(57)【要約】  本発明は、薬物送達における改善、より詳細には、例えば、ｉ）２つのアミノ酸をステープルしてステープルＣＰＰ’ｓ（ＳｔａＰ’ｓ）を形成するかまたはｉｉ）３つ以上のアミノ酸をステッチしてステッチＣＰＰ’ｓ（ＳｔｉＰ’ｓ）を形成することにより安定化されている細胞透過剤（ＣＰＡ’ｓ）または細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ’ｓ）の使用に関する。これらの安定化ＣＰＰ’ｓは、ＢＡＣがＣＰＰにより細胞膜を介して運搬され得るように、直接的にまたは二機能リンカー（ＢＦＬ）を介して薬剤または生物活性化合物（ＢＡＣ）に複合される。得られる分子は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ’ｓ）と称される。好ましいＢＡＣは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）などの電気的に低い電荷を有するオリゴヌクレオチドである。本発明はまた、ＢＡＣの細胞への取り込みを促進する方法、内因性または外因性遺伝子の改変を必要とする疾患の治療におけるＤＣＣＰＭの使用、薬剤またはＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法、薬剤またはＢＡＣを天然状態で薬剤またはＢＡＣに対して抵抗性がある部位に導入する方法、本発明のＤＣＣＰＭ’ｓを投与するステップを含む対象を治療する方法、ならびにＤＣＣＰＭおよび１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物に関する。【選択図】図５Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．生物活性化合物（ＢＡＣ）、および
ｉｉ．細胞透過剤（ＣＰＡ）
を含み、ここでＢＡＣおよびＣＰＡは直接的にまたは二機能リンカー（ＢＦＬ）を介して連結され、かつ前記ＣＰＡは、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することによりその上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチド（ＣＰＰ）である、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）。
【請求項２】
前記ＳｔｉＰまたはＳｔａＰが、前記ペプチドの２つのアミノ酸間にクロスリンクまたは架橋を含む、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３】
前記クロスリンクまたは架橋が、２つの成分、炭化水素架橋および末端メチル基を含む、請求項２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項４】
前記ペプチドが、全炭化水素テザーを有する少なくとも２つの非天然アミノ酸（例えば、α−メチル、α−ペンテニルグリシン）を含む、請求項２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項５】
ＣＰＡが、（Ｓ）−ペンテニルアラニン（Ｓ５）もしくはその鏡像異性体（Ｒ５）、Ｓ−オクテニルアラニン（Ｓ８）もしくはその鏡像異性体（Ｒ８）またはそれらの組み合わせ（例えば、Ｒ−オクテニルアラニン／Ｓ−ペンテニルアラニン（Ｒ８／Ｓ５）またはＳ−オクテニルアラニン／Ｒ−ペンテニルアラニン（Ｓ８／Ｒ５）の１つ以上を組み込むステープルまたはステッチで安定化される、請求項３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項６】
表１の非天然アミノ酸の１つ以上の間にクロスリンクまたは架橋を含む、請求項２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項７】
前記安定化ペプチドが、共有結合により形成される２つ以上のオレフィン含有側鎖を含む、請求項６に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項８】
前記安定化された立体構造が少なくとも１つのαヘリックスを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項９】
前記安定化された立体構造が少なくとも１つのβシートを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１０】
前記安定化された立体構造が少なくとも１つのαヘリックスおよび１つのβシートを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１１】
前記ＢＡＣがオリゴヌクレオチド（ＯＮ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１２】
前記ＯＮが電気的に低い電荷を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１３】
前記ＯＮが電気的に中性の電荷を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１４】
前記ＯＮが、ポリ核酸（ＰＮＡ）またはホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である、請求項１２または１３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１５】
前記ＯＮが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１６】
前記ＯＮが、表４の化合物から選択される化学物質を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１５に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１７】
前記ＢＡＣが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である、請求項１１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１８】
前記ＢＡＣが、内因性または外因性遺伝子の発現を改変する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１９】
前記内因性遺伝子が、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患または後天性ウイルス感染症を標的にする、請求項１８に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２０】
前記ＢＦＬが、表５の化学物質から選択される化学物質を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２１】
シクロヘキサンスペーサーによって分離されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびマレイミド反応基を含有するアミンからスルフヒドリルへのクロスリンカーを含む、請求項２０に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２２】
前記ＢＦＬが、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）である、請求項２０または２１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２３】
前記ＢＦＬがＨＮＡであり、かつ前記ＣＰＰの末端に組み込まれている、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２４】
前記ＢＦＬがＨＮＡであり、かつ前記ＯＮが、共有結合による複合を促進するため、４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾されている、請求項２３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２５】
前記ＳＭＣＣがＰＥＧ化される、請求項２２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２６】
前記ＨＮＡがＰＥＧ化される、請求項２３または２４に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２７】
前記ＣＰＡが前記ＢＦＬの第１の末端に共有結合により連結される、請求項２０に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２８】
前記ＢＡＣが前記ＢＦＬの第２の末端に共有結合により連結される、請求項２０に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２９】
１．５ＫＤａより大きいサイズを有する、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３０】
生物活性化合物（ＢＡＣ）の細胞への取り込みを、前記生物活性化合物の、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）との直接的なまたは二機能リンカー（ＢＦＬ）を介した複合によって薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を形成し、かつ前記ＤＣＣＰＭを好適な溶媒中で前記細胞に提示することにより、促進するための方法。
【請求項３１】
内因性または外因性遺伝子の発現の改変を必要とする疾患の治療に用いられる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３２】
神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患または後天性ウイルス感染症の治療に用いられる、請求項３１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に用いられる、請求項３１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３４】
前記ジストロフィン遺伝子のＡＯＮ標的化エクソン５１を含む、請求項３３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３５】
薬剤またはＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法であって、前記薬剤またはＢＡＣを、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結するステップを含む、方法。
【請求項３６】
薬剤またはＢＡＣを天然状態で前記薬剤またはＢＡＣに対して抵抗性がある部位に導入する方法であって、前記薬剤またはＢＡＣを、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結するステップと、それを対象に投与するステップと、を含む、方法。
【請求項３７】
前記組織が、心臓、脳、筋肉または肝臓の１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
内因性または外因性遺伝子の発現を改変するように対象を治療する方法であって、請求項１〜２９または３１〜３４のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭを投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
請求項１〜２９または３１〜３４のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭおよび１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物。
【請求項４０】
経口的、非経口的、静脈内または局所的投与に適応した、請求項３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達における改善に関する。
【０００２】
より詳細には、細胞透過剤（Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）（ＣＰＡ’ｓ）の使用、より詳細にはさらに、例えば：ｉ）２つのアミノ酸をステープルして（ｓｔａｐｌｉｎｇ）ステープルＣＰＰ’ｓ（ｓｔａｐｌｅｄ  ＣＰＰ’ｓ）（ＳｔａＰ’ｓ）を形成するかまたはｉｉ）３つ以上のアミノ酸をステッチして（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）ステッチＣＰＰ’ｓ（ｓｔｉｔｃｈｅｄ  ＣＰＰ’ｓ）（ＳｔｉＰ’ｓ）を形成することにより安定化されている細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ’ｓ）の使用に関する。
【０００３】
これらの安定化されたＣＰＰ’ｓは、薬剤または生物活性化合物（ＢＡＣ）に直接的にまたは二機能リンカー（ＢＦＬ）を介して複合されることにより、ＢＡＣはＣＰＰにより細胞膜を介して運搬され得る。得られる分子は、薬剤担送細胞透過分子（Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（ＤＣＣＰＭ’ｓ）と称される。
【０００４】
この様式で送達される好ましいＢＡＣ’ｓは、オリゴヌクレオチド（ＯＮ’ｓ）、より好ましくはさらに電気的に低い電荷を有するオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３）、最も好ましくは電気的に中性のオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−１〜＋１）、例えば限定はされないが、ポリ核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ’ｓ）またはその修飾誘導体である。
【０００５】
好ましいＢＦＬは、アミン基などの修飾を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含むようにＰＥＧ化されるか、またはスペーサー、例えばβ−アラニンを組み込んでもよい。これらの修飾は、可溶化を改善するかまたは機能的部分間の適切なスペーシングを提供し得る。
【０００６】
本発明はまた、ＢＡＣの細胞への取り込みを促進する方法、内因性または外因性遺伝子の改変を要求する疾患の治療におけるＤＣＣＰＭの使用、薬剤またはＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法、薬剤またはＢＡＣを天然状態で薬剤またはＢＡＣに対して抵抗性がある部位に導入する方法、本発明のＤＣＣＰＭ’ｓを投与するステップを含む対象を治療する方法、ならびにＤＣＣＰＭおよび１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０００７】
さらに、さらなる態様が詳細な説明から明らかになるであろう。
【背景技術】
【０００８】
すべての疾患の治療において、薬剤またはＢＡＣを身体、より好ましくは標的部位での細胞へ、最小毒性で最大効果を保証する様式で送達することが望ましい。これは困難な課題であり得る。
【０００９】
標的化様式で送達される薬剤またはＢＡＣの例が、ＯＮ類似体を含む用語のオリゴヌクレオチド（ＯＮ’ｓ）である。
【００１０】
ＯＮ’ｓは、必須ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質配列を標的にし得、（ｉ）ＲＮＡスプライシング、（ｉｉ）タンパク質翻訳または（ｉｉｉ）他の核酸：核酸もしくは核酸：タンパク質相互作用を抑制するための立体的遮断を含む幾つかの方法で遺伝子発現を調節し得る。
【００１１】
詳細には、ＯＮ’ｓの特異的なＲＮＡ配列モチーフへのハイブリダイゼーションにより、スプライソソームの正確なアセンブリが阻止され、それによりプレｍＲＮＡ中の標的エクソンを認識することができず、ひいては成熟遺伝子転写物中のこれらのエクソンが除去される。インフレームエクソンの除去により、切断されても機能的である遺伝子産物がもたらされ得；フレーム外エクソンの除去により、転写物のフレームシフトがもたらされ、潜在的には中途での停止コドンおよび標的遺伝子発現レベルにおける低下がもたらされる。
【００１２】
加えて、ＯＮ’ｓは、翻訳機構の結合を阻止するため、ウイルス遺伝子転写物の５’翻訳開始部位を標的にするように設計され得る。ウイルス翻訳を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用は十分に確立された技術であり１、マールブルグおよびエボラなどのウイルス出血熱に対する臨床試験にまで進んでいる２，３。
【００１３】
さらに、ＯＮは、二次および三次構造がタンパク質または他の細胞標的に結合し、それにより特定の遺伝子発現レベルまたは他の細胞プロセス（例えば翻訳後修飾）に影響し得るようなアプタマーを形成するように設計され得る。
【００１４】
ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体のｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉに基づくリボヌクレアーゼＨの誘導の利点をしのぐ立体的遮断に基づく抑制の利点は、オフターゲット副作用の可能性低下である。
【００１５】
負荷電骨格を生成するためのＯＮの修飾により、安定性が改善されるが４〜７、これらの骨格化学物質、例えば２’Ｏ−メチルホスホチオエート類似体は、膜毒性の課題を引き出し、血小板減少症および注射部位といった臨床解釈上の問題を引き起こし８、それにより投与プロトコルがますます間欠的になっても有効性が毒性課題により阻止される９。
【００１６】
確かに、国際公開第２０１３／１５０３３８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／０５３６２２号パンフレットは双方とも、小型の（典型的には１．５ＫＤａより小さい）負荷電ＯＮ’ｓを、１５以上のアミノ酸および１５〜２７の範囲内のアミノ酸の正電荷の線状またはステープルペプチドと複合体を形成することにより、送達することを開示している。
【００１７】
ＪＡＣＳ，Ｖｏｌ  １３６，２０１４，ＧＪ  Ｈｉｌｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌでは、細胞を透過できるステープルおよびステッチペプチドが記載されている。これらのペプチドであれば、オリゴヌクレオチドを送達するため、おそらくは上に開示される国際出願中に開示される場合と同様に、すなわち複合体形成により用いることができるという可能性について言及されている。はるかに大型の（１．５ＫＤａ超から、２．５ＫＤａ、５ＫＤａ、７．５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１２．５ＫＤａもしくはそれより大に至るまで）新しい実体を、ＢＡＣをＣＰＡと任意選択的にはＢＦＬを介して共有結合により連結することにより作出することを示唆することはなく、確かに先行的な方法は、複合体形成を促進するため、各々の成分が反対電荷を有することを必要とする。
【００１８】
直接的にまたはＢＦＬを用いて間接的に（共有結合により）複合される、電気的に低い電荷を有するオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３）、最も好ましくは電気的に中性のオリゴヌクレオチド（ｐＨ７．５で電荷−１〜＋１）、例えば限定はされないが、ポリ核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ’ｓ）の使用は、明白でも明確でもなかったが、ＯＮ上の電荷を制限することはさらに、担体としてのより小さいペプチド（１５アミノ酸長未満、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６からわずか４もしくは５に至るまで）の使用を可能にする。
【００１９】
非荷電ＯＮ骨格、例えばホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の使用は、前臨床および臨床状況において欠点のない安全性の記録を有することから興味深いＢＡＣ’ｓを表す２，１０〜１３。
【００２０】
しかし、細胞を透過し、それらの標的に接近するそれらの能力は、それらの非荷電性に起因して損なわれる１４。
【００２１】
したがって、それらの細胞への侵入を促進するという課題を克服することは望ましい。
【００２２】
過去２０年にわたり、薬剤およびＢＡＣ’ｓの生物学的作用部位への送達を促進するＣＰＡ’ｓを開発することに多くの研究が注力されてきた。
【００２３】
その手法は、一般に、ＢＡＣの細胞侵入を促進するため、荷電ペプチドを非共有結合複合体として用いることであった。複合についても試みられている。
【００２４】
国際公開第２０１４／０６４２５８号パンフレットは、既存の複合技術の例である。負荷電ＯＮは、標的化ペプチドにリンカーを介してカップリングされる。標的化ペプチドは、受容体標的化部分であり、ステープルまたはステッチペプチドでなく、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が受容体標的化部分を用いて細胞侵入できるか否かに関しては、一旦負荷電ＯＮがかかる部分に結合されると、非共有結合相互作用がその立体構造を改変することから、当然ながら多くの疑問が生じる１５。
【００２５】
国際公開第８９／０３８４９号パンフレットは、オリゴヌクレオチド−ポリアミド複合体を開示している。ステッチまたはステープルペプチドの使用に関しての開示はない。その記載される方法では、オリゴヌクレオチドは、本質的に、ペプチドの鎖伸長のためのスキャフォールドとして用い、送達のための複合体として用いない。
【００２６】
国際公開第２０１１／１３１６９３号パンフレットは、所与の標的遺伝子に特異的な核酸および神経伝達物質トランスポーターの選択的阻害剤を含有する核酸構築物を記載している。送達剤としてのステッチまたはステープルペプチドの使用に関しての開示はない。
【００２７】
ペプチド媒介性細胞送達を生じさせる能力があるペプチドはまた、細胞送達ペプチド（ＣＤＰ）と称されてもよい。例として、ポリアルギニン、ペネトラチン（アンテナペディアホメオドメインに基づく）、またはＰＭＯ内在化ペプチド（ＰＩＰ）が挙げられる。
【００２８】
しかし、それらの最初の記載１６以来、また多数のＣＰＰが複数のアルギニン、β−アラニンおよび６−アミノヘキサン酸残基（例えば、ポリ−Ａｒｇ１２、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｐｉｐ６ａ）を含有すると仮定すると［ｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／で維持されるデータベース］１７、臨床試験のすべての相を通じて進行しているＣＰＰ送達薬がないことは意外である。部分的には、これは、大部分のＣＰＰ’ｓを有効にする共通のアルギニンリッチコアが、膜変形も引き起こし１８、より高等な哺乳類では、これが禁制的で有毒な副作用、例えば腎臓の尿細管変性として現れること１９が理由であり得る。
【００２９】
生理学的ｐＨでは、またアミノ酸Ｒ基のｐＫａに基づき、形式電荷（ＦＣ）は、式：
【数１】
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（式中、Ｖ＝孤立中性原子の価電子；Ｎ＝規定される原子上の非結合価電子の数；Ｂ＝結合で共有される電子の総数）
に基づいて算出され得る。
【００３０】
確かに、これに基づき、典型的には今日まで用いられるＣＰＰは、多数の正電荷残基を有する。この正電荷と膜毒性との間に相関があることが示されている２０。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
したがって、アミノ酸配列内により少量の正電荷残基を有する一方で、生体膜を通過する能力を保持するＣＰＰは、より臨床的に重要となる。
【００３２】
出願人は、安定化ＣＰＡ’ｓを利用することによりこの主な障害を克服している。薬剤またはＢＡＣを、ステッチおよびステープルペプチドを含む安定化ＣＰＡに連結することにより、意外にも、ＣＰＡ’ｓについての技術の現状よりも１０〜２０倍優れるような増強された細胞取り込み動態が得られている２１，２２。
【００３３】
ジストロフィンを生成する遺伝子を修復するように標的化されたＯＮを送達することにより、このことが例示されている。ＯＮを用いて特定遺伝子を標的化することは、例えば国際公開第２００９／０５４７２５号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１２３３６９号パンフレットによって例示のように、当然ながら本質的に公知である。しかし、これらの公表物では、負荷電骨格が用いられ、カーゴが直接的にまたは複合体形成を用いて送達される。
【００３４】
ステープルおよびステッチペプチド、すなわち２つ連結されたアミノ酸（ステープル）または３つ以上連結されたアミノ酸（ステッチ）を調製するための一方法は、アミノ酸を、例えばオレフィン（アルケン）基を有するように修飾されたペプチドに組み込むことである（固相ペプチド合成中、規定された相対的位置に組み込まれてもよい）。例えば、次に、ペプチドが、典型的には、αヘリックスは本質的ではないが、安定化構造をとるように誘導する、１つ（ステープル［本明細書中でＳｔａＰとして表される］）または２つ以上（ステッチ［本明細書中でＳｔｉＰとして表される］）の全炭化水素クロスリンクを閉じるように樹脂上の閉環メタセシスが用いられる。ＳｔａＰ’ｓにおいては、立体化学的配置に応じて、Ｓ５（Ｓ−ペンテニルアラニン）もしくはＲ５（Ｒ−ペンテニルアラニン）、またはＳ８（Ｓ−オクテニルアラニン）もしくはＲ８（Ｒ−オクテニルアラニン）と称される、非天然アミノ酸の鏡像異性体の一方または双方のいずれかを用いることは好ましい。ＳｔｉＰ’ｓにおいては、さらなる非天然オレフィン含有α，α−ジ置換アミノ酸（Ｂ５またはＢ８）が用いられる。しかし、クロスリンキング法は、非天然オレフィン含有α，α−ジ置換アミノ酸の閉環メタセシスに制限されない。ペプチドを安定化させるため、他のクロスリンキング化学、例えばＯ−アリルセリン類似体（Ｓ−ＯＡＳまたはＲ−ＯＡＳ）間の閉環メタセシスが用いられてもよい。
【００３５】
既存のＣＰＡならびにＳｔｉＰ’ｓおよびＳｔａＰ’ｓの細胞侵入動態は異なる。伝統的なＣＰＰは、エネルギーに依存しない直接的な原形質膜転位を介して、またはエネルギー依存性のクラスリンおよびカベオリン介在性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入するが、本発明にて用いられるＳｔｉＰ’ｓおよびＳｔａＰ’ｓは、エネルギー依存性であるがクラスリンおよびカベオリンに依存しない機構を介して侵入する２１，２３。ＳｔｉＰ’ｓおよびＳｔａＰ’ｓの取り込みがヘパリン硫酸の低下した細胞装飾（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ）とともに抑制されると仮定すると２１、マクロピノサイトーシス侵入機構が推測され２４、この改変された侵入機構が最新式と比べて増強された細胞取り込みおよび生体分布を可能にすることが示唆される。
【００３６】
それらの非修飾ペプチド前駆物質と比較して、ＳｔａＰ’ｓおよびＳｔｉＰ’ｓは、一般に、強固な細胞取り込み、タンパク分解性分解に対する顕著な抵抗性、および非ヒト霊長類において１２時間を超える半減期を支持し得るインビボ安定性を示す２５。薬剤類におけるこうした増強が極めて強固な構造、および例えばα−ヘリックスのコアにおける骨格アミド結合の埋没に由来する可能性は高い。この構造的な強固さはまた、主要組織適合性複合体の設計ではペプチドが提示されるための拡張された立体構造をとる必要があることから、ＳｔｉＰ’ｓおよびＳｔａＰ’ｓが免疫原性を示す可能性を低下させる。膜毒性および免疫原性の潜在的な低下または欠乏は、薬剤およびＢＡＣ’ｓ、例えばＯＮ’ｓに複合されるときの化合物の臨床解釈可能性を高める。
【００３７】
ＢＡＣおよびＣＰＰは、直接的に共有結合により複合され得るか、またはＢＦＬを介して共有結合により複合され得る。複合反応においては、多数の官能基が用いられてもよい。
【００３８】
ＯＮは、ヒト、動物およびより下等な生物における任意の遺伝子に対して立体的遮断を誘導するように用いることができ、それ故、ヒトおよび動物における自然疾患（遺伝性および加齢性疾患を含む）または後天性疾患に適用され得る。
【００３９】
例えば、ウイルス出血熱（ＶＨＦ）は、遷延性の炎症性サイトカイン応答が静脈および動脈の漸進的破壊をもたらすという動物由来の疾病である。ＶＨＦの原因は、エボラおよびマールブルグウイルスならびに幾つかのアレナウイルスを含み；これらの疾患は現在、治療不能と考えられている。ウイルス出血熱は、高熱および出血障害によって特徴づけられ、ショックおよび臓器不全により死をもたらし得る。ＡＳＯは、翻訳機構の結合を阻止するため、ウイルス遺伝子転写物の５’翻訳開始部位を標的にするように設計され得る。ＡＳＯを用いてウイルス翻訳を抑制することは、十分に確立された技術であり１、マールブルグおよびエボラなどのウイルス出血熱に対する臨床試験にまで進んでいる２，３。１つのＰＭＯであるＡＶＩ−７５３７は、２０１４〜１５年の西アフリカでのエボラ大流行において、ヒト使用について評価された。
【００４０】
一部の組織、例えば心臓は、ネイキッドＰＭＯの遺伝子導入に特に抵抗性であり、それは異なる小胞媒介性ＰＭＯ取り込み機構を反映し得る２３。事実、ネイキッドＰＭＯの直接的な心臓内注射は効率的遺伝子導入をもたらすこともなく２６、抵抗性組織は、反復投与または高用量の方法を要求する傾向がある２７〜２９。しかし、ＣＰＰ複合がＰＭＯの生体分布および血清安定性を改善する一方３０〜３２、依然として毒性がパイプラインの開発にとっての主な障害である１９。
【００４１】
立体的遮断をするＡＳＯの有効な臨床解釈としては、ＣＰＰは、ＢＡＣを細胞質または核質に有効に送達する一方で、細胞侵入に関連した任意の毒性を制限する必要がある。
【００４２】
したがって、薬剤またはＢＡＣを標的部位により効率的に、またはより低い毒性および免疫原性で送達することができるＤＣＣＰＭ’ｓを提供するならば、大変望ましいことになる。
【課題を解決するための手段】
【００４３】
本発明の第１の態様によると、
ｉ．生物活性化合物（ＢＡＣ）、および
ｉｉ．細胞透過剤（ＣＰＡ）
を含み、ここでＢＡＣおよびＣＰＡは直接的にまたは二機能リンカー（ＢＦＬ）を介して連結され、かつＣＰＡは、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチド（ＣＰＰ）である、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）が提供される。
【００４４】
ステープルペプチド（ＳｔａＰ）は、例えば２つの立体構造的に隣接したアミノ酸を一緒にステープルすることにより形成されてもよく、またステッチペプチド（ＳｔｉＰ）は、例えば少なくとも３つの立体構造的に隣接したアミノ酸をステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより形成されてもよい。
【００４５】
ステープルまたはステッチする結果、ペプチドの２つの立体構造的に隣接したアミノ酸間でクロスリンクまたは架橋が形成される。
【００４６】
好ましい実施形態では、クロスリンクまたは架橋は、２つの成分、炭化水素架橋および末端メチル基を含む。炭化水素架橋は、二重炭化水素結合または一重炭化水素結合からなってもよい。
【００４７】
ＣＰＰは、好ましくは、全炭化水素テザーを有する少なくとも２つの非天然アミノ酸（例えば、α−メチル、α−ペンテニルグリシン）を含む。
【００４８】
好ましいステープルまたはステッチＣＰＰは、（Ｓ）−ペンテニルアラニン（Ｓ５）もしくはその鏡像異性体（Ｒ５）、Ｓ−オクテニルアラニン（Ｓ８）もしくはその鏡像異性体（Ｒ８）またはそれらの組み合わせ（例えば、Ｒ−オクテニルアラニン／Ｓ−ペンテニルアラニン（Ｒ８／Ｓ５）またはＳ−オクテニルアラニン／Ｒ−ペンテニルアラニン（Ｓ８／Ｒ５）の１つ以上を組み込む。
【００４９】
ＣＰＰ中に組み込まれ、また相互間でクロスリンクまたは架橋を形成するように反応される好ましい非天然アミノ酸は表１中に例示され、一部の例示的かつ好ましい得られるＣＰＰは表２中に例示される。
【００５０】
【表１】
2019508481.tif 000004
【００５１】
【表２−１】
2019508481.tif 000005
【００５２】
【表２−２】
2019508481.tif 000006
【００５３】
【表２−３】
2019508481.tif 000007
【００５４】
【表２−４】
2019508481.tif 000008
【００５５】
【表２−５】
2019508481.tif 000009
【００５６】
【表２−６】
2019508481.tif 000010
【００５７】
代替的なＣＰＰおよびそれらの作製方法は、Ｃｈｕら、２０１４およびそれに関連した補足情報に開示されており、参照により援用される２１。
【００５８】
例証的な安定化ペプチドは、典型的には閉環メタセシスを介して、共有結合により形成された２つ以上のオレフィン含有側鎖を含む。
【００５９】
安定化された立体構造は、典型的には少なくとも１つのαヘリックスを含む。しかし、それは、選択肢の中に、少なくとも１つのターン（例えば限定はされないが、α、β、γ、δまたはπ）、βシートを形成するための幾つかのターン、またはαヘリックス、ターン、もしくはβシートの１つ以上の組み合わせを含んでもよい。
【００６０】
ＣＰＰの形式電荷は、生理学的ｐＨ（約７．５）で算出され、アミノ酸Ｒ基のｐＫａに基づく。これらの値（ｐＫｘ）は表３で表される。
【００６１】
【表３】
2019508481.tif 000011
【００６２】
典型的には現在まで用いられるＣＰＰは、多数の正電荷残基を有する。アミノ酸配列内の正電荷残基の量を低減する一方で、生体膜を通過する能力を保持することは、より臨床的に重要となる。
【００６３】
したがって、表２に例示されるペプチド配列に対する電荷を低減することは可能である。
【００６４】
好ましいＢＡＣは、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）、さらにより好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である。様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド化学物質は表４中に例示され、ここで低電荷または中性電荷化学物質、例えばホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の使用が好ましい。
【００６５】
【表４】
2019508481.tif 000012
【００６６】
ＢＡＣは、内因性または外因性遺伝子の発現を標的にし、改変し得る。内因性遺伝子標的は、限定はされないが、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患に関連する遺伝子を含み、また外因性遺伝子標的は、後天性疾患、例えばウイルス感染症のものを含む。
【００６７】
ＢＡＣがＣＰＰに直接的に連結されてもよい一方、出願人はＢＦＬの使用が望ましいことを見出している。例示的、非限定的なＢＦＬ化学物質が表５中に例示される。
【００６８】
【表５−１】
2019508481.tif 000013
【００６９】
【表５−２】
2019508481.tif 000014
【００７０】
表５に対する脚注として、以下に注意すべきである。
【００７１】
図５Ａは、以下、限定はされないが以下の規定される原子または基が好ましい場合のＤＣＣＰＭの一般構造を強調する。
【００７２】
図５Ｃに図示される好ましい実施形態では、Ｙ１＝窒素、Ｙ２＝水素、Ｙ３＝スペーサー、例えば（ＰＥＧ）ｎ（ｎ＝５）（限定はされないが表５中の同定されたもの）、Ｚ＝硫黄含有部分、例えばシステインおよびＬ＝ＳＭＣＣなどのＢＦＬである。
【００７３】
他の実施形態では、図５Ａに示される構造のバリエーションが利用されてもよい。例えば、別の実施形態が図５Ｄに図示のようにＢＦＬのＣＰＡへの複合のためにチオールを要求しない場合、Ｚ＝Ｙ３である（ここでＹ３は表５中のスペーサーである）。ＢＡＣおよびＣＰＡの複合のために硫黄を要求しない（例えば表５中のエントリー９〜１１に限定されない）ＢＦＬの場合、Ｚ＝ａ（ＬとＹ３との間の共有結合）である。
【００７４】
他の実施形態では、スペーサー、ＢＦＬの使用が要求されなくてもよく、そのような場合、図７に示されるＤＣＣＰＭの形成のためのチオール基、次いで以下が適用される。スペーサーが利用されない場合、Ｙ３は、Ｙ１とＢＡＣとの間の共有結合を表し得、この場合、ＺおよびＬ＝Ｙ１である（ここでＹ１はＣＰＡのＮ末端である）。
【００７５】
これらの化学はさらに拡張されてもよく、表６は、アミノ酸への修飾とそれを介して官能基が導入され、ＤＣＣＰＭに対する望ましい特性を提供し得ることを例証する。これらは、限定はされないが、アセチル、コレステロール、脂肪酸、ポリエチレングリコール、多糖、アミノグリカン、糖脂質、ポリフェノール、核局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体、および標的化分子を含むことになる。
【００７６】
【表６】
2019508481.tif 000015
【００７７】
好ましいリンカー化学では、ＢＦＬとＣＰＰとの間に共有結合を形成するため、シクロヘキサンスペーサーによって分かれたＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびマレイミド反応基を含有するアミン−スルフヒドリルクロスリンカー、すなわち、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）が用いられる。
【００７８】
ＢＦＬとしてＳＭＣＣを用いる中間体化合物およびそれから得られるＤＣＣＰＭの模式図が図５ｂに表される。
【００７９】
特に好ましい実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコールを単一または複数単位の（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎ＝１〜１０個のＰＥＧ分子）で組み込んでもよい。
【００８０】
以降、ＣＰＰが配列ＲＫＦ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５を含み、かつＢＦＬがＰＥＧ化ＳＭＣＣである場合、得られる化合物はＣＰ８Ｍと称される。
【００８１】
ＣＰＰが配列ＲＫＦ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５を含み、かつＢＦＬがＰＥＧ化ヒドラジナル（ｈｙｄｒａｚｙｎａｌ）ニコチン酸（ＨＮＡ）である場合、得られる化合物はＨＰ８Ｍと称される。
【００８２】
ＣＰＰが配列ＲＫＦ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５を含み、かつＢＦＬがＳＭＣＣである場合、得られる化合物はＣ８Ｍと称される。
【００８３】
したがって、ＣＰＡ、例えば化合物ＩＩＩ（図５ｂ）は、必要があれば、優先的に（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎ＝１〜１０）を組み込み、ＢＦＬに共有結合により連結されてもよい。
【００８４】
ＣＰＰへの共有結合は、例えば限定はされないが、β−アラニンまたは任意の他の好適な部分を介してもよい。
【００８５】
好ましい実施形態では、（ＰＥＧ）ｎは硫黄含有分子、例えばシステインを用いて連結され、ＰＥＧ化（ＳＭＣＣ）としての共有結合を可能にする。これは次いでＢＡＣ上の官能基、好ましい実施形態では一次アミン（化合物Ｉ）に共有結合により連結され、それ故、ＤＣＣＰＭ（化合物Ｖ）が生成される。
【００８６】
本発明の第２の態様によると、生物活性化合物（ＢＡＣ）の細胞への取り込みを、生物活性化合物の、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）への直接的なまたは二機能リンカー（ＢＦＬ）を介しての複合により薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を形成し、かつ前記ＤＣＣＰＭを好適な溶媒中の前記細胞に提示することにより、促進するための方法が提供される。
【００８７】
ＢＡＣがＯＮである場合のＤＣＣＰＭを形成するため、ＨＮＡがＣＰＰの末端に組み込まれている場合、共有結合による複合を促進するため、ＯＮは４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾されている。
【００８８】
本発明の第３の態様によると、内因性または外因性遺伝子の発現の改変を要求する疾患の治療にて用いるための本発明の第１の態様のＤＣＣＰＭが提供される。
【００８９】
ＤＣＣＰＭは、例えば、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患の治療において、または後天性ウイルス感染症を治療するため、用いられてもよい。
【００９０】
一実施形態では、ＤＣＣＰＭは、筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において用いられるが、当業者は、本発明が広範囲の遺伝子を標的にするために用いることができることを容易に理解するであろう。
【００９１】
ＤＭＤの場合、ＤＣＣＰＭは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１を標的化するＡＯＮを含んでもよい。
【００９２】
本発明の第４の態様によると、薬剤またはＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法であって、薬剤またはＢＡＣを、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結するステップを含む、方法が提供される。
【００９３】
本発明の第５の態様によると、薬剤またはＢＡＣを、天然状態で薬剤またはＢＡＣに対して抵抗性がある部位に導入する方法であって、薬剤またはＢＡＣを、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するかまたはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより上に設けられた立体構造を有する安定化ペプチドであるＣＰＰに連結するステップと、それを対象に投与するステップと、を含む方法が提供される。
【００９４】
薬剤またはＢＡＣを、例えば心臓、脳または筋肉などの標的組織に投与するため、本発明のＤＣＣＰＭを用いることができる。
【００９５】
本発明の第６の態様によると、内因性または外因性遺伝子の発現を改変するように対象を治療する方法であって、本発明のＤＣＣＰＭを対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００９６】
本発明の第７の態様によると、本発明のＤＣＣＰＭと、組成物が経口的に、非経口的に、静脈内にまたは局所的に投与されることを可能にする１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物が提供される。
【００９７】
本発明の実施形態は、以下の貼付の図面を参照して以下にさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１ａ−ｃ】クロスリンクが形成され得るようにさらなる化学修飾を可能にするオレフィン含有α，α−ジ置換アミノ酸の組み込みによって安定化されているＣＰＰの一般的な模式図を示す。２つのかかる非天然アミノ酸のクロスリンクは、ステープリングと称され；２つを超える非天然アミノ酸を含むクロスリンクは、ステッチングと称される。この模式図は、本願の表１および２に対して参照され得る。
【図１ａ】ＳｔａＰ  ＣＰＡを形成するためのグラブス第１世代触媒を用いる非環化およびｉ，ｉ＋４閉環メタセシス（ＲＣＭ）の例である。
【図１ｂ】通常の還元化学を用いて還元されたＲＣＭ  ＳｔａＰの例である。
【図１ｃ】異なるＳｔａＰまたはＳｔｉＰ  ＲＣＭの立体配置およびそれらに対応する開始位置の選択を示す模式図である。
【図２】ＳｔａＰ上の電荷の相対的位置を図示する（が、位置および電荷は任意の並べ替えまたは組み合わせにおいて変動し得る）、電荷変異体：３＋（ＣＰ８Ｍ−３）、２＋（ＣＰ８Ｍ−２）、１＋（ＣＰ８Ｍ−１）および０＋（ＣＰ８Ｍ−０）の構造を例証する。
【図３】表６で規定されるような変動する官能基を有するＳｔａＰまたはＳｔｉＰ中に組み込まれ得るアミノ酸の構造を例証する。そこでは官能基はバイオコンジュゲーションとして用いることができる。
【図４ａ】ＳｔａＰを形成するためのＲＣＭ反応の表示である。
【図４ｂ】ＳｔａＰおよび非環化を記述するペプチドの得られたＣＤスペクトルを示す。
【図４ｃ】ＣＰ８ＭのＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルである。スペクトルは、１０％Ｄ２Ｏおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウムが添加されたＨ２Ｏ中、室温で収集された。
【図４ｄ】ＣＰ８ＭのＮＯＥＳＹ  ＮＭＲスペクトルである。スペクトルは、１０％Ｄ２Ｏおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウムが添加されたＨ２Ｏ中、室温で収集された。
【図４ｅ】ＣＰ８ＭのＴＯＣＳＹ  ＮＭＲスペクトルである。スペクトルは、１０％Ｄ２Ｏおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウムが添加されたＨ２Ｏ中、室温で収集された。
【図５ａ】表５で規定されるようなリンカーおよびスペーサーの変異体を表すＳｔａＰ  ＤＣＣＰＭの模式図である。
【図５ｂ】ＳｔａＰのＰＭＯへの複合における合成ステップを表すＤＣＣＰＭの模式図である。ＰＭＯが修飾されて５’アミン基（化合物Ｉ）を生成し；ヘテロ二機能性タンパク質架橋剤４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ；化合物ＩＩ）が５’アミン基に付着され、化合物ＩＶを生成し；ｉ，ｉ＋４ステープルペプチド（化合物ＩＩＩ）が複合され、最終ＤＣＣＰＭ（化合物Ｖ）を生成する。
【図５ｃ】ＳＭＣＣリンカーを用いてＯＮに複合されたＣＰ８ＭのＤＣＣＰＭ（例えばＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ）である。
【図５ｄ】ＨＮＡリンカーを用いたＨＰ８ＭのＤＣＣＰＭ（ＰＭＯ−ＨＰ８Ｍ）である。ここや他の箇所でのＦＩＴＣ基は任意の他の蛍光標識であってもよく、あくまで可視化できるように存在する。
【図６】ＦＩＴＣ標識ＰＭＯ（化合物Ｉ）およびＣＰＡ（化合物ＩＩＩ）のｎ末端が二機能リンカーのジスクシンイミジルグルタル酸塩（ＤＳＧ）を介して連結され、化合物ＶＩを形成する場合のＦＩＴＣ標識ＤＣＣＰＭの一般的な模式図を示す。
【図７】ＦＩＴＣ標識ＰＭＯが共有窒素を通じてＣＰＡに直接的に複合され、化合物ＶＩＩを形成する場合のＤＣＣＰＭの一般的な模式図を示す。
【図８ａ−ｏ】図１、図２および図５で表される化合物の合成ステップおよび分子量の液体クロマトグラフィー−質量分析による立体構造を示す。本願中のすべてのＰＭＯは、特に指定がない限り、蛍光標識される。
【図８ａ】ＣＰ８Ｍ−ＮＣのＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ７６Ｈ１３０Ｎ１８Ｏ１６Ｓ２＋（Ｍ＋２Ｈ）２＋における質量：計算値７９１．５、実測値７９１．８；
【図８ｂ】ＣＰ８ＭのＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ７４Ｈ１２５Ｎ１８Ｏ１６Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ）＋における質量：計算値１５５４．９、実測値１５５４．５；
【図８ｃ】Ｃ８ＭのＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ５９Ｈ９５Ｎ１６Ｏ１０Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ）＋における質量：計算値１２２０．５、実測値１２２０．１；
【図８ｄ】ＨＰ８ＭのＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ７７Ｈ１２５Ｎ２０Ｏ１６＋（Ｍ＋Ｈ）＋における質量：計算値１５８６．９、実測値１５８６．５；
【図８ｅ】ＰＭＯのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ３３２Ｈ５００Ｎ１５３Ｏ１１０Ｐ２５（Ｍ）における質量：計算値９１６４．１６７５、実測値９１６４．１８８２；
【図８ｆ】ＰＭＯ−ＳＭＣＣのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ３４４Ｈ５１３Ｎ１５４Ｏ１１３Ｐ２５（Ｍ）における質量：計算値９３８３．２５７０、実測値９３８３．２７０４；
【図８ｇ】ＰＭＯ−ＣＰ８ＭのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ４１８Ｈ６３８Ｎ１７２Ｏ１２９Ｐ２５Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ）＋における質量：計算値１０９３７．１８０６、実測値１０９３７．２３７７；
【図８ｈ】ＮＦ−ＰＭＯ−ＣＰ８ＭのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ３９３Ｈ６１９Ｎ１７２Ｏ１２１Ｐ２５Ｓ（Ｍ）における質量：計算値１０４９０．０３７２、実測値１０４９０．２２６８；
【図８ｉ】ＰＭＯ−ＨＰ８ＭのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ４１７Ｈ６２６Ｎ１７３Ｏ１２７Ｐ２５（Ｍ）における質量：計算値１０８６３．１２８５、実測値１０８６３．０７１６；
【図８ｊ】ＦＩＴＣ３＋（ＣＰ８Ｍ−３）のＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ９２Ｈ１３２Ｎ１８Ｏ２０Ｓ２＋（Ｍ＋２Ｈ）２＋における質量：計算値９２０．５、実測値９２１．０；
【図８ｋ】ＦＩＴＣ２＋（ＣＰ８Ｍ−２）のＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ９２Ｈ１３１Ｎ１７Ｏ２０Ｓ２＋（Ｍ＋２Ｈ）２＋における質量：計算値９１３．０、実測値９１３．６；
【図８ｌ】ＦＩＴＣ１＋（ＣＰ８Ｍ−１）のＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ９２Ｈ１２９Ｎ１４Ｏ２０Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ）＋における質量：計算値１７８３．１、実測値１７８２．６；
【図８ｍ】ＦＩＴＣ＋（ＣＰ８Ｍ−０）のＬＲＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）質量スペクトルである。Ｃ９２Ｈ１２６Ｎ１１Ｏ２０Ｓ−（Ｍ−Ｈ）−における質量：計算値１７３８．１、実測値１７３８．０；
【図８ｎ】ＰＭＯ−４−ＦＢのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ３４０Ｈ５０３Ｎ１５３Ｏ１１２Ｐ２５＋（Ｍ−Ｈ）＋における質量：計算値９２９５．１８０２、実測値９２９５．２１６８；および
【図８ｏ】ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ−ＮＣのＨＲＭＳ（ＬＱＴ−ＥＳＩ）質量スペクトルである。Ｃ４２０Ｈ６４２Ｎ１７２Ｏ１２９Ｐ２５Ｓ＋（Ｍ−Ｈ）＋における質量：計算値１０９６５．２１１２、実測値１０９６５．２１６２。
【図９ａ−ｂ】ＳＭＣＣおよびＨＮＡリンカーシステムの比較複合効率を示す。
【図９ａ】ＵＶ分光学によって分析された、ＨＰ８ＭおよびＰＭＯ−４ＦＢのＰＭＯ−ＨＰ８Ｍへの％転換を示す。％転換は、７０５μＭの開始反応濃度に基づくビス−アリールヒドラゾン結合のＡ３５０により算出された。対応する出発物質（ＨＰ８ＭおよびＰＭＯ−４ＦＢ）および得られる複合体（ＰＭＯ−ＨＰ８Ｍ）のＵＶ特性。
【図９ｂ】ＰＭＯ−ＣＰ８ＭおよびＰＭＯ−ＨＰ８Ｍの％単離収率を示す。
【図１０ａ】トランスフェクション試薬なしの培養下で維持されたヒト骨肉腫細胞株（Ｕ２ＯＳ）へのＤＣＣＰＭ送達における用量依存性増加を示す、蛍光顕微鏡画像を示す。生物活性化合物は、配列：配列ｉｄ１：５’ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ３’（ｍＲＮＡスプライシング成熟の間、エクソン２３の除去を引き起こす、マウスジストロフィン遺伝子のエクソン２３に標的化されるアンチセンス試薬）を有するＰＭＯであり；二機能リンカーはＰＥＧ化ＳＭＣＣであり；かつＳｔａＰはＲＫＦ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５であった。ＤＣＣＰＭのこの立体配置は、後の図面中でＰＭＯ−ＣＰ８Ｍとして表される；複合されないＰＭＯは対照として作用する。すべての化合物が、４時間、トランスフェクション試薬なしの培養下で維持されたＵ２ＯＳ細胞に添加された。
【図１０ｂ】トランスフェクション試薬なしの培養下で維持されたヒト骨肉腫細胞株（Ｕ２ＯＳ）へのＰＭＯおよびＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの送達のグラフ表示である。
【図１１】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＰＭＯの取り込みのフローサイトメトリーによる分析である。細胞は、ＰＭＯの不在下、または１μＭのＰＭＯ、１μＭのＰＭＯ−Ｃ８Ｍもしくは１μＭのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ−ＮＣの存在下（すべてはフルオレセイン標識された）、３７℃で４時間インキュベートされた。細胞をＰＢＳで洗浄後、蛍光が測定された。
【図１２ａ】４時間、トランスフェクション試薬なしで、ＦＩＴＣ＋３（ＣＰ８Ｍ３）、ＦＩＴＣ＋２（ＣＰ８Ｍ−２）およびＦＩＴＣ＋１（ＣＰ８Ｍ−１）で処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１２ｂ】４時間、トランスフェクション試薬なしで、ＦＩＴＣ＋３（ＣＰ８Ｍ３）、ＦＩＴＣ＋２（ＣＰ８Ｍ−２）およびＦＩＴＣ＋１（ＣＰ８Ｍ−１）で処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。グラフはＦＬ１の平均蛍光強度を表す。
【図１３】ＰＭＯが蛍光標識を有する場合、トランスフェクション試薬なしの培養下で維持されたジストロフィン遺伝子のｍｄｘ突然変異（Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ）を有するマウス細胞株への５μＭのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは５μＭのＰＭＯのいずれかの送達の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図１４】ＰＭＯが蛍光標識を有する場合、マウスジストロフィンエクソン２３のエクソン除去が、５μＭのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍが遺伝子導入されている（５μＭのＰＭＯ単独で処理されたものを除く）Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ細胞に制限されることを示すアガロースゲル電気泳動画像を示す。ＰＭＯ−ＣＰ８ＭまたはＰＭＯとのインキュベーション後２４時間で、Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ細胞が回収され、ＲＮＡが単離された。ＲＮＡが逆転写され、マウスジストロフィン遺伝子のエクソン２０〜２６の間の増幅、それに続くエクソン２０〜２６の間のネステッド増幅が実施され、エクソン２３が存在する場合に９０１ｂｐの断片またはエクソン２３が除去される場合に６８８ｂｐの断片が完全長産物として得られた。
【図１５】ｍｄｘマウスの、２．２ナノモルのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは２．２ナノモルのＰＭＯのいずれかの前脛骨筋への単回筋肉内注射（ＰＭＯのモル濃度に関連する用量）後の前脛骨筋からのジストロフィンに対する免疫細胞化学染色を示す。筋肉は投与７日後に回収された。
【図１６】２．２ナノモルのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは２．２ナノモルのＰＭＯのいずれかが注射されたｍｄｘマウスの前脛骨筋からのジストロフィンに対する免疫細胞化学染色について陽性である骨格筋線維の数のグラフ表示を示す。すべての用量がＰＭＯのモル濃度に照らして投与される。
【図１７ａ−ｄ】ｍｄｘマウスの骨格筋からのジストロフィンに対する免疫細胞化学染色を示す。
【図１７ａ】１マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは１マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ［＊蛍光標識されていないＰＭＯを表す］の単回腹腔内注射後の横隔膜から得られる。筋肉は投与７日後に回収された。
【図１７ｂ】全部で４．４マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは４．４マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの複数回静脈内注射後である。
【図１７ｃ】全部で１０．９マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは１０．９マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの複数回腹腔内注射後である。
【図１７ｄ】腹腔内投与後のジストロフィンに対する免疫細胞化学染色について陽性である骨格筋線維の数のグラフ表示である。すべての用量が、ＰＭＯ［＊蛍光標識されていないＰＭＯを表す］のモル濃度に照らして投与される。筋肉は投与１４日後に回収された。
【図１８ａ−ｃ】心筋からのジストロフィンに対する免疫細胞化学染色を示す。
【図１８ａ】１マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは１マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの単回腹腔内注射後のｍｄｘマウスに関する。筋肉は投与７日後に回収された。
【図１８ｂ】全部で７．６マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは７．６マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの複数回腹腔内注射後である。筋肉は投与１４日後に回収された。
【図１８ｃ】全部で１０．９マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは１０．９マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの複数回腹腔内注射後である。
【図１８ｄ】全部で７．６マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは７．６マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの複数回腹腔内注射後のジストロフィンに対する免疫細胞化学染色について陽性である心筋線維の数のグラフ表示である。
【図１８ｅ】全部で１０．９マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは１０．９マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの複数回腹腔内注射後のジストロフィンに対する免疫細胞化学染色について陽性である心筋線維の数のグラフ表示である。すべての用量がＰＭＯ［＊蛍光標識されていないＰＭＯを表す］のモル濃度に照らして投与される。心臓は投与１４日後に回収された。
【図１９】ｍｄｘマウスの、８．７ＫＤａの全カーゴサイズを有するＰＭＯ−ＣＰ８Ｍおよび９．２ＫＤａの全カーゴサイズを有するＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの腹腔内注射後の心筋からのジストロフィンに対する免疫細胞化学染色を示す。心臓は投与１４日後に回収された。
【図２０】ｍｄｘマウスの、１マイクロモル／ｋｇのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍまたは１マイクロモル／ｋｇのＰＭＯの単回腹腔内注射後の小脳からのジストロフィンに対する免疫細胞化学染色を示す。すべての用量がＰＭＯ［＊蛍光標識されていないＰＭＯを表す］のモル濃度に照らして投与される。小脳は投与７日後に回収された。
【図２１】ＰＭＯまたはＰＭＯ−ＨＰ８Ｍのｍｄｘマウスへの静脈内投与後のフルオレセイン標識ＰＭＯのインビボでの肝細胞取り込みを示す（単回静脈内注射、１マイクロモル／ｋｇ、注射２週間後に分析された）。注射されていないｍｄｘマウスが陰性対照として用いられた。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
詳細な説明
本発明は、特許請求される発明の利益を立証する単一例を参照して例示される。
【０１００】
細胞取り込みを実証するため、例示的な薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）が、ＦＩＴＣ標識を伴って作製された（実施例１）。
【０１０１】
例示的なＤＣＣＰＭは、
ｉ）生物活性化合物（ＢＡＣ）−（非限定例として表４を参照）；
ｉｉ）安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）（非限定例として表２を参照）；および
ｉｉｉ）二機能リンカー（ＢＦＬ）（非限定例として表５を参照）
を含む。
【０１０２】
ＤＣＣＰＭを形成する３つの成分は下記により詳細に説明されるが、図５に図示される通り、ＢＡＣおよびＣＰＡは直接的に連結され得る（図６）。
【０１０３】
１．生物活性化合物
生物活性化合物は、生体細胞内で生物学的効果を発揮し得る任意の化合物である。好ましくは、本質的ではないが、ＢＡＣは、１つ以上の内因性または外因性遺伝子の発現に対して影響するものである。例として、核酸、ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタマーおよび医薬品が挙げられる。本発明で用いられる好ましい生物活性化合物は、小さい電荷（正または負のいずれか）を与え得るポリ核酸（ＰＮＡ）またはＰＭＯまたはそれらの修飾誘導体などの電気的に中性のオリゴヌクレオチド（生理学的ｐＨが約７．５で電荷−１〜＋１）を含む。
【０１０４】
生物活性化合物は、ｉ）ＲＮＡスプライシング；ｉｉ）タンパク質翻訳またはｉｉｉ）他の核酸：核酸または核酸：タンパク質相互作用（内因性または外因性（病原体由来）遺伝子の遺伝子発現を改変する）を抑制または増強するための立体的遮断化合物として用いられてもよい。
【０１０５】
ＯＮの特異的なＲＮＡ配列モチーフへのハイブリダイゼーションにより、スプライソソームの正確なアセンブリが阻止され、それによりプレｍＲＮＡ中の標的エクソンを認識することができず、ひいては成熟遺伝子転写物中のこれらのエクソンが除去される。インフレームエクソンの除去により、切断されても機能的である遺伝子産物がもたらされ得；フレーム外エクソンの除去により、転写物のフレームシフトがもたらされ、潜在的には中途での停止コドンおよび標的遺伝子発現レベルにおける低下がもたらされる。
【０１０６】
加えて、ＯＮは、翻訳機構の結合を阻止するため、内因性またはウイルス遺伝子転写物の５’翻訳開始部位を標的にするように設計され得る。ウイルス翻訳を抑制するためのＡＳＯの使用は十分に確立された技術であり、マールブルグおよびエボラなどのウイルス出血熱に対する臨床試験にまで進んでいる。
【０１０７】
さらに、ＯＮは、転写物の安定性を改変する内因性転写物の３’非翻訳領域を標的にするように設計され得る。かかる標的は、限定はされないが、転写物のポリアデニル化および／または切断部位を含む。
【０１０８】
さらに、ＯＮは、二次および三次構造がタンパク質または他の細胞標的に結合し、それにより特定の遺伝子発現レベルに影響し得るようなアプタマーを形成するように設計され得る。
【０１０９】
非限定例のＯＮ化学物質が表４中に例示される。
【０１１０】
例示される非限定例では、標的は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１であり、配列：
配列ｉｄ２：５’ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ３’
を含む。
【０１１１】
２．安定化ペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）
本発明の細胞透過剤は、安定化ペプチドである。
【０１１２】
ペプチドは、ステープルしてステープルペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか、またはステッチしてステッチペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより安定化されてもよい。
【０１１３】
全炭化水素ステープルおよびステッチは、特性、例えば、αヘリカル構造、プロテアーゼ抵抗性、細胞浸透率、および生物学的活性を与え得る。
【０１１４】
ステープルおよびステッチペプチド配列の非限定例が、表２中に例示され、（表２中に規定されるような）Ｓ５、Ｓ８およびＢ５を含むペプチド配列を含む。
【０１１５】
例えばαヘリカル構造の安定化は、例えば閉環メタセシスにより達成され得、グラブス第１世代および第２世代ならびにグラブス−ホベイダ第１世代および第２世代を含む種々のルテニウム触媒により触媒されてもよい。
【０１１６】
すべてのペプチド成分（アミノ酸、非天然アミノ酸、非ステープル／非ステッチ、部分的ステープル／ステッチおよびステープル／ステッチペプチド）は、特定の幾何または立体異性形態で存在してもよい。すべての化合物は、シスおよびトランス異性体、（Ｒ）−および（Ｓ）−鏡像異性体、ジアステレオ異性体ならびにそれらのラセミ混合物を含む。
【０１１７】
好ましい異性体／鏡像異性体は、濃縮され、より高い割合の１つの特定の異性体または鏡像異性体を生じることになる。その実施形態は、重量を基準として９０％超、９５％、９８％もしくは９９％の好ましい異性体／鏡像異性体からなってもよい。
【０１１８】
ペプチド構造の安定化に用いられる非天然アミノ酸の非限定例が表１中に例示される。
【０１１９】
一実施形態では、出願人は、全炭化水素テザーを有するα、α−２置換非天然アミノ酸（例えば、α−メチル、α−ペンテニルグリシン）を用いる。
【０１２０】
単一ターンのステープリングにおいては、一実施形態では、例えばｉ，ｉ＋４位で（Ｓ）−ペンテニルアラニン（Ｓ５）を用いることができ、また別の実施形態では、二重ターンのステープリングにおいては、例えばｉ，ｉ＋７位でＲ−オクテニルアラニン／Ｓ−ペンテニルアラニン（Ｒ８／Ｓ５）またはＳ−オクテニルアラニン／Ｒ−ペンテニルアラニン（Ｓ８／Ｒ５）のいずれかの組み合わせを用いることができる。所与のペプチド鋳型内部に２つ以上のステープルを設けるため、同じ対合を用いることができる。ステッチペプチドを作製するため、Ｓ５はｉで置換され、Ｂ５はｉ＋４位で置換され、またＳ８はｉ，ｉ＋４，ｉ＋１１位で置換され得る。形成されるアミノ酸Ｓ５およびその鏡像異性体Ｒ５、または形成されるアミノ酸Ｓ８およびその鏡像異性体Ｒ８は、それらが有するステープルと逆の立体化学的配置に限り異なる。
【０１２１】
単一または二重ターンのステープルの包含に基づき、ペプチドは、表２中の配列の１つ以上からなってもよい。表２中に示される特定のペプチドに基づき、当業者は、３、４、５もしくはそれより多いターンを安定化するステープルを有するペプチドを容易に想定することができる。
【０１２２】
炭化水素架橋は、二重炭化水素結合または一重炭化水素結合からなってもよい。
【０１２３】
一実施形態では、細胞透過剤は、配列ＲＦＫ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５を含むステッチまたはステープルペプチドを有する。
【０１２４】
別の実施形態では、ペプチドは、分岐ステープルペプチドである。分岐ステープルペプチドは、ペプチドの２以上の鎖からなる。分岐ペプチドは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて形成されてもよく、一実施形態では、２つのペプチド鎖を分岐するのにリジン残基が用いられる。
【０１２５】
開示されるペプチド配列の機能的誘導体を用いることができる。機能的誘導体は、元のペプチドへの挿入を含む代表的な断片または相同体またはペプチドを有してもよい。典型的な誘導体であれば、元のペプチド配列の７０％、８０％、９０％もしくはそれより多くを有することになり、元のペプチドのアミノ酸の数の最大２００％を有してもよい。生物活性化合物の送達を増強するのであれば、誘導体が用いられることになる。
【０１２６】
ペプチド配列は、他の部分の付加を可能にする官能基を含むように修飾アミノ酸を含み得る。かかる部分の非限定例として、アセチル、コレステロール、脂肪酸、ポリエチレングリコール、多糖、アミノグリカン、糖脂質、ポリフェノール、核局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体および標的化分子が挙げられる。
【０１２７】
３．二機能リンカー
ＢＡＣをＣＰＡに連結するため、二機能リンカーが用いられてもよい。
【０１２８】
好ましいリンカーは、例えば、ＢＡＣ上のアミン基とＣＰＡ末端上のスルフヒドリル（チオール）基（通常はシステイン残基）との間を連結することになる。これを達成するための基質の例として、限定はされないが、表５中に例証されるような、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）、ＡＭＡＳ（Ｎ−α−マレイミドアセトキシ−オキシスクシンイミドエステル、ＢＭＰＳ（Ｎ−β−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル）、ＤＭＶＳ（Ｎ−δ−マレイミドバレリル−オキシスクシンイミドエステル、ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイル−オキシスクシンイミドエステル）、およびＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸）が挙げられる。
【０１２９】
別の好ましいリンカーシステムがヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）であるが、ＢＡＣがＰＭＯである場合、ＰＭＯは４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾される。
【０１３０】
ＤＳＧ（グルタル酸ジスクシンイミジル）およびＤＳＣＤＳ（ジスクシンイミジル−シクロヘキシル−１，４−ジエステル）などの他のリンカーは、ＢＡＣの５’−アミノ基をＣＰＡのＮ末端に連結する能力を含むことになる（表５、エントリー８および９）。
【０１３１】
リンカーは、ＤＣＣＰＭに対して望ましい特性を与える他の要素、例えばＯＮとＣＰＡとの間のスペーサー、または溶解度を高めることになる要素、例えば図５ｃおよび５ｄに図示されるようなＰＥＧ化配列を含んでもよい。非限定例が表５に示される。
【０１３２】
生物活性化合物は、キメラ細胞送達ペプチドに共有結合により付着される。さらに、これは当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。好ましくは、細胞送達ペプチドは、ジスルフィド架橋またはチオールマレイミドリンカー、例えばＳＭＣＣを用いて生物活性化合物に付着され；その付着は、アミドリンカーまたはオキシムリンカーまたはチオエーテルリンカーを用いてもよい。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：（原理証明）
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療におけるＲＮＡの立体的遮断を増強するためのＤＣＣＰＭ
導入
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、世界中で最も一般的な遺伝性致死性小児疾患であり、世界的な発生率は出生数で約４０００の１である３３。この重篤な筋消耗障害は、大半の家族では、リーディングフレームの破壊およびタンパク質ジストロフィンの中途での切断をまねく遺伝子突然変異により引き起こされる３４，３５。
【０１３４】
ＤＭＤ転写物のＲＮＡスプライシング抑制は特別な見込みを有する。ＡＳＯの特異的なＲＮＡ配列モチーフへのハイブリダイゼーションにより、スプライソソームの正確なアセンブリが阻止され、それによりプレｍＲＮＡ中の標的エクソンを認識することができず、ひいては成熟遺伝子転写物中のそれらが除去される。切断されても機能的であるジストロフィンタンパク質の再発現をもたらすＡＳＯ媒介性ＲＮＡスプライシング抑制が、インビトロで前臨床ｍｄｘマウスモデルにおいて実証されており２９、３６〜４１、それにより臨床的開発プログラムが得られた８，１３。
【０１３５】
静脈内投与されたＰＭＯがジストロフィンの再発現における用量依存的増加を示しており、幾らかの機能的利益を伴うが１３，４２、骨格筋ジストロフィンの回復は、多数の複数回投与後、患者間で依然として非常に変化しやすい。重要なことに、多数の他の標的組織（例えば脳および心臓）は、反復投与または高用量の手法が用いられるときであっても、ＰＭＯ遺伝子導入に対する抵抗性を維持する２７〜２９。
【０１３６】
現在まで、非修飾ＣＰＡの複合により、ＰＭＯの体内分布および血清安定性が改善されているが３０〜３２、パイプラインの開発にとっては依然として毒性が主要な障害である１９。
【０１３７】
出願人は、ＤＭＤ転写物のＲＮＡスプライシング抑制を引き起こすことで知られるＰＭＯに複合される、安定化される、例えばＳｔａＰ（またはＳｔｉＰ）に基づくＣＰＡが、ネイキッドＰＭＯに対して抵抗性がある組織内で、ＣＰＡ関連毒性の可能性を伴わずに、より高レベルのジストロフィン回復およびジストロフィンの再発現をもたらすことになると仮定した。
【０１３８】
材料および方法
ＳｔａＰの核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析
Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ５００（５００ＭＨｚ）分光計を用いて、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが記録された。試料は、１０％Ｄ２Ｏおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウムを有するＨ２Ｏに溶解した。
【０１３９】
ＮＯＥＳＹスペクトルが、１２６２６．２６３Ｈｚの掃引幅、直接寸法での４０９６の複合点（ＤＱＤ取得モード）および１０２４の間接点（Ｓｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ取得モード）で記録された。高いシグナル対ノイズでのクロスピークを得る一方、スピン拡散を概ね回避するように、２５０ミリ秒のＮＯＥＳＹ混合時間を用いた。水に対する事前飽和パルスおよび２０％のＺ−勾配（４，５）を伴う３−９−１９パルス配列が、溶媒抑制を促進した。ＴＯＣＳＹスペクトルが、８０ミリ秒の混合時間のＭＬＥＶ１７配列を用いる等核Ｈａｒｔｍａｎ−Ｈａｈｎ移行を伴い、ＮＯＥＳＹと同じスペクトル幅および分解能で記録された（６）。励起（３ｄＢ）およびスピンロック（１２．２ｄＢ）について、２つのパワーレベルを用いた。ＮＯＥＳＹと同様、水抑制が達成された。
【０１４０】
高分解能質量分析
高分解能質量スペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＱＴ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬで、電子スプレーイオン化条件（ＥＳＩ）下、または指定がある場合には大気圧イオン化（ＡＰＩ）条件下で記録した。
【０１４１】
円二色性（ＣＤ）分光
ＣＤ分析をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｃｈｉｒａｓｃａｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ分光計で実施した。試料を０．１２５Ｗ／Ｗ％でＤ２Ｏに溶解し、データを室温で３通りに取得し、その後、ビルトインｑＣＤソフトウェアを用いて平均化し、平滑化した。ブランク補正を得るため、ブランクＤ２Ｏスペクトルを取得データから差し引くことにより、グラフをプロットした。
【０１４２】
ＰＭＯ−ＣＰ８ＭおよびＮＦ−ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの合成
ＰＭＯ（２２．２ｍｇ、２．１μＭ）をＰＢＳ（４００μＬ、１×）に溶解し、ＭｅＣＮ１００μＬに溶解したＳＭＣＣリンカー（６ｍｇ、１８μＭ、９×過剰）の添加後、室温でインキュベートした。４５分後、ＰＢＳ１×で水和したセファデックスｇ２５を用いて混合物を脱塩し、溶出剤としても用いた。ＲＣＭ−Ｃ−ＰＥＧ−８Ｍｅｒ（３ｍｇ、２．５μＭ）を固定化ＴＣＥＰ（７５０μＬ）と１時間混合した。次に、ＳＭＣＣ修飾ＰＭＯをＰＢＳ／ＭｅＣＮ（５００μＬ  ４：１）で脱塩し、直ぐにペプチドを固定化ＴＣＥＰから溶出し、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＬＢカラムでの精製前、室温で３時間撹拌した。
【０１４３】
溶液を４ＨＬＢカラムに負荷し、ミリＱ水で洗浄し、任意の塩、次いで水中２０％ＭｅＣＮを除去し、最終的にＰＭＯ−ＣＰ８Ｍを水中５０％ＭｅＣＮで除去した。ＭｅＣＮ含量は回転蒸発により減少し、その後に複合体を凍結乾燥し、最終の凍結乾燥化合物を得た。
【０１４４】
ＰＭＯ−ＨＰ８Ｍの合成
ＰＭＯのＰＭＯ−４ＦＢへの修飾
４−ＦＢ（２５０ｍｇ、１．５ｍＭ）を、ＣＯＭＵ（１．２ｇ、２．６ｍＭ）およびＮＨＳ（２３０ｍｇ、２．０ｍＭ）を有するＤＭＦに溶解し、数分間撹拌した。Ｎｂ、４−ＦＢは、ＤＩＥＡを添加するまで、完全には溶解しなかった。次にＤＩＥＡ（０．５４ｍＬ、３．０ｍＭ）を添加し、その時、反応混合物は無色から淡黄色／オレンジに変化した。反応混合物を１時間撹拌し、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨを用いてＴＬＣにより監視した。混合物をＤＣＭで分離し、ＤＭＦを除去し、次にＤＭＣを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、２，４ＤＮＰで陽性染色している上部スポットを溶出した。生成物をオフホワイト固体１１２ｍｇ（３０％）として収集した。
【０１４５】
ＰＭＯ（３０．４ｍｇ、３μＭ）を４−ＦＢの溶液に添加し、炭酸塩緩衝液：ＭｅＣＮ（５０％ＭｅＣＮ）に溶解し、ＮＨＳ活性化４−ＦＢ（１０ｍｇ、３２μＭ）を添加し、一晩撹拌した。次に混合物を、溶出剤として水：ＭｅＣＮを伴うセファデックスＧ２５  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅを用いて脱塩した。ＭｅＣＮを回転蒸発により除去し、次に残存する溶出剤を凍結乾燥した。凍結乾燥生成物が２４ｍｇ、８３％の収率で得られた。
【０１４６】
ＰＭＯ−４ＦＢのＨＰ８Ｍへの複合
ＨＰ８ＭをミリＱ超純水（１００μＬ）に溶解し、１２ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。アルデヒド修飾ＰＭＯ（７ｍｇ、０．７６μＭ）を水／ＭｅＣＮ（３００μＬ、１：１）に溶解し、セファデックスＧ２５  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅおよび溶出剤として水／ＭｅＣＮ（１：１）を用いて脱塩した。次に収集した画分を水：ＭｅＣＮ混合物（１：１）で全容量１ｍＬに希釈し、ＰＭＯ含量はＵＶ／ｖｉｓにより分析し、６．５ｍｇ／ｍＬまたは７０５μＭであることが判明した。次にＨＮＡペプチドおよびＡｎａｌｉｎｅ（最終濃度１０ｍＭ）を添加し、ＵＶ／ｖｉｓをＡ３５４の証拠について監視し、ＰＭＯのペプチドへの複合を算出するために用いた。
【０１４７】
ＰＭＯおよびペプチド合成
ＰＭＯを５’アミン基および３’フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識を伴って合成し、Ｇｅｎｅｔｏｏｌ  ＬＬＣ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，Ｏｒｅｇ．ＵＳＡ）により＞９０％に精製した。すべてのペプチドを、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で標準的なＦｍｏｃペプチド化学を用い、確立されたプロトコルに従って合成した。ＮＭＰ中、１０当量のアミノ酸、９．９当量のＨＣＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡ（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂の初期負荷に対する当量）の混合物の添加により、カップリング反応を施した。少なくとも１時間、反応を進行させておいた。２時間、ＮＭＰ中、４当量のアミノ酸、３．９当量のＨＣＴＵおよび１０当量のＤＩＰＥＡを用いて、非天然アミノ酸のカップリング（Ｒ／Ｓ５、Ｒ／Ｓ８またはＢ５）を施した。オレフィン含有非天然アミノ酸の閉環メタセシス反応をグラブスＩ触媒（ベンジリデン−ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ジクロロルテニウム）で促進し、窒素通気下で１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）に約１０ｍｇ／ｍＬまで２時間溶解した。その後、余分な触媒をＤＣＥで樹脂から洗浄し、次にＮ末端ＦＩＴＣとカップリングさせた。完了時、ペプチドを樹脂から同時に切断し、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳおよび２．５％水を含有する切断カクテルを用いて脱保護した。粗ペプチドを５０％アセトニトリル／水に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルターを通過させ、Ｃ−１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。化合物の同定および純度を、カップリングされたＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて評価した。精製画分をプールし、蒸発させ、Ｓｐｅｅｄｖａｃによりアセトニトリルおよび微量ＴＦＡを除去し、次に乾燥するまで凍結乾燥した。非閉環ペプチドもまた、対照として生成された。
【０１４８】
細胞培養および遺伝子導入
Ｕ２ＯＳ細胞（ヒト骨肉腫）を、８％ＣＯ２／９２％空気雰囲気下、３７℃で、１０％胎児子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。
【０１４９】
Ｈ２Ｋ  ｍｄｘマウス筋芽細胞を、８％ＣＯ２／９２％空気雰囲気下、３３℃で、２０％胎児子ウシ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｙｅｏｖｉｌ，ＵＫ）、および２０単位／ｍｌのγ−インターフェロン（Ｒｏｃｈｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。次に細胞をトリプシンで処理し、０．１ｍｇ／ｍｌのＥＣＭゲル（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした２４ウェルプレート内に８×１０４／ｃｍ２で蒔いた。Ｈ２Ｋ  ｍｄｘ細胞に、播種の２４時間後、最終容量０．２ｍｌの通常の増殖培地中での処理物（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を遺伝子導入した。遺伝子導入の４時間後、ＰＭＯまたはＰＭＯ−ＳＡＰを取り出し、５％ウマ血清を添加したＤＭＥＭと交換した。遺伝子導入の４８時間後、蛍光およびＲＮＡ抽出を実施した。
【０１５０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胚性腎臓）を、８％ＣＯ２／９２％空気雰囲気下、３７℃で、１０％胎児子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。
【０１５１】
Ｕ２ＯＳ細胞を、任意のトランスフェクション促進試薬を用いて、増加濃度（０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭおよび１０μＭ）のＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍとともにインキュベートし；Ｈ２Ｋ  ｍｄｘマウス筋芽細胞を、５．０μＭのＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍとともにインキュベートし：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＰ８Ｍ（１．０μＭ、１０μＭおよび１００μＭ）および１．０μＭのＰＭＯ、ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ、ＰＭＯ−Ｃ８Ｍとともにインキュベートした。各々の化合物の相対的侵入を判定するため、蛍光のレベルを顕微鏡またはフローサイトメトリー法により４９４ｎｍで定量化した。
【０１５２】
ＲＮＡ抽出およびネステッドＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡをＨ２Ｋ  ｍｄｘマウス筋芽細胞細胞（ＲＮｅａｓｙ，Ｑｉａｇｅｎ，ＵＫ）から単離した。ＲＮＡを逆転写し（ｎａｎｏｓｃｒｉｐｔ２，Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＵＫ）、エクソン２０および２６の間の増幅、それに続いてエクソン２０および２６の間のネステッド増幅を実施し、マウスジストロフィンのエクソン２３を除外する場合、９０１ｂｐまたは６８８ｂｐの完全長産物を得た。生成物を（トリス酢酸塩４０ｍＭおよび１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸で緩衝した）１％アガロースゲルに負荷した。
【０１５３】
動物
固形飼料および水に自由にアクセスできるｍｄｘマウスをすべての実験にて用いた。すべての実験は、イギリス内務省（ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ）により認可された手順に従い、Ａｎｉｍａｌ  ｕｎｉｔ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫにて実施した。マウスは、所望される時点でＣＯ２吸入または頸部脱臼により殺害し、筋肉および他の組織を液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０１５４】
ＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの投与
筋肉内投与：ｍｄｘマウスの前脛骨筋に、２．２ナノモルのＰＭＯまたは２．２ナノモルのＰＭＯ−ＣＰ８Ｍのいずれかをイソフルラン麻酔下で注射した。全身投与：ｍｄｘマウスに、ＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ（または非蛍光標識変異体）の単回または反復腹腔内注射を、１マイクロモル／ｋｇ〜１０．９マイクロモル／ｋｇ（送達全体）の範囲の用量で施すか；あるいは、ｍｄｘマウスに、１マイクロモル／ｋｇ〜４．４マイクロモル／ｋｇ（全体）の範囲でのＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの単回または反復血管内注射を施した。骨格筋、心臓、脳および肝臓を含む一連の組織は、実験終了時に回収した。
【０１５５】
組織学および免疫細胞化学
骨格筋、心臓および脳においては、１０μＭの凍結切片を切断し、ジストロフィンに対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ１５２７７；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いてジストロフィンタンパク質を検出した。通常のヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて、一般病理および形態を評価した。肝臓においては、１０μＭの凍結切片を乾燥し、蛍光適合性マウント培地（Ｄａｋｏ）中に包埋し、一般的な蛍光を４９４ｎｍで顕微鏡的に評価した。
【０１５６】
フローサイトメトリー
蛍光標識ＰＭＯの取り込みを、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーにより測定した。ＰＭＯトランスフェクト細胞をトリプシンで放出し、ＰＢＳで洗浄し、分析前に氷上で維持した。単一の生細胞内での細胞蛍光を、適切なゲーティング後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて測定した。未処理細胞を用いて、％フルオレセイン陽性細胞の測定のためのゲーティング設定を確立した。
【０１５７】
統計学的分析
すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差として報告する。治療群と対照群との間の統計学的差異をＳｉｇｍａＳｔａｔ（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＫ）により評価し、スチューデントｔ検定を適用した。有意性はＰ値＜０．０５として受容した。
【０１５８】
結果
円二色性および核磁気共鳴データによると、ペプチドの規則的構造が想定通りであり、かつステープルペプチドがαヘリカル構造をとることが確認された（図４）。
【０１５９】
ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍを形成するためのＰＭＯ−ＳＭＣＣとＣＰＰとの複合が、一貫して１０％の効率をもたらしている。意外にも、４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾されるＰＭＯおよびＣＰＰの末端に組み込まれるヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）に基づく複合をとることにより、複合の効率が高まり、ＰＭＯ−ＨＰ８Ｍが５９％で得られた（図９）。
【０１６０】
ＰＭＯは、質量分析により確認される通り、二機能リンカー（ＰＥＧ化ＳＭＣＣ）およびＣＰＰ（ＲＫＦ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５）に複合した（図７）。その後、ＰＭＯおよびＰＭＯ−ＣＰ８Ｍを、標準の細胞株（Ｕ２ＯＳ）に遺伝子導入し、ＣＰ８Ｍが細胞への増強された細胞侵入を与えるか否かを判定した。ネイキッドＰＭＯは細胞侵入に対して抵抗性があり、ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍでの蛍光における用量依存的増加と比べて、バックグラウンド蛍光シグナルのみを発した（図１０ａおよび１０ｂ）。バックグラウンドを上回るシグナルの欠如は、蛍光における比較的増加の統計学的解析を可能にしないが、ＣＰ８Ｍの複合がなければ、ＰＭＯは細胞に侵入しないことが明確に実証された。
【０１６１】
ＨＥＫ２９３Ｔヒト胚性腎細胞において実施した遺伝子導入実験によると、ＰＭＯが細胞侵入に対して抵抗性があることが再び実証された。重要なことに、ＣＰ８Ｍの非閉環変異体（ＣＰ８Ｍ−ＮＣと称する）もまた、ＰＭＯ単独の場合を上回るような顕著な細胞侵入をもたらさなかった。しかし、コア配列ＲＫＦ−Ｓ５−ＲＬＦ−Ｓ５を含む閉環変異体では、（ＰＭＯ−Ｃ８Ｍを形成するため）蛍光標識ＰＭＯに複合されるとき、ＰＭＯがここで効率的に細胞内に取り込まれることが示された（図１１）。これにより、閉環メタセシスに従ってペプチド配列上に設けられる形状が、ＢＡＣがＯＮ、より詳細にはＰＭＯである場合のＤＣＣＰＭの細胞侵入を促進するのに重要であることが確認される。
【０１６２】
ＣＰ８Ｍの形式電荷は、生理学的ｐＨで＋３である。我々はまた、この配列内部の形式電荷の低減により、特に低下した濃度で＋２（ＣＰ８Ｍ−２）および＋１（ＣＰ８Ｍ−１）の形式電荷（図１２ａおよび１２ｂ）を有するＣＰ８Ｍ変異体の意外かつ顕著な細胞侵入がさらにもたらされることを示すデータを提供する。電荷の減少により、ＣＰ８Ｍで認められる場合と異なり、用量依存的増加しないことを説明する溶解度の課題がもたらされる。表５および表６で重視されるような代替的な賦形剤またはペプチドの操作は、これら溶解度の課題を克服する可能性が高い。
【０１６３】
Ｈ２Ｋ  ｍｄｘマウス筋芽細胞において遺伝子導入実験を実施したとき、ＰＭＯが筋細胞侵入に対して抵抗性があり、それはＣＰ８Ｍの複合とともに克服される（図１３）、またＰＭＯのＣＰ８Ｍ介在性送達の結果、ジストロフィン転写物のＲＮＡ編集の立体的遮断をもたらし、それによりエクソン２３が転写物から除去される（図１４）といった知見が確認された。さらに、ＰＭＯのみの試料からのエクソン除去の欠如は、比較統計学的解析の妨げとなるが、ＰＭＯの侵入の結果としてのエクソン除去が、ＰＭＯがＣＰ８Ｍに複合されるときに限って生じることが強調される。
【０１６４】
ＣＰ８ＭがＰＭＯの生物学的活性の障害となったか否かを判定するため、ｍｄｘ雌マウスの前脛骨筋への直接的な筋肉内投与（２．２ナノモル）を実施し、投与７日後、筋肉を回収した。ジストロフィン再発現の百分率は、ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ（８０５．７５）とネイキッドＰＭＯ（７６２．２５）との間で不確定であり、統計学的有意差は認められなかった（ｎ＝４、ｐ＝０．８６３；図１５および図１６）。したがって、ＣＰ８Ｍが、ＰＭＯの生物学的活性に対して立体障害を全く与えないことが判定された。
【０１６５】
ＣＰ８Ｍ部分が骨格筋への細胞侵入を増強したか否かを判定するため、ＰＭＯ−ＣＰ８ＭおよびＰＭＯの全身投与をｍｄｘマウスにおいて実施した。様々な最適以下の量（全体的に、１マイクロモル／ｋｇ、４．４マイクロモル／ｋｇ、１０．９マイクロモル／ｋｇ）を腹腔内または静脈内注射のいずれかにより投与し、横隔膜および／または前脛骨（ＴＡ）の筋肉を投与７日後に回収した。１マイクロモル／ｋｇの単回腹腔内投与後、横隔膜の筋肉では、ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ治療後にＰＭＯ対照群と比べてよりジストロフィン陽性の線維が得られた（図１７ａ、ｎ＝１）。前脛骨筋では、静脈内（４．４マイクロモル／ｋｇ；ｎ＝３）データは、群間で不確定であり（図１７ｂおよび図１７ｄ、ｐ＝０．２０１）、腹腔内（１０．９マイクロモル／ｋｇ；ｎ＝４）データも同様であった（図１７ｃおよび図１７ｄ、ｐ＝０．８８６）。
【０１６６】
（４．４マイクロモル／ｋｇ；ｎ＝３）データは、群間で不確定であり（図１７ｂおよび図１７ｄ、ｐ＝０．２０１）、腹腔内（１０．９マイクロモル／ｋｇ；ｎ＝４）データも同様であった（図１７ｃおよび図１７ｄ、ｐ＝０．８８６）。
【０１６７】
ＣＰ８Ｍが細胞侵入を増強したか否かを判定するため、ＰＭＯ−ＣＰ８ＭおよびＰＭＯの全身腹腔内投与をｍｄｘマウスにおいて実施した（図１８〜２１）。投与から１または２週間後、一連の組織を回収し、凍結した（骨格筋、心臓、脳および肝臓）。
【０１６８】
単回低用量のＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ（１マイクロモル／ｋｇ）を投与し（ｎ＝１／群）、投与７日後、組織を回収した。ＰＭＯでなくＰＭＯ−ＣＰＭ８の投与後、ジストロフィン陽性の心筋線維を検出した（図１８ａ）。
【０１６９】
さらに、我々はｍｄｘマウスに反復腹腔内投与を実施した。ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ（蛍光標識なし）の全部で７．６マイクロモル／ｋｇの４日にわたる腹腔内注射（ｎ＝４／群）により、投与２週間後、等モル量のＰＭＯの注射と比べて、ジストロフィン陽性の心筋線維における有意な増加がもたらされた（３４０±６９対５７±１７の線維、ｐ＜０．０１；図１８ｂおよび１８ｄ）。
【０１７０】
さらに、出願人は、ＰＭＯまたはＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの全部で１０．９マイクロモル／ｋｇの２日にわたる腹腔内投与を実施した（ｎ＝４／群）。再び、ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍの投与により、ＰＭＯの投与と比べて、有意により数が多いジストロフィン陽性の心筋線維がもたらされた（６８０±１６３対３３±８の線維、ｐ＜０．０５；図１８ｃおよび１８ｅ）。
【０１７１】
ｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィン再発現の誘導によって明らかなように、８．７ｋＤａおよび９．２ｋＤａ双方のＰＭＯ−ペプチド複合体の心筋線維への送達が奏功した（図１９、ｎ＝４）。
【０１７２】
ＰＭＯでなく、ＰＭＯ−ＣＰ８Ｍ（双方とも蛍光標識なし）の単回低用量（１マイクロモル／ｋｇ）静脈内投与により、ｍｄｘマウス小脳のプルキンエ細胞におけるジストロフィン発現の回復がもたらされた（図２０；ｎ＝１／群）。ＰＭＯ対照において、ジストロフィン発現は認められなかった。
【０１７３】
ＰＭＯ−ＨＰ８Ｍの単回低用量（１マイクロモル／ｋｇ）静脈内投与により、投与２週間後、ＰＭＯの投与と比べて、血管付近での肝細胞蛍光の増加がもたらされ（図２１；ｎ＝１／群）、これは肝細胞へのＰＭＯ−ＨＰ８Ｍの取り込み増加を意味している。
【０１７４】
結論
生成されたデータから、ステープルすることにより安定化されたＣＰＡの（ＰＭＯの形態での）ＢＡＣへのＢＦＬを介した複合がＰＭＯの細胞への侵入を促進することが理解できる。ＳｔａＰ  ＣＰＡは、インビトロおよびインビボ双方のアッセイシステムにおいてＰＭＯの侵入を促進した。
【０１７５】
出願人のデータは、ＨＮＡおよび４−ホルミル安息香酸に基づき修飾されたリンカーシステムが、ＢＡＣとＣＰＡとの間の複合の効率を改善するという証拠を提示する。
【０１７６】
意外なことに、形式電荷が低減されたＣＰＡの変異体が、より低い濃度で細胞侵入の増強を示す。これは、ＣＰＡ、より詳細にはＣＰＰの毒性学的特性を改善することに関して重要な後遺症を有することになる。
【０１７７】
ＲＮＡスプライシング抑制のインビボモデルによると、αヘリカルペプチドに複合されたＰＭＯの生物学的作用が、筋肉内投与後、ネイキッドＰＭＯに匹敵することが示され、それ故、αヘリカルペプチド部分にカップリングされるとき、ＰＭＯに対して立体障害がもたらされないことが判定された。
【０１７８】
データによると、ＲＮＡスプライシング抑制のインビボモデルでは、安定化ＣＰＡが、特により低い用量で、骨格筋への細胞侵入を増強することがあるという事実が示される。しかし、ＰＭＯは、ＣＰＰ複合なしに骨格筋に侵入することが知られている。
【０１７９】
意外にも、また非常に顕著なことに、ＰＭＯがＳｔａＰと複合されるとき、ネイキッドＰＭＯの遺伝子導入に抵抗性がある組織が、心臓および脳（プルキンエ細胞）区画の双方でジストロフィンタンパク質を再発現することが実証されている。
【０１８０】
出願人は、ＣＰＰが現行の最先端技術で述べられている場合をはるかに超える異なるサイズおよび質量のカーゴの侵入を促進し得るという証拠をさらに提示する。
【０１８１】
対処可能なヒトおよび動物疾患のレパートリーは、ここでは、ＰＭＯの安定化ペプチドと複合されるときに増強される薬物動態により、拡張され、増やされる。神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患および後天性ウイルス感染症はすべて、標的化することができる。
【０１８２】
参考文献；
１  Ｉｖｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＶＩ−７５３７  ａｎｄ  ＡＶＩ−７２８８  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ  ４，２８０６−２８３０，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ４１１２８０６（２０１２）．
２  Ｈｅａｌｄ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｓｃｅｎｄｉｎｇ−ｄｏｓｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５８，６６３９−６６４７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ａａｃ．０３４４２−１４（２０１４）．
３  Ｗａｒｒｅｎ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １６，９９１−９９４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．２２０２（２０１０）．
４  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｂａｃｏｎ，Ｔ．Ａ．＆  Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｔｒａｃｔｓ，ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ，ｓｅｒａ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０，２５９−２６７（１９９０）．
５  Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，Ｍａｙｒａｎｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．＆  Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ  ｂｙ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ａｎｄ  ｍｉｘｅｄ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７，１４０１−１４０５（１９９０）．
６  Ｔｅｒｅｓｈｋｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ２’−Ｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１０６２６−１０６３４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ９８０３９２ａ（１９９８）．
７  Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ−１）  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏ−ＲＮＡ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７，２３９−２５２（１９８９）．
８  Ｇｏｅｍａｎｓ  Ｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒａｕｓ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ（ｓｔｕｄｙ  ＤＭＤ１１４０４４）．Ｗｏｒｌｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ；Ａｓｉｌｏｍａｒ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｏｃｔ  １−５，２０１３（２１０３）．
９  Ｇｏｅｍａｎｓ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ，Ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｏｐｅｎ−Ｌａｂｅｌ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１，ｅ０１６１９５５，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６１９５５（２０１６）．
１０  Ｄｉｒｉｎ，Ｍ．＆  Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＡＤＭＥ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３，８７５−８８８，ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１３．７７４３６６（２０１３）．
１１  Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｅａｔ−ｄｏｓｅ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｏｆ  ＡＶＩ−４６５８，ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ＰＭＯ）  ｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３０，３１３−３２１，ｄｏｉ：１０．１１７７／１０９１５８１８１１４０３５０５（２０１１）．
１２  Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．，Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．＆  Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，Ｓ．Ｂ．Ｓａｆｅｔｙ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＶＩ−４６５８．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２９，１４３−１５６，ｄｏｉ：１０．１１７７／１０９１５８１８０９３５９２０６（２０１０）．
１３  Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７４，６３７−６４７，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２３９８２（２０１３）．
１４  Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，Ｈ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １１，２５７−２６６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｇｍ．１２８８  ［ｄｏｉ］（２００９）．
１５  Ｋｒｅｕｔｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ−ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｉｓ  ｂｕｔ  ｏｎｌｙ  ｈａｖｅ  ｐａｒｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ４０２０８，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４０２０８（２０１２）．
１６  Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．，Ｊｏｌｉｏｔ，Ａ．Ｈ．，Ｃｈａｓｓａｉｎｇ，Ｇ．＆  Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ａ．Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，１０４４４−１０４５０（１９９４）．
１７  Ｇａｕｔａｍ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＣＰＰｓｉｔｅ：ａ  ｃｕｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｄａｔａｂａｓｅ  ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｕｒａｔｉｏｎ  ２０１２，ｂａｓ０１５，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｄａｔａｂａｓｅ／ｂａｓ０１５（２０１２）．
１８  Ｈｉｒｏｓｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｆｏｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０，９８４−９９３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１．３１３（２０１２）．
１９  Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．＆  Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９８，２２９６−２３０３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｍｅｍ．２０１０．０２．０１２（２０１０）．
２０  Ｔｕｎｎｅｍａｎｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｖｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−ａｒｇｉｎｉｎｅｓ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  １４，４６９−４７６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｓｃ．９６８（２００８）．
２１  Ｃｈｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ  ６，１１１−１１９，ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ４ＭＤ００１３１Ａ（２０１５）．
２２  Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｉｔｃｈｅｄ  α−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖｉａ  Ｂｉｓ  Ｒｉｎｇ−Ｃｌｏｓｉｎｇ  Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６，１２３１４−１２３２２，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ５０５１４１ｊ（２０１４）．
２３  Ｌｅｈｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｐ６ａ−ＰＭＯ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２，３２０７−３２１７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２０（２０１４）．
２４  Ｎａｋａｓｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｉｓ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，４９２−５０１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ０６１２８２４（２００７）．
２５  Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＭＤＭ２  ａｎｄ  ＭＤＭＸ  ｆｏｒ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０，Ｅ３４４５−３４５４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０３００２１１０（２０１３）．
２６  Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｓ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  １８，５９７−６０５，ｄｏｉ：Ｓ０９６０−８９６６（０８）００１４１−７  ［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｎｍｄ．２００８．０５．０１１  ［ｄｏｉ］（２００８）．
２７  Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．，Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．，Ｋｏｌｅ，Ｒ．＆  Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．Ｓ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ８５，４４４−４５３，ｄｏｉ：ｃｖｐ３３５  ［ｐｉｉ］１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｐ３３５  ［ｄｏｉ］（２０１０）．
２８  Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｅ−ｙｅａｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １９，５７６−５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２８８（２０１１）．
２９  Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，１４８１４−１４８１９，ｄｏｉ：０８０５６７６１０５  ［ｐｉｉ］１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０５６７６１０５  ［ｄｏｉ］（２００８）．
３０  Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６，１６２４−１６２９，ｄｏｉ：ｍｔ２００８１２０  ［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｍｔ．２００８．１２０  ［ｄｏｉ］（２００８）．
３１  Ｂｅｔｔｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｉｐ６−ＰＭＯ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｅｘｏｎ  Ｓｋｉｐｐｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ＤＭＤ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  １，ｅ３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１２．３０（２０１２）．
３２  Ｉｖａｎｏｖａ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＮＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６，６４１８−６４２８（２００８）．
３３  Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７１，３０４−３１３，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２３５２８（２０１２）．
３４  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｊｒ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｌｏｃｕｓ．Ｃｅｌｌ  ５１，９１９−９２８．（１９８７）．
３５  Ｍｏｎａｃｏ，Ａ．Ｐ．，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｉｅｃｈｔｉ−Ｇａｌｌａｔｉ，Ｓ．，Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．Ａｎ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｐａｒｔｉａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＭＤ  ｌｏｃｕｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２，９０−９５（１９８８）．
３６  Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｘ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＤＭＤ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２，９０７−９１４（２００３）．
３７  Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｏｄｙｗｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，１７５−１７７（２００６）．
３８  Ｋｉｎａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｃａｌ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ＡＶＩ−４６５８  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ８，９１８−９２８，ｄｏｉ：Ｓ１４７４−４４２２（０９）７０２１１−Ｘ  ［ｐｉｉ］１０．１０１６／Ｓ１４７４−４４２２（０９）７０２１１−Ｘ  ［ｄｏｉ］（２００９）．
３９  Ｌｕ，Ｑ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｏｄｙ−ｗｉｄｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２，１９８−２０３（２００５）．
４０  ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｃａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＰＲＯ０５１．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５７，２６７７−２６８６，ｄｏｉ：３５７／２６／２６７７  ［ｐｉｉ］１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０７３１０８  ［ｄｏｉ］（２００７）．
４１  Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １７，１３２−１４０，ｄｏｉ：ｇｔ２００９１２０  ［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｇｔ．２００９．１２０  ［ｄｏｉ］（２０１０）．
４２  Ｃｉｒａｋ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ  ２，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７８，５９５−６０５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０１４０−６７３６（１１）６０７５６−３（２０１１）．
【図１Ａ】
2019508481.tif 000016
【図１Ｂ】
2019508481.tif 000017
【図１Ｃ】
2019508481.tif 000018
【図２】
2019508481.tif 000019
【図３】
2019508481.tif 000020
【図４Ａ】
2019508481.tif 000021
【図４Ｂ】
2019508481.tif 000022
【図４Ｃ】
2019508481.tif 000023
【図４Ｄ】
2019508481.tif 000024
【図４Ｅ】
2019508481.tif 000025
【図５Ａ】
2019508481.tif 000026
【図５Ｂ】
2019508481.tif 000027
【図５Ｃ】
2019508481.tif 000028
【図５Ｄ】
2019508481.tif 000029
【図６】
2019508481.tif 000030
【図７】
2019508481.tif 000031
【図８ａ】
2019508481.tif 000032
【図８ｂ】
2019508481.tif 000033
【図８ｃ】
2019508481.tif 000034
【図８ｄ】
2019508481.tif 000035
【図８ｅ】
2019508481.tif 000036
【図８ｆ】
2019508481.tif 000037
【図８ｇ】
2019508481.tif 000038
【図８ｈ】
2019508481.tif 000039
【図８ｉ】
2019508481.tif 000040
【図８ｊ】
2019508481.tif 000041
【図８ｋ】
2019508481.tif 000042
【図８ｌ】
2019508481.tif 000043
【図８ｍ】
2019508481.tif 000044
【図８ｎ】
2019508481.tif 000045
【図８ｏ】
2019508481.tif 000046
【図９Ａ】
2019508481.tif 000047
【図９Ｂ】
2019508481.tif 000048
【図１０Ａ】
2019508481.tif 000049
【図１０Ｂ】
2019508481.tif 000050
【図１１】
2019508481.tif 000051
【図１２ａ】
2019508481.tif 000052
【図１２ｂ】
2019508481.tif 000053
【図１３】
2019508481.tif 000054
【図１４】
2019508481.tif 000055
【図１５】
2019508481.tif 000056
【図１６】
2019508481.tif 000057
【図１７ａ】
2019508481.tif 000058
【図１７ｂ】
2019508481.tif 000059
【図１７ｃ】
2019508481.tif 000060
【図１７ｄ】
2019508481.tif 000061
【図１８ａ】
2019508481.tif 000062
【図１８ｂ】
2019508481.tif 000063
【図１８ｃ】
2019508481.tif 000064
【図１８ｄ】
2019508481.tif 000065
【図１８ｅ】
2019508481.tif 000066
【図１９】
2019508481.tif 000067
【図２０】
2019508481.tif 000068
【図２１】
2019508481.tif 000069
【国際調査報告】
2019508481.tif 000070
2019508481.tif 000071
2019508481.tif 000072