(57)【要約】  本発明は、高グリコシル化組換えヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の融合タンパク質、その調製方法、および使用である。該融合タンパク質は、Ｎ端からＣ端まで、ヒトＦＶＩＩＩ、可撓性ペプチドリンカー、少なくとも１つのヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位、および半減期延長部分（好ましくはヒトＩｇＧ  Ｆｃ変異体）を順に含む。該融合タンパク質は、組換えＦＶＩＩＩに類似する生物学的活性および延長された体内活性半減期を有するため、薬物動態および薬効を改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ端からＣ端まで、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子、可撓性ペプチドリンカー、少なくとも１つのヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位、および半減期延長部分をこの順に含むヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の融合タンパク質であって、
該半減期延長部分は、ヒト免疫グロブリンＦｃ断片、アルブミン、トランスフェリンまたはＰＥＧから選ばれる、前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質はグリコシル化されたものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質は、哺乳動物細胞で発現されることによりグリコシル化される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現されることによりグリコシル化される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、または前記ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記可撓性ペプチドリンカーは、２つまたは複数のＧ、Ｓ、ＡおよびＴ残基から選ばれるアミノ酸を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記可撓性ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ａ（ＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＧＧＳ）ｄ繰り返し単位を組み合わせて形成されたアミノ酸配列の一般式を有し、ａ、ｂ、ｃおよびｄは０以上の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≧１である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、
（ｉ）ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳグループ、
（ｉｉ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳグループ、
（ｉｉｉ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳグループ、
（ｉｖ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳグループ、
（ｖ）ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳグループ
から選ばれる、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位は、配列番号７に示すアミノ酸配列またはその短縮配列を含み、前記短縮配列は、少なくとも２つのグリコシル化部位を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位は、
（ｉ）ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、
（ｉｉ）ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、
（ｉｉｉ）ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ、
（ｉｖ）ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ
というアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位は、請求項９または１０に記載の剛性単位のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合タンパク質の半減期延長部分は、ヒト免疫グロブリンＦｃ変異体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ヒト免疫グロブリンＦｃ変異体は、低下したＡＤＣＣ効果および／またはＣＤＣ効果を有し、および／またはＦｃＲｎ受容体との結合親和性が強化されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｆｃ変異体は、
（ｉ）Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、およびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域、
（ｉｉ）Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域、
（ｉｉｉ）Ｔｈｒ２５０ＧｌｎおよびＭｅｔ４２８Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域、
（ｉｖ）Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２５０Ｇｌｎ、およびＭｅｔ４２８Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域、
（ｖ）Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域
から選ばれる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１６に示すとおりである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質の活性が＞６０００ＩＵ／ｍｇである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１９】
配列番号１７に示す配列を含む、請求項１８に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む、または請求項２０に記載のベクターがトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２２】
医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤、および有効用量の請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
（ａ）請求項１８または１９に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＣＨＯ細胞に導入し、ＣＨＯ由来の細胞系を生成するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）においてその増殖培地中で２４時間ごとの発現が１ＩＵ／１０６（百万）個の細胞を超えた高収率細胞株をスクリーニングするステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）でスクリーニングされた細胞株を培養し、融合タンパク質を発現させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた発酵液を回収し、融合タンパク質を分離して精製するステップと、
を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の調製方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｄ）における融合タンパク質の精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子篩クロマトグラフィーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の、出血性疾患を予防または治療するための医薬の調製における使用。
【請求項２６】
ＦＶＩＩＩ先天性または後天性欠乏症患者の出血性疾患の予防または治療、血友病Ａ患者の自発的または手術出血の予防または治療のための医薬の調製における使用を含む、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質の分野に関し、より具体的には、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の融合タンパク質、その調製方法、および使用、特に、複数種の血液凝固に関連する疾患を治療する医薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、抗血友病因子とも呼ばれ、内因性血液凝固系において十分に重要な作用を有する。ＦＶＩＩＩ分子遺伝学の多くの研究結果によれば、性染色体Ｘ連鎖遺伝子にＦＶＩＩＩを欠乏すると、Ａ型血友病を引き起こすことが明らかになった。統計によれば、血友病Ａは、男性集団における罹患率が１／５０００であり、血友病総数の８０％以上を占めている。血友病Ａに対する現在常用の治療方法は補充療法（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）であり、すなわち、血友病患者が欠乏する血液凝固因子ＶＩＩＩを補充する方法である。
【０００３】
ＦＶＩＩＩは、多構造の大分子糖タンパク質であり、３つのＡドメイン（Ａ１、Ａ２、Ａ３）、１つの炭水化物富化かつ必須ではない中央ドメイン（Ｂドメイン）、および２つのＣドメイン（Ｃ１、Ｃ２）という６つのドメインに分けられる。成熟したタンパク質は、分子量が約２８０ｋＤａの軽鎖および重鎖で構成される。軽鎖の分子量は約８０ｋＤａで、構造がＡ３、Ｃ１およびＣ２を含み、連結方式がＡ３−Ｃ１−Ｃ２である。重鎖の分子量は約９０〜２００ｋＤａで、構造がＡ１、Ａ２およびＢを含み、連結方式がＡ１−Ａ２−Ｂである。重鎖と軽鎖の連結は金属イオン依存性のものである。血漿内に、重鎖と軽鎖の二量体は、さらに高親和性でフォン・ウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ、ｖＷＦ）と結合し、成熟前の分解から保護される。血漿内の非活性化ＦＶＩＩＩとｖＷＦとの結合の半減期は約１２時間である。ＦＶＩＩＩは、重鎖内のアミノ酸Ａｒｇ３７２とＡｒｇ７４０および軽鎖内のＡｒｇ１６８９で、活性化された血液凝固第ＦＸ（ＦＸａ）因子およびトロンビンタンパク質により加水分解および切断されることで活性化され、それにより、ｖＷＦ因子は活性化されたＦＶＩＩＩ二量体（ＦＶＩＩＩａ）を放出して生成し、Ｃａ２＋の存在下で、それはリン脂質の表面で活性化された血液凝固第ＦＩＸ（ＦＩＸａ）因子およびＦＸと強固な複合体を形成する。ＦＸは続いてＦＩＸａにより活性化され、活性化されたＦＸは複合体から解離され、さらにプロトロンビンをトロンビンに変換し、後者はフィブリノーゲンをフィブリンに直接変換することができる。血液凝固システムの補助因子の１種として、ＦＶＩＩＩは、ＦＩＸａのＦＸに対する活性化触媒効率を数桁分に強化することができる。
【０００４】
ＦＶＩＩＩ分子は、今までクローン化された最も長い遺伝子断片の１つであり、臨床に適用される分子量が最も大きいタンパク質医薬である。分子量が大きく、グリコシル化の程度が高い組換えタンパク質について、哺乳動物細胞は最適な発現システムである。しかし、ＦＶＩＩＩの体外での組換え発現量は、他の性質が類似する遺伝子よりも明らかに低く、例えば、ＦＶＩＩＩの発現レベルはＦＩＸの１％でしかない。これは生体のＦＶＩＩＩに対するニーズの反映であるかもしれないが、ＦＶＩＩＩの体外での組換え発現にとって大きな障害であることに違いない。また、ＦＶＩＩＩの血液における半減期が相対的に短く、８〜１２時間でしかないため、重篤な血友病Ａ患者は予防的治療を行う際、静脈内（ｉ．ｖ．）注射を週に約３回しなければならない。
【０００５】
ＦＶＩＩＩの体内機能半減期を延長するために、従来技術では、ＦＶＩＩＩをＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、トランスフェリンまたはＩｇＧＦｃ等の半減期延長部分と連結される。例えば、現在Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ（Ｎ８−ＧＰ）、Ｂａｙｅｒ（ＢＡＹ９４−９０２７）およびＢａｘｔｅｒ（ＢＡＸ  ８５５）社は、いずれもＰＥＧ化した長期有効なＦＶＩＩＩ製品を開発し、且つ臨床研究に入った。しかし、該タンパク質の調製プロセスにＰＥＧとＦＶＩＩＩとを化学的に結合する追加ステップを追加したため、最終収率が低下し、調製コストが増加する。薬物動態学的研究データによれば、ＰＥＧ化したＦＶＩＩＩが著しく延長された半減期を取得しておらず、例えば、Ｎ８−ＧＰのＡ型血友病患者の体内での循環半減期が約１８時間（ＴｉｅｄｅＡら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、２０１３、１１：６７０〜６７８）であることが示された。ＢＡＹ９４−９０２７の臨床Ｉ期の研究によれば、その健康な人体内での半減期が約１８．２時間であり、野生型ＦＶＩＩＩよりも約１．４倍延長した（ＣｏｙｌｅＴら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、２０１２、１８（Ｓｕｐｐｌ３）：２２）ことが示された。Ｂａｘ８５５の半減期は約１８時間である（Ｔｕｒｅｃｅｋ  ＰＬら、Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ、２０１２、３２Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ２９〜３８）。
【０００６】
米国Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社により開発された単量体−二量体ハイブリッド型の組換えＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質（ｍｏｎｏｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ）：Ｅｌｏｃｔａｔｅ（登録商標）は、２０１４年６月に米国ＦＤＡによって発売が許可された。臨床データによれば、人体内でＥｌｏｃｔａｔｅ（登録商標）の半減期が１．５〜１．７倍でしか延長されず（Ｄｕｍｏｎｔ  ＪＡら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２、１１９：３０２４〜３０３０。ＰｏｗｅｌｌＪＳら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２、１１９：３０３１〜３０３７）、３〜５日ごとに１回注射する必要があることが示された。報告によれば、Ｂｉｏｇｅｎ社が構築したｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃの二重発現ベクターをＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、その発現産物には、ｒＦＶＩＩＩＦｃホモ二量体の形式の融合体が検出されることを予期せず、単量体−二量体ハイブリッド型のｒＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質およびＦｃ二量体でしか発現されなかった。該社の研究者は、採用した発現システムはホモ二量体型の分子量が大きすぎるため、宿主細胞は分子量が約４００ＫＤａのｒＦＶＩＩＩＦｃホモ二量体タンパク質を分泌することができず、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ単量体間の立体障害効果により重合できないことを可能な原因として推測した（Ｐｅｔｅｒｓ  ＲＴら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、２０１３、１１（１）：１３２〜４１）。これにより、ホモ二量体型ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の発現はかなり難しいことが分かった。
【０００７】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）β鎖のカルボキシ末端ペプチド（以下、ＣＴＰと呼ぶ）も一部のタンパク質の体内半減期を延長する作用を有するため、一部の特許文献に開示された融合タンパク質に含まれる半減期延長部分は、免疫グロブリンＦｃ断片、ＨＳＡ、ＣＴＰまたは半減期を延長できる他の融合リガンドを選択して使用してもよい。また、ＣＴＰはリンカーとして主に同一のタンパク質の異なるサブユニットを連結するために使用されてもよい。例えば、中国専利ＣＮ１０３５３９８６０Ａ、ＣＮ１０３５３９８６１Ａ、ＣＮ１０３５３９８６８ＡおよびＣＮ１０３５３９８６９Ａに開示された融合タンパク質において、ＣＴＰはリンカーとして卵胞刺激ホルモンのｂｅｔａサブユニットとａｌｐｈａサブユニットとの間に位置し、特許ＷＯ２００５０５８９５３Ａ２に開示された融合タンパク質において、ＣＴＰはリンカーとして糖タンパク質ホルモンのｂｅｔａサブユニットとａｌｐｈａサブユニットとを連結するために使用されている。
【０００８】
本発明者は、従来技術に基づいてＣＴＰをリンカーまたは半減期延長部分とするのではなく、それを可撓性ペプチドリンカー（例えば（ＧＧＧＧＳ）ｎ）と連結して新たなリンカー配列を構成し、ＦＶＩＩＩと半減期延長部分との間に（例えば、免疫グロブリンＦｃ断片であってもよいが、従来技術で提示されたＣＴＰを含まない）設置し、新たなＦＶＩＩＩ融合タンパク質を構成することで、半減期をさらに延長し、且つ、良好な生物学的活性および機能を保持する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、延長された体内活性半減期および組換えＦＶＩＩＩに類似する生物学的活性を有する高グリコシル化したホモ二量体型血液凝固第ＶＩＩＩ因子のＦｃ融合タンパク質を提供する。また、本発明は、前記融合タンパク質を効率的かつ安定して発現させる方法を提供し、該方法で発現した融合タンパク質は、収量が高く、調製および保管中に安定性が良く、且つ、その生物活性が既に市販されている組換えＦＶＩＩＩ因子と類似するという利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、Ｎ端からＣ端まで、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）、可撓性ペプチドリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ、Ｌ）、少なくとも１つのヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチド剛性単位（以下、ＣＴＰ剛性単位と略称し、（ＣＴＰ）ｎと表示され、好ましくは、ｎが１、２、３、４、または５である）、および半減期延長部分（例えば、免疫グロブリンＦｃ断片、アルブミン、トランスフェリンまたはＰＥＧであり、好ましくはヒトＩｇＧ  Ｆｃ変異体（ｖＦｃと表示される）である）を順に含む高グリコシル化ＦＶＩＩＩ融合タンパク質（以下、融合タンパク質と略称する）を提供する。本発明の一部の好ましい実施例において、前記融合タンパク質はｈＦＶＩＩＩ−Ｌ−ＣＴＰｎ−ｖＦｃと表示される。
【００１１】
ここで、前記ｈＦＶＩＩＩは野生型またはその突然変異型であり、さらに、前記野生型ｈＦＶＩＩＩは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。好ましくは、前記突然変異型ｈＦＶＩＩＩは配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％が相同であり、より好ましくは、前記突然変異型ｈＦＶＩＩＩは配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％が相同である。最も好ましくは、前記突然変異型ｈＦＶＩＩＩは配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％が相同である。
【００１２】
ここで、前記可撓性ペプチドリンカーは非免疫原性であることが好ましく、且つ、ｈＦＶＩＩＩとＦｃとの間に十分な空間距離を生じ、それらの間の立体障害効果を最低限に低減させる。好ましくは、２つまたはより多くのアミノ酸残基からなる可撓性ペプチドリンカーを使用し、且つ、アミノ酸がＧｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｌａ（Ａ）、およびＴｈｒ（Ｔ）から選ばれる。
【００１３】
より好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーはＧおよびＳ残基を含む。Ｃ−ペプチドの長さは融合タンパク質の活性に非常に重要である。本発明について、前記ペプチドリンカーは、（ＧＳ）ａ（ＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＧＧＳ）ｄ繰り返し単位を組み合わせて形成されたアミノ酸配列の一般式を含むことが好ましく、ａ、ｂ、ｃおよびｄは０以上の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≧１である。
【００１４】
具体的には、本発明の実施例において、好ましくは、前記ペプチドリンカーは、
（ｉ）Ｌ１：ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列（配列番号２に示す）、
（ｉｉ）Ｌ２：ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列（配列番号３に示す）、
（ｉｉｉ）Ｌ３：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列（配列番号４に示す）、
（ｉｖ）Ｌ４：ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列（配列番号５に示す）、
（ｖ）Ｌ５：ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ配列（配列番号６に示す）を含む。
【００１５】
ここで、前記ＣＴＰ剛性単位は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端の１１３番目〜１４５番目のアミノ酸からなる全長配列またはその断片から選ばれ、具体的には、前記ＣＴＰ剛性単位は、配列番号７に示すアミノ酸配列またはその短縮配列を含む。まず、このような人体内に天然に存在する複数のグリコシル化部位を含むＣＴＰポリペプチドは非免疫原性のものである。次に、複数のグリコシル化部位を含むＣＴＰ剛性Ｃ−ペプチドは、可撓性Ｃ−ペプチドのランダムコイルに対し、安定した立体配座を形成することができ、ＦＶＩＩＩおよびＦｃ断片が独立に折り畳んで正確な三次元配座を形成し、且つそれぞれの生物活性に影響を及ぼさないように促す。また、ＣＴＰグリコシル基側鎖の保護作用はＣ−ペプチドのプロテアーゼに対する感受性を低減することができる。
【００１６】
好ましくは、前記ＣＴＰ剛性単位は、少なくとも２つのグリコシル化部位を含み、例えば、本発明の１つの好ましい実施例において、前記ＣＴＰ剛性単位は２つのグリコシル化部位を含み、例示的には、前記ＣＴＰ剛性単位は配列番号７のＮ端の１０個のアミノ酸、すなわち、ＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊を含み、または、前記ＣＴＰ剛性単位は配列番号７のＣ端の１４個のアミノ酸、すなわち、Ｓ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱを含む。また、別の実施例において、前記ＣＴＰ剛性単位は３つのグリコシル化部位を含み、例示的には、前記ＣＴＰ剛性単位は配列番号７のＮ端の１６個のアミノ酸、すなわち、ＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊Ｒを含み、また、他の一部の実施例において、前記ＣＴＰ剛性単位は４つのグリコシル化部位を含み、例示的には、前記ＣＴＰ剛性単位は２８、２９、３０、３１、３２または３３個のアミノ酸を含み、且つヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットの第１１３、１１４、１１５、１１６、１１７または１１８位から始め、第１４５位で終了する。具体的には、前記ＣＴＰ剛性単位は配列番号７のＮ端の２８個のアミノ酸、すなわち、ＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱを含む。本文において、＊はグリコシル化部位を表す。各種の可能性は全て本発明の独立した実施形態を表す。
【００１７】
他の一部の実施例において、本発明に係るＣＴＰ剛性単位は天然ＣＴＰアミノ酸配列と少なくとも７０％が相同である。他の一部の実施例において、本発明に係るＣＴＰ剛性単位は天然ＣＴＰアミノ酸配列と少なくとも８０％が相同である。他の一部の実施例において、本発明に係るＣＴＰ剛性単位は天然ＣＴＰアミノ酸配列と少なくとも９０％が相同である。他の一部の実施例において、本発明に係るＣＴＰ剛性単位は天然ＣＴＰアミノ酸配列と少なくとも９５％が相同である。
【００１８】
本発明の具体的な実施例において、好ましくは、前記ＣＴＰ剛性単位は、
（ｉ）ＣＴＰ１：ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号７に示す）、
（ｉｉ）ＣＴＰ２：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号８に示す）、
（ｉｉｉ）ＣＴＰ３：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（配列番号９に示す）、
（ｉｖ）ＣＴＰ４：ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１０に示す）
という配列を含む。
【００１９】
本発明の一部の実施例において、前記融合タンパク質は１つの上記ＣＴＰ剛性単位を含む。
【００２０】
本発明の他の一部の実施例において、前記融合タンパク質は１つ以上の上記ＣＴＰ剛性単位を含み、好ましくは、２つ、３つ、４つまたは５つの上記ＣＴＰ剛性単位を含み、例えば、本発明の１つの実施例において、前記融合タンパク質は２つのＣＴＰ３剛性単位、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＣＴＰ３−ＣＴＰ３、または（ＣＴＰ３）２と表示される）を含む。
【００２１】
半減期延長部分は、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  Ｆｃ断片から選ばれることが好ましく、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４およびその変異体のＦｃ断片から選ばれることがより好ましい。さらに、前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ変異体は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃに位置する少なくとも１種のアミノ酸修飾を含み、且つ、変異体は、低下したエフェクター機能（ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ効果）を有し、および／または新生児受容体ＦｃＲｎとの結合親和性が強化される。さらに、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ変異体は、
（ｉ）ｖＦｃγ１：Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、およびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域（配列番号１１に示すアミノ酸配列）、
（ｉｉ）ｖＦｃγ２−１：Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域（配列番号１２に示すアミノ酸配列）、
（ｉｉｉ）ｖＦｃγ２−２：Ｔｈｒ２５０ＧｌｎおよびＭｅｔ４２８Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域（配列番号１３に示すアミノ酸配列）、
（ｉｖ）ｖＦｃγ２−３：Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２５０Ｇｌｎ、およびＭｅｔ４２８Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域（配列番号１４に示すアミノ酸配列）、
（ｖ）ｖＦｃγ４：Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域（配列番号１５に示すアミノ酸配列）
のグループから選ばれても良い。
【００２２】
本発明に係るＩｇＧＦｃ変異体は、（ｉ）〜（ｖ）に係る５種の変異体を含んでもよいが、それらに限定されず、ＩｇＧの同種のサブクラス間の２種類の機能性変異体の変異部位の組み合わせまたは重ね合わせであってもよく、例えば、上記（ｉｖ）に係る変異体は、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における変異部位を重ね合わせて取得された新たなＩｇＧ２  Ｆｃの組み合わせ変異体である。
【００２３】
本発明に係る融合タンパク質におけるＦｃ変異体（ｖＦｃ）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４等のヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。このようなＣＨ２領域は、２２８、２３４、２３５および３３１位（ＥＵ計数システムにより決定される）にアミノ酸突然変異を含む。これらのアミノ酸突然変異はＦｃのエフェクター機能を低減することができると信じられる。ヒトＩｇＧ２はＦｃγＲと結合しないが、極めて弱い補体活性を示す。Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ２変異体は、天然Ｆｃγ２よりも補体活性がより低く、さらに依然としてＦｃγＲ非結合子であるべきである。ＩｇＧ４Ｆｃは、活性化補体カスケードに欠陥があり、且つ、ＦｃγＲとの結合親和性はＩｇＧ１よりも約１桁低い。天然Ｆｃγ４と比べ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を有するＦｃγ４変異体は最も小さいエフェクター機能を示すべきである。Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ１も、天然Ｆｃγ１よりも低下したエフェクター機能を示す。これらのＦｃ変異体は、いずれも天然ヒトＩｇＧ  ＦｃよりもＦＶＩＩＩ融合タンパク質の調製にさらに適する。２５０および４２８位（ＥＵコード体系により決定される位置）にアミノ酸突然変異を含むことにより、Ｆｃ領域と新生児受容体ＦｃＲｎとの結合親和性を増加し、半減期をさらに延長する（Ｐａｕｌ  Ｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４、２７９：６２１３〜６２１６）。上記２種類の機能性変異体の相互の組み合わせまたは重ね合わせは、新たな組み合わせ変異体を取得し、そのエフェクター機能を低減するとともにその半減期を延長する。本発明に係るＦｃ変異体は、上記いくつかの部位の突然変異を含んでもよいが、それらに限定されず、他の部位の置換を導入することでＦｃが低下したエフェクター機能を有し、および／またはＦｃＲｎ受容体との結合力を強化してもよく、それと同時に、Ｆｃ変異体の機能／活性を低減することや不良な配座の変化を引き起こすこともなく、よく見られる変異部位はＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１、２７６（９）：６５９１〜６０４を参照することができる。
【００２４】
本発明の１つの好ましい実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１６に示すとおりである。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、上記融合タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００２６】
本発明の１つの好ましい実施例において、前記融合タンパク質のＤＮＡ配列は配列番号１７に示すとおりである。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、上記ＤＮＡを含むベクターを提供する。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、上記ベクターを含む、または上記のベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【００２９】
本発明の具体的な実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ由来の細胞株ＤＧ４４である。
【００３０】
本発明の第５の態様によれば、医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤、および有効量の上記融合タンパク質を含む。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、
（ａ）前記ＤＮＡをＣＨＯ細胞に導入し、ＣＨＯ由来の細胞系を生成するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）においてその増殖培地中で２４時間ごとの発現が１ＩＵ／１０６個の細胞を超えた高収率細胞株をスクリーニングするステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）でスクリーニングされた細胞株を培養し、融合タンパク質を発現させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた発酵液を回収し、融合タンパク質を分離して精製するステップと、
を含むＣＨＯ由来の細胞系等の哺乳動物細胞系から前記融合タンパク質を調製または生産する方法を提供する。
【００３２】
さらに、前記ステップ（ａ）におけるＣＨＯ由来の細胞系はＤＧ４４である。
【００３３】
さらに、前記ステップ（ｃ）において、細胞培養はバッチ、灌流または流加培養方法を選択することができる。
【００３４】
さらに、前記ステップ（ｄ）において、４ステップのクロマトグラフィーを採用して融合タンパク質を精製し、それぞれアフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子篩クロマトグラフィーである。本発明は実施例５を参照しながら、その好ましい条件をさらに提供する。
【００３５】
本発明の好ましい実施例において、上記方法を採用して調製された融合タンパク質の活性＞６０００ＩＵ／ｍｇである。
【００３６】
本発明の第６の態様によれば、前記融合タンパク質の、ＦＶＩＩＩ欠乏または機能的欠陥による出血性疾患または事象を予防または治療するための医薬の調製における使用を提供する。
【００３７】
さらに、前記疾患は血友病Ａ（またはＡ型血友病と呼ばれる）を含む。血友病Ａ患者の自発的出血事象、手術予防、周術期の処理または手術治療において、本発明に係る融合タンパク質は出血の発生を制御または予防する作用を果たす。
【発明の効果】
【００３８】
本発明者は、本発明に開示および／または記載された融合タンパク質およびその調製方法の利点は以下のようにまとめられることを発見した。
【００３９】
１、本発明で構築されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質は、そのＦｃセグメントが非開裂性であり、すなわち、Ｆｃ断片の補体、受容体結合ドメインを突然変異することで、Ｆｃと対応する受容体との結合親和性を調節し、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を低減または除去し、Ｆｃセグメントが活性タンパク質の体内半減期を延長する作用のみを保留するが、細胞傷害性を発生しない。Ｂｉｏｇｅｎ社により開発されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質は、そのＦｃセグメントが天然源からのもので、Ｆｃにより媒介される不良なエフェクター機能が必ず患者の治療リスクを増加すると予測できる。
【００４０】
２、本発明は、ＣＨＯ細胞を用いて融合タンパク質を発現し、且つ、発現産物にホモ二量体型ＦＶＩＩＩ  Ｆｃ融合タンパク質のみが含まれ、その精製ステップが簡単で効率的である。Ｂｉｏｇｅｎ社は、単量体−二量体ハイブリッド（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）ＦＶＩＩＩ融合タンパク質を発現させるために、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＦｃを発現する二重発現ベクターを構築し、ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトする（米国特許、公開番号：ＵＳ２０１３０２７４１９４Ａ１）。その発現した融合タンパク質発酵液には、３種類の形式の産物が含まれるべきであると予想され、それぞれＦＶＩＩＩ−Ｆｃ：ＦＶＩＩＩ−Ｆｃホモ二量体型（Ｄｉｍｅｒｉｃ）融合タンパク質、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ：Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッド（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）融合タンパク質、およびＦｃ：Ｆｃ二量体である。融合タンパク質の発現プロセスにおいて、宿主細胞がＦＶＩＩＩ−ＦｃおよびＦｃとの２種類の一本鎖分子を同時に発現し、さらにそれぞれ２つずつ重ね合わせて上記３種類の産物を形成する必要があるため、最終目的の産物の発現効率を大きく低減する。それと同時に、精製プロセスにおいて、他の２種類の形式の不純物を除去する必要があり、その精製プロセスもより複雑となり、生産効率が低下し、その製造コストも大きく増加した。そのため、本発明の調製方法は、Ｂｉｏｇｅｎ社が開発したＭｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｒＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質に対して一定の技術的優位性および価格的優位性を有し、その発現、精製プロセスはいずれもより簡単、効率的で、製造コストもより低い。
【００４１】
３、ＨｅｍＡマウスに、３０ＩＵ／ｋｇ、９０ＩＵ／ｋｇおよび２７０ＩＵ／ｋｇの用量で本発明のＦＶＩＩＩ融合タンパク質ＦＰ−Ｂを投与し、中、高用量グループは、ＨｅｍＡマウスの急性出血の状況を効果的に制御することができ、且つ、ＦＰ−Ｂの各用量グループのマウスの生存率は、組換えＦＶＩＩＩ（Ｘｙｎｔｈａ、ファイザー株式会社）投与グループよりいずれも向上し、融合タンパク質ＦＰ−ＢがＸｙｎｔｈａよりも長い薬効作用を有することが反映された。それと同時に、ＦＰ−Ｂ高用量および低用量グループは、出血時間および出血量等の結果でいずれも用量関連性を示す。
【００４２】
４、本発明に係る融合タンパク質は組換えＦＶＩＩＩと比べ、低下した免疫原性を有し、患者体内の中和抗体の発生を低減することを予想できる。
【００４３】
５、本発明で調製された融合タンパク質は、相対的に高い生物学的活性を保持し、精製された各バッチの融合タンパク質の活性が約６０００〜１００００ＩＵ／ｍｇの範囲にあり、モル比換算で活性が約２３４０〜３９００ＩＵ／ｎＭ（各融合タンパク質に２つのＦＶＩＩＩが含まれ、１１７０〜１９５０ＩＵ／ｎＭＦＶＩＩＩに相当する）である。また、一部のバッチでは、精製された融合タンパク質の活性はさらに１２０００ＩＵ／ｍｇ（モル比換算で活性が約４６８０ＩＵ／ｎＭで、２３４０ＩＵ／ｎＭ  ＦＶＩＩＩに相当する）を超える。そのため、本発明で調製された融合タンパク質は、Ｂｉｏｇｅｎ社が開発した単量体−二量体ハイブリッドｒＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質（活性が１６６０〜１７７０ＩＵ／ｎＭである）（Ｊ．ＭｃＣｕｅら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、２０１５、４３：２１３〜２１９）、および市販されている組換えＦＶＩＩＩ  ＲｅＦａｃｔｏ（活性が１５２１〜２２８７ＩＵ／ｎＭ）（米国特許、公開番号：ＵＳ２０１３０２７４１９４Ａ１）の活性に相当するか、さらに高く、本発明に係る融合タンパク質は、そのＣ端に融合されたＦｃがＦＶＩＩＩの活性にほとんど影響を及ぼさないことを意味する。
【００４４】
６、本発明に係る融合タンパク質は、複数のグリコシル基側鎖を有する剛性ＣＴＰポリペプチドを含み、（ＧＧＧＧＳ）ｎのような可撓性Ｃ−ペプチドのランダムコイルに対し、安定した立体配座を形成することができ、このような「バリア」作用は、ＦＶＩＩＩおよびＦｃセグメントが独立に折り畳んで正確な三次元配座を形成し、且つそれぞれの生物活性に影響を及ぼさないように促す。ＣＴＰはグリコシル基を含み、負に帯電した高シアル化されたＣＴＰは、腎臓のそれに対する消去作用を抵抗し、融合タンパク質の半減期をさらに延長することができる。一方、ＣＴＰグリコシル基側鎖の保護作用は、Ｃ−ペプチドのプロテアーゼに対する感受性を低減し、融合タンパク質が連結ドメインで分解されにくいようにすることができる。
【００４５】
７、本発明に係る融合タンパク質は、発酵、精製プロセスおよび保管プロセスでいずれも良好な安定性を有する。
【００４６】
８、本発明に係る融合タンパク質の調製方法は収量が高く、３００ｍｌのフラスコに１４日間培養し、累積収量は少なくとも１５０ｍｇ／Ｌに達することができ、プロセスの拡大が可能で、大規模な工業化生産を実現する。
【００４７】
本発明の範囲内に、本発明の上記各構成要件と以下（例えば、実施例）具体的に説明する各構成要件との間は、互いに組み合わせて新たなまたは好ましい技術案を構成することができることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の実施例に係るｐｃＤＮＡ３発現ベクター内のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ（酵素切断部位をホワイトスペースで表記）断片のＦＰ−Ｂのヌクレオチド配列、および推定されたアミノ酸配列である。ヒトＦＶＩＩＩはシグナルペプチド（１〜１９、点線で表記）および成熟ＦＶＩＩＩタンパク質（２０〜１４５７）で構成される。成熟した融合タンパク質は、ｈＦＶＩＩＩ（２０〜１４５７）、可撓性ペプチドリンカー（１４５８〜１４８４、下線で表記）、ＣＴＰ剛性単位（１４８５〜１５１２、波線で表記）、およびｖＦｃγ２−３変異体（１５１３〜１７３５）を含む。
【図２】精製後のＦＰ−Ｂタンパク質のＳＥＣ−ＨＰＬＣピークプロフィールである。
【図３】精製後のＦＰ−Ｂタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図。
【図４】尾切断後の各マウスの出血量（μｌ）である。注：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図５】尾切断後の各マウスの出血時間（ｓ）である。注：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
ｈＣＧ−βカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）
ＣＴＰはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ−サブユニットカルボキシ末端に由来する短いペプチドである。生殖に関連する４種類のポリペプチドホルモン卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、同じα−サブユニットおよびそれぞれ特異なβ−サブユニットを含む。他の３種類のホルモンと比べ、ｈＣＧの体内半減期が明らかに延長され、これは主にβ−サブユニットにおける特有のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）に由来する（Ｆａｒｅｓ  ＦＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９２、８９（１０）：４３０４〜４３０８）。天然のＣＴＰには３７個のアミノ酸残基が含まれ、４つのＯ−グリコシル化部位を有し、末端がシアル酸残基である。負に帯電した高シアル化されたＣＴＰは、腎臓のそれに対する消去作用と抵抗して、タンパク質の体内での半減期を延長することができる（ＦａｒｅｓＦＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９２、８９（１０）：４３０４〜４３０８）。しかし、本発明者は創造的に少なくとも１つのＣＴＰポリペプチドと適当な長さの可撓性Ｃ−ペプチドとを連結し、それら共にＣ−ペプチドとしてＦＶＩＩＩと半減期延長部分とを連結するために使用する（例えば、免疫グロブリンＦｃ断片）。
【００５０】
本発明者は、ＦＶＩＩＩとＦｃ変異体との間にＣＴＰペプチドを増加することで、一部の剛性Ｃ−ペプチドを増加することに相当する。一方、Ｎ端に融合されたＦＶＩＩＩがＦｃ変異体とＦｃＲｎとの結合部位に影響を及ぼさないことを保証し、半減期に影響を及ぼし、また、ＦｃのＰｒｏｔｅｉｎＡ結合部位は調製プロセスにおける精製ステップにとって重要であり、ＣＴＰを連結してＮ端に融合されたＦＶＩＩＩがそれとｐｒｏｔｅｉｎＡとの結合部位を「カバー」しないことを保証するため、より安価でより適用するフィラーを選択して融合タンパク質を精製し、精製コストを低減することができる。他方、ＣＴＰの添加により、大きさが約２５ｋＤａのＦｃ断片がＮ端に融合されたＦＶＩＩＩの正確な折り畳みを干渉して生物学的活性／機能の低下または喪失となることもない。複数のグリコシル基側鎖を有する剛性ＣＴＰポリペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのような可撓性Ｃ−ペプチドのランダムコイルに対し、安定した立体配座を形成することができ、このような「バリア」作用は、ＦＶＩＩＩおよびＦｃセグメントが独立に折り畳んで正確な三次元配座を形成し、且つそれぞれの生物活性に影響を及ぼさないように促す。他方、ＣＴＰグリコシル基側鎖の保護作用は、Ｃ−ペプチドのプロテアーゼに対する感受性を低減し、融合タンパク質が連結ドメインで分解されにくくにすることができる。
【００５１】
ＩｇＧＦｃ変異体
非開裂性Ｆｃ変異体
Ｆｃ素子は免疫グロブリンＩｇＧの定常ドメインＦｃ断片に由来し、病原体を撲滅する免疫防御では重要な作用を果たす。Ｆｃにより媒介されるＩｇＧのエフェクター機能は、（１）細胞表面のＦｃ受容体（ＦｃγＲｓ）と結合し、ファゴサイトーシス、または分解作用、またはキラー細胞が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）経路によって病原体を消化するか、あるいは（２）第１の補体成分Ｃ１のＣ１ｑと結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）経路を誘発し、病原体を分解するという２種類のメカニズムにより発揮する。４種類のヒトＩｇＧサブクラスのうち、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３はＦｃγＲｓと効果的に結合することができ、ＩｇＧ４とＦｃγＲｓとの結合親和性が相対的に低く、ＩｇＧ２とＦｃγＲｓとの結合は低くて測定しにくいため、ヒトＩｇＧ２はほとんどＡＤＣＣ効果がない。また、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はさらにＣ１ｑと効果的に結合して補体カスケード反応を活性化することができる。ヒトＩｇＧ２とＣ１ｑとの結合は相対的に弱く、ＩｇＧ４はＣ１ｑと結合しない（ＪｅｆｆｅｒｉｓＲら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９８、１６３：５９〜７６）ため、ヒトＩｇＧ２のＣＤＣ効果も相対的に弱い。明らかに、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の構築に非常に適合する天然ＩｇＧサブクラスが存在しない。エフェクター機能を有しない非開裂性Ｆｃを得るために、最も有効な方法は、Ｆｃ断片における補体、受容体結合ドメインを突然変異して改造し、Ｆｃと関連する受容体との結合親和性を調節し、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を低減または除去し、機能タンパク質の生物学的活性およびＦｃセグメントの長期有効な体内半減期のみを保留するが、細胞傷害性を生じないことである。より多くの非開裂性Ｆｃ変異体に含まれる変異部位は、ＳｈｉｅｌｄｓＲＬら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２００１、２７６（９）：６５９１〜６０４、または中国発明専利ＣＮ２０１２８００３１１３７．２を参照することができる。
【００５２】
新生児受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性が強化されたＦｃ変異体
ＩｇＧの血漿半減期は、それとＦｃＲｎとの結合に依存し、一般的にｐＨ６．０である場合に結合し、ｐＨ７．４（血漿ｐＨ）である場合に解離する。両者の結合部位に対する研究により、ＩｇＧにおけるＦｃＲｎと結合する部位を改造し、ｐＨ６．０である場合に結合能力を増加させる。ＦｃＲｎの結合に重要なヒトＦｃγドメインの一部の残基の突然変異は血清半減期を増加できることが既に証明されている。Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｖ３０８、Ｅ３８０、Ｍ４２８およびＮ４３４における突然変異は、ＦｃＲｎ結合親和性を増加または低減することができると報告されている（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、Ｎａｔ．ＲｖｉｅｗＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７：７１５〜７２５、２００７）。韓国特許番号ＫＲ１０−１０２７４２７は、増加されたＦｃＲｎ結合親和性を有するトラスツズマブ（ハーセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）変異体を開示し、且つ、これらの変異体は、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｙ、２７９Ｑ、２７９Ｙ、３０８Ｆおよび３０８Ｙから選ばれる１つまたはより多くのアミノ酸修飾を含む。韓国特許公開番号ＫＲ２０１０−００９９１７９はベバシズマブ（アバスチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）変異体を提供し、且つ、これらの変異体は、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４ＳおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓに含まれるアミノ酸修飾により、増加された体内半減期を示す。また、Ｈｉｎｔｏｎらは、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌとの２つの変異体が、ＦｃＲｎとの結合をそれぞれ３倍、７倍増加させることも発見した。２つの部位を同時に突然変異すると、結合は２８倍増加する。アカゲザルの体内で、Ｍ４２８ＬまたはＴ２５０ＱＭ／４２８Ｌ変異体は、血漿半減期が２倍増加したことを示す（ＰａｕｌＲ．Ｈｉｎｔｏｎら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ、２００６、１７６：３４６〜３５６）。より多くの新生児受容体（ＦｃＲｎ）との結合親和性が強化されたＦｃ変異体に含まれる変異部位は、中国発明専利ＣＮ２０１２８００６６６６３．２を参照することができる。また、研究によれば、５種類のヒト源化抗体のＦｃセグメントに対してＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ突然変異を行うことは、ＦｃとＦｃＲｎとの相互作用を改善するだけでなく、その後の体内薬物動態試験において、皮下注射で投与し、Ｆｃ突然変異抗体は野生型抗体と比べ、薬物動態パラメータが改善され、例えば、体内暴露量が増加され、浄化率が低下し、皮下生物利用度が向上したことが発見した（Ｄａｔｔａ−ＭａｎｎａｎＡら．ＭＡｂｓ．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、２０１２、４（２）：２６７〜２７３．）。
【００５３】
融合タンパク質およびその調製方法
本発明の融合タンパク質遺伝子は、コドンが最適化された人工合成方法で調製されたものである。本発明に係るヌクレオチド配列によれば、当業者は簡単に様々な既知の方法で本発明のコード核酸を製造することができる。これらの方法は、人工合成または従来のサブクローン等に限定されず、具体的な方法はＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」を参照することができる。本発明の１つの実施形態として、ヌクレオチド配列を段階的に合成してからサブクローンを行う方法により、本発明のコード核酸配列を構築する。
【００５４】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする配列と、それに作動的に連結された発現制御配列とを含む哺乳動物細胞の発現ベクターをさらに提供する。前記「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」とは、直線ＤＮＡ配列の一部が、同じ直線ＤＮＡ配列の他の部分の活性を調節または制御することができる状況を指す。例えば、プロモーターが配列の転写を制御すれば、それはコード配列に作動可能に連結されたものである。
【００５５】
哺乳動物細胞発現ベクターは、市販されているもの、例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐＩＲＥＳ、ｐＤＲ、ｐＢＫ、ｐＳＰＯＲＴ等の真核細胞システム発現に使用可能なベクターを採用してもよいが、それらに限定されない。当業者は宿主細胞に基づいて適当な発現ベクターを選択してもよい。
【００５６】
既知の空の発現ベクターの酵素切断パターンによれば、当業者は、通常の方法で制限酵素の切断とつなぎ合わせにより、本発明の融合タンパク質のコード配列を適当な制限部位に挿入し、本発明の組換え発現ベクターを作製することができる。
【００５７】
本発明は、本発明の融合タンパク質のコード配列を含む、本発明の融合タンパク質を発現する宿主細胞をさらに提供する。前記宿主細胞は真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＲＳＦ細胞等が好ましいが、それらに限定されない。本発明の好ましい形態として、前記細胞はＣＨＯ細胞であり、本発明の融合タンパク質を好ましく発現することができ、活性が良好で、安定性が良好である融合タンパク質を得ることができる。
【００５８】
本発明は、組換えＤＮＡ技術で本発明の融合タンパク質を調製する方法を提供し、以下のステップを含む。
【００５９】
１）融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。
２）１）の核酸配列を適当な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターを得る。
３）２）の組換え発現ベクターを適当な宿主細胞に導入する。
４）発現に適する条件で宿主細胞を培養してトランスフェクトする。
５）上清を収集し、融合タンパク質の産物を精製する。
【００６０】
前記コード配列を宿主細胞に導入することは、本分野の複数種の既知の技術、例えば、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス感染、アルカリ金属イオン法を採用してもよいが、それらに限定されない。
【００６１】
宿主細胞の培養および発現については、ＯｌａｎｄｅｒＲＭら、ＤｅｖＢｉｏｌＳｔａｎｄ１９９６、８６：３３８を参照することができる。遠心により懸濁液内の細胞および残渣を除去し、上清を収集することができる。
【００６２】
上記調製された融合タンパク質をほぼ均一な性質に精製することができ、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で単一または特定のバンドを呈する。まず、発現上清を濃縮し、濃縮液をゲルクロマトグラフィーの方法でさらに精製し、またはイオン交換クロマトグラフィーの方法で精製することができる。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーである。ゲルマトリックスは、アガロース、デキストラン、ポリアミド等のタンパク質の精製によく使用される媒体であってもよい。Ｑ−またはＳＰ−基は、理想的なイオン交換基である。最後に、ヒドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィー等の方法で上記精製産物をさらに精製してもよい。上記全ての精製ステップは、異なる組み合わせを利用し、最終的にタンパク質の純度をほぼ均一にすることができる。前記融合タンパク質の特異性抗体、受容体またはリガンドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて発現した融合タンパク質を精製してもよい。使用するアフィニティーカラムの特性により、通常の方法、例えば、高塩緩衝液、ｐＨの変更等の方法を用いてアフィニティーカラムに結合された融合性ポリペプチドを溶出することができる。
【００６３】
医薬組成物
本発明は、有効用量の（好ましくは約２〜１０μｇ／ｋｇである）の本発明の融合タンパク質、および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物をさらに提供する。通常、有効量の本発明の融合タンパク質を無毒、不活性、医薬的に許容できる水性担体媒体に調製することができ、ここで、ｐＨが通常約５〜８であり、好ましくは、ｐＨが約６〜８である。「有効量」または「有効用量」という用語は、ヒトおよび／または動物に機能または活性を与え、或いはヒトおよび／または動物に受け入れられる量を意味する。「医薬的に許容できる」成分は、ヒトおよび／または哺乳動物に適用し、過度の好ましくない副反応（例えば、毒性、刺激およびアレルギー）がない、すなわち、合理的な利益／リスク比を有する物質である。「医薬的に許容できる担体」という用語は、各種の賦形剤および希釈剤を含む治療剤の投与に用いられる担体を意味する。
【００６４】
医薬的に許容できる担体は、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、アルコール、およびその組み合わせを含んでもよいが、それらに限定されない。通常の医薬製剤は投与方式に合うべきであり、本発明の医薬組成物は注射剤の形式に作製することができ、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他の補助剤を含む水溶液を用いて通常の方法により調製される。前記医薬組成物は無菌の条件で製造することが好ましい。活性成分の投与量は治療の有効量である。本発明の医薬製剤は持続放出製剤に作製することができる。
【００６５】
本発明に係る融合タンパク質の有効量は、投与のモードおよび治療待ちの疾患の重篤度等に従って変化する。好ましい有効量の選択は、当業者が各種の要因に基づいて決定することができる（例えば、臨床試験により）。前記要因は、前記融合タンパク質の薬物動態パラメータ、例えば、生物利用率、代謝、半減期等と、患者が治療しようとする疾患の重篤度、患者の体重、患者の免疫状況、投与経路等とを含んでもよいが、それらに限定されない。
【実施例】
【００６６】
実施例１．ＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードする発現プラスミドを構築する
ＦＶＩＩＩリーダーペプチド、成熟タンパク質、可撓性ペプチドリンカー、ＣＴＰ剛性単位、およびヒトＩｇＧ  ｖＦｃ変異体をコードする遺伝子配列は、全て手動で最適化されたＣＨＯ細胞によって好まれるコドンであり、人工合成により取得された。合成された融合タンパク質の全長ＤＮＡ断片の５′端および３′端にそれぞれ１つの制限エンドヌクレアーゼの酵素切断部位を有し、それぞれＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩであり、全長ＤＮＡ断片がｐＵＣ５７転移ベクターの対応する酵素切断部位の間に挿入され、ＤＮＡ配列決定によって配列を検証した。
【００６７】
その後、上記得られた融合タンパク質の全長遺伝子断片を、中間ベクターからｐｃＤＮＡ３．１をテンプレートとして改造された発現プラスミドＰＴＹ１Ａ１の対応する酵素切断部位の間に転移し、融合タンパク質の高発現プラスミドを得た。ＰＴＹ１Ａ１プラスミドは、１）ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターおよび哺乳動物細胞外因性高発現に必要なエンハンサーと、２）細菌においてカナマイシン耐性を有し、哺乳動物細胞においてＧ４１８耐性を有する二重スクリーニングされたマーカーと、３）宿主細胞がＤＨＦＲ遺伝子欠乏型である場合、メトトレキサート（ＭＴＸ）は融合遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子を共に増幅することができるマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子発現カセットと（米国特許ＵＳ４、３９９、２１６を参照）の重要な発現部品を含んでもよいが、それらに限定されない。また、融合タンパク質の発現プラスミドを哺乳動物の宿主細胞系にトランスフェクトし、安定した高レベルの発現を取得するために、好ましい宿主細胞系はＤＨＦＲ酵素欠乏型ＣＨＯ−細胞である（米国特許ＵＳ４、８１８、６７９を参照）。２日間トランスフェクトした後、培地を０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む選択培地に変え、細胞を一定の濃度（５０００〜１００００個の生存細胞／穴）で９６穴培養用プレートに植え付け、大きな離散細胞クローンが現れるまで１０〜１４日間培養した。ＥＬＩＳＡ分析方法で、使用される医薬に耐性を有するトランスフェクタントをスクリーニングした。９６穴培養用プレートを限界希釈することにより、サブクローンは高レベルの融合タンパク質の穴を生じた。
【００６８】
以下の表に示すように、本発明は、異なる長さのペプチドリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）、異なる構成のＣＴＰ剛性単位、およびいくつかの異なるサブクラスのＩｇＧＦｃ変異体（ｖＦｃ）素子からなる１シリーズのｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質を構築した。少なくとも１つを含むかつ異なる長さのＣＴＰ剛性単位がいずれも融合タンパク質の活性を著しく向上させることができることを検証するために、融合タンパク質ＦＰ−Ａ、ＦＰ−Ｂ、ＦＰ−Ｃ、ＦＰ−Ｄ、およびＦＰ−Ｅを構築した。ここで、ＦＰ−Ｂのアミノ酸およびコードヌクレオチドは図１に示すとおりである。ＣＴＰ剛性単位の融合タンパク質活性に対する重要性を検証するために、ＣＴＰ剛性単位を含まないＦｃ融合タンパク質ＦＰ−ＧおよびＦＰ−Ｈを同時に構築し、発現プラスミドの構築方法は上記内容と同じである。また、ＣＴＰ剛性単位位置の重要性を検証するために、ＣＴＰのＦｃＣ端に位置するＦＰ−Ｆをさらに構築した。詳細は表１を参照する。各構成要素のアミノ酸配列を配列表に示す。
【００６９】
【表１】
2019531087.tif 000002
【００７０】
実施例２．各融合タンパク質の一過性発現および活性の測定
実施例１で得られた８種の発現プラスミドを、３０ｍｌのフラスコにおいてＤＮＡＦｅｃｔ  ＬＴ試薬ＴＭ（ＡＴＧＣｅｌｌ社）を用いて３×１０７ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞は１０００ｎｇ／ｍｌのビタミンＫ１を含む無血清増殖培地中で５日間増殖させ、上清内の融合タンパク質の濃度を測定し、且つ、実施例６または７で説明した方法でその活性を測定した。ＥＬＩＳＡの結果により、８種のプラスミドの該条件での一過性発現量は類似するが、それらの血液凝固活性は大きな差を示すことが示された。
【００７１】
ここで、ＦＰ−Ａのモル比活性を１００％と定義した。ＦＰ−Ｇ細胞培養の上清内の融合タンパク質は、不活性形式の重合体形式で分泌されることが多い。一方、ＦＰ−ＦおよびＦＰ−Ｈプラスミドが発現した融合タンパク質は活性が相対的に低く、それぞれＦＰ−Ａの約２０．５％および約１５．２％であり、同様に大部分が重合体形式で発現した。また、融合タンパク質ＦＰ−Ｆ、ＦＰ−ＧおよびＦＰ−Ｈの安定性が相対的に悪く、分解しやすい。報告によれば、ＦＶＩＩＩ２３０３〜２３３２領域の脂質結合ドメイン（Ｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）がその機能に極めて重要であり、該領域のごく僅かな配座変化はタンパク質の重合を引き起こし、活性の喪失になる（ＧｉｌｂｅｒｔＧＥら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、３２（３７）：９５７７〜９５８５）。そのため、培養上清内のＦＶＩＩＩ融合タンパク質ＦＰ−Ｆ、ＦＰ−ＧおよびＦＰ−Ｈは、脂質結合ドメインの配座がＣ端Ｆｃリガンドの影響を受けて変化し、タンパク質の凝集を引き起こし、活性を大きく低減すると推測された。ＣＴＰを含むＦＰ−Ｂ、ＦＰ−Ｃ、ＦＰ−ＤおよびＦＰ−Ｅの活性は、それぞれＦＰ−Ａの１１３．４％、９６．０％、８７．４％および９３．７％である。
【００７２】
ＦＰ−Ｂ、ＦＰ−ＦおよびＦＰ−Ｈの活性の差異から、ペプチドリンカーを延長するだけでは、融合タンパク質の活性を効果的に改善することができず、融合タンパク質が重合および分解しやすい問題も解決できないことが分かった。ＣＴＰの加入により、融合タンパク質ＦＰ−Ｂの活性が著しく増加した。その原因を推測すると、長すぎる可撓性ペプチドリンカーはＦＶＩＩＩにより高い柔軟性を与え、Ｆｃに対して自由に回転できるようにし、これはＦＶＩＩＩの立体構造をＦｃドメインにより近づける可能性があり、両者の間にＣＴＰ剛性単位を加入し、一方で一端の剛性ペプチドリンカーを増加し、互いを遠ざけることに相当し、より重要なのは、ＣＴＰ剛性単位は複数のグリコシル基側鎖を含み、可撓性ペプチドリンカーのランダムコイル形態に対し、ＣＴＰ剛性単位は固定の空間配座を形成することができ、融合タンパク質の異なる機能ドメインを効果的に分けることができ、これは２つの部分が独立に折り畳んで正確な三次元配座を形成し、高い活性を保持することにさらに有利である。ＦＰ−ＢおよびＦＰ−Ｆの活性の比較によってこのような推測の正確性を検証し、すなわち、ＣＴＰ剛性単位がＦｃ  Ｃ端にあるＦＰ−Ｆの活性はＣＴＰ剛性単位のＦｃのＮ端にあるＦＰ−Ｂの２０％以下である。以上の結果から、ＣＴＰ剛性単位が融合タンパク質の活性に極めて重要であり、且つ、ＣＴＰ剛性単位がＦｃのＮ端にあることが融合タンパク質の活性を効果的に向上させることができることが実証された。
【００７３】
実施例３．高発現融合タンパク質を安定してトランスフェクトする細胞系をスクリーニングする
上記ＦＰ−Ａ、ＦＰ−Ｂ、ＦＰ−Ｃ、ＦＰ−ＤおよびＦＰ−Ｅの発現プラスミドを哺乳動物の宿主細胞系にトランスフェクトし、ＦＶＩＩＩ融合タンパク質を発現した。安定した高レベルの発現を維持するために、好ましい宿主細胞はＤＨＦＲ欠乏型のＣＨＯ細胞である（米国特許ＮＯ．４８１８６７９）。１つの好ましいトランスフェクト方法はエレクトロポレーションであり、リン酸カルシム共沈法、リポフェクション、およびマイクロインジェクション等を含む他の方法を使用してもよい。エレクトロポレーション方法は、３００Ｖ電圧および１０５０μＦｄコンデンサに設置するＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用し、キュベット内に配置された２〜３×１０７個の細胞に５０μｇのＰｖｕＩで線形化された発現プラスミドを添加し、エレクトロポレーション後の細胞を３０ｍｌの増殖培地を含むフラスコに転移した。２日間トランスフェクトした後、培地を０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む増殖培地に変え、細胞を一定の濃度で９６穴培養用プレートに植え付け、大きな離散細胞クローンが現れるまで１０〜１２日間培養した。抗ヒトＩｇＧ  ＦｃのＥＬＩＳＡ分析方法で、使用される医薬に耐性を有するトランスフェクタントをスクリーニングし、抗ＦＶＩＩＩのＥＬＩＳＡ分析方法で融合タンパク質発現の定量測定を行い、その後、限界希釈法によってサブクローンが高レベルの発現融合タンパク質の穴を生じてもよい。
【００７４】
融合タンパク質の高レベルの発現を実現するために、ＭＴＸ医薬に抑制されたＤＨＦＲ遺伝子を用いて共増幅することが好ましい。段階的に増加される濃度のＭＴＸを含む増殖培地において、ＤＨＦＲ遺伝子を用いて融合タンパク質遺伝子を共増幅してトランスフェクトした。ＤＨＦＲ発現が陽性であるサブクローンを限界希釈し、徐々に加圧して６μＭと高いＭＴＸ培地で増殖できるトランスフェクタントをスクリーニングし、その分泌率を測定し、高発現外因性タンパク質の細胞系をスクリーニングした。２４時間ごとの分泌率が約１（好ましくは約３）ＩＵ／１０６（すなわち、百万）個の細胞を超えた細胞系を無血清培地で適応的に浮遊培養し、その後、条件培地で融合タンパク質を精製した。
【００７５】
以下の実施例において、ＦＰ−Ｂを例とし、上記実施例でスクリーニングされたいくつかの融合タンパク質の発酵、精製ステップおよび方法を具体的に説明し、ＦＰ−Ａ、ＦＰ−Ｃ、ＦＰ−ＤおよびＦＰ−Ｅの方法は同じであり、実施例では説明を省略する。
【００７６】
実施例４．融合タンパク質を生産する
実施例３で好ましく得られた高収率の細胞株を、まず、培養皿で無血清馴化培養を行い、その後、フラスコに移して浮遊馴化培養を行った。細胞がこれらの培養条件に適応した後、３００ｍｌのフラスコに供給流加培養を行い、または毎日培地を交換する方法により灌流培養を模擬した。実施例３でスクリーニングされた融合タンパク質ＦＰ−Ｂを生産するＣＨＯ由来の細胞株を、３００ｍｌ体積のフラスコに１４日間供給流加培養し、発現した組換え融合タンパク質の累積収量は２００ｍｇ／Ｌに達し、生存細胞の密度は最大で１５×１０６個／ｍＬに達することができる。より多くの融合タンパク質を得るために、１０００ｍｌのフラスコを選択して培養してもよい。他の培養方法は、上記ＣＨＯ由来の細胞株を１００ｍｌ体積のフラスコに毎日培地を交換し、発現した組換え融合タンパク質の毎日の累積収量は約２０ｍｇ／Ｌであり、フラスコにおける生存細胞の密度は最大で３０×１０６個／ｍＬに達することができる。以上の２種類の方法で生産された組換え融合タンパク質の測定された生物学的活性は相当である。
【００７７】
実施例５．融合タンパク質を精製して定性する
本発明は主に４ステップのクロマトグラフィーを採用して融合タンパク質ＦＰ−Ｂを精製した。それぞれがアフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子篩クロマトグラフィーである（本実施例に採用されるタンパク質精製装置は、米国ＧＥ社のＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５Ｍである。本実施例に採用される試薬は、全て国薬集団化学試薬有限公司から購入され、純度は全て分析グレードである）。
【００７８】
ステップ１、アフィニティークロマトグラフィー：Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ社の耐アルカリＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄまたは他の市販されている組換えｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー媒体（例えば、ＧＥのＭａｂｓｅｌｅｃｔ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＴＯＳＯＨのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−６５０Ｆ、Ｓｍａｒｔ−ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｂｅａｄ、Ｓｅｐａｘ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭａｂＰｕｒｉｘ、ＰａｌｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ）を採用して試料捕捉、濃縮、一部の汚染物の去除を行った。まず、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を平衡した。清澄された発酵液を５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でローディングし、積載量が５００００ＩＵ／ｍｌ以下である。ローディングが完了した後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を平衡し、結合していない成分を洗浄した。２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、２ＭのＮａＣｌ、４Ｍのｕｒｅａ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の洗浄ｂｕｆｆｅｒ１を使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積を洗浄し、一部の汚染物を除去した。２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を平衡した。その後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０％のエチレングリコール、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の洗浄ｂｕｆｆｅｒ２を使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積を洗浄し、一部の汚染物を除去した。２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を平衡した。その後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、５０％のエチレングリコール、ｐＨが５．０の溶出ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０ｃｍ／ｈ以下の線形流速で目標産物を溶出し、目標ピークを収集し、ｐＨ９．０の２ＭのＴｒｉｓでｐＨを中性（７．０〜８．０）まで中和した。
【００７９】
ステップ２、疎水性クロマトグラフィー：Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ社のＢｕｔｙｌ  ＨＰまたは他の市販されている疎水性クロマトグラフィー媒体（例えば、ＧＥのＢｕｔｙｌ  ＨＰ、ＴＯＳＯＨのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ−６５０、Ｓｍａｒｔ−ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのＢｕｔｙｌ  Ｂｅａｄｓ  ４ＦＦ、Ｓｅｐａｘ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧｅｎｅｒｉｋ  ＭＣ３０−ＨＩＣ  Ｂｕｔｙｌ、ＭｅｒｃｋのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  Ｐｒｏｐｙｌ）を使用して中間精製を行い、重合体の含有量を低減した。ステップ１の親和溶出液に一定の割合の重合体が依然として含まれ、重合体の形成原因が様々で、構造が改造されていない重合および構造が変化した重合を含み、それらの生物学的活性の差が大きいため、生物学的活性の分析に大きな干渉をもたらす。そのため、捕捉が完了した後、まず重合体を除去した。目標タンパク質が重合した後、重合体と単量体との間に、電荷特性および疎水性を含む性質的な差異が存在し、疎水性の差異で両者を分離した。精製の最後のステップが分子篩クロマトグラフィーであるため、ステップ１のアフィニティークロマトグラフィーで捕捉された融合タンパク質は、またＢｕｔｙｌ  ＨＰでステップ２の精製を行い、その目標は重合体を部分的に除去し、その含有量を１０％よりも低くすることである。まず、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を平衡した。有機溶剤の含有量を低減するために、親和捕捉されたサンプルを平衡ｂｕｆｆｅｒで２倍希釈し、その後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の濃縮ｂｕｆｆｅｒを等容量に添加した。その後、ローディングし、積載量を＜２００００ＩＵ／ｍｌに制御した。ローディングが完了した後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄した。その後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、２０％のエチレングリコール、ｐＨが６．８〜７．２のｗａｓｈｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄し、一部の重合体を除去した。最後に、目標タンパク質を溶出し、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、５０％のエチレングリコール、ｐＨが６．８〜７．２の溶出ｂｕｆｆｅｒを使用し、６０ｃｍ／ｈ以下の線形流速で溶出し、溶出成分を段階的に収集し、それぞれＳＥＣ−ＨＰＬＣに送って検査する。単量体の百分率が９０％よりも大きい目標成分を合わせて次のクロマトグラフィーを行った。
【００８０】
ステップ３、陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ社のＱ−ＨＰまたは他の市販されている陰イオン交換クロマトグラフィー媒体（例えばＧＥのＱＨＰ、ＴＯＳＯＨのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａ  Ｃａｐ  Ｑ−６５０、Ｓｍａｒｔ−ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのＤＥＡＥ  Ｂｅａｄｓ６ＦＦ、Ｓｅｐａｘ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧｅｎｅｒｉｋ  ＭＣ−Ｑ、ＭｅｒｃｋのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、ＰａｌｌのＱ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤＦ）を使用して中間精製を行い、構造変異体を分離し、ＨＣＰ、ＤＮＡ等の汚染物をさらに除去した。まず、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄した。ステップ２の疎水性クロマトグラフィーで分離された目標タンパク質を２倍に希釈し、有機物の濃度を低減してからローディングし、積載量を５０００〜１００００ＩＵ／ｍｌに制御した。ローディングが完了した後、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、５０〜１００ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの３〜５個のカラム体積（ＣＶ）を洗浄した。その後、線形勾配の塩濃度を採用して溶出し、２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の溶出ｂｕｆｆｅｒを使用し、溶出ｂｕｆｆｅｒが０〜１００％で、２時間かかり、線形流速を５０ｃｍ／ｈ以下に制御することを条件とし、溶出成分を段階的に収集し、それぞれサンプルを送り、タンパク質の含有量、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、活性およびＨＣＰ含有量の検出を行った。タンパク質濃度測定およびタンパク質活性測定により、タンパク質の比活性が約１００００ＩＵ／ｍｇであると算出した。
【００８１】
ステップ４、分子篩クロマトグラフィー：Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ社のＣｈｒｏｍｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅまたは他の市販されている分子篩媒体（例えばＧＥのｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）を使用して分離し、その目標は、重合体の含有量を＜５％に低減し、且つ、重要な汚染物の含有量をさらに低減することである。２０ｍＭのＨｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨが６．８〜７．２の平衡ｂｕｆｆｅｒを使用し、２０〜４０ｃｍ／ｈの線形流速でクロマトグラフィーカラムの２つのカラム体積（ＣＶ）を洗浄した。ローディング量がカラム体積の３％以下で、２０ｃｍ／ｈの線形流速で洗浄し、溶出成分を順に収集し、ＳＥＣで検出し、合併した。
【００８２】
サンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ純度結果およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果をそれぞれ図２および図３に示し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果により、精製後の融合タンパク質ＦＰ−Ｂの主ピーク純度が９７％以上に達し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動バンドが予想通りで、非還元電気泳動は加工されていない融合タンパク質（３９０ＫＤａ）と、電気泳動時にＦＶＩＩＩの重鎖を１本脱落した後の断片ＨＣ−ＬＣ−Ｌ−ＣＴＰ−Ｆｃ：ＬＣ−Ｌ−ＣＴＰ−Ｆｃ（３００ＫＤａ）と、重鎖を２本脱落した後の（ＬＣ−Ｌ−ＣＴＰ−Ｆｃ）２二量体断片（２１０ＫＤａ）およびＨＣ（９０ＫＤａ）とを含む。還元した後、明らかなＨＣ−ＬＣ−Ｌ−ＣＴＰ−Ｆｃ（１９０ｋＤａ）、ＬＣ−Ｌ−ＣＴＰ−Ｆｃ（１０５ＫＤａ）、およびＨＣ（９０ＫＤａ）の一本鎖バンドが得られた。
【００８３】
実施例６．発色基質法で融合タンパク質の体外活性を間接的に測定する
ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の活性は発色基質法で測定できる。本実施例はＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｃｏａｔｅｓｔ  ＳＰＦＶＩＩＩキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｒｅｆ．Ｋ８２４０８６）を用いて測定し、その検出原理は以下の通りである。トロンビンにより活性化されると、ＦＶＩＩＩａはリン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、ＦＩＸａと結合して酵素複合体を形成し、続いて因子Ｘを活性化してその活性化形式Ｘａに変えることができる。活性化により形成された因子Ｘａはさらに、その特異的な発色基質（Ｓ−２７６５）を分解させ、発色団ｐＮＡを放出することができる。４０５ｎｍで生成されたｐＮＡの量を測定すると、その量に直接比例するＦＸａの活性の大きさを知ることができ、体系において因子ＩＸａおよび因子Ｘの含有量が一定で過剰であるため、ＦＸａの活性はＦＶＩＩＩａの含有量のみに直接関連する。本法で測定されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質の比活性は約６０００〜１００００ＩＵ／ｍｇであった。
【００８４】
実施例７．血液凝固法で融合タンパク質の生物学的活性を直接測定する
凝固法でＦＶＩＩＩの生物学的活性を測定することは、ＦＶＩＩＩ因子の血漿欠乏による凝固時間の延長する能力を訂正することにより取得される。ドイツのＳｉｅｍｅｎｓ社のＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｌａｓｍａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＯＴＸＷ１７）キットを用いてＦＶＩＩＩ活性を検出する方法は以下の通りである。まず、力価が知られている中国食品薬品検定研究院のＦＶＩＩＩ活性標準品を、５％のＦＶＩＩＩ欠乏血漿で１０ＩＵ／ｍｌに希釈し、その後、それぞれ１０倍、２０倍、４０倍および８０倍希釈した。全自動血液凝固分析装置（ＣＡ５００、ＳＹＳＭＥＸ社）で活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定した。ＦＶＩＩＩ活性標準品溶液の力価（ＩＵ／ｍｌ）の対数がその対応する凝固時間（ｓ）の対数に対応することで線形回帰し、ＦＶＩＩＩ標準品で検量線を作成した。その後、測定待ちのサンプルを適度に希釈した後、ＦＶＩＩＩ欠乏基質血漿と混合し、ＡＰＴＴ測定を行った。検量線方程式に代入すると、測定待ちのサンプルＦＶＩＩＩの力価を算出することができ、これにより、測定待ちのサンプルＦＶＩＩＩの比活性の大きさを求めることができ、単位がＩＵ／ｍｇであった。本法で測定されたでＦＶＩＩＩ融合タンパク質の比活性は約６０００〜１００００ＩＵ／ｍｇであった。
【００８５】
実施例８．融合タンパク質の血友病Ａマウスの急性出血に対する止血作用
ＶＩＩＩ因子の遺伝子からホモを除去したＨｅｍＡマウスの尾切断出血モデル（ｔａｉｌｃｌｉｐ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）で、実施例５で調製された融合タンパク質ＦＰ−ＢのＨｅｍＡマウス体内における止血活性を評価した。８〜１２週齢の雄ＨｅｍＡマウス（上海南方模式生物責任有限公司から購入）を選択し、１週間馴化した後、マウスを体重に従ってランダムに６グループに分け、さらに１グループのＨｅｍＡマウス陰性対照グループおよび１グループの正常Ｃ５７マウスの対照グループを設置し、それぞれ１回尾静脈注射して異なる活性用量の融合タンパク質ＦＰ−Ｂまたは対象医薬である注射用組換えヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｘｙｎｔｈａ、ファイザー株式会社）を投与した。動物のグループ分け状況を表２に示す。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
投与する前に、まず、１．０％のペントバルビタールナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）を０．１ｍｌ／１０ｇの用量で腹腔注射してマウスを麻酔し、その後、マウスを３７℃の加熱マットに置いてその体温を保持した。マウスの尾を３７℃の温水に１０分間浸入し、尾静脈を拡張させ、続いて表２に示す用量で投与した。投与してから１０分間後に、マウスの尾の末端から１．５ｃｍで切断し、尾端を約１３ｍｌの予熱生理食塩水が添加された遠心管に迅速に浸入させ、時間計測を始めた。出血が３０分内に停止すると、出血時間および出血量を記録する。出血時間が３０分を超えると、３０分と記録する。出血量（ｍｌ）＝（採血後の遠心管の重量（ｇ）−採血前の遠心管の重量（ｇ））／１．０５である。３０分後に、マウスの尾を生食塩水管から取り出した。２４時間内に、１０ｍｉｎごとに再出血状況を観察して記録し、マウスの生存数を記録した。全てのデータは平均数±標準誤差（`ｘ±ＳＥＭ）で表示され、各実験グループ間の比較はｔ−ｔｅｓｔ検定分析を採用し、分析ソフトウェアはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を採用し、ｐ＜０．０５は統計学的意義があると考えられる。
【００８８】
図４および図５における各グループの動物の出血時間および出血量の統計結果から分析すると、ＨｅｍＡマウスにＦＰ−Ｂ２７０ＩＵ／ｋｇを投与してから１０分間後に、その出血時間および出血量はＣ５７対照グループに近く、血液凝固促進効果が明らかで、ＦＰ−Ｂが血友病等の血液凝固因子欠乏症の急性出血の状況の有効な血液凝固剤とすることができることを意味する。マウスにＦＰ−Ｂ９０ＩＵ／ｋｇを投与した後、出血時間および出血量では同様にＣ５７対照グループに近かった。同等の活性用量のＦＰ−ＢおよびＸｙｎｔｈａをそれぞれ投与し、ＨｅｍＡマウスの出血量に著しい差はないが、各用量で、ＦＰ−Ｂグループの出血時間はいずれもＸｙｎｔｈａグループよりも僅かに少なく、ＦＰ−ＢがＸｙｎｔｈａよりも一定の薬効優位性を有する可能性があることを示す。ＦＰ−Ｂ  ３０  ＩＵ／ｋｇ投与グループと比べ、ＦＰ−Ｂ９０ＩＵ／ｋｇグループの出血時間は著しく短縮され（ｐ＜０．０５）、ＦＰ−Ｂ２７０ＩＵ／ｋｇグループの出血時間は著しく短縮され（ｐ＜０．０５）、出血量も著しく減少し（ｐ＜０．０５）、融合タンパク質ＦＰ−ＢのＨｅｍＡマウス急性出血に対する止血作用が一定の用量−効果関係を有することが示された（詳細な結果を表３に示す）。
【００８９】
術後の回復状況から見ると、同じ活性用量のＦＰ−ＢおよびＸｙｎｔｈａを投与し、ＦＰ−Ｂの各用量グループのマウスの生存率はいずれも同等の活性用量のＸｙｎｔｈａグループより優れ、融合タンパク質ＦＰ−ＢがＸｙｎｔｈａよりも長い薬効作用を有することが反映された（表３を参照）。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
本発明で言及された全ての文献はいずれも本出願に参照として引用され、それぞれの文献が別個に参照として引用されるとおりである。また、本発明の上記説明した内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を行うことが可能であり、これらの等価な形式は、同様に本出願に特許請求の範囲により限定される範囲に含まれることを理解すべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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