(57)【要約】  本発明は、ＣＲＩＳＰＲを基礎とするゲノム操作のための共有的及び／又は非共有的方法で互いに会合されたＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＤＮＡ修復鋳型とを含むハイブリッド核酸構築物に関する。さらに、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドをさらに含む分子複合体が提供される。複合体内の全ての成分は物理的に近接している。さらに、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ配列及び／又は分子複合体を含む植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫が提供される。さらに、原核細胞又は真核細胞における少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変するための方法及び植物又は植物細胞を生産するための方法が提供される。最終的に、原核細胞もしくは原核生物、又は真核細胞もしくは真核生物における遺伝子編集又はゲノム操作のための、少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列の使用、又は分子複合体の使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下、
（ａ）少なくとも１つのＲＮＡ核酸配列を含み、かつＣＲＩＳＰＲ核酸配列との会合を含むＣＲＩＳＰＲ核酸配列であって、
（ｉ）第一のＤＮＡ標的配列に相補的である第一の配列部分、及び
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互に作用して配置される第二の配列部分
を含む、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列、
（ｂ）ＤＮＡ核酸配列を含む修復鋳型核酸配列であって、第二のＤＮＡ標的配列に相補的である少なくとも一部を含み、かつ標的の相同組換え修復を媒介するために配置された、修復鋳型核酸配列、並びに
（ｃ）任意に、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列と修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域
を含む、少なくとも１つのＲＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡ核酸配列を含むか、又はそれらからなるハイブリッド核酸配列であって、ハイブリッド核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互作用して、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが第一のＤＮＡ標的配列を認識できかつ任意にＤＮＡ切断を誘発することができ、かつハイブリッド核酸配列が、第二のＤＮＡ標的配列の部位で修復鋳型核酸配列によって媒介される相同組換え修復を介してゲノム操作を指示する、前記ハイブリッド核酸配列。
【請求項２】
修復鋳型核酸配列及び／又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列が、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基修飾を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列が、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ修復鋳型核酸配列が、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のハイブリッド核酸配列。
【請求項３】
修復鋳型核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の３’末端でＣＲＩＳＰＲ核酸配列と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の５’末端と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列内に位置している、請求項１又は２に記載のハイブリッド核酸配列。
【請求項４】
少なくとも１つの修復鋳型核酸配列が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列に共有的に付着しており、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列に非共有的に付着している、請求項１から３までのいずれか１項に記載のハイブリッド核酸配列。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の少なくとも１つのハイブリッド核酸配列、及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む分子複合体であって、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドが機能的な方法で会合している、前記分子複合体。
【請求項６】
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）を含むストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、又はナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）を含むナイセリア属種（Neisseria spp.）、コリネバクター属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifactor）、ユーバクテリム属（Eubacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、バクテロイデス属（Bacteroides）、フラビボーラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、スフェロケタ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリルム属（Azospirillum）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、ロゼブリア属（Roseburia）、パービバキュラム属（Parvibaculum）、ニトラティフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）及びカンピロバクター属（Campylobacter）のＣａｓポリペプチドからなる群から独立して選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、アシダミノコッカスＢＶ３Ｌ６種（Acidaminococcus sp. BV3L6）を含むアシダミノコッカス属種（Acidaminococcus spp.）、ラクノスピラ細菌ＮＤ２００６（Lachnospiraceae bacterium ND2006）を含むラクノスピラ属種（Lachnospiraceae spp.）、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２を含むフランシセラ属種（Francisella spp.）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、プレボテラ属種（Prevotella spp.）、又はポーフィロモナス属種（Porphyromonas spp.）のＣｐｆ１ポリペプチドを含む、古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチドから選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドニッカーゼ又はＣＲＩＳＰＲポリペプチド欠失エンドヌクレアーゼ活性を含む、ＣａｓＸポリペプチド又はＣａｓＹポリペプチド、又はそれらの多様体及び／又は機能的断片及び／又は組合せ物から選択される、請求項５に記載の分子複合体。
【請求項７】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の少なくとも１つのハイブリッド核酸配列を含むか又はそれにより編集され、又は請求項５又は６に記載の少なくとも１つの分子複合体を含む、植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫。
【請求項８】
原核細胞又は真核細胞において少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変する方法であって、
（ｉ）目的のゲノム領域で少なくとも１つの第一のＤＮＡ標的配列及び少なくとも第二のＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を準備すること、
（ｉｉ）請求項１から４までのいずれか１項に記載の少なくとも１つのハイブリッド核酸配列及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む、請求項５又は６に記載の少なくとも１つの分子複合体を準備すること、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの分子複合体と少なくとも１つのＤＮＡ標的配列とを適した条件下で接触させて、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列のＣＲＩＳＰＲ核酸配列の第一の配列部分と、少なくとも１つの第一のＤＮＡ標的配列との相補的塩基対を得て、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって第一のＤＮＡ標的配列の認識を達成し、及び任意に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって少なくとも１つのＤＮＡ切断を誘導すること、ここで、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つの第二のＤＮＡ標的配列の部位で相同組換え修復を指示する、及び
（ｉｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を含む少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を得ること
により、原核細胞又は真核細胞において少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変する方法。
【請求項９】
分子複合体の少なくとも１つのハイブリッド核酸配列が、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドとは無関係に少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞に提供され、少なくとも１つの分子複合体が、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞内で構築されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの真核細胞が、植物細胞、好ましくは、オオムギ（Hordeum vulgare）、ホルデウム・ブルブソム（Hordeum bulbusom）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarium）、トウモロコシ（Zea mays）、アワ（Setaria italica）、オリザ・ミヌタ（Oryza minuta）、イネ（Oriza sativa）、オリザ・オーストラリエンシス（Oryza australiensis）、オリザ・アルタ（Oryza alta）、コムギ（Triticum aestivum）、マカロニコムギ（Triticum durum）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticale）、リンゴ（Malus domestica）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、ハマムギクサ（Hordeum marinum）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ゴウシュウヤブジラミ（Daucus glochidiatus）、サトウダイコン（Beta vulgaris）、ダウクス・プシルス（Daucus pusillus）、ダウクス・ムリカツス（Daucus muricatus）、ノラニンジン（Daucus carota）、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、ブドウ（Vitis vinifera）、エリスランテ・グタタ（Erythrante guttata）、ゲンセリア・アウレア（Genlisea aurea）、キュウリ（Cucumis sativus）、マルバグワ（Morus notabilis）、アラビドプシス・アレノサ（Arabidopsis arenosa）、アラビドプシス・リラタ（Arabidopsis lyrata）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、クルシヒマラヤ・ヒマライカ（Crucihimalaya himalaica）、クルシヒマラヤ・ワリチイ（Crucihimalaya wallichii）、タネツケバナ（Cardamine flexuosa）、マメグンバイナズナ（Lepidium virginicum）、ナズナ（Capsella bursa pastoris）、オルマラビドプシス・プミラ（Olmarabidopsis pumila）、ヤマハタザオ（Arabis hirsute）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ダイコン（Raphanus sativus）、ブラシカ・ユンカセア（Brassica iuncacea）、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ルッコラ（Eruca vesicaria subsp. sativa）、オレンジ（Citrus sinensis）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、シセル・ヤマシタ（Cicer yamashitae）、シセル・ビユグム（Cicer bijugum）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、シセル・レチクラツム（Cicer reticulatum）、シセル・ユダイクム（Cicer judaicum）、カヤヌス・カヤニフォリウス（Cajanus cajanifolius）、ビロードヒメクズ（Cajanus scarabaeoides）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ダイズ（Glycine max）、ワタ属種（Gossypium sp.）、ゲンゲ（Astragalus sinicus）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、ハナウリクサ（Torenia fournieri）、タマネギ（Allium cepa）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、及びニラ（Allium tuberosum）からなる群から選択される植物、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からの植物細胞である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変が、収量改善、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、酸化ストレス、重金属ストレス、塩ストレスもしくは浸水を含む非生物的ストレスに対する耐性、昆虫に対する耐性、細菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、真菌に対する耐性もしくは線虫に対する耐性を含む生物的ストレスに対する耐性、グリホサート、グルホシネート、ＡＬＳ阻害剤及びジカンバを含む除草剤に対する耐性、倒伏抵抗性、開花期、脱粒抵抗性、種子の色、胚乳組成、栄養含有量、又は少なくとも１つの植物細胞における分子薬学アプローチを可能にするゲノム編集を含む代謝工学からなる群から選択される特性を生じるゲノム編集アプローチである、請求項８から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、以下、
（ｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を含む、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を同定及び／又は選択するステップ
を含む、請求項８から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
以下、
（ｉ）請求項８から１２までのいずれ１項に記載の方法を実施するステップ、ここで少なくとも１つの真核細胞は植物細胞である、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの少なくとも１つの植物細胞から少なくとも１つの植物又はそれらの子孫を得るステップ、
（ｉｉｉ）任意に、少なくとも１つの植物又はそれらの子孫の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を決定するステップ
を含む、植物又は植物細胞を製造するための方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物から選択され、好ましくは、植物が、トウモロコシ（Zea mays）を含むゼア属種（Zea spp.）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、又はサトウダイコン（Beta vulgaris）を含むベタ属種（Beta spp.）、又はライムギ（Secale cereal）を含むセカレ属種（Secale spp.）、又はコムギ（Triticum aestivum）を含むトリチカム属種（Triticum spp.）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
原核細胞もしくは原核生物又は真核細胞もしくは真核生物、好ましくは植物細胞又は植物における遺伝子編集のための、請求項１から４までのいずれか１項に記載の少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列の使用、又は請求項５又は６に記載の分子複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける二本鎖切断の部位の周りの修復鋳型の局所有効性を高めることによってＣＲＩＳＰＲを基礎とする遺伝子編集又はゲノム操作のための順応性があり安定なツールを提供するための共有結合法及び／又は非共有結合法で互いに会合されたＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＤＮＡ修復鋳型核酸配列を含むハイブリッド核酸配列構築物に関する。さらに、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドをさらに含む分子複合体であって、複合体内の全ての成分が、物理的に近くにあり、したがって標的とした及び制御された方法で改変されるべきＤＮＡ標的配列の部位でｉｎ ｓｉｔｕで容易に入手できる、分子複合体が提供される。さらに、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ配列及び／又は分子複合体を含むか又はハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ配列及び／又は分子複合体により編集された植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫が提供される。これらのツールに基づいて、原核細胞又は真核細胞における少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変するための方法及び植物又は植物細胞を製造するための方法が提供される。最終的に、少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列の使用、又は原核細胞もしくは原核生物又は真核細胞もしくは真核生物における、好ましくは植物細胞又は植物における遺伝子編集又はゲノム操作のための互いに会合させたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、修復鋳型ＤＮＡ及びＣＲＩＳＰＲポリペプチド配列を含む分子複合体の使用が提供される。
【０００２】
発明の背景
高精度の遺伝子編集又はゲノム操作は、目的のゲノムの標的化及び部位特異的操作を可能にする遺伝子操作の最も重要な分野の１つとして発展してきた。部位特異的ゲノム操作のために不可欠な必要条件は、定義された位置で対象の核酸を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）又は１つ以上の一本鎖切断のいずれかを誘発するために使用することができる、プログラム可能なヌクレアーゼである。代わりに、前記ヌクレアーゼは、もはやヌクレアーゼ機能を含まず、むしろ他の酵素と組み合わせて認識分子として作用するキメラ多様体又は変異多様体であってよい。したがって、これらのヌクレアーゼ又はそれらの多様体は、任意の遺伝子編集又はゲノム操作のアプローチの鍵となる。近年、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート：ＣＲＩＳＰＲ）系の一部としてＣａｓ又はＣｐｆ１を含む、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む、多くの適したヌクレアーゼ、特にテーラードエンドヌクレアーゼ（ｔａｉｌｏｒｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が開発されている。
【０００３】
それらの自然環境において、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＣＲＩＳＰＲ系がウイルス攻撃に対する防御のための適応免疫系の役割を果たす細菌中で進化した。ウイルスに暴露に対して、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ＲＮＡは、ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子剤の一部から転写される。ウイルスゲノムに対して相補的な配列を含む前記ＲＮＡは、ウイルスゲノム中の標的配列に対してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の標的化を媒介する。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は切断され、それによってウイルス標的の複製が妨げられる。ここ数年にわたって、ＣＲＩＳＰＲ系は、真核細胞においても遺伝子編集又はゲノム操作にうまく適応されている。動物細胞における編集及び人類のための治療の適用は、現在、重要な研究の主眼点である。複雑な動物及び植物ゲノムの標的とした改変は、大変な仕事である。
【０００４】
自然環境におけるＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ又は他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば特定のＤＮＡ二本鎖切断を生じうるＣｐｆ１ヌクレアーゼ（Zetscheら、"Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR- Cas System", Cell, 163, pp. 1 -13, October 2015）と組み合わせて、少なくとも１つの小さい個々の非コードＲＮＡを含む分子複合体を記載している。現在、ＣＲＩＳＰＲ系は、５つの型のＣＲＩＳＰＲ系を含む２つの分類、例えばエフェクターとしてＣａｓ９を使用するＩＩ型系、及びエフェクター分子としてＣｐｆ１を使用するＶ型系に識別されている（Makarovaら、Nature Rev. Microbiol., 2015）。人工ＣＲＩＳＰＲ系において、合成非コードＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は任意に改変ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ヌクレアーゼとして作用するために改変した、又はあらゆるヌクレアーゼ機能を欠いている）は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの機能を組み合わせた少なくとも１つの合成又は人工のガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡと併用されてよい（Makarovaら、2015、前述）。天然の系においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより媒介される免疫応答は、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を要求し、その際、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特異的活性を制御するこのガイドＲＮＡの成熟は、これまでに特徴付けられている種々のＣＲＩＳＰＲ系間で著しく変動する。第一に、スペーサーとして公知でもある侵入ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端での２つの隣接する繰り返し領域間に組み込まれる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、干渉ステップのための鍵となる酵素としてＣａｓ９ヌクレアーゼをコードし、それは、ガイドモチーフとしてｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の双方を含む系である。これらは、ハイブリダイズされ、そしてＲＮＡｓｅＩＩＩによって認識され、成熟ｃｒＲＮＡを形成するために切断されてよい二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成する。続いて、これらは、ヌクレアーゼを標的核酸領域に特異的に向けるためにＣａｓ分子と順に会合する。組換えｇＲＮＡ分子は、可変ＤＮＡ認識領域とＣａｓ相互作用領域の双方を含んでよく、したがって、特異的標的核酸及び所望のＣａｓヌクレアーゼとは無関係に、特異的に設計されてよい。さらに安全なメカニズムとして、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）が標的核酸領域に存在する必要があり、これらはＣａｓ９／ＲＮＡ複合体認識ＤＮＡから直接続くＤＮＡ配列である。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（化膿性連鎖球菌）からのＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」又は「ＮＡＧ」（Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）であると記載されている（Jinekら、"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity"、Science 2012、337：816-821）。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）からのＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」である。さらなる多様体ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が公知である。したがって、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）（髄膜炎菌）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴを切断する。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃ��ｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを切断する。近年、さらなるＰＡＭモチーフＮＮＮＮＲＹＡＣが、カンピロバクター属のＣＲＩＳＰＲ系について記載されている（国際公開第２０１６／０２１９７３号Ａ１（ＷＯ ２０１６／０２１９７３ Ａ１））。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて、ｔｒａｃｒＲＮＡを有さないＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９系により認識される通常のＧリッチＰＡＭとは対照的に短いＴリッチＰＡＭによって生じる標的ＤＮＡを効率的に認識して切断する（Zetscheら、前述）。さらに、改変ＣＲＩＳＰＲポリペプチドを使用することにより、特異的な一本鎖切断が得られる。Ｃａｓニッカーゼと種々の組換えｇＲＮＡとの併用は、二本鎖ＤＮＡニッキングによって非常に特異的なＤＮＡ二本鎖切断も含んでもよい。２つのｇＲＮＡを使用することによって、さらに、ＤＮＡ結合及びしたがってＤＮＡ切断の特異性が最適化されうる。一方で、さらに、細菌について最初に記載されたＣＲＩＳＰＲエフェクター、例えばＣａｓＸ及びＣａｓＹが利用可能であり、ゲノム操作の目的のために使用されてよいさらなるエフェクターを示す（Bursteinら、"New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes"、Nature、2017、542、237-241）。
【０００５】
目下、例えば、エンドヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９上にあるＩＩ型系又はその多様体もしくは任意のキメラ型は、ゲノム操作のために改変されている。２つの成分、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも言われるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる合成ＣＲＩＳＰＲ系は、エンドヌクレアーゼＣａｓ９と会合することができる標的とされる遺伝子に特異的なｇＲＮＡを同時発現することによってノックアウト細胞又は動物を生じるために使用されてよい。とりわけ、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ又は任意の他のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質又はそれらの多様体もしくは触媒作用による活性断片と相互作用する１つのドメイン、及び目的の標的核酸と相互作用し、したがってｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合（「一本鎖ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）又は単に「ｇＲＮＡ」）を示す他のドメインを含む人工的な分子である（Science 2012、前述）。ゲノム標的は、任意の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であってよいが、但し標的はＰＡＭ配列のすぐ上流にある。ＰＡＭ配列は、標的結合にとって非常に重要であり、正確な配列はＣａｓ９の種に依存し、そして例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９については５’ＮＧＧ３’又は５’ＮＡＧ３’（Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）（Jinekら、Science 2012、前述）を読む。スタフィロコッカス・アウレウスからのＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲ（Ｎ）である。多くのさらなる多様体ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が公知であり、とりわけＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴを切断するナイセリア・メニンギティディスＣａｓ９を含む。ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを切断する。改質Ｃａｓヌクレアーゼを使用して、標的とされた一本鎖切断は、目的の標的配列に導入されてよい。１つ以上のｇＲＮＡを使用することは、全体の特異性をさらに高め、かつ非特異的な効果を低減する。
【０００６】
一旦発現されると、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの「足場」ドメインとＣａｓ９上の表面に露出した正電荷を帯びた溝との間の相互作用を介してリボヌクレオタンパク質複合体を形成する。Ｃａｓ９は、分子が不活性非ＤＮＡ結合立体配座から活性ＤＮＡ結合立体配座にシフトする、ｇＲＮＡ結合に対する立体配座の変化を生じる。重要なことに、ｇＲＮＡの「スペーサー」配列は、標的ＤＮＡと相互作用するために自由なままである。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、任意のゲノム配列をＰＡＭと結合させるが、ｇＲＮＡスペーサーが標的ＤＮＡと一致する程度によってＣａｓ９が切断されるかどうか決定する。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が推定ＤＮＡ標的に結合すると、ｇＲＮＡ標的配列の３’末端にある「シード」配列が標的ＤＮＡにアニールし始める。シードＤＮＡ配列及び標的ＤＮＡ配列が一致する場合に、ｇＲＮＡは、（ｇＲＮＡの極性に対して）３’から５’の方向で標的ＤＮＡにアニールし続けるであろう。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び同様にＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１及び他のＣＲＩＳＰＲ系は、ｇＲＮＡが正しく設計されている場合に非常に特異的であるが、特にＣＲＩＳＰＲ技術に基づく臨床用途について、特に特異性が依然として主要な関心事である。ＣＲＩＳＰＲ系の特異性は、ｇＲＮＡ標的配列がゲノムの残りの部分と比較してゲノム標的に対してどれくらい特異的であるかによって大部分が決定される。
【０００８】
植物界は、緑藻、コケ植物、シダ植物及び陸生植物のゲノム並びに表現型の違いをもたらす高い不均一性及び多様性の種を含む。植物ゲノム及びそれらの複雑さは、高精度の遺伝子編集又はゲノム操作にとって難題である。ゼア属（トウモロコシ（ｍａｉｚｅ又はｃｏｒｎ））は、例えば、全穀物作物の中で、２０１２年には８億７５００万トンの収量である、世界で最も高い生産量を有する。それは１０の単数染色体数を有する約２．４ギガベース（Ｇｂ）の大きなゲノムを有する（Schnableら、2009；Zhangら、2009）。トリチクム・エスティバム（Triticum aestivum）（パンコムギ）は、例えば、〜１７Ｇｂと推定されるゲノムサイズを有する六倍体である。ベータ・ブルガリス亜種ブルガリス（Beta vulgaris ssp. vulgaris）（サトウダイコン）は、約４７０メガベース（Ｍｂ）〜約５６９Ｍｂの範囲のゲノムサイズを有する。植物細胞の特定の構造及び組成、並びに植物の特有の発達は、植物細胞内の標的配列を改変するための使用を意図する場合に、ＣＲＩＳＰＲツールについての特定の適応を要求する。したがって、動物、特に哺乳動物の系のために確立されたＣＲＩＳＰＲツール及びそれに関連する原理は、必ずしも目的の植物細胞において機能するとは限らず、植物において広範な適用を達成するための技術を確立するための特定の戦略が必要である。
【０００９】
同様に、動物、及び特に哺乳動物のゲノムは複雑であり、例えば、ハツカネズミのゲノムについて２．７Ｇｂ又はホモサピエンスのゲノムについて３．２Ｇｂを含む。特に、ＣＲＩＳＰＲを基礎とする遺伝子編集又はゲノム操作のアプローチがヒトゲノム内の標的の正確な遺伝子編集又はゲノム操作のために使用されることを意図する場合に、あらゆる種類の非特異的効果が非常に有害でありうるために、高い特異性を提供する緊急の必要性がある。
【００１０】
一般に二本鎖切断（ＤＳＢ）又はＤＮＡ損傷がゲノムの完全性にとって有害であるため、ゲノム操作に関して決定的に考慮されるべき他の態様は、目的のゲノム標的部位の切断後に必要な修復メカニズムである。ゲノム材料中のＤＳＢは、複製中に電離放射線、化学物質、酸化、酵素、及び一本鎖切断によって生じてよく、遺伝子損失、失速したＤＮＡ複製、及び細胞死をもたらしうる深刻な形態のＤＮＡ損傷を示す。したがって、細胞機構が二本鎖切断（ＤＳＢ）修復のメカニズムを提供することが非常に重要である。細胞は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ損傷のいずれかの修復を試みる固有のメカニズムを有する。ＤＳＢ修復メカニズムは、２つの主要な基本型、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）に分けられている。一般に、相同性を基礎とする修復メカニズムは、通常、相同組換え修復（ＨＤＲ）と言われる。
【００１１】
ＮＨＥＪは、相同配列を必要としないが、しばしば誤りがちであり、したがって潜在的に変異原性である動物及び植物において優位な核応答である（Wyman C, Kanaar R. "DNA double- strand break repair: all's well that ends well", Annu. Rev. Genet. 2006; 40, 363-83）。ＨＤＲによる修復は相同性を要求するが、破壊されたものを修復するために無傷の染色体を使用するＨＤＲ経路、すなわち二本鎖切断修復及び合成依存鎖アニーリング（synthesis-dependent strand annealing）は非常に正確である。古典的なＤＳＢ修復経路において、３’末端が無傷の相同鋳型に侵入し、そしてＤＮＡ修復合成のためのプライマーとして作用し、最終的に二重ホリデイジャンクション（ｄＨＪ）の形成をもたらす。ｄＨＪは、侵入鎖の伸長が第２のＤＳＢ末端からＤＮＡを「捕獲」及び合成する場合に形成される四本鎖分岐構造である。個々のＨＪは、２つの方法のうちの１つでの切断により分解される。合成依存鎖アニーリングは保存的であり、もっぱら非乗換え事象（non-crossover event）をもたらす。これは、全ての新たに合成された配列が同一の分子上に存在することを意味する。ＮＨＥＪ修復経路とは異なり、合成依存鎖アニーリングにおける鎖侵入及びＤループ形成に続いて、侵入鎖の新たに合成された部分を、鋳型から移動し、他のＤＳＢ末端での侵入していない鎖の処理した末端に戻す。非侵入鎖の３’末端は、伸長され、連結されてギャップを満たす。ＨＤＲのさらなる経路があり、まだ完全に特徴付けられていない破壊誘発修復経路（break- induced repair pathway）と言われる。この経路の中心的な特徴は、修復のために使用されうるＤＳＢでの唯一の侵入末端の存在である。
【００１２】
さらなるＨＤＲ経路は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）である。ＳＳＡは、非保存性であり、３０ｂｐ超の直列反復配列間で生じ、欠失をもたらす。近年、マイクロホモロジー媒介末端連結（ＭＭＥＪ）は、真核生物におけるＤＳＢの特徴的なタイプとして認識されている。相同性の非常に短い（２〜１４ｂｐ）領域のみが、この経路のために要求され、そしてそれは、典型的にＳＳＡのような欠失を放置する。それは、ＨＲ及びＮＨＥＪ経路と遺伝的に区別されており、哺乳動物細胞においてＮＨＥＪに対する補助として作用する（以下から公知である、T., Huq, E., & Herrin, D. L. (2010). Microhomology-mediated and nonhomologous repair of a double-strand break in the chloroplast genome of Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 707(31 ), 13954-13959）。さらに、植物における、いわゆる代替末端連結（alternative end-joining；ＡＥＪ）経路が記載されている（Charbonnel C, Allain E, Gallego ME, White CI (201 1 ) Kinetic analysis of DNA double-strand break repair pathways in Arabidopsis. DNA Repair (Amst) 10: 61 1 -619）。要約すると、ＨＲ／ＨＤＲは、鋳型として姉妹染色分体上で相同な一続きのＤＮＡを使用する。したがって、高いフェデリティーが得られるが、しかしながら効率は低下する。対照的に、ＮＨＥＪは非常に効率的であり、有意な相同性とは無関係に両端を再結合することができる直接的な経路であるが、一方でこの効率は、このプロセスがエラーが発生しやすく、かつ挿入又は欠失に関連しうるという欠点を伴う。
【００１３】
したがって、自然な修復経路に影響を与えようとする遺伝子編集又はゲノム操作的アプローチのために、重要なパラメータである修復鋳型（ＲＴ）の物理的設計が必要である。ｓｓＤＮＡ又は部分的ｄｓＤＮＡのいずれかとしてＲＴを提供することが可能であってよい。短いオリゴヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡとして又はｄｓＤＮＡとして送達される場合に、多種多様な動物系におけるＨＲにうまく使用されてきた。報告されている遺伝子編集の頻度は、長いｄｓＤＮＡ  ＲＴよりは高くない（Yangら、2013）。自由分子として送達される、約７０〜９９ｂｐの範囲のｓｓＤＮＡ  ＲＴは、動物系においてうまく使用されており（Yangら、2013; Davis and Maizels, 2014）、かつある場合にはより長いｓｓＤＮＡ  ＲＴよりも良好である（例えば、Yangら、2013）。７０ｂｐより短いｓｓＤＮＡ  ＲＴも通常使用されるが、わずかに遺伝子編集の頻度が低下する。ＣＲＩＳＰＲを基礎とする遺伝子編集又はゲノム操作編集の記載内容におけるｇＲＮＡに関連するストランドバイアスも、ｓｓＤＮＡ  ＲＴでも見出されている（Yangら、2013）。
【００１４】
修復鋳型（ＲＴ）と組み合わせてゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲツールに依存する現在のプロトコルは、二本鎖又は一本鎖のいずれかの核酸ＲＴの個別の提供にもっぱら依存しており、それは、塩基対及びハイブリダイゼーションによってのみ修復されるＤＮＡにおける破壊を順に認識する。しかしながら、ＤＮＡ切断が誘発される部位でのＲＴの物理的及び時間的な有効性は、それらの方法が区画での正しい配置、濃度、及びしたがって化学量論量におけるＲＴの正確な空間的及び時間的な供給を提供しないため、現在利用可能な方法により制御できず、修復を実施すべきである場合に、好ましくは標的ＤＮＡ切断の誘導直後に、切断だけでなく修復の事象も特異的に制御する。
【００１５】
文献において、２つの配列間の相同組換えは、その配列が有意な量の分離を伴うよりもむしろ核内でごく接近している場合に、より頻繁に生じることが証明されている。例えば、染色体に位置するドナー分子及び標的の間で得られた遺伝子編集率のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）における分析は、ドナーが標的と同一染色体上に存在する両方の場合において、２つの遺伝子座が異なる染色体上に位置する他の場合よりも高かった（Fauserら、2012）。しかしながら、これらの調査結果は、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲを基礎とする遺伝子編集又はゲノム操作のアプローチを最適化するために合理的な方法で決して利用されていない。
【００１６】
米国特許出願第２０１５／０３７６６４５号Ａ１（ＵＳ ２０１５／０３７６６４５ Ａ１）は、ＤＮＡ修復、変異、又は置換のためのツールとして核酸配列を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒｓTMを使用する遺伝子治療の組成物及び方法を開示している。ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、インビボ又はインビトロで細胞内での標的ＤＮＡ配列の相同組換え修復、変異、又は置換のための核酸配列鋳型を含み、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、複製の細菌源又は抗生物質選択遺伝子の双方を欠き、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、約２５００ｂｐまでのサイズを有する。しかしながら、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒをコードする修復鋳型の効果は、標的ＤＮＡ配列の近くの核酸配列に対する修復鋳型配列の相補性にもっぱら依存し、かつ目的の標的部位での修復鋳型の物理的有効性は全く制御されない。
【００１７】
米国特許出願第２０１５／００８２４７８号Ａ１（ＵＳ ２０１５／００８２４７８ Ａ１）は、植物又は植物細胞のゲノム中の標的配列のゲノム改変のための、植物の選択のための、遺伝子編集のための、及び目的のポリヌクレオチドを植物のゲノムに挿入のための植物におけるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を使用する組成物及び方法に関する。前記方法及び組成物は、植物、植物細胞又は種子のゲノム内の目的の標的部位及びヌクレオチドを改変又は変更するための効果的な系を提供するためにガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を使用する。導入されたＤＳＢの修復を媒介するために、別個のＨＤＲ修復ＤＮＡベクターが開示及び使用されており、又はＮＨＥＪによる自発的修復が示唆されている。
【００１８】
欧州特許第２ ９５８ ９９６号Ａ１（ＥＰ ２ ９５８ ９９６ Ａ１）は、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）又はヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）によって媒介される遺伝子破壊を増加させるために細胞内にＮＨＥＪメカニズムの阻害剤を提供することによって特異的ＤＳＢ修復の問題を克服することを試みている。ＤＮＡ依存型プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）及び／又はポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１／２（ＰＡＲＰ１／２）の小分子阻害剤を使用して、これらのＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路の重要な酵素活性を阻害することによって、ヌクレアーゼによる遺伝子破壊のレベルは、古典的なＮＨＥＪ、例えば代替的なＮＨＥＪ及び／又はマイクロホモロジー媒介末端連結よりもエラーを起こしやすい修復経路を頼ることで細胞を強制することによって増加する。したがって、追加の化学物質がゲノム編集の過程で追加されるが、しかしこれはいくつかの細胞型及びアッセイについて不利である可能性がある。これは、処理した細胞のゲノムの完全性及び／又は再生能にも影響しうる。
【００１９】
Nishimasuら（"Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA", Cell, 156(5): 935-49, 2014）は、２．５Åの解像度でのｓｇＲＮＡとその標的ＤＮＡとの複合体におけるストレプトコッカス・ピオゲネスのＣａｓ９の結晶構造を開示しており、特に、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ三元複合体、並びにＣａｓ９の２つのローブ、すなわち認識ローブ及びヌクレアーゼローブを明らかにしている。しかしながら、詳細な構造情報が提供されているにもかかわらず、ＤＳＢ修復の問題を除いて、どのようにして構造知識をゲノム編集に利用させることができるかについてのさらなる機能的な技術的教示がない。
【００２０】
Tsaiら（"Dimeric CRISPR RNA-guided Fokl nucleases for highly specific genome editing", Nature Biotechnology, 32, 569-576 (2014), doi:10.1038/nbt.2908）は、ＲＮＡ−ガイドＦｏｋｌヌクレアーゼ（ＲＦＮ）及びＣｓｙ４を基礎とした多重ｇＲＮＡ発現系を開示している。標的としてのヒト細胞について、３’末端上で２８ｂｐの追加の配列を有するｇＲＮＡと、会合した１８７アミノ酸（２１．４ｋＤ）Ｃｓｙ４（Ｃａｓ６）タンパク質とを有するＣａｓ９が、標準ｇＲＮＡ対照と比較して、ＤＳＢ誘発において少なくとも９０％の活性を維持していたことが見出された。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集を最適化するためにＤＮＡ修復鋳型の概念をｇＲＮＡと一緒にする、これらの調査結果の潜在的な影響に関する開示はない。
【００２１】
さらに、Shechnerら（"Multiplexable, locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-Display", Nature Methods, 12(7), 664-670 (2015), doi: 10.1038/nmeth.3433）は、長い非コードのｓｓＲＮＡ配列に転写的に融合させたｓｇＲＮＡを導入した場合でさえも、特定のゲノム標的部位と相互作用するＣａｓについての能力を証明した。転写融合を、ｓｇＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端及び３’末端で、並びに標準ｓｇＲＮＡ構造の内部ステムループで試験した。全ての配置が、Ｃａｓ９による配列特異的ターゲティングが可能であったが、ｓｇＲＮＡ上での５’及び３’転写融合は最も効果的であった。３’融合は、４８１９ｂｐもの長さのｓｓＲＮＡカーゴで特異的ターゲティングを示した。しかしながら、Shechnerらは、多重ターゲティング及び異所性ターゲティングの態様に焦点を合わせており、高精度のゲノム操作のための効率的なｓｇＲＮＡ／修復鋳型複合体を提供する問題に対処するためのあらゆる修復鋳型又は修復鋳型ツールに関連するｇＲＮＡを教示していない。
【００２２】
したがって、例えば、目的の細胞における標的部位のために最適化されたｇＲＮＡを提供し、かつ同時に遺伝子編集又はゲノム操作の介入を制御するために不可欠であるＤＳＢの高精度であり正確なＨＤＲを媒介する可能性を提供することにより、高精度ゲノム切断を組み合わせた、適したＣＲＩＳＰＲツール、具体的には、植物、特に主要作物植物の精密な編集のために最適化されたツールを提供することにおける継続的な必要性が存在する。
【００２３】
したがって、酵母、動物及び植物細胞を含む真核細胞に特に適した、精密なゲノム編集のための修復鋳型を提供するための新規の戦略を提示することが目的である。
【００２４】
バイオテクノロジーにおける、例えば標的とした特性の発展のための治療的アプローチ、遺伝子治療又は植物もしくは微生物ゲノム操作のための、ゲノム編集のとてつもない進歩にもかかわらず、導入されるべき標的ゲノムの改変の特異性又は標的としていない効果に関して依然として大きな問題及び懸念がある。この問題は、とりわけ、目的のゲノム標的核酸の破壊及び関連する修復を誘発する場合に得られる精度の程度に関係する。
【００２５】
ＤＳＢを誘発するあらゆる種類の遺伝子編集又はゲノム操作もアプローチは、望ましくない核酸交換を引き起す、潜在的に有害なＤＮＡ切断及びおそらく望ましくないＤＮＡ修復メカニズムを導入するため、標的ＤＮＡ修復鋳型（ＲＴ）の使用も含意する高精度で制御された遺伝子編集又はゲノム操作を達成するためのより効率的な方法及びツールを開発することが継続的に必要とされている。
【００２６】
オフターゲット効果を媒介することなく成功したゲノム操作を提供することにしばしば関連する別の問題は、厳密に、切断が起き、したがって修復されなければならない時点でＤＳＢの部位での修復鋳型の物理的有効性である。通常、所望の編集の事象は、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）経路を介するか又は前述した内因性相同配列での組換えを介する修復によって打ち負かされる。改変される標的生物に依存して、これは、目的の修復鋳型と一緒に遺伝子編集又はゲノム操作のツールを導入するための集中的な戦略を要求し、その結果、すべてのツール、すなわちエンドヌクレアーゼシザー（endonuclease scissors）、ガイドｇＲＮＡ及び修復鋳型が、適切なタイミングで、ゲノム、すなわち好ましくは核、又は任意の他のゲノム保有区画、例えばミトコンドリアを含む細胞内の区画に到達すことができる。この制限を部分的に克服するための方法の１つは、修復鋳型を増幅し、それにより核内の鋳型の存在量を増加させ、そしておそらくジェミニウイルスベクターの助けによるＤＳＢの修復のために使用することをより有効にすることによる方法である（例えば、Mach, Plant Cell. 2014, doi:10.1 105/tpc.1 14.122606；及びBaltesら、Plant Cell. 2014, doi: 10.1 105/tpc.1 13.1 19792を参照されたい）。しかしながら、修復鋳型は別個の物理的実体として送達され、したがって、ＤＳＢがエンドヌクレアーゼにより導入される時点で、ＤＮＡ修復が正確に必要とされる場所で、修復鋳型が実際に存在することを確認することを制御するメカニズムはない。
【００２７】
ＣＲＩＳＰＲ適用に関して、遊離ｓｓＤＮＡヌクレオチドを修復鋳型又はプラスミド由来の修復鋳型（http://bloq.addqene.org/crispr-101-homology-directed-repairを参照されたい）として使用することが頻繁に提案されているが、まだ戦略は開示又は示唆されておらず、これは、ＤＳＢが生じた場合に、修復鋳型が実際にｉｎ ｓｉｔｕで修復されるべきＤＳＢと物理的に接触することを保証する。
【００２８】
この時点で、異なる標的細胞に必要な遺伝子編集又はゲノム操作及び／又は修復鋳型ツールの送達の特有の差異が明らかになる。これに関して、植物細胞は、細胞壁を含む特定の顕著な特徴を有し、植物細胞における遺伝子編集又はゲノム操作を、動物／哺乳動物細胞について確立された遺伝子編集又はゲノム操作とは完全に異なる作業課題にしている。それというのも、ゲノム編集及び／又は修復ツールの送達は、他の真核細胞とは異なる形質転換、トランフェクション及び／又は形質導入の方法によって媒介されるからである。しかしながら、これらの特性は、非常に正確な植物ゲノム編集を達成するために考慮されなければならない。現在、遺伝的構築物の形で遺伝物質を目的の植物細胞に導入するための、生物学的及び物理的手段を含む種々の植物形質転換方法が存在する。一般的な生物学的手段は、何十年もの間、種々の植物材料に使用されてきた、アグロバクテリウム属種での形質転換である。ウイルスベクターを媒介した植物形質転換は、遺伝物質を目的の細胞に導入するためのさらなる戦略を示す。植物生物学における適用を見出す物理的手段は、遺伝子銃トランスフェクション又は微粒子媒介遺伝子移入とも言われる微粒子銃であり、それは目的の核酸又は遺伝子構築物を含む被覆微粒子又はナノ粒子を標的細胞又は組織にトランスフェクトするための物理的送達手段を指す。物理的導入方法は、核酸、すなわちＲＮＡ及び／又はＤＮＡ、並びにタンパク質を導入するために適している。同様に、特に、目的の核酸又はアミノ酸構築物を植物細胞に導入する特異的な形質転換法又はトランフェクション法が存在し、それはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子、及び細胞膜透過性ペプチドを含む。さらに、とりわけリン酸カルシウムでのトランフェクション、リポソーム、例えばカチオン性リポソームを使用するトランフェクション、又はＤＥＡＤ−デキストランもしくはポリエチレンイミンを含むカチオンポリマーでのトランフェクション、又はそれらの組合せを含む、遺伝子構築物及び／又は核酸及び／又はタンパク質を導入する、化学物質に基づくトランフェクション法が存在する。したがって、前記送達法及び送達媒体又はカーゴは、動物及び哺乳動物細胞を含む他の真核細胞のために使用される送達ツールとは本質的に異なり、全ての送達方法は、特に微調整及び最適化されなければならず、その結果、ゲノム編集を仲介するための目的の構築物が十分に機能的で能動的な方法で、目的の標的細胞の特定の区画に導入されることができる。
【００２９】
したがって、本発明の目的は、植物細胞を含む真核細胞における高精度のゲノム編集に適した新たなツール及び方法を提供することにおける顕著な必要性を克服すること、特にＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の分野において、ＤＳＢが修復さる部位及びその時点での修復鋳型の物理的有効性に関する遺伝子編集の分野における進行中の制限、及びしたがって非相同末端連結経路（ＮＨＥＪ）を介した又は（内因性）相同配列（ＨＲ／ＨＤＲ）での組換えを介したＤＮＡ修復メカニズムによる競合を克服することである。本発明の他の目的は、別個の修復鋳型又は修復オリゴヌクレオチド、さらにはＣＲＩＳＰＲ核酸及び修復鋳型特性を一様にする分子又は分子複合体を提供する必要なしに、真核細胞における部位特異的ゲノム編集のために利用されることができ、標的部位、すなわち原核細胞、真核生物ゲノム、特に動物細胞、特に哺乳動物細胞、又は植物のゲノムに容易に送達することができる単純化ＣＲＩＳＰＲツールキットを提供することであり、それというのも、動物又は植物細胞のゲノム編集中に達せられる精度は、医学及び食品管理当局によって設定される必然的に高い規制要件を満たすために依然として改善されなければならないからである。本明細書において開示されるＲＮＡとのハイブリッドであり、タンパク質−ＲＮＡヌクレアーゼ複合体に物理的に結合している修復鋳型のオフターゲット組込みの危険性は、遊離分子として細胞に導入されるｓｓ−ＤＮＡ又はｄｓ−ＤＮＡ修復鋳型よりも低い。さらに、植物特異的送達方法を助ける植物特異的ゲノム編集構築物をトランスフェクトするために特に最適化された送達ツールを提供することが目的であった。さらに、生産プロセスにおける中間体として外来ＤＮＡを組み込むあらゆる形態の遺伝子改変に対する特定の権限における感応性の理由で、必要に応じて、一時的に提供されるＲＮＡ及び部位特異的ヌクレアーゼを使用して一時的な編集活性に依存できるアプローチを提供することが目的であった。最終的に、本発明の目的は、面倒なクローニング及び予備試験を必要としないため、新たな標的の試験に関して時間節約であるという点で最近の方法より優れている遺伝子編集又はゲノム操作の方法を提供することであった。
【００３０】
発明の要約
前記目的は、本発明に従って、修復鋳型をヌクレアーゼ複合体に対する「カーゴ」として直接利用することによってＤＳＢの部位に送達することにより、修復鋳型の有効性の問題を解決することによって達せられる。ｉｎ ｓｉｔｕで切断が行われる時点で修復鋳型を二本鎖切断に向かわせることは、切断の修復における活用のための修復鋳型（ＲＴ）の局所的な有効性を高める。それによって、本発明によるＣＲＩＳＰＲ核酸／ＲＴツールは、特注の修復鋳型を提供することを補助するだけでなく、さらに遺伝子編集の事象の頻度及び／又は特異性を増加させるのを助けることができる。このアイデアは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体及びインビトロでの核酸操作における核酸、例えばｇＲＮＡの存在を、ゲノム編集ツール及び／又は修復鋳型を標的細胞内の目的の区画に送達するための特定の送達ツール及び方法と組み合わせた、同時のゲノム切断及び標的修復のために、部位特異的ヌクレアーゼ及び修復鋳型の機能性を単一の分子複合体に組み合わせるために活用する。したがって、この系は、大型動物、特に哺乳動物、又は時にはさらにより複雑な植物ゲノムにおけるオフターゲット分裂を最小限にするために必要である、ＣＲＩＳＰＲアプローチのより高い特異性、及びしたがってオフターゲットへの影響の低減を可能にする。
【００３１】
特に、前記目的は、第一の態様において、
（ａ）少なくとも１つのＲＮＡ核酸配列を含み、かつＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列との会合を含むＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列であって、（ｉ）第一のＤＮＡ標的配列に相補的である第一の配列部分及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互に作用して配置される第二の配列部分を含む、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列、
（ｂ）ＤＮＡ核酸配列を含む修復鋳型核酸配列であって、第二のＤＮＡ標的配列に相補的である少なくとも一部を含み、かつ標的の相同組換え修復を媒介するために配置された、修復鋳型核酸配列、及び
（ｃ）任意にＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列と修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域
を含む、少なくとも１つのＲＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡ核酸配列を含むか、それらからなるハイブリッド核酸配列を提供することにより解決され、ここで、ハイブリッド核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互作用して、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが第一のＤＮＡ標的配列を認識できかつ任意にＤＮＡ切断を誘発することができ、かつハイブリッド核酸配列は、第二のＤＮＡ標的配列の部位で修復鋳型核酸配列によって媒介される相同組換え修復を介してゲノム操作を指示し、第二のＤＮＡ標的配列は、細胞の内因性ＤＮＡ配列を示す。
【００３２】
第一の態様の一実施形態において、ハイブリッド核酸配列であって、修復鋳型核酸配列及び／又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列が、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基改変を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含み、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列が、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ修復鋳型核酸配列が、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む、ハイブリッド核酸配列が提供される。
【００３３】
前記態様の他の実施形態において、ハイブリッド核酸配列であって、修復鋳型核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列の３’末端でＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列の５’末端と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列内に位置している、ハイブリッド核酸配列が提供される。
【００３４】
本発明による前記第一の態様のさらに他の実施形態において、ハイブリッド核酸であって、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列又は少なくとも１つのガイド核酸配列に共有的に付着しており、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列又は少なくとも１つのガイド核酸配列に非共有的に付着している、ハイブリッド核酸が提供される。
【００３５】
本発明による第二の態様において、本発明の第一の態様による少なくとも１つのハイブリッド核酸配列、及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む分子複合体であって、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドが機能的方法で会合している、分子複合体が提供される。
【００３６】
本発明の任意の態様に従った一実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルスを含むストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス・アウレウス、又はナイセリア・メニンギティディスを含むナイセリア属種、コリネバクター属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifactor）、ユーバクテリム属（Eubacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、バクテロイデス属（Bacteroides）、フラビボーラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、スフェロケタ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリルム属（Azospirillum）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、ロゼブリア属（Roseburia）、パービバキュラム属（Parvibaculum）、ニトラティフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）及びカンピロバクター属（Campylobacter）のＣａｓポリペプチドからなる群から独立して選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、アシダミノコッカスＢＶ３Ｌ６種（Acidaminococcus sp. BV3L6）を含むアシダミノコッカス属種、ラクノスピラ細菌ＮＤ２００６（Lachnospiraceae bacterium ND2006）を含むラクノスピラ属種、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１ １２を含むフランシセラ属種、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、プレボテラ属種（Prevotella spp.）、又はポーフィロモナス属種（Porphyromonas spp.）のＣｐｆ１ポリペプチドを含む、古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチドから選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドニッカーゼ又はＣＲＩＳＰＲポリペプチド欠失エンドヌクレアーゼ活性を含む、ＣａｓＸポリペプチド又はＣａｓＹポリペプチド、又はそれらの多様体及び／又は機能的断片及び／又は組合せ物から選択される。
【００３７】
本発明による他の態様において、したがって、第一の態様による少なくとも１つのハイブリッド核酸配列を含むかそれにより編集され、又は本発明の第二の態様による少なくとも１つの分子複合体を含む、植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫が提供される。
【００３８】
本発明によるさらに他の態様において、原核細胞又は真核細胞において少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変するための方法であって、
（ｉ）目的のゲノム領域で少なくとも１つの第一のＤＮＡ標的配列及び少なくとも１つの第二のＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を準備すること、
（ｉｉ）本発明の第一の態様について詳述した少なくとも１つのハイブリッド核酸配列及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む、本発明の第２の態様について詳述した少なくとも１つの分子複合体を準備すること、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの分子複合体と少なくとも１つのＤＮＡ標的配列とを適した条件下で接触させて、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の第一の配列の一部又は少なくとも１つのハイブリッド核酸配列のガイド核酸配列と、少なくとも１つの第一のＤＮＡ標的配列との相補的塩基対を得て、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって第一のＤＮＡ標的配列の認識を達成し、及び任意に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって少なくとも１つのＤＮＡ切断を導入すること、ここで、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つの第二のＤＮＡ標的配列の部位で相同組換え修復を指示する、及び
（ｉｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を含む少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を得ること
により、原核細胞又は真核細胞において少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変するための方法が提供される。
【００３９】
この態様の一実施形態において、分子複合体の少なくとも１つのハイブリッド核酸配列は、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドとは無関係に少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞に提供され、少なくとも１つの分子複合体は、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞内で会合している。
【００４０】
少なくとも１つの真核細胞が、哺乳動物、霊長類、又はヒトの細胞である、第一の態様のさらなる実施形態が提供される。一実施形態において、細胞は、ヒトの細胞である。一実施形態において、細胞は、造血細胞、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を含むリンパ球、体細胞、生殖細胞、出生前細胞、例えば接合体、胚盤胞又は胚細胞、幹細胞、有糸分裂可能な細胞、又は減数分裂可能な細胞である。好ましくは、細胞は、動物の免疫細胞又は癌細胞である。一実施形態において、ＤＮＡ切断標的領域は染色体核酸である。
【００４１】
第一の態様の一実施形態において、細胞は、植物細胞、好ましくは、オオムギ（Hordeum vulgare）、ホルデウム・バルボーサム、（Hordeum bulbusom）、モロコシ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Saccharum officinarium）、トウモロコシ（Zea mays）、アワ（Setaria italica）、オリザ・ミヌタ（Oryza minuta）、イネ（Oriza sativa）、オリザ・オーストラリエンシス（Oryza australiensis）、オリザ・アルタ（Oryza alta）、コムギ（Triticum aestivum）、マカロニコムギ（Triticum durum）、ライムギ（Secale cereale）、ライコムギ（Triticale）、リンゴ（Malus domestica）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、ハマムギクサ（Hordeum marinum）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ゴウシュウヤブジラミ（Daucus glochidiatus）、サトウダイコン（Beta vulgaris）、ダウクス・プシルス（Daucus pusillus）、ダウクス・ムリカツス（Daucus muricatus）、ノラニンジン（Daucus carota）、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）、ブドウ（Vitis vinifera）、エリスランテ・グタタ（Erythrante guttata）、ゲンセリア・アウレア（Genlisea aurea）、キュウリ（Cucumis sativus）、マルバグワ（Morus notabilis）、アラビドプシス・アレノサ（Arabidopsis arenosa）、アラビドプシス・リラタ（Arabidopsis lyrata）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、クルシヒマラヤ・ヒマライカ（Crucihimalaya himalaica）、クルシヒマラヤ・ワリチイ（Crucihimalaya wallichii）、タネツケバナ（Cardamine flexuosa）、マメグンバイナズナ（Lepidium virginicum）、ナズナ（Capsella bursa pastoris）、オルマラビドプシス・プミラ（Olmarabidopsis pumila）、ヤマハタザオ（Arabis hirsute）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）、ダイコン（Raphanus sativus）、ブラシカ・ユンカセア（Brassica juncacea）、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ルッコラ（Eruca vesicaria subsp. sativa）、オレンジ（Citrus sinensis）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、シセル・ヤマシタ（Cicer yamashitae）、シセル・ビユグム（Cicer bijugum）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）、シセル・レチクラツム（Cicer reticulatum）、シセル・ユダイクム（Cicer judaicum）、カヤヌス・カヤニフォリウス（Cajanus cajanifolius）、ビロードヒメクズ（Cajanus scarabaeoides）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ダイズ（Glycine max）、ワタ属種（Gossypium sp.）、ゲンゲ（Astragalus sinicus）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、ハナウリクサ（Torenia fournieri）、タマネギ（Allium cepa）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、及びニラ（Allium tuberosum）からなる群から選択される植物、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からの植物細胞である。
【００４２】
本発明によるこの態様のさらに他の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変は、収量改善、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、酸化ストレス、重金属ストレス、塩ストレスもしくは浸水を含む非生物的ストレスに対する耐性、昆虫に対する耐性、細菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、真菌に対する耐性もしくは線虫に対する耐性を含む生物的ストレスに対する耐性、グリホサート、グルホシネート、ＡＬＳ阻害剤及びジカンバを含む除草剤に対する耐性、倒伏抵抗性、開花期、脱粒抵抗性、種子の色、胚乳組成、栄養含有量を含む農業特性の改善、又は少なくとも1つの植物細胞における分子薬学アプローチを可能にするゲノム編集を含む代謝工学からなる群から選択される特色を生じるゲノム編集アプローチである。
【００４３】
この態様のさらなる実施形態において、前記方法は、さらに、以下、
（ｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改質を含む、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を同定及び／又は選択するステップ
を含む。
【００４４】
本発明のさらなる態様において、以下
（ｉ）本発明の前述の態様について詳述した方法を実行するステップ、ここで少なくとも１つの真核細胞は植物細胞である、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの少なくとも１つの植物細胞から少なくとも１つの植物又はそれらの子孫を得るステップ、
（ｉｉｉ）任意に、少なくとも１つの植物又はそれらの子孫の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を決定するステップ
を含む植物又は植物細胞を製造するための方法が提供される。
【００４５】
本発明による前記態様の一実施形態において、少なくとも１つの植物又は植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物から選択され、好ましくは、植物は、トウモロコシを含むゼア属種、ベンサミアナタバコ、又はサトウダイコンを含むベタ属（Beta）種、又はライムギを含むセカレ属種、又はコムギを含むトリチカム属種からなる群から選択される。
【００４６】
本発明によるさらに他の態様において、本発明の第一の態様による少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列の使用、又は原核細胞もしくは原核生物又は真核細胞もしくは真核生物における、好ましくは植物細胞もしくは植物におけるゲノム編集のための本発明の第二の態様による分子複合体の使用が提供される。
【００４７】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、続く詳細な説明、図面、配列表、並びに付属の特許請求の範囲から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】図１ａ  Ａ〜Ｄは、本発明による種々のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド核酸配列のための可能な配置及び会合の種々の方法の限定されない例を示す。図１ａは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列が５’末端に位置し、かつＲＴが、ＣＲＩＳＰＲ核酸の３’末端でＣＲＩＳＰＲ核酸と会合している配置を示す。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ核酸への一本鎖修復鋳型（ＲＴ）（ｓｓＤＮＡ）のワトソン・クリック塩基対による非共有的な会合、ここで、ＣＲＩＳＰＲ核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして、ｃｒＲＮＡ（例えばＣｐｆ１のための、又はＣｐｆ１由来のＣＲＩＳＰＲエフェクター）として、又はそれらの組合せ（例えばｓｇＲＮＡ）として機能する配列を含むＲＮＡ分子を含む。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸と一本鎖ＲＴ（ｓｓＤＮＡ）との共有的な会合。この形は、単分子としてＲＮＡ及びＲＴの一部の配列合成により、又は別個の部分をライゲーションして単分子を形成することにより作製されうる。（Ｃ）二本鎖ＲＴ（ｄｓＤＮＡ）と会合したＣＲＩＳＰＲ核酸の非共有的な会合。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ核酸と二本鎖ＲＴ（ｄｓＤＮＡ）との共有的な会合。
【図１ｂ】図１ｂ  Ａ〜Ｄは、本発明による種々のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド核酸配列のためのさらに可能な配置及び会合の種々の方法の限定されない例を示す。図１ｂは、ＲＴが５’末端に位置し、かつＣＲＩＳＰＲ核酸が、ＲＴの３’末端と会合している配置を示す。（Ａ）一本鎖修復鋳型（ＲＴ）（ｓｓＤＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ核酸とのワトソン・クリック塩基対による非共有的な会合、ここで、ＣＲＩＳＰＲ核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして、又はｃｒＲＮＡ（例えばＣｐｆ１のための、又はＣｐｆ１由来のＣＲＩＳＰＲエフェクター）として機能する配列、又はそれらの組合せ（例えばｓｇＲＮＡ）を含むＲＮＡ分子を含む。（Ｂ）一本鎖ＲＴ（ｓｓＲＮＡ）のＣＲＩＳＰＲ核酸への共有的な会合。この形は、単分子としてＲＮＡ及びＲＴの一部の配列合成により、又は別個の部分をライゲーションして単分子を形成することにより作製されうる。（Ｃ）二本鎖ＲＴ（ｄｓＲＮＡ）のＣＲＩＳＰＲ核酸への非共有的な会合。（Ｄ）二本鎖ＲＴ（ｄｓＲＮＡ）のＣＲＩＳＰＲ核酸への共有的な会合。
【図２】図２  Ａ〜Ｃは、本発明によるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド核酸を形成するために、少なくとも１つのＲＮＡストレッチを含むＣＲＩＳＰＲ核酸にＲＴを付着又は会合させることができる可能な位置の限定されない例を示す。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ核酸、例えばｓｇＲＮＡの３’末端への一本鎖又は二本鎖ＲＴの共有又は非共有的な会合。（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸、例えばｓｇＲＮＡの５’末端への一本鎖又は二本鎖ＲＴの共有又は非共有的な会合。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ核酸、例えばｓｇＲＮＡへの一本鎖又は二本鎖ＲＴの内部の共有又は非共有的な会合。修復鋳型（ＲＴ／ｒｔ）の一部は全ての図において灰色で示される。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、ＲＴと、ＣＲＩＳＰＲ核酸、例えばｓｇＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡの３’領域との、又はその内部での共有的な会合の一実施形態を使用する、本明細書において開示されたヌクレアーゼ複合体での目的のゲノム配列への編集を段階的に導入するための制限のない例を示す。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ、ＣａｓＸもしくはＣａｓＹ又はそれらの任意の多様体との複合体中のハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸（ＣＲＩＳＰＲ核酸、例えばｓｇＲＮＡ、及び修復鋳型（ｒｔ））の概略図。（Ｂ）標的ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ））に結合した複合体の概略図及び切断部位の表示（黒い三角）。（Ｃ）切断された標的ＤＮＡの概略図。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって離された切断された標的ＤＮＡ及び相補的ワトソン・クリック塩基対による修復鋳型（ｒｔ）との相互作用の概略図。（Ｅ）相同組換え中にＲＴからコピーされた編集を含む修復された標的部位（ｇＤＮＡ）（グレーで示す）の概略図。修復鋳型（ＲＴ／ｒｔ）の一部は全ての図において灰色で示される。
【図４】図４は、ＲＮＡ−ＤＮＡライゲーションアッセイの設定（表にして調査、上部）及び結果（トリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）尿素ゲル、６％アクリルアミド、下部）を示す。この目的のために、ＲＴとして５’リン酸化ｓｓＤＮＡを購入した。続いてこのｓｓＤＮＡを５’アデニル化し、続いて得られたアデニル化ＲＴを目的のＣＲＩＳＰＲ核酸の３’末端にライゲートした。ＲｅｃＪＦ、一本鎖ＤＮＡ特異的５’エキソヌクレアーゼを使用して、ＣＲＩＳＰＲ核酸にライゲートしたアデニル化ＲＴの成功したライゲーションを試験した。それぞれの方法ステップのエダクト及び混合物を、ＴＢＥ尿素ゲルに適用して、それぞれの方法ステップのエダクト及びそれぞれの生成物を観測した。
【００４９】
定義
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」又は「一本鎖ガイドＲＮＡ」もしくは「ｓｇＲＮＡ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との合成融合物を示すか、又はｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡのみからなる単一のＲＮＡ分子を示すか、又は個々にｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含むｇＲＮＡを示す。ｔｒａｃｒ及びｃｒＲＮＡ部分は、それぞれのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって要求に応じて存在する場合に、したがって、必ずしも１つの共有的に付着したＲＮＡ分子上に存在する必要はないが、非共有又は共有相互作用によって会合して又は会合されて、本開示によりｇＲＮＡを提供できる２つの個々のＲＮＡ分子によって構成することもできる。一本鎖ＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼ、例えばＣｐｆ１（Zetscheら、2015、前述を参照されたい）の場合に、例えば、一本鎖ガイド核酸配列としてのｃｒＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングを媒介するために十分であってよい。
【００５０】
「ガイド核酸（配列）」及び「ＣＲＩＳＰＲ核酸（配列）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと特異的に相互作用でき、かつ少なくとも１つのＲＡＡ部分を含む核酸配列を意味する。
【００５１】
「ゲノム編集」、「遺伝子編集」及び「ゲノム操作」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の生きている生物の遺伝情報又はゲノムの標的とした特異的な改変のための戦略及び技術を示す。そのように、この用語は遺伝子編集を含むが、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も含む。それ自体、前記用語は遺伝子編集を含むが、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も含む。さらに、核（存在するならば）及び細胞の他の遺伝子情報の編集又は操作を含む。さらに、「ゲノム編集」及び「ゲノム操作」という用語は、エピジェネティック編集又は操作、すなわち、例えば遺伝子発現における遺伝的変化を引き起こす可能性があるメチル化、ヒストン修飾、又は非コードＲＮＡの標的改変を含む。
【００５２】
「ＣＲＩＳＰＲポリペプチド」、「ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」、「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」、「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」又は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、本明細書において互換的に使用され、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼとして作用する、任意の天然に生じる又は人工的なアミノ酸配列、又はそれをコードする核酸配列を示し、ここで「ＣＲＩＳＰＲポリペプチド」は、任意の生物のＣＲＩＳＰＲ系に由来し、標的ゲノム操作のためにクローン及び使用されてよい。「ＣＲＩＳＰＲポリペプチド」という用語は、天然に生じるＣＲＩＳＰＲエフェクター配列の変異体又は触媒活性断片又は融合物も含む。したがって、「ＣＲＩＳＰＲポリペプチド」は、例えば、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、又はその自然環境においてエンドヌクレアーゼ機能を有するＣＲＩＳＰＲポリペプチドのヌクレアーゼ欠損多様体さえも示してよい。
【００５３】
配列又は分子に関連する「ヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書において互換的に使用され、天然源又は合成源の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを示す。したがって、ヌクレオチド配列という用語は、その長さに独立して任意のＤＮＡ又はＲＮＡ配列のために使用され、該用語は、少なくとも１つのヌクレオチドを含む任意のヌクレオチド配列を含むが、任意の種類のより大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも含む。したがって、該用語は、天然及び／又は合成のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）配列を示し、これらは任意に合成核酸類似体を含んでいてよい。本開示による核酸は、任意に最適化されたコドンであってよい。コドン最適化は、ＤＮＡ又はＲＮＡのコドン使用頻度が、目的の細胞又は生物における前記組換え核酸の転写速度を改善するために、目的の細胞又は生物の使用頻度に適合されることを意味する。当業者は、標的核酸が、コドン縮重により１つの位置で改変されてよい一方で、この改変が、標的細胞又は生物の種特異的コドン使用頻度を考慮に入れるためのコドン最適化によって達せられ、翻訳後にその位置で同一のアミノ酸配列をもたらすであろう事実を十分に認識している。本明細書による核酸配列は、以下の制限のない生物のリストについて特異的コドン最適化を実施できる：オオムギ、モロコシ、ライムギ、ライコムギ、サトウキビ、トウモロコシ、アワ、イネ、オリザ・ミヌタ、オリザ・オーストラリエンシス、オリザ・アルタ、コムギ、マカロニコムギ、ライコムギ、ホルデウム・バルボーサム、ミナトカモジグサ、ハマムギクサ、タルホコムギ、リンゴ、サトウダイコン、ヒマワリ、ゴウシュウヤブジラミ、ダウクス・プルシス、ダウクス・ムリカツス、ノラニンジン、ユーカリプタス・グランディス、エリスランテ・グタタ、ゲンセリア・アウレア、ニコチアナ・シルベストリス、タバコ、ニコチアナ・トメントシフォルミス、ベンサミアナタバコ、トマト、ジャガイモ、ロブスタコーヒーノキ、ブドウ、キュウリ、マルバグワ、アラビドプシス・サリアナ、アラビドプシス・リラタ、アラビドプシス・アレノサ、クルシヒマラヤ・ヒマライカ、クルシヒマラヤ・ワリチイ、タネツケバナ、マメグンバイナズナ、ナズナ、オルマラビドプシス・プミラ、ヤマハタザオ、セイヨウアブラナ、ブラシカ・オレラセア、ブラシカ・ラパ、ブラシカ・ユンカセア、ブラシカ・ニグラ、ルッコラ、オレンジ、ナンヨウアブラギリ、ダイズ、ワタ属種、ブラックコットンウッド、ハツカネズミ（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicu）又はホモ・サピエンス（Homo sapiens）。
【００５４】
本明細書において使用される「送達構築物」又は「送達ベクター」という用語は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むハイブリッド核酸及び／又は目的のアミノ酸配列を含む核酸を標的細胞、好ましくは真核細胞に運搬するためのカーゴについて使用される任意の生物学的又は化学的手段を示す。したがって、本明細書において使用される送達構築物又はベクターという用語は、本開示による遺伝子又は組換え構築物を、標的細胞、組織、器官又は生物に送達するための輸送手段を示す。したがって、ベクターは、直接又は間接的に、目的の標的細胞に又は植物の所望の細胞区画中の植物標的構造に送達するための配列、例えば調節配列又は局在化配列を任意に含む核酸配列を含んでよい。ベクターは、アミノ酸配位列又はリボヌクレオ分子複合体を標的細胞又は標的構造に導入するために使用されてもよい。通常、本明細書において使用されるベクターは、プラスミドベクターである。さらに、本発明によるある好ましい実施形態に従って、目的の構築物又は配列又は複合体の直接導入が実施される。直接導入という用語は、本開示により改質されるＤＮＡ標的配列を含む所望の標的細胞又は標的構造が、送達ベクターと共に送達された材料がその効果を発揮する目的の特定の標的細胞に直接形質転換又は形質導入又はトランスフェクトされることを意味する。間接導入という用語は、それ自体が形質転換されるべき目的の実際の標的細胞又は構造を示すものではないが、しかし、それらの構造は、実際の標的構造、例えば分裂組織細胞もしくは組織、又は幹細胞もしくは組織への、好ましくは本開示による遺伝子構築物を含むベクターの全身拡散及び転移の基礎として役立つ構造、例えば葉の細胞又は器官もしくは組織の細胞への導入が達せられることを意味する。ベクターという用語が、アミノ酸配列及び／又はハイブリッド核酸配列を含む核酸配列を標的細胞にトランスフェクトする記載内容において使用される場合に、ベクターという用語は、ペプチド又はタンパク質移入に適した作用剤、例えばイオン性脂質混合物、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、又は微粒子銃を意味する。核酸材料の導入の記載内容において、ベクターという用語は、プラスミドベクターを意味するだけでなく、例えば微粒子銃によって目的の標的細胞への核酸の導入及び／又はアミノ酸配列送達の基礎として役立ってよい適切な担体材料も意味する。前記担体材料は、とりわけ、金粒子又はタングステン粒子を含む。最終的に、例えば、以下のウイルス株に由来する改質されたウイルスのような、本開示による少なくとも１つの遺伝子構築物の導入のためのウイルスベクターも含む：アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、ワクシニアウイルス、センダイウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メイズストリークウイルス（ＭＳＶ）、オオムギストライプモザイクウイルス（ＢＳＭＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ、受託番号：ＲＮＡ１：Ｘ５８４５６；ＲＮＡ２：Ｘ５８４５７；ＲＮＡ３：Ｘ５８４５８）、メイズストライプウイルス（ＭＳｐＶ）、メイズラヤドフィノウイルス（Maize rayado fino virus）���ＭＹＤＶ）、メイズ萎縮モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）、ベニーウイルス（Benyviridae）科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばビート壊死性萎黄ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３５１４；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３５１５；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３５１６；ＲＮＡ４：ＮＣ＿００３５１７）又はブロモウイルス（Bromoviridae）科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばアルファモザイクウイルス属のウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００１４９５；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００２０２４；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００２０２５）、又はブロモウイルス（Bromovirus）属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＢＭＶ（前述）、又はククモウイルス（Cucumovirus）属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばキュウリモザイクウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００２０３４；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００２０３５；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００１４４０）、オレアウイルス（Oleavirus）属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、カリモウイルス科（Caulimoviridae）の、特にバドナウイルス（Badnavirus）属又はカリモウイルス属のｄｓＤＮＡウイルス、例えば種々のバナナストリークウイルス（受託番号：ＮＣ＿００７００２、ＮＣ＿０１５５０７、ＮＣ＿００６９５５又はＮＣ＿００３３８１）又はカリフラワーモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１４９７）、又はカベモウイルス属（Cavemovirus）、ペチュウイルス属（Petuvirus）、ロサドナウイルス属（Rosadnavirus）、ソレンドウイルス属（Solendovirus）、ソイモウイルス属（Soymovirus）又はツングロウイルス属（Tungrovirus）のウイルス、クロステロウイルス科（Closteroviridae）、例えばアンペロウイルス属（Ampelovirus）、クリニウイルス属（Crinivirus）のプラスストランドＲＮＡウイルス、例えばレタス伝染性黄斑ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３６１７；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３６１８）又はトマト萎黄ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００７３４０；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００７３４１）、クロステロウイルス属（Vlosterovirus）のプラスストランドＲＮＡウイルス、例えばビート萎黄ウイルス（受託番号：NC_001598）、又はベラリウイルス属（Velarivirus）のプラスストランドＲＮＡウイルス、ジェミニウイルス科（Geminiviridae）、例えばベクトルウイルス属（Becurtovirus）、ベグモウイルス属（Begomovirus）の一本鎖ＤＮＡ（±）ウイルス、例えばビーンゴールデン黄化モザイクウイルス、タバコカーリーシュートウイルス、タバコモトルリーフカーリーウイルス、トマトクロロティックモトルウイルス、トマト萎縮リーフウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、トマトリーフカーリーウイルス、トマトモルトウイルスもしくはトマト黄斑ウイルス、又はクルトウイルス属（Curtovirus）のジェミニウイルス科一本鎖ＤＮＡ（±）ウイルス、例えばビートカーリートップウイルス、又はトポクウイルス属（Topocuvirus）、ツルンクルトウイルス属（Turncurtvirus）、又はマストレウイルス属（Mastrevirus）のジェミニウイルス科一本鎖ＤＮＡ（±）ウイルス、例えばマイゼストリークウイルス（前述）、タバコ黄化萎縮ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、ルテオウイルス科（Luteoviridae）、例えばルテオウイルス属（Luteovirus）のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオオムギ黄化萎縮ウイルス−ＰＡ  Ｖ（受託番号：ＮＣ＿００４７５０）、ポレロウイルス属のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばポテトリーフロールウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１７４７）、ナノウイルス属（Nanovirus）又はバブウイルス属（Babuvirus）を含むナノウイルス科（Nanoviridae）の一本鎖ＤＮＡウイルス、アルファパルティティウイルス属（Alphapartitivirus）、ベータパルティティウイルス属（Betapartitivirus）又はデルタパルティティウイルス属（Deltapartitivirus）を特に含むパルティティウイルス科（Partiviridae）の二本鎖ＲＮＡウイルス、ポスピウイリド科（Pospiviroidae）のウイロイド、ブランビウイルス属（Brambyvirus）、バイモウイルス属（Bymovirus）、イポモウイルス属（Ipomovirus）、マクルラウイルス属（Macluravirus）、ポアセウイルス属（Poacevirus）を例えば含むポティウイルス科（Potyviridae）のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばコムギモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿０１２７９９）、又はポティウイルス属（Potyvirus）のポティウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばビートモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００５３０４）、マイゼ萎縮モザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００３３７７）、ポテトウイルスＹ（受託番号：ＮＣ＿００１６１６）又はゼアモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿０１８８３３）、又はトリティモウイルス属（Tritimovirus）のポティウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばブロムストリークモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００３５０１）又はコムギストリークモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１８８）、シュードウイルス科（Pseudoviridae）、例えばシュードウイルス属（Pseudovirus）又はサイアウイルス属（Sirevirus）の一本鎖ＲＮＡウイルス、レオウイルス科（Reoviridae）の二本鎖ＲＮＡウイルス、例えばイネ萎縮ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３７７３；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３７７４；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３７７２；ＲＮＡ４：ＮＣ＿００３７６１；ＲＮＡ５：ＮＣ＿００３７６２；ＲＮＡ６：ＮＣ＿００３７６３；ＲＮＡ７：ＮＣ＿００３７６０；ＲＮＡ８：ＮＣ＿００３７６４；ＲＮＡ９：ＮＣ＿００３７６５；ＲＮＡ１０：ＮＣ＿００３７６６；ＲＮＡ１１：ＮＣ＿００３７６７；ＲＮＡ１２：ＮＣ＿００３７６８）、例えばアルファネクロウイルス属（Alphanecrovirus）、アウレウスウイルス属（Aureusvirus）、ベータネクロウイルス属（Betanecrovirus）、カルモウイルス属（Carmovirus）、ダイアンソウイルス属（Dianthovirus）、ギャランティウイルス属（Gallantivirus）、マカナウイルス属（Macanavirus）、マクロモウイルス属（Machlomovirus）、パニコウイルス属（Panicovirus）、トンブスウイルス属（Tombusvirus）、ウンブラウイルス属（Umbravirus）もしくはゼアウイルス属（Zeavirus）を含むトンブスウイルス科（Tombusviridae）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばマイゼ壊死性ストリークウイルス（受託番号：ＮＣ＿００７７２９）、又はビルガウイルス科（Virgaviridae）のプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばフロウイルス属（Furovirus）、ホルデイウイルス属（Hordeivirus）のウイルス、例えばオオムギストライプモザイクウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３４６９；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３４８１；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３４７８）又はペクルウイルス属（Pecluvirus）、ポモウイルス属（Pomovirus）、トバモウイルス属（Tobamovirus）もしく��トブラウイルス属（Tobravirus）のウイルス、例えばタバコラットルウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３８０５；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３８１１）、並びにモノネガウイルス目（Mononegavirales）、特にラブドウイルス科（Rhabdoviridae）のマイナス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばオオムギ黄化縞モザイクウイルス（受託番号：ＫＭ２１３８６５）又はレタス壊死性黄化ウイルス（受託番号／標本：ＮＣ＿００７６４２／ＡＪ８６７５８４）、ピコルナウイルス目（Picornavirales）、特にセコウイルス科（Secoviridae）、例えばコモウイルス属（Comovirus）、ファバウイルス属（Fabavirus）、ネポウイルス属（Nepovirus）、チェラウイルス属（Cheravirus）、サドワウイルス属（Sadwavirus）、セクイウイルス属（Sequivirus）、トラドウイルス属（Torradovirus）もしくはワイカウイルス属（Waikavirus）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、ティモウイルス目（Tymovirales）、特にアルファウレキシウイルス科（Alphaflexiviridae）、例えばアレキシウイルス属（Allexivirus）、ロラウイルス属（Lolavirus）、マンダリウイルス属（Mandarivirus）もしくはポテックスウイルス属（Potexvirus）、ティモウイルス目、特にベータフレキシウイルス科（Betaflexiviridae）、例えばキャピロウイルス属（Capillovirus）、カルラウイルス属（Carlavirus）、シトリウイルス属（Citrivirus）、フォベアウイルス属（Foveavirus）、テポウイルス属（Tepovirus）もしくはビティウイルス属（Vitivirus）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、ティモウイルス目、特にティモウイルス科（Tymoviridae）のプラス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばマクラウイルス属（Maculavirus）、マラフィウイルス属（Marafivirus）もしくはティモウイルス属（Tymovirus）のウイルス、並びに細菌ベクター、例えばアグロバクテリウム属種、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の細菌ベクター。最終的に、ベクターという用語は、ポリマー又は脂質を基礎とする送達構築物を含む、物理的導入法と組み合わせて直鎖状核酸配列（一本鎖又は二本
鎖）を標的細胞に導入するための適した化学輸送作用剤も含む。
【００５５】
したがって、適した送達構築物又はベクターは、ウイルスベクター、アグロバクテリウム種属、又はナノ粒子、例えばメソ孔シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）、ナノ結晶、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）ポリマーを基礎とするアプローチもしくはＤＥＡＥデキストラン等のポリマーを含むカチオンポリマー、又はカチオン表面を生じるためのＰＥＩの非共有表面アタッチメント、脂質もしくはポリマー小胞、又はそれらの組合せを含む化学送達構築物を含む、ヌクレオチド配列を標的細胞に送達するための生物学的意味を含む。脂質又はポリマー小胞は、例えば、脂質、リポソーム、脂質カプセル化系、ナノ粒子、小核酸−脂質粒子配合物、ポリマー、及びポリマーソームから選択されうる。
【００５６】
「遺伝子構築物」又は「組換え構築物」という用語は、本開示による植物、植物細胞、組織、器官又は材料を含む任意の原核標的細胞又は真核標的細胞に導入又は形質転換、トランスフェクト又は形質導入するための、とりわけ、プラスミドもしくはプラスミドベクター、コスミド、人工酵母染色体もしくは細菌人工染色体（ＹＡＣ及びＢＡＣ）、ファージミド、細菌ファージを基礎とするベクター、発現カセット、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む単離した一本鎖もしくは二本鎖核酸配列、アミノ酸配列、改質したウイルスを含むウイルスベクター、並びにそれらの組み合わせ又は混合物を含む構築物を意味するために本明細書において使用される。本開示による組換え構築物は、核酸又はアミノ酸配列の形のいずれかでのエフェクタードメインを含んでよく、ここでエフェクタードメインは、標的細胞中で効果を発揮することができ、トランスジーン、ガイドＲＮＡ（（ｓ）ｇＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡを含む一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子、又はとりわけ酵素又はそれらの触媒活性断片を含むアミノ酸配列、結合タンパク質、抗体、転写ファクター、ヌクレアーゼ、好ましくは部位特異性ヌクレアーゼ等を含む、分子を示す。さらに、組換え構築物は、制御配列及び／又は局在化配列を含んでよい。組換え構築物は、プラスミドベクターを含むベクターに組み込まれてよく、及び／又は組換え構築物は、ベクター構築物から単離されて、例えばポリペプチド配列の形で又はベクターに連結されていない一本鎖もしくは二本鎖核酸として存在してよい。例えば形質転換による導入後に、遺伝子構築物は、例えば、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡの形で又はアミノ酸配列として、染色体外に残っていてよい、すなわち、標的細胞のゲノム中に組み込まれていなくてよい。代わりに、本開示による遺伝子構築物又はそれらの一部は、核酸ゲノムを含む標的細胞のゲノム、又はミトコンドリアもしくは葉緑体等の色素体のゲノムを含む他の標的細胞の遺伝子エレメントに安定して組み込まれてよい。この連結において使用されるプラスミドベクターという用語は、本来プラスミドから得られる遺伝子構築物をいう。プラスミドは、通常、二本鎖核酸配列の形での環状自己複製染色体外エレメントをいう。遺伝子工学の分野において、これらのプラスミドは、例えば抗生物質又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、標的核酸配列をコードする遺伝子、局在化配列、制御配列、タグ配列、抗生物質マーカーもしくは蛍光マーカーを含むマーカー遺伝子等を挿入することにより、日常的に標的改変を受ける。元のプラスミドの構造成分、例えば複製起点は、維持されている。本発明の特定の実施形態に従って、局在化配列は、核局在化配列、色素体局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含んでよい。前記局在化配列は、植物バイオテクノロジーの分野における当業者に利用可能である。目的の種々の標的細胞において使用するための種々のプラスミドベクターが市販されており、それらの改質は、それぞれの分野における当業者に公知である。
【００５７】
「遺伝子改変した」又は「遺伝子操作」又は「遺伝子（遺伝的）操作した」という用語は、本明細書では広義に使用され、直接的又は間接的に、標的細胞、組織、器官又は生物の内在性遺伝物質又はトランスクリプトーム又はプロテオームに影響を及ぼして、目的の方法でそれを改変し、その結果、人間の介入なしにその状態と異なるようにすることにより達成される核酸配列又はアミノ酸配列、標的細胞、組織、器官又は生物の任意の改変を意味し、一方で、ゲノム編集という用語は、標的細胞のゲノムの標的操作を具体的に示す。人間の介入は、インビトロもしくはインビボ、又はその双方で実施されてよい。さらなる改変は、例えば、１つ以上の点変異、例えば標的タンパク質工学のためのもしくはコドン最適化のための点変異、欠失、及び少なくとも１つの核酸もしくはアミノ酸分子の１つ以上の挿入又は欠失（相同組換えも含む）、核酸又はアミノ酸配列の改質、又はそれらの組合せを含んでよい。この用語は、天然に生じるものと同等の配列、生物又は材料に類似しているが、目的の操作の少なくとも１つのステップにより構築されている、植物又はその植物材料を含む核酸分子又はアミノ酸分子又は宿主細胞又は生物体も含む。
【００５８】
したがって、本明細書において使用される「標的遺伝子操作」、又は「標的化」もしくは「部位特異的」遺伝子編集又はゲノム編集は、標的化された方法、すなわち少なくとも１つの細胞、好ましくは植物細胞において所望の効果を達成するための標的細胞における少なくとも１つの特定の位置で及び特定の適した状況下で実施される、「遺伝子操作」の結果である。
【００５９】
本明細書において使用される「トランスジーン（導入遺伝子）」又は「トランスジェニック（遺伝子導入）」という用語は、１つの生物のゲノムから取り出されるか又は合成的に生成される少なくとも１つの核酸配列であって、目的の宿主細胞又は生物又は組織に導入され、続いて「安定な」形質転換又はトランフェクションのアプローチにより宿主のゲノムに組み込まれる、少なくとも１つの核酸配列を示す。対照的に、「一過性」の形質転換又はトランフェクション又は導入という用語は、安定した組込み又は取り込みを達成することなく導入された少なくとも１つの分子の転写及び／又は翻訳及び／又は会合及び／又は活性をもたらす、細胞質、核を含む細胞小器官、ミトコンドリア、液胞、葉緑体、又は膜内を含むがこれらに限定されない、細胞の少なくとも１つの目的の区画への導入及びしたがって細胞のゲノムに導入されたそれぞれの少なくとも１つの分子の遺伝を達成するための、少なくとも１つの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖又はそれらの混合物）及び／又は任意に適した化学的又は生物学的物質を含むアミノ酸配列を含む分子ツールを導入する方法を示す。
【００６０】
本明細書において使用される「植物」又は「植物細胞」という用語は、植物生物、植物器官、分化及び未分化植物組織、植物細胞、種子、並びにそれらの誘導体及び子孫を示す。植物細胞は、例えば、種子、成熟胚、未成熟胚、分裂組織、実生、異なる分化状態のカルス組織、葉、花、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、花粉管及び小胞子、プロトプラスト、大型藻類及び微細藻類からの細胞を含むが、これらに制限されない。種々の植物細胞は、一倍体、二倍体、四倍体、六倍体又は多数体のいずれかであってよい。
【００６１】
本明細書において使用される「対象」は、ヒト又はヒトでない動物のいずれかを意味しうる。前記用語は、哺乳動物（例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウス及びラット又はハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、及びヤギ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、対象は、ヒトである。
【００６２】
本明細書において使用される「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。前記効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防する点で予防的であってよく、並びに／又は疾患及び／又はその疾患に起因する有害作用について部分的又は完全に治癒する点で治療的であってよい。本明細書において使用される「治療」は、哺乳動物における疾患又は症状の任意の治療を含み、かつ以下を含む：（ａ）疾患又は症状を獲得する素因があってよいが、疾患又は症状を有していると未だ診断されていない対象における疾患又は症状の発生を予防すること、（ｂ）疾患又は症状を抑制すること、すなわちその発症を阻止すること、又は（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行生じること。治療薬は、疾患もしくは損傷の発症前、発症中又は発症後に投与されうる。治療が患者の望ましくない臨床的症状を安定化又は軽減する進行中の疾患の治療が、特に目的とされる。かかる治療は、冒された組織における機能の完全な喪失の前に実施されることが望ましい。対象の療法は、望ましくは、疾患の症候性段階中に、及びいくつかの場合には、疾患の症候性段階後に投与されるであろう。
【００６３】
本明細書において使用される「植物材料」は、任意の発達段階中の植物から得られてよい任意の材料を示す。植物材料は、植物体中で、又は植物又はそれらの植物組織もしくは器官のインビトロ培養物から得られる。したがって、前記用語は、植物細胞、組織及び器官、並びに発達した植物構造物、並びに細胞内区画、例えば核酸、ポリペプチド、及び植物細胞もしくは区画内に見いだされ、及び／又は植物によって産生され、又は任意の発生段階における任意の植物細胞、組織又は植物の抽出物から得られる全ての化学的植物物質又は代謝産物を含む。前記用語は、植物材料により含まれる少なくとも１つの植物細胞に由来する植物材料の誘導体、例えばプロトプラストも含む。したがって、前記用語は、植物の分裂組織細胞又は分裂組織も含む。
【００６４】
本明細書において使用される「変異」及び「改変」という用語は、インビボ又はインビトロで、核酸操作の記載内容における、欠失、挿入、付加、置換、編集、鎖切断、及び／又は付加物の導入を示すために互換的に使用される。欠失は、１つ以上のヌクレオチドが存在しない核酸配列における変化として定義される。挿入又は付加は、１つ以上のヌクレオチドの付加でもたらされる核酸配列における変化である。「置換」又は編集は、置き換えられた１つ以上のヌクレオチドからの異なる分子である分子による１つ以上のヌクレオチドの置き換えに起因する。例えば、核酸は、チミンをシトシン、アデニン、グアニン又はウリジンに置き換えることによって例示されるように、異なる核酸により置き換えられうる。ピリミジンからピリミジン（例えば、ＣからＴ又はＴからＣへのヌクレオチド置換）又はプリンからプリン（例えば、ＧからＡ又はＡからＧへのヌクレオチド置換）を塩基転移といい、一方で、ピリミジンからプリン又はプリンからピリミジン（例えば、ＧからＴ又はＧからＣ又はＡからＴ又はＡからＣ）を塩基転換という。代わりに、核酸は、チミンをチミングリコールに置き換えることにより例示されるように、改質した核酸により置き換えられうる。変異は、ミスマッチをもたらしうる。ミスマッチという用語は、２つの核酸間の非共有相互作用を示し、それぞれの核酸は、異なるヌクレオチド配列又は核酸分子上に存在し、それは塩基対合則に従わない。例えば、部分的相補配列５’−ＡＧＴ−３’及び５’−ＡＡＴ−３’について、Ｇ−Ａミスマッチ（塩基転移）が存在する。
【００６５】
「鎖切断」という用語は、二本鎖核酸、例えばＤＮＡ標的配列としてゲノム配列に関する場合に、一本鎖切断及び／又は二本鎖切断を含む。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の２つの鎖の１つにおける中断を示す。これは、二本鎖核酸配列の双方の鎖における中断を示す二本鎖切断と対照的である。本開示による鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ又はその多様体を含む、適したエンドヌクレアーゼを使用して、目的の核酸塩基位置での酵素的切断により二本鎖核酸配列に導入されてよく、ここで、多様体は、野生型タンパク質の酵素機能をまだ発揮することができる野生型タンパク質又はエンドヌクレアーゼの変異した又は短縮された型であってよい。
【００６６】
本明細書において使用される「相補的」又は「相補性」は、２つのＤＮＡ間、２つのＲＮＡ間、又は本発明によるハイブリッド配列に関してＲＮＡとＤＮＡ核酸領域との間の相互作用を意味する。ＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオ塩基により定義された、２つの核酸領域は、互いに鍵と鍵穴モデルに従ってハイブリダイズすることができる。この目的のために、ワトソン−クリック塩基対合の原理は、相補的塩基が適用されるため、それぞれアデニン及びチミン／ウラシル並びにグアニン及びシトシンの基準を有する。さらに、非ワトソン−クリック対、例えば逆ワトソン−クリック対、フーグスティーン対、逆フーグスティーン対及びゆらぎ対も、それぞれの塩基対が互いに水素結合を構築することができる限り、すなわち２つの異なる核酸鎖が前記相補性に基づいて互いにハイブリダイズすることができる限り、本明細書において使用される用語「相補的」に含まれる。
【００６７】
本明細書において使用される「一過性導入」という用語は、好ましくは送達ベクターの助けを借りて又は送達ベクターを使用せずに送達ベクターに又は組換え構築物に組み込まれる本開示による少なくとも１つの核酸配列の、標的構造、例えば植物細胞への一過性導入を示し、ここで、少なくとも１つの核酸配列は、標的構造の内因性核酸材料に組み込まれない適した反応条件下で導入され、ゲノム全体は、少なくとも１つの核酸配列が標的細胞の内因性ＤＮＡに組み込まれないように生じる。結果として、一過性導入の場合に、導入された遺伝子構築物は、標的構造の子孫、例えば原核生物、動物又は植物細胞の子孫に遺伝しないであろう。少なくとも１つの核酸配列又はその転写もしくは翻訳から生じる産物は、一時的に、すなわち一過性に、構成的又は誘導可能な形でのみ存在し、したがって制限された時間でそれらの効果を発揮するために標的細胞内でのみ活性化されてよい。したがって、一過性導入により導入された少なくとも１つの核酸配列は、細胞の子孫に対して遺伝性ではないであろう。しかしながら、核酸配列が一過性に導入される効果は、潜在的に標的細胞の子孫に受け継がれてよい。
【００６８】
本明細書において使用される「安定な組み込み」又は「安定して組み込まれる」という用語は、好ましくは送達ベクター又は組換え構築物に組み込まれた、本開示による少なくとも１つの核酸配列の安定な組み込みを示す。組込みは、標的細胞の核ゲノム、又は目的の真核細胞区画内の任意の他のゲノムの核外物質、例えばミトコンドリア又は植物細胞色素体のいずれかで起こってよい。したがって、安定して組み込まれた少なくとも１つの組換え構築物は、改変された標的細胞の子孫に対して遺伝性があるだろう。遺伝的構築物の性質に依存して、遺伝的構築物の全て又は一部は、遺伝的構築物が、安定的に組み込まれる標的領域を含むいくつかの目的の領域、並びにとりわけ植物細胞内での遺伝子構築物の輸送、送達、維持、及び正確な局在化のために要求されるさらなる領域（しかしながらその領域は、それ自体は組み込まれないであろうが、当業者に公知である安定して組み込まれるための目的の領域のためのカーゴとしての役割を果たす）を含みうるため、安定的に組み込まれる。少なくとも１つの造血細胞もしくは組織又は分裂組織細胞もしくは組織への本開示による少なくとも１つの遺伝的構築物の安定な組み込みは、結果として、アプローチのために有利であってよい前記少なくとも１つの造血細胞又は分裂細胞の全ての発生段階を通して改変された細胞の子孫に対する、このように改変された標的構造のゲノム領域、すなわちＤＮＡ標的領域の遺伝をもたらし、少なくとも１つの造血分裂組織細胞の分化及び発生から生じる最終的な細胞型における標的とされた遺伝子改変、及び該細胞型の収量が所望される。例えば、植物の成熟していない花序の少なくとも１つの分裂組織細胞への安定した組込みを達成することは、成熟していない花序の少なくとも１つの分裂組織細胞から発生的に得られる花粉又は胚珠の配偶子への導入された遺伝的特徴の安定な遺伝をもたらし得る。少なくとも１つの多能性造血細胞又は任意の多能性もしくは多分化能性細胞への安定な組込みは、導入された遺伝的特徴の安定した遺伝を同様に導くであろう。
【００６９】
本明細書において使用される「微粒子銃」という用語は、遺伝子銃トランフェクション又は微粒子媒介遺伝子移入とも言われ、目的の核酸又は遺伝子構築物を含む被覆微粒子又はナノ粒子を標的細胞又は組織にトランスフェクトするための物理的導入方法を示す。マイクロ粒子又はナノ粒子は、発射体として機能し、しばしば「遺伝子銃」と呼ばれる適した装置を使用して高圧下で目的の標的構造上で発射される。微粒子銃による形質転換は、目的の遺伝子で覆われた金属の微小発射体を使用し、そして、「遺伝子銃」として公知の装置（Sandfordら、1987年）を使用して標的細胞上に標的組織の細胞壁を貫通するには十分に速いが細胞死を引き起こすには十分厳しくはない速度で発射する。細胞壁が完全に除去されているプロトプラストの場合に、前記条件は論理的に異なる。少なくとも１つの微小発射体上で沈着した核酸又は遺伝子構築物は、照射後に細胞内に放出され、そして前記した定義に従ってゲノムに組み込まれるか又は一過性に発現される。微小発射体の加速は、高電圧放電又は圧縮ガス（ヘリウム）により達せられる。使用される金属粒子に関しては、金属粒子が非毒性、非反応性であり、標的細胞よりも小さい直径を有することが必須である。最も一般的に使用されるものは、金又はタングステンである。一般的な使用に関して、遺伝子銃及び関連するシステムの製造元及び提供者から公的に入手可能な多くの情報がある。
【００７０】
本開示による原核細胞又は真核細胞、好ましくは動物細胞、及びより好ましくは植物又は植物細胞又は植物材料の記載内容において本明細書において使用される「誘導体」又は「子孫」又は「後代」という用語は、性的及び無性的繁殖を含む自然生殖的繁殖から生じるかかる細胞又は物質の子孫を示す。前記繁殖が、親生物又は親細胞とはゲノム的に異なる子孫又は後代をもたらす自然現象から生じる生物のゲノムへの変異の導入を導くことができるが、しかしながら、同一の属／種にまだ属し、かつ親の組換え宿主細胞とほぼ同一の特徴を有することは当業者に周知である。したがって、生殖又は再生中の自然現象から生じるかかる誘導体又は子孫又は後代は、本開示の用語に含まれる。さらに、「誘導体」という用語は、物質又は分子の記載内容において、細胞又は生物を示すよりむしろ、直接的に、又は他から間接的に得られる改変によって意味してよい。これは、細胞又は材料から得られる細胞又は植物代謝産物に由来する核酸配列を意味してよい。
【００７１】
本明細書において使用される「標的領域」、「標的部位」、「標的構造」、「標的構築物」、「標的核酸」又は「標的細胞／組織／生物」、又は「ＤＮＡ標的領域」という用語は、標的細胞の任意の区画内の任意のゲノム領域であってよい標的を示す。
【００７２】
本明細書において使用される「制御配列」という用語は、目的の核酸配列の転写及び／又は翻訳及び／又は改変を指示することができる核酸配列又はアミノ酸配列を示す。
【００７３】
「タンパク質」、「アミノ酸」又は「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、触媒酵素機能又は構造的もしくは機能的効果を有するアミノ酸配列を示す。「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」又は「アミノ酸分子」という用語は、任意の天然の又は化学合成したタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び酵素、又は改質したタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び酵素を含み、ここで「改質した」という用語は、野生型配列を短く切断したが、まだ活性部分を含むタンパク質、ペプチド、ポリペプチド及び酵素の任意の化学的又は酵素的改質を含む。
【００７４】
詳細な説明
本発明の第一の態様に従って、
（ａ）少なくとも１つのＲＮＡ核酸配列を含み、かつＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列との会合を含むＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列であって、（ｉ）第一のＤＮＡ標的配列に相補的である第一の配列部分及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互に作用して配置される第二の配列部分を含む、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列、
（ｂ）ＤＮＡ核酸配列を含む修復鋳型核酸配列であって、第二のＤＮＡ標的配列に相補的である少なくとも一部を含み、かつ標的の相同組換え修復を媒介するために配置された、修復鋳型核酸配列、及び
（ｃ）任意にＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はガイド核酸配列と修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域
を含む、少なくとも１つのＲＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡ核酸配列を含むか、それらからなるハイブリッド核酸配列が提供され、ここで、ハイブリッド核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互作用して、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが第一のＤＮＡ標的配列を認識できかつ任意にＤＮＡ切断を誘発することができ、かつハイブリッド核酸配列は、第二のＤＮＡ標的配列の部位で修復鋳型核酸配列によって媒介される相同組換え修復を介してゲノム操作を指示し、第二のＤＮＡ標的配列は、細胞の内因性ＤＮＡ配列を示す。
【００７５】
本発明によるハイブリッド核酸配列の適した構成は、図１ａＡ〜Ｄ、図１ｂＡ〜Ｄ、及び図２Ａ〜Ｃに示されるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して、修復鋳型（ＲＴ）は、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの形であってよく、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸又はガイド核酸（ｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に、共有又は非共有的方法で、３’末端、５’末端で付着してよく、又はＲＴは、例えば定義したサイズ及び形状のヘアピン二次構造を形成するｇＲＮＡ内に配置されてよい。この設計は、ＲＮＡ及びＲＴ部分の双方が、少なくとも１つの目的のＲＮＡと目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの相互作用を妨げることなく、かつ同時に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ／ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ対によって誘発されるＤＮＡ切断の部位に近接してＲＴを配置することなく、双方の機能を果たすことができることを可能にする。当然、ゲノム操作に適した異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、本発明によるＲＴを含むＣＲＩＳＰＲ核酸との相互作用に関して異なる立体的要件を有し、その結果、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの固有の機能、すなわちＣＲＩＳＰＲ核酸によって補助されるＤＮＡ標的化、及びＤＮＡ切断が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列に付着したＲＴを含むハイブリッド核酸配列の存在下でも媒介されることができる。
【００７６】
したがって、本発明による少なくとも１つのＲＮＡ及び少なくとも１つのＤＮＡ核酸配列、又は単にハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列を含むか又はそれらからなるハイブリッド核酸配列は、２つの機能性を含むキメラＲＮＡ及びＤＮＡ含有分子を示す。第一に、それは、リボ核酸を含むＣＲＩＳＰＲ核酸配列（ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ）部分を含む。ｇＲＮＡは、通常、２つのヌクレオチド配列部分を含み、その際、１つのヌクレオチド配列は、目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの相互作用に必要であり、もう１つのヌクレオチド配列は標的ドメインを含み、ここで標的ドメインは、逆ストランドにおけるＰＡＭ配列に隣接する目的の相補的ＤＮＡ標的配列に塩基対によりハイブリダイズすることができ、したがってこの相補的ＤＮＡ標的配列は、本発明による第１のＤＮＡ標的配列を示す。第二に、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、目的のＤＮＡ標的配列に導入されるべき所望の編集を含むことができる修復鋳型核酸配列部分を含む。さらに、修復鋳型核酸配列は、ＤＮＡ標的配列のすぐ上流及びすぐ下流の追加の相同配列、すなわち左右の相同性アームを含んでよい。それぞれの相同性アームの長さ及び結合位置は、導入される変化のサイズに依存し、かつ最適な効率のために調節されてよい。例えば、Ｃａｓ９（Richardsonら、Nature Biotechnology、2016、doi：10.1038 / nbt.3481において記載されている）によって最初に放出された切断されたＤＮＡ鎖に特異的な相補性を有する修復鋳型が最も効率的な修復をもたらしてよいだろう。修復鋳型は、特定の適用に依存する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列であってよい。修復鋳型は、ヌクレアーゼによる結合を破壊するためにゲノムＤＮＡと比較して多型を含んでよく、そうでなければ、修復鋳型は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド切断のために適した標的となる。例えば、ＰＡＭは、もはや存在しないように変異させることができるが、コードされるアミノ酸配列を変化しないサイレント変異に対応する遺伝子のコード領域は影響を受けない。ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが使用される他の実施形態において、修復鋳型配列内でＰＡＭ配列の存在が可能である。一実施形態において、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含むが、ハイブリッドは、以下にさらに詳述するように、ゲノム編集に適したそれに付着するさらなる部分も含んでよい。他の実施形態において、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列からなる。
【００７７】
最適なＲＴサイズが、ＨＲ媒介ＤＳＢ修復の効率化のために相同性アームサイズとのヌクレアーゼ効率のバランスを提供する使用されるＣＲＩＳＰＲ系に依存して存在してよいことが見出された。
【００７８】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡエレメントを一体化する１つのＲＮＡ核酸配列として提供されうる。他の実施形態において、例えばＣｐｆ１ポリペプチド又はその多様体もしくは触媒活性のある断片を使用してＶ型ＣＲＩＳＰＲ系と共に作用する場合に、ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡエレメントを含む。さらにさらなる実施形態において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、双方が必要とされる場合に、２つの別々のＲＮＡ分子上で提供される、多くのＣＲＩＳＰＲ系における自然の状況を模倣する１超のＲＮＡ核酸配列として提供されてよい。したがって、ある実施形態において、この配置は、自然に別々のＲＮＡ鎖において２つのエレメント（ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ）を有する可能性を可能にする。一実施形態において、ＣｒＲＮＡを提供する別々のＲＮＡ核酸分子が提供され、かつ別々の核酸分子が提供される。ｃｒＲＮＡ部分又はｔｒａｃｒＲＮＡ部分のいずれかは、修復鋳型（ＲＴ）核酸配列と会合されてよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＲＴハイブリッド又はｃｒＲＮＡ：ＲＴを提供することは、ｇＲＮＡ：ＲＴハイブリッドと比較してそれぞれの分子の長さがより短いために、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ＲＴ又はｃｒＲＮＡ：ＲＴのエキソビボ化学合成が選択される場合に好ましく、ここで、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの機能を一様にした単一のＲＮＡ分子からなる。
【００７９】
ある実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ部分を含むＣＲＩＳＰＲ核酸配列が、ハイブリッド核酸配列の５’部分を形成することが想定されうる。このトポロジー又は構成は図１ａに示されている。
【００８０】
他の実施形態において、少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ部分を含むＲＴが、ハイブリッド核酸配列の５’部分を形成することが想定されうる。このトポロジーは図１ｂに示されている。
【００８１】
さらに他の実施形態において、ＲＴ部分は、図２に示すようにＣＲＩＳＰＲ核酸内に位置していると想定されていてよい。図２Ｃに示されるように、ＲＴは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列内の個々の部分として特定のループ領域に位置しうる。図２に示すようなＣＲＩＳＰＲ核酸−ＲＴトポロジーを提供するために、ＣＲＩＳＰＲ核酸部分をＲＴに会合させる２つの工ステップが、少なくとも１つのＲＮＡ部分を含むＣＲＩＳＰＲ核酸部分内にＤＮＡを含むＲＴ部分を配置するために必要となってよい。
【００８２】
天然の塩基対形成能力を利用することに加えて、核酸を互いに連結するための十分な化学的及び酵素的方法が当業者に利用可能であり、その結果、ハイブリッド核酸配列の任意のトポロジーが現在利用可能な技術で提供されうる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ核酸の任意の成分、すなわち少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸及び／又は少なくとも１つのＲＴは、それらの遊離５’末端又は３’末端に付加的な改変又は標識を含むか、又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸内及び／又は少なくとも１つのＲＴ内で任意のヌクレオチドに付着しうる。前記改変又は標識は、ＣＲＩＳＰＲ核酸及び／又はＲＴを互いに連結するための官能基を提供する目的を果たしうる。他の実施形態において、改変又は標識は、ＲＴ及び／又はＣＲＩＳＰＲ核酸に、及びしたがって本発明による会合したハイブリッド核酸に追加の機能性、例えば個々の成分、又はハイブリッド核酸配列、又はハイブリッド核酸配列と目的の標的細胞内の目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの間の分子複合体でさえも可視化及び／又はトラッキングを可能にする蛍光機能性を提供する目的を果たしうる。これは、特定の区画の可視化、又はインビボ等での複合体の利用可能性についての試験を可能にしうる。
【００８３】
本発明によるハイブリッド核酸配列内のＣＲＩＳＰＲ核酸及びＲＴの最適なトポロジーは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド及び対応する目的のＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び目的の改変される標的細胞に依存しうる。一実施形態において、例えば、ｓｇＲＮＡが使用される場合に、５’ＣＲＩＳＰＲ核酸配列−３’ＲＴトポロジーが好ましくてよく、それというのも、このトポロジーは、ＲＴ部分が相同性検索をアシストして標的とされるＨＤＲ事象において最良の結果を保証することができるように、３’−ＲＴ末端を結合されずに柔軟なままにするからである。このトポロジーは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに機能しうる、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、例えばＣｐｆ１の使用が想定される場合にも適していてよい。
【００８４】
ハイブリッド核酸配列の遊離５’及び３’末端で導入される、ある嵩高く立体的に要求の厳しい改変又は標識について、５’ＲＴ−３’ＣＲＩＳＰＲ核酸配列のトポロジーが、目的のハイブリッド核酸配列と複合体を形成してＣＲＩＳＰＲポリペプチドの最適な性能を可能にするために好ましい。さらに、任意の追加の５’又は３’改変又は標識とは無関係に、５’ＲＴ−３’ＣＲＩＳＰＲ核酸配列のトポロジーは、同起源のＣＲＩＳＰＲ核酸とのそれらの固有の相互作用特性により、ある特定のＣＲＩＳＰＲポリペプチドに好ましくてよい。
【００８５】
さらに、ハイブリッド核酸配列のトポロジーは、使用されるＣＲＩＳＰＲ核酸配列に依存しうる。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの組合せは、ｃｒＲＮＡのみの使用とは異なる要求を有しうる。同様に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのｓｇＲＮＡ融合は、ＣＲＩＳＰＲ核酸部分の場合のように、本発明によるハイブリッド核酸配列内での他の配置を可能にしてよく、その際、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分はハイブリダイズし、互いに共有結合的に融合しない。本明細書において開示される異なるハイブリッド核酸配列に基づいて、並びにＣＲＩＳＰＲ核酸部分及びＲＴ部分の位置に関して異なるトポロジーを有するこれらの構築物の試験に基づいて、当業者は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列、ＲＴ、及びしたがって改変されるべき目的の標的遺伝子座について、本発明によるハイブリッド核酸構築物の最良のトポロジーを決定することができる。
【００８６】
したがって、本発明によるハイブリッド核酸配列は、原核細胞並びに真菌、動物及び植物細胞を含む真核細胞を含む、任意の目的の細胞型における精密なゲノム編集に適しており、同時にゲノム編集中の修復鋳型及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの時空間的利用可能性を可能にする適切な物理的連結ツールを示す。
【００８７】
本発明の全ての態様及び実施形態に従って、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び修復鋳型核酸配列は、互いに会合している。本開示による「〜と会合する」又は「会合する」という用語は、広く解釈されるべきであり、したがって本発明に従って、ＣＲＩＳＰＲ適合性ＲＮＡが、ＤＮＡ修復鋳型物理的に会合して提供されることを意味し、その際、会合は、共有又は非共有の性質のいずれかであり、相同組換えのための修復鋳型の利用可能性を本質的に高める。修復鋳型の無差別な増幅、又は物理的にＲＮＡに連結していない過剰な修復鋳型の提供の代わりに、修復鋳型ヌクレオチド配列は、ＲＮＡによってＤＮＡ標的に導かれるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体と共にＤＳＢに提示され、これにより、ゲノム編集アプローチの予測可能性及び特異性が著しく改善する。
【００８８】
本発明によるさらなる実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、双方の共有及び／又は非共有的な結合又は付着によって少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列に付着される。この実施形態に従って、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ複合体は、そのゲノム内で第一及び第二のＤＮＡ標的配列を含む目的の標的細胞中で、インビトロ又はインビボのいずれかで目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドと会合されてよい、インビトロで合成したヌクレオチド分子として提供されてよい。好ましくは、細胞は、真菌、動物又は植物細胞を含む真核細胞である。
【００８９】
本発明の種々の態様による一実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列（ＲＴ）は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列に共有的に付着される。共有的な付着又は共有結合は、互いに共有的に付着した分子又は配列の原子間での電子対の共有を含む化学結合である。
【００９０】
本発明の種々の態様による他の実施形態において、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列に非共有的に付着される。非共有的な相互作用は、電子の共有を含まず、むしろ分子／配列間の又は分子／配列内での電磁相互作用のより分散した変化を含むという点で共有結合とは異なる。したがって、非共有的な相互作用又は付着は、静電相互作用、ファンデルワールス力、π効果及び疎水性効果を含む。核酸分子に関して特に重要なのは、静電相互作用としての水素結合である。水素結合（Ｈ結合）は、部分的に正の水素原子と、該水素原子に共有結合していない極めて電気陰性の、部分的に負の酸素、窒素、硫黄、又はフッ素原子との間の相互作用を含む、特定のタイプの双極子相互作用である。本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が、塩基対合によって相補鎖と連結してハイブリダイズした複合体を形成する任意のプロセスを使用する、相補的核酸、すなわちＤＮＡ及び／又はＲＮＡの対合を示す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度及び長さ、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、並びに核酸内のＧ：Ｃ比といった要因によって影響を受ける。ハイブリダイズした複合体という用語は、相補的なＧ塩基及びＣ塩基間並びに相補的なＡ塩基及びＴ／Ｕ塩基間での水素結合の形成によって２つの核酸配列間で形成された複合体を示す。ハイブリダイズした複合体又は対応するハイブリッド構築物は、２つのＤＮＡ核酸分子間、２つのＲＮＡ核酸分子間、又はＤＮＡ核酸分子とＲＮＡ核酸分子との間で形成されうる。全ての群について、核酸分子は、インビトロ又はインビボで生成された天然に生じる核酸分子、及び／又は人工又は合成の核酸分子であってよい。上述したハイブリダイゼーション、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ配列の間で形成することができるワトソン−クリック塩基対は、特定の水素結合パターンによって決定され、それは本発明による非共有的な付着形態を表す。
【００９１】
本発明による非共有的な会合に関して、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型配列は、ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合によって互いに会合してよい。
【００９２】
非共有相互作用の他の形態は、電荷によって、少なくとも１つの修復鋳型配列と少なくとも１つの成分、又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列もしくはＣＲＩＳＰＲポリペプチドのいずれかとの会合である。
【００９３】
共有的な会合又は付着に関して、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型配列は、インビボ又はインビトロのいずれかで産生される隣接した分子と連結される。共有的及び／又は非共有的な付着は、例えば、共有的に付着したＣＲＩＳＰＲ核酸配列／修復鋳型配列に非共有的に付着したさらなる修復鋳型核酸配列をさらに含んでよい、共有的に付着したＣＲＩＳＰＲ核酸配列／修復鋳型配列を提供することによって組み合わされてもよい。このアプローチは、共有的に付着したＣＲＩＳＰＲ核酸配列／修復鋳型配列が、少なくとも部分的にインビボで産生され、かつインビボ又はインビトロのいずれかで産生されるさらなる修復鋳型が、既存のＣＲＩＳＰＲ核酸配列／修復鋳型複合体に付加されるべきである場合に、特に適している。
【００９４】
本発明の種々の実施形態に従って、共有的及び非共有的な会合又は付着に関する前記開示は、前述したように互いに会合されてよい１つより多い部分、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含んでいてよいＣＲＩＳＰＲ核酸配列についても当てはまる。他の実施形態において、ＲＴは、目的のＣＲＩＳＰＲ核酸配列内で配置されて、本発明によるハイブリッド核酸配列を形成してよく、そのハイブリッドは、前述したように共有的及び非共有的な会合によって形成されてよい。
【００９５】
前述のNishimasuらからも明らかなように、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが通常ヘテロ二本鎖構造を含む少なくとも１つの部分を含む場合に本発明の開示に従ってＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互作用するように構成されてよく、それは、配列に依存した方法で、すなわちＡ、Ｕ、Ｇ及びＣを含むＲＮＡの塩基との相互作用を介して、又は配列に依存しない方法で、すなわちｇＲＮＡヌクレオチド配列のリン酸骨格とＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの相互作用を介して認識される。
【００９６】
本発明の第一の態様及びさらなる態様の特定の実施形態に従って、第一のＤＮＡ標的配列は、細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは真菌、動物又は植物細胞のゲノム内に位置してよく、その際ゲノムは、核ゲノム、及び色素体のゲノムを含む他のゲノム部分を含む。
【００９７】
「ＤＮＡ標的配列」は、標的としたゲノム編集が実施されるべきゲノム領域を定義する。ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び修復鋳型核酸配列が異なる機能性を本質的に有するという事実によって、第一及び第二のＤＮＡ標的領域が存在しうる。したがって、第一のＤＮＡ標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の第一の配列部分が相補的である目的のＤＮＡ標的領域の領域を定義し、一方で第二のＤＮＡ標的配列は、修復鋳型核酸配列の少なくとも一部が相補的である目的のＤＮＡ標的領域の領域を定義する。第一及び第二のＤＮＡ標的領域は、目的のＤＮＡ標的配列内で、同一であるか、又は好ましくは異なるが、おそらくは重複する領域であってよい。
【００９８】
ＣＲＩＳＰＲ核酸配列に対する標的部位と修復鋳型核酸配列（ＲＴ）に対する相同性の部位との間の空間的関係は変動してよい。２つの部位は、同一であってよく、完全にもしくは部分的に重複してよく、又は目的のゲノム内の任意の数のヌクレオチドによって分離されてよい。ＲＴは、鎖がＣＲＩＳＰＲ核酸配列スペーサー配列によって標的化されるかとは無関係に、ゲノムＤＮＡの双方の鎖に、又は個々にいずれかの鎖に相同性を有してよい。効率的な修復鋳型は、Ｃａｓ９（Richardsonら、Nature Biotechnology、2016、doi：10.1038 / nbt.3481において記載されている）によって最初に放出された切断されたＤＮＡ鎖に対して特異的な相補性を有するように配置されうる。
【００９９】
本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、一般的に低い効率の相同組換え修復（ＨＤＲ）／相同組換え（ＨＲ）を克服すると予測される。それというのも、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列部分に関して化学量論的に存在する修復鋳型ヌクレオチド配列の物理的利用可能性を保証し、標的とされたゲノム鎖が切断される場所でのｉｎ ｓｉｔｕでのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＤＮＡ標的配列中のＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって導入されるからである。
【０１００】
したがって、本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列の一部としてのＤＮＡ改変修復鋳型という用語は、ＤＮＡ切断の改変及び／又は修復のための型を提供することができる一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列であってよいヌクレオチド配列を意味する。
【０１０１】
本発明の第一の態様による好ましい一実施形態において、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列は、インビトロで事前に構築されていてよく、その際ＲＮＡ及びＤＮＡ部分は、互いに共有的に付着されているか、又は非共有的に付着されているかのいずれかである。一実施形態において、ＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列は事前に構築され、かつＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、転写可能なＤＮＡもしくは翻訳可能なＲＮＡ構築物として、又は直接アミノ酸配列として、別々に標的細胞に送達され、かつＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列及びＣＲＩＳＰＲは、標的細胞内で複合体を形成する。他の実施形態において、ＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列及びＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、インビトロで構築されてよく、そしてリボ核タンパク質複合体が、改質されるべき少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的ヌクレオチド配列を含む目的の標的細胞に導入される。
【０１０２】
機能的な事前に構築した複合体を標的細胞に導入することは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用する場合に、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲポリペプチドの活性が、本発明による第二のＤＮＡ標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ核酸配列に連結したＤＮＡ修復鋳型ヌクレオチド配列と相同組換えを直ちに伴う事実により、標的とした二本鎖切断並びに同時に修復及び部位特異的改変をもたらす。したがって、ＲＴの利用可能性の乏しさ又は極めて特異的であり制御可能なゲノム編集事象を阻害する非特異的ＮＨＥＪ事象（上述の発明の背景を参照されたい）の欠点は、同時に低減されるうることであり、それというのも、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列及び対応するＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列：ＣＲＩＳＰＲポリペプチド及びＣＲＩＳＰＲ核酸配列／ＣＲＩＳＰＲポリペプチド：修復鋳型の適切な化学量論的組成で同等に標的部位に達することができるからである。さらなる利点は、修復鋳型の標的外への組み込みの可能性が、それ自体はゲノムに組み込むことができない、複合体のタンパク質及びＲＮＡ成分との物理的会合のために減少することである。
【０１０３】
本開示における「標的化された相同組換え修復」という用語は、独立して、配列挿入、少なくとも１つの配列位置の編集、欠失又は再編成を含んでよい、本出願による修復鋳型配列によって導入されてよい任意のタイプの変更を含み、ここで、高等真核生物におけるゲノム編集アプローチのための好ましい戦略は、現在挿入、欠失又は編集であり、それというのも、これらの戦略は、ＤＮＡ標的配列内の目的の配列の標的化したノックインもしくはノックアウト、又は少なくとも１つの配列の部位特異的改変を可能にするからである。
【０１０４】
本発明によるハイブリッド核酸配列と協同してエキソビボ又はインビボで形成された分子複合体によって媒介されるような標的化された相同組換え修復の例は、例示的なＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ／ＣＲＩＳＰＲ核酸配列／修復鋳型複合体について及び所与の内因性ＤＮＡ標的配列についてのＤＮＡ認識結合、切断及び続く修復の時系列を示す図３Ａ〜Ｅに見出される。
【０１０５】
本発明の種々の態様による一実施形態において、修復鋳型核酸配列及び／又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、合成ヌクレオチド配列を含み、任意に骨格及び／又は塩基改変を含有する、天然に生じるか又は天然に生じないヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含んでよく、ここで、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、一本鎖又は部分的に一本鎖のＲＮＡヌクレオチド配列を含み、かつ修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
任意のＣＲＩＳＰＲゲノム編集アプローチに対する挑戦は、本発明のハイブリッド核酸配列のＲＮＡ部分及び機能的ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、核、又はゲノムＤＮＡを含む任意の他の区画、すなわちＤＮＡ標的配列に、機能的な（劣化していない）方法で輸送されなければならないという事実である。ＲＮＡが、ポリペプチド又は二本鎖ＤＮＡよりも安定性が低く、かつより高いターンオーバーを有し、特に容易にヌクレアーゼにより分解されるため、特に本発明の第一の態様によるある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つの天然に生じないヌクレオチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の安定性を増大させる本発明による好ましい骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ロックド核酸修飾、Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾、ジ−ホスホロチオエート修飾、及びペプチド核酸修飾からなる群から選択される。特に、全ての前記骨格修飾は、２つの核酸鎖間の相補的塩基対合の形成をさらに可能にするが、それでも内因性ヌクレアーゼによる切断に対してより耐性がある。本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列と組み合わせて利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの配列に依存しない相互作用に含まれる、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列のそれらのヌクレオチド位置を改変しないことが必要であってよい。前記情報は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ／ＣＲＩＳＰＲ核酸配列複合体について入手可能なものとして入手可能な構造情報に由来してよい。
【０１０７】
本発明の第一の態様によるある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列は、ヌクレオチド及び／又は塩基修飾、好ましくは全部ではなく選択されたヌクレオチド配列位置を含みうることが想定される。これらの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｄａｂｏｙｌ、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、リン酸ソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ”、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）の付加からなる群から選択される。好ましくは、前記付加は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の３’末端又は５’末端で導入される。この修飾は、細胞内のＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の細胞局在化を視覚化して、それぞれの配列の分布、濃度及び／又は利用可能性を研究することができるという有利な効果を有する。さらに、本発明による目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドとハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ構築物との相互作用を研究することができる。かかる相互作用を研究する方法、又は前述したように修飾又はタグ付けされたヌクレオチド配列を視覚化するための方法は、それぞれの分野の当業者に利用可能である。
【０１０８】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の任意のヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＤＮＡ修復鋳型核酸配列の少なくとも１つのヌクレオチドにより含まれる標識又はリンカーとして前記修飾の１つを含んでよい。本明細書において使用されるように、「ヌクレオチド」は、一般的に、塩基−糖−リン酸の組み合わせを示してよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似体を含んでよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ））のモノマー単位であってよい。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシドアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はそれらの誘導体を含んでよい。かかる誘導体は、例えば、限定されるものではないが、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ及び７−デアザ−ｄＡＴＰ、並びにそれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を含んでよい。本明細書において使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びそれらの誘導体を示してよい。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄｌＴＰ、及びｄｄＴＴＰを含んでよいが、これらに制限されない。ヌクレオチドは、標識付けされていないか、又は周知の技術により検出可能に標識付けされうる。標識付けは、量子ドットで実施されてもよい。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識及び酵素標識を含んでよい。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−５ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙａｎｉｎｅ及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含みうるが、これらに制限されない。
【０１０９】
標識又はリンカーは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列又はその一部及びＤＮＡ修復鋳型核酸配列を互いに連結するため、又はハイブリッド核酸配列を目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドに連結するためのクリックケミストリーに適した部分を含んでもよい。
【０１１０】
分子複合体を構築するために本発明による任意の核酸又はアミノ酸を修飾するために適したクリックケミストリー分野を含む反応について、インビトロ又はインビボでの一例は、アジド化して１，４−二置換−１，２，３−トリアゾールを形成するアルキンのヒュスゲン１，３−双極子環化付加である。銅（Ｉ）での触媒反応は、穏やかで非常に効率的であり、保護基を必要とせず、多くの場合に精製を必要としない。アジド及びアルキン官能基は、一般に、生体分子及び水性環境に対して不活性である。トリアゾールは、天然に見られる広範なアミド成分に類似しているが、アミドとは異なり、切断を受けにくい。さらに、それらは酸化又は還元することはほとんど不可能である。
【０１１１】
当業者に公知であるように、インビボ反応に適したある特定のクリックケミストリー反応は、反応性基、例えばアジド、末端アルキン又は歪みアルキン（例えば、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ））に依存し、反応性基は、それらの天然の対応物の代わりに組み込まれるそれに応じて修飾されたヌクレオチドを介してＲＮＡ又はＤＮＡの任意の形に導入されてよい。標識は、酵素的に又は化学的に導入されてよい。得られるＣＬＩＣＫ官能化ＤＮＡは、続いて、Ｃｕ（Ｉ）触媒化アルキン−アジド（ＣｕＡＡＣ）又はＣｕ（Ｉ）を含まない歪みアルキン−アジド（ＳＰＡＡＣ）クリック化学反応によって加工されてよく、その際、銅を含まない反応が、細胞又は生存系内での適用に好ましい。続く精製作業のために（アジド、ビオチンのアルキン又はＤＢＣＯ含有ビオチン化試薬を介して）ビオチン基を導入し、続く顕微鏡画像化のために（蛍光アジド、蛍光アルキン又はＤＢＣＯ含有蛍光染料を介して）蛍光基を導入し、又は生体分子、例えば本発明によるＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＤＮＡ修復鋳型に架橋して、官能化生体分子を共有結合及び／又は提供するために、これらの反応を本発明により使用してよい。
【０１１２】
一実施形態において、本発明による任意に精製され、機能的に会合した５’末端又は３’末端クリックケミストリー標識ハイブリッド核酸配列は、任意の形質転換又はトランフェクション法によって細胞又は細胞系に送達され、対応するＣＲＩＳＰＲポリペプチドを安定に又は一過性に発現する。それにより、ハイブリッド核酸配列のＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、既に修復鋳型に付着しているＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互作用し、それによってＣＲＩＳＰＲポリペプチドを活性化する。目的のゲノム標的部位における切断中に、切断部位への修復鋳型の近接は、それによってＨＤＲ頻度を高める。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ハイブリッド核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に存在するクリック化学標識と適合性があるクリック化学標識を含んでよく、したがってハイブリッド核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に存在するクリック化学標識と反応することができる。
【０１１３】
種々のさらなる化学反応及び対応する修飾は、本開示による核酸、すなわち任意のＣＲＩＳＰＲ核酸及び一本鎖又は二本鎖の修復鋳型を共有的方法で互いに連結するために、当業者に利用可能である。これらの修飾は、種々の架橋剤、例えばチオクト酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルのようなチオール修飾、第一級アミンと反応する化学基（−ＮＨ2）を含む。これらの第一級アミンは、生理的ｐＨで正に帯電している。したがって、それらは、主に、天然のタンパク質の三次構造の外側表面に生じ、そこでそれらは、水性媒体中に導入された対合試薬に容易に接近できる。さらに、典型的な生物学的試料又はタンパク質試料中の利用可能な官能基の中で、第一級アミンは特に求核性であり、それらをいくつかの反応性基との結合のために標的化することを容易にする。第一級アミンと化学結合を形成する多数の合成化学基がある。これらには、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、スルホネート（−ＳＯ3）基を含有するスルホ−ＮＨＳエステル、例えばビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ3）、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキザール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、無水物、及びフルオロフェニルエステルが含まれる。
【０１１４】
ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＤＮＡ修復鋳型核酸配列を共役する目的のために、それぞれの核酸配列の５’末端又は３’末端で修飾又は標識を挿入することが好ましく、その結果、その後の共有結合が、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＤＮＡ修復鋳型核酸配列との間で所望の方向で作り出される。修飾又は標識の位置は、それぞれ図１ａ及び図１ｂにおいて示されるような異なるトポロジー又は構成から明らかなように、産生されるべきハイブリッド核酸構築物のトポロジーに依存するであろう。
【０１１５】
本発明の種々の態様による任意の実施形態について、ハイブリッド核酸配列及びＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、目的の標的細胞内の関連する区画における目的のＤＮＡ標的配列に到達することが必要である。本発明の特定の実施形態に従って、局在化配列は、核局在化配列、色素体局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含んでよい。したがって、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド及び／又はハイブリッド核酸構築物は、対応する局在化配列、好ましくは細胞の核ゲノムに複合体を向けるための核局在化配列（ＮＬＳ）を含む必要がある。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はハイブリッド核酸は、アミノ末端もしくはその付近で又はハイブリッド核酸配列の５’末端もしくはその付近で約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のＮＬＳ、又はカルボキシ末端もしくはその付近で又はハイブリッド核酸配列の３’末端もしくはその付近で約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のＮＬＳ、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端／５’末端で１個以上のＮＬＳ及びカルボキシ末端／３’末端で１個以上のＮＬＳ）を含んでよい。１個より多いＮＬＳが存在する場合に、それぞれは他から独立して選択されてよく、単一のＮＬＳが１つより多いコピー中に存在してもよく、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１個以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在してもよい。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又はハイブリッド核酸配列は、最大で６個のＮＬＳを含みうる。本発明によるハイブリッド核酸配列にＮＬＳを付着するために、ＮＬＳは、ペプチド又はインビトロ転写配列として提供されてよく、次いでこれをＣＲＩＳＰＲ核酸配列、ＲＴ、又はハイブリッド核酸配列の遊離５’末端及び／又は３’末端に化学的に付着させてよい。
【０１１６】
ＮＬＳがＣＲＩＳＰＲポリペプチド又はそれをコードする配列に付着しているいくつかの実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個又はそれ以上のアミノ酸の範囲内である場合に、Ｎ末端又はＣ末端の近くにあると見なされる。ＮＬＳの制限のない例は、以下に由来するＮＬＳ配列を含む：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２）を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４）を有するｃ−ｍｙｃＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５）を有するｈＲＮＰＡＩ  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号８）；ヒトｐ５３の配列ＰＸＰＫＫＫＰＬ（配列番号９）（ここで、配列番号９の８位での「Ｌ」は任意である）；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１１）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１２）；デルタ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）；ヒト  ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）。いくつかの実施形態において、局在化シグナルは、色素体局在化シグナル、例えば色素体又はミトコンドリア局在化シグナルであってよい。適した色素体局在化シグナルは、葉緑体輸送ペプチド又はミトコンドリア標的化ペプチドからなる群から選択される。さらに、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質に由来するペプチド又はそれをコードする配列は、目的の構築物又は分子を目的の細胞及び／又は細胞内区画に標的化するために適していてよい。適したＴａｔペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１７）に由来するか、又はモチーフＧＲＫＫＲ（配列番号１８）を含む。
【０１１７】
ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが核酸配列の形で少なくとも１つの送達ベクターの助けを借りて細胞に送達される実施形態において、局在化シグナルは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの認識及び／又は切断機能を妨げないＣＲＩＳＰＲポリペプチド内の任意の適した位置で局在化シグナルをコードする核酸配列として、共有結合により、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする配列に共有的に付着されてよい。
【０１１８】
一実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、蛍光レポーター遺伝子又はタンパク質と共有的に又は非共有的に会合されてよい。このレポーターは、ＤＮＡとして、ｍＲＮＡとして、独立したタンパク質として、又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドに連結した融合タンパク質として送達されてよい。
【０１１９】
ＣＲＩＳＰＲ核酸配列部分及び修復鋳型（ＲＴ）部分を含む本発明によるハイブリッド核酸配列分子は、いくつかの方法により製造されうる。これは、合成プロセスにおいて適切な場合にはＲＮＡ塩基を、及び合成プロセスにおいて適切な場合にはＤＮＡ塩基を付加する化学合成によって製造されてよい。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＲＴは、互いに独立して合成されてよく、次いでその分子が、前記したように互いに会合されてよい。他の選択肢は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、又はＲＮＡ、好ましくは一本鎖ＲＮＡに核酸を連結することができる他の酵素を使用することである。ここで、ＲＮＡ及びＤＮＡ成分は、任意の方法によって独立して生じ、混合され、製造者のプロトコルに従って酵素にさらされ、そしてライゲーションによって共有結合的に連結され、すなわち共有結合を生じる。本明細書において開示される修飾及び標識は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列部分及びＲＴ部分を互いに共有的に連結するために使用されうる。ＣＲＩＳＰＲ核酸配列のＲＴへの共有結合のための他の戦略は、それらの各々を他の連結化学基又は複合体、例えばペプチドに連結することを含む。このタイプのアプローチは、ハイブリッド核酸配列が後に細胞内で検出されなければならない場合に、又はさらなる機能がハイブリッド核酸配列にあるべき場合に特に適している。ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はハイブリッド核酸配列のいずれかの化学修飾は、ハイブリッド核酸配列を安定化させるため、及び細胞酵素による分解を回避して目的のＤＮＡ標的部位でのハイブリッド核酸配列及びＣＲＩＳＰＲポリペプチドの高い同時利用可能性を得るために、非常に重要であってよい。
【０１２０】
本発明の種々の態様のある特定の実施形態に従って、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列と修復鋳型核酸配列との間にリンカー領域を含んでよい。この配列は、ハイブリッド核酸配列の双方の個々の部分がそれらの機能を十分に発揮することができるように、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び修復鋳型核酸配列の最適な幾何学形状を達成するのにために提供されてよい。リンカー又はテザー領域の長さ及び組成は、特定のＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＲＴ対のための重要な設計面でありうる。一実施形態において、特にＲＴの左側の相同性アームの５’末端は、リンカー領域を含んでよい。テザー又はリンカーは、種々の形をとってよい。ＲＴの左側又は右側の相同性アームから出発して、ＲＴのこの部分が染色体標的へのＲＴの移動を可能にするためのテザー又は柔軟なリンカーとして及びＨＲ反応を媒介する相同性として作用することを可能にすることは、本開示に基づき、ゲノム編集のために現在広く使用されている修復鋳型の通常の設計パラメータの知識を有する当業者によって、実施されてよい。
【０１２１】
考慮されるべき設計パラメータは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの切断部位に関する修復鋳型相同性の幾何学形状、修復鋳型が相同である目的のＤＮＡ標的部位内の鎖、影響を及ぼしうる修復鋳型のサイズ、リンカーが導入されるかどうか、及びどの長さのリンカーが導入されるかを含む。リンカー配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び修復鋳型の共有的な及び非共有的な会合の双方に使用されてよい。したがって、本開示に基づいて、及びNishimasu（前述）、Tsaiら（Nature Biotechnology, 32, 569-576, (2014)）、又はShechnerら（Nature Methods, 12(7), 664-670 (2015), doi: 10.1038/nmeth.3433）において提供された情報に基づいて、当業者は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＲＴ部分の双方があらゆる立体的制約なしにそれらの機能を十分に発揮できるようにいくつかのハイブリッド核酸が使用される場合に、ハイブリッド核酸配列に適したリンカー領域を定義して、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＲＴとの間又は異なるＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＲＴの間の特定の配列を定義することができる。少なくとも１つのリンカー領域は、ＲＴから少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列を適切に分離するか、又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＲＴの位置を最適化するために、最大１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個までの追加のヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態において、リンカー配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＲＴのより良好な位置決めを達成するために、最大１５０個、２００個、２５０個、５００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個まで、又は少なくとも４７００個もしくは５０００個のヌクレオチドを含んでよい。
【０１２２】
ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＲＴの非共有的な会合のために、１つのアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＲＴ中で部分的に相補的な配列を提供して、２つの分子をＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合によって自然に会合させることである。
【０１２３】
非共有的な会合の他の方法が考えられ、例えば分子の電荷を使用してＲＴと編集複合体のいくつかの成分との十分な会合を生じることである。他の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドもしくは少なくとも１つのハイブリッド核酸配列、又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はそのＲＴ部分は、タグ及び結合パートナー、すなわちハイブリッド核酸配列、又はＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はそのＲＴ部分を含んでよく、かつ少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、それぞれ、タグの対応する結合パートナーを含み、その結果、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＲＴとの間の塩基対合及びＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの間の会合に加えて非共有相互作用が生じて、相互作用が増大し、したがって分子リボ核タンパク質複合体の安定性が増大する。
【０１２４】
ヒト細胞において、３’末端上で２８ｂｐの追加の配列を有するｇＲＮＡと、会合した１８７アミノ酸（２１．４ｋＤ）Ｃｓｙ４タンパク質とを有するＣａｓ９が、標準ｇＲＮＡ対照と比較して、ＤＳＢ誘発において少なくとも９０％の活性を維持していた（Tsaiら、Nature Biotech., 32, 2014）。これは、ｓｇＲＮＡの３’末端に連結されたカーゴのための、及び伸長ｓｇＲＮＡ分子のための適した構造−機能潜在性の、Ｃａｓ９によるかなり十分な耐性を示唆している。Ｃａｓ９耐性は、標準的なｇＲＮＡにおいて、Ｃａｓ９タンパク質の構造の外側で及び活性部位を保持する表面にほぼ垂直な表面上で保持されるヘアピンで停止させる核酸配列の遊離３’末端の順応性によって部分的に可能である（Nishimasuら、2014；Andersら、2014）。さらに、Shechnerら（"Multiplexable, locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-Display", Nature Methods, 12(7), 664-670 (2015), doi : 10.1038/nmeth.3433）は、長い非コードｓｓＲＮＡ分子が、ｓｇＲＮＡの５’末端又は３’末端に、又はヒト細胞ゲノム中のｄＣａｓ９タンパク質による配列−特異的標的化活性の損失なしに、ｓｇＲＮＡの内部ループ内に、転写的に付着されてよいことを示す。４．８ｋｂまでのｓｓＲＮＡは、配列−特異的標的化活性を維持しながら、リボ核タンパク質複合体によって順応された。
【０１２５】
本発明の種々の態様による一実施形態において、修復鋳型核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の３’末端でＣＲＩＳＰＲ核酸配列と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の５’末端と会合し、及び／又は修復鋳型核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列内に位置している。
【０１２６】
驚くべきことに、本発明の発明者によって、一本鎖又は二本鎖ＲＴのいずれかである３’に位置するＤＮＡ修復鋳型配列（ＲＴ）を有するＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からのＣａｓ９、又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ形からのＣｐｆ１、又は他のＣＲＩＳＰＲポリペプチドエフェクターによって標的に送達されるため、相同配列と自由に相互作用することが見出された。５’に位置するＤＮＡ修復鋳型配列、又は一本鎖もしくは二本鎖ＲＴ、又はその双方のいずれかの３’及び５’に位置するＲＴを有するＣＲＩＳＰＲ核酸配列を使用した場合にも同様の観察がなされた。したがって、３’又は５’に位置することは、ＲＴがＣＲＩＳＰＲ核酸配列の３’末端又は５’末端に共有的に付着していることを意味し、又はＲＴがＣＲＩＳＰＲ核酸配列の３’及び／又は５’領域に付着した配列に対応する領域にハイブリダイズされる、すなわち該領域と非共有的に会合されることを意味してよい。さらに、ＲＴは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列のステムループに共有結合的に導入されてよく、又は機能的ハイブリッド核酸構築物を得るために前記ＣＲＩＳＰＲ核酸配列のステムループと非共有的に会合されてよい。したがって、前記したＣＲＩＳＰＲ核酸配列の種々の位置でＣＲＩＳＰＲ核酸配列と会合したＤＮＡが十分に許容され、したがってこの新たな形のハイブリッド複合体が、遺伝子編集の原理の２つの側面：（１）ＣＲＩＳＰＲ核酸配列によって媒介される標的化の正確さ、及び（２）ＲＴによって媒介されるような効率的かつ部位特異的修復、をまとめるのに適していることが見出された。さらに、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＲＴとを近接させて、目的のＤＮＡ標的部位で目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドと共にハイブリッド構築物の安定性及び利用可能性を増大させる相乗効果がある。
【０１２７】
ＲＴがＣＲＩＳＰＲ核酸配列の３’末端又は５’末端に結合している場合に、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列と共に送達されるこの伸長された修復鋳型ヌクレオチド配列の長さに対する制限はほとんどない。したがって、ＲＴの長さは、むしろ導入されるべき標的とされた修飾によって決まる。典型的なＲＴ配列は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの切断頻度の有意な損失を観察することなく、約２０〜８０００ｂｐ又はそれ以上の、例えば２０〜５０００ｂｐの、３０〜８０００ｂｐの、３０〜５０００ｂｐの、４０〜８０００ｂｐの、４０〜５０００ｂｐの、５０〜８０００ｂｐの、５０〜５０００ｂｐの、６０〜８０００ｂｐの、６０〜５０００ｂｐの、７０〜８０００ｂｐの、７０〜５０００ｂｐの、８０〜８０００ｂｐの、８０〜５０００ｂｐの、９０〜８０００ｂｐの、９０〜５０００ｂｐの、１００〜８０００ｂｐの、１００〜５０００ｂｐの長さの一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡを有してよい。当業者に公知であるように、ＲＴ鋳型の長さは、もたらされる／導入されるべき修飾／挿入の種類によって強く左右される。目的のタンパク質をコードするより長い核酸配列のノックインが意図される場合に、ＲＴ配列の長さは以下の長さを有する：目的のタンパク質をコードする核酸構築物の長さ＋配列の左側及び右側に位置する２つの十分に長い相同性アーム。したがって、原則として１５００ｂｐの上限はないが、ＲＴは最大５０００又はさらにそれ以上の塩基対（ｂｐ）を有してよい。例えば、修復鋳型としてプラスミドＤＮＡを使用し、標的部位内に修復鋳型を作製することにより現在導入されているより長いインサートは、修復鋳型の全長が数１０００ｂｐを有することができるように８００ｂｐ以上の左右相同性アームを使用する。核酸インサートの長さは、事前実験で決定されてよい目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼを阻害しないように設計されるべきである。
【０１２８】
本発明による第二の態様において、本発明の第一の態様による少なくとも１つのハイブリッド核酸配列、及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む分子複合体であって、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドが機能的方法で会合している、分子複合体が提供される。
【０１２９】
「機能的に会合している」という用語は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドとＣＲＩＳＰＲ核酸配列の第二の配列部分とが前記したように好ましくは非共有的な会合の形によって互いに相互作用できるように、分子リボ核タンパク質複合体を接触させることを意味する。少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含む少なくとも１つのハイブリッド核酸配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列と目的の少なくとも１つの対応するＣＲＩＳＰＲポリペプチドとを接触させる前、後又は同時に独立して構築される。一実施形態において、複合体全体は、編集されるべき少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的領域を含む標的細胞に導入される前に、インビトロで会合される。他の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列の前又は後ろの少なくとも１つの標的細胞に導入される。ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ポリペプチド配列をトランスフェクトすることによって、又は少なくとも１つのポリペプチドをコードするＲＮＡで少なくとも１つの標的細胞をトランスフェクトもしくは形質転換することによって、又は標的細胞内で転写及び翻訳されてよい少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする送達構築物を導入することによって、標的細胞に導入されてよい。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、目的の細胞又は生物のゲノムに、構成的に又は誘導的に発現するように安定して組み込まれてもよい。同様に、ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び修復鋳型核酸配列は、インビトロで提供された構築された構築物と同時に提供されてよい。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又は修復鋳型核酸配列のいずれかは、前記した適切な送達ベクターの助けを借りて標的細胞にトランスフェクト又は形質転換されてよい。好ましい実施形態において、全分子複合体は、インビトロで構築され、次いで目的の標的細胞に導入されてゲノム編集構築物の最良の空間的及び化学量論的制御を可能にする。他の好ましい実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ハイブリッド核酸配列の前の標的細胞に導入され、その後少なくとも１つのハイブリッド核酸配列が、目的の標的細胞に導入される。導入されたＣＲＩＳＰＲ核酸配列が既に細胞に存在するＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって即座に結合されそして安定化されるように、ポリペプチドと比較してＲＮＡの本質的に低い安定性によって、連続した順序は、ある特定のアプローチに好ましくてよい。理論に縛られることを望むものではないが、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び修復鋳型核酸配列のエキソビボでの構築は、例えばガイドＲＮＡ単独と比較して、構築物の安定性を高めてもよい。
【０１３０】
さらにさらなる実施形態において、分子複合体の個々の成分は、前記した標識又はリンカーの形で少なくとも１つの修飾を含んでよい。前記修飾は、安定な共有的又は非共有的会合を得るためにインビボ又はインビトロで分子複合体を会合することを助けることができる。例えば、クリックケミストリー基又はＮＨＳ−エステル化学物質を使用して分子を共有結合させることができる。代わりに、非共有的な会合は、１つの修飾としてのビオチン及びビオチン結合タンパク質部分によって、又は単鎖Ｆｖ抗体断片とその同族標的との間で得られてよく、ここで、前記修飾は連結されるべき分子複合体の成分内に存在する。これらの方法により、核酸と他の核酸との間、又は核酸とアミノ酸成分との間の機能的会合が得られてよい。
【０１３１】
ある特定の適用のために、目的の細胞に導入する前にインビトロで成分を会合させることが適切であってよい。他の適用のために、例えば細胞内の視覚化プロセスのために、なくとも１つの蛍光部分又は染料を含む分子複合体を使用することが適切であってよい。したがって、細胞内での細胞（細胞内）局在及び／又は動態を監視するために、個々の成分の導入、及び任意にそれらの転写／発現の後に、インビボでのみ個々の成分を連結することが適切であってよい。
【０１３２】
本発明によるハイブリッド核酸配列及び／又は分子複合体の一部としての本発明による少なくとも１つの修復鋳型核酸配列のサイズは変動してよい。改変されるべきＤＮＡ標的配列に依存して、該サイズは約２０ｂｐ〜約５０００ｂｐ又はさらに８０００ｂｐの範囲であってよい。
【０１３３】
目的のＤＮＡ標的領域への特異的な変異又は挿入を生じるために使用されるＨＤＲ鋳型は、修飾される標的配列を囲んで一定量の相同性を要求する。修飾の挿入部位が、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの場合には融合パートナーにより影響を受けるため、ＤＳＢから１００ｂｐ以下、理想的には可能であれば１０ｂｐ未満である場合に最良であり、相同性アームの全長は、これらを設計する場合に考慮される重要な要素である。より長い距離でも機能するであろうが、効率はおそらくより低くなり、目的のＤＮＡ標的配列に導入されるべき所望の修飾が存在することを確実にするために選択マーカーの導入が必要になるであろう。
【０１３４】
本発明の種々の態様に従って、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ核酸分子であってよい。少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、１つ以上の直鎖の、ｓｓ−又はｄｓ−ＤＮＡ分子の形で提供されてよい。しかしながら、ゲノム編集アプローチの特異性を高めるために、全ての成分が正しい化学量論で同時に導入されてよいため、特に機能的なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ−ＣＲＩＳＰＲ核酸−ＲＴ複合体の利用可能性を高めるために適している、分子複合体がエキソビボで組み立てられる場合に、エキソビボで生じる、少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖の修復鋳型核酸配列を使用することが適切であってよい。
【０１３５】
一本鎖又は二本鎖のいずれかであるより大きい核酸配列の合成は、通常の先行技術の方法を使用して達せられる。ある特定の実施形態について、部分的に一本鎖及び／又は部分的に二本鎖の修復鋳型核酸配列も適切であってよいことに留意されたい。一本鎖及び／又は二本鎖核酸配列と任意の種類の導入との任意の組み合わせは、分子複合体のＣＲＩＳＰＲポリペプチドの導入と同時、又は導入の前又は後に、可能である。一実施形態において、鋳型核酸配列が特定のゲノム編集アプローチに有益であるため、第二の態様による分子複合体を標的細胞に導入することが想定され、ここで標的細胞は、修復鋳型又は追加の修復鋳型配列をコードする追加のプラスミドベクターを含み、分子複合体が異なる成分が提供された後にインビボで構築できる。一般に、ＤＮＡ標的領域が位置する標的細胞内のその部位での修復鋳型核酸配列の高い物理的利用可能性は、非常に正確なゲノム編集事象を可能にするために非常に重要である。ある特定の実施形態において、特に一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ修復鋳型は、相同性相互作用が最適な相同組換え修復を得るために十分な長さを提供しながら、できるだけ低い分子量を保ちながら正しいバランスをとるために適している。
【０１３６】
本発明の任意の態様に従った一実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルスを含むストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス・アウレウス、又はナイセリア・メニンギティディスを含むナイセリア属種、コリネバクター属、サテレラ属、レジオネラ属、トレポネーマ属、フィリファクター属、ユーバクテリム属、ラクトバチルス属、マイコプラズマ属、バクテロイデス属、フラビボーラ属、フラボバクテリウム属、スフェロケタ属、アゾスピリルム属、グルコナセトバクター属、ロゼブリア属、パービバキュラム属、ニトラティフラクター属マイコプラズマ属及びカンピロバクター属のＣａｓポリペプチドからなる群から独立して選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、アシダミノコッカスＢＶ３Ｌ６種を含むアシダミノコッカス属種、ラクノスピラ細菌ＮＤ２００６を含むラクノスピラ属種、フランシセラ・ノビシダＵ１ １２を含むフランシセラ属種、ユーバクテリウム・エリゲンス、プレボテラ属種、又はポーフィロモナス属種のＣｐｆ１ポリペプチドを含む、古細菌又は細菌からのＣｐｆ１ポリペプチドから選択され、又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドニッカーゼ又はＣＲＩＳＰＲポリペプチド欠失エンドヌクレアーゼ活性を含む、ＣａｓＸポリペプチド又はＣａｓＹポリペプチド、又はそれらの多様体及び／又は機能的断片及び／又は組合せ物から選択される。
【０１３７】
本発明による一実施形態において、本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、例えば、オフターゲット変異を最小にするための変異体であるＣａｓ９ニッカーゼと共に使用されてよく、ここで、それぞれＣａｓ９由来のニッカーゼ変異体に特異的である対のガイドＲＮＡが使用される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、インビトロで発現され、翻訳され、又は合成されたポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする送達ベクターが使用され、ここで送達ベクターは、さらに調節配列又は局在化シグナルを含んでよい。変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は双方の鎖を切断する能力を欠くように対応する野生型酵素に関して変異させたＣＲＩＳＰＲポリペプチドも、本開示による種々の実施形態に含まれる。例えば、化膿連鎖球菌からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）を使用することができ、これは、Ｃａｓ９を目的のＤＮＡ標的領域の双方の鎖を切断するエンドヌクレアーゼから一本鎖を切断するニッカーゼに変換する。Ｃａｓ９ポリペプチドをニッカーゼにする変異の他の例に、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉドメイン、ＲｕｖＣ ＩＩドメイン、及びＲｕｖＣ ＩＩＩドメイン、又はＨＮＨドメイン）を変異させて、実質的にすべてのＤＮＡ切断活性を欠く変異Ｃａｓ９を生成してよい。いくつかの実施形態において、Ｄ１０Ａ変異を、１つ以上のＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ変異と組み合わせて、実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠くＣａｓ９酵素を生成する。いくつかの実施形態において、変異型酵素のＤＮＡ切断活性が変異させていない形の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下である場合に（一例として、変異型のＤＮＡ切断活性が変異させていない野生型と比較して無効又は無視できる場合であってよい）、ＣＲＩＳＰＲ酵素は実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠いていると見なされる。酵素が化膿連鎖球菌からのＣａｓ９ではない場合に、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で変異を生じさせることができる（これは例えば標準的な配列比較ツールによって突き止められる）。特に、化膿連鎖球菌からのＣａｓ９において、以下：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａの変異のいずれか又は全てが好ましく、任意の置換アミノ酸のための保存的置換も、本開示に従って想定される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの変異の同一又は保存的置換は、ある特定の実施形態、特に化膿連鎖球菌からのＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０についても可能である。しかしながら、他のＣａｓ９において、化膿連鎖球菌からのＤ１０及びＨ８４０のＣａｓ９に対応する残基も可能である。所与のＣＲＩＳＰＲタンパク質の「オルソログ」又は「オルソロガス」も、本発明の実施において使用されてもよい。オルソログは、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オルソログは、進化の過程で同一の機能を保持する。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインと共に最も大きい��クレアーゼとの相同性を共有する酵素の一般分類を示すことができるため、Ｃａｓ９と同定されうる。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９、又はＳ．サーモフィルスからの野生型Ｃａｓ９由来であり、そのタンパク質配列は、受託番号Ｇ３ＥＣＲ１でのスイスプロットデータベースにおいて提供されている。同様に、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９、又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２でのスイスプロットに含まれる。
【０１３９】
一実施形態において、本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列の少なくとも１つのＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、選択されたＣＲＩＳＰＲ酵素又は特定の長さのポリペプチドに対して最適な活性、すなわち認識特性を有するために設計されてよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、インビトロ又はインビボで転写又は翻訳されてよいＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子を切断することにより、又は合成ＣＲＩＳＰＲを提供することにより、対応する野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素よりも短い長さに切断されてよい。酵素の異なる部分が異なるオルソログ間で取り替え又は交換されて、目的に合わせた特異性を有するキメラ酵素を得る、キメラＣａｓ９酵素の生成も可能である。
【０１４０】
したがって、本開示による「多様体」又は「機能的断片」は、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に由来する、すなわち野生型酵素とある程度の配列相同性を有するが本明細書において記載されいくつかの方法で変異（改変）されている、任意のＣＲＩＳＰＲタンパク質又はそれらの短縮型を含む。Ｃａｓ９由来のヌクレアーゼによる酵素活性は、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズし、標的配列の２０ヌクレオチドに続いて本明細書に記載したように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の例を有する、標的部位配列で二本鎖切断を生じる。この酵素機能は、ニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ多様体又はヌクレアーゼ失活多様体を生成することによって変えられる。さらに、本開示によるＣＲＩＳＰＲポリペプチド多様体をコドン最適化して、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドを標的細胞、好ましくは真核細胞、好ましくは動物又は植物細胞のコドン使用頻度に適合させることができる。
【０１４１】
前記態様の一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが野生型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの触媒機能を依然として発揮するという条件で、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、野生型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの触媒活性断片であってよく、及び／又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、最適化したコドンであってよく、及び／又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、タグ配列に連結されていてよく、ここで、タグは、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＦＬＡＧタグ、蛍光性を有するタグ、例えば（Ｅ）ＧＦＰ（（高感度）緑色蛍光タンパク質）タグ、ＤｓＲｅｄタグ、ｍＣｈｅｒｒｙタグ、（ｔ）ｄｔｏｍａｔｏタグ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタグ等から選択されるタグ、ストレプトアビジンもしくはｓｔｒｅｐタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ミトコンドリアもしくは核を含む細胞内区画にターゲティング可能な輸送ペプチド、ｓｎａｐタグ及び／又はそれらに付着したアミノ酸配列の分泌を可能にする分泌タグ、通常天然に生じない非天然アミノ酸、又は前記タグの組み合わせからなる群から選択されてよく、及び／又はＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＤＮＡニッカーゼとして機能する修飾ＣＲＩＳＰＲペプチドであってよく、及び／又はＣＲＩＳＰＲポリペプチド又はその触媒活性断片は、他の機能部分、好ましくは酵素活性を有する機能ポリペプチド部分、好ましくはクロマチンモデリング機能及び／又は相同組換えの促進及び／又は転写の改質を有する機能的部分との融合分子の形で存在してよい。多細胞生物の組織内の少なくとも１つの修飾細胞を分析する場合に、かかるタグ及びマーカータンパク質、特に蛍光タンパク質タグは、それらが複雑な組織のより深い層においてでさえも決定できるように明るい蛍光を有することが好ましい。適した蛍光タンパク質は市販されており、当業者によって特定の目的のために容易に選択されてよい。
【０１４２】
本発明の種々の実施形態にしがたって、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド及び／又はハイブリッドＣＲＩＳＰＲ核酸配列／ＤＮＡ核酸配列のいずれかは、修飾されるべき目的のゲノムＤＮＡ配列を含む細胞区画へのＣＲＩＳＰＲポリペプチドの効率的な標的化のための少なくとも１つの核局在化配列及び／又は色素体局在化配列、例えばミトコンドリア局在化配列又は葉緑体局在化配列を含みうる。かかる局在化配列のための配列要求は、分子生物学の分野における当業者に公知である。ＣＲＩＳＰＲポリペプチド又はハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド配列の機能を妨げずに、局在化配列は、Ｎ末端もしくはＣ末端部分、又はそれぞれの分子の対応する５’末端もしくは３’末端に融合、すなわち共有結合される。
【０１４３】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、タンパク質産生のための組換え技術を使用するか、又は対応するアミノ酸配列の合成によって、エキソビボで産生されるポリペプチド配列として提供されうる。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、目的の標的細胞の導入時に対応するアミノ酸配列に翻訳されてよいＲＮＡ配列として提示さる。さらにさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、目的の細胞において安定な発現のため又は一過性の発現のために構成されたＤＮＡ構築物として挿入されてよく、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、構成的又は誘導的な方法で目的の標的細胞において転写及び翻訳される。本発明によるＣＲＩＳＰＲポリペプチドを標的細胞に導入するための適切なＤＮＡ構築物及び会合方法は、当業者に公知であるが、植物細胞における適用に特に適している本発明のある特定の実施形態によるＣＲＩＳＰＲポリペプチドを導入する特定の方法を、以下にさらに詳細に記載する。
【０１４４】
分子複合体、又はそれらの一部、すなわち少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチド、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つのＲＴ、又はそれらをコードする構築物は、適した送達構築物を使用して目的の標的細胞に導入されなければならない。当然、分子複合体がインビトロで完全に構築され、その後標的細胞に導入されるかどうか、又は分子複合体の異なる成分が別々に細胞に導入され、その複合体が目的の標的細胞内で非共有的相互作用によって構築されるかどうかの事実に依存して、送達構築物のタイプは変動する。導入は、通常、適した送達構築物を使用することによって実施される。
【０１４５】
本発明の異なる態様の種々の実施形態に従って本明細書において使用される「送達構築物」又は「（送達）ベクター」という用語は、目的のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を標的真核細胞に輸送するためのカーゴとして使用される任意の生物学的又は化学的又は非化学的又は粒子ベースの手段及び／又は方法を示す。適した送達構築物は、ウイルスベクター、アグロバクテリウム種、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、又はナノ粒子、ナノ結晶、脂質もしくはポリマー小胞、リン酸カルシウム又はそれらの組み合わせを含む化学送達構築物を含む、標的細胞にヌクレオチド配列を送達するための生物学的手段を含む。脂質又はポリマー小胞は、例えば、脂質、リポソーム、脂質カプセル化系、ナノ粒子、例えばメソ孔シリカナノ粒子、小核酸−脂質粒子配合物、ポリマー、例えばＤＥＡＥデキストラン又はポリエチレンイミンのようなカチオンポリマー、及びポリマーソームから選択されうる。一実施形態において、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー（高分岐有機化合物）、及び多糖からなる群から選択される。他の実施形態において、脂質カプセル化系は、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、及び粒子を標的組織に送達する親油性化合物の１つ以上を含む。さらなる実施形態において、送達構築物は、メソ孔シリカナノ粒子であってよい。ナノ粒子及びナノ結晶は、一般に、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、場合によりで約２０ｎｍ未満、及びいくつかの態様において１０ｎｍ未満の小さい粒径を有する。ナノ粒子の有用な制限のない例には、酸化マグネシウム、及び金、銀等を含む金属ベースのナノ粒子が含まれる。適した活性剤ナノ結晶は、マグネタイト（ＦｅｓＣ）が含まれる。
【０１４６】
例えば、１，３−ジアミノプロパン側鎖又は１，２−ジアミノエタン側鎖を有するポリ（アスパルトアミド）誘導体からのカチオン性複合体は、カチオン性ポリマーとして使用されてよく、ここで、１，２−ジアミノエタン側鎖は、それらの最小の細胞毒性によって特定の適用に好ましくあってよい（Miyataら、J. Am. Chem. Soc, 2008, 130(48):16287-94）。細胞へのＤＮＡ及び／又はＲＮＡの送達を改善するために、それぞれの核酸は、損傷から保護されなければならず、かつ細胞への侵入が促進される必要がある。この目的のために、いわゆるトランフェクションプロセス中の望ましくない分解から核酸を保護する能力を有するリポプレックス及びポリプレックスが作製されている（Tros de lllarduyaら、Eur. J. Pharm. Sci., 2010, 40(3):159-70）。これらの複合体は、カチオン性リポソーム又はポリマーから形成され、かつ、ウイルスベクター、例えばレンチウイルス又はＡＡＶと会合される炎症及び免疫応答の欠点が、該ウイルスベクターの高い核酸移入効率を使用するために時に深刻である場合に、ウイルスベクター送達ための、特に遺伝子治療の分野における代替法を示す。核酸を分解から保護し、そして高いトランフェクション効率を可能にするそれらの特徴によって、リポプレックス及びポリプレックスは、本開示による任意のハイブリッド核酸又は分子複合体を目的の細胞に送達するために適している。
【０１４７】
本発明に従って、任意の送達粒子、例えばマイクロ粒子又はナノ粒子は、複数の官能化表面ドメインを有しうる。前記粒子は、表面を有するコア構造；それぞれコア構造の表面に結合する第一の末端及び第一の官能基を含む第二の末端を含む複数の第一のリンカー、例えばヘテロ官能性リンカー；並びにそれぞれコア構造の表面に結合する第一の末端及び第一の官能基とは異なる第二の官能基を含む第二の末端を含む複数の第二のリンカー、例えばヘテロ官能性リンカーを含み、ここで、リンカーは、それらのそれぞれの第一の末端を介してコア構造の表面に結合しており（かつコア表面から外側に伸長できる）、第一及び第二の官能基は、表面ドメインの外側モザイクを形成し、それぞれのドメインは、大多数の１つのタイプの官能基を含む。新しい粒子は、３個、４個又はそれ以上の複数のリンカーを含んでよい。いくつかの実施形態において、第一及び第二のリンカーは、異なる官能基を除いて同一であってよい。ある特定の実施形態において、粒子は、３個以上の異なるリンカーを含んでよい。種々の実施形態において、リンカーは、脂質、界面活性剤、ポリマー、炭化水素鎖、又は両親媒性ポリマーであるか、又はそれを含んでよい。例えば、リンカーは、ポリエチレングリコール又はポリアルキレングリコールであるか、又はそれを含んでよい。ある特定の実施形態において、リンカーの第一の末端は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した脂質を含み、かつ第二の末端は、ＰＥＧに結合した官能基を含む。
【０１４８】
ある特定の実施形態において、前述した組み合わせた又はマルチドメインの送達技術を使用するトランフェクション又は形質導入の方法論が使用されうる。一実施形態において、少なくとも１つのＣＰＰを、機能的な方法でさらなるドメインと会合させて、本発明によるハイブリッド核酸配列、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、又は分子複合体を目的の標的細胞にトランスフェクトするために適した送達媒介物を提供してよい。したがって、送達媒介物は、目的の標的細胞のサイトゾル又は他の区画への構築物又は複合体のトランフェクション／形質転換効率を高めるために、ＣＰＰドメインに連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含みうる。いくつかの実施形態において、送達媒介物は、エンドソームエスケープを容易にするためのエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含み、細胞質区画に到達しうる。本明細書において使用されるように、「エンドソーム漏出ドメイン」という表現は、エンドソームに捕捉された高分子が細胞質区画に到達する能力を付与するアミノ酸の配列を示す。理論に縛られることなく、エンドソーム漏出ドメインは、短い配列（しばしばウイルス性又は細菌性ペプチドに由来する）であり、これはエンドソーム膜の不安定化及び細胞質へのエンドソーム内容物の遊離を誘導すると考えられる。本明細書において使用されるように、「エンドソーム溶解性ペプチド（endosomolytic peptide）」は、エンドソーム膜を不安定化する特性を有するこの一般クラスのペプチドを示すことを意図する。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書の合成ペプチド又はポリペプチドベースのシャトル剤は、エンドソーム溶解性ペプチドであるＥＬＤを含みうる。本開示による送達媒介物の一部として使用するために適したＥＬＤは、米国特許第２０１６／０２９８０７８号Ａ１（ＵＳ ２０１６／０２９８０７８ Ａ１）において開示されており、酸性ｐＨで膜を破壊するペプチド、例えばｐＨ依存性膜活性ペプチド（ＰＭＡＰ）又はｐＨ依存性溶解性ペプチドを含む。例えば、ペプチドＧＡＬＡ及びＩＮＦ−７は、ｐＨの低下がペプチドが含有するアミノ酸の電荷を変える場合にαヘリックスを形成する両親媒性ペプチドである。より詳述すれば、理論に縛られることなく、ＧＡＬＡのようなＥＬＤは、ｐＨの低下による立体構造変化に続いて膜脂質の孔及びフリップフロップを形成することによってエンドソーム漏出を誘発することが示唆される（Kakudo, Chakiら、2004, Li, Nicol et al., 2004）。対照的に、ＩＮＦ−７のようなＥＬＤは、エンドソーム膜に蓄積して不安定化することによってエンドソーム漏出を誘発することが示唆されている（El-Sayed、Futakiら、2009）。したがって、エンドソーム成熟の過程で、付随するｐＨの低下は、ペプチドの立体配座の変化を引き起こし、これはエンドソーム膜を不安定化してエンドソーム内容物の遊離をもたらす。同一の原理が、シュードモナス属の毒素Ａにも当てはまると考えられる（Varkouhi, Scholteら、2011）。ｐＨの低下に続いて、毒素の転位ドメインの立体配座が変化し、孔を形成するエンドソーム膜への挿入を可能にする（London 1992、O'Keefe 1992）。これは最終的にはエンドソームの不安定化及びエンドソーム外への複合体の転位に有利である。さらに、ＥＬＤは、抗���ペプチド（ＡＭＰ）、例えば線状カチオン性αヘリックス抗菌ペプチド（ＡＭＰ）もしくはかかる配列に由来するペプチドであってよく、又はＥＬＤは、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）、例えばセクロピン−Ａ／メリチンハイブリッド（ＣＭシリーズ）ペプチドもしくはかかる配列に由来するペプチドであってよい。かかるペプチドは、膜を破壊する能力を有する、最も小さく最も効果的なＡＭＰ由来ペプチドの中にあると考えられる。セクロピンは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の双方に対して膜撹乱能を有する抗菌ペプチドの系統群である。セクロピンＡ（ＣＡ）は、最初に同定された抗菌ペプチドであり、直線構造を有する３７個のアミノ酸から構成される。メリチン（Ｍ）は２６個のアミノ酸のペプチドであり、ハチ毒中で見られる細胞膜溶解性因子である。セクロピン−メリチンハイブリッドペプチドは、真核細胞に対する細胞毒性（すなわち非溶血性）、任意の抗菌剤における望ましい特性を伴わずに短い有効な抗菌ペプチドを産生することが示されている。これらのキメラペプチドは、セクロピンＡの親水性Ｎ末端ドメインとメリチンの疎水性Ｎ末端ドメインの種々の組み合わせから構築され、そして細菌モデル系で試験されている。２つの２６量体、ＣＡ（１−１３）Ｍ（１−１３）及びＣＡ（１−８）Ｍ（１−１８）（Bomanら、1989）は、メリチンの毒性効果を伴わない天然セクロピンＡのより広いスペクトル及び改善された効力を証明することが示されている。いくつかの実施形態において、ＥＬＤは、エンドソームに蓄積される場合にエンドソーム膜不安定化も生じてよいインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のＨＡ２サブユニットのＮ末端に由来するペプチドであってよい。
【０１４９】
本明細書において使用され、本発明による少なくとも１つの分子複合体又は少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列を提供するために適している物理的導入方法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、又はプラスミドＤＮＡで機能化される細長いナノ構造及びかかるナノ構造のアレイ、例えばカーボンナノファイバー又はシリコンナノワイヤを使用するインペールフェクション（impalefection）、及び化学的方法を示し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むマイクロもしくはナノ粒子又は化学物質の使用に依存してよい。
【０１５０】
例えば、分子複合体の成分がエキソビボで会合している実施形態について、送達ベクターは、脂質ベースの又はポリマーのベクターであってよい。脂質ベースの又はポリマーのベクターは、例えば、脂質、リポソーム、脂質カプセル化系、マイクロ粒子、ウイスカー、ナノ粒子、小核酸−脂質粒子、ポリマー、及びポリマーソームから選択されうる。いくつかの実施形態において、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー、及び多糖からなる群から選択されてよい。他の実施形態において、脂質カプセル化系は、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、及び粒子を標的細胞に送達する親油性化合物の１つ以上を含む。
【０１５１】
哺乳動物細胞について、種々の治療目的のための免疫細胞のエキソビボ改変は、特異的に改変されたリンパ球、好ましくはＴ細胞を養子移入することによっていくつかの腫瘍疾患と戦うために過去１０年間で多くの関心を集めている。特にＣＤ８+Ｔ細胞リンパ球は、この点に関して興味深い標的である。単一のナイーブＴ細胞、単一の一次及び単一の二次中央記憶Ｔ細胞に由来する免疫応答が、同様のサイズ及び表現型の多様性に達し、匹敵する確率的変動を受け、かつ最終的に、３世代の連続的な単一細胞養子移入及び感染による再増殖によって、ＣＤ８+Ｔ細胞及びそれらの子孫のインビボでの運命マッピングによって測定された細菌性病原体での他の致命的な感染に対する免疫能を再構築してよい（Grafら、Immunity, 41 , 1 16-126, 2014）。造血細胞からの新規の胸腺Ｔ細胞が完全に成熟した後に、抗原特異的Ｔ細胞は、長期間にわたって維持されてよく、ここで抗原は、異種抗原、例えばウイルス又は癌細胞で発現された抗原であってよい。したがって、そのようなエフェクターＴ細胞又はその前駆体の標的改変は、免疫療法に適したＴ細胞を提供するための重要な戦略を示す。ナイーブＴ細胞は、中央メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、そして最終的にエフェクターＴ細胞を生じる、幹細胞メモリーＴ細胞と言われる段階を通して分化し、ここで、エフェクターＴ細胞は、最終的に標的細胞を認識し破壊する高分化細胞を示す。エフェクターメモリー及びエフェクターＴ細胞は、末梢組織へ輸送するための能力を有するＴ細胞のサブセットである。他のサブセットである、組織常在性メモリーＴ細胞が現在示唆されており、これはこれ以上循環しない（例えば、Farberら、Nature Reviews Immunology, 14, 24-35, 2014を参照されたい）。
【０１５２】
さらに、癌の免疫療法は、組換え型の腫瘍反応性受容体を発現するＴ細胞の養子移入が、他の方法で治療抵抗性の悪性腫瘍を治療でき（Brentjensら、2013；Gruppら、2013；Porterら、2011）、かつ養子移入療法における操作されたＴ細胞の使用が、癌、特に血液癌の治療において著しい望みを示していることを示す、いくつかの最初のめざましい臨床事例を提供している。ますます、定義されたサブセットの遺伝的に改変されたＴ細胞及び表現型の組成は、癌免疫療法の成功を増やすために使用される（Riddellら、Cancer J., 20(2), 141 -144, 2014を参照されたい）。血液悪性腫瘍及び固形腫瘍のための治療法としてのキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞の使用は、より広く普及してきている。この目的のために、Ｔ細胞は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために改変される（例えば、Anurathapanら、Molecular Therapy, 22, 623-633, 2014を参照されたい）。また、いわゆる抗腫瘍効果を増強するためにＴ細胞を再標的化及び再プログラミングするための第二世代のＣＡＲ、例えばＣＤ２８又は４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを組み込んだＣＤ１９標的化ＣＡＲがますます重要になっている（例えば、Sjoukjeら、Nature Reviews Drug Discovery, 14, 499-509, 2015を参照されたい）。
【０１５３】
高精度で遺伝子編集を媒介することにおけるその適合性についての本発明によるハイブリッド核酸配列又は分子複合体の能力を試験するために、種々の哺乳動物細胞株（接着培養又は懸濁培養）が当業者に利用可能であり、該細胞株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、又はLeibniz Institute German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（ＤＳＭＺ）から入手できる。細胞株は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３Ａ細胞を含むＨＥＫ２９３細胞、ＴＨＰ−１、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＡ４６、Ｂａｌｂ３Ｔ３並びにＨＴ２細胞を含む。さらに、初代細胞培養は、目的の細胞型におけるそのゲノム操作能力について本発明によるハイブリッド核酸配列又は分子複合体を試験するために哺乳動物から得ることができる。目的の細胞培養物を培養し維持するための培養培地、培養条件及び添加剤は、製造業者の指示に従って当業者に利用可能である。
【０１５４】
したがって、本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、好ましくは疾患の治療のために、１つ以上の哺乳動物細胞をインビボ又はエキソビボで改変するための重要なツールを示す。例えば、リンパ球細胞、より好ましくは任意の発生段階のＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の発現遺伝子を改変してＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖に高精度で影響を及し、改変させた細胞又は細胞集団の治療的適用のために有害であってよいオフターゲット効果を回避するＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【０１５５】
同様に、本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列は、家畜又は他の動物細胞における遺伝物質の改変のための有用なツールを示してよい。例えば、遺伝子疾患の編集又は有利な特徴、例えば肉、牛乳のための編集、例えば乳糖の含有量を減らした牛乳、又は家畜もしくは家禽の産卵。
【０１５６】
したがって、一実施形態において、インビボ又はエキソビボで、少なくとも１つの目的の免疫細胞に本発明によるハイブリッド核酸構築物を導入して、疾患、好ましくは自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病もしくは慢性関節リウマチ、又は増殖性疾患、例えば癌を治療することを含む、動物の免疫細胞の集団を生成する方法が提供される。
【０１５７】
ゲノム編集のための標的を形成するほとんどの植物種の好ましい組織は、未熟胚、胚形成カルス、無傷植物の分裂組織、花粉、花粉管もしくは卵細胞、懸濁細胞、又は再生能を有する他の細胞型である。いくつかの植物について、好ましい組織は、プロトプラスト又は葉であってよい。処理され、次いで植物全体に再生されてよい任意の細胞は、好ましい組織又は細胞と考えられてよい。組織の調製、再生、及びＤＮＡ送達のためのプロトコルは、種、組織の種類、送達方法及び他の要因に依存して異なる。一般的な送達方法は、ＤＮＡ又はタンパク質で被覆された金又はタングステン粒子での細胞の微粒子銃である。他の送達方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介形質転換、エレクトロポレーション、ウイルス感染、細胞への直接注射、及びアグロバクテリウム媒介形質転換である。いくつかの植物において、受精直後に花柱を通してスライスし、編集試薬を含む液体を切断した花粉管に適用することによって受精卵細胞に送達することができる。動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞について、エレクトロポレーション、すなわち電気パルスを適用することによる細胞膜中の小孔の瞬間的な形成に基づくトランフェクション技術は、本発明による少なくとも１つの分子複合体を導入するために適したアプローチを示してよい。哺乳動物の初代細胞、幹細胞及びトランフェクションしにくい細胞株を含む、多数の異なる細胞型を用いた直接トランフェクションの成功のためのいくつかの細胞型特異的プロトコルが当業者に利用可能であり、それらは少なくとも1つの本発明による分子複合体のための送達ツールとして適している。送達に適した２つ以上の方法又は作用剤の組み合わせは、そのゲノムが編集されなければならない細胞タイプに依存して優れた結果を提供してよく、したがって本発明の範囲内に含まれることに留意することが重要である。
【０１５８】
好ましい送達方法は、インビトロでＣＲＩＳＰＲ核酸配列−ＲＴハイブリッド核酸を構築し、そしてそれを目的の標的細胞に適用する前にインビトロで産生され、任意に精製されたＣＲＩＳＰＲポリペプチドに導入することである。しかしながら、他の有用な送達方法は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド送達と同時、その前又は特にその後に、ハイブリッド核酸の適用と共に、インビボでの転写及び／又は発現のために、少なくとも１つの標的細胞への、任意にさらなる調節エレメントを含むｍＲＮＡとして又は遺伝的ＤＮＡ構築物としてのＣＲＩＳＰＲポリペプチドの送達であってよい。ＣＲＩＳＰＲ核酸配列とＲＴ成分との非共有的な会合の場合に、これらの分子は別々に送達されてもよく、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、ＲＮＡとして、又はインビボで転写されてよいＤＮＡ発現カセットとして送達されてよい。少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチド又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列が発現カセットとして送達される場合に、特に標的細胞が植物細胞である場合にＲＮＡ又はＤＮＡのウイルスレプリコン又はウイルスベクターから発現させることが好ましくてよい。
【０１５９】
本発明の第二の態様による好ましい実施形態において、少なくとも１つの分子複合体はエキソビボで会合しており、複合体の異なる成分、すなわち、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸を含む少なくとも１つのハイブリッド核酸、並びに少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを、エキソビボ／インビトロで化学的又は組換えして合成し、そしてその異なる成分は、好ましくは構築前に精製される。本発明による少なくとも１つの分子複合体の構築後に追加の精製ステップを実施してよい。ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、又はポリペプチド、又はリボヌクレオ−及びリボヌクレオタンパク質−複合体を精製する方法は、当業者には容易に利用可能である。任意にインビトロで分析されてよい高純度の及び化学量論的な分子複合体の提供は、高効率で正確なゲノム編集ツールを提供することが可能である。
【０１６０】
本発明による種々の態様によるさらなる実施形態において、従来の修復鋳型核酸配列が、プラスミドの形で又は核酸オリゴヌクレオチドの形で、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸に加えて、標的ゲノム編集事象の効率をさらに高めるために使用されてよい。通常、プラスミド又は他の二本鎖ＤＮＡ修復鋳型を適用するかどうか、又は一本鎖オリゴヌクレオチドを修復鋳型として使用するかどうかの決定的要因は、導入されるべき意図する修飾のサイズに依存する。当業者は、本発明によるハイブリッド核酸構築物に加えて使用することができるさらなる従来の修復鋳型を容易に定義することができる。これらの従来の修復鋳型は、標的細胞が植物細胞である場合に送達ベクター、例えばジェミニウイルスベクターによって、又は本発明によるハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列について本明細書においても詳述されている直接トランフェクションもしくは導入によって、少なくとも１つの目的の標的細胞に導入されてよい。
【０１６１】
本発明によるさらなる態様において、少なくとも１つの成分を含み、さらに適切な緩衝液及び試薬を含むキットが提供され、ここで該成分は本発明の第二の態様による分子複合体を含み、少なくとも１つの複合体は、予め構築された複合体として提供されてよく、又は好ましくはその別個の構成要素の形で提供されてよく、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチド、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含む。好ましくは核酸配列用の乾燥粉末又は凍結乾燥粉末の形での分子複合体の異なる構成要素を別々に提供することは、特にＲＮＡ配列がポリペプチドよりも安定性が非常に低いため、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ構築物の核酸配列のより高い安定性を保証する。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、適した貯蔵緩衝液、例えばＣａｓ９ポリペプチドについて３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロールを含む貯蔵緩衝液（２５℃でｐＨ７．４）中で送達されてよい。前記キットは、さらに、それぞれのＣＲＩＳＰＲポリペプチドの活性に要求される適したイオン、例えばＣａｓ９酵素についてのＭｇ2+を含む適切な反応緩衝液を含んでよい。さらに、キットが標識又は他の修飾される成分を含む実施形態について、該キットは、目的の細胞への前記成分のトランフェクション後に前記成分の会合（共有的な連結又は非共有的な会合）を補助及び／又は誘発するための追加の緩衝液及び化学物質を含んでよい。他の実施形態において、前記キットは、本発明の分子複合体の少なくとも１つの成分を同時に又は続けて目的の標的細胞にトランスフェクト、形質導入又は形質転換するための本明細書において開示された送達構築物又は媒介物を含む容器を含んでよい。代わりに、前記キットは、それぞれ凍結乾燥したｍＲＮＡ又は凍結乾燥したタンパク質としてＣＲＩＳＰＲ成分を含んでよい。この態様によるさらなる実施形態において、前記キットは、分子複合体としてＣＲＩＳＰＲ成分を含む成分に加えて、適した送達媒介物又は送達システムを提供するさらなる成分を含んでよい。この態様によるさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド及びハイブリッド核酸配列は、少なくとも２つの成分して提示される。ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、目的の細胞に形質転換又はトランスフェクトされるベクターとして提示されてよいが、一方で少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型を含むハイブリッド核酸配列は、別個の成分として提示されてよい。したがって、本開示によるキットは、複数の成分が存在する場合に異なる成分の同時又は続けた使用に適していてよい。任意に、この態様によるキットは、使用説明書、特に編集される標的細胞に特異的な使用説明書を含んでよい。本発明のこの態様によるさらなる好ましい実施形態において、キットは、所望の形質の改変を得るための特定のツールを含む、目的の特定の植物のための形質開発キットを提供するために特別に開発される。この実施形態によって、前記キットは、目的の形質を植物細胞内の目的のＤＮＡ標的遺伝子座に移入するために構成された特定の修復鋳型を含む。さらに、前記キットは、少なくとも１つのＣ��ＩＳＰＲ核酸配列との分子複合体として会合した、適したＣＲＩＳＰＲ酵素又は２つのＣＲＩＳＰＲニッカーゼを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、第一のＤＮＡ標的に相補的である少なくとも１つの第一の配列部分、及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドと相互作用するように構成された第二の配列部分を含み、かつ少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、目的の特定の形質を保有する修復鋳型と会合されているか、又は会合できるように構成されている。この実施形態によるキットが植物細胞でも形質特異的でもあるため、前記キットの使用は、形質開発を達成するための目的のゲノムＤＮＡ遺伝子座の迅速な標的化及び修飾を可能にし、それというのもＣＲＩＳＰＲ核酸配列成分がＰＡＭモチーフ及び目的のＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用するように既に設計され、かつ提供された修復鋳型が便利な方法で挿入又は修飾されるべき配列を提示するからである。
【０１６２】
したがって、本発明による一態様において、第一の態様による少なくとも１つのハイブリッド核酸配列を含むかそれにより編集され、又は本発明の第二の態様による少なくとも１つの分子複合体を含む、植物、植物細胞、植物材料、又はそれらの誘導体、又はそれらの子孫が提供される。本発明による他の態様において、ハイブリッド核酸配列で改変されている、植物、植物細胞、植物材料、又は誘導体、又はそれらの子孫が提供される。
【０１６３】
本発明によるさらに他の態様において、原核細胞又は真核細胞において少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変するための方法であって、
（ｉ）目的のゲノム領域で少なくとも１つの第一のＤＮＡ標的配列及び少なくとも第二のＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を準備すること、
（ｉｉ）本発明の第一の態様について詳述した少なくとも１つのハイブリッド核酸配列及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む、本発明の第２の態様について詳述した少なくとも１つの分子複合体を準備すること、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの分子複合体と少なくとも１つのＤＮＡ標的配列とを適した条件下で接触させて、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列の第一の配列の一部又は少なくとも１つのハイブリッド核酸配列と、少なくとも１つの第一のＤＮＡ標的配列との相補的塩基対を得て、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって第一のＤＮＡ標的配列の認識を達成し、及び任意に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドによって少なくとも１つのＤＮＡ切断を導入すること、ここで、少なくとも１つのハイブリッド核酸配列の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列は、少なくとも１つの第二のＤＮＡ標的配列の部位で相同組換え修復を指示する、及び
（ｉｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を含む少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を得ること
により、原核細胞又は真核細胞において少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改変するための方法が提供される。
【０１６４】
一実施形態において、分子複合体の少なくとも１つのハイブリッド核酸配列は、少なくとも１つの分子複合体の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドとは無関係に少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞に提供されてよく、少なくとも１つの分子複合体は、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞内で会合している。
【０１６５】
前述したように、少なくとも１つの分子複合体は、インビトロで構築した複合体として提供し、次いでこれを少なくとも１つの目的の標的細胞に導入してよい。代わりに、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチド及び／又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又は少なくとも１つの修復鋳型核酸配列のいくつか又は全部を、遺伝子ＲＮＡ又はＤＮＡ構築物として挿入してよく、インビボで産生し、その結果、少なくとも１つの分子複合体の最終的な構築がインビボで起こってよい。好ましい実施形態において、少なくとも１つの分子複合体はエキソビボで結合され、そして少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチド、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び少なくとも１つの修復鋳型核酸配列を含む少なくとも１つの分子複合体が、少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的配列を含む少なくとも１つの標的細胞への少なくとも１つの分子複合体の機能的導入を可能にする適切な送達ベクターによって少なくとも１つの細胞に同時に提供される。
【０１６６】
本開示による方法の記載内容において本明細書において言及される「適切な条件」又は「適切な反応条件」は、原核細胞又は真核細胞を含む形質転換又は製造される細胞又は生物の成長及び発生の双方を可能にする条件、及び目的の少なくとも１つの細胞又は生物に目的の遺伝子構築物を安定的に組み込むか又は一時的に導入するために必要な条件を示す。原核生物又は細菌の増殖及び／又は形質転換を促進するための条件は、当業者に公知である（Green及びSambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Pressも参照されたい）。動物細胞の増殖を促進するための及び／又は動物、特に哺乳動物細胞への遺伝物質の導入のための条件は、種々の異なる細胞株について当業者に利用可能である（前述のGreen及びSambrookを参照されたい）。とりわけ温度、光、水、酸素、鉱物栄養素及び土壌支持体を含む、植物又は植物細胞の成長及び発生を促進するための条件は、植物種によって異なり、本明細書において提供される開示の知識において当業者によって容易に決定されてよい。目的の少なくとも１つの分子複合体の安定な組み込み又は一過性導入を達成するためのさらなる適切な条件は、少なくとも１つの目的の分子複合体の導入のために選択される形質転換方法、形質転換される植物材料又は植物細胞の発生段階、及び導入されるべき少なくとも１つの目的の分子複合体に依存する。前記適切な条件は、本明細書において開示され特許請求される、例示的な分子複合体及び適切な送達ベクター及び送達技術と組み合わせて、前記方法に適した条件を定義する本開示に照らして当業者によって定義されてよい。
【０１６７】
本発明の前記方法による一実施形態において、少なくとも１つの細胞は、植物細胞、好ましくは、オオムギ、ホルデウム・ブルブソム、モロコシ、サトウキビ、トウモロコシ、アワ、オリザ・ミヌタ、イネ、オリザ・オーストラリエンシス、オリザ・アルタ、コムギ、マカロニコムギ、ライムギ、ライコムギ、リンゴ、ミナトカモジグサ、ハマムギクサ、タルホコムギ、ゴウシュウヤブジラミ、サトウダイコン、ダウクス・プシルス、ダウクス・ムリカツス、ノラニンジン、ユーカリプタス・グランディス、ニコチアナ・シルベストリス、ニコチアナ・トメントシフォルミス、タバコ、ベンサミアナタバコ、トマト、ジャガイモ、ロブスタコーヒーノキ、ブドウ、エリスランテ・グタタ、ゲンセリア・アウレア、キュウリ、マルバグワ、アラビドプシス・アレノサ、アラビドプシス・リラタ、アラビドプシス・サリアナ、クルシヒマラヤ・ヒマライカ、クルシヒマラヤ・ワリチイ、タネツケバナ、マメグンバイナズナ、ナズナ、オルマラビドプシス・プミラ、ヤマハタザオ、セイヨウアブラナ、ブラシカ・オレラセア、ブラシカ・ラパ、ダイコン、ブラシカ・ユンカセア、ブラシカ・ニグ、ルッコラ、オレンジ、ナンヨウアブラギリ、ブラックコットンウッド、タルウマゴヤシ、シセル・ヤマシタ、シセル・ビユグム、ヒヨコマメ、シセル・レチクラツム、シセル・ユダイクム、カヤヌス・カヤニフォリウス、ビロードヒメクズ、インゲンマメ、ダイズ、ワタ属種、ゲンゲ、ミヤコグサ、ハナウリクサ、タマネギ、ネギ、ニンニク、ヒマワリ、キクイモ、及びニラからなる群から選択される植物、又は前記植物の１つに属する任意の多様体もしくは亜種からの植物細胞である。
【０１６８】
標的としての植物細胞に関して、例えば、種々の形質転換法及び／又はトランフェクション法が、当業者に利用可能である。トウモロコシのプロトプラストについて、例えば、適切な方法が、Sheen、J. 2002. A transient expression assay using maize mesophyll protoplastsにおいて開示されている。アラビドプシス属のプロトプラストについて、適したプロトコルは、http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2007.199から入手できる。タバコ及び他の双子葉植物のプロトプラストについて、適したプロトコルは、www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1 104/pp.1 12.205179から入手できる。したがって、本開示の知識を有し、引用されたプロトコルを知っている当業者は、本発明による分子複合体を単子葉植物又は双子葉植物に由来する植物プロトプラストに導入するために適した方法を定義することができる。
【０１６９】
プロトプラストは、遺伝子編集の技術及び試薬を試験するために非常に有用であるが、遺伝子編集した植物の再生のためにそれらは常に好ましい細胞型であるとは限らず、プロトプラストから効率的に再生する植物種は非常に少ない。この場合に、ほとんどの植物種のための好ましい組織は、未熟胚、胚形成カルス、受精した胚、無傷植物の分裂組織、花粉、花粉管もしくは卵細胞、胚形成懸濁細胞、又は再生能を有する他の細胞型である。一般的な物理的送達方法は、ＤＮＡ又はタンパク質で被覆された金又はタングステン粒子での細胞の微粒子銃であり、一方で一般的な生物学的会合方法は、本明細書において開示されたアグロバクテリウム属又は（改変した）ウイルスベクターを使用する。
【０１７０】
本開示に従って言及される「分裂組織細胞」は、分裂組織又は形成層又は形成組織とも言われる植物内の組織タイプに属する。動物生物の幹細胞と同様に、未分化細胞を代表する植物の分裂組織細胞は、遺伝的素因並びにさらなる環境的及び発生的要因に依存して、特殊化した細胞型に発達及び分化する固有の能力を有する。植物生物において、分裂組織は、胚発生の間に存在するだけでなく、植物の全生活環の間にも見出すことができ、その結果、本開示による分裂組織細胞又は分裂組織の標的化された遺伝子改変は、植物の胚又は実生に限定されないが、むしろ、例えば、生殖性植物器官、例えばトウモロコシの房又は穂の基礎を築く分裂組織を標的とする場合に、より大きな実生及びより成熟した植物においても実施することができる。
【０１７１】
本開示による種々の態様による一実施形態に従って、分裂組織細胞は、少なくとも１つの分裂組織細胞又は分裂組織を含む植物胚の成熟もしくは未熟植物細胞又は植物の実生であってよい。
【０１７２】
ある特定のゲノム編集アプローチのために、目的の所望の構築物又はその一部を有するトランスジェニック生物が、最初に形質転換又はトランスフェクトされた目的の植物細胞の子孫に安定して挿入された構築物を受け継ぐことができる場合に、分子複合体をコードする発現カセットの安定な組み込みが望ましい。前記安定な組込みは、核ゲノムと色素体のゲノムを含む核外ゲノムとを含む生物、好ましくは真核生物の任意のゲノム領域に起きてよい。
【０１７３】
一過性の導入は、目的の分子複合体又はその一部の導入によって特定の効果が望まれる場合に望ましいかもしれないが、構築物自体は、最初に細胞の子孫に受け継がれるべきではない。規制上の理由から、かかるアプローチは、特に植物細胞、組織、器官又は改変されるべきＤＮＡ標的配列を含む構造物としての材料を用いた特定の用途に特に適していてよい。
【０１７４】
本明細書において使用される「標的組込み」又は「機能的組込み」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む他の核酸分子への核酸分子の結合、又は少なくとも１つの細胞内の標的構造へのタンパク質の結合を含む、転写及び／又は翻訳及び／又は触媒活性及び／又は結合活性を可能にする、少なくとも１つの細胞への目的の遺伝子構築物の組込みを示す。適切な場合、機能的組込みは、核、サイトゾル、ミトコンドリア、葉緑体、液胞、膜、細胞壁等を含む、少なくとも１つの細胞の特定の細胞区画内で起こる。したがって、「機能的組込み」という用語は、前述した「安定した組込み」という用語とは対照的に、目的の分子複合体は、アグロバクテリウム属による形質転換を含む生物学的方法又は微粒子銃を含む物理的方法に及び続く工程よる形質転換、トランフェクション又は形質導入によって少なくとも１つの細胞に導入され、該分子複合体が導入された少なくとも１つの細胞内で又は細胞上にその効果を発揮することを意味する。導入されるべき遺伝子構築物の性質に依存して、前記効果は当然変化してよく、そして単独で又は組み合わせて、とりわけリボ核酸への遺伝子構築物によってコードされるＤＮＡの転写、アミノ酸配列へのＲＮＡの翻訳、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、又はＲＮＡ干渉に使用するためのｓｉＲＮＡの活性を含む細胞内のＲＮＡ分子の活性、及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡを含む他の核酸分子への核酸分子の結合、又は少なくとも１つの細胞内の標的構造へのタンパク質の結合、又は一過的に又は安定した方法でベクターもしくは遺伝子構築物を介して送達される配列の組み込みを含む結合活性を含む。前記効果は、少なくとも１つの細胞等内で酵素又はその触媒活性部分を示すアミノ酸配列の触媒活性も含んでもよい。本開示による分子複合体の機能的組込み後に得られる前記効果は、当業者に公知であるように、目的の遺伝子構築物に含まれる制御配列又は局在化配列の存在に依存してよい。
【０１７５】
前述したように、多能性又は多分化能性の細胞を標的とする本発明による方法は、形質転換及び形質転換された少なくとも１つの細胞、特に分裂組織細胞のさらなる発達の双方は、植物又はそれからの植物材料の再生のための面倒なインビトロ培養工程の必要性を排除できるという利点をもたらす。しかしながら、特定の実施形態において、特定の必要性に応じて、さらなる培養、スクリーニング又は試験のために植物細胞、組織、器官又は材料を外植又は解剖することが適切であってよい。植物細胞、組織、器官又は材料のインビトロでの培養のためのいくつかの方法が当業者に利用可能である。
【０１７６】
したがって、目的の所望の構築物又はその一部を保有するトランスジェニック植物が安定して挿入され、かつ挿入された構築物又はその一部が最初に形質転換された目的の植物細胞の子孫に遺伝する場合に、安定な組込みが望ましい。前記安定な組込みは、核ゲノムと植物細胞の色素体のゲノムを含む核外ゲノムとを含む植物の任意のゲノム領域に起きてよい。
【０１７７】
一過性の導入は、目的遺伝子構築物又はその一部の導入によってある特定の効果、例えばサイレンシング効果、ノックイン又はノックアウトを含む標的操作が望まれる場合に望ましいかもしれないが、構築物自体は、最初に形質転換、トランスフェクト又は形質導入された細胞の子孫に受け継がれるべきではない。
【０１７８】
本発明による前記態様のさらに他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列及び／又はＲＴを含む少なくとも１つの目的の分子複合体又はその一部の導入は、ハンドヘルド遺伝子銃（例えば、Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）又は固定遺伝子銃を含む遺伝子銃を含む微粒子銃、アグロバクテリウム属種を使用した又はウイルスベクターを使用した形質転換を含む形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、炭化ケイ素ウイスカー技術並びに化学種、例えばリン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム又はカチオン性ポリマー及び非化学種の使用を含むウイスカー技術、例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、レーザーを使用する光学的トランフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、送達構築物を動物、好ましくは齧歯類動物の臓器、好ましくは肝臓に注入することによるＤＮＡの流体力学的遺伝子送達、又はそれらの組合せからなる群から選択される方法を使用して実施されうる。
【０１７９】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つの真核細胞は、分裂組織的植物細胞であってよく、該植物細胞は、本発明による分子複合体の導入後に、花序の成熟の発達段階が達成されるまで、植物細胞は適切な条件下でさらに培養されて、本発明による少なくとも１つの分子複合体によって媒介される目的の改変を含む植物又は植物材料を得る。例えば、インビトロで培養されたトウモロコシの房から発芽可能で生存可能な花粉を製造するためのいくつかのプロトコルが、例えばPareddy DRら(1992) Maturation of maize pollen インビトロ. Plant Cell Rep 1 1 (10):535- 539. doi:10.1007/BF00236273、Stapleton AEら(1992) Immature maize spikelets develop and produce pollen in culture. Plant Cell Rep 1 1 (5-6):248-252、又はPareddy DRら(1989) Production of normal, germinable and viable pollen from インビトロ-cultured maize tassels. Theor Appl Genet 77 (4):521 - 526において当業者に利用可能である。これらのプロトコルは、とりわけ、雄穂の成長及び成熟を促進するために、雄穂の切除、表面滅菌及びカイネチンを含む培地中での培養に基づく。小穂が形成された後に、葯の継続的な収穫を行うことができる。放出後、葯は花粉が出るまで乾燥される。代わりに、葯を解剖し、花粉を液体媒体中に流し込み、続いてそれを使用して穂を受粉させてよい。
【０１８０】
本明細書において使用される「花序の成熟」とは、少なくとも１つの分裂組織細胞を含む植物の未成熟の花序が発生段階に達し、成熟花序、すなわち雄花序（雄）又は雌花序（雌）が得られ、したがって花粉（雄）又は胚珠（雌）又はその双方の配偶子が存在する場合示す。植物の生殖相の前記段階は、得られた植物材料が、さらなる植物の受粉のため又は他の植物の花粉による受精のために直接使用することができため、特に重要である。
【０１８１】
本発明による前記方法によるさらなる実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変は、収量改善、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、酸化ストレス、重金属ストレス、塩ストレスもしくは浸水を含む非生物的ストレスに対する耐性、昆虫に対する耐性、細菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、真菌に対する耐性もしくは線虫に対する耐性を含む生物的ストレスに対する耐性、グリホサート、グルホシネート、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤及びジカンバを含む除草剤に対する耐性、倒伏抵抗性、開花期、脱粒抵抗性、種子の色、胚乳組成、栄養含有量、又は少なくとも１つの植物細胞における分子薬学アプローチを可能にするゲノム編集を含む代謝工学からなる群から選択されるゲノム編集アプローチであってよい。
【０１８２】
本発明の前記方法による他の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列の改変は、少なくとも１つの真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、好ましくは哺乳動物白血球中の免疫細胞をウイルス性疾患の治療もしくは免疫療法、特に癌免疫療法に適した改変細胞を得るためにエキソビボで改変するためのゲノム編集アプローチであってよい。
【０１８３】
好ましい一実施形態において、本発明による前記方法は、真核細胞、好ましくは少なくとも１つの植物細胞を標的化した方法で改変して、遺伝子改変した植物、好ましくはトランスジェニックでない植物を提供する方法であり、その際、該方法は、とりわけ形質発生のための方法であってよい。例えば、植物遺伝子のコード配列中の１つ、２つ、３つ又はそれ以上のヌクレオチドの高度な部位特異的な置換を導入して、少なくとも１つの除草剤、例えばグリホサート、グルホシネート、ジカンバ又はアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害除草剤に対する耐性を付与する１つ以上のアミノ酸の置換を生じてよい。さらに、他の実施形態において、ヌクレオチド結合部位−ロイシンリッチリピート（ＮＢＳ−ＬＲＲ）植物遺伝子のコード配列における１つ以上のアミノ酸の置換は、植物の病害抵抗性を最適化するためにタンパク質の病原体認識スペクトルを変化させるだろう。さらにさらなる実施形態において、小さなエンハンサー配列又は転写因子結合部位は、植物遺伝子の内因性プロモーター中で改変されるか、又は植物遺伝子のプロモーターに導入されて、プロモーターによって制御された植物遺伝子の発現プロファイル又は強度を変えてよい。発現プロファイルは、他の領域、例えばイントロン、３’非翻訳領域、シス−又はトランス−エンハンサー配列における種々の改変、導入又は欠失によって変化させてよい。さらにさらなる実施形態において、植物細胞、好ましくは分裂組織的植物細胞のゲノムは、改変した分裂組織細胞から生じる植物が農学的又は薬学的に関心のある化学物質又は化合物、例えば、インスリンもしくはインスリン類似体、抗体、目的の酵素機能を有するタンパク質、又は医薬として、栄養補助食品として、もしくはヘルスケア製品として適切な他の任意の薬学的に関連のある化合物を産生することができる方法で改変されてよい。
【０１８４】
この方法によって導入することができる形質の制限のない例は、害虫、例えばルートワーム、テッポウムシ、ヨトウムシ、カブトムシ、アブラムシ、ヨコバイ、ゾウムシ、ダニ及びカメムシに対する抵抗性又は耐性である。これらは、例えば、害虫に対する植物の固有の抵抗性を増大させるため、又は該害虫に対するその誘引性を低下させるために、植物遺伝子の改変によって作製されてよい。他の形質は、線虫、細菌、真菌又はウイルス性の病原体又はそれらのベクターに対する抵抗性又は耐性であってよい。さらに他の形質は、より効率的な栄養使用、例えば高められた窒素使用、窒素固定における効率の改善又は導入、高められた光合成効率、例えばＣ３植物のＣ４への変換であってよい。さらに他の形質は、非生物的ストレス、例えば温度、給水、塩分、ｐＨに対する耐性、日光曝露における極値に対する耐性を高めてよい。追加の形質は、植物の食用部分又は摂食可能部分の味、外観、栄養素又はビタミンプロファイルに関連する特徴であってよく、又はこれらの部分の貯蔵寿命又は品質に関連してよい。最終的に、形質は、農学的品質、例えば倒伏、花振るい、開花時期、成熟、出芽、収穫、植物構造、生育量、サイズ、収量、及び他の特性に対する耐性に関連してよい。
【０１８５】
本発明による前記方法による一実施形態において、標的細胞は、原核細胞であってよく、改変は、少なくとも１つの原核細胞の目的のゲノム標的領域の少なくとも１つの改変を含み、ここで、該改変は、抗生物質に対する耐性を含む、生物的又は非生物的ストレスに対する細菌の耐性を調節又は増加させるために適しており、かつ該改変は、少なくとも１つの原核細胞のファージ耐性を改善するために適している。他の実施形態において、前記改変は、少なくとも１つの目的の原核細胞のＤＮＡ標的部位に目的の遺伝子を挿入すること、例えば蛍光マーカータンパク質又は他の選択マーカーをコードする配列を少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的部位に挿入することを含みうる。他の実施形態において、前記改変は、ノックアウト、すなわち少なくとも１つの原核細胞における少なくとも１つの目的のＤＮＡ標的部位の削除を含む。原核細胞はさらに分化することはないが、直接それらの子孫に目的の改変を導入することができ、かつ原核細胞は通常真核細胞と比較して非常に短い生成時間を有するため、本発明による少なくとも１つの分子複合体の形での少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡによって導入される改変を急速に得ることができ、そして得られた改編された細胞の集団を、非常に短時間で得て、分析することができる。
【０１８６】
ある特定の実施形態に対して、本発明による前記方法は、さらに、（ｖ）少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改質を含む、少なくとも１つの原核細胞又は真核細胞を同定及び／又は選択するステップを含む。
【０１８７】
少なくとも１つの原核生物又は真核生物細胞のゲノムにおいて実施される本開示による改変を分析又は同定するための方法は、当業者に公知であり、かつポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、とりわけリアルタイム定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、分析的ＰＣＲ等を含むポリメラーゼ連鎖反応、明視野及び暗視野顕微鏡を含む顕微鏡、分散染色、位相差、蛍光、共焦点、微分干渉コントラスト、逆重畳積分、電子顕微鏡、ＵＶ顕微鏡、ＩＲ顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、細胞の代謝産物の分析、改変した細胞の変更された抵抗スペクトルの分析、ＲＮＡ分析、プロテオーム分析、例えば目的のマーカー遺伝子もしくは導入遺伝子の機能的組込みを決定するための機能的アッセイ、又はノックアウト、サザンブロット解析、ディープシーケンシングを含むシーケンシング、並びにそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない。次いで、所望の改変を含む細胞は、さらなる培養又は任意の他の下流の操作工程について選択されてよい。
【０１８８】
本発明によるさらなる態様において、（ｉ）前記した真核細胞中で少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を改質する方法を実施するステップ、ここで少なくとも１つの真核細胞は植物細胞である、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの少なくとも１つの植物細胞から少なくとも１つの植物又はそれらの子孫を得るステップ、（ｉｉｉ）任意に、少なくとも１つの植物又はそれらの子孫の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つのＤＮＡ標的配列における改変を決定するステップを含む、植物又は植物細胞を製造するための方法が提供される。
【０１８９】
この態様を実施するために適した植物細胞、組織、器官及び材料は、上述されている。本開示による「製造」という用語は広く解釈されるべきであり、植物又は植物細胞の遺伝物質に対して実施される任意の形態の遺伝子操作を含む。少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列と少なくとも１つの修復鋳型核酸と少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドとを含む少なくとも１つのハイブリッド核酸配列を含む少なくとも１つの分子複合体の提供は、上述した異なる成分の一過性の作用又は安定な組込み、又はそれらの組合せを可能にする方法で実施されてよい。好ましくは、少なくとも１つの分子複合体、又はそれらの異なる成分は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードする配列、修復鋳型核酸ＤＮＡをコードする配列、及びＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする配列を含むこれらのエフェクター成分のいずれかを目的の標的細胞のゲノムへ組み込まない一過性の方法で提供される。
【０１９０】
本発明による前前記製造方法による一実施形態において、少なくとも１つの植物又は植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物から選択され、好ましくは、植物は、トウモロコシを含むゼア属種、ベンサミアナタバコ、又はサトウダイコンを含むベタ属種、又はライムギを含むセカレ属種、又はコムギを含むトリチカム属種からなる群から選択される。
【０１９１】
本開示を通して詳述されるように、本発明による方法は適切であり、機能的に会合されたハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ構築物を使用することの要点が種であるため、すべての生命界に属する標的細胞に適合されてよいが、但し、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ核酸配列と少なくとも１つのＲＴとの共有的又は非共有的な相互作用によって決定される細胞内でのＤＮＡ修復のための相同組換え機構が存在する。それぞれの標的細胞及びそれぞれの標的について個々に決定しなければならないものは、（ｉ）前述したように適合性でなければならないＣＲＩＳＰＲ核酸配列及びＣＲＩＳＰＲポリペプチド、（ｉｉ）目的のＣＲＩＳＰＲ核酸配列と目的のＤＮＡ標的領域内のＰＡＭ部位とのマッチング、並びに（ｉｉｉ）導入されるべきＤＮＡ標的配列及び標的改変である。公的に入手可能な任意の配列決定されたゲノムについて、したがって、適切な核酸配列の設計は、本発明の開示に基づいてインシリコでなされてよい。
【０１９２】
本発明によるさらに他の態様において、本発明の第一の態様による少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸配列の使用、又は原核細胞もしくは真核細胞におけるゲノム編集のための本発明の第二の態様による分子複合体の使用が提供される。この態様の一実施形態において、前記使用は、真核細胞、好ましくは真菌、動物又は植物細胞もしくは成分のための使用である。
【０１９３】
本発明による種々の態様及び実施形態に従って、真核細胞、又は真核細胞を改変するための方法もしくは使用は、明らかに、ヒトをクローニングする任意のプロセス、ヒトの生殖系の遺伝的同一性もしくはヒトの胚の使用を改変するためのプロセス、又はそれから細胞を得るためにヒトの胚の破壊を必要とする方法を含まない。
【０１９４】
次の非限定的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【０１９５】
実施例
次の非限定的な実施例に従って本発明をさらに説明する。
【０１９６】
実施例１：ＣＲＩＳＰＲポリペプチドとの組み合わせに適したハイブリッド核酸配列
一実施例において、テイラードｓｇＲＮＡ又は他の適したＣＲＩＳＰＲ核酸を、双方の相補的塩基対及び一本鎖対鋳型を有するＲＮＡ−ＤＮＡライゲーションによりハイブリダイズする。共有的な会合のために、合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ｓｓＲＮＡリガーゼの製造者のプロトコルを使用してＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に共有的に連結する。非共有的な会合のために、部分的に相補的な配列を有するＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドを混合し、ワトソン−クリック塩基対によって複合体にする。ハイブリダイゼーションの成功は、ゲルシフトアッセイで確認することができる。ゲルシフトアッセイ前のＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅでのハイブリッド核酸のアリコートの処理は、いくつかのハイブリッド核酸がＲＮＡ及びいくつかのＤＮＡから構成されていたことを示す。そして、核酸ハイブリッドを、組換えＣＲＩＳＰＲポリペプチド、例えばＣｐｆ１、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ又はＣａｓＹタンパク質で複合体化する。複合体化の成功を、プロテイナーゼＫ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅでの処理及びモック処理によって検証し、そして関連するゲルシフトパターンを観察できる。組換えＣＲＩＳＰＲポリペプチドを製造し、続いて外部の商業的実体を通して又は内部の能力により精製した。試験したハイブリッド核酸配列の異なる構成を、図１ａ及び図１ｂ及び図２において示す。
【０１９７】
実施例２：ＣＲＩＳＰＲタンパク質とハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸との複合体によるＤＮＡ標的のインビトロでの切断
一実施例において、部位特異性エンドヌクレアーゼとしてのＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えばＣｐｆ１、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ又はＣａｓＹタンパク質の機能性を、使用した場合に、記載した核酸ハイブリッド技術で試験した。ｓｇＲＮＡ又は他の適したＣＲＩＳＰＲ核酸のための少なくとも１つの標的部位を含む線状にしたプラスミドを、本発明において記載したＣＲＩＳＰＲタンパク質−ＣＲＩＳＰＲ核酸−ＲＴ複合体（例えばＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＲＴ複合体）と混合した。種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びそれらの多様体について当業者に公知である正しいＲＴ、温度及びコファクター等を含むヌクレアーゼ活性に適した条件下でインキュベートした後に、ＤＮＡ標的プラスミドを、アガロースゲル上で操作し、そして予期した標的部位を切断したことを示すバンドサイズについて観察した。標的ＤＮＡのインビトロでの切断は、「カーゴ」としてｓｇＲＮＡが、部位特異的エンドヌクレアーゼとしての複合体の通常の機能を妨げなかったことを示した。
【０１９８】
実施例３：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質によるインビボでの編集
ＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えばＣｐｆ１、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ又はＣａｓＹタンパク質、及びハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸を含む提供された複合体によって標的遺伝子をインビボで編集できたことを証明するために、形質転換したプラスミド内で含まれる非機能的ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子を、シグナルヌクレオチドを変更することにより修復してｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子からの蛍光シグナルを復活した。標的鎖又は標的でない鎖に対する相補性を有するｓｓＤＮＡ修復鋳型の提供によって編集するために最適な使用を決定するために、双方の鎖の修復鋳型を有する複合体を比較した。
【０１９９】
実施例１において得られたハイブリッド核酸ＲＮＡ／ＤＮＡ−ＣＲＩＳＰＲポリペプチド複合体を使用して、コドン位置５１で早期に終止シグナルを生じるＡからＴへのシグナル点変異を有するｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子をコードするエピソームプラスミド標的を修復した。このプラスミドを、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを媒介する送達によってＣＲＩＳＰＲタンパク質及びハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸を含む編集複合体と一緒にトウモロコシのプロトプラストに導入した。そして、一本鎖修復鋳型を、ＣＲＩＳＰＲ核酸、例えばｓｇＲＮＡに、相補塩基対を介して連結する。修復鋳型は、切断部位の〜８０塩基対下流及び〜４０塩基対上流の領域に対して相補性がある。編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって早期に評価できる。
【０２００】
実施例４：相補的塩基対による共有的な付着又は会合によってＲＮＡに付着したＲＴと複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質によるインビボでの編集
種々の方法で製造したハイブリッド核酸分子での編集を証明するために、実施例３において同定した最適条件を使用して、ｓｇＲＮＡへの修復鋳型のハイブリッド核酸共有結合又は非共有塩基対合による同一のエピソームプラスミド標的の修復を評価した。
【０２０１】
マーカー、特に蛍光マーカーを使用した場合に、編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおける蛍光コード遺伝子、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２０２】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ核酸（ｇＲＮＡ）の５’末端又は３’末端にＲＴを連結することにより形成された核酸ハイブリッドと複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質によるインビボでの編集
一実施例において、実施例３において記載した方法を使用して、ｓｇＲＮＡ又は他の適したＣＲＩＳＰＲ核酸の５’末端又は３’末端にハイブリダイズ又は連結した修復鋳型についての性能を同定することができる。実施例４において決定された共有的な好ましい連結をここで使用してよい。Tsaiら（"Dimeric CRISPR RNA-guided Fokl nucleases for highly specific genome editing", Nature Biotechnology, 32, 569-576 (2014), doi:10.1038/nbt.2908）、及びさらに、Shechnerら（"Multiplexable, locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-Display", Nature Methods, 12(7), 664-670 (2015), doi: 10.1038/nmeth.3433）において示される結果に基づいて、３’融合が好ましいと予想される。
【０２０３】
編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって蛍光表現型、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２０４】
実施例６：ハイブリッド核酸と複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質によるインビボ編集のためのＣＲＩＳＰＲ核酸と修復鋳型との間の最適なリンカー長の決定
一実施例において、ｇＲＮＡと修復鋳型との間で５００塩基対の長さまで５０塩基対ずつ増加するリンカー長を使用して、実施例３にいて記載される標的を修復するための相同組換えのための最適な条件を同定した。リンカー長のセットを使用することは、タンパク質標的鎖の幾何学的形態を克服するためにハイブリッド内で要求される必須の柔軟性を決定するのに役立つ。これは、分子複合体の相互作用を調整し、かつＲＴの存在下でもＣＲＩＳＰＲ複合体がその効果を発揮できることを保証するために、異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びしたがって特定のｇＲＮＡ及び個々の修復鋳型（ＲＴ）で操作する場合に特に必要である。実施例３の条件を、実施例３〜５で決定した最適なパラメータと共に使用した。リンカーは、標的遺伝子の近くの配列に対して相補性を有するＤＮＡであった。
【０２０５】
編集の成功は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカーを使用した場合に、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらすだろう。したがって、異なるリンカー長で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。同様に、目的の細胞型、抗生マーカー、タグ配列、制御配列等のために適した任意の蛍光マーカーを含む任意の他の選択可能な目的のマーカーを使用できる。
【０２０６】
実施例７：ハイブリッド核酸と複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質によるインビボ編集のための修復鋳型の最適な配置の決定
一本鎖又は二本鎖の修復鋳型での編集を証明するために、実施例３において記載したインビボアッセイを、２つの配置の相対的な比較のために使用した。一本鎖修復鋳型は、より低い分子量に基づいて良好であると予想され、短いｄｓＤＮＡオリゴよりも短いｓｓＤＮＡオリゴを使用した編集の高い割合が公表されている。しかしながら、二本鎖の修復鋳型を使用することは、大きい配列が編集又は挿入される必要がある場合に必須であってよい。実施例４及び６の最適条件をこの実施例において使用できる。
【０２０７】
成功した編集事象は、それらに含まれる少なくとも１つのプラスミドにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によって蛍光表現型、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。したがって、異なる修復鋳型で編集の関連する効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２０８】
実施例８：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質による標的の染色体のインビボでの編集
一実施例において、実施例３〜７によって最適化された方法を使用して、染色体標的遺伝子を編集した。ここで、早期の終止コドンｔｄＴｏｍａｔｏカセットの安定した挿入を有するトランスジェニックのトウモロコシ植物を使用して、標的の染色体のための本発明の有用性を証明した。編集の成功は、ゲノムＤＮＡにおいて組み込まれたｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の修復によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらした。編集の効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２０９】
実施例９：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質による標的の染色体への遺伝子カセットのインビボでの挿入
標的の染色体への完全長遺伝子の挿入のための本発明の有用性を証明するために、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光受容体遺伝子及びターミネーターをトウモロコシのｈｍｇ１３遺伝子に組込み、ｈｍｇ１３の内因性プロモーターによって駆動する発現によってｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光シグナルをもたらした。その結果は、長い挿入物が、本発明の方法を使用して製造でき、かつ前記挿入のための条件を最適化するのに役立つことを証明できた。
【０２１０】
編集の成功は、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光表現型を示すいくつかの細胞をもたらす。この表現型は、標的のｈｍｇ１３へのｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の挿入、続くｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の発現によって生じる。したがって、試験したそれぞれの細胞型についての対応する編集の効率は、それぞれの処理からもたらされる豊富な蛍光細胞を測定することによって評価できる。
【０２１１】
実施例１０：ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化したＣａｓ９タンパク質を植物細胞に送達するための細胞透過性ペプチドの使用
実施例８又は９において同定された最適系をこの実施例において使用して、ＰＥＧに基づく形質転換と細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）での形質転換の有効性を試験した。以前の刊行物及び出願は、送達のためのＣＰＰの使用が、細胞壁を有する細胞へのハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ核酸と複合体化されたＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質の導入を可能にすることを示唆している。したがって、ＣＰＰを、ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質内で使用し、又はＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端のシステインとＣＰＰ上のＮ末端のシステインとの間で形成されたジスルフィド結合によってＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結した。遊離ＣＰＰは、核酸鎖上での一過性の結合を介したＣＲＩＳＰＲ核酸複合体の移入を助けるためにも使用できる。初期のＣＰＰは、ＨＩＶ ＴＡＴペプチド（例えば配列番号１７及び１８を参照されたい）、又はそれらに由来する配列及び／又は（Ａｒｇ）9配列を含みうる。その有効性を、プロトプラスト系における成功したｔｄＴｏｍａｔｏ発現による実施例３〜９の最適な方法を使用して試験できる。
【０２１２】
実施例１２：さらなるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
前述したように、本発明によるハイブリッド核酸配列は、異なるＣＲＩＳＰＲ系の種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに適している。任意のエフェクターヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ又はＣａｓＹについて、ｇＲＮＡ及びＲＴの最適な条件及び長さは、前記実施例１〜１１において詳述したように評価され、それぞれの目的の細胞型のための目的のゲノム編集事象のための最適な結果を得るであろう。さらに、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼでの最初の実験を、１つ以上のｇＲＮＡ、及びｇＲＮＡの少なくとも１つと会合した１つ又は２つの個々のＲＴを使用して、前述した方法と同一の方法を実施した。最初の結果は、これが、真核細胞における精密なゲノム編集のための有望なアプローチであると思われることを証明している。
【０２１３】
実施例１３：動物細胞の構築物
本発明の方法を、相同組換えすることができる条件で真核細胞において使用することができる。マウスＴ細胞又はＴ細胞前駆体を、インビトロで改変して、癌免疫療法に適しているようにそれらを調節することができる。本発明によるハイブリッド核酸構築物は、動物系に対して特異的に最適化（コドン最適化）及び設計（ＰＡＭ、標的部位）された場合に、目的の真核動物細胞型における高精度のゲノム編集に使用できることを実証することができた。したがって、本発明において記載される方法を使用してＴ細胞の増殖又は機能を制御する発現遺伝子の改変は、特に哺乳動物における治療に使用することができ、より具体的には本発明による構築物で目的の細胞型を改変することによって対象における疾患又は障害を治療することができる。
【０２１４】
実施例１４：露出した未成熟な雄穂組織の形質転換／トランフェクション
前述したように、植物又は植物の標的構造に遺伝物質を導入するための、植物細胞、組織、器官又は植物全体又はその一部を形質転換するための種々の物理的／機械的並びに生物学的手段が記載されている。前記方法は、同様に、本発明による、少なくとも１つのハイブリッドＲＮＡ／ＤＭＡ核酸配列及び／又は少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び／又は少なくとも１つの修復鋳型、及び／又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲポリペプチドを導入するために適している。分裂組織細胞、例えば雄のトウモロコシ植物からの雄穂組織を露出させ、そして得た後に、この組織を形質転換するために以下の方法を適用することができる。
【０２１５】
生物学的手段に関して、植物組織又はその細胞を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を媒介した形質転換を含むアグロバクテリウム属で形質転換することができる。この種類の形質転換は、当業者に公知である（Jones, H.D.ら、"Review of methodologies and a protocol for the Agrobacterium-medialed transformation of wheat", plant methods, 2005；又はFrame, B.R.ら、"Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system", Plant, 2002を参照されたい）。このために、目的の構築物を含むアグロバクテリウム属の培養物を、例えば、適した抗生物質、１０ｍＭ  ＭＥＳ及び２００ｍＭ  ＡＣＥを含むＬＢ培地中で２８℃で終夜培養した。翌日、終夜培養物を１５分間４４０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。そしてそのペレットを、再度１５分間４４００ｒｐｍで２分間遠心分離し、そして残りの上清を捨てた。そのペレットを再懸濁した（５ｍｌ  Ｈ2Ｏ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2＋２０μΜ  ＡＣＥ）。６００ｎｍでの光学密度を１．５に調整する。そしておそらく希釈した懸濁液をさらに使用できる。
【０２１６】
生物学的手段によって植物の分裂組織細胞又は組織を形質転換するための他の可能性は、ウイルスベクターの使用である。ウイルスベクターは、ＤＮＡとして又はＲＮＡとして及び目的の植物標的構造に導入することができる利点を有する。さらに、ウイルスベクター又は植物ウイルスは、異なる細胞及び組織に伝播する能力を有する。
【０２１７】
本発明の目的のために、ウイルス粒子、ウイルスのインビトロ転写、又はウイルスを保有するアグロバクテリアをコードするＴ−ＤＮＡを、濾過（真空及び非真空）により目的の植物標的構造に導入することができる。代わりに、植物液を使用して実験を実施できる。この目的のために、タバコ又はホウレンソウを目的のウイルスに感染させ、続いて目的の前記ウイルスを植物液から単離して種々の植物からの他の植物標的構造、特に分裂組織細胞又は組織をウイルスを含有する植物液で感染させることができる。
【０２１８】
目的の雄穂構造を形質転換する生物学的手段にもかかわらず、粒微子銃に加えて、形質転換のためのさらなる物理的／機械的手段を使用することができる。
【０２１９】
適した１つの方法はマイクロインジェクションである。好ましくはマイクロマニピュレーターを使用して試験される任意の種類の分裂組織構造のために、マイクロインジェクションを使用できる。特定の分裂組織構造、例えば雄穂又は雌穂分裂組織のサイズによって、マイクロインジェクションを、顕微鏡の制御下で、又は標的構造が十分に大きい場合には顕微鏡の補助なしで実施することができる。溶液中で二本鎖プラズマＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質、並びにウイルス粒子を含む目的の植物標的構造に導入されるべき種々の異なる標的分子のための種々の方法を使用して、注入を実施できる。これらの異なる分子を、目的の分裂組織細胞又は構造に標的分子を注入することを補助するマイクロニードル又はナノニードルの助けを借りて適用することができる。標的分子を、最初に針上に被覆し、そして目的の分裂組織細胞又は構造に挿入する。
【０２２０】
他の適した方法は、微粒子銃、例えば粒子送達系を使用した微粒子銃であり、この方法はさらに前記で開示されている。
【０２２１】
この技術のさらなる発達は、炭化ケイ素（ＳｉＣ）ウイスカー（例えばSilar（登録商標）Silicon Carbide Whisker）とマイクロインジェクションの組合せの使用である。この目的のために、本発明による二本鎖（場合によりプラスミド）ＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、もしくは分子リボヌクレオ複合体、又はウイルス粒子を、炭化ケイ素ウイスカー上に沈殿させて、目的の分裂組織構造又は細胞にマイクロインジェクションの針を介して注入する。この技術は、単一細胞をトランスフェクトできるだけでなく、ウイスカーの拡散により並行して異なる細胞を貫通することができるという利点を有する。さらに、針を細胞内に侵入させる必要がなく、ウイスカーのサイズが非常に小さいため、細胞の破壊が少なくなる。
【０２２２】
実施例１５：改変を検出するための方法
本発明による少なくとも１つのＤＮＡ標的配列に導入されるような任意の一過性又は安定な改変を、蛍光レポーターを使用する場合に、蛍光検出手段を使用して検出できる。雄穂組織、例えば葯及び乾燥花粉は強い自発蛍光を有するため、これらの細胞及び組織については他の手段を使用すべきある。したがって、検出を、さらなる分子方法、例えば濃縮ＰＣＲ、ＰＣＲ消化、濃縮ＰＣＲとＰＣＲ消化との組み合わせ、定量的ＰＣＲ、又はディープシーケンシングもしくは次世代シーケンシングを含むシーケンシング、又はＲＴ−ＰＣＲ、又はサザンブロットもしくはノーザンブロット分析によって、達成及び確認できる。タンパク質のレベルを、ウエスタンブロッティング等によって分析できる。表現型的に検出可能な形質を少なくとも１つの目的の細胞に導入した場合に、アッセイを実施して、前記形質、例えば抵抗性、蛍光性、形態的変異表現型、又は任意のさらなる形質が少なくとも１つの改変した細胞又はその子孫又はその誘導体に存在するかどうかを検出することも可能である。前記検出方法は当業者に公知である。
【０２２３】
異なる標的植物及びその細胞における安定な組込み事象を分析するための通常の設定は、以下のように実施されてよい：最初に、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、蛍光タンパク質、例えば赤色蛍光タンパク質をコードする異なる構築物で形質転換された例えば雄穂、葯又は花粉組織／細胞を含む異なる材料から抽出する。要するに、試料を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって分析することができる。前記試料から、いくつかの試料は、陽性の事象を示し、その後に選択されてよい、明らかな、すなわち非常に強い、（赤色の）蛍光シグナルを示すであろう。これらの試料から、後の結果が未消化ＤＮＡと関連していないことを排除するために逆転写酵素を含まない対照を含めて、ｃＤＮＡを作製する。転写測定のために使用されたポジティブＤＮＡシグナルを有する試料のうち、いくつかの試料は明らかな転写を示すことができ、他の試料は潜在的な転写を示すことができた（明らかに測定できたものの境界で）。
【０２２４】
実施例１６：適したハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸の調製
種々の異なるハイブリッド核酸をインビトロで調製し、そして図４に示したように試験した。最初に、目的のＣａｓ又はＣｐｆヌクレアーゼ及び目的のゲノム標的核酸に適したＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ核酸を設計した（図４において示した例において１００ｎｔ）。修復鋳型としてｓｓＤＮＡを、ＲＴとして設計し、標的ＨＤＲ修復を導入した（図４において示した例において１２７ｎｔ）。異なるＣＲＩＳＰＲ核酸及び目的のＲＴのＲＮＡ−ＤＮＡライゲーションのために、それぞれ、５’アデニル化ＲＴを使用した。この目的のために、５’ホスホリル化ｓｓＤＮＡ（又は任意に５’ホスホリル化を有するｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ）を購入又は合成してよく、まだホスホリル化されていない場合に、ｓｓＤＮＡをホスホリル化して、５’ホスホリル化ＲＴを提供してよい。１つの設定として、ＲＴ ＤＮＡストック（４ｎｍｏｌホスホリル化ウルトラマー）を調製して１００μＭストックを提供した。次に、前記ＲＴを、水を含まずに３０００ｎｇ／μｌのホスホリル化ＲＴストック２μｌ、１０×５’ＤＮＡアデニル化反応緩衝液（２μｌ）、１ｍＭ  ＡＴＰ（４μｌ）、Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ（４μｌ、１００ｐｍｏｌ）及びヌクレアーゼ８μｌを使用して分析した。その混合物を、１時間６５℃でインキュベートし、続いて酵素を不活化した（５分、８５℃）。そして、ＲＮＡ−ＤＮＡライゲーションを、アデニル化修復鋳型２２５０ｎｇ（アデニル化反応物の〜７．５μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤１μｌ、ＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ核酸７５０ｎｇ、５０％ＰＥＧ溶液（５μｌ、最終的に１０％）、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ反応緩衝液２．５μｌ、及びリガーゼ０．５μｌを使用して実施した。その混合物を、１時間２５℃でインキュベートし、続いて酵素を不活化した（２０分、６５℃）。最終的に、ＲｅｃＪＦ処理を実施した。ＲｅｃＪＦは、一本鎖ＤＮＡ特異的５’エキソヌクレアーゼであり、すなわちＲｅｃＪＦは任意のライゲートされていないＲＴ  ＤＮＡを分解する。ＲＮＡ−ＤＮＡライゲーション生成物  １５μｌ、ＮＥＢ緩衝液２  ２μｌ、ＲｅｃＪＦ  １．５μｌ及びヌクレアーゼ１．５μｌ（水は含まない）を、３０分間３７℃でインキュベートし、続いて酵素を不活性化した（２０分、６５℃）。反応の結果及びステップを、視覚化のためにゲル−赤色染色を使用して６％アクリルアミドＴＢＥ尿素ゲル上で分析した。
【０２２５】
図４から明らかであるように、ライゲーションから得られたサイズにおける明らかなシフトとは別に、ＲｅｃＪＦ処理からの保護は、得られたライゲーション生成物がＲｅｃＪＦによって分解されなかったため、ＲＴの５’末端がもはや利用できないことをさらに示す。したがって、最適な目的の任意のＣＲＩＳＰＲ核酸及びカスタムメイドの修復鋳型を、前記方法によって互いに共有的に付着させて、ゲノム操作のためのトランフェクションに適した安定な構築物を提供することができる。ＣＲＩＳＰＲ核酸とＲＴとの間の結合は、ＣＲＩＳＰＲ核酸及びＲＴを別々に提供するアプローチと比較して、構築物の高い安定性により最大効率を提供するための目的の細胞へのトランフェクション後の構築物の物理的利用可能性を保証する。
【０２２６】
そして、ハイブリッドＣＲＩＳＰＲ核酸／ＲＴ構築物を、インビトロ又はインビボのいずれかで目的のＣＲＩＳＰＲポリペプチドと会合させて、目的の遺伝子編集をもたらす安定に会合した核−タンパク質複合体を構築することができ、これは、選択したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって誘導されたゲノムＤＮＡ切断の部位でＣＲＩＳＰＲ核酸に融合したＲＴの提示によって直ちに修復することができる。
【０２２７】
ハイブリッド核酸内で互いに関連するＣＲＩＳＰＲ核酸及びＲＴの異なるトポロジーの効率を比較するために、目的のＲＴを設計及び合成し、目的の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのための種々のＣＲＩＳＰＲ核酸配列を、インシリコで設計し、そして合成した。得られたＲＴを任意に蛍光染色で５’末端で標識した。そして、ＲＴ及びＣＲＩＳＰＲ核酸を、互いに化学的に融合させるか、又はＲＴ及びＣＲＩＳＰＲ核酸配列内の相補的伸長に基づいて互いにハイブリダイズさせて、さらなる試験のために５’ＲＴ−ＣＲＩＳＰＲ核酸３’構築物を提供した。
【０２２８】
実施例１７：ハイブリッド核酸及び従来のＲＴ／ＣＲＩＳＰＲ核酸対のインビボでの遺伝子編集効率の比較
前述したようにハイブリッド核酸配列を使用して標的化ＤＮＡ切断及び修復を導入する効率、並びにＲＴ核酸とＣＲＩＳＰＲ核酸が別々に提供され互いに関連していない従来の設定に対する差異を比較するために、次の実施例を設定した。
【０２２９】
一実施例において、異なる立体配置におけるハイブリッド修復鋳型（ＲＴ）−ＣＲＩＳＰＲ核酸複合体（それぞれ５’−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ＲＴ−３’又は３’−ＲＴ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−３’）のＨＤＲ効率を、個別に送達した２つの成分のＨＤＲ効率と比較する。その複合体を、実施例１６において前述したように、アデニル化修復鋳型とＣＲＩＳＰＲ核酸とのライゲーションによって、又はＣＲＩＳＰＲ核酸と最適なＲＴとを互いに化学的に連結することによって形成する。目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、目的の標的ゲノム及び改変されるべき目的のゲノム標的部位に依存して、図１ａ及び図１ｂにおいて詳述されるハイブリッド核酸配列のための任意の構成を選択することができる。そしてＣＲＩＳＰＲ核酸とＲＴｔの複合体を精製する。次に、精製した複合体を、目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼで構築し、そして得られた分子複合体を、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション法によりプロトプラスト細胞集団にトランスフェクトする。代わりに、安定な（構成的又は誘導性）又は一過性の方法で、目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現する細胞集団を選択肢、そしてエキソビボで形成したハイブリッド核酸配列複合体を、例えばＰＥＧ法によってプロトプラスト細胞集団に形質転換する。平行して、同量のＣＲＩＳＰＲ核酸及びアデニル化修復鋳型を、ライゲーション工程なしに、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション法によりプロトプラスト細胞集団に送達する。再び、標的のプロトプラストに依存して、ＣＲＩＳＰＲ核酸及びアデニル化ＲＴを、エキソビボで目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと構築するか、又は個々にＣＲＩＳＰＲ核酸及びアデニル化ＲＴを、目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを安定して又は一過的に発現するプロトプラストにトランスフェクトする。
【０２３０】
４８時間後に、２つの細胞集団を採取し、それらのゲノムＤＮＡを抽出し、そして標的遺伝子座を、分子技術、例えば（濃縮）ＰＣＲ又はアンプリコンディープシーケンシングによって分析する。ＨＤＲ効率を相対値として比較する。目的の標的遺伝子が目的の細胞のゲノム内に含まれる欠損した蛍光をコードする遺伝子、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子（前記実施例３を参照されたい）であり、ハイブリッド核酸配列及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを形成して、それぞれの蛍光遺伝子の蛍光を回復する場合に、得られた細胞集団を、実施例３において前述したように、得られた細胞集団内の蛍光を測定することによって分析することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０２３１】
配列番号１は、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核定位配列／シグナル（ＮＬＳ）を開示する。
配列番号２は、核細胞質二分ＮＬＳを開示する。
配列番号３は、ｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳを開示する。
配列番号４は、さらなるｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳを開示する。
配列番号５は、ｈＲＮＰＡＩ  Ｍ９  ＮＬＳを開示する。
配列番号６は、インポーチン−アルファからのＩＢＢドメインを開示する。
配列番号７は、筋腫Ｔタンパク質に由来する配列を開示する。
配列番号８は、筋腫Ｔタンパク質に由来するさらなる配列を開示する。
配列番号９は、ヒトｐ５３に由来する配列を開示する。
配列番号１０は、マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶに由来する配列を開示する。
配列番号１１は、インフルエンザウイルスＮＳ１に由来する配列を開示する。
配列番号１２は、インフルエンザウイルスＮＳ１に由来するさらなる配列を開示する。
配列番号１３は、肺炎ウイルスデルタ抗原に由来する配列を開示する。
配列番号１４は、マウスＭｘ１タンパク質に由来する配列を開示する。
配列番号１５は、ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼに由来する配列を開示する。
配列番号１６は、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドに由来する配列を開示する。
配列番号１７は、ＨＩＶ  Ｔａｔに由来する配列を開示する。
配列番号１８は、ＨＩＶ  Ｔａｔに由来するさらなる配列を開示する。
【図１ａ】
2019517261.tif 000002
【図１ｂ】
2019517261.tif 000003
【図２】
2019517261.tif 000004
【図３】
2019517261.tif 000005
【図４】
2019517261.tif 000006
【配列表】
2019517261000001.app
【国際調査報告】
2019517261.tif 000007
2019517261.tif 000008