(57)【要約】  本発明は、高い抗ＲＳＶ中和力価を有するモノクローナル抗体に関する。本発明は更に、本発明の抗体をコードする単離された核酸およびそれにより形質転換された宿主細胞を提供する。本発明は更に、特に乳幼児および高齢者における受動免疫療法剤としての、本発明の抗体および核酸を使用する診断、予防および治療方法を提供する。
2019503648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
１）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメント、
２）配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む重鎖可変領域および／または配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメント、および
３）配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む重鎖可変領域および／または配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体のフレームワーク領域内にいずれかの配列変異が存在するもの
からなる群から選択される、軽鎖免疫グロブリン、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖および重鎖の両方の免疫グロブリンを含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫＤ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する、請求項１または２記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む抗体と同じヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫＤ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
該抗体が、以下の相互作用、すなわち、
１）軽鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｐｈｅ９１およびＬｅｕ９２を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９の側鎖と相互作用し、該相互作用は、ＣＤＲ３ループ内のＰｈｅ９１およびＬｅｕ９２のカルボニル酸素とヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９のグアニジノ窒素との間の２つの水素結合の形成によるものである；
２）軽鎖ＣＤＲ２ループが、残基Ａｓｐ５０およびＧｌｕ５５を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｓｎ４２６およびＬｙｓ４４５と水素結合を形成する；
３）重鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｔｙｒ１０４およびＴｙｒ１１０を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質上のＩｌｅ４３２とのファンデルワールス相互作用のための表面を形成する；
４）重鎖ＣＤＲ３ループが、Ａｓｎ１０７を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＬｙｓ４３３と水素結合を形成する；ならびに
５）軽鎖がＲＳＶ融合前三量体の隣接単量体のＧｌｕ１６１およびＳｅｒ１８２に詰め寄る
の１以上を介してヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する、請求項４記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
該抗体が、以下の相互作用、すなわち、
１）軽鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｐｈｅ９１およびＬｅｕ９２を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９の側鎖と相互作用し、該相互作用は、ＣＤＲ３ループ内のＰｈｅ９１およびＬｅｕ９２のカルボニル酸素とヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９のグアニジノ窒素との間の２つの水素結合の形成によるものである；
２）軽鎖ＣＤＲ２ループが、残基Ａｓｐ５０およびＧｌｕ５５を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｓｎ４２６およびＬｙｓ４４５と水素結合を形成する；
３）重鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｔｙｒ１０４およびＴｙｒ１１０を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質上のＩｌｅ４３２とのファンデルワールス相互作用のための表面を形成する；
４）重鎖ＣＤＲ３ループが、Ａｓｎ１０７を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＬｙｓ４３３と水素結合を形成する；ならびに
５）軽鎖がＲＳＶ融合前三量体の隣接単量体のＧｌｕ１６１およびＳｅｒ１８２に詰め寄る
の全てを介してヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する、請求項５記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
該抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
各軽鎖が、配列番号８を含む可変領域およびヒトカッパ軽鎖（配列番号１４）を含み、各重鎖が、配列番号７を含む可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１３）を含む、２本の軽鎖と２本の重鎖とを有する完全長抗体である請求項７記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
該抗体が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項７記載の単離された抗体。
【請求項１０】
重鎖のアミノ酸配列が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２５のアミノ酸配列からなる、請求項８記載の単離された抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ抗体である、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
ＣＨＯ細胞において産生される抗体である、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
配列番号７または８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２３または２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載のポリペプチドのいずれか１つをコードする単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５または１６記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の抗体、抗原結合性フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２０】
インフルエンザ、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパラインフルエンザ（ｈＰＩＶ）、ヒトライノウイルス（ｈＲＶ）、マイコプラズマ・ニューモニア（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アデノウイルス、ボカウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルスまたはＢＫウイルスから選択される呼吸器病原体に対する抗体またはその抗原結合性フラグメントを更に含む、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
呼吸器病原体がインフルエンザ、ｈＣＭＶ、ｈＭＰＶ、ｈＰＩＶ、ノロウイルスまたはＢＫウイルスである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
１）請求項１〜１２記載の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれか１つの重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養し、
２）所望により、該抗体または抗原結合性フラグメントを該宿主細胞および／または培地から回収することを含む、抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの有効量を、所望によりもう１つの予防または治療剤と共に、対象に投与することを含む、ヒト対象におけるＲＳＶ感染の予防または治療方法。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの有効量を、所望によりもう１つの予防または治療剤と共に、対象に投与することを含む、ヒト対象における移植関連ＲＳＶ感染の予防または治療方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  Ｇタンパク質ならびにそれらの断片から選択される抗原とを含む免疫原性組成物。
【請求項２６】
サンプルを請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体またはフラグメントと接触させ、該抗体またはフラグメントとペプチドとの複合体の存在を検出することを含む、サンプルにおけるヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはその断片の存在を検出するための方法であって、該複合体の検出がＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の存在を示す、方法。
【請求項２７】
１）感染または感染症を予防または治療するための、あるいは
２）感染性合併症による呼吸器疾患および移植疾患を予防または治療するための
医薬の製造における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項２８】
ＲＳＶ感染の予防または治療のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項１９〜２１のいずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い抗ＲＳＶ中和力価を有するヒトモノクローナル抗体、ならびに乳幼児および高齢者における受動免疫療法剤としてのこれらの抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラミクソウイルスは、重要なヒトおよび動物病原体である包膜マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ、ＲＳＶ）はパラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科に属する。Ａ型およびＢ型の２つの亜型が特定されており、６月齢未満の小児においては、重篤であり時には致命的でさえある呼吸器感染の主要原因である。ＣＯＰＤ、喘息、癌、免疫不全状態（ＨＩＶまたは移植後を含む）のような基礎疾患を有する成人も、重篤なＲＳＶ感染症を発症するリスクを有する。５０歳を超える成人における急性呼吸器感染による年間入院の１５％がＲＳＶにより引き起こされる。米国においては、ＲＳＶは毎年１００，０００件を超える入院を引き起こし、世界中で毎年約１６０，０００人の死亡を引き起こすと推定されている。現在、ＲＳＶに対するワクチンは存在せず、ホルマリン不活化ウイルスでの治験は、ＲＳＶに感染した際の乳幼児における疾患重篤度の増加を伴っていた。ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）およびヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）を含む他の科のメンバーも、ｈＲＳＶに類似した急性呼吸器疾患を引き起こす。
【０００３】
ｈＲＳＶゲノムは、１１個のタンパク質をコードする約１５ｋｂの一本鎖マイナスセンスＲＮＡ分子である。これらのタンパク質のうちの２個はビリオンの主要表面糖タンパク質である。これらは、（ｉ）細胞へのウイルス結合を媒介する付着（Ｇ）タンパク質、および（ｉｉ）感染サイクルの初期段階におけるウイルスと細胞膜との融合、および特徴的な合胞体を形成する、感染細胞の膜と隣接細胞の膜との融合の両方を促進する融合タンパク質（Ｆ）である。付着タンパク質Ｇは細胞表面受容体に結合し、Ｆと相互作用する。この相互作用はＦにおけるコンホメーション変化を誘発して膜融合を誘発し、それにより、ウイルスリボ核タンパク質複合体を宿主細胞の細胞質内に放出する。
【０００４】
Ｆタンパク質またはＧタンパク質に対するモノクローナル抗体はインビトロにおける中和作用およびインビボにおける予防効果を有することが示されている。例えば、ＢｅｅｌｅｒおよびＣｏｅｌｉｎｇｈ  １９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２９４１−５０；Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏら，１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：９２５−３２；Ｔａｙｌｏｒら，１９８４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５２：１３７−１４２；Ｗａｌｓｈら，１９８４，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３：７５６−７５８；ならびに米国特許第５，８４２，３０７および第６，８１８，２１６号を参照されたい。Ｆ糖タンパク質上の中和エピトープは最初は、抗体エスケープ変異体において変化したアミノ酸を特定すること及びＲＳＶ  Ｆ由来ペプチドへの抗体結合を評価することによりマッピングされた。これらの研究は、中和抗体が、しばしば、２つの異なる線状エピトープを標的とすることを示した。融合前および融合後Ｆ形態の抗原部位の総説については、Ｇｒａｈａｍら，２０１５，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：３０−３８を参照されたい。抗原部位ＩＩ（部位Ａとも称される）は残基２５５〜２７５を含み、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）の標的である。このエピトープはコンホメーション依存的であると推定され、このエピトープと複合体化したパリビズマブのより強力な誘導体の構造は、線状エピトープがヘリックス−ループ−ヘリックス・コンホメーションをとることを明らかにした。抗原部位ＩＶ（部位Ｃとも称される）は残基４２２〜４３８を含み、抗体ＭＡｂ１９および１０１Ｆの標的である。このエピトープは、システインに富む領域のＣ末端であり、ドメインＩＩの一部であり、これは、相同パラミクソウイルスＦ糖タンパク質においては、融合前および融合後のコンホメーションの間で構造的に不変のままである。５Ｃ４、ＡＭ２２およびＤ２５は、融合前Ｆタンパク質上にのみ存在する部位０と称されるエピトープを示し、パリビズマブより５０倍強力であった。ＭｃＬｅｌｌａｎら，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０：１１１３−１１１７；国際特許出願番号ＷＯ  ２００８／１４７１９６および米国特許第８，５６８，７２６号を参照されたい。他のｈＲＳＶ抗体は国際特許出願番号ＷＯ９４／０６４４８およびＷＯ９２／０４３８１ならびに米国特許第８，２２１，７５９号を参照されたい。
【０００５】
能動免疫化のためのＲＳＶワクチンは、入手可能であったとしても、未熟免疫系を有する新生児または免疫抑制された患者の治療には使用できないであろう。より慢性の形態の疾患の結果として、予防用受動免疫療法が必要な患者においては、現在の療法は、プール血漿から製造されたヒトＩｇＧの定期的静脈内接種により行われる。このタイプの療法は、中和抗ＲＳＶ抗体の力価が低いため、大量のグロブリン（例えば、０．７５ｇ／ｋｇ）を要し、したがって、診療所または病院において、高リスク月間（秋、冬および早春）には毎月、長時間（２〜４時間）にわたる静脈内投与を要する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概括
本発明は、以下に特定する構造的および機能的特徴を含む抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
１つの実施形態においては、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−９ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【０００７】
もう１つの実施形態においては、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態においては、該軽鎖または軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該軽鎖は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖に結合していない。ある実施形態においては、該軽鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖に結合している。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【０００８】
もう１つの実施形態においては、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【０００９】
１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該軽鎖または軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該軽鎖は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖に結合していない。ある実施形態においては、該軽鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖に結合している。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗体フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００１０】
１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００１１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号７からなる重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を含む重鎖可変領域と、配列番号８からなる軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を含む軽鎖可変領域とを含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。これらの前記実施形態においては、フレームワーク領域内に配列変異が存在する。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００１２】
もう１つの実施形態においては、本発明はまた、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは重鎖ＣＤＲ（配列番号１〜３）内および／または軽鎖ＣＤＲ（配列番号４〜６）内に１、２または３個のアミノ酸置換を含む。配列番号７のＶＨ配列は配列番号１〜３のＣＤＲを有し、配列番号８のＶＬ配列は配列番号４〜６のＣＤＲを有する。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００１３】
１つの実施形態においては、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する。もう１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる軽鎖とを含み、ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、所望により、以下の特徴の少なくとも１つを有していてもよい：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、本発明は、配列番号２３の重鎖と配列番号２５の軽鎖とを含む抗体の場合と同じ、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のエピトープに結合する抗体または抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは以下の特徴の少なくとも１つを有する：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。１つの実施形態においては、該抗体はそれぞれ配列番号７および８の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは配列番号７の重鎖可変領域および／または配列番号８の軽鎖可変領域内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００１５】
もう１つの実施形態においては、本発明は、配列番号２３の重鎖と配列番号２５の軽鎖とを含む抗体の、ヒトＲＳＶへの結合を交差遮断する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは以下の特徴の少なくとも１つを有する：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは配列番号７の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは配列番号７の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは重鎖ＣＤＲ（配列番号１〜３）内および／または軽鎖ＣＤＲ（配列番号４〜６）内に１、２または３個のアミノ酸置換を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００１６】
１つの実施形態においては、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖もしくは３０個以下のアミノ酸置換を含むその変異体および／または１２個以下のアミノ酸置換を含む配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントに関する。ある実施形態においては、重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００１７】
ある実施形態においては、本発明は、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する単離された抗体または抗原結合性フラグメントに関するものであり、ここで、該抗体は以下の相互作用の１以上または以下の相互作用の全てを介してヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する：
１）軽鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｐｈｅ９１およびＬｅｕ９２を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９の側鎖と相互作用し、該相互作用は、ＣＤＲ３ループ内のＰｈｅ９１およびＬｅｕ９２のカルボニル酸素とヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９のグアニジノ窒素との間の２つの水素結合の形成によるものである；
２）軽鎖ＣＤＲ２ループが、残基Ａｓｐ５０およびＧｌｕ５５を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｓｎ４２６およびＬｙｓ４４５と水素結合を形成する；
３）重鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｔｙｒ１０４およびＴｙｒ１１０を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質上のＩｌｅ４３２とのファンデルワールス相互作用のための表面を形成する；
４）重鎖ＣＤＲ３ループが、Ａｓｎ１０７を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＬｙｓ４３３と水素結合を形成する；ならびに
５）軽鎖がＲＳＶ融合前三量体の隣接単量体のＧｌｕ１６１およびＳｅｒ１８２に詰め寄る（ｐａｃｋ）。
【００１８】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは単離されている。
【００１９】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは組換え抗体である。
【００２０】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは完全長抗体である。
【００２１】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）前記の可変重鎖のいずれかと、（ｂ）リーダーペプチド（例えば、配列番号１０のリーダーペプチド）とからなる重鎖可変領域を含みうる。前記実施形態のいずれかの或る態様においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）前記の軽重鎖のいずれかと、（ｂ）リーダーペプチド（例えば、配列番号１０のリーダーペプチド）とからなる軽鎖可変領域を含みうる。
【００２２】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、前記の可変重鎖のいずれかと任意のヒト重鎖定常ドメインとを含む抗体である。１つの実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントはＩｇＧアイソタイプのものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒト重鎖定常ドメインを含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト重鎖ＩｇＧ１定常ドメインを含み、ここで、該ＩｇＧ１定常ドメインはアフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。
【００２３】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは前記の可変軽鎖のいずれか及びヒト軽鎖定常ドメインを含みうる。１つの実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトカッパ軽鎖定常ドメインまたはその変異体を含み、ここで、該変異体は、２０、１０、５、３、２または１個まで修飾アミノ酸置換を含む。もう１つの実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトラムダ軽鎖定常ドメインまたはその変異体を含み、ここで、該変異体は、２０、１０、５、３、２または１個まで修飾アミノ酸置換を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むヒトカッパ軽鎖定常ドメインを含む。
【００２４】
１つの実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体は、２本の軽鎖と２本の重鎖とを有する完全四量体構造を含み、ここで、各軽鎖は、配列番号８を含む可変領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域（配列番号１４）を含み、各重鎖は、配列番号７を含む可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１３）を含む。
【００２５】
前記実施形態のいずれかの或る態様においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントは少なくとも１つの予防または治療剤にコンジュゲート化（結合）されうる。１つの実施形態においては、該治療剤は第２抗体またはそのフラグメント、免疫調節剤、ホルモン、細胞毒性剤、酵素、放射性核種、第２抗体であって少なくとも１つの免疫調節剤、酵素、放射能標識、ホルモン、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは細胞毒性剤にコンジュゲート化されたもの、あるいはそれらの組合せを含む。
【００２６】
本発明はまた、配列番号１〜８、２３もしくは２５のいずれか１つのアミノ酸配列または任意の前記配列の断片を含む単離されたポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、重鎖アミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００２７】
本発明はまた、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントのいずれか１つをコードする単離された核酸を提供する。１つの実施形態においては、本発明は、配列番号１〜８、２３または２５のポリペプチドのいずれか１つをコードする単離された核酸を提供し、ここで、該ポリペプチドは、所望により、リーダー配列を含んでいてもよい。ある実施形態においては、重鎖アミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含まない。本発明はまた、配列番号１〜８、２３または２５のポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは、所望により、リーダー配列を含んでいてもよい）のいずれか１つをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。ある実施形態においては、重鎖アミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含まない。これらの単離された核酸およびそれらを含む発現ベクターは、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを組換え宿主細胞内で発現させるために使用されうる。したがって、本発明はまた、配列番号１〜８、２３または２５のポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは、所望により、リーダー配列を含んでいてもよい）のいずれか１つをコードする単離された核酸を含む宿主細胞を提供する。ある実施形態においては、重鎖アミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含まない。１つの実施形態においては、該宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。１つの実施形態においては、該宿主細胞は酵母細胞、例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞である。
【００２８】
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態においては、医薬上許容される担体または希釈剤はＬ−ヒスチジンである。この実施形態の１つの態様においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、７％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０（ｐＨ６．０）中で処方（製剤化）される。該抗体または抗原結合性フラグメントは、典型的には、そのような処方（製剤）中に約１００ｍｇ／ｍＬで存在する。
【００２９】
１つの実施形態においては、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、もう１つの予防または治療剤とを含む組成物を提供する。１つの実施形態においては、前記のもう１つの予防または治療剤は、第２の抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメントからなる群から選択される。１つの実施形態においては、本発明の第２の抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００３０】
本発明はまた、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントのいずれか１つを含む容器または注射装置を提供する。１つの実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００３１】
本発明はまた、本発明の抗体（またはその抗原結合性フラグメント）の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養し、所望により、該抗体または抗原結合性フラグメントを該宿主細胞および／または培地から回収することを含む、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法を提供する。１つの実施形態においては、該重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび該軽鎖をコードするポリヌクレオチドは単一のベクター内に存在する。もう１つの実施形態においては、該重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび該軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、異なるベクター内に存在する。１つの実施形態においては、該重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび該軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗体または抗原結合性フラグメントをコードしている。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００３２】
本発明はまた、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントの有効量を、所望によりもう１つの予防もしくは治療剤または治療手技と共に、対象に投与することを含む、ｈＲＳＶ感染の予防または治療を要する対象におけるｈＲＳＶ感染の予防または治療方法を提供する。１つの実施形態においては、治療される対象はヒト対象である。１つの実施形態においては、前記のもう１つの予防または治療剤は、以下のものからなる群から選択される：第２の抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメント、抗ｈＲＳＶ  Ｆ抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸、あるいは抗体コンジュゲート。１つの実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００３３】
本発明はまた、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントの有効量を、所望によりもう１つの予防もしくは治療剤または治療手技と組合せて、対象に投与することを含む、ｈＲＳＶ感染の予防または治療を要する対象におけるｈＲＳＶ感染の予防または治療方法を提供する。１つの実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００３４】
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを含むワクチンまたは免疫原性組成物を提供する。１つの実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００３５】
１つの実施形態においては、該ワクチンまたは免疫原性組成物は更に、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  Ｇタンパク質ならびにそれらの断片から選択される抗原を含む。
【００３６】
本発明はまた、サンプルを本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、該抗体またはフラグメントと該ペプチドとの複合体の存在を検出することを含む、（Ｆタンパク質またはその断片を検出することにより）サンプルにおけるＲＳＶの存在を検出するための方法を提供し、ここで、該複合体の検出はＲＳＶ  Ｆタンパク質の存在を示す。１つの実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、該重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、該軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００３７】
本発明はまた、親抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体を得、該親抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のエフェクター機能を増強することを含む、抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体の抗ｈＲＳＶ活性を増強する方法を提供し、ここで、得られる抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体の活性は、親抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体と比較して増強している。本明細書中で用いる「親抗抗体」は、野生型Ｆｃ領域および／または野生型グリコシル化（すなわち、未操作哺乳類宿主細胞におけるポリペプチドの発現から生じるグリコシル化パターン）を有する抗体を意味する。親抗体のエフェクター機能は、そのＦｃ領域を突然変異させることにより、または例えば該抗体をアフコシル化することによりそのグリコシル化を改変すること（後記で更に詳細に説明される）により増強されうる。１つの実施形態においては、親抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のエフェクター機能は、親抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のＦｃ領域内に突然変異を施すことにより増強される。もう１つの実施形態においては、親抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のエフェクター機能は、該抗体からフコース残基を除去すること、または糖タンパク質にフコースを付加する酵素の活性を除去するように遺伝的に操作された宿主細胞において該抗体を発現させることにより増強される。
【００３８】
詳細な説明
略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。
【００３９】
ＡＤＣＣ    抗体依存性細胞傷害；
ＣＤＣ    補体依存性細胞傷害；
ＣＤＲ    Ｋａｂａｔ（カバト）番号付け系を用いて定められた、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域；
ＣＨＯ    チャイニーズハムスター卵巣；
ＥＬＩＳＡ    酵素結合イムノソルベントアッセイ；
ＦＲ    抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域；
ＨＲＰ    ホースラディッシュペルオキシダーゼ；
ＩＣ５０    ５０％の抑制をもたらす濃度；
ＩｇＧ    免疫グロブリンＧ；
Ｋａｂａｔ    Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔ（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により開発された免疫グロブリンアライメントおよび番号付け系；
ｍＡｂまたはＭａｂまたはＭＡｂ    モノクローナル抗体；
Ｖ領域    異なる抗体間で配列が可変性であるＩｇＧ鎖のセグメント。それは軽鎖内のＫａｂａｔ残基１０９および重鎖内の１１３まで伸長する；
ＶＨ    免疫グロブリン重鎖可変領域；
ＶＫ    免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域。
【００４０】
定義
本発明がより容易に理解されうるように、幾つかの科学技術用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書中で用いる他の全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有する。
【００４１】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、その対応複数対象物を含む。
【００４２】
「投与」および「治療（処理、処置）」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体との外因性医薬、治療剤、診断剤または組成物の接触を意味する。細胞の処理は、該細胞との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療、処置）」は、試薬、診断剤、結合性化合物または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）処理をも意味する。
【００４３】
「ＲＳＶ疾患」は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染によって直接的または間接的に引き起こされる任意の疾患、ならびに患者をＲＳＶによる感染にかかりやすくする疾患または状態を意味する。前者の範疇に入る疾患の例には、肺炎および細気管支炎が含まれる。後者の範疇における疾患および状態（すなわち、重篤なＲＳＶ感染のリスクに患者をさらす疾患および状態）には、嚢胞性線維症、先天性心疾患、癌、加齢性免疫抑制、移植レシピエント、および一般に、免疫抑制の状態または免疫系の機能低下を引き起こす任意の状態、例えば術後臓器移植レジメンまたは早産が含まれる。
【００４４】
「治療する」または「治療」は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを含有する組成物のような治療剤を、該治療剤が治療活性を示す疾患の症状の１以上を有する又は該疾患を有する疑いのある対象または患者に内的または外的に投与することを意味する。典型的には、該治療剤は、いずれかの臨床的に測定可能な度合によるそのような症状の退縮の誘導またはそのような症状の進行の抑制により、治療対象または集団における１以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与される。いずれかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療剤の量は患者の病態、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を惹起する薬物の能力のような要因によって変動しうる。疾患症状が軽減したかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって典型的に用いられるいずれかの臨床的尺度により評価されうる。抗ＲＳＶ抗体での治療は、他の呼吸器病原体を治療するための他の介入（抗抗体、核酸、ワクチンおよび小分子化合物）とも組合されうるであろう。
【００４５】
「予防する」または「予防」は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを含有する組成物のような予防剤を、該予防剤が予防活性を示すｈＲＳＶに感染するリスクを有する対象または患者に内的または外的に投与することを意味する。予防には、後のＲＳＶ感染の可能性または重症度の低減、ＲＳＶ感染時の下気道感染（ＬＲＩ）に関連した症状の改善、およびＲＳＶ感染に対する防御のための免疫の誘導が含まれる。典型的には、予防剤は、感染を阻止するために、肺および／または鼻におけるＲＳＶを中和するのに有効な量で投与される。いずれかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な予防剤の量は患者の年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を惹起する予防剤の能力のような要因によって変動しうる。疾患症状が軽減したかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって典型的に用いられるいずれかの臨床的尺度により評価可能であり、ある場合には、それは入院の必要性を低減するであろう。
【００４６】
ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質
ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質は、共有結合したＦ１およびＦ２サブユニットへとタンパク質分解により切断される準安定性三量体前駆体（Ｆ０）として合成される。パラミクソウイルス科のＰＩＶ５およびＲＳＶメンバーに関しては、融合前形態のＦ三量体の原子構造が決定されている。ＭｃＬｅｌｌａｎら，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８５：７７８８−７７９６（ＲＳＶ）およびＷｅｌｃｈら，２０１２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０９：１６６７２−１６６７７（ＰＩＶ）を参照されたい。融合前Ｆは、短いＣ末端の細胞質尾部、単一の膜貫通ドメイン、ヘリックス柄（ｈｅｌｉｃａｌ  ｓｔａｌｋ）および球状頭部ドメインを有する。ＮＤＶ、ｈＰＩＶ３およびＲＳＶ  Ｆ（融合後形態）の原子構造は、大きなリフォールディング事象が生じて前融合Ｆを融合後Ｆへと変換し、この場合、球状頭部ドメインの一部が再編成して６ヘリックス束を形成することを示している。これらの構造は、ペプチド阻害データと共に、Ｆ媒介性膜融合のモデルを示唆しており、該モデルにおいては、活性化に際して、Ｆ１／Ｆ２が再編成して、疎水性融合ペプチドをＦ１のＮ末端から標的細胞膜内に挿入してプレヘアピン中間体を形成する。この比較的伸長した構造はウイルスを細胞膜に係留し、崩壊して、融合後構造の安定な６ヘリックス束を形成する。準安定融合前形態からプレヘアピン中間体および融合後コンホメーションへの移行は、エネルギー勾配を下るように進行し、融合後形態は最も安定な状態であり、Ｆリフォールディング中に放出されたエネルギーは膜融合と共役している。
【００４７】
ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質なる語はヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質およびその断片、例えば、シグナルペプチドを欠くその成熟断片を含む。本発明の１つの実施形態においては、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ１４２６６（ｈＲＳＶ  Ｂ株９３２０）において開示されているアミノ酸配列を含む。
【００４８】
抗ｈＲＳＶ抗体およびその抗原結合性フラグメント
本発明は、融合前Ｆタンパク質および融合後Ｆタンパク質の両方に結合するヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質（好ましくは、ＲＳＶ  Ａ菌株およびＢ菌株の両方からのもの）に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント、ならびにそのような抗体またはフラグメントの使用を提供する。幾つかの実施形態においては、該抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体は単離されている。本明細書に記載されている抗体はＦタンパク質のＩＶ部位のエピトープに結合する。本明細書に記載されている本発明の実施形態のいずれかにおいては、ある実施形態においては、重鎖もしくは重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まず、および／または軽鎖もしくは軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含まない。ある実施形態においては、重鎖は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなり、軽鎖は配列番号２５のアミノ酸配列を含む、それから実質的になる、またはそれからなる。
【００４９】
好ましい実施形態においては、抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体は完全にヒト形態である。本発明のモノクローナル抗体の主な利点は、それがヒトＣＤＲ３配列を含み、幾つかの実施形態においては、完全にヒトモノクローナル抗体でありうることから導かれる。したがって、ＲＳＶ疾患の免疫予防および免疫療法のための本発明の完全ヒトモノクローナル抗体のインビボでの使用は受動的投与抗体に対する宿主免疫応答の問題を著しく軽減する。この問題は、異種またはキメラ由来の先行技術のモノクローナル抗体が使用される場合に一般に生じる。この利点の第２の重要な態様は、非ヒト配列を含有する異種またはキメラタンパク質の発現が終結され得ない遺伝子治療用途の場合の、これらのヒトモノクローナル抗体の潜在的安全性である。
【００５０】
本明細書中で用いる抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを意味する。「ヒトＲＳＶに特異的に結合する」抗体またはその抗原結合性フラグメントは、約１ｎＭのＫＤまたはより高いアフィニティ（例えば、１ｎＭ〜２ｐＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭまたは２ｐＭ）で融合前または融合後ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合するが、この配列を欠く他のタンパク質には結合しない抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、ヒトｈＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合する本発明の抗体はウシＲＳＶ  Ｆタンパク質に対しても交差反応性である。本明細書中で用いる「交差反応性」は、抗体が他の種由来の相同タンパク質と反応する能力を意味する。抗体がヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合するかどうかは、当技術分野で公知のいずれかのアッセイを用いて判定されうる。結合アフィニティを決定するための当技術分野で公知のアッセイの例には、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）が含まれる。
【００５１】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその使用方法を含む。本明細書中で用いる「抗体」なる語は、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体を意味する。したがって、それは最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（２本の軽鎖と２本の重鎖とを含む完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体およびキメラ抗体を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原結合性フラグメントおよびその使用方法を含む。本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、特に示されていない限り、抗体の抗原結合性フラグメント、すなわち、完全長抗体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗原結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｆａｂフラグメントおよびその使用方法を含む。「Ｆａｂフラグメント」は１個の軽鎖ならびに１個の重鎖の可変領域およびＣＨ１から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とはジスルフィド結合を形成し得ない。「Ｆａｂフラグメント」は抗体のパパイン切断の産物でありうる。
【００５４】
本発明は、抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメント（これはＦｃ領域を含む）ならびにそれらの使用方法を含む。「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２個の重鎖フラグメントを含有する。それらの２個の重鎖フラグメントは２以上のジスルフィド結合により、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合している。
【００５５】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｆａｂ’フラグメントおよびその使用方法を含む。「Ｆａｂ’フラグメント」は１個の軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１個の重鎖の部分またはフラグメント、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域を含有し、その結果、２個のＦａｂ’フラグメントの、２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成しうる。
【００５６】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびその使用方法を含む。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２個の軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の部分を含有する２個の重鎖を含有し、その結果、それらの２個の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、それらの２個の重鎖の間のジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ’フラグメントから構成される。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は抗体のペプシン切断の産物でありうる。
【００５７】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｆｖフラグメントおよびその使用方法を含む。「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００５８】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質ｓｃＦｖフラグメントおよびその使用方法を含む。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体なる語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントであって、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖内に存在するものを意味する。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの総説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。また、国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号を参照されたい。
【００５９】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質ドメイン抗体およびその使用方法を含む。「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーにより共有結合されて２価ドメイン抗体を形成する。２価ドメイン抗体の、２個のＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的化しうる。
【００６０】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質二価抗体およびその使用方法を含む。「二価抗体」は２個の抗原結合部位を含む。幾つかの場合には、それらの２個の結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性でありうる（後記を参照されたい）。
【００６１】
本発明は抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質ジアボディおよびその使用方法を含む。本明細書中で用いる「ジアボディ」なる語は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む。同一鎖上で２個のドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとペア形成することを強要され、２個の抗原結合部位を生成する。ジアボディは、例えばＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８に、より詳細に記載されている。操作された抗体変異体の総説としては、全般的には、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を参照されたい。
【００６２】
典型的には、何らかの方法で修飾された本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、活性がモル基準で表された場合、（親抗体と比較した場合に）その結合活性の少なくとも１０％を保有する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは親抗体としてのｈＲＳＶ  Ｆタンパク質結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保有する。また、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、その生物活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的変異体」または「機能保存変異体」と称される）を含みうると意図される。
【００６３】
本発明は、単離された抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントならびにそれらの使用方法を含む。「単離（された）」抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それらが産生された細胞または細胞培養からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含有しない。そのような生物学的分子には、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞残渣および増殖培地のような他の物質が含まれる。単離された抗体または抗原結合性フラグメントは更に、宿主細胞からの又はその増殖培地の生物学的分子のような発現系成分を少なくとも部分的に含有しない。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような生物学的分子の完全な非存在、または水、バッファーもしくは塩の非存在、または該抗体もしくはフラグメントを含む医薬製剤の成分に関するものを意図したものではない。
【００６４】
本発明はモノクローナル抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。また、本発明は、多くの（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）単離されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物を含む。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は実質的に均一な抗体の集団を意味し、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる可能な自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して特異的であることが多い可変ドメイン、特にＣＤＲ内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要するとは解釈されない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。
【００６５】
一般に、基本的（または「完全長」）抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域またはドメインを含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能をもたらす定常領域またはドメインを定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしての、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。抗体またはその抗原結合性フラグメントの文脈においては、ドメインおよび領域なる語は、適当な場合には、互換的に用いられうる。
【００６６】
各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は一般に同じである。
【００６７】
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、特定のエピトープへの結合が可能になるように、フレームワーク領域により整列されている。一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ，１９７８，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら，１９７７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義に基づいている。
【００６８】
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体またはその抗原結合性フラグメントのアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列により抗体のＣＤＲ領域を定めている）を参照されたい。また、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（構造により抗体のＣＤＲ領域を定めている）も参照されたい。本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる語は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。
【００６９】
「単離された核酸分子」または「単離されたポリヌクレオチド」は、該単離ポリヌクレオチドが天然で見出される場合のポリヌクレオチドの全部または一部を伴っておらず、あるいはそれが天然で連結していないポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの何らかの組合せを意味する。本開示の目的においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は無傷染色体を含まない、と理解されるべきである。特定されている核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定されている配列に加えて、１０個まで又は更には２０個まで又はそれ以上の他のタンパク質またはその一部もしくは断片のコード配列を含むことが可能であり、あるいは、挙げられている核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、および／あるいは、ベクター配列を含むことが可能である。
【００７０】
「制御配列」なる語は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、所望により、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公知である。
【００７１】
核酸またはポリヌクレオチドが「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列に対して機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に（しかし常にそうであるとは限らないが）、「機能的に連結（されている）」は、連結されているそれらのＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、かつ、リーディングフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は簡便な制限部位における連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００７２】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に用いられ、全てのそのような表示は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる語は、導入（トランスファー）の数には無関係に、初代対象細胞、およびそれに由来する培養を含む。また、意図的な又は故意でない突然変異のため、全ての後代は厳密に同一のＤＮＡ含量を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代も含まれる。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
【００７３】
本明細書中で用いる「生殖系列配列」は未再構成免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を意味する。いずれかの適当な未再構成免疫グロブリン配列源が用いられうる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのウェブサイト上でＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ生殖系列データベースから得られうる。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１に記載されているとおりに得られうる。
【００７４】
典型的な抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体の物理的および機能的特性
本発明は、特定されている構造的および機能的特徴を有する抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメント、ならびにＲＳＶ感染に関連した疾患／状態の治療または予防における該抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。
【００７５】
「本発明の抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメント」は、本明細書に記載されている任意の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）またはその変異体（例えば、配列変異体または機能的変異体）；表７に記載されているＣＤＲの任意の１以上を含む任意の抗体または抗原結合性フラグメント；本明細書に記載されている抗体（例えば、ＲＢ１）と同じ、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質におけるエピトープに結合する任意の抗体または抗原結合性フラグメント；およびＲＳＶ結合に関して、本明細書に記載されている抗体（例えば、ＲＢ１）を交差遮断（部分的または完全）する又は該抗体により交差遮断（部分的または完全）される任意の抗体または抗原結合性フラグメントを含む。
【００７６】
交差遮断性抗体およびその抗原結合性フラグメントは、標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー）において本発明の抗体と交差競合するそれらの能力に基づいて特定されうる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイが使用可能であり、該アッセイにおいては、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質をプレート上に固定化し、該抗体の１つを蛍光標識し、該標識抗体の結合に関して競合する非標識抗体の能力を評価する。追加的または代替的に、交差競合する該抗体の能力を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ分析が用いられうる。ＲＳＶ  Ｆタンパク質への別の抗体（例えば、抗体Ｄ２５）の結合を試験抗体が抑制しうることは、該試験抗体がＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合に関して別の抗体（例えば、Ｄ２５）と競合可能であり、したがって幾つかの場合には、抗体Ｄ２５と同じｈＲＳＶ  Ｆタンパク質上のエピトープあるいは重複エピトープに結合しうることを示している。
【００７７】
前記のとおり、本発明の抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントのいずれかと同じエピトープに結合する抗体およびそのフラグメントも本発明の一部を構成する。更に、ある実施形態においては、本発明の抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のいずれかにより結合されるエピトープと重複するエピトープに結合する抗体も本発明の一部を構成する。標的抗原上の抗体エピトープを位置決定（マッピング）するための幾つかの方法が利用可能であり、それらには、Ｈ／Ｄ−Ｅｘ、質量分析、Ｘ線結晶解析、ペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）分析および部位特異的突然変異誘発が含まれる。例えば、タンパク質分解および質量分析と組合されたＨＤＸ（水素重水素交換）が、特異的抗原Ｙ上の抗体のエピトープを決定するために用いられうる。ＨＤＸ−ＭＳは、Ｄ２Ｏ中で自然に又はその抗体の存在下で種々の時間間隔でインキュベートした場合の、抗原による重水素取り込みの度合の正確な測定および比較に基づいている。重水素は露出領域内のタンパク質のアミドバックボーン上の水素と交換されるが、抗体に結合した抗原の領域は保護され、タンパク質分解断片のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の後で僅かな交換しか又は交換を全く示さないであろう。
【００７８】
本発明の抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体の免疫グロブリン鎖およびそのＣＤＲの例には、表７に開示されているもの（配列番号１〜８、２３および２５）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は、配列番号１〜８、２３および２５のアミノ酸配列を含む又はそれらから実質的になる又はそれらからなる任意のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む。
【００７９】
本発明の範囲は、本明細書に記載されている免疫グロブリン鎖の変異体（例えば、配列番号７、８のいずれか）を含む単離された抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントを含み、ここで、該変異体は以下の特徴の１以上を示す：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００８０】
ある実施形態においては、本発明は、配列番号８（ＶＬ）および７（ＶＨ）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する、ヒトｈＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、該変異体は所望の結合および特性、例えば以下のものを示す：（ｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する；あるいは（ｉｉ）表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合後Ｆタンパク質に結合する。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００８１】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質におけるアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換されることを意味し、この場合、そのような変化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させることなく施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照されたい）。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を表１に示す。
【表１】
2019503648.tif 000003
【００８２】
本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明に含まれる。本明細書中で用いる「機能保存的変異体」は、所望の特性、例えば抗原アフィニティおよび／または特異性を改変することなく１以上のアミノ酸残基が変化している、抗体またはフラグメントを意味する。そのような変異体は、類似特性を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換、例えば、表１の保存的アミノ酸置換を含むが、これらに限定されるものではない。また、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個まで又はそれ以上のアミノ酸置換（これらは専らフレームワーク領域内に存在しうる、またはそれらのうちの１以上は１以上のＣＤＲ内に位置しうる）を有する、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のＶＬドメインを含む単離されたポリペプチド（例えば、配列番号８）、および本発明の抗ｈＲＳＶ抗体のＶＨドメインを含む単離されたポリペプチド（例えば、配列番号７）を提供する。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００８３】
もう１つの実施形態においては、本明細書に記載されているＶＬドメインまたはＶＨドメインの１以上に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％または７５％の配列同一性を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを有し、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質への特異的結合を示し、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。もう１つの実施形態においては、本発明の結合性抗体またはその抗原結合性フラグメントは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個まで又はそれ以上のアミノ酸置換（これらは専らフレームワーク領域内に存在しうる、またはそれらのうちの１以上は１以上のＣＤＲ内に位置しうる）を有するＶＬおよびＶＨドメイン（シグナル配列を有する及び有さない）を含み、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質への特異的結合を示す。ある実施形態においては、該重鎖または重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含まない。
【００８４】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は更に、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントのポリペプチドまたは免疫グロブリン鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の少なくとも１つの成熟免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび／または少なくとも１つの成熟免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードしている。幾つかの実施形態においては、単離されたポリヌクレオチドは、単一ポリヌクレオチド分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードしており、他の実施形態においては、軽鎖および重鎖は別々のポリヌクレオチド分子上でコードされている。もう１つの実施形態においては、該ポリヌクレオチドは更に、シグナル配列をコードしている。例えば、本発明は、配列番号１〜８、２３および２５に記載されているアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれにハイブリダイズするポリヌクレオチド、そしてまた、そのようなハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる任意のポリペプチドを含む。１つの実施形態においては、本発明は、配列番号１５（可変重鎖）または配列番号１６（可変軽鎖）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸配列を含む。ある実施形態においては、核酸の特性、例えば或る宿主における発現を増強するために、コドン最適化が用いられうる。１つの実施形態においては、本発明は、配列番号１７（コドン最適化可変重鎖）または配列番号１８（コドン最適化可変軽鎖）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸配列を含む。ある実施形態においては、リーダー配列が使用されうる。１つの実施形態においては、本発明は、それぞれ配列番号２１または配列番号２２を与えるように重鎖または軽鎖に連結された配列番号１９（リーダー配列および重鎖）または配列番号２０（リーダー配列および軽鎖）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸配列を含む。
【００８５】
一般に、該ポリヌクレオチドは低度、中等度または高度なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する能力を維持する抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードしている。第１ポリヌクレオチド分子が第２ポリヌクレオチド分子に「ハイブリダイズ可能」と言えるのは、温度および溶液イオン強度の適当な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）、第１ポリヌクレオチド分子の一本鎖形態が第２ポリヌクレオチド分子にアニーリングしうる場合である。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミドの非存在；または３０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、４２℃を含む。典型的な中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は５×または６×ＳＳＣの存在下の４０％  ホルムアミド、および０．１％  ＳＤＳ、４２℃である。高度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は５０％  ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ、４２℃、または所望により、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）である。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、それらの２つのポリヌクレオチドが相補的配列を含有することを要する。尤も、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ、および相補性の度合、当技術分野でよく知られた変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きければ大きいほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。１００ヌクレオチドを超える長さのハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短いポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，１１．７−１１．８を参照されたい）。
【００８６】
１つの実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２）およびＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３）を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはその抗原結合性フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００８７】
１つの実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号５）およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６）を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインまたはその抗原結合性フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００８８】
１つの実施形態においては、本発明は、配列番号７の免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたは配列番号２３の重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００８９】
１つの実施形態においては、本発明は、配列番号８の免疫グロブリン重鎖可変（ＶＬ）ドメインまたは配列番号２５の軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００９０】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクター、例えばプラスミドを提供し、ここで、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。また、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供する。また、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの免疫グロブリン鎖をコードする発現ベクターまたは核酸を含有する宿主細胞を培地内で培養し、該宿主細胞または培地から該抗原またはその抗原結合性フラグメントを単離することを含む、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはポリペプチドの製造方法も提供する。
【００９１】
同様に本発明に含まれるものは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム［ここで、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択される（例えば、予想閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大マッチ：０；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス；ギャップコスト：存在１１、伸長１；条件付き組成スコアマトリックス補正（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ））］により比較を行った場合、本発明で提供される抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％同一である、８０％同一である、より好ましくは、少なくとも約９０％同一である、最も好ましくは、少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、例えば免疫グロブリンポリペプチドである。
【００９２】
配列同一性は、２つの配列が最適にアライメントされた場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が同等位置において同一である度合を意味する。
【００９３】
以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌら（２００５）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２（２０）：５１０１−５１０９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００９４】
結合アフィニティ
限定的なものではなく一例に過ぎないが、本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメントは、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に少なくとも約１×１０−９ＭのＫｄ値（すなわち、１×１０−９Ｍ以下のＫＤ値）でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質に結合しうる。１つの実施形態においては、本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメントは、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に少なくとも約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質に結合しうる。１つの実施形態においては、本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメントは、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質に結合しうる。１つの実施形態においては、本明細書に開示されている抗体および抗原結合性フラグメントは、ＢＩＡＣＯＲＥまたは類似技術により測定された場合に少なくとも約１００ｐＭのＫＤ値（すなわち、約１００ｐＭ以下のＫＤ値）でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質に結合しうる。１つの実施形態においては、本明細書に開示されている抗体および抗原結合性フラグメントは、ＢＩＡＣＯＲＥまたは類似技術により測定された場合に少なくとも約１０ｐＭのＫＤ値（すなわち、約１０ｐｍ以下のＫＤ値）でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質に結合しうる。１つの実施形態においては、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、ＢＩＡＣＯＲＥまたは類似技術により測定された場合に約１ｐＭ〜約１００ｐＭのＫＤ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質に結合しうる。
【００９５】
抗体およびその抗原結合性フラグメントの製造方法
本発明は、抗体またはフラグメントを発現する細胞系をそのような発現に好ましい条件下で培養し、所望により、該抗体またはフラグメントを該細胞および／または増殖培地（例えば、細胞培養培地）から単離することを含む、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を含む。
【００９６】
本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体は組換え法によって（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７発現系、哺乳類細胞発現系または下等真核生物発現系において）も製造されうる。この実施形態においては、本発明の抗体免疫グロブリン分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸をｐＥＴ系プラスミド内に挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７系内で発現させることが可能である。例えば、本発明は、抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその免疫グロブリン鎖を宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＢＬ２１またはＢＬ２１ＤＥ３）内で発現させるための方法を含み、該方法は、Ｔ７プロモーターに機能的に連結された免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドをも含む細胞内でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させることを含む。例えば、本発明の１つの実施形態においては、細菌宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｌａｃプロモーターに機能的に連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の存在下の該宿主細胞のインキュベーションにより該ポリメラーゼおよび該鎖の発現が誘導される。
【００９７】
当技術分野で公知である組換え抗体を製造するための幾つかの方法が存在する。抗体の組換え製造のための方法の一例は米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【００９８】
形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するためのいずれかの公知方法により行われうる。哺乳類細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、遺伝子銃注入および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを包含する。また、ウイルスベクターにより哺乳類細胞内に核酸分子を導入することが可能である。細胞を形質転換する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。
【００９９】
したがって、本発明は、本発明の抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメントまたはその免疫グロブリン鎖の組換え製造方法であって、該抗体またはフラグメントの免疫グロブリン鎖（例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン）の１以上をコードするポリヌクレオチドを導入し、そのような発現に好ましい条件下で宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））を培養し、所望により、該宿主細胞から、および／または該宿主細胞を増殖させた培地から、該抗体またはフラグメントまたは鎖を単離することを含む製造方法を含む。
【０１００】
抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体は、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている方法のいずれかによっても合成されうる。
【０１０１】
本明細書に開示されている抗体またはフラグメントまたは免疫グロブリン鎖の発現のための宿主としての、哺乳類細胞を含む真核宿主細胞および原核宿主細胞は当技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系を包含する。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞系を包含する。哺乳類宿主細胞はヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を包含する。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するのかを決定することにより選択される。使用されうる他の細胞系としては、昆虫細胞系、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞が挙げられる。真菌細胞には、例えば以下のものを含む酵母および糸状菌細胞が含まれる：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、任意のサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、任意のクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、任意のフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。重鎖またはその抗原結合性部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合、該宿主細胞における該抗体もしくはフラグメントもしくは鎖の発現、または該宿主細胞が培養される培地内への分泌を可能にするのに十分な時間にわたって該宿主細胞を培養することにより、該抗体を製造する。
【０１０２】
抗体およびその抗原結合性フラグメントおよび免疫グロブリン鎖は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。更に、生産細胞系からの本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントおよび免疫グロブリン鎖（またはそれからの他の部分）の発現は、幾つかの公知技術を用いて増強されうる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、一定条件下で発現を増強するための一般的アプローチである。ＧＳ系は欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５号および第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号において全体的または部分的に考察されている。したがって、本発明の１つの実施形態においては、哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）はグルタミンシンテターゼ遺伝子を欠いており、グルタミンの非存在下の培地内で増殖されるが、この場合、該免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞における該遺伝子の欠如を相補するグルタミンシンテターゼ遺伝子を含む。
【０１０３】
本発明は、本発明の抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメントを精製するための方法を含み、該方法は、該抗体またはフラグメントを含むサンプルを精製媒体（例えば、カチオン交換媒体、アニオン交換媒体、疎水性交換媒体、アフィニティ精製媒体（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ））に導入し、該媒体に結合しない該サンプルのフロースルー画分からの精製抗体またはフラグメントを集め、あるいは該フロースルー画分を廃棄し、結合抗体またはフラグメントを該媒体から溶出し、溶出液を集めることを含む。本発明の１つの実施形態においては、媒体は、サンプルが適用されるカラム内に存在する。本発明の１つの実施形態においては、宿主細胞における該抗体またはフラグメントの組換え発現の後で該精製方法を行い、例えば、この場合、まず、宿主細胞を細胞溶解し、所望により、ライセートを不溶物から精製した後、媒体上の精製を行う。
【０１０４】
一般に、個々の細胞系またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、該細胞系またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有するであろう。したがって、抗体の個々のグリコシル化パターンは、該抗体を製造するために使用される個々の細胞系またはトランスジェニック動物に左右されるであろう。しかし、本発明で提供される核酸分子によりコードされる、または本発明で提供されるアミノ酸を含む全ての抗体は、該抗体が有しうるグリコシル化パターンには無関係に、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態においては、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体が有利でありうる。なぜなら、これらの抗体は、インビトロおよびインビボの両方において、それらのフコシル化対応物より高い効力を典型的に示すことが示されているからである（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および第７，２１４，７７５号を参照されたい）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこれらの抗体が免疫原性である可能性は低い。なぜなら、それらの炭水化物構造は、ヒト血清ＩｇＧにおいて存在する集団の正常成分であるからである。
【０１０５】
本発明は、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質および別の抗原、例えばｈＲＳＶ  Ｇタンパク質に対する結合特異性を有する二重特異性および二官能性抗体ならびに抗原結合性フラグメント、ならびにそれらの使用方法を含む。二重特異性または二官能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法により製造されうる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照されたい。また、二重特異性抗体は「ジアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２）として形成されうる。
【０１０６】
本発明は更に、本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ抗体の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原結合性フラグメントを含む。該抗体フラグメントにはＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれ、これは例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断により製造されうる。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元により製造されうる。
【０１０７】
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、種々のクラスに帰属されうる。免疫グロブリンの、少なくとも５つの主要クラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらの幾つかは更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類されうる。本発明は抗体のこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかの抗体および抗原結合性フラグメントを含む。
【０１０８】
１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは重鎖定常領域、例えばヒト定常領域、例えばγ１、γ２、γ３もしくはγ４ヒト重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えばラムダもしくはカッパヒト軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。例えば、限定的なものではないが、ヒト重鎖定常領域はγ４であることが可能であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであることが可能である。もう１つの実施形態においては、該抗体のＦｃ領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を有するγ４である（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊら，２００１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１−８）。
【０１０９】
１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントはＩｇＧ１サブタイプの重鎖定常領域を含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態においては、種々の定常ドメインが、本発明で提供されるＣＤＲに由来するヒト化ＶＬおよびＶＨ領域に連結されうる。例えば、本発明の抗体（またはフラグメント）の個々の意図される使用がエフェクター機能の改変を求めるものである場合には、ヒトＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインが使用可能であり、あるいはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４が使用可能である。
【０１１１】
ヒトＩｇＧ１抗体は長い半減期およびエフェクター機能、例えば補体活性化および抗体依存性細胞傷害性をもたらすが、そのような活性は該抗体の全ての用途に望ましいとは限らない可能性がある。そのような場合、例えばヒトＩｇＧ４定常ドメインが使用されうる。本発明は、ＩｇＧ４定常ドメインを含む抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメント、例えば、アンタゴニストヒト化抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびフラグメント、ならびにそれらの使用方法を含む。１つの実施形態においては、該ＩｇＧ４定常ドメインはＥＵ系における２２８位およびＫＡＢＡＴ系における２４１位に対応する位置において天然ヒトＩｇＧ４定常ドメイン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１８６１．１）とは異なることが可能であり、この場合、適切な鎖内ジスルフィド結合形成を妨げうるＣｙｓ１０６およびＣｙｓ１０９（ＥＵ系におけるＣｙｓ２２６およびＣｙｓ２２９位ならびにＫＡＢＡＴ系におけるＣｙｓ２３９およびＣｙｓ２４２位に対応する）間の潜在的鎖間ジスルフィド結合を妨げるために天然Ｓｅｒ１０８はＰｒｏで置換される。Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｕｎｏｌ．３０：１０５を参照されたい。他の場合においては、半減期を増加させるために又はエフェクター機能を低減するために修飾された修飾ＩｇＧ１定常ドメインが使用されうる。
【０１１２】
抗体の改変
本発明の抗体は、抗体の特性を改善するために、フレームワーク突然変異に付されうる。１つのそのようなフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内または更には１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより該抗体の潜在的免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、米国特許第７，１２５，６８９号に更に詳細に記載されている。
【０１１３】
特定の実施形態においては、脱アミド化または異性化を避けるために、最終的な抗体の、より高い化学的安定性を得るために、露出側鎖を含有する或るアミノ酸を別のアミノ酸残基へと変化させることが望ましいであろう。アスパラギンの脱アミド化はＮＧ、ＤＧ、ＮＧ、ＮＳ、ＮＡ、ＮＴ、ＱＧまたはＱＳ配列上で生じ、イソアスパラギン酸残基の生成をもたらす可能性があり、該残基はポリペプチド鎖内にねじれ（キンク）を導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）。ＤＧ、ＤＳ、ＤＡまたはＤＴ配列において異性化が生じうる。ある実施形態においては、本開示の抗体は脱アミド化またはアスパラギン異性部位にを含有しない。
【０１１４】
例えば、特にＣＤＲ内の、いずれかのＡｓｎ−Ｇｌｙ配列におけるイソアスパルタートの形成の可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）残基はＧｌｎまたはＡｌａへと改変されうる。同様の問題はＡｓｐ−Ｇｌｙ配列においても生じうる。ＲｅｉｓｓｎｅｒおよびＡｓｗａｄ（２００３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１２８１。イソアスパルタート形成は抗体のその標的抗原への結合を減弱し、または完全に阻止しうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４を参照されたい。１つの実施形態においては、該アスパラギンはグルタミン（Ｇｌｎ）へと改変される。小さなアミノ酸がアスパラギンまたはグルタミンに隣接して存在する場合にはより高い率で生じる脱アミド化の可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接したアミノ酸を改変することも望ましいかもしれない。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ＆  Ｋｏｌｂｅ（１９９４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．６６２：２６１を参照されたい。また、抗原結合アフィニティを低減し、そしてまた、最終抗体調製物における分子不均一性に寄与しうるメチオニン硫黄の酸化の可能性を低減するために、ＣＤＲ内のいずれかのメチオニン残基（典型的には溶媒露出Ｍｅｔ）がＬｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅまたは他のアミノ酸へと改変されうる（同誌）。また、Ａｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合の潜在的な切断を妨げ又は最小にするために、ＣＤＲにおいて見出されるいずれかのＡｓｎ−Ｐｒｏの組合せをＧｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｓｎ−Ａｌａへと改変することが望ましいかもしれない。ついで、そのような置換を有する抗体をスクリーニングして、該置換がｈＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する抗体のアフィニティもしくは特異性または他の所望の生物活性を、許容し得ないレベルに低減しないことを確認する。
【表２】
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【０１１５】
Ｆｃ領域の抗体改変
本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）はまた、Ｆｃ領域内の修飾を含むように、典型的には、該抗体の特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能（例えば、抗原依存性細胞傷害性）の１以上を変化させるために改変（操作）されうる。更に、本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は化学的に修飾可能であり（例えば、１以上の化学的部分が該抗体に結合可能である）、あるいは、再び該抗体またはフラグメントの特性の１以上を改変するために、そのグリコシル化を改変するように修飾されうる。これらの実施形態のそれぞれは後記に更に詳細に記載されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１１６】
本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）はまた、改変されたエフェクター機能をもたらすための、修飾（または遮断）されたＦｃ領域を有する抗体およびフラグメントをも含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２を参照されたい。そのような修飾は、診断および療法における可能な有益な効果を伴って、免疫系の種々の反応を増強または抑制するために用いられうる。Ｆｃ領域の改変には、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃの付加が含まれる。Ｆｃに対する変化はまた、治療用抗体における抗体の半減期を改変することが可能であり、それほど頻繁でない投与ならびにそれによる便利さの向上および物資の使用の減少を可能にする。Ｐｒｅｓｔａ，２００５，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４−３５を参照されたい。
【０１１７】
本発明の１つの実施形態においては、ＣＨ１のヒンジ領域は、該ヒンジ領域内のシステイン残基の数が増加または減少するように修飾される。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に更に詳細に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進させるために、または抗体の安定性を増強もしくは低減するために改変される。
【０１１８】
もう１つの実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、その生物学的半減期を増加させるために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許６，２７７，３７５号に記載されているとおり、以下の突然変異の１以上が導入されうる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されているとおり、生物学的半減期を増加させるために、該抗体は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合性エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。１つの実施形態においては、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）突然変異が導入される。例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，４６：１７５０を参照されたい。
【０１１９】
更に他の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントのエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、該抗体がエフェクターリガンドに対する改変されたアフィニティを有し、親抗体の抗原結合能を保有するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置換されうる。アフィニティが改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に更に詳細に記載されている。
【０１２０】
もう１つの例においては、該抗体がＣ１ｑ結合の変化および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の低減もしくは消失を示すように、アミノ酸残基３２９、３３１および３３２から選択される１以上のアミノ酸が別のアミノ酸残基で置換されうる。このアプローチは米国特許第６，１９４，５５１号に詳細に記載されている。
【０１２１】
もう１つの例においては、アミノ酸２３１位および２３９位における１以上のアミノ酸残基を改変して、それにより、補体を固定する該抗体の能力を改変する。このアプローチは国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２９３５１に更に詳細に記載されている。
【０１２２】
更にもう１つの例においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらす能力を低減するために、および／またはＦｃγ受容体に対する該抗体またはフラグメントのアフィニティを低減するために、以下の位置：２３８、２３９、２４３、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９位における１以上のアミノ酸を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。このアプローチは国際特許出願公開番号ＷＯ  ００／４２０７２に更に詳細に記載されている。更に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位が位置決定されており、改善した結合を示す変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。
【０１２３】
本発明の１つの実施形態においては、本発明の抗体（例えば、ＲＢ１）がエフェクター機能をもたらす能力を低減するために、および／または抗炎症特性を増強するために、残基２４３および２６４を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。１つの実施形態においては、２４３位および２６４位における残基をアラニンへと変化させることにより、該抗体またはフラグメントのＦｃ領域を修飾する。１つの実施形態においては、該抗体またはフラグメントがエフェクター機能をもたらす能力を低減するために、および／または抗炎症特性を増強するために、残基２４３、２６４、２６７および３２８を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。
【０１２４】
エフェクター機能の増強
幾つかの実施形態においては、抗ｈＲＳＶ抗体のＦｃ領域は、エフェクター機能をもたらす該抗体もしくは抗原結合性フラグメントの能力を増強するために、および／またはＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）へのそれらの結合を増強するために、修飾される。
【０１２５】
本明細書中で用いる「エフェクター機能」なる語は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）媒介性応答、Ｆｃ媒介性食作用または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、およびＦｃＲｎ受容体を介した抗体リサイクリングの１以上を意味すると意図される。
【０１２６】
抗原結合性タンパク質の定常領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃＲ）［ＦｃガンマＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む］との間の相互作用が抗原結合性タンパク質のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣをもたらすと考えられている。Ｆｃ受容体は抗体架橋にも重要であり、これは抗腫瘍免疫に重要でありうる。
【０１２７】
エフェクター機能は、例えば、ＡＤＣＣエフェクター機能を測定するための、ナチュラルキラー細胞へのＦｃγＲＩＩＩの結合または単球／マクロファージへのＦｃγＲＩの結合による方法を含む幾つかの方法で測定されうる。例えば、本発明の抗原結合性タンパク質はナチュラルキラー細胞アッセイにおいてＡＤＣＣエフェクター機能に関して評価されうる。そのようなアッセイの例はＳｈｉｅｌｄｓら，２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，ｐ  ６５９１−６６０４；Ｃｈａｐｐｅｌら，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ  ２６８，ｐ  ２５１２４−２５１３１；Ｌａｚａｒら，２００６  ＰＮＡＳ，１０３；４００５−４０１０において見出されうる。
【０１２８】
本発明の抗体のＡＤＣＣもしくはＣＤＣの特性またはそれらの架橋特性は幾つかの方法で増強されうる。
【０１２９】
残基Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化の改変または特異的突然変異を含有するヒトＩｇＧ１定常領域はＦｃ受容体への結合を増強することが示されている。幾つかの場合においては、これらの突然変異はＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強することも示されている（Ｌａｚａｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６，１０３；４００５−４０１０；Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１，２７６；６５９１−６６０４；Ｎｅｃｈａｎｓｋｙら，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，４４；１８１５−１８１７）。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態においては、そのような突然変異は、２３９、３３２および３３０位（ＩｇＧ１）または他のＩｇＧアイソタイプにおける同等位置から選択される位置の１以上に存在する。適当な突然変異の例としては、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌが挙げられる。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている本発明の抗原結合性タンパク質は２３９および３３２位において突然変異しており（例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ）、またはもう１つの実施形態においては、それは、２３９および３３２および３３０から選択される３以上の位置において突然変異している（例えば、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌ（ＥＵインデックスの番号付け））。
【０１３１】
本発明のもう１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質がエフェクター機能の増強を示すようにグリコシル化プロファイルの改変を有する重鎖定常領域を含む抗体を提供する。例えば、この場合、該抗体はＡＤＣＣの増強またはＣＤＣの増強を示し、あるいはそれはＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の両方の増強を示す。グリコシル化プロファイルの改変を有する抗原結合性タンパク質を製造するための適当な方法の例は国際特許出願公開番号ＷＯ２００３０１１８７８およびＷＯ２００６０１４６７９ならびに欧州特許出願番号ＥＰ１２２９１２５に記載されている。
【０１３２】
もう１つの態様においては、本発明は「非フコシル化」または「アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」抗体を提供する。非フコシル化抗体は、フコース残基を有さないＦｃの複合型Ｎ−グリカンのトリ−マンノシルコア構造を含有する。Ｆｃ  Ｎ−グリカンからのコアフコース残基を欠くこれらの糖操作抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合能の増強により、フコシル化等価体より強力なＡＤＣＣを示しうる。
【０１３３】
本発明はまた、ａ）本明細書に記載されている単離された核酸を含む発現ベクターを含み、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼを含まない組換え宿主細胞を培養し、ｂ）抗原結合性タンパク質を回収する工程を含む本発明の抗体の製造方法を提供する。該組換え宿主細胞は、通常、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有していなくてもよく（例えば、酵母宿主細胞、例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．））、あるいはアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼを不活性化するように遺伝的に修飾されていてもよい。アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を不活性化するように遺伝的に修飾された組換え宿主細胞が入手可能である。例えば、ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）から入手可能なＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）技術システムを参照されたい。それにおいては、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くＣＨＯＫ１ＳＶ細胞が、機能的ＦＵＴ８遺伝子を含有する細胞において産生される同一モノクローナル抗体と比べて増強した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示すモノクローナル抗体を産生する。ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）技術システムの種々の態様が米国特許第７，２１４，７７５号、第６，９４６，２９２号ならびに国際特許出願番号ＷＯ００６１７３９およびＷＯ０２３１２４０に記載されている。他の適当なシステムも当業者に認識されるであろう。
【０１３４】
そのような修飾は単独で用いられうるだけでなく、エフェクター機能を更に増強するために互いに組合せて用いられうることが当業者に明らかであろう。
【０１３５】
修飾グリコシル化を有する抗体の製造
更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１態）は特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、アフコシル化または非グリコシル化（アグリコシル化）（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体またはフラグメント（すなわち、該抗体は、それぞれ、フコースまたはグリコシル化を欠く）が製造されうる。抗体またはフラグメントのグリコシル化パターンは、例えば、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原に対する該抗体またはフラグメントのアフィニティまたはアビディティを増強するために改変されうる。そのような修飾は、例えば、該抗体またはフラグメント配列内のグリコシル化部位の１以上を改変することにより達成されうる。例えば、可変領域フレームワークグリコシル化部位の１以上の除去をもたらし、それによりその部位におけるグリコシル化を排除する１以上のアミノ酸置換が施されうる。そのような非グリコシル化は抗原に対する該抗体またはフラグメントのアフィニティまたはアビディティを増強しうる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【０１３６】
本明細書に開示されている抗体および抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は更に、哺乳類またはヒト様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された下等真核宿主細胞、特に真菌宿主細胞、例えば酵母および糸状菌において産生されるものを含む（例えば、Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５０２７；Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４−１２４６；Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３；Ｎｅｔｔら，（２０１１）Ｙｅａｓｔ  ２８（３）：２３７−５２；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｏｃｔ；１８（５）：３８７−９２を参照されたい）。これらの遺伝的に修飾された宿主細胞は、該細胞内で産生される糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを制御する能力を有し、その結果、特定のＮ−グリカン構造が優勢な糖タンパク質の組成物が製造されうる（例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号を参照されたい）。これらの遺伝的に修飾された宿主細胞は、特定のＮ−グリカン構造を主に有する抗体を製造するために使用されている（例えば、Ｌｉら（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５を参照されたい）。
【０１３７】
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は更に、二分岐および多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）種を含むフコシル化および非フコシル化ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンを含むが、これらに限定されるものではない）を含む、下等真核宿主細胞において産生されるものを含む。
【０１３８】
特定の実施形態においては、本発明において提供する抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ−グリカンを有する抗体またはフラグメントを含みうる。特定の態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。
【０１３９】
特定の実施形態においては、本発明において提供する抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つの複合Ｎ−グリカンを有する抗体およびフラグメントを含む。特定の態様においては、該複合Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中の複合Ｎ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。１つの実施形態においては、本発明において提供する抗体およびその抗原結合性フラグメントは複合Ｎ−グリカンを含み、ここで、複合Ｎ−グリカンの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％が構造ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含み、ここで、そのような構造はアフコシル化されている。そのような構造は、例えば、操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞において製造されうる。
【０１４０】
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンはフコシル化されている。一般に、該フコースは、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，６−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧａｌとのα１，２−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、または該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，４−結合で存在する。
【０１４１】
したがって、前記の糖タンパク質組成物の特定の態様においては、該グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，６−結合フコース；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，４−結合フコース；あるいはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，２−結合フコースで存在する。
【０１４２】
更に詳細な態様においては、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、限定的なものではないがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を含む高マンノースＮ−グリカン、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造からなるＮ−グリカンを含む。
【０１４３】
前記の更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは更に、フコシル化および非フコシル化二分岐および多アンテナ種を含む。
【０１４４】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム（糖形態）」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ−結合オリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。糖基のプロセシングは翻訳と同時にＥＲの内腔において生じ、翻訳後はＮ−結合糖タンパク質のためにゴルジ装置において継続する。
【０１４５】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。通常、Ｎ−グリカン構造は、非還元末端を左側に、そして還元末端を右側にして表される。Ｎ−グリカンの還元末端は、該タンパク質上のグリコシル化部位を含むＡｓｎ残基に結合している末端である。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「少（ｐａｕｃｉ）マンノースコア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数において異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐（分枝）構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有する。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」が挙げられ、ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をも有しうる。複合Ｎ−グリカンは、コアフコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換をも有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端における少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上の０個以上のマンノースとを有する。前記の種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム（糖形態）」とも称される。
【０１４６】
複合Ｎ−グリカンに関しては、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は以下を意味する。「Ｇ−２」は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ−１」なる語は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ０」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ１」なる語は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ２」なる語は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ１」なる語は、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ２」なる語は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味する。特に示されていない限り、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は、Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコースを欠くＮ−グリカン種を意味する。該用語が「Ｆ」を含む場合、「Ｆ」は、該Ｎ−グリカン種が該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基上にフコース残基を含有することを示す。例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ａ１ＦおよびＡ２Ｆは全て、Ｎ−グリカンが、該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコース残基を更に含むことを示す。酵母および糸状菌のような下等真核生物は、通常、フコースを示すＮ−グリカンを産生しない。
【０１４７】
多アンテナＮ−グリカンに関しては、「多アンテナＮ−グリカン」なる語は、該Ｎ−グリカンの１，６アームもしくは１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基上のＧｌｃＮＡｃ残基、または該Ｎ−グリカンの１，６アームおよび１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基のそれぞれにおいてＧｌｃＮＡｃ残基を更に含むＮ−グリカンを意味する。したがって、多アンテナＮ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられうる。「１−４」なる語は１、２、３または４個の残基を意味する。
【０１４８】
二分岐Ｎ−グリカンに関しては、「二分岐Ｎ−グリカン」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ残基が該Ｎ−グリカンの還元末端においてマンノース残基に結合している、Ｎ−グリカンを意味する。二分岐Ｎ−グリカンは式ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられることが可能であり、ここで、各マンノース残基はその非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。これに対して、多アンテナＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられる場合、該式は、２つのＧｌｃＮＡｃ残基が、Ｎ−グリカンの、２つのアームの一方の非還元末端において、マンノース残基に結合しており、１つのＧｌｃＮＡｃ残基が、該Ｎ−グリカンの他方のアームの非還元末端において、マンノース残基に結合していることを示す。
【０１４９】
抗体の物理特性
本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は更に、軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域内に１以上のグリコシル化部位を含有しうる。あるグリコシル化部位は抗原結合の変化による該抗体のｐＫの変化または該抗体もしくはフラグメントの免疫原性の低減をもたらしうる（Ｍａｒｓｈａｌｌら，１９７２，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２；ＧａｌａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４；Ｗａｌｌｉｃｋら，１９８８，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９；Ｓｐｉｒｏ，２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７；Ｍｉｍｕｒａら，２０００，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフにおいて生じることが公知である。
【０１５０】
各抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、一般には６〜９．５のｐＨ範囲内である特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内である。
【０１５１】
各抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は特徴的な融解温度を有し、より高い融解温度は、より大きなインビボ総安定性を示す（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ＲおよびＭａｎｎｉｎｇ  ＭＣ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１）。一般に、ＴＭ１（初期アンフォールディングの温度）は６０℃より高い、６５℃より高い、または７０℃より高いことが可能である。抗体またはフラグメントの融点は、示差走査熱量測定（Ｃｈｅｎら（２００３）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２）または円二色性（Ｍｕｒｒａｙら（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９）を用いて測定されうる。
【０１５２】
もう１つの実施形態においては、急速に分解しない抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）を選択する。抗体またはフラグメントの分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＡＪおよびＨｕｇｈｅｓ  ＤＥ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２）を用いて測定されうる。
【０１５３】
もう１つの実施形態においては、望ましくない免疫応答の誘発および／または変化した若しくは好ましくない薬物動態特性を招きうる凝集作用が最小である抗体（例えば、ＲＢ１）およびその抗原結合性フラグメントを選択する。一般に、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下の凝集を示す抗体およびフラグメントが許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む幾つかの技術により測定されうる。
【０１５４】
抗体コンジュゲート
本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は化学的部分にコンジュゲート化（結合）されることも可能である。該化学的部分は、とりわけ、重合体、放射性核種、細胞毒性因子でありうる。特定の実施形態においては、該化学的部分は、対象の体内の該抗体またはフラグメントの半減期を増加させる重合体である。適当な重合体には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）（これらに限定されるものではない）を包含する親水性重合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｌｅｅら（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）はＰＥＧコンジュゲート化一本鎖抗体を開示している。Ｗｅｎら，（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレーター（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））に結合したＰＥＧに対して抗体をコンジュゲート化することを開示している。
【０１５５】
本明細書に開示されている抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）はまた、例えば９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈおよび４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅのような標識に対してコンジュゲート化されうる。
【０１５６】
本明細書に開示されている抗体および抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、例えば、その生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅ）されることも可能である。抗体またはフラグメントをペグ化するためには、典型的には、１以上のＰＥＧ基が該抗体または抗体フラグメントに結合する条件下、該抗体またはフラグメントを、反応性形態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。特定の実施形態においては、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性水溶性重合体）とのアシル化反応またはアルキル化反応により行われる。本明細書中で用いる「ポリエチレングリコール」なる語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれか、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを含むと意図される。ある実施形態においては、ペグ化されるべき抗体またはフラグメントは非グリコシル化抗体またはフラグメントである。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用されうる。例えば、欧州特許出願番号ＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照されたい。
【０１５７】
本明細書に開示されている抗体および抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、蛍光または化学発光標識、例えば発蛍光団、例えば希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定フリーラジカルに対してコンジュゲート化されることも可能である。
【０１５８】
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、細胞毒性因子、例えばジフテリア毒素、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトイアッカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ、モモルディカ・カランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシンにコンジュゲート化されることも可能である。
【０１５９】
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）を種々の部分にコンジュゲート化するための当技術分野で公知のいずれかの方法が利用可能であり、該方法は、Ｈｕｎｔｅｒら，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４；Ｐａｉｎら，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，１９８２，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されている方法を包含する。抗体およびフラグメントのコンジュゲート化方法は常套手段であり、当技術分野において非常によく知られている。
【０１６０】
抗ｈＲＳＶ抗体の予防的および治療的用途
更に、本明細書に開示されている単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）を使用して、ＲＳＶ感染の症状の予防、治療または改善を要する対象（ヒト対象を含む）においてＲＳＶ感染の症状を予防、治療または改善するための方法を提供する。本発明の１つの実施形態においては、そのような対象はＲＳＶ感染に罹患している。本発明の１つの実施形態においては、そのような対象はＲＳＶ感染のリスクを有する。
【０１６１】
特定の実施形態においては、ＲＳＶ感染に関連した１以上の症状の治療、予防または改善のために、本発明の１以上の抗体またはそのフラグメントを含む予防用、治療用または医薬組成物を、ＲＳＶ力価を減少させるのに有効な量で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。この実施形態においては、抗体または抗体フラグメントの有効量は、例えば、哺乳動物からの肺からの洗浄液または喀痰サンプルにおけるＲＳＶの濃度により測定された、肺におけるＲＳＶ力価を低下させる。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ感染に関連した症状の治療、予防または改善のために、本発明の１以上の抗体またはそのフラグメントを含む予防用、治療用または医薬組成物を、哺乳動物においてＲＳＶを中和する及び／又はＲＳＶ感染を阻止するのに有効な量で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【０１６２】
モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトおよび他の動物の両方においてＲＳＶ疾患に対して免疫療法的に使用されうる。本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに関して本明細書中で用いる「免疫療法的に」または「免疫療法」なる語は、予防的および治療的な両方の投与、ならびに実質的に精製されたポリペプチド産物での受動免疫化および該産物またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列の導入による遺伝子治療の両方を示す。受動免疫には、能動的体液性免疫の移行またはそれを要する対象への抗体の供与が含まれる。したがって、本発明の或る実施形態においては、本発明は、能動的体液性免疫の移行のための方法、およびＲＳＶ感染のリスクを有する患者にＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えばＩｇＧ抗体を供与する方法を提供する。したがって、該モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＳＶ疾患の可能性および／または重症度を低減するために、高リスク対象に投与されることが可能であり、あるいは活動性感染を既に明らかに示している対象に投与されうる。
【０１６３】
本発明はまた、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの成人性または小児性ＲＳＶ関連疾患、限定的なものではないが例えば、下気道感染症、肺炎、気管気管支炎、細気管支炎、気管支炎、および任意の関連感染症または炎症障害、限定的なものではないが例えば、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、成人性呼吸窮迫症候群、アレルギー性鼻炎、通年性鼻炎、喘息、全身性アナフィラキシー、受容体過敏反応、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、過敏性肺炎、細胞内生物による肉芽腫、薬物過敏、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患の少なくとも１つ、またはそれらに関連した少なくとも１つの炎症；細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの感染症、限定的なものではないが例えば、急性および慢性細菌感染、急性および慢性寄生性または感染性過程の少なくとも１つ、例えば、細菌、ウイルスおよび真菌感染、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、ＢまたはＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群、血栓溶解性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、毒素ショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疽、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、カリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、睾丸炎、精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、エプスタイン・バーウイルス、バイタル（ｖｉｔａｌ）関連血球貪食症候群、致命的（バイタル）脳炎、無菌性髄膜炎などをモジュレーションまたは治療するための方法を提供する。そのような方法は、所望により、少なくとも１つのＲＳＶ抗体またはその抗原性フラグメントを含む組成物または医薬組成物の有効量を、そのようなモジュレーション、治療または療法を要する細胞、組織、器官、動物または患者に投与することを含みうる。
【０１６４】
１つの実施形態においては、ＲＳＶ感染に関連した１以上の症状を治療、予防または改善するために、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む予防用、治療用または医薬組成物を哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。もう１つの実施形態においては、嚢胞性線維症、気管支肺異形成、先天性心疾患、先天性免疫不全もしくは後天性免疫不全を有するヒトに、または移植（例えば、骨髄、肺または造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ））を受けたヒトに、ＲＳＶ感染に関連した１以上の症状を治療、予防または改善するために、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む予防用、治療用または医薬組成物を投与する。
【０１６５】
もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ感染に関連した１以上の症状を治療、予防または改善するために、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む予防用、治療用または医薬組成物を、ヒト乳児、好ましくは早産ヒト乳児、またはＲＳＶ感染による入院のリスクを有するヒト乳児に投与する。更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む予防用、治療用または医薬組成物を、高齢者またはグループホーム（例えば、養護施設またはリハビリセンター）の居住者または免疫無防備状態の個体に投与する。
【０１６６】
ＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する、高アフィニティのおよび／または強力なインビボ抑制性抗体および／または中和抗体またはその抗原結合性フラグメントを、ＲＳＶ感染の予防およびＲＳＶ感染の治療の両方のために使用することが好ましい。ＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する、高アフィニティのおよび／または強力なインビボ抑制性抗体および／または中和抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを、ＲＳＶ感染の予防およびＲＳＶ感染の治療の両方のために使用することも好ましい。そのような抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質および／またはＦ糖タンパク質の断片に対するアフィニティを有する。
【０１６７】
本発明の抗体および機能的等価体（例えば、その抗原結合性フラグメント）はＲＳＶ  Ｆタンパク質内のエピトープを認識する。該エピトープを特異的に認識する抗体またはその機能的等価体は、既に公知である、異なるエピトープに結合するＲＳＶ特異的抗体、例えばパリビズマブ、Ｄ２５、ＡＭ１４、ＡＭ１６およびＡＭ２３と組合されうる。該エピトープを特異的に認識する本発明の抗体または機能的等価体を公知ＲＳＶ特異的抗体と組合せることにより、同じ療法中に２以上の異なるＲＳＶエピトープが認識される。このように、ＲＳＶに対する、より強力な免疫原性応答および／またはＲＳＶに対する、より高い抗体特異性が得られうる。ＲＳＶに対する、より強力な免疫原性応答およびより高い特異性により、そのような組合せは、ＲＳＶ関連障害の、より有効な治療および／または予防をもたらしうる。
【０１６８】
１以上のＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する本発明の１以上の抗体またはそのフラグメントは予防剤として身体において局所的または全身的に使用されうる。本発明の抗体またはそのフラグメントはまた、他のモノクローナルもしくはキメラ抗体、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７およびＩＬ−１５）（これらは、例えば、該抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるように働く）と組合せて有利に使用されうる。本発明の抗体またはそのフラグメントはまた、他のモノクローナルもしくはキメラ抗体、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７およびＩＬ−１５）（これらは、例えば、免疫応答を増強するように働く）と組合せて有利に使用されうる。本発明の抗体またはそのフラグメントはまた、ＲＳＶ感染を治療するために使用される１以上の薬物、例えば抗ウイルス剤と組合せて有利に使用されうる。
【０１６９】
本発明の抗体またはフラグメントは以下の薬物の１以上と組合せて使用されうる：ＮＩＨ−３５１（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、組換えＲＳＶワクチン（Ａｖｉｒｏｎ）、ＲＳＶｆ−２（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、Ｆ−５００４２（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）、Ｔ−７８６（Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）、ＶＰ−３６６７６（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）、ＲＦＩ−６４１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＶＰ−１４６３７（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）、ＰＦＰ−１およびＰＦＰ−２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＲＳＶワクチン（Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）ならびにＦ−５００７７（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）。
【０１７０】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、単独で、または他のタイプの治療（例えば、ホルモン療法、免疫療法および抗炎症剤）と組合せて投与されうる。一般に、患者と同じ種である種起源または種反応性（抗体の場合）の産物の投与が好ましい。したがって、好ましい実施形態においては、ヒトまたはヒト化抗体、フラグメント誘導体、類似体または核酸は、治療または予防のために、ヒト患者に投与される。
【０１７１】
「対象」は哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、サル［例えば、カニクイザル、例えば、マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］またはウサギである。本発明の好ましい実施形態においては、対象はヒト対象である。
【０１７２】
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、単独で、または抗ウイルス療法と組合せて使用されうる。
【０１７３】
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、単独で、または別のＲＳＶモノクローナル抗体と組合せて使用されうる。
【０１７４】
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、単独で、または別のＲＳＶワクチンと組合せて使用されうる。
【０１７５】
「組合される（組合せて）」なる語は、本発明の方法において投与される成分（例えば、抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）およびペンブロリズマブ）が、同時運搬のために単一組成物へと製剤化されることが可能であり、あるいは２以上の組成物（例えば、キット）に別々に製剤化されることが可能であることを示す。各成分は、その他の成分が投与される時点とは異なる時点で対象に投与されうる。例えば、各投与は、ある時間にわたって、幾つかの間隔をあけて非同時（例えば、別々または連続的）に行われうる。更に、そのような別々の成分は、同じ経路または異なる経路によって対象に投与されうる。
【０１７６】
実験的および診断的用途
本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）はアフィニティ精製剤として使用されうる。このプロセスにおいては、当技術分野でよく知られた方法を用いて、該抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントを固相、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、ガラスもしくはアガロース樹脂または濾紙上に固定化する。該固定化抗体またはフラグメントを、精製すべきｈＲＳＶ  Ｆタンパク質（またはその断片）を含有するサンプルと接触させ、ついで、該固定化抗体またはフラグメントに結合したｈＲＳＶ  Ｆタンパク質タンパク質以外のサンプル中の実質的に全ての物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、該結合ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば、プロテインＡ）を溶出する溶媒で該支持体を洗浄する。そのような固定化抗体およびフラグメントは本発明の一部を形成する。
【０１７７】
更に、例えば、ウエスタンブロットおよび本明細書に記載されている他のイムノアッセイを行うのに有用である二次抗体を産生させるための抗原を提供する。特に、本明細書に開示されている治療用抗体（例えば、ＲＢ１）の可変領域および／またはＣＤＲ配列を含み、例えば治療場面において該抗体の存在を特異的に検出するために使用される抗イディオタイプ抗体を産生させるために使用されうるポリペプチドを開示する。
【０１７８】
抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメントはまた、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質に関する検出アッセイにおいて、例えば、特定の細胞、組織または血清におけるその発現を検出するのに有用でありうる。そのような診断方法は種々の疾患診断において有用でありうる。
【０１７９】
本発明は、本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）の使用を含むＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）を含む。
【０１８０】
例えば、そのような方法は以下の工程を含む：
（ａ）抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントで基体（例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えばプラスチックプレートの表面）をコーティングすること；
（ｂ）ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質の存在に関して試験されるべきサンプルを該基体に適用すること；
（ｃ）該プレートを洗浄して、該サンプル中の未結合物質を除去すること；
（ｄ）ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原に同様に特異的である検出可能な様態で標識された抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用すること；
（ｅ）該基体を洗浄して、未結合標識抗体を除去すること；
（ｆ）標識抗体が酵素結合体である場合には、酵素により蛍光シグナルに変換される化学物質を適用すること；および
（ｇ）標識抗体の存在を検出すること。
【０１８１】
該基体に結合した標識の検出はｈＲＳＶ  Ｆタンパク質の存在を示す。
【０１８２】
もう１つの実施形態においては、該標識抗体またはその抗原結合性フラグメントはペルオキシダーゼで標識され、これはＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な変色をもたらす。あるいは、該標識抗体またはフラグメントは、検出可能な放射性同位体（例えば、３Ｈ）で標識され、これは、シンチラントの存在下、シンチレーションカウンターにより検出されうる。
【０１８３】
本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）はウエスタンブロットまたは免疫−タンパク質ブロット法において使用されうる。そのような方法は本発明の一部を構成し、例えば以下のことを含む。
【０１８４】
（１）当技術分野で公知の方法（例えば、半乾燥ブロッティングまたはタンクブロッティング）を用いて、ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質の存在に関して試験すべきサンプル由来の（例えば、サンプル中のタンパク質のＰＡＧＥまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分離からの）タンパク質を膜または他の固体基体上へ所望により移し、結合ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片の存在に関して試験すべき膜または他の固体基体を本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させること。
【０１８５】
そのような膜は、例えば、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにおいてｈＲＳＶの存在に関して試験すべきタンパク質が（例えば、該ゲルにおける電気泳動分離の後で）トランスファー（転移）されたニトロセルロースまたはビニル系（例えば、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ））膜の形態をとりうる。該膜を該抗ｈＲＳＶ抗体またはフラグメントと接触させる前に、所望により、該膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合するように、該膜を例えば脱脂乾燥乳などでブロッキングしてもよい。
【０１８６】
（２）該膜を１回以上洗浄して、未結合抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはフラグメントおよび他の未結合物質を除去すること；ならびに
（３）結合した抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはフラグメントを検出すること。
【０１８７】
結合抗体またはフラグメントの検出は、該膜または基体上および該サンプル中にｈＲＳＶタンパク質が存在することを示す。該結合抗体またはフラグメントの検出は、検出可能な様態で標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）に該抗体またはフラグメントを結合させ、該二次抗体の存在を検出することによるものでありうる。
【０１８８】
本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は免疫組織化学的方法にも使用されうる。そのような方法は本発明の一部を構成し、例えば、
（１）ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質の存在に関して試験すべき細胞を本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、
（２）該細胞上または細胞内の該抗体またはフラグメントを検出することを含む。
【０１８９】
該抗体またはフラグメント自体が検出可能な様態で標識されている場合、それは直接的に検出されうる。あるいは、検出可能な様態で標識された二次抗体に該抗体またはフラグメントを結合させ、該標識を検出することが可能である。
【０１９０】
医薬組成物および投与
本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体および抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）の医薬組成物または無菌組成物を製造するためには、該抗体またはその抗原結合性フラグメントを医薬上許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。
【０１９１】
治療用および診断用物質の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液または懸濁液の形態で、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造されうる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。１つの実施形態においては、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを１〜２０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ５〜７）中で適当な濃度まで希釈し、所望により、浸透圧のためにＮａＣｌまたはスクロース（例えば、２〜１５％（ｗ／ｖ））を加えてもよい。安定性を増強するために、追加的物質、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０が０．０１〜０．１０％（ｗ／ｖ）で加えられうる。代表的な製剤は１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、７％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０（ｐＨ６．０）である。
【０１９２】
単独で又は別の治療剤と組合せて投与される本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントの毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により決定されうる。毒性効果と治療効果との用量比は治療係数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の決定において使用されうる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。該投与量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。
【０１９３】
投与方法は様々でありうる。投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮または動脈内が含まれる。好ましい投与方法は筋肉内、静脈内および鼻腔内である。
【０１９４】
特定の実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、侵襲的経路、例えば注射により投与されうる。本発明の更に詳細な実施形態においては、抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたはその医薬組成物は静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、または吸入、エアゾール運搬により投与される。非侵襲性経路（例えば、経口的、例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤）による投与も本発明の範囲内である。
【０１９５】
本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）またはその医薬組成物のいずれかを含む容器（例えば、プラスチックまたはガラスバイアル、例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空穿孔針またはシリンジシリンダーを有するもの）を提供する。本発明はまた、本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）またはその医薬組成物のいずれかを含む注射装置を提供する。注射装置は、非経口経路、例えば筋肉内、皮下または静脈内経路により患者の体内に物質を導入する装置である。例えば、注射装置はシリンジ（例えば、医薬組成物が予め充填されたもの、例えば、自動注入装置）であることが可能であり、これは、例えば、注射すべき流体（例えば、抗体もしくはフラグメントまたはその医薬組成物）を保持するためのシリンダーまたは筒状物、該流体の注射のために皮膚および／または血管を穿刺するための針、ならびに該シリンダーから及び針穿孔を介して該流体を押出すプランジャーを含む。本発明の１つの実施形態においては、本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたはその医薬組成物を含む注射装置は静脈内（ＩＶ）注射装置である。そのような装置は、カニューレまたはトロカール／針を介して患者の体内に導入される流体（例えば、生理食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２を含み、所望によりグルコースを含む乳酸リンゲル液）を保持するためのバッグ（袋）またはリザーバ（貯蔵容器）に接続されうるチューブに接続されうるカニューレまたはトロカール／針の中に該抗体もしくはフラグメントまたはその医薬組成物を含む。本発明の１つの実施形態においては、トロカールおよびカニューレが対象の静脈内に挿入され、挿入カニューレからトロカールが取り外されたら、該抗体もしくはフラグメントまたはその医薬組成物が装置内に導入されうる。ＩＶ装置は、例えば、（例えば、手または腕における）末梢静脈内；上大静脈または下大静脈、または心臓の右心房（例えば、中央ＩＶ）内；あるいは鎖骨下、内頚、または大腿静脈に挿入されることが可能であり、例えば、それが上大静脈または右心房（例えば、中心静脈線）に達するまで、心臓に向けて進入可能である。本発明の１つの実施形態においては、注射装置は自動注入装置、ジェットインジェクターまたは外部注入ポンプである。ジェットインジェクターは、該抗体もしくはフラグメントまたはその医薬組成物を患者の体内へ導入するために、表皮に浸透する液体の高圧ナロー（ｎａｒｒｏｗ）ジェットを使用する。外部注入ポンプは、制御された量の該抗体もしくはフラグメントまたはその医薬組成物を患者の体内に運搬する医療装置である。外部注入ポンプは電気的または機械的に駆動されうる。ポンプは、ポンプによって異なる様態で作動する。例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバ内に流体を保持し、可動式ピストンが流体運搬を制御し、弾性（ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ）ポンプは伸縮性バルーンリザーバ内に流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力が流体運搬を駆動する。蠕動ポンプにおいては、１組のローラーが可撓性チューブの或る長さを絞り込んで、流体を前方へ押出す。マルチチャネルポンプにおいては、流体は複数のリザーバから複数の速度で運搬されうる。
【０１９６】
本明細書に開示されている医薬組成物は、例えば米国特許第６，６２０，１３５号、第６，０９６，００２号、第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されている装置のような無針（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ）皮下注射装置によっても投与されうる。該医薬組成物を含むそのような無針装置も本発明の一部である。本明細書に開示されている医薬組成物は注入によっても投与されうる。医薬組成物を投与するための良く知られたインプラントおよびモジュールの例には、米国特許第４，４８７，６０３号（これは、制御された速度で医薬を分注するための移植可能な微量注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２３３号（これは、正確な注入速度で医薬を運搬するための医薬注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２２４号（これは、連続的薬物運搬のための可変流量移植可能注入装置を開示している）、米国特許第４，４３９，１９６号（これは、マルチチャンバ・コンパートメントを有する浸透性薬物運搬系を開示している）に開示されているものが含まれる。多数の他のそのようなインプラント、運搬系およびモジュールは当業者によく知られており、本発明の医薬組成物を含むものは本発明の範囲内である。
【０１９７】
投与レジメンは、該治療用抗体または抗原結合性フラグメントの血清または組織代謝回転速度、症状の程度、該予防用／治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近可能性を含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小にすると同時に標的罹患状態の改善をもたらす十分な治療用抗体またはフラグメントを運搬する。したがって、運搬される生物学的物質の量は、部分的には、個々の予防用／治療用抗体および治療される状態の重症度に左右される。治療量抗体またはフラグメントの適当な用量を選択する際の指針が入手可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら，２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら，１９９９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎら，２００１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら，２０００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら，２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら，２０００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照されたい）。
【０１９８】
適当な用量の決定は、例えば、予防または治療に影響を及ぼすことが当技術分野で知られている又は疑われているパラメータまたは因子を用いて、臨床家によりなされる。一般に、用量は、最適用量より幾分少ない量から開始し、ついで、負の副作用と比較して所望または最適効果が得られるまで、少しずつ増量する。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。一般に、使用される生物学的物質を、治療のために標的化される動物と同じ種から誘導し、それにより該薬剤に対する免疫応答を最小にすることが望ましい。例えば、ヒト対象の場合には、ヒト化抗体および完全ヒト抗体が望ましいかもしれない。
【０１９９】
本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、連続的注入により、または例えば、毎日、週１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、毎年などで投与される用量で投与される。投与は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔内、直腸内、筋肉内、大脳内、髄腔内投与または吸入により行われうる。毎週の全用量は、一般には、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ以上である（例えば、Ｙａｎｇら，２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄら，２００２，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕら，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１５１−１４４を参照されたい）。また、用量は、対象の血清中の抗ｈＲＳＶ抗体の所定の目標濃度、例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上を達成するように投与されうる。他の実施形態においては、本発明の抗ｈＲＳＶ抗体は、例えば、皮下または静脈内に、毎週、隔週、「４週間ごと」、毎月、隔月または年４回、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で投与される。
【０２００】
本明細書中で用いる「有効量」なる語は、単独で又は追加的な治療／予防剤と共に細胞、組織または対象に投与された場合に、ＲＳＶを中和する及び／又はＲＳＶ感染に関連した疾患もしくは状態の症状の１以上を予防する若しくは該症状の１以上における測定可能な改善を引き起こすのに有効である、本発明の抗ｈＲＳＶまたはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）の量を意味する。有効量は更に、症状の少なくとも部分的な予防または改善をもたらすのに十分な該抗体またはフラグメントの量を意味する。有効量は、単独で投与される個々の有効成分に適用される場合には、その成分のみに関するものである。有効量は、組合せ体に適用される場合には、連続投与または同時投与のいずれで組合せ投与されるかにかかわらず、予防または治療効果をもたらす、有効成分の組合された量を意味する。ある実施形態においては、有効量は、５カ月間にわたって１０μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬの臨床目標血清濃度をもたらす量である。１つの実施形態においては、有効量は、標準的な前臨床コットンラットモデルにおいて測定された場合に、有効性に関して１０μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌのトラフ濃度（Ｃｔｒｏｕｇｈ）目標を与える、ヒトにおける用量である。
【０２０１】
キット
更に、本明細書に記載されている医薬上許容される担体および／または予防／治療剤（これらに限定されるものではない）を含む１以上の追加的成分と共に、本明細書に開示されている抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）（これらに限定されるものではない）を含む１以上の成分を含むキットを提供する。該抗体もしくはフラグメントおよび／または該予防／治療剤は、純粋な組成物として、または医薬組成物において医薬上許容される担体と組合せて製剤化されうる。
【０２０２】
１つの実施形態においては、該キットは、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）またはその医薬組成物を１つの容器（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル）内に、そしてその医薬組成物および／または予防／治療剤をもう１つの容器（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル）内に含む。
【０２０３】
もう１つの実施形態においては、該キットは、単一の共通の容器内に、所望により医薬組成物において、一緒に製剤化される１以上の予防／治療剤と所望により組合されていてもよい、本発明の抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）と医薬上許容される担体とを含む、本発明の組合せを含む。
【０２０４】
該キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を含む場合、該キットは、そのような投与を行うための装置を含みうる。例えば、該キットは前記の１以上の皮下針または他の注射装置を含みうる。
【０２０５】
該キットは、該キットにおける医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含みうる。一般に、そのような情報は、封入されている医薬組成物および剤形を有効かつ安全に使用することにおいて患者および医師を補助する。例えば、本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書（インサート）において供給されうる：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメータ、適応症および用法、禁忌、警告、予防策、有害反応、過剰投薬、適切な投与量および投与、供給方法、適切な保存条件、参考資料、製造業者／流通業者情報ならびに特許情報。
【０２０６】
検出用キットおよび予防用／治療用キット
便宜上、本発明の抗ｈＲＳＶ抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＲＢ１）は、キットとして、すなわち、診断用または検出用アッセイを行うための説明を伴う所定量の試薬のパッケージ化された組合せとして提供されうる。該抗体またはフラグメントが酵素で標識されている場合には、該キットは、該酵素により要求される基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体）を含む。また、他の添加物、例えば安定剤、バッファー（例えば、ブロッキングバッファーまたは細胞溶解バッファー）などが含まれうる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度をもたらすように大きく変動しうる。特に、該試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解時に与える賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として提供されうる。
【０２０７】
また、例えばＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型または競合形態）のようなイムノアッセイを含む種々の検出アッセイにおいて使用される１以上のそのような試薬を含む診断用または検出用試薬およびキットを提供する。キットの成分は固体支持体に予め結合していることが可能であり、あるいはキットが使用される際に固体支持体の表面に適用されることが可能である。本発明の幾つかの実施形態においては、シグナル生成手段は、本発明の抗体またはフラグメントが予め結合した状態で提供されることが可能であり、あるいは使用前に１以上の成分、例えばバッファー、抗体−酵素コンジュゲート、酵素基質などと一緒にすることを要しうる。キットはまた、追加的な試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質などを含みうる。該固相表面はチューブ、ビーズ、マイクロタイタープレート、ミクロスフェア、またはタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドを固定化するのに適した他の材料の形態でありうる。特定の態様においては、化学発光性もしくは発色性産物の形成または化学発光性もしくは発色性基質の還元を触媒する酵素がシグナル生成手段の成分の１つである。そのような酵素は当技術分野でよく知られている。キットは、本明細書に記載されている捕捉剤および検出試薬のいずれかを含みうる。所望により、キットは、本発明の方法を実施するための説明をも含みうる。
【０２０８】
また、容器、例えばバイアルまたはボトル内にパッケージングされた抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントを含み、更に、該容器に貼付またはパッケージングされたラベルを含むキットを提供し、該ラベルは該容器の内容物を記載し、本明細書に記載されている１以上の病態を予防／治療するための該容器の内容物の使用に関する指示および／または説明を提供する。
【０２０９】
１つの態様においては、該キットは、ＲＳＶ感染に関連した疾患／状態を予防または治療するためのものであり、抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびもう１つの予防／治療剤またはワクチンを含む。該キットは、所望により、更に、非経口投与用、例えば静脈内投与用のシリンジを含みうる。もう１つの態様においては、該キットは、抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントを含み、そしてまた、該ワクチンまたはもう１つの治療剤と共に該抗体またはフラグメントを使用することを示す、容器に貼付またはパッケージングされたラベルを含む。更にもう１つの態様においては、該キットは、該ワクチンまたはもう１つの予防／治療剤を含み、そしてまた、該抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体またはフラグメントと共に該ワクチンまたはもう１つの予防／治療剤を使用することを示す、容器に貼付またはパッケージングされたラベルを含む。ある実施形態においては、抗ｈＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体およびワクチンまたはもう１つの予防／治療剤は別個のバイアル内に存在し、あるいは同じ医薬組成物中で一緒になっている。
【０２１０】
併用予防または療法の場合、２つの予防／治療剤の共投与は、それらの物質がそれらの予防／治療効果を奏する期間の重複が存在する限り、それらの物質が同時に又は同じ経路によって投与されることを要しない。異なる日または週の投与と同様に、同時または連続投与が想定される。
【０２１１】
本明細書に開示されている抗体、ペプチド、抗原結合性フラグメントまたはポリヌクレオチドの少なくとも１つと、検出試薬または予防／治療剤として該組成物を使用するための説明とを含む、本明細書に開示されている予防／治療用キットおよび検出用キットも調製されうる。そのようなキットにおいて使用される容器は、典型的には、該検出用および／または予防／治療用組成物の１以上が配置されうる、そして好ましくは、適切にアリコート化されうる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の適当な容器を含みうる。第２の予防／治療剤も提供される場合には、該キットは、この第２の検出用および／または予防／治療用組成物が配置されうる第２の異なる容器をも含有しうる。あるいは複数の化合物が単一医薬組成物において調製可能であり、単一収容手段、例えばバイアル、フラスコ、シリンジ、ボトルまたは他の適当な単一容器内にパッケージングされうる。本明細書に開示されているキットはまた、典型的には、商業的販売のために密封された、該バイアルを収容するための手段、例えば、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器を含む。放射能標識、発色性、蛍光性または他のタイプの検出可能な標識または検出手段が該キット内に含まれる場合、標識剤は検出用または予防／治療用組成物自体と同じ容器において提供されることが可能であり、あるいは、第２の組成物が配置されうる、そして適切にはアリコート化されうる第２の異なる収容手段内に配置されうる。あるいは検出試薬および標識は単一収容手段において調製されることが可能であり、ほとんどの場合、該キットは、典型的には、商業的販売および／または簡便な包装（パッケージング）および運搬のために密封して該バイアルを収容するための手段をも含む。
【０２１２】
本明細書に記載されている検出またはモニタリング方法を実施するための装置または器具をも提供する。そのような装置は、サンプルが入れられうるチャンバーまたはチューブ、サンプルの流れを装置に通すためのバルブまたはポンプを所望により含んでいてもよい流体処理系、血液から血漿または血清を分離するための所望により含まれていてもよいフィルター、捕捉剤または検出試薬の添加のための混合チャンバー、および捕捉剤免疫複合体に結合した検出可能な標識の量を検出するための所望により含まれていてもよい検出装置を含みうる。サンプルの流れは受動的（例えば、サンプルが適用されたら該装置の更なる操作を要しない毛管力、流体静力または他の力によるもの）または能動的（例えば、機械ポンプ、電気浸透ポンプ、遠心力または空気圧の増加により生じる力の適用によるもの）でありうる。
【０２１３】
他の実施形態においては、プロセッサ、コンピュータ可読メモリおよびルーチン（これは、コンピュータ可読メモリ上で保存され、本明細書に記載されている方法のいずれかを実施するためにプロセッサ上で実行されるように適合化される）をも提供する。適当なコンピューティングシステム、環境および／または設定の例には、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ハンドヘルドまたはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースシステム、セットトップボックス、プログラマブルコンシューマエレクトロニクス、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、前記のシステムまたはデバイスのいずれかを含む分散コンピューティング環境、あるいは当技術分野で公知のいずれかの他のシステムが含まれる。
【０２１４】
一般的方法
分子生物学における標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２，１９８９  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎおよび２００１  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．に記載されている。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも記載されており、これは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載している。
【０２１５】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製のための方法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照されたい）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造、精製およびフラグメント化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前掲）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０２１６】
一本鎖抗体およびジアボディが記載されている（例えば、Ｍａｌｅｃｋｉら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：２１３−２１８；Ｃｏｎｒａｔｈら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７３４６−７３５０；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−２６２９０；ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１７７−１８９；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。二官能性抗体が提供されている（例えば、Ｍａｃｋら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７０２１−７０２５；Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：７−１５；Ｖｏｌｋｅｌら（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：８１５−８２３；Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：１−６；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｒａｓｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７６２３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９；ならびに米国特許第５，９３２，４４８号、第５，５３２，２１０号および第６，１２９，９１４号を参照されたい）。
【０２１７】
二重特異性抗体も提供されている（例えば、Ａｚｚｏｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４９３；Ｋｉｔａら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７４：９１１５；Ｐａｎｄｅｙら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８６３３；Ｚｈｅｎｇら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：１２９９９；Ｐｒｏｐｓｔら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２１４；Ｌｏｎｇ（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８７５を参照されたい）。
【０２１８】
抗体は例えば小薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲート化されうる。抗体は治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例えば色素、放射性同位体、酵素または金属、例えばコロイド金に結合した抗体を包含する（例えば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；ＨｓｉｎｇおよびＢｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９を参照されたい）。
【０２１９】
蛍光標識細胞分取検出系（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチドおよび抗体を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓｙ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０２２０】
免疫系の標準的な組織学的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【０２２１】
例えば抗原フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、ヒトＲＳＶ  Ｆ融合前（Ａ）および融合後（Ｂ）タンパク質に対するヒトＲＳＶ抗体Ｄ２５、パリビズマブおよびＲＢ１の結合曲線（ＥＬＩＳＡからのもの）を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株（Ａ）およびＲＳＶ  Ｂ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株（Ｂ）におけるヒトＲＳＶ抗体の中和曲線を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、融合Ｆタンパク質のアラニンスキャニング突然変異誘発によるＲＢ１のエピトープマッピング（Ａ）、および融合前Ｆ結晶構造上のエピトープマッピング残基（Ｂ）を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、肺においてＤ２５と比較された場合の、抗体の濃度に対してプロットされたＲＳＶ  Ａのコットンラットチャレンジモデル（Ａ）、および抗体の濃度に対してプロットされたＲＳＶ  Ｂチャレンジ（Ｂ）における、ＲＢ１の有効性、またはＲＳＶ  Ａチャレンジ（Ｃ）およびＲＳＶ  Ｂチャレンジ（Ｄ）に関する、抗体の用量に対してプロットされた、組織内に存在するウイルス粒子（ＰＦＵ／ｇ）を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、鼻においてＤ２５と比較された場合の、抗体の濃度に対してプロットされたＲＳＶ  Ａのコットンラットチャレンジモデル（Ａ）、および抗体の濃度に対してプロットされたＲＳＶ  Ｂチャレンジ（Ｂ）における、ＲＢ１の有効性、またはＲＳＶ  Ａチャレンジ（Ｃ）およびＲＳＶ  Ｂチャレンジ（Ｄ）に関する、抗体の用量に対してプロットされた、組織内に存在するウイルス粒子（ＰＦＵ／ｇ）を示す。
【図６】図６はヒトＲＳＶ  Ａ  Ｆタンパク質に対するヒトＲＳＶ抗体ＲＢ１＋ＹＴＥの結合曲線（ＥＬＩＳＡからのもの）を示す。
【図７】図７は、ＹＴＥ突然変異セットを有するモタビズマブに対するＲＢ１−ＹＴＥ（ＲＢ１＋ＹＴＥ）のアカゲザルにおける薬物動態特性を示す。
【０２２３】
実施例
実施例１：完全ヒトＲＳＶ中和抗体の特定
強力なＨＲＳＶ中和抗体を特定するために、血清を、インフォームドコンセントを得たドナーから得、インビトロでＨＲＳＶウイルスを中和する能力に関してアッセイした。該中和アッセイのために、まず、血清サンプルを系列希釈し、ついで、増強した緑色蛍光タンパク質を発現する６００ｐｆｕのｈＲＳＶ−Ａ株（ＲＳＶ−ＧＦＰ）と共にインキュベートした。９６ウェルＵ底プレートにおいて、ウェルあたり２００μｌの全容量中、ＲＳＶ−ＧＦＰを血清稀釈物と１：１で３７℃で１時間混合した。ついで、ウェル当たり１００μｌの該混合物をＨＥｐ−２細胞播種プレート（ウェル当たり１５，０００細胞）に移した。プレートをａｃｕｍｅｎ（登録商標）Ｃｅｌｌｉｓｔａ（ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）でスキャンし、データをＧＦＰ事象の数および総蛍光強度（ウェル当たり）としてエクスポートした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、４パラメータ曲線フィッティングによりＮＴ５０値を計算した。ＲＳＶ  前Ｆ（ｐｒｅ−Ｆ）タンパク質および後Ｆ（ｐｏｓｔ−Ｆ）タンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合力価の測定を以下のとおりに行った。Ｎｕｎｃ  Ｃ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）をウェル当たり５０μｌのｈＲＳＶ  前Ｆ（ＭｃＬｅｌｌａｎら，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２：５９２を参照されたい）または後Ｆタンパク質（融合後Ｆ  ＬＺＦ２１タンパク質は、融合ペプチドを伴わないｗｔＦエクトドメインからなる（ＭｃＬｅｌｌｅｎら，２０１１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８５：７７８８を参照されたい））（ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩コーティングした。該プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ついでＰＢＳ中の３％  脱脂乳でブロッキングした。ついで５０μｌの系列希釈血清サンプルをウェルごとに加え、室温で９０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を１：２，０００希釈で加えた。１時間後、プレートを洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ溶液（ＶｉｒｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）で発色させた。Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＶＩＣＴＯＲ２（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、ＯＤ４５０ｎｍの読取り値を得た。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して、４パラメーター曲線フィッティングによりＥＣ５０値を計算した。高いＨＲＳＶ中和および結合力価を示したドナーの集団を呼び戻して、ＰＢＭＣを得るために、より大きな血液容量を得た。ＰＢＭＣの調製は商業的ベンダーによって行われ、購入したＰＢＭＣをその後の使用まで液体窒素において保存した。
【０２２４】
１名の被験者からのＰＢＭＣが良好な中和力価を示し、融合後Ｆタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて最高力価をも示し、融合前Ｆタンパク質に対する選り抜きの（エリート）結合体でもあった（データ非表示）。したがって、このドナーのＰＢＭＣを、ＦＡＣＳソーティングにより後Ｆ特異的記憶Ｂ細胞を単離するために選択した。
【０２２５】
ＥＺ  Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン化キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を製造業者の説明に従い使用してＬＺＦ２１（ＭｃＬｅｌｌｅｎら，２０１１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８５：７７８８）をビオチン化することにより、ビオチン化三量体融合後Ｆタンパク質（ＬＺＦ２１）を製造した。ＬＺＦ２１タンパク質は、融合ペプチドを伴わない野生型Ｆタンパク質エクトドメインからなる（ＭｃＬｅｌｌｅｎら，２０１１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８５：７７８８）。融合Ｆタンパク質特異的マウスハイブリドーマ４Ｄ７（４Ｄ７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＲＳＶ  Ａ２ウイルスで免疫化することにより作製されたマウスハイブリドーマである）。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＲＳＶ  Ａ２ウイルスで２回、腹腔内に免疫化し、静脈注射により２０μｇの精製ＲＳＶ  Ａ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用して融合の３日前に追加免疫した。脾臓を回収し、ポリエチレングリコールを使用して脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。細胞を培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）に加え、２４５ｍｍ×２４５ｍｍの正方形ペトリ皿内でプレーティングし、３７℃、５％  ＣＯ２で２週間インキュベートした。個々のコロニーを、ＣｌｏｎｅＰｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用して採取し、９６ウェルプレートに移し、前記のとおりに１週間インキュベートした。ついで精製ＲＳＶ  Ａ２に対するＥＬＩＳＡにより抗ＲＳＶ活性に関して上清をスクリーニングした。４Ｄ７を含む陽性クローンを増殖させ、限界希釈により更にサブクローニングした。前記のとおりにサブクローンをスクリーニングし、４Ｄ７−８を特定し、ＦＡＣＳによる記憶Ｂ細胞に対するＬＺＦ２１−ビオチンの染色を最適化するために使用した（データ非表示）。これらの最適化実験により、１．５μｇ／ｍｌのＬＺＦ２１−ビオチンが後Ｆ特異的記憶Ｂ細胞の染色のための最良濃度であると決定された。無関係なマウスハイブリドーマを陰性対照として使用し、１００〜１０００倍過剰の非標識ＬＺＦ２１との結合を競合させることにより、該染色反応の特異性が実証された。
【０２２６】
抗原特異的記憶Ｂ細胞はＣＤ３−ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋ＬＺＦ２１＋として示された。これらの細胞を、ＣＤ４０リガンド発現性ＨＥＫ２９３細胞系（標準的な分子生物学技術を用いて作製された）およびＩＬ−２１（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ  Ｗａｌｅｓ，ＰＡ）を含有する９６ウェルプレート（１細胞／ウェル）内に選別した。３０個の選別サンプルのうち、６個のウェルからの上清がＥＬＩＳＡアッセイ（前記のとおりに行った）において後Ｆタンパク質への結合を示した。これらのサンプルは前Ｆタンパク質にも結合する（データ非表示）。ついでこれらの６個のサンプルを、前記のとおりに、希釈することなく中和アッセイにおいて試験した。ＧＦＰ事象の減少に基づいて中和活性の存在が確認された。６個のサンプルのうちの２個（ＲＢ１およびＲＢ１１と称される）がＨＲＳＶ−Ａ株の完全な中和を示した（表３を参照されたい）。
【表３】
2019503648.tif 000005
【０２２７】
単一選別記憶Ｂ細胞培養のためのＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＴ
第１部：
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のマニュアルに従い使用して、ＲＢ１ヒットライセートからの９６ウェルプレートからのＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度を、ＵＶ２６０ｎｍでＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して測定した。リーダー配列（フォワード）およびＩｇＧ  ＪＨ、カッパ定常領域またはラムダ定常領域のＣ’末端（リバース）からの配列を使用するプライマー配列を使用する抗体重鎖および軽鎖遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅における鋳型として、ＲＢ１ウェルからの抽出ＲＮＡを使用した。
【０２２８】
ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者の説明に従い使用して、抗体配列を増幅した。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：５０℃で３０分間、９５℃で１５分間、［９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間］×４０、７２℃で１０分間および４℃で保持。
【０２２９】
該ＲＴ−ＰＣＲ産物をネステッドＰＣＲの鋳型として直接使用した。
【０２３０】
第２部：ネステッドＰＣＲ
該ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：１２３５５−０１２）を使用して抗体可変領域を増幅するためのネステッドＰＣＲにおける鋳型として使用した。ネステッドＰＣＲプライマーの設計は、ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖可変領域のフレームワーク１領域の生殖系列配列に基づいていた。
【０２３１】
１μｌのＲＴ−ＰＣＲ産物を２．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー、２．５μｌの１０×ＰＣＲＸ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物、０．５μｌのフォワードプライマープール（それぞれ１０μＭ）、０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼおよび１７μの水と混合した。ネステッドＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で１分間の１０サイクル、ついで９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間の３０サイクル、ついで６８℃で７分間の伸長し、ついで短期保存のための４℃での保持。
【０２３２】
ＶＨおよびＶＫまたはＶＨおよびＶＬ増幅ＰＣＲ産物のＲＢ１ネステッドＰＣＲ産物を、抗体軽鎖および重鎖遺伝子を一緒にアニーリングするための特異的リンカーとのオーバーラップＰＣＲにおける鋳型として用いて、次工程のインフュージョンクローニングを容易にした。
【０２３３】
第３部：オーバーラップＰＣＲおよびインフュージョンクローニング
ｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこの反応において使用した。クローニングベクター内へのオーバーラップＰＣＲ産物のインフュージョンクローニングが容易となるように、フォワードおよびリバースプライマーを設計した。１μｌの重鎖ネステッドＰＣＲ産物、１μｌの軽鎖ネステッドＰＣＲ産物および１μｌのリンカーを５μｌの１０×ＰＣＲバッファー、５μｌの１０×ＰＣＲＸエンハンサー、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、１μｌのｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼおよび３３μｌの水と混合した。
【０２３４】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間、［９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で２分間］×１０、［９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で２分間］×３０，６８℃で７分間、４℃で保持。
【０２３５】
オーバーラップＰＣＲ産物をインフュージョンクローニングのためにアガロースゲルで精製した（約１．２ｋｂのＲＢ１  ＶＨ＋ＶＫオーバーラップＰＣＲ産物が得られた）。インフュージョンクローニングを適用して、ＲＢ１  ＶＨ＋ＶＫオーバーラップＰＣＲ産物をｐＭａｂ１１Ｅｘｐ２（軽鎖発現の場合にはＯｍｐＡリーダー配列を伴い、重鎖発現の場合にはＰｅｌＢリーダー配列を伴う）ベクター内にクローニングした。Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ（登録商標）クローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用し、製造業者の説明に従った。形質転換体を採取し、配列決定のためにＧｅｎｅＷｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）へ送った。
【０２３６】
配列決定の結果をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）で分析した。
【０２３７】
ＲＢ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表７に示す（患者の単離ＲＢ１可変重鎖および可変軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９および配列番号８に示されている）。ヌクレオチド変化を有するＪｈリバースプライマーの設計ゆえに、天然配列の１２５位に存在するイソロイシンは発現タンパク質においてはトレオニンに変化した（得られたＲＢ１可変重鎖は配列番号７に示されている）。コドン最適化およびヒトＩｇＧ１変換ならびにＣＨＯ一過性発現および産生のために、ＲＢ１抗体重鎖および軽鎖可変ドメイン遺伝子のアミノ酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ送った。合成ＤＮＡをＣＨＯ−３Ｅ７細胞発現のためにｐＴＴ５ベクター内にサブクローニングした。各抗体の重鎖および軽鎖をコードする組換えプラスミドをＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養物内に一過性にコトランスフェクトした。第６日に回収された細胞培養上清をプロテインＡカラムによる精製に使用した。精製されたＲＢ１ヒトＩｇＧ１を、実施例２に記載されている中和アッセイおよび他の特徴づけ実験において使用した。
【０２３８】
実施例２：抗ｈＲＳＶ抗体の特徴づけ
実施例１に記載されているＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＲＢ１は前Ｆおよび融合後Ｆタンパク質の両方に結合したが（ＥＣ５０は１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲であった）、Ｄ２５抗体（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓら，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：１２３−１２８を参照されたい）は融合前Ｆに優先的に結合した。図１Ａ〜Ｂを参照されたい。
【表４】
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【０２３９】
ＲＢ１、ＲＢ１１および文献に報告されている幾つかの基準抗体（Ｄ２５、パリビズマブ、完全長［Ｄ２５抗体は公開配列に基づいて社内で製造され、ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）（パリビズマブ）はＭｙｏｄｅｒｍ，Ｎｏｒｒｉｓｔｏｗｎ，ＰＡから購入された］）に関する中和をＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６（商標））およびＲＳＶ  Ｂ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株１８５３７株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５８０（商標））において比較した。試験サンプルを、２％  熱不活性化ＦＢＳで補足されたＥＭＥＭ中、１１個の希釈点にわたって３倍系列希釈した。ついで該系列希釈サンプルを、１００ｐｆｕ／ウェルのＲＳＶ  ＡまたはＢ株を含有する２％  熱不活性化ＦＢＳで補足された等体積のＥＭＥＭと混合した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、１．５×１０５細胞／ｍｌの濃度の１００μｌのＨＥｐ−２細胞を、該ウイルス／抗体混合物を含有する９６ウェルプレートに移した。感染後の第３日に、該細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ついで８０％  アセトン中で室温で１０分間固定した。ＲＳＶ  Ｆ（ｍＡｂ１４３−Ｆ３−Ｂ１３８）とＲＳＶ  Ｎ（３４Ｃ９）特異的マウスｍＡｂ（社内で入手したもの）との混合物を該プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧをプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄した。赤外色素−ストレプトアビジンを、ＲＳＶ特異的シグナルを検出するために使用し、アッセイ標準化のための２つの細胞染色剤を９６ウェルプレートに加え、暗所で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、暗所で２０分間風乾させ、細胞標準化のためには７００チャンネルレーザーを使用し、ＲＳＶ特異的シグナルの検出のためには８００チャンネルレーザーを使用して、Ｌｉｃｏｒ  Ａｅｒｉｕｓ（登録商標）自動イメージングシステムで読取った。８００／７００比および中和率（％）を計算し、ＩＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄにおける４パラメーター曲線フィットにより決定した。
【０２４０】
ＲＢ１はＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂ株を等しい効力（１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０）で中和することが可能であった。ＲＢ１はまた、基準抗体と比較して優れた抗ＲＳＶ中和を示した。図２Ａ〜Ｂおよび表４を参照されたい。
【表５】
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【０２４１】
融合前および融合後Ｆタンパク質へのＲＢ１の結合に関するアフィニティ測定：
抗ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体ＲＢ１（実施例１に記載されているとおりに製造）の動力学的結合活性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴により測定した。約５０００ＲＵの抗マウスＩｇＧ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１００８−３８、または約１３，０００ＲＵのヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆｃガンマ、フラグメント特異的，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１１２−００６−０７１をアミンカップリング化学法によりＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップ（カタログ番号ＢＲ−１００５−３０）上に固定化した。
【０２４２】
会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）ならびに平衡解離定数ＫＤを分析するために、バックグラウンド減算結合センサーグラムを使用した。得られたデータセットを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン２．０）を使用して、１：１ラングミュア結合モデルでフィットさせた。表５は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態および融合後形態に対する抗ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体のアフィニティを要約したものである。
【表６】
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【０２４３】
ＲＢ１は、〜３１ｐＭのＫｄを有する、融合前Ｆタンパク質の非常に強力な結合体である。融合後結合のＫｄは下方の０．４１ｎＭの大きさであった。国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４１２１０２１  Ａ１に報告されているＤ２５のＫｄは５７ｐＭであった。また、融合後Ｆタンパク質と比較して、１．４×１０−４の、より遅い解離速度からも分かるとおり、融合前Ｆ上では、抗体ＲＢ１は、融合後の場合より長く留まった。
【０２４４】
実施例３：ＲＢ１抗体のエピトープマッピング
融合Ｆタンパク質上のＲＢ１の結合エピトープを、アラニンスキャン突然変異誘発実験を行うことによりマッピングした。エピトープマッピングは、記載されているとおりに（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＤｏｒａｎｚ，２０１４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３（１）：１３−２０）、Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒにおいてショットガン突然変異誘発により行われた。ショットガン突然変異誘発ライブラリーを構築するために、ＲＳＶ−Ｆタンパク質発現ベクターを突然変異誘発させて、クローンのライブラリーを得る。そのそれぞれは、個々の点突然変異体を表し、該タンパク質内の全ての残基を累積的にカバーする。各残基の側鎖寄与を定めるためのより制御された方法をもたらすアラニンスキャニング突然変異誘発を用いて、ライブラリーを構築した。半自動ロボットプロトコールを用いて、各突然変異プラスミドを個々にクローニングし、配列決定し、ミニプレップし、ヒト細胞における反復トランスフェクション、発現および抗体結合アッセイのために３８４ウェルマイクロプレートフォーマット内でアレイ化した。アラニンスキャニング突然変異体ライブラリーを、抗体結合の喪失に関してＲＢ１に対してスクリーニングした。アルギニン−４２９およびイソロイシン−４３２の２つの残基がＲＢ１結合に決定的に重要であることが確認された。後記および図３Ａを参照されたい。ＲＢ１はＩＶ部位モノクローナル抗体（１０１Ｆ様）であるようであり、文献におけるＩＶ部位結合抗体は融合前Ｆおよび融合後Ｆの両方に結合すると報告されている。
【表７】
2019503648.tif 000009
【０２４５】
本発明者らは更に、結合エピトープをよりよく理解するために、融合前Ｆタンパク質を伴うＲＢ１  Ｆａｂを共結晶化した。３．４〜３．５オングストロームで結晶から回折データを収集した。ＲＢ１抗体は重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲループとの相互作用を介して融合前Ｆタンパク質に結合する。軽鎖ＣＤＲ３ループは、Ｐｈｅ９１およびＬｅｕ９２のカルボニル酸素とＡｒｇ４２９のグアニジノ窒素との間の２つの水素結合の形成を介してＡｒｇ４２９の側鎖と相互作用する。また、軽鎖上では、ＣＤＲ２ループ上のＡｓｐ５０およびＧｌｕ５５は、ＲＳＶのＡｓｎ４２６およびＬｙｓ４４５と水素結合を形成するように位置している。ＲＢ１の重鎖のＣＤＲ３ループを介して広範囲の相互作用が生じ、Ｔｙｒ１０４およびＴｙｒ１１０はＲＳＶ上のＩｌｅ４３２とのファンデルワールス相互作用の表面を形成する。ＲＳＶのＬｙｓ  ４３３はＣＤＲ３ループのＡｓｎ  １０７と水素結合を形成する。結晶構造から、ＲＢ１の軽鎖はまた、ＲＳＶ融合前三量体のＧｌｕ１６１およびＳｅｒ１８２または隣接単量体に詰め寄る（ｐａｃｋ）。
【０２４６】
ＲＢ１に関して特定された結合エピトープは、文献に報告されている９４６個中９４４個のＦタンパク質配列の間で高度に保存されている。これは、この領域に対する抗体に対する耐性（抵抗性）が低いと予想されることを示唆している。
【０２４７】
実施例４：動物モデルにおけるＲＳＶ抗体の抗ＲＳＶ活性
コットンラットチャレンジモデルにおいて防御をもたらすために、ＲＢ１抗体をＤ２５およびパリビズマブと比較した。この研究は、２．５ｍｇ／ｋで与えられ０．２５ｍｇ／ｋｇまで１０倍系列希釈されたパリビズマブ、Ｄ２５およびＲＢ１抗体を含んでいた。受動免疫療法のこのモデルにおいて、コットンラットにＲＢ１、Ｄ２５またはパリビズマブを第０日に種々の濃度で与え、１日後に１０５  ｐｆｕのＲＳＶで該ラットをチャレンジした。チャレンジＲＳＶウイルスの鼻および肺の力価をチャレンジの４日後に測定し、プラークアッセイによりウイルス排出を決定するために用いた。
【０２４８】
コットンラット：平均体重約１００グラムの３〜７週齢の少なくとも５匹のコットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））をＳＡＧＥ  Ｌａｂｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）から入手した。通常のげっ歯類用飼料および水を自由に与えた。
【０２４９】
抗体試薬：凍結乾燥パリビズマブ１００ｍｇ（Ｍｙｏｄｅｒｍ，Ｎｏｒｒｉｓｔｏｗｎ，ＰＡ）を１００ｍｇ／ｍｌで水中に配合（製剤化）した。その他の抗体は社内で発現され、精製された。
【０２５０】
抗体試薬の製剤化：製剤化バッファーは各抗体に特異的にタンパク質を安定化させ、沈殿を予防するものであった。製剤化は以下のとおりであった：ＲＢ１およびＤ２５を１×リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）中で希釈した。パリビズマブを、製造業者の推奨に従い、２５ｍＭ  ヒスチジンおよび１．３ｍＭ  グリシン（ｐＨ６．０）中で該タンパク質を有効に緩衝化する蒸留水中に溶解することにより製剤化した。
【０２５１】
投与溶液の調製、投与および分析：
用いたコホートの平均体重を決定するために、５匹の動物を無作為に秤量した。製剤は、動物への投与の約１時間前に調製した。抗体の凍結ストックを湿潤氷上で１回の解凍で解凍した。各抗体を、各群に投与される適切な用量濃度に希釈した。第０日（研究の開始時）に、各群に無作為に割り付けられた動物を１〜４％  イソフルラン麻酔で軽く鎮静させ、２６Ｇシリンジおよび針で右四頭筋内に０．１ｍｌを筋肉内投与した。動物は２分以内に鎮静効果から回復した。約２４時間後（＋／−  ２時間）、コットンラットを１〜４％  イソフルランで鎮静させ、眼窩後叢から採血した後、直ちにＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地中の１×１０５．５  ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２またはＲＳＶ  Ｂ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ野生型ウイルスを鼻孔経由で投与した。接種の４日後、動物をＣＯ２吸入により犠死させ、肺（左葉）および鼻甲介を摘出し、湿潤氷上のスクロースリン酸グルタミンバッファー（ＳＰＧ）を含有するハンクス平衡塩溶液（Ｌｏｎｚａ）（１０倍体積）中でホモジナイズした。サンプルを２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により清澄化し、アリコート化し、急速凍結し、直ちに、プラークアッセイにおける試験まで−７０℃で凍結保存した。
【０２５２】
図４Ａ〜Ｄおよび図５Ａ〜Ｄに示されているとおり、ＲＢ１は、Ｄ２５と同様に、そしてパリビズマブ（これは鼻においてウイルス力価に影響を及ぼすことができなかった）より良好に、２．５ｍｐｋの用量でＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの両方に関してウイルス力価における２〜３  ｌｏｇの減少を肺および鼻において達成することが可能であった。
【０２５３】
実施例５：ＲＢ１のＦｃ改変
ＩｇＧに対する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は母体から胎児への受動的体液性免疫の伝達において十分に特徴づけられている。また、一生を通して、ＦｃＲｎはＩｇＧを分解から保護し、それにより、血清中のこのクラスの抗体の長い半減期が説明される。例えば、Ｉｓｒａｅｌら，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８９：５７３−８を参照されたい。ＦｃＲｎは、補体のＣ１ｑ成分または古典的ＦｃγＲの結合部位とは異なる部位においてＩｇＧのＦｃ部分に結合する。ＦｃＲｎ−Ｆｃ共結晶構造は、ＦｃＲｎがＩｇＧ抗体のＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域に結合することを示した。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ経路の顕著な特徴は絶対（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ｐＨ依存性である。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合はリソソームにおける酸性ｐＨ（６．０）により駆動され、一方、解離は細胞外環境の中性ｐＨ（７．４）で生じる。リソソームにおける酸性化（ｐＨ６．０〜６．５）は低マイクロモルのアフィニティでのＩｇＧのＦｃ領域へのＦｃＲｎの結合を可能にし、異化からそれを保護する。ついで該保護ＦｃＲｎ結合ＩｇＧは細胞表面へと往復運搬され、細胞外環境中に放出される。この過程は、細胞外分解へのそれらの曝露を低減することにより、抗体を保護する。
【０２５４】
半減期を改善するためにＲＢ１抗体をＦｃ改変に付した。ＲＢ１＋ＹＴＥは、ＲＢ１のＦｃ部分に導入された三重突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ））を有するＲＢ１の誘導体である。このＹＴＥの突然変異の組合せは新生児Ｆｃ受容体への抗体結合を改善して、ヒトにおけるより長い半減期をもたらす。例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４を参照されたい。モタビズマブのＦｃ領域内の３つのアミノ酸における突然変異（ＹＴＥ：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）はヒトおよびサルの両方に関してｐＨ６．０でインビトロＦｃＲｎ結合における１０倍の増加をもたらして、サルにおいてインビボ血清半減期における４倍の増加をもたらした。Ｒｏｂｂｉｅら，２０１３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５７：６１４７−５３を参照されたい。
【０２５５】
コドン最適化およびヒトＩｇＧ１変換ならびにＣＨＯ一過性発現および産生のために、ＲＢ１＋ＹＴＥ抗体重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に送った。ＲＢ１＋ＹＴＥのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表７に示す。
【０２５６】
合成ＤＮＡをＣＨＯ−３Ｅ７細胞発現のためにｐＴＴ５ベクター内にサブクローニングした。各抗体の重鎖および軽鎖をコードする組換えプラスミドをＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養物内に一過性にコトランスフェクトした。第６日に回収された細胞培養上清をプロテインＡカラムによる精製に使用した。精製ＲＢ１＋ＹＴＥヒトＩｇＧ１を中和アッセイおよび他の特徴づけ実験に使用した。
【０２５７】
実施例６：ＲＢ１＋ＹＴＥの特徴づけ
実施例１に記載されているとおりに行ったＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＲＢ−１＋ＹＴＥはＦタンパク質に結合し、ＥＣ５０は１．９７〜２．４５７ｎｇ／ｍｌの範囲であった。図６を参照されたい。ＲＢ１＋ＹＴＥおよび文献（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ，ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１０１５８９８５）に報告されている基準抗体（公開配列に基づいて社内で製造された）に関する中和をＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６（商標））およびＲＳＶ  Ｂ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株１８５３７株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５８０（商標））において比較した。試験サンプルを、２％  熱不活性化ＦＢＳで補足されたＥＭＥＭ中、１１個の希釈点にわたって３倍系列希釈した。ついで該系列希釈サンプルを、１００ｐｆｕ／ウェルのＲＳＶ  ＡまたはＢ株を含有する２％  熱不活性化ＦＢＳで補足された等体積のＥＭＥＭと混合した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、１．５×１０５細胞／ｍｌの濃度の１００μｌのＨＥｐ−２細胞を、該ウイルス／抗体混合物を含有する９６ウェルプレートに移した。感染後の第３日に、該細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ついで８０％  アセトン中で室温で１０分間固定した。ＲＳＶ  Ｆ（ｍＡｂ１４３−Ｆ３−Ｂ１３８）とＲＳＶ  Ｎ（３４Ｃ９）特異的マウスｍＡｂ（ｍＡｂ１４３−Ｆ３−Ｂ１３８および３４Ｃ９は、それぞれの抗原でのマウスの免疫化およびハイブリドーマ技術を用いるＢ細胞の不死化により誘導された社内抗体である）との混合物を該プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧをプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄した。赤外色素−ストレプトアビジンを、ＲＳＶ特異的シグナルを検出するために使用し、アッセイ標準化のための２つの細胞染色剤を９６ウェルプレートに加え、暗所で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、暗所で２０分間風乾させ、細胞標準化のためには７００チャンネルレーザーを使用し、ＲＳＶ特異的シグナルの検出のためには８００チャンネルレーザーを使用して、Ｌｉｃｏｒ  Ａｅｒｉｕｓ（登録商標）自動イメージングシステムで読取った。８００／７００比および中和率（％）を計算し、ＩＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄにおける４パラメーター曲線フィットにより決定した。
【０２５８】
ＲＢ−１＋ＹＴＥはＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂ株を同等効力（５〜１０ｎｇ／ｍｌＩＣ５０）で中和することが可能であった。表６を参照されたい。
【表８】
2019503648.tif 000010
【０２５９】
ＲＢ１のＦｃ部分におけるＹＴＥ突然変異の導入は、ＲＳＶ  ＡおよびＢ株を中和する該抗体のインビトロ効力を変化させなかった。ＲＳＶ  Ａのインビトロ中和効力は、ＲＢ１およびＲＢ１＋ＹＴＥに関して、それぞれ、３および３．６ｎｇ／ｍｌであった。ＲＳＶ  Ｂのインビトロ中和効力は、ＲＢ１およびＲＢ１＋ＹＴＥに関して、それぞれ、１．７および３．４９ｎｇ／ｍであった。Ｂｉｏｃｏｒｅにより測定された速度定数はＲＢ１およびＲＢ１＋ＹＴＥに関して類似していたが、このことは、抗体のＦｃ領域におけるＹＴＥの導入がその抗原結合特性を変化させなかったことを示唆している。
【０２６０】
非ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）薬物動態研究がＮｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＬ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＬＡ）において実施された。生物製剤未処置の８頭の雄アカゲザルを無作為化し、２つの研究群の１つに割り付けた（ｎ＝４／群）。各動物はＲＢ１＋ＹＴＥまたはモタビズマブ−ＹＴＥ（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一静脈内（ｉ．ｖ．）用量の投与を受けた。第０日、投与後の０．５、１、３、８および２４時間の時点、ならびに投与後の第１、２、３、５、７および１０日に、血液サンプルを採取した。アカゲザル血清中のＲＢ１＋ＹＴＥ（ヒト×［ＲＳＶ］ｍＡｂ（ＲＢ１−ＹＴＥ）ＩｇＧ１／カッパ（ＣＥ））およびモタビズマブ ＹＴＥ（ヒト化×［ＲＳＶ］ｍＡｂ  ＩｇＧ１／カッパ）の両方を定量するために、ＥＣＬ系イムノアッセイを用いた。
【０２６１】
該アッセイは捕捉試薬としてのビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧカッパ鎖（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および検出試薬としてのスルホＴＡＧマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用した。該アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、最小必須希釈度（ＭＲＤ）が２０の場合、１．３７ｎｇ／ｍｌであると決定された。
【０２６２】
ＲＢ１＋ＹＴＥおよびモタビズマブ−ＹＴＥを定量するために、同じイムノアッセイを用いて、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されたアカゲザルにおいて、ＲＢ１＋ＹＴＥおよびモタビズマブ−ＹＴＥの薬物動態を最大１０日間評価した。各動物に関して、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｗｉｎｎｏｎｌｉｎ  ６．３（Ｃａｒｔａｒａ，ＮＪ）を使用して、非コンパートメントモデルを各動物の血清濃度データにフィットさせて、曲線下面積（ＡＵＣ０〜１０日）を推定した。ＡＵＣ０〜１０日を各処理群に関して４頭の動物にわたって平均し、平均±標準偏差として表した。ＲＢ１＋ＹＴＥに関しては、ＡＵＣ０〜１０日＝１１５９±１１６μｇ／ｍＬ＊日であり、モタビズマブ−ＹＴＥに関しては、ＡＵＣ０〜１０日＝１３８１±６３．０μｇ／ｍＬ＊日である。
【０２６３】
ＲＢ１＋ＹＴＥ（図の凡例においてはＲＢ１−ＹＴＥとして示されている）およびモタビズマブ−ＹＴＥは、アカゲザルにおいて、類似した血清濃度プロファイルおよび薬物動態を示した。図７を参照されたい。ＮＨＰにおけるＲＢ１＋ＹＴＥ  ＰＫは、文献で報告されているカニクイザルにおけるモタビズマブ−ＹＴＥ  ＰＫと同等であることも判明した。Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：２３５１４−２４を参照されたい。
【０２６４】
本明細書中に引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、そのような引用が、参照により組み入れるという宣誓陳述の直前直後にない場合であっても、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許［それらのそれぞれは３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従い明らかに特定されるものである］に関連づけることを出願人が意図しているものである。参照により組み入れるという宣誓陳述が明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的（ｇｅｎｅｒａｌ）陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。
【０２６５】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲に含まれると意図される。
【表９】
2019503648.tif 000011
【０２６６】
2019503648.tif 000012
【０２６７】
2019503648.tif 000013
【０２６８】
2019503648.tif 000014
【０２６９】
2019503648.tif 000015
【図１Ａ】
2019503648.tif 000016
【図１Ｂ】
2019503648.tif 000017
【図２Ａ】
2019503648.tif 000018
【図２Ｂ】
2019503648.tif 000019
【図３Ａ】
2019503648.tif 000020
【図３Ｂ】
2019503648.tif 000021
【図４Ａ】
2019503648.tif 000022
【図４Ｂ】
2019503648.tif 000023
【図４Ｃ】
2019503648.tif 000024
【図４Ｄ】
2019503648.tif 000025
【図５Ａ】
2019503648.tif 000026
【図５Ｂ】
2019503648.tif 000027
【図５Ｃ】
2019503648.tif 000028
【図５Ｄ】
2019503648.tif 000029
【図６】
2019503648.tif 000030
【図７】
2019503648.tif 000031
【配列表】
2019503648000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月25日(2018.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
１）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメント、
２）配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む重鎖可変領域および／または配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメント、および
３）配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む重鎖可変領域および／または配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体のフレームワーク領域内にいずれかの配列変異が存在するもの
からなる群から選択される、軽鎖免疫グロブリン、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖および重鎖の両方の免疫グロブリンを含む、請求項１に記載のヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫＤ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する、請求項１または２記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む抗体と同じヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または類似技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）により測定された場合に約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫＤ値でヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
該抗体が、以下の相互作用、すなわち、
１）軽鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｐｈｅ９１およびＬｅｕ９２を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９の側鎖と相互作用し、該相互作用は、ＣＤＲ３ループ内のＰｈｅ９１およびＬｅｕ９２のカルボニル酸素とヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９のグアニジノ窒素との間の２つの水素結合の形成によるものである；
２）軽鎖ＣＤＲ２ループが、残基Ａｓｐ５０およびＧｌｕ５５を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｓｎ４２６およびＬｙｓ４４５と水素結合を形成する；
３）重鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｔｙｒ１０４およびＴｙｒ１１０を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質上のＩｌｅ４３２とのファンデルワールス相互作用のための表面を形成する；
４）重鎖ＣＤＲ３ループが、Ａｓｎ１０７を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＬｙｓ４３３と水素結合を形成する；ならびに
５）軽鎖がＲＳＶ融合前三量体の隣接単量体のＧｌｕ１６１およびＳｅｒ１８２に詰め寄る
の１以上を介してヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する、請求項４記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
該抗体が、以下の相互作用、すなわち、
１）軽鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｐｈｅ９１およびＬｅｕ９２を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９の側鎖と相互作用し、該相互作用は、ＣＤＲ３ループ内のＰｈｅ９１およびＬｅｕ９２のカルボニル酸素とヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｒｇ４２９のグアニジノ窒素との間の２つの水素結合の形成によるものである；
２）軽鎖ＣＤＲ２ループが、残基Ａｓｐ５０およびＧｌｕ５５を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＡｓｎ４２６およびＬｙｓ４４５と水素結合を形成する；
３）重鎖ＣＤＲ３ループが、残基Ｔｙｒ１０４およびＴｙｒ１１０を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質上のＩｌｅ４３２とのファンデルワールス相互作用のための表面を形成する；
４）重鎖ＣＤＲ３ループが、Ａｓｎ１０７を介して、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質のＬｙｓ４３３と水素結合を形成する；ならびに
５）軽鎖がＲＳＶ融合前三量体の隣接単量体のＧｌｕ１６１およびＳｅｒ１８２に詰め寄る
の全てを介してヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する、請求項５記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
該抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
各軽鎖が、配列番号８を含む可変領域およびヒトカッパ軽鎖（配列番号１４）を含み、各重鎖が、配列番号７を含む可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１３）を含む、２本の軽鎖と２本の重鎖とを有する完全長抗体である請求項７記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
該抗体が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項７記載の単離された抗体。
【請求項１０】
重鎖のアミノ酸配列が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２５のアミノ酸配列からなる、請求項８記載の単離された抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ抗体である、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
ＣＨＯ細胞において産生される抗体である、前記請求項のいずれか１項記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
配列番号７または８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２３または２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載のポリペプチドのいずれか１つをコードする単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５または１６記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の抗体、抗原結合性フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２０】
インフルエンザ、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパラインフルエンザ（ｈＰＩＶ）、ヒトライノウイルス（ｈＲＶ）、マイコプラズマ・ニューモニア（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アデノウイルス、ボカウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルスまたはＢＫウイルスから選択される呼吸器病原体に対する抗体またはその抗原結合性フラグメントを更に含む、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
呼吸器病原体がインフルエンザ、ｈＣＭＶ、ｈＭＰＶ、ｈＰＩＶ、ノロウイルスまたはＢＫウイルスである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
１）請求項１〜１２記載の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれか１つの重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養し、
２）所望により、該抗体または抗原結合性フラグメントを該宿主細胞および／または培地から回収することを含む、抗体または抗原結合性フラグメントの製造方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントと、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  Ｇタンパク質ならびにそれらの断片から選択される抗原とを含む免疫原性組成物。
【請求項２４】
サンプルを請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体またはフラグメントと接触させ、該抗体またはフラグメントとペプチドとの複合体の存在を検出することを含む、サンプルにおけるヒトＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはその断片の存在を検出するための方法であって、該複合体の検出がＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の存在を示す、方法。
【請求項２５】
１）感染または感染症を予防または治療するための、あるいは
２）感染性合併症による呼吸器疾患および移植疾患を予防または治療するための
医薬の製造における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項２６】
ＲＳＶ感染の予防または治療のための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項１９〜２１のいずれか１項記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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2019503648.tif 000033
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