(57)【要約】開示される技術は、創傷、例えば、慢性創傷または感染した創傷の検出のための化学物質に関し、かかる化合物を含有する組成物、基質、キット、包帯材料、および物品、ならびにシステムを含む。開示される技術は、診断アッセイにおいて、ならびに特定の部分および／または反応部位における酵素作用に基づいた慢性または感染した創傷の診断および／または検出において、これらの組成物、キット、およびシステムを使用する方法にさらに関する。さらなる開示は、複数のマーカーの発現に基づいて創傷を特徴付ける方法、ならびにかかる情報を用いて、慢性または感染した創傷に罹患している患者を治療、管理、および追跡するための方法に関する。【選択図】図７
2019513238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ａ−Ｉ
式Ｉ
（式中、
Ａは、アンカーであり、
Ｉは、インジケータ領域である）
で示される化合物を含む、化学物質。
【請求項２】
前記アンカーＡが、共有結合性相互作用を介して前記インジケータＩと共有結合的に会合されて、認識部位Ｓを形成する、請求項１に記載の化学物質。
【請求項３】
前記Ｓが、創傷特異的ヒドロラーゼに対して特異的である、請求項２に記載の化学物質。
【請求項４】
Ａが、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグルカン、もしくはキトサン、またはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、その混合物、もしくは組み合わせを含む、請求項１に記載の化学物質。
【請求項５】
前記アンカーＡが、キトサン、またはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、その混合物、もしくは組み合わせを含む、請求項４に記載の化学物質。
【請求項６】
前記キトサンのモノマーが、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、そのオリゴマー、またはその組み合わせを含む、請求項５に記載の化学物質。
【請求項７】
前記キトサンが、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、またはその組み合わせのうちの少なくとも２つの単位を含む、請求項５に記載の化学物質。
【請求項８】
前記キトサン誘導体が、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサン、キトサンオリゴ糖、カルボキシメチルキトサン、またはヒドロキシアルキルキトサンを含む、請求項５に記載の化学物質。
【請求項９】
前記キトサン誘導体が、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサンを含む、請求項８に記載の化学物質。
【請求項１０】
前記キトサン誘導体が、約４０％〜約９０％のアセチル化度（ＤＡ）を含むアセチル化キトサンである、請求項９に記載の化学物質。
【請求項１１】
前記キトサン誘導体が、５０％超のアセチル化度（ＤＡ）を含むアセチル化キトサンである、請求項９に記載の化学物質。
【請求項１２】
前記キトサン誘導体が、ハロゲン化される、請求項９に記載の化学物質。
【請求項１３】
前記アンカーＡが、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミンダイマー（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；そのオリゴマー；またはその組み合わせからなる群から選択される、キトサン化合物またはその誘導体を含む、請求項５に記載の化学物質。
【請求項１４】
前記アンカーに結合された前記インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフが、グリコシダーゼの基質である、請求項１に記載の化学物質。
【請求項１５】
前記アンカーに結合された前記インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフが、リゾチームであるグリコシダーゼの基質である、請求項１２に記載の化学物質。
【請求項１６】
前記インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフが、キトサン、またはそのモノマーの１α−炭素、そのオリゴマー、またはその誘導体に結合される、請求項１５に記載の化学物質。
【請求項１７】
前記インジケータが、スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する染料、またはジクロルトリアジン反応基を含有する染料を含む、請求項１に記載の化学物質。
【請求項１８】
前記スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する染料が、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、もしくは反応性オレンジ１６、またはその組み合わせである、請求項１７に記載の化学物質。
【請求項１９】
前記ジクロルトリアジン反応基を含有する染料が、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、もしくは反応性ブラウン１０、またはその組み合わせである、請求項１７に記載の化学物質。
【請求項２０】
前記インジケータが、発光性分子、化学発光性分子、蛍光色素、蛍光消光剤、脂質、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体もしくはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素からなる群から選択される検出可能な標識を含む、請求項１に記載の化学物質。
【請求項２１】
前記アンカーＡが、グリコシド結合を介して前記インジケータＩに直接コンジュゲートされる、請求項１に記載の化学物質。
【請求項２２】
前記アンカーが、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミン二量体（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；前記構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；またはその組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、請求項２１に記載の化学物質。
【請求項２３】
前記インジケータが、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、もしくは反応性オレンジ１６、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０、またはその組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の化学物質。
【請求項２４】
前記インジケータが、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、またはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からの疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）、またはそのキメラバリアントを含む、請求項１に記載の化学物質。
【請求項２５】
前記アンカーが、セルロースもしくはその誘導体またはテレフタル酸ポリエチレンもしくはその誘導体を含む、請求項２４に記載の化学物質。
【請求項２６】
前記インジケータが、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性結合モジュール（ＣＢＭ）を含み、前記アンカーは、セルロースもしくはその誘導体を含み、前記インジケータが、前記アンカーで親水的に会合される、請求項２５に記載の化学物質。
【請求項２７】
前記インジケータが、ポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）を含み、前記アンカーは、テレフタル酸ポリエチレンもしくはその誘導体を含み、前記インジケータは、前記アンカーと疎水的に会合される、請求項２４に記載の化学物質。
【請求項２８】
ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む、キメラ構築体。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドが、ｔｒｘＡ遺伝子を含む、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３０】
前記スペーサーが、ポリヒスチジンタグを含む、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３１】
前記スペーサーが、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグを含む、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３２】
前記エンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）を含む、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３３】
ｅｌａｓｕｂ１配列をさらに含む、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３４】
前記ｅｌａｓｕｂ１配列が、前記エンテロキナーゼ切断部位の後に位置する、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３５】
前記ｅｌａｓｕｂ１配列が、システイン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、またはチロシンからなる群から選択される機能的アミノ酸をコードする、請求項２８に記載のキメラ構築体。
【請求項３６】
前記ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）をコードする核酸をさらに含む、請求項３３に記載のキメラ構築体。
【請求項３７】
前記ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある疎水性Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）をコードする核酸をさらに含む、請求項３３に記載のキメラ構築体。
【請求項３８】
前記ｅｌａｓｕｂ１配列において、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識の両方、をコードする、核酸をさらに含む、請求項３６に記載のキメラ構築体。
【請求項３９】
前記ｅｌａｓｕｂ１配列において、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識の両方、をコードする、核酸をさらに含む、請求項３７に記載のキメラ構築体。
【請求項４０】
発現制御配列および請求項３７に記載のキメラ構築体を含む、ベクター。
【請求項４１】
発現制御配列および請求項３８に記載のキメラ構築体を含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４４】
細菌性細胞または昆虫細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
細菌性細胞または昆虫細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
ａ．ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、
ｂ．ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、
ｃ．エンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、
ｄ．前記エンテロキナーゼ切断部位の後にｅｌａｓｕｂ１配列、
ｅ．前記ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、および
ｆ．前記ｅｌａｓｕｂ１配列において、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、
をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体によってコードされるタンパク質を作製する方法であって、
前記キメラ構築体の発現を誘発するのに十分な条件下で、請求項４２に記載の宿主細胞を培養し、前記細胞培養から前記キメラタンパク質を得ることと、任意に、Ｈｉｓ−タグ親和性精製によって前記構築体を精製することとを含む、方法。
【請求項４７】
ａ．ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、
ｂ．ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、
ｃ．エンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、
ｄ．前記エンテロキナーゼ切断部位の後にｅｌａｓｕｂ１配列、
ｅ．前記ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある疎水性Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、および
ｆ．前記ｅｌａｓｕｂ１配列において、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、
をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体によってコードされるタンパク質を作製する方法であって、
前記キメラ構築体の発現を誘発するのに十分な条件下で、請求項４３に記載の宿主細胞を培養し、前記細胞培養から前記キメラタンパク質を得ることと、任意に、Ｈｉｓ−タグ親和性精製によって前記構築体を精製することとを含む、方法。
【請求項４８】
請求項３７に記載のキメラ構築体によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項４９】
請求項３８に記載のキメラ構築体によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項５０】
請求項４８に記載のポリペプチドおよび染料または標識を含む、組成物。
【請求項５１】
請求項４９に記載のポリペプチドドおよび染料または標識を含む、組成物。
【請求項５２】
アンカーおよび請求項４８に記載のポリペプチドを含む、化学物質。
【請求項５３】
アンカーおよび請求項４９に記載のポリペプチドを含む、化学物質。
【請求項５４】
セルロースまたはその誘導体を含む親水性アンカーを含む、請求項５２に記載の化学物質。
【請求項５５】
テレフタル酸ポリエチレンまたはその誘導体を含む疎水性アンカーを含む、請求項５３に記載の化学物質。
【請求項５６】
生物学的試料中のＨＬＥおよびＣａｔＧからなる群から選択される酵素の存在または不在を判定するための方法であって、前記試料を、請求項５０に記載の組成物または請求項５２に記載の化学物質と接触させることと、前記標識を検出することとを含む、方法。
【請求項５７】
生物学的試料中のＨＬＥおよびＣａｔＧからなる群から選択される酵素の存在または不在を判定するための方法であって、前記試料を、請求項５１に記載の組成物または請求項５３に記載の化学物質と接触させることと、前記標識を検出することとを含む、方法。
【請求項５８】
感染したまたは慢性創傷を診断するための方法であって、前記創傷を、請求項５０に記載の組成物または請求項５２に記載の化学物質と接触させることと、前記標識を検出することとを含む、方法。
【請求項５９】
感染したまたは慢性創傷を診断するための方法であって、前記創傷を、請求項５１に記載の組成物または請求項５３に記載の化学物質と接触させることと、前記標識を検出することとを含む、方法。
【請求項６０】
視覚的検査を介しての前記創傷の原位置検出を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
視覚的検査を介しての前記創傷の原位置検出を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ポリペプチドであって、
（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、
（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、
（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または
（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、
に記載の配列を含み、
式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｌは、連結部分であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む、ポリペプチド。
【請求項６３】
ｙが、それぞれ独立して、１〜５０の整数である、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ｙが、それぞれ独立して、１〜１０の整数である、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ｙが、それぞれ独立して、１〜６の整数である、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
前記配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含む前記ペプチドの各々が、それぞれ独立して、エラスターゼに対して不安定である、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
アミン保護基をさらに含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基をさらに含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
請求項６２に記載のポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
【請求項７０】
請求項６２に記載のペプチドを含む、アンカー領域（Ａ）およびインジケータ領域（Ｉ）を含む、化学物質。
【請求項７１】
ポリペプチド配列であって、
（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または
（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）、
に記載のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数であり、
Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、
Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、
Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、
Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、
Ｌは、連結部分であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む、ポリペプチド。
【請求項７２】
ｙが、それぞれ独立して、１〜３の整数である、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
前記配列（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）を含む前記ペプチドの各々が、それぞれ独立して、カテプシンＧに対して不安定である、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
アミン保護基をさらに含む、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基をさらに含む、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
請求項７１に記載のポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
【請求項７７】
請求項７１に記載のペプチドを含む、アンカー領域（Ａ）およびインジケータ領域（Ｉ）を含む、化学物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３１５，５４６号、および２０１６年３月３０日に出願された第６２／３１５，５５６号の利益を主張し、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、これに関して一部が作製される。
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、全般に、創傷治癒、具体的には、創傷の検出および治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物において、皮膚の傷害は、細胞的および生物学的事象である、組織化された複雑なカスケードを引き起こし、治癒した創傷をもたらす。創傷治癒は、解剖学的な連続性および機能の復元をもたらす、複雑な動的なプロセスであり、完全に治癒した創傷とは、正常な解剖学的構造、機能、および外観に回復したものである。典型的な創傷は、４つの段階−「滲出」期、増殖期、修復期、および上皮成熟（Ｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｍｕｎｉｃｈ，１９９４）、または止血、炎症、増殖、およびリモデリング期（Ｎｗｏｍｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．１９９８，２５，３４１）からなるモデルを介して治癒する。炎症期は、創傷治癒プロセスにおいて特に重要であり、創傷位置で生化学的反応は、治癒を促進するが、過度のプロテアーゼの生成により組織破壊も生じる。
【０００４】
創傷の感染は、より遅いまたは停止した治癒プロセスをもたらす。例えば、創傷の病原体は、毒性を生成し（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種）、ｐＨを上昇させるアンモニアのような有毒な代謝産物を生成し（例えば、Ｐｒｏｔｅｕｓ種）、プロテアーゼのような組織溶解酵素を活性化または生成するか、または組織浸潤を促進し、それによって、創傷のサイズまたは重症度の増加をもたらし得る。最悪の場合、病原体は、創傷を残し、敗血症を引き起こし得る。
【０００５】
創傷の慢性化を抑制するために、様々な評価技術および／またはツールは、臨床的および獣医学的設定において用いられる。感染した創傷を評価する現行の方法は、主に、創傷と関連する様々なパラメータのためのアッセイすることに基づいている。例えば、創傷は、視覚的に評価され得、長さおよび深さ測定が、行われ得、デジタル写真は、創傷の視覚的状況およびサイズを追跡する場合に、使用され得る（Ｋｒａｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。臨床診療では、感染の診断は、臭い、局部的な痛み、熱、腫れ、分泌、発赤、の存在などの二次パラメータの測定に基づいている。炎症および分泌などのこれらの臨床インジケータの多くは、創傷における感染に対し、低い予測値を有する。他の場合では、創傷位置で病原性微生物叢の数（複数可）およびタイプ（複数可）は、検査および／または臨床的診断手順を用いて決定され得る。病院検査室中の微生物学試験後の創傷の綿棒採取は、細菌定着の確認および感染と関連する株の特定のための選択肢であり、それによって、正確な抗生物質コースの処方を可能にする。しかしながら、このプロセスは、時間がかかり、労働集約的である。感染の診断の遅れは、抗生物質の投与を遅延させることができ、敗血症を発症するリスクを増加させ得る。
【０００６】
既存の臨床診断に関連する最大の欠点のうちの１つは、感染の発症および検出タイミングと関連付けられるラグである。例えば、綿棒採取手順を用いて感染の積極的な特定は、創傷部位で微生物の「臨界質量」の達成に依存することが多く、検出可能なレベルに達するまで早期検出は行われない。また、綿棒は、周囲組織の叢で汚染され、それによって、診断手順を複雑にすることがある。他の欠点には、例えば、サンプリング誤差、綿棒の輸送の遅延、分析手順のエラー、および／または報告のエラーが含まれる。Ｂｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１４（２）：２４４−２６９，２００１による検討を参照されたい。
【０００７】
したがって、好ましくは、感染の臨床症状の兆候の前に、臨床診断を可能にする、臨床感染の早期診断を可能にする診断試薬および方法が、差し迫っているが、満たされていない要求がある。また、臨床症状の兆候の前に、創傷の臨床感染を予測するのに役立ち得る、組成物および方法を必要とする。このような予測的補助は、創傷が悪化し、外科手術または他の大幅な介入が、さらに感染を予防するために必要とされる前に、好適な治療（例えば、抗菌性治療）による早期介入を可能にし得る。さらに、臨床医ができるだけ早く、創傷感染に応答し得る場合、感染はまた、最小の抗生物質の使用で治療され得る。これにより、入院の必要性を低減し、例えば、他の罹患対象との接触の結果として、二次感染のリスクを低減し得る。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に開示される技術は、感染したおよび／または慢性創傷を検出する組成物および方法を提供する。本明細書に開示される技術は、感染した創傷の検出の感度、精度、および特異度を増加させることと、定性的および定量的測定の能力を提供することと、原位置でおよびリアルタイムで感染した創傷の検出の速度を増加させることと、によって既存のアッセイ時に改善する。本明細書に記載されるアッセイおよび方法は、部分的に、感染したまたは慢性創傷に存在するバイオマーカーおよび／またはプローブを検出する特定の試薬の使用に基づいている。検出プロセスは、感染した創傷に存在するが、非感染または非慢性創傷に存在しないマーカーに対して特異的である試薬の使用を含み得、検出ステップは、プローブがマーカーに作用されるときに生成されるシグナル（複数可）の定性的または定量的測定を含み得る。検出方法が創傷に存在する酵素の検出を含む実施形態において、プローブは、任意に増幅され得るシグナルを生成する、酵素に対して特異的である修飾酵素基質を含む。これは、検出の効率および特異度を大いに改善する。さらに、複数の検出プローブは、それぞれ、１つ以上の標的に対して特異的であり、例えば、創傷に対して特異的である酵素は、用いられ得る。これは、診断アッセイの効率および精度の両方を最大限にするが、一方、偽陽性の発生を最小限にするのを大いに役立つ（例えば、非特異的な相互作用および／または標的冗長性により）。さらに、本明細書に開示される実験結果は、そこに基づいた新規のプローブおよびアッセイ技術が、様々な種類の創傷を検出するおよび特徴付けることができることを確認する。最終的に、開示される技術の試薬は、慢性創傷の治療および管理をモニタリングおよび評価するために、抗生物質、抗真菌薬などの治療分子とともに使用され得る。
【０００９】
本明細書に記載される実施形態は、それによって生成される酵素を含む免疫系の細胞が、創傷の初期診断のマーカーとして機能し得ることが、一部分において、発見に基づいている。これらの細胞、例えば、好中球は、細菌（および他の病原体）を取り込み、および／またはそれらを酵素で中和させることによって、感染症と闘うために創傷部位で動員される。いくつかの酵素は、タンパク質（例えば、エラスターゼ、カテプシンＧ）に対して特異的であり、その他は、細胞壁構成成分（例えば、リゾチーム）に対して特異的であり、さらにその他は、タンパク質の変性（例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、および他のペルオキシダーゼ）を媒介する。これらの細胞、例えば、好中球は、概して、短命のみであり、それらが感染の領域において溶解する際、酵素を含むそれらのリソソームの内容物を放出し、次いで、創傷の状態の信頼性が高い測定値を提供するために検出することができる。
【００１０】
したがって、本明細書に記載される様々な実施形態は、特に、目的となる生物学的試料、例えば、創傷組織中の骨髄性細胞、および好中球の存在を示す、酵素マーカーの検出を利用する。したがって、創傷流体におけるような酵素の増加したレベルまたは活性は、侵襲性細菌に有利になるように、増大した細菌の攻撃および宿主／細菌平衡の障害の兆候に対応する。
【００１１】
一実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域である、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１２】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、アンカーＡは、共有結合性相互作用を介してインジケータＩと共有結合的に会合されて、認識部位Ｓを形成する、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１３】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、アンカーＡは、共有結合性相互作用を介してインジケータＩと共有結合的に会合されて、認識部位Ｓを形成し、認識部位（Ｓ）は、創傷特異的ヒドロラーゼに対して特異的である、化学物質が、本明細書に提供される。この実施形態下で、ヒドロラーゼは、グリコシダーゼまたはプロテアーゼである。具体的には、この実施形態下で、プロテアーゼは、エラスターゼ、カテプシンＧ、またはミエロペルオキシダーゼである。
【００１４】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、またはキトサン、またはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、その混合物または組み合わせを含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１５】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、キトサン、またはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、その混合物または組み合わせを含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１６】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、Ｄ−グルコサミンまたはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含むキトサンのモノマー、そのオリゴマー、またはその組み合わせを含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１７】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、またはその組み合わせのうちの少なくとも２つの単位を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１８】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサン、キトサンオリゴ糖、カルボキシメチルキトサン、またはヒドロキシアルキルキトサン、またはその誘導体を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００１９】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサンを含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２０】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサンを含み、アセチル化キトサンは、約４０％〜約９０％のアセチル化度（ＤＡ）を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２１】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサンを含み、アセチル化キトサンは、５０％超のアセチル化度（ＤＡ）を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２２】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサンを含み、キトサンは、ハロゲン化される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２３】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、キトサン、またはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、その混合物または組み合わせを含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２４】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーＡは、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミン二量体（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；そのオリゴマー；またはその組み合わせからなる群から選択されるキトサン化合物またはその誘導体を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２５】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフは、アンカーに複合体化され、共役体は、グリコシダーゼの基質である、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２６】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフは、アンカーに複合体化され、共役体は、グリコシダーゼの基質である、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２７】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフは、アンカーに複合体化され、複合体は、リゾチームの基質である、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２８】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフは、キトサンまたはそのモノマー、そのオリゴマー、またはその誘導体の１α−炭素でグリコシド結合を介してアンカーに複合体化される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００２９】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）は、スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する染料またはジクロルトリアジン反応基を含有する染料を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３０】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、もしくは反応性オレンジ１６、またはその組み合わせである染料をさらに含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３１】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）は、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、もしくは反応性ブラウン１０、またはその組み合わせである染料をさらに含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３２】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータ（Ｉ）は、発光性分子、化学発光性分子、蛍光色素、蛍光消光剤、脂質、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体もしくはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素からなる群から選択される検出可能な標識を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３３】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーは、グリコシド結合を介してインジケータに直接複合化される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３４】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーは、グリコシド結合を介してインジケータに直接複合化され、アンカーは、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミン二量体（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；またはその組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３５】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーは、グリコシド結合を介してインジケータに直接複合化され、インジケータは、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、もしくは反応性オレンジ１６、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０、またはその組み合わせからなる群から選択される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３６】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、アンカーは、グリコシド結合を介してインジケータに直接複合化され、アンカーは、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミン二量体（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；またはその組み合わせからなる群から選択される化合物を含み、インジケータは、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５もしくは反応性オレンジ１６、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０、またはその組み合わせからなる群から選択される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３７】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータは、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、またはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からの疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）、またはそのキメラバリアントを含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３８】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータは、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、またはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からの疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）、またはそのキメラバリアントを含み、アンカーは、セルロースもしくはその誘導体またはテレフタル酸ポリエチレンもしくはその誘導体を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００３９】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータは、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、またはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からの疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）、またはそのキメラバリアントを含み、アンカーは、セルロースもしくはその誘導体またはテレフタル酸ポリエチレンもしくはその誘導体を含む、化学物質が、本明細書に提供される。
【００４０】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータは、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、またはそのキメラバリアントを含み、アンカーは、セルロースもしくはその誘導体を含み、インジケータは、アンカーで親水的に会合される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００４１】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有する化合物を含む化学物質であって、式中、Ａはアンカーであり、Ｉはインジケータ領域であり、インジケータは、ポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）を含み、アンカーは、テレフタル酸ポリエチレンまたはその誘導体を含み、インジケータは、アンカーと疎水的に会合される、化学物質が、本明細書に提供される。
【００４２】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部をコードするポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。
【００４３】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）遺伝子、ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部をコードするポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。
【００４４】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部をコードするポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。具体的には、この実施形態下で、スペーサー配列は、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグをコードする。
【００４５】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。
【００４６】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。具体的には、この実施形態下で、ｅｌａｓｕｂ１配列は、エンテロキナーゼ切断部位の後に位置する。特に、この実施形態下で、ｅｌａｓｕｂ１配列は、システイン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、またはチロシンからなる群から選択される機能的アミノ酸をコードする。
【００４７】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。
【００４８】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にあるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供される。
【００４９】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。
【００５０】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にあるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。
【００５１】
別の実施形態において、発現制御配列を含むベクター、ならびにｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体が、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。
【００５２】
別の実施形態において、発現制御配列を含むベクターと、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にあるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体とが、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。
【００５３】
別の実施形態において、発現制御配列を含むベクターと、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体とを含む宿主細胞が、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。具体的には、この実施形態下で、宿主細胞は、細菌性細胞または昆虫細胞または哺乳動物細胞である。
【００５４】
別の実施形態において、発現制御配列を含むベクターと、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にあるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体とを含む、宿主細胞が、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。具体的には、この実施形態下で、宿主細胞は、細菌性細胞または昆虫細胞または哺乳動物細胞である。
【００５５】
別の実施形態において、（ａ）ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、（ｂ）ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、（ｃ）エンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、（ｄ）エンテロキナーゼ切断部位の後にｅｌａｓｕｂ１配列、（ｅ）ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、ならびに（ｆ）ｅｌａｓｕｂ１配列において、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体によってコードされるタンパク質を作製する方法が、本明細書に提供され、本方法は、キメラ構築体の発現を誘発するのに十分な条件下で、キメラ構築体を含む宿主細胞を培養し、細胞培養からキメラタンパク質を得ることと、任意に、Ｈｉｓ−タグ親和性精製によって構築体を精製することと、を含む。
【００５６】
別の実施形態において、（ａ）ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、（ｂ）ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、（ｃ）エンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、（ｄ）エンテロキナーゼ切断部位の後にｅｌａｓｕｂ１配列、（ｅ）ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある疎水性Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、ならびに（ｆ）ｅｌａｓｕｂ１配列において、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体によってコードされるタンパク質を作製する方法が、本明細書に提供され、本方法は、キメラ構築体の発現を誘発するのに十分な条件下で、キメラ構築体を含む宿主細胞を培養し、細胞培養からキメラタンパク質を得ることと、任意に、Ｈｉｓ−タグ親和性精製によって構築体を精製することと、を含む。
【００５７】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にある親水性結合モジュール（ＣＢＭ）、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体によってコードされるポリペプチドであり、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。この実施形態下で、ポリペプチド（「ＣＢＭポリペプチド」）および染料および標識を含有するＣＢＭ配列を含む組成物が、本明細書に提供される。この実施形態下で、ＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含む組成物を含む、アンカーおよびインジケータ領域を含む化学物質が、本明細書にさらに提供される。特に、この実施形態下で、セルロースまたはその誘導体であるアンカー、ならびにＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含むインジケータ領域を含む化学物質が、本明細書に提供される。
【００５８】
別の実施形態において、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）もしくはその一部、ポリ−ヒスチジン−タグをコードするスペーサー配列、およびエンテロキナーゼ切断部位もしくはその一部、およびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ならびにｅｌａｓｕｂ１配列およびｅｌａｓｕｂ１配列の直下流にあるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＭ）配列、をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むキメラ構築体によってコードされるポリペプチドが、本明細書に提供され、ｅｌａｓｕｂ１配列は、ＨＬＥ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）、またはＣａｔＧ認識部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）、またはＨＬＥおよびＣａｔＧ認識部位の両方、をコードする、核酸を含む。この実施形態下で、ポリペプチドを含有するＰＤＭ配列（「ＰＤＭポリペプチド」）、および染料または標識を含む組成物が、本明細書に提供される。この実施形態下で、アンカー、ならびにＰＤＭポリペプチドおよび染料／標識を含む組成物を含むインジケータ領域を含む化学物質が、本明細書にさらに提供される。特に、この実施形態下で、テレフタル酸ポリエチレンまたはその誘導体であるアンカー、ならびにＰＤＭポリペプチドおよび染料／標識を含む組成物を含むインジケータ領域を含む化学物質が、本明細書に提供される。
【００５９】
別の実施形態において、生物学的試料中のＨＬＥおよびＣａｔＧからなる群から選択される酵素の存在または不在を判定するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、生物学的試料を、ＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含有する組成物、またはアンカーならびにＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含むインジケータを含む化学物質と接触させることと、標識を検出することと、を含む。
【００６０】
別の実施形態において、生物学的試料中のＨＬＥおよびＣａｔＧからなる群から選択される酵素の存在または不在を判定するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、生物学的試料を、ＰＤＭポリペプチドおよび染料／標識を含有する組成物、またはアンカーならびにＰＤＭポリペプチドおよび染料／標識を含むインジケータを含む化学物質と接触させることと、標識を検出することと、を含む。
【００６１】
別の実施形態において、感染したまたは慢性創傷を診断するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、創傷を、ＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含有する組成物、またはアンカーならびにＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含むインジケータを含む化学物質と接触させることと、標識を検出することと、を含む。この実施形態下で、創傷は、組織、例えば、かかる診断を必要とする対象、例えば、ヒト対象の皮膚組織中に存在する。具体的には、この実施形態下で、検出は、原位置で行われる。特に、この実施形態下で、診断は、染料の視覚的および／または電子的評価に基づいて、複数の時点であり得る。
【００６２】
別の実施形態において、感染したまたは慢性創傷を診断するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、創傷を、ＰＤＭポリペプチドおよび染料／標識を含有する組成物、またはアンカー、ならびにＣＢＭポリペプチドおよび染料／標識を含むインジケータを含む化学物質と接触させることを含む。この実施形態下で、創傷は、組織、例えば、かかる診断を必要とする対象、例えば、ヒト対象の皮膚組織中に存在する。具体的には、この実施形態下で、検出は、原位置で行われる。さらに、この実施形態下で、診断は、染料の視覚的および／または電子的評価に基づいて、複数の時点であり得る。
【００６３】
別の実施形態において、感染したまたは慢性創傷を治療するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、創傷を、前述の組成物のうちのいずれかと接触させることを含み、該組成物は、少なくとも１つの抗生物質および任意に治癒剤と一緒に含む。この実施形態下で、治療される創傷は、組織、例えば、かかる診断を必要とする対象、例えば、ヒト対象の皮膚組織中に存在する。さらに、この実施形態下で、創傷は、原位置で治療され、治療前または治療後の診断を伴い得る。
【００６４】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００６５】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、１〜５０の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００６６】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００６７】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、１〜６の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００６８】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含み、配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含むペプチドの各々は、それぞれ独立して、エラスターゼに対して不安定である。この実施形態下で、ポリペプチドの各々は、任意に、アミン保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基で保護され得る。
【００６９】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識および担体を含む。
【００７０】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）に記載される配列を含むポリペプチドを含む、アンカー領域（Ａ）およびインジケータ領域（Ｉ）を含む化学物質が、本明細書に提供され、式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００７１】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択された数であり、Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００７２】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、１〜３から選択された数であり、Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００７３】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）に記載される配列を含むポリペプチドが、本明細書に提供され、式中、Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択された数であり、Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含み、配列（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）を含むポリペプチドは、それぞれ独立して、カテプシンＧに対して不安定である。この実施形態下で、ポリペプチドの各々は、任意に、アミン保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基で保護され得る。
【００７４】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物が、本明細書に提供され、式中、Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択された数であり、Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識および担体を含む。
【００７５】
一実施形態において、（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、アンカー領域（Ａ）およびインジケータ領域（Ｉ）を含む化学物質が、本明細書に提供され、式中、Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択された数であり、Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、検出可能な標識を含む。
【００７６】
対象技術の他の実施形態および構成は、以下の発明の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろうと理解され、対象技術の様々な構成は、実施例または説明図によって示され、説明されている。実現されるように、対象技術は、他の異なる構成を可能にし、そのいくつかの詳細は、全て対象技術の範囲から逸脱することなく、様々な他の態様において修正を可能にする。したがって、図面および詳細な説明は、実際には、限定的ではなく例示的であると見なされる。
【００７７】
本開示を理解するために、これより、添付の図面を参照して、例として説明されており、本開示の実施形態および実施例を以下の説明と共に説明することが、本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例２の赤外線スペクトル。様々なアセチル化度（ＤＡ）を有するキトサン誘導体が、生成されたが、４８％のＤＡを有する材料のみをさらに使用した。
【図２】実施例２の赤外線スペクトルおよびＮＭＲスペクトル。様々なＤＡを有するキトサン誘導体が、生成されたが、４８％のＤＡを有する材料のみをさらに使用した。
【図３】実施例５のキトオリゴ糖の赤外線スペクトル。
【図４】実施例６のキトオリゴ糖の赤外線スペクトル。
【図５】１ｍＬのリゾチーム当たり５０００単位でインキュベートしたときの染料複合化アセチルキトサンからの染料放出の時間経過。
【図６】（Ａ）キトサンが様々な濃度の複合化した染料を有するときのリン酸緩衝液中で１ｍＬのリゾチーム当たり５０００単位でインキュベートしたときの染料複合化アセチルキトサンからの染料放出の時間経過、（Ｂ）ＢＳＡとして２％タンパク質を含有する人工創傷流体のいずれかのリン酸緩衝液中で１ｍＬのリゾチーム当たり５０００単位でインキュベートしたときの染料複合化アセチルキトサンからの染料放出の時間経過。
【図７】実施例１１の固定化ニトラジンイエローおよびブロモクレゾールパープルの色応答は、調製物が乾燥されるｐＨに応じて異なる。
【図８】異なる染色度の異なるリゾチーム応答性の染料放出の比較。
【図９】反応性染料とＰＧとの間の割合の影響。
【図１０】エラスターゼ応答性の染料放出。
【図１１】様々な構築物の複数の配列アライメント。アスタリスク（＊）は、同一性を示し、セミコロン（：）は、保存的置換を示し、ピリオド（．）は、半保存的置換を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明の詳細な説明
これより、様々な態様は、以下により十分に記載されよう。しかしながら、かかる態様は、多くの異なる形態で具現化され得、本明細書で示す実施形態に限定されるものと解釈してはならず、むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全であるように提供され、その範囲を当業者に完全に伝達するであろう。
【００８０】
この開示全体を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物が、参照されている。これらの特許、特許出願、および刊行物の開示全体は、参照によりその全体が本明細書において組み込まれ、本開示の日付現在当業者に既知の最先端の技術がより完全に記述される。本開示は、言及される特許、特許出願、刊行物と本開示との間に何らかの矛盾がある場合は優先する。
【００８１】
Ｉ．定義
様々な範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各中間値および任意の他に述べられる値またはその述べられる範囲の中間値が本開示内に包含されることを目的とする。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が述べられている場合、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、および７μｍはまた、明確に開示されており、１μｍ以上の値の範囲および８μｍ以下の値の範囲であることが意図されている。
【００８２】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途明確に規定されない限り、複数の言及を含む。それ故に、例えば、「ポリマー」への言及は、単一のポリマー、ならびに同じまたは異なるポリマーのうちの２つ以上を含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤、ならびに同じまたは異なる賦形剤のうちの２つ以上、および同類のものを含む。
【００８３】
「約」という語句は、数値を直接先行するとき、開示の文脈が別段の指示がない、またはこのような解釈と矛盾しない限り、その数値のプラスまたはマイナス１０％の範囲、例えば、「約５０」は、４５〜５５を意味し、「約２５，０００」は、２２，５００〜２７，５００などを意味する。例えば、「約４９、約５０、約５５などの数値の一覧において、「約５０」は、先行する値と後続値との間の間隔（複数可）の半分未満にまで及ぶ範囲、例えば、４９．５より多く５２．５未満を意味する。さらに、「約値未満」または「約値よりも多く」という語句は、本明細書に提供される「約」という用語の定義を考慮して理解されるべきである。
【００８４】
「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全体的にまたは完全に、例えば、いくつかの所与の量の８０％〜９５％もしくはそれ以上、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％またはそれ以上の重量％もしくは体積％、または測定される任意の他のパラメータを意味する。「実質的に含まない」とは、いくつかの所与の量のほぼ全体的にまたは完全に不在する、例えば、いくつかの所与の量の約１％未満から約２０％のレベルで存在する、例えば、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、またはそれ以上の重量％もしくは体積％、または測定される任意の他のパラメータを意味する。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」とは、薬学的組成物の１〜５重量％以下のレベルで存在することを意味する。
【００８５】
ＩＩ．要約
創傷および創傷管理の治療法および診断のための組成物およびシステムが、本明細書に提供され、この組成物は、使用中、原位置で創傷において酵素レベルの増加があることを示す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「創傷」は、組織構造の連続性または完全性の物理的破壊を指す。「創傷治癒」とは、組織の完全性の回復を指す。これは、組織の完全性の部分的または完全な回復を指し得ることが理解されよう。それ故に、創傷の治療は、創傷治癒プロセスに関連する１つ以上の段階またはプロセスの、促進、改善、進行、加速、またはそうでなければ前進を指す。
【００８７】
創傷は、急性または慢性であり得る。褥瘡、静脈肢潰瘍、および糖尿病性足潰瘍を含む、慢性創傷は、単純に、治癒できない創傷と説明され得る。慢性創傷の正確な分子病原論は、十分に理解されていないが、多因子性であると認められている。急性損傷中の常在および遊走細胞の正常な応答が損なわれるため、これらの創傷は、長期の炎症反応、不完全な創傷細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリング、および再上皮化の失敗によって特徴付けられる。
【００８８】
創傷は、任意の内部創傷、例えば、挫傷形成もしくは内部潰瘍などの、皮膚の外部構造の完全性が維持されているもの、または外部創傷、特に皮膚創傷である可能性があり、したがって組織は任意の内部または外部体組織であり得る。一実施形態において、組織は、皮膚（ヒト皮膚など）であり、すなわち創傷は皮膚または表皮創傷などの皮膚創傷である。
【００８９】
ヒト皮膚は、２つの異なる層、表皮および真皮からなり、その下に皮下組織がある。皮膚の主な機能は、外部の外傷および病原体感染からの内部臓器および組織への保護、感覚、ならびに体温調節を提供することである。ほとんどの哺乳動物の皮膚組織は、同様に構造化されている。
【００９０】
皮膚の最も外側の層である表皮は、厚さ約０．０４ｍｍで、無血管性であり、４つの細胞型（ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞）からなり、いくつかの上皮細胞層に層形成される。表皮の最も内側の上皮層は基底膜であり、これは真皮に直接接触し、表皮を真皮に固定している。皮膚で起こっている全ての上皮細胞分裂は、基底膜で起こる。細胞分裂後、上皮細胞は、表皮の外部表面へと遊走する。この遊走中に、細胞は、角質化として既知のプロセスを経験し、それにより核が失われ、細胞は強靱、平坦、抵抗性の生きていない細胞へと変換される。遊走は、細胞が最も外側の表皮構造である角質層に達すると完了し、この層はその下にある組織の乾燥を防ぐ助けをする、乾燥した耐水性の扁平細胞層である。この死滅上皮細胞の層は、持続的に脱落し、基底膜から表面へと移動する角質化細胞によって置き換えられている。表皮上皮は、無血管性であるため、基底膜は、その栄養供給を真皮に依存している。
【００９１】
真皮は、表皮に栄養を供給する高度に血管化した組織層である。加えて、真皮は、神経終末、リンパ管、コラーゲンタンパク質、および結合組織を含む。真皮は、厚さ約０．５ｍｍで、主に線維芽細胞およびマクロファージからなる。これらの細胞型は、大部分は、コラーゲンの産生および維持を担っており、タンパク質は、皮膚を含む、全ての動物結合組織に見出される。コラーゲンは、主に皮膚の復元力がある弾力性の性質を担っている。コラーゲンが豊富な真皮の下に見られる皮下組織は、皮膚の可動性、保温材、カロリー保存庫、およびその上の組織への血液を提供する。
【００９２】
創傷は、２つの一般的範疇、部分厚さ創傷または完全厚創傷の１つに分類することができる。部分厚さ創傷は、表皮および真皮表面に限定され、皮膚血管への損傷はない。完全厚創傷は、真皮の破壊を含み、より深い組織層に拡がって、皮膚血管の破壊を含む。部分厚さ創傷の治癒は、上皮組織の単純な再生によって起こる。完全厚創傷における創傷治癒は、もっと複雑である。本明細書に企図される皮膚創傷は、部分厚さ創傷または完全厚創傷のいずれかであり得る。
【００９３】
本明細書に企図される創傷には、切創および裂創、外科的切開および創傷、穿刺、擦過傷、引っ掻き傷、圧迫創、表皮剥脱、摩擦創（例えば、おむつかぶれ、摩擦による水疱）、褥瘡性潰瘍（例えば、加圧または床ずれ）；熱による創傷（直接または伝導、対流、もしくは放射のいずれかによる冷および熱源、ならびに電気的熱源からの熱傷）、化学的創傷（例えば、酸またはアルカリ熱傷）または開放性もしくは無傷の膿を含む病原体感染（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）、皮膚発疹、斑点およびアクネ、潰瘍、慢性創傷、（下肢および足潰瘍などの糖尿病関連創傷、静脈肢潰瘍ならびに褥瘡を含む）、皮膚移植（ｇｒａｆｔ／ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）供与および受容部位、免疫応答状態、例えば、乾癬および湿疹、胃または腸潰瘍、口の潰瘍を含む口腔創傷、軟損傷した骨または骨、切断創および角膜病変が含まれる。
【００９４】
化学物質およびその組成物
本明細書に記載される実施形態は、慢性創傷を診断および／または治療するために使用され得る化学物質を提供する。本明細書に記載される、化学物質およびその組成物は、哺乳動物創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出するための方法において使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される、化学物質およびその組成物は、哺乳動物における慢性創傷を診断するための方法において使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される、化学物質およびその組成物は、哺乳動物における感染した創傷を診断するための方法において使用される。他の実施形態において、本明細書に記載される、化学物質およびその組成物は、哺乳動物における創傷を治療するための方法において使用される。さらなる実施形態において、本明細書に記載される、化学物質およびその組成物は、哺乳動物における感染したまたは慢性創傷を治療するための方法において使用される。
【００９５】
一実施形態において、体液からの酵素活性を検出することができる化学物質が、本明細書に提供され、この化学物質は、アンカー領域（Ａ）およびインジケータ領域（Ｉ）を含む。この実施形態下で、化学物質は、基本的な化学構造Ａ−Ｉ（式Ｉ）を有し、式中、Ａは、アンカー領域であり、Ｉは、インジケータ領域である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、アンカー領域（Ａ）は、酵素認識部位（Ｓ）を介して、インジケータ領域（Ｉ）と会合される。この実施形態下で、酵素認識部位は、酵素に結合することができる構造またはモチーフである。
【００９７】
一実施形態において、酵素認識部位（Ｓ）は、アンカー領域内に天然に存在する。別の実施形態において、酵素認識部位（Ｓ）は、化学修飾を介してアンカー領域に導入される。あるいは、酵素認識部位（Ｓ）は、インジケータ領域（Ｉ）内に天然に存在し得るか、または１つ以上の化学修飾に介して、インジケータ領域（Ｉ）内に合成的に導入され得る。
【００９８】
一実施形態において、式Ｉの化学物質は、共有結合的にまたは非共有結合的に、インジケータ（Ｉ）と会合される、アンカー（Ａ）を含む。特に、アンカー領域（Ａ）とインジケータ領域（Ｉ）との間の会合は、共有結合性相互作用を介して媒介される。当該技術分野で理解されるように、共有結合は、結合された原子間の電子を共有することを伴う。対照的に、非共有結合は、例えば、イオン相互作用、静電相互作用、水素結合相互作用、生理化学相互作用、ファン・デル・ワールス力、ルイス酸／ルイス塩基相互作用、またはその組み合わせを含み得る。
【００９９】
一実施形態において、アンカーＡは、共有結合性相互作用を介してインジケータＩと会合されて、認識部位Ｓを形成する。別の実施形態において、アンカーＡは、認識部位Ｓの一部ではない共有結合性相互作用を介してインジケータＩと会合される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、化学物質は、酵素に不安定なまたは酵素反応領域（Ｒ）をさらに含む。一実施形態において、反応領域（Ｒ）は、アンカー領域の一部ではない。別の実施形態において、反応領域（Ｒ）は、インジケータ領域（Ｉ）の一部である。またさらに、反応領域（Ｒ）は、酵素認識部位（Ｓ）の一部である。
【０１０１】
一実施形態において、反応領域（Ｒ）は、エラスターゼ、リゾチーム、カテプシンＧ、およびミエロペルオキシダーゼ、またはその組み合わせからなる群から選択される１つ以上の標的酵素と相互作用する。
【０１０２】
アンカー領域（Ａ）
式Ｉの化学物質のいくつかの実施形態において、アンカー領域は、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、またはキトサン、またはそのモノマー、その誘導体、その混合物または組み合わせである化合物を含む。
【０１０３】
一実施形態において、アンカーＡは、キトサン、またはそのモノマー、その誘導体、その混合物または組み合わせである化合物を含む。非共有結合は、例えば、イオン相互作用、静電相互作用、水素結合インテリル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）を含み得る。したがって、キトサンモノマーは、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含み得る。別の実施形態において、キトサンは、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、またはその組み合わせのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上の単位を含み得る。より短い断片を含むキトサンは、一般に、キチンを、アルカリ性基質、例えば、水酸化ナトリウムで処理することによって、および任意に、個々のモノマー単位間のグリコシド結合を加水分解することによって製造される。
【０１０４】
別の実施形態において、アンカーＡは、キトサン誘導体を含む。実施例キトサンまたはキトサン誘導体には、キトサン塩、水溶性キトサン、水溶性の無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサン、キトサンオリゴ糖、カルボキシメチルキトサン、およびヒドロキシアルキルキトサンが含まれる。ヒドロキシアルキルのヒドロキシアルキル置換基、キトサン、およびカルボキシメチルキトサンのカルボキシメチル置換基は、キチンまたはキトサン環サブユニット上のペンダント窒素または酸素基のいずれかに結合され得る。代表的なヒドロキシアルキルキトサンとしては、ヒドロキシエチルキトサン（グリコールキトサンとしても知られる）、ヒドロキシプロピルキトサン、ジヒドロキシプロピルキトサン、ヒドロキシブチルキトサン、およびジヒドロキシブチルキトサンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
一実施形態において、キトサン誘導体は、無作為に置換された部分的Ｎ−、部分的Ｏ−アセチル化キトサンである。アセチル化キトサン誘導体は、概して、アセチル化度またはアセチル化度によって定義される。当該技術分野で理解されるように、アセチル化度（ＤＡ）は、キトサン分子中のユニットの総数に対してＮ−アセチル−ｄ−グルコサミンユニットの割合を表す。Ｃｈａｔｅｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（３）：２６１−８，２００１を参照されたい。「アセチル化度」という用語とは、水溶性キトサンまたはキトサン誘導体上の遊離アミノ基の割合を意味する。Ｎ−アセチル化の割合は、脱アセチル化値から計算され得る。Ｎ−アセチル化またはＯ−アセチル化という用語はまた、ＮまたはＯのいずれか上のＣ（Ｏ）ＣＨ３による置換度と称される。当該技術分野で理解されるように、５０％超のＮ−アセチル化のＤＡ値を有するキトサン誘導体は、キチンと記載される場合がある。しかしながら、「キトサン」という用語は、キトサンを含み、Ｎ−アセチル化が５０％超である場合、キチンを含むように本明細書の開示全体を通して使用される。米国特許第７，６８３，０３９号を参照されたい。
【０１０６】
一実施形態において、キトサン誘導体は、少なくとも約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の％、例えば、約４５％〜９５％、特に、約６０％〜約８０％のＤＡを有する。特に、キトサンは、少なくとも４８％の脱アセチル化、特に少なくとも７５％の脱アセチル化である。
【０１０７】
一実施形態において、本明細書で使用される「キトサン誘導体」は、キトサンの塩、アミド、エステル、エノールエーテル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物、またはプロドラッグを含む。かかる誘導体は、かかる誘導体化のための既知の方法を使用して当業者によって容易に調製され得る。ある特定の実施形態において、誘導体は、実質的な毒性効果なしに動物またはヒトに投与し得、薬学的に活性があるか、またはプロドラッグである。代表的なタイプのキトサン誘導体は、米国特許第９，０１２，４２９号、同第５，７７３，６０８号、同第３，９１１，１１６号に記載されている。
【０１０８】
別の実施形態において、誘導体は、ポリマー化合物の塩、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、またはＢａ２＋、好ましくは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋の塩である。ナトリウムまたはカルシウム塩などのキチンおよびキトサンの塩は、当該技術分野で既知である。米国特許第５，５９９，９１６号を参照されたい。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、誘導体アンカー化合物は、ハロゲン化アンカー化合物、例えば、ハロゲン化多糖、ハロゲン化セルロース、ハロゲン化ポリアクリレート、ハロゲン化ポリエチレンイミン、ハロゲン化ポリアクリルアミド、ハロゲン化ペプチドグリカン、または、ハロゲン化キトサン、もしくはそのモノマー、例えば、ハロゲン化Ｄ−グルコサミン、および／またはハロゲン化Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである。ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択され、特に、ハロゲンは、Ｃｌである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、誘導体化合物は、アンカー化合物の異性体である。「異性体」という用語は、同じ式を有するが、分子中の原子の異なる配置を有する化合物を含む。実施形態において、化合物の異性体は、化合物の「互変異性体」または「立体異性体」である。「立体異性体」という用語は、１つ以上の立体中心のキラリティーが異なる化合物を指す。立体異性体は、光学異性体およびジアステレオマーを含む。「互変異性体」という用語は、エノール−ケトおよびイミン−エナミン互変異性体、またはアンカー化合物の互変異性形態などの、プロトンの位置が異なる化合物の代替形態を指す。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、アンカー化合物は、前述の化合物のうちの１つ以上の組み合わせまたは混合物を含有し得る。「組み合わせ」という用語は、互いに複合体化または非複合体化され得る、１つを超える構成成分を含有する化合物を含む。一実施形態において、アンカー化合物は、例えば、共有結合または非共有結合性相互作用を介して、互いに複合体化される前述の化合物のうちの１つ以上の組み合わせを含む。特定の例として、アンカーは、キトサンおよび酸化セルロースの組み合わせを含み得る。米国特許出願公開第２０１４／００４５７６１号を参照されたい。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、化合物は、前述のポリマー化合物の混合物を含む。「混合物」という用語は、それらの個々の特性を失い得る反応が生じない２つ以上の基質を一緒にする混和を指す。例えば、化合物Ａおよび化合物Ｂの混合物は、混合物の総重量が合計１００％、例えば、化合物Ａ／化合物Ｂの重量比が９９：１、または化合物Ａ／化合物Ｂの重量比が１：９９になり得るように、化合物Ａおよび化合物Ｂの任意の重量比を含有し得る。典型的な混合物は、前述のポリマー化合物の約２、３、４、５、またはそれ以上含有し得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、アンカーＡは、イオン化学基、親水性部分を有する材料、または疎水性部分を有する材料、例えば、脂肪族鎖または脂肪族アルコールをさらに含む。アンカーがイオン化学基を含む実施形態において、イオン化学基は、陽電荷または負電荷を持ち得る。いくつかの実施形態において、アンカー領域は、光活性フェニルアジドまたはエポキシド基などの支持材料への共有結合のための反応部分を含む。米国特許出願公開第２０１６／０１５９７７７号を参照されたい。
【０１１４】
反応基をキトサンおよび／または多糖、セルロース、グリカンなどの他のゴリコシド化合物に導入する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第７，１２５，９６８号は、キチン／キトサンを含み、炭水化物、光反応性官能基、両親媒性基、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびグルコサミノグリカンのうちの少なくとも１つをその中に組み込まれる、官能化キトサン誘導体を開示する。かかる技術は、他のアンカー化合物のタイプを誘導体化するために使用され得る。
【０１１５】
特に、アンカー領域Ａは、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミン二量体（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；またはその組み合わせを含む。
【０１１６】
インジケータ
いくつかの実施形態において、化学物質は、１つ以上のインジケータ、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれ以上のインジケータを含む。かかる組成物は、例えば、同じゲルポリマーまたは異なるゲルポリマーに複合化された複数の基質を含み得る。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、インジケータが、標識される。本明細書で使用される、「標識」という用語は、エピトープ結合剤または他の基質材料に結合される任意の物質を指し、基質は、検出方法によって検出可能である。好適な標識の非限定的な例としては、発光性分子、化学発光性分子、蛍光色素、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼを含む）が挙げられる。標識をアンカー化合物に結合するための方法は、実施例に記載されている。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、インジケータは、検出可能な標識である標識で標識される。検出可能な標識は、部分であり、この存在は、直接または間接的に確認され得る。概して、標識の検出は、例えば、エネルギーの放出などの検出可能なシグナルの生成を伴う。標識は、化学的、ペプチド、または核酸性質のものであってもよいが、これはあまり限定されない。使用される標識の性質は、実施される分析の性質、使用されるエネルギー源および検出器の種類、およびポリマー、分析物、プローブ、ならびに一次および二次分析物に特異的な結合パートナーの種類を含む、様々な要因に応じて異なるであろう。
【０１１９】
特定の実施形態において、標識は、それが結合している成分と立体的および化学的に相溶性である、例えば、アンカー領域である。具体的には、標識は、酵素認識部位（Ｓ）および／または酵素反応領域（Ｒ）を妨げない形状およびサイズのものである。
【０１２０】
一実施形態において、アンカーに結合されたインジケータまたはその中のモチーフは、グリコシダーゼの基質である。具体的には、アンカーに結合されたインジケータまたはその中のモチーフは、リゾチームの基質である。
【０１２１】
別の実施形態において、アンカーに結合されたインジケータまたはその中のモチーフは、エラスターゼ、カテプシンＧ、もしくはミエロペルオキシダーゼ（ＭＡＯ）、またはその組み合わせからなる群から選択されるプロテアーゼの基質である。
【０１２２】
別の実施形態において、アンカーに結合されたインジケータまたはその中のモチーフは、リゾチームであるグリコシダーゼ、およびエラスターゼ、カテプシンＧ、もしくはミエロペルオキシダーゼ（ＭＡＯ）、またはその組み合わせからなる群から選択されるプロテアーゼの基質である。
【０１２３】
一実施形態において、アンカーに結合されたインジケータまたはその中のモチーフは、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシル、中性染料、荷電染料、ナノ粒子、またはコロイド金粒子である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、アンカーに結合されたインジケータ（Ｉ）またはその中のモチーフは、ペルオキシダーゼ基質である。いくつかの実施形態において、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２イノフェノール、ＡＢＴＳ（ｓｔｒａｔｅ．いくつかの実施形態において、酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンベンジジン、３，４ジアミノ安息香酸、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、インドキシル、インジゴ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンから選択される。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、アリールアミンである。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、アミノフェノールである。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、アミノフェノールエーテルである。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、インドキシルである。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、中性染料である。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、荷電染料である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、および反応性オレンジ１６、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、荷電染料は、レマゾールブリリアントブルー、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、トルイジンブルーである。いくつかの実施形態において、荷電染料は、反応性ブラック５、またはその加水分解（ａｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、反応性バイオレット５、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、反応性オレンジ１６、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０などのジクロロトリアジン系反応性染料である。いくつかの実施形態において、ジクロロトリアジン系反応性染料は、ブラックに見える。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する反応性染料である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、または反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、レマゾールブリリアントブルーである。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、または反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５またはレマゾールブリリアントブルーである。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、コロイド金粒子である。いくつかの実施形態において、インジケータ（Ｉ）またはそれに結合された標識は、荷電染料、インドール誘導体、またはルミノール誘導体である。
【０１２７】
特に、アンカーに結合されたインジケータまたはその中のモチーフは、スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する染料、例えば、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、もしくは反応性オレンジ１６、またはその組み合わせ；またはジクロルトリアジン反応基を含有する染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０、またはその組み合わせを含む。
【０１２８】
アンカー−インジケータ複合体
様々な酵素において、アンカーＡは、例えば、グリコシド結合を介して、インジケータＩに直接複合化される。複合体のアンカー部分は、例えば、キトサン、Ｎ−アセチルキトサン；オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン；アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；グルコサミン二量体（ＧｌｃＮＡｃ）２；アセチル−キトサン；キトビオースオクタアセテート；構造（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ（式中、ｎ＝４、５、または６である）を含むキトオリゴマー；キトオリゴ糖；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド；またはその組み合わせからなる群から選択される。同様に、インジケータは、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、もしくは反応性オレンジ１６、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０、またはその組み合わせからなる群から選択される。グリコシド結合は、インジケータ化合物において反応基を用いて、アンカー化合物のヒドロキシル基の間に形成される。グリコシダーゼの天然基質を模倣するために、アンカー分子の糖骨格の１α−炭素は、グリコシド結合に関与する。
【０１２９】
マーカー
本明細書に記載される実施形態は、様々な生物学的マーカーのためのアッセイが慢性または感染した創傷に存在する化学部分を利用し得る。一実施形態において、マーカーは、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、およびペルオキシダーゼからなる群から選択される酵素である、創傷特異的マーカーである。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「創傷特異的酵素」は、創傷において差次的に発現される酵素である。「差次的発現」とは、酵素のレベルまたは活性が、他の部位、例えば、正常な組織または周囲組織と比較して、創傷微小環境においてより高いまたは低いことを意味する。特に、差次的発現は、正常または未創傷組織と比較して、創傷微小環境において酵素のより高いレベルの発現または活性を意味する。酵素の差次的発現は、日常手段によって分析され得る。例えば、試料中の酵素のレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他の免疫測定法によって分析され得る。酵素の活性は、基質の損失の速度および／または生成物の形成の速度を測定する、例えば、質量分光法またはＨＰＬＣを使用することによって分析され得る。かかる技術は、当該技術分野で既知であり、実施例の項に記載されている。
【０１３１】
一実施形態において、マーカーは、ヒドロラーゼである。本明細書で使用される場合、「ヒドロラーゼ」または「加水分解酵素」は、化学結合、例えば、エステラーゼおよびヌクレアーゼ（破断エステル結合）、グリコラーゼ（破断グリコシドリンカー）、ペプチダーゼ  （破断ペプチド結合）などの加水分解を触媒する酵素である。
【０１３２】
特定の一実施形態において、創傷特異的グリコシドヒドロラーゼは、リゾチームである。リゾチーム（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ６１６２６［ヒト］およびＰ０８９０５［マウス］）は、グリコシドヒドロラーゼであり、その主な機能は、細菌の細胞壁を破壊することである。それは、Ｎ−アセチルムラミン酸とペプチドグリカン中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間、およびキトデキシトリン（ｃｈｉｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）中のＮ−アセチル−Ｄグルコサミン残基間に（１→４）−β−結合を加水分解する。リゾチームのための天然基質は、細菌性細胞壁のペプチドグリカン層である。しかしながら、ムレイン分解生成物ならびに合成化合物を含む様々な低分子質量基質は、様々な光度、同位体、および免疫学的リゾチームアッセイに使用されている。Ｈｏｌｔｊｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＸＳ，７５：１０５−１０，１９９６。Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ５６３９およびＳｉｇｍａカタログ番号Ｎ８６３８も参照されたい。
【０１３３】
一実施形態において、化学部分の個々の構成成分は、創傷特異的ヒドロラーゼ、例えば、創傷特異的リゾチームによる認識に適している。
【０１３４】
あるいはまたはさらに、化学部分の個々の構成成分は、他の創傷特異的酵素による認識のために修飾され得る。一実施形態において、さらなる創傷特異的酵素は、プロテアーゼである。本明細書で使用される場合、「創傷特異的プロテアーゼ」は、創傷において差次的に発現されるプロテアーゼである。「差次的発現」とは、プロテアーゼのレベルまたは活性が、他の部位、例えば、正常な組織または周囲組織と比較して、創傷微小環境においてより高いまたは低いことを意味する。特に、差次的発現は、未創傷組織と比較して、創傷微小環境においてプロテアーゼのより高いレベルの発現または活性を意味する。プロテアーゼの差次的発現は、日常手段によって分析され得る。例えば、試料中のプロテアーゼのレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他の免疫測定法によって分析され得る。プロテアーゼの活性は、ペプチド基質の損失の速度および／または生成物の形成の速度を測定する、例えば、質量分光法またはＨＰＬＣを使用することによって分析され得る。かかる技術は、当該技術分野で既知であり、実施例の項に記載されている。
【０１３５】
一実施形態において、創傷特異的プロテアーゼは、カテプシンＧ（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０８３１１［ヒト］およびＰ２８２９３［マウス］）であり、これは、アズール顆粒中に保存されているキモトリプシンファミリーの３つのセリンプロテアーゼのうちの１つである。カテプシンＧ特異的基質は、配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ  ｏｒ  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ７３８８およびＭ７７７１）を有する。
【０１３６】
別の実施形態において、創傷特異的プロテアーゼは、エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼまたはＨＮＥ）（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０８２４６［ヒト］およびＱ３ＵＰ８７［マウス］）である。ＨＮＥは、キモトリプシンと同じファミリーのセリンプロテイナーゼであり、広範な基質特異性を有する。炎症中、好中球およびマクロファージによって分泌され、細菌および宿主組織を破壊する。一実施形態において、ＨＮＥを検出するための基質は、コア配列アラニン−アラニン−プロリン−バリン（ＡＡＰＶ）を有する。別の実施形態において、ＨＮＥのための基質は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ／Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ  （ＡＰＥＥＩ／ＭＲＲＱ）である（Ｋａｓｐｅｒｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１１（７）：２５１８−２５２３，２０１４、Ｋｏｒｋｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，８４４：１２５−１３８，２０１２）。
【０１３７】
さらに、さらなる実施形態において、創傷特異的酵素は、ペルオキシダーゼ、より具体的には、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）である。ＭＰＯ（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０５１６４［ヒト］およびＰ１１２４７［マウス］）は、好中性顆粒球に見出されたペルオキシダーゼである。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびハロゲン化物（通常、塩化物）の存在下で、それは、抗菌基質次亜塩素酸塩、一重項酸素（１Ｏ２）、塩素（Ｃｌ２）、およびヒドロキシラジカル（ＯＨ・）を生成する。ＭＰＯは、テトラメチルベンジジンまたは４−ベンゾイルアミノ−２，５  −ジメトキシアニリンを使用して検出され得る。Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２７（２）：３４６−５０，１９８２、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．，７７，５９８−６２５，２００５を参照されたい。
【０１３８】
酵素認識部位（Ｓ）
本明細書に開示される実施形態が創傷特異的マーカーの特定の検出に関する限りにおいて、創傷特異的マーカーのための酵素認識部位（Ｓ）を含有する基質が、本明細書に開示されている。それ故に、一実施形態において、化学部分は、創傷特異的酵素に対する認識部位、例えば、酵素切断部位を含む、アンカー領域Ａまたはインジケータ（Ｉ）を含む。
【０１３９】
一実施形態において、酵素認識部位は、グリコシド結合を含む。本明細書で使用される場合、「グリコシド結合」は、サッカリド（またはサッカリドに由来する分子）のヘミアセタールまたはヘミケタール基とアルコールなどのいくつかの化合物のヒドロキシル基との間に形成される。グリコシド結合を含有する基質は、グリコシドである。「グリコシド」という用語は、現在、糖のヘミアセタール（またはヘミケタール）基と、−ＳＲ（チオグリコシド）、−ＳｅＲ（セレノグリコシド）、−ＮＲ１Ｒ２（Ｎ−グリコシド）、またはさらに−ＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｃ−グリコシド）などのヒドロキシル以外のいくつかの化学基との間に形成された結合を有する化合物も網羅するように拡張される。
【０１４０】
一実施形態において、本明細書に開示される化学部分は、グリコラーゼによって切断される１つ以上のグリコシド結合を含有する。特定の一実施形態において、化学部分は、直接的にまたは別の基に介して、アンカーＡおよびインジケータＩを連結するグリコシド結合を含む。特に、アンカーＡおよびインジケータＩは、１つ以上のグリコシド結合を介して直接連結され、この場合、化学物質は、グリコラーゼによって切断され、したがって、グリコラーゼの検出に使用され得る。
【０１４１】
一実施形態において、インジケータ分子は、ペプチド結合を含む酵素的に切断可能なペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」は、２つのアミノ酸間の縮合反応によって形成され、一方の酸部分が他方のアミノ部分と反応して、２つのアミノ酸間のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を生成する。個々のペプチドは、配列特異的プロテアーゼによる認識のためのモチーフを提供する。本明細書で使用される場合、「配列特異的プロテアーゼ」という用語は、その消化のためのペプチドの特定の配列を認識するプロテアーゼ（例えば、カスパーゼ）を意味し、その一方からのペプチドを連続して分解するかまたは配列非特異的様式でペプチドを消化する一般的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）とは異なる。配列特異性のための、ペプチド基質のアミノ酸配列は、４つ以上のアミノ酸（ａ．ａ．）残基を含み得る。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、直鎖または分岐鎖アミノ酸、ペプチド模倣薬、ならびにその薬学的に許容される塩を含む天然ペプチドを含む。典型的に、ペプチドは、複数のアミノ酸残基、例えば、共有結合、例えば、ペプチド結合を介して互いに結合されている、２、３、４、５、６、８、１０またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。「アミノ酸残基」は、本開示のペプチドに組み込まれた個々のアミノ酸ユニットを意味する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するまたは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体、立体異性体、および天然に存在するアミノ酸に同様に機能するアミノ酸模倣薬を意味する。（１）ヒスチジン（Ｈｉｓ）（２）イソロイシン（Ｉｌｅ）（３）ロイシン（Ｌｅｕ）（４）リジン（ｙｓｉｎｅ）（Ｌｙｓ）（５）メチオニン（Ｍｅｔ）（６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（７）スレオニン（Ｔｈｒ）（８）トリプトファン（Ｔｒｐ）（９）バリン（Ｖａｌ）（１０）アルギニン（Ａｒｇ）（１１）システイン（Ｃｙｓ）（１２）グルタミン（Ｇｌｎ）（１３）グリシン（Ｇｌｙ）（１４）プロリン（Ｐｒｏ）（１５）セリン（Ｓｅｒ）（１６）チロシン（Ｔｙｒ）（１７）アラニン（Ａｌａ）（１８）アスパラギン（Ａｓｎ）（１９）アスパラギン酸（Ａｓｐ）（２０）グルタミン酸（Ｇｌｕ）（２１）セレノシステイン（Ｓｅｃ）などの天然アミノ酸が、本定義によって含まれ、非天然アミノ酸：（ａ）シトルリン、（ｂ）シスチン、（ｃ）ガマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、（ｄ）オルニチン、（ｆ）テアニンおよびベタインなどのアミノ酸誘導体、カルニチン、カルノシンクレアチン、ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシプロリン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ−ｅ）、タウリン、チラミンを含む。これらの中で、反応性側鎖を含有するアミノ酸、例えば、システイン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、アスパルテート／アスパラギン、グルタメート／グルタミン、グリシン、アラニンなどは、特に、基質の修飾のために特に用いられる。
【０１４３】
酵素反応部位（Ｒ）
いくつかの実施形態において、化学物質は、１創傷特異的酵素の検出のための１つ以上の酵素に不安定なまたは酵素反応領域（Ｒ）を含有する。
【０１４４】
一実施形態において、酵素が、リゾチームなどのグリコシダーゼであり、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、任意に、アセチル化される、少なくとも３つのグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンまたはペプチドグリカンユニットのアシルキトサンを含む。酵素反応部位は、例えば、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンまたはペプチドグリカンユニットのうちの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０またはそれ以上のユニットを含有し得る。一実施形態において、Ｒは、少なくとも３つのグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンまたはその組み合わせを含み、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンは、任意に、アセチル化される。別の実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、ペプチドグリカンを含み、ペプチドグリカンは、任意に、アセチル化される。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、化学部分は、上に開示されている１つ以上の創傷特異的プロテアーゼ、例えば、カテプシンＧ、およびミエロペルオキシダーゼ、エラスターゼ、またはその組み合わせに対して酵素反応部位（Ｒ）を含む。本明細書で使用される場合、「プロテアーゼのための反応部位」という用語は、そのプロテアーゼ活性のための基質として、例えば、１つ以上の生成物に切断され得る基質としてプロテアーゼによって認識される、タンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、化学物質は、複数のアミノ酸を含むペプチド配列を含むペプチド領域を含む。「複数の」という用語は、個々のユニットが構造的かつ／または機能的に異なる必要はないが、２つ以上のユニット、例えば、アミノ酸を意味する。典型的には、化学物質のインジケータ領域（Ｉ）は、創傷特異的プロテアーゼのための酵素反応部位として機能するペプチドを含む。
【０１４６】
一実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、エラスターゼ、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼ、またはその組み合わせに対して不安定であるペプチドを含む。
【０１４７】
一実施形態において、酵素に不安定な領域は、エラスターゼに対して不安定であるペプチドを含む。この実施形態下で、エラスターゼの発色インジケータは、ハイコントラストであり、それ故に、医薬品において原位置で使用されるとき、透明なインジケータとして機能し得る。
【０１４８】
理想的な基質は、青色、バイオレット、または濃緑色を作製し得る。それはまた、高い代謝回転を有する立体的に許容される位置において固定され得る。当該技術分野の状態は、反対である。利用可能な基質は、低分子量であるが、黄色可溶性発色団をもたらす、ｐ−ニトロフェノール基を含有する。最も経験のある研究者は、基質が活性部位にその方法を見つける可能性が最も高いという理由で、基質は水中で可溶性であるべきであると見なす。
【０１４９】
対照的に、本明細書に記載される実施形態は、その一般的な理由から離れる。エラスターゼが、固相基質、すなわち、定義によって、可溶性でない、それ故に、それに特異的な基質が適合される必要がある、構造的タンパク質を消化すると企図された。したがって、例えば、電子的検出で用いられ得るインジケータの色およびシステムの両方が、創傷環境に適合させた。
【０１５０】
したがって、可溶性基質を用いるのに当該技術分野で教示とは対照的に、本明細書に記載される実施形態は、青色、バイオレット、または緑色をもたらす低い水溶性のエラスターゼ基質の使用を企図する。
【０１５１】
一実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、
ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、
式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１５２】
一実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、
ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、
式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１５３】
別の実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、
ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、
式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１５４】
さらに別の実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、
ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、
式中、各Ｘは、独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｌは、連結部分であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１５５】
別の特定の実施形態において、反応性領域Ｒは、ペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含み、式中、Ｘ、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りであり、ｙは、それぞれ独立して、１〜５０の整数である。
【０１５６】
さらに、さらなる実施形態において、反応性領域Ｒは、ペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含み、式中、Ｘ、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りであり、ｙは、それぞれ独立して、１〜１０の整数である。
【０１５７】
特に、反応性領域Ｒは、ペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含み、式中、Ｘ、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りであり、ｙは、それぞれ独立して、１〜６の整数である。
【０１５８】
一実施形態において、配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含む上述のペプチドの各々は、それぞれ独立して、エラスターゼに対して不安定である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）においてアミノ酸のうちの１つ以上は、例えば、アミン保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護される。
【０１６０】
全般に、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、式中、
一実施形態において、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｌから選択され、
ｂは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｒ、Ｌ，Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｅは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｅから選択され、
ｆは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択される。
【０１６１】
別の実施形態において、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、式中、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｌから選択され、
ｂは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｅは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｅから選択され、
ｆは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択される。
【０１６２】
別の実施形態において、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、式中、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｌから選択され、
ｂは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｅは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｅから選択され、
ｆは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択される。
【０１６３】
別の実施形態において、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、式中、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇから選択され、
ｂは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択され、
ｅは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｆは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａ、Ｇから選択される。
【０１６４】
特に、別の実施形態において、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、式中、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆから選択され、
ｂは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａから選択され、
ｇは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａ、Ｇから選択され、
ｅは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａ、Ｇから選択され、
ｆは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａ、Ｇから選択される。
【０１６５】
好ましくは、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、式中、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆから選択され、
ｂは、アミノ酸がないか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａから選択され、
ｇは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａから選択され、
ｄは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａから選択され、
ｅは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａから選択され、
ｆは、アミノ酸がないか、または独立して、Ａから選択される。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、カテプシンＧに対して不安定であるペプチドを含む。
【０１６７】
一実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、
ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、のアミノ酸を含むペプチドを含み、式中、
Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数であり、
Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、
Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、
Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、
Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、
Ｚは、検出可能な標識を含み、ペプチドは、カテプシンＧに対して不安定である。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列においてアミノ酸のうちの１つ以上は、保護される。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列においてアミノ酸のうちの１つ以上は、ｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列においてアミノ酸のうちの１つは、ｆｍｏｃ基で保護される。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応性領域は、
ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）、のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、式中、
Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数であり、
Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリン、およびグルタミンから選択され、
Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、およびセリンから選択され、
Ｎ２は、プロリン、アラニン、およびグリシンから選択され、
Ｎ１は、セリン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシン、およびメチオニンから選択され、
Ｌは、連結部分であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１７０】
一実施形態において、配列ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）およびＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）を含む前述のペプチドの各々は、それぞれ独立して、カテプシンＧに対して不安定である。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）およびＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）においてアミノ酸のうちの１つ以上は、例えば、アミン保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護される。
【０１７２】
検出可能な標識Ｚ
いくつかの実施形態において、Ｚは、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシル、中性染料、荷電染料、ナノ粒子、またはコロイド金粒子である。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、Ｚは、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２イノフェノール、ＡＢＴＳ（ｓ、ペルオキシダーゼ基質酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンベンジジン、３，４ジアミノ安息香酸、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミンＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、インドキシル、インジゴ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンから選択されるペルオキシダーゼ基質である。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、Ｚは、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェノールエーテル、インドキシル、中性染料、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、および反応性オレンジ１６から選択される荷電染料、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。特に、Ｚは、レマゾールブリリアントブルー；トルイジンブルー；反応性ブラック５から選択される荷電染料、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０などのジクロロトリアジン系反応染料である。いくつかの実施形態において、ジクロロトリアジン系反応性染料は、ブラックに見える。いくつかの実施形態において、Ｚは、スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する反応性染料である。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、Ｚは、ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、Ｚは、コロイド金粒子である。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、Ｚは、荷電染料、インドール誘導体、またはルミノール誘導体である。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、フェノール、アミノフェノール、アミノフェノールエーテル、インドキシル、またはキノンを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、フェノールを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、アミノフェノールを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、アミノフェノールエーテルを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、インドキシルを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、キノンを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、ミエロペルオキシダーゼと反応するが、ヘムとは反応しない。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、中性染料、荷電染料、ナノ粒子、またはコロイド金粒子を含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、ペルオキシダーゼ基質を含む。いくつかの実施形態において、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンベンジジン、３，４ジアミノ安息香酸、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミンＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、および４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、Ｎ−（２−ヒドロキシ）テトラデシル−Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲから選択される。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、アリールアミンを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、アミノフェノールを含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、中性染料を含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、荷電染料を含む。いくつかの実施形態において、荷電染料は、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、および反応性オレンジ１６、またはこれらのそれぞれの加水分解もしくは加安分解誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、荷電染料は、レマゾールブリリアントブルー、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、トルイジンブルーである。いくつかの実施形態において、荷電染料は、反応性ブラック５、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、反応性バイオレット５、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。いくつかの実施形態において、荷電染料は、反応性オレンジ１６、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体である。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０などのジクロロトリアジン系反応染料を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、Ｚは、コロイド金粒子である。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、荷電染料、インドール誘導体、またはルミノール誘導体を含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、インドール誘導体を含む。いくつかの実施形態において、酵素に不安定なまたは酵素反応領域は、ルミノール誘導体を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、正常な周囲照明の可視色変化を示す染料を含む。いくつかの実施形態において、染料は、一般に赤色、黄色、または茶色である創傷製品に対する対比色を有する。さらなる実施形態において、染料は、バイオレット、ブルー、または濃緑色である。いくつかの実施形態において、染料は、バイオレットである。いくつかの実施形態において、染料は、ブルーである。いくつかの実施形態において、染料は、濃緑色である。いくつかの実施形態において、染料は、低分子量を有し、荷電され、反応性または連結可能な基を含み、ガンマ照射に対して安定しており、深く着色される。いくつかの実施形態において、染料は、シバクロン系染料、アゾ染料、およびレマゾール染料、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、染料は、シバクロン系染料から選択される。いくつかの実施形態において、染料は、アゾ染料から選択される。いくつかの実施形態において、染料は、レマゾール染料、またはその加水分解もしくは加安分解誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、染料は、ローダミン、クマリン、シアニン、キサンテン、ポリメチン、ピレン、ジピロメテンボロンジフルオリド、ナフタルイミド、フィコビリタンパク質、ペリジニウムクロロフィルタンパク質、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、テキサスレッド、カリフォルニアレッド、ｉＦｌｕｏｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｆ、カルボキシロードル、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−クロム、ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、フィコエリトリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオロセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（および−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ３５０、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商���）  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＴＲ、およびジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、またはその複合体、またはその組み合わせから選択される。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０などのジクロロトリアジン系反応性色素を含む。いくつかの実施形態において、ジクロロトリアジン系反応性染料は、ブラックに見える。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、スルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する反応性染料の反応生成物を含む。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、または反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、レマゾールブリリアントブルーである。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、または反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態において、反応性染料は、反応性ブラック５またはレマゾールブリリアントブルーである。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、正常周囲照明の色変化を示す粒子（例えば、コロイド金属または量子ドット）を含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、コロイド金粒子を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、紫外線光下で可視色変化を示す染料を含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、蛍光性である染料を含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、発光性である染料を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、酵素反応性部分を含む。いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、アクセサリー酵素と相互作用して、肉眼で見えるまたは電子的手段によって検出可能である生成物を生成する。いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、アクセサリー酵素と相互作用して、肉眼で見える生成物を生成する。いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、アクセサリー酵素と相互作用して、電子的手段によって検出可能である生成物を生成する。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、インジゴを生成するための使用される末端糖に応じて、ヘキサミニダーゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、またはガラクトシダーゼによって切断するインドキシルグリコシドを含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、アクセサリー酵素によって酸化されるフェノールを含み、可視生成物を生成する。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、可視生成物を生成するためにラッカーゼによって酸化されるフェノールを含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、電子的手段によって検出可能である金属モチーフを含む。いくつかの実施形態において、インジケータ領域は、電子的手段によって検出可能であるフェロセンまたはフェロセンアナログを含む。いくつかの実施形態において、アクセサリー酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼ、およびラッカーゼから選択される。いくつかの実施形態において、アクセサリー酵素は、創傷流体中に存在しない。いくつかの実施形態において、アクセサリー酵素は、創傷流体中に存在する。いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、アクセサリー酵素と相互作用して、紫外線光下で見える生成物を生成する。
【０１８９】
複数の酵素認識部位（Ｓ）および反応部位（Ｒ）を含有する化学物質
さらなる実施形態において、アンカーＡ、インジケータＩを含有する化学物質が、本明細書に開示されており、これらは、複数の酵素認識部位（Ｓ）および酵素反応基（Ｒ）を個々にまたは一緒に含む。典型的には、かかる化学物質は、複数の酵素、例えば、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つのグリコシダーゼを含む組み合わせのためのアッセイに用いられる。
【０１９０】
一実施形態において、アンカーＡ、インジケータＩを含有する化学物質が、本明細書に開示されており、これらは、複数の酵素認識部位（Ｓ）および酵素反応部位（Ｒ）を個々にまたは一緒に含み、少なくとも１つの反応部位は、グリコシダーゼ、例えば、リゾチームに対して特異的であり、少なくとも１つの酵素反応部位は、エラスターゼ、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼ、またはその組み合わせからなる群から選択されるプロテアーゼに対して特異的である。これらの酵素に対する個々の反応部位および認識部位は、上述されている。
【０１９１】
一実施形態において、アンカーＡ、インジケータＩを含有する化学物質が、本明細書に開示されており、これらは、複数の酵素認識部位（Ｓ）および酵素反応部位（Ｒ）を個々にまたは一緒に含み、少なくとも１つの反応部位は、グリコシダーゼ、例えば、リゾチームに対して特異的であり、少なくとも１つの酵素反応部位は、エラスターゼからなる群から選択されるプロテアーゼに対して特異的である。これらの酵素に対する個々の反応部位および認識部位は、上述されている。
【０１９２】
一実施形態において、アンカーＡ、インジケータＩを含有する化学物質が、本明細書に開示されており、これらは、複数の酵素認識部位（Ｓ）および酵素反応部位（Ｒ）を個々にまたは一緒に含み、少なくとも１つの反応部位は、グリコシダーゼ、例えば、リゾチームに対して特異的であり、少なくとも１つの酵素反応部位は、カテプシンＧからなる群から選択されるプロテアーゼに対して特異的である。これらの酵素に対する個々の反応部位および認識部位は、上述されている。
【０１９３】
一実施形態において、アンカーＡ、インジケータＩを含有する化学物質が、本明細書に開示されており、これらは、複数の酵素認識部位（Ｓ）および酵素反応部位（Ｒ）を個々にまたは一緒に含み、少なくとも１つの反応部位は、グリコシダーゼ、例えば、リゾチームに対して特異的であり、少なくとも１つの酵素反応部位は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）からなる群から選択されるプロテアーゼに対して特異的である。これらの酵素に対する個々の反応部位および認識部位は、上述されている。
【０１９４】
酵素基質の組み合わせを用いるより大きな予測力のため、複数の反応および認識部位を含む化学物質の診断的有用性が、上記のように、単一（例えば、単一のタイプ）の反応および認識部位を含む物質と比較して、非常に強化され得ることが企図される。最低限でも、複数の反応／認識部位を含む物質は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上のマーカーの診断を同時に可能にするであろう。例として、創傷部位におけるリソソームおよびプロテアーゼ活性は、本明細書で開示されるマルチプレックス化学物質を使用して同時に検出および監視され得る。
【０１９５】
支持材料
いくつかの実施形態において、化学物質のアンカー領域（Ａ）は、例えば、共有結合性相互作用、イオン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、水素結合相互作用、生理化学相互作用、ファン・デル・ワールス力、ルイス酸／ルイス塩基相互作用、またはその組み合わせを介して、支持材料に化学物質を結合する。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、支持マトリックスは、デキストラン、アガロース、シリカ、合成ポリマー、または抗体、リガンド、もしくはエピトープタグに共有結合的に連結しているデキストラン、アガロース、シリカ、もしくは合成ポリマーを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、アンカー領域は、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、紫外線活性化可能反応基、ペプチドグリカン、もしくはキトサン誘導体、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態において、アンカー領域は、紫外線照射の短期間後の支持材料に結合する。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、化学物質は、創傷流体によって湿潤されることができ、毛細管作用を示す濾紙または織布もしくは不織布材料などの支持材料上またはその中に印刷される。いくつかの実施形態において、報告する物質または化学物質は、創傷流体によって湿潤されることができ、全ての寸法において類似する毛細管作用を示す濾紙または織布もしくは不織布材料などの支持材料上またはその中に化学的に結合される。いくつかの実施形態において、化学物質は、創傷流体によって湿潤されることができ、毛細管作用を示す濾紙または織布もしくは不織布材料などの支持材料上またはその中にイオン的に結合される。いくつかの実施形態において、化学物質は、創傷流体によって湿潤されることができ、毛細管作用を示す濾紙または織布もしくは不織布材料などの支持材料上またはその中に共有結合的に結合される。支持材料としては、繊維として有用な、セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリアクリレート、および他の同様のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、支持材料は、セルロースである。いくつかの実施形態において、支持材料は、ポリアミドである。いくつかの実施形態において、支持材料は、ポリエステルである。いくつかの実施形態において、支持材料は、ポリアクリレートである。
【０１９９】
さらなる部分
場合によっては、創傷のｐＨは、血管新生、プロテアーゼ活性、酸素放出、および細菌毒性などの創傷治癒の多くの因子に影響を及ぼすことができる。慢性非治癒性創傷は、高いアルカリ性環状を有し得る。創傷が治癒に向かって進むため、創傷のｐＨは、中性になり、次いで、酸性をなす。創傷のｐＨのモニタリングは、創傷の状態（例えば、感染または感染なし）を評価し、治療への創傷の応答を決定するのに役立つための方法を提供し得る。
【０２００】
したがって、いくつかの実施形態において、創傷における感染の検出のための化学物質は、可視色変化を示すｐＨ感受性部分を含むインジケータ領域を含む。一実施形態において、ｐＨ感受性部分は、アルカリ性ｐＨ、例えば、ｐＨ＝７．２〜９．５、ｐＨ＝７．２〜９．０、ｐＨ＝７．２〜８．５、ｐＨ＝７．２〜８．０、ｐＨ＝７．５〜８．５、ｐＨ＝７．５〜９．０、ｐＨ＝８．０〜９．０で可視色変化を示す。他の実施形態において、ｐＨ感受性部分は、ｐＨ＝７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、または９．５、またはその０．１増分で可視色変化を示す。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、ｐＨ感受性部分は、中性ｐＨ範囲、例えば、ｐＨ＝６．９、７．０、または７．１、またはその０．０５増分で可視色変化を示す。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、ｐＨ感受性部分は、酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ＝４．５〜６．８、ｐＨ＝４．５〜６．５、ｐＨ＝５．０〜６．８、ｐＨ＝５．４〜６．８、ｐＨ＝５．４〜６．５で可視色変化を示す。他の実施形態において、ｐＨ感受性部分は、ｐＨ＝４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９、またはその０．１増分で可視色変化を示す。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、ｐＨ感受性部分は、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッド、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、ニトラジンいエロー、およびスルホフタレイン染料、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【０２０４】
組成物：
本明細書に記載される実施形態は、さらに、式Ｉの化合物を含有する組成物に関する。かかる組成物は、従来の方法を用いて調製され得る。
【０２０５】
一旦製剤化されると、式Ｉの化合物の得られたストック組成物は、従来の方法を用いて、例えば、担体、ゲル化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、乳化剤などを用いて、所望の形態、例えば、ゲル、香油、ローション、クリーム、ペースト、軟膏などにさらに修飾され得る。例えば、ＷＯ２０１３／００４９５３を参照されたい。
【０２０６】
組成物に使用される担体は、水、グリセリン、ジグリセリン、グリセリン誘導体、グリコール、グリコール誘導体、糖、エトキシ化および／またはプロポキシ化されたエステルおよびエーテル、尿素、ＰＣＡナトリウム、アルコール、エタノール、イソプロピルアルコール、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態において、担体は、プロピレングリコールである。典型的には、組成物は、組成物の約１重量％から組成物の約９９．９重量％、より典型的には、組成物の約２重量％から組成物の約９５重量％、より典型的には、組成物の約５重量％から組成物の約９０重量％の量で担体を含有する。
【０２０７】
熱可逆性ゲル化剤は、例えば５０℃などの昇温で親水性担体中で溶解性、部分的な溶解性または混和性を有し、かつ、基質への適用が必要な場合、２５℃まで冷却したときに当該担体の粘性を濃くする能力があるが、５０℃ではあまり粘性がない成分と定義される。好適な親水性担体には、水、グリコール、例えば、プロピレングリコールが含まれる。組成物に使用される熱可逆性ゲル化剤は、ステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸カリウムなどの脂肪酸の塩が含まれ得る。これらの塩は、組成物に添加され得るか、または脂肪酸を添加し、適切な塩基で中和することにより原位置で作製され得る。組成物の原位置で形成する例は、ステアリン酸および水酸化ナトリウムを提供し、ステアリン酸ナトリウムを形成することである。他の共通の熱可逆性ゲル化剤には、例えば、ポリエチレングリコールおよびその誘導体（例えば、ＰＥＧ−２０、ＰＥＧ−１５０ジステアレート、ＰＥＧ−１５０ペンタエリスリチルテトラステアレート、ジステアレス−７５ＩＰＤＩ、ジステアレス−１００ＩＰＤＩ）、脂肪アルコール（例えば、セチルアルコール）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ヒドロキシステアリン酸およびその誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
【０２０８】
担体および熱可逆性ゲル化剤に加えて、組成物は、様々な他の成分および構成成分を含有し得る。組成物中に含まれ得る他の成分の例は、皮膚軟化剤、ステロールまたはステロール誘導体、天然または合成の脂肪または油、増粘剤、レオロジー調整剤、ポリオール、界面活性剤、アルコール、エステル、シリコン、クレイ、デンプン、セルロース、微粒子、保湿剤、被膜形成剤、滑り調整剤、表面調整剤、皮膚保護剤、湿潤剤、日焼け止め剤などである。
【０２０９】
薬学的組成物および／または調製物：
本明細書に記載される実施形態は、さらに、式Ｉの前述の化合物のうちの１つ以上および担体を含む薬学的組成物および／または調製物に関する。「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー性反応、または他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび／または他の哺乳動物の組織との接触に使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に見合った、これらの化合物、塩、組成物、剤形などを指すために本明細書に用いられる。いくつかの態様では、「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または哺乳動物（例えば、動物）、より具体的にはヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に挙げられていることを意味する。
【０２１０】
薬学的組成物は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって調製され得る。かかる組成物の例は、（ａ）局所塗布、例えば、物品（例えば、ガーゼ、パッド、綿棒、包帯）、クリーム、軟膏、ゲル、ローションなど、（ｂ）非経口投与、例えば、滅菌溶液または懸濁液としての皮下、筋肉内、または静脈内注射、（ｃ）経口投与、外部塗布（例えば、水性および非水性溶液または懸濁液を含む飲薬）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、飼料に混合するためのペレット、舌に塗布するためのペースト，適用のための適用のためのペーストなどに適応したものを含む。
【０２１１】
ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の抗生物質薬剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「抗生物質」または「抗菌剤」という用語は、微生物の成長を阻害するか、または破壊する基質を指す。好ましくは、抗生物質は、感染性因子の毒性を抑制するおよび／または感染性疾患を治療するのに有用である。抗生物質はまた、微生物、例えば、酵母または真菌によって生成される天然形態が構造的に変化している、半合成基質を指す。
【０２１２】
好ましくは、抗生物質は、β−ラクタム（β−ラクタマーゼ阻害剤およびセファロスポリンを含む）、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、および／またはグリシルシクリンおよび／またはポリミキシンからなる群から選択される。抗菌剤の任意の組み合わせはまた、例えば、少なくとも１つのβ−ラクタムおよび少なくとも１つのフルオロキノロン、少なくとも１つのアミノグリコシドおよび１つのセファロスポリン、少なくとも１つのβ−ラクタムおよび１つのβ−ラクタマーゼ阻害剤、、任意に、アミノグリコシドなどと一緒に用いられ得る。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「β−ラクタム」阻害剤には、天然および半合成ペニシリンおよびペニシリン誘導体、例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン、およびオキサシリン；メチシリン、ジクロキサシリン、およびフルクロキサシリン；テモシリン；アモキシシリンおよびアンピシリン；アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、およびピペラシリン；ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、およびＰＺ−６０１；セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフォタキシム、およびセフポドキシム；セフェピムおよびセフピロム；セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピム、およびセフピロム；セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾール、およびフロモキセフ；チゲモナム、ノカルジシンＡ、およびタブトキシン；クラブラン酸、モキサラクタム、およびフロモキセフが含まれる。フルオロキノロンには、シプロフロキサシン、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、およびモキシフロキサシンが含まれる。アミノグリコシドには、例えば、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジビベカシン、ゲンタマイシン、シスマイミン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、およびストレプトマイシンが含まれ、合成誘導体クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンを含む。テトラサイクリンには、天然に存在する化合物（例えば、テトラサイクリン、クロロテトラシクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン）、または半合成剤（例えば、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン）が含まれる。グリシルグリシン（例えば、ミノサイクリン／チゲサイクリン）は、テトラサイクリンに由来する。ポリミキシンは、例えば、ポリミキシンＢおよびポリミキシンＥ（コリスチン）を含む。
【０２１４】
ある特定の実施形態において、組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬ、４３ｍｇ／ｍＬ  ４４ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上の濃度で抗生物質を含有し得る。例えば、イミペネムおよびエルタペネムは、５０、３０、２０、１５、１０、５、および１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用され得る。
【０２１５】
創傷包帯：
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される創傷包帯材料、例えば、式Ｉの化合物を含む創傷包帯が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、創傷包帯は、本明細書に記載される創傷包帯材料、例えば、式Ｉの化合物から本質的になる。
【０２１６】
一実施形態において、本明細書に開示される創傷包帯は、生体適合性、生分解性、非免疫原性、および容易に市販されている。
【０２１７】
一実施形態において、式Ｉの化合物は、繊維状粒子または粉末粒子などの粒子の形態で提供され、任意に、薬剤を含有する。特に、材料は、好ましくは、ＣＭＣ繊維を含有する。
【０２１８】
組成物は、好ましくは、包帯材料および他の化合物の密接な混合物を含み得る。例えば、一実施形態において、密接な混合物は、包帯材料の混合した溶液または分散液、および溶媒などの好適なビヒクル、またはこのような溶液または分散液から溶媒を除去することによって生成される固体組成物を含む。この実施形態下で、包帯材料は、材料の少なくとも５重量％、より好ましくは、少なくとも１０重量％、２０重量％、３０重量％、５０重量％、７５重量％、９０重量％、またはそれ以上の重量％を作製する。ある特定の好ましい実施形態において、材料は、包帯材料から本質的になる。
【０２１９】
材料の他の構成成分は、０〜２５重量％の、例えば、約１〜約２０重量％の、例えば、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カルシウムなどのアルギナート、デンプングリコール酸ナトリウムなどのデンプン誘導体、メチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、またはヒアルロン酸もしくはその塩、コンドロイチン硫酸、もしくはヘパラン硫酸などのグルコサミノグリカンなどの、１つ以上の他の生体適合性多糖を含んでもよい。材料はまた、約２５重量％までの、例えば、約１〜約２０重量％の、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン、およびこれらの混合物、からなる群から選択される、１つ以上の構造的タンパク質を含んでもよい。好ましくは、タンパク質は、コラーゲンを含み、より好ましくは、コラーゲンから本質的になる。材料はまた、約２０重量％までの、好ましくは、約２〜約１０重量％の水も含んでもよい。材料はまた、０〜４０重量％の、例えば、約５〜約２５重量％の可塑剤、好ましくは、グリセロールまたはソルビトールなどの多価アルコールも含有してもよい。
【０２２０】
ある特定の実施形態において、材料はまた、約１０重量％までの、例えば、約０．０１〜約５重量％の、典型的には、約０．１〜約２重量％の、非ステロイド系の抗炎症薬（例えば、アセトアミノフェン）、ステロイド、局所麻酔薬、抗菌剤、または、増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子、または血小板由来増殖因子）などの、１つ以上の治療用の創傷治癒剤、も含有してもよい。抗菌剤は、例えば、防腐薬、抗生物質、またはこれらの混合物を含んでもよい。好ましい抗生物質は、テトラサイクリン、ペニシリン、テラマイシン、エリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリマイシンＢ、ムピロシン、クリンダマイシン、およびこれらの混合物を含む。好ましい防腐薬は、コロイド状銀（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｓｉｌｖｅｒ）を含む銀、当該材料を構成している１つ以上のアニオン性ポリマーの塩を含む銀塩、スルファジアジン銀、クロルヘキシジン、ポビドンヨード、トリクロサン、スクラルファート、第４級アンモニウム塩、およびこれらの混合物を含む。開示される技術に従ってこれらの薬用創傷包帯材料は、創傷包帯材料が使用中に分解するように、治療剤の持続放出を提供する。
【０２２１】
上記のパーセントの全ては、乾燥状態の重量に基づいている。好ましくは、創傷包帯材料と他の補助剤および材料との重量比率は、約１：９９〜約９９：１である。より好ましくは、重量比は、約１：９〜約９：１の範囲内、より好ましくは、約４：１〜約１：４の範囲内、さらにより好ましくは、約２：１〜約１：２の範囲内である。
【０２２２】
材料は、粉末、微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）、フレーク、マットまたはフィルムなどの任意の好都合な形態であり得る。
【０２２３】
ある特定の実施形態において、材料は、局所塗布のための半固体またはゲルの軟膏の形態である。
【０２２４】
ある特定の実施形態において、材料は、慢性創傷に対する塗布のための、凍結乾燥した、または溶媒乾燥した、生体吸収性のスポンジの形態である。好ましくは、スポンジの平均の気孔寸法は、１０〜５００μｍ、より好ましくは、約１００〜３００μｍの範囲内である。好適なスポンジは、好適な治療剤と一緒に、式Ｉの化合物を含む水性分散液を凍結乾燥または溶媒乾燥させることによって作製されている。
【０２２５】
さらに他の実施形態において、材料は、柔軟なフィルムの形態であり、この形態は、連続的（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）であっても、断続的（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）であってもよい（例えば、穴あけされている）。柔軟なフィルムは、好ましくは、グリセロールなどのそのフィルムを柔軟にするための可塑剤を含む。
【０２２６】
様々な範囲の制御可能な特性を有する、両方のゲル形成ポリマー、例えば、セルロース誘導体の入手しやすさは、開示される技術の組成物の特性が、優れた程度に制御され得ることを意味する。特に、材料の生物学的吸収、多孔性、および密度の速度は、制御され得る。．
【０２２７】
一実施形態において、式Ｉの化合物を含む組成物の活性層を備える、シート形態の創傷包帯材料が、本明細書に提供される。活性層は、通常、使用中の創傷接触層であり得るが、いくつかの実施形態において、液体透過性の表面シートによって創傷から分離され得る。一実施形態において、活性層の領域は、約１ｃｍ２〜約４００ｃｍ２、特に、約４ｃｍ２〜約１００ｃｍ２である。
【０２２８】
別の実施形態において、創傷包帯材料は、活性層の創傷面と反対側の活性層に広がる裏打ちシートをさらに含む。好ましくは、裏打ちシートは、活性層よりも大きく、そのため、幅１ｍｍ〜５０ｍｍ、好ましくは、５ｍｍ〜２０ｍｍの辺縁領域が活性層周辺に広がって、いわゆるアイランドドレッシング（ｉｓｌａｎｄ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を形成する。そのような場合には、裏打ちシートは、好ましくは、少なくともその辺縁領域内の感圧医療グレード接着剤でコーティングされる。
【０２２９】
包帯材料が裏打ちシートを含む実施形態において、裏打ちシートは、実質的に液体不透過性である。別の実施形態において、裏打ちシートは、半透過性であり、例えば、裏打ちシートは、好ましくは、水蒸気に対して透過性であるが、液体水または創傷滲出液に対して透過性ではない。好ましくは、裏打ちシートはまた、微生物に対して不透過性である。好適な連続的な追従性の裏打ちシートは、好ましくは、裏打ちシート単独の水蒸気透過率（ＭＶＴＲ）が３７．５℃、１００％〜１０％の相対湿度差において３００〜５０００ｇ／ｍ２／２４時間、好ましくは、５００〜２０００ｇ／ｍ２／２４時間で有するであろう。裏打ちシートの厚みは、好ましくは、１０〜１０００マイクロメートル、より好ましくは、１００〜５００マイクロメートルの範囲内にある。
【０２３０】
裏打ちシートを形成するために好適なポリマーは、ポリウレタンおよびポリアルコキシアルキルアクリレートおよびメタクリレートが挙げられる。好ましくは、裏打ちシートは、主に閉細胞である高密度封止ポリウレタンフォームの連続層を含む。好適な裏打ちシート材料は、ポリウレタンフィルムである。
【０２３１】
接着剤を含むバッキング層を含む創傷包帯において、接着層は、水蒸気透過性である、およびまたは水蒸気の通過を許容するようにパターンを施されている必要がある。接着層は、好ましくは、島型の創傷包帯に従来使用されているタイプの連続的な水蒸気透過性、感圧性の接着層、例えば、アクリレートエステルコポリマー、ポリビニルエチルエーテル、およびポリウレタンに基づいた感圧性接着剤である。ポリウレタン系感圧性接着剤は、選択的に使用され得る。
【０２３２】
別の実施形態において、包帯は、多層の吸収性物品のさらなる層を含み得、活性層と保護シートとの間に構築され得る。例えば、これらの層は、使用中の活性層を支持するために開口したプラスチックフィルムを含み得、この場合、フィルムの開口が、ヒドロゲル層の開口を有するレジスタに好ましく整列させる。
【０２３３】
なおさらに、他の実施形態において、包帯は、特に、包帯が滲出創傷で使用する者である場合、活性層と保護シートとの間に吸収性層を含み得る。任意の吸収層は、創傷治癒技術分野における創傷流体、血清、または血液を吸収するために従来使用される層のうちのいずれかであり得、これには、ガーゼ、不織布、超吸収剤、ヒドロゲル、およびこれらの混合物が含まれる。好ましくは、吸収層は、連続気泡型親水性ポリウレタンフォームなどの吸収フォームの層を含む。他の実施形態において、吸収層は、不織繊維ウェブ、例えば、ビスコース短繊維を梳いたウェブであってもよい。
【０２３４】
ある特定の実施形態において、創傷包帯は、取り外し可能なカバーシートによって保護され得る。カバーシートは、通常、柔軟な熱可塑性材料から形成される。好適な材料は、ポリエステルおよびポリオレフィンを含む。好ましくは、カバーシートの接着対向面は、解放表面である。つまり、カバーシートからヒドロゲル層の剥離を支援するために、活性層および裏打ちシート上の粘着剤に対してのみ弱く付着する表面。例えば、カバーシートは、フルオロポリマーなどの非接着性プラスチックから形成され得るか、またはシリコンまたはフルオロポリマー剥離剤塗布などの剥離剤塗布とともに提供され得る。
【０２３５】
一実施形態において、創傷包帯は、滅菌されており、微生物不透過性容器内に包装される。
【０２３６】
キット：
ある特定の実施形態において、開示される技術は、１つまたは別々のコンパートメントにおいて、式Ｉの化合物を、任意に、賦形剤、担体、または油と一緒に含む、キットを提供する。キットは、１つ以上のコンパートメントにおいて、さらなる成分、例えば、ゲル化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、乳化剤などをさらに含み得る。キットは、任意に、創傷、例えば、慢性または感染した創傷を診断、検出、または治療するための物品を製剤化するための取扱説明書を含み得る。キットはまた、創傷の治療の際に、個々にまたは一緒に、構成成分を使用するための取扱説明書も含み得る。
【０２３７】
関連実施形態において、開示される技術は、前述の組成物を含むパッケージおよび少なくとも１つの吸収性物品（上述の）を含むキットを提供する。代替として、キットは、個々の成分を、別々に、任意にパッケージ中でまたはパッケージとともに使用可能な二次情報を一緒に含み得る。
【０２３８】
本明細書に開示される他の実施形態は、創傷の治療のための包帯の調製のための組成物の使用に関する。好ましくは、創傷は、慢性創傷、例えば、静脈性潰瘍、褥瘡性潰瘍、および糖尿病性潰瘍からなる群から選択される創傷である。
【０２３９】
表面：
開示される技術の実施形態は、式Ｉの前述の化合物を含む表面をさらに提供し、レポーターまたはペプチドは、パートナー、例えば、酵素への結合を可能にするように配向される。好ましくは、表面は、固体支持体の表面である。多くのおよび異なる固体支持体は、当業者には既知である。有用な固体支持体には、天然ポリマー炭水化物およびそれらの合成的に修飾された架橋、または置換誘導体、例えば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル、特に硝酸およびカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、およびセルロースエステル；窒素を含有する天然ポリマー、例えば、架橋または修飾ゼラチンを含む、タンパク質および誘導体；ラテックスおよびゴムなどの天然炭化水素ポリマー；好適に多孔質構造で調製され得る合成ポリマー、例えば、ビニルポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分に加水分解された誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記の重縮合物のコポリマーおよびターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミド、ならびに他のポリマー、例えば、ポリウレタンまたはポリエポキシド；アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩などの多孔質無機材料、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩；ならびにアルミニウムまたはケイ素の酸化物または水和物、例えば、クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラス（これらの材料は、上記のポリマー材料とともにフィルターとして使用し得る）；ならびに上記種類の混合物またはコポリマー、例えば、既存の天然ポリマー上において合成ポリマーの重合を開始することによって得られるグラフトコポリマーが挙げられる。
【０２４０】
一実施形態において、支持体は、アレイプレート、例えば、マイクロアレイのウェルである。かかるアレイを構築するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７（２３）：８２１９−８２２５，２０１１。式Ｉの各化合物（またはペプチドインジケータ単独）は、アレイにおける物理的欠陥による不規則なデータを排除するために、三重にスポットされ得る。
【０２４１】
システム：
開示される技術の実施形態は、前述の組成物および／またはキットを含む診断システムをさらに提供する。
【０２４２】
診断システムの様々な構成成分は、様々な形態で提供され得る。例えば、式Ｉの化合物（例えば、ペプチドレポーターを含有する化合物）は、凍結乾燥試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥試薬は、再構成されるとき、アッセイでの使用の準備ができている構成成分のそれぞれの適切な比と完全な混合物を形成するように、凍結乾燥前に予め混合され得る。加えて、開示される技術の診断システムは、キットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。
【０２４３】
核酸
一実施形態において、ペプチドをコードする核酸：
ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）が、本明細書に含まれる。
【０２４４】
別の実施形態において、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのポリペプチド配列をコードする核酸、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片が、本明細書に含まれる。
【０２４５】
特定の実施形態において、表４に記載されるポリペプチド配列をコードする核酸（ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓのための）、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片が、本明細書に含まれる。
【０２４６】
本明細書で使用される、「核酸」または「核酸配列」という語句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそのいずれかの断片、一本鎖もしくは二本鎖であり得、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を示し得るゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様材料を指す。この文脈において、「断片」とは、約１０ヌクレオチド長超、最も好ましくは、少なくとも約４０ヌクレオチド長、少なくとも約１００ヌクレオチド長、または少なくとも約３００ヌクレオチド長である、これらの核酸配列を指す。
【０２４７】
本明細書に開示される実施形態は、さらに、前述のポリヌクレオチドのバリアントに関する。
【０２４８】
一実施形態において、例えば、以下のペプチドをコードする核酸：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の％の同一性があるヌクレオチド配列を含む、または代替としてそれからなる、前述の核酸のバリアントが、本明細書に含まれる。
【０２４９】
一実施形態において、例えば、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ，ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓにおいて配列をコードするヌクレオチド、またはそれに対して相補鎖、またはそのＲＮＡ等価物、またはその相補的ＲＮＡ等価物に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の％の同一性があるヌクレオチド配列を含む、または代替としてそれからなる、前述の核酸のバリアントが、本明細書に含まれる。
【０２５０】
関連実施形態において、例えば、表４に記載されるポリペプチド配列をコードする核酸（ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓのための）、またはそれに対して相補鎖、またはそのＲＮＡ等価物、またはその相補的ＲＮＡ等価物に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の％の同一性があるヌクレオチド配列を含む、または代替としてそれからなる、前述の核酸のヌクレオチド配列バリアントが、本明細書に含まれる。当業者は、コードする核酸配列に到達するために、日常のソフトウェア、例えば、Ｔｈｒｅｅ−ｔｏ−Ｏｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ（それぞれの入力したポリペプチド配列のために３つの潜在的な核酸配列を生成する）を使用することができる。Ｔｈｒｅｅ−ｔｏ−Ｏｎｅソフトウェアは、バイオインフォマティクス（ｄｏｔ）ｏｒｇから自由に利用可能である。
【０２５１】
「パーセント同一性」または「同一性％」という語句は、２つ以上のアミノ酸または核酸配列の比較において見出される配列相同性の割合を指す。パーセント同一性は、例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用することによって電子的に決定され得る。ＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムは、異なる方法、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄに従って２つ以上の配列の間にアライメントを作成することができる（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４）。Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム群は、全ての対の間の距離を検査することによってクラスターに配列する。クラスターは、ペアとして整列され、次にグループに整列される。２つのアミノ酸配列、例えば、配列Ａおよび配列Ｂ間の類似性パーセントは、配列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基の数を引き、配列Ｂのギャップ残基の数を引いた数を配列Ａと配列Ｂ間の残基マッチ数の合計で割り、その値に１００を掛けることにより計算される。２つのアミノ酸配列間の相同性が低いまたはないときのギャップは、類似性パーセントを決定するのに含まれない。核酸配列間の類似性パーセントはまた、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄによって、またはＪｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄなどの当該技術分野で既知の他の方法によっても計算することができる。（例えば、Ｈｅｉｎ，Ｊ．（１９９０）  Ｍｅｈｔｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６−６４５を参照されたい。）配列間の同一性はまた、当該技術分野で既知の他の方法によって、例えば、ハイブリダイゼーション条件を変えることによっても決定することができる。
【０２５２】
別の実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはより低いストリンジェンシー条件下で、１つ以上の核酸分子にハイブリダイズするバリアントポリヌクレオチドが、本明細書に含まれる。この用語が本明細書に使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」は、それにより核酸鎖は、塩基対合を介して相補鎖と結合する、任意のプロセスを指す。例えば、高ストリンジェンシー条件下では、約３７℃〜４２℃で約５０％ホルムアミドにおいてハイブリダイゼーションを起こすことができた。低減されたストリンジェンシー条件下では、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％ホルムアミドにおいてハイブリダイゼーションを起こすことができた。特に、高いストリンジェンシー条件では、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、ならびに切断及び変性したサケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ中、４２℃でハイブリダイゼーションを起こすことができた。上記のように低減されたストリンジェンシー条件においては、３５％ホルムアミド中、３５℃の低下させた温度においてハイブリダイゼーションを起こすことができた。目的となる核酸のプリン対ピリミジンの比率を計算することおよびそれに応じて温度を調節することにより、特定のストリンジェンシーレベルに対応する温度範囲をさらに狭めることができる。上記の範囲および条件の変更は、当該技術分野で公知である。
【０２５３】
本明細書で使用される、「ハイブリダイゼーション複合体」という用語は、相補塩基間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間で形成される複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成され得るか、または溶液に存在する１つの核酸配列と固体支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、もしくはガラススライド、または細胞またはそれらの核酸が固定されている任意の他の適切な基質）上に固定される別の核酸配列との間で形成され得る。
【０２５４】
別の実施形態において、前述の核酸のポリヌクレオチド断片であるバリアントが、本明細書に含まれる。
【０２５５】
オリゴヌクレオチド、例えば、１つ以上の核酸にハイブリダイズするＰＣＲプライマーもまた、本明細書に含まれる。本明細書で使用される、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＰＣＲ増幅、またはハイブリダイゼーションアッセイもしくはマイクロアレイにおいて使用され得る、少なくとも約６ヌクレオチドから６０ヌクレオチド、好ましくは、約１５〜３０ヌクレオチド、および最も好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、これらの用語が当該技術分野で一般に定義されるように、「増幅プライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、および「プローブ」という用語と実質的に同等である。
【０２５６】
ＰＮＡなどの修飾核酸もまた、本明細書に含まれる。本明細書で使用される、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、組成物に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに選択的に結合して、転写の伸長を停止するものであり、ペグ化して細胞におけるそれらの寿命を延長し得る。（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．８：５３−６３を参照されたい）
【０２５７】
ベクター
前述の核酸のうちの１つ以上を含有するベクターも、本明細書に含まれる。一実施形態において、ベクターは、核酸をコードする少なくとも１つのタンパク質、例えば、１つ以上のさらなる配列を有する操作可能な連結において、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのポリペプチド配列をコードする核酸、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片を含む。さらなる配列は、本質的に合成であり得る。本明細書で使用される、「動作可能に関連付けられる」または「動作可能に連結された」という用語は、機能的に関連した核酸配列を指す。プロモーターがコードされたポリペプチドの転写を制御する場合、プロモーターは、コード配列と動作可能に関連付けられるか、または動作可能に連結される。動作可能に関連付けられるか、または動作可能に連結された核酸配列が、連続してまたはリーディングフレーム中であり得るが、ある特定の遺伝学的要素、例えば、リプレッサー遺伝子は、コードされたポリペプチドに隣接して連結されないが、依然としてポリペプチドの発現を制御するオペレーター配列に結合する。
【０２５８】
コドン最適化配列
前述の核酸配列およびベクターのコドン最適化配列が、本明細書に含まれる。宿主細胞、例えば、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫Ｈｉ５細胞中の発現のためのコドン最適化は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａから自由に利用可能である、Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ（ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて日常的に行われ得る。
【０２５９】
宿主細胞
前述の核酸配列およびベクターを含有する宿主細胞が、本明細書に含まれる。一実施形態において、宿主細胞は、ポリペプチド生成物を生成するための標準的な培養条件下でベクターに含まれる遺伝子配列、例えば、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのポリペプチド配列、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片を組換え技術によって発現することができる。特定の一実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０２６０】
ポリペプチド
一実施形態において、アミノ酸配列：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）を含むポリペプチドが、本明細書に含まれる。
【０２６１】
別の実施形態において、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのポリペプチド配列、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片が、本明細書に含まれる。
【０２６２】
特定の実施形態において、表４に記載されるポリペプチド配列（ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓのための）、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片が、本明細書に含まれる。
【０２６３】
別の実施形態において、例えば、ポリペプチド配列：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の％の同一性があるアミノ酸配列を含む、または代替としてそれからなる、前述のポリペプチドのバリアントが、本明細書に含まれる。
【０２６４】
別の実施形態において、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのポリペプチド配列、またはその酵素で切断可能な断片に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の％の同一性があるアミノ酸配列を含む、または代替としてそれからなる、バリアントポリペプチドが、本明細書に含まれる。特に、断片は、本明細書に記載されるヒドロラーゼ酵素、例えば、リゾチーム、エラスターゼ、カテプシンＧ、ＭＡＯ、またはその組み合わせのための酵素認識部位（Ｓ）または酵素反応部位（Ｒ）のための最小構造モチーフを含む。あるいはまたはさらに、断片ペプチドは、抗体またはその抗原結合ドメインによって認識され得る免疫原性分子である。
【０２６５】
ホモログ
別の実施形態において、前述のペプチドおよびポリヌクレオチドへのホモログが、本明細書に含まれる。本明細書で使用される、「相同性」という用語は、相補性の度合いを指す。部分相同性または完全相同性が存在し得る。「同一性」という語は、「相同性」という語に置き換えられ得る。標的核酸にハイブリダイズすることから同一の配列を少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同である」と称される。標的配列への完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低減されたストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノースブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて検査され得る。実質的に相同的な配列またはハイブリダイゼーションプローブは、低減されたストリンジェンシーの条件下で標的配列への完全に相補的な配列の結合を競合し、阻害するであろう。これは、低減されたストリンジェンシー条件が非特異的結合を許すと言っているわけではなく、低減されたストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、少しでも部分的な相補性の度合い（例えば、約３０％未満の相同性または同一性）を欠く第２の標的配列の使用によって試験することができる。非特異的結合の非存在下で、実質的に相同的な配列またはプローブは、第２の非相補的標的配列にハイブリダイズしないであろう。
【０２６６】
変異体
【０２６７】
別の実施形態において、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのコアポリペプチド配列、またはその酵素で切断可能な断片において変異体を含むバリアントペプチドが、本明細書に含まれる。
【０２６８】
一実施形態において、変異体は、１−３アミノ酸の置換、欠失、添加である。好ましくは、変異は、そのように形成される、変異体ペプチドにおいて酵素認識部位を変化しない。変異が、認識部位または切断部位の組成物の変化をもたらす場合、変異が保存されたアミノ酸置換によるものであることが企図される。
【０２６９】
本明細書で使用される、「挿入」または「添加」という語は、それぞれ、天然に存在する分子に見出される配列に対して、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの添加をもたらす、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を指す。本明細書で使用される、「置換」は、異なるアミノ酸またはヌクレオチドによって、それぞれ、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を指す。
【０２７０】
抗体
本明細書に開示される実施形態は、前述の免疫原性ペプチドのうちの１つ以上に特異的に結合する抗体をさらに含む。
【０２７１】
一実施形態において、抗体は、アミノ酸配列：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）を含むポリペプチドに結合する。別の実施形態において、抗体は、これらのポリペプチドの断片に結合する。かかる抗体の抗原結合断片、例えば、（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）合成によって発生した抗体を含む、Ｆ（ａｂ）ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメインが、本明細書に企図される。
【０２７２】
一実施形態において、抗体は、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭ、ＥｌａＳｕｂ２＿ＰＤＭ  Ｈｉｓ、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＰＤＭのためのポリペプチド配列、またはその酵素で切断可能な断片および／もしくはその免疫原性断片に結合する。かかる抗体の抗原結合断片、例えば、（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）合成によって発生した抗体を含む、Ｆ（ａｂ）ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメインが、本明細書に企図される。
【０２７３】
精製された分子
精製された生体分子、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、および／または抗体分子（その複合体を含む）が、本明細書に含まれる。本明細書で使用される、「実質的に精製された」という用語は、それらの自然の環境から取り除かれて、単離または分離され、自然に会合されている他の構成成分から少なくとも約６０％除去、好ましくは、約７５％除去、最も好ましくは、約９０％除去されている、核酸、アミノ酸、または抗体を指す。
【０２７４】
本明細書に記載される実施形態において、生体分子は、化学物質、例えば、アンカー領域および／またはインジケータ領域の様々な構成成分と組み合わせることによって変化され得、そのため、それらの形態および／または機能性が任意の天然対応物と比較して著しく変化する。
【０２７５】
式Ｉの化合物を作製する方法：
本明細書に提供される実施形態は、さらに、式Ｉの化合物（その前駆体を含む）を作製する方法に関する。「前駆体」という用語は、中間または最終生成物を生成するための反応物質として用いられる任意の化合物を含む。
【０２７６】
一実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式中、Ａが上述のアンカーであり、Ｉが上述のインジケータである）を含む式Ｉの化合物を作製する方法が、本明細書に提供され、本方法は、例えば、共有結合を介して、アンカーをインジケータ分子で複合体化することを含む。一実施形態において、アンカーまたはインジケータは、創傷特異的マーカー、例えば、前述のように、ヒドロラーゼ、およびより具体的には、プロテアーゼまたはグリコシダーゼなどの創傷特異的酵素のための認識部位（Ｓ）または反応／不安定部位（Ｒ）を含み得る。この実施形態下で、創傷特異的マーカーのための基質は、例えば、加水分解基質、例えば、アミノ酸、糖、ペプチド、多糖、核酸、脂質、またはその組み合わせを含む。
【０２７７】
一実施形態において、アンカーは、ペプチド結合、グリコシド結合、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、無水物結合、または同様の結合を介して、レポーター分子に複合体化される。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」は、２つのアミノ酸間の縮合反応によって形成され、一方の酸部分が他方のアミノ部分と反応して、２つのアミノ酸間のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を生成する。一実施形態において、ペプチド結合は、創傷特異的プロテアーゼ、例えば、エラスターゼ、カテプシンＧ、もしくはＭＡＯ、またはその組み合わせで切断される。本明細書で使用される場合、「グリコシド結合」は、サッカリド（またはサッカリドに由来する分子）のヘミアセタールまたはヘミケタール基とアルコールなどのいくつかの化合物のヒドロキシル基との間に形成される。一実施形態において、ペプチド結合は、創傷特異的グリコシダーゼ、例えば、リゾチームで切断される。
【０２７８】
グリコシド、ペプチド、エステル、オキシエステル、アミド、オキシアミド、エーテル、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、またはアルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノなどの他の結合を生成するための反応部分を複合体化するための方法は、当該技術分野で既知であり、実施例においてさらに記載されている。
【０２７９】
別の実施形態において、構造Ａ−Ｉ（式中、ＡおよびＩは、それぞれ、前述される通りである）を含む式Ｉの化合物を作製する方法が、本明細書に提供される。
【０２８０】
一実施形態において、Ａは、グリコシド結合を介して、Ｉに複合体化される。
【０２８１】
別の実施形態において、Ａは、親水性または疎水性結合を介して、Ｉに複合体化される。
【０２８２】
一実施形態において、構造Ａ−Ｉを有する式Ｉの化合物は、初めに、アンカー領域Ａをインジケータ領域Ｉと複合体化されて、式Ｉの化合物を生成することによって合成される。
【０２８３】
別の実施形態において、インジケータは、初めに、遺伝子組み換え技術、例えば、好適な宿主細胞中のインジケータ領域をコードする核酸を発現し、インジケータをアンカー領域と組み合わせることによって合成される。この実施形態下で、一例において、インジケータ領域は、例えば、親水性または疎水性に、アンカー領域に結合する核酸配列を含有するように設計されている。親水性相互作用の１つの代表的な例は、極性基を含有するアンカー、例えば、部分的に脱アセチル化された（例えば、３０％未満のＤＡ）キトサン、セルロース、またはカルボキシメチルセルロース（またはその誘導体）の使用を含み、セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）と相互作用する。疎水性相互作用の別の代表的な例は、非極性基を含有するアンカー、例えば、テレフタル酸ポリエチレン（またはその誘導体）の使用を含み、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（ＰＤＢ）からの疎水性結合モジュールと相互作用する。
【０２８４】
一実施形態において、ペプチドインジケータ、例えば、アミノ酸配列：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）を含むポリペプチド（バリアントポリペプチドを含む）は、宿主細胞発現系を介して合成され得る。このような方法は、例えば、前述のポリペプチドまたはバリアントのうちの１つ以上をコードする構築物を生成することと、当該構築物を好適なベクター、例えば、プラスミドベクターまたはバキュロウイルスベクターに配置することと、宿主細胞、例えば、Ｅ  ｃｏｌｉまたは昆虫Ｈｉ５細胞を、ベクターでトランスフェクトすることと、好適な条件下で宿主細胞を培養して、当該ベクターの発現を可能にすることと、任意に、培養物から発現したポリペプチドを精製することと、を含み得る。
【０２８５】
別の実施形態において、ペプチドインジケータ、例えば、アミノ酸配列：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（式中、Ｘ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｌ、およびＺは、それぞれ、上述の通りである）を含むポリペプチド（バリアントポリペプチドを含む）は、固相ペプチド合成を用いて合成され得る（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１４）：２１４９−２１５４を参照されたい）。
【０２８６】
なおさらに、構造Ａ−Ｉを有する式Ｉの化合物は、単一の反応チャンバまたは複数の反応チャンバ中で合成され得る。
【０２８７】
診断および治療方法：
一実施形態において、本明細書に記載される組成物、包帯材料、物品、キット、およびシステムは、創傷、特に、慢性または感染した創傷を診断または治療するのに有用である。任意の種類の創傷が、診断および／または治療され得るが、実施形態は、創傷流体が滲み出る創傷を診断および治療するのに特に適している。例えば、創傷は、慢性または急性創傷であり得る。慢性創傷の代表的な例としては、例えば、静脈性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および未知の病因の慢性潰瘍が挙げられる。急性創傷の代表的な例には、例えば、急性外傷性裂傷が含まれ、これは、恐らく、意図的な手術切開から生じる。
【０２８８】
本明細書で使用される場合、「創傷流体」という用語は、創傷の表面で存在するか、または吸引、吸収、または洗浄による創傷表面から取り除かれる任意の創傷滲出液または他の流体（好適には、血液を実質的には含まない）を指す。決定、測定、または定量化は、患者の身体から取り除かれている創傷流体で好適に行われるが、原位置で創傷流体でも行われ得る。「創傷流体」という用語は、通常、創傷部位から離れている血液または組織血漿を指さない。創傷流体は、哺乳動物創傷流体、好ましくはヒト創傷流体である。
【０２８９】
一実施形態において、診断方法は、創傷を、本明細書に記載される、式Ｉまたは式ＩＩの化合物、かかる化合物を含む包帯材料を含む少なくとも１つの組成物、かかる材料または化合物を含む物品、かかる材料または化合物を含むキット、またはかかる材料または化合物を含むシステムと接触させることと、創傷で会合したパラメータを測定することと、を含む。特定の実施形態において、測定されるパラメータは、創傷特異的ヒドロラーゼのレベルまたは活性である。特に、測定されるパラメータは、ヒドロラーゼの活性である。
【０２９０】
前述の実施形態において、測定は、原位置または実験施設内で行われ得る。本明細書で使用される場合、「原位置」という用語は、システムまたはデバイスの文脈内に存在するかまたは行われる、プロセス、事象、目的、または構成成分を指し、これは、周囲環境、例えば、組成物、物品、システム、またはデバイスが接触する生物学的材料を含む。例として、原位置反応は、デバイス中に存在する様々な構成成分の反応物（例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物）を指し得、ヒト皮膚組織によって提供される構成成分（例えば、酵素を含有する創傷滲出液）を含む。この用語は、環境の外を指す、実験施設内で対比される。
【０２９１】
第２の実施形態において、測定は、実験施設内で、例えば、開示される技術の装置またはデバイスにおいて、分析のために創傷から流体を除去することが行われる。
【０２９２】
好適には、測定は、原位置で行われる。
【０２９３】
１つの診断的実施形態において、レポーター、例えば、創傷特異的酵素によって作用される基質の生成物のレベルを決定することを含む、方法。さらに具体的には、本方法は、ヒドロラーゼ酵素生成物のレベルを決定することを含む。本明細書で使用される場合、「決定すること」という用語は、当該ヒドロラーゼの活性もしくはレベルの数値を測定することと、活性もしくはレベルが既定の範囲を上回るまたは下回る場合に構築することと、および／または活性もしくはレベルの数値を対照標準値と比較することと、を含む。対照標準値は、未損傷部位または健常対象から得られた生検材料中のヒドロラーゼのレベルまたは活性を決定することとを含み得る。
【０２９４】
特定の一実施形態において、「決定すること」という用語は、少なくとも１つの創傷特異プロテアーゼのパラメータ（例えば、活性またはレベル）が、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチーム、またはその組み合わせからなる群から選択されることを測定することと、当該パラメータが、第１の既定の閾値を超える場合に構築することと、および／またはパラメータの数値を対照標準値と比較することと、を含む。対照標準値は、未損傷部位または健常対象から得られた生検材料中のプロテアーゼのパラメータを決定することとを含み得る。関連する実施形態において、「決定すること」という用語は、複数の前述のプロテアーゼと関連付けられたパラメータの加重平均（加重和）が、当該加重平均の既定の閾値を超えるかどうかを確立することを含む。
【０２９５】
１つの特定の実施形態において、パラメータは、創傷流体中の分析物（例えば、プロテアーゼ）の活性レベルである。典型的には、個々の分析物の活性は、ユニット／ｍＬの単位で発現される。
【０２９６】
別の実施形態において、パラメータは、創傷流体中の分析物（例えば、プロテアーゼ）の活性レベルである。典型的には、量という用語はまた、特定の分析物の活性を示す。
【０２９７】
本明細書で使用される場合、「組み合わせた量」または「組み合わせた活性」という用語は、複数の値への数学関数の適用を生じる単一の数値、例えば、多数の個々の分析物について得られた量を指す。例えば、「組み合わせた量」または「組み合わせた活性」という用語は、個々の値の群の合計または生成物を指し得る。典型的には、「組み合わせた量」または「組み合わせた活性」という用語は、個々の値の群の合計を指す。例えば、好適な実施形態において、エラスターゼの量は、エラスターゼ様活性（例えば、Ｕ／ｍＬ）を指し、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の量は、それぞれの分析物の総濃度（例えば、ｎｇ／ｍＬ）を指す。
【０２９８】
本明細書で使用されるとき、「定量化する」という用語は、実験誤差のマージン内の試料中の特定の分析物（複数可）または基質（複数可）の絶対数量を測定することを指す。
【０２９９】
「マーカー」または「分析物」という用語は、本明細書に定義される、装置、デバイス、キット、または方法を用いて特定または決定される、任意の化学物質を指す。開示される技術の装置、デバイス、キット、または方法によって決定または特定されるマーカーまたは分析物は、前述の酵素の切断された生成物である。
【０３００】
本明細書で使用されるとき、「既定の範囲」という用語は、当業者が理解し得るデータ範囲またはプロファイルを指し、特定のサブクラスの患者を示す。例えば、既定の範囲は、抗生物質療法などの特定の創傷治療によく反応し得る創傷に特有であるデータ範囲またはプロファイルを指す。代替として、既定の範囲は、好適には、抗生物質療法などの特定の創傷治療にあまり反応し得ない創傷に特有であるデータ範囲を指し得る。
【０３０１】
本明細書で使用されるとき、「既定の閾値」という用語は、当業者が決定し得る最小レベルを指し、例えば、上にさらに説明されるように、既知の治癒および非治癒創傷のために決定される統計的分析のレベルに基づいて、非治癒創傷を示す。臨床的に有用される試験に関して、閾値は、高プロテアーゼ活性を有する非治癒創傷が正確に特定されるように、適切なレベルで設定されるべきである。閾値の増加は、非治癒性創傷のみが閾値を超える可能性を増加させるであろう。しかしながら、閾値が高すぎる場合、非治癒の創傷は、高レベルのプロテアーゼにより、特定され得ず、臨床的には、これは、それらが必要とされるプロテアーゼを調節する治療を受けないことを意味し得る。
【０３０２】
本明細書で使用されるとき、「対照標準値」または「対照」という用語は、別のデータポイントまたはデータセットを定義または正規化するために、参照または比較として使用され得るデータセットまたはプロファイルを指す。例えば、「対照」または「対照標準値」という用語は、特定のサブクラスの患者を示す、データセットまたはプロファイルであり得る。好適には、対照標準値は、治癒または非治癒創傷状態を示す、データセットまたはプロファイルであり得る。
【０３０３】
好適には、開示される技術の他の態様または実施形態において、「対照」または「対照標準値」という用語は、当業者に、創傷が抗生物質治療などの創傷治療に対して反応するまたは反応しない可能性が高いかどうかを決定することを可能にさせる、比較ツールとして使用され得る、データセットまたはプロファイルであり得る。一実施形態において、対照標準値は、創傷治療にあまり反応しない患者を示す、データセットまたはプロファイルである。典型的には、対照標準値は、創傷治療によく反応する患者を示す、データセットまたはプロファイルである。本明細書に開示される創傷治療によく反応する傾向がある患者は、治療にほとんど反応しない傾向がある患者よりも低いヒドロラーゼの組み合わせた量または活性を示す。例えば、本明細書に開示される創傷治療によく反応する傾向がある患者は、より低く組み合わせた量の少なくとも１つの創傷特異的ヒドロラーゼを示す。
【０３０４】
一実施形態において、ヒト好中球エラスターゼ活性の閾値は、約５Ｕ／ｍＬ〜約３０Ｕ／ｍＬであって、例えば、約６Ｕ／ｍＬ、約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、約９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／ｍＬ、約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、またはそれ以上の間の全ての値を含み、慢性創傷感染を示す。
【０３０５】
特定の一実施形態において、少なくとも９．６のヒト好中球エラスターゼ活性の閾値は、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態において、少なくとも２２．９Ｕ／ｍＬのヒト好中球エラスターゼ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０３０６】
一実施形態において、約１０００Ｕ／ｍＬ〜約１００００Ｕ／ｍＬのリゾチーム活性レベルの閾値であって、例えば、約１１００Ｕ／ｍＬ、約１２００Ｕ／ｍＬ、約１３００Ｕ／ｍＬ、約１４００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１６００Ｕ／ｍＬ、約１７００Ｕ／ｍＬ、約１８００Ｕ／ｍＬ、約１９００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約２１００Ｕ／ｍＬ、約２２００Ｕ／ｍＬ、約２３００Ｕ／ｍＬ、約２４００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２６００Ｕ／ｍＬ、約２７００Ｕ／ｍＬ、約２８００Ｕ／ｍＬ、約２９００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約３２５０Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３７５０Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約４２５０Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４７５０Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ、約５２５０Ｕ／ｍＬ、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５７５０Ｕ／ｍＬ、約６０００Ｕ／ｍＬ、またはそれ以上の間の全ての値を含み、慢性創傷感染を示す。特定の一実施形態において、少なくとも４８００Ｕ／ｍＬのリゾチーム活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０３０７】
一実施形態において、約１０Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬのカテプシンＧ活性レベルの閾値は、例えば、約１５Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、約３０Ｕ／ｍＬ、約３５Ｕ／ｍＬ、約４０Ｕ／ｍＬ、約４５Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ、約５５Ｕ／ｍＬ、約６０Ｕ／ｍＬ、約６５Ｕ／ｍＬ、約７０Ｕ／ｍＬ、約７５Ｕ／ｍＬ、約８０Ｕ／ｍＬ、約８５Ｕ／ｍＬ、約９０Ｕ／ｍＬ、約９５Ｕ／ｍＬ、約１００Ｕ／ｍＬ、約１１０Ｕ／ｍＬ、約１２０Ｕ／ｍＬ、またはそれ以上の間の全ての値を含み、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態において、少なくとも５０Ｕ／ｍＬ、少なくとも４０Ｕ／ｍＬ、少なくとも３０Ｕ／ｍＬ、少なくとも２０Ｕ／ｍＬ、少なくとも１５Ｕ／ｍＬ、または少なくとも１０Ｕ／ｍＬのカテプシンＧ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０３０８】
本明細書に開示される実施形態は、さらに、本明細書に記載される、組成物、材料、物品、包帯、キット、および／またはシステムを用いて慢性または感染した創傷の治療に関する。治療実施形態は、開示される技術の組成物、材料、物品、包帯、キット、システム、またはデバイスを、それを必要とする対象と接触させることを含む。任意に、本方法は、対象が治療に応答するかどうかの決定を含み得る。
【０３０９】
当業者は、創傷が「治療に応答する」かどうかを容易に特定することができ得る。特に、当業者は、創傷治療、特に、酸化セルロースを含む創傷包帯による治療に対して良好な応答または応答不良を予測するまたは示す特許請求の範囲に特定されるプロテアーゼのレベルを容易に判定することができるであろう。本明細書で使用される、「応答性」および「レスポンダー（複数可）」という用語は、創傷治療、特に、薬理学的薬剤、例えば、抗生物質による治療によく応答すると見なされる創傷を指す。同様に、「非応答性」および「非レスポンダー（複数可）」は、創傷治療、特に、薬理学的薬剤、例えば、抗生物質による治療によく応答すると見なされない創傷を指す。創傷を指す。例えば、４週間の創傷治療後に、５０％よりも良好な創傷閉鎖を示す患者は、当該治療に対して応答すると見なされる。
【０３１０】
ある特定の実施形態において、患者は、本明細書に記載される、組成物、物品、システム、またはデバイスで同時に診断され、治療され得る。本明細書で使用されるとき、「同時に」という用語は、規定された目的、例えば、診断および治療を一緒に行うことを意味する。
【０３１１】
ある特定の実施形態において、患者は、本明細書に記載される、組成物、物品、システム、またはデバイスで連続して診断され、治療され得る。本明細書で使用されるとき、「連続して」という用語は、規定された目的、例えば、診断および治療は、例えば、治療前の診断または治療後の診断、またはその組み合わせ、例えば、第１の診断＝＝＞治療＝＝＞第２の診断を時間的または空間的に分離されることを意味する。
【０３１２】
本明細書に記載される実施形態は、介護士または患者が、創傷が治癒されない可能性が高いかどうかを迅速かつ確実に判定するために、この判定に基づいて適切な治療法を選択することをさらに可能にする。例えば、非治癒創傷は、治癒を促進するために、特定の治療剤を含む創傷包帯などの特定の創傷包帯の塗布を必要とし得る。したがって、本明細書に記載される実施形態は、創傷、例えば、慢性または感染した創傷の治療方法をさらに提供し、本方法は、創傷が治癒または非治癒であるかどうかを判定し、続いて、非治癒である場合、創傷への治療剤を含む創傷包帯を塗布することを含む。
【０３１３】
本明細書に記載される実施形態は、感染した創傷の診断または検出のための方法およびアッセイを提供する。本方法は、細菌感染剤の検出に適している。一実施形態において、創傷は、グラム陰性菌で感染している。典型的なグラム陰性菌には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、およびシアノバクテリアなどのプロテオバクテリアが含まれる。医薬品と関連して分類されるとき、それらには、呼吸器系の障害を引き起こすＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、泌尿器系の障害を引き起こすＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、ならびに消化器系の障害を引き起こすＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇａｅｒｔｎｅｒ、ならびにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ髄膜炎菌、カタラリス菌、および淋菌などのミクロコッカスが含まれる。
【０３１４】
別の実施形態において、創傷は、グラム陽性菌で感染している。「グラム陽性菌」とは、その細胞壁中のテイコ酸（例えば、リポテイコ酸および／または壁テイコ酸）、または機能的に同等の糖コポリマー（例えば、ラムノース多糖（ｒｈａｍｎｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、タイクロン酸、アラビノガラクタン、リポマンナン、およびリポアラビノマンナン）を含有する（複数可）、バクテリアまたは細菌を意味する。機能的に同等の糖コポリマーの非限定的な例は、Ｗｅｉｄｅｎｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，６：２７６−２８７，２００８に記載されている。
【０３１５】
細菌には、哺乳動物宿主（例えば、ウシ、マウス、ウマ、霊長類、ネコ、イヌ、およびヒト宿主）を感染させる、病原性細菌が含まれる。かかる病原性細菌の例には、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、またはＬｉｓｔｅｒｉａなどの細菌種のメンバーが含まれる。ヒト宿主において疾患を引き起こす病原性細菌のいくつかの臨床的に関連する例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、毒性原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ���Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１６】
別の実施形態において、感染性細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ＣＲ−Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ；ＣＲ−Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからなる群から選択される。別の実施形態において、感染性細菌は、多剤耐性Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、薬物耐性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生腸内細菌、バンコマイシン耐性腸球菌、多剤耐性ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、薬物耐性非チフス性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、薬物耐性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ、薬物耐性Ｓｈｉｇｅｌｌａ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、薬物耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、および薬物耐性Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからなる群から選択される。別の実施形態において、感染性細菌は、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、エリスロマイシン耐性Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、クリンダマイシン耐性Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される。
【０３１７】
ある特定の実施形態において、慢性または感染した創傷は、宿主対象において見出される。好ましくは、宿主は、哺乳動物、例えば、齧歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオンアニマル、または非家畜化若しくは野生動物である。一実施形態において、対象は、齧歯類、例えば、マウス、ラット、モルモット、などであってもよい。別の実施形態において、対象は、家畜動物であってもよい。好適な家畜動物の非限定的な例は、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、およびアルパカを含んでもよい。さらに別の実施形態において、対象は、コンパニオンアニマルであってもよい。コンパニオンアニマルの非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、およびトリなどのペットを含んでもよい。さらに別の実施形態において、対象は、動物園動物であってもよい。本明細書で使用される場合、「動物園動物」とは、動物園に見出され得る動物を指す。かかる動物は、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミ、およびクマを含んでもよい。例示的な実施形態において、対象は、ヒトである。
【０３１８】
一態様では、哺乳動物創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法は、本明細書に提供され、本方法は、（ａ）哺乳動物創傷と接触して、本明細書に記載される創傷包帯材料を配置することと、（ｂ）哺乳動物創傷と接触して創傷包帯材料を、１つ以上の参照試料と視覚的に比較することと、（ｃ）哺乳動物創傷と接触して創傷包帯材料中にレポーター分子の濃度の定性的決定を得ることと、を含む。
【０３１９】
好ましくは、診断および治療は、原位置で行われる。したがって、本明細書に記載される実施形態は、容易で非侵襲的な様式において、創傷の診断および治療を可能にする。例えば、診断は、リアルタイムで行われてもよく、治療は、感染した創傷または患者に（全身的に）適用され得、創傷治療の進行は、リアルタイムにわたって、例えば、創傷治癒によるレポーター分子によって生成されるシグナルの消失をモニタリングされ得る。
【０３２０】
別の態様において、化学物質を用いた創傷におけるプロテアーゼ活性を検出する方法が、本明細書に提供され、化学物質は、アンカー領域、酵素に不安定なまたは酵素反応領域、およびインジケータ領域からなる群から選択される１つ以上の構成成分を含む。別の態様において、本方法は、いかなる反応も肉眼で確認できるように、ＭＰＯ、エラスターゼ、リゾチーム、ホスホリパーゼ、およびカタラーゼの基質を固体表面上に配置することを含む。別の態様において、本方法は、基質を含有する材料とそれらを接触させ、その後、基質の変化を評価させることによって、創傷、涙、硝子体、ＣＳＦ、気道吸引もしくは唾液、滑液、血液、血漿、血清、尿、腹膜、皮下、胆液、腸管もしくは同様の流体を含む、様々な体液を評価するのに役立つ。
【実施例】
【０３２１】
本明細書に記載される構造、材料、組成物、および方法は、代表的な例であることが意図されており、本開示の範囲が、実施例の範囲によって限定されないことが理解されるであろう。当業者は、実施形態および開示される技術が、開示される構造、材料、組成物、および方法における変形例で実践されてもよく、本開示の範囲内であると見なされることが理解されよう。
【０３２２】
実施例１：キトサンの精製
キトサン（１０ｇ、エビ殻から）を、２％酢酸溶液（１Ｌ）に溶解した。この溶液を、室温で一晩撹拌し、その後、ナイロンフィルタ（０．４５μｍ）を使用して濾過した。続いて、４Ｍ  ＮａＯＨの添加によって、ｐＨが、８になるまで調整して、キトサンを沈殿した。得られた沈殿物を、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分）によって分離し、洗浄溶液のｐＨが、約７に達するまで、蒸留水で徹底的に洗浄した。その後、沈殿物を、９０％エタノールで洗浄し、残りのエタノールを蒸発させて、キトサンを凍結乾燥させた。精製生成物を、ＦＴＩＲ（１５６０ｃｍ−１、１６４０ｃｍ−１）によって分析し、およそ４８％のＤＡを有する材料をさらに使用した。
【０３２３】
実施例２：キトサンの選択的Ｎ−アセチル化
精製したキトサン（実施例１）を、１０％酢酸溶液に溶解して、１％キトサン溶液を得た。等量の９６％エタノールを、無水酢酸と同様に添加した。反応物を、ｐＨが７になるまで調整する前に１時間撹拌した。沈殿物を、遠心分離によって単離し、凍結乾燥させた。続いて、得られたアセチル化キトサンを、蒸留水で数回洗浄し、再度凍結乾燥させた。Ｎ−アセチル化度（ＤＡ）を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＴＩＲ（１５６０ｃｍ−１、１６４０ｃｍ−１）によって分析し、以下の図に示されるように、４０〜６０％であることが見出された。様々なＤＡを有するキトサン誘導体が、生成されたが、４８％のＤＡを有する材料のみをさらに使用した。
【０３２４】
実施例３：アセチル−キトサンの上への反応性ブラック５の複合
アセチル化キトサン（ＤＡ＝４８％、１００ｍｇ；実施例２）を、反応性ブラック５の０．５％（ｗ／ｗ）溶液を添加する（０．５ｍＬ）前に、蒸留水中に懸濁した。蒸留水中の２．５％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＳＯ４及び１％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＣＯ３からなる溶液を添加し、混合物を、２５℃で１０分間インキュベートした。６５℃でその後のインキュベーションステップ後に、固体を、遠心分離（７８００ｒｐｍ、５分）によって分離した。洗浄溶液が無色の状態であり、続いて、凍結乾燥させるまで、沈殿物を、蒸留水で洗浄した。反応が完了した後に、染料含量を、非結合反応性ブラック５を測定して決定した。染料は、主に、沈殿物および高いＭＷ画分と関連した。アシル化度は、４８％であった。
【表１】
2019513238.tif 000003
【０３２５】
実施例４：キトオリゴ糖を得るためにキトサンの加水分解
精製したキトサン（２．５ｇ；実施例１）を、酢酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５）に溶解して、１％キトサン溶液を得た。その後、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓからのキトサナーゼ（１単位）を添加し、反応混合物を、サーモミキサー上で５日間撹拌した（３７℃、１５０ｒｐｍ）。溶液を真空濃縮し、非オリゴマーキトサンを、１体積当量の９６％エタノールを使用して沈殿させた。上清を再度濃縮し、続いて、オリゴ糖を、９体積当量のアセトンの添加によって沈殿させた。オリゴ糖を遠心分離によって単離し、水中の５０％アセトンで数回洗浄し、事前洗浄することなく凍結乾燥させた。重合度を、ＴＬＣおよびＳＥＣ（ＴＳＫゲルＧ５０００  ＰＷＸＬ、標準としてＰｕｌｌｕｌａｎ）によって決定し、約２４の重合度に関連して５３６０の平均ＭＷを示した。
【表２】
2019513238.tif 000004
【０３２６】
実施例５：キトオリゴ糖の選択的Ｎ−アセチル化
キトオリゴ糖混合物（７ｇ）（実施例４）を、９６％エタノール（４００ｍＬ）を添加する前に、蒸留水（２００ｍＬ）に溶解した。溶液を、５分間撹拌し、無水酢酸（４．１２ｍＬ、遊離アミンまでの１モル当量計算）を添加した。混合物を、１０％ＮａＯＨ溶液で７になるまで調整する前に、室温でさらに２時間撹拌した。溶媒を除去し、残りの沈殿物を凍結乾燥させた。Ｎ−アセチル化度を、１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴＩＲ（１５６０ｃｍ−１、１６４０ｃｍ−１）、および染料含量（測光法で、６２６ｎｍ）によって分析した。Ｎ−アセチル化度は、４８％であることが見出された。
【０３２７】
実施例６：キトオリゴ糖の上にトルイジンＯブルーの複合
アセチル化キトオリゴ糖（ＤＡ＝４８％、７ｇ；実施例５）を、１％酢酸（５００ｍＬ）中に分散させた。その後、トルイジンＯブルー（３．９ｇ）を添加し、１ｍｌのグルタルアルデヒド溶液を添加する前に、溶解させた。混合物を、２時間撹拌し、ｐＨを、１０％ＮａＯＨを使用して、７になるまで調整した。固体分画を、濾過によって単離し、蒸留水で数回洗浄し、凍結乾燥させた。Ｎ−アセチル化度を、１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴＩＲによって、および光学的に分析した。アセチル化度は、４８％であることが見出された。染料含量は、０．７４であることが見出された。
【０３２８】
染色キトサン誘導体のリゾチーム消化。合成基質を、異なる培地：リン酸カリウム緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ６．２）、ならびに５０００Ｕのニワトリ卵白からのリゾチームを含有する人工創傷流体、および感染した創傷からヒト創傷流体において調査された（図５および６を参照されたい）。
【０３２９】
２ミリグラムのリゾチーム基質を、それぞれの試験培地中で懸濁し、３５℃でインキュベートした。時間の測定のために、試料を、簡単に遠心分離し、２００μＬの上清を、９６ウェルプレートに移し、それぞれの染料の吸収最大で光学的に分析した。分析後、採取した試料を、反応バイアルに戻し、さらにインキュベートした。
【０３３０】
人工創傷流体の組成物は、ヒト血清アルブミン（２％）、塩化ナトリウム（０．３６％）、重炭酸ナトリウム（０．０５％）、クエン酸ナトリウム（０．０２％）、乳酸ナトリウム（０．１％）、グルコース（０．１％）、塩化カルシウム二水和物（０．０１％）、塩化マグネシウム（０．０２％）、および尿素（０．０１％）を含有した。
【０３３１】
実施例７：創傷感染の検出のためのインドール／キトオリゴマー系基質の合成。
（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ−インドール（ｎ＝４〜６）キチンのアセトリシスの合成
キチン（２ｇ）を、冷却した無水酢酸（２０ｍＬ）中に懸濁し、濃縮スルフリック（ｓｕｌｕｆｕｒｉｃ）酸（２，３ｍＬ）を滴加した。懸濁液を一晩撹拌し、室温に到達させた。溶液を、氷水で希釈した後、酢酸ナトリウム（１２ｇ）で中和した。溶液を濾過し、濾液をコロルホルム（ｃｈｏｌｏｒｆｏｒｍ）で抽出した。クロロホルム相を、重炭酸塩で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空内で濃縮した。
【０３３２】
重合度（ＤＰ）を変化する得られたキトオリゴ糖（ＣＯＳ）を、クロロホルム：エタノール勾配（９８：２→９０：１０）を用いて、ＭＰＬＣ（ＳｉＯ２、４０ｇ）によって分画した。
【化１】
2019513238.tif 000005
【０３３３】
実施例８：１−クロロ，３−Ｏ，６−Ｏ−ジアセチル−４−Ｏ−［３−Ｏ，４−Ｏ，６−Ｏ−トリアセチル−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物７）
キトビオースオクタアセタート２（２０ｍｇ）を、塩化アセチル中で懸濁し、溶液を、ＨＣｌガスで飽和させ、３０時間撹拌した。その後、溶液を蒸発させ、さらに精製することなく使用した。
【化２】
2019513238.tif 000006
【化３】
2019513238.tif 000007
【０３３４】
実施例９：１−（５−ブロモ−４−クロロ−Ｎ−アセチル−３−インドリル），３−Ｏ，６−Ｏ−ジアセチル−４−Ｏ−［３−Ｏ，４−Ｏ，６−Ｏ−トリアセチル−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物１３）
化合物７（０，０２８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）に溶解し、１１（８２．８７ｍｇ）を添加し、溶解した。その後、テトラブチル−アンモニウム硫酸水素塩（９．７ｍｇ）および１ｍＬの１Ｍ  炭酸カリウム溶液を添加した。激しく撹拌しながら、反応物を室温で１時間放置した。有機相を分離し、溶媒を加圧下で除去した。
【０３３５】
１２ｇのＭＰＬＣカラムを、１０カラム体積にわたって、１５部クロロホルム対１部エタノールへの純粋クロロホルムの勾配で分離のために使用された。次いで、５カラム体積の１５部クロロホルム対１部エタノールを、アイソクラチックを使用した。最終フラッシングステップは、５カラム体積に対して１０部クロロホルム対１部エタノールであった。
【化４】
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【０３３６】
実施例１０：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）オキサゾリン１５
ＧｌｃＮＡｃ１４（１００ｍｇ）を、Ｈ２Ｏ（１，８ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０，６ｍＬ）を添加した。溶液を、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ、２３０ｍｇ）の添加前に氷浴中で冷却した。溶液を、３０分間撹拌した。ＤＭＣおよびＴＥＡを、溶離液としてＨ２Ｏを用いて、ＭＰＬＣ（Ｃ１８）によって取り除かれた。生成物画分をプールし、真空内で濃縮した。
【化５】
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【０３３７】
ＧｌｃＮＡｃ二量体（化合物１７）
化合物１５（２７ｍｇ）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８，０）に溶解し、キチナーゼ（２５ｍＵ／ｍＬ）を添加した。溶液を、インキュベートし、反応進行を、ＴＬＣ（ＣＨＣＬ３：ＭｅＯＨ  ２：１）によってモニタリングした。
【化６】
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【０３３８】
（ＧｌｃＮＡｃ）２−インドール（化合物１８）
化合物１５（２７ｍｇ）およびＧｌｃＮＡｃ−インドール１６を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８，０）に溶解し、キチナーゼ（２５ｍＵ／ｍＬ）を添加した。溶液を、インキュベートし、反応進行を、ＴＬＣ（ＣＨＣＬ３：ＭｅＯＨ  ２：１）によってモニタリングした。
【化７】
2019513238.tif 000011
【０３３９】
実施例１１：２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシルクロリド
【化８】
2019513238.tif 000012
氷浴で冷却しながら、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンテトラアセタート（３９１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、塩化アセチル（７ｍＬ）中に懸濁した。混合物を、アルゴンで５分間脱気した。その後、ＭｅＯＨ（１．００ｍＬ）を、２時間にわたって滴加した。初めの１５分間のＭｅＯＨの添加中、反応混合物をアルゴンで脱気し、次いで、アルゴン雰囲気下でそれを維持した（常に、氷浴中で撹拌した）。ＭｅＯＨｌの完全な添加後、反応混合物を、氷浴で冷却しながら、さらに１０分間撹拌した。その後、それを室温まで加温し、室温で一晩撹拌した。混合物を、乾燥するまで濃縮し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に取り込み、再度乾燥するまで濃縮し、ジイソプロピルエーテル（１５ｍＬ）中に取り込み、もう一度乾燥するまで濃縮し、黄色固体を得、これを、さらに精製することなく、使用した。
【０３４０】
実施例１２：（Ｎ−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−インドール−３−イル）２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド（１２ａ）および（５−ブロモ−４−クロロ−インドール−３−イル）２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド（１２ｂ）
【化９】
2019513238.tif 000013
１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールアセテート（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加する前に、ＤＭＦ（乾燥、４ｍＬ）を、アルゴンで５分間脱気した。混合物を、アルゴンでさらに５分間脱気し、次いで、ＮａＯＭｅ（５１ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、一度に添加した。アルゴンで脱気しながら、室温での撹拌は、２５分間継続し、その後、２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシルクロリド（１１０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を、一度に添加した。アルゴンで１時間脱気しながら、反応混合物を、光からの保護（アルミホイル）下で室温で撹拌し、次いで、光からの保護下で一晩室温でアルゴン雰囲気下で撹拌した。混合物を、乾燥するまで濃縮し、トルエン（３×２０ｍＬ）で同時蒸発させた。その後、それを、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中に取り込み、濾過した。濾液を、乾燥するまで濃縮し、１５０ｍｇの粗生成物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋：５９７（１４ｂ）および［Ｍ＋Ｎａ］＋：６３９（１２ａ）。
【０３４１】
実施例１３：（インドックス−３−イリック酸（ｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）メチルエステル）２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１０】
2019513238.tif 000014
２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシルクロリド（１．００ｍｍｏｌ、実施例１３）、ＴＢＡＨＳ（３３９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、およびメチル−３−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキシレート（２１０ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（乾燥、１０ｍＬ）に室温で溶解した。次いで、Ｋ２ＣＯ３溶液（１２ｍＬ）を、一度に添加し、混合物を室温で２．５時間撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を添加した。抽出後、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、乾燥するまで濃縮した。粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（３０．０ｇのシリカゲル、溶離：ＤＣＭ中５％  ＭｅＯＨ）によって精製し、２５０ｍｇの純粋な生成物および９２ｍｇの不純物生成物を単離した。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋：５４３、［Ｍ＋Ｋ］＋：５５９。
【０３４２】
実施例１４：（インドックス−３−イリック酸メチルエステル）２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１１】
2019513238.tif 000015
（インドックス−３−イリック酸メチルエステル）２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド（２５０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（７ｍＬ）中に室温で懸濁した。ＮａＯＭｅ（触媒量）を添加し、混合物を、室温で１時間４５分間撹拌した。沈殿物を濾過した。沈殿物および濾液のＭＳが同一であるため、それらを再度組み合わせ、乾燥するまで濃縮した。生成物を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１、１０ｍＬ）中に懸濁し、冷蔵庫中に３時間保持した。無色固体を濾過して、９０ｍｇの無色固体を得た。濾液を、再度乾燥するまで濃縮して、１０５ｍｇの茶色っぽい固体を得た。固体および濾液の両方を、さらに精製することなく使用した。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋：４１７。
【０３４３】
実施例１５：        （インドックス−３−イリック酸）２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１２】
2019513238.tif 000016
（インドックス−３−イリック酸メチルエステル）２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド（１０５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、ＮａＯＨ溶液（水中０．１Ｍ、１０ｍＬ）中に懸濁し、室温で３．５時間撹拌した。反応混合物を、乾燥するまで濃縮し、生成物を、さらに精製することなく使用した。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋：４０３。
【０３４４】
実施例１６：（Ｎ−アセチル−インドール−３−イル）２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド
【化１３】
2019513238.tif 000017
（インドックス−３−イリック酸）２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド（１０５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＡｇＯＡｃ（１２５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２０７ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、及びＡｃ２Ｏ（６ｍＬ）を１１８℃（油浴温度）まで１時間加熱した。次いで、反応混合物を室温まで冷却した。ＤＣＭ（４０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）を添加した。抽出後、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３−ｓｏｌ．（３×３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、乾燥するまで濃縮した。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋：５２７。
【０３４５】
実施例１７：ペルアセチル−オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン
【化１４】
2019513238.tif 000018
ピリジン（５００μＬ）および無水酢酸（５００μＬ）を、キトサンオリゴマー（５対４．１の比でオリゴマーおよび酢酸ナトリウムの混合物）（１０１ｍｇ、１〜４の鎖長さ）に添加し、混合物を室温で一晩振盪した。全ての材料を溶解しなかったため、混合物を再度一晩振盪した。その後、それを、冷蔵庫中に１０日間保持した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加し、混合物を、氷冷クエン酸（水中１０％、２０ｍＬ）に注ぎ入れた。抽出後、有機相を、氷冷クエン酸（水中１０％、２０ｍＬ）で洗浄し、続いて、ブライン（１５ｍＬ）で洗浄した。有機相を、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、乾燥するまで濃縮した（６４ｍｇの粗生成物）。粗生成物を、さらに精製することなく使用した。ＭＳデータ：ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋（二量体）：６９９、［Ｍ＋Ｎａ］＋（三量体）：９８６。
【０３４６】
実施例１８：１−クロロ−ペルアセチル−オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン
【化１５】
2019513238.tif 000019
実施例１９の粗生成物を、アルゴン雰囲気下で塩化アセチル（１ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却した。ＭｅＯＨ（５５μＬ）を、約１分以内に滴加した。完全な添加後、混合物を氷浴中でさらに１０分間撹拌し、次いで、溶液を室温まで加温し、さらなる塩化アセチル（０５ｍＬ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、それを、乾燥するまで濃縮し、ジクロロメタン（５ｍＬ）中に取り込み、再度乾燥するまで濃縮し、ジイソプロピルエーテル中に懸濁し、さらに乾燥するまで濃縮して、５５ｍｇの粗生成物を得た。粗生成物を、さらに精製することなく次のステップのために使用した。
【０３４７】
実施例１９：Ｏ−（２−カルボキシメチル−３−インドキシル）−ペルアセチル−オリゴ−β−Ｄ−１，４−グルコサミン
【化１６】
2019513238.tif 000020
実施例２０の粗生成物（５５ｍｇの粗生成物）、テトラブチルアンモニウム水素硫酸塩（２０ｍｇ）、およびメチル３−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキシレート（１３ｍｇ）を、ＤＣＭ（乾燥、１．５ｍＬ）に室温で溶解し、Ｋ２ＣＯ３（水中１Ｍ、１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）および水（１５ｍＬ）を添加した。抽出後、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、乾燥するまで濃縮した（３９ｍｇの粗生成物）。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶離：ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ。単離：１つの糖部分を有する１．８ｍｇの生成物、２つの糖部分を有する１．２ｍｇの生成物。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋（モノマー）：５４３、［Ｍ＋Ｎａ＋］（二量体）：８３０。
【０３４８】
実施例２０．創傷感染の検出のためのフェノール／キトサン／ラッカーゼ系基質の合成。
Ｎ−アセチルキトサンを、シナピン酸（ＳＡ）で移植した。
【０３４９】
Ｎ−アセチルキトサンを、酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５，０）に溶解して、１％溶液（ｗ／ｖ）を得た。２０ｍＬのこの溶液を、エタノール（２０ｍＭ）中の２０ｍＬのシナピン酸溶液と混合した。ＥＤＣおよびＮＨＳを添加し（各１，３ｇ）、溶液を２時間撹拌した。ＮａＯＨ（１Ｍ）を滴加することによって、反応を停止し、フェノールを洗浄溶液中でこれ以上検出し得なくなるまで、得られた沈殿物を水で洗浄した。その後、生成物を凍結乾燥させた。
【０３５０】
Ｎ−アセチルキトサン／アミノメトキシフェノールナノ粒子
Ｎ−アセチルキトサンを、酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５，０）に溶解し、アミノメトキシフェノール（エタノールに溶解）を添加して、２０ｍＭの総濃度を得た。２，３ｍＬのこの溶液を、１，６ｍＬのドデカンと混合し、超音波処理装置に適用して、乳剤を生成した。
【０３５１】
ＳＡの加水分解は、リゾチームによってＮ−アセチルキトサンを移植した。
【０３５２】
Ｎ−アセチルキトサン（５ｍｇ）を移植したＳＡを、リゾチーム（０，１ｍｇ／ｍＬ）を含有する５００μＬのリン酸カリウム緩衝液（６２ｍＭ、ｐＨ６，２）中に懸濁した。溶液を、１時間インキュベートした。反応上清を、ラッカーゼ（１Ｕ／ｍＬ）でインキュベートし、急速な色変化を観察した。
【０３５３】
リゾチームによるＮ−アセチルキトサン／アミノメトキシフェノールナノ粒子の加水分解
Ｎ−アセチルキトサン／アミノメトキシフェノールナノ粒子乳剤（５０μＬ）を、リゾチーム（０，１ｍｇ／ｍＬ）およびラッカーゼ（１Ｕ／ｍＬ）を含有する、４５０μＬのリン酸カリウム緩衝液（６２ｍＭ、ｐＨ６，２）と混合した。ナノ粒子を、１５分後破壊し（透明な溶液を得る）、強力な色を発した。
【０３５４】
実施例２１．創傷感染の検出のためのペプチドグリカンの染色
異なる反応染色を、ペプチドグリカンの染料のために使用することができる（表１）。反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、または反応性オレンジ１６などのスルホニルエチル−硫酸水素−反応基を含有する反応染料が、好ましい。代替として、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、および反応性ブラウン１０などのジクロルトリアジン反応基を含有する染料を、使用することができる。染料を、ペプチドグリカンによる反応度、および染色したペプチドグリカンを、リゾチームでインキュベートしたとき、染料が放出された速度の検討によって評価した（染色については、実施例７、および消化アッセイについては、実施例６の前述の項を参照されたい）。
表１．反応染料の評価
【表３】
2019513238.tif 000021
【０３５５】
ペプチドグリカン染色手順１：
反応染料で染色するためにペプチドグリカンの調製および殺菌：
動物質を含まない発酵からＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｃｔｉｃｕｓ細胞ブロスを、４０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離して、湿式細胞ペレットを得た。細胞ペレット（２０ｇ）を、ｄｄＨ２Ｏ（８００ｍｌ）で２回洗浄して、あらゆる残りの培地構成成分（一定の遠心分離条件）を除去した。
【０３５６】
湿式Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｃｔｉｃｕｓ細胞ペレット（２０ｇ、湿式：乾式の比、４：１、５ｇの乾燥Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｃｔｉｃｕｓ細胞）を、１Ｍ  ＨＣｌ（８０ｇ）中に懸濁し、６０℃で１時間、７２０ｒｐｍでインキュベートした。次いで、殺菌し、断続的な細胞を、４０００ｇで、４℃で、１５分間遠心分離した。ペプチドグリカンペレットを再懸濁し、Ｎａ−リン酸緩衝液（４００ｍｌ、１００ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄し、懸濁液のｐＨを中性ｐＨに調整して、破砕プロセス（一定の遠心分離条件）の細胞構成成分を除去した。５００ｍｌのｄｄＨ２Ｏを用いた別の洗浄ステップを行って、破壊した細胞構成成分および緩衝液塩を除去した。最終洗浄ステップ後に得られたペレットを、染色手順の使用の準備が整った。
【０３５７】
ペプチドグリカン（５０ｍｇ）、反応性ブラック５（５ｍｇ）、Ｎａ２ＣＯ３（１０ｍｇ）、およびＮａ２ＳＯ４（２５ｍｇ）を、再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）（２ｍＬ）に溶解／懸濁した。１分間振とうした後、反応混合物を、２５℃で、７５０ｒｐｍで１０分間インキュベートし、続いて、二次インキュベーションステップで、６５℃で、７５０ｒｐｍでさらに３０分間振とうした。
【０３５８】
染色したペプチドグリカンを、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を収集し、ペレットを、ｄｄＨ２Ｏ中で再懸濁し、１００００ｇで１０分間再度遠心分離した。上清が透明になるまで、洗浄手順を繰り返した。異なる緩衝液または有機溶媒様エタノールは、洗浄手順のために使用され得る。全ての上清の吸収レベルを、５９７ｎｍで測定した。上清は、吸収度が０．０５の値を下回った場合、透明として定義された。上清中の非結合染色の量を、較正曲線および上清の測定した吸収レベルを用いて計算した。したがって、ペプチドグリカン結合染料の量を計算した。染色したペプチドグリカンを、４〜８℃で最長２週間保存するか、またはより長い保存期間中、凍結乾燥を介して乾燥させた。
【０３５９】
ペプチドグリカン乾燥手順２：
反応性ブラック５（２００ｍｇ）およびペプチドグリカン（３００ｍｇ）を、ｄｄＨ２Ｏ（４０ｍＬ）に溶解した。反応溶液を、５０℃で３０分間撹拌した。３０分間、Ｎａ２ＳＯ４（１ｇ）を、６分毎に添加した（総量：４ｇ）。初めの３０分間のインキュベーション後、Ｎａ３ＰＯ４（２００ｍｇ）を、反応溶液に添加し、これを、５０℃で３０分間再度撹拌した。
【０３６０】
染色したペプチドグリカンを、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を収集し、ペレットを、ｄｄＨ２Ｏ中で再懸濁し、１００００ｇで１０分間再度遠心分離した。上清が透明になるまで、洗浄手順を繰り返した。異なる緩衝液または有機溶媒様エタノールは、洗浄手順のために使用され得る。全ての上清の吸収レベルを、５９７ｎｍで測定した。上清は、吸収度が０．０５の値を下回った場合、透明として定義された。上清中の非結合染色の量を、較正曲線および上清の測定した吸収レベルを用いて計算した。したがって、ペプチドグリカン結合染料の量を計算した。凍結乾燥を介して安定しているまたは乾燥させるように見える場合、染色したペプチドグリカンを、４〜８℃で保存した。
【０３６１】
ペプチドグリカン染色手順３：
ペプチドグリカン（１５０ｍｇ、乾燥重量）を、ｄｄＨ２Ｏ（２０ｍｌ）中に懸濁し、５０℃まで加熱した。反応性ブラック５（表Ｘに従って異なる量の反応染料を有する７つの異なるバリアント）の添加によって、反応を開始した。反応物を、５０℃で１時間撹拌した（２１０ｒｐｍ）。開始から１０分後、Ｎａ２ＣＯ３を、周期的に、１０分毎に添加した（５×１００ｍｇ、１０、２０、３０、４０、および５０分の反応時間後）。Ｎａ２ＣＯ３の最終添加後、反応混合物を、さらに１０分間撹拌した。反応溶液を、４０００ｇで、４℃で１５分間遠心分離した。ペレットを再懸濁し、ｄｄＨ２Ｏ（４０ｇ）中で３回洗浄し、常に、前述同様に遠心分離した。異なる緩衝液または有機溶媒様エタノールは、洗浄手順のために使用され得る。全ての上清を計量し、非結合染料濃度の判定および染色度の判定のためのさらなる結果において使用した。したがって、１ｍｌの各上清を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１００００ｇおよび周囲温度で５分間遠心分離した。１００μｌの各上清を、９６ウェルプレートに３回移し、吸収レベルを、５９７ｎｍで測定した。上清は、吸収度が０．０５の値を下回った場合、透明として定義された。上清中の非結合染色の量を、較正曲線および上清の測定した吸収レベルを用いて計算した。結合染料の割合を、表２に列挙する。全染色ペプチドグリカン構築体の反応性ブラック５（ＬＰＧ−ＲＢ５）の割合も、表２に列挙する。
表２：染色したペプチドグリカンの異なるバリアント
【表４】
2019513238.tif 000022
【０３６２】
実施例２２．創傷感染の検出のためのリゾチーム活性測定
染色したペプチドグリカン：
ＬＰＧ−ＲＢ５バリアント毎の１つの懸濁液（実施例２１）（１．５ｍｇ／ｍｌ）を、調製し（ＮａＣｌ溶液、０．９％）、６  １ｍｌの試料に、それぞれ分けた（３陽性、３陰性）。陽性対照を、１０，０００Ｕ／ｍｌの最終リゾチーム活性になるまでリゾチームストック溶液（１０μｌ、１，０００，０００Ｕ／ｍｌ）と混合した。全ての試料を、３７℃で６０分間インキュベートし、その後、遠心分離した（５分、１００００ｇ）。青色の発生を、上清中で検出した。１００μｌの各上清を、９６ウェルプレートに移し、吸収度を、５９７ｎｍで測定した。異なるバリアントの上清の吸収度を、図８に示す。染色度の影響を図９に示す。
【０３６３】
染料：ＰＧ比の計算：
非結合染料の量：
【数１】
2019513238.tif 000023
ＡｂｓＷＬ…５９７ｎｍで異なる洗浄溶液の測定された吸収度
ｄ…染色較正曲線の線形回帰の切片
ｋ…染色較正曲線の線形回帰の傾き
ｚ…測定された洗浄溶液の希釈係数
ｙ…洗浄溶液の体積（ｍｌ）
ｘ…洗浄溶液中のＲＢ５の量（ｍｇ）
結合染料の量：
ａ＝(使用した染料の量)−（非結合染料の量）
ａ…結合染料の量
染料容器中の染料含量の検討：
ｃ＝ａ＊０．８５
ｃ…結合染料の量（ｍｇ）（検討した染料含量）
０．８５…８５％の染料含量
ａ…結合染料の量（ｍｇ）
反応染料（反応性ブラック５）の脱離基による体重減少の検討：
ｆ＝ｃ＊０．７６
ｆ…結合染料の最終量（ｍｇ）（−反応基）
ｃ…結合染料の量（ｍｇ）（検討した染料含量）
ＰＧとＲＢ５との間の比：
【数２】
2019513238.tif 000024
Ｒ…純粋なＰＧとＲＢ５との比
Ｌ…乾燥ＰＧ−ＲＢ５の収量（ｍｇ）
ｆ…結合染料の最終量（ｍｇ）
【０３６４】
実施例２３：ミエロペルオキシダーゼ活性の検出のための比色酵素アッセイ
３，４−ジアミノ安息香酸、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸、２，３−ジアミノ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、２−アミノフェノール、２−アミノ−３−メトキシ安息香酸、メチル−３，４−ジアミニベンゾエート、および２−アミノ−４−メトキシフェノールのような試薬は、ＭＰＯ活性の検出のために使用することができる（表２）。アッセイ条件：１ｍｇ／ｍＬのＤＡＢＡまたは等価物を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）に溶解した。Ｈ２Ｏ２を、５ｍＭの最終濃度に添加した。基質／Ｈ２Ｏ２溶液（９５μＬ）を、５μＬのＭＰＯ含有試料とともに９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。溶液は、ＭＰＯ酸化時に茶色っぽく変化した。反応物を、標準光度プレートリーダーを用いて４５０ｎｍでモニタリングした。
表３．新規のＭＰＯ基質の評価
【表５】
2019513238.tif 000025
【０３６５】
実施例２４．ポリマー結合配列を有するヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）およびヒトカテプシンＧ（ＣａｔＧ）基質の構築
セロビオヒドロラーゼＩ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの親水性炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）、またはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からの疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）の４つのコンカテマーのうちの１つをコードする、キメラ遺伝子バリアントを、合成した。親水性結合モジュール（ＣＢＭ）を有するキメラバリアントが、セルロース系濾紙／布への結合を可能にし、対照的に、疎水性結合モジュール（ＰＤＭ）を有するキメラバリアントが、ＰＥＴ（テレフタル酸ポリエチレン）系ストリップへの結合を可能にする。
【０３６６】
適切な組換えタンパク質発現をもたらすために、ＴｒｘＡ−ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ融合タンパク質のバリアントが、設計された。構築体は、ｔｒｘＡ（チオレドキシン）遺伝子、ＴｒｘＡ融合タグを目的となるタンパク質から分離するために、６ｘＨｉｓ−タグおよびエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）をコードする短スペーサー配列からなる。エンテロキナーゼ部位に続いて、配列をコードする新たに設計されたｅｌａｓｕｂ１＿ｃｂｍを、構築体に導入した。ｅｌａｓｕｂ１配列は、チオール基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシ基などのたくさんの官能基を曝露するアミノ酸をコードする。これらのアミノ酸（システイン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、またはチロシン）は、キメラペプチドへの染料またはプロ染料の結合を容易にするすべきである。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のためのコード配列は、ｅｌａｓｕｂ１＿ｃｂｍと称される、ｅｌａｓｕｂ１配列の直下流に位置していた。さらに、ＨＬＥ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）またはＣａｔＧ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）のための２つ以上の認識／切断部位を、配列をコードするｅｌａｓｕｂ１に導入した。ＨＬＥまたはＣａｔＧの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含む、ある特定の染料分子（例えば、レマゾールブリリアントブルー）を、上記のアミノ酸の官能基に結合した。ＨＬＥまたはＣａｔＧによるキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド断片の放出をもたらす。イオン交換を通して、酵素反応（ＨＬＥまたはＣａｔＧ）は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片を結合することによって視覚化され得る。キメラペプチドの精製のために、Ｈｉｓ−タグ（６ｘＨｉｓ）をコードするさらなる反復配列伸長を、ｅｌａｓｕｂ１＿ｃｂｍ融合構築体のＣ末端の末端に結合させた。
【０３６７】
融合構築体ｔｒｘＡ＿＿ｅｌａｓｕｂ１＿ｃｂｍ＿ｈｉｓのＤＮＡ配列；発現ベクターｐＥＴ３２ｂ（＋）からの配列は、下線を引く：
ＡＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＧＧＴＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＡＧＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＧＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＴＴＡＴＡＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ
ＴｒｘＡ＿ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ−Ｈｉｓ誘導タンパク質のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＩＩＨＬＴＤＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡＥＷＣＧＰＣＫＭＩＡＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬＫＥＦＬＤＡＮＬＡＧＳＧＳＧＨＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤＤＤＫＡＭＧＧＳＣＧＧＧＧＳＡＡＰＶＧＧＧＧＳＡＡＰＶＧＧＧＧＳＰＰＧＧＮＲＧＴＴＴＴＲＲＰＡＴＴＴＧＳＳＰＧＰＴＱＳＨＹＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＰＴＶＣＡＳＧＴＴＣＱＶＬＮＰＹＹＳＱＣＬＬＥＨＨＨＨＨＨ＊
天然ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ融合タンパク質のタンパク質配列：
ＭＧＧＳＣＧＧＧＧＳＡＡＰＶＧＧＧＧＳＡＡＰＶＧＧＧＧＳＰＰＧＧＮＲＧＴＴＴＴＲＲＰＡＴＴＴＧＳＳＰＧＰＴＱＳＨＹＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＰＴＶＣＡＳＧＴＴＣＱＶＬＮＰＹＹＳＱＣＬＬＥＨＨＨＨＨＨ＊
【０３６８】
親水性結合モジュールを有するバリアントを、表４に示されるように設計した。
表４：可能な疎水性結合モジュールと同様に、親水性結合モジュール（ＣＢＭ）を有するバリアント
【表６】
2019513238.tif 000026
【０３６９】
バリアント１：ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ。
ＥｌａＳｕｂ１構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭと称される、ＥｌａＳｕｂ１タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのためにコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＨＬＥ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）における２つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＨＬＥの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＨＬＥを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド断片の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＨＬＥ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片を結合させることによって可視化されるべきである。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７０】
バリアント２：ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ。
ＣａｔＧＳｕｂ１構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭと称される、ＥｌａＳｕｂ１タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのためにコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＣａｔＧ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）における２つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＣａｔＧの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＣａｔＧを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド断片の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＣａｔＧ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片を結合させることによって可視化されるべきである。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７１】
バリアント３：ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ。
ＥｌａＳｕｂ１構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＥｌａＳｕｂ１＿ＣＢＭと称される、ＥｌａＳｕｂ１タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのためにコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＨＬＥ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）における２つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＨＬＥの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＨＬＥを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド断片の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＨＬＥ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片を結合させることによって可視化されるべきである。このキメラバリアントの精製のために、Ｈｉｓ−タグをコードする反復配列伸長を、炭水化物結合モジュールをコードする配列に続いて結合させる。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７２】
バリアント４：ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ。
ＣａｔＧＳｕｂ１構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＣａｔＧＳｕｂ１＿ＣＢＭと称される、ＥｌａＳｕｂ１タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのためにコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＣａｔＧ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）における２つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＣａｔＧの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＣａｔＧを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド断片の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＣａｔＧ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片を結合させることによって可視化されるべきである。このキメラバリアントの精製のために、Ｈｉｓ−タグをコードする反復配列伸長を、炭水化物結合モジュールをコードする配列に続いて結合させる。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７３】
バリアント５：ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ。
ＥｌａＳｕｂ２構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭと称される、ＥｌａＳｕｂ２タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのために３つのコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＨＬＥ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）における３つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＨＬＥの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＨＬＥを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド／ペプチド断片（複数可）の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＨＬＥ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片（複数可）を結合させることによって可視化されるべきである。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７４】
バリアント６：ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ。
ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭと称される、ＣａｔＧＳｕｂ２タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのために３つのコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＣａｔＧ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）における３つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＣａｔＧの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＣａｔＧを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド／ペプチド断片（複数可）の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＣａｔＧ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片（複数可）を結合させることによって可視化されるべきである。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７５】
バリアント７：ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ。
ＥｌａＳｕｂ２構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＥｌａＳｕｂ２＿ＣＢＭと称される、ＥｌａＳｕｂ２タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのために３つのコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＨＬＥ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）における３つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＨＬＥの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＨＬＥを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド／ペプチド断片（複数可）の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＨＬＥ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片（複数可）を結合させることによって可視化されるべきである。このキメラバリアントの精製のために、Ｈｉｓ−タグをコードする反復配列伸長を、炭水化物結合モジュールをコードする配列に続いて結合させる。このバリアントのアミノ酸配列を表４に示す。
【０３７６】
バリアント８：ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ＿Ｈｉｓ
ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭ構築体は、主に親水性アミノ酸の伸長をコードする。天然の親水性結合モジュール（ＣＢＭ）のための配列は、ＣａｔＧＳｕｂ２＿ＣＢＭと称される、ＣａｔＧＳｕｂ２タンパク質配列の直下流に位置している。この領域内で、システインのために３つのコドンが挿入される。システインのチオール基は、染料またはプロ染料のキメラペプチドへの結合を容易にするべきである。さらに、ＣａｔＧ（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）における３つの認識／切断部位は、親水性スペーサー領域に導入される。ＣａｔＧの作用を可視化するために、陽性または陰性荷電基を含むある特定の染料分子は、システインのチオール基に結合され得る。ＣａｔＧを通したキメラペプチドの酵素的切断は、連結された染料またはプロ染料を担持するペプチド／ペプチド断片（複数可）の放出をもたらすべきである。イオン交換を通して、ＣａｔＧ酵素反応は、染料の荷電基を通して放出されたペプチド断片（複数可）を結合させることによって可視化されるべきである。このキメラバリアントの精製のために、Ｈｉｓ−タグをコードする反復配列伸長を、炭水化物結合モジュールをコードする配列に続いて結合させる。このバリアントのアミノ酸配列を表５に示す。
【０３７７】
バリアント９〜バリアント１６は、疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）に対して親水性炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を変更することを除いて、バリアント１〜バリアント８と同様に設計され得る。
表５Ａ：親水性炭水化物結合モジュールを有するキメラタンパク質バリアントのアミノ酸配列。
【表７】
2019513238.tif 000027
表５Ｂ：親水性炭水化物結合モジュールを有するキメラ遺伝子バリアントのヌクレオチド配列。８つの構築体を全て、クローニングベクターのＭＣＳに位置するＮｃｏ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限部位を用いて、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）の発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。
【表８】
2019513238.tif 000028
2019513238.tif 000029
【０３７８】
実施例２５：ポリマー結合配列を有するエラスターゼ（ＨＬＥ）基質の発現。
【０３７９】
バリアント３（実施例９）：ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）［ｐＥＴ３２ｂ（＋）ｅｌａ  ｓｕｂ１＿ｃｂｍ  ｈｉｓ］
キメラ遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位／酵素を用いてｐＥＴ３２ｂ（＋）発現システムにクローン化した。キメラペプチドの最終タンパク質発現を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、プロテアーゼ欠乏発現宿主において行われ、ｐＥＴ３２ｂ（＋）発現ベクターのＴ７プロモーターに基づいた適切なタンパク質発現を可能にする。組換え［ｐＥＴ３２ｂ（＋）ｅｌａ  ｓｕｂ１＿ｃｂｍ］構築体を持っている、ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）宿主株の発酵は、プラスミドを維持するための１００μｇ  ｍｌ−１アンピシリンを補充した２×ＴＹ培地で行われた。振盪しながら３０℃で一晩成長させた培養物を使用して、主要培養物を接種した。光学密度が６００ｎｍで約０．６に達するまで、振盪しながら、細胞を、３７℃（迅速誘導用プロトコル）および３０℃（遅延誘導用プロトコル）で成長した。組換え構築体の発現を、０．５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によって誘導し、それに対して、タンパク質発現を、３７℃で４時間（迅速誘導）でおよび１８℃で２０時間（遅延誘導）行った。プロトコル（迅速および遅延誘導）は両方とも、可溶性組換えタンパク質の収率に関する同じ結果を示した。タンパク質発現後、細胞を遠心分離によって採取し、細胞をリゾチーム処理によって破壊し、続いて、超音波処理した。組換えタンパク質の適切なタンパク質発現を、同様に発現された空のｐＥＴ３２ｂ（＋）ベクターと比較して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニタリングした。粗溶解物からキメラ構築体の精製は、ＩＢＡプロトコルに従って、ＩＢＡ  Ｎｉ−ＮＴＡセファロース重力流カラム（１ｍｌ）を用いて行われた。精製タンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検査した。溶出後、高イミダゾール濃度に対してタンパク質の曝露を阻止するために、緩衝液交換は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＰＤ１０の脱塩カラムを用いて行われた。精製したキメラ融合構築体の収率は、２ｇの初期細胞ペレット当たり３０ｍｇのタンパク質で計算され得る。ＴｒｘＡ融合タグからキメラ構築体を分離するために、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの組換え発現したウシエンテロキナーゼを使用した。ＴｒｘＡ−タグからの所望のキメラ構築体の分離を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した。ＨＬＥ認識／切断部位を含有する単離されたキメラタンパク質を、陽性および陰性荷電群を曝露するそれらの能力に関する異なる特性を呈する様々な染料またはプロ染料を有するカップリング手順で２回使用した。
【０３８０】
完全キメラ構築体は、親水性炭水化物結合モジュールを介してセルロース系濾紙（または布）に吸着された。キメラペプチドを含有する濾過ストリップを、０．０５Ｕ／ｍｌのＨＬＥを含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．４）、ならびにヒト創傷流体を用いて、３０分間インキュベートした。最初に、エラスターゼ活性を示す未着色の試料（透明な上清）は、付着した染料に応じて、青色を発色した。内部ＨＬＥ制限部位（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）のうちの一方または両方における酵素的切断により、付着したレマゾールブリリアントブルー染料分子を含むペプチド断片は、結合せず、青色の上清をもたらす。あるいは、疎水性結合モジュール（ＰＤＢ）を有するキメラ構築体は、ＰＥＴ（テレフタル酸ポリエチレン）系担体材料への吸着のために使用することができる。ＨＬＥ切断部位の代わりにＣａｔＧ切断部位を持つキメラバリアントの産生は、ＨＬＥ制限部位を保有する構築体を示すのと同じ必要条件下でヒトＣａｔＧ酵素の検出を可能にする。
【０３８１】
ＰＤＭドメインを含有する構築体において、ＰＤＭ基は、これまでに記載される様式においてＣＢＤで交換し得る。Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓからのポリヒドロキシ酪酸デポリメラーゼ（ＰＢＭまたはＰＤＭ）配列は、Ｒｉｂｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｔｏ  Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  Ｃｕｔｉｎａｓｅ  ｔｏ  Ｔｕｎｅ  Ｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ＰＥＴ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，”Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１４（６），ｐｐ１７６９−１７７６，２０１３において記載される。Ｒｉｂｉｔｓｃｈにおける開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、任意の固相結合ドメインは、この様式で使用され得る。他のタイプのＣＢＤペプチドは、所望の機能性を達成するために、同義に使用され得る。
【０３８２】
前述の実施例および機能的アッセイに示されるように、本明細書に開示されている構築体は、ＣＢＤなどの非溶解性アンカー（ａｎｃｈｅｒ）を含み、これは、他のアンカー、特に他のＣＢＤまたはＰＤＭで交換され得る。より小さいアンカーは、化学量論（ｓｔｏｉｃｉｏｍｅｔｒｉｃ）の理由のために好ましい。
【０３８３】
構築体を含有した酵素認識部位に関して、エラスターゼは、本明細書に例示されるように、広範な選好を有し、ＡＡＰＶ配列が最も好ましいが、ＡＡＰＦは、代謝回転の観点からほぼ同じであり、ＡＡＡＡは、同様である。それ故に、これらの配列のいずれも、機能を失わずに他のものに交換され得る。
【０３８４】
それに添付される構築体およびアミノ酸のＣ末端に関して、多くの変形が可能であるが、コンセンサスは、側鎖の欠如および荷電の欠如が、切断部位を妨げることが重要である。システイン（Ｃｙｔｅｉｎｅ）は、アンカー染料への手段として、特に、１構築体当たり１つ、好ましくは、切断部位当たり１つ以下使用される。それらは、スルホン化された染料が必要以上に酵素と相互作用しないことを確実にするために、切断部位から遠位にあるべきである。
【０３８５】
ペプチド基質で用いられる染料に関して、認識部位を標的とする特定の酵素を考慮することが重要である。この目的を達成するために、エラスターゼは、塩基性酵素であり、強力な負荷電基によって阻害される。これは、１切断部位当たり１つを超えるスルホン化染料が必要とされないことを意味する。スルホン酸基の数が、１切断部位当たり４より低いことが望ましい。かかるスルホン酸基の数が多くなるについて、切断部位へのアクセスを隠すリスクがある。
【０３８６】
実施例２６：エラスターゼ基質としてビニルスルホン染料を用いた精製Ｔｒｘ−Ｅｌａ−Ｓｕｂ１の染色
精製および凍結乾燥Ｔｒｘ−Ｅｌａ−Ｓｕｂ１を、Ｈ２Ｏ（０．０１ｇ／２．５ｍｌ）（タンパク質濃度約０．２ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。緩衝液を、ＰＤ１０のカラムを用いて、トリス−ＨＣｌからＮａ２ＰＯ４／Ｎａ２ＳＯ４溶液まで交換した。
【０３８７】
ビニルスルホン染料（レマゾールブリリアントブルーＲ、ＲＢＢ）：２１０μｌのＲＢＢによる染色７．７ｍｇは１．５ｍｌのＮａ２ＰＯ４／Ｎａ２ＳＯ４に溶解した）溶液を、１９００μｌのタンパク質溶液に添加し、３７℃で８０分間振とうした（７５０ｒｐｍ）。
【０３８８】
精製は、Ｈｉｓ−タグ精製を介して行われた。
【０３８９】
エラスターゼによるＴｒｘ−Ｅｌａ−Ｓｕｂ１−ＲＢＢの反応：
染色および精製ペプチド構築体を、セルロース表面上に塗布し、３７℃で２時間乾燥させた。非結合Ｔｒｘ−Ｅｌａ−Ｓｕｂ１−ＲＢＢを、Ｈ２Ｏで除去した。塗布したエラスターゼ基質を有するストリップを、それぞれ、エラスターゼ含有緩衝液を用いて、それを用いずにインキュベートした。エラスターゼ応答性の染料放出は、図１０に見ることができる。
【０３９０】
実施例２７：ニトラジンイエローおよびブロモクレゾールパープルの固定化
（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）を介してセルロースへのニトラジンイエローおよびブロモクレゾールパープルの固定化上記の染料の１５ｍＭ  溶液を、ＧＰＴＭＳ（３００ｍＭ）と２５℃で一晩反応させる。完全な反応混合物（５μＬ）を、濾紙ストリップ上にピペットで移し、８０℃で３０分間、１７０℃で５分間乾燥させた。その後、染色されたストリップを、水中で徹底的に洗浄する。ストリップのｐＨ応答は、異なるｐＨの溶液でそれらをインキュベートすることによって観察され得る。ｐＨ４．５、７．２、または８．５でインキュベートした後の色応答を、図７に示す。染料混合物は両方とも、ｐＨ８．５の緩衝液以外には色応答を示さず、それらのｐＨ遷移が、ｐＨ７．２〜８．５の間にあることを示す。
【０３９１】
実施例２８：ｐＨインジケータとしてセルロースのようなＯＨが豊富な表面へのブロモクレゾールパープルの３ステップの固定化。
【０３９２】
１．ステップ：撹拌条件下、周囲温度での、酢酸（５７μＭ）中のＧＰＴＭＳ（９ｍＭ〜４５０ｍＭ）の１０〜１８０分間の反応。
【０３９３】
２．ステップ：反応溶液中のＯＨが豊富な表面（例えば、セルロース）の浸漬。８０〜１２０℃で、５〜２０分間浸漬した材料のインキュベーション。
【０３９４】
３．ステップ：ブロモクレゾールパープル（０．１〜３．３ｍｇ／ｍｌ）は、前処理した材料上に塗布し、１２０℃で２０分間乾燥させた。
【０３９５】
異なるｐＨ値で異なる色を、表６に列挙する。
表６：固定化したブロモクレゾールパープルの異なるｐＨ値および対応する色
【表９】
2019513238.tif 000030
【０３９６】
実施例２９：ホスホリパーゼＣ系試験−液体システム
診断システムの調製
この診断ツールについて、ホスホリパーゼＣの基質としてｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンを使用した。ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンを、水（５０〜１００ｍＭ）に溶解する。７０％ソルビトール（ｐＨ７．２）を有する２５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液を、アッセイ緩衝液として使用した。２３０μｌの緩衝液および１００μｌの基質を、マイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０３９７】
診断：５〜１２μＬ、優先的に８〜１０μｌの体積の創傷流体試料を、試験システムに添加し、手動振盪によって１０秒間混合する。この混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、感染は、無色から黄色への色の変化によって示されるであろう。
【０３９８】
試験プロトコルおよび結果：
感染した創傷流体試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、ＩＡに記載される診断システムとともにインキュベートする。３０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１０】
2019513238.tif 000031
【０３９９】
実施例３０：ホスホリパーゼＡ２系試験−液体システム
診断システムの調製。  この診断ツールについて、ホスホリパーゼＡ２−基質として４−ニトロ−３−オクタノイル安息香酸を使用した。４−ニトロ−３−オクタノイル安息香酸（１，７ｍＭ）を、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，２）、１５０ｍＭのＫＣＬ、および１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するアッセイ緩衝液に溶解する。１９０μｌの緩衝液を、マイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０４００】
診断：５〜１２μＬ、優先的に８〜１０μｌの創傷流体試料の体積を、試験システムに添加し、１０秒間手動振盪によって混合する。この混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、感染は、無色から黄色への色の変化によって示されるであろう。
【０４０１】
試験プロトコルおよび結果：感染した創傷流体試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、ＩＡに記載される診断システムとともにインキュベートする。３０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１１】
2019513238.tif 000032
【０４０２】
実施例３１：カタラーゼ系試験−液体システム
診断システムの調製：
この診断ツールについて、カタラーゼの基質としてパーパルドを使用した。パーパルトを、水（５０〜１００ｍＭ）に溶解する。２００μｌの基質溶液を、マイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０４０３】
診断：５〜１２μＬ、優先的に８〜１０μｌの創傷流体試料の体積を、試験システムに添加し、１０秒間手動振盪によって混合する。この混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、感染は、無色から濃紫色への色の変化によって示されるであろう。
【０４０４】
試験プロトコルおよび結果：感染した創傷流体試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、ＩＡに記載される診断システムとともにインキュベートする。３０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して紫色のみの色の変化を示した。
【表１２】
2019513238.tif 000033
【０４０５】
実施例３２：体液の試験
ＭＰＯ、エラスターゼ、リゾチーム、ホスホリパーゼ、およびカタラーゼのうちの１つ以上のための基質を含有する材料、および任意に、ｐＨインジケータを、創傷、涙、硝子体、ＣＳＦ、気道吸引もしくは唾液、滑液、血液、血漿、血清、尿、腹膜、皮下、胆液、腸管もしくは同様の流体などの体液と接触させる。感染生物または組織からの試料は、より高い反応度を示す傾向がある。反応物のうちの１つ以上の組み合わせを、感染およびその度合いを検出するために使用する。
【０４０６】
実施例３３：エラスターゼ系試験−液体システム
０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．５ＭのＮａＣｌを含有）中のＤＭＳＯ中の２０ｍＭの濃度で溶解した、１００μＬのＮ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドニトロ溶液を、透明なエッペンドルフチューブにピペットで移す。Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドの最終濃度は、０．０５〜２．５０ｍＭであり得、優先的には、０．８０〜１．２０ｍＭである。１〜１５μＬ、優先的に２〜５μＬの体積の喀痰試料を、試験システムに添加し、手動振盪によって１０秒間混合する。この混合物を、室温で５分間インキュベートする。その後、創傷感染は、薄いピンク色から黄色への色の変化によって示されるであろう。非感染喀痰試料を含有する混合物は、色を変化しないであろう。２μＬの感染した喀痰試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染喀痰試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、１．０ｍＭのＮ−メトキシコスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドの基質濃度を含有するＩＡに記載される診断システムでインキュベートした。１０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した喀痰試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１３】
2019513238.tif 000034
【０４０７】
実施例３４：エラスターゼ系試験−セルロース紙系システム
診断システムの調製。
Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドを、ジメトキシスルホキシド中で２８１ｍＭの濃度で溶解する。２〜５μｌ、優先的に２μｌのこの溶液を、ワットマン濾紙にピペットで移した。
【０４０８】
次いで、Ｎ−メトキシコスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドでインキュベートしたワットマン濾紙の試験システムを、１〜５μｌ、優先的に２μｌの喀痰試料および２μｌ  ２μｌのＮａＣｌ（５０ｍＭ）でインキュベートし、室温で５分間インキュベートする。その後、感染は、黄色への濾紙の色の変化によって示されるであろう。いかなる感染した喀痰試料も、色の変化しないであろう。
【０４０９】
ワットマン濾紙の小さな綿棒を用いて、感染した試料（Ａ、Ｂ）および非感染試料（Ｃ、Ｄ）を、採取し、基質ｍＭのＮ−メトキシコスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドを含有する１Ｃに記載される診断システムに置かれた。１０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１４】
2019513238.tif 000035
【０４１０】
実施例３５：カテプシン系試験−液体システム
Ｎ−スクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを、ジメトキシスルホキシド中の２０ｍＭの濃度で溶解し、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有）中で稀釈する。Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ  ｐ−ニトロアニリドは、０．５〜５ｍＭであり得、優先的に３ｍＭである。
【０４１１】
１〜５μＬ、優先的に２〜４μＬの体積の喀痰試料を、試験システムに添加し、手動振盪によって混合する。この混合物を、３７℃で２０分間インキュベートする。その後、感染は、黄色への色の変化によって示されるであろう。非感染試料を含有する混合物は、色を変化しないであろう。
【０４１２】
５μＬの感染した喀痰試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染喀痰試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、３．０ｍＭのＮ−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドの基質濃度を含有するＩＡに記載される診断システムでインキュベートした。
【０４１３】
２０〜３０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１５】
2019513238.tif 000036
【０４１４】
実施例３６：カテプシン系試験−セルロース系システム
Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを、ジメトキシスルホキシド中の２０ｍＭの濃度で溶解し、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有）中で稀釈する。Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドの最終濃度は、０．５〜１０ｍＭであり得、優先的に５．００ｍＭである。１０μＬのこの溶液を、ワットマン濾紙にピペットで移した。
【０４１５】
次いで、Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドでインキュベートしたワットマン濾紙の試験システムを、１〜５μｌ、優先的に２μｌの喀痰試料、および２μｌ  ２μｌのＮａＣｌ（５０ｍＭ）でインキュベートし、室温で２０分間インキュベートする。その後、感染は、黄色への濾紙の色の変化によって示されるであろう。いかなる感染した喀痰試料も、色の変化しないであろう。
【０４１６】
ワットマン濾紙の小さな綿棒を用いて、感染した試料（Ａ、Ｂ）および非感染試料（Ｃ、Ｄ）を、採取し、基質  ｍＭ  Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドを含有する１Ｃに記載される診断システムに置かれた。２１０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１６】
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【０４１７】
実施例３７：ミエロペルオキシダーゼ系試験−液体システム
この診断ツールについては、６つの異なる基質、すなわち、ＴＭＢ、ＡＢＴＳ、グアイアコール、４−アミノ−３−メトキシ安息香酸、およびＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲを使用することができる。０．３Ｍのスクロースを含む３３５０μｌのコハク酸塩緩衝液（ｐＨ５．４）を使用し、１５μｌの１％  Ｈ２Ｏ２および７μｌの基質（５〜４０ｍＭのＡＢＴＳ、２０〜１５０ｍＭのＴＭＢ、０．０２５ｍＭのＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、１０〜５０ｍＭの４−アミノ−３−メトキシ安息香酸、および１０〜２０ｍＭのグアイアコール）を添加した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を、初めに、Ｎ，Ｎ−メチルホルミアミドに溶解し、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲを、エタノールに溶解するが、ＡＢＴＳを、水中に溶解し得、４−アミノ−３−メトキシ安息香酸を、ＤＭＳＯに溶解する。グアイアコール．１００μｌの溶液を、マイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０４１８】
１〜７μＬ、優先的に４〜６μＬの体積の喀痰試料を、試験システムに添加し、手動振盪によって１０秒間混合する。この混合物を、室温で１０分間インキュベートする。その後、感染は、それぞれ、無色から青色（ＴＭＢまたは緑色（ＡＢＴＳ）、茶色から赤色（４−アミノ−３−メトキシ安息香酸およびグアイアコール）の色の変化によって示されるであろう。非感染試料を含有する混合物は、色が変化しないであろう。
【０４１９】
感染した喀痰試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染喀痰試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、異なる基質を含有するＩＡに記載される診断システムとともにインキュベートする。５分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対してＴＭＢのみの場合に青色への色の変化を示した。
【表１７】
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【０４２０】
実施例３８：ミエロペルオキシダーゼ系試験−セルロース系システム
１，５μｌのＨ２Ｏ２（５０ｍＭ）および１，５μｌの基質（１０９ｍＭのＡＢＴＳ、４５４ｍＭのＴＭＢ、２３０ｍＭのＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ、ｘｍＭのグアイアコール、ｘｍＭの４−アミノ−３−メトキシ安息香酸）を、小型ワットマン濾紙ディスク上にインキュベートした。
【０４２１】
次いで、異なるＭＰＯ基質でインキュベートしたワットマン濾紙の試験システムを、１〜５μｌ、優先的に２μｌの喀痰試料でインキュベートし、室温で５分間インキュベートする。その後、感染は、青色、緑色、または茶色っぽい赤色への濾紙の色の変化によって示されるであろう。いかなる感染した喀痰試料も、色の変化しないであろう。
【０４２２】
ワットマン濾紙の小さな綿棒を用いて、感染した試料（Ａ、Ｂ）および非感染試料（Ｃ、Ｄ）を、採取し、基質ＴＭＢ、ＡＢＴＳ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、グアイアコール、および４Ａ３Ｍｂａを含有する１Ｃに記載される診断システムに置かれた。５分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂの場合に茶色（４Ａ３Ｍｂａ）の色の変化を示した。
【表１８】
2019513238.tif 000039
【０４２３】
実施例３９：ホスホリパーゼＡ２系試験−液体システム
この診断ツールについて、ホスホリパーゼＡ２−基質として４−ニトロ−３−オクタノイル安息香酸を使用した。４−ニトロ−３−オクタノイル安息香酸（１，７ｍＭ）を、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，２）、１５０ｍＭのＫＣＬ、および１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するアッセイ緩衝液に溶解する。１９０μｌの緩衝液を、マイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０４２４】
５〜１２μＬ、優先的に８〜１０μｌの体積の喀痰創傷流体試料を、試験システムに添加し、手動振盪によって１０秒間混合する。この混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、感染は、無色から黄色への色の変化によって示されるであろう。感染した喀痰試料（Ａ、Ｂ）および非感染試料（Ｅ、Ｆ）を、ＩＡに記載される診断システムとともにインキュベートする。３０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して黄色のみの色の変化を示した。
【表１９】
2019513238.tif 000040
【０４２５】
実施例４０：カタラーゼ系試験−液体システム
この診断ツールについて、カタラーゼの基質としてパーパルドを使用した。パーパルトを、水（５０〜１００ｍＭ？）に溶解する。２００μｌの基質溶液を、マイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０４２６】
５〜１２μＬ、優先的に８〜１０μＬの体積の喀痰試料を、試験システムに添加し、手動振盪によって１０秒間混合する。この混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、感染は、無色から濃紫色への色の変化によって示されるであろう。
【０４２７】
感染した創傷流体試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、ＩＡに記載される診断システムとともにインキュベートする。３０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した喀痰試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して紫色のみの色の変化を示した。
【表２０】
2019513238.tif 000041
【０４２８】
実施例４１：リゾチーム系試験−液体システム
１〜１５ｍｇの量のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ  ｐｅｐ−チドグリカンを、１５ｍｌの０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁される。優先的に、８〜１０ｍｇの量を、懸濁される。２９０μＬのこの溶液を、透明なマイクロタイタープレートにピペットで移す。
【０４２９】
１０μＬの体積の喀痰を、試験システムに添加し、手動振盪によって１０秒間混合する。この混合物を、３７℃で１５分間インキュベートする。その後、感染は、濁度の低下によって示されるであろう。非感染試料を含有する混合物は、変化しないであろう。
【０４３０】
１０μＬの感染した喀痰試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）および非感染喀痰試料（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、リゾチームの基質としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを含有する２Ａに記載される診断システムでインキュベートした。２０分のインキュベーション後の試料の外観検査は、感染した試料Ａ、Ｂ、およびＣに対して濁度のみの変化を示した。
【表２１】
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【０４３１】
感染の検出のためのリゾチーム活性測定
染色したペプチドグリカン。
【０４３２】
ＬＰＧ−ＲＢ５バリアント毎の１つの懸濁液（１．５ｍｇ／ｍｌ）を、調製し（ＮａＣｌ溶液、０．９％）、６  １ｍｌの試料に、それぞれ分けた（３陽性、３陰性）。陽性対照を、１０，０００Ｕ／ｍｌの最終リゾチーム活性になるまでリゾチームストック溶液（１０μｌ、１，０００，０００Ｕ／ｍｌ）と混合した。全ての試料を、３７℃で６０分間インキュベートし、その後、遠心分離した（５分、１００００ｇ）。青色の発生を、上清中で検出した。１００μｌの各上清を、９６ウェルプレートに移し、吸収度を、５９７ｎｍで測定した。
【０４３３】
他の実施形態：
前述の実施例は、一般的にまたは具体的に記載される反応物質を置換する、および／または前述の実施例に使用されるもののためにこの開示された技術の条件を操作することによって同様に首尾よく繰り返すことができる。
【０４３４】
前述の説明から、当業者は、この開示された技術の本質的な特性を容易に確認し、その精神および範囲から逸脱することなく、開示される技術の様々な変更および修正を行い、様々な使用量および条件に適合させ得る。
【０４３５】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この開示された技術が属する当業者により通常理解されているものと同様の意味を有する。本明細書に記載されるものに類似したまたは等価な方法および材料を、開示される技術の実施または試験において使用することもできるが、適切な方法および材料は、上述の段落に記載されている。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであり、限定的であることを意図されない。矛盾する場合、定義を含む本明細書は、制御するであろう。
【０４３６】
本明細書に引用される全ての米国特許および公開または非公開米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される全ての公開参考文献、文書、写本、および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されるＮＣＢＩ、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＢＩ、ＰＵＢＭＥＤデータベースに付随する全ての識別子および受入番号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３７】
本開示の技術の好ましい実施形態が本明細書に示され説明されてきたが、そのような実施形態が単に例として提供されることは当業者には明白であろう。現在、多くの変形、変更、および置換が、開示される技術から逸脱することなく当業者が思いつくだろう。本明細書に記載される開示される技術の実施形態の様々な代替案が開示される技術の実施で使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、開示される技術の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内の方法および構造は、それらに含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019513238.tif 000049
【図８】
2019513238.tif 000050
【図９】
2019513238.tif 000051
【図１０】
2019513238.tif 000052
【図１１】
2019513238.tif 000053
【配列表】
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【国際調査報告】
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