(57)【要約】本発明は、異なる種類のモノマーに特異的な光学的標識を含むポリヌクレオチドまたはタンパク質等のポリマーを解析するためのナノポアに基づく方法に関する。一部の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを通って一列で移動するようにモノマーを制約する、ステップ、（ｂ）ポリマーが励起ゾーンを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルの時間順のセットを検出するステップ、（ｃ）光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップ、および（ｄ）ポリマーからの光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットからモノマーの配列を決定するステップを含む。
2019513387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、前記ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、前記ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを通って一列で移動するように前記モノマーを制約する、ステップと、
前記励起ゾーンを通過するときに、前記モノマーからの光学的シグナルの時間順のセットを検出するステップと、
光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、
前記ポリマーからの前記光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットからモノマーの配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリマーが、標識されたヌクレオシド三リン酸の存在下で鋳型核酸分子にアニールされたプライマーを伸長することにより標識されたポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーが、前記ポリヌクレオチドが前記ナノポアを移動して前記励起ゾーンを通過するときに初期光学的シグナルを生成する標識されたヌクレオチドを有する鍵配列を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記伸長されたプライマーにおける少なくとも２個の異なる種類のヌクレオチドを、鑑別可能な蛍光標識によって生成された蛍光シグナルによって同定することができるように、前記標識されたヌクレオシド三リン酸が、少なくとも２個の異なる種類のヌクレオシド三リン酸に付着された少なくとも２個の鑑別可能な蛍光標識を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、ポリヌクレオチドであり、前記決定するステップが、前記光学的シグナルから決定されたヌクレオチドの重複するセグメントから候補配列を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出するステップが、前記光学的シグナルを生成するために、前記励起ゾーンにおいて前記光学的標識を励起することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記光学的標識が、蛍光標識であり、前記励起ゾーンが、前記ナノポア、隣接する蛍光標識の相互クエンチ、および／またはクエンチ剤によって決定される体積および幾何学的配置を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、前記蛍光標識を空間的に制約して、その移動の際の蛍光シグナルの放出を防止する穿孔を有する、ステップと、
前記蛍光標識を励起するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記穿孔を通って移動するときに、前記蛍光標識からの蛍光シグナルの時系列を検出するステップと、
蛍光シグナルの前記時系列から、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドに付着された蛍光標識の配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドにおける前記蛍光標識が、別個の蛍光シグナルを放出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光シグナルの前記時系列における各値が、複数の前記蛍光標識からの蛍光シグナルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出するステップが、蛍光シグナルの複数の測定された標識特異的時系列を形成するために、前記別個の蛍光シグナルを分離することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記決定するステップが、蛍光シグナルの前記複数の標識特異的時系列を、ヌクレオチド配列と比較することと、蛍光シグナルの前記測定された標識特異的時系列に最も近い蛍光シグナルの時系列を生成するヌクレオチド配列を選択することとを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記決定するステップが、前記蛍光シグナルから決定されたヌクレオチドの重複するセグメントから候補配列を形成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、進入口および退出口を有する穿孔を有し、穿孔が、前記蛍光標識を空間的に制約して、その移動の間の蛍光シグナルの放出を防止する、ステップと、
前記穿孔の前記進入口に隣接する進入口領域および前記穿孔の前記退出口に隣接する退出口領域を包含するエバネセント場によって、前記蛍光標識を励起するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記穿孔を移動するときに、前記蛍光標識からの蛍光シグナルの時系列を検出するステップであって、前記検出された蛍光シグナルが、前記進入口領域および前記退出口領域における蛍光標識の蛍光シグナルを含む、ステップと、
蛍光シグナルの前記時系列から、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドに付着された蛍光標識の配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
異なる種類のヌクレオチドに付着された前記蛍光標識が、鑑別可能な蛍光シグナルを生成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出するステップが、前記鑑別可能な蛍光シグナルを分離するステップを含み、前記決定するステップが、前記分離された蛍光シグナルの時系列から蛍光標識の前記配列を決定することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ナノポアの穿孔を通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、自由溶液中でヌクレオチドの蛍光標識が実質的にクエンチされるように、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識され、前記穿孔内の蛍光標識が、その中で検出可能な蛍光シグナルが実質的に生成されないように制約され、異なる種類のヌクレオチドが、鑑別可能な蛍光シグナルを生成する異なる蛍光標識で標識される、ステップと、
前記ナノポアを退出する際、および先行する相互にクエンチする蛍光標識またはクエンチ剤との相互作用によりクエンチする前に、各ヌクレオチドの前記蛍光標識を励起するステップと、
前記ナノポアを退出する蛍光標識によって生成された蛍光シグナルを測定するステップと、
蛍光シグナルのヌクレオチド特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のヌクレオチド由来の蛍光シグナルを分離するステップと、
前記ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナルの前記ヌクレオチド特異的な時間順のセットからヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月１４日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３２２，３４３号に基づく優先権の利益を主張しており、その内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ナノポア配列決定は、１ラン当たりの配列決定にかかる費用の低下、試料調製の単純化、ランタイムの低下、配列読み取りデータの長さの増加、リアルタイム試料解析の提供その他を含む、現在のＤＮＡ配列決定技術における多くの課題を克服するためのアプローチとして提案された。しかし、ナノポアを用いたＤＮＡ解析等、ポリマー解析は、信頼できるナノ構造製作、ＤＮＡ移動速度の制御、明確なヌクレオチド識別、大規模アレイのナノスケールセンサ由来のシグナルの検出および処理等々、それ自体の一連の技術的困難を有する；例えば、Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）。
【０００３】
ヌクレオチドの光学的検出は、ナノポア配列決定の分野における技術的困難のいくつか、例えば、大規模アレイのナノポアから独立的シグナルを収集することの困難に対する潜在的解決策として提案された。しかし、蛍光に基づくシグナルにより、単一分子の光学的検出におけるバックグラウンドノイズの克服は、依然として重大な課題であり、これは、励起の空間的領域を限定することによりバックグラウンド励起を最小化する、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）システム等の顕微鏡システムの高頻度使用をもたらした。しかし、励起体積を限定するための現在利用できる技法であっても、収集されたシグナルは、いかなる時点においても、同じ分解能限界区域および励起体積内における複数の光学的標識からの寄与を含む場合があり、これは、塩基コーリングを大いに複雑化する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上述を考慮すると、複数の空間的に鑑別不能な標識由来の光を含む検出された光学的シグナルにもかかわらず、明確な塩基コーリングを可能にする方法およびデバイスが利用できれば、ナノポア配列決定技術および光学に基づくナノポア配列決定等のその特定の適用にとって有利であると予想される。
【０００６】
発明の要旨
本発明は、光学的標識およびナノポアを使用した、ポリマー解析、特に、ポリヌクレオチド解析のための方法およびデバイスを対象にする。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明は、ポリマーを解析する方法であって、（ａ）ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを通って一列で移動するようにモノマーを制約する、ステップと、（ｂ）ポリマーが励起ゾーンを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルの時間順のセットを検出するステップと、（ｃ）光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、（ｄ）ポリマーからの光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットからモノマーの配列を決定するステップとを含む方法を対象にする。
【０００８】
他の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドを解析する方法であって、（ａ）ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識されており、ナノポアが、蛍光標識を空間的に制約して、その移動の間の蛍光シグナルの放出を防止する穿孔を有する、ステップと、（ｂ）蛍光標識を励起するステップと、（ｃ）ポリヌクレオチドが穿孔を通って移動するときに、蛍光標識からの蛍光シグナルの時系列を検出するステップと、（ｄ）蛍光シグナルの時系列から、ポリヌクレオチドのヌクレオチドに付着された蛍光標識の配列を決定するステップとを含む方法を対象にする。
【０００９】
本発明は、光学に基づくナノポア解析における２個以上の光学的標識の寄与を含む光学的測定の問題を有利に克服する。本発明の上述および他の利点は、多数の実行および用途において例証されており、その一部は、後述および本明細書を通して要約される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＦＲＥＴおよび落射照明システムを使用した、ある実施形態における本発明の要素を図解する。
【００１１】
【図２Ａ】図２Ａは、ＦＲＥＴおよびＴＩＲＦシステムを使用した、ある実施形態における本発明の要素を図解する。
【００１２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、２種の標識されたモノマーが、励起ゾーンを通過するときに同時に光学的シグナルを放出する、ある実施形態における本発明の要素を図解する。
【００１３】
【図３】図３は、共焦点落射照明システムの基礎構成要素を図解する。
【００１４】
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｂは、ＦＲＥＴを用いない励起のためのＴＩＲＦシステムの要素を図解する。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｂは、ＦＲＥＴを用いない励起のためのＴＩＲＦシステムの要素を図解する。
【００１５】
【図５】図５は、複数の光学的標識由来の光を含む光学的シグナルの測定に基づきヌクレオチド配列をコーリングするためのステップを図解するフローチャートである。
【００１６】
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｃは、それぞれトランスチャンバ、シスチャンバ、ならびにシスおよびトランスチャンバの両方においてクエンチ剤を用いた本発明の実施形態を図解する。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｃは、それぞれトランスチャンバ、シスチャンバ、ならびにシスおよびトランスチャンバの両方においてクエンチ剤を用いた本発明の実施形態を図解する。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｃは、それぞれトランスチャンバ、シスチャンバ、ならびにシスおよびトランスチャンバの両方においてクエンチ剤を用いた本発明の実施形態を図解する。
【００１７】
【図７】図７は、タンパク質ナノポア、およびバックグラウンドを低下させるためのナノポアアレイ上の金属層による落射照明またはＦＲＥＴによるＴＩＲを使用した、本発明の実施形態を図解する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、様々な修飾および代替形態を受容するが、これらの詳述については、図面に例として示し、詳細に記載する。しかし、その意図するところは、本発明を、記載されている特定の実施形態に限定することではないことを理解されたい。それどころか、その意図するところは、本発明の精神および範囲内に収まるあらゆる修飾、均等物および代替物を網羅することである。例えば、本発明の特定のナノポアの種類および数、特定の標識、ＦＲＥＴペア、検出スキーム、製作アプローチが、説明目的で示されている。しかし、他の種類のナノポア、ナノポアのアレイおよび他の製作技術を利用して、本明細書に記述されているシステムの様々な態様を実行することができるため、本開示が、この点における限定を意図しないことが認識されるべきである。本発明の態様に関するガイダンスは、当業者に周知の多くの利用できる参考文献および専門書に見出すことができ、そのようなものとして、例えば、Cao、Nanostructures  &  Nanomaterials（Imperial  College  Press、２００４年）；Levinson、Principles  of  Lithography、第２版（SPIE  Press、２００５年）；DoeringおよびNishi編、Handbook  of  Semiconductor  Manufacturing  Technology、第２版（CRC  Press、２００７年）；Sawyerら、Electrochemistry  for  Chemists、第２版（Wiley  Interscience、１９９５年）；BardおよびFaulkner、Electrochemical  Methods:  Fundamentals  and  Applications、第２版（Wiley、２０００年）；Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）；Hermanson、Bioconjugate  Techniques、第２版（Academic  Press、２００８年）；その他が挙げられ、これらの関連部分は、参照により本明細書に組み込む。
【００１９】
一態様では、本発明は、ナノポアおよび光学的検出を使用して、ポリマーを解析するための方法およびデバイスを対象にする。一部の実施形態では、異なる種類のモノマーは、モノマーの同定を可能にする鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる標識を有する。斯かる標識されたポリマーは、分解能限界区域中のまたはこれと交差する光学的検出領域を通って一列で移動するようにモノマーを制約するナノポアを通して移動させることができる。一連の光学的シグナルは、斯かる分解能限界区域から測定され、各光学的測定は、異なる隣接モノマー（例えば、構成成分シグナルは、回折限界区域内から生成されるため、ポリマーにおけるその順序は、単一の測定から決定することができない）由来の複数の構成成分シグナルを含む。一部には、本発明は、一部の構成において、ポリマーの光学に基づくナノポア解析が、（ｉ）２個以上の標識されたモノマーの配列由来の重複する寄与を含む光学的測定の時系列を生成し、これにより、単一の測定からモノマーの順序付けを決定することを、不可能ではないとしても困難なものとし、（ｉｉ）鑑別可能なシグナルを生成するモノマーのための光学的標識を選択することにより、光学的測定を、異なる種類のモノマーにおける異なる標識からの寄与へと分離することができ、これにより、重複する測定が、配列情報へと変換されることを可能にするという認識および見解に基づく。
【００２０】
一態様では、本発明の方法は、（ａ）ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンまたはシグナル生成ゾーンを通って一列で移動するようにモノマーを制約する、ステップと、（ｂ）ポリマーが励起ゾーンまたはシグナル生成ゾーンを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルの時系列を検出するステップと、（ｃ）異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、（ｄ）励起ゾーンまたはシグナル生成ゾーンからの分離された光学的シグナルの時系列からモノマーの配列を決定するステップとによって実行することができる。
【００２１】
本明細書において、用語「励起ゾーン」、「シグナル生成ゾーン」、「検出ゾーン」または同様の用語は、光学的シグナルが生成または収集されるナノポアに隣接する空間的領域または体積を意味する。一部の実施形態では、標識されたモノマーは、「遷移区間」の間に斯かるゾーンを移行することができる。斯かる領域または体積は、光学的標識に励起エネルギーが送達される様式（例えば、ＦＲＥＴ、ＴＩＲＦその他）、光学的標識の性質（例えば、自己および／または相互クエンチが存在するか否か）、用いられるナノポア構成（例えば、タンパク質または非タンパク質ナノポア、遮光層の存在または非存在）、クエンチ剤の存在または非存在、等々が挙げられるがこれらに限定されない、当業者に公知のいくつかの因子によって決定することができる。一部の実施形態では、励起またはシグナル生成ゾーンは、ヌクレオチドの公知配列、公知標識および／または公知濃度のクエンチ剤を有する被験または較正ポリヌクレオチドによって生成された光学的シグナルを測定することにより経験的に決定することができる。一部の実施形態では、ナノポアに隣接する励起ゾーンまたはシグナル生成ゾーンはそれぞれ、斯かる体積を占有するヌクレオチドの数が、１〜４個の範囲内もしくは１〜３個の範囲内、または、さらに他の実施形態では、１〜２個の範囲内であるような、体積および幾何学的配置を有する。一部の実施形態では、斯かるゾーンは、ナノポアのトランス開口に隣接する単一の近接体積を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明は、蛍光標識されたポリヌクレオチド分析物のヌクレオチドを逐次同定するための、ナノポア、蛍光クエンチおよび蛍光シグナリングの使用に関する。ポリヌクレオチド分析物の斯かる解析は、例えば、ナノポアのアレイを使用することにより、単一のポリヌクレオチドにおいて、または複数のポリヌクレオチドにおいて並行して同時に行うことができる。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに付着されながら少なくとも以下の３種の状態が可能な蛍光標識で標識される：（ｉ）付着された蛍光標識の蛍光が、直接隣接するモノマーにおける蛍光標識によって、またはクエンチ剤との相互作用によってクエンチされる、実質的にクエンチされた状態；例えば、標識されたポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを試験および操作するための従来の水溶液またはバッファー中で自由である場合、本発明に従ってポリヌクレオチドに付着された蛍光標識は、実質的にクエンチされる。（ｉｉ）付着された蛍光標識の自由溶液移動または整列が撹乱または限定されて、蛍光標識からの検出可能な蛍光シグナルがほとんどまたは全く生成されないように、標識されたポリヌクレオチドがナノポアを通って移動しながら、立体的に制約された状態。（ｉｉｉ）蛍光標識のヌクレオチドがナノポアを退出するにつれて（「遷移区間」または「区間」の間）、ポリヌクレオチドに付着された蛍光標識が、立体的に制約された状態からクエンチされた状態へと遷移する、遷移状態。本発明の一部の実施形態は（一部には）、遷移区間の間に、蛍光標識（そうでなければ実質的に完全に標識され、自己クエンチまたはクエンチされたポリヌクレオチド上）が検出可能な蛍光シグナルを生成することができ、しかも測定されたシグナルに寄与する退出する標識の数が（少なくとも一部には）、標識されたポリヌクレオチドの移動スピードを制御することにより制御され得るという発見の適用である。移動スピード（例えば、１ミリ秒当たりのナノポアを退出するヌクレオチド）が、遷移速度（クエンチされ得るシグナル由来の、すなわち、クエンチ速度）よりも高い場合、測定された蛍光シグナルまたはシグナル試料は、２種以上の標識からの寄与を含み得る。この環境は、シグナル解析をより困難なものとし、おそらく、より不正確なものとする。一部の実施形態に従って、この問題は、例えば、一度に実質的に１個のみの蛍光標識が、測定された蛍光シグナルに蛍光を与えるように移動スピードを低下させることにより、移動スピードを調整することにより改良され得る。
【００２３】
この発見の根底にあるいかなる理論に限定される意図もないが、遷移区間において生成された蛍光シグナルが、ナノポアから出現した蛍光標識の１個または複数の自由に回転可能な双極子の存在によるものであり、これにより、例えば、直接的励起後に、またはＦＲＥＴを介した励起により、蛍光標識が、蛍光シグナルを生成できるようになると考えられる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ等、一本鎖ポリヌクレオチドであるが、特に、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを通って移動するときに、ナノポアを一度に１個ずつ退出するにつれて蛍光標識によって生成されたシグナルを記録することにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、移動スピードは、測定された蛍光シグナルに寄与する蛍光標識の数を最小にするように選択することができる。斯かる選択は、作動中に制御可能なパラメータのリアルタイム調整（ナノポアにわたる電圧、温度その他等）または予め決定された機器設定（例えば、反応バッファー粘性、イオン濃度その他）のいずれかにより為すことができる。退出後に、各付着された蛍光標識は、遷移区間において、ナノポアにおける制約された状態から、自由溶液中のポリヌクレオチドにおけるクエンチされた状態へと遷移する。遷移区間において、標識は、測定することができる蛍光シグナルを生成することができる。言い換えると、一部の実施形態では、本発明の方法のステップは、ナノポアにおける制約された状態から、自由溶液中のポリマーにおけるクエンチされた状態へと遷移しているときに、各蛍光標識を励起するステップを含む。上述の通り、この遷移区間または期間において、蛍光標識は、それが付着されたヌクレオチドを示す検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。
【００２４】
一部の実施形態では、上で使用される「実質的にクエンチされた」は、蛍光標識が、隣接する相互にクエンチする標識がないことを除いて同じ条件下で生成されたシグナルから少なくとも３０パーセント低下した蛍光シグナルを生成することを意味する。一部の実施形態では、上で使用される「実質的にクエンチされた」は、蛍光標識が、隣接する相互にクエンチする標識がないことを除いて同じ条件下で生成されたシグナルから少なくとも５０パーセント低下した蛍光シグナルを生成することを意味する。
【００２５】
一部の実施形態では、光学的シグナルは、ＦＲＥＴシグナルであってもよく、またはモノマーに付着された直接的に励起された蛍光標識由来の蛍光放出であってもよい。図１は、タンパク質ナノポア（１００）が、脂質二重層（１０２）に配置され、（次いで）これが、不透明層（１０８）（金属層等）、窒化ケイ素層（１１０）およびケイ素支持層（１１２）を含む固体状態膜（１０６）の開口部（１０４）にわたって配置された、一実施形態の構成成分を図解する。不透明層（１０８）は、望まれないバックグラウンド蛍光を励起し得る、固体状態膜（１０６）を通した励起ビーム（１１４）の透過を防止または低下させる。異なって標識されたモノマー（黒色（１２２）および白色（１２４）として図解）を有するポリマー（１２０）が、ナノポア（１００）を通過するときに、各測定区間において、複数のモノマー（１４１、１４２および１４３等）が、同じ分解能限界区域内の励起ゾーン（１２６）および（１２８）に存在する。図解された実施形態において、落射照明システムを用いて光学的測定が為され、ナノポア（１００）が、ナノポア（１００）に対し内部のモノマー由来の光学的シグナルが抑制され、測定された光学的シグナルに寄与しないように選択されたことが仮定される。励起ゾーン（１２８）は、ＦＲＥＴドナー（１３０）に隣接するＦＲＥＴゾーンである；すなわち、励起ゾーン（１２８）は、ＦＲＥＴドナー（１３０）と、アクセプター標識またはＦＲＥＴアクセプター標識と称することもできる、モノマーに付着された光学的標識との間のＦＲＥＴがその内で起こり得る、ＦＲＥＴドナー（１３０）からの距離を画定する。励起ゾーン（１２６）は、開口部（１０４）の寸法が、励起ビーム（１１４）の波長を十分に下回るように選択された場合に常に起こる、開口部（１０４）への励起ビーム（１１４）の構成成分の非伝播突出である。図解される通り、本実施形態では、複数のモノマー（１４１、１４２および１４３）が、モノマー（１４１、１４２および１４３）が励起ゾーン（１２６）および（１２８）に存在する瞬間または区間において測定された光学的シグナルに寄与するであろう。
【００２６】
図２は、Soniら、Review  of  Scientific  Instruments、８１巻：０１４３０１頁（２０１０年）；および参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１２／０１３５４１０号に記載されているもの等、システムにおいて全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）励起を用いて光学的測定が為される実施形態を図解する。本実施形態では、ＦＲＥＴドナー（２０２）が付着されたタンパク質ナノポア（２００）は、開口部（２０８）を備える固体状態膜（２０６）に配置された脂質二重層（２０４）に挿入される。異なる屈折率を有する固体状態膜（２０６）のシス（２０５）およびトランス（２０７）側における電解質を選択することにより、全反射照明（ＴＩＲ）が可能となる。結果として、エバネセント場が固体状態膜（２０６）のシス（２０５）側に作製されるように、固体状態膜（２０６）が配置された平面にまたはその付近にＴＩＲ境界（２１０）が作製される。エバネセント場は、そのナノポア（２００）への進入に先立ち光学的標識を励起することができる。ＦＲＥＴゾーン（２２０）内でＦＲＥＴドナー（２０２）およびモノマー（２１９）上の標識の間にＦＲＥＴが起こり得るように、ＦＲＥＴドナー（２０２）は、ＴＩＲ境界（２１０）において反射される光によって直接的に励起される。図１の実施形態と同様に、標識されたモノマーがナノポア（２００）の穿孔内に存在するときに、標識による蛍光放出が抑制されるように、ナノポア（２００）を選択することができる。２２５、２２６および２２７等、複数のモノマーが、図面において示されている構成に記録される光学的測定に寄与する。
【００２７】
一部の実施形態では、モノマー上の標識は、図４Ａに示すものと同様の装置を使用して、エバネセント場単独によって励起することができる。この装置において、ナノポアに関連する各光学的測定が、複数の標識されたモノマー由来の寄与を含有するように、ナノポアまたはナノポアアレイのトランス側の非常に狭い第２のチャンバは、エバネセント場が、根底にあるスライドグラスの表面から伸長して、ナノポアの進入口および退出口の両方に励起ゾーンを確立することを可能にする。２０〜１００ｎｍの範囲内の厚さを有し得る窒化ケイ素層（４０２）において開口部（４００）（脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアを含むことができる）のアレイを形成することができる。窒化ケイ素層（４０２）は、ケイ素支持層（４０３）に形成することができる。第２のチャンバ（４０６）は、窒化ケイ素層（４０２）、二酸化ケイ素層（４０４）によって形成することができ、これは、第２のチャンバ（４０６）の高さおよびスライドグラス（４１０）の表面（４０８）を決定する。二酸化ケイ素層（４０４）は、５０〜１００ｎｍの範囲内の厚さを有し得る。表面（４０８）から窒化ケイ素層（４０２）にわたって伸長する所望のエバネセント場（４０７）は、ＴＩＲが起こるように、スライドグラス（４１０）に対して適切な角度で光線（４１２）を方向付けることにより確立することができる。アレイ（４００）を通して標識されたポリヌクレオチド分析物を駆動するために、第１および第２のチャンバ（４０６および４２１）に作動的に接続された電極を用いて、第１のチャンバ（４１６）においてシス（−）条件を確立することができ、第２のチャンバ（４０６）においてトランス（＋）条件を確立することができる。図４Ｂは、窒化ケイ素層（４０２）の表面に配置された脂質二重層（４２２）に挿入されたタンパク質ナノポア（４２０）を図表で示す、アレイ（４００）における開口部の特定の実施形態のクローズアップである。穿孔（４２１）に対し内部における標識の蛍光放出の抑制を引き起こす寸法を有する穿孔（４２１）により選択された、ナノポア（４２０）を通って移動している、標識されたモノマー（例えば、４２７）を有するポリマー（４２５）を示す。本実施形態では、開口部（４００）を含有する分解能限界区域由来の特定の時点ｔまたは区間で測定された光学的シグナルは、励起領域におけるモノマー、例えば、モノマーｎ１〜ｎ４およびｎ１３〜ｎ１５上の複数の標識からの寄与を含むことができる。
【００２８】
図２Ｂは、２個の標識されたモノマーによって生成された蛍光を含む蛍光シグナルの収集のさらなる図解を提供する。図２Ｂは、ナノポア（２００２）を通って移動する標識されたポリヌクレオチド（２０００）を示し、標識されたポリヌクレオチド（２０００）は、２個の標識「ａ」および「ｂ」（例えば、これは、「ａ」で標識されたｄＣ、ならびに「ｂ」で標識されたｄＡ、ｄＧおよびｄＴ、その他に対応し得る）を含む。ナノポア（２００２）から自由なヌクレオチドの標識は、他の標識との相互作用（２０１１）またはクエンチ剤の作用（図示せず）のいずれかによりクエンチされている。ナノポア（２００２）の内側のヌクレオチドの標識は、ナノポアを通るその移行の全体または一部において検出可能なシグナルを産生しないように、制約および／または配向されている（２０１４）。標識されたポリヌクレオチド（２０００）のヌクレオチドは、ナノポア（２００２）の退出口（２０１５）から出現すると、励起ビーム（２０１０）によって励起され、クエンチされる前の区間において検出可能なシグナルを生成し得るようになる。移動スピードＶ１が速い場合、２個以上の標識が、検出器（２０１８）によって収集される蛍光シグナル、すなわち、測定された蛍光シグナルに蛍光を寄与させるように、クエンチに先立ちヌクレオチドによって移動される距離（２００８）は、ポリヌクレオチド（２０００）のヌクレオチド間距離を超え得る。隣接する標識間の距離は、励起光（２０１０）の回折限界を下回るため、標識（励起ゾーンまたはシグナル生成ゾーン（クエンチによって画定される場合）（２０９９）における）の順序付けに関する情報は得られないが、特化したアルゴリズム、例えば、Timpら、Biophys.  J.、１０２巻：Ｌ３７〜Ｌ３９頁（２０１２年）；Carsonら、Nanotechnology、２６巻：０７４００４頁（２０１５年）を使用して斯かる情報を推論するためのアプローチが存在する。別個の放出バンドを有する蛍光標識を使用した光学的検出の場合、複数の標識からの蛍光の相対的寄与を評価するために、測定された蛍光シグナルは、例えば、バンドパスフィルターを使用して、２種またはそれよりも多いチャネルへと分離することができる。しかし、蛍光に寄与する蛍光標識の数が、例えば、３、４種またはそれよりも多くに増加するにつれて、ヌクレオチドの正確な順序付けの決定における困難が増加する。例えば、２種の蛍光標識の放出最大に対応する２種のチャネルのシグナル強度が、図２Ｂ（２０３１および２０３２）に図解されており、それによると、２種の蛍光標識が、測定されたシグナルに寄与する。例えば２０３３の実線によって表される強度値は、標識「ａ」に由来し、例えば２０３６の破線によって表される強度値は、標識「ｂ」に由来する。図２Ｂの両方のチャネルにおける実線および破線の存在は、蛍光標識の重複する放出バンドを反映し、測定された強度の量が両方の標識に由来するため、一緒に収集された場合に解析を複雑化する。
配列決定
【００２９】
本発明に従って、標識されたポリマーが、ナノポアおよびその関連する励起ゾーンを通って移動するときに、光学的測定の時間順のセットが記録される。隣接する時点における光学的測定は、各光学的測定が、隣接するモノマーの標識からの寄与を含有するという意味で重複している。よって、例えば、３種のモノマーが、各時点でシグナルを生成する場合（例えば、励起ゾーンを左から右に移動するポリマー…−Ａ−（Ｂ−Ｃ−Ｄ）−…のＢ、ＣおよびＤ）、および、連続的測定の間で、１個のモノマーが励起ゾーンを退出し、別のモノマーが励起ゾーンに進入する場合（括弧で示す）（例えば、Ａが進入し、Ｄが退出する：−（Ａ−Ｂ−Ｃ）−Ｄ…）、２個の連続的光学的測定は、同じモノマー由来の寄与を含有するであろう（この例では、両方の測定は、ＢおよびＣ由来の寄与を含む）。上述の例は、ナノポアを通ったポリマー移動のごく単純化されたモデルに基づく；しかし、連続的重複光学的測定の概念は、ポリマー移動のより複雑な説明に適用可能である。
【００３０】
ナノポアにおける複数の異なる標識されたモノマー由来の放出は、同じ分解能限界区域から生じるため、モノマーに関する相対的位置情報（特に、配列情報）は、単一の光学的測定から決定することができない。しかし、モノマー特異的シグナルを生成する標識の重複および使用のため、一部の実施形態では、配列情報は、モノマー特異的シグナルの複数の時間順のセットへと分離される場合、光学的シグナル測定の時間順のセットから決定することができる。ハイブリダイゼーションデータから標的ポリヌクレオチド配列を再構築するために、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）において使用されるものと同様のアルゴリズムを使用して、そこで標的ポリヌクレオチドを再構築することができる、例えば、参照により組み込む、米国特許第５，００２，８６７号；Timpら、Biophys.  J.、１０２巻：Ｌ３７〜Ｌ３９頁（２０１２年）；その他。（ｉ）時間順の重複するシグナルおよびシグナルならびに（ｉｉ）それらのモノマー特異的構成成分への分離の制約は、光学的検出の場合の決定ステップを有意に単純化する。
【００３１】
図５は、ナノポア移動の単純モデルに基づき、重複する光学的シグナルの時間順のセットからモノマー配列情報を決定するためのステップの一実施形態を図解する。単純モデルは、各時間ステップ（ナノポアからのポリマーの進入および退出時を除いて）における光学的測定がそれぞれ、同数のモノマー（図５において、「ｎ組」と称され、測定が、ｎ個のモノマー由来の寄与を含有するであろうことを示す）由来のシグナル寄与を含有することを仮定する。より複雑なモデルが、移動スピードの局所変動、モノマーの直線的移動における偏差、および他の同様の現象のため、各測定における異なる数の寄与モノマーを可能にし得ることが理解される。すなわち、一部の実施形態では、異なる時間における光学的測定は、異なる数のヌクレオチド由来の寄与を有することができる。一部の実施形態では、異なる数のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドのセグメントに沿って順序付けられる。図５によって図解される決定するステップは、標識されたポリマーが、ナノポアを通過したこと、および、モノマー特異的シグナルへの光学的シグナルの分離を含む、光学的測定の時間順のセットが作製されたことを仮定する（５００）。進入および退出後における励起ゾーン（複数可）には必然的に異なる数のモノマーが存在するため、ポリマーの進入および退出は、別々に処理される。本実施形態では、これらの条件下における最初および最終の光学的測定が、最初および最終のモノマーが、それらのモノマー特異的シグナルから直接的に決定されることを可能にすることが仮定される。他の実施形態では、解析のための標識されたポリマーの調製は、配列決定ステップに役立つ光学的シグナルの公知配列を生成する目的のための、斯かる標識されたポリマーの一端または両端における、複数の予め決定された標識されたヌクレオチドの挿入を含むことができる。斯かる予め決定された標識されたヌクレオチドは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔまたは４５４配列決定における鍵配列と同様のものとなるであろう、例えば、参照により組み込む米国特許第７，５７５，８６５号。
【００３２】
図５に戻ると、決定ステップの初めに、時間指標ｉは、ゼロに設定され；現在の時間ｉにおける候補配列のための指標ｊは、１に設定され（５０２）；モノマー特異的な時間順の光学的シグナルのセットの初期ｎ組が、試験される（５０４）。斯かる試験は、まず、時間ｉにおける測定から、測定と一貫したモノマーのあらゆる可能なｎ組を決定し、次いで、これらのｎ組から、候補配列Ｓｉと適切に重複するものを決定するステップを含む。測定と一貫したセットのためにｎ組をそれぞれ適切に重複させることにより、新しい候補配列Ｓｉ＋１が形成される（そして、配列Ｓｉが伸長される）（５０６）。新しい伸長された候補配列Ｓｉ＋１が保存され、時間ｉ＋１における候補配列の数をもたらす指標Ｊｉ＋１がアップデートされる（５０８）。このステップは、全候補配列Ｓｉが試験されるまで反復され（５１０）、時間順のセットにおける各光学的測定が試験されるまで、各時間ｉにおいて同様の試験が行われる。
ナノポアおよびナノポアアレイ
【００３３】
本発明により使用されるナノポアは、固体状態の膜または同様のフレームワークにおいて構成された、固体状態ナノポア、タンパク質ナノポア、またはタンパク質ナノポア、もしくはカーボンもしくはグラフェンナノチューブ等の有機ナノチューブを含むハイブリッドナノポアであってもよい。ナノポアの重要な特色は、そのモノマーが、シグナル生成領域（または励起ゾーンその他）を順次通過するように、すなわち、ヌクレオチド等のモノマーが、検出ゾーン（または励起領域もしくは同様の領域）を一列で通過するように、ポリヌクレオチド等のポリマー分析物を制約することを含む。一部の実施形態では、ナノポアの追加的な特色は、一本鎖核酸を通過させるが、二本鎖核酸または等しくかさばった分子を通過させないことを含む。他の実施形態では、ナノポア、特にタンパク質ナノポアは、ＦＲＥＴシグナルまたはさらには蛍光シグナルが抑制されるよう、その穿孔が、モノマーの標識が立体的に制約されるようなサイズになるように選択することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスに関連して使用されるナノポアは、平面状の表面に規則的に配置され得る、ナノポアのクラスターのアレイ等、アレイの形態で提供される。一部の実施形態では、異なるクラスターのナノポア由来の光学的シグナルが、用いられる光学的検出システムによって鑑別可能となるように、クラスターはそれぞれ、別々の分解能限界区域に存在するが、同じクラスター内のナノポア由来の光学的シグナルは、用いられる光学的検出システムによって斯かるクラスター内の特異的ナノポアに必ずしも割り当てられなくてもよい。
【００３５】
固体状態ナノポアは、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）その他が挙げられるがこれらに限定されない、種々の材料において製作することができる。ＤＮＡ配列決定等、分析的適用のためのナノポアの製作および操作は、参照により本明細書に組み込む次の例示的な参考文献に開示されている：Ling、米国特許第７，６７８，５６２号；Huら、米国特許第７，３９７，２３２号；Golovchenkoら、米国特許第６，４６４，８４２号；Chuら、米国特許第５，７９８，０４２号；Sauerら、米国特許第７，００１，７９２号；Suら、米国特許第７，７４４，８１６号；Churchら、米国特許第５，７９５，７８２号；Bayleyら、米国特許第６，４２６，２３１号；Akesonら、米国特許第７，１８９，５０３号；Bayleyら、米国特許第６，９１６，６６５号；Akesonら、米国特許第６，２６７，８７２号；Mellerら、米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号；Howorkaら、国際特許公開ＷＯ２００９／００７７４３；Brownら、国際特許公開ＷＯ２０１１／０６７５５９；Mellerら、国際特許公開ＷＯ２００９／０２０６８２；Polonskyら、国際特許公開ＷＯ２００８／０９２７６０；Van  der  Zaagら、国際特許公開ＷＯ２０１０／００７５３７；Yanら、Nano  Letters、５巻（６号）：１１２９〜１１３４頁（２００５年）；Iqbalら、Nature  Nanotechnology、２巻：２４３〜２４８頁（２００７年）；Wanunuら、Nano  Letters、７巻（６号）：１５８０〜１５８５頁（２００７年）；Dekker、Nature  Nanotechnology、２巻：２０９〜２１５頁（２００７年）；Stormら、Nature  Materials、２巻：５３７〜５４０頁（２００３年）；Wuら、Electrophoresis、２９巻（１３号）：２７５４〜２７５９頁（２００８年）；Nakaneら、Electrophoresis、２３巻：２５９２〜２６０１頁（２００２年）；Zheら、J.  Micromech.  Microeng.、１７巻：３０４〜３１３頁（２００７年）；Henriquezら、The  Analyst、１２９巻：４７８〜４８２頁（２００４年）；Jagtianiら、J.  Micromech.  Microeng.、１６巻：１５３０〜１５３９頁（２００６年）；Nakaneら、J.  Phys.  Condens.  Matter、１５巻、Ｒ１３６５〜Ｒ１３９３頁（２００３年）；DeBloisら、Rev.  Sci.  Instruments、４１巻（７号）：９０９〜９１６頁（１９７０年）；Clarkeら、Nature  Nanotechnology、４巻（４号）：２６５〜２７０頁（２００９年）；Bayleyら、米国特許出願公開第２００３／０２１５８８１号；その他。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明は、１個または複数の遮光層、すなわち、１個または複数の不透明層を有するナノポアアレイを含む。典型的には、ナノポアアレイは、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化アルミニウムその他等の材料の薄いシートにおいて製作され、これは特に、使用される厚さ、例えば、５０〜１００ｎｍ未満の厚さでは光を容易に透過する。分析物の電気的検出のため、これは問題とならない。しかし、ナノポアを移動する標識された分子の光学に基づく検出において、アレイを透過する光は、意図される反応部位の外側で材料を一定に励起し、これにより、例えば、非特異的バックグラウンド蛍光、ナノポアに未だ進入していない分子の標識由来の蛍光その他から光学的ノイズを生成する。一態様では、本発明は、励起ビームからの光を反射および／または吸収する１個または複数の遮光層をナノポアアレイに提供し、これにより、アレイのナノポアに関連する意図される反応部位において生成された光学的シグナルのバックグラウンドノイズを低下させることにより、この問題に取り組む。一部の実施形態では、これは、意図される反応部位における光学的標識が、直接的照射によって励起されることを可能にする。一部の実施形態では、不透明層は、金属層であってもよい。斯かる金属層は、Ｓｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。一部の実施形態では、斯かる金属層は、Ａｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。さらに他の実施形態では、斯かる金属層は、アルミニウムもしくは金を含むことができる、またはアルミニウムを唯一含むことができる。不透明層の厚さは、広く変動することができ、層を構成する材料の物理的および化学的特性に依存する。一部の実施形態では、不透明層の厚さは、少なくとも５ｎｍまたは少なくとも１０ｎｍまたは少なくとも４０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚さは、５〜１００ｎｍの範囲内であってもよい；他の実施形態では、不透明層の厚さは、１０〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。不透明層は、励起ビームからの光の１００パーセントを遮断（すなわち、反射または吸収）する必要はない。一部の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも１０パーセントを遮断することができ；他の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも５０パーセントを遮断することができる。
【００３７】
不透明層またはコーティングは、本技術分野で公知の種々の技法によって固体状態膜に製作することができる。化学的蒸着、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸発およびスパッタリングを含む物理的蒸着、鋳造その他を含む、材料沈着技法を使用することができる。一部の実施形態では、原子層沈着を使用することができ、例えば、参照により組み込む、米国特許第６，４６４，８４２号；Weiら、Small、６巻（１３号）：１４０６〜１４１４頁（２０１０年）を参照。
【００３８】
一部の実施形態では、１〜１００ｎｍチャネルまたは開口部を、膜等、固体基板、通常、平面状基板を通して形成することができ、これを通して、一本鎖ＤＮＡ等の分析物が、移動するように誘導される。他の実施形態では、２〜５０ｎｍチャネルまたは開口部が、基板を通して形成され；さらに他の実施形態では、２〜３０ｎｍまたは２〜２０ｎｍまたは３〜３０ｎｍまたは３〜２０ｎｍまたは３〜１０ｎｍチャネルまたは開口部が、基板を通して形成される。ナノポアを生成する固体状態アプローチは、頑強性および耐久性、ならびにナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハスケールでナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質に基づくシステムと比較して優れた機械的、化学的および熱的特徴、ならびに電子的または光学的読み取り技法と統合する可能性を提案する。他方では、生物学的ナノポアは、特に、１〜１０ナノメートル範囲内の、再現性のある狭い穿孔または管腔を提供すると共に、ナノポアの物理的および／または化学的特性を仕立てるため、ならびに従来のタンパク質工学方法によってＦＲＥＴドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光標識等の化学基または要素を直接的にまたは間接的に付着されるための技法を提供する。タンパク質ナノポアは典型的に、機械的支持のために繊細な脂質二重層に頼り、正確な寸法を有する固体状態ナノポアの製作は、依然として難易度が高い。一部の実施形態では、固体状態ナノポアは、生物学的ナノポアと組み合わせて、これらの弱点のいくつかを克服する、いわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成し、これにより、生物学的ポアタンパク質の正確さに、固体状態ナノポアの安定性を付与することができる。光学的読み取り技法のため、ハイブリッドナノポアは、ナノポアの正確な位置を提供し、これは、データ取得を大幅に単純化する。
【００３９】
一部の実施形態では、クラスターは、開口部のアレイを含有する固相膜によって支持された脂質二重層にタンパク質ナノポアを配置することによって形成することもできる。例えば、斯かるアレイは、固相支持に製作された（例えば、穿孔された、エッチングされたその他）開口部を含むことができる。斯かる開口部の幾何学的配置は、用いられた製作技法に応じて変動し得る。一部の実施形態では、斯かる開口部のそれぞれは、別々の分解能限界区域に関連付けられるまたはこれによって包含される；しかし、他の実施形態では、複数の開口部が、同じ分解能限界区域内に存在してもよい。開口部の断面積は、広く変動することができ、異なるクラスター間と同じであっても同じでなくてもよいが、斯かる面積は通常、従来の製作アプローチの結果として実質的に同じである。一部の実施形態では、開口部は、１０〜２００ｎｍの範囲内の最小線寸法（例えば、円形開口部の場合は直径）を有する、または約１００〜３×１０４ｎｍ２の範囲内の面積を有する。開口部にわたり、脂質二重層が配置され得る。開口部毎のタンパク質ナノポアの分布は、例えば、挿入ステップの際にタンパク質ナノポアの濃度を制御することにより変動され得る。斯かる実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含むことができる。タンパク質ナノポアが開口部にランダムに挿入する一部の実施形態では、平均して１個または複数の開口部を含有するクラスターは、ゼロを超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．２５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．７５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、１．０を超える多数のタンパク質ナノポアを有する。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、第１のチャンバおよび第２のチャンバ（「シスチャンバ」および「トランスチャンバ」と称される場合もある）の間に連絡を設置し、第２のまたはトランスチャンバに直面する表面に脂質二重層を支持する、そこを通る開口部のアレイを有するＳｉＮ膜等の固相膜を含む。一部の実施形態では、斯かる固相膜における開口部の直径は、１０〜２００ｎｍの範囲内または２０〜１００ｎｍの範囲内であってもよい。一部の実施形態では、斯かる固相膜は、斯かる二重層が、トランスチャンバに直面する表面における開口部に及ぶ領域において脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアをさらに含む。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、本明細書に記載されている技法を使用して、固相膜のシス側から挿入される。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたは穿孔を含み、一端に「キャップ」構造を有し、他端に「ステム」構造を有するという点において、α−ヘモリジンと同一または同様の構造を有する（Songら、Science、２７４巻：１８５９〜１８６６頁（１９９６年）の用語法を使用）。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアを使用すると、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバに曝露され、そのステム構造がトランスチャンバに曝露されるように配向されたタンパク質ナノポアをもたらす。
【００４１】
一部の実施形態では、本発明は、特に、ポリヌクレオチドの光学に基づくナノポア配列決定のために、クラスターにおけるハイブリッドナノポアを用いることができる。斯かるナノポアは、タンパク質ナノポア等のタンパク質バイオセンサが安定的に挿入された、固体状態オリフィスまたは開口部を含む。荷電ポリマーは、従来のタンパク質工学技法によってタンパク質ナノポア（例えば、アルファヘモリジン）に付着されることができ、その後、適用された電界を使用して、固体状態膜における開口部にタンパク質ナノポアをガイドすることができる。一部の実施形態では、固体状態基板における開口部は、タンパク質よりも僅かに小さくなるように選択され、これにより、これが開口部を通して移動することを防止する。その代わりに、タンパク質は、固体状態オリフィスに包埋されるであろう。
【００４２】
一部の実施形態では、ドナーフルオロフォアは、タンパク質ナノポアに付着される。次に、この複合体は、タンパク質ナノポアが固体状態ナノホールに輸送されてハイブリッドナノポアを形成するまで、固体状態ナノホールまたは開口部にわたり電界を適用することにより、固体状態開口部またはナノホール（例えば、３〜１０ｎｍの直径）に挿入される。ハイブリッドナノポアの形成は、（ａ）固体状態ナノホールの部分的遮断に基づく電流の降下を引き起こす挿入されたタンパク質ナノポア、および（ｂ）ドナーフルオロフォアの光学的検出によって検証することができる。
【００４３】
固体状態または合成のナノポアは、上に引用されている参考文献において例証される通り、種々の仕方で調製することができる。一部の実施形態では、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、例えば、参照により本明細書に組み込むYangら、Nanotechnolgy、２２巻：２８５３１０頁（２０１１年）によって開示される通り、種々の材料における合成ナノポアを穿孔することができる。独立した膜となるように加工された薄膜材料、例えば、窒化ケイ素の１個または複数の領域を支持するチップが、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバに導入される。顕微鏡は、低拡大率のために設定されつつ、ＨＩＭモーター制御が使用されて、イオンビームの通路内に独立した膜を届ける。焦点および非点収差（stigmation）を含むビームパラメータは、独立した膜に隣接する領域において、ただし、固体基板上で調整される。パラメータが妥当に固定されたら、独立した膜領域がイオンビーム走査領域の中央に置かれ、ビームがブランクにされるように、チップ位置が移動される。ＨＩＭ視野は、予期されるナノポアパターン全体を含有するのに十分であり、将来的な光学的読み取りにおいて有用となるのに十分な（すなわち、光学的拡大率、カメラ分解能等に依存する）寸法（μｍ単位の）に設定される。次に、イオンビームは、ピクセル滞留時間において視野全体にわたって１回ラスターされ、これは、膜自己蛍光の全てまたは大部分の除去に十分な総イオン線量をもたらす。次に、視野は、単一のナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかのリソグラフィーにより画定されたミリングの実行に妥当な値（上で使用されるものよりも小さい）に設定される。パターンのピクセル滞留時間は、試料加工に先立つ較正試料の使用により決定される、１個または複数の予め決定された直径のナノポアをもたらすように設定される。このプロセス全体は、単一のチップにおける所望の領域毎に、および／またはＨＩＭチャンバ内に導入されたチップ毎に反復される。
【００４４】
一部の実施形態では、ナノポアは、光学に基づくナノポア配列決定方法における使用のために付着された１個または複数の標識を有することができる。標識は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアのメンバーであってもよい。斯かる標識は、有機フルオロフォア、化学発光標識、量子ドット、金属性ナノ粒子および／または蛍光タンパク質を含むことができる。標的核酸は、ヌクレオチドにつき１個の別個の標識を有することができる。ヌクレオチドに付着された標識は、有機フルオロフォアからなる群から選択され得る。ポアタンパク質における標識付着部位は、従来のタンパク質工学方法によって生成することができ、例えば、標識の特異的結合を可能にする突然変異体タンパク質を構築することができる。例として、タンパク質の所望の位置にシステイン残基を挿入することができ、この操作は、標識の付着に使用することができるチオール（ＳＨ）基を挿入する。システインは、天然起源のアミノ酸を置き換えてもよく、または付加アミノ酸として取り込まれてもよい。次に、マレイミド活性化標識は、タンパク質ナノポアのチオール残基に共有結合により付着される。好まれる実施形態では、タンパク質ナノポアへの標識の付着または核酸における標識は、可逆的である。切断可能クロスリンカーを実行することにより、容易に破壊できる化学結合（例えば、Ｓ−Ｓ結合またはｐＨに不安定な結合）が導入され、対応する条件が満たされたときに、標識を除去することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、励起ビーム送達および光学的シグナル収集が単一の対物レンズを通して起こる、落射照明システムは、ポリマー分析物上の標識またはナノポア上のドナーの直接的照射に使用することができる。本発明による使用のための共焦点落射照明システムの基礎構成成分は、図３に図解されている。励起ビーム（３０２）は、ダイクロイック（３０４）を通過し、励起ビーム（３０２）の焦点を層状の膜（３００）に合わせる（３１０）対物レンズ（３０６）に当たり、そこで、標識が、直接的に励起されて、蛍光シグナル等の光学的シグナルを発する、または、ＦＲＥＴ相互作用を介して間接的に励起されて、光学的シグナルを放出する。斯かる光学的シグナルは、対物レンズ（３０６）によって収集され、励起ビーム（３０２）の光を通過するが光学的シグナル（３１１）の光を反射するように選択されたダイクロイック（３０４）へと方向付けられる。反射された光学的シグナル（３１１）は、これがピンホール（３１６）を通って検出器（３１８）に当たるように焦点を合わせるレンズ（３１４）を通過する。
【００４６】
一部の実施形態では、ポリマー（一本鎖ポリヌクレオチド等）を解析するための上述の方法を実行するためのデバイスは典型的に、層状の膜およびナノポアにわたる電界を確立するための１セットの電極を含む。一本鎖核酸は、チャンバに負電極を置くことにより層状の膜の「シス」側として構成された、第１のチャンバにおける電解質中に置くことによりナノポアに曝露される。電界の適用により、負の一本鎖核酸は、ナノポアによって捕捉され、チャンバに正電極を置くことにより膜の「トランス」側として構成された、層状の膜の向こう側の第２のチャンバへと移動される。移動のスピードは、第１および第２のチャンバ中の電解質のイオン強度、ならびにナノポアにわたり適用された電圧に部分的に依存する。光学に基づく検出において、移動スピードは、例えば、異なる電圧に対しナノポアにつき異なる予想速度でシグナルを生成する、標識された一本鎖核酸の予め決定された標準を使用した、予備的較正測定によって選択され得る。よって、ＤＮＡ配列決定適用のため、移動スピードは、斯かる較正測定からのシグナル速度に基づき選択され得る。結果的に、斯かる測定から、例えば、ナノポアのアレイにわたる、信頼できるヌクレオチド同定を可能にするまたは最大化する、電圧が選択され得る。一部の実施形態では、斯かる較正は、解析されている鋳型の試料由来の核酸を使用して為すことができる（予め決定された標準配列の代わりにまたはそれに加えて）。一部の実施形態では、斯かる較正は、配列決定ランの際にリアルタイムで行うことができ、適用された電圧は、斯かる測定に基づき、例えば、ヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化するように、リアルタイムで修飾することができる。
移動スピードの制御
【００４７】
ナノポアを通したポリヌクレオチドの移動スピードの役割、およびその制御の必要は、移動している分析物の同定に電流変化が使用される、ナノポア技術の分野で認められている。著しい困難（例えば、ナノポアにわたる電位、温度その他）を伴わずにリアルタイムで調整することができる方法、および困難（反応バッファー粘性、タンパク質ナノポアの穿孔における荷電側鎖の存在または非存在、反応バッファーのイオン組成および濃度、ポリヌクレオチド分析物に付着されたまたはハイブリダイズされた減速基、分子モーターその他）を伴い作動中のみに調整することができる方法の両方を含む、多種多様な方法が、移動スピードの制御に使用された、例えば、参照により本明細書に組み込む、Batesら、Biophysical  J.、８４巻：２３６６〜２３７２頁（２００３年）；Carsonら、Nanotechnology、２６巻（７号）：０７４００４頁（２０１５年）；Yehら、Electrophoresis、３３巻（２３号）：５８〜６５頁（２０１２年）；Meller、J.  Phys.  Cond.  Matter、１５巻：Ｒ５８１〜Ｒ６０７頁（２００３年）；Luanら、Nanoscale、４巻（４号）：１０６８〜１０７７頁（２０１２年）；Keyser、J.  R.  Soc.  Interface、８巻：１３６９〜１３７８頁（２０１１年）；その他。一部の実施形態では、本発明の方法が実行されながら、移動スピードの能動的制御のためのステップ（単数または複数）が含まれる、例えば、電位、温度その他；他の実施形態では、本発明の方法が実行されながら、能動的に制御または変化されない移動スピードを決定するステップ（単数または複数）が含まれる、例えば、反応バッファー粘性、イオン濃度その他。後者に関して、一部の実施形態では、移動スピードは、１〜６０パーセントの範囲内の、ある濃度のグリセロールまたは均等な試薬を有する反応バッファーを提供することにより選択される。
【００４８】
前者の実施形態（リアルタイム移動スピード調整による）に関して、１個または２個以上の標識が、測定されたシグナルに寄与する蛍光であるか否かに関する尺度は、蛍光が収集される複数のチャネルの間での蛍光強度の分布に基づくことができる。典型的には、複数のチャネルは、使用した蛍光標識の放出バンドに対応する、２、３または４個のチャネルを含む。ナノポア退出口に隣接する領域から発出する蛍光の測定された試料において、単一の標識のみが、測定されたシグナルに寄与する場合、異なるチャネル（例えば、４個のチャネル）の間でのシグナル強度の相対的分布は、（１，０，０，０）；（０，１，０，０）；（０，０，１，０）または（０，０，０，１）として理想的に表すことができる。他方では、２種以上の標識が、測定された蛍光シグナルに寄与した場合、相対的分布は、２個以上のチャネルにおいて非ゼロ値を含み、より悪い事例では、４種の異なる標識が等しく寄与し、これは、上述の表現では（．２５，．２５，．２５，．２５）として出現するであろう。相対的強度分布（１，０，０，０）；（０，１，０，０）；（０，０，１，０）または（０，０，０，１）に対応する最大値と、（．２５，．２５，．２５，．２５）の相対的強度分布に対応する最小値との間で単調に変動するであろう尺度は、リアルタイムで移動スピードの制御に使用することができる。例えば、初期移動スピードは、その最小付近であった斯かる尺度の値に基づき低減させることができた。斯かる低減は、例えば、ナノポアにわたる電位を予め決定された量だけ低減させることにより実行することができ、その後、尺度を再計算することができた。斯かるステップは、プロセスが最適化されるまで反復することができた。
【００４９】
上述の通り、移動スピードは、一部には、ナノポアにわたる電圧差（または電場強度）、およびポリヌクレオチドがナノポアに曝露される（例えば、第１のチャンバの１壁を構成する固相膜に配置される）第１のチャンバの反応混合物またはバッファーにおける条件に依存する。ナノポアによるポリヌクレオチド捕捉速度は、斯かるポリヌクレオチドの濃度に依存する。一部の実施形態では、ナノポア配列決定のための従来の反応混合物条件、例えば、１Ｍ  ＫＣｌ（またはＮａＣｌ、ＬｉＣｌその他等、均等な塩）およびｐＨ緩衝系（例えば、使用されているタンパク質、例えば、タンパク質ナノポア、ヌクレアーゼその他が変性されないことを確実にする）を、本発明（ナノポアにわたる電位を変動させることにより移動スピードを制御するための）により用いることができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝系を使用して、６．８〜８．８の範囲内の値に実質的に一定にｐＨを維持することができる。一部の実施形態では、ナノポアにわたる電圧差は、７０〜２００ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態では、ナノポアにわたる電圧差は、８０〜１５０ｍＶの範囲内であってもよい。操作に適切な電圧は、従来の測定技法を使用して選択することができる。ナノポアにわたる電流（または電圧）は、市販の機器を使用して容易に測定することができる。移動スピードが所望の範囲内となるように、電圧差を選択することができる。一部の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０００ヌクレオチド未満のスピードを含む。他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０〜６００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００〜５００ヌクレオチドである。同様に、移動スピードに影響を与える他の因子、例えば、温度、粘性、イオン濃度、タンパク質ナノポアの穿孔における荷電側鎖その他は、上に引用されている範囲内の移動スピードを得るように選択することができる。
【００５０】
一部の実施形態では、一本鎖核酸のための上述の方法を実行するためのデバイスは典型的に、ナノポア（アレイを含むことができる）にわたる電界を確立するための電極のセットの設置を含む。チャンバに負電極を置くことにより層状の膜の「シス」側として構成された、第１のチャンバにおける電解質（すなわち、反応バッファー）中に置くことにより、一本鎖核酸は、ナノポアに曝露される。電界の適用により、負の一本鎖核酸は、ナノポアによって捕捉され、チャンバに正電極を置くことにより膜の「トランス」側として構成された、層状の膜の向こう側の第２のチャンバに移動される。上述の通り、移動のスピードは、一部には、第１および第２のチャンバにおける電解質のイオン強度、ならびにナノポアにわたって印加される電圧に依存する。光学に基づく検出において、移動スピードは、例えば、異なる電圧に対してナノポア当たりの異なる予想速度でシグナルを生成する、標識された一本鎖核酸の予め決定された標準を使用した、予備的較正測定によって選択することができる。よって、ＤＮＡ配列決定適用のため、初期移動スピードは、斯かる較正測定由来のシグナル速度と共に、上記の相対的シグナル強度分布に基づく尺度に基づき選択することができる。結果的に、斯かる測定から、例えば、ナノポアのアレイにわたる、信頼できるヌクレオチド同定を可能にするまたは最大化する電圧を選択することができる。一部の実施形態では、斯かる較正は、解析されている鋳型の試料由来の核酸を使用して為すことができる（予め決定された標準配列の代わりにまたはそれに加えて）。一部の実施形態では、斯かる較正は、配列決定ランにおいてリアルタイムで行うことができ、印加された電圧は、斯かる測定に基づきリアルタイムで修飾して、例えば、ヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化することができる。
相互におよび自己クエンチする標識を用いる実施形態
【００５１】
上述の通り、一部の実施形態では、ナノポアを退出するヌクレオチドにおける標識から以外での蛍光放出を低下させるために、すなわち、シグナル生成ゾーンの空間的広がりを制限するために、クエンチ剤に加えて、自己および相互にクエンチする蛍光標識を使用することができる。斯かる蛍光標識の使用は、参照により組み込む米国特許出願公開第２０１６／０１２２８１２号に開示されている。一部の実施形態では、モノマーは、標的ポリヌクレオチドに付着されながら、少なくとも３種の状態が可能な蛍光標識で標識される：（ｉ）付着された蛍光標識の蛍光が、直接隣接するモノマーにおける蛍光標識によってクエンチされる、実質的にクエンチされた状態；例えば、標識されたポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを試験および操作するために、従来の水溶液において自由である場合、本発明に従ってポリヌクレオチドに付着された蛍光標識は、実質的にクエンチされる。（ｉｉ）付着された蛍光標識の自由溶液移動または整列が撹乱または限定されて、蛍光標識からの検出可能な蛍光シグナルがほとんどまたは全く生成されないように、標識されたポリヌクレオチドが、ナノポアを通って移動している、立体的に制約された状態。（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドがナノポアを通って移動する際に蛍光標識がナノポアを退出するにつれて（「遷移区間」において）、ポリヌクレオチドに付着された蛍光標識が、立体的に制約された状態からクエンチされた状態へと遷移する、遷移状態。
【００５２】
一部には、この例は、遷移区間において、蛍光標識（その他の面では実質的に完全に標識され、自己クエンチされたポリヌクレオチドにおける）が、検出可能な蛍光シグナルを生成することができるという発見の適用である。この発見の根底にあるいかなる理論に限定される意図もないが、遷移区間において生成された蛍光シグナルが、ナノポアから出現する蛍光標識における自由に回転可能な双極子の存在によるものであり、これにより、蛍光標識が、例えば、直接的励起後にまたはＦＲＥＴを介して、蛍光シグナルを一時的に生成することができるようになると考えられる。立体的に制約された状態と、クエンチされた状態の両方において、双極子は、その回転自由が限定され、これにより、放出した光子の数を低下させるまたは限定する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、通常、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の一本鎖ポリヌクレオチドであるが、特に、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドが、ナノポアを通って移動するときに、ナノポアを一度に１個ずつ退出するにつれて、付着された蛍光標識によって生成されたシグナルを記録することにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。退出後に、各付着された蛍光標識は、ナノポア中における制約された状態から自由溶液中のポリヌクレオチドにおけるクエンチされた状態へと、遷移区間において遷移する。言い換えると、一部の実施形態では、本発明の方法のステップは、ナノポアにおける制約された状態から自由溶液中のポリヌクレオチドにおけるクエンチされた状態へと遷移しているときに、各蛍光標識を励起するステップを含む。上述の通り、この遷移区間または期間において、蛍光標識は、これが付着されたヌクレオチドを示す検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明は、ナノポアを通したポリヌクレオチドの移動において、モノマーに付着された蛍光標識が、検出可能な蛍光シグナルを産生できない（または実質的にできない）制約された状態へと押し進められるように、蛍光標識およびナノポアを選択することができるという発見の適用を含む。一部の実施形態では、１〜４ｎｍの範囲内の直径を有する穿孔または内腔を有するナノポアが選択される；他の実施形態では、２〜３ｎｍの範囲内の直径を有する穿孔または内腔を有するナノポアが選択される。一部の実施形態では、斯かる穿孔直径は、タンパク質ナノポアによってもたらされる。一部の実施形態では、蛍光標識がナノポアを退出するときは常に、蛍光シグナルを生成することが実質的にできない状態から、これが放出するよう誘導され得る蛍光シグナルによって検出可能かつ同定可能な状態へと遷移するように、斯かるナノポアは、本発明に従って制約された状態へと蛍光標識を押し進めるために使用される。よって、ポリヌクレオチドのモノマーの配列のそれぞれに付着された蛍光標識は、ナノポア退出口に直接隣接する領域（「遷移ゾーン」または「遷移体積」または「検出ゾーン」）において蛍光シグナルを突然生成する際に、順次検出することができる。一部の実施形態では、上述の直径のナノポアにより、有機蛍光色素が、蛍光標識として使用される。一部の実施形態では、少なくとも１種の斯かる有機蛍光色素が、キサンテン色素、ローダミン色素およびシアニン色素からなるセットから選択される。ポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するための一部の実施形態は、（ａ）ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのモノマーが、蛍光標識で標識され、ナノポアが、その穿孔内に、その中で検出可能な蛍光シグナルが実質的に生成されないような、制約された状態へと蛍光標識を制約する、ステップと、（ｂ）ナノポアを退出する際に各モノマーの蛍光標識を励起するステップと、（ｃ）退出する蛍光標識によって生成された検出ゾーンにおける蛍光シグナルを測定して、蛍光標識が付着されたモノマーを同定するステップと、（ｄ）検出ゾーン外の励起された蛍光標識から蛍光シグナルをクエンチするステップと、（ｄ）蛍光シグナルの配列からポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するステップとにより行うことができる。さらなる実施形態では、蛍光標識は、ＦＲＥＴペアのアクセプターであり、ＦＲＥＴペアの１種または複数のドナーは、退出口のＦＲＥＴ距離内のナノポアに付着されられる。
【００５４】
一部の実施形態では、上で使用される「実質的にクエンチされた」は、蛍光標識が、隣接する相互にクエンチする標識がないことを除いて同じ条件下で生成されたシグナルから少なくとも３０パーセント低下した蛍光シグナルを生成することを意味する。一部の実施形態では、上で使用される「実質的にクエンチされた」は、蛍光標識が、隣接する相互にクエンチする標識がないことを除いて同じ条件下で生成されたシグナルから少なくとも５０パーセント低下した蛍光シグナルを生成することを意味する。
【００５５】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４種の別々の反応を行うことにより決定され、この反応において、標的ポリヌクレオチドのコピーは、単一の蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有する。斯かる実施形態のバリアントでは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４種の別々の反応を行うことにより決定され、この反応において、標的ポリヌクレオチドのコピーは、１種の蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有するが、同時に、同じ標的ポリヌクレオチドにおける他のヌクレオチドは、第２の蛍光標識で標識されている。例えば、第１の蛍光標識が、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＡに付着される場合、第２の蛍光標識は、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＣ、ＧおよびＴ（すなわち、「非Ａ」ヌクレオチド）に付着される。同様に、この例を続けると、第２の反応において、第１の標識は、標的ポリヌクレオチドのＣに付着され、第２の蛍光標識は、標的ポリヌクレオチドのＡ、ＧおよびＴ（すなわち、「非Ｃ」ヌクレオチド）に付着される。ヌクレオチドＧおよびＴについても、同様である。
【００５６】
同じ標識スキームは、ヌクレオチド型のサブセットに関する従来の用語法の観点から表現することができる；よって、上述の例では、第１の反応において、第１の蛍光標識は、Ａに付着され、第２の蛍光標識は、Ｂに付着される；第２の反応において、第１の蛍光標識は、Ｃに付着され、第２の蛍光標識は、Ｄに付着される；第３の反応において、第１の蛍光標識は、Ｇに付着され、第２の蛍光標識は、Ｈに付着される；第４の反応において、第１の蛍光標識は、Ｔに付着され、第２の蛍光標識は、Ｖに付着される。
【００５７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはペプチド等、ポリマーは、単一の種類のモノマーに付着された単一の蛍光標識で標識することができ、例えば、ポリヌクレオチドの全Ｔ（または実質的に全Ｔ）は、蛍光標識、例えば、シアニン色素で標識される。斯かる実施形態では、ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナルの収集物または配列は、特定のポリヌクレオチドのシグネチャーまたはフィンガープリントを形成することができる。一部の斯かる実施形態では、斯かるフィンガープリントは、決定されるべきモノマーの配列に十分な情報を提供しても提供しなくてもよい。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明の特色は、相互にクエンチするセットのメンバーである蛍光色素または標識による、ポリヌクレオチド分析物の実質的にあらゆるモノマーの標識である。ポリヌクレオチド分析物の標識を参照した用語「実質的にあらゆる」の使用は、化学的および酵素的標識技法が、典型的に、１００パーセント未満の効率であることを了承する。一部の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも８０パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。他の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも９０パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。他の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも９５パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。蛍光色素の相互にクエンチするセットは、次の特性を有する：（ｉ）各メンバーは、全メンバーの蛍光をクエンチする（例えば、ＦＲＥＴまたは静的もしくは接触機構によって）、および（ｉｉ）各メンバーは、励起され、非クエンチ状態であると、別個の蛍光シグナルを生成する。すなわち、相互にクエンチするセットが、２種の色素、Ｄ１およびＤ２からなる場合、（ｉ）Ｄ１は、自己クエンチされ（例えば、別のＤ１分子との接触クエンチにより）、これは、Ｄ２によってクエンチされ（例えば、接触クエンチにより）、（ｉｉ）Ｄ２は、自己クエンチされ（例えば、別のＤ２分子との接触クエンチにより）、これは、Ｄ１によってクエンチされる（例えば、接触クエンチにより）。相互にクエンチするセットのための蛍光色素または標識を選択するためのガイダンスは、参照により本明細書に組み込む次の参考文献に見出すことができる：Johansson、Methods  in  Molecular  Biology、３３５巻：１７〜２９頁（２００６年）；Marrasら、Nucleic  Acids  Research、３０巻：ｅ１２２頁（２００２年）；その他。一部の実施形態では、相互にクエンチするセットのメンバーは、芳香環構造等、相互作用を積み重ねることができる構成成分または部分を含む、有機蛍光色素を含む。蛍光色素または標識の例示的な相互にクエンチするセットは、ローダミン色素、フルオレセイン色素およびシアニン色素から選択することができる。一実施形態では、相互にクエンチするセットは、ローダミン色素、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセイン色素、ＦＡＭを含むことができる。別の実施形態では、蛍光色素の相互にクエンチするセットは、オレゴングリーン４８８、フルオレセイン−ＥＸ、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＲｅｄ−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、１種または複数のＢＯＤＩＰＹ色素、テキサスレッド、オレゴングリーン５１４、および１種または複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒからなる群から２種またはそれよりも多い色素を選択することにより形成することができる。代表的なＢＯＤＩＰＹ色素は、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５を含む。代表的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５０���、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０および７９０を含む。
【００５９】
上述の通り、一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが、相互にまたは自己クエンチする蛍光標識で標識されたそれぞれ異なる種類のモノマーを有する別々の反応（各種類のモノマーにつき１種）を行うことにより決定される。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが、同じ相互にクエンチするセットから選択される異なる相互にクエンチする蛍光標識で標識されたそれぞれ異なる種類のモノマーを有する別々の反応（各種類のモノマーにつき１種）を行うことにより決定される。相互にクエンチするセットが、２種の色素のみを含有する実施形態では、選択されたモノマー（モノマーＸとする）は、第１の相互にクエンチする色素で標識され、他の全ての種類のモノマー（すなわち、非モノマーＸ）は、同じセット由来の第２の相互にクエンチする色素で標識される。よって、この実施形態のステップは、一方はモノマーＸを示し、他方は非モノマーＸを示す、２種の異なる蛍光シグナルの配列を生成する。
【００６０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの隣接ヌクレオチド等、ポリヌクレオチドにおける隣接するモノマー（同じ種類の）に付着されたときに自己クエンチする、単一の蛍光標識（例えば、複数の種類のモノマーを含むポリヌクレオチドにおける単一種類のモノマーに付着された）を使用することができる。例示的な自己クエンチ蛍光標識として、オレゴングリーン（Oregon  Green）４８８、フルオレセイン−ＥＸ、ＦＩＴＣ、ローダミンＲｅｄ−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹＳおよびテキサスレッドが挙げられるがこれらに限定されず、例えば、これらは、Molecular  Probes  Handbook、第１１版（２０１０年）に開示されている。
クエンチ剤を用いる実施形態
【００６１】
図６Ａ〜図６Ｃは、ナノポアデバイスにクエンチ剤が適用される場合に対応する本発明の異なる実施形態を図解する：トランスチャンバのみ（図６Ａ）、シスチャンバのみ（図６Ｂ）またはシスおよびトランスチャンバの両方（図６Ｃ）。図６Ａにおいて、シスチャンバ（６０２）からトランスチャンバ（６０４）へと固相膜（６０８）のナノポア（６０６）を移動している、標識されたポリヌクレオチド（６００）が図解されている。トランスチャンバ（６０４）には、「Ｑ」で表記されている非蛍光クエンチ剤（６０５）が浸漬されている。本発明のクエンチ剤は、標識されたポリヌクレオチド（６００）のための移動条件下で可溶性であり、同じ条件下で、クエンチ剤は、実質的な配列特異性なしで、（６００）等の一本鎖ポリヌクレオチドに結合する。下でより十分に説明される通り、非対称シアニン色素等の多くの周知の有機色素の誘導体と共に、斯かる化合物ならびにオリゴヌクレオチドおよび／またはそのアナログのコンジュゲートを含む、多種類の非蛍光クエンチ剤を本発明による使用に利用できる。本実施形態では、クエンチ剤の種類および濃度ならびに移動スピードの選択は、検出ゾーン（６１０）を画定する。一部の実施形態では、「検出ゾーン」は、蛍光シグナルが収集されて、標識されたポリヌクレオチドに関する配列情報等の情報が決定される生データを形成する、領域または体積（近接または非近接であり得る）を意味する。検出ゾーン（６１０）外のトランスチャンバ（６０４）における蛍光標識は、トランスチャンバ（６０４）において標識されたポリヌクレオチド（６００）の部分に結合されたクエンチ剤（６０５）によって実質的にクエンチされる。一部の実施形態では、クエンチ剤は、より十分に後述する通り、有機色素に基づく１個または複数のクエンチ部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドまたはアナログを含む。例えば、シスチャンバ（６０２）における蛍光標識が実質的に励起されないように、固相膜（６０８）が、不透明層であるまたはこれを含む場合に、図６Ａの実施形態を用いることができる。
【００６２】
図６Ｂは、クエンチ剤（６０５）がシスチャンバ（６０２）に配置されていることを除いて、図６Ａのものと実質的に同じ要素を示す。この構成は、望まれないエバネセント波または同様の非放射光エネルギーが、シスチャンバ（６０２）へと伸長し、収集される蛍光シグナルを生成する蛍光標識を励起する環境下で望ましい場合がある。シスチャンバ（６０２）における標識されたポリヌクレオチド（６００）に結合するクエンチ剤（６０５）は、斯かる蛍光シグナルを低下させるまたは排除する。一部の実施形態では、クエンチ剤（６０５）が、ナノポア（６０６）を通した移動から除外されるように、クエンチ剤（６０５）およびナノポア（６０６）の横断面が選択される。一部の実施形態では、これは、より十分に後述する通り、タンパク質ナノポアα−ヘモリジン、ならびにオリゴヌクレオチドまたはそのアナログおよび１個または複数のクエンチ化合物のコンジュゲートを含むクエンチ剤を使用することにより達成することができる。
【００６３】
図６Ｃは、クエンチ剤（６０５）が、シスチャンバ（６０２）およびトランスチャンバ（６０４）の両方に存在する実施形態を図解し、このことは、図６Ａおよび図６Ｂの両方の実施形態について記載された利点を提供する。
【００６４】
図７は、次の要素を含む実施形態を図解する：脂質二重層（７０２）に配置されたタンパク質ナノポア（７００）；バックグラウンド蛍光を防止または低下させるための固相膜（７０６）における不透明層（７０８）による蛍光標識の落射照明；およびトランスチャンバ（７２６）に配置されたクエンチ剤（７１０）。上述の通り、蛍光標識されたヌクレオチド（標識は、（７２２）と同様に「ｆ」で示されている）を有するポリヌクレオチド（７２０）は、シスチャンバ（７２４）からトランスチャンバ（７２６）へとナノポア（７００）を通して移動される。オリゴヌクレオチドクエンチャー（７１０）は、ナノポア（７００）から出現するポリヌクレオチド（７２０）の部分へのオリゴヌクレオチドクエンチャー（７２８）のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、濃度、温度、塩濃度その他）、トランスチャンバ（７２６）に配置される。参照により本明細書に組み込むHuberら、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／００７６０９１に記載されている通り、ナノポアの移行の際の蛍光標識からのシグナルが抑制されるように、ナノポア（７００）を選択することができる。よって、標識されたヌクレオチドは、領域（７２８）においてナノポア（７００）から出現すると、抑制されなくなり、シグナルを生成することができる。全てではないにしても大部分の形態の直接的照射（例えば、非ＦＲＥＴ）により、斯かる出現した標識は、トランスチャンバ（７２６）へとさらに移動する際に、蛍光を放出し続け、これにより、収集されるシグナルに大いに寄与するであろう。出現しつつあるポリヌクレオチドに結合するトランスチャンバ（７２６）におけるクエンチ剤により、斯かる放出は、有意に低下させることができ、収集されるシグナルを解析してポリヌクレオチド（７２０）に関するヌクレオチド配列情報を得ることができる、検出ゾーン（７２８）を画定することができる。一部の実施形態では、標識されたポリヌクレオチドが、検出ゾーンを通って移動する際に、単一の蛍光標識からの蛍光シグナルが、検出期間において検出ゾーン（７２８）から検出される。他の実施形態では、複数の蛍光シグナルが、予め決定された期間に、検出ゾーン（７２８）において複数の蛍光標識から収集される。一部の実施形態では、斯かる検出期間は、１ミリ秒未満または０．１ミリ秒未満または０．０１ミリ秒未満である。一部の実施形態では、斯かる検出期間は、少なくとも０．０１ミリ秒または少なくとも０．１ミリ秒または少なくとも０．５ミリ秒である。
【００６５】
本発明のクエンチ剤は、ナノポア配列決定条件下で、（ｉ）実質的に非蛍光であり、（ｉｉ）一本鎖核酸、特に、一本鎖ＤＮＡに結合し、（ｉｉｉ）非放射的に他の分子から励起エネルギーを吸収し、これを非放射的に放出する、いずれかの化合物（または化合物のセット）を含む。一部の実施形態では、クエンチ剤は、一本鎖ＤＮＡにさらに非共有結合により結合する。より十分に後述する通り、シアニンおよびキサンテン色素等、一般的合成色素の非蛍光誘導体が挙げられるがこれらに限定されない、多種類のクエンチ化合物を本発明による使用に利用できる。クエンチ化合物の選択におけるガイダンスは、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，３２３，３３７号；同第６，７５０，０２４号および同様の参考文献に見出すことができる。
【００６６】
一部の実施形態では、クエンチ剤は、蛍光をクエンチすることが公知の重原子（臭素またはヨウ素等）により共有結合により修飾された、またはニトロ基もしくはアゾ基等の蛍光をクエンチすることが公知の他の基により共有結合により修飾された、一本鎖ＤＮＡ結合色素であってもよい。一本鎖ＤＮＡに結合することが公知の色素の例は、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（Zipperら（２００４年）Nucleic  Acids  Research.３２巻（１２号））である。シアニン（cynanine）Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ構造へのニトロ、臭素、ヨウ素および／またはアゾ基の取り込みは、ＤＮＡ上に存在し得る蛍光標識をクエンチするであろう一本鎖ＤＮＡ結合基部分をもたらす。
【００６７】
一部の実施形態では、クエンチ剤は、結合部分および１個または複数のクエンチ部分を含む。結合部分は、実質的な配列特異性なしで一本鎖核酸に結合するいずれかの化合物を含むことができる。結合部分は、ペプチドもしくはオリゴヌクレオチド、または修飾された連結および／もしくはモノマーを有するどちらかのアナログを含むことができる。オリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、デュプレックス形成または非塩基対形成アプタマー結合によるポリヌクレオチドへの結合をもたらすことができる。一部の実施形態では、結合部分は、６〜６０ヌクレオチドの範囲内の長さを有するオリゴヌクレオチドまたはそのアナログを含む。斯かるオリゴヌクレオチドまたはアナログは、１個のクエンチ部分または複数のクエンチ部分にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドまたはアナログにコンジュゲートされた複数のクエンチ部分は、２または３個である。結合部分にコンジュゲートされたクエンチ部分は、同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、結合部分が、オリゴヌクレオチドまたはアナログである場合は常に、２個のクエンチ部分が、そこにコンジュゲートされ、１個はオリゴヌクレオチドの５’端に、もう１個は３’端にある。２〜３個のクエンチ部分を有するオリゴヌクレオチドまたはアナログは、例えば、本明細書に引用されている参考文献に開示されている通り、従来の連結および合成化学を使用して合成することができる。
【００６８】
オリゴヌクレオチドまたはアナログは、単一種として提供することができる、または異なる配列、したがって、異なる結合特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドまたはアナログの混合物として提供することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはアナログは、ランダム配列ポリマーである；すなわち、所与の長さのあらゆる可能な配列の混合物として提供される。例えば、斯かるオリゴヌクレオチドまたはアナログは、６−ｍｅｒでは式「ＮＮＮＮＮＮ」、または８−ｍｅｒでは「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧもしくはＴまたはそれらのアナログであり得る）によって表すことができる。
【００６９】
オリゴヌクレオチドに関連した「アナログ」は、１個または複数のヌクレオチドアナログを含有するオリゴヌクレオチドを意味する。定義セクションに記載されている通り、「ヌクレオチドアナログ」は、修飾された連結部分、糖部分または塩基部分を有し得るヌクレオチドである。本発明により使用することができる例示的なオリゴヌクレオチドアナログとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）その他が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７０】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分は、ユニバーサル塩基を含む；すなわち、塩基対相互作用を不安定化させることなく、４種の天然ヌクレオチドのいずれかを置き換えることができる１個または複数のヌクレオチドアナログを含有する。ユニバーサル塩基特性を有するヌクレオチドアナログは、参照により本明細書に組み込むLoakes、Nucleic  Acids  Research、２９巻（１２号）：２４３７〜２４４７頁（２００１年）に記載されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分は、２’−デオキシイノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、３−ニトロピロールヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチドその他を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、クエンチ剤は、一緒に作用して、一本鎖の標識されたポリヌクレオチドの望まれない蛍光シグナルをクエンチする、２個またはそれよりも多い化合物の組合せを含むことができる。例えば、クエンチ剤は、標識されたポリヌクレオチドとデュプレックスを形成することができるオリゴヌクレオチド（例えば、ポリデオキシイノシン）と、別々に、クエンチャーである二本鎖干渉物質を含むことができる。よって、ポリデオキシイノシンが、標識されたポリヌクレオチドに結合する場合は常に、クエンチ干渉物質は、その結果得られるデュプレックスに結合し、ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナルをクエンチする。
【００７２】
標識されたポリヌクレオチドの蛍光標識の蛍光シグナルを検出可能にクエンチすることができるいずれかの合成色素が、本発明の目的に許容されるクエンチ部分である。特に、本発明において使用される通り、クエンチ部分は、標識されたポリヌクレオチドにおける蛍光標識の放出バンドとの少なくともある程度のスペクトル重複を示す吸収バンドを保有する。この重複は、十分なスペクトル重複が存在するという条件で、クエンチ部分（アクセプター）の最大吸光度波長よりも低いまたはさらには高い波長放出最大で起こる蛍光標識（ドナー）の放出により起こり得る。エネルギー移動は、アクセプターのより高い電子状態へのドナーの放出の移動により起こる場合もある。当業者は、使用されている蛍光標識の放出スペクトルに関する該色素の励起バンドの試験により、所与のクエンチ部分の有用性を決定する。
【００７３】
典型的には、本発明における蛍光クエンチは、蛍光標識および本発明のクエンチ部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴまたは電荷移動複合体の形成による）により起こる。ドナーおよびアクセプター化合物のスペクトルおよび電子特性は、標識されたポリヌクレオチドにおける蛍光標識およびクエンチ部分の間の分離距離と同様に、観察されるエネルギー移動の程度に強い効果を有する。分離距離が増加するにつれて、蛍光クエンチの程度が減少する。
【００７４】
色素の最大放出波長が、標識されたポリヌクレオチドに結合される場合、蛍光標識の最大放出波長から十分に分離されているという条件で、クエンチ部分は、任意選択で、蛍光となることができる。しかし、好ましくは、クエンチ部分は、オリゴヌクレオチドまたはアナログに共有結合によりコンジュゲートされる場合、ほんのぼんやりとした蛍光である、または実質的に非蛍光である。実質的に非蛍光は、本明細書において、本明細書における方法のいずれかに関して記載されているアッセイ溶液におけるクエンチ部分の蛍光効率が、５パーセント未満またはこれに等しい、好ましくは、１パーセント未満またはこれに等しいことを示す。他の実施形態では、共有結合により結合されたクエンチ部分は、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満の量子収量を示す。一部の実施形態では、本発明のクエンチオリゴヌクレオチドに関連する蛍光標識の蛍光は、共有結合により結合されたクエンチ部分の非存在下での同じ蛍光標識に関連する同じオリゴヌクレオチドと比べて５０％超クエンチされる。別の実施形態では、蛍光標識は、非標識オリゴヌクレオチドと比べて９０％超クエンチされる。さらに別の実施形態では、核酸染色は、非標識オリゴヌクレオチドと比べて９５％超クエンチされる。
【００７５】
一部の実施形態では、クエンチ部分は、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンゾインドール、オキサゾールもしくはベンゾオキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン（ヒドロキシクマリンおよびアミノクマリン、ならびにそれらのフッ素化およびスルホン化誘導体を含む（参照により組み込む米国特許第５，８３０，９１２号、Geeら（１９９８年）および米国特許第５，６９６，１５７号、Wangら（１９９７年）に記載）、ポリアザインダセン（例えば、全て参照により組み込む、米国特許第４，７７４，３３９号、Hauglandら（１９８８年）；米国特許第５，１８７，２８８号、Kangら（１９９３年）；米国特許第５，２４８，７８２号、Hauglandら（１９９３年）；米国特許第５，２７４，１１３号、Kangら（１９９３年）；米国特許第５，４３３，８９６号、Kangら（１９９５年）；米国特許第６，００５，１１３号、Wuら（１９９９年））、キサンテン、オキサジンもしくはベンゾオキサジン、カルバジン（参照により組み込む米国特許第４，８１０，６３６号、Corey（１９８９年））、またはフェナレノン（phenalenone）もしくはベンズフェナレノン（参照により組み込む米国特許第４，８１２，４０９号、Babbら（１９８９年））であってもよい。
【００７６】
他の実施形態では、実質的に非蛍光色素であるクエンチ部分は、特に、アゾ色素（ＤＡＢＣＹＬまたはＤＡＢＳＹＬ色素およびこれらの構造的アナログ等）、マラカイトグリーンもしくはフェノールレッド等のトリアリールメタン色素、４’，５ｚ−ジエーテル置換フルオレセイン（米国特許第４，３１８，８４６号（１９８２年））または非対称シアニン色素クエンチャー（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９３７，７１７（１９９９年））を含む。
【００７７】
クエンチ部分がキサンテンである実施形態では、合成色素は、任意選択で、フルオレセイン、ロドール（参照により組み込む米国特許第５，２２７，４８７号、Hauglandら（１９９３年））またはローダミンである。本明細書において、フルオレセインは、ベンゾ−もしくはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセインまたはナフトフルオレセインを含む。同様に、本明細書において、ロドールは、セミナフトロダフルオロ（参照により組み込む米国特許第４，９４５，１７１号、Hauglandら（１９９０年））を含む。キサンテンは、キサンテン色素のフッ素化誘導体（参照により組み込む国際公開番号ＷＯ９７／３９０６４、Molecular  Probes,  Inc.（１９９７年））およびキサンテン色素のスルホン化誘導体（参照により組み込む国際公開番号ＷＯ９９／１５５１７、Molecular  Probes,  Inc.（１９９９年））を含む。本明細書において、オキサジンは、レゾルフィン（resorufm）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジンおよびこれらのベンゾ置換アナログを含む。
【００７８】
さらなる実施形態では、クエンチ部分は、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，３９９，３９２号に記載されている、１個または複数のアミノ窒素原子において、芳香族または芳香族複素環系によって置換された３−および／または６−アミノキサンテンの実質的に非蛍光誘導体である。これらのクエンチ色素は典型的に、５３０ｎｍを上回る吸収最大を有し、観察可能な蛍光がほとんどないまたは全くなく、ケミルミフォア、リン光体またはフルオロフォアによって放出されるもの等、幅広いスペクトルのルミネセンス放出を効率的にクエンチする。一実施形態では、クエンチ色素は、置換ローダミンである。別の実施形態では、クエンチ化合物は、置換ロドールである。
【００７９】
さらに他の実施形態では、クエンチ部分は、参照により本明細書に組み込む次の特許に記載されているＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）化合物（ＢＨＱ）として公知の１種または複数の非蛍光クエンチャーを含むことができる：７，０１９，１２９；７，１０９，３１２；７，５８２，４３２；８，４１０，０２５；８，４４０，３９９；８，６３３，３０７；８，９４６，４０４；９，０１８，３６９；または９，１３９，６１０。追加的なクエンチ部分は、参照により本明細書に組み込む次のものに開示されている：米国特許第６，６９９，９７５号；同第６，７９０，９４５号；および同第８，１１４，９７９号。
ナノポアおよびポリマーのための標識
【００８０】
一部の実施形態では、ナノポアは、１種または複数の量子ドットで標識することができる。特に、一部の実施形態では、１種または複数の量子ドットは、ナノポアに付着されることができる、またはナノポアに隣接する（およびナノポアの入口または出口のＦＲＥＴ距離内の）固相支持体に付着されることができ、分析物におけるアクセプターとのＦＲＥＴ反応におけるドナーとして用いられる。量子ドットの斯かる使用は、周知であり、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，２５２，３０３号；同第６，８５５，５５１号；同第７，２３５，３６１号；その他等、科学および特許文献に広く記載されている。
【００８１】
ポア標識として利用され得る量子ドットの一例は、水溶液において合成され得るＣｄＴｅ量子ドットである。ＣｄＴｅ量子ドットは、一級アミン、チオール等の求核基またはカルボン酸等の官能基を官能基付与され得る。ＣｄＴｅ量子ドットは、タンパク質ポアの外部における一級アミンへの量子ドットの共有結合による連結に利用され得るカルボン酸官能基を有するメルカプトプロピオン酸キャッピングリガンドを含むことができる。架橋反応は、バイオコンジュゲーション技術分野の当業者に公知の標準架橋試薬（ホモ二官能性およびヘテロ二官能性）を使用して達成することができる。修飾が、ナノポアを通した核酸の移動を損なわないまたは実質的に損なわないことを確実にするためには注意を要する。これは、ナノポアへのドナー標識の付着に使用される、用いられているクロスリンカー分子の長さを変動させることにより達成することができる。
【００８２】
例えば、天然アルファヘモリジンタンパク質のリシン残基１３１の一級アミン（Song,  L.ら、Science  ２７４巻（１９９６年）：１８５９〜１８６６頁）を使用して、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスルホサクシニミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）カップリング化学により、カルボキシ修飾ＣｄＴｅ量子ドットを共有結合により結合することができる。あるいは、アミノ酸１２９（スレオニン）を、システインへと交換することができる。天然アルファヘモリジンタンパク質には他のシステイン残基が存在しないため、新たに挿入されたシステインのチオール側鎖を使用して、他の化学部分を共有結合により付着されることができる。
【００８３】
生物学的ポリマー、例えば、核酸分子またはポリマーは、１種または複数のアクセプター標識で標識することができる。核酸分子のため、核酸分子の４種のヌクレオチドまたは構成要素のそれぞれをアクセプター標識で標識し、これにより、各天然起源のヌクレオチドに対する標識された（例えば、蛍光）対応物を作製することができる。アクセプター標識は、変換された核酸の部分または鎖全体における１個または複数のヌクレオチドに付着されることができる、エネルギー受容分子の形態であってもよい。
【００８４】
種々の方法を利用して、核酸分子またはポリマーのモノマーまたはヌクレオチドを標識することができる。標識されたヌクレオチドは、鋳型として本来の試料を使用した新たな核酸の合成の際に核酸に取り込むことができる（「合成による標識」）。例えば、核酸の標識は、ＰＣＲ、全ゲノム増幅、ローリングサークル増幅、プライマー伸長その他により、または当業者に公知の上述の方法の様々な組合せおよび拡張により達成することができる。
【００８５】
標識は、求核剤（アミン、チオール等）等の反応基を含むことができる。次に、天然の核酸には存在しない斯かる求核剤を使用して、ＮＨＳエステル、マレイミド、エポキシ環、イソシアネート等、アミンまたはチオール反応性化学により蛍光標識を付着することができる。斯かる求核剤反応性蛍光色素（すなわち、ＮＨＳ−色素）は、異なる供給源から容易に商業的に入手することができる。小型の求核剤で核酸を標識する利点は、「合成による標識」アプローチが使用される際の、斯かる標識されたヌクレオチドの取り込みの高い効率にある。かさばった蛍光標識された核酸構成要素は、新たに合成されたＤＮＡへの重合プロセスの際の標識の立体障害のために、ポリメラーゼによる取り込みが不十分な場合がある。
【００８６】
２種またはそれよりも多い相互にクエンチする色素が使用される場合は常に、斯かる色素は、直交性付着化学を使用してＤＮＡに付着することができる。例えば、ＮＨＳエステルを使用して、一級アミンと非常に特異的に反応させることができる、またはマレイミドは、チオール基と反応するであろう。一級アミン（ＮＨ２）またはチオール（ＳＨ）修飾ヌクレオチドのどちらも市販されている。これらの相対的に小型の修飾は、ポリメラーゼ媒介性ＤＮＡ合成において容易に取り込まれ、ＮＨＳまたはマレイミド修飾色素のいずれかを使用して、その後の標識反応に使用することができる。斯かる直交性リンカー化学を選択および使用するためのガイダンスは、Hermanson（上に引用）に見出すことができる。
【００８７】
典型的な付着位置のための追加的な直交性付着化学は、銅触媒反応および無触媒反応のためのヒュスゲン型環化付加；例えば、Gutsmiedlら、Org.  Lett.、１１巻：２４０５〜２４０８頁（２００９年）に開示されているアルケンプラスニトリル酸化物環化付加；例えば、Seeligら、Tetrahedron  Lett.、３８巻：７７２９〜７７３２頁（１９９７年）に開示されているディールスアルダー環化付加；例えば、Casiら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１３４巻：５８８７〜５８９２頁（２０１２年）；Shaoら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１１７巻：３８９３〜３８９９頁（１９９５年）；Rideout、Science、２３３巻：５６１〜５６３頁（１９８６年）に開示されているカルボニルライゲーション；例えば、Brinkley、Bioconjugate  Chemistry、３巻：２〜１３頁（１９９２年）に開示されているマイケル付加；例えば、Schulerら、Bioconjugate  Chemistry、１３巻：１０３９〜１０４３頁（２００２年）；Dawsonら、Science、２６６巻：７７６〜７７９頁（１９９４年）に開示されているネイティブ化学的ライゲーション；または例えば、Hermanson（上に引用）に開示されている活性エステルを介したアミド形成を含む。
定義
【００８８】
「エバネセント場」は、非伝播電磁場を意味する；すなわち、ポインティングベクトルの平均値がゼロである電磁場である。
【００８９】
「ＦＲＥＴ」または「フェルスターまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起されたドナーフルオロフォアから基底状態のアクセプターフルオロフォアへの、無放射双極子−双極子エネルギー移動機構を意味する。ＦＲＥＴ相互作用におけるエネルギー移動の速度は、アクセプターの吸収スペクトルとドナーの放出スペクトルとのスペクトル重複の程度、ドナーの量子収量、ドナーおよびアクセプター遷移双極子の相対的配向性、ならびにドナーおよびアクセプター分子の間の距離に依存する；Lakowitz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）。特に興味深いＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターに移動され、次いで、そのドナーを励起する光（すなわち、「ＦＲＥＴシグナル」）よりも低い周波数を有する光子としてアクセプターによって放出されるエネルギーの部分を生じる相互作用である。「ＦＲＥＴ距離」は、ＦＲＥＴ相互作用が起こり得、ＦＲＥＴアクセプターによって産生される検出可能なＦＲＥＴシグナルが生じ得る、ＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターの間の距離を意味する。
【００９０】
「キット」は、本発明の方法を行うための材料または試薬を送達するためのいずれかの送達系を指す。反応アッセイの文脈において、斯かる送達系は、ある位置から別の位置への、反応試薬（例えば、適切な容器内の、相互にクエンチする蛍光標識等の蛍光標識、蛍光標識連結剤、酵素等）および／または支持材料（例えば、バッファー、アッセイを行うための書面の説明書等）の貯蔵、輸送または送達を可能にする系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１個または複数の同封物（例えば、箱）を含む。斯かる内容物は、一緒にまたは別々に、意図される受取人に送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含有することができ、一方、第２またはそれよりも多い容器は、相互にクエンチする蛍光標識を含有する。
【００９１】
「ナノポア」は、予め決定されたまたは識別できる順序での基板を通した分析物の通過を可能にする、あるいはポリマー分析物の場合は、予め決定されたまたは識別可能な順序での基板を通したそのモノマー単位の通過を可能にする、基板に位置するいずれかの開口を意味する。後者の場合、予め決定されたまたは識別可能な順序は、ポリマーにおけるモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例として、タンパク質性またはタンパク質に基づくナノポア、合成または固体状態ナノポア、およびタンパク質ナノポアが包埋された固体状態ナノポアを含むハイブリッドナノポアが挙げられる。ナノポアは、１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍの内径を有することができる。タンパク質ナノポアの例として、例えば、参照により本明細書に組み込むRhee,  M.ら、Trends  in  Biotechnology、２５巻（４号）（２００７年）：１７４〜１８１頁；Bayleyら（上に引用）；Gundlachら、米国特許出願公開第２０１２／００５５７９２号；その他に開示されている、アルファ−ヘモリジン、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡおよびＬａｍＢ（マルトポリン）が挙げられるがこれらに限定されない。単一の核酸分子の移動を可能にするいずれかのタンパク質ポアを用いることができる。ナノポアタンパク質は、ポア外部の特異的部位において、またはポア形成タンパク質を構成する１個もしくは複数のモノマー単位外部の特異的部位において、標識することができる。ポアタンパク質は、アルファ−ヘモリジン、ＭｓｐＡ、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、炭疽ポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびＬａｍＢ（マルトポリン）等が挙げられるがこれらに限定されない、タンパク質の群から選択される。固体状態の孔へのポアタンパク質の統合は、荷電ポリマーをポアタンパク質に付着することにより達成される。電界を適用した後に、荷電複合体は、固体状態の孔内に電気泳動的に引き寄せられる。合成ナノポアまたは固体状態ナノポアは、様々な形態の固体基板に作製することができ、その例として、シリコーン（例えば、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、プラスチック、ガラス、半導体材料およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。合成ナノポアは、脂質二重層膜に位置する生物学的タンパク質ポアよりも安定的であってもよい。合成ナノポアは、重合エポキシ等が挙げられるがこれに限定されない、適した基板に包埋されたカーボンナノチューブを使用することにより作製することもできる。カーボンナノチューブは、均一かつ明確に定義された化学的および構造的特性を有することができる。１〜数百ナノメートルに及ぶ、様々なサイズのカーボンナノチューブを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、結果として、ナノポアを通した核酸の電気泳動的輸送は、単純かつ予測可能になる（Ito,  T.ら、Chem.  Commun.１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの基板表面は、タンパク質ポアの共有結合による付着を可能にするために、または表面特性を光学的ナノポア配列決定に適したものにするために化学修飾されていてよい。斯かる表面修飾は、��有結合または非共有結合であってもよい。大部分の共有結合修飾は、オルガノシラン沈着を含み、これに関する最も一般的なプロトコールについて記載する：１）水性アルコールからの沈着。これは、シリル化表面を調製するための最も手軽な方法である。９５％エタノール−５％水の溶液は、ｐＨ４．５〜５．５となるように酢酸で調整される。撹拌しつつシランを添加して、２％最終濃度を得る。加水分解およびシラノール基形成後に、基板を２〜５分間添加する。エタノールに短時間浸漬することにより過剰な材料をすすぎ出した。シラン層の硬化は、５〜１０分間、セ氏１１０度で為される。２）気相沈着。シランは、化学的蒸着方法によって乾燥非プロトン性条件下で基板に適用することができる。このような方法は、単層沈着を好む。閉鎖チャンバ設計において、基板は、５ｍｍ蒸気圧の達成に十分な温度まで加熱される。あるいは、シラン蒸発が観察されるまで真空状態にすることができる。３）スピンオン沈着。スピンオン適用は、最大の官能基付与および多層沈着を好む加水分解性条件下で、または単層沈着を好む乾燥条件下で為すことができる。一部の実施形態では、本発明の方法により単一のナノポアが用いられる。他の実施形態では、複数のナノポアが用いられる。後者の実施形態の一部では、複数のナノポアは、通常、固相膜等の平面状基板に配置された、ナノポアのアレイとして用いられる。ナノポアアレイのナノポアは、例えば、直線的パターンで、規則的に間隔をあけていてよい、またはランダムに間隔をあけていてよい。好まれる実施形態では、ナノポアは、平面状固相基板において直線的パターンで規則的に間隔をあける。
【００９２】
「ナノ構造」（「ナノスケール構造」および「ナノスケール特色」と互換的に使用される）は、数ナノメートル〜数百ナノメートル、例えば、１〜１０００ナノメートルの範囲内の少なくとも一寸法を有する構造を意味する。一部の適用では、斯かる範囲は、２〜５００ナノメートルであり；他の適用では、斯かる範囲は、３〜５００ナノメートルである。ナノ構造の形状および幾何学的配置は、広く変動することができ、ナノポア、ナノウェル、ナノ粒子、および一連の反応の実行に特に適した他のいずれかの簡便な形状が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ナノ構造は、固相膜と操作的に会合したタンパク質ナノポアであってもよい。ナノポアおよびナノウェル等、一部のナノ構造は、固相膜または他の固体等、より大型の一般的な基板に形成されて、ナノポアまたはナノウェルのアレイを形成することができる。特に興味深いナノ構造は、化学的、物理的（例えば、ＦＲＥＴ）、酵素的および／または結合反応、または一連の斯かる反応を支持または含有することができるナノ構造である。一部の実施形態では、ナノウェル等、ナノ構造は、１ナノリットル未満の（１０×−９リットル）、１ピコリットル未満のまたは１フェムトリットル未満の容量を封入する。他の実施形態では、個々のナノウェルのそれぞれは、１０００ゼプトリットル未満の、１００ゼプトリットル、８０ゼプトリットルまたは５０ゼプトリットル未満のまたは１ゼプトリットル未満の、またはさらには１００ヨクトリットル未満の容量を提供する。一部の実施形態では、ナノウェルは、ゼロモード導波を含む。
【００９３】
「ペプチド」、「ペプチド断片」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」またはペプチドを参照した「断片」は、本明細書において同義に使用されており、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の単一の分枝していない鎖で構成されている化合物を指す。ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸は、ポリエチレングリコール、色素、ビオチン、ハプテンまたは同様の部分が挙げられるがこれらに限定されない、様々な部分により誘導体化されていてよい。タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドにおけるアミノ酸残基の数は、広く変動し得る；しかし、一部の実施形態では、本明細書で参照されているタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、２〜７０個のアミノ酸残基を有することができ；他の実施形態では、２〜５０個のアミノ酸残基を有することができる。他の実施形態では、本明細書で参照されているタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、数十個のアミノ酸残基、例えば、２０個から、最大で千個またはそれよりも多いアミノ酸残基、例えば、１２００個を有することができる。さらに他の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはこれらの断片は、１０〜１０００個のアミノ酸残基を有することができる；または２０〜５００個のアミノ酸残基を有することができる；または２０〜２００個のアミノ酸残基を有することができる。
【００９４】
「ポリマー」は、線形の鎖となるよう接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含むポリヌクレオチドとして、または２種類以上のアミノ酸を含むポリペプチドとして、２型以上のモノマーを含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体またはアナログ、ならびにアミノ酸ならびにその誘導体およびアナログを限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、ポリマーは、ホスホジエステル連結またはそのアナログによってヌクレオシドモノマーが接続されたポリヌクレオチドである。
【００９５】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの線形ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソンクリック型の塩基対形成、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたはリバースフーグスティーン型の塩基対形成その他等、モノマー対モノマーの相互作用の規則的パターンとして天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。斯かるモノマーおよびそのヌクレオシド間連結は、天然起源またはそのアナログ、例えば、天然起源のまたは非天然起源のアナログであってもよい。非天然起源のアナログは、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、フルオロフォアまたはハプテン等の標識の付着を可能にする連結基を含有する塩基その他を含むことができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションその他等、酵素による加工を要求する場合は常に、当業者は、これらの事例におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、いずれかまたは一部の位置に、ヌクレオシド間連結、糖部分または塩基のある特定のアナログを含有しないであろうことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは典型的に、「オリゴヌクレオチド」と通常称される場合の数個のモノマー単位、例えば、５〜４０個から、数千個のモノマー単位へと、サイズに幅がある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」等、文字（大文字または小文字）配列によって表される場合は常に、ヌクレオチドが、左から右へ５’→３’順序であり、他に示されていなければ、または文脈から明らかでなければ、「Ａ」が、デオキシアデノシンを表示し、「Ｃ」が、デオキシシチジンを表示し、「Ｇ」が、デオキシグアノシンを表示し、「Ｔ」が、チミジンを表示し、「Ｉ」が、デオキシイノシンを表示し、「Ｕ」が、ウリジンを表示することが理解されるであろう。他に記されていなければ、用語法および原子番号付けの慣習は、StrachanおよびRead、Human  Molecular  Genetics  2（Wiley-Liss、New  York、１９９９年）に開示されているものに従うであろう。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル連結によって連結された４種の天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡはこれらのリボース対応物）を含む；しかし、これは、例えば、修飾された塩基、糖またはヌクレオシド間連結を含む、非天然ヌクレオチドアナログを含むこともできる。当業者には、酵素が、活性のために特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件を有する場合（例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスその他）、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、十分に、当業者の知識範囲内、特に、Sambrookら、Molecular  Cloning、第２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York、１９８９年）および同様の参考文献等、専門書からのガイダンス内であることが明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖型または二本鎖型（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドお��びそれぞれの相補体のデュプレックス）のいずれかを指すことができる。当業者には、用語使用の文脈から、いずれの型が、または両方の型が意図されているか明らかになると予想される。
【００９６】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とデュプレックスを形成した後に、核酸合成の開始点として作用することができ、伸長されたデュプレックスが形成されるように鋳型に沿ってその３’端から伸長されることができる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は通常、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ等、核酸ポリメラーゼにより行われる。伸長プロセスにおいて付加されたヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲内または１８〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用した線形増幅反応、または２種またはそれよりも多いプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の適用のためのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参照により組み込む次の参考文献によって証明される通り、当業者に周知のものである：Dieffenbach編、PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual、第２版（Cold  Spring  Harbor  Press、New  York、２００３年）。
【００９７】
「分解能限界区域」は、その中では個々の特色または光放出源を光学的シグナル検出システムによって鑑別することができない、ナノポアまたはナノウェルアレイの表面の区域である。理論によって限定されることを意図するものではないが、斯かる分解能限界区域は、光学的システムの分解能限界（「回折限界」または「回折障壁」と称される場合もある）によって決定される。斯かる限界は、放出源の波長および光学的構成成分によって決定され、ｄ＝λ／ΝＡ（式中、ｄは、解像され得る最小特色であり、λは、光の波長であり、ＮＡは、光の焦点を合わせるために使用される対物レンズの開口数である）によって定義することができる。よって、２個またはそれよりも多いナノポアが、分解能限界区域内に存在し、２個またはそれよりも多い光学的シグナルが、それぞれのナノポアにおいて生成される場合は常に、光学的検出システムは、いずれの光学的シグナルが、いずれのナノポアに由来するか鑑別または決定することができない。本発明に従って、ナノポアアレイの表面は、分解能限界区域に対応する、非重複領域または実質的に非重複領域へと分割または細分することができる。分解能限界区域に対応する斯かる細分化のサイズは、用いられる特定の光学的検出システムに依存し得る。一部の実施形態では、光放出源が、可視スペクトル内に存在する場合は常に、分解能限界区域は、３００ｎｍ２〜３．０μｍ２の範囲内である；他の実施形態では、分解能限界区域は、１２００ｎｍ２〜０．７μｍ２の範囲内である；他の実施形態では、分解能限界区域は、３×１０４ｎｍ２〜０．７μｍ２の範囲内であり、区域の前述の範囲は、ナノポアまたはナノウェルアレイの表面に関連する。一部の実施形態では、可視スペクトルは、約３８０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲内の波長を意味する。
【００９８】
ポリヌクレオチドを参照した「配列の決定」、「配列決定」または「ヌクレオチド配列の決定」または同様の用語は、ポリヌクレオチドの部分的および完全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、例えば、標的ポリヌクレオチドの単にＡおよびＣの配列等、４種の天然ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの完全セットのサブセットの配列を含む。すなわち、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち１、２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、配列の決定は、その配列が、２進コード、例えば、「ｃ−（非ｃ）（非ｃ）ｃ−（非ｃ）−ｃ．．．」を表す「１００１０１．．．」その他として表されるような、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内における単一の種類のヌクレオチド、例えば、シトシンの順序付けおよび位置を同定することにより達成することができる。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチドのためのフィンガープリントとして機能する標的ポリヌクレオチドの部分列を含むこともできる；すなわち、ポリヌクレオチドのセット、例えば、細胞によって発現される全て異なるＲＮＡ配列内で、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを独特に同定する部分列。
【００９９】
本開示は、明記されている特定の形態の範囲に限定されることを意図しないが、本明細書に記載されている変種の代替物、修飾および均等物を網羅することを意図する。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮することにより当業者にとって明らかとなり得る他の変種を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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