(57)【要約】  本発明は、細菌によって引き起こされる哺乳動物（ヒト及び動物）の感染症の治療の一般的分野に関し、特に、結核（ＴＢ）、マイコバクテリアによって引き起こされるブルーリ潰瘍及びハンセン病のような疾患の治療に関する。本発明は、上記の問題を克服する可能性を有する一連の新しいベンゾチアジノン化合物の生成を目的とする。本発明は、好ましい実施形態において、置換基Ｒ１〜Ｒ１５が請求項１及び従属請求項に記載の意味を有する一般式（Ｉ）の化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩。
【化１５】
2019533013.tif 000030
(I)
（式中、
Ｒ１はＮＯ２を表し、
Ｒ２はＣＦ３を表し、
置換基Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも一方は、ＯＨ、ＳＲ１４、ＮＨＲ１５、ＣＮ、Ｎ３、１〜４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、場合のよってハロゲン化された、直鎖又は分岐の脂肪族基、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アシルであり、Ｒ３及びＲ４のうちの他方は、さらに水素であってもよく、
Ｒ６は、２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル又は４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５は互いに独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基である）
【請求項２】
（Ｓ）−７−メチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（９ａ）、
（Ｓ）−５−メチル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（９ｂ）、
（Ｓ）−５−エチル−２−（２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１０）、
（Ｓ）−７−エチル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１１）、
（Ｓ）−５−シクロプロピル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１２）、
（Ｓ）−５−エチニル−２−（２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１３）、
（Ｓ）−２−（２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−４−オキソ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−７−カルボニトリル（１４）、
（Ｓ）−５、７−ジメチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１、３−ベンゾチアジン−４−オン（１５）、
２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−５−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１６）、
２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−７−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１７）、
からなる群から選択される請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
（Ｓ）−５−メチル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（９ｂ）、
２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−５−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１６）、
からなる群から選択される請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
前記請求項のいずれかに記載の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項５】
微生物感染によって引き起こされる疾患の治療方法において使用するための化合物であって、式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩、又は請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量が、それを必要とする患者に投与されることを含む、化合物。
【請求項６】
哺乳動物におけるマイコバクテリア感染症の治療的もしくは予防的処置のための方法における使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項７】
前記方法が、哺乳動物における結核又はハンセン病感染の治療的もしくは予防的処置のためである、請求項６に記載の使用のための化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項８】
下記式（ＩＩ）に示す構造を有するマイゼンハイマー錯体。
【化１６】
2019533013.tif 000031
(II)
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立してＮＯ２、ＮＲ７Ｒ８、ＮＨＯＲ９、−ＣＯＯＲ９、ＣＮ、ＣＯＮＲ１０Ｒ１１、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＳＯ２ＮＲ１２Ｒ１３、直鎖又は分枝状のＣ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＦ３、１〜３個の炭素原子を有するモノ−、ジ−又はトリフルオロアルキルであり；ただし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方はニトロ基であり；
Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立して、水素、ヒドロキシル、−ＳＲ１４、ＣＮ、−Ｎ３、又は１〜４個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和の、場合によりハロゲン化された、直鎖状もしくは分岐鎖状の脂肪族基（radical）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルコキシであり；
Ｒ５は、水素、又は１〜６個の炭素原子を有する不飽和もしくは飽和の、場合によりハロゲン化された、直鎖もしくは分岐の脂肪族基(radical)；１〜４個の炭素原子を含有するアシル、−ＣＯＮＨＲ１０又は−のＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４であり；
Ｒ６は、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリール置換基、好ましくは２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル基又は４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基であり；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、互いに独立して、水素、１〜６個の炭素原子を有する不飽和もしくは飽和、場合によりハロゲン化された、直鎖もしくは分岐脂肪族基(radical);フェニル；１〜４個の炭素原子を有するベンジル又はアシル；から選択される)
【請求項９】
前記ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリール置換基が、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される１〜３個の置換基で置換されている、請求項８に記載の式（ＩＩ）のマイゼンハイマー錯体。
【請求項１０】
式中、Ｒ１がＮＯ２であり、Ｒ２がＣＦ３であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ１又は２個の水素又はメチル及び水素であり、Ｒ５が水素又はメチルであり、Ｒ６は２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イルである、請求項８又は９に記載の式（ＩＩ）のマイゼンハイマー錯体。
【請求項１１】
式中、Ｒ１がＮＯ２であり、Ｒ２がＣＦ３であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ１個又は２個の水素であり、Ｒ５が水素又はメチルであり、Ｒ６は４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基である、請求項８又は９に記載の式（ＩＩ）のマイゼンハイマー錯体。
【請求項１２】
ニトロ置換ベンゾチアジノン化合物の代謝を解明するための研究手段としての、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のマイゼンハイマー錯体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、細菌によって引き起こされる哺乳動物（ヒト及び動物）の感染症の一般的治療分野に関し、特に、マイコバクテリアによって引き起こされる結核（TB）、ブルーリ潰瘍及びハンセン病のような疾患の予防的又は治療的処置に関する。
【０００２】
特に、本発明は、既知の抗結核化合物の最近のｉｎ  ｖｉｖｏ代謝試験、それによって達成された結果について、並びに既知化合物と比較して生物活性及びｉｎ  ｖｉｖｏ代謝安定性を改善する可能性を有する一連の新しいベンゾチアジノン化合物について報告する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
マイコバクテリアの感染に起因する結核、ハンセン病及びブルーリ潰瘍のような感染症は、疾病負荷と死亡率の点では、ヒトの健康への最も挑戦的な脅威に属する。結果として、特に薬物耐性を克服し、そして利用可能な薬物の既知の劇的な副作用を克服するために、改善された生物活性又は改善された代謝安定性を有する新しい薬物に対する緊急の必要性がある。
【０００４】
ベンゾチアジノン及びそれらの抗菌剤としての、特にマイコバクテリアに対する使用は、一般に知られている。（Ｓ）−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，３］チアジン−４−オン（ＢＴＺ０４３）と関連する２−［４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル］−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４−Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（ＰＢＴＺ１６９）は、国際公開第２００７／１３４６２５号及び国際公開第２０１２／０６６５１８号に記載されている。両化合物は、可能性のある開発のために広範な研究を受けている、非常に強力な抗結核剤である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の要約
上記の背景を考慮すると、マイコバクテリアに対する高い抗菌活性を提供するだけでなく、以前に記載された化合物と比較して、安全性、代謝安定性及び良好なＡＤＭＥプロファイルのようなの代替的な又はさらに改善された特性をも示す新規化合物を開発することが非常に望ましい。
【０００６】
本発明は、上記の問題を克服する可能性を有する一連の新しいベンゾチアジノン化合物の生成を目的とする。
【０００７】
本発明の一部として報告されているベンゾチアジノンを用いた最近のｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＢＴＺ０４３及びＰＢＴＺ１６９のマイゼンハイマー錯体を含む、新しくかつ全く前例のない還元経路を明らかにした。この還元経路は、前記マイゼンハイマー錯体及びその後続の化学の詳細な特徴付けを可能にした化学的研究によって確認されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらのｉｎ  ｖｉｖｏ研究及び化学的研究とＬＣ−ＭＳの物理化学的特徴付け及びアッセイ開発との組み合わせもまた、抗結核剤のこの有望なクラスの合理的なリード化合物の最適化(lead  optimization)のための基礎を提供した。特に、ニトロ置換ベンゾチアジノン化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ代謝は、前記ニトロベンゾチアジノン部分の脱芳香族化を含むことが見出された。以下の式（Ｉ）中の位置Ｒ３及びＲ４の一方又は両方の水素原子をより大きな置換基で置換することにより、これらのベンゾチアジノンの重要な代謝を変えることができ、及びしたがってさらに改良された抗マイコバクテリア化合物への合理的なアクセスが可能になる。
【０００９】
好ましい実施形態では、本発明は、したがって、式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩に関する。：
【化１】
2019533013.tif 000002
(I)
（式中、
Ｒ１はＮＯ２を表し、
Ｒ２はＣＦ３を表し、
置換基Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも一方は、ＯＨ、ＳＲ１４、ＮＨＲ１５、ＣＮ、Ｎ３、１〜４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、場合のよってハロゲン化された、直鎖又は分岐の脂肪族基、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アシルであり、Ｒ３及びＲ４のうちの他方は、さらに水素であってもよく、
Ｒ６は、２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル又は４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５は互いに独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基である）
【００１０】
実施形態［１］に記載の上記式（Ｉ）における一実施形態では、Ｒ３及びＲ４は両方とも上記で定義された通りであり、且つ、水素とは異なる。本発明の別の実施形態において、Ｒ３は水素であり、そしてＲ４は上で定義された通りである。本発明のさらなる実施形態において、Ｒ４は水素であり、そしてＲ３は上で定義された通りである。
【００１１】
本発明の新規ベンゾチアジノン化合物及び／又はそれらの医薬的に許容可能な塩は、疾患の治療的処置に有用である。好ましくは、前記疾患は結核、ハンセン病又はブルーリ潰瘍を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面の説明
【図１】図１ａ）−ｄ）は、以下を開示している。：  ａ）ニトロベンゾチアジノン一般の作用の分子機構；  ｂ）ＢＴＺ０４３処理ミニブタの血漿サンプルの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムセクション（２５４ｎｍのＵＶトレース）、サンプル調製直後（上）及び数時間後（下）；  ｃ）ＮａＢＨ４を介したＢＴＺ０４３の還元によって得られた生成物混合物の特徴的な化学シフト領域；  ｄ）ＮａＢＨ４を介したＢＴＺ０４３の還元によって得られた生成物混合物（下）と比較したＢＴＺ０４３処理ミニブタの血漿サンプル（上）のＨＰＬＣクロマトグラムセクション（２５４ｎｍのＵＶトレース）。
【図２】図２ａ）−ｂ）は、  ａ）還元及びメチル化ステップの略図、  ｂ）６ａ／ｂ及び５ｂの構造ならびに６ａ／ｂの特徴的なＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ及びＨＭＢＣカップリング、である。
【図３】図３ａ）−ｄ）は、  ａ）新鮮な(fresh)全血をＢＴＺ０４３及びＤＭＳＯと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後に得られた血漿サンプルのＨＰＬＣプロファイルセクション（２５４ｎｍトレース）（ヒト血液による対照(control)）、ここで、５ｂの同一性は明白にＵＶ特性及び保持時間によって保証されている、ＨＰＬＣプロファイルセクション；  ｂ）ｍ／ｚ＝４５９．１６４９〜４５９．１６９５（ｃｏｒｒ．７ｂ  ［ＰＢＴＺ１６９＋２Ｈ＋Ｈ］＋）での、    Ｉ：  新鮮な全血をＰＢＴＺ１６９とｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後に得られた血漿サンプル；    ＩＩ：  新鮮な全血をＢＴＺ０４３とｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後に得られた血漿サンプル（陰性対照）；    ＩＩＩ：  アセトニトリル／水中でＰＢＴＺ１６９をＮａＢＨ４で還元することによって調製した標準(reference)混合物;の抽出イオンクロマトグラム（ＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ、ポジティブモード）、ここで７ａ／７ｂの位置化学は５ａ／ｂと同様に提案された、抽出イオンクロマトグラム；  ｃ）ＢＴＺ０４３を用いたＭｅ−グリニヤール反応の略図；  ｄ）新鮮な全血を、ｍ／ｚ＝４３４．０９７０−４３４．１０１４（ｃｏｒｒ．  ５ｂ  ［ＢＴＺ０４３＋２Ｈ＋Ｈ］＋）で、    Ｉ：  ＢＴＺ０４３（陽性対照）と、    対照(controls)：  アセトニトリル／水中でＮａＢＨ４を用いてＩＩ：  ９ａ及びＩＩＩ：  ９ｂを還元することによって調製した標準混合物と；一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後に得られた血漿サンプルの正規化抽出イオンクロマトグラム（ＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ、ポジティブモード）であって、ここで、位置化学は割り当てられなかった、正規化抽出イオンクロマトグラム；である。
【図４】図４は、合成された５ｂ標準化合物（下）及びＢＴＺ０４３と共に１５分間嫌気的にインキュベートされた酵母細胞懸濁液からの上清（上）のＨＰＬＣプロファイルセクション（２５４ｎｍトレース）であり、ここで５ｂの同一性は、ＵＶ特性及び保持時間によって明確に保証されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、既知のベンゾチアジノン化合物ＢＴＺ０４３及びＰＢＴＺ１６９の使用に関する最近のｉｎ  ｖｉｖｏ研究の結果を開示するのであって、前記２つの化合物のマイゼンハイマー錯体を含む新しい、且つ、完全に前例のない還元経路を明らかにした。前記還元は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験及び化学試験と、ＬＣ−ＭＳの物理化学的特性決定及びアッセイ開発との組み合わせを用いることによって、マイゼンハイマー錯体及びその後続の化学の完全な特性決定を可能にする化学試験によって確認された。
【００１４】
化学構造（Ｓ）−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロ−メチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン、（１）、を有するＢＴＺ０４３、及び化学構造２−［４−［シクロヘキシルメチル］ピペラジン−１−イル］−８−ニトロ−６−（トリフルオロ−メチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン、（２）、を有する関連化合物ＰＢＴＺ１６９は、可能性のある開発のために広範な研究を受けている非常に強力な抗結核薬である（Ｍａｋａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｏｎｅｓ  Ｋｉｌｌ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｒａｂｉｎａｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，  ８０１−８０４  （２００９）。
【００１５】
図１に示すように、ＢＴＺ０４３、関連ベンゾチアジノン(benzothazinones)及び単純化された類似体（参考文献１）は、ニトロ置換基が一過性ニトロソ部分（３）に還元され、次いで結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ））のデカプレニルホスホリル−β−Ｄ−リボース２’オキシダーゼ（ＤｐｒＥ１）の必須システイン残基と反応してセミメルカプタール（4）を与える、プロドラッグである。前記ＤｐｒＥ１酵素は、マイコバクテリアの細胞壁構築に不可欠なプロセスであるアラビナン生合成に必要であり（参考文献2）、そして共有結合付加物の形成（４）は結核菌の生存能力の阻害及び喪失をもたらす。したがって、重要な還元化学の詳細はかなり興味深いものである。システインを模倣するチオラートを包含する求核剤は、ＢＴＺ０４３のニトロ芳香族コアへの古典的なｃｉｎｅ付加（参考文献３）(フォンリヒター反応、参考文献４)、及び一過性かつ反応性のニトロソ中間体へのニトロ基の同時還元を伴う類似体を受ける（参考文献５）ことが以前に報告されている。前記ニトロ芳香族コアの位置選択的求電子性は、ニトロ基に対してｏｒｔｈｏ及びｐａｒａの有意な正の性質を示すＭｕｌｌｉｋｅｎ電荷計算と一致していた。（構造１参照）。
【００１６】
我々は、ＢＴＺ０４３が水素化物によってもｉｎ  ｖｉｖｏで代謝的に還元されて一時的ではあるが分離可能なマイゼンハイマー錯体を形成し、それらが次に親化合物に容易に再酸化されることを見出した。完全な物理化学的特徴付け及びその後の化学変換の確認のために十分な量のマイゼンハイマー錯体を得るために、還元を化学的に行うこともできる。このプロセスの解明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験中の様々な薬物濃度の観察を明らかにしながら、新しいｉｎ  ｖｉｖｏプロドラッグの生成、そして最終的には新しい抗マイコバクテリア薬への洞察を提供した。結果は、この重要なクラスの抗結核薬の継続的な開発の間に考慮することが重要であろう重要な意味を有する。
【００１７】
ＢＴＺ０４３の低ナノモルｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗結核活性は、非常に初期のｉｎ  ｖｉｖｏ研究を促進した。いくつかの血漿サンプルを室温で保存した後に薬物曝露について繰り返し分析した場合、それぞれの血漿サンプルの分析物濃度及び生物活性は有意に増加するように思われた。
【００１８】
この事象から数年後、ＰＫ試験における薬物曝露値は、経時的に決定されたＢＴＺ０４３の濃度について非常に高い偏差と謎の増加を特徴としていた（図１ｂを参照）。
【００１９】
興味深いことに、未処理動物からのブランク血漿にＢＴＺ０４３をスパイクした場合、この観察はなされなかった。スパイクしたサンプルでは、ピーク面積は経時的に完全に変化しないままであった。それゆえ、この現象の可能な説明は、空気にさらされたときに熱的又は酸化的に不安定な未だ未知の代謝産物を含むであろうと推論された。しかし、初期の標準化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝アッセイ（ミクロソームと肝細胞）では、決定的な化学的仮説を立てるのに役立つ代謝物は同定されなかった。
【００２０】
見過ごされがちな代謝産物を明らかにするために、室温での異なるインキュベーションタイム後の血漿サンプルの高分解能ＨＰＬＣクロマトグラムの慎重な分析を組み込んだＢＴＺ０４３のさらなる代謝研究を行った。クロマトグラフィー条件の最大の安定性を確実にするために、全ての溶媒を真空処理及び／又は窒素でスパージすること(sparging)により慎重に脱気した。確かに、これらのより厳しい条件下では、親薬物による積分面積は時間とともに増加したが、非常に異常なＵＶスペクトルを有するより早い溶出ピークが最初に認められたが、時間とともに消失することがわかった（図１ｂ）。ＢＴＺ０４３ピーク面積の同時の劇的な増加（一部のサンプルでは＞１００％）は、この一時的な代謝産物の重要性を強調していた。ＨＲＭＳ分析は、この新たに検出された化合物（ｍ／ｚ＋＝４３４．０９８８、Ｃ１７Ｈ１９Ｆ３Ｏ５Ｎ３Ｓ＋）がＢＴＺ０４３それ自体（ｍ／ｚ＋＝４３２．０８３５、Ｃ１７Ｈ１７Ｆ３Ｎ３Ｏ５Ｓ＋）より２個だけ多い水素原子を含むことを示唆した。この代謝産物はＢＴＺ０４３の酵素的還元によって形成される可能性があり、それが空気中の酸素に対して不安定であることが疑われた。
【００２１】
その化学的不安定性及びプラズマからの材料の限られた利用可能性のために、詳細な研究のために十分な量を得るための代替方法が求められた。その分子量に基づいて、新しい化合物はＢＴＺ０４３の化学的還元によって入手できるかもしれないと予想された。さらに、以前に報告されたｃｉｎｅ付加化学に基づいて、単純な化学水素化物源もまた還元プロセスを開始することができると予想された。実際、様々な溶媒中でＢＴＺ０４３をＮａＢＨ４で処理すると、持続性のある明るいオレンジ色／赤色の溶液が直ちに形成された。水素化物の添加の３０秒後に取った反応混合物のアリコートのＬＣ／ＭＳは、以前に検出された代謝産物と同一の保持時間、明確なＵＶスペクトル及び質量を有するピークを含有する化合物混合物の生成を明らかにした。過剰のＮａＢＨ４を添加して反応を完結させた。
【００２２】
興味深いことに、ＢＴＺ０４３をＰｄ／Ｃ（Ｈ２）、Ｐｔ／Ｃ（Ｈ２）、電気化学的還元（Ｐｔ／Ｐｔ）、Ｚｎ／ＮＨ４Ｃｌａｑ．、ＢＨ３−付加物、トリエチルシラン、二酸化硫黄、亜ジチオン酸ナトリウム、ハンチュ(Hantzsch)エステル（参考文献８）及びＮＡＤＨを包含する様々な他の還元条件で処理した場合、同じ還元代謝物は生成されなかった。より穏やかなホウ素系水素化物、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３及びＮａＢＨ３ＣＮとの反応は無効であり、出発ＢＴＺ０４３の完全な回収をもたらした。その後の１ＨＮＭＲ分光法による分析は、実際に形成された還元生成物が、最初に用いられた中性クロマトグラフィー条件下で共溶出した２つの主成分の混合物であることを明らかにした（図１ｃ）。ＨＰＬＣを酸性ｐＨ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））で実施した場合、両方の化合物を分離することができた。２つの化合物は実質的に異なるＵＶスペクトルを有していたが同じ質量ピーク（ｍ／ｚ＋＝４３４．０９８８）を有し、これらは異性体であることを示唆していた。還元化合物は２つの方法のいずれかによって単離することができた。反応溶媒を除去し、続いて分取ＨＰＬＣ及び凍結乾燥により、鮮やかなオレンジ色の赤色固体を得た。これをＬＣ／ＭＳ及び詳細なＮＭＲ研究による再分析により、同じ還元生成物の混合物であることを確認した。あるいは、反応混合物をＴＦＡで酸性化すると、濃い赤色の顔料が沈殿し、これを洗浄し、遠心分離により集め、真空乾燥することができた（図２ａ）。この固体は、室温でも大気中の酸素でも短期間安定していることが証明されたが、酸性化した反応混合物を放置した場合、又は単離した固体を脱気していない溶液に溶解して保存した場合、還元された物質は容易にＢＴＺ０４３に再酸化された。
【００２３】
標準物質として、この化学的に生成された反応生成物混合物を用いた詳細なＬＣ／ＭＳ実験は、マイナーな異性体（５ｂ）が、経口投与量のＢＴＺ０４３を受けたミニブタからの血漿サンプル中に観察された未知の代謝産物と実際に同一である一方、主成分（５ａ）は血漿サンプル中に完全に存在しないことを示した（図１ｄ参照）。
【００２４】
還元生成物の混合物の予備的ＮＭＲ研究は、ＢＴＺ０４３（１）についての特徴的な芳香族プロトンシグナルの損失及びさらなる高磁場(upfield)シグナルの出現を示した。還元中の赤／オレンジ色の急速な形成、及びＢＴＺ０４３への求核剤のｃｉｎｅ付加化学の以前の観察と一緒に、これは、水素化物が一時的であるが検出可能なマイゼンハイマー錯体を形成するために添加されたかもしれないことを示唆した。
【００２５】
異性体還元生成物を分離するのに必要とされる酸性ＨＰＬＣ条件もまた取り扱い中の急速な再酸化を促進したので、より詳細な構造確認のために、より安定で単離可能な誘導体を生成することが求められていた。
【００２６】
脱芳香族化還元生成物は、詳細な特徴付けに適した誘導体を提供するかもしれない求電子剤との反応を受けやすいはずであると予想された。実際、還元生成物混合物と硫酸ジメチルとの反応は、代謝産物（５ｂ）及びその異性体（５ａ）とほぼ同一である別々のＵＶスペクトルを有する２つの新しい低極性生成物（６ａ、ｂ）を与えた（図２ａ）。
【００２７】
したがって、新しく識別された構造５ａ及び５ｂならびに６ａ及び６ｂは、本発明の一部を形成する。
【００２８】
両方の化合物は、分取ＨＰＬＣによるマルチミリグラム規模でのそれらの単離及び１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲによるそれらの完全な特徴付けを可能にするために室温で十分に可溶性かつ安定であることが証明された。マイゼンハイマー錯体の生成と一致して、各異性体（６ａ／ｂ）は、１つの低磁場プロトン（それぞれ３．７及び３．５ｐｐｍ）及び後にＤＥＰＴ１３５測定によってメチレン基であると割り当てられた新たな高磁場シグナル（それぞれ７．０及び７．３ｐｐｍ）のみを有した。このデータは、ＢＴＺ０４３の還元が芳香族コアで起こり、２つの生成物（５ａ／ｂに対応する６ａ／ｂ）がマイゼンハイマー錯体水素化物の位置異性体であることを明確に示していた（図２ａ）。マイゼンハイマー錯体は知られているが、但し、電子不足の芳香族系の求核置換反応における非常に不安定な中間体であることが多い。そして、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによるＴＮＴのような爆発物の生分解のような生物学的システムでは稀な例が確認されている。
【００２９】
しかしながら、本発明者らの知る限りでは、マイゼンハイマー錯体をｉｎ  ｖｉｖｏで得るための変換は、いかなる薬物又は薬物候補についても記載されていない。６ａ／ｂにメチル基を導入することで、ＮＯＥＳＹとＨＭＢＣのカップリング研究を組み合わせることで、両方の異性体の位置化学を割り当てることもできた（図２ｂ）。化学水素化物還元は２つの異性体生成物を生成したが、ｉｎ  ｖｉｖｏで５ｂしか観察されなかったという事実は、酵素プロセスが代謝物の生成に関与している可能性があることを示唆しており、これも活性ニトロソ類似体の直接の前駆体として役立つ可能性がある（図２ａ）。したがって、我々は、ＢＴＺ０４３を５ｂに変換するそれらの能力について生物学的材料をスクリーニングした。
【００３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝実験と一致して、５ｂはミクロソーム分解アッセイでは検出できず、嫌気性条件下及び過剰量の添加ＮＡＤＨの存在下でさえ検出できなかった。また、細胞株（Ｋ５６２、白血病細胞株）に暴露しても、ＢＴＺ０４３と共に５μｇ・ｍＬ−１でインキュベートした場合、５ｂの痕跡は見られなかった（データ未掲載）。しかしながら、ＢＴＺ０４３に曝露された新鮮な全ヒト血液のＨＰＬＣ分析は、数時間後にＢＴＺ０４３の５ｂへの変換を明らかにした（図３ａ参照）。対照的に、新たに調製された血漿中に５ｂの生成は見られなかった（データ未掲載）。
【００３１】
この実験は、血球がニトロベンゾチアジノンを対応するマイゼンハイマー錯体に変換することができることを実証しただけでなく、５ｂの形成がヒトにおいても同様に関連性があることを実証した。
【００３２】
ニトロベンゾチアジノンが臨床試験に入るとき、この知識はメソッド開発とサンプル取り扱いにとって非常に重要になる。アッセイの再現性を高めるために、我々はまた、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのマウス血液をその代謝能力について調べたところ、再び５ｂの産生を確認見出した（図３ａ）。ＢＴＺ０４３の経口投与を受けたミニブタ及びラットの血漿サンプルを用いたさらなる研究でも同様の結果が得られ、推定還元酵素が哺乳動物に豊富に存在することが示唆された。ＰＢＴＺ１６９はＢＴＺ０４３と同じ電子的に反応性のあるコアを持っているので、我々はそれを同様の化学的及び血液誘発性還元研究に付した。予想通り、反応のＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ分析は、ＰＢＴＺ１６９もまた、ＢＴＺ０４３で観察されたのと同じ位置選択性で対応するマイゼンハイマー錯体（７ｂ）と同程度の還元を受けることを示している（図３ｂ）。これもまた、これらの重要なニトロベンゾチアジノン抗結核剤の中でこの化学の影響を強調している。血液誘発性の還元の証明は、対応するマイゼンハイマー錯体の形成についてのニトロベンゾチアジノンライブラリの代謝研究を可能にするであろう。
【００３３】
ＢＴＺ０４３及びＰＢＴＺ１６９の生物学的還元がそれぞれ単一の位置異性体還元生成物（すなわち５ｂ）を生成したという事実は、ベンゾチアジノンコアの5位に置換基を導入することにより、リード化合物の最適化(lead  optimization)及び潜在的な代謝抑制の機会を提供した。ベンゾチアジノンとDprE1の結合モデルもこの位置でいくらかの柔軟性を示した。
【００３４】
５−置換ベンゾチアジノンの製造は、水素化物研究の結果に触発されたＢＴＺ０４３合成経路を修正することによって達成することができたが、我々は１ステップで置換ベンゾチアジノンを得るために他の求核試薬との反応を検討した。示されたように、我々は以前に、チオレート及びシアン化物を包含する求核試薬が、ＢＴＺ０４３及び類似体のニトロ芳香族コアへの古典的なｃｉｎｅ付加（フォン・リヒター反応）を受けることを報告した。
【００３５】
ＢＴＺ０４３がＭｅＭｇＢｒ又は（Ｍｅ）２Ｚｎと容易に反応して、ゆっくり酸化されて９ａ／ｂの位置異性体混合物を与えるＭｅ−ＢＴＺマイゼンハイマー錯体（８ａ／ｂ）を与えることも示すことができた。異性体を分取ＨＰＬＣにより分離し、そして十分に特徴付けした。
【００３６】
したがって、新しい構造８ａ／ｂ及び９ａ／ｂも本発明の一部を形成する。
【００３７】
別々の化合物を血液アッセイにおけるそれらの代謝挙動について注意深く調べた。上記の仮説と一致して、ＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ分析によって示されるように、異性体９ｂの還元型は、代謝アッセイにおいて痕跡量でしか検出され得なかったが、興味深いことに、９ａもｉｎ  ｖｉｔｒｏでかなり検出可能な量のマイゼンハイマー錯体のみを形成した。
【００３８】
これらの結果によって動機付けられた、メチル、エチル、シクロプロピル、エチニル及びニトリル残基を有する１及び２のさらなる誘導体を、同様の求核的アプローチにより合成した一方、対応するマイゼンハイマー錯体中間体を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）の付加により酸化した。新しい誘導体は低い細胞毒性（ＨｅＬａ）を示し、血液分析においてマイゼンハイマー錯体（相対マイゼンハイマー錯体水素化物（hydride  Meisenheimer  complex、ＭＨＣ）形成）を形成する傾向を劇的に減少させ、及び良好な乃至優秀な抗マイコバクテリア活性を示した（表１）。Ｍｔｂ株Ｈ３７Ｒｖ及び多剤耐性株に対する最良の効力が、１及び２の５−メチル誘導体について観察された。
【００３９】
これらの結果は、ベンゾチアジノンのマイゼンハイマー錯体を形成する代謝傾向は、ベンゾチアジノンコアの５位及び７位に置換基を導入することによって調整することができ、そして深部構造活性研究においてさらに標的代謝的に推進される段階を設定することができることを示す。
【００４０】
結論
従って、ベンゾチアジノン類（ＢＴＺ０４３、ＰＢＴＺ１６９）の薬物動態試験における不安定薬物曝露は、マイゼンハイマー錯体を生じるまだ見過ごされている代謝変換の結果であることを実証することができた。それらの代謝産物は酸素感受性であり、そして容易に親薬物に再変換する。酸素に対するそれらの不安定性にもかかわらず、ＢＴＺ０４３を経口投与されたミニブタ及びラットの血漿サンプル中にかなりの量のマイゼンハイマー錯体５ｂが単一の位置異性体として検出された。
【００４１】
真正標準物質を提供するために、ＨＰＬＣにより分離可能なマイゼンハイマー錯体の位置異性体混合物を得るため、水素化ホウ素ナトリウムを使用することができる、１ステップ合成アプローチが見出された。
【００４２】
結局、メチル化によってこれらの化合物を安定化する方法が見出された。これは、それらの構造を完全に解明するための、且つ、それらの位置化学をＮＭＲによって特定するための重要な要件であった。この代謝変換を起こしやすくてもよい他の化合物のスクリーニングを可能にするために、非常に単純なＨＰＬＣ−ＨＲＭＳに基づく全血アッセイが設計され、そして他のベンゾチアジノン類（例えばＰＢＴＺ１６９）も同様に変換できることを見出した。
【００４３】
最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの水素化物攻撃の高い位置選択性は、リード化合物の最適化(lead  optimization)のための選択肢を促した一方、求核攻撃による１ステップ戦略でベンゾチアジノンコアに置換基を組み込むための非常に柔軟なアプローチが見出された。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマイゼンハイマー錯体を形成する傾向は、これらの置換基の導入によって制御できることを示すことができた。
【００４５】
ニトロ化合物は結核治療薬の中で非常に普及しているので、生物分析的定量化、毒性評価、又は単に生物学的材料の適切な取り扱いを包含するすべての下流の手順に重大な影響を与える可能性があるため、開発の非常に早い段階でこのタイプの代謝変換を考慮する必要があることは明らかである。
【００４６】
特に肺結核治療において、肺内のプロドラッグ５ｂの酸化によるＢＴＺ０４３の遊離は、標的とされた局所抗生作用に対する全く新しい概念を示している。強力なベンゾチアジノン足場（ＰＢＴＺ１６９、（２）も参照）は一般にこの種の還元化学に傾向があるように思われるので、他の結核発症(TB-development)プログラムにおいても同様の変化に遭遇する可能性が非常に高い。
【００４７】
［１］したがって、本発明はまた、式（Ｉ）の新規化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩を包含する。
【化２】
2019533013.tif 000003
(I)
（式中、
Ｒ１はＮＯ２を表し、
Ｒ２はＣＦ３を表し、
置換基Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも一方は、ＯＨ、ＳＲ１４、ＮＨＲ１５、ＣＮ、Ｎ３、１〜４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、場合のよってハロゲン化された、直鎖又は分岐の脂肪族基、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アシルであり、Ｒ３及びＲ４のうちの他方は、さらに水素であってもよく、
Ｒ６は、２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル又は４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５は互いに独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基である）
【００４８】
式（Ｉ）の化合物の前記異なる置換基は以下のように定義される。
前記ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。
前記脂肪族基は、直鎖又は分岐鎖のＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル基(radical)である。
前記Ｃ１−Ｃ６アルキルは直鎖又は分岐鎖アルキルであり、そしてメチル、エチル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第２ブチル、第３ブチル、ペンチル、３−メチルブチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−エチルブチルを包含する。
前記Ｃ１−Ｃ４アルキルは直鎖又は分岐鎖アルキルであり、そしてメチル、エチル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第２又は第３ブチルを包含する。
前記Ｃ２−Ｃ６アルケニルは直鎖又は分枝鎖アルケニルであり、そしてビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、５−ヘキセニル、４−メチル−３−ペンテニルを包含する。
前記Ｃ２−Ｃ６アルキニルは直鎖又は分枝鎖アルキニルであり、そしてエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルを包含する。
前記Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルである。
前記脂肪族基(radical)は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素で置換されていてもよい。
前記Ｃ１−Ｃ４アルコキシは直鎖又は分枝鎖アルコキシ、及びメトキシ、エトキシ、プロポキシ又はイソプロポキシ、ブトキシ又はイソブトキシである。
前記Ｃ１−Ｃ４アシルは、ホルミル、アセチル、プロピオニル及びブチリル基を包含する。
式（Ｉ）の前記新規化合物は、当技術分野において公知の方法に従って合成することができる。
好ましくは、上記式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４の両方は、上記で定義した通りであり、且つ、両方とも水素とは異なる。本発明の別の実施形態において、Ｒ３は水素であり、そしてＲ４は上で定義された通りである。本発明のさらなる実施形態において、Ｒ４は水素であり、Ｒ３は上記の通りである。
【００４９】
［２］好ましい実施形態は、
（Ｓ）−７−メチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（９ａ）、
（Ｓ）−５−メチル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（９ｂ）、
（Ｓ）−５−エチル−２−（２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１０）、
（Ｓ）−７−エチル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１１）、
（Ｓ）−５−シクロプロピル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１２）、
（Ｓ）−５−エチニル−２−（２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１３）、
（Ｓ）−２−（２−メチルー１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−４−オキソ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−７−カルボニトリル（１４）、
（Ｓ）−５、７−ジメチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１、３−ベンゾチアジン−４−オン（１５）、
２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−５−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１６）、
２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−７−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１７）、
からなる群から選択される［１］に記載の式（Ｉ）の化合物である。
【００５０】
［３］さらに好ましい実施形態は、
（Ｓ）−５−メチル−２−（２−メチル１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（９ｂ）、
２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−５−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（１６）、
からなる群から選択される実施形態［２］に記載の式（Ｉ）の化合物である。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の化合物は、細菌によって引き起こされる感染症の治療に有用である。より具体的には、本発明の化合物は、ヒト及び動物における結核感染症及び他のマイコバクテリア感染症の予防的及び治療的処置に有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物に関する。
【００５２】
［４］したがって、本発明のさらなる態様はまた、［１］から［３］にに記載の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物に関する。
【００５３】
１つ以上の医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤をさらに含む、実施形態［６］に記載の式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物も開示される。
【００５４】
本発明の化合物のイオン化可能なバージョンの医薬的に許容可能な塩は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトの組織又は動物の組織との接触に使用するのに適していると当該技術分野において一般に考えられる酸又は塩基の塩である。そのような塩には、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩及び有機酸塩、ならびにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩が包含される。
【００５５】
具体的な医薬的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸などのアルカン酸などの酸の塩が包含される。
同様に、医薬的に許容可能なカチオンとしては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウムが包含されるが、これらに限定されない。
当業者であれば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ｐ．１４１８  （１９８５）によって列挙されたものを包含する、本発明の化合物のためのさらなる医薬的に許容可能な塩を認識するであろう。
【００５６】
［５］本発明はさらに、微生物感染によって引き起こされる疾患の治療方法において使用するための化合物に関するものであって、式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩、又は［１］〜［４］のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量が、それを必要とする患者に投与されることを含む。
【００５７】
［６］特に、本発明による式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩は、哺乳動物におけるマイコバクテリア感染症の治療方法において使用することができる。
【００５８】
［７］哺乳動物における結核又はハンセン病感染の治療的又は予防的処置に使用するための、本発明による式（Ｉ）の化合物及び／又はその医薬的に許容可能な塩が特に好ましい。
本発明の化合物は、静脈内、皮下もしくは筋肉内注射による又は鼻腔内塗布による局所又は非経口投与のための、医薬的に許容可能な媒体中の希釈溶液又は懸濁液の形態で当該技術分野で知られている方法の使用により処方することができる(formulated)。好ましい方法では、前記新規化合物は、経口投与用の医薬的に許容可能な賦形剤と共に錠剤、カプセル剤又は水性懸濁液剤の形態で製造される。
医薬的に許容可能な賦形剤は製薬分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  （１９８５）に記載されている。前記医薬的賦形剤は、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択することができる。
さらに、上に実証されたように、前記新たに同定された還元経路はベンゾチアジノン化合物に適用可能である。そのような化合物とのマイゼンハイマー錯体は等しく本発明の一部を形成する。
【００５９】
［８］本発明の別の態様は、式（ＩＩ）の単離可能な新たに同定されたマイゼンハイマー錯体である。
【化３】
2019533013.tif 000004
(II)
式中、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立してＮＯ２、ＮＲ７Ｒ８、ＮＨＯＲ９、−ＣＯＯＲ９、ＣＮ、ＣＯＮＲ１０Ｒ１１、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＳＯ２ＮＲ１２Ｒ１３、直鎖又は分枝状のＣ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＦ３、１〜３個の炭素原子を有するモノ−、ジ−又はトリフルオロアルキルであり；ただし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方はニトロ基であり；
Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立して、水素、ヒドロキシル、−ＳＲ１４、ＣＮ、−Ｎ３、又は１〜４個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和の、場合によりハロゲン化された、直鎖状もしくは分岐鎖状の脂肪族基（radical）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルコキシであり；
Ｒ５は、水素、又は１〜６個の炭素原子を有する不飽和もしくは飽和の、場合によりハロゲン化された、直鎖もしくは分岐の脂肪族基(radical)；１〜４個の炭素原子を含有するアシル、−ＣＯＮＨＲ１０又は−のＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４であり；
Ｒ６は、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリール置換基であり；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、互いに独立して、水素、１〜６個の炭素原子を有する不飽和もしくは飽和、場合によりハロゲン化された、直鎖もしくは分岐脂肪族基(radical);フェニル；１〜４個の炭素原子を有するベンジル又はアシル；から選択される。
【００６０】
式（ＩＩ）の化合物の前記異なる置換基は以下のように定義される。
前記ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。
前記脂肪族基は、直鎖状もしくは分枝鎖状のＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル基である。
前記Ｃ１−Ｃ６アルキルは直鎖又は分岐鎖アルキルであり、そしてメチル、エチル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第２ブチル、第３ブチル、ペンチル、３−メチルブチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−エチルブチルを包含する。
前記Ｃ１−Ｃ４アルキルは直鎖又は分岐鎖アルキルであり、そしてメチル、エチル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第２又は第３ブチルを包含する。
前記Ｃ２−Ｃ６アルケニルは直鎖又は分枝鎖アルケニルであり、そしてビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、５−ヘキセニル、４−メチル−３−ペンテニルを包含する。
前記Ｃ２−Ｃ６アルキニルは直鎖又は分枝鎖アルキニルであり、そしてエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルを包含する。
前記Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルである。
前記脂肪族基は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素で置換されていてもよい。
前記Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基は直鎖状又は分枝状であるアルコキシ、及びメトキシ、エトキシ、プロポキシ又はイソプロポキシ、ブトキシ又はイソブトキシである。
前記Ｃ１−Ｃ４アシルは、ホルミル、アセチル、プロピオニル及びブチリル基を包含する。
【００６１】
前記ヘテロアリールは、炭素原子、水素原子、及び１以上のヘテロ原子、好ましくは窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される、１〜３個のヘテロ原子、を含む単環式又は多環式芳香族環である。ヘテロアリール基の具体例には、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジル、トリアジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、（１，２，３）−及び（１，２，４）−トリアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フェニル、イソオキサゾリル、及びオキサゾリルが包含される。
【００６２】
前記ヘテロアリール基は、非置換であるか、又はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル又はＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ及びＣ１−Ｃ４アシルから選択される１〜３個の置換基で置換することができる。
【００６３】
好ましくは、ヘテロアリール基は単環式環であり、ここで前記環は窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択される１〜３個のヘテロ原子、ならびに２〜５個の炭素原子を含む。特に好ましいのは、窒素原子１〜２個、並びに酸素原子及び硫黄原子から選ばれる０〜１個の原子を含有し、且つ、５〜６個の環構成原子を有するヘテロアリール基であり、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジニルが包含される。
【００６４】
前記ヘテロシクロアルキルは、炭素及び水素原子及び少なくとも一つのヘテロ原子、好ましくは、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から選ばれる１〜４個のヘテロ原子、を含む非芳香族単環式又は多環式環である。ヘテロシクロアルキルは、前記環がそれらの存在によって芳香族にされない限り、前記環内に１個以上の炭素−炭素二重結合又は炭素−ヘテロ原子二重結合を有することができる。ヘテロシクロアルキル基の例には、アジリジニル、ピロリジニル、ピロリジノ、ピペリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、ピペラジノ、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、テトラヒドロピラニル、及びピラニルが包含される。
【００６５】
ヘテロシクロアルキル基は、非置換であるか、又はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル又はＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ及びＣ１−Ｃ４アシルから選択される１〜３個の置換基で置換することができる。
【００６６】
好ましくは、前記ヘテロシクロアルキル基は、１〜３個のヘテロ原子を有する単環式又は二環式環である。特に好ましいのは、前記２−メチル−１、４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル及び前記４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基である。
【００６７】
前記ヘテロアルキルは、炭素及び水素原子及び少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは、窒素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜４個のヘテロ原子、を含む直鎖状又は分枝状アルキルである。ヘテロアルキルは、１つ以上の炭素−炭素二重結合又は炭素−ヘテロ原子二重結合を持つことができる。
【００６８】
ヘテロアルキル基は、非置換であるか、又はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル又はＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ及びＣ１−Ｃ４アシルから選択される１〜３個の置換基で置換することができる。
【００６９】
好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の前記マイゼンハイマー錯体は、非置換であるＲ６のヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリール基を含有する。
【００７０】
［９］別の実施形態によれば、実施形態［８］に記載の式（ＩＩ）の前記マイゼンハイマー錯体の前記ヘテロ、ヘテロアルキル又はヘテロアリール基Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル又はＣ２−Ｃ６アルキニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アシルから選択される１〜３個の置換基で置換されている。
【００７１】
［１０］さらなる実施形態は、式（ＩＩ）の単離マイゼンハイマー錯体である。式中、Ｒ１がＮＯ２であり、Ｒ２がＣＦ３であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ１又は２個の水素又はメチル及び水素であり、Ｒ５が水素又はメチルであり、Ｒ６は２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イルである。
【００７２】
［１１］さらなる一実施形態は、実施形態［８］の式（ＩＩ）によるマイゼンハイマー錯体を包含する。式中、Ｒ１がＮＯ２であり、Ｒ２がＣＦ３であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ１個又は２個の水素であり、Ｒ５が水素又はメチルであり、Ｒ６は４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル基である。
【００７３】
［１２］ニトロ置換ベンゾチアジノン化合物の代謝を解明するための研究手段としての、上記実施形態［８］〜［１１］のいずれかに記載のマイゼンハイマー錯体の使用。したがって、ＢＴＺ０４３及びＰＢＴＺ１６９の新たに同定されたマイゼンハイマー錯体もまた本発明の一部を形成する。
【実施例】
【００７４】
実験セクション
計装
分析用ＨＰＬＣ（ＬＣ−ＵＶ／Ｖｉｓ）は、ＭｉｃｒｏＡＬＳオートサンプラー、ＣａｐＰｕｍｐ、ＡＬＳＴｈｅｒｍ、カラムオーブン及びＤＡＤからなる１１００シリーズＨＰＬＣシステム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）で実施した。
ＨＰＬＣ条件：  ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラムＫｉｎｅｔｅｘ５μｍ、ＸＢ−Ｃ１８、１００Å、２５０×４．６ｍｍ及び勾配溶出（ＭｅＣＮ（０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ）；１０：９０〜１００：０、２０分、及び１００：０、さらに１０分間、流速０．５ｍＬ・ｍｉｎ−１）、注入量３−５μＬ。
クロマトグラフィーモジュールＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ、フォトダイオードアレイ検出器２９９６、及び質量分析計Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱからなるＷａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）ＺＱ装置で緩衝液(buffered)ＬＣ−ＭＳ分析を行った。
ＨＰＬＣ条件：  Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｏ  Ｃ１８ＹＭＣ  ３×５０ｍｍカラム及び勾配溶出（ＭｅＣＮ）：１０ｍＭの酢酸アンモニウム（Ｈ２Ｏ）；５：９５〜８０：２０、１０分、流量０．７ｍＬ・ｍｉｎ−１）。
ＭＳエレクトロスプレー源は、キャピラリー電圧３．５ｋＶ及び脱溶媒和温度３００℃で操作した。
ＬＣ−ＨＲＭＳ測定は、エレクトロスプレーイオン源を備えたＥｘａｃｔｉｖｅ  Ｑ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ高性能ベンチトップＬＣ  ＨＲＭＳと、カラムオーブンを備えたオートサンプラー、１２５０ポンプ、及びＰＤＡ検出器からなるＡｃｃｅｌａ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。  
ＨＰＬＣ条件：  サーモサイエンティフィックカラムＡｃｃｕｃｏｒｅ  Ｃ１８、２．６μｍ、１００ｘ２．１ｍｍ及び勾配溶出（ＭｅＣＮ（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（Ｈ２Ｏ）；５：９５〜９８：２、１０分及び９８：２、さらに１２分間、流量０．２ｍＬ・ｍｉｎ−１）、３〜５μＬ注入容量。
【００７５】
分取ＨＰＬＣは、ＢｉｎａｒｙＰｕｍｐ３２１及び１５６ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を備えたＧｉｌｓｏｎ  Ａｂｉｍｅｄで行った。
ＨＰＬＣ条件：  ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラムＬｕｎａ  Ｃ１８、１０μｍ、２５０×２１．２ｍｍ及び勾配溶出（ＭｅＣＮ（０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ）；流速２１ｍＬ・分−１）、酸性条件、及び勾配溶出（ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ；流速２１ｍＬ・分−１）、中性条件。
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ５００ＭＨｚ又は６００ＭＨｚ機器で記録した。スペクトルは残留溶媒シグナルに対して正規化した。以下の略語が多重度のために使用された：  ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｑｔ＝クインテット。
【００７６】
化学調製
全ての化学薬品(chemicals)は商業的供給業者から購入し、そしてそれ以上精製せずに使用した。ＢＴＺ０４３（１）及びＰＢＴＺ１６９（２）は、国際公開第２００７／１３４６２５号Ａ１パンフレット、国際公開第２００９／０１０１６３号Ａ１パンフレット及び国際公開第２０１２／０６６５１８号Ａ１パンフレットに詳細に記載されている既知の調製方法と同様にして合成した。
【００７７】
シュレンクテクニックを用いて、不活性ガス（アルゴン）下で反応を行った。アセトニトリル、テトラヒドロフラン及びジエチルエーテルは、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＰｕｒｅＳｏｌｖ  ＭＤ−７ＥＮ溶媒精製システムから使用した。酢酸エチル、アセトニトリル及び水を３回の凍結−排気−解凍−サイクルによって脱気した。
【００７８】
【化４】
2019533013.tif 000005
【００７９】
化合物の混合物５ａ／ｂ：  ＢＴＺ０４３は（２００ｍｇは、４６４μｍｏｌ）をアセトニトリルと水の混合物（５ｍＬ、４：１）に溶解し、ＴＬＣ分析で遊離体が消失するまで水素化ホウ素ナトリウムをゆっくり加えた。反応中に形成された沈殿物を追加の水の添加により連続的に溶解させた。深紅色の固体の沈殿が完了するまでＴＦＡをゆっくり加えた。混合物を遠心分離し、上清を捨てた。残渣を水（２×５ｍＬ）及びアセトニトリル（２×５ｍＬ）で洗浄し、高真空中で乾燥して、５ａ／ｂを主に含む粗混合物を得た（１７５ｍｇ、５ａ：５ｂ≒７：３、約４０４μｍｏｌ、約８７％）。この物質をさらに精製することなくその後の化学誘導体化に使用した。
【００８０】
【数１】
2019533013.tif 000006
【００８１】
化合物５ｂ：  並行実験において、酸性条件下（４０分間で１５〜７０％のアセトニトリル）で５ａ／ｂの粗反応生成物の分取ＨＰＬＣにより５ｂ（基準物質）の分析サンプルを生成した（ＴＦＡ沈殿前）。すべての溶媒を即座に除去し、乾燥生成物を不活性ガス下で貯蔵したとき、材料は比較的安定していた。溶液中、特に大気中の酸素の存在下で急速な酸化が起こった。適切な不活性操作条件下でも、目的の化合物を完全に回収することが重要であった。
【００８２】
【化５】
2019533013.tif 000007
【００８３】
化合物６Ａ／Ｂ：  ５ａ／ｂの化合物混合物（１７５ｍｇ、約４０４μｍｏｌ）をアセトニトリル（８ｍＬ）に溶解した。硫酸ジメチル（１４０μＬ、１８６ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２００μＬ、１４６ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。メタノール（２００μＬ、１５８ｍｇ、４．９３ｍｍｏｌ）を加えた後、混合物を室温で７０分間、さらに６０分間攪拌した。赤色溶液を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、塩酸で洗浄した（２×５０ｍＬ、２Ｍ）。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。残渣をアセトニトリルに溶解し、遠心分離し、そして上清を分取ＨＰＬＣ（中性条件、６０分間で４０〜７０％アセトニトリル）にかけて純粋な６ａ（保持時間＝２８分、１７ｍｇ、８％）及び６ｂ（保持時間＝４７分、４ｍｇ、２％）を得た。
【００８４】
化合物６ａ：
【数２】
2019533013.tif 000008
【００８５】
化合物６ｂ：
【数３】
2019533013.tif 000009
【００８６】
式（Ｉ）の新規実施例化合物９ａ／ｂは、一般に上記の方法に類似した方法に従って合成された。
【００８７】
一般的な手順：
非置換ベンゾチアジノン（０．４６ミリモル；ＢＴＺ０４３又はＰＢＴＺ１６９）を無水ＴＨＦ（５〜１０ｍｌ）中に溶解し、−７８°Ｃまで冷却した。そして対応する有機金属試薬（１．６〜２．２当量）を滴下した。有機リチウム化合物を使用する場合、ＴＨＦ中の前記ベンゾチアジノンの溶液を予備形成された有機金属種に添加した。
添加完了後、混合物を１〜１８時間撹拌した。ＤＤＱ（１．７〜２．３当量）を添加し、混合物を０℃で３時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（４×７５ｍｌ）、水（７５ｍｌ）及びブライン（７５ｍｌ）で洗浄した。有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣の精製をカラムクロマトグラフィーにより行った（ＳｉＯ２、軽油−ＥｔＯＡｃ又は軽油−ＤＣＭ−アセトン）。
【００８８】
実施例９ａ及び実施例９ｂ：
【化６】
2019533013.tif 000010
【００８９】
化合物９ａ／ｂ。  ＭｅＭｇＢｒ（ジブチルエーテル中、３４０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ、１Ｍ）を、ジエチルエーテル（３ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（３ｍＬ）中の１の溶液（１４６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）にゆっくり加えた。溶液を室温で２時間撹拌し、水（５ｍＬ）を加え、そして混合物を酢酸エチル（２×３５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残渣をメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（１０分間で１０％〜１００％のアセトニトリル）によって精製して、９ａ（２０ｍｇ、１３％）及び９ｂ（５ｍｇ、３％）を得た。
【００９０】
あるいは、ＭｅＭｇＢｒ（ＴＨＦ中０．３Ｍ）を用いた一般的手順に従って、４０ｍｇ（１９％、０．０９ｍｍｏｌ）の９ｂ及び２７ｍｇ（１３％、０．０６ｍｍｏｌ）の９ａを淡黄色固体として得た。
【００９１】
化合物例９ａ（（Ｓ）−７−メチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【数４】
2019533013.tif 000011
【００９２】
実施例９ｂ  （（Ｓ）−５−メチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【数５】
2019533013.tif 000012
【００９３】
実施例１０  （（Ｓ）−５−エチル−２−（２−メチル−１、４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化７】
2019533013.tif 000013
ＢＴＺ０４３及びＥｔＭｇＢｒ（ＴＨＦ中０．３Ｍ）を用いた一般手順に従って、３１ｍｇ（１５％、０．０７ｍｍｏｌ）の表題化合物を明黄色の固体として得た。
【数６】
2019533013.tif 000014
【００９４】
実施例１１  （（Ｓ）−７−エチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化８】
2019533013.tif 000015
ＢＴＺ０４３及びＥｔＭｇＢｒ（ＴＨＦ中０．３Ｍ）を用いた一般手順に従って、３２ｍｇ（１５％、０．０７ｍｍｏｌ）の表題化合物をオフホワイトの固体として得た。
【数７】
2019533013.tif 000016
【００９５】
実施例１２（（Ｓ）−５−シクロプロピル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１、３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化９】
2019533013.tif 000017
ＢＴＺ０４３及び臭化シクロプロピルマグネシウム（ＴＨＦ中０．５Ｍ）を用いた一般的手順に従って、４２ｍｇ（１９％、０．０９ｍｍｏｌ）の表題化合物を淡黄色固体として得た。
【数８】
2019533013.tif 000018
【００９６】
実施例１３  （Ｓ）−５−エチニル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化１０】
2019533013.tif 000019
［２−（トリメチルシリル）エチニル］−リチウム及びＢＴＺ０４３を用いた一般的手順に従って、４５ｍｇ（１９％、０．０９ｍｍｏｌ）の淡褐色油状物を得た。そのうち２５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解させた。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）、ＫＦ（８．３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を周囲温度で１．５時間撹拌した。混合物を酢酸エチル（１５ｍＬ）で希釈し、半飽和ＮａＨＣＯ３（２×１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下で濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、軽油−ＤＣＭ−アセトン、４：４：１）で精製して２０ｍｇ（９３％、０．０４４ｍｍｏｌ）の感光性灰色固体を得た。
【００９７】
【数９】
2019533013.tif 000020
【００９８】
実施例１４  （（Ｓ）−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−４−オキソ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−７−カルボニトリル）：
【化１１】
2019533013.tif 000021
無水ＴＨＦ（７ｍＬ）中のＢＴＺ０４３（２００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却し、無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中のｎ−Ｂｕ４ＮＣＮ（１５７ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。添加完了後、混合物を−７８℃で１時間撹拌し、次いでＤＤＱ（１７５ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃に温め、１８時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（４×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下で濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、軽油−ＤＣＭ−アセトン、５：５：１及びＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ、５０／１）及びＭｅＣＮからの再結晶によって精製して５０ｍｇ（２４％、０．１１ｍｍｏｌ）の表題化合物を黄色固体として得た。
【００９９】
【数１０】
2019533013.tif 000022
【０１００】
実施例１５  （Ｓ）−５，７−ジメチル−２−（２−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イル）−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化１２】
2019533013.tif 000023
９ａ（２０７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）及びＭｅＭｇＢｒ（ＴＨＦ中３Ｍ）を使用する一般手順に従って、２５ｍｇ（１１．７％、０．０５ｍｍｏｌ）の表題化合物をオフホワイトの固体として得た。
【数１１】
2019533013.tif 000024
【０１０１】
実施例１６  （２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−５−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化１３】
2019533013.tif 000025
ＰＢＴＺ１６９（ＣＡＳ［１３７７２３９−８３−２］）及びＭｅＭｇＣｌ（ＴＨＦ中３Ｍ）使用する一般的な手順に従って、５３ｍｇ（２４％、０．１１mmol）の表題化合物を橙色固体として得た。
【数１２】
2019533013.tif 000026
【０１０２】
実施例１７  （２−（４−（シクロヘキシルメチル）ピペラジン−１−イル）−７−メチル−８−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン）：
【化１４】
2019533013.tif 000027
ＰＢＴＺ１６９（ＣＡＳ［１３７７２３９−８３−２］）及びＭｅＭｇＣｌ（ＴＨＦ中３Ｍ）を使用する一般的な手順に従って、８５ｍｇ（３９％、０．１８ｍｍｏｌ）の表題化合物を橙色固体として得た。
【数１３】
2019533013.tif 000028
【０１０３】
バイオ分析手順
全ての動物実験はＡＴＲＣ（Ａｕｒｉｇｏｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｕｎａｋｅｓｚｉ、ハンガリー）で行われた。
ミニブタ血漿サンプル：
ミニブタは３６０ｍｇ／ｋｇの経口用量のＢＴＺ０４３を受けた。血液は、化合物製剤の投与後２時間に採取し、直ちに氷上で冷却し、血漿アリコート得るため、４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離し、急速凍結した血漿アリコートを−80℃で保存した。血漿アリコート（５０μＬ）を氷上で不活性条件下でアセトニトリル（２００μＬ）と混合し（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、嫌気性ワークステーション）、ボルテックスし、超音波浴中で処理し（３〜５秒）、４℃及び９７５０rpmで遠心分離した。上清を窒素流で残留量約４０μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＨＲＭＳで分析した。
【０１０４】
ラット血漿サンプル：
雌ウィスターは１７０ｍｇ／ｋｇＢＴＺ０４３の経口投与を受けた。イソフルラン麻酔下で化合物製剤を投与して２時間後に採血し（Ｋ３−ＥＤＴＡ）、直ちに氷上で冷却し、４℃及び３０００ｒｐｍで遠心分離して血漿アリコートを得、これを瞬間凍結して−８０℃で保存した。。血漿アリコート（５０μＬ）を氷上で不活性条件下でアセトニトリル（２００μＬ）と混合し、ボルテックスし、超音波浴中で処理し（３〜５秒）、４℃及び９７５０ｒｐｍで遠心分離した。上清を窒素流で残留量約４０μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＨＲＭＳで分析した。
【０１０５】
新鮮血アッセイ
ヒト：
ＤＭＳＯ中のＢＴＺ０４３溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製し、この溶液１μＬを新鮮な全血の１ｍＬアリコートに添加した。混合物を３７℃で２時間又は１６時間振盪し、４℃及び３０００ｒｐｍで遠心分離して血漿を得た。血漿サンプル（６０μＬ）を氷上でアセトニトリル（２４０μＬ）と混合し、ボルテックスし、超音波浴中で処理し（３〜５秒）、そして４℃及び９７５０ｒｐｍで遠心分離した。上清を窒素流で残留量約４０μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＨＲＭＳで分析した。
【０１０６】
マウス：
イソフルラン麻酔下での頸椎脱臼後にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから新鮮な全血を採取した。テストアイテム溶液をＤＭＳＯ（５ｍｇ／ｍＬ）において調製し、この溶液０．４μＬを新鮮な全血４００μＬに加えた。混合物を３７℃で４時間インキュベートし、４℃及び３０００ｒｐｍで遠心分離して血漿を得た。血漿サンプル（５０μＬ）を氷上でアセトニトリル（２００μＬ）と混合し、ボルテックスし、超音波浴（３〜５秒）中で処理し、そして４℃及び９７５０ｒｐｍで遠心分離した。上清を窒素流で残留量約４０μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＨＲＭＳで分析した。
【０１０７】
酵母アッセイ：
嫌気条件下で（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、嫌気性ワークステーション）、新鮮な商業パン酵母（２００ｍｇの湿潤質量）をリン酸カリウム緩衝液に懸濁した（ｐＨ７．５、１００ｍＭ）、ＤＭＳＯ中ＢＴＺ０４３の溶液（５μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。混合物を３７℃で５分間インキュベートし、氷上でアセトニトリル（２００μＬ）と混合し、そして４℃及び９７５０ｒｐｍで遠心分離した。上清を窒素流で残留量約４０μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣで分析した。図４を参照。
【０１０８】
相対マイゼンハイマー錯体水素化物（ＨＭＣ）形成
安楽死後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから新鮮な全血を採取した。テストアイテムの溶液はＤＭＳＯで調製し（通常１０ｍｇ／ｍＬ、溶解性の低い化合物は低い）、０．５μＬの各溶液を３００μＬの新鮮な全血に不活性条件下（グローブボックス、＜２０ｐｐｍ  Ｏ２）で添加した。混合物を３７℃で４時間（７５０ｒｐｍ）インキュベートし、４℃及び３０００ｒｐｍで遠心分離して血漿を得た。血漿アリコート（２５μＬ）を−４５℃で保存し、ＬＣ−ＨＲＭＳ測定の１．５時間前までに解凍した。アリコートを直ちに氷上でアセトニトリル（７５μＬ、内部標準として２．５μｇ・ｍＬ−１［Ｄ４］−ＢＴＺ０４３を含有する）と混合し、ボルテックスし、４℃及び１６．１ｋｒｃｆで遠心分離した。上清をエアーシールバイアルに移し、ＬＣ−ＨＲＭＳにより分析した。全てのサンプルは二通りに調製した。マイゼンハイマー錯体水素化物（ＨＭＣ）の形成は、［Ｍ＋２Ｈ＋Ｈ］＋ピーク(複数可)の面積の商、及び各試験項目のそれぞれの抽出イオンクロマトグラムにおける［Ｍ＋Ｈ］＋及び［Ｍ＋２Ｈ＋Ｈ］＋ピーク面積の合計として計算された（５ｐｐｍウィンドウ）。相対的ＨＭＣ形成は、同じアッセイにおける各誘導体のＨＭＣ形成とＢＴＺ０４３のＨＭＣ形成との商として計算された。
【０１０９】
レサズリンマイクロタイターアッセイ（ＲＥＭＡ）
当該アッセイは、以前に記載されているように行った（Ｐａｌｏｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ：  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ａｎｔｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４６（８），  ２７２０−２  （２００２））。１ウェルあたりの接種物として１００μＬの細菌懸濁液を使用した。無菌ポリスチレン９６ウェル平底プレート（ＢＤ）の各深層化において、物質作業溶液の連続２倍希釈液１００μｌを与えた。各プレートには薬物を含まない増殖コントロール及びＭＴＢを含まない培地の無菌コントロールを含めた。インキュベーション中の蒸発を避けるために、２００マイクロリットルの滅菌水をすべての外周ウェルに加えた。次いでプレートを自己接着膜で覆い、そして３７℃でインキュベートした。７日後、アッセイを０．０２％レサズリンの新たに調製した溶液３０μｌを添加することにより染色した。レサズリン（シグマ−アルドリッチ、ドイツ）。プレートを３７℃でさらに２４時間再インキュベートした。青色（酸化状態）からピンク色（還元状態）への色の変化は細菌の増殖を示し、そしてＭＩＣはこの色の変化を妨げる薬物の最低濃度として定義された。ＲＥＭＡプレートの各ロットは、ＭＩＣの範囲（４μｇ／ｍＬ−６３ｐｇ／ｍＬ）を評価することによって品質が保証されていた。
【０１１０】
細胞毒性測定
テストアイテムをＤＭＳＯに溶解した（典型的には１０ｍｇ／ｍＬ、溶解性の低い化合物は低い）。溶液をＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した。ＨｅＬａ細胞（ＤＳＭ  ＡＣＣ５７）をＲＰＭＩ  １６４０中で増殖させ、０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．２５％トリプシンを使用してソフトトリプシン処理した後に対数増殖期で回収した。各実験について、９６ウェルマイクロプレートの１ウェルあたり約１０，０００細胞に０．１ｍＬの培養培地を播種した。試験化合物を添加する前に、ＨｅＬａ細胞を４８時間プレインキュベートした（最終ＤＭＳＯ濃度≦０．５％）。試験化合物はサブコンフルエント単層上で注意深く希釈した。次いで、インキュベーションを３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で行った。接着性ＨｅＬａ細胞をグルタルアルデヒドで固定し、０．０５％のメチレンブルー溶液で１０分間染色した。穏やかに洗浄した後、染色剤をウェル内で０．２ｍＬの０．３３Ｎ  ＨＣｌで溶出した。ＳＵＮＲＩＳＥマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）中で６６０ｎｍで光学濃度を測定した。
【０１１１】
前述のバイオ分析手順の結果を表１に記載する。
【表１】
2019533013.tif 000029
ＰＤＲ＝多剤耐性（イソニアジド及びストレプトマイシン）；
ｎ.ｄ.＝決定されていない(not  determined)。
【０１１２】
参考文献
１    Ｍａｋａｒｏｖ，  Ｖ．，  Ｍａｎｉｎａ，  Ｇ．，  Ｍｉｋｕｓｏｖａ，  Ｋ．，  Ｍoeｌｌｍａｎｎ，  Ｕ．，  Ｒｙａｂｏｖａ，  Ｏ．，  Ｓａｉｎｔ−Ｊｏａｎｉｓ，  Ｂ．，  Ｄｈａｒ，  Ｎ．，  Ｐａｓｃａ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｂｕｒｏｎｉ，  Ｓ．，  Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ，  Ａ．  Ｐ．，  Ｍｉｌａｎｏ，  Ａ．，  Ｄｅ  Ｒｏｓｓｉ，  Ｅ．，  Ｂｅｌａｎｏｖａ，  Ｍ．，  Ｂｏｂｏｖｓｋａ，  Ａ．，  Ｄｉａｎｉｓｋｏｖａ，  Ｐ．，  Ｋｏｒｄｕｌａｋｏｖａ，  Ｊ．，  Ｓａｌａ，  Ｃ．，  Ｆｕｌｌａｍ，  Ｅ．，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｐ．，  ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｂｒｏｄｉｎ，  Ｐ．，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，  Ｔ．，  Ｗａｄｄｅｌｌ，  Ｓ．，  Ｂｕｔｃｈｅｒ，  Ｐ．，  Ａｌｂｒｅｔｈｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ，  Ｉ．，  Ｂｒｏｓｃｈ，  Ｒ．，  Ｎａｎｄｉ，  Ｖ．，  Ｂｈａｒａｔｈ，  Ｓ．，  Ｇａｏｎｋａｒ，  Ｓ．，  Ｓｈａｎｄｉｌ，  Ｒ．  Ｋ．，  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  Ｖ．，  Ｂａｌｇａｎｅｓｈ，  Ｔ．，  Ｔｙａｇｉ，  Ｓ．，  Ｇｒｏｓｓｅｔ，  Ｊ．，  Ｒｉｃｃａｒｄｉ，  Ｇ．  ＆  Ｃｏｌｅ，  Ｓ．  Ｔ．  Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｏｎｅｓ  Ｋｉｌｌ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｒａｂｉｎａｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，  ８０１−８０４  （２００９）．
２    Ｚｕｍｌａ，  Ａ．，  Ｎａｈｉｄ，  Ｐ．  ＆  Ｃｏｌｅ，  Ｓ．  Ｔ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １２，  ３８８−４０４  （２０１３）．
３    Ｍａｋａｒｏｖ，  Ｖ．，  Ｌｅｃｈａｒｔｉｅｒ，  Ｂ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．，  Ｎｅｒｅｓ，  Ｊ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓａｒ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｒａａｄｓｅｎ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，  Ｒ．  Ｃ．，  Ｒｙａｂｏｖａ，  Ｏ．  Ｂ．，  Ｖｏｃａｔ，  Ａ．，  Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｗｉｄｍｅｒ，  Ｎ．，  Ｂｕｃｌｉｎ，  Ｔ．，  Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｗ．，  Ａｎｄｒｉｅｓ，  Ｋ．，  Ｐｏｊｅｒ，  Ｆ．，  Ｄｙｓｏｎ，  Ｐ．  Ｊ．  ＆  Ｃｏｌｅ，  Ｓ．  Ｔ．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｎｅｗ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｏｎｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ６，  ３７２−３８３  （２０１４）．
４    Ｔｉｗａｒｉ，  Ｒ．，  Ｍoeｌｌｍａｎｎ，  Ｕ．，  Ｃｈｏ，  Ｓ．，  Ｆｒａｎｚｂｌａｕ，  Ｓ．  Ｇ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｐ．  Ａ．  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎｓｐｉｒｅｄ  ｂｙ  ＢＴＺ０４３  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ．  ＡＣＳ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ，  ５，  ５８７−５９１  （２０１４）．
５    Ｂａｔｔ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｊａｂｅｅｎ，  Ｔ．，  Ｂｈｏｗｒｕｔｈ，  Ｖ．，  Ｑｕｉｌｌ，  Ｌ．，  Ｌｕｎｄ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，  Ｌ．，  Ａｌｄｅｒｗｉｃｋ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｆｕｅｔｔｅｒｅｒ，  Ｋ．  ＆  Ｂｅｓｒａ，  Ｇ．  Ｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤｐｒＥ１  ｂｙ  ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０９，  １１３５４−１１３５９  （２０１２）．
６    Ｔｒｅｆｚｅｒ，  Ｃ．，  Ｓｋｏｖｉｅｒｏｖａ，  Ｈ．，  Ｂｕｒｏｎｉ，  Ｓ．，  Ｂｏｂｏｖｓｋａ，  Ａ．，  Ｎｅｎｃｉ，  Ｓ．，  Ｍｏｌｔｅｎｉ，  Ｅ．，  Ｐｏｊｅｒ，  Ｆ．，  Ｐａｓｃａ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｍａｋａｒｏｖ，  Ｖ．，  Ｃｏｌｅ，  Ｓ．  Ｔ．，  Ｒｉｃｃａｒｄｉ，  Ｇ．，  Ｍｉｋｕｓｏｖａ，  Ｋ．  ＆  Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｋ．  Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｏｎｅｓ  ａｒｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｅｃａｐｒｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｅ  ２’−ｏｘｉｄａｓｅ  ＤｐｒＥ１．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３４，  ９１２−９１５  （２０１２）．
７    Ｎｅｒｅｓ，  Ｊ．，  Ｐｏｊｅｒ，  Ｆ．，  Ｍｏｌｔｅｎｉ，  Ｅ．，  Ｃｈｉａｒｅｌｌｉ，  Ｌ．  Ｒ．，  Ｄｈａｒ，  Ｎ．，  Ｂｏｙ−Ｒoeｔｔｇｅｒ，  Ｓ．，  Ｂｕｒｏｎｉ，  Ｓ．，  Ｆｕｌｌａｍ，  Ｅ．，  Ｄｅｇｉａｃｏｍｉ，  Ｇ．，  Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ，  Ａ．  Ｐ．，  Ｒｅａｄ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｚａｎｏｎｉ，  Ｇ．，  Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｄｅ  Ｒｏｓｓｉ，  Ｅ．，  Ｐａｓｃａ，  Ｍ．  Ｒ．，  ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｄｙｓｏｎ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｒｉｃｃａｒｄｉ，  Ｇ．，  Ｍａｔｔｅｖｉ，  Ａ．，  Ｃｏｌｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ＆  Ｂｉｎｄａ，  Ｃ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｏｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｍｅｄ．  ４，  １５０ｒａ１２１−１５０ｒａ１２１  （２０１２）．
８    Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｃ．  ＆  Ｋｏｏｖｉｔｓ，  Ｐ．  Ｊ．  Ａｎ  ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ／ｎｉｔｒｏ−Ｍａｎｎｉｃｈ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏａｌｋｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｔｈｉｏｕｒｅａ  ｏｒｇａｎｏｃａｔａｌｙｓｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ２８９７  （２０１３）．
９    Ｋｈｉｌｙａｓ，  Ｉ．  Ｖ．，  Ｚｉｇａｎｓｈｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｐａｎｎｉｅｒ，  Ａ．  Ｊ．  ＆  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｒ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅ  ｏｎ  ２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｔｏｌｕｅｎｅ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｙｅａｓｔ．  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ２４，  ６３１−６４４  （２０１３）．
１０    Ｔｉｗａｒｉ，  Ｒ．，  Ｍｏｒａｓｋｉ，  Ｇ．  Ｃ．，  Ｋｒｃｈｎａｋ，  Ｖ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｃｏｌｏｎ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｍ．，  Ｈｅｒｒｅｒｏ，  Ｅ．，  Ｏｌｉｖｅｒ，  Ａ．  Ｇ．  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｔｈｉｏｌａｔｅｓ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｒｅｄｏｘ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＴＺ０４３  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｉｔｒｏａｒｏｍａｔｉｃ  ａｎｔｉ−ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３５，  ３５３９−３５４９  （２０１３）．
１１    Ｐａｌｏｍｉｎｏ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ａ．，  Ｃａｍａｃｈｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ：  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ａｎｔｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４６（８），  ２７２０−２  （２００２）．
【図１】
2019533013.tif 000032
【図２Ａ）】
2019533013.tif 000033
【図２Ｂ）】
2019533013.tif 000034
【図３】
2019533013.tif 000035
【図４】
2019533013.tif 000036
【国際調査報告】
2019533013.tif 000037
2019533013.tif 000038
2019533013.tif 000039
2019533013.tif 000040
2019533013.tif 000041
2019533013.tif 000042