(57)【要約】  アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドとアディポネクチン受容体との親和性が高くなってＡＭＰＫリン酸化を効果的に活性化させることのできる、アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドを提供する。第２型糖尿病の治療剤が有する副作用を最小限にするとともに、従来の治療剤よりも優れた効能を有する治療剤を提供する。【選択図】図１
2019531094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（Ｘａａ１−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）
（ただし、
前記配列番号１において、前記Ｘａａ１は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびこれらと同様の特性を有する非天然アミノ酸からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
前記Ｘａａ２は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびこれらと同様の特性を有する非天然アミノ酸からなる群から選ばれるいずれか一つである）
を含む
ことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列のＮ末端にＸ−Ｌ１のアミノ酸配列がさらに結合される
（ただし、
前記Ｘは、
１〜１０個のアミノ酸と、
１〜２００ｋＤａの重さを有する直鎖状または分枝鎖状のポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）と、
脂肪親和性化合物と、
ペプチド・トランスダクション・ドメイン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と、からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
前記Ｌ１は、前記配列番号１のＮ末端と前記Ｘを連結する単一結合または連結環の役割を果たす化合物である）
請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列のＣ末端にＬ２−Ｚのアミノ酸配列をさらに含む
（ただし、
前記Ｚは、
１〜１０個のアミノ酸と、
１〜２００ｋＤａの重さを有する直鎖状または分枝鎖状のポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）と、
脂肪親和性化合物と、
ペプチド・トランスダクション・ドメイン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と、からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
前記Ｌ２は、前記配列番号１のＣ末端と前記Ｚを連結する単一結合または連結環の役割を果たす化合物である）
請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
アディポネクチン受容体の作用薬である
請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
アディポネクチン受容体１との解離定数が２〜１６μＭである
請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化させるのに０．８〜４μＭが必要である
請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記配列番号１は、
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号２）と、
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号３）と、
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号４）と、からなる群から選ばれるいずれか一つである
請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドをエンコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドを有効成分とする、第２型糖尿病の予防または治療用の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学、細胞生物学、並びに分子生物学の分野の全般に関連するものであり、さらに詳しくは、第２型糖尿病の治療のためのアディポネクチン受容体に対して作用する作用薬ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、遺伝的、環境的な原因によってインスリン分泌の減少および抵抗性などのようにインスリンの分泌に問題があって、あるいは、インスリンの機能に異常が生じて、血液中の葡萄糖が細胞に伝達／貯蔵できずに血液中に過度に多くなり、血糖の数値が正常人よりもはるかに高くなる高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）の症状を示す深刻な代謝性疾患である。糖尿病は、大きく、第１型糖尿病（Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｔ１）、第２型糖尿病（Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、妊娠性糖尿病（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅ）に分類される。
【０００３】
特に、本発明と関連がある第２型糖尿病は、大韓民国糖尿患者のほとんどを占めるが、主として小児において発病する第１型糖尿病とは異なり、主として成人において発病するが、適切な機能が行える十分な量のインスリンが体内において分泌されないか、あるいは、細胞がインスリンに反応しないインスリン抵抗性によって発病する。
【０００４】
体重の減量、健康食の摂取、十分な運動、持続的な血糖数値のチェックを行うことで糖尿の病症を調節することができるとはいえ、この疾患は進行性疾病であるため、初期には薬で調節可能であるが、次第に症状が悪化して、結局、インスリン注射を投与されることを余儀なくされる。過体重者および肥満者の場合、体内から心血管系／代謝系を不安定にする虞がある化学物質が分泌されるため、正常体重者に比べて、第２型糖尿病に進行するリスクがはるかに高いことが知られている。第２型糖尿病が発病するリスクは、加齢につれて高くなるといえるが、これは、体重が増え、かつ、物理的な運動量が減るためであると思われる。
【０００５】
従来の糖尿治療剤としては、大きく、インスリン製剤、スルホンウレア系薬物、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）系薬物、ビグアニド系薬物、α−グルコシダーゼ阻害剤、メグリチニド系、インクレチン・ミメティクス（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤などに分けられる。糖尿の診断後に、運動、食事療法を用いた治療に失敗する場合、糖尿の治療には、一般に、米国糖尿病学会（ＡＤＡ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のガイドラインを参考として、抗糖尿治療剤の単独または併用投与療法が利用されているが、１次的に選択される薬剤は、ビグアニド系のメトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）であり、２次および３次の薬剤は、スルホニルウレア系、グリニド系、チアゾリジンジオンおよびＤＰＰ４阻害剤などであり、次いで、ＧＬＰ−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）作用薬注射剤またはインスリン注射剤が用いられる。
【０００６】
ビグアニドに属するフェンホルミン（Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）とメトホルミンは、１９５７年から糖尿病治療剤として使われ始めた。しかしながら、フェンホルミンは、乳酸過多症の副作用を示して多くの国において使用が禁止され、メトホルミンは、現在、第２型糖尿病の治療剤として世界で最も多く使われている。メトホルミンは、血糖値を下げるが、低血糖症を引き起こさず、インスリンの分泌を促すこともない。しかも、メトホルミンは、体重に影響を及ぼさないか、あるいは、僅かな体重の減少効果を奏し、血漿の脂質にも良好な効果を奏する。メトホルミン療法の主な副作用は、消化器官において現われる。毎日２，５５０ｍｇのメトホルミンを服用した患者は、腹部不快感、腹部膨満感、金属性味などを経験する。
【０００７】
高脂血症治療であり、僅かな血糖降下作用を有するクロフィブラートから誘導されたＴＺＤｓ系薬物は、糖尿病治療剤であって、血糖降下作用と僅かな高脂血症治療効果を有している。ＴＺＤｓは、インスリン抵抗性を減少させ、インスリンによる血糖の消費を増加させ、筋肉と脂肪における血糖の利用率の増加および肝臓における血糖の生成の抑制を介して血糖値を調節する。ＴＺＤｓは、脂肪細胞の分化と脂タンパクの代謝に関与する遺伝子を総体に調節する遺伝子であるＰＰＡＲγのリガンドであって、ＴＺＤｓがＰＰＡＲγを活性化させると、脂肪細胞の分化が起こり、脂肪細胞における血糖の利用性とインスリン抵抗性が改善される。ＰＰＡＲγは、筋肉細胞に極少量発現され、肝細胞には発現されないため、ＴＺＤｓが筋肉におけるインスリン抵抗性を改善することは、脂肪細胞における作用による間接的な効果であると知られている。ＴＺＤｓ系薬物の主な副作用は、体重の増加と浮腫などである。
【０００８】
α−グルコシダーゼ抑制剤（ＡＧＩｓ）は、吸収されて体内において作用しない薬物であって、第２型糖尿病の病理学的な欠陥を改善する薬物ではない。α−グルコシダーゼは、小腸の刷子縁（ｂｒｕｓｈ  ｂｏｒｄｅｒ）に存在し、澱粉、デキストリン、マルトースなどの炭水化物を吸収可能な単糖類に分解させるときに必要な酵素である。この酵素の抑制剤は、消化された炭水化物の吸収を防ぐことはできず、消化された炭水化物の吸収を遅らせて、食後に血糖とインスリンの濃度が急激に上昇しないようにする。第２型糖尿病患者では、食物の摂取後に上昇した血糖に対応する適切な量のインスリンが分泌されないか、あるいは、徐々に分泌される。小腸において糖の吸収を遅らせると、膵臓が適正量のインスリンを分泌可能になって、食後に血糖値が急激に上昇することを防ぐ。食後に血糖値が急激に上昇することは、心血管系の死亡率と密接な関係がある。ＡＧＩｓの副作用は、消化器系に主として現われるが、腹痛、屁（おなら）、下痢などである。このような副作用は、吸収されていない炭水化物が大腸を通過しながら生じる浸透圧による流体引き込み（ｆｌｕｉｄ  ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）に起因し、屁は、ＧＩフローラが炭水化物を代謝させて生成された気体相の産物のためである。
【０００９】
現在臨床で使われている従来の経口用の糖尿治療剤の場合、継続的な血糖の正常化の維持という肯定的な側面に加えて、長期にわたる服用の際に低血糖の誘発、下痢、腹部膨満感、体重の増加、乳酸血中、心臓の毒性、肝臓の毒性などの様々な副作用を引き起こすだけではなく、結局インスリンの分泌機能をする膵臓のベータ細胞が非可逆的に損傷／破壊され、インスリン抵抗性が生じるため、結局薬効が低下してインスリンを注射することを余儀なくされる状態となる。また、糖尿病治療剤として最も広く用いられているインスリンの場合、毎日２〜３回の皮下注射をしなければならないため、注射に対する不便さ／拒否感が大きく、これもまた、低血糖の誘発可能性が非常に高いという問題を抱えている。したがって、長期にわたって服用しても、膵臓のベータ細胞の保護機能を有しながらも、低血糖を誘発することなく血糖の数値を非常に有効に下げるとともに、体重の増加およびインスリン抵抗性を画期的に解決することのできる、より優れた効能を有し、しかも、安全性に富んだ薬物の開発が必要であり、かつ、患者の利便性を図るための長期継続型の糖尿病治療剤の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする技術的課題は、アディポネクチン受容体の解析に基づいて設計された作用薬ペプチドを提供することにより、糖尿病、特に、第２型糖尿病の治療剤が有する副作用を最小限にするとともに、従来の治療剤よりも優れた効能を有する治療剤を提供することである。
【００１１】
本発明が解決しようとする技術的課題は、以上において言及した技術的課題に制限されず、言及されていない他の技術的課題は、次の記載から本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって明らかに理解できる筈である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記技術的課題を達成するために、本発明の一様態によるペプチドは、
配列番号１（Ｘａａ１−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）を含み、
【００１３】
前記アミノ酸配列において、前記Ｘａａ１は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびこれらと同様の特性を有する非天然アミノ酸からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
【００１４】
前記Ｘａａ２は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびこれらと同様の特性を有する非天然アミノ酸からなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。
【００１５】
前記ペプチドは、
前記アミノ酸配列のＮ末端にＸ−Ｌ１のアミノ酸配列がさらに結合されてもよく、
前記Ｘは、
１〜１０個のアミノ酸と、
１〜２００ｋＤａの重さを有する直鎖状または分枝鎖状のポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）と、
脂肪親和性化合物と、
ペプチド・トランスダクション・ドメイン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と、からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
前記Ｌ１は、前記配列番号１のＮ末端と前記Ｘを連結する単一結合または連結環の役割を果たす化合物であってもよい。
【００１６】
前記ペプチドは、
前記アミノ酸配列のＣ末端にＬ２−Ｚのアミノ酸配列をさらに含み、
前記Ｚは、
１〜１０個のアミノ酸と、
１〜２００ｋＤａの重さを有する直鎖状または分枝鎖状のポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）と、
脂肪親和性化合物と、
ペプチド・トランスダクション・ドメイン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と、からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
前記Ｌ２は、前記配列番号１のＣ末端と前記Ｚを連結する単一結合または連結環の役割を果たす化合物であってもよい。
【００１７】
前記ペプチドは、アディポネクチン受容体の作用薬であってもよい。
【００１８】
前記ペプチドは、アディポネクチン受容体１との解離定数が２〜１６μＭであってもよい。
【００１９】
前記ペプチドは、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化させるのに０．８〜４μＭが必要であってもよい。
【００２０】
前記ペプチドは、
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号２）と、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号３）と、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号４）と、からなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。
【００２１】
本発明の他の様態による組成物は、前記ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００２２】
本発明のさらに他の様態による治療用の薬学的組成物は、前記ペプチドを有効成分とする、第２型糖尿病の予防または治療のためのものであってもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドは、リファレンスペプチドＡＤＰ３５５に比べて、ＡＤＩＰＯＲ１への親和性がさらに良好である。本発明の他の一実施形態によれば、アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドは、リファレンスペプチドＡＤＰ３５５に比べて、さらに有効にＡＭＰＫリン酸化を活性化させることができる。
【００２４】
本発明の効果は、前述した効果に何等限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載の発明の構成から推論可能なあらゆる効果を網羅するものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アディポネクチン受容体ＡＤＩＰＯＲ１に対する合成ペプチド（３−ラウンドにおいて３個のペプチド、４−ラウンドにおいて４個のペプチド）の表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）実験による解離定数値を示す表
【図２】表面プラズモン共鳴実験による３−ラウンドのペプチドの解離定数値を示すグラフ
【図３】表面プラズモン共鳴実験による４−ラウンドのペプチドの解離定数値を示すグラフ
【図４】３−１ペプチド、４−３ペプチドおよび４−４ペプチドのＡＭＰＫリン酸化活性度の測定のためのＨｅｐＧ２細胞株におけるウェスタンブロッティングの実験結果を示す説明図
【図５】３−１ペプチド、４−３ペプチドおよび４−４ペプチドのＡＭＰＫリン酸化活性度の測定のためのＣ２Ｃ１２細胞株におけるウェスタンブロッティングの実験結果を示す説明図
【図６】田辺弘明らが発表したＡＤＩＰＯＲ１のＸ線構造の解析結果を基に分子モデリング手法を用いたアディポネクチンの予想結合部位および結合モデルを示す説明図
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例について詳しく説明する。しかしながら、本発明は、種々の異なる形態に具体化可能であり、ここで説明する実施例に何等限定されない。
【００２７】
実施例１：ＡＤＩＰＯＲ１組み換えタンパク質の合成および分離精製
【００２８】
ＡＤＩＰＯＲ１タンパク質配列としては、ＡＤＩＰＯＲ１構造の解析に用いられたものと同様の、Ｎ末端８８個のアミノ酸が除去された配列を用い、このタンパク質配列を作成し得る遺伝子をコドン最適化によって合成した（ＩＤＴ）。このとき、円滑なクローニングと発現済みのタンパク質の精製のために、５’末端には、ＢａｍＨＩ制限酵素サイトと、ＦｌａｇタグおよびＴＥＶプロテアーゼ認識配列（ＥＮＬＹＦＱＧ）を挿入し、３’末端には、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを挿入した。確保された遺伝子は、バキュロウイルスの製作に必要なｐＦＡＳＴｂａｃ１ベクトルに入れてクローニングを行った。クローニングされたベクトルをＤＨ１０ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に注入して組み換えを介してＡＤＩＰＯＲ１遺伝子を含むＢａｃｍｉｄを確保した。バキュロウイルスを製作するために確保されたＢａｃｍｉｄを、トランスフェクション（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＳＦ９細胞（５×１０＾４細胞）にトランスフェクションさせ、５日後に培地に分泌されたバキュロウイルスを確保した。次いで、増幅過程を経て多量のバキュロウイルスを製作した。確保されたバキュロウイルスを１Ｌ  ＳＦＭ９００培地に培養されたＳＦ９  ｃｅｌｌ（５×１０＾６細胞／ｍｌ）に入れて感染させ、３日間２７℃の温度においてタンパク質を発現させた。組み換えＡＤＩＰＯＲ１を発現させるＳＦ９細胞は、遠心分離機によって確保し、確保された細胞ペレットは、−８０℃において一定量に小分けして保管し、必要に応じて、新鮮にタンパク質の精製に用いて、精製後の保管に伴うタンパク質の不活性化の可能性がある膜タンパク質の欠点を最小限に抑えた。細胞膜に発現された膜タンパク質であるＡＤＩＰＯＲ１を精製するために、ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（１％ＤＤＭ）を用いて溶解させ、溶解されたサンプルは、抗Ｆｌａｇ抗体ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と１時間かけて氷で反応させた。次いで、ｆｌａｇペプチドで抗Ｆｌａｇ抗体ビーズに結合されたＡＤＩＰＯＲ１を溶離した。このようにして１次的に精製されたＡＤＩＰＯＲ１をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｄｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単量体タンパク質のみを確保した。このサイズ排除クロマトグラフィーを用いた精製には、０．１％ＤＤＭ、０．００５％ＣＨＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液が用いられた。
【００２９】
実施例２：細胞の維持
【００３０】
Ｃ２Ｃ１２およびＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣから購入し、ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）培地に１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下のインキュベータで培養して用いた。
【００３１】
実施例３：Ｃ２Ｃ１２筋管の分化
【００３２】
Ｃ２Ｃ１２細胞を１２ウェルに接種した後、８０％以上の密集度を示すときにＰＢＳで一回水洗いした後、ＤＭＥＭに２．５％のウマ血清および１％のペニシリン／ストレプトマイシンが添加された分化培地に入れ替え、次いで、毎日新たな分化培地に培地を交換しながら５〜７日間分化した後に実験に供した。
【００３３】
実施例４：化合物の処理、サンプリングおよび免疫ブロット
【００３４】
アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）とアディポロン（Ａｄｉｐｏｒｏｎ）の場合、分化されたＣ２Ｃ１２に５〜１５分間処理したとき、ＡＤＰ３５５の場合、様々ながん細胞株において２４時間の絶食（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）後に１時間の修復を行った後、１５、３０、４５、６０分間にかけて処理したとき、３０分でその効果が極大化することが既に報告されているため、前記のような先行研究を基に、実験に供される細胞数を最適化させた後、ＨｅｐＧ２の場合、５時間の絶食後に修復を経て３０分間、Ｃ２Ｃ１２の場合は、２４時間の絶食後に１０分間ペプチドの処理を行った。処理済みの細胞のサンプルは、冷たいＰＢＳで一回水洗いした後、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤が添加されたＲｉＰＡ緩衝液を添加して１５分間溶解を行った。１５分後、１４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行ってタンパク質のみを回収し、定量後に４Ｘサンプル緩衝液および２−ＭＥを添加し、ウェスタンブロッティング用のサンプルを製造した。ウェスタンブロッティングは、通常のウェスタンブロッティング実験手法を用い、ＡＭＰＫ、ｐ−ＡＭＰＫ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＡＣＣ、ＧＡＰＤＨの抗体を種類に応じて１：１０００または１：２０００に希釈して行い、ＬＡＳ−４０００装備を用いてイメージ化させた。
【００３５】
試験例１：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた結合ペプチドの探索および結合力の測定
【００３６】
ペプチドとＡＤＩＰＯＲ１との間の結合力を解析するために精製した組み換えＡＤＩＰＯＲ１（Δ８８）をＣＭ５チップにアミン結合によって３０００ＲＵ以上で付着した。ペプチドは、泳動用緩衝液（０．１％ＤＤＭ、０．００５％ＣＨＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４）で希釈して様々な濃度でＳＰＲ装備に注入して結合力を解析した。このとき、アフィニティー解析法（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｉｔｔｉｎｇ）若しくはキネティクス解析法（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を用いて親和性の値を計算した。ペプチドの溶解度の解析のために、ＤＭＳＯでプチドストックを作成した後、適切な緩衝液に希釈させ、未溶解の沈殿物を除去し、ペプチドの濃度を各ペプチドの消散係数（ｅｘｔｉｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）の値とＡ２８０吸光度の値を測定して計算した。
【００３７】
合計で４つのラウンド別に合成されたペプチドの親和性を確認し、特に、３−ラウンドおよび４−ラウンドのペプチドの親和性は、それぞれ図２および図３に示す。
図２の詳細な説明は、次の通りである。
３−１ペプチド：ｃｙａｎ：１００μＭ、ｐｉｎｋ：２５ｕＭ、ｂｌｕｅ：１０ｕＭ、ｇｒｅｅｎ：５ｕＭ、ｏｒａｎｇｅ：２．５ｕＭ
残りのペプチド：ｙｅｌｌｏｗ：５０ｕＭ、：２５ｕＭ、ｐｉｎｋ：１０ｕＭ、ｂｌｕｅ：２．５ｕＭ、ｇｒｅｅｎ：１ｕＭ、ｒｅｄ：０．５ｕＭ
図２において、３−１の場合、３−１の場合、Ｋｄの値（∽１６ｕＭ）のように設計された他のペプチドよりも高いため、比較的に高い親和性を示す。
図３の詳細な説明は、次の通りである。
ｙｅｌｌｏｗ：５０ｕＭ、ｃｙａｎ：２５ｕＭ、ｐｉｎｋ：１２．５ｕＭ、ｂｌｕｅ：６．２５ｕＭ、ｇｒｅｅｎ：３．１２ｕＭ、ｏｒａｎｇｅ：１．５６ｕＭ
図３において、４−３、４−４番のペプチドにおいて、それぞれ６〜１０ｕＭと２〜４．３ｕＭのＫｄ値が測定された。
【００３８】
試験例２：ＨｅｐＧ２細胞株における薬効の評価
【００３９】
実験の前日に、ＨｅｐＧ２細胞株を１２ウェルプレートに８＊１０＾５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で分注した後、一晩中培養した後、当日に無血清培地で５時間絶食させた後、ＤＭＳＯ  ０．４％（ＭＯＣＫ）、アディポネクチン１０μｇ／ｍｌとともにリファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドを２０ｕＭ、４ｕＭ、０．８ｕＭの濃度で３０分間処理した後、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解させ、サンプルを作成して９５℃において１０分間沸騰した後、１２ｕｇをローディングしてウェスタンブロッティングを行った。
前記のようなウェスタンブロッティングの結果を図４に示し、各図の詳細な説明は、次の通りである。
Ａ．リファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドの濃度別のウェスタンブロッティング結果
Ｂ．リファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドのｐＡＭＰＫに対する相対的な濃度
Ｃ．リファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドのｐＡＣＣに対する相対的な濃度
【００４０】
図４は、ＨｅｐＧ２細胞株におけるリファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドのＡＭＰＫリン酸化活性度を示している。
【００４１】
試験例３：Ｃ２Ｃ１２筋管の分化およびＣ２Ｃ１２細胞株における薬効の評価
【００４２】
Ｃ２Ｃ１２細胞を１２ウェルに接種した後、８０％以上の密集度を示すときにＰＢＳで一回水洗いした後、ＤＭＥＭに２．５％のウマ血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加された分化培地に入れ替え、その後、毎日新たな分化培地に培地を交換しながら５〜７日間分化した後に実験に供した。
【００４３】
８＊１０＾５個のＣ２Ｃ１２細胞株を１２ウェルプレートに分注し、前記のような方法を用いて筋管で分化を誘導した後、ＤＭＳＯ  ０．４％（ＭＯＣＫ）、アディポネクチン１０ｕｇおよびリファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドを２０ｕＭ、４ｕＭ、０．８ｕＭの濃度で１０分間処理した後、ＨｅｐＧ２細胞株の方法と同様にしてウェスタンブロッティングを行った。
前記のようなウェスタンブロッティングの結果を図５に示し、各図の詳細な説明は、次の通りである。
Ａ．リファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドの濃度別のウェスタンブロッティング結果
Ｂ．リファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドのｐＡＭＰＫに対する相対的な濃度
Ｃ．リファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドのｐＡＣＣに対する相対的な濃度
【００４４】
図５は、Ｃ２Ｃ１２細胞株におけるリファレンスペプチドＡＤＰ３５５、３−１ペプチド、４−３ペプチド、４−４ペプチドのＡＭＰＫリン酸化活性度を示している。
【００４５】
前述した本発明の説明は、単なる例示のためのものであり、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態へと容易に変形できる。よって、前述した実施形態は、あらゆる面において例示的なものに過ぎず、限定的ではない。例えば、単一型であると説明されている各構成要素は、分散されて実施されてもよく、同様に、分散されていると説明されている構成要素も、組み合わせられた形態に実施されてもよい。
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態も本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
以下、添付図面を参照して本発明について説明する。しかしながら、本発明は、様々な異なる形態で実現され得るので、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。また、図面において、本発明を明確に説明するために説明に関係のない部分は省略し、明細書全体を通して類似の部分には類似の符号を付した。
【００４７】
明細書全体を通して、ある一部分が他の部分と「連結（接続、接触、結合）」されているという場合、それには「直接連結」されているものだけでなく、その間にさらに他の部材を介して「間接的に連結」されているものも含まれる。また、ある一部分がある構成要素を「含む」という場合、それは特に断らない限り他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに備えることを意味するものである。
【００４８】
本発明に用いられる用語は、単に特定の実施形態について説明するために用いられるものであり、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現には、文脈からみて明らかに他の意味を有さない限り、複数の言い回しを含む。本発明における「含む」、「有する」などの用語は、明細書に記載されている特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはそれらの組み合わせが存在することを示すものであり、１つまたはそれ以上の他の特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはそれらの組み合わせの存在または付加可能性を予め排除するものではない。
以下、添付図面を参照し、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００４９】
前記アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）は、脂肪細胞由来のポリペプチドであり、アディポネクチン受容体であるＡＤＩＰＯＲ１若しくは２に結合してＡＭＰＫ若しくはＰＰＡＲ−ａシグナルに関与する。肥満の場合、血中のアディポネクチン数値が低いことが知られており、これは、インスリン抵抗性を高めて第２型糖尿病を引き起こすことが知られている。脂肪組織において分泌された後、その他の器官において活性を有するタンパク質をアディポカインまたはアディポサイトカインと呼ぶが、アディポネクチンは、このようなアディポカインの一種である。アディポネクチンは、分泌量が減ると、脂肪の蓄積量が増えるという固有の特性とともに、血中の脂肪酸の濃度および肝と筋肉における中性脂肪数値を下げて、インスリン感受性を増やし、血管内皮細胞にＴＮＦ−ａ誘発単核細胞の癒着を低減させ、血小板を抑制して抗炎症と抗アテローム性効果を奏する。また、筋肉においては、ＡＣＣ（ ａｃｅｔｙｌ  CoA ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ）のリン酸化、脂肪酸の消費、血糖の摂取、並びに乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）の生成を刺激し、肝臓においては、ＡＣＣのリン酸化および糖新生の過程に含まれた分子を低減させることにより、血糖を下げる役割を果たす。
【００５０】
前記アディポネクチンは、三量体（ｔｒｉｍｅｒ）若しくは六量体（ｈｅｘａｍｅｒ）の形で血液内に存在して循環し、特に、前記アディポネクチンの球状ドメインは、ＡＤＩＰＯＲ１の結合部位を有しているドメインであることが知られており、主な結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）がアミノ酸１５３から１６２（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ；アディポネクチン活性領域）であることが知られている。
【００５１】
前記アディポネクチン受容体は、ＡＤＩＰＯＲ１とＡＤＩＰＯＲ２の２通りであることが判明しており、アディポネクチンが結合する主な受容体である。７膜貫通ドメインを有する受容体タンパク質として知られている。特に、ＡＤＩＰＯＲ１は、ＡＭＰＫシグナルを活性化させることが知られている。本発明の一実施形態によれば、前記アディポネクチン受容体は、ＡＤＩＰＯＲ１とＡＤＩＰＯＲ２であってもよく、好ましくは、ＡＤＩＰＯＲ１であってもよい。
【００５２】
前記作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）とは、ある生体作用物質の受容体に結合してその物質が有する作用と同様の（または、類似の）作用をする物質または薬剤、若しくは受容部位の活性を高める分子のことをいう。生体内において産生される内因性のものと、生体外から投与される外因性のものがある。部分作用薬は、受容体と結合しても１００％の薬理作用を発現せず、容量を増やしても効果は大きくならない。
【００５３】
前記ペプチドとは、二つ以上のアミノ酸がペプチド結合によって共有結合を形成する分子のことをいう。本発明の一実施形態によれば、前記ペプチドは、自然状態のペプチド、組み換えペプチドまたは合成ペプチドであってもよい。
【００５４】
前記アミノ酸とは、塩基性の性質を有するアミン（−ＮＨ２）と、酸性の性質を有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とが共存する特定の構造を有する分子のことをいい、タンパク質の構成要素である。一つのアミノ酸分子に結合されているアミノ基と、他のアミノ酸分子に結合されているカルボキシル基とが反応をすると、水と二つのアミノ酸によって構成された一つの新たな分子が形成される。新たな分子はジペプチドと呼び、反応結果として生じる結合をペプチド結合と呼ぶ。アミン基のある部分はＮ末端と呼び、カルボキシル基のある部分をＣ末端と呼ぶ。一つのタンパク質が形成されるためには、数多くのペプチド結合が形成されなければならない。自然には、２０個のアミノ酸が存在しており、その中の１２固である、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、およびチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）は、食べる食品を原料として我々の身体中で合成される。残りの８個であるイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｅ）、およびスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）は合成されない。
【００５５】
前記非天然アミノ酸とは、自然には存在しないアミノ酸のことをいい、人間によって合成または作成されたアミノ酸のことをいう。具体的には、ヨウ素化チロシン（ｉｏｄｉｎａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、メチル化チロシン（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、糖化セリン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ）、糖化スレオニン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、アゼチジン−２−カルボン酸（ａｚｅｔｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３，４−ジヒドロプロリン（３、４−ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ）、ペルチアプロリン（ｐｅｒｔｈｉａｐｒｏｌｉｎｅ）、カナバニン（ｃａｎａｖａｎｉｎｅ）、エチオニン（ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、セレノメチオニン（ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、アニモヘキサン酸（ａｎｉｍｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、テルルメチオニン（ｔｅｌｌｕｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、ホモアリルグリシン（ｈｏｍｏａｌｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、およびホモプロパルギルグリシン（ｈｏｍｏｐｒｏｐａｒｇｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）を含み、Ｄ−アミノ酸もまた非天然アミノ酸に含まれる。
【００５６】
前記同様の特性を有する非天然アミノ酸とは、天然アミノ酸と物理的、化学的若しくは機能的に類似の特徴を有している非天然アミノ酸のことをいい、天然アミノ酸に置き換えたとき、天然アミノ酸が有するのと類似または同様の効果を奏するものをいう。本発明の一実施形態によれば、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンと同様の特性とは、芳香族の特性を有するアミノ酸であってもよい。芳香族アミノ酸とは、アミノ酸側鎖に芳香環（ベンゼン環とその誘導体）を有するアミノ酸のことをいう。したがって、芳香族アミノ酸と同様若しくは類似の特性を有する非天然アミノ酸であってもよい。
【００５７】
前記ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）とは、エチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）の重合体のことをいう。本発明の一実施形態によれば、前記ポリエチレングリコールは、メトキシルＰＥＧマレイミド（ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）））、メトキシルＰＥＧ分岐されたマレイミド（ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ｆｏｒｋｅｄ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）））、メトキシルＰＥＧオルト−ピリジル二重硫黄化物（ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ｏｒｔｈｏ−ｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ））、ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ｖｉｎｙｌｓｕｌｐｈｏｎｅ）、若しくはメトキシルＰＥＧアルデヒド（ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ａｌｄｅｈｙｄｅ（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ））とオルト−ピリジル二重硫黄化−ＰＥＧ−ヒドラジド（ｏｒｔｈｏ−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ＰＥＧ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ））の組成物であってもよい。本発明の他の一実施形態によれば、前記ポリエチレングリコールは、５ｋ−ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）、２０ｋ−ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）、４０ｋ−ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）、５ｋ−ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ、10ｋ−ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ、２０ｋ−ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ、またはｍＰＥＧ３０  ｋＤ−ＡＬＤとＯＰＳＳ−ＰＥＧ２ｋ−ヒドラジドの組成物からなる群から選ばれてもよい。
【００５８】
前記脂肪親和性化合物とは、自然に存在する化合物であって、具体的には、飽和または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｉｋｅｔｏｎｅ）、テルペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）、ビタミン、カロテノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）、または合成化合物、具体的には、炭酸（ｃａｒｂｏｎ  ａｃｉｄ）、アルコール、アミン（ａｍｉｎｅ）、一つ以上のアルキル（ａｌｋｙｌ）、アリール（ａｒｙｌ）、アルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）、若しくは他の色々な不飽和化合物を有するスルホン酸であってもよい。
【００５９】
前記ペプチド・トランスダクション・ドメイン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）とは、細胞膜タンパク質を浸透して入り込むことのできるタンパク質のことをいい、他の化合物と結合されて生成された複合体に、該複合体が細胞膜内に入り込む能力を与えることができる。本発明の一実施形態によれば、前記ペプチド・トランスダクション・ドメインは、既知の膜透過特性を有するタンパク質であってもよい。
【００６０】
前記単一結合または連結環の役割を果たす化合物、すなわち、前記Ｌ１またはＬ２は、前記Ｘ若しくは前記Ｚと前記作用薬ペプチドのアミノ酸配列のＮまたはＣ末端との間に位置し、前記作用薬ペプチドの安定性を付加し得る化合物であって、具体的に、少なくとも二つの官能基であってもよい。好ましくは、前記Ｌ１またはＬ２は、二つおよび複数の官能基、例えば、アルキル基（ａｌｋｙｌ−）、アリール基（ａｒｙｌ−）、アラキル基（ａｒａｋｙｌ−）またはペプチド官能基であってもよい。
前記Ｘが前記作用薬ペプチドに入り込まなければ、Ｌ１もまた入り込まないということは、当業者にとって明らかである。
また、前記Ｚが前記作用薬ペプチドに入り込まなければ、Ｌ２もまた入り込まないということは、当業者にとって明らかである。
【００６１】
本発明の一実施形態によれば、前記アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドは、アディポネクチン受容体のＸ線構造の解析結果を基に、分子モデリング手法によって予測された結合モデルを構築して設計可能である。ここで、分子モデリング手法とは、分子メカニックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）という経験的力場を用いて色々な分子の３次元的な構造を求め、これからそれらの分子の物理的、化学的な性質を計算し、コンピューターグラフィックを用いて形状化させる手法のことをいう。実際の分子に最も近い３次元的な分子構造を得ることを狙っており、色々な方法を通じて（量子力学的な計算若しくはＸ線データベース検索など）最適な構造を得た後、この構造を用いて関心のある色々な物理的、化学的な性質を計算し、これを基に新たな分子の設計を可能にする役割を果たす。分子モデリングに関連するソフトウェアとしては、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．１（Ｂｉｏｖｉａ社製）とＭａｅｓｔｒｏ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）などが挙げられる。
【００６２】
具体的に述べると、ＡＤＩＰＯＲ１のＸ線構造における柔軟性が高く、アディポネクチンの結合およびこれによる活性化に大きな影響を与えないＡＤＩＰＯＲ１の３６４番以降のアミノ酸を除去して結合モデルを構築することができる（図６を参照）。構築された結合モデル上において、アディポネクチンのＴｙｒ１５８とＰｈｅ１６０は、ＡＤＩＰＯＲ１の疎水性ポケットに位置して結合することができる。ここで、疎水性ポケットとは、アディポネクチン受容体にリガンドタンパク質が結合する部位の一つであり、リガンドのアミノ酸がアディポネクチン受容体に疎水性結合をし得る部位のである。
【００６３】
図６を参照すると、図６のＡから、アディポネクチン結合ポケットを確認することができ、それぞれのポケットに対するアディポネクチン活性領域（図６のＢ）の結合モデルが図６のＣおよび図６のＤのように構築可能である。そして、予測結合部位−１への結合モデル（図６のＣ）から明らかなように、アディポネクチンのチロシン（Ｙ）とフェニルアラニン（Ｆ）の部分が疎水性ポケット（青いポケット）に入り込むことができ、各アミド結合の主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）とＡＤＩＰＯＲ１との間の水素結合は、赤い点線にて示される。予測結合−２への結合モデルも同様に、チロシン（Ｙ）とフェニルアラニン（Ｆ）の部分が疎水性ポケットに入り込み、さらなる水素結合をし得ることが確認できる。
【００６４】
前記構築された結合モデルに基づいて、前記アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドを設計することができ、かつ、既知のアディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドが利用可能である。本発明の一実施形態によれば、ＡＤＩＰＯＲ１の作用薬ペプチドであるアディポネクチンの活性領域、ＡＤＰ３５５（Ｈ−ＤＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｎｖａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＤＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＤＳｅｒ−ＮＨ２）、およびＡＤＰ３９９（Ｈ−ＤＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｎｖａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＤＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＤＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）２−Ｄａｂ−ＮＨ２）が利用可能である。
【００６５】
解離されていない分子と、解離によって生成した原子または原子団との間で質量作用の法則が成り立つとき、その平衡定数を解離定数と呼ぶ。前記解離定数は、受容体と各リガンドとの間の結合力または親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を測定する上で用いられる。前記解離定数は、本発明のアディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドと前記アディポネクチン受容体との親和性を測定する上で使用可能である。
【００６６】
図３および図４を参照すると、本発明において、前記作用薬ペプチドと、前記アディポネクチン受容体、特に、アディポネクチン受容体１（ＡＤＩＰＯＲ１）との間の解離定数を測定するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）実験を行った。まず、発現精製されたアディポネクチン受容体であるＡＤＩＰＯＲ１を固定化し、合計で４ラウンドにわたって候補ペプチドとの解離定数を測定した。図３は、３−ラウンドのペプチド候補に対する解離定数を測定した結果を示しており、特に、配列番号２のアミノ酸配列を有している３−１ペプチドの解離定数値が１６ｕＭ以下であって、Ｌａｓｚｌｏ  Ｏｔｖｏｓらが開発したＡＤＩＰＯＲ１の別の作用薬であると知られているリファレンスペプチドＡＤＰ３５５が有する１００ｕＭ以上の解離定数値に比べてさらに良好な親和性を示している。また、図４は、４−ラウンドにおいてペプチド候補に対する親和性を測定した結果を示しており、配列番号３のアミノ酸配列を有している４−３ペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有している４−４ペプチドの解離定数値がそれぞれ６〜１０ｕＭおよび２〜４．３ｕＭと測定されて、これもまた、リファレンスペプチドＡＤＰ３５５が有する１００ｕＭ以上の解離定数値比べてさらに良好な親和性を示している。
【００６７】
前記ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）とは、セリン／スレオニンキナーゼであって、脂質代謝と葡萄糖代謝の調節因子として知られており、糖尿と肥満において重要な調節作用をする。ＡＭＰＫは、細胞内のエネルギーの消耗時に増えるＡＭＰによって活性化してＡＴＰの使用を抑制し、異化作用（ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）を誘導して、エネルギー恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を保つのに核心的な役割を果たす。脂肪代謝の点からみて、ＡＭＰＫ活性化は、脂肪酸の合成を誘導する酵素であるＦＡＳ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）とＡＣＣ（ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を抑制し、コレステロールの生合成の制限酵素（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）であるＨＭＧ−ＣｏＡリダクテーゼを抑制するため、体内の脂質の生成の調節に影響を及ぼす。葡萄糖の生成過程には、ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓを抑制する作用をし、筋肉細胞のＧＬＵＴ４の量を増やして筋肉への葡萄糖の移動量を増やす作用をする。したがって、糖尿病患者においてＡＭＰＫ活性化を誘導すると、様々な治療機序を有することになる。
【００６８】
図４は、ＡＭＰＫに対するリン酸化の測定に関し、肝細胞株であるＨｅｐＧ２細胞株において前記配列番号２のアミノ酸配列を有している３−１ペプチド、前記配列番号３のアミノ酸配列を有している４−３ペプチドおよび前記配列番号４のアミノ酸配列を有している４−４ペプチドを対象としてウェスタンブロッティングを行った結果を示しているが、図４の実験結果を検討したところ、前記３−１ペプチドおよび前記４−３ペプチドは、最下の濃度である０．８ｕＭからＡＭＰＫをリン酸化させることが確認され、これは、２０ｕＭにおいて少量のリン酸化が確認されたＡＤＰ３５５に比べてその効能がはるかに高い。なお、前記３種類のペプチドがＡＭＰＫの下位タンパク質であるＡＣＣのリン酸化に及ぼす影響を調べてみたとき、前記３−１および前記４−３ペプチドが前記リファレンスペプチドＡＤＰ−３５５と比べて、同等のレベルにまたはさらに盛んにＡＣＣをリン酸化させることが観察された（図４のＡおよび図４のＣを参照）。
【００６９】
図５は、ＡＭＰＫに対するリン酸化の測定に関し、Ｃ２Ｃ１２細胞株において前記３−１ペプチド、前記４−３ペプチドおよび前記４−４ペプチドを対象としてウェスタンブロッティングを行った結果を示しているが、図５の結果から、前記３−１ペプチドは、０．８ｕＭの低い濃度でもＡＭＰＫをリン酸化させることが観察できたが、前記４−３ペプチドおよび４−４ペプチド、リファレンスペプチドＡＤＰ３５５の場合は、４ｕＭからリン酸化が確認された。この結果から明らかなように、前記３−１ペプチドの活性が最も卓越であった（図５のＡおよび５のＢを参照）。なお、ＡＭＰＫの下位タンパク質であるＡＣＣの場合は、前記４−４ペプチドの０．８ｕＭの条件を除くすべての条件下でリン酸化が増えることが確認された（図５のＡおよび５のＣを参照）。
【００７０】
本発明の他の様態による前記ポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドがリン酸と糖との間の共有結合によって他のヌクレオチドと連結されて鎖状に形成されたものをいい、その例としてＤＮＡ若しくはＲＮＡが挙げられる。ヌクレオチドは、核酸を構成する単位体であって、リン酸・糖・塩基からなる。ＤＮＡを構成する基本単位体をジオキシリボヌクレオチドと呼び、ＲＮＡの単位体をリボヌクレオチドと呼ぶ。ヌクレオチドの糖は、５個の炭素によって構成された単糖類であるが、２番の炭素の位に水酸基を有する場合にはリボース（ｒｉｂｏｓｅ）と呼び、酸素なしに水素のみがある場合にはデオキシリボース（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）と呼ぶ。リボースはＲＮＡの構成要素であり、デオキシリボースはＤＮＡの構成要素である。アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）がＤＮＡの塩基を構成し、ＲＮＡの塩基には、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）が用いられる。
【００７１】
本発明のさらに他の様態による前記薬学的組成物は、アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドを有効成分として含んでもよい。前記薬学的組成物には、前記アディポネクチン受容体に対する作用薬ペプチドの他にも、薬学的に許容される担体またはその他の添加剤などが種々に添加可能であるということは明らかであるため、これについての具体的な説明は省略する。
【００７２】
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態も本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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