(57)【要約】本発明は、ＭＰＳ  Ｉを治療するための組成物および方法を提供する。（ａ）左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、（ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、（ｃ）レトロウイルスの移出エレメントと、（ｄ）セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、（ｅ）α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、（ｆ）右側の（３’）レンチウイルスＬＴＲと、を含む、ポリヌクレオチド。【選択図】図１
2019536484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、
（ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）レトロウイルスの移出エレメントと、
（ｄ）セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
（ｅ）α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、
（ｆ）右側の（３’）レンチウイルスＬＴＲと、を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記レンチウイルスが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）、ビスナ・マエディ（ｖｉｓｎａ−ｍａｅｄｉ）ウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記レンチウイルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記レンチウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記５’ＬＴＲのプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターで置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記３’ＬＴＲが、１つ以上の修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記３’ＬＴＲが、１ラウンドのウイルス複製を超えたウイルス転写を防止する１つ以上の欠失を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記３’ＬＴＲが、前記３’ＬＴＲのＵ３領域におけるＴＡＴＡボックス、ならびにＳｐ１およびＮＦ−κＢ転写因子結合部位の欠失を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記３’ＬＴＲが、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターが、インテグリンサブユニットアルファＭ（ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ）プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）プロモーター、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ１）プロモーター、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）プロモーター、ｓｐａｌｔ様転写因子１（ＳＡＬＬ１）プロモーター、接着Ｇタンパク質結合受容体Ｅ１（Ｆ４／８０）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、およびそれらの転写活性断片からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターが、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターまたはその転写活性断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターが、短いＥＦ１αプロモーターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターが、長いＥＦ１αプロモーターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ＩＤＵＡポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＩＤＵＡポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、発現のために最適化されたコドンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
（ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、
（ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）ＲＲＥレトロウイルスの移出エレメントと、
（ｄ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｅ）ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターと、
（ｆ）右側の（３’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
（ａ）左側の（５’）ＣＭＶプロモーター／ＨＩＶ−１キメラＬＴＲと、
（ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）ＲＲＥレトロウイルスの移出エレメントと、
（ｄ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｅ）ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターと、
（ｆ）右側の（３’）ＳＩＮ  ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたはウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターで形質導入された、哺乳動物細胞。
【請求項２０】
前記細胞が造血細胞である、請求項１９に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２１】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１９または２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２３】
ｇａｇをコードする第１のポリヌクレオチドと、ｐｏｌをコードする第２のポリヌクレオチドと、ｅｎｖをコードする第３のポリヌクレオチドと、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、を含む、産生細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の産生細胞によって産生された、レンチウイルスベクター。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を含むレンチウイルスベクターを含む、組成物。
【請求項２６】
薬学的に許容される担体と、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の哺乳類細胞を含むレンチウイルスベクターと、を含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
ＭＰＳ  Ｉを治療する方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターで形質導入された細胞、または請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
ＭＰＳ  Ｉを治療する方法であって、請求項２６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
対象におけるＭＰＳ  Ｉに関連する少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターで形質導入された細胞、または請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
対象におけるＭＰＳ  Ｉに関連する少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、請求項２６に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
前記ＭＰＳ  Ｉが、ハーラー症候群（ＭＰＳＩ−Ｈ）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）、またはシャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＰＳ  Ｉが、重症のＭＰＳ  Ｉまたは軽症のＭＰＳ  Ｉである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの症状が、ＧＡＧの蓄積、失明、聴力消失、学習および言語発達の遅滞、呼吸器疾患、心疾患、骨格異形症、ならびに認知機能低下からなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年１２月６月出願の米国仮特許出願第６２／４３０，７９５号の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照することによって本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０８１＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは２４ＫＢであり、２０１７年１２月６日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、遺伝子治療に関する。より具体的には、本発明は、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）を治療するための遺伝子治療組成物およびその使用方法に関する。
【０００４】
関連技術の説明
ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、リソソーム蓄積症として知られる重大な遺伝性障害の分類である。ＭＰＳは、連続的に特定のムコ多糖を分解し、再利用する身体の能力に干渉する。
【０００５】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）は、身体の多くの部分に影響を及ぼす病態である。この障害は、一時、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）、およびシャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）（最も重症のものから最も軽症の順に列挙されている）の３つの別個の症候群に分けられていた。これらの３つの症候群の各々の間には非常に多くの重複があるため、ＭＰＳ  Ｉは現在、重症および軽症の種類に分けられている。重症のＭＰＳ  Ｉは、約１００，０００人に１人の新生児において生じる。軽症のＭＰＳ  Ｉはより稀であり、約５００，０００人に１人の新生児において生じる。
【０００６】
ＭＰＳ  Ｉを有する人は、酵素α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするα−Ｌイズロニダーゼ遺伝子（ＩＤＵＡ）の不完全なコピーを有する。ＩＤＵＡは、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸と呼ばれる２つのＧＡＧ中に存在する非硫酸化α−Ｌイズロン酸を加水分解することによって、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはムコ多糖として知られる大きな糖分子の分解を担う。ＩＤＵＡ機能の喪失により、未消化のデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸ならびに他の有害な物質が身体中の細胞に蓄積される。
【０００７】
両方の形態のＭＰＳ  Ｉが多くの異なる器官および組織に影響を及ぼし得るが、重症のＭＰＳ  Ｉを有する人は、失明、聴力消失、学習および言語発達の遅滞、呼吸器および心臓の問題をはじめとする神経機能の進行性の低下を経験する。発達遅延は通常１歳までに現れ、重度に冒された個体は、最終的に基本的な機能的スキルを喪失する（発達的に退行する）。この形態の障害を有する子供は、通常、寿命が短く、場合によっては小児期後期までしか生存することができない。軽症のＭＰＳ  Ｉは、角膜混濁、心臓弁の欠陥、および骨格異形症を特徴とし、この形態の疾患を有する個体は典型的には成人まで生存し、寿命が短い場合も短くない場合もある。軽症の種類を有する人の一部は学習障害も有するが、他の人は知能的な障害を有さない。心臓病および気道閉塞が両方の種類のＭＰＳ  Ｉを有する人における主な死因である。
【０００８】
処置によりＭＰＳ  Ｉを有する個体の寿命および生活の質は改善され得るが、治療法は存在しない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、概して、部分的には、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）の少なくとも１つの症状の治療、予防、または改善のための遺伝子治療組成物および方法に関する。特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）、またはシャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）である。特定の実施形態では、ＭＰＳは、重症のＭＰＳ  Ｉまたは軽症のＭＰＳ  Ｉである。
【００１０】
様々な実施形態では、左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右側の（３’）レンチウイルスＬＴＲと、を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００１１】
特定の実施形態では、レンチウイルスは、ＨＩＶ（ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含めたヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディ（ｖｉｓｎａ−ｍａｅｄｉ）ウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶ−１である。
【００１４】
さらなる実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターで置換されている。
【００１５】
さらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、１つ以上の修飾を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、３’ＬＴＲは、１回目のウイルス複製を超えたウイルス転写を防止する１つ以上の欠失を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、３’ＬＴＲのＵ３領域におけるＴＡＴＡボックス、ならびにＳｐ１およびＮＦ−κＢ転写因子結合部位の欠失を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、３’ＬＴＲは自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【００１９】
ある特定の実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、インテグリンサブユニットアルファＭ（ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ）プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）プロモーター、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ１）プロモーター、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）プロモーター、ｓｐａｌｔ様転写因子１（ＳＡＬＬ１）プロモーター、接着Ｇタンパク質結合受容体Ｅ１（Ｆ４／８０）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、およびそれらの転写活性断片からなる群から選択される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターまたはその転写活性断片を含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターまたはその転写活性断片を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、短いＥＦ１αプロモーターである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、長いＥＦ１αプロモーターである。
【００２４】
さらなる実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
【００２５】
特定の実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現のために最適化されたコドンである。
【００２６】
特定の実施形態では、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ＲＲＥレトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターと、右側の（３’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００２７】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドであって、左側の（５’）ＣＭＶプロモーター／ＨＩＶ−１キメラＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ＲＲＥレトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターと、右側の（３’）ＳＩＮ  ＨＩＶ−１  ＬＴＲと、を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００２８】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたはウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００２９】
様々な実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクターで形質導入された哺乳動物細胞が提供される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞は造血細胞である。
【００３１】
ある特定の実施形態では、細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【００３２】
特定の実施形態では、細胞は幹細胞または前駆細胞である。
【００３３】
様々な実施形態では、産生細胞は、ｇａｇをコードする第１のポリヌクレオチドと、ｐｏｌをコードする第２のポリヌクレオチドと、ｅｎｖをコードする第３のポリヌクレオチドと、本明細書で企図されるポリヌクレオチドと、を含む。
【００３４】
様々な特定の実施形態では、本明細書で企図される産生細胞によって産生されるレンチウイルスベクターが提供される。
【００３５】
様々なある特定の実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドまたは哺乳動物細胞を含むレンチウイルスベクターを含む組成物が提供される。
【００３６】
様々なさらなる実施形態では、薬学的に許容される担体と、本明細書で企図されるポリヌクレオチドまたは哺乳動物細胞を含むレンチウイルスベクターとを含む薬学的組成物が提供される。
【００３７】
様々なさらなる実施形態では、ＭＰＳ  Ｉを治療する方法であって、本明細書で企図される、ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターで形質導入された細胞、または哺乳動物細胞を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００３８】
様々ないくつかの実施形態では、ＭＰＳ  Ｉを治療する方法であって、本明細書で企図される薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００３９】
様々な特定の実施形態では、対象におけるＭＰＳ  Ｉに関連する少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、本明細書で企図される、ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター、ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターで形質導入された細胞、または哺乳動物細胞を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００４０】
様々な実施形態では、対象におけるＭＰＳ  Ｉに関連する少なくとも１つの症状を軽減させる方法であって、本明細書で企図される薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００４１】
特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ）である。
【００４２】
特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）である。
【００４３】
特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）である。
【００４４】
特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、重症のＭＰＳ  Ｉである。
【００４５】
特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、軽症のＭＰＳ  Ｉである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの症状は、ＧＡＧの蓄積、失明、聴力消失、学習および言語発達の遅滞、呼吸器疾患、心疾患、骨格異形症、ならびに認知機能低下からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターの例示的なアーキテクチャを示す。
【図２Ａ】野生型対照細胞、ＩＤＵＡ−／−細胞、およびＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクター（ｐＭＮＤ−ＩＤＵＡおよびｐＥＦ１α−ＩＤＵＡ）で形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞におけるＩＤＵＡ酵素活性をアッセイする代表的な実験からのデータを示す。
【図２Ｂ】野生型細胞および非形質導入ＩＤＵＡ−／−線維芽細胞でアッセイしたバックグラウンドレベルと比較して、ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＩＤＵＡ−／−線維芽細胞が細胞培養上清中に約１０倍高い活性ＩＤＵＡを分泌することを示す。
【図３】野生型対照細胞、ＩＤＵＡ−／−細胞（ＧＭ０７９８およびＧＭ０６２１４）、ならびにＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞（ＭＮＤ．ＩＤＵＡおよびＥＦ１α（ＥＦＳ）．ＩＤＵＡ）からの細胞溶解液中のＩＤＵＡおよびアクチン発現のウェスタンブロットを示す。
【図４】ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αプロモーターを含むＬＶＶで形質導入されたヒトＣＤ３４＋細胞が、擬似形質導入細胞と比較して同様の増殖速度論を呈したことを示す。
【図５】ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αを含むＬＶＶで形質導入され、サイトカインで７日間培養されたヒトＣＤ３４＋細胞のＶＣＮを示す。
【図６】メチルセルロース培養中、１２日目の、ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αプロモーターを含むＬＶＶで形質導入されたヒトＣＤ３４＋細胞の個々のコロニーＶＣＮを示す。
【図７】ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αを含むＬＶＶで形質導入され、サイトカインで７日間培養されたヒトＣＤ３４＋細胞からの細胞ペレットおよび上清におけるＩＤＵＡ活性を示す。
【図８】メチルセルロース培養中、１２日目の、ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αプロモーターを含むＬＶＶで形質導入されたヒトＣＤ３４＋細胞からの細胞ペレットにおけるＩＤＵＡ活性を示す。
【図９】ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αを含むＬＶＶで形質導入され、サイトカインで７日間培養された３つのヒトＣＤ３４＋ドナー細胞のＶＣＮを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードする例示的なレンチウイルスベクターの配列を示す。
配列番号２は、ＩＤＵＡをコードする例示的なレンチウイルスベクターの配列を示す。
配列番号３〜１３は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４〜１６は、プロテアーゼ切断部位および自己切断性ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
【００４９】
（発明を実施するための形態）
Ａ．概要
本発明は、概して、部分的に、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）、シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）、重症のＭＰＳ  Ｉ、および軽症のＭＰＳ  Ｉを含む、ＭＰＳ  Ｉの少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するための改良された遺伝子治療組成物および方法に関する。
【００５０】
ＭＰＳ  Ｉを有する子供は、生まれたときにはＭＰＳ  Ｉの兆候または症状を有さない場合があるが、一部は、臍の周り（臍ヘルニア）または下腹部（鼠径ヘルニア）に柔らかい膨出を有する。重症のＭＰＳ  Ｉを有する個体は、一般的に、１歳までに障害の他の兆候および症状を示し始めるが、軽症のＭＰＳ  Ｉを有するものは、小児期の後期にかけてより軽度の特徴を発症する。
【００５１】
ＭＰＳ  Ｉは、大頭症、水頭症、心臓弁異常、特有の顔面特徴、肝腫大、脾腫大、および巨舌症と関連付けられ得る。声帯が大きくなることもあり、太い嗄声をもたらす。ＭＰＳ  Ｉを有する一部の人においては気道が狭くなり、頻繁な上気道感染症、および睡眠中の一時的な呼吸停止（睡眠時無呼吸）を引き起こす場合がある。ＭＰＳ  Ｉを有する個体はまた、目の透明なカバー（角膜）の混濁を発症する場合もあり、これは顕著な視力の喪失を引き起こし得る。冒された個体はまた、聴力消失および繰り返し起こる耳感染症を有し得る。ＭＰＳ  Ｉを有する個体の一部は、伸長が低く、動きやすさに影響する関節変形（拘縮）を有する。重度のＭＰＳ  Ｉを有するほとんどの個体はまた、多発性骨形性不全症、手根管症候群、および脊髄を圧迫し損傷し得る頸椎脊椎管狭窄症を有する。
【００５２】
両方の形態のＭＰＳ  Ｉが多くの異なる器官および組織に影響を及ぼし得るが、重症のＭＰＳ  Ｉを有する人は、１〜４歳の間に症状を経験し、失明、聴力消失、学習および言語発達の遅滞、呼吸器および心臓の問題をはじめとする神経機能を進行的に喪失する。軽症のＭＰＳ  Ｉを有する個体は通常、短い寿命を有さず、角膜混濁、心臓弁欠陥、および骨格異形症によって呈する。
【００５３】
様々な実施形態では、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードする遺伝子治療ベクターが企図される。遺伝子治療は、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを優先的に含む。遺伝子治療ベクターは、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されないウイルスベクターであり得る。
【００５４】
本明細書で企図される遺伝子治療ベクターで形質導入された細胞も様々な態様で提供される。いくつかの好ましい実施形態では、形質導入された細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含むが、これに限定されない造血細胞である。
【００５５】
様々な他の実施形態では、本明細書で企図される遺伝子治療組成物は、好ましくは、ＭＰＳ  Ｉと診断されたか、またはそれを有する対象を有する対象に投与される。
【００５６】
様々な他の実施形態では、本明細書で企図される遺伝子治療組成物は、好ましくは、ＩＤＵＡ遺伝子において１つ以上の変異を有する対象を有する対象に投与される。
【００５７】
特定の実施形態の実践は、特に矛盾を示さない限り、当該技術分野の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは、例示のために以下に記載されている。このような技法は文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌における研究論文を参照されたい。
【００５８】
Ｂ．定義
別段に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。特定の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の方法および材料を使用することができるが、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００５９】
冠詞「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち少なくとも１つ、または１つ以上）を指すために使用される。例として、「ａｎ（１つの）要素」とは、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【００６０】
選択肢（例えば、ｏｒ「または」）の使用は、選択肢のいずれか一方、その両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
【００６１】
「および／または」という用語は、選択肢のいずれか一方、または両方を意味すると理解されるべきである。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけ変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
【００６３】
一実施形態では、範囲、例えば１〜５、約１〜５、または約１〜約５は、範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単なる例示的な実施形態では、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５の、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５もしくは５．０の、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０の表現と同等である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、基準となる含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の、含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」とは、基準となる含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同等の、例えば生理学的効果などの効果を生じる、含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【００６５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、明記されているステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を包含するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を排除するものではないことを示唆すると理解されたい。「からなる」とは、「からなる」という句に続くものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の一切の要素が存在すべきでないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、この句の後に列挙されている任意の要素を包含し、列挙された要素に関する本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されるものとする。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、列挙された要素が必要または必須であるが、記載された要素の活性または作用に実質的に影響する他の要素は存在しないことを示す。
【００６６】
本明細書を通して、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせの言及は、実施形態に関連して説明した特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所における前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせることができる。一実施形態における特徴の明確な記載は、特定の実施形態における特徴を除外するための根拠として役立つことも理解される。
【００６７】
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」とは、一般に、ビヒクルまたは対照分子／組成物と比較して、より高い生理学的応答を誘発するか、引き起こすか、または生み出す、本明細書で企図される組成物および／または方法の能力を指す。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量とは、典型的に、「統計的に有意な」量であり、対照の量の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍以上（例えば、５００倍、１０００倍）（１を超える全ての整数およびその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７１．８倍などを含む）である増加を含み得る。
【００６８】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「弱める（ａｂａｔｅ）」とは、一般的に、ビヒクルまたは対照組成物または方法の応答と比較して、減少した生理学的応答をもたらす組成物または方法を指す。形質導入された細胞の「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」量とは、典型的に、「統計的に有意な」量であり、対照の量の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍以上（例えば、５００倍、１０００倍）（１を超える全ての整数およびその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７１．８倍などを含む）である減少を含み得る。
【００６９】
「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「保存する（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）」または「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」または「変化なし（ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な変化なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的に減少なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、一般に、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれか、または特定の細胞における応答によって引き起こされる応答に匹敵する生理学的応答を指す。匹敵する応答は、参照応答と有意差がないか、または測定可能に違いがない応答である。
【００７０】
「ＭＰＳ  Ｉ」とは、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）を指し、特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ＩＤＵＡの機能、活性、および／または発現を減少させるα−Ｌイズロニダーゼ遺伝子（ＩＤＵＡ）における１つ以上の変異を特徴とする。特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ）を指す。特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）を指す。特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）である。特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、重症のＭＰＳ  Ｉを指す。特定の実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、軽症のＭＰＳ  Ｉを指す。
【００７１】
以下の説明において、ある特定の詳細は、本明細書で意図される本発明の種々の例示的な実施形態の徹底的な理解を提供するために記載されている。しかし、当業者には、これらの詳細なしで特定の例示的な実施形態を実施することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載の構造および置換基の種々の組み合わせから誘導された個々のベクター、またはベクターの群が、各ベクターまたはベクターの群が個別に記載されているのと同じ程度に本出願により開示されていることが理解されるべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換基の選択は本開示の範囲内である。
【００７２】
Ｃ．ポリペプチド
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、反対のことが示されない限り、従来の意味、すなわちアミノ酸の配列として互換的に用いられる。一実施形態では、「ポリペプチド」には、融合ポリペプチドおよび他のバリアントが含まれる。ポリペプチドは、種々の周知の組換えおよび／または合成技術のいずれかを用いて調製することができる。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含むことができ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない、当該技術分野で既知の他の修飾が含まれる。
【００７３】
種々の実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドを含むがこれに限定されないポリペプチドが本明細書で企図される。
【００７４】
本明細書で使用する「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境からの、ならびに、細胞の他の成分関連するものからの、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロ単離および／または精製を指し、すなわち、それはインビボ物質と有意に関連していない。
【００７５】
ポリペプチドには、「ポリペプチドバリアント」が含まれる。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入において、天然に存在するポリペプチドと異なっていてもよい。このようなバリアントは、天然に存在し得るものであり、または例えば上記ポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態では、ポリペプチドに１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することによって、ポリペプチドの生物学的特性を調節することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で企図される任意の参照配列と少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドバリアントを含み、典型的にはバリアントはその参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【００７６】
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性な断片」または「最小限の生物学的に活性な断片」とは、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を指す。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換え生産された１つ以上のアミノ酸の、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失もしくは置換を有する単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある特定の実施形態では、断片は少なくとも５，６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸長であることが理解されよう。
【００７７】
ポリペプチド断片の実例は、触媒ドメインなどを含む。
【００７８】
上記のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で変更することができる。そのような操作のための方法は、当該技術分野において一般的に知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそれらの中に引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出すことができる。
【００７９】
ある特定の実施形態では、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、ペプチド化学の分野の当業者がポリペプチドの二次構造および疎水性を実質的に変化させないように、アミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換したものである。特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において修飾を行うことができ、ポリペプチドには、少なくともおおよそ、およびなおも得る、所望の特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を有するポリペプチドが含まれる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して同等の、または改良されたバリアントポリペプチドを作製することが望まれる場合、当業者は、例えば、コードするＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変化させることができる。
【００８０】
どのアミノ酸残基が生物活性を失うことなく置換、挿入または欠失され得るかを決定するための指針は、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ  ＶｅｃｔｏｒまたはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアのような当該分野で周知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖に関連するアミノ酸ファミリーの１つの置換を含む。天然アミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は当業者に既知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変えることなく作製することができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい。）。
【００８１】
このような変更を行う際には、アミノ酸のヒドロパシーインデックスを考慮することができる。タンパク質に対する相互作用的生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、当該技術分野で一般に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、参照により本明細書に組み込まれる）。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいてヒドロパシーインデックスが割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は：イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（０．４）、トレオニン（０．７）、セリン（０．８）、トリプトファン（０．９）、チロシン（１．３）、プロリン（１．６）、ヒスチジン（３．２）、グルタミン酸（３．５）、グルタミン（３．５）、アスパラギン酸（３．５）、アスパラギン（３．５）、リジン（３．９）およびアルギニン（４．５）である。
【００８２】
ある種のアミノ酸は、類似のヒドロパシーインデックスまたはスコアを有する別のアミノ酸に置換でき、類似の生物学的活性を有するタンパク質がなおも得られる、すなわち生物学的機能的に同等のタンパク質をなおも得ることができることは、当該技術分野において既知である。このような変更を行う際には、ヒドロパシーインデックスが±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が特に好ましく、±０．５以内の置換がさらにより特別に好ましい。類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることも当該技術分野で理解されている。
【００８３】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものに置換することができ、生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のタンパク質をなおも得ることができることが理解される。このような変更では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特別に好ましい。
【００８４】
上に概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくことができる。
【００８５】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集性コンジュゲート、および無関係な化学的部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合性コンジュゲートをさらに含む。共有結合性バリアントは、当該技術分野で知られているように、アミノ酸鎖またはＮ末端残基またはＣ末端残基に見出される基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントはまた、対立遺伝子バリアント、種バリアント（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔ）および突然変異タンパク質も含む。タンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の切断または欠失もまた変異である。
【００８６】
特定の実施形態で企図されるポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態では、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
【００８７】
別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所に開示されるような１つ以上の自己切断性ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
【００８８】
融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、クロマチン再構成ドメイン、ヒストン修飾ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、細胞外ドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、多量体化ドメイン、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、およびＨＡ）ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含むことができる。融合ポリペプチドは、典型的にはＣ末端からＮ末端に連結されるが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端にも連結することができる。特定の実施形態では、融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存される限り、保存的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、突然変異体、部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）および種間相同体を含むことができる。融合ポリペプチドは、化学合成法または２つの部分間の化学結合によって生成されてもよく、または一般に他の標準技術を用いて調製されてもよい。融合ポリペプチドを含む連結ＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所に開示されているような好適な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結される。
【００８９】
融合ポリペプチドは、ポリペプチド内の１つ以上のポリペプチドまたはドメインを連結するために使用され得るリンカーを任意に含み得る。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造にフォールディングするのに十分な距離だけ任意の２つ以上のポリペプチド成分を分離するために使用され得る。
【００９０】
例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（ｎは少なくとも１、２、３、４または５の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ＧＧＧ（配列番号３）、ＤＧＧＧＳ（配列番号４）、ＴＧＥＫＰ（配列番号５）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号６）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記参照）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１、２、３、４または５）（配列番号７）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号８）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１０）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１１）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１２）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１３）。あるいは、可動性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３））、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。
【００９１】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間に、または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。さらに、ポリペプチド切断部位を任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、レア制限酵素認識部位、自己切断性リボザイム認識部位）、および自己切断性ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【００９２】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断性ペプチドは、当業者には既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位には、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２によりコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップイエローフレックウイルス（Ｐａｒｓｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓ））３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼ、の切断部位を含むが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーのため、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えばＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１４）、例えばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１５）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１６）（Ｘは任意のアミノ酸を表す（ＴＥＶによる切断はＱとＧまたはＱとＳとの間に生じる））が一実施形態では好ましい。
【００９３】
ある特定の実施形態では、自己切断性ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【００９４】
様々な実施形態では、本明細書で企図されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドの発現または安定性は、１つ以上のタンパク質不安定化配列またはタンパク質分解配列（デグロン）によって調節される。それらの迅速なプロテアソームの代謝回転を実施するためにタンパク質を不安定化するためのいくつかの戦略が、本明細書において企図される。
【００９５】
タンパク質不安定化配列の実例としては、不安定化ボックス（Ｄボックス）（細胞周期内の周期を達成するために、急速かつ完全なユビキチン媒介性タンパク質分解を経る必要がある細胞周期依存性タンパク質中に９個のアミノ酸が存在する（例えば、Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７：５６７０−８を参照されたい））、ＫＥＮボックス（Ｃｄｈ１によって標的化されるＡＰＣ認識シグナル（例えば、Ｐｆｌｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４：６５５−６５を参照されたい））、Ｏボックス（Ｆｚｒ／Ｃｄｈ１によって活性化された後期促進複合体（ＡＰＣ）によって、Ｍ相の終わりに、およびＧ１のほとんどにわたって分解される、複製開始点認識複合体タンパク質１（ＯＲＣ１）中に存在するモチーフ（例えば、Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９（２０）：２４５８−２４６５を参照されたい））、Ａボックス（Ｃｄｈ１による後期促進複合体中に分解されるＡｕｒｏｒａ−Ａ中に存在するモチーフ（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：２２７４−２２８５を参照されたい））、ＰＥＳＴドメイン（プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）残基に富み、急速なプロテアーゼ破壊のためにタンパク質を標的とするモチーフ（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｔｒｅｎｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２１（７）：２６７−２７１を参照されたい））、プロテアーゼ破壊のために急速に処理されるＮ末端ルールモチーフ、Ｎ−デグロンモチーフ、およびユビキチン融合分解（ＵＦＤ）モチーフ（例えば、Ｄａｎｔｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：５３８−４を参照されたい））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
特定の実施形態での使用に好適なデグロンのさらなる実例には、リガンド制御可能なデグロンおよび温度調節可能なデグロンが含まれるが、これらに限定されない。リガンド制御可能なデグドンの非限定的な例には、シールド１によって安定化されるもの（例えば、Ｂｏｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｖｉｏｌ．７（８）：５３１−５３７を参照されたい）、オーキシンによって不安定化されるもの（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６（１２）：９１７−９２２を参照されたい）、およびトリメトプリムによって安定化されるもの（例えば、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１７（９）：９８１−８を参照されたい）が含まれる。
【００９７】
温度調節可能なデグロンの非限定的な例には、ＤＨＦＲＴＳデグロン（例えば、Ｄｏｈｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（５１５１）：１２７３−１２７６を参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書で企図されるポリペプチドは、Ｄボックス、Ｏボックス、Ａボックス、ＫＥＮモチーフ、ＰＥＳＴモチーフ、サイクリンＡおよびＵＦＤドメイン／基質、リガンド制御可能なデグロン、ならびに温度調節可能なデグロンからなる群から選択される１つ以上の分解配列を含む。
【００９９】
Ｄ．ポリヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、組換え、合成または単離されたものであってもよい。ポリヌクレオチドには、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１００００個、または少なくとも１５０００個の、またはそれ以上のヌクレオチドの多量体形態、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態、ならびに全ての中間の長さを指す。「中間の長さ」とは、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０１００】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはコドン最適化されていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を与える要因としては、（ｉ）２つ以上の生物または遺伝子または合成的に構築されたバイアステーブル間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物、遺伝子、または遺伝子のセット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）状況を含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）それらのデコードｔＲＮＡによるコドンの変動、（ｖ）トリプレットの全体的または１つの位置のいずれかで、ＧＣ％に従ったコドンの変動、（ｖｉ）例えば天然に存在する配列のような参照配列との類似度の変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的性質、（ｉｘ）コドン置換セットの設計に基づくＤＮＡ配列の機能に関する事前知識、および／または（ｘ）各アミノ酸のコドンセットの系統的変動、のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ポリヌクレオチドの実例としては、配列番号１〜２に記載のポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
様々な例示的な実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドには、発現ベクター、ウイルスベクター、トランスファープラスミド、発現カセット、およびα−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）遺伝子は、タンパク質のスルファターゼファミリーのメンバーであるＩＤＵＡ（ＭＰＳ  ＩおよびＩＤＡとも称される）をコードする。典型的には、ヒトＩＤＵＡタンパク質は、前駆体形態として産生される。ヒトＩＤＵＡは、６５３個のアミノ酸であり、シグナルペプチド（１〜２６）と、（β／α）８  ＴＩＭバレルドメイン（４２〜３９６）と、短いヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン（４８２〜５０８）を含むβサンドウィッチドメイン（２７〜４２および３９７〜５４５）と、Ｉｇ様ドメイン（５４６〜６４２）とを含む。ＩＤＵＡは、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の２つのグリコサミノグリカンの末端α−Ｌイズロン酸残基を加水分解する。この加水分解は、これらのグリコサミノグリカンのリソソーム分解のために必要とされる。酵素の欠乏を生じるこの遺伝子における変異は、常染色体劣性遺伝疾患であるムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）をもたらす。この遺伝子における変異は、常染色体劣性遺伝リソソーム蓄積症であるムコ多糖症Ｉ型と関連付けられている。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などは、参照ポリヌクレオチド配列との実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、またはストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを包含する。したがって、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」には、１つ以上のヌクレオチドが付加または欠失または修飾されているか、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、修飾されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持するような、突然変異、付加、欠失および置換を含む特定の変更を参照ポリヌクレオチドに対して行うことができることは、当該技術分野において十分に理解されている。
【０１０５】
本明細書で使用される「配列同一性」または例えば「に対して５０％同一の配列」を含む記述は、配列が比較のウインドウにわたってヌクレオチドごとに同一またはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の割合」は、比較のウインドウにわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列で生じる位置数を決定して整合した位置数を得、整合した位置数を比較のウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウのサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることによって計算され得る。典型的にはポリペプチドバリアントが参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する場合、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」」は、天然起源の状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、断片に通常隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または、自然界に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
【０１０７】
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語としては、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に、または３’から５’の方向にアノテートすることができる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、５’から３’への鎖は、その配列がプレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるので［ＤＮＡではチミン（Ｔ）であるが、ＲＮＡではその代わりにウラシル（Ｕ）であること以外］、「センス」、「プラス」または「コード」鎖と称される。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である、相補的な３’から５’への鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」または「非コード」鎖と称される。本明細書で使用される場合、「逆方向」という用語は、３’から５’の方向に記載された５’から３’までの配列、または５’から３’の方向に記載された３’から５’までの配列を指す。
【０１０８】
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対合の規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、多くの場合、５’末端を左側にし、３’末端を右側にして逆相補物、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’として記載される。その逆相補物と同等である配列は、パリンドローム配列であると言える。相補性は、塩基対合の規則に従って核酸の塩基の一部のみがマッチする、「部分的な」ものであってよい。あるいは、核酸間に「完全な」または「全」相補性が存在してもよい。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「核酸カセット」または「発現カセット」は、ＲＮＡおよびその後ポリペプチドを発現し得るベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含む。別の実施形態では、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含む。ベクターは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット中の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換細胞内での活性に必要な適切な翻訳後修飾を受け、かつ適切な細胞内区画を標的とすることまたは細胞外区画への分泌によって、生物学的活性のために適切な区画に転座され得るように、位置的および配列的にベクター内で方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合させたその３’末端および５’末端を有し、例えば、それは各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態では、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される治療遺伝子の配列を含む。カセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから取り出すことおよびそれに挿入することができる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「目的のポリヌクレオチド（複数可）」は、発現されることが望ましい発現ベクターに挿入された１つ以上のポリヌクレオチド、例えばポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（すなわち、目的のポリペプチド）をいう。好ましい実施形態では、本発明のベクターおよび／またはプラスミドは、１つ以上の目的のポリヌクレオチド、例えばＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、例えば、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのように、神経セロイドリポフスチン症の治療、予防、または改善において治療効果を提供するポリペプチドをコードし、これは、「治療用ポリペプチド」と呼ぶことができる。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡを含むがこれらに限定されない阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当該技術分野で既知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、転写後応答エレメント、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片でも使用することができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールでの使用により限定されることが好ましいことが意図されている。
【０１１３】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり入手可能な種々の十分に確立された技術の任意のもの用いて調製、操作、発現および／または送達することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。
【０１１４】
ベクターの実例は、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃを含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
ベクターのさらなる実例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
ベクターとして有用なウイルスの実例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
発現ベクターの実例には、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書中に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのそのような発現ベクターに連結され得る。
【０１１８】
特定の実施形態では、ベクターは、エピソーム性ベクターまたは染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、用語「エピソーム性」は、宿主の染色体ＤＮＡへの組み込みなくおよび分裂宿主細胞から徐々に喪失することなく複製することができるベクターを指し、前記ベクターが染色体外またはエピソームに複製することも意味する。
【０１１９】
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域−複製開始点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、転写後調節エレメント、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性が変動し得る。利用するベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、多くの好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
【０１２０】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これらに限定されないベクターであり、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内在性または異種性制御配列を含む。「内在性」制御配列とは、ゲノム内で所与の遺伝子に天然に連結したものである。「外因性」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置されたものであり、したがって、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれる。「異種性」制御配列とは、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。「合成」制御配列は、１つ以上の内在性および／または外因性配列のエレメント、および／または特定の遺伝子治療のために最適なプロモーターおよび／またはエンハンサー活性を提供する、インビトロまたはインシリコで決定される配列を含み得る。
【０１２１】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを開始させおよび転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）を含む。
【０１２２】
用語「エンハンサー」は、転写の増強をもたらすことが可能な配列を含み、一部の場合には、別の制御配列に対する方向とは独立して機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的にまたは相加的に機能し得る。用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことが可能な配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０１２３】
用語「作動可能に連結した」は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することが可能になる関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドの機能的な連結を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を導く。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「構成的発現制御配列」は、作動可能に連結した配列の転写を絶え間なくまたは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、またはそれぞれ制限された種類の細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系統特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０１２５】
特定の実施形態において使用するのに好適な例示的な遍在発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短い伸長因子１−α（ＥＦ１ａ−ｓｈｏｒｔ）プロモーター、長い伸長因子１−α（ＥＦ１ａ−ｌｏｎｇ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
特定の実施形態では、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系統特異的または組織特異的発現を達成するために（例えば、細胞型、細胞系統または組織のサブセットのみにおいて、または特定の発生段階の間に、ポリペプチドをコードする特定の核酸を発現するために）、細胞、細胞型、細胞系統または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
【０１２７】
組織特異的な発現制御配列の実例としては、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞での発現）、ｒｕｎｔ転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター（幹細胞での特異的発現）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞での発現）、ＣＤ４３プロモーター（白血球および血小板での発現）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞での発現）、ＣＤ６８プロモーター（マクロファージでの発現）、ＣＹＰ４５０  ３Ａ４プロモーター（肝細胞での発現）、デスミンプロモーター（筋肉での発現）、エラスターゼ１プロモーター（膵腺房細胞での発現、エンドグリンプロモーター（内皮細胞での発現）、線維芽細胞特異的タンパク質１プロモーター（ＦＳＰ１）プロモーター（線維芽細胞での発現）、フィブロネクチンプロモーター（線維芽細胞での発現）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター（内皮細胞での発現）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（星状細胞での発現）、インスリンプロモーター（膵臓β細胞での発現）、インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター（巨核球）、細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ−２）プロモーター（内皮細胞）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）プロモーター（造血細胞）、ケラチン５プロモーター（ケラチノサイトでの発現）、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター（筋肉での発現）、筋原性分化１（ＭＹＯＤ１）プロモーター（筋肉での発現）、ネフリンプロモーター（足細胞での発現）、骨ガンマカルボキシグルタメートタンパク質２（ＯＧ−２）プロモーター（骨芽細胞での発現）、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ２Ｂ（Ｏｘｃｔ２Ｂ）プロモーター、（ハプロイド−精子細胞での発現）、界面活性タンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）プロモーター（肺での発現）、シナプシンプロモーター（ニューロンでの発現）、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター（造血細胞での発現）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「条件的発現」とは、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などを含むがこれらに限定されない任意の種類の条件的発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的な発現を排除するものではない。ある特定の実施形態では、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、目的のポリヌクレオチドの条件的発現を提供する。
【０１２９】
誘導性プロモーター／系の実例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
条件的発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的には２つの）部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」は、野生型タンパク質であってよい、１つ以上の組換え部位（例えば、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、またはそれ以上）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはその突然変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントを包含する。特定の実施形態における使用に好適なリコンビナーゼの実例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
ポリヌクレオチドは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用する、用語「組換え配列」、「組換え部位」または「部位特異的組換え部位」は、リコンビナーゼが認識して結合する特定の核酸配列を指す。
【０１３２】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対のコア配列と隣接している１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を２つ含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
ＦＬＰリコンビナーゼのための好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばフィーｃ３１によって認識される。φＣ３１  ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位ａｔｔＢ（３４ｂｐ長）とａｔｔＰ（３９ｂｐ長）との間のみで組換えを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。それぞれ細菌およびファージゲノム上のファージインテグラーゼのための結合部位の名をとるａｔｔＢおよびａｔｔＰはいずれも、φＣ３１ホモダイマーによって結合されているであろう不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、反応を不可逆的にする。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置づけ、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
【０１３５】
特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列を、１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それにより、遺伝子のキャップ非依存性翻訳を導くエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般的に用いられるＩＲＥＳの例としては、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものが挙げられる。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得ることができるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得ることができるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）、ならびにＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳは、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ジシストロウイルス科（Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）およびフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）種のウイルスゲノムおよびＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０１３８】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コンセンサスコザック配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、ｍＲＮＡのリボソームの小サブユニットへの最初の結合を著しく容易にし、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号１７）であり、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０１３９】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’ポリアデニル化配列を含む。用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加することによりｍＲＮＡの安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の増大に寄与する。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、急速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。ベクターにおいて使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の好適な異種性または内在性のポリＡ配列が挙げられる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞は、直接毒性および／または制御されない増殖のリスクを低減するための誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を保有する宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子の特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量化の特異的化学誘導剤（ＣＩＤ）を使用して活性化することができる。
【０１４１】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で企図される遺伝子修飾された細胞をインビボでネガティブ選択に感受性にさせる遺伝子セグメントを含む。「ネガティブ選択」は、個体のインビボ状態の変化の結果として排除され得る注入された細胞を指す。ネガティブ選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば化合物に感受性を与える遺伝子の挿入から生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は当該分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を与える単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１  ＴＫ）遺伝子、細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌性シトシンデアミナーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、インビトロでネガティブ選択可能表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。ポジティブ選択マーカーは、宿主細胞に導入されると、遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。このタイプの遺伝子は、当該分野で既知であり、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
一実施形態では、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択可能エレメントは、ネガティブ選択可能エレメントの喪失が必然的にポジティブ選択マーカーの喪失を伴うように連結される。特定の実施形態では、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーが融合され、一方の喪失が必然的に他方の喪失につながる。上記の所望のポジティブおよびネガティブ選択特性の両方を付与するポリペプチドを発現産物として産生する融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性およびインビボにおけるネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドを生じる。優位なポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーとの融合に由来する二機能性選択融合遺伝子の使用を記載しているＳ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
【０１４４】
好ましいポジティブ選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏおよびｇｐｔからなる群より選択される遺伝子に由来し、好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−１  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔからなる群より選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される例示的な二機能性選択融合遺伝子には、ポジティブ選択マーカーがｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、ネガティブ選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択マーカーに由来する遺伝子が含まれるが、これに限定されない。
【０１４５】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行または運搬することができる核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結している、例えば、それに挿入されている。ベクターは、細胞における自律複製を指示する配列を含んでもよく、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含んでもよい。ベクターの実例は、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌性人工染色体、およびウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを送達するための例示的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスファー、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に好適なポリヌクレオチド送達系の実例は、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性の脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体標的化、細菌由来、非生存ナノセルに基づく送達も、特定の実施形態において企図される。
【０１４８】
好ましい実施形態では、１つ以上の治療用ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをウイルス法によって標的細胞に導入することができる。
【０１４９】
Ｅ．ウイルスベクター
１つ以上の治療用ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルス法によって標的細胞に導入することができる。特定の実施形態では、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクター、さらにより好ましくはレンチウイルスベクターを用いて標的細胞に導入される。
【０１５０】
当業者には明らかになるとおり、用語「ウイルスベクター」は、広く使用されており、一般には核酸分子の移行または細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移行プラスミド）、または核酸の移行を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルス粒子は、一般には、種々のウイルスの構成成分を含み、時には核酸（複数可）に加えて宿主細胞の構成成分も含む。
【０１５１】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態での使用に好適なウイルスベクター系の実例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、遺伝子導入用ワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
レトロウイルスは遺伝子を送達するための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合により組み込むＲＮＡウイルスを指す。いったんウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それは「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型としての機能を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を導く。
【０１５３】
特定の実施形態における使用に好適な例証的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルス」は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例証的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）、ビスナ・マエディ（ｖｉｓｎａ−ｍａｅｄｉ）ウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。特定の実施形態では、レンチウイルスは、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。
【０１５５】
用語ウイルスベクターは、核酸を細胞内に移行することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移行された核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクターおよび移行プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび／または機能的遺伝エレメントを含有する。用語「レトロウイルスベクター」は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントまたはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。用語「レンチウイルスベクター」は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントまたはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。用語「ハイブリッドベクター」は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列を含むベクターまたは移行プラスミドを指す。
【０１５６】
特定の実施形態では、用語「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」は、レンチウイルス移行プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及している場合、これらのエレメントの配列は、レンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、ＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することと理解されるべきである。
【０１５７】
様々な実施形態では、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で議論されるように、１つ以上のＬＴＲ、ならびに以下のアクセサリーエレメント：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、移出エレメント、ＩＤＵＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーター、ポリ（Ａ）配列を含み、および任意にＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インシュレーターエレメント、選択マーカー、および細胞自殺遺伝子のうちの１つ以上または全てを含むことができる。
【０１５８】
特定の実施形態では、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組み込み型または非組み込み型または組み込み欠陥レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、用語「組み込み欠陥レンチウイルス」または「ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み不能ウイルスベクターは、特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
インテグラーゼ活性を低減させるのに好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例証的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
用語「長い末端反復（ＬＴＲ）」は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域を含有する、レトロウイルスのＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルおよびウイルスのゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。５’ＬＴＲに、ゲノムの逆転写のために必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングのために必要な配列（プシー部位）が近接している。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、用語「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」、「プシー」、および符号「Ψ」は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスのＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置する非コード配列を指しており、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０１６２】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを改変した結果としていくつかの安全性強化を含む。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として既知の右側の（３’）ＬＴＲのエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクターを指す。さらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列に置き換わるように改変されている。５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生の間にウイルスのゲノムの転写を駆動するための異種プロモーターで置き換えることによって、さらなる安全性の増強がもたらされる。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない様式で高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないので、複製コンピテントウイルスが生成される組換えの可能性が低下する。ＬＴＲに対する改変、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変なども、本発明に包含されることに留意するべきである。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＬＡＰエレメント」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」は、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクトおよび中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）にあるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点および中心終結配列（ＣＴＳ）にある中心終結点により、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスのゲノム核内移行のシス活性決定因子として働く可能性があり、かつ／またはウイルスの力価を増大させる可能性がある。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内で目的の異種遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、移行プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、ベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴおよび／またはＣＴＳエレメントに１つ以上の変異を有するＦＬＡＰエレメントを含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳエレメントのいずれかを含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳエレメントを含まない。
【０１６４】
「移出エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の移出を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ移出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３）、ならびにＢ型肝炎転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および必要に応じて、転写終結シグナルをベクターに組み込むことによって増大する。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同様のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）が、タンパク質における異種核酸の発現を増大させることができる。特定の実施形態では、ベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥのような転写後調節エレメントを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥのような転写後調節エレメントを欠くか、または含まない。
【０１６６】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。ベクターにおいて使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の好適な異種性もしくは内在性ポリＡ配列が挙げられる。
【０１６７】
ある特定の実施形態によると、ウイルスベクターの骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／もしくはレンチウイルスの配列の多くの異なる供給源を用いることができ、または特定のレンチウイルスの配列における多数の置換および変更を、移行ベクターの本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させることができることが理解されるべきである。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、その多くがウイルスベクターまたは移行プラスミドを作製するために適合させることができ、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。
【０１６８】
特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右側の（３’）レンチウイルスＬＴＲと、を含む。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、好ましくはレンチウイルスベクター、より好ましくはＨＩＶレンチウイルスベクター、さらに好ましくはＨＩＶ−１レンチウイルスベクターである。
【０１６９】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＬＴＲのプロモーター領域が異種プロモーターで置換された左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右側の（３’）レンチウイルスＬＴＲと、を含む。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【０１７０】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、改変されていないＬＴＲと比較して１つ以上の改変を含む右側の（３’）レンチウイルスＬＴＲと、を含む。ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、好ましくは、１ラウンドのウイルス複製を超えたウイルス転写を防止する１つ以上の欠失を含み、より好ましくは、３’ＬＴＲのＵ３領域のＴＡＴＡボックスおよびＳｐ１およびＮＦ−κＢ転写因子結合部位の欠失を含み、さらにより好ましくは自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【０１７１】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＬＴＲのプロモーター領域が異種プロモーターで置換された左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右側の（３’）レンチウイルス性ＳＩＮ  ＬＴＲと、を含む。
【０１７２】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＬＴＲのプロモーター領域が異種プロモーターで置換された左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ヒトα−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターまたはその転写活性断片と、右側の（３’）レンチウイルス性ＳＩＮ  ＬＴＲと、を含む。
【０１７３】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＬＴＲのプロモーター領域が異種プロモーターで置換された左側の（５’）レンチウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、レトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ヒトα−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターまたはその転写活性断片と、右側の（３’）レンチウイルス性ＳＩＮ  ＬＴＲと、を含む。好ましい実施形態では、ＥＦ１αプロモーターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の最初のイントロンを欠いており、「ＥＦ１α短プロモーター」と呼ばれる。他の実施形態では、ＥＦ１αプロモーターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の最初のイントロンを含み、「ＥＦ１α長プロモーター」と呼ばれる。
【０１７４】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、左側の（５’）ＣＭＶプロモーター／ＨＩＶ−１キメラＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ＲＲＥレトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ヒトα−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターまたはＥＦ１α−短プロモーターと、右側の（３’）レンチウイルス性ＳＩＮ  ＬＴＲと、を含む。
【０１７５】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、左側の（５’）ＣＭＶプロモーター／ＨＩＶ−１キメラＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ＲＲＥレトロウイルスの移出エレメントと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ヒトα−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターまたはＥＦ１α−短プロモーターと、右側の（３’）レンチウイルス性ＳＩＮ  ＬＴＲと、異種ポリアデニル化シグナルと、を含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、人工ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたはウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルである。
【０１７６】
妥当なウイルス力価を達成するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、移行ベクターをウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｘ遺伝子、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルスの遺伝子を含むパッケージング細胞系にトランスフェクトすることによって産生される。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。レトロウイルス／レンチウイルス移行ベクターを、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞系に導入して、産生細胞または産生細胞系を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞系に導入することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素またはＡＤＡなどと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下でクローンを選択し、単離することができる。選択マーカー遺伝子は、コード遺伝子に、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結させることができる。
【０１７８】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）により、細胞系から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染させ、形質転換することができる宿主細胞の範囲が決定される。レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどの場合では、ｅｎｖタンパク質としてはｇｐ４１およびｇｐ１２０が挙げられる。以前に記載されているとおり、パッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、ウイルス性ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。
【０１７９】
特定の実施形態において用いることができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、Ｅｂｏｌａ、Ｓｅｎｄａｉ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルス）由来のエンベロープならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科）由来のエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
他の実施形態では、ウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質としては、Ａ型インフルエンザ、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）など、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）１および２ならびにオーストラリアコウモリウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）など、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型など、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス（Ｓａｂｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）など、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ科、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルスなど、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含むＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含むＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパーウイルスなど、大痘瘡および小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｌｔｉｓ）を引き起こすウイルスなどのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
一実施形態では、組換えレトロウイルス、例えばＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞が提供される。
【０１８２】
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になる。好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇを用いてシュードタイピングされる。一実施形態では、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞系」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要であるウイルスの構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞系への言及において使用される。パッケージング細胞を調製するために、任意の好適な細胞系を使用することができる。一般に、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞系を作製するために使用される細胞はヒト細胞である。使用することができる好適な細胞系としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞はＡ５４９細胞である。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、用語「産生細胞系」は、パッケージング細胞系およびパッケージングシグナルを含む移行ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞系を指す。感染性のウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３、およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって例示されている。感染性ウイルス粒子はパッケージング細胞から従来の技法を用いて収集することができる。例えば、感染性粒子は、当該技術分野で既知のとおり、細胞溶解、または細胞培養物の上清を収集することによって収集することができる。必要に応じて、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。好適な精製技法は当業者に周知である。
【０１８５】
特定の実施形態では、ハーラー症候群の少なくとも１つの症状を治療および／または予防および／または改善するために対象に投与される遺伝子改変細胞を生成するために、１つ以上のポリペプチドを発現するウイルスベクターで形質導入された宿主細胞。ある特定の実施形態に従って利用され得る、遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に関連する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｃｈｅｓｔ  １１１（６  Ｓｕｐｐ．）：１３８Ｓ−１４２Ｓ、Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１９７５−８１、Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｌｉｖｅｒ  １９：２６５−７４、Ｏｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１：１７９−８６、Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２、Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−５６、Ａｌｔ，Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：７４６−５８、Ｂｒｏｄｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０１、Ｓｔｒａｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ８：２１５９−２１７２、Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：４３−４９、およびＬｅｅ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４８３−８に見出すことができる。
【０１８６】
「宿主細胞」は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロにおいて、本明細書中に企図される組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトする、感染させる、または形質導入する細胞を包含する。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させた細胞を含んでよい。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、治療を必要とする対象に投与する。ある特定の実施形態では、用語「標的細胞」は、宿主細胞と互換的に使用され、トランスフェクトする、感染させる、または形質導入する、所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、幹細胞または前駆細胞である。ある好ましい実施形態では、標的細胞は体細胞、例えば成体幹細胞、前駆細胞または分化細胞である。特に好ましい実施形態では、標的細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞である。さらなる治療標的細胞が本明細書で議論される。
【０１８７】
Ｆ．遺伝子改変細胞
様々な実施形態では、細胞は、ＩＤＵＡポリペプチドを発現するように遺伝子改変され、遺伝的に改変された細胞は、神経セロイドリポフスチン症を治療するために使用される。細胞は、エクスビボ、インビトロ、またはエクスビボで遺伝子改変することができる。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質を細胞内の全遺伝物質に加えることを指す。用語「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」および「遺伝子操作された細胞」は互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正または改変する、または治療用ポリペプチド、例えばＩＤＵＡを発現させる目的で、細胞中の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の外部の遺伝物質の導入を指す。
【０１８８】
細胞は、自己由来／自源性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「自己」）であっても非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ対象由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は同種異系のものである。
【０１８９】
特定の実施形態では、ＩＤＵＡをコードするベクターは、１つ以上の動物細胞、好ましくは哺乳動物、例えば非ヒト霊長類またはヒト、より好ましくはヒトに導入される。
【０１９０】
特定の実施形態では、細胞の集団は、本明細書で企図されるベクターで形質導入される。本明細書で使用される場合、用語「細胞集団」は、本明細書の他の場所に記載されているように、任意の数および／または組み合わせの同種または異種細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。例えば、造血幹細胞または前駆細胞の形質導入のために、細胞の集団は、臍帯血、胎盤血液、骨髄または末梢血から単離または取得され得る。細胞の集団は、形質導入される標的細胞型の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％を含み得る。ある特定の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞は、当該分野で既知の方法を用いて、異種細胞の集団から単離または精製され得る。
【０１９１】
特定の実施形態では、細胞は初代細胞である。本明細書で使用される用語「初代細胞」は、組織から単離され、インビトロまたはエクスビボでの増殖のために確立されている細胞を指すことが当該技術分野において知られている。対応する細胞は、たとえあったとしてもごく少数の集団倍増を受けており、したがって、連続細胞系と比較して、それらが由来する組織の主な機能的構成要素の代表であり、インビボ状態に対するより代表的なモデルを表す。初代細胞系を樹立するための様々な組織および方法から試料を得る方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７を参照されたい）。本発明の方法における使用のための初代細胞は、例えば、血液、リンパ腫および上皮腫瘍に由来する。一実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。
【０１９２】
用語「幹細胞」は、（１）長期にわたって自己再生できること、または元の細胞と同一のコピーを少なくとも１つ生成することができること、（２）単一細胞レベルで、多数の、またいくつかの例ではただ１つの特殊化した細胞型に分化することができること、および（３）インビボで組織の機能的再生をすること、ができる未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生上の能力に従って、全能性、多能性、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性に細分類される。「自己再生」とは、変更されていない娘細胞を産生する独特の能力および特殊化した細胞型を生成する独特の能力（潜在力）を有する細胞を指す。自己再生は、２つのやり方で実現することができる。非対称細胞分裂により、親の細胞と同一である娘細胞が１つと、親の細胞とは異なり、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が１つ産生される。対称細胞分裂により、同一の娘細胞が２つ産生される。細胞の「増殖」または「拡大」とは、対称的に分裂する細胞を指す。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、用語「前駆体」または「前駆細胞」は、自己再生する能力、およびより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は単一の系列に沿って分化するが、かなり広範囲の増殖能力も有し得る。
【０１９４】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物体の生存期間にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することができる拘束された造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じさせる。用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当該技術分野で既知のその他の系列を含めた、生物体の血液細胞の種類の全てを生じさせる多分化能性幹細胞を指す（Ｆｅｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３５，３８７号、ＭｃＧｌａｖｅ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４６０，９６４号、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６７７，１３６号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７５０，３９７号、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７５９，７９３号、ＤｉＧｕｉｓｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６８１，５９９号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）。一実施形態では、ＨＳＣはＣＤ３４＋細胞である。致死的に放射線照射した動物またはヒトに移植すると、造血幹細胞および前駆細胞は赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ系の造血細胞プールを再配置させることができる。
【０１９５】
本明細書で企図される組成物および方法で形質導入される好ましい標的細胞型には、造血細胞、好ましくはヒト造血細胞、より好ましくはヒト造血幹細胞および前駆細胞、さらにより好ましくはＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞が含まれる。
【０１９６】
本明細書で企図される方法および組成物で形質導入された造血細胞を得るための例示的な供給源としては、臍帯血、骨髄または動員末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
特定の実施形態では、本明細書で企図されるＩＤＵＡをコードするウイルスベクターで形質導入された造血細胞には、ＣＤ３４＋細胞が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用する「ＣＤ３４」は、しばしば細胞−細胞接着因子として作用する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞および前駆細胞の両方の細胞表面マーカーである。
【０１９８】
本明細書で企図される方法および組成物による形質導入に好適な造血幹細胞または前駆細胞のさらなる実例としては、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である造血細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）である造血細胞、ならびにＣＤ１３３＋である造血細胞が挙げられる。
【０１９９】
一実施形態では、本明細書で企図されるＩＤＵＡをコードするウイルスベクターで形質導入された造血細胞には、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞が含まれる。
【０２００】
造血階層を特徴付けるための様々な方法が存在する。特徴付けの１つの方法は、ＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、遺伝子が、第１染色体（マウス）上の単一の遺伝子座に大部分がタンデムに位置し、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、最初はＴ細胞刺激に関与すると考えられていた＞１０分子の群である。このファミリーは、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などを含み、ＣＤ１５０は創始メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｅｒ）であり、したがって、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層についてのサインＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）−ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−；多能性前駆細胞（ＭＰＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ２４４＋；系列制限前駆細胞（ＬＲＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋；一般的な骨髄系前駆体（ＣＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ；顆粒球−マクロファージ前駆体（ＧＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ；および巨核球−赤血球前駆体（ＭＥＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
【０２０１】
一実施形態では、本明細書で企図されるＩＤＵＡをコードするウイルスベクターで形質導入された造血細胞には、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−細胞が含まれる。
【０２０２】
様々な実施形態では、本明細書で企図されるＩＤＵＡをコードするウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞の集団が提供される。好ましい実施形態では、ＨＳＰＣはＣＤ３４＋造血細胞である。
【０２０３】
Ｇ．組成物および製剤
本明細書で企図される組成物および製剤は、本明細書で企図される任意の数の形質導入または非形質導入細胞またはその組み合わせ、ウイルスベクター、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの組み合わせを含み得る。組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、または１つ以上の他の療法の様式と組み合わせて、細胞または動物に投与するための薬学的に許容される担体と共に製剤化された組成物を指す。所望であれば、組成物は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与することもできることも理解されよう。特定の実施形態では、追加の薬剤が意図された治療を送達する組成物の能力に悪影響を与えない限り、組成物に含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。
【０２０４】
本明細書で企図される特定のエクスビボおよびインビボ製剤および組成物は特に、単独で、または１つ以上の他の治療様式と組み合わせて投与する細胞、組織、器官、または動物に投与するための薬学的に許容される担体と共に製剤化された、形質導入または非形質導入細胞またはそれらの組み合わせと、ウイルスベクターとの組み合わせを含むことができる。
【０２０５】
本明細書で企図される特定のインビボ製剤および組成物は、細胞、組織、器官、または動物への投与のための薬学的に許容される担体と共に製剤化されたウイルスベクターの組み合わせを、単独で、または１つ以上の他の療法様式と組み合わせて含む。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化された、治療有効量の形質導入細胞、例えば造血細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞などを含む細胞の集団を含む。
【０２０７】
特定の他の実施形態では、本発明は、レトロウイルスベクター、例えば、１つ以上の薬学的に許容される担体で製剤化されたレンチウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【０２０８】
本明細書で企図される薬学的組成物は、本明細書で企図されるＩＤＵＡをコードするベクターまたはプロウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む形質導入細胞を含む。
【０２０９】
本明細書で使用する、「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なしに、合理的な利益／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
【０２１０】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療用細胞がそれらと投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の実例は、細胞培養培地、水および油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む）などの滅菌液体であり得る。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。特定の実施形態における好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分も組成物に組み込むことができる。
【０２１１】
一実施形態では、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態では、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内または髄腔内投与に好適である。薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液、細胞培養培地、または分散液が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の培地または薬剤が形質導入された細胞と適合しない場合を除いて、薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。
【０２１２】
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、遺伝子改変された造血幹細胞および／または前駆細胞および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で企図される細胞に基づく組成物を含む組成物は、腸内または非経口投与方法によって、または所望の治療目標を達成するために他の好適な化合物と組み合わせて別個に投与することができる
【０２１３】
薬学的に許容される担体は、治療されるヒト対象への投与に好適なものにするために、十分に高い純度および十分に低い毒性を有していなければならない。さらに組成物の安定性を維持または増加させるべきである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、組成物の他の成分と組み合わせた場合に、所望のバルク、コンシステンシーなどを提供するために計画された投与方法を念頭に置いて選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、これらに限定することなく、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などである。本明細書で企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
このような担体溶液はまた、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤を含み得る。本明細書で使用される、用語「緩衝液」は、その化学的な構成が、ｐＨの有意な変化なしに酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝液の例には、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、５％デキストロース水（Ｄ５Ｗ）、通常／生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
薬学的に許容される担体は、約７の組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在してもよい。あるいは、組成物は、約６．８〜約７．４の範囲、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４のｐＨを有する。さらに別の実施形態では、組成物は約７．４のｐＨを有する。
【０２１６】
本明細書で企図される組成物は、無毒性の薬学的に許容される媒体を含み得る。組成物は懸濁液であってもよい。本明細書で使用される、用語「懸濁液」は、細胞が固体支持体に付着していない非接着性の状態を指す。例えば、懸濁液として維持された細胞は、撹拌（ｓｔｉｒｒｅｄ）または撹拌（ａｇｉｔａｔｅｄ）され、培養皿のような支持体に接着されない。
【０２１７】
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、造血幹細胞および／または前駆細胞が許容される液体培地または液体（例えば、生理食塩水または無血清培地、静脈内（ＩＶ）バッグなど）中で分散される懸濁液中で製剤化される。許容される希釈剤には、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、無血清細胞培養培地、およびＣｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地などの極低温保存に好適な培地が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物由来の天然タンパク質を実質的に含まず、造血幹細胞および前駆細胞などの細胞集団を含む組成物を保存するのに好適である。治療用組成物は、ヒト患者に投与されることを意図されており、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清およびウシ胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は無血清培地である。
【０２２０】
血清を含まない培地は、血清含有培地に対していくつかの利点を有し、簡略化されたより良好な組成物、汚染の程度の減少、感染因子の潜在的供給源の排除、および低コストを含む。種々の実施形態では、無血清培地は動物を含まず、任意にはタンパク質を含まない培地であってもよい。培地は、任意に、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。「動物を含まない」培地は、その成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物を含まない培地中で天然の動物タンパク質を置換し、栄養素は、合成、植物または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は実質的にタンパク質を含まないと定義される。
【０２２１】
特定の組成物に使用される無血清培地の実例は、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＸ−ＶＩＶＯ  １０を含むが、これらに限定されない。
【０２２２】
好ましい実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅで製剤化される。
【０２２３】
様々な実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地中に製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を用いて解凍後の高い細胞生存率結果を維持することができる。特定の組成物に使用される凍結保存培地の実例は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２を含むが、これらに限定されない。
【０２２４】
一実施形態では、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を含む溶液中に製剤化される。
【０２２５】
特定の実施形態では、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、および微生物汚染を実質的に含まない。エンドトキシンに関して「実質的に含まない」とは、生物学的製剤についてＦＤＡにより許容される１日あたり５ＥＵ／ｋｇ体重の総エンドトキシンであり、平均的な７０ｋｇの人に対して、細胞の総投与量あたり３５０ＥＵであるよりも少ない細胞の１用量あたりのエンドトキシンであることを意味する。特定の実施形態では、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、または５．０ＥＵ／ｍＬを含む。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターを含むが、これに限定されない、ウイルスベクター系の送達（すなわちウイルス媒介形質導入）に好適な組成物および製剤が企図される。
【０２２７】
エキソビボ送達のための例示的な製剤には、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、および様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介トランスフェクション）のような当該分野で既知の様々なトランスフェクション剤の使用も含まれ得る。リポソームは、以下により詳細に記載されるように、水性流体の一部を閉じ込める脂質二重層である。ＤＮＡはカチオン性リポソームの外表面に自発的に会合し（これらの電荷によって）、これらのリポソームは細胞膜と相互作用する。
【０２２８】
特定の実施形態では、薬学的に許容される担体溶液の製剤化は、例えば経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、髄腔内、くも膜下腔内、および髄腔内投与および製剤化のような、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載の特定の組成物を使用するための好適な投薬レジメンおよび治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。当業者であれば、本明細書で企図される特定の実施形態は、薬学分野において周知であり、かつ例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に記載されているものなどの他の製剤を含むことができることを理解するであろう。
【０２２９】
Ｈ．遺伝子治療法
本明細書中に企図される遺伝子改変された細胞は、ＭＰＳ  Ｉの予防、治療、および改善における使用のため、またはＭＰＳ  Ｉ、もしくはＩＤＵＡ発現および／もしくは活性を減少または消失させるＩＤＵＡ遺伝子に変異を有する対象に関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、または改善するための、改良された医薬品を提供する。一実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ）である。一実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）である。一実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）である。一実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、重症のＭＰＳ  Ｉである。一実施形態では、ＭＰＳ  Ｉは、軽症のＭＰＳ  Ｉである。
【０２３０】
本明細書で使用される場合、用語「医薬品」は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して生成される遺伝子改変細胞を指す。特定の実施形態では、医薬品は、遺伝子改変された造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む。特定の理論に拘束されることを望まないが、医薬品中の治療用遺伝子の量を増加させることにより、インビボでの対応する遺伝子の発現がないかまたは最小である対象の治療が可能となり、これにより遺伝子治療が以前に実行可能な治療選択肢ではなかった被験者に遺伝子治療をもたらす機会を著しく拡大した。
【０２３１】
本明細書で企図される形質導入された細胞および対応するレトロウイルスベクターは、遺伝子療法の改良された方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子治療」は、細胞のゲノムへの遺伝子の導入を指す。様々な実施形態では、本発明のウイルスベクターは、ＭＰＳ  Ｉを有すると診断されたかもしくは疑われる対象、またはＩＤＵＡ発現および／もしくは活性を減少させる１つ以上の変異を含むＩＤＵＡ遺伝子を有する対象に、治癒的、予防的、または改善的利益を提供するポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現する発現制御配列を含む。
【０２３２】
種々の実施形態では、レトロウイルスベクターは、インビボでの遺伝子治療を必要とする対象の細胞、組織、または臓器への直接注射によって投与される。様々な他の実施形態では、細胞は、本明細書で企図されるベクターでインビトロまたはエクスビボで形質導入され、場合によってはエクスビボで拡大される。次いで、形質導入された細胞は、遺伝子治療を必要とする対象に投与される。
【０２３３】
本明細書で企図される遺伝子治療法における形質導入および投与に好適な細胞には、幹細胞、前駆細胞、および本明細書の他の場所に記載の分化細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、形質導入された細胞は、本明細書の他の場所に記載される造血幹細胞または前駆細胞である。
【０２３４】
本明細書で企図される遺伝子治療組成物および方法において使用するのに好ましい細胞には、自己由来／自源性（「自己」）細胞が含まれる。
【０２３５】
本明細書で使用される場合、用語「個体」および「対象」は、しばしば互換的に使用され、遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療剤および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療することができる疾患、障害または状態の症状を示す任意の動物をいう。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療剤、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療することができる神経セロイドリポフスチン症の症状を示す任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、家畜、ならびに飼育動物またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象には、ＭＰＳ  Ｉを有するか、ＭＰＳ  Ｉと診断されたか、またはリスクがあるかもしくはＭＰＳ  Ｉを有しているヒト患者が含まれる。
【０２３６】
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療剤、および本明細書の他の箇所で開示される方法で治療できる特定の疾患、障害または状態と診断された対象を指す。
【０２３７】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患または病理学的状態の症状または病状に対する有益または望ましい効果を含み、処置される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーにおける最小限の低減を含むことができる。治療は、任意で、疾患または状態の軽減、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。「治療」は、疾患または状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などの類似の用語は、疾患または状態の発生または再発の可能性を予防、抑制または低減するためのアプローチを示す。それはまた、疾患または状態の発症または再発を遅らせること、または疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅らせることを指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の言葉は、疾患または状態の発症または再発の前に疾患または状態の強度、効果、症状および／または負担を軽減することも含む。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つの症状を改善する」という語句は、対象が治療されている疾患または状態の１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態では、治療される疾患または状態は、ＭＰＳ  Ｉであり、少なくとも１つの症状は、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの症状は、ＧＡＧの蓄積、失明、聴力消失、学習および言語発達の遅滞、呼吸器疾患、心疾患、骨格異形症、ならびに認知機能低下からなる群から選択される。
【０２４０】
特定の実施形態では、対象には、ハーラー症候群の少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するのに十分な量の遺伝子改変された細胞または遺伝子治療ベクターが投与される。
【０２４１】
特定の実施形態では、対象には、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｈ／Ｓ）の少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するのに十分な量の遺伝子改変された細胞または遺伝子治療ベクターが投与される。
【０２４２】
特定の実施形態では、対象には、シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｉ−Ｓ）の少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するのに十分な量の遺伝子改変された細胞または遺伝子治療ベクターが投与される。
【０２４３】
特定の実施形態では、対象には、重症のＭＰＳ  Ｉの少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するのに十分な量の遺伝子改変された細胞または遺伝子治療ベクターが投与される。
【０２４４】
特定の実施形態では、対象には、軽症のＭＰＳ  Ｉの少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するのに十分な量の遺伝子改変された細胞または遺伝子治療ベクターが投与される。
【０２４５】
本明細書で使用される場合、用語「量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の予防的または治療的結果を達成するための、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「有効量（ａｎ  ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」をいう。
【０２４６】
「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するのに有効なウイルスまたは形質導入された治療用細胞の量を指す。典型的には、ただし必ずしも必要ではないが、予防投与量が疾患の前または初期の対象において使用されるので、予防有効量は治療有効量未満の量である。
【０２４７】
ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体の幹細胞および前駆細胞の所望の応答を誘発する能力により変化できる。治療有効量はまた、ウイルスまたは形質導入された治療細胞の毒性または有害な効果が、治療上有益な効果よりも凌駕される量である。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」ために有効な量を含む。
【０２４８】
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明のベクター、組成物および方法によって提供される重要な利点は、既存の方法と比較して、形質導入された細胞の割合が高い細胞の集団を投与することによって達成することができる遺伝子治療の高い有効性である。
【０２４９】
形質導入された細胞は、骨髄切除治療を受けている、または受けていない個体において、骨髄または臍帯血移植の一部として投与され得る。一実施形態では、本発明の形質導入細胞は、化学療法または放射性骨髄療法を受けた個体に骨髄移植で投与される。
【０２５０】
一実施形態では、形質導入された細胞の用量は、対象に対し静脈内に送達される。好ましい態様において、形質導入された造血幹細胞は対象に静脈内投与される。
【０２５１】
例示的な一実施形態では、対象に提供される形質導入細胞の有効量は、少なくとも２×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６個の細胞／ｋｇ、もしくは少なくとも１０×１０６個の細胞／ｋｇ、またはそれを超える数の細胞／ｋｇであり、全ての介在する細胞の用量を含む。
【０２５２】
別の例示的な実施形態では、対象に提供される形質導入細胞の有効量は、約２×１０６個の細胞／ｋｇ、約３×１０６個の細胞／ｋｇ、約４×１０６個の細胞／ｋｇ、約５×１０６個の細胞／ｋｇ、約６×１０６個の細胞／ｋｇ、約７×１０６個の細胞／ｋｇ、約８×１０６個の細胞／ｋｇ、約９×１０６個の細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、またはそれを超える数の細胞／ｋｇであり、全ての介在する細胞の用量を含む。
【０２５３】
別の例示的な実施形態では、対象に提供される形質導入細胞の有効量は、約２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、約３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、約４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、約５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、または６×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇであり、全ての介在する細胞の用量を含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、１０２〜１０１０個の細胞／ｋｇ体重、好ましくは、１×１０６個の細胞／ｍＬ、２×１０６個の細胞／ｍＬ、３×１０６個の細胞／ｍＬ、４×１０６個の細胞／ｍＬ、５×１０６個の細胞／ｍＬ、６×１０６個の細胞／ｍＬ、７×１０６個の細胞／ｍＬ、８×１０６個の細胞／ｍＬ、９×１０６個の細胞／ｍＬ、１０×１０６個の細胞／ｍＬ、およびこれらの範囲内の全ての整数値を含むがこれらに限定されない１０５〜１０７個の細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され得ると一般的に述べることができる。細胞の数は、その中に含まれる細胞のタイプと同様に、組成物が意図される最終的な使用に依存する。いくつかの実施形態で提供される使用の場合、細胞は一般に１リットル以下の容量であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であってもよい。したがって、特定の実施形態における所望の細胞の密度は、典型的には、１０６個超の細胞／ｍＬ、１０７個超の細胞／ｍＬ、または１０８個超の細胞／ｍＬである。臨床的に関連する細胞数は、累積的に１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個以上の細胞である複数の注入に分配することができる。細胞に基づく組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与することができる。細胞は、治療を受けている患者に対して、同種、同系、異種、または自己由来であってもよい。
【０２５５】
投薬量のいくらかの変動は、治療される対象の状態に依存して必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与を担当する者は、個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。
【０２５６】
当業者は、本明細書で企図される形質導入細胞または遺伝子治療ベクターを含む組成物の適切な投与経路および有効量の正確な投与量を決定するために日常的な方法を使用することができるであろう。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される薬学的組成物の複数回の投与が、治療を行うために必要とされ得る。特定の実施形態では、医薬品は１回投与される。特定の実施形態では、医薬品は、１年、２年、５年、１０年、またはそれを超える年のスパンにわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回またはそれを超える回数投与される。
【０２５８】
個々の刊行物、特許出願、または発行された各特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に指示されているかのように、本明細書中に引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５９】
前述の実施形態は、理解を明確にするために、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに特定の変更および改変を行うことが可能であることは当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、例示のために提供されたものであって、本発明を限定するものではない。当業者は、本質的に類似の結果を生じるように変更または改変することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０２６０】
実施例１
ＩＤＵＡベクターの構築
キメラ５’ＬＴＲと、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターまたは短い伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターと、α−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、自己不活性化（ＳＩＮ）３’ＬＴＲと、を含有する第３世代のレンチウイルスベクターを構築した。例えば、図１ならびに配列番号１および２を参照されたい。表１および２は、ＩＤＵＡをコードする例示的なレンチウイルスベクターの様々なヌクレオチドセグメントの識別特性、ＧｅｎＢａｎｋ参照、供給源の名称、および引用文献を示す。
【表１−１】
2019536484.tif 000003
【表１−２】
2019536484.tif 000004
【表２−１】
2019536484.tif 000005
【表２−２】
2019536484.tif 000006
【０２６１】
実施例２
ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された線維芽細胞
ＩＤＵＡ遺伝子（ＩＤＵＡ−／−細胞）のホモ接合突然変異のためにＩＤＵＡ活性が欠損したヒト線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手し（細胞株ＧＭ６２１４（Ｗ４０２Ｘ／Ｗ４０２Ｘ）、ＧＭ７９８（Ｗ４０２Ｘ／Ｗ４０２Ｘ））、形質導入前に２４時間、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した。培養したＩＤＵＡ−／−細胞を、５．０Ｅ４個の細胞／ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、６ウェル組織培養プレートにこの細胞懸濁液を１ウェル当たり２ｍＬプレーティングし、３７℃に置いた。細胞播種の２４時間後、いずれかの未精製のレンチウイルスベクター１ｍＬで細胞を形質導入した。１ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを対照ウェルに添加し、細胞を３７℃インキュベーターに入れ替える。形質導入２４時間後、完全な培地交換を行った。形質導入の４８時間後、各ウェルからの２５０μＬの上清を滅菌エッペンドルフチューブに移し、−８０℃で凍結させた。１ｍＬのリン酸緩衝液で細胞を洗浄し、０．５ｍＬの１Ｘ  ＴｒｙｐｌＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して持ち上げた。細胞を１試料当たり２つの滅菌エッペンドルフチューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。上清を吸引し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。
【０２６２】
実施例３
ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された細胞におけるタンパク質発現
野生型対照細胞、ＩＤＵＡ−／−細胞（ＧＭ０７９８およびＧＭ０６２１４）、ならびにＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞（ＭＮＤ．ＩＤＵＡおよびＥＦ１α（ＥＦＳ）．ＩＤＵＡ）からの凍結した細胞ペレットをウェスタンブロッティングのために氷上で解凍した。３００μＬの哺乳動物タンパク質抽出試薬および３μＬの１００Ｘ  ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を各細胞ペレットに添加した。ペレットを穏やかに上下にピペット操作して再懸濁させ、細胞をプレートロッカー上で、室温で１０分間インキュベートした。細胞を４℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を滅菌エッペンドルフチューブに移した。ローディング色素は、２５μＬのβ−メルカプトエタノールを４７５μＬの４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加することによって調製した。試料を、３０μＬの調製したローディング色素および９０μＬの試料の３：１の試料対ローディング色素の比で混合した。各試料２０μＬおよびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅラダー８μＬをＮｕＰａｇｅ  ４−１２  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲルのウェルにロードした。ゲルを１Ｘ  ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液中２００Ｖで４０分間泳動させる。
【０２６３】
ｉＢｌｏｔ  ７分移送システムにおけるｉＢｌｏｔ移送スタックを使用してゲルを移送した。膜を室温で５分間、１Ｘトリス緩衝生理食塩水ですすいだ。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液＋マウス抗ＩＤＵＡ抗体（ＭＡＢ４１１９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））の１：５００希釈液およびマウス抗β−アクチン抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ３２８０）の１：１０００希釈液中、４℃でインキュベートした。翌朝、膜を室温で５分間トリス緩衝生理食塩水中で３回すすいだ。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中、８００ＲＤロバ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｃｏｒ  ９２６−３２２１２）の１：１０００希釈液を含有する二次抗体カクテル。膜を二次抗体カクテル中、室温で１時間インキュベートし、そして室温で５分間トリス緩衝食塩水で３回すすいだ。ブロットはＬｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬＸイメージングシステムで画像化した。
【０２６４】
図３は、野生型対照細胞、ＩＤＵＡ−／−細胞（ＧＭ０７９８およびＧＭ０６２１４）、ならびにＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞（ＭＮＤ．ＩＤＵＡおよびＥＦ１α（ＥＦＳ）．ＩＤＵＡ）からの細胞溶解液中のＩＤＵＡおよびアクチン発現のウェスタンブロットを示す。
【０２６５】
実施例４
ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞におけるＩＤＵＡ活性の回復
野生型対照細胞、ＩＤＵＡ−／−細胞、およびＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクター（ｐＭＮＤ−ＩＤＵＡおよびｐＥＦ１α−ＩＤＵＡ）で形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞からの細胞ペレットを１５０μＬの酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（ｐＨ４．０）、各１０μＭのペプスタチンＡおよびトランス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ６４））に再懸濁した。ＩＤＵＡ活性の蛍光測定は、Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｍｅｔ．１１１：１１３−５に記載される方法に基づいて、４−ＭＵ−αＬ−イズロニド基質の切断に基づいて計算する。細胞溶解物または細胞上清の全タンパク質の１５〜２５μｇを、１５０μＬの酢酸緩衝液中、最終濃度６２．５μＭの４−ＭＵ−α−Ｌイズロニドと共に３７℃で２０時間インキュベートした。１００μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ１２．０）の添加によってアッセイを停止した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２分光蛍光光度計（実施例３５５、Ｅｍ．４６０）を使用して蛍光を測定した。
【０２６６】
図２Ａは、野生型対照細胞、ＩＤＵＡ−／−細胞、およびＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクター（ｐＭＮＤ−ＩＤＵＡおよびｐＥＦ１α−ＩＤＵＡ）で形質導入されたＩＤＵＡ−／−細胞におけるＩＤＵＡ酵素活性をアッセイする代表的な実験からのデータを示す。形質導入された細胞におけるＩＤＵＡの過剰発現はまた、細胞培養上清中の酵素的に活性なＩＤＵＡの分泌を導いた。患者および野生型線維芽細胞の両方におけるＩＤＵＡ活性は、バックグラウンドレベルで維持されたが、形質導入されたＩＤＵＡ−／−線維芽細胞におけるＩＤＵＡの過剰発現は、上清中のＩＤＵＡ活性を１０〜２０倍増加させた。図２Ｂ。したがって、ＩＤＵＡ遺伝子治療は、形質導入された細胞を矯正するだけでなく、隣接する細胞におけるＩＤＵＡ欠損を矯正する可能性も有する。
【０２６７】
実施例５
ＩＤＵＡをコードするＬＶＶで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞における活性酵素発現
ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αプロモーターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）で形質導入された（ＭＰＳ  Ｉ）。細胞をサイトカイン含有培地中で４８時間予備刺激し、２００μｇ／ｍＬのポロキサマー３３８および１０μＭのＰＧＥ２を使用してＭＯＩ５、１５、または３０で２４時間形質導入した。形質導入後、細胞をメチルセルロースにプレーティングし、造血前駆体コロニー形成させるために１２日間培養したか、またはサイトカイン含有培地で７日間培養した。ペレットおよび上清中の細胞成長、ＶＣＮ、個々のコロニーのＶＣＮおよびＬＶＶ＋細胞％、ならびにＩＤＵＡ活性について試料を分析した。
【０２６８】
培養物中の細胞は、擬似物と比較して同様の成長速度論を停止、これは、いずれのＬＶＶも毒性をもたらさなかったことを示す。図４。
【０２６９】
サイトカインで７日間培養した形質導入細胞でＶＣＮを測定した。各ベクターでの形質導入は、全てのＭＯＩにわたって高いＶＣＮをもたらした。ＭＮＤ含有ベクターは、ＥＦ１α含有ベクターよりも高いＶＣＮに達した。図５。
【０２７０】
ＭＯＩ５試料からの個々のコロニーを１２日目のメチルセルロース培養物から摘出し、ＶＣＮおよびＬＶＶ＋細胞％についてｑＰＣＲにより分析した。両方のベクターは、３を超える平均ＶＣＮおよび高いＬＶＶ＋％をもたらした。ＭＮＤベクターは、わずかにより効率的に細胞を形質導入した。図６。
【０２７１】
形質導入された細胞をサイトカイン中で７日間培養した後、細胞ペレットおよび上清をＩＤＵＡ活性についてアッセイした。ＩＤＵＡ活性は、両方のベクターについて、ＭＯＩにわたって細胞ペレット中で同等であった。図７、左パネル。ＭＮＤベクターは、ＥＦ１αベクターよりも高い上清中のＩＤＵＡ活性レべルを有した。図７、右パネル。
【０２７２】
１２日目のメチルセルロースからのプールした全コロニーにおいてもＩＤＵＡ活性を測定した。形質導入した細胞は、ＭＯＩおよびベクターにわたって同等のＩＤＵＡ活性を呈した。図８。
【０２７３】
実施例６
ＩＤＵＡをコードするＬＶＶで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞およびマウスＬｉｎ−細胞
３人のドナーからのヒトＣＤ３４＋細胞およびマウスＬｉｎ−細胞を、ＩＤＵＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤまたはＥＦ１αプロモーターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）で形質導入した。細胞をサイトカイン含有培地中で４８時間予備刺激し、２００μｇ／ｍＬのポロキサマー３３８および１０μＭのＰＧＥ２を使用して、２〜６０の範囲のＭＯＩで２４時間形質導入した。形質導入後、サイトカイン含有培地中で細胞を７日間培養した。
【０２７４】
サイトカインで７日間培養した形質導入細胞でＶＣＮを測定した。全てのドナーにわたって、ＭＯＩの増加と共にＶＣＮが上昇する傾向がある。図９。
【０２７５】
実施例７
インビボＩＤＵＡ遺伝子治療モデル
ＩＤＵＡ変異を有するマウスに、ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＨＳＣを投与し、表現型的に特徴付けする。ＩＤＵＡ変異マウスに、２週齢以下で、骨髄造血幹細胞を切除するための治療を受けさせ、ＩＤＵＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＨＳＣを投与する。
【０２７６】
初回治療後１日目から臨床評価が行われ、約４週齢で、振戦の観察、全身状態、体重増加（約４週齢で開始、毎週）、握力（約８週齢で開始、隔週）、ロータロッド（約１３週齢、１８週齢時）、および歩行分析（約１６および約２４週齢時）を含む臨床評価がマウスに行われる。
【０２７７】
行動アッセイに加えて、造血幹細胞治療後の一般的な健康状態および免疫系再構成を評価するために、移植後にマウスを他のパラメータについて試験するが、これには、貯蔵物質、神経細胞およびグリア細胞の数、および（各切片の複数の脳領域を捕捉するための）矢状切片における形態（例えば、軸索変性）、ＩＤＵＡ欠損の影響を受けた組織における交差矯正（発現）の証拠、血液／脳／組織溶解物中のＩＤＵＡ酵素活性、骨髄形態、全実験終了時のマウス骨髄中のベクターコピー数の測定、生着細胞の同定、を評価するための、完全臨床血液化学パネル、ＣＮＳグロス形態学および組織学的解析が含まれる。
【０２７８】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある全ての実施形態を、かかる特許請求の範囲が権利を有するものと均等な全範囲と共に含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は開示内容により限定されない。
【図１】
2019536484.tif 000007
【図２Ａ】
2019536484.tif 000008
【図２Ｂ】
2019536484.tif 000009
【図３】
2019536484.tif 000010
【図４】
2019536484.tif 000011
【図５】
2019536484.tif 000012
【図６】
2019536484.tif 000013
【図７】
2019536484.tif 000014
【図８】
2019536484.tif 000015
【図９】
2019536484.tif 000016
【配列表】
2019536484000001.app
【国際調査報告】
2019536484.tif 000017
2019536484.tif 000018