(57)【要約】  新生児免疫細胞系のインビトロのバイオミメティックモデルが、当該モデルを用いて、免疫原性の刺激（例えばワクチン接種）に対する、乳幼児の免疫細胞媒介および体液性の応答の前臨床評価において使用する方法と共に提供される。モデルとしては、臍帯血由来濾胞性ヘルパーＴ細胞とＢ細胞とを含むもの、および臍帯血由来の樹状細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とを含むものが挙げられる。例えば、モデルは、抗原およびワクチンの露出に対するに細胞応答の分析を介して、候補ワクチンを評価するために用いることができる。
2019531717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択薬剤に対する細胞応答を評価する方法であって、
（ａ）選択薬剤を、臍帯血由来の樹状細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、前記樹状細胞による前記選択薬剤の取り込みを促進する条件下で細胞培養物を維持し、薬剤刺激された樹状細胞の第１集団を形成し、
（ｂ）（ａ）で発達させた薬剤刺激された樹状細胞と臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、Ｔ細胞の活性化を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｃ）薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、Ｔ細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、ここで、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団は、薬剤刺激された樹状細胞の前記第１集団と同じ方法で調製されており、
（ｄ）Ｔ細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／またはＴ細胞を分析し、それによって選択薬剤に対する細胞応答を評価する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
活性について選択薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）選択薬剤を、臍帯血由来の樹状細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、前記樹状細胞による前記選択薬剤の取り込みを促進する条件下で細胞培養物を維持し、薬剤刺激された樹状細胞の第１集団を形成し、
（ｂ）（ａ）で発生させた薬剤刺激された樹状細胞と臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、Ｔ細胞の活性化を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｃ）薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、Ｔ細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、ここで、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団は、薬剤刺激された樹状細胞の前記第１集団と同じ方法で調製されており、
（ｄ）Ｔ細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／またはＴ細胞を分析し、それによって活性について選択薬剤をスクリーニングする、
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
前記第１の細胞培養物が、前記第２の細胞培養物の形成の前に、約１２〜３６時間維持される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の細胞培養物が、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団が添加される前に、約５〜１０日間維持される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｃ）の培養物が、（ｄ）の分析の前に、約２〜８時間維持される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞応答は、サイトカインまたはマーカーの産生である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２６のうちの１つ以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１３４、およびＣＤ１５４のうちの１つ以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記選択薬剤が、抗原、ワクチン、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、ウイルス、ビリオン、細菌、真菌、または、それらの断片である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記臍帯血Ｔ細胞が、前記臍帯血由来の樹状細胞に対して自家性である、請求項１〜９のいずれ一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）の培養物における、薬剤刺激された樹状細胞の臍帯血Ｔ細胞に対する比が、約１：５から約１：１００の範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｃ）の培養物に添加される、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団の、臍帯血Ｔ細胞に対する比が、約１：５から約１：１００の範囲である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記樹状細胞が、以下のマーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記臍帯血由来の樹状細胞が、
（ａ）細胞培養ウェルの下部チャンバーの上に分離可能に吊される当該ウェルの上部チャンバー内に収容されている多孔質膜の上面で内皮細胞を培養し、
（ｂ）（ａ）の多孔質膜上の内皮細胞に臍帯血単核細胞を与え、
（ｃ）前記臍帯血単核細胞を与えてから約４８時間後に、多孔性膜および内皮細胞を収容している前記上部チャンバーを取り外し、
（ｄ）樹状細胞を前記ウェルの下部チャンバーから分離する、
ことを含む方法によって調製される、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
前記多孔質膜が、ポリカーボネート膜である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記多孔質膜は、大きさ約１〜１５μｍの範囲の穴を有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
膜支持体が、前記ウェルの上部チャンバー、前記ポリカーボネート膜、および前記ウェルの下部チャンバーを提供することに用いられる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウェルの下部チャンバーが、細胞外マトリックス材料を含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞外マトリックス材料が、ゼラチン、コラーゲン、合成細胞外マトリックス材料、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリグリコール酸、天然細胞外マトリックス材料、キトサン、プロトサン（ｐｒｏｔｏｓａｎ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる材料を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウェルの下部チャンバーが、繊維芽細胞、支持体細胞、および間質細胞を更に含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記（ａ）の第１の細胞培養物が、前記ウェルの下部チャンバーである、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞またはヒト体細胞ハイブリッドＥＡ．ｈｙ９２６である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記内皮細胞が、形質転換された内皮細胞系である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
内皮細胞が、前記多孔質膜の両面に培養される、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記内皮細胞が、前記臍帯血単核細胞を加える前に、コンフルエンシーに達するまで培養される、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内皮細胞が、前記臍帯血単核細胞を加える前であって、多層細胞発育に達成するまで、培養される、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞外マトリックス材料の層が前記多孔質膜の上面にあって、前記内皮細胞が前記細胞外マトリックス材料層上で培養される、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞外マトリックス材料の層が前記多孔質膜の上面および下面にあって、前記内皮細胞が細胞外マトリックス材料層の両方の層に培養される、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞外マトリックスが、ゼラチン、コラーゲン、合成細胞外マトリックス材料、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリグリコール酸、天然細胞外マトリックス材料、キトサン、プロトサン（ｐｒｏｔｏｓａｎ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる材料を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
活性についてワクチンをスクリーニング方法であって、
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって活性についてワクチンをスクリーニングする、
ことを含む、前記方法。
【請求項３１】
ワクチンの効能を評価する方法であって、
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによってワクチンの効能を評価する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３２】
インビトロの細胞培養を用いてワクチンのインビボでの効能を予測する方法であって、
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、細胞応答が見出された場合、前記ワクチンはインビボでの効能を有すると予測する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記第１の細胞培養物が、約８〜１２日間維持される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
追加ワクチンが、少なくとも１回、第１の細胞培養物に添加される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の細胞培養物が、約８〜１２日間維持され、追加ワクチンが、最初のワクチンの添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチンの添加後５、６または７日目のうちの１つに添加される、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
照射を受けたフィーダー細胞が、ワクチン添加の１回以上の繰り返しの際に、第１の培養物に添加される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記照射を受けたフィーダー細胞が、無血清培地で成長した臍帯血単核細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記（ｃ）の培養物が、約８〜１２日間維持される、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＩＬ−２１が、（ｃ）の培養物に添加される、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記（ｃ）の培養物が、約１〜２５日間維持され、第２の細胞培養物に対するワクチン特異的抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１が、第２の細胞培養物の調製後の２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後の５、６または７日目のうちの１つに、添加される、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞応答は、ＴFH細胞によるサイトカインの産生、ＴFH細胞によるマーカーの発現、Ｂ細胞によるサイトカインの産生、Ｂ細胞によるマーカーの発現、およびＢ細胞によるワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生のうちの１つ以上である、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記サイトカインが、ＣＸＣＬ１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはＩＬ−２１のうちの１つ以上である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マーカーが、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＩｇＤ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つ以上である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ワクチンが、不活化、弱毒化、トキソイド、サブユニット、コンジュゲート、結合価および異型のワクチン、またはタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、ウイルス、ビリオン、細菌、菌類、またはそれらの断片、または抗原刺激された樹状細胞である、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチン特異的抗原が、ワクチンの一部またはワクチンの構成成分である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の細胞活性化因子が、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３からなる群から選ばれる、請求項４０〜４５のいずれか一項である方法。
【請求項４７】
前記臍帯血Ｂ細胞が、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して自家性である、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記臍帯血Ｂ細胞が、第２の細胞培養物に臍帯血Ｂ細胞の添加する前に、ＣｐＧ２００６で処理される、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比が、約１：１から約１：１００の範囲である、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の細胞培養物が、３次元マトリックスに形成される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記マトリックスが、ゲルマトリックスである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
活性についてワクチンをスクリーニングする方法であって、
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチンの添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチンの添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって活性についてワクチンをスクリーニングする、
ことを含む、前記方法。
【請求項５３】
ワクチンの効能を評価する方法であって、
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチンの添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチンの添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによってワクチンの効能を評価する、
ことを含む、前記方法。
【請求項５４】
インビトロの細胞培養を用いてワクチンのインビボでの効能を予測する方法であって、
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチン添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチン添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって、このような抗体が見出される場合、前記ワクチンはインビボで効能を有すると予測する、
ことを含む、前記方法。
【請求項５５】
前記照射を受けたフィーダー細胞が、無血清培地で成長した臍帯血単核細胞である、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ワクチンが、不活化、弱毒化、トキソイド、サブユニット、コンジュゲート、結合価および異型のワクチン、またはタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、ウイルス、ビリオン、細菌、菌類、またはそれらの断片、または抗原刺激された樹状細胞、である、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ワクチンに特異的な抗原が、ワクチンの一部またはワクチンの構成成分である、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記臍帯血Ｂ細胞が、第２の細胞培養物に臍帯血Ｂ細胞の添加する前に、ＣｐＧ２００６で処理される、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記マトリックスが、ゲルマトリックスである、  請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ワクチン接種は感染に対する最善の防御であり、生後数カ月は、ワクチンが疾患に対し強力な防護を誘導することができる重要な期間を提供する。しかしながら、ワクチンおよび免疫治療の臨床開発および改良は、未成熟の免疫系での免疫反応をテストするための適切なインビトロアッセイの欠如によって妨げられている。新生児（ｎｅｏｎａｔａｌ）および乳幼児（ｉｎｆａｎｔ）の免疫のインビトロモデルの開発は、出生後に投与することができるワクチンの研究を進める上で大きな利点となるであろう。ここに記載される本発明は、このような、および他の重要な目的に関する。
【発明の概要】
【０００２】
ここに提供されるのは、哺乳類の新生児免疫系のインビトロモデルとして共に供する細胞培養構築物および方法論である。これら哺乳類の臍帯血ベースの新生児モジュール免疫インビトロ構築物（ｎＭＩＭＩＣ：ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）モデルは、選択抗原（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）に対する若齢期の免疫応答を予測するために用いることができ、乳幼児および歩き始めの幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）用ワクチンの前臨床評価における一次スクリーニングとして役立てることができる。
【０００３】
本発明のｎＭＩＭＩＣモデルは、若齢期のナイーブ免疫（ｎａｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の態様を再現する。ｎＭＩＭＩＣモデルにおける発生期の臍帯血に由来する免疫細胞を用いて、ここに開示されるモデルは、臨床において観察される新生児および乳幼児の免疫応答を真似る。これらのｎＭＩＭＩＣモデルは、臍帯血由来の哺乳動物新生児免疫系の成分（例えば、Ｔ、Ｂ、および樹状細胞（ＤＣｓ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を利用し、インビボにて生理学的濃度で観察されるものと同様の比率でそれらを培養物中に提示する能力を提供する。これらのモデルを用いて、本発明者らは、（１）抗原処理した臍帯血由来（ｃｏｒｄ−ｂｌｏｏｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ）樹状細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞に適用して細胞媒介性応答を生じさせること、および（２）臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｂ細胞のヘルプおよび体液性応答に必須である特殊なクラスのＴリンパ球である、Ｔ濾胞性ヘルパー細胞（ＴFH）に分化させることができ、これらのＴFH細胞をナイーブＢ細胞に適用して小児期ワクチンに対する抗原特異的抗体応答を生じさせることができた。
【０００４】
本発明の実施形態は、２つの特定のｎＭＩＭＩＣモデル、ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルおよびｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル、並びに、抗原に対する哺乳類新生児免疫系の成分の細胞応答について情報を提供するためにこれらのモデルを使用する方法、および、候補ワクチンの評価において使用する方法を含む。
【０００５】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデル
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルは、主として、臍帯血由来の樹状細胞（ＤＣｓ）および臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、例えば、新生児抗原提示およびＣＤ４＋Ｔ細胞反応について選択薬剤の効果をアッセイするために用いることができる。ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルが多くの異なる態様で用いることができることは容易に明らかであろうが、このモデルの非限定的な例として、選択薬剤（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｇｅｎｔ）に対する新生児免疫系の細胞の反応をインビトロで評価する方法を例示することができる。具体的には、第１の実施形態として、本発明は、選択薬剤に対する細胞応答を評価する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）選択薬剤を、臍帯血由来の樹状細胞（ＤＣｓ）を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、前記樹状細胞による前記選択薬剤の取り込みを促進する条件下で細胞培養物を維持し、薬剤刺激された樹状細胞の第１集団を形成し、
（ｂ）（ａ）で発達させた薬剤刺激された樹状細胞と臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、Ｔ細胞の活性化を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｃ）薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、Ｔ細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、ここで、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団は、薬剤刺激された樹状細胞の前記第１集団と同じ方法で調製されており、
（ｄ)Ｔ細胞応答について（ｃ）の細胞培養物からの上清および／またはＴ細胞を分析し、それによって選択薬剤に対する細胞応答を評価すること、
を含む。
【０００６】
他の非限定的な例として、ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルは、哺乳類新生児免疫系の成分に対する活性について選択薬剤（例えば、抗原、ワクチン）をスクリーニングするインビトロでの方法を例示することができる。具体的には、第２の実施形態として、本発明は、活性について選択薬剤をスクリーニングする方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）選択薬剤を、臍帯血由来の樹状細胞（ＤＣｓ）を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、前記樹状細胞による前記選択薬剤の取り込みを促進する条件下で細胞培養物を維持し、薬剤刺激された樹状細胞の第１集団を形成し、
（ｂ）（ａ）で発達させた薬剤刺激された樹状細胞と臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、Ｔ細胞の活性化を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｃ）薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、Ｔ細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、ここで、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団は、薬剤刺激された樹状細胞の前記第１集団と同じ方法で調製されており、
（ｄ）Ｔ細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞の細胞応答について分析し、それによって活性について前記選択薬剤をスクリーニングする、
ことを含む。
【０００７】
これら第１および第２の実施形態の側面において、第１の細胞培養物は、約３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、または４８時間以上、第２の細胞培養物の形成の前に維持される。特定の一側面において、第１の細胞培養物は、約１２〜３６時間、第２の細胞培養物の形成の前に維持される。
【０００８】
これら第１および第２の実施形態の側面において、第２の細胞培養物は、薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を加える前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間以上維持される。特定の一側面において、第２の細胞培養物は、薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を添加する前に、約５〜１０日間維持される。
【０００９】
これら第１および第２の実施形態の側面において、（ｃ）の培養物は、（ｄ）の分析前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間以上維持される。特定の一側面において、（ｃ）の培養物は、（ｄ）の分析前に、約２〜８時間維持される。
【００１０】
これら第１および第２の実施形態の側面において、Ｔ細胞応答は、サイトカインまたはマーカーの産生でありうる。サイトカインの例としては、以下に限定されるものではないが、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２６のうちの１つ以上が挙げられる。マーカーの例としては、以下に限定されるものではないが、１つ以上のＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１３４、およびＣＤ１５４が挙げられる。
【００１１】
これら第１および第２の実施形態の側面において、選択薬剤は、抗原、ワクチン、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、ウイルス、ビリオン、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌（ｆｕｎｇｉ）、および断片でありうる。
【００１２】
これら第１および第２の実施形態の側面において、臍帯血Ｔ細胞は、臍帯血由来の樹状細胞に対して自家性（すなわち、同じ生物体由来）である。この実施形態の他の側面において、臍帯血Ｔ細胞は、臍帯血由来の樹状細胞に対し同種異系（すなわち、同じ種の他の生物体由来）である。
【００１３】
これら第１および第２の実施形態の側面において、（ｂ）の培養物中における、薬剤刺激された樹状細胞の臍帯血Ｔ細胞に対する比は、約１：５から約１：１００の範囲である。
【００１４】
これら第１および第２の実施形態の側面において、（ｃ）の培養物に添加される薬剤刺激された樹状細胞の第２集団の、臍帯血Ｔ細胞に対する比は、約１：５から約１：１００の範囲である。
【００１５】
これら第１および第２の実施形態の側面において、臍帯血由来の樹状細胞は、以下のマーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現していることにより特徴づけられうる。
【００１６】
本発明ならびにこれら第１および第２の実施形態の別の側面において、臍帯血由来の樹状細胞は、
（ａ）細胞培養ウェルの下部チャンバーの上に分離可能に吊される当該ウェルの上部チャンバー内に収容されている多孔質膜の上面で内皮細胞を培養し、
（ｂ）（ａ）の多孔質膜上の内皮細胞に臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ：ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を与え、
（ｃ）前記臍帯血単核細胞を与えてから約４８時間後に、多孔質膜および内皮細胞を収容している前記上部チャンバーを取り外し、
（ｄ）樹状細胞を前記ウェルの下部チャンバーから分離する、
ことを含む方法によって調製しうる。
【００１７】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、多孔質膜は、ポリカーボネート膜、または、直径約１から１５μｍの範囲の孔を有するもの、またはその両方を備える膜でありうる。いくつかの実施形態において、ウェルの上部チャンバー、ポリカーボネート膜、およびウェルの下部チャンバーを提供するために、透過性支持体を用いてもよい。このような透過性支持体としては、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ社のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）パーミアブルサポートが挙げられる。
【００１８】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、ウェルの下部チャンバーは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）材料を含みうる。いくつかの実施形態において、細胞外マトリックス材料は、以下に限定されるものではないが、ゼラチン、コラーゲン、合成細胞外マトリックス材料、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、天然細胞外マトリックス材料、キトサン、プロトサン（ｐｒｏｔｏｓａｎ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニンおよびそれらの混合物から選ばれる材料を含みうる。ウェルの下部チャンバーは、更に、繊維芽細胞、支持細胞、および間質細胞のうちの１つ以上を含みうる。
【００１９】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、内皮細胞は、以下に限定されるものではないが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）およびヒト体細胞ハイブリッドＥＡ．ｈｙ９２６でありうる。追加の側面において、内皮細胞は、形質転換された内皮細胞系でありうる。
【００２０】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、内皮細胞は、多孔質膜の両面に培養してもよい。
【００２１】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、内皮細胞は、臍帯血単核細胞を加える前に、コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達するまで培養することができる。
【００２２】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、内皮細胞は、臍帯血単核細胞を加える前に、多層細胞増殖に達するまで、培養してもよい。
【００２３】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、細胞外マトリックス材料の層は、多孔質膜の上面にあってもよく、内皮細胞は細胞外マトリックス材料層上に培養される。あるいは、細胞外マトリックス材料の層は上面および多孔質膜の下面にあってもよく、内皮細胞は細胞外マトリックス材料の両方の層上に培養される。細胞外マトリックス材料は、以下に限定されるものではないが、ゼラチン、コラーゲン、合成細胞外マトリックス材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然細胞外マトリックス材料、キトサン、プロトサン（ｐｒｏｔｏｓａｎ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、およびそれらの混合物から選ばれる材料を含みうる。
【００２４】
これらの実施形態の側面において、樹状細胞を調製するのに用いられるウェルの下部チャンバーは、（ａ）の第１の細胞培養物としての役割も果たしうる。
【００２５】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、主として、臍帯血由来濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞および臍帯血Ｂ細胞を含んでおり、例えば、抗原提示およびＢ細胞応答についての選択薬剤の効果をアッセイするために用いることができる。ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、多くの異なる態様で用いることができ、非限定的な例として、選択ワクチン（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）に対する新生児免疫系の細胞応答をインビトロで評価する方法が挙げられる。このように、第３の実施形態として、本発明は、活性についてワクチンをスクリーニングする方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって活性についてワクチンをスクリーニングする、
ことを含む。
【００２６】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、他の非限定的な例として、インビトロのテストを経てワクチンの潜在的効能を評価するインビトロの方法として例示することができる。
具体的には、第４の実施形態として、本発明は、ワクチンの効能をアッセイする方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによってワクチンの効能を評価する、
ことを含む。
【００２７】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、更なる非限定的な例として、インビトロの細胞培養物を用いてワクチンのインビボにおける効能を予測するインビトロの方法として例示することができる。
具体的には、第５の実施形態として、本発明は、インビトロの細胞培養物を用いてワクチンのインビボにおける効能を予測する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、細胞応答が見出された場合、前記ワクチンはインビボでの効能を有すると予測する、
ことを含む。
【００２８】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、第１の細胞培養物は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日以上間維持される。特定の一側面において、第１の細胞培養物は、約８〜１２日間維持される。
【００２９】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、追加ワクチンが、少なくとも１回、２回、３回、またはそれより多く、第１の細胞培養物に添加される。特定の一側面において、追加ワクチンは、少なくとも１回、第１の細胞培養に添加される。照射を受けたフィーダー細胞を、１回以上のワクチン添加の繰り返しの際に、第１の培養物に添加してもよい。照射を受けたフィーダー細胞は、これに限定されるものではないが、無血清培養媒体において成長した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【００３０】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、第１の細胞培養物は約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間以上維持され、追加ワクチンが、最初のワクチン添加後、２、３または４日目に添加され、そして、追加ワクチンが、最初のワクチンの添加後、５、６または７日目に添加される。特定の一側面において、第１の細胞培養物は、約８〜１２日間維持され、追加ワクチンが、最初のワクチン添加後、２、３または４日目のうちの１つの日に添加され、そして、５、６または７日目のうちの１つの日に添加される。照射を受けたフィーダー細胞を、ワクチン添加の１回以上の繰り返しの際に、第１の培養物に添加してもよい。照射を受けたフィーダー細胞は、これに限定されるものではないが、無血清培養媒体において成長した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【００３１】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、（ｃ）において添加されるワクチン特異的抗原は、第２の細胞培養物が調製された後まもなく、すなわち（ｂ）の第２の細胞培養物の調製後の約１時間以内に、（ｂ）の第２の細胞培養物に添加される。
【００３２】
これらの実施形態の側面において、（ｃ）の培養物は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間以上維持される。特定の一側面において、（ｃ）の培養物は、約８〜１２日間維持される。
【００３３】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、ＩＬ−２１は、通常、約１０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、（ｃ）の培養物に添加しうる。添加される場合、ＩＬ−２１は次の１つ以上の時点で添加される：（ｉ）ワクチン特異的抗原が（ｂ）の第２の細胞培養物に添加されるとき、（ｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、２、３または４日目、および（ｉｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、５、６または７日目。
【００３４】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、（ｃ）の培養物は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日以上の期間維持され、ＩＬ−２１は、（ｉ）ワクチン特異的抗原が（ｂ）の第２の細胞培養物に添加されるとき、（ｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、２、３または４日目、および（ｉｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、５、６または７日目、に添加される。
【００３５】
これらの第３、４および５の実施形態の側面において、細胞応答は、ＴFH細胞によるサイトカインの産生、ＴFH細胞によるマーカーの発現、Ｂ細胞によるサイトカインの産生、Ｂ細胞によるマーカーの発現、および、Ｂ細胞による、ワクチン特異的抗原に対し結合特異性を有する抗体の産生のうちの１つ以上である。サイトカインは、以下に限定されるものではないが、ＣＸＣＬ１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２１のうちの１つ以上でありうる。マーカーは、以下に限定されるものではないが、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＩｇＤ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つ以上でありうる。
【００３６】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、ワクチンは、以下に限定されるものではないが、不活化、弱毒化、トキソイド、サブユニット、コンジュゲート、結合価および異型のワクチン、または、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、ウイルス、ビリオン、細菌、真菌、または、それらの断片、または、抗原刺激された樹状細胞でありうる。
【００３７】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、ワクチン特異的抗原は、以下に限定されるものではないが、ワクチンの一部またはワクチンの構成成分でありうる。
【００３８】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、１つ以上の細胞活性化因子は、以下に限定されるものではないが、抗ＣＤ２８抗体で、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３でありうる。
【００３９】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して自家性（すなわち、同じ生物体由来）である。
【００４０】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血Ｂ細胞を第２の細胞培養物に添加する前に、ＣｐＧ２００６で処理してもよい。
【００４１】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００の範囲である。
【００４２】
これら第３、４および５の実施形態の側面において、第２の細胞培養物は、３次元マトリックスに形成してもよい。マトリックスは、ゲルマトリックスでもよい。
【００４３】
他の非限定的な例において、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、抗原の免疫原性を評価するインビトロの方法として用いることができる。具体的には、第６の実施形態として、本発明は、抗原の免疫原性を評価する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）抗原および１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）前記抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって抗原の免疫原性を評価する、
ことを含む。
【００４４】
この第６の実施形態の側面において、第１の細胞培養物は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日以上の期間維持される。特定の一側面において、第１の細胞培養物は、約８〜１２日間維持される。
【００４５】
この第６実施形態の側面において、追加抗原は、少なくとも１回、２回、３回、またはそれより多く、第１の細胞培養物に添加される。特定の一側面において、追加抗原は、少なくとも１回、第１の細胞培養物に添加される。照射を受けたフィーダー細胞を、１回以上の抗原添加の繰り返しの際に、第１の培養物に添加してもよい。照射を受けたフィーダー細胞は、これに限定されるものではないが、無血清培養培地において成長した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【００４６】
この第６の実施形態の側面において、第１の細胞培養物は約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間以上維持され、追加抗原が、最初の抗原添加の後、２、３または４日目に添加され、そして、追加抗原が、最初の抗原添加の後、５、６または７日目に添加される。特定の一側面において、第１の細胞培養物は約８〜１２日間維持され、追加抗原が、最初の抗原添加の後、２、３または４日目のうちの１つの日に添加され、そして、５、６または７日目のうちの１つの日に添加される。照射を受けたフィーダー細胞を、１回以上のワクチン添加の繰り返しの際に、第１の培養物に添加してもよい。照射を受けたフィーダー細胞は、これに限定されるものではないが、無血清培養培地において成長した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【００４７】
この第６の実施形態の側面において、（ｃ）において添加される抗原は、第２の細胞培養物が調製された後まもなく、すなわち（ｂ）の第２の細胞培養物の調製後の約１時間以内に、（ｂ）の第２の細胞培養物に添加される。
【００４８】
この第６実施形態の側面において、（ｃ）の培養物は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日間以上維持される。特定の一側面において、（ｃ）の培養物は、約１〜２５日間維持される。
【００４９】
この第６の実施形態の側面において、ＩＬ−２１を、通常、約１〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、（ｃ）の培養物に添加しうる。添加される場合、ＩＬ−２１は以下の時点の１つ以上で添加される：（ｉ）抗原が（ｂ）の第２の細胞培養物に添加されるとき、（ｉｉ）第２の細胞培養の調製後、２、３または４日目、および（ｉｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、５、６または７日目。
【００５０】
この第６の実施形態の側面において、（ｃ）の培養物は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日以上の期間維持され、ＩＬ−２１は、（ｉ）抗原が（ｂ）の第２の細胞培養物に添加されるとき、（ｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、２、３または４日目、および（ｉｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、５、６または７日目に添加される。
【００５１】
この第６実施形態の側面において、細胞応答は、ＴFH細胞によるサイトカインの産生、ＴFH細胞によるマーカーの発現、Ｂ細胞によるサイトカインの産生、Ｂ細胞によるマーカーの発現、およびＢ細胞による抗原に対し結合特異性を有する抗体の産生、のうちの１つ以上である。サイトカインは、以下に限定されるわけではないが、ＣＸＣＬ１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２１の１つ以上でありうる。マーカーは、以下に限定されるわけではないが、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＩｇＤ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つ以上でありうる。
【００５２】
この第６実施形態の側面において、１以上の細胞活性化因子は、以下に限定されるものではないが、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３でありうる。
【００５３】
この第６の実施形態の側面において、臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して自家性（すなわち、同じ生物体体由来）である。
【００５４】
この第６の実施形態の側面において、臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血Ｂ細胞を第２の細胞培養物に添加する前に、ＣｐＧ２００６で処理してもよい。
【００５５】
この第６の実施形態の側面において、第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲である。特定の一側面において、第２の細胞培養物における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、または１：１００である。
【００５６】
この第６実施形態の側面において、第２の細胞培養物は、３次元マトリックスに形成してもよい。マトリックスは、ゲルマトリックスでもよい。
【００５７】
具体的な一例である、第７の実施形態として、本発明は、インビボで、活性についてワクチンをスクリーニングする方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチンの添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチンの添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって活性について、前記ワクチンをインビトロでスクリーニングする、
ことを含む。
【００５８】
他の例である、第８実施形態として、本発明は、ワクチンの効能をインビトロで評価する方法に関し、当該方法は下記：  
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチン添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチン添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって前記ワクチンの効能をインビトロで評価する、
ことを含む。
【００５９】
更なる例である、第９の実施形態として、本発明は、インビトロの細胞培養物を用いてワクチンのインビボでの効能を予測する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチン添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチン添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって、このような抗体が見出される場合、前記ワクチンはインビボで効能を有すると予測する、
ことを含む。
【００６０】
これら第７、８および９の実施形態の側面において、照射を受けたフィーダー細胞は、これに限定されるものではないが、無血清培養媒体において成長した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【００６１】
これら第７、８および９の実施形態の側面において、ワクチンは、以下に限定されるわけではないが、不活化、弱毒化、トキソイド、サブユニット、コンジュゲート、結合価および異型のワクチン、または、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、ウイルス、ビリオン、細菌、真菌、または、それらの断片、または抗原刺激された樹状細胞でありうる。
【００６２】
これら第７、８および９の実施形態の側面において、ワクチン特異的抗原は、以下に限定されるものではないが、ワクチンの一部またはワクチンの構成成分でありうる。
【００６３】
これら第７、８および９の実施形態の側面において、臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血Ｂ細胞を第２の細胞培養物に添加する前に、ＣｐＧ２００６で処理してもよい。
【００６４】
これら第７、８および９の実施形態の側面において、マトリックスは、ゲルマトリックスでもよい。
【００６５】
以上の記述は、以下の本発明の詳細な説明をより理解しうるように、本発明の特徴及び技術的利点を包括的に概説したものである。以下では、本発明の特許請求の範囲の主題を構成する本発明の更なる特徴及び利点について記述する。本明細書に開示する任意の概念及び特定の実施形態を、本発明と同じ目的を達成するための他の構造を変更又は設計するための基礎として利用できることは、当業者によって理解されよう。このような均等な構成は、特許請求の範囲に記載されている本発明の思想及び範囲から逸脱するものではないことは、当業者によって理解されよう。その構成と運用方法の両方に関して本発明の特徴であると考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点と共に、添付図面を参照する以下の説明から一層理解される。なお、任意の説明、図、実施例等は、例示及び説明のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】選択抗原を評価するためのｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞モデル。選択抗原で２４時間前処理された新生児樹状細胞（１）は、７日間、ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養される（２）。ついで、共培養物は、分析（４）の前に、抗原処理された樹状細胞（３）に、５〜７時間、再暴露される。分析は、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）などの手段によって、サイトカイン発現をアッセイすることを含みうる。
【００６７】
【図２】ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞モデル：Ｈｉｂ−ＴＴ（「Ｈｉｂ」）を有するｎＭＩＭＩＣの刺激は、フローサイトメトリーを介して新生児の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を導く。複数の細胞内のサイトカインが、ｎＭＩＭＩＣ  Ｔ細胞アッセイにおいて、Ｈｉｂ−ＴＴに応答して増加した。細胞内サイトカイン分析の前に、抗原処理された樹状細胞を受け取った臍帯血Ｔ細胞を７日間共培養し、一方は標的樹状細胞で再刺激し、他方は再刺激しなかった。各対内の第２バーは、Ｈｉｂ−ＴＴで刺激および再刺激された培養物を表す。各サイトカインについてのデータは、％ＣＤ４＋ＯＸ４０＋ｃｙｔｏｋｉｎｅ＋細胞として示されている。グラフのデータは、ボックスウィスカープロット（ｂｏｘ  ａｎｄ  ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔ）で表され、１番目と３番目の四分位数がボックスの端にあり、中央値はボックスの内側の線であり、データセットの最大値と最小値がウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）で示されている。
【００６８】
【図３】ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞モデル：Ｈｉｂ−ＴＴ（「Ｈｉｂ」）用いたｎＭＩＭＩＣの刺激は、フローサイトメトリーを介して新生児のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を導く。各バーの上の％は、刺激指数（ＳＩ）またはバックグラウンドに対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）が≧１．５であったドナーの数を表す。刺激指数は、Ｈｉｂ−ＴＴで処理し再刺激した培養物（Ｈｉｂ−ＴＴ／Ｈｉｂ−Ｔ）を、Ｈｉｂ−ＴＴで処理したが再刺激しなかった培養物（Ｈｉｂ−ＴＴ／ＮｏＡｇ）で割って算出した。ＳＩによって実証されるように、複数の細胞内サイトカインが、ｎＭＩＭＩＣ  Ｔ細胞アッセイにおいてＨｉｂ−ＴＴに応答して増加している。
【００６９】
【図４】選択抗原を評価するためのｎＭＩＭＩＣ  ｎａｉｖｅ  ナイーブＴFH／Ｂ細胞モデル。選択抗原は、抗原特異的臍帯血ＴFH細胞を産生するのに用いられる。ついで、ＴFH細胞はＢ細胞と共培養され、上清収集および抗体分析の前に、複合培養物は抗原によって任意に再刺激される。
【００７０】
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂ。ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導ＩｇＭ抗体［ＭｅｎＡＣＹＷ（髄膜炎菌ワクチン）−ＤＴ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ］応答を、ｎＭＩＭＩＣモデルにおいて観察した。ｎＭＩＭＩＣにおけるＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体は、４つ全ての髄膜炎菌血清型（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５）に応答し、いくつかのドナーはバックグラウンドに対する倍率変化の増加を示している。これらの実験において、Ｈｉｂ−ＴＴ（「Ｈｉｂ」）は、関係のない非髄膜炎菌のバックグラウンドコントロールとして働く。図５Ａにおいて、データは、ＩｇＭ抗体の大きさ(ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ)（ＭＳＤ単位で表す）を示し、他方図５Ｂにおいて、データは刺激指数（ＳＩ）またはバックグラウンドＨｉｂ−ＴＴコントロールに対する倍率変化を示している。各バーの上の％は、ＳＩが≧１．５であったドナーの数を表す。
【図５Ｂ】（上記［図５Ａ］の説明と同じ。）
【００７１】
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｂ。ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導ＩｇＧ抗体応答を、ｎＭＩＭＩＣモデルにおいて観察した。ｎＭＩＭＩＣにおいてＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導抗原特異的ＩｇＧ抗体は、４つ全ての髄膜炎菌血清型（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５）に応答し、いくつかのドナーは血清型Ｃのバックグラウンドに対する倍率変化の増加を示している。これらの実験において、Ｈｉｂ−ＴＴ（「Ｈｉｂ」）は、関係のない非髄膜炎菌のバックグラウンドコントロールとして働く。図６Ａにおいて、データはＩｇＧ抗体の大きさ(ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ)（ＭＳＤ単位で表す）を示し、他方図６Ｂにおいて、データは刺激指数（ＳＩ）またはバックグラウンドＨｉｂ−ＴＴコントロールに対する倍率変化を示している。各バーの上の％は、ＳＩが≧１．５であったドナーの数を表す。
【図６Ｂ】（上記［図６Ａ］の説明と同じ。）
【００７２】
【図７】デング熱ウイルスワクチン誘導免疫ＩｇＭ抗体応答が、ｎＭＩＭＩＣモデルで観察された。ｎＭＩＭＩＣモデルにおいてデング熱ワクチン誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体は、４つ全てのデング熱ワクチン血清型（１、２、３、４）に応答し、いくつかのドナーは血清型１、３および４のバックグランドに対する倍率変化の増加を示す。これらの実験において、Ａｃｔ  Ｈｉｂ−ＴＴ（「Ａｃｔ  Ｈｉｂ」）は、関係のない非デング熱ウイルスバックグラウンドコントロールとして働く。抗体大きさを左のグラフに、刺激指数を右のグラフに示す。刺激指数（ＳＩ）は、デング熱抗体産生応答をＡｃｔ−ＨＩＢコントロールで割って算出された。１．５以上のＳＩは、ポジティブ応答と考えられる。
【００７３】
【図８】黄熱ウイルスワクチン誘導抗原特異的ＩｇＧ抗体応答が、ｎＭＩＭＩＣモデルで観察された。ｎＭＩＭＩＣモデルにおいて黄熱ウイルスワクチン誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体は、１７Ｄ黄熱ウイルスワクチンに応答し、いくつかのドナーはバックグランドに対する倍率変化の増加を示す。これらの実験において、デング熱ウイルス（「デング熱」）は、関係のない非黄熱ウイルスバックグラウンドコントロールとして働く。抗体大きさを左のグラフに、刺激指数を右のグラフに示す。刺激指数（ＳＩ）は、黄熱抗体応答をデング熱コントロールで割って算出された。１．５以上のＳＩは、ポジティブ応答と考えられる。
【００７４】
【図９】ＭｅｎＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴは両方とも、４つ全ての血清型の髄膜炎菌性抗ＩｇＭ抗体産生を刺激する：Ａｂ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ。髄膜炎菌性ワクチン誘導ＩｇＭ抗体応答が、ｎＭＩＭＩＣモデルで観察された。両方のワクチンは、ｎＭＩＭＩＣにおいて、我々とは関係のない非髄膜炎菌性Ａｃｔ−ＨＩＢコントロールに対して、臍帯血ドナーのポジティブＩｇＭ抗体応答を示す。
【００７５】
【図１０】ＭｅｎＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴは両方とも、４つ全ての血清型の髄膜炎菌性抗ＩｇＭ抗体産生を刺激する：Ｓｔｉｍ  Ｉｎｄｅｘ。ＩｇＭデータの、髄膜炎菌性ＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴ刺激指数を示す。１．５以上のＳＩは、ポジティブ応答と考えられる。パーセント（％）は、１．５以上のＳＩを有するドナーの数を表す。
【００７６】
【図１１】ＭｅｎＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴは両方とも、４つ全ての血清型の髄膜炎菌性抗ＩｇＧ抗体産生を刺激する：Ａｂ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ。髄膜炎菌性ワクチン誘導ＩｇＧ抗体応答が、ｎＭＩＭＩＣモデルで観察された。ＭｅｎＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴは両方とも、ｎＭＩＭＩＣにおいて、我々とは関係のない非髄膜炎菌性Ａｃｔ−ＨＩＢコントロールに対して臍帯血ドナーのポジティブＩｇＧ抗体反応を示している。
【００７７】
【図１２】ＭｅｎＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴは両方とも、４つ全ての血清型の髄膜炎菌性抗ＩｇＭ抗体産生を刺激する：刺激指数（Ｓｔｉｍ  Ｉｎｄｅｘ）。ＩｇＧデータの、髄膜炎菌性ＡＣＷＹ−ＤＴおよびＡＣＷＹ−ＴＴ刺激指数を示す。１．５以上のＳＩは、ポジティブ応答と考えられる。パーセント（％）は、１．５以上のＳＩを有するドナーの数を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
Ｉ．定義
本明細書で使用する不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、一以上を意味しうる。本明細書において、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、有する、備える）」等と関連して使用される場合、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、一又は複数を意味することがある。本明細書で使用する「他の（ａｎｏｔｈｅｒ）」とは、少なくとも第２の又はそれ以上を意味しうる。更に、文脈による要求がない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
【００７９】
本明細書で使う、「約（ａｂｏｕｔ）」は、明示の有無にかかわらず、数値、例えば、整数、分数、及び百分率について言及する。「約」という用語は、示された値と等価である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と当業者がみなすことができる数値の範囲（例えば、指示された値の＋／−５〜１０％）を、一般的に意味する。場合によっては、用語「約」は、最も近い有効数字に丸められた数値を含むことができる。
【００８０】
本明細書において使う、「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、免疫応答を誘導する薬剤（ａｇｅｎｔ）（例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖、糖脂質など）のことをいうか；および／または、生物に暴露されるか投与されたとき、Ｔ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）、Ｆｃ受容体（例えば、樹状細胞およびマクロファージによって高レベルで発現される、活性化しているＦｃ受容体）、Ｂ細胞受容体によって、または抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される）に、結合する薬剤のことをいう。いくつかの実施形態において、抗原は、生物体において体液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。あるいは又はさらには、いくつかの実施形態において、抗原は、生物体における細胞応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を伴う）を誘発する。
【００８１】
本明細書において用いる、「ワクチン」とは、免疫応答を刺激することができる（例えば、抗原を含有する）投与可能で予防的な、化合物、組成物、または物質のことをいい、それが原因となる病原体（例えば、ウイルス、バクテリア、真菌など）による感染に対する防御を与える（または感染の症状を改善する）。
【００８２】
本明細書中で用いる、「アジュバント」とは、抗原の免疫応答を非特異的に増強する 物質または媒体のことをいう。  アジュバントには、抗原が吸着する、ミネラル（ミョウバン、酸化アルミニウム三水和物、またはリン酸塩）の懸濁液；または、抗原溶液を鉱油で乳化したもの（例えば、フロイント不完全アジュバント）、ときには更に抗原性を増強するために死滅させたミコバクテリウムを含めたもの（フロイント完全アジュバント）、である油中水型エマルション、および 水中油型エマルション（例えば、ＭＦ５９、ＡＳ０３）、を含めることができる。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むもの）を、アジュバントとして使うこともできる。アジュバントは、生体分子（例えば、共刺激分子）も含む。生物学的アジュバントとしては、例えば、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、および４１ＢＢＬが挙げられる。
【００８３】
ＩＩ．本発明
上記にて概説のとおり、本発明は、哺乳類の新生児免疫細胞系のインビトロモデルとして共に役立つ、細胞培養構築物および方法論を提供する。構築物が臍帯血および臍帯血由来の免疫細胞を含む細胞培養物であるので、構築物は、新生児モジュール免疫インビトロ構築物（ｎＭＩＭＩＣ：ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と称する。これらのｎＭＩＭＩＣモデルは、選択薬剤（例えば抗原）に対する若齢期の免疫応答を予測するために用いることができ、それらは、乳幼児および歩き始めの幼児用ワクチンの前臨床評価における第一次評価としても役立てることができる。
【００８４】
ｎＭＩＭＩＣモデルは、臍帯血免疫細胞を利用する。そのような細胞の使用は、細胞研究のために新生児、乳幼児、および歩き始めの幼児から十分に大量の血液を得ることに関連する実用上のおよび倫理的な問題ゆえに、インビトロでの早期免疫を研究するための唯一の実用的アプローチである。臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）は、例えば、米国全体の血液バンクから入手しうる。
【００８５】
公表された文献に見られるように、免疫反応を評価するために臍帯血を利用しているグループがある一方、細胞の種類や濃度の比率、多細胞相互作用、および時空間的細胞動態など、哺乳類の免疫システムの細胞成分のバランスを考慮したシステムは提供されていない。ここに提供されるｎＭＩＭＩＣモデルを用いて、人間の新生児および乳幼児の免疫応答プロファイルが再現される。重要なこととして、ワクチン接種に対する統計的に有意な新生児免疫応答を、数百（フェーズ２試験）または数千（フェーズ３試験）もの乳幼児の参加が必要となる臨床試験よりも、はるかに少ないドナーサンプル（２０〜４０臍帯血単核細胞サンプル）で達成できる。これらのアッセイは、小規模な臨床試験であっても実行するのにかかるコストの何分の一かのコストで実施できる。今日までに出された実験データは、ｎＭＩＭＩＣモデルが、細菌コンジュゲート製剤などの様々なワクチンの免疫原性を評価するためのインビトロバイオミメティックシステムとして役立てることができるという強力な証拠を提供する。ｎＭＩＭＩＣモデルシステムは、非常に実用的かつ達成可能なアプローチを包含するだけでなく、ヒューマンコンポーメント（ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、すなわち乳幼児を利用する必要なしに、ヒト乳幼児免疫系における免疫学的応答を評価するための強力なツールを提供する。これは、複雑な臨床試験を行う前に、新規または改良されたワクチンの処方および使用に関する決定的な結果を提供する。
【００８６】
同様に上記にて概説したとおり、本発明のｎＭＩＭＩＣモデルは、臍帯血からの哺乳類新生児免疫系の成分（例えば、Ｔ、Ｂ、および樹状細胞）を利用し、それらを、インビボの生理学的条件下で観察されるものと同様の比率で、培養物中に提示する能力を提供する。これらのモデルを用いて、本発明者らは、（１）臍帯血由来樹状細胞（ＤＣｓ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて細胞性応答を惹起し、（２）臍帯血由来ＴFH細胞およびナイーブＢ細胞を用いて小児期ワクチンに対する抗原特異的抗体応答を惹起することができた。
【００８７】
このように、本発明は、２つの特定のｎＭＩＭＩＣモデル、ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／ＴセルモデルおよびｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル、並びに、抗原に対する哺乳類新生児免疫系の成分の細胞応答についての情報を提供するために、これらのモデルを使用する方法  および、候補ワクチンの評価において使用する方法、として定めることができる。
【００８８】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデル
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルは、本発明の２つのｎＭＩＭＩＣモデルのうち第一ものである。このモデルは、主として、臍帯血由来樹状細胞（ＤＣｓ）および臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、例えば、新生児抗原提示およびＣＤ４＋Ｔ細胞反応についての選択薬剤の効果をアッセイするために、用いることができる。新生児免疫細胞系は未発達であるので、この種のシステムの抗原およびワクチンに対する応答は、少年（ｊｕｖｅｎｉｌｅ）および大人の免疫系で見られるそれらとは異なることがあり得る。したがって、このモデルは、新生児免疫細胞系の複雑さを研究するばかりではなく、抗原またはワクチンに対する乳幼児であり得そうな応答に関する重要な情報を得るために、用いることができる。
【００８９】
最も広い観念において、ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルは、（ｉ）臍帯血由来の樹状細胞（ＤＣｓ）の集団を調製または取得すること、（ｉｉ）選択薬剤に樹状細胞を曝露し、取り込みを可能にすること、（ｉｉｉ）これらの薬剤刺激された樹状細胞を臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に培養すること、および（ｉｖ）細胞応答を評価すること、によって利用される。よって、このモデルの使用により、新生児樹状細胞による薬剤の取り込みおよび提示、薬剤刺激された樹状細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間の相互作用、および薬剤刺激された樹状細胞によって活性化されるときのＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞応答などの異種の機能性を研究することができる。
【００９０】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／細胞モデルが多くの異なる態様で用いることができることは容易に明らかであろうが、このモデルは、一般的に、選択薬剤に対する新生児免疫系の細胞の応答をインビトロで評価する方法として特徴づけることができる。しかして、本発明は、選択薬剤に対する細胞応答を評価する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）選択薬剤を、臍帯血由来の樹状細胞（ＤＣｓ）を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、前記樹状細胞による前記選択薬剤の取り込みを促進する条件下で細胞培養物を維持し、薬剤刺激された樹状細胞の第１集団を形成し、
（ｂ）（ａ）で発達させた薬剤刺激された樹状細胞と臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、Ｔ細胞の活性化を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｃ）薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、Ｔ細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、ここで、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団は、薬剤刺激された樹状細胞の前記第１集団と同じ方法で調製されており、
（ｄ)Ｔ細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／またはＴ細胞を分析し、それによって選択薬剤に対する細胞応答を評価すること、
を含む。
【００９１】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルは、哺乳類の新生児免疫細胞系の成分に対する活性について選択薬剤（例えば、抗原、ワクチン）をスクリーニングするインビトロでの方法としても特徴づけることもできる。しかして、本発明は、活性について選択薬剤をスクリーニングする方法にも関し、当該方法は下記：
（ａ）選択薬剤を、臍帯血由来の樹状細胞（ＤＣｓ）を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、前記樹状細胞による前記選択薬剤の取り込みを促進する条件下で細胞培養物を維持し、薬剤刺激された樹状細胞の第１集団を形成し、
（ｂ）（ａ）で発生させた薬剤刺激された樹状細胞と臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、Ｔ細胞の活性化を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｃ）薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、Ｔ細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、ここで、薬剤刺激された樹状細胞の前記第２集団は、薬剤刺激された樹状細胞の前記第１集団と同じ方法で調製されており、
（ｄ）Ｔ細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／またはＴ細胞を分析し、それによって活性について選択薬剤をスクリーニングすること、
を含む。
【００９２】
このモデルが使用される場合、他の重要な要因の中でもとりわけ、第１の細胞培養物はある期間は維持され、その期間は培養条件および抗原の同一性に応じて変わる。しかしながら、第１の細胞培養物は、第２の細胞培養物の形成の前に、一般的には、約１から４８時間維持される。適切な期間は、第２の細胞培養物の形成の前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８時間以上、そして、約１２〜３６時間、約１５〜３３時間、約１８〜３０時間、および約２１〜２７時間でありうる。
【００９３】
このモデルが使用される場合、同様に、他の重要な要因の中でもとりわけ、第２の細胞培養物はある期間は維持され、その期間は培養条件および抗原の同一性に応じて変わる。しかしながら、第２の細胞培養物は、薬剤刺激された樹状細胞の第２集合を加える前に、一般的には、約１から２０日の間にかけて維持される。適切な期間は、薬剤刺激された樹状細胞の第２集団を添加する前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日以上、そして、約１０〜２０日、約１２〜２０日、約１４〜１０日、約１６〜２０日、約１２〜１６日、約１４〜１６日、約４〜１０日、約５〜１０日、および約６〜８日でありうる。
【００９４】
このモデルが使用される場合、他の重要な要因の中でもとりわけ、（ｃ）の培養物はある期間は維持され、その期間は培養条件および抗原の同一性に応じて変わる。しかしながら、（ｃ）の培養物は、（ｄ）の分析の前に、一般的には、約１から１０時間の間にかけて維持される。適切な期間は、（ｄ）の分析前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間以上、そして、約６〜１２時間、約８〜１２時間、約１０〜１２時間、約８〜１０時間、約２〜８時間、約３〜７時間、および約４〜６時間程度でありうる。
【００９５】
このモデルが使用される場合、分析されるＴ細胞応答は、例えば、サイトカインまたはマーカーの産生でありうる。サイトカインの例としては、以下に限定されるものではないが、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２およびＩＬ−２６のうちの１つ以上が挙げられる。マーカーの例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１３４、およびＣＤ１５４のうちの１つ以上が挙げられる。
【００９６】
当業者は、本発明のこのモデルまたは他のモデルのいずれかで用いられる選択薬剤は、広く様々なものがあり、樹状細胞によって取り込まれ、提示される能力によってのみ限定されると理解するであろう。適切な薬剤は、一般的に、抗原およびワクチンとして定義することができ、それらは更に、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび多糖、ならびにウイルス、ビリオン、細菌、菌類、およびそれらの断片、として定義することができる。
【００９７】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルにおいて使用することができる免疫細胞は、モデルの使用様式に応じて、単一の臍帯血供給源または２つ以上の供給源に由来し得る。したがって、例えば、臍帯血Ｔ細胞は、臍帯血由来の樹状細胞に対して自家性（すなわち、同じ生物体由来）、または臍帯血由来の樹状細胞に対して同種異系（すなわち、同じ種の別の生物由来）とすることができる。
【００９８】
（ｂ）の培養物中における薬剤刺激された樹状細胞の臍帯血Ｔ細胞に対する比は、モデルの使用様式、選択薬剤の同一性、および培養物中に含まれる他の成分などの要因に応じて変えることができる。樹状細胞のＴ細胞に対する比は、約１：５から約１：１００の範囲でありうる。多くの用途において、比は、約１：２０から約１：８０または約１：３０から約１：５０の範囲でありうるが、許容可能な範囲は、約１：１０〜約１：５０、約１：２０〜約１：６０、約１：１５〜約１：３５、および約１：３０〜約１：５５でもありうる。
【００９９】
同様に、（ｃ）の培養物に添加される、薬剤刺激された樹状細胞の第２集団中の細胞の、臍帯血Ｔ細胞に対する、培養物中における比は、モデルの使用様式、選択薬剤の同一性、および培養物中に含まれる他の成分などの要因に応じて変えることができる。樹状細胞のＴ細胞に対する比は、約１：５から約１：１００の範囲でありうる。多くの用途において、比は、約１：５から約１：５０または約１：５から約１：１５の範囲でありうるが、許容可能な範囲は、約１：５〜約１：２０、約１：１０〜約１：２５、約１：１５〜約１：３０、および約１：２０〜約１：４０でもありうる。
【０１００】
これらの実施形態の側面において、臍帯血由来の樹状細胞は、以下のマーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現することとして特徴づけられうる。
【０１０１】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルで用いられる臍帯血由来樹状細胞は、モデルの使用と併せて用意することができるか、または、他から、例えば、商業的供給源から、入手することができる。樹状細胞は、活性細胞培養物から得ることができるか、または細胞の冷凍アリコートから調製することができる。本発明の一側面において、臍帯血由来の樹状細胞は、下記：
（ａ）細胞培養ウェルの下部チャンバーの上に分離可能に吊される当該ウェルの上部チャンバー内に収容されている多孔質膜の上面で内皮細胞を培養し、
（ｂ）（ａ）の多孔質膜上の内皮細胞に臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）を与え、
（ｃ）前記臍帯血単核細胞を与えてから約４８時間後に、多孔質膜および内皮細胞を収容している前記上部チャンバーを取り外し、
（ｄ）樹状細胞を前記ウェルの下部チャンバーから分離する、
ことを含む方法によって調製することができる。
【０１０２】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する上記の方法において、多孔質膜は、ポリカーボネート膜、または、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、もしくはポリエステル（ＰＥＴ）で構成された膜でありうる。多孔質膜は、通常、例えば単球および未発達の樹状などの細胞が通過できる孔を有する。その孔は、直径が約１から１５μｍの範囲であり、一般的に、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４と１５μｍとの間であろう。ウェルの上部チャンバー、多孔質膜、およびウェルの下部チャンバーを提供するために、透過性支持体を用いてもよい。そのような透過性支持体の例としては、Ｃｏｒｎｉｎｇ社のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）パーミアブルサポートがある。
【０１０３】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する方法において、ウェルの下部チャンバーは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を含みうる。細胞外マトリックス材料は、以下に限定されるものではないが、ゼラチン、コラーゲン、合成細胞外マトリックス材料、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、天然細胞外マトリックス材料、キトサン、プロトサン（ｐｒｏｔｏｓａｎ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニンおよびそれらの混合物から選ばれる材料を含みうる。ウェルの下部チャンバーは、更に、繊維芽細胞、支持細胞、および間質細胞のうちの１つ以上を含みうる。
【０１０４】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する上記の方法において、内皮細胞は、以下に限定されるものではないが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）およびヒト体細胞ハイブリッドＥＡ．ｈｙ９２６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９２２TM；ＡＴＣＣ、マナッサ、バージニア）でありうる。追加の側面において、内皮細胞は、形質転換された内皮細胞系でありうる。
【０１０５】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する上記の方法において、内皮細胞は、多孔質膜の両面に培養してもよい。更に、内皮細胞は、臍帯血単核細胞を加える前に、コンフルエンシーに達するまで培養してもよい。あるいは、内皮細胞は、臍帯血単核細胞を加える前に、多層細胞増殖に達するまで、培養してもよい。
【０１０６】
臍帯血由来の樹状細胞を調製する上記の方法において、細胞外マトリックス材料の層は、多孔質膜の上面にあってもよく、内皮細胞は細胞外マトリックス材料層上に培養される。あるいは、細胞外マトリックス材料の層は、多孔質膜の上面および下面にあってもよく、内皮細胞は、細胞外マトリックス材料の両方の層上に培養される。細胞外マトリックス材料は、以下に限定されるものではないが、ゼラチン、コラーゲン、合成細胞外マトリックス材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然細胞外マトリックス材料、キトサン、プロトサン（ｐｒｏｔｏｓａｎ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、およびそれらの混合物から選ばれる材料を含みうる。
【０１０７】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルが、臍帯血由来の樹状細胞を調製する上記の方法と併せて用いられる場合、 樹状細胞の調製に用いられるウェルの下部チャンバーは、（ａ）の第１の細胞培養物としての役割を果たしうる。あるいは、（ａ）の第１の細胞培養物は、樹状細胞が移される別個の培養物とすることもできる。
【０１０８】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、本発明の２つのｎＭＩＭＩＣモデルのうち第２ものである。このモデルは、臍帯血由来の濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞および臍帯血Ｂ細胞を含んでおり、例えば、新生児抗原提示およびＢ細胞反応についての選択薬剤の効果をアッセイするために用いることができる。ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルと同様に、このモデルもまた、新生児免疫細胞系の複雑さを研究するばかりではなく、抗原またはワクチンに対する乳幼児であり得そうな応答に関する重要な情報を得るために、用いることができる。
【０１０９】
最も広い観念において、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、（ｉ）選択薬剤の存在下において臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞から臍帯血由来ＴFH細胞の集団を調製すること、（ｉｉ）これらのＴFH細胞およびナイーブ臍帯血Ｂ細胞を含む第２の細胞培養物を調製すること、（ｉｉｉ）追加の薬剤またはその断片を培養物に添加すること、（ｉｖ）細胞の応答を評価すること、によって利用される。したがって、このモデルの使用により、ＴFH細胞の成熟、ＴFH細胞による薬剤の取り込みおよび提示、薬剤刺激されたＴFH細胞とＢ細胞との相互作用、ならびにＴFH細胞およびＢ細胞の細胞応答などの異種の機能性を研究することができる。
【０１１０】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルが多くの異なる態様で用いることができることは容易に明らかであろうが、このモデルは、一般的には、選択ワクチンに対する新生児免疫系の細胞の応答を評価するインビトロでの方法として特徴づけることができる。したがって、本発明は、活性についてワクチンをスクリーニングする方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって活性についてワクチンをスクリーニングする、
ことを含む。
【０１１１】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、インビトロのテストを経てワクチンの潜在的効能を評価する、インビトロでの方法として特徴づけることもできる。したがって、本発明はまた、ワクチンの効能を評価する方法にも関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによってワクチンの効能を評価する、
ことを含む。
【０１１２】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、更に、インビトロの細胞培養物を用いてワクチンのインビボにおける効能を予測するインビトロでの方法として特徴づけることができる。したがって、本発明はまた、インビトロの細胞培養を用いてワクチンのインビボにおける効能を予測する方法にも関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、細胞応答が見出された場合、前記ワクチンはインビボでの効能を有すると予測する、
ことを含む。
【０１１３】
加えて、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルは、抗原の免疫原性を評価するインビトロでの方法として特徴づけることができる。したがって、本発明は、抗原の免疫原性を評価する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）抗原および１つ以上の細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１のインビトロ細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で細胞培養物を維持し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と臍帯血Ｂ細胞とを含む第２のインビトロ細胞培養物を形成し、
（ｃ）前記抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で培養物を維持し、
（ｄ）細胞応答について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって抗原の免疫原性を評価する、
ことを含む。
【０１１４】
このモデルが使用される場合、他の重要な要因の中でもとりわけ、第１の細胞培養物はある期間は維持され、その期間は培養条件およびワクチン／抗原の同一性に応じて変わる。しかしながら、一般的には、第１の細胞培養物は約１から２０日間維持される。適切な期間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日以上、そして約７〜１３日、 約８〜１２日、約９〜１１日でありうる。
【０１１５】
このモデルが使われる場合、追加のワクチン／抗原を、１回、２回、３回、またはそれより多く、第１の細胞培養物に添加してもよい。追加のワクチン／抗原は、第１の細胞培養物に添加される最初のワクチン／抗原と同一でもよい。あるいは、追加のワクチン／抗原は、最初のワクチン／抗原が関わるまたは由来するのと同じ病原体または疾患に対する免疫応答を刺激する、異なるワクチン／抗原でありうる。例えば、最初のワクチン／抗原は、特定のウイルスまたは細菌から１つ以上の抗原を含んでいてよく、追加のワクチン／抗原は、同じウイルスまたは細菌から１つ以上の異なる抗原を含んでいてもよい。追加のワクチン／抗原はまた、最初のワクチン／抗原とは異なる処方でもよい。例えば、最初のワクチン／抗原は、アジュバントを用いてもよいし、追加のワクチン／抗原は、アジュバントを用いなくてもよい。特定の一側面において、追加のワクチン／抗原は、少なくとも１回、第１の細胞培養物に添加される。照射を受けたフィーダー細胞を、ワクチン／抗原添加の１回以上の繰り返しの際に、第１の培養物に添加してもよい。照射を受けたフィーダー細胞は、これに限定されるわけではないが、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【０１１６】
追加のワクチン／抗原が添加される場合、最初のワクチン／抗原添加後、２、３または４日目に添加されてもよく、および／または、追加のワクチン／抗原は、最初のワクチン／抗原添加後、５、６または７日目に添加される。特定の一側面において、第１の細胞培養物は約８〜１２日間維持され、追加のワクチン／抗原が、最初のワクチン／抗原添加の後、２、３または４日目のうちの１つの日に添加され、そして、５、６または７日目のうちの１つの日に添加される。
【０１１７】
このモデルが用いられる場合、（ｃ）に添加される抗原またはワクチン特異的抗原は、（ｂ）の細胞培養物が調製された後まもなく、すなわち、（ｂ）の細胞培養物の調製後、約１、２、３、４、５、または６時間以上以内に、添加される。このモデルで用いられるワクチン特異的抗原の同一性は、ワクチンの同一性に基づいて幅広く変わるであろうが、このような抗原は、通常、ワクチンの一部またはワクチンの構成成分である。（ｃ）に添加される抗原またはワクチン特異的抗原は、（ａ）に添加される最初のワクチン／抗原と同一でもよい。あるいは、（ｃ）に添加される抗原またはワクチン特異的抗原は、（ａ）に添加されるワクチン／抗原と異なっていてもよい（すなわち、（ａ）に添加されるワクチン／抗原中に存在しないものでもよい）。あるいは、（ｃ）に添加される抗原またはワクチン特異的抗原は、（ａ）に添加されるワクチン／抗原と異なってもよいが、ステップ（ａ）のワクチン／抗原が関わる同じ病原体または疾患に対して免疫応答を刺激する能力がありうる。例えば、ステップ（ａ）において添加されたワクチン／抗原は、特定のウイルスまたは細菌からの１つ以上の抗原（例えば多糖）を含んでいてもよく、そして、追加のワクチン／抗原は、同じウイルスまたは細菌と異なる１つ以上の抗原（例えばポリペプチド）を含んでいてもよい。
【０１１８】
このモデルが使用される場合、他の重要な要因の中でもとりわけ、（ｃ）の培養物もまた、ある期間は維持され、その期間は、培養条件、およびワクチンまたは抗原の同一性に応じて変わる。しかしながら、（ｃ）の培養物は、一般的には、約１から２５日間維持される。適切な期間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日以上、そして、約１０〜２０日、約１２〜１８日、約１４〜１６日、約７〜１３日、約８〜１２日、および約９〜１１日でありうる。
【０１１９】
これらの実施形態の側面において、ＩＬ−２１を、（ｃ）の培養物に添加してもよい。添加量は変更してよいが、培地中の最終濃度は、一般的には、約１〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲であろう。適切な濃度は、約１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、５０〜３５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ、１００〜４００ｎｇ／ｍｌ、１５０〜５００ｎｇ／ｍｌおよび２００〜５００ｎｇ／ｍｌでありうる。
【０１２０】
ＩＬ−２１が添加される場合、ＩＬ−２１は以下の１つ以上の時点で添加しうる：（ｉ）抗原またはワクチン特異的抗原が（ｂ）の第２の培養物に添加されるとき、（ｉｉ）第２の細胞培養の調製後、２、３または４日目、および（ｉｉｉ）第２の細胞培養物の調製後、５、６または７日目。特定の一側面において、（ｃ）の培養物は、約８〜１２日、１０日間維持され、そして、抗原またはワクチン特異的抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１は、第２の細胞培養物の調製後の２、３または４日目の３日うちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後の５、６または７日目の６日のうちの１つで、添加される。
【０１２１】
このモデルが使われるときに、細胞応答は、ＴFH細胞によるサイトカインの産生、ＴFH細胞によるマーカーの発現、Ｂ細胞によるサイトカインの産生、Ｂ細胞によるマーカーの発現、および抗原に対する結合特異性を有する抗体またはＢ細胞によるワクチン特異的抗原の産生、のうちの１つ以上である。サイトカインは、以下に限定されるものではないが、ＣＸＣＬ１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２１のうちの１つ以上でありうる。マーカーは、以下に限定されるものではないが、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＩｇＤ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つ以上でありうる。
【０１２２】
当業者は、このモデルにおいて用いうるワクチンまたは抗原は、広く様々なものが可能であり、ＴFH細胞によって処理され、Ｂ細胞に対して提示される能力によってのみ限定されることを理解するであろう。適切なワクチンは、一般的には、不活化、弱毒化、トキソイド、サブユニット、コンジュゲート、結合価および異型のワクチンとして定義することができ、それらは更に、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび多糖、ならびに、ウイルス、ビリオン、細菌および菌類などの微生物およびその断片、および抗原刺激された樹状細胞として定義することができる。
【０１２３】
このモデルで使用される細胞活性化因子の１つ以上は、以下に制限されるものではないが、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３でありうる。
【０１２４】
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／ＴFH細胞モデルにおいて使用することができる免疫細胞は、モデルの使用様式に応じて、単一の臍帯血供給源または２つ以上の供給源に由来し得る。したがって、例えば、臍帯血Ｂ細胞は、ＴFH細胞が由来する臍帯血ＣＤ４＋Ｔに対して自家性（すなわち、同じ生物体由来）であり得る。臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して異種（すなわち、異なる種の生物体由来）でさえあり得る。
【０１２５】
このモデルが用いられる場合、臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血Ｂ細胞を（ｂ）の第２の細胞培養物に添加する前に、ＣｐＧ２００６（ＯＤＮ  ２００６；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア）で処理してもよい。ＣｐＧ２００６が用いられる場合、Ｂ細胞は、（ｂ）の第２の細胞培養物を形成する前に、約１〜４８時間、濃度約０．１〜５μｇ／ｍｌの活性化因子で処理される。
【０１２６】
第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、モデルの使用様式、選択薬剤（ワクチンまたは抗原）の同一性、および培養物中に含まれる他の成分などの要因に応じて変えることができる。多くの用途について、比は、約１：１から約１：１００の範囲でありうる。
【０１２７】
このモデルが用いられる場合、第２の細胞培養物は、３次元マトリックス中に形成してもよい。マトリックスは、以下に限定されるものではないが、３Ｄ細胞培養のためのハイドロゲルなどのゲルマトリックスでありうる。マトリックスは、１つ以上の細胞外マトリックス成分を含有してもよく、そのようなものには、以下に限定されるものではないが、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびラミニンのうちの１つ以上が含まれる。
【０１２８】
具体的な一例では、本発明は、インビトロで、活性についてワクチンをスクリーニングする方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチン添加後２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチン添加後５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって、インビトロで、活性についてワクチンをスクリーニングする、
ことを含む。
【０１２９】
他の例では、本発明は、ワクチンの効能をインビトロで評価する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチンの添加の後の２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチンの添加の後の５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによってワクチンの効能をインビトロで評価する、
ことを含む。
【０１３０】
更なる一例において、本発明は、インビトロの細胞培養を用いてワクチンのインビボでの効能を予測する方法に関し、当該方法は下記：
（ａ）ワクチンおよび細胞活性化因子を、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む第１の細胞培養物に添加し、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件下で、約８〜１２日間、細胞培養物を維持し、
ここで、前記細胞活性化因子は、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３のうちの１つ以上であり、
ここで、照射を受けたフィーダー細胞および追加ワクチンを、最初のワクチンの添加の後の２、３または４日目のうちの１つ、および、最初のワクチンの添加の後の５、６または７日目のうちの１つに添加し、
（ｂ）（ａ）で発達したＴFH細胞と自家性臍帯血Ｂ細胞とを含む第２の細胞培養物を３次元マトリックス中で形成し、
ここで、前記第２の細胞培養物中における、ＴFH細胞の臍帯血Ｂ細胞に対する比は、約１：１から約１：１００までの範囲であり、
（ｃ）ワクチン特異的抗原を、（ｂ）の細胞培養物に添加し、細胞応答を促進する条件下で、約１〜２５日間、培養物を維持し、
ここで、前記抗原を添加のうえで、ＩＬ−２１を、第２の細胞培養物の調製後２、３または４日目のうちの１つ、および、第２の細胞培養物の調製後５、６または７日目のうちの１つに、（ｂ）の細胞培養物に添加し、
（ｄ）前記Ｂ細胞による、前記ワクチン特異的抗原に対する結合特異性を有する抗体の産生について、（ｃ）の細胞培養物からの上清および／または細胞を分析し、それによって、このような抗体が見出される場合、前記ワクチンはインビボで効能を有すると予測する、
ことを含む。
【０１３１】
これらの例において、照射を受けたフィーダー細胞は、以下に限定されるものではないが、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）でありうる。
【０１３２】
当業者は、このモデルにおいて用いうるワクチンは、広く様々なものが可能であり、ＴFH細胞によって処理され、Ｂ細胞に提示される能力によってのみ限定されることを理解するであろう。適切なワクチンは、一般的には、不活化、弱毒化、トキソイド、サブユニット、コンジュゲート、結合価および異型のワクチンとして定義することができ、それらは更に、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび多糖、ならびに、ウイルス、ビリオン、細菌および菌類などの微生物、およびそれらの断片、および抗原刺激された樹状細胞として定義することができる。
【０１３３】
このモデルで用いられるワクチン特異的抗原は、ワクチンの同一性に基づいて幅広く変わるであろうが、このような抗原は、通常、ワクチンの一部またはワクチンの構成成分である。
【０１３４】
臍帯血Ｂ細胞は、臍帯血Ｂ細胞を第２の細胞培養物に添加する前に、ＣｐＧ２００６で処理してもよい。ＣｐＧ２００６が用いられる場合、Ｂ細胞は、（ｂ）の第２の細胞培養物を形成する前に、約１〜４８時間、濃度約０．１〜５μｇ／ｍｌの活性化因子で処理される。
【０１３５】
マトリックスは、以下に限定されるものではないが、３Ｄ細胞培養のためのハイドロゲルなどのゲルマトリックススでありうる。
【０１３６】
両方のモデルに適用できる全般的特徴
本発明の各実施形態および側面において、サイトカイン、マーカーおよび他の因子の産生および／または存在についての上清および細胞培養培地の分析は、当業者によく知られ理解されている手段によって実施することができ、以下に限定されるものではないが、そのようなものには、サイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル（例えば、ミリポアのＭＩＬＬＩＰＬＥＸマップTMキット）、ＥＬＩＳＡまたはＭＳＤ（ｍｅｓｏｓｃａｌ  ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）マルチ・アレイ技術が含まれる。
【０１３７】
本発明の各実施形態および側面において、サイトカイン、細胞表面マーカーおよび他の因子の産生および／または発現についての細胞（例えばＴFH細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞）の分析は、当業者によく知られ理解されている手段によって実施することができ、そのようなものには、以下に限定されるものではないが、特異性をもって選択される分子に結合する１つ以上の抗体を用いるフローサイトメトリーが含まれる。
【０１３８】
本発明の各実施形態および側面において、細胞抗体産生についての上清および細胞培養培地の分析は、当業者によく知られ理解されている手段によって実施することができ、そのようなものには、以下に限定されるものではないが、磁気ビーズパネル、ＥＬＩＳＡ、またはＭＳＤマルチ・アレイ技術が含まれる。同様に、本発明の各実施形態および側面において、細胞抗体産生についてのＢ細胞の分析は、当業者によく知られ理解されている手段によって実施することができ、そのようなものには、以下に限定されるものではないが、磁気ビーズパネル、ＥＬＩＳＡ、またはＭＳＤマルチ・アレイ技術が含まれる。
【０１３９】
本発明の各実施形態および側面において、細胞応答（例えばＴFH細胞、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の応答）を促進する培養条件としては、インビトロでの免疫細胞の培養に通常関連した培養条件（例えば、５％ＣＯ2、９５％相対湿度、および３７℃）が含まれる。
【０１４０】
本発明の各実施形態および側面において、ワクチン特異的濾胞性ヘルパーＴ（ＴFH）細胞の発達を促進する条件としては、免疫細胞の培養に通常関連した培養条件（例えば、５％ＣＯ２、９５％相対湿度、および３７℃）が含まれる。
【０１４１】
本発明の各実施形態および側面において、臍帯血細胞の供給源は、ヒト、ヒト以外の霊長類、トリ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコまたは齧歯動物）、または他の哺乳でありうる。
【０１４２】
ＩＩＩ．  実施例
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデル
ｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルの使用について、図１を示しつつ、以下に詳述する。
【０１４３】
末梢組織等価（ＰＴＥ）法を用いて、ヒトの臍帯血樹状細胞を、内皮細胞層（ヒト体細胞ハイブリッドＥＡ．ｈｙ９２６細胞）を含むトランスウェル・システム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ）で生成した。０日目に、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を、孔直径約１〜１５μｍの２４ウェルトランスウェルインサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ）に２０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＭ１９９培地中に、１×１０4から１×１０5細胞の密度で、プレーティングした。６日目に、Ｍ１９９培地を、無血清培地で置換した。７日目に、臍帯血単球（ＣＢＭＣｓ）を集め、無血清培養物中に１×１０6から５０×１０6細胞で、ＥＡ．ｈｙ９２６層を含む２４ウェルトランスウェルインサート上にプレーティングした。樹状細胞がこの層を通って移動するにつれて、それらは抗原を提示する能力を有する成熟細胞に分化した。
【０１４４】
同じく７日目に、２４ウェルトランスウェルにプレーティングされたＥＡ．ｈｙ９２６の第２のセットを、２０％ＦＣＳを含むＭ１９９培地中に用意し、７日間培養し、１３日目に無血清培地に培地交換した。
【０１４５】
８日目に、臍帯血単核細胞を加えた培養物のトランスウェルインサートを取り出し、０日目に調製したＥＡ．ｈｙ９２６細胞を重層した新鮮なトランスウェルと交換した。この時点で、樹状細胞はトランスウェルを通って２４ウェル皿の一番下に移動しており、まだトランスウェルインサートに存在する他の細胞タイプは取り除かれる。続いて、実験用培養物は所定濃度の対象とする抗原で処理する一方、コントロール培養物はビヒクル単独に受けた。この実験では、選択抗原は、ヘモフィルスｂ破傷風トキソイドコンジュゲートワクチン（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｂ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ：Ｈｉｂ−ＴＴ（サノフィ  パスツール））とした。
【０１４６】
９日目に、抗原の存在および非存在において処理された樹状細胞を採取し、単離された臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に１：５から１：１００の間の比（樹状細胞：Ｔ細胞）で共培養し、７日間インキュベートした。臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞は、磁気ビーズ分離によるネガティブセレクションを使用して分離した。１４日目に、臍帯血単核細胞を、第２セットのＥＡ．ｈｙ９２６トランスウェルプレート（７日目に調製）に一晩添加し、抗原処理を、上記のように新鮮なＥＡ．ｈｙ９２６トランスウェルと交換した後の１５日目に加えた。
【０１４７】
１６日目に、第１の樹状細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物を集め、第２の共培養物を、処理および無処置のトランスウェルで生成した樹状細胞の第２のセットを用いて調製した。第１の樹状細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養物を、５×１０4から１×１０6の間でプレーティングし、採取した樹状細胞の第２のセットを５×１０3から１×１０5の間でプレーティングした。トランスウェルで生成した樹状細胞の第２のセットを、フローサイトメトリーによる細胞内のサイトカイン分析の前に、２から１０時間にわたり再刺激した。
【０１４８】
細胞内サイトカインの染色を行い、抗原に応答したＴｈ１（ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＩＬ−２）およびＴｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）サイトカインサブセットの両方の蓄積をフローサイトメトリーよって分析した。フローサイトメトリーには、青色、赤色および紫色レーザーを有するＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）サイトメーター、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェア、ＣＤ４＋Ｔ細胞分析のために以下のパネルを使用した。
【表１】
2019531717.tif 000003
【０１４９】
分析により、Ｈｉｂ−ＴＴを有するｎＭＩＭＩＣ  樹状細胞／Ｔ細胞モデルの刺激が新生児の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に導くことが示された。図２に示すように、複数の細胞内のサイトカインが、ｎＭＩＭＩＣ  Ｔ細胞アッセイにおいてＨｉｂ−ＴＴに応答して増加したことが、フローサイトメトリーを介してアッセイされた。抗原処理された樹状細胞を受け取った臍帯血Ｔ細胞を７日間共培養し、細胞内サイトカイン分析の前に、一方を標的樹状細胞で再刺激し、他方は再刺激しなかった。各着色した一対のうち２本目のバーは、Ｈｉｂ−ＴＴで刺激および再刺激されて培養されたものを示す。
【０１５０】
図３に示すように、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生もまた増加したことが、フローサイトメトリーを介してアッセイされた。図３において、各バーの上の％は、刺激指数（ＳＩ）またはバックグラウンドに対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）が≧１．５であったドナーの数を表す。複数の細胞内のサイトカインが、ＳＩによって示されるように、モデル中のＨｉｂ−ＴＴに応答して増加することが見出された。これらの結果は、フローサイトメトリーを介したサイトカイン評価によって実証されたように、Ｔｈ１（ＴＮＦαおよびＩＬ−８）、Ｔｈ２（ＩＬ−１３、ＩＬ−６）、ならびにＴｈ１７（ＩＬ−１７）の応答が現れ、Ｈｉｂ−ＴＴによる刺激に応答して、臍帯血ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化したことを示す。
【０１５１】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルの使用について、図４を示しつつ、以下に詳述する。
【０１５２】
０日目に、ヒト臍帯血単球（ＣＢＭＣｓ）を集め、無血清培養培地中１×１０6から５０×１０6細胞で、２４ウェル培養プレートのウェルにプレーティングした。ウェルの第１グループは、選択抗原（濃度は選択抗原用に最適化）、抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ）およびを含むＴFH分化カクテルで処理された。ウェルの第２グループは、後のステップでフィーダー細胞として供するため、未処理のままにされた。細胞の第３グループは、ネガティブコントロールとするために、未処理のままとした。選択ワクチンは、髄膜炎菌性多糖体Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ型−１３５ジフテリアコンジュゲートワクチン（ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ：ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｇｒｏｕｐｓ  Ａ，  Ｃ，  Ｙ  ａｎｄ  Ｗ−１３５  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ（サノフィ  パスツール）およびＨｉｂ−ＴＴ（コントロール）であった。
【０１５３】
３日目に、臍帯血単核細胞を、選択したウェルから、強いピペッティングおよび／または細胞を擦過することによってコニカルチューブに採取し、続いて無血清培地でリンスした。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ネガティブセレクションを用いて磁気ビーズ分離によって集められた臍帯血単核細胞から分離した。続いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルにつき、１×１０5から１０×１０6細胞の濃度で、無血清培養培地にプレーティングした。１×１０4から５×１０5の照射を受けた臍帯血単核細胞フィーダー細胞および追加のＴFH分化カクテルを、選択したウェルに添加した。
【０１５４】
６日目、照射を受けたフィーダー細胞（１×１０3〜１×１０5）およびＴFH分化カクテルを、追加で、選択したウェルに添加した。
【０１５５】
１０日目に、ＴFHをウェルから採取し、１×１０4から５×１０5細胞を、１×１０5から１０×１０6の単離された臍帯血Ｂ細胞（ネガティブ磁気ビーズ選択）と共に、３Ｄ細胞培養用のハイドロゲル中で、共培養した。ＴFH細胞のＢ細胞に対する共培養比は、１：１から１：１００の範囲に調製した。ＴFH分化カクテルに存在した同じ抗原を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に添加した。
【０１５６】
１２日目に、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、ＩＬ−２１を添加した（１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）。１４日目に、ＩＬ−２１を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、再び添加した。
【０１５７】
２０日目に、Ｂ細胞を培養物から採取し、培養培地を集めた。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗原特異的抗体産生について、４つすべての髄膜炎菌性血清型抗原（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５）がコーティングされたメソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）９６ウェルプレートを用いて分析した。メソスケールディスカバリーのＩｇＭおよびＩｇＧ二次抗体を、上清中の抗体を検出するために用いた。
【０１５８】
分析により、ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導抗体応答（ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルを用いて発生させることができることが実証された。図５に示されるように、４つすべての髄膜炎菌性血清型（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５）に対するＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体応答（ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）が、数人のドナーにおいて観察された。バックグランドに対する倍率変化の増加が、図５に示される。
【０１５９】
図６に示された結果は、数人のドナーが血清型Ｃについてのバックグランドに対する倍率変化の増加を示し、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルが、髄膜炎菌の各血清型に対するＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ誘導抗原特異的ＩｇＧ抗体応答を示すためにも使用できることを実証している。
【０１６０】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル  −  デング熱
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルの使用について、図４を示しつつ、以下に詳述する。
【０１６１】
０日目に、ヒト臍帯血単球（ＣＢＭＣｓ）を集め、無血清培養培地中１×１０6から５０×１０6細胞で、２４ウェル培養プレートのウェルにプレーティングした。ウェルの第１グループは、選択抗原（濃度は選択抗原によって最適化）、抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ）を含むＴFH分化カクテルで処理した。ウェルの第２グループは、後のステップでフィーダー細胞として供するため、未処理のままとした。細胞の第３グループは、ネガティブコントロールとするために、未処理のままとした。選択ワクチンは、血清型１、２、３および４（サノフィ  パスツール）およびＨｉｂ−ＴＴ（コントロール）からなるデング熱ウイルスワクチンであった。
【０１６２】
３日目に、臍帯血単核細胞を、選択したウェルから強力なピペッティングおよび／または穏やかな擦過によってコニカルチューブに採取し、続いて、無血清培養培地でリンスした。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ネガティブセレクションを用いて磁気ビーズ分離によって採取された臍帯血単核細胞から分離した。続いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルにつき、１×１０5から１０×１０6細胞の濃度で、無血清培養培地にプレーティングした。１×１０4から５×１０5の照射を受けた臍帯血単核細胞フィーダー細胞および追加のＴFH分化カクテルを、選択したウェルに添加した。
【０１６３】
６日目、照射を受けたフィーダー細胞（１×１０3〜１×１０5）およびＴFH分化カクテルを、追加で、選択したウェルに添加した。
【０１６４】
１０日目に、ＴFHをウェルから採取し、１×１０4から５×１０5細胞を、１×１０5から１０×１０6の単離された臍帯血Ｂ細胞（ネガティブ磁気ビーズ選択）と共に、３Ｄ細胞培養用のハイドロゲル中で、共培養した。ＴFH細胞のＢ細胞に対する共培養比は、１：１から１：１００の範囲に調製した。ＴFH分化カクテルに存在した同じ抗原を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養に添加した。
【０１６５】
１２日目に、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、ＩＬ−２１を添加した（１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）。１４日目に、ＩＬ−２１を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、再び添加した。
【０１６６】
２０日目に、Ｂ細胞を培養物から採取し、培養培地を集めた。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗原特異的抗体産生について、４つすべてのデング熱血清型抗原（１、２、３、および４）がコーティングされたメソスケールディスカバリー９６ウェルプレートを用いて分析した。メソスケールディスカバリーのＩｇＭおよびＩｇＧ二次抗体を、上清中の抗体を検出するために用いた。
【０１６７】
分析により、デング熱ウイルス誘導抗体応答（Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルを用いて生じさせることができることが実証された。図７に示されるように、４つすべてのデング熱血清型（１、２、３および４）に対するデング熱ウイルス誘発抗原特異的ＩｇＭ抗体応答（Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）が、数名のドナーで観察された。バックグラウンドに対する倍率変化の増加を、図７に示す。
【０１６８】
図７に示された結果は、数人のドナーが血清型についてのバックグランドに対して倍率変化の増加を示し、ｎＭＩＭＩＣ Ｂ細胞／ ＴFHモデルは、デング熱の各血清型に対するデング熱ウイルス誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体応答を示すためにも使用できることを実証している。
【０１６９】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル  −  黄熱ワクチン
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルの使用について、図４を示しつつ、以下に詳述する。
【０１７０】
０日目に、ヒト臍帯血単球（ＣＢＭＣｓ）を集め、無血清培養培地中１×１０6から５０×１０6細胞で、２４ウェル培養プレートのウェルにプレーティングした。ウェルの第１グループは、ウェルの第１グループは、選択抗原（濃度は選択抗原用に最適化）、抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ）を含むＴFH分化カクテルで処理された。ウェルの第２グループは、後のステップでフィーダー細胞として供するため、未処理のままとした。細胞の第３グループは、ネガティブコントロールとするために、未処理のままとした。選択ワクチンは、１７Ｄ黄熱ウイルスワクチン（サノフィ  パスツール）およびデング熱ワクチン（コントロール）であった。
【０１７１】
３日目に、臍帯血単核細胞を、選択したウェルから強いピペッティングおよび／または細胞を擦過することによってコニカルチューブに採取し、続いて無血清培地でリンスした。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ネガティブセレクションを用いて、磁気ビーズ分離によって採取された臍帯血単核細胞から分離した。続いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルにつき、１×１０5から１０×１０6細胞の濃度で、無血清培養培地にプレーティングした。１×１０4から５×１０5の照射を受けた臍帯血単核細胞フィーダー細胞および追加のＴFH分化カクテルを、選択したウェルに添加した。
【０１７２】
６日目、照射を受けたフィーダー細胞（１×１０3〜１×１０5）およびＴFH分化カクテルを、追加で、選択したウェルに添加した。
【０１７３】
１０日目に、ＴFHをウェルから採取し、１×１０4から５×１０5細胞を、１×１０5から１０×１０6の単離された臍帯血Ｂ細胞（ネガティブ磁気ビーズ選択）と共に、３Ｄ細胞培養用のハイドロゲル中で、共培養した。ＴFH細胞のＢ細胞に対する共培養比は、１：１から１：１００の範囲に調製した。ＴFH分化カクテルに存在した同じ抗原を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養に添加した。
【０１７４】
１２日目に、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、ＩＬ−２１を添加した（１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）。１４日目に、ＩＬ−２１を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、再び添加した。
【０１７５】
２０日目に、Ｂ細胞を培養物から採取し、培養培地を集めた。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗原特異的抗体産生について、１７Ｄ黄熱ウイルスワクチンでコーティングしたメソスケールディスカバリー９６ウェルプレートを使用して分析した。メソスケールディスカバリーのＩｇＭおよびＩｇＧ二次抗体を、上清中の抗体を検出するために用いた。
【０１７６】
分析により、１７Ｄ黄熱ウイルスワクチン誘導抗体応答（１７Ｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルを用いて生じさせることができることが実証された。図８に見られるように、１７Ｄ黄熱ウイルスワクチン誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体応答（１７Ｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）が、数人のドナーにおいて観察された。バックグラウンドに対する倍率変化の増加を、図８の右に示す。
【０１７７】
図８に示された結果は、数人のドナーが血清型についてのバックグランドに対して倍率変化の増加を示し、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルは、１７Ｄ黄熱ウイルスワクチン誘導抗原特異的ＩｇＭ抗体のワクチンに対する応答を示すためにも使用できることを実証している。
【０１７８】
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデル  −  髄膜炎菌性ワクチン
ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFH細胞モデルの使用について、図４を示しつつ、以下に詳述する。
【０１７９】
０日目に、ヒト臍帯血単球（ＣＢＭＣｓ）を集め、無血清培養培地中１×１０6から５０×１０6細胞で、２４ウェル培養プレートのウェルにプレーティングした。ウェルの第１グループは、選択抗原（濃度は選択抗原用に最適化）、抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ）を含むＴFH分化カクテルで処理された。ウェルの第２グループは、後のステップでフィーダー細胞として供するため、未処理のままとした。細胞の第３グループは、ネガティブコントロールとするために、未処理のままとした。選択ワクチンは、髄膜炎菌性多糖体Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ型−１３５ジフテリアコンジュゲートワクチン（ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴ）およびＡ、Ｃ、ＹおよびＷ型−１３５破傷風トキソイドコンジュゲートワクチンおよびＨｉｂ−ＴＴで（コントロール）あった。
【０１８０】
３日目に、臍帯血単核細胞を、選択したウェルから強いピペッティングおよび／または細胞を擦過することによってコニカルチューブに採取し、続いて無血清培地でリンスした。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ネガティブセレクションを用いて磁気ビーズ分離によって採取された臍帯血単核細胞から分離した。続いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルにつき、１×１０5から１０×１０6細胞の濃度で、無血清培養培地中にプレーティングした。１×１０4から５×１０5の照射を受けた臍帯血単核細胞フィーダー細胞および追加のＴFH分化カクテルを、選択したウェルに添加した。
【０１８１】
６日目、照射を受けたフィーダー細胞（１×１０3〜１×１０5）およびＴFH分化カクテルを、追加で、選択したウェルに添加した。
【０１８２】
１０日目に、ＴFHをウェルから採取し、１×１０4から５×１０5細胞を、１×１０5から１０×１０6の単離された臍帯血Ｂ細胞（ネガティブ磁気ビーズ選択）と共に、３Ｄ細胞培養用のハイドロゲル中で、共培養した。ＴFH細胞のＢ細胞に対する共培養比は、１：１から１：１００の範囲に調製した。ＴFH分化カクテルに存在した同じ抗原を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養に添加した。
【０１８３】
１２日目に、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、ＩＬ−２１を添加した（１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）。１４日目に、ＩＬ−２１を、ＴFH細胞／Ｂ細胞共培養物に、再び添加した。
【０１８４】
２０日目に、Ｂ細胞を培養物から採取し、培養培地を集めた。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗原特異的抗体産生について、４つすべての髄膜炎菌性血清型抗原（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５）がコーティングされたメソスケールディスカバリー９６ウェルプレートを用いて分析した。メソスケールディスカバリーのＩｇＭおよびＩｇＧ二次抗体を、上清中の抗体を検出するために用いた。
【０１８５】
分析により、ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴおよびＴＴによって誘導された抗体応答を、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルを用いて生じさせることができることが実証された。図９に示されるように、４つすべての髄膜炎菌性血清型（Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ−１３５）に対するＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴおよびＴＴによって誘導された抗原特異的ＩｇＭ抗体応答が、数人のドナーにおいて観察された。バックグラウンドに対する倍率変化の増加を、図９に示す。図１０もまた、これらのワクチンがＩｇＭ抗体についてのほとんどの血清型に対して１．５を超える刺激指数（ＳＩ）を示したことを実証している。
【０１８６】
図１１は、ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴおよびＴＴの４つの血清型すべてが、我々とは関係のない非髄膜炎菌Ａｃｔ−ＨＩＢコントロールに対して、ポジティブ抗体、ｎＭＩＭＩＣ中の臍帯血ドナーのＩｇＧ応答を示すことを示す。図１２は、ＩｇＧ抗体データの刺激指数（ＳＩ）を示す。
【０１８７】
図９〜１２に示された結果は、数人のドナーがバックグランドに対して倍率変化の増加を示し、ｎＭＩＭＩＣ  Ｂ細胞／ＴFHモデルが、各血清型に対し、ＭｅｎＡＣＹＷ−ＤＴおよびＭｅｎＡＣＹＷ−ＴＴワクチン誘導抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答を示すためにも使用できることを実証している。
【０１８８】
本発明について、特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることは、当業者にとって明らかである。特許請求の範囲は、ここに記述した特定の実施形態に限定されない。
【図１】
2019531717.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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