(57)【要約】遺伝子型決定に対して十分に正確な融解曲線を得ながら、高速核酸融解分析を行う方法及びシステムが提供された。この迅速にＤＮＡを調べる能力は、ポイントオブケア分子検査等の結果までの時間が重要である場合にはいずれも有用となるはずである。具体的には、微小流体技術が、全体の融解曲線を取得するのに１秒未満を要する、最高で５０℃／秒の速度の融解分析によって遺伝子型決定することを可能とする。高速融解は、融解分析の時間を減少させ、エラーを減少させ、小さいアンプリコンの遺伝子型判別を改善する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸高速融解分析を行う方法であって、
１以上の核酸試料を有する微小流体デバイスを準備することと、
前記１以上の核酸試料と通信状態にある画像化システムを準備することと、
前記１以上の核酸試料と熱伝達状態にある熱システムを準備することと、
核酸解離を達成するため前記１以上の核酸試料の温度を、１℃／秒〜５０℃／秒の範囲から選択される上昇速度で前記熱システムによって上昇させることと、
核酸解離中に前記１以上の核酸試料の画像を取得して、各核酸試料に対して融解プロファイルを生成することと、
前記融解プロファイルに基づいて前記核酸を遺伝子型決定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記微小流体デバイスが、微小流体カートリッジ及び反応チップを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応チップが１以上のマイクロチャネルを備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１以上の試料が前記反応チップの前記１以上のマイクロチャネルに存在する場合に、前記融解分析が行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸融解分析が、１℃／秒〜８℃／秒の範囲から選択される速度で前記１以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸融解分析が、８℃／秒〜１６℃／秒の範囲から選択される速度で前記１以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１以上の核酸がそれぞれ１００ｂｐ長未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微小流体デバイスが、前記核酸融解分析を行う前に準備される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記１以上の核酸の増幅が、前記核酸融解分析に先行する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１以上の核酸試料がそれぞれ、前記核酸の融解温度よりも実質的に高い融解温度を有する少なくとも１つの内部温度コントロール配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子型が、使用されている前記融解速度に対してクラス間とクラス内の距離の閾値の比として計算される判別値を使用することによって分類され、前記クラス間距離が遺伝子型間の違いを反映し、前記クラス内距離が同じ遺伝子型の複製物間の違いを反映する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の上昇速度で前記１以上の核酸試料について融解曲線を連続して得て、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な上昇速度を決定することを更に含み、前記遺伝子型判別が０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の上昇速度に対して計算される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
使用される前記上昇速度がクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それがノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
６より大きいホモ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
５より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
核酸高速融解分析を行うシステムであって、
１以上の核酸試料を有する微小流体デバイスと、
前記１以上の核酸試料と熱伝達状態にある熱システムであって、前記１以上の核酸試料の温度が、核酸解離を達成するため、１℃／秒〜５０℃／秒の範囲から選択される速度で前記熱システムによって上昇される、熱システムと、
前記１以上の核酸試料と通信状態にある画像化システムであって、前記画像化システムが、各核酸試料に対して融解プロファイルを生成するとともに、前記融解プロファイルに基づいて核酸の遺伝子型決定をするため、核酸解離中に前記１以上の核酸試料の画像を取得する、画像化システムと、
を備える、システム。
【請求項１７】
前記微小流体デバイスが、微小流体カートリッジ及び反応チップを備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記反応チップが１以上のマイクロチャネルを備える、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記１以上の試料が前記反応チップの前記１以上のマイクロチャネルに存在する場合に、前記融解分析が行われる、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記核酸融解分析が、１℃／秒〜８℃／秒の範囲から選択される速度で前記１以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記核酸融解分析が、８℃／秒〜１６℃／秒の範囲から選択される速度で前記１以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記１以上の核酸がそれぞれ１００ｂｐ長未満である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２３】
前記微小流体デバイスが、前記核酸融解分析を行う前に準備される、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２４】
前記１以上の核酸の増幅が、前記核酸融解分析に先行する、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１以上の核酸試料がそれぞれ、前記核酸の融解温度よりも実質的に高い融解温度を有する少なくとも１つの内部温度コントロール配列を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２６】
遺伝子型が、使用されている融解速度に対するクラス間及びクラス内の距離の閾値として計算される判別値を使用することによって分類され、前記クラス間距離が遺伝子型間の違いを反映し、前記クラス内距離が同じ遺伝子型の複製物間の違いを反映する、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記融解プロファイルが、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な上昇速度を決定するため、０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の上昇速度で前記１以上の核酸試料について連続して得られ、前記遺伝子型判別が０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の上昇速度に対して計算される、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２８】
前記最適な上昇速度がクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それがノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２９】
６より大きいホモ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
５より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別値を得ることを更に含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３１】
核酸高速融解分析を行う方法であって、
１以上の核酸試料を有する微小流体デバイスを準備することと、
前記１以上の核酸試料と通信状態にある画像化システムを準備することと、
前記１以上の核酸試料の温度を上昇させて核酸変性を達成するための前記１以上の核酸試料と熱伝達状態にある熱システムを準備することと、
複数の融解速度において前記１以上の核酸試料について複数の融解曲線を連続して得ることと、
各融解速度に対して、クラス間対クラス内の距離の比として前記複数の融解曲線に対して遺伝子型判別を計算することと、
なお、前記クラス間距離が異なる遺伝子型を有する融解曲線間の違いを反映し、前記クラス内距離が同じ遺伝子型の融解曲線間の違いを反映する；
前記遺伝子型判別を最大化する最適な融解速度を同定することと、
を含む、方法。
【請求項３２】
遺伝子型が、使用されている融解速度に対してクラス間及びクラス内の距離の閾値を使用することによって分類される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記融解曲線が、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な融解速度を決定するため、０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の融解速度で前記１以上の核酸試料について連続して得られ、前記遺伝子型判別が０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の融解速度に対して計算される、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記最適な融解速度がクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それがノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
６より大きいホモ接合体遺伝子型判別を得ることを更に含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
５より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別を得ることを更に含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３６８，４３５号、２０１７年５月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５０３，５５０号及び２０１７年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３０，４８１号の優先権を主張し、それらの特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物に対する高速ＤＮＡ融解分析に関する。融解分析は、ＤＮＡ融解中に正確で迅速な温度調節を可能とする微小流体デバイスで行われる。
【背景技術】
【０００３】
微小流体技術は、より速いターンアラウンドタイム、並びにそれほど高価ではない細胞及び分子のアッセイを許容する、迅速な試料の処理及び流体の正確な制御を可能とする。例えば、微小流体デバイスでは、希少な循環腫瘍細胞が濃縮され、操作され、分析され得る。
【０００４】
ＤＮＡは室温で二本鎖であるが、温度が上昇されるにつれて一本鎖へとばらばらに分離される。ＤＮＡが二本鎖である場合にのみ蛍光を発する蛍光色素を添加することにより、リアルタイムで温度が上昇しているときに、ＤＮＡの解離又は変性とも称されるＤＮＡの融解を見ることができる。ＰＣＲ産物の遺伝子型決定、変異体スキャニング、配列同一性、メチル化及びコピー数の分析に対する一般的な方法である高分解能ＤＮＡ融解分析は、現在、ほとんど全ての市販のリアルタイムＰＣＲ測定器に組み込まれている。ＧＣの含量、分布及び配列は、単一の塩基の遺伝子型決定及び配列変異体に対するスキャンに使用され得るＤＮＡ融解プロファイルを決定する。ＤＮＡ融解プロファイルは、試料温度Ｔに応じた蛍光Ｆを表す曲線、又は温度Ｔに応じた蛍光曲線のマイナスの微分−ｄ（Ｆ）／ｄＴを表す曲線である。
【０００５】
微小流体デバイスの処理能力は、大規模並列配列決定、又はデジタルＰＣＲ等において、並列反応の数を増加させることにより高められる場合がある。また、処理能力は、ターンアラウンドタイムを短くすることにより高められ得て、速度はポイントオブケア診断において特に重要である。以前は、測定器は、遺伝子型決定及び他の適用に対して、正確にＤＮＡを融解（変性）するため何時間も要した。ＤＮＡ融解分析は、０．０１℃／秒以下の速度で歴史的に行われており、融解曲線を収集するのに何時間も要していた。その後、蛍光融解分析は、はるかに速い速度でＰＣＲ産物を分析する方法として導入されたが、まだ１℃／秒未満であった。高分解能融解を要求する現在のリアルタイムＰＣＲ測定器は、推奨される融解速度が異なる。０．００５℃／秒〜約０．１℃／秒の速度は、融解曲線を取得するのに５分間〜９５分間を要する、現在利用可能な測定器に標準的のようである（非特許文献１）。核酸融解分析を迅速化する最近の試みは、融解が０．５℃／秒で行われ、合計１２．５分間で完了するＰＣＲ及び高速融解をもたらした（非特許文献２）。
【０００６】
以前に幾つかの適用に対して、より速い融解速度が実施された。ヒーター上の単層マイクロビーズにアニールされた対立遺伝子特異的プローブは、１℃／秒での遺伝子型決定を可能とした（非特許文献３）。人工テンプレートにアニールされた分子ビーコンを用いた、７秒未満の遺伝子型決定が報告された（非特許文献４）。しかしながら、これらの研究はいずれも、高分解能ではないか、又は高分解能熱融解に使用される遺伝子型決定に対して極めて重要なヘテロ二本鎖検出を調査していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Li et al., "Genotyping accuracy of high-resolution DNA melting instruments," Clin Chem 2014;60:864-72
【非特許文献２】Sundberg et al., Clin Chem. 2014 Oct; 60(10):1306-13
【非特許文献３】Russom et al., "Rapid Melting Curve Analysis on Monolayered Beads for High-Throughput Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms," Anal. Chem., 2006, 78 (7), pp 2220-2225
【非特許文献４】Ahberg et al., "Single fluorescence channel-based multiplex detection of avian influenza virus by quantitative PCR with intercalating dye," Sci Rep 2015;5:11479
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、数分から数時間ではなく、数秒のうちにＤＮＡ融解分析を行うことによって、遺伝子型決定に十分正確な融解曲線を得る方法及びシステムが必要とされている。このＤＮＡを迅速に調べる能力は、ポイントオブケア分子検査等において、結果までの時間が重要である場合にはいずれも有用となるはずである。さらに、遺伝子型決定に対する融解速度の効果を判断することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様では、核酸高速融解分析を行う方法及びシステムが提供される。具体的には、１以上の核酸試料が微小流体デバイスに導入される。１以上の核酸試料は、画像化システムと光通信状態にあり、また熱システムと熱伝達状態にある。１以上の核酸試料の温度は、核酸解離を達成するため、１℃／秒〜５０℃／秒の範囲から選択される上昇速度で熱システムによって上昇される。１以上の核酸試料の画像を、融解（解離）プロファイルを生成するため、核酸融解（解離）中に取得する。最後に、融解プロファイルに基づいて核酸の遺伝子型決定を行う。
【００１０】
一実施の形態では、微小流体デバイスは、微小流体カートリッジ及び反応チップを備える。更に別の実施の形態では、反応チップは１以上のマイクロチャネルを備える。本発明の更なる実施の形態では、１以上の試料が反応チップの１以上のマイクロチャネルにある場合、融解分析が行われる。
【００１１】
本発明の別の実施の形態によれば、１以上の核酸の増幅が核酸融解分析に先行する。幾つかの実施の形態では核酸融解分析は、１℃／秒〜８℃／秒又は８℃／秒〜１６℃／秒の範囲から選択される速度で１以上の核酸試料の温度を上昇させることによって行われる。
【００１２】
更に別の実施の形態では、微小流体デバイスは、核酸融解分析を行う前に準備される。更なる実施の形態では、１以上の核酸試料はそれぞれ、核酸の融解温度よりも実質的に高い融解温度を有する少なくとも１つの内部温度コントロール配列を含む。
【００１３】
一実施の形態では、遺伝子型決定は、使用されている融解速度に対するクラス間及びクラス内の距離の閾値の比を使用して分類された。具体的には、融解曲線は、最適な上昇速度を決定するため、０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の上昇速度で１以上の核酸試料について連続して得られた。最適な上昇速度は最も高い遺伝子型判別値に対応し、遺伝子型判別は０．１３℃／秒〜３２℃／秒の間の複数の上昇速度のそれぞれに対して計算される。使用される上昇速度はクラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それはノーコール（no-call）試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する。一実施の形態では、５より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別値が得られる。更に別の実施の形態では、６より大きいヘテロ接合体遺伝子型判別値が得られる。
【００１４】
本発明の更に別の態様では、核酸高速融解分析を行う方法が提供される。具体的には、１以上の核酸試料が微小流体デバイスに導入される。１以上の核酸試料は、画像化システムと光通信状態にあり、熱システムと熱伝達状態にある。熱システムは、核酸融解（変性）を達成するため、１以上の核酸試料の温度を上昇させる。次に、複数の融解速度で１以上の核酸試料について複数の融解曲線を連続して得る。クラス間対クラス内の距離の比として各融解速度の複数の融解曲線に対し、遺伝子型判別を計算する。クラス間距離は異なる遺伝子型を有する融解曲線間の差を反映し、クラス内距離は同じ遺伝子型の融解曲線間の差を反映する。最後に、遺伝子型判別を最大化する最適な融解速度が同定される。
【００１５】
本特許ファイル又は出願ファイルはカラー仕上げの少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数の場合もある）を伴うこの特許又は特許出願公開のコピーは、要請に基づき、必要な手数料を支払うことにより、特許商標庁から提供される。
【００１６】
本明細書に組み込まれ、明細書の一部をなす添付の図面は、本開示の主題に関する種々の実施形態を示す。図面において、同じ参照符号は、同一の、又は機能的に類似の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、高速融解を行うため使用される、本発明によるプライミングステーション（Ａ）及び測定器（Ｂ）を明示する図である。
【図２】本発明の一実施形態による微小流体カートリッジを示す図である。
【図３】一実施形態に従って、微小流体チップを使用するための微小流体反応システムの機能ブロック図である。
【図４】図４Ａ〜図４Ｅは、それぞれ１℃／秒、５℃／秒、１０℃／秒、１５℃／秒及び２０℃／秒の速度（上昇速度）で試料温度を継続的に上昇させることによって融解された因子２のＤＮＡ試料に対する融解曲線のマイナスの微分を明示する図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｅは、それぞれ２０℃／秒、１５℃／秒、１０℃／秒、５℃／秒及び１℃／秒の速度で試料温度を継続的に上昇させることによって融解された因子２のＤＮＡに対する融解曲線を明示する図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、２０℃／秒の速度で試料温度を継続的に上昇させることによって融解された因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡに対する融解曲線を明示する図である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、５０℃／秒の速度で試料温度を継続的に上昇させることによって融解された因子２及び因子５のＤＮＡに対する融解曲線を明示する図である。
【図８】図８Ａ〜図８Ｄは、５０℃／秒の速度で試料温度を継続的に上昇させることによって融解されたＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡに対する融解曲線を明示する図である。
【図９】上昇速度に応じて因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８の野生型ＤＮＡの検出された融解温度を明示する図であり、上昇速度は０．０１℃／秒〜５０℃／秒の範囲である。
【図１０】因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８の野生型ＤＮＡの融解温度を対数目盛で明示する図であり、上昇速度は０．０１℃／秒〜２０℃／秒の範囲である。
【図１１】上昇速度に応じて因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８の野生型ＤＮＡの融解温度を明示する図であり、上昇速度は０．０１℃／秒〜６０℃／秒の範囲である。
【図１２】因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８の野生型ＤＮＡの融解温度を対数目盛で明示する図であり、上昇速度は０．０１℃／秒〜６０℃／秒の範囲である。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｉは、ＭＴＨＦＲ  １２８６の単一ヌクレオチド変異体を包含する４６ｂｐのＰＣＲ産物の融解曲線に対する融解速度の効果を明示する図である。
【図１４】０．１３℃／秒、８℃／秒及び３２℃／秒の融解速度で調べた４種類の単一ヌクレオチド変異体（因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６６５、ＭＴＨＦＲ  １２８６）の融解曲線を明示する図である。
【図１５】遺伝子型判別の融解速度依存を明示する図である。
【図１６】異なる融解速度に対する手作業による遺伝子型決定の精度を示すヒストグラムである。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｃは、融解曲線に対する融解速度及びデータ密度の効果を明示する図である。全ての融解データは、ハードウェアによってサポートされる最大頻度である、１秒当たり３０点で取得された。
【図１８】融解速度に応じてゲノム及び合成ＤＮＡに対して正規化された蛍光の差を明示する図である。
【図１９】図１９Ａ及び図１９Ｂは、ヘテロ接合（パネルＡ）及びホモ接合（パネルＢ）に対する融解速度の加速及び減速に応じて遺伝子型判別を明示する図である。
【図２０】図２０Ａは、ＭＴＨＦＲ  ６６５、因子２、因子５及びＭＴＨＦＲ  １２８６のそれぞれに対して、融解速度に応じて野生型遺伝子型の融解温度（Ｔｍ）を明示する図である。図２０Ｂは、ＭＴＨＦＲ  ６６５、因子２、因子５及びＭＴＨＦＲ  １２８６のそれぞれに対して、融解速度に応じて図２０Ａの各Ｔｍと１℃／秒でのＴｍの間の差を明示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は幾つかの実施形態を有し、当該技術分野において既知の細部に関しては特許、特許出願及び他の参考文献に頼る。それゆえ、本明細書において或る特許、特許出願又は他の参考文献が引用されるか、又は繰り返されるとき、その特許、特許出願又は他の参考文献は、あらゆる目的のために、そして説明される提案のために、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすことを理解されたい。
【００１９】
一連のＰＣＲ及び融解分析に対する微小流体プラットフォームを使用することにより、それぞれ単一ヌクレオチド変異体を含む４つの標的（ＭＴＨＦＲ  ６６５、因子２、因子５及びＭＴＨＦＲ  １２８６）を増幅し、次いで０．１３℃／秒〜３２℃／秒の範囲に亘る種々の速度で融解した。因子２遺伝子（Ｆ２、ＦＩＩ、因子ＩＩ、Ｆ２  ｃ．＊９７、Ｆ２  ｃ．＊９７Ｇ＞Ａ、ｒｓ１７９９９６３としても知られる）は、プロトロンビン（凝固因子ＩＩとも称される）と称されるタンパク質を作製する指示を提供する。凝固因子は、正常な血液凝固にとって不可欠な関連タンパク質群である。ヒト因子５遺伝子中の突然変異（Ｆ５、ＦＶ、因子Ｖ、Ｆ５  ｃ．１６０１、Ｆ５  ｃ．＊１６０１Ｇ＞Ａ、ｒｓ６０２５としても知られる）は、血液凝固の増加（凝固性亢進）を引き起こす。ＭＴＨＦＲ  ６６５（ＭＴＨＦＲ  ｃ．６６５Ｃ＞Ｔ、ＭＴＨＦＲ  ｃ．６７７Ｃ＞Ｔ、ｒｓ１８０１１３３としても知られる）及びＭＴＨＦＲ  １２８６（ＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６Ａ＞Ｃ、ＭＴＨＦＲ  ｃ．１２９８Ａ＞Ｃ、ｒｓ１８０１１３１としても知られる）の遺伝子は、ＭＴＨＦＲ酵素を作製する指示を提供する。言い換えれば、ＭＴＨＦＲの遺伝子は、ＭＴＨＦＲ酵素の産生を「誘発する」。したがって、ＭＴＨＦＲ遺伝子中の突然変異は、酵素機能に影響を及ぼす可能性がある。
【００２０】
一実施形態では、バックグラウンド除去、正規化、及びマイナスの微分プロットへの変換の後、目視検査によって遺伝子型を手作業で決定した。更に別の実施形態では、自動化された遺伝子型決定を使用した。測定基準として曲線間の最大の垂直方向の差の絶対値を使用して、遺伝子型間及び遺伝子型内の違いに基づき、遺伝子型判別比によって、遺伝子型間の差を定量した。融解温度によって異なるホモ接合曲線の遺伝子型決定をし、ヘテロ接合曲線を形状によって同定した。
【００２１】
図１Ａ及び図１Ｂは、高速融解を行うために使用されるプライミングステーション１００及び測定器１０４を明示する。図１Ａのプライミングステーション１００はインターフェースガスケット１０６、及びそこに挿入される微小流体カートリッジ１０２を備える。本発明の一実施形態による微小流体カートリッジを図２に明示する。カートリッジ（インターフェースチップ）１０２は、１以上の微小流体チャネル２０８及び廃棄ウェル２１２に接続された１以上のアクセスチューブ（例えば、毛細管又は他のチューブ）又はウェル２０６を備える。反応チップ２０４は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び熱融解等の化学反応を実行し得る。反応チップ２０４は、熱ゾーン２１８を提供するヒーター２２０との熱伝達状態にある１以上の微小流体チャネル２１０を備えてもよい。
【００２２】
一実施形態では、図１Ａのプライミングステーションは寸法（３１ｃｍ×１８ｃｍ×１０ｃｍ）を有する。図１Ａのプライミングステーション１００は、図１Ｂの測定器（遺伝子アナライザシステム）１０４に対してカートリッジ１０２を準備するための単純なユーザーワークフローを提供する。プライミングステーションの中心コンポーネントは弁、ガスケット及び真空ポンプを含む（図示せず）。非限定的な一実施形態では、カートリッジ１０２の微小流体チャネル２０８（図２）を、プライミングプロセス中に脱気した脱イオン水で満たした。具体的には、毛細管シッパーを含むカートリッジウェル２０６（図２）に脱イオン水を充填し、カートリッジ１０２をプライミングステーション１００に置いた。プライミングステーションの電源を入れ、蓋１１０を閉じて、掛け金を掛けた。一旦、蓋１１０を閉じると、ガスケット１０６は、カートリッジ１０２のシッパー、ベント及び廃棄ウェルを密封した。プライミングステーションは、真空ポンプを初期化し、カートリッジ１０２の存在を確認した。プライミングステーションによって表示された場合、脱イオン水をリザーバにピペットで移した。カートリッジ１０２を準備するため「実行」ボタンを押した場合、真空ポンプは、シッパーウェル２０６（図２）に対して陰圧を印加し、脱イオン水を脱気した。数分後、異なる圧力を使用し、反応チップ２０４のマイクロチャネル２１０（図２）を水で満たして、シッパーウェル２０６（図２）からベント２１４及び廃棄ウェル２１２（図２）へと水を引いた。プライミングが完了すると、蓋１０６を開け、カートリッジ１０２をプライミングステーション１００から取り出した。プライミングプロセスを完了するため、カートリッジ１０２のシッパーウェル２０６（図２）から手作業で水を取り除いた。一実施形態では、プライミングプロセスは約１０分かかった。本発明の一実施形態によるプライミングステーションは、参照することにより本明細書の一部をなす、２０１７年７月１０日付で出願されたMullに対する米国特許出願第１５／６４４，９８６号に詳しく記載される。
【００２３】
図１Ｂの測定器（遺伝子アナライザ）１０４は、開いた消耗品引き出し１１２及び挿入された消耗品を備える。消耗品は、引き出し内に位置するカートリッジ１０２及び３８４ウェルマイクロタイタープレート１１４を含む。一実施の形態では、測定器１０４は寸法（７９ｃｍ×７９ｃｍ×７９ｃｍ）を有する。蠕動ポンプで制御されたトラッキング溶液の蛍光エッジを検出することによって、カートリッジの反応チップマイクロチャネルにおける流体運動を光学的にモニターした。しかしながら、ヘテロ接合遺伝子型決定は、小容量のチャネル形状によって損なわれ、少ないコピー数のため、野生型と突然変異体のＤＮＡ鎖の不均等な分布をもたらし、１つの対立遺伝子が、蛍光モニタリング領域内の他の対立遺伝子よりも増幅されることに結び付く。これを修正するため、トラッキング溶液エッジを、各動きの間、２０秒間に亘ってエッジを保持しながら、約０．９ｍｍの距離に亘ってＰＣＲ中に前後にシフトさせた。これにより、試料の対立遺伝子がＰＣＲの間、十分に混合されるようにした。最後の２回のＰＣＲサイクルに対して、前後運動を停止し、正常なエッジ制御を再開した。
【００２４】
ＰＣＲとトラッキング溶液のロボット（図示せず）の両方が、同時に機能するように、測定器１０４に提供された。一実施形態では、ＰＣＲ液体操作ロボットは、オンボードで自動化された混合を行う、液体充填システムであった。脱イオン水リザーバ、シリンジ、及び９方弁を使用して、８チャネルのＰＣＲロボットピペットシステムによって水を流した。具体的には、各実行を開始する前に、８つ全ての流体ライン（例として、限定せずに、９００μＬ）を通して脱イオン水を汲み出した。ＰＣＲロボットは、３８４ウェルマイクロタイタープレート１１４から自動的にテンプレート混合物（例として、限定せずに２μＬ）及びプライマー混合物（例として、限定せずに１μＬ）を吸引した。ＰＣＲ及びＨＳＭ分析用のカートリッジシッパー２０６（図２）に試薬を送達する前に、ピペットチップの末端にビーズ（例として、限定せずに３μＬ）を作り、次いでピペットチップへとビーズを吸引して戻し、このプロセスを合計８回繰り返すことによって２つの成分を共に混合した。
【００２５】
チャネル１及びチャネル８の外側の２つの微小流体ヒーターの追加によって８チャネル微小流体カートリッジの加熱均一性を達成した。追加の埋め込みヒーターは、より正確なＨＳＭのため外側チャネルに対する温度勾配を減少した。追加の埋め込みヒーターは、引用することにより本明細書の一部をなす、Coursey et al.に対する米国特許出願公開第２０１５／００６９０４５号に詳しく記載される。
【００２６】
非限定的な一実施形態では、引用することにより本明細書の一部をなす米国特許出願公開第２０１４／０２７２９２７号、同第２０１２／００５８５１９号及び同第２００９／００６０７９５号に記載される測定器１０４及びカートリッジ１０２を、核酸融解曲線を測定するために使用した。
【００２７】
非限定的な一実施形態では、測定器ソフトウェアは、リアルタイム組み込みＬｉｎｕｘ（登録商標）ベース機器上で実行する汎用プログラミング言語Ｃ＋＋でコードされた。Ｃ＋＋は、デバイスドライバ及びリアルタイムの制約のもとでハードウェアの直接操作に依拠する他のソフトウェアに書き込むために使用され得る。測定器ソフトウェアは、ヒーター、ロボティクス、ポンプ及び光学素子等のハードウェアコンポーネントのそれぞれを制御する。また、測定器ソフトウェアは、ＰＣＲ及びＨＳＭを実施してデータを収集するためにユーザ定義試験ワークフローを管理し、テスト実行中の任意のエラーを効果的に扱う。グラフィカルユーザインタフェースは、強化されたユーザ体験を提供するＷｉｎｄｏｗｓクライアントアプリケーションを構築するための次世代プレゼンテーションシステムのＷｉｎｄｏｗｓ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを使用してＣ＃及び拡張アプリケーションマークアップ言語（ＸＡＭＬ：extensible application markup language）で書かれたＷｉｎｄｏｗｓ系アプリケーションである。Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＰＣにグラフィカルユーザインタフェースをインストールして、伝送制御プロトコル及びインターネットプロトコル（ＴＣＰ／ＩＰ）を介して測定器と通信し、ワークフローを実行して状態をモニターするために使用した。
【００２８】
図３は、本発明の一実施形態による、微小流体システムの機能ブロック図である。幾つかの実施形態では、微小流体システム３００は準備ステージ３３８（例えば、ピペッターシステム）を含んでもよい。非限定的な一実施形態では、準備ステージ３３８は、１以上の試料溶液の作製に適切なデバイス（例えば、ＰＣＲロボット）、及び１以上のブランキング溶液の作製に適切なデバイス（例えば、ブランキングロボット）を備えてもよい。例えば、図２に図示されるように、準備ステージ３３８は、１以上の試料３４０及び１以上の試薬３４２を含んでもよく、試料３４０と１以上の試薬３４２とを混合することによって試料溶液を作製してもよい。幾つかの実施形態では、準備ステージ３３８からの流体は、カートリッジ１０２のアクセスチューブ又はウェル２０６によってカートリッジ１０２の微小流体チャネルへと進入し得る。カートリッジ１０２の微小流体チャネルからの流体は、反応チップ２０４のポートを介して反応チップ２０４の微小流体チャネルに進入し得る。反応チップ２０４の熱ゾーン２１８では、反応チップ１０４の微小流体チャネルにおいて流体は、ＰＣＲのための熱サイクリング（すなわち、温度サイクリング）に続いて、融解データ取得のための熱上昇（すなわち、温度上昇）に供されてもよい。
【００２９】
幾つかの実施形態では、微小流体反応システム２００は、システム制御装置３４８を含んでもよい。システム制御装置３４８は、フロー制御装置３５０、加熱制御装置３５２、検出システム３５４、及び／又は融解アナライザ３５６を含んでもよい。フロー制御装置３５０は、カートリッジ１０２の微小流体チャネル及び反応チップ２０４の微小流体チャネルを通して流体のフローを制御してもよい。
【００３０】
加熱制御装置３５２（すなわち、熱制御装置）は、熱ゾーンと関連する１以上の加熱素子２２０の加熱を制御し得る。非限定的な実施形態では、加熱素子２２０の制御は、１以上の温度センサ３５８（例えばＲＩＤ、又は薄膜サーミスタ若しくは薄膜熱電対温度計等）によって決定される温度に基づいてもよい。この方法では、熱ゾーン２１８における１以上のチャネルの温度は、所望の温度で維持されてもよく、所望の温度を通して繰り返されてもよく、及び／又は１以上の温度シーケンス若しくはプロファイルに従って上昇されてもよい。しかしながら、加熱素子２２０が薄膜ヒーターである場合等の幾つかの実施形態では、加熱素子２２０は、温度センサ３５８の機能を提供してもよい。また、本発明の幾つかの実施形態では、熱ゾーン２１８は、加熱制御装置３５２によって制御されてもよい１以上の冷却デバイス３６０によって冷却されてもよい。一実施形態では、冷却デバイス３６０は、例えば、ペルチェ素子、ヒートシンク又は強制対流空気冷却デバイスであってもよい。
【００３１】
検出システム３５４は、カートリッジ１０２のチャネルにおけるフローをモニターしてもよく、反応チップ２０４のチャネルにおけるフローをモニターしてもよく、及び／又はＰＣＲ増幅及び／又は融解データ取得中の反応チップ２０４からの蛍光を測定してもよい。検出システム３５４がカートリッジ１０２のチャネル及び／又は反応チップ２０４のチャネルにおけるフローをモニターする幾つかの実施形態では、検出システム３５４は、フロー制御装置３５０に対してフィードバックを提供してもよい。
【００３２】
幾つかの非限定的な実施形態では、図３に図示されるように、検出システム３５４は、インターフェース励起デバイス３６６を制御して、カートリッジ１０２のチャネルにおいて流体（例えば、ブランキング溶液）中の蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ６４７）を励起して、カートリッジ１０２のチャネルにおいて流体から発光され、カートリッジ検出デバイス３６８によって検出される蛍光の指標となるシグナルを受信し得る。同様に、検出システム３５４は、反応フロー励起デバイス３７０を制御して反応チップ２０４の第２のゾーンにおいて１以上のチャネルの流体中の蛍光色素を励起して、反応チップ２０４の第２のゾーンにおいて１以上のチャネルにおいて流体から発光され、反応フロー検出デバイス３７２によって検出される蛍光の指標となるシグナルを受信し得る。
【００３３】
検出システム３５４がＰＣＲ増幅及び／又は融解データ取得中に反応チップ２０４の蛍光を測定する幾つかの実施形態では、検出システム３５４は、反応チップ２０４の熱ゾーン２１８において１以上のチャネルの流体において蛍光色素を励起するため熱ゾーン２１８の励起デバイス３７４を制御して、反応チップ２０４の熱ゾーン２１８における１以上のチャネルの流体から発光され、熱ゾーン２１８の検出デバイス３７６によって検出される蛍光の指標となるシグナルを受信し得る。幾つかの非限定的な実施形態では、熱ゾーン２１８の励起デバイスは、１以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）（例えば青色ＬＥＤ）を含んでもよい。さらに、一実施形態では、熱ゾーン２１８の励起デバイス３７４は、１以上のモード（例えば、低出力／低強度モード、及び高出力／高強度モード）で操作可能であってもよい。
【００３４】
幾つかの実施形態では、システム３００は、融解データ取得中に検出システム３５４によって測定される熱ゾーン２１８において、試料スラグの一部分からの蛍光に基づいて試料スラグ中の核酸の融解温度を同定するため融解分析を行うことができる融解アナライザ３５６を含んでもよい。幾つかの実施形態では、融解アナライザ３５６は、融解分析を行うようにプログラム化されているプロセッサ及びメモリを有するコンピューターであってもよい。しかしながら、代替的な実施形態では、融解アナライザ３５６は、特定用途向け集積回路又は融解分析を行うように構成される他のデジタル及び／又はアナログの制御回路であってもよい。
【実施例】
【００３５】
図４〜図６、図７Ｂ及び図７Ｄ、図８Ｂ及び図８Ｄ、並びに図１３及び図１４中の曲線は、蛍光融解曲線のマイナスの微分−ｄ（Ｆ）／ｄＴを表し、式中、Ｔは試料温度であり、ＦはＤＮＡ変性の指標となる蛍光である。非限定的な一実施例では、図４〜図８及び図１３及び図１４の曲線を、図１〜図３を参照して、上に記載される測定器１０４、カートリッジ１０２、反応チップ２０４、及びシステム３００を使用して測定した。チャネル間の微小な温度変化を制御するため、試料（ＭＴＨＦＲ  ６６５、因子２、因子５及びＭＴＨＦＲ  １２８６）を、内部温度コントロール（ＩＴＣ：internal temperature control）と共にそれぞれ測定した。
【００３６】
実施例１（因子２）
図４Ａ〜図４Ｆ及び図５Ａ〜図５Ｆは、ＰＣＲ反応で得られた因子２のＤＮＡの融解（解離、変性）分析に関する。図４Ａ〜図４Ｆはそれぞれ、微小流体チップ（すなわち、図２の反応チップ２０４）の８個のチャネルにおいて融解された異なる因子の２ＤＮＡ試料に対するＤＮＡ融解曲線（変性曲線又は解離曲線とも称される）の例示的なマイナスの微分を明示する。微小流体チップの各チャネルについて、上昇速度１℃／秒（図４Ａ）、５℃／秒（図４Ｂ）、１０℃／秒（図４Ｃ）、１５℃／秒（図４Ｄ）、及び２０℃／秒（図４Ｆ）で試料温度を上昇させることにより、因子２のＤＮＡ試料に対して複数の融解反応が行われる。したがって、その後、１℃／秒、５℃／秒、１０℃／秒、１５℃／秒、及び２０℃／秒の速度で各チャネルの試料を融解させる。
【００３７】
図形４０２によって図示されるように、チャネルはそれぞれ異なる因子２のＤＮＡ試料を有する。具体的には、チャネル１〜チャネル３及びチャネル６（左から右に数える）は野生型因子２のＤＮＡ試料を有し（黒色で示される）、チャネル４はホモ接合突然変異を含む因子２のＤＮＡ試料を有し（青色で示される）、チャネル５、チャネル７及びチャネル８はヘテロ接合突然変異を含む因子２のＤＮＡ試料を有する（赤色で示される）。図４Ａ〜図４Ｆはそれぞれ、３種類の曲線、例えば、野生型因子２のＤＮＡ試料に対応する融解曲線のマイナスの微分、ホモ接合突然変異を有する因子２のＤＮＡ試料に対応する融解曲線のマイナスの微分、及びヘテロ接合突然変異を有する因子２のＤＮＡ試料に対応する融解曲線のマイナスの微分を明示する。野生型及びホモ接合の曲線は形状が類似するが、異なる融解温度によって判別される。対照的に、ヘテロ接合曲線は異なる数のピークを有する異なる形状を呈する。しかしながら、重複ピークヘテロ接合曲線を、１℃／秒（図４Ａ）及び５℃／秒（図４Ｂ）の上昇速度のみで観察することができた。より速い速度であっても、まだ野生型、ホモ接合、及びヘテロ接合の曲線間の形状の差（より幅広いピーク、より低いピーク高さ）が存在するが、重複ピークは１０℃／秒（図４Ｃ）、１５℃／秒（図４Ｄ）、及び２０℃／秒（図４Ｆ）の上昇速度ではそれ以上明らかでなくなる。重複ピークの喪失は、より低いデータ密度、及びより平滑化されているデータと関係があるかもしれない。
【００３８】
図５Ａ〜図５Ｆは、図４Ａ〜図４Ｆに示されるのと同じ実験設定に対応するが、逆の順序で行われた融解曲線のマイナスの微分を示す。具体的には、その後、各チャネルにおいて試料を２０℃／秒（図５Ａ）、１５℃／秒（図５Ｂ）、１０℃／秒（図５Ｃ）、５℃／秒（図５Ｄ）、及び１℃／秒（図５Ｆ）の速度で融解する。野生型、ホモ接合、及びヘテロ接合の曲線間の形状における重複ピークの違いは、１℃／秒（図５Ｆ）、５℃／秒（図５Ｄ）、及び１０℃／秒（図５Ｃ）の上昇速度でのみ観察され得る。
【００３９】
実施例２（因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８）
図６Ａ〜図６Ｃは、２０℃／秒の速度で試料温度を上昇させることによって融解された因子５、ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡの融解分析に関する。微小流体チップは、それぞれが図形４０２によって示される野生型、ホモ接合、及びヘテロ接合の試料の１つを有し得る８個のチャネルを有する。
【００４０】
図６Ａは、２０℃／秒の速度で試料温度を上昇させることにより、ＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡを融解することに関する。具体的には、参照符号４０２によって示されるように、チャネル１〜チャネル３及びチャネル６（左から右に数える）は野生型ＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡ試料を有する（黒色で示される）。チャネル４、チャネル５、チャネル７及びチャネル８は、ヘテロ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡ試料を有する（赤色で示される）。
【００４１】
図６Ｂは、２０℃／秒で試料温度を上昇させることにより因子５のＤＮＡを融解することに関する。具体的には、チャネル１、チャネル２及びチャネル６は、野生型因子５のＤＮＡを有する（黒色の曲線）。チャネル５及びチャネル６及びチャネル７は、ヘテロ接合突然変異を含む因子５のＤＮＡを有する（赤色の曲線）。最後に、チャネル３は、ホモ接合突然変異を含む因子５のＤＮＡを有する（青色の曲線）。
【００４２】
図６Ｃは、２０℃／秒で試料温度を上昇させることによりＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡを融解することに関する。具体的には、チャネル１及びチャネル５〜チャネル８は野生型ＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡを有する（黒色で示される）。チャネル５及びチャネル４は、ヘテロ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡを有する（赤色で示される）。最後に、チャネル２は、ホモ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  １２９８  ＤＮＡを有する（青色で示される）。
【００４３】
実施例３（因子２及び因子５）
図７Ａは、因子２のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光Ｆを表す融解曲線を明示する。図７Ｂは、因子２のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光のマイナスの微分−ｄ（Ｆ）／ｄＴを示す。試料中の二本鎖ＤＮＡの解離を達成するため、試料温度は５０℃／秒の速度で上昇する。図形４０２によって示されるように、微小流体チップのチャネル１〜チャネル３及びチャネル６は野生型因子２のＤＮＡを有し（黒色の曲線）、チャネル５は、ホモ接合突然変異を含む因子２のＤＮＡを有し（青色の曲線）、チャネル７及びチャネル８はヘテロ接合突然変異を含む因子２のＤＮＡを有する（赤色の曲線）。
【００４４】
図７Ｃは、因子５のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光Ｆを表す融解曲線を明示する。図７Ｄは、因子５のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光のマイナスの微分−ｄ（Ｆ）／ｄＴを表す融解曲線を示す。試料中の二本鎖ＤＮＡの解離を達成するため、試料温度は５０℃／秒の速度で上昇する。微小流体チップのチャネル１〜チャネル３及びチャネル５及びチャネル６は野生型因子５のＤＮＡを有し（黒色の曲線）、チャネル４はホモ接合突然変異を含む因子５のＤＮＡを有し（黒色の曲線）、チャネル７及びチャネル８はヘテロ接合突然変異を含む因子５のＤＮＡを有する（赤色の曲線）。したがって、５０℃／秒の上昇速度であっても、試料はまだ遺伝子型決定が可能である。
【００４５】
実施例４（ＭＴＨＦＲ  ６７７及びＭＴＨＦＲ  １２９８）
図８Ａは、ＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光Ｆを明示する。図８Ｂは、ＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光のマイナスの微分−ｄ（Ｆ）／ｄＴを示す。試料中の二本鎖ＤＮＡの解離を達成するため、試料温度は５０℃／秒の速度で上昇する。微小流体チップのチャネル１、チャネル２、チャネル４及びチャネル６は野生型ＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡを有し（黒色の曲線）、チャネル３はホモ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡを有し（青色の曲線）、チャネル５、チャネル７及びチャネル８はヘテロ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  ６７７のＤＮＡを有する（赤色の曲線）。
【００４６】
図８Ｃは、ＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光Ｆを明示する。図８Ｄは、ＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡ試料に対する温度に応じて正規化された蛍光のマイナスの微分−ｄ（Ｆ）／ｄＴを示す。試料中の二本鎖ＤＮＡの解離を達成するため、試料温度は、５０℃／秒の速度で上昇する。微小流体チップのチャネル１、チャネル３及びチャネル６〜チャネル８は、野生型ＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡを有し（黒色の曲線）、チャネル２はホモ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡを有し（青色の曲線）、チャネル４及びチャネル５はヘテロ接合突然変異を含むＭＴＨＦＲ  １２９８のＤＮＡを有する（赤色の曲線）。したがって、５０℃／秒の上昇速度であっても、まだ試料を遺伝子型決定することができる。
【００４７】
図９及び図１１は、融解プロセス中に温度上昇速度からの検出されたＤＮＡ融解温度の依存性を明示する。図１０及び図１２は、温度上昇速度からの検出されたＤＮＡ融解温度の依存性を対数目盛で明示する。具体的には、野生型因子２、野生型因子５、野生型ＭＴＨＦＲ  ６７７及び野生型ＭＴＨＦＲ  １２９８の融解温度は、異なる温度上昇速度でプロットされる。上昇速度は、図９では０．０１℃／秒〜５０℃／秒の範囲、図１１では０．０１℃／秒〜６０℃／秒の範囲である。したがって、図９〜図１２は、融解速度が増すにつれて、融解温度Ｔｍがシフトすることを明示し、それは測定器の読み取りに対して実際の流体温度の多少の温度遅延が存在するという事実を暗示する。
【００４８】
約４分〜１秒未満の取得時間と共に０．１３℃／秒〜３２℃／秒で変化する融解速度で行われる高速融解分析の更なる例が以下に提供される。具体的には、凝固に関連する４種類の遺伝子座、すなわち因子２、因子、ＭＴＨＦＲ  ６６５及びＭＴＨＦＲ  １２８６を、迅速ＰＣＲに続いて高速融解（ＨＳＭ）を実施する図１Ｂの高速遺伝子アナライザで増幅し、融解した。非限定的な一実施形態では、各カートリッジの実行に対して、各ＰＣＲ産物の融解を、速度を加速する又は減速させるいずれかの順で、０．１３℃／秒〜３２℃／秒の異なる速度で９回繰り返した。８個の微小流体カートリッジから４つの遺伝子座に対する９種類の速度は、２８８の分析するためのデータセットをもたらした。８チャネルの各データセットは、２つの野生型、２つのホモ接合変異体、２つのヘテロ接合変異体、１つのネガティブコントロール、及び１つのゲノムＤＮＡ試料を含んだ。ネガティブコントロール融解曲線は、予想通り内部温度コントロールを示したが、そうでない場合は陰性であった。
【００４９】
オリゴヌクレオチド
標準ホスホラミダイト化学（Integrated DNA Technologies）によってプライマー、コントロール及び検量用試料を合成し、それらの配列を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2019533474.tif 000003
【００５１】
Ｆ２プライマーは４８塩基対（ｂｐ）の生成物、Ｆ５プライマーは４３ｂｐの生成物、ＭＴＨＦＲ  ｃ．６６５プライマーは４８ｂｐの生成物、及びＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６プライマーは４６ｂｐの生成物を生じた。４５ｂｐの二本鎖内部温度コントロールは、３’−リン酸末端の相補的オリゴヌクレオチドで構成され、全ての反応に含まれた。先に記載されるように（Cao et al., "Automated microfluidic platform for serial polymerase chain reaction and high-resolution melting analysis. J Lab Autom 2016;21:402-11）、温度較正用の低い及び高い融解温度（Ｔｍ）の検量用試料を使用した。上に指定される適切なプライマー対と共に包含するため因子２、因子５、及び２つのＭＴＨＦＲの変異体遺伝子座に対して二本鎖ＤＮＡテンプレート（ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）、Integrated DNA Technologies）を合成した。テンプレート配列を表２に提示する。
【００５２】
【表２】
2019533474.tif 000004
【００５３】
非限定的な一実施形態では、野生型とホモ接合変異体のテンプレートはいずれも各遺伝子座に対して合成され、ヘテロ接合ＤＮＡ試料は等量の野生型及び変異体の合成テンプレートを混合することによって得られた。合成テンプレートは、２００ｂｐ長〜２０１ｂｐ長の範囲であった。全てのオリゴヌクレオチドを、２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって定量した。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応
非限定的な一実施形態では、Ｆ２  ｃ．＊９７Ｇ＞Ａ、Ｆ５  ｃ．１６０１Ｇ＞Ａ、ＭＴＨＦＲ  ｃ．６６５Ｃ＞Ｔ及びＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６Ａ＞Ｃに対する遺伝子型決定アッセイを図１Ａ、図２及び図３に記載される測定器で行った。最初に３８４ウェルプレート（すなわち１１４、図１Ｂ）に、各アッセイに対するプライマー混合物及び分析される各試料に対するテンプレート混合物を含む試薬を手作業で充填した。各プライマー混合物は、２つのプライマーと、二本鎖内部温度コントロールを構成する２つのオリゴヌクレオチドと、ｄＮＴＰと、Ｔｒｉｓ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ベタイン、ＤＭＳＯ及びＴｗｅｅｎ  ２０を含む一般的なバッファー試薬とを含んだ。各テンプレート混合物は、抗Ｔａｑ抗体を含むＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体（例として、限定せずに、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）Ｔａｑ、Takara Bio USA）と、ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ色素（BioFire Defense）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、上に列挙される一般的なバッファー成分と、テンプレートＤＮＡとを含んだ。合成テンプレート（ホモ接合野生型、ホモ接合突然変異体、又はヘテロ接合）、ヒトゲノムＤＮＡ（４つの遺伝子座のそれぞれで野生型）、又は水（テンプレートなしコントロールのため）のいずれかからなる各テンプレート混合物にテンプレートＤＮＡを最後に添加した。ＰＣＲの直前までテンプレート混合物（ポリメラーゼ／抗体、ＢＳＡ、色素及びテンプレート）からプライマー混合物（プライマー、内部温度コントロール、ｄＮＴＰ）を分離することにより、非特異的増幅を制限した。
【００５５】
増幅及び分析の直前に測定器によってロボット制御でプライマー及びテンプレートの混合物を合わせた。ＰＣＲ中の最終混合濃度は次の通りであった：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、３０ｍＭ  ＫＣｌ、１Ｍベタイン、２％ＤＭＳＯ、０．０５％ＢＳＡ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ  ２０、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  全ｄＮＴＰ、０．５μΜ  ＩＴＣ、１．０μΜの各プライマー、１×ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ色素、ＴａｑＳｔａｒｔ（商標）抗体を含む１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡテンプレート（合成テンプレート、ゲノムＤＮＡ又はテンプレートなしのコントロールのため水のいずれか）。合成テンプレートを使用した場合、それらの最終濃度は０．００２  ｐｇ／μＬ（約１００００コピー／μＬ）であった。ゲノムＤＮＡがテンプレートであった場合、２０ｎｇ／μＬを使用した（約６４００のハプロイドコピー／μＬ）。これらの濃度は、各標的に対するリアルタイムＰＣＲによって同様の定量サイクル（Ｃｑｓ）をもたらし、合成テンプレート全てが全長及び／又は純粋でなくてもよいことを示唆する。非限定的な一実施形態では、マイクロチップ（すなわち、図２の反応チップ２０４）を各微小流体カートリッジ上の以下の位置の時間で８個の試料を実行するように設計した。
チャネル１：野生型ゲノムＤＮＡ
チャネル２：野生型合成テンプレート
チャネル３：ヘテロ接合合成テンプレート
チャネル４：ホモ接合突然変異体合成テンプレート
チャネル５：ヘテロ接合合成テンプレート
チャネル６：野生型合成テンプレート
チャネル７：ホモ接合突然変異体合成テンプレート
チャネル８：テンプレートなしのコントロール
【００５６】
迅速温度サイクリングは、５０℃／秒のプログラム化された融解温度で９５℃まで加熱して３０秒間の初期変性の保持、続く１２．５℃／秒、４０サイクルでＸ℃まで冷却して２秒間の保持、１．８℃／秒で７２℃まで加熱して３秒間の保持、及び５０℃／秒で９５℃まで加熱して２秒間の保持を含んだ。アニーリング温度（Ｘ℃）はアッセイによって変えた：Ｆ２：Ｘ＝６５℃、Ｆ５：Ｘ＝６２℃、ＭＴＨＦＲ  ｃ．６６５：Ｘ＝６０℃及びＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６：Ｘ＝６２℃。ＰＣＲを完了する時間はＦ２については１０分間、Ｆ５及びＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６については１１．３分間、並びにＭＴＨＦＲ  ｃ．６６５については１２．２分間であった。４０サイクルのＰＣＲの後、プログラム化された２００℃／秒で９５℃まで加熱して１．５秒間保持し、続いてプログラム化された２００℃／秒で５０℃まで冷却し、２秒間保持する、８秒間で完了した追加の変性／再生工程があった。
【００５７】
高速融解（ＨＳＭ：HIGH SPEED MELTING）
ＰＣＲの後、１秒当たり３０フレームのカメラ取込み率で６５℃〜９５℃で行われるＨＳＭのため、同じ微小流体チャネル位置に試料は留まった。最も低速で開始して最も高速まで進行する、又は最も高速で開始して最も低速まで進行するいずれかで、０．１３℃／秒、０．２５℃／秒、０．５℃／秒、１℃／秒、２℃／秒、４℃／秒、８℃／秒、１６℃／秒及び３２℃／秒で各生成物を９回融解した。対応する融解時間及びデータ取得密度を表３に与える。
【００５８】
【表３】
2019533474.tif 000005
【００５９】
一実施形態では、図２に図示される８個の微小流体カートリッジを、２つの部位で４個実行した。各部位において、２個のカートリッジを高速から低速で融解して、２個を低速から高速で融解して実行した。
【００６０】
実施例５（ＭＴＨＦＲ  １２８６）
図１３Ａ〜図１３Ｉは、単一ヌクレオチド変異体を含むＰＣＲ産物融解曲線に対する融解速度の効果を明示する。一実施形態では、ＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６Ａ＞Ｃ遺伝子座を包含する４６ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、内部温度コントロール（ＩＴＣ）と共に異なる速度で繰り返し融解した。チャネル間の任意の温度変化を補正するため、指数関数的バックグラウンド除去、正規化、及び内部温度コントロールに対する線形温度調整によって融解データを処理した。各融解速度の融解曲線のマイナスの微分プロットは、黒色線として２つの野生型試料（ＷＴ）、青色線として２つのホモ接合変異体（ＨＯＭ）、及び赤色線として２つのヘテロ接合体（ＨＥＴ）を示す。ＰＣＲ産物はおよそ７０℃〜８３℃で融解するのに対し、内部温度コントロールはより高いおよそ８３℃〜８７℃で融解する。見かけ上の融解温度は、融解速度に伴って上昇する（図２０Ａを参照されたい）。重複遺伝子型は明確にクラスター化し、より低温のヘテロ二本鎖ピークは上昇速度が増すにつれて、高さが増し、より高いピークにより近い高さとなる。３２℃／秒において、ヘテロ二本鎖及びホモ二本鎖のピークが、低いデータ密度のため、単一で幅広いピークへと併合する。それにもかかわらず、遺伝子型決定は、全ての速度で明らかに可能である。
【００６１】
実施例６
図１４は、低速（０．１３℃／秒）、高速（８℃／秒）及び超高速（３２℃／秒）の融解速度で調べた４つのＳＮＶ遺伝子座（Ｆ２  ｃ．＊９７Ｇ＞Ａ、Ｆ５  ｃ．１６０１Ｇ＞Ａ、ＭＴＨＦＲ  ｃ．６６５Ｃ＞Ｔ、及びＭＴＨＦＲ  ｃ．１２８６Ａ＞Ｃ）の融解曲線のマイナスの微分を明示する。具体的には、バックグラウンド除去、正規化及び内部温度コントロールに対する温度調整（内部温度コントロール（ＩＴＣ）ピークは図示されない）の後の正規化されたマイナスの微分が３種類の融解速度で示される。各パネルは、野生型（黒色）、ホモ接合変異体（青色）及びヘテロ接合体（赤色）を含む３種類の遺伝子型の合成複製物を含む。０．１３℃／秒での小さいヘテロ二本鎖のピークは、８℃／秒ではより大きくなり、ホモ二本鎖のピークの高さに類似するのに対し、ホモ接合ピークはより高くより狭くなる。３２℃／秒では、ヘテロ接合二本鎖のピークは、データ収集速度がホモ接合ピークの鋭さを制限することから単一で幅広いピークへと併合するが、全ての遺伝子型は、容易に識別可能のままである。
【００６２】
図１５は、融解速度に応じた遺伝子型判別を図示する。クラス間対クラス内の距離の遺伝子型判別比を使用して、遺伝子型を分類することの容易さを定量した。クラス間は、遺伝子型間の差を指す。クラス内は、同じ遺伝子型の複製物間の差を指す。野生型対ホモ接合体（点線）、及び野生型対ヘテロ接合体（実線）を示す。２本の曲線間の距離は、ｘ軸（温度）に沿った各データ点における絶対差の平均を取ることにより計算される。図１５では、複数の標的（因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６６５、ＭＴＨＦＲ  １２８６）に対しても同様にデータを平均した。図１５において各点は、各融解速度に対する８回のカートリッジ実行において４つ全ての遺伝子座を分析する２人の研究者から得られた平均（無次元）判別比を表示する。上記遺伝子座に対する絶対値差分は分散を増加する（エラーバーは平均値の標準誤差を示す）が、４つ遺伝子型の遺伝子座（ＭＴＨＦＲ  ６６５、因子２、因子５、及びＭＴＨＦＲ  １２８６）の全てを、遺伝子座に対する融解速度の効果を最も良く示すためにデータに含めた。
【００６３】
定量のため、クラス間の計算に含まれる全てのペアの比較を平均することによって、クラス間の差を計算した。例えば、各８チャネル読み取りに対する２つの野生型と２つのヘテロ接合の試料間の４つのペアの差を平均して、野生型対ヘテロ接合のクラス間の差を得た。クラス内の差について、関与する各遺伝子型のうちの全てのペアの曲線間の距離を平均した。一実施形態では、合計１７２８本の融解曲線を取得し（９種類の融解速度での４つの遺伝子座において重複する３つの遺伝子型の８個のカートリッジの実行）、そのうち５個（０．３％）を分析から排除した（カートリッジ又は流体の制御の問題に起因する泡又は不規則な融解曲線）。除外された試料は、０．１３℃／秒の１本の曲線、及び１℃／秒及び２℃／秒の両方の速度での２本の曲線であった。計算を行うため特注ソフトウェアを使用した。
【００６４】
片側ｔ検定を使用し、不等分散を仮定したところ、０．１３℃〜８℃の遺伝子型判別は、ホモ接合体（ｐ＝０．００５）及びヘテロ接合体（ｐ＝０．０００４）に対して有意差があった。ｐは確率値である。ホモ接合突然変異が野生型とは有意に異なる確率、またヘテロ接合突然変異が野生型とは有意に異なる確率も確率ｐである。両方の確率値ｐが０．０５未満であれば、その差は有意で真であると言い、遺伝子型が区別され得るという事実を支持する。
【００６５】
本発明の一態様によれば、遺伝子型決定は、使用されている融解速度に対するクラス間及びクラス内の距離の閾値を使用することによって分類される。融解速度に従って、可能性の高い分類領域を拡大することができ、そうすることによって、より高い感度及び特異度を得ることができる。使用される最適な融解速度は、クラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それはノーコール試料の数と並んで、コールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する。融解曲線は、最も高い遺伝子型判別に対応する最適な融解速度を決定するため、特定の間隔において複数の上昇速度で１以上の核酸試料について連続して得られ、遺伝子型判別は、上記間隔の各上昇速度に対して計算される。最適な上昇速度は、クラス間対クラス内の距離の比を最大化し、それは、ノーコール試料の数、並びにコールされた試料のうちの偽陽性及び偽陰性の試料の数を最小化する。
【００６６】
図１５に基づいて、ホモ接合体の最良の判別は、２℃／秒〜８℃／秒の速度で起こるのに対し、ヘテロ接合体は８℃／秒〜１６℃／秒において最も良好に判別される。データ密度が低い非常に高速の場合を除いて、野生型とヘテロ接合体との間よりも野生型とホモ接合体との間により良好な判別が存在する。したがって、図１５に基づいて、高速融解により、遺伝子型判別において約２倍の増加を達成することができる。
【００６７】
非限定的な一実施形態では、地理的に２つの場所で全ての実験を行った。各現場から１人の、２人の研究者は、ＬａｂＶｉｅｗ（National Instruments）で書き込まれた特注ソフトウェアを使用して、手動で管理されたコンピューター支援分析によって８回のカートリッジ実行に由来する全てのデータを分析した。指数関数的バックグラウンドからの融解シグナルの偏差を測定することによって、バックグラウンド決定に対する初期のより高温及びより低温の領域を自動的に割り当てた。融解曲線領域に対する内部温度を５％偏差で設定し、外側限界は上部及び下部の領域の両方に対して２℃の間隔を定義した。必要に応じて、これらの領域を手作業で再検討し、調整した。バックグラウンド減算及び正規化の後の曲線間の最大垂直距離の絶対値として、２本の曲線の間の距離を得た。この決定を行うため、融解領域内に収集された全てのポイントを使用した。この数は融解速度により変化した（表３を参照されたい）。
【００６８】
図１６は、手作業による遺伝子型決定の精度対融解速度を明示する。９種類の融解速度それぞれに対して、２人の研究者は視覚的に１９２本の融解曲線を遺伝子型決定するか、又は研究者は遺伝子型のコールを行うことができないと判断した（不確定）。各融解速度における第１の研究者（「１」と呼ぶ）及び第２の研究者（「２」と呼ぶ）に対する不確定及び不正確な遺伝子型コールのパーセンテージを示す。全て組み合わせると、１３個（０．４％）の不確定及び２個（０．０６％）の不正確な遺伝子型コールがあった。遺伝子型判別比の分析とほぼ一致して、２℃／秒〜８℃／秒の融解速度で全ての遺伝子型決定コールは正しく、不正確コールと１３個中１０個の不確定コールはいずれも０．１３℃／秒〜１℃／秒の速度で発生し、残りの３個の不正確コールは１６℃／秒〜３２℃／秒の速度で発生し、ここではデータ密度が遺伝子型決定の困難性の主な原因となり得る。
【００６９】
具体的には、０．０６％の全体エラー率及び０．４％の不確定率に対して、第２の研究者（「２」）は、２個（０．１％）の不正確及び３個（０．２％）の不確定なコールを行ったのに対し、他方の研究者は不正確コールを行わなかったが１０個（０．６％）の不確定コールを行った。全てのエラーは、０．５℃／秒未満の速度で行われたのに対し、不正確コールの７７％は１℃／秒以下であり、２３％が１６℃／秒以上の速度であった。
【００７０】
図１７Ａ〜図１７Ｃは、ＭＴＨＦＲ  １２８６の突然変異に対して、融解速度及びデータ密度の効果を分離する。ＭＴＨＦＲ  １２８６遺伝子型決定に対するデータ密度の影響を、高密度データセットを「間引きする（thinning）」ことにより探索した。０．１３℃／秒で得られた融解曲線は、１６℃／秒での取得と等価な低密度データセットに変換された。間引きされたデータは、１６℃／秒で取得されたものと同様に遺伝子型に分類されず、より高い融解速度がデータ密度の変化ではなく遺伝子型決定における改善を説明したことを実証する。
【００７１】
具体的には、ハードウェアによってサポートされる最大頻度である１秒当たり３０点で全ての融解データを取得した。図１７Ａでは、０．１３℃／秒の最も遅い融解速度で、１℃当たりおよそ２３０点を得て、過剰なサンプリングとノイズに起因する太いラインが観察された。３２℃／秒では、遺伝子型判別は、サンプリング不足の（under-sampling）融解曲線の特徴により精度が低下した（図示せず）。図１７Ｂでは、図１７Ａからの０．１３℃／秒のデータを１℃当たり２点で再度サンプリングし、図１７Ｃに示される１６℃／秒の曲線と同じ速度を取得した。したがって、一定のデータ密度では、１６℃／秒の融解速度は、０．１３℃／秒よりも信頼度の高い遺伝子型決定を可能とする。
【００７２】
図１８は、ＰＣＲに対するテンプレートとしての合成ＤＮＡとゲノムＤＮＡ（因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６６５、及びＭＴＨＦＲ  １２８６）との間の類似性及び単一のカートリッジ実行における融解分析を図示する。ＤＮＡ供給源の判別比（Ｃ）は、ゲノムＤＮＡ融解曲線から合成融解曲線までの平均距離（Ａ）を合成融解曲線間の平均距離（Ｂ）で割ったものである。９種類の指数関数的に増加する融解速度で４種類の標的遺伝子座を融解する１つの典型的なカートリッジからのデータを使用した。供給源の判別比は融解速度に対する判別比に近似したままであり、この分析において合成ＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間にほとんど差がないことを示唆する。ＤＮＡ増幅の分散を制限し、融解の遺伝子型分解能（genotype resolution）に注目し、各カートリッジ実行に対して１つの遺伝子座当たり２つの各遺伝子型を有するように、合成テンプレートを使用した。合成テンプレートによって得られた結果は、ゲノムＤＮＡによって得られたものに近似した。合成曲線間の距離に対する合成曲線とゲノム曲線間の距離の判別比を使用して、類似性を定量したところ、１に近似したままであった。
【００７３】
図１９Ａ及び図１９Ｂは、因子２、因子５、ＭＴＨＦＲ  ６６５、ＭＴＨＦＲ  １２８６のＤＮＡに対する異なるカートリッジ実行に対する融解速度の加速と減速との間の類似点を図示する。全てのカートリッジの融解曲線は、同じＰＣＲ産物に対して異なる融解速度で連続して実行された。カートリッジ実行の半分を、増加する速度（０．１３℃／秒から３２℃／秒）、半分は減少する速度（３２℃／秒から０．１３℃／秒）で行った。図１９Ａは、全体的なヘテロ接合対野生型の判別比（図１５、四角形を含む実線）を、増加する速度のカートリッジ（十字を含む線（１））及び減少する速度のカートリッジ（三角形を含む線（２））からの寄与に分離する。図１９Ｂは、ホモ接合突然変異体の判別比（図１５、三角形を含む破線）を、増加する速度のカートリッジ（丸を含む線（３））及び減少する速度のカートリッジ（星印を含む線（４））からの寄与に分離する。両方の場合において、遺伝子型判別比は、より速い融解速度によって、１６℃／秒で水準化又はわずかに減少する前に８℃／秒に近いピークまで増加し、その後３２℃／秒で減少する。エラーバーは平均値の標準誤差である。中間速度（２℃／秒）において、各パネルの曲線間の差は有意ではなく（ヘテロ接合体に対してｐ＝０．６３、ホモ接合体に対してｐ＝０．０５４）、加速する速度と減速する速度との間にほとんど差がないことを示唆する。Ｐは、低速から高速、又は高速から低速の試験順序の実行の間の差がある確率である。確率値ｐは両方とも０．０５よりも大きく、融解を実行する順序間に差がないことを意味する。これは、上記データが試験を実行した順序によってバイアスされないことを示す。加速する速度を使用する４個のカートリッジからの全ての遺伝子型データを、減速する速度を使用する４個のカートリッジと比較すると、同様の遺伝子型判別対融解速度曲線が観察された。ヘテロ接合（図１９Ａ）とホモ接合（図１９Ｂ）の両方の判別比は、融解速度８℃／秒周辺の形状及びピークに類似した。したがって、遺伝子型決定に対する速度の効果の更なる分析のため、加速及び減速の両方のカートリッジを組み合わせた。同様に、明らかな差がなかったため、アナライザ及び位置の全体的な効果を組み合わせた。
【００７４】
図２０Ａ及び図２０Ｂは、測定器によって測定した融解温度（Ｔｍ）が融解速度と共に上昇することを図示する。図２０Ａでは、８回のカートリッジ実行のうちの１回に得られた４つの遺伝子座それぞれの野生型融解温度（Ｔｍ）を、９種類の指数関数的に２倍になる融解速度に対してプロットした。二重の野生型試料の融解曲線の平均Ｔｍとして各値を計算した。これらのＴｍは、バックグラウンド除去、正規化、及びそれらの内部温度コントロールの温度の平衡化の後のマイナスの微分ピークの最小二乗二次式フィットの最大値によって与えられる。図２０Ｂでは、１℃／秒の野生型Ｔｍ（カートリッジヒーターを較正するために使用される融解速度）を図２０Ａの各Ｔｍから減算して、最大２℃／秒の融解上昇速度の全ての遺伝子座に対するＴｍ上昇の正確な均一性、及びより高速でのより大きな可変性を観察する。遺伝子座は、ＭＴＨＦＲ  ６６５（緑色の三角形）、因子２（青色の菱形）、因子５（赤色の正方形）及びＭＴＨＦＲ  １２８６（紫色の十字）であった。
【００７５】
各遺伝子座の測定器で測定したＴｍは、０．１３℃／秒〜３２℃／秒で融解速度が２５０倍増加したことから、平均で約２．８℃増加した（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。４℃／秒以上で起こった変化の増加は、おそらくは、データ密度の減少が、マイナスの微分ピークフィットの正確性に影響したからである。８個の全てのチャネルが均等に影響されたことから、遺伝子型決定は、このＴｍシフトによって影響を受けず、全ての遺伝子型比較を特定の速度で行った。代表的なカートリッジ実行から取った、０．１３℃／秒から３２℃／秒までのＭＴＨＦＲ  １２８６遺伝子座の遺伝子型決定に対する融解速度の効果を図１３Ａ〜図１３Ｉに示す。各パネル内で、２つの野生型、２つのヘテロ接合変異体、及び２つのホモ接合変異体の曲線のデータセットを示す。それらのデータセットはいずれも、各曲線で右端のピークに見られる、それらの内部温度コントロールの平均Ｔｍに対して整列される。速度が０．１３℃／秒から８℃／秒に増加するにつれて、ヘテロ接合体のヘテロ二本鎖のピークが増加し、高さ及び面積の点でホモ二本鎖のピークに近づき、ホモ接合ピークはより高くより狭くなった。８℃／秒〜３２℃／秒では、併合された２つのヘテロ接合ピーク及びホモ接合ピークは、明らかに低いデータ密度（１６℃／秒で２点／℃未満）のためにより短くより広くなった。３２℃／秒であっても、まだ目視検査によって容易に融解曲線を遺伝子型決定した。同様の傾向が、０．１３℃／秒、８℃／秒、及び３２℃／秒の融解速度で４つ全ての遺伝子座について見られ（図１４）、ここでは内部温度コントロールは図示されていない。例えば、０．１３℃／秒でのＭＴＨＦＲ  ６６５の遺伝子型決定は、小さなヘテロ二本鎖のピークのみを有した。８℃では、ヘテロ二本鎖の寄与ははるかに大きく、ホモ二本鎖のピークへと併合されたが、遺伝子型決定は、２つの速度の間で１．９倍増加した定量的遺伝子型決定の比によって確認されるように、視覚的により容易であった。すなわち、ヘテロ接合体の小さなアンプリコンの遺伝子型決定については、別々のピークへのヘテロ二本鎖及びホモ二本鎖の寄与の分離は、異なる遺伝子型の分離ほど重要ではなかった。
【００７６】
全てのクラスの単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）に対する上記観察の普遍性を探索し、ＧＣ含量、ホモポリマーストレッチ及びアンプリコン長さの効果を観察するため（表４及び表５を参照されたい）、追加の盲検試験を行った。具体的には、追加の単一ヌクレオチド変異体遺伝子座（表５）を、０．１３℃／秒〜３２℃／秒の速度で試験した。表４に示されるプライマー及び条件を使用して、カルーセルＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｖ．１．５で、試料をヒトゲノムＤＮＡ又はプラスミドからＰＣＲ増幅した。一実施形態では、各プライマー０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＫｌｅｎＴａｑ１（商標）（Ab Peptides）０．４Ｕ、抗Ｔａｑ抗体（eEnzyme）６４ｎｇ、ＭｇＣｌ２  ３ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ウシ血清アルブミン（Sigma）５００ｍｇ／Ｌ、１×ＬＣＧｒｅｅｎ（商標）Ｐｌｕｓ色素（BioFire Defense）、及び各ｄＮＴＰ  ２００μｍｏｌ／Ｌを含む、１０μＬ容量でＰＣＲを行った。増幅後、試料を融解した。このプロセスは、融解の結果のみを試験するように、ＰＣＲに由来する任意の変化を制限する。
【００７７】
ヘテロ接合遺伝子型決定に対するＳＮＶクラス間の明らかな差はなかったが、予想通り、ホモ接合体はＳＮＶにおいて検出するのが困難であった。３９％〜６５％で変化するＧＣ含量に明らかな傾向はなかった。
【００７８】
より速い融解速度での小さなアンプリコンの遺伝子型決定の改善に関する観察は、３９％〜６５％の異なるＧＣ含量の全てのＳＮＶクラスに当てはまるように見え、ホモポリマーストレッチによって影響されなかった。しかしながら、ＧＣ含量及びホモポリマーストレッチは、ＰＣＲ増幅の容易さに影響する可能性がある。一旦十分に増幅されると、ＧＣ含量及びホモポリマーストレッチは、ＨＳＭに悪影響を及ぼすようには見えなかった。対照的に、ＰＣＲ産物の長さは、遺伝子型決定の融解速度依存性に影響した。盲検試験において４８ｂｐ長〜７８ｂｐ長の生成物については、いずれも最も遅い速度（０．１３℃／秒〜０．２５℃／秒）でヘテロ接合体コールの９２％は正しく、８％がノーコールのままであった。９６ｂｐ長〜１０１ｂｐ長の生成物については、遅い速度と速い速度の両方でエラーがあり、０．１３℃／秒で５％ノーコール、並びに３２℃／秒で２％ノーコール及び１％ミスコールであった。２００ｂｐ〜２７２ｂｐの生成物では、速い速度で多くのエラーがあった。したがって、およそ５０ｂｐの小さなアンプリコンに対して、より速い融解は遺伝子型決定を改善する。より速い融解は、およそ５０ｂｐの小さなアンプリコンで最も有益であった。１００ｂｐでは融解速度は、遺伝子型を判別する能力に影響するようには見えなかったのに対し、２００ｂｐ超では、その傾向は逆転されて、より遅い融解がより良好な遺伝子型決定をもたらした。
【００７９】
ここで調べられた融解速度は、約４分間〜１秒未満の取得時間を伴って、０．１３℃／秒〜３２℃／秒で変化した。興味深いことに、小さなアンプリコンでは、より高速ではなくより低速でのみ珍しい遺伝子型決定のエラーがあった。すなわち、小さなアンプリコンのより高速の融解は、少なくとも最高８℃／秒でより良好な融解を達成するようである。曲線が固定カメラフレームの速度によって引き起こされる低いデータ密度のために広がる最も速い速度であっても、遺伝子型決定はまだ視覚的に明確である。
【００８０】
融解速度が増加するにつれて、ヘテロ二本鎖のピークは高さ及び面積が増加し、ヘテロ接合体を同定することをより容易にする。これは、小さなアンプリコン中のヘテロ二本鎖を、経時的に組換えが起こり、より安定な平衡状態のホモ二本鎖を形成する、不安定で不平衡な二本鎖と見なすことにより合理化することができる。より遅い速度では、組換えが臨界温度で生じるのに更に時間がかかり、観察されるヘテロ二本鎖ピークは縮小する。より速い速度では、組換えに時間はかからず、より多くのヘテロ二本鎖が観察される。この説明は先の観察（Wittwer et al., "High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen," Clin Chem 2003; 49:853-60）と一致する。しかしながら、より長いＰＣＲ産物中のヘテロ二本鎖はより組換えしにくい。
【００８１】
より速い速度がなぜ小さなアンプリコンにおけるホモ接合体の遺伝子型決定を改善するかを合理的に説明することはより困難である。速度が０．１３℃／秒を超えて増加するにつれ、見かけ上のＴｍは上昇し、ホモ接合体から増幅された微分ピークはより鋭く（より高く、より狭く）なり、種々の遺伝子型の試料間の垂直方向分離及び得られた判別比を増加させることによって、より明瞭な視覚的及び定量的な遺伝子型決定をもたらす。おそらく、上記機構は、鎖の分離対会合の非平衡効果でもある。ホモ接合体の遺伝子型決定に最も良い速度は、ヘテロ接合体に対する最も良い速度（８℃／秒〜１６℃／秒）よりも低い、２℃／秒〜８℃／秒であり、特有の機構を示唆する。
【００８２】
特に３２℃／秒で、融解の特徴が不明瞭となるほどデータ密度が低下する場合、ホモ接合体及びヘテロ接合体の判別の質はいずれも低下する。融解中のより速いデータ取得は、この限界を取り去り、おそらくは更に良好な遺伝子型判別と共に、更に早い速度を可能とし得る。
【００８３】
およそ５０ｂｐの小さなアンプリコンのより速い融解によるここで見られる遺伝子型決定の改善は、全ての種類のＳＮＶに概ね当てはまるように見える。高い若しくは低いＧＣ含量の増幅又はホモポリマーストレッチはＰＣＲを複雑にし得るが、標的を増幅することができる場合、それらは高速融解によって遺伝子型決定され得る。しかしながら、より速い速度によるより良好な結果は、ヘテロ二本鎖スキャニング等の１００ｂｐ超のより大きなアンプリコンを使用する他の融解の適用に当てはまらない場合がある。確かに、アンプリコンがより大きくなるにつれてより速い速度での遺伝子型決定の改善は減少し、更には２００ｂｐ超のアンプリコンでその傾向は逆転する。
【００８４】
より速い速度での小さなアンプリコンの遺伝子型決定の改善に関する機構が何であれ、ここで観察されたホモ接合及びヘテロ接合の遺伝子型決定によって共有される８℃／秒の最適速度はエクストリームＰＣＲに付加価値を提供するであろう。１５秒間〜３０秒間のＰＣＲに続く４秒間の融解のプロトコルは、ポイントオブケア分子診断を同じ１５秒間〜３０秒間のＰＣＲに続く４分間の融解よりもはるかに実行可能なものとし得て（１０倍速い）、更には現場での逐次試験を反映させることも可能となる。ＰＣＲの前に調製を必要としない試料については、結果は３０秒未満で入手可能となるはずである。試料の調製を必要とし、かかる手順が３０秒未満で完了可能である場合、１分間の試料−回答分子診断の解決策を可能とする。最終的な考察として、どのようにして速いＰＣＲ又は融解を行うことができるかということに対して制限が提案された（そして、それが広く受け入れられた）としても、それらの制限は時間と共に時代遅れとなっていく。
【００８５】
したがって、微小流体技術は、全体の融解曲線を取得するのに１秒未満を要する、最高５０℃／秒の速度の融解分析による遺伝子型決定を可能とする。高速融解は、融解分析に要する時間を減少させ、エラーを減少させ、小さなアンプリコンの遺伝子型判別を改善する。エクストリームＰＣＲと合わせて、高速融解は１分未満の核酸増幅及び遺伝子型決定を約束する。
【００８６】
本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）「１つの（a、an）」及び「その（the）」という用語並びに類似の指示物を使用することは、本明細書において他に指示されない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「備える」、「有する」、「含む」及び「含有する」という用語は、他に言及されない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書において値の範囲を列挙することは、本明細書において他に指示されない限り、その範囲内に入る別々の各値を個々に参照する簡潔な方法としての役割を果たすことを意図するにすぎず、本明細書において個々に列挙されたかのように、別々の各値が本明細書に組み込まれる。本明細書において説明される全ての方法は、本明細書において他に指示されない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序において実行することができる。本明細書において与えられるありとあらゆる例、又は例示する用語（例えば、「等の（such as）」）の使用は、本発明の理解をより容易にすることを意図するにすぎず、別に特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書における文言は、任意の特許請求されない要素を、本発明を実施する上で不可欠であると示すものと解釈されるべきでない。
【００８７】
本開示の主題について、特徴の様々な組合せ及び部分的組合せを含む幾つかの例示的な実施形態を参照してかなり詳細に記載し示したが、当業者は、他の実施形態並びにその変形形態及び変更形態を、本開示の範囲内に包含されるものとして容易に理解するであろう。さらに、こうした実施形態、組合せ及び部分的組合せの記載は、請求項に係る主題が、請求項に明示的に列挙されているもの以外の特徴又は特徴の組合せを必要とするということを意味するようには意図されていない。したがって、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に包含される全ての変更形態及び変形形態を含むように意図されている。
【図１】
2019533474.tif 000006
【図２】
2019533474.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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