(57)【要約】  本発明は、（ａ）と（ｂ）：［（ａ）反応部分（前記反応部分は、ペプチドの官能基と反応して共有結合を形成して；それへ共有結合で結合することが可能である）；（ｂ）質量分析計において、（ｉ）ペプチドを断片化するのに必要とされるエネルギー未満のエネルギー、及び／又はペプチドより高い変換率で；並びに（ｉｉ）（ｉ）による前記エネルギーで、そして前記反応基を介してペプチドへ結合する場合は、ペプチドへ結合する前記化合物内の単一部位で断片化して、第一部分と第二部分（前記第二部分は、前記ペプチドへ結合している）を生じる部分］を含むか又はそれらからなる化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）と（ｂ）：
［（ａ）反応部分（前記反応部分は、ペプチドの官能基と反応して共有結合を形成して；それへ共有結合で結合することが可能である）；
（ｂ）質量分析計において、
（ｉ）ペプチドを断片化するのに必要とされるエネルギー未満のエネルギー、及び／又はペプチドより高い変換率で；並びに
（ｉｉ）（ｉ）による前記エネルギーで、そして前記反応基を介してペプチドへ結合する場合は、ペプチドへ結合する前記化合物内の単一部位で断片化して、第一部分と第二部分（前記第二部分は、前記ペプチドへ結合している）を生じる部分］を含むか又はそれらからなる化合物。
【請求項２】
同位体標識されて、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の同位体標識原子を含み、同位体標識原子は、好ましくは１３Ｃ及び／又は１５Ｎである、請求項１の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）：
−Ｘ−ＣＨ２−（Ｙ）ｎ−Ｚ−      （Ｉ）
［式中：
Ｘは、ＳＣＨ３、ＳＯ、又はＳＯ２であり；
Ｙは、ＣＨ２、ＮＨ、又はＯであり（但し、（Ｙ）ｎは、ＮＨとＯより選択される０又は１つの基を含む）；
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８、好ましくは０又は１であり；そして
Ｚは、ＣＨＡ−Ｙ又はＣＨ２−ＣＯであり、ここでＡは、電子吸引基、好ましくはＮＯ２、又はＦのようなハロゲンである］の部分（ここで好ましくは前記部分は、−ＳＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−である）を含む、請求項１〜請求項２のいずれか１項の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩ）：
Ｂ１−式（Ｉ）−Ｂ２−Ｄ      （ＩＩ）
［式中：
Ｂ１とＢ２は、好ましくはＣ原子での多重化同位体ラベリングに適した部分であり；
Ｄは、請求項１に定義されるような反応部分である］を有する、好ましくは請求項１〜請求項３のいずれか１項の化合物、又はその塩又は溶媒和物、又は適用可能な場合は、その互変異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、又は混合物。
【請求項５】
Ｂ１が、
式（ＩＩＩａ）又は式（ＩＩＩｂ）：
Ｈ３Ｃ−（Ｙ）ｍ−Ｅ−（Ｙ）ｐ      （ＩＩＩａ）、又は
Ｋ−ＣＨ２−（Ｙ）ｍ−Ｅ−（Ｙ）ｐ      （ＩＩＩｂ）
［式中：
Ｅは、Ｏ−ＣＯ、Ｎ−ＣＯ、Ｓ−ＣＯ、Ｏ−ＣＳ、Ｓ−ＣＳ、（ＣＨ２）２、又はＮＨ−ＣＯであり；
Ｙは、請求項３において定義されるか又はＣＨ（ＣＨ３）であり；
ｍは、１、２、又は３であり；そして
ｐは、１、２、又は３であり；
Ｋは、濃縮部分である］によって定義され（ここで好ましくはＢ１は、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨ３−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２、又はＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２である）；
及び／又は
Ｂ２が、式（ＩＶａ）、式（ＩＶｂ）、又は式（ＩＶｃ）：
ＮＲ１−（ＣＨ２）ｑ−Ｇ      （ＩＶａ）、
ＣＨＲ１−（ＣＨ２）ｑ−Ｇ      （ＩＶｂ）、又は
ＯＲ１−（ＣＨ２）ｑ−Ｇ      （ＩＶｃ）
［式中：
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はシクロペンチル又はシクロヘキシルのようなシクロアルキルであり；
Ｇは、求められる場合は、Ｂ２を前記反応基Ｄへ連結するための官能基であり；
ｑは、１、２、３、４、５、６、７、又は８、好ましくは１である］によって定義される（ここで好ましくはＢ２は、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯである）、請求項４の化合物。
【請求項６】
（ａ）同位体標識されている（ここで同位体標識は、Ｂ１、式（Ｉ）、及びＢ２の１以上又はすべてに存在する）；及び／又は
（ｂ）式（Ｖａ）又は式（Ｖｂ）：
【化１】
2019536026.tif 000013
［式中：Ｒ２は、水素、又はハロゲン、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４Ｒ５＋、又はＮＯ２のような電子吸引基であり、ここでＲ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又はＣ２〜Ｃ６アルキニルであり；
Ｊは、同位体ラベリングに適して、Ｃと場合によってはＮ及び／又はＯを含有する部分であり；好ましくは置換又は未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又は置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、ここで１又は２個の炭素原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、及びＰより選択されるヘテロ原子、ＯＨ、ハロゲン、メチル、及びメトキシが含まれる置換基で置き換えてよく；Ｊは、最も好ましくは、Ｈ３Ｃ−（ＣＨ２）ｒ−Ｏである；
ｎは、０と１９の間の整数であり；そして
ｒは、０と２０の間の整数である］；
【化２】
2019536026.tif 000014
［式中：Ｒ２は、ハロゲン、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４Ｒ５＋、又はＮＯ２のような電子吸引基であり、ここでＲ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又はＣ２〜Ｃ６アルキニルであり；
ｒとｔは、独立して、１と２０の間の整数である］を有する、請求項４又は請求項５の化合物。
【請求項７】
前記第一部分が帯電していない、請求項１〜請求項６のいずれか１項の化合物。
【請求項８】
（ａ）請求項１〜請求項７のいずれか１項に定義されるような１以上の化合物を担っているペプチド；及び
（ｂ）（ａ）の化合物（複数）より、請求項４に定義されるような式（Ｉ）中のＸとＣＨ２の間の結合を切断することによって入手される１以上の相補的部分（ここで前記単数又は複数の相補的部分は、前記ペプチドと第二部分からなるか又はそれらを含む）より選択される第二化合物。
【請求項９】
請求項４に定義されるような式（ＩＩ）の化合物より、請求項３に定義されるような式（Ｉ）中のＸとＣＨ２の間の結合を切断することによって入手される第一部分であって、Ｂ１を含む、前記第一部分。
【請求項１０】
請求項１〜請求項７のいずれか１項の複数の化合物（ここで前記化合物は、化学的に同一であって、異なって同位体標識される）を含んでなるか又はそれらからなるキット。
【請求項１１】
前記第二部分がそれらの精密質量に関して異なって、場合によってはそれらの整数（nominal）質量に関しても異なる、請求項１０のキット。
【請求項１２】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に定義されるような化合物、又は請求項１０又は請求項１１のキットの、同重体ラベリング（isobaric labeling）への使用。
【請求項１３】
質量分析法を実施する方法であって：
（ａ）請求項１〜請求項８のいずれか１項に定義されるような化合物とペプチドを反応させて、化合物−ペプチドコンジュゲートを入手する工程；
（ｂ）（ａ）の成果をイオン化する工程；及び
（ｃ）
（ｉ）前記コンジュゲートが前記化合物内の単一部位で好ましくは分解するエネルギーで（ｂ）の成果を断片化する工程；及び
（ｉｉ）前記化合物と前記ペプチドの両方を断片化するエネルギーで（ｂ）の成果を断片化する工程の一方又は両方を実施する工程（ここで（ｉ）と（ｉｉ）がともに実施される場合、それらは、同時的に又は任意の順序で連続的に実施される）を含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
ペプチドを定量する方法であって、請求項１３の方法と、
（ｄ）（ｃ）（ｉ）において入手されるフラグメントの量、及び／又は（ｃ）（ｉｉ）において入手されるフラグメントの量より、所与ペプチドの量を決定する工程の追加工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
質量分析法用の試料調製の方法であって、前記試料は、タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドを含んでなり、そして：
（ａ）有っても無くてもよい、好ましくはトリプシンでの前記試料のタンパク分解消化；及び
（ｂ）前記タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチド、又は工程（ａ）が実施される場合は、工程（ａ）において入手されるペプチドを、請求項１〜請求項７のいずれか１項に定義されるような化合物と反応させる工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に定義されるような少なくとも１つの化合物の、タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドの質量分析法による定量のための使用。
【請求項１７】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に定義されるような化合物の、質量分析法におけるペプチドの単離又は濃縮のための使用（前記単離又は濃縮は、好ましくは中性損失（neutral loss）に基づく）。
【請求項１８】
質量分析法においてペプチドを単離するか又は濃縮する方法であって：
（ａ）請求項１〜請求項７のいずれか１項に定義されるような化合物とペプチドを反応させる工程；
（ｂ）（ａ）の成果をイオン化する工程；
（ｃ）（ｂ）において入手されるイオンをそれらのｍ／ｚ比に従って分離させる工程；
（ｄ）前記イオンを、化合物を断片化するがペプチドは断片化しないエネルギーで、好ましくは、正規化ＨＣＤ衝突エネルギーを請求項２に定義されるような数値以下で使用することによって断片化する工程；
（ｅ）（ｄ）において入手されるイオンをそれらのｍ／ｚ比に従って分離させる工程；；及び
（ｆ）（ｃ）のスキャンと比較してｍ／ｚのシフトを明示する（ｅ）のイオンを単離する工程（前記シフトは、請求項１に定義されるような第一部分に対応する）を含んでなり、それによって前記ペプチドを単離する、前記方法。
【請求項１９】
イオンが単離される場合、そのような単離工程は、１２Ｃイオンだけが単離されるように実施され、それは、好ましくは
（ｉ）１２Ｃイオンを所定の同位体クラスター内で選択すること；及び
（ｉｉ）非対称単離ウィンドウ（an asymmetric isolation window）を使用することによって達成される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
質量分析計を操作する方法であって、イオンを単離する工程を含んでなり、ここでそのような単離工程は、１２Ｃイオンだけが単離されるように実施され、それは、好ましくは
（ｉ）１２Ｃイオンを所定の同位体クラスター内で選択すること；及び
（ｉｉ）非対称単離ウィンドウを使用することによって達成される、前記方法。
【請求項２１】
検出器を含んでなる質量分析計を操作する方法であって、前記検出器は、好ましくはオービトラップ（Orbitrap）検出器であり、前記検出器におけるフラグメントイオンの解析の間に経過する時間において、１以上のさらなる前駆イオンを断片化する工程を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）と（ｂ）［（ａ）反応部分（前記反応部分は、ペプチドの官能基と反応して共有結合を形成して；それへ共有結合で結合することが可能であると、（ｂ）質量分析計において、（ｉ）ペプチドを断片化するのに必要とされるエネルギー未満のエネルギー、及び／又はペプチドより高い変換率で；並びに（ｉｉ）（ｉ）による前記エネルギーで、そして前記反応基を介してペプチドへ結合する場合は、ペプチドへ結合する前記化合物内の単一部位で断片化して、第一部分と第二部分（前記第二部分は、前記ペプチドへ結合している）を生じる部分）］を含むか又はそれらからなる化合物に関する。
【０００２】
本明細書では、特許出願と製造業者のマニュアルが含まれる多数の文献が引用される。これら文献の開示は、本発明の特許性に関連するとみなされないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、すべての関連文書は、それぞれ個々の文書が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されるのと同じ程度で、参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
質量分析法（ＭＳ）は、分析物を（ｉ）定量する、及び／又は（ｉｉ）同定することを可能にする分析法である。処理能力（throughput）を高めること、及び／又は２種以上の試料間の直接比較の目的では、異なる起源の試料を一緒にする場合がある。そのような実験設定では、質量スペクトルにおいてどのピークがどの試料に由来するのかを決定すること、そしてさらに、個別の試料をプールする前に所定分析物のどのくらいの量がそこに存在するのかを決定することが可能であることが重要である。同定の側面に関しては、このことは、典型的には、特にタンパク質とペプチドの分野では、タンパク様分析物の断片化をもたらすモードにおいて質量分析計を操作することによってなされる。
【０００４】
同重体ラベリング（isobaric labeling）は、定量的プロテオミクス用に技術確立された方法である。上記に言及した試料プーリングと共に使用される場合、個々の試料を異なる質量タグで標識する。前記質量タグが同重体であるということは、それらが同一の質量を有することを意味する。同重体であることに加えて、前記質量タグは、断片化部位を含有する。断片化部位は、質量タグを第一部分と第二部分へ分割する。第一部分は、「レポーター部分」とも呼ばれて、第二部分は、「バランス部分」とも呼ばれる。同重体質量タグのセットが定義上は同じ質量のタグを含有する場合でも、このことは、前記定量タグのセットに含まれる個別のレポータータグとバランスタグに当てはまるわけではない。差次的（differential）同位体標識スキームを使用すると、それぞれのレポーター部分とそれぞれのバランス部分がその個別の質量を有するので、シグナルの起源を同定して、それが由来する試料へそれを帰属させることが可能になる。バランス部分は、分析物又はそのフラグメントへ付いたままである。分析物（又はそのフラグメント）とバランス部分からなる化合物は、相補的フラグメント又は相補的イオンとも呼ばれる。
【０００５】
技術確立された同位体質量タグは、ペプチドとポリペプチドも断片化するエネルギーで断片化する。このことは、定量と同定を同じ時点で実施することを可能にする。つまり、断片化すると、レポーター部分及び／又はバランス部分により、シグナルの起源を決定してその量を定量することが可能になり、そして分析物それ自体より入手されるフラグメントによって、その本性（identity）を決定することが可能になるのである。
【０００６】
このアプローチには、言及した利点があるものの、本発明者は、いくつかの欠点を認識した。特に、標的ペプチドと同時に単離して同時に断片化する干渉性のペプチドイオンによって、正確度と精度がともに損なわれる。プロトン転移イオン−イオン反応と高調波ＭＳ３スキャンのような追加の気相単離工程は、これらの課題に対処しようとするものであるが、これらの方法は、取得速度及び感度の低下を犠牲にして成り立つものである（Ow, S. Y., et al., J プロテオーム Res, 2009. 8(11): p. 5347-55; Wenger, C. D., et al., Nat Methods, 2011. 8(11): p. 933-5）。ＴＭＴ質量バランサーを担うフラグメントイオンに基づいた、標識ペプチドのＭＳ２レベルでの定量が代替法を提供するのは、これらの相補的ＴＭＴ（ＴＭＴＣ）イオンが前駆体特異的であって、同時流出性のペプチドによって影響を受けないからである（Wuhr, M., et al., Anal Chem, 2012. 84(21): p. 9214-21）。ＰＴＲ戦略やＭＳ３戦略と異なって、この方法は、四重極 Orbitrap 機器（Q Exactive）のような、広範囲の高分解質量分析計で実施することができる。しかしながら、この方法の現行の制約は、大部分のペプチド、特により高い荷電状態と高移動性のプロトンを有するペプチドでは、相補的イオンの形成が非効率であることである。さらに、ペプチド同位体クラスターの同時単離の故に、ＴＭＴＣイオンが干渉して、定量性を損なってしまう。
【０００７】
先行技術の制約に照らせば、本発明の根底にある技術課題は、質量分析法のための同重体ラベリングについて改善された手段及び方法の提供にあると見ることができる。
【発明の概要】
【０００８】
この技術課題は、本明細書で開示される特許請求項によって解決された。従って、第一の側面において、本発明は、（ａ）と（ｂ）［（ａ）反応部分（前記反応部分は、ペプチドの官能基と反応して共有結合を形成して；それへ共有結合で結合することが可能である）と、（ｂ）質量分析計において、（ｉ）ペプチドを断片化するのに必要とされるエネルギー未満のエネルギー、及び／又はペプチドより高い変換率で；並びに（ｉｉ）（ｉ）による前記エネルギーで、そして前記反応基を介してペプチドへ結合する場合は、ペプチドへ結合する前記化合物内の単一部位で断片化して、第一部分と第二部分（前記第二部分は、前記ペプチドへ結合している）を生じる部分］を含むか又はそれらからなる化合物に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本化合物は、第一の側面に従って、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質へ共有結合で結合されるように設計される。このことは、要件（ａ）によって実行される。化合物をペプチドへカップリングするための数多くの化学法が当業者に利用可能であって知られている。その目的に対する好ましい解決法及び／又は例示の解決法をさらに詳しく下記に開示する。第一の側面による反応部分と反応することが可能である、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の好ましい官能基は、アミノ基、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のＮ末端主鎖アミノ基、又は側鎖アミノ基である。従って、好ましい反応部分は、アミン反応部分である。
【００１０】
分析物、より具体的にはペプチドと反応すると、化合物−ペプチドコンジュゲートが生成される。前記単一部位でのフラグメンテーション時に、前記化合物−ペプチドコンジュゲートは、前記第一部分と第二コンジュゲートを生じる。第二コンジュゲートは、前記第一部分の損失後の本発明の前記化合物の残存部分（第二部分）と前記ペプチドのコンジュゲートである。本発明による同じ化合物で複数のペプチドが誘導される場合、フラグメンテーションにより、複数の第二コンジュゲートが生じるものである。これらの第二コンジュゲートは、定常部分と可変部分を有する。可変部分は、特定の第二部分に含まれる特定のペプチドによって決定されて、定常部分とは、本発明の化合物に由来する、第二コンジュゲートの成分である。この部分は、本明細書において、第二コンジュゲートの定常部分とも呼ばれる。当該技術分野では、そして本発明の同重体タグとは異なる同重体タグに関しては、定常部分は、「バランシング（balancing）部分」とも呼ばれる。第二部分又は定常部分は、第一の側面に準拠して、所定の化合物について同じ化学構造をいつでも有するという意味において、定常である。同位体置換に関しては、同じ化学構造を有する本発明の化合物のセット内では、例えば、本発明に準拠したキット内では、前記第二部分又は定常部分がそれらの同位体置換に関して互いに異なり、その結果は、本発明の化合物のそのようなセット内、又は本発明のキット内の異なる第二部分が異なる質量、少なくとも異なる精密質量と、好ましくは異なる整数質量も有すると理解される。構造に関して言えば、第二部分の定常部分とは、一般に、開裂可能な結合から始まって、前記第二コンジュゲート中の分析物又はペプチドの第一元素に先行する原子で終わる、本発明の化合物の部分である。ある状況下では、プロトン、水素、又は水、等の損失が起こり得る。
【００１１】
前記反応部分へ共有結合で結合した前記化合物は、質量分析計において断片化する部分をさらに含むか、又はそれから追加的になる。その点において重要な特徴は、断片化が、ペプチドを断片化するのに必要とされるエネルギー未満であるエネルギーで起こることである。あるいは、又はさらに、該部分は、質量分析計において、ペプチドより高い変換率で断片化する。「変換率」という用語については、下記にさらに定義される。一般的に言えば、ペプチドより高い変換率という要件は、全ペプチドフラグメンテーション未満のすべてのエネルギーに適用される。好ましい態様では、ペプチドフラグメンテーションが、（例えば、約２３と約３０の間の間隔において）約３０以上の正規化高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）衝突エネルギー（ＮＣＥ）で起こる。本発明に準拠した部分（ｂ）は、好ましくは、約２３未満の正規化ＨＣＤ衝突エネルギー（ＮＣＥ）で断片化する。
【００１２】
フラグメンテーション閾値がＨＣＤ衝突エネルギーに関連して規定される一方で、本発明の化合物の使用は、特別な解離法に制約されない。例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、ＳＩＤ、ＥＴＤ、ＥＣＤ、又はＵＶを同様に使用してよい。
【００１３】
当該技術分野では、質量分析計を異なるモードで操作し得ることが確立されている。モードは、質量分析計においてイオンによって獲得されるエネルギーによって区別することができる。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である分析物に関連すると、質量分析計を断片化モードと非断片化モードで操作することが可能である。非断片化モードにおいて、分析物は、本質的にインタクトなままであるが、このことは、断片化モードに当てはまらない。より高いエネルギーの使用により、分析物、特にペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、断片化するものである。所定の画分又は試料が断片化モードと非断片化モードで同時に解析されるように、この２種のモード間で速やかに転換するように質量分析計を操作してもよい。
【００１４】
先行技術では、ペプチドも断片化するエネルギーで断片化する同重体ラベルが提供されるが、このことは、本発明に当てはまらない。本発明は、より低いエネルギーで、及び／又はより高い変換率で断片化する、第一の側面の部分（ｂ）を提供する。結果として、本発明の第一の側面に準拠した化合物は、新しい選択肢、即ち、部分（ｂ）だけが断片化してペプチドは断片化しないエネルギーで質量分析計を操作すること、及び／又は部分（ｂ）がペプチドより高い変換率で断片化するようにそれを操作することを提供する。後者の機能要件に準拠すると、所定エネルギーでのペプチドフラグメンテーションは、完全に非存在である必要はないと理解される。むしろ、重要であるのは、部分（ｂ）が所定エネルギーで、より高い変換率で断片化することである。閾値については、下記にさらに定義される。明らかに、十分に高いエネルギーでは、部分（ｂ）とペプチドがともに同等で高い度合いまで断片化するものである。
【００１５】
好ましい態様において、上記に言及したペプチドの断片化は、ペプチド骨格の断片化である。「ペプチド骨格」という用語は、その技術確立された意味を有する。それは、αアミノ基の窒素原子、α炭素原子、及び所定ペプチドの各構成アミノ酸のα炭素原子へ直接結合したカルボニル基の炭素原子によって形成される共有結合鎖を意味する。
【００１６】
「より高い変換率」という用語は、好ましくは、ペプチドと比較して少なくとも２倍以上、好ましくは、ペプチドと比較して少なくとも３倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍以上断片化される部分（ｂ）に関連する。好ましくは、これらの倍率変化値は、化合物フラグメンテーションの最適エネルギーに適用される。好ましくは、化合物フラグメンテーションについての前記最適エネルギーは、２２以下の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）においてである。
【００１７】
さらに注記すべきは、部分（ｂ）が単一の一定部位で断片化することである。フラグメンテーションにより、第一部分と第二部分が生じる。第一の側面の化合物の低エネルギーフラグメンテーション及び／又は高変換特性のある化合物について、先行技術では、記載することも示唆することもされていないが、我々は、言及した第一部分と第二部分が技術確立された同重体ラベリング化合物のレポーター部分とバランス部分に対応することに注記している。
【００１８】
第一部分が解放されるのに対し、第二部分は、ペプチドへ結合したままである。第二部分とペプチドからなる分子又はイオンは、相補的部分、相補的分子、又は相補的イオンとも呼ばれる。
【００１９】
本発明による化合物は、結合したペプチドを本質的にそのままにしておく条件の下で、それらのフラグメンテーションを可能にしながらの高い変換率を特徴とする。「変換」という用語は、本明細書において、フラグメンテーションと同等であるとして使用される。本発明による化合物の変換は、上記に概説したような技術確立されたタンデム質量タグ（ＴＭＴ）のそれより少なくとも５倍高いか又は少なくとも１０倍高い。好ましくは、これらの倍率変化値は、化合物フラグメンテーションの最適エネルギーに適用される。好ましくは、前記化合物フラグメンテーションの最適エネルギーは、２２以下の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）でのものである。開示の実施例において、対応するデータを示す。
【００２０】
１つ以上の部位で断片化する、例えば、２つの部位で断片化するＤＳＳＯ又はＴＭＴのような、さらに技術確立された質量タグがある。本発明の部分（ｂ）は、それが１つの部位で効率的に断片化するという点で、それらから識別される。
【００２１】
本発明の化合物は、それらが同位体標識される（詳細については、さらに下記を参照のこと）場合、同重体質量タグとして使用することができる。最新の質量タグは、上記に考察したように、分析物（分析物は、好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質である）の定量と同定を同時に提供する。本発明の第一の側面に準拠した化合物のフラグメンテーション特性により、質量分析法の上記２つの側面のもつれを解くことができる。特に、本発明の化合物の断片化をもたらすが、結合されたペプチド分析物は断片化しないエネルギーを選択することによって、分析物のさらなる断片化が起こらないか又はほとんど起こらない間に、定量を実施することができる。このことは、例えば、分析物の本性がすでにわかっている、及び／又は分析物のフラグメントが定量に否定的に干渉する状況の下で、有利である。
【００２２】
第一の側面に準拠した化合物は、好ましい態様において同位体標識される一方で、同位体標識されなくてもよい。第一の側面に準拠した化合物の非同位体標識型も、明瞭な利点を与える。例えば、それは、目的のペプチドについてのＭＳベースの濃縮又は単離の方法を提供する。例を挙げると、目的のペプチドがシステイン残基を含有するものである場合である。システインは、反応性のスルフヒドリル基を含有する。第一の側面に準拠した化合物は、前記スルフヒドリル基と反応する反応部分を備えてよい。前記スルフヒドリル基と反応するそのような反応部分の例は、ヨードアセトアミドである。本発明のそのような化合物へ共有結合で結合しているシステイン含有ペプチドが質量分析計において第一の側面に準拠した化合物だけが断片化するエネルギーで断片化されると、相補的フラグメントが得られるが、この相補的フラグメントは、該ペプチドを含有するが、第一の側面に準拠した化合物の第一部分は含有しない。換言すると、第一の側面に準拠した化合物のフラグメンテーション挙動によって、システインを有して、第一の側面に準拠した化合物をそれへ結合させるすべてのペプチドは、同一の分子量を失うことになる。そのような特性は、第一の側面に準拠した非標識型の化合物によって付与されて、単離及び濃縮の目的のために利用することが可能であり、この場合は、目的の各ペプチドの生化学的な濃縮又は単離が不要となる。下記にさらに詳述される本発明の側面は、第一の側面に準拠した非標識化合物の上記タイプの応用に関する。
【００２３】
第一の側面に準拠した部分（ｂ）の断片化時に生成される第一部分と第二部分は、同一でないと理解される。前記部分（ｂ）は、対称的に断片化しないし、それは、対称的な分子でもない。さらに、第一の側面に準拠した化合物を全体として考慮すれば、単一の反応部分だけが存在することが少なくとも好ましい。前記単一の反応部分は、前記第二部分である部分（ｂ）のその部分へ共有結合で結合する。それによってのみ、該化合物がそのペプチド結合型で断片化するときに、相補的フラグメントが生成されて、その相補的フラグメントが分析物（前記ペプチドである）と前記第二部分を含むか又は好ましくはそれらからなることが確実になるのである。
【００２４】
さらに、少なくとも好ましい態様では、第一の側面に準拠した前記化合物が単一の部分（ｂ）を含むと理解される。
第一の側面の項目（ｂ）（ｉｉ）では、ペプチドへ結合した場合の化合物のフラグメンテーションにより２つのフラグメントが生じると定義されているが、第一の側面に準拠した化合物は、ペプチドへ結合していない場合でも、部分（ｂ）内の単一部位で断片化するものであると理解されたい。その非ペプチド結合型での部分（ａ）（即ち、反応部分）のフラグメンテーション挙動に関して言えば、それは、ある特定の応用のために選択される特別な反応部分に左右されるものである。もっとも、そのことは本発明に特に関連しない。重要であるのは、部分（ｂ）が上記に注記したような単一部位で断片化することである。
【００２５】
第一の側面の項目（ｉｉ）に述べられるような「（ｉ）による前記エネルギー」は、（有意な）ペプチドフラグメンテーションの閾値未満のエネルギーを意味すると理解される。さらに、「より高い変換率」は、統計学的に有意により高い変換率を意味すると理解される。好ましくは、統計学的に有意により高い変換率は、約２２までの正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ：下記参照）で起こる。
【００２６】
第一の側面の化合物の好ましい態様において、（ａ）前記化合物は、前記反応基を介してペプチドへ結合した場合、約１７、約１９、約２１、又は約２３の正規化ＨＣＤ衝突エネルギーで、それぞれ約３５％、約５５％、約７５％、又は約９０％のメジアン変換率で断片化する；及び／又は（ｂ）前記単一部位以外の部位でのフラグメンテーションは、（ａ）に準拠したエネルギーで、２０％未満、好ましくは１０％未満である。
【００２７】
第一の側面の化合物のさらに好ましい態様において、（ａ）前記化合物は、前記反応基を介してペプチドへ結合した場合、約１２、約１４、約１６、約１８、又は約２０以上の正規化ＨＣＤ衝突エネルギーで、それぞれ約３０％、約４５％、約６５％、約７５％、又は８５％以上のメジアン変換率で断片化する。
【００２８】
上記に注記したように、「変換」と「フラグメンテーション」は、本明細書において同等に使用される。例えば、３０％の変換率とは、該化合物の３０％が断片化された一方で７０％がインタクトなままであることを意味する。化合物フラグメンテーション（化合物変換とも呼ばれる）の百分率は、ペプチド結合性レポーターイオン（非断片化ペプチドへ結合した断片化化合物）の強度をインタクト化合物と断片化化合物にある前駆イオン（非断片化ペプチド）の総計強度で割ることによって計算される。
【００２９】
「ＨＣＤ」という略語は、技術確立されていて、高エネルギー衝突解離を意味する。実際問題として、化合物を断片化するのに必要とされるエネルギーは、前記化合物の質量と電荷に依存する。衝突エネルギー（ＣＥ）の均一な尺度を有するために、正規化衝突エネルギーという概念が導入されてきた。絶対衝突エネルギーは、正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）より、以下のように計算することができる：
【００３０】
【化１】
2019536026.tif 000002
【００３１】
［式中、ｍは、考慮下の化合物の質量であって、ｚは、その電荷である］。絶対衝突エネルギーが可変であって、電荷と質量に依存するのに対し、ＮＣＥは、各イオンでいつでも同じ値である；例えば、Neta et al., Journal of the American Society for Mass Spectrometry 20, 469-476 (2009) を参照のこと。
【００３２】
好ましくは、上記に定義された正規化衝突エネルギーは、Thermo Fisher 製の Q exactive（精密）質量分析計で決定される。他の機器でも、同様に正規化されるエネルギーを使用してよい。
【００３３】
上記より、本発明の化合物には、ペプチド骨格より低いエネルギーで断片化するという特徴があることが明らかである。当業者には、フラグメンテーションが、一般に、エネルギー増加時の瞬間的な開始を特徴としないプロセスであることが理解されよう。むしろ、所定のＮＣＥで完全に断片化する分子のフラグメンテーションは、ある程度まで、所定値より低いエネルギーでも起こり得るのである。例えば、ペプチド骨格の有意なフラグメンテーションは、２７以上のＮＣＥ値で起こるが、より低いエネルギーでも、有意に低い度合いまでは、起こり得る。本発明の目的にとって重要であるのは、ペプチドの骨格が本質的にインタクトなままである間に本化合物の選好的なフラグメンテーションが起こるという条件が存在することである。このことが当てはまる典型的なＮＣＥ値は、５と２２の間、好ましくは１０と２２の間のＮＣＥである。これらは、ペプチド骨格のフラグメンテーションに比較した場合に、本化合物のフラグメンテーションが統計学的に有意に高い程度で起こるエネルギーである。一方を本化合物のフラグメンテーション率として他方をペプチド骨格のフラグメンテーション率とする両者間の統計学的有意差という概念を受け入れると、以下のように定義されるΔＮＣＥ：（ペプチド骨格が少なくとも３０％断片化される）ＮＣＥ−（本発明に準拠した分子が少なくとも３０％断片化される）ＮＣＥという変数を導入することができる（化合物フラグメンテーションの定義については、上記８頁を参照のこと）。この値は、本発明に準拠した分子では、正数である。ＴＭＴのような先行技術の同重体タグでは、それが負数又は０である。
【００３４】
ペプチド骨格フラグメンテーション（ペプチド骨格変換とも呼ばれる）の百分率は、すべてのフラグメントイオン（インタクト化合物と断片化化合物のｂイオンとｙイオン）の合計をペプチドフラグメントイオンとペプチド前駆イオンの総計強度（インタクト化合物と断片化化合物のｂ及びｙイオンと前駆イオンの総計強度）で割ることによって計算される。
【００３５】
さらに好ましい態様では、前記化合物が同位体標識されて、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の同位体標識原子を含み、同位体標識原子は、好ましくは、１３Ｃ及び／又は１５Ｎである。
【００３６】
第一の側面に準拠した化合物の同位体標識型は、同重体質量タグとして有用である。本明細書の序論部分で概説したような、同重体質量タグについての確立された概念に一致して、同位体標識質量タグは、典型的には、２種以上の異なる標識型で提供されて、ここで全質量は、いつでも同じである。複数の異なる同位体標識化合物があって、前記化合物は、同じ構造を有して、本発明の好ましいキットを構成する。
【００３７】
全質量が同一である一方で、標識化スキームは、第一部分と第二部分の質量の変動を許容するやり方で選択される。所定のラベリングスキーム下で同じ全質量を有する、様々に標識される可能な化合物の最大数は、所定のラベリングパターンによって提供可能な最大度の多重化（multiplexing）を決定する。単純な例を挙げると、第一の側面に準拠した化合物は、第一部分に、標識され得る正確に１つの位置が存在して、第二部分にも、標識され得る正確に１つの位置が存在するように設計され得る。ラベリングは、例えば、１３Ｃラベリングであり得る。部分（ｂ）に正確に１つの１３Ｃ標識があるならば、このことは２通りのやり方で、即ち、第一部分中の言及位置を標識することによるか又は第二部分中の言及位置を標識することによって実行され得る。これにより、質量は同一であるが、部分（ｂ）のフラグメンテーション時に識別可能なシグナルを生じる２種の同重体質量タグが生じる。
【００３８】
第一及び／又は第二部分がラベリングに適用可能な１より多い位置を含有する事例では、より高度の多重化が可能である。
さらに好ましい態様では、前記化合物が同位体標識されない。
【００３９】
構造上の条件では、前記化合物が式（Ｉ）：
−Ｘ−ＣＨ２−（Ｙ）ｎ−Ｚ−      （Ｉ）
［式中：
Ｘは、ＳＣＨ３、ＳＯ、又はＳＯ２であり；Ｙは、ＣＨ２、ＮＨ、又はＯであり（但し、（Ｙ）ｎは、ＮＨとＯより選択される０又は１つの基を含む）；ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、又は８、好ましくは０又は１であり；そしてＺは、ＣＨＡ−Ｙ又はＣＨ２−ＣＯであり、ここでＡは、電子吸引基、好ましくはＮＯ２、又はＦのようなハロゲンである］の部分を含むことが好ましく、ここで前記部分は、−ＳＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−である。
【００４０】
前記化合物が式（Ｉ）の部分を含むとすると、その（完全な）化合物では、ＸとＺ上の自由原子価が飽和していると理解される。
前記式（Ｉ）内にある、（Ｘ）と隣接ＣＨ２基の間の結合は、そこでフラグメンテーションが起こる、上記に言及したような単一部位である。重要にも、前記結合は、ペプチド結合ではない。先行技術の同重体タグでは、断片化部位としてペプチド結合が頻繁に使用される。それ故に、先行技術の同重体タグでは、分析物をインタクトにしたままでのタグの選択的フラグメンテーションをもたらさない。それとは著しく異なって、本発明は、ペプチド結合よりフラグメンテーションを受けやすい化合物を提供する。他方で、断片化されることになる本発明の化合物中の結合は、さほど脆いわけでもない。さらに説明すると、ごく脆い結合の場合は、フラグメンテーションがイオン化のプロセスの間にすでに起きてしまうので、それは望ましいことではない。かくして、本発明の化合物は、一方で分析物（特にペプチド）より低いエネルギーで断片化するタグを使用することの利点を認識することと、イオン化相で生じ得る関連のフラグメンテーションを回避することの間で均衡をはかるものである。関連のフラグメンテーションが起こるとみなされるのは、本発明の化合物の５％より多くがイオン化相の間に断片化する場合であろう。
【００４１】
式（Ｉ）に図示していない部分は、式（Ｉ）中のＸ−ＣＨ２結合より高いエネルギーで断片化する。
Ｘは、ＳＯであることが特に好ましい。
【００４２】
Ｙは、ＣＨ２であることが特に好ましい。
ｎは、０であることが特に好ましい。
Ｚは、ＣＨ２−ＣＯであることが特に好ましい。
【００４３】
Ｘは、本発明の化合物の対称中心を規定するものではない。
式（Ｉ）中の原子、好ましくはＣ原子とＮ原子は、同位体標識することができる。
さらに好ましい態様では、前記反応基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；アジド類（フェニルアジド及びニトロフェニルアジドのようなアリールアジド類が含まれる）；ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル類；ソラレン；ジアジリン類；ホスフィン類；アセトアミド類（ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、及びクロロアセトアミドのような）；ヨード酢酸；マレイミド；チオスルホネート；ビニルスルホネート；ピリジルジチオール；アルキン類；イミドエステル類；ジフルオロアリールのようなハロゲン化アリール；ヒドラジド類；アルコキシアミン類；カルボジイミド類；イソシアネート、及びグリオキサールより選択される。
【００４４】
特に好ましいのは、ＮＨＳである。
さらなる反応基は、当業者の自由裁量であって、標的指向される、目的の所定ペプチド内の官能基に基づいて選択することができる；例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques（ISBN: 978-0-12-382239-0）を参照のこと。標的指向され得るペプチド中の官能基は、Ｎ末端のアミノ基と塩基性アミノ酸中のアミノ基、システインのスルフヒドリル基、セリン、スレオニン、及びチロシンのヒドロキシル基、並びにアスパラギン酸とグルタミン酸の側鎖カルボキシレートを含む。
【００４５】
第一の側面に関連するが、別の異なる第二の側面において、本発明は、好ましくは、先行の請求項のいずれかの化合物［前記化合物は、式（ＩＩ）：
Ｂ１−式（Ｉ）−Ｂ２−Ｄ      （ＩＩ）
（式中、Ｂ１とＢ２は、好ましくはＣ原子での多重化同位体標識、好ましくはＣ原子での多重化同位体ラベリングに適した部分であり；Ｄは、第一の側面に関連して定義されるような反応部分である）を有する］、又はその塩又は溶媒和物、又は適用可能な場合、その互変異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、又は混合物を提供する。
【００４６】
反応部分Ｄは、Ｂ２だけに連結することが明らかである。少なくとも好ましい態様において、Ｂ１は、どの反応部分も含まない。
多重化同位体ラベリングの概念については、本明細書の上記に説明されている。従って、部分Ｂ１と部分Ｂ２のいずれか一方が差次的同位体ラベリングに適している少なくとも１個の原子を含有すると理解される。差次的同位体ラベリングの例は、ある同位体標識型の所定位置に１３Ｃが存在して、別の同位体標識型の所定位置に１２Ｃ（またあるいは、天然の同位体分布）が存在することである。
【００４７】
１３Ｃは、炭素原子の好ましい同位体標識型である。あるいは、又はさらに、窒素原子も、それらが部分Ｂ１と部分Ｂ２に存在する場合は、同位体標識され得る。窒素に好ましい同位体標識は、１５Ｎである。
【００４８】
第二の側面に準拠した化合物の好ましい態様では、Ｂ１が、式（ＩＩＩａ）又は式（ＩＩＩｂ）：
Ｈ３Ｃ−（Ｙ）ｍ−Ｅ−（Ｙ）ｐ      （ＩＩＩａ）
Ｋ−ＣＨ２−（Ｙ）ｍ−Ｅ−（Ｙ）ｐ      （ＩＩＩｂ）
［式中：Ｅは、Ｏ−ＣＯ、Ｓ−ＣＯ、Ｏ−ＣＳ、Ｓ−ＣＳ、（ＣＨ２）２、又はＮＨ−ＣＯであり；Ｙは、式（Ｉ）に関連して定義されるか又はＣＨ（ＣＨ３）であり；ｍは、１、２、又は３であり；そしてｐは、１、２、又は３であり；Ｋは、濃縮部分である］によって定義され（ここで好ましくは、Ｂ１は、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨ３−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２、又はＣＨ３−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２である）；及び／又は
Ｂ２が、式（ＩＶａ）、式（ＩＶｂ）又は、式（ＩＶｃ）：
ＮＲ１−（ＣＨ２）ｑ−Ｇ      （ＩＶａ）
ＣＨＲ１−（ＣＨ２）ｑ−Ｇ      （ＩＶｂ）
ＯＲ１−（ＣＨ２）ｑ−Ｇ      （ＩＶｃ）
［式中：Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はシクロペンチル及びシクロヘキシルのようなシクロアルキルであり；Ｇは、求められる場合、Ｂ２を前記反応基Ｄへ連結するための官能基であり；ｑは、１、２、３、４、５、６、７、又は８、好ましくは１である］によって定義され、ここで好ましくは、Ｂ２は、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯである。
【００４９】
Ｂ１は、濃縮部分Ｋを含んでもよい。このことは、式（ＩＩＩｂ）のように示される。
Ｅは、Ｏ−ＣＯであることが特に好ましい。
ｍは、１であることが特に好ましい。
【００５０】
ｐは、１であることが特に好ましい。
上記に注記したように、部分Ｂ２は、反応基Ｄへ連結し、さらに基Ｄは、ペプチドのアミノ酸中の官能基へ結合するように設計される。前記反応基Ｄの特別な設計に依存して、この反応基Ｄを部分Ｂ２へ連結することをもたらす連結基Ｇがあることは、有利であるか又は必要であり得る。例を挙げると、反応基ＤがＮＨＳである場合、連結させるための官能基、即ち、基Ｇは、ＣＯである。ＮＨＳのヒドロキシ基が前記ＣＯへ結合すると、活性エステルが生成される；例えば、下記の式（Ｖ）を参照のこと。
【００５１】
Ｒ１は、Ｈであることが特に好ましい。
ｑは、１であることが特に好ましい。
特に好ましいのは、式（ＩＶａ）である。
【００５２】
さらに好ましい態様では、前記化合物が（ａ）同位体標識されていて、ここで同位体標識は、Ｂ１、式（Ｉ）、及びＢ２の１以上又はすべてに存在し；及び／又は（ｂ）式（Ｖａ）又は式（Ｖｂ）：
【００５３】
【化２】
2019536026.tif 000003
【００５４】
［式中：Ｒ２は、水素、又はハロゲン、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４Ｒ５＋、又はＮＯ２のような電子吸引基であり、ここでＲ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又はＣ２〜Ｃ６アルキニルであり；
Ｊは、同位体ラベリングに適して、Ｃと場合によってはＮ及び／又はＯを含有する部分であり；好ましくは置換又は未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又は置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、ここで１又は２個の炭素原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、及びＰより選択されるヘテロ原子、ＯＨ、ハロゲン、メチル、及びメトキシが含まれる置換基で置き換えてよく；Ｊは、最も好ましくは、Ｈ３Ｃ−（ＣＨ２）ｒ−Ｏ、Ｈ３Ｃ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ、Ｈ３Ｃ−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ、又はＨ３Ｃ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨであり；
ｎは、０と１９の間の整数、好ましくは１であり；そして
ｒは、０と２０の間の整数、好ましくは１である］；
【００５５】
【化３】
2019536026.tif 000004
【００５６】
［式中：Ｒ２は、ハロゲン、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４Ｒ５＋、又はＮＯ２のような電子吸引基であり、ここでＲ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又はＣ２〜Ｃ６アルキニルであり；
ｒとｔは、独立して、１と２０の間の整数である］を有する。
【００５７】
特に好ましい態様では、式（Ｖａ）が式（Ｖａ１）：
【００５８】
【化４】
2019536026.tif 000005
【００５９】
［式中、ｒは、０と２０の間の整数であり；そして
ｓは、０と１９の間の整数である］によって実行される。
特に好ましい態様では、式（Ｖｂ）が式（Ｖｂ１）：
【００６０】
【化５】
2019536026.tif 000006
【００６１】
［式中、ｒとｔは、独立して、１と２０の間の整数であって、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、上記に定義される通りである］によって実行される。
式（Ｖａ１）に関しては、ｓ＝ｒ−１であることが好ましい。このことは、ラベリングに適した同数のＣ原子がフラグメンテーション部位の両側にあることを可能にする。
【００６２】
好ましい態様では、ｒ＝２であってｓ＝１である（これは、式（Ｖａ３）の化合物に該当する）、又はｒ＝４であってｓ＝３である（式（Ｖａ２）の化合物）。この要件に合致する分子を式（Ｖａ２）と式（Ｖａ３）に示す。数字は、フラグメンテーション部位の両側でのラベリングに適したＣ原子を示す。
【００６３】
【化６】
2019536026.tif 000007
【００６４】
式（Ｖａ２）の化合物では、多重化ラベリング、即ち、８重化（8-plexing）が可能であって、式（Ｖａ３）の化合物では、６重化が可能である。
式（Ｖａ）を実行するさらに好ましい分子は：
【００６５】
【化７】
2019536026.tif 000008
【００６６】
である。
同様に、式（Ｖａ１）において、ｒ＝１でｓ＝０であれば５重化、ｒ＝２でｓ＝１であれば６重化、そしてｒ＝３でｓ＝２であれば７重化が可能である。
【００６７】
式（Ｖｂ）に関しては、ｒ＝ｔであることが好ましい。このことは、ラベリングに適した同数のＣ原子がフラグメンテーション部位の両側にあることを可能にする。好ましい態様では、ｒ＝ｔ＝４である。
【００６８】
上記に注記したように、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、置換又は未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはシクロアルキル、置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル若しくはシクロアルケニル、又は置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルである。好ましい置換基は、ＯＨ、ハロゲン、メチル、及びメトキシである。Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝メチルであることが好ましい。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち２つが一緒にＯ又はＳであってよい。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の３個目は、Ｏ又はＳであってよい。例えば、ＮＲ３Ｒ４Ｒ５は、ＮＯ２であってよい。
【００６９】
式（Ｖｂ）の好ましい態様を下記に示す。
【００７０】
【化８】
2019536026.tif 000009
【００７１】
式（Ｖａ）のさらに好ましい化合物は、式（Ｖａ７）：
【００７２】
【化９】
2019536026.tif 000010
【００７３】
の化合物である。
式（Ｖａ）のさらに特に好ましい化合物は：
【００７４】
【化１０】
2019536026.tif 000011
【００７５】
である。
式（Ｖａ）のＮＨＳ含有化合物のペプチド（前記ペプチドは、アミノ基ＮＨ２を保有する）へのカップリングを、式（Ｖａ７）の化合物についての以下のスキームに例示する：
【００７６】
【化１１】
2019536026.tif 000012
【００７７】
本発明に準拠した化合物のさらに好ましい態様では、前記第一部分が帯電していない。換言すると、化合物−ペプチドコンジュゲートが開裂して第一部分と第二部分を生じる時には、中性損失が起こって、前記コンジュゲートに元は存在した電荷は、分析物を含むフラグメントである第二部分上にその全体が残存する。結果として、分析物を含んでなるイオンのｍ／ｚは、フラグメンテーション時に不変のままである。このことが有利であるのは、分析物のイオンが、高い分解能及び／又は高い正確度を概して特徴とするスペクトルの部分（低位のｍ／ｚ範囲）に出現することになるからである。特に、より高い荷電状態がフラグメンテーション時に維持されるので、先行技術に比べて感度が増加する。
【００７８】
第三の側面において、本発明は、第一及び／又は第二の側面に準拠して定義されるような複数の化合物を含んでなるか又はそれらからなるキットを提供し、ここで（ａ）前記化合物は、化学的に同一であって、異なって同位体標識されている；又は（ｂ）前記化合物は、化学的に異なっていて、同位体標識されていない。
【００７９】
この側面は、異なる２タイプのキットに関する。項目（ａ）に準拠したキットが同重体ラベリングのためにに設計される一方で、項目（ｂ）に準拠したキットは、下記にさらに詳述される、一定質量損失（loss-of-a-constant-mass）応用のために設計される。
【００８０】
項目（ａ）に関連すると、差次的に標識されるすべての可能な型がキットに含まれることが好ましい。
項目（ａ）にまた関連すると、前記第二部分及び／又は第二コンジュゲートの上記に開示された定常部分がそれらの精密質量に関して、そして場合によってはそれらの整数質量に関して異なることが好ましい。「整数質量」という用語は、化合物に含まれる質量数の総和を意味する。「精密質量」という用語は、統一原子量単位（ｕ）での化合物の実際の（通常は非整数の）質量を意味する。本発明に準拠したキットに含まれる化合物の第二部分がその精密質量に関して、そして場合によってはそれらの整数質量に関して互いに異なるならば、第一部分もまたそれらの質量において異なるはずであると理解される。
【００８１】
一般的に言えば、第二部分の定常部分がそれらの整数質量に関して異なるキットが優先されよう。しかしながら、ある事例では、例えば、多重化の度合いを高める目的のために、前記化合物のある対又はサブセットについて、第二部分の定常部分の間で、精密質量に関してのみ違いがあって、整数質量に関しては違いが無い化合物を本発明のキットに含めることが望ましい。
【００８２】
項目（ｂ）に関しては、アミノ基へ結合させるために設計される反応部分を第一化合物が含み、スルフヒドリル基へ結合させるために設計される反応部分を第二化合物が含む、等のように前記複数の化合物を選択してよい。
【００８３】
いずれの場合でも、前記キットは、説明書付きのマニュアルを含み得る。項目（ａ）の場合、前記説明書は、同重体質量タグを使用する定量的質量分析法を実施する方法に関し得る。項目（ｂ）の場合、マニュアルは、一定質量損失に基づく方法を実施するための説明書を提供し得る。その点では、下記にさらに開示されるような本発明の方法についてマニュアルが記載することが好ましい。
【００８４】
第四の側面において、本発明は、（ａ）第一又は第二の側面に準拠して定義されるような１以上の化合物を担うペプチド；及び（ｂ）上記に定義されるような式（Ｉ）中のＸとＣＨ２の間の結合を断片化することによって（ａ）の化合物（複数）より入手される１以上の相補的部分より選択される第二化合物を提供し、ここで前記相補的部分（単数又は複数）は、前記ペプチドと第二部分からなるか又はそれらを含む。
【００８５】
この側面の項目（ａ）は、第一又は第二の側面に準拠した化合物のペプチド結合型に関する。項目（ｂ）は、（ａ）のフラグメンテーション生成物に関する。
好ましい態様では、前記第二化合物に含まれる前記ペプチドがタンパク質のタンパク分解消化によって入手されて、好ましくは、トリプシン消化ペプチドである。
【００８６】
さらに好ましい態様では、前記ペプチドと前記第二化合物がイオン化されている。
前記ペプチドがイオン化されている、第二化合物の好ましい態様において、前記ペプチドの電荷は、少なくとも２である。
【００８７】
第五の側面において、本発明は、第二化合物のライブラリーを提供し、前記第二化合物は、本明細書の上記に定義されている。
前記ライブラリーの好ましい態様では、（ａ）前記ライブラリーが第二化合物を含むか又はそれからなり、前記第二化合物は、１つのタンパク質又は複数のタンパク質より、タンパク分解消化、好ましくはトリプシン消化によって入手される複数のペプチド、又は好ましくはそのすべてのペプチドを含んでなる；及び／又は（ｂ）第一又は第二の側面の所定化合物についてのすべての可能な化学的に同一で異なって同位体標識される化合物、又は対応する第二部分がそれぞれ、前記第二化合物に含まれる。
【００８８】
本発明に準拠した第二化合物が、第一又は第二の側面の化合物へ結合したペプチドであっても、それから入手される相補的部分であってもよいことに注目すると、第五の側面に準拠したライブラリーも、一方又は両方のタイプの第二化合物を含み得るか又はそれからなり得ると理解される。
【００８９】
第六の側面において、本発明は、第一部分を提供し、前記第一部分は、上記に定義されるような式（ＩＩ）の化合物より、式（Ｉ）中のＸとＣＨ２の間の結合を断片化することによって入手され、ここで前記第一部分は、Ｂ１を含む。前記第一部分は、それが帯電していれば、ＭＳによって検出可能であろう。しかしながら、上記に注記したように、前記第一部分は、好ましくは、非電荷である。
【００９０】
それに関連して、本発明は、第七の側面において、第六の側面に準拠して定義されるような、複数の異なって同位体標識される第一部分を提供する。
第六の側面と第七の側面は、第四の側面、特にその項目（ｂ）に準拠した第二化合物と第五の側面に準拠した第二化合物のライブラリーに対して相補的であると見ることができる（再び、前記第二化合物が第四の側面の項目（ｂ）に準拠した第二化合物である場合）。換言すると、言及した単一部位で断片化が起こる場合には、第一部分と第二化合物（第四の側面の項目（ｂ）に準拠した）が創出される。
【００９１】
第八の側面において、本発明は、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような化合物、又は第三の側面の項目（ａ）に準拠したキットの同重体ラベリングへの使用を提供する。
【００９２】
同重体ラベリングという概念それ自体は、技術確立されていて、本明細書において上記で考察した。同重体ラベリングは、多重化を可能にする。本発明の好ましい化合物に関連した多重化のより具体的な考察を上記に提供している。
【００９３】
第九の側面において、本発明は、質量分析法のための試料調製の方法を提供し、前記試料は、タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドを含んでなり、そして前記方法は：（ａ）有っても無くてもよい、前記試料の、好ましくはトリプシンでのタンパク分解消化；及び（ｂ）前記タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチド、又は工程（ａ）が実施される場合は、工程（ａ）において入手されるペプチドを、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような化合物と反応させる工程を含んでなる。
【００９４】
前記方法の好ましい側面において、該方法は、（ｃ）少なくとも１つのさらなる試料について、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような化合物で第九の側面の前記方法を反復する工程をさらに含み、この化合物は、工程（ｂ）において使用される化合物と比較すると、それと化学的に同一で、異なって同位体標識されている。「異なって同位体標識されている」という用語は、一方は第一試料、他方はさらなる試料のペプチドへ結合した化合物のフラグメンテーション時に、いずれの場合でもその定常部分がそれらの精密質量に関して、そしてさらには、それらの整数質量に関しても異なる場合がある（好ましくは、そのように異なる）第二部分が生成されることを示唆する。
【００９５】
第十の側面において、本発明は、定量的質量分析法の方法を提供し、前記方法は、第九の側面の方法と、（ｄ）（ｂ）と（ｃ）の成果をプールする工程；（ｅ）（ｄ）の成果の質量分析法を実施する工程を含んでなり、ここでは、第一部分及び／又は相補的部分のピーク強度が所定試料に含まれる所定ペプチドの量を示している。好ましくは、所定試料に含まれる所定ペプチドの量を決定する目的のために、相補的部分のピーク強度を使用する。このことは、異なる試料に由来するピークだけでなく、異なる分析物（即ち、所定試料内の異なるペプチド）もスペクトル中の異なるｍ／ｚ値で出現するので、有利である。これは、質量分析計において解析されるイオンが分析物をその一部として含むからである。これにより、本発明は、レポーター強度しかモニターされない先行技術の方法から区別される。
【００９６】
相補的部分を解析することのさらなる利点は、同時流出する分析物による干渉が有意に低下することである。レポーターイオンについて解析する先行技術の方法が一般に比圧縮（ratio compression）に悩まされるのに対し、このことは、本発明のアプローチにあてはまらない。「比圧縮」という用語は、２つの試料を比較するときに、所定分析物の相対存在量を全体的に過少評価することを意味する。
【００９７】
本発明の化合物を使用する、本発明のこの側面では、同重体ラベリングのアプローチを実行する。
好ましい態様では、好ましくは第一の側面に準拠して定義されるような値以下で正規化ＨＣＤ衝突エネルギーを使用することによって、断片化が第一の側面に準拠して定義される単一部位でのみ、又は実質的に単一部位でのみ起こるように、工程（ｅ）を実施する。
【００９８】
この態様は、第一と第二の側面に準拠した化合物の特性から利益を得る。特に、分析物の定量と分析物の同定のもつれが解かれる。質量分析計においてより低いエネルギーを使用することによって、本発明の化合物だけが断片化するがペプチド分析物は断片化しない、及び／又は該化合物は、ペプチド分析物より高い変換率で断片化する。これにより、本発明の開裂した化合物を含有する相補的ペプチドレポーターイオンのＭＳ２スキャンでのＭＳ２ベースの定量が可能になる。
【００９９】
第十の側面に関連して、本発明は、第十一の側面において、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような少なくとも１つの化合物の、タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドの質量分析法による定量への使用を提供する。
【０１００】
前記使用に準拠して、好ましくは、第一又は第二の側面の１以上の化合物を担うペプチドをイオン化して、選好的には、データ依存性取得法（ＴｏｐＸのような）で選択し、引き続き約２３未満、約２１未満、約１９未満、又は約１７未満のＮＣＥで断片化して、前記ペプチドと開裂した本発明の化合物を含んでなる相補的レポーターイオンをＭＳ２スキャンにおいて定量する。
【０１０１】
前記使用の好ましい態様では、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような２以上の化合物が使用されて、ここで該化合物は、化学的に同一であって異なって同位体標識される。
【０１０２】
さらに好ましい態様では、前記使用が、前記タンパク質、前記ポリペプチド、及び／又は前記ペプチドの質量分析計における同定及び／又はフラグメンテーションに関与しない。
【０１０３】
第十二の側面において、本発明は、質量分析法におけるペプチドの単離工程又は濃縮工程への第一又は第二の側面の化合物の使用を提供し、前記単離する工程又は濃縮する工程は、好ましくは、中性損失及び／又は一定損失に基づく。
【０１０４】
上記に注記したように、本発明に準拠した化合物の断片化特性は、同位体ラベリングを必要としない（特に、差次的な同位体ラベリングスキームを必要としない）応用においても利用され得る。それとは反対に、上記に開示された使用である、そのような応用の１つでは、考慮下の分析物のそれぞれが本発明の化合物へ結合して、対応するコンジュゲートが低いエネルギーで断片化されるときに相補的イオンが生成され、ここでは、前記相補的イオンの質量がすべての事例において、それらが生成されるペプチド−化合物コンジュゲートより同じ質量だけ異なることが求められる。この同じ質量だけの差は、「一定損失」とも呼ばれる。しかしながら、このことは、本発明の化合物が第十二の側面に準拠して使用されるときに、同位体標識されることを排除するものではない。
【０１０５】
第十二の側面に関連して、本発明は、第十三の側面において、ペプチドを質量分析法で単離するか又は濃縮する方法を提供し、前記方法は：（ａ）第一又は第二の側面に準拠して定義されるような化合物とペプチドを反応させる工程；（ｂ）（ａ）の成果をイオン化する工程；（ｃ）（ｂ）において入手されるイオンをそれらのｍ／ｚ比に従って分離する工程；（ｄ）化合物を断片化するがペプチドは断片化しないエネルギーで、好ましくは、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような値以下で正規化ＨＣＤ衝突エネルギーを使用することによって、前記イオンを断片化する工程；（ｅ）（ｄ）において入手されるイオンをそれらのｍ／ｚ比に従って分離する工程；及び（ｆ）ＭＳ１スキャンに比較した場合にｍ／ｚのシフトを明示する（ｅ）のイオンを単離して（前記シフトは、第一又は第二の側面に準拠して定義されるような第一部分に対応する）、それによって前記ペプチドを単離する工程を含んでなる。
【０１０６】
工程（ｃ）は、通常は、「ＭＳ１スキャン」と呼ばれる。ＭＳ１スキャンの間は、フラグメンテーションが起こらない。工程（ｄ）に準拠した断片化は、技術確立された全イオンフラグメンテーション（ＡＩＦ）スキャンに類似しているが、第十二の側面に準拠して定義されるように、選択される正規化衝突エネルギーはより低くて、その帰結として、ペプチドは、断片化されないか又は実質的に断片化されない。工程（ｆ）において単離されるイオンは、フラグメンテーションのような、さらなる下流処理へ処すことが可能であって、前記フラグメンテーションは、一般に、「ＭＳ２スキャン」と呼ばれる。
【０１０７】
工程（ｆ）に準拠した前記単離工程は、例えば以下の好ましい態様に準拠して、質量分析計における前記イオンのあらゆる下流処理において目的の特定イオンへより多くの取得時間を投入することを可能にする。より多くの時間を投入することは、より良好な感度、及び／又はより高い取得速度を意味する。
【０１０８】
好ましい態様では、第十三の側面の前記方法が、工程（ｆ）の後に、（ｇ）ペプチドを断片化する工程；及び（ｈ）（ｇ）の成果をｍ／ｚ比に従って分離して、それによって前記ペプチドを同定する工程をさらに含む。
【０１０９】
この好ましい態様は、ＭＳ２スキャンである。有利にも、本発明の第十三の側面は、ＭＳ３スキャンを必要としない。
さらに好ましい態様では、前記方法が、工程（ａ）に先立って、（ａ’）タンパク質を含んでなる試料の（好ましくはトリプシンでの）タンパク分解消化によって、（ａ）の前記ペプチドを入手する工程をさらに含む。
【０１１０】
第十又は第十三の側面の方法のさらに好ましい態様では、イオンが単離される場合、そのような単離は、１２Ｃイオンだけが単離されるように実施される。
さらに、別の側面において、本発明は、質量分析計を操作する方法を提供し、前記方法は、イオンを単離する工程を含んでなり、ここで前記単離する工程は、１２Ｃイオンだけが単離されるように実施される。
【０１１１】
「１２Ｃイオン」という用語は、１２Ｃ原子である炭素原子だけを含有するイオンを指定する。
このこと（即ち、１２Ｃイオンだけが単離されるような単離）は、大抵の質量分析計の標準設定から逸脱する、熟慮された選択であると理解されたい。さらに説明すると、デフォルトによる質量分析計では、最も豊富なイオンが同位体クラスターより選択される。これは、１２Ｃ、１３Ｃ、又は１４Ｃ同位体であり得る。その機器によってなされる選択は、同位体のタイプに基づくのではなくて、単にその存在度に基づくのである。上記に開示した好ましい態様に準拠すると、存在度は、イオン選択を支配するパラメータとしては棄却される。むしろ、１２Ｃイオンだけが単離されることが実行されるのである。このことは、上記に考察した比圧縮を有意に抑制するか又は回避するためのさらなる手段となる。
【０１１２】
「同位体クラスター」という用語は、その技術確立された意味を有する。それは、単一の所定構造のある分子に属する、質量スペクトル中のピークの群又はクラスターを意味する。多数のピークが発現することの理由は、それぞれの単一分子中に、天然の同位体分布及び／又は意図的な同位体ラベリングの結果として、異なる同位体が存在することの結果である。
【０１１３】
好ましい態様では、単離ウィンドウを目的のモノアイソトピック（monoisotopic）イオンに中心化することによって、前記単離が実効される。
前記中心化は、前記単離ウィンドウの中心をより低いｍ／ｚ比の方向へ、好ましくは約０．０５Ｔｈと約０．５Ｔｈの間だけ、好ましくは約０．１Ｔｈだけ補正すること（offsetting）によって実効されることが好ましい。「Ｔｈ」は、ｍ／ｚスケールの共通単位であるトムソン（Thomson）を意味し、即ち、１Thomson＝１ａｍｕ／電荷である。
【０１１４】
さらに説明すると、機器デフォルトは、単離ウィンドウを選択される前駆イオンに集中させることになる。単離ウィンドウが一定のサイズを有するので、選択される前駆イオンのデフォルト対称下限公差と上限公差を使用する場合には、同時流出イオンの同時選択が起こり得て、多くの場合は、必然的に起こるものである。前記単離ウィンドウの前記一定のサイズは、一般的に０．４Ｔｈと２．０Ｔｈの間の範囲にある。典型的な値は、１．４Ｔｈである。本出願の出願日に利用可能な機器で可能な最小の単離ウィンドウは、約０．４Ｔｈである。
【０１１５】
それとは異なって、上記に開示した好ましい態様では、単離ウィンドウの中心を補正することが求められる。換言すると、デフォルト対称単離ウィンドウを非対称なものに置き換えるのである。「非対称」という用語は、単離ウィンドウが、好ましくはその形状と幅を変化させることなく、より低いｍ／ｚ比の方向へ好ましくは約０．０５Ｔｈと約０．５Ｔｈの間だけシフトされることを意味する。このことは、特に１より高い荷電状態のペプチドの、１３Ｃ標識イオンの同時単離を回避するさらなる手段である。結果として、１２Ｃフラグメントイオンだけが該部分のさらなる開裂によってＭＳ２スペクトルにおいて産生されて、第一の側面と第二の側面の１以上の化合物を担うペプチドの正確で低干渉の選択、並びにＭＳ２ベースの定量を可能にする。
【０１１６】
荷電状態２の場合は、例えば、ごく狭い単離ウィンドウにより、１３Ｃピークの同時単離が一部減少される可能性がある。しかしながら、単離ウィンドウのサイズを減少させることは、単離効率の減少をもたらすので、該イオンには、より長い注入時間と、それ故により多くの時間が必要とされる。この補正の利点は、ほとんどイオン損失が無いままでより大きなウィンドウを使用し得て、それでも１３Ｃピークの同時単離を回避し得ることである。
【０１１７】
上記に開示した特に好ましい態様では、質量分析計のデフォルト設定からの２種の逸脱：（ｉ）最も豊富なイオンではなくて、意図的に１２Ｃを単離することと、及び（ｉｉ）非対称な単離ウィンドウを使用することが一体になることを理解されたい。換言すると、１２Ｃイオンだけを単離することが、好ましくは、（ｉ）１２Ｃイオンを所定の同位体クラスター内で選択すること；及び（ｉｉ）非対称な単離ウィンドウを使用することによって実効される。
【０１１８】
さらに好ましい態様では、前記単離ウィンドウが約０．２Ｔｈと約０．４Ｔｈの間の幅を有する。
実施例７と図面７は、上記に考察したような質量分析計デフォルトの変更に関する態様を例示する。
【０１１９】
第十四の側面において、本発明は、質量分析法を実施する方法に関し、前記方法は：（ａ）本発明に準拠して定義されるような化合物とペプチドを反応させて、化合物−ペプチドコンジュゲートを入手する工程；（ｂ）（ａ）の成果をイオン化する工程；及び（ｃ）（ｉ）前記コンジュゲートが前記化合物内の単一部位で選好的に断片化するエネルギーで（ｂ）の成果を断片化する工程；及び（ｉｉ）前記化合物と前記ペプチドの両方を断片化するエネルギーで（ｂ）の成果を断片化する工程の一方又は両方を実施する工程（ここで（ｉ）と（ｉｉ）がともに実施される場合、それらは、同時的に又は任意の順序で連続的に実施される）を含んでなる。
【０１２０】
この方法は、本発明の化合物を使用するＭＳを対象とする。
工程（ｄ）が利用される場合、この側面は、ペプチドがインタクトである相補的イオンの同時解析を対象として、イオンは、第二部分の定常部分とペプチドのフラグメントを含んでなる。このことは、２つの断片化工程（ｃ）及び（ｄ）によって表される。いずれの場合も、工程（ｂ）において入手されるイオンを利用する。従って、工程（ｃ）では（ｂ）の成果の１分量が使用されて、工程（ｄ）では、好ましくは、工程（ｂ）の成果の別の分量が使用されると理解される。上記に示したような本発明のこの側面の規定では、エネルギーが関数用語で規定される。当業者は、有利にも低いエネルギーで断片化する本発明の化合物と本開示の教示を提供されたならば、どのくらいのエネルギーが工程（ｃ）に、そしてどのくらいのエネルギーが工程（ｄ）に適しているのかを即座に決定することができる。すでに述べたが、我々は、工程（ｃ）に好ましいＮＣＥが２２以下であることに注目している。工程（ｄ）に好ましいＮＣＥは、２７以上である。
【０１２１】
上記に開示した方法と第十一の側面の使用の好ましい態様では、前記使用の経過においてペプチド分析物の断片化が起こる場合、入手されたＭＳスペクトルは、スタッキング（stacking）を含んでなる後処理へ処される。前記後処理は、好ましくは、コンピュータで実行される。「スタッキング」という用語は、同じペプチドフラグメントに由来する全ピークの強度を合計することを意味する。さらに説明すると、（多重化の目的のために）差次的に標識される本発明の化合物の使用の故に、同じペプチドフラグメントに由来するがその質量が異なる、（別個のピークを生じる）複数のイオンが産生される。これらのイオンのピーク強度を合算する。これにより、より信頼度の高い同定が可能になる。
【０１２２】
好ましくは、前記「スタッキング」には、ＭＳスペクトルの表示の変更も関与する。特に、１つの特定のペプチドフラグメントに由来するすべてのイオンについて、各ペプチドフラグメントにつき１つのピークを、好ましくは該ペプチドフラグメントのｍ／ｚ値で、本発明の非断片化化合物とともに提示する。このピークの高さは、すべての重畳（stacked）ピークの合計である。
【０１２３】
好ましくは、スペクトルの表示における前記変更は、定量の後でなされる。この重畳ピークは、（改善された）同定に使用される。一般的に言って、定量と同定は、互いに独立していて、決まった順序で実施するに及ばない。
【０１２４】
ペプチドフラグメントの例は、ｂイオンとｙイオンである。「ペプチドフラグメント」という用語には、非断片化ペプチドも含めてよい。
所定のスタッキングでは、１つの特定のペプチドフラグメントに由来するピーク群だけを使用する。これらのピークを生じる分子種は、本発明の化合物に由来する部分に関してのみ異なっていて、その部分とは、非断片化化合物と、同位体ラベリングに関して異なる、第二部分の定常部分である。
【０１２５】
この側面の好ましい態様では、前記方法が、（ｄ）（ｃ）（ｉ）において入手されるフラグメントの量、及び／又は（ｃ）（ｉｉ）において入手されるフラグメントの量より、所定ペプチドの量を決定する工程の追加工程を含む。定量には、（ｃ）（ｉ）と（ｃ）（ｉｉ）の両方を実施することが好ましい。
【０１２６】
所定ペプチドの量は、（ｃ）（ｉ）において入手されるフラグメントと（ｃ）（ｉｉ）において入手されるフラグメントについて観測されて、所定ペプチド分子種に属するか又はそれらに由来するピーク強度のメジアン又は平均として、又はその加重メジアン又は平均として決定し得る。加重平均を使用する場合、そのピークがより正確であれば、好ましくは、より高いピークへより高い重みを付ける。また、信号雑音比が３未満のピークは、好ましくは無視される。本発明の化合物で入手されるＭＳデータの処理を改善する追加又は代替の手段は、以下の通りである。それぞれの定常部分（即ち、ペプチド分析物へ付いた本発明の化合物のフラグメント）により「チャネル（channel）」が規定される。それぞれのｂイオンとそれぞれのｙイオンがスペクトル中のクラスターを規定して、各チャネルには、複数のクラスターがある。あるクラスターが他のすべてから異なる強度分布を有するならば、前記異なる分布を明示するチャネルは、削除される。
【０１２７】
利点に関して言えば、我々は、本明細書の上記において、本発明の化合物が、同時流出するペプチドによる干渉の有意な低下を可能にすることに注目した。この好ましい態様は、干渉をさらに抑制するためのさらに追加の手段である。この好ましい態様によって、比圧縮の問題（これについては当該技術分野でよく知られていて、本明細書の上記に考察した）がさらに軽減される。特に、平均化は、正確度と精度を改善する。変動係数は、典型的には、少なくとも２５％低下する。最後に、これらの手段が無い場合はＭＳ３が必要になるかもしれないが、平均化を実施する多くの事例では、ＭＳ２で十分である。ＭＳ３は、さらに正確でない場合もあろう。ＭＳ３に対するペプチド結合性レポーターイオンの利益は、オービトラップ（orbitrap）検出器によるｍ／ｚ定量の分解能がＭＳ３のような四重極ベースの単離よりいつでも高いことである。
【０１２８】
第十五の側面において、本発明は、検出器を含んでなる質量分析計を操作する方法を提供し、前記検出器は、好ましくは Orbitrap 検出器であり、前記方法は、前記検出器におけるフラグメントイオンの解析の間に経過する時間において、１以上のさらなる前駆イオンを採取して断片化する工程を含んでなる。
【０１２９】
ある状況では、前駆イオンよりフラグメンテーションによって入手されるフラグメントイオンを検出器において解析するための時間が後続の前駆イオンを採取して断片化するのに必要とされる時間を超えてしまう。結果として、分光計の最新の配置を使用するとき、前駆体の単離及びフラグメンテーションに使用される、前記分光計に含まれるデバイスは、検出器がビジーである間、アイドルになる。オービトラップ解析機付きの Q Exactive 機器では、ペプチドの同定に十分なイオンを含有するＭＳ２スキャンを入手するのに１０５〜５ｘ１０５個のイオンが通常収集される。Q Exactive 機器では、先のフラグメンテーションスキャンのｍ／ｚがオービトラップにより解析される間に、前駆イオンが採取されて断片化される。フラグメントイオンのｍ／ｚをオービトラップにおいて解析するための時間が所望される分解能に左右される一方で、十分な前駆イオンを採取して断片化するのに必要とされる時間は、前駆イオンの存在度に左右される。故に、典型的には、オービトラップが先のスキャンを解析するのに依然としてビジーである間に、十分に豊富な前駆体に対して十分な前駆イオンを採取することができる。
【０１３０】
ＭＳ２スキャンの分解能が高いほど、（ほとんど質量差の無いピークを分解してから互いに識別し得るので）その質量精度はより高くて、同定と定量はより良好である。１つのＭＳ２スキャンにおいて一緒に解析される前駆体の数が多いほど、複雑なペプチド混合物において同定されるペプチド配列の数も多い。
【０１３１】
上記の側面は、有利にも、言及したアイドル時間を利用する（十分なイオンが採取されて断片化されるが、検出器は依然としてビジーである）。最新の配置を使用すると、このアイドル時間は、さらなるイオンを単離して断片化するのに使用されない。本発明では、このアイドル時間を使用して、第二の、そして時間が許せば、第三、第四、等の前駆イオンを単離して断片化する。それによって、同一のＭＳ２（フラグメンテーション）スキャンにおいて、多数の前駆イオンを読み出すことが可能である。複数の前駆体を採取することによって、より高い分解能でＭＳ２スキャンを実施することができる。あるいは、複数の前駆体を採取することによって、より多くの前駆体を、解析時間を延長することなく、同じ分解能で解析することができる。
【０１３２】
より多くの前駆体のＭＳ２スキャンを同じ分解能で実施する例を挙げると：
Q Exactive HF オービトラップ機器での標準法では、１０５個の前駆イオンを５５ｍｓ以内に採取してから断片化し、ｍ／ｚ  ２００で３０，０００の分解能で解析し、６４ｍｓの遷移時間を生じる。本発明の方法を使用すると、例えば、２種の異なる前駆イオン（それぞれ１０５個のイオン）を５５ｍｓ以内に採取し（例えば、各前駆体の１０５個のイオンを採取するには２５ｍｓで十分である）、そして引き続き断片化して、ｍ／ｚ  ２００で３０，０００の分解能で解析し、６４ｍｓの遷移時間を生じる。
【０１３３】
ＭＳ２スキャンをより高い分解能で実施する例を挙げると：
Q Exactive HF オービトラップ機器での標準法では、１０５個の前駆イオンを５５ｍｓ以内に採取してから断片化して、ｍ／ｚ  ２００で３０，０００の分解能で解析し、６４ｍｓの遷移時間を生じる。本発明の方法を使用すると、例えば、２種の異なる前駆イオン（それぞれ１０５個のイオン）を１１０ｍｓ以内に採取し（各前駆体の１０５個のイオンを採取するには５５ｍｓで十分である）、そして引き続き断片化して、ｍ／ｚ  ２００で６０，０００の分解能で解析し、１２８ｍｓの遷移時間を生じる。その場合、２種の前駆体は、同一の時間枠内で、より高い分解能で解析される。
【０１３４】
質量分析計を操作する前記方法は、本発明の他の方法及び使用のいずれもの好ましい態様であって、第一の側面と第二の側面に準拠した化合物を利用する方法及び使用が含まれて、さらにまた、１２Ｃイオンを単離する工程を含んでなる上記開示の方法が含まれる。
【０１３５】
本明細書において特徴づけられる態様に関しては、特に請求項において、従属請求項において言及される各態様が、前記従属請求項が従属する各請求項（独立又は従属）の各態様と組み合わされると企図される。例えば、独立請求項１が３つの代替態様：Ａ、Ｂ、及びＣを列挙し、従属請求項２が３つの代替態様：Ｄ、Ｅ、及びＦを列挙して、請求項３が請求項１と請求項２に従属して、３つの代替態様：Ｇ、Ｈ、及びＩを列挙する場合、本明細書は、他に具体的に述べなければ、以下の組合せに対応する態様を明確に開示すると理解されたい：Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉ。
【０１３６】
同様に、そしてまた独立及び／又は従属請求項が代替態様を列挙しない場合には、従属請求項が複数の先行請求項に再言及するならば、それによって網羅される主題のあらゆる組合せが明確に開示されているとみなされると理解される。例えば、独立請求項１があって、従属請求項２が請求項１に再言及して、従属請求項３が請求項と２請求項１にともに再言及している場合、請求項３と請求項１の主題の組合せは、請求項３、請求項２、及び請求項１の主題の組合せとして明瞭かつ明確に開示されていることいなる。請求項１〜請求項３のいずれか１項に言及するさらなる従属請求項４が存在する場合は、請求項４と請求項１の主題、請求項４、請求項２、及び請求項１の主題、請求項４、請求項３、及び請求項１の主題、並びに請求項４、請求項３、請求項２、及び請求項１の主題の組合せが明瞭かつ明確に開示されていることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１−１】図面１：対称的なスルホキシドリンカー：ＳＬ１の化学構造とフラグメンテーション挙動。
【図１−２】図面１：対称的なスルホキシドリンカー：ＳＬ１の化学構造とフラグメンテーション挙動。
【図２−１】図面２：非対称なスルホキシドリンカー：ＡＳＬ１の化学構造とフラグメンテーション挙動。
【図２−２】図面２：非対称なスルホキシドリンカー：ＡＳＬ１の化学構造とフラグメンテーション挙動。
【図２−３】図面２：非対称なスルホキシドリンカー：ＡＳＬ１の化学構造とフラグメンテーション挙動。
【図２−４】図面２：非対称なスルホキシドリンカー：ＡＳＬ１の化学構造とフラグメンテーション挙動。
【図３−１】図面３：活性化誘導変換率。「変換」は、非断片化部分から断片化部分への変換を意味する。例えば、０．４の変換率は、化合物の６０％が断片化されずに、４０％が断片化したことを意味する。
【図３−２】図面３：活性化誘導変換率。「変換」は、非断片化部分から断片化部分への変換を意味する。例えば、０．４の変換率は、化合物の６０％が断片化されずに、４０％が断片化したことを意味する。
【図３−３】図面３：活性化誘導変換率。「変換」は、非断片化部分から断片化部分への変換を意味する。例えば、０．４の変換率は、化合物の６０％が断片化されずに、４０％が断片化したことを意味する。
【図３−４】図面３：活性化誘導変換率。「変換」は、非断片化部分から断片化部分への変換を意味する。例えば、０．４の変換率は、化合物の６０％が断片化されずに、４０％が断片化したことを意味する。
【図４−１】図面４：別個の衝突エネルギーにより、ＡＳＬ１結合性ペプチドの定量と同定が可能になる。
【図４−２】図面４：別個の衝突エネルギーにより、ＡＳＬ１結合性ペプチドの定量と同定が可能になる。
【図５−１】図面５：ＡＳＬ１ベースの同重体ラベリング試薬（複数）。
【図５−２】図面５：ＡＳＬ１ベースの同重体ラベリング試薬（複数）。
【図５−３】図面５：ＡＳＬ１ベースの同重体ラベリング試薬（複数）。
【図５−４】図面５：ＡＳＬ１ベースの同重体ラベリング試薬（複数）。
【図５−５】図面５：ＡＳＬ１ベースの同重体ラベリング試薬（複数）。
【図６−１】図面６：慣用のＴＭＴ標識ペプチドの相補的前駆イオンへの変換
【図６−２】図面６：慣用のＴＭＴ標識ペプチドの相補的前駆イオンへの変換
【図６−３】図面６：慣用のＴＭＴ標識ペプチドの相補的前駆イオンへの変換
【図７−１】図面７：単離ウィンドウの全体シフトにより、１２Ｃモノアイソトピック前駆イオンだけの正確な選択が可能になる。
【図７−２】図面７：単離ウィンドウの全体シフトにより、１２Ｃモノアイソトピック前駆イオンだけの正確な選択が可能になる。
【図８】図面８：三重化同位体コード化合物（Ｖａ７）を用いた正確で無干渉性のＭＳ２ベースのプロテオーム定量の設計及び概念。
【図９】図面９：三重化同位体コード（ＡＳＬ２）を用いた多重化定量のプロテオームワイド評価。
【図１０】図面１０：トリプシン処理ヒーラ（HeLa）消化物の単測解析における非対称な四重極単離ウィンドウシフトの最適化。
【図１１】図面１１：化合物フラグメンテーションとペプチド骨格フラグメンテーションの（Ｖａ７）とＴＭＴｚｅｒｏについてのΔ（デルタ）ＮＣＥ。
【図１２】図面１２：（ＡＳＬ２）で標識した、消化された酵母及びヒトのヒトプロテオームの精密定量。
【図１３】図面１３：レポーターイオンとフラグメントイオンを使用することによる、レポーター定量。
【図１４】図面１４：レポーターイオンとフラグメントイオンを使用することによる、レポーター定量。
【図１５】図面１５：「標識フラグメンテーション」対「ペプチド骨格フラグメンテーション」の比較。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は、本発明を例証する。
参考実施例１
対称的な同重体質量タグ
以下の記載は、図面１に言及する。
【０１３９】
（Ａ１）対称的なスルホキシドリンカー：ＳＬ１の化学構造。ＳＬ１では、Ｒ１＝デスチオビオチン（desthiobiotin）で、Ｒ２＝トリアゾール−ペグ（peg）−ヨードアセトアミドである。ＳＬ１のフラグメンテーション時に産生されることが予測される構造は、それぞれＲ１部分とＲ２部分のアルケンフラグメント（Ａ２、Ａ５）、スルフェン酸フラグメント（Ａ３、Ａ６）、又はチオールフラグメント（Ａ４、Ａ７）である。（Ｂ〜Ｃ）ＳＬ１について静電スプレーで解析して、ＳＩＤエネルギーを０〜５０ｅＶまで０．５ｅＶずつ段階的に高めて、ＭＳスペクトルをｍ／ｚ  ２００と１０００の間で記録した。各スキャンの全イオン電流に従ってイオン強度を正規化して、生じる強度を各荷電状態について観測される最大強度で割って、異なる存在度のイオンを同じＹ軸上にプロットすることを可能にした。（Ｂ）全長ＳＬ１に対応するイオンの荷電状態：ｚ＝１とｚ＝２での相対強度。衝突エネルギーの増加に伴って、全長ＳＬ１が開裂する。（Ｃ）指定のＳＬ１フラグメントに対応するイオンの相対強度。
【０１４０】
実施例２
非対称的な同重体質量タグ
以下の記載は、図面２に言及する。
【０１４１】
（Ａ８）非対称的なスルホキシドリンカー：ＡＳＬ１の化学構造。ＡＳＬ１では、Ｒ１＝デスチオビオチンで、Ｒ２：ペグ（peg）−ヨードアセトアミドである。ＡＳＬ１のスルホキシド部位での開裂により３種のフラグメント：（Ａ９）デスチオビオチンスルフェン酸フラグメント、（Ａ１０）デスチオビオチンチオールフラグメント、及び（Ａ１１）スルフヒドリルアルケンフラグメントが産生される。（Ｂ及びＣ）ＡＳＬ１について静電スプレーで解析して、ＳＩＤエネルギーを０〜１００ｅＶまで１ｅＶずつ段階的に高めて、ＭＳスペクトルをｍ／ｚ  １００と２５００の間で記録した。各スキャンの全イオン電流に従ってイオン強度を正規化して、生じる強度を各荷電状態について観測される最大強度で割って、異なる存在度のイオンを同じＹ軸上にプロットすることを可能にした。（Ｂ）全長ＡＳＬ１に対応するイオンの荷電状態：ｚ＝１とｚ＝２での相対強度。衝突エネルギーの増加に伴って、全長ＡＳＬ１が開裂する。（Ｃ）指定のＡＳＬ１フラグメントに対応するイオンの相対強度。（Ｄ及びＥ）ＡＳＬ１について静電スプレーで解析して、ＨＣＤエネルギーを０〜１００ｅＶまで１ｅＶずつ段階的に高めて、ＭＳスペクトルをｍ／ｚ  ２００と２５００の間で記録した。各スキャンの全イオン電流に従ってイオン強度を正規化して、生じる強度を各荷電状態について観測される最大強度で割って、異なる存在度のイオンを同じＹ軸上にプロットすることを可能にした。（Ｄ）全長ＡＳＬ１に対応するイオンの荷電状態：ｚ＝１とｚ＝２での相対強度。衝突エネルギーの増加に伴って、全長ＡＳＬ１が開裂する。（Ｅ）指定のＡＳＬ１フラグメントに対応するイオンの相対強度。
【０１４２】
実施例３
変換率
以下の記載は、図面３に言及する。
【０１４３】
（Ａ〜Ｃ）ＳＬ１とＡＳＬ１について静電スプレーで解析して、ＳＩＤエネルギーを０〜１００ｅＶまで１ｅＶずつ段階的に高めて、ＭＳスペクトルをｍ／ｚ  １００と２５００の間で記録した。イオン強度を各スキャンの全イオン電流によって正規化した。（Ａ）Ｒ１部分のイオンについての、ＳＩＤ＝０ｅＶでのＡＩＦスキャンにおける全ＳＬ１に対する、指定エネルギーでのＡＩＦスキャンにおけるＳＬ１フラグメントの正規化強度の比。０．１の変換率とは、そのリンカーの１０％が開裂型として存在して、９０％が全長イオンとして存在していることを示す。（Ｂ）Ｒ２部分のイオンについての、ＳＩＤ＝０ｅＶでのＡＩＦスキャンにおける全ＳＬ１に対する、指定エネルギーでのＡＩＦスキャンにおけるＳＬ１フラグメントの正規化強度の比。（Ｃ）Ｒ１部分とＲ２部分のイオンについての、ＳＩＤ＝０ｅＶでのＡＩＦスキャンにおける全ＡＳＬ１に対する、指定エネルギーでのＡＩＦスキャンにおけるＡＳＬ１フラグメントの正規化強度の比。（Ｄ）ＡＳＬ１について静電スプレーで解析して、ＨＣＤエネルギーを０〜１００ｅＶまで１ｅＶずつ段階的に高めて、ＭＳスペクトルをｍ／ｚ  ２００と２５００の間で記録した。イオン強度を各スキャンの全イオン電流によって正規化した。Ｒ１部分とＲ２部分のイオンについての、ＳＩＤ＝０ｅＶでのＡＩＦスキャンにおける全ＡＳＬ１に対する、指定エネルギーでのＡＩＦスキャンにおけるＡＳＬ１フラグメントの正規化強度の比。
【０１４４】
実施例４
定量と同定の分離
以下の記載は、図面４に言及する。
【０１４５】
ＡＳＬ１結合性ペプチドについてＬＣ−ＭＳで測定して、ＨＣＤセルを使用して、指定の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）でＭＳ２スキャンを実施した。ＭＳ生データについて、MaxQuant ソフトウェアで解析した。各スキャンの全イオン電流に従って、イオン強度を正規化した。（Ａ）同定された全ＡＳＬ１結合性ペプチドの異なるＮＣＥでのスコア。（Ｂ）開裂したＡＳＬ１と全ＡＳＬ１でのＭＳ２スペクトルにおけるｂイオンとｙイオンのイオンカウント比。垂線は、メジアン値を示す。２の比は、全長ＡＳＬ１より開裂性ＡＳＬ１に対して２倍多いｂイオンとｙイオンが結合したことを示す。（Ｃ）開裂したＡＳＬ１と全ＡＳＬ１でのＭＳ２スペクトルにおけるｂイオンとｙイオンのイオン強度比。垂線は、メジアン値を示す。２の比は、開裂性ＡＳＬ１に対して結合したｂイオンとｙイオンが全長ＡＳＬ１とのその対応相手より２倍強く結合していることを示す。
【０１４６】
実施例５
本発明のラベリング試薬
以下の記載は、図面５に言及する。
【０１４７】
（Ａ）Ｒ１：同位体コード質量レポーター（ＴＭＴ命名法に従うが、使用されない）とＲ２：同位体コード質量バランサー（質量レポーターに対応する）を含有するＡＳＬ１と活性スクシンイミドエステル（ＡＳＬ２）に基づく、同重体ラベリング戦略用の化学構造。このリンカーにより、３種の前駆分子が同一の質量を有して、断片化された分子が異なり質量を有する、三重化定量が可能になる。（Ｂ〜Ｅ）ヒーラ（HeLa）ペプチドをＡＳＬ２の軽いバージョン（すべてＣ１２同位体）で標識した。（Ｂ）ＨＣＤを使用する多様な正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）でのＭＳ２スキャンにおける、ＡＳＬ２標識化前駆イオン（非開裂性ペプチド骨格と非開裂性リンカー）の相補的前駆イオン（開裂性リンカーのある非開裂性ペプチド骨格）に対する変換比。この前駆イオンは、ペプチド骨格でのフラグメンテーションが無いままＭＳ２スキャンのために単離されたペプチドに対応する。１０％の変換比とは、この前駆イオンの１０％が開裂性ＡＳＬ２を含有して、その９０％が全長ＡＳＬ２を含有することを示す。（Ｃ）ＨＣＤを使用する多様なＮＣＥでのＭＳ２スキャンにおいて、全イオン電流（ＴＩＣ）の％として表される、ＡＳＬ２標識化前駆イオンの強度。（Ｄ）ＨＣＤを使用する多様なＮＣＥでのＭＳ２スキャンにおける、相補的ＡＳＬ２標識化前駆イオンの強度。（Ｅ）ＨＣＤを使用する多様なＮＣＥでのＭＳ２スキャンにおいて、全イオン電流（ＴＩＣ）の％として表される、相補的ＡＳＬ２標識化前駆イオンの強度。
【０１４８】
実施例６
ＴＭＴ質量タグとの比較
以下の記載は、図面６に言及する。
【０１４９】
（Ａ〜Ｃ）ヒーラ（HeLa）ペプチドを慣用のＴＭＴデュプレックス（duplex）で標識した。ＨＣＤを使用する２７の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）でのＭＳ２スキャンにおける、ＴＭＴ標識化前駆イオンの相補的前駆イオンに対する変換比。この前駆イオンは、ペプチド骨格でのフラグメンテーションが無いままＭＳ２スキャンのために単離されたペプチドに対応する。１０％の変換比とは、この前駆イオンの１０％が開裂性ＡＳＬ２を含有して、その９０％が全長ＡＳＬ２を含有することを示す。この前駆イオンは、ペプチド骨格でのフラグメンテーションが無いままＭＳ２スキャンのために単離されたペプチドに対応する。（Ｂ）ＨＣＤを使用する２７のＮＣＥでのＭＳ２スキャンにおいて、全イオン電流（ＴＩＣ）の％として表される、相補的ＴＭＴ標識化前駆イオンの強度。（Ｃ）ＨＣＤを使用する多様なＮＣＥでのＭＳ２スキャンにおいて、全イオン電流（ＴＩＣ）の％として表される、ＴＭＴ標識化前駆イオンの強度。
【０１５０】
実施例７
単離ウィンドウの最適化
以下の記載は、図面７に言及する。
【０１５１】
（Ａ）二重荷電：ｚ＝２ペプチド分子種でのフルスキャン。（Ｂ）０．８Ｔｈ単離ウィンドウでの単離、中心化。（Ｃ）三重荷電：ｚ＝３ペプチド分子種でのフルスキャン。（Ｄ）０．４Ｔｈ単離ウィンドウでの単離、中心化。（Ｅ）三重荷電ｚ＝３ペプチド分子種でのフルスキャン。（Ｆ）０．４Ｔｈ単離ウィンドウでの単離、−０．１Ｔｈ補正。
【０１５２】
実施例８
以下の記載は、図面８に言及する。
（ａ）１：３：１０の比で混合した（Ｖａ７）標識化酵母ペプチドの質量スペクトル。二重荷電前駆イオンのＨＣＤフラグメンテーションにより、中性損失基が分離されて、ペプチド結合性レポーターイオンのクラスターを生じる。（ｂ）前駆体質量の情報は、（Ｖａ７）標識ペプチドのペプチド結合性レポーターイオンにおいて保持される。色付きピークは、２種のプロテオーム実験（混合比：酵母では１：３：１０、ヒトでは１：１：１）において同定された酵母ペプチド由来のペプチド結合性レポーターイオンを示す。灰色のピークは、同時単離ペプチド由来のペプチド結合性レポーターイオンである。（ｃ）（重い同位体無しのＶａ７）とＴＭＴ−０で標識したヒーラ（HeLa）ペプチドを１０と３４の間の正規化衝突エネルギーで断片化した（（Ｖａ７）についてＮ＝１７，５６５個の前駆体で、ＴＭＴについて２０，６１０個の前駆体）。
【０１５３】
実施例９
以下の記載は、図面９に言及する。
（ａ）少なくとも２つのペプチド結合性レポーターチャネルで種々の強度シグナルを用いた、１つのプロテオーム／２つのプロテオーム実験におけるＭＳ／ＭＳスキャン。（ｂ）ヒーラ（HeLa）バックグラウンドプロテオーム（１：１：１で混合）の非存在又は存在下に１：３：１０の比で混合した酵母ペプチドの、単測ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験において定量されたペプチド結合性レポーターイオン比（常用対数）（１：３の混合比ではＮ＝７，４１９スキャンと３，０５５スキャン、そして１：１０の混合比ではＮ＝６，７２９スキャンと２，６２２スキャン）。（ｃ）１：１２：１４４の比で混合した酵母ペプチドの、単測ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験において定量されたペプチド結合性レポーターイオン比（常用対数）（１：１２の混合比ではＮ＝６，６０６スキャン、そして１：１４４の混合比ではＮ＝２，６４２スキャン）。（ｄ）３連のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定において、混合した酵母／ヒーラの２プロテオームモデルの１６種の高ｐＨ画分において全部で９，６０７のタンパク質群を同定した。この中で、９，４７１のタンパク質群を少なくとも２つのペプチド結合性レポーターチャネルにおいて種々の強度シグナルで定量した。（ｅ）（ｄ）より定量された酵母タンパク質群の比分布（常用対数）（１：３の混合比では、Ｎ＝３，１６０、３，２１２、３，１３９、そして１：１０の混合比では、Ｎ＝３，０２２、３，０５９、２，９９０）。（ｆ）少なくとも２回の反復実験において、同定されたタンパク質群の９２％（８，８８１）を定量した。（ｇ）（ＡＳＬ２）で定量した、酵母とヒトのタンパク質群の順位付け存在度。（ｇ）（ＡＳＬ２）を用いた、酵母転写因子のような低存在性タンパク質の正確な定量。Kulak et al.20 より推定されるコピー数を括弧に示す。
【０１５４】
実施例１０
以下の記載は、図面１０に言及する。
（ａ）０．８Ｔｈ（Ｎ＝２，０７６）、１．０Ｔｈ（Ｎ＝２，０７０）、及び１．４Ｔｈ（Ｎ＝２，０４１）の単離幅での単離ウィンドウ補正の関数としての、モノアイソトピック前駆イオンに対するＭ＋１同位体ピークのメジアン存在度。（ｂ）上記のように、０．８Ｔｈの単離幅について、二重荷電前駆イオン（Ｎ＝１，４７６）だけを図示する。（ｃ）パネルｃにあるように、三重荷電前駆体（Ｎ＝２８４）だけを図示する。誤差のバーは、＋／−四分位範囲を示す。この統計からは、０強度値を除外した。
【０１５５】
実施例１１
以下の記載は、図面１１に言及する。
（ａ）（Ｖａ７）で標識したヒーラ（HeLa）ペプチドと、ＴＭＴ−０で標識したヒーラ（HeLa）ペプチドを１０と３４の間の正規化衝突エネルギーで断片化した。ペプチド骨格フラグメンテーションに対する化合物フラグメンテーションの差としてΔＮＣＥを計算した（（Ｖａ７）ではＮ＝６，５２３、そしてＴＭＴ−０ではＮ＝１３，０６７の前駆体）。化合物フラグメンテーション（化合物変換とも呼ばれる）のＮＣＥは、化合物が少なくとも３０％断片化される最小ＮＣＥとして定義した。ペプチド結合性レポーターイオン（非断片化ペプチドへ結合した断片化化合物）の強度をインタクト化合物と断片化化合物にある前駆イオン（非断片化ペプチド）の総計強度で割ることによって、化合物フラグメンテーションを計算した。化合物フラグメンテーションが３０％に達しなければ、化合物フラグメンテーションのＮＣＥは、最大の化合物フラグメンテーションのＮＣＥとして定義した。ペプチド骨格フラグメンテーション（ペプチド骨格変換とも呼ばれる）のＮＣＥは、すべてのフラグメントイオン（ｂイオンとｙイオン）の合計がペプチドフラグメントとペプチド前駆イオン（ｂイオンとｙイオン、及び前駆イオン）の総計強度の３０％に達するときのＮＣＥとして定義した。ペプチド骨格フラグメンテーションが３０％より上に達しなければ、ペプチド骨格フラグメンテーションのＮＣＥは、ペプチド骨格フラグメンテーションがその最大に達するときのＮＣＥとして定義した。ＮＣＥ１０又はＮＣＥ３４でのペプチド骨格フラグメンテーションのＮＣＥでの前駆体、又は荷電状態が２未満又は３より高い前駆体は、解析から除外した。
【０１５６】
実施例１２
以下の記載は、図面１２に言及する。
（ａ）酵母（混合比１：３：１０）とヒト（混合比１：１：１）のペプチド（上パネルのヒト／酵母ではＮ＝１９８，３０７／１２２，３３５で、下パネルのヒト／酵母ではＮ＝１９７，９３９／１０１，４９６）のＭＳ／ＭＳスキャンにおけるペプチド結合性レポーターイオン比の分布（常用対数）。（ｂ）３連注入における、（ＡＳＬ２）標識化されて定量された酵母とヒトのタンパク質群の変動係数分布（酵母とヒトではＮ＝８８５６／８７０５で、酵母ではＮ＝３２８７／３１５２）。
【０１５７】
実施例１３
以下の記載は、図面１３に言及する。
（ａ）ヒーラ（HeLa）プロテオームをＡＳＬ２で標識して、１：１：１（チャネル１：チャネル２：チャネル３）の比で混合した。チャネル３でのシグナル強度を他のチャネルでの強度で割ることによって、個々のヒーラペプチドの比を計算した。レポーターイオン（即ち、中性損失のある前駆イオン）だけを使用すること、又は中性損失のあるすべてのフラグメントイオンからの定量情報を考慮することのいずれかによって比を計算した。（ｂ）各チャネルと定量の方法について変動係数（ＣＶ）を計算した。ＣＶは、多数のフラグメントイオンからの定量情報を使用することによって抑えられる。
【０１５８】
実施例１４
以下の記載は、図面１４に言及する。
（ａ）ヒーラ（HeLa）プロテオームをＡＳＬ２で標識して、１：３：１０（チャネル１：チャネル２：チャネル３）の比で混合した。チャネル３でのシグナル強度を他のチャネルでの強度で割ることによって、個々のヒーラペプチドの比を計算した。レポーターイオン（即ち、中性損失のある前駆イオン）だけを使用すること、又は中性損失のあるすべてのフラグメントイオンからの定量情報を考慮することのいずれかによって比を計算した。（ｂ）各チャネルと定量の方法について変動係数（ＣＶ）を計算した。ＣＶは、多数のフラグメントイオンからの定量情報を使用することによって抑えられる。
【０１５９】
実施例１５
以下の記載は、図面１５に言及する。
（ａ）（Ｖａ７、非標識三重）−標識ヒーラ（HeLa）ペプチドを１０と３４の間の正規化衝突エネルギーで断片化した。ペプチド結合性レポーターイオン（非断片化ペプチドへ結合した断片化化合物）の強度をインタクト化合物と断片化化合物にある前駆イオン（非断片化ペプチド）の総計強度で割ることによって、化合物フラグメンテーション（化合物変換とも呼ばれる）の百分率を計算した。ペプチド骨格フラグメンテーション（ペプチド骨格変換とも呼ばれる）の百分率は、すべてのフラグメントイオン（インタクト化合物と断片化化合物のｂイオンとｙイオン）の合計をペプチドフラグメントイオンとペプチド前駆イオンの総計強度（インタクト化合物と断片化化合物のｂ及びｙイオンと前駆イオンの総計強度）で割ることによって計算した。ＮＣＥ１０又はＮＣＥ３４でのペプチド骨格フラグメンテーション（実施例１１を参照のこと）のＮＣＥでの前駆体、又は荷電状態が２未満又は３より高い前駆体は、解析から除外した（化合物フラグメンテーションではＮ＝６，５０９の前駆体で、ペプチド骨格フラグメンテーションではＮ＝６，５１１の前駆体）。
【図１−１】
2019536026.tif 000015
【図１−２】
2019536026.tif 000016
【図２−１】
2019536026.tif 000017
【図２−２】
2019536026.tif 000018
【図２−３】
2019536026.tif 000019
【図２−４】
2019536026.tif 000020
【図３−１】
2019536026.tif 000021
【図３−２】
2019536026.tif 000022
【図３−３】
2019536026.tif 000023
【図３−４】
2019536026.tif 000024
【図４−１】
2019536026.tif 000025
【図４−２】
2019536026.tif 000026
【図５−１】
2019536026.tif 000027
【図５−２】
2019536026.tif 000028
【図５−３】
2019536026.tif 000029
【図５−４】
2019536026.tif 000030
【図５−５】
2019536026.tif 000031
【図６−１】
2019536026.tif 000032
【図６−２】
2019536026.tif 000033
【図６−３】
2019536026.tif 000034
【図７−１】
2019536026.tif 000035
【図７−２】
2019536026.tif 000036
【図８】
2019536026.tif 000037
【図９】
2019536026.tif 000038
【図１０】
2019536026.tif 000039
【図１１】
2019536026.tif 000040
【図１２】
2019536026.tif 000041
【図１３】
2019536026.tif 000042
【図１４】
2019536026.tif 000043
【図１５】
2019536026.tif 000044
【国際調査報告】
2019536026.tif 000045
2019536026.tif 000046
2019536026.tif 000047
2019536026.tif 000048
2019536026.tif 000049