(57)【要約】  グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む抗感染症組成物が提供される。
2019513837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子；抗感染成分、および担体を含む、抗感染症組成物であって、前記抗感染成分が抗感染活性を前記組成物に付与する１種または複数の分子を含む、感染症組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、動的光散乱法により測定した場合に約０．３未満のＰＤＩ、および約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間、好ましくは６０〜１１０ｎｍの平均粒径を有する、請求項１に記載の抗感染症組成物。
【請求項３】
前記組成物中の前記ナノ粒子の少なくとも９０％が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間の平均粒径を有する、請求項１または２に記載の抗感染症組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、または約１４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間の平均直径を有する、請求項３に記載の抗感染症組成物。
【請求項５】
前記抗感染成分が、抗生物質、抗真菌剤または抗原生動物化合物を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項６】
前記抗生物質、抗真菌剤または抗原生動物化合物が、前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子にコンジュゲートされている、請求項５に記載の抗感染症組成物。
【請求項７】
前記抗感染成分が、前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の表面に結合している正の電荷を持つ分子を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム化合物で官能化されている、請求項７に記載の抗感染症組成物。
【請求項９】
前記ナノ粒子が第四級アンモニウム化合物で官能化されている、請求項８に記載の抗感染症組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、Ｃ２〜Ｃ３２第四級アンモニウム化合物で官能化されている、請求項９に記載の抗感染症組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が疎水性官能基でさらに官能化されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項１２】
局所投与のためである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、１種または複数の医薬品または診断剤にコンジュゲートされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、抗感染症剤にコンジュゲートされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、抗真菌剤にコンジュゲートされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗感染症組成物を含む、インプラント（埋込物）もしくはバイオ医療機器またはインプラント（埋込物）もしくはバイオ医療機器のためのコーティング。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗感染症組成物で全体的、または部分的にコーティングされている、インプラント（埋込物）またはバイオ医療機器。
【請求項１８】
組織工学用足場材、創傷被覆材または絆創膏、ワイヤ、縫合糸、またはペースメーカー、人工関節、カテーテル、ステント、もしくは血管形成バルーンなどの移植機器である、請求項１６または１７に記載のインプラント（埋込物）またはバイオ医療機器。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が全重量に対して０．５〜９５％の濃度で存在する、請求項１６または１７に記載のインプラント（埋込物）またはバイオ医療機器用のコーティング。
【請求項２０】
水ベースまたはアルコールベースの溶媒に溶解されていて、前記ナノ粒子が全重量に対して０．１〜２０％の濃度で存在する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗感染症組成物。
【請求項２１】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、感染症を処置する方法。
【請求項２２】
前記微生物感染症が真菌感染症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物感染症が細菌感染症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌感染症が緑膿菌（P.aeruginosa）に起因する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者が嚢胞性線維症を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物がバイオフィルムの形成、維持または成長を減少させる、または阻害する、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が菌体密度検知プロセスを阻害する、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞内感染を処置する方法。
【請求項２９】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗感染症組成物を含む、皮膚清浄剤。
【請求項３０】
ａ  全重量に対して約２５％〜約７５％の消毒アルコール；
ｂ  全重量に対して約０．１％〜５．０％の前記抗感染症組成物；
ｃ  殺ウイルス有効量の有機酸；および
ｄ  水
を含む、請求項２９に記載の皮膚清浄剤。
【請求項３１】
ゲル剤、ローション剤またはエアゾールスプレー剤の形態である、請求項２９または３０に記載の皮膚清浄剤。
【請求項３２】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗感染症組成物を含む、表面清浄剤。
【請求項３３】
ａ  全重量に対して約５０％〜９０％の消毒アルコール；
ｂ  全重量に対して約０．５％〜１０．０％の前記抗感染症組成物；
ｃ  前記組成物のｐＨを約５未満に維持するために十分であり、全重量に対して約０．１％〜約５％を構成する酸成分；および
ｄ  水
を含む、請求項３２に記載の表面清浄剤。
【請求項３４】
ゲル剤、ローション剤またはスプレー剤の形態である、請求項３２または３３に記載の表面清浄剤。
【請求項３５】
表面でのバイオフィルムの形成を阻害する方法であって、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗感染症組成物を前記表面に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
抗生物質の抗微生物活性を増強する方法であって、カチオン化グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子および前記抗生物質を同時投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記ナノ粒子が、動的光散乱法により測定した場合に約０．３未満のＰＤＩおよび約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間、好ましくは６０〜１１０ｎｍの平均粒径を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物中の前記ナノ粒子の少なくとも９０％が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間の平均粒径を有する、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、または約１４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間の平均直径を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナノ粒子がフィトグリコーゲンのナノ粒子である、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノ粒子および前記抗生物質を同時に投与する、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ナノ粒子および前記抗生物質を連続的に投与する、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗生物質が、ベータ−ラクタム、フルオロキノロン、アミノクマリン、マクロライド、フェニコール、テトラサイクリン、グリコペプチドまたはキノロンである、請求項３６から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ナノ粒子が、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム化合物を使用してカチオン化されている、請求項３６から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ナノ粒子が、第四級アンモニウム化合物を使用してカチオン化されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ナノ粒子が、疎水性官能基でさらに官能化されている、請求項３６から４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第６２／３２２，４７８号による優先権を主張し、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗感染症組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
グリコーゲンは、動物における短期エネルギー貯蔵物質である。哺乳動物では、グリコーゲンは、筋肉および肝臓組織において生じる。これは、１，４−グルカン鎖から構成され、α１，６−グルコシド連結を介して高度に分枝していて、１０６〜１０８ダルトンの分子量を有する。グリコーゲンは、動物組織中に存在し、微生物、例えば、細菌および酵母において蓄積することも見出されている。
【０００４】
フィトグリコーゲンは、その構造および物理的特性の両方に関して、グリコーゲンに非常に類似している多糖である。これは、その植物由来の由来源に基づき、グリコーゲンとは区別される。フィトグリコーゲンの主要な供給源は、スイートコーンの穀粒、他にも、コメ、オオムギ、およびモロコシの特別品種である。
【０００５】
グリコーゲン、フィトグリコーゲンおよび関連グリコーゲン様物質の用途が示唆されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、第四級アンモニウム化合物で官能化されたカチオン化フィトグリコーゲンなどの変性グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンを含む、グリコーゲンもしくはフィトグリコーゲンナノ粒子（本明細書では、「フィトグリコーゲンナノ粒子」と称する）を含む抗感染症組成物に関する。さらに、本開示は、抗感染症剤として使用するための、フィトグリコーゲンナノ粒子を含む組成物に関する。
【０００７】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子は、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム化合物で官能化されている。好ましい一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子は、第四級アンモニウム化合物で官能化されている。一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子は、一般構造：
Ｐ／Ｇ−（リンカー）−Ｎ（Ｒ１Ｒ２Ｒ３）＋
［式中、Ｒ１／２／３は、Ｃ１〜Ｃ３２アルキル鎖である］を有する第四級アンモニウム化合物で官能化されている。一部の実施形態では、Ｒ１／２／３は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖、好ましくはＣ１〜Ｃ２４アルキル鎖である。他の実施形態では、リンカーは、任意選択であり、第四級アンモニウム化合物は、ナノ粒子に直接的に付着する。リンカーは、さらなる官能基を伴うか、もしくは伴わないＣ１〜Ｃ３２アルキル鎖、あるいはポリエチレンオキシドもしくはポリエチレンイミンなどのオリゴマーまたはポリマーを含んでもよい。
【０００８】
一実施形態では、抗感染症組成物は、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を抗感染成分と共に含み、その抗感染成分は、組成物に抗感染活性を付与する１種または複数の分子、および担体を含む。
【０００９】
一実施形態では、抗感染症組成物は、動的光散乱法により測定した場合に約０．３未満の多分散指数（ＰＤＩ）を有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む。一実施形態では、抗感染症組成物は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間の平均粒径を有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む。一実施形態では、抗感染症組成物は、約６０ｎｍ〜約１１０ｎｍの間の平均粒径を有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む。
【００１０】
一実施形態では、抗感染成分は、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生生物剤または抗原生動物化合物を含む。
【００１１】
様々な実施形態で、フィトグリコーゲンナノ粒子は、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生生物剤および／または抗原生動物化合物のうちの１種または複数にコンジュゲートしている。他の実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生生物剤および／または抗原生動物化合物のうちの１種または複数と同時に投与する。
【００１２】
一実施形態では、抗感染症剤を、バイオフィルム阻害剤として使用する。一実施形態では、組成物は、バイオフィルムの形成、維持または成長を減少させる、または阻害する。別の実施形態では、本組成物は、菌体密度検知（クオラムセンシング）プロセスおよび病原性因子の生成を阻害する。
【００１３】
一部の実施形態では、抗感染症組成物を、皮膚用清浄剤（skin sanitizer）または表面清浄剤（surface sanitizer）として使用することができ、清浄剤は、ゲル剤、ローション剤、洗浄液剤またはスプレー剤の形態である。他の実施形態では、抗感染症組成物を、細胞内感染を処置するために使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】シアニル化を介してのフィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子誘導体化を示す図である。
【図２】フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子の略図である。
【図３】死細胞により測定した場合の、単分散グリコーゲンナノ粒子によるＨｅｐ２（癌肝臓細胞）に対する細胞傷害性を、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）と比較して示すグラフである。
【図４】乳酸デヒドロキナーゼ（ＬＤＨ）の放出により測定した場合の、単分散グリコーゲンナノ粒子（ｎｐｓ）によるＨｅｐ２（癌肝臓細胞）に対する細胞傷害性を、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）と比較して示すグラフである。
【図５】ローダミンＢにコンジュゲートさせた単分散フィトグリコーゲンナノ粒子と共にインキュベートした正常マウス内皮細胞の蛍光顕微鏡観察である。
【図６】ローダミンＢとコンジュゲートさせた単分散フィトグリコーゲンナノ粒子と共にインキュベートした白血球の蛍光顕微鏡観察である。
【図７】天然フィトグリコーゲン（暗灰色の棒）およびそのカチオン化形態（中抜きの棒）の存在下または非存在下で成長中の緑膿菌（P.aeruginosa）によるピオシアニン産生を示すグラフである。データは、内部三連反復試験での３つの独立した実験の平均である（ｎ＝９±ＳＥＭ）。
【図８】緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１の（ａ）遊泳（swimming）（ｂ）トゥイッチング（固体表面を這う運動性）および、（ｃ）スウォーミング（半固体表面における集団での）運動性がカチオン化フィトグリコーゲン（□）によってはマイナスの影響を受けるが、天然フィトグリコーゲン（■）によってはマイナスの影響を受けないことを示すグラフである。データは、非補充条件下で得られた平均値に対して正規化されている。結果を、アッセイ内三連反復試験およびプレート当たり３回の測定値の記録を伴う独立した三連実験により確認した（ｎ＝２７±ＳＥＭ）。
【図９】天然またはカチオン化フィトグリコーゲンを補充された変法Ｍ９培地中で緑膿菌（P.aeruginosa）が形成するバイオフィルムの代表画像である。
【図１０】天然フィトグリコーゲンを補充された変法Ｍ９培地（■）またはキングＡ培地（◆）における緑膿菌（P.aeruginosa）によるバイオフィルム付着成長の定量化を示すグラフである。比例データは、ｎ＝９の平均±ＳＥＭである；吸光度値を、培地のみの中で成長させたバイオフィルムの平均吸光度値に正規化した。
【図１１】カチオン化フィトグリコーゲンを補充された変法Ｍ９培地（□）またはキングＡ培地（◇）中での緑膿菌（P.aeruginosa）によるバイオフィルム形成の定量化を示すグラフである。比例データは、ｎ＝９の平均±ＳＥＭであり；吸光度値を、培地のみの中で成長させたバイオフィルムの平均吸光度値に正規化した。
【図１２】予め形成させたバイオフィルムをカチオン化フィトグリコーゲンで処理した後の、緑膿菌（P.aeruginosa）によるバイオフィルム付着成長の代表的な画像である。
【図１３】カチオン化フィトグリコーゲンで処置した後の、緑膿菌（P.aeruginosa）により予め形成されたバイオフィルムの除去を示すグラフである。四連反復アッセイ内反復試験として実験を行い、３回繰り返した。データを、２０ｈＴバイオフィルムサブセットで得られた平均Ａ５７０に対して正規化している（ｎ＝１２±ＳＥＭ）。
【図１４】カチオン化フィトグリコーゲンに対する緑膿菌（P.aeruginosa）バイオフィルムの２０時間の短期曝露が、バイオフィルムの低減をもたらすことを示すグラフである。２０時間、バイオフィルムを培地のみ（暗色の棒）、および１ｍｇの天然フィトグリコーゲン．ｍｌ−１（灰色の棒）または１ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１（中抜きの棒）を含む培地に曝露した。値は、ｎ＝１２の平均±ＳＥＭである。
【図１５】カチオン化フィトグリコーゲンがＭＩＣ未満の選択抗生物質の望ましくない特徴であるバイオフィルム形成の増強を防止することを示すグラフである。吸光度データを、抗生物質を含まない対応培地条件に正規化した。アッセイをミュラー−ヒントン培地（●）または１（灰色）もしくは１０ｍｇ（○）のカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充された培地中で行った。値は、ｎ＝１２の平均±ＳＥＭである。
【図１６】カチオン化フィトグリコーゲンおよび抗生物質トブラマイシンの組合せがバイオフィルム根絶を増強することを示すグラフである。吸光度データを、抗生物質を含まない対応培地条件に正規化した。アッセイを、ミュラー−ヒントン培地（●）または１（灰色）もしくは１０ｍｇ（○）のカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充された培地中で行った。値は、ｎ＝１２の平均±ＳＥＭである。
【図１７】カチオン化フィトグリコーゲンおよび抗生物質シプロフロキサシンの組合せがバイオフィルム根絶を増強することを示すグラフである。吸光度データを、抗生物質を含まない対応培地条件に正規化した。アッセイを、ミュラー−ヒントン培地（●）または１（灰色）もしくは１０ｍｇ（○）のカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充された培地中で行った。値は、ｎ＝１２の平均±ＳＥＭである。
【図１８】カチオン化フィトグリコーゲンは、懸濁液から細胞の沈降をもたらすが、天然フィトグリコーゲンは沈降をもたらさないことを示す画像である。代表画像は、天然またはカチオン化フィトグリコーゲンを補充された培地中でインキュベートされた細胞の懸濁液を含有するマイクロチューブから示されている。上部液相の同時清澄化を随伴する、カチオン化フィトグリコーゲンを含有するチューブの底部での物質（細胞）の形成に注意されたい。
【図１９】天然またはカチオン化フィトグリコーゲンと共にインキュベートされた緑膿菌（P.aeruginosa）細胞の代表的な透過電子顕微鏡写真である。暗色の矢印は、フィトグリコーゲンを示している。細胞表面でのカチオン化フィトグリコーゲンの局在化に注意されたい；白色の矢印は、細胞表面の乱れ（perturbation）領域を示している。スケールバーは１μｍを表している。
【図２０】ＴＨＰ−１単核細胞によるＣｙ５．５標識ＰＨＸ粒子の内在化：Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）と共に４℃で２４時間にわたって（Ａ）、３７℃で６時間にわたって（Ｂ）および３７℃で２４時間にわたってインキュベートされたＴＨＰ−１細胞の蛍光共焦点画像である。Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンナノ粒子、ＤＡＰＩで染色された核、およびＡＦ４８８で染色された細胞膜。
【図２１】ヌードＣＤ−１マウスの繰り返し血液採取から得られたＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの薬物動態プロファイルを示すグラフである。
【図２２】未処置のヌードＣＤ−１マウスにおいて静脈内注射後３０分目および２４時間目にｅｘ  ｖｉｖｏで撮像された臓器の蛍光シグナルの定量化を示すグラフである。平均蛍光濃度データは、肝臓および腎臓に加えて、肺および心臓でも高いシグナルが検出され得ることを示唆している。３０分目での蛍光濃度は、２４時間目よりも高い。走査前データは、Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンを注射されなかったマウスでの蛍光濃度データを示している（すなわち、背景の自家蛍光）。データは、平均＋／−ＳＤとして表されている。
【図２３】未処置のヌードＣＤ−１マウスにおいてＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの静脈内注射後３０分目および２４時間目にｅｘ  ｖｉｖｏで撮像された脳における蛍光シグナルの定量化を示すグラフである。データは、走査前（自家蛍光レベル）と比較して、Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンから、脳において測定可能なシグナルが存在することを示している。シグナルは、３０分目に最高であり、ゆっくり経時的に２４時間目で低下する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「抗感染症剤」は、感染の進行または拡大を制限する薬剤を指す。抗感染症剤には、抗細菌剤、抗真菌剤および抗寄生生物剤などの抗微生物剤が含まれ、それらは、細胞成長を制限する、または細胞死をもたらすことにより作用する。抗感染症剤にはまた、成長阻害および細胞死以外の機構を介して感染の進行または拡大を制限する薬剤が含まれる。抗感染症剤は、感染体および標的宿主の両方の生理学的応答を変化させることにより作用し得る。菌体密度検知阻害剤は、前者の例であり；ワクチンは、後者の例である。用語「抗感染症剤」は、本明細書で使用される場合、抗微生物活性、および他にも病原性因子の産生の減弱または変更の両方を通じて作用し得る。用語「病原性因子」は、本明細書で使用される場合、感染をもたらす生体の能力に寄与する、細胞によって産生される因子である。病原性因子は、細胞から排出される、分泌される、または落とされ得（例えば、酵素、毒素）、細胞の一部（例えば、膜修飾物（membrane modifications）、または細胞の行動（例えば、運動性、バイオフィルム形成）であり得る。
【００１６】
用語「抗生物質」および「抗細菌剤」は、細菌感染症または細菌の拡散の処置または予防において使用される薬剤を指すために互換的に使用され、細菌を死滅させる、または細菌の成長を阻害する薬剤の両方を含む。用語「抗真菌剤」は、真菌感染症または真菌の拡散の処置または予防において使用される薬剤を指すために使用され、真菌を死滅させる、または真菌の成長を阻害する薬剤の両方を含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「バイオフィルム」は、細菌、古細菌、ウイルス、原生動物、真菌または藻類を含む微生物の凝集体を指し、その中で、細胞は往々にして、細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）の自己生産マトリックス内に包埋され、お互いに、および／または表面に接着している。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「カチオン化フィトグリコーゲン」は、短鎖第四級アンモニウム化合物を含有するものなど、正の電荷を持つ官能基を含むように変性されたフィトグリコーゲンを指す。短鎖第四級アンモニウム化合物は、非置換であるか、または１個もしくは複数のＮ、Ｏ、Ｓ、もしくはハロゲン原子で置換されている、１〜３２個の炭素原子、好ましくは１〜３０個の炭素原子、より好ましくは１〜２４個の炭素原子を有する少なくとも１個のアルキル部分を含む。好ましい一実施形態では、短鎖第四級アンモニウム化合物は、１〜１６個の炭素原子を有する少なくとも１個のアルキル部分を含む。一実施形態では、変性剤は、０．０５〜２．０、好ましくは０．３〜１．２の置換度を有する３−（トリメチルアンモニオ）２−ヒドロキシプロピ−１−イルである。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外ポリマー物質」（ＥＰＳ）は、微生物によって自己生産されるマトリックスを指し、任意の組み込まれる外来物質は一般に、例えば、細胞外ＤＮＡ、タンパク質、脂質および多糖を含む、様々な構造形態での細胞外バイオポリマーから構成される。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投薬で、かつ特定の期間にわたって有効な量を指す。薬理学的薬剤の治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬理学的薬剤の能力などの因子によって変動し得る。治療有効量はまた、薬理学的薬剤のいずれかの毒性または有害な作用よりも治療上の有益効果が上回る量である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「患者」は、感染症について処置を受ける動物を指し、これは、一実施形態では、脊椎動物、一実施形態では、哺乳動物、一実施形態では、ヒト患者であってよい。本明細書で使用される場合、用語「処置」は、疾患または状態の変化または改善をもたらすために、本発明の組成物を投与することを指し、これは、その１つまたは複数の症状の緩和を含んでよい。使用は、予防的であってもよい。予防、寛解、および／または処置は、疾患または状態の経過を変化させるために、一定の間隔での、または疾患もしくは状態の発症前の複数回の投与を必要とし得る。
【００２２】
本開示は、短鎖第四級アンモニウム化合物で官能化されたカチオン化フィトグリコーゲンなどの変性グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンを含む、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子（「フィトグリコーゲンナノ粒子」）を含む抗感染症組成物に関する。さらに、本開示は、抗感染症剤として使用するための、フィトグリコーゲンナノ粒子を含む組成物に関する。一実施形態では、抗感染症剤をバイオフィルム阻害剤として使用する。
【００２３】
一実施形態では、ナノ粒子を、所望の治療結果を達成するために必要な抗生物質の量を低減させるために、抗生物質処置の一成分として使用してもよい。
【００２４】
フィトグリコーゲンは、平均鎖長１１〜１２、１→４連結および１→６で生じている分岐点を有し、分岐度が約６％〜約１３％のα−Ｄグルコース鎖の分子から構成される。一実施形態では、フィトグリコーゲンは、天然源および合成フィトグリコーゲンから得られるフィトグリコーゲンの両方を含む。本明細書で使用される場合、用語「合成フィトグリコーゲン」は、植物由来物質、例えば、デンプンを含む基質に対して酵素プロセスを使用して調製されたグリコーゲン様生成物を含む。
【００２５】
グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンを得るために最も知られている方法の産出物ならびにグリコーゲンおよびフィトグリコーゲンの最も多い市販源は、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲン粒子の両方、さらには、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンの他の生成物および分解生成物を含む高度に多分散の生成物であり、そのことにより、本明細書に記載の組成物および方法におけるそれらの有効性が低くなる。したがって、適切に実質的に単分散のグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンを使用する。これらの実質的に単分散のグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、低い多分散指数を有する。好ましい一実施形態では、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を使用する。一実施形態では、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子は、Ｍｉｒｅｘｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＰｈｙｔｏＳｐｈｅｒｉｘ（商標）である。
【００２６】
一実施形態では、フィトグリコーゲンは、本明細書に記載の方法により製造される単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を指す。記載の方法により、単一のフィトグリコーゲン分子である実質的に球形のナノ粒子の生産が可能になる。
【００２７】
好ましい一実施形態では、単分散カチオン化フィトグリコーゲンナノ粒子を使用する。
【００２８】
フィトグリコーゲンナノ粒子の単分散組成物を下記に詳述する。本明細書に記載の組成物の単分散および微粒子の性質は、それらを抗感染症適用において使用するために高度に適したものとする特性と関連している。さらに、これらのフィトグリコーゲンナノ粒子は適切に、約３０〜１５０ｎｍの間、一実施形態では、６０〜１１０ｎｍの間のサイズを有する。
【００２９】
したがって、好ましい一実施形態では、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の抗感染症組成物を使用する。
【００３０】
本明細書において教示するとおりのフィトグリコーゲンナノ粒子は、それらを抗感染症組成物において使用するために特に適したものとするいくつかの特性を有する。多くの既存の薬物は、身体から迅速に排出されて、投薬量の増加の必要性をもたらす。フィトグリコーゲンナノ粒子のコンパクトな球形性は、効率的な細胞取込みと関連する一方で、フィトグリコーゲンの高度分枝性および高分子量はそれぞれ、ゆっくりとした酵素分解および血管内保持時間の増加と関連すると考えられる。
【００３１】
図２に示すとおり、各フィトグリコーゲン粒子は、非常に高い分子量（最高１０７Ｄａ）により特徴づけられる高分枝グルコースホモポリマーから作製される単一分子である。このホモポリマーは、１→４連結および１→６で生じている分岐点を有し、分岐度が約１０％のα−Ｄグルコース鎖からなる。これらの粒子は、球形であり、出発物質およびフィルターステップを変動させることにより、３０〜１５０ｎｍの範囲の直径の種々のサイズで製造され得る。フィトグリコーゲンナノ粒子上の高密度の表面基は、水中への急速な溶解、高濃度のフィトグリコーゲンナノ粒子の水溶液での低い粘度およびせん断減粘効果（shear thinning effects）などのフィトグリコーゲンナノ粒子の様々な独特の特性をもたらす。これは、匹敵する分子量の線状および低分枝多糖の高い粘度および不十分な溶解性と対照的である。さらに、これは、水またはＤＭＳＯ中の高濃度（最高３０％）で安定な分散液の製剤を可能にする。
【００３２】
実施例によって実証されるとおり、本発明者らは、フィトグリコーゲンナノ粒子が、種々の種類の細胞によって細胞内に蓄積され得ることを見出した。
【００３３】
フィトグリコーゲンナノ粒子が内在化されると、そのナノ粒子は細胞ヒドロラーゼによって消化される。分解速度は、低分子によるフィトグリコーゲン誘導体化、例えば、メチル化、ヒドロキシプロピル化の程度によって制御され得る（これは、多糖鎖に対するヒドロラーゼの親和性、したがって、加水分解の速度に影響を及ぼす）。
【００３４】
フィトグリコーゲンナノ粒子をさらに、特異的な組織標的分子で変性することができる。
【００３５】
フィトグリコーゲンナノ粒子は、非毒性であり、アレルゲン性は知られておらず、ヒト身体のグリコーゲン分解酵素（例えば、アミラーゼおよびホスホリラーゼ）により分解され得る。酵素分解による生成物は、グルコースの非毒性分子である。
【００３６】
フィトグリコーゲンナノ粒子は一般に、光安定性であり、広範なｐＨ、電解質、例えば塩濃度にわたって安定性である。
【００３７】
米国特許出願公開第２０１０／０２７２６３９号明細書（本発明の所有者に譲渡。その開示はその全体で参照により本明細書で組み込まれる）は、細菌および甲殻類バイオマスからグリコーゲンナノ粒子を生産する方法を提供している。開示の方法は概して、機械的な、または化学処理により細胞を破壊するステップ；遠心分離により不溶性の細胞成分を分離するステップ；酵素処理、続く、粗多糖、脂質、およびリポ多糖（ＬＰＳ）を含有する抽出物を生成する透析、または別法ではフェノール−水抽出により、細胞溶解産物からタンパク質および核酸を排除するステップ；弱酸加水分解または多価カチオンの塩での処理によりＬＰＳを排除して、不溶性ＬＰＳ産物を沈殿させるステップ；ならびに限外濾過および／またはサイズ排除クロマトグラフィによりグリコーゲン富化画分を精製するステップ；ならびに限外濾過または超遠心分離により得ることができる、適切な有機溶媒または濃グリコーゲン溶液でグリコーゲンを沈殿させるステップ；および凍結乾燥させて、グリコーゲンの粉末を生産するステップを含む。細菌バイオマスから生産されたグリコーゲンナノ粒子は、分子量５．３〜１２．７×１０6Ｄａにより特徴づけられ、直径３５〜４０ｎｍの粒径を有し、単分散であった。
【００３８】
フィトグリコーゲンの単分散組成物を製造する方法は、「Phytoglycogen  Nanoparticles and Methods of Manufacture Thereof」（国際出願公開第２０１４／１７２７８６号で開示されており、その開示はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）と標題された国際特許出願において開示されている。一実施形態では、記載の単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を製産する方法は、ａ．破壊したフィトグリコーゲン含有植物材料を約０〜約５０℃間の温度の水に浸漬させるステップ；ｂ．ステップ（ａ．）の産物を固液分離に掛けて、水性抽出物を得るステップ；ｃ．ステップ（ｂ．）の水性抽出物を約０．０５μｍ〜約０．１５μｍの間の最大平均孔径を有する精密濾過材料に通すステップ；およびｄ．ステップｃ．からの濾液を限外濾過に掛けて、約３００ｋＤａ未満、一実施形態では約５００ｋＤａ未満の分子量を有する不純物を除去して、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を含む水性組成物を得るステップを含む。この方法の一実施形態では、フィトグリコーゲン含有植物材料は、トウモロコシ、コメ、オオムギ、モロコシまたはそれらの混合物から選択される穀物である。一実施形態では、ステップｃ．はステップ（ｂ．）の水性抽出物を（ｃ．１）約１０μｍ〜約４０μｍの間の最大平均孔径を有する第１の精密濾過材料；（ｃ．２）約０．５μｍ〜約２．０μｍの間の最大平均孔径を有する第２の精密濾過材料、および（ｃ．３）約０．０５〜０．１５μｍの間の最大平均孔径を有する第３の精密濾過材料に通すことを含む。この方法はさらに、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を含む水性組成物を、アミロスクラーゼ（amylosucrose）、グリコシルトランスフェラーゼ、分枝酵素またはこれらの任意の組合せを使用する酵素処理に掛けるステップ（ｅ）を含むことができる。この方法は、フィトグリコーゲン材料を劣化させる化学的、酵素的または熱処理の使用を回避する。水性組成物をさらに乾燥することができる。
【００３９】
一実施形態では、ナノ粒子を、スイートコーン出発物質（Zea mays var.saccharataおよびZea mays var.rugosa）から生産する。一実施形態では、スイートコーンは、標準（ｓｕ）品種または糖分増強（ｓｅ）品種のものである。一実施形態では、組成物を、デント・ステージまたはミルク・ステージのスイートコーンの穀粒から生産する。動物または細菌供給源からのグリコーゲンとは異なり、フィトグリコーゲンの使用は、これらの他の供給源と関連し得るプリオンまたは内毒素での汚染の危険性を低減させる。
【００４０】
ナノ粒子組成物の多分散指数（ＰＤＩ）は、動的光散乱（ＤＬＳ）技法により決定することができ、この実施形態では、ＰＤＩは標準偏差対平均直径比の２乗として決定される（ＰＤＩ＝（σ／ｄ）2）。ＰＤＩはポリマーの分子量の分布を通じて表すこともでき、この実施形態では、ＭｗのＭｎに対する比として定義され、ここで、Ｍｗは重量平均モル質量であり、Ｍｎは数平均モル質量である（以後、このＰＤＩ測定値をＰＤＩ*と称する）。第１のケースでは、単分散材料はゼロ（０．０）のＰＤＩを有し、第２のケースでは、ＰＤＩ*は１．０となる。
【００４１】
一実施形態では、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む抗感染症組成物、本質的に単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物からなる抗感染症組成物、または単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物のみからなる抗感染症組成物を提供する。適切には、これらのナノ粒子は、下記でさらに記載するとおりに変性される。一実施形態では、抗感染症組成物は、動的光散乱法により測定した場合に約０．３未満、未満約０．２未満、約０．１５未満、約０．１０未満、または０．０５未満のＰＤＩを有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む抗感染症組成物、本質的に当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物からなる抗感染症組成物、または当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物のみからなる抗感染症組成物。一実施形態では、抗感染症組成物は、ＳＥＣ  ＭＡＬＳにより測定した場合に約１．３未満、約１．２未満、約１．１５未満、約１．１０未満、または１．０５未満のＰＤＩ＊を有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む抗感染症組成物、本質的に当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物からなる抗感染症組成物、または当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物のみからなる抗感染症組成物。
【００４２】
一実施形態では、抗感染症組成物は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの間の平均粒径を有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む抗感染症組成物、本質的に当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物からなる抗感染症組成物、または当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物のみからなる抗感染症組成物。一実施形態では、抗感染症組成物は、約６０ｎｍ〜約１１０ｎｍの平均粒径を有する単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む抗感染症組成物、本質的に当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物からなる抗感染症組成物、または当該単分散フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物のみからなる抗感染症組成物。他の実施形態では、約４０〜約１４０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍの平均粒径を有するナノ粒子を含む抗感染症組成物、本質的に当該ナノ粒子からなる抗感染症組成物、または当該ナノ粒子の組成物のみからなる抗感染症組成物組成物を提供する。これらのナノ粒子を、下記でさらに記載するとおりに変性してもよい。
【００４３】
実施例１に、および「Phytoglycogen Nanoparticles and Methods of Manufacture Thereof」との標題で国際出願公開第２０１４／１７２７８６号で公開されている国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０００３８０に詳述されているとおりの、フィトグリコーゲンナノ粒子を生産する方法が、医薬グレード条件下での調製に適している。
【００４４】
フィトグリコーゲンナノ粒子の化学的変性
フィトグリコーゲンナノ粒子に特異的な特性を付与するために、これらを、炭水化物ケミストリーで一般的な多数の方法を介して化学的に変性することができる。
【００４５】
したがって、好ましい一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を変性する。得られた生成物は、本明細書では互換的に、官能化ナノ粒子または誘導体と称される。官能化をナノ粒子の表面で、または粒子の表面および内部の両方で実施することができるが、単一分枝ホモポリマーとしてのグリコーゲンまたはフィトグリコーゲン分子の構造は維持する。一実施形態では、官能化をナノ粒子の表面上で実施する。当業者には理解されるであろうとおり、化学的変性は、非毒性であり、ヒト消費に一般に安全であるべきである。上記の方法により生産されるフィトグリコーゲンナノ粒子の化学的特徴を、その親水性で若干負に帯電した本来の状態から、正に、および／もしくは負に帯電した状態、または部分的に、もしくは高度に疎水性となるように変化させてもよい。多糖の化学的な加工は当技術分野で周知である。例えば、J.F Robyt、Essentials of Carbohydrate Chemistry, Springer, 1998;およびM. Smith, and J. March、March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure Advanced Organic Chemistry、Wiley、2007を参照されたい。
【００４６】
下記でさらに記載するとおり、正電荷を有するように変性されたナノ粒子は、抗微生物活性を含む抗感染活性を実証する。
【００４７】
ナノ粒子を直接的または間接的に官能化することができ、１つまたは複数の中間リンカーまたはスペーサーを使用することができる。ナノ粒子を、２つ以上、３つ以上、または４つ以上の官能化ステップを含む１つまたは１つ以上の官能化ステップに掛けることができる。
【００４８】
適切に官能化されたアルキル基でのエーテル化による、ヒドロキシル基から別の官能基への相互変換による、または酸化によるフィトグリコーゲンのヒドロキシル基の化学的官能化により、様々な誘導体を生産することができる。そのような官能基には、これらだけに限定されないが、求核および求電基、ならびに酸性および塩基性基、例えば、カルボニル基、アミン基、チオール基、カルボキシル基、ならびにアミドまたはエステルなどのそれらの誘導体、アジド、ニトリル、ハロゲニドおよびトシル、メシルまたはトリフレートなどのシュード−ハロゲニドン、ならびにアルキル、ビニル、フェニル、ベンジル、プロパルギルおよびアリル基などのヒドロカルビル基が含まれる。アミノ基は、第一級、第二級、第三級、または第四級アミノ基、好ましくは第四級アミノ基であり得る。
【００４９】
官能化ナノ粒子は、生体分子、低分子、治療剤、マイクロ−およびナノ粒子、薬学的に活性な部分、高分子、診断用標識、キレート化剤、分散剤、電荷調節剤（charge modifying agent）、粘度調節剤、界面活性剤、凝固剤および凝集剤、さらには、これらの化合物の様々な組合せなどの、様々な用途に重要である様々な所望の分子とさらにコンジュゲートさせることができる。ある特定の実施形態では、２種以上の異なる化合物を、多官能価誘導体を生産するために使用する。
【００５０】
一実施形態では、官能化ナノ粒子を、第四級アンモニウム化合物で変性する。
【００５１】
グルコースサブユニット上のヒドロキシル基の反応性は低い。そうであっても、高いｐＨで、エポキシド、ハロゲン化アルキルまたは無水物との反応が可能であり、対応するエーテルまたはエステル連結を形成する。エポキシドまたは無水物官能基を有する水溶性化学品は、塩基性ｐＨ（８〜１３）で、フィトグリコーゲンナノ粒子（適切な触媒の存在下で）と反応する。水性環境での誘導体化が多くの場合に好ましいが、一部の反応（例えば、アルキルハライドとの）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミドまたはピリジンなどの有機溶媒、または上述のものと塩化リチウムもしくはフッ化テトラブチルアンモニウムなどの塩との混合物中で最も良好に行われる。当業者には明らかであるとおり、毒性が低く、相対的に穏やかな条件で反応性である水溶性化合物が特に適している。
【００５２】
ヒドロキシル基の反応性を増大させるための単純なアプローチは、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４および／またはＣ−６の位置でのグルコースヒドロキシル基を選択的に酸化させて、カルボニルもしくはカルボキシル基またはカルボキシルを得ることである。過硫酸塩、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸カリウム、臭素、亜塩素酸ナトリウム、ＴＥＭＰＯとして一般に公知の（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１イル）オキシダニル、およびデス−マーチンペルヨージナンなど、用いることができる幅広いスペクトルのレドックス開始剤が存在する。
【００５３】
カルボニル基で官能化されたフィトグリコーゲンナノ粒子は、第一級または第二級アミン基を有する化合物に対して容易に反応する。これは、イミン形成（反応式１）をもたらし、これをさらに、還元剤、例えば、ホウ水素化ナトリウムでアミンに還元させることができる（反応式２）。この還元ステップは、アミノ生成物をもたらし、これは、イミン中間体よりも安定しており、また、未反応のカルボニルをヒドロキシル基に変換する。カルボニルの除去は、非標的分子（例えば、血漿タンパク質）との誘導体化ナノ粒子の非特異的相互作用の可能性を有意に低減させる。
（反応式１）
Ｐ／Ｇ  ＮＡＮＯ  −ＣＨ＝Ｏ  ＋  Ｈ２Ｎ−Ｒ  →  Ｐ／Ｇ  ＮＡＮＯ−ＣＨ＝ＮＨ−Ｒ  ＋  Ｈ２Ｏ
還元剤
（反応式２）
Ｐ／Ｇ  ＮＡＮＯ  −ＣＨ＝ＮＨ−Ｒ  →  Ｐ／Ｇ  ＮＡＮＯ  −ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ
【００５４】
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）などのカップリング試薬を使用して、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などの補助剤試薬を添加して、または添加せずに、カルボキシル基を活性化させることができる。次いで、活性化カルボキシレートを非常に穏やかな条件下で、アミノまたはヒドロキシ基などの求核試薬と反応させる（実施例９、１０）。この種の活性化は、低分子の上のカルボキシル基を活性化するために、およびそれを天然フィトグリコーゲンのヒドロキシ基またはアミノ化フィトグリコーゲンのアミノ基と反応させるために使用することができる；またはこれは、酸化フィトグリコーゲンの上のカルボキシル基を活性化させ、アミノ含有低分子をそれに付着するために使用することができる（実施例１２）。
【００５５】
ある特定の実施形態では、記載のナノ粒子を、シアニル化のプロセスを介して官能化する。このプロセスは、多糖ヒドロキシル上でシアン酸エステルおよびイミドカルボネートの形成をもたらす。これらの基は、非常に穏やかな条件下で第一級アミンと容易に反応して、共有結合的連結を形成する（図１）。臭化シアンおよび１−シアノ−４−ジエチルアミノ−ピリジニウム（ＣＤＡＰ）などのシアニル化剤を、ナノ粒子の官能化のために使用することができる。
【００５６】
フィトグリコーゲンまたは変性フィトグリコーゲン上に存在する官能基に付着することができる官能基を持つ化合物を、ナノ粒子に直接的に付着させることができる。しかしながら、一部の用途では、化合物を、ポリマースペーサーまたは「リンカー」を介して結合させてもよい。これらは、アミノ、カルボニル、カルボキシル、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミジル、イソシアネート、（例えば、ジアミノヘキサン、エチレングリコビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、アミノエタンチオールなど）などの官能基を持つホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーであり得る。
【００５７】
第四級アンモニウム化合物で官能化された変性フィトグリコーゲンナノ粒子の抗微生物活性を、その疎水性を変性することによりさらに増強してもよい。したがって、好ましい一実施形態では、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を、第四級アンモニウムおよび疎水基の両方で二重変性する。疎水性相互作用を、適切な置換度および疎水性官能基を選択することにより微調整することができる。官能基の例には、これらだけに限定されないが、１〜２４の間の鎖長さの脂肪族アルキル、アルケニル、アルキニルまたはベンジルエーテルおよびエステルまたはトリアルキルシリルエーテル（実施例５〜７）が含まれる。
【００５８】
一実施形態では、対象に、本明細書に記載のとおりの組成物の治療有効量を投与することを含む、微生物感染症に罹患している対象を処置する方法を提供する。一実施形態では、組成物は、正の表面電荷を有する官能化フィトグリコーゲンナノ粒子を含む。一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、第二級、第三級または第四級アンモニウム基で官能化する。一実施形態では、組成物は、両親媒性基で官能化されたフィトグリコーゲンナノ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、第四級アンモニウム化合物で官能化させたグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む。ある特定の実施形態では、上記のとおりのフィトグリコーゲンナノ粒子を、さらにコンジュゲートさせることなく、官能化し、使用してもよい。
【００５９】
他の実施形態では、ナノ粒子をさらに、いくつか例を挙げると生体分子、低分子、治療剤、薬学的に活性な部分、高分子、診断用標識、キレート化剤、分散剤、界面活性剤、電荷調節剤、粘度調節剤、凝固剤および凝集剤、さらには、上記の様々な組合せが含まれ得る他の化合物にコンジュゲートさせてもよい。
【００６０】
コンジュゲートさせることができる生体分子には、ペプチド、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、成長因子および走化性因子などの細胞応答化合物、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、および核酸が含まれる。
【００６１】
一実施形態による抗感染症組成物は、他の分子にコンジュゲートされている官能化単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を含む。様々な実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子はさらに、医薬品にコンジュゲートされている。様々な実施形態では、ナノ粒子は、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生生物剤および／または抗原生動物化合物のうちの１種または複数にコンジュゲートされている。変性剤として使用される薬学的に有用な部分には、疎水性変性剤、薬物動態変性剤、および生物学的に活性な変性剤が含まれる。
【００６２】
フィトグリコーゲンナノ粒子にコンジュゲートされる化合物は、吸光、発光（light emitting）、蛍光、ルミネセンス（luminescent）、ラマン散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、およびエレクトロルミネセンス特性を有してもよい。
【００６３】
多官能価誘導体を生産するために、２種以上の異なる化合物を使用することができる。例えば、１種の化合物は、抗体およびアプタマーなどの特異的結合性生体分子のリストから選択することができる一方で、第２の化合物は、抗感染症剤のリストから選択されるであろう。例えば、１種の化合物は、カチオン性種であってよい一方で、第２の化合物は、抗生物質であってよい。
【００６４】
ローディング効率は、コンジュゲートされる分子の分子量および特性（電荷、疎水性など）に依存する。置換度は、薬物で誘導体化されたアンヒドログルコース単位の％として表される。例えば、薬物が１００Ｄａの分子量を有し、置換度が５０％であるならば、フィトグリコーゲンナノ粒子１ｇは、薬物０．３１ｇを担持するであろう。低分子（＜１００Ｄａ）では、置換度＞３０％が一般に達成され、メチル基では１００％に高くなる。より大きな分子（粒子の細孔構造を通過できない）は、フィトグリコーゲンナノ粒子の表面でのみコンジュゲートさせることができ、置換度は、より低く、一般に、０．１〜２．０％である。
【００６５】
抗感染活性
実施例で詳述するとおり、本発明者らは、それらを抗感染症用途での使用に高度に適したものにする特性を有する、その官能化形態を含むフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を開発してきた。
【００６６】
一実施形態では、正の電荷を持つフィトグリコーゲンナノ粒子を含む、それからなる、または本質的にそれからなる抗感染症組成物を提供する。フィトグリコーゲンナノ粒子の表面を、上記のとおりのいくつかの技法を通じてカチオン性にすることができる。
【００６７】
一実施形態では、フィトグリコーゲン、好ましくはフィトグリコーゲンの正の電荷を持つナノ粒子を含む抗感染症組成物を記載する。一実施形態では、組成物はさらに、一実施形態では、薬学的に許容される担体である、担体を含む。
【００６８】
一実施形態では、ナノ粒子を両親媒性化合物で変性する。
【００６９】
それらを抗感染症剤として有用なものにし得る、フィトグリコーゲンナノ粒子に対するカチオン性変性は、第二級、第三級または第四級アミノ基、特に、第四級アンモニウム誘導体での変性を含み得る。一実施形態では、第四級アンモニウム誘導体を、ヒドロキシプロピル−トリメチルアンモニウムおよびヒドロキシプロピル−アルキル−ジメチルアンモニウムから選択することができ、ここで、アルキルは、脂肪族Ｃ２〜Ｃ３２脂肪族炭化水素、例えば、これらだけに限定されないが、ラウリル−、ミリスチル−またはステアリル−である。別の実施形態では、アルキルは、Ｃ２〜Ｃ３２炭化水素、好ましくはＣ２〜Ｃ３０、より好ましくはＣ２〜Ｃ２４である。
【００７０】
細菌の表面は典型的には、アニオン性であり、理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、フィトグリコーゲンナノ粒子の表面上に、局在した高密度のカチオン化基を作製すると、細菌成長および生理学に影響を及ぼし得る蓄積電荷に基づいた作用が生じると仮定している。
【００７１】
実施例により実証されるとおり、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）およびカンジダ・ユチリス（Candida utilis）に対する抗感染活性が、フィトグリコーゲンナノ粒子の組成物の存在下で示される。
【００７２】
好ましい一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、短鎖第四級アンモニウム化合物で官能化されたカチオン化形態に変性する。
【００７３】
実施例で示されるとおり、カチオン化フィトグリコーゲンの存在下でのインキュベーション後に、様々なクラスの抗生物質に対する抗感染感受性の増大が、緑膿菌（P.aeruginosa）、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）およびカンジダ・ユチリス（C.utilis）に対して示される。
【００７４】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、これらだけに限定されないが、ペニシリン、カルボキシペニシリン、アミノペニシリン、グリコペプチド、キノロン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、フェニコール、スルホンアミド、テトラサイクリン、アミノクマリン、リポペプチドまたはアミノグリコシドから選択され得る抗生物質と同時投与する。
【００７５】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、これらだけに限定されないが、ポリエン、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、アリルアミン、またはエキノキャンディン系抗真菌剤から選択され得る抗真菌剤と共に同時投与する。
【００７６】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子、およびこれらだけに限定されないが、ペニシリン、カルボキシペニシリン、アミノペニシリン、グリコペプチド、キノロン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、フェニコール、スルホンアミド、テトラサイクリン、アミノクマリン、リポペプチド、カチオン性抗微生物ペプチド、またはアミノグリコシドから選択され得る抗生物質の両方を含む、抗感染症組成物を提供する。
【００７７】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子、およびこれらだけに限定されないが、ポリエン、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、アリルアミン、またはエキノキャンディン系抗真菌剤から選択され得る抗真菌の両方を含む、抗感染症組成物を提供する。
【００７８】
一実施形態では、ナノ粒子を、これらだけに限定されないが、ペニシリン、カルボキシペニシリン、アミノペニシリン、グリコペプチド、キノロン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、フェニコール、スルホンアミド、テトラサイクリン、アミノクマリン、リポペプチド、カチオン性抗微生物ペプチド、またはアミノグリコシドから選択され得る抗生物質とコンジュゲートさせる。
【００７９】
一実施形態では、ナノ粒子を、これらだけに限定されないが、ポリエン、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、アリルアミン、またはエキノキャンディン系抗真菌剤から選択され得る抗真菌にコンジュゲートさせる。
【００８０】
一実施形態では、抗感染症組成物はさらに、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００８１】
本明細書に記載のとおりの抗感染症組成物を、細菌、真菌または寄生生物感染症を処置するために使用することができ、また、予防的に使用することもできる。
【００８２】
それを必要とする対象に、本明細書に記載のとおりの抗感染症組成物の治療有効量を投与することを含む、微生物感染症を処置する方法も提供する。一実施形態では、微生物感染症は、真菌感染症である。一実施形態では、微生物感染症は、細菌感染症である。
【００８３】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、微生物の菌力および病原性を調節するために、同時治療剤として、抗生物質としてではなく、抗感染症剤として使用する。
【００８４】
感染症は、細胞内感染症であってよい。
【００８５】
フィトグリコーゲンナノ粒子の抗感染活性は、下記でより詳細に検討されるとおり、全体的に、または部分的に、バイオフィルムの形成、維持、もしくは成長を減少させる、または阻害することにより作用し得る。
【００８６】
一部の実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子の抗感染活性は、細菌、酵母、真菌、または寄生生物などの感染体による病原性因子の産生を減弱する、または変更して、感染をもたらす能力を減少させることを通じて作用し得る。
【００８７】
様々な実施形態で、感染は、肝臓、上気道および下気道（例えば、副鼻腔炎、百日咳、肺炎）、眼、耳、歯肉および／または口腔（例えば、歯周炎および歯肉炎）、腎臓、腸管、生殖−尿路および膀胱、血液（例えば、菌血症）、脳、髄膜、脊髄、骨、腸および／または心臓系においてである。別の実施形態では、感染症は、創傷または皮膚感染症である。
【００８８】
一実施形態では、それを必要とする対象に、本明細書に記載のとおりの組成物の治療有効量を投与することを含む、細胞内感染症を処置する方法を提供する。様々な実施形態で、細胞内感染症は、これらだけに限定されないが、；レジオネラ−ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、カンジダ属（Candida spp.）、サルモネラ属（Salmonella spp.）、侵入性大腸菌属（E. coli spp.）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、クラミジア（Chlamydia）、シゲラ属（Shigella spp.）、野兎病菌（Francisella tularensis）、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、ナイセリア（Neisseria）、ブルセラ属（Brucella spp.）、バルトネラ属（Bartonella spp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、コクシエラ・バーネッティイ（Coxiella burnettii）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasmata capsulatum）、および／またはニューモシスチス・イロベチイ／カリニ（Pneuomcystis jirovecii/carinii）を含む、微生物に起因し得る。
【００８９】
上気道（upper respiratory tract）および／もしくは下気道（lower respiratory tract）ならびに／または気道（airways）の感染症は、本来、細菌性または真菌性であり得る。細菌性肺感染症の一般的な原因には、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス属（Haemophilus species）、肺炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が含まれる。真菌性肺感染症をもたらす一般的な病原体には、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、ブラジルパラコクシジオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）、ニューモシスチス・イロベチイ／カリニ（Pneuomcystis jirovecii/carinii）、カンジダ属（Candida spp.）、アスペルギルス属（Aspergillus spp.）、ムコール属（Mucor spp.）およびクリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）が含まれる。
【００９０】
一実施形態では、それを必要とする対象に、本明細書に記載のとおりの組成物の治療有効量を投与することを含む、肺内の細胞内感染症を処置する方法を提供する。
【００９１】
一実施形態では、抗感染症剤は、バイオフィルムの形成、維持または成長を減少させる、または阻害するように作用し得る。
【００９２】
肺への投与は、これだけに限られないが、吸入によってよい。
【００９３】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、肺感染症を処置するために同時治療剤として、またはコンジュゲートされた抗感染症剤の一部として使用する。
【００９４】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、嚢胞性線維症を有する個体に典型的である緑膿菌（P.aeruginosa）の慢性肺感染症を処置するための同時治療剤として使用することができる。
【００９５】
胃腸炎は、これらだけに限定されないが、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、シゲラ属（Shigella spp.）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、サルモネラ属（Salmonella spp.）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、大腸菌（Escherichia coli）、カンジダ属（Candida spp.）を含む多くの微生物に起因し得る。一実施形態では、本明細書に記載のとおりの組成物を、胃腸炎を処置するために使用することができる。
【００９６】
一実施形態では、抗感染症剤は、小腸におけるバイオフィルムの形成、維持または成長を減少させる、または阻害するように作用し得る。
【００９７】
小腸への投与は、これだけに限られないが、経口か、または坐剤によってよい。
【００９８】
一実施形態では、感染症は、皮膚感染症であり、組成物を局所塗布する。細菌性皮膚感染症には、これらだけに限定されないが、ざ瘡、膿痂疹、蜂巣炎および連鎖球菌感染症が含まれる。真菌性皮膚感染症には、これらだけに限定されないが、足白癬（みずむし）、頑癬（いんきんたむし）、体白癬（白癬）および酵母感染症が含まれる。
【００９９】
様々な実施形態で、感染は、切断、水疱、熱傷、虫刺、手術創、注射部位またはカテーテル挿入部位と関連し得る。
【０１００】
一実施形態では、感染症は、髪または爪の感染症である。一実施形態では、本明細書に記載のとおりの組成物を含む抗感染症用シャンプーを提供する。
【０１０１】
下記でさらに記載するとおり、本明細書に記載のとおりの組成物を、散剤、ローション剤、ゲル剤、フォーム剤、スプレー剤または軟膏剤として適切に製剤化することができる。
【０１０２】
使用にはまた、抗細菌皮膚清浄剤、および表面清浄剤が含まれる。一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、防腐剤または清浄剤の活性化合物とコンジュゲートさせてもよい。表面清浄剤としてのフィトグリコーゲンナノ粒子の使用は、下記でより詳細に論述するとおりの細胞成長の阻害または細胞死、バイオフィルム形成の阻害、バイオフィルムの溶解または菌体密度検知の撹乱を通じて作用し得る。
【０１０３】
別の実施形態では、本明細書に記載のとおりの抗感染症組成物を、診断機器、ペースメーカー、人工関節、ステント、およびカテーテルなどの移植機器などの医療機器のための抗感染症コーティングとして使用してもよい。他の実施形態では、組成物を、絆創膏、外科縫合糸、創傷用包帯、ワイプ、タオレット、パッチまたはスポンジに含浸させるか、またはその上にコーティングしてもよいか、または骨セメントに組み込んでもよい。一実施形態では、感染は、留置カテーテル、ペースメーカー、人工関節、人工内耳、およびステントなどの移植機器と関連している。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の抗感染症組成物を、細胞内感染症の処置において使用する。多くの病原細菌が、それらを死滅させるはずの免疫系（単核細胞／貪食細胞）の細胞を含む宿主細胞内で感染および生存し得る。そのような感染を処置することは、さらに困難である。それというのも、いったん細胞内に入ると、病原体は、抗生物質に対して多少とも保護されるためである。多くの抗生物質が、食細胞性または非食細胞性の細胞および組織であってもなくても、一般に、低い細胞膜透過性、急速な流出などによって、蓄積の欠如を示す。多くの場合に、細胞内部において細菌を効果的に死滅させるためには、より多くの抗生物質用量が必要とされる。本明細書に記載のとおりのフィトグリコーゲンナノ粒子は、宿主細胞、例えば、マクロファージへの抗生物質の標的送達を提供し、細胞内細菌を死滅させるために有効な濃度を達成することによって、この問題を解決する。実施例によって実証されるとおり、フィトグリコーゲンナノ粒子は、細胞膜を通じて化合物を運搬することができ、細胞質内に蓄積することが示された。
【０１０５】
本明細書に記載のとおりのフィトグリコーゲンナノ粒子は、ペプチド、例えば、抗微生物ペプチドを安定化させることができる。溶液で貯蔵されているか、または凍結されているか、または無水製剤で製剤化（例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥）されているタンパク質およびペプチドは、凝集、分解、変性、酸化および脱アミドによって、それらの有効性を経時的に失う傾向がある。活性の安定化は、貯蔵寿命の改善に役立ち得るが、これはまた、面倒な貯蔵要件を少なくすることを、例えば、冷却のための要件を制限することを可能にし得る。フィトグリコーゲンナノ粒子は、有機化合物を安定化させることができる。上述のとおり、グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンの高分枝性は、遅い酵素分解と関連する。理論に束縛されることは望まないが、本明細書に記載のとおりの単分散フィトグリコーゲンナノ粒子は、タンパク質およびペプチド溶液に対して構造安定化もたらすのみならず、酵素分解の立体障害を通じて分解を阻害することもできる。
【０１０６】
実施例により実証されるとおり、コンジュゲートされた抗生物質−フィトグリコーゲンは、切断されなくても作用し得るし；同じく、切断された生成物としても作用し得る。
【０１０７】
バイオフィルムは、微生物の固着コミュニティーであり、その中で細胞は、お互いに、また多くの場合に表面に接着している。これらの接着細胞は、液体培地中に懸濁する単細胞であるプランクトン様微生物細胞とは生理学的に別個である。バイオフィルムにおいて見出される接着細胞は、細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）の自己生産マトリックス内に包埋されており；ＥＰＳはまた、組み込まれた外来物質も含み得る。このＥＰＳは、様々な構造形態の細胞外バイオポリマーから一般に構成される凝塊である。ＥＰＳは、この種の環境で生息する微生物が、場合によっては抗感染症剤への感受性が低くなることを可能にする。ＥＰＳは、微生物に、これらだけに限定されないが、３−Ｄアーキテクチャーが可能であること、細胞構成、微小環境の作製、および多くの表現型の生成を含む利点を与える。まとめると、これらは、抗感染症剤および他の不利な薬剤に対する感受性の減少、捕食および侵襲の低減、免疫応答の成分の回避ならびに感染を根絶することの当然の困難を含む、バイオフィルムコミュニティーの重要な特徴を可能にする。
【０１０８】
バイオフィルムは、天然環境に存在し、病院および産業の状況でも一般的である。バイオフィルムは、天然組織および医療機器を含む、生体および非生体表面で形成され得る。微生物が、ヒト宿主を含む宿主の上で、またはその中でバイオフィルムを形成することに成功する場合に、慢性および処置不可能な感染症が生じ得る。
【０１０９】
実施例において詳述するとおり、本発明者らは、バイオフィルムの形成、維持および成長を減少させる、または阻害するための使用に高度に適したものとする特性を有する、その官能化形態を含むフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を開発してきた。
【０１１０】
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、官能化フィトグリコーゲンナノ粒子でのバイオフィルムの処置が、バイオフィルム形成の破壊および／もしくはその低減ならびに／またはバイオフィルム溶解の増強をもたらす電荷をベースとした機構を通じて、バイオフィルムの形成、維持および成長を減少させる、または阻害し得ると仮定している。
【０１１１】
さらに、下記で論述するとおり、電荷をベースとした相互作用は、菌体密度検知関連プロセスを阻害して、病原性因子の生成の減弱をもたらし得る。
【０１１２】
病原性因子の生成の変更または減弱は、細胞−細胞外相互作用を調節する、あるいは毒素、バイオフィルムもしくは酵素の生成を減少させる、または阻害する細胞表現型を変化させ得る。
【０１１３】
菌体密度検知は、一連の細菌プロセスを調節する、密度に依存した細胞−対−細胞シグナル伝達系である。これは、細菌によるシグナルの生成および環境への放出、ならびに受容体によるシグナル検出（「センシング」）を伴う２ステッププロセスである。クオラムを示す閾値濃度に達すると、これは、遺伝子の上方または下方調節を指示し、それによって、単細胞の協調応答および協奏集団応答（concerted population responses）を可能にする。
【０１１４】
菌体密度検知は、感染、病原性因子の生成、表面のコロニー形成およびバイオフィルム形成を含むいくつかの細菌プロセスにとって重要である。菌体密度検知は、微生物による感染性疾患の進行において中枢的な因子として立証されているので、菌体密度検知を阻害し、それによって、菌力を減弱させるストラテジーを開発する運動が存在している。
【０１１５】
菌力および病因と一致する病原性因子および表現型の生成の調節における菌体密度検知の役割に加えて、菌体密度検知シグナルはまた、宿主とも結びついている。生成されるある種の菌体密度検知シグナルは、宿主免疫系の応答を変化させ、かつ宿主防御の破壊をコーディネートする免疫調節特性を有する。
【０１１６】
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、フィトグリコーゲンナノ粒子が、菌体密度検知プロセスを阻害して病原性因子の生成を調節し、かつ宿主とも結びついて宿主免疫系の応答を変化させ得ると仮定している。
【０１１７】
実施例で実証されるとおり、カチオン化フィトグリコーゲンの存在下で、緑膿菌（P.aeruginosa）において、菌体密度検知調節プロセスの下方調節および破壊が生じる。さらに、実施例で実証されるとおり、カチオン化フィトグリコーゲンの存在下で、ピオシアニン産生の低減、バイオフィルム形成の減少、バイオフィルム溶解の増強およびバイオフィルム付着成長の減少が生じる。
【０１１８】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、上記のとおりの皮膚または表面清浄剤として使用する。一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、上記のとおりのゲル剤として、または半固体状態で使用することができる。
【０１１９】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、スプレー剤、任意選択でエアゾール形態で使用することができる。一実施形態では、組成物は、ヒトまたは非生体表面上で局所的に使用することができる製品のスプレー剤である。別の実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、エアゾール化形態で吸入することができる。
【０１２０】
別の実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、バイオフィルムの形成、維持または成長を減少させる、または阻害するために内部で使用することができる。
【０１２１】
実施例で示すとおり、カチオン化フィトグリコーゲンの存在下で、緑膿菌（P.aeruginosa）の運動性およびピオシアニン産生の減少が観察される。スウォーミング運動性およびピオシアニン産生は、緑膿菌（P.aeruginosa）において菌体密度検知プロセスにより調節される２つの病原性因子である。カチオン化フィトグリコーゲンは、菌力および病原性を調節するために、それ自体は抗生物質としてではないが、抗感染症剤として、嚢胞性線維症を有する患者の呼吸器内で典型的な慢性緑膿菌（P.aeruginosa）感染症の管理において、同時治療剤として作用し得る。
【０１２２】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、上記のとおりの抗生物質、抗真菌剤、または抗寄生生物剤と併せて使用する。別の実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、上記のとおりの抗生物質、抗真菌剤、抗寄生生物剤および／または抗原生動物化合物、抗接着分子、鎮痛剤、抗凝固剤、局所麻酔剤、およびイメージング剤のうちの１種または複数にコンジュゲートさせる。
【０１２３】
一実施形態では、フィトグリコーゲンナノ粒子を、微生物の菌力および病原性を調節するために、同時治療剤として、抗生物質としてではなく、抗感染症剤として使用する。一実施形態では、微生物は、プランクトン様集団内にある。別の実施形態では、微生物は、バイオフィルムコミュニティー内にある。
【０１２４】
製剤および投与
本発明のナノ粒子をまた、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合、封入、または別段に会合させてもよく、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせてもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的担体」または「賦形剤」は、単独であるか、生物学的に活性な、または診断上有用な分子に、動物にコンジュゲートしているかどうかに関わらず、官能化フィトグリコーゲンナノ粒子を送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的に不活性な媒体であり得る。賦形剤は、液体または固体であってよく、フィトグリコーゲンナノ粒子および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせた場合に、所望のバルク、粘稠度などが得られるように、計画された投与手法を考慮して選択される。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどの１種または複数、および、それらの組合せが含まれる。薬学的に許容される担体はさらに、薬理学的薬剤の貯蔵寿命または有効性を増強する湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの少量の補助物質を含んでもよい。
【０１２５】
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、医薬品工業で周知の従来の技法によって調製することができる。そのような技法は、活性成分を薬学的担体または賦形剤と会合させるステップを含む。一般には製剤を、活性成分を液体担体、微粉固体担体、または両方と均一かつ緊密に会合させ、次いで、必要な場合には、生成物を（例えば、送達のための具体的な粒径に）成形することによって調製する。
【０１２６】
医薬組成物を製剤化する目的のために、本明細書において教示するとおりに調製した単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を、乾燥微粒子／粉末形態で提供してもよいし、または例えば、水溶液中に溶解させてもよい。
【０１２７】
様々な実施形態で、低い粘度が望ましい場合、本明細書に記載のとおりのフィトグリコーゲンナノ粒子成分を、抗感染症組成物中で、最高約２５ｗ／ｗ％、約２０ｗ／ｗ％、約１５ｗ／ｗ％、約１０ｗ／ｗ％、約５ｗ／ｗ％、約１ｗ／ｗ％および約０．０５〜０．５％の間の濃度で適切に使用してよい。
【０１２８】
高粘度が望ましい用途では、フィトグリコーゲンナノ粒子成分を、製剤中で、約２５ｗ／ｗ％を超える濃度で使用してもよい。ゲル剤または半固体が望ましい用途では、最高約３５ｗ／ｗ％の濃度を使用することができるか、またはフィトグリコーゲンナノ粒子成分を、粘度上昇剤またはゲル化剤との混合物で使用することができる。
【０１２９】
組成物は、水ベースの製剤またはアルコールベースの製剤であってもよい。適切なアルコールには、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシジグリコール、またはグリセロールまたはそれらの組合せが含まれる。
【０１３０】
本明細書に記載の抗感染症組成物を、局所または全身処置が望ましいかどうかに応じて、かつ処置されるエリアに応じていくつかの方式で投与することができる。上述の一般性を限定するものではないが、投与経路は、局所、例えば、皮膚への、または吸入による、または眼用もしくは視覚用組成物の形態での投与；経口（これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤または滴剤の形態を含む）もしくは坐剤の形態など、腸内；または例えば、皮下、静脈内、動脈内もしくは筋肉内を含めて、非経口；または気道および／もしくは肺に送達するための吸入形態であってよい。
【０１３１】
一実施形態では、抗感染症組成物は、経皮送達のために皮膚に塗布するための局所製剤である。本明細書において開示する単分散ナノ粒子は特に、フィルム形成性薬剤として有用である。ナノ粒子が単分散性であるので、均一な密充填したフィルムが可能である。組成物は、低い水活性を有する安定なフィルムを形成する。したがって、化学的に変性した場合、これらを、皮膚に付着させ、かつ生理活性物質を皮膚をわたって運搬するために使用することができる。様々な実施形態で、局所製剤は、ゲル剤、クリーム剤、フォーム剤、ローション剤、スプレー剤または軟膏剤の形態であってよい。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明の抗感染症組成物は、インプラント（埋込物）の形態である。一実施形態では、本明細書に記載のとおりの医用組成物を、医用物品を形成するために使用する。適切には、これらのインプラント（埋込物）および医用物品は、生体適合性であってよく、これは、それらが、細胞、組織またはｉｎ  ｖｉｖｏ機能に対して重大な有害作用を有さないであろうことを意味する。適切には、これらのインプラント（埋込物）および医用物品は、生体吸収性または生分解性（全体的に、または部分的に）であってよい。全体的に、または部分的に本明細書に記載のとおりの組成物を使用して形成され得る医用物品の例には、これらに限定されないが：組織工学用足場材および関連機器、創傷被覆材および絆創膏、縫合糸、移植可能なワイヤ用のコーティング、カテーテル、ステント、血管形成バルーンおよび他の機器などの移植機器が含まれる。
【０１３３】
一実施形態では、本発明の抗感染症組成物は、コーティングまたはフィルムの形態である。これらのコーティングおよびフィルムを、例えば、丸剤を含む剤形をコーティングするために使用することができる。これらをまた、保護フィルムとして局所塗布で、または創傷治癒フィルム被覆製剤で適切に使用することができる。フィトグリコーゲンナノ粒子を水性分散液で使用することができるか、または他のフィルム形成性ポリマー、ポリオール、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなどの可塑剤と、疎水性変性剤（例えば、脂質、ステアロプテンおよび蜜蝋）、結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、医薬品活性成分（ＡＰＩ）、および抗感染症剤と一緒に混合することができる。この点について、イオン化可能基、例えば、カルボキシル、アミノまたは疎水基を有する変性グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、より良好な湿潤、表面への接着、ＡＰＩ分散および抗感染症特性を提供し得る。
【０１３４】
カテーテル、ステントなどのコーティングの場合には、本明細書に記載のとおりのフィトグリコーゲンナノ粒子組成物は、滑沢ももたらし得る。
【０１３５】
様々な実施形態で、変性フィトグリコーゲンナノ粒子を重要な物質（例えば、別のＡＰＩ）を封入して、熱、酸化およびＵＶ安定性の増強を得るために使用することができ、例えば、ＡＰＩをグリコーゲンまたはフィトグリコーゲン溶液中に分散させ、噴霧乾燥することができる（熱および／または酸化分解からの保護をもたらす封入）。
【０１３６】
一実施形態では、さらなるＡＰＩを初めに、フィトグリコーゲンナノ粒子に封入し、次いで、製剤に導入することができる。
【実施例】
【０１３７】
[実施例１]
スイートコーン穀粒からのフィトグリコーゲンの抽出
凍結スイートコーン穀粒（含水率７５％）１ｋｇを脱イオン水２Ｌと２０℃で混合し、ブレンダー内で、３０００ｒｐｍで３分間にわたって粉砕した。マッシュを１２，０００×ｇで１５分間にわたって４℃で遠心分離した。合わせた上清画分を、０．１μｍ細孔サイズを有する膜フィルターを使用するクロスフロー濾過（ＣＦＦ）に掛けた。濾液を、５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を使用し、室温および６の透析体積でバッチ透析濾過によりさらに精製したが、透析体積は、濃縮水体積に対する、透析濾過中に動作に導入された合計ｍｉｌｌｉＱ水の体積の比である。
【０１３８】
濃縮水画分を２．５体積の９５％エタノールと混合し、８，０００×ｇで１０分間にわたって４℃で遠心分離した。濃縮水を２．５体積の９５％エタノールと混合し、８，０００×ｇで１０分間にわたって４℃で遠心分離した。フィトグリコーゲンを含有するペレット状物をオーブン内で５０℃で２４時間にわたって乾燥し、次いで、４５メッシュにミル粉砕した。乾燥フィトグリコーゲンの重量は９７ｇであった。
【０１３９】
動的光散乱法（ＤＬＳ）測定によると、生成したフィトグリコーゲンナノ粒子は、８３．０ｎｍの粒径直径および０．０８１の多分散指数を有した。
【０１４０】
[実施例２]
３−（トリメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパ−１−イル誘導体化フィトグリコーゲンの合成
フィトグリコーゲン２２５ｇを、水中０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１５００ｍｌに分散させた。次いで、６９％２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液３４６ｍｌを、５時間の経過中に混合物に添加した。混合物を２４時間にわたって室温で撹拌し、その後、６．２Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。生成物をエタノール２リットルの添加により沈殿させ、一晩、−２０℃で貯蔵する。沈澱物を収集し、エタノールで３回洗浄し、乾燥するまで８０℃でオーブン乾燥する。生成物の置換度（ＤＳ）をＮＭＲ分光法を使用してアセスメントし、０．７３であることを見出した。
【０１４１】
滅菌フィトグリコーゲンおよび変性フィトグリコーゲンの調製を、２つの方法のうちの１つを使用して得た。
【０１４２】
方法１  −  溶液のフィルター減菌（２ｗｔ／ｖｏｌ％を超えない）
溶液を、滅菌０．２μｍ細孔サイズのフィルターを介してのシリンジ駆動濾過により滅菌し、濾液を滅菌容器に収集した。次いで、濃度の何らかの低減を説明するために、濾液の乾燥重量を決定した。
【０１４３】
方法２  −  無水物質のガンマ線照射
フィトグリコーゲンおよびその誘導体の予め秤量したサンプルをガラスバイアルに分取し、６ｋＧｙの線量に照射した。ガンマ線照射された物質（トリプチケースソイブロス２０ｍｇ／ｍＬ）を２５℃または３７℃のいずれかでインキュベートした。成長は、４８時間後に見られず、この時点で、物質は、無菌と考えられた。
【０１４４】
[実施例３]
３−（トリメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパ−１−イル誘導体化フィトグリコーゲンの合成、代替手順。
フィトグリコーゲン１ｇを、水酸化ナトリウム水溶液（異なる実施例、水１〜５ｍｌに溶解した０．１２５〜２．５ｍｍｏｌの間のＮａＯＨ）と混合し、４５℃に加熱する。３０分の経過中に、６９％２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液３．０７ｍｌを添加し、混合物をさらに２〜６時間にわたって４５℃で撹拌する。反応時間の終了時に、水５〜９ｍｌを添加し、混合物を室温に冷却し、１Ｍ  ＨＣｌで中和する。次いで、生成物をエタノール８０ｍｌ中での沈殿により単離する。固体をエタノールで洗浄し、水２０ｍｌに再溶解し、さらに透析により精製する。凍結乾燥して、生成物を白色の固体として得る。
【０１４５】
[実施例４]
長鎖３−（Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパ−１−イル誘導体化フィトグリコーゲンの合成
８．２３ｍｍｏｌの（３−クロロ−２−ヒドロキシ−プロパ−１−イル）ジメチルアルキルアンモニウムクロリド（アルキル＝ラウリル、ココアルキル、ステアリル）を５０％ＮａＯＨ  ０．８２ｍｌと４５℃で混合する。５分間にわたって撹拌した後に、２０％フィトグリコーゲン水溶液３．３３ｍｌを添加し、混合物を６時間にわたって４５℃で撹拌する。反応混合物を２５℃に冷却し、１Ｍ  ＨＣｌで中和する。次いで、生成物をヘキサン５０ｍｌ中で沈殿させることにより単離する。固体をヘキサンで洗浄し、水２０ｍｌおよび飽和ＮａＣｌ  １０ｍｌに再溶解し、透析によりさらに精製する。凍結乾燥して、生成物を白色の固体として得る。
【０１４６】
[実施例５]
カチオン化フィトグリコーゲンのアルキル化
実施例４からの、ＤＳ＝０．８８を有するカチオン化フィトグリコーゲン０．５ｇを無水ジメチルスルホキシド１０ｍｌに８０℃で溶解する。水０．５ｍｌおよび５０％ＮａＯＨ（異なる量、ａ．０．０２１、ｂ．０．０８３、ｃ．０．２０６、ｄ．０．４９５、ｅ．１．２３５）を添加し、１０分間にわたって激しく撹拌する。次いで、異なる量のアルキルハロゲン化物（ヨウ化エチル、臭化ベンジル、ヨウ化ドデシル、ヨウ化オクタデシル；量：ａ．０．２５５ｍｍｏｌ、ｂ．１．０２ｍｍｏｌ、ｃ．２．５５ｍｍｏｌ、ｄ．６．１２ｍｍｏｌ、ｅ．１５．３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を２時間にわたって６０℃で撹拌し、次いで、これを室温に冷却し、氷酢酸で中和する。次いで、反応混合物をジエチルエーテルおよび／またはヘキサンで複数回抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液中に再懸濁する。透析および凍結乾燥の後に、生成物が白色の粉末として得られる。ドデシルおよびオクタデシル修飾の場合には、乾燥生成物をジエチルエーテルで洗浄して、残留長鎖アルコールを除去した。
【０１４７】
[実施例６]
カチオン化フィトグリコーゲンのアシル化
実施例４からの、ＤＳ＝０．８８を有するカチオン化フィトグリコーゲン０．５ｇを、隔膜を備えたガラスバイアル内に秤量する。シリンジを介して、無溶媒酸塩化物（塩化ブチリル、塩化ラウロイル）３０．５ｍｍｏｌを撹拌しながら滴下添加する。形成する懸濁液をさらに１時間にわたって撹拌し、次いで、ヘキサン３０ｍｌを添加することにより沈殿させる。沈澱物をヘキサンで３回洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３  １０ｍｌに溶解し、１時間にわたって撹拌する。過剰のＮａＨＣＯ３を１Ｍ  ＨＣｌで中和し、次いで、飽和ＮａＣｌ  ２０ｍｌを添加し、混合物を透析する。６０℃でオーブン乾燥して、生成物を白色の粉末として得る。
【０１４８】
[実施例７]
カチオン化フィトグリコーゲンのシリル化
実施例４からの、ＤＳ＝０．８８を有するカチオン化フィトグリコーゲン０．５ｇを１０５℃で１６時間にわたってオーブン乾燥させ、８０℃で１時間にわたって加熱することにより、ジメチルスルホキシド１０ｍｌに溶解する。反応槽をゴム隔膜でキャップし、０℃に冷却する。トリエチルアミンを添加し（異なる量：ａ．０．１６６ｍｌ、ｂ．０．６６２ｍｌ、ｃ．１．６５ｍｌ、ｄ．３．９７ｍｌ、ｅ．９．５３ｍｌ）、続いて、シリル塩化物（塩化トリメチルシリル、塩化トリエチルシリル；量：ａ．０．３６ｍｍｏｌ、ｂ．１．４６ｍｍｏｌ、ｃ．３．６４ｍｍｏｌ、ｄ．８．７４ｍｍｏｌ、ｅ．２０．７４ｍｍｏｌ）を滴下添加する。反応混合物を終夜撹拌し、次いで、アセトニトリル中で沈殿させる。固体を温アセトニトリルで複数回洗浄し、次いで、６０℃および１００ｍｂａｒで終夜乾燥する。
【０１４９】
【表１】
2019513837.tif 000003
【０１５０】
[実施例８]
２−ブロモエチルアミンでのフィトグリコーゲンのアミノ化
フィトグリコーゲン２００ｍｇをジメチルスルホキシド２ｍＬに溶解し、粉末化ＮａＯＨ  ２５０ｍｇをゆっくり添加し、１５分間にわたって撹拌した。ジメチルスルホキシド１．５ｍＬ中の２−ブロモエチルアミン・ＨＢｒ  ３２４．９ｍｇの溶液を添加した。１０分後に、追加のジメチルスルホキシド０．５ｍＬを添加し、反応物をさらに４時間にわたって２５℃で撹拌した。４時間後に、水１０ｍＬを反応混合物に添加した。生成物をエタノール２８ｍｌ中で沈殿させ、０℃に冷却し、冷エタノールで３回洗浄した。室温で乾燥して、生成物を白色の固体として得た。
【０１５１】
[実施例９]
アミノ化フィトグリコーゲンとＣｙ５．５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのコンジュゲーション
アミノ化フィトグリコーゲン（実施例８により調製）１００ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）１９．８ｍＬに懸濁させた。ジメチルスルホキシド２．２ｍＬ中のＣｙ５．５−ＮＨＳエステル１ｍｇの溶液を添加し、ボルテックス処理した。反応物を室温で終夜にわたって暗所で撹拌し続けた。サンプルを、冷エタノール４５ｍｌを添加することによって沈殿させた。上清が無色になるまで、固体を冷エタノールで洗浄し、空気乾燥して、生成物を青色の固体として得た。
【０１５２】
[実施例１０]
多糖ナノ粒子とＣｙ５．５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのコンジュゲーション
実施例１により生成した多糖ナノ粒子１００ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）２０ｍＬ中に懸濁させた。対照バイアル（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液を含有）中の温度プローブと共に、溶液を含有する反応槽をアルミニウムホイルに包み、３５℃のホットプレート上に置いた。Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．）１ｍｇをＤＭＦ４ｍＬ中に懸濁させた。１時間の間に、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステルを１ｍＬのアリコットで添加した。溶液のｐＨを添加の前後にしばしばチェックし、２Ｍ  ＨＣｌ溶液の添加で８．４に調整した。ＤＭＦ中のＣｙ５．５ＮＨＳエステルの最後のアリコットを添加した後に、ｐＨをモニターし、必要な場合には調整した。反応をさらに２時間にわたって進行させ、その後、上述のとおり、ｐＨを２Ｍ  ＨＣｌ溶液で４．０に調整した。
【０１５３】
得られた多糖ナノ粒子−Ｃｙ５．５コンジュゲートを含有する酸性化溶液に、２体積のエタノールを添加した。この溶液を４℃に冷却し、６０００ｒｐｍで１５分間にわたって遠心分離した。遠心分離の後に、上清を捨て、ペレット状物を脱イオン水１５ｍＬに再懸濁させた。２体積のエタノールを再懸濁させたペレット状物に添加し、これを以前のとおり、冷却し、遠心分離した。これを、捨てる上清が透明無色になるまで、さらに１回繰り返した。ペレット状物を最後に、ホモジナイザーの使用により無水ジエチルエーテル１０ｍＬに再懸濁させた。得られたコンジュゲートを、微量加熱で乾燥するまで蒸発させることにより得た。
【０１５４】
[実施例１１]
多糖ナノ粒子のＴＥＭＰＯ酸化
実施例１により生成した多糖ナノ粒子５０ｍｇを０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）１５ｍＬに懸濁させた。溶液を氷浴に入れて、４℃に３０分間にわたって冷却した。（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシダニル（ＴＥＭＰＯ）０．３ｍｇおよび臭化ナトリウム３．５ｍｇを０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０）２５０μＬに懸濁させた。３０分後に、両方を多糖ナノ粒子溶液に滴下添加した。続いて、次亜塩素酸ナトリウム０．０８ｍＬを多糖ナノ粒子溶液に添加し、続いて、これを反応のために密閉した。酸化を２６時間にわたって継続させた。酸化を、エタノール４０μＬを添加することによって停止させた。酸化物をさらに３０分間にわたって室温で撹拌した。
【０１５５】
酸化多糖ナノ粒子を含有する溶液を透析用袋（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．；ＭＷＣＯ１２〜１４，０００）に除去して、脱イオン水に対して２日間にわたって交換した。その後、透析用袋からの残留溶液を乾燥まで凍結乾燥して、コンジュゲートを無水化合物にした。
【０１５６】
[実施例１２]
ＴＥＭＰＯ−酸化多糖ナノ粒子とアンホテリシンＢのコンジュゲーション
反応の前に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．５）を含有する溶液を使用のために作製した（０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）１３．５ｍＬ；ＥＤＣ  ２７０μＬ）。前に概略したとおりのＴＥＭＰＯ酸化により生成した酸化多糖ナノ粒子２７ｍｇを上述のＥＤＣ／ＭＥＳ溶液１０ｍＬに溶解した。溶解した多糖ナノ粒子をアンホテリシンＢ  ９ｍｇ（ＥＤＣ／ＭＥＳ  ３．５ｍＬ中）と室温で２時間にわたって反応させた。その後、反応混合物を３７℃にして、さらに２４時間にわたって反応させた。
【０１５７】
２４時間後に、コンジュゲーション反応溶液を透析用袋に移し、脱イオン水に対して２日間にわたって透析した。透析用袋中に含有される得られた溶液を、乾燥するまで凍結乾燥して、コンジュゲートを得た。
【０１５８】
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法を使用して生成物を分析したところ、コンジュゲート１ｍｇが、アンホテリシンＢ  ７３μｇを含有することが見出された。これは、０．０１５のＤＳに対応する。
【０１５９】
[実施例１３]
細胞培養におけるグリコーゲン／フィトグリコーゲンの細胞傷害性
細胞生存率に対するグリコーゲン／フィトグリコーゲンナノ粒子の効果を分析して、粒子の細胞傷害性をアセスメントした。グリコーゲン／フィトグリコーゲンナノ粒子を、冷水を使用してウサギ肝臓、ムラサキイガイ、およびスイートコーンから抽出し、実施例１に記載されているとおりに抽出した。
【０１６０】
使用細胞系：ニジマスのエラ上皮細胞（ＲＴＧ−２）。
【０１６１】
細胞生存率の変化を測定するために、２種の蛍光インジケーター色素アラマーブルー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＣＦＤＡ−ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用し；これらの色素はそれぞれ、細胞代謝および膜完全性を測定する。これらの色素では、より強い蛍光が、より多くの生細胞を示す。
【０１６２】
結果を、図３および４に示す。いずれのアッセイも、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のフィトグリコーゲンの存在下での４８時間のインキュベーションの後に、細胞においていずれの細胞傷害性効果も検出しなかった。
【０１６３】
[実施例１４]
グリコーゲン／フィトグリコーゲンナノ粒子組成物の細胞取込み
蛍光顕微鏡法を、ローダミンＢ（オレンジ色の蛍光）にコンジュゲートしたフィトグリコーゲンナノ粒子に曝露された正常なマウス内皮細胞で行った。図５に示されているとおり、ナノ粒子は、細胞質にのみ蓄積した。
【０１６４】
蛍光顕微鏡法を、ローダミンＢにコンジュゲートしたフィトグリコーゲンナノ粒子に曝露された白血球で行った。
【０１６５】
翅脈からの血液２ミリリットルを、凝固を防ぐための５０μｇ／ｍＬのヘパリンを含有する５ｍＬシリンジにより収集した。末梢血単核細胞を密度勾配により単離した。簡単に述べると、等体積のＰＢＳと混合したヘパリン化血液２ｍＬを１０ｍＬ円錐管内の２ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０８３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の表面に慎重に添加し、次いで、５００×ｇで２０分間にわたって室温で遠心分離に掛けた。遠心分離の後に、第１の層とＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０８３培地との間の界面にある単核含有細胞を収集した。３８℃に加熱したＰＢＳ  ５ｍＬで３回、５００×ｇで５分間にわたって遠心分離することによって洗浄した後に、ペレット状物を９０％ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ウシ胎児血清を含有する完全培地で再懸濁させた。
【０１６６】
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１をトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）培地中で、３２℃で、シェーカー上で、１８０ｒｐｍで培養した。細菌細胞を終夜培養物から、３０００×ｇでの１５分間にわたる遠心分離により採取し、次いで、約１０９細胞／ｍｌの密度までＴＳＢ中に再懸濁させた。
【０１６７】
単核細胞懸濁液をｎａｎｏＰＧ−ローダミンＢ（最終濃度約０．１％）および／または細菌と混合し（最終細菌細胞濃度約１０８細胞／ｍｌまで）、ＣＬＳＭ調査の前に、混合物を３８℃で２時間にわたってインキュベートした。
【０１６８】
図６に示されているとおり（矢印Ｐは、細菌細胞およびＰＧローダミンＢを含むファゴソームを示す）、ローダミンＢにコンジュゲートしているフィトグリコーゲンナノ粒子は、単核細胞により取り込まれ、ファゴソームに局在化された。この実験では、単核細胞が、細菌により活性化され、次いで、細菌およびｎａｎｏＰＧ−ローダミンＢの両方を内在化した。結果として、ローダミンＢは、細菌と共にファゴソームに同時局在化された。対照的に、単核細胞が細菌への曝露により刺激されなかった場合、単核細胞によるｎａｎｏＰＧ−ローダミンＢの内在化および蓄積はなかった。このことは、ｎａｎｏＰＧ−ローダミンＢが、単核細胞食作用を活性化しなかったこと、したがって、単核細胞により血流から除去されないであろうことを示している。
【０１６９】
[実施例１５]
カチオン化フィトグリコーゲンの抗感染特性
抗感染症剤は、感染症の拡大を制限または予防する。細胞成長を阻害する、または細胞死をもたらす薬剤は、抗感染症剤としての可能性を有する。最少発育防止濃度（ＭＩＣ）アッセイを行って、カチオン化フィトグリコーゲンの抗細菌特性を評価した。ＭＩＣは、「寒天またはブロス希釈感受性試験において微生物の可視成長を防止する抗感染症剤の最小濃度」と定義される。
【０１７０】
細菌に対するＭＩＣアセスメントを、ブロス微量希釈に従って、Clinical and Laboratory Standards Institute document M07-A9: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standardにより行った。グラム陽性生体、枯草菌（Bacillus subtilis）１６８、ならびに２種のグラム陰性生体、大腸菌（Escherichia coli）ＡＢ２６４（Ｋ−１２）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１をアセスメントした。生体の長期保存培養物を−８０℃で、グリセロール（１５ｖｏｌ／ｖｏｌ％）中で維持した。保存株を、トリプチケースソイ寒天プレート上で継代培養することによって復活させ、１８時間にわたって３７℃で成長させ、次いで、４℃で最高１週間にわたって貯蔵した。終夜培養物を、ミュラー−ヒントンブロスに保存プレートからの３〜４つのコロニーを接種し、２０〜２４時間にわたって３７℃で１５０ｒｐｍでインキュベートすることにより成長させた。終夜培養物を新鮮なミュラー−ヒントンブロス（２ｖｏｌ／ｖｏｌ％）に接種するために使用した。次いで、培養物を中央対数期、約２〜４×１０７ＣＦＵ．ｍｌ−１まで成長させ、この時点で、培養物を、ＭＩＣプレートのための接種源を調製するために使用した。ガンマ線照射された天然フィトグリコーゲンおよびカチオン化フィトグリコーゲンの滅菌溶液を、必要に応じて、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で再構成し、希釈することによって調製した。マッチドフィルター滅菌物質を使用して、対照比較を行った。ＭＩＣを、１００〜１０００μｇの天然またはカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１の最終アッセイ内濃度で、１００μｇ．ｍｌ−１の増加で漸増させてアセスメントした。陰性成長対照は、滅菌培地を含んだ。陽性成長対照は、接種培地を含んだ。接種物は、使用する直前に、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で希釈することにより調製した。アッセイにおけるさらなる希釈により、５×１０５ＣＦＵ．ｍｌ−１の最終アッセイ内細胞密度を得た。プレートを３７℃で２０時間にわたってインキュベートし、その時点で、ウェルを成長についてスコアリングした。ＭＩＣを、成長をもたらさない（光学的に透明）薬剤の最小濃度として記録した。ＭＩＣアッセイを、各実験内で三連で行い、データを確認するために２回繰り返した（ｎ＝６）。実施例３に詳述した代替手順により調製したカチオン化フィトグリコーゲンも、二倍希釈増分で、１９〜１０  ０００μｇ．ｍｌ−１まででアセスメントした。ＭＩＣアッセイを単一反復試験で行い、データを確認するために３回繰り返した（ｎ＝３）。
【０１７１】
ＭＩＣアッセイを行って、酵母のカンジダ・ユチリス（Candida utilis）ＡＴＣＣ９９５０に対するカチオン化フィトグリコーゲンの抗真菌活性を評価した。ブロス微量希釈アッセイをClinical and Laboratory Standards Institute document M27-A2 Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard-Second Editionにより行った。カンジダ・ユチリス（C.utilis）の長期保存培養物を−８０℃で、グリセロール（１５ｖｏｌ／ｖｏｌ％）中で維持した。炭酸水素ナトリウムを含有せず、０．１６５Ｍ  ＭＯＰＳを補充され、ｐＨ７．０に調整されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｎａｄａ）をこのアッセイのために使用した。ガンマ線照射した天然フィトグリコーゲンおよびカチオン化フィトグリコーゲン（実施例２）の滅菌溶液を、必要に応じて、滅菌ブロス中で再構成し、希釈することにより調製した。マッチドフィルター滅菌物質を使用して、対照比較を行った。ＭＩＣを、３０〜１００μｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１ＲＰＭＩ  １６４０の最終アッセイ内濃度で、１０μｇ．ｍｌ−１の増加で漸増させてアセスメントした。陰性成長対照は、滅菌培地を含んだ。陽性成長対照は、接種培地を含んだ。接種物は、使用する直前に調製した。トリプシンソイブロス（３５℃、１５０ＲＰＭ）中で成長させたカンジダ・ユチリス（C.utilis）ＡＴＣＣ９９５０の終夜培養物を希釈して、０．５×１０３ＣＦＵ．ｍｌ−１の最終ウェル内濃度を、陰性成長対照ウェルを除くすべてのウェルで得た。接種したら、プレートを４８時間にわたって３５℃で静的にインキュベートした。アッセイの終了時に、ウェルを成長についてスコアリングした。ＭＩＣを、成長をもたらさない（光学的に透明）薬剤の最小濃度として記録した。実験をアッセイ内三連反復試験（in-assay triplicates）として行い、３回繰り返した（ｎ＝９）。
【０１７２】
枯草菌（B.subtilis）１６８および大腸菌（E.coli）Ｋ−１２の両方が、カチオン化フィトグリコーゲンに対して感受性があり、それぞれ≧２００および３００μｇ．ｍｌ−１の濃度で細胞成長を阻害した。すべての試験濃度で、天然フィトグリコーゲンは成長阻害をもたらさなかった。緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１の成長は、試験濃度のカチオン化フィトグリコーゲンによっては影響を受けなかった。このことは、堅牢な細胞壁のアーキテクチャーおよびこの生体の適合性により得、より高い濃度での潜在的な阻害効果を排除するものではない。
【０１７３】
同様に、≧６０μｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１の濃度は、酵母カンジダ・ユチリス（C.utilis）ＡＴＣＣ９９５０の成長阻害をもたらした。すべての試験濃度で、天然フィトグリコーゲンは、成長阻害をもたらさなかった。
【０１７４】
代替の合成プロトコール（実施例３に記載）も、様々な置換度（ＤＳ）で置換されていて、成長阻害に重要であることが見出されているカチオン化フィトグリコーゲンを生成するために使用した。実施例３の合成プロトコールを使用して得られるものと一致し、０．７の同様のＤＳを有するこのカチオン化フィトグリコーゲンのＭＩＣは、３１２．５μｇ．ｍｌ−１の値で、枯草菌（B.subtilis）１６８に対して比較的同様のままであった。２種のグラム陰性菌、大腸菌（E.coli）Ｋ−１２および緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１に対するＭＩＣは、かなり変化し、両方とも、１０  ０００μｇ．ｍｌ−１の値を有した。１．３４の値へのＤＳの上昇は、これらのＭＩＣ値をそれぞれ２５００および３１２．５μｇ．ｍｌ−１に低下させた。緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１によって示された感受性の増大は、細菌細胞の外表面にあり、大腸菌（E.coli）においてよりも緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１においてより大きな正味負電荷を担持しているリポ多糖の核領域と、より大きな正味正電荷を持つカチオン化フィトグリコーゲンとの間の相互作用の増大による可能性がある。
【０１７５】
[実施例１６]
フィトグリコーゲンの二重変性はカチオン化フィトグリコーゲンの特性の成長阻害を改善する
フィトグリコーゲンを、カチオン性基および他の置換基の両方を持つように、実施例５〜７により変性した。ＭＩＣ値を、実施例１５においてすでに記載したプロトコールにより立証した。実験を単一アッセイ内反復試験として行い、３回繰り返した（ｎ＝３）。単一変性（すなわちカチオン化）フィトグリコーゲンのＭＩＣに対して４倍以上の変化を有するＭＩＣ値は、ＭＩＣ値において統計的に有意な変化を表した。単一変性カチオン化フィトグリコーゲンのＭＩＣに対して４倍の変化をもたらした、カチオン化フィトグリコーゲン組合せに対する二重変性のみが、統計的に有意な改善をもたらす（ＭＩＣ値が統計的に有意に低い）ことを示した。
【０１７６】
枯草菌（B.subtilis）１６８に対してカチオン化フィトグリコーゲンのＭＩＣの統計的に有意な増強をもたらしたアセスメントパネルからの２つの変性は、ブチリルまたはＱＵＡＢ４２６置換基であった。両方の事例で、試薬を合成プロトコール中にそれぞれ６および２のモル当量比で使用した場合に、ＭＩＣは、≧８倍濃度まで低減した。
【０１７７】
有意な増強は、グラム陰性大腸菌（E.coli）Ｋ−１２では見出されなかった一方で、いくつかの変性が、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１に対して試験した場合にＭＩＣの低減をもたらした。特に、ベンジル変性は、０．１５および９のモル当量比で用いた場合には８倍の低減を、０．６、１．５および３．６のモル当量比で用いた場合には３２倍の低減をもたらした。エチル変性は、合成中に０．１５、０．６および９のモル当量比で用いた場合に、８倍の低減をもたらした。ブチリルおよびラウリル変性は、６のモル当量比で、両方ともＭＩＣの８倍低減を同じくもたらした。トリメチルシリル二重変性の生成は、ＭＩＣを８倍（試薬を０．０７、０．２８モル当量比で使用）、および４倍（４．３）低減させた。トリエチルシリル基を持つカチオン化フィトグリコーゲンの二重変性は、ＭＩＣを８倍（０．０７のモル当量比）低減させた。
【０１７８】
[実施例１７]
カチオン化フィトグリコーゲンは抗生物質に対するプランクトン様細胞の感受性を増強する。
実施例１５で定義したとおりのＭＩＣアッセイを、滅菌および非処理９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、示されている場合には培地に追加的に、天然またはカチオン化フィトグリコーゲンを補充することを除いて、Clinical and Laboratory Standards Institute document M07-A9: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standardおよび文献M27-A2 Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard-Second Editionのいずれかに記載のブロス微量希釈技法に従って行った。カンジダ・ユチリス（C.utilis）ＡＴＣＣ９９５０、枯草菌（B.subtilis）１６８および大腸菌（E.coli）ＡＢ２６４を用いて行われたアセスメントは、天然またはカチオン化フィトグリコーゲンをカチオン化フィトグリコーゲンでのそれらの個々のＭＩＣ値の１／８、１／４、１／２の濃度で使用した。日和見病原体緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１のアセスメントを、０．５、１または１０ｍｇの天然またはカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１の最終アッセイ内濃度で行った。実験をアッセイ内二連反復試験として行い、最低３回繰り返した（ｎ＝６）。
【０１７９】
スクリーニングされた抗生物質は、いくつかの異なるクラスからの代表であり、それらを表２にまとめる。ＭＩＣアッセイを、各実験内で二連で行い、データを確認するために最低３回繰り返した（ｎ＝６）。非補充培地ＭＩＣに対して４倍以上の変化を有するＭＩＣ値は、ＭＩＣ値の統計的に有意な変化を表す。非補充培地ＭＩＣに対して４倍の変化をもたらしたこれらの抗生物質−カチオン化フィトグリコーゲンの組合せのみが、増強作用（ＭＩＣ値が低くなった）、または忍容性（ＭＩＣ値が増加した）をもたらすことを示すと考えられた。
【０１８０】
すべての試験された生体で、天然フィトグリコーゲンの補充は、非補充培地で得られたＭＩＣ値に対して同じままであるか、または２倍変化を示すＭＩＣ値をもたらした。すなわち、天然フィトグリコーゲンは、多様なクラスの抗生物質からの代表例のＭＩＣに影響を及ぼさなかった。このことは、例えば、コンジュゲートされた抗生物質の高く局所の用量を送達するために、微生物を標的とした特注のナノ技術を開発するための中性プラットフォームとしての天然フィトグリコーゲンの可能性を強調している。
【０１８１】
【表２】
2019513837.tif 000004
【０１８２】
対照的に、カチオン化フィトグリコーゲンの補充は、すべてのアッセイされた生体について、選択された抗生物質のＭＩＣ値に対して数倍の変化をもたらした（表３、４）。すべての事例で、これらの値の変化は、数倍の低減であり、すなわち、細胞は、抗生物質に対してより感受性があった。抗生物質に対する増感はまた、濃度依存的であり、低濃度では、これは失われたか（表３）、または低減した（表４）。予測されたとおり、カチオン化フィトグリコーゲンをＭＩＣ未満の濃度で用いると（表３）、増強効果は、より高い濃度で用いた場合よりも低かった（表４）。加えて、すべての抗生物質−カチオン化フィトグリコーゲンの組合せが増感を示すものではなかった；このことは、濃度依存的であるだけでなく、抗生物質の標的およびスクリーニングで使用された生体にも関連した。すなわち、経験的に確立される必要のある、抗生物質およびカチオン化フィトグリコーゲンの最適な組合せが存在する。総じて、試験されたすべての生体およびカチオン化フィトグリコーゲン−抗生物質の組合せを通じてのアセスメントは、１４種の異なるクラスの抗生物質のうちの１３種が、統計的に有意な倍数の低減を示したと指し示した。
【０１８３】
【表３】
2019513837.tif 000005
【０１８４】
【表４】
2019513837.tif 000006
【０１８５】
カチオン化フィトグリコーゲンは、細菌および酵母を多様なクラスの抗生物質の作用に対して増感し、より低い濃度の抗生物質が、アッセイにおいて成長阻害を達成するために必要であった。ＭＩＣ値に対するそのような変化はまた、作用の潜在的な根本的機序を示し、細胞透過性バリアの混乱、また、より疎水性の細胞表面をもたらす応答変化を含む。加えて、透過性などの細胞特性の変化も、細胞を、免疫系の成分に対してより感受性であるようにし得る。ＥＤＴＡなどの透過剤（permeabilizer）での細胞の処置は、細菌細胞壁を攻撃して、細胞溶解をもたらす先天免疫系の成分であるリゾチームの作用の増強を実証している。したがって、カチオン化フィトグリコーゲンナノ粒子を、同時治療剤として使用することができ、それによって、細菌および酵母などの感染体は、抗生物質などの化学療法レジメンおよび宿主免疫系に対してもより従順になる。
【０１８６】
[実施例１８]
抗微生物活性とコンジュゲートした抗生物質−フィトグリコーゲンの合成
アンホテリシンＢをフィトグリコーゲンナノ粒子にコンジュゲートするための方法は実施例１２に詳述されている。
【０１８７】
アンホテリシンＢ−フィトグリコーゲンコンジュゲート（ＰＨＧ−ＡＭＢ）の活性を酵母、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）ＡＴＣＣ９９５０に対して、変性ブロス微量希釈アッセイ（ＣＬＳＩ  Ｍ２７−Ａ２；実施例１５）を使用してアッセイした。炭酸水素ナトリウムを含有せず、０．１６５Ｍ  ＭＯＰＳを補充され、ｐＨ７．０に調整されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｎａｄａ）をアッセイのために使用した。１６００μｇ  ＡＭＢ／ｍｌのＤＭＳＯの保存液を−８０℃で貯蔵し、使用前に希釈した。５００μｇのＰＨＧ−ＡＭＢ．ＲＰＭＩ１６４０ｍｌ−１を、アッセイ当日に新たに調製した。簡単に述べると、１６μｇのＡＭＢ．ＲＰＭＩ  １６４０ｍｌ−１および５００μｇのＰＨＧ−ＡＭＢ．ＲＰＭＩ  １６４０ｍｌ−１の二倍希釈を、ＲＰＭＩ１６４０中で連続２倍希釈により調製した。対照は、ウェルにおけるＰＨＧ−ＡＭＢの濃度変化を模倣するように調整したフィトグリコーゲンを補充されたＡＭＢを含んだ。陰性成長対照ウェルは、滅菌培地を含有した。陽性成長対照ウェルは、培地、またはフィトグリコーゲンを補充された培地を含有した。ＭＩＣを、ウェルにおいて成長をもたらさなかった（光学的に透明な）薬剤の最小濃度として記録した。アッセイを二連反復試験として、最低３つの独立した反復試験で行った。
【０１８８】
ＲＰＭＩ１６４０およびフィトグリコーゲンを補充されたＲＰＭＩ１６４０中の０．５μｇのＡＭＢ．ｍｌ−１のＭＩＣ値を、カンジダ・ユチリス（C.utilis）ＡＴＣＣ９９５０を４８時間にわたって３５℃で成長させた後に得た。すなわち、抗細菌抗生物質での以前の観察と一致して、フィトグリコーゲンは、抗真菌剤のＭＩＣに対して影響を有さなかった。
【０１８９】
コンジュゲートＰＨＸ−ＡＭＢは、３１．２５μｇのＰＨＧ−ＡＭＢ．ｍｌ−１のＭＩＣで成長阻害特性を示した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光測光法を使用して、コンジュゲートがコンジュゲート１ｍｇ当たりアンホテリシンＢ  ７３μｇを含有することを決定し、これは、２．２８μｇのアンホテリシンＢ．ｍｌ−１の絶対ＭＩＣ値をもたらした。すなわち、アンホテリシンＢは、フィトグリコーゲンにコンジュゲートさせることができ、ＭＩＣの多少の低減は伴うが活性なままであり、フィトグリコーゲンが抗生物質のためのナノ粒子送達系として機能し得ることを強調し得た。
【０１９０】
[実施例１９]
カチオン化フィトグリコーゲンは、菌体密度検知経路により緊密に調節される病原性因子であるピオシアニンの産生に負の影響を及ぼす。
【０１９１】
ピオシアニンは、緑膿菌（P.aeruginosa）の多くの株により産生される顔料であり、病原性因子として、レドックスプロセスにおいて、および菌体密度検知経路の停止シグナルとして多様な役割を果たす。重要なことに、ピオシアニンの産生は、菌体密度検知シグナル伝達系のヒエラルキーを介して緊密に調節される。これらの系などは、複雑な調節ネットワークを形成し、一緒に、緑膿菌（P.aeruginosa）の菌力ならびに急性および慢性感染症をもたらすその能力に重要な他の鍵となる表現型を制御する。培養物におけるピオシアニンの容易に識別し得る特徴的な青緑色によって、これは、菌体密度検知システムの干渉および病原性因子の生成における当然の変化をアセスメントするための当初スクリーニングにおける常套的な選択となっている。抗細菌活性が望ましいが、菌力を減弱する能力も利点である。アジスロマイシンなどのマクロライド抗生物質は、同時治療剤として、嚢胞性線維症を有する患者の呼吸器内の緑膿菌（P.aeruginosa）感染症を処置する際に、抗生物質としてではなく、菌力および病原性を調節するための手段として利用されてきた。
【０１９２】
ピオシアニン産生をアッセイし、わずかに変更させたすでに公知の方法によって定量化した。緑膿菌（P.aeruginosa）培養物を、ミュラー−ヒントンブロスブロス中で、３７℃および１５０ｒｐｍで、様々な濃度の天然フィトグリコーゲンまたはカチオン化フィトグリコーゲンの存在下で成長させた。２０時間目に、培養物２ｍｌをクロロホルム１．２ｍｌと共に激しく混合することによって抽出した。相分離の後に、クロロホルム相を新鮮な管に移し、０．２Ｎ  ＨＣｌ  ０．４ｍｌを添加し、相を激しく混合した。相が分離したら、ＨＣｌ相の２００μｌアリコットを９６ウェルプレートのウェルに移動させ、Ａ５５０を、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬ８００プレートリーダーで測定し；値を、較正プロットを使用してｕｇのピオシアニン．ｍｌ−１に変換した。実験を三連で行い、独立三連実験で繰り返した（ｎ＝９）。
【０１９３】
天然またはカチオン化フィトグリコーゲンの存在下での２０時間のインキュベーションの後に、ピオシアニン産生を定量することで、カチオン化フィトグリコーゲンのみが、ピオシアニン産生に影響を及ぼしたことが明らかになった（図７）。０．５〜２．５ｍｇ．ｍｌ−１のカチオン化フィトグリコーゲン濃度で、非補充培地に対して、ピオシアニン産生の５０〜９０％の低減が測定された。１０ｍｇ．ｍｌ−１で、ピオシアニン産生の約７５％回復が存在した。奇妙にも、非補充条件では、上限を超えると、ピオシアニン産生はそれを超えなかった。
【０１９４】
すなわち、カチオン化フィトグリコーゲンと共に緑膿菌（P.aeruginosa）をインキュベーションすることは、病原性因子、ピオシアニンの産生に影響を及ぼした。さらに、これは、Ｕ型の濃度依存性応答をもたらし、有効性の下限および上限閾値を、かつ病原性因子ピオシアニンの産生を損なう変性ナノ粒子の能力に関して最適な有効性の濃度範囲を示している。
【０１９５】
[実施例２０]
カチオン化フィトグリコーゲンは、細菌遊走、コロニー形成および感染に重要なプロセスである細菌運動性に負の影響を与える
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、運動性の３つの形態、遊泳、スウォーミングおよびトゥイッチングを示し、これらはすべて、感染性疾患をもたらす生体の可能性に寄与し、遊走、付着およびコロニー形成、さらには、バイオフィルム形成および成熟、ならびにバイオフィルム集団または感染症の病巣からの分散に重要である。
【０１９６】
変性遊泳運動性アッセイを使用して、カチオン化フィトグリコーゲンによる緑膿菌（P.aeruginosa）の遊泳運動性の阻害についてアセスメントした。保存株を変法Ｍ９中で継代培養することによって復活させ、２０〜２４時間（１５０ｒｐｍ、３７℃）にわたって成長させた。変法Ｍ９培地を次のとおり調製した  −  ２０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｗｔ／ｖｏｌ％カザミノ酸。培地を、１２１℃で３０分間にわたってオートクレーブ処理することによって滅菌し、約４５℃に冷却した後に、最終濃度の１１ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを補充した。運動性プレートを当日に、０．３％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢａｃｔｏ  ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ；  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）を用いて固化させたｍＭ９培地を使用して調製した。オートクレーブの後に、冷却した寒天に、上に示した補充物および０．１、０．５、０．７５、１．０、２．５または１０．０ｍｇの滅菌天然またはカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１培地も補充した。対照は、フィトグリコーゲンを添加されていない遊泳寒天を含んだ。生物学的安全キャビネット内で層流条件下で作業しながら、２５ｍｌアリコットを滅菌ペトリ皿に注ぎ入れ、ふたを開けて固化させた（１時間）。１時間後に、プレートに穿刺接種し、寒天の表面から数ｍｍまで終夜培養し、次いで、反転させることなくインキュベートした（３７℃、２４時間）。成長期間の終了時に、遊泳ゾーン当たり３つの直径測定を記録し、遊泳ゾーンの表面積の拡大を計算するために使用した。実験をアッセイ内三連反復試験として行い、３回繰り返した（ｎ＝２７）。
【０１９７】
寒天０．５ｗｔ／ｖｏｌ％を含有する変法Ｍ９培地で作製されたスウォームプレート寒天を使用して、緑膿菌（P.aeruginosa）のスウォーミング運動性を測定した。滅菌天然またはカチオン化フィトグリコーゲンを添加して、０．１、０．５、０．７５、１．０、２．５または１０．０ｍｇ．ｍｌ−１培地の最終濃度を達成した。対照は、補充のないスウォーム寒天を含んだ。生物安全キャビネット内で作業して、２０ｍｌアリコットを滅菌ペトリ皿に注ぎ入れ、ふたを開けて固化させた。１５分後に、寒天を合計６０分間にわたって固化させた。接種源を、２４時間にわたって変法Ｍ９培地内で３７℃および１５０ｒｐｍで成長させた緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１の培養物から細胞を採取することにより調製した。細胞をペレット化し、ペレット状物を再懸濁させ、滅菌０．９ｗｔ／ｖｏｌ％のＮａＣｌ中で２回洗浄した。洗浄した細胞ペレットを３．０単位の最終ＯＤ６００まで再懸濁させた。接種源３μｌをプレートの中央にピペット操作することにより、プレートに接種した。プレートを室温で２時間にわたって放置し、その後、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。２４時間後に、観察を行い、プレートをさらに２４時間にわたって室温でインキュベートした。実験の終了時に、観察および画像を記録した。直径拡張（ｍｍ）の３回の測定を各プレートで行った（ｎ＝２７）。実験を三連反復試験で行い、独立した三連実験で繰り返した（ｎ＝２７）。
【０１９８】
トゥイッチング運動性を、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）細菌寒天（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ：Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）を補充されたルリア−ベルターニ培地（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）中でアッセイした。適切な場合には、トゥイッチング運動性用寒天を約４５℃に冷却し、滅菌天然またはカチオン化フィトグリコーゲンを添加して、０．１、０．５、０．７５、１．０、２．５または１０．０ｍｇのフィトグリコーゲン．ｍｌ−１の最終濃度を達成した。対照は、補充のないトゥイッチ寒天を含んだ。生物安全キャビネット内で作業して、トゥイッチング運動性用寒天の１０ｍＬアリコットを滅菌ペトリ皿に分注し、ふたを閉めて１時間にわたって固化させた。緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株をトリプシンソイ寒天プレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ；  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）上で継代培養することにより復活させ、２０時間にわたって３７℃で成長させた。接種源を、トリプシンソイ寒天プレートの表面からいくつかのコロニーを掻き取るために滅菌ピペットチップを使用し、それらを濃厚スラリー内で撹拌することで作製した。スラリーを使用して、各運動性用アッセイプレートの中央に、プレートの底部まですべて通して穿刺接種した。プレートを３７℃で（４８時間）インキュベートした。実験を三連反復試験で行い、３回の測定を各アセスメントで行い、独立に３回繰り返した（ｎ＝２７）。フィトグリコーゲンの高濃度での不透明度により、寒天：プレート界面でのトゥイッチゾーンを、上にある寒天を除去した後に再測定した。値は、±１ｍｍ内であった。
【０１９９】
運動性の３つの形態はすべて、天然の非誘導体化フィトグリコーゲンではなく、カチオン化フィトグリコーゲン（図８）。さらに、これは濃度依存的であることを示し、カチオン化フィトグリコーゲンの濃度が増加すると、運動性の妨害に対する効果が高くなった。
【０２００】
フィトグリコーゲンまたは低濃度のカチオン化フィトグリコーゲンの補充は、中程度（＜１０％増加）から高度（＞２０％）の運動性の増加（図８）をもたらし、潜在的な用途の限定を表した。それというのも、スウォーミングおよびトゥイッチング運動性は、バイオフィルム形成および成長と正相関しているためである。しかしながら、これは、バイオフィルム形成がアッセイされた場合には支持されなかった（さらなる詳細については、実施例２２を参照されたい）。有効性の限界がアッセイ方法と関連すること、および運動性が、本明細書において見出されたよりも低い濃度では妨害されるであろうことが考えられる。根底にある原因は理解されていないが、フィトグリコーゲンの驚くべき保水能が、空気に曝露された寒天プレート上の細胞に対する結果の可能性がある。
【０２０１】
≧０．７５ｍｇ．ｍｌ−１の濃度では、カチオン化フィトグリコーゲンは、細菌運動性のすべての形態を明らかに妨害する。細菌運動性は、感染性疾患の拡大および進行に寄与するいくつかのプロセスに重要であるので、本発明者らはまた、カチオン化フィトグリコーゲンが、運動性および運動性をベースとしたプロセスに影響を及ぼす抗感染症剤として作用し得るであろうと仮定した。
【０２０２】
[実施例２１]
天然フィトグリコーゲンは、バイオフィルムの形成および付着成長を制限する
バイオフィルムは、微生物の固着コミュニティーであり、その中で細胞は、お互いに、また多くの場合に表面に接着している。コミュニティーのメンバーは、ウイルス、細菌、酵母、真菌、藻類、原生動物、線虫から選び得る。バイオフィルムは典型的には、細胞外ポリマー物質から構成されるマトリックス内に入っている。これは典型的には、バイオフィルムにより生成されるが、外来源からの物質も組み込んでよい。
【０２０３】
バイオフィルムは、天然環境に存在し、病院および産業の状況でも一般的である。バイオフィルムは、天然組織および医療機器を含む生体および非生体表面で形成され得る。バイオフィルムコミュニティーは、遊離の遊泳プランクトン様細胞よりも持続的で、かつ不応性である。観察される相違には、抗感染症剤および他の不利な薬剤に対する感受性の低下、捕食および侵襲の低減、ならびに免疫応答の成分の回避が含まれる。すなわち、感染体がバイオフィルム様式の成長を採用すると、感染体のクリアランスまたは処置は、より困難である。微生物が、ヒト宿主を含む宿主の上、またはその内部でのバイオフィルムの形成に成功する場合には、慢性および処置不可能な感染症が生じ得る。したがって、バイオフィルムの形成および成長を制限するのみならず、制御もすることが可能であることが望ましい。
【０２０４】
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１を変性Ｍ９またはキングＡ培地（２２〜２４時間、３７℃、１５０ｒｐｍ）中で継代培養することにより復活させた。変法Ｍ９培地を、寒天を添加しなかったことを除いて実施例１９で記載したとおりに調製した；キングＡ培地は、２％プロテオーゼペプトン、１％Ｋ２ＳＯ４、０．１６４％  ＭｇＣｌ２、１％グリセロールを含有した。清潔な滅菌ガラス管（１８×１５０ｍｍ）をアッセイのために使用した。培地または滅菌天然フィトグリコーゲンを補充された培地の保存培地溶液を調製した。保存溶液に、予め成長させた培養物（１：２０００希釈）を接種し、十分に混合し、２ｍｌアリコットを滅菌管に移動させた。管を２０時間にわたって（３７℃、１５０ｒｐｍ）インキュベートした。蓄積したバイオフィルムを、Ｈｕｃｋｅｒクリスタルバイオレット（０．１ｗｔ／ｖｏｌ％の最終アッセイ内濃度）で１５分間にわたって室温で染色することによって可視化した。過剰の染剤を、デカンテーションし、次いで、保持されていない色素を除去するために大量の水ですすぐことにより除去した。管を逆さにし、空気乾燥した。付着成長したバイオマスは染剤を保持し、管の壁上で紫色に着色した塊として観察された（図９）。画像を記録し、保存した。保持された染剤を３３％酢酸（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で溶解し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ２５ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して分光測光法（λ＝５７０ｎｍ）で定量化した。実験を三連アッセイで行い、独立三連実験（ｎ＝９）として繰り返した。
【０２０５】
バイオフィルム形成および付加成長を変化させる天然フィトグリコーゲンの能力は、成長条件に依存することが見出された（図１０）。変法Ｍ９を使用した場合には、バイオフィルムの変化はほとんど特記されなかったが、キングＡ培地へのフィトグリコーゲンの補充は、最終バイオマス値を最高５３％低減させた。
【０２０６】
観察されたとおり、最高１０ｍｇのフィトグリコーゲン．ｍｌ−１変法Ｍ９培地の濃度は、形成されるバイオフィルムのほんのわずかな低減しかもたらさなかった（図１０）。しかしながら、フィトグリコーゲンの濃度を１００ｍｇのフィトグリコーゲン．ｍｌ−１に増加させると、バイオフィルム形成のかなりの低減が存在した（変法Ｍ９培地；図９）。これは、１００ｍｇのフィトグリコーゲン．ｍｌ−１培地の補充が、非補充培地において成長させた個々のバイオフィルムでの値に対して１７．７％±３．３（変法Ｍ９培地）および５９．０％±８．０（キングＡ培地）である付着成長バイオマス値を有するバイオフィルムをもたらすことを実証した定量的測定により裏付けられた（ｎ＝１４±ＳＥＭ）。キングＡ培地での％低減は、１０および１００ｍｇのフィトグリコーゲン．ｍｌ−１の両方で同様であり、これが、この培地の有効性の程度であり得ることを示していた。
【０２０７】
すなわち、天然フィトグリコーゲンは、当初の形成プロセスおよびその後のバイオフィルム成長の両方を制限することができる。さらに、この能力は、部分的に成長条件の変化により本明細書では示されるとおりの局所環境条件により規定され、濃度依存的でもあり、より高い濃度では、より大きな低減をもたらす。表面コロニー形成およびバイオフィルム形成を制限するデキストランなどの他の多糖の能力についての報告と同様に、天然の未変性フィトグリコーゲンは、バイオフィルムを形成する緑膿菌（P.aeruginosa）の能力を損なう。このことは、細胞付着および接着、細胞分裂およびミクロコロニー形成、ミクロコロニー拡張およびバイオフィルムの熟成、ならびにバイオフィルム分散を含む、バイオフィルム形成および成長のステップのいずれか、またはそれらのすべてで起こり得る。緑膿菌（P.aeruginosa）は、バイオフィルム研究のためのモデル生体とみなされ、得られたデータが他の生体にも当てはまるであろうことが予測される。
【０２０８】
[実施例２２]
カチオン化フィトグリコーゲンは、バイオフィルムの形成および展開の阻害において、フィトグリコーゲンよりも有効である
実施例２１は、バイオフィルムを形成するバイオフィルム研究のためのモデル生体、緑膿菌（P.aeruginosa）の能力を妨害するための天然および未変性フィトグリコーゲンの使用についての知識を伝えた。この実施例では、本発明者らは、フィトグリコーゲンのカチオン化形態を利用する。
【０２０９】
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１を変法Ｍ９またはキングＡ培地中で継代培養することによって復活させた（２２〜２４時間、３７℃、１５０ｒｐｍ）；処方および調製は、実施例２１に記載されている。実験を本質的に、培地に滅菌カチオン化フィトグリコーゲンを補充したことを除いて実施例２１に記載のとおりに行った。実験を三連アッセイで行い、独立三連実験として繰り返した（ｎ＝９）。
【０２１０】
カチオン化フィトグリコーゲンの存在下での成長は、形成されるバイオフィルムの量において、容易に明らかな視覚的および定量的相違をもたらした。図９は、様々な濃度のカチオン化フィトグリコーゲンと共に成長した緑膿菌（P.aeruginosa）によって形成された代表的な染色バイオフィルムの画像を示している。図１１は、漸増量のカチオン化フィトグリコーゲンの補充が付着成長バイオフィルムの安定的な低減をもたらしたことを示している。２種の異なる培地が、同様の結果でアセスメントされた（中抜きの四角は変法Ｍ９培地を表し、中抜きのひし形はキングＡ培地を表す）。
【０２１１】
天然フィトグリコーゲンはバイオフィルム成長を低減させたが（実施例２１）、より低濃度のカチオン化フィトグリコーゲンが、匹敵するバイオフィルム予防のために必要であった。視覚的な観察が、図１０および１１に示されているとおりの定量的測定によって裏付けられた。
【０２１２】
カチオン化フィトグリコーゲンは、バイオフィルムの付着成長の制限において、天然フィトグリコーゲンよりも優れた能力を有する。カチオン化フィトグリコーゲンと同様の低減をもたらすためには、約１０倍多い天然フィトグリコーゲンが必要とされる。これに関連して、フィトグリコーゲンの天然および変性形態は、抗バイオフィルムおよび抗汚損薬剤として、または製剤の一部として役立ち得る。
【０２１３】
[実施例２３]
カチオン化フィトグリコーゲンは、表面への細胞接着を制限する
バイオフィルム形成の決定的ステップは、表面への細胞の付着で始まる。これは多因子プロセスであり、その結果を、細胞、細胞表現型、細胞表面特性および付属物、表面の特性ならびに局所環境条件などのパラメーターによって決定する。下流のバイオフィルム成長を制限するであろうために、表面への細胞接着を妨害する能力が望ましい。
【０２１４】
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１をミュラー−ヒントンブロス（Ｏｘｏｉｄ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）中で継代培養することにより復活させ、２０〜２２時間にわたって成長させた（３７℃、１５０ｒｐｍ）。細胞接着アッセイを、滅菌９６ウェルポリスチレンプレート内で行った。簡単に述べると、補充されていないか、または１もしくは１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充されているブロスの保存液を、５×１０５ＣＦＵ．ｍｌ−１の最終細胞密度まで接種した。１００μｌアリコットを８ウェル／条件にピペッティングした。陰性成長対照は非接種培地を含有した。プレートを静的に５時間にわたって３７℃でインキュベートし、次いで、生物学的安全キャビネットに移動させた。ウェル内容物を、ピペットを使用して吸引し、廃棄し、ウェルを０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌですすいだ。接着した細胞を０．１％Ｈｕｃｋｅｒクリスタルバイオレット（１００μｌ／ウェル）で１５分間にわたって室温で染色した。ウェル内容物を吸引し、ウェルを水で過剰に洗浄して、いずれの非結合染剤も除去した。プレートを空気乾燥した。残留染剤を３３％酢酸（ｖｏｌ／ｖｏｌ；１００μｌ／ウェル）で可溶化し、次いで、λ＝６００ｎｍでＢｉｏＴｅｋ  ＥＬ８００プレートリーダーを使用して定量した。実験を八重反復試験で行い、３回繰り返した（ｎ＝２４±ｓｅｍ）。
【０２１５】
５時間のインキュベーション期間の後に、緑膿菌（P.aeruginosa）細胞を非補充成長培地の存在下でインキュベートすると、１．０２３±０．０４９の染剤保持吸光度値によって示されるとおりの付着値を得たが、１または１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１の存在下でのインキュベーションは低減をもたらし、それぞれ０．３４５±０．０１２および０．５３６±０．０４１の値を有した。
【０２１６】
１０ｍｇ．ｍｌ−１のより高い濃度においてよりも、１ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１で、ポリスチレンプレートへの緑膿菌（P.aeruginosa）の付着のより大きな低減が観察された。最も有望な説明は、ナノ粒子と細胞および表面材料の性質との間で生じる相互作用のバランスに関し、ポリスチレンは、相対的に疎水性が高い。この事例では、正味で正の電荷を持つカチオン化フィトグリコーゲンは、疎水性ポリスチレン表面および負の電荷を持つ細胞の両方に結合すると予測される。
【０２１７】
細胞と表面との間に最大の反発をもたらし、組成物およびナノ粒子の濃度などの他のパラメーターによって影響を受けるであろういくつかの最適条件が存在する可能性がある。所与の用途で、製剤を経験的に確立し、任意の表面、環境、細胞および組成物ならびにナノ粒子の濃度を考慮することが推奨される。
【０２１８】
[実施例２４]
カチオン化フィトグリコーゲンでの表面の前処理は細胞接着を制限する
最初の細胞接着がバイオフィルム形成の決定的瞬間であるが、表面の特性も重要である。未処置の表面特性は、いわゆるコンディショニングフィルム（conditioning film）の形成に影響を及ぼし、これは、ごく簡単には、局所環境から表面上に吸着された部分からなり、脂質およびタンパク質を含み得る。したがって、全表面特性に寄与するので、コンディショニングフィルムは重要であり；バイオフィルムを制限するアプローチの１つは、付着および接着を忌避するコンディショニングフィルムを介しての表面特性の計画的な変化を通じたものである。
【０２１９】
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１をミュラー−ヒントンブロス（Ｏｘｏｉｄ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）中で継代培養することにより復活させ、２０〜２２時間にわたって成長させた（３７℃、１５０ｒｐｍ）。細胞接着アッセイを滅菌９６ウェルポリスチレンプレート内で行った。簡単に述べると、ウェルの前処理を、対応するウェルに、１００μｌのブロス、または１もしくは１０ｍｇカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充されたブロスをピペッティングすることにより行った。プレートを、ＰａｒａＦｉｌｍ（商標）を使用して密閉し、２０時間にわたって４℃でインキュベートした。２０時間後に、プレートを生物学的安全キャビネットに移動させ、ウェル内容物を吸引し、廃棄し、ウェルを０．９％ＮａＣｌ（ｗｔ／ｖｏｌ）で洗浄した。この時点で、前調整されたウェルへの細胞接着を、実施例２３に記載のとおりに行った。実験を八重反復試験で行い、３回繰り返した（ｎ＝２４±ｓｅｍ）。
【０２２０】
非補充培地または１ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１で前処理されたウェル内の細菌付着は、それぞれ１．０２３±０．０４９および１．０３６±０．０４５単位の同様の吸光度値を有した（表５）。しかしながら、１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１でのウェルの前処理は、細菌付着を約７５％低減させた（０．２５１±０．０１６の吸光度値が測定された）。
【０２２１】
【表５】
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【０２２２】
表面前処理と、カチオン化フィトグリコーゲンを含有する溶液と共にインキュベートすることとの組合せは、細胞接着を制限することがさらに見出された（表５）。有効性において、最大の低減が、１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１の表面前処理で起こることが見出される傾向が存在し、０＞１＞１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１付着ブロスの傾向が続いた。１ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１での表面前処理のゼロ有効性とは対照的に、付着ブロスの補充は、付着を防止する能力を復活させ、付着ブロスのみと共にインキュベートするよりもわずかに有効であった。
【０２２３】
[実施例２５]
カチオン化フィトグリコーゲンはバイオフィルムの成熟を撹乱する
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１を変法Ｍ９培地中で継代培養することにより復活させ、２２〜２４時間にわたって成長させた（３７℃、１５０ｒｐｍ）。変法Ｍ９培地を実施例２１に記載のとおりに調製した。滅菌ガラス管（１８×１５０ｍｍ）をバイオフィルム形成アッセイのために使用した。保存溶液に固定相培養物（１：２０００希釈）を接種し、十分に混合し、２ｍＬアリコットを滅菌管に移動させた。管を６時間にわたって３７℃および１５０ｒｐｍでインキュベートした。６時間の移動時間の前に、培地または変性フィトグリコーゲンを補充された培地の保存滅菌溶液を調製した。６時間目に、培養物を、ピペットで吸引することにより除去し、すぐに、適切な予熱溶液で置き換えた。管を、インキュベーターに、３７℃および１５０ｒｐｍで２０時間の合計インキュベーション時間となるようにさらに１４時間にわたって、戻した。陰性対照は、非移動および移動非補充培地サンプル管を含み、移動ステップから生じる不一致についてアッセイするために使用した。２０時間目に、蓄積したバイオフィルムを実施例１４に記載のとおりに定量化した。実験を三連アッセイで行い、独立した四連実験として繰り返した（ｎ＝１２）。
【０２２４】
カチオン化フィトグリコーゲンで６時間齢のバイオフィルムを処理すると、２０時間目に付着成長パターンに変化が生じた。図１２は、様々な濃度のカチオン化フィトグリコーゲンで処理した後に緑膿菌（P.aeruginosa）により形成される代表的なバイオフィルムの記録画像を示している；図１３は、様々な濃度のカチオン化フィトグリコーゲンで処置した後の緑膿菌（P.aeruginosa）からの事前形成バイオフィルムの付着成長の定量化を示している。６時間目に、２０時間目よりは少なかったものの、かなりのバイオフィルムが形成された。２０ｈおよび２０ｈＴバイオフィルムは、２０時間にわたって培地を交換せずにバイオフィルムが２０時間にわたって蓄積し得たサンプル（移動なし）、および関連培養培地が６時間目に交換され、次いで、合計２０時間にわたってインキュベートされたサンプル（２０ｈＴ、移動）を表している。両方の事例で、同様の量のバイオフィルムが存在し、これは、移動ステップが事象の正常な進行を撹乱することはなかったことを示した。対照的に、培地が様々な濃度のカチオン化フィトグリコーゲンを補充された培地で交換されたすべてのサンプルは、２０時間までに付着成長したバイオフィルムの消失を示した（図１２および１３）。
【０２２５】
カチオン化フィトグリコーゲンは、新生バイオフィルムの継続した成熟を防止し得た。この効果は濃度依存的であり、濃度の漸増は有効性の上昇と相関する。これは、荷電ナノ粒子と、バイオフィルム内の細胞または細胞外マトリックスの成分との間の相互作用を通じて起こり得る。成熟のこの休止はまた、マイクロコロニーの膨張および分化に影響を及ぼす細胞の運動性の制限に関連し得る。実施例２０では、カチオン化フィトグリコーゲンは、運動性を妨害することを示したが、この運動性は、バイオフィルムのホールマークである３−Ｄアーキテクチャーの開発に重要であり、かつ微小環境の発生および多くの表現型の創出に不可欠である。
【０２２６】
[実施例２６]
カチオン化フィトグリコーゲンでのバイオフィルムの短期処理は、バイオフィルム塊の低減をもたらす。
カチオン化フィトグリコーゲンは、バイオフィルム内の細胞、および細胞外マトリックスの成分の両方とも相互作用し得る。次いで、カチオン化フィトグリコーゲンは、そのような相互作用を通じて、バイオフィルムを撹乱し得るという結果になる。このことは、金属カチオンなどの、他の正に荷電された種で、またはキレート化剤で実証されており、それらは、バイオフィルムからのカチオンを除去するか、またはそれに代わり、細胞とマトリックスとの間の微細構造配置および組織化に対する損傷をもたらす。
【０２２７】
緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１を変法Ｍ９培地中で継代培養することにより復活させ、２２〜２４時間にわたって成長させた（３７℃、１５０ｒｐｍ）。変性Ｍ９培地を調製した（実施例２１）。滅菌ガラス管（１８×１５０ｍｍ）をバイオフィルム形成アッセイのために使用した。保存溶液に固定相培養物（１：２０００希釈）を接種し、十分に混合し、２ｍＬアリコットを滅菌管に移動させた。管を２０時間にわたって３７℃および１５０ｒｐｍでインキュベートした。２０時間目に、管のセットを生物学的安全キャビネットに移動し、培養物を吸引により除去し、すぐに、１ｍｇの天然またはカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を含有する適切な予熱移動溶液と交換した。非補充培地を陰性対照として使用した。管をインキュベーターに戻し、移動後５、１０、３０および６０分目にサンプル採取した。管内容物を吸引により除去し、廃棄した。管を滅菌０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌで穏やかにすすいで、ゆるく付着している細胞を除去し、残りのバイオフィルムバイオマスを定量した（実施例２１）。実験を三連で行い、４回繰り返した（ｎ＝１２）。
【０２２８】
短期曝露アセスメントを行って、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１により形成されたバイオフィルムに対する、カチオン化フィトグリコーゲンの補充の影響を評価した。これは、生物付着した非生物または生物表面を処理するための抗バイオフィルム薬剤として含めて、潜在的な用途を有する。バイオフィルムを、天然またはカチオン化フィトグリコーゲンで５、１０、３０または６０分間にわたって処理した（図１４）。培地または天然フィトグリコーゲンを補充された培地中で短時間インキュベートした後に、バイオフィルムの消失は起こらなかった（図１４）。対照的に、カチオン化フィトグリコーゲンは、４０％の平均低減を誘導した。特に、この低減は、それぞれ５、１０、３０および６０分目に平均４３、４０、４０、３９％の低減で、全アセスメント期間を通じて相対的に一定であり続け、この低減が急速な事象であること、および最高１時間のインキュベーションの延長によって、測定されるバイオマスの消失が増加しなかったことを示した。
【０２２９】
この効果は、実施例２２および２５に記載のとおりのカチオン化フィトグリコーゲンでの処理後の結果と対照的である。カチオン化フィトグリコーゲンは、これらだけに限定されないが、基層上でのコンディショニングフィルムの形成、運動性の妨害、細胞表面特性の変化、菌体密度検知をベースとするプロセスへの干渉、バイオフィルム細胞外マトリックス物質とバイオフィルム内の細胞との相互作用を含む、異なる機構を通じて、バイオフィルムの形成および展開の段階で作用すると提案される。バイオフィルムのこの多段階標的化により、カチオン化フィトグリコーゲンは、抗バイオフィルムまたは抗汚損薬剤として多用途なものとなっている。
【０２３０】
[実施例２７]
カチオン化フィトグリコーゲンは、バイオフィルム成長を刺激するＭＩＣ未満の選択された抗生物質の能力を阻害する
抗生物質は、宿主内の微生物感染を予防または制限するために使用される薬剤である。結果の成功には、抗生物質および抗生物質濃度の選択を含むいくつかのパラメーターが重要である。患者に抗生物質を投与すると、濃度は最大に達するまで上昇し、次いで、抗生物質が身体から排泄されるにつれて低下する。処置レジメンは、治療濃度を維持することを求める。しかしながら、このことは、抗生物質の濃度が最少発育防止濃度未満（ＭＩＣ）レベルであり得る期間ではまれではない。ＭＩＣ未満の抗生物質は、細菌細胞による応答を誘発することが示されている；重大なことに、これらは、生存および存続ストラテジーを含む。例えば、ＭＩＣ未満のアミノグリコシド抗生物質は、日和見病原体緑膿菌（P.aeruginosa）によるバイオフィルムの増加を刺激する。
【０２３１】
ＭＩＣ未満の濃度のアミノグリコシドトブラマイシンでバイオフィルム形成の増強を制限するカチオン化フィトグリコーゲンでの可能性を滅菌９６ウェルポリスチレンプレートにおいてアセスメントした。緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１をミュラー−ヒントンブロス（Ｏｘｏｉｄ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）中で継代培養することにより復活させ、２０〜２２時間にわたって成長させた（３７℃、１５０ｒｐｍ）。ガンマ線照射されたカチオン化フィトグリコーゲンの滅菌溶液を、必要に応じて、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で再構成および希釈することにより調製した。ウェルは、０．４μｇのトブラマイシン．ｍｌ−１として、１または１０ｍｇ．ｍｌ−１のカチオン化フィトグリコーゲンの非存在下または存在下で経験的に確立されたＭＩＣ値の０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．２５、１．５倍の最終濃度を含有した。陰性成長対照は、補充されていないか、または１もしくは１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充されている滅菌培地を含んだ。陽性成長対照は、補充されていないか、または１もしくは１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を補充されている接種培地を含有した。接種源を、５×１０５ＣＦＵ．ｍｌ−１の最終アッセイ内細胞密度で、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で希釈することにより使用直前に調製した。プレートを静的に３７℃でインキュベートした。２０時間目に、バイオフィルムを染色し、すでに記載したプロトコール（実施例２３）により定量した。実験を四連反復試験で行い、３回繰り返した（ｎ＝１２）。
【０２３２】
刊行されている文献と一致して、ＭＩＣ未満の濃度のアミノグリコシドトブラマイシンは、バイオフィルムの形成の増加をもたらした（図１５）。培地のみの対照に対して、バイオフィルムは、１．３３（ＭＩＣの１／４）、＞２．００（ＭＩＣの１／２）および１．５（ＭＩＣの３／４）の倍数で蓄積することが見出された。≧ＭＩＣの値でのみ、バイオフィルムの蓄積は低減した。
【０２３３】
データセットをまた、トブラマイシンを添加しなかった場合のバイオフィルム蓄積でのそれらの対応する値に対して正規化した（図１５）。培地にカチオン化フィトグリコーゲンを補充した場合、ＭＩＣの１／４のトブラマイシンは、形成されるバイオフィルムの増加は存在せず、これは、ＭＩＣ未満の抗生物質によるバイオフィルムの増強の阻害を示した。ＭＩＣの１／２のトブラマイシンでは、カチオン化フィトグリコーゲンは、対応する補充培地で形成されるバイオフィルムに対して、バイオフィルムを約７０％低減させた。ＭＩＣの３／４のトブラマイシンでは、この低減はさらに大きく９０％のレベルに達する。同様の効果は、トブラマイシンの濃度がＭＩＣを上回るまで、非補充培地では見られなかった。
【０２３４】
カチオン化フィトグリコーゲンを、その治療濃度未満である抗生物質と組み合わせて使用すると、これは、バイオフィルム成長の増強を逆転させる。バイオフィルムは、急性および慢性感染性疾患の発症において同定されている重要なステップであり、また、化学療法レジメンに対する従順性が低く、宿主免疫防御および応答能力に対して保護されている。したがって、抗生物質濃度が、細胞成長の阻害または細胞死をもたらすために治療上必要である濃度未満である場合に、カチオン化フィトグリコーゲンとの併用療法は、バイオフィルムの形成の増強を防止する方法である。バイオフィルムの形成および増殖を防止することにより、これらの微生物細胞は、特に、次の用量が送達されると、抗生物質の作用に対する感受性を維持する。加えて、微生物細胞は、バイオフィルムの遮蔽状態に侵入しないので、これらの細胞は、宿主免疫系の防御作用に対してアクセス可能なままである。
【０２３５】
[実施例２８]
カチオン化フィトグリコーゲンおよび抗生物質の組合せは、バイオフィルムの根絶を増強する
カチオン化フィトグリコーゲンが、細胞運動性、細胞付着、バイオフィルムの形成および成熟を阻害し得ること、また、細菌を多様なクラスの抗生物質の作用に対してより感受性にすることがすでに示されている（実施例１７、１９、２０、２２〜２６）。加えて、カチオン化フィトグリコーゲンは、ＭＩＣ未満の抗生物質の性質を、バイオフィルム増殖を増強するように逆転させた（実施例２７）。本発明者らは、カチオン化フィトグリコーゲンを抗生物質と組み合わせることが、バイオフィルムを低減させ、処理するための改善方法であることを実証する。
【０２３６】
バイオフィルム成長および処理を滅菌９６ウェルポリスチレンプレートで行った。ガンマ線照射されたカチオン化フィトグリコーゲンの滅菌溶液を、必要に応じて、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で再構成し、希釈することによって調製した。緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１（３７℃、１５０ｒｐｍ、１６〜１８時間）をミュラー−ヒントンブロス（Ｏｘｏｉｄ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）中で継代培養することにより復活させた。接種源を、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で５×１０５ＣＦＵ．ｍｌ−１の最終アッセイ内細胞密度まで希釈することにより使用直前に調製した。この溶液１００μｌをウェルに移動させ、インキュベートした（３７℃、１５０ｒｐｍ）。滅菌ブロスが、陰性成長対照であった。２０時間目に、プレートを生物学的安全キャビネットに移動させ、ウェル内容物を穏やかに吸引し、ウェルを、滅菌０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌですすいだ。次いで、２０時間バイオフィルムを、０、１または１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を含むミュラー−ヒントンブロス中の０、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、および４×ＭＩＣのシプロフロキサシンまたはトブラマイシンに曝露した。ＭＩＣ値を経験的に、それぞれトブラマイシンおよびシプロフロキサシンで０．４および０．１２５μｇ．ｍｌ−１として確立した。陰性成長対照は、非補充か、または１もしくは１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を含む滅菌培地を、滅菌成長培地をすでに含有するウェル内に含んだ。陽性成長対照は、非補充か、または１もしくは１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を含む接種培地を含有した。プレートを３７℃でさらに２４時間にわたってインキュベートし、その後、バイオフィルムをすでに記載したとおりに定量した。実験を四連反復試験で行い、３回繰り返した（ｎ＝１２）。
【０２３７】
選択された２種の抗生物質のうち、カチオン化フィトグリコーゲンは、トブラマイシンではなくシプロフロキサシンの作用に対して細胞を増感した（実施例１７）。種々の組合せの抗生物質およびカチオン化フィトグリコーゲン（図１６、１７）で２４時間にわたって処理する前に、バイオフィルムを２０時間にわたって成長させた。
【０２３８】
ＭＩＣ未満のトブラマイシンによるバイオフィルム形成の誘導と同様に、２０時間バイオフィルムをトブラマイシンで処理すると、ＭＩＣ値の０．１２５〜２倍の範囲で、バイオフィルム増殖の正味の増加が存在した（図１６）。ＭＩＣの４倍のトブラマイシンでは、バイオフィルムは、当初のバイオフィルムに対して４０％低減した。バイオフィルムが、抗生物質に対して感受性が低いことは公知であるが、このデータは、抗生物質がバイオフィルム成長を刺激し得ることを示した。同様の予期しなかった傾向もＭＩＣ未満のシプロフロキサシンで見出された（図１７）。ＭＩＣでは、バイオフィルムに変化はなく、ＭＩＣ値の２倍および４倍で、それぞれ６４％および７３％減少した。
【０２３９】
１ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１と組み合わせたトブラマイシンまたはシプロフロキサシンのいずれかでのバイオフィルムの処理が、バイオフィルム蓄積の抗生物質誘導性増加を防止するために十分であった（図１６、１７）。１０ｍｇのカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１の補充は、トブラマイシンおよびシプロフロキサシンの両方でのＭＩＣ未満の濃度で、バイオフィルム蓄積の低減をもたらした（図１６、１７）。例えば、トブラマイシンのＭＩＣでは、これは、培地のみ対照における対応するＭＩＣトブラマイシンの約１０％であるバイオフィルムをもたらす。シプロフロキサシンの０．５ＭＩＣでは、バイオフィルムは、培地のみにおける対応する０．５ＭＩＣの２０％であった。
【０２４０】
まとめると、カチオン化フィトグリコーゲンを抗生物質と組み合わせて使用すると、これは、抗生物質誘導性バイオフィルム増殖の規模を逆転させる。バイオフィルムは、急性および慢性感染性疾患の発症において同定されている重要なステップであり、また、化学療法レジメンに対する従順性が低く、宿主免疫防御および応答能力に対して保護されている。したがって、これらが、細胞成長または細胞死の阻害をもたらすために治療上必要な濃度未満である濃度である場合に、カチオン化フィトグリコーゲンとの併用療法は、抗生物質に帰せられ得るバイオフィルムの成長の増強を防止する方法である。より高い濃度のカチオン化フィトグリコーゲンを抗生物質と組み合わせて使用すると、これは、バイオフィルムの量を低減させる。
【０２４１】
[実施例２９]
カチオン化フィトグリコーゲンは、細胞を懸濁液から沈降させる
細胞懸濁液からの細胞の沈降は、綿状凝集または粒子間の反発を低減させる全表面電荷の低減を含むいくつかの機構を通じて起こり得る。微粒子の沈降は、水精製および処置などのプロセスに重要である。加えて、溶液中の細胞間、または細胞と基層との間の相互作用を変化させることを通じて、コロニー形成、付着およびバイオフィルム形成の進行が影響を受け得る。
【０２４２】
ガンマ線照射されたカチオン化フィトグリコーゲンの滅菌溶液を、必要に応じて、滅菌ミュラー−ヒントンブロス中で再構成し、希釈することによって調製した。緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１保存株は、緑膿菌（P.aeruginosa）ＰＡＯ１（３７℃、１５０ｒｐｍ、１６〜１８時間）をミュラー−ヒントンブロス（Ｏｘｏｉｄ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎａｄａ）中で継代培養することにより復活させた。１ｍｌアリコットの細胞を５分間にわたって６０００×ｇで遠心分離し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）で２回洗浄し、０、１、または１０ｍｇの天然またはカチオン化フィトグリコーゲン．ｍｌ−１を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液中に再懸濁させた。次いで、サンプルをベンチトップ上に３０分間にわたって置き、その後、沈降物の形成を観察した。サンプルの全載ネガティブ染色された調製物を、透過型電子顕微鏡法を使用して観察した。高濃度のバックグラウンド粒子を、細胞を短時間ペレット化することにより（３０００×ｇ、５分）低減させ、上清を除去し、ペレットを５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）中に穏やかに再懸濁させた。ホルムバール−および炭素コーティングされた銅製グリッド（２００メッシュ；Ｍａｒｉｖａｃ）を、フィルム側を下にして、サンプル１０μｌの上に１０秒間にわたって浮かべた。グリッドを除去し、エッジをＷｈａｔｍａｎ  ｎｏ．１濾紙に当てて、余分を吸い取った（wick off）。次いで、グリッドを、５０μｌのナノピュア水（nanopure water)上に（サンプル側を）浮かべることにより洗浄し、吸い取り、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）酢酸ウラニル１０μｌ上に１０秒間にわたって浮かべ、乾燥まで吸い取った。グリッドを、標準的な操作条件下で８０ｋＶの加速電圧で操作するＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過電子顕微鏡を使用して調査した。
【０２４３】
天然フィトグリコーゲンではなく、カチオン化フィトグリコーゲンの補充が、緑膿菌（P.aeruginosa）細胞を、溶液から沈降させることが見出された（図１８）。これは急速なプロセスで、沈降物は１０分以内に可視化した。細胞の顕微鏡法は、天然ではなくカチオン化フィトグリコーゲンが細胞と直接相互作用したことを示した（図１９）。これが全細胞表面電荷に変化をもたらし、細胞を沈降させ得たと予測される。加えて、これは、付着およびバイオフィルム形成などのプロセスを阻害するであろう。
【０２４４】
カチオン化フィトグリコーゲンで処理された細胞が細胞壁の混乱の徴候を示したことも注目された（図１９）。これは一部では、カチオン化フィトグリコーゲンによる抗生物質に対する増感を説明し得（実施例１７）、また、抗生物質の取込み、または菌体密度検知シグナルなどの拡散プロセスに重要であり得る膜パラメーターの変化をもたらし得た。
【０２４５】
[実施例３０]
フィトグリコーゲンナノ粒子の皮膚刺激の可能性
ヒト反復パッチ試験（Human Repeat Insult Test）（ＨＲＩＰＴ）を３週間にわたって、後に休止期間、およびチャレンジ期間を続けて実施して、フィトグリコーゲンを含有するクリーム製剤の皮膚刺激（接触皮膚炎）および増感の可能性（接触アレルギー）を評価した。研究を単一施設、無作為化研究；試験処方の間に処置の個人間比較を伴う二重盲検：フィトグリコーゲンを含む、および含まないクリーム基剤として設計した。フィトグリコーゲンを含むクリーム基剤の処方を実施例３１に記載する。フィトグリコーゲンを含まないクリーム基剤では、フィトグリコーゲンを対応する量の水に置き換えた。
【０２４６】
いずれの性別でも２４〜７６歳の間（平均年齢＝４６．８８歳）の合計５０人の健康なボランティアがこの研究のために選択された。
【０２４７】
試験製剤および対照（純ワセリン、ＵＳＰ）を含有する貼付剤を、試験エリアに施用し、皮膚に接触させたままにした。第１の貼付剤を４８時間後に除去し、試験後に、新鮮な試験製剤を含む新たな貼付剤を施用した。試験製剤を選択されたゾーンの上に１日置きに、週に３回、３週連続して施用した。これを誘導相と称する。
【０２４８】
上記の誘導相の完了後に、１０〜１４日間の休止期間を計画した。次いで、チャレンジ相を開始した。この相では、貼付剤を、誘導相で使用した部位とは異なる部位に施用した。施用の４８時間後に、貼付剤を除去し、試験部位を清浄にし、非忍容性または刺激の何らかの徴候について皮膚科医が調査した。
【０２４９】
フィトグリコーゲンを含有する製剤でのＨＲＩＰＴの結果を表６にまとめた。
【０２５０】
【表６】
2019513837.tif 000008
【０２５１】
本明細書に記載の研究の結果に基づき、フィトグリコーゲンは皮膚刺激の徴候も皮膚感作ももたらさないと結論された。したがって、非刺激および低アレルギー性物質と考えられる。
【０２５２】
[実施例３１]
フィトグリコーゲンを含む医薬組成物
クリーム剤の形態のこの製剤は、フィトグリコーゲンを活性成分として含有し、局所投与により適している。
【０２５３】
フィトグリコーゲンを含むクリーム剤の処方を表７に記載する。
【０２５４】
【表７】
2019513837.tif 000009
【０２５５】
組成物を次のとおりに調製した。
【０２５６】
水およびグリセリンをビーカー内で合わせた。次いで、フィトグリコーゲンおよびザンサンガムを分散させた。混合物を７５℃に加熱した。相Ｂの成分を個別のビーカー内で合わせ、７５℃に加熱した。相Ｂを相Ａに添加し、均一になるまで１２００ｒｐｍで混合した。温度が４０℃に低下したときに、相Ｃの成分を混合物に添加した。混合を４００ｒｐｍで１０分間にわたって継続して、十分な混合を確実にした。
【０２５７】
[実施例３２]
ＴＣＰ−１単核細胞によるＣｙ５．５標識グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子の内在化
Ｃｙ５．５標識グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子を実施例１０に記載されているとおりに生成した。この研究で使用される粒子への近赤外蛍光色素（Ｃｙ５．５）のコンジュゲーションは、共焦点蛍光顕微鏡法によるナノ粒子取込みの分析を可能にした。
【０２５８】
ＭＣＰ−１細胞を、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＣｙ５．５標識グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子と共に、４℃（陰性対照）および３７℃で０．５、２、６および２４時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定し、ＰＢＳで再び洗浄した。次いで、固定された細胞をＤＡＰＩ（核）およびＡＦ４８８（細胞膜）で染色した。グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子の内在化を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによりアセスメントした。
【０２５９】
エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスプロセスがもはや活性ではない４℃でのインキュベーションは、ＴＨＰ−１細胞と会合したいかなる粒子ももたらさなかった（図２０）。これにより、表面結合でのＴＨＰ−１細胞によるナノ粒子の蓄積は存在しないことが確認された。対照的に、６時間にわたる３７℃でのインキュベーションは、細胞質でのＣｙ５．５標識グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子のかなりの蓄積を明らかにした（図２０）。しかしながら、０．５〜２時間の時間間隔では、取込みは、非常に低かった。
【０２６０】
[実施例３３]
Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンコンジュゲートの注射後のナイーブマウスにおける薬物動態（ＰＫ）プロファイル
Ｃｙ５．５標識フィトグリコーゲン（０．０８μＭ  Ｃｙ５．５／ｍｇ）を実施例１０に記載のとおり合成した。
【０２６１】
ヌードＣＤ−１マウス（ｎ＝３）１８〜２０グラムに、ＰＢＳ中に分散させたＣｙ５．５−フィトグリコーゲンを３００ｍｇ／マウスｋｇの用量で注射した。わずかな血液サンプル（５０μｌ）をマウス（下顎下静脈）から、ヘパリン化管を使用して複数時間間隔（１５分、１時間、２時間、６時間および２４時間）で収集した。これらの時点を蛍光により、サイトフルオリメータープレートメーターを使用して分析した。ナノ粒子濃度を、血液中で希釈されたＣｙ５．５−フィトグリコーゲンナノ粒子の既知の濃度からなる標準曲線を使用して内挿した。
【０２６２】
図２１から分かり得るとおり、血液中のＣｙ５．５−フィトグリコーゲン濃度は、指数関数的に経時的に低下し、２４時間までに除去された。排出半減期は、２時間であると決定（計算）された。半減期は、化合物の当初血液濃度を５０％低減させるために身体が必要とする期間を指す。
【０２６３】
すべての光学的イメージング実験を、小動物用タイムドメインｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２プレクリニカルイメージャーを使用して行い、画像を分析するか、ＡＲＴ  Ｏｐｔｉｘ  Ｏｐｔｉｖｉｅｗ分析ソフトウェア２．０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ）を使用して蛍光濃度マップとして再構成した。８０ＭＨｚの繰返し周波数および１２ｐｓ光パルスの時間分解能で６７０ｎｍパルスレーザーダイオードを励起のために使用した。７００ｎｍでの蛍光発光を高感度時間相関単一光子計数システムにより収集し、高速光電子増倍管を通じて検出した。
【０２６４】
Ｃｙ５．５標識フィトグリコーゲン（０．８μＭ  Ｃｙ５．５／ｍｇ）を実施例１０に記載のとおりに合成した。
【０２６５】
未処置の動物では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにより、肝臓、肺（すべての時点）、腎臓（１５分〜６時間）、膀胱（１５分〜６時間）、および脳（１５分〜２時間）においてＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの強いシグナルが明らかになった（図２２および２３）。
【０２６６】
３０分目および２４時間目のｅｘ  ｖｉｖｏデータによって、実際に肺においてＣｙ５．５−フィトグリコーゲンのかなりの取込みが存在し、脳では、より低い程度であることが確認された（図２２および２３）。脳におけるシグナルは、遅い時点（２４時間）と比較して、早い時点（３０分）で最も高い。Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンナノ粒子はグルコースポリマーであるので、グルコース輸送において非常に活性であることが公知である脳および肺などの臓器は、グルコース輸送担体を介してＣｙ５．５−フィトグリコーゲンを蓄積することが可能である。
【０２６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングデータは、肝臓がＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの代謝を主に担うことを実証した。さらに、肝臓で代謝されたナノ粒子は、血流に再侵入し、次いで、腎臓系を通じて排出され得る、より小さなＣｙ５．５標識グルコース誘導体を生成することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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