(57)【要約】  定量的分析方法であって、薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュールの変化度を定量的に比較するために用いる方法である。本方法は、様々な次元（属性）を有するモジュールの位相パラメータを統合し、モジュール変化の総合的で包括的な指標を構築して定量化し、薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュールの変化度を定量的に分析して比較するものである。本方法は、１）薬物介入前の生体分子ネットワークおよび薬物介入後の生体分子ネットワークを構築し、薬物介入前の生体分子ネットワークのモジュールおよび薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュールを識別することと、２）変化を示している薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュールを照合し、変化を示しているモジュールのペアを明らかにすることと、３）モジュールの様々な次元を示している位相パラメータを統合し、位相パラメータの重みを合わせ、包括的なモジュール評価システムを構築し、薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュールの全体的な立体配座の変化を計算することとを含む。本発明は、バイオネットワーク分析、新薬の設計および開発、薬理学的機序研究などの分野に適応できるものである。【選択図】図８
2019532421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワーク内のモジュールの変化を定量的に分析する方法であって、以下の工程：
（１）それぞれのモジュールに対して薬物介入前の生体分子ネットワークおよび薬物介入後の生体分子ネットワークを、ノード数≧３を標準とみなすことによって識別し、薬物介入前の前記生体分子ネットワークのモジュールの群および薬物介入後の前記生体分子ネットワークのモジュールの群を得る工程と、
（２）工程（１）で識別した両方のモジュール群に対し、薬物介入後の前記生体分子ネットワークの前記モジュール群を薬物介入前の前記生体分子ネットワークの前記モジュール群と照合させて、１つ以上のモジュール再構築ペアを得る工程と、
（３）工程（２）で得た前記１つ以上のモジュール再構築ペアの各々に対し、総合的かつ包括的な指標ｋ値を用いて前記ペアになっている前記モジュールの変化を定量化する工程であって、前記総合的かつ包括的な指標ｋ値は、以下の式を用いて、様々な次元および重みを描写している位相パラメータから計算され、
【数１】
2019532421.tif 000017
式中、ｎは選択した位相パラメータの数を表し、ｉは１〜ｎの整数であり、ａiは、薬物介入前の前記モジュール群の前記モジュールの前記ｉ番目の位相パラメータの特徴的な空間ベクトルを表し、ｂiは、薬物介入後の前記モジュール群の前記モジュールの前記ｉ番目の位相パラメータの特徴的な空間ベクトルを表し、ｄiは、薬物介入前および薬物介入後の前記ｉ番目の位相パラメータの前記２つの特徴的な空間ベクトルの間の距離を表し、ｗiは、各位相パラメータの重みを表す、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
工程（１）では、前記生体分子ネットワークは、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク、遺伝子共発現ネットワーク、遺伝子転写調節ネットワーク、生体代謝ネットワーク、エピジェネティックネットワーク、表現型ネットワーク、シグナル伝達経路ネットワークネットワーなどであり、
好ましくは、前記生体分子ネットワークは、タンパク質どうしの相互作用ネットワークまたは遺伝子共発現ネットワークである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）では、前記モジュールは、ＭＣＯＤＥ、ＭＣＬ、ＣＦｉｎｄｅｒ、ＣＰＭ、ＳＰＣ、Ｇ−Ｎアルゴリズム、ＭｏｄｕＬａｎｄ、ＷＧＣＮＡ、ＤＭＥ、ＭＩＮＥ、ＳＶＤなどのうちの１つ以上から選択した方法によって識別され、
好ましくは、モジュールを識別する前記方法は、ＭＣＯＤＥまたはＷＧＣＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（３）では、前記位相パラメータは、ノード、エッジ、特徴的な経路の長さ、隣接物の平均数、ネットワーク密度、ネットワーク集中化、異質性、クラスタ係数、位相係数、中間中心性、接近中心性、応力中心性、最短経路、重みおよび接続性のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（３）では、ｎ≧５、好ましくはｎ≧８、さらに好ましくはｎ≧１０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記重みは、階層分析法、デルファイ法、重み付けによる因子分析、情報重み付け法、主成分分析、エントロピー重み付け法、優越性チャート、標準偏差などによって決定され、
好ましくは、前記重みは、階層分析法によって決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワークで有効なモジュール再構築ペアを識別する方法であって、以下の工程：
（Ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法の工程（１）〜（３）を実施し、前記モジュールの前記変化度を表す前記総合的かつ包括的な指標ｋ値を得る工程と、
（Ｂ）工程（１）での前記薬物を無効な薬物である物質に置き換えて請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法の工程（１）〜（３）を繰り返し、１つ以上のモジュール再構築ペアでの前記モジュールの前記変化度を表す１つ以上の総合的かつ包括的な指標ｋ値を得て、最大ｋ値を閾値として選択する工程と、
（Ｃ）工程（Ａ）で得た前記ｋ値を工程（Ｂ）で得た前記閾値と比較し、工程（Ａ）で得たいずれかのモジュール再構築ペアの前記ｋ値≧前記閾値であれば、前記モジュール再構築ペアを有効なモジュール再構築ペアとして識別する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的情報技術の分野に関する。具体的には、本発明は、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク、遺伝子発現調節ネットワーク、薬物代謝ネットワークおよび薬物標的ネットワークなどの複雑な生体分子ネットワークに薬物を介入させた後に、ある立体配座から別の立体配座へのモジュールの変化を定量化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネットワークの構造分析は、関心のあるシステムをネットワークとして表し、その後、定量的指標を用いてそのネットワークの位相構造の特徴を研究するプロセスである。ネットワークの階層の中位の粒度にあるモジュールは、ネットワークの局所の特徴および構成を表している。したがって、ネットワークの位相パラメータを測定する方法を用いて、モジュールの位相特徴を描写できる。
【０００３】
ネットワーク薬理学では、体の生体システムが安定してバランスの取れた状態にあるとき、体は健康であると考える。しかしながら、生体システム（生体ネットワーク）のバランス（健康状態）が乱れたり壊れたりすると、体には、病的状態または疾患状態に至る変化が起こる。薬物の疾患に対する治療効果は、外乱情報に対する生体システムまたは生体ネットワークの反応として見ることができる。換言すれば、有効な薬物の作用によって、変化を弱め得る方向にバランスが傾き、その後、生体システムのバランスは回復するか、バランスが崩れる度合いが減少する。しかし、薬物の作用がネットワークの全体的な変化によって効果的に反映され得るかどうかには議論の余地がある。対照的に、一部の研究では、ネットワークの一部およびセグメント（モジュール）に変化を集中させると、薬物の作用をより直接的かつ効果的に評価し得ることが示唆されている。
【０００４】
これまでの研究では、１つまたは複数の位相パラメータのそれぞれを使用する定量分析を通してモジュールの変化度を測定することが実施されていたが、モジュールの全体的な（多次元の）立体配座の変化度の包括的な定量分析は無視されていた。したがって、モジュールの全体的な立体配座の変化度を包括的に定量化する新規の方法を提供することが先行技術には依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の技術的課題に鑑みて、本発明は、生体分子ネットワーク内でのモジュールの全体的な立体配座の変化度を定量化する新規の方法を提供することである。本方法は、様々な次元の位相パラメータ（すなわち様々な特性の位相パラメータ）を統合し、モジュールに対する包括的な評価システムを構築することによって、薬物介入前および薬物介入後のモジュールの全体的な立体配座の変化度を定量的に分析できるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
定義
本明細書で使用したように、「生体分子ネットワーク」という用語は、生体システムに様々な組織形態で存在する生体システムのネットワークを指し、このネットワークは、種々の生体分子を表すノードと、生体分子どうしの相互作用関係を表すエッジとで構成される。一般的な生体分子ネットワークは、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク、遺伝子共発現ネットワーク、遺伝子転写調節ネットワーク、生体代謝ネットワーク、エピジェネティックネットワーク、表現型ネットワーク、シグナル伝達経路ネットワークネットワーなどであってよい。
【０００７】
本明細書で使用したように、「ノード」という用語は、生体分子ネットワーク内の種々の個々の生体分子を指す。例えば、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク内のノードは、個々のタンパク質を表す。
【０００８】
本明細書で使用したように、「エッジ」という用語は、生体分子ネットワーク内の種々の個々の生体分子どうしの何らかの特定の関係を指す。生体分子ネットワークでは、２つの別個の生体分子間の関係は、エッジとして示される。例えば、タンパク質どうしの相互作用ネットワークでは、タンパク質（ノード）どうしの相関関係にある興味深い関係が両者の間のエッジで表される。
【０００９】
本明細書で使用したように、「モジュール」という用語は、少なくとも３つの異なる生体分子（ノード）から成り、生体分子ネットワーク内の機能と形態の両方で比較的独立している実体を指す。ネットワークの位相構造では、１つのモジュール内でのノードの接続は比較的密集しているが、異なるモジュール内でのノードの接続は比較的まばらである。モジュールは、モジュールを構成している個々の生体分子（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および小分子などのノード）どうしの相互作用に由来する独立した機能を有する。
【００１０】
本明細書で使用したように、「モジュールの変化」という用語は、外乱（例えば薬物介入）が異なる時間または空間（例えば薬物介入の前および後）で起こることによるモジュールの変化（分割、融合、縮小、拡大など）を指す。
【００１１】
本明細書で使用したように、「（モジュールの）次元」という用語は、隣接物、ネットワーク密度、ネットワーク集中化、中間中心性などのパラメータで記述できるモジュールの位相構造の個々の特性を指す。「次元」および「特性」という用語は、本明細書では互換的に使用できる。
【００１２】
本明細書で使用したように、「モジュール再構築ペア」という用語は、薬物介入前の生体分子ネットワーク内のモジュールと、薬物介入後の生体分子ネットワーク内のモジュールとからなるモジュールのペアを指し、この２つのモジュールは、少なくとも１つの（≧１）ノードが重複している。
【００１３】
本明細書で使用したように、「有効なモジュール再構築ペア」という用語は、薬物介入前および薬物介入後の変化度が特定の閾値を超えているモジュール再構築ペアを指す。
【００１４】
本明細書で使用したように、「無効な薬物」という用語は、関心のある特定の病状で投与した後に所望の改善を達成できなかった薬物を指す。
【００１５】
本発明が提供する技術的解決策は以下の通りである。
【００１６】
１つの態様では、本発明は、薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワーク内のモジュールの変化を定量的に分析する方法であって、以下の工程：
（１）それぞれのモジュールに対して薬物介入前の生体分子ネットワークおよび薬物介入後の生体分子ネットワークを、ノード数≧３を標準とみなすことによって識別し、薬物介入前の生体分子ネットワークのモジュールの群および薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュールの群を得る工程であって、
好ましくは、モジュールは、ＭＣＯＤＥ、ＭＣＬ、ＣＦｉｎｄｅｒ、ＣＰＭ、ＳＰＣ、Ｇ−Ｎアルゴリズム、ＭｏｄｕＬａｎｄ、ＷＧＣＮＡ、ＤＭＥ、ＭＩＮＥ、ＳＶＤなどのうちの１つ以上から選択した方法によって識別され、本発明の特定の実施形態に従い、本発明で使用したモジュールを識別する方法は、ＭＣＯＤＥまたはＷＧＣＮＡであり、
好ましくは、生体分子ネットワークは、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク、遺伝子共発現ネットワーク、遺伝子転写調節ネットワーク、生体代謝ネットワーク、エピジェネティックネットワーク、表現型ネットワーク、シグナル伝達経路ネットワークネットワーなどであってよく、さらに好ましくは、生体分子ネットワークは、タンパク質どうしの相互作用ネットワークまたは遺伝子共発現ネットワークである、工程と、
（２）工程（１）で識別した両方のモジュール群に対し、薬物介入後の生体分子ネットワークのモジュール群を薬物介入前の生体分子ネットワークのモジュール群と照合させて、１つ以上のモジュール再構築ペアを得る工程と、
（３）工程（２）で得た１つ以上のモジュール再構築ペアの各々に対し、総合的かつ包括的な指標ｋ値を用いてペアになっているモジュールの変化を定量化する工程であって、総合的かつ包括的な指標ｋ値は、以下の式を用いて、様々な次元および重みを描写している位相パラメータから計算され、
【００１７】
【数１】
2019532421.tif 000003
【００１８】
式中、ｎは選択した位相パラメータの数を表し、ｉは１〜ｎの整数であり、ａiは、薬物介入前のモジュール群のモジュールのｉ番目の位相パラメータの特徴的な空間ベクトルを表し、ｂiは、薬物介入後のモジュール群のモジュールのｉ番目の位相パラメータの特徴的な空間ベクトルを表し、ｄiは、薬物介入前および薬物介入後のｉ番目の位相パラメータの２つの特徴的な空間ベクトルの間の距離を表し、ｗiは、各位相パラメータの重みを表す、工程と
を含む、方法を提供する。
【００１９】
様々な次元の位相パラメータは、本発明の工程（３）でモジュールの変化を定量化するための総合的かつ包括的な指標を構築するのに使用するものであり、表１から選択され得る。
【００２０】
【表１】
2019532421.tif 000004
【００２１】
好ましくはｎ≧５、さらに好ましくはｎ≧８、さらに好ましくはｎ≧１０である。
【００２２】
重みは、階層分析法、デルファイ法、重み付けによる因子分析、情報重み付け法、主成分分析、エントロピー重み付け法、優越性チャート、標準偏差などによって決定され得る。本発明の特定の実施形態によれば、重みは階層分析法によって決定される。
【００２３】
上記の方法の技術上の工程表を図８に示している。
【００２４】
別の態様では、本発明は、薬物介入前および薬物介入後の生体分子ネットワークで有効なモジュール再構築ペアを識別する方法であって、以下の工程：
（Ａ）上記の方法の工程（１）〜（３）を実施し、モジュールの変化度を表す総合的かつ包括的な指標ｋ値を得る工程と、
（Ｂ）工程（１）での薬物を無効な薬物である物質に置き換えて上記の方法の工程（１）〜（３）を繰り返し、１つ以上のモジュール再構築ペアでのモジュールの変化度を表す１つ以上の総合的かつ包括的な指標ｋ値を得て、最大ｋ値を閾値として選択する工程と、
（Ｃ）工程（Ａ）で得たｋ値を工程（Ｂ）で得た閾値と比較し、工程（Ａ）で得たいずれかのモジュール再構築ペアのｋ値≧閾値であれば、そのモジュール再構築ペアを有効なモジュール再構築ペアとして識別する工程と
を含む、方法を提供する。
【００２５】
モジュールの変化を定量化する本方法は、生体ネットワーク分析、新薬の開発および設計、薬理学的機序研究などの分野で使用できるものである。例えば、本発明の特定の実施形態によれば、脳虚血のマウスモデルに精製したＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分を介入させ、その後、薬物介入前の疾患状態のマウスモデルの生体分子ネットワークおよび薬物介入後の生体分子ネットワークをそれぞれ得た。続いて、モジュールの識別および照合、ならびに生体分子ネットワーク内のモジュールの変化の定量化を実施して、薬物介入前および薬物介入後のモジュール再構築ペアを得た。得られたモジュール再構築ペアをさらに、無効な薬物であるｃｏｎｃｈａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａｌｌｓｔａを用いて得たデータと比較し、有効なモジュール再構築ペアを識別した。また、モジュール再構築ペアと有効なモジュール再構築ペアは両方とも、薬物開発および薬学的機序研究に関連する情報を提供できるものである。
【００２６】
以下に添付の図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１の各群に対するネットワーク構築の結果を示す図である。ネットワーク内では、ノードは遺伝子またはタンパク質を表し、ノードの間にあるエッジは遺伝子またはタンパク質どうしの相互作用を表している。図１では、パネル１−ａはＶｅｈｉｃｌｅ群の結果を示し、パネル１−ｂはＢＪ群の結果を示し、パネル１−ｃはＪＵ群の結果を示している。
【図２】実施例１のＭＣＯＤＥ方法を用いて各ネットワークからモジュールを識別した結果を示す図である。図２では、パネル２−ａはＶｅｈｉｃｌｅ群の識別結果を示し、パネル２−ｂはＢＪ群の識別結果を示し、パネル２−ｃはＪＵ群の識別結果を示している。
【図３】実施例１での薬物介入前の状態（状態Ａ）から薬物介入後の状態（状態Ｂ）へのモジュールの変化度である総合的かつ包括的な指標ｋを計算するのに使用する式を示す図である。
【図４】実施例１の有効なモジュール再構築ペアであるＶｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪ群を示す図である。
【図５】実施例１の有効なモジュール再構築ペアであるＶｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵ群を示す図である。
【図６】実施例４のＶｅｈｉｃｌｅ−ｂｌａｃｋとＪＡ−ｃｙａｎからなるモジュール再構築ペアから得たｋ値を示す図である。
【図７】実施例４のＶｅｈｉｃｌｅ−ｖｉｏｌｅｔとＪＡ−ｌｉｇｈｔｙｅｌｌｏｗ、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｖｉｏｌｅｔとＪＡ−ｒｅｄ、およびＶｅｈｉｃｌｅ−ｖｉｏｌｅｔとＪＡ−ｙｅｌｌｏｗからなるモジュール再構築ペアから得たｋ値を示す図である。
【図８】本発明の方法の技術上の工程表を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を特定の実施形態と併せてさらに詳細に説明する。提供する実施形態は、本発明を説明するために用いるに過ぎず、本発明の範囲を何らかの形で限定するものではないことは、当業者から理解されるであろう。
【００２９】
本発明の目的は、異なる状態でのモジュール（例えば、薬物介入前（疾患状態である可能性がある）および薬物介入後の生体分子ネットワーク内のモジュール）の変化度を定量化して、薬物介入に関与する反応を生み出す有効なモジュール再構築ペアを識別し、それによって疾患治療および薬物開発に導く土台を提供することである。本方法の有効性および実行可能性は、以下の実施例で証明される。これらの実施例は非限定的なものであり、本方法は他の種類のネットワークにも適用できるものである。
【００３０】
以下の実施形態での実験方法は、特に他の特定の指示がない限り、すべて従来の方法である。以下の実施例で使用する医薬材料、試薬材料などは、特に他の特定の指示がない限り、市場で入手可能な従来の製品である。
【００３１】
実施例１  脳虚血のマウスモデルにＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分を介入させ、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク内のモジュールの変化を定量化し、有効なモジュール再構築ペア（１０個の位相パラメータの組み合わせ）を識別する。
【００３２】
データソース
この実施例のデータは、以下のようにして得た一連の遺伝子に由来するものである。脳虚血のマウスモデルに、精製したＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分、すなわちバイカリン（ＢＡ）、ｊａｓｍｉｎｏｉｄｉｎ（ＪＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＡ）、バイカリン＋ｊａｓｍｉｎｏｉｄｉｎ（ＢＪ、ＢＡ＋ＪＡ）、ｊａｓｍｉｎｏｉｄｉｎ＋ウルソデオキシコール酸（ＪＵ、ＪＡ＋ＵＡ）、および無効成分のｃｏｎｃｈａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａｕｓｔａ（ＣＭ）のそれぞれを介入させ、有意に異なる発現をした遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を用いて分析し、その後、生物学的機能アノテーションと統計的に有意に関連していた一連の遺伝子を、ＩＰＡの生物学的機能を強化する結果から抽出した。脳虚血のマウスモデルの群のうち、Ｖｅｈｉｃｌｅ群は統計的に有意な遺伝子が１４９、ＢＡ群は７４、ＪＡ群は１２１、ＵＡ群は１０４、ＢＪ群は７０、ＪＵ群は１０７あり、ＣＭ群は統計的に有意な遺伝子が４０あった。この７つの群の遺伝子は、総合背景（マウスの遺伝子およびタンパク質相互作用の総合データ）に対する標的遺伝子としてマッピングした。
【００３３】
この実施例では、Ｖｅｈｉｃｌｅ群から得られたデータを薬物介入前のデータとして使用し、相加効果を有するＢＪ群から得られたデータおよび相乗効果を有するＪＵ群から得られたデータを薬物介入後のデータとして使用した。
【００３４】
図１に示したように、脳虚血モデル群（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）のタンパク質どうしの相互作用ネットワーク（パネル１−ａ）は、３７５０個のノードおよび９１６２個のエッジで構成され、ＢＪ群のタンパク質どうしの相互作用ネットワーク（パネル１−ｂ）は、２９６８個ノードおよび６２７３個のエッジで構成され、ＪＵ群のタンパク質どうしの相互作用ネットワーク（パネル１−ｃ）は、３４２９個のノードおよび８１１１個のエッジで構成されていた。
【００３５】
薬物介入前および薬物介入後のモジュールの変化を定量化するプロセスは以下の通りである。
工程１：ＭＣＯＤＥ（ノード数≧３）を用いてモジュールに対して各ネットワークを識別する。図２に結果を示したが、この図では、脳虚血モデル群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のタンパク質どうしの相互作用ネットワークから識別したモジュールをパネル２−ａに示し、ＢＪ群のタンパク質どうしの相互作用ネットワークから識別したモジュールをパネル２−ｂに示し、ＪＵ群のタンパク質どうしの相互作用ネットワークから識別したモジュールをパネル２−ｃに示した。
【００３６】
工程２：介入前後のネットワークでのモジュールの変化を追跡する。この実施例では、薬物介入群（ＢＪ群またはＪＵ群）から識別したモジュールをＶｅｈｉｃｌｅ群から識別したモジュールと照合させ、重複ノードを少なくとも１つ有する２つのモジュールをモジュール再構築ペアと定義した。最後に、ＢＪ群およびＪＵ群をＶｅｈｉｃｌｅ群と照合して得られたモジュール再構築ペアの結果を表２および表３に示した。
【００３７】
【表２】
2019532421.tif 000005
2019532421.tif 000006
【００３８】
工程３：総合的かつ包括的な指標（複数の位相パラメータと、特定の位相パラメータの重要性を反映している重みとの組み合わせで形成される総合的かつ包括的なモジュールの位相パラメータの指標）を用いてモジュールの変化度を定量化する。この指標を用いてモジュールの変化を定量化した。この実施例では、モジュールの様々な次元を表す１０個の位相パラメータ、すなわちノード、エッジ、元のノード、元のエッジ、隣接物の平均数、ネットワーク密度、ネットワーク集中化、平均中間中心性、平均重み、および最短経路を組み合わせた（異なるパラメータどうしの共線性を排除することを基本として、その他のパラメータを選択することもできる）。薬物介入前の群では（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）、モジュールＡの構造を「ａ」と設定し、その位相状態、例えば特徴的な空間ベクトルなどを、上記の１０個のパラメータを使用してａ1、ａ2、ａ3、……ａ10と表記した（様々な特性の変量）。一方、薬物介入後の群（ＢＪ群またはＪＵ群）では、モジュールＡは位相構造がモジュールＢに変化し、対応する位相構造「ｂ」をｂ1、ｂ2、ｂ3、……ｂ10と表記した。表４に示したように、それと同時に、様々なパラメータの重要性を反映している対応する重み（階層分析法）を組み合わせた。図３に示したように、モジュールＡからモジュールＢへの位相パラメータの包括的な変化をｋ値で表した。ｋ値は０から１の間であった。ｋ値が小さいほど２つのモジュールどうしの全体的な差は小さく、ｋ値が大きいほど２つのモジュールどうしの差は大きい。
【００３９】
【表３】
2019532421.tif 000007
【００４０】
薬物介入前の疾患状態から薬物介入後の状態へのモジュールの変化度を、図３に記載したｋ値を計算する方法を用いて計算した。表５（Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪ）および表６（Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵ）を参照されたい。
【００４１】
【表４】
2019532421.tif 000008
【００４２】
モジュール再構築ペアＶｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪのｋ値のうちの最大ｋ値は、０．５８７（Ｖｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ７）で、最小のｋ値は０．１８０（Ｖｅｈｉｃｌｅ２−−ＢＪ２）であることがわかる。ほとんどのｋ値は０．３から０．５の間で、平均値は０．３５５である。
【００４３】
【表５】
2019532421.tif 000009
【００４４】
モジュール再構築ペアＶｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵのｋ値のうちの最大ｋ値は、０．５５６（Ｖｅｈｉｃｌｅ１２−−ＪＵ１５）で、最小のｋ値は０．１３７（Ｖｅｈｉｃｌｅ１６−−ＪＵ４）で、平均値は０．３２６であることがわかる。
【００４５】
工程４：この実施例の工程３でＶｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪまたはＶｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵのモジュールの変化度を定量的に分析することに基づいて、閾値ｋ0を用いて薬物を介入させた疾患ネットワークで有益な反応を生み出せる有効なモジュール再構築ペアを識別する。閾値ｋ0は以下のようにして得た。
【００４６】
無効な薬物ｃｏｎｃｈａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａｕｓｔａ（ＣＭ）を介入させた脳虚血のモデルのネットワークをＶｅｈｉｃｌｅ群のネットワークと比較し、ｃｏｎｃｈａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａｕｓｔａを介入させた群でのモジュールの最大変化を表す最大ｋ値を閾値として使用した。Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪまたはＶｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵのいずれかのモジュール再構築ペアのｋ値が≧０．４５６であった場合、そのモジュール再構築ペアを有効なモジュール再構築ペアとみなした。
【００４７】
【表６】
2019532421.tif 000010
【００４８】
図４では、Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪ群から識別した３つの有効なモジュール再構築ペアは、ａ．Ｖｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ２、Ｖｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ７、ｂ．Ｖｅｈｉｃｌｅ１１−−ＢＪ１６であった。図５では、Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵ群から識別した３つの有効なモジュール再構築ペアは、ａ．Ｖｅｈｉｃｌｅ１２−−ＪＵ１５、ｂ．Ｖｅｈｉｃｌｅ１６−−ＪＵ１９、ｃ．Ｖｅｈｉｃｌｅ２０−−ＪＵ１３であった。
【００４９】
実施例２  脳虚血のマウスモデルにＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分を介入させ、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク内のモジュールの変化を定量化し、有効なモジュール再構築ペア（８つの位相パラメータの組み合わせ）を識別する。
【００５０】
使用したデータソースは、実施例１のものと同じであった。この実施例では、実施した工程１および工程２は、実施例１に記載したものと同じであった。
【００５１】
工程３：モジュールの様々な次元を表している８つの位相パラメータ、すなわちノード、エッジ、元のノード、元のエッジ、ネットワーク密度、ネットワーク集中化、平均重み、および最短経路を組み合わせた。各パラメータの重みを表８に示した。実施例１で記載したｋ値の計算方法を用いて、疾患状態から薬物を介入させたＪＵ群の状態へのモジュールの変化度を以下に示した。
【００５２】
【表７】
2019532421.tif 000011
2019532421.tif 000012
【００５３】
Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵの全モジュール再構築ペアのうち、Ｖｅｈｉｃｌｅ１２−−ＪＵ１５が引き続き最大ｋ値を有するモジュール再構築ペアであり、Ｖｅｈｉｃｌｅ１６−−ＪＵ４が引き続き最小ｋ値を有するモジュール再構築ペアであることがわかる。ｋの平均値は０．３５５であり、これは実施例１の平均値と同じである。
【００５４】
この実施例では、実施例１で記載した方法と同じ方法でｃｏｎｃｈａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａｕｓｔａ（ＣＭ）、Ｑｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの無効成分を用いて閾値ｋ0を得た。その後、薬物を介入させた疾患ネットワークで有益な反応を生み出せる有効なモジュール再構築ペアを識別するためにこの閾値を用いた。８つの位相パラメータを組み合わせた定量的指標の場合、ＣＭを介入させた脳虚血モデルのネットワークで最大のモジュール変化を表した最大ｋ値は０．５３５であった（表１０）。Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵのいずれかのモジュール再構築ペアのｋ値が≧０．５３５であった場合、そのモジュール再構築ペアを有効なモジュール再構築ペアとみなした。
【００５５】
【表８】
2019532421.tif 000013
【００５６】
Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵ群から識別した３つの有効なモジュール再構築ペアは、Ｖｅｈｉｃｌｅ１２−−ＪＵ１５（ｋ＝０．６４０）、Ｖｅｈｉｃｌｅ１６−−ＪＵ１９（ｋ＝０．５４３）、Ｖｅｈｉｃｌｅ２０−−ＪＵ１３（ｋ＝０．５７３）であり、これらは、実施例１で識別した有効なモジュール再構築ペアと同じであった。
【００５７】
実施例３  脳虚血のマウスモデルにＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分を介入させ、タンパク質どうしの相互作用ネットワーク内のモジュールの変化を定量化し、有効なモジュール再構築ペア（５つの位相パラメータの組み合わせ）を識別する。
【００５８】
使用したデータソースは、実施例１のものと同じであった。この実施例では、実施した工程１および工程２は、実施例１に記載したものと同じであった。
【００５９】
工程３：モジュールの様々な次元を表している５つの位相パラメータ、すなわちノード、エッジ、元のノード、元のエッジ、およびネットワーク集中化を組み合わせた。各パラメータの重みを表１１に示した。実施例１で記載したｋ値の計算方法を用いて、疾患状態から薬物を介入させたＢＪ群の状態へのモジュールの変化度を以下に示した。
【００６０】
【表９】
2019532421.tif 000014
【００６１】
Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪの全モジュール再構築ペアでは、最大ｋ値は０．８５８（Ｖｅｈｉｃｌｅ１１−−ＢＪ１６）、最小ｋ値は０．２５５（Ｖｅｈｉｃｌｅ２−−ＢＪ７）、ｋの平均値は０．４９６であることがわかる。
【００６２】
この実施例では、実施例１で記載した方法と同じ方法でｃｏｎｃｈａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａｕｓｔａ（ＣＭ）、Ｑｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの無効成分を用いて閾値ｋ0を得た。その後、薬物を介入させた疾患ネットワークで有益な反応を生み出せる有効なモジュール再構築ペアを識別するためにこの閾値を用いた。５つの位相パラメータを組み合わせた定量的指標の場合、ＣＭを介入させた脳虚血モデルのネットワークで最大のモジュール変化を表した最大ｋ値は０．７２２であった（表１３）。Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＪＵのいずれかのモジュール再構築ペアのｋ値が≧０．７２２であった場合、そのモジュール再構築ペアを有効なモジュール再構築ペアとみなした。
【００６３】
【表１０】
2019532421.tif 000015
【００６４】
Ｖｅｈｉｃｌｅ−−ＢＪ群から識別した３つの有効なモジュール再構築ペアは、Ｖｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ２（ｋ＝０．７３３）、Ｖｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ７（ｋ＝０．８５０）、Ｖｅｈｉｃｌｅ１１−−ＢＪ１６（ｋ＝０．８５８）であり、これらは、実施例１で識別した有効なモジュール再構築ペアと同じであった。ただし、３つの有効なモジュール再構築ペアのｋ値は、実施例１の順序とは異なる順序になった。実施例１では、３つの有効なモジュール再構築ペアは、値が上昇する順に、Ｖｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ２、Ｖｅｈｉｃｌｅ１１−−ＢＪ１６およびＶｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ７であったが、この実施例では、Ｖｅｈｉｃｌｅ１１−−ＢＪ１６のｋ値はＶｅｈｉｃｌｅ４−−ＢＪ７よりも大きい。
【００６５】
実施例４  脳虚血のマウスモデルにＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分を介入させ、遺伝子共発現ネットワーク内のモジュールの変化を定量化する。
【００６６】
この実施例では、精製したＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇの有効成分であるｊａｓｍｉｎｏｉｄｉｎ（ＪＡ）を介入させた脳虚血マウスモデルに対する遺伝子発現プロファイルデータを使用した。具体的な実施プロセスは以下のとおりであった。
【００６７】
１．データソース
Ｖｅｈｉｃｌｅ群の遺伝子発現プロファイルデータを介入前のデータとして採用し、ＪＡ群の遺伝子発現プロファイルデータを介入後のデータとして採用した。各群からの遺伝子発現プロファイルデータは、１２の試料から得た３７４の遺伝子で構成されていた（Ｔｂｐ、Ｚｅｂ１、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｆｏｘｂ１、Ｃｒｅｂ１、Ｃａｍｋ２ｇ、Ｃｓｆ１、Ｆ５、Ｈｓｐｄ１、Ｍａｔｎ２、Ｍｔ１、Ａｄａｍｔｓ１、Ｋｌｆ６、Ｄｆｆａ、Ｒｇｓ１８、Ｒｈｏａ、Ｋｃｎｍｂ１、Ｐｄｃｄ１１、Ｐｄｐｋ１、Ｃａｓｐ８ａｐ２、Ｍｏｇａｔ１、Ｒｐｓ２６、Ａｋ１、Ｃｓｎｋ２ａ２、Ｄｋｋ２、Ｐｐｍ１ｅ、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｒｐ５３ｉ１１、Ｓｍｐｄ３、Ｇｒｉｎ１、Ｃｄｋ５、Ｊｕｎｄ、Ｅ２ｆ１、Ａｐｏｅ、Ｉｌ１ｂ、Ｐｒｋａｒ１ｂ、Ｉｌ７ｒ、Ｎｇｆｂ、Ｒｅｌａ、Ｉｆｎａｒ１、Ａｄｃｙ６、Ｂａｋ１、Ｆｚｄ６、Ｐｒｋｃｈ、Ｒｇｓ４、Ａｃｔｇ１、Ｇｃｋ、Ｒｇｓ９、Ｓｏｘ９、Ｒｇｓ１、Ｄｇｋｅ、Ｒｇｓ２０、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｎ１、Ｐｒｋｃｎ、Ｄｇｋｚ、Ｃｓｎｋ１ｇ１、Ｄｕｓｐ４、Ｉｌ１１、Ｇｒｂ２、Ｓｈｃ１、Ｓｙｋ、Ｓｉｍ２、Ｙｗｈａｈ、Ｆｇｆ１３、Ｂｉｄ、Ｇｓｔｍ２、Ｒａｒｇ、Ｐｏｕ３ｆ１、Ｃａｍｋ２ｂ、Ｍａｐｋａｐｋ２、Ｔｃｆ４、Ｓｏｓ１、Ｓｔａｔ５ａ、Ｖｅｇｆｂ、Ｂａｄ、Ｅｔｖ３、Ｉｄ１、Ｌｃａｔ、Ｎｆ１、Ｇｓｎ、Ｂｂｃ３、Ｃｌｕ、Ｃａｐｎ９、Ｅｒｃｃ５、Ｃｏｍｔ、Ｃｔｓｌ、Ａｍｐｈ、Ｖｅｇｆｃ、Ｂａｘ、Ｃｙｐ５１、Ｓｏｘ１０、Ｎｆｙｃ、Ｇａｔａ２、Ｉｄ３、Ｌｅｆ１、Ｐｏｕ６ｆ１、６３３０５０３Ｃ０３Ｒｉｋ、Ｅｃｈ１、Ｃｃｌ４、Ｉｔｍ２ａ、Ｈｓｐａ１ａ、Ｃｂｘ３、Ｋｌｆ１０、Ｉｄｈ３ｇ、Ｇｐｘ２、Ｍａｐ２ｋ５、Ｄａｘｘ、Ｅ２ｆ３、Ｆｇｆ１２、Ｉｋｂｋｇ、Ｂｔｒｃ、Ｉｋｂｋａｐ、Ｉｆｎａｒ２、Ｃｄｋ５、Ｐｓｍｂ１、Ｓｕｆｕ、Ｇａｂ１、Ｓｏｘ３０、Ｐｘｎ、Ｐｙｇｏ２、Ｃｔｎｎｂ１、Ｇｒｉｎ２ａ、Ｉｌ５ｒａ、Ｃｄｋ４、Ｂｃｌ２ｌ１、Ａｃｔｂ、Ｍｙｂ、Ｐｒｋｃａ、Ｃｓｆ２ｒｂ２、Ｇｎａｑ、Ｂ−ｒａｆ、Ｗｎｔ６、Ａｄｃｙ７、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｆｚｄ７、Ｐｒｋｃｍ、Ｒｏｃｋ１、Ａｄｃｙ８、Ｐｒｋｃｃ、Ｓｕｂ１、Ｔｕｂａ１ｂ、Ｒｇｓ６、Ｐｌｃｂ１、Ｍｋｎｋ１、Ｄｉａｂｌｏ、Ｍｅｆ２ｃ、Ｌｒｐ１ｂ、Ｄｇｋｇ、Ｒｇｓ１２、Ｓｅｒｐｉｎａ５、Ｈｓｐｂ１、Ｐｐｍ１ｂ、Ｄｌｋ１、Ｃｄｃ４２、Ｆａｄｄ、Ｍｄｆｉ、Ｆｇｆ１１、Ｍａｐ３ｋ４、Ｋｌｋ１ｂ３、Ｉｌ６ｒａ、Ｔｇｆｂ２、Ｗｎｔ１１、Ｃｃｎａ１、Ｍａｐ２ｋ６、Ｈｔｒ１ｆ、Ｚｍａｔ３、Ｂｎｉｐ３、Ｔｓｇ１０１、Ｖｉｍ、Ｓｒｆ、Ｄ１４Ａｂｂ１ｅ、Ｃｄｈ１１、Ｖｄａｃ２、Ｔｆｄｐ１、Ｇａｋ、Ｃｃｎａ２、Ｖｅｇｆａ、Ｖｅｇｆａ、Ｈｄａｃ１、Ｓｒｅｂｆ１、Ｓｔｃｈ、Ｅ２ｆ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｇｎａ１２、Ｇｎａ１３、Ｃａｃｎｂ３、Ｚｉｃ１、Ｐｏｕ４ｆ３、Ｔｃｆ１２、Ｌｄｂ１、Ｃａｐｎｓ１、Ｆｘｙｄ２、Ｇｃｇｒ、ＬＯＣ１００３０４５８８、Ｓｙｔ１１、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｐｂｘ２、Ｉｅｒ３、Ｍａｐｋ９、Ｃｔｎｎｂｉｐ１、Ｆｇｆ１５、Ｓｍａｄ３、Ｎｌｋ、Ｍｅｃｐ２、Ｓｉｇｉｒｒ、Ｒｇｓ１８、Ｐｔｋ２ｂ、Ｓａｐ３０ｂｐ、Ｐｃｍｔ１、Ｔｃｆ３、Ｂｒａｆ、Ａｎｋｒｄ６、Ｒｇｓ５、Ｒａｐ１ｇａｐ、Ａｄｃｙ１、Ｇｒｉｎ２ｂ、Ｇａｐ４３、Ｍａｐ２ｋ１、Ｍａｐｋ１０、Ｔｇｆｂ１、Ｌｔａ、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｗｎｔ３、Ｒａｒａ、Ｐｒｋｃｄ、Ａｔｆ４、Ａｄｃｙａｐ１ｒ１、Ｃｙｃｓ、Ｈｉｎｔ１、Ｒｄｘ、Ｓｒｃ、Ａｄｃｙ９、Ｐｒｋｃｅ、Ｓｈｃｂｐ１、Ｅｌｋ３、Ｒｇｓ１４、Ｒｇｓ１７、Ｄｕｓｐ１０、Ｔｕｂｂ３、Ｃｙｃ１、Ｄｕｓｐ１６、Ｐｌｃｇ２、Ｆｚｄ１０、Ｄｇｋｄ、Ｓｔａｔ３、Ｍａｐｋ１４、Ｍａｐ２ｋ４、Ｈｔｒ１ａ、Ｍａｐ３ｋ２、Ｆｒａｔ１、Ｃａｓｐ７、Ｅｅｆ２ｋ、Ｔｈｂｄ、Ｒａｒｂ、Ｃａｍｋ４、Ｈｔｒ２ｃ、Ｅ２ｆ５、Ｍｅｔ、Ｈｔｒ７、Ｃａｍｋ２ｂ、Ｓｔａｔ６、Ｓｏｄ１、Ｅｆｎａ４、Ｖｄａｃ３、Ａｄまたはａ１、Ｂｍｐ１、Ｖｄａｃ１、Ｇｒｂ２、Ｉｇｆｂｐ２、Ｔｏｐ２ｂ、Ｒｐｌ３５、Ｂｄｎｆ、Ｐｐｐ３ｃｂ、Ｒａｆ１、Ｃｐｅ、Ｃａｃｎｂ３、０６１０００７Ｃ２１Ｒｉｋ、Ｇｎａ１４、Ｇｎａ１１、Ｔｕｂａ１ａ、Ｚｉｃ３、Ｍｌｘ、Ｉｄ４、Ｌｄｂ２、Ｓｅｐｐ１、Ｐｒｏｄｈ、Ｓ１００ａ９、Ｐｇａｍ２、Ｒｃａｎ１、Ａｂｃｃ５、Ｃｃｒ５、Ａｐ１ｍ１、Ｍａｐ３ｋ５、Ｃｓｎｋ１ｅ、Ａｘｉｎ１、Ｆｒｅｑ、Ｓｈ２ｂ１、Ｒｐｓ６ｋａ４、Ｗｉｆ１、Ｎｋｄ１、Ｐａｍ、Ｃｒｅｍ、Ｔｇｍ２、Ｂａｒｈｌ１、Ｔｒａｄｄ、Ｐｌｃｄ４、Ｐｐｐ２ｒ４、Ｏｔｕｄ７ｂ、Ｒｇｓ７、Ｃａｓｐ２、Ｊｕｎｂ、Ｉｌ２ｒｇ、Ｂａｄ、Ｉｌ１ａ、Ｅｇｒ１、Ｐｄｇｆａ、Ｇａｐｄｈ、Ｅｉｆ４ｅ、Ａｐｃ、Ｐｒｋｃｚ、Ｐａｒｐ１、Ｅｇｆｒ、Ｐｒｋｃｂ１、Ｒｇｓ２、Ｔｒａｆ２、Ｃｃｒ３、Ｒｇｓ１６、Ｓｍｐｄ１、Ｔｂｐ、Ｄｇｋａ、Ｍｏｓ、Ｂ２３０１２０Ｈ２３Ｒｉｋ、Ｅｉｆ４ｅ２、Ｒｇｓ１９、Ａｄｃｙ３、Ｃｒｅｂ５、Ｔａｆ７、Ｐｉｋ３ｃａ、Ｓｔａｔ１、Ｉｌ１５、Ａｔｆ３、Ｄｖｌ３、Ｍａｐ３ｋ３、Ｃａｓｐ４、Ｋｃｎｑ１、Ｐｔｐ４ａ３、ｆｏｓＢ、Ｗｎｔ３ａ、Ｃａｌｍ１、Ｈｔｒ３ａ、Ｃｒｋｌ、Ｃａｓｐ３、Ｌｈｘ１、Ｃａｍｋ４、Ｓｅｌｅｎｂｐ２、Ｔｃｆｅ２ａ、Ｓｃｇ５、Ｐｏｌｄ３、Ｍｍｐ２、Ｆａｒｐ２、Ｐｏｌｄ２、Ｐｏｌｄ１、Ｇｐｘ４、Ａｐｐ、Ｍｌｈ３、Ｒｂｌ２、Ｔｐｐ２、Ｃｄｈ３、Ｆｍｏ２、Ｐｏｌｄ４、Ａｒｆ１、Ｓｏｘ１、Ａｒｈｇｅｆ１）。
【００６８】
２．ネットワーク構築およびモジュール分割
Ｖｅｈｉｃｌｅ群およびＪＡ群の遺伝子共発現ネットワーク（各ネットワークに対して３７４個のノード）を、重みを付けした遺伝子共発現ネットワーク分析（ＷＧＣＮＡ）を用いて構築し、その後、モジュールに分割した（最小モジュールを３つのノードを有するように設定した）。最後に、Ｖｅｈｉｃｌｅ群から４８個のモジュールが得られ、ＪＡ群から４２個のモジュールが得られた。Ｖｅｈｉｃｌｅ群およびＪＡ群から識別した４つのモジュール再構築ペア、すなわちＶｅｈｉｃｌｅ−ｂｌａｃｋとＪＡ−ｃｙａｎ、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｖｉｏｌｅｔとＪＡ−ｌｉｇｈｔｙｅｌｌｏｗ、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｖｉｏｌｅｔとＪＡ−ｒｅｄ、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｖｉｏｌｅｔとＪＡ−ｙｅｌｌｏｗに対してＫ値の分析を行った。実施例１で記載した１０個の位相パラメータの組み合わせを用いてモジュールの変化の定量的追跡を実施する。この４つのモジュール再構築ペアの該当ｋ値を表１４、図７および図８に示した（破線の円で強調したノードは、モジュール再構築ペアの重複ノードであった）。
【００６９】
【表１１】
2019532421.tif 000016
【００７０】
本発明の実施形態に対する上記の説明は、本発明を限定するよう意図するものではなく、当業者は、本発明に従った種々の変更および変形を加えることができ、これらは本発明の趣旨を逸脱しない限り添付の特許請求の範囲の保護範囲内である。
【図１−ａ】
2019532421.tif 000018
【図１−ｂ】
2019532421.tif 000019
【図１−ｃ】
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【図２−ａ】
2019532421.tif 000021
【図２−ｂ】
2019532421.tif 000022
【図２−ｃ】
2019532421.tif 000023
【図３】
2019532421.tif 000024
【図４ａ】
2019532421.tif 000025
【図４ｂ】
2019532421.tif 000026
【図５ａ】
2019532421.tif 000027
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
2019532421.tif 000029
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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