(57)【要約】  本発明は、ＰＰＣ又はＤＰＰＧ等、遷移温度が約４１度である第１脂質と、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ等、遷移温度が約５５度である第２脂質と、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等のＰＥＧ化ＤＳＰＥと、を含む脂質混合物と、生体適合性がある気体と、を備える。第１脂質は、脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％である、生理的に許容可能な脂質担体に気体が充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液に関する。
2019503403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）遷移温度が４１度である第１脂質と、遷移温度が５５度である第２脂質と、ＰＥＧ化ＤＳＰＥと、を含む脂質混合物と、
（ｂ）生体適合性がある気体と、を備え、
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、４０〜６３重量％の範囲で含まれる、生理的に許容可能な脂質担体に気体が充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液。
【請求項２】
前記第１脂質はＤＰＰＣ又はＤＰＰＧである、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し５０〜６３重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項４】
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し４０〜６０重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項５】
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し５０〜６０重量％の範囲で含まれる、請求項４に記載の懸濁液。
【請求項６】
前記第１脂質はＤＰＰＣである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項７】
前記第１脂質はＤＰＰＧである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項８】
前記第２脂質はＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項９】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００である、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１０】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、全体量に対し１０〜１５重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、全体量に対し１２．５重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１２】
さらに、前記懸濁液は１〜２０％のグリセロールを含有する、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１３】
さらに、前記懸濁液は５％のグリセロールを含有する、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１４】
前記気体はパーフルオロカーボン、ＳＦ６、ＡＲ及びＮ２の群から選択される、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１５】
前記パーフルオロカーボンは、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、又はＣ５Ｆ１２の群から選択される、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１６】
請求項１に係る気体が充填された、マイクロバブルを含有する懸濁液を保存するシールバイアル。
【請求項１７】
前記気体はパーフルオロカーボン、ＳＦ６、ＡＲ及びＮ２の群から選択される、請求項１６に記載のシールバイアル。
【請求項１８】
前記第１脂質はＤＰＰＣ又はＤＰＰＧである、請求項１６に記載のシールバイアル。
【請求項１９】
前記第２脂質はＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである、請求項１６に記載のシールバイアル。
【請求項２０】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００である、請求項１６に記載のシールバイアル。
【請求項２１】
さらに１〜２０％のグリセロールを含有する、請求項１６に記載のシールバイアル。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
従来の超音波エコーに超音波造影剤を使用することにより、コントラストが向上した超音波を入手することができる。商用的に入手できる造影剤は、静脈投与することによって体循環に送達する、気体が充填されたマイクロバブルである。現在、様々なマイクロバブル造影剤が入手可能である。マイクロバブルは、シェルの構造、気体コアの構造、ターゲットとなるか否かによって異なる。シェル又は気体コアの組成に関わらず、マイクロバブルのサイズはおおよそ均一である。マイクロバブルのサイズは、直径１〜５マイクロメーターである。このようなマイクロバブルをベースとした超音波造影剤は、血流でよく循環し、超音波画像において向上したエコーを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明の観点は、生理的に許容可能な脂質担体に気体で充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液に関する。懸濁液は、（ａ）遷移温度が約４１度である第１脂質と、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ等、遷移温度が約５５度である第２脂質と、ＰＥＧ化ＤＳＰＥと、を含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備える。この第１脂質は、脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％の範囲で含まれる。
【０００３】
本発明の観点はシールバイアルに関する。シールバイアルは、（ａ）遷移温度が約４１度である第１脂質と、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ等、遷移温度が約５５度である第２脂質と、ＰＥＧ化ＤＳＰＥと、を含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備え、前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％の範囲で含まれる。
【０００４】
本発明の観点は、気体が充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液又は懸濁液を保存するシールバイアルを用意する方法に関する。
【０００５】
＜参照による組み込み＞
本明細書で言及されるすべての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許、または、特許出願が、特異的にかつ個別に参照することによって組み込まれると意図されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の特徴および利点は、本発明の原則が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによってより良く理解されるであろう。
【図１Ａ】異なるＤＰＰＣ比で製造した、サンプル１ａ〜８ａのマイクロバブル濃度を表す。
【図１Ｂ】異なるＤＰＰＣ比で製造した、サンプル１ａ〜８ａのマイクロバブルの平均径を表す。
【図２Ａ】異なるＤＰＰＧ比で製造した、サンプル１ｂ〜８ｂのマイクロバブル濃度を表す。
【図２Ｂ】異なるＤＰＰＧ比で製造した、サンプル１ｂ〜８ｂのマイクロバブルの平均径を表す。
【図３】ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００の脂質混合物によって調製された、サンプル１ａ〜８ａで生成したマイクロバブル画像の強度の時間変化を示す。
【図４Ａ】ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の脂質混合物によって用意された、サンプル１ａ〜８ａの時間−蓄積強度曲線を示す。
【図４Ｂ】サンプル１ａの相対的蓄積強度値を１００％とした場合における、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の脂質混合物によって用意された、サンプル１ａ〜８ａの相対的蓄積強度の結果である。
【図５】ＤＰＰＧ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００の脂質混合物によって用意されたサンプル３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成した、マイクロバブル画像の強度の時間変化を示す。
【図６Ａ】ＤＰＰＧ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００脂質混合物によって用意されたサンプル１ｂから８ｂの時間−蓄積強度曲線を示す。
【図６Ｂ】サンプル１ｂの相対蓄積強度値を１００％とした場合における、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００の脂質混合物によって用意された、サンプル１ｂ〜８ｂの相対蓄積強度の結果を示す。
【図７Ａ】サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成されたマイクロバブルの濃度を示す。
【図７Ｂ】サンプル１ａ、３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄで生成されたマイクロバブルの濃度を示す。
【図８Ａ】サンプル３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成したマイクロバブルの時間−強度の変化を示す画像である。
【図８Ｂ】サンプル３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄで生成したマイクロバブルの時間−強度の変化を示す画像である。
【図８Ｃ】サンプル３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成された時間−蓄積強度曲線の結果を示す。
【図８Ｄ】サンプル３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄで生成された時間−蓄積強度曲線の結果を示す。
【図８Ｅ】サンプル１ａの相対蓄積強度値を１００％とした場合における、サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成された相対蓄積強度の結果を示す。
【図８Ｆ】サンプル１ａの相対蓄積強度値を１００％とした場合における、サンプル１ａ、３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄで生成された相対蓄積強度の結果を示す。
【図９Ａ】サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成したマイクロバブルの濃度を示す。
【図９Ｂ】サンプル３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃで生成したマイクロバブル画像の強度の時間変化を示す。
【図９Ｃ】サンプル３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅの時間−蓄積強度曲線を示す。
【図９Ｄ】サンプル１ａの相対蓄積強度値を１００％とした場合における、サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅの相対的蓄積強度を示す。
【図１０Ａ】サンプル１ａ、６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２及びＰＥＧ４０Ｓ_３におけるマイクロバブルの濃度を示す。
【図１０Ｂ】サンプル１ａ、６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２及びＰＥＧ４０Ｓ_３で生成したマイクロバブルの画像強度の時間変化を示す。
【図１０Ｃ】サンプル６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２及びＰＥＧ４０Ｓ_３におけるマイクロバブルの時間−蓄積強度曲線を示す。
【図１０Ｄ】サンプル１ａの相対蓄積強度値を１００％とした場合における、サンプル１ａ、６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２及びＰＥＧ４０Ｓ_３におけるマイクロバブルの時間−蓄積強度曲線を示す。
【図１１Ａ】サンプル１ａ、３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆにおけるマイクロバブルの濃度を示す。
【図１１Ｂ】サンプル３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆで生成したマイクロバブル画像の強度の時間変化を示す。
【図１１Ｃ】サンプル３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆにおけるマイクロバブルの時間−蓄積強度曲線の結果を示す。
【図１１Ｄ】サンプル１ａの相対蓄積強度値を１００％とした場合における、サンプル１ａ、３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆの相対蓄積強度の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
出願人は思いがけないことに、熱安定性及び長期間のin vivo安定性に優れており、超音波造影剤として長期の有効時間を気体できる、マイクロバブルを生成する方法を発見した。
【０００８】
従来技術より、画像化技術では比較的少ないマイクロバブル、例えば注入あたりの１０６〜１０８のマイクロバブル必要とされることが知られている。現在、購入可能なマイクロバブルは直径が大きく、血流において安定しないことから、目的の組織において短時間で十分な量を蓄積することが困難である。
【０００９】
本願発明では、生理的に許容可能な液体担体に含まれた、濃度が高くかつ安定性に優れた、気体で充填されたマイクロバブルの懸濁液を発見した。
【００１０】
特に本発明は、生理的に許容可能な脂質担体に気体が充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液に関する。懸濁液は（ａ）ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧ等、遷移温度が約４１度である第１脂質と、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ等、遷移温度が約５５度である第２脂質と、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等のＰＥＧ化ＤＳＰＥと、を含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備える。第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％である。一実施形態において、第１脂質はＤＰＰＣ又はＤＰＰＧである。一実施形態において、第１脂質は、脂質混合物の全体量に対し、５０〜６３重量％の範囲、４０〜６０重量％の範囲、４０〜５０重量％の範囲又は４０〜５０重量％の範囲で含まれる。一実施形態において、第１脂質はＤＰＰＣである。一実施形態において、第１脂質はＤＰＰＧである。一実施形態において、第２脂質はＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである。一実施形態において、第２脂質はＤＳＰＣである。一実施形態において、第２脂質はＤＳＰＧである。一実施形態において、ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００である。一実施形態において、ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００である。一実施形態において、ＰＥＧ化ＤＳＰＥは全体量に対して約１０〜１５重量％の範囲で含まれる。一実施形態において、ＰＥＧ化ＤＳＰＥは全体量に対して約１２．５重量％の範囲で含まれる。一実施形態において、懸濁液はシールバイアルに保存されている。一実施形態において、本発明は懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルを製造する方法に関する。一実施形態において、前記懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルは、１〜２０％のグリセロールが含まれる。一実施形態において、前記懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルは、５％のグリセロールが含まれる。一実施形態において、前記気体はパーフルオロカーボン、ＳＦ６、ＡＲ及びＮ２の群から選択される。一実施形態において、前記パーフルオロカーボンは、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、又はＣ5Ｆ12である。  一実施形態は、気体が充填されたマイクロバブルの懸濁液に関する。懸濁液は、遷移温度が摂氏約４１度の第１のリン脂質（ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧ）、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである第２のリン脂質、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等であるＰＥＧ化ＤＳＰＥを含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備え、前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％の範囲で含まれる。一実施形態において、懸濁液はシールバイアルに保存されている。一実施形態において、本発明は懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルを製造する方法に関する。
【００１１】
一実施形態は気体が充填されたマイクロバブルの懸濁液に関する。懸濁液は、（ａ）ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧである第１のリン脂質と、遷移温度が摂氏約５５度である第２のリン脂質（ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ等）と、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等であるＰＥＧ化ＤＳＰＥを含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備え、前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％で含まれる。一実施形態において、懸濁液はシールバイアルに保存されている。一実施形態において、本発明は懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルを製造する方法に関する。
【００１２】
一実施形態は気体が充填されたマイクロバブルの懸濁液に関する。懸濁液は（ａ）ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧを備える第１のリン脂質と、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである第２のリン脂質と、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等であるＰＥＧ化ＤＳＰＥを含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備える。第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％で含まれる。一実施形態において、懸濁液はシールバイアルに保存されている。一実施形態において、本発明は懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルを製造する方法に関する。
【００１３】
一実施形態は、気体が充填されたマイクロバブルの懸濁液に関する。懸濁液は（ａ）遷移温度が約４１度である、第１のリン脂質（ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧ等）と、ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである第２のリン脂質と、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００と置換可能である）を含む脂質混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備える。第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、約４０〜６３重量％の範囲で含まれる。一実施形態において、懸濁液はシールバイアルに保存されている。一実施形態において、本発明は懸濁液又は懸濁液が保存されたシールバイアルを製造する方法に関する。
【００１４】
一実施形態は、気体が充填されたマイクロバブル懸濁液に関し（ａ）ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧと、ＤＳＰＣ又はＤＰＰＧと、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００から選択された、ＰＥＧ化されたＤＳＰＥを備える液体混合物と、（ｂ）生体適合性がある気体と、を備える。ＤＰＰＣ又はＤＰＰＧの比は脂質混合物内において４０重量％〜６３重量％の範囲で含まれる。一実施形態は、懸濁液はシールバイアル内に保存されている。一実施形態は、前記懸濁液又はシールバイアルに保存される懸濁液の製造方法に関する。
【００１５】
一実施形態は、遷移温度（Ｔｍ）が摂氏４１度である第１脂質には、１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ-(1'−ｒａｃ−グリセロール)（ＤＰＰＧ）等が適しており、特に本開示の脂質混合物内において、４０重量％〜６３重量％で含まれる。一実施形態では、開示された脂質混合物において、５０重量％〜６３重量％の範囲、４０重量％〜６０重量％の範囲、または４０重量％〜５０重量％の範囲で含まれる。
【００１６】
本願発明においては、ＤＰＰＣは脂質混合物において４０重量％〜６３重量％の範囲で含まれることにより、安定性に優れた高濃度のマイクロバブルを供給することができる。一実施形態において、ＤＰＰＣは５０重量％〜６０重量％の範囲で含まれる。
【００１７】
同様に、ＤＰＰＣを荷電した脂質ＤＰＰＧに置き換えることにより、安定性が優れた高濃度のマイクロバブルを供給できる。一実施形態では、開示された脂質混合物において、ＤＰＰＧは４０重量％〜６３重量％の範囲で含まれる。一実施形態では、ＤＰＰＧは４０重量％〜６０重量％の範囲、４０重量％〜５０重量％の範囲、または５０重量％〜６０重量％の範囲で含まれる。
【００１８】
本発明の慣行において、想定以上の結果を与える安定性に優れた高濃度のマイクロバブル懸濁液には、脂質混合物として、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＩＵＰＡＣ名[(２Ｒ)-2−３−ジ(オクタデカノキシ)プロピル]２−(トリメチルアザニウミル)エチルホスフェート又は１,２−ジオクタデカノリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ-(１'−ｒａｃ−グリセロール)（ＤＳＰＧ）が使用される。ＤＳＰＣ及びＤＳＰＧの遷移温度（Ｔｍ）は摂氏５５度を持つことから、同様の性質及び遷移温度を持つ脂質は同一または同様の結果をもたらすことが期待できる。
【００１９】
これまで開示されてきた内容（例えばＵＳ２００９／０２６３３３０号公報を参照）とは異なり、ポリマー変性脂質の含有量（例えば開示された脂質混合物においてＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が１２．５ｗ／ｗで含まれる）は、マイクロバブルの量に悪影響を及ぼさないことが発見された。驚くべきことに、１０〜１５％ｗ／ｗのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００及び遷移温度が低い脂質の好ましい組成物（例えばＤＰＰＣ及びＤＰＰＧ）と遷移温度が高い脂質（例えばＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ）とを混合することにより、想定以上に安定したマイクロバブルを生成できる。
【００２０】
従前より、ポリマー変異、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合脂質が知られている。ここで開示されているＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合脂質を意味し、例えば、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)−２０００](ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００)、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)−３０００](ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００)、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)−５０００](ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００)等をいう。
【００２１】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００は、全てＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の機能と同様に反応するため、ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、場合によっては想定以上の結果が２つのＰＥＧ化脂質にも及ぶことがある。実施例４は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の代わりに使用された場合における、想定外の結果を示す。一実施形態では、脂質混合物における、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等のＰＥＧ化ＤＳＰＥの比は、約１０〜１５重量％の間である。一実施形態では、脂質混合物における、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等のＰＥＧ化ＤＳＰＥの比は、約１２．５重量％である。
【００２２】
マイクロバブルに適した気体は、例えば、気体、Ｏ2、Ｎ2、Ｈ2、ＣＯ2、Ｎ2Ｏ、ＳＦ6、希ガス、炭化水素ガス、パーフルオロカーボン、その他フッ素ガス、並びにはこれらの組み合わせが含まれる。
【００２３】
一実施形態において、シールバイアスに保存される懸濁液に使用される気体は、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ４Ｆ1２又はＳＦ６、Ａｒ又はＮ２等のパーフルオロカーボンガスの群から選択される。
【００２４】
一実施形態では、開示されているシールバイアル又は懸濁液は、さらに１〜２０％のグリセロールを含む。一実施形態では、シールバイアル又は懸濁液は、５％のグリセロールを含む。マイクロバブル生成の分野において知られている方法に従って、追加のグリセロールが使用される。
【００２５】
適した脂質担体は、水、典型的には無菌のパイロジェンフリー水（中間の親水性製品への汚染をなるべく防止するため）、食塩水（注入する最終製品が低張性ではないため有利にバランスできる）、塩又は砂糖、糖アルコール、グリコール又は他の非イオンポリオール物質（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール）など等張化剤を１つ以上含む水溶液が挙げられる。
【００２６】
一実施形態においては更に、グリセロールは、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルブミン、アミノ酸、糖アルコール、ブタン−１−３−ジオール、プロパン−１,２−３−トリオール、プロパン−１,２−ジオール、プロパン-1−３−ジオール、プロパン-1-オール、エタン−１,２−ジオール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホオキシド、またはこれらの組み合わせと置き換えられる。
【００２７】
他の賦形剤が使用される場合には、ラクトース、スターチ（例えばコーンスターチ）、変性コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、ウッドセルロース、結晶セルロース、これらの組み合わせなどが含まれる。
【００２８】
バインダーが使用される場合、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、これらの部分ケン化物などが含まれ、これらは単独または組み合わせて使用可能である。
【００２９】
崩壊薬が使用される場合は、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルボキシデンプンナトリウム、カルシウムカルメロース、デンプングリコール酸ナトリウム、コリドンＣＬ、コーンスターチ、部分α化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスポビドン（例えばクロスポビドンＸＬ−１０）、これらの組み合わせ等が含まれる。
【００３０】
潤滑剤が使用される場合、例えばマグネシウムステアレート、ステアリン酸、パルミチン酸、カルシウムステアレート、タルク、これらの組み合わせ等が含まれる。
【００３１】
本開示の化合式、組成物又は原料に関して使用される用語「許容可能な」とは、治療される検体の一般的な健康に長期間の悪影響を与えないものをいう。
【００３２】
本開示で使用される用語「担体」とは、化合物を細胞又は組織への浸透を促進する、比較的に毒性が低い化合物又は作用剤をいう。
【００３３】
用語「希釈液」は、送達前に化合物を希釈するために使用する化合物をいう。希釈液は安定した環境を与えるため、化合物を安定させるために使用することもできる。バッファ溶液（ｐＨ制御又は管理を与えることもできる）で溶解された塩は、希釈液として使用することができ、これにはホスフェートでバッファされた食塩水が含まれるが、これに限定されない。
【００３４】
用語「対象」又は「患者」は哺乳類を包含する。哺乳類の例は、これに限定されないが、全ての哺乳網、すなわちヒト、チンパンジー及び他のサル人類及びサルなどの猿人類、牛、馬、羊、山羊、豚などの家畜、ウサギ、犬、猫などの身近な動物、齧歯動物、マウス、ねずみ、ギニーピッグ、等が複じゃれた、実験用動物でもある。一実施形態において、哺乳類はヒトである。
【００３５】
一実施形態において、液体状の懸濁液には、１つまたは複数のポリマーが含まれる。ポリマーには、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース系水溶性ポリマー、又はクロスリンクされたカルボキシ含有ポリマー等の非水溶性ポリマーが含まれる。所定の医薬組成物には、例えばカルボキシメチルセルロース、カルボマー（アクリル酸重合体）、ポリ（メチルメチアクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリカルボフィルアクリリン酸／ブチルアクリレートコポリマー、アルギン酸ナトリウム及びデキストラン等から選択される、粘膜付着性のポリマーが含まれる。
【００３６】
これらの多様な実施形態又はオプションは、様々な、又は全ての組み合わせで使用できる。
以下の説明は、本発明を説明するものであり、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１．ＤＳＰＣを基礎とした脂質混合物によるマイクロバブルの生成＞
設計：気体が充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液に使用する脂質混合物の全体的な遷移温度（Ｔｍ）を低くするために、Ｔｍが摂氏約４１度の脂質（例えばＤＰＰＣ又はＤＰＰＧ等）と、Ｔｍが摂氏約５５度の脂質（例えばＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ等）とを一緒に使用した。
【００３８】
手順１：気体を充填する前における脂質混合物の準備
表１及び表２に示されるサンプル番号の組成物に従い、各バイアルに、第１脂質（例えばＤＰＰＣ又はＤＰＰＧ）、第２脂質（例えばＤＳＰＣ又はＤＳＰＧ）及びＰＥＧ化脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の脂質混合物を、クロロフォルム及びメタノールなどの適した有機溶媒に溶解する。有機溶媒が取り除かれた後、均一な脂質混合物のフィルムが形成される。生成された脂質混合物に対し、ＰＢＳ（例えば５％グリセロールＰＢＳ）等の食塩水を含むグリセロールを１〜２０％の範囲で添加する。必要であれば水溶性脂質混合物を加熱し、均一なリポソーム溶液を生成する。０．８ｍＬのリポソーム溶液を２ｍＬグラスバイアルに分配するバイアル毎の脂質混合物の濃度は、４ｍｇ／ｍＬで固定される。
【００３９】
手順２：気体の充填
手順１で準備したバイアルを、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ４Ｆ1２又はＳＦ６、Ａｒ又はＮ2等のパーフルオロカーボンガスを含有する密閉チャンバで密封する。代替として、バイアルを所望の気体で密封前にパージしても良い。気体が充填されたバイアルは室温または冷蔵室で保管され、使用時にバブルが発生する状態で置かれる。
【００４０】
手順３：使用前または試験前に、バイアルを撹拌機に配置し、マイクロバブル溶液が形成されるまで、リポソーム溶液を室温で攪拌する。
【表１】
2019503403.tif 000003
メモ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の重量比（％）は１２．５％で固定されており、モル比は各組成において３．６〜３．９％である。
【表２】
2019503403.tif 000004
メモ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の重量比（％）は１２．５％で固定されており、モル比は各組成において３．６〜３．９％である。
【００４１】
＜実施例２＞
実施例の調製方法によって調製されたマイクロバブルの測定
各バイアルで調製されたマイクロバブルをマルチサイザーで測定し、マイクロバブルの平均径及び濃度を特定した。
結果は、表３及び表４、図１及び図２で表す。
【表３】
2019503403.tif 000005
【表４】
2019503403.tif 000006
【００４２】
図１Ａ及び図１Ｂは、サンプル番号１ａ〜８ａに含まれるマイクロバブルの濃度及び平均径を表す。図２Ａ及び図２Ｂは、サンプル番号１ｂ〜８ｂに含まれるマイクロバブルの濃度及び平均径を表す。
【００４３】
形成されたマイクロバブルの濃度及び平均径に基づき、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝摂氏５５度）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００と共に、４０％〜６２．５％（ｗ／ｗ）のＤＰＰＣ（Ｔｍ＝摂氏４１度、電荷が中性の脂質）を含むサンプルは、よりよい結果を与えることが明確に示される。
【００４４】
形成されたマイクロバブルの濃度及び平均径に基づき、同様に、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝摂氏５５度）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００と共に、４０％〜６２．５％（ｗ／ｗ）のＤＰＰＧ（Ｔｍ＝摂氏４１度、荷電した脂質）を含むサンプルは、よりよい結果を与える。
【００４５】
データによって、遷移温度が低い（Ｔｍ＝摂氏４１度）第１脂質（荷電されている、又は荷電されていない）が４０％〜６２．５％（ｗ／ｗ）、ＤＳＰＣである第２脂質、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が１２．５％（ｗ／ｗ）である場合、マイクロバブルの平均径が小さいにも関わらず、高濃度のサンプルを供給する。
【００４６】
＜実施例３：調製したマイクロバブルの安定性評価＞
各バイアルで調製されたマイクロバブルは、人間に使用する際の温度である摂氏３７度以下での安定性について、試験を行った。食塩水でマイクロバブルを８０００倍に希釈し、摂氏３７度においてファントムで配置された。試験中、温度は管理された。各サンプルの強度を記録するために、臨床用の超音波診断装置である、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＸ−５０を使用し、超音波造形画像状態における、結果物のマイクロバブル溶液画像を撮影した。取得した画像を処理するためには、Ｍａｔｌａｂ社のソフトウェアを使用し、各ピクセルの色彩レベル及び任意の単位によってコントラスト強度を計算した。
【００４７】
図３は各サンプル１ａ〜８ａにおける、マイクロバブルの強度と時間変化の画像である。各サンプル（１ａ〜８ａ）の超音波画像のコントラスト強度を計算し、蓄積することにより、各サンプル間のエコー性能を比較した。
【００４８】
本発明は、超音波イメージングにおいて使用する頑丈な気泡を持つ造影剤を供給することを目的としている。これには２つの見地、すなわち、超音波イメージングにおけるコントラストの向上及び気泡の持続性（有効な気泡の半減期のイメージング）を考慮する必要がある。臨床試験においては、長期間のエコー向上性及び持続性が求められる。例えば、局所的な肝病変を診断するためには、１０分よりも長い半減期が推奨される。すなわち、本発明では蓄積方法を使用し、当初のコントラスト強度を使用せず、各形成における全体のエコー性能を表す。
【００４９】
まずは、各サンプルにおける各超音波画像のコントラスト強度を数値化し、時間とともに蓄積する。毎分のコントラスト強度が蓄積される。時間間隔は５０分で設定する。コントラスト向上性及び持続性が高い気泡は、最後の時点（すなわち５０分）において高い蓄積強度を持つ。
【００５０】
図４Ａは、試験の開始から５０分間に蓄積したコントラスト強度の数値に基づく（表５を参照）、時間−蓄積強度の曲線を示す。
【表５】
2019503403.tif 000007
【００５１】
図４Ｂは、サンプル１ａの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル１ａから８ａまでの相対的な蓄積強度の比較結果を示す。
【００５２】
図４Ｂの結果は、脂質混合物におけるＤＰＰＣの範囲が４０重量％〜６２．５重量％であるサンプル３ａ、４ａ、５ａ、６ａは、サンプル１ａ、２ａ、７ａ、８ａと比較して、著しい違いがあることを示す。
【００５３】
安定性試験の結果は、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝摂氏５５度）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００と共に４０％〜６２．５％（ｗ／ｗ）の範囲でＤＰＰＣを使用（Ｔｍ＝摂氏４１度）することにより、撮像目的においては有用な安定したマイクロバブルが供給できることを示す。ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の脂質混合物によって用意されたマイクロバブルの遷移温度（Ｔｍ）は、摂氏４５〜４９．５度の間で推移する。試験の結果は、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００と共に４０％〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲でＤＰＰＣを使用することにより、撮像目的において更に安定したマイクロバブルが供給できることを示す。ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００の脂質混合物によって用意されたマイクロバブルの望ましい遷移温度（Ｔｍ）は、摂氏４６．６〜４９．５度の間で推移する。
【００５４】
図５は、サンプル１ｂから８ｂにおいて、マイクロバブルの強度の時間変化を示す画像である。ＤＰＰＧ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００脂質混合物によって用意された処方に基づき、各サンプル（サンプル１ｂから８ｂ）の超音波画像のコントラスト強度を計算及び蓄積し、サンプル間のエコー性能を比較した。
【００５５】
図６Ａは、試験開始から５０分間に蓄積したコントラスト強度の数値に基づき（表６を参照）、サンプル１ｂ〜８ｂの時間−蓄積強度曲線を表す。
【表６】
2019503403.tif 000008
【００５６】
図６Ｂは、サンプル１ｂの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル１ｂから８ｂの相対的な蓄積強度の比較結果を示す。
【００５７】
ＤＰＰＧを全体量のうちの４０％〜６２．５％の範囲で含有した、サンプル３ｂ、４ｂ、５ｂ及び６ｂは、サンプル１ｂ、２ｂ、７ｂ及び８ｂと比較して著しい違い及び改善があることが判明した。
【００５８】
同様に、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝摂氏５５度）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００と共に使用された、ＤＰＰＧの範囲が４０％〜６２．５％（ｗ／ｗ）のＤＰＰＧ（Ｔｍ＝摂氏４１度、荷電した脂質）のサンプルは、形成されたマイクロバブルの濃度及び平均径に基づき、よりよい結果を与えることを示した。この発見に基づき、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の脂質混合物によって準備されたマイクロバブルの遷移温度（Ｔｍ）は、摂氏４５〜４９．５度の間で推移する。一実施形態では、ＤＳＰＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００と共に、６２．５％（ｗ／ｗ）のＤＰＰＧを使用することにより、撮像目的においてさらに安定したマイクロバブルを供給する。
【００５９】
要約すると、このデータは、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝摂氏５５度）等の遷移温度が高い脂質及び約１２．５％（ｗ／ｗ）のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００と、４０％〜６２．５％（ｗ／ｗ）の、荷電された又はされていない、遷移温度が低い脂質は、人体に使用される場合に安定性が高い（例えば摂氏３７度）マイクロバブルを供給することを示す。
【００６０】
＜実施例４：ＰＥＧ化ＤＳＰＥを含有する製剤によって生成されたマイクロバブルの安定性評価＞
実施例３で示す通り、各バイアルで調製されたマイクロバブルについて、人間に使用する場合の温度である摂氏３７度における安定性を試験した。本試験の目的は、脂質混合物で使用されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００等、同様のＰＥＧ化ＤＳＰＥが、同様の結果を与えるかを確認することである。
本試験においては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を使用した。
【００６１】
脂質混合物は、表７及び表８に基づき調製された。
【表７】
2019503403.tif 000009
【表８】
2019503403.tif 000010
【００６２】
各バイアルで調製したマイクロバブルをマルチサイザーで評価し、マイクロバブルの平均径及び濃度を特定する。結果は、表９及び表１０で表す。
【表９】
2019503403.tif 000011
【表１０】
2019503403.tif 000012
【００６３】
表９で示される通り、サンプル３ａ及びサンプル３ｃのマイクロバブルの濃度及び平均径は類似しかつ比較可能であり、また、サンプル６ａ及びサンプル６ｃのマイクロバブルの濃度及び平均径は類似しかつ比較可能である。特に図７Ａで示す通り、マイクロバブルのサンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃの濃度を比較した場合、サンプル３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃの濃度はサンプル１ａよりも高い。
【００６４】
表１０で示される通り、サンプル３ｂ及びサンプル３ｄのマイクロバブルの濃度及び平均径は類似しかつ比較可能であり、また、サンプル６ｂ及びサンプル６ｄのマイクロバブルの濃度及び平均径は類似しかつ比較可能である。特に図７Ｂで示される通り、サンプル１ａ、３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄのマイクロバブルの濃度を比較した場合、サンプル３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄのマイクロバブルの濃度はサンプル１ａよりも高い。
【００６５】
次に、超音波コントラスト画像条件において、結果物であるマイクロバブル溶液サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃの画像を毎分撮影し、各サンプルの強度を記録した。図８Ａは、撮影された画像を示す。図８Ｂは、マイクロバブル溶液サンプル３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄの画像を示す。
【００６６】
マイクロバブル溶液サンプル３ａ、６ａ、３ｂ、６ｂ、３ｃ、６ｃ、３ｄ、６ｄの超音波画像のコントラスト強度を計算し、蓄積することにより、各サンプル間のエコー性能を比較した。図８Ｃ及び図８Ｄは、試験開始から５０分間で蓄積したコントラスト強度の数値に基づく（表１１及び表１２を参照）、時間−蓄積強度の曲線を示す。
【表１１】
2019503403.tif 000013
【表１２】
2019503403.tif 000014
【００６７】
図８Ｅは、サンプル１ａの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃの相対的な蓄積強度の結果を示し、ここで、サンプル３ａ、６ａ、３ｃ、６ｃのグループは、サンプル１ａよりも優れた相対的蓄積強度を与えることを示す。この結果は、サンプル３ａ、６ａ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含有するＤＰＰＣ）は、高い安定性プロファイルを与えるという点においては、サンプル３ｃ、６ｃ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含有するＤＰＰＣ）と比較して顕著な差がないことを示す。
【００６８】
図８Ｆは、サンプル１ａの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル１ａ、３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄの相対的な蓄積強度の結果を示し、ここで、サンプル１ａ、３ｂ、６ｂ、３ｄ、６ｄのグループは、サンプル１ａよりも優れた相対的な蓄積強度を与えることを示す。この結果は、サンプル３ｂ、６ｂ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含有するＤＰＰＧ）は、高い安定性プロファイルを与えるという点においては、サンプル３ｄ、６ｄ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含有するＤＰＰＧ）と比較して顕著な差がないことを示す。
【００６９】
従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を使用した結果の利点は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を使用した場合にも及ぶことが明確となる。
【００７０】
＜実施例５：ＤＳＰＣ又はＤＳＰＧを含有する調製物におけるマイクロバブルの安定性の比較＞
実施例３で示す通り、各バイアルで調製されたマイクロバブルについて、人間に使用する場合の温度である摂氏３７度における安定性を試験した。ここで、同じ条件でマイクロバブルを調製するにあたり、脂質混合物に、同じＴｍを有する第２脂質ＤＳＰＧを使用した。この試験は、実施例１〜４に示された結果を、同じまたは同様のＴｍを有する、異なる第２脂質に拡張することができるかを評価することを目的とする。
【００７１】
表１３に示された組成物に基づき脂質混合物を調合し、第１脂質ＤＰＰＣとＤＳＰＥ−２０００を使用した。
【表１３】
2019503403.tif 000015
【００７２】
マルチサイザーを使用し、各バイアルで形成されたマイクロバブルの平均径及び濃度を評価した。結果は表１４に示す。
【表１４】
2019503403.tif 000016
表１４で示される通り、サンプル３ａ及びサンプル３ｅのマイクロバブルの濃度及び平均径は類似しかつ比較可能であり、また、サンプル６ａ及びサンプル６ｅのマイクロバブルの濃度及び平均径は類似しかつ比較可能である。特に図９Ａで示される通り、サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅのマイクロバブルの濃度を比較した場合、サンプル３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅのマイクロバブル濃度はサンプル１ａよりも高い。
【００７３】
次に、超音波コントラスト画像条件において、結果物であるマイクロバブル溶液サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅの画像を毎分撮影し、各サンプルの強度を記録した。図９Ｂは、撮影した画像を示す。
【００７４】
マイクロバブル溶液サンプル３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅのコントラスト強度をそれぞれ計算し、蓄積することにより、各サンプル間のエコー性能を比較した。図９Ｃは、試験開始から５０分間で蓄積したコントラスト強度の数値に基づく（表１５を参照）、時間−蓄積強度の曲線を示す。
【表１５】
2019503403.tif 000017
【００７５】
図９Ｄは、サンプル１ａの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル１ａ、３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅの相対的な蓄積強度の結果を示し、ここで、サンプル３ａ、６ａ、３ｅ、６ｅのグループは、サンプル１ａよりも優れた相対的蓄積強度を与えることを示す。この結果は、サンプル３ａ、６ａ（ＤＰＰＣを含む）のグループは、サンプル３ｅ、６ｅ（ＤＳＰＧを含む）のグループと比較して顕著な差がないことを示す。
【００７６】
従って、ＤＳＰＣを使用した結果の利点は、ＤＳＰＧを使用した場合にも及ぶことが明確となる。
【００７７】
＜実施例６：本発明の組成と、異なるＰＥＧ化脂質を使用した既知の処方との安定性の比較＞
処方例（例えば、サンプル６ａ及び６ｅ）について、米国特許公開第２０１４／０３２８７６７号に開示された既知の組成と比較し、安定性試験を行った。選択した処方及び実施例の処方は、全て脂質混合物の遷移温度（Ｔｍ）が摂氏４５度である。試験される各サンプルの準備方法は、実施例１と同様の条件で行われる。各サンプルの組成物は、表１６で示す。
【表１６】
2019503403.tif 000018
【００７８】
マルチサイザーを使用し、各バイアルで形成されたマイクロバブルの平均径及び濃度を評価した。結果は表１７に示す。図１０Ａは、サンプル１ａ、６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３によって生成されたマイクロバブルの濃度を示す。
【表１７】
2019503403.tif 000019
【００７９】
表１７で示される通り、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を使用した場合における、サンプル６ａ及び６ｅで調製されたマイクロバブルの濃度は、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３によって調製されたマイクロバブルの濃度と比較して高い。
【００８０】
サンプル６ａ及び６ｅの濃度は、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３の濃度よりも高いことが明確に示されており、これらの３つのサンプルのマイクロバブルの平均径は、１．２〜１．５μｍである。これらのサンプルの全体の遷移温度Ｔｍが摂氏４５度であるにも関わらず、本発明による組成（例えばサンプル６ａ及び６ｅ）は、濃度が２〜３倍高い。比率が同様である、異なるＰＥＧ化脂質（例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）は、多くのマイクロバブルを生成するために重要な役割を持つ。
【００８１】
これらの３つのサンプルには、実施例３で示された安定性試験と同様の試験を行った。次に、超音波コントラスト画像条件において、結果物であるマイクロバブル溶液サンプル６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３の画像を毎分撮影し、各サンプルの強度を記録した。図１０Ｂは、撮影された画像を示す。
【００８２】
サンプル６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３の超音波画像を撮像してコントラスト強度をそれぞれ計算し、蓄積することにより、各サンプル間のエコー性能を比較した。図１０Ｃは、試験開始から５０分間で蓄積したコントラスト強度の数値に基づく（表１８を参照）、時間−蓄積強度の曲線を示す。
【表１８】
2019503403.tif 000020
【００８３】
図１０Ｄは、サンプル１ａの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル１ａ、６ａ、６ｅ、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３の相対的な蓄積強度の結果を示す。
【００８４】
サンプル６ａ及び６ｅは、ＰＥＧ４０Ｓ_２、ＰＥＧ４０Ｓ_３のサンプルと比較し、安定性が高いことが明確に示される。遷移温度が摂氏４５度であるにも関わらず、特定の調製物は既知の調製物と比較して特徴的かつ想定以上の安定性を与える。本開示で示された、濃度が高くかつ安定性に優れた、想定以上かつ優れた安定性が高いマイクロバブルは、人間に広く使用できる。
【００８５】
＜実施例７：遷移温度が低い第１脂質の直接比較の調査＞
安定性が高いマイクロバブルを調製できる可能性がある脂質を調査するにあたり、脂質混合物にＴｍ値が低い脂質（例えば１５：０ＰＣ（１,２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン、Ｔｍ＝摂氏３５度）を使用し、マイクロバブルを調製し、遷移温度が４１度である第１脂質を含有するマイクロバブルと比較した。１５：０ＰＣは、炭素数が１６であるＤＰＰＣ又はＤＰＰＧとは異なり、炭素数が１５である短い炭素鎖を持つ、ＤＰＰＣ及びＤＰＰＧ（Ｔｍ＝摂氏４１度）と類似する化学構造を持つ、合成リン脂質である。
【００８６】
表１９に記載された組成に従って脂質混合物を用意し、第１脂質としてＤＰＰＣ又は１５：０ＰＣ、第２脂質としてＤＳＰＣを使用し、並びにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を使用した。
【表１９】
2019503403.tif 000021
【００８７】
マルチサイザーを使用し、各バイアルで形成されたマイクロバブルの平均径及び濃度を特定した。結果は表２０に示す。
【表２０】
2019503403.tif 000022
【００８８】
表２０で示す通り、サンプル３ｆ及び５ｆのマイクロバブルの濃度は、３a及び３ｂの濃度と比較して著しい違いがあることを示した。特に図１１Ａで示される通り、サンプル１ａ、３ａ、３ｆ、５ｆのマイクロバブルの濃度を比較した場合において、サンプル１ａ、３ａの濃度は、濃度がサンプル１ａよりも低いサンプル３ｆ及び５ｆの濃度よりも高い。濃度が低いということは、１５：０ＰＣを含有するサンプル、例えばサンプル３ｆ及び５ｆは、条件下において活性しなかったことを示す。この結果は、サンプル３ｆ及び５ｆによる調製は、安定性プロファイルが高い気泡を生成するには適していないことを示す。本試験における全ての調製に対し、さらに超音波画像試験が行われた。
【００８９】
次に、超音波コントラスト画像条件において、結果物であるマイクロバブル溶液サンプル３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆの画像を毎分撮影し、各サンプルの強度を記録した。図１１Ｂは、撮影した画像を示す。
【００９０】
サンプル３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆの超音波画像を撮像してコントラスト強度をそれぞれ計算し、蓄積することにより、各サンプル間のエコー性能を比較した。図１０Ｃは、試験開始から５０分間で蓄積したコントラスト強度の数値に基づく（表２１を参照）、時間−蓄積強度の曲線を示す。
【表２１】
2019503403.tif 000023
【００９１】
図１１Ｄは、サンプル１ａの蓄積強度値を１００％に通常化した場合における、サンプル３ａ、５ａ、３ｆ、５ｆの相対的な蓄積強度の結果を示す。サンプル３ｆ及び５ｆは、サンプル３ａ及び５ａと隣り合わせで比較した。この結果は、遷移温度が摂氏４１度である第１脂質を含むサンプルは、遷移温度が摂氏３５度である１５：０ＰＣを使用したサンプルと比較して、２．４４倍から１１．６２倍の改善があることを示す。この結果によって、遷移温度が摂氏４１度である第１脂質（例えばＤＰＰＣ及びＤＰＰＧ）は、持続性が長い安定したマイクロバブルを供給する想定外の利点があることが確認された。遷移温度Ｔｍが低い第１脂質は、脂質混合物の温度Ｔｍを下げるが、結果を改善するわけではない。
【００９２】
本明細書には本発明の実施形態を例示しているが、これらの実施例は一態様として提供されていることは、当業者にとっては明らかである。様々な変形例、変更及び代替は、本発明の範囲を逸脱することなく、当業者にとって自明の範囲において発生し得る。本発明を実施するにあたり、実施形態に対する様々な変形を適用し得る。本発明の単純な変形乃至変更はいずれも本発明の領域に属するものであり、本発明の具体的な保護範囲は添付の特許請求の範囲により明確になるであろう。
【図１Ａ】
2019503403.tif 000024
【図１Ｂ】
2019503403.tif 000025
【図２Ａ】
2019503403.tif 000026
【図２Ｂ】
2019503403.tif 000027
【図３】
2019503403.tif 000028
【図４Ａ】
2019503403.tif 000029
【図４Ｂ】
2019503403.tif 000030
【図５】
2019503403.tif 000031
【図６Ａ】
2019503403.tif 000032
【図６Ｂ】
2019503403.tif 000033
【図７Ａ】
2019503403.tif 000034
【図７Ｂ】
2019503403.tif 000035
【図８Ａ】
2019503403.tif 000036
【図８Ｂ】
2019503403.tif 000037
【図８Ｃ】
2019503403.tif 000038
【図８Ｄ】
2019503403.tif 000039
【図８Ｅ】
2019503403.tif 000040
【図８Ｆ】
2019503403.tif 000041
【図９Ａ】
2019503403.tif 000042
【図９Ｂ】
2019503403.tif 000043
【図９Ｃ】
2019503403.tif 000044
【図９Ｄ】
2019503403.tif 000045
【図１０Ａ】
2019503403.tif 000046
【図１０Ｂ】
2019503403.tif 000047
【図１０Ｃ】
2019503403.tif 000048
【図１０Ｄ】
2019503403.tif 000049
【図１１Ａ】
2019503403.tif 000050
【図１１Ｂ】
2019503403.tif 000051
【図１１Ｃ】
2019503403.tif 000052
【図１１Ｄ】
2019503403.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月9日(2018.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）遷移温度が摂氏４１度である第１脂質と、遷移温度が摂氏５５度である第２脂質と、ＰＥＧ化ＤＳＰＥと、を含む脂質混合物と、
（ｂ）生体適合性がある気体と、を備え、
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し、４０〜６３重量％の範囲で含まれる、生理的に許容可能な脂質担体に気体が充填されたマイクロバブルを含有する懸濁液。
【請求項２】
前記第１脂質はＤＰＰＣ又はＤＰＰＧである、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し５０〜６３重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項４】
前記第１脂質は、前記脂質混合物の全体量に対し４０〜６０重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項５】
前記第２脂質はＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項６】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００である、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項７】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、全体量に対し１０〜１５重量％の範囲で含まれる、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項８】
さらに、前記懸濁液は１〜２０％のグリセロールを含有する、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項９】
前記気体はパーフルオロカーボン、ＳＦ６、ＡＲ及びＮ２の群から選択される、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１０】
請求項１に係る気体が充填された、マイクロバブルを含有する懸濁液を保存するシールバイアル。
【請求項１１】
前記気体はパーフルオロカーボン、ＳＦ６、ＡＲ及びＮ２の群から選択される、請求項１０に記載のシールバイアル。
【請求項１２】
前記第１脂質はＤＰＰＣ又はＤＰＰＧである、請求項１０に記載のシールバイアル。
【請求項１３】
前記第２脂質はＤＳＰＣ又はＤＳＰＧである、請求項１０に記載のシールバイアル。
【請求項１４】
前記ＰＥＧ化ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００である、請求項１０に記載のシールバイアル。
【請求項１５】
さらに、前記懸濁液は１〜２０％のグリセロールを含有する、請求項１０に記載のシールバイアル。
【国際調査報告】
2019503403.tif 000054