(57)【要約】  本発明は、オピオイド薬に特異的な抗体を動物において産生させるのに適したオキシコドンおよびヒドロコドンのイムノコンジュゲートを製造するためのハプテンおよびその製造方法を提供する。血清のような体液中にオピオイド薬を含有するヒトへのオピオイド特異的抗体の投与は該オピオイド薬を該抗体に結合させて、該オピオイドを薬物作用の生成に利用不可能にする。したがって、該抗体は、オキシコドンおよびヒドロコドンの薬物過剰摂取の作用を逆転させるために、または多幸感のような該薬物の知覚精神作用を逆転させるために使用されうる。【選択図】図１
2019533020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2019533020.tif 000016
（式中、Ｒ４はＨまたはＯＨである）の化合物を含む、イムノコンジュゲートのためのハプテン。
【請求項２】
式（ＩＩ）
【化２】
2019533020.tif 000017
［式中、Ｒ４はＨまたはＯＨであり、担体は破傷風トキソイド（ＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）である］のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
担体が破傷風トキソイドまたはウシ血清アルブミンである請求項２の式（ＩＩ）のイムノコンジュゲートの有効量を動物に投与し、ついで、オピオイド特異的抗体を含む、動物の免疫系において産生された抗血清を、動物から抽出することを含む、動物においてオピオイド特異的抗体を産生させる方法であって、オピオイド薬がオキシコドンまたはヒドロコドンである、方法。
【請求項４】
オピオイド薬の血清濃度を有するヒトに、有効量または濃度の請求項３記載のオピオイド特異的抗体を投与することを含む、ヒトの体液において抗体結合オピオイド薬を産生させる方法であって、オピオイド薬がオキシコドンまたはヒドロコドンである、方法。
【請求項５】
オピオイド薬の血清濃度を有するヒトに、有効量または濃度の請求項３記載のオピオイド特異的抗体を投与することを含む、オキシコドンまたはヒドロコドンを含むオピオイド薬のヒトにおける作用を阻止する方法。
【請求項６】
オピオイド薬の血清濃度を有するヒトに、有効量または濃度の請求項３記載のオピオイド特異的抗体を投与することを含む、オキシコドンまたはヒドロコドンを含むオピオイド薬のヒトにおける過剰摂取を逆転させることを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
精神作用の知覚を引き起こすのに十分なオキシコドンまたはヒドロコドンのようなオピオイド薬の血清濃度を有するヒトにおけるオピオイドの知覚精神作用を軽減または排除することを含み、有効量または濃度の請求項３記載のオピオイド特異的抗体を該ヒトに投与することを含む、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗オピオイドワクチンに関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年１０月２４日付け出願の米国仮特許出願第６２／４１１，８５０号（その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の優先権を主張するものである。
【０００３】
米国政府の援助に関する陳述
本発明は、米国薬物乱用研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｕｓｅ）により授与された１ＵＨ２ＤＡ０４１１４６−０２に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
オキシコドンおよびヒドロコドンのような処方オピオイド（ＰＯ）は疼痛管理のための非常に有効な薬物であるが、それらは乱用および嗜癖の重大なリスクをも引き起こしうる。ＰＯの消費は世界的に増加しており、過剰摂取により毎年数万人が死亡している。ワクチン接種に基づく薬物動態学的戦略は、ＰＯの乱用を抑制するための魅力的な手段を提示している。本明細書においては、構造的に適合した薬物−ハプテン設計により高アフィニティ抗オピオイド抗体を誘導することが判明した２つの能動的ＰＯワクチンの製造を記載する。これらのワクチンの投与は、薬物血清半減期における先例のない増加と共に、オピオイド鎮痛活性の有意な遮断をもたらした。重要なことに、致命的な過剰摂取に対して能動的ワクチン接種が防御し得ないという非常に困難な制約が否定された。
【０００５】
処方オピオイド（ＰＯ）鎮痛薬は現代の疼痛管理療法の基礎を形成しているが、それらは、最も頻繁に誤用され乱用される薬物の１つである（図１）。実際、米国においては、これらの薬物の違法使用が蔓延のレベルに達しており、２０１４年にはＰＯの過剰摂取による１８，８９３件の死亡が報告されている［１］。注目すべきことに、現在では、これらの薬物は毎年、ヘロインの場合より多数の死者を出している［２］。この傾向は北米に限ったことではなく、ＰＯの消費およびＰＯの過剰摂取は欧州全域、特に英国、ドイツおよびスペインにおいても増加している［３］。ほぼ全てのＰＯの誤用が近年増加しているが、オキシコドンおよびヒドロコドン製品は、最も広範かつ頻繁に乱用されているオピオイドである［１−２，４］。
【０００６】
オキシコドンおよびヒドロコドンは、中枢神経系（ＣＮＳ）においてミュー（μ）オピオイド受容体（ＭＯＲ）を主に活性化する有効な半合成オピオイド鎮痛薬である。しかし、オキシコドンおよびヒドロコドンの陶酔効果により、それらは物質依存症および医原性嗜癖の共通の原因となる。これらの薬物の急性および慢性乱用は呼吸抑制および脳低酸素症のような幾つかの重大な合併症を招きうる。薬物乱用警告ネットワーク（Ｄｒｕｇ  Ａｂｕｓｅ  Ｗａｒｎｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＤＡＷＮ）は、オキシコドンが、救急科受診に関連した最も一般的なＰＯであり（１５１，２１８）、ヒドロコドン（８２，４８０）がそれに続くと報告している［５］。衝撃的なことに、オキシコドンおよびヒドロコドンの過剰摂取に伴うＰＯ関連死は米国では２０００年から２０１４年の間に約４倍増加した［４］。
【０００７】
オキシコドンおよびヒドロコドンの致命的かつ常習性の作用に対処するために、本発明者らはワクチンによる薬物動態（ＰＫ）戦略を追求した。このアプローチにおいては、自由循環オピオイド分子に結合し、それがＣＮＳに侵入してＭＯＲ活性化を誘発するのを妨げうる薬物特異的ＩｇＧ抗体を誘導する小分子−免疫原性タンパク質コンジュゲートを使用する。ＰＯ嗜癖を治療するための伝統的な薬理学的戦略（ＭＯＲアゴニストまたはアンタゴニスト；例えば、メタドン、ブプレノルフィン、ナルトレキソン）と比較して、ＰＫ戦略は、（１）ＭＯＲと直接的に相互作用することなく薬物活性を遮断しうること、（２）有害で不快な副作用が少ないこと、および（３）戦略的に間隔が空けられたブースター注射を行うことにより循環抗体が１年間まで持続することを含む幾つかの利点を有する［６］。概ね、そのようなワクチンは、過度のコンプライアンス要求を患者に課すことなく、長期間にわたって標的薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を有効に抑制しうる。
【発明の概要】
【０００８】
概略
本発明は、種々の実施形態において、式（Ｉ）
【化１】
2019533020.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ４はＨまたはＯＨである）の化合物を含む、イムノコンジュゲートのためのハプテンを提供する。式（ＩＩ）
【化２】
2019533020.tif 000004
【００１０】
［式中、Ｒ４はＨまたはＯＨであり、担体は破傷風トキソイド（ＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）である］のイムノコンジュゲートは式（Ｉ）のハプテンから製造されうる。
【００１１】
式（ＩＩ）のイムノコンジュゲートは、応答性抗体の産生のために動物に投与された場合、ヒトにおいて血清濃度のオキシコドンまたはヒドロコドンに結合するのに適したオピオイド特異的抗体を動物において産生させうる。抗体産生方法は、担体が破傷風トキソイドまたはウシ血清アルブミンである式（ＩＩ）のイムノコンジュゲートの有効量を動物に投与し、ついで、オピオイド特異的抗体を含む、動物の免疫系で産生された抗血清を動物から抽出することを含む。
【００１２】
本発明は更に、種々の実施形態において、オピオイド薬（ここで、該オピオイド薬はオキシコドンまたはヒドロコドンである）の血清濃度を有するヒトに、有効量または濃度のオピオイド特異的抗体を投与することを含む、ヒトの体液において抗体結合オピオイド薬を産生させる方法を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、オピオイド薬の血清濃度を有するヒトに、有効量または濃度のオピオイド特異的抗体を投与することを含む、オキシコドンまたはヒドロコドンを含むオピオイド薬のヒトにおける作用を阻止する方法を提供しうる。
【００１４】
したがって、本発明は更に、オピオイド薬の血清濃度を有するヒトに、有効量または濃度のオピオイド特異的抗体を投与することを含む、オキシコドンまたはヒドロコドンを含むオピオイド薬のヒトにおける過剰摂取を逆転させる方法を提供しうる。
【００１５】
更に、本発明はまた、精神作用を引き起こすのに十分なオキシコドンまたはヒドロコドンのようなオピオイド薬の血清濃度を有するヒトにおけるオピオイドの知覚精神作用を軽減または排除する方法であって、有効量または濃度のオピオイド特異的抗体を該ヒトに投与することを含む方法を提供しうる。例えば、知覚精神作用は多幸感でありうる。
【００１６】
詳細な説明
オキシコドンおよびヒドロコドンを標的とするコンジュゲートワクチンは共に既に開示されているが、これらの研究において使用されたハプテンは、免疫薬物療法の概念に基づく、問題の薬物の適切な化学構造を完全には維持していなかった［７］。本発明者らが既に公開しているとおり、標的薬物の元の構造を忠実に維持しているハプテンは、そうでないものよりも、高アフィニティ抗体の産生において優れていることが多い［８］。この一般的な設計原理を考慮して、本発明者らは、オキシコドンおよびヒドロコドンの両方のＮ−メチル基を無水コハク酸由来のリンカーで置換することを選択した。
【００１７】
この免疫化学的知見に基づいて、オキシコドン−ＴＴ（オキシ−ＴＴ）およびヒドロコドン−ＴＴ（ヒドロ−ＴＴ）の合成を、スキーム１に示されているとおりに達成した。重要なことに、スクシンアミド酸部分を有するＮ−ブチル基によるオキシコドンおよびヒドロコドンのＮ−メチル基の置換は、標準的なアミドアップリング条件下で破傷風トキソイド（ＴＴ）にハプテンがコンジュゲート化されることを可能にした（スキーム１）［９］。本発明者らが本発明者らの担体タンパク質としてＴＴを選択したのは、乱用薬物に対するワクチンにおけるその有効性が実証されているからである［１０］。コンジュゲート化後、オキシ−ＴＴおよびヒドロ−ＴＴの両方をアジュバントとしてのミョウバンおよびＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６と共に製剤化した。これらも本発明者らの過去の研究の過程で良好な有効性を示している［１０−１１］。
【化３】
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【００１８】
得られたワクチンを４回の腹腔内（ＩＰ）注射でマウスに投与した。この一連の事象により、オキシ−ＴＴおよびヒドロ−ＴＴの両方は、それらのコグネイト（同族）コーティング抗原に対して試験された場合、高い抗体中点力価（オキシ−ＴＴでは約４００，０００、そしてヒドロ−ＴＴでは２００，０００）を誘導した（図２）。注目すべきことに、これらの力価は研究終了時までに幾分低下したが、第７０日の両方の動物コホートにおいて尚も相当な抗体の存在が認められた。
【００１９】
本発明者らのワクチンの機能的有効性を評価するために、げっ歯類モデルにおけるオピオイド薬の上脊髄性および脊髄性鎮痛効力を測定するためにしばしば使用されるホットプレートおよびテールフリック抗侵害受容アッセイ［１２］の両方を行った。これらのアッセイにおいては、オキシコドンおよびヒドロコドンは用量反応的に疼痛閾値を上昇させ、それらの有効性は、数回の投与にわたる熱刺激に対する応答潜時を測定することにより定量されうる。ワクチン接種マウスからの抗体は標的薬物に結合し、それらの薬理学的効果を鈍化するため、有効なワクチンはこれらの抗侵害受容アッセイにおいて右方向へのシフトを示すであろう。本研究においては、ワクチン接種はオキシコドンおよびヒドロコドンの両方のＥＤ５０に関して大幅な増加をもたらした（オキシ−ＴＴにより９．０６±０．６１ｍｇ、ヒドロ−ＴＴにより１５．１７±０．５０ｍｇ）。用量比としてのこれらのＥＤ５０シフトの定量（オキシコドンＥＤ５０における約１０倍のシフト、およびヒドロコドンＥＤ５０における約６倍のシフト）は、ワクチン接種が達成しうる有意な薬力学的緩衝能を示した（図３）。
【００２０】
この戦略の機能的有用性を更に特徴づけるために、本発明者らは次に、得られた抗体がインビトロで臨床的に妥当な濃度のそれらの２つのＰＯに結合する能力を調べた。オキシコドン乱用者およびヒドロコドン乱用者における最近の臨床試験は、約３００ｎｇ／ｍＬの定常状態血清濃度が高揚感の主観的知覚と相関することを示した［１３］。したがって、本発明者らのワクチンが、この濃度を有効に遮断するための強力な抗体応答を生成させうるかどうかを判断するために、オキシ−ＴＴおよびヒドロ−ＴＴでワクチン接種されたマウスからの血清を３００ｎｇ／ｍＬのオキシコドンおよびヒドロコドンでチャレンジした。ついで、透析膜を横切って拡散しうる薬物の量をＬＣＭＳにより定量した。喜ばしいことに、本発明者らは、ワクチン接種マウスからの血清がこの濃度の全ての遊離薬物に結合しうるが、ワクチン未接種血清はこれらの種に対する特異的結合を示さないことを見出した。予想通り、各ワクチンにより産生された抗体はオキシコドンとヒドロコドンとを識別しなかった。この後者の知見は、一見すると、ハプテンが薬物と構造的に合致する必要があるという本発明者らの仮説に反するように思われる。しかし、オキシ−ＴＴまたはヒドロ−ＴＴハプテンに基づく単純な分子モデリング実施は、Ｃ−１４位の原子が空間的に隔離されていることを示しており、したがって、これは、免疫系により識別されない免疫化学的にサイレントなエピトープである。
【００２１】
本発明者らは次に、薬物代謝に対するワクチンの効果を検討した。オキシコドンおよびヒドロコドンの代謝クリアランス速度を測定するために、両方の薬物を含有するカセット製剤をワクチン接種マウスおよびワクチン未接種マウスに投与し、ついで２４時間にわたって連続的な採血を行った［１４］。ついで、各時点で血中に残存する薬物の量を、ＬＣＭＳを用いて定量した（図４）。ワクチン未接種マウスにおいては、オキシコドンおよびヒドロコドンは１０〜２０分の血清半減期を有することが判明した。驚いたことに、ワクチン接種は薬物半減期を１２〜３８．５時間に延長し、これは、ワクチン未接種動物と比較して６８〜２６８倍の増加であった。ニコチンに対するワクチン接種は半減期における７．４倍を示したに過ぎなかったというファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）による報告［１４］とこれとは対照的であった。本発明者らの分析は、ワクチンが血清中の薬物のピーク濃度を増加させていることをも示した。これは、ワクチン接種が末梢において遊離薬物を隔離するという予想と一致している。半減期（ｔ１／２）はｔ１／２＝（０．６９３  ＊  Ｖｄ）／ＣＬの関係により決定されるため、これらの知見は、半減期に対するワクチンの効果が薬物の分布容積（Ｖｄ）の増加よりもクリアランス（ＣＬ）速度の減少によるものである可能性が高いことを示している。
【００２２】
これらの観察された薬力学的効果と薬物動態学的効果との間の関連性を評価するために、本発明者らは次に、ワクチンがオキシコドンおよびヒドロコドンの体内分布をどのように変化させうるのかを調べた。ワクチン接種およびワクチン未接種マウスをオキシコドンまたはヒドロコドンで処理した後、１５分の時点でマウスを急速断頭により犠死させ、血液および脳における薬物濃度をＬＣＭＳにより測定した。前記で考察したＰＫデータの場合と同様に、この実験からの本発明者らの結果は、ワクチン誘導血清抗体が血中の大量の遊離薬物を有効に捕捉しうることを明らかに示している（図５）。興味深いことに、全てのマウスに等量の薬物が投与されたが、ワクチン接種マウスにおいて見出された薬物の総濃度はワクチン未接種動物におけるよりも高いようであった。前記のインビトロ血清結合結果と併せて考察すると、ワクチン接種動物の血流中の未結合薬の割合の有意な減少が試験化合物の肝クリアランスの速度を最終的に制限していると考えられる。
【００２３】
これら２つのワクチンの顕著な薬物動態学的効果が確認されたため、本発明者らは、ワクチンのポリクローナル反応の、より深い理解を追求することにし、効力を更に解析するための手段として、それらの動力学を調べた。したがって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に注目した（表１）。ここで、本発明者らは、各オピオイドに関する抗体結合動力学を直接測定することができた（ｋａ：会合速度定数、ｋｄ：解離速度定数、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ：解離平衡定数）［１０ｂ］。この設計戦略を用いて、アフィニティ精製ポリクローナル免疫グロブリンＧ（ｐＩｇＧ）をＳＰＲチップ上にローディングし、遊離ＰＯでチャレンジした。表１に示されているとおり、抗オキシコドンおよび抗ヒドロコドンｐＩｇＧは共に、両方のコグネイト薬に対する極めて高いアフィニティ（ナノモル以下のＫＤ）を示した。前記のとおり、この交差反応性は、免疫サイレント（ｉｍｍｕｎｏｓｉｌｅｎｔ）化学エピトープであるＣ−１４位によるものである。一方、該ｐＩｇＧは、モルヒネに対しは、より低いアフィニティを有していた。これは、おそらく、Ｃ−３（ヒドロキシル）、Ｃ−６（ヒドロキシル）およびＣ−７，８（アルケン）におけるその大きな構造上の相違によるものであろう。この解釈はヘロインおよびフェンタニルに関する比較的弱いＫＤによっても裏付けられている。追加的な薬物−ハプテン構造分析は、２つの嵩高いアセチルとＣ−７，８−アルケンとを含有するヘロインおよびモルフィナン骨格を欠くフェンタニルがこれらの薬物に対する低い抗体アフィニティをもたらす理由を示している。したがって、構造的に異なる鎮痛薬は尚も、オキシ−ＴＴまたはヒドロ−ＴＴで治療された個体における疼痛管理のための有効な治療選択肢でありうる。
【００２４】
誘導抗体は遊離オキシコドンおよびヒドロコドンに対する極めて高いアフィニティおよび長期的な結合の両方を示したため、急性過剰摂取に対して防御するオキシ−ＴＴおよびヒドロ−ＴＴの能力を評価した。ワクチン未接種マウスに４２６ｍｇ／ｋｇのオキシコドンを皮下（ＳＣ）投与した場合、２４時間の時点で１４．２％の生存率が認められたが、オキシ−ＴＴワクチン接種動物においては、全生存率は３７．５％に増加した。同様に、８６ｍｇ／ｋｇのヒドロコドンが皮下投与されたワクチン未接種マウスにおいては、２４時間の時点で２５％の生存率が認められたが、ヒドロ−ＴＴでワクチン接種された動物の６２．５％が生存した（図６）。本発明者らがこれらの結果を強調するのは、過去３０年間にわたり、ワクチン接種および過剰摂取治療は、モノクローナル抗体（受動ワクチン）の大きなボーラスを使用してのみ可能であると考えられていたからである。明らかに、これらの能動的ワクチンは完全な防御をもたすわけではないが、本発明者らの知見は、能動的ワクチンが薬物過剰摂取を軽減し得ないと主張している散在する懐疑論者および更には否定論者に異議を唱えるものである。
【００２５】
要約すると、これらのオピオイドコンジュゲートワクチンは、それらのコグネイト（同族）オピオイドの中枢性薬力学的作用の十分なインビボ中和を示す高アフィニティ抗体の強力な産生を示す一方で、更には、血流中のこれらの化合物の半減期を劇的に延長させた。重要なことに、本研究はまた、オキシ−ＴＴおよびヒドロ−ＴＴワクチンがヒドロコドンおよびオキシコドンの致死量による急死を抑制しうることを立証しており、これは、最終的に、広がりつつあるＰＯ過剰摂取の蔓延をくいとめるのに役立ちうる。本発明において設計されたハプテン方法論は、他のクラスの頻繁に乱用される薬物に関する将来のワクチン接種研究を活気づけると期待される。
【００２６】
引用文献
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［１０］ａ）Ｎ．Ｔ．Ｊａｃｏｂ，Ｊ．Ｗ．Ｌｏｃｋｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｂ．Ａ．Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．Ｅｕｂａｎｋｓ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１６，５９，２５２３−２５２９；ｂ）Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ａ．Ｋｉｍｉｓｈｉｍａ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｂ．Ｚｈｏｕ，Ｋ．Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１６，５５，３７７２−３７７５．
［１１］Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｊ．Ｍ．Ｌｉｖｅｌｙ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ２０１４，１１，１０７５−１０８０．
［１２］Ａ．Ｗ．Ｂａｎｎｏｎ，Ａ．Ｂ．Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｕｎｉｔ  ８  ９．
［１３］Ｔ．Ｌ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｋ．Ｄｅｖａｒａｋｏｎｄａ，Ｋ．Ｋｏｓｔｅｎｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｔ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｐａｉｎ  Ｍｅｄ  ２０１５．
［１４］Ｍ．Ｊ．ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，Ｄ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，Ｎ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｂｅｎｏｉｔ，Ｓ．Ｐ．ＭｃＥｌｈｉｎｅｙ，Ｍ．Ｕｎｎｉｔｈａｎ，Ｓ．Ｃ．ＤｅＭａｒｃｏ，Ｂ．Ｃｌａｙ，Ｃ．Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｄｅｏｒａ，Ｊ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎ，Ｄ．Ｒ．Ｓｔｅａｄ，Ｊ．Ｒ．Ｍｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１６，３８，１８４−１９６．
【表１】
2019533020.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は処方オピオイドおよびヘロインの構造を示す。
【図２】図２は実験の時系列ならびに抗オキシコドンおよび抗ヒドロコドン抗体価を示す。５０μｇのオキシ（Ｏｘｙ）−ＴＴおよびヒドロ（Ｈｙｄｒｏ）−ＴＴを１ｍｇのミョウバンおよび５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６と共に製剤化（処方）し、Ｎ＝６のマウスにそれぞれＩＰ投与した。オキシ−ＢＳＡおよびヒドロ−ＢＳＡコンジュゲートに対するＥＬＩＳＡにより、力価を決定した。略語：ａ＝抗侵害受容アッセイ、ｂ＝出血、ｂｂ＝血液／脳内分布研究、ｐ＝ＰＫ研究、ｓ＝ＳＰＲ分析、ｖ＝ワクチン接種。点は平均±ＳＥＭを示す。
【図３】図３はホットプレート（Ａ〜Ｄ）およびテールフリック（Ｅ〜Ｈ）抗侵害受容アッセイにおける腹腔内ワクチン接種マウスおよびワクチン未接種マウス（ｎ＝６）の行動結果に関するデータを示す。ワクチン接種マウスおよびワクチン未接種マウスに特定の薬物を累積的に投与し、侵害受容までの潜時をホットプレートおよびテールフリック試験により測定した。バーは平均値±ＳＥＭを示す。＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１  両側ｔ検定。
【図４】図４は、４ｍｇ／ｋｇのオキシコドンおよびヒドロコドンの腹腔内カセット注射の後の、ワクチン接種マウスおよびワクチン未接種マウス（全体でｎ＝６、時点当たりｎ＝２）に関する血清薬物動態結果を示す。バーは平均＋ＳＥＭを示す。点線は各回帰に関する９５％  ＣＩを表す。
【図５】図５は血液および脳サンプルにおけるオキシコドンおよびヒドロコドンの体内分布に関するグラフによる証拠を示す。ワクチン接種マウスおよび未処置マウス（それぞれｎ＝３）に８ｍｇ／ｋｇのヒドロコドンまたは４ｍｇ／ｋｇのオキシコドンを腹腔内投与し、ついで、注射の１５分後に幹血および脳を採取した。薬物の定量をＬＣＭＳ分析により行った。バーは平均値±ＳＥＭを示す。＊＝ｐ＜０．０１。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１  一元配置分散分析。
【図６】図６は致死量の処方オピオイドの投与び後の生存率に関するグラフによる証拠を示す。ワクチン接種動物およびワクチン未接種動物（ｎ＝７〜８）に４２６ｍｇ／ｋｇのオキシコドン（Ａ）または８６ｍｇ／ｋｇのヒドロコドン（Ｂ）を皮下投与し、生存率を連続的に１２０分間測定し、ついで注射の１２時間後および２４時間後に再び測定した。
【００２８】
実施例
化学
核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ））スペクトルは、特に示されていない限り、Ｂｒｕｋｅｒ６００装置で測定した。１Ｈ  ＮＭＲの化学シフトはクロロホルム（７．２６ｐｐｍ）またはメタノール（３．３１ｐｐｍ）からの高磁場側のｐｐｍで示されており、カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）単位で示されている。スピン多重度に関しては以下の略語が用いられる：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード（幅広）。１３Ｃ  ＮＭＲの化学シフトは重水素化クロロホルムの７７．０ｐｐｍまたは重水素化メタノールの４９．３ｐｐｍの三重線の中心線に対するｐｐｍで示されている。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量はＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ  ＩｏｎＴｒａｐで得た。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量スペクトルはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＥで得た。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は厚さ０．２５ｍｍのシリカゲル６０  Ｆ２５４のＭｅｒｃｋプレコート分析プレート上で行った。分取ＴＬＣ（ＰＴＬＣ）分離は、シリカゲル６０  Ｆ２５４でプレコートされたＭｅｒｃｋ分析プレート（厚さ０．５０または０．２５ｍｍ）上で行った。
【００２９】
動物
６〜８週齢の雄Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝６／群）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手した。温度および湿度が制御された部屋を含むＡＡＡＬＡＣ認証動物施設において、マウスを群れで収容し、マウスを逆の光周期（点灯：午後９時〜午前９時）で維持した。全ての実験は、暗期、一般的には午後１時〜午後４時の間に行った。全般的な健康状態はＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの科学者および獣医職員の両方によりモニターされ、全ての研究はスクリップス動物保護および使用委員会（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）および米国国立衛生研究所の介護および使用のための指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従い実施された。１００〜１５０μＬの全血を集めるために、尾先端切断（＜１ｃｍ）または後眼窩穿刺を用いて血清サンプルを採取し、ついでサンプルを１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離した。
【００３０】
ハプテンの合成
オキシコドンハプテンの合成
【化４】
2019533020.tif 000007
【００３１】
ＣＨＣｌ３（１．０ｍＬ）中の１（３２．３ｍｇ，１０２μｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨＣＯ３（８６．０ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）および１−クロロエチルクロロホルマート（６０．０μＬ，５４５μｍｏｌ）を室温で加え、ついで反応混合物を、撹拌しながら、還流するまで加熱した。還流温度で２２時間攪拌した後、追加的な１−クロロエチルクロロホルマート（３０．０μＬ，２７２μｍｏｌ）を室温で反応混合物に加え、ついで反応混合物を再び、撹拌しながら、還流するまで加熱した。還流温度で更に３時間撹拌した後、反応混合物を室温に冷却し、ついでＭｅＯＨ（２．０ｍＬ）で処理した。室温で６時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１で抽出した。水層をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１で３回抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留油状物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１）により精製して、ノルオキシコドン（２３．１ｍｇ，７４．８％）を無色油状物として得た［１］。
【００３２】
１，２−ジクロロエタン（７００μＬ）中のノルオキシコドン（２３．１ｍｇ，７６．６μｍｏｌ）の溶液にＮａ２ＳＯ４（３２．６ｍｇ，２３０μｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃプロリジン−２−オール（４３．０ｍｇ，２３０μｍｏｌ）［２］およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２５．０ｍｇ，１１４μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１で抽出した。水層をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１で３回抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留油状物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）により精製して、２（３０．７ｍｇ，８４．７％）を無色油状物として得た。
【００３３】
［α］２３Ｄ−１１３．１（ｃ  １．００，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．７０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｓ，１Ｈ），４．５６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０２（ｔｄ，Ｊ＝１４．４，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．６０（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．５３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），２．４０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．３０（ｄｔ，Ｊ＝１４．４，３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．１６（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），２．０４（ｔｄ，Ｊ＝１７．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），１．９７（ｔｄ，Ｊ＝１２．６，５．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８８（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８４−１．７８（ｍ，１Ｈ），１．６２（ｔｄ，Ｊ＝１５．０，３．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５８（ｂｒ  ｄｄ，Ｊ＝１２．６，４．２Ｈｚ，１Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２０８．５，１５６．０，１４５．０，１４３．０，１２９．４，１２４．９，１１９．４，１１４．９，９０．３，７０．３，６２．９，５６．６，５３．９，５０．７，４５．９，４３．５，４０．３，３６．１，３１．５，３０．６，２８．４（３Ｃ），２７．９，２４．８，２２．９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）４７３．２６５７（Ｃ２６Ｈ３７Ｎ２Ｏ６としての計算値：４７３．２６５２）。
【化５】
2019533020.tif 000008
【００３４】
ＣＨ２Ｃｌ２（６００μＬ）中の２（３０．７ｍｇ，６４．９μｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（６０．０μＬ）を室温で加えた。室温で２時間撹拌した後、反応混合物を真空中でトルエンと共蒸発させた。残留油状物を、更に精製することなく、次工程で使用した。
【００３５】
１，４−ジオキサン（６００μＬ）中の粗化合物の溶液にＴＥＡ（１９．５μＬ，１４０μｍｏｌ）および無水コハク酸（６．６ｍｇ，６３．９μｍｏｌ）を室温で加え、ついで反応混合物を１００℃に加熱した。１００℃で１時間撹拌した後、反応混合物を真空中で蒸発させた。残留固体をＰＴＬＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１）により精製して、３（１２．３ｍｇ，２工程で４０．１％）を白色固体として得た。
【００３６】
［α］２２Ｄ−７７．１（ｃ  ０．５０，ＣＨ３ＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ６．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），３．４０（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，７．８，５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｄ，Ｊ＝１９．８，１Ｈ），３．１８（ｄｔ，Ｊ＝１３．８，２．４Ｈｚ，２Ｈ），３．１４（ｔｄ，Ｊ＝１３．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ｔｄ，Ｊ＝１４．４，４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０２（ｄｄｄ，Ｊ＝１９．２，６．０，１．２Ｈｚ，１Ｈ），２．９７（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，１０．８，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｔｄ，Ｊ＝１３．２，５．Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｑ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．６，６．０Ｈｚ，１Ｈ），２．５０（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．０，６．６，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４６（ｄｄ，Ｊ＝９．０，５．４Ｈｚ，１Ｈ），２．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．０，７．２，６．０Ｈｚ，１Ｈ），２．２２（ｄｔ，Ｊ＝１５．０，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０６（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，４．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８２−１．７３（ｍ，１Ｈ），１．７３−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．６３（ｔｄ，Ｊ＝１４．４，３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．６２−１．５５（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ２０９．７，１８０．１，１７６．３，１４６．７，１４５．０，１２９．８，１２４．７，１２１．７，１１７．９，９１．２，７１．６，６４．０，５７．９，５４．７，５１．０，４７．６，３８．９，３６．３，３３．７，３３．６，３２．７，２９．８，２７．９，２４．４，２３．０；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）４７３．２２９５（Ｃ２５Ｈ３３Ｎ２Ｏ７としての計算値：４７３．２２８８）。
【００３７】
ヒドロコドンハプテンの合成
【化６】
2019533020.tif 000009
【００３８】
ＣＨＣｌ３（４００μＬ）中の４（４４．８ｍｇ，１５０μｍｏｌ）の溶液にＮａＨＣＯ３（５０．０ｍｇ，５９５μｍｏｌ）および１−クロロエチルクロロホルマート（３３．０μＬ，２９７μｍｏｌ）を室温で加え、ついで反応混合物を、攪拌しながら、還流するまで加熱した。還流温度で４．５時間撹拌した後、反応混合物を室温に冷却し、ついでＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）で処理した。室温で１１時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１で抽出した。水層をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１で３回抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留油状物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝５：１）により精製して、ノルヒドロコドン（３１．９ｍｇ，７４．７％）を無色油状物として得た。
【００３９】
１，２−ジクロロエタン（５００μＬ）中のノルヒドロコドン（１５．６ｍｇ，５４．６μｍｏｌ）の溶液にＮａ２ＳＯ４（２３．２ｍｇ，１６３μｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃプロリジン−２−オール（３０．６ｍｇ，１６３μｍｏｌ）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１７．８ｍｇ，８１．４μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で２．５時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１で抽出した。水層をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１で３回抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留油状物をＰＴＬＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９：１）により精製して、５（２０．７ｍｇ，８３．０％）を無色油状物として得た。
【００４０】
［α］２３Ｄ−８６．４（ｃ  １．００，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．６９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．６４（ｓ，１Ｈ），３．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．１４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），２．９５（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．６４（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５３（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），２．４１（ｄｔ，Ｊ＝１３．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｂｒ  ｄｄ，Ｊ＝１３．８，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．３５−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．１５（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），２．０９（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．８３（ｄｑ，Ｊ＝１２．６，４．２Ｈｚ，１Ｈ），１．７９（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），１．６１−１．５０（ｍ，３Ｈ），１．５０−１．３８（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．２４（ｑｄ，Ｊ＝１３．８，３．６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２０７．８，１５６．０，１４５．４，１４２．８，１２７．３，１２６．１，１１９．７，１１４．６，９１．３，５７．３，５６．８，５４．３，４７．３，４５．０，４２．３，４０．５，４０．２，３５．３，２８．５（３Ｃ），２８．４（２Ｃ），２７．８，２５．６，２０．８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）４５７．２７０９（Ｃ２６Ｈ３７Ｎ２Ｏ５としての計算値：４５７．２７０２）。
【化７】
2019533020.tif 000010
【００４１】
ＣＨ２Ｃｌ２（４００μＬ）中の５（１８．６ｍｇ，４０．７μｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（４０．０μＬ）を室温で加えた。室温で５時間撹拌した後、反応混合物を真空中でトルエンと共蒸発させた。残留油状物を、更に精製することなく、次工程で使用した。
【００４２】
１，４−ジオキサン（４００μＬ）中の粗化合物の溶液にＴＥＡ（１７．０μＬ，１２２μｍｏｌ）および無水コハク酸（４．１ｍｇ，３９．７μｍｏｌ）を室温で加え、ついで反応混合物を１００℃に加熱した。１００℃で２時間撹拌した後、反応混合物を真空中で蒸発させた。残留固体をＰＴＬＣ（ＳｉＯ２；ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＭｅＣＮ＝６：１．５：２）により精製して、６（１１．９ｍｇ，２工程で６３．９％）を白色固体として得た。
【００４３】
［α］２２Ｄ−５０．９（ｃ  ０．７８，ＣＨ３ＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ６．８３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｓ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．８９−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．３１−３．２９（ｍ，１Ｈ），３．２０（ｂｒ  ｄｄ，Ｊ＝１３．２，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．０９（ｄｔ，Ｊ＝１０．２，６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｄｔ，Ｊ＝１２．６，３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，Ｊ＝１９．８，６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｔｄ，Ｊ＝１３．８，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｔｄ，Ｊ＝１２．６，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４６（ｔｄ，Ｊ＝１３．２，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｄｔ，Ｊ＝１３．８，３．０Ｈｚ，１Ｈ），１．９８（ｄｑ，Ｊ＝１３．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．８５（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，１．８，４．２Ｈｚ，１Ｈ），１．８２−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．６６−１．５９（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｑｄ，Ｊ＝１２．６，３．０Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ２０９．８，１８０．４，１７６．３，１４７．１，１４４．９，１２７．９，１２５．４，１２１．９，１１７．７，９２．２，５９．９，５８．０，５４．６，４７．５，４７．４，４０．５（２Ｃ），３８．３，３４．３，３３．９，３３．６，２７．５，２６．４，２２．５（２Ｃ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）４５７．２３４６（Ｃ２５Ｈ３３Ｎ２Ｏ６としての計算値：４５７．２３３９）。
【００４４】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）へのハプテンのコンジュゲート化
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイド（ＴＴ）へのオキシコドンハプテンのコンジュゲート化
【化８】
2019533020.tif 000011
【００４５】
ＤＭＦ（９９．０μＬ）およびＨ２Ｏ（１１．０μＬ）中の３（２．６ｍｇ，５．５４μｍｏｌ）の溶液にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（２．０ｍｇ，１６．８μｍｏｌ）およびＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）（３．０ｍｇ，１５．６μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で５時間撹拌した後、反応混合物を２つの部分に分けた。
【００４６】
一方の部分（６６．３μＬ）を室温でｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（７３．１μＬ，１０．０ｍｇ／ｍＬ）中のＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の溶液中に室温で加え、他方の部分（４３．７μＬ）をｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（７３４μＬ，１．５ｍｇ／ｍＬ）中のＴＴ（ＵＭａｓｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の溶液中に室温で加えた。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物のそれぞれを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ透析装置を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに対して室温で透析した。バッファーを２時間ごとに６時間交換し、ついで透析を４℃で１２時間継続した。コンジュゲートをＢＣＡアッセイにより定量し、４℃で保存した。
【００４７】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイド（ＴＴ）へのヒドロコドンハプテンのコンジュゲート化
【化９】
2019533020.tif 000012
【００４８】
ＤＭＦ（８１．０μＬ）およびＨ２Ｏ（９．０μＬ）中の３（２．１ｍｇ，４．５μｍｏｌ）の溶液にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（１．６ｍｇ，１３．４μｍｏｌ）およびＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）（２．５ｍｇ，１３．０μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で５時間撹拌した後、反応混合物を２つの部分に分けた。
【００４９】
一方の部分（４２．６μＬ）を室温でｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（５０．５μＬ，１０．０ｍｇ／ｍＬ）中のＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の溶液中に室温で加え、他方の部分（４３．８μＬ）をｐＨ７．４のＰＢＳバッファー（７３４μＬ，１．５ｍｇ／ｍＬ）中のＴＴ（ＵＭａｓｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の溶液中に室温で加えた。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物のそれぞれを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ透析装置を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに対して室温で透析した。バッファーを２時間ごとに６時間交換し、ついで透析を４℃で１２時間継続した。コンジュゲートをＢＣＡアッセイにより定量し、４℃で保存した。
【００５０】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）へのオキシコドンおよびヒドロコドンハプテンのコンジュゲート化
【化１０】
2019533020.tif 000013
【００５１】
ＤＭＦ（６０．０μＬ）およびＨ２Ｏ（７．０μＬ）中の３または６（１．０ｍｇ，２．１μｍｏｌ）の溶液にＮＨＳ（２．４ｍｇ，２０．８μｍｏｌ）およびＥＤＣ（４．０ｍｇ，２０．８μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物の６０μＬアリコートをｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中の１．０ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０アミン（使用前にｐＨ７．４のＰＢＳバッファーで４回洗浄）に室温で加えた。室温で２時間撹拌した後、ビーズをｐＨ７．４のＰＢＳバッファーで２回洗浄し、４℃で保存した。
【００５２】
ワクチン製剤および投与
マウス１匹当たり、約６０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中の５０μｇのオキシ−ＴＴまたはヒドロ−ＴＴ  ＋  ５０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６（Ｅｕｒｏｆｉｎ）を１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）のミョウバン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と一緒にし、３０分間、ボルテックス混合した。該懸濁液を第０、１４、２８および５０週にマウス（６匹／群）に腹腔内注射した。第２１、３５および７０週に各マウスから採血した。
【００５３】
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析
この研究において製造された各ハプテンＢＳＡコンジュゲートに関するコピー数（ハプテン密度）を定量するために、サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に付し、以下の式に従い、オキシ−ＢＳＡおよびヒドロ−ＢＳＡの分子量（ＭＷ）を未修飾ＢＳＡの分子量と比較した（ＴＴの代替物としてＢＳＡを使用した）。
【００５４】
コピー数＝（ＭＷハプテン−タンパク質−ＭＷタンパク質）／（ＭＷハプテン−ＭＷ水）
ＭＷＢＳＡ＝６６，５００Ｄａ、ＭＷ水＝１８Ｄａ
ＭＷオキシコドンハプテン＝４７２．５Ｄａ、ＭＷオキシ−ＢＳＡ＝７７，８５２Ｄａ、
コピー数オキシ−ＢＳＡ＝２５．０
ＭＷヒドロコドンハプテン＝４５６．５Ｄａ、ＭＷヒドロ−ＢＳＡ＝７９，８９５Ｄａ
コピー数ヒドロ−ＢＳＡ＝３０．５
ＥＬＩＳＡ法
まず、半面積（ｈａｌｆ−ａｒｅａ）高結合９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０）をウェル当たり２５μｇのオキシ−ＢＳＡまたはヒドロ−ＢＳＡで３７℃で一晩コートし、液体を蒸発させた。ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）バッファー中の５％  脱脂乳で室温で１時間ブロッキングした後、ワクチン接種マウス血清を、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中の２％  ＢＳＡで、１：１０００から始めて１２列にわたって１：３で系列希釈した。室温で２時間インキュベートした後、プレートをＨ２Ｏで１０回洗浄し、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中の２％  ＢＳＡ中の１：１０，０００希釈のロバ抗マウスＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）二次（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で１．５時間インキュベートした。Ｈ２Ｏで１０回洗浄した後、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた。ＴＭＢ添加の５分後、該混合物を２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で処理した。プレートを１５分間インキュベートした後、それらの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭにおいて、吸光度値をサンプルごとに最高吸光度値に対して正規化し、ｌｏｇ（インヒビター）対正規化応答−可変勾配式を用いて曲線をフィットさせて、中点力価および標準誤差を決定した。ワクチン未接種マウスは、検出可能な抗オキシまたは抗ヒドロ力価を全く含んでいなかった。
【００５５】
以下の追加工程以外は同様の方法で競合的ＥＬＩＳＡを行った。ＩＣ８０希釈の血清をオキシ−ＢＳＡまたはヒドロ−ＢＳＡコート化プレート内で１ｍＭ〜０．０２ｎＭ（１１個の５倍希釈）の遊離オキシコドンまたはヒドロコドン希釈物と共に２時間インキュベートした。ＩＣ５０は、オキシコドンに対するオキシ−ＴＴ：０．３４±０．０３μＭ、ヒドロコドンに対するオキシ−ＴＴ：０．２２±０．０２、ヒドロコドンに対するヒドロ−ＴＴ：０．１４±０．０１、オキシコドンに対するヒドロ−ＴＴ：０．１８±０．０２μＭであると計算された。それらの値は、ＳＰＲ結果と比較して約７０倍ずれている。
【００５６】
抗侵害受容能試験
採血の少なくとも２日後、既に記載されているとおりに［３］、主に上脊髄性（ホットプレート）および脊髄性（テールフリック）行動試験において、累積的なオキシコドンおよびヒドロコドン応答に関してマウスを試験した。５４℃の表面上のアクリルシリンダー（直径１４ｃｍ＊２２ｃｍ）内にマウスを配置し、以下の侵害受容応答の１つを行うまでの潜時を計測することにより、ホットプレート試験を測定した：後足の舐め、後足の震え／引っ込め、またはジャンプ。典型的なベースライン潜時は１０〜２０秒であり、組織損傷を防ぐために３５秒のカットオフを課した。応答後、マウスをプレートから取り出した。吸収性の実験用吸収バッドから構成される小袋内にマウスを軽く拘束し、尾の先端の１ｃｍを加熱水浴内に浸漬し、引っ込めまでの時間を計測することにより、尾部浸漬試験を行った。典型的なベースライン応答は０．５〜１秒であり、組織損傷を防ぐために１０秒のカットオフを用いた。尾部浸漬はより反射的な挙動であるため、試験順序としては、常に最初にホットプレートを行い、ついで尾部浸漬を行う。両方の抗侵害受容アッセイの完了の直後に、オキシコドンまたはヒドロコドン（生理食塩水中、２．０ｍＬ／ｋｇ）を直ちに腹腔内注射した。各注射の約１５分後に試験を反復し、両方のアッセイにおいて完全な抗侵害受容が観察される（すなわち、カットオフ時間を超える）まで、累積用量を増加させながら、試験および注射のこのサイクルを反復した。
【００５７】
血清結合試験の手順
第７０日に集めたマウス血清をプールし、マウス１匹当たり１０μＬの血清を使用してＰＢＳ中に１０倍希釈した。この希釈血清１００μＬを５ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ６ウェル平衡透析器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）の片側に入れた（ｎ＝２）。ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡ中の３００ｎｇ／ｍＬのオキシコドンまたはヒドロコドン１００μＬを透析膜の反対側に加えた［４］。プレートローテーター（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上で室温で２２〜２４時間の平衡化の後、各チャンバーからの５０μＬのサンプルを、内部標準（ＩＳ）として１０μＭのｄ６−ヒドロコドンまたはｄ６−オキシコドンを含有する５０μＬのＭｅＣＮに加えた。ついでサンプルを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＬＣＭＳ分析のために８０μＬの上清を取り出した。移動相としてＨ２Ｏ  ＋  ０．１％  ギ酸およびＭｅＣＮ  ＋  ０．１％  ギ酸を使用して、各サンプルの５μＬのアリコートを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＳＢ−Ｃ８カラムを備えたＬＣＭＳシステムに注入した。ＭｅＣＮ  ＋  ０．１％  ギ酸の比率を１０分間の実施にわたって５％から９５％まで直線的に増加させ（１５０μＬ／分）、ついで５％  ＭｅＣＮ  ＋  ０．１％  ギ酸で１０分間の洗浄段階を行った。
【００５８】
重水素化質量および非重水素化質量をＭａｓｓＨｕｎｔｅｒにおいて抽出し、得られたピークを積分した。サンプル分析全体にわたる変動性を説明するために、非重水素化ピークサイズをＩＳピークと共に正規化した。結合薬物の比率を、式［血清カウント／（血清カウント＋バッファーカウント）］×１００を用いて計算した（表２）。
【表２】
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【００５９】
薬物動態試験の手順
第６３日に、３群（オキシ−ＴＴ、ヒドロ−ＴＴおよび未処理）の雄Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５〜６）に、０．８ｍｇ／ｍｌのオキシコドンおよびヒドロコドンを含有する溶液を腹腔内注射（５ｍｌ／ｋｇ）して、これらの薬物のそれぞれに関して４ｍｇ／ｋｇの用量を投与した。ついで動物をそれらの檻に戻した。ついで、独立した予め設定された時点（５、１５、３０、６０、１２０、２４０または１４４０分）で後眼窩採血により２つまたは３つの血液サンプルを各動物から採取して、各測定時点に関してｎ＝１〜２のデータを得た。各マウスに関して採取された厳密な時点を群に関して釣りあわせた。採取血液サンプルを氷上で０．５〜４時間保存し、ついで１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ついで血清を集め、ＬＣＭＳによる分析まで−２０℃で保存した。ＬＣＭＳ分析の日に、各サンプルからの２０μＬを、１μＭ濃度のｄ６−ヒドロコドンおよびｄ６−オキシコドンを含有する８０μＬのＭｅＣＮに加えた。これらのサンプルを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、８０μＬの上清を集めた。ついで、前記と同じ注射および実施プロトコルを用いて、各サンプルをＬＣＭＳに付した。既知濃度（０ｎＭ〜１０μＭ）の各化合物が添加されたブランクマウス血清を使用し、ヒドロコドンおよびオキシコドンの両方に関する１０点標準曲線を使用して、各薬物の血清濃度の定量を行った。終末排出期間の時間に対して濃度値の自然対数をプロットし、得られた線の傾きを求めることにより、各条件に関する排出速度定数（ｋｅ）を計算した。ついで、式Ｌｎ（２）／ｋｅを用いて、各条件に関する半減期を計算した（表３）［５］。
【表３】
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【００６０】
血液／脳内分布試験の手順
第７７日に、３群（オキシ−ＴＴ、ヒドロ−ＴＴおよび未処理）の雄Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５〜６）に０．４ｍｇ／ｍｌのオキシコドンまたは０．８ｍｇ／ｍｌのヒドロコドンを腹腔内注射（１０ｍｌ／ｋｇ）し、該マウスをそれらの檻に戻した。注射の１５分後、イソフルランに浸したガーゼパッドを含有する５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）円錐遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から構成されるノーズコーンを使用して、動物を完全に麻酔した。ついで、鋭利な断頭台を使用して、動物を迅速に断頭し、ゴンゲウルス（ｇｏｎｇｅｕｒｓ）で脳を摘出し、幹血を採取した。血液を氷上に０．５〜２時間配置し、ついで１０，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、血清を集めた。ドライアイス冷却アセトン浴を使用して、脳組織を直ちに急速冷凍した。血清および脳サンプルを抽出およびＬＣＭＳ分析まで−８０℃で保存した。各全凍結脳に０．２Ｍ  過塩素酸水溶液（１．０ｍＬ）を加えた。Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（登録商標）（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ，ＮＹ）を使用して、混合物をホモジナイズし、ついで３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ホモジナイズした脳混合物の上清液の２００μＬのアリコートにＭｅＯＨ中の２００μＬ（２５０ｎｇ／ｍＬ）のｄ６−ヒドロコドンまたはｄ６−オキシコドンを加え、１分間、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標））混合して平衡化した。ついで混合物をＯａｓｉｓ（登録商標）ＰＲｉＭＥ  ＨＬＢ抽出カートリッジで抽出し、抽出した溶液を、ＧＥＮＥＶＡＣ（登録商標）を使用して蒸発させた。血清の各５０μＬアリコートに０．１Ｍ  過塩素酸水溶液（１００μＬ）およびｄ６−ヒドロコドンまたはｄ６−オキシコドンを加え、ついで混合物を１分間、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標））混合して平衡化した。平衡化後、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＰＲｉＭＥ  ＨＬＢ抽出カートリッジを使用する固相抽出を行った。ついで、抽出した溶液を、ＧＥＮＥＶＡＣ（登録商標）を使用して蒸発させた。これらの組織サンプルを、前記の注射および実施プロトコルを用いて分析し、オキシコドンおよびヒドロコドンに関する１０点標準曲線を使用して定量した。
【００６１】
過剰摂取試験
４群（オキシ−ＴＴ、ヒドロ−ＴＴ、オキシ−未処理およびヒドロ−未処理）の雄Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｎ＝７〜８）に正常生理食塩水中の４２６ｍｇ／ｋｇ  オキシコドンまたは８６ｍｇ／ｋｇ  ヒドロコドンを皮下注射した。ついで動物を２時間絶えず観察し、ついで、注射の１２時間後および２４時間後に１回の測定を行った。２４時間の時点で、以下の数の動物が死亡していた：オキシ−ＴＴ，５／８；ヒドロ−ＴＴ，３／８；オキシ−未処理，６／７；ヒドロ−未処理，６／８。
【００６２】
統計学
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）において行った。全ての値は平均±ＳＥＭとして示されている。抗侵害受容データを時間から最大可能効果（％）（％  ＭＰＥ）に変換した。これは以下のとおりに計算される：％ＭＰＥ＝（試験−ベースライン）／（カットオフ−ベースライン）＊１００。ついで、ｌｏｇ（アゴニスト）対正規化応答非線形回帰を用いて、このデータをフィットさせた。各疼痛試験および個々の処理群に関してＥＤ５０値およびＥＤ５０の９５％信頼区間を計算して、効力比を決定し、統計的有意差（α＜０．０５）の検証を行った。
【００６３】
精製マウス抗オキシコドンおよび抗ヒドロコドン免疫グロブリンの結合動力学のの決定
マウスＩＧ［磁気オキシコドンまたはヒドロコドン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して第３５日の採血から直接精製されたもの］と、オキシコドン、ヒドロコドン、オキシモルフォン、ヒドロモルフォン、モルヒネ、ヘロインおよびフェンタニルを含むオピオイドとの間の結合動力学を、研究等級ＣＭ７センサーチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴により決定した。リガンド、マウス抗オキシコドンおよび抗ヒドロコドンＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）を、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング反応を製造業者の説明に従い用いて、ＣＭ７チップ表面に直接的に固定化した。参照フローセルとして使用した２つの追加的なフローセルもＮＨＳ／ＥＤＣ化学により活性化した。該表面の全てを１．０Ｍ  エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の７分間の注射によりブロッキングした。動力学データを収集するために、ＨＢＳ−ＥＰ  ＋  バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｐ２０（ｐＨ７．４））中で調製された一連の濃度のオピオイド（表１を参照されたい）であるアナライトを、３０μＬ／分の流速で２５℃の温度で、それらの２つのフローセル上に注入した。複合体を、それぞれ３００秒間および６００秒間、会合および解離させた。各アナライトサンプルの２回の注入（ランダムな順序）およびブランクバッファー注入をそれらの２つの表面上に流した。各アナライト注入後、更に１８００秒間、ランニングバッファー中で表面を再生した。データを収集し、二重参照し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒ．４．１）によるグローバルデータ分析を用いて１：１ラングミュア相互作用モデルにフィットさせた。
【００６４】
実施例において引用された文献
［１］Ｏ．Ｈ．Ｋｖｅｒｎｅｎｅｓ，Ａ．Ｍ．Ｎｙｇａｒｄ，Ａ．Ｈｅｇｇｅｌｕｎｄ，Ｈ．Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ，ＷＯ２００７１３７７８２  Ａ１  ２００７．
［２］Ｙ．Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｈ．Ａｒａｉ，Ｋ．Ｍａｋｉｎｏ，Ｙ．Ｈａｍａｄａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００８，６４，１１５６８−１１５７９．
［３］Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｊ．Ｍ．Ｌｉｖｅｌｙ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ２０１４，１１，１０７５−１０８０．
［４］Ｔ．Ｌ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｋ．Ｄｅｖａｒａｋｏｎｄａ，Ｋ．Ｋｏｓｔｅｎｂａｄｅｒ，Ｊ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｔ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｐａｉｎ  Ｍｅｄ  ２０１５．
［５］Ｍ．Ｊ．ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，Ｄ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，Ｎ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｂｅｎｏｉｔ，Ｓ．Ｐ．ＭｃＥｌｈｉｎｅｙ，Ｍ．Ｕｎｎｉｔｈａｎ，Ｓ．Ｃ．ＤｅＭａｒｃｏ，Ｂ．Ｃｌａｙ，Ｃ．Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｄｅｏｒａ，Ｊ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎ，Ｄ．Ｒ．Ｓｔｅａｄ，Ｊ．Ｒ．Ｍｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１６，３８，１８４−１９６。
【００６５】
本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物を、各個の刊行物の全体が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００６６】
用いられている用語および表現は記述の用語として用いられており、限定的なものではなく、また、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外する意図は無く、特許請求されている本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更が当業者によって施されることが可能であり、そのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内とみなされると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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