(57)【要約】  本発明は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現している哺乳動物細胞（特に、ヒト細胞）であって、当該表面タンパク質の第２アイソフォームを発現している細胞を有している患者の治療に使用するための、哺乳動物細胞に関する。第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、機能的に区別できないが、免疫学的には区別できる。本発明はさらに、下記（１）および（２）から選択される、医学的状態の治療方法に使用するための薬剤にも関する：（１）抗体もしくは抗体様分子を含んでいる化合物、または、抗体もしくは抗体様分子からなる化合物；（２）抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞、または、キメラ抗原受容体をを有している免疫エフェクター細胞。上記薬剤は、表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれか一方に特異的に反応する。上記第１アイソフォームと上記第２アイソフォームとは、機能的に区別できないが、免疫学的には区別できる。上記薬剤を投与して、当該薬剤が反応するアイソフォームを有している細胞を除去する。
2019533450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面タンパク質の第１アイソフォームを発現している哺乳動物細胞（特に、ヒト細胞）であって、
上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームは、当該表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別でき、
上記表面タンパク質の上記第２形態を発現している細胞を有する患者の治療に使用するための、哺乳動物細胞。
【請求項２】
上記表面タンパク質は、細胞外ポリペプチド配列を有しており、
上記第１アイソフォームは、上記第２アイソフォームと比較すると、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を有している、
請求項１に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項３】
上記第１アイソフォームと上記第２アイソフォームとは、（i）抗体様分子結合、（ii）抗体結合、または（iii）抗体もしくは抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞の反応、または（iv）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有している免疫エフェクター細胞（特に、Ｔ細胞）の反応、によって区別できる、請求項１または２に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項４】
上記表面タンパク質は、以下から選択され：
ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗｌ２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｕ、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１５ｓｕ、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５ａ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｅ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７ａ、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、ＣＤ３７１、ＢＣＭＡ、免疫グロブリン軽鎖（λまたはκ）、ＨＬＡタンパク質、およびβ２−ミクログロブリン；
特に、上記表面タンパク質は、下記から選択される：
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡ、免疫グロブリン軽鎖（λまたはκ）、ＨＬＡタンパク質およびβ２−ミクログロブリン；
請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項５】
上記第１アイソフォームは、上記患者の元来のゲノムＤＮＡにはコードされていない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項６】
上記第１アイソフォームは、上記患者の元来のゲノムＤＮＡ中にある上記表面タンパク質の遺伝子をコードしている配列を変化させることによって得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項７】
上記第１アイソフォームは、上記表面タンパク質の上記第２アイソフォームのアミノ酸配列において、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸（または、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１５個もしくは２０個のアミノ酸）を、挿入、欠失および／または置換させることによって得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項８】
上記挿入、欠失および／または置換は、以下の工程によって達成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞：
（ａ）異なる哺乳動物種の１または数個の相同配列（特に、マウス、ラット、霊長類およびヒトのホモログ）を比較し、非保存部位に挿入、欠失および／または置換を配置する工程；
（ｂ）コンピュータ支援構造予測によって、挿入、欠失および／または置換を施される領域の二次構造が変化しないと予測される挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｃ）コンピュータ支援構造予測に従って、リガンド結合が可能な部位に位置している挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｄ）上記表面タンパク質の、予想されるまたは実験的に確立されたタンパク質−タンパク質相互作用に関与していない、配列中の挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｅ）ジスルフィド結合、分子間相互作用もしくは分子内相互作用、疎水性スタッキングを削除または導入しない挿入、欠失および／または置換を選択する工程；ならびに、
（ｆ）タンパク質の折畳みに重要な、タンパク質の翻訳後修飾部位を削除または導入しない挿入、欠失および／または置換を選択する工程。
【請求項９】
上記挿入、欠失および／または置換は、上記第１表面タンパク質の細胞外の部位（特に、細胞外ループ）に位置している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１０】
上記細胞は、上記表面タンパク質の上記第２アイソフォームを発現している細胞の特異的除去の前、同時または後に投与され、
特に、上記表面タンパク質の上記第２アイソフォームを発現している細胞の除去は、（i）抗体様分子、（ii）抗体、（iii）抗体または抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞、および、（iv）キメラ抗原受容体を有している免疫エフェクター細胞（特に、Ｔ細胞）から選択される薬剤を、上記患者に投与することによって行われ、
上記薬剤は、上記細胞表面タンパク質の上記第２アイソフォームと特異的に反応するが、上記第１アイソフォームとは特異的に反応しない、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１１】
上記細胞は、上記表面タンパク質の上記第２アイソフォームに対して反応する抗体または抗体様分子（特に、キメラ抗原受容体）を発現している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１２】
上記表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ８およびＣＤ４から選択され、
特に、上記表面タンパク質は、ＣＤ４５である、
請求項１１に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１３】
上記哺乳動物細胞は、造血細胞（特に、造血幹細胞またはＴ細胞）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１４】
上記細胞は、上記患者に存在する疾患関連遺伝子異常を修正する遺伝子改変を有している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１５】
上記疾患関連遺伝子異常は、Ｆｏｘｐ３の変異である、請求項１４に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１６】
上記治療は、Ｔ細胞媒介性疾患（特に、ＩＰＥＸ様症候群、ＣＴＬＡ−４関連免疫調節障害、血球貪食症候群、ＡＬＰＳ症候群、または、ヘテロ接合性の生殖細胞ＰＴＥＮ変異に起因する症候群）の治療である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の治療に使用するための哺乳動物細胞。
【請求項１７】
医学的状態の治療に使用するための、下記から選択される薬剤であって、
（ａ）抗体または抗体様分子を含んでいる化合物、または、抗体または抗体様分子からなる化合物；および、
（ｂ）抗体もしくは抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞、または、キメラ抗原受容体を有している免疫エフェクター細胞；
上記薬剤は、表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に反応し、
上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームは、当該表面タンパク質の上記第２アイソフォームと、機能的に区別できないが、免疫学的には区別でき、
上記薬剤を投与することにより、上記薬剤が反応するアイソフォームを有している細胞が除去される、
薬剤。
【請求項１８】
上記抗体または抗体様分子は、毒素（特に、サポリン）に連結されている、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
上記薬剤は、二重特異性抗体または二重特異性抗体様分子である、請求項１７または１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
上記薬剤は、二重特異性抗体または二重特異性抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞である、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項２１】
上記薬剤は、下記を有している免疫エフェクター細胞である、請求項１７に記載の薬剤：
（ａ）第１表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に反応する第１抗体または第１抗体様分子であって、
上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび上記第２アイソフォームは、機能的に区別できないが免疫学的には区別できる、第１抗体または第１抗体様分子；ならびに、
（ｂ）第２表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に反応する第２抗体または第２抗体様分子であって、
上記第２表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび上記第２アイソフォームは、機能的に区別できないが免疫学的には区別できる、第２抗体または第２抗体様分子。
【請求項２２】
上記薬剤は、抗体様分子（特に、キメラ抗原受容体）を有している抗体様分子（特に、Ｔ細胞）であり、
上記医学的状態は、造血性疾患（特に、悪性造血性疾患）である、
請求項１７、２０または２１のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２３】
移植片対宿主病の治療に使用するための、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２４】
下記を含んでいる、複合薬剤であって、
（ａ）第１表面タンパク質に対して反応する、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の第１薬剤；および、
（ｂ）第２表面タンパク質に対して反応する、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の第２薬剤；
特に、造血性疾患の治療のための複合薬剤（とりわけ、悪性造血性疾患の治療のための複合薬剤）。
【請求項２５】
上記第１薬剤および上記第２薬剤は、キメラ抗原受容体を有しているＴ細胞である、請求項２４に記載の複合薬剤。
【請求項２６】
上記第１表面タンパク質はＣＤ１９であり、上記第２表面タンパク質はＣＤ４５である、請求項２４または２５に記載の複合薬剤。
【請求項２７】
患者において表面タンパク質の第１アイソフォームを発現している細胞を、in vivoで追跡する方法であって、
上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームは、上記表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別でき、
上記第１アイソフォームに特異的に反応するリガンドを、上記患者に投与する工程を含む、
方法。
【請求項２８】
下記の工程を含む、in vivoで細胞を選択的に枯渇または濃縮する方法：
（ａ）細胞を提供する工程であって、
上記細胞は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現しており、
上記第１アイソフォームは、アミノ酸マーカーに関して、上記表面タンパク質の第２アイソフォームとは異なっており、
上記第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含んでおり、
上記第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含んでいる、工程；
（ｂ）上記細胞のゲノムＤＮＡ中において、上記核酸配列Ａから上記核酸配列Ｂへの変異を誘導する工程；ならびに、
（ｃ）上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を選択的に濃縮／枯渇する工程。
【請求項２９】
下記の構成要素を備えている、キット：
（ａ）細胞表面タンパク質をコードしている遺伝子のゲノム位置を標的とする、塩基エディタガイドＲＮＡであって、
（i）上記遺伝子には、核酸のマーカー配列に関して異なる２種類のアイソフォームが存在しており、アイソフォーム１は第１マーカー配列を有しており、アイソフォーム２は第２マーカー配列を有しており、
（ii）上記ゲノム位置は、塩基エディタＰＡＭ配列と、上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列と、を有している、塩基エディタガイドＲＮＡ；ならびに、
（ｂ）任意構成で、アイソフォーム１およびアイソフォーム２の遺伝子産物にそれぞれ特異的に結合する、第１抗体および第２抗体。
【請求項３０】
上記細胞表面タンパク質は、マウスＴｈｙ１またはマウスＣＤ４５である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
上記細胞表面タンパク質は、マウスＣＤ４５であり、
上記塩基エディタガイドＲＮＡは、配列番号００４、配列番号００５、および配列番号００６から選択される核酸配列を有している、
請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
以下の構成要素を備えているキット：
（ａ）細胞表面タンパク質をコードしている遺伝子のゲノム位置を標的とする、ガイドＲＮＡであって、
（i）上記遺伝子には、核酸のマーカー配列に関して異なる２種類のアイソフォームが存在しており、アイソフォーム１は第１マーカー配列を有しており、アイソフォーム２は第２マーカー配列を有しており、
（ii）上記ゲノム位置は、ＰＡＭ配列と、上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列と、を有している、ガイドＲＮＡ；
（ｂ）下記（i）〜（iii）を有している、ＤＮＡコンストラクト；ならびに、
（i）上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列
（ii）上記ＰＡＭ配列（特に、変異しており非機能性である上記ＰＡＭ配列）
（iii）上記細胞表面タンパク質をコードしている遺伝子の上記ゲノム位置の、５’および３’におけるゲノムＤＮＡ配列に相同である、一対の相同性アーム
（ｃ）任意構成で、アイソフォーム１およびアイソフォーム２の遺伝子産物にそれぞれ特異的に結合する、第１抗体および第２抗体。
【請求項３３】
上記相同性アームは、各々が、８５塩基対（ｂｐ）以上、特に４５０ｂｐ以上、とりわけ約２０００ｂｐを含んでいる、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
上記細胞表面タンパク質は、マウスＴｈｙ１またはマウスＣＤ４５である、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
上記細胞表面タンパク質は、マウスＴｈｙ１であり、
下記（ａ）または（ｂ）を満たす、請求項３２に記載のキット：
（ａ）上記ガイドＲＮＡは、配列番号００１であり、
上記ＤＮＡコンストラクトは、配列番号００７（ｎｏ  ｍｕｔ）、配列番号００８（ｍｕｔ）、配列番号００９（４ｘ  ｍｕｔ）、配列番号０１０（２ｋｂ）、配列番号０１１（４ｋｂ）、配列番号０１２（１ｋｂ）、および配列番号０１３（１６０ｂｐ）から選択される；または、
（ｂ）上記ガイドＲＮＡは、配列番号００２であり、
上記ＤＮＡコンストラクトは、配列番号０１４（１２０ｂｐ）および配列番号０１５（１８０ｂｐ）から選択される。
【請求項３６】
上記細胞表面タンパク質は、マウスＣＤ４５であり、
上記ガイドＲＮＡは、配列番号００３であり、
上記ＤＮＡコンストラクトは、配列番号０１６、配列番号０１７（１ｋｂ）、配列番号０１８（２ｋｂ）および配列番号０１９（４ｋｂ）から選択される、
請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
安定なＣａｓ９発現のために遺伝子操作されたマウスＴ細胞を含んでいる、請求項３２〜３６のいずれか１つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞集団の選択的な枯渇または濃縮が望ましい医療用途における、変異体ではあるが機能性の細胞表面タンパク質を有している細胞の使用に関する。ＤＮＡ二本鎖切断の相同組換え修復などの遺伝子編集方法（特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集）によって、あるいは塩基エディタを使用することによって、変異体ではあるが機能性の細胞表面タンパク質を細胞に導入することができる。本発明はさらに、in vivoにおいて編集済細胞を選択的に枯渇させるための、薬剤および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞療法は非常に強力な治療の選択肢であるが、重篤かつ望ましくない副作用を伴うことが多い。導入する細胞の導入遺伝子および／または遺伝子操作が、悪性形質転換を引き起こす場合がある。ＣＡＲ−Ｔ細胞の導入により、重篤なオン・ターゲット効果およびオフ・ターゲット効果（サイトカイン放出症候群）をもたされる場合がある。また、同種Ｔ細胞の導入は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす場合がある。腫瘍学における細胞療法の成功によって、非悪性疾患を含む他の適応症のための細胞療法が促進される可能性が高い。細胞療法の安全性を高めるために、特に非致死性疾患の治療に使用される場合には、移植した細胞が移植後数年間に亘って確実に安全なものであることが重要となる。重篤な望ましくない副作用が発生している場合に、「安全スイッチ」または「殺傷スイッチ」によって移植細胞を能動的かつ選択的に枯渇させる可能性があるならば、細胞療法の安全性は顕著に増大するであろう。
【０００３】
本発明に通底する課題は、細胞を永久的に標識して追跡するシステムを提供することである。このシステムは、標識された細胞または標識されていない細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、選択的に枯渇させることができる。これらの課題は、独立請求項の構成によって解決される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現している哺乳動物細胞に関しており、
上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームは、当該表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別でき、
上記哺乳動物細胞は、上記表面タンパク質の上記第２形態を発現している細胞を有する患者の治療に使用するためものである。
【０００５】
「免疫学的には区別できる」という表現は、第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に結合するリガンドによって区別することができる、表面タンパク質の第１アイソフォームおよび第２アイソフォームを表す。
【０００６】
本明細書に関連して、「特異的結合」という表現は、解離定数：ＫＤ≦１０−７である結合を表す。
【０００７】
本明細書に関連して、「リガンド」という表現は、抗体または抗体様分子に関する。抗体または抗体様分子は、他の分子と連結されていてもよい（例えば、免疫毒素と）。あるいは、抗体または抗体様分子は、細胞（特に、免疫細胞）の表面上に存在していてもよい。
【０００８】
本明細書に関連して、「抗体」という用語は、細胞生物学および免疫学の分野で知られている意味で使用される。この用語は、（i）全長抗体（免疫グロブリンのＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）またはＭ型（ＩｇＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない）、（ii）これらの任意の抗原結合断片または単鎖、および、（iii）これらに関連するコンストラクトまたはこれらから誘導されるコンストラクト、を表す。全長抗体とは、２本以上の重鎖（Ｈ鎖）および２本以上の軽鎖（Ｌ鎖）を含んでいる糖タンパク質であって、重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって相互に連結されている。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成されている。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からから構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを有している。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと宿主組織（または宿主因子）との結合を媒介することができる。このような宿主組織または宿主因子としては、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、および古典的補体系の第１成分が挙げられる。
【０００９】
本明細書に関連して、「抗体様分子」という用語は、他の分子または標的に、高い親和性で特異的に結合することができる分子を表す（ＫＤ≦１０−７ｍｏｌ／Ｌ、特にＫＤ≦１０−８ｍｏｌ／Ｌ）。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同様に、標的に結合する。用語「抗体様分子」には、リピート含有タンパク質（設計されたアンキリンリピート含有タンパク質（Molecular Partners, Zuerich）など）、アルマジロリピート含有タンパク質に由来するポリペプチド、ロイシンリッチリピート含有タンパク質に由来するポリペプチド、Affimer、抗体由来分子（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）など）、およびテトラトリコペプチドリピート含有タンパク質に由来するポリペプチド、が含まれる。
【００１０】
用語「抗体様分子」には、さらに、タンパク質Ａドメインに由来するポリペプチド、フィブロネクチンのドメインＦＮ３に由来するポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメインに由来するポリペプチド、リポカリンに由来するポリペプチド、ジンクフィンガーに由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）に由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同性ドメイン３（ＳＨ３）に由来するポリペプチド、ＰＤＺドメインに由来するポリペプチド、γクリスタリンに由来するポリペプチド、ユビキチンに由来するポリペプチド、シスチンノットポリペプチドに由来するポリペプチド、およびノッチンに由来するポリペプチド、が含まれる。
【００１１】
理想的には、表面タンパク質の第１アイソフォームおよび第２アイソフォームは、２種類のリガンドによって区別することができる。一方のリガンドは、第１アイソフォームを特異的に認識できる。他方のリガンドは、第２アイソフォームを特異的に認識できる。つまり、各リガンドは、一方のアイソフォームに特異的に結合できるが、他方のアイソフォームには特異的に結合できない。換言すれば、一方のアイソフォームにのみ特異的に結合し、他方には特異的に結合しないことによって、リガンドは２種類のアイソフォームを区別できる。
【００１２】
「機能的に区別できない」という表現は、第１アイソフォームおよび第２アイソフォームが、細胞内で同じ機能を同じように果たすことができ、顕著な機能上の障害を伴わないことを表す。つまり、第１アイソフォームおよび第２アイソフォームは、機能的にはほとんど区別できない。特定の実施形態においては、少々の機能上の障害ならば許容されうる。
【００１３】
本明細書に関連して、「細胞表面タンパク質の第１アイソフォームおよび／または第２アイソフォーム」という表現は、当該細胞表面タンパク質の、第１アレルおよび第２アレルを表す。
【００１４】
特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００１５】
特定の実施形態において、表面タンパク質の第２アイソフォームは、タンパク質の野生型の形態（すなわち、通常天然に存在している形態）に関連している。一方、第１アイソフォームは、第２アイソフォームをコードしている核酸配列に変異を導入することによって得られるアイソフォームに関連している。
【００１６】
特定の実施形態において、表面タンパク質の第２アイソフォームは、天然のアイソフォームである。一方、第１アイソフォームは、遺伝子操作アイソフォームであり、天然のアイソフォームに由来している。
【００１７】
本明細書に関連して、「天然タンパク質」という表現は、細胞のゲノム内の核酸配列によってコードされているタンパク質を表す。この核酸配列は、遺伝子操作による挿入または変異を受けていない。換言すれば、天然タンパク質とは、遺伝子組換え蛋白質でもなく、遺伝子操作されたタンパク質でもないタンパク質である。
【００１８】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、細胞外ポリペプチド配列を有している。このとき、第１アイソフォームと第２アイソフォームとを比較すると、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１５個または２０個アミノ酸が、挿入、欠失および／または置換している。
【００１９】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、細胞外ポリペプチド配列を有している。このとき、第１アイソフォームと第２アイソフォームとを比較すると、１〜２０個（特に１〜５個、とりわけ１〜３個）のアミノ酸が、挿入、欠失および／または置換している。
【００２０】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、細胞外ポリペプチド配列を有している。このとき、第１アイソフォームと第２アイソフォームとを比較すると、１個のアミノ酸が挿入、欠失および／または置換している。
【００２１】
特定の実施形態において、挿入、欠失、および／または置換は、異なる哺乳動物種の間において保存されていない部位に位置している。
【００２２】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、表面タンパク質の二次構造を変化させない。
【００２３】
特定の実施形態において、挿入、欠失、および／または置換は、結晶構造解析またはコンピュータ支援構造予測によって特定された、リガンド結合が可能な部位に位置している。
【００２４】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、結晶構造解析またはコンピュータ支援構造予測によって特定された、他の哺乳動物のタンパク質と比較して固有のトポロジーを有する部位に位置している。
【００２５】
本明細書に関連して、「固有のトポロジー」という表現は、ある表面タンパク質（この表面タンパク質を、１〜２０個のアミノ酸で挿入、欠失および／または置換して修飾する）にのみ存在し、他の哺乳動物のタンパク質には存在しない（特に、他のヒト表面タンパク質には存在しない）トポロジーを表す。他のタンパク質において、同一または非常に類似したトポロジーが存在していると、上記部位に位置しているエピトープを認識する特異的抗体の産生が妨げられる。
【００２６】
特定の実施形態において、挿入、欠失、および／または置換は、予想される（または実験的に確立もしくは確認された）タンパク質−タンパク質相互作用に関与する表面タンパク質の部位に位置していない。
【００２７】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、ジスルフィド結合、分子間相互作用もしくは分子内相互作用、疎水性スタッキングを削除または導入しない。挿入、欠失および／または置換によって、塩橋性の分子間相互作用または分子内相互作用を削除する場合、この塩橋性相互作用の削除が、タンパク質内の新しい相互作用によって補填されることを確認せねばならない。補填されないならば、塩橋性相互作用の削除は回避すべきである。
【００２８】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、タンパク質の折畳みに重要なタンパク質の翻訳後修飾部位（特に、グリコシル化部位）を、削除または導入しない。
【００２９】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、タンパク質の折畳みに関連しないタンパク質の翻訳後修飾部位（特に、グリコシル化部位）を削除または導入する。これによって、新規なエピトープを作製する。
【００３０】
特定の実施形態において、第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、抗体様分子の結合または抗体の結合によって区別できる。
【００３１】
特定の実施形態において、第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、抗体を有している免疫エフェクター細胞の反応によって区別できる。特定の実施形態において、第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞の反応によって区別できる。特定の実施形態において、第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、抗体を有している免疫エフェクター細胞の反応によって区別できる。特定の実施形態において、第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞の反応によって区別できる。特定の実施形態において、第１アイソフォームと第２アイソフォームとは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有しているＴ細胞（特に、活性化Ｔ細胞）の反応によって区別できる。
【００３２】
本明細書に関連して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、結合特異性（特に、モノクローナル抗体の特異性）をＴ細胞に移植した、改変受容体に関する。一般的なＣＡＲの形態には、（i）所望の結合特異性を有しているモノクローナル抗体に由来する、細胞外ドメイン、（ii）膜貫通ドメイン、（iii）細胞内ドメイン、が含まれている（Gill and June, Imm Rev, 2014）。細胞外ドメインには、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域を有している、単鎖可変断片が含まれている。ＣＡＲの細胞外ドメインをコードしているヌクレオチド配列は、所望の結合特異性を有している抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞に由来していてもよい（Gill and June, Imm Rev, 2014; Fields, Nat Prot, 2013）。
【００３３】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、下記から選択される：
ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗｌ２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｕ、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１５ｓｕ、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５ａ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｅ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７ａ、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、ＣＤ３７１、免疫グロブリン軽鎖（λまたはκ）、ＨＬＡタンパク質およびβ２−ミクログロブリン。
【００３４】
本明細書に関連して、ＨＬＡとは、「ヒト白血球抗原」を表す。ＨＬＡとしては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ．Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲなどが挙げられる。
【００３５】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、下記から選択される：
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、免疫グロブリン軽鎖（λまたはκ）、ＨＬＡタンパク質およびβ２−ミクログロブリン。
【００３６】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂおよびＣＤ２７９から選択される。
【００３７】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯから選択される。
【００３８】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１１７から選択される。
【００３９】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）およびＣＤ３１９から選択される。
【００４０】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８およびＣＤ２６９から選択される。
【００４１】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ４およびＣＤ８から選択される。
【００４２】
特定の実施形態において、表面タンパク質はＣＤ４５である。
【００４３】
特定の実施形態において、表面タンパク質はＴｈｙ１（ＣＤ９０）である。
【００４４】
特定の実施形態において、表面タンパク質はＣＤ１９である。
【００４５】
本明細書に関連して、「Ｔｈｙ１」とは、"thymus cell antigen 1, theta"を表す（別名ＣＤ９０；UniProt ID P04216: (human)）。
【００４６】
本明細書に関連して、「ＣＤ４５」とは、"protein tyrosine phosphatase, receptor type, C (Ptprc)"を表す（UniProt ID: P08575 (human)）。
【００４７】
実施例の動物実験におけるＣＤ４５およびＣＤ９０は、ヒトの遺伝子およびヒトのタンパク質の、マウスにおけるホモログを表す。請求項３０〜３１および３４〜３６では、特に、マウスのホモログである「マウスＣＤ４５」および「マウスＣＤ９０／Ｔｈｙ１」を表す。
【００４８】
特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ４である。特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ２である。特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＣＤ８である。特定の実施形態において、表面タンパク質は、ＨＬＡタンパク質である。
【００４９】
特定の実施形態において、表面タンパク質の第１アイソフォームは、患者の元来のゲノムＤＮＡにコードされていない。
【００５０】
特定の実施形態において、細胞は、同種異系細胞である。同種異系細胞とは、細胞を受容する者と遺伝的に類似している、ドナー由来の細胞を表す。ドナーは、血縁者であってもよいし、血縁者でなくてもよい。
【００５１】
特定の実施形態において、細胞は、自家細胞である。同種異系細胞とは、細胞を受容する者と同じ人に由来する細胞をいう。
【００５２】
特定の実施形態においては、患者の元来のゲノムＤＮＡ中にある表面タンパク質をコードしている配列を変化させ、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換を誘導することによって、第１アイソフォームを得た。
【００５３】
特定の実施形態においては、表面タンパク質をコードしているｍＲＮＡを、ＲＮＡ編集技術で変化させることによって、第１アイソフォームを得た（Zhang, 2017）。この方法は、ゲノムＤＮＡを変化させないが、表面タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸を挿入、欠失および／または置換する。
【００５４】
特定の実施形態においては、表面タンパク質の第２アイソフォームのアミノ酸配列中の、１個、２個、３個、４個または５個（または、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１５個または２０個）のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を誘導することによって、第１アイソフォームを得た。
【００５５】
特定の実施形態においては、表面タンパク質の第２アイソフォームのアミノ酸配列中の１〜２０個（特に１〜５個、とりわけ１〜３個）のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を誘導することによって、第１アイソフォームを得た。
【００５６】
特定の実施形態においては、表面タンパク質の第２アイソフォームのアミノ酸配列中の１個のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を誘導することによって、第１アイソフォームを得た。
【００５７】
アミノ酸の挿入、欠失および／または置換は、患者の元来のゲノムＤＮＡ中にある、表面タンパク質をコードしている配列を変化させることによって達成することができる（遺伝子編集）。あるいは、表面タンパク質をコードしているｍＲＮＡを変化させることによって達成することができる（ＲＮＡ編集）。両方の編集形態も、タンパク質のアミノ酸配列に変化を生じさせる。
【００５８】
特定の実施形態において、挿入、欠失、および／または置換は、下記の工程によって行われる：
（ａ）異なる哺乳動物種の１または数個の相同配列（特に、マウス、ラット、霊長類およびヒトのホモログ）を比較し（アラインメントし）、非保存部位に挿入、欠失および／または置換を配置する工程；
（ｂ）結晶構造解析またはコンピュータ支援構造予測によって、挿入、欠失および／または置換を施される領域の二次構造が変化しないと予測される挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｃ）結晶構造解析コンピュータ支援構造予測に従って、リガンド結合が可能な部位に位置している挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｄ）上記表面タンパク質の、予想されるまたは実験的に確立されたタンパク質−タンパク質相互作用に関与していない、配列中の挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｅ）ジスルフィド結合、分子間相互作用もしくは分子内相互作用、疎水性スタッキングを削除または導入しない挿入、欠失および／または置換を選択する工程；あるいは、
（ｆ）タンパク質の折畳みに重要な、タンパク質の翻訳後修飾部位（特に、グリコシル化部位）を削除または導入しない挿入、欠失および／または置換を選択する工程。
【００５９】
特定の実施形態において、挿入、欠失、および／または置換は、下記の工程によって行われる：
（ａ）異なる哺乳動物種の１または数個の相同配列（特に、マウス、ラット、霊長類およびヒトのホモログ）を比較し（アラインメントし）、非保存部位に挿入、欠失および／または置換を配置する工程；
（ｂ）結晶構造解析またはコンピュータ支援構造予測によって、挿入、欠失および／または置換を施される領域の二次構造が変化しないと予測される挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｃ）結晶構造解析コンピュータ支援構造予測に従って、リガンド結合が可能な部位に位置している挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｄ）上記表面タンパク質の、予想されるまたは実験的に確立されたタンパク質−タンパク質相互作用に関与していない、配列中の挿入、欠失および／または置換を選択する工程；
（ｅ）ジスルフィド結合、分子間相互作用もしくは分子内相互作用、疎水性スタッキングを削除または導入しない挿入、欠失および／または置換を選択する工程；ならびに、
（ｆ）タンパク質の折畳みに重要な、タンパク質の翻訳後修飾部位（特に、グリコシル化部位）を削除または導入しない挿入、欠失および／または置換を選択する工程。
【００６０】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、結晶構造解析またはコンピュータ支援構造予測に従って、他の哺乳動物のタンパク質と比較して固有のトポロジーを有している部位に位置するように選択される。
【００６１】
本明細書に関連して、非保存部位とは、進化の間に頻繁に変異が発生している部位に関する（多数の相同配列の多重配列アラインメント（ＭＳＡ）から推定される）。部位特異的な保存は、特定の部位において作用する、機能上または構造上の制約の存在を示している。これによって、タンパク質の構造または機能を保存する際の、重要性を評価できる。各部位における溶媒の接近しやすさの程度は、入手可能な実験的に決定された構造から予想（または観測）される。この溶媒の接近しやすさの程度によって、構造上重要な部位（高度に保存され、内部に存在することが多い）と、機能的に重要な部位（リガンド結合、基質結合またはタンパク質−タンパク質相互作用に関与している。また、高度に保存され、露出されている）と、が区別できる。したがって、本明細書に関連して、非保存部位とは、進化上あまり保存されておらず、溶媒の接近が容易である部位に関する。
【００６２】
類似した配列を検索する方法は充分に確立されており、相同性の推定に日常的に使用されている。このような方法としては、広汎に使用されているＢＬＡＳＴの他、より感度の高い、プロファイルに基づく方法や隠れMarkovモデルに基づく方法が挙げられる（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＨＨｂｌｉｔｓなど）。
【００６３】
ローカルアラインメント情報およびグローバルアラインメント情報を効果的に組合せることによって、相同配列の多重配列アラインメントを得ることができる（Ｔ−ＣＯＦＦＥＥが実行しているように）。あるいは、可能であれば、構造情報を組み込んでＭＳＡを構築させても、相同配列の多重配列アラインメントを得ることができる（ＭＡＦＦＴ、ＰＲＯＭＡＬＳ３Ｄ、３Ｄ  Ｃｏｆｆｅｅ）。
【００６４】
ＭＳＡから部位特異的保存を効果的に推定する方法は、Shannonエントロピーの測定、類似性に基づくマトリクス（すなわち、ＢＬＯＳＵＭ）、または確率進化モデル（最尤および経験Bayesパラダイム（Rate4Site）など）に基づいている。
【００６５】
タンパク質の三次元構造を予測する効果的な方法としては、比較に基づく方法（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ、ＭＯＤＥＬＬＥＲ、ＲａｐｔｏｒｘおよびＩｎｔＦＯＬＤなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
Ｂ細胞のエピトープを予測する方法は、アミノ酸の物理化学的特性（すなわち、疎水性、柔軟性、極性、および露出している表面）を利用して、不連エピトープまたは線状エピトープのいずれかの一部である確率を、残基に基づいて提供する。このようなツールとしては、Ｅｌｌｉｐｒｏ、ＳＥＰＰＡ、ＢｅｐｉＰｒｅｄ、ＡＢＣｐｒｅｄ、ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ、ＥｐｉＳｅａｒｃｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
特定の実施形態において、挿入、欠失および／または置換は、第１表面タンパク質の細胞外の部位（特に、細胞外ループ）に位置している。細胞外ループにおける変異は、タンパク質の機能に影響を及ぼしにくい。
【００６８】
所定の表面タンパク質に対して反応する抗体または抗体様分子が既に存在する場合、この抗体によって認識される当該所定の表面タンパク質のエピトープの情報を用いて、挿入、欠失および／または置換の部位を選択することができる。上記既存の抗体が結合するエピトープを備えている上記所定のタンパク質のアイソフォームは、第２アイソフォームに対応している。また、改変エピトープを備えている上記所定のタンパク質の新規な改変アイソフォームは、第２アイソフォームに対応している。
【００６９】
ＣＤＲモデリングについては、［Messih, Bioinformatics, 2014］にて説明されている。
【００７０】
特定の実施形態においては、表面タンパク質の第２アイソフォームを発現している細胞の特異的除去前に、除去と同時に、または除去後に、細胞を投与する。特定の実施形態においては、抗体様分子、抗体、抗体または抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞、およびキメラ抗原受容体を有している免疫エフェクター細胞（特に、Ｔ細胞）から選択される薬剤を患者に投与することによって、表面タンパク質の第２アイソフォームを発現している細胞を除去する。このとき、上記薬剤は、細胞表面タンパク質の第２アイソフォームに特異的に反応するが、第１アイソフォームには特異的に反応しない。
【００７１】
特定の実施形態において、細胞は、表面タンパク質の第２アイソフォームに対して反応する抗体または抗体様分子を発現している。
【００７２】
特定の実施形態において、細胞は、表面タンパク質の第２アイソフォームに対して反応するキメラ抗原受容体を発現している。
【００７３】
特定の実施形態において、細胞は、表面タンパク質の第２アイソフォームに対して反応する抗体または抗体様分子（特に、キメラ抗原受容体）を発現している。このとき、上記表面タンパク質は、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ８およびＣＤ４から選択される。特に、表面タンパク質は、ＣＤ４５である。
【００７４】
特定の実施形態において、細胞は、下記を発現している：
（ａ）第１表面タンパク質の第１アイソフォームであって、当該第１表面タンパク質の第１アイソフォームは、第１表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別できる、第１アイソフォーム；および、
（ｂ）第２表面タンパク質の第１アイソフォームであって、当該第２表面タンパク質の第１アイソフォームは、第２表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別できる。
【００７５】
特定の実施形態において、第１表面タンパク質はＣＤ１９であり、第２表面タンパク質はＣＤ４５である。
【００７６】
特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、造血幹細胞（血球芽細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、自然リンパ球（ＩＬＣ）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂリンパ球、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、およびガンマデルタＴ細胞（γδＴ）を含む群から選択される。
【００７７】
特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、造血細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、造血幹細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、免疫細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、Ｂ細胞である。
【００７８】
特定の実施形態において、細胞は遺伝子改変されており、これにより、患者に存在する疾患関連遺伝子異常を修正したり、打消したりする。「疾患関連遺伝子異常を修正する遺伝子改変」という表現は、導入遺伝子の挿入、疾患関連変異の遺伝子修正、遺伝子の削除（特に、疾患関連変異を有している遺伝子の削除）、遺伝子の発現に重要なエピジェネティック修飾の変化、またはそれらの組合せなども含まれる。「遺伝子の削除」という表現は、例えば、途中に終止コドンを挿入することによって、あるいは調節リプレッサー配列を挿入することによって、遺伝子の機能を削除すること（つまり、遺伝子の発現を阻害すること）なども含まれる。
【００７９】
特定の実施形態において、細胞は、導入遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、導入遺伝子は、疾患関連遺伝子異常によって影響を受けるタンパク質の、機能的なアイソフォームをコードしている核酸配列である。導入遺伝子は、疾患関連遺伝子異常を有していない。
【００８０】
特定の実施形態において、細胞は、疾患関連変異の遺伝子修正を含んでいる。細胞が疾患関連遺伝子異常の遺伝子修正を含んでいる場合、天然の遺伝子の中にある疾患を引き起こす変異は、遺伝子編集技術を用いて修正される。
【００８１】
本明細書に関連して、遺伝子編集または遺伝子操作とは、生物のゲノムにおいて、核酸配列の挿入、欠失または置換を与える技術に関する。遺伝子編集は、ゲノムＤＮＡにおける部位特異的な二本鎖切断を伴う。あるいは、遺伝子編集は、ゲノムＤＮＡにおける部位特異的な一本鎖切断（ニック）を伴う。非限定的な例として、遺伝子編集は、（i）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって媒介される部位特異的な二本鎖切断後のＨＤＲによって達成することができるし、（ii）部位特異的な塩基エディタの使用によっても達成することができる。
【００８２】
特定の実施形態において、疾患関連遺伝子異常は、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＣＤ２５遺伝子、Ｓｔａｔ５ｂ遺伝子、Ｓｔａｔ１遺伝子およびＩｔｃｈ遺伝子から選択される遺伝子における変異である。
【００８３】
特定の実施形態において、疾患関連遺伝子異常は、Ｆｏｘｐ３遺伝子における変異である。
【００８４】
特定の実施形態は、患者へ哺乳動物細胞を投与した後に、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が発症する場合に関連している。これらの場合、細胞表面タンパク質の第１アイソフォームに特異的に結合するが、第２アイソフォームには特異的に結合しない抗体または抗体様分子を患者に投与することによって、細胞を特異的に除去する。あるいは、細胞表面タンパク質の第１アイソフォームに特異的に反応するが、第２アイソフォームには特異的に反応しない免疫エフェクター細胞（特に、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を患者に投与することによって、細胞を特異的に除去する。
【００８５】
特定の実施形態において、治療には、造血幹細胞の移植が含まれる。
【００８６】
特定の実施形態において、治療には、Ｔ細胞の移植が含まれる（つまり、Ｔ細胞療法）。
【００８７】
特定の実施形態において、治療には、臓器移植が含まれる。
【００８８】
特定の実施形態において、治療は、遺伝性の造血性疾患の治療に関する。遺伝性の造血性疾患の非限定的な例としては、サラセミアが挙げられる。
【００８９】
特定の実施形態において、治療は、Ｔ細胞媒介疾患（特に、遺伝性のＴ細胞媒介疾患）の治療に関する。とりわけ、ＩＰＥＸ様症候群、ＣＴＬＡ−４関連免疫調節障害症、血球貪食症候群、ＡＬＰＳ症候群、またはヘテロ接合性の生殖細胞ＰＴＥＮ変異に起因する症候群の治療に関する。
【００９０】
特定の実施形態において、Ｔ細胞媒介性疾患は、腺性内分泌不全症・腸疾患を伴う免疫調節障害（Ｘ連鎖性）症候群（ＩＰＥＸ、ＯＭＩＭ：http://www.omim.org/entry/304790）またはＩＰＥＸ様症候群である。このとき、上記ゲノム位置は、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＣＤ２５遺伝子、Ｓｔａｔ５ｂ遺伝子、Ｓｔａｔ１遺伝子およびＩｔｃｈ遺伝子から選択される遺伝子に含まれる変異である（Verbsky and Chatila, Curr Opin Pediatr. 2013 Dec;25(6):708-14）。これらの遺伝子における変異は、遺伝子産物の発現または正常な機能を妨げる。これらのゲノム位置を編集して、変異を排除すると、遺伝子およびタンパク質の発現が回復する。
【００９１】
特定の実施形態において、治療は、免疫不全症、（特に、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ））の治療に関する。
【００９２】
特定の実施形態において、疾患関連遺伝子異常はＦｏｘｐ３遺伝子の変異であり、疾患は腺性内分泌不全症・腸疾患を伴う免疫調節障害（Ｘ連鎖性）症候群（ＩＰＥＸ）である。特定の実施形態において、疾患関連遺伝子異常は、Ｆｏｘｐ３の変異（特に、Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘの変異）である。この変異は、遺伝子産物の正常な機能を妨げる。このゲノム位置の編集により、変異型ＤＮＡ配列が野生型ＤＮＡ配列に戻り、したがって、Ｆｏｘｐ３遺伝子およびＦｏｘｐ３タンパク質の発現が回復する（図２０）。
【００９３】
機序こそ異なるものの、非常に攻撃的であるため、ＩＰＥＸは腫瘍／癌に匹敵する悪性疾患と見做すことができる。疾患関連遺伝子異常を有している病原性の造血細胞／免疫細胞の除去は、少なくとも一時的には正当化される。
【００９４】
本明細書に関連して、「Ｆｏｘｐ３遺伝子」という用語は、"human forkhead box P3, NCBI GENE ID: 50943"に関する。本願実施例に記載の動物実験では、マウスＦｏｘｐ３ｋ２７６Ｘ変異を遺伝子編集により修復した。この変異は、臨床的に関連するヒトＦｏｘｐ３変異を再現している（Ramsdell et al., Nature reviews. Immunology 14, 343-349 (2014); Lin et al., The Journal of allergy and clinical immunology 116, 1106-1115 (2005)）。
【００９５】
本発明者らは、遺伝子編集によってマウスＴ細胞のＦｏｘｐ３ｋ２７６Ｘ変異を修正できることを示した（図２０、２１、２２、２６）。また、本発明者らは、修復済Ｔ細胞が機能性であり、他の免疫細胞を抑制できることをも実証した（図２４、２５）。これらのＴ細胞は、（i）直接修復されたものであってもよいし、（ii）修復済ＨＳＣに由来していてもよいし、（iii）ｉＰＳ由来のＴ細胞であってもよい。本発明者らはさらに、養子移入したＴ細胞が、Ｆｏｘｐ３を欠損した宿主の中で増殖することを実証した。最大で半分のＴ細胞がＴｒｅｇになり、疾患を抑制する（図２９）。このことによって、scurfy／ＩＰＥＸ症候群に対するＴ細胞療法の実現可能性が示される。本発明者らは、ＣＤ４を枯渇させることにより、疾患を予防できることを示した（図３０−３２）。それゆえ、ＣＤ４＋細胞は、病原性細胞である。したがって、治療アプローチは、原則的に次のようになるだろう。まず、ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させる。次に、Ｆｏｘｐ３を修復したＣＤ４＋Ｔ細胞を移植して、免疫学的バランスを回復させる。しかし、遺伝子を修復したＴ細胞も、病原性のＦｏｘｐ３欠損Ｔ細胞も、いずれもＣＤ４を発現している。そのため、ＣＤ４＋Ｔ細胞を継続的に枯渇させると、病原性の細胞だけでなく、養子移入した遺伝子修復済された細胞も殺されてしまう。これに対する解決手段として、Ｆｏｘｐ３遺伝子の修正と併せて、アレル改変を行うことが挙げられよう。本発明者らは、Ｆｏｘｐ３遺伝子を修正して、ＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換することの実現可能性を実証する（図２０）。その結果、天然のＣＤ４５エピトープ（例えば、ＣＤ４５．２）に対する抗体を利用して、病原性のＦｏｘｐ３欠損細胞を枯渇させることができる。Ｆｏｘｐ３を修復された細胞が、改変ＣＤ４５アレル（例えば、ＣＤ４５．１）に変換されているならば、移植された遺伝子修復済細胞は、もはや枯渇されない。これによって、免疫バランスが回復するまで、病原性細胞の枯渇と、機能性の修復済細胞の補充とが、同時に実行できる。この時点において、病原性宿主細胞の選択的な除去を停止させることができる。本発明者らは実際に、ＣＤ４５の枯渇によって、Ｆｏｘｐ３欠損マウスの生存が実質的に延長することを示した。
【００９６】
さらに、Ｆｏｘｐ３遺伝子を修正した細胞は、Ｆｏｘｐ３タンパク質を再発現しているだけでなく、ＣＤ２５を上方制御している（図２０、２１、２２、２６）。ＣＤ２５は、in vitroおよびin vivoにおいて高い親和性を示す、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体である。生理学的には、Ｆｏｘｐ３は野生型Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現を正に制御し、ＩＬ−２／ＣＤ２５／Ｓｔａｔ５の軸は制御性Ｔ細胞の生存に必要である。そこで本発明者らは、Ｆｏｘｐ３を再発現している遺伝子修正Ｔ細胞は、ＩＬ−２の治療的投与によってin vivoにて増殖できると仮定した（図２３）。ＩＬ−２／抗ＩＬ−２ｍＡｂ複合体、低用量ＩＬ−２療法、（改変）ＩＬ−２変異体、その他のＴｒｅｇ増殖プロトコルによれば、Ｔ細胞がin vivoで増殖できることは、充分に立証されている。図２７は、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２ｍＡｂ複合体を利用することによって、修復済Ｔ細胞がin vivoで増殖できることを示している。
【００９７】
特定の実施形態において、疾患関連遺伝子異常はＣＴＬＡ−４遺伝子に含まれている変異であり、疾患はＣＴＬＡ−４変異に関連するヒト免疫調節不全症候群である（Schubert et al., Science Translational Medicine 5, 215ra174-215ra174 (2013); Kuehn et al., Science (New York, N.Y.) 345, 1623-1627 (2014)）。
【００９８】
本発明の第２の態様は、医学的状態の治療に使用するための、下記から選択される薬剤でを提供する。
（ａ）抗体または抗体様分子を含んでいる化合物、または、抗体または抗体様分子からなる化合物；および、
（ｂ）抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞、または、キメラ抗原受容体を有している免疫エフェクター細胞。
【００９９】
上記薬剤は、表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に反応し、当該表面タンパク質の第１アイソフォームは、当該表面タンパク質の第２アイソフォームと、機能的に区別できないが、免疫学的には区別できる。そして、上記薬剤を投与することにより、上記薬剤が反応するアイソフォームを有している細胞が除去される。
【０１００】
特定の実施形態において、医学的状態は、造血性障害である。
【０１０１】
特定の実施形態において、医学的状態は、悪性造血性疾患である。
【０１０２】
特定の実施形態において、医学的状態は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ１９細胞）による治療に対して屈折性(refractive to)の悪性造血性疾患である。
【０１０３】
特定の実施形態において、医学的状態は、非悪性造血性疾患である。
【０１０４】
特定の実施形態において、医学的状態は、自己免疫疾患である。
【０１０５】
特定の実施形態において、医学的状態は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。
【０１０６】
本明細書に関連して、移植片対宿主病とは、遺伝的に異なる者から移植組織の受け取った後における医学的合併症に関する。ドナー組織（移植片）中の免疫細胞は、レシピエント（宿主）を異物として認識する。
【０１０７】
特定の実施形態において、医学的状態は、造血幹細胞移植に起因する移植片対宿主病である。
【０１０８】
特定の実施形態において、医学的状態は、養子移入に起因する移植片対宿主病である。本明細書に関連して、養子移入または養子細胞療法とは、患者に対するヒト細胞（通常は免疫細胞）の移植に関する。この細胞は、自家由来であっても同種異系であってもよい。遺伝子編集技術によって達成される標的化修飾により、移植細胞産物を改造して、（i）遺伝子欠損を修復したり、（ii）移植細胞の効能を増大させたり、（iii）所望の追加の特徴（誘導分子または安全スイッチなど）を細胞に組み込んだりすることが可能になる。
【０１０９】
特定の実施形態において、医学的状態は、臓器移植に起因する移植片対宿主病である。
【０１１０】
特定の実施形態において、抗体または抗体様分子は毒素に連結されており、それによって免疫毒素を形成している。特定の実施形態において、抗体または抗体様分子は、サポリン連結されている。
【０１１１】
特定の実施形態において、薬剤は、二重特異性抗体または二重特異性抗体様分子である。つまり、薬剤は、２つの異なる種類の抗原に同時に結合できる抗体または抗体様分子である。
【０１１２】
特定の実施形態において、薬剤は、二重特異性抗体または二重特異性抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞である。
【０１１３】
特定の実施形態において、上記薬剤は、下記を有している免疫エフェクター細胞である：
（ａ）第１表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に反応する第１抗体または第１抗体様分子であって、
上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび上記第２アイソフォームは、機能的に区別できないが免疫学的には区別できる、第１抗体または第１抗体様分子；ならびに、
（ｂ）第２表面タンパク質の第１アイソフォームまたは第２アイソフォームのいずれかに対して特異的に反応する第２抗体または第２抗体様分子であって、
上記第２表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび上記第２アイソフォームは、機能的に区別できないが免疫学的には区別できる、第２抗体または第２抗体様分子。
【０１１４】
特定の実施形態において、第１表面タンパク質は、ＣＤ１９である。
【０１１５】
特定の実施形態において、第２表面タンパク質は、ＣＤ４５またはＣＤ３４である。
【０１１６】
特定の実施形態において、第１表面タンパク質はＣＤ１９であり、第２表面タンパク質はＣＤ４５である。
【０１１７】
特定の実施形態において、薬剤は、悪性造血性疾患の治療方法に使用するための、抗体もしくは抗体様分子を有している免疫エフェクター細胞、またはキメラ抗原受容体を有している免疫エフェクター細胞（特に、Ｔ細胞）、である。
【０１１８】
特定の実施形態において、薬剤は、造血性疾患（特に、悪性造血性疾患）の治療方法で使用するための、ＣＤ４５に対するキメラ抗原受容体を有しているＴ細胞である。
【０１１９】
ＣＤ４５は、造血性疾患の治療用途における、特に好適な標的である。というのも、ＣＤ４５は、悪性細胞を含む全ての造血細胞で発現しているためである。ＣＤ４５は細胞の生存に重要であり、それゆえ、細胞が耐性を発達させるのは非常に難しい。
【０１２０】
本発明の他の態様は、下記を含んでいる、複合薬剤を提供する：
（ａ）第１表面タンパク質に対して反応する、第２の態様に係る第１薬剤；および、
（ｂ）第２表面タンパク質に対して反応する、第２の態様に係る第２薬剤。
【０１２１】
特定の実施形態において、複合薬剤は、造血性疾患の治療のために提供される。
【０１２２】
特定の実施形態において、複合薬剤は、悪性造血性疾患の治療のために提供される。
【０１２３】
特定の実施形態において、複合薬剤は、非悪性造血性疾患の治療のために提供される。
【０１２４】
特定の実施形態において、第１薬剤および第２薬剤は、キメラ抗原受容体を有しているＴ細胞である。
【０１２５】
特定の実施形態において、第１表面タンパク質はＣＤ１９であり、第２表面タンパク質はＣＤ４５である。
【０１２６】
特定の実施形態において、第１薬剤は抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞であり、第２薬剤は抗ＣＤ４５  ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【０１２７】
特定の実施形態において、悪性造血性疾患は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ１９細胞）単独での治療に対して屈折性(refractive to)である。
【０１２８】
本発明の他の態様は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現している細胞を、in vivoで追跡する方法を提供し、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームは、上記表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別でき、上記方法は、上記第１アイソフォームに特異的に反応するリガンドを、上記患者に投与する工程を含む。
【０１２９】
あるいは、本発明の上記態様は、患者に由来する組織中において表面タンパク質の第１アイソフォームを発現している細胞を追跡する方法を提供し、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームは、上記表面タンパク質の第２アイソフォームと機能的に区別できないが、免疫学的には区別でき、上記方法は、上記第１アイソフォームに特異的に反応するリガンドを、上記患者に由来する上記組織に投与する工程を含む。
【０１３０】
本発明の上記態様の特定の実施形態において、患者に由来する組織は、血液サンプルに関する。このような血液サンプルを、ＦＡＣＳによって分析してもよい。本発明の上記態様の特定の実施形態において、患者に由来する組織は、臓器の組織サンプル（例えば、生検された肝臓などのサンプル）に関する。このような組織サンプルを、組織学的方法を用いて分析してもよい。
【０１３１】
本発明のさらに他の態様は、下記の工程を含む、in vivoで細胞を選択的に枯渇または濃縮する方法を提供する：
（ａ）細胞を提供する工程であって、
上記細胞は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現しており、
上記第１アイソフォームは、アミノ酸マーカーに関して、上記表面タンパク質の第２アイソフォームとは異なっており、
上記第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含んでおり、
上記第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含んでいる、工程；
（ｂ）上記細胞のゲノムＤＮＡ中において、上記核酸配列Ａから上記核酸配列Ｂへの変異を誘導する工程；ならびに、
（ｃ）上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を選択的に濃縮／枯渇させる工程。
【０１３２】
本明細書に関連して、「細胞の選択的な枯渇」という用語は、あるマーカー／アレル／アイソフォームを発現している細胞の総数または濃度を、選択的に減少させることに関する。
【０１３３】
第１アイソフォームを発現している細胞および第２アイソフォームを発現している細胞が所定の体積にを含まれているとき、第１アイソフォームを発現している細胞の選択的の枯渇は、第２アイソフォームを発現している細胞の濃縮に対応していることを、当業者であれば理解する。
【０１３４】
非限定的な例示であるが、選択的な枯渇は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）によって達成できる。あるいは、選択的な枯渇は、天然抗原受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有している細胞（特に、免疫受容体細胞）の反応によっても達成できる。選択的な枯渇はまた、エフェクター化合物（薬物または毒素など）に連結されていない抗体または抗体様分子の投与によっても達成できる。
【０１３５】
本発明者らは、ＣＤ４５．２またはＣＤ４５．１に対する抗体を利用して、in vivoにおける選択的な枯渇が可能であることを実証した（図１２）。２つの細胞集団（例えば、ＣＤ４５．２＋Ｔ細胞およびＣＤ４５．１＋Ｔ細胞）に共通しているエピトープに対する抗体をを使用すると、両方の細胞集団を非選択的に枯渇させる（例えば、ＣＤ４に対する枯渇）。これとは対照的に、共通して発現している表面タンパク質（例えば、ＣＤ４５）の、あるアレル（例えば、ＣＤ４５．２）に対して選択的に結合し、他のアレル（例えば、ＣＤ４５．１）に対しては選択的に結合しない抗体を利用した枯渇は、特定のｍＡｂが結合するアレルを発現している細胞のみを枯渇させる。例を示すと、ＣＤ４５．２＋細胞を枯渇させることによりＣＤ４５．１＋細胞が残り、そのため、ＣＤ４５．１＋細胞は相対的に濃縮される。毒素がｍＡｂに連結されている場合には、より効率的に枯渇させることができる。
【０１３６】
毒素に連結していない抗体または抗体様分子を使用する利点としては、免疫毒素を利用する治療がＨＳＣの枯渇を招く一方で、毒素に連結していない抗体または抗体様分子を利用する治療ならばＨＳＣが残っている点が挙げられる。すなわち、このことは、造血系が部分的に保存されることになるの、望ましい場合がある。
【０１３７】
本発明者らが実証したところによると、一アミノ酸の差異を細胞内に導入でき、２種類のアイソフォーム／アレルに特異的に結合する２つの異なるリガンド（天然／操作）でこれらを識別できる（ＥＰ１６１９６８６０．７、ＥＰ１６１９６８５８．１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９７９９を参照）。特異的に設計された人工変異、または希少ではあるが天然に存在する変異（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））を、内因性の表面発現遺伝子に導入して、抗原を変化させる。当業者が理解するところによると、この変異は、本分野で公知の任意の方法によって導入できる（ＨＤＲおよび塩基エディタなど）。その後、改変されたエピトープを利用して、人工エピトープを特異的かつ選択的に認識するリガンドによって、編集済細胞を選択的に枯渇させる。あるいは、天然エピトープを認識するが改変エピトープを認識しないリガンドによる枯渇に対して、編集済細胞は耐性を有しており、それゆえ移植細胞は残る（一方、宿主細胞は枯渇されうる）。
【０１３８】
その後、「編集済細胞／改変細胞（細胞表面タンパク質の第１アイソフォームが第２アイソフォームに変化した細胞）」を移植（特に、養子移入）に用いる場合に、２種類の異なるアイソフォームを利用して、移植細胞と宿主細胞とを区別できる。これによって、移植細胞を追跡できる。というのも、移植細胞は永久的に標識されるためである。追跡は、in vivoまたはex vivoのいずれでも、標識リガンドを用いて達成できる（例えば、フローサイトメトリーによって、あるいは、細胞または組織に対する組織化学によって）。移植細胞または宿主細胞の一方に特異的なリガンドをin vivoにて適用すると、移植細胞（改変細胞）または宿主細胞にのみ結合するを用いて、移植細胞または宿主細胞の一方を選択的に枯渇させることができる。また、選択的な細胞枯渇は、移植細胞または宿主細胞の一方を認識する天然抗原受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有している細胞によっても達成できる。
【０１３９】
改変細胞の選択的な枯渇は、「安全スイッチまたは殺傷スイッチ」を提供することにより、重要な安全上の機能を構成する。安全スイッチおよび自殺遺伝子の基本概念は、［Jones et al., Front Pharmacol.; 5:254. doi: 10.3389］に説明されている。本発明者らのアプローチは、より単純で、より安全で、より多用途である。原則として、養子移入される任意の細胞を改変して、改変アレル／エピトープと、in vitroもしくはin vivoでの選択スイッチ、追跡スイッチ、安全スイッチおよび／または選択的な除去スイッチと、を有するようにすることができる。限定されない例としては、（i）改変アレルのみを有しており、他の点では遺伝子操作されていない細胞や、（ii）追加の改変された特徴を有している細胞（ＣＡＲ細胞など）、が挙げられる。例えば、移植片対白血病効果に利用される同種異系の移植細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を生じさせる場合がある。移植に先立って改変アレルを組み込んでいる場合には、当該改変アレルによって移植細胞を除去して、ＧｖＨＤを軽減／治療することができる。（図２）。同様に、移植された自己の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または病原体特異的リンパ球を改変して、改変アレルを有するようにすることができる。これによって、オフ・ターゲット効果または過剰なオン・ターゲット効果に起因する望ましくない副作用が生じる場合に、移植された細胞を除去することができる（図２）。ＣＡＲをｍＡｂ由来として、既知のｍＡｂの特異性と細胞（例えば、キラーＴ細胞）の特徴とを組合せてもよい。原則として、ＣＡＲを導入することによって、所与の細胞（Ｔ細胞）の傷害活性（または抑制活性）を特定の標的抗原に再指向させる原理は、広範な疾患に適用可能である（悪性腫瘍の他にも、自家免疫疾患、移植または他の造血性疾患など）。ＣＡＲ１９Ｔ細胞の成功は、治療剤としてのＣＡＲ細胞の可能性を示している。しかし、重要なことに、ＣＡＲ１９Ｔ細胞は、何種類かのＣＤ１９＋腫瘍を治癒するのに非常に有効であるが、種々の異なる標的分子に対して反応する何種類かのＣＡＲ−Ｔ細胞は、時として、重篤で致死性の副作用を呈する。このような副作用には、サイトカイン放出症候群および／または神経毒性があり、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲコンストラクト、および他の標的（ＣＤ１２３などであるが、これに限定されない）を標的とするＣＡＲコンストラクトの何種類かについて実証されている。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の移植後に、これを制御／除去する能力は重要である（図２、１０、１９）。ＣＡＲ細胞の場合には、改変アレルを安全スイッチとして機能させることができる。また、（おそらく数年後に、）移植した改変細胞が悪性になるか、または任意の種類の望ましくないオン・ターゲット・ダメージまたはオフ・ターゲット・ダメージを引き起こす場合には、この改変細胞を排除することもできる。あるいは、自己由来の改変細胞を残す一方で、疾患を引き起こす宿主細胞を選択的に除去することができる。本発明者らの方法とは対照的に、既存の技術は移植細胞の除去に限定されており、宿主細胞は容易には除去できない。改変アイソフォームによれば、宿主細胞の除去しながら、自家細胞（例えば、遺伝子修復した自家細胞、または他の方法で改変した自家細胞）を移植できる。本発明の方法によって導入されるアイソフォームの切替えがなければ、健康な細胞を移植するときには、宿主細胞の除去を停止する必要がある。この場合、新たに移植された修復済細胞は増殖するが、宿主細胞も増殖してしまい、もはや除去することができず、疾患を引き起こす宿主細胞が修復済細胞を排除してしまう危険がある。したがって、本発明の方法により改変細胞に枯渇に対する耐性を与えることによって、治療アプローチとして非常に有意義である。例えば、抗ＣＤ１９−ＣＡＲ細胞によって認識されるＣＤ１９エピトープを、自家造血細胞において変異させて、ＣＤ１９の機能性を保ったまま、枯渇用の抗ＣＤ１９  ｍＡｂまたは抗ＣＤ１９−ＣＡＲ細胞が改変細胞に結合して破壊できなくなるようにすることができるだろう。これによって、現在有効な抗ＣＤ１９−ＣＡＲ細胞の主要な合併症は、排除されるであろう。抗ＣＤ１９−ＣＡＲは、ＣＤ１９を発現している悪性の造血性腫瘍の排除に非常に高い成功率を誇っているが、同時に、ＣＤ１９を発現している健康な宿主細胞の排除をも招いてしまう。このことは低ガンマグロブリン血症を導き、したがって感染の危険性が増大する。変異ＣＤ１９は、健康な自家造血幹細胞（ＨＳＣ）による、宿主免疫系の再構成を可能とする。これによって、抗ＣＤ１９−ＣＡＲ細胞に耐性を示すＢ細胞が産生される。したがって、ＣＡＲ１９  Ｔ細胞が経時的に再発を防止できる一方で、耐性のある編集済細胞が感染に対する自然な保護を提供する。それゆえ、患者はもはや、ＩＶＩＧ注入に依存しなくなるであろう。非遺伝毒性プレコンディショニングによれば（例えば、抗体による）、ＨＳＣ移植は部分的キメラとして潜在的に達成できる（Nat Biotech, 2016）。あるいは、一般的なヒト集団に見出されるエピトープ（例えば、ＣＤ４５．２アナログ）を認識する抗ＣＤ４５−ＣＡＲ細胞を用いて、全ての造血宿主細胞を排除できる（悪性疾患または他の疾患を引き起こす造血細胞など）。ＣＤ４５は、全ての造血細胞（ほとんどの悪性細胞など）において発現しているため、好適な標的である。また、ＣＤ４５はリンパ球の生存に重要である。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞によってＣＤ４５が標的化される場合には、細胞がＣＤ４５を下方制御しうる可能性や、ＣＤ４５を変異させてＣＡＲ−Ｔ細胞による標的化を逃れる可能性は低くなる。このことは、再発の危険性を低下させるであろう。改変ＣＤ４５エピトープ（例えば、ＣＤ４５．１）を有している健康な自家造血幹細胞（ＨＳＣ）または他の造血細胞の移植によれば、宿主内で健康な造血系を再構築することができ、この造血系は、もはや抗ＣＤ４５−ＣＡＲ細胞によっては枯渇されない（ＣＤ４５．２からＣＤ４５．１への切替え実験を参照）。主要な利点は、腫瘍または細胞型に特異的な抗原を必要とせずに、ＣＤ４５を発現している全ての悪性腫瘍を標的化できることである（Ｔ細胞性悪性腫瘍および骨髄性悪性腫瘍などであるが、これらに限定されない）。すなわち、本発明は、悪性の造血性腫瘍および他の非悪性の造血性疾患を治療するための、普遍的に適用可能なシステムを提供するのである。これによって、「適切な標的抗原を同定する」という、ＣＡＲ−Ｔ療法の主要な障害が克服される（Klebanoff, Nat Med 2016）。したがって、ＣＡＲ−Ｔ療法をに反応する疾患への応用が、実質的に拡大されうる。ＣＡＲ−Ｔ療法は、ＣＤ１９＋腫瘍の治療には大きな成功を挙げているが、他の悪性の造血性腫瘍には大きな課題を残している。一例として、多発性骨髄腫の治療は、ある部分では、適切な標的抗原の欠如が原因となって、依然として大きな課題のままである（Mikkilineni, Blood, 2017; Sadelain, Nature 2017）。また、造血性腫瘍は、同種異系細胞を必要とせずに治療できるようになり、それゆえ、ＧｖＨＤを主要な合併症から除外できるようになるだろう。さらに、枯渇中に再構成を開始できるので、回復までの時間が短縮される。重要なことに、移植細胞に枯渇に対する耐性を与えるために利用される変異は、その後必要になった場合には、当該移植細胞を再び枯渇させるためにも利用できる。ＣＡＲ細胞に依存したＨＳＣの枯渇は、緩やかな（すなわち、非遺伝毒性の）プレコンディショニングを達成する代替的な方法として使用できる可能性がある。ＣＡＲ４５細胞はまた、ＨＳＣをも排除する。「骨髄」移植またはＨＳＣ移植に昨今採用されている"hit and replace"戦略は、ＣＡＲ４５を使用すれば達成できる。毒性のある化学療法や放射線照射の代わりに、患者のプレコンディショニングをＣＡＲ４５で行うことができた。ＣＡＲ４５細胞によってＨＳＣおよび造血系を除去し、これをアレル改変された耐性を有しているＨＳＣで置き換えることの利点は、望ましくない細胞の除去の間に造血系の再構成が開始できるので、移植後の危険な時間を排除しうることである。それゆえ患者は、長期間にわたって骨髄が枯渇したり免疫が抑制されたりせずに、常に機能性の免疫系を有しているであろう。したがって、本発明者の戦略によれば、昨今におけるＨＳＣ移植の主要な合併症である感染を排除することができる。標的細胞をＨＳＣに特異的に制限するための抗原（または抗原の組合せ）に対するＣＡＲ細胞は、内因性のＨＳＣを枯渇するために使用できる。ＨＳＣに対してＣＡＲ細胞を特異的かつ排他的に指向させるための合成生物学的アプローチ（例えば、ＡＮＤゲートを用いた）においては、抗原の組合せは、例えば、抗ＣＤ４５または抗ＣＤ３４ならびに第２抗原でありうる。
【０１４０】
ＣＡＲ４５療法とアレル改変されたＨＳＣによる造血系の置換とを組合せたものは、ＣＡＲ１９療法の代替となりうるかもしれないし（全てのＣＤ１９＋細胞は、ＣＤ４５も発現しているため）、ＣＡＲ１９およびＣＡＲ４５の組合せ療法として使用されうるかもしれない。また、ＣＡＲ４５療法は、ＣＡＲ１９療法の治療後における、再発性のＣＤ１９陰性悪性腫瘍またはＣＤ１９変異悪性腫瘍にも適用できる。
【０１４１】
本発明のこの態様は、細胞を置換する普遍的な戦略を表している。細胞は、自家または他家の造血細胞であってもよい。置換する細胞がＨＳＣである場合、上記の方法は、任意の悪性の造血性腫瘍または他の造血性障害を治療するために使用できる。
【０１４２】
既存の「安全スイッチ」アプローチと比較したときの、本発明者らのアプローチの他の利点としては、以下の点が挙げられる。本発明者らのアプローチは内因性タンパク質を使用しており、導入遺伝子またはタグを細胞に導入する必要がない。２種類のエピトープは機能的に同一であるが、特異的に結合するリガンドによって区別することができる。このアプローチは、どのリガンドが使用されるかによって、移植細胞または宿主細胞のいずれをも枯渇させることができる。設計された変異がゲノムに導入されるので、安全上の特徴点は細胞内に永久的に残り続け、サイレンシングされることがない（これは、ウイルスによって導入された遺伝子組換え安全スイッチには生じうることである）。また、改変エピトープは、人工的な大型の安全スイッチ／自殺遺伝子コンストラクトよりも抗原性が低い。したがって、改変エピトープは、宿主細胞に拒絶される可能性が低い。さらに、改変アイソフォームの使用は、標的化された変異に依存している。したがって、他の安全スイッチ／自殺遺伝子（通常はウイルスにより送達され、ゲノム内にランダムに組み込まれるので、挿入による変異誘発を招く場合がある）よりも安全である可能性が高い（Cornu, Nat Med, 2017）。
【０１４３】
当業者が理解していることには、細胞表面タンパク質を第１アイソフォームから第２アイソフォームに変化させるために、ＨＤＲ以外の他の方法を適用できる。非限定的な例として、塩基エディタを用いたアイソフォームの切替えが挙げられる（Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946を参照）。このアプローチは、ｄｓＤＮＡ切断を必要とすることなく所望のアミノ酸の編集を可能にするので、安全性をさらに増大させることができる。塩基エディタまたはその関連技術は、プラスミドもしくはミニサークル（ｄｓＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはＲＮＰとして送達できる。
【０１４４】
細胞表面タンパク質の第１アイソフォームから第２アイソフォームへの切替えと、疾患を引き起こす遺伝子（例えば、Ｆｏｘｐ３遺伝子）の修復とを組合せる場合には、第１アイソフォームを発現している細胞を枯渇させることによって、in vivoで（すなわち、宿主への導入後に）非修復済細胞を枯渇させることができる。本発明者らが実証したところによると、アイソフォームの切替えおよび遺伝子欠損の修復の両方がＨＤＲによって達成される例では、アイソフォームの切替えが生じた細胞の中において、正常に遺伝子修復が成功する確率が高まる（図２０）。第１遺伝子におけるアイソフォームの切替えと、第２遺伝子における遺伝子改変とを組合せることにより、遺伝子操作された細胞に安全上の特徴点を導入することができる。
【０１４５】
また、アイソフォームの切替えは、宿主内において移植された編集済細胞を追跡するためのマーカーとしても使用できる。
【０１４６】
他の態様によれば、下記の工程を含む、未編集細胞と編集済細胞との組成物において、細胞を選択的に枯渇または濃縮する方法が提供される：
（ａ）細胞を提供する工程であって、
上記細胞は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現しており、
上記第１アイソフォームは、アミノ酸マーカーに関して、上記表面タンパク質の第２アイソフォームとは異なっており、
上記第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含んでおり、
上記第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含んでいる、工程；
（ｂ）部位特異的な遺伝子操作によって核酸配列Ａを核酸配列Ｂに交換し、これによって、上記細胞における上記第１アイソフォームの発現を上記第２アイソフォームの発現へと変化させることを、上記細胞内において誘導する工程；ならびに、
（ｃ）上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を選択的に濃縮／枯渇させる工程。
【０１４７】
特定の実施形態において、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換をもたらす遺伝子操作は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡによって誘導される二本鎖切断後の相同組換え修復によって達成される。このとき、ガイドＲＮＡは、第１ゲノム位置にアニーリングすることができる。
【０１４８】
本明細書に関連して、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」とは、本分野で公知のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを表し、ＣＲＩＳＰＲ様配列に誘導されるＤＮＡ鎖の切断をを促進する。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、Streptococcus pyogenesのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（SpyCas9）；FrancisellaのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ（FnCpf1）、AcidaminococcusのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ（AsCpf1）、およびLachnospiraceae bacteriumのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ（LbCpf1）；ＳｐｙＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１もしくはＬｂＣｐｆ１の任意のオルソログ；または、ＳｐｙＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１もしくはＬｂＣｐｆ１、またはそのオルソログの、任意の改変タンパク質；が挙げられる。当業者が理解するところによると、本発明には、新規に発見または改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ変異体も含まれる。
【０１４９】
本明細書に関連して、「オルソログ」という用語は、単一の祖先遺伝子から垂直の遺伝によって進化してきた、遺伝子および対応するポリペプチドを表す。つまり、オルソログ遺伝子／オルソログポリペプチドは、共通する祖先を有しており、種が２つの異なる種に分岐したときに分化した。この２つの種における単一の遺伝子のコピーが、オルソログと呼ばれる。２つの遺伝子がオルソログであることを確認するために、当業者ならば、遺伝子の整列させたヌクレオチド配列またはポリペプチドの整列させたアミノ酸配列を比較することによって、遺伝子系統を系統発生分析することができる。
【０１５０】
本明細書に関連して、「ガイドＲＮＡ」と言う用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを所定ののゲノム位置へと誘導できる、合成ＲＮＡを表す（このゲノム位置において、エンドヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ内のホスホジエステル結合を切断する）。当業者が理解しているところによると、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用する場合、発現する「ガイドＲＮＡ」は、（i）Ｃａｓ９の結合に必要な配列と、ユーザが定義する「標的配列」との両方を有している、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、（ii）２つのＲＮＡ分子の組合せであって、一方はＣａｓ９の結合に必要な配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を有しており、他方はユーザが定義する「標的配列」（ｃｒＲＮＡ）を有していている、ＲＮＡ分子の組合せであってもよい。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを使用する場合、発現する「ガイドＲＮＡ」は、（i）Ｃｐｆ１の結合に必要な配列とユーザが定義する「標的配列」との両方を有している単一のＲＮＡ分子であってもよいし、（ii）単一のｃｒＲＮＡアレイとして導入される、いくつかのガイドＲＮＡであってもよい（Zetsche, Nat Biotech, 2016）。「標的配列」は、所定のゲノム位置にアニーリングすることができる。これによって、標的配列は、改変されるゲノム標的を規定する（通常、２０ヌクレオチド程度である）。
【０１５１】
Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断は、標的ＤＮＡ中にある短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在に依存しており、標的化可能な配列の選択は制限されている。例えば、Streptococcus pyogenes由来のＣＡＳ９（ＳｐｙＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列：５’−ＮＧＧ−３’に対応している。特定の実施形態において、ＤＮＡ修復コンストラクトは、変異ＰＡＭ配列を有している。この変異は、ＰＡＭ配列の機能を奪うが、タンパク質の発現、安定性または機能には影響しない。変異ＰＡＭ配列を有しているＤＮＡ修復コンストラクトを使用することにより、ＨＤＲ効率が高まる。
【０１５２】
当業者が理解するところによると、ＣＲＩＳＰＲシステムの他にも、部位特異的なＤＮＡ編集の代替手段が存在する。すなわち、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、もしくはアルゴノートに基づくシステム（Nat Biotechnol. 2016 Jul;34(7):768-73）、または塩基エディタ（Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946）を使用できる。本発明には、部位特異的なＤＮＡ編集のための、これらの代替手段の使用も含まれる。
【０１５３】
特定の実施形態において、第１ＤＮＡ修復コンストラクトは、上記方法の第１工程（ゲノムＤＮＡ鎖を切断する工程）で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムの基質ではない。これは、第１ＤＮＡ修復コンストラクトが、ＰＡＭ配列を有していないためである。それゆえ、第２エンドヌクレアーゼイベントによる挿入後には、挿入配列は切断できない。
【０１５４】
特定の実施形態において、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換をもたらす遺伝子操作は、塩基エディタ（Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946; Gaudelli, Nature 2017を参照）およびガイドＲＮＡとともに、細胞をトランスフェクション／エレクトロポレーションすることによって達成される。この塩基エディタは、アミノ酸マーカーＡをコードしている核酸配列Ａを、アミノ酸マーカーＢをコードしている核酸配列Ｂに変換することができる。また、このガイドＲＮＡは、アミノ酸マーカーＡをコードしている核酸配列Ａへと塩基エディタを導くことができる。実施例にて後述するように、塩基エディタを設計することにより、マウスＣＤ４５．１を、マウス４５．２に変換することができる（図９）。このことは、実証されているＨＤＲアプローチの代替として、塩基エディタを使用したアレル改変の実現可能性を示している。しかし、ゲノム中のヌクレオチドが塩基編集に反応するか否かに関する制約のために、本発明者らは、ＣＤ９０．２をＣＤ９０．１に変換する塩基エディタ、またはＣＤ９０．１をＣＤ９０．２に変換する塩基エディタ設計することはできなかった。さらに、ＮＧＧ  ＰＡＭに関連して設計されている塩基エディタ（Komor et al., Nature 2016を参照）に基づいて、ＣＤ４５．１をＣＤ４５．２に変換する塩基エディタ、またはＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換する塩基エディタを設計することはできなかった。対照的に、改変されたＰＡＭ部位特異性を認識する改変Ｃａｓ９バリアントを作製することにより、塩基エディタによって標的化できるヌクレオチドの数が増大した（Kim, Nat Biotech 2017）。本発明者らは、ＣＤ４５．１配列中に存在するＧの近傍にある、Staphylococcus aureus（ＳａＫＫＨ−ＢＥ３）のＰＡＭ部位を同定した（このＧがＡに変異すると、ＣＤ４５．２アレルに変換される）。そこで、編集ウィンドウの位置５にあるＧを、Ａに置換するｓｇＲＮＡを設計した。なぜならば、ＳａＫＫＨ  −ＢＥ３は、編集ウィンドウ内の他の位置よりも、位置５にあるＧを最も効率的に編集するためである。次に、本発明者らは、ガイドＲＮＡ／塩基エディタの対を設計して、ＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換した（図９ｂ）。新規に設計されたＡ／Ｔアデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）は、Ｇ／Ｃを変換できる。原則として、この新規なＡＢＥを用いると、ＣＤ４５．２アレルに必須なＡを、ＣＤ４５．１アレルのＧに変換できる。しかし、今回利用できるＡＢＥは、所望の変異の近傍にＮＧＧ  ＰＡＭを必要とするが、ＡＢＥを正確に位置付けるために利用できる上記のＰＡＭは存在しない。そこで、本発明者らは、シチジンデアミナーゼ塩基エディタに適用される規則に基づいて、ＡＢＥと推定されるものを設計した。既知のシチジンデアミナーゼ塩基エディタと新規なＡＢＥとは、類似した編集ウィンドウ内を編集するので、この戦略が上手く行くと想定しても合理的である。本発明者らは、２つの選択肢を発見した。一方は、Ｃａｓ９  ＳａＫＨ−ＡＢＥ融合に基づくと推定されるものであり、他方はＣａｓ９  ＶＱＲ−ＡＢＥ融合に基づくと推定されるものであった（図９ｂ）。フランキングＡも変換され、これによりエピトープが変化する可能性も、除外はできない。したがって、塩基エデ���タを使用してＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換する際には、編集ウィンドウが狭く、非常に特異的な塩基エディタが必要になる。先日報告された塩基エディタは、編集ウィンドウが１〜２ヌクレオチドであるため、適している（Kim, Nat Biotech, 2017）。要約すると、上記の例が説明しているのは、アレル編集のために塩基を変換する原理はプラットフォームに依存せず、ＨＤＲ媒介アプローチによって達成してもよいし、代替手段（塩基編集など）によって達成してもよい、ということである。細胞型および所望の変異のゲノム上の文脈に応じて、いずれかを選択できる。
【０１５５】
本明細書に関連して、「ＤＮＡ修復コンストラクト」とは、ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡ鎖の損傷（特に、二本鎖切断（ＤＳＢ））を、ＨＤＲによって修復するためのテンプレートとして使用される、ＤＮＡコンストラクトを表す。ＤＮＡ修復コンストラクトは、相同性アームおよび所定の遺伝子組換え配列を有している。相同性アームは、ＤＳＢの５’および３’にあるゲノムＤＮＡ配列に対して、相同的である。所定の遺伝子組換え配列は、相同性アームの間に位置している。ＨＤＲによるゲノムＤＮＡ修復の際、所定の遺伝子組換え配列は、ゲノムＤＮＡに挿入される。当業者が理解しているところによると、ＤＮＡ修復コンストラクトは、線状（一本鎖または二本鎖）であってもよいし、環状（例えば、プラスミド、ミニサークルプラスミド）であってもよい。
【０１５６】
当業者が理解するところによると、「ガイドＲＮＡは所定のゲノム位置にアニーリングできる」という表現は、ガイドＲＮＡの一部（ユーザが定義する「標的配列」）が、ストリンジェンシーの高い条件下において、所定のゲノム位置にアニーリングできることを表す。ガイドＲＮＡは、上記所定のゲノム位置にアニーリングできない、他の部分を有している。所定のゲノム位置に（部分的に）アニーリングすることによって、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを当該所定のゲノム位置に誘導する。これによって、上記所定のゲノム位置においてＤＳＢが生じる。
【０１５７】
特定の実施形態においては、ＨＤＲ増強試薬（特に、バニリンまたはルカパリブ）を、遺伝子編集プロトコルの間に使用する。本明細書に関連して、バニリンとは、４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：121-33-5）を表す。本明細書に関連して、ルカパリブは、８−フルオロ−２−｛４−［（メチルアミノ）メチル］フェニル｝−１，３，４，５−テトラヒドロ−６Ｈ−アゼピノ［５，４，３−ｃｄ］インドール−６−オン（ＣＡＳ番号：283173-50-2）を表す。
【０１５８】
本明細書において、一つの分割可能な特徴点の代替物が「実施形態」として提示されているときは常に、上記代替物を自由に組合せて、本明細書に開示されている本発明の別の実施形態が形成できることを理解されたい。
【０１５９】
出願ＥＰ１６１９６８６０．７、ＥＰ１６１９６８５８．１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９７９９、およびＥＰ１７１９７８２０．８は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
本発明を、下記の実施例および図によってさらに説明する。これらの実施例および図から、さらなる実施形態および利点が引き出されうる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】免疫学的に識別できる、細胞表面タンパク質の変異体の改変原理を示す。アイソフォームＡおよびアイソフォームＢは、同じ機能を果たしうる（機能的に同等である）。この例において、アイソフォームＡは、天然に生じる表面タンパク質を表しており、改変されて変異体アイソフォームＢになる。
【図２】免疫学的に識別できる細胞表面変異体が、ヒト細胞療法の安全性をどのように向上させるかを示す。
【図３Ａ】表面タンパク質の２種類のアイソフォームが、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって区別できることを示す。上段の配列：配列番号０２０、下段の配列：配列番号０２１。
【図３Ｂ】図３Ａを参照。
【図４】概念実証実験：初代細胞における、ＣＤ９０．２（アレルＡ）からＣＤ９０．１（アレルＢ）への変換。左側のフローサイトメトリーパネルは、純粋な出発集団であるＣＤ９０．２＋初代Ｔ細胞を示す。その後、細胞をin vitroにて改変して、ＣＤ９０．２からＣＤ９０．１に変換する。編集後の４つの異なる集団は区別できる：（i）ＣＤ９０．２＋ホモ接合細胞（未編集の出発集団；左上）、（ii）ＣＤ９０．１＋／ＣＤ９０．２＋ヘテロ接合細胞（右上）、（iii）ＣＤ９０．１＋ホモ接合体の細胞（右下）、（iv）ＣＤ９０を欠失した細胞（左下）。右下の四角形にあたるアレル改変細胞は、出発時の（元来の）内因性アレル（ＣＤ９０．２）を、もはや発現していない。ＣＤ９０．１＋ＣＤ９０．２−細胞の純粋な集団を用いて、患者への移植前に、in vitroにて正しく編集された細胞を単離することができる。
【図５Ａ】概念実証実験（その２）：初代細胞におけるＣＤ４５．２（アレルＡ）からＣＤ４５．１（アレルＢ）への変換。上段の配列：配列番号０２２、下段の配列：配列番号０２３。ＣＤ９０．２からＣＤ９０．１へのアレル変換に関して示したように（図４）、右下の四角形にあたるアレル改変細胞は、もはや出発時の（元来の）内因性アレル（ＣＤ４５．２）を発現していない。患者への移植前に、この細胞を用いて、正しく編集された細胞の純粋集団を単離することができる。
【図５Ｂ】図５Ａを参照。
【図６】Ｃａｓ９リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）を用いた、ＥＬ４細胞における遺伝子編集を示す。エレクトロポレーションの条件（方法の節に記載する）以外は、プラスミドに基づくアプローチと同様に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体および＋／−ＨＤＲ  ２ｋｂテンプレートを、ＥＬ４細胞にトランスフェクションした。この結果は、異なるアプローチ（例えば、プラスミドまたはＲＮＰ）によってアレル編集を達成できることを実証している。すなわち、アレル編集は、プラットフォームに依存しない。
【図７】Ｃａｓ９リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）を用いた、初代マウスＴ細胞における遺伝子編集を示す。プラスミドに基づくアプローチと同様に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体および＋／−ＨＤＲ  ２ｋｂテンプレートを、初代マウスＴ細胞にトランスフェクションした。図６と同様に、この結果は、アレルＡをアレルＢに変換するアレル編集が、プラットフォームに依存しないことを実証している。
【図８】アレル改変細胞の、非常に純粋なex vivoにおける選抜を示す。左側のパネル：ＣＤ４５．２細胞をＣＤ４５．１細胞に改変した後には、４つの集団が生じる（図４と同様）。次に、フローサイトメトリーによって、４つの集団の全てを非常に高い純度に精製した。右側のパネルは、４つの集団の各々について、精製後の純度を示す。結論：４つの可能な細胞集団は全て、改変アレルに基づいて、ex vivoにて高純度に精製できる。Sanger  ＤＮＡシーケンシングによって、正しく遺伝子編集されていることを確認した（不図示）。
【図９Ａ】（Ａ）ＣＤ４５．１をＣＤ４５．２変換する塩基エディタ、および、（Ｂ）ＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換する塩基エディタの設計を示す。（Ａ）上段の配列：配列番号０２４、下段の配列：配列番号０２５。（Ｂ）選択肢１および選択肢２における上段の配列：配列番号０２６、選択肢１および選択肢２における下段の配列：配列番号０２７。（Ａ）ガイドＲＮＡを設計して、ＰＡＭ（NNRRT）で制限されるＳａＫＫＨ−ＢＥ３塩基エディタと併せて使用した。選択したＰＡＭ配列を、黒い点線で表している（ATTTGT）。ガイドＲＮＡを灰色線で表し、塩基編集ウィンドウ（ガイドＲＮＡのヌクレオチド４〜７）を表している。この塩基エディタによって、位置５のＧがＡに変換される。このようにして、ＣＤ４５．１アレルは、ＣＤ４５．２アレルへと変換される。（Ｂ）改変アデニン塩基エディタは、ＡをＧに変換できる。ＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換するための、２つの選択肢を発見した。選択肢１：Ｃａｓ９  ＳａＫＫＨ（ＰＡＭは黒点線）と併せて用いるようにｓｇＲＮＡ（灰色線）を設計した。これによって、塩基編集ウィンドウの位置５のＡが、Ｇに変換される。選択肢２：Ｃａｓ９  ＶＱＲと併せて用いるｓｇＲＮＡ（灰色線）。ＰＡＭを黒破線で表している。これによって、塩基編集ウィンドウの位置６のＡがＧに変換される。選択肢１および選択肢２によって、ＣＤ４５．２アレルからＣＤ４５．１アレルに変換される。
【図９Ｂ】図９Ａを参照。
【図１０】移植細胞を任意的に除去することの背景にある概念を示す。細胞を患者から採取した後、ex vivoで編集して、あるアレルを他のアレルへと変換する。編集が成功した細胞を選抜して、選択的な枯渇に必要なエピトープを有している細胞の純粋集団を注入する。つまり、アレル改変は、必要に応じて移植細胞を除去するという選択肢を付け加えた。
【図１１Ａ】in vivoにおいて、移植細胞または宿主細胞を選択的に枯渇させる応用を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａを参照。
【図１２】in vivoにおける選択的な除去の概念実証実験を示す。in vivoにおける除去のモデル。（１）精製ＣＤ４５．２＋Ｔ細胞およびＣＤ４５．１＋Ｔ細胞の１：１混合物を用いた、全てのＴ細胞を欠く免疫不全マウス（Ｒａｇ  ＫＯ）の再構成。使用したＴ細胞は、コンジェニック細胞であるが、編集済細胞ではない。（２）抗体による枯渇。非選択的抗体（抗ＣＤ４）と選択的抗体（抗ＣＤ４５．２）との比較。抗ＣＤ４５．２抗体は、毒素と連結されていないか、または、毒素（サポリン）と連結されている。（３）１週間後の解析。
【図１３】in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的な枯渇：血中のＴ細胞の定量化を示す。
【図１４】in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的な枯渇：リンパ系器官におけるＴ細胞の相対数の定量化を示す。リンパ節（ＬＮ）および腸間膜リンパ節（ｍｅｓＬＮ）を分析した以外は、図１２と同じ手順である。
【図１５】in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的な枯渇：リンパ系器官におけるＴ細胞の相対数の定量化を示す。脾臓（ＳＰ）を分析した以外は、図１２と同じ手順である。
【図１６】in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的な枯渇：リンパ系器官におけるＴ細胞の絶対数の定量化を示す。リンパ節（ＬＮ）および腸間膜リンパ節（ｍｅｓＬＮ）を分析した以外は、図１２と同じ手順である。
【図１７】in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的な枯渇：リンパ系器官におけるＴ細胞の絶対数の定量化を示す。脾臓（ＳＰ）を分析した以外は、図１２と同じ手順である。
【図１８】in vivoにおけるアレル編集済細胞の選択的な除去に関する概念実証実験（その２）を示す。実験手法：（１）ex vivoにて、ＣＤ４５．２Ｔ細胞をエレクトロポレーションし、ＣＤ４５．１へと改変する。（２）Ｔ細胞欠損マウス（Ｒａｇ  ＫＯ）へと養子移入する。移植前に純度による選抜は行わなかった。（３）数週間後、品質管理によりアレル編集が成されていることを実証する。（４）ＣＤ４５．２細胞を抗体によって枯渇させ、編集済細胞のみを残す。結論：ＰｏＣによると、in vivoにおいてＣＤ４５．２＋宿主細胞および未編集細胞が枯渇され、アレルを改変したＣＤ４５．１＋細胞は残ったことが実証される。
【図１９】本発明の適用を示す。アレル改変は安全性を向上させる（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の）。改変細胞は、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ４５）の第１アイソフォームと、キメラ抗原受容体に反応を示す所定の標的（例えば、ＣＤ１９（ＣＡＲ−１９））と、を発現している。ＣＡＲ１９をＴ細胞に組み込むとともに、ＣＤ４５の第２アレルを、ＣＤ４５の第１アレルに変換する。これによって、移植されたＣＡＲ−Ｔ細胞と、改変されていない宿主細胞とを区別することができる。治療に関連する毒性が生じた場合、病原性のＣＡＲ−Ｔ細胞を選択的に除去して、ＣＡＲ−Ｔに関連する毒性を停止させる。
【図２０Ａ】scurfy細胞およびヒトＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異を有している細胞の遺伝子修正を示す。また、アイソフォームを切替えた代理表面マーカーにゲーティングした際の、遺伝子修復済細胞の相対頻度の上昇を示す。（Ａ）野生型Ｆｏｘｐ３（Ｃ５７ＢＬ／６）のゲノムＤＮＡ配列（配列番号０２８）、標的変異Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘを含んでいるＦｏｘｐ３遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列（配列番号０２９；中途に終止コドンが導入されている）、および、scurfyマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｏｘｐ３ｓｆ／Ｊ）のＦｏｘｐ３遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列（配列番号０３０；自然発生的な２ｂｐ挿入があり、フレームシフトしている）、を整列させたもの。ｓｇＲＮＡの結合部位（緑色線）およびＰＡＭ配列（黒線）。
【図２０Ｂ】（Ｂ）Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞を遺伝子編集する際のプロトコル。（工程１）in vitroで活性化させる。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異を標的とするｓｇＲＮＡをコードしているプラスミドと、１ｋｂ野生型（ｗｔ）Ｆｏｘｐ３修復テンプレートを有している環状プラスミドと、とともにエレクトロポレーションする。（工程２）トランスフェクションに成功した細胞を、ＧＦＰの発現に基づいて単離する。（工程３）遺伝子編集のためにin vitroにて細胞を増殖させる。ｒｈＩＬ−２、ＴＧＦ−β（またはＴＧＦ−βとレチノイン酸（ＲＡ）との組合せ）、およびサイトカイン中和抗体（抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮγ）の存在下にて、７日間。
【図２０Ｃ】（Ｃ）対照マウス（ＷＴ）に由来する全てのＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘマウスに由来する全てのＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、Ｂと同じ実験手法とした。ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現をフローサイトメトリーで分析した（生存ＣＤ４＋Ｔ細胞でゲーティング）。空のｐｘ４５８プラスミドでエレクトロポレーションした野生型細胞は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に分化した（左側のパネル）。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘのみを含んでいるｓｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞は、Ｆｏｘｐ３に分化しなかった（中央のパネル）。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘと１ｋｂ  Ｆｏｘｐ３  ｄｓＤＮＡ修復テンプレートとを含んでいるｓｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞は、Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現が回復した（右側のパネル）。上段：ＴＧＦ−βのみによるＦｏｘｐ３誘導。下段：ＴＧＦ−βとＲＡを組合せたＦｏｘｐ３誘導。ＴＧＦ−βのみと比較すると、ＴＧＦ−βおよびＲＡの組合せは、損傷していないＦｏｘｐ３遺伝子座を有している細胞において（すなわち、野生型および修復済細胞において）、Ｆｏｘｐ３を発現している細胞をより高い頻度で生じさせる。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞を用いた２回の実験、およびＦｏｘｐ３ｓｆ／Ｊ細胞を用いた１回の実験における、代表的なデータ。
【図２０Ｄ】（Ｄ）代理マーカーとして、ＣＤ４５アイソフォームの多重切替えを利用した、Ｆｏｘｐ３を発現している遺伝子修復済細胞の濃縮。実験手法はＢと同様であるが、２種類のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ  Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６ＸおよびｓｇＲＮＡＣＤ４５．２＿Ｒ１）および２種類の１ｋｂ  ｄｓＤＮＡテンプレート（Ｆｏｘｐ３野生型およびＣＤ４５．１）をコードしているプラスミドと共に、エレクトロポレーションした。７日後、ＣＤ４５．２、ＣＤ４５．１、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３をフローサイトメトリーで分析した（生存ＣＤ４＋細胞でゲーティング）。上側のパネル：ＣＤ４５．１−細胞（緑色線）およびＣＤ４５．１＋細胞（赤色線）でのプレゲーティング。下側のパネル：アイソフォームを切替えたＣＤ４５．１＋細胞における、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の濃縮。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞を用いた２回の実験、およびＦｏｘｐ３ｓｆ／Ｊ細胞を用いた１回の実験における、代表的なデータ。
【図２１Ａ】プラスミドに基づくアプローチおよびＲＮＰに基づくアプローチによる、Ｆｏｘｐ３遺伝子の修復を示す。（Ａ）Ｆｏｘｐ３  ＫＯマウス由来のＣＤ４  Ｔ細胞を、ｓｇＲＮＡプラスミドのみで（または、ｓｇＲＮＡプラスミドとＦｏｘｐ３野生型ＨＤＲテンプレートとを併せて）トランスフェクションした。トランスフェクション（プラスミドトランスフェクション）の２４時間後、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞を選別した。細胞選別の後すぐに、Ｆｏｘｐ３分化カクテルの存在下にて、実験の終了まで細胞を増殖させた。
【図２１Ｂ】（Ｂ）Ｆｏｘｐ３  ＫＯマウス由来のＣＤ４  Ｔ細胞を、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体のみで（または、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体と＋／−ＨＤＲテンプレート（１８０ｂｐ  ｓｓＤＮＡまたは２ｋｂプラスミド）とを併せて）トランスフェクションした。ＲＮＰでトランスフェクションした細胞の全集団を、Ｆｏｘｐ３分化カクテルの存在下にて、実験の終了まで増殖させた。
【図２２】in vitroにおいて、Ｔ細胞のＦｏｘｐ３遺伝子の修復に成功した。上段：野生型Ｆｏｘｐ３（Ｃ５７ＢＬ／６）のゲノムＤＮＡ配列（配列番号０３１）、および、標的変異Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘを含んでいるＦｏｘｐ３遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列（配列番号０３２；中途に終止コドンが導入されている）、を整列させたもの。ｓｇＲＮＡの結合部位（緑色線）およびＰＡＭ配列（黒線）。ｗｔコントロールに由来する全てのＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘマウスに由来する全てのＣＤ４＋Ｔ細胞をトランスフェクションした。ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現を、フローサイトメトリーで分析した（生存ＣＤ４＋Ｔ細胞でゲーティング）。空のｐｘ４５８プラスミドでエレクトロポレーションしたｗｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞へと分化した（上側のパネル）。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘのみを含んでいるｓｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞は、Ｆｏｘｐ３に分化しなかった（中央のパネル）。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘおよび１ｋｂ  Ｆｏｘｐ３  ｄｓＤＮＡ修復テンプレートを含んでいるｓｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞は、Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現が回復した（下側のパネル）。ＴＧＦβとＲＡとを併用して、Ｆｏｘｐ３を誘導した。
【図２３】Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞を遺伝子編集するためのプロトコルを示す。細胞をin vitroにて活性化させる。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異を標的化するｓｇＲＮＡをコードしているプラスミドと、１ｋｂ  ｗｔ  Ｆｏｘｐ３修復テンプレートとを含んでいる環状プラスミドと共に、エレクトロポレーションする。トランスフェクションに成功した細胞を、ＧＦＰ発現に基づいて単離する。細胞をin vivoに移植してＦｏｘｐ３分化させ、その後ＩＬ−２レジメンを施す。
【図２４】細胞の養子移入から１４週間後における、マウスの臨床上の表現型を示す。ＷＴマウスおよび修復マウスには疾患が見られなかった。ＫＯ細胞の移植により、皮膚の炎症および脱毛症を生じた。図２３と同様の実験手法。
【図２５】ＫＯ細胞を移植したマウスの臨床上の表現型（Ｔ細胞の浸潤）と、耳および尾の皮膚におけるＣＤ４／ＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤との相関を示す。野生型Ｔ細胞または修復Ｔ細胞を移植したマウスの耳および尾の皮膚においては、ＣＤ４／ＣＤ３＋Ｔ細胞は見られないか、または非常に少数であった。データを％および絶対数で示す。
【図２６】ＷＴ細胞および修復済細胞を移植したマウスにおける、ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の存在を示す。ＫＯ細胞を移植したマウスでは、ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は見られなかった。データを、Ｆｏｘｐ３の割合（％）およびＭＦＩで示す。図２３と同様の実験手法。
【図２７】修復したＴｒｅｇが、ＩＬ−２に応答することを示す。実験の最終週における追加のＩＬ−２療法によって、ＷＴ細胞および修復済細胞を移植したマウスにおいては、ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が増加した。ＫＯ細胞を移植したマウスでは、ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は見られなかった。これらのデータは、ＷＴ細胞および修復したＴｒｅｇ細胞が、ＩＬ−２に対して同程度に応答することを実証している。
【図２８】ＷＴ細胞および修復したＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞が、種々の細胞表面マーカー（ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１およびＫＬＲＧ１）を同等のレベルで発現していることを示す。ＣＤ２５および追加マーカー（例えば、ＧＩＴＲ）の組合せを利用して、これらの集団を濃縮できる。Ｆｏｘｐ３を欠損するＴ細胞は表現型が異なり、例えば、ＧＩＴＲおよびＫＬＲＧ１を発現していない。
【図２９】ＣＤ４５．１＋  ＷＴ細胞の養子移入により、Ｆｏｘｐ３欠損マウスが救命され、寿命を８週間まで延長したことを示す（試験の最後において、疾患の徴候なし）。Ｆｏｘｐ３  ＫＯマウスに高い割合（５０％）で見られるＷＴ  Ｔｒｅｇ細胞によって、宿主のＴ細胞の活性化が抑制される（ＣＤ４４Ｈｉｇｈ細胞よりも低い割合（％））。このことは、ＷＴ  Ｔ細胞により免疫調節を完全に回復させ、scurfy疾患を制御するできることを実証している。さらに、Ｆｏｘｐ３を欠損している微小環境によって、Ｆｏｘｐ３を有しているＴ細胞が大幅に増殖する。
【図３０】Ｆｏｘｐ３  ＫＯマウスにおけるＣＤ４の枯渇実験を示す（リンパ節（ＬＮ））。Ｔ細胞の遺伝子修復と選択的な抗体による枯渇との組合せ：病原細胞を枯渇させた後、遺伝子を修正したＴ細胞を移植する。ＣＤ４の枯渇により、かなりの程度scurfy疾患が予防され、平均余命が有意に延長した。ＫＯ枯渇マウスと、未処置のＫＯマウスまたはＷＴマウスとを比較すると、ＣＤ４  Ｔ細胞が少ないか存在しないことを示すＦＡＣＳのデータは、この観察結果を支持している。
【図３１】Ｆｏｘｐ３  ＫＯマウスにおけるＣＤ４の枯渇実験を示す（脾臓（ＳＰ））。Ｔ細胞の遺伝子修復と選択的な抗体による枯渇との組合せ：病原細胞を枯渇させた後、遺伝子を修正したＴ細胞を移植する。ＣＤ４の枯渇により、scurfy疾患が大いに抑制され、平均余命が有意に延長した。ＫＯ枯渇マウスと、未処置のＫＯマウスまたはＷＴマウスとを比較すると、ＣＤ４  Ｔ細胞が少ないか存在しないことを示すＦＡＣＳのデータは、この観察結果を支持している。
【図３２】（Ａ）は、ＣＤ４の枯渇により、Ｆｏｘｐ３欠損マウスにおけるscurfy疾患の発症が抑制されることを示す。（Ｂ）は、ＣＤ４枯渇により、Ｆｏｘｐ３欠損マウスの尾の皮膚における皮膚炎の発症が大いに抑制されることを示す。
【実施例】
【０１６２】
初代Ｔ細胞におけるプラスミドに基づいた効率的な遺伝子の除去、初代Ｔ細胞における標的化された点変異の導入、代理細胞表面マーカーのアイソフォームの切替えをモニタリングすることによるＨＤＲ編集済細胞の濃縮、および、マウスscurfy細胞の遺伝子修正に関する説明は、ＥＰ１６１９６８６０．７、ＥＰ１６１９６８５８．１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９７９９を参照。
【０１６３】
〔遺伝子操作された変異（アレル改変）を設計するのための一般的な考慮事項〕
リガンドの特異的な結合を変化させ、第２の特異的なリガンドの結合を可能とするために、標的化された小変異（一ヌクレオチドまたは一アミノ酸変異でありうる）を導入することにより遺伝子のアレルを改変することは、治療的用途における一般的原理として有用であるかもしれない。この変異は、改変タンパク質の機能を可能な限り保存するように設計される。免疫原性を変化させて、特異的に結合するリガンド（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）など）または抗体様分子（Affimer、ＤＡＲＰＩＮＳ、ナノボディなど）を生じさせる必要がある。このようなリガンドは、特異的結合に関してスクリーニングする必要がある。また、免疫原の特徴は、注意深く設計する必要がある。同時に、この変異は、抗原に小さな変化を与えるだけなので、in vivoにおいて強力な免疫反応を引き起こす可能性は低い。マウスにおけるコンジェニック・マーカーは、これらの基準を正に満たしている。ＣＤ９０．１とＣＤ９０．２との差異も、ＣＤ４５．１とＣＤ４５．２と差異も、いずれも一ヌクレオチドであり、一アミノ酸の差異をもたらす。いずれの場合も、この差異は、特異的なｍＡｂによって検出できる。そのため、各遺伝子に対応する一対のｍＡｂがある。これらの差異からｍＡｂを作製することができるが、コンジェニックな細胞を対応するコンジェニックな宿主に移植した場合（すなわち、ＣＤ９０．１＋細胞をＣＤ９０．２＋宿主マウスに移植した場合（またはその逆）；あるいは、ＣＤ４５．１＋細胞をＣＤ４５．２＋宿主に移植した場合）でも、細胞は免疫学的に拒絶されない。このことは、このような小さな抗原性の差異ならば、in vivoにおいて免疫系に許容されることを意味している。要約すると、これらの特性によって、コンジェニックに標識した細胞が作製された。この細胞は、免疫学的研究の非常に有用なツールとして、数十年間使用されてきた。免疫学的には、これらの細胞は自家移植のための代理細胞として使用される。それは、この細胞が、上述の１つの変異を除いて遺伝的に同一であるためである。しかし、コンジェニックな小さな差異により、移植細胞と宿主細胞とは区別できる。
【０１６４】
〔操作するタンパク質の選択〕
ヒトにおいて治療用の類似システムを設計するためには、いくつかの点を考慮する必要がある。原則上、変異は、タンパク質をコードしている任意の遺伝子に導入できる。所定のタンパク質の発現パターンにも、関係があるだろう（すなわち、遍在的に発現していてもよいし、所望であれば、細胞または組織特異的に発現であってもよい）。表面上にて発現しているタンパク質は、最も直接的に標的化されうる。それゆえ、ほとんどの場合において選択されるタンパク質である。一例として、ＣＤ１〜ＣＤ３７１の分化のクラスターによって特徴づけられるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない（Engel, J Immunol November 15, 2015, 195 (10) 4555-4563; http://www.hcdm.org/）。他の所定のタンパク質は、遍在的に発現しているタンパク質であってもよい。このようなタンパク質としては、全ての細胞（非免疫細胞を含む）で発現している、β−２−ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩの定常部位などが挙げられる。あるいは、特定の細胞型で発現しているタンパク質が所定のタンパク質であってもよい。例えば、造血細胞のヒトＣＤ４５、Ｔ細胞のヒトＣＤ３、ヒトＴ細胞受容体構成要素の定常領域、Ｂ細胞免疫グロブリンの定常領域（軽鎖のκおよびλ、もしくは重鎖定常領域など）、ヒトＣＤ４補助受容体もしくはヒトＣＤ８補助受容体、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３など）、共刺激分子（ＣＤ２８もしくはＣＤ４０など）、造血幹細胞のＣＤ３４、細胞のサブセットに発現している特異的なアイソフォーム（ＣＤ４５ＲＡもしくはＣＤ４５ＲＯなど）が挙げられる。最後のケースの場合、ＣＤ４３ＲＡとＣＤ４５ＲＯとで異なる可変領域内（選択的にスプライシングされるエキソン内）に変異を設計する。偏在的に発現している分子（β−２−ミクログロブリンまたはＨＬＡ−Ｉなど）に変異を導入すると、実質的に任意の哺乳動物細胞（より具体的には、任意のヒト細胞）において使用されうる固有のシステムとして役立つかもしれない。この改変は、未改変の宿主細胞を残しながら、改変細胞を追跡および除去するために使用できる。このような特徴は、例えば、細胞療法における殺傷スイッチとして有用となるかもしれない。この細胞には、種々の種類の幹細胞（例えば、筋幹細胞）、肝細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来する細胞が含まれる。細胞型に特異的なタンパク質（ＣＤ４５など）に変異を導入することは、特定組織に由来する全ての細胞を標的とするのに有用であるかもしれない。造血系の場合、ヒトＣＤ４５の改変は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を標識するのに役立つかもしれない（このＨＳＣを用いて、内因性の造血系を置換する）。このＨＳＣの全ての子孫は、元々のＨＳＣのゲノムに導入されたものと同じ変異を有している。元来の宿主の造血系を、任意の手段によって除去する場合（例えば、放射線照射、化学療法、枯渇リガンド（ｍＡｂまたは抗体様分子など）、毒素と連結しているｍＡｂ、細胞による除去（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞による除去）など）、置換された造血系は、たとえ自家由来であっても、導入された変異によって識別できる。あるいは、改変細胞を残しながら、宿主細胞の除去することもできる。
【０１６５】
〔設計上の考慮事項〕
◆タンパク質の発現パターン（偏在的であるか、細胞または組織に特異的であるか）
◆細胞外タンパク質：ほとんどの場合、特異的なリガンドが接近可能である、所定のタンパク質の細胞外の部位に変異が導入される。サブセットに特異的な発現が望まれる場合は、常に発現しているエキソン内、または選択的にスプライシングされるエキソン内に、変異を導入することができる。
◆種間での保存：保存されているアミノ酸（ａａ）または構造は、機能的に関連する可能性が高い。したがって、手を付けるべきではない。むしろ、保存されていない領域に変異を組み込むべきである。
◆アミノ酸の化学的性質（例えば、極性、電荷、疎水性）
◆アミノ酸の類似性：機能を保存するために、変異は所与のアミノ酸を関連するアミノ酸に変換すべきである。ただし、依然として、特異的なリガンドによって検出可能な変化である必要がある。
◆天然に生じる変異：タンパク質ファミリーのメンバー（異なる生物の相同配列）の多重配列アラインメントにおいて所定の位置で観察されるアミノ酸の変異に対応する変異は、当該タンパク質の機能および構造に影響を及ぼさない可能性が高い。それゆえ、変異の設計に選択されうる。
◆構造上の考慮：構造データは、可能な変異の理論設計の一助となりうる。改変するアミノ酸は、リガンド結合に接近できなければならない。ループにおける変異は、機能上比較的許容度が高く、したがって所定の部位でありうる。
◆疾患を引き起こす既知の変異を避ける。
◆既知のヒトの遺伝的変異の考慮：機能上許容される一塩基多型（ＳＮＰ）は、好適な変異の候補である。
◆二次修飾（グリコシル化など）に重要な部位は、変異させるべきでない。
◆ジスルフィド結合に重要な部位は、変異させるべきでない。
◆公表されている相互作用に重要な部位（例えば、水素結合、塩橋、疎水性スタッキング相互作用）は、変異させるべきでない。この相互作用は、タンパク質内部に生じるのものだけでなく、複数のタンパク質複合体または受容体−リガンド相互作用のためのタンパク質−タンパク質相互作用に関与するものも含む。
◆過去に成功しているシステムを考慮する（ＣＤ９０．１／ＣＤ９０．２（Ｑ→Ｒ）など）。
◆既知の結合リガンド（既知のｍＡｂなど）の結合部位を考慮する。また、相補性決定領域（ＣＤＲ）の計算モデリングを考慮する。
◆既知の「活性部位」を避ける（例えば、酵素の触媒部位）。
◆他のヒトタンパク質に存在する、構造的に非常に類似したドメインは避ける。特異的なリガンドが交差するリスクを高める可能性が高いため。
◆免疫原性を考慮する：適切なペプチド免疫原を生じさせる可能性が高い部位を選択する。
【０１６６】
〔一般的に適用可能な、プラットフォームに依存しない原理としてのアレル改変〕
ＥＰ１６１９６８６０．７、ＥＰ１６１９６８５８．１、およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９７９９において、本発明者らが実証し特徴付けたのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓプラットフォームを用いて、アレル改変のための標的化された点変異を導入し、その後選択的な除去を行う方法である。本発明者らが実証したところによると、２つ異なるの点変異を２つの異なる遺伝子に導入し、当該導入された変異を利用して、in vivoにおいて、改変細胞を追跡および／または選択的に除去できる。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびｄｓＤＮＡテンプレートに頼って、相同組換え修復（ＨＤＲ）を達成していた。しかし、使用されていた例は、変異を導入する一つの方法に過ぎない。代替手段としては、他の種類のヌクレアーゼが挙げられる。その例は、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、他の天然もしくは改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｃａｓ９、ｃｐｆ−１など）、high fidelityヌクレアーゼ、または、ＰＡＭ依存性が改変されているヌクレアーゼ（Komor, Cell, 2017）などである。さらに、上記の原理は、ヌクレアーゼの送達形態には依存しない。プラスミド、ｍＲＮＡ、組換えタンパク質、ガイドＲＮＡと複合した組換えタンパク質（すなわち、リボ核複合体、ＲＮＰ）、splitリコンビナーゼ、または、組込みウイルスもしくは非組込みウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、または他のウイルス送達プラットフォーム）として、ヌクレアーゼを送達できる。送達の方法としては、エレクトロポレーションまたは他の形態（例えば、リポフェクション、ナノ粒子送達、cell squeezeまたは物理的穿孔）などが挙げられる。また、ＨＤＲ鋳型は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡであってもよい。これらの形態は、短鎖ｓｓＤＮＡ、長鎖ｓｓＤＮＡ、または環状もしくは線状ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはウイルス性のＤＮＡテンプレート（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））であってもよい。標的細胞に応じて、特異的なＡＡＶ血清型を用いて、内容物を細胞に送達する。ヒトＴ細胞およびヒト造血幹細胞に関しては、ＡＡＶ６としてＨＤＲテンプレートが提供されることが多い。しかし、エンドヌクレアーゼＲＮＰおよび短鎖ｓｓＤＮＡ  ＨＤＲテンプレートもまた、上首尾に利用できる。したがって、変異を導入する方法は柔軟でありうる。
【０１６７】
〔他のアプローチ（例えば、塩基コンバータまたは塩基エディタ）を使用するアレル改変〕
本発明者らが実証したのは、ＨＤＲに続く標的化されたｄｓＤＮＡ切断を、いかにして利用して、アレル改変のための標的化された小さな変異（すなわち、正確な変異）を導入するか、ということであった。また、いかにすれば設計した点変異を生存細胞のゲノム中に導入できるか、という他のアプローチもある。例えば、新規に設計されたキメラ融合タンパク質は、標的ＤＮＡの塩基を、他の塩基に直接変換することができる（Komor, Nature 2016; Nishida, Science 2016; Yang, Nat Comm, 2016; Ma, Nat Meth 2016）。デアミナーゼなどの酵素を、ＤＮＡ結合モジュール（ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどであるが、これらには限定されない）と融合させることができる。天然に生じるシチジンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）、および、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）またはＡＩＤオルソログであるＰｍｃｄＡ１（ウミヤツメ由来）は、ＤＮＡ中のシチジン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換することができる。ＤＮＡ複製機構では、Ｕを修復する前にＤＮＡ複製が起こる場合、ＵをＴとして扱う。このことは、Ｃ：Ｇ塩基対からＴ：Ａ塩基対への変換を招く（Yang, Nat Comm, 2016; Komor, Nature 2016）。それゆえ、いくつかのグループは、ＤＮＡ結合モジュールと融合したデアミナーゼを有している、改変キメラタンパク質を開発している。この改変キメラタンパク質は、デアミナーゼを特定のゲノム遺伝子座に運ぶために使用される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを改変して触媒能を失わせた変異体（ｄＣａｓ９）を使用する場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを送達システムとして使用することができる。このアプローチは、融合したエフェクター分子を特定のゲノム遺伝子座に標的化するために、上手く利用されてきた。蛍光タンパク質を特定の遺伝子座に標的化する応用や、トランスアクチベーターまたはリプレッサーを特定のゲノム遺伝子座に導入して特定の遺伝子の発現を制御する応用もある（Wang, Ann Rev Biochem, 2016）。シチジンデアミナーゼまたはＡＩＤと、ニッカーゼＣａｓ９とを融合し、塩基編集の効率を改善するためにさらに改変を施すことにより、直接的に標的化した塩基の変換が可能となる（Komor, Nature 2016; Nishida, Science 2016）。特定の状況下において、上記の手法はＨＤＲアプローチを超える利点を有しているかもしれない。というのも、塩基エディタはｄｓＤＮＡ切断を誘導せず、ＤＮＡ  ＨＤＲテンプレートの送達も必要としないためである。したがって、この代替アプローチは、indelをより減少させることができる。それゆえ、ＨＤＲに基づくゲノム改変の安全な代替手法（または、安全性を増した代替手法）となるかもしれない。さらに、ｍＲＮＡまたはＲＮＰとして塩基エディタを送達することは、充分ありうる話で、特定の細胞型に関しては毒性が低減されるかもしれない。ヒトＴ細胞に関して、Ｃａｓ９  ＲＮＰは、成功したゲノム編集アプローチを提供している（Schumann, PNAS, 2015）。したがって、ＲＮＰの形態の塩基コンバータは、造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）およびＴ細胞など）に非常に適しているであろうことが予想されうる。しかし原則として、塩基変換は、任意の細胞（哺乳動物細胞など）に適用できる、アレル改変の好適なアプローチでありうる。設計した点変異を導入した後には、下流での用途に使用できる（細胞標識、細胞追跡、および選択的な除去など）。ＲＮＰとして送達された塩基エディタは、哺乳動物細胞、マウス胚およびゼブラフィッシュ胚、ならびに生きたマウスの内耳において、標的ヌクレオチドの編集に成功した（Rees, Nat Comm, 2017; Kim, Nat Biotech, 2017 doi:10.1038/nbt.3816）。このように、上記の研究は、特異的なＤＮＡを用いない塩基編集の実現可能性を示している。しかし、（ヒト）ゲノム中における、塩基変換に反応しやすいヌクレオチドの数は、ＨＤＲアプローチよりも制限されている。これは、塩基変換が、ＰＡＭ配列に依存する上に（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく塩基コンバータの場合）、さらなる制約を有しているためである。シチジンデアミナーゼ塩基エディタは、ＣからＴ（または、ＧからＡ）への変換しかできない。しかし、新規に改変されたアデニン塩基エディタは、ＡからＧ（または、ＴからＣ）へと変換することができる（Gaudelli, Nature 2017）。しかし、ＰＡＭの制約に加えて、塩基変換は、融合タンパク質の特定の設計および／または改変によって規定されている特定のウィンドウ内でしか起こせない。したがって、塩基エディタを用いる場合、ＨＤＲによって導入される点変異と比較すると、編集可能なヌクレオチドの数は、遥かに制限される（Komor, Nature 2016）。さらに、塩基変換のウィンドウには、数個のヌクレオチドが含まれている。例えば、いわゆる塩基エディタ３（ＢＥ３）のうち、S. pyogenesのＣａｓ９を使用するもの（ＳｐＢＥ３；Komor et al., Nature 2016を参照）に関して、このウィンドウには約５ヌクレオチドが含まれる。したがって、複数のＣヌクレオチドが隣接している配列内で、１つのＣをＴに編集することはできない。これによって、得られるタンパク質のアミノ酸を変化させる場合のある、望ましくない追加の変異がもたらされてしまう。同様の編集ウィンドウは、アデニン塩基エディタにも適用される。また、異なるＢＥ３（S. aureusのＣａｓ９に基づいているＳａＢＥ３）は、標準的なＢＥ３編集ウィンドウの外側にあるＣを標的として、検出可能な塩基編集を与える。これらの制限に対処するために、新規な塩基コンバータ変異体は、狭い編集ウィンドウと、ＮＧＧとは異なるＰＡＭ特異性（例えば、ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴおよびＮＮＮＲＲＴ）を有するように改変されている。しかし、所与の一ヌクレオチドを変換する特定の塩基エディタの設計は、依然として困難である（Kim, Nat Biotech 2017, doi:10.1038/nbt.3803）新規な塩基コンバータによって、哺乳動物のゲノム中の標的化可能なヌクレオチドの範囲が拡大されるが、全てのヌクレオチドを自由に編集できるわけではない。しかしそれでも、塩基コンバータの利点のいくつかを利用するために、本発明者らは、ＣＤ９０．１からＣＤ９０．２へのアレル改変、ＣＤ９０．２からＣＤ９０．１へのアレル改変、ＣＤ４５．１からＣＤ４５．２へのアレル改変、またはＣＤ４５．２からＣＤ４５．１へのアレル改変のための塩基エディタの設計を試みた。しかし、従来のＮＧＧで制限される塩基エディタでは、これらの変換のいずれも、利用可能な塩基エディタで達成することができない。両方の遺伝子（ＣＤ９０およびＣＤ４５に）に関して、アレルの差異がＧからＡへの置換によってコードされているにもかかわらず、である（この置換は、原則として、デアミナーゼによる変換に反応しやすい）。唯一の解決策は、ＳａＣａｓ９に基づくＢＥ３の変異体（ＰＡＭの制約をＮＮＲＲＴに緩和する、３つの変異を有している）を利用することであった（Kleinstiver, Nature 2015; Kim, Nat Biotech, 2016 (doi:10.1038/nbt.3803)）。この塩基エディタを選択することにより、ＣＤ４５．１アレルをＣＤ４５．２アレルに変換する塩基エディタ、および対応するｓｇＲＮＡを設計することができた（図９Ａ）。しかし、この塩基エディタは、ＣＤ４５．１をＣＤ４５．２に変換するだけで、ＣＤ４５．２をＣＤ４５．１に変換しない。そこで、本発明者らは、アデニン塩基エディタと推定されるものを設計した（Ｃａｓ９  ＳａＫＫＨまたはＣａｓ９  ＶＱＲと融合しているアデニン塩基エディタ；図９Ｂ）。一方、現存する塩基エディタの変異体であっても、ＣＤ９０アレルは変換できない。
【０１６８】
〔方法〕
初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子編集、ＥＬ−４細胞の遺伝子編集、およびＦｏｘｐ３の修復プロトコルに関する詳細な方法は、ＥＰ１６１９６８６０．７、ＥＰ１６１９６８５８．１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９７９９を参照。
【０１６９】
〔ヒトＴ細胞の単離および抗体〕
健康なドナーのバフィーコート（Blutspendezentrum, Basel）から、Lymphoprep（Stemcell Technologies；商標）の密度勾配を利用して、初代ヒトＴ細胞を単離した。Easysep Human naive CD4+ T-cell enrichment kit（Stemcell Technologies）を利用し、製造者のプロトコルに従って、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を事前に濃縮した。あるいは、ナイーブＴ細胞の単離工程を設けずに、臍帯血をＰＭＢＣの材料として用いた（ナイーブＴ細胞が高頻度で見られるため）。濃縮の前後において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサンプルを以下の抗体で染色し、純度を評価した：αＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ−４）、αＣＤ２５−ＡＰＣ（ＢＣ９６）、αＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ７１１（ＨＩ１００）、αＣＤ４５ＲＯ−ＢＶ４５０（ＵＣＨＬ１）、αＣＤ６２Ｌ−ＢＶ６０５（ＤＲＥＧ−５６）、αＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（ＨＩＴ３ａ）、およびZombie-UV viability dye（全てBiolegendより購入）。
【０１７０】
手順を要約すると以下の通りである。１サンプルのバフィーコート（５０ｍＬ）に対して、２×５０ｍＬのフィルタ付Falconチューブを用意し、各チューブに１６ｍＬのLymphoprepを注入して、３００ｇにて１分間遠心分離する。各フィルタ付チューブ（５０ｍＬ）に血液を等分して分注し、ＰＢＳで５０ｍＬまで満たす。２０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離する（加速時間：４、減速時間１）。血清の一部を除去し、廃棄する。新しい５０ｍＬのFalconチューブに、白血球のバフィーコートを慎重に溜める。濃縮されたＰＢＭＣ画分に滅菌ＰＢＳを加えて約５０ｍＬにし、３００ｇにて５分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを１０ｍＬのＰＢＳで再懸濁して５０ｍＬまで満たし、３００ｇにて５分間遠心分離する。必要であれば、精製工程に先立って、赤血球を赤血球溶解バッファで溶解させる。
【０１７１】
〔ヒトＴ細胞をトランスフェクションするプロトコル〕
血液または臍帯血に由来するナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞または全ＰＢＭＣを、トランスフェクションに使用した。Ｔ細胞を活性化させるために、２×１０６個の細胞を２４ウェルプレート（Corning）に播種した。このプレートは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のａ−ＣＤ３（ハイブリドーマクローンＯＫＴ３）およびａ−ＣＤ２８（ハイブリドーマクローンＣＤ２８）で被覆されていた（いずれもBiolegend製）。被覆濃度は、ａ−ＣＤ３の場合は、５μｇ／ｍＬ（高）、２．５μｇ／ｍＬ（中）、または１μｇ／ｍＬ（低）であった。ａ−ＣＤ２８の場合は、２．５μｇ／ｍＬ（高）、１μｇ／ｍＬ（中）、または０．５μｇ／ｍＬ（低）であった。５０ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２；RD systems）および５％ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間静置した。２４時間後、Ｔ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。活性化させた２×１０６個のＴ細胞を、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションには、Amaxa Transfection System, T-020 program (for plasmid)またはNeon（登録商標）Transfection System（ThermoFisher）を利用した。エレクトロポレーションの条件は、以下の通りであった：電圧（１６００Ｖ）、パルス幅（１０ｍｓ）、パルス（３回）、１００μＬチップ、バッファＲ（ＲＮＰ用）。空のプラスミドｐｘ４５８（Addgene plasmid number: 48138）、または、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｅｒＲＮＡ−Ａｔｔｏ５５０（IDT）−Ｃａｓ９(Berkeley)複合体で、細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーションの後、細胞を２４ウェルプレートに播種した。このプレートには、５０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加した６５０μＬの完全培地が注入されており、ｍＡｂが植え付けられていた。このｍＡｂの濃度は、最初の活性化に用いた濃度の半分である。すなわち、抗ＣＤ３は２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、または０．５μｇ／ｍＬであり、抗ＣＤ２８は１．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、または０．２５μｇ／ｍＬであった。２４時間後、Fortessa analyzer（BD Biosciences）を利用して、ＧＦＰ＋細胞またはＡｔｔｏ５５０＋細胞の発現を評価した。
【０１７２】
〔ＣＤ４５．２の枯渇実験〕
Ｃ５７ＢＬ６マウス（ＣＤ４５．２）およびＣ５７ＢＬ６コンジェニックマウス（ＣＤ４５．１）から、EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit（Stem cell Technologies）を利用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＲＡＧ  ＫＯマウスに、ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を与えて再構築した。このＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５．２とＣＤ４５．１との比率が１：１であった（１０×１０６個ずつ）。Ｔ細胞移植と同日から３日間連続して、ＰＢＳ（非処置群）または枯渇用の抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５、２５０μｇ）を、マウスに腹腔内注射した。ＣＤ４５．２−ＺＡＰ免疫毒素は、ＣＤ４５．２ビオチン化抗体（分子量：１６０ｋＤａ、Biolegend）と、ストレプトアビジン−ＳＡＰ複合体（１個のストレプトアビジン当たり２．８個のサポリン分子、分子量：１３５ｋＤａ、Advanced Targeting Systems）と、を組合せることによって作製した。組合せのモル比は１：１とし、その後使用の直前に、ＰＢＳで稀釈した（最初の文献にて説明されているものと同様。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5179034/）。免疫毒素または複合していないＣＤ４５．２抗体を用いたコントロールを、静脈内注射することによって、in vivoで投与した。１週間後、血液、末梢リンパ節（ＬＮ）、腸間膜リンパ節（ｍｅｓＬＮ）および脾臓（ＳＰ）を採取し、蛍光色素を結合させた下記のｍＡｂで、細胞を染色した（全てBiolegend）：抗ＣＤ４５．２（１０４）、抗ＣＤ４５．１（Ａ２０）、抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）。サンプルをBD Fortessa（BD Biosciences）にかけ、FlowJoソフトウェア（Tree Star）で分析した。
【０１７３】
〔項目〕
＜項目１＞真核細胞内の第１ゲノム位置における第１相同組換え修復（ＨＤＲ）イベントを決定する方法であって、
上記細胞は、第１表面タンパク質の第１アイソフォームを発現しており、上記第１アイソフォームは、アミノ酸マーカーに関して、上記第１表面タンパク質の第２アイソフォームとは異なっており、上記第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含んでおり、上記第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含んでおり、
上記第１ゲノム位置は、上記核酸配列Ａを有しており、下記の工程を含む、方法：
（ａ）上記第１ゲノム位置において、第１ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程；
（ｂ）上記核酸配列Ｂと、上記第１ゲノム位置の５’および３’のＤＮＡ配列と相同的である第１相同性アームと、を有している、第１ＤＮＡ修復コンストラクトを提供する工程；
（ｃ）上記細胞において、上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現を決定し、任意で、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を精製する工程；
（ｄ）上記第１ＨＤＲイベントの発生を決定する工程であって、上記細胞における上記第１表面タンパク質の上記第２アイソフォームの発現は、上記第１ＨＤＲイベントの発生と同義である、工程。
【０１７４】
＜項目２＞上記第１ＨＤＲイベントの発生を、２つ以上の実験条件において決定し、第２実験条件よりも第１実験条件において、上記第２アイソフォームの発現の割合が上記第１アイソフォームに対して増加している場合に、当該第１実験条件におけるＨＤＲ効率が増加している、と判断する、項目１に記載の方法。
【０１７５】
＜項目３＞工程（ａ）および（ｂ）を、バニリンおよび／またはルカパリブを含んでいる細胞培養培地中で行い、特に、上記培地は、５０μＭ〜５００μＭのバニリン、および／または、０．５μＭ〜２．５μＭのルカパリブを含んでおり、とりわけ、上記培地は、約３００μＭのバニリン、および／または、約１μＭのルカパリブを含んでいる、項目１または２に記載の方法。
【０１７６】
＜項目４＞上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび上記第２アイソフォームは、リガンド（特に、抗体）によって互いに区別ができ、上記リガンドは、識別可能に、（i）上記アミノ酸マーカーＡに結合でき、上記アミノ酸マーカーＢには結合できないか、または、（ii）上記アミノ酸マーカーＢに結合でき、上記アミノ酸マーカーＡには結合できないか、のいずれかである、項目１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７７】
＜項目５＞上記第１表面タンパク質は、天然タンパク質である、項目１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
＜項目６＞上記第１表面タンパク質は、遺伝子組換えタンパク質である、項目１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１７９】
＜項目７＞上記精製は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって達成される、項目１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
＜項目８＞上記精製は、上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは第２アイソフォームを発現している細胞を、磁気ビーズにより濃縮する工程を含む、項目１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
＜項目９＞上記第１表面タンパク質は、Ｔｈｙ１またはＣＤ４５である、項目１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０１８２】
＜項目１０＞ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）と、ガイドＲＮＡと、をコードしているＤＮＡ発現コンストラクトを上記細胞にトランスフェクションすることにより、上記第１ゲノム位置における上記第１二本鎖切断が誘導され、上記ガイドＲＮＡは、上記第１ゲノム位置に対してアニールできる、項目１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
＜項目１１＞上記相同性アームは、それぞれが約２０００塩基対（ｂｐ）を有している、項目１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８４】
＜項目１２＞未編集細胞および編集済細胞の組成物から、編集済細胞を選択的に枯渇または濃縮する方法であって、
（ａ）上記未編集細胞は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現しており、上記編集済細胞は、項目１〜１１のいずれか１つに記載の方法によって、上記表面タンパク質の第２アイソフォームを発現するように編集されており、上記第２アイソフォームは、アミノ酸マーカーに関して、上記第１アイソフォームと異なっており、上記第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含んでおり、上記第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含んでいる；かつ、
（ｂ）上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは第２アイソフォームの発現に基づいて、上記編集済細胞を選択的に濃縮または枯渇させる；
方法。
【０１８５】
＜項目１３＞細胞組成物中の細胞を選択的に枯渇または濃縮する方法であって、下記工程を含む方法：
（ｃ）細胞を提供する工程であって、上記細胞は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現しており、上記第１アイソフォームは、アミノ酸マーカーに関して、上記表面タンパク質の第２アイソフォームとは異なっており、上記第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含んでおり、上記第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含んでいる、工程；
（ｄ）上記核酸配列Ａを有しているゲノム位置において、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程；
（ｅ）上記核酸配列Ｂと、上記ゲノム位置の５’および３’のＤＮＡ配列に対して相同的である相同性アームと、を有しているＤＮＡ修復コンストラクトを提供する工程；
（ｆ）上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を選択的に濃縮／枯渇する工程。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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