(57)【要約】  核酸ライブラリを生成する方法が提供される。ある特定の態様では、本方法は、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）とオリゴヌクレオチドプールとを組み合わせることを含む。オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域と、相補性領域同定配列と、を含み得る。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して配列において相補的であり対応する長さを有するオーバーハング領域を有する標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸とハイブリダイズする条件下にある。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される。
2019532014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ライブラリを生成するための方法であって、
標的核酸を含む核酸組成物であって、標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含む、核酸組成物と、
オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールであって、
前記オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（ｉ）標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み、
相補性領域を含む前記プール中のオリゴヌクレオチドが、異なる長さの相補性領域を含み、
前記相補性領域同定ポリヌクレオチドは、前記相補性領域の１つ以上の特徴に特異的であり、前記１つ以上の特徴が、前記相補性領域の長さを含む、オリゴヌクレオチドプールとを、
前記オリゴヌクレオチド中の相補性領域が、対応する長さを有する前記標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズする条件下で組み合わせ、それによって核酸ライブラリのためのハイブリダイゼーション生成物を形成することを含む、方法。
【請求項２】
前記相補性領域の前記１つ以上の特徴が、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸の一部は、オーバーハングを含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの一部は、相補性領域を含まず、かつ相補性領域に特異的でない同定ポリヌクレオチドを含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
オーバーハングを含む前記標的核酸が、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
オーバーハングを含む各標的核酸の一方の末端または両方の末端が、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、またはリボ核酸（ＲＮＡ）から産生される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡが、細胞から採取される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から産生される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが、細胞から採取される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである、またはゲノムＤＮＡから産生される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸が、動物からの試料から採取される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物が、絶滅動物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物が、哺乳動物である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が、ヒト属からのものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸が、無細胞核酸である、または無細胞核酸から産生される、請求項１〜８、１０、１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記無細胞核酸が、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便から選択される、体液試料から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記無細胞核酸が、無細胞胎児ＤＮＡを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記無細胞核酸が、循環癌ＤＮＡを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記無細胞核酸が、循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記無細胞核酸が、宿主ＤＮＡおよび非宿主ＤＮＡを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記非宿主ＤＮＡが、感染性病原体からのものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
非宿主ＤＮＡが、移植片からのものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
標的核酸中のオーバーハングが、天然のオーバーハングである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的核酸が、前記プールと組み合わせる前に、長さが改変されていない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物を前記プールと組み合わせる前に、試料から核酸を単離し、それによって前記核酸組成物を生成することから本質的に成るプロセスによって、前記核酸組成物を調製することを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸組成物を前記プールと組み合わせる前に、試料から核酸を単離し、それによって単離された核酸を生成することと、
単離された核酸の一方または両方の末端をリン酸部分または化学的反応性の部分で修飾し、それによって核酸組成物を生成することと
から本質的に成るプロセスによって、核酸組成物を調製することを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸が、前記プールと組み合わせたときに溶液中にある、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
標的核酸が、固定細胞試料中に存在しない、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸が、固定組織試料中に存在しない、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドプールが、オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記プール中のすべてのオリゴヌクレオチドが、オーバーハングを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドのそれぞれが、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドのそれぞれの一方の末端または両方の末端が、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
一方の末端で、前記オーバーハングが、前記相補性領域を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記相補性領域同定ポリヌクレオチドが、前記相補性領域を含む前記オーバーハングが５’オーバーハングであるか、または３’オーバーハングであるかに対して特異的である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドプールが、第１の鎖および第２の鎖を含むオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖が、第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２の鎖が、前記第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドプールが、それぞれが第１の鎖および第２の鎖から本質的に成るオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖が、第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２の鎖が、前記第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドプールが、ヘアピン構造をとることができる一本鎖を含むオリゴヌクレオチドを含み、
前記一本鎖が、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドの一部が、前記第２のポリヌクレオチドの一部に相補的である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドプールが、それぞれがヘアピン構造をとることができる一本鎖から本質的に成るオリゴヌクレオチドを含み、
前記オリゴヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドの一部が、前記第２のポリヌクレオチドの一部に相補的である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記プールが、３つ以上のヌクレオチド塩基のオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記プール中の前記オリゴヌクレオチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド長である、またはそれらの組み合わせであるオーバーハングを含む、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記プールが、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記プールが、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
それらの一部を含む、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記プールが、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット。
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、請求項３２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記プールが、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
それらの一部を含む、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、前記標的核酸中の塩基と特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、請求項３２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルのうちの２つ以上を含むヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドプールが、特定のオーバーハング長に対して、異なる複数のオーバーハングポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記オリゴヌクレオチドプールが、特定のオーバーハング長に対して可能性のあるすべてのオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドプールが、各オーバーハング長について可能性のあるすべてのオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中の前記オーバーハングポリヌクレオチドが、ランダムである、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、前記標的核酸中の塩基と非特異的な塩基対合することができるヌクレオチドを含む、請求項３２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、ニトロインドール、デオキシイノシン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ニトロインドールが、５−ニトロインドールである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記デオキシイノシンが、２−デオキシイノシンである、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
オリゴヌクレオチドの末端が、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする前記標的核酸の末端に共有結合することができる、請求項３２〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする前記標的核酸の鎖の５’末端に共有結合することができる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記相補性領域に隣接する前記オリゴヌクレオチドの領域が、前記相補性領域同定ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含む、請求項３２〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記プール中の前記オリゴヌクレオチドが、標的核酸とハイブリダイズするオーバーハングを有する末端と反対側の末端に、反対向きのオーバーハングを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記組み合わせの後に、前記反対向きのオーバーハングを埋めることを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプールの前記オリゴヌクレオチドが、前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部を含む、請求項３２〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部が、核酸結合ドメインを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸結合ドメインは、プライマー結合ドメインである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部が、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチドプールの前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む、請求項３２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記オリゴヌクレオチドの前記相補性領域の１つ以上のヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記オリゴヌクレオチドの前記相補性領域の各ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記非天然ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の骨格修飾を含む、請求項３２〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記標的核酸の末端が、ハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドの末端に連結される条件に、前記ハイブリダイゼーション生成物を曝露することを含む、請求項１〜３１および３２〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記組成物中の前記標的核酸が、５’リン酸化されている、請求項１〜３１、３２〜７２、および７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、リン酸化されていない、請求項１〜３１、３２〜７２、７３、および７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、リン酸化されている、請求項１〜３１、３２〜７２、および７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸組成物を前記オリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で、前記組成物中の前記標的核酸を、ホスホリル転移活性を含む薬剤と接触させることを含む、請求項１〜３１、３２〜７２、および７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸組成物を前記オリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、前記組成物中の前記標的核酸を、ホスホリル転移活性を含まない薬剤と接触させることを含む、請求項１〜３１、３２〜７２、および７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記核酸組成物を前記オリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、前記プール中の前記オリゴヌクレオチドを、ホスホリル転移活性を含まない薬剤と接触させることを含む、請求項１〜３１、３２〜７２、および７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
標的核酸の末端が、前記標的核酸がハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドの末端に共有結合する条件下で、前記ハイブリダイゼーション生成物を、リガーゼ活性を含む薬剤と接触させることを含む、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ハイブリダイゼーション生成物が、第１のリガーゼ活性を含む第１の薬剤、および前記第１のリガーゼ活性とは異なる第２のリガーゼ活性を含む第２の薬剤に接触させられる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１のリガーゼ活性および前記第２のリガーゼ活性が、独立して、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、粘着末端リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、および凝集末端リガーゼ活性から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記オリゴヌクレオチドのそれぞれの末端が、第１の化学的反応性の部分を含み、前記標的核酸のそれぞれの末端が、第２の化学的反応性の部分を含み、
前記第１の化学的反応性の部分が、前記第２の化学的反応性の部分と反応し、オリゴヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に共有結合を形成することができる、請求項１〜３１、３２〜７２、および７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記核酸組成物を前記オリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、前記第２の化学的反応性の部分が前記標的核酸のそれぞれの末端に組み込まれる条件下で、前記組成物中の前記標的核酸を、１つ以上の化学物質と接触させることを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１の化学的反応性の部分が前記第２の化学的反応性の部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に共有結合を形成する条件下に、前記ハイブリダイゼーション生成物を、１つ以上の化学物質と共に曝露することを含む、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする前記標的核酸との間に１，２，３−トリアゾールを形成するために、前記第１の化学的反応性の部分は、前記第２の化学的反応性の部分と反応することができる、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１の化学的反応性の部分が、銅を含む条件下で、前記第２の化学的反応性の部分と反応することができる、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１の化学的反応性の部分が、アジド含有部分および５−オクタジイニルデオキシウラシルから選択され、前記第２の化学的反応性の部分が、独立して、アジド含有部分、ヘキシニル、および５−オクタジイニルデオキシウラシルから選択される、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記アジド含有部分が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル−アジドである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記オリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造をとることができる一本鎖を含み、前記一本鎖が、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、および切断条件下で切断可能な１つ以上の切断部位を含む、請求項１〜３１、４１〜７２、および７３〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記オリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造をとることができる一本鎖から本質的に成り、前記一本鎖が、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、および切断条件下で切断可能な１つ以上の切断部位を含む、請求項１〜３１、４１〜７２、および７３〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１のポリヌクレオチドが、前記第２のポリヌクレオチド中の第１の領域に相補的な第１の領域を含み、前記第１のポリヌクレオチドが、前記第２のポリヌクレオチド中の第２の領域に相補的でない第２の領域を含む、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記１つ以上の切断部位が、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間に位置する、請求項９０、９１、または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記１つ以上の切断部位が、ウラシルおよび／またはデオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記１つ以上の切断部位が、ジオールを含む、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ジオールが、５’から５’への結合に組み込まれた隣接ジオールである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記１つ以上の切断部位が、制限酵素認識部位を含む、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記制限酵素認識部位が、レアカッター制限酵素認識部位である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記組み合わせの後に、切断条件に前記１つ以上の切断部位を曝露し、それによって前記オリゴヌクレオチドを切断することを含む、請求項９０〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記オリゴヌクレオチドが、５’から３’方向において、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
前記第１のポリヌクレオチドと、
前記１つ以上の切断部位と、
前記第２のポリヌクレオチドと、
前記５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
前記相補性領域と、を含む、請求項９０〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記オリゴヌクレオチドが、５’から３’方向において、
前記相補性領域と、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
前記第１のポリヌクレオチドと、
前記１つ以上の切断部位と、
前記第２のポリヌクレオチドと、
前記５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、請求項９０〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）５’から３’方向において、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
前記第１のポリヌクレオチドと、
前記１つ以上の切断部位と、
前記第２のポリヌクレオチドと、
前記５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
前記相補領域と、を含む、オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）５’から３’方向において、
前記相補性領域と、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
前記第１のポリヌクレオチドと、
前記１つ以上の切断部位と、
前記第２のポリヌクレオチドと、
前記５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドと、の混合物を含む、請求項９０〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記組み合わせの後に、前記相補性領域同定ポリヌクレオチドを、結合ポリヌクレオチドおよび前記相補性領域同定ポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件下で、前記相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な結合ポリヌクレオチドを含む結合剤と接触させ、それによって結合複合体および前記結合剤に結合していない核酸を生成することを含む、請求項３２〜７２、７３〜８９、および９０〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記結合剤が、固相を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記結合剤が、リンカーを含み、前記リンカーが固相に結合しているか、または結合することができる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記結合複合体を、前記結合剤に結合していない核酸から分離することを含む、請求項１０３〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
標的核酸の配列を決定するための方法であって、
請求項１〜３１、３２〜７２、７３〜８９、９０〜１０２、および１０３〜１０６のいずれか一項に記載の方法を実行し、それによって核酸ライブラリを生成することと、
前記核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、を含む、方法。
【請求項１０８】
前記オリゴヌクレオチド中の前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
（ｉ）前記核酸組成物を前記オリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、
（ｉｉ）前記ハイブリダイゼーション生成物中の前記オリゴヌクレオチドに前記標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、
（ｉｉｉ）前記複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、
（ｉｖ）前記核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、
から本質的になる、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
（ｉ）前記核酸組成物を前記オリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、
（ｉｉ）前記ハイブリダイゼーション生成物中の前記オリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、
（ｉｉｉ）特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上の結合剤と複合体を会合させ、それによって濃縮複合体を生成することと、
（ｉｖ）前記濃縮複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、
（ｖ）前記核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、
から本質的になる、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記オリゴヌクレオチドを修飾することは、前記オリゴヌクレオチド中の１つ以上の切断部位を切断することを含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記オリゴヌクレオチドを修飾することが、前記標的核酸中のオーバーハングと相互作用する前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングとは反対側の、前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングを埋めることを含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記配列決定プロセスが、高度に多重化された配列決定プロセスである、請求項１０７〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記配列決定プロセスが、配列決定リードを生成する、請求項１０７〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記配列決定リードに基づいて、前記標的核酸のオーバーハングの配列を決定することを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記配列決定リードに基づいて、相補性領域同定ポリヌクレオチドの配列を決定することを含む、請求項１１４または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記標的核酸の前記オーバーハングの長さを決定することを含む、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
核酸組成物中の特定のオーバーハングを分析するための方法であって、
請求項１０７〜１１７のいずれか一項に記載の方法に従って核酸の配列を決定することと、
標的核酸中のオーバーハングの量を定量化し、それによってオーバーハングの定量化を生じることと、を含む、方法。
【請求項１１９】
前記オーバーハングの定量化が、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）特定の長さ、または（ｖ）前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のうちの２つ、３つ、または４つの組み合わせとして特徴付けられるオーバーハングについてのものである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
オーバーハングの定量化が、（ｉ）５’オーバーハングまたは３’オーバーハング、および（ｉｉ）特定の長さとして特徴付けられるオーバーハングについてのものである、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記オーバーハングの定量化に基づいて、前記標的核酸組成物を生じさせた核酸試料中の標的核酸の供給源を同定することを含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記方法が、法医学的分析のために行われる、請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記方法が、診断的分析のために行われる、請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールを含む、組成物であって、
前記オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（ｉ）核酸組成物の標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み、
相補性領域を含むプール中のオリゴヌクレオチドが、異なる長さの相補性領域を含み、
相補性領域同定ポリヌクレオチドが、相補性領域の１つ以上の特徴に特異的であり、前記１つ以上の特徴は、相補性領域の長さを含む、組成物。
【請求項１２５】
前記相補性領域の前記１つ以上の特徴が、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）前記（ｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、または（ｖ）前記（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、をさらに含む、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記オリゴヌクレオチドの一部が、相補性領域を含まず、かつ相補的領域に特異的でない同定ポリヌクレオチドを含む、請求項１２４または１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記組成物が、容器中に存在する、請求項１２４〜１２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記組成物が、液体組成物である、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記組成物が、凍結乾燥組成物である、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション生成物中で標的核酸にハイブリダイズしている、請求項１２４〜１２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記オリゴヌクレオチドプールが、オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２４〜１３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記プール中のすべてのオリゴヌクレオチドが、オーバーハングを含む、請求項１２４〜１３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３３】
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、請求項１３１または１３２に記載の組成物。
【請求項１３４】
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドのそれぞれが、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、請求項１３１〜１３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３５】
オーバーハングを含む前記オリゴヌクレオチドのそれぞれの一方の末端または両方の末端が、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３６】
一方の末端で、前記オーバーハングが、前記相補性領域を含む、請求項１３５に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記相補性領域同定ポリヌクレオチドが、前記相補性領域を含むオーバーハングが５’オーバーハングであるか、または３’オーバーハングであるかに対して特異的である、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記オリゴヌクレオチドプールが、それぞれが第１の鎖および第２の鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１の鎖が、第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２の鎖が、前記第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記オリゴヌクレオチドプールが、それぞれがヘアピン構造をとることができる一本鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含み、
前記オリゴヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドと、前記第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドと、を含む、請求項１３１〜１３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４０】
前記プールが、３つ以上のヌクレオチド塩基のオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３１〜１３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記プール中の前記オリゴヌクレオチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド長、またはそれらの組み合わせであるオーバーハングを含む、請求項１３１〜１４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記プールが、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、請求項１３１〜１４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記プールが、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの一部を含む、請求項１３１〜１４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記プールが、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、請求項１３１〜１４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記プールが、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）前記標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの一部を含む、請求項１３１〜１４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、前記標的核酸中の塩基と特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、請求項１３１〜１４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルのうちの２つ以上を含むヌクレオチドを含む、請求項１４６に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記オリゴヌクレオチドプールが、特定のオーバーハング長に対して、異なる複数のオーバーハングポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４６または１４７に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記オリゴヌクレオチドプールが、特定のオーバーハング長に対して可能性のあるすべてのオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記オリゴヌクレオチドプールが、各オーバーハング長について可能性のあるすべてのオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングポリヌクレオチドが、ランダムである、請求項１４６〜１５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、前記標的核酸中の塩基と特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、請求項１３１〜１５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記プールの前記オリゴヌクレオチド中のオーバーハングが、ニトロインドール、デオキシイノシン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３１〜１５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記ニトロインドールが、５−ニトロインドールである、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記デオキシイノシンが、２−デオキシイノシンである、請求項１５３または１５４に記載の組成物。
【請求項１５６】
オリゴヌクレオチドの末端が、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする標的核酸の末端に共有結合することができる、請求項１３１〜１５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５７】
オリゴヌクレオチド鎖の３’末端が、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする前記標的核酸の鎖の５’末端に共有結合することができる、請求項１３１〜１５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記相補性領域に隣接する前記オリゴヌクレオチドの領域が、前記相補性領域同定ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含む、請求項１３１〜１５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記プール中の前記オリゴヌクレオチドが、標的核酸とハイブリダイズするオーバーハングを有する末端と反対側の末端に、反対向きのオーバーハングを含む、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記組み合わせの後に、前記反対向きのオーバーハングを埋めることを含む、請求項１５９に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記オリゴヌクレオチドプールの前記オリゴヌクレオチドが、前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部を含む、請求項１３１〜１６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部が、核酸結合ドメインを含む、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記核酸結合ドメインが、プライマー結合ドメインである、請求項１６２に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記相補性領域および前記相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部が、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、請求項１６２または１６３に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記オリゴヌクレオチドプールの前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む、請求項１３１〜１６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記オリゴヌクレオチドの前記相補性領域の１つ以上のヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記オリゴヌクレオチドの前記相補性領域の各ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記非天然ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、請求項１６５〜１６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の骨格修飾を含む、請求項１３１〜１６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７０】
オーバーハングを含む前記標的核酸のそれぞれが、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、請求項１２４〜１６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７１】
オーバーハングを含む前記標的核酸のそれぞれが、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７２】
オーバーハングを含む前記標的核酸のそれぞれの一方の末端または両方の末端が、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、請求項１７０または１７１に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記標的核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、またはリボ核酸（ＲＮＡ）から産生されるものである、請求項１２４〜１７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ＲＮＡが、細胞から採取されるものである、請求項１７３に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記標的核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から産生されるものである、請求項１２４〜１７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記ＤＮＡが、細胞から採取されるものである、請求項１７５に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである、またはゲノムＤＮＡから産生されるものである、請求項１７６に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記標的核酸が、動物からの試料から採取されるものである、請求項１２４〜１７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記動物が、絶滅動物である、請求項１７８に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記動物が、哺乳動物である、請求項１７８または１７９に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記動物が、ヒト属からのものである、請求項１７８、１７９、または１８０に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記標的核酸が、無細胞核酸である、または無細胞核酸から生成されるものである、請求項１２４〜１７３、１７５、および１７８〜１８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記無細胞核酸が、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便から選択される体液試料から採取されるものである、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記無細胞核酸が、無細胞胎児ＤＮＡを含む、請求項１８２または１８３に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記無細胞核酸が、循環癌ＤＮＡを含む、請求項１８２または１８３に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記無細胞核酸が、循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記無細胞核酸が、宿主ＤＮＡおよび非宿主ＤＮＡを含む、請求項１８２または１８３に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記非宿主ＤＮＡが、感染性病原体からのものである、請求項１８７に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記非宿主ＤＮＡが、移植片からのものである、請求項１８７に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記標的核酸が、溶液中にある、請求項１２４〜１８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９１】
標的核酸が、固定細胞試料中に存在しない、請求項１２４〜１９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９２】
標的核酸が、固定組織試料中に存在しない、請求項１２４〜１９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９３】
請求項１２４〜１９２のいずれか一項に記載の組成物と、
核酸ライブラリを生成するために組成物を使用するための指示と、を含む、キット。
【請求項１９４】
核酸試料の核酸の５’リン酸化に適合したキナーゼをさらに含む、請求項１９３に記載のキット。
【請求項１９５】
前記キナーゼが、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）である、請求項１９４に記載のキット。
【請求項１９６】
ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項１９３〜１９５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立科学財団により授与された契約番号１５１３５０１に基づく政府支援によって実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連する特許出願
本特許出願は、第１の指名された発明者としてＲｉｃｈａｒｄ  Ｅ．Ｇｒｅｅｎが命名し、弁護士整理番号ＵＣＳＣ−３５０ＰＲＶによって指定された、核酸ライブラリの生成方法と題する、２０１６年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３６２，９０４号の利益を主張する。前述の出願の全内容は、すべてのテキスト、表、および図面を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
序文
ＤＮＡ配列決定における最近の進歩は、ゲノミクスの分野に革命をもたらし、単一の研究グループでさえも、非常に迅速、かつ実質的に低いコストで大量の配列データを生成することを可能にした。これらのハイスループットシークエンシング技術は、ディープトランスクリプトームシークエンシングおよび転写の定量化、全ゲノムシークエンシング、および再シークエンシングをより多くの研究者およびプロジェクトに利用可能にする。
【０００４】
様々な市販のハイスループットシークエンシングプラットフォームが存在し、例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１：３１−４６、Ｍｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１１０：３−２４、Ｒｅｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ５８（４）：５８６−５９７、および他の箇所に記載されている。Ｉｌｌｕｍｉｎａのプラットフォームでは、配列決定プロセスは、スライドガラスの表面上でのアダプター連結ＤＮＡ断片のクローン増幅を含む。塩基は、塩基の取り込み、洗浄、画像化、および切断の進歩的期間を通じて、一度にテンプレート鎖の１つのヌクレオチド鎖を配列決定する、環状可逆的終止戦略を用いて読み込まれる。この戦略では、蛍光標識された３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰを使用して、重合反応を一時停止し、組み込まれていない塩基の除去および追加のヌクレオチドを決定するための蛍光イメージングを可能にする。結合電荷デバイス（ＣＣＤ）カメラでフロー細胞をスキャンした後、蛍光部分および３’ブロックを除去し、このプロセスを繰り返す。
【０００５】
近年大きな進歩を遂げている新たな単分子戦略は、ナノ細孔に基づく配列決定であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓがこの方法の開発および商業化を主導している。ナノ細孔配列決定は、主に、小チャネルを通るＤＮＡまたは個々のヌクレオチドの遷移に依存している。配列決定フロー細胞は、それぞれが生物学的ナノ細孔によって穿孔された合成二重層を含有する、数百の独立したマイクロウェルを含む。配列決定は、塩基が分子モータータンパク質によって細孔を通過するときに誘導される電流の特徴的な変化を測定することによって達成される。ライブラリ調製は最小限であり、ＤＮＡの断片化およびアダプターの連結を含み、ＰＣＲ増幅の有無にかかわらず行うことができる。このライブラリ設計は、単一分子から両方のＤＮＡ鎖を配列決定することを可能にし、それは正確さを増す。
【０００６】
特定の種類の実験に適切な配列決定プラットフォームの選択は重要な検討事項であり、エラーの原因、エラー率、ならびに配列決定のスピードおよび費用を含む、利用可能な技術の詳細な理解が必要である。配列決定の費用が劇的に減少した一方で、ライブラリ調製のスループットおよび費用は、現在、制限要因である。
【発明の概要】
【０００７】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。ある特定の態様では、本方法は、標的核酸とオリゴヌクレオチドプールとを組み合わせることを含む。オリゴヌクレオチドプールの各オリゴヌクレオチドは、（ｉ）標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み得る。プール中のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの相補性領域を含み得、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域の長さに特異的であり得る（相補性領域の他の特徴に特異的であり得る）。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチド中の相補性領域が、対応する長さを有する標的核酸中のオーバーハングとハイブリダイズし、それによって（例えば、核酸ライブラリのための）ハイブリダイゼーション生成物を形成する条件下である。
【０００８】
ある特定の態様では、本方法は、５’リン酸化核酸と、オリゴヌクレオチドプールと、を組み合わせることを含む。オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域と、相補性領域同定配列と、を含み得る。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、配列において相補的であり、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有するオーバーハング領域を有する５’リン酸化核酸の核酸とハイブリダイズする条件下である。例えば、本開示の方法の実施において、用途を見出す組成物およびキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本開示の一実施形態による核酸ライブラリを生成する方法を図式的に示す。
【図２】本開示の実施形態による方法を使用して得られた配列決定リードの数を示す。
【図３】本開示の実施形態による方法を使用して調製されたライブラリにおけるミスマッチの割合を示す。
【図４】健常なドナーの血漿および尿から精製したＤＮＡ断片の長さ分布を示す。
【図５】健常な血漿ｃｆＤＮＡからの各ＤＮＡオーバーハングタイプおよび長さの観測数を示す。
【図６】健常な尿ｃｆＤＮＡからの各ＤＮＡオーバーハングタイプおよび長さの観測数を示す。
【図７】ヘアピン型バーコードアダプターの概略図を示す。切断可能な部位は、化学的に切断可能な部位または酵素的に切断可能な部位を含み得る。バーコードは、一本鎖オーバーハングのタイプおよび長さを示す。
【図８】毛幹から回収されたＤＮＡ断片の長さを示す。上のパネル：１４０歳のルートレス毛髪抽出物から回収したＤＮＡ断片をヒトゲノムにマッピングした。ほとんどすべての断片は、５０ｂｐ未満の長さであった。下のパネル：新鮮な毛髪から抽出したＤＮＡからの配列決定ライブラリの長さのＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎトレース。この長さは、約１１０ｂｐの配列決定アダプターを含んでいた。したがって、新鮮な髪でも、ほとんどのＤＮＡ断片は、５０ｂｐ未満の長さであった。
【図９】１３個の標準ＣＯＤＩＳマーカーからの最短ＰＣＲ生成物のアンプリコン長を示す。これらのマーカーは長さの多型であるため、ヒトに存在する最小のアンプリコンは、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１．１または１６、Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｐｌｕｓ、ＣＯｆｉｌｅｒ、またはＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒプライマーセットから入手可能なＰＣＲプライマーセットに対して選択された。ミニＳＴＲでも、毛幹中の核ＤＮＡに典型的に見られるサイズ範囲を超える鋳型分子が必要である（図８）。データは、ワールドワイドウェブのユーアールエルのｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅからのものである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。ある特定の態様では、本方法は、標的核酸とオリゴヌクレオチドプールとを組み合わせることを含む。オリゴヌクレオチドプールの各オリゴヌクレオチドは、（ｉ）標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み得る。プール中のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの相補性領域を含み得、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域の長さに特異的であり得る（相補性領域の他の特徴に特異的であり得る）。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチド中の相補性領域が、対応する長さを有する標的核酸中のオーバーハングとハイブリダイズし、それによって（例えば、核酸ライブラリのための）ハイブリダイゼーション生成物を形成する条件下である。
【００１１】
ある特定の態様では、本方法は、５’リン酸化核酸と、オリゴヌクレオチドプールと、を組み合わせることを含む。オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域と、相補性領域同定配列と、を含み得る。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、配列において相補的であり、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有するオーバーハング領域を有する５’リン酸化核酸の核酸とハイブリダイズする条件下である。例えば、本開示の方法の実施において、用途を見出す組成物およびキットも提供される。
【００１２】
本発明のシステムおよび方法をより詳細に記載する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、方法、組成物、およびキットの範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定的であることを意図していないこともまた理解されたい。
【００１３】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上他に明確な指示のない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在値、およびいずれかの他の記載された値またはその記載された範囲内の介在値が、方法、組成物、およびキットに包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれ得、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界に応じて、方法、組成物、およびキット内にも包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちの一方または両方を除外する範囲もまた、方法、組成物、およびキットに含まれる。
【００１４】
特定の範囲は、数値の前に「約」という用語が付されて本明細書で提示される。本明細書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近いかまたはほぼ等しい数のためのリテラルサポートを提供する。数が特定の列挙された数に近いかほぼ等しいかを決定するにあたり、近似または近似の列挙されていない数は、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。
【００１５】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、方法、組成物、およびキットが属する当該技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法、組成物、およびキットもまた、方法、組成物、およびキットの実施または試験に使用することができるが、代表的な例示的方法、組成物、およびキットについてここで記載する。
【００１６】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであり、提供される刊行日は独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法、組成物、およびキットが、このような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。
【００１８】
明瞭さのために、別の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキットの特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキットの様々な特徴はまた、別々に、またはいずれかの適切な部分的組み合わせで提供され得る。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書において、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する程度まで、まさに各々およびすべての組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのように開示される。加えて、こうした変形を記載する実施形態において列挙されるすべての部分的組み合わせも、本方法、組成物、およびキットによって具体的に包含され、本明細書において、まさに各々およびすべてのこのような部分的組み合わせが本明細書に個別かつ明示的に開示されているかのように開示される。
【００１９】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
【００２０】
方法
上記に要約したように、本開示の態様は、核酸ライブラリを生成する方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、オーバーハングを含む標的核酸を含む核酸組成物と、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールと、を組み合わせることを含み、オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（ｉ）標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み、プール中のオリゴヌクレオチドが、異なる長さの相補性領域を含み、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域の１つ以上の特徴（例えば、長さ）に特異的である。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチド中の相補性領域が、対応する長さを有する標的核酸中のオーバーハングとハイブリダイズし、それによって（例えば、核酸ライブラリのための）ハイブリダイゼーション生成物を形成する条件下である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本方法は、５’リン酸化核酸と、様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域と、相補性領域同定配列と、を含む、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールと、を組み合わせることを含む。そのような態様では、この組み合わせは、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、配列において相補的であり、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有するオーバーハング領域を有する５’リン酸化核酸の核酸とハイブリダイズする条件下である。そのようなハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸は、本明細書において「ハイブリダイゼーション生成物」と称され得る。本方法の態様は、これより、さらに詳細に説明されるであろう。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本方法は、組み合わせるステップの前に、核酸試料から核酸の５’末端をリン酸化することによって５’リン酸化核酸を生成することをさらに含む。核酸の５’リン酸化を実施するための試薬およびキットは、公知であり、入手可能である。例えば、ＡＴＰのγ位から、ポリヌクレオチド（二重および一重）鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）の５’−ヒドロキシル末端ならびにヌクレオシド３’−モノホスフェートへのＰｉの転移および交換を触媒する、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ＰＮＫ）で核酸を処理することができる。適切な反応条件としては、例えば、１×ＰＮＫ反応緩衝液（例えば、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．６、２５℃）中で核酸をＰＮＫと３７℃で３０分間インキュベートすることが挙げられる。任意に、リン酸化反応後に、ＰＮＫは、例えば、６５℃で２０分間熱不活性化され得る。いくつかの実施形態において、本方法は、組み合わせるステップの前に、核酸試料から核酸の５’末端をリン酸化することによって５’リン酸化核酸を生成することを含まない。そのような場合、核酸試料は、天然にリン酸化された５’末端を有する核酸を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、プールと組み合わせる前に長さが改変されていない。この文脈において、「改変されていない」とは、標的核酸が試料（例えば、生きた生物または死んだ生物から単離された核酸を含む試料）から単離され、次いで、標的核酸の長さを改変することなくオリゴヌクレオチドプールと組み合わされることを意味する。例えば、標的核酸は、短縮されず（例えば、それらは制限酵素もしくはヌクレアーゼまたは長さを減少させる物理的条件（例えば、剪断条件、切断条件）と接触せず）、１つ以上のヌクレオチドによって長さが増加しない（例えば、末端はオーバーハングにおいて埋められない；ヌクレオチドは末端に付加されない）。標的核酸の一方の末端または両方の末端にリン酸基または化学的反応性基を付加することは、核酸の長さを改変することとは見なされない。
【００２４】
ある特定の態様では、本開示の方法は、組み合わせるステップの後に、標的核酸の末端がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に連結される条件下でハイブリダイゼーション生成物を曝露することを含む。連結は、それがハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドへの標的核酸の共有結合を可能にする任意の適切なアプローチによって達成され得る。標的核酸の一方の末端がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの一方の末端に連結されると、典型的には２つの結合事象は、１）標的核酸中の一本鎖の３’末端からオリゴヌクレオチド中の一本鎖の５’末端、および２）標的核酸中の他方の鎖の５’末端からオリゴヌクレオチド中の他方の鎖の３’末端で行われる。標的核酸の両方の末端がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドにそれぞれ連結されると、典型的には４つの結合事象は、１）標的核酸中の一本鎖の３’末端からオリゴヌクレオチド中の一本鎖の５’末端、２）標的核酸中の他方の鎖の５’末端からオリゴヌクレオチド中の他方の鎖の３’末端、３）および４）他のオリゴヌクレオチドに結合した標的核酸の反対側の末端については（１）および（２）と同じで行われる。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示の方法は、組み合わせるステップの後に、標的核酸の末端が、標的核酸がハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの末端に共有結合されている条件下で、ハイブリダイゼーション生成物を、リガーゼ活性を含む薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション生成物は、第１のリガーゼ活性を含む第１の薬剤と、第１のリガーゼ活性とは異なる第２のリガーゼ活性を含む第２の薬剤とを接触させられる。例えば、第１のリガーゼ活性および第２のリガーゼ活性は、独立して、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、粘着末端（sticky end）リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、および凝集末端（cohesive end）リガーゼ活性から選択され得る。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示の方法は、生体適合性付着物を介して標的核酸をオリゴヌクレオチドに連結することを含む。方法は、例えば、「クリック」化学またはタグ付けを含み得、これらは、生体分子を連結するのに有用な生体適合性反応を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの各々の末端は、第１の化学的反応性の部分を含み、標的核酸の各々の末端は、第２の化学的反応性の部分を含む。そのような実施形態において、第１の化学的反応性の部分は、典型的には、第２の化学的反応性の部分と反応し、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に共有結合を形成することができる。ある特定の態様では、本開示の方法は、核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、第２の化学的反応性の部分が標的核酸のそれぞれの末端に組み込まれる条件下で組成物中の標的核酸を１つ以上の化学物質と接触させることを含む。ある特定の態様では、本開示の方法は、組み合わせるステップの後に、第１の化学的反応性の部分が第２の化学的反応性の部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に共有結合を形成する条件下で、ハイブリダイゼーション生成物を、１つ以上の化学物質に曝露することを含む。いくつかの実施形態において、第１の化学的反応性の部分は、第２の化学的反応性の部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に１，２，３−トリアゾールを形成することができる。いくつかの実施形態において、第１の化学的反応性の部分は、銅を含む条件下で、第２の化学的反応性の部分と反応することができる。第１および第２の化学的反応性の部分は、任意の適切な対合を含み得る。例えば、第１の化学的反応性部分は、アジド含有部分および５−オクタジイニルデオキシウラシルから選択され得、第２の化学的反応性部分は、独立して、アジド含有部分、ヘキシニル、および５−オクタジイニルデオキシウラシルから選択され得る。いくつかの実施形態において、アジド含有部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル−アジドである。
【００２７】
ある特定の態様では、本開示の方法は、組み合わせるステップの後に、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドおよび核酸を連結することを含む。含まれる場合、そのような連結ステップは、核酸の５’リン酸化末端をそれにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端に連結することを含む。そのような連結反応を実施するための適切な試薬（例えば、リガーゼ）およびキットは、公知であり、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能なＩｎｓｔａｎｔ  Ｓｔｉｃｋｙ−ｅｎｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘが利用可能である。使用され得るリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（例えば、低濃度または高濃度）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｌｉｇａｓｅ（登録商標）などが挙げられる。連結反応を実施するのに適した条件は、使用されるリガーゼのタイプに応じて変わるであろう。そのような条件に関する情報は、容易に利用可能である。
【００２８】
ある特定の実施形態によれば、組み合わせるステップの間、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、二本鎖として存在する。すなわち、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸鎖以外の核酸鎖にハイブリダイズし得る。ある特定の態様では、二本鎖は、相補性領域に隣接する（例えば、すぐ隣接する）オリゴヌクレオチドの領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよび核酸鎖を含む。いくつかの実施形態において、相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域は、相補性領域同定ポリヌクレオチド（相補性領域の同定配列）のすべてまたは一部を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプールは、第１の鎖および第２の鎖を含む、オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプールは、それぞれが第１の鎖および第２の鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含む。第１の鎖および第２の鎖から本質的になるということは、オリゴヌクレオチドが核酸の任意のさらなる鎖を含まない（例えば、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする）ことを意味する。したがって、本明細書において、「から本質的になる」とは、オリゴヌクレオチド中の鎖の数を指し、オリゴヌクレオチドは、鎖の数に必須ではない他の特徴を含むことができる（例えば、検出可能な標識を含み得る、他の領域を含み得る）。第１の鎖は、第１のポリヌクレオチドを含み、第２の鎖は、第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、二本鎖として存在するとき、二本鎖の一部またはすべては、核酸とハイブリダイズする末端と反対側の二本鎖の末端にオーバーハングを含み得る。そのような二本鎖オーバーハングが存在するとき、組み合わせの後に、本開示の方法は、二本鎖によって形成されるオーバーハングを埋めることをさらに含み得る。そのような充填反応を実施するための試薬およびキットは、公知であり、入手可能である。充填反応を実施するのに適したポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノー）断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。充填反応を実施するのに適した条件は、例えば、使用されるポリメラーゼのタイプに応じて変わり、その反応条件情報は容易に入手可能である。
【００３１】
ある特定の態様では、本明細書中の方法は、ヘアピンアダプターを使用して実施され得る。ヘアピンアダプターは、一般に、二本鎖「幹（ステム）」領域および一本鎖「ループ」領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる一本鎖（すなわち、連続的な一本鎖）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる一本鎖（すなわち、連続的な一本鎖）から本質的になる。一本鎖から本質的になることは、オリゴヌクレオチドが、連続鎖の一部ではない（例えば、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする）いかなるさらなる核酸鎖も含まないことを意味する。したがって、本明細書において、「から本質的になる」とは、オリゴヌクレオチド中の鎖の数を指し、オリゴヌクレオチドは、鎖の数に必須ではない他の特徴を含むことができる（例えば、検出可能な標識を含み得る、他の領域を含み得る）。ヘアピン構造を形成することができる一本鎖を含むか、または本質的にそれからなるオリゴヌクレオチドは、本明細書においてヘアピンアダプターと称され得る。
【００３２】
ヘアピンアダプターは、一本鎖内に複数のポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ヘアピンアダプターは、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドの一部は、第２のポリヌクレオチドの一部に相補的である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第１の領域に相補的な第１の領域を含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第２の領域に相補的ではない第２の領域を含む。相補的領域は、しばしば、ヘアピンアダプターのステムを形成し、非相補的領域は、しばしば、ヘアピンアダプターのループまたはその一部を形成する。第１および第２のポリペプチドは、例えば、増幅プライミング部位および特異的配列決定アダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）などの本明細書に記載のアダプターの構成要素を含み得る。
【００３３】
ヘアピンアダプターは、切断条件下で切断することができる１つ以上の切断部位を含み得る。いくつかの実施形態において、切断部位は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの間に位置する。切断部位での切断は、しばしば、ヘアピンアダプターから２本の別々の鎖を生成する。いくつかの実施形態において、切断部位での切断は、「Ｙ」構造を形成する２つの不対鎖を有する部分的に二本鎖アダプターを生成する。切断部位は、例えば、ウラシルおよび／またはデオキシウリジン塩基を含み得る。ウラシルおよび／またはデオキシウリジンを含む切断部位は、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅなど、およびそれらの組み合わせを用いて切断することができる。いくつかの実施形態において、切断部位は、ジオールを含む。例えば、切断部位は、５’から５’への連結に組み込まれた隣接ジオールを含み得る。ジオールを含む切断部位は、例えば、過ヨウ素酸塩を用いて化学的に切断することができる。いくつかの実施形態において、切断部位は、制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態において、切断部位は、レアカッター制限酵素認識部位（例えば、ＮｏｔＩ認識配列）を含む。レアカッター制限酵素認識部位は、一般に、哺乳動物および他の生物からのＤＮＡ／ＲＮＡ中に低頻度で生じる。例えば、レアカッター制限酵素認識部位は、ヒトまたは哺乳動物のゲノム配列にはめったに見られない配列を含み得る。制限酵素認識部位またはレアカッター制限酵素認識部位を含む切断部位は、制限酵素またはレアカッター制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ）によって切断され得る。いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、ヘアピンオリゴヌクレオチドのプールを標的核酸と組み合わせた後、１つ以上の切断部位を切断条件に曝露し、それによってオリゴヌクレオチドを切断することを含む。いくつかの実施形態において、切断部位は、平滑末端制限酵素認識部位を含む。平滑末端制限酵素認識部位を含む切断部位は、平滑末端制限酵素によって切断され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ヘアピンアダプターは、オーバーハング領域（例えば、５’オーバーハング、３’オーバーハング）を含む。ヘアピンアダプターのオーバーハング領域は、典型的には、二本鎖の「ステム」部分に隣接し、かつ「ループ」部分の反対側の端部に位置する。本明細書のヘアピンアダプターのオーバーハング領域は、典型的には、本明細書に記載の相補性領域を含む。相補性領域を含む本明細書のヘアピンアダプターはまた、しばしば、相補性領域同定ポリヌクレオチド（例えば、相補性領域の長さに特異的であり、時には相補性領域のタイプ（５’または３’）および／または配列に特異的な同定ポリヌクレオチド）も含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンアダプターは、５’から３’方向において、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドと、１つ以上の切断部位と、第２のポリヌクレオチドと、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な第２の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、相補性領域と、を含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンアダプターは、５’から３’方向において、相補性領域と、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドと、１つ以上の切断部位と、第２のポリヌクレオチドと、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な第２の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンアダプターのプールは、１）５’から３’方向において、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドと、１つ以上の切断部位と、第２のポリヌクレオチドと、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な第２の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドと、２）５’から３’方向において、相補性領域と、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドと、１つ以上の切断部位と、第２のポリヌクレオチドと、第１の相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な第２の相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドと、の混合物を含む。上記のある特定の実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチドは、５’から３’方向において、第１のポリヌクレオチドの第１の部分、第１のポリヌクレオチドの第２の部分、第２のポリヌクレオチドの第２の部分、および第２のポリヌクレオチドの第２の部分に順序付けられており、各ポリヌクレオチドの第１の部分は相補的であり、各ポリヌクレオチドの第２の部分は相補的ではない。
【００３５】
ある特定の態様では、本明細書中の方法は、固定化アダプターを使用して実施され得る。そのような方法では、一本鎖オリゴヌクレオチドの第１のセット（例えば、一本鎖バーコード可変相補性領域アダプター）は、固相に固定化される。次いで、相補体オリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズさせて、二本鎖固定化オリゴヌクレオチドを形成する。二本鎖標的核酸は、固定化オリゴヌクレオチドに接合（例えば、連結）される。次いで、標的核酸の遊離末端は、第２セットのオリゴヌクレオチドに接合（例えば、連結）される。一本鎖オリゴヌクレオチドは、核酸を固相に付着させるための任意の適切な方法に従って固相に固定化され得る。方法は、例えば、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡまたはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応基／相補化学反応基などの結合対のメンバーを利用することを含み得る。
【００３６】
上記のように、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドの相補性領域は、様々な長さおよびヌクレオチド配列を有する。相補性領域は、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在する５’および／または３’オーバーハングの長さ、アイデンティティ、またはその両方を調べる／検出するのに適するように設計することができる。相補性領域は、例えば、５’リン酸化核酸が生成された、および／または標的核酸が得られた核酸試料のタイプに基づいて設計することができる。ある特定の態様では、相補性領域のヌクレオチド配列は、例えば、オリゴヌクレオチドのプールが標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在することが疑いがある任意の可能性のあるオーバーハング配列に相補的な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドを含むように、相補性領域の長さにわたるランダムヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプールは、特定のオーバーハング長に対してすべての可能性のあるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む。特定のオーバーハング長に対してすべての可能性のあるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせは、各位置がオーバーハングの長さにわたってＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得ることを意味する。例えば、３ヌクレオチドオーバーハングは、各位置がＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得るとき、４３の可能なポリヌクレオチド配列配置（６４の可能なポリヌクレオチド）を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプールは、各オーバーハング長についてすべての可能性のあるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む。例えば、１〜１０塩基長のオーバーハング長を有するオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールは、以下の可能なオーバーハング配列の総数４＋４２＋４３＋４４＋４５＋４６＋４７＋４８＋４９＋４１０を含み得る。
【００３７】
他の態様では、相補性領域のヌクレオチド配列（複数可）は、例えば、そのような１つ以上のサブセットの調査／検出が、病状を診断する、５’リン酸化核酸が生成された、および／または標的核酸が得られた、ならびに／または同様の核酸試料の供給源を同定することの目的のために有益である場合、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在する目的の１つ以上のサブセットの５’および／または３’オーバーハング配列を調査／検出するように特に設計され得る。
【００３８】
オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドの相補性領域は、任意の適切な長さであり得、その適切な長さは、例えば、５’リン酸化核酸が生成された、および／または標的核酸が得られた、核酸試料の供給源に基づいて変化し得る。例えば、相補性領域の長さは、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在する疑いがある任意の可能なオーバーハングの長さを表す／対応するように設計することができる。ある特定の実施形態において、相補性領域の長さは、例えば、そのような１つ以上のサブセットの調査／検出が、病状を診断する、５’リン酸化核酸が生成された、および／または標的核酸が得られた、ならびに／または同様の核酸試料の供給源を同定することの目的のために有益である場合、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在する目的の１つ以上のサブセットの５’および／または３’オーバーハングを調査／検出するように特に設計することができる。ある特定の実施形態において、相補性領域の長さは、そのサブセットのみについてライゲーションパートナーを提供することによって、試料からのＤＮＡ断片のサブセットを濃縮するように設計することができる。
【００３９】
ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールは、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド長などの１〜５０ヌクレオチド長の様々な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプールは、５０ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、２０ヌクレオチド長以下、１９ヌクレオチド長以下、１８ヌクレオチド長以下、１７ヌクレオチド長以下、１６ヌクレオチド長以下、１５ヌクレオチド長以下、１４ヌクレオチド長以下、１３ヌクレオチド長以下、１２ヌクレオチド長以下、１１ヌクレオチド長以下、１０ヌクレオチド長以下、９ヌクレオチド長以下、８ヌクレオチド長以下、７ヌクレオチド長以下、６ヌクレオチド長以下、５ヌクレオチド長以下、４ヌクレオチド長以下、３ヌクレオチド長以下、または２ヌクレオチド長以下の様々な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールは、２ヌクレオチド長以上、例えば、３ヌクレオチド長以上、４ヌクレオチド長以上、５ヌクレオチド長以上、６ヌクレオチド長以上、７ヌクレオチド長以上、８ヌクレオチド長以上、９ヌクレオチド長以上、１０ヌクレオチド長以上、１１ヌクレオチド長以上、１２ヌクレオチド長以上、１３ヌクレオチド長以上、１４ヌクレオチド長以上、１５ヌクレオチド長以上、１６ヌクレオチド長以上、１７ヌクレオチド長以上、１８ヌクレオチド長以上、１９ヌクレオチド長以上、２０ヌクレオチド長以上、３０ヌクレオチド長以上、４０ヌクレオチド長以上、または５０ヌクレオチド長以上の様々な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプールのある特定のオリゴヌクレオチドは、相補性領域を有しない。そのようなオリゴヌクレオチドは、平滑末端であり得、標的核酸の１つ以上の平滑末端に接合（例えば、連結）されるのが可能であり得る。相補性領域を有しないオリゴヌクレオチドは、ゼロヌクレオチド長を有する相補性領域を有すると称され得る。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドの相補性領域同定配列（例えば、バーコード）は、そのそれぞれのオリゴヌクレオチドに存在する相補性領域を独自に同定し、次に、相補性領域が特異的にハイブリダイズする標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在する各種類のオーバーハング（例えば、長さ、５’または３’、および／または同様の）を独自に同定する。しばしば、異なる長さのオーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドは、互いに異なり、独特である。典型的には、ｉ）異なる長さのオーバーハングにハイブリダイズする相補性領域、およびｉｉ）異なるタイプ（すなわち、３’、５’）の相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドは、互いに異なり、独特である。一般に、「相補性領域の長さに特異的な」２つの相補性領域同定配列は、異なる長さのオーバーハングを有するプールのオリゴヌクレオチド中には存在しない。言い換えれば、所与の長さの相補性領域に特異的な所与の相補性領域同定配列（または一連の配列）は、そのような所与の長さの相補性領域（オーバーハング）を有するオリゴヌクレオチド中にのみ存在するであろう。異なる長さの相補性領域を有するオリゴヌクレオチドは、異なる相補性領域同定配列（または一連の配列）を含むであろう。いくつかの実施形態において、特定の長さのオーバーハングを有するプール中のすべてのオリゴヌクレオチドに対して１つの相補性領域同定配列がある。いくつかの実施形態において、一方の相補性領域同定配列が５’オーバーハングに対する所与の長さに特異的であり、他方の相補性領域同定配列が３’オーバーハングに対する所与の長さに特異的であるように、特定の長さのオーバーハングを有するプール中のすべてのオリゴヌクレオチドに対して２つの相補性領域同定配列がある。いくつかの実施形態において、オーバーハングの配列に関係なく、特定の長さのオーバーハングを有するプール中のすべてのオリゴヌクレオチドに対して１つまたは２つの相補性領域同定配列（複数可）がある。いくつかの実施形態において、特定の長さのオーバーハングを有するプール中のオリゴヌクレオチドについてのサブセットの相補性領域同定配列があり、サブセット中の異なる相補性領域同定配列は、（例えば、相補性領域の長さおよびタイプ（すなわち、５’または３’）に特異的であることに加えて）オリゴヌクレオチド内の異なる相補性領域配列に特異的である。「相補性領域同定配列」、「相補性領域同定ポリヌクレオチド」、「同定ポリヌクレオチド」、「可変オーバーハングバーコード」、「可変相補性領域バーコード」、および「バーコード」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００４２】
本明細書におけるポリヌクレオチドは、より大きなポリヌクレオチドの一部であり得る。より大きなポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドであり得る。例えば、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、本明細書中のオリゴヌクレオチドの領域またはドメインと考えられ得る。したがって、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域同定領域または相補性領域同定ドメインと称され得る。２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、第１および第２のポリヌクレオチド）はそれぞれ、同じより大きなポリヌクレオチドの一部であり得、同じより大きなポリヌクレオチドは、例えば、同じオリゴヌクレオチドであり得る。そのような２つ以上のポリヌクレオチドは、より大きいポリヌクレオチドの領域またはドメイン、例えば、本明細書中のオリゴヌクレオチドの第１および第２の領域、または本明細書中のオリゴヌクレオチドの第１および第２のドメインと称され得る。
【００４３】
例として、例示のみを目的として、オリゴヌクレオチドプールは、１ヌクレオチド長の５’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第１のサブセット、２ヌクレオチド長の５’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第２のサブセット、３ヌクレオチド長の５’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第３のサブセット、４ヌクレオチド長の５’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第４のサブセット、１ヌクレオチド長の３’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第５のサブセット、２ヌクレオチド長の３’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第６のサブセット、３ヌクレオチド長の３’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第７のサブセット、４ヌクレオチド長の３’オーバーハングに特異的にハイブリダイズする相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列を含むオリゴヌクレオチドの第８のサブセット、および必要に応じて記載されるとおりに含み得る。
【００４４】
相補性領域同定配列（例えば、バーコード）は、例えば、オリゴヌクレオチドプール中に存在する様々な異なる相補性領域を表すのに十分な数の固有の相補性領域同定配列を提供するために、任意の適切な長さであり得る。ある特定の態様では、相補性領域同定配列は、２〜１０ヌクレオチド長、例えば、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、または３〜５（例えば、５）ヌクレオチド長である。
【００４５】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプールのうちのいずれかは、相補性領域を有しないオリゴヌクレオチドをさらに含み得、このオリゴヌクレオチドは、相補性領域を有しないオリゴヌクレオチドに特異的な同定配列を含み得る。相補領域を含まないオリゴヌクレオチドは、例えば、平滑末端を有する（すなわち、オーバーハングがない）標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸の検出／調査の用途として見出される。
【００４６】
オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（または「ヌクレオチド類似体）、または天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの混合物を含み得る。オリゴヌクレオチド中に存在し得る非天然ヌクレオチドとしては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）ヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、例えば、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドであり得、例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の架橋核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチドを含む。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、例えば、１つ以上のＢＮＡヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドであり得、例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、ＢＮＡヌクレオチドであり得る。
【００４７】
ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されていない。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されている。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズした後にリン酸化されている。例えば、標的核酸にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチド中の一本鎖の３’末端を標的核酸中の一本鎖の５’リン酸化末端に連結した後、オリゴヌクレオチド中の反対側の鎖の５’末端がリン酸化され、次いで、標的核酸中の反対側の鎖の３’末端に連結される。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズする前にリン酸化されている。そのような態様では、方法は、（例えば、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの比率を調節することによって）オリゴヌクレオチド二量体形成の防止、および／または（例えば、核酸サイズ選択方法によって）オリゴヌクレオチド二量体の除去を含み得る。
【００４８】
「オーバーハング」という用語は、一般に、核酸分子の末端にある一本鎖部分を指す。例えば、核酸分子は、１つ以上の対合ヌクレオチド（塩基）を含む二本鎖または「二重」領域、および１つ以上の不対ヌクレオチド（塩基）を含む一本鎖または「オーバーハング」領域を含み得る。典型的には、オーバーハングは、（例えば、二本鎖領域が側面に位置する一本鎖領域とは対照的に）核酸分子の末端にある一本鎖領域を指す。オーバーハングは、本明細書において５’オーバーハングまたは３’オーバーハングとして記載され得る。５’オーバーハングは、一般に、二本鎖部分が終わり、一本鎖部分が始まる接合部から始まり、オーバーハングの末端（自由端）で終わる、３’から５’方向への従来の核酸の方向性に従って読み出す核酸分子の末端の一本鎖領域を指す。３’オーバーハングは、一般に、二本鎖部分が終わり、一本鎖部分が始まる接合部から始まり、オーバーハングの末端（自由端）で終わる、５’から３’方向への従来の核酸の方向性に従って読み込む核酸分子の末端の一本鎖領域を指す。本明細書中に記載されるように、標的核酸は、（例えば、核酸分子の一方の末端に）オーバーハングを含み得、（例えば、核酸分子の両方の末端に）２つのオーバーハングを含み得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２つのオーバーハング、１つのオーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２つの３’オーバーハング、２つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの平滑末端、１つの５’オーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸中のオーバーハングは、天然のオーバーハングである。天然のオーバーハングは、一般に、試料組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、修飾されていない（例えば、埋められていない、切断されていない、導入されていない）オーバーハングを指す。天然のオーバーハングは、一般に、単離された試料を切断剤（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素）と接触させることによって作り出されるオーバーハングを含まない。
【００４９】
本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドは、オーバーハング（例えば、オリゴヌクレオチドの一方の末端に）を含み得、２つのオーバーハング（例えば、オリゴヌクレオチドの両方の末端に）を含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つのオーバーハング、１つのオーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つの３’オーバーハング、２つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの５’オーバーハング、１つの３’オーバーハングと１つの平滑末端、１つの５’オーバーハングと１つの平滑末端、２つの平滑末端、またはこれらの組み合わせを含む。本明細書に記載のヘアピン構造オリゴヌクレオチドについて、そのようなオリゴヌクレオチド（例えば、切断されていない状態で）は、一般に、１つのオーバーハング（例えば、５’オーバーハングまたは３’オーバーハング）を含み、場合によっては、オーバーハングを含まない（すなわち、平滑末端）。一般に、本明細書においてオリゴヌクレオチド中のオーバーハングのうちの１つは、相補性領域を含む。多くの場合、本明細書においてオリゴヌクレオチド中のオーバーハングのうちの１つは、相補性領域である。本明細書においてオリゴヌクレオチドについて論じるとき、「オーバーハング」および「相補性領域」という用語は、互換的に使用され得る。本明細書においてオリゴヌクレオチドおよび標的核酸を論じるとき、「オーバーハング」および「オーバーハング領域」という用語は、互換的に使用され得る。
【００５０】
本明細書で使用される「相補的」または「相補性」という用語は、標的核酸の領域、例えば、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸のオーバーハング領域への非共有結合によって塩基対形成するヌクレオチド配列を指す。正準ワトソン−クリック型塩基対において、グアニン（Ｇ）がＤＮＡにおいてシトシン（Ｃ）と塩基対を形成するように、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラシル（Ｕ）で置き換えられる。したがって、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である。ＲＮＡでは、ＡはＵに相補的であり、逆もまた同様である。典型的には、「相補的」または「相補性」とは、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。これらの用語はまた、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが対応する位置の他方の鎖のすべてのヌクレオチドに相補的であるように完全に相補的な二本鎖も含み得る。場合によっては、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であり得、その場合、すべての対応する位置において、すべてのヌクレオチドが標的核酸中のすべてのヌクレオチドに相補的であるとは限らない。例えば、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドの相補性領域は、５’核酸の核酸のオーバーハングに完全に（すなわち、１００％）相補的であり得るか、またはオリゴヌクレオチドの相補性領域は、完全ではない（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％）、ある程度の相補性を共有し得る。２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列させることによって決定することができる（例えば、最適な整列のために第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較し、２つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列中の位置が他方の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、その分子は、その位置で同一である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例はＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３８９−３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。一態様では、配列比較のためのパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定することができ、または変更することができる（例えば、ワード長＝５またはワード長＝２０）。
【００５１】
ある特定の態様では、「相補的」または「相補性」は、構造的相補性（例えば、オーバーハング相補性）を指し得る。例えば、３’、６塩基対オーバーハングを有する標的核酸は、５’、６塩基対オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドと構造的相補性を有し得る。構造的相補性は、非特異的塩基対合を含み得る。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸中の塩基と非特異的な塩基対合が可能な１つ以上のヌクレオチドを有する相補性領域を含む。例えば、３’、６塩基対オーバーハングを有する標的核酸は、５’、６塩基対オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドと構造的相補性を有することができ、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、標的核酸オーバーハング中の対応する位置に塩基の可能性のすべてまたは一部を有する、非特異的に対合することができる１つ以上のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、すべてのヌクレオチドが標的核酸中の塩基と非特異的な塩基対合することができる相補性領域を含む。非特異的な塩基対合することができるヌクレオチドは、上記の４つの典型的な塩基（例えば、ニトロインドール、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、イノシン、デオキシイノシン、２−デオキシイノシン）のいずれかを置換することができる「ユニバーサル塩基」、または４つの典型的な塩基（例えば、非天然塩基ＰおよびＫ）のうちの２つまたは３つ（すべてではない）を置き換えることができる「縮重／ウォッブル塩基」と称され得る。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上のユニバーサル塩基を含む相補性領域を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドオーバーハングは、ユニバーサル塩基からなる相補性領域を含む。
【００５２】
組み合わせるステップ中の「条件」は、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、配列が相補的であり、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有するオーバーハング領域を有する標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸に特異的にハイブリダイズする条件である。いくつかの実施形態において、対応する長さは、同じ長さ（すなわち、相補性領域および標的核酸オーバーハング中の同じ数の塩基）を指す。特異的なハイブリダイゼーションが起こるかどうかは、相補性領域とオーバーハング領域との間の相補性の程度、それらの長さ、およびハイブリダイゼーションが起こる温度のような要因によって決定され、それはその相補性領域／オーバーハングの融解温度（ＴＭ）によって通知され得る。融解温度は、相補性領域／オーバーハングの半分がハイブリダイズしたままであり、相補性領域／オーバーハングの半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、実験的に決定され得るか、または以下の式を使用して予測され得る：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（６０／Ｎ）（式中、Ｎは、鎖長であり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である）。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照のこと。様々なパラメータに依存する他のより先進的なモデルはまた、様々なハイブリダイゼーション条件に応じて、相補性領域／オーバーハングの二本鎖のＴｍを予測するために使用することもできる。特異的核酸ハイブリダイゼーションを達成するためのアプローチは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ２，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に見出され得る。
【００５３】
ある特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域および相補性領域の同定配列以外の１つ以上の部分（または「ドメイン」）を含む。そのようなさらなる部分は、例えば、核酸増幅、配列決定（例えば、ハイスループット配列決定）、またはその両方などの、ハイブリダイゼーション生成物またはその誘導体を利用する１つ以上の下流の適用を容易にするために提供され得る。ある特定の態様では、さらなる部分（すなわち、相補性領域および相補性領域同定配列以外）は、核酸結合ドメインを含む。目的の核酸結合ドメインは、例えば、プライマー結合ドメインを含む。ある特定の実施形態によれば、さらなる部分は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む。
【００５４】
「配列決定アダプター」とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ配列決定システム）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ  ＲＳ  ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ＧＳ  ＦＬＸ＋および／またはＧＳジュニア配列決定システム）、または目的の任意の他の配列決定プラットフォーム、によって提供される配列決定プラットフォームなどの目的の配列決定プラットフォームによって利用される核酸配列の少なくとも一部（またはその相補物）を含む１つ以上の核酸ドメインを意味する。
【００５５】
ある特定の態様では、配列決定アダプターは、表面結合配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおいてフロー細胞の表面に結合したＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）、排列決定プライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのリード１またはリード２プライマーが結合することができるドメイン）、バーコードドメイン（例えば、特定のバーコードまたは「タグ」を用いて所与の試料からのすべての分子をマークすることによって試料多重化を可能にするように配列決定される核酸の試料供給源を一意に同定するドメイン、そのような「バーコードドメイン」は、典型的には、相補性領域同定配列として使用するための本明細書に記載のバーコードと同じではない）、バーコード配列決定プライマー結合ドメイン（バーコードを配列決定するために使用されるプライマーが結合するドメイン）、例えば、独自のタグが配列決定されるインスタンスの数に基づいて発現レベルを決定するために、目的の分子を一意にマーキングするための分子の同定ドメイン（例えば、４、６、または他の数のヌクレオチドのランダム化タグなどの分子インデックスタグ）、任意のそのようなドメインの補完物、またはそれらの任意の組み合わせ、から選択される核酸ドメインであるか、またはそれらを含む。ある特定の態様では、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）および分子の同定ドメイン（例えば、分子インデックスタグ）は、同じ核酸に含まれてもよい。
【００５６】
オリゴヌクレオチドが、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含むさらなる部分を含むとき、１つ以上のさらなる配列決定アダプターおよび／または配列決定アダプターの残りの部分が、様々なアプローチを用いてハイブリダイゼーション生成物に加えられ得る。例えば、配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分は、ライゲーション、ＰＣＲ増幅などによって付加され得る。ＰＣＲの場合、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ハイブリダイゼーション生成物の一方の末端でハイブリダイゼーション生成物のオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズするための）と、配列決定アダプターのさらなるおよび／または残りの部分を含む５’領域と、を含む、第１の増幅プライマー、ならびに３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、第１の増幅プライマーがハイブリダイズする末端と反対側のハイブリダイゼーション生成物の末端でハイブリダイゼーション生成物のオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズするための）と、配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分を含む５’領域と、を含む、第２の増幅プライマーを含む、増幅プライマー対を用いることができる。
【００５７】
標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）は、目的の任意の核酸であり得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる任意の長さ、例えば、１０塩基以上、２０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上、５００塩基以上、１０００塩基以上、２０００塩基以上、３０００塩基以上、４０００塩基以上、５０００塩基以上、またはそれ以上のポリマーであり得る。ある特定の態様では、核酸は、例えば、１０塩基以下、２０塩基以下、５０塩基以下、１００塩基以下、５００塩基以下、１０００塩基以下、２０００塩基以下、３０００塩基以下、４０００塩基以下、または５０００塩基以下のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなるポリマーである。
【００５８】
ある特定の態様では、標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ある特定の態様では、５’リン酸化核酸は、５’リン酸化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。目的のＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ断片を含む）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）相補的ＤＮＡ（または目的の任意のＲＮＡもしくはＤＮＡから合成された「ｃＤＮＡ」）、組換えＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
ある特定の実施形態によれば、標的核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。ある特定の実施形態によれば、５’リン酸化核酸は、５’リン酸化リボ核酸（ＲＮＡ）である。目的のＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランザクション低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ−ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ−ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、Ｐｉｗｉと相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、またはこのようなＲＮＡタイプもしくはサブタイプの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様では、本発明の方法は、二次ＲＮＡ構造、例えば、分子内ハイブリダイゼーション（例えば、ステム形成）から生じる目的のＲＮＡ中のオーバーハングを検出／同定するのに使用される。
【００６０】
標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）は、単一の細胞、複数の細胞（例えば、培養細胞）、組織、器官、または生物（例えば、細菌、酵母など）から単離された核酸試料を含むが、これらに限定されない、目的の任意の核酸試料から調製され得る。ある特定の態様では、核酸試料は、動物の細胞（複数可）、組織、器官、および／または同等物から単離される。いくつかの実施形態において、動物は、哺乳動物（例えば、ヒト属からの哺乳動物、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、または目的の任意の他の哺乳動物）である。他の態様では、核酸試料は、細菌、酵母、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、両生類（例えば、カエル（例えば、アフリカツメガエル））、ウイルス、植物、または任意の他の非哺乳動物の核酸試料源などの哺乳動物以外の供給源から単離される／得られる。
【００６１】
核酸試料は、現存する生物または動物から得られる（例えば、単離される）ことができる。しかしながら、他の態様では、核酸試料は、絶滅（または「古代」）生物または動物、例えば、ヒト属の絶滅哺乳動物などの絶滅哺乳動物から得られる（例えば、単離される）ことができる。いくつかの態様では、核酸は、法医学的分析の一部として得られ得る。いくつかの態様では、核酸は、診断分析の一部として得られ得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）は、分解ＤＮＡを含み得る。分解ＤＮＡは、低品質ＤＮＡまたは高度に分解されたＤＮＡと称され得る。分解ＤＮＡは、高度に断片化され得、ミスコーディングの損傷を受けやすい塩基類似体や無塩基部位などの損傷を含み得る。例えば、シトシン残基の脱アミノ化から生じる配列決定エラーは、分解ＤＮＡから得られる特定の配列中に存在し得る（例えば、ＣからＴへのおよびＧからＡへのミスコーディング）。
【００６３】
ある特定の実施形態によれば、標的核酸は、無細胞核酸、例えば、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、またはその両方を含む。ある特定の実施形態によれば、５’リン酸化核酸は、無細胞核酸、例えば、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、またはその両方から産生される。そのような無細胞核酸は、任意の適切な供給源から得えられ得る。ある特定の態様では、無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便からなる群から選択される、体液試料から得られる。いくつかの実施形態において、無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡである。ある特定の態様では、無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、無細胞核酸は、感染性因子ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、無細胞核酸は、移植片からのＤＮＡを含む。
【００６４】
本明細書で使用される「無細胞核酸」という用語は、実質的に細胞を有しない供給源から単離された核酸を指し得る。無細胞核酸は、「細胞外」核酸、「循環無細胞」核酸（例えば、ＣＣＦ断片、ｃｃｆ  ＤＮＡ）、および／または「無細胞循環」核酸と称され得る。無細胞核酸は、血液中に存在し得、血液から（例えば、動物の血液から、ヒト対象の血液から）得られ得る。無細胞核酸は、検出可能な細胞を含まないことが多く、細胞要素または細胞残留物を含み得る。無細胞核酸のための無細胞供給源の非限定的な例は、上記されている。無細胞核酸を得ることは、試料を直接得ること（例えば、試料、例えば、試験試料を採取すること）、または試料を採取した別の人から試料を得ることを含み得る。理論に制限されることなく、無細胞核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞破壊の生成物であり得、これは、しばしば、スペクトル（例えば、「ラダー」）にわたって一連の長さを有する無細胞核酸の基礎を提供する。いくつかの実施形態において、試験対象からの試料核酸は、循環無細胞核酸である。いくつかの実施形態において、循環無細胞核酸は、試験対象からの血漿または血清からのものである。いくつかの態様では、無細胞核酸は、分解されている。
【００６５】
無細胞核酸は、異なる核酸種を含むことができ、したがって、ある特定の実施形態において、本明細書では「異種」と称される。例えば、癌を有する対象からの試料は、癌細胞（例えば、腫瘍、新生物）からの核酸および非癌細胞からの核酸を含み得る。別の例では、妊娠中の女性からの試料は、母体の核酸および胎児の核酸を含み得る。別の例では、感染症または感染性疾患を有する対象からの試料は、宿主核酸および感染性病原体（例えば、細菌、真菌、原虫）からの核酸を含み得る。別の例では、移植を受けた対象からの試料は、宿主核酸およびドナー臓器または組織からの核酸を含み得る。いくつかの例において、癌、胎児、感染因子、または移植核酸は、時には、全核酸の約５％〜約５０％である（例えば、全核酸の約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９％が、癌、胎児、感染因子、または移植核酸である）。別の例では、異種の無細胞核酸は、２人以上の対象からの核酸（例えば、犯罪現場からの試料）を含み得る。
【００６６】
核酸試料は、腫瘍核酸試料（すなわち、腫瘍から単離された核酸試料）であり得る。本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての新生物細胞の増殖および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸大腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、様々な種類の頭頸部癌などが挙げられる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、核酸は、核酸を含む試料（複数可）の処理後に、本明細書に記載の方法を実施するために提供される。例えば、核酸は、試料（複数可）から抽出、単離、精製、もしくは部分的に精製、および／または濃縮することができる。「単離された」という用語は、一般に、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合は自然環境、または外因的に発現される場合は宿主細胞）から取り出された核酸を指す。「単離された核酸」という用語は、対象（例えば、ヒト対象）から取り出された核酸を指すことができる。単離された核酸は、供給源試料中に存在する成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）が提供され得る。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分を約５０％〜９９％超含み得ない。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超含み得ない。「精製された」という用語は、一般に、核酸を精製手順に供する前に存在する非核酸成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）を含有するという条件で、核酸を指す。精製核酸を含む組成物は、他の非核酸成分を約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超含み得ない。いくつかの実施形態において、核酸は、濃縮されている（例えば、核酸の量は、溶液の体積あたり増加する）。
【００６８】
目的の供給源からＤＮＡおよびＲＮＡを単離、精製、および／または濃縮するためのアプローチ、試薬、およびキットは、当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば、目的の供給源からＤＮＡを単離するためのキットには、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）によるＤＮｅａｓｙ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）、およびＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）の核酸単離／精製キット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＤＮＡｚｏｌ（登録商標）、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）、ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（登録商標）核酸単離／精製キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）、およびＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）核酸単離／精製キットが含まれる。ある特定の態様では、核酸は、固定された生物学的試料、例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離される。ＦＦＰＥ組織からのゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＦＦＰＥキット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＦＦＰＥ用のＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商標）全核酸単離キット、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰＥキットなどの市販のキットを用いて単離され得る。
【００６９】
核酸試料が得られる（例えば、単離される）生物、植物、動物などが絶滅している（または「古代」）場合、そのような核酸を回収するための適切な戦略は、公知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２８（５９７９）：７１０−７２２、Ｐｏｉｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１１（５７５９）：３９２−３９４、Ｓｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３（３７）：１３５７８−１３５８４、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ４５６（７２２０）：３８７−９０、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ４６３（７２８２）：７５７−７６２、および他の箇所に記載されている。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、組成物とオリゴヌクレオチドのプールとを組み合わせる前に、核酸組成物（例えば、標的核酸を含む核酸組成物）を調製することを含む。いくつかの実施形態において、核酸組成物を調製することは、試料から核酸を単離し、それによって核酸組成物を生成することを含む。いくつかの実施形態において、核酸組成物は、試料から核酸を単離し、それによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスによって調製される。いくつかの実施形態において、核酸組成物は、試料から核酸を単離し、それによって単離された核酸を生成することと、単離された核酸の一方または両方の末端をリン酸部分または化学的反応性部分で修飾し、それによって核酸組成物を生成することと、から本質的になるプロセスによって調製される。この文脈において、「から本質的になる」は、調製された組成物中の核酸が、標的核酸組成物とオリゴヌクレオチドプールとの組み合わせを促進するのに適した任意の薬剤または状態（例えば、緩衝液、温度修飾）で修飾できることを意味する。
【００７１】
ある特定の態様では、標的核酸は、プールと組み合わされるとき、溶液中にある。ある特定の態様では、標的核酸は、固定細胞試料中にはなく、固定組織試料中にはない。例えば、いくつかの実施形態において、本方法は、固定細胞試料中にはなく、および／または固定組織試料中にはない、オーバーハングを含む標的核酸を含む核酸組成物溶液、ならびにオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールを組み合わせることを含み、オリゴヌクレオチドの一部またはすべては、（ｉ）標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み、プール中のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの相補性領域を含み、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域の１つ以上の特徴（例えば、長さ）に特異的である。
【００７２】
ある特定の態様では、本開示の方法は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸（すなわち、組み合わせるステップの間に生成された「ハイブリダイゼーション生成物」）を配列決定することをさらに含む。「ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸の配列決定すること」または「ハイブリダイゼーション生成物の配列決定すること」とは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸／ハイブリダイゼーション生成物またはそれらの誘導体のヌクレオチド配列を決定することを意味する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸の誘導体／ハイブリダイゼーション生成物は、例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸を連結すること、ハイブリダイゼーション生成物をＰＣＲ増幅すること、またはそれらの組み合わせによって調製され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、配列決定プロセスは、高度に多重化された配列決定プロセスである。いくつかの実施形態において、配列決定プロセスは、配列決定リードを生成する。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、配列決定リードに基づいて標的核酸に対するオーバーハングの配列を決定することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、配列決定リードに基づいて相補性領域同定ポリヌクレオチドの配列を決定することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、標的核酸に対するオーバーハングの長さを決定することを含む。
【００７４】
配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定プラットフォーム、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）（または「次世代配列決定（ＮＧＳ）」）プラットフォームなどを含む任意の適切な配列決定プラットフォーム上で実行され得る。目的のＨＴＳ／ＮＧＳ配列決定プラットフォームとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／もしくはＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ配列決定システム）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭＴＭおよび／もしくはＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ  ＲＳ  ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ＧＳ  ＦＬＸ＋および／もしくはＧＳジュニア配列決定システム）、または目的の任意の他の配列決定プラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、増幅（例えば、固相増幅）などによって）配列決定すること、増幅を配列決定すること、および配列決定するデータを分析することのためのハイブリダイゼーション生成物を調製するための詳細なプロトコルは、目的の配列決定システムの製造業者から入手可能である。
【００７５】
いくつかのＨＴＳ／ＮＧＳ配列決定プラットフォームは、配列決定される核酸が一方の末端に第１のアダプターを有し、もう一方の末端に第２のアダプターを有することを必要とし、第１および第２のアダプターは同じでもあっても、異なっていてもよい。各末端に異なるアダプターを有するハイブリダイゼーション生成物を生成するための一例のスキームを図１に示す。図１の特定の非限定的な例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５アダプターがハイブリダイゼーション生成物の一方の末端に提供され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７アダプターが反対側の末端に提供されている。したがって、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション生成物の一方または両方の末端に１つ以上の配列決定アダプター（またはその一部）を提供して、所望のＨＴＳ／ＮＧＳ配列決定プラットフォームでの生成物の下流配列決定を容易にするように設計され得る。
【００７６】
本開示の方法が、ハイブリダイゼーション生成物を配列決定することをさらに含むとき、得られた配列決定データは、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）、したがって、５’リン酸化核酸を調製し、および／または標的核酸を得た、核酸の様々な特性を評価するために使用され得る。ある特定の実施形態によれば、本開示の方法は、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの様々な相補性領域に対応する相補性領域同定配列を含む配列決定リードの数に基づいて標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）のオーバーハング含量を決定することを含む。このようにして、相補性領域同定配列（例えば、バーコード）は、各タイプのオリゴヌクレオチド相補性領域を独自に同定し、次に相補性領域は特異的にハイブリダイズする標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）中に存在する各タイプのオーバーハングを独自に同定する。「オーバーハング含有量」は、５’リン酸化核酸（したがって、５’リン酸化核酸が調製された核酸）中に存在するオーバーハングの長さ、アイデンティティ（５’オーバーハングもしくは３’オーバーハング）、配列、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、本方法は、オーバーハング含量に基づいて、（例えば、法医学目的のために）５’リン酸化核酸が生成されたおよび／または標的核酸が得られた核酸試料の供給源を同定することを含む。
【００７７】
いくつかの態様では、本明細書中の方法は、核酸組成物中の特定のオーバーハングを分析することを含む。そのような方法は、本明細書に記載の方法に従って核酸を配列決定することと、標的核酸中のオーバーハングの量を定量化し、それによってオーバーハング定量化を生成することを含み得る。いくつかの実施形態において、オーバーハングの定量化は、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）特定の長さ、または（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうちの２つ、３つ、もしくは４つの組み合わせとして特徴付けられる、オーバーハングについてのものである。いくつかの実施形態において、オーバーハングの定量化は、（ｉ）５’オーバーハングまたは３’オーバーハング、および（ｉｉ）特定の長さとして特徴付けられる、オーバーハングについてのものである。いくつかの態様では、本明細書中の方法は、標的核酸組成物がオーバーハングの定量化に基づいて発生した、核酸試料中の標的核酸の供給源を同定することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、法医学分析のために行われる。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、診断分析のために行われる。
【００７８】
本開示の一実施形態による方法を、図１に図式的に示す。この実施例では、目的の核酸試料からの核酸は、５’リン酸化されている（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用して）。次に、５’リン酸化核酸およびオリゴヌクレオチドプールを、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが配列に相補的であるオーバーハング領域を有する５’リン酸化核酸の核酸にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドの相補性領域（図１に黒で示す）に関して対応する長さを有する条件下で組み合わせる。オリゴヌクレオチドは、そのそれぞれのオリゴヌクレオチドの相補性領域を独自に同定する相補性領域同定配列（図１の「バーコード」）を含む。この実施例では、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよび核酸鎖を含む二本鎖として存在する（例えば、図１の「オリゴ」および「鎖」、上から２番目のボックスを参照のこと）。また、この実施例では、オリゴヌクレオチドは、配列決定アダプターまたはその一部を含む（例えば、図１の「ｓｅｑアダプター」（ここでは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５またはＰ７）、上から２番目のボックスを参照のこと）。図１に示す特定の実施形態において、組み合わせるステップの後に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドと核酸とを、互いに連結する。また、この実施形態において、連結生成物を、鎖置換フィルイン反応（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼを用いて）に曝露して、各末端上の配列決定アダプターを完成する。図１に示されるこの例示的な方法の生成物は、例えば、様々な５’リン酸化核酸、順に、目的の試料中の様々な元の核酸のオーバーハング含量に関する情報を得るために、ハイスループット配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームを使用する）などの目的の下流用途において使用され得る。
【００７９】
いくつかの態様では、方法は、標的核酸の種を濃縮することを含む。例えば、本明細書中の方法は、特定のオーバーハング特性（例えば、長さ、タイプ（５’、３’）、配列）を有する標的核酸の種を濃縮することを含み得る。特定のオーバーハング特性を有する標的核酸の種の濃縮は、特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに従って達成され得る。例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと複合体を形成した特定の標的核酸は、特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに従って（例えば、相補性領域同定ポリヌクレオチドの配列に従って、または別の特性（例えば、修飾）に従って）標的核酸の残りから分離され得る。いくつかの実施形態において、方法は、複合体（本明細書のオリゴヌクレオチドに結合した標的核酸）を特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上の結合剤と会合させ、それによって濃縮複合体を生成することを含む。「特異的にハイブリダイズする」という用語とは、特異的または特異性は、一般に、ある分子から別の分子（例えば、ポリヌクレオチド鎖から相補鎖）への結合またはハイブリダイゼーションを指す。すなわち、特異的または特異性とは、２つの分子のいずれかと他の分子との認識、接触、または複合体形成が実質的に少ないことと比較して、２つの分子間の安定な複合体の認識、接触、および形成を指す。ハイブリダイズという用語は、一般に、２つの分子間の安定な複合体の形成を指す。いくつかの態様では、特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、結合対のメンバーを含む。いくつかの態様では、特定の相補性領域同定ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、結合対のメンバーを含む。結合対は、例えば、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡもしくはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／固有因子、化学反応基／相補化学反応基などを含み得る。いくつかの実施形態において、特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上の結合剤を、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着させることができる。特定の種のオーバーハングを有する標的核酸の濃縮は、その後、生体分子を分離するための任意の適切な方法（例えば、プルダウンアッセイ、固体支持体の使用など）に従って達成され得る。
【００８０】
ある特定の態様では、本開示の方法は、（ｉ）核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション生成物中のオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、（ｉｉｉ）複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、（ｉｖ）核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、を含む。ある特定の態様では、本開示の方法は、（ｉ）核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション生成物中のオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、（ｉｉｉ）複合体を特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上の結合剤と会合させ、それによって濃縮生成することと、（ｉｖ）濃縮複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、（ｖ）核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、を含む。
【００８１】
ある特定の態様では、本開示の方法は、（ｉ）核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション生成物中のオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、（ｉｉｉ）複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、（ｉｖ）核酸ライブラリを配列決定プロセスにさらすことと、から本質的になる。ある特定の態様では、本開示の方法は、（ｉ）核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション生成物中のオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、（ｉｉｉ）複合体を特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上の結合剤と会合させ、それによって濃縮複合体を生成することと、（ｉｖ）濃縮複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、（ｖ）核酸ライブラリを配列決定プロセスにさらすことと、から本質的になる。上記方法が記載のステップ「から本質的になる」とき、本方法は、任意の記載のステップ（例えば、洗浄、加熱、冷却、単離、精製、濃縮、希釈、分離など）に関連するさらなる日常操作を含み得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを修飾することは、オリゴヌクレオチド中の１つ以上の切断部位を切断すること（例えば、ヘアピンアダプター中の１つ以上の切断部位で切断すること）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを修飾することは、標的核酸中のオーバーハングと相互作用するオリゴヌクレオチド中のオーバーハングとは反対側のオリゴヌクレオチド中のオーバーハングを埋めることを含む。
【００８３】
組成物
組成物も提供される。組成物は、例えば、本開示の方法を実施する際に使用され、任意の所望の組み合わせにおいて、本開示の方法を記載する節において上記に記載の任意の成分（例えば、オリゴヌクレオチドプール、オリゴヌクレオチド成分／領域、標的核酸、５’リン酸化核酸など）を含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、組成物は、目的の核酸試料中のオーバーハングに特異的にハイブリダイズするように適合された様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールと、相補性領域同定配列と、を含む。オリゴヌクレオチドプール、オリゴヌクレオチド、ならびにオリゴヌクレオチド領域および配列は、本発明の方法を記載する節において上記のとおりであり得る。
【００８５】
本開示の組成物のいずれも容器内に存在し得る。適切な容器としては、チューブ、バイアル、およびプレート（例えば、９６ウェルプレートまたは他のウェルプレート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
ある特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在するオリゴヌクレオチドプールを含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌクレアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などは、このような組成物に存在してもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、凍結乾燥組成物である。凍結乾燥プロセス中の不安定化条件からオリゴヌクレオチドプールを保護するために、凍結保護剤をそのような組成物に含めてもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、およびアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭ〜５００ｎＭの量で含まれることができる。ある特定の態様では、本開示の組成物は、凍結乾燥形態から再構成された液体形態である。凍結乾燥組成物を再構成するための一例の手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された容積に相当する）を加えることであり、しかしながら、緩衝剤、抗菌剤、および／または同等物を含む溶液は、再構成のために使用され得る。
【００８８】
ある特定の態様では、本開示の組成物のオリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸鎖を含む二本鎖として存在する。ある特定の実施形態によれば、相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域は、相補性領域同定配列のすべてまたは一部を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物のオリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部を含む。例えば、相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部は、核酸結合ドメインを含み得る。核酸結合ドメインは、プライマー結合ドメインであり得る。ある特定の態様では、相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む。ある特定の態様では、相補性領域のヌクレオチド配列は、相補性領域の長さにわたるランダムヌクレオチド配列である。
【００９０】
ある特定の態様では、本組成物中に存在するオリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の骨格修飾を含む。例えば、オリゴヌクレオチド骨格は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡに対して修飾されていてもよい。骨格修飾は、例えば、ホスホジエステル基または全糖ホスホジエステルを代替のアニオン性、中性、およびカチオン性構造で置換することを含み得る。本開示の組成物において、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（または「ヌクレオチド類似体」）、または天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの混合物を含み得る。オリゴヌクレオチド中に存在し得る非天然ヌクレオチドとしては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）ヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、例えば、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドであり得、例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドであり得る。
【００９１】
ある特定の態様では、本組成物中に存在するオリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されていない。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は、目的の核酸試料からの核酸、例えば、目的の核酸試料から生成される標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）をさらに含む。ある特定の態様では、そのような核酸が存在するとき、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、配列が相補的であり、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有するオーバーハング領域を有する標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）の核酸にハイブリダイズする。核酸は、５’リン酸化ＤＮＡ、例えば、５’リン酸化ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ断片を含む）、５’リン酸化ミトコンドリアＤＮＡなどであり得る。あるいは、またはさらに、核酸は、５’リン酸化ＲＮＡであり得る。
【００９３】
標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）は、生物、植物、動物などから得られた核酸試料からのものであり得る。例えば、標的核酸（例えば、５’リン酸化核酸）は、現存の動物核酸または絶滅した（例えば、「古代の」）動物核酸であり得る。目的の動物核酸としては、現存のまたは絶滅した哺乳動物の核酸、ひと属からの現存のまたは絶滅した哺乳動物からの核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
ある特定の実施形態によれば、標的核酸は、無細胞核酸である。ある特定の実施形態によれば、５’リン酸化核酸は、５’リン酸化無細胞核酸である。目的の無細胞核酸としては、無細胞胎児ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
キット
上記に要約したように、本開示は、キットを提供する。キットは、例えば、任意の所望の組み合わせにおいて、本開示の方法を記載する節において上記に記載の任意の有用な成分（例えば、オリゴヌクレオチドプール、オリゴヌクレオチド成分／領域、標的核酸、５’リン酸化核酸など）を含み得る。
【００９６】
ある特定の態様では、本開示のキットは、上記の本開示の組成物のうちのいずれかを含む。キットは、本開示の方法の実施形態を実施するのに有用な任意の試薬、緩衝液などをさらに含み得る。いくつかの実施形態によれば、本キットは、核酸試料の５’リン酸化核酸に適合したキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ））、ＤＮＡリガーゼ、充填および／または鎖置換反応、ならびにそれらの任意の組み合わせを行うのに適した酵素（例えば、ポリメラーゼ）を含む。
【００９７】
キットの成分は、別々の容器に存在してもよく、または複数の成分が単一の容器に存在してもよい。適切な容器は、単一チューブ（例えば、バイアル）、１つ以上のウェルのプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）などを含む。
【００９８】
キットは、例えば、核酸ライブラリを生成するために組成物を使用するための指示を含み得る。説明書は、適切な記録媒体に記録することができる。例えば、取扱説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そのようなものとして、取扱説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素のラベル（すなわち、包装または副包装に関連）などに存在し得る。他の実施形態において、取扱説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の取扱説明書は、キットには存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから取扱説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、取扱説明書を閲覧することができ、かつ／または取扱説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。取扱説明書と同様に、取扱説明書を得るための手段は、適切な基材上に記録される。
【００９９】
有用性
本発明の方法、組成物、およびキットは、研究、臨床、法医学、および他の状況を含む様々な状況で使用される。ある特定の態様では、本方法は、目的の核酸試料のオーバーハング含量が、相補性領域同定配列と目的の核酸試料の核酸との物理的会合（ハイブリダイゼーションによる）に基づいて決定される核酸ライブラリの生成に用途を見出し、相補性領域同定配列（例えば、バーコード）は、それが物理的に関連している核酸中のオーバーハングの存在および／またはタイプの決定を可能にする。本開示の方法の実施形態は、目的の核酸試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方の末端の分子特性の一括学習を可能にする。例えば、本開示の方法の実施形態は、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が５−プライムまたは３−プライムオーバーハングを有するかどうか、そのオーバーハングがどれくらいの長さであるか、および／または同等物の一括学習を可能にする。本開示の方法の実施形態は、標準的なＨＴＳ配列決定技術を使用し、得られた配列決定リードをそれがどのタイプのオーバーハングを有するかに対応するカテゴリーに分割することにより、これらの分子の配列決定を可能にする。
【０１００】
本開示の方法を用いてオーバーハング含量を決定することは、５’リン酸化核酸が調製された、および／または標的核酸が得られた核酸試料に関する様々な有用な情報を提供し得る。例えば、オーバーハング含量を知ることは、例えば、血漿または別の適切な供給源からの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を分析するのに価値がある。ｃｆＤＮＡは、血液細胞、妊婦の胎児細胞、癌を有する個体の腫瘍細胞、臓器移植レシピエントの移植臓器組織などを含む様々な供給源に由来することが示されている。本開示の方法の実施形態によって提供されるオーバーハング含量は、例えば、診断目的のための起源の供給源によって、配列決定リードを分類するために使用され得る。
【０１０１】
さらに、オーバーハング含量は、法医学試料からの混合ＤＮＡを分析するために使用され得る。例えば、精液、血液、または目的の別の供給源由来からのＤＮＡは、その供給源にとって診断的である最終的な特徴を有し得、ＤＮＡ配列は、この情報に基づいて分割され得る。
【０１０２】
さらに、古代のＤＮＡ試料（例えば、絶滅した生物、植物、または動物からの試料）中のオーバーハング含量を決定することは、そのような試料およびその試料が由来する生物、植物、動物などを特徴付けるのに有用な情報を提供する。例えば、古代のＤＮＡ試料（例えば、絶滅した哺乳動物からのＤＮＡ試料）は、しばしば、混入ＤＮＡ（例えば、混入細菌ＤＮＡなど）を含む。そのような場合、目的のＤＮＡ配列は、そのようなタイプのオーバーハングが特定のＤＮＡ源に関連するとき、検出されたオーバーハングのタイプに基づいて混入ＤＮＡ配列から分割され得る。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、本開示の方法は、オーバーハングの長さおよびタイプの関数として、ＤＮＡ抽出物（例えば、古代のＤＮＡ抽出物）中の塩基損傷の速度および位置を決定する際に用途を見出す。この実施形態のさらなる詳細は、以下の実験の節に提供されている。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
【０１０５】
実験
標準的なライブラリ調製プロトコルでは、各二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の末端は、５’末端を埋め（fill-in）、３’末端を噛み戻す（chew back）酵素の作用によって平滑末端化されるように作られる。したがって、分子末端の実際のアイデンティティは、これらのプロトコルでは失われている。以下の実施例において提示されるのは、もしあれば、どの種類のオーバーハングが元の分子に存在していたかを示すバーコード配列を各読み取りに導入する配列決定ライブラリを生成する方法である。
【０１０６】
実施例１−ライブラリの構築および配列決定
用いたライブラリ調製物は、添付の説明が本明細書の方法の節に提供されている、図１に図式的に示されたものと一致した。この実施例のアプローチの特徴は、（ｉ）バーコード化オリゴ（本明細書では「アダプター」とも称される）がリン酸化されず、したがってコンカテマーを形成することができなかったこと、（ｉｉ）相補性領域は、各長さのすべてのランダム配列の均等な割合であった、（ｉｉｉ）配列決定され、各ＤＮＡまたはＲＮＡ断片上に存在するオーバーハングの長さおよびアイデンティティ（５’または３’）を示すバーコードスキームが各アダプターに含まれた。
【０１０７】
上記のようにバーコードオリゴを用いて古代バイソン抽出物からいくつかのライブラリを構築した。１つの対照実験では、試料を、すべてのＤＮＡ分子を平滑末端化する酵素のカクテルで前処理した（実験ＡＰＮ−０９）。別の組の実験では、試料を、ＰＮＫのみで処理し（図１を参照）、内因性末端を試料中にあるように残した（実験ＡＰＮ−１５およびＡＰＮ−１６）。
【０１０８】
ライブラリ生成後、各ライブラリから２×７５のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定システムランで配列決定して、各ライブラリから数百万の読み取りを生成した。
【０１０９】
実施例２−バイソンゲノムへの読み込み（配列決定リード）のマッピング
図２は、上記のバーコード化オリゴプールを用いてバイソンゲノムにマッピングする、ＰＮＫ（実験ＡＰＮ−１５）のみで処理された試料から得られたリード数を示す。
【０１１０】
これらの結果は、それらの末端に様々な長さの３’および５’オーバーハングを有する古代ＤＮＡ抽出物からの分子の相対的比率を定量化することが可能であることが実証された。（ｉ）少なくとも研究されたバイソンＤＮＡ抽出物において、天然の平滑末端分子はまれである、（ｉｉ）５’オーバーハングは３’オーバーハングよりも一般的であった（または配列決定に好適な分子を生成するために適正な長さを有しない３’オーバーハングによるものであり得る）、（ｉｉｉ）同定されたオーバーラップは、１つから８つのヌクレオチドのオーバーラップを含んでいた、ことが見出された。配列決定された多くの８つのヌクレオチドバーコードがあったので、これは抽出物中に存在するさらに長い一本鎖オーバーラップがあることを示し得る。
【０１１１】
対照実験（実験ＡＰＮ−０９）では、ほぼすべてのバイソンリードは、平滑末端バーコードからであった。
【０１１２】
実施例３−ミスマッチ率
ＡＰＮ−１５の実験データをさらに分析して、バイソン配列リードとバイソンゲノムとの間のミスマッチ率を定量化した。この分析は、一本鎖オーバーハングの長さおよびタイプの関数として、古代のＤＮＡ抽出物中の塩基損傷の速度と位置を示すように設計された。シトシンの脱アミノ化は、古代ＤＮＡにおける化学的塩基損傷の主な形態であることが示されている。ウラシル塩基を生成するシトシン脱アミノの結果は、ウラシルがチミジンとして読み込まれるということである。したがって、ＣからＴへの変化は、古代のＤＮＡ配列データによく見出され得る。脱アミノ化したシトシンが、シーケンサーによって読み込まれるものと反対の鎖上に存在する場合、ＣからＴの相補体、すなわち、ＧからＡが観察される。シトシンの脱アミノ化の速度は、二本鎖ＤＮＡよりも一本鎖ＤＮＡの方がはるかに高いことも知られている。したがって、ＣからＴへの置換の速度は、対応するバーコード配列によって示されるオーバーハングの長さまで、各分子の開始部分で最も高くなり得る。
【０１１３】
図３は、分子内の位置ならびに一本鎖オーバーハングの長さおよびタイプの関数として、実験ＡＰＮ−１５におけるＣからＴおよびＧからＡへの速度の差を示す。３’オーバーハング分子において、ＧからＡへの速度は、二本鎖部分が始まる点までは高いことが見出された。この分子はオーバーハングアダプターを３’オーバーハングに連結することによって作製されるので、ＧからＡは、３’オーバーハング分子において分析される。したがって、脱アミノ化したシトシンは、ウラシルに相補的なＡを含む分子とアニールするであろう。５’オーバーハングの分析は、同じ特徴の多くを示したが、ただし相補体においてのものだった。
【０１１４】
実施例４−健常な対象からの血漿および尿中のＤＮＡ断片末端の特徴付け
血漿および尿中のＤＮＡ断片の性質を調べるために、上記および図１に示されるバーコード可変オーバーハングアダプターセットを用いて、いくつかのライブラリを作製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡＡＭＰ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓキットを用いて、１ｍＬ〜４ｍＬの健康なドナーの血漿および健康なドナーの尿からＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で処理して、すべての遊離５プライム末端をリン酸化した。次いで、バーコード可変オーバーハングアダプターを、これらのＤＮＡ断片に連結した。この実施例では、単一酵素ライゲーション戦略を使用し、これらの結果をここに示す。ある特定の用途では、平滑末端リガーゼおよびニックシーリングリガーゼの重複しない活性に対応するために、２つの酵素ライゲーション戦略を使用した。次いで、連結したアダプター末端をＢｓｔ２．０ポリメラーゼで埋めた。
【０１１５】
図４に示されるように、ＤＮＡ断片の長さ分布は、血漿試料と尿試料との間で異なった。一般に、血漿ＤＮＡ断片は、ヒストンの周りに巻き付けられたＤＮＡの特徴である、長さ約１６５塩基対のモードを有する。理論に制限されることなく、これは、ＤＮＡ断片が単一のヒストンと会合したＤＮＡを含むような、ヒストン上のＤＮＡの酵素的分解と一致する。尿からのＤＮＡ断片はより短く、長さ分布に明確なモードは見られなかった。
【０１１６】
アダプターセットに含まれるバーコードを使用して、これらのデータのオーバーハングの分布を決定した。具体的には、ヒトゲノムにマッピングされる各配列決定された断片（ほぼすべてのＤＮＡ断片）は、どのバーコードが分子の各末端に存在するかによって分類された。このようにして、各ＤＮＡ断片の末端のアイデンティティが、血漿および尿中で調査され得た。図５は、血漿配列データについてのこれらの計数を示す。最も一般的な構成は、分子の両方の末端において、２塩基の５プライム（５’）オーバーハングを示すバーコードであった。理論によって制限されることなく、この構成は、その切断特性が裸のＤＮＡ基質上で特徴付けられているＤＦＦ４０／ＣＡＤアポトーシスエンドヌクレアーゼの結果であり得る。インビトロでは、ＤＦＦ４０／ＣＡＤは、一般に、５プライムオーバーハングを残し、シトシン残基の周りで優先的に切断する。この実施例で作成された配列データの分析は、断片の末端付近にシトシン塩基の濃縮を示した。
【０１１７】
尿試料からのＤＮＡ配列データについても同じ分析を行った。これらの結果を図６に示す。血漿ＤＮＡとは対照的に、単一の構成が最も多くなることはなかった。その代わりに、より長い５プライム（５’）オーバーハングが、３プライム（３’）オーバーハングや平滑末端分子よりも一般的に観察された。
【０１１８】
実施例５−ヘアピン型バーコード化可変オーバーハングアダプター
この実施例では、バーコード化可変オーバーハングアダプターをＤＮＡ断片に結合するための別の概念が記載されている。この概念は、いくつかの可能な構成のうちの１つを示す図７に図式的に示されている。単一のヘアピンアダプターをＤＮＡ断片の各末端に連結することができる。ＤＮＡの極性のために、図７に示されるヘアピンアダプターの上の鎖は、標的ＤＮＡ分子の５プライム（５’）末端に連結され、下の鎖は、標的ＤＮＡ分子の３プライム（３’）末端に連結される。図７に示すように、上の鎖の一部は、下の鎖の一部に相補的であり、それはアダプターのステム領域を形成し、上の鎖の一部は、下の鎖の一部に相補的ではなく、それはアダプターのヘアピンループ領域を形成する。ヘアピンは、いくつかのアプローチ（例えば、化学的、酵素的）のうちの１つを用いて切断可能な部位で切断される。切断後、ヘアピンループ領域内の上の配列と下の配列は、異なる鎖に分離され、連結されたＤＮＡ分子の各末端にＹ字型を形成する。Ｙのアームに存在する異なる配列は、標準的なハイスループット配列決定ライブラリへの増幅のための独立したプライミング部位として役立つ。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームでは、アダプターの一方の鎖は、Ｐ５アダプター配列を含み、反対側の鎖は、Ｐ７アダプター配列を含む。
【０１１９】
ヘアピンアダプターは、非ヘアピンバーコード可変オーバーハングアダプターセットについて上述したように、オーバーハングのタイプ（５’または３’）および長さの同定を可能にするバーコードおよびオーバーハングを有し得る。例えば、これらのヘアピンアダプターは、アダプターの５’または３’末端に様々な長さおよび様々な配列のオーバーハングを有し得る。アダプタープールのうちのあるものは、オーバーハングを有しない（すなわち、平滑末端の標的核酸への連結のための平滑末端の）ヘアピンアダプターも含む。
【０１２０】
実施例６−固定化したバーコード化可変オーバーハングアダプター
この実施例では、バーコードした可変オーバーハングアダプターをＤＮＡ断片に結合するための別の概念が記載されている。一本鎖Ｐ７バーコード化オーバーハングアダプターは、５’リン酸化され、３’末端は、ビオチン化された。ビオチン化側をストレプトアビジンに固定化した。Ｐ７アダプターに対する相補体をハイブリダイズさせて、二本鎖固定化アダプターを形成した。二本鎖標的核酸を、固定化したアダプタープールに連結した。Ｐ５バーコード化オーバーハングアダプターを、固定化された標的核酸の遊離側に連結した。次いで、アダプターを埋めた。
【０１２１】
実施例７−ＤＮＡ配列データの効率的な回収およびＤＮＡ分子の履歴の保存
いくつかの供給源から回収されたＤＮＡ断片は、特徴的なオーバーハングを残し得、主に特定の配列の状況において作用する、特定のヌクレアーゼの作用の結果であることが多い。この実施例では、ＤＮＡ分子上のオーバーハングのアイデンティティを保存する技術的アプローチが記載されている。このアプローチは、一般に法医学的分析に耐えられないと考えられている難しい生物学的試料に適用される。例えば、核ゲノムマーカーの遺伝子プロファイルは、一般的に、根のない毛幹から抽出されたＤＮＡからは回収できない。この実施例では、毛幹に核ＤＮＡが存在し、１００歳を超えている毛幹からでさえも回収可能であった。しかしながら、試料の年齢にかかわらず、このＤＮＡは短い断片として存在した（図８）。毛幹において、核ＤＮＡ断片は、一般に、核ＤＮＡを切断する酵素であるＤＮａｓｅ１Ｌ２を含む特定の分解経路の最終生成物である。角質細胞の形成（毛髪を構成する細胞の最終的な成熟）の間、核ゲノムは、残りのＤＮＡが短い断片で見出されるように、ヌクレオソーム間で切断される。したがって、新鮮な毛髪であっても、毛幹中に存在するＤＮＡは、十分に説明されている天然の生物学的プロセスによって、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析にとっては短すぎるようにされる。図９に示すように、ｍｉｎｉＳＴＲの最小アンプリコン長（ヒトに存在する最短バリアントのサイズ）は、毛幹中の核ＤＮＡの典型的な断片長よりも長い。さらに、毛幹から回収されるＤＮＡの量は、可変的であり、一般的に少ない。これらの理由から、根のない毛幹から回収したＤＮＡを使用したＳＴＲマーカーの標準的なＰＣＲ増幅は、一般的には機能しないであろう。
【０１２２】
本明細書に記載のＤＮＡ配列決定ライブラリアプローチは、ＤＮＡ断片の末端の状態についての情報を保存する。このアプローチは、死後の崩壊または自然の生物学的プロセスによって断片化されたＤＮＡを持つ多くの試料タイプから法医学的な同定を可能にする。例えば、根のない毛髪、月日の経った血液の染み、および骨の断片はすべて、短い断片としてＤＮＡを含み、以前は法医学的な同定にはあまり適していなかったか、または受け入れられなかった。
【０１２３】
本明細書に記載のＤＮＡ配列決定ライブラリアプローチを表１に列挙した試料パネルで試験して、（１）配列決定ライブラリ中のＤＮＡ情報を捕捉する方法の効率を決定し、（２）各供給源からの分子の歴史を識別するためのこの情報の価値を発見し、これは、複雑な混合物を分析するのに有用であり得る。
【表１】
2019532014.tif 000003
【０１２４】
表１に列挙されている供給源のそれぞれは、現在困難で扱いにくいと考えられている有用な法医学的データの潜在的な供給源である。専用のクリーンルーム施設でＤＮＡを抽出した後、（１）各試料から回収されたＤＮＡの量を定量化する、（２）各ＤＮＡ断片の末端の状態をコードするバーコード化可変オーバーハングアダプターライブラリを作製する、（３）高効率ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用する標準ショットガンライブラリを作製し、（４）従来のＣＯＤＩＳマーカーパネルの従来のＰＣＲ増幅を実施する。タッチＤＮＡ実験については、比較のためにＨＶＲＩおよびＨＶＲＩＩアンプリコン生成物を作製する。
【０１２５】
これらのデータの比較分析は、（１）従来のアプローチに対する、バーコード化可変オーバーハングアダプターライブラリアプローチからのＤＮＡ回収の相対効率の決定、ならびに（２）これらの生物学的供給源由来のＤＮＡからのＤＮＡオーバーハング末端における差の発見および記述を可能にする。
【０１２６】
実施例８−実施形態の例
以下に記載される実施例は、ある特定の実施形態を例示し、技術を限定しない。
実施形態１．核酸ライブラリを生成する方法であって、
５’リン酸化核酸と、様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールと、相補性領域同定配列とを、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、配列に相補的であるオーバーハング領域を有する５’リン酸化核酸の核酸にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有する条件下で組み合わせることを含む、方法。
実施形態２．組み合わせの前に、核酸試料から核酸の５’末端をリン酸化することによって、５’リン酸化核酸を生成することを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．組み合わせの後に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸を連結することを含む、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
実施形態４．組み合わせの間に、オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドと、相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域にハイブリダイズした核酸鎖と、を含む、二本鎖として存在する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５．相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域は、相補性領域同定配列のすべてまたは一部を含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態６．二本鎖が、核酸とハイブリダイズする末端とは反対側の二本鎖の末端にオーバーハングを含み、組み合わせの後に、二本鎖によって形成されるオーバーハングを埋めることを含む、実施形態４または実施形態５に記載の方法。
実施形態７．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８．相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部は、核酸結合ドメインを含む、実施形態７に記載の方法。
実施形態９．核酸結合ドメインは、プライマー結合ドメインである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、実施形態８または実施形態９に記載の方法。
実施形態１１．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドの相補性領域の様々なヌクレオチド配列は、ランダムである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３．オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４．オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．非天然ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、実施形態１２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されていない、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７．５’リン酸化核酸は、５’リン酸化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８．５’リン酸化ＤＮＡは、５’リン酸化ゲノムＤＮＡである、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９．５’リン酸化核酸は、５’リン酸化リボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０．５’リン酸化核酸は、動物から得られた核酸試料から調製される、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１．動物は、絶滅動物である、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．動物は、哺乳動物である、実施形態２０または実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．動物は、ヒト属からのものである、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４．５’リン酸化核酸は、無細胞核酸から生成される、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５．無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便からなる群から選択される、体液試料から得られる、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６．無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡである、実施形態２４または実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７．無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡである、実施形態２４または実施形態２５に記載の方法。
実施形態２８．ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸を配列決定することをさらに含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．配列決定の前に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび核酸を連結することを含む、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０．５’リン酸化核酸の核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの様々な相補性領域に対応する相補性領域同定配列を含む配列決定リードの数に基づいて５’リン酸化核酸のオーバーハング含量を決定することを含む、実施形態２８または２９に記載の方法。
実施形態３１．オーバーハング含量に基づいて、５’リン酸化核酸が生成された核酸試料の供給源を同定することを含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．様々な長さおよびヌクレオチド配列の相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールと、相補性領域同定配列と、を含む、組成物。
実施形態３３．組成物は、容器中に存在する、実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４．組成物は、液体組成物である、実施形態３２または実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５．組成物は、凍結乾燥組成物である、実施形態３２または実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３６．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと、相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域にハイブリダイズした核酸鎖と、を含む、二本鎖として存在する、実施形態３２〜３５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３７．相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域は、相補性領域同定配列のすべてまたは一部を含む、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態３８．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部を含む、実施形態３２〜３７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３９．相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部は、核酸結合ドメインを含む、実施形態３８に記載の組成物。
実施形態４０．核酸結合ドメインは、プライマー結合ドメインである、実施形態３９に記載の組成物。
実施形態４１．相補性領域および相補性領域同定配列以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、実施形態３９または実施形態４０に記載の組成物。
実施形態４２．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドの相補性領域の様々なヌクレオチド配列は、ランダムである、実施形態３２〜４１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４３．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む、実施形態３２〜４２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４４．オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上は、非天然ヌクレオチドである、実施形態４３に記載の組成物。
実施形態４５．オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態４４に記載の組成物。
実施形態４６．非天然ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４７．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されていない、実施形態３２〜４６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４８．５’リン酸化核酸を含む、実施形態３２〜４７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４９．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドが、配列に相補的であるオーバーハング領域を有する５’リン酸化核酸の核酸にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドの相補性領域に対して対応する長さを有する、実施形態４８に記載の組成物。
実施形態５０．５’リン酸化核酸は、５’リン酸化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態４８または実施形態４９に記載の組成物。
実施形態５１．５’リン酸化ＤＮＡは、５’リン酸化ゲノムＤＮＡである、実施形態５０に記載の組成物。
実施形態５２．５’リン酸化核酸は、５’リン酸化リボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態４８または実施形態４９に記載の組成物。
実施形態５３．５’リン酸化核酸は、動物から得られた核酸試料から調製される、実施形態４８〜５２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５４．動物は、絶滅動物である、実施形態５３に記載の組成物。
実施形態５５．動物は、哺乳動物である、実施形態５３または実施形態５４に記載の組成物。
実施形態５６．動物は、ヒト属からのものである、実施形態５５に記載の組成物。
実施形態５７．５’リン酸化核酸は、無細胞核酸から産生される、実施形態４８〜５６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５８．無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便からなる群から選択される、体液試料から得られる、実施形態５７に記載の組成物。
実施形態５９．無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡである、実施形態５７または実施形態５８に記載の組成物。
実施形態６０．無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡである、実施形態５７または実施形態５８に記載の組成物。
実施形態６１．請求項３２〜４７のいずれか１つに記載の組成物と、核酸ライブラリを生成するために組成物を使用するための指示と、を含む、キット。
実施形態６２．核酸試料の５’リン酸化核酸に適合したキナーゼをさらに含む、実施形態６１に記載のキット。
実施形態６３．キナーゼは、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）である、実施形態６２に記載のキット。
実施形態６４．ＤＮＡリガーゼをさらに含む、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載のキット。
Ａ１．核酸ライブラリを生成するための方法であって、標的核酸を含む核酸組成物であって、標的核酸の一部またはすべてがオーバーハングを含む、核酸組成物と、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールであって、オリゴヌクレオチドの一部またはすべてが、（ｉ）標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み、相補性領域を含むプール中のオリゴヌクレオチドが、異なる長さの相補性領域を含み、相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域の１つ以上の特徴に特異的であり、１つ以上の特徴が、相補性領域の長さを含む、オリゴヌクレオチドプールとを、オリゴヌクレオチド中の相補性領域が、対応する長さを有する標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズする条件下で組み合わせ、それによって核酸ライブラリのためのハイブリダイゼーション生成物を形成することを含む、方法。
実施形態Ａ１．１相補性領域の１つ以上の特徴は、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ  、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、をさらに含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ１．２標的核酸の一部は、オーバーハングを含まない、実施形態Ａ１またはＡ１．１に記載の方法。
実施形態Ａ１．３オリゴヌクレオチド一部は、相補性領域を含まず、かつ相補性領域に特異的でない同定ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１、Ａ１．１、またはＡ１．２に記載の方法。
実施形態Ａ２．オーバーハングを含む標的核酸は、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１．３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３．オーバーハングを含む各標的核酸が、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ４．オーバーハングを含む各標的核酸の一方の末端または両方の末端が、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５．標的核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、またはリボ核酸（ＲＮＡ）から産生される、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５．１ＲＮＡは、細胞から採取される、実施形態Ａ５に記載の方法。
実施形態Ａ６．標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から産生される、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ７．ＤＮＡは、細胞から採取される、実施形態Ａ６に記載の方法。
実施形態Ａ８．ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである、またはゲノムＤＮＡから産生される、実施形態Ａ７に記載の方法。
実施形態Ａ９．標的核酸は、動物からの試料から採取される、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ１０．動物は、絶滅動物である、実施形態Ａ９に記載の方法。
実施形態Ａ１１．動物は、哺乳動物である、実施形態Ａ９またはＡ１０に記載の方法。
実施形態Ａ１２．動物は、ヒト属からのものである、実施形態Ａ１１に記載の方法。
実施形態Ａ１３．標的核酸は、無細胞核酸である、または無細胞核酸から産生される、実施形態Ａ１〜Ａ５、Ａ６、およびＡ９〜Ａ１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ１４．無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便から選択される、体液試料から得られる、実施形態Ａ１３に記載の方法。
実施形態Ａ１５．無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡを含む、実施形態Ａ１３またはＡ１４に記載の方法。
実施形態Ａ１６．無細胞核酸は、循環癌ＤＮＡを含む、実施形態Ａ１３またはＡ１４に記載の方法。
実施形態Ａ１７．無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡを含む、実施形態Ａ１６に記載の方法。
実施形態Ａ１８．無細胞核酸は、宿主ＤＮＡおよび非宿主ＤＮＡを含む、実施形態Ａ１３またはＡ１４に記載の方法。
実施形態Ａ１９．非宿主ＤＮＡは、感染性病原体からのものである、実施形態Ａ１８に記載の方法。
実施形態Ａ２０．非宿主ＤＮＡは、移植片からのものである、実施形態Ａ１８に記載の方法。
実施形態Ａ２１．標的核酸中のオーバーハングは、天然のオーバーハングである、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２２．標的核酸は、プールと組み合わせる前に、長さが改変されていない、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２３．組成物をプールと組み合わせる前に、試料から核酸を単離し、それによって核酸組成物を生成することから本質的になるプロセスによって、核酸組成物を調製することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２４．核酸組成物をプールと組み合わせる前に、試料から核酸を単離し、それによって単離された核酸を生成することと、単離された核酸の一方または両方の末端をリン酸部分または化学的反応性の部分で修飾し、それによって核酸組成物を生成することと、から本質的になるプロセスによって、核酸組成物を調製することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２５．標的核酸は、プールと組み合わせたときに溶液中にある、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２６．標的核酸は、固定細胞試料中に存在しない、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２７．標的核酸は、固定細胞試料中に存在しない、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１．オリゴヌクレオチドプールは、オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２．プール中のすべてのオリゴヌクレオチドは、オーバーハングを含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
実施形態Ｂ３．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドは、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｂ１またはＢ２に記載の方法。
実施形態Ｂ４．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドのそれぞれは、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ５．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドのそれぞれの一方の末端または両方の末端は、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ５．１一方の末端で、オーバーハングは、相補性領域を含む、実施形態Ｂ５に記載の方法。
実施形態Ｂ５．２相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域を含むオーバーハングが５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれであるかに対して特異的である、実施形態Ｂ５に記載の方法。
実施形態Ｂ６．オリゴヌクレオチドプールは、第１の鎖および第２の鎖を含むオリゴヌクレオチドを含み、第１の鎖は、第１のポリヌクレオチドを含み、第２の鎖は、第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ５．２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ６．１オリゴヌクレオチドプールは、それぞれが第１の鎖および第２の鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含み、第１の鎖は、第１のポリヌクレオチドを含み、第２の鎖は、第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ５．２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ７．オリゴヌクレオチドプールは、ヘアピン構造をとることができる一本鎖を含むオリゴヌクレオチドを含み、一本鎖は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドの一部は第２のポリヌクレオチドの一部に相補的である、実施形態Ｂ１〜Ｂ５．２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ７．１オリゴヌクレオチドプールは、それぞれがヘアピン構造をとることができる一本鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドの一部は、第２のポリヌクレオチドの一部に相補的である、実施形態Ｂ１〜Ｂ５．２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ８．プールは、３つ以上のヌクレオチド塩基のオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７．１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ９．プール中のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０ヌクレオチド長、またはそれらの組み合わせであるオーバーハングを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１０．プールは、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１１．プールは、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
それらの一部を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１２．プールは、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット。
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１３．プールは、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
それらの一部を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１４．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、標的核酸中の塩基と特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ１５．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルのうちの２つ以上を含むヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１４に記載の方法。
実施形態Ｂ１６．オリゴヌクレオチドプールは、特定のオーバーハング長に対して、異なる複数のオーバーハングポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１４または実施形態Ｂ１５に記載の方法。
実施形態Ｂ１７．オリゴヌクレオチドプールは、特定のオーバーハング長に対してすべての可能性があるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１６に記載の方法。
実施形態Ｂ１８．オリゴヌクレオチドプールは、各オーバーハング長についてすべての可能性のあるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１７に記載の方法。
実施形態Ｂ１９．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングポリヌクレオチドは、ランダムである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２０．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、標的核酸中の塩基と非特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２１．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、ニトロインドール、デオキシイノシン、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ２０に記載の方法。
実施形態Ｂ２２．ニトロインドールは、５−ニトロインドールである、実施形態Ｂ２１に記載の方法。
実施形態Ｂ２３．デオキシイノシンは、２−デオキシイノシンである、実施形態Ｂ２１または実施形態Ｂ２２に記載の方法。
実施形態Ｂ２４．オリゴヌクレオチドの末端は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする標的核酸の末端に共有結合することができる、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２５．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする標的核酸中の鎖の５’末端に共有結合することができる、実施形態Ｂ２４に記載の方法。
実施形態Ｂ２６．相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域は、相補性領域同定ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ２７．プール中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズするオーバーハングを有する末端とは反対側の末端に、反対向きのオーバーハングを含む、実施形態Ｂ２６に記載の方法。
実施形態Ｂ２８．組み合わせの後に、反対向きのオーバーハングを埋めることを含む、実施形態Ｂ２７に記載の方法。
実施形態Ｂ２９．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３０．相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部は、核酸結合ドメインを含む、実施形態Ｂ２９に記載の方法。
実施形態Ｂ３１．核酸結合ドメインは、プライマー結合ドメインである、実施形態Ｂ３０に記載の方法。
実施形態Ｂ３２．相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、実施形態Ｂ３０またはＢ３１に記載の方法。
実施形態Ｂ３３．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３４．オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態Ｂ３３に記載の方法。
実施形態Ｂ３５．オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態Ｂ３４に記載の方法。
実施形態Ｂ３６．非天然ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、実施形態Ｂ３３〜Ｂ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｂ３７．オリゴヌクレオチドは、１つ以上の骨格修飾を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ１．標的核酸の末端がそれがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの末端に連結される条件下でハイブリダイゼーション生成物を曝露することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７およびＢ１〜Ｂ３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ２．組成物中の標的核酸は、５’リン酸化されている、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ３．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されていない、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１またはＣ２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ４．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、リン酸化されている、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ５．核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、５’リン酸が標的核酸の５’末端に付加される条件下で、組成物中の標的核酸を、ホスホリル転移活性を含む薬剤と接触させることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ６．核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、組成物中の標的核酸をホスホリル転移活性を含む薬剤と接触させることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ７．核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、プール中のオリゴヌクレオチドをホスホリル転移活性を含まない薬剤と接触させることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１〜Ｃ６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ８．標的核酸の末端は、標的核酸がハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの末端に共有結合している条件下で、ハイブリダイゼーション生成物を、リガーゼ活性を含む薬剤と接触させることを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ９．ハイブリダイゼーション生成物は、第１のリガーゼ活性を含む第１の薬剤、および第１のリガーゼ活性とは異なる第２のリガーゼ活性を含む第２の薬剤に接触させられる、実施形態Ｃ８に記載の方法。
実施形態Ｃ１０．第１のリガーゼ活性および第２のリガーゼ活性は、独立して、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、粘着末端リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、および凝集末端リガーゼ活性から選択される、実施形態Ｃ９に記載の方法。
実施形態Ｃ１１．オリゴヌクレオチドのそれぞれの末端は、第１の化学的反応性の部分を含み、標的核酸のそれぞれの末端は、第２の化学的反応性の部分を含み、第１の化学的反応性の部分は、第２の化学的反応性の部分と反応し、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に共有結合を形成することができる、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、およびＣ１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ１２．核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせる前に、第２の化学的反応性の部分が標的核酸のそれぞれの末端に組み込まれる条件下で、組成物中の標的核酸を、１つ以上の化学物質と接触させることを含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
実施形態Ｃ１３．第１の化学的反応性の部分が第２の化学的反応性の部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に共有結合を形成する条件下で、ハイブリダイゼーション生成物を、１つ以上の化学物質に曝露することを含む、実施形態Ｃ１１またはＣ１２に記載の方法。
実施形態Ｃ１４．第１の化学的反応性の部分は、第２の化学的反応性の部分と反応して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸との間に１，２，３−トリアゾールを形成することができる、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ１５．第１の化学的反応性の部分は、銅を含む条件下で、第２の化学的反応性の部分と反応することができる、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ１６．第１の化学的反応性の部分は、アジド含有部分および５−オクタジイニルデオキシウラシルから選択され、第２の化学的反応性の部分は、独立して、アジド含有部分、ヘキシニル、および５−オクタジイニルデオキシウラシルから選択される、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｃ１７．アジド含有部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル−アジドである、実施形態Ｃ１６に記載の方法。
実施形態Ｄ１．オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる一本鎖を含み、一本鎖が、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、および切断条件下で切断することができる１つ以上の切断部位を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ７〜Ｂ３７、およびＣ１〜Ｃ１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ１．１オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造をとることができる一本鎖を含み、一本鎖が、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、および切断条件下で切断することができる１つ以上の切断部位を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ７〜Ｂ３７、およびＣ１〜Ｃ１７に記載の方法。
実施形態Ｄ１．２第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第１の領域に相補的な第１の領域を含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第２の領域に相補的でない第２の領域を含む、実施形態Ｄ１またはＤ１．１に記載の方法。
実施形態Ｄ２．１つ以上の切断部位は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に位置する、実施形態Ｄ１、Ｄ１．１、またはＤ１．２に記載の方法。
実施形態Ｄ３．１つ以上の切断部位は、ウラシルおよび／またはデオキシウリジンヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ４．１つ以上の切断部位は、ジオールを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ４．１ジオールは、５’から５’への結合で組み込まれた隣接ジオールである、実施形態Ｄ４に記載の方法。
実施形態Ｄ５．１つ以上の切断部位は、制限酵素認識部位を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ５．１制限酵素認識部位は、レアカッター制限酵素認識部位である、実施形態Ｄ５に記載の方法。
実施形態Ｄ６．組み合わせの後に、切断条件に１つ以上の切断部位を曝露し、それによってオリゴヌクレオチドを切断することを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ５．１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ７．オリゴヌクレオチドが、５’から３’方向において、５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドと、
１つ以上の切断部位と、第２のポリヌクレオチドと、５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、相補性領域と、を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ８．オリゴヌクレオチドが、５’から３’方向において、相補性領域と、５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドと、１つ以上の切断部位と、第２のポリヌクレオチドと、５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｄ９．オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）５’から３’方向において、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
第１のポリヌクレオチドと、
１つ以上の切断部位と、
第２のポリヌクレオチドと、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
相補領域を含む、５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）５’から３’方向において、
相補性領域と、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、
第１のポリヌクレオチドと、
１つ以上の切断部位と、
第２のポリヌクレオチドと、
５’相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な３’相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドと、の混合物を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｅ１．組み合わせの後に、相補性領域同定ポリヌクレオチドを、結合ポリヌクレオチドおよび相補性領域同定ポリヌクレオチドはハイブリダイズする条件下で、相補性領域同定ポリヌクレオチドに相補的な結合ポリヌクレオチドを含む結合剤と接触させ、それによって、結合複合体および結合剤に結合していない核酸を生成することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、Ｃ１〜Ｃ１７、およびＤ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｅ２．結合剤は、固相を含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
実施形態Ｅ３．結合剤は、リンカーを含み、リンカーは、固相に結合しているか、または結合することができる、実施形態Ｅ１に記載の方法。
実施形態Ｅ４．結合複合体を、結合剤に結合していない核酸から分離することを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｆ１．標的核酸を配列決定するための方法であって、
実施形態Ａ１〜Ａ２７、Ｂ１〜Ｂ３７、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｄ１〜Ｄ９、およびＥ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法を実施し、それによって核酸ライブラリを生成することと、
核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、を含む、方法。
実施形態Ｆ２．オリゴヌクレオチド中の相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、実施形態Ｆ１に記載の方法。
実施形態Ｆ３．
（ｉ）核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション生成物中のオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、
（ｉｉｉ）複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、
（ｉｖ）核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、から本質的になる、実施形態Ｆ１またはＦ２に記載の方法。
実施形態Ｆ４．
（ｉ）核酸組成物をオリゴヌクレオチドプールと組み合わせ、それによってハイブリダイゼーション生成物を形成することと、
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション生成物中のオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結し、それによって複合体を生成することと、
（ｉｉｉ）特定の相補性領域同定ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つ以上の結合剤と複合体を会合させ、それによって濃縮複合体を生成することと、
（ｉｖ）濃縮複合体中のオリゴヌクレオチドを修飾し、それによって核酸ライブラリを生成することと、
（ｖ）核酸ライブラリを配列決定プロセスに曝露することと、から本質的になる、実施形態Ｆ１またはＦ２に記載の方法。
実施形態Ｆ５．オリゴヌクレオチドを修飾することは、オリゴヌクレオチド中の１つ以上の切断部位を切断することを含む、実施形態Ｆ３またはＦ４に記載の方法。
実施形態Ｆ６．オリゴヌクレオチドを修飾することは、標的核酸中のオーバーハングと相互作用するオリゴヌクレオチド中のオーバーハングと反対側にオリゴヌクレオチド中のオーバーハングを埋めることを含む、実施形態Ｆ３またはＦ４に記載の方法。
実施形態Ｆ７．配列決定プロセスは、高度に多重化された配列決定プロセスである、実施形態Ｆ１〜Ｆ６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｆ８．配列決定プロセスは、配列決定リードを生成する、実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｆ９．配列決定リードに基づいて、標的核酸についてのオーバーハングの配列を決定することを含む、実施形態Ｆ８に記載の方法。
実施形態Ｆ１０．配列決定リードに基づいて、相補性領域同定ポリヌクレオチドの配列を決定することを含む、実施形態Ｆ８またはＦ９に記載の方法。
実施形態Ｆ１１．標的核酸についてのオーバーハングの長さを決定することを含む、実施形態Ｆ８〜Ｆ１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｇ１．核酸組成物中の特定のオーバーハングを分析するための方法であって、
実施形態Ｆ１〜Ｆ１１のいずれか１つに記載の方法に従って、核酸の配列決定することと、
標的核酸中のオーバーハングの量を定量化し、それによってオーバーハングの定量化を生じることと、を含む、方法。
実施形態Ｇ２．オーバーハングの定量化は、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）特定の長さ、または（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のうちの２つ、３つ、または４つの組み合わせとして特徴付けられる、オーバーハングについてのものである、実施形態Ｇ１に記載の方法。
実施形態Ｇ３．オーバーハングの定量化は、（ｉ）５’オーバーハングまたは３’オーバーハング、および（ｉｉ）特定の長さとして特徴付けられる、オーバーハングについてのものである、実施形態Ｇ１またはＧ２に記載の方法。
実施形態Ｇ４．標的核酸組成物がオーバーハングの定量化に基づいて発生した、核酸試料中の標的核酸の供給源を同定することを含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｇ５．方法は、法医学分析のために行われる、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｇ６．方法は、診断的分析のために行われる、実施形態Ｇ１〜Ｇ４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｈ１．オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプールを含む、組成物であって、
オリゴヌクレオチドの一部またはすべては、（ｉ）核酸組成物の標的核酸中のオーバーハングにハイブリダイズすることができる相補性領域と、（ｉｉ）相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含み、
相補性領域を含むプール中のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの相補性領域を含み、
相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域の１つ以上の特徴に特異的であり、１つ以上の特徴は、相補性領域の長さを含む、組成物。
実施形態Ｈ．１．１相補性領域の１つ以上の特徴は、（ｉ）５’オーバーハング、（ｉｉ）３’オーバーハング、（ｉｉｉ）特定の配列、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、または（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の組み合わせ、をさらに含む、実施形態Ｈ１に記載の組成物。
実施形態Ｈ１．２オリゴヌクレオチドの一部は、相補性領域を含まず、かつ相補的領域に特異的ではない同定ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１またはＨ１．１に記載の組成物。
実施形態Ｈ２．組成物は、容器中に存在する、実施形態Ｈ１〜Ｈ１．２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ３．組成物は、液体組成物である、実施形態Ｈ１〜Ｈ２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ４．組成物は、凍結乾燥組成物である、実施形態Ｈ１〜Ｈ２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ５．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション生成物中の標的核酸にハイブリダイズする、実施形態Ｈ１〜Ｈ４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ６．オリゴヌクレオチドプールは、オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ７．プール中のすべてのオリゴヌクレオチドは、オーバーハングを含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ８．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドは、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｈ６またはＨ７に記載の組成物。
実施形態Ｈ９．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドのそれぞれは、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１０．オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドのそれぞれの一方の末端または両方の末端は、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１０．１一方の末端で、オーバーハングは、相補性領域を含む、実施形態Ｈ１０に記載の組成物。
実施形態Ｈ１０．２相補性領域同定ポリヌクレオチドは、相補性領域を含むオーバーハングが５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかに特異的である、実施形態Ｈ１０．１に記載の組成物。
実施形態Ｈ１１．
オリゴヌクレオチドプールは、それぞれが第１の鎖および第２の鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含み、
第１の鎖は、第１のポリヌクレオチドを含み、第２の鎖は、第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１０．２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１２．
オリゴヌクレオチドプールは、それぞれがヘアピン構造をとることができる一本鎖から本質的になるオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドに相補的な第２のポリヌクレオチドと、を含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１３．プールは、３つ以上のヌクレオチド塩基のオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１４．プール中のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド長、またはそれらの組み合わせであるオーバーハングを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１５．プールは、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１６．プールは、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
それらの一部を含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１７．プールは、
標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、
標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域を含むオリゴヌクレオチドのサブセット、または
これらの組み合わせを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１８．プールは、
（ｉ）標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）前記標的核酸中の１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の６ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の７ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の８ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の９ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１０ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１１ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１２ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１３ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、
（ｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１４ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、および
（ｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域と、（ｉｉ）標的核酸中の１５ヌクレオチド長の３’オーバーハングにハイブリダイズする相補性領域に特異的な相補性領域同定ポリヌクレオチドと、を含む、オリゴヌクレオチドのサブセット、または
それらの一部を含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ１９．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、標的核酸中の塩基と特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ１８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ２０．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルのうちの２つ以上を含むヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１９に記載の組成物。
実施形態Ｈ２１．オリゴヌクレオチドプールは、特定のオーバーハング長に対して、異なる複数のオーバーハングポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１９またはＨ２０に記載の組成物。
実施形態Ｈ２２．オリゴヌクレオチドプールは、特定のオーバーハング長に対してすべての可能性のあるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ２１に記載の組成物。
実施形態Ｈ２３．オリゴヌクレオチドプールは、各オーバーハング長についてすべての可能性のあるオーバーハングポリヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ２２に記載の組成物。
実施形態Ｈ２４．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングポリヌクレオチドは、ランダムである、実施形態Ｈ１９〜Ｈ２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ２５．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、標的核酸中の塩基と特異的に塩基対合することができるヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ２４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ２６．プールのオリゴヌクレオチド中のオーバーハングは、ニトロインドール、デオキシイノシン、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ２５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ２７．ニトロインドールは、５−ニトロインドールである、実施形態Ｈ２６に記載の組成物。
実施形態Ｈ２８．デオキシイノシンは、２−デオキシイノシンである、実施形態Ｈ２６またはＨ２７に記載の組成物。
実施形態Ｈ２９．オリゴヌクレオチドの末端は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする標的核酸の末端に共有結合することができる、実施形態Ｈ６〜Ｈ２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ３０．オリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション生成物中でハイブリダイズする標的核酸の鎖の５’末端に共有結合することができる、実施形態Ｈ６〜Ｈ２９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ３１．相補性領域に隣接するオリゴヌクレオチドの領域は、相補性領域同定ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ３０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ３２．プール中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズするオーバーハングを有する末端とは反対側の末端に、反対向きのオーバーハングを含む、実施形態Ｈ３１に記載の組成物。
実施形態Ｈ３３．組み合わせの後に、反対向きのオーバーハングを埋めることを含む、実施形態Ｈ３２に記載の組成物。
実施形態Ｈ３４．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部を含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ３５．相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部は、核酸結合ドメインを含む、実施形態Ｈ３４に記載の組成物。
実施形態Ｈ３６．核酸結合ドメインは、プライマー結合ドメインである、実施形態Ｈ３５に記載の組成物。
実施形態Ｈ３７．相補性領域および相補性領域同定ポリヌクレオチド以外の一部は、配列決定アダプターのすべてまたは一部を含む、実施形態Ｈ３５またはＨ３６に記載の組成物。
実施形態Ｈ３８．オリゴヌクレオチドプールのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ３７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ３９．オリゴヌクレオチドの相補性領域の１つ以上のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態Ｈ３８に記載の組成物。
実施形態Ｈ４０．オリゴヌクレオチドの相補性領域の各ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドである、実施形態Ｈ３９に記載の組成物。
実施形態Ｈ４１．非天然ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、実施形態Ｈ３８〜Ｈ４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ４２．オリゴヌクレオチドは、１つ以上の骨格修飾を含む、実施形態Ｈ６〜Ｈ４１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ４３．オーバーハングを含む標的核酸のそれぞれは、二本鎖部分および一本鎖オーバーハングを含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ４２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ４４．オーバーハングを含む標的核酸のそれぞれは、一方の末端にオーバーハングまたは両方の末端にオーバーハングを含む、実施形態Ｈ４３に記載の組成物。
実施形態Ｈ４５．オーバーハングを含む標的核酸のそれぞれの一方の末端または両方の末端は、独立して５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む、実施形態Ｈ４３またはＨ４４に記載の組成物。
実施形態Ｈ４６．標的核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、またはリボ核酸（ＲＮＡ）から産生される、実施形態Ｈ１〜Ｈ４５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ４６．１ＲＮＡは、細胞から採取される、実施形態Ｈ４６に記載の組成物。
実施形態Ｈ４７．標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から産生される、実施形態Ｈ１〜Ｈ４５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ４８．ＤＮＡは、細胞から採取される、実施形態Ｈ４７に記載の組成物。
実施形態Ｈ４９．ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである、またはゲノムＤＮＡから産生される、実施形態Ｈ４８に記載の組成物。
実施形態Ｈ５０．標的核酸は、動物からの試料から採取される、実施形態Ｈ１〜Ｈ４９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ５１．動物は、絶滅動物である、実施形態Ｈ５０に記載の組成物。
実施形態Ｈ５２．動物は、哺乳動物である、実施形態Ｈ５０またはＨ５１に記載の組成物。
実施形態Ｈ５３．動物は、ヒト属からのものである、実施形態Ｈ５０、Ｈ５１、またはＨ５２に記載の組成物。
実施形態Ｈ５４．標的核酸は、無細胞核酸である、または無細胞核酸から産生される、実施形態Ｈ１〜Ｈ４６、Ｈ４７、およびＨ５０〜Ｈ５３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ５５．無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便から選択される、体液試料から得られる、実施形態Ｈ５４に記載の組成物。
実施形態Ｈ５６．無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡを含む、実施形態Ｈ５４またはＨ５５に記載の組成物。
実施形態Ｈ５７．無細胞核酸は、循環癌ＤＮＡを含む、実施形態Ｈ５４またはＨ５５に記載の組成物。
実施形態Ｈ５８．無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡを含む、実施形態Ｈ５７に記載の組成物。
実施形態Ｈ５９．無細胞核酸は、宿主ＤＮＡおよび非宿主ＤＮＡを含む、実施形態Ｈ５４またはＨ５５に記載の組成物。
実施形態Ｈ６０．非宿主ＤＮＡは、感染性病原体からのものである、実施形態Ｈ５９に記載の組成物。
実施形態Ｈ６１．非宿主ＤＮＡは、移植片からのものである、実施形態Ｈ５９に記載の組成物。
実施形態Ｈ６２．標的核酸は、溶液中にある、実施形態Ｈ１〜Ｈ６１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ６３．標的核酸は、固定細胞試料中に存在しない、実施形態Ｈ１〜Ｈ６２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｈ６４．標的核酸は、固定組織試料中に存在しない、実施形態Ｈ１〜Ｈ６２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｉ１．実施形態Ｈ１〜Ｈ６４のいずれか１つに記載の組成物と、核酸ライブラリを生成するために組成物を使用するための指示と、を含む、キット。
実施形態Ｉ２．核酸試料の５’リン酸化核酸に適合したキナーゼをさらに含む、実施形態Ｉ１に記載のキット。
実施形態Ｉ３．キナーゼは、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）である、実施形態Ｉ２に記載のキット。
実施形態Ｉ４．ＤＮＡリガーゼをさらに含む、実施形態Ｉ１〜Ｉ３のいずれか１つに記載のキット。
【０１２７】
このように、上記は単に本開示の原理を説明しているにすぎない。当業者であれば、たとえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲内に含まれる種々の構成を考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に記載されたすべての例および条件語句は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に記載された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を記載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいかなる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１】
2019532014.tif 000004
【図２】
2019532014.tif 000005
【図３】
2019532014.tif 000006
【図４】
2019532014.tif 000007
【図５】
2019532014.tif 000008
【図６】
2019532014.tif 000009
【図７】
2019532014.tif 000010
【図８】
2019532014.tif 000011
【図９】
2019532014.tif 000012
【国際調査報告】
2019532014.tif 000013
2019532014.tif 000014
2019532014.tif 000015