(57)【要約】  生成物、例えば組換えタンパク質、例えば抗体の生成の間に、宿主細胞タンパク質を検出及び／又は定量するのに有用な方法及び組成物が本明細書において開示されている。
2019533135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
例えば、タンパク質のリスク（例えば、調製物、例えば、対象に投与される調製物、例えば医薬調製物中に汚染物質として存在する場合に該タンパク質がもたらすリスク）を査定するために、試料を迅速に解析する単純な方法であって、
ａ）ｉ）プロセスにより生成される、該タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）を含む該試料、及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、該試料中の該タンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）該試料混合物と共に、該タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
該酵素が実質的な活性を維持しており、該タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、該タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、該タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、該タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）該試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、該試料を解析して、タンパク質のリスクを査定する、単純な方法。
【請求項２】
タンパク質のリスクを査定するために、試料を迅速に解析する単純な方法であって、
ａ）ｉ）プロセスにより生成される、該タンパク質（例えば、ＨＣＰ）、及び場合により治療生成物（例えば、組換えポリペプチド）を含む該試料、及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、該試料中の該タンパク質を変性させる第１の変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）該試料混合物と共に、該タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
該酵素が実質的な活性を維持しており、該タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、該タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、該タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、該タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）該試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、該試料を解析して、タンパク質のリスクを査定する、単純な方法。
【請求項３】
複数の異なる試料を評価するステップ、例えば、少なくとも２、４、８、１０、５０、９６、１００、１９２、２００、５００又は１，０００の異なる試料を評価するステップをさらに含み、それぞれが、異なるプロセスによって行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１及び第２の異なる試料に対するリスクの査定を比較するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記比較に応答して、前記生成物を生成するプロセスを選択するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記比較に応答して、前記試料の１つを選択するステップ、分類するステップ又はさらに処理するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、該プロセスにより生成される、該生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法であって、
ａ）ｉ）該プロセスにより生成される、該タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）、及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば１８〜２６℃の間、例えば２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、該試料中の該タンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）該試料混合物と共に、該タンパク質が基質となる該酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、該タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）例えばクロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用することにより、該タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、該タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、該タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）該試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、該プロセスにより生成される、該生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法。
【請求項８】
生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、該プロセスにより生成される、該生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法であって、
ａ）ｉ）該プロセスにより生成される、該タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）、及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、該試料中の該タンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）該試料混合物と共に、該タンパク質が基質となる該酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
該酵素が実質的な活性を維持しており、該タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）例えばクロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用することにより、該タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、該タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、該タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）該試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、該プロセスにより生成される、該生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法。
【請求項９】
生成物を作製する複数の異なるプロセスを評価するステップ、例えば、少なくとも２、４、８、１０、５０、９６、１００、１９２、２００、５００又は１，０００の異なるプロセスを評価するステップをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
第１及び第２の異なるプロセスに対する前記評価を比較するステップをさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記比較に応答して、前記生成物を作製するプロセスを選択するステップをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、汚染物質又は他の望ましくない構成成分（例えば、一連の条件により生成される生成物の断片、変性型、又はミスフォールディング型、又は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）若しくはその断片）である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記変性剤、第１の変性剤又は第２の変性剤が、デオキシコラート及び尿素、グアニジン塩酸塩、又は尿素及びグアニジン塩酸塩を含む、これらからなる、又はこれらから本質的になる、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料混合物中の変性剤の濃度が、前記試料／酵素混合物中の変性剤の濃度よりも高い、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試料混合物中の変性剤の濃度が、前記タンパク質を変性させるほど十分に高く、例えば、前記タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が変性し、
試料／酵素混合物中の変性剤の濃度が、前記酵素を変性させないほど十分に低く、例えば、前記酵素の５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２又は１％未満しか変性しない、
請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料混合物中の前記変性剤の濃度が、
ｉ）少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．５又は８；
ｉｉ）１〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、６〜６．６Ｍ、６Ｍ、６．６Ｍ又は８Ｍ；
ｉｉｉ）０〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は２Ｍ；又は
ｉｖ）０．０１％〜５０％、１％〜４０％、１％〜２０％、０．５％〜１０％、０．０１％〜５％又は０．１％〜２％（ｍ／ｖ）
である、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料混合物が、第１の変性剤（すなわち、（ａ）（ｉｉ）の前記変性剤）を含み、前記試料／酵素混合物が前記第１の変性剤及び第２の変性剤を含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の変性剤がグアニジン塩酸塩であり、前記第２の変性剤が尿素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料混合物中の前記第１の変性剤の濃度が、１〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、６〜６．６Ｍ、６Ｍ、６．６Ｍ又は８Ｍである、請求項１７又は１８のどちらかの方法。
【請求項２０】
前記試料／酵素混合物中の前記第１の変性剤の濃度が、
ｉ）０〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は２Ｍ；
ｉｉ）４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下；又は
ｉｉｉ）０．５又は０．１Ｍ以下、例えば本質的に０Ｍ
である、請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料／酵素混合物中の前記第２の変性剤の濃度が、
ｉ）４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下；
ｉｉ）０．５又は０．１Ｍ以下、例えば本質的に０Ｍ；又は
ｉｉｉ）２Ｍ又は０．５Ｍ以下
である、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
脱アミド化反応が、実質的に阻害されるように、前記試料混合物のｐＨが十分に低く、例えば前記タンパク質のアスパラギン及びグルタミン側鎖の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が変化せず、
前記試料／酵素混合物のｐＨが、前記酵素が活性であるように十分に高く、例えば、前記酵素が、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００％活性であり、例えば最大効率と比較して、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％の効率で働く、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料混合物のｐＨが、５．５±１、０．７５、０．５又は０．２５（例えば、５．５±０．５）であり、前記試料／酵素混合物のｐＨが、７．３±１、０．７５、０．５又は０．２５（例えば、７．３±０．５）である、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料混合物のｐＨが５．５であり、前記試料／酵素混合物のｐＨが７．３である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質又はタンパク質消化生成物のシステイン残基のアルキル化を含まない、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料混合物及び／又は試料／酵素混合物が、還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールを含む、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料混合物中の還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールの濃度が、前記試料／酵素混合物中の濃度よりも高い、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料混合物中の還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールの濃度が、前記タンパク質の前記システインを実質的に還元するほど十分に高く、例えば、前記タンパク質の前記システイン残基の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が還元され、
前記試料／酵素混合物中の還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールの濃度が、前記方法の他のステップ又は製造方法を妨害しないほど十分に低く、例えば、前記還元剤が、装置（例えば、質量分析計又は分析用カラム）中で有意に蓄積することはなく、又はデータ（例えば、質量分析データ）においてさらなるシグナルを生成することがない、
請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料混合物中の前記還元剤の濃度が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭである、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料／酵素混合物中の前記還元剤の濃度が、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５又は０．１ｍＭ、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５又は０．１ｍＭ以下である、請求項２６から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項２６から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質消化生成物が、サイズ、電荷又は親和性のうちの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれより多い）に基づいて分離される、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質消化生成物を分離するステップが、クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動、イオン移動度、又は本明細書に記載されているいずれかのクロマトグラフィー法を使用するステップを含む、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
（ｃ）が、タンパク質消化生成物を、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳ、タンデム質量分析法又はＲＰ−ＬＣＭＳ２によって特定するステップをさらに含む、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
（ｃ）が、クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、前記タンパク質消化生成物を分離するステップ、及び例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳ、タンデム質量分析法又は１Ｄ  ＲＰ−ＬＣＭＳ２によって前記タンパク質消化生成物を特定するステップを含む、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
複数の、例えば、少なくとも２、１０、２０、９６、１００、１９２、１，０００又は１０，０００の試料中の、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％のタンパク質消化生成物に、素性、構造又は組成を分類し又は割り当てる、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質リスクスコアが、
対象における、前記タンパク質、及び場合により生成物を含む調製物の投与に対する、望ましくない、例えば標的外の特性、例えば免疫原性、
前記生成物の調製、例えば薬物の調製における、前記タンパク質の望ましくない作用、例えば、変性、沈殿又は着色を引き起こす性向、及び
前記試料中に存在する前記タンパク質の存在量の値
のうちの１つ又は複数の関数である、請求項１から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｄ）を繰り返して、試料中で特定された１つ又は複数（例えば、少なくとも２、１０、５０、１００、２００、５００、１０００又はすべて）のタンパク質に対するタンパク質リスクスコアを得る、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｄ）が、例えば、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームによって生成される、タンパク質リスクスコア、例えば免疫原性リスクスコアを得るステップを含む、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｄ）が、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームによって生成される免疫原性リスクスコアを得るステップを含む、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料にプロセスリスクスコアを与えるステップをさらに含む、請求項１から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロセスリスクスコアが、前記試料のタンパク質の前記１つ又は複数のタンパク質リスクスコアの関数である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プロセスリスクスコアが、式：
プロセスリスクスコア＝Σ（［プロテイン存在量］×［免疫原性リスクスコア］）
に基づいて算出される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、複数の試料、例えば、少なくとも２、１０、５０、９６、１０、１９２又は１０００を解析するために繰り返され、
前記試料の２つ以上（例えば、すべて）が、異なる製造プロセス又は方法を使用して得られ、プロセスリスクスコアが複数の試料（例えば、すべての試料）に対して得られるか、又は
前記試料の２つ以上（例えば、すべて）が、製造プロセス又は方法の間に異なる時点で得られ、プロセスリスクスコアが複数の試料（例えば、すべての試料）に対して得られる、請求項４１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
製造プロセス又は方法、例えば、前記試料を得るために使用される前記製造プロセス又は方法の前記プロセスリスクスコアを参照と比較するステップを含む、請求項４１から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
第１の製造プロセス又は方法の前記プロセスリスクスコアを、第２の製造プロセス又は方法のプロセスリスクスコアと比較するステップを含む、請求項４１から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
第１の時点におけるプロセスの前記プロセスリスクスコアを、第２の時点におけるプロセスの前記プロセスリスクスコアと比較するステップを含む、請求項４１から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記比較に応答して、例えば、さらなる解析、又はさらなる使用のために、前記製造プロセス又は方法の１つを選択して、例えば前記生成物、例えば組換えポリペプチドを作製するステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
細胞培養物（例えば、ＣＨＯ、例えば、ＧＳ−ＣＨＯ、細胞培養物）の細胞培養上清に由来する、ＨＣＰ又はタンパク質消化生成物の特徴及びタンパク質リスクスコアを特定するライブラリを含む（例えば、コンピュータ可読媒体上に記憶又は記録される）データベース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年８月１２日に出願の米国特許出願第６２／３７４，４８９号への優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、生成物、例えば組換えタンパク質、例えば抗体の生成の間に、宿主細胞タンパク質不純物を検出及び／又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、様々な製造プロセスの後の最終製品中に存在し得る、宿主タンパク質の望ましくない複雑な混合物である。このようなＨＣＰは、とりわけ、製品の効力及び患者の安全性にリスクをもたらす恐れがある。
【０００４】
これまで、ＨＣＰ不純物の試験は、ＥＬＩＳＡに基づく方法及び／又はプロテオミクスの分野における進歩を使用して遂行されてきた。プロテオミクスを利用するＨＣＰ不純物試験は、２次元クロマトグラフィー分離に基づいてきた。この手法は強力であるが、ルーチンプロセス開発ツールとして使用するのに十分なスループットを欠いている。このようなツールの欠如は、プロテオームＨＣＰ査定が、多くの場合、開発決定を基礎付け得る情報源としてよりも、方法開発に伴う生成物の解析に応答してそれに限定されてきたことを意味する。したがって、単純で迅速なハイスループット法で、バイオ医薬製品中のＨＣＰを検出及び定量する方法が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一部には、最終製剤化製品、例えば、組換えタンパク質中の汚染物質としてタンパク質が引き起こすリスクを査定するために、ある製品、例えば組換えポリペプチドを製造するプロセス又は方法により生成する、タンパク質（単数）、例えばタンパク質（複数）、例えば、ＨＣＰ又はその断片を含む、試料（単数）、例えば複数の試料を迅速に解析する方法の開発に関する。例えば、製造のプロセス又は方法により生成された組換えポリペプチドの試料は、本明細書に記載されている方法により解析されて、任意のタンパク質、例えばタンパク質（複数）、例えばＨＣＰ又はその断片が汚染物質として引き起こすことがあるリスクを迅速に査定することができる。このような例示的な方法では、多数の試料は、製造プロセス又は方法に関連する汚染物質のリスクの比較を可能にするような方法で、多数のタンパク質のリスクを査定するために、迅速且つ正確に査定され得る。したがって、本発明の方法は、製造プロセス又は方法の間で、評価、区別及び選択するのに有用となり得る。さらに、本発明の方法は、タンパク質に関連するリスクの査定に基づいた試料間の評価、区別及び選択をするため、並びに現在進行中のタンパク質の開発及び関連する汚染物質リスクを決定するための製造プロセス又は方法をモニタリングするために、さらに有用となり得る。
【０００６】
一態様では、本発明は、例えば、タンパク質のリスク（例えば、調製物、例えば、対象に投与される調製物、例えば医薬調製物中に汚染物質として存在する場合にそのタンパク質がもたらすリスク）を査定するために、試料を迅速に解析する単純な方法であって、
ａ）ｉ）プロセスにより生成される、タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）を含む試料、及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、試料を解析して、タンパク質のリスクを査定する、単純な方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、タンパク質のリスクを査定するために、試料を迅速に解析する単純な方法であって、
ａ）ｉ）プロセスにより生成される、タンパク質（例えば、ＨＣＰ）、及び場合により治療生成物（例えば、組換えポリペプチド）を含む試料、及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
条件、例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる第１の変性剤の濃度の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、試料を解析して、タンパク質のリスクを査定する、単純な方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法であって、
ａ）ｉ）このプロセスにより生成される、タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）、及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素、又はグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物（例えば、ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）例えばクロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用することにより、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法であって、
ａ）ｉ）このプロセスにより生成される、タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）、及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、ａ）からの一定分量の試料混合物）；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）例えばクロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用することにより、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、リスク（生成物の調製における生成物以外のタンパク質の含有により表されるリスク）を査定するために、生成物、例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカインを製造する方法を評価する方法であって、
ａ）ｉ）製造方法により生成される、１つ又は複数のタンパク質及び生成物、例えば、組換えポリペプチド；及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップであって、
場合により、（ｄ）は、複数のタンパク質、例えばタンパク質消化生成物により特定されるすべてのタンパク質に対して繰り返される、ステップ、並びに
ｅ）製造する方法にプロセスリスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物、例えば組換えポリペプチドを製造する方法を評価して、リスクを査定する方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、リスク（生成物の調製における生成物以外のタンパク質の含有により表されるリスク）を査定するために、生成物、例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカインを製造する方法を評価する方法であって、
ａ）ｉ）製造方法により生成される、１つ又は複数のタンパク質及び生成物、例えば、組換えポリペプチド；及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップであって、
場合により、（ｄ）は、複数のタンパク質、例えばタンパク質消化生成物により特定されるすべてのタンパク質に対して繰り返される、ステップ、並びに
ｅ）製造する方法にプロセスリスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物、例えば組換えポリペプチドを製造する方法を評価して、リスクを査定する、方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、生成物を含む試料を用意するステップを含む、生成物、例えば組換えポリペプチドを製造する方法であって、試料が、本明細書に記載されている試料を解析する方法により解析される、方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、細胞培養物（例えば、ＣＨＯ、例えば、ＧＳ−ＣＨＯ、細胞培養物）の細胞培養上清に由来する、ＨＣＰ又はタンパク質消化生成物の特徴及びタンパク質リスクスコアを特定するライブラリを含む（例えば、コンピュータ可読媒体上に記憶又は記録される）データベースを提供する。
【００１４】
本発明の利点には、本明細書において開示されている方法により、単純で迅速なリスク査定、例えば、免疫原性査定、解離、生成物安定性を、ゲノムが既知である任意の生成システムに対して、又は生成システムの特定の変異体（例えば、具体的にはＣＨＯのサブセットとしてのＧＳ  ＣＨＯ）に対して行うことが可能となることが挙げられる。リスク、例えば、免疫原性の査定は、様々な患者集団（例えば、地理的領域又は民族性による）に対して行うことができる。世界集団に対する、タンパク質汚染物質、例えばＨＣＰの総合的な平均スコアは、単一の特に感受性の高い群に対して高いスコアを隠すことがあるので、上記のことは重要である。リスク、例えば、免疫原性の計算は、本開発プロセスに完全に統合される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明による解析法の上位レベルの概略を図示している。
【図２】は、ｐＤＡＤＭＡＣが媒介するＨＣＰ除去が、タンパク質ｐＩと相関しているかどうかを決定するために定量した各タンパク質のｐＩ値を示すグラフ表示である。
【図３】タンパク質ＳＥＴに関するＬＣ−ＭＳプロファイルである。
【図４】様々な精製条件下で処理された様々な生成物及び細胞系に対する、総合的な生成物分解リスクスコアの比較を示すグラフである。
【図５】様々な精製条件下で処理された様々な生成物及び細胞系に対する、ホスホリパーゼＢ存在量の比較を示すグラフである。
【図６】様々な精製条件下で処理された様々な生成物及び細胞系に対する、カテプシンＤ存在量の比較を示すグラフである。
【図７】様々な精製条件下で処理された様々な生成物及び細胞系に対する、総合的な免疫原性リスクスコアの比較を示すグラフである。
【図８】代替タンパク質除去法により処理された培養上清中の合計ＨＣＰ存在量の比較を示すグラフである。
【図９】代替タンパク質除去法により処理された培養上清中の生成物解離リスクスコアの比較を示すグラフである。
【図１０】代替タンパク質除去法により処理された培養上清における、生成物分解リスクスコアの比較を示すグラフである。
【図１１】全ＨＣＰレベルと比較した、代替タンパク質除去法により処理された培養上清における、例となる特定のＨＣＰ存在量の比較を示すグラフである。
【図１２】メタノール解毒経路、及びｐＡＯＸ誘起における、タンパク質発現の変化を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ヒト患者への投与に許容される組換えバイオ医薬品タンパク質の場合、製造プロセス及び精製プロセスに起因する残留汚染物質が、最終的な生物学的製品、例えば組換えポリペプチドから除去されることが重要である。これらのプロセスによる汚染物質としては、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ及びタンパク質、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が挙げられる。汚染物質タンパク質、例えばＨＣＰは、免疫応答、アジュバント活性、直接的な生物活性又は生成物の相互作用／分解を含めた、生成物の安全性プロファイルに影響を及ぼし得る、幅広い望ましくない効果を生成することがある。これらの宿主細胞汚染物質は、プロセス特異的タンパク質、例えばＨＣＰを含み、これは、組換えＤＮＡ技術に由来するバイオロジクス（例えば組換えポリペプチド）中のプロセス関連不純物／汚染物質である。
【００１７】
米国及び外国の規制は、多くの場合、このような汚染物質の除去を要求している。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、インビボでのヒト使用が意図されているバイオ医薬品は、外来性免疫グロブリン及び非免疫グロブリン不純物をできるだけ不含にすべきであることを要求しており、タンパク質、例えばＨＣＰなどの潜在的な不純物の検出及び定量に関する試験を要求している。同様に、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）は、バイオテクノロジー製品／生物学的製品に対する試験手順及び許容基準に関するガイドラインを提示している。
【００１８】
微量レベルで存在する不純物タンパク質の検出及び定量における解析上の難題に主に基づき、生成物学的治療剤における、汚染物質タンパク質、例えばＨＣＰの測定は、歴史的に、ＥＬＩＳＡ方法を使用した凝集物基準に基づいて行われており、結果は、集団内の特定及び相対的レベルに関する情報なしに、タンパク質、例えばＨＣＰの坪量（ｇｒａｍｍａｇｅ）の合計として報告されている。汚染物質タンパク質、例えば、ＨＣＰのＥＬＩＳＡは、ヌルトランスフェクト細胞系に由来する、総タンパク質及びタンパク質断片の組合せに基づいて開発されており、解析対象における汚染物質タンパク質、例えばＨＣＰ負荷は存在量だけが変わり、組成は変わらないという固有の仮説に基づいて行われる。
【００１９】
現在のプロテオミクスに基づく方法は、これらが、製造及びプロセス開発、生成物のモニタリング及び解析を行うためのルーチンツールとして使用するのに十分なスループットを有していないので、用途は限定される。規制当局は、各混入タンパク質に関連するリスク査定を要求しており、この既存のプロテオミクスに基づく方法は、迅速な規模変更可能な方法で対処されない。このような迅速な、ハイスループットツールの欠如は、プロテオームタンパク質、例えばＨＣＰの汚染物質の査定は、多くの場合、開発決定を基礎付け得るルーチンツールとしてよりも、プロセス開発おける少数の試料の解析に応答してそれに限定されていることを意味する。
【００２０】
バイオ医薬品の製造が直面する特定の問題は、各タンパク質、例えば各ＨＣＰは、異なるタンパク質、例えばＨＣＰの集団で、類似の全存在量で、非常に可変のリスクプロファイルを生じる、特定の個別の活性を有するということである。不純物として存在するタンパク質、例えばＨＣＰの混合物は、とりわけ、タンパク質、例えば、ＨＣＰが、タンパク質治療剤に直接、結合することによって、精製により「ピギーバック」することができることが知られているので、生成物間でかなり変動し得る。このことは、治療剤が投与されると、生成物及び界面活性剤の分解、アジュバント活性及び有害な免疫応答を含めた、いくつかの問題をもたらす恐れがある。
【００２１】
本発明により、すべての製造規模、並びに治療用タンパク質のすべての製造段階及び精製段階において、ルーチンプロセス開発を支援するための十分なスループットを伴って、タンパク質治療剤中にどのような特定のタンパク質、例えばＨＣＰが存在しているかを特定することが可能となる。
【００２２】
本開示は、例えば、製造プロセス開発、生成モニタリング及び最終製品の解析を含めた、商業的需要に適合する形式でプロテオミクスを使用した、生成物中、例えば、精製した治療生成物又は組換えポリペプチドにおける、タンパク質、例えばＨＣＰのプロテオーム解析を記載している。
【００２３】
このプロセスは、免疫原性のインシリコ予測に基づいた、各タンパク質、例えばＨＣＰの統合した臨床的リスク査定を組み込む。これらの予測は、特定の生成システムに基づいており、ある種のタンパク質、例えばＨＣＰ、エピトープ（例えば、地理的領域又は民族性による）に特に感受性が高くなり得る、規定された患者の部分集団に対して行うことができる。ハイスループット解析方法及び統合した不純物リスク査定の特定の組合せにより、製造プロセス開発中に、算出された臨床的リスクに基づいて行われる、ルーチン決定が可能となる。これらの結論は、生成システムの特定のゲノムと潜在的な患者応答の全範囲の両方を考慮すると、高い信頼性を伴って行うことができる。
【００２４】
本明細書において開示されているタンパク質、例えばＨＣＰのプロテオミクスに基づく解析は、製造プロセス全体にわたり使用することができ、こうして、製造の規模拡大の間の、タンパク質、例えばＨＣＰを検出するための様々なアッセイの開発が回避される。すなわちこの方法は、規模に依存しない。小規模から大規模までの製造プロセス全体にわたる同一のモニタリング方法の使用により、１つの規模から別の規模までの生産速度の移行において、付随する誤差を伴う、様々な製造規模で複数のモニタリング法を開発する必要性があるなどの、複数の問題が回避される。むしろ、プロテオソーム法は、製造規模に無関係に使用することができる、単純な、一貫した、再現性のある迅速な方法を提供する。同じセットのタンパク質、例えばＨＣＰは、例えば、細胞培養中、タンパク質発現中、並びに精製前及び精製後に、タンパク質、例えばＨＣＰの変化を示す、プロセスの様々な段階においてモニタリングされることもやはり確実となる。
【００２５】
本開示は、とりわけ、プロテオーム解析の重要ステップを最適化することにより、数百の試料（例えば、生成物、例えば組換えポリペプチド又は治療生成物を製造するプロセス及び方法から誘導される試料）を迅速に解析する方法を記載し、例えば、変性剤、例えば、デオキシコラート、尿素及びグアニジン塩酸塩の特定の組合せ及びレベルを適用すること、個別の酵素のみ、例えばタンパク質分解酵素とは反対に、選択したｐＨ（例えば、低ｐＨ、例えば酸性条件）において、いくつかの様々な酵素、例えば、タンパク質分解酵素を使用すること、及び結果品質を喪失しないで、アルキル化ステップを省略することなどである。
【００２６】
本開示の方法は、試料混合物において、非常に低いレベルで存在する、数千種のタンパク質（例えば、ＨＣＰ）を検出する、特定する及びその存在量を定量することが可能である。本開示の方法は、例えば、精製した生成物、例えば組換えポリペプチドを解析するためだけに好適なものよりもむしろ、細胞の上清を使用して、製造及びプロセスの開始時に適用可能である。
【００２７】
本開示の方法は、一般に使用される方法よりもかなり迅速に、且つより多数の試料に対して行うことができる。本開示の例示的な方法は、３〜５日間で１００の試料を解析することができる一方、一般に使用される方法は、６つの試料を解析するため５〜１０日間を必要とする。伝統的に、これは、少なくとも１０倍のスループット向上となる。一実施形態では、スループットは、少なくとも、約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍又は９０倍、改善される。
【００２８】
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践において、及び／又は本発明を試験するために、本明細書に記載されているものに類似した又は等価な任意の方法及び物質が使用され得るが、好ましい物質及び方法が本明細書に記載されている。本発明を記載及び特許請求する際に、以下の用語は、定義が与えられ得る場合、どのように定義されるかに準拠して使用される。
【００２９】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみであって、制限することを意図するものでないことも理解されるべきである。
【００３０】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の１つ、又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すために、本明細書において使用される。例として、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、１つの細胞又は１つ超の細胞を意味することができる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、試料の文脈における用語「タンパク質（単数又は複数）」とは、製造プロセス又は方法により生成される試料中の、所望の生成物、例えば所望の組換え生成物、例えば治療生成物ではない任意のタンパク質を指す。一部の実施形態では、タンパク質は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）又はその断片とすることができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞タンパク質」又は「ＨＣＰ」は、組換えポリペプチド生成物を生成するために使用される生物によって生成又はコードされる任意のタンパク質であって、意図する組換え生成物に無関係な、タンパク質を指す。ＨＣＰは、最終薬物物質では、望ましくない。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「半定量的」とは、各個々の種に対する特定の標準品を参照することのない、質量分析法による異なる化学種の比較査定を指す。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「内因性」とは、生物、細胞、組織又は系に由来する、又はこれらの内部で天然に生成する任意の物質を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「外因性」とは、生物、細胞、組織又は系に導入される、又はこれらの外部で生成する任意の物質を指す。したがって、「外因性核酸」とは、生物、細胞、組織又は系に導入される、又はこれらの外部で生成する核酸を指す。実施形態では、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入される、生物、細胞、組織又は系の内部に天然に生成しない、又は天然に見いだすことができない。一実施形態では、外因性核酸の配列は、非天然配列であるか、又は非天然生成物をコードする。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「非相同性」とは、異なる種に由来する生物、細胞、組織又は系に導入されるときの、１つの種に由来する任意の物質を指す。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらのＤＮＡ若しくはＲＮＡの組合せ、及びそれらの一本鎖形態又は二本鎖形態のどちらかのポリマーを指す。用語「核酸」としては、以下に限定されないが、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡが含まれる。一実施形態では、核酸分子は、合成（例えば、化学的合成又は人工）又は組換えである。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸として、類似の結合特性を有する天然のヌクレオチドのアナログ又は誘導体を含有する分子を包含し、天然又は非天然ヌクレオチドに類似して代謝される。特に示さない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ及び相補性配列、並びに明示的に示された配列を暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」（例えば、本発明の方法の文脈において使用されない場合のタンパク質）は互換的に使用され、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって、共有結合により連結されているアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限は設けられない。一実施形態では、タンパク質は、１つ超、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ超のポリペプチドを含むことができ、この場合、各ポリペプチドは、共有結合又は非共有結合／相互作用のどちらかによって互いに結合している。ポリペプチドは、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって、互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用される場合、この用語は、短鎖（当分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとしても一般的に称される）、並びにより長い鎖（当分野において、タンパク質として一般的に称され、これには多くのタイプが存在する）の両方を指す。「ポリペプチド」としては、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同性のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「生成物」は、生成物を生成するよう修飾された又は操作された細胞により生成する、例えば発現される、分子、核酸、ポリペプチド又は任意のそれらのハイブリッドを指す。一実施形態では、生成物は、天然生成物又は非天然生成物、例えば合成生成物である。一実施形態では、生成物の一部が天然である一方、その生成物の別の部分は非天然である。一実施形態では、生成物は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドである。一実施形態では、生成物は、診断的使用又は前臨床的使用に好適である。別の実施形態では、生成物は、例えば、疾患の処置のための治療的使用に好適である。一実施形態では、生成物は、表１又は表２から選択される。一実施形態では、修飾した又は操作された細胞は、発現を制御する、又は生成物をコードする外因性核酸を含む。他の実施形態では、修飾された又は操作された細胞は、例えば、核酸ではない他の分子であって、細胞中での生成物の発現又は構築を制御する他の分子を含む。
【００４０】
一実施形態では、細胞の修飾は、内因性核酸配列、例えば内因性遺伝子の発現を制御又は改変する、例えば向上させる、核酸配列を含む外因性核酸の導入を含む。このような実施形態では、修飾された細胞は、細胞によって天然で又は内因的に発現される内因性ポリペプチド生成物を生成するが、この修飾は、非修飾細胞と比べて、例えば、ポリペプチドの内因性生成又は品質と比べて、生成物の生成及び／又は生成物の品質を高める。
【００４１】
別の実施形態では、細胞の修飾は、本明細書に記載されている、組換えポリペプチドをコードする、外因性核酸の導入を含む。このような実施形態では、修飾した細胞は、天然又は非天然とすることができる、組換えポリペプチド生成物を生成する。このような実施形態では、修飾した細胞は、細胞により内因的にやはり発現され得る、又は発現され得ない、組換えポリペプチド生成物を生成する。組換えポリペプチド生成物が細胞により内因的にやはり発現される実施形態では、この修飾により、非修飾細胞と比べて、例えば、ポリペプチドの内因性生成又は品質と比べて、生成物の生成及び／又は生成物の品質を高める。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、本明細書に記載されている細胞によって生成することができるポリペプチドを指す。組換えポリペプチドは、ポリペプチドをコードする配列の少なくとも１つのヌクレオチド、又はポリペプチドの発現を制御する配列からなる少なくとも１つのヌクレオチドが、（細胞又は前駆細胞の）遺伝子工学により形成されたものである。例えば、少なくとも１つのヌクレオチドは改変され、例えば、これは細胞に導入されたか、又は遺伝子工学的に再配列された生成物である。実施形態では、組換えポリペプチドの配列は、ポリペプチド又はタンパク質の天然アイソフォームとは違いがない。実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド又はタンパク質の天然アイソフォームの配列とは異なる。実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は、同じ種に由来する。実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞に内因性であり、言い換えると、細胞は第１の種に由来し、組換えポリペプチドは、その第１の種から生じたものである。実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、同一である、若しくは実質的に同一であるか、又は細胞の内因性ゲノムによりコードされるポリペプチドと、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％未満しか違いがない。実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は異なる種に由来する。例えば、組換えポリペプチドはヒトポリペプチドであり、細胞は、非ヒト、例えばげっ歯類、例えばＣＨＯ又は昆虫細胞である。実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞に外因性である。言い換えると、細胞は第１の種に由来し、組換えポリペプチドは、第２の種に由来する。一実施形態では、ポリペプチドは、合成ポリペプチドである。一実施形態では、ポリペプチドは、非天然出源に由来する。実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチド、又はヒトポリペプチド若しくはタンパク質の天然アイソフォームに由来するアミノ酸配列に違いのないヒトポリペプチド又はタンパク質である。実施形態では、組換えポリペプチドは、１、２、３、４、５、１０、１５又は２０のアミノ酸残基以下のヒトポリペプチド又はタンパク質の天然アイソフォームとは異なる。実施形態では、組換えポリペプチドは、そのアミノ酸残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１５％以下、ヒトポリペプチドの天然アイソフォームとは異なる。
【００４３】
用語として本明細書において使用される「取得する」又は「取得すること」は、物理的実態又は値、例えば数値の所有を、物理的実体若しくは値を「直接的、取得する」又は「間接的に取得する」ことにより得ることを指す。「直接、取得する」とは、物理的実体又は値を得るためのプロセスを行うこと（例えば、合成方法又は解析方法を行うこと）を意味する。「間接的に取得する」とは、別の機関又は供給元（例えば、物理的実体又は値を直接、取得した第３機関の実験室）から物理的実体又は値を受け取ることを指す。物理的実体の直接的な取得は、物理的物質、例えば出発原料の物理的変化を含む過程を行うことを含む。例示的な変化には、２種以上の出発原料から物理的実体を作製すること、物質をせん断若しくは断片化すること、物質を分離若しくは精製すること、２種以上の個別の実体を混合物に一緒にすること、共有結合又は非共有結合を切断又は形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。ある値を直接的に取得することには、ある試料又は別の物質の物理的変化を含む過程、例えば、物質、例えば試料、解析対象又は試薬の物理的変化を含む解析過程を行うこと（時として、本明細書では、「物理的解析」と称される）、ある解析方法、例えば、以下：物質、例えば解析対象、又はその断片若しくは誘導体を、別の物質から分離すること又は精製すること；解析対象、又はその断片若しくは他の誘導体を、別の物質、例えば緩衝液、溶媒又は反応物と混合すること；或いは、例えば、解析対象の第１の原子と第２の原子との間の共有結合若しくは非共有結合を切断又は形成することによる、解析対象、又はその断片若しくは他の誘導体の構造を変化させること；或いは、例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有結合若しくは非共有結合を切断又は形成することによる、試薬、又はその断片若しくは他の誘導体の構造を変化させることのうちの１つ又は複数を含む方法を行うことが含まれる。
【００４４】
用語が本明細書において使用される「試料を取得する」とは、試料、例えば組織試料又は核酸試料の所有を、試料を「直接取得する」又は「間接的に取得する」ことによって、得ることを指す。「試料を直接、取得する」とは、試料を得るための過程（例えば、手術又は抽出などの物理的方法を行うこと）を行うことを意味する。「試料を間接的に取得する」とは、別の機関又は供給元（例えば、試料を直接、取得した第３機関の実験室）から試料を受け取ることを指す。試料を直接、取得することは、ある組織、例えば、ヒト患者における組織、又は患者から以前に単離した組織などの、物理的物質、例えば出発原料の物理的変化を含む過程を行うことを含む。例示的な変化には、出発原料から物理的実体を作製すること、組織を切断若しくは解体すること、物質を分離若しくは精製すること（例えば、試料組織又は核酸試料）、２種以上の個別の実体を一緒にして混合物にすること、共有結合又は非共有結合を切断又は形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。試料の直接的な取得は、例えば、上記の通り、試料又は別の物質の物理的変化を含む過程を行うことを含む。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「タンパク質消化生成物」とは、タンパク質の断片、例えば酵素の作用により生成するペプチド、例えば、タンパク質が基質となるタンパク質分解酵素を指す。酵素の例には、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、及び当分野で公知の他のものが含まれる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「タンパク質リスクスコア」は、生成物、例えば治療生成物、例えば治療生成物の最終製剤中の、汚染物質又は不純物として、タンパク質、例えばＨＣＰ又はその断片に関連するリスクの査定を含む。タンパク質リスクスコアは、以下：タンパク質及び生成物を含む調製物の投与を受ける対象における、望ましくない、例えば標的外特性、例えば免疫原性、例えば望ましくない免疫反応；生成物の調製、例えば薬物の調製におけるタンパク質の望ましくない作用、例えば、変性、沈殿、着色又は臭気を引き起こす性向；及び試料中に存在するタンパク質の存在量の値のうちの１つ又は複数の関数とすることができる。例えば、プロセス又は製造方法により生成される、場合により生成物を含む試料は、１種又は複数のタンパク質汚染物質を含む。本発明の方法は、試料内のタンパク質又はその断片を解析して、１種又は複数のタンパク質リスクスコアを試料中で特定した各タンパク質に割り当てることができる。一部の実施形態では、タンパク質リスクスコアは、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）、例えば免疫原性スコアにより生成する値であるか、又はこの値を含む。一部の実施形態では、タンパク質リスクスコアは、試料中のタンパク質存在量の値である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「プロセスリスクスコア」は、プロセス又は製造方法に関連するリスクの査定を含み、試料中に存在する、プロセス又は製造方法により生じる、タンパク質のタンパク質リスクスコアの関数である。例えば、試料Ａは、プロセスＡにより生じ得、試料Ｂは、プロセスＢにより生じ得る。本発明の方法を使用して、試料Ａ及びＢを解析して、それらのタンパク質汚染物質のタンパク質リスクスコアを査定し、プロセスＡ及びＢのプロセスリスクスコアが決定され、これにより、プロセスＡ及びＢの迅速な比較が可能になる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「プロセス」は、とりわけ、タンパク質、又は複数のタンパク質、例えばＨＣＰ若しくはその断片を含む試料を生成する、一連の１つ又は複数の操作及び／又は条件である。一部の実施形態では、試料は、生成物、例えば組換えポリペプチド、又は治療生成物をさらに含む。例えば、例示的なプロセスは、組換えポリペプチドの発現が起こりやすい条件下、複数の細胞を培養することを含み、こうして、試料、例えば、１種又は複数のタンパク質、例えばＨＣＰ又はその断片、及び生成物、例えば組換えポリペプチドを含む、細胞培養物、上清又は細胞溶解物が生成する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「製造方法」は、生成物、例えば組換えポリペプチド又は治療生成物、及びタンパク質又は複数のタンパク質、例えばＨＣＰ若しくはその断片を含む試料を生成する、一連の１つ又は複数の操作及び／又は条件である。例えば、例示的な製造方法は、組換えポリペプチドの発現が起こりやすい条件下、複数の細胞を培養することを含むことができ、こうして、試料、例えば、１種又は複数のタンパク質、例えばＨＣＰ若しくはその断片、及び生成物、例えば組換えポリペプチドを含む、細胞溶解物、上清又は細胞培養物が生成する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、ＭＳ１は、質量分析法を意味する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、ＭＳ２は、タンデム質量分析法を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「実質的に活性な」又は「実質的な活性」とは、理想条件下、例えば、変性剤、還元剤又は非推奨ｐＨの存在なしに、酵素供給業者又は条件により推奨される条件下、参照の効率／反応速度、例えばその酵素の最も高い効率／反応速度と比較して、一連の条件下、又は本明細書に記載されている方法若しくはプロセスのステップにおいて、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％活性な、例えば、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％の効率／反応速度で動く、例えば試料中の酵素、例えば複数の酵素を記載する。
【００５３】
本明細書において引用されている特許、特許出願及び刊行物のあらゆる開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明は、特定の態様を参照しながら開示されているが、本発明の他の態様及び変形が、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者である他者により考案され得ることは明白である。添付の特許請求の範囲は、このような態様及び均等な変形のすべてを含むことが意図されている。
【００５４】
試料調製
本明細書に記載されている方法は、試料、例えば、プロセス又は製造方法により生成する、タンパク質、例えばＨＣＰを含む試料、例えば、細胞培養物、上清又は細胞溶解物を含む試料を解析するための方法を一部、列挙している。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、解析用の試料の調製を列挙している。一部の実施形態では、解析は、質量分析法、試料内のタンパク質、例えばＨＣＰの同定、及び／又はタンパク質、例えばＨＣＰに対するリスクスコアの割り当て、及び／又は試料を生成する製造プロセス／方法を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、解析用の試料の調製は、タンパク質、例えばＨＣＰを変性剤に曝露させることを含むことができる。一部の実施形態では、変性剤は、カオトロピック作用剤、酸、塩基、還元剤又は洗剤である。一部の実施形態では、変性剤は、グアニジン塩酸塩、尿素及びデオキシコラートから選択される。一部の実施形態では、変性剤は、複数のタイプの変性剤又は複数の変性剤、例えば、尿素及びデオキシコラート、又はグアニジン塩酸塩及び尿素の組合せである。一部の実施形態では、解析用試料の調製は、複数のステップを含み、この場合、１つのステップにおいて提供される変性剤は、第２のステップにおいて提供される変性剤とは異なる、又は変性剤の濃度が変更される、例えば、ステップ毎に変えられる。一部の実施形態では、試料調製の複数のステップは、第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩の濃度を変更する、例えば、希釈によって、低下することができ、第２の変性剤、例えば尿素を導入するか又はその濃度を高めることができる。一部の実施形態では、試料混合物中の変性剤の濃度は、少なくとも、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．５又は８Ｍである。一部の実施形態では、試料混合物中の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩の濃度は、１〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、６〜６．６Ｍ、６Ｍ、６．６Ｍ又は８Ｍである。一部の実施形態では、試料混合物中の変性剤、例えば尿素の濃度は、０〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は２Ｍである。一部の実施形態では、試料混合物中の変性剤、例えば、デオキシコラートの濃度は、少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．２％、１．５％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％又は５０％（ｍ／ｖ）、例えば０．１％〜２％である。一部の実施形態では、試料混合物中の変性剤、例えば、デオキシコラートの濃度は、０．０１％〜５０％、１％〜４０％、１％〜２０％、０．５％〜１０％、０．０１％〜５％又は０．１％〜２％（ｍ／ｖ）である。一部の実施形態では、試料（例えば、試料混合物）は、尿素とデオキシコラートの両方を含む。一部の実施形態では、試料（例えば、試料混合物）は、尿素とデオキシコラートの両方を含み、尿素の濃度は、少なくとも８Ｍ（例えば、８Ｍ）であり、デオキシコラートの濃度は、少なくとも１％（例えば、１％）（ｍ／ｖ）である。一部の実施形態では、試料（例えば、試料混合物）は、尿素とデオキシコラートの両方を含み、尿素の濃度は、少なくとも８Ｍ（例えば、８Ｍ）であり、デオキシコラートの濃度は、少なくとも０．０１％（例えば、０．０１％）（ｍ／ｖ）である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物中の変性剤の濃度は、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物中の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩の濃度は、０．５又は０．１Ｍ以下、例えば、本質的に０Ｍである。一部の実施形態では、試料／酵素混合物中の変性剤、例えば尿素の濃度は、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下、例えば、２Ｍ以下又は０．５Ｍ以下である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物中の変性剤、例えば、デオキシコラートの濃度は、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００２５％、０．００１％又は０．０００１％以下であり、例えば実質的に０％（ｍ／ｖ）である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物は、尿素とデオキシコラートの両方を含む。一部の実施形態では、試料／酵素混合物は、尿素とデオキシコラートの両方を含み、尿素の濃度は、２Ｍ以下（例えば、２Ｍ又は０．５Ｍ）であり、デオキシコラートの濃度は、０．００２５％（ｍ／ｖ）以下である。一部の実施形態では、試料、例えば、デオキシコラートを含む試料混合物及び／又は試料／酵素混合物はまた、アセトニトリル、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％のアセトニトリル（例えば、８０％アセトニトリル）（ｍ／ｖ）を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、解析用の試料の調製は、タンパク質を還元剤に曝露させることを含むことができる。タンパク質中に存在するジスルフィド結合は、タンパク質を変性させるために還元することを必要とすることがある。企図される還元剤は、当分野で公知なものであり、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノール（すなわち、２−メルカプトエタノール）を含む。一部の実施形態では、試料混合物中の還元剤の濃度は、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭ、例えば、少なくとも１０ｍＭ、例えば、１０ｍＭである。一部の実施形態では、試料／酵素混合物中の還元剤の濃度は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５又は０．１ｍＭ以下、例えば、１ｍＭ以下、例えば１ｍＭである。
【００５７】
一部の実施形態では、解析用の試料の調製は、タンパク質をアルキル化剤に曝露させることを含み得ない。アルキル化剤、例えばヨードアセトアミドを、ジスルフィド結合の再形成を防止する１つの方法として、システインのチオール基をアルキル化するために使用することができる。理論によって拘泥されることを望むものではないが、試料調製全体にわたり、還元剤の存在の維持により、例えば、低濃度の還元剤（例えば、１ｍＭの還元剤、例えば、１ｍＭのＴＣＥＰ）により、例えばタンパク質の変性に寄与する、アルキル化剤の必要性が軽減され得る。さらに、アルキル化ステップの省略は、試料調製時間を早めることができる。
【００５８】
一部の実施形態では、解析用試料の調製は、試料混合物又は試料／酵素混合物における、特定のｐＨをもたらすこと含むことができる。一部の実施形態では、試料混合物のｐＨは、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５又は８である。一部の実施形態では、試料混合物のｐＨは、５．５である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物のｐＨは、６、６．２５、６．５、６．７５、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．７５、８、８．２５又は８．５である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物のｐＨは、７、７．２、７．３又は８である。一部の実施形態では、試料／酵素混合物のｐＨは、７．３である。本出願人は、本発明の方法の使用において、酵素の反応に対して最小限の影響で、酵素反応に対する最適ｐＨ未満を使用することができるが、総合的な解析速度が高まることを予想外にも発見した（例えば、６つの試料の実行から９６又は１９２の試料の実施となり、同様に３〜５日間で全解析を実施する（例えば、３日間、４日間又は５日間））。
【００５９】
一部の実施形態では、試料調製は、室温で行われる。一部の実施形態では、試料調製、例えば、変性の条件は、３０〜６０℃の間、例えば、４５〜５５℃、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃で行われる。一部の実施形態では、試料調製、例えば、変性の条件は、１０〜３０℃の間、例えば、１８〜２６℃、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃、又は２０℃で行われる。
【００６０】
一部の実施形態では、解析用試料の調製は、試料／酵素混合物における、酵素、例えばタンパク質分解酵素の供給を含むことができる。酵素、例えば、タンパク質分解酵素は、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、又は当分野で公知の他の酵素とすることができる。前記酵素の使用方法及び特徴もまた、当分野において入手可能である。一部の実施形態では、酵素、例えば、タンパク質分解酵素は、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１５、１：１０、１：８、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２又は１：１となる比（酵素対タンパク質）で存在する。一部の実施形態では、酵素、例えばタンパク質分解酵素は、１：２０の比（酵素対タンパク質）で存在する。一部の実施形態では、酵素、例えばタンパク質分解酵素は、１：４０の比（酵素対タンパク質）で存在する。
【００６１】
１次元クロマトグラフィー
本明細書において記載されている方法において使用するのに好適な１次元（１Ｄ）クロマトグラフィーの方法は、当業者に周知であり、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。一部の実施形態では、１次元クロマトグラフィー方法は、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーである。クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動、イオン移動度を含むことができる。例えば、抗体のプロセス規模精製（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ２０１１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  ＩＳＢＮ：１１１８２１０７４３；抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、第１巻、生成及び精製（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ２０１３年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ；抗体の生成及び特徴付けにおける基礎方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｇａｒｙ  Ｃ．  Ｈｏｗａｒｄ  ２０００年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓも参照されたい。
【００６２】
さらなる例示的なクロマトグラフィー方法には、以下に限定されないが、強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、アミドカラムクロマトグラフィー及びそれらの組合せが含まれる。例示的な質量分析法（ＭＳ）には、以下に限定されないが、タンデムＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、質量分析法を伴うイオン移動分離（ＩＭＳ−ＭＳ）、電子移動解離（ＥＴＤ−ＭＳ）及びそれらの組合せが含まれる。例示的な電気泳動による方法には、以下に限定されないが、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ＣＥ−ＭＳ、ゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とその後の特定のグリカン構造を認識する抗体を使用するウェスタンブロッティング法、及びそれらの組合せが含まれる。例示的な核磁気共鳴（ＮＭＲ）には、以下に限定されないが、１次元ＮＭＲ（１Ｄ−ＮＭＲ）、２次元ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ）、相関分光磁気核スピンＮＭＲ（ＣＯＳＹ−ＮＭＲ）、全相関分光ＮＭＲ（ＴＯＣＳＹ−ＮＭＲ）、異核種単一量子コヒーレンスＮＭＲ（ＨＳＱＣ−ＮＭＲ）、異種核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ−ＮＭＲ）、回転核オーバーハウザー効果分光ＮＭＲ（ＲＯＥＳＹ−ＮＭＲ）、核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ−ＮＭＲ）及びそれらの組合せが含まれる。
【００６３】
質量分析法
本明細書に記載されている方法に使用するために好適な質量分析方法は、当業者に公知であり、例えば、エレクトロスプレーイオン化ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化ＭＳ、飛行時間型ＭＳ、フーリエ変換イオンサイクロン共鳴ＭＳ、四重極飛行時間型ＭＳ、リニア四重極、四重極イオントトラップ型ＭＳ、オービトラップ型、円筒形イオントラップ型、３次元イオントラップ型、四重極質量フィルター、タンデム質量分析法を含む。一部の実施形態では、質量分析法はタンデム質量分析法である。例えば、タンパク質の質量分析法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｊｕｌｉａｎ  Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇｅ  ２００８年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；タンデム質量分析法を使用するタンパク質配列決定及び同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋｉｎｔｅｒ  ２００５年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；質量分析法を使用するタンパク質治療剤の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｇｕｏｄｏｎｇ  Ｃｈｅｎ  ２０１４年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａも参照されたい。
【００６４】
生成パラメータ
生成パラメータは、本明細書で使用する場合、生成プロセスにおけるパラメータ又は要素である。選択することができる生成パラメータには、例えば、グリコタンパク質調製を生成するために使用される細胞又は細胞系、培養培地、培養プロセス又はバイオリアクター変数（例えば、回分、フィード回分又は潅流）、グリコタンパク質調製の精製プロセス及び製剤化が含まれる。
【００６５】
一次生成パラメータには、以下が含まれる：１）宿主のタイプ；２）宿主の遺伝学；３）培地タイプ；４）発酵プラットフォーム；５）精製ステップ；及び６）製剤化。二次生成パラメータは、本明細書で使用する場合、一次生成パラメータの各々内の、調節可能又は変化可能な生成パラメータである。例には、以下：所望のグルカン特性に基づく宿主サブクローンの選択；構成的又は誘発性宿主遺伝子レベルの調節；新規遺伝子又はプロモータ要素の導入；培地添加物（例えば、表ＩＶの部分リスト）；物理化学的成長特性；成長容器のタイプ（例えば、バイオリアクターのタイプ、Ｔフラスコ）；細胞密度；細胞周期；所望のグリカンタイプを含む生成物の富化（例えば、レクチン又は抗体が媒介する富化、イオン交換クロマトグラフィー、ＣＥ又は類似の方法による）；又は、当業者に明瞭な類似の二次生成パラメータが含まれる。
【００６６】
培地
本明細書に記載されている方法は、所望のグリカン特性（単数又は複数）に対して正の相関を有する、培地構成成分及び／若しくは培地構成成分の濃度を決定並びに／又は選択することを含むことができる。培地構成成分は、培養条件に応じて、グリコタンパク質生成の過程にわたり、又は培地の変更がある場合、添加又は投与することができる。培地構成成分は、培養物、及び細胞培養物の副生成物である、構成成分に直接添加される構成成分を含む。
【００６７】
培地構成成分には、例えば、緩衝剤、アミノ酸含有物、ビタミン含有物、塩含有物、無機含有物、血清含有物、炭素源含有物、脂質含有物、核酸含有物、ホルモン含有物、微量要素含有物、アンモニア含有物、共因子含有物、指示薬含有物、低分子含有物、加水分解物含有物及び酵素モジュレータ含有物が含まれる。
【００６８】
様々な培地構成成分の例は、以下が提示される：
アミノ酸    糖前駆体
ビタミン    指示薬
炭素源（天然及び非天然）    ヌクレオシド又はヌクレオチド
塩    ブチラート又は有機物
糖    ＤＭＳＯ
血清    動物由来の生成物
植物由来の水解物    遺伝子誘導物質
ピルビン酸ナトリウム    非天然糖
界面活性剤    細胞内ｐＨの調節剤
アンモニア    ベタイン又は浸透圧保護剤
脂質    微量要素
ホルモン又は成長因子    無機物
緩衝剤    非天然アミノ酸
非天然アミノ酸    非天然ビタミン
【００６９】
例示的な緩衝剤には、Ｔｒｉｓ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ビシン、ＢＥＳ、ＴＥＳ、コカジル酸塩、ＭＥＳ、酢酸塩、ＭＫＰ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、グリシンアミド及びアセトアミドグリシンが含まれる。培地は、血清不含とすることができるか、又は例えば、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、動物由来の血清代替物（例えば、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇ、ＳＦ及びＨＹ；脱脂粉乳；ウシＥＸ−ＣＹＴＥ）、フェチュイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、血清アルブミン及びトランスフェリンなどの動物由来生成物を含むことができる。血清不含培地が選択される場合、例えば、パルミチン酸及び／又はステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）などの脂質が含まれ得る。
【００７０】
脂質構成成分には、油、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、グリセリド、ステロイド、リン脂質、スフィンゴ脂質及びリポタンパク質が含まれる。培地に含まれ得る、又は培地から除去される例示的なアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを含む。培地中に存在し得る、又は培地から除去され得るビタミンの例には、ビタミンＡ（レチノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピロキシドン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ、ビタミンＥ及びビタミンＫが含まれる。
【００７１】
培地中に存在し得る、又は培地から除去され得る無機物の例には、ビスマス、ホウ素、カルシウム、塩素、クロム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ニッケル、リン、カリウム、ルビジウム、セレン、ケイ素、ナトリウム、ストロンチウム、硫黄、テルル、チタン、タングステン、バナジウム及び亜鉛が含まれる。例示的な塩及び無機物には、ＣａＣｌ２（無水）、ＣｕＳＯ４  ５Ｈ２Ｏ、Ｆｅ（ＮＯ３）．９Ｈ２Ｏ、ＫＣｌ、ＫＮＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４（無水）、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＥ３（無水）、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；リノール酸、リポ酸、Ｄ−グルコース、ヒポキサンチン２Ｎａ、フェノールレッド、ブトレシン２ＨＣｌ、ピルビン酸ナトリウム、チミジン、ピルビン酸、コハク酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸Ｎａ．六水和物、グルタチオン（還元型）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、リノール酸メチル、バクトペプトンＧ、アデノシン、シチジン、グアノシン、２’−デオキシアデノシンＨＣｌ、２’−デオキシシチジンＨＣｌ、２’−デオキシグアノシン及びウリジンが含まれる。所望のグリカン特徴が、減少したフルコシル化である場合、生成パラメータは、マンガン、例えば約０．１μＭ〜５０μＭの濃度で存在するマンガンの存在下で、細胞、例えばＣＨＯ細胞、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ不足ＣＨＯ細胞を培養することを含むことができる。フルコシル化の減少はまた、例えば、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、例えば、デヒドロ葉酸レダクターゼ不足ＣＨＯ細胞）を約３５０〜５００ｍＯｓｍのオスモル濃度で培養することにより得ることができる。オスモル濃度は、塩を培地に添加することにより、又は生成中に蒸発が発生するにつれて、塩を副生物として生成させることにより調節することができる。
【００７２】
ホルモンには、例えば、ソマトスタチン，成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、インスリン、プロラクチン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ソマトトロピン、エストラジオール及び黄体ホルモンが含まれる。成長因子には、例えば、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨由来成長因子（ＢＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、［米国特許第６，８３８，２８４（Ｂ２）からの成長因子］、ヘミン及びＮＡＤが含まれる。培地に存在し得る、又は培養培地から除去され得る界面活性剤の例には、Ｔｗｅｅｎ−８０及びｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が含まれる。低分子は、例えば、ブチラート、アンモニア、非天然糖、非天然アミノ酸、クロロキン及びベタインを含むことができる。
【００７３】
物理化学パラメータ
生成パラメータはまた、物理化学パラメータを含むことができる。このような条件は、温度、ｐＨ、オスモル濃度、せん断力又は撹拌速度、酸化、スパージ速度（ｓｐｕｒｇｅ  ｒａｔｅ）、成長容器、タンジェンシャルフロー、ＤＯ、ＣＯ２、窒素、フィード回分、レドックス、細胞密度及びフィード戦略を含むことができる。選択され得る物理化学パラメータの例には、例えば、ｐＨ、オスモル濃度、せん断力又は撹拌速度、酸化、スパージ速度、成長容器、タンジェンシャルフロー、回分溶解したＯ２、ＣＯ２、窒素、フィード回分、レドックス、細胞密度、潅流培養物、フィード戦略、温度及び培養時間を含むことができる。
【００７４】
追加の生成パラメータは、当業者に公知であり、例えば、抗体発現及び生成（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）（２０１１年）（編）Ｍｏｈａｍｅｄ  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【００７５】
生成物、及びそれらをコードする核酸
生成物、例えば、本発明の方法に列挙されている細胞及び生成物を生成することが可能な細胞又は細胞系を特定、選択又は作製する方法が、本明細書において提供される。本開示によって包含されている生成物には、以下に限定されないが、ある細胞により生成し得る、例えば、発現し得る、分子、核酸、ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体）、又はそれらのハイブリッドが含まれる。一部の実施形態では、細胞は、生成物を生成するよう、操作されている、又は修飾されている。このような修飾には、生成物の生成を制御又はこれをもたらす分子の導入を含む。例えば、細胞は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を導入することにより修飾されて、この細胞は、生成、例えば、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドの発現及び分泌に好適な条件下で培養される。
【００７６】
実施形態では、培養した細胞を使用して、治療的使用のための、タンパク質、例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体、及び／又は組換えタンパク質を生成する。実施形態では、培養した細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学的中間体又は代謝産物を生成する。例えば、実施形態では、約４０００ダルトンから約１４０，０００ダルトン超の分子量を有する分子を生成することができる。実施形態では、これらの分子は、幅広い複雑性を有することができ、グリコシル化を含めた、翻訳後修飾を含むことができる。
【００７７】
実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（又はボツリヌスニューロトキシンの他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射）、インターフェロンアルファ−ｎｌ、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド、カルシトニン、エタネルセプト、ヘモグロビンｇｌｕｔａｍｅｒ２５０（ウシ）、ドロトレコジンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ナコグアルファ、モナニン，エプタコグアルファ（活性型）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、アルプンメート（Ａｌｐｈｎｍａｔｅ）、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラシチム、セルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラムリンチド、イニグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン、モルグラモスチン、トリプトレリン酢酸塩、ヒストレリン（Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、リュープロリド（ＡＴＲＩＧＥＬ）、リュープロリド（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ユートロピン、ソマトロピン、メカセルミン、エンルファビチリド、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリシン、インスリン（吸入型）、インスリンリスプロ、インスリンデテルミル、インスリン（ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシチド、ミエロピド、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、酢酸グラチラマー、ゲポン、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリベ、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセニン、ロフェロン−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス‘組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン，ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、ＣＴＣ−１１１、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチリン、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクチムン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４、エポエチンデルタ、トランスジェニック抗トロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトラーゼ、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イズルスルファーゼ、オムナパトリラート、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル，イカチバント、エカランチド、オミガナン、オーログラブ、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド、チファコジン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、ダイアミド、ＤＷＰ−４１２，成長ホルモン、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン、インスリン（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−ｎ３、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、リポキシサン、ルスプルチド、ＭＰ５２、シプリューセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア、ビテスペン、ヒトトロンビン、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ、テルリプレシン、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、Ｂｏｗｍａｎ  ＢｉｒＫ型阻害剤、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス、オザレリクス、ロルニデプシン、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、ペプスカン、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジチド、アルブフェロン、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ−２，オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ネミフィチド、ｒＡＡＴ、ＣＧＲＰ、ペグスネルセプト、チモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サーモンカルシトニン（ｅｌｉｇｅｎ）、エクサモレリン、カプロモレリン、カルデバ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、ク���サリン、ｒＮＡＰｃ２、組換え第Ｖ因子１１１（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、ソノリシスプロリーゼ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エクセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン、ＡＣＭ−９６０４、リナクロチドエアセタート、ＣＥＴｉ−１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ、速効性インスリン（注射剤、Ｖｉａｄｅｌ）、インスリン（ｅｌｉｇｅｎ）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ、ムルチキン、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０、タラクトフェリン、ｒＥＶ−１３１、ｒＥＶ−１３１、組換えヒトインスリン、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン、胆汁酸活性化リパーゼ、メリスパーゼ、アラリンホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、ＡＬＴＵ−１３５、組換えノイラミニダーゼ、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、Ｔａｔタキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、オスタボリン−Ｃ、ＰＴＨアナログ、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆ、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａ、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組換え  ｐｌａｇｕｅ  ＦＩＶ、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７、ＰＲ１ペプチド抗原、変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチン、ＷＴ１−ペプチド、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン、ルピントリビル、レチクロース、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ−ガラクトシダーゼ  Ａ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２−特異的免疫毒素、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン−受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７、Ｌ−１９をベースとするｒａ、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨ、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ、Ａ���Ｐ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン、ｒ（ｍ）ＣＲＰ，肝選択的インスリン、スバリン、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、テリパラチド（ｅｌｉｇｅｎ）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合物、ＥＰ−１０４３、ｇｐＥ１、ｇｐＥ２、ＭＦ−５９、ｈＰＴＨ（１−３４）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクムニン、ＢＩＭ−２３１９０、多重エピトープチロシナーゼペプチド、エンカスチム、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的ＴＮＦ、デスモプレシン、オンルセプト及びＴＰ−９２０１である。
【００７８】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、アダリムバブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ  ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））又は任意の他の好適なポリペプチド（バイオシミラー及びバイオベターを含む）である。
【００７９】
他の適切なポリペプチドは、以下及びＵＳ２０１６／００９７０７４の表１に列挙されているものである。
【表１−１】
2019533135.tif 000003
【表１−２】
2019533135.tif 000004
【表１−３】
2019533135.tif 000005
【表１−４】
2019533135.tif 000006
【００８０】
実施形態では、ポリペプチドは、表２に示されている、ホルモン、血液凝固／凝固因子、サイトカイン／成長因子、抗体分子（ｍｏｌｅｌｃｕｌｅ）、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。
【表２−１】
2019533135.tif 000007
【表２−２】
2019533135.tif 000008
【表２−３】
2019533135.tif 000009
【表２−４】
2019533135.tif 000010
【００８１】
実施形態では、タンパク質は、表３に示されている、多重特異的タンパク質、例えば、二重特異的抗体である。
【表３−１】
2019533135.tif 000011
【表３−２】
2019533135.tif 000012
【表３−３】
2019533135.tif 000013
【表３−４】
2019533135.tif 000014
【表３−５】
2019533135.tif 000015
【表３−６】
2019533135.tif 000016
【表３−７】
2019533135.tif 000017
【表４−１】
2019533135.tif 000018
【表４−２】
2019533135.tif 000019
【表５−１】
2019533135.tif 000020
【表５−２】
2019533135.tif 000021
【表６−１】
2019533135.tif 000022
【表６−２】
2019533135.tif 000023
【表７−１】
2019533135.tif 000024
【表７−２】
2019533135.tif 000025
【表８−１】
2019533135.tif 000026
【表８−２】
2019533135.tif 000027
【表９】
2019533135.tif 000028
【００８２】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、がん細胞によって発現される抗原である。一部の実施形態では、組換え又は治療ポリペプチドは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。一部の実施形態では、組換え又は治療ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレチクリン、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、癌胎児性抗原（ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングリオシドＧＤ３、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、グリコタンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様成長因子受容体１、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ−６、黒色腫特異的コンドロイチンスルファートプロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソテリン、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６，ミュラー管阻害性物質（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩ、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ、抗原、ＴＮＦ−アルファ前駆体及びそれらの組合せから選択される。
【００８３】
一部の実施形態では、ポリペプチドは活性受容体であり、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α４β１インテグリン、β２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤ１ＯＯ、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭｌ（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳｌ（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＫＩＲの活性化形態、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、１つ又は複数の天然細胞毒性受容体、ＮＴＢ−Ａ、ＰＥＮ−５、及びそれらの組合せから選択され、場合により、β２インテグリンは、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１  ｂ−ＣＤ  １８又はＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８を含み、場合によりＫＩＲの活性化形態は、ＫＩＲ２ＤＳｌ、ＫＩＲ２ＤＳ４又はＫＩＲ−Ｓを含み、場合により天然細胞毒性受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６又はＮＫｐ８０を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、阻害性受容体であり、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−ｌ／ＣＤ８５ｊ、ＫＩＲの阻害性形態、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９及びそれらの組合せから選択され、場合により、ＫＩＲの阻害性形態は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２又はＫＩＲ−Ｌを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、活性受容体であり、ＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙｌ０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）及びそれらの組合せから選択される。
【００８６】
一部の実施形態では、ポリペプチドは阻害性受容体であり、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈｌ（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）及びそれらの組合せから選択される。
【００８７】
他の例示的なタンパク質には、以下に限定されないが、Ｌｅａｄｅｒら、「タンパク質治療剤：まとめ及び薬理学的分類（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００８年、７巻：２１〜３９頁（参照により組み込まれている）の表１〜１０に記載されている任意のタンパク質；又は本明細書に記載されている任意のコンジュゲート、変異体、アナログ若しくは組換えポリペプチドの機能的断片が含まれる。
【００８８】
他の組換えタンパク質生成物には、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ及びアドネクチンなどの非抗体足場又は代替的なタンパク質足場を含むが、これらに限定されない。このような非抗体足場又は代替タンパク質足場は、１つ若しくは２つ、又はそれ超、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つ、又はそれ超の異なる標的又は抗原を認識或いは結合するよう操作され得る。
【００８９】
同様に、核酸、例えば、生成物、例えばポリペプチド、例えば本明細書に記載されている組換えポリペプチドをコードする外因性核酸が本明細書において提供されている。所望の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、所望の核酸配列、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリをスクリーニングすること、核酸を含むことが知られているベクターに由来する核酸配列を誘導する、又は標準的技法を使用して、細胞及びこれを含有する組織から直接単離するなどにより、当分野において公知の組換え法を使用して得ることができる。代替的に、組換えポリペプチドをコード化する核酸は、クローニングよりはむしろ、合成により生成することができる。組換えＤＮＡ技法及び技術は、高度に進歩し、当分野において、十分に確立されている。したがって、本明細書に記載されている組換えポリペプチドのアミノ酸配列の知識を有する当業者は、組換えポリペプチドをコードすると思われる核酸配列を容易に想起及び生成することができる。
【００９０】
一部の実施形態では、外因性核酸は、宿主細胞によって内因的に発現される生成物の発現を制御する。このような実施形態では、外因性核酸は、内因性生成物の発現を増大させる１種又は複数の核酸を含む（本明細書では、「内因性生成物のトランス活性化配列」とも呼ばれる）。例えば、内因性生成物の発現を増大する核酸配列は、構成的に活性なプロモータ、又はより強力な、例えば所望の部位における転写を増大する、例えば、所望の内因性遺伝子生成物の発現を増大するプロモータを含む。内因性生成物のトランス活性化配列を含む、外因性核酸の導入後、前記外因性核酸は、例えば、内因性生成物をコードするゲノム配列に近位の事前選択された位置において、細胞の染色体ゲノムに統合され、こうして、内因性生成物のトランス活性化配列により、所望の内因性生成物のトランス活性化又は発現は増大される。細胞を修飾するため、例えば外因性核酸を導入するため、内因性生成物の発現を増大させるための他の方法が、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，２７２，０７１号に記載されている。
【００９１】
本明細書に記載されている生成物の発現は、組換えポリペプチド又はその一部をコードする核酸をプロモータに操作可能に連結して、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって、通常、実現される。ベクターは、真核生物又は原核生物の複製及び統合に好適となり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモータなどの他の調節要素を含有する。
【００９２】
生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする、又は内因性生成物の発現を制御することができる核酸配列を含む、本明細書に記載されている核酸配列は、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、以下に限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含めた、ベクターにクローニングすることができる。特に対象とするベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及び配列決定ベクターを含む。実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２年、分子クローニング：実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルにおいて記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、以下に限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含む。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物における複製機能の起点、プロモータ配列、好都合の制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又は複数の選択可能マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。ウイルスに由来するベクターは、娘細胞において、導入遺伝子及びその伝播の長期的に安定な統合を可能にするので、長期遺伝子移入を実現する好適な手段である。
【００９３】
ベクターはまた、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来）、原核生物におけるエピソーム複製及び複製（例えば、ＳＶ４０起源、及びＣｏｌＥ１又は当分野で公知の他のもの）、及び／又は選択を可能にする要素、例えば選択マーカー若しくはレポーター遺伝子を含むことができる。
【００９４】
一実施形態では、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドを発現するために転写開始を可能にするポリメラーゼの動員を担う、プロモータ配列をさらに含む。一実施形態では、本明細書に記載されている方法に好適なプロモータ配列は、通常、高量の転写を推進するためのエンヘンサーに通常、関連し、したがって、標的外因性ｍＲＮＡの大きなコピーをもたらす。実施形態では、プロモータは、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）の主要前初期プロモータ（Ｘｉａ、Ｂｒｉｎｇｍａｎｎら、２００６年）及びＳＶ４０プロモータ（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、Ｍｏｒｙら、１９８４年）を含み、それらのどちらも、それらの同名のウイルスに由来するか、又はそれらから誘導されるプロモータである。いくつかの他のそれほど一般的ではないウイルスプロモータが、ラウス肉腫ウイルス長端末反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）、及びモロニーマウス白血病レトロウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲ（Ｐａｐａｄａｋｉｓ、Ｎｉｃｋｌｉｎら、２００４年）を含めた、発現ベクターに含ませる際に、転写を推進するために首尾よく使用されてきた。別の実施形態では、特異的内因性哺乳動物プロモータを、目的の遺伝子の構成的転写を推進するために利用することができる（Ｐｏｎｔｉｌｌｅｒ、Ｇｒｏｓｓら  ２００８年）。ＣＨＯ特異的チャイニーズハムスター伸長因子１−アルファ（ＣＨＥＦ１α）プロモータは、ウイルスをベースとする配列に高収量の代替物をもたらす（Ｄｅｅｒ、Ａｌｌｉｓｏｎ  ２００４年）。プロモータに加え、本明細書に記載されているベクターは、上記のエンヘンサー領域；転写速度を上方調節するための転写因子を動員することができるコアプロモータに近位の特異的ヌクレオチドモチーフ領域をさらに含む（Ｒｉｅｔｈｏｖｅｎ  ２０１０年）。プロモータ配列と同様に、これらの領域は、多くの場合、ウイルスから誘導され、ｈＣＭＶ及びＳＶ４０エンハンサー配列などのプロモータ配列内に包含される、又はアデノウイルス由来配列などのものがさらに含まれ得る（Ｇａｉｌｌｅｔ、Ｇｉｌｂｅｒｔら  ２００７年）。
【００９５】
一実施形態では、生成物、例えばポリペプチド、例えば本明細書に記載されている組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。一実施形態では、選択可能マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）；ジヒドロフォラートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）に耐性をもたらす酵素；又はハイグロマイシン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオシン、ピューロマイシン又はブラストサイジンなどの抗生物質に耐性をもたらす酵素を含む抗生物質マーカーを含む。別の実施形態では、選択マーカーは、Ｓｅｌｅｘｉｓ選択システム（例えば、Ｓｅｌｅｘｉｓ  ＳＡから市販されている、ＳＵＲＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）及びＳｅｌｅｘｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（商標））又はＣａｔａｌａｎｔ選択システムを含むか、又はこれらと適合する。
【００９６】
一実施形態では、本明細書に記載されている組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、細胞を特定するのに有用な選択マーカーを含む、又は細胞は、本明細書に記載されている組換え生成物をコードする核酸を含む。別の実施形態では、選択マーカーは、本明細書に記載されている通り、組換え生成物をゲノムにコードする核酸配列の統合を含む細胞（単数又は複数）を特定するのに有用である。ある細胞、又は組換えタンパク質をコードする核酸配列を統合した細胞の特定は、ある細胞、又は生成物を安定的に発現する細胞系の選択及び操作に有用となり得る。
【００９７】
使用に好適なベクターは市販されており、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃから入手可能なＧＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）、ＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現システム又はＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ技術に関連するベクター、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｆａｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．（２０１３年）；１巻（５号）：４８７〜５０２頁に記載されているベクターを含む。ＧＳ発現ベクターは、ＧＳ遺伝子、又はその機能的断片（例えば、ＧＳミニ遺伝子）、及び１つ又は複数の、例えば１つ、２つ若しくは３つ又はそれ超の、目的遺伝子の発現のための非常に効率的な転写カセット、例えば、本明細書に記載されている組換えポリペプチドをコードする核酸を含む。ＧＳミニ遺伝子は、ゲノムＣＨＯ  ＧＳ遺伝子のイントロン６を含む、例えば、これらからなる。一実施形態では、ＧＳベクターは、ＳＶ４０Ｌプロモータ、及び１つ又は２つのポリＡシグナルに操作可能に連結したＧＳ遺伝子を含む。別の実施形態では、ＧＳベクターは、ＳＶ４０Ｅプロモータ、ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化シグナルに操作可能に連結しているＧＳ遺伝子を含む。このような実施形態では、例えば、目的の遺伝子、又は本明細書に記載されている組換えポリペプチドを発現するための転写カセットは、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモータ、及び第１のイントロンを含めたｈＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子からの５’−未翻訳配列を含む。他のベクターは、ＧＳ発現ベクターに基づいて構築され得、例えば、この場合、他の選択マーカーが、本明細書に記載されている発現ベクターにおけるＧＳ遺伝子に置きかえられている。
【００９８】
本明細書に記載されている方法に使用する好適なベクターは、以下に限定されないが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＡＴ、ｐｃＤＮＡ３．３ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＴａｒｇｅｔ、ＨａｌｏＴａｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）；ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ｐＣＭＶ６（Ｏｒｉｇｅｎｅ）；ｐＥＥ１２又はｐＥＥ１４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）又はｐＢＫ−ＣＭＶ／ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ−７／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの他の市販のベクターを含む。
【００９９】
細胞及び細胞培養物
実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞以外の細胞である。実施形態では、細胞は、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、イヌ、ウマ、フェレット又はネコである。実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、又はげっ歯類細胞、例えば、ハムスター細胞、マウス細胞又はラット細胞である。別の実施形態では、細胞は、アヒル、オウム、魚、昆虫、植物、真菌又は酵母に由来する。一実施形態では、細胞は古細菌である。実施形態では、細胞は、放射菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の種、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。
【０１００】
一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。
【０１０１】
別の実施形態では、細胞は、ＨｅＩａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１及びＣＨＯＺＮ、又はこれらに由来する任意の細胞である。一実施形態では、細胞は幹細胞である。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載している細胞のうちのいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養物中の任意の一次細胞に由来する細胞である。
【０１０２】
実施形態では、細胞は、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、例えば、組換えポリペプチド、例えば表１又は２から選択される組換えポリペプチドを発現する本明細書に記載している細胞のいずれか１つである。
【０１０３】
大規模生成
本明細書に記載されている装置、設備及び方法は、原核細胞系及び／又は真核細胞系を含めた、任意の所望の細胞系を培養するのに好適である。さらに、実施形態では、装置、設備及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（接着性）細胞を培養するのに好適であり、ポリペプチド生成物、核酸生成物（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）などの医薬生成物及びバイオ医薬生成物、或いは細胞及び／若しくはウイルス治療に使用されるものなどの細胞及び／又はウイルスの生成のために構築されている生成操作に好適である。
【０１０４】
実施形態では、細胞は、組換え治療生成物又は診断生成物などの生成物を発現又は生成する。細胞によって生成する生成物の例には、以下に限定されないが、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異的抗体）、抗体模倣物（抗原に特異的に結合するが、例えばＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディ、アドネクチン又はＩｇＮＡＲなどの抗体に構造的に関連していない、ポリペプチド分子）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療剤（例えば、遺伝子治療及びウイルス免疫療法のための抗がん腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター）、細胞治療剤（例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞及び成人幹細胞）、ワクチン又は脂質封入粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）又はＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質又はアミノ酸が含まれる。実施形態では、装置、設備及び方法は、バイオシミラーを生成するために使用され得る。
【０１０５】
明記されている通り、実施形態では、装置、設備及び方法により、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、又は、例えば、酵母細胞若しくは糸状真菌細胞などの下等真核細胞、又はグラム陽細胞若しくはグラム陰性細胞などの原核細胞の生成、及び／或いは真核細胞又は原核細胞の生成物、例えば真核細胞により大規模で合成される、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）の生成を可能にする。本明細書で特に明記されない限り、装置、設備及び方法は、以下に限定されないが、ベンチスケール、パイロットスケール及び実生産スケールの生産量を含めた、任意の所望の容量又は生成を含むことができる。
【０１０６】
実施形態では、装置及び方法により、細胞の生成（単数及び複数）、とりわけ、細胞、例えば哺乳動物細胞により、大規模で合成される、タンパク質、ペプチド（上で詳細に議論されている）、抗生物質又はアミノ酸の生成が可能になる。
【０１０７】
多数のフラスコ、ボトル、反応器及び制御器により、細胞培養システムの生成及びスケールアップが可能となる。このシステムは、所望のグリカン特性（単数又は複数）とのその相関に、少なくとも一部基づいて選択することができる。細胞は、例えば、回分、フィード回分、潅流、又は連続培養として成長させることができる。選択され得る生成パラメータは、例えば、培地を集める時（培養時間の間の早期、中期又は後期）及び頻度を含めた培地の添加又は除去；細胞培養物が撹拌される速度の上昇又は低下；細胞が培養される温度の上昇又は低下；培養密度が調節されるような培地の添加又は除去；細胞培養を開始又は停止する時間の選択、及び細胞培養パラメータが変更される時間の選択を含む。このようなパラメータは、回分、フィード回分、潅流及び連続培養条件のうちのいずれかについて選択され得る。
【０１０８】
実施形態では、大規模生成のための培養細胞は、真核細胞、例えば、動物細胞、例えば哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト細胞系、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系又はハイブリ−ドーマ細胞系とすることができる。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞系である。
【０１０９】
実施形態では、大規模生成のための培養細胞は、上で詳細に議論した抗体、例えば、モノクローナル抗体、及び／又は組換えタンパク質、例えば治療的使用のための組換えタンパク質を生成するために使用される。実施形態では、細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学的中間体又は代謝産物を生成する。
【０１１０】
実施形態では、大規模生成のための細胞は、医療、研究又は商業的目的のための、真核細胞、生化学マーカー、目的の組換えペプチド又はヌクレオチド配列、タンパク質、酵母、昆虫細胞、安定な又はウイルス感染した、ＣＨＯ細胞、サル細胞、溶解生成物などの、鳥類の細胞又は哺乳動物細胞である。
【０１１１】
実施形態では、大規模生成のための細胞は、原核細胞である、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などのグラム陽性細胞の株である。実施形態では、宿主細胞は、フィルミクテス門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）であり、例えば宿主細胞は、バシラス属である。使用することができるバシラス（ＢＳａｃｉｌｌｕｓ）は、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ・アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ・リケニフォミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、納豆菌（Ｂ．ｎａｔｔｏ）、Ｂ・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などの株などである。実施形態では、宿主細胞は、枯草菌３ＮＡ及び枯草菌１６８などの枯草菌である。バシラス属は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６、４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０−１２１４から得ることができる。
【０１１２】
実施形態では、大規模生成のための原核細胞は、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細胞、例えば、市販されている、株ＴＧ１、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉである。
【０１１３】
適切な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）などの、微生物株保存機関から市販されている。
【０１１４】
実施形態では、細胞培養は、回分培養、フィード回分培養、抜き取り及び充填培養又は連続培養として行われる。実施形態では、細胞培養は、懸濁培養である。一実施形態では、細胞又は細胞培養は、組換えポリペプチドを発現するため、インビボで置かれ、例えばモデル生物又はヒト対象に置かれる。
【０１１５】
一実施形態では、培養培地は血清不含である。血清不含及びタンパク質不含培地は、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓで市販されている。
【０１１６】
哺乳動物細胞系に好適な培地及び培養方法は、例えば、米国特許第５，６３３，１６２号において記載されている通り、当分野において周知である。実験室でのフラスコ又は低密度細胞培養のため、及び特定の細胞タイプの需要に適合されている、標準的細胞培養培地の例は、例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ、Ｇ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９ｆ頁．１９６７年）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ａ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ、７８巻、１頁１７３ｆｆ、１９６３年）、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地（Ｈａｍ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．５３巻、２８８ｆｆ．頁、１９６５年）又はイスコフ改変ＤＭＥＭ培地（アルブミン、トランスフェリン及びレシチンがない）（Ｉｓｃｏｖｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１巻、９２３ｆｆ．頁、１９７８年）である。例えば、ハムＦ１０又はＦ１２培地は、ＣＨＯ細胞培養のために特に設計されたものである。ＣＨＯ細胞培養に特に適合させた他の培地は、ＥＰ−４８１７９１に記載されている。このような培養培地は、ウシ胎児血清が補給され得（ＦＢＳ、ウシ胎児血清ＦＣＳとも呼ばれる）、後者のウシ胎児血清は、天然源の多量のホルモン及び成長因子を供給することが知られている。哺乳動物の細胞培養は、最近では、科学教科書及びマニュアルに十分に記載されている決まった手順の操作であり、例えば、Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｎｅｙ、動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）、マニュアル、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ／Ｎ．Ｙ．、２０００年に詳細に網羅されている。
【０１１７】
他の好適な培養方法は、当業者に公知であり、利用される組換えポリペプチド生成物及び宿主細胞に依存し得る。細胞により発現される組換えポリペプチドの発現及び生成に好適な条件を決定又は最適化することは、当業者の技量の範囲内にある。
【０１１８】
一態様では、大規模生成のための細胞又は細胞系は、生成物、例えば、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。実施形態では、細胞又は細胞系は、生成物、例えば、治療生成物又は診断生成物を発現する。所望のポリペプチド又はタンパク質を発現する細胞を遺伝子修飾又は操作するための方法は、当分野で周知であり、例えば、トランスフェクト、形質導入（例えば、ウイルス形質導入）又は電気穿孔法を含む。
【０１１９】
核酸、例えば本明細書に記載されている外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃法、マイクロインジェクション、電気穿孔法などを含む。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２年、分子クローニング：実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい。
【０１２０】
核酸、例えば本明細書に記載されている外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入する化学的手段は、マクロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含めた脂質をベースとする系などの、コロイド状分散液系を含む。送達用ビヒクルとして、インビトロ及びインビボで使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。標的化ナノ粒子又は他の好適なサブミクロンサイズの送達系によるポリヌクレオチドの送達などの、核酸の最先端技術の標的送達の他の方法が利用可能である。
【０１２１】
実施形態では、宿主細胞の核酸、例えば宿主細胞のゲノム又は核酸染色体への外因性核酸の統合が望ましい。宿主細胞のゲノムへの外因性核酸の統合が行われたかどうかを決定する方法は、ＧＳ／ＭＳＸ選択方法を含むことができる。ＧＳ／ＭＳＸ選択方法は、組換えＧＳ遺伝子によるグルタミン補助栄養の相補性を使用して、細胞から高い発現レベルのタンパク質を選択する。手短に言えば、ＧＳ／ＭＳＸ選択方法は、組換えポリペプチド生成物をコード化する外因性核酸を含むベクター上のグルタミンシンテターゼをコードする核酸を含ませることを含む。メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）の投与により、ゲノムに安定的に統合された細胞が選択され、外因性核酸は、組換えポリペプチドとＧＳの両方をコードする。ＧＳが、一部の宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞により内因的に発現され得ると、ＭＳＸによる選択の濃度及び期間を最適化して、宿主ゲノムに組換えポリペプチドをコードする外因性核酸の安定的な統合により、高度に生成する細胞を特定することができる。ＧＳ選択及びその系は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｆａｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．（２０１３年）；１巻（５号）：４８７〜５０２頁にさらに記載されている。
【０１２２】
宿主細胞ゲノムに外因性核酸を安定的に統合させた細胞を特定及び選択するための他の方法は、以下に限定されないが、外因性核酸上にレポーター遺伝子を含ませること、及び細胞におけるレポーター遺伝子の存在を査定すること、並びに外因性核酸のＰＣＲ解析及び検出を含むことができる。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、選択された、特定された又は生成した細胞は、安定に発現させるため、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を統合するための選択方法しか使用しないで、選択される細胞よりも高い収量のタンパク質生成物を生成することができる。実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して選択、特定又は生成される細胞は、タンパク質分解の阻害剤に接触させない細胞、又は安定に発現させるため、例えば、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を統合するために選択されるためだけの細胞と比べて、生成物、例えば組換えポリペプチドを、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍若しくは１０倍又はこれ超で生成する。
【０１２４】
細胞系及び組換えポリペプチド生成の方法
哺乳動物及び微生物選択系の両方における現状技術は、ＤＮＡのＲＮＡの転写レベルにおいて、選択圧を適用することである。目的遺伝子は、選択マーカーに強く連結されており、これにより、選択マーカーを高いレベルで発現させて、目的遺伝子の高い発現をもたらす可能性が高い。選択マーカーを高いレベルで発現する細胞は、生存及び増殖を行うことができ、そうでない細胞は、生存及び増殖をする可能性は低く、例えば、アポトーシスする及び／又は死滅する。このように、細胞の集団は、選択マーカー、及び暗示的に高いレベルで目的遺伝子を発現する細胞で富化し得る。この方法は、直接的なタンパク質の発現を非常に首尾よく行えることが証明されている。実施形態では、本明細書に記載されている方法は、実質的に純粋なタンパク質生成物を実現する。本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」は、発熱性物質が実質的に不含である、核酸が実質的に不含である、並びに／又は内因性細胞のタンパク質酵素及び宿主細胞に由来する構成成分（ポリメラーゼ、リポソームタンパク質及びシャペロンタンパク質など）が実質的に不含であることが意図されている。実質的に純粋なタンパク質生成物は、宿主細胞に由来する、混入した内因性タンパク質、核酸又は他のマクロ分子が、例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満しか含有していない。
【０１２５】
生成物、例えば組換えポリペプチドの回収及び精製方法は、当分野において十分に確立されている。組換えポリペプチド生成物を回収するため、物理的又は化学的又は物理化学的方法を使用する。物理的又は化学的又は物理化学的方法は、ろ過方法、遠心分離法、超遠心分離法、抽出法、凍結乾燥法、沈殿法、結晶化法、クロマトグラフィー法、又はそれらの２つ以上の方法の組合せとすることができる。実施形態では、クロマトグラフィー方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（又は、ゲルろ過）、イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び／又はマルチモーダルクロマトグラフィーのうちの１つ又は複数を含む。
【０１２６】
本明細書に記載されている装置、設備及び方法は、原核細胞及び／又は真核細胞を含めた、任意の所望の細胞を培養するのに好適である。本方法は、例えば、反応器、例えばバイオリアクター中で行うことができる。さらに、実施形態では、装置、設備及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（接着性）細胞を培養するのに好適であり、ポリペプチド生成物などの分子生成物、或いは細胞及び／若しくはウイルス治療に使用されるものなどの細胞及び／又はウイルスの生成のために構成されている生成操作に好適である。
【０１２７】
実施形態では、細胞は、組換え治療生成物又は診断生成物などの生成物を発現又は生成する。以下により詳細に記述されている通り、細胞により生成する生成物の例は、以下に限定されないが、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異的抗体）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、又は脂質封入粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）を含む。実施形態では、装置、設備及び方法は、バイオシミラーを生成するために使用することができる。
【０１２８】
実施形態では、装置、設備及び方法により、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、及び／又は真核細胞、例えば、真核細胞により大規模で合成される、タンパク質、ペプチド、抗生物質又はアミノ酸である生成物の生成を可能にする。本明細書において特に明記されない限り、装置、設備及び方法は、以下に限定されないが、ベンチスケール、パイロットスケール及び実生産スケールの生産量を含めた、任意の所望の容量又は生成を含むことができる。
【０１２９】
さらに、及び特に本明細書に明記されていない限り、装置、設備及び方法は、以下に限定されないが、撹拌式槽、エアリフト、繊維、マイクロ繊維、中空繊維、セラミック製マトリックス、流動床、固定床、噴流床及び／又は撹拌式バイオリアクタ槽を含めた、任意の好適な反応器を含むことができる。例えば、一部の態様では、例となるバイオリアクターユニットは、以下：栄養素及び／炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の流通、気相及び液相の分離、温度の維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、及び／又は清浄／滅菌のうちの１つ若しくは複数、又はすべてを行うことができる。発酵ユニットなどの例となる反応器ユニットは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００個、又はそれより多いバイオリアクターを含むことができる。様々な実施形態では、バイオリアクターは、回分、半フィード回分、フィード回分、潅流及び／又は連続発酵プロセスに好適となり得る。任意の好適な反応器の直径を使用することができる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの間の容量を有することができる。非限定例には、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル及び／又は５０，０００リットルの容量を含む。さらに、好適な反応器は、多回使用、単回使用、使い捨て又は非使い捨てとすることができ、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ、又は任意の他の好適なステンレス鋼）などの金属合金、及びインコネル、プラスチック及び／又はガラスを含めた任意の好適な材料から形成され得る。一部の実施形態では、好適な反応器は、丸型、例えば円筒形とすることができる。一部の実施形態では、好適な反応器は、正方形、例えば長方形とすることができる。正方形型反応器は、一部の場合、使用の容易さ（例えば、熟練者による投入及び設定）、反応器の内容物のより強い混合及び均質性、並びに床設置面積が小さいなどの、円形反応器よりも利点をもたらすことがある。
【０１３０】
実施形態では、及び本明細書において特に明記されていない限り、本明細書に記載されている装置、設備及び方法はまた、このような生成物の分離、精製及び単離を行うための操作及び／又は装置などの、特に明記されていない、任意の好適な単位操作及び／又は装置を含むことができる。伝統的な現場組み立て設備、モジュール設備又は任意の他の好適な建築物、設備及び／又はレイアウトなどの任意の好適な設備及び環境を使用することができる。例えば、一部の実施形態では、モジュールクリーンルームを使用することができる。さらに、及び特に明記しない限り、本明細書に記載されている装置、システム及び方法は、単一位置又は設備に収容する、及び／又はこれらで行うことができるか、或いは代替として、離れた若しくは複数の位置及び／又は設備に収容する、並びに／又はこれらで行うことができる。
【０１３１】
非限定例により及び非限定的に、全体が参照により明細書に組み込まれている、米国特許公開第２０１３／０２８０７９７号；同第２０１２／００７７４２９号；同第２０１１／０２８０７９７号；同第２００９／０３０５６２６号、並びに米国特許第８，２９８，０５４号；同第７，６２９，１６７号；及び同第５，６５６，４９１号は、好適となり得る、例となる設備、装置及び／又はシステムを記載している。
【０１３２】
実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト又はげっ歯類又はウシの細胞系又は細胞株とすることができる。このような細胞、細胞系又は細胞株の例は、例えば、マウス骨髄腫（ＮＳ０）−細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３，ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性細胞系又はハイブリドーマ細胞系とすることができる。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞系である。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。真核細胞はまた、例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３などの鳥類の細胞、細胞系又は細胞株とすることができる。
【０１３３】
一実施形態では、真核細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成人幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの、多能性幹細胞とすることができる。
【０１３４】
実施形態では、培養細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト細胞系、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系又はハイブリドーマ細胞系とすることができる。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞系である。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。
【０１３５】
実施形態では、細胞は、酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、藻細胞（例えば、藍色細菌（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ））、又は植物細胞（例えば、タバコ、アルファルファ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎ））である。一実施形態では、細胞はげっ歯類細胞である。別の実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯ−Ｋ１である。
【０１３６】
実施形態では、細胞は幹細胞である。一実施形態では、細胞は、本明細書において記載されている細胞のうちのいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養物中の任意の一次細胞に由来する細胞である。
【０１３７】
実施形態では、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞又は非実質細胞などの肝細胞である。例えば、細胞は、付着型代謝適格ヒト肝細胞（ｐｌａｔｅａｂｌｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、付着型誘導適格ヒト肝細胞、付着型Ｑｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁適格ヒト肝細胞（１０名及び２０名のドナーからプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパ−細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一又はプールしたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアケゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（ドメスティックショートヘア肝細胞を含む）及びウサギ肝細胞（ニュージンランドホワイト肝細胞を含む）とすることができる。例となる肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ＬＬＣ、６  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ２７７０９から市販されている。
【０１３８】
一実施形態では、真核細胞は、例えば、酵母細胞（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｅｎｕｓ）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、メチロトローフ酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）及びピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｇｅｎｕｓ）（例えば、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）又はコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｕｓ）（例えば、出芽酵母、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミケス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミケス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ））、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｕｓ）（例えば、クルイベロミケス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、乳糖発酵性酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｅｎｕｓ）（例えば、キャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、キャンディダ・ボイジニニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｅｎｕｓ）（例えば、ジオトリカム  ファメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、（ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヨロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はシゾサッカロマイセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などの下等真核細胞である。ピキア・パストリスの種が好ましい。ピキア・パストリス株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ；及びＣＢＳ７４３５である。
【０１３９】
一実施形態では、真核細胞は、真菌細胞（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａなど））、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）（Ａ．テルモフィルム（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など）、ケタマカビ（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）（Ｃ．テルモフィルム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））など）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（Ｃ．テルモフィレ（Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、ノムシタケ属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐ）（サナギタケ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ））、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クテノミセス属（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）など）、グロメレラ属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）（Ｇ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）など）、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）（Ｈ．イェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）など）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）（イネいもち病菌（Ｍ．ｏｒｚｙａｅ）など）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（Ｍ．テルモフィレ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）（Ｎ．ヘアマトコッカ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ）など））、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）など）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）（Ｓ．テルモフィレ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、チエラビア  属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）（Ｔ．テレストリス（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ｔ．ヘテロタリカ（Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）など）、トリコデルマ属（Ｔ．リーゼイなど）、又はバーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）（Ｖ．ダリア（Ｖ．ｄａｈｌｉａ）など）である。
【０１４０】
一実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻細胞（例えば、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ドゥナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、藍色細菌門（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（藍菌）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎ）又はオクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ））、又は植物細胞（例えば、単子葉植物に由来する細胞（例えば、トウモロコシ、コメ、ムギ又はエノコログサ）、又は双子葉植物に由来するもの（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）又はシロイヌナズナ）である。
【０１４１】
一実施形態では、細胞は、細菌細胞又は原核細胞である。
【０１４２】
実施形態では、原核細胞は、バシラス属、ストレプトマイセス属、レンサ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又はラクトバシラス属などのグラム陽性細胞である。使用することができるバシラス属は、例えば、枯草菌、Ｂ・アミロリクエファシエンス、Ｂ・リケニフォミス、納豆菌又はＢ・メガテリウムである。実施形態では、細胞は、枯草菌３ＮＡ及び枯草菌１６８などの枯草菌である。バシラス属は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６、４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ４３２１０−１２１４から得ることができる。
【０１４３】
一実施形態では、原核細胞は、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉなどの大腸菌、並びに例えばＢＬ−２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌株Ｂ株などのグラム陰性細胞であり、これらはすべて市販されている。
【０１４４】
適切な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）又は米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）などの、微生物株保存機関から市販されている。
【０１４５】
実施形態では、培養した細胞を使用して、治療的使用のための、タンパク質、例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体、及び／又は組換えタンパク質を生成する。実施形態では、培養した細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学中間体又は代謝産物を生成する。例えば、実施形態では、約４０００ダルトンから約１４０，０００ダルトン超の分子量を有する分子を生成することができる。実施形態では、これらの分子は、幅広い複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）を有することができ、グリコシル化を含めた、翻訳後修飾を含むことができる。
【０１４６】
本明細書において開示されている方法及びプロセスは、以下に限定されないが、（１）ゲノムが既知である任意の生成システムに対して、又は生成システムの特定の変異体（例えば、具体的には、ＣＨＯのサブセットとしてのＧＳ  ＣＨＯ）に対して、免疫原性を行うことを可能にする方法、及び（２）様々な患者集団（例えば、地理的領域又は民族性による）に対して行われる免疫原性査定を含めた、いくつかの利点を実現する、本開発プロセスに完全に統合される免疫原性計算を含む。これは、世界集団のＨＣＰに対する総合的な平均スコアが、単一の特に感受性の高い群に対する高いスコアを隠すことがあるので重要である。
【０１４７】
番号を付与した実施形態
１．例えば、タンパク質のリスク（例えば、調製物、例えば、対象に投与される調製物、例えば医薬調製物中に汚染物質として存在する場合にそのタンパク質がもたらすリスク）を査定するために、試料を迅速に解析する単純な方法であって、
ａ）ｉ）プロセスにより生成される、タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）を含む試料、及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、試料を解析して、タンパク質のリスクを査定する、単純な方法。
【０１４８】
２．  タンパク質のリスクを査定するために、試料を迅速に解析する単純な方法であって、
ａ）
ｉ）プロセスにより生成される、タンパク質（例えば、ＨＣＰ）、及び場合により治療生成物（例えば、組換えポリペプチド）を含む試料、及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
条件、例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる第１の変性剤の濃度の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、試料を解析して、タンパク質のリスクを査定する、単純な方法。
【０１４９】
３．複数の異なる試料を評価するステップ、例えば、少なくとも２、４、８、１０、５０、９６、１００、１９２、２００、５００又は１，０００の異なる試料を評価するステップをさらに含み、それぞれが、異なるプロセスによって行われる、段落１又は２のどちらかの方法。
【０１５０】
４．第１及び第２の異なる試料に対するリスクの査定を比較するステップをさらに含む、段落３の方法。
【０１５１】
５．上記の比較に応答して、生成物を生成するプロセスを選択するステップをさらに含む、段落４の方法。
【０１５２】
６．上記の比較に応答して、試料の１つを選択するステップ、分類するステップ又はさらに処理するステップをさらに含む、段落４の方法。
【０１５３】
７．生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法であって、
ａ）
ｉ）このプロセスにより生成される、タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）、及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素、又はグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）例えばクロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用することにより、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法。
【０１５４】
８．生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法であって、
ａ）ｉ）このプロセスにより生成される、タンパク質、及び場合により生成物（例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカイン）、
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、ａ）からの一定分量の試料混合物）；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）例えばクロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用することにより、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、並びに
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物を作製するプロセスを評価する、例えば、このプロセスにより生成される、生成物以外のタンパク質、例えば、汚染物質によりもたらされるリスクの査定を組み込んで評価を行う方法。
【０１５５】
９．生成物を作製する複数の異なるプロセスを評価するステップ、例えば、少なくとも２、４、８、１０、５０、９６、１００、１９２、２００、５００又は１，０００の異なるプロセスを評価するステップをさらに含む、段落７又は８のどちらかの方法。
【０１５６】
１０．第１及び第２の異なるプロセスに対する評価を比較するステップをさらに含む、段落９の方法。
【０１５７】
１１．上記の比較に応答して、生成物を作製するプロセスを選択するステップをさらに含む、段落１０の方法。
【０１５８】
１２．リスク（生成物の調製における生成物以外のタンパク質の含有により表されるリスク）を査定するために、生成物、例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカインを製造する方法を評価する方法であって、
ａ）ｉ）製造方法により生成される、１つ又は複数のタンパク質及び生成物、例えば、組換えポリペプチド；及び
ｉｉ）変性剤、例えば、デオキシコラート及び尿素
を含む試料混合物を、
例えば、１０〜３０℃、例えば、１８〜２６℃の間、例えば、２０±３℃、２０±２℃、２０±１℃又は２０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）
ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；及び
ｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、試料混合物と共に、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップであって、
場合により、（ｄ）は、複数のタンパク質、例えばタンパク質消化生成物により特定されるすべてのタンパク質に対して繰り返される、ステップ、並びに
ｅ）製造する方法にプロセスリスクスコアを割り当てるステップ、
を含み、
これにより、生成物、例えば組換えポリペプチドを製造する方法を評価して、リスクを査定する方法。
【０１５９】
１３．リスク（生成物の調製における生成物以外のタンパク質の含有により表されるリスク）を査定するために、生成物、例えば、組換えポリペプチド、例えば、抗体、酵素又はサイトカインを製造する方法を評価する方法であって、
ａ）ｉ）製造方法により生成される、１つ又は複数のタンパク質及び生成物、例えば、組換えポリペプチド；及び
ｉｉ）第１の変性剤、例えばグアニジン塩酸塩
を含む試料混合物を、
例えば、３０〜６０℃、例えば、４５〜５５℃の間、例えば、５０±３℃、５０±２℃、５０±１℃又は５０℃の温度において、試料中のタンパク質を変性させる変性剤の濃度とする条件で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｂ）、
ｉ）試料混合物（例えば、（ａ）からの一定分量の試料混合物）；
ｉｉ）第２の変性剤、例えば、尿素；及び
ｉｉｉ）試料混合物と共に、タンパク質が基質となる酵素、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、事前選択された又は規定された標的部位においてタンパク質を開裂する酵素、例えば、トリプシン、ｌｙｓＣ、ＧｌｕＣ又はＡｓｐＮを含む酵素調製物
を含む試料／酵素混合物を、
酵素が実質的な活性を維持しており、タンパク質と反応し、例えば、これを開裂して、タンパク質消化生成物をもたらす条件の下で、用意、例えば形成及び／又は維持するステップ、
ｃ）クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離し、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳにより、タンパク質消化生成物を同定し、１つ又は複数のタンパク質消化生成物を使用して、タンパク質消化生成物に関連するタンパク質を同定するステップ、
ｄ）試料中で特定したタンパク質に対してタンパク質リスクスコアを割り当てるステップであって、
場合により、（ｄ）は、複数のタンパク質、例えばタンパク質消化生成物により特定されるすべてのタンパク質に対して繰り返される、ステップ、並びに
ｅ）製造する方法にプロセスリスクスコアを割り当てるステップ
を含み、
これにより、生成物、例えば組換えポリペプチドを製造する方法を評価して、リスクを査定する方法。
【０１６０】
１４．生成物を製造する複数の異なる方法を評価するステップ、例えば、生成物の製造の少なくとも２、４、８、１０、５０、９６、１００、１９２、２００、５００又は１，０００の異なる方法を評価するステップをさらに含む、段落１２又は１３のどちらかの方法。
【０１６１】
１５．生成物の製造の第１及び第２の異なる方法に対するリスクの査定を比較するステップをさらに含む、段落１４の方法。
【０１６２】
１６．上記の比較に応答して、生成物を作製する方法を選択するステップ又は分類するステップをさらに含む、段落１４の方法。
【０１６３】
１７．タンパク質が、汚染物質又は他の望ましくない構成成分（例えば、一連の条件により生成される生成物の断片、変性型、又はミスフォールディング型、又は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）若しくはその断片）である、段落１〜１６のいずれかの方法。
【０１６４】
１８．変性剤、第１の変性剤又は第２の変性剤が、デオキシコラート及び尿素、グアニジン塩酸塩、又は尿素及びグアニジン塩酸塩を含む、これらからなる、又はこれらから本質的になる、段落１〜１７のいずれかの方法。
【０１６５】
１９．変性剤又は第１の変性剤が、グアニジン塩酸塩を含む、これからなる又はこれから本質的になる、段落１〜１８のいずれかの方法。
【０１６６】
２０．変性剤又は第１の変性剤が、尿素及びデオキシコラートを含む、これからなる又はこれから本質的になる、段落１〜１８のいずれかの方法。
【０１６７】
２１．変性剤又は第２の変性剤が、尿素を含む、これからなる又はこれから本質的になる、段落１〜１８のいずれかの方法。
【０１６８】
２２．試料混合物中の変性剤の濃度が、試料／酵素混合物中の変性剤の濃度よりも高い、段落１〜２１のいずれかの方法。
【０１６９】
２３．
試料混合物中の変性剤の濃度が、タンパク質を変性させるほど十分に高く、例えば、タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が変性し、
試料／酵素混合物中の変性剤の濃度が、酵素を変性させないほど十分に低く、例えば、酵素の５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２又は１％未満しか変性しない、
段落１〜２２のいずれかの方法。
【０１７０】
２４．酵素調製物と試料混合物との組合せが、変性剤を希釈し（すなわち、変性剤の濃度が低下する）、こうして変性剤が酵素を変性させない、段落１〜２３のいずれかの方法。
【０１７１】
２５．試料混合物中の変性剤の濃度が、
ｉ）少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．５又は８；
ｉｉ）１〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、６〜６．６Ｍ、６Ｍ、６．６Ｍ又は８Ｍ；
ｉｉｉ）０〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は２Ｍ；又は
ｉｖ）  ０．０１％〜５０％、１％〜４０％、１％〜２０％、０．５％〜１０％、０．０１％〜５％又は０．１％〜２％（ｍ／ｖ）
である、段落１〜２４のいずれかの方法。
【０１７２】
２６．試料／酵素混合物の変性剤の濃度が、
ｉ）４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下；
ｉｉ）０．５又は０．１Ｍ以下、例えば本質的に０Ｍ；
ｉｉｉ）２Ｍ又は０．５Ｍ以下；又は
ｉｖ）２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００２５％、０．００１％又は０．０００１％以下、例えば実質的に０％（ｍ／ｖ）
である、段落１〜２５のいずれかの方法。
【０１７３】
２７．試料混合物が、第１の変性剤（すなわち、（ａ）（ｉｉ）の変性剤）を含み、試料／酵素混合物が第１の変性剤及び第２の変性剤を含む、段落１〜２６のいずれかの方法。
【０１７４】
２８．第１の変性剤がグアニジン塩酸塩であり、第２の変性剤が尿素である、段落２７の方法
【０１７５】
２９．試料混合物中の第１の変性剤の濃度が、１〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、６〜６．６Ｍ、６Ｍ、６．６Ｍ又は８Ｍである、段落２７又は２８のどちらかの方法。
【０１７６】
３０．試料／酵素混合物の第１の変性剤の濃度が、
ｉ）  ０〜１０Ｍ、２〜９Ｍ、３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、５〜７Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は２Ｍ；
ｉｉ）４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下；又は
ｉｉｉ）０．５又は０．１Ｍ以下、例えば本質的に０Ｍ
である、段落２７〜２９のいずれかの方法。
【０１７７】
３１．試料／酵素混合物中の第２の変性剤の濃度が、
ｉ）４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５又は０．１Ｍ以下；
ｉｉ）０．５又は０．１Ｍ以下、例えば本質的に０Ｍ；又は
ｉｉｉ）２Ｍ又は０．５Ｍ以下
である、段落２７〜３０のいずれかの方法。
【０１７８】
３２．脱アミド化反応が、実質的に阻害されるほど、試料混合物のｐＨが十分に低く、例えばタンパク質のアスパラギン及びグルタミン側鎖の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が変化せず、
酵素が活性であるほど、試料／酵素混合物のｐＨが十分に高く、例えば、酵素が、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００％活性であり、例えば最大効率と比較して、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％の効率で働く、
段落１〜３１のいずれかの方法。
【０１７９】
３３．試料混合物のｐＨが、試料／酵素混合物のｐＨよりも、例えば少なくとも１，１．５又は２単位低い、段落１〜３２のいずれかの方法。
【０１８０】
３４．試料混合物のｐＨが、５．５±１、０．７５、０．５又は０．２５（例えば、５．５±０．５）であり、試料／酵素混合物のｐＨが、７．３±１、０．７５、０．５又は０．２５（例えば、７．３±０．５）である、段落１〜３３のいずれかの方法。
【０１８１】
３５．試料混合物のｐＨが５．５であり、試料／酵素混合物のｐＨが７．３である、段落１〜３４のいずれかの方法。
【０１８２】
３６．タンパク質又はタンパク質消化生成物のシステイン残基のアルキル化を含まない、段落１〜３５のいずれかの方法。
【０１８３】
３７．試料、試料混合物、又は試料／酵素混合物のうちの１つ又は複数（例えば、すべて）を条件に曝露するステップ、例えば、試薬、例えばアルキル化剤、例えばヨードアセトアミドを添加して、タンパク質又はタンパク質消化生成物のシステイン残基をアルキル化するステップを含まない、段落１〜３６のいずれかの方法。
【０１８４】
３８．試料混合物及び／又は試料／酵素混合物が、還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールを含む、段落１〜３７のうちのいずれかの方法。
【０１８５】
３９．試料混合物中の還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールの濃度が、試料／酵素混合物中の濃度よりも高い、段落３８の方法。
【０１８６】
４０．試料混合物中の還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールの濃度が、タンパク質のシステインを実質的に還元するほど十分に高く、例えば、タンパク質のシステイン残基の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が還元され、
試料／酵素混合物中の還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はベータ−メルカプトエタノールの濃度が、本方法の他のステップ又は製造方法を妨害しないほど十分に低く、例えば、還元剤が、装置（例えば、質量分析計又は分析用カラム）中で有意に蓄積することはなく、又はデータ（例えば、質量分析データ）においてさらなるシグナルを生成することがない、
段落３８又は３９のどちらかの方法。
【０１８７】
４１．試料混合物中の還元剤の濃度が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍＭである、段落３８〜４０のいずれかの方法。
【０１８８】
４２．試料／酵素混合物中の還元剤の濃度が、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５又は０．１ｍＭ、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５又は０．１ｍＭ以下である、段落３８〜４１のいずれかの方法。
【０１８９】
４３．還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、段落３８〜４２のいずれかの方法。
【０１９０】
４４．タンパク質消化生成物が、サイズ、電荷又は親和性のうちの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれより多い）に基づいて分離される、段落１〜４３のいずれかの方法。
【０１９１】
４５．タンパク質消化生成物を分離するステップが、クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動、イオン移動度、又は本明細書に記載されているいずれかのクロマトグラフィー法を使用するステップを含む、段落１〜４４のいずれかの方法。
【０１９２】
４６．（ｃ）が、タンパク質消化生成物を、例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳ、タンデム質量分析法又はＲＰ−ＬＣＭＳ２によって特定するステップをさらに含む、段落１〜４５のいずれかの方法。
【０１９３】
４７．（ｃ）が、クロマトグラフィー、例えば、１次元クロマトグラフィーを使用して、タンパク質消化生成物を分離するステップ、及び例えば、質量分析法、例えば、ＬＣ／ＭＳ、タンデム質量分析法又は１Ｄ  ＲＰ−ＬＣＭＳ２によってタンパク質消化生成物を特定するステップを含む、段落１〜４６のいずれかの方法。
【０１９４】
４８．例えば、質量分析法によってタンパク質消化生成物を特定するステップが、１つ又は複数のタンパク質消化生成物に対する、又は各タンパク質消化生成物の質量、電荷、保持時間又は溶出時間、及び場合により強度（例えば、存在量又は量）を評価するステップを含む、段落１〜４７のいずれかの方法。
【０１９５】
４９．１つ又は複数のタンパク質消化生成物、又は複数のタンパク質消化生成物のそれぞれについて、タンパク質消化生成物の質量、電荷、保持時間又は溶出時間、及び場合により強度（例えば、存在量又は量）のうちの１つ若しくは複数、又はすべての関数となる値（例えば、複数のタンパク質消化生成物の表示上の位置に関連する数値又は値）を割り当てるステップを含む、段落１〜４８のいずれかの方法。
【０１９６】
５０．３次元表示上の値を表示するステップを含む、段落４９の方法であって、例えば、軸、例えばｙ軸が、質量電荷比の関数となる値を表し、第２の軸、例えばｘ軸が、保持時間又は溶出時間の関数となる値を表し、第３の軸、例えばｚ軸が、タンパク質消化生成物の強度（例えば、存在量又は量）を表す、方法。
【０１９７】
５１．上記の値が、質量、電荷、保持時間及び強度（例えば、存在量又は量）の関数となる、段落４９又は５０のどちらかの方法。
【０１９８】
５２．第１の試料に由来するタンパク質消化生成物の値を、第２の試料に由来するタンパク質消化生成物の値と比較するステップを含む、段落４９〜５１のいずれかの方法。
【０１９９】
５３．第１の試料中のタンパク質消化生成物の量が、第２の試料に由来するタンパク質消化生成物の量よりも多い、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００又は１０００％多い、段落５２の方法。
【０２００】
５４．第２の試料中のタンパク質消化生成物の量が、第１の試料に由来するタンパク質消化生成物の量よりも多い、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００又は１０００％多い、段落５２の方法。
【０２０１】
５５．１つ又は複数のタンパク質消化生成物に対する値と同一性との間の相関を提示するステップを含む、段落４９〜５４のいずれかの方法。
【０２０２】
５６．試験試料中のタンパク質消化生成物を特定する又は分類するステップをさらに含む、段落１〜５５のいずれかの方法であって、
値、例えば、試験試料に由来するタンパク質消化生成物の質量、電荷、保持時間又は溶出時間、及び場合により強度（例えば、存在量又は量）の関数である値を得るステップ、
その値に応答して、試験試料に由来するタンパク質消化生成物を特定又は分類するステップを含む、方法。
【０２０３】
５７．試験試料に由来するタンパク質消化生成物に関する値を、参照値、例えば、既知の素性、構造又は組成であるタンパク質消化生成物の値と比較するステップを含む、段落５６の方法。
【０２０４】
５８．第１の試料に由来するタンパク質消化生成物に関する値と参照値との比較に応答して、第１の試料に由来するタンパク質消化生成物に、素性、構造又は組成を分類し又は割り当てるステップを含む、段落５７の方法。
【０２０５】
５９．試料中の複数の、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％のタンパク質消化生成物に、ある素性、構造又は組成を分類し又は割り当てる、段落１〜５８のいずれかの方法。
【０２０６】
６０．例えば、質量分析法によって、タンパク質消化生成物を特定するステップが、少なくとも２、１０、２０、９６、１００、１９２、１，０００又は１０，０００の試料からのタンパク質消化生成物に対する値を参照値、例えば、既知の素性、構造又は組成のタンパク質消化生成物に対する値と比較するステップをさらに含む、段落４９〜５９のいずれかの方法。
【０２０７】
６１．例えば、質量分析法によって、タンパク質消化生成物を特定するステップが、試料及び参照値に由来するタンパク質消化生成物の値の類似性に応答して、少なくとも２、１０、２０、９６、１００、１９２、１，０００又は１０，０００の試料からのタンパク質消化生成物に、ある素性、構造又は組成を分類し又は割り当てるステップをさらに含む、段落４９〜６０のいずれかの方法。
【０２０８】
６２．少なくとも２、１０、２０、９６、１００、１９２、１，０００又は１０，０００の試料中の、複数の、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％のタンパク質消化生成物に、ある素性、構造又は組成を分類し又は割り当てる、段落１〜６１のいずれかの方法。
【０２０９】
６３．複数の試料に対して行われる、段落１〜６２のいずれかの方法であって、複数の試料の１つ又は複数が異なる製造プロセス又は方法により生成され、例えば、これにより、１つ又は複数のタンパク質消化生成物のレベルを最適化する、例えば最小化する又は最大化する、条件又は一式の条件（例えば、本明細書に記載されている、変性剤の選択、変性剤の濃度、ｐＨ、温度、還元剤、インキュベート時間及び他の条件のうちの１つ又は複数）を特定することを可能にする、方法。
【０２１０】
６４．複数の試料を解析するために繰り返す、段落１〜６３のいずれかの方法であって、各試料が、複数の条件下、例えば、少なくとも２、１０、５０、９６、１００、１９２、１，０００又は１０，０００の条件下で解析され、上記方法が、複数の試料の解析に応答して、前記複数の条件のそれぞれに由来する試料を選択するステップをさらに含む、方法。
【０２１１】
６５．製造プロセス又は方法、例えば、１つ又は複数のタンパク質消化生成物の予め選択した又は最適化したレベルをもたらす製造プロセス又は方法を分類又は選択するステップをさらに含む、段落１〜６４のいずれかの方法。
【０２１２】
６６．製造プロセス又は方法、例えば、１つ又は複数のタンパク質の予め選択した又は最適化したレベルをもたらす製造プロセス又は方法を分類又は選択するステップをさらに含む、段落１〜６５のいずれかの方法。
【０２１３】
６７．タンパク質リスクスコアが、
対象における、タンパク質、及び場合により生成物を含む調製物の投与に対する、望ましくない、例えば標的外の特性、例えば免疫原性、
生成物の調製、例えば薬物の調製における、タンパク質の望ましくない作用、例えば、変性、沈殿又は着色を引き起こす性向、及び
試料中に存在するタンパク質の存在量の値
のうちの１つ又は複数の関数である、段落１〜６６のいずれかの方法。
【０２１４】
６８．ステップ（ｄ）を繰り返して、試料中で特定された１つ又は複数（例えば、少なくとも２、１０、５０、１００、２００、５００、１０００又はすべて）のタンパク質に対するタンパク質リスクスコアを得る、段落１〜６７のいずれかの方法。
【０２１５】
６９．ステップ（ｄ）が、例えば、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームによって生成される、タンパク質リスクスコア、例えば免疫原性リスクスコアを得るステップを含む、段落１〜６８のいずれかの方法。
【０２１６】
７０．ステップ（ｄ）が、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームによって生成される、免疫原性リスクスコアを得るステップを含む、段落１〜６９のいずれかの方法。
【０２１７】
７１．試料にプロセスリスクスコアを与えるステップをさらに含む、段落１〜７０のいずれかの方法。
【０２１８】
７２．プロセスリスクスコアが、試料のタンパク質の１つ又は複数のタンパク質リスクスコアの関数である、段落７１の方法。
【０２１９】
７３．プロセスリスクスコアが、式：
プロセスリスクスコア＝Σ（［プロテイン存在量］×［免疫原性リスクスコア］）
に基づいて算出される、段落７１又は７２のどちらかの方法。
【０２２０】
７４．方法が、複数の試料、例えば、少なくとも２、１０、５０、９６、１０、１９２又は１０００を解析するために繰り返され、
試料の２つ以上（例えば、すべて）が、異なる製造プロセス又は方法を使用して得られ、プロセスリスクスコアが複数の試料（例えば、すべての試料）に対して得られるか、又は
試料の２つ以上（例えば、すべて）が、製造プロセス又は方法の間に、異なる時点で得られ、プロセスリスクスコアが複数の試料（例えば、すべての試料）に対して得られる、段落７１〜７３のいずれかの方法。
【０２２１】
７５．製造プロセス又は方法、例えば、試料を得るために使用される製造プロセス又は方法のプロセスリスクスコアを参照と比較するステップを含む、段落７１〜７４のいずれかの方法。
【０２２２】
７６．第１の製造プロセス又は方法のプロセスリスクスコアを、第２の製造プロセス又は方法のプロセスリスクスコアと比較するステップを含む、段落７１〜７５のいずれかの方法。
【０２２３】
７７．第１の時点におけるプロセスのプロセスリスクスコアを、第２の時点におけるプロセスのプロセスリスクスコアと比較するステップを含む、段落７１〜７５のいずれかの方法。
【０２２４】
７８．上記の比較に応答して、例えば、さらなる解析、又はさらなる使用のために、製造プロセス又は方法の１つを選択して、例えば生成物、例えば組換えポリペプチドを作製するステップを含む、段落７６の方法。
【０２２５】
７９．上記の比較に対応して、製造プロセス又は方法のパラメータ、例えば、培地補給物、酸素、多価陽イオン、アンモニウム、鉄、窒素、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、マンガン、凝集剤又は清澄剤（例えば、ミョウバン、アルミニウム、クロロハイドラート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸第一鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化第二鉄）、ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム）、選択試薬（例えば、抗生物質、例えばネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸）、酪酸ナトリウム又はアミノ酸のレベル又は存在を改変するステップを含む、段落７５又は７７のどちらかの方法。
【０２２６】
８０．上記の比較に対応して、製造プロセス又は方法のパラメータ、例えば、培地補給物、酸素、多価陽イオン、アンモニウム、鉄、窒素、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、マンガン、凝集剤又は清澄剤（例えば、ミョウバン、アルミニウム、クロロハイドラート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸第一鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化第二鉄）、ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム）、選択試薬（例えば、抗生物質、例えばネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸）、酪酸ナトリウム又はアミノ酸のレベル又は存在を改変することなく、製造プロセス又は方法を継続するステップを含む、段落７５又は７７のどちらかの方法。
【０２２７】
８１．生成物を含む試料を用意するステップを含む、生成物、例えば組換えポリペプチドを製造する方法であって、試料が、段落１〜６及び１７〜８０のいずれかの試料を解析する方法により解析される、方法。
【０２２８】
８２．製造プロセス又は方法が、複数の細胞（例えば、複数のＣＨＯ細胞、例えば、複数のＧＳ−ＣＨＯ細胞）からの発現及び分泌を含む、段落１〜８１のいずれかの方法。
【０２２９】
８３．組換えポリペプチド試料中の、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を検出、モニタリング、特定又は定量する方法であって、
ａ）細胞の培養物（例えば、ＣＨＯ、例えばＧＳ−ＣＨＯ、細胞培養物）から発現及び分泌された組換えポリペプチドを含む試料を生成又は得るステップ、
ｂ）クロマトグラフィー、例えば１次元クロマトグラフィーを使用する、複数のＨＣＰ構成成分（例えば、断片化又は開裂ＨＣＰ構成成分）を分離して、複数の分離したＨＣＰ構成成分の各ＨＣＰ構成成分の特徴の特定を決定するステップ、
ｃ）複数の各ＨＣＰの特定特徴を評価するステップであって、
これにより、組換えポリペプチド試料中の、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を検出、モニタリング、特定又は定量するステップ、並びに
場合により、ｄ）複数の試料、例えば、製造プロセス又は方法から、異なる時間で得た試料に対して（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップ、及び複数の試料間で、特定特徴、例えばタンパク質（単数又は複数）のリスクを評価するステップ
を含む、方法。
【０２３０】
８４．生成物、例えば、組換えポリペプチドを製造する方法を評価する方法であって、
ａ）細胞の培養物（例えば、ＣＨＯ、例えばＧＳ−ＣＨＯ、細胞培養物）から発現及び分泌された組換えポリペプチドを含む試料を生成又は得るステップ、
ｂ）クロマトグラフィー、例えば１次元クロマトグラフィーを使用する、複数のＨＣＰ構成成分（例えば、断片化又は開裂ＨＣＰ構成成分）を分離して、複数の分離したＨＣＰ構成成分の各ＨＣＰ構成成分の特定特徴を決定するステップ、
ｃ）複数の各ＨＣＰの特定特徴を評価するステップ、及び
場合により、ｄ）複数の試料、例えば、生成物の様々な製造方法によって得られた試料に対して（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップ、及び複数の製造方法の間で、特定特徴、例えばタンパク質（単数又は複数）のリスクを評価するステップであって、
これにより、製造方法を評価するステップ
を含む、方法。
【０２３１】
８５．試料が培養上清を含む、段落１〜８４のいずれかの方法。
【０２３２】
８６．試料が細胞溶解物を含む、段落１〜８４のいずれかの方法。
【０２３３】
８７．試料が培養上清及び細胞溶解物を含む、段落１〜８６のいずれかの方法。
【０２３４】
８８．生成物又は組換えポリペプチドが、ホモポリマー又はヘテロポリマー型ポリペプチド、例えばホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はそれらの断片、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ又はウシ抗体に由来する、通常、ウサギを起源とするヒト化抗体又はその断片のホモポリマー又はヘテロポリマーである、段落１〜８７のいずれかの方法。
【０２３５】
８９．生成物又は組換えポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、段落１〜８８のいずれかの方法。
【０２３６】
９０．生成物又は組換えポリペプチドが、表１、表２、表３又は表４に開示されているものである、段落１〜８９のいずれかの方法。
【０２３７】
９１．生成物又は組換えポリペプチドが抗体である、段落１〜９０のいずれかの方法。
【０２３８】
９２．抗体が、モノクローナル抗体である、段落９１の方法。
【０２３９】
９３．モノクローナル抗体が治療用抗体である、段落９２の方法。
【０２４０】
９４．細胞が哺乳動物細胞である、段落８２〜９３のいずれかの方法。
【０２４１】
９５．宿主細胞が、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、イヌ、ウマ、フェレット又はネコである、段落９４の方法。
【０２４２】
９６．細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、段落９５の方法。
【０２４３】
９７．ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ細胞、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ細胞又はＣＨＯ由来細胞である、段落９６の方法。
【０２４４】
９８．細胞が、ＨｅＩａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、又はそれらに由来する任意の細胞である、段落８２〜９７のいずれかの方法。
【０２４５】
段落
９９．１２０、９６、７２、４８、２４、１２、６、４又は３時間以下しかかからない、段落１〜９８のいずれかの方法。
【０２４６】
１００．細胞培養物（例えば、ＣＨＯ、例えば、ＧＳ−ＣＨＯ、細胞培養物）の細胞培養上清に由来する、ＨＣＰ又はタンパク質消化生成物の特徴及びタンパク質リスクスコアを特定するライブラリを含む（例えば、コンピュータ可読媒体上に記憶又は記録される）データベース。
【実施例】
【０２４７】
本発明は、以下の実験例を参照することにより、さらに詳細に記載される。これらの実施例は、例示目的のみのために提示されており、別段の指定がない限り、制限することを意図するものではい。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書において提示されている教示の結果として明白となるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０２４８】
さらなる説明なしに、当業者は、上述の説明及び以下の例となる実施例を使用して、本発明の化合物を作製して利用すること、及び特許請求した方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に指摘し、本開示の残りを決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２４９】
（例１）
方法
以下は、実施例２、３及び４全体を通して使用され、言及される方法を記載する。
【０２５０】
試験試料
ｃＢ７２．３  ＩｇＧ４ｋ抗体は、１０００Ｌスケールの発酵バイオリアクター培養から生成した。材料は、標準的な一次回収ろ過トレインを使用して採取するか、又は０．１％（最終）塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムを添加することにより処理してＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅフィルターを使用して採取するかのどちらかとした。材料の各回分に関すると、（１）澄んだ細胞培養上清、（２）プロテインＡ（ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）クロマトグラフィーから中和した溶出液、（３）陰イオン交換（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ）クロマトグラフィーらの溶出液からなる試料を用意した。
【０２５１】
ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ
固定化抗ＣＨＯ  ＨＣＰポリクローナル抗体（ヌルトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系に由来するタンパク質に対して成長させた）を使用して、試料中の残留ＨＣＰを捕捉した。結合済みＨＣＰを、ビオチンにコンジュゲートした同一ポリクローナル抗体を使用して検出し、次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたエクストラビジン（ｅｘｔｒａｖａｄｉｎ）により検出した。３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色性基質として使用した。
【０２５２】
試料調製
タンパク質治療剤の構造分析のための一般的なトリプシン作用による消化プロトコルを試料調製に使用した。各試料中のタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度測定により、及びｃＢ７２．３に対して理論的に算出した吸光係数に対する参照値によって決定した。個別の試料調製に由来する３つの技術的複製物を、各試料に関して解析した。ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏ（ペプチド及びタンパク質同定の場合）、及びプロテオミクス用のＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ（試料間の正規化を含む、標識不含定量の場合）を使用して、並行して未処理データを処理した。ペプチドの特定は、データ照合用のＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩにインポートした。Ｈｉ３定量は、手作業で、各タンパク質に対する３つの最高強度のペプチドに対する、すべての検出された帯電状態を合計して正規化した強度に基づいて行った。タンパク質は、少なくとも３つのペプチドが検知された場合にのみ、定量した。提案した分析法の上位レベルの概略が、図１に示されている。
【０２５３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用の試料調製
分析前に、試料を６．６ＭグアニジンＨＣｌ中で変性し、ＴＣＥＰによって還元して、トリプシンにより消化させた。３つの複製物を各試料に対して調製した。この解析手法を用い、質量分析法に適合する緩衝液マトリックスに、タンパク質混合物からペプチドを効果的に生成し得る任意の試料調製法を使用することができると予想される。
【０２５４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ取得
データは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ  Ｑ−ＯＴ−ｑＩＴ質量分析計に連結したＤｉｏｎｅｘ  ＲＳＳＬｎａｎｏ  ｎａｎｏＬＣシステムを使用して取得した。各試料に関してトリプシンペプチド１μｌの体積を、９８：２の水：アセトニトリル＋０．０８％ＴＦＡからなるロード用緩衝液中で、ＰｅｐＭａｐ１００  Ｃ１８  ３００ÅのＮａｎｏ−Ｔｒａｐカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）上に、１２μｌ／分で３分間、注入した。３分後、分析用カラム（ＥａｓｙＳｐｒａｙ  ＲＳＬＣ  Ｃ１８  ２μｍ、１００Å、７５μｍ×２５ｃｍ（Ｔｈｅｒｍｏ））上に捕捉用カラムを通じて逆方向に、ｎａｎｏＬＣ流を向けた。直線グラジエントは、水中の０．１％ギ酸と８０：２０のアセトニトリル：水中の０．１％ギ酸との間を適用した。
【０２５５】
イオン化源の設定は、２５００Ｖのスプレー電圧及び２７５℃の移送管温度で取得している間に変えなかった。質量分析計は、３５０〜１，５５０ｍ／ｚの範囲にわたり、２．０ｅ５のＡＧＣ標的、及び５０ｍｓの最大注入時間で、四重極分離での１２０，０００ＦＷＨＭ（半値全幅）の名目解像度で、オービトラップにおいて、ＭＳ１データを取得するため、陽イオン化モードで構成した。データは、個々の試薬イオン源からの生成時に、フルオランチンイオン基準質量に基づく内部標準を使用して質量補正した。ｚ＝２とｚ＝６との間の電荷状態しか、ＭＳ２断片化に選択しなかった。
【０２５６】
ＭＳ２断片化は、２８％の正規化した衝突エネルギー、１．０ｅ４のＡＧＣ標的、及び「通常」捕捉スキャン速度において２００ｍｓの最大スキャン時間において、線形イオン捕捉で行った。
【０２５７】
質量分析法のデータ解析
ＭＳ２断片化に基づいたタンパク質同定は、ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。タンパク質同定は、細胞培養上清（ＣＣＣＳ）のみに対して行った。ペプチドレベルでの偽発見率は、デコイ融合法を使用して、＜０．１％で制御した（Ｚｈａｎｇ，Ｊら、「ＰＥＡＫＳ  ＤＢ：高感度及び正確なペプチド同定に対するデノボ配列決定支援データベース探索（ＰＥＡＫＳ  ＤＢ：  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４巻（１１号）、１１１頁（２０１２年））。各タンパク質の帰属に関して、少なくとも３つの固有のペプチドを必要とした。質量許容差は、親イオンの場合、＜７．５ｐｐｍ、及びフラグメントイオンの場合、＜０．３Ｄａで指定した。同定は、ＴｒＥＭＢＬデータベース内のげっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）分類群に対して行った。
【０２５８】
すべての試料のＭＳ１データ処理は、プロテオミクスソフトウェア向けのＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩを使用して行った。試料データをインポートして、自動で保持時間を整列し、応答を対照となる上清試料に対して正規化した。ピーク検出は「最も高い」感度設定で行った。ペプチド同定をインポートし、帰属を目視試験して、定量が、スペクトル干渉を示さなかったペプチドに対して専ら行われたことを確実にした。相対的な定量は、Ｈｉ３法に基づいて行った。
【０２５９】
インシリコ免疫原性解析
各同定したタンパク質の配列を、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームを使用して、インシリコ免疫原性査定に供した。Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）は、免疫原性リスクのスクリーニングに関するインシリコプラットフォームである（Ｗａｌｌｅ  Ｖａｎ，Ｉら、「タンパク質薬の開発における免疫原性スクリーニング（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７巻（３号）、４０５頁（２００７年））。このプラットフォームは、この配列に由来するすべての１０マーペプチドのＨＬＡクラスＩＩ受容体への結合親和力を予測することにより、タンパク質配列中の潜在的なＴ細胞エピトープを特定する。
【０２６０】
スクリーニングは、世界集団を標的して行った。世界集団ＨＬＡの組は、免疫原性プロファイリングの一次注目点である、８５ＨＬＡクラスＩＩアロタイプ、特に４３ＤＲＢ１アロタイプを含む。上から２５％の最も多量に存在するヒトタンパク質を含めた、ヒトプロテオームフィルターを使用して、自己ペプチド（ＨＬＡ分子に現れるが、Ｔ細胞受容体に結合しないペプチド）をフィルタリングした。タンパク質への免疫原性リスクスコアは、タンパク質中の予期されるＴ細胞エピトープの数、及び影響を受けたＨＬＡアロタイプの集団頻度を考慮することにより得られる。
【０２６１】
（例２）
ＣＨＯ  ＨＣＰライブラリの作製
この実施例において提供される方法は、実施例２に記載されている方法で使用されるＣＨＯ  ＨＣＰライブラリの生成を記載している。
【０２６２】
ＣＨＯ細胞培養物のＣＣＣＳから決定したＨＣＰに由来するＭＳ１ピークの参照ライブラリを生成した。参照ライブラリは、保持時間及びｍ／ｚ空間における枠を定義して、次に、精製試料に対して取得したデータに適用した。哺乳動物細胞の発現システムにおける生産用バイオリアクターに由来するＣＣＣＳは、統合領域において、ＨＣＰとして提供され得る各ＣＨＯタンパク質を含有しているので、これを続いて、同じ解析内のすべての精製試料に適用することができる。したがって、ＨＣＰ解析の同定及び定量の状況は切り離されているが、解析における各精製試料に対する、関連する特定のＣＣＣＳのそれぞれの試料が必要となる。しかし、一般には、バイオプロセス開発に対する制限はない。ＣＣＣＳに由来する統合ライブラリの使用は、複数の解析の実施の必要性が回避される。
【０２６３】
解析したＣＣＣＳ試料のすべてにわたり、合計で６２７のタンパク質同定が得られた。この集団のうち、２５９のタンパク質は、ＭＳ１処理ソフトウェアでのピーク検出及び定量を可能にするほど十分な存在量があった。検出限界と定量限界との間の感度差異は、各値に生じた異なる機構に起因し得る。検出限界は、イオン捕捉断片化データから生成したペプチド配列の一致に対するｐ値によってＭＳ２データから定義する。この研究において使用したトラップへの比較的高いイオン注入回数により、高いＭＳ２検出感度がもたらされた。さらに、ＭＳ２検出は、単一ＭＳ１親イオンスキャンのみに基づいて可能であった。対照的に、ＭＳ１データの定量に使用したピーク検出アルゴリズムは、十分に定められたクロマトグラフィーピークが、複数のスキャン間に存在することを必要とした。すなわち少ないスキャン数で現れるシグナルは、通常、データフィルタリングＱＣチェックに合格しない。クロマトグラフィーによるピーク検出に対する要件はまた、１２０，０００ＦＷＨＭの解像度では、比較的迅速なＭＳ１スキャン時間（最大で、５００，０００ＦＷＨＭの解像度でより遅いスキャン速度よりも）の使用を推進した。
【０２６４】
相対的な定量は、Ｈｉ３手法に基づいて行った（Ｊ．Ｃ．Ｓｉｌｖａら、「ＬＣＭＳＥによるタンパク質の絶対定量：並行ＭＳ取得による（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＬＣＭＳＥ：ａ  ｖｉｒｔｕｅ  ｏｆ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ＭＳ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．５巻（１号）、１４４頁（２００６年））。定量基準としてｍＡｂ生成物ペプチドピークを使用すると、上清試料中のＭＳ１ピーク検出は、１０ｐｐｍとなる報告閾値まで低下して可能であった。ＬＣ−ＭＳによって得られた全ＨＣＰの結果を、標準ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡを使用して試験した同一試料に対して得られた結果と比較した。手短に言うと、固定化抗ＣＨＯ  ＨＣＰポリクローナル抗体（ヌルトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系に由来するタンパク質に対して成長させた）を使用して、試験試料中の残留ＨＣＰを捕捉した。結合済みＨＣＰを、ビオチンにコンジュゲートした同一ポリクローナル抗体を使用して検出し、次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたエクストラバジンにより検出した。３，３‘，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色性基質として使用した。ＨＣＰは、アッセイ内で生成した標準曲線に対して定量した。アッセイ間対照をすべてのアッセイに含ませた。ＨＣＰのスパイク回収は、１００％±２５％の合格判定基準を満たした。結果が表５に示されている。ＭＳＳとは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅを指す。
【表１０】
2019533135.tif 000029
【０２６５】
質量分析法によって決定された報告済み全ＨＣＰ値は、ＥＬＩＳＡにより報告されたものよりも１０〜１００倍の間で高いが、他のグループによるこれまでの研究において得られた、精製済み及び部分精製済みｍＡｂ生成物における６１１ｐｐｍ〜１０，０００ｐｐｍの間の値と幅広く一致した（Ｃ．Ｅ．Ｄｏｎｅａｎｕら、「包括的なオンラインでの２次元液体クロマトグラフィー／質量分析法によるバイオ治療用タンパク質における宿主細胞タンパク質の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｏｓｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、ＭＡｂｓ．４巻（１号）、２４頁（２０１２年）；Ａ．Ｆａｒｒｅｌｌら、「独立ＬＣ−ＭＳ（Ｅ）の２次元データを使用する、定量的な宿主細胞タンパク質解析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＬＣ−ＭＳ（Ｅ））」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８７巻（１８号）、９１８６頁（２０１５年）；Ｍ．Ｒ．Ｓｃｈｅｎａｕｅｒ、Ｇ．Ｃ．Ｆｌｙｎｎ及びＡ．Ｍ．Ｇｏｅｔｚｅ、「質量分析法を使用したバイオ治療剤中の宿主細胞タンパク質不純物の同定及び同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２８巻（２号）、１５０頁（２０１２年）；Ｑ．Ｚｈａｎｇら、「質量分析法を使用する、モノクローナル抗体精製の間の宿主細胞タンパク質の包括的追跡（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、ＭＡｂｓ．６巻（３号）、６５９頁（２０１４年））。
【０２６６】
（例３）
ＤＳＰへのＨＣＰチャレンジに及ぼす（塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム）の影響
この実施例において提供される方法は、とりわけ、組換え治療ポリペプチド、例えば抗体を生成するためのプロセスをモニタリング及び開発するための手段として、１Ｄクロマトグラフィーを使用する、ＨＣＰのプロテオミクスに基づく解析の使用に関連する。この実施例は、検討しながらのプロセス開発検討を記載しており、この場合、生成物の培養物の一次回収の間に使用した、新規プロセスである化学的な、すなわち凝集剤である塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムの影響を、精製プロセスに対するＨＣＰクリアランスに関して決定した。
【０２６７】
ｐＤＡＤＭＡＣを使用する及び使用しない流れからの等価な試料間のＨＣＰを存在量に関して比較した。偽発見率は、５％で制御した。定量データを得た２５９のタンパク質の中で、１２１のタンパク質が、ｐＤＡＤＭＡＣ処理のないＣＣＣＳと比較して、ｐＤＡＤＭＡＣにより処理したＣＣＣＳ試料では、顕著（ｐ＜０．０５、ｑ＜０．０５）に低下することを示した。この実験において定量した各タンパク質に対するｐＩ値を算出して、ｐＤＡＤＭＡＣが媒介するＨＣＰ除去がタンパク質のｐＩと相関するかどうかを決定し、全体的に相関がないことが観察されたが（図２）、ｐＤＡＤＭＡＣの存在下で、存在量が２倍超で増加したことを示すタンパク質はすべて、＜５となるｐＩ計算値を有することが留意された。ｐＩの算出は、アミノ酸配列のみに基づいて行った：溶媒が接近可能な電荷情報はこの分析に含まず、電荷をベースとする相互作用は、全体の電荷よりもむしろ、タンパク質表面の特定の区域により媒介される可能性が高い。
【０２６８】
１０のタンパク質が、ｐＤＡＤＭＡＣ処理したＣＣＣＳ試料の有意（ｐ＜０．０５、ｑ＜０．０５）な増加を示した（表６）。タンパク質ＳＥＴ（存在量における最も高い変化を示すタンパク質）の定量に使用した例となるペプチドのＬＣ−ＭＳプロファイルが、図３に示されている。
【表１１−１】
2019533135.tif 000030
【表１１−２】
2019533135.tif 000031
【０２６９】
この解析全体にわたり、ｐＤＡＤＭＡＣの存在又は非存在により、プロテインＡの溶出試料又は最終生成物試料におけるいずれのＨＣＰの存在量も有意な差異（ｐ＜０．０５、ｑ＜０．０５）は決定されなかった（表７）。ここで採用した統計学的手法は、本解析方法に対して提案されている用途に基づくものであり、この解析方法は、個々の精製プロセスが、全集団と比較した、性能の有意な改善又は悪化を生じさせるかどうかを判定することであった（したがって、すべての集団化が等価であるという帰無仮説を使用した）。したがって、ｐＤＡＤＭＡＣを含んだプロセスは、特定のＨＣＰレベルに関して、対照プロセスよりもかなり優れたものではないか又は悪化した。
【表１２】
2019533135.tif 000032
【０２７０】
（例４）
プロセス免疫原性リスク査定
精製済み生成物試料におけるＨＣＰ負荷を鑑みると、ＣＣＣＳ中で特定されたＨＣＰの３％が、精製試料中のＨＣＰ含有量の６０％より多く含むと算出された。この観察は、精製によりＨＣＰの「ピギーバック」が、ＨＣＰ不純物の大部分の原因である可能性が高いことを示す以前の研究と一致し（Ｎ．Ｅ．Ｌｅｖｙら、「モノクローナル抗体のバイオプロセシングにおける、宿主細胞タンパク質生成物に関連する不純物の同定及び特徴付け（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．１１１巻（５号）、９０４頁（２０１４年）；Ｖ．Ｎ．Ｓｉｓｏｄｉｙａら、「ハイスループットプロテインＡクロマトグラフィーを使用するモノクローナル抗体との宿主細胞タンパク質の相互作用の検討（Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７巻（１０号）、１２３３頁（２０１２年）；Ｒ．Ｄ．Ｔａｒｒａｎｔら、「プロテインＡクロマトグラフィー中の宿主細胞タンパク質の吸着特徴（Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２８巻（４号）、１０３７頁（２０１２年））、ＨＣＰ集団における主要な差異が、精製試料中に存在するものと、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡに使用される抗血清の生成に使用したものとの間に存在していることを確認した。
【０２７１】
ＣＣＣＳ試料において特定されたＨＣＰの完全リストが、Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームを使用して解析され、各タンパク質（免疫原性リスクスコア、例えば免疫原性リスクスコア）に割り当てたリスクスコアとなった。得られたスコアは、Ｔ細胞活性化に対する最悪の場合のシナリオを表す。タンパク質内在化、抗原プロセシング及びＴ細胞受容体特異性などの免疫原性に寄与する他の因子のため、ＭＨＣ結合剤として同定されたペプチドのサブセットのみが、実際に、Ｔ細胞エピトープとなる。ＣＣＣＳ試料中の上位から２０の最も存在量の多いタンパク質が、それぞれのプロセス免疫原性リスクスコアと共に表８に示されている。
【表１３】
2019533135.tif 000033
【０２７２】
総合的なＨＣＰの免疫原性リスクスコアを、解析した試料の各々に対して算出した（表９）。これは、以下の通り算出した。
プロセスリスクスコア＝Σ（［タンパク質の存在量］ｘ［免疫原性リスクスコア］）
【表１４】
2019533135.tif 000034
【０２７３】
このプロセスリスクスコアは、検討下にあるプロセスの変化が、免疫原性タンパク質のレベルに基づくと、患者のリスクを増大させなかったことを、生物学的に関連して実証するものである。さらに、これらのスコアを使用して、免疫原性に関して、懸濁細胞培養物において必要となる可能性が低い高い影響をもたらすタンパク質を特定した。
【０２７４】
これらの結果は、ＨＣＰのプロテオミクスに基づく解析は、製造プロセス全体にわたり使用することができ、こうして、製造の規模拡大の間のＨＣＰを検出するための様々なアッセイの開発が回避されることを実証している。すなわちこの方法は、規模に依存しない。小規模から大規模までの全製造プロセス全体にわたる同じモニタリング方法の使用により、１つの規模から別の規模までの生産速度の移行における、付随する誤差を伴って、様々な製造規模で、複数のモニタリング法を開発する必要性などの、複数の問題を回避される。むしろ、プロテオーム法は、製造規模に無関係に使用することができる、単純な、一貫した、再現性のある方法を提供する。同一の組のＨＣＰが、細胞培養、タンパク質発現中、並びに精製前及び精製後に、ＨＣＰの変化を示すプロセスの様々な段階においてモニタリングされることがやはり確実にされる。
【０２７５】
このプロセスは、本開発プロセスに完全に統合された免疫原性計算を含んで、以下に限定されないが、（１）ゲノムが既知である任意の生成システムのため、又は生成システムの特定の変異体（例えば、具体的には、ＣＨＯのサブセットとしてのＧＳ  ＣＨＯ）のために、免疫原性を行うことを可能にする方法、及び（２）様々な患者集団（例えば、地理的領域又は民族性による）のために行われる免疫原性査定を含めた、いくつかの利点を提供する。これは、世界集団の場合のＨＣＰの総合的な平均スコアは、単一の特に感受性の高い群に対する高いスコアを隠すことがあるので重要である。
【０２７６】
要約すると、上述の実施例は、迅速且つ規模拡大可能な、ＨＣＰ不純物の定量的及び半定量的解析を実証している。この手法は、最も普及している確立された方法と比べて、約１０倍のスループット向上を実証する（Ｃ．Ｅ．Ｄｏｎｅａｎｕら、「包括的なオンラインでの２次元液体クロマトグラフィー／質量分析法によるバイオ治療用タンパク質における宿主細胞タンパク質の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｏｓｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」、ＭＡｂｓ．４巻（１号）、２４頁（２０１２年））。解析は、Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計を使用する、１次元逆相ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２を使用して行い、分析時間は、試料あたり、１時間未満であった。この手法は、澄んだ培養上清から決定したＨＣＰに由来するＭＳ１のピークの参照ライブラリの生成に依存するものであった。この参照ライブラリは、保持時間及びｍ／ｚ空間における枠を定義して、次に、精製試料に対して取得したデータに適用することができる。したがって、この試験方法が精製済み抗体治療剤中のＨＣＰを特定する能力は最大化されて、Ｈｉ３法を使用して行われる半定量的解析から切り離される（Ｊ．Ｃ．Ｓｉｌｖａら、「ＬＣＭＳＥによるタンパク質の絶対定量：並行ＭＳ取得による（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＬＣＭＳＥ：ａ  ｖｉｒｔｕｅ  ｏｆ  ｐａｒａｌｌｅｌＭＳ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．５巻（１号）、１４４頁（２００６年））。精製済み物質のＨＣＰプロファイルは、次に、コンピュータでの免疫原性予測手段であるＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）と組み合わせて、生成プロセスに対する総合的なＨＣＰ免疫原性リスクスコアを生成した。一旦、患者に影響する可能性がある生成物の影響又はインビボでの関連性に関して特定されて査定されると、特定の重要な鍵となるＨＣＰを、次に、特定のＥＬＩＳＡ又は標的ＬＣ−ＭＳ２方法により、型通りのＱＣ解析の一部としてモニタリングすることができる。
【０２７７】
（例５）
方法
実施例５〜８では、リスクをベースとするプロセス開発とタンパク質発現システムの機構的解析の両方に対するプロテオームによる手法を、哺乳動物及び酵母系の両方で試験した。この方法は、総合的且つ特定のリスク因子を判定し、生成プロセスの選択及び最適化を容易にし、試料を受領して１週間以内に結果をもたらした。データの変換は、プロセス開発環境において決定的に重要である。このように生成したデータは、任意の他の確立した技法により得ることができなかった。
【０２７８】
このデータセットは、この方法の決まった手順での使用により、商業的なプロセス開発プロジェクトにおいて実行され得ることを確立するものである。
【０２７９】
以下は、使用した方法を記載し、実施例６、７及び８全体を通して参照した。実施例５がない場合、実施例１の方法を、実施例６、７及び８に適用する。
【０２８０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用の試料調製
３つの複製物を各試料に対して調製した。１０μｌの体積の各試料を０．５ｍｌのエッペンドルフ管に移送した。９０μｌの０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（ｐＨ５．５）、６．６ＭグアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を各複製物に加えた。５０℃において３０分間、インキュベートした。続いて、製造業者の指示書の従い、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ尿素、１ｍＭ  ＴＣＥＰに、すべての試料をバッファー交換した。消化は、質量分析法グレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：２０トリプシン：タンパク質比率で加え、２５℃で１８時間のインキュベートにより行った。消化は、２％（最終）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の添加によってクエンチした。
【０２８１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ取得
データは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ  Ｑ−ＯＴ−ｑＩＴ（四重極−オービトラップリニアイオントラップ）質量分析計に連結したＤｉｏｎｅｘ  ＲＳＳＬｎａｎｏ  ｎａｎｏＬＣシステムを使用して取得した。各試料に関してトリプシンペプチド１μｌ体積を、９８：２の水：アセトニトリル＋０．０８％ＴＦＡからなるロード用緩衝液中で、ＰｅｐＭａｐ１００  Ｃ１８  ３００Å  Ｎａｎｏ−Ｔｒａｐカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）上に、１２μｌ／分で３分間、注入した。３分後、分析用カラム（ＥａｓｙＳｐｒａｙ  ＲＳＬＣ  Ｃ１８  ２μｍ、１００Å、７５μｍ×２５ｃｍ（Ｔｈｅｒｍｏ））上に捕捉用カラムを通じて逆方向に、ｎａｎｏＬＣ流を向けた。直線グラジエントは、水中の０．１％ギ酸と８０：２０のアセトニトリル：水中の０．１％ギ酸との間を適用した。
【０２８２】
イオン化源の設定は、２５００Ｖのスプレー電圧及び２７５℃の移送管温度で取得中、変更しなかった。質量分析計は、３５０〜１，５５０ｍ／ｚの範囲にわたり、２．０ｅ５のＡＧＣ標的及び５０ｍｓの最大注入時間で、四重極分離での１２０，０００ＦＷＨＭの名目解像度で、オービトラップにおいて、ＭＳ１データを取得するための陽イオン化モードで構成した。データは、個々の試薬イオン源からの生成時に、フルオランチンイオン基準質量に基づく内部標準を使用して質量補正した。ｚ＝２とｚ＝６との間の電荷状態しか、ＭＳ２断片化に選択しなかった。
【０２８３】
ＭＳ２断片化は、２８％の正規化した衝突エネルギー、１．０ｅ４のＡＧＣ標的、及び「通常」捕捉スキャン速度において２００ｍｓの最大スキャン時間において、線形イオン捕捉で行った。
【０２８４】
質量分析法のデータ解析
ＭＳ２断片化に基づいたタンパク質同定は、ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行った。タンパク質同定は、ＣＣＣＳ（澄んだ細胞培養上清）のみに対して行った。ペプチドレベルでの偽発見率は、デコイ融合技術を使用して、＜０．１％で制御した（Ｚｈａｎｇ，Ｊら、「ＰＥＡＫＳ  ＤＢ：高感度及び正確なペプチド同定に対するデノボ配列決定支援データベース探索（ＰＥＡＫＳ  ＤＢ：  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４巻（１１号）、１１１頁（２０１２年））。各タンパク質の帰属に関して、少なくとも３つの固有のペプチドを必要とした。質量許容差は、親イオンの場合、＜７．５ｐｐｍ、及びフラグメントイオンの場合、＜０．３Ｄａで指定した。
【０２８５】
データは、ＰＥＡＫＳ  ｓｔｕｄｉｏ７を使用して、ＵＮＩＰＲＯＴ  ＣＨＯプロテオーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）に対して処理し、存在するタンパク質を同定した。同定は、培養上清試料に関してのみ行った。試料はすべて、プロテオミクスのためのＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩを使用して処理した。ＰＥＡＫＳからの同定は、この実験全体を通じて、定量するためＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓにインポートした。各細胞系のデータを独立して処理した。定量は、Ｈｉ５法を使用して行った。
【０２８６】
ＳＢＱ（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ）精製した細胞系の各々に対して、プロテオミクスソフトウェアのためのＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ内で、Ｈｉ５定量を行った。この場合、Ｈｉ５定量は、ソフトウェア（このソフトウェアは、この機能を含ませるようアップグレードした）内で行った。この能力は、データ解析の複雑さを大幅に減少させた。定量目的のために、抗体重鎖又は軽鎖のどちらか一方を定量用標準品として使用し、２，０００，０００として設定した（このソフトウェアにおける単位は、ｆｍｏｌとして指定されるが、この値は、ｍＡｂのｍｏｌ数がそれぞれ、重鎖２ｍｏｌ及び軽鎖２ｍｏｌを含有するので、ＨＣＰレベルは、百万分率として報告するように設定した）。
【０２８７】
インシリコ免疫原性解析
各同定したタンパク質の配列を、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）プラットフォームを使用して、インシリコ免疫原性査定に供した。
【０２８８】
Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）は、免疫原性リスクをスクリーニングするためのインシリコプラットフォームである。このプラットフォームは、この配列に由来するすべての１０マーペプチドのＨＬＡクラスＩＩ受容体への結合親和力を予測することにより、タンパク質配列中の潜在的なＴ細胞エピトープを特定する。
【０２８９】
スクリーニングは、世界集団を標的して行った。世界集団ＨＬＡの組は、免疫原性プロファイリングの一次注目点である、８５ＨＬＡクラスＩＩアロタイプ、特に４３ＤＲＢ１アロタイプを含む。上から２５％の最も多量に存在するヒトタンパク質を含めた、ヒトプロテオームフィルターを使用して、自己ペプチド（ＨＬＡ分子に現れるが、Ｔ細胞受容体に結合しないペプチド）をフィルタリングした。
【０２９０】
タンパク質への免疫原性リスクスコアは、タンパク質中の予期されるＴ細胞エピトープの数、及び影響を受けたＨＬＡアロタイプの集団頻度を考慮することにより得られる。
【０２９１】
（例６）
高いリスクのタンパク質の存在を最小化するための宿主細胞系及び精製条件の選択
この実施例において提示されている方法は、バイオロジクスの精製スキームの開発において使用する。精製プロセスステップの最適化のための典型的なワークフローは、条件の組合せをスクリーニングすることを含む。この場合、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ樹脂を使用するイオン交換ステップを、この手順において使用される緩衝液のｐＨ及びこのカラムの負荷能力に関して検討した。いくつかの確立された手法は、ＡＫＴＡ規模での精製を使用してこれらの条件を最適化し、その結果、合計で９つの試料を比較する。しかし、精製条件のスクリーニング用ロボットプラットフォームの使用の増大は、標準的開発段階において生成される試料数がかなり増加する。これらの段階を支援するため、意思決定可能となるよう、単回解析での９６以上の試料の解析は適切な転換速度を伴って行われなければならない。
【０２９２】
これらの条件を模倣するため、宿主細胞系と生成物との間のさらなる比較をこの実験にやはり含ませた。これにより、代表的な試料数の試験が可能になるが、やはりこの方法は、候補となる生成細胞系及び生成スキームの統合試験を支援することができることを実証した。同一の生成物を発現する細胞系は、非常に異なる不純物プロファイル／リスクを有することができること、及び選択は力価、生成物品質及び成長特徴の既存の測定値に加えて、このパラメータに基づくことができると仮定した。この場合、これらの細胞系はまた、精製のための様々な最適条件を有すると思われる。
【０２９３】
この実験において検討した要因は、以下の通りであった：
・精製緩衝液ｐＨ：ｐＨ５、ｐＨ６及びｐＨ７
・負荷能力：５００ｍｇ／ｍｌ、１０００ｍｇ／ｍｌ、１５００ｍｇ／ｍｌ
・これらの要因を、以下の細胞系及び生成物に関して試験した：
・Ｅ２２、Ｌｏｎｚａプラットフォーム法において、高い細胞濃度まで成長するｃＢ７２．３抗体を発現する細胞系。
・３Ｃ１２、Ｌｏｎｚａプラットフォーム法において、平均的な細胞濃度まで成長するｃＢ７２．３抗体を発現する細胞系。
・Ａ１４、Ｌｏｎｚａプラットフォーム法において、平均的な細胞濃度まで成長するＨ３５ｋ１抗体を発現する細胞系。
【０２９４】
これらの要因のすべての組合せを、３つの技術的複製物として解析し、合計で８１の試料を生成した。この試料数は、ＤｏＥ（実験計画法）実験手法から誘導したものに類似した（しかし、ＤｏＥ設計では、これらの複製物は既にこの実験設計に統合されているので、たった１つの技術的複製物にしか行わなかった）。さらに、各細胞系の培養上清試料はまた、三連で解析した。これらは、ＨＣＰの検出、同定に使用して、個々のＨＣＰの定量のための精製試料に適用する不純物マップを生成した。
【０２９５】
次に、特定したＨＣＰのリストを、インシリコ免疫原性査定手段である、既に報告したＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）によって解析し、やはり薬物生成物との潜在的な相互作用を査定するための遺伝子オントロジーによって解析した。これにより、同一の方法を、タンパク質の識別子又は配列のリストから数値的因子を生成することが可能な任意のリスクをベースとする手段に使用することができることを実証する。抗体生成の場合、ＨＣＰ免疫原性の影響は、プロテインＡの親和性精製が、不純物除去の非常に有効な方法となるので、比較的小さいと考えることができた。しかし、バイオ治療剤それ自体又は他の界面活性剤のどちらか一方との相互作用のために、ＨＣＰは、薬物生成物の安定性に関する問題を引き起こすといういくつかの報告例がある。
【０２９６】
生成物相互作用リスクスコアは、遺伝子オントロジー用語における、関連キーワードを探索することにより決定した。データベースから誘導されたこれらの用語は、試験試料内で見いだされた遺伝子識別子を調査するものである。プロテアーゼ活性に関連する用語を含むタンパク質は、関連するものとしてタグ付けされ、スコア１を与えた。薬物生成物の分解において立証されている活性を有する特定のタンパク質（タンパク質又は界面活性剤の分解）には、さらに一層高い９という重み付けを与える（この場合、カテプシンＤ１及びホスホリパーゼＢ２）。薬物安定性、効力又は安全性に影響を及ぼすことが経験的に示されている他のタンパク質を含めた、より幅広いデータベースの開発により、この手法が拡張されて、治療用タンパク質又は製剤に特異的なスコア付けを行うことができる。例えば、ホスホリパーゼＢは、ポリソルベートを含有する製剤を含む生成物に関連するとしか見なされなかった。
【０２９７】
このスコア付けにより、最終薬物製品の分解の最小リスクを有する、特定のプロセス条件の選択が可能となる。様々な細胞系及び精製条件に関する、統合された生成物相互作用のリスクが、図４に示されており、薬物製品の安定性に関する陰性結果を有すると報告されている特定のＨＣＰのプロファイルが、図５及び図６に示されている。Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）による、ＨＣＰアミノ酸配列解析をベースとする免疫原性査定が、図７に示されている。
【０２９８】
細胞系と精製条件との間の有意な差異は、一般的及び特異的な生成物の両方の相互作用リスク、及び免疫原性査定に関して明確に区別することが可能であった。
【０２９９】
ＨＣＰプロファイルの変化が、同じｃＢ７２．３生成物を発現する２つの細胞系に関して明記されており、この手法をやはり使用して、ＨＣＰ不純物プロファイルに基づいた、及び精製スキーム間の細胞系を選択することができることが示された。ｃＢ７２．３生成物を発現する２つの細胞系に関すると、Ｅ２２は、試験した大部分の条件下で、３Ｃ１２と比較して、一層高い生成物分解リスクスコアを与えた。負荷能力が増大すると、生成物分解リスクが低下するが、個々の目的タンパク質は、その条件に個々の応答を示すという一般的な傾向が観察された。例えば、ホスホリパーゼＢのレベルは、細胞系Ａ１４の場合、低いｐＨにおいて負荷能力と共に向上した。
【０３００】
したがって、この手法は、特定のタンパク質治療剤の各々に対して、個々の及び統合したリスク因子に基づいて、情報提供された決定を行うことを容易にするため、試験試料間のリスクの差異を検出すると実証された。
【０３０１】
精製戦略に対して行われる総合的な推奨は、以下の通りであった：
Ｅ２２−５００ｍｇ／ｍｌでｐＨ７
３Ｃ１２−任意の候補負荷能力でｐＨ７
Ｈ３５Ｋ１−任意の候補負荷能力でｐＨ７
【０３０２】
しかし、推奨は、所望の製剤（ホスホリパーゼＢの添加剤との相互作用に基づく）及び投与経路に応じて変わり得る（例えば、皮下投与は、免疫原性リスク因子に関して一層高い重み付けが必要となり得る）。
【０３０３】
この方法は、細胞系の選択にも使用することができた。この場合、３Ｃ１２は、同じ宿主細胞系から誘導され、同じ生成物を作製するにもかかわらず、試験したすべての条件下で、Ｅ２２よりも薬物生成物の安定性に影響を及ぼし得る、精製試料中でより低いレベルのＨＣＰを生成することが実証された。反対に、Ｅ２２は、３Ｃ１２と比較して、より低い総合的なＨＣＰ免疫原性リスクを有する精製試料を一貫して生成した。
【０３０４】
（例７）
生成物の回収のための異なるプロセスの査定
プロテオーム法の一次回収プロセスの開発への適用も評価した。この場合、プロテインＡクロマトグラフィー前のＨＣＰのクリアランス前の２つの代替的な方法を試験した：Ｎｉａｎ，Ｒ．ら「先進的なクロマチン抽出により、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの捕捉性能が改善される（Ａｄｖａｎｃｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、１４３１頁、１〜７巻（２０１６年）の手法に従うクロマチン抽出、及び３Ｍ  Ｅｍｐｈａｚｅフィルターを使用する上清の透明化。両方の方法に使用されたｃＢ７２．３抗体を発現する培養物に由来する培養上清の試料も解析し、定量するための試験試料に適用したＨＣＰ不純物マップを生成した。試料はすべて、三連で解析した。
【０３０５】
両方の処理法は、対照試料と比較して、それぞれの試料の各々において、ＨＣＰ負荷が軽減した。クロマチン除去処理は、総合的なＨＣＰ負荷を対照の約半分にまで低下した。Ｅｍｐｈａｚｅ処理により、総合的なＨＣＰ負荷が約２５％低下した（図８）。ＨＣＰ負荷の低下は各タンパク質に対して等しくなかった。あるタンパク質はどちらの処理によっても影響されなかった。クロマチン除去は、一般に、Ｅｍｐｈａｚｅにより効果的である。タンパク質は、クロマチン除去プロセスによるよりも、Ｅｍｐｈａｚｅによって、一層低下した。各ＨＣＰの生物物理特性のさらなる解析を行い、その影響を及ぼす特定の特性があるかどうかを決定することができた。
【０３０６】
異なるプロセスの代替に対するリスク解析は、既に記載した通り生成物の相互作用に対する可能性に対して行った。さらに、追加的なプロセスリスクを査定した。生成物の解離（抗体の鎖間のジスルフィド結合の還元）が、産業間の多数のプロセス及び生成物において観察された。これは、培養上清中の、２つの特定の酸素システムである、チオレドキシン及びグルタレドキシンシステムの存在にリンクした。この実験では、解離リスクを、関与し得る潜在的な遺伝子生成物の各々、及びジスルフィド結合の異性化に関与するものなどの還元可能性を有する他のタンパク質に関して、これらの立証した酵素システムをスコア付けすることにより査定した。
【０３０７】
異なるプロセスの選択肢のリスク査定により、各場合において、リスクタグ付けされたタンパク質に対する一般的な傾向は、全ＨＣＰと同じであることが示された。しかし、解離リスクスコア付けは、ＨＣＰ低下の一般レベルよりも、クロマチン低下処理に対して大きな規模での低下を示した。全ＨＣＰの２分の１倍未満となることに比べて、解離リスクスコア（ｐ＜０．０３）は５分の１倍の低下となった（図９）。リスクは、クロマチン除去処理によって、全ＨＣＰレベルから予期されると思われるものよりも低減されたという点で、分解リスクスコアは、同様のパターンに従った（図１０）。
【０３０８】
総タンパク質と特定のリスクスコアとの間に観察された差異は、伝統的な凝集物の測定によってよりもむしろ個々にＨＣＰをモニタリングすることによって生じる情報において得られるもの、及びその情報を使用してプロセス決定を推進する方法を強調する。同一のデータセットにおける多数のタンパク質は、処理間の存在量の差異がないことを示した。これらのタンパク質のいずれかが、リスク因子として特定される場合、全ＨＣＰの総合的な測定値は、工学的プロセスがそれらを除去すると、誤解が生じると思われる。例えば、カルボキシペプチダーゼ（遺伝子名Ｉ７９＿００６８１６）は、任意の試料間に変化がないことを示している一方、ピルビン酸キナーゼ（遺伝子名Ｈ６７１＿４ｇ１３０４１）は、Ｅｍｐｈａｚｅ処理によって影響を受けないが、クロマチン除去処理によってほとんど完全に消滅した（図１１）。
【０３０９】
（例８）
生成物を回収するための様々な発現及び発酵システムの査定
ピキア・パストリス発現システムに由来する細胞培養上清試料を、ＨＣＰ内容物及び組成に関して解析した。試料は、表１０に示されている３種の異なるレポータータンパク質、２種の異なる誘発系及び異なる発酵条件を、様々なｐＨ及び温度と共に表した。各試料は、三連で試験した。
【表１５】
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【０３１０】
生成したＬＣ−ＭＳＭＳデータは、処理中のデータのより優れた整列を可能にするため、治療用タンパク質の各々に関して、個別に解析した。データベースの検索は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから、コマガタエラ・ファフィ（株ＡＴＣＣ７６２７３／ＣＢＳ７４３５／ＣＥＣＴ１１０４７／ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０／Ｗｅｇｎｅｒ２１−１）（酵母）（ピキア・パストリス）に関するプロテオームに対して行った。発現プロファイル（ｑ値＜０．０１）における有意な変化及び倍率変化＞２を示すタンパク質は、発現プロファイルにおける類似性を評価した。
【０３１１】
ｐＡＯＸ誘起
タンパク質３は、メタノール誘発系ｐＡＯＸ及びＬｏｎｚａの制限グルコース誘発系ｐＧ１．３を使用して発現させた。ｐＡＯＸ系を取り込んだ試料は、メタノール代謝（アルコールオキシダーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）に特異的なタンパク質の存在量の顕著な増加、及びメタノール代謝中に生成する反応性酸素種の代謝を示した（スーパーオキシドディスムターゼ、ペロキシドレキシンＰＭＰ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン）。メタノール代謝周辺の代謝プロセスが、ｐＧ１．３誘発に比較して、ｐＡＯＸ誘発培養物中のタンパク質発現レベルの観察される変化と共に、図１２に示されている。
【０３１２】
この実験内で、さらなる変化が観察されており、試料７、８及び１０に比べて、試料９及び１１の場合の、高い力価と相関した。これらのタンパク質は、タンパク質のフォールディングに関与する、ＡＴＰアーゼ、ＧＰ１アンカー細胞表面グリコタンパク質、ペプチジル−プロピルシストランスイソメラーゼ、及び翻訳延長因子ＥＦ−１ガンマ（コマガタエラ・ファフィ）（Ｃ４Ｒ６Ｅ８）と相同性を示す特徴付けられていないタンパク質Ｆ２ＱＵＪ０を含んだ。
【０３１３】
ｐＧ１．３システムを表す試料は、プロセッション（ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎ）炭水化物（グルカナーゼ、グルコシダーゼ）及び構造タンパク質に関与する酵素の発現量の増加も示した。
【０３１４】
上清タンパク質に及ぼす温度及びｐＨ影響
様々な発酵条件は、タンパク質発現プロフィールの変化に相当する。温度及びｐＨの上昇時に、発酵の実施に関して、存在量の増加がシャペロンタンパク質ＨＳＰ９０に観察された。
【０３１５】
条件３は、タンパク質生合成と共に関与するタンパク質、例えばリポソームタンパク質、延長因子；細胞の呼吸、例えばデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼ、コンドリアタンパク質を含めた、幅広い範囲のタンパク質の存在量の大きな増加を示した。これは、混入事象が起こる恐れがあるこのようなプロセス間の観察と相関した。この試料におけるタンパク質数の増加の特定により、この方法はまた、バイオリアクター中の他の生物の成長が培養上清のタンパク質組成を混乱させる場合を検出することが可能となることを実証している。
【０３１６】
この実施例において、プロテオーム法を使用して、プロセス選択に関するリスクに基づく査定よりもむしろ、より多くの発現プラットフォームの機構的解析を行うことができた。代謝過程に関してピキア・パストリス試料により生成した情報のこのような解析は、タンパク質発現の誘発及び培養物条件の変化に関与した。この技術により、シャペロンの生成、タンパク質のフォールディング及びタンパク質の翻訳後修飾のシステムのためのバイオプロセスの最適化が可能になり、これらのすべてが、バイオ治療剤の生成の成功に関連する。
【０３１７】
まとめると、これらの実施例は、数百の試料を迅速に解析して、数百の可能なタンパク質、例えばＨＣＰ、製造のプロセス及び方法に導入される汚染物質を特定して査定するのに有用な方法を示す。本明細書において示されている方法は、生成物、例えば組換えポリペプチドの様々な製造プロセス及び方法を評価する能力、並びにタンパク質、例えばＨＣＰ、それらが生成した汚染物質、及びそれ自体を製造するプロセス及び方法に関連する総合的なリスクスコアに関連するリスクスコアに基づいて、前記プロセスの間で選択する能力を有する。本明細書において示されている方法は、最終精製生成物、例えば組換えポリペプチド又は精製済み治療生成物により、早期段階、例えば細胞上清からの、所与の製造プロセス又は方法をモニタリングする能力を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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