関連した疾患、癌、糖尿網膜病症または老人性黄斑変性に使用すると、これらの疾患を非常に効果的に予防および治療することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｎ−末端のＬ−Ａｒｇがアセチル化したことを特徴とする血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制用ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を抑制することを特徴とする請求項１に記載の血管新生抑制用ペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項４】
前記組成物は、腫瘍の成長と転移、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬よりなる疾患群から選択された一つ以上の疾患の予防および治療に使用されることを特徴とする請求項３に記載の血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する癌の予防および治療用組成物。
【請求項６】
前記癌は、固形癌であることを特徴とする請求項５に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項７】
前記固形癌は、大腸癌であることを特徴とする請求項６に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物。
【請求項１０】
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｌ−ＡｒｇがＤ−Ａｒｇで置換されたことを特徴とする血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制用ペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を抑制することを特徴とする請求項１０に記載の血管新生抑制用ペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、腫瘍の成長と転移、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬よりなる疾患群から選択された一つ以上の疾患の予防および治療に使用されることを特徴とする 請求項１２に記載の血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項１４】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する癌の予防および治療用組成物。
【請求項１５】
前記癌は、固形癌であることを特徴とする請求項１４に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項１６】
前記固形癌は、大腸癌であることを特徴とする請求項１５に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項１７】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物。
【請求項１８】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む血管新生に関連した疾患の治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む血管新生に関連した疾患の予防方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物の用途。
【請求項２２】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、癌の治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、癌の予防方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む癌の予防および治療用組成物の用途。
【請求項２５】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む糖尿網膜病症の治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む糖尿網膜病症の予防方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物の用途。
【請求項２８】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む老人性黄斑変性の治療方法。
【請求項２９】
請求項１に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む老人性黄斑変性の予防方法。
【請求項３０】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物の用途。
【請求項３１】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む血管新生に関連した疾患の治療方法。
【請求項３２】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む血管新生に関連した疾患の予防方法。
【請求項３３】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含む血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物の用途。
【請求項３４】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、癌の治療方法。
【請求項３５】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、癌の予防方法。
【請求項３６】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含む癌の予防および治療用組成物の用途。
【請求項３７】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む糖尿網膜病症の治療方法。
【請求項３８】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む糖尿網膜病症の予防方法。
【請求項３９】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物の用途。
【請求項４０】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む老人性黄斑変性の治療方法。
【請求項４１】
請求項１０に記載のペプチドを必要な個体に投与する段階を含む老人性黄斑変性の予防方法。
【請求項４２】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された血管新生抑制用ペプチドＡｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥ、およびこれを有効成分として含有する血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物に関し、具体的に、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＮ−末端のＡｒｇがアセチル化したことを特徴とする血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制用ペプチドと、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＬ−ＡｒｇがＤＡｒｇで置換されたことを特徴とする血管新生抑制用ペプチド、およびこれらのペプチドを有効成分として含有する組成物を過多な血管新生による疾患（癌、糖尿網膜病症または老人性黄斑変性）の予防および治療用に使用する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、正常および病理的条件でもすべて起こり、既存の血管から新しい血管が生成されることをいう。胚芽発達および傷治癒のような生理的条件と癌の成長および網膜疾患誘発のような病理的条件で起こるすべての血管新生は、血管新生促進因子と抑制因子の均衡によって調節される。しかし、病理的条件で血管新生促進因子の過多な生成および蓄積によって誘発される非正常的な血管生成は、腫瘍成長および転移、関節リウマチ、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性を含む様々な疾患の原因になる。
【０００３】
血管新生は、多様な血管新生促進因子により誘発される血管内皮細胞の活性化、増殖、移動および管形成を含む順次的過程により誘導されることが一般的である。血管新生促進因子のうち血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）は、多様な信号伝達連鎖反応を活性化させて、内皮細胞の増殖、移動、分化を誘導する役割をする。病理的条件でＶＥＧＦは、非正常的な血管新生を誘導して腫瘍細胞および網膜細胞の成長と血管漏出を促進させて、腫瘍の成長および転移、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性などを引き起こす。したがって、ＶＥＧＦの中和抗体と信号抑制剤を利用して、ＶＥＧＦの生物学的活性と信号伝達連鎖反応を妨害することにより、癌血管と網膜血管の新生を制御することができる。ＶＥＧＦやＶＥＧＦの受容体を標的とする血管新生抑制薬物は、病理的（非正常的な）血管新生に関連したヒト疾患を効果的に制御する良い治療戦略である。
【０００４】
最近、いくつかの血管新生抑制抗体、蛋白質および化学物質は、腫瘍、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性を含む過多な血管新生関連疾病治療用に開発されて臨床に使用されたが、高血圧および出血のような副作用が発生したり、低い特異性と生体利用率、抗原性および不適合な薬物動態などのような治療的限界点が報告されている。一般的に、小さいペプチドは、大量生産が容易であり、抗原性がなく、高い溶解度と生体利用率などの長所があるため、薬剤の開発に良い材料として提案されている。
【０００５】
これより、本発明者らは、ＶＥＧＦにより誘導される血管新生を効果的に抑制できるペプチドを開発するために多様な研究を試みており、その結果、ＶＥＧＦ受容体−２とＶＥＧＦ間の結合を効果的に遮断するＲＬＹＥ（Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）ペプチドを開発することができた。このペプチドは、ＶＥＧＦにより誘導される血管新生を効果的に抑制する活性を示し、このような活性は、過多な血管新生により誘発される疾病、特に癌の治療剤として非常に有用に使用できることが確認された。
【０００６】
しかし、追加研究を通じてＲＬＹＥペプチドは、血液内で分解が速くて、半減期が長くないことを確認して、これを改善する必要性を感じた。半減期を増やすことができると、持続的効果を期待できるので、過多な血管新生により誘発される疾病（癌、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性）を治療するのに一層有用なものと判断し、これに伴って、ＲＬＹＥペプチドの半減期を改善できる方法を研究するようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開特許ＷＯ９７／４１８２４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇ．Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｔ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｇｅｎｇｒｉｎｏｖｉｔｃｈ，Ｚ．Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＦＡＳＥＢＪ．１３（１９９９）９−２２．
【非特許文献２】Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，ｖａｓｃｕｌａｒ，ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（１９９５）２７−３１．
【非特許文献３】Ｒ．Ｈ．Ａｄａｍｓ，Ｋ．Ａｌｉｔａｌｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８（２００７）８４６４−８４７８．
【非特許文献４】Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｈ．Ｐ．Ｇｅｒｂｅｒ，Ｊ．ＬｅＣｏｕｔｅｒ，Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆＶＥＧＦ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）６６９−６７６．
【非特許文献５】Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｒ．Ｓ．Ｋｅｒｂｅｌ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３８（２００５）９６７−７４．
【非特許文献６】Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）／ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ）１０９（２００５）２２７−２４１．
【非特許文献７】Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａ，ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄＤｉｓｅａｓｅ，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（Ｓｅｏｕｌ）２２（２０１４）１−９．
【非特許文献８】Ｆ．Ｍ．Ｙａｋｅｓ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｔａｎ，Ｋ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｓｈｉ，Ｐ．Ｙｕ，Ｆ．Ｑｉａｎ，Ｆ．Ｃｈｕ，Ｆ．Ｂｅｎｔｚｉｅｎ，Ｂ．Ｃａｎｃｉｌｌａ，Ｊ．Ｏｒｆ，Ａ．Ｙｏｕ，Ａ．Ｄ．Ｌａｉｒｄ，Ｓ．Ｅｎｇｓｔ，Ｌ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｌｅｓｃｈ，Ｙ．Ｃ．Ｃｈｏｕ，Ａ．Ｈ．Ｊｏｌｙ，Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４），ａｎｏｖｅｌ  ＭＥＴ  ａｎｄ  ＶＥＧＦＲ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１０（２０１１）２２９８−２３０８．
【非特許文献９】Ｓ．Ｒ．Ｗｅｄｇｅ，Ｄ．Ｊ．Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｍ．Ｄｕｋｅｓ，Ｊ．Ｋｅｎｄｒｅｗ，Ｒ．Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｂｏｆｆｅｙ，Ｐ．Ｊ．Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｊ．Ｏ．Ｃｕｒｗｅｎ，Ｈ．Ｌ．Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｇ．Ａ．Ｇｒａｈａｍ，Ｇ．Ｄ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ａ．Ｐ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｓ．Ｓｔｏｋｅｓ，Ｂ．Ｃｕｒｒｙ，Ｇ．Ｈ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｐ．Ｆ．Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｌ．Ｂｉｇｌｅｙ，Ｌ．Ｆ．Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎ，ＺＤ６４７４  ｉｎｈｉｂｉｔｓｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（２００２）４６４５−４６５５．
【非特許文献１０】Ｗ．Ｋ．Ｙｏｕ，Ｂ．Ｓｅｎｎｉｎｏ，Ｃ．Ｗ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｂ．Ｆａｌｃｏｎ，Ｈ．Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｌ．Ｃ．Ｙａｏ，Ｄ．Ｔ．Ａｆｔａｂ，Ｄ．Ｍ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＶＥＧＦ  ａｎｄ  ｃ−Ｍｅｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅａｍｐｌｉｆｙ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１（２０１１）４７５８−４７６８．
【非特許文献１１】Ｄ．Ｄ．Ｈｕ−Ｌｏｗｅ，Ｈ．Ｙ．Ｚｏｕ，Ｍ．Ｌ．Ｇｒａｚｚｉｎｉ，Ｍ．Ｅ．Ｈａｌｌｉｎ，Ｇ．Ｒ．Ｗｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ａｍｕｎｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ａ．Ｒｅｗｏｌｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｅ．Ｙ．Ｗｕ，Ｍ．Ａ．ＭｃＴｉｇｕｅ，Ｂ．Ｗ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒ．Ｓ．Ｋａｎｉａ，Ｐ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｄ．Ｒ．Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｎｄｅｒ，Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｘｉｔｉｎｉｂ（ＡＧ−０１３７３６），ａｎ  ｏｒａｌ，ｐｏｔｅｎｔ，ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  １，２，３，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（２００８）７２７２−７２８３．
【非特許文献１２】Ｆ．Ｈｉｌｂｅｒｇ，Ｇ．Ｊ．Ｒｏｔｈ，Ｍ．Ｋｒｓｓａｋ，Ｓ．Ｋａｕｔｓｃｈｉｔｓｃｈ，Ｗ．Ｓｏｍｍｅｒｇｒｕｂｅｒ，Ｕ．Ｔｏｎｔｓｃｈ−Ｇｒｕｎｔ，Ｐ．Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ，Ｇ．Ｂａｄｅｒ，Ａ．Ｚｏｅｐｈｅｌ，Ｊ．Ｑｕａｎｔ，Ａ．Ｈｅｃｋｅｌ，Ｗ．Ｊ．Ｒｅｔｔｉｇ，ＢＩＢＦ  １１２０：ｔｒｉｐｌｅ  ａｎｇｉｏｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ｇｏｏｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８（２００８）４７７４−４７８２．
【非特許文献１３】Ｊ．Ｃ．Ｓｏｒｉａ，Ａ．Ｍａｕｇｕｅｎ，Ｍ．Ｒｅｃｋ，Ａ．Ｂ．Ｓａｎｄｌｅｒ，Ｎ．Ｓａｉｊｏ，Ｄ．Ｈ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｂｕｒｃｏｖｅａｎｕ，Ｍ．Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｂ．Ｂｅｓｓｅ，Ｊ．Ｐ．Ｐｉｇｎｏｎ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｈａｓｅ  ＩＩ／ＩＩＩ  ｔｒｉａｌｓ  ａｄｄｉｎｇｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｔｏ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｓ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（２０１３）２０−３０．
【非特許文献１４】Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｓ．Ｎａｍｋｏｏｎｇ，Ｙ．Ｍ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｌｅｅ、Ｋ．Ｓ．Ｈａ，Ｈ．Ｔ．Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．Ｇ．Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｍ．Ｋｉｍ，Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒａｆ−１／ＭＥＫ／ＥＲＫ−  ａｎｄ  ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｅＮＯＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９１（２００６）Ｈ２８３６−Ｈ２８４６．
【非特許文献１５】Ｊ．Ｈ．Ｓｏ，Ｓ．Ｋ．Ｈｏｎｇ，Ｈ．Ｔ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｓ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｈ．Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｋ．Ｂａｅ，Ｔ．Ｋｕｄｏｈ，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．Ｋｉｍ、２０１０．Ｇｉｃｅｒｉｎ／Ｃｄ１４６  ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １５（２０１０）１０９９−１１０．
【非特許文献１６】Ｙ．Ｃａｏ，Ａ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｓ．Ａ．Ａｎ，Ｒ．Ｗ．Ｊｉ，Ｄ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ｌｌｉｎａｓ，Ｋｒｉｎｇｌｅ  ５  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）２２９２４−２２９２８
【非特許文献１７】Ｐ．Ｃ．Ｌｅｅ、Ａ．Ｎ．Ｓａｌｙａｐｏｎｇｓｅ，Ｇ．Ａ．Ｂｒａｇｄｏｎ，Ｌ．Ｌ．Ｓｈｅａｒｓ  ２ｎｄ，Ｓ．Ｃ．Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｈ．Ｄ．Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｂｉｌｌｉａｒ，Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｅＮＯＳ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７（１９９９）Ｈ１６００−１６０８．
【非特許文献１８】Ｋ．Ｒ．Ｋｉｄｄ，Ｂ．Ｍ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｆｉｓｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４０（２００３）５８５−５９４．
【非特許文献１９】Ｓ．Ｉｓｏｇａｉ，Ｍ．Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｂ．Ｍ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ：ａｎ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙｌａｒｖａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３０（２００１）２７８−３０１．
【非特許文献２０】Ｊ．Ｉ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ，ＶＥＧＦ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（２００９）１３４７−１３５６．
【非特許文献２１】Ａ．Ｉｄｂａｉｈ，Ｆ．Ｄｕｃｒａｙ，Ｍ．Ｓｉｅｒｒａ  Ｄｅｌ  Ｒｉｏ，Ｋ．Ｈｏａｎｇ−Ｘｕａｎ，Ｊ．Ｙ．Ｄｅｌａｔｔｒｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ：ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １３（２００８）９７８−９９２．
【非特許文献２２】Ｋ．Ｍ．Ｃｏｏｋ，Ｗ．Ｄ．Ｆｉｇｇ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６０（２０１０）２２２−２４３．
【非特許文献２３】Ｈ．Ｍ．Ｖｅｒｈｅｕｌ，Ｈ．Ｍ．Ｐｉｎｅｄｏ，Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ７（２００７）４７５−４８５．
【非特許文献２４】Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｌ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｙ．Ｓｈｉｎｇ，Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｍ．Ｍｏｓｅｓ，Ｗ．Ｓ．Ｌａｎｅ，Ｙ．Ｃａｏ，Ｅ．Ｈ．Ｓａｇｅ，Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ：ａｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｂｙ  ａＬｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃｅｌｌ  ７９（１９９４）３１５−３２８．
【非特許文献２５】Ｇ．Ｓ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｍ．Ｋａｗａｉ，Ｒ．Ａ．Ｃｒａｉｇ，Ｄ．Ｊ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．Ｍａｊｅｓｔ，Ｒ．Ｌ．Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｌｙｓｙｌ  ４−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓｐｏｔｅｎｔ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｋｒｉｎｇｌｅ  ５，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４（２００４）９６５−９６６．
【非特許文献２６】Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｆｅｉ，Ｍ．Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ，Ａ．Ｓｏｎｇ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７（２００４）３３５−３４５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、より長い半減期を有することで、持続的血管新生抑制効果を通じて過多な血管新生に関連した疾病の予防および治療効果を有する新しいペプチドを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含有することにより、血管新生関連疾患である癌と網膜疾患に対する優れた予防および治療効果を示す組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、血管新生関連疾患である癌と網膜疾患の予防および治療方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、血管新生関連疾患である癌と網膜疾患に対する優れた予防および治療効果を示すための前記ペプチドを有効成分として含有する組成物の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一様態によれば、本発明は、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ（Ｒ−Ｌ−Ｙ−ＥあるいはＲＬＹＥ）のアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＮ−末端のＬ−Ａｒｇがアセチル化したことを特徴とする血管新生抑制用ペプチド（Ａｃ−ＲＬＹＥ）およびＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいてＮ−末端のＬ−ＡｒｇがＤ−Ａｒｇで置換されたことを特徴とする血管新生抑制用ペプチド（Ｒ（Ｄ）ＬＹＥ）を提供する。
【００１４】
前記二つのペプチドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を抑制することができる。
【００１５】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含有する過多な血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む血管新生に関連した疾患の治療方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを個体に投与する段階を含む血管新生に関連した疾患の予防方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含む血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物の用途を提供する。
【００１９】
本発明の血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物は、腫瘍の成長と転移、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬よりなる疾患群から選択された一つ以上の疾患の予防および治療に使用されることが好ましい。
【００２０】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含有する癌の予防および治療用組成物を提供する。
【００２１】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、癌の治療方法を提供する。
【００２２】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む、癌の予防方法を提供する。
【００２３】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含む癌の予防および治療用組成物の用途を提供する。
【００２４】
本発明のペプチドは、癌の予防および治療用組成物は、多様な種類の癌のうち特に固形癌を効果的に予防および治療することができる。
【００２５】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物を提供する。
【００２６】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む糖尿網膜病症の治療方法を提供する。
【００２７】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む糖尿網膜病症の予防方法を提供する。
【００２８】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物の用途を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物を提供する。
【００３０】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む老人性黄斑変性の治療方法を提供する。
【００３１】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを必要な個体に投与する段階を含む老人性黄斑変性の予防方法を提供する。
【００３２】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記ペプチドのうち少なくとも一つのペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物の用途を提供する。
【００３３】
本発明のペプチドは、ヒトまたは動物の医薬品、食品または飼料などの用途に使用することができる。
【００３４】
この際、本発明によるペプチドは、食品医薬品安全庁（ＫＦＤＡ）の通常の薬剤学的製剤への剤形化基準または健康機能助食品の剤形基準に基づいて剤形化することができる。
【００３５】
本発明のペプチドは、それ自体を使用するか、または、薬剤学的に許容可能な酸付加塩または金属複合体、例えばナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）等のような塩の形態で使用できる。より具体的に、酸付加塩は、  塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩が使用できる。
【００３６】
本発明のペプチドは、通常の方法で、投与方法、投与形態および治療目的に応じて前記オリゴペプチドを薬剤学的に許容可能な担体とともに混合して希釈したり、容器形態の担体内に封入させることが好ましい。
【００３７】
前記担体が希釈剤として使用される場合には、塩水、緩衝剤、デキストロース、水、グリセロール、リンガー液、ラクトース、スクロース、カルシウムシリケート、メチルセルロースおよびエタノールよりなる群から選択された少なくとも１種以上の担体を使用した経口投与と非経口投与用で粉末、顆粒、注射液、シロップ、溶液剤、錠剤、座薬、 ペッサリー（ｐｅｓｓａｒｉｅｓ）、軟膏、クリームまたはエアロゾール等のような剤形で製造できる。ただし、この際、担体が前記のような種類の担体に限定されるものではない。この際、非経口投与は、経口以外に硝子体腔内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）、直腸、静脈、腹膜、筋肉、動脈、経皮、鼻腔、吸入等を介した有効成分の投与を意味する。
【００３８】
前記剤形に充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んで哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を誘導し得るように剤形化することができる。また、投与量は、患者の状態、投与経路および投与形態に応じて調節され得るので、限定されるものではなく、症状に応じて本発明の分野における通常の知識を有する者なら自明に多様な範囲内で使用できるが、通常、本発明では、実験的な有効量で本発明のペプチドを体重１ｋｇ当たり約０．５〜１．０ｍｇ程度を一日に連続的または間欠的に投与が可能なものと判断される。
【発明の効果】
【００３９】
本発明のペプチドは、長い半減期を有し、ＶＥＧＦにより誘導される血管新生抑制効果に非常に優れている。したがって、本発明で開発したペプチドは、過多な血管新生に関連した疾患、癌、糖尿網膜病症または老人性黄斑変性に使用すると、これらの疾患を非常に効果的に予防および治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ヒト血清でＲＬＹＥペプチドの安定性を実験した結果である。Ａ：ヒト血清（ｓｅｒｕｍ）と生理食塩水（ｎｏ  ｓｅｒｕｍ）でＲＬＹＥの安定性を実験した結果、Ｂ：ヒト血清でＲＬＹＥ安定性に及ぼす蛋白質分解酵素阻害剤の効果を確認した結果、Ｃ：ヒト血清でＲＬＹＥの安定性に及ぼすアミノペプチダーゼＢの阻害剤であるベスタチンの効果を実験した結果。ＮＣが陰性対照群；ＣＴＲＬが生理食塩水対照群。
【図２】図２は、ＲＬＹＥと変形されたＲＬＹＥのヒト血清内安定性および血管内皮細胞の移動に及ぼす効果を実験した結果である。Ａ：ヒト血清でＲＬＹＥと変形されたＲＬＹＥ（Ａｃ−ＲＬＹＥ、ＲＬＹＥ−ＮＨ２、Ａｃ−ＲＬＹＥ−ＮＨ２、Ｒ（Ｄ）ＬＹＥ）の安定性を実験した結果、Ｂ：ＲＬＹＥと変形されたＲＬＹＥがヒト血清で半減期（ｔ１／２）および血管内皮細胞の移動抑制効果（ＩＣ５０）を実験した結果。
【図３】図３は、ヒト血清で前処理有無によってＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥが血管内皮細胞の管形成に及ぼす影響を実験した結果である。Ａ：リン酸緩衝食塩水に３時間前処理したペプチドがＶＥＧＦ（Ｖ）により誘導される血管内皮細胞の管形成を抑制する効果を実験した結果、Ｂ：ヒト血清と３時間前処理したペプチドがＶＥＧＦ（Ｖ）により誘導される血管内皮細胞の管形成を抑制する効果を実験した結果。
【図４】図４は、ヒト大腸癌細胞を移植したマウスモデルでＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥが腫瘍成長抑制に及ぼす効果を示した図である。Ａ：ペプチドまたは ベバシズマブ（ＢＶＺ）の投与が腫瘍の大きさに及ぼす効果を実験した結果（腫瘍誘導３０日）、Ｂ：ペプチドまたはベバシズマブの投与が腫瘍成長の抑制に及ぼす効能を実験した結果（腫瘍誘導３０日間）、Ｃ：ペプチドまたはベバシズマブの投与が癌血管生成を抑制する効果を実験した結果。
【図５】図５は、レーザー誘導脈絡膜新生血管マウスモデルでＲＬＹＥとＡｃ−ＲＬＹＥによる脈絡膜血管新生の抑制効能の実験結果である。Ａ：ヘマトキシリン−エオシン染色を通じてペプチドが脈絡膜新生血管を抑制する効果を実験した結果（点線で示された部分は、脈絡膜新生血管膜の境界を表示）、Ｂ：脈絡膜新生血管の面積に対する定量的な分析結果、Ｃ：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合デキストランを静脈注射後に摘出した眼球の網膜色素上皮／脈絡膜／鞏膜複合体組織でペプチドが脈絡膜新生血管を抑制する効果を実験した結果。
【図６】図６は、糖尿マウスモデルでＲＬＹＥとＡｃ−ＲＬＹＥによる網膜血管の漏出抑制効能を実験した結果である。Ａ：ペプチドがストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により誘導された糖尿による網膜血管の漏出を抑制する効果を実験した結果。Ｂ：ペプチドによる糖尿による網膜血管の漏出抑制効果を定量化した結果。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明することとする。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されない。
【００４２】
＜Ａｃ−ＲＬＹＥペプチドおよびＲ（Ｄ）ＬＹＥの抗血管新生効果、癌と網膜疾患治療効果の確認＞
１．実験方法
１−１．実験材料および動物倫理
実験に使用されたすべてのペプチド［ＲＬＹＥ、ＥＹＬＲ、Ａｃ−ＲＬＹＥ（ＲＬＹＥのＮ−末端をアセチル化したペプチド）、ＲＬＹＥ−ＮＨ２（ＲＬＹＥのＣ−末端をアミド化したペプチド）、Ｒ（Ｄ）ＬＹＥ（ＲＬＹＥのＬ型アルギニンをＤ型アルギニンで置換したペプチド）］は、（株）ペプトロン（韓国大田）に依頼して合成した。すべての動物実験は、江原大学校の実験動物保護と使用に対する倫理委員会のガイドラインによって行った。
【００４３】
１−２．ペプチド安定性の分析
正常なヒトから採取した血液を遠心分離（テーブルトップ遠心分離機、３０００ｒｐｍ、２０分）して血清を分離した。血清を気孔のサイズが０．２２μＭのフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した後、ヒト血清５０μＬに１００μｇのＲＬＹＥ、Ｒ（Ｄ）ＬＹＥ、ＲＬＹＥ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＬＹＥ（１００μｇ／５０μＬ、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）と混合し、時間別に３７℃で恒温させた。試料をＣ１８逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離（Ｖｙｄａｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ、０．１％  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ  ｆｏｒｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ０．１％  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｉｎ  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｆｏｒ  ｅｌｕｔｉｏｎ）した後、ペプチド濃度をピークの面積で計算した。
【００４４】
１−３．血管内皮細胞の移動分析
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の移動分析は、６．５ｍｍ直径のポリカーボネートフィルタ（気孔サイズ、８μｍ）が付着したトランスウェル細胞培養容器（Ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｔｅ）を使用して行った。フィルタの表面は、１０μｇのゼラチンでコートした。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）が含有された新鮮なＭ１９９培地（１％ウシ胎児血清）をトランスウェルの下側の培養容器に入れ、０．１５ｎＭと１．５ｎＭのペプチドで常温で３０分間反応させたヒト血管内皮細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を上側の培養容器に注意深く移した。二酸化炭素−恒湿恒温器で４時間培養し、トランスウェルフィルタの下方に移動した細胞をヘマトキシリン−エオシン染色で染色し、光学顕微鏡で定量した。
【００４５】
１−４．血管内皮細胞の管形成分析
ヒト血管内皮細胞の管形成程度は、マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を利用して確認した。マトリゲル（１０ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ）２５０μＬを２４ウェルプレートに入れ、３０分間３７℃で重合されるようにした。Ｍ１９９（１％ウシ胎児血清）培地に６時間培養したヒト血管内皮細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養容器のマトリゲル上に注意深く移した後、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を単独あるいはペプチド（０．１５ｎＭ）とともに３７℃で２０時間培養した。一方、ペプチドは、リン酸緩衝食塩水あるいは新鮮なヒト血清で３時間反応させたものを使用してもよい。ヒト血管内皮細胞の管形成程度は、逆位相差顕微鏡で撮影し、管形成の長さは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で測定し、定量した。
【００４６】
１−５．ヒト結腸癌（ＨＣＴ１１６）異種移植マウスモデル
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ、６週齢、雄性）の左側わき腹にヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６，１×１０７細胞／１００μＬ）を皮下注射し、腫瘍の体積が少なくとも５０〜７０ｍｍ３になった時（約７日所要）、生理食塩水（陰性対照群）、ＲＬＹＥ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、Ｒ（Ｄ）ＬＹＥ（１．０ｍｇ／ｋｇ）またはＡｃ−ＲＬＹＥ（１．０ｍｇ／ｋｇ）（以上、実験群）を毎日１回腹膜内に注射した。ＶＥＧＦ中和抗体であるベバシズマブは、２ｍｇ／ｋｇで一週間に二回腹膜内に注射した（陽性対照群）。腫瘍のサイズは、カリパスを使用して２次元的に測定した。腫瘍の体積（ｍｍ３）は、広さ２×の長さ×０．５２の公式を使用して計算した。
【００４７】
１−６．腫瘍血管の形成測定
腫瘍組織を１０％ホルマリンで固定させ、パラフィンに挿入した。腫瘍組織の切片でスライドを作製した後、キシレンに沈漬してパラフィンを除去し、１００％、９５％、８０％、７０％エタノールを段階的に処理して再水和した。その後、スライドを脱イオン水で常温で数回洗浄した。細胞内ペロキシダーゼの活性を抑制するために、組織切片を０．３％過酸化水素が含まれたメタノールで１５分間反応させ、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した。組織切片を３％ヤギ血清が含まれたリン酸緩衝食塩水で２時間常温で反応させた後、ＦＩＴＣ−イソレクチンＢ４（５ｍｇ／ｍＬ；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１時間反応させた。組織切片をリン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、パーマウント（ｐｅｒｍｏｕｎｔ）溶液で永久用スライドを作製して、腫瘍血管を蛍光顕微鏡で撮影した。
【００４８】
１−７．レーザー誘導脈絡膜新生血管（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の測定
レーザー誘導脈絡膜新生血管動物モデルを作るために、マウスの網膜に４００ｍＷの強さで５０ｍｓ持続時間のダイオードレーザーを照射すると、網膜層と脈絡膜層の間のＢｒｕｃｈ膜の破壊が起こり、以後、１４日にわたって脈絡膜新生血管が誘発される。前記条件で６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの網膜にレーザーを照射した後、１０日目になる日に安全検診を通じて病変の生成有無を確認し、１．５ｍＭのＥＹＬＲ、ＲＬＹＥおよびＡｃ−ＲＬＹＥ溶液１μＬを硝子体腔内に注射した。この際、対照群には、同量の食塩水を注射した。４日後（レーザー照射１４日後）、マウスの眼球を摘出して治療効果分析のための実験を進めた。摘出された眼球を４％パラホルムアルデヒドに１２時間固定し、眼球をパラフィンに包埋した。パラフィン組織から４μｍ厚さの切片を準備し、ヘマトキシリン−エオシン染色を施行した。以後、各個体で脈絡膜新生血管膜（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の面積が最も広い切片の写真を撮影し、脈絡膜新生血管膜の面積をＩｍａｇｅＪプログラム（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を利用して定量的に分析した。食塩水を注射した対照群において脈絡膜新生血管面積の平均を１００％にして各治療群の治療効果を分析した。一方、マウスの眼球を摘出する１時間前に、１ｍＬ（１．２５ｍｇ）のＦＩＴＣ−デキストラン（２５０ｋＤａ）を左心室に注射して全身的に灌流されるようにした。眼球を摘出した後、４％パラホルムアルデヒドに１時間固定した。以後、角膜および水晶体をはさみで切って除去し、網膜をピンセットで注意深く除去して、網膜色素上皮／脈絡膜／鞏膜複合組織を準備した。網膜の平面状標本マウント（ｒｅｔｉｎａｌ  ｆｌａｔ  ｍｏｕｎｔ）した複合組織を蛍光顕微鏡を通じて観察し、写真を撮影した。
【００４９】
１−８．ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）により誘導された糖尿網膜病症マウスモデル
クエン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ４．５）で新鮮に作ったＳＴＺ溶液（１００ｍＭ）をマウスの腹腔に１５０ｍｇ／ｋｇで注射し、低血糖ショックを防止するために１０％ショ糖を十分に供給した。２日後からＡｃｃｕ−ｃｈｅｋ  ｐｅｒｆｏｒｍａ血糖測定機（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血糖を測定し、１〜２週内に非空腹血糖が３００ｍｇ／ｄＬ以上を維持する時、糖尿動物モデルとして使用した。糖尿が誘発されたマウスを２％のａｖｅｒｔｉｎで麻酔し、１．５ｍＭのＥＹＬＲ、ＲＬＹＥおよびＡｃ−ＲＬＹＥ溶液１μＬを硝子体腔内に注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。この際、対照群には、同量のリン酸緩衝食塩水を注射した。ペプチドを注射し、２４時間後にマウスの左心室に１ｍｌ（１．２５ｍｇ）のＦＩＴＣ−デキストラン（２５０ｋＤａ）を注射して約５分間循環させた。頸椎脱骨でマウスを安楽死させた後、眼球を摘出して常温で４％のパラホルムアルデヒドに１時間固定した。固定された眼球から網膜を分離して、網膜の平面状標本マウント（ｒｅｔｉｎａｌ  ｆｌａｔｍｏｕｎｔ）を製作し、共焦点顕微鏡で血管漏出現象を観察した。一方、網膜血管から漏出されたＦＩＴＣ−デキストラン蛍光度をＦｌｕｏｖｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅで測定した。
【００５０】
２．実験結果
２−１．ヒト血清でＲＬＹＥペプチドの安定性実験および短い半減期の原因分析
ＲＬＹＥの安定性を評価するためにＲＬＹＥペプチドをそれぞれリン酸緩衝食塩水とヒト血清に入れ、時間別に３７℃で恒温した。ＲＬＹＥをリン酸緩衝食塩水に入れて恒温させた場合、ＲＬＹＥペプチドの分解が起こらず、ヒト血清で恒温した場合、ＲＬＹＥの半減期が１．２時間と現れた（図１Ａ参照）。
【００５１】
一方、ＲＬＹＥがヒト血清内でどんな成分により安定性が減少するかを確認するために、血清の主な成分であるアルブミンおよび各種蛋白質分解酵素の阻害剤を添加して３７℃で恒温した。その結果、アルブミンは、ＲＬＹＥの分解を誘導せず、蛋白質分解酵素阻害剤として知られているアプロチニン、ＥＤＴＡ、ロイペプチン、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を処理しても、ヒト血清によるＲＬＹＥの分解を阻害しないことを確認した（図１Ｂ参照）。しかし、アミノペプチダーゼＢの阻害剤であるベスタチンを添加した時、ヒト血清によるＲＬＹＥの分解を効果的に抑制することを確認した（図１Ｃ参照）。このような結果は、ＲＬＹＥが血清に存在するアミノペプチダーゼＢにより分解されることを提示している。
【００５２】
２−２．ＲＬＹＥとＲＬＹＥのＮ／Ｃ−末端を変形させたペプチドのヒト血清内安定性および薬理活性の研究
ＲＬＹＥと変形されたＲＬＹＥ（Ａｃ−ＲＬＹＥ，ＲＬＹＥ−ＮＨ２，Ａｃ−ＲＬＹＥ−ＮＨ２，Ｒ（Ｄ）ＬＹＥ）の安定性を評価するために、ヒト血清で１２時間３７℃で恒温した。その結果、ＲＬＹＥおよびＲＬＹＥ−ＮＨ２の半減期がそれぞれ１．２時間および１．３時間と低く現れ、Ａｃ−ＲＬＹＥおよびＲ（Ｄ）ＬＹＥペプチドの半減期がそれぞれ８．８時間および７．０時間と現れた（図２Ａ参照）。
【００５３】
ＲＬＹＥと変形されたＲＬＹＥの薬理効能を確認するために、血管新生の典型的な現象中の一つである血管内皮細胞の移動に及ぼす効果を研究した。ヒト血管内皮細胞にＶＥＧＦを処理して血管内皮細胞の移動を誘導する条件でそれぞれのペプチドを添加し、細胞の移動抑制に対するＩＣ５０値を測定した。その結果、ＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥ、ＲＬＹＥ−ＮＨ２、Ａｃ−ＲＬＹＥ−ＮＨ２およびＲ（Ｄ）ＬＹＥ  ＩＣ５０値は、それぞれ０．０８，０．０５，０．１１，８０．２，０．０６ｎＭであり、初期に血管新生抑制効能があると確認されたＲＬＹＥと比較した時、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥの血管新生抑制効能が類似しているか、若干優れていることが確認された（図２Ｂ参照）。このような結果は、ＲＬＹＥをＡｃ−ＲＬＹＥおよびＲ（Ｄ）ＬＹＥで変形した時、ペプチドの安定性が高くなり、また、内皮細胞の移動を効果的に阻害させることができることを意味する。
【００５４】
２−３．血清の存在有無によるＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥの薬理活性研究
新しい血管生成は、血管内皮細胞の増殖および移動だけでなく、内皮細胞の管形性と関連した形態的分化が非常に重要である。したがって、ＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥをそれぞれリン酸緩衝食塩水とヒト血清に３時間恒温させた後、血管内皮細胞の管形成に及ぼす効果を２次元マトリゲルを利用して調査した。これらのペプチドをリン酸緩衝食塩水に前処理した場合、ＶＥＧＦにより誘導される管形成を効果的に抑制し、抑制効能は、３種のペプチドが全部類似していた（図３Ａ参照）。一方、これらのペプチドをヒト血清に３時間前処理した場合、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥは、内皮細胞の管形成を効果的に抑制したが、ＲＬＹＥによる管形成の抑制効果は微弱であった（図３Ｂ参照）。このような結果は、血液内でＲＬＹＥの安定性が低くて、薬理効能が減少し、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥの安定性が高くて、薬理効能が持続することを提示している。したがって、血液が存在する生体内では、変形されたＲＬＹＥの効能は非常に高いものと思われる。
【００５５】
２−４．マウス腫瘍モデルでＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥの抗癌効能研究
ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を異種移植したヌードマウスモデルでＲＬＹＥ、Ａｃ−ＲＬＹＥおよびＲ（Ｄ）ＬＹＥの抗癌効果を調査するために、それぞれのペプチドを１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で毎日１回腹腔に注射し、陽性対照群として使用するために臨床で使用されるＶＥＧＦ中和抗体抗癌剤であるベバシズマブ（アバスチン）を２．０ｍｇ／ｋｇで一週間に二回腹腔に注射した。その結果、これらのペプチドは、腫瘍のサイズと成長を抑制し、ＲＬＹＥよりＡｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥの抗癌効果に優れていることが分かった（図４Ａと図４Ｂ参照）。Ａｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥの抗癌効果は、陽性対照群であるベバシズマブよりは多少低くなった。腫瘍組織内に生成された血管をＦＩＴＣ−イソレクチンＢ４で染色した結果、Ａｃ−ＲＬＹＥ，Ｒ（Ｄ）ＬＹＥによる癌血管生成の抑制効果は、ＲＬＹＥより優れていた（図４Ｃ参照）。このような結果は、ＲＬＹＥのＮ−末端アミノ酸であるＬ−アルギニン（Ｒ）を変形させたＡｃ−ＲＬＹＥとＲ（Ｄ）ＬＹＥは、生体内で安定性が増加し、これに伴って、癌血管の生成を効果的に抑制して抗癌効能を増加させることを提示する。
【００５６】
２−５．ＲＬＹＥとＡｃ−ＲＬＹＥによるレーザー誘導脈絡膜新生血管の抑制効能研究
難治性眼球疾患である老人性黄斑変性治療剤の開発は、レーザー誘導脈絡膜新生血管の抑制効能をマウスモデルで研究することが一般的である。レーザー誘導脈絡膜新生血管マウスにペプチドを投与し、誘導脈新生血管の抑制効果を確認した結果、ＥＹＬＲ（ＲＬＹＥペプチドの逆配列）は、脈絡膜新生血管の発生程度に変化がないのに対し、ＲＬＹＥとＡｃ−ＲＬＹＥを投与した場合、効果的に減少させ、Ａｃ−ＲＬＹＥの効果がＲＬＹＥより顕著に優れていた（図６Ａと図６Ｂ参照）。網膜の平面状標本マウント（ｒｅｔｉｎａｌ  ｆｌａｔｍｏｕｎｔ）技法を利用した研究においても、Ａｃ−ＲＬＹＥがＲＬＹＥより脈絡膜新生血管の抑制効果に優れていることを確認した（図６Ｃ参照）。このような結果は、ＲＬＹＥのＮ−末端を変形させたＡｃ−ＲＬＹＥは、血管新生に関連した老人性黄斑変性治療剤として活用できることを提示している。
【００５７】
２−６．ＲＬＹＥとＡｃ−ＲＬＹＥによる糖尿網膜病症の治療効能研究
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与して糖尿網膜病症を誘導したマウスモデルで網膜血管の漏出現象が顕著に増加することを確認し、ＲＬＹＥとＡｃ−ＲＬＹＥの投与は、網膜血管の漏出を効果的に抑制した（図６Ａと図６Ｂ参照）。一方、これら二つのペプチドの網膜血管の漏出抑制効果を比較した結果、Ａｃ−ＲＬＹＥガＲＬＹＥより血管漏出抑制効果に優れていることが確認された。このような結果は、Ａｃ−ＲＬＹＥが糖尿疾患で誘発される網膜血管の漏出現象を効果的に抑制する糖尿網膜病症の治療剤として活用できることを提示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月6日(2018.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｎ−末端のＬ−Ａｒｇがアセチル化したことを特徴とする血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制用ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を抑制することを特徴とする請求項１に記載の血管新生抑制用ペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項４】
前記組成物は、腫瘍の成長と転移、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬よりなる疾患群から選択された一つ以上の疾患の予防および治療に使用されることを特徴とする請求項３に記載の血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する癌の予防および治療用組成物。
【請求項６】
前記癌は、固形癌であることを特徴とする請求項５に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項７】
前記固形癌は、大腸癌であることを特徴とする請求項６に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物。
【請求項１０】
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕのアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｌ−ＡｒｇがＤ−Ａｒｇで置換されたことを特徴とする血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制用ペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を抑制することを特徴とする請求項１０に記載の血管新生抑制用ペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、腫瘍の成長と転移、糖尿網膜病症、老人性黄斑変性、関節リウマチおよび乾癬よりなる疾患群から選択された一つ以上の疾患の予防および治療に使用されることを特徴とする 請求項１２に記載の血管新生に関連した疾患の予防および治療用組成物。
【請求項１４】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する癌の予防および治療用組成物。
【請求項１５】
前記癌は、固形癌であることを特徴とする請求項１４に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項１６】
前記固形癌は、大腸癌であることを特徴とする請求項１５に記載の癌の予防および治療用組成物。
【請求項１７】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する糖尿網膜病症の予防および治療用組成物。
【請求項１８】
請求項１０に記載のペプチドを有効成分として含有する老人性黄斑変性の予防および治療用組成物。
【国際調査報告】
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