(57)【要約】特定の態様では、本開示は、TGF-ベータファミリーのＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体の細胞外ドメインおよびTGF-ベータファミリーのII型セリン／トレオニンキナーゼ受容体の細胞外ドメインを含む可溶性ヘテロマーポリペプチド複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ActRIIA、ActRIIB、TGFBRII、BMPRII、およびMISRIIから選択されるII型受容体の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチド複合体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、およびALK7から選択されるＩ型受容体の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチド複合体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＡＬＫ７スーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、組換えヘテロ多量体。
【請求項２】
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
ｂ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、
請求項１に記載のヘテロ多量体。
【請求項３】
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸の１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］による置換を含み、
ｂ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸の１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］による置換を含む、
請求項２に記載のヘテロ多量体。
【請求項４】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のヘテロ多量体。
【請求項６】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項５に記載のヘテロ多量体。
【請求項７】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；
ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項６に記載のヘテロ多量体。
【請求項８】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；
ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項７に記載のヘテロ多量体。
【請求項９】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、請求項４から８までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含む、請求項４から８までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号６７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４または５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、請求項６から１０までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１２または１３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、請求項６から１０までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１５または１６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のヘテロ多量体。
【請求項２０】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、請求項６から１０までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１７または１８に記載のヘテロ多量体。
【請求項２１】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２２】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のヘテロ多量体。
【請求項２３】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項２２に記載のヘテロ多量体。
【請求項２４】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；
ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項２３に記載のヘテロ多量体。
【請求項２５】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；
ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項２４に記載のヘテロ多量体。
【請求項２６】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含む、請求項２１から２５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２７】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、請求項２１から２５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２８】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号６６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１または２２に記載のヘテロ多量体。
【請求項２９】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までおよび１２から１４までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３０】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のヘテロ多量体。
【請求項３１】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、請求項２３から２７までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項２９または３０に記載のヘテロ多量体。
【請求項３２】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までおよび１５から１７までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３３】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のヘテロ多量体。
【請求項３４】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、請求項２３から２７までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項３２または３３に記載のヘテロ多量体。
【請求項３５】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１から３までおよび１８から２０までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３６】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のヘテロ多量体。
【請求項３７】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、請求項２３から２７までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項３５または３６に記載のヘテロ多量体。
【請求項３８】
ａ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
ｂ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、
請求項１に記載のヘテロ多量体。
【請求項３９】
ａ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸の１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］による置換を含み、
ｂ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸の１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］による置換を含む、
請求項３８に記載のヘテロ多量体。
【請求項４０】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項３８または３９に記載のヘテロ多量体。
【請求項４１】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のヘテロ多量体。
【請求項４２】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項４３】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；
ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４２に記載のヘテロ多量体。
【請求項４４】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；
ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４３に記載のヘテロ多量体。
【請求項４５】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、請求項４０から４４までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４６】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１のＴ１４４に対応する位置におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含む、請求項４０から４４までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４７】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号６７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４０または４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項４８】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項３８または３９に記載のヘテロ多量体。
【請求項４９】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のヘテロ多量体。
【請求項５０】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、請求項４２から４６までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４８または４９に記載のヘテロ多量体。
【請求項５１】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項３８または３９に記載のヘテロ多量体。
【請求項５２】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載のヘテロ多量体。
【請求項５３】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、請求項４２から４６までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項５１または５２に記載のヘテロ多量体。
【請求項５４】
ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項３８または３９に記載のヘテロ多量体。
【請求項５５】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のヘテロ多量体。
【請求項５６】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、請求項４２から４６までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項５４または５５に記載のヘテロ多量体。
【請求項５７】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項３８または３９に記載のヘテロ多量体。
【請求項５８】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載のヘテロ多量体。
【請求項５９】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；
ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項５８に記載のヘテロ多量体。
【請求項６０】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；
ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項５９に記載のヘテロ多量体。
【請求項６１】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、
ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；
ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびに
ｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）
から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項６０に記載のヘテロ多量体。
【請求項６２】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含む、請求項５７から６１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６３】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含む、請求項５７から６１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６４】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号６６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７または５８に記載のヘテロ多量体。
【請求項６５】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項５７または５８に記載のヘテロ多量体。
【請求項６６】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載のヘテロ多量体。
【請求項６７】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、請求項５９から６３までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項６５または６６に記載のヘテロ多量体。
【請求項６８】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ３  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項５７または５８に記載のヘテロ多量体。
【請求項６９】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載のヘテロ多量体。
【請求項７０】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインが、請求項５９から６３までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項６８または６９に記載のヘテロ多量体。
【請求項７１】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項５７または５８に記載のヘテロ多量体。
【請求項７２】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載のヘテロ多量体。
【請求項７３】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、請求項５９から６３までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項７１または７２に記載のヘテロ多量体。
【請求項７４】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドを含み、前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含み、かつ／または前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含む、組換えヘテロ多量体。
【請求項７５】
ａ）前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、かつ
ｂ）前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、
請求項７４に記載のヘテロ多量体。
【請求項７６】
ａ）前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸の１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］による置換を含み、かつ
ｂ）前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸の１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］による置換を含む、
請求項２に記載のヘテロ多量体。
【請求項７７】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドを含み、前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含み、かつ／または前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含む、組換えヘテロ多量体。
【請求項７８】
ａ）前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、かつ
ｂ）前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、
請求項７７に記載のヘテロ多量体。
【請求項７９】
ａ）前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸の１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］による置換を含み、かつ
ｂ）前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸の１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］による置換を含む、
請求項７８に記載のヘテロ多量体。
【請求項８０】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項８１】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項８２】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、
ｂ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項８３】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項８４】
配列番号３１のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項８０から８３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８５】
配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項８０から８３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８６】
前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項８０から８５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８７】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項８０から８５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項８０から８５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項８８】
前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項８７に記載のヘテロ多量体。
【請求項８９】
ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項８０から８５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項８０から８５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項９０】
前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項８９に記載のヘテロ多量体。
【請求項９１】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項９２】
配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項９１に記載のヘテロ多量体。
【請求項９３】
配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項９２に記載のヘテロ多量体。
【請求項９４】
前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項９１から９３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項９５】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９３から９５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９３から９５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項９６】
前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項９５に記載のヘテロ多量体。
【請求項９７】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９３から９５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９３から９５までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項９８】
前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項９７に記載のヘテロ多量体。
【請求項９９】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項１００】
配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項９９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０１】
配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項９９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０２】
前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項９９から１０１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０３】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９９から１０１までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９９から１０１までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項１０４】
前記ＩｇＧ２  Ｆｃドメインが、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項１０３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０５】
第１のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）および第２のＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組換えヘテロ多量体であって、
ａ）前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９９から１０１までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、かつ
ｂ）前記第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、請求項９９から１０１までのいずれか一項に記載のＩｇＧ１アミノ酸置換に対応する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、
組換えヘテロ多量体。
【請求項１０６】
前記ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である、請求項１０５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０７】
ａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｂ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｃ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｄ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｅ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｆ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｇ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｈ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｉ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｊ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｋ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｌ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｍ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｎ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｏ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｐ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｑ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｒ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｓ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｔ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｕ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｖ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｗ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｘ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｙ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｚ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ａａ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｂｂ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｃｃ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｄｄ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｅｅ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｆｆ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｇｇ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｈｈ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であり；
ｉｉ）前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質であり、前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質である、
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１０８】
ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質、およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質から選択され、かつ
ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質、およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質から選択され、
前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドを含む、
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１０９】
ａ）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質；
ｂ）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質；
ｃ）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質；
ｄ）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質；
ｅ）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質；
ｆ）ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質；
ｇ）ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質；
ｈ）ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質；
ｉ）ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質；
ｊ）ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質；
ｋ）ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質；
ｌ）ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質；
ｍ）ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質；
ｎ）ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質；
ｏ）ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質；
ｌ）ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質；
ｍ）ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質；
ｎ）ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質；
ｏ）ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質；
ｐ）ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質；
ｑ）ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質およびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質
を含む、請求項１０８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１０】
ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、およびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質から選択され、
ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、およびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質から選択され、
前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドを含む、
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１１】
ａ）ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｂ）ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｃ）ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｄ）ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｅ）ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質およびＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｆ）ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質およびＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｇ）ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質およびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｈ）ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質およびＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｉ）ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質およびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
ｊ）ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質およびＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質
を含む、請求項１１０に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１２】
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号１４のアミノ酸２２〜３４（例えば、アミノ酸残基２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸９５〜１１８（例えば、アミノ酸残基９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１１８）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号１４のアミノ酸２２〜１１８；
ｃ）配列番号１４のアミノ酸３４〜９５；ならびに
ｄ）配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、または４１４のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１３】
前記ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号１８のアミノ酸２１〜３５（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸９９〜１２３（例えば、アミノ酸残基９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および１２３）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号１８のアミノ酸３５〜９９；
ｃ）配列番号１８のアミノ酸２１〜１２３；ならびに
ｄ）配列番号１８、１９、１３６、１３８、４２１、および４２２のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１４】
前記ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号２２のアミノ酸２４〜６１（例えば、アミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、および６１）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸１３０〜１５２（例えば、アミノ酸残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、および１５２）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号２２のアミノ酸６１〜１３０；
ｃ）配列番号２２のアミノ酸２４〜１５２；ならびに
ｄ）配列番号２２、２３、１１５、１１７、４０７、および４０８のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１５】
前記ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号２６または８３のアミノ酸２３〜３４（例えば、アミノ酸残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号２６または８３のアミノ酸１０１〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号２６または８３のアミノ酸３４〜１０１；
ｃ）配列番号２６または８３のアミノ酸２３〜１２６；ならびに
ｄ）配列番号２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、および４０４のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１６】
前記ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号３０または８７のアミノ酸２５〜３６（例えば、アミノ酸残基２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および３６）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号３０または８７のアミノ酸１０６〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号３０または８７のアミノ酸３６〜１０６；
ｃ）配列番号３０または８７のアミノ酸２５〜１２６；ならびに
ｄ）配列番号３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、および４２４のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１７】
前記ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号３４のアミノ酸１４〜３２（例えば、アミノ酸残基１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸１０２〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号３４のアミノ酸３２〜１０２；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸１４〜１２６；
ｄ）配列番号３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、４２６のいずれか１つのアミノ酸配列、
ｅ）
ｉ）配列番号９１のアミノ酸２６〜６２（例えば、アミノ酸残基２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、および６２）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸１３２〜１５６（例えば、アミノ酸残基１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、および１５６）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｆ）配列番号９１のアミノ酸６２〜１３２；ならびに
ｇ）配列番号９１のアミノ酸２６〜１５６
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１８】
前記ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸２１〜２８（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸９２〜１１３（例えば、アミノ酸残基９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、および１１３）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸２８〜９２；
ｃ）配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸２１〜１１３；ならびに
ｄ）配列番号３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５、および４０６のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１１９】
前記ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号９のアミノ酸２１〜３０（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号９のアミノ酸３０〜１１０；
ｃ）配列番号９のアミノ酸２１〜１３５；ならびに
ｄ）配列番号９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、および４１０のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２０】
前記ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号１のアミノ酸２０〜２９（例えば、アミノ酸残基２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、アミノ酸残基１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号１の２９〜１０９；
ｃ）配列番号１の２０〜１３４；
ｄ）配列番号１の２５〜１３１；ならびに
ｅ）配列番号１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、および４０２のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２１】
前記ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号４６または７１のアミノ酸２７〜３４（例えば、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号４６または７１のアミノ酸１２３〜１５０（例えば、アミノ酸残基１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号４６または７１のアミノ酸３４〜１２３；
ｃ）配列番号４６または７１のアミノ酸２７〜１５０；ならびに
ｄ）配列番号４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、および４１２のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２２】
前記ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号６７のアミノ酸２３〜４４（例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号６７のアミノ酸１６８〜１９１（例えば、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０または１９１）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号６７のアミノ酸４４〜１６８；
ｃ）配列番号６７のアミノ酸２３〜１９１；
ｄ）
ｉ）配列番号４２のアミノ酸２３〜５１（例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、および５１）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸１４３〜１６６（例えば、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｅ）配列番号４２のアミノ酸５１〜１４３；
ｆ）配列番号４２のアミノ酸２３〜１６６；ならびに
ｇ）配列番号４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７、および４１８のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２３】
前記ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、または第２のＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ）
ｉ）配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１７〜２４（例えば、アミノ酸残基１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４）のいずれか１つで始まり、かつ
ｉｉ）配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１１６〜１４９（例えば、アミノ酸残基１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、および１４９）のいずれか１つで終わる
ポリペプチド；
ｂ）配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸２４〜１１６；
ｃ）配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１７〜１４９；ならびに
ｄ）配列番号５０、５１、７５、７６、７９、および８０のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２４】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩ型融合タンパク質、または第２のＩ型融合タンパク質が、前記Ｉ型ドメインと前記Ｆｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２５】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩＩ型融合タンパク質、または第２のＩＩ型融合タンパク質が、前記ＩＩ型ドメインと前記Ｆｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２６】
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ（配列番号６２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号６０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧ（配列番号５８）、ＧＧＧＧ（配列番号５９）、およびＳＧＧＧ（配列番号１８）から選択される、請求項１２４または１２５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２７】
前記ヘテロ多量体、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩ型融合タンパク質、第２のＩ型融合タンパク質、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩＩ型融合タンパク質、第２のＩＩ型融合タンパク質が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１２８】
前記ヘテロ多量体、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩ型融合タンパク質、第２のＩ型融合タンパク質、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩＩ型融合タンパク質、第２のＩＩ型融合タンパク質が、グリコシル化されている、請求項１２７に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２９】
前記ヘテロ多量体、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩ型融合タンパク質、第２のＩ型融合タンパク質、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩＩ型融合タンパク質、第２のＩＩ型融合タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から入手可能なグリコシル化パターンを有する、請求項１２８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３０】
前記ヘテロ多量体または融合タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティーからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３１】
ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティーからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドによるシグナル伝達を阻害する、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３２】
前記リガンドシグナル伝達が、細胞に基づくアッセイにおいて測定される、請求項１３１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３３】
ヘテロ二量体である、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３４】
１つまたは複数のアミノ酸修飾が、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８．  ０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３５】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質とＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩの差異が少なくとも０．７である（例えば、ｐＩの差異が少なくとも０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または少なくとも４．０である）、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３６】
前記第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩの差異が少なくとも０．７である（例えば、ｐＩの差異が少なくとも０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または少なくとも４．０である）、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３７】
前記第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩの差異が少なくとも０．７である（例えば、ｐＩの差異が少なくとも０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または少なくとも４．０である）、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１３８】
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体と薬学的に許容される担体とを含む医薬調製物。
【請求項１３９】
実質的にパイロジェンフリーである、請求項１３８に記載の医薬調製物。
【請求項１４０】
前記請求項のいずれかに記載のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、および／または第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む組換え核酸。
【請求項１４１】
前記請求項のいずれかに記載のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質、および／または第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む組換え核酸。
【請求項１４２】
請求項１４０に記載のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４３】
請求項１４１に記載のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４４】
請求項１４０に記載のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列および請求項１４０に記載のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４５】
請求項１４０から１４４までのいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４６】
請求項１４０から１４４までのいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは請求項１４５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４７】
ＣＨＯ細胞である、請求項１４６に記載の細胞。
【請求項１４８】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体を作製する方法であって、細胞をＩ型−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１４２に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項１４３に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１４９】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体を作製する方法であって、細胞をＩ型−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１４４に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１５０】
第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体を作製する方法であって、細胞を第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１４２に記載の第１の組換えポリヌクレオチドおよび請求項１４２に記載の第２の組換えポリヌクレオチドを含み、請求項１４２に記載の第１の組換えポリヌクレオチドと請求項１４２に記載の第２の組換えポリヌクレオチドが異なるＩ型受容体ポリペプチドをコードする、方法。
【請求項１５１】
第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体を作製する方法であって、細胞を第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１４３に記載の第１の組換えポリヌクレオチドおよび請求項１４３に記載の第２の組換えポリヌクレオチドを含み、請求項１４３に記載の第１の組換えポリヌクレオチドと請求項１４３に記載の第２の組換えポリヌクレオチドが異なるＩＩ型受容体ポリペプチドをコードする、方法。
【請求項１５２】
Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体を作製する方法であって、
ａ）第１の細胞をＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップであって、前記第１の細胞が、請求項１４２に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップと、
ｂ）そのように発現したＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を回収するステップと、
ｃ）第２の細胞をＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップであって、前記第２の細胞が、請求項１４３に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップと、
ｄ）そのように発現したＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を回収するステップと、
ｅ）回収されたＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および回収されたＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質をＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体形成に適した条件下で組み合わせるステップと
を含む方法。
【請求項１５３】
前記ヘテロ多量体を回収するステップをさらに含む、請求項１５０から１５２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質を、ＴＰＡリーダー配列を使用して発現させる、請求項１５０から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、ＴＰＡリーダー配列を使用して発現させる、請求項１５０から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ＴＰＡリーダーが、配列番号９８のコード配列を含む、請求項１５４または１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５５から１５６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ヘテロ多量体がヘテロ二量体である、請求項１５０から１５６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
本明細書に記載の障害または状態を有する患者を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１から１３６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む方法。
【請求項１６０】
前記障害または状態が、貧血である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記障害または状態が、サラセミアである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６２】
前記障害または状態が、骨髄異形成症候群である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６３】
前記障害または状態が、骨髄線維症である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６４】
前記障害または状態が、異常ヘモグロビン症である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６５】
前記障害または状態が、鎌状赤血球症である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６６】
それを必要とする患者において輸血負荷を低減するための方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から１３６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む方法。
【請求項１６７】
エリスロポエチンレベルが、年齢および性別が同様である１または複数の健康な患者のエリスロポエチンレベルと比べて内因的に高い患者を処置するための方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から１３６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む方法。
【請求項１６８】
貧血を有し、ＥＰＯ（またはその誘導体またはＥＰＯ受容体アゴニスト）を用いた処置に対して不応答性または不耐容性である患者を処置するための方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から１３６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１６年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／４０４，５６３号からの優先権の利益を主張する。上記出願の明細書はその全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物どちらにおいても多種多様な細胞型に対して生物学的効果を発揮することが公知である。当該スーパーファミリーのメンバーは、胚発生中にパターン形成および組織特定化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化を含めた種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。当該ファミリーは、２つの一般的な系統学的クレード：ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、およびノーダルを含む、つい最近進化したスーパーファミリーのメンバー、ならびに、いくつものＢＭＰおよびＧＤＦを含む、当該スーパーファミリーの、関連性がより遠いタンパク質のクレードに分類される。Hinck（２０１２年）FEBS  Letters、５８６巻：１８６０〜１８７０頁。ＴＧＦ−ベータファミリーメンバーは、多様な、多くの場合に相補的である生物学的効果を有する。ＴＧＦ−ベータファミリーのメンバーの活性を操作することにより、多くの場合、生物体において有意な生理的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ピエモンテおよびベルジャンブルーウシ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも称される）遺伝子に、筋肉量の顕著な増加を引き起こす機能喪失型突然変異を有する。Grobetら（１９９７年）Nat  Genet.、１７巻（１号）：７１〜４頁。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子が筋肉量の増加、および報告によれば、例外的な強度に関連付けられている。Schuelkeら（２００４年）N  Engl  J  Med、３５０巻：２６８２〜８頁。
筋肉、骨、脂肪、赤血球、および他の組織の変化は、ＴＧＦ−ベータファミリーリガンドによって媒介されるシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５、および／または８）を増強または阻害することによって実現することができる。したがって、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの種々のリガンドの活性を制御する作用剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Hinck（２０１２年）FEBS  Letters、５８６巻：１８６０〜１８７０頁
【非特許文献２】Grobetら（１９９７年）Nat  Genet.、１７巻（１号）：７１〜４頁
【非特許文献３】Schuelkeら（２００４年）N  Engl  J  Med、３５０巻：２６８２〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一部には、本開示は、その断片およびバリアントを含めた少なくとも１つのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７ポリペプチド）、ならびに、その断片およびバリアントを含めた少なくとも１つのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）を含む、ヘテロ多量体を提供する。他の態様では、本開示は、その断片およびバリアントを含めた少なくとも２つの異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７ポリペプチド）を含むヘテロ多量体を提供する。さらに他の態様では、本開示は、その断片およびバリアントを含めた少なくとも２つの異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）を含むヘテロ多量体を提供する。任意選択で、本明細書に開示されるヘテロ多量体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体）は、それらの対応するホモ多量体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体およびＡＬＫ４ホモ二量体）と比較して異なるリガンド結合特異性／プロファイルを有する。本明細書において実施例により示される通り、新規のリガンド結合特質を含めた新規の性質がＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのＩ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロ多量体のポリペプチド複合体によって示される。
【０００５】
ヘテロ多量体構造としては、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、およびより高次の複合体が挙げられる。例えば、図１、２、および１５を参照されたい。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドは、受容体のリガンド結合ドメイン、例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体の細胞外ドメインを含むことが好ましい。したがって、ある特定の態様では、本明細書に記載のタンパク質複合体は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩから選択されるＩＩ型ＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体の細胞外ドメインならびにその短縮物およびバリアント、ならびに、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７から選択されるＩ型ＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体の細胞外ドメインならびにその短縮物およびバリアントを含む。本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型ポリペプチド、ならびにそれらを含むタンパク質複合体は、可溶性であることが好ましい。ある特定の態様では、本開示のヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ミュラー管阻害因子（ＭＩＳ）、およびレフティー）に結合する。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、これらのリガンドの１つまたは複数に、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、または１０−１２よりも大きいまたはそれと同等のＫＤで結合する。一般に、本開示のヘテロ多量体は、少なくとも１つのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドの１つまたは複数の活性に拮抗し（を阻害し）、そのような活性の変更は、例えば、本明細書に記載の細胞に基づくアッセイを含めた、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して測定することができる。本開示のヘテロ多量体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも４時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間の血清中半減期を示すことが好ましい。任意選択で、本開示のヘテロ多量体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも６日、８日、１０日、１２日、１４日、２０日、２５日、または３０日の血清中半減期を示し得る。
【０００６】
Ｔ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドおよび相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列および第２のポリペプチドは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。他の態様では、本明細書に記載のヘテロ多量体は、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合で会合した第１のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のヘテロ多量体は、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合で会合した第１のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバーと直接接続している、またはリンカーなどの介在配列がＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列と相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列の間に位置していてよい。同様に、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバーと直接接続していてもよく、またはリンカーなどの介在配列がＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドのアミノ酸配列と相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列の間に位置していてもよい。リンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４の細胞外ドメインのＣ末端（「尾部」）におけるおよそ１５アミノ酸の構造化されていない領域に対応するものであってもよく、または二次構造が比較的自由な５アミノ酸から１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の間の人工的な配列であってもよい。リンカーはグリシン残基およびプロリン残基に富むものであってよく、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含有するものであってよい。リンカーの例としては、これだけに限定されないが、配列ＴＧＧＧ（配列番号６２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号６０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号６１）、ＧＧＧＧ（配列番号５９）、およびＧＧＧ（配列番号５８）が挙げられる。
【０００７】
本明細書に記載の相互作用対は、二量体化が促進されるように、またはより高次の多量体が形成されるように設計される。一部の実施形態では、相互作用対は、相互作用して複合体、特にヘテロ二量体複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列であってよいが、実施的な実施形態では、ホモ二量体配列を形成する相互作用対を使用することもできる。相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーは、非対称対であってよい、つまり、対のメンバーは自己会合するのではなく互いと優先的に会合する。したがって、非対称相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーはヘテロ二量体複合体が形成されるように会合し得る。あるいは、相互作用対は無誘導であってよい、つまり、対のメンバーは、実質的な優先性を伴わずに互いと会合または自己会合し得、したがって、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。したがって、無誘導相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーは、ホモ二量体複合体またはヘテロ二量体複合体が形成されるように会合し得る。任意選択で、相互作用の作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと共有結合で会合する。任意選択で、相互作用の作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと非共有結合で会合する。任意選択で、相互作用対の第１のメンバー（例えば、非対称または無誘導相互作用対）は、相互作用対の第２のメンバーと共有結合性機構および非共有結合性機構の両方を通じて会合する。
【０００８】
ある特定の態様では、Ｉ型および／またはＩＩ型ポリペプチドは、融合タンパク質であってよい。例えば、一部の実施形態では、Ｉ型ポリペプチドは、Ｉ型ポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非Ｉ型）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質（例えば、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）であってよい。同様に、一部の実施形態では、ＩＩ型ポリペプチドは、ＩＩ型ポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＩＩ型）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質（ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）であってよい。
【０００９】
一部の実施形態では、Ｉ型ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。同様に、一部の実施形態では、ＩＩ型ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。従来のＦｃ融合タンパク質および抗体は無誘導相互作用対の例であり、一方、種々の工学的に作製されたＦｃドメインは非対称相互作用対として設計されている［Spiessら（２０１５年）Molecular  Immunology、６７巻（２Ａ）号：９５〜１０６頁］。したがって、本明細書に記載の相互作用対の第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分を含めた免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、相互作用対の第１のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）免疫グロブリン、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）免疫グロブリン、ＩｇＥ免疫グロブリン、またはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、Ｉ型：Ｉ型、ＩＩ型：ＩＩ型、および／またはＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。同様に、相互作用対の第２のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。例えば、相互作用対の第２のメンバーは、配列番号２００〜２０７、３１００、３２００、３３００、３４００および３５００のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。一部の実施形態では、相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーは、同じ免疫グロブリンのクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。他の実施形態では、相互作用対の第１のメンバーおよび第２のメンバーは、異なる免疫グロブリンのクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。
【００１０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含むＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸置換、カチオン化、脱アミノ化、カルボキシル末端アミノ酸異種性、リン酸化、およびグリコシル化）を含み、かつ／または、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含む、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸修飾により、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質とＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の間のｐＩの差異の増大が付与される。他の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸修飾により、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質とＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の間のｐＩの差異の増大が付与される。さらに他の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸修飾により、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質とＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の間のｐＩの差異の増大が付与され、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸修飾により、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質とＩ型−Ｆｃ融合タンパク質の間のｐＩの差異の増大が付与される。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ｐＩを少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．３、１．５、１．７、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、または少なくとも４．０）変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質とＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩの差異は少なくとも０．７である（例えば、ｐＩの差異が少なくとも０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または少なくとも４．０であるまたはそれよりも大きい）。
【００１１】
ある特定の態様では、本開示のＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。例えば、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸を１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］で置換することによって修飾することができる。同様に、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸を１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］で置換することによって修飾することができる。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ��合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７ＫまたはＤ１７７Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニ���、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３ＫまたはＤ１８３Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ
）；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む��一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示のＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。例えば、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸を１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］で置換することによって修飾することができる。同様に、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸を１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］で置換することによって修飾することができる。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では��ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７ＫまたはＤ１７７Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６���に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３ＫまたはＤ１８３Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３
６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含��。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示のＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびに第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含み、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドである。例えば、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸を１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］で置換することによって修飾することができる。同様に、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸を１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］で置換することによって修飾することができる。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７ＫまたはＤ１７７Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ��６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３ＫまたはＤ１８３Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけ
るアミノ酸置換および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００１４】
ある特定の態様では、本開示のＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを増大させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびに第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含み、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質と第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドである。例えば、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または負荷電アミノ酸を１つまたは複数の正荷電アミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）］で置換することによって修飾することができる。同様に、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を、１つまたは複数の中性または正荷電アミノ酸を１つまたは複数の負荷電アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｅ）またはグルタミン酸（Ｄ）］で置換することによって修飾することができる。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２Ｋ、またはＮ１６２Ｈ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９Ｋ、またはＤ１７９Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６２Ｒ、Ｎ１６２ＫまたはＮ１６２Ｈ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１７９ＫまたはＤ１７９Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）；ｂ）配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＮ１６２に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｎ１６２Ｒ）および配列番号３１００のＤ１７９に対応する位置におけるアルギニンによる置換（Ｄ１７９Ｒ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）；ｂ）配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７Ｋ、またはＤ１７７Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＮ１６０に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６０Ｒ、Ｎ１６０Ｋ、またはＮ１６０Ｈ）および配列番号３２００のＤ１７７に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１７７Ｒ、Ｄ１７７ＫまたはＤ１７７Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけ��アルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）；ｂ）配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＳ１６９に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｓ１６９Ｒ、Ｓ１６９Ｋ、またはＳ１６９Ｈ）および配列番号３３００のＤ１８６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８６Ｒ、Ｄ１８６Ｋ、またはＤ１８６Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）；ｂ）配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３Ｋ、またはＤ１８３Ｈ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＮ１６６に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｎ１６６Ｒ、Ｎ１６６Ｋ、またはＮ１６６Ｈ）および配列番号３５００のＤ１８３に対応する位置におけるアルギニン、リシン、またはヒスチジンによる置換（Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８３ＫまたはＤ１８３Ｈ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３８ＥまたはＫ１３８Ｄ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１７ＥまたはＫ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）；ｂ）配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３１００のＫ１３８に対応する位置におけるグルタミン酸による置換（Ｋ１３８Ｅ）および配列番号３１００のＫ２１７に対応する位置におけるアスパラギン酸による置換（Ｋ２１７Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置
におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ２  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）；ｂ）配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３２００のＫ１３６に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１３６ＥまたはＫ１３６Ｄ）および配列番号３２００のＫ２１５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２１５ＥまたはＫ２１５Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、配列番号３３００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ３  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）；ｂ）配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３３００のＫ１４５に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４５ＥまたはＫ１４５Ｄ）および配列番号３３００のＫ２２４に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２４ＥまたはＫ２２４Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質のｐＩを変化させる１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４融合Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアミノ酸置換および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアミノ酸置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ａ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）；ｂ）配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）；ならびにｃ）配列番号３５００のＫ１４２に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ１４２ＥまたはＫ１４２Ｄ）および配列番号３５００のＫ２２１に対応する位置におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸による置換（Ｋ２２１ＥまたはＫ２２１Ｄ）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００１５】
本明細書に記載の通り、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質および／またはＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ヘテロ多量体形成（例えば、Ｉ型−Ｆｃ：ＩＩ型−Ｆｃヘテロ二量体形成）を促進する１つまたは複数の修飾を含み得る。同様に、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質および／またはＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ多量体形成（例えば、Ｉ型−Ｆｃおよび／またはＩＩ型−Ｆｃホモ二量体化）を阻害する１つまたは複数の修飾を含み得る。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質および／またはＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質は、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数の修飾を含み、かつホモ多量体形成を阻害する１つまたは複数の修飾を含み得る。
【００１６】
例えば、一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３１００のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３１００のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３１００のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３１００のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３２００のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２００のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３２００のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３２００のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２００のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３２００のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３３００のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３００のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含むＩｇＧ��  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３３００のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３００のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３００のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３００のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３３００のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３００のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３３００のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３００のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３００のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３００のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３５００のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５００のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３５００のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３５００のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５００のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３５００のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、Ｉ型：Ｉ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３１００のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３１００のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：Ｉ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３２００のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２００のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有する第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３２００のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有する第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：Ｉ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３３００のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３００のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有する第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３３００のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３００のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３００のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３００のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有する第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：Ｉ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３５００のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５００のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有する第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３５００のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有する第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３１００のＳ１３２位におけるシステインによる置換（Ｓ１３２Ｃ）および配列番号３１００のＴ１４４位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３１００のＹ１２７位におけるシステインによる置換（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４位におけるセリンによる置換（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５位におけるバリンによる置換（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３２００のＳ１３０位におけるシステインによる置換（Ｓ１３０Ｃ）および配列番号３２００のＴ１４２位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有する第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３２００のＹ１２５位におけるシステインによる置換（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２位におけるセリンによる置換（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４位におけるアラニンによる置換（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３位におけるバリンによる置換（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを有する第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型：Ｉ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３３００のＳ１３９位におけるシステインによる置換（Ｓ１３９Ｃ）および配列番号３３００のＴ１５１位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１５１Ｗ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有する第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３３００のＹ１３４位におけるシステインによる置換（Ｙ１３４Ｃ）、配列番号３３００のＴ１５１位におけるセリンによる置換（Ｔ１５１Ｓ）、配列番号３３００のＬ１５３位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５３Ａ）、および配列番号３３００のＹ１９２位におけるバリンによる置換（Ｙ１９２Ｖ）を含むＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有する第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号３５００のＳ１３６位におけるシステインによる置換（Ｓ１３６Ｃ）および配列番号３５００のＴ１４８位におけるトリプトファンによる置換（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有する第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号３５００のＹ１３１位におけるシステインによる置換（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８位におけるセリンによる置換（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０位におけるアラニンによる置換（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９位におけるバリンによる置換（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有する第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。
【００１９】
ある特定の態様では、本開示のＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号６６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号６７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸；ｂ）配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびにｃ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６６０の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６０の１４４に対応する位置のトリプトファンをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニン；ｂ）配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびにｃ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６７０の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７０の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７０の１４６に対応する位置のアラニン、配列番号６７０の１８５に対応する位置のバリンをさらに含む。
【００２０】
ある特定の態様では、本開示のＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号６６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有するＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号６７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有するＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸；ｂ）配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびにｃ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６６０の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６０の１４４に対応する位置のトリプトファンをさらに含む。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニン；ｂ）配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびにｃ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６７０の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７０の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７０の１４６に対応する位置のアラニン、配列番号６７０の１８５に対応する位置のバリンをさらに含む。
【００２１】
ある特定の態様では、本開示のＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号６６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有する第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号６７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有する第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸；ｂ）配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびにｃ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６６０の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６０の１４４に対応する位置のトリプトファンをさらに含む。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニン；ｂ）配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびにｃ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６７０の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７０の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７０の１４６に対応する位置のアラニン、配列番号６７０の１８５に対応する位置のバリンをさらに含む。
【００２２】
ある特定の態様では、本開示のＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体は、ａ）配列番号６６０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有する第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質；ならびにｂ）配列番号６７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＦｃドメインを有する第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸；ｂ）配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸；ならびにｃ）配列番号６６０の１３８に対応する位置のグルタミン酸および配列番号６６０の２１７に対応する位置のアスパラギン酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６６０の１３２に対応する位置のシステインおよび配列番号６６０の１４４に対応する位置のトリプトファンをさらに含む。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、ａ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニン；ｂ）配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニン；ならびにｃ）配列番号６７０の１６２に対応する位置のアルギニンおよび配列番号６７０の１７９に対応する位置のアルギニンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号６７０の１２７に対応する位置のシステイン、配列番号６７０の１４４に対応する位置のセリン、配列番号６７０の１４６に対応する位置のアラニン、配列番号６７０の１８５に対応する位置のバリンをさらに含む。
【００２３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００２４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、および配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００２７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００２８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００２９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＳ１３２に対応する位置にシステイン（Ｓ１３２Ｃ）、および配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４４Ｗ）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３１００のＹ１２７に対応する位置にシステイン（Ｙ１２７Ｃ）、配列番号３１００のＴ１４４に対応する位置にセリン（Ｔ１４４Ｓ）、配列番号３１００のＬ１４６に対応する位置にアラニン（Ｌ１４６Ａ）、配列番号３１００のＹ１８５に対応する位置にバリン（Ｙ１８５Ｖ）、および配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３１００のＨ２１３に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３１００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３３】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３４】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、および配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、および配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、および配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３７】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、および配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３８】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＳ１３０に対応する位置にシステイン（Ｓ１３０Ｃ）、および配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４２Ｗ）を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３２００のＹ１２５に対応する位置にシステイン（Ｙ１２５Ｃ）、配列番号３２００のＴ１４２に対応する位置にセリン（Ｔ１４２Ｓ）、配列番号３２００のＬ１４４に対応する位置にアラニン（Ｌ１４４Ａ）、配列番号３２００のＹ１８３に対応する位置にバリン（Ｙ１８３Ｖ）、および配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含む、組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３２００のＨ２１１に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３２００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００３９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４１】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４２】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、および配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖを含む）ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、および配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、および配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４５】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、および配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩ型：Ｉ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４６】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質を含む組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体であって、ａ）第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＳ１３６に対応する位置にシステイン（Ｓ１３６Ｃ）、および配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にトリプトファン（Ｔ１４８Ｗ）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含み、ｂ）第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３５００のＹ１３１に対応する位置にシステイン（Ｙ１３１Ｃ）、配列番号３５００のＴ１４８に対応する位置にセリン（Ｔ１４８Ｓ）、配列番号３５００のＬ１５０に対応する位置にアラニン（Ｌ１５０Ａ）、配列番号３５００のＹ１８９に対応する位置にバリン（Ｙ１８９Ｖ）、および配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置に酸性アミノ酸を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、組換えＩＩ型：ＩＩ型ヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、配列番号３５００のＨ２１７に対応する位置の酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第１のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。一部の実施形態では、第２のＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、配列番号３５００のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一である。
【００４７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００４８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００４９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００６９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００７９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００８９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００９９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１００】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０３】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０４】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０６】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０７】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０８】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１０９】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１１０】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１１１】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１１２】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１１３】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸２２〜３４（例えば、アミノ酸残基２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）のいずれか１つで始まり、配列番号１４のアミノ酸９５〜１１８（例えば、アミノ酸残基９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１１８）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸２２〜１１８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸３４〜９５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、および４１４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。
【０１１４】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸２１〜３５（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５）のいずれか１つで始まり、配列番号１８のアミノ酸９９〜１２３（例えば、アミノ酸残基９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および１２３）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸３５〜９９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸２１〜１２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８、１９、１３６、１３８、４２１、および４２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。
【０１１５】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸２４〜６１（例えば、アミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、および６１）のいずれか１つで始まり、配列番号２２のアミノ酸１３０〜１５２（例えば、アミノ酸残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、および１５２）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸６１〜１３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸２４〜１５２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２、２３、１１５、１１７、４０７、および４０８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。
【０１１６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６または８３のアミノ酸２３〜３４（例えば、アミノ酸残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４）のいずれか１つで始まり、配列番号２６または８３のアミノ酸１０１〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６または８３のアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６または８３のアミノ酸２３〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、および４０４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。
【０１１７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３０または８７のアミノ酸２５〜３６（例えば、アミノ酸残基２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および３６）のいずれか１つで始まり、配列番号３０または８７のアミノ酸１０６〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３０または８７のアミノ酸３６〜１０６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３０または８７のアミノ酸２５〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、および４２４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。
【０１１８】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１４〜３２（例えば、アミノ酸残基１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２）のいずれか１つで始まり、配列番号３４のアミノ酸１０２〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸３２〜１０２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１４〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、および４２６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９１のアミノ酸２６〜６２（例えば、アミノ酸残基２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、および６２）のいずれか１つで始まり、配列番号９１のアミノ酸１３２〜１５６（例えば、アミノ酸残基１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、および１５６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９１のアミノ酸６２〜１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９１のアミノ酸２６〜１５６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。
【０１１９】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸２１〜２８（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８）のいずれか１つで始まり、配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸９２〜１１３（例えば、アミノ酸残基９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、および１１３）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸２８〜９２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３８、３０５、または３０９のアミノ酸２１〜１１３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５、および４０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。
【０１２０】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２１〜３０（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のいずれか１つで始まり、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸２１〜１３５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、および４１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。
【０１２１】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１アミノ酸２０〜２９（例えば、アミノ酸残基２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、アミノ酸残基１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２０〜１３４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、および４０２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢドメインを含む。
【０１２２】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４６または７１のアミノ酸２７〜３４（例えば、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）のいずれか１つで始まり、配列番号４６または７１のアミノ酸１２３〜１５０（例えば、アミノ酸残基１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４６または７１のアミノ酸３４〜１２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４６または７１のアミノ酸２７〜１５０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、および４１２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。
【０１２３】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦＢＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸２３〜４４（例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４）のいずれか１つで始まり、配列番号６７のアミノ酸１６８〜１９１（例えば、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０または１９１）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸４４〜１６８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸２３〜１９１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７、および４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４２のアミノ酸２３〜５１（例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、および５１）のいずれか１つで始まり、配列番号４２のアミノ酸１４３〜１６６（例えば、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４２のアミノ酸５１〜１４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４２のアミノ酸２３〜１６６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。
【０１２４】
ある特定の態様では、本開示は、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１７〜２４（例えば、アミノ酸残基１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４）のいずれか１つで始まり、配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１１６〜１４９（例えば、アミノ酸残基１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、および１４９）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸２４〜１１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５０、７５、または７９のアミノ酸１７〜１４９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５０、５１、７５、７６、７９、および８０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸、および有機誘導体化剤とコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチドは、グリコシル化されており、例えばＣＨＯ細胞を含めた哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現から入手可能なグリコシル化パターンを有する。
【０１２６】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。本明細書に開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結していてよく、本開示は、そのような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞をさらに提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。
【０１２７】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチドのいずれかならびにそのようなポリペプチドを含むタンパク質複合体を作製するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に開示される核酸のいずれかを適切な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において発現させるステップを含み得る。そのような方法は、ａ）細胞を、本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップであって、前記細胞がＩ型またはＩＩ型ポリペプチド発現構築物で形質転換されるステップと、ｂ）そのように発現したＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを回収するステップとを含み得る。本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型ポリペプチド、ならびにそのタンパク質複合体は、細胞培養物からタンパク質を得るための周知の技法のいずれかを使用し、粗製物、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収することができる。
【０１２８】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示されるヘテロ多量体複合体のいずれかを作製するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に開示される核酸のいずれかを適切な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において発現させるステップを含み得る。そのような方法は、ａ）本明細書に開示されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドのコード配列を含む核酸および本明細書に開示されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドのコード配列を含む核酸を含む細胞を得るステップと、（ｂ）そのような細胞を、本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型ポリペプチドの発現に適した条件下で培養するステップと、ｃ）そのように発現したそのようなＩ型およびＩＩ型ポリペプチドを含むヘテロマー複合体を回収するステップとを含み得る。本明細書に開示されるヘテロ多量体複合体は、細胞培養物からタンパク質を得るための周知の技法のいずれかを使用し、粗製物、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収することができる。
【０１２９】
本明細書に記載のタンパク質複合体のいずれかを医薬調製物に組み入れることができる。任意選択で、そのような医薬調製物は、他のポリペプチド成分に関して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％純粋である。任意選択で、本明細書に開示される医薬調製物は、１つまたは複数の追加的な活性薬剤を含んでよい。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＩＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体および１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＩＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を含む。
【０１３０】
本開示は、例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの１つまたは複数のリガンドによる影響を受ける筋肉、骨、脂肪、赤血球、および他の組織に関連する種々の疾患および障害の処置または予防において使用するための方法およびヘテロ多量体をさらに提供する。そのような疾患および障害としては、これだけに限定されないが、筋肉喪失または不十分な筋肉の成長（例えば、筋萎縮；デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを含めた筋ジストロフィー；筋萎縮性側索硬化症；および悪液質）に関連する障害、ならびに望ましくない体重増加に関連する障害（例えば、肥満症、２型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、高血圧症、変形性関節症、脳卒中、呼吸障害、および胆嚢疾患）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ多量体複合体を、それを必要とする対象において体脂肪含有量を減少させるまたは体脂肪含有量の増加率を低下させるために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ多量体複合体を、患者におけるコレステロールおよび／またはトリグリセリドレベルを低下させるために使用することができる。
【０１３１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、貧血を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、サラセミアを処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、骨髄異形成症候群（myelodysplastinc  syndrome）を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、骨髄線維症を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、異常ヘモグロビン症を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、鎌状赤血球症を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、それを必要とする患者において輸血負荷を低減するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、エリスロポエチンレベルが、年齢および性別が同様である１または複数の健康な患者のエリスロポエチンレベルと比べて内因的に高い患者を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマー複合体を、貧血を有し、ＥＰＯ（またはその誘導体またはＥＰＯ受容体アゴニスト）を用いた処置に対して不応答性または不耐容性である患者を処置するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロマータンパク質複合体の２つの概略図例を示す。図１Ａは、各ポリペプチド鎖内に含有される多量体化ドメインにより共有結合または非共有結合で集合させることができる、１つのＩ型受容体融合ポリペプチドと、１つのＩＩ型受容体融合ポリペプチドとを含むヘテロ二量体タンパク質複合体を示す。２つの集合した多量体化ドメインは、相互作用対を構成し、これは、誘導または無誘導のいずれかであってよい。図１Ｂは、図１Ａに示された２つのヘテロ二量体複合体を含むヘテロ四量体タンパク質複合体を示す。より高次の複合体を想定することができる。
【０１３３】
【図２】図２は、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」と示される）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるものなどの他の種に由来するＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６またはＡＬＫ７タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド、例えば、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、４１４、１８、１９、１３６、１３８、４２１、４２２、２２、２３、１１５、１１７、４０７、４０８、２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、４０４、３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、４２４、３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、４２６、３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５、および４０６）と、ＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」と示される）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるものなどの他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＭＩＳＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、またはＴＧＦＢＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド、例えば、９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、４１０、１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、４０２、４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、４１２、５０、５１、７５、７６、７９、８０、４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７、および４１８）を含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。例示された実施形態では、Ｉ型受容体ポリペプチドは、相互作用対（「Ｃ」）の第１のメンバーを含む融合ポリペプチドの一部であり、ＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用対（「Ｄ」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの一部である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーを、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に配置することができる。相互作用対（Ｃ、Ｄ）の第１および第２のメンバーは、誘導（非対称）対であってよく、これは、対のメンバーが自己会合ではなく互いに優先的に会合することを意味し、または相互作用対は、無誘導であってよく、これは、対のメンバーが互いに会合するか、もしくは実質的な優先性なしに自己会合してよく、同じもしくは異なるアミノ酸配列を有してよいことを意味する。伝統的なＦｃ融合タンパク質と抗体とは、無誘導相互作用対の例であるが、種々の工学的に作製されたＦｃドメインが、誘導（非対称）相互作用対として設計されている［例えば、Spiessら（２０１５年）Molecular  Immunology  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁］。
【０１３４】
【図３】図３は、囲みで示されるリガンドと直接接触する、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の合成分析に基づく、本明細書で推定される残基を有するヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号５００）とヒトＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号２）の細胞外ドメインのアラインメントを示す。
【０１３５】
【図４】図４は、その細胞内ドメインを含まない様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、および５０６）、その細胞内ドメインを含まないヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質（配列番号５０７）、およびコンセンサスＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質（配列番号５０８）の複数の配列アラインメントを示す。
【０１３６】
【図５】図５は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用したヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの複数の配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は点線の下線で示される。二重下線は、非対称鎖対合を促進するためにＩｇＧ１  Ｆｃ中で工学的に作製された位置の例ならびに他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置を示す。
【０１３７】
【図６】図６は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。各タンパク質複合体について、リガンドは、リガンドシグナル伝達阻害と良好に相関する速度定数ｋｏｆｆによって順位付けられ、結合親和性の降順に列挙される（最も強固に結合したリガンドは上に列挙される）。左の黄色、赤色、緑色、および青色の線は、解離速度定数の規模を示す。黒色の実線は、ヘテロ二量体に対する結合がホモ二量体と比較して増強しているか、または変化していないリガンドを示すが、赤色の破線は、ホモ二量体と比較して実質的に減少した結合を示す。示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体について観察されるようにアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に減少した結合を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対する中間レベルの結合を保持する。
【０１３８】
【図７】図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、例外的に高い親和性でＢＭＰ２およびＢＭＰ４に結合し、いずれかのホモ二量体と比較してＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７に対する大きく増強された結合を示す。ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する減少した結合を示し、また、より高い程度でこれらのリガンド間、特に、アクチビンＡとアクチビンＢの間を識別する。さらに、高い親和性でＢＭＰ９およびＧＤＦ３に結合するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の能力は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体については存在しない。
【０１３９】
【図８】図８は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に対する強い結合を有する５つのリガンドのうちの４つ（アクチビンＡ、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１）は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体に対する減少した結合を示すが、例外は、ヘテロ二量体に対する緊密な結合を保持するアクチビンＢである。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に対する中間的な結合を有する３つのリガンド（ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、特に、ＢＭＰ９）は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体に対する減少した結合を示す。対照的に、ＢＭＰ５は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に対し弱い結合しかないにもかかわらず、中間的な強度でＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７ヘテロ二量体に結合する。試験したリガンドはＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体に結合しない。
【０１４０】
【図９】図９は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦＣ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＢに対する優先的かつ強力な結合を示し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体と似ている（図８）。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体は、部分的には、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に特徴的なＢＭＰ９に対する緊密な結合を保持することによって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃとは異なる。試験したリガンドは、ＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体に結合しない。
【０１４１】
【図１０】図１０は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＡＢおよびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持しながら、アクチビンＡに対する増強された結合、特に、アクチビンＡＣに対する増強された結合を示す。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体に対する最も高い親和性を有するリガンド、アクチビンＢは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体に対する減少した親和性を示す（依然として高い親和性の範囲内にあるが）。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体はまた、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較してＢＭＰ１０に対する顕著に減少した結合を示す。
【０１４２】
【図１１】図１１は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体に特徴的なＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対する強力な結合を大きく保持するが、ヘテロ二量体は、ホモ二量体と共に存在しないＢＭＰ９よりもＢＭＰ１０に対する中程度の選択性を示す。また、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体と違って、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体のものよりも約１０倍速い解離速度を有するにもかかわらず、ＢＭＰ１５に結合する。
【０１４３】
【図１２】図１２は、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体が結合するよりもはるかにより強くＢＭＰ６に結合し、ほぼ１０倍遅い解離速度を反映している。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４に対するそのほとんど変化していない結合により、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３ヘテロ二量体は、したがって、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ６の接合阻害剤であると考えることができる。この結合プロファイルは、ＢＭＰ４およびＢＭＰ２に対する例外的に強力な結合が、ＢＭＰ６を含む中間レベルの結合を有する４つのリガンドと比較して、このリガンド対について高度に選択的であると同定される、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体のものとは対照的である。
【０１４４】
【図１３】図１３は、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、高いまたは中間の強度でいくつかのアクチビンリガンドに結合することによって両方のホモ二量体と異なり、ＢＭＰ１５のみに弱く結合することによってＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と異なる。最も注目すべきことに、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、ヘテロ二量体リガンドであるアクチビンＡＢに対して強く、かつ高い選択性で結合する。
【０１４５】
【図１４】図１４は、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体と比較した、２つの異なるＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関するリガンド結合データを示す。形式は、図６と同じである。示されるように、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対するかなりの親和性を依然として保持しながら、ＴＧＦβ２に対するその高い選択性においてＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と顕著に異なる。ＴＧＦβＲＩＩの長いアイソフォームを組み込んだヘテロ二量体は、その短いアイソフォームの対応物が結合するよりも強く、かつ選択的にＴＧＦβ２に結合した。試験したリガンドは、ＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体に結合しない。
【０１４６】
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｄは、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」と示される）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるものなどの他の種に由来するＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６またはＡＬＫ７タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド、例えば、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、４１４、１８、１９、１３６、１３８、４２１、４２２、２２、２３、１１５、１１７、４０７、４０８、２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、４０４、３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、４２４、３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、４２６、３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５、および４０６）と、ＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」と示される）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるものなどの他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＭＩＳＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、またはＴＧＦＢＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド、例えば、９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、４１０、１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、４０２、４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、４１２、５０、５１、７５、７６、７９、８０、４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７、および４１８）を含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。例示された実施形態では、Ｉ型受容体ポリペプチドは、相互作用対（「Ｃ１」）の第１のメンバーを含む融合ポリペプチドの一部であり、ＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用対（「Ｃ２」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの一部である。好適な相互作用対は、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、その短縮物およびバリアントを含んでいた［例えば、Spiessら（２０１５年）Molecular  Immunology  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーを、Ｉ型受容体ポリペプチドまたはＩＩ型受容体ポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に配置することができる。相互作用対の第１および第２のメンバーは、無誘導であってよく、これは、対のメンバーが互いに会合するか、または実質的な優先性なしに自己会合し、それらが同じまたは異なるアミノ酸配列を有してよいことを意味する。図１５Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導（非対称）対であってよく、これは、対のメンバーが自己会合ではなく互いに優先的に会合することを意味する。図１５Ｂを参照されたい。より高次の複合体を想定することができる。図１５Ｃおよび１５Ｄを参照されたい。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１５−４】同上。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
１．概要
一部において、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインおよびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含むヘテロ多量体、少なくとも２つの異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含むヘテロ多量体、少なくとも２つの異なるＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含むヘテロ多量体、そのようなヘテロ多量体を作製する方法、ならびにその使用に関する。本明細書に記載の通り、一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７から選択されるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。同様に、一部の実施形態では、これらのヘテロ多量体は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩから選択されるＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、対応するホモ多量体の試料と比べて変化したＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合特異性／プロファイルを有する（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ：ＡＬＫ４ヘテロ二量体をＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体またはＡＬＫ４：ＡＬＫ４ホモ二量体と比較して）。
【０１４８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含めた、３０種を超える分泌型因子で構成される。例えば、Weissら（２０１３年）Developmental  Biology、２巻（１号）：４７〜６３頁を参照されたい。脊椎動物および無脊椎動物の両方において見いだされるスーパーファミリーのメンバーは、多様な組織において遍在的に発現し、発生の最も早い段階から動物の一生を通じて機能する。実際に、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、幹細胞自己再生、原腸形成、分化、器官の形態形成、および成体組織恒常性の重要なメディエーターである。この遍在する活性と一致して、異常なＴＧＦ−ベータスーパーファミリーシグナル伝達は、例えば、自己免疫疾患、心血管疾患、線維性疾患、およびがんを含めた広範囲のヒト病理に関連付けられる。
【０１４９】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドは、一方の単量体の中心３−１／２ターンへリックスが他方の単量体のベータ鎖によって形成された凹表面に対してパッケージングされた、同じ二量体構造を共有する。大多数のＴＧＦ−ベータファミリーメンバーは、分子間ジスルフィド結合によってさらに安定化される。このジスルフィド結合は、２つの他のジスルフィド結合により形成された環を横切り、「システインノット」モチーフと称されているものが生成される。例えば、Linら、（２００６年）Reproduction、１３２巻：１７９〜１９０頁およびHinckら（２０１２年）FEBS  Letters、５８６巻：１８６０〜１８７０頁を参照されたい。
【０１５０】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーシグナル伝達は、リガンド刺激を受けると下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化し活性化するＩ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される。例えば、Massague（２０００年）Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol.、１巻：１６９〜１７８頁を参照されたい。これらのＩ型受容体およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。一般に、Ｉ型受容体は細胞内シグナル伝達を媒介し、一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型受容体とＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、それにより、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化がもたらされる。
【０１５１】
ＴＧＦ−ベータファミリーは、それらが結合するＩ型受容体およびそれらが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づいて２つの系統学的枝に分けることができる。一方は、つい最近進化した枝であり、例えば、ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびノーダルを含み、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を通じてシグナル伝達を行う［Hinck（２０１２年）FEBS  Letters、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。他方の枝は、スーパーファミリーの、関連性がより遠いタンパク質を含み、それらとして、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７が挙げられ、Ｓｍａｄ１、５、および８を通じてシグナル伝達を行う。
【０１５２】
ＴＧＦ−ベータアイソフォームは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの創始メンバーであり、それらには、哺乳動物において、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３と称される３つの公知のアイソフォームが存在する。成熟生理活性ＴＧＦ−ベータリガンドは、ホモ二量体として機能し、主にＩ型受容体ＡＬＫ５を通じてシグナル伝達を行うが、さらに内皮細胞ではＡＬＫ１を通じてシグナル伝達を行うことも見いだされている。例えば、Goumansら（２００３年）Mol  Cell、１２巻（４号）：８１７〜８２８頁を参照されたい。ＴＧＦ−ベータ１は、最も豊富であり、遍在的に発現するアイソフォームである。ＴＧＦ−ベータ１は、創傷治癒において重要な役割を有することが公知であり、構成的に活性なＴＧＦ−ベータ１導入遺伝子を発現するマウスでは線維症が発生する。例えば、Clouthierら、（１９９７年）J  Clin.  Invest.、１００巻（１１号）：２６９７〜２７１３頁を参照されたい。ＴＧＦ−ベータ１は、Ｔ細胞活性化および制御性Ｔ細胞の維持にも関与する。例えば、Liら、（２００６年）Immunity、２５巻（３号）：４５５〜４７１頁を参照されたい。ＴＧＦ−ベータ２発現は、ヒト神経膠芽腫細胞において最初に記載され、胚神経系のニューロンおよび星状膠細胞において生じる。ＴＧＦ−ベータ２は、Ｔリンパ球のインターロイキン２依存性成長を抑制することが公知である。ＴＧＦ−ベータ３は、ヒト横紋筋肉腫細胞系から最初に単離され、以後、肺腺癌細胞系および腎臓癌細胞系において見いだされている。ＴＧＦ−ベータ３は、口蓋および肺の形態形成に重要であることが公知である。例えば、Kubiczkovaら、（２０１２年）Journal  of  Translational  Medicine、１０巻：１８３頁を参照されたい。
【０１５３】
アクチビンは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーであり、卵胞刺激ホルモンの分泌の制御因子として最初に発見されたが、その後、種々の生殖および非生殖に関する役割が特徴付けられている。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体（それぞれβＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である３つの主要なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムは、主に肝臓において発現するアクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態も公知である。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーでは、アクチビンは、独特であり、卵巣細胞および胎盤細胞におけるホルモンの産生を刺激することができ、神経細胞の生存を支持することができ、細胞型に応じて細胞周期の進行に正または負の影響を及ぼすことができ、また、少なくとも両生類の胚において中胚葉の分化を誘導することができる多機能性因子である。例えば、DePaoloら（１９９１年）Proc  Soc  Ep  Biol  Med.、１９８巻：５００〜５１２頁；Dysonら（１９９７年）Curr  Biol.、７巻：８１〜８４頁；ならびにWoodruff（１９９８年）Biochem  Pharmacol.、５５巻：９５３〜９６３頁を参照されたい。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連ヘテロ二量体であるインヒビンにより拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の制御では、アクチビンはＦＳＨ合成および分泌を促進するが、インヒビンはＦＳＨ合成および分泌を低減する。アクチビン生理活性を制御し、かつ／またはアクチビンに結合することができる他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）、およびα２−マクログロブリンが挙げられる。
【０１５４】
本明細書に記載の通り、「アクチビンＡ」に結合する作用剤は、単離されたβＡサブユニットの状況であるか二量体複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてかにかかわらず、βＡサブユニットに特異的に結合する作用剤である。ヘテロ二量体複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合では、「アクチビンＡ」に結合する作用剤は、βＡサブユニット内に存在するエピトープに対して特異的であり、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」に拮抗する（を阻害する）、本明細書に開示される作用剤は、単離されたβＡサブユニットの状況であるか二量体複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてかにかかわらずβＡサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用剤である。βＡβＢヘテロ二量体の場合では、「アクチビンＡ」を阻害する作用剤は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害し、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用剤である。この原則は、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合する作用剤および／またはそれを阻害する作用剤にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」、「アクチビンＡＣ」、「アクチビンＡＥ」、「アクチビンＢＣ」、または「アクチビンＢＥ」に拮抗する、本明細書に開示される作用剤は、βＡサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性およびβＢサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用剤である。同じ原則が、「アクチビンＡＣ」、「アクチビンＡＥ」、「アクチビンＢＣ」、または「アクチビンＢＥ」に結合する作用剤および／またはそれを阻害する作用剤にも当てはまる。
【０１５５】
ノーダルタンパク質は、初期胚形成において、中胚葉および内胚葉の誘導および形成、ならびにその後の心臓および胃などの軸構造の組織化における機能を有する。発生中の脊椎動物の胚の背側組織は主に脊索および脊索前板の軸構造に寄与する一方で、周囲の細胞を動員して非軸胚構造を形成することが実証されている。ノーダルは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方ならびにＳＭＡＤタンパク質として公知の細胞内エフェクターを通じてシグナル伝達を行うと思われる。試験により、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢがノーダルに対するＩＩ型受容体として機能するという観念が裏付けられる。例えば、Sakumaら（２００２年）Genes  Cells.、２００２年、７巻：４０１〜１２頁を参照されたい。ノーダルリガンドがそれらの補因子（例えば、ＣｒｉｐｔｏまたはＣｒｙｐｔｉｃ）と相互作用してアクチビンのＩ型受容体およびＩＩ型受容体が活性化され、それらによりＳＭＡＤ２がリン酸化されることが示唆されている。ノーダルタンパク質は、中胚葉の形成、前側パターン形成、および左右軸の特定化を含めた、初期の脊椎動物の胚に重要な多くの事象に関係付けられる。実験による証拠から、ノーダルシグナル伝達により、アクチビンおよびＴＧＦ−ベータに特異的に応答することが以前示されたルシフェラーゼレポーターであるｐＡＲ３−Ｌｕｘが活性化されることが実証されている。しかし、ノーダルは、骨形成タンパク質に対する特異的応答性レポーターであるｐＴｌｘ２−Ｌｕｘを誘導することはできない。最近の結果から、ノーダルシグナル伝達が、ＴＧＦ−ベータおよびアクチビンによるシグナル伝達も媒介するＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３によって媒介されることの直接的な生化学的証拠がもたらされる。さらなる証拠により、ノーダルシグナル伝達には細胞外タンパク質であるＣｒｉｐｔｏまたはＣｒｙｐｔｉｃが必要であり、これにより、ノーダルシグナル伝達がアクチビンまたはＴＧＦ−ベータのシグナル伝達とは別個のものになっていることが示された。
【０１５６】
ＢＭＰおよびＧＤＦは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの特徴的なフォールディングを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを一緒に形成する。例えば、Riderら（２０１０年）Biochem  J.、４２９巻（１号）：１〜１２頁を参照されたい。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６としても公知）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５、およびデカペンタプレジックを含む。ＢＭＰにその名称を与えた、骨形成を誘導する能力に加えて、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範囲の組織の発生において形態形成活性を示す。ＢＭＰ／ＧＤＦホモ二量体およびヘテロ二量体は、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体二量体の組合せと相互作用して多数の可能性のあるシグナル伝達複合体を生じさせ、それにより、２つの競合するＳＭＡＤ転写因子のセットのうちの１つが活性化される。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的かつ局在する機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発生的制限を含めたいくつものやり方で、およびサイトカインに高い親和性で結合するいくつかの特異的なＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を通じて制御される。不思議なことに、いくつものこれらのアンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに似ている。
【０１５７】
増殖分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の制御因子であり、発達中の骨格筋および成人の骨格筋において高度に発現する。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８ヌル突然変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする。例えば、McPherronら、Nature（１９９７年）３８７巻：８３〜９０頁を参照されたい。ウシにおいて、および著しく、ヒトにおいて、ＧＤＦ８の天然に存在する突然変異に関して骨格筋量の同様の増加が明らかである。例えば、Ashmoreら（１９７４年）Growth、３８巻：５０１〜５０７頁；SwatlandおよびKieffer、J.  Anim.  Sci.（１９９４年）３８巻：７５２〜７５７頁；McPherronおよびLee、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA（１９９７年）９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；Kambadurら、Genome  Res.（１９９７年）７巻：９１０〜９１５頁；ならびにSchuelkeら（２００４年）N  Engl  J  Med、３５０巻：２６８２〜８頁を参照されたい。試験により、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋消耗がＧＤＦ８タンパク質発現の増大を伴うことも示された。例えば、Gonzalez-Cadavidら、PNAS（１９９８年）９５巻：１４９３８〜４３頁を参照されたい。さらに、ＧＤＦ８は、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートすることができ、筋芽細胞の細胞増殖をモジュレートすることができる。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号を参照されたい。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合し、それにより、その生物活性を不活化することができる。例えば、Miyazonoら（１９８８年）J.  Biol.  Chem.、２６３巻:６４０７〜６４１５頁；Wakefieldら（１９８８年）J.  Biol.  Chem.、２６３巻:７６４６〜７６５４頁；ならびにBrownら（１９９０年）Growth  Factors、３巻:３５〜４３頁を参照されたい。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質としては、フォリスタチン、および潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる。例えば、Gamerら（１９９９年）Dev.  Biol.、２０８巻:２２２〜２３２頁を参照されたい。
【０１５８】
ＧＤＦ１１は、ＢＭＰ１１としても公知であり、マウスの発達中に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する分泌型タンパク質である。例えば、McPherronら（１９９９年）Nat.  Genet.、２２巻:２６０〜２６４頁；ならびにNakashimaら（１９９９年）Mech.  Dev.、８０巻:１８５〜１８９頁を参照されたい。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において独特の役割を果たす。例えば、Gamerら（１９９９年）Dev  Biol.、２０８巻：２２２〜３２頁を参照されたい。ＧＤＦ１１は、発達中のニワトリの肢における軟骨形成および筋形成の負の制御因子であることが示された。例えば、Gamerら（２００１年）Dev  Biol.、２２９巻：４０７〜２０頁を参照されたい。筋肉におけるＧＤＦ１１の発現からも、ＧＤＦ８と同様に、筋肉の成長の制御におけるその役割が示唆される。さらに、脳におけるＧＤＦ１１の発現により、ＧＤＦ１１が神経系の機能に関わる活性も有する可能性があることが示唆される。興味深いことに、ＧＤＦ１１が嗅上皮における神経発生を阻害することが見いだされた。例えば、Wuら（２００３年）Neuron.、３７巻：１９７〜２０７頁を参照されたい。したがって、ＧＤＦ１１には、筋疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）などの疾患の処置においてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの適用があり得る。
【０１５９】
ＢＭＰ７は、骨原性タンパク質−１（ＯＰ−１）とも称され、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。さらに、ＢＭＰ７は、幅広い生理的プロセスを制御する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成の現象に関与する骨誘導因子であり得る。ＢＭＰ７がカルシウム制御および骨恒常性において役割を果たすことも見いだされている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７およびアクチビンは、別個のＩ型受容体をヘテロマー受容体複合体に動員する。観察された主要なＢＭＰ７  Ｉ型受容体はＡＬＫ２であったが、アクチビンはＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に排他的に結合した。ＢＭＰ７およびアクチビンは別個の生物学的応答を引き出し、異なるＳＭＡＤ経路を活性化した。例えば、Macias-Silvaら（１９９８年）J  Biol  Chem.、２７３巻：２５６２８〜３６頁を参照されたい。
【０１６０】
抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）は、ミュラー管阻害因子（ＭＩＳ）としても公知であり、ＴＧＦ−ベータファミリー糖タンパク質である。１つのＡＭＨ関連ＩＩ型受容体が同定され、ＡＭＨＲＩＩ、あるいはＭＩＳＲＩＩと名付けられている。ＡＭＨは、ヒト男性胚におけるミュラー管の退縮を誘導する。ＡＭＨは、生殖年齢の女性において発現し、周期または妊娠によって変動しないが、卵母細胞の数量および品質の両方が低減するにつれて段階的に減少することが見いだされ、これにより、ＡＭＨが卵巣生理機能のバイオマーカーとして機能し得ることが示唆される。例えば、Zecら、（２０１１年）Biochemia  Medica、２１巻（３号）：２１９〜３０頁を参照されたい。
【０１６１】
アクチビン受容体様キナーゼ−１（ＡＬＫ１）は、あるいはＡＣＶＲＬＫ１として公知である、ＡＣＶＲＬ１遺伝子の産物であり、発現が主に内皮細胞に制限されるＩ型受容体である。例えば、OMIM  entry  ６０１２８４を参照されたい。ＡＬＫ１は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０などのＴＧＦ−ベータファミリーリガンドの結合によって活性化され、また、ＡＬＫ１シグナル伝達は発生的血管形成および病理学的血管形成のどちらの制御にも重要である。ＡＬＫ１発現は、初期のマウスの発達における脈管形成および血管新生の部位と重複し、ＡＬＫ１ノックアウトマウスはおよそ胚齢１１．５日に重症の血管異常が原因で死亡する（例えば、CunhaおよびPietras（２０１１年）Blood  １１７巻（２６号）：６９９９〜７００６頁を参照されたい）。ＡＬＫ１発現は、肝星細胞および軟骨細胞などの他の細胞型においても記載されている。さらに、ＡＬＫ１は、アクチビン受容体様キナーゼ−２（ＡＬＫ２）と共に、間葉系幹細胞におけるＢＭＰ９に誘導される骨形成性シグナル伝達のために重要であることが見いだされている。例えば、CunhaおよびPietras（２０１１年）Blood  １１７巻（２６号）：６９９９〜７００６頁を参照されたい。
【０１６２】
ＡＬＫ２は、あるいはＡｃｔＲＩＡまたはＡＣＶＲＬＫ２として公知である、ＡＣＶＲ１遺伝子の産物であり、アクチビンおよびＢＭＰに結合することが示されているＩ型受容体である。ＡＬＫ２ノックアウトマウスは原腸形成後すぐに死亡するので、ＡＬＫ２は胚形成のために重要である。例えば、Mishinaら（１９９９年）Dev  Biol.、２１３巻：３１４〜３２６頁およびOMIM  entry  １０２５７６を参照されたい。ＡＬＫ２の構成的に活性な突然変異は、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）に関連する。ＦＯＰは、筋肉、腱および靭帯を含めた線維組織が自然発生的にまたは損傷時に骨化する稀な遺伝障害である。ＡＬＫ２のコドン２０６におけるアルギニンからヒスチジンへの突然変異が、ヒトにおけるＦＯＰに関連する天然に存在する突然変異である。この突然変異は、リガンドの結合を伴わずにＡＬＫ２を介したＢＭＰ特異的シグナル伝達を誘導する。例えば、Fukudaら、（２００９年）J  Biol  Chem.  ２８４巻（１１号）：７１４９〜７１５６頁およびKaplanら、（２０１１年）Ann  N.Y.  Acad  Sci.、１２３７巻：５〜１０頁を参照されたい。
【０１６３】
アクチビン受容体様キナーゼ−３（ＡＬＫ３）は、あるいはＡＣＶＲＬＫ３として公知である、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の産物であり、ＢＭＰファミリーの多数のリガンドの効果を媒介するＩ型受容体である。遍在する組織発現を伴ういくつかのＩ型受容体とは異なり、ＡＬＫ３は、より特殊化された機能性と一致して、制限された発現パターンを示す。例えば、ten  Dijke（１９９３年）Oncogene、８巻:２８７９〜２８８７頁およびOMIM  entry  ６０１２９９を参照されたい。ＡＬＫ３は、一般に、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７およびＢＭＰファミリーの他のメンバーの高親和性受容体として認識される。ＢＭＰ２およびＢＭＰ７は、骨芽細胞分化の強力な刺激物質であり、現在、脊椎融合およびある特定の偽関節骨折における骨形成を誘導するために臨床的に使用されている。ＡＬＫ３は、骨芽細胞におけるＢＭＰ２およびＢＭＰ４シグナル伝達の媒介に関する重要な受容体と考えられる。例えば、Laveryら（２００８年）J.  Biol.  Chem.、２８３巻：２０９４８〜２０９５８頁を参照されたい。ホモ接合性ＡＬＫ３ノックアウトマウスは胚形成の初期（約９．５日目）に死亡するが、骨芽細胞におけるＡＬＫ３の条件破壊を有する成体マウスでは、新たに形成された骨は組織崩壊の証拠を示したにもかかわらず骨質量の増加が示されることが最近報告された。例えば、Kamiya（２００８年）J.  Bone  Miner.  Res.、２３巻：２００７〜２０１７頁；ならびにKamiya（２００８年）Development、１３５巻：３８０１〜３８１１頁を参照されたい。この所見は、ＢＭＰ２およびＢＭＰ７（ＡＬＫ３のリガンド）の臨床使用における骨生成剤としての効果とは驚くべき対比である。
【０１６４】
アクチビン受容体様キナーゼ−４（ＡＬＫ４）は、あるいはＡＣＶＲＬＫ４として公知である、ＡＣＶＲ１Ｂ遺伝子の産物であり、アクチビン、ノーダルおよびＧＤＦを含めたいくつものＴＧＦ−ベータファミリーリガンドに関するシグナルを伝達するＩ型受容体である。ＡＬＫ４突然変異は、膵がんに関連し、ヒト下垂体腫瘍ではドミナントネガティブ短縮型ＡＬＫ４アイソフォームの発現が高度に発現する。例えば、Tsuchidaら、（２００８年）Endocrine  Journal  ５５巻（１号）：１１〜２１頁およびOMIM  entry  ６０１３００を参照されたい。
【０１６５】
アクチビン受容体様キナーゼ−５（ＡＬＫ５）は、ＴＧＦＢＲ１遺伝子の産物であり、大多数の細胞型において広範に発現する。ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、およびＧＤＦ−８を含めたいくつかのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドは、ＡＬＫ５を介してシグナル伝達を行い、下流のＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３を活性化する。ＡＬＫ５が欠損したマウスは、卵黄嚢および胎盤の血管発生において重度の欠陥を示し、循環赤血球を欠き、妊娠中期に死亡する。これらの胚は正常な造血潜在性を有するが、増殖の増強および不適切な内皮細胞の遊走を有することが見いだされた。したがって、ＡＬＫ５依存性シグナル伝達は血管新生のためには重要であるが、造血前駆細胞の発生および機能的造血には重要ではない。例えば、Larssonら、（２００１年）The  EMBO  Journal、２０巻（７号）：１６６３〜１６７３頁およびOMIM  entry  １９０１８１を参照されたい。内皮細胞では、ＡＬＫ５はＡＬＫ１シグナル伝達と協同的におよび逆に作用する。ＡＬＫ５は、細胞遊走および増殖を阻害し、これは特にＡＬＫ１と逆の効果である。例えば、Goumansら（２００３年）Mol  Cell、１２巻（４号）：８１７〜８２８頁を参照されたい。さらに、ＡＬＫ５は、筋肉の成長を負に制御すると考えられる。筋ジストロフィーのマウスモデルの筋肉におけるＡＬＫ５のノックダウンにより、線維症が低減し、筋肉の成長に関連する遺伝子の発現が増大することが見いだされた。例えば、Kemaladewiら、（２０１４年）Mol  Ther  Nucleic  Acids、３巻、ｅ１５６頁を参照されたい。
【０１６６】
アクチビン受容体様キナーゼ−６（ＡＬＫ６）は、ＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子の産物であり、その欠損は、ヒトおよびマウスの両方において軟骨異形成症および肢欠陥に関連付けられている。例えば、Demirhanら、（２００５年）J  Med  Genet.、４２巻：３１４〜３１７頁を参照されたい。ＡＬＫ６は、骨格の発達全体を通して広範に発現し、マウスにおける軟骨形成に必要とされる。例えば、Yiら、（２０００年）Development、１２７巻：６２１〜６３０頁およびOMIM  entry  ６０３２４８を参照されたい。
【０１６７】
アクチビン受容体様キナーゼ−７（ＡＬＫ７）は、ＡＣＶＲ１Ｃ遺伝子の産物である。ＡＬＫ７ヌルマウスは、生存可能であり、稔性であり、骨格または肢形成異常を示さない。ＡＬＫ７を通じたＧＤＦ３シグナル伝達は、インスリン感受性および肥満症において役割を果たすと思われる。これは、Ａｌｋ７ヌルマウスが、脂肪蓄積、および食餌誘導性肥満に対する抵抗性を示すという結果によって裏付けられる。例えば、Anderssonら、（２００８年）PNAS、１０５巻（２０号）：７２５２〜７２５６頁を参照されたい。ＡＬＫ７により媒介されるノーダルシグナル伝達は、種々の異なるがん細胞系において腫瘍促進効果および腫瘍抑制効果の両方を有するとして意味付けられている。例えば、De  Silvaら、（２０１２年）Frontiers  in  Endocrinology、３巻：５９頁およびOMIM  entry  ６０８９８１を参照されたい。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「ＡｃｔＲＩＩ」という用語は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、ＡＣＶＲ２Ａ遺伝子によりコードされるアクチビン受容体ＩＩ型Ａ（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子によりコードされるアクチビン受容体ＩＩ型Ｂ（ＡｃｔＲＩＩＢ）の両方を含む。ＡｃｔＲＩＩ受容体は、アクチビン、ＧＤＦ８（ミオスタチン）、ＧＤＦ１１、ならびにＢＭＰのサブセット、特にＢＭＰ６およびＢＭＰ７を含めた種々のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合するＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体である。ＡｃｔＲＩＩ受容体は、筋肉および神経筋障害（例えば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および筋萎縮）、望ましくない骨／軟骨成長、脂肪組織障害（例えば、肥満症）、代謝障害（例えば、２型糖尿病）、および神経変性障害を含めた種々の生物学的障害に関係付けられる。例えば、Tsuchidaら、（２００８年）Endocrine  Journal  ５５巻（１号）：１１〜２１頁、Knopfら、Ｕ．Ｓ．８，２５２，９００、ならびにＯＭＩＭエントリー１０２５８１および６０２７３０を参照されたい。
【０１６９】
形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ型（ＴＧＦＢＲＩＩ）は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子によりコードされ、ＴＧＦ−ベータリガンドに結合し、下流のＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３エフェクターを活性化することが公知のＩＩ型受容体である。例えば、Hinck（２０１２年）FEBS  Letters、５８６巻：１８６０〜１８７０頁およびOMIM  entry  １９０１８２を参照されたい。ＴＧＦＢＲＩＩを通じたＴＧＦ−ベータシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖、制御性Ｔ細胞の維持および前軟骨幹細胞の増殖のために重要である。例えば、Liら、（２００６年）Immunity、２５巻（３号）：４５５〜４７１頁およびChengら、Int.  J.  Mol.  Sci.、２０１４年、１５巻、１２６６５〜１２６７６頁を参照されたい。
【０１７０】
骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ）は、ＢＭＰＲ２遺伝子によりコードされ、ある特定のＢＭＰリガンドに結合すると考えられるＩＩ型受容体である。一部の例では、ＢＭＰＲＩＩへの効率的なリガンド結合は、妥当なＴＧＦＢＲ  Ｉ型受容体の存在に依存する。例えば、Rosenzweigら、（１９９５年）PNAS、９２巻：７６３２〜７６３６頁を参照されたい。ＢＭＰＲＩＩの突然変異は、ヒトにおける肺高血圧症を伴う。OMIM  entry  ６００７９９を参照されたい。
【０１７１】
ミュラー管阻害因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＲＩＩ）は、あるいは抗ミュラーホルモンＩＩ型受容体として公知である、ＡＭＨＲ２遺伝子の産物であり、ＩＩ型ＴＧＦ−ベータ受容体である。ＭＩＳＲＩＩは、ＭＩＳリガンドに結合するが、シグナル伝達のためにはＡＬＫ３またはＡＬＫ６などの妥当なＩ型受容体の存在を必要とする。例えば、Hinck（２０１２年）FEBS  Letters、５８６巻：１８６０〜１８７０頁およびOMIM  entry  ６００９５６を参照されたい。ＭＩＳＲＩＩは、ヒトにおける性分化に関与し、ヒト男性におけるミュラー退縮に必要である。ＡＭＨは、生殖年齢の女性において発現し、周期または妊娠で変動しないが、卵母細胞の数量および品質の両方が低減するにつれて段階的に減少することが見いだされ、これにより、ＡＭＨが卵巣生理機能のバイオマーカーとして機能し得ることが示唆される。例えば、Zecら、（２０１１年）Biochemia  Medica、２１巻（３号）：２１９〜３０頁およびOMIM  entry  ６００９５６を参照されたい。
【０１７２】
ある特定の態様では、本開示は、ａ）ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）およびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）を含むヘテロ多量体ｂ）少なくとも２つのＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）の細胞外ドメインを含むヘテロ多量体、ならびに少なくとも２つのＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）の細胞外ドメインを含むヘテロ多量体、好ましくは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ミュラー管阻害因子（ＭＩＳ）、およびレフティー）によって開始される細胞内シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）に拮抗する可溶性ヘテロ多量体の使用に関する。本明細書に記載の通り、そのようなアンタゴニストヘテロ多量体複合体は、例えば、筋肉喪失、不十分な筋肉の成長、神経変性、骨量減少、骨密度の低下および／または石灰化、不十分な骨成長、肥満症などの代謝障害および貧血などの赤血球障害に関連する種々の障害／状態の処置または予防において有用であり得る。
【０１７３】
特に、本開示のデータにより、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインおよびＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含むヘテロ多量体がそれらの対応するホモ多量体複合体と比較して異なるリガンド結合特異性／プロファイルを有することが実証される。
【０１７４】
本明細書で使用される用語は、本開示の文脈の中で、および各用語が使用される特定の文脈において、概して、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。特定の用語を、本開示の組成物および方法およびそれらの作製および使用の仕方の記載に関して実践者に追加的な手引きを提供するために以下または本明細書の他の箇所で考察する。用語の任意の使用の範囲または意味は、それが使用される特定の文脈から明らかになるであろう。
【０１７５】
「ヘテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、少なくとも第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含む複合体であり、第２のポリペプチドは第１のポリペプチドとはアミノ酸配列が少なくとも１つのアミノ酸残基により異なる。ヘテロマーは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロ二量体」を含む場合もあり、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドに加えてポリペプチドが存在する高次構造を形成する場合もある。ヘテロ多量体の例示的な構造としては、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造が挙げられる。ヘテロ二量体は、本明細書では、Ｘ：Ｙまたは同等にＸ−Ｙと称され、Ｘは第１のポリペプチドを示し、Ｙは第２のポリペプチドを示す。ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、組換えタンパク質複合体（例えば、１つまたは複数のポリペプチド成分が組換えタンパク質であってよい）、単離されたタンパク質複合体および／または精製されたタンパク質複合体である。
【０１７６】
「相同」とは、その文法形式および綴りの変形全てが、同一種の生物体のスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに異なる種の生物体に由来する相同タンパク質を含めた、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関連性を指す。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性の観点からであるか特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によるものかにかかわらずそれらの配列類似性に反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な使用において、および本出願において、「相同」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾されている場合、配列類似性を指す場合があり、また、共通の進化的起源に関係する場合もあり、関係しない場合もある。
【０１７７】
「配列類似性」という用語は、その文法形式全てが、共通の進化的起源を共有する場合もありしない場合もある核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す。
【０１７８】
「パーセント（％）配列同一性」とは、参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関しては、配列をアラインメントし、必要であれば最大のパーセント配列同一性を実現するためにギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一である候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内に入る種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするための妥当なパラメーターを決定することができる。しかし、本発明の目的に関しては、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して％アミノ酸（核酸）配列同一性値を生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムの作者はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．であり、ソースコードはＵ．Ｓ．  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書にファイルされており、そこでＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公的に入手可能である、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルすべきである。配列比較パラメーターは全てＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【０１７９】
「作動させる」とは、その文法形式全てが、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化する（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、もしくは不活性タンパク質を活性な状態になるように誘導することによって）、またはタンパク質活性および／もしくは遺伝子の活性を増大させるプロセスを指す。
【０１８０】
「拮抗する」とは、その文法形式全てが、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害する（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害するもしくは低減させることによって、もしくは活性なタンパク質を不活性な状態になるように誘導することによって）、またはタンパク質の活性および／もしくは遺伝子の活性を低減させるプロセスを指す。
【０１８１】
「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、数値に関連して使用される場合、当業者によく知られており、許容される正確度の区間を示す。一般に、そのような正確度の区間は、±１０％である。その代わりに、特に生物システムにおいては、「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、所与の値から１桁分以内、好ましくは５倍以下、より好ましくは２倍以下の値を意味し得る。
【０１８２】
本明細書に開示される数値範囲には、範囲を規定する数が含まれる。
【０１８３】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、この用語が使用される文脈によりそうでないことが明白に示される場合を除き、複数の指示対象を包含する。「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）という用語、ならびに「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。さらに、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」とは、本明細書で使用される場合、２つまたはそれよりも多くの指定の特徴または成分のそれぞれを、他方を伴うまたは伴わないとして具体的に開示するものとみなされるべきである。したがって、「および／または」という用語は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（のみ）、および「Ｂ」（のみ）を含むものとする。同様に、「および／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される場合、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；ならびにＣ（のみ）のそれぞれを包含するものとする。
２．ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドならびにそれらのヘテロ多量体
【０１８４】
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、４１４、１８、１９、１３６、１３８、４２１、４２２、２２、２３、１１５、１１７、４０７、４０８、２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、４０４、３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、４２４、３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、４２６、３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５および４０６などの、ヒトまたは他の種からのＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７タンパク質）と１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ受容体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、配列番号９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、４１０、１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、４０２、４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、４１２、５０、５１、７５、７６、７９、８０、４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７および４１８などの、ヒトまたは他の種からのＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩタンパク質）とを含むヘテロ多量体；少なくとも２つの異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、４１４、１８、１９、１３６、１３８、４２１、４２２、２２、２３、１１５、１１７、４０７、４０８、２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、４０４、３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、４２４、３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、４２６、３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５および４０６などの、ヒトまたは他の種からのＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７タンパク質）を含むヘテロ多量体；および少なくとも２つの異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、配列番号９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、４１０、１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、４０２、４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、４１２、５０、５１、７５、７６、７９、８０、４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７および４１８などの、ヒトまたは他の種からのＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩタンパク質）を含むヘテロ多量体複合体に関し、これらは、本明細書では一般に、「ヘテロマー」、「ヘテロ多量体複合体」または「ヘテロ多量体」と称される。好ましくは、ヘテロ多量体は、可溶性であり、例えば、ヘテロ多量体は、少なくとも１つのＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの可溶性部分（ドメイン）および少なくとも���つのＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの可溶性部分を含む。一般に、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体の細胞外ドメインは、Ｉ型およびＩＩ型受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、１つまたは複数のＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６および／またはＡＬＫ７受容体細胞外ドメイン）および／またはＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよび／またはＭＩＳＲＩＩ受容体細胞外ドメイン）を含む。ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩの例示的な細胞外ドメインは、本明細書中で開示され、そのような配列はもちろん、それらの断片、機能的バリアントおよび修飾形態も、本開示の発明（例えば、ヘテロ多量体組成物およびそれらの使用）に従って使用され得る。本開示のヘテロ多量体は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびより高次のオリゴマー構造を含む。例えば、図１、２および１５を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１８５】
３フィンガー毒素フォールド（three-finger  toxin  fold）として公知の決定的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する１０、１２または１４の保存システイン残基により形成される。例えば、Greenwaldら（１９９９年）Nat  Struct  Biol  ６巻：１８〜２２頁；Hinck（２０１２年）FEBS  Lett  ５８６巻：１８６０〜１８７０頁を参照されたい。これらの保存システインの最外部により画定されるような、ＴＧＦβスーパーファミリー受容体のコアリガンド結合ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位；配列番号９（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位；配列番号１４（ＡＬＫ１前駆体）の３４〜９５位；配列番号１８（ＡＬＫ２前駆体）の３５〜９９位；配列番号２２（ＡＬＫ３前駆体）の６１〜１３０位；配列番号２６および８３（ＡＬＫ４前駆体）の３４〜１０１位；配列番号３０および８７（ＡＬＫ５前駆体）の３６〜１０６位；配列番号３４（ＡＬＫ６アイソフォームＢ前駆体）の３２〜１０２位；配列番号３８、３０５および３０９（ＡＬＫ７前駆体）の２８〜９２位；配列番号４２（ＴＧＦＢＲＩＩアイソフォームＢ前駆体）の５１〜１４３位；配列番号４６および７１（ＢＭＰＲＩＩ前駆体）の３４〜１２３位；配列番号５０、７５および７９（ＭＩＳＲＩＩ前駆体）の２４〜１１６位；配列番号６７（ＴＧＦＢＲＩＩアイソフォームＡ前駆体）の４４〜１６８位；ならびに配列番号９１（ＡＬＫ６アイソフォームＡ前駆体）の６２〜１３２位に対応する。これらのシステイン画定コア配列に隣接する構造的規則性の低いアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更することなくどちらかの末端で短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮についての例示的な細胞外ドメインは、配列番号２、３、５、６、１０、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、３０２、３０６、３１０および３１３を含む。
【０１８６】
好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、これらに限定されないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティーを含む、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、および／またはそのようなリガンドの活性を阻害する（活性に拮抗する）。特に、本開示のヘテロ多量体を使用して、１つまたは複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドにより開始されるシグナル伝達（signaling  transduction）（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達）に拮抗することができ、これは、例えば、本明細書に記載されるものなどの、細胞に基づくアッセイを使用して、判定することができる。本明細書に記載のそのようなアンタゴニストヘテロ多量体は、例えば、筋肉喪失、不十分な筋肉の成長、神経変性、骨量減少、骨密度の低下および／もしくは石灰化、不十分な骨成長、ならびに／または肥満に関連する、様々な障害／状態の処置または予防に有用であり得る。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、それらの対応するホモ多量体複合体と比較して（例えば、対応するＡｃｔＲＩＩＢまたはＡＬＫ４ホモ二量体に対してＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、異なるリガンド結合特異性／プロファイルを有する。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「ＡｃｔＲＩＩＢ」という用語は、任意の種からの活性受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡｃｔＲＩＩＢへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０１８８】
「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示の至る所で、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７、ＷＯ２００８／０９７５４１、およびＷｏ２０１０／１５１４２６に提供されており、これらの文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列は、以下の通りである：
【化１】
2019536439.tif 000002
【化２】
2019536439.tif 000003
【０１８９】
シグナルペプチドは、一重下線で示され；細胞外ドメインは、太字フォントで示され；可能性のある内在性Ｎ連結グリコシル化部位は、二重下線で示されている。
プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、次の通りである：
【０１９０】
【化３】
2019536439.tif 000004
【０１９１】
一部の実施形態では、Ｎ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を有するタンパク質が、産生され得る。細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失している配列（Δ１５配列）は、次の通りである：
【０１９２】
【化４】
2019536439.tif 000005
【０１９３】
配列番号１の６４位にアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態も、文献で報告されている。例えば、Hildenら（１９９４年）Blood、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照されたい。出願人は、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対して相対的に低い親和性を有することを突き止めた。対照的に、６４位にアルギニン（Ｒ６４）を有する同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対して低ナノモルから高ピコモルの範囲の親和性を有する。したがって、Ｒ６４を有する配列は、本開示でのヒトＡｃｔＲＩＩＢの「野生型」参照配列として使用される。
６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、次の通りである：
【化５】
2019536439.tif 000006
【化６】
2019536439.tif 000007
【０１９４】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントにより示されている。
代替Ａ６４形態のプロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、次の通りである：
【化７】
2019536439.tif 000008
【０１９５】
一部の実施形態では、Ｎ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を有するタンパク質が、産生され得る。細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失している配列（Δ１５配列）は、次の通りである：
【化８】
2019536439.tif 000009
【０１９６】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号７で示され、これは、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０を表す。配列番号７で示されるような配列は、６４位にアルギニンを備えており、その代わりにアラニンを備えるように配列を修飾してもよい。プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号８で示される。配列番号８の配列は、６４位にアルギニンを備えており、その代わりにアラニンを備えるように配列を修飾してもよい。
【０１９７】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、図３に示されている。このアラインメントは、ＡｃｔＲＩＩリガンドと直接接触すると考えられる両方の受容体中のアミノ酸残基を示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合ポケットが、一部は、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１により規定されることを示した。これらの位置では、保存的突然変異が許容されると予想される。
【０１９８】
加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、脊椎動物間でよく保存され、細胞外ドメインの大きい伸長が完全に保存される。例えば、図４は、様々なＡｃｔＲＩＩＢオルソログと比較したヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多配列アラインメントを描示する。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くもまた高度に保存される。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性に重要である、リガンド結合ドメイン内の肝要なアミノ酸位置を予測すること、ならびに正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性を有意に変化させることなく置換を許容する可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、今般開示される方法に従って有用な、活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置における１つもしくは複数のアミノ酸を含むことがあり、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列におけるものと同様である残基を含むことがある。限定する意図はないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＢバリアントを定義するためのこの手法を説明する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号２）におけるＬ４６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号５０６）ではバリンであり、そのためこの位置を変更してもよく、任意選択で、Ｖ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更してもよい。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、この部位が、多種多様な変化に対して許容性であり得、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含み得ることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＴ９３は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、幅広い構造的なバリエーションがこの位置では許容されることを示し、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好適である。ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１０８は、ＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性基、例えばＩ、ＶもしくはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメインのＥ１１１は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨを含む荷電残基はもちろん、ＱおよびＮも、この位置において許容されるであろうことを示す。ヒト細胞外ドメインのＲ１１２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、これは、ＲおよびＨを含む塩基性残基が、この位置において許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインにおける１１９位におけるＡは、相対的に保存されにくく、齧歯類ではＰおよびＸｅｎｏｐｕｓではＶとして現れ、したがって、本質的にあらゆるアミノ酸が、この位置において許容されるはずである。
【０１９９】
さらに、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的および機能的特性の点で、特に、リガンド結合に関して、当技術分野において特徴付けられている［Attisanoら（１９９２年）Cell  ６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Greenwaldら（１９９９年）Nature  Structural  Biology  ６巻（１号）：１８〜２２頁；Allendorphら（２００６年）PNAS  １０３巻（２０号：７６４３〜７６４８頁；Thompsonら（２００３年）The  EMBO  Journal  ２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書での教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢバリアントを生成する方法についてのガイダンスを十分に提供している。
【０２００】
例えば、３フィンガー毒素フォールドとして公知の決定的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する保存システイン残基により形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat  Struct  Biol  ６巻：１８〜２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS  Lett  ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存システインの最外部により画定されるような、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアリガンド結合ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位に対応する。したがって、これらのシステイン画定コア配列に隣接する構造的規則性の低いアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更することなく、Ｎ末端で残基約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８個分、および／またはＣ末端で残基約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個分、短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮についての例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは、配列番号２、３、５および６を含む。
【０２０１】
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失がアクチビンに対する受容体の親和性を低下させることを明らかにした。本配列番号１のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃ（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）と比較して、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合が低減されている。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較して、幾分低減されてはいるが同様の活性を保持する。
【０２０２】
したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１に関して）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは、すべて活性であると予想されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性が高いだろう。同様に、残基１２９〜１３４（配列番号１に関して）のいずれかにおける突然変異は、リガンド結合親和性を大幅に変化させると予想されない。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に関して）の突然変異がリガンド結合を実質的に減少させないことは、当技術分野で公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、早くもアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終わることもあるが、１０９および１１９で、またはこれらの間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８もしくは１１９）で終わる形態は、リガンド結合が低減されていると予想される。アミノ酸１１９（配列番号１に関して）は、保存されにくく、そのため容易に変更または短縮される。１２８（配列番号１に関して）またはそれ以降で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンド結合活性を保持するはずである。配列番号１に関して、１１９および１２７でまたはこれらの間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６もしくは１２７）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、中等度の結合能力を有することになる。これらの形態のいずれかを、臨床または実験状況に依存して使用することが望ましいだろう。
【０２０３】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、アミノ酸２９（配列番号１に関して）またはそれより前で始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持すると予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインに相当する。２４位（配列番号１に関して）におけるアラニンからアスパラギンへの突然変異は、リガンド結合に実質的に影響を与えることなくＮ連結グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これは、アミノ酸２０〜２９に対応する、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域における突然変異が、十分に許容されることを確証する。特に、２０、２１、２２、２３および２４位（配列番号１に関して）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、全般的リガンド結合活性を保持するはずであり、２５、２６、２７、２８および２９位（配列番号１に関して）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドも、リガンド結合活性を保持すると予想される。驚くべきことに、２２、２３、２４または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が最も高い活性を有することになることが実証された、例えば、米国特許第７，８４２，６６３号。
【０２０４】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０〜２９のいずれか１つに対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか１つで始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４のいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の例は、配列番号１の２０〜２９位（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９位のいずれか１つ）または２１〜２９位（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９位のいずれか１つ）で始まり、配列番号１の１１９〜１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）、１１９〜１３３位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２もしくは１３３位のいずれか１つ）、１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）、または１２９〜１３３位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２もしくは１３３位のいずれか１つ）で終わるポリペプチドを含む。他の例は、配列番号１の２０〜２４位（例えば、２０、２１、２２、２３もしくは２４位のいずれか１つ）、２１〜２４位（例えば、２１、２２、２３もしくは２４位のいずれか１つ）、または２２〜２５位（例えば、２２、２２、２３もしくは２５位のいずれか１つ）で始まり、配列番号１の１０９〜１３４位（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）、１１９〜１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）または１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３もしくは１３４位のいずれか１つ）で終わる構築物を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号１の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するものも企図される。
【０２０５】
本明細書に記載される変形形態を、様々な方法で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、リガンド結合ポケットに１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、かつリガンド結合ポケットの４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位に０、１つまたは複数の非保存的変更を含む。可変性が特によく許容され得る結合ポケット外の部位は、細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端（上述の通り）、ならびに４２〜４６および６５〜７３位（配列番号１に関して）を含む。６５位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合を実際に向上させるため、Ｒ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合に対して有害作用を及ぼさないと予想される［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化は、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化をおそらく消失させ、したがって、これは、この領域での有意な変化が許容される可能性が高いことを裏付ける。Ｒ６４Ａ変化は、許容されにくいが、Ｒ６４Ｋは、よく許容されるため、６４位ではＨなどの別の塩基性残基が許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。加えて、当技術分野において記載されている突然変異誘発プログラムの結果は、保存するのに有益であることが多いアミノ酸位置がＡｃｔＲＩＩＢ中にあることを示す。配列番号１に関して、これらは、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、および特にトリプトファン）、３７位（酸性、および特に、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特に、フェニルアラニンまたはチロシン）を含む。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが望ましい可能性がある他の位置は、次の通りである：すべて配列１に関して、５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、特に、Ｅ、Ｄ、ＲまたはＫ）。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。したがって、一部の実施形態では、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０〜２９に対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか１つで始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。他の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１および４０２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応するアミノ酸位置が、酸性アミノ酸でない（すなわち、天然に存在するＤもしくはＥアミノ酸残基でも、人工の酸性アミノ酸でもない）、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡｃｔＲＩＩＡ」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２０８】
「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示の至る所で、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７に提供されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は、次の通りである：
【化９】
2019536439.tif 000010
【０２０９】
シグナルペプチドは、一重下線により示され；細胞外ドメインは、太字フォントで示され；可能性のある内在性Ｎ連結グリコシル化部位は、二重下線により示されている。
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列は、次の通りである：
【化１０】
2019536439.tif 000011
細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失している配列（Δ１５配列）は、次の通りである：
【化１１】
2019536439.tif 000012
【０２１０】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１２で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００に対応する。プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１３で示される通りである。
【０２１１】
活性（例えば、リガンド結合）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの一般式は、配列番号９のアミノ酸３０で開始してアミノ酸１１０で終わるポリペプチドを含むものである。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含み得る。任意選択で、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、任意選択で、それぞれ、１〜５（例えば、１、２、３、４もしくは５）または３〜５（例えば、３、４もしくは５）の範囲の位置で始まり、１１０〜１１６（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５もしくは１１６）または１１０〜１１５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４もしくは１１５）の範囲の位置で終わり、配列番号９に対して、リガンド結合ポケットにおける１、２、５、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化、ならびにリガンド結合ポケットの４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位における０、１つまたは複数の非保存的変更を含む、配列番号９のアミノ酸１２〜８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含む。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号９、１０、１１、１１８、１２０、４０９または４１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号９、１０、１１、１１８、１２０、４０９または４１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む。
【０２１３】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦＢＲＩＩ」という用語は、任意の種からの形質転換増殖因子−ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）タンパク質のファミリー、およびそのようなタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＴＧＦＢＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＴＧＦＢＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２１４】
「ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド」という用語は、ＴＧＦＢＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３２３３．４）は、以下の通りである：
【化１２】
2019536439.tif 000013
【０２１５】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列は、次の通りである：
【化１３】
2019536439.tif 000014
【０２１６】
ヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４４で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００３２４２．５のヌクレオチド３８３〜２０８３に対応する。プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４５で示される。
ＴＧＦＢＲＩＩの代替アイソフォームであるアイソフォームＡ（ＮＰ＿００１０２００１８．１）は、次の通りである：
【化１４】
2019536439.tif 000015
【０２１７】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォームＡ）は、次の通りである：
【化１５】
2019536439.tif 000016
【０２１８】
ＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォームＡ）をコードする核酸配列は、配列番号６９で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１０２４８４７．２のヌクレオチド３８３〜２１５８に対応する。プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド（アイソフォームＡ）をコードする核酸配列は、配列番号７０で示される。
【０２１９】
上述のＴＧＦβＲＩＩアイソフォーム（配列番号４２、４３、６７および６８）のいずれも、ＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に起こる（Konradら、BMC  Genomics  ８巻：３１８頁、２００７年）ように、３６アミノ酸（配列番号９５）の挿入物を、ＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端付近に位置するグルタミン酸残基対（配列番号４２の１５１位と１５２位；配列番号４３の１２９位と１３０位；配列番号６７の１７６位と１７７位；または配列番号６８の１５４位と１５５位）の間に組み込むことができるだろう。
【化１６】
2019536439.tif 000017
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、可溶性（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、上記のような配列番号９５の挿入を伴うまたは伴わない、配列番号４２、４３、６７または６８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号９５の挿入を伴うまたは伴わない、配列番号４２、４３、６７もしくは６８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２２１】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＢＭＰＲＩＩ」という用語は、任意の種からの骨形成タンパク質ＩＩ型受容体（ＢＭＰＲＩＩ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＢＭＰＲＩＩタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＢＭＰＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＢＭＰＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２２２】
「ＢＭＰＲＩＩポリペプチド」という用語は、ＢＭＰＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９５．２）は、次の通りである：
【化１７】
2019536439.tif 000018
【化１８】
2019536439.tif 000019
【０２２３】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド配列は、次の通りである：
【化１９】
2019536439.tif 000020
ＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４８で示され、次の通りである：Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２０４．６のヌクレオチド１１４９〜４２６２。細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４９で示される。
【０２２４】
ＢＭＰＲＩＩの代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８６５１９．１）は、次の通りである：
【化２０】
2019536439.tif 000021
【０２２５】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム２）は、次の通りである：
【化２１】
2019536439.tif 000022
【０２２６】
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号７３で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列Ｕ２５１１０．１のヌクレオチド１６３〜１７５２に対応する。シグナル配列は、下線付きである。細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号７４で示される。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、可溶性（例えば、ＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１または４１２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１もしくは４１２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２２８】
ある特定の態様では、本開示は、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＭＩＳＲＩＩ」という用語は、任意の種からのミュラー管阻害因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＲＩＩ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＭＩＳＲＩＩタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＭＩＳＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＭＩＳＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２２９】
「ＭＩＳＲＩＩポリペプチド」という用語は、ＭＩＳＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５４３４．１）は、次の通りである：
【化２２】
2019536439.tif 000023
【０２３０】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列は、次の通りである：
【化２３】
2019536439.tif 000024
【０２３１】
ＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号５２で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０５４７．２のヌクレオチド８１〜１７９９に対応する。細胞外ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５３で示される。
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１５８１６２．１）は、次の通りである：
【化２４】
2019536439.tif 000025
【０２３２】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム２）は、次の通りである：
【化２５】
2019536439.tif 000026
【０２３３】
ＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号７７で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１６４６９０．１のヌクレオチド８１〜１５１４に対応する。プロセシングされた可溶性（細胞外）ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号７８で示される。
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム３（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１５８１６３．１）は、次の通りである：
【化２６】
2019536439.tif 000027
【０２３４】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム３）は、次の通りである：
【化２７】
2019536439.tif 000028
【０２３５】
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号８１で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１６４６９１．１のヌクレオチド８１〜１５１４に対応する。プロセシングされた可溶性（細胞外）ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号８２で示される。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、可溶性（例えば、ＭＩＳＲＩＩの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号５０、５１、７５、７６、７９または８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号５０、５１、７５、７６、７９もしくは８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２３７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ１」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−１タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ１タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ１への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ１ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２３８】
「ＡＬＫ１ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ１ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ１前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００１１．２）は、次の通りである：
【化２８】
2019536439.tif 000029
【０２３９】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ１ポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化２９】
2019536439.tif 000030
【０２４０】
ヒトＡＬＫ１前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１６で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００００２０．２のヌクレオチド２８４〜１７９２に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１７で示される。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ１ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ１の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ１ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３または４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３もしくは４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ１ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２４２】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ２」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−２タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ２タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ２への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ２ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２４３】
「ＡＬＫ２ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ２ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０９６．１）は、次の通りである：
【化３０】
2019536439.tif 000031
【化３１】
2019536439.tif 000032
【０２４４】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ２ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化３２】
2019536439.tif 000033
【０２４５】
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２０で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０５．４のヌクレオチド４３１〜１９５７に対応する。細胞外ＡＬＫ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２１で示される。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ２ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ２の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ２ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１８または１９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号１８もしくは１９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２４７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ３ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ３」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−３タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ３タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ３への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ３ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２４８】
「ＡＬＫ３ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ３ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ３前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４３２０．２）は、次の通りである：
【化３３】
2019536439.tif 000034
【０２４９】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ３ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化３４】
2019536439.tif 000035
【０２５０】
ヒトＡＬＫ３前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２４で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３２９．２のヌクレオチド５４９〜２１４４に対応する。シグナル配列は、下線付きであり、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。細胞外ヒトＡＬＫ３ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２５で示される。
【０２５１】
活性（例えば、リガンド結合）ＡＬＫ３ポリペプチドの一般式は、配列番号２２の任意のアミノ酸位置２５〜３１（すなわち２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１位）で始まり、配列番号２２の任意のアミノ酸位置１４０〜１５２（すなわち、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２位）で終わるポリペプチドを含むものである。その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３３８，３７７号を参照されたい。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ３ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ３ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ３の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ３ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号２２の任意のアミノ酸位置２５〜３１（すなわち２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１位）で始まり、配列番号２２の任意のアミノ酸位置１４０〜１５３（すなわち、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２位）で終わるアミノ酸を含む少なくとも１つのＡＫＬ３ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号２２、２３、１１５、１１７、４０７または４０８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号２２、２３、１１５、１１７、４０７もしくは４０８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２５３】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ４」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−４タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ４タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ４への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２５４】
「ＡＬＫ４ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、次の通りである：
【化３５】
2019536439.tif 000036
【０２５５】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化３６】
2019536439.tif 000037
【０２５６】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２８）で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８〜１５９２に対応する。細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８で示される。
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォームＣ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６４７３３．３）は、次の通りである：
【化３７】
2019536439.tif 000038
【０２５７】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列（アイソフォームＣ）は、次の通りである：
【化３８】
2019536439.tif 000039
【０２５８】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列は、配列番号８５で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２８．３のヌクレオチド７８〜１７１５に対応する。細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列は、配列番号８６で示される。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号２６，２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３または４０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３もしくは４０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２６０】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ５」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−５タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ４タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ５への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ５ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２６１】
「ＡＬＫ５ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ５ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４６０３．１）は、次の通りである：
【化３９】
2019536439.tif 000040
【０２６２】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化４０】
2019536439.tif 000041
【０２６３】
ＡＬＫ５前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３２で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４６１２．２のヌクレオチド７７〜１５８５に対応する。細胞外ヒトＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３３で示される。
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５２５２２０７．１）は、次の通りである：
【化４１】
2019536439.tif 000042
【０２６４】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列（アイソフォーム２）は、次の通りである：
【化４２】
2019536439.tif 000043
【０２６５】
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号８９で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＸＭ＿００５２５２１５０．１のヌクレオチド７７〜１５９７に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号９０で示される。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ５ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ５の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ５ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３０、３１、８７または８８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号３０、３１、８７もしくは８８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２６７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ６」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−６タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ６タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ６への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ６ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２６８】
「ＡＬＫ６ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ６ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９４．１）は、次の通りである：
【化４３】
2019536439.tif 000044
【０２６９】
シグナルペプチドは、一重下線により示されており、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化４４】
2019536439.tif 000045
【０２７０】
ＡＬＫ６前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３６で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２０３．２のヌクレオチド２７５〜１７８０に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３７で示される。
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２４３７２２．１）は、次の通りである：
【化４５】
2019536439.tif 000046
【化４６】
2019536439.tif 000047
【０２７１】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチド配列（アイソフォーム２）は、次の通りである：
【化４７】
2019536439.tif 000048
【０２７２】
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号９３で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２５６７９３．１のヌクレオチド２２〜１６１７に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号９４で示される。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ６の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３４、３５、９１または９２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３４、３５、９１もしくは９２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２７４】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ７ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ７」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−７タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ７タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ７への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ７ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２７５】
「ＡＬＫ７ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ７ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ７についての４つの天然に存在するアイソフォームが記載されている。ヒトＡＬＫ７アイソフォーム１前駆体タンパク質の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６６０３０２．２）は、次の通りである：
【化４８】
2019536439.tif 000049
【０２７６】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ７アイソフォーム１ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化４９】
2019536439.tif 000050
【０２７７】
ヒトＡＬＫ７アイソフォーム１前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、下記で配列番号４０で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿１４５２５９．２のヌクレオチド２４４〜１７２２に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム１）をコードする核酸配列は、配列番号４１で示される。
【０２７８】
ヒトＡＬＫ７の代替アイソフォームであるアイソフォーム２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０４５０１．１）は、そのプロセシングされた形態で次の通り（配列番号３０１）に示され、ここで、細胞外ドメインは、太字フォントで示される。
【化５０】
2019536439.tif 000051
【化５１】
2019536439.tif 000052
細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）のアミノ酸配列は、次の通りである：
【０２７９】
【化５２】
2019536439.tif 000053
【０２８０】
プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、下記で配列番号３０３で示され、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３１．１のヌクレオチド２７９〜１６０７に対応する。
【０２８１】
細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号３０４で示される。
【０２８２】
代替ヒトＡＬＫ７前駆体タンパク質であるアイソフォーム３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０４５０２．１）は、次の通り（配列番号３０５）に示され、ここで、シグナルペプチドは、一重下線により示される。
【化５３】
2019536439.tif 000054
【０２８３】
プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム３）のアミノ酸配列は、次の通り（配列番号３０６）である。このアイソフォームは、膜貫通ドメインを欠き、したがって、その全体が可溶性であると提唱されている（Robertsら、２００３年、Biol  Reprod  ６８巻：１７１９〜１７２６頁）。配列番号３０６のＮ末端バリアントは、下記のように予測される。
【化５４】
2019536439.tif 000055
【０２８４】
プロセシングされていないＡＬＫ７ポリペプチド前駆体タンパク質（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号３０７で示され、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３２．１のヌクレオチド２４４〜１４８２に対応する。プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号３０８で示される。
【０２８５】
代替ヒトＡＬＫ７前駆体タンパク質であるアイソフォーム４のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１０４５０３．１）は、次の通り（配列番号３０９）に示され、ここで、シグナルペプチドは、一重下線により示される。
【化５５】
2019536439.tif 000056
【０２８６】
プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム４）のアミノ酸配列は、次の通り（配列番号３１０）である。ＡＬＫ７アイソフォーム３同様、アイソフォーム４は、膜貫通ドメインを欠き、したがって、その全体が可溶性であると提唱されている（Robertsら、２００３年、Biol  Reprod  ６８巻：１７１９〜１７２６頁）。配列番号３１０のＮ末端バリアントは、下記のように予測される。
【化５６】
2019536439.tif 000057
【０２８７】
プロセシングされていないＡＬＫ７ポリペプチド前駆体タンパク質（アイソフォーム４）をコードする核酸配列は、配列番号３１１で示され、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３３．１のヌクレオチド２４４〜１２４４に対応する。プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム４）をコードする核酸配列は、配列番号３１２で示される。
【０２８８】
ラットにおける完全長ＡＬＫ７（アイソフォーム１）のシグナル配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６２０７９０．１を参照されたい）に基づき、およびヒトＡＬＫ７とラットＡＬＫ７間の高い配列同一性度に基づき、プロセシングされた形態のヒトＡＬＫ７アイソフォーム１は、次の通り（配列番号３１３）であると予測される。
【化５７】
2019536439.tif 000058
【０２８９】
配列番号３９がＮ末端でアミノ酸１、２、３、４、５、６または７個分短縮されており、配列番号３１３がＮ末端でアミノ酸１または２個分短縮されている、プロセシングされたＡＬＫ７アイソフォーム１の活性バリアントが予測される。配列番号３１３と一致して、プロセシングされた形態のヒトＡＬＫ７アイソフォーム３（配列番号３０６）およびヒトＡＬＫ７アイソフォーム４（配列番号３１０）ではロイシンがＮ末端アミノ酸であると、さらに予想される。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ７ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ７ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ７の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ７ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３８、３９、１１２、１１４、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、４０５または４０６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３８、３９、１１２、１１４、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、４０５もしくは４０６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２９１】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、有効期間およびｉｎ  ｖｉｖｏでの耐タンパク質分解性）を増強するというような目的で、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）の構造を修飾することにより機能的バリアントを作製することを企図している。バリアントを、アミノ酸置換、欠失、付加、またはこれらの組合せにより産生することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩での、トレオニンのセリンでの孤立した置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連性があるアミノ酸での同様の置き換え（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想することは理にかなっている。保存的置き換えは、側鎖に関連性があるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的ホモログを生じさせるかどうかは、細胞において野生型ポリペプチドと同様の方法で応答を生じさせるバリアントポリペプチドの能力、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティーを含む、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、バリアントポリペプチドの能力を評定することによって、容易に判定することができる。
【０２９２】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性を増強する（例えば、有効期間延長、および／または耐タンパク質分解性増大）というような目的で、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドおよび／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの構造を修飾することにより機能的バリアントを作製することを企図している。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるための、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）受容体の特異的突然変異を企図している。そのような突然変異は、Ｏ連結またはＮ連結グリコシル化部位などの、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入するために、または消失させるために、選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、適切な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここでの「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を、一般に含む。ポリペプチドの配列への（Ｏ連結グリコシル化部位に対する）１つもしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基の付加により、またはそのような残基による置換により、変更を加えることもできる。グリコシル化認識部位の第１もしくは第３のアミノ酸位置の一方もしくは両方における様々なアミノ酸の置換もしくは欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ポリペプチド上の糖鎖部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドとポリペプチドとの化学的または酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング方法に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の糖鎖部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に遂行することができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処置は、アミノ酸配列を原形のまま残しつつ、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いてほとんどのまたはすべての糖を切断する結果となる。ポリペプチド上の糖鎖部分の酵素的切断は、Thotakuraら［Meth.  Enzymol.（１９８７年）１３８巻：３５０頁］によって記載されたような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により果すことができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は、すべて、ペプチドのアミノ酸配列による影響を受け得る異なるグリコシル化パターンを導入することができるので、使用する発現系のタイプに依存して、必要に応じてポリペプチドの配列を調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体複合体は、適切なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系において発現させることができるが、他の哺乳動物発現細胞系も有用であると予想される。
【０２９４】
本開示は、突然変異体、特に、本明細書で開示されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）のコンビナトリアル突然変異体のセット、ならびに短縮突然変異体を作製する方法をさらに企図している。コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、リガンド結合）ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体配列の同定に、特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変化またはリガンド結合の変化などの特性の変化を有するポリペプチドバリアントを生成することであり得る。様々なスクリーニングアッセイが下記で提供され、そのようなアッセイを使用してバリアントを評価することができる。例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよびＩＩ型受容体複合体バリアントを、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）に結合する能力、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体への結合を防止する能力、および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドによって引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力について、スクリーニングすることができる。
【０２９５】
本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の活性を、例えば、細胞に基づくｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで、試験することもできる。例えば、遺伝子の発現、または筋肉細胞での筋肉産生に関与するタンパク質の活性に対する、ヘテロ多量体複合体の効果を評定することができる。これを、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）の存在下で行うことができ、細胞に、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよびＩＩ型受容体複合体ならびに任意選択でＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを産生するように、トランスフェクトすることができる。同様に、本開示のヘテロ多量体複合体をマウスまたは他の動物に投与することができ、当技術分野で認知されている方法を使用して、筋肉形成および強度などの１つまたは複数の測定値を評定することができる。同様に、ヘテロ多量体またはそのバリアントの活性を、骨芽細胞、脂肪細胞および／または神経細胞において、これらの細胞の増殖に対する任意の効果について、例えば、本明細書に記載のアッセイおよび当技術分野において常識のアッセイにより、試験することができる。ＳＭＡＤ反応性レポーター遺伝子をそのような細胞系において使用して、下流のシグナル伝達に対する効果をモニターすることができる。
【０２９６】
参照ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と比較して選択性の増加または一般に効力の増大を有する、コンビナトリアル由来バリアントを生成することができる。そのようなバリアントは、組換えＤＮＡ構築物から発現された場合、遺伝子療法プロトコールで使用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する未修飾ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じさせることができる。例えば、変化したタンパク質を、タンパク質分解に対して、または未修飾ポリペプチドの崩壊もしくは別様の不活性化を生じさせる他の細胞過程に対して、より安定にまたはより不安定にさせることができる。そのようなバリアント、およびそれらをコードする遺伝子を利用して、ポリペプチドの半減期をモジュレートすることによりポリペプチド複合体レベルを変更することができる。例えば、短い半減期は、より短期的な生物学的効果を生じさせることができ、誘導性発現系の部分の場合、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルのより厳格な調節を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質では、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において突然変異を生じさせて、例えば免疫原性、半減期および可溶性を含む、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体の１つまたは複数の活性を変化させることができる。
【０２９７】
コンビナトリアルライブラリーは、可能性のあるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体配列の少なくとも一部分を各々が含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に遺伝子配列にライゲーションすることができ、したがって、可能性のあるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／もしくはＩＩ型受容体をコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして発現可能であり、または代替的に、より大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能である。
【０２９８】
縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるホモログのライブラリーを生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、次いで、合成遺伝子を、発現のための適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野において周知である。例えば、Narang,  SA（１９８３年）Tetrahedron  ３９巻：３頁；Itakuraら（１９８１年）Recombinant  DNA、Proc.  3rd  Cleveland  Sympos.  Macromolecules、AG  Walton編、Amsterdam:  Elsevier  ２７３〜２８９頁；Itakuraら（１９８４年）Annu.  Rev.  Biochem.  ５３巻：３２３頁；Itakuraら（１９８４年）Science  １９８巻：１０５６頁；Ikeら（１９８３年）Nucleic  Acid  Res.  １１巻：４７７頁を参照されたい。このような技術は、他のタンパク質の定方向進化に利用されてきた。例えば、Scottら（１９９０年）Science  ２４９巻：３８６〜３９０頁；Robertsら（１９９２年）PNAS  USA  ８９巻：２４２９〜２４３３頁；Devlinら（１９９０年）Science  ２４９巻：４０４〜４０６頁；Cwirlaら（１９９０年）PNAS  USA  ８７巻：６３７８〜６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照されたい。
【０２９９】
あるいは、他の形態の突然変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を生成し、ライブラリーから、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発［例えば、Rufら（１９９４年）Biochemistry  ３３巻：１５６５〜１５７２頁；Wangら（１９９４年）J.  Biol.  Chem.  ２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Balintら（１９９３年）Gene  １３７巻：１０９〜１１８頁；Grodbergら（１９９３年）Eur.  J.  Biochem.  ２１８巻：５９７〜６０１頁；Nagashimaら（１９９３年）J.  Biol.  Chem.  ２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Lowmanら（１９９１年）Biochemistry  ３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびCunninghamら（１９８９年）Science  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁を参照されたい］を使用するスクリーニングにより、リンカースキャニング突然変異誘発［例えば、Gustinら（１９９３年）Virology  １９３巻：６５３〜６６０頁；およびBrownら（１９９２年）Mol.  Cell  Biol.  １２巻：２６４４〜２６５２頁；McKnightら（１９８２年）Science  ２３２巻：３１６頁を参照されたい］により、飽和突然変異誘発［例えば、Meyersら（１９８６年）Science  ２３２巻：６１３頁を参照されたい］により；ＰＣＲ突然変異誘発［例えば、Leungら（１９８９年）Method  Cell  Mol  Biol  １巻：１１〜１９頁を参照されたい］により；または化学的突然変異誘発を含むランダム突然変異誘発「例えば、Millerら（１９９２年）A  Short  Course  in  Bacterial  Genetics、CSHL  Press、Cold  Spring  Harbor、NY；およびGreenerら（１９９４年）Strategies  in  Mol  Biol  ７巻：３２〜３４頁を参照されたい］により、単離することができる。特にコンビナトリアル設定での、リンカースキャニング突然変異誘発は、短縮された（生物活性）形態のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよび／またはＩＩ型受容体ポリペプチドを同定するための魅力的な方法である。
【０３００】
点突然変異および短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ついでに言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が、当技術分野において公知である。そのような技術は、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体のコンビナトリアル突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに、一般に、適応可能であろう。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用されている技術は、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングすること、結果として得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換させること、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を助長する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを、概して含む。好ましいアッセイは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）結合アッセイおよび／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイを含む。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよびＩＩ型ヘテロ多量体は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよび／またはＩＩ型受容体ポリペプチド中に天然に存在する何らかのものに加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。そのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加およびアセチル化を含むが、これらに限定されない。結果として、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよびＩＩ型ヘテロ多量体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類または単糖類、およびリン酸塩などの、非アミノ酸エレメントを含み得る。ヘテロ多量体複合体の機能性に対するそのような非アミノ酸エレメントの効果は、他のヘテロ多量体複合体バリアントについて本明細書で記載されるように試験することができる。本開示のポリペプチドが、新生形態のポリペプチドを切断することにより細胞において産生される場合、翻訳後プロセシングもタンパク質の適切なフォールディングおよび／または機能に重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、そのような翻訳後活性のための特異的細胞内機構および特徴的メカニズムを有し、それらの細胞を、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドならびにそれらを含むヘテロ多量体の適切な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。
【０３０２】
ある特定の態様では、本明細書で開示されるポリペプチドは、少なくとも１つのＩＩ型受容体ポリペプチドと共有結合または非共有結合で会合している少なくとも１つのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型ポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成し得る。好ましくは、本明細書で開示されるポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成するが、より高次のヘテロ多量体、例えば、これらに限定されないが、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらにオリゴマー構造（例えば、図１、２および１５を参照されたい）も含まれる。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよび／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書で開示される場合、「多量体化ドメイン」という用語は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間の共有結合性または非共有結合性相互作用を促進する、アミノ酸またはアミノ酸配列を指す。本明細書で開示されるポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合でまたは非表有結合で連結されることがある。好ましくは、多量体化ドメインは、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進するための、第１のポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型ポリペプチド）と第２のポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型ポリペプチド）の間の相互作用を促進し、任意選択で、ホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるか、または別様に不利な状態にし、それによって所望のヘテロ多量体（例えば、図１、２または１５を参照されたい）の収量を増加させる。
【０３０３】
本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を生成するために、当技術分野において公知の多くの方法を使用することができる。例えば、第１のポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型ポリペプチド）上の天然に存在するアミノ酸をシステインなどの遊離チオール含有残基で置き換え、その結果、遊離チオールが、第２のポリペプチド（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型ポリペプチド）上の別の遊離チオール含有残基と、第１のポリペプチドと第２のポリペプチド間にジスルフィド結合が形成されるように相互作用することにより、天然に存在しないジスルフィド結合を構築することができる。ヘテロ多量体形成を促進するための相互作用のさらなる例は、Kjaergaardら、ＷＯ２００７１４７９０１に記載されているものなどのイオン性相互作用；Kannanら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２に記載されているものなどの静電ステアリング効果；Christensenら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７に記載されているものなどのコイルドコイル相互作用；PackおよびPlueckthun、（１９９２年）Biochemistry  ３１巻：１５７９〜１５８４頁に記載されているものなどのロイシンジッパー；およびPackら（１９９３年）Bio/Technology  １１巻：１２７１〜１２７７頁に記載されているものなどのヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。様々なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィドブリッジなどによるような共有結合によって、またはアビジン−ビオチンもしくはロイシンジッパー技術によるような親和性相互作用によって、達成することができる。
【０３０４】
ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用対の一方の成分を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、第２のポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合している第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体であって、第１のポリペプチドが、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含む、タンパク質複合体を形成し得る。相互作用対は、複合体、特にヘテロ二量体複合体を形成するように相互作用する任意の２つのポリペプチド配列であってよいが、効力のある実施形態は、ホモ二量体複合体を形成することができる相互作用対を利用することもある。相互作用対の一方のメンバーを、例えば、配列番号１４、１５、１２４、１２６、４１３、４１４、１８、１９、１３６、１３８、４２１、４２２、２２、２３、１１５、１１７、４０７、４０８、２６、２７、８３、８４、１０４、１０６、４０３、４０４、３０、３１、８７、８８、１３９、１４１、４２３、４２４、３４、３５、９１、９２、１４２、１４４、４２５、４２６、３８、３９、３０１、３０２、３０５、３０６、３０９、３１０、３１３、１１２、１１４、４０５、４０６、９、１０、１１、１１８、１２０、４０９、４１０、１、２、３、４、５、６、１００、１０２、４０１、４０２、４６、４７、７１、７２、１２１、１２３、４１１、４１２、５０、５１、７５、７６、７９、８０、４２、４３、６７、６８、１２７、１２９、１３０、１３２、４１５、４１６、４１７および４１８のいずれか１つの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸配列からなるポリペプチド配列を含む、本明細書に記載のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドと融合させることができる。相互作用対を、血清半減期の延長などの特性／活性の向上を付与するように選択してもよく、または特性／活性の向上をもたらすために別の部分を結合させるアダプターとして作用するように選択してもよい。例えば、ポリエチレングリコール部分を、血清半減期の延長などの特性／活性の向上をもたらすために相互作用対の一方または両方の成分に結合させてもよい。
【０３０５】
相互作用対の第１および第２のメンバーは、非対称対であってもよく、これは、対のメンバーが、自己会合するのではなく優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称の相互作用対の第１および第２のメンバーは、ヘテロ二量体複合体（例えば、図２および１５を参照されたい）を形成するように会合し得る。あるいは、相互作用対は、無誘導であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性なく、互いに会合することもあり、または自己会合することもあり、したがって、同じアミノ酸配列を有することもあり、または異なるアミノ酸配列を有することもあることを意味する。したがって、無誘導相互作用対の第１および第２のメンバーは、ホモ二量体複合体を形成するように会合することもあり、またはヘテロ二量体複合体を形成するように会合することもある。任意選択で、相互作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと共有結合で会合する。任意選択で、相互作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと非共有結合で会合する。
【０３０６】
具体的な例として、本開示は、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインなどの免疫グロブリンの定常ドメインまたはＦｃドメインを含むポリペプチドに融合しているＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するＦｃドメインは、本明細書で提供される。ＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性のどちらかを低下させる他の突然変異は公知であり、まとめて、これらのバリアントのいずれもが本開示に含まれ、本開示のヘテロ多量体複合体の有利な成分として使用され得る。任意選択で、配列番号２０８のＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する完全長ＩｇＧ１に従って番号付けされた）などの残基における１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有する突然変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体に結合する能力が低下している。他の場合、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有する突然変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する能力が増大している。
【０３０７】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号３１００）。点線下線は、ヒンジ領域を示し、実線下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部には、本開示は、配列番号３１００に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在するバリアントは、配列番号３１００で使用された番号付けシステム（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照されたい）に従ってＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう。
【化５８】
2019536439.tif 000059
【０３０８】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号３２００）。点線下線は、ヒンジ領域を示し、二重下線は、配列にデータベースコンフリクトがある位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。一部には、本開示は、配列番号３２００に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【化５９】
2019536439.tif 000060
【０３０９】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用され得るアミノ酸配列の２つの例は、下記で示される。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖における場合の４倍以下の長さであることができ、３つの同一の１５残基セグメントを含有し、その前に同様の１７残基セグメントがある。下記で示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３３００）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有するが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３４００）は、完全長ヒンジ領域を含有する。各々の場合、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従って、点線下線は、ヒンジ領域を示し、実線下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部には、本開示は、配列番号３３００および３４００に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【化６０】
2019536439.tif 000061
【化６１】
2019536439.tif 000062
【０３１０】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照されたい）は、配列番号３３００に使用された番号付けシステムに変換した場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変異の１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照されたい］。具体的には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域のすべてを欠いている。バリアントＷＩＳは、ヒンジ領域に通常は存在する１１個に加えて７位に追加の鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域のすべて、およびヒンジの一部を欠く。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子形を表すこともあり、または別のガンマ鎖サブクラスを表すこともある。本開示は、これらのバリアントの１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含むさらなる融合タンパク質を提供する。
【０３１１】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号３５００）。点線下線は、ヒンジ領域を示す。一部には、本開示は、配列番号３５００に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【化６２】
2019536439.tif 000063
【０３１２】
Ｆｃドメインにおける種々の工学的に作製された突然変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３１００）に関して本明細書で提示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異を図５におけるＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから導出することができる。等しくないヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図５）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号３１００、３２００、３３００および３５００において異なるアミノ酸番号を有する。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号３１００、３２００、３３００および３５００）における所与のアミノ酸位置が、番号付けが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの場合のように（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体を包含するときの同じ位置とは異なる番号によって特定されることになることも理解され得る。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号３１００）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７）およびヒトＩｇＧ１重鎖における選択されたＣＨ３位置間の対応は、次の通りである。
【表１−１】
2019536439.tif 000064
【表１−２】
2019536439.tif 000065
【０３１３】
単一の細胞系からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生の際に生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二特異性抗体の産生の際に主として直面するように、鎖会合問題は、異なる重鎖および／または軽鎖が単一の細胞系において産生される場合に本質的に生じる複数の組合せの中から所望の多鎖タンパク質を効率的に産生させるという難題に関する［例えば、Kleinら（２０１２年）mAbs  ４巻：６５３〜６６３頁を参照されたい］。この問題は、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖が同じ細胞において産生される場合、最も深刻であり、この場合、１つだけが概して所望されるときに可能性のある鎖の組合せが（これらの一部は同一であるが）合計１６存在する。それにもかかわらず、同じ原理により、異なる（非対称）重鎖を２つだけ組み込む所望の多鎖融合タンパク質の収量減少が説明される。
【０３１４】
好ましい非対称の融合タンパク質を許容可能な収量で産生するために単一の細胞系においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望の対合を増加させる様々な方法が、当技術分野において公知である［例えば、Kleinら（２０１２年）mAbs  ４巻：６５３〜６６３頁；およびSpiessら（２０１５年）Molecular  Immunology  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁を参照されたい］。Ｆｃ含有鎖の所望の対合を達成するための方法は、電荷に基づく対合（静電ステアリング）、「ノブ−イントゥ−ホール」立体的対合、ＳＥＥＤｂｏｄｙ対合、およびロイシンジッパーに基づく対合を含むが、これらに限定されない。例えば、Ridgwayら（１９９６年）Protein  Eng  ９巻：６１７〜６２１頁；Merchantら（１９９８年）Nat  Biotech  １６巻：６７７〜６８１頁；Davisら（２０１０年）Protein  Eng  Des  Sel  ２３巻：１９５〜２０２頁；Gunasekaranら（２０１０年）；２８５巻：１９６３７〜１９６４６頁；Wranikら（２０１２年）J  Biol  Chem  ２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４、およびＷＯ２０１１／０３４６０５を参照されたい。本明細書に記載される通り、これらの方法を使用して、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体ポリペプチド、少なくとも２つの異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド、ならびに少なくとも２つの異なるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロ二量体を生成することができる。図１５を参照されたい。
【０３１５】
例えば、特定のポリペプチド間の相互作用を促進することができる１つの手段は、Arathoonら、Ｕ．Ｓ．７，１８３，０７６およびCarterら、Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８に記載されているものなどの、突出−イントゥ−空洞（protuberance-into-cavity）（ノブ−イントゥ−ホール）相補領域を工学的に作製することによるものである。「突出」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用対）の境界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突出と同一のまたは同様のサイズの相補的「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用対）の境界面に任意選択で作出される。適切な位置にあり、適切な寸法を有する突出または空洞が、第１または第２のポリペプチドのどちらかの境界面に存在する場合、対応する空洞または突出を、それぞれ、隣接する境界面に工学的に作製するだけでよい。
【０３１６】
中性ｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に荷電しており、リシン、アルギニンおよびヒスチジンは、正に荷電している。これらの荷電残基を使用して、ヘテロ二量体形成を促進すること、および同時にホモ二量体形成を妨げることができる。引力相互作用が、反対の電荷間で起こり、反発相互作用が、同じ電荷間で起こる。一部には、本明細書で開示されるタンパク質複合体は、荷電境界面残基の部位特異的突然変異誘発を行うことにより、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進するために引力相互作用を、および任意選択で、ホモ二量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるために反発相互作用を使用する。
【０３１７】
例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン境界面は、ドメイン−ドメイン相互作用に関与する４種の特有の荷電残基（charge  residue）対：Ａｓｐ３５６−Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７−Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２−Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖における残基番号付けが（’）により示されている］を含む。ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおける残基を指定するためにここで使用される番号付けスキームが、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに準拠することに留意されたい。ＣＨ３−ＣＨ３ドメイン相互作用に存在する２回対称性のため、各々の特有の相互作用は、構造に２回示されることになる（例えば、Ａｓｐ−３９９−Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９−Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９−Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体形成とホモ二量体形成の両方に有利である。第１の鎖における電荷極性を切り替える単一の突然変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；正電荷から負電荷へ）は、第１の鎖のホモ二量体の形成に不利な相互作用をもたらす。不利な相互作用は、同じ電荷（負−負；Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９’およびＤ３９９−Ｋ４０９Ｅ’）間で起こる反発相互作用に起因して生じる。第２の鎖における電荷極性を切り替える同様の突然変異（Ｄ３９９Ｋ’；負から正へ）は、第２の鎖のホモ二量体形成に不利な相互作用（Ｋ４０９’−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ−Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これら２つの突然変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロ二量体形成に有利な相互作用（Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９−Ｋ４０９’）をもたらす。
【０３１８】
ヘテロ二量体形成およびホモ二量体防止に対する静電ステアリング効果を、例えばＡｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０を含む第２の鎖における反対荷電残基と対合することもあり、またはしないこともある、さらなる荷電残基の突然変異によって、さらに増強することができる。下記の表は、本明細書で開示されるポリペプチド複合体のヘテロ多量体形成を増進するために単独でまたは組み合わせて使用することができる、可能性のある電荷変化突然変異を収載する。
【表２−１】
2019536439.tif 000066
【表２−２】
2019536439.tif 000067
【０３１９】
一部の実施形態では、本願の融合タンパク質におけるＣＨ３−ＣＨ３境界面を構成する１つまたは複数の残基は、相互作用が静電的に不利になるような荷電アミノ酸で置き換えられる。例えば、境界面における正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）は、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換えられる。あるいは、または前述の置換と組み合わせて、境界面における負荷電アミノ酸は、正荷電アミノ酸で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、所望の電荷特性を有する天然に存在しないアミノ酸で置き換えられる。負荷電残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）のＨｉｓへの突然変異が、立体的課題の原因になり得る、側鎖体積の増加につながることになることに留意されたい。さらに、Ｈｉｓプロトン供与体および受容体形態は、局在環境に依存する。これらの課題を設計戦略とともに考慮するべきである。境界面残基は、ヒトおよびマウスＩｇＧサブクラスにおいて高度に保存されるため、本明細書で開示される静電ステアリング効果をヒトおよびマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用することができる。この戦略をＣＨ３ドメイン境界面における非荷電残基の荷電残基への修飾に拡大することもできる。
【０３２０】
一部には、本開示は、電荷対合（静電ステアリング）に基づいて相補性になるように工学的に作製されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。静電相補性を有する１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドに任意に融合させて、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロマー複合体）の生成に有利であるように、第１のＦｃに相補的なＦｃ配列とともに共発現させることができる。静電ステアリングに基づくこの例では、工学的に作製されたアミノ酸置換が二重下線付きである、配列番号２００［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号２０１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］が、相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドを、配列番号２００または配列番号２０１の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２００および２０１）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化６３】
2019536439.tif 000068
【化６４】
2019536439.tif 000069
【０３２１】
一部には、本開示は、立体的相補性のために工学的に作製されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。一部には、本開示は、ノブ−イントゥ−ホール対合を立体的相補性の例として提供する。立体的相補性を有する１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドに任意に融合させて、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、第１のＦｃに相補的なＦｃ配列とともに共発現させることができる。ノブ−イントゥ−ホール対合に基づくこの例では、工学的に作製されたアミノ酸置換が二重下線付きである、配列番号２０２［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号２０３［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］が、相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを、配列番号２０２または配列番号２０３の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２０２および２０３）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化６５】
2019536439.tif 000070
【化６６】
2019536439.tif 000071
【０３２２】
工学的に作製されたジスルフィド結合と組み合わされたノブ−イントゥ−ホール対合に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号２０４［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号２０５［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］で開示される。これらの配列中の工学的に作製されたアミノ酸置換は二重下線付きであり、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを、配列番号２０４または配列番号２０５の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２０４および２０５）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化６７】
2019536439.tif 000072
【化６８】
2019536439.tif 000073
【０３２３】
一部には、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの指状嵌入β鎖セグメントを生成するように工学的に作製されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にする鎖交換工学的作製ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体の使用を含む［例えば、Davisら（２０１０年）Protein  Eng  Design  Sel  ２３巻：１９５〜２０２頁を参照されたい］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有する１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドに任意に融合させて、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、第１のＦｃに相補的なＦｃ配列とともに共発現させることができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）対合に基づくこの例では、ＩｇＡ  Ｆｃからの工学的に作製されたアミノ酸置換が二重下線付きである、配列番号２０６［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号２０７［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］が、相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを、配列番号２０６または配列番号２０７の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ＩｇＧ−ＩｇＡ対（配列番号２０６および２０７）において使用することができるＦｃ単量体を生成することになることは理解され得る。
【化６９】
2019536439.tif 000074
【化７０】
2019536439.tif 000075
【０３２４】
一部には、本開示は、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合された切断可能ロイシンジッパードメインを用いる非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロ二量体抗体重鎖の優先的構築を生じさせるのに十分である。例えば、Wranikら（２０１２年）J  Biol  Chem  ２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁を参照されたい。本明細書で開示される通り、ロイシンジッパー形成鎖に結合された１対のＦｃ配列の一方を、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずに、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドに任意に融合させて、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、相補的ロイシンジッパー形成鎖に結合されたＦｃ配列とともに共発現させることができる。精製後の細菌エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃでの構築物のタンパク質消化は、ロイシンジッパードメインを放出して、構造が天然Ｆｃの構造と同一であるＦｃ構築物をもたらすことができる。ロイシンジッパー対合に基づくこの例では、工学的に作製された相補的ロイシンジッパー配列が下線付きである、配列番号２１３［ｈＧ１Ｆｃ−Ａｐ１（酸性）］および配列番号２１４［ｈＧ１Ｆｃ−Ｂｐ１（塩基性）］が、相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドを、配列番号２１３または配列番号２１４の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずにｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）に結合されたロイシンジッパー形成配列が、下記の相補的ロイシンジッパー形成対（配列番号２１３および２１４）において使用することができるＦｃ単量体を生成することになることは理解され得る。
【化７１】
2019536439.tif 000076
【化７２】
2019536439.tif 000077
【０３２５】
ある特定の態様では、本開示は、Ｉ型受容体ポリペプチドの等電点（ｐＩ）を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含むＩ型受容体ポリペプチド（例えば、Ｉ型−Ｆｃ融合タンパク質）、および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの等電点を変化させる１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含むＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＩＩ型−Ｆｃ融合タンパク質）に関する。一部の実施形態では、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０より高いｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインが、完全多ドメインタンパク質の構築に選択される。他の実施形態では、約９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５または５．０未満のｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインが、完全多ドメインタンパク質の構築に選択される。単一のタンパク質が複数の電荷形態を有することになることは、当業者には理解されるであろう。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、タンパク質の電荷は、アミノ酸置換、カチオン化、脱アミノ化、カルボキシル末端アミノ酸不均質、リン酸化およびグリコシル化を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるメカニズムにより修飾することができる。
【０３２６】
タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動および様々なコンピュータアルゴリズムを含むがこれらに限定されない、様々な方法により決定することができる（例えば、Bjellqvistら、１９９３年、Electrophoresis  １４巻：１０２３頁を参照されたい）。一実施形態では、ｐＩは、多重温度冷蔵バス再循環ユニットおよびＥＰＳ  ３５０１  ＸＬ電源を備えた、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ２電気泳動システムを使用して決定される。プレキャストアンフォラインゲル（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＩ範囲２．５〜１０）に、タンパク質試料が負荷される。広範囲ｐＩマーカー標準物質（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｐＩ範囲３〜１０、８μＬ）が、タンパク質の相対ｐＩを決定するために使用される。電気泳動は、例えば、１５００Ｖ、５０ｍＡで１０５分間、行われる。ゲルは、例えば、精製水で１×に希釈されたＳｉｇｍａ固定液（５×）を使用して固定される。染色は、例えば、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一晩、室温で行われる。脱染は、例えば、２５％エタノール、８％酢酸および６７％精製水からなる溶液で行われる。等電点は、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ密度計を使用して標準物質の検量線と比較して決定される。１または複数の計量は、異なるｐＨ値、異なる温度、異なる剪断応力および異なる凍結／融解サイクルからなる群から選択される１つまたは複数の異なる条件下でドメインの安定性を特徴付ける計量をさらに含み得る。
【０３２７】
一部には、本開示は、所望のヘテロマー種の精製を助長するＦｃドメインにおけるさらなる突然変異と組み合わせての上記の方法により、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）および相補的Ｆｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの正荷電アミノ酸（例えば、アルギニン）（配列番号６６０および６７０）のさらなる置換を加えた、上記で開示されているような、工学的に作製されたジスルフィド結合と組み合わされたノブ−イントゥ−ホール対合に基づくＦｃドメインの相補性である。これら４つのアミノ酸置換は、等電点の差異に基づいて異種ポリペプチド混合物からの所望のヘテロマー融合タンパク質の選択的精製を助長する。これらの配列中の工学的に作製されたアミノ酸置換は、下に二重下線が付いており、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号６６０または配列番号６７０の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号６６０および６７０）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化７３】
2019536439.tif 000078
【化７４】
2019536439.tif 000079
【０３２８】
別の例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖（配列番号６８０）の２１３位におけるヒスチジンのアルギニンへの置換を加えた、上記で開示されているような、工学的に作製されたジスルフィド結合と組み合わされたノブ−イントゥ−ホール対合に基づくＦｃドメインの相補性を含む。この置換（Ｋａｂａｔらの番号付けシステムではＨ４３５Ｒと示される）は、プロテインＡに対する親和性の差異に基づいて望ましくないホモ二量体からの所望のヘテロマーの分離を助長する。工学的に作製されたアミノ酸置換は、二重下線により示され、構築物のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、配列番号６８０または配列番号２０５の両方ではないが、どちらかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図５を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、配列番号６８０（下記）および配列番号２０５の相補的ｈＧ１Ｆｃ対の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化７５】
2019536439.tif 000080
【０３２９】
Ｆｃドメインにおける種々の工学的に作製された突然変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３１００）に関して上記で提示されている。Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異を、図５中のＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから導出することができる。等しくないヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図５）に基づく類似のＦｃ位置は、次の表で要約される通り、配列番号３１００、３２００、３３００、３４００および３５００において異なるアミノ酸番号を有する。
【表３】
2019536439.tif 000081
【０３３０】
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントを、所望の機能性と一致する任意の様式で配列することができる。例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインを、異種ドメインのＣ末端側に配置してもよく、または代替的に、異種ドメインをＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／もしくはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインのＣ末端側に配置してもよい。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインならびに異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列を、どちらかのドメインのＣもしくはＮ末端側に含んでいてもよく、またはドメイン間に含んでいてもよい。
【０３３１】
例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含むことがある。Ｂ部分は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立して、０、１、または１より多くのアミノ酸であってもよく、Ａ部分とＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に結合されていてもよい。リンカーは、グリシン残基を多く含むことがあり（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３個のグリシン残基）、またはグリシンおよびプロリン残基を多く含むこともあり、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、またはトレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号５８）、ＧＧＧＧ（配列番号５９）、ＴＧＧＧＧ（配列番号６０）、ＳＧＧＧＧ（配列番号６１）、ＴＧＧＧ（配列番号６２）またはＳＧＧＧ（配列番号６３）シングレットまたはリピートを含有することもある。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうちの１つまたは複数を向上させるポリペプチド部分である）で示されるようなアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである）で示されるようなアミノ酸配列を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号１００、１０２、１０４、１０６、１１２、１１４、１１５、１１７、１１８、１２０、１２１、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５および４１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【０３３２】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体ヘテロ多量体は、所望の特性を付与するための１つまたは複数の異種部分（ドメイン）をさらに含む。例えば、一部の融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。そのような融合ドメインの周知の例は、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。親和性精製を目的として、グルタチオンコンジュゲート樹脂、アミラーゼコンジュゲート樹脂、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲート樹脂などの、親和性クロマトグラフィー用の適切なマトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーとともに有用なＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形態で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、リガンド捕捉ポリペプチドの検出を助長するように選択され得る。そのような検出ドメインの例は、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）はもちろん「エピトープタグ」も含み、エピトープタグは、通常は、特異的抗体が利用できる短いペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用できる周知のエピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグを含む。一部の場合、融合ドメインは、適切なプロテアーゼによる融合タンパク質の部分的消化を可能にし、それによって融合タンパク質からの組換えタンパク質の遊離を可能にする、プロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンのプロテアーゼ切断部位を有する。その場合、遊離されたタンパク質をその後のクロマトグラフ分離により融合ドメインから単離することができる。
【０３３３】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することができる１つまたは複数の修飾を含む。例えば、そのような修飾は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を向上させ、ポリペプチドの循環半減期を向上させ、および／またはポリペプチドのタンパク質分解を低減させる。そのような安定化修飾は、融合タンパク質（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドドメインならびにスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および糖鎖部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの糖鎖部分の除去を含む）を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のような融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すばかりでなく、非タンパク質様修飾、例えば、糖鎖部分、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性部分も含む。
【０３３４】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、単離されたポリペプチド複合体である。本明細書で使用される場合、単離されたタンパク質（もしくはタンパク質複合体）またはポリペプチド（もしくはポリペプチド複合体）は、その天然環境の成分から分離されているものである。一部の実施態様では、本開示のヘテロ多量体複合体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により判定して、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い純度に精製される。抗体純度を評定するための方法は、当技術分野において周知である［例えば、Flatmanら（２００７年）J.  Chromatogr.  B  ８４８巻：７９〜８７頁を参照されたい］。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体調製物は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を実質的に含まない。例えば、一部の実施形態では、ヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体調製物は、約１０％、９％、８％、７％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体、および約１０％、９％、８％、７％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドホモ多量体を含む。
【０３３５】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチド、ならびにこれらのヘテロ多量体は、様々な当技術分野で公知の技術により産生することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、Bodansky,  M.、Principles  of  Peptide  Synthesis、Springer  Verlag、Berlin（１９９３年）およびGrant  G.  A.（編）、Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide、W.  H.  Freeman  and  Company、New  York（１９９２年）に記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００を参照されたい）。あるいは、本開示のポリペプチドおよび複合体（それらの断片またはバリアントを含む）は、当技術分野において周知であるような様々な発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して組換えにより産生することができる。さらなる実施形態では、本開示の修飾または未修飾ポリペプチドは、組換えにより産生された完全長ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドを、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対合している塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することによって消化することにより、産生され得る。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）を使用して、タンパク質切断部位を同定することができる。
【０３３６】
本開示のＴＧＦ−ベータＩ型受容体ポリペプチド：ＴＧＦ−ベータＩＩ型受容体ポリペプチドヘテロ多量体に結合するリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）に結合する、およびそのようなリガンドに拮抗する抗体に関して、抗体を、そのようなリガンドのエピトープに結合する第１の部分であって、したがって、Ｉ型受容体と結合について競合するこの抗体の第１の部分を含み、そのようなリガンドのエピトープに結合する第２の部分であって、したがって、ＩＩ型受容体と結合について競合するこの抗体の第２の部分を含む二特異性抗体として設計することができると考えられる。この要領で、単一のリガンドを標的とする二特異性抗体を、ＡＬＫ７：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体により付与され得る二重のＩ型−ＩＩ型受容体結合遮断を模倣するように、設計することができる。同様に、少なくとも第１の抗体が、そのようなリガンドのエピトープに結合し、したがって、第１の抗体が、結合についてＩ型受容体と競合し、および少なくとも第２の抗体が、そのようなリガンドのエピトープに結合し、したがって、第２の抗体が、結合についてＩＩ型受容体と競合する、２つまたはそれより多くの抗体の組合せを使用して、同じ効果を達成することができるだろうと考えられる。
３．ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードする核酸
【０３３７】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体（それらの断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含む）をコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１２は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体ポリペプチドをコードし、その一方で、配列番号１３は、ＡｃｔＲＩＩＡの成熟細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖状であってもよく、または二本鎖状であってもよい。そのような核酸は、ＤＮＡ分子であってもよく、またはＲＮＡ分子であってもよい。これらの核酸は、例えば、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体を作製するための方法において使用することができる。
【０３３８】
本明細書で使用される場合、単離された核酸は、その天然の環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を元々含有する細胞内に含有されている核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０３３９】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３のいずれか１つのバリアントである核酸を含むと解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントを含む、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を含み、したがって、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３のいずれか１つで指定されるヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むことになる。
【０３４０】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である単離されたまたは組換え核酸配列によりコードされる。配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３に相補的な配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列もまた、本開示の範囲内であることは、当業者には理解されるであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されていてもよく、組換えであってもよく、および／または異種ヌクレオチド配列ともしくはＤＮＡライブラリー内で融合されていてもよい。
【０３４１】
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３で指定されるヌクレオチド配列、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３の相補配列、またはそれらの断片と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変えることができることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができるだろう。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度を、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーより選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度を、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から、約６５℃での高ストリンジェンシー条件へと増大させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または温度もしくは塩濃度を、他方の変数は変化させて、一定に保持してもよい。一実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣ、続いて室温で２×ＳＳＣでの洗浄という、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０３４２】
遺伝コードの縮重のため配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、３０３、３０４、３０７、３０８、３１１、３１２、１０１、１０５、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７、１４０および１４３で示される核酸とは異なる単離された核酸も、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が、１つより多くのトリップレットにより指定される。同じアミノ酸を規定するコドン、または同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンの同義コドンである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％以下）におけるこれらのバリエーションが、自然の対立遺伝子のバリエーションのために所与の種の個体間に存在し得ることを、当業者は理解するであろう。任意のおよびすべてのそのようなヌクレオチドのバリエーションならびに結果として生じるアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【０３４３】
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸を、発現構築物中の１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができる。制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適しているであろう。非常に多くのタイプの適切な発現ベクターおよび好適な制御配列が、様々な宿主細胞について当技術分野では公知である。典型的には、前記１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。当技術分野において公知であるような構成的または誘導性プロモーターが、本開示により企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または１つより多くのプロモーターのエレメントを併せ持つハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内のプラスミドなどのエピソーム上に存在することもあり、または発現構築物は染色体内に挿入されることもある。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変わることになる。
【０３４４】
本開示のある特定の態様では、対象核酸は、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む発現ベクター内に備えられている。制御配列は、当技術分野で認知されており、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメントを含む。例示的な制御配列は、Goeddel；Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology、Academic  Press、San  Diego、CA（１９９０年）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列に作動的に連結したときそのＤＮＡ配列の発現を調節する多種多様な発現調節配列のいずれかをこれらのベクターにおいて使用して、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現調節配列は、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが公知の他の配列、ならびにそれらの様々な組合せを含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプなどの因子に依存し得ることは理解されるはずである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによりコードされている任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮するべきである。
【０３４５】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物細胞）のどちらかまたは両方における発現に好適なベクターにライゲーションすることにより、産生させることができる。組換えＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの産生のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、好適なベクターは、次のタイプのプラスミドを含む：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【０３４６】
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの伝播を助長するための原核生物配列と、真核細胞において発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞と真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を助長するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下記の遺伝子療法送達系の説明の中で見つけることができる。プラスミドの調製の際および宿主生物の形質転換の際に利用される様々な方法が、当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方についての他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、例えば、Molecular  Cloning  A  Laboratory  Manual、第３版、Sambrook、FritschおよびManiatis編（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００１年）を参照されたい。一部の事例では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）を含む。
【０３４７】
好ましい実施形態では、ベクター、例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）は、ＣＨＯ細胞における対象ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの産生用に設計されることになる。明らかであろうが、対象遺伝子構築物を使用して、精製のために、培養で繁殖された細胞において対象ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの発現を生じさせて、例えば、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含む、タンパク質を産生させることができる。
【０３４８】
本開示は、対象ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの１つまたは複数についてのコード配列を含む組換え遺伝子がトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。宿主細胞は、いずれの原核または真核細胞であってもよい。例えば、本開示のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用して）、酵母、または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系］において発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０３４９】
したがって、本開示は、さらに、対象ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドを産生させる方法に関する。例えば、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドをコードする発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの発現を起こさせるのに適切な条件下で、培養することができる。ポリペプチドを分泌させ、細胞およびポリペプチドを含有する培地の混合物から単離することができる。あるいは、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、回収して溶解した細胞から得られる細胞質画分または膜画分から単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当技術分野において周知である。対象ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いる免疫親和性精製、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤を用いる親和性精製（例えば、プロテインＡカラムが、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体−Ｆｃおよび／またはＩＩ型受容体−Ｆｃ融合タンパク質を精製するために使用され得る）を含む、タンパク質を精製するための当技術分野において公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、または両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、その精製を助長するドメインを含有する融合タンパク質である。
【０３５０】
一部の実施形態では、精製は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成される。ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて精製を完了することができよう。ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体−Ｆｃおよび／またはＩＩ型受容体−Ｆｃ融合タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより判定して＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度に、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥにより判定して＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度に精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長類、齧歯類（マウス）、およびヒトにおいて望ましい結果を達成するのに十分であるレベルであるべきである。
【０３５１】
別の実施形態では、組換えＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その場合、精製リーダー配列を、その後、エンテロキナーゼでの処置により除去して、精製されたＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドを得ることができる。例えば、Hochuliら（１９８７年）J.  Chromatography  ４１１巻：１７７頁；およびJanknechtら（１９９１年）PNAS  USA  ８８巻：８９７２頁を参照されたい。
【０３５２】
融合遺伝子を作製する技術は、周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、従来の技術に従って、ライゲーションのために平滑末端または付着末端を利用して、適切な末端をもたらすために制限酵素消化を利用して、付着末端の埋め込みを適宜利用して、望ましくない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処置を利用して、および酵素的ライゲーションを利用して行われる。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続した遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、２つの連続した遺伝子断片をアニールして、キメラ遺伝子配列を生成することができる。例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら編、John  Wiley  &  Sons：１９９２年を参照されたい。
４．スクリーニングアッセイ
【０３５３】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリー受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するための、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ヘテロ多量体の使用に関する。このスクリーニングによって同定される化合物を試験して、骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンなどの組織をモジュレートするそれらの能力を評定することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組織成長をモジュレートするそれらの能力を評定することができる。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
【０３５４】
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達）を標的とすることにより組織成長をモジュレートするための治療剤をスクリーニングする非常の多くの手法がある。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングを行って、選択された細胞系に対するＴＧＦβスーパーファミリー受容体媒介効果を乱す薬剤を同定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の、その結合パートナー、例えば、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）への結合を特異的に阻害するかまたは低減させる化合物をスクリーニングし、同定するために行われる。あるいは、アッセイは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の、その結合パートナー、例えばＴＧＦβスーパーファミリーリガンドへの結合を増強する化合物を同定するために、使用することができる。さらなる実施形態では、化合物を、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と相互作用するそれらの能力により、同定することができる。
【０３５５】
様々なアッセイ形式は、十分であろうし、本開示に照らして、本明細書に明確に記載されていないものが、それにもかかわらず、当業者により把握されるであろう。本明細書に記載の本発明の試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアル化学的方法により作出され得る。あるいは、対象化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織成長のモジュレーターとして作用するそれらの能力について試験される化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物により産生されることもあり（例えば、天然産物）、化学的に生成されることもあり（例えば、ペプチド模倣物を含む小分子）、または組換えにより産生されることもある。本発明により企図される試験化合物は、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモン、および核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する有機小分子である。
【０３５６】
本開示の試験化合物を、単一の、個別の実体として提供することができ、またはコンビナトリアルケミストリーにより作製されたものなどの、複雑度がより大きいライブラリーで提供することができる。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験系に対する試験化合物の提示は、単離された形態での提示であってもよく、または特に初期スクリーニングステップでは、化合物の混合物としての提示であってもよい。任意選択で、化合物は、他の化合物と任意選択で誘導体化されることがあり、化合物の単離を助長する誘導体化基を有することがある。誘導体化基の非限定的な例は、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０３５７】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ハイスループットアッセイは、所与の期間内に調査される化合物の数を最大化するために望ましい。精製または半精製タンパク質を用いて誘導され得るものなどの、無細胞系において行われるアッセイは、試験化合物により媒介される分子標的の変化の迅速な発生および比較的容易な検出を可能にするようにそれらを生成することができるという点で、「一次」スクリーンとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの効果は、その代わりに、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とその結合パートナー（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）との間の結合親和性の変化で顕在化され得るような分子標的に対する薬物の効果に主眼が置かれるアッセイであるｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では、一般に無視することができる。
【０３５８】
単に説明するために、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、目的の化合物を、アッセイの意図に応じて、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに通常結合することができる単離され精製されたＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と接触させる。次いで、化合物およびＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の混合物を、適切なＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）を含有する組成物に添加する。ヘテロ多量体−スーパーファミリーリガンドの検出および定量は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とその結合タンパク質の間の複合体形成を阻害する（または増強する）点での化合物の有効性を判定する手段となる。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を使用して得られるデータから用量反応曲線を生成することにより評定することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較のためのベースラインを得ることもできる。例えば、対照アッセイでは、単離され精製されたＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を含有する組成物に添加し、ヘテロ多量体−リガンド複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量する。一般に、反応物を混合し得る順序を変えることができ、同時に混合することができることは理解されるであろう。さらに、好適な無細胞アッセイ系をもたらすために、精製されたタンパク質の代わりに細胞の抽出物および溶解物を使用してもよい。
【０３５９】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の、別のタンパク質への結合は、様々な技術により検出することができる。例えば、複合体の形成のモジュレーションを、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識された（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈ）、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）または酵素標識されたＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体および／またはその結合タンパク質を使用して、イムノアッセイにより、またはクロマトグラフ検出により、定量することができる。
【０３６０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とその結合タンパク質との間の相互作用の程度を直接的または間接的に測定する際の蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図している。さらに、光導波路（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号を参照されたい）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサーおよび面積力センサーに基づくものなどの他の検出方法が、本開示の多くの実施形態に適合する。
【０３６１】
さらに、本開示は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とその結合パートナーとの間の相互作用を妨げるまたは増強する薬剤を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用捕捉アッセイの使用を企図している。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervosら（１９９３年）Cell  ７２：２２３〜２３２頁；Maduraら（１９９３年）J  Biol  Chem  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Bartelら（１９９３年）Biotechniques  １４巻：９２０〜９２４頁；およびIwabuchiら（１９９３年）Oncogene  ８巻：１６９３〜１６９６頁を参照されたい。特定の実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッド系の使用を企図している［例えば、VidalおよびLegrain、（１９９９年）Nucleic  Acids  Res  ２７巻：９１９〜２９頁；VidalおよびLegrain、（１９９９年）Trends  Biotechnol  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号、同第５，９５５，２８０号および同第５，９６５，３６８号を参照されたい］。
【０３６２】
ある特定の実施形態では、対象化合物は、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と相互作用するそれらの能力により同定される。化合物とＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体との間の相互作用は、共有結合性であることもあり、または非共有結合性であることもある。例えば、そのような相互作用を、光架橋、放射標識リガンド結合、および親和性クロマトグラフィーを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで同定することができる。例えば、Jakoby  WBら（１９７４年）Methods  in  Enzymology  ４６巻：１号を参照されたい。ある特定の場合、化合物を、メカニズムに基づくアッセイ、例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体に結合する化合物を検出するためのアッセイで、スクリーニングすることができる。これは、固相または流体相結合事象を含み得る。あるいは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体をコードする遺伝子を、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）で細胞にトランスフェクトし、ライブラリーに対して好ましくはハイスループットスクリーニングにより、またはライブラリーの個々のメンバーに関して、スクリーニングすることができる。メカニズムに基づく他の結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用してもよい。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された標的、または固定化された抗体により捕捉された標的、またはキャピラリー電気泳動により分割された標的を用いて、行うことができる。結合した化合物は、通常、比色エンドポイントまたは蛍光もしくは表面プラズモン共鳴を使用して検出され得る。
５．例示的な治療使用
【０３６３】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、ＴＧＦβスーパーファミリー受容体（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）および／またはＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）の異常な活性に関連する疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。これらの疾患、障害または状態は、一般に、本明細書では「ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態」または「ＴＧＦβスーパーファミリー関連障害」と称される。ある特定の実施形態では、本発明は、個体に、治療有効量の本明細書に記載されているＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せを投与することにより、それを必要とする個体を処置または予防する方法を提供する。本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体のいずれも、本明細書で開示される治療使用のために個々にまたは組み合わせて利用することができる可能性がある。これらの方法は、例えば齧歯類、霊長類およびヒトを含む哺乳動物の治療的および予防的処置を特に目的とする。
【０３６４】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計学的試料において、未処置対照試料と比較して処置試料において障害または状態の発生率を低下させる、あるいは未処置対照試料と比較して障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を遅延させるか、または症状の重症度を低下させる化合物を指す。「処置すること」という用語は、本明細書で使用される場合、一旦確立された状態の改善または除去を含む。いずれにせよ、予防または処置は、医師または他の医療提供者により提供される診断、および治療剤の投与についての意図した結果で識別され得る。
【０３６５】
ＴＧＦβスーパーファミリー受容体−リガンド複合体は、組織成長はもちろん、初期発生過程、例えば様々な構造の適切な形成にも、または性発達、下垂体ホルモン産生ならびに骨および軟骨の生成を含む、１つもしくは複数の発生後の能力にも、不可欠な役割を果す。したがって、ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態／障害は、異常な組織成長および発達異常を含む。加えて、ＴＧＦβスーパーファミリー関連状態は、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患および腫瘍などの、細胞増殖および分化の障害を含むが、これらに限定されない。
【０３６６】
例示的なＴＧＦβスーパーファミリー関連状態は、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮症）、うっ血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤに関連する筋消耗）、筋消耗症候群、サルコペニア、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、成人発症型糖尿病）、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）を含む。他の例示的なＴＧＦβスーパーファミリー関連状態は、筋変性および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）、ならびに免疫障害（例えば、リンパ球の異常な増殖または機能に関連する障害）を含む。
【０３６７】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、筋ジストロフィーの処置の一部として使用される。「筋ジストロフィー」という用語は、骨格筋ならびに時には心筋および呼吸筋の漸進的衰弱および低下を特徴とする変性筋疾患群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化で始まる進行性筋消耗および筋力低下を特徴とする遺伝性障害である。筋肉が徐々に変性するにつれて、その人の筋力が低下する。対象ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体を含むレジメンで処置することができる例示的な筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エミリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー・デジュリン型としても公知）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ；スタイナート病としても公知）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）を含む。
【０３６８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、１８６０年代にフランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代にＤＭＤのこのバリアントを最初に記載したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒにちなんで名付けられたものである。ＤＭＤは、男性における最も頻度の高い遺伝性疾患の１つであり、男児３，５００名に１名が発症する。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕上に位置するジストロフィン遺伝子が欠損している場合に起こる。男性は、Ｘ染色体のコピーを１つしか保有しないので、ジストロフィンのコピーを１つしか有さない。ジストロフィンタンパク質がないと、筋肉は、収縮および弛緩のサイクル中に容易に損傷される。この疾患の早期の間は、筋肉は再生により代償するが、後になると、筋肉前駆細胞は進行中の損傷についていくことができず、健常な筋肉は非機能性線維脂肪組織に置き換えられる。
【０３６９】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における種々の突然変異の結果として生じる。ＢＭＤ患者は、多少のジストロフィンを有するが、それは、不十分な量であるか、または質が悪い。多少のジストロフィンの存在は、ＢＭＤを有する患者の筋肉を、ＤＭＤを有する患者の筋肉ほど重度にまたは急速に変性しないように保護する。
【０３７０】
動物での研究は、ＧＤＦ８シグナル伝達経路の阻害が、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者における疾患の様々な態様を有効に処置し得ることを示す（Bogdanovichら、２００２年、Nature  ４２０巻：４１８〜４２１頁；Pistilliら、２０１１年、Am  J  Pathol  １７８巻：１２８７〜１２９７頁）。したがって、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体は、ＧＤＦ８阻害剤（アンタゴニスト）として作用することができ、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者においてｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ８および／または関連ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによるシグナル伝達を遮断する代替手段となり得る。
【０３７１】
同様に、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、筋肉成長を必要とする他の疾患状態において筋肉量を増加させるための有効な手段となり得る。例えば、ルー・ゲーリック病または運動ニューロン疾患とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、骨格筋収縮の開始に必要な中枢神経系の成分である運動ニューロンを攻撃する、慢性、進行性かつ不治のＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンが劣化して最終的には死滅し、人の脳は通常は十分に機能および警告し続けるが、筋収縮の開始は脊髄レベルで遮断される。ＡＬＳを発症する個体は、典型的には４０〜７０歳の間であり、変性する最初の運動ニューロンは、腕または脚の神経を支配するものである。ＡＬＳを有する患者は、歩行が困難であることがあり、物を落とすことがあり、転倒することがあり、発語が不明瞭になることがあり、こらえきれずに笑うまたは泣くことがある。疾患が進行するにつれて、肢の筋肉が、廃用により萎縮し始める。筋力低下は、衰弱させることになり、患者は、最終的には、車椅子を必要とするか、または寝たきりになる。大部分のＡＬＳ患者は、呼吸不全がもとで、または肺炎のような人工呼吸器による補助の合併症がもとで、疾患発症から３〜５年で死亡する。
【０３７２】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体による筋肉量増加の促進は、筋消耗疾患に罹患している者にも恩恵をもたらす可能性がある。Gonzalez-Cadavidら（上掲）は、ＧＤＦ８発現が、ヒトの除脂肪体重と逆相関すること、およびＧＤＦ８遺伝子の発現増加が、ＡＩＤＳ消耗症候群を有する男性の体重減少に関連することを報告した。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８の機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状を、完全には除去しないにしても、緩和することができ、したがって、ＡＩＤＳ患者の生活の質を有意に向上させることができる。
【０３７３】
ＧＤＦ８機能の喪失は、栄養摂取量の減少のない脂肪減少にも関連する（Zimmersら、上掲；McPherronおよびLee、上掲）ので、対象ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、さらに、肥満および２型糖尿病の発生を緩徐化または予防するための治療剤として使用することができる。
【０３７４】
がん食欲不振−悪液質症候群は、がんの最も衰弱性および致死性の高い態様の１つである。この症候群は、多くのタイプのがんの−死亡時にがん患者のおおよそ８０％に存在する−共通の特徴であり、生活の質不良および化学療法に対する応答不良の原因になるばかりでなく、同等の腫瘍を有するが体重減少のない患者で見出される生存期間より短い生存期間の原因にもなる。がんを有する患者において、発病前の体重の５パーセントより大きい不随意の体重減少が、６カ月以内に起こった場合、悪液質が概して疑われる。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗ならびに精神的苦痛を伴い、悪液質は、がんと宿主間の複雑な相互作用から生じる。がん悪液質は、サイトカイン産生、脂質動員およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変化に影響を与える。食欲不振は一般的であるとはいえ、食物摂取量減少単独ではがん患者に見られる体組成の変化を説明することができず、栄養摂取量を増加させることで消耗症候群を好転させることはできない。現在、悪液質過程を調節する処置も、好転させる処置もない。成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身性過剰発現は、ヒト悪液質症候群に見られるものに類似した顕著な筋肉および脂肪減少を誘導することが判明した（Zimmersら、上掲）ので、対象ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体医薬組成物は、筋肉成長が所望される悪液質症候群の症状の予防、処置または緩和に有益に使用することができる。上記の筋肉喪失の予防、処置または緩和に有用なヘテロ多量体の例は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃである。
【０３７５】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、骨および／もしくは軟骨形成を誘導する方法、骨量減少を予防する方法、骨石灰化を増加させる方法、骨の脱灰を予防する方法、ならびに／または骨密度を増加させる方法において、使用することができる。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体は、潜在性低骨密度と診断された患者において、骨粗鬆症の発症に対する防御対策として有用であり得る。
【０３７６】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損の治癒において医療利用され得る。対象方法および組成物はまた、開放性骨折ばかりでなく閉鎖性骨折の整復の際にも、およびまた人工関節の固定の改善にも、予防的に使用され得る。骨形成剤により誘発される新規骨形成は、先天性である、外傷により誘発される、または腫瘍学的切除により引き起こされる、頭蓋顔面欠損の修復に有用であり、美容整形外科にも有用である。さらに、本発明の方法および組成物は、歯周病の処置において、および他の歯修復過程において使用することができる。ある特定の場合、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、造骨細胞を引きつけるための、造骨細胞の増殖を刺激するための、または造骨細胞の前駆体の分化を誘導するための環境を提供することができる。本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、骨粗鬆症の処置にも有用であり得る。さらに、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を、軟骨欠損の修復、および変形性関節症の予防／好転に使用することができる。上記の骨形成の誘発、骨量減少の予防、骨石灰化の増加、骨の脱灰の予防および／または骨密度の増加に有用なヘテロ多量体の例は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃである。
【０３７７】
本発明の方法および組成物は、骨量減少を特徴とするまたは引き起こす状態、例えば、骨粗鬆症（二次性骨粗鬆症を含む）、副甲状腺機能亢進症、慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常症、性ホルモン枯渇もしくは除去（例えば、アンドロゲンおよび／もしくはエストロゲン）、グルココルチコイド処置、関節リウマチ、重症熱傷、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、低カルシウム血症、低リン血症、骨軟化症（腫瘍性骨軟化症を含む）、高リン血症、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能亢進症（家族性副甲状腺機能亢進症を含む）および偽性副甲状腺機能低下症、骨への腫瘍転移、腫瘍もしくは化学療法の結果としての骨量減少、骨および骨髄の腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）、虚血性骨障害、歯周病および口腔骨量減少、クッシング病、パジェット病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不全、腎尿細管性アシドーシス、または神経性食欲不振症に適用することができる。本発明の方法および組成物は、偽関節骨折、別様に治りが遅い骨折、胎児および新生児骨異形成症（例えば、低カルシウム血症、高カルシウム血症、カルシウム受容体欠損およびビタミンＤ欠乏症）、骨壊死（顎の骨壊死を含む）ならびに骨形成不全症を含む、骨形成または治癒不全を特徴とする状態にも適用することができる。加えて、同化作用に起因して、そのようなアンタゴニストは、骨損傷または侵食に関連する骨痛を軽減することになる。骨吸収抑制作用の結果として、そのようなアンタゴニストは、異常骨形成の障害、例えば、骨芽球性腫瘍転移（例えば、原発性前立腺または乳がんに関連するもの）、骨原性骨肉腫、大理石骨病、進行性骨幹異形成症、骨内膜性骨増殖症、骨斑紋症、および流蝋骨症を処置するのに有用であり得る。処置することができる他の障害は、線維性異形成症および軟骨異形成症を含む。
【０３７８】
別の特定の実施形態では、本開示は、骨折あるいは軟骨および／もしくは骨欠損または歯周病に関連する他の状態を修復するための治療方法および組成物を提供する。本発明は、さらに、創傷治癒および組織修復のための治療方法および組成物を提供する。創傷のタイプは、熱傷、切創および潰瘍を含むが、これらに限定されない。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８４／０１１０６を参照されたい。そのような組成物は、治療有効量の本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体の少なくとも１つを、薬学的に許容されるビヒクル、担体またはマトリックスとの混合物で含む。
【０３７９】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、骨量減少を引き起こす状態、例えば、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、クッシング病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態もしくは吸収不全、腎尿細管性アシドーシス、または神経性食欲不振症に適用することができる。女性であること、低体重を有すること、およびセデンタリーライフスタイルにつながることが、骨粗鬆症（骨折リスクにつながる、骨塩密度の低下）のリスク因子であることは、一般に理解される。しかし、骨粗鬆症は、ある特定の医薬の長期使用の結果として生じることもある。薬物または別の医学的状態の結果として生じる骨粗鬆症は、二次性骨粗鬆症として公知である。クッシング病では、身体により産生される（produceds）過剰量のコルチゾールが、骨粗鬆症および骨折をもたらす。二次性骨粗鬆症に関連する最も一般的な医薬は、副腎皮質ステロイド薬であり、これは、副腎により天然に産生されるホルモンであるコルチゾールのように作用する薬物群である。十分なレベルの甲状腺ホルモンが骨格の発達に必要とされるが、過剰な甲状腺ホルモンは、徐々に骨量を減少させ得る。アルミニウムを含有する制酸薬は、腎臓の問題を有する人々、特に、透析を受けている人々が高用量で摂取すると、骨量減少につながり得る。二次性骨粗鬆症を引き起こすことがある他の医薬は、てんかん発作を予防するために使用される、フェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ）およびバルビツレート；一部の型の関節炎、がんおよび免疫障害のための薬物であるメトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｆｏｌｅｘ  ＰＦＳ）；一部の自己免疫疾患を処置するために、および臓器移植患者において免疫系を抑制するために使用される薬物であるシクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）；前立腺がんおよび子宮内膜症を処置するために使用される黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ）；抗凝固薬であるヘパリン（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ、Ｌｉｑｕａｅｍｉｎ）；ならびに高コレステロールを処置するために使用される、コレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）を含む。がん治療の結果として生じる骨量減少は、広く認知されており、がん治療関連骨量減少（ＣＴＩＢＬ）と称される。骨転移は、骨に空洞を生じさせることがあり、それらの空洞をＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体での処置により治すことができる。骨量減少は、歯肉の陥凹部にある細菌が毒素および有害酵素を産生する慢性感染症である歯肉疾患によっても引き起こされることがある。
【０３８０】
さらなる実施形態では、本開示は、異常なまたは望ましくない骨成長に関連する疾患または障害を処置するための方法および治療剤を提供する。例えば、先天性障害である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を有する患者は、生活の質に対して大きな影響を及ぼす、軟部組織において自然発症的にまたは組織外傷に応答して進行する異所性骨成長により苦しめられる。加えて、異常な骨成長は、人工股関節置換術後に起こることがあり、したがって、手術結果を損なわせ得る。これは、病的骨成長、ならびに対象方法および組成物が治療的に有用であり得る状況の、より一般的な例である。同方法および組成物は、他の形態の異常な骨成長（例えば、外傷、熱傷または脊髄傷害後の骨の病的成長）を処置するのに、および転移性前立腺がんまたは骨肉腫に関連して見られる異常な骨成長に関連する望ましくない状態を処置または予防するのにも有用であり得る。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せを、がんを有する患者において骨形成を促進するために使用することができる。ある特定の腫瘍（例えば、前立腺、乳房、多発性骨髄腫、または副甲状腺機能亢進症を引き起こす任意の腫瘍）を有する患者は、腫瘍誘発性骨量減少、骨転移および治療剤に起因する骨量減少のリスクが高い。そのような患者は、骨量減少または骨転移の証拠の非存在下であっても、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはヘテロ多量体の組合せで処置することができる。患者を、骨量減少または骨転移の証拠についてモニターすることもでき、指標がリスク増大を示唆する場合にはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置することができる。一般に、ＤＥＸＡスキャンが骨密度の変化を評定するために利用されるが、骨リモデリングの指標を使用して、骨転移の尤度を評定してもよい。血清マーカーをモニターしてもよい。骨型アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）は、骨芽細胞中に存在する酵素である。ＢＳＡＰの血中レベルは、骨転移および骨リモデリング増加をもたらす他の状態を有する患者において増加する。オステオカルシンおよびプロコラーゲンペプチドも、骨形成および骨転移に関連付けられる。前立腺がんにより引き起こされる骨転移を有する患者において、およびそれ程ではないが、乳がんからの骨転移において、ＢＳＡＰの増加が検出されている。ＢＭＰ７レベルは、骨に転移した前立腺がんでは高いが、膀胱、皮膚、肝臓または肺がんに起因する骨転移では高くない。Ｉ型カルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）は、骨吸収中に形成されるコラーゲンにおいて見出される架橋である。骨は、絶えず破壊され、再形成されるので、ＩＣＴＰは、全身で見出されるであろう。しかし、骨転移部位でのレベルは、正常な骨の領域より有意に高くなる。ＩＣＴＰは、前立腺、肺および乳がんに起因する骨転移において高レベルで見出された。別のコラーゲン架橋である、Ｉ型Ｎ末端テロペプチド（ＮＴｘ）は、骨代謝回転中にＩＣＴＰとともに産生される。ＮＴｘの量は、肺、前立腺および乳がんを含む多くの異なるタイプのがんにより引き起こされる骨転移において増加される。また、ＮＴｘのレベルは、骨転移の進行とともに増加する。したがって、このマーカーは、転移の検出にも、疾患の程度の測定にも、使用することができる。吸収についての他のマーカーは、ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンを含む。吸収マーカーおよび骨転移マーカーの何らかの増加は、患者において、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体の組合せでの治療が必要であることを示す。
【０３８２】
本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せを、他の骨活性医薬品と併せて投与してもよい。併せての投与は、単一の共製剤の投与により遂行してもよく、同時投与により遂行してもよく、または別々の時点での投与により遂行してもよい。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、他の骨活性薬剤とともに投与されると、特に有利であり得る。患者は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の摂取と、カルシウムサプリメント服用、ビタミンＤ服用、適切な運動の実施、および／または、一部の場合、他の医薬の利用とを併せて行うことから恩恵を受けることができる。他の医薬の例は、ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモンおよびラロキシフェンを含む。ビスホスホネート（アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲンおよびラロキシフェンは、骨リモデリングサイクルに影響を与え、骨吸収抑制薬として分類される。骨リモデリングは、骨吸収および骨形成という２つの異なるステージからなる。骨吸収抑制薬は、骨リモデリングサイクルの骨吸収部分を緩徐化するか、または停止させるが、このサイクルの骨形成部分を緩徐化しない。結果として、新たな形成が骨吸収より速い速度で継続し、骨密度が徐々に増加し得る。副甲状腺ホルモンの１形態であるテリパラチドは、骨リモデリングサイクルにおける骨形成の速度を増大させる。アレンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防（１日に５ｍｇまたは週１回３５ｍｇ）と処置（１日に１０ｍｇまたは週１回７０ｍｇ）の両方に認可されている。アレンドロネートは、骨量減少を低減させ、骨密度を増加させ、脊椎、手首および股関節骨折のリスクを低下させる。アレンドロネートは、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンおよびコルチゾン）の長期使用の結果としての男性および女性におけるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症の処置ならびに男性における骨粗鬆症の処置にも認可されている。アレンドロネート＋ビタミンＤは、閉経後の女性における骨粗鬆症の処置（週１回７０ｍｇ＋ビタミンＤ）に、および骨粗鬆症を有する男性における骨量を改善する処置に認可されている。イバンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置に認可されている。月１回のピル（１５０ｍｇ）として摂取する場合、イバンドロネートを毎月同じ日に摂取するべきである。イバンドロネートは、骨量減少を低減させ、骨密度を増加させ、脊椎骨折のリスクを低下させる。リセドロネートは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置に認可されている。毎日（５ｍｇ用量）または週１回（３５ｍｇ用量、または３５ｍｇ用量とカルシウム）を摂取すると、リセドロネートは、骨量減少を緩徐化し、骨密度を増加させ、脊椎および非脊椎骨折のリスクを低下させる。リセドロネートは、これらの医薬（すなわち、プレドニゾンまたはコルチゾン）の長期使用の結果として生じるグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症を予防および／または処置するための男性および女性による使用にも認可されている。カルシトニンは、カルシウム制御および骨代謝に関与する、天然に存在するホルモンである。閉経してから５年を超えている女性では、カルシトニンは、骨量減少を緩徐化し、脊椎骨密度を増加させ、骨折に関連する疼痛を軽減し得る。カルシトニンは、脊柱骨折のリスクを低下させる。カルシトニンは、注射（１日に５０〜１００ＩＵ）または鼻腔用スプレー（１日に２００ＩＵ）として利用可能である。
【０３８３】
患者はまた、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せおよびさらなる骨活性薬を併せて摂取することから恩恵を受けることができる。エストロゲン療法（ＥＴ）／ホルモン療法（ＨＴ）は、骨粗鬆症の予防に認可されている。ＥＴは、骨量減少を低減させ、脊椎と股関節の両方における骨密度を増加させ、閉経後の女性における股関節および脊椎骨折のリスクを低下させることが証明されている。ＥＴは、最も一般的には、１日におおよそ０．３ｍｇの低用量または１日におおよそ０．６２５ｍｇの標準用量を送達するピルまたは皮膚パッチの形態で投与され、７０歳を過ぎてから開始した場合でさえ有効である。エストロゲンは、単独で利用された場合、女性の子宮内膜のがん（子宮内膜がん）を発症するリスクを増加させることがある。このリスクをなくすために、医療提供者は、無傷の子宮を有する女性に、ホルモンプロゲスチンをエストロゲンと組み合わせて処方する（ホルモン補充療法またはＨＴ）。ＥＴ／ＨＴは、更年期症状を軽減し、骨の健康に対して有益な効果があることが証明されている。副作用は、膣出血、乳房圧痛、気分障害および胆嚢疾患を含み得る。ラロキシフェン、１日に６０ｍｇは、閉経後骨粗鬆症の予防および処置に認可されている。ラロキシフェンは、エストロゲンの有益な効果を、それらの潜在的欠点を伴うことなく、提供するために開発されてきた、選択的エステロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）と呼ばれる薬物群からのものである。ラロキシフェンは、骨量を増加させ、脊椎骨折のリスクを低下させる。ラロキシフェンが、股関節および他の非脊椎骨折のリスクを低下させることができることを実証するためのデータは、まだ入手できない。副甲状腺ホルモンの１形態であるテリパラチドは、閉経後の女性および骨折リスクの高い男性における骨粗鬆症の処置に認可されている。この医薬は、新たな骨形成を刺激し、骨塩密度を有意に増加させる。閉経後女性では、脊椎、股関節、足、肋骨および手首において骨折低減が認められた。男性では、脊椎で骨折低減が認められたが、他の部位での骨折低減を評価するのに十分なデータはなかった。テリパラチドは、２４カ月以下の間、連日注射として自己投与される。
【０３８４】
他の実施形態では、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せを、動物における体脂肪含量を制御するために、および体脂肪含量に関連する状態、特に、体脂肪含量に関連する健康を損なう状態を処置または予防するために使用することができる。本発明によれば、体重を制御する（調節する）ことは、体重を低下もしくは増加させること、体重増加率を低下もしくは増大させること、または体重減少率を増大もしくは低下させることを指すことができ、体重を積極的に維持することまたは有意に変化させないこと（例えば、そうしなければ体重を増加または減少させる可能性がある外的または内的影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せを投与することにより、体重を制御することに関する。
【０３８５】
一部の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、動物における体重を低下させるおよび／または体重増加を低減するために、より詳細には、肥満のリスクがあるまたは肥満に罹患している患者において肥満を処置または改善するために使用することができる。別の特定の実施形態では、本発明は、体重を増加させることまたは保持することができない動物（例えば、消耗症候群を有する動物）を処置するための方法および化合物を対象とする。そのような方法は、体重および／またはボディマスを増加させるのに、あるいは体重および／またはボディマス減少を低減させるのに、あるいは望ましくない低い（例えば、不健康な）体重および／もしくはボディマスに関連するかまたはそれらにより引き起こされる状態を改善するのに有効である。加えて、高コレステロールの障害（例えば、高コレステロール血症または脂質異常症（dislipidemia））を、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せで処置することができる。
【０３８６】
ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、それを必要とする対象において赤血球レベルを増大させるために、貧血を処置もしくは予防するために、および／または無効赤血球生成を処置もしくは予防するために使用することができる。ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、赤血球レベルを増大させるための従来の治療手法、特に、多因子由来の貧血を処置するために使用されるものと組み合わせて使用され得る。赤血球レベルを増大させるための従来の治療手法は、例えば、赤血球輸血、１つまたは複数のＥＰＯ受容体活性化剤の投与、造血幹細胞移植、免疫抑制性の生物製剤および薬物（例えば、副腎皮質ステロイド）を含む。ある特定の実施形態では、患者は、貧血を有し、ＥＰＯ（またはその誘導体またはＥＰＯ受容体アゴニスト）での処置に対して応答しないか、または不耐容である。ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、それを必要とする対象において無効赤血球生成および／または無効赤血球生成に関連する障害を処置または予防するために使用することができる。ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、貧血または無効赤血球生成障害を処置または予防するための従来の治療手法、特に、多因子由来の貧血を処置するために使用されるものと組み合わせて使用することができる。
【０３８７】
一般に、本開示に記載の疾患または状態の処置または予防は、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せを「有効量」で投与することにより達成される。薬剤の有効量は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。本開示の薬剤の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起するその薬剤の能力によって変わり得る。「予防有効量」は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。
【０３８８】
ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体、またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せは、健常個体および選択された患者集団において赤血球、ヘモグロビンまたは網状赤血球レベルを増大させるために使用され得る。適切な患者集団の例は、望ましくなく低い赤血球またはヘモグロビンレベルを有する者、例えば、貧血を有する患者、および望ましくなく低い赤血球またはヘモグロビンレベルを発生するリスクがある者、例えば、大量失血をもたらす可能性がある大手術または他の手技をまさに受けようとしている患者を含む。一実施形態では、十分な赤血球レベルを有する患者をＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体、またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の組合せで処置して赤血球レベルを増大させ、次いで、採血し、輸血におけるその後の使用のために血液を保管する。
【０３８９】
ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、貧血を有する患者における赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルを増加させるために使用され得る。ヒトにおけるヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルを観察する場合、個体のバリエーションを考慮に入れるとはいえ、ふさわしい年齢および性別カテゴリーについての正常未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、１０〜１２．５ｇ／ｄｌ、および典型的には約１１．０ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、健常成人における正常範囲内であると見なされるが、治療の観点から見ると、標的レベルが低いほど、引き起こされる心血管系副作用は少ないだろう［例えば、Jacobsら（２０００年）Nephrol  Dial  Transplant  １５巻、１５〜１９頁を参照されたい］。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞により占有される血液試料の体積のパーセンテージ）を貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性については約４１〜５１％、成人女性については３５〜４５％の範囲である。ある特定の実施形態では、患者は、赤血球、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットの標的レベルに患者を回復させることを目的とする投薬レジメンで処置され得る。ヘモグロビンおよびヘマトクリットレベルは、人によって異なるので、最適には、標的ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルは、患者ごとに個別化され得る。
【０３９０】
貧血は、組織傷害、感染症および／または慢性疾患、特にがんを有する患者において観察されることが多い。一部の対象では、貧血は、骨髄における低いエリスロポエチンレベルおよび／またはエリスロポエチンに対する不十分な応答により識別される［例えば、Adamson（２００８年）Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１７版；McGraw  Hill、New  York、６２８〜６３４頁を参照されたい］。貧血の潜在的原因は、例えば、失血、栄養不良（例えば、タンパク質の食事摂取量の低減）、投薬反応、骨髄に関連する様々な問題、および多くの疾患を含む。より詳細には、貧血は、例えば、骨髄移植；固形腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、および結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群および多発性骨髄腫）；放射線療法；化学療法（例えば、白金含有レジメン）；これらに限定されないが、関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性または慢性皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含む、炎症性および自己免疫疾患；特発性または先天性の状態を含む急性または慢性腎疾患または不全；急性または慢性肝疾患；急性または慢性出血；患者非自己もしくは自己抗体に起因しておよび／または宗教的理由（例えば、一部のエホバの証人）のために赤血球の輸血が不可能である状況；感染症（例えば、マラリアおよび骨髄炎）；例えば、鎌状赤血球症（貧血）、サラセミアを含む、ヘモグロビン異常症；薬物使用または乱用（例えば、アルコール誤用）；輸血を避ける何らかの理由から貧血を有する小児患者；ならびに循環過負荷への懸念のために輸血を受けることができない、高齢患者または貧血を伴う基礎心肺疾患を有する患者を含む、様々な障害および状態に関連付けられている［例えば、Adamson（２００８年）Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１７版；McGraw  Hill、New  York、６２８〜６３４頁を参照されたい］。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、本明細書で開示される障害または状態の１つまたは複数に関連する貧血を処置または予防するために使用することができるだろう。
【０３９１】
多くの因子が、がん関連貧血の一因となり得る。一部は、疾患過程自体に、ならびにインターロイキン−１、インターフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子などの炎症性サイトカインに関連する［Bronら（２００１年）Semin  Oncol  ２８巻（補遺８号）：１〜６頁］。その効果の中でも、炎症は、肝要な鉄制御ペプチドであるヘプシジンを誘導することによって、マクロファージからの鉄排出を阻害し、一般に、赤血球生成への鉄利用能を制限する［例えば、Ganz（２００７年）J  Am  Soc  Nephrol  １８巻：３９４〜４００頁を参照されたい］。様々な経路による失血も、がん関連貧血の一因となり得る。がん進行に起因する貧血の有病率は、がんのタイプによって変わり、前立腺がんにおける５％から多発性骨髄腫における９０％まで様々である。がん関連貧血は、疲労、および生活の質の低下、処置有効性の低下、および死亡率の増加を含む、患者にとって深刻な結果をもたらす。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、がん関連貧血を処置するために使用することができるだろう。
【０３９２】
低増殖性貧血は、骨髄の原発性機能不全または不全の結果として生じ得る。低増殖性貧血は、慢性疾患の貧血、腎臓疾患の貧血、低代謝状態に関連する貧血、およびがんに関連する貧血を含む。これらのタイプの各々において、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して不相応に低い。他の低増殖性貧血は、早期鉄欠乏性貧血、および骨髄の損傷により引き起こされる貧血を含む。これらのタイプでは、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して相応に上昇する。顕著な例は、抗がん薬および／または化学療法薬またはがん放射線療法により引き起こされる骨髄抑制であろう。臨床試験の広範な再調査により、軽度貧血が化学療法後の患者の１００％に起こり得る一方で、より重度の貧血がそのような患者の８０％以下に起こり得ることが判明した［例えば、Groopmanら（１９９９年）J  Natl  Cancer  Inst  ９１巻：１６１６〜１６３４頁を参照されたい］。骨髄抑制薬は、例えば、１）アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン）；２）代謝拮抗薬、例えば、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、プリンアナログ（例えば、チオグアニン）、およびピリミジンアナログ（例えば、ゲムシタビン）；３）細胞傷害性抗生物質、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）；４）キナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）；５）有糸分裂阻害剤、例えば、タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；および７）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカンおよびエトポシド）を含む。加えて、低代謝率をもたらす状態は、軽度から中等度の低増殖性貧血を生じさせ得る。そのような状態には、内分泌不全状態がある。例えば、貧血は、アジソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、または去勢されているもしくはエストロゲンで処置されている男性において起こり得る。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体は、過剰増殖性貧血を処置するために使用することができるだろう。
【０３９３】
慢性腎臓疾患が低増殖性貧血と関連することがあり、貧血の程度は、腎機能低下レベルによって重症度が変わる。そのような貧血は、エリスロポエチンの不十分な産生および赤血球の生存率低下に主として起因する。慢性腎臓疾患は、通常は、何年もまたは何十年もの期間をかけて末期（ステージ５）疾患へと徐々に進行し、進行した時点で、患者生存のために透析または腎臓移植が必要とされる。貧血は、多く場合、この過程の早期に発症し、疾患が進行するにつれて悪化する。腎臓疾患の貧血の臨床的帰結は、十分に文書で裏付けられており、左室肥大、認知機能の障害、生活の質の低下、および免疫機能の変化の発生を含む［例えば、Levinら（１９９９年）Am  J  Kidney  Dis  ２７巻：３４７〜３５４頁；Nissenson（１９９２年）Am  J  Kidney  Dis  ２０巻（補遺１号）：２１〜２４頁；Revickiら（１９９５年）Am  J  Kidney  Dis  ２５巻：５４８〜５５４頁；Gafterら（１９９４年）Kidney  Int  ４５巻：２２４〜２３１頁を参照されたい］。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体は、急性または慢性腎疾患または不全を処置するために使用することができるだろう。
【０３９４】
外傷または分娩後出血からなどの、十分な体積の急性失血の結果として生じる貧血は、急性出血後貧血として公知である。ＲＢＣが他の血液成分とともに比例的に枯渇するので、急性失血は、最初は、貧血を伴わない血液量減少を引き起こす。しかし、血液量減少が流体を血管外コンパートメントから血管コンパートメントに移す生理的メカニズムを迅速に作動させることになり、その結果として、血液希釈が生じ、貧血になる。慢性の場合、失血は、体内鉄貯蔵量を徐々に枯渇させ、最終的に鉄欠乏症に至る。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、急性失血の結果として生じる貧血を処置するために使用することができるだろう。
【０３９５】
鉄欠乏性貧血は、中間段階として負の鉄バランスおよび鉄欠乏性赤血球生成を含む、鉄欠乏増加の段階的進行の最終段階である。鉄欠乏症は、妊娠、不十分な食事、腸管吸収不良、急性または慢性炎症および急性または慢性失血などの状態において例示されるように、鉄要求量増加、鉄摂取量減少、または鉄喪失量増加の結果として生じ得る。このタイプの軽度から中等度の貧血に関して、骨髄は、低増殖性のままであり、ＲＢＣ形態は、概して正常であるが、軽度の貧血であっても、多少の小球性低色素性ＲＢＣをもたらすことがあり、重度鉄欠乏性貧血への移行に不随して、骨髄の過剰増殖が起こり、小球性および低色素性ＲＢＣの出現頻度が次第に高くなる［例えば、Adamson（２００８年）Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１７版；McGraw  Hill、New  York、６２８〜６３４頁を参照されたい］。鉄欠乏性貧血の適切な治療は、その原因および重症度に依存し、主な従来の選択肢として経口鉄剤、非経口鉄製剤、およびＲＢＣ輸血がある。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、慢性鉄欠乏症を処置するために使用することができるだろう。
【０３９６】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄血球の無効な産生、および急性骨髄性白血病への転換のリスクを特徴とする、多様な一連の血液学液状態である。ＭＤＳ患者では、血液幹細胞が成熟して健常な赤血球、白血球または血小板にならない。ＭＤＳ障害は、例えば、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰芽球を伴う不応性貧血、移行期の過剰芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、および５ｑ単独の染色体異常を伴う骨髄異形成症候群を含む。これらの障害は、造血細胞の量と質の両方の不可逆的異常として顕在化するので、ほとんどのＭＤＳ患者が慢性貧血に罹患している。したがって、ＭＤＳ患者は、赤血球レベルを増大させるために、輸血、および／または増殖因子（例えば、エリスロポエチンもしくはＧ−ＣＳＦ）での処置を、最終的に必要とする。しかし、多くのＭＤＳ患者は、そのような治療の頻度に起因して副作用を発症する。例えば、頻繁に赤血球輸血を受ける患者は、余分な鉄の蓄積から組織および臓器損傷を示し得る。したがって、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、ＭＤＳを有する患者を処置するために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わせて、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を使用して、ＭＤＳに罹患している患者を処置することができる。他の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と、例えば、サリドマイド、レナリドミド、アザシチジン（azacitadine）、デシタビン、エリスロポエチン、デフェロキサミン、抗胸腺細胞グロブリンおよびフィルグラスチム（filgrastrim）（Ｇ−ＣＳＦ）を含む、ＭＤＳを処置するための１つまたは複数のさらなる治療剤との組合せを使用して、ＭＤＳに罹患している患者を処置することができる。
【０３９７】
鉄動態研究に基づいて再生不良性貧血、出血、または末梢溶血とは元来区別され［例えば、Rickettsら（１９７８年）Clin  Nucl  Med  ３巻：１５９〜１６４頁を参照されたい］、無効赤血球生成によって、成熟ＲＢＣの産生が、骨髄中に存在する赤血球前駆体（赤芽球）の数を前提として予想されるものより少ない、多様な貧血群が説明される［Tannoら（２０１０年）Adv  Hematol  ２０１０：３５８２８３］。そのような貧血では、エリスロポエチンレベルを上昇させたとしても、成熟ＲＢＣの無効な産生に起因して組織低酸素状態が続く。エリスロポエチンレベル上昇が赤芽球の大規模な拡大増殖を駆動し、その結果、髄外赤血球生成に起因して脾腫（脾臓の腫大）に至る［例えば、Aizawaら（２００３年）Am  J  Hematol  ７４巻：６８〜７２頁を参照されたい］、赤芽球誘導性骨病態に至る［例えば、Di  Matteoら（２００８年）J  Biol  Regul  Homeost  Agents  ２２巻：２１１〜２１６頁を参照されたい］、および治療的ＲＢＣ輸血の非存在下であっても組織鉄過剰に至る［例えば、Pippardら（１９７９年）Lancet  ２巻：８１９〜８２１頁を参照されたい］可能性がある悪循環が、最終的には発生する。したがって、赤血球生成の有効性を後押しすることにより、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体は、前述の循環を打破し、こうして、根底にある貧血ばかりでなく、エリスロポエチンレベル上昇、脾腫、骨病態、および組織鉄過剰といった関連する合併症も緩和することができる。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、貧血およびＥＰＯレベル上昇はもちろん、合併症、例えば、脾腫、赤芽球誘導性骨病態、鉄過剰、およびそれらに付随する病態も含む、無効赤血球生成を処置または予防するために使用することができる。一部の実施形態では、ＥＰＯレベル上昇は、同様の年齢および／または同じ性別の１名または複数名の健常対照患者に対しての上昇である。脾腫に関して、そのような病態は、胸痛または腹痛および網内系過形成を含む。髄外造血は、脾臓内ばかりでなく、ことによると他の組織内でも、髄外造血性偽腫瘍の形態で生じ得る［例えば、Musallamら（２０１２年）Cold  Spring  Harb  Perspect  Med  ２巻：ａ０１３４８２頁を参照されたい］。赤芽球誘導性骨病態に関して、付随する病態は、低骨塩密度、骨粗鬆症、および骨痛を含む［例えば、Haidarら（２０１１年）Bone  ４８巻：４２５〜４３２頁を参照されたい］。鉄過剰に関して、付随する病態は、ヘプシジン抑制および食事に含まれる鉄の過剰吸収［例えば、Musallamら（２０１２年）Blood  Rev  ２６巻（補遺１号）：Ｓ１６〜Ｓ１９頁を参照されたい］、複数の内分泌疾患および肝線維症／肝硬変［例えば、Galanelloら（２０１０年）Orphanet  J  Rare  Dis  ５巻：１１頁を参照されたい］、ならびに鉄過剰性心筋症［Lekawanvijitら、２００９年、Can  J  Cardiol  ２５巻：２１３〜２１８頁］を含む。
【０３９８】
無効赤血球生成の最も一般的な原因は、無傷のアルファ−およびベータ−ヘモグロビン鎖の産生の不均衡が赤芽球成熟中にアポトーシス増加をもたらす遺伝性ヘモグロビン異常症である、サラセミア症候群である［例えば、Schrier（２００２年）Curr  Opin  Hematol  ９巻：１２３〜１２６頁を参照されたい］。集合的にサラセミアは、世界中で最も出現頻度が高い遺伝子障害の１つであり、米国においても全世界においても深刻さを増す公衆衛生問題の一因となると予測される疫学的パターンの変化を伴う［Vichinsky（２００５年）Ann  NY  Acad  Sci  １０５４巻：１８〜２４頁］。サラセミア症候群は、それらの重症度に応じて命名される。したがって、α−サラセミアは、軽症型α−サラセミア（α−サラセミア形質としても公知；罹患α−グロビン遺伝子２個）、ヘモグロビンＨ症（罹患α−グロビン遺伝子３個）、および重症型α−サラセミア（胎児水腫としても公知；罹患α−グロビン遺伝子４個）を含む。β−サラセミアは、軽症型β−サラセミア（β−サラセミア形質としても公知；罹患β−グロビン遺伝子１個）、中間型β−サラセミア（罹患β−グロビン遺伝子２個）、ヘモグロビンＥサラセミア（罹患β−グロビン遺伝子２個）、および重症型β−サラセミア（クーリー貧血としても公知；罹患β−グロビン遺伝子２個、その結果、β−グロビンタンパク質が完全に非存在となる）を含む。β−サラセミアは、複数の臓器に影響を及ぼし、相当高い罹患率および死亡率を伴い、現在のところ生涯にわたるケアを必要とする。β−サラセミアを有する患者の平均余命は、近年、鉄キレート化と組み合わせて定期的に輸血を使用することから延びてきたが、輸血および消化管による鉄の過剰吸収の両方の結果として生じる鉄過剰は、心疾患、血栓症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、糖尿病、骨粗鬆症および骨減少など、重篤な合併症を引き起こし得る［例えば、Rundら（２００５年）N  Engl  J  Med  ３５３巻：１１３５〜１１４６頁を参照されたい］。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、サラセミア症候群を処置または予防するために使用することができる。
【０３９９】
一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、サラセミア症候群に加えて無効赤血球生成の障害を処置するために使用することができる。そのような障害は、鉄芽球性（siderblastic）貧血（遺伝性または後天性）；赤血球異形成貧血（Ｉ型およびＩＩ型）；鎌状赤血球貧血；遺伝性球状赤血球症；ピルビン酸キナーゼ欠損症；葉酸欠損症（先天性疾患、摂取量の減少、または要求量の増加に起因する）、コバラミン欠損症（先天性疾患、悪性貧血、吸収障害、膵臓機能不全、または摂取量の減少に起因する）などの状態、ある特定の薬物、または未解明の原因により引き起こされる可能性がある、巨赤芽球性貧血（先天性赤血球形成異常性貧血、不応性巨赤芽球性貧血、または赤白血病）；例えば骨髄線維症（骨髄化生）および骨髄癆を含む骨髄癆性貧血；先天性赤血球生成性ポルフィリン症；ならびに鉛中毒を含む。
【０４００】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、無効赤血球生成のための支持療法と組み合わせて使用され得る。そのような療法は、貧血を処置するための、赤血球または全血どちらかの輸血を含む。慢性または遺伝性貧血では、鉄恒常性の正常なメカニズムが、繰り返される輸血により圧倒され、最終的には、心臓、肝臓および内分泌腺などの主要組織内への鉄の毒性であり、ことによると致死性である蓄積に至る。したがって、無効赤血球生成を慢性的に患っている患者のための支持療法は、１つまたは複数の鉄キレート化分子での処置であって、尿および／または糞便での鉄排泄を促進し、それによって組織鉄過剰を予防するかまたは好転させるための処置も含む［例えば、Hershko（２００６年）Haematologica  ９１巻：１３０７〜１３１２頁；Caoら（２０１１年）Pediatr  Rep  ３巻（２号）：ｅ１７頁を参照されたい］。有効な鉄キレート剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒生成による、大部分の鉄毒性の主要因である可能性が高い、酸化形態の非トランスフェリン結合鉄である第二鉄に、選択的に結合し、それを中和することができなければならない［例えば、Espositoら（２００３年）Blood、１０２巻：２６７０〜２６７７頁を参照されたい］。これらの薬剤は、構造的に多様であるが、すべてが、１：１（六座の薬剤）、２：１（三座）、または３：１（二座）の化学量論比で個々の鉄原子と中和八面体配位錯体を形成することができる、酸素または窒素供与原子を保有する［Kalinowskiら（２００５年）Pharmacol  Rev、５７巻：５４７〜５８３頁］。一般に、有効な鉄キレート剤はまた、比較的低分子量（例えば、７００ダルトン未満）であり、罹患組織への接近を可能にするために水溶性でもあり脂溶性でもある。鉄キレート分子の具体的な例は、連日非経口投与を必要とする細菌由来の六座の薬剤であるデフェロキサミン、ならびに経口活性の合成薬剤であるデフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）を含む。２つの鉄キレート剤の同日投与からなる併用療法は、キレート剤単剤療法に応答しない患者において有望であり、単独でのデフェロキサミン（dereroxamine）に関する患者コンプライアンス不良の課題を克服する上でも有望である［Caoら（２０１１年）Pediatr  Rep  ３巻（２号）：ｅ１７頁；Galanelloら（２０１０年）Ann  NY  Acad  Sci、１２０２巻：７９〜８６頁］。
【０４０１】
ある特定の態様では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、患者における血球輸血負担を減少させるために使用され得る。例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を使用して、血球輸血を、４〜８週間にわたって、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体処置の開始前の同じ期間と比較して約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を超えて減少させることができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を使用して、血球輸血を、４〜８週間にわたって、患者においてＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体処置の開始前の同じ期間と比較して約５０％を超えて減少させることができる。ある特定の実施形態では、患者は、患者を赤血球、ヘモグロビンおよび／もしくはヘマトクリットの標的レベルに回復させること、または赤血球、ヘモグロビンおよび／もしくはヘマトクリットの許容されるレベルを維持しながら赤血球輸血の低減もしくは排除（輸血負担の低減）を可能にすることを目的とする投薬レジメンで処置され得る。ヘモグロビンおよびヘマトクリットレベルは人によって異なるので、最適には、標的ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルは、患者ごとに個別化され得る。
【０４０２】
本明細書で使用される場合、「〜と組み合わせて」または「併せての投与」は、第２の治療が、体内でまだ有効である（例えば、２つの化合物が患者において同時に有効であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血液、血清または血漿中の薬剤の測定可能な濃度と相関しないことがある。例えば、異なる治療用化合物を、同じ製剤でまたは別々の製剤で、同時にまたは逐次的に、および異なるスケジュールで投与することができる。したがって、そのような処置を受ける個体は、異なる治療の組み合わされた効果からの恩恵を受けることができる。本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を、１つもしくは複数の他のさらなる薬剤もしくは支持療法と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各治療剤は、その個々の薬剤について決められた用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。レジメンに用いられる特定の組合せは、本開示のアンタゴニストと治療の適合性、および／または達成すべき所望の治療効果を考慮に入れることになる。
【０４０３】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、無効赤血球生成のためのヘプシジンまたはヘプシジンアゴニストと組み合わせて使用され得る。主として肝臓で産生される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞およびマクロファージ上に局在する鉄排出タンパク質であるフェロポルチンの分解を誘導するその能力のため、鉄代謝の主要制御因子と考えられる。大まかに言うと、ヘプシジンは、細胞外鉄の利用能を低下させるため、ヘプシジンアゴニストは、無効赤血球生成の処置に有益であり得る［例えば、Nemeth（２０１０年）Adv  Hematol、２０１０：７５０６４３を参照されたい］。この見解は、β−サラセミアのマウスモデルにおけるヘプシジン発現増加という有益な効果により裏付けられる［Gardenghiら（２０１０年）J  Clin  Invest  １２０巻：４４６６〜４４７７頁］。
【０４０４】
ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、小型の（小球性）、特大の（大球性）、奇形の、または異常な色の（低色素性）ＲＢＣを一部には特徴とする、ＲＢＣ成熟異常の貧血を処置するのにも適しているであろう。
【０４０５】
ある特定の実施形態では、本開示は、個体に治療有効量の本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体およびＥＰＯ受容体活性化剤を投与することにより、それを必要とする個体における貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を、ＥＰＯ受容体活性化剤と組み合わせて使用して、ＥＰＯの有害効果を受けやすい患者におけるこれらの活性化剤の必要用量を低減させることができる。これらの方法を患者の治療的および予防的処置に使用することができる。
【０４０６】
本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体をＥＰＯ受容体活性化剤と組み合わせて使用して、赤血球の増加を、特に、ＥＰＯ受容体活性化剤のより低い用量範囲で達成することができる。これは、高用量のＥＰＯ受容体活性化剤に関連する公知のオフターゲット効果およびリスクを低減させる点で有益であり得る。ＥＰＯの主要な有害効果は、例えば、ヘマトクリットまたはヘモグロビンレベルの過剰な増大、および赤血球増加症を含む。ヘマトクリットレベル上昇は、高血圧症（より詳細には、高血圧症の増悪）および血管血栓症に至ることがある。一部は高血圧症に関連する、報告されているＥＰＯの他の有害効果は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、ならびに血栓症、高血圧性脳症および赤血球無形成（red  cell  blood  cell  aplasia）に起因する脳性痙攣である。例えば、Singibarti（１９９４年）J.  Clin  Investig  ７２巻（補遺６号）、Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Horlら（２０００年）Nephrol  Dial  Transplant  １５巻（補遺４号）、５１〜５６頁；Delantyら（１９９７年）Neurology  ４９巻、６８６〜６８９頁；およびBunn（２００２年）N  Engl  J  Med  ３４６巻（７号）、５２２〜５２３頁を参照されたい。
【０４０７】
本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体が、ＥＰＯとは異なるメカニズムにより作用するという条件で、これらのアンタゴニストは、ＥＰＯに対してあまり応答しない患者において赤血球およびヘモグロビンレベルを増大させるのに有用であり得る。例えば、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体は、ＥＰＯの通常用量から増加用量（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）の投与がヘモグロビンレベルを標的のレベルまで増大させる結果とならない患者に有益であり得る。ＥＰＯ応答が不十分である患者はすべてのタイプの貧血に見られるが、がんを有する患者および末期腎疾患を有する患者において、より多くの非応答者数が特に頻繁に観察されている。ＥＰＯに対する不十分な応答は、構成的である（ＥＰＯでの初回処置時に観察される）こともあり、または後天的である（ＥＰＯでの反復処置時に観察される）こともある。
【０４０８】
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置されている患者、または処置される候補者である患者を、患者における１つまたは複数の血液学的パラメーターを測定することにより管理するための方法を提供する。血液学的パラメーターは、本開示のアンタゴニストで処置される候補者である患者に対する適切な投薬を評価するために、処置中に血液学的パラメーターをモニターするために、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストでの処置中に投薬量を調整するかどうかを評価するために、および／または本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用することができる。血液学的パラメーターの１つまたは複数が正常レベル外である場合、本開示の１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬を低減させてもよく、遅らせてもよく、または終了してもよい。
【０４０９】
本明細書で提供される方法に従って測定することができる血液学的パラメーターは、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵量、および当技術分野で認知されている方法を使用して、赤血球レベル増大と相関する、体液中で見出される他の作用因子を含む。そのようなパラメーターを、患者からの血液試料を使用して判定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルの増大は、血圧の増大を引き起こし得る。
【０４１０】
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置される候補者である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、正常範囲外であるか、または高めの正常値である場合には、血液学的パラメーターが自然にまたは治療的介入によって正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投与の開始を遅らせることができる。例えば、候補患者が高血圧または前高血圧である場合には、患者の血圧を下げるために患者を降圧剤で処置することができる。例えば、利尿薬、アドレナリン阻害剤（アルファブロッカーおよびベータブロッカーを含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含む、個々の患者の状態に適する任意の降圧剤を使用することができる。あるいは、食事および運動レジメンを使用して、血圧を処置することができる。同様に、候補患者が、正常よりも低いか、または低めの正常値である鉄貯蔵量を有する場合には、患者の鉄貯蔵量が正常または許容されるレベルに戻るまで、食事および／または鉄サプリメントの適切なレジメンで患者を処置することができる。正常より高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する高い患者については、レベルが正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投与を遅らせることができる。
【０４１１】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置される候補者である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、正常範囲外であるか、または高めの正常値である場合には、投与の開始を遅らせないことがある。しかし、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬の投薬量または頻度を、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投与時に生じる血液学的パラメーターの許容され難い増大のリスクを低下させることになる量に設定することができる。あるいは、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と、血液学的パラメーターの望ましくないレベルに対処する治療剤とを組み合わせる治療レジメンを、患者のために開発することができる。例えば、患者が高血圧を有する場合には、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体および降圧剤の投与を含む治療レジメンを設計することができる。所望の鉄貯蔵量より低い鉄貯蔵量を有する患者については、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体および鉄補充の治療レジメンを開発することができる。
【０４１２】
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置される候補者である患者のために、１つまたは複数の血液学的パラメーターについてのベースラインパラメーターを確立することができ、ベースライン値に基づいて、その患者に適した投薬レジメンを確立することができる。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメーターを使用して、患者に適した投薬レジメンの情報を得ることができる。例えば、健常患者が被定義正常範囲より高い確立されたベースライン血圧測定値を有する場合、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体での処置の前に、患者の血圧を、一般集団について正常と見なされる範囲内に至らせる必要がないことがある。本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体での処置前の１つまたは複数の血液学的パラメーターについての患者のベースライン値は、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体での処置中の血液学的パラメーターに対する何らかの変化をモニターするための関連比較値として使用することもできる。
【０４１３】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置されている患者において、１つまたは複数の血液学的パラメーターが測定される。血液学的パラメーターを使用して、処置中に患者をモニターし、本開示の１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬または別の治療剤のさらなる投薬の調整または終了を可能にすることができる。例えば、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投与が、血圧、赤血球レベルもしくはヘモグロビンレベルの増大、または鉄貯蔵量の低減をもたらす場合には、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬は、１つまたは複数の血液学的パラメーターに対する本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の影響を低下させるために、量または頻度が低減され得る。本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投与が、患者に有害である１つまたは複数の血液学的パラメーターの変化をもたらす場合には、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬を、血液学的パラメーターが許容されるレベルに戻るまで一時的に終了してもよく、または永久に終了してもよい。同様に、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投与の用量または頻度を低減させた後に１つまたは複数の血液学的パラメーターが許容される範囲内に至らない場合には、投薬を終了することができる。本開示の１つもしく複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬の低減もしくは終了の代替として、またはそれに加えて、血液学的パラメーターの望ましくないレベルに対処するさらなる治療剤、例えば、降圧剤または鉄サプリメントを、患者に投薬することができる。例えば、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体で処置されている患者が高血圧を有する場合には、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬を同じレベルで継続することができ、降圧剤が処置レジメンに追加されるか、本開示の１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬を（例えば、量および／または頻度に関して）低減させることができ、降圧剤が処置レジメンに追加されるか、または本開示の１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の投薬を終了することができ、そして患者を降圧剤で処置することができる。
６．医薬組成物
【０４１４】
ある特定の態様では、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体を単独で、または医薬製剤の成分（治療用組成物もしくは医薬組成物とも称される）として投与することができる。医薬製剤は、含有する活性成分（例えば、本開示の薬剤）の生物活性が有効であることを可能にするような形態である調製物であって、その製剤が投与されることになる対象に許容され難いほど毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。対象化合物は、ヒト医学または獣医学において使用するための任意の適便な方法での投与のために製剤化することができる。例えば、本開示の１つまたは複数の薬剤を、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学的に許容される担体は、活性成分以外の医薬製剤中の成分であって、対象にとって一般的に非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤および／または保存料を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本開示での使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質不含の生理的に許容される形態である。上記の製剤に任意選択で含めることができる、本明細書に記載されるもの以外の治療的に有用な薬剤を、本開示の方法で対象薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０４１５】
ある特定の実施形態では、組成物は、非経口的に［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射または皮内注射により］投与されることになる。非経口投与に好適な医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用直前に再構成して滅菌注射用溶液または分散液にすることができる滅菌粉末と組み合わせて、本開示の１つまたは複数の薬剤を含み得る。注射用溶液または分散液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、または製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤に利用することができる好適な水性または非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびそれらの好適な混合物を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング材（例えば、レシチン）の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０４１６】
一部の実施形態では、本開示の治療方法は、埋込物またはデバイスからの医薬組成物の全身または局所投与を含む。さらに、医薬組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）への送達のための形態に封入または注入することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、本開示の薬剤の１つまたは複数を標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に送達することができ、発達中の組織に構造を持たせることができ、最適には体内に再吸収され得る、マトリックスを含み得る。例えば、マトリックスは、本開示の１つまたは複数の薬剤の徐放をもたらすことができる。そのようなマトリックスを、他の埋込み型医療用途に現在使用されている材料で形成することができる。
【０４１７】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、審美的外観、および界面特性のうちの１つまたは複数に基づき得る。対象組成物の特定の用途により、適切な製剤が規定されることになる。可能性のある組成物用マトリックスは、生分解性で化学的に定義されている硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、例えば、骨および真皮コラーゲンを含む、生分解性で生物学的に明確に定義されているものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外基質成分で構成されている。他の可能性のあるマトリックスは、例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスを含む、非生分解性で化学的に定義されているものである。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムを含む、上述のタイプの材料のいずれの組合せで構成されていてもよい。バイオセラミックスは、組成を変化させることができ（例えば、アルミン酸カルシウム−リン酸カルシウム）、ならびに細孔経、粒径、粒子の形状、および生分解性の１つまたは複数を変化させるように加工することができる。
【０４１８】
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を局所投与することができる。「局所適用」または「局所的に」は、医薬組成物と、例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜を含む体表との接触を意味する。局所医薬組成物は、様々な適用形態を有することができ、組成物の局所投与時に組織付近に配置されるようにまたは組織と直接接触している状態になるように適合された薬物含有層を概して含む。局所投与に好適な医薬組成物は、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、フォーム、ペースト、パテ、半固体または固体として製剤化された組合せでの本開示の１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドヘテロ多量体を含み得る。液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、フォーム、ペーストまたはパテ形態の組成物は、標的組織上に組成物を塗り広げる、噴霧する、塗り付ける、軽く塗る、またはローラーで延ばすことにより、適用することができる。組成物を滅菌包帯材、経皮パッチ、ギプスおよび絆創膏に含浸させることもできる。パテ、半固体または固体形態の組成物は、変形可能であり得る。それらは、弾性または非弾性（例えば、可撓性もしくは剛性）であり得る。ある特定の態様では、組成物は、複合剤の一部を構成し、繊維、微粒子、または同じもしくは異なる組成を有する複数の層を含み得る。
【０４１９】
液体形態の局所組成物は、薬学的に許容される溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液を含み得る。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水もしくは他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む、当技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤を含有し得る。
【０４２０】
局所ゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固体または固体組成物は、１つまたは複数の増粘剤、例えば、多糖類、合成ポリマーまたはタンパク質に基づくポリマーを含み得る。本発明の一実施形態では、本明細書でのゲル化剤は、好適には非毒性であり、所望の粘度をもたらすものである。増粘剤は、ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミド、Ｎ−ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、プルロニック、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ポリビニルシリケート、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノースまたはラクトース）で置換されているポリアクリレート、アクリルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、多糖類、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、変性セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアー、カラゲナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、加工デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ゴム、ヒアルロナン（hylaronans）、ヒドロゲル、ゼラチン、グルコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン・アクリロニトリルグラフトコポリマー、デンプンポリアクリル酸ナトリウム、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシルエチルアクリレート、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、スルホン化ヒドロゲル、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（メタクリル酸スルホエチル）、ＳＰＭ（メタクリル酸スルホプロピル）、ＳＰＡ（アクリル酸スルホプロピル）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリルオキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸（methacryllic  acid）アミドプロピル−ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸−ビス（１−プロピルスルホン酸（sulfonizacid）−３）エステル二カリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３−アクリルアミド−３−メチルブタン酸）、ベータ−カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸二量体）、および無水マレイン酸−メチルビニルエーテルポリマー、これらの誘導体、これらの塩、これらの酸、ならびにこれらの組合せのポリマー、コポリマー、および単量体を含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、所定量の本開示の化合物および任意選択で１つまたは複数の他の活性成分を各々が含有す��、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、薬用キャンディー（スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガントなどの着香基剤を使用する）、粉末、顆粒、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油型もしくは油中水型液体エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、またはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤を使用する）、および／またはマウスウォッシュの形態で、経口投与することができる。本開示の化合物および任意選択で１つまたは複数の他の活性成分を、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。
【０４２１】
経口投与のための固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末および顆粒）では、本開示の１つまたは複数の化合物は、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴム）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯またはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、およびこれらの混合物を含む、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合され得る。カプセル、錠剤およびピルの場合、医薬製剤（組成物）は、緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物を、例えば、ラクトースまたは乳糖はもちろん高分子量ポリエチレングリコールも含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟および硬ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することもできる。
【０４２２】
医薬組成物の経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含み得る。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水もしくは他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む、当技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口製剤は、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤、保存剤、およびこれらの組合せを含む、アジュバントも含むことができる。
【０４２３】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカント、およびこれらの組合せを含む、懸濁化剤を含有し得る。
【０４２４】
微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸を含む、様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることにより確保することができる。
【０４２５】
ある特定の実施形態では、組成物に、例えば糖または塩化ナトリウムを含む等張剤を含めることが望ましいことがある。加えて、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅らせる薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の持続的吸収をもたらすことができる。
【０４２６】
投薬量レジメンが、本開示の薬剤の１つまたは複数の作用を修飾する様々な因子を考慮して担当医により決定されることになることは理解される。赤血球形成を促進するＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の場合、様々な因子は、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、患者の食事、赤血球レベル低下の一因となり得る任意の疾患の重症度、投与の回数、および他の臨床学的因子を含み得るが、これらに限定されない。最終組成物への他の公知の活性薬剤の添加も、投薬量に影響を与え得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血過程の他の指標のうちの１つまたは複数の定期的評定により、進展をモニターすることができる。
【０４２７】
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の薬剤の１つまたは複数のｉｎ  ｖｉｖｏ産生のための遺伝子療法も提供する。そのような療法は、上記に列挙されたような障害の１つまたは複数を有する細胞または組織への薬剤配列の導入により、その治療効果を達成することになる。薬剤配列の送達は、例えば、キメラウイルスまたはコロイド分散系などの、組換え発現ベクターを使用することにより、達成することができる。本開示の薬剤配列の１つまたは複数の好ましい治療的送達は、標的化リポソームの使用である。
【０４２８】
本明細書で教示されるような遺伝子療法に利用することができる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）を含む。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの派生物であってもよい。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これらに限定されない。いくつかのさらなるレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターのすべてが、選択マーカー用の遺伝子を移入するまたは組み込むことができ、その結果、形質導入された細胞を同定および生成することができる。例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることにより、レトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することにより遂行される。特異的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入して、またはウイルス包膜に結合させて、本開示の薬剤の１つまたは複数を含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にすることができることを、当業者は認識するであろう。
【０４２９】
あるいは、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを組織培養細胞に直接トランスフェクトすることができる。次いで、これらの細胞に、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドがトランスフェクトされる。得られた細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。
【０４３０】
本開示の薬剤の１つまたは複数のための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づく系を含む。ある特定の実施形態では、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および無傷のウイルス粒子を水性内部に封入し、生物活性形態で細胞に送達することができる。例えば、Fraleyら（１９８１年）Trends  Biochem.  Sci.、６巻：７７頁を参照されたい。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入方法は、当技術分野において公知である。例えば、Manninoら（１９８８年）Biotechniques、６巻：６８２頁、１９８８年を参照されたい。
【０４３１】
リポソームの組成は、通常、ステロイド（例えば、コレステロール）含み得るリン脂質の組合せである。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む、他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づく、リポソームの標的化も可能であり、当技術分野において公知である。
【実施例】
【０４３２】
ここで、本発明を一般的に記載し、単に、ある特定の実施形態および本発明の実施形態の例示のために含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されるであろう。
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４３３】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてそれぞれ別々にＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は以下に提供される。
【０４３４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＡＬＫ４−Ｆｃホモ多量体とは反対に、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ多量体の形成を促進するための方法論は、非対称ヘテロマー複合体の形成を誘導するためにＦｃドメインのアミノ酸配列中に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用対を作製するための多くの異なる手法が本開示に記載される。
【０４３５】
それぞれ、配列番号１００〜１０２および１０４〜１０６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、１つの手法では、一方のＦｃドメインを相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：
【化７６】
2019536439.tif 000082
を用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１００）を、以下に示す：
【化７７】
2019536439.tif 000083
【０４３６】
リーダー（シグナル）配列およびリンカーは、下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１００のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１０１）によってコードされる：
【化７８】
2019536439.tif 000084
【０４３７】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１０２）は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化７９】
2019536439.tif 000085
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号１０４）は、以下の通りである：
【化８０】
2019536439.tif 000086
【０４３８】
リーダー配列およびリンカー配列は、下線付きである。上記の配列番号１００および１０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１０４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１０５）によってコードされる：
【化８１】
2019536439.tif 000087
【化８２】
2019536439.tif 000088
【０４３９】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１０６）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化８３】
2019536439.tif 000089
【０４４０】
それぞれ、配列番号１０２および配列番号１０６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４４１】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４０３〜４０４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列中に例示されるように、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：
【化８４】
2019536439.tif 000090
を用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４０１）を、以下に示す：
【化８５】
2019536439.tif 000091
【０４４２】
リーダー（シグナル）配列およびリンカー配列は、下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４０１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通りである：
【化８６】
2019536439.tif 000092
【０４４３】
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４０３）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化８７】
2019536439.tif 000093
【０４４４】
リーダー配列およびリンカーは下線付きである。上記の配列番号４０１および４０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４０３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０４４５】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化８８】
2019536439.tif 000094
【化８９】
2019536439.tif 000095
【０４４６】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４０４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４４７】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
【０４４８】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、それぞれ、配列番号７００〜７３０および７４０〜７７０のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列に例示されるように、精製を容易にするために相補的疎水性相互作用、さらなる分子間ジスルフィド結合、および静電気的差異を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７００）を、以下に示す：
【化９０】
2019536439.tif 000096
【０４４９】
リーダー配列およびリンカーは下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（リシンを酸性アミノ酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号７００のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号７１０）によってコードされる：
【化９１】
2019536439.tif 000097
【０４５０】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通り（配列番号７２０）であり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化９２】
2019536439.tif 000098
【化９３】
2019536439.tif 000099
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号７３０）によってコードされる：
【化９４】
2019536439.tif 000100
【０４５１】
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号７４０）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化９５】
2019536439.tif 000101
【化９６】
2019536439.tif 000102
【０４５２】
リーダー配列およびリンカーは下線付きである。上記の配列番号７００および７２０のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換（チロシンをシステインで、トレオニンをセリンで、ロイシンをアラニンで、チロシンをバリンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（アスパラギンをアルギニンで、アスパラギン酸をアルギニンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号７４０のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号７５０）によってコードされる：
【化９７】
2019536439.tif 000103
【化９８】
2019536439.tif 000104
【０４５３】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通り（配列番号７６０）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化９９】
2019536439.tif 000105
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号７７０）によってコードされる：
【化１００】
2019536439.tif 000106
【化１０１】
2019536439.tif 000107
【０４５４】
それぞれ、配列番号７２０および配列番号７６０のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４５５】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、配列番号７８０、７９０、８００および８１０のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列ならびに配列番号４８０、８２０、および８３０のＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列中に例示されるように、精製を容易にするために、具体的にＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド鎖中に、相補的疎水性相互作用、さらなる分子間ジスルフィド結合、およびアルギニン置換を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーｊを用いる。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７８０）を、以下に示す：
【化１０２】
2019536439.tif 000108
【０４５６】
リーダー配列およびリンカーは下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、別のアミノ酸置換（ヒスチジンをアルギニンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号７８０のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号７９０）によってコードされる：
【化１０３】
2019536439.tif 000109
【０４５７】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通り（配列番号８００）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１０４】
2019536439.tif 000110
【化１０５】
2019536439.tif 000111
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号８１０）によってコードされる：
【化１０６】
2019536439.tif 000112
【０４５８】
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態は、配列番号４０３（上に示されている）であり、配列番号７８０および８００のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために４つのアミノ酸置換を含有し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号８２０）によってコードされる：
【化１０７】
2019536439.tif 000113
【０４５９】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、配列番号４０４（上に示されている）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号８３０）によってコードされる：
【化１０８】
2019536439.tif 000114
【化１０９】
2019536439.tif 000115
【０４６０】
それぞれ、配列番号８００および配列番号４０４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４６１】
様々なＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）、ならびにマルチモーダルクロマトグラフィー（静電気的および疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）のうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０４６２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【０４６３】
リガンド解離速度は、リガンドトラップを評価するための特に重要なパラメーターである。ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された可溶性受容体-Ｆｃタンパク質は、リガンドについて天然受容体と絶え間ない競合にある。ＴＧＦベータスーパーファミリーの内因性リガンドが典型的に細胞表面の同族受容体に結合する場合、分子時間尺度では相対的に遅い多段階のシグナル伝達プロセスが誘発される。天然受容体は、部分的には、リガンド結合事象から細胞内シグナルを生成するためにかなりの時間が必要とされるため、リガンドからゆっくりと解離する。リガンドについて有効に競合する可溶性受容体−Ｆｃタンパク質については、リガンドとのその複合体の解離速度は、天然受容体とのリガンド複合体の解離速度と類似するか、またはそれより遅い必要がある。リガンド結合は動的プロセスであり、リガンドの一部の画分は常に未結合の形態にあり、したがって、受容体−Ｆｃタンパク質の用量にとって、できるだけ長く標的リガンドを捕捉することが治療的に重要である。より多くの捕捉されたリガンドを選択して結合平衡をシフトさせるための１つの手段は、阻害剤の濃度（用量レベル）を増加させることであるが、これは、許容性および安全性を低下させるオフターゲット効果を生成し得る。好ましい手法は、より低濃度の阻害剤でリガンド拮抗作用の有効レベルを達成するためのリガンド結合選択性と共に、より遅いリガンド解離速度（より長い捕捉時間）を有する阻害剤を使用することである。
【表４−１】
2019536439.tif 000116
【表４−２】
2019536439.tif 000117
【０４６４】
これらの比較結合データは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体のいずれかと比べて変更された結合プロファイル／選択性を有することを示している。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体について観察されるように、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対する実質的に減少した結合を示す。特に、ＢＭＰ９は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体に対する低いか、または観察不可能な親和性を示すが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対する中間レベルの結合を保持する。図６を参照されたい。
【０４６５】
したがって、これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを示している。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体よりも有用である。例としては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＣ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数の拮抗作用を最小化することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例３）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較した、マウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の活性プロファイル
【０４６６】
ホモ二量体およびヘテロ二量体複合体をマウスにおいて試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの活性プロファイルの差異を調査した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、約１０週齢で開始して４週間、週２回、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体（３または１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）を皮下投薬した（ｎ＝群あたり９匹のマウス）。ＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体は、表面プラズモン共鳴によって決定された場合、無細胞条件下で高い親和性でリガンドに結合することができないため、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験しなかった。研究評価項目は、体重；ベースラインおよび研究完了（４週）時に核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された全身除脂肪量および全身脂肪量；ベースラインおよび４週時に二重エネルギーｘ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって決定された全身骨塩密度；ならびに４週時に決定された腓腹筋、大腿直筋、および胸筋の重量を含んでいた。
【表５】
2019536439.tif 000118
【０４６７】
研究結果は、上記の表にまとめられている。予想通り、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体は、体組成の顕著な変化を引き起こし、多くはＧＤＦ８およびアクチビンの阻害の公知の効果と一致していた。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体を用いる野生型マウスの処置は、ビヒクル処置対照と比較して、研究の経過にわたって、２倍を超える体重増加をもたらした。これに伴って、ビヒクルと比較して、正味の体重増加は、全身除脂肪量および全身骨塩密度での大幅な増加、ならびに全身脂肪量での大幅な減少があった。除脂肪量（典型的には、マウスにおいては体重の約７０％）は脂肪量（典型的には、体重の約１０％）よりもはるかに大きいため、除脂肪および脂肪組織の正規化された（パーセンテージに基づく）変化は、絶対的変化とのその一致において異なることが認識されるべきである。腓腹筋、大腿直筋、および胸筋を含む、検査した個々の骨格筋は全て、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体を用いる処置の経過にわたって、ビヒクル対照と比較して重量が大幅に増加した。
【０４６８】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、２つの複合体の示差的なリガンド選択性にもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のものと著しく類似するある特定の効果をもたらした。上記の表に示されたように、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体を用いるマウスの処置は、列挙された全ての評価項目について同じ用量レベルでＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の効果と一致していた、ほぼ一致していた、またはそれを超えていた。３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の効果は、１０ｍｇ／ｋｇと比較していくつかの評価項目について軽度に減弱し、したがって、用量効果関係に関する証拠を提供した。
【０４６９】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のものと非常に類似する、骨格筋および骨に対する有益な同化効果、ならびに脂肪組織に対する異化効果を発揮する。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と違って、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対する低親和性のみ、または一過的な結合を示し、したがって、血管新生などの、これらのリガンドによって媒介されるプロセスを同時に阻害しない。この新規の選択性は、例えば、筋肉および骨に対する刺激効果、ならびに脂肪に対する阻害効果を必要とするが、血管新生の変更を必要としない患者の処置において有用である。
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４７０】
出願人は、それぞれ、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ３の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃと呼ばれる。
【０４７１】
ヘテロマーＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。
【０４７２】
第１の手法では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１００〜１０２として上の実施例１に提供されている。
相補的ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、以下の通りである：
【化１１０】
2019536439.tif 000119
【化１１１】
2019536439.tif 000120
【０４７３】
リーダーおよびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１１５のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０４７４】
このＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１１６）によってコードされる：
【化１１２】
2019536439.tif 000121
【０４７５】
成熟ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質配列は、以下の通り（配列番号１１７）であり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１１３】
2019536439.tif 000122
【化１１４】
2019536439.tif 000123
【０４７６】
それぞれ、配列番号１０２および配列番号１１７のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４７７】
それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４０７〜４０８のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、実施例１で考察されている。
ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４０７）は、以下の通りである：
【化１１５】
2019536439.tif 000124
【０４７８】
リーダー配列およびリンカーは下線付きである。上記の配列番号４０１および４０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ３融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４０７のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０４７９】
成熟ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４０８）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【化１１６】
2019536439.tif 000125
【化１１７】
2019536439.tif 000126
【０４８０】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４０８のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４８１】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例５）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０４８２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表６−１】
2019536439.tif 000127
【表６−２】
2019536439.tif 000128
【０４８３】
これらの比較結合データは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体のいずれかと比べて変更された結合プロファイル／選択性を有することを示している。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較して、例外的に高い親和性でＢＭＰ２およびＢＭＰ４に結合し、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７に対する大きく増強された結合を示す。ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対する減少した結合を示し、また、これらのリガンド間、特に、アクチビンＡとアクチビンＢとの間をより高い程度で識別する。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体が高い親和性でＢＭＰ９およびＧＤＦ３に結合する能力は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体については存在しない。図７を参照されたい。
【０４８４】
したがって、これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体が、アクチビンＢ、ＧＤＦ５／ＧＤＦ６／ＧＤＦ７リガンドサブファミリー、および最も顕著にはＢＭＰ９を除く、いくつかの重要なＢＭＰリガンドの選択的阻害剤であることを示している。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体のいずれかよりも有用である。例としては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ６またはアクチビンＢの拮抗作用を保持するが、同化筋肉効果を有する１つもしくは複数のリガンド（例えば、アクチビンＡおよびＧＤＦ８）または血管新生効果を有するリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）の拮抗作用を最小化することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例６）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較したマウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の活性プロファイル
【０４８５】
ホモ二量体およびヘテロ二量体複合体をマウスにおいて試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの活性プロファイルの差異を調査した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０週齢で開始して６．５週間（４６日）、週２回、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体（３または１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）を腹腔内投薬した（ｎ＝群あたり５匹のマウス）。研究評価項目は、体重、ベースラインおよび研究完了（６．５週）時に核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された全身脂肪量；ならびにベースラインおよび６．５週時に二重エネルギーｘ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって決定された全身骨塩密度を含んでいた。
【表７】
2019536439.tif 000129
【０４８６】
研究結果は、上記の表にまとめられている。予想通り、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体は、全てビヒクルと比較して、体重および全身骨塩密度を大幅に増加させ、全身脂肪量を大幅に減少させた。また予想通り、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体は、ビヒクルと比較して全身骨塩密度を大幅に増加させたが、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と違って、体重または全身脂肪量のいずれも大幅に変更しなかった。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、注目すべきことに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体のいずれとも異なる活性プロファイルを示した。いずれかの用量レベルでのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体を用いるマウスの処置は、少なくともいずれかのホモ二量体と同様、骨塩密度を大幅に増加させた。しかしながら、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と違って、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、脂肪量を大幅に減少させ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と違って、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、体重を変更することなく、脂肪量を大幅に減少させた。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、脂肪組織に対する潜在的に有益な効果と共に骨に対する有益な効果を発揮する。この新規の選択性は、例えば、骨に対する刺激効果、および脂肪に対する阻害効果を必要とするが、体重の変更を必要としない患者の処置において有用である。
（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４８７】
出願人は、それぞれ、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ７の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ７−Ｆｃと呼ばれる。
【０４８８】
ヘテロマーＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。
【０４８９】
第１の手法では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１００〜１０２として上の実施例１に提供されている。
相補的ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、以下の通り（配列番号１１２）である：
【化１１８】
2019536439.tif 000130
【化１１９】
2019536439.tif 000131
【０４９０】
シグナル配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１１２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１１３）によってコードされる：
【化１２０】
2019536439.tif 000132
【０４９１】
成熟ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１１４）は、以下の通りであると予想され、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１２１】
2019536439.tif 000133
【０４９２】
それぞれ、配列番号１０２および配列番号１１４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４９３】
それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４０５〜４０６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ７−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、実施例１で考察されている。
ＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４０５）は、以下の通りである：
【化１２２】
2019536439.tif 000134
【０４９４】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号４０１および４０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ７融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基を欠失させることができる。配列番号４０５のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０４９５】
成熟ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４０６）は、以下の通りであると予想され、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１２３】
2019536439.tif 000135
【０４９６】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４０６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ７−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０４９７】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例８）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０４９８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表８】
2019536439.tif 000136
【０４９９】
これらの比較結合データは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体のいずれかと比較して異なる結合プロファイルを有することを示している。興味深いことに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に対して強く結合する５つのリガンドのうちの４つ（アクチビンＡ、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１）は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体に対する減少した結合を示し、例外は、ヘテロ二量体に対する緊密な結合を保持するアクチビンＢである。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に対する中間の結合を有する３つのリガンド（ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、特に、ＢＭＰ９）は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体に対する減少した結合を示す。対照的に、ＢＭＰ５は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に対し弱くしか結合しないにもかかわらず、中間の強度でＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７ヘテロ二量体に結合する。試験したリガンドはＡＬＫ７−Ｆｃホモ二量体に結合しない。図８を参照されたい。
【０５００】
したがって、これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＢのより選択的なアンタゴニストであることを示している。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体よりも有用である。例としては、アクチビンＢの拮抗作用を保持するが、アクチビンＡ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数の拮抗作用を最小化することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例９）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５０１】
出願人は、それぞれ、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ２の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃと呼ばれる。
【０５０２】
ヘテロマーＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。
【０５０３】
第１の手法では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１００〜１０２として実施例１に提供されている。
相補的ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、以下の通り（配列番号１３６）である：
【化１２４】
2019536439.tif 000137
【０５０４】
シグナル配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３６のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１３７）によってコードされる：
【化１２５】
2019536439.tif 000138
【化１２６】
2019536439.tif 000139
【０５０５】
成熟ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１３８）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１２７】
2019536439.tif 000140
【０５０６】
それぞれ、配列番号１０２および配列番号１３８のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５０７】
それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４２１〜４２２のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、実施例１で考察されている。
ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４２１）は、以下の通りである：
【化１２８】
2019536439.tif 000141
【０５０８】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号４０１および４０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ２融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基を欠失させることができる。配列番号４２１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５０９】
成熟ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４２２）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１２９】
2019536439.tif 000142
【０５１０】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４２２のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５１１】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例１０）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５１２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表９−１】
2019536439.tif 000143
【表９−２】
2019536439.tif 000144
【０５１３】
これらの比較結合データは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体のいずれとも異なるリガンド結合プロファイルを示すことを示している。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＢに対する優先的かつ強力な結合を示し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体と似ている（実施例８を参照されたい）。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体は、部分的には、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に特徴的なＢＭＰ９に対する緊密な結合を保持することによってＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃと異なるが、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃは、あったとしても、ＢＭＰ９を非常に弱く結合する。試験したリガンドはＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体に結合しない。図９を参照されたい。
【０５１４】
これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＢのより選択的なアンタゴニストであることを示している。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では有用である。例としては、アクチビンＢの一次的な拮抗作用を保持し、ＢＭＰ９、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１の二次的な拮抗作用を有するものを補足することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例１１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５１５】
出願人は、それぞれ、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ５の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃと呼ばれる。
【０５１６】
ヘテロマーＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。
【０５１７】
第１の手法では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１００〜１０２として実施例１に提供されている。
相補的ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、以下の通り（配列番号１３９）である：
【化１３０】
2019536439.tif 000145
【化１３１】
2019536439.tif 000146
【０５１８】
シグナル配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３９のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１４０）によってコードされる：
【化１３２】
2019536439.tif 000147
【化１３３】
2019536439.tif 000148
【０５１９】
成熟ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１４１）は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１３４】
2019536439.tif 000149
【０５２０】
それぞれ、配列番号１０２および配列番号１４１のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５２１】
それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４２３〜４２４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、実施例１で考察されている。
ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４２３）は、以下の通りである：
【化１３５】
2019536439.tif 000150
【０５２２】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号４０１および４０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ５融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基を欠失させることができる。配列番号４２３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５２３】
成熟ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４２４）は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１３６】
2019536439.tif 000151
【０５２４】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４２４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５２５】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例１２）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５２６】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１０】
2019536439.tif 000152
【０５２７】
（実施例１３）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５２８】
細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ融合することができる、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ６の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロマー複合体を生成することができる。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ６−Ｆｃと呼ばれる。
【０５２９】
ヘテロマーＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。
【０５３０】
第１の手法では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１００〜１０２として上の実施例１に提供されている。
相補的ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質はＴＰＡリーダーを用い、以下の通り（配列番号１４２）である：
【化１３７】
2019536439.tif 000153
【化１３８】
2019536439.tif 000154
【０５３１】
シグナル配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１４２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１４３）によってコードされる：
【化１３９】
2019536439.tif 000155
【化１４０】
2019536439.tif 000156
【０５３２】
成熟ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１４４）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１４１】
2019536439.tif 000157
【０５３３】
それぞれ、配列番号１０２および配列番号１４４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５３４】
それぞれ、配列番号４０１〜４０２および４２５〜４２６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ６−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更することができる。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、実施例１で考察されている。
ＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４２５）は、以下の通りである：
【化１４２】
2019536439.tif 000158
【０５３５】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号４０１および４０２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ６融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基を欠失させることができる。配列番号４２５のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５３６】
成熟ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４２６）は、以下の通りであってよく、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１４３】
2019536439.tif 000159
【０５３７】
それぞれ、配列番号４０２および配列番号４２６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ６−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５３８】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例１４）
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５３９】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれる。
【０５４０】
ヘテロマーＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１１８）を、以下に示す：
【化１４４】
2019536439.tif 000160
【０５４１】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１１８のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１１９）によってコードされる：
【化１４５】
2019536439.tif 000161
【化１４６】
2019536439.tif 000162
【０５４２】
成熟ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１２０）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１４７】
2019536439.tif 000163
【０５４３】
この第１の手法では、相補的ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１０４〜１０６として上の実施例１に提供されている。
【０５４４】
それぞれ、配列番号１２０および配列番号１０６のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５４５】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４０９）を、以下に示す：
【化１４８】
2019536439.tif 000164
【０５４６】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４０９のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５４７】
成熟ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１０）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１４９】
2019536439.tif 000165
【０５４８】
この第２の手法では、相補的ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号４０３〜４０４として上の実施例１に提供されている。
【０５４９】
それぞれ、配列番号４１０および配列番号４０４のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５５０】
様々なＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例１５）
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較したＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５５１】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１１−１】
2019536439.tif 000166
【表１１−２】
2019536439.tif 000167
【０５５２】
これらの比較結合データは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃまたはＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体のいずれかと比べて変更された結合プロファイル／選択性を有することを示している。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＡＢおよびＧＤＦ１１に対する強力な結合を保持しながら、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＡに対する増強された結合、特に、アクチビンＡＣに対する増強された結合を示す。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体に対する最も高い親和性を有するリガンド、アクチビンＢは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体に対する減少した親和性を示す（依然として高い親和性の範囲内にあるが）。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体はまた、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して、ＢＭＰ１０に対する顕著に減少した結合を示す。図１０を参照されたい。
【０５５３】
これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体よりも、アクチビンＢよりアクチビンＡおよびアクチビンＡＢの選択的なアンタゴニストであることを示している。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＡＣに対する実質的に増加した親和性およびＢＭＰ１０に対する大きく減少した親和性を有する。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体よりも有用である。例としては、ＢＭＰ１０の阻害を回避しながら、アクチビンＢよりも優先的にアクチビンＡおよび／またはアクチビンＡＢと拮抗し、アクチビンＡＣの強力な阻害を得ることが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例１６）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５５４】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＢＭＰＲＩＩおよびヒトＡＬＫ１の細胞外ドメインを含む可溶性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は以下に提供される。
【０５５５】
ヘテロマーＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１２１）を、以下に示す：
【化１５０】
2019536439.tif 000168
【０５５６】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１２２）によってコードされる：
【化１５１】
2019536439.tif 000169
【化１５２】
2019536439.tif 000170
【０５５７】
成熟ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１２３）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１５３】
2019536439.tif 000171
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号１２４）は、以下の通りである：
【化１５４】
2019536439.tif 000172
【０５５８】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号１２１および１２３のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１２５）によってコードされる：
【化１５５】
2019536439.tif 000173
【０５５９】
成熟ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１２６）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１５６】
2019536439.tif 000174
【化１５７】
2019536439.tif 000175
【０５６０】
それぞれ、配列番号１２３および配列番号１２６のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５６１】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４１１）を、以下に示す：
【化１５８】
2019536439.tif 000176
【０５６２】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５６３】
成熟ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１２）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【化１５９】
2019536439.tif 000177
【化１６０】
2019536439.tif 000178
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４１３）は、以下の通りである：
【化１６１】
2019536439.tif 000179
【０５６４】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号４１１および４１２のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上に二重下線により示されたＡＬＫ１融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５６５】
成熟ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４１４）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１６２】
2019536439.tif 000180
【０５６６】
それぞれ、配列番号４１２および配列番号４１４のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５６７】
様々なＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例１７）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体と比較したＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５６８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１２】
2019536439.tif 000181
【０５６９】
これらの比較結合データは、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体のものとは異なるが、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体のものとは類似する結合プロファイル／選択性を有することを示している。例えば、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体に特徴的なＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に対する強力な結合を概ね保持するが、ヘテロ二量体は、ホモ二量体と共に存在しないＢＭＰ９よりもＢＭＰ１０に対する中程度の選択性を示す。また、ＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体と違って、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体のものよりもほぼ１桁弱い親和性を有するにもかかわらず、ＢＭＰ１５に結合する。図１１を参照されたい。したがって、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体は、例えば、血管新生の阻害のために、ＢＭＰ９、特に、ＢＭＰ１０の選択的拮抗作用が有利である、ある特定の治療適用において、またはＢＭＰ１５の拮抗作用も有利である適用において予想外に有用である。
（実施例１８）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５７０】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＢＭＰＲＩＩおよびヒトＡＬＫ２の細胞外ドメインを含む可溶性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は本明細書に提供される。
【０５７１】
ヘテロマーＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１２１〜１２３として上の実施例１６に提供されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、実施例１６に示されたようにＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２１および１２３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５７２】
相補的ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１３６〜１３８として実施例９に提供されている。配列番号１２１および１２３のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、実施例９に示されたようにＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３６および１３８のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０５７３】
それぞれ、配列番号１２３および配列番号１３８のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５７４】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列（配列番号４１１〜４１２）は、実施例１６で考察されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、実施例１６に示されたようにＢＭＰＲＩＩ−ＦｃポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１１および４１２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５７５】
相補的ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列（配列番号４２１〜４２２）は、実施例９で考察されている。配列番号４１１〜４１２のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、実施例９に示されたようにＡＬＫ２融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４２１〜４２２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５７６】
それぞれ、配列番号４１２および配列番号４２２のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５７７】
様々なＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例１９）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体と比較したＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５７８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ２−Ｆｃヘテロ二量体、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ２−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１３】
2019536439.tif 000182
【０５７９】
（実施例２０）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５８０】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＢＭＰＲＩＩおよびヒトＡＬＫ３の細胞外ドメインを含む可溶性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は本明細書に提供される。
【０５８１】
ヘテロマーＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１２１〜１２３として上の実施例１６に提供されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、実施例１６に示されたようにＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２１および１２３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５８２】
相補的ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１１５〜１１７として実施例４に提供されている。配列番号１２１および１２３のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、実施例４に示されたようにＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１１５および１１７のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０５８３】
それぞれ、配列番号１２３および配列番号１１７のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５８４】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列（配列番号４１１〜４１２）は、実施例１６で考察されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、実施例１６に示されたようにＢＭＰＲＩＩ−ＦｃポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１１および４１２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５８５】
相補的ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列（配列番号４０７〜４０８）は、実施例４で考察されている。配列番号４１１〜４１２のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、実施例４に示されたようにＡＬＫ３融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４０７および４０８のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５８６】
それぞれ、配列番号４１２および配列番号４０８のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５８７】
様々なＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２１）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体と比較したＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５８８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１４−１】
2019536439.tif 000183
【表１４−２】
2019536439.tif 000184
【０５８９】
これらの比較結合データは、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体のものとは明確に違うが、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体のものとも異なるリガンド結合選択性を有することを示している。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体が結合するよりもＢＭＰ６にはるかにより強く結合するが、これは、ほぼ１０倍遅い解離速度を反映している。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４に対するそのほとんど変化していない結合により、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３ヘテロ二量体は、したがって、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ６の接合阻害剤であると考えることができる。この結合プロファイルは、ＢＭＰ４およびＢＭＰ２に対する例外的に強い結合が、それを、ＢＭＰ６を含む中間レベルの結合を有する４つのリガンドと比較して、このリガンド対に対して高度に選択的であると同定される、ＡＬＫ３−Ｆｃホモ二量体のものとは対照的である。図１２を参照されたい。したがって、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ６の接合拮抗作用が有利である、ある特定の治療適用において予想外に有用である。
（実施例２２）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０５９０】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＢＭＰＲＩＩおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は本明細書に提供される。
【０５９１】
ヘテロマーＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１２１〜１２３として上の実施例１６に提供されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、実施例１６に示されたようにＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２１および１２３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５９２】
相補的ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびコードする核酸配列は、配列番号１０４〜１０６として実施例１に提供されている。配列番号１２１および１２３のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、実施例１に示されたようにＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１０４および１０６のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０５９３】
それぞれ、配列番号１２３および配列番号１０６のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５９４】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列（配列番号４１１および４１２）は、実施例１６で考察されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、実施例１６に示されたようにＢＭＰＲＩＩ−ＦｃポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１１および４１２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５９５】
相補的ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列（配列番号４０３および４０４）は、実施例１で考察されている。配列番号４１１および４１２のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、実施例１に示されたようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４０３および４０４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０５９６】
それぞれ、配列番号４１２および配列番号４０４のＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０５９７】
様々なＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２３）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較したＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０５９８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＢＭＰＲＩＩ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１５−１】
2019536439.tif 000185
【表１５−２】
2019536439.tif 000186
【０５９９】
これらの比較結合データは、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体が、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体のいずれのものとも違うリガンド結合選択性を有することを示している。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、高いまたは中間の強度でいくつかのアクチビンリガンドに結合することによって両方のホモ二量体と異なり、ＢＭＰ１５のみに弱く結合することによってＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と異なる。最も注目すべきことに、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、ヘテロ二量体リガンドアクチビンＡＢに強く、かつ優先的に結合する。図１３を参照されたい。したがって、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、特に、アクチビンＡＢの拮抗作用が有利であり、ＢＭＰ１５（排卵に大きく関与する）の拮抗作用を回避すべきである、ある特定の治療適用において予想外に有用である。
（実施例２４）
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０６００】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＴＧＦβＲＩＩの短い（正準）アイソフォームおよびヒトＡＬＫ１の細胞外ドメインを含む可溶性ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は本明細書に提供される。
【０６０１】
ヘテロマーＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。
ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１２７）を、以下に示す：
【化１６３】
2019536439.tif 000187
【化１６４】
2019536439.tif 000188
【０６０２】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２７のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１２８）によってコードされる：
【化１６５】
2019536439.tif 000189
【化１６６】
2019536439.tif 000190
【０６０３】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１２９）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１６７】
2019536439.tif 000191
【０６０４】
相補的ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１２４〜１２６として実施例１６に提供されている。配列番号１２７および１２９のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、実施例１６に示されたＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２４および１２６のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０６０５】
それぞれ、配列番号１２９および配列番号１２６のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６０６】
上記のＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号１２６）が、短いアイソフォームの細胞外ドメインの代わりにＴＧＦβＲＩＩの長い（Ａ）アイソフォーム（ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ）の細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質と対合した、バリアントＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロマー複合体を生成することができる。
ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１３０）を、以下に示す：
【化１６８】
2019536439.tif 000192
【化１６９】
2019536439.tif 000193
【０６０７】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３０のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１３１）によってコードされる：
【化１７０】
2019536439.tif 000194
【化１７１】
2019536439.tif 000195
【０６０８】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１３２）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１７２】
2019536439.tif 000196
【０６０９】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。
ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４１５）を、以下に示す：
【化１７３】
2019536439.tif 000197
【０６１０】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１５のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６１１】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１６）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１７４】
2019536439.tif 000198
【０６１２】
相補的ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列（配列番号４１３および４１４）は、実施例１６で考察されている。配列番号４１５および４１６のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、実施例１６に示されたＡＬＫ１融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１３および４１４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６１３】
それぞれ、配列番号４１６および配列番号４１４のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６１４】
上記のＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号４１４）が、短いアイソフォームの細胞外ドメインの代わりにＴＧＦβＲＩＩの長い（Ａ）アイソフォーム（ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ）の細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質と対合した、バリアントＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロマー複合体を生成することができる。
ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４１７）を、以下に示す：
【化１７５】
2019536439.tif 000199
【化１７６】
2019536439.tif 000200
【０６１５】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１７のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６１６】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４１８）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１７７】
2019536439.tif 000201
【０６１７】
それぞれ、配列番号４１８および配列番号４１４のＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６１８】
様々なＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２５）
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体と比較したＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０６１９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ１−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１６】
2019536439.tif 000202
【０６２０】
（実施例２６）
ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０６２１】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＴＧＦβＲＩＩの短い（正準）アイソフォームおよびヒトＡＬＫ５の細胞外ドメインを含む可溶性ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は本明細書に提供される。
【０６２２】
ヘテロマーＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１２７〜１２９として上の実施例２４に提供されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、実施例２４に示されたＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２７および１２９のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６２３】
相補的ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１３９〜１４１として実施例１１に提供されている。配列番号１２７および１２９のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、実施例１１に示されたＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３９および１４１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０６２４】
それぞれ、配列番号１２９および配列番号１４１のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６２５】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列（配列番号４１５〜４１６）は、実施例２４で考察されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、実施例２４に示されたＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１５〜４１６のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６２６】
相補的ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列（配列番号４２３〜４２４）は、実施例１１で考察されている。配列番号４１５〜４１６のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、実施例１１に示されたＡＬＫ５融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４２３〜４２４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６２７】
それぞれ、配列番号４１６および配列番号４２４のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドを、同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６２８】
様々なＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２７）
ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０６２９】
出願人は、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＦｃドメインにそれぞれ別々に融合された、ヒトＴＧＦβＲＩＩの長い（Ａ）アイソフォームの細胞外ドメインおよびヒトＡＬＫ５の細胞外ドメインを含む可溶性ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は本明細書に提供される。
【０６３０】
ヘテロマーＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃの形成を、実施例１に記載されたものと同様の手法によって誘導することができる。第１の手法では、一方のＦｃドメインを相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するために変更するが、他方のＦｃドメインを相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するために変更する。ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１３０〜１３２として上の実施例２４に提供されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、実施例２４に示されたＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３０および１３２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６３１】
相補的ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列およびそれをコードする核酸配列は、配列番号１３９〜１４１として実施例１１に提供されている。配列番号１３０および１３２のＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、実施例１１に示されたＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３９および１４２のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０６３２】
それぞれ、配列番号１３２および配列番号１４１のＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６３３】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための第２の手法では、Ｆｃドメインを、相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入するために変更する。ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチド配列（配列番号４１７〜４１８）は、実施例２４で考察されている。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、実施例２４に示されたＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−ＦｃポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４１７〜４１８のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６３４】
相補的ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドのポリペプチド配列（配列番号４２３〜４２４）は、実施例１１で考察されている。配列番号４１７〜４１８のＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、実施例１１に示されたＡＬＫ５融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４２３〜４２４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０６３５】
それぞれ、配列番号４１８および配列番号４２４のＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチドを、同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせることができる。
【０６３６】
様々なＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例２８）
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体と比較したＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の活性プロファイル
【０６３７】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、実施例２６〜２７に記載のＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−ＦｃおよびＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ヘテロマーまたはホモマータンパク質複合体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上に独立に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表１７】
2019536439.tif 000203
【０６３８】
これらの比較結合データは、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイルが、いかなるリガンドにも結合しなかった、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体のものおよびＡＬＫ５−Ｆｃホモ二量体のものと顕著に異なることを示している。平衡解離定数（ＫＤ）に基づくと、３つのＴＧＦβリガンドの解離速度が類似していたにもかかわらず、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体は、ＴＧＦβ１よりもはるかに高い親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合した。対照的に、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ３よりもＴＧＦβ２に対する高い選択性を示した。特に、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体が結合したよりも約５桁高い親和性および約４桁遅い解離速度でＴＧＦβ２に結合した。ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体はまた、短いアイソフォームを含有するヘテロ二量体が結合したよりも強くＴＧＦβ２に結合した。図１４を参照されたい。ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体のいずれもＢＭＰ９またはＢＭＰ１０に結合することができなかった（データは示さない）が、このことは、これらのＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体をＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ１−Ｆｃヘテロ二量体から識別する（実施例２５を参照されたい）。２つのＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体のセンサーグラムは、低いシグナル振幅を示したが、これは、各タンパク質の実質的画分が不活性であったことを示している。
【０６３９】
表面プラズモン共鳴によって得られたこれらのデータをより良く解釈するために、Ａ５４９細胞中でのリポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の活性を阻害するＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質の能力を決定した。このアッセイは、リポータープラスミドｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２−蛍ルシフェラーゼ（Dennlerら、１９９８年、EMBO  １７巻：３０９１〜３１００頁）およびｐＲＬＣＭＶ−ウミシイタケルシフェラーゼをトランスフェクトされたヒト肺癌細胞系に基づくものであり、後者はトランスフェクション効率に関する対照である。ＣＡＧＡモチーフがＴＧＦβ応答遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在するため、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子に対して一般に使用されているものである。
【０６４０】
アッセイの第１日目に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を、ウェルあたり６．５×１０４個の細胞で４８ウェルプレート中に分配し、一晩インキュベートした。全てのインキュベーションは、別途指摘しない限り、３７℃および５％ＣＯ２で、組織培養インキュベーター中で行った。２日目に、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２−蛍ルシフェラーゼ、１００ｎｇのｐＲＬＣＭＶ−ウミシイタケルシフェラーゼ、３０μＬのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、および９７０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液を、室温で３０分間予備インキュベートし、次いで、０．１％ＢＳＡを補充した２４ｍＬのＥａｇｌｅの最少必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））中に添加した。播種した細胞から培地を除去し、このトランスフェクション混合物を、一晩のインキュベーションのために細胞（５００μｌ／ウェル）にアプライした。３日目に、培地を除去し、細胞を、以下に記載のように調製されるリガンドと阻害剤との混合物と共に一晩インキュベートした。
【０６４１】
被験物質の連続希釈液を、２００μＬ体積のアッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ）中、４８ウェルプレート中で作製した。試験リガンドを含有する等体積のアッセイ緩衝液を添加して、予め決定されたＥＣ５０に等しい最終リガンド濃度を得た。ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから得た。試験溶液を３０分間インキュベートし、次いで、２５０μＬの混合物をトランスフェクトされた細胞に添加した。被験物質の各濃度を、二連で決定した。試験溶液と共に一晩インキュベートした後、細胞をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、次いで、受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）を用いて溶解し、−７０℃で一晩保存した。４日目および最終日に、プレートを、穏やかに振とうしながら室温に加温した。細胞溶解物を化学発光プレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いてルミノメーター中で分析して、正規化されたルシフェラーゼ活性を決定した。
【０６４２】
このアッセイを使用して、ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質バリアントが、ＴＧＦβＲＩＩリガンドによる細胞シグナル伝達を阻害する能力を比較した。結果を、以下の表に示す。
【表１８】
2019536439.tif 000204
【０６４３】
ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体に関する結果は、野生型ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−ＦｃおよびＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃホモ二量体に関する以前の報告と一致していた（del  Reら、J  Biol  Chem  ２７９巻：２２７６５頁、２００４年）。この実験では、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃホモ二量体はＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を強力に阻害したが、最大１０ｎＭのホモ二量体濃度でＴＧＦβ２を阻害することができなかった。この知見は、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体に結合するＴＧＦβ２の低い親和性と一致するが、奇妙なことに、その遅い解離速度と一致しない（上記の結合結果を参照されたい）。対照的に、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体は、細胞環境中の３つ全てのＴＧＦβリガンドを強力に阻害した。したがって、ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴＧＦβ２の優先的拮抗作用、またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の組み合わせた拮抗作用が有利である、ある特定の治療適用において予想外に有用である。
【化１７８】
2019536439.tif 000205
【化１７９】
2019536439.tif 000206
【化１８０】
2019536439.tif 000207
【化１８１】
2019536439.tif 000208
【０６４４】
【化１８２】
2019536439.tif 000209
【０６４５】
【化１８３】
2019536439.tif 000210
【０６４６】
【化１８４】
2019536439.tif 000211
【０６４７】
【化１８５】
2019536439.tif 000212
【０６４８】
【化１８６】
2019536439.tif 000213
【化１８７】
2019536439.tif 000214
【０６４９】
【化１８８】
2019536439.tif 000215
【０６５０】
【化１８９】
2019536439.tif 000216
【０６５１】
【化１９０】
2019536439.tif 000217
【０６５２】
【化１９１】
2019536439.tif 000218
【０６５３】
【化１９２】
2019536439.tif 000219
【０６５４】
【化１９３】
2019536439.tif 000220
【０６５５】
【化１９４】
2019536439.tif 000221
【０６５６】
【化１９５】
2019536439.tif 000222
【０６５７】
【化１９６】
2019536439.tif 000223
【化１９７】
2019536439.tif 000224
【化１９８】
2019536439.tif 000225
【化１９９】
2019536439.tif 000226
【化２００】
2019536439.tif 000227
【０６５８】
【化２０１】
2019536439.tif 000228
【０６５９】
【化２０２】
2019536439.tif 000229
【０６６０】
【化２０３】
2019536439.tif 000230
【０６６１】
【化２０４】
2019536439.tif 000231
【０６６２】
【化２０５】
2019536439.tif 000232
【化２０６】
2019536439.tif 000233
【０６６３】
【化２０７】
2019536439.tif 000234
【０６６４】
【化２０８】
2019536439.tif 000235
【０６６５】
【化２０９】
2019536439.tif 000236
【０６６６】
【化２１０】
2019536439.tif 000237
【０６６７】
【化２１１】
2019536439.tif 000238
【０６６８】
【化２１２】
2019536439.tif 000239
【０６６９】
【化２１３】
2019536439.tif 000240
【０６７０】
【化２１４】
2019536439.tif 000241
【０６７１】
【化２１５】
2019536439.tif 000242
【０６７２】
【化２１６】
2019536439.tif 000243
【０６７３】
【化２１７】
2019536439.tif 000244
【０６７４】
【化２１８】
2019536439.tif 000245
【０６７５】
【化２１９】
2019536439.tif 000246
【化２２０】
2019536439.tif 000247
【化２２１】
2019536439.tif 000248
【０６７６】
【化２２２】
2019536439.tif 000249
【０６７７】
【化２２３】
2019536439.tif 000250
【０６７８】
【化２２４】
2019536439.tif 000251
【０６７９】
【化２２５】
2019536439.tif 000252
【０６８０】
【化２２６】
2019536439.tif 000253
【０６８１】
【化２２７】
2019536439.tif 000254
【０６８２】
【化２２８】
2019536439.tif 000255
【０６８３】
【化２２９】
2019536439.tif 000256
【０６８４】
【化２３０】
2019536439.tif 000257
【０６８５】
【化２３１】
2019536439.tif 000258
【０６８６】
【化２３２】
2019536439.tif 000259
【０６８７】
【化２３３】
2019536439.tif 000260
【０６８８】
【化２３４】
2019536439.tif 000261
【０６８９】
【化２３５】
2019536439.tif 000262
【０６９０】
【化２３６】
2019536439.tif 000263
【０６９１】
【化２３７】
2019536439.tif 000264
【０６９２】
【化２３８】
2019536439.tif 000265
【０６９３】
【化２３９】
2019536439.tif 000266
【０６９４】
【化２４０】
2019536439.tif 000267
【０６９５】
【化２４１】
2019536439.tif 000268
【図１】
2019536439.tif 000269
【図２】
2019536439.tif 000270
【図３】
2019536439.tif 000271
【図４】
2019536439.tif 000272
【図５】
2019536439.tif 000273
【図６】
2019536439.tif 000274
【図７】
2019536439.tif 000275
【図８】
2019536439.tif 000276
【図９】
2019536439.tif 000277
【図１０】
2019536439.tif 000278
【図１１】
2019536439.tif 000279
【図１２】
2019536439.tif 000280
【図１３】
2019536439.tif 000281
【図１４】
2019536439.tif 000282
【図１５−１】
2019536439.tif 000283
【図１５−２】
2019536439.tif 000284
【図１５−３】
2019536439.tif 000285
【図１５−４】
2019536439.tif 000286
【配列表】
2019536439000001.app
【国際調査報告】
2019536439.tif 000287
2019536439.tif 000288
2019536439.tif 000289
2019536439.tif 000290
2019536439.tif 000291
2019536439.tif 000292