(57)【要約】  ＮＫｐ４６結合免疫グロブリン可変領域、及びこの可変領域を含むタンパク質、例えば抗体及び多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質は、ＮＫ細胞に結合し、且つこのＮＫ細胞を特異的にリダイレクトして目的の標的細胞を溶解することができる。このタンパク質は、疾患、特に癌又は感染病の処置に有用である。
2019503713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインであって、
（ａ）配列番号１９９又は２００（ＮＫｐ４６−１  Ｈ１又はＨ３可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２０１（ＮＫｐ４６−１  Ｌ１可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号２０２、２０３、又は２０４（ＮＫｐ４６−２  Ｈ１、Ｈ２、又はＨ３可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２０５（ＮＫｐ４６−２  Ｌ１可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｃ）配列番号２０６、２０７、又は２０８（ＮＫｐ４６−３  Ｈ１、Ｈ３、又はＨ４可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２０９（ＮＫｐ４６−３  Ｌ１可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号２１０、２１１、又は２１２（ＮＫｐ４６−４  Ｈ１可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２１３（ＮＫｐ４６−４  Ｌ２可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｅ）配列番号２１５（ＮＫｐ４６−９  Ｈ２可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２１７又は２１８（ＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｆ）配列番号２１６（ＮＫｐ４６−９  Ｈ３可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２１７又は２１８（ＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメイン）のアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の組み合わせを含む、抗原結合ドメイン。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原結合ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項３】
前記タンパク質は、抗体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質は、多重特異的抗原結合タンパク質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＶＨ及び前記ＶＬは、単一ポリペプチド鎖上に位置し、且つペプチドリンカーを介して互いに融合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＶＨは、前記タンパク質内の第１のポリペプチド鎖上に位置し、及び前記ＶＬは、前記タンパク質内の第２のポリペプチド鎖上に位置する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質は、完全長ＩｇＧ抗体、又は前記ＮＫｐ４６ポリペプチドとの結合性を維持するその断片である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質は、目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインをさらに含む多重特異的タンパク質であり、前記多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に、前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、抗体：ＮＫｐ４６−１  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−１  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ４Ｌ１、ＮＫｐ４６−４  Ｈ１Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ３Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ１、又はＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ２のいずれか１つのそれぞれのＶＨ及びＶドメインと少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬドメインを含む、タンパク質。
【請求項１０】
ヒトＮＫｐ４６ポリペプチド及び非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドであって、前記抗原結合ドメインは、ヒト起源のフレームワーク配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、及びヒト起源のフレームワーク配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記タンパク質は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ（ＮＫｐ４６−１）；
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ（ＮＫｐ４６−２）；
（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ（ＮＫｐ４６−３）；又は
（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ（ＮＫｐ４６−４）；又は
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ（ＮＫｐ４６−９）
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む、タンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１】
前記タンパク質は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３３遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ３−１１及び／又はＩＧＫＶ３−１５遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−４６及び／又はＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−ＮＬ１遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ
からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれかに一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原結合ドメインは、抗体：ＮＫｐ４６−１  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−１  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ４Ｌ１、ＮＫｐ４６−４  Ｈ１Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ３Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ１、又はＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ２のいずれか１つのそれぞれのＶＨ及びＶＬドメインと少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗原結合ドメイン又はそれを含む前記タンパク質若しくはポリペプチドは、
ａ．野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５に変異を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチド；
ｂ．前記野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４のいずれか１つ以上に変異を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチド；並びに
ｃ．前記野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６のいずれか１つ以上に変異を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチド
からなる群から選択される変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＶＨ及びＶＬドメインは、同じポリペプチド鎖上に存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗原結合ドメイン。
【請求項１５】
前記ＶＨ及びＶＬドメインは、ペプチドリンカーによって分離されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合ドメイン。
【請求項１６】
目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインをさらに含む多重特異的タンパク質であり、前記多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に、前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
単一ポリペプチド鎖からなる、請求項１６に記載の多重特異的タンパク質。
【請求項１８】
ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する前記抗原結合ドメイン及び目的の抗原に結合する前記抗原結合ドメインは、リンカーを介してＶＬに融合されたＶＨをそれぞれ含む、請求項１６又は１７に記載の多重特異的タンパク質。
【請求項１９】
二量体、三量体、又は四量体から選択される多量体ポリペプチドである、請求項１６又は１８に記載の多重特異的タンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質は、Ｆｃドメインの少なくとも一部を含み、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＣＤ１６ポリペプチドに対して低い結合性を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記タンパク質は、Ｆｃドメインの少なくとも一部を含み、前記Ｆｃドメインは、二量体であり、且つヒトＣＤ１６に対する結合性を維持している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記タンパク質は、ヒトＣＨ１又はＣκ定常ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）に融合された少なくとも１つの重鎖又は軽鎖可変ドメイン及びＦｃドメインをそれぞれ含む少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むヘテロ多量体タンパク質であり、前記タンパク質鎖は、ＣＨ１−Ｃκ二量体化され、且つ非共有結合により、及び任意選択的に、それぞれのＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間に形成されたジスルフィド結合により、且つそれぞれのＦｃ部分のＣＨ３ドメイン間の非共有結合により、さらに互いに結合されている、請求項１〜１６又は１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１及び第２ポリペプチド鎖の両方は、前記ＣＨ１及び／又はＣκドメインと前記Ｆｃドメインとの接合部にヒンジドメインを含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記抗原結合ドメイン、ポリペプチド、又は多重特異的タンパク質は、前記ＮＫｐ４６ポリペプチドに一価で結合する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記タンパク質は、ヘテロ二量体であり、且つ
（ａ）ドメイン配置：
Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−Ｖｂ−２
を有する第１のポリペプチド、及び
（ｂ）ドメイン配置：
Ｖｂ−１−（ＣＨ又はＣＫ）ｂ−Ｆｃドメイン
を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、
Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり；
（ＣＨ１又はＣＫ）ｂは、中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、及び前記Ｖｂ−１は、前記中心鎖のＶａ−１と共に抗原結合ドメインを形成し、Ｖａ−２とＶｂ−２とは、抗原結合ドメインを共に形成する、請求項１〜１６又は１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記タンパク質は、ヘテロ三量体であり、且つ
（ａ）ドメイン配置：
Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ
を有する第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）ドメイン配置：
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ−Ｆｃドメイン
を有する第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）ドメイン配置：
Ｖｂ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄ
を有する第３のポリペプチド鎖
を含み、
Ｖａ−１及びＶｂ−１の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり；
（ＣＨ１又はＣＫ）ｃは、中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、且つ前記Ｖａ−１と前記Ｖｂ−１とは、抗原結合ドメインを形成し；及び
（ＣＨ１又はＣＫ）ｄは、前記中心鎖上の前記（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、且つ前記Ｖａ−２と前記Ｖｂ−２とは、抗原結合ドメインを形成する、請求項１〜１６又は１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｖａ−２とＶｂ−２とは、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインを共に形成する、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ドメイン配置：
【化１】
2019503713.tif 000051
を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
ドメイン配置：
【化２】
2019503713.tif 000052
を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
ドメイン配置：
【化３】
2019503713.tif 000053
を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記タンパク質は、カニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記タンパク質は、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドとの結合について、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９の前記ＶＨ及びＶＬドメインを有するモノクローナル抗体と競合する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードする単離された核酸。
【請求項３６】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を産生する組換え細胞。
【請求項３７】
タンパク質を産生する方法であって、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質の発現に適した条件下において、請求項３６に記載の細胞を培養するステップと、前記タンパク質を回収するステップとを含む方法。
【請求項３８】
疾患の処置のための薬剤としての、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物の使用。
【請求項３９】
対象の疾患を処置する方法であって、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
前記疾患は、癌、感染病、又は炎症性若しくは自己免疫疾患である、請求項３８又は３９に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての図面及び配列表を含め、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１５年１２月２８日出願の米国仮特許出願第６２／２７１，４７４号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、２０１６年１２月１９日に作成された３７６ＫＢサイズの「ＮＫｐ４６−７  ＰＣＴ＿ＳＴ２５  ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【０００３】
免疫グロブリン可変領域、及びこの可変領域を含むタンパク質、例えば抗体及び多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質は、ＮＫ細胞に結合し、且つこのＮＫ細胞を特異的にリダイレクトして目的の標的細胞を溶解することができる。このタンパク質は、疾患、特に癌又は感染病の処置に有用である。
【背景技術】
【０００４】
２つの異なるエピトープに結合する二重特異的抗体は、特異性を高める機会、効力を拡張する機会、及び従来のモノクローナル抗体では達成できない作用の新規な機序を利用する機会を提供する。同時に２つの標的に結合する二重特異的抗体の様々な形態が報告されている。また、二重特異的抗体を用いて２つの異なる受容体を架橋してシグナル伝達経路を阻害することは、様々な適用例で有用性を示している（例えば、（非特許文献１）を参照されたい）。二重特異的抗体は、２つの異なる受容体を中和するために使用されてきた。他のアプローチでは、二重特異的抗体は、免疫エフェクター細胞を動員するために使用され、ここで、Ｔ細胞の活性化が、２つの異なる細胞型における受容体に同時に結合する二重特異的抗体によって腫瘍細胞の近傍で達成される（（非特許文献２）を参照されたい）。これまでに開発されたアプローチは、主として、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に結合する二重特異的抗体に関係している。しかしながら、他の例では、一方のアームがＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合し、且つ他方のアームが目的の抗原、例えば、ＣＤ１９に結合する二重特異的抗体が開発された（（非特許文献３）を参照されたい）。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、不所望の細胞、例えば、腫瘍又はウイルス感染細胞を排除することができる効率的な免疫学的監視機構を提供する。ＮＫ細胞の特徴及び生物学的特性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７を含む表面抗原の発現、細胞表面上のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を含む。
【０００６】
ＮＫ細胞の活性は、シグナルの活性化及び阻害の両方を伴う複合機構によって調節される。ＮＫ細胞媒介認識及びＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の殺生において重要な役割を果たすいくつかの異なるＮＫ細胞受容体が同定されている。１つの受容体は、ＮＫ細胞に特異的ではないが、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣに関与するＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）である。別のＮＫ細胞受容体は、ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＮＫｐ４６である。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞に特異的であり、特定のｍＡｂによって誘導されるその架橋は、細胞内Ｃａ＋＋のレベルを上昇させる強いＮＫ細胞の活性化をもたらし、それにより細胞障害性が誘発され、リンホカインが放出される。（特許文献１）（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）は、Ｆｃγ陽性の血液悪性腫瘍の処置での、Ｆｃγ受容体に結合する単一特異的完全長ＩｇＧ抗ＮＫｐ４６抗体の使用を開示している。腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）上のＦｃγ受容体は、ＮＫ細胞に結合する抗ＮＫｐ４６抗体のＦｃドメインと相互作用し、それにより、活性化ＮＫ細胞が、抗体の２つの反応部分（例えば、抗原認識ドメイン及びＦｃドメイン）によってそれらの標的細胞に接近するようになり、処置の効率を高めると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０５８５８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊａｃｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２０８５０−２０８５９
【非特許文献２】Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９（１２）：４９４１−４
【非特許文献３】Ｋｅｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．３０３（２）：１２８−１３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまで、ＮＫ細胞特異的二重特異的抗体は開発されていない。ＮＫ細胞障害性を漸増させる除去剤、例えば、抗腫瘍抗体は、典型的にはＣＤ１６によってＡＤＣＣを媒介する完全長ＩｇＧ１である。様々な形態の二重特異的抗体の存在にもかかわらず、恩恵をもたらし得る新規な十分に定義された作用機序を有し、且つ完全長抗体に加えて使用することができるタンパク質が当技術分野でなお要望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本発明は、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチド及び非ヒト霊長類（例えば、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＮＫｐ４６ポリペプチドの両方と交差反応する抗体超可変領域の発見に起因する。別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に結合する一本鎖タンパク質及び多重特異的タンパク質（例えば、限定されるものではないが、抗体ベースのタンパク質形態を含む、ポリペプチド、一本鎖タンパク質、多重鎖タンパク質）で機能を維持する抗体超可変領域の発見に起因する。
【００１１】
また、抗原結合ドメインによって結合されたエピトープも提供される。抗原ドメインは、非常に強力な抗原結合タンパク質を提供するＮＫｐ４６上のエピトープに結合する。エピトープは、ＮＫ細胞の表面に発現されるＮＫｐ４６を含め、ヒト及び非ヒト霊長類によってさらに共有されている。
【００１２】
可変領域は、一価でＮＫｐ４６に結合するポリペプチド（例えば、抗体、Ｆｃタンパク質、ｓｃＦｖなど）に組み込まれた場合、（標的細胞の非存在下で）ＮＫｐ４６活性化を誘発することなく、単離ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６への結合を可能にする。可変領域は、一本鎖ポリペプチドとして、例えば、Ｆ（ａｂ）型と同様にペプチドリンカーによって分離された直列型可変領域として高親和性でＮＫｐ４６に結合することができ、且つ一価結合剤として、ＮＫ細胞が標的細胞を溶解するように誘導することを可能にするＮＫｐ４６エピトープに結合することができる。このような特性は、特に、重鎖及び軽鎖抗ＮＫｐ４６可変領域を介してＮＫｐ４６及び目的の抗原に結合し、且つ目的の抗原に特異的に結合する超可変領域（例えば、重鎖及び軽鎖可変領域）を介して標的細胞上の目的の抗原に特異的に結合する多重特異的（例えば、二重特異的）タンパク質におけるものを含め、様々な適用例でこれらを有利にする。このような多重特異的タンパク質は、ＮＫ細胞をリダイレクトして、目的の抗原を発現する標的細胞、例えば、疾患に関与する細胞を溶解することができる。本明細書に開示される超可変領域及びヒト化可変領域は、一本鎖形態の一価結合性を維持し、これらが単一ポリペプチド鎖上に配置される構造で有利に使用することができるが、これらは、他の適用例、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、生物学的試料中で）ヒト及び／又は非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、それを調節し、且つ／又はそれを検出するように、例えば、可変領域が、別々の鎖上にある他のタンパク質、例えば、二重特異的抗体及びＦｃタンパク質、又はより一般的には単一特異的及び／又は従来の抗ＮＫｐ４６抗体上にある他のタンパク質でも使用し得ることを理解されたい。
【００１３】
一態様では、ヒト及び非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドの両方に（例えば、本明細書の方法により、表面プラズモン共鳴及び／又はフローサイトメトリーによって評価される、ＮＫｐ４６発現細胞に対して同様の親和性で）結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）が提供される。一実施形態では、ＡＢＤは、一本鎖抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）としてＮＫｐ４６ポリペプチドに結合することができる。一実施形態では、ＡＢＤは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域（例えば、重鎖及び軽鎖可変ドメインが単一のポリペプチド鎖上に位置する）を含む（又はこれに含まれる）。別の実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、多量体タンパク質内の異なるポリペプチド鎖上に位置する。重鎖可変領域は、ヒト起源の重鎖フレームワーク領域を含み、軽鎖可変領域は、ヒト起源の軽鎖フレームワーク領域を含み、任意選択的に、重鎖及び／又は軽鎖フレームワーク領域は、１つ以上のアミノ酸改変（例えば、残基が、その位置の親（例えば、マウス）フレームワークに存在する残基によって置換される置換、復帰変異）を含み、任意選択的に、アミノ酸改変は、非ヒト霊長類ＮＫｐ４６への結合を提供するか又は増加させる。一実施形態では、このようなＡＢＤ及び／又は可変領域を含むタンパク質、Ｆｃタンパク質、抗体、又は抗体断片が提供される。一態様では、このような抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）をコードする単離された核酸及び／又は組換え核酸が提供される。
【００１４】
このようなタンパク質又はポリペプチドの例としては、例えば、単一のポリペプチド鎖ＮＫｐ４６結合ドメイン（単一ポリペプチド鎖上に位置するヒトＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ、例えば、（ポリ）ペプチドリンカーによって分離されたＶＨ及びＶＬを含むポリペプチド）が挙げられる。一実施形態では、一本鎖ＮＫｐ４６結合ドメインは、ペプチドリンカーによって分離された、本明細書に開示されるＶＨ及びＶＬドメインを含む。単一ポリペプチド鎖は、１つ以上のさらなるポリペプチド鎖を含む多鎖ポリペプチドに含まれてもよく、又は単一ポリペプチド鎖として単離されてもよい。抗ＮＫｐ４６  ＡＢＤを含むタンパク質又はポリペプチドの別の例としては、第１及び第２ポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質が挙げられ、ここで、一方の鎖は、本明細書に開示される抗ＮＫｐ４６  ＡＢＤのＶＨドメインを含み、及び他方の鎖は、本明細書に開示される抗ＮＫｐ４６  ＡＢＤのＶＬを含み、これらの鎖は、ＶＨ及びＶＬがＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインを形成するように構成されている。
【００１５】
一態様では、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、任意選択的に、非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドにさらに結合するタンパク質又はポリペプチド（例えば、単一特異的、二重特異的、若しくは多重特異的抗体又はタンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、又はＦ（ａｂ）２、多重特異的Ｆｃタンパク質）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、（ａ）ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子に由来するヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−１抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む重鎖可変領域；並びに（ｂ）ヒトＩＧＫＶ１−３３遺伝子に由来するヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−１抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む軽鎖可変領域を含む。任意選択的に、Ｋａｂａｔ付番、Ｃｈｏｔｉａ付番、又はＩＭＧＴ付番によって定義されるＣＤＲである。一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４（配列番号１を参照されたい）のいずれか１つ以上の変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−１  Ｈ１又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含み、且つ軽鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−１  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含む。
【００１６】
一態様では、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、任意選択的に、非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドにさらに結合するタンパク質又はポリペプチド（例えば、単一特異的、二重特異的若しくは多重特異的抗体若しくはタンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、又はＦ（ａｂ）２、多重特異的Ｆｃタンパク質）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、（ａ）ＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子に由来するヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−２抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む重鎖可変領域；並びに（ｂ）ＩＧＫＶ１−３９遺伝子に由来するヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−２抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む軽鎖可変領域を含む。任意選択的に、Ｋａｂａｔ付番、Ｃｈｏｔｉａ付番、又はＩＭＧＴ付番によって定義されるＣＤＲである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は軽鎖可変領域は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−２  Ｈ１、Ｈ２、又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含み、且つ軽鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−２  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含む。
【００１７】
一態様では、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、任意選択的に、非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドにさらに結合するタンパク質又はポリペプチド（例えば、単一特異的、二重特異的若しくは多重特異的抗体若しくはタンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、又はＦ（ａｂ）２、多重特異的Ｆｃタンパク質）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、（ａ）ＩＧＨＶ１−６９遺伝子に由来するヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−３抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む重鎖可変領域；並びに（ｂ）ＩＧＫＶ３−１１及び／又はＩＧＫＶ３−１５遺伝子に由来するヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）（例えば、ＩＧＫＶ３−１１及びＩＧＫＶ３−１５配列又はセグメントの両方を含むモザイク可変領域）と、ＮＫｐ４６−３抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む軽鎖可変領域を含む。任意選択的に、Ｋａｂａｔ付番、Ｃｈｏｔｉａ付番、又はＩＭＧＴ付番によって定義されるＣＤＲである。一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６（配列番号１を参照されたい）のいずれか１つ以上の変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−３  Ｈ１、Ｈ３、又はＨ４可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含み、且つ軽鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−３  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含む。
【００１８】
一態様では、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、任意選択的に、非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドにさらに結合するタンパク質又はポリペプチド（例えば、単一特異的、二重特異的若しくは多重特異的抗体若しくはタンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、又はＦ（ａｂ）２、多重特異的Ｆｃタンパク質）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、（ａ）ＩＧＨＶ１−４６及び／又はＩＧＨＶ１−６９遺伝子に由来するヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）（例えば、ＩＧＨＶ１−４６及びＩＧＨＶ１−６９配列又はセグメントの両方を含むモザイク可変領域）と、ＮＫｐ４６−４抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む重鎖可変領域；並びに（ｂ）ＩＧＫＶ１−ＮＬ１遺伝子に由来するヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−４抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む軽鎖可変領域を含む。任意選択的に、Ｋａｂａｔ付番、Ｃｈｏｔｉａ付番、又はＩＭＧＴ付番によって定義されるＣＤＲである。一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５（配列番号１を参照されたい）のいずれか１つ以上の変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は軽鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−４  Ｈ１可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含み、且つ軽鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−４  Ｌ２可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含む。
【００１９】
一態様では、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、任意選択的に、非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドにさらに結合するタンパク質又はポリペプチド（例えば、単一特異的、二重特異的若しくは多重特異的抗体若しくはタンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、又はＦ（ａｂ）２、多重特異的Ｆｃタンパク質）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、（ａ）ＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子に由来するヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−９抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む重鎖可変領域；並びに（ｂ）ＩＧＫＶ１−３９遺伝子に由来するヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３）と、ＮＫｐ４６−９抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３とを含む軽鎖可変領域を含む。任意選択的に、Ｋａｂａｔ付番、Ｃｈｏｔｉａ付番、又はＩＭＧＴ付番によって定義されるＣＤＲである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含み、且つ軽鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−９  Ｈ３可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含み、且つ軽鎖可変領域は、ＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメインのアミノ酸配列（又はこのアミノ酸配列と少なくとも８０、９０％、９５％、又は９８％の同一性を共有するアミノ酸配列）を含む。
【００２０】
一態様では、それぞれヒトＦＲ１、２、及び３フレームワーク領域を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合ドメイン、又はヒト及び非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチド、例えば、細胞表面ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するようなＡＢＤを含むタンパク質又はポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、多重特異的ポリペプチド、二重特異的抗体、ＤＡＲＴ（登録商標）、若しくはＢｉＴｅ（登録商標）、又はこのようなものを含むタンパク質など）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、
（ａ）それぞれ配列番号１９９又は２００に示されているＮＫｐ４６−１  Ｈ１又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２０１に示されているＮＫｐ４６−１  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｂ）それぞれ配列番号２０２、２０３、又は２０３に示されているＮＫｐ４６−２  Ｈ１、Ｈ２、又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２０５に示されているＮＫｐ４６−２  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｃ）それぞれ配列番号２０６、２０７、又は２０８に示されているＮＫｐ４６−３  Ｈ１、Ｈ３、又はＨ４可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２０９に示されているＮＫｐ４６−３  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号２１０、２１１、又は２１２に示されているＮＫｐ４６−４  Ｈ１、Ｈ２、又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２１３に示されているＮＫｐ４６−４  Ｌ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｅ）それぞれ配列番号２１５に示されているＮＫｐ４６−９  Ｈ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２１７又は２１８に示されているＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｆ）配列番号２１５に示されているＮＫｐ４６−９  Ｈ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びそれぞれ配列番号２１７又は２１８に示されているＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む。
【００２１】
一態様では、それぞれヒトＦＲ１、２、及び３フレームワーク領域を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合ドメイン、又はヒト及び非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するようなＡＢＤを含むタンパク質又はポリペプチドが提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、
（ａ）配列番号３に示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号４に示されているアミノ酸配列を有するＶＬドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３３遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｂ）配列番号５に示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＶＬドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｃ）配列番号７に示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号８に示されているアミノ酸配列を有するＶＬドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ３−１１及び／又はＩＧＫＶ３−１５遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｄ）配列番号９に示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−４６及び／又はＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有するＶＬドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−ＮＬ１遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｅ）配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号１４に示されているアミノ酸配列を有するＶＬドメインのＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む。
【００２２】
任意の態様では、抗原結合ドメインは、抗体：ＮＫｐ４６−１  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−１  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ４Ｌ１、ＮＫｐ４６−４  Ｈ１Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ３Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ１、又はＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ２のいずれか１つのそれぞれのＶＨ及びＶＬと少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含み得る。
【００２３】
一態様では、それぞれヒトＦＲ１、２、及び３フレームワーク領域を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合ドメイン、又はＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するようなＡＢＤを含むタンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体、多重特異的タンパク質）が提供され、このタンパク質又はポリペプチドは、抗体：ＮＫｐ４６−１  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−１  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−２  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ１Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ３Ｌ１、ＮＫｐ４６−３  Ｈ４Ｌ１、ＮＫｐ４６−４  Ｈ１Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−４  Ｈ３Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ１、ＮＫｐ４６−９  Ｈ２Ｌ２、ＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ１、又はＮＫｐ４６−９  Ｈ３Ｌ２のいずれか１つのそれぞれのＶＨ及びＶＬと少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９８％（又は１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。これらの抗体のＶＨ及びＶＬ配列は、表Ｃ及び実施例１のパートＢに列挙される。
【００２４】
一実施形態では、ＮＫｐ４６−１  ＶＬは、Ｋａｂａｔ  ８７位にアミノ酸置換を含み得、任意選択的に、８７位の残基はフェニルアラニンである。ＮＫｐ４６−１  ＶＨは、Ｋａｂａｔ残基２７、６６、及び／又は６７にアミノ酸置換を含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基３７、４８、及び／又は９１に置換をさらに含み得る。任意選択的に、特定の位置に存在する残基は、例えば、実施例１に示されるように、本明細書の位置で置換された残基である。
【００２５】
一実施形態では、ＮＫｐ４６−２  ＶＬは、Ｋａｂａｔ  ４８位にアミノ酸置換を含み得、任意選択的に、４８位の残基はバリンである。ＮＫｐ４６−２  ＶＨは、Ｋａｂａｔ残基２７及び／又は７１にアミノ酸置換を含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基４８及び／又は６７に置換をさらに含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基３１に置換をさらに含み得る。任意選択的に、特定の位置に存在する残基は、例えば、実施例１に示されるように、本明細書の位置で置換された残基である。
【００２６】
一実施形態では、ＮＫｐ４６−３  ＶＬは、Ｋａｂａｔ  ４９位にアミノ酸置換を含み得、任意選択的に、４９位の残基はリジンである。ＮＫｐ４６−３  ＶＨは、Ｋａｂａｔ残基２７にアミノ酸置換を含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基４８及び／又は６７に置換をさらに含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基６９に置換をさらに含み得る。任意選択的に、特定の位置に存在する残基は、例えば、実施例１に示されるように、本明細書の位置で置換された残基である。
【００２７】
一実施形態では、ＮＫｐ４６−４  ＶＬは、Ｋａｂａｔ  ３６位及び／又は４８位にアミノ酸置換を含み得、任意選択的に、３６位の残基はフェニルアラニンであり、任意選択的に、４８位の残基はバリンである。ＮＫｐ４６−４  ＶＨは、Ｋａｂａｔ残基３０、４８及び／又は９３にアミノ酸置換を含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基６７に置換をさらに含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基６９に置換をさらに含み得る。任意選択的に、特定の位置に存在する残基は、例えば、実施例１に示されるように、本明細書の位置で置換された残基である。
【００２８】
一実施形態では、ＮＫｐ４６−９  ＶＬは、Ｋａｂａｔ  ３６位にアミノ酸置換を含み得、任意選択的に、３６位の残基はシステインであり、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基４８に置換をさらに含み、任意選択的に、４８位の残基はバリンである。ＮＫｐ４６−９  ＶＨは、Ｋａｂａｔ残基７１にアミノ酸置換を含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基２７に置換をさらに含み、任意選択的に、Ｋａｂａｔ残基４８及び／又は６７に置換をさらに含み得る。任意選択的に、特定の位置に存在する残基は、例えば、実施例１に示されるように、本明細書の位置で置換された残基である。
【００２９】
任意の実施形態の一態様では、このタンパク質又はポリペプチドは、ＮＫｐ４６に１価で結合する。任意の実施形態の態様では、このタンパク質又はポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する１つ以下の抗原結合ドメインを含むか又は包含する。
【００３０】
一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、ヒトＦｃドメイン又はその一部を含み、このＦｃドメイン又はその一部は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）及びヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合することができる。ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）が全てのＮＫ細胞上に存在するわけでないため、ＦｃγＲＩＩＩａを介して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を与えるように設計された従来の治療用抗体（例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１）は、全てのＮＫ細胞を動員しない可能性があり；これに対して本タンパク質は、ＮＫｐ４６を介して全てのＮＫ細胞を応答させることができ、従って、本タンパク質は、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞及びＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化又は増加させるのに有用となる。
【００３１】
一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、ヒトＦｃドメイン又はその一部を含み、このＦｃドメイン又はその一部は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、ヒトＣＤ１６ポリペプチドには結合しない。
【００３２】
一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドである。一実施形態では、このタンパク質又はポリペプチドは、多量体ポリペプチド、任意選択的に、二量体、三量体、又は四量体タンパク質である。
【００３３】
有利には、一実施形態では、ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下において、多重特異的タンパク質は、（ｉ）標的細胞上の目的の抗原及び（ｉｉ）ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に結合することができ、標的細胞上の目的の抗原及びＮＫｐ４６の両方に結合すると、ＮＫｐ４６によってＮＫ細胞にシグナル伝達を誘導し、且つ／又はこのＮＫ細胞を活性化することができ（このタンパク質はＮＫｐ４６アゴニストとして作用する）、これにより、特にＮＫｐ４６によって伝達される活性化シグナルによってＮＫ細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解が促進される。特定の有利な実施形態では、多重特異的は、ＮＫｐ４６に結合する単一抗原結合ドメインを含む（このタンパク質はＮＫｐ４６に１価で結合する）。一実施形態では、このタンパク質は、標的細胞上の目的の抗原及びＮＫ細胞上のＮＫｐ４６の両方に結合すると、ＮＫｐ４６によってＮＫ細胞にシグナル伝達を誘導することができる。一実施形態では、このタンパク質は、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含み、この第１又は第２の抗原結合ドメインの一方は、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、及びこの第１又は第２の抗原結合ドメインの他方は、標的細胞で発現される目的の抗原に結合する。
【００３４】
一実施形態では、多重特異的タンパク質は、単量体である。一実施形態では、多重特異的タンパク質は、二量体、例えば、ヘテロ二量体、三量体、又は四量体である。一実施形態では、このタンパク質は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、又はリンカーペプチドによって分離されたＮＫｐ４６（本明細書に開示されるＶＨ及びＶＬ）に結合するＡＢＤのＶＨ及びＶＬドメインを含む第１のポリペプチド鎖、及び任意選択的なＦｃドメイン、及び目的の抗原に結合する１つ以上の可変領域又は抗原結合ドメインを含む第２のポリペプチド鎖、及び任意選択的なＦｃドメインを含む四量体である。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチド鎖の両方は、Ｆｃドメインを含み、このタンパク質は、二量体Ｆｃドメインを含み、任意選択的に、Ｆｃドメインは、ヒトＣＤ１６に結合することができる。一実施形態では、単量体又は二量体タンパク質は、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と目的の抗原に結合する抗原結合ドメインとの間にＦｃドメインが入ったドメイン構造を有するタンパク質を含む。一実施形態では、多重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドは、二重特異的抗体である。
【００３５】
本明細書のタンパク質のいずれかの一実施形態では、目的の抗原に結合する多重特異的タンパク質の抗原結合ドメインは、ＮＫ細胞によって溶解しようとする標的細胞によって発現される抗原（例えば、ポリペプチド）に結合する。任意選択的に、このような抗原は、癌細胞、腫瘍関連免疫細胞（例えば、免疫抑制因子又は調節細胞）、ウイルス感染細胞、又は自己免疫若しくは炎症性疾患に寄与する細胞によって発現される。任意選択的に、目的の抗原は、それに特異的に結合する完全長ヒトＩｇＧ１抗体に接触したときに細胞内に内部移行され得ることが分かっている癌抗原である。
【００３６】
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬ、抗体重鎖及び／又は軽鎖、一本鎖抗原結合ドメイン、本開示のタンパク質のいずれかの第１、第２、第３、又はさらなるポリペプチド鎖をコードする組換え核酸が提供される。本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、本開示の核酸を含む組換え宿主細胞が提供される。
【００３７】
いずれの方法も、特に「発明を実施するための形態」を含め、本出願に開示されるあらゆるステップを含むとしてさらに特徴付けることができる。本発明は、本明細書に開示のタンパク質を同定する、試験する、及び／又は産生する方法にさらに関する。本発明は、任意の本方法によって得ることができる多重特異的タンパク質にさらに関する。本開示は、本明細書に開示される多重特異的タンパク質の医薬剤又は診断剤にさらに関する。本開示は、治療又は診断の方法での多重特異的タンパク質の使用方法にさらに関する。
【００３８】
本発明のこれら及び追加の有利な態様及び特徴は、本明細書の他の箇所でさらに説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、分離されたときにＢ２２１（ＣＤ１９）細胞株又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下でＴ／Ｂ細胞凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１細胞及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が混合培養されたときに細胞の凝集を引き起こすことを示す。
【図２−１】図２Ａ〜Ｆは、産生された二重特異的タンパク質の異なるドメイン配置を示す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図２−５】同上。
【図２−６】同上。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４に基づくＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的Ｆ１及びＦ２抗体は、静止ＮＫ細胞をそのＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に誘導することができるが、アイソタイプ対照抗体は、このＤａｕｄｉ細胞の除去をもたらさなかったことをそれぞれ示す。リツキシマブ（ＲＴＸ）は、ＡＤＣＣの陽性対照として機能し、ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌ）で得られた最大応答は２１．６％の特異的溶解であった。
【図４−１】図４Ａ（上側パネルＣＤ１０７、下側パネルＣＤ６９）は、Ｆ２形態タンパク質におけるＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する二重特異的抗体が標的細胞の非存在下で静止ＮＫ細胞を活性化しないが、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及び陽性対照アレムツズマブがＮＫ細胞を活性化したことを示す。
【図４−２】図４Ｂは、Ｄａｕｄｉ標的細胞の存在下において、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４結合ドメインのそれぞれを含む）が静止ＮＫ細胞を活性化させたが（上側パネルＣＤ１０７、下側パネルＣＤ６９）、完全長抗ＣＤ１９が最良でもＮＫ細胞の非常に低い活性化のみを示したことを示す。完全長抗ＮＫｐ４６抗体又はアレムツズマブのいずれも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を超える実質的な活性化の増加を示さなかった。
【図４−３】図４Ｃ（上側パネルＣＤ１０７、下側パネルＣＤ６９）は、ＣＤ１９陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下において、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４可変領域のそれぞれを含む）のいずれもＮＫ細胞を活性化しなかったことを示す。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツズマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化と同様のレベルでＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は活性化を誘導しなかった。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、１：１の低いエフェクター：標的比において、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体のそれぞれがＤａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させたこと、及び二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９が、ＡＤＣＣ誘導抗体である完全長ヒトＩｇＧ１のように抗ＣＤ１９抗体よりも遥かに強力であることを示す。上側パネルはＣＤ１０７（図５Ａ）であり、下側パネルはＣＤ６９（図５Ｂ）を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、各ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質（一本鎖形態Ｆ３、並びに多量体形態Ｆ５及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６陰性ｈＮＫｐ４６陽性ＮＫ細胞株によってＤａｕｄｉ（図６Ａ）細胞又はＢ２２１（図６Ｂ）細胞の特異的な溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体は、それを誘導しなかったことを示す。
【図７】ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＦ５形態のＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質は、Ｄａｕｄｉ標的細胞溶解の媒介において完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体又はＦ６形態二重特異的タンパク質よりも遥かに強力であることを示す。ＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＦ６形態の二重特異的抗ＣＤ１９は、完全長ｌｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同程度にＤａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において強力であり、これは、対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体がＣＤ１９に二価で結合することを考えると注目に値する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は１つ又は２つ以上を意味し得る。
【００４１】
「含む」が使用される場合、これは、任意選択的に「本質的に〜からなる」で置き換えることができ、さらに任意選択的に「〜からなる」に置き換えることができる。
【００４２】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という語は、エピトープに免疫特異的に結合することができる３次元構造を含むドメインを指す。従って、一実施形態では、前記ドメインは、超可変領域、任意選択的に抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択的に少なくとも１つのＶＨドメインを含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。
【００４３】
本明細書の「抗体」という語は、広い意味で使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、並びに抗体断片及び誘導体（但し、所望の生物学的活性を示すものに限られる）を含む。抗体の作製に適切な様々な技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に示されている。「抗体断片」は、完全長抗体、例えば、その抗原結合領域又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体断片、及び１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように１つに結合又は連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書に記載され、再考察されている。
【００４４】
本明細書で使用される「抗体誘導体」という語は、完全長抗体、又は例えばその少なくとも抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片を含み、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学修飾されている。これは、限定されるものではないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体、及びこれらの変異体を含む。
【００４５】
「超可変領域」という語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９８７；１９６：９０１−９１７）を含む。典型的には、この領域のアミノ酸残基の付番は、前出のＫａｂａｔらに記載の方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の付番」、及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番方式を指す。Ｋａｂａｔ付番方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はＦＲ又はＣＤＲへの挿入に一致するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントによって所与の抗体について決定することができる。
【００４６】
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された連続した領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。
【００４７】
本明細書で定義される「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体由来定常領域のことである。本明細書で使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」とは、κ（Ｃκ）又はλ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域のことである。定常軽鎖は、典型的には、単一ドメインを含み、且つ本明細書で定義されるように、Ｃκの１０８〜２１４位、又はＣλを指し、付番は、ＥＵインデックスによる（（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。本明細書で使用される「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、μ、δ、γ、α、又はε遺伝子によってそれぞれコードされてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして抗体のアイソタイプを確定する抗体の領域のことである。完全長ＩｇＧ抗体では、本明細書で定義される定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７位を含み、付番は、ＥＵインデックスによる。
【００４８】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドのことである。Ｆａｂは、分離されたこの領域、又はポリペプチド、多重特異的ポリペプチド、若しくはＡＢＤ、又は本明細書で概説された他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。
【００４９】
本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片のことであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の再考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００５０】
本明細書で使用される「Ｆｖ」、又は「Ｆｖ断片」、又は「Ｆｖ領域」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことである。
【００５１】
本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドのことである。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びに可撓性ヒンジＮ末端からこれらのドメインまでを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、少なくとも残基Ｃ２２６、Ｐ２３０、又はＡ２３１からそのカルボキシ末端までを含むように定義され、この付番はＥＵインデックスによる。Ｆｃは、以下に記載される、分離されたこの領域、又はＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドのことである。Ｆｃポリペプチドは、限定されるものではないが、抗体、Ｆｃ融合体、及びＦｃ断片を含む。
【００５２】
本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれ軽鎖（κ及びλを含む）免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（Ｖκ（ＶＫ）及びＶλを含む）遺伝子及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域のことである。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲとの関連では、例えば、Ｋａｂａｔと同様に（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｅ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）、及びＣｈｏｔｈｉａと同様に正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成軽鎖及び構成重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置して整列させる役割を果たし、ＣＤＲは抗原への結合に主に関与する。
【００５３】
「特異的に結合する」という語は、抗体又はポリペプチドを、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するナイーブタンパク質のいずれかを用いて評価される、好ましくは競合的結合アッセイでの結合パートナー、例えば、ＮＫｐ４６に結合できることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的結合を決定する他の方法は、以下にさらに記載され、当技術分野で周知である。
【００５４】
抗体又はポリペプチドが、特定のモノクローナル抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６単一又は二重特異的抗体との関連でのＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９）と「競合する」と言われる場合、この「競合する」は、抗体又はポリペプチドが、組換え標的（例えば、ＮＫｐ４６）分子又は表面発現標的（例えば、ＮＫｐ４６）分子のいずれかを用いた結合アッセイでモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいてＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９のＮＫｐ４６ポリペプチド又はＮＫｐ４６発現細胞に対する結合性を低下させる場合、抗体は、それぞれＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９と「競合する」と言われる。
【００５５】
本明細書で使用される「親和性」という語は、抗体又はポリペプチドのエピトープへの結合の強さを指す。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数ＫＤによって示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数ＫＡは１／ＫＤによって定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によって）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。
【００５６】
本発明との関連では、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指定する。
【００５７】
「エピトープ」という語は、抗原決定基を指し、抗体又はポリペプチドが結合する抗原の範囲又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、並びに特定の抗原結合抗体又はペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基、即ち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質エピトープは、例えば、抗体又は受容体と結合することができる複合抗原分子上の最も単純な形態又は最も小さい領域である。エピトープは、線形又は高次構造／構造であり得る。「線形エピトープ」という語は、アミノ酸の線形配列（一次構造）上の連続したアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「高次構造又は構造エピトープ」という語は、全てが連続しているわけではないアミノ酸残基から構成され、従って分子の折り畳み（二次、三次、及び／又は四次構造）によって互いに近接するアミノ酸の線形配列の分離した部分を表すエピトープとして定義される。高次構造エピトープは３次元構造によって決まる。従って、「高次構造の」という語は、「構造の」という語と頻繁に同義的に使用される。
【００５８】
本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドの変異体を指し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブ又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ナイーブアミノ酸配列内の特定の位置に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。
【００５９】
「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００６０】
２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」又は「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の計算モデル又はコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた同様の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。
【００６１】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
【００６２】
「単離された」分子は、組成物中の主な種である分子であり、この組成物中では、この分子は、この分子が属する分子のクラスに対して見出される（即ち、単離された分子は、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％以上を構成する）。通常、ポリペプチドの組成は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連でのポリペプチドに対して、又は少なくとも提案される使用との関連での実質的に活性なペプチド種に対して９８％、９８％、又は９９％の均一性を示す。
【００６３】
本明細書に関連して、「処置」又は「処置する」は、反対の旨の記載がない限り、疾患又は障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する兆候を予防すること、緩和すること、管理すること、治癒すること、又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認されていない患者の「処置」は、防止又は予防療法であり、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認された患者の「処置」は、一般に、防止又は予防療法とはならない。
【００６４】
本明細書で使用される「ＮＫ細胞」は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６及び／又はＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを用いて、当技術分野で周知の方法でＮＫ細胞を特定することができる。ＮＫ細胞のいかなる亜集団もＮＫ細胞という語に包含される。本明細書に関連して、「活性な」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解するか又は他の細胞の免疫機能を促進する能力を有するＮＫ細胞を含む生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、血液サンプルからの単離、細胞吸着除去療法、組織又は細胞の収集などによって得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイの有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＫＳ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｎｎａ  Ｍ）．Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に記載されている。
【００６５】
「内在化」という語は、「細胞内への内部移行」と互換的に用いられ、分子を細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に移動させるプロセスに関連する分子事象、生化学的事象、及び細胞事象を指す。分子の細胞内への内部移行に関与するプロセスは周知であり、とりわけ、細胞外分子（例えば、ホルモン、抗体、及び有機小分子）；膜結合分子（例えば、細胞表面受容体）；及び細胞外分子に結合した膜結合分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜結合分子に結合した抗体）の内部移行を含み得る。従って、「内部移行の誘導及び／又は増加」は、細胞内への内部移行が開始され、且つ／又は細胞内への内部移行の速度及び／若しくは程度が増加する事象を含む。
【００６６】
本明細書で使用される、Ｎｋｐ４６で「アゴニスト」活性を有する作用物質は、「ＮＫｐ４６シグナル伝達」を引き起こす又は増加させることができる作用物質である。「ＮＫｐ４６シグナル伝達」は、細胞内シグナル伝達経路を活性化させるか又は伝達するＮＫｐ４６ポリペプチドの能力を指す。ＮＫｐ４６シグナル伝達活性の変化は、例えば、シグナル伝達要素のリン酸化の監視などによるＮＫｐ４６シグナル伝達経路の変化を測定するように設計されたアッセイ、特定のシグナル伝達要素と他のタンパク質若しくは細胞内構造の結合を測定するアッセイ、又はキナーゼなどの成分の生化学活性において、又はＮＫｐ４６感受性プロモーター又はエンハンサーの制御下でのレポーター遺伝子の発現を測定するように設計されたアッセイにより、又はＮＫｐ４６ポリペプチドによって媒介される下流の効果（例えば、ＮＫ細胞における特定の細胞溶解装置の活性化）により間接的に測定することができる。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子であり得る（例えば、サイトカインの産生を監視する）、又は細胞に人工的に導入される遺伝子であり得る。他の遺伝子は、このような調節要素の制御下に置くことができ、従って、ＮＫｐ４６シグナル伝達のレベルを報告する役割を果たす。
【００６７】
「ＮＫｐ４６」は、Ｎｃｒ１遺伝子又はこのような遺伝子から調製されるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。あらゆる天然に存在するイソ型、対立遺伝子、又は変異体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドという語（例えば、配列番号１に９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一のＮＫｐ４６ポリペプチド、又はその少なくとも２０、３０、５０、１００、若しくは２００のアミノ酸残基の連続した配列）に包含される。ヒトＮＫｐ４６（イソ型ａ）の３０４のアミノ酸残基の配列は、以下のように示される。
【化１】
2019503713.tif 000003
【００６８】
配列番号１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４８２０に一致し、この開示は、参照により本明細書に組み入れられる。ヒトＮＫｐ４６  ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９に示されており、この開示は、参照により本明細書に組み入れられる。カニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ＮＫｐ４６ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸残基配列は、次の通りである。
【化２】
2019503713.tif 000004
【００６９】
抗ＮＫｐ４６抗体の作製
抗ＮＫｐ４６抗原結合ドメインは、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドの細胞外部分に結合する。一態様では、本開示のＶＨ及びＶＬを含むタンパク質は、ヒト化抗体であるか又はそれを含む。一態様では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４定常ドメインから選択される定常ドメインを含み、任意選択的に１つ以上のアミノ酸改変を含む。一態様では、抗ＮＫｐ４６抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマＩｇ又はラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、単一ドメインＦＶ、及び一本鎖抗体断片から選択される抗体断片を含む。一態様では、抗ＮＫｐ４６抗体は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲから選択される合成又は半合成抗体由来分子；及び多重特異的抗体を含む。この作用物質は、任意選択的に、Ｆｃドメインをさらに含み得る。一態様では、抗体は、少なくとも部分的に精製された形態である。一態様では、抗体は、本質的に単離された形態である。
【００７０】
抗体は、当技術分野で公知の様々な技術によって作製することができる。例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、２０１６年６月２３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１６／０６４５３７号明細書（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）に記載されているように、抗体競合を評価することができる免疫学的スクリーニングアッセイは、本明細書の抗原結合ドメインを評価できるため、ＮＫｐ４６上の同じエピトープに結合する抗体を選択するために使用することができる。
【００７１】
典型的には、本明細書で提供される抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合タンパク質は、ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、本明細書の実施例で作製されるＮＫｐ４６ポリペプチド）に対して約１０４〜約１０１１Ｍ−１（例えば、約１０８〜約１０１０Ｍ−１）の範囲の親和性を有する。例えば、特定の態様では、本開示は、例えば、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析による）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングによって決定される、ＮＫｐ４６に対する１×１０−９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合タンパク質を提供する。より特定の例示的な態様では、本開示は、ヒト又はカニクイザルのＮＫｐ４６タンパク質に対して約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、又は約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫＤを有する抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合タンパク質を提供する。一実施形態では、ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合タンパク質は、１−ｌｏｇ又は２−ｌｏｇのみ異なる、ヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６タンパク質に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００７２】
抗体又はＮＫｐ４６結合タンパク質は、例えば、約１００ナノモル、約６０ナノモル、約１０ナノモル、約５ナノモル、又は１ナノモル以下、好ましくはサブナノモル以下、又は任意選択的に約５００ピコモル、約２００ピコモル、約１００ピコモル、又は約１０ピコモル以下の平均ＫＤ（即ち、これらよりも高い親和性）によって特徴付けることができる。ＫＤは、例えば、例えば、組換え作製されたヒトＮＫｐ４６タンパク質をチップ表面上に固定化し、続いて試験されるべき抗体を溶液に加えることによって決定することができる。
【００７３】
ＮＫｐ４６ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体又は他のＮＫｐ４６結合タンパク質をコードするＤＮＡを単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのための適切な発現ベクターに導入される。次いで、宿主は、抗体又は他のＮＫｐ４６結合タンパク質の組換え作製のために使用される。例えば、ＤＮＡを発現ベクターに導入することができ、通常、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞で所望のタンパク質を合成した。
【００７４】
一実施形態では、本明細書のタンパク質及び抗体は、ＮＫｐ４６のＤ１ドメイン、ＮＫｐ４６のＤ２ドメイン、又は配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１及びＤ２ドメインの両方にまたがる領域に（Ｄ１及びＤ２ドメインの境界、Ｄ１／Ｄ２接合部で）結合する。一実施形態では、このタンパク質又は抗体は、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、又は１０−１０Ｍ未満のＫＤによって特徴付けられるヒトＮＫｐ４６に対する親和性を有する。
【００７５】
別の実施形態では、このタンパク質又は抗体は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４のようなＮＫｐ４６上の実質的に同じエピトープでＮＫｐ４６に結合する。別の実施形態では、抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４によって結合されるセグメントに少なくとも部分的に重複するか、又はこのセグメントの少なくとも１つの残基を含む。一実施形態では、エピトープの全ての重要な残基は、ドメインＤ１又はＤ２に対応するセグメントにある。一実施形態では、抗体は、Ｄ１ドメインに存在する残基及びＤ２ドメインに存在する残基に結合する。一実施形態では、この抗体又はタンパク質は、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのドメインＤ１又はＤ２に対応するセグメントにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ以上の残基を含むエピトープに結合する。一実施形態では、この抗体又はタンパク質は、ドメインＤ１に結合し、且つ残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５の１つ、２つ、３つ、又は４つを含むエピトープに結合する。一実施形態では、この抗体又はタンパク質は、ドメインＤ１／Ｄ２接合部に結合し、且つ残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含むエピトープに結合する。一実施形態では、この抗体はドメインＤ２に結合し、且つ残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６の１つ、２つ、３つ、又は４つを含むエピトープに結合する。
【００７６】
本明細書の実施例のセクションは、一連の変異ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドの構造を説明する。ＮＫｐ４６変異体でトランスフェクトされた細胞への抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質の結合を測定し、これを、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（配列番号１）に結合する抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質の能力と比較した。本明細書で使用される抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合の減少は、結合親和性の低下（例えば、公知の方法、例えば、特定の変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験により、又は変異ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定される）、及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質の全結合能力の低下（例えば、抗ＮＫｐ４６抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって証明される）が存在することを意味する。結合の有意な減少は、変異残基が抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質への結合に直接関与するか、又は抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質がＮＫｐ４６に結合するときに結合タンパク質に近接していることを示す。従って、エピトープは、好ましくはこのような残基を含み、且つこのような残基に隣接したさらなる残基を含み得る。
【００７７】
一部の実施形態では、結合の有意な減少は、抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は結合能力が、この抗体又はタンパク質と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１に示されるポリペプチド）との間の結合に対して４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超減少していることを意味する。特定の実施形態では、結合は、検出可能な限界よりも低下する。一部の実施形態では、結合における有意な減少は、抗ＮＫｐ４６抗体の変異ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合が、抗ＮＫｐ４６抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１に示されているポリペプチド（又はその細胞外ドメイン））との間で観察される結合の５０％未満である（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、又は１０％未満）であるときに証明される。このような結合の測定は、当技術分野で公知の様々な結合アッセイを用いて行うことができる。このような１つのアッセイの特定の例は、実施例のセクションで説明される。
【００７８】
一部の実施形態では、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１）中の残基が置換された変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して有意に低い結合性を示す抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質が提供される。形態は、本明細書で使用される略語表記法では、野生型残基：ポリペプチド中の位置：配列番号１に示されている残基が付番された変異残基である。
【００７９】
一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５（配列番号１を参照されたい）のいずれか１つ以上の変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。
【００８０】
一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４（配列番号１を参照されたい）のいずれか１つ以上の変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。
【００８１】
一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体又はタンパク質は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６（配列番号１を参照されたい）のいずれか１つ以上の変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。
【００８２】
親抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、及びＮＫｐ４６−４の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、本明細書中の表Ｂに記載されている。ヒト及び非ヒト霊長類ＮＫｐ４６の両方に対して高い結合親和性を示したヒト化抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、本明細書中の表Ｃに記載されている。
【００８３】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ−４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９抗体の重鎖可変領域は、それぞれの抗体について、ヒト重鎖ＦＲ１フレームワーク領域；表Ａに記載のアミノ酸配列又はその少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１領域；ヒト重鎖ＦＲ２フレームワーク領域；表Ａに記載のアミノ酸配列又はその少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２領域；ヒト重鎖ＦＲ３フレームワーク領域；及び表Ａに記載のアミノ酸配列又はその少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３領域を含み得る。任意選択的に、この可変領域は、ヒト重鎖ＦＲ４フレームワーク領域をさらに含む。
【００８４】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ−４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９抗体の軽鎖可変領域は、それぞれの抗体について、ヒト軽鎖ＦＲ１フレームワーク領域；表Ａに記載のアミノ酸配列又はその少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１領域；ヒト軽鎖ＦＲ２フレームワーク領域；表Ａに記載のアミノ酸配列又はその少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；ヒト軽鎖ＦＲ３フレームワーク領域；及び表Ａに記載のアミノ酸配列又はその少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ３領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失していてもよく、又は異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＬＣＤＲ３領域を含み得る。任意選択的に、この可変領域は、ヒト軽鎖ＦＲ４フレームワーク領域をさらに含む。
【００８５】
ＶＨ及びＶＬの組み合わせの例としては、
（ａ）配列番号３のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号４のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３３遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｂ）配列番号５のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号６のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｃ）配列番号７のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号８のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ３−１１及び／又はＩＧＫＶ３−１５遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；
（ｄ）配列番号９のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ１−４６及び／又はＩＧＨＶ１−６９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号１０のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−ＮＬ１遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ；又は
（ｅ）配列番号１３のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＨ、並びに配列番号１４のＣＤＲ１、２、及び３と、ヒトＩＧＫＶ１−３９遺伝子セグメントのＦＲ１、２、及び３とを含むＶＬ
が挙げられる。
【００８６】
別の態様では、ＶＨ及びＶＬの組み合わせの例としては、
（ａ）ＮＫｐ４６−１  Ｈ１又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びＮＫｐ４６−１  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｂ）ＮＫｐ４６−２  Ｈ１、Ｈ２、又はＨ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びＮＫｐ４６−２  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｃ）ＮＫｐ４６−３  Ｈ１、Ｈ３、又はＨ４可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びＮＫｐ４６−３  Ｌ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｄ）ＮＫｐ４６−４  Ｈ１可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びＮＫｐ４６−４  Ｌ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｅ）ＮＫｐ４６−９  Ｈ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｆ）ＮＫｐ４６−９  Ｈ３可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及びＮＫｐ４６−９  Ｌ１又はＬ２可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
が挙げられる。
【００８７】
一実施形態では、前述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＫａｂａｔに従っている。一実施形態では、前述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＣｈｏｔｉａ付番に従っている。一実施形態では、前述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＩＭＧＴ付番に従っている。
【００８８】
一実施形態では、特定のＶＨ又はＶＬは、実施例１に示されているＫａｂａｔ位置でヒトフレームワークにアミノ酸置換（例えば、復帰変異）を含み；任意選択的に、対応するＫａｂａｔ位置において実施例１で置換されたアミノ酸残基は、特定の位置に存在するとして特定することができる。
【００８９】
本明細書の実施形態のいずれかの別の態様では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、２、及び３のいずれも、その少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の連続したアミノ酸の配列によって特徴付けることができ、且つ／又は対応する配列番号又は表Ａに記載されている特定のＣＤＲ又はＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するとして特徴付けることができる。
【００９０】
ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、及びＣｈｏｔｈｉａ定義システムによるＣＤＲの配列は以下の表Ａに要約されている。本発明による抗体の可変鎖の配列は以下の表Ｂに記載されている。本明細書の任意の実施形態では、ＶＬ又はＶＨ配列は、シグナルペプチド又はその任意の一部を含むか又は欠くように指定又は付番することができる。
【００９１】
【表１−１】
2019503713.tif 000005
【００９２】
【表１−２】
2019503713.tif 000006
【００９３】
【表２】
2019503713.tif 000007
【００９４】
【表３】
2019503713.tif 000008
【００９５】
多重特異的抗体及びポリペプチド
ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、本明細書で提供される抗ＮＫｐ４６  ＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬ配列に由来し得る（「抗ＮＫｐ４６可変ドメイン」のセクションを参照されたい）。抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６（例えば、細胞表面で発現されるヒトＮＫｐ４６）に結合することができる抗原結合ドメインを形成するように同一又は別々のポリペプチドに配置することができる。ＡＢＤは、例えば、ｓｃＦｖ、直列型ｓｃＦｖ、Ｂｉｔｅ、ＤＡＲＴ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、抗体、二重特異的抗体、又は単量体若しくは多量体Ｆｃタンパク質として作製することができる。
【００９６】
多重特異的タンパク質（例えば、抗体、直列型ｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ、ＤＡＲＴ、Ｆｃタンパク質）の構築のために、目的の抗原（ＮＫｐ４６以外）に結合する抗原結合ドメインを、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、エンジニアリングされたＫｕｎｉｔｚドメインに基づくアフィボディ、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０の細胞外ドメインに基づくモノボディ又はアドネクチン、リポカリン由来のアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎｓ（設計アンキリンリピートドメイン）、多量体化ＬＤＬＲ−Ａモジュール、アビマー、又はシステインに富むノッチンペプチド（ｋｎｏｔｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）から容易に得ることができる。例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられるＧｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５を参照されたい。
【００９７】
目的の抗原（ＮＫｐ４６以外）に結合する可変ドメインは、抗体、例えば、２つのポリペプチド鎖上に見られる関連するＶＬ及びＶＨドメインの形態、又は一本鎖抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、若しくはＶＨＨドメインの形態の抗体から得ることができる。抗原結合ドメイン（例えば、ＡＢＤ１及びＡＢＤ２）も、Ｆａｂとして抗体から容易に得ることができる。
【００９８】
典型的には、抗体は、最初は、抗体（例えば、ヒトポリペプチド）を得るのに望ましいポリペプチド、又は典型的には免疫原性断片であるその断片若しくは誘導体を含む免疫原を用いて、非ヒト動物、例えば、マウスの免疫によって得られる。非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。
【００９９】
多重特異的ポリペプチドで使用するための目的の抗原（ＮＫｐ４６以外）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、所望の細胞標的に基づいて選択することができ、例えば、癌抗原、細菌抗原、又はウイルス抗原などを含み得る。本明細書で使用される「細菌抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷細菌、弱毒細菌、若しくは死菌、あらゆる構造的若しくは機能的細菌タンパク質若しくは炭水化物、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含む。例としては、グラム陽性細菌抗原及びグラム陰性細菌抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクターピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓ）種、特に結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、イントラセルラ菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特に淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ファエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）；嫌気性連鎖球菌（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚｕｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特に炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（���ｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １Ｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パストレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパストレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。
【０１００】
本明細書で使用される「ウイルス抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷全ウイルス、弱毒全ウイルス、若しくは死滅全ウイルス、任意の構造的若しくは機能的ウイルスタンパク質、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含む。ウイルス抗原の供給源としては、限定されるものではないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス；ヒトコクサッキーウイルス；ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ボルナビリダエ科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリダウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）の科からのウイルスが挙げられる。別法では、ウイルス抗原は、組換えにより作製することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される「癌抗原」及び「腫瘍抗原」という語は、同義的に使用され、癌細胞によって差次的に発現されるか、又は腫瘍促進効果（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ）（例えば、免疫抑制効果）を有する非腫瘍細胞（例えば、免疫細胞）によって発現される抗原（ＮＫｐ４６以外）を指し、これにより、癌細胞を標的にするために利用することができる。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原の一部は、正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現されるものではないか、又はより低いレベル若しくは少ない頻度で発現される。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（即ち、発現されない）抗原、分化の特定の段階のみで発現される抗原、及び胚抗原及び胎児抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けることができる。他の癌抗原は、変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスに保持されたウイルス遺伝子によってコードすることができる。さらに他の癌抗原は、腫瘍促進効果を媒介することができる免疫細胞、例えば、単球又はマクロファージ、任意選択的に、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞上で発現させることができる。
【０１０２】
癌抗原は、通常、過剰発現されるか又は異常な回数で発現されるか、又は標的の細胞集団によって発現される正常細胞の表面抗原である。理想的には、標的抗原は、増殖細胞（例えば、腫瘍細胞）又は腫瘍促進細胞（例えば、免疫抑制効果を有する免疫細胞）上でのみ発現されるが、これは、実際には稀にのみ観察される。結果として、標的抗原は、多くの場合、増殖疾患組織と健康組織との間の差次的な発現に基づいて選択される。癌抗原の例としては、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、Ｓｉｇｌｅｃファミリーメンバー、例えば、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）又はＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６、及びＴＭＥＦＦ２が挙げられる。癌抗原の例としては、免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、例えば、サイトカイン受容体、Ｋｉｌｌｅｒ−Ｉｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリータンパク質、例えば、Ｋｉｌｌｅｒ−Ｉｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＩＬ−６受容体も挙げられる。例としては、網羅するものではないが、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ−３）、ネクチン（例えば、ネクチン−４）、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーのタンパク質、レチノイン酸初期ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１（ＲＡＥＴ１）ファミリーのタンパク質、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、δ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１又はＮＴＲＫＲ１（ＥＣ２．７．１０．１）としても知られている）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポイエチン−２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットからなるヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、インテグリン受容体、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩ��ｂβ３−インテグリン、ＰＤＧＦβ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８受容体、ｈＣＧ、ＩＬ−６受容体、ＣＳＦ１Ｒ（腫瘍関連単球及びマクロファージ）、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸線種様ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。一態様では、目的の抗原は、例えば、Ｆｃγ受容体細胞の存在下又は非存在下のいずれかにおいて、従来のヒトＩｇＧ１抗体によって結合されると細胞内に内部移行され得る抗原（例えば、上記の抗原のいずれか１つ）である。一態様では、目的の抗原は、ＣＤ１９ポリペプチドであり；一態様では、多重特異的タンパク質はｓｃＦｖを含み、このｓｃＦｖは、本明細書の実施例の抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９に結合するか、又は本明細書に示される抗ＣＤ１９重鎖及び軽鎖可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ−１、２、及び３を含む。
【０１０３】
一実施形態では、目的の抗原に結合するＡＢＤは、目的の抗原（例えば、マウス抗体、ヒト抗体）に結合する親抗体に由来し（例えば、この親抗体の超可変領域又はそのＣＤＲを含み）、その抗原性標的（細胞上の目的の抗原）に結合すると、この目的の抗原の抑制的調節又は細胞内への内部移行を促進又は誘導する。一実施形態では、目的の抗原は、癌抗原、例えば、内部移行することが分かっている上記の癌抗原（例えば、免疫グロブリン免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）メンバー、例えば、サイトカイン受容体α鎖又はβ鎖、Ｋｉｌｌｅｒ−Ｉｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリータンパク質、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｓｉｇｌｅｃファミリーメンバー、ＥＧＦ受容体及びＥＧＦ様受容体ファミリーメンバー、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、インテグリン、抗ＭｕｌｌｅｒｉａｎホルモンＩＩ型受容体、及びＣＳＦ−１Ｒなど）の１つである。一実施形態では、抗原性標的は、腫瘍促進効果を媒介することができる免疫細胞、例えば、単球又はマクロファージ、任意選択でサプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞上に存在するポリペプチドである。
【０１０４】
一実施形態では、非ＮＫｐ４６  ＡＢＤは、癌抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、又は感染細胞（例えば、ウイルス感染）又は炎症促進性免疫細胞上に存在する抗原に結合する。
【０１０５】
所望の特異性及び／又は活性を有する適切な抗原結合ドメインが特定されると、ＡＢＤのそれぞれをコードするＤＮＡを、適切な宿主へのトランスフェクションのために、任意の要素、例えば、酵素認識タグ、ＣＨ１、Ｃκ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン並びに他の任意選択的な要素をコードするＤＮＡ（例えば、ヒンジ領域をコードするＤＮＡ）と共に、適切な配置で適切な発現ベクターに別個に配置することができる。ＡＢＤは、互いに機能的に連結された所望のドメインを有するＦｃポリペプチドを作製するために、いずれのタイプのポリペプチドが作製されるべきかに応じて、１つの発現ベクター又は別個のベクターに配置することができる。次いで、宿主を多重特異的ポリペプチドの組換え産生に使用することができる。
【０１０６】
例えば、ポリペプチド融合産物をベクターから作製することができ、このベクターでは２つのＡＢＤの第１のＡＢＤが、ＣＨ２ドメインのＮ末端に（例えば、重鎖又は軽鎖ＣＨ１、ＣＫ、又はＣλ定常領域及び／又はヒンジ領域を介して直接）機能的に連結され、ＣＨ２ドメインが、そのＣ末端からＮ末端でＣＨ３ドメインに機能的に連結されている。２つのＡＢＤの第２のＡＢＤは、いずれかの末端でポリペプチドに連結することができるか、又は第１のＡＢＤを含むポリペプチドと二量体、例えば、ヘテロ二量体を形成する第２のポリペプチド鎖上とすることができる。このポリペプチドは、完全長Ｆｃドメインを含み得る。
【０１０７】
次いで、例えば、多重特異的ポリペプチドを適切な宿主細胞で又は任意の適切な合成プロセスによって産生することができる。多重特異的ポリペプチドの発現用に選択された宿主細胞は、限定されるものではないが、免疫グロブリンＣＨ２ドメインのタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変化を含め、最終組成物にとって重要な寄与因子である。宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択してもよい。別法では、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種又は生物、例えば、原核細胞又は生物、例えば、天然又はエンジニアリングされた大腸菌属（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）から選択することができる。
【０１０８】
様々な異なるタンパク質形態を、単量体、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及び四量体の多重特異的タンパク質を含む本開示のＮＫｐ４６結合ＶＨ−ＶＬ対を使用して調製することができる。限定されるものではないが、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、２０１６年６月２３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１６／０６４５３７号明細書（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）に記載されている様々な形態のいずれも含まれる。
【０１０９】
単量体タンパク質
一例では、多重特異的タンパク質は、単一ポリペプチド鎖中において、ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合ドメイン（例えば、（ポリ）ペプチドリンカーによって分離された、本明細書に開示されるＶＨ及びＶＬを含むＡＢＤ）及びＮＫｐ４６以外の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、タンパク質又はポリペプチドは、本開示の抗ＮＫｐ４６  ＶＨ及びＶＬを含むｓｃＦｖ、又はＮＫｐ４６に結合するｓｃＦｖを含む直列型ｓｃＦｖ、及び任意選択的に別のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合された（ポリ）ペプチドリンカーによって連結された、ＮＫｐ４６又はＮＫｐ４６以外の目的の抗原に結合する第２のｓｃＦｖであるか、又はこれらを含む。
【０１１０】
このような一本鎖抗原結合タンパク質の例としては、ＢｉＴＥ及びＤＡＲＴタンパク質形態が挙げられる。ＢＩＴＥ（登録商標）（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ）として知られているｓｃＦｖベースの二重特異的抗体構築物は、可撓性リンカーを介して直列に連結された、それぞれＶＨとＶＬとの対によって提供される、２つの抗原結合ドメインを含む単一ポリペプチドを利用する（例えば、Ｎａｇｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ＆Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５０：８８６−９１；Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：４５３−６４；Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：４９４１−４４を参照されたい）。ＤＡＲＴ（登録商標）（Ｄｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）と呼ばれる別の二重特異的抗体は、ジスルフィド安定化ダイアボディ設計を利用する（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ  １１７：４５４２−５１；Ｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６２：１９３３−４３を参照されたい）。
【０１１１】
一実施形態では、単一ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメイン（例えば、完全長Ｆｃドメイン又はその一部）をさらに含み、任意選択的に、Ｆｃドメインは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に配置される。
【０１１２】
任意の実施形態の一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び／又は第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、任意選択的に、このｓｃＦｖは、ヒトフレームワークアミノ酸配列を含む。一実施形態では、（ａ）ＮＫｐ４６に結合する第１のｓｃＦｖ、（ｂ）ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する第２のｓｃＦｖ、及び任選択的に（ｃ）ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含む単量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドが提供される。任選択的的に、このＦｃドメインは、（ｉ）別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体化せず、且つ（ｉｉ）ヒトＦｃＲｎに結合することができる。任意選択的に、Ｆｃドメインは、第１のｓｃＦｖと第２のｓｃＦｖとの間に配置される。
【０１１３】
２つのＡＢＤ及びＦｃドメインの少なくとも一部を含むポリペプチド融合産物が単量体である場合、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するために配置することができ、且つ／又はアミノ酸改変を含むことができる。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するために二量体の界面に変異を含む。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するための直列型ＣＨ３ドメインである（又はＦｃドメインが直列型ＣＨ３ドメインを含む）。このような単量体は、（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して）部分的なＦｃＲｎ結合性を維持する。任意選択的に、単量体ポリペプチドは、中程度の親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、ＦｃＲｎに対する結合性を維持するが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃＲｎ受容体に対して低い結合性を有する。Ｆｃ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインに、１つ以上のＦｃγ受容体に対する結合性をさらに低下させるか、又は実質的に消失させる１つ以上のアミノ酸改変をさらに含み得る。
【０１１４】
１つの構成では、ヒトＦｃドメインの少なくとも一部を有する単量体Ｆｃ由来ポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有利に含むことができ、前記ＣＨ３ドメインは、別のＦｃ由来ポリペプチドとの二量体化を防止するための改変ＣＨ３二量体界面（例えば、ＣＨ３二量体界面の変異）を含む。例えば、図２Ａ）の形態１及び２を参照されたい。本明細書の任意のポリペプチド又は方法の一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位（又はＹ４０７位）、及び／又はＫ４０９位（Ｋａｂａｔと同様のＥＵ付番）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つでアミノ酸置換を含む。
【０１１５】
単量体多重特異的タンパク質に使用することができるＣＨ３ドメインの別の構成は、直列型ＣＨ３ドメインである（例えば、図２Ａの形態３及び４を参照されたい）。直列型ＣＨ３ドメインは、第１及び第２のＣＨ３ドメインを含み、２つのＣＨ３ドメインは、非共有相互作用を介して互いに結合している。一実施形態では、２つのＣＨ３ドメインは、各ＣＨ３ドメインのＣＨ３二量体化界面を介して互いに結合している。一実施形態では、ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインを含む別のポリペプチド鎖と二量体化しない。直列型ＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用するが、ヒトＦｃγ受容体、特にＣＤ１６に対して低い結合性を有するか又は結合しない。
【０１１６】
多量体タンパク質
ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ（例えば、本明細書に開示されるＶＨ及びＶＬを含むＡＢＤ）を含む多量体二重特異的タンパク質、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及び四量体（後者は、例えば、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体を含む）は、様々な形態に従って作製することができる。
【０１１７】
一実施形態では、多量体タンパク質又はポリペプチドは、２つの異なる親抗体に由来する可変領域（又はその１ＣＤＲ、２ＣＤＲ、若しくは３ＣＤＲ）を含む２つの重鎖、及び２つの異なる親抗体に由来する可変領域（又はその１ＣＤＲ、２ＣＤＲ、若しくは３ＣＤＲ）を含む２つの軽鎖から構成される四量体抗体である。このような四量体は、（ａ）可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＦｃドメインをそれぞれ含む２つの重鎖、並びに（ｂ）軽鎖可変領域及びＣＫドメインをそれぞれ含む２つの抗体軽鎖を含むことができ、一方の重鎖可変領域は、軽鎖可変領域と共にＮＫｐ４６に結合し、他方の重鎖可変領域は、軽鎖可変領域と共に目的の抗原に結合する。
【０１１８】
多量体タンパク質を作製する１つの有利な方法は、それぞれヒトＣＨ１又はＣκ定常ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）に融合された少なくとも１つの重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む異なるポリペプチド鎖の組立によるものであり、タンパク質鎖は、ＣＨ１−Ｃκ二量体化され、且つ非共有結合によって、及び任意選択的なそれぞれのＣＨ１とＣκドメインとの間に形成されるジスルフィド結合によってさらに互いに結合される。一実施形態では、それぞれＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含む少なくとも２つ又は３つのポリペプチド鎖を含む、第１及び第２の抗原に結合する単離又は精製されたヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質が提供され、これにより、これらの鎖は、非共有結合により、及び任意選択的にＣＨ１とＣκドメインとの間のジスルフィド結合により、さらに互いに結合され、任意選択的に、これにより、これらの鎖は、Ｆｃ部分のそれぞれの可変領域とＣＨ３ドメインとの間の非共有結合によってさらに結合される。
【０１１９】
可変領域及び定常領域は、各鎖がその所望の相補的なパートナー鎖（ｐａｒｔｎｅｒ  ｃｈａｉｎ）と優先的に会合するように選択及び構成することができる。従って、得られる多量体タンパク質は、組換え宿主細胞を用いる従来の作製方法を用いて作製するのが容易である。単位におけるＣＨ１及びＣκといずれのＶＨ、ＶＬを会合させるかの選択は、所望の多量体の形成を促進するように対合するべき単位間の親和性に基づく。得られる多量体は、相補的なＶＨドメインとＶＬドメインとの間の非共有結合により、相補的なＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間の非共有結合により、及び任意選択的に相補的なＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間のジスルフィド結合により、及び／又は任意選択的に相補的なヒンジドメイン間のジスルフィド結合により、さらに結合される。ＶＨ−ＶＬ会合は、ＶＨ−ＶＨ又はＶＬ−ＶＬよりも強く、結果として、本明細書に示されるように、ＶＨ又はＶＬをＣＨ１又はＣκのいずれかに隣接して配置することができ、且つ得られるＶ−Ｃ単位は、好ましくはそのＶ−Ｃ対応物とパートナーになる。例えば、ＶＨ−Ｃκは、ＶＨ−ＣＨ１よりもＶＬ−ＣＨ１と優先的に対合する。加えて、Ｆｃドメインを含むことにより、２つのＦｃ含有鎖がＦｃドメインのＣＨ３ドメイン間の非共有結合によって結合されるため、好ましい鎖対合がさらに改善される。異なるＶ−Ｃ組み合わせは、任意選択的に、Ｆｃ対合にさらに組み合わせられ、これによりヘテロ多量体タンパク質を作製するためのツールを提供する。
【０１２０】
一実施形態では、ヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、単量体Ｆｃドメインを含み（例えば、第２のポリペプチドはＦｃドメインを含まない）、任意選択的に、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメイン又は直列型ＣＨ３ドメインを含む。
【０１２１】
別の実施形態では、上記ヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、ヒトＣＤ１６に結合することができる二量体Ｆｃドメイン、例えば、アミノ酸残基Ｎ２９７でＮ結合型グリコシル化を含むヒトＦｃドメイン（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）を含む。
【０１２２】
ヘテロ二量体は、例えば、以下の構成を有することができる（図２Ａ及び図２Ｃに形態２、１１、及び１２として示されているようなタンパク質の例も参照されたい）。
【化３】
2019503713.tif 000009
ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
【０１２３】
ヘテロ二量体は、別の例では、以下の構成を有することができる（図２Ｂに形態１０として示されているこのようなタンパク質の例も参照されたい）。
【化４】
2019503713.tif 000010
ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
【０１２４】
得られるヘテロ二量体は、別の例では、以下の構成を有することができる（図２Ｄ及び図２Ｅに形態１３及び１４として示されているようなタンパク質の例も参照されたい）。
【化５】
2019503713.tif 000011
ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ−２及びＶｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
【０１２５】
ヘテロ三量体タンパク質は、例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部（即ち、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位間に配置されている）を含む中心（第１）のポリペプチド鎖を使用することによって形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質に使用される中心のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）以下のドメイン配置を有することができる：
Ｖａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ。
【０１２６】
次いで、第２のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）ドメイン配置：
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ、又は
Ｖｂ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｃが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、Ｖａ−１とＶｂ−１とが抗原結合ドメインを形成する。
【０１２７】
次いで、第３のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）ドメイン配置：
Ｖｂ−２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｄが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、Ｖａ−２とＶｂ−２とが抗原結合ドメインを形成する。
【０１２８】
二量体Ｆｃドメイン（図２Ｄ及び図２Ｅにも形態５、６、７、及び１６として示されている）を有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例は、ドメイン配置：
【化６】
2019503713.tif 000012
を有する。
【０１２９】
単量体Ｆｃドメイン（図２Ｂ及び図２Ｃにも形態８、９、及び１７として示されている）を有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例は、ドメイン配置：
【化７】
2019503713.tif 000013
を有する。
【０１３０】
従って、三量体ポリペプチドの構成では、第１のポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の可変ドメイン（即ち、第２鎖及び第３鎖の可変ドメイン）を有する抗原結合ドメインをそれぞれ形成する２つの可変ドメインを有することができ、第２のポリペプチド鎖は、１つの可変ドメインを有し、第３のポリペプチドは、１つの可変ドメインを有する。
【０１３１】
三量体ポリペプチドは、
（ａ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含む、第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメイン、及び任意選択的にＦｃドメインを含む、第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に（例えば、そのＣ末端で）融合された可変ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及び定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第３のポリペプチドが、非共有結合により、及び任意選択的に、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によりさらに結合されたＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、第３のポリペプチド鎖
を含み、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドと第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、且つ第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。目的の２つの抗原の１つは、ＮＫｐ４６であり、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤは、本開示のＶＨ−ＶＬ可変ドメイン対を含む。
【０１３２】
形成される三量体二重特異的ポリペプチドのドメイン配置の例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる。
【０１３３】
【表４】
2019503713.tif 000014
【０１３４】
任意のドメイン配置では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２−ＣＨ３単位（完全長ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はその断片）を含み得る。Ｆｃドメイン（二量体Ｆｃドメイン）を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能である（例えば、野生型ＣＨ３ドメイン）。Ｆｃドメイン（単量体Ｆｃドメイン）を有する１つの鎖のみを含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能であり、例えば、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３二量体界面にアミノ酸改変を有するか、又はＦｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能な直列型ＣＨ３ドメインを含む。
【０１３５】
一部の例示的な構成では、多重特異的タンパク質は、四量体、例えば、２つの軽鎖及び２つの異なる重鎖を有するヘテロ二量体型四量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｔｅｔｒａｍｅｒ）であり得、重鎖は、ヘテロ二量体化のためにエンジニアリングされる。このようなタンパク質は、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、２０１６年６月２３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１６／０６４５３７号明細書（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）に記載されているように調製することができる。
【０１３６】
本開示の任意のタンパク質では、ヒンジ領域は、典型的には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のポリペプチド鎖に存在し、且つ／又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在し得る。ヒンジ領域は、任意選択的に、例えば、適切なリンカーペプチドによって置き換えることができる。
【０１３７】
本開示で記載されるタンパク質ドメインは、任意選択的に、Ｎ末端からＣ末端であると指定することができる。例示のための開示のタンパク質の配置は、Ｎ末端（左側）からＣ末端へと示されている。ドメインは、互いに融合されていると言える（例えば、ドメインは、その左側のドメインのＣ末端に融合されていると言え、且つ／又はドメインは、その右側のドメインのＮ末端に融合されていると言える）。
【０１３８】
本開示に記載されるタンパク質ドメインは、直接又は介在アミノ酸配列を介して互いに融合することができる。例えば、ＣＨ１又はＣＫドメインは、リンカーペプチド、任意選択的にヒンジ領域又はその断片を介してＦｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に融合される。別の例では、ＶＨ又はＶＫドメインは、リンカーペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合される。直列型に互いに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、（例えば、ｓｃＦｖのように）リンカーペプチドを介して融合される。Ｆｃドメインに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、リンカーペプチドを介して融合される。２つのポリペプチド鎖は、非共有結合により、及び任意選択的に相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン内のシステイン残基間に形成される鎖間ジスルフィド結合によりさらに互いに結合される（「｜」によって示される）。
【０１３９】
リンカー及びＦｃドメインは、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、２０１６年６月２３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１６／０６４５３７号明細書（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）により詳細に記載されている。
【０１４０】
多重特異的タンパク質が作製されると、このタンパク質を生物学的活性について評価することができる。
【０１４１】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、精製ＮＫ細胞）及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）の活性化を誘導することができる。
【０１４２】
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、精製ＮＫ細胞）及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）にＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導することができる。
【０１４３】
任意選択的に、ＮＫ細胞の活性化又はシグナル伝達は、活性化の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ１０７、ＣＤ６９などの発現の増加によって特徴付けられる。
【０１４４】
活性は、例えば、多重特異的ポリペプチドの存在下において、標的細胞とＮＫｐ４６発現細胞とを互いに接触させることによって測定することができる。一例では、標的細胞とＮＫ細胞との凝集が測定される。別の例では、多重特異的タンパク質は、例えば、ＮＫ細胞の活性に関連した当技術分野で公知の任意の特性又は活性、例えば、細胞毒性のマーカー（ＣＤ１０７）又はサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮ−γ若しくはＴＮＦ−α）の測定可能な増加をもたらす能力、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、リダイレクト殺傷アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）において標的細胞を溶解する能力などについて評価することができる。活性アッセイは、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、２０１６年６月２３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１６／０６４５３７号明細書（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）により詳細にさらに記載されている。
【０１４５】
化合物の使用
ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインを含む本開示による化合物は、例えば、ＮＫｐ４６ポリペプチド及び／又はＮＫｐ４６ポリペプチドを発現する細胞（例えば、ＮＫ細胞）への結合、これらの検出、除去、精製、又はこれらの活性の調節を含め、様々な用途に使用することができる。
【０１４６】
一態様では、必要とする哺乳動物の処置又は診断用の医薬製剤の製造における本明細書で定義される任意の化合物の使用が提供される。また、薬剤として、又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質として上記定義された任意の化合物の使用も提供される。さらなる態様では、経口投与、局所投与、又は注射用の固体又は液体製剤を提供するために、上記定義された化合物を含む医薬組成物を調製する方法が提供される。このような方法又はプロセスは、少なくとも化合物を薬学的に許容され得る担体と混合するステップを含む。
【０１４７】
一態様では、特定の効果を与えることによって所定の状態を処置する、予防する、若しくはより一般的には所定の状態に影響を及ぼす、又は本明細書に記載の多重特異的タンパク質若しくはこの多重特異的タンパク質を含む（医薬）組成物を用いて特定の状態を検出する方法が提供される。
【０１４８】
例えば、一態様では、本発明は、必要とする患者（例えば、癌又はウイルス若しくは細菌感染を有する患者）においてＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞の活性を回復させるか又は高める方法を提供し、この方法は、前記患者に本明細書に記載の多重特異的タンパク質を投与するステップを含む。一実施形態では、この方法は、リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）の活性の増加が有益であるか、又は不十分なＮＫ細胞の活性によって引き起こされる若しくは特徴付けられる疾患、例えば、癌又はウイルス若しくは微生物／細菌感染を有する患者にＮＫｐ４６＋リンパ球の活性の増加に関する。
【０１４９】
本明細書に記載のポリペプチドを使用して、抗体で処置することができる障害、例えば、癌、固形及び非固形腫瘍、血液悪性腫瘍、感染、例えば、ウイルス感染、及び免疫又は自己免疫疾患を予防又は処置することができる。
【０１５０】
一実施形態では、目的の抗原（非ＮＫｐ４６抗原）は、以下からなる群から選択される癌のタイプの悪性細胞の表面で発現される抗原である：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ  １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）。
【０１５１】
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドを使用して、以下からなる群から選択される癌を予防又は処置することができる：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。本発明によって処置することができる他の例示的な障害としては、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ  １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。
【０１５２】
一例では、腫瘍抗原は、リンパ腫細胞又は白血病細胞の表面で発現される抗原であり、多重特異的タンパク質は、リンパ腫又は白血病を有する個人に投与され、且つ／又はこの個人の処置に使用される。任意選択的に、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、又はＣＤ３３から選択される。
【０１５３】
一態様では、処置の方法は、例えば、本明細書に開示される疾患、例えば、上記の群から選択される癌の処置のために、治療有効量の本明細書に記載の多重特異的タンパク質を個人に投与するステップを含む。治療有効量は、疾患又は障害を有する患者に治療効果を有する（又は疾患若しくは障害を有する患者及び患者と実質的に同様の特徴を有する患者の少なくとも相当な割合でこのような効果を促進する、高める、及び／又は誘導する）任意の量であり得る。
【０１５４】
一実施形態では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、単剤療法（他の治療薬を用いない）として、又は抗体が投与される特定の治療目的に通常利用される作用物質を含む１つ以上の他の治療薬との併用治療に使用することができる。追加の治療薬が、処置される特定の疾患又は状態の単剤療法でその治療薬に典型的に使用される量及び治療計画で通常投与される。このような治療薬は、癌の処置に使用される場合、限定されるものではないが、抗癌剤及び化学療法薬を含み；感染病の処置では、限定されるものではないが、抗ウイルス薬及び抗生物質を含む。
【０１５５】
本明細書に開示されるタンパク質及び／又はポリペプチドをキットに含めることができる。このキットは、任意選択的に、任意の数のポリペプチド及び／又は他の化合物、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は他の数のタンパク質及び／又はポリペプチド及び／又は他の化合物をさらに含み得る。キットの内容についてのこの記載は、決して限定ではないことを理解されたい。例えば、キットは、他のタイプの治療化合物を含み得る。任意選択的に、キットは、タンパク質及び／又はポリペプチドの使用についての取扱説明書、例えば、本明細書に記載の方法の詳細も含む。
【０１５６】
また、上記定義された化合物を含む医薬組成物も提供される。化合物は、医薬組成物として医薬担体と共に精製された形態で投与することができる。形態は、意図する投与方式及び治療又は診断用途によって決まる。医薬担体は、化合物を患者に送達するのに適した任意の適合性の非毒性物質とすることができる。薬学的に許容され得る担体は、当技術分野で公知であり、例えば、水溶液、例えば、（滅菌）水若しくは生理緩衝食塩水、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、又は注射可能な有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を含む。薬学的に許容され得る担体は、例えば化合物の吸収を安定させるか又は高めるように作用する、生理的に許容され得る化合物をさらに含み得る。このような生理的に許容され得る化合物は、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン、抗酸化物、例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含む。当業者であれば、生理的に許容され得る化合物を含む薬学的に許容され得る担体の選択が、例えば、組成物の投与経路によって決まることを理解されよう。薬学的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、及び分散剤なども医薬組成物に含まれ得る。
【０１５７】
化合物は、非経口投与することができる。非経口投与用の化合物の調製は、滅菌でなければならない。滅菌は、任意選択的に凍結乾燥及び再生の前又は後での、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。化合物の投与の非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、若しくは病巣内経路による注射又は注入に従う。化合物は、注入又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物及びその必要な投与計画に合わせて、任意選択的に２０％アルブミン溶液が添加された１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース及び１ｍｇ〜１０ｇの化合物を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で公知である。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：
抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の作製
パートＡ：抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質で免疫した。マウスは、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により２回目の免疫を行い、最後に、１０μｇのＮＫｐ４６タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞に融合し、これを放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
【０１５９】
一次スクリーニング：増殖しているクローンの上清（Ｓ／Ｎ）を、細胞表面でヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いるフローサイトメトリーによって一次スクリーニングで試験した。簡単に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングでは、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。
【０１６０】
ＮＫｐ４６に結合する抗体のセレクションを選択し、完全長ヒトＩｇＧ抗体及び二重特異的抗体として作製した。実施例２〜１３の二重特異的分子に関してその活性について評価された可変領域の中には、本明細書の表Ｂに示されているそれぞれの可変領域を有する抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、及び−９があった。
【０１６１】
パートＢ：ヒト化抗ヒト／抗カニクイザルＮＫｐ４６抗体の作製
本明細書の表Ｂに示されているそれぞれの可変領域を有する抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、及び４を、以下に示されているアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）移植によってヒト化抗体として作製した。抗体は、ＣＨＯ細胞を用いて産生し、ヒトＮＫｐ４６への結合について試験した。
【０１６２】
ＣＤＲ移植抗体のそれぞれは、良好な親和性でヒトＮＫｐ４６に結合した。しかしながら、ＣＤＲ移植抗体のいずれも、カニクイザルＮＫｐ４６には結合しなかった。ヒトＮＫｐ４６上のエピトープを決定し（実施例１３を参照されたい）；抗体可変領域の高次構造又はＣＤＲの配置に影響を及ぼす改変が、認識されるべきカニクイザルＮＫｐ４６で共有されるエピトープを可能にし得るという可能性を考慮して、ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、及び−９のＣＤＲ移植抗体のそれぞれについて複数の変異体を用意し、ＣＨＯ細胞を用いて産生し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、及び−９のそれぞれについて、ヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６結合によって共有されるエピトープの良好な親和性での認識を可能にする１つ以上の変異体を同定した。３Ｄモデリング研究に基づいて、ＮＫｐ４６−１  ＣＤＲ及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトＩｇＧ１抗体として作製し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。
【０１６３】
抗体ＮＫｐ４６−１
３Ｄモデリング研究に基づいて、ＮＫｐ４６−１  ＣＤＲ及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトＩｇＧ１抗体として作製し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。重鎖と軽鎖の２つの組み合わせは、ヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６の両方に結合することができる。重鎖可変領域「Ｈ１」及び重鎖「Ｈ３」は、いずれの場合も軽鎖「Ｌ１」と組み合わせた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、ＮＫｐ４６−１重鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ヒトＩＧＨＶ１−６９＊０６遺伝子フレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子フレームワーク４領域を含んでいた。軽鎖可変領域：ＮＫｐ４６−１軽鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ヒトＩＧＫＶ１−３３＊０１遺伝子フレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子フレームワーク４領域。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って選択した。Ｈ１鎖、Ｈ３鎖、及びＬ１鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた（以下に太字及び下線付きで示されている）。Ｌ１は、Ｋａｂａｔ軽鎖残基８７にフェニルアラニンを有していた。Ｈ１は、Ｋａｂａｔ重鎖残基２７にチロシンを、且つＫａｂａｔ残基６６及び６７にそれぞれリジン及びアラニンを有していた。加えて、Ｈ３は、Ｋａｂａｔ残基３７にグリシンを、Ｋａｂａｔ残基４８にイソロイシンを、且つＫａｂａｔ残基９１にフェニルアラニンを有していた。
ＮＫｐ４６−１：“Ｈ１”重鎖可変領域
【化８】
2019503713.tif 000015
ＮＫｐ４６−１：“Ｈ３”重鎖可変領域
【化９】
2019503713.tif 000016
ＮＫｐ４６−１：“Ｌ１”軽鎖可変領域
【化１０】
2019503713.tif 000017
【０１６４】
抗体ＮＫｐ４６−２
３Ｄモデリング研究に基づいて、ＮＫｐ４６−２  ＣＤＲ及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトＩｇＧ１抗体として作製し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。重鎖と軽鎖の３つの組み合わせは、ヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６の両方に結合することができる。重鎖可変領域「Ｈ１」、「Ｈ２」、及び重鎖「Ｈ３」は、いずれの場合も軽鎖「Ｌ１」と組み合わせた。興味深いことに、さらに、Ｈ１Ｌ１は、配列番号５及び６のＶＨ及びＶＬを有する親抗体ＮＫｐ４６−２と比較して改善された結合親和性を有していた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、ＮＫｐ４６−２重鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ヒトＩＧＨＶ４−３０−４＊０１遺伝子フレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＨＪ１＊０１遺伝子フレームワーク４領域を含んでいた。軽鎖可変領域：ＮＫｐ４６−２軽鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１遺伝子フレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子フレームワーク４領域。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って選択した。Ｌ１鎖、Ｈ１鎖、Ｈ２鎖、及びＨ３鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた（以下に太字及び下線付きで示されている）。Ｌ１は、Ｋａｂａｔ軽鎖残基４８にバリンを有していた。Ｈ１は、Ｋａｂａｔ重鎖残基２７にチロシンを、且つＫａｂａｔ残基７１にアルギニンを有していた。加えて、Ｈ２は、Ｋａｂａｔ残基４８にメチオニンを、且つＫａｂａｔ残基６７にイソロイシンを有していた。加えて、Ｈ３は、Ｋａｂａｔ残基３１にトレオニンを有していた。
ＮＫｐ４６−２：“Ｈ１”重鎖可変領域
【化１１】
2019503713.tif 000018
ＮＫｐ４６−２：“Ｈ２”重鎖可変領域
【化１２】
2019503713.tif 000019
ＮＫｐ４６−２：“Ｈ３”重鎖可変領域
【化１３】
2019503713.tif 000020
ＮＫｐ４６−２：“Ｌ１”軽鎖可変領域
【化１４】
2019503713.tif 000021
【０１６５】
抗体ＮＫｐ４６−３
３Ｄモデリング研究に基づいて、ＮＫｐ４６−３  ＣＤＲ及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトＩｇＧ１抗体として作製し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。重鎖及び軽鎖の３つの組み合わせは、ヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６の両方に結合することができる。重鎖可変領域「Ｈ１」、「Ｈ３」、及び重鎖「Ｈ４」は、いずれの場合も軽鎖「Ｌ１」と組み合わせた。興味深いことに、さらに、Ｈ３Ｌ１は、配列番号７及び８のＶＨ及びＶＬを有する親抗体ＮＫｐ４６−３と比較して改善された結合親和性を有していた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、ＮＫｐ４６−３重鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ヒトＩＧＨＶ１−６９＊０２遺伝子フレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子フレームワーク４領域を含んでいた。軽鎖可変領域：ＮＫｐ４６−３軽鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ＩＧＫＶ３−１５由来のＦＲ１及びＦＲ２並びにＩＧＫＶ３−１１由来のＦＲ３を用いるモザイクアプローチによって形成されたフレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＫＪ２＊０１遺伝子フレームワーク４領域。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って選択した。Ｌ１鎖、Ｈ１鎖、Ｈ３鎖、及びＨ４鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた（以下に太字及び下線付きで示されている）。Ｌ１は、Ｋａｂａｔ軽鎖残基４９にリジンを有していた。Ｈ１は、Ｋａｂａｔ重鎖残基２７にチロシンを有していた。加えて、Ｈ３は、Ｋａｂａｔ残基４８にイソロイシンを、且つＫａｂａｔ残基６７にアラニンを有していた。加えて、Ｈ４は、Ｋａｂａｔ残基６９にロイシンを有していた。
ＮＫｐ４６−３：“Ｈ１”重鎖可変領域
【化１５】
2019503713.tif 000022
ＮＫｐ４６−３：“Ｈ３”重鎖可変領域
【化１６】
2019503713.tif 000023
ＮＫｐ４６−３：“Ｈ４”重鎖可変領域
【化１７】
2019503713.tif 000024
ＮＫｐ４６−３：“Ｌ１”軽鎖可変領域
【化１８】
2019503713.tif 000025
【０１６６】
抗体ＮＫｐ４６−４
３Ｄモデリング研究に基づいて、ＮＫｐ４６−４  ＣＤＲ及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトＩｇＧ１抗体として作製し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。軽鎖「Ｌ２」と組み合わせられた重鎖可変領域「Ｈ１」は、ヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６の両方、並びに親抗体に結合することができた。２つの他の抗原結合領域（１つが「Ｌ２」及び「Ｈ２」から構成され、もう１つが「Ｌ２」及び「Ｈ３」から構成されている）は、カニクイザルＮＫｐ４６に中等度で結合することができたが、その親和性は、ヒトＮＫ−４６の親和性の１０分の１であった。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、ＮＫｐ４６−４重鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ＩＧＨＶ１６４６由来のＦＲ１、ＩＧＨＶ１−６９由来の０ＦＲ３、及び共通ＦＲ２（ＩＧＨＶ１−４６とＩＧＨＶ１−６９が同じＦＲ２を共有する）を用いるモザイクアプローチを用いて設計されたヒトフレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子フレームワーク４領域を含んでいた。軽鎖可変領域：ＮＫｐ４６−４軽鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１由来のフレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子フレームワーク４領域。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って選択した。Ｌ２鎖、Ｈ１鎖、Ｈ２鎖、及びＨ３鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた（以下に太字及び下線付きで示されている）。Ｌ２は、Ｋａｂａｔ軽鎖残基３６にフェニルアラニンを、且つＫａｂａｔ残基４８にバリンを有していた。Ｈ１は、Ｋａｂａｔ重鎖残基３０にトレオニンを、Ｋａｂａｔ残基４８にイソロイシンを、且つＫａｂａｔ残基９３にバリンを有していた。Ｈ２は、Ｋａｂａｔ残基６７にトレオニンを有していた。加えて、Ｈ３は、Ｋａｂａｔ残基６９にロイシンを有していた。
ＮＫｐ４６−４：“Ｈ１”重鎖可変領域
【化１９】
2019503713.tif 000026
ＮＫｐ４６−４：“Ｈ２”重鎖可変領域
【化２０】
2019503713.tif 000027
ＮＫｐ４６−４：“Ｈ３”重鎖可変領域
【化２１】
2019503713.tif 000028
ＮＫｐ４６−４：“Ｌ２”軽鎖可変領域
【化２２】
2019503713.tif 000029
【０１６７】
抗体ＮＫｐ４６−９
３Ｄモデリング研究に基づいて、ＮＫｐ４６−９  ＣＤＲ及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトＩｇＧ１抗体として作製し、カニクイザルＮＫｐ４６への結合について試験した。軽鎖可変領域「Ｌ１」又は「Ｌ２」のいずれかと組み合わせられたときの重鎖可変領域「Ｈ２」、及び軽鎖可変領域「Ｌ１」又は「Ｌ２」のいずれかと組み合わせられたときの重鎖可変領域「Ｈ３」は、親抗体（配列番号１３及び１４のＶＨ及びＶＬを有する）よりも高い親和性でヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６の両方に結合することができた。「Ｈ１」鎖は、試験されたいずれの軽鎖を有するカニクイザルＮＫｐ４６とも結合できなかったが、ヒトＮＫｐ４６には十分に結合できた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、ＮＫｐ４６−９重鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ＩＧＨＶ４−３０−４＊０１由来のヒトフレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子フレームワーク４領域を含んでいた。軽鎖可変領域：ＮＫｐ４６−９軽鎖ＣＤＲ（以下に下線付きで示されている）、ＩＧＫＶ１−３９＊０１由来のフレームワーク１、２、及び３領域、並びにヒトＩＧＫＪ２＊０１遺伝子フレームワーク４領域。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番に従って選択した。Ｌ１鎖、Ｌ２鎖、Ｈ１鎖、Ｈ２鎖、及びＨ３鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた（以下に太字及び下線付きで示されている）。Ｌ１は、Ｋａｂａｔ残基３６にシステインを有していた。Ｌ２は、Ｋａｂａｔ軽鎖残基４８にバリンを有していた。Ｈ１は、Ｋａｂａｔ重鎖残基７１にアルギニンを有していた。加えて、Ｈ２は、Ｋａｂａｔ残基２７にチロシンを有していた。Ｈ３は、Ｋａｂａｔ残基４８にメチオニンを、且つＫａｂａｔ残基６７にイソロイシンを有していた。
ＮＫｐ４６−９：“Ｈ１”重鎖可変領域
【化２３】
2019503713.tif 000030
ＮＫｐ４６−９：“Ｈ２”重鎖可変領域
【化２４】
2019503713.tif 000031
ＮＫｐ４６−９：“Ｈ３”重鎖可変領域
【化２５】
2019503713.tif 000032
ＮＫｐ４６−９：“Ｌ１”軽鎖可変領域
【化２６】
2019503713.tif 000033
ＮＫｐ４６−９：“Ｌ２”軽鎖可変領域
【化２７】
2019503713.tif 000034
【０１６８】
実施例２：
エフェクター細胞受容体を標的とする、ＦｃＲｎには結合するがＦｃγＲには結合しない二重特異的抗体形態の同定
この実験の目的は、Ｆｃドメインを、抗ＮＫｐ４６結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することにあった。二重特異的タンパク質は、その抗ＮＫｐ４６結合ドメインを介してＮＫｐ４６に一価で結合する。単量体Ｆｃドメインは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する少なくとも部分的な結合性を維持するが、ヒトＣＤ１６及び／又は他のヒトＦｃγ受容体には実質的に結合しない。結果として、二重特異的タンパク質は、Ｆｃγ媒介（例えば、ＣＤ１６媒介）標的細胞溶解を誘導しない。
【０１６９】
実施例２−１  抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ抗ＣＤ３の作製及び結合分析
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗ＮＫｐ４６二重特異的抗体が作製されていないため、ＮＫｐ４６を介したＮＫ細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の機能を調べるために、ＮＫｐ４６の代わりにＣＤ３をモデル抗原として使用した。
【０１７０】
腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）をベースとした二重特異的Ｆｃを使用して、新規な単量体二重特異的ポリペプチド形態のＦｃＲｎ結合及びＣＤ１９結合機能を評価した。最終ポリペプチドのドメイン配置は、「Ｆ１」形態とも呼ばれる（ＣＨ２ドメインの星は、本明細書で試験されたポリペプチドには含まれていない任意選択的なＮ２９７Ｓ変異を示す）。
【０１７１】
二重特異的単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）をベースに構築した。ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含んでいた。このポリペプチドは、次のように配置されたドメインを有する：抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＤ３。アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。
【０１７２】
ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含んでいた。ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２であった。単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分及び抗ＣＤ１９のＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下に示されている。
【０１７３】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖに対応する軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列は次の通りであった。
【０１７４】
【表５】
2019503713.tif 000035
【０１７５】
単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分及び最終二重特異的ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏポリペプチド（その構築物では最後のＫが除去された）のＤＮＡ配列が配列番号１１７に示されている。アミノ酸配列が配列番号２に示されている。抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３完全配列（成熟タンパク質）が配列番号１１８に示されている。
【０１７６】
組換えタンパク質のクローニング及び産生
コード配列を直接合成及び／又はＰＣＲによって構築した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，＃Ｒ０４５Ａ）を用いて行い、ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６０９．２５０）を用いて１％アガロースゲルから精製した。精製した後、ＰＣＲ産物を定量してから、製造者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，＃ＳＴ０３４５）に記載されているようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結反応を行った。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６２５．４）を用いてＥＶＯ２００（Ｔｅｃａｎ）で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、ＣＨＯ細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
【０１７７】
ＣＨＯ細胞を、フェノールレッド及び６ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘが添加されたＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖した。トランスフェクションの前日に、細胞をカウントし、１７５，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションのために、細胞（２００，０００細胞／トランスフェクション）を、ＡＭＡＸＡ  ＳＦ細胞株キット（ＡＭＡＸＡ，＃Ｖ４ＸＣ−２０３２）に記載されているように調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄ装置でＤＳ１３７プロトコルを用いてヌクレオフェクトした。全てのトランスフェクションは、３００ｎｇの検証済みプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を２４ウェルプレートの予熱された培養培地に播種する。２４時間後、ハイグロマイシンＢを培養培地に添加した（２００μｇ／ｍｌ）。タンパク質の発現を１週間後に培地で監視する。次いで、タンパク質を発現している細胞をサブクローニングして最高の産生株を得る。９６平底ウェルプレートを用いて、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された２００μｌの培養培地に１細胞／ウェルで細胞を播種して、サブクローニングを行った。クローンの生産性を試験する前に、細胞を３週間放置した。
【０１７８】
ＩｇＧ１−Ｆｃ断片を含む組換えタンパク質を、プロテインＡビーズ（−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｒｅｆ．：１７−１２７９−０３）を用いて精製する。簡単に述べると、細胞培養上清を濃縮し、遠心分離によって清澄化し、プロテインＡカラムに注入し、組換えＦｃ含有タンパク質を捕捉した。タンパク質を酸性ｐＨ（クエン酸０．１Ｍ  ｐＨ３）で溶出し、ＴＲＩＳ−ＨＣＬ  ｐＨ８．５を用いて即座に中和し、１×ＰＢＳで透析した。「ｓｉｘ  ｈｉｓ」タグを含む組換えｓｃＦｖを、コバルト樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。他の組換えｓｃＦｖをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【０１７９】
実施例２−２：抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＣＤ３〜Ｂ２２１、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＵＴ７８、及びＣＨＯ細胞株の結合分析
細胞を回収して、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３産生細胞の細胞上清で４℃において１時間染色した。染色緩衝液（ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ  ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ）で２回洗浄した後、細胞をヤギ抗ヒト（Ｆｃ）−ＰＥ抗体（ＩＭ０５５０  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ−１／２００）で４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０１８０】
ＣＤ３及びＣＤ１９の発現もフローサイトメトリーによって制御した。細胞を回収して、５μｌの抗ＣＤ３−ＡＰＣ及び５μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体を用いて、ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ  ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ緩衝液で４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０１８１】
抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３細胞株（ＨＵＴ７８及びＪＵＲＫＡＴ細胞株）及びＣＤ１９細胞株（Ｂ２２１細胞株）に結合するが、陰性対照として使用されるＣＨＯ細胞株には結合しない。
【０１８２】
実施例２−３：
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３によるＴ細胞及びＢ細胞の凝集
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３をＴ／Ｂ細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、ＣＤ１９及びＣＤ３発現細胞の凝集において機能するか否かを評価した。
【０１８３】
結果が図１に示されている。上のパネルは、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下で凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が同時にインキュベートされるときに細胞を凝集させることを示し、二重特異的抗体が機能的であることを例示する。下のパネルは、抗体を含まない対照を示す。
【０１８４】
実施例２−４：
二重特異的単量体ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性試験
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸  ｐＨ５．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％界面活性剤ｐ２０）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えマウスＦｃＲｎをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１８５】
ＦｃＲｎの固定化
組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。ＦｃＲｎタンパク質を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０１８６】
親和性試験
一価親和性試験をＳｉｎｇｌｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ（ＳＣＫ）プロトコルに従って行った。５段階希釈の４１．５〜６６０ｎＭの可溶性分析物（抗体及び二重特異的分子）を（再生なしで）ＦｃＲｎに添加し、再生の１０分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、１：１ＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
【０１８７】
結果
そのＣＨ２−ＣＨ３ドメインが２つの抗原結合ドメイン（ここでは２つのｓｃＦｖ）間に配置された抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３を評価して、このような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、ＦｃＲｎに対する結合性を維持することができ、それにより、従来の二重特異的抗体と比較して改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するか否かを決定した。結果は、ＦｃＲＮ結合性が維持されたことを示し、このモデルは、正常なＩｇＧに対して、２：１の比率（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）ではなく１：１の比率（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）を示唆している。
【０１８８】
親和性を、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗体に対してＳＰＲを用いて評価した。単量体Ｆｃは、ＦｃＲｎに対して著しい単量体結合性を維持した（単量体Ｆｃ：ＫＤ＝１９４ｎＭの親和性；二価結合性を有する完全長抗体：ＫＤ＝１５．４ｎＭの親和性）。
【０１８９】
実施例３：
抗ＣＤ１９ｘ抗ＮＫｐ４６二重特異的単量体Ｆｃドメインポリペプチドの作製
ＮＫ細上の活性化受容体が標的細胞の溶解に寄与し得るかは不明であり、さらに抗ＮＫｐ４６抗体がＮＫｐ４６をブロックし得るため、細胞毒性がＮＫｐ４６によって媒介することができたか否かはさらに不明であった。そのため、本発明者らは、二重特異的タンパク質形態が、ＮＫｐ４６のトリガーを引き起こすことができたか否か、及びそれが標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６アゴニズムを誘導し、それにより、標的から離れた不適切なＮＫ活性化及び／又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらすことができたか否かを調べた。
【０１９０】
新規な二重特異的タンパク質形態を、ＦｃＲｎには結合するがＦＣγＲには結合しない一本鎖タンパク質として開発した。加えて、２つ又は３つのポリペプチド鎖を含み、Ｆｃドメインが単量体を維持している多量体タンパク質を開発し、この多量体タンパク質は、ｓｃＦｖ形態に変換されたときにそれらの標的に対する結合性を維持しない抗体可変領域での使用に適合している。ｓｃＦｖ形態は、抗体のスクリーニングに便利に使用することができ、少なくとも１つの結合領域をＦ（ａｂ）構造として含めることにより、任意の抗標的（例えば、抗腫瘍）抗体可変領域を、抗体がｓｃＦｖとして結合性を維持するか否かにかかわらず、二重特異的タンパク質内のＦ（ａｂ）形態として二重特異的構築物で直接発現させて試験することができ、それにより、利用可能な抗体を単純にスクリーニングしてその数を増加させることができる。Ｆｃドメインが単量体を維持するこれらの形態は、最大の配座柔軟性を維持するという利点を有し、且つ以下に示すようにＮＫｐ４６又は標的抗原に対する最適な結合性を可能にし得る。
【０１９１】
異なる構築物を、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖからの可変ドメイン、及び実施例１に示されたＮＫｐ４６受容体に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて、二重特異的抗体の調製に使用するために作製した。また、ＮＫｐ４６受容体に特異的な市販の抗体Ｂａｂ２８１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が市販するｍＩｇＧ１（Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０  ａｎｄ  Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６も参照されたい））からの可変領域を抗ＮＫｐ４６として用いて作製した。
【０１９２】
Ｆｃドメインが、一本鎖ポリペプチド又は１つの鎖のみがＦｃドメインを有する多量体において単量体を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を２つの異なる戦略：（１）特定の変異を包含するＣＨ３ドメイン（ＥＵ付番）、即ち、Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙの使用；又は（２）直列型ＣＨ３ドメインが、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する、互いに結合した可撓性リンカーによって分離されている直列型ＣＨ３ドメインの使用によって防止した。上記特定された点変異を含む単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同じであった。直列型ＣＨ３ドメインを有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は図２Ａ〜２Ｄに示されている。
【０１９３】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列も実施例２−１と同じであった。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。様々な抗ＮＫｐ４６  ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列が以下に示されている。
【０１９４】
【表６】
2019503713.tif 000036
【０１９５】
【表７】
2019503713.tif 000037
【０１９６】
形態１（Ｆ１）（抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＮＫｐ４６（ｓｃＦｖ））
形態１（Ｆ１）のドメイン構造が図２Ａに示されている。二重特異的Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）に特異的なｓｃＦｖ及びＮＫｐ４６受容体に特異的なｓｃＦｖをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
（Ｖκ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−Ｖκ）抗ＮＫｐ４６
【０１９７】
アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。図２に示されている最終ポリペプチドのドメイン配置（ＣＨ２ドメインの星は、任意選択的なＮ２９７Ｓ変異を示す）では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖが抗ＮＫｐ４６  ｓｃＦｖによって置換されている。（Ｖκ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメインとＶκドメインとの間にリンカーを含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的ポリペプチドのアミノ酸配列（完全な配列（成熟タンパク質））が、以下の表２Ｂに列記された対応する配列番号に示されている。
【０１９８】
【表８】
2019503713.tif 000038
【０１９９】
形態２（Ｆ２）：ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３
Ｆ２ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であり、それは、同様にＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ）を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（Ｖκ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ。
【０２００】
（Ｖκ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶκ単位（即ち、ｓｃＦｖ）から構成されていた。本発明の二重特異的ポリペプチドの他の形態と同様に、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ２タンパク質の第１鎖及び第２鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４０及び１４１に示されている。
【０２０１】
形態３（Ｆ３）：ＣＤ１９−Ｆ３−ＮＫｐ４６−３
Ｆ３ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖上の２つのＣＨ３ドメインが互いに結合し、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止される直列型ＣＨ３ドメインを含んでいた。
【０２０２】
一本鎖ポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する。
（Ｖκ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−Ｖκ）抗ＮＫｐ４６
【０２０３】
（ＶκＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶκ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質で単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４２に示されている。
【０２０４】
形態４（Ｆ４）：ＣＤ１９−Ｆ４−ＮＫｐ４６−３
Ｆ４ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ３のように直列型ＣＨ３ドメインを含み、さらにＮ結合型グリコシル化を防止し、且つＦｃγＲ結合を消失させるＮ２９７Ｓ変異を含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロファイルを示した。ＮＫｐ４６−３可変ドメインを有するＦ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４３に示されている。
【０２０５】
形態８（Ｆ８）
Ｆ８ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｂに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ２と同様であり、且つ同様にＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ、並びにＮ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性をさらに消失させるＮ２９７Ｓ変異）を含む。Ｆ８タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残ったもの（野生型、Ｆ８Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第２のもの（Ｆ８Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換しているリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３のもの（Ｆ８Ｃ）。変異体Ｆ８Ｂ及びＦ８Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止するため作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される；
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−Ｃκ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＣＤ１９−Ｃκ。
【０２０６】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ８Ｃ）の高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、同様に単純なＳＥＣプロフィールを示した。ＮＫｐ４６−３可変領域を有するＦ８タンパク質（Ｃ変異体）の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４４、１４５、及び１４６に示されている。
【０２０７】
形態９（Ｆ９）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ９ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びそれぞれＣＨ１−Ｃκの二量体化によって中心鎖に結合された２つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。三量体Ｆ９タンパク質のドメイン構造が図２Ｂに示されており、ＣＨ１とＣκドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインは、抗体がｓｃＦｖ形態で機能を維持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするＦ（ａｂ）構造を有する。ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメインを含み、且つＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含む。Ｆ９タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残った第１のもの（野生型、Ｆ９Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第２のもの（Ｆ９Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換しているリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３のもの（Ｆ９Ｃ）。変異型Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−Ｃκ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＣＤ１９−Ｃκ。
【０２０８】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、８．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ａ）及び３．０ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ｂ）の高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、同様に単純なＳＥＣプロフィールを示した。
【０２０９】
Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ａの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４７、１４８、及び１４９に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｂの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５０、１５１、及び１５２に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｃの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５３、１５４、及び１５５に示されている。
【０２１０】
形態１０（Ｆ１０）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１０ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びＣＨ１−Ｃκの二量体化によって中心鎖に結合された第２のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。二量体Ｆ１０タンパク質のドメイン構造が図２Ｂに示され、ＣＨ１とＣκドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４に示されているように直列型ＣＨ３ドメインを含み、且つＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含む。Ｆ１０タンパク質の３つの変異体も作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残った第１のもの（野生型、Ｆ１０Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第２のもの（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換しているリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３のもの（Ｆ１０Ｃ）。変異型Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止するため作製に利点を提供した。（Ｖκ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶκ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。ヘテロ二量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−Ｖκ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＣＤ１９−Ｃκ。
【０２１１】
これらのタンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌ（Ｆ１０Ａ）の良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、同様に単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ１０Ａタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５６（第２鎖）及び１５７（第１鎖）に示されている。Ｆ１０Ｂタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５８（第２鎖）及び１５９（第１鎖）に示されている。Ｆ１０Ｃタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６０（第２鎖）及び１６１（第１鎖）に示されている。
【０２１２】
形態１１（Ｆ１１）：ＣＤ１９−Ｆ１１−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１１ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｃに示されている。このヘテロ二量体タンパク質は、抗原結合ドメインの構造が逆である点を除いてＦ１０と同様である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ様構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。このヘテロ二量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（Ｖκ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−Ｃκ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１。
【０２１３】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、同様に単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６２（第１鎖）及び配列番号１６３（第２鎖）に示されている。
【０２１４】
形態１２（Ｆ１２）：ＣＤ１９−Ｆ１２−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１２ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｃに示されており、ＣＨ１とＣκドメインとの間の結合は、ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１１に類似しているが、Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣκドメインが逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（Ｖκ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＮＫｐ４６−Ｃκ。
【０２１５】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．８ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、同様に単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ１２タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６４（第１鎖）及び配列番号１６５（第２鎖）に示されている。
【０２１６】
形態１７（Ｆ１７）：ＣＤ１９−Ｆ１７−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１７ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｃに示されており、ＣＨとＣκドメインとの間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ９と同様であるが、ＶＨ及びＶκドメイン、並びにＣ末端Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣκドメインは、それぞれ、それらのパートナーと逆である。このヘテロ三量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−Ｖκ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＮＫｐ４６−Ｃκ、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＣＤ１９−Ｃκ。
【０２１７】
加えて、Ｆ１７タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残った第１のもの（野生型、Ｆ１７Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第２のもの（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換しているリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３のもの（Ｆ１７Ｃ）。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ１７Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６６、１６７、及び１６８に示されている。
【０２１８】
実施例４：
二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的ＮＫｐ４６抗体形態
二量体Ｆｃドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発し、このタンパク質構築物は、実施例３の単量体Ｆｃドメインタンパク質の多数の利点を共有するが、高い親和性でＦｃＲｎに結合する。ＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）に対して低い結合性を有する若しくは結合性が消失しているか、又はＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）に対する結合性を有する様々なタンパク質形態を作製し、例えば、ヒトＣＤ１６に対する結合親和性は、ＳＰＲによって評価される野生型ヒトＩｇＧ１抗体の結合親和性の１−ｌｏｇの範囲内であった（例えば、実施例１６の方法を参照されたい）。この様々なポリペプチド形態を、（ＶＨ−（ＣＨ１／Ｃκ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位又は（Ｖκ−（ＣＨ１又はＣκ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験し、比較した。ＣＨ３ドメインの一方又は両方は、任意選択的に介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン（分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン）、直列型可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。２つの鎖が、ＣＨ１−Ｃκ二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成するか、又は第３鎖と結合する場合には三量体を形成する。
【０２１９】
様々な構築物を、二重特異的抗体の調製に使用するために、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖに由来する可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列、並びに実施例１で明らかにされたＮＫｐ４６に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて作製した。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ドメイン構造は、図２Ａ〜図６Ｄに示されている。
【０２２０】
形態５（Ｆ５）：ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣκドメインとＣＨ２ドメインとの間に図形で示されている）及びＣＨ１とＣκドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−Ｃκ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１。
【０２２１】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３７ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、同様に単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６９（第２鎖）、１７０（第１鎖）、及び１７１（第３鎖）に示されている。
【０２２２】
形態６（Ｆ６）：ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されている。Ｆ６タンパク質は、Ｆ５と同じであるが、Ｎ連結グリコシル化を防止するためのＮ２９７Ｓ置換を含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１２ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７２（第２鎖）、１７３（第１鎖）、及び１７４（第３鎖）に示されている。
【０２２３】
形態７（Ｆ７）：ＣＤ１９−Ｆ７−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ７ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されている。Ｆ７タンパク質は、中心鎖とＶκ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのＣ末端でＦｃドメインに連結されたＣＨ１及びＣκドメインにシステインのセリンでの置換を有する点を除いてＦ６と同じである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１１ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７５（第２鎖）、１７６（第１鎖）、及び１７７（第３鎖）に示されている。
【０２２４】
形態１３（Ｆ１３）：ＣＤ１９−Ｆ１３−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１３ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣκドメインとＣＨ２ドメインとの間に示されている）及びＣＨ１ドメインとＣκドメインとの間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−Ｖκ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖκ抗ＣＤ１９−Ｃκ−ＣＨ２−ＣＨ３。
【０２２５】
（ＶＨ−Ｖκ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶκ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。
【０２２６】
タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、６．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。２つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７８（第２鎖）及び１７９（第１鎖）に示されている。
【０２２７】
形態１４（Ｆ１４）：ＣＤ１９−Ｆ１４−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１４ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１４ポリペプチドは、Ｆ１３形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）の代わりに、Ｆ１４二重特異的形態は、Ｎ連結グリコシル化をなくすためにＣＨ２ドメイン変異Ｎ２９７Ｓを有する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。２つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８０（第２鎖）及び１８１（第１鎖）に示されている。
【０２２８】
形態１５（Ｆ１５）：ＣＤ１９−Ｆ１５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１５ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＮ末端ＶＨ−ＣＨ１とＶκ−Ｃκ単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、０．９ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質で単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８２（第２鎖）、１８３（第１鎖）、及び１８４（第３鎖）に示されている。
【０２２９】
形態１６（Ｆ１６）：ＣＤ１９−Ｆ１６−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１６ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＣ末端ＶＨ−ＣＫとＶκ−ＣＨ１単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８５（第２鎖）、１８６（第１鎖）、及び１８７（第３鎖）に示されている。
【０２３０】
形態Ｔ５（Ｔ５）
三量体Ｔ５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｆに示されている。Ｔ５ポリペプチドは、Ｆ５形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第３鎖（Ｆｃドメインを欠いている鎖）のＣ末端におけるｓｃＦｖ単位の融合により異なる。従って、このタンパク質は、目的の抗原に対する２つの抗原結合ドメイン及びＮＫｐ４６に対する１つの抗原結合ドメインを有し、且つそのＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｔ５タンパク質は、異なる抗体に由来するヒトＣＤ２０に結合する（且つＣＤ２０上の異なるエピトープに結合する）２つの抗原結合ドメインを有していた。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、Ｇａｚｙｖａｒｏ（登録商標）、オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＶＨ及びＶＬを含んでいた。第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＶＨ及びＶＬを含んでいた。第３の抗原結合ドメインは、ヒトＮＫｐ４６に結合する。Ｔ５タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列が以下に示されている（リツキシマブ配列は太字で下線付きであり、抗ＧＡ１０１配列は下線付きであり、抗ＮＫｐ４６配列はイタリック体である）。
【０２３１】
ＧＡ１０１−Ｔ５−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド１（配列番号１８８）
【化２８】
2019503713.tif 000039
ポリペプチド２（配列番号１８９）
【化２９】
2019503713.tif 000040
ポリペプチド３：（配列番号１９０）
【化３０】
2019503713.tif 000041
【０２３２】
形態Ｔ６（Ｔ６）
三量体Ｔ６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｆに示されている。Ｔ６ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第３鎖（Ｆｃドメインを欠いている鎖）のＣ末端におけるｓｃＦｖ単位の融合により異なる。この三量体タンパク質は、目的の抗原に対する２つの抗原結合ドメイン及びＮＫｐ４６に対する１つの抗原結合ドメインを含み、Ｎ２９７置換によりそのＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｔ６タンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体ＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含み、且つ第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、リツキシマブのＶＨ及びＶＬを含む。Ｔ６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列が配列番号１９１、１９２、及び１９３に示されている。
【０２３３】
形態Ｔ９Ｂ（Ｔ９Ｂ）
三量体Ｔ９Ｂポリペプチドのドメイン構造が図２Ｆに示されている。Ｔ９Ｂポリペプチドは、Ｆ９形態（Ｆ９Ｂ変異体）の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離ＣＨ１ドメイン（第３鎖上）のＣ末端におけるｓｃＦｖ単位の融合により異なる。このタンパク質は、目的の抗原に対する２つの抗原結合ドメイン及びＮＫｐ４６に対する１つの抗原結合ドメインを含むが、単量体Ｆｃドメイン及び／又はＮ２９７置換によりそのＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。上記のような三量体タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｔ９Ｂタンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有していた。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体ＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含み、且つ第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体リツキシマブのＶＨ及びＶＬを含んでいた。Ｔ９Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列が以下に示されている。
【０２３４】
ＧＡ１０１−Ｔ９Ｂ−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド２：（配列番号１９５）
【化３１】
2019503713.tif 000042
ポリペプチド１：（配列番号１９４）
【化３２】
2019503713.tif 000043
ポリペプチド３（配列番号１９６）：
【化３３】
2019503713.tif 000044
【０２３５】
形態Ｔ１１（Ｔ１）：ＣＤ１９−Ｔ１１−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｔ１１ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｆに示されている。Ｔ１１ポリペプチドは、Ｆ１１形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離ＣＨ１ドメインのＣ末端におけるｓｃＦｖ単位の融合により異なる。この二量体タンパク質は、目的の抗原に対する２つの抗原結合ドメイン及びＮＫｐ４６に対する１つの抗原結合ドメインを含むが、単量体Ｆｃドメイン及び／又はＮ２９７置換によりそのＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｔ１１タンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。第１の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、親抗体ＧＡ１０１のＶＨ及びＶＬを含み、且つ第２の抗ＣＤ２０  ＡＢＤは、リツキシマブのＶＨ及びＶＬを含んでいた。Ｔ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列が以下に示されている。
【０２３６】
ＧＡ１０１−Ｔ１１−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド１（配列番号１９７）：
【化３４】
2019503713.tif 000045
ポリペプチド２（配列番号１９８）：
【化３５】
2019503713.tif 000046
【０２３７】
実施例５：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、二重特異的タンパク質によるＮＫｐ４６結合親和性
Ｂａｃｏｒｅ  Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ  １０ｍＭは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＡを（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａで精製した。
【０２３８】
プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡを結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２３９】
結合試験
まず、二重特異的タンパク質を、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の抗体からの異なる抗ＮＫｐ４６可変領域を有する実施例２に記載の形態Ｆ１で試験した。次に、抗体を、ＮＫｐ４６−３抗体からの抗ＮＫｐ４６可変領域を有する異なる形態Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４として試験し、完全長ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３抗体と比較した。
【０２４０】
二重特異的タンパク質を１μｇ／ｍＬでプロテインＡチップ上において捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、５μｇ／ｍＬにおいて、捕捉した二重特異的抗体に注入した。ブランク差し引きのために、サイクルを再び行って、ＮＫｐ４６タンパク質を泳動用緩衝液に替えた。
【０２４１】
Ｂａｂ２８１抗体を、ＳＰＲによってＮＫｐ４６に対する結合性について別個に試験し、さらに細胞表面にヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いてフローサイトメトリーによって試験した。ＦＡＣＳスクリーニングのために、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。ＳＰＣ及びＦＡＣＳの結果は、Ｂａｂ２８１ベースの抗体が、ＮＫｐ４６細胞株にもＮＫｐ４６  Ｆｃタンパク質にも結合しないことを示した。Ｂａｂ２８１は、二重特異的形態で存在する場合、その標的に対する結合性を失った。
【０２４２】
親和性試験
一価親和性試験を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｗｉｚａｒｄ）が推奨する正規のＣａｐｔｕｒｅ−Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って行った。６２．５〜４００ｎＭの範囲のヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。
【０２４３】
結果
ＳＰＲは、ＮＫｐ４６−１、２、３、及び４  ｓｃＦｖ結合ドメインを有する形態Ｆ１の二重特異的ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合したが、他の抗ＮＫｐ４６抗体のｓｃＦｖを有する他の二重特異的ポリペプチドは、ＮＫｐ４６結合性を維持しなかったことを示した。単量体二重特異的形態で結合性を維持しなかった結合ドメインは、当初はＮＫｐ４６に結合したが、二重特異的形態への変換時に結合性を失った。形態Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４の二重特異的ポリペプチドの全ては、ＮＫｐ４６−３可変領域を用いる場合にＮＫｐ４６に対する結合性を維持した。一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が以下の表３に示されている。
【０２４４】
【表９】
2019503713.tif 000047
【０２４５】
実施例６：
Ｄａｕｄｉ腫瘍標的に対するＮＫ細胞とＦｃ含有ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質との結合
単量体Ｆｃドメイン及び実施例３に記載の一本鎖Ｆ１又は二量体Ｆ２形態に従って配置されたドメイン、及びＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体を、ＮＫ細胞にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｂリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるＤａｕｄｉ）を溶解させる機能的能力について試験した。Ｆ２タンパク質は、ｓｃＦｖ形態ではＮＫｐ４６に対する結合性を失うが、Ｆ２のＦ（ａｂ）様形態では結合性を維持するＮＫｐ４６−９の可変領域をさらに含んでいた。
【０２４６】
簡単に述べると、（ａ）静止ヒトＮＫ細胞、及び（ｂ）ヒトＮＫｐ４６でトランスフェクトされたヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１のそれぞれの細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中の典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで異なる濃度の単量体二重特異的抗体の存在下において、ＫＨＹＧ−１では５０、静止ＮＫ細胞では（Ｆ１タンパク質に対して）１０又は（Ｆ２タンパク質に対して）８．８に等しいエフェクター／標的比において、ｈＮＫ４６でトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１と混合した。短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、上清のサンプルを取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ  ベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
【０２４７】
結果
ＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ実験モデルでは、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）及びＣＤ１９／ＣＤ３二重特異的抗体）と比較して、ヒトＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。
【０２４８】
静止ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したときに、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が同様に、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体）と比較して、ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。リツキシマブ（ＲＴＸ、キメラＩｇＧ１）を静止ヒトＮＫ細胞によるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の陽性対照として使用した。ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌで）で得られた最大応答は、２１．６％の特異的溶解であり、二重特異的抗体が高い標的細胞溶解活性を有することを例証した。静止ＮＫ細胞での実験の結果は、一本鎖Ｆ１タンパク質については図３Ａに示され、二量体Ｆｃタンパク質については図３Ｂに示されている。
【０２４９】
実施例７：
完全長抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂと枯渇抗腫瘍ｍＡｂとの比較：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質が非特異的ＮＫ活性化を防止する
これらの試験は、二重特異的抗体が、非特異的ＮＫ細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。
【０２５０】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較（ＡＤＣＣ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
【０２５１】
実験は、対照として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ、高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０  ＡＤＣＣ誘導抗体対照；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ、標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１；並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。
【０２５２】
様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８  Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＮＫ細胞の活性化に対する機能的な影響について試験した。
【０２５３】
簡単に述べると、ＮＫ活性化を、フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ１０７の発現を評価することによって試験した。アッセイは、完全ＲＰＭＩ、１５０μＬ最終／ウェルにおいて９６Ｕウェルプレートで行った。エフェクター細胞は、ドナーから精製した新鮮なＮＫ細胞とした。標的細胞は、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９−陽性）、ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−陰性）、又はＫ５６２（ＮＫ活性化対照細胞株）とした。Ｋ５６２陽性対照に加えて、以下の３つの条件を試験した。
＞ＮＫ細胞のみ
＞ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（Ｃ１９＋）
＞ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、２．５：１（５０，０００Ｅ：２０，０００Ｔ）とし、抗体の希釈範囲は、１／４希釈で１０μｇ／ｍＬから始めた（ｎ＝８の濃度）。抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞を混合し、３００ｇで１分間回転させ、３７℃で４時間インキュベートし、５００ｇで３分間回転させ、染色緩衝液（ＳＢ）で２回洗浄し、５０μＬの染色Ａｂミックスを加え、３００ｇで３０分間インキュベートし、ＣｅｌｌＦｉｘを含むＳＢ再懸濁ペレットで２回洗浄し、４℃で一晩保存し、Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＨＴＳ）で蛍光を明らかにした。
【０２５４】
結果
１．ＮＫ細胞のみ
結果は図４Ａに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下において、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）はいずれも、ＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現による評価によるとＮＫ細胞を活性化しなかった。完全長抗ＣＤ１９もＮＫ細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでＮＫ細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
【０２５５】
２．ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）
結果は図４Ｂに示されている。標的抗原発現細胞の存在下において、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の結合ドメインのそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。完全長抗ＣＤ１９は、最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化のみを示した。完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図４は、完全長抗ＮＫｐ４６抗体が、ＮＫ細胞のみの存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示すことを示す。アレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのＮＫ細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度（ＥＴ  ２．５：１）では、活性化は、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
【０２５６】
３．ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
結果は図４Ｃに示されている。標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下において、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
【０２５７】
結論として、二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質は、完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体、及び標的細胞の非存在下で同様にＮＫ細胞を活性化する枯渇ＩｇＧアイソタイプの完全長抗体とは異なり、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができる。抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質で達成されるＮＫ細胞の活性化は、完全長抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１抗体で観察される活性化よりも高かった。
【０２５８】
実施例８：
低いＥＴ比での枯渇抗腫瘍ｍＡｂ：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質の比較効果
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター：標的比において、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるＥＴ比は、実施例７で使用された２．５：１のＥＴ比又は実施例６の１０：１のＥＴ比よりもｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇するであろう設定に近いと考えられる１：１とした。
【０２５９】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
【０２６０】
実験は、対象として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ（高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０  ＡＤＣＣ誘導抗体対照）；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ（標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１）、並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８  Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現により評価される、ＮＫ細胞活性化に対する機能的な影響について試験した。これらの実験は、ＥＴ比を１：１としたことを除いて実施例７と同様に行った。
【０２６１】
結果
結果は図５に示されている（図５Ａ：ＣＤ１０７及び図５Ｂ：ＣＤ６９）。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化した。
【０２６２】
Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、この設定で低い活性を有するＡＤＣＣ誘導抗体のような完全長ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体よりも遥かに強力であった。さらに、この低いＥ：Ｔ比の設定では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと同程度に強力であり、差異は、差異が２．５：１のＥＴ比で観察された濃度よりも１０倍高い最高濃度でのみ観察された。
【０２６３】
標的細胞の非存在下又は標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下では、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示した。抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体は、ＨＵＴ７８細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化しなかった。
【０２６４】
結論として、二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質は、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができ、より低いエフェクター：標的比は、ＮＫ細胞の活性化の媒介において従来のヒトＩｇＧ１抗体よりも有効である。
【０２６５】
実施例９：
ＮＫｐ４６の動作機序
ＮＫｐ４６−３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ２、Ｆ３、Ｆ５、又はＦ６形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９二重特異的抗体を、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞株にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、リツキシマブ（抗ＣＤ２０  ＡＤＣＣ誘導抗体）、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。
【０２６６】
簡単に述べると、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中の典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで１／５希釈（ｎ＝８の濃度）で１０−７ｍｏｌ／ｍＬから始まる希釈範囲の試験抗体の存在下において、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した。
【０２６７】
短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
【０２６８】
結果
結果は、図６Ａ（ＫＨＹＧ−１対Ｄａｕｄｉ）及び図６Ｂ（ＫＨＹＧ−１対Ｂ２２１）に示されている。ＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ実験モデルでは、各ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１  ｈＮＫｐ４６  ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体は誘導しなかった。
【０２６９】
実施例１０：
新鮮なヒトＮＫ細胞を用いる二重特異的抗体と従来のＩｇＧ抗体との比較効果
ＮＫｐ４６−３由来の抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有するＦ５形態に従った配置を有するヒトＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を、精製されたＮＫ細胞にＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、Ｆ６形態（ＣＤ１６結合を欠いている）と同じ二重特異的抗体及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ１９抗体、並びにヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。
【０２７０】
簡単に述べると、ＥＦＳ  Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔからの新鮮なヒト精製ＮＫ細胞の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中の典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＨＵＴ７８細胞（ＣＤ１９を発現しない陰性対照細胞）を５１Ｃｒで標識し、次いで１／１０希釈（ｎ＝８の濃度）で１０μｇ／ｍｌから始まる希釈範囲の試験抗体の存在下において、１０：１に等しいエフェクター／標的比でＮＫ細胞と混合した。
【０２７１】
短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μｌの上清を取り出し、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
【０２７２】
結果が図７に示されている。Ｎ２９７置換によりＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６（Ｆ６形態の二重特異的タンパク質）は、Ｄａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同程度に強力であり、これは、対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体がＣＤ１９に二価で結合すること、及び抗ＣＤ１９がＣＤ１６によって結合されることを考慮すると注目に値する。驚くべきことに、ＦｃドメインがＣＤ１６にさらに結合するＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６（Ｆ５形態のタンパク質）は、Ｄａｕｄｉ標的細胞の溶解の媒介において完全長ｌｇＧ１抗ＣＤ１９抗体又はＦ６形態の二重特異的タンパク質よりも遥かに強力である。同等のレベルの標的細胞の溶解では、ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６は、完全長抗ＣＤ１９  ＩｇＧ１よりも少なくとも１０００倍強力であった。
【０２７３】
実施例１１：
様々な二重特異的形態のＦｃＲｎに対する結合性
様々な抗体形態のヒトＦｃＲＮに対する親和性を、実施例２〜６に記載されているように、組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することにより、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。
【０２７４】
ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗ＣＤ１９抗体、及びＮＫｐ４６−３（Ｆ２ではＮＫｐ４６−２）からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、又はＦ１４形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質をそれぞれの分析物について試験し、全てのセンサーグラムを、定常状態又は１：１のＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
【０２７５】
結果は以下の表４に示されている。二量体Ｆｃドメイン（形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１３、Ｆ１４）を有する二重特異的タンパク質は、完全長ＩｇＧ１抗体の親和性と同様の親和性でＦｃＲｎに結合した。単量体Ｆｃドメイン（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１）を有する二重特異的タンパク質もＦｃＲｎに対する結合性を示したが、二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的タンパク質よりも低い結合性であった。
【０２７６】
【表１０】
2019503713.tif 000048
【０２７７】
実施例１２：
ＦｃγＲへの結合
このような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質がＦｃγ受容体への結合性を維持できるか否かを評価するために、様々な多量体Ｆｃタンパク質を評価した。
【０２７８】
ＳＰＲ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＮａＣｌがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えヒトＦｃＲ（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ、及びＣＤ１６ｂ）をクローニングし、産生し、且つ精製した。
【０２７９】
Ｆ５及びＦ６二重特異的抗体ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３又はＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３をセンサーチップＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。二重特異的抗体を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定レベル（即ち、８００〜９００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の非活性化を、１００ｍＭ  エタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２８０】
一価親和性試験を典型的な動力学的ウィザード（メーカーの推奨）に従って評価した。ＣＤ６４について０．７〜６０ｎＭ、他の全てのＦｃＲについて６０〜５０００ｎＭの可溶性分析物（ＦｃＲ）の連続希釈液を固定化二重特異的抗体上に注入し、再生前に１０分間解離させた。全てのセンサーグラムセットを、ＣＤ６４には１：１動力学的結合モデルを用い、他の全てのＦｃＲには定常状態アフィニティーモデルを用いてフィッティングした。
【０２８１】
完全長野生型ヒトＩｇＧ１は、全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合したが、ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３二重特異的抗体はいずれの受容体にも結合しなかった。他方、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３は、ヒト受容体ＣＤ６４（ＫＤ＝０．７ｎＭ）、ＣＤ３２ａ（ＫＤ＝８４６ｎＭ）、ＣＤ３２ｂ（ＫＤ＝１８５０ｎＭ）、ＣＤ１６ａ（ＫＤ＝１０９８ｎＭ）、及びＣＤ１６ｂ（ＫＤ＝２４２６ｎＭ）のそれぞれに結合した。従来のヒト抗ＩｇＧ１抗体は、Ｆｃ受容体に対して同等の結合（以下の表に示されているＫＤ）を有する。
【０２８２】
【表１１】
2019503713.tif 000049
【０２８３】
実施例１３：
抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープマッピング
Ａ．競合アッセイ
競合アッセイを以下に記載の方法に従って表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行った。
【０２８４】
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ  １０ｍＭ  ＮａＣｌ  ５００ｍＭがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。抗６ｘＨｉｓ標識抗体をＱＩＡＧＥＮから購入した。ヒト６ｘＨｉｓ標識ＮＫｐ４６組換えタンパク質（ＮＫｐ４６−Ｈｉｓ）をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａで精製した。
【０２８５】
抗Ｈｉｓ抗体をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡ及び抗Ｈｉｓ抗体を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２０００〜２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２８６】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４に一致するＮＫｐ４６結合領域を有する正常なヒトＩｇＧ１キメラ親抗体を、抗６ｘＨｉｓ標識抗体チップを用いて行われた競合試験に使用した。
【０２８７】
１μｇ／ｍＬの、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体をプロテインＡチップで捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質をＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の群の第２の試験二重特異的抗体と共に５μｇ／ｍＬで注入した。
【０２８８】
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４のいずれも、ＮＫｐ４６に対する結合について互いに競合せず、これらの抗体はそれぞれ異なるエピトープを表している。
【０２８９】
Ｂ．ＮＫｐ４６変異体に対する結合性
抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＮＫｐ４６の２つのドメイン上の分子表面に露出された１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換によって定義されるＮＫｐ４６変異体を設計した。このアプローチにより、以下の表に示されている、Ｈｅｋ−２９３Ｔ細胞でトランスフェクトされた４２の変異体が作製された。以下の表５の標的アミノ酸変異は共に、配列番号１の付番を用いて示されている（Ｊａｒｏｎ−Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８（１２）：６１６５−７４で使用された付番にも一致している）。
【０２９０】
【表１２】
2019503713.tif 000050
【０２９１】
変異体の生成
ＮＫｐ４６変異体をＰＣＲによって生成した。増幅された配列をアガロースゲルにかけて、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（参照番号７４０６０９）を用いて精製した。次いで、それぞれの変異体について生成された２つ又は３つの精製ＰＣＲ産物をＣｌｏｎＴｅｃｈ  ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムで発現ベクターに連結した。変異配列を含むベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐで調製し、配列決定した。配列決定後、変異配列を含むベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＭｉｎｉｐｒｅｐで調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてベクターでトランスフェクトし、導入遺伝子発現の試験前にＣＯ２インキュベーターで３７℃において２４時間インキュベートした。
【０２９２】
抗ＮＫｐ４６のＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞に対する結合性のフローサイトメトリー分析
全ての抗ＮＫｐ４６抗体をそれらのそれぞれの変異体に対する結合性についてフローサイトメトリーによって試験した。１つ又はいくつかの変異体に対する結合性をある濃度（１０μｇ／ｍｌ）で失う抗体を決定するために最初の実験を行った。結合性の消失を確認するために、抗体の滴定を、結合性がＮＫｐ４６変異体（１〜０，１〜０．０１〜０．００１μｇ／ｍｌ）によって影響を受けると思われる抗体に対して行った。
【０２９３】
結果
抗体ＮＫｐ４６−１は、野生型ＮＫ４６と比較して、残基Ｋ４１、Ｅ４２、及びＥ１１９（ＮＫｐ４６野生型で付番）に変異を有する変異体２に対して低い結合性を有していた。同様に、ＮＫｐ４６−１はまた、残基Ｙ１２１及びＹ１９４に変異を有する追加変異Ｓｕｐｐ７に対して低い結合性を有していた。
【０２９４】
抗体ＮＫｐ４６−３は、残基Ｉ１３５及びＳ１３６に変異を有する変異体１９に対して低い結合性を有していた。同様に、ＮＫｐ４６−１はまた、残基Ｐ１３２及びＥ１３３に変異を有する追加変異Ｓｕｐｐ８に対して低い結合性を有していた。
【０２９５】
抗体ＮＫｐ４６−４は、残基Ｒ１０１及びＶ１０２に変異を有する変異体６に対して低い結合性を有していた。同様に、ＮＫｐ４６−１はまた、残基Ｅ１０４及びＬ１０５に変異を有する追加変異Ｓｕｐｐ６に対して低い結合性を有していた。
【０２９６】
この試験では、本発明者らは、抗ＮＫｐ４６抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−３、及びＮＫｐ４６−４）のエピトープを特定した。ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−３、及びＮＫｐ４６−１のエピトープは、それぞれＮＫｐ４６のＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、及びＤ１／Ｄ２接合部にある。Ｒ１０１、Ｖ０１２、Ｅ１０４、及びＬ１０５は、ＮＫｐ４６結合性に不可欠の残基であり、ＮＫｐ４６−４のエピトープの一部と定義される。ＮＫｐ４６−１のエピトープは、Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及びＹ１９４残基を含む。ＮＫｐ４６−３のエピトープは、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及びＳ１３６残基を含む。
【０２９７】
表題及び副題は、本明細書では便宜のためにのみ使用され、本発明を限定すると決して一切解釈するべきではない。上述の要素の全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、本発明に包含される。本明細書で述べられた値の範囲は、本明細書に特段の記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値について個々に述べられる省略方法の役割を単に果たすものであり、それぞれの別個の値は、本明細書で個々に述べられたかのように本明細書に包含される。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子又は測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合は「約」によって変更される、対応するおおよその測定値を示すものと見なすことができる）。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。
【０２９８】
本明細書に記載されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確な記載がない限り、いずれの要素も本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈される語は本明細書には存在しない。
【０２９９】
語、例えば、１つ又は複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つ又は複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。
【０３００】
本発明は、適用される法律によって許容される最大程度まで、本明細書に記載される態様又は請求項で述べられる主題の全ての変更形態及び均等物を含む。
【０３０１】
本明細書で述べられる全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により含められると具体的且つ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
【０３０２】
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例によってある程度詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変形形態及び変更形態をなし得ることが本発明の教示から明白であろう。
【図１】
2019503713.tif 000054
【図２−１】
2019503713.tif 000055
【図２−２】
2019503713.tif 000056
【図２−３】
2019503713.tif 000057
【図２−４】
2019503713.tif 000058
【図２−５】
2019503713.tif 000059
【図２−６】
2019503713.tif 000060
【図３】
2019503713.tif 000061
【図４−１】
2019503713.tif 000062
【図４−２】
2019503713.tif 000063
【図４−３】
2019503713.tif 000064
【図５】
2019503713.tif 000065
【図６】
2019503713.tif 000066
【図７】
2019503713.tif 000067
【配列表】
2019503713000001.app
【国際調査報告】
2019503713.tif 000068
2019503713.tif 000069
2019503713.tif 000070
2019503713.tif 000071
2019503713.tif 000072
2019503713.tif 000073