(57)【要約】本開示は、内因性ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ（ＴＦＬ）遺伝子の活性が低下した遺伝的に改変されたイチゴ植物（例えば、プラグ苗）を生育させるための方法に関する。上記遺伝的に改変されたイチゴ植物は、Ｆｒａｇａｒｉａ属のものである。ＴＦＬ１活性が低下した遺伝的に改変されたイチゴ植物は、低地、高地、北緯、南緯のうちのいずれかに位置する苗床において、または制御された環境設備において生育される。ＴＦＬ１活性が低下した遺伝的に改変されたイチゴ植物のイチゴ果実の収量は、従来どおり生育させたプラグ苗より高い。本開示の植物は、ｐＳＩＭ２４４１ベクターで形質転換される。
2019532643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ（ＴＦＬ）遺伝子によってコードされる転写因子の活性が低下した遺伝的に改変されたプラグ苗を生育させるための方法であって、該方法は、該プラグ苗を、苗床位置において基材中または基材上で生育させる工程であって、ここで該遺伝的に改変されたプラグ苗は、温度または光周期とは無関係に開花する工程、を包含する方法。
【請求項２】
前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、Ｆｒａｇａｒｉａ属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、Ｆｒａｇａｒｉａ属のハイブリッド植物または栽培品種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ、またはＦｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、二倍体、四倍体、五倍体、六倍体、八倍体、十倍体であるか、または特徴づけられていない倍数性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、イチゴ植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、一季成りイチゴ植物、早生一季成りイチゴ植物、中早生一季成りイチゴ植物、中生一季成りイチゴ植物、中晩生一季成りイチゴ植物、晩生一季成りイチゴ植物、短日性イチゴ植物品種、一季咲きイチゴ植物品種、長日性イチゴ植物品種、中日性イチゴ植物品種、四季咲き性イチゴ植物品種、反復性イチゴ植物品種、二季咲きイチゴ植物品種、長日性イチゴ植物品種、または四季成りイチゴ植物品種である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記苗床位置は、（１）低地、（２）高地、（３）北半球の商業的果実生産のために北緯、（３）南半球の商業的果実生産のために南緯であるか、または（４）制御された環境設備にある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＦＬ遺伝子によってコードされる前記転写因子の活性が低下した前記遺伝的に改変されたプラグ苗からのイチゴ果実の収量は、同じ条件下で生育された場合に、遺伝的に改変されていないプラグ苗からのイチゴ果実の収量より多い、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＦＬ遺伝子によってコードされる前記転写因子の活性が低下した遺伝的に改変されたプラグ苗を生育させるための前記基材は、燻蒸農薬で処理されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記燻蒸農薬は、臭化メチル、１，３−ジクロロプロペン、トリクロロニトロメタン、クロロピクリン、ヨウ化メチル、テトラヒドロ−３，５−ジメチル−２Ｈ−１，３，５−チアジアジン−２−チオン、Ｎ−メチルジチオカルバミン酸ナトリウム、Ｎ−メチルジチオカルバミン酸カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＦＬ遺伝子は、ＴＦＬ１遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＦＬ１遺伝子は、配列番号１、配列番号４、配列番号２、配列番号５、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号３、配列番号６、もしくは配列番号８のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＦＬ１遺伝子の活性の低下は、遺伝子発現レベルの低下、遺伝子コピー数の低下、遺伝子増幅の低下、ＲＮＡ活性レベの低下ル、ｍＲＮＡ存在量の低下、ｍＲＮＡ合成速度の低下、ｍＲＮＡ安定性の低下、タンパク質活性レベルの低下、タンパク質合成の低下、タンパク質存在量の低下、タンパク質安定性の低下、タンパク質酵素活性の低下、タンパク質リン酸化の低下、またはこれらの組み合わせを含む群から選択される方法によって達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＦＬ１遺伝子の活性の低下は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ゲノム編集、または内因性ＴＦＬ１遺伝子の変異によって誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ干渉は、前記Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞における前記内因性ＴＦＬ１遺伝子を標的化するＲＮＡｉカセットの発現によって、または該内因性ＴＦＬ１遺伝子を標的化するＲＮＡｉトリガーの局所適用によって、誘導される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲノム編集は、前記Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ媒介性ヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの発現によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記内因性ＴＦＬ１遺伝子の変異は、化学的変異誘発、放射線変異誘発、トランスポゾン変異誘発、挿入変異誘発、背番号付き変異誘発、部位特異的変異誘発、および／または自然変異誘発によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写因子ＴＦＬの活性が低下した前記遺伝的に改変されたプラグ苗は、長日性品種、短日性品種、または中日性品種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆｒａｇａｒｉａ植物における内因性ＴＦＬ１遺伝子の活性を低下させるための方法であって、該方法は、該Ｆｒａｇａｒｉａ植物をｐＳＩＭ２４４１ベクターで形質転換する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記ｐＳＩＭ２４４１ベクターは、配列番号１４のヌクレオチド配列の挿入領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記挿入領域は、発現カセットを含み、ここで該発現カセットは、前記ＴＦＬ１遺伝子のフラグメントのセンスコピーおよびアンチセンスコピーを作動可能な連結において同じ鎖上に含み、ここで該フラグメントの該センスコピーおよび該アンチセンスコピーは、形質転換されたＦｒａｇａｒｉａ植物の細胞において発現される場合に、遺伝子サイレンシングに十分な長さを有し、そして該発現カセットは、一緒に作動可能に連結された、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１４のヌクレオチド配列の挿入領域を含む、前記ｐＳＩＭ２４４１ベクターで形質転換されたＦｒａｇａｒｉａ植物またはプラグ苗。
【請求項２４】
前記Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞において発現される場合の前記発現カセットは、前記内因性ＴＦＬ１の活性の低下を引き起こす、請求項２３に記載の形質転換されたＦｒａｇａｒｉａ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本特許出願は、２０１７年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４０２，５８２号に対する優先権を主張し、その利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ（ＴＦＬ）遺伝子によってコードされる転写因子の活性が低下した遺伝的に改変されたイチゴプラグ苗を育て、より高収量のイチゴ果実を生じさせることに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
従来のイチゴは、光サイクルおよび温度のような環境信号を使用して、開花を調節する。このプロセスは、春化といわれる。従来の商業的イチゴ生産では、イチゴプラグ苗は、春化が起こる最初の生育期の間は苗圃で育てる。プラグ苗の従来の商業的イチゴ生産は、代表的には、（１）高地苗圃、（２）北半球の商業的果実生産のためのより北緯に位置する苗圃、（３）南半球の商業的果実生産のためのより南緯に位置する苗圃、または（４）制御された環境設備において行われる。プラグ苗は、苗圃から、商業的果実生産のための異なる圃場へと輸送される。従来の商業的イチゴ生産では、春化は、より高い全収量のイチゴを生産するために必要である。
【０００４】
この従来の商業的イチゴ栽培慣習の欠点としては、以下が挙げられる：１）燻蒸農薬を要する土壌中の害虫および／または病原体への、苗圃中の植物の曝露；２）苗床と果実生産圃場との間で植物を移動させる輸送コスト；ならびに３）苗圃および果実生産圃場のための増加した面積の使用。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本開示は、植物生産（例えば、イチゴ植物生産）を遺伝的に増強するための組成物および方法を提供する。本開示の植物は、苗床での春化工程を必要としない。それら植物は、温室またはスクリーンハウスの中の滅菌土壌において繁殖され得、天候が良くなったときに適切な時期に果実生産（または商業的生産）圃場に、または通年天候が制御された温室で植え付けることができる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、１種または複数種の改変された遺伝子を有する植物が提供される。いくつかの実施形態において、上記植物は、Ｒｏｓａｃｅａｅ科に属する。いくつかの実施形態において、上記植物は、Ｆｒａｇａｒｉａ属に属する。いくつかの実施形態において、上記植物は、イチゴ植物である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、上記遺伝子は、開花期シグナル伝達経路に関与する。いくつかの実施形態において、上記遺伝子は、ＴＦＬ遺伝子、ＴＦＬ遺伝子を調節する上流の遺伝子、またはＴＦＬ遺伝子によって調節される下流の遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記イチゴ植物における１種または複数種の遺伝子は、ＴＦＬの遮断もしくは阻害、またはＴＦＬによって負に制御されるその下流のシグナル伝達カスケードの活性化および過剰発現をもたらすように改変される。いくつかの実施形態において、上記ＴＦＬ遺伝子は、ＴＦＬ１、ＴＦＬ２、またはＴＦＬ３である。いくつかの実施形態において、上記ＴＦＬ１遺伝子は、配列番号１、配列番号４、配列番号２、配列番号５、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号３、配列番号６、もしくは配列番号８のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＦＬ１遺伝子は、配列番号１、配列番号４、配列番号２、配列番号５、配列番号７、または配列番号３、配列番号６、もしくは配列番号８のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＦＬ１遺伝子の低下した活性は、任意の適切な方法によって達成される。いくつかの実施形態において、上記方法としては、遺伝子発現レベルの低下、遺伝子コピー数の低下、遺伝子増幅の低下、ＲＮＡ活性レベルの低下、低下したｍＲＮＡ存在量の低下、低下したｍＲＮＡ合成速度、低下したｍＲＮＡ安定性、低下したタンパク質活性レベル、タンパク質合成、タンパク質存在量の低下、タンパク質安定性の低下、タンパク質酵素活性の低下、タンパク質リン酸化の低下、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＴＦＬ遺伝子（例えば、ＴＦＬ１遺伝子）の低下した活性は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ゲノム編集、または内因性ＴＦＬ遺伝子の変異によって誘導される。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡ干渉は、Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞における上記内因性ＴＦＬ遺伝子を標的化するＲＮＡｉカセットの発現によって、または上記内因性ＴＦＬ遺伝子を標的化するＲＮＡｉトリガーの局所適用によって、誘導される。いくつかの実施形態において、上記ゲノム編集は、Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ媒介性ヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの発現によるものである。いくつかの実施形態において、上記内因性ＴＦＬ遺伝子の変異は、化学的変異誘発、放射線変異誘発、トランスポゾン変異誘発、挿入変異誘発、背番号付き変異誘発、部位特異的変異誘発、および／または自然変異誘発によるものである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記イチゴ植物における１種または複数種の遺伝子は、ＦＴの、またはＦＴによって正に調節されるその下流にあるシグナル伝達カスケードの活性化または過剰発現をもたらすように改変される。いくつかの実施形態において、上記ＦＴ遺伝子は、ＦＴ１（例えば、配列番号２２、配列番号２４、もしくは配列番号２５のＤＮＡ配列を有する遺伝子、または配列番号２３、もしくは配列番号２６のＦＴ１タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を有する遺伝子）である。いくつかの実施形態において、上記ＦＴ遺伝子は、ＦＴ２（ＤＮＡ配列は配列番号２７；ＰＲＴ配列は、配列番号２８または配列番号２９である）である。いくつかの実施形態において、上記ＦＴ遺伝子は、ＦＴ３（ＤＮＡ配列は配列番号３０；ＰＲＴ配列は配列番号３１）である。いくつかの実施形態において、上記ＦＴ遺伝子は、配列番号２２、配列番号２４、もしくは配列番号２５、または配列番号２３もしくは配列番号２６をコードする遺伝子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本開示はまた、植物（例えば、プラグ苗）を育てるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記プラグ苗は、遺伝的に改変されたプラグ苗である。いくつかの実施形態において、上記プラグ苗は、Ｆｒａｇａｒｉａ属のものである。いくつかの実施形態において、上記プラグ苗は、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ、またはＦｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａである。いくつかの実施形態において、上記プラグ苗は、二倍体、四倍体、五倍体、六倍体、八倍体、十倍体であるか、または特徴づけられていない倍数性を有する。いくつかの実施形態において、上記植物は、イチゴ植物である。いくつかの実施形態において、上記プラグ苗は、一季成りイチゴ植物、早生一季成りイチゴ植物、中早生一季成りイチゴ植物、中生一季成りイチゴ植物、中晩生一季成りイチゴ植物、晩生一季成りイチゴ植物、短日性イチゴ植物品種、一季咲きイチゴ植物品種、長日性イチゴ植物品種、中日性イチゴ植物品種、四季咲き性イチゴ植物品種、反復性イチゴ植物品種（recurrent  strawberry  plant  variety）、二季咲きイチゴ植物品種、長日性イチゴ植物品種、または四季成りイチゴ植物品種である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記植物において１種または複数種の開花遺伝子を制御する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、植物生産の間に、上記植物において１種または複数種の開花遺伝子を制御する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記開花遺伝子は、ＴＦＬシグナル伝達カスケードにおける遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記開花遺伝子は、ＴＦＬである。いくつかの実施形態において、上記開花遺伝子は、ＦＴである。
【００１２】
従って、本開示は、遺伝的に改変されたプラグ苗を育てるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変されたプラグ苗は、遺伝的に改変されていないコントロール植物と比較して、ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ（ＴＦＬ）遺伝子によってコードされる転写因子の活性が低下している。ＴＦＬ遺伝子の低下した活性は、いくつかの実施形態において、ＴＦＬによって正に調節されるその下流のシグナル伝達カスケードの低下した活性を包含する。いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変されたプラグ苗は、遺伝的に改変されていないコントロール植物と比較して、Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔ（ＦＴ）の増加した活性を有する。ＴＦＬ遺伝子の増加した活性は、いくつかの実施形態において、ＦＴによって正に調節されるその下流のシグナル伝達カスケードの増加した活性を包含する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記プラグ苗を、苗床において基材中または基材上で生育させる工程であって、ここで上記遺伝的に改変されたプラグ苗は、温度または光周期とは無関係に開花する工程を包含する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、上記苗床位置は、（１）低地、（２）高地、（３）北半球の商業的果実生産のために北緯、（３）南半球の商業的果実生産のために南緯であるか、または（４）制御された環境設備にある。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、旧来から使用されるコンディショニング（conditioning）工程を含まない。旧来は、イチゴプラグ苗は、春化が起こる時間の間の最初の生育サイクルの間に、苗圃において育てる。この最初の生育サイクルの後に、上記プラグ苗は、果実生産圃場または生産圃場へと移す。このような旧来のコンディショニングの間に、燻蒸農薬が、イチゴプラグ苗を感染から予防するために通常使用される。
【００１６】
旧来は、イチゴプラグ苗は、上記最初の生育サイクルの間に、より低地の位置に移す前に、高地で生育される。このような旧来の工程の間に、商業的に生育させるイチゴプラグ苗は、位置としては、海抜約４０００〜５０００フィートの間の高度（例えば、北部カリフォルニア）でコンディショニングさせる。高地でのこのような旧来のコンディショニングの間に、農薬が、イチゴプラグ苗を感染から予防するために通常使用される。イチゴプラグ苗のコンディショニングは、該プラグが高地で育てられることを要求する。代表的には、商業的に生育されるイチゴプラグ苗は、位置としては、海抜４０００〜５０００フィートの間の高度（例えば、北部カリフォルニア）でコンディショニングされる。このような高地は、約６００〜１０００フィート、約１０００−２０００フィート、約２０００〜３０００フィート、約３０００〜４０００フィート、約４０００〜５０００フィート、約５０００〜６０００フィート、またはより高い海抜からなる高度の範囲を含む。本発明の方法は、高地コンディショニングのこの工程を排除し、そしてこのような高地で植物を生育させる必要がない。
【００１７】
本開示の方法は、植物の収量（例えば、果実の収量）を改善する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される遺伝的に改変された植物（例えば、ＴＦＬ遺伝子によってコードされる転写因子の活性が低下している植物、またはＦＴ遺伝子の活性が増加している植物）の果実の収量は、同じ条件下で育てた場合、遺伝的に改変されていないコントロール植物からの果実の収量より多い。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記方法の植物は、農薬（例えば、燻蒸農薬）で処理されていない基材の中で育てる。いくつかの実施形態において、上記基材は、土壌または土基材である。旧来から使用されるコンディショニング工程では、燻蒸農薬は、病原体感染を低下させるために、イチゴプラグ苗が育つ間に使用される。いくつかの実施形態において、燻蒸農薬は、以下である：臭化メチル、１，３−ジクロロプロペン、トリクロロニトロメタン、クロロピクリン、ヨウ化メチル、テトラヒドロ−３，５−ジメチル−２Ｈ−１，３，５−チアジアジン−２−チオン、Ｎ−メチルジチオカルバミン酸ナトリウム、Ｎ−メチルジチオカルバミン酸カリウム、またはこれらの任意の組み合わせ。本出願の方法は、旧来の苗床での春化工程で処理される植物と比較した場合に、燻蒸農薬の必要性を低下または排除する。
【００１９】
本開示の方法は、プラグ苗生育の開始から所望のイチゴ果実の最終生産までに必要な時間量を、少なくとも約６ヶ月間短縮する。結果として、イチゴプラグ苗、およびその後のイチゴ果実の収量は、旧来の苗床での春化工程で処理した植物と比較した場合に、連続開花に起因して、商業的生産圃場において育つ間に増加する。
【００２０】
本開示に一致して、内因性ＴＦＬ１遺伝子の低下した発現を有するイチゴプラグ苗は、温度変化および長日周期と短日周期との間の変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）（別段、春化として公知）とは無関係に生育し得る。従って、本開示は、その形質転換されていない系統によって示される高地コンディショニングの必要性なしに、イチゴ植物を生産するための方法を提供する。
【００２１】
一実施形態において、上記生産されるイチゴは、Ｆｒａｇａｒｉａ属のものである。一実施形態において、イチゴは、米国内の商業的圃場で育てるイチゴの商業的に魅力的な品種である。別の実施形態において、イチゴは、米国外の商業的圃場で育てるイチゴの商業的に魅力的な品種である。一実施形態において、商業的に魅力的な品種は、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａまたはＦｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａであり得る。いくつかの実施形態において、上記Ｆｒａｇａｒｉａ植物は、長日性品種、短日性品種、または中日性品種である。
【００２２】
一実施形態において、上記方法は、ＴＦＬシグナル伝達カスケードをダウンレギュレートする工程を包含する。ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ（ＴＦＬ）シグナル伝達カスケードの調節制御は、環境信号に応じた開花の終了を妨げる。一実施形態において、上記方法は、ＴＦＬ１遺伝子、ＴＦＬ２遺伝子、またはＴＦＬ３遺伝子の抑制によってＴＦＬシグナル伝達カスケードをダウンレギュレートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記ＴＦＬ１遺伝子は、配列番号１または配列番号４の配列を有する。別の実施形態において、上記ＴＦＬ１遺伝子のコード領域（ｃＤＮＡ）は、配列番号２、配列番号５、または配列番号７の配列を有する。別の実施形態において、上記ＴＦＬ１遺伝子のタンパク質配列は、配列番号３、配列番号６、または配列番号８の配列を有する。一実施形態において、上記抑制は、ＲＮＡｉ、ゲノム編集ツールまたは任意の他の適切な遺伝子編集ツールであり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態において、Ｆｒａｇａｒｉａ植物における内因性ＴＦＬ１遺伝子の発現の抑制は、抑制ベクター（例えば、ｐＳＩＭ２４４１ベクター）でのＦｒａｇａｒｉａ植物の形質転換を用いて行われる。いくつかの実施形態において、上記ｐＳＩＭ２４４１ベクターは、配列番号１４のヌクレオチド配列の挿入領域を含む。さらなる実施形態において、上記挿入領域は、形質転換されたＦｒａｇａｒｉａ植物の細胞において発現された場合に内因性ＴＦＬ１遺伝子の抑制を引き起こす発現カセットを含む。一実施形態において、上記ＲＮＡｉ発現カセットＦａＴＦＬは、作動可能に連結された配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、内因性ＴＦＬ遺伝子における変異は、非天然の手段（例えば、化学的変異誘発、放射線変異誘発、トランスポゾン変異誘発、挿入変異誘発、背番号付き変異誘発、部位特異的変異誘発、および自然変異誘発を用いる）によって、Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞に導入される。
【００２５】
本開示はまた、Ｆｒａｇａｒｉａ植物において内因性ＴＦＬ１遺伝子の活性を低下させるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記Ｆｒａｇａｒｉａ植物を、本明細書で記載されるとおりのｐＳＩＭ２４４１ベクターで形質転換する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記ｐＳＩＭ２４４１ベクターは、配列番号１４のヌクレオチド配列の挿入領域を含む。いくつかの実施形態において、上記挿入領域は、発現カセットを含み、ここで上記発現カセットは、上記ＴＦＬ１遺伝子のフラグメントのセンスコピーおよびアンチセンスコピーを、作動可能な連結において同じ鎖上に含み、ここで上記フラグメントのセンスコピーおよびアンチセンスコピーは、形質転換されたＦｒａｇａｒｉａ植物の細胞において発現される場合に、遺伝子サイレンシングに十分な長さを有し、そして上記発現カセットは、一緒に作動可能に連結される、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１を含む。
【００２６】
本開示はさらに、上記ｐＳＩＭ２４４１ベクターで形質転換されたＦｒａｇａｒｉａ植物またはプラグ苗を提供する。いくつかの実施形態において、上記ｐＳＩＭ２４４１ベクターは、配列番号１４のヌクレオチド配列の挿入領域を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｆｒａｇａｒｉａ植物の細胞において発現される場合の上記発現カセットは、上記内因性ＴＦＬ１の活性の低下を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１。Ｔ−ＤＮＡ左境界と右境界との間のベクターｐＳＩＭ２４０２の挿入領域の模式的代表図。挿入物は、配列番号１３によって示されるように、長さが２３０４ｂｐである。
【図２】図２。Ｔ−ＤＮＡ左境界と右境界との間のベクターｐＳＩＭ２４４１の挿入領域の模式的代表図。挿入物は、配列番号１４によって示されるように、長さが４３０７ｂｐである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
電子提出したテキストファイルの説明
電子提出したテキストファイルの内容は、それらの全体において本明細書に参考として援用される：配列表のコンピューター読み取り可能なフォーマットのコピー（ファイル名：  ＪＲＳＩ−０７７−０１ＵＳ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ＿２０１７０９１４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録した日：２０１７年９月１４日、ファイルサイズ  ３８キロバイト）。
【００２９】
詳細な説明
以下の説明において、多くの用語が使用される。このような用語によって与えられるべき範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
【００３０】
アレル（ａｌｌｅｌｅ）。  アレルは、１つの形質または特性に関する遺伝子の１つまたはこれより多くの代替の形態のうちのいずれかである。二倍体細胞または生物では、所定の遺伝子の２つのアレルが、相同な染色体の対の上で相当する遺伝子座を占める。
【００３１】
アミノ酸配列。  本明細書で使用される場合、植物から単離されるか、植物に元々備わっているか、もしくは植物において天然に存在するか、あるいは合成により作製されるが、内因性対応物の核酸配列から成るオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質およびこれらのフラグメントを含む。
【００３２】
「境界」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−ＤＮＡに由来する境界配列をいう。そのＴ−ＤＮＡ境界は、これが連結されるポリヌクレオチドの組み込みを促進し容易にする。本開示のＤＮＡ挿入物は好ましくは、境界配列（左境界および右境界の配列）を含む。ＤＮＡ挿入物の境界配列は、長さ５〜１００ｂｐ、長さ１０〜８０ｂｐ、長さ１５〜７５ｂｐ、長さ１５〜６０ｂｐ、長さ１５〜５０ｂｐ、長さ１５〜４０ｂｐ、長さ１５〜３０ｂｐ、長さ１６〜３０ｂｐ、長さ２０〜３０ｂｐ、長さ２１〜３０ｂｐ、長さ２２〜３０ｂｐ、長さ２３〜３０ｂｐ、長さ２４〜３０ｂｐ、長さ２５〜３０ｂｐ、または長さ２６〜３０ｂｐの間である。ＤＮＡ挿入物の左境界配列および右境界配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに由来してもよいし（Ｔ−ＤＮＡ）、その境界配列は、改変されるべき植物のゲノムから単離されおよび／またはそのゲノムに元々備わっていてもよい（Ｐ−ＤＮＡ）。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は代表的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ）に由来する。他のポリヌクレオチド配列は、本開示の境界配列に付加されてもよいし、本開示の境界配列内に組み込まれてもよい。従って、ＤＮＡ挿入物左境界、またはＤＮＡ挿入物右境界は、５’−マルチクローニング部位および３’−マルチクローニング部位、またはさらなる制限部位を有するように改変され得る。ＤＮＡ挿入物境界配列は、付随するベクターからの骨格ＤＮＡが、植物ゲノムの中に組み込まれない可能性を増加させるように改変され得る。
【００３３】
「商業的生産圃場」または「果実生産圃場（ｆｒｕｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ）」とは、イチゴ植物を果実生産のために生育させる圃場または環境をいう。
【００３４】
「コンディショニングさせる（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）」または「コンディショニング（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）」とは、イチゴプラグ苗が春化を受けるように、該苗を生育させるプロセスを指す。いくつかの実施形態において、コンディショニングは、短い生育期の間に、高地（３０００〜５０００フィート）に位置する苗床で行う。別の実施形態において、北半球におけるイチゴ生産のために、コンディショニングは、短日性およびより冷涼な温度を伴う北緯に位置する苗床において行う。別の実施形態において、南半球におけるイチゴ生産のために、コンディショニングは、短日およびより冷涼な温度を有する南緯に位置する苗床において行う。なお別の実施形態において、そのコンディショニングは、春化を誘導するように制御された光曝露および温度の両方を有する制御された環境において行う。そのコンディショニングまたは春化は、プラグ苗をイチゴ生産圃場に移す前に行う。いくつかの実施形態において、コンディショニングのための温度は、＜−２℃、または＜−２．２℃、または＜−１．５℃、または＜０℃、または＜５℃、または約６℃、または約７℃、または約８℃、または約９℃、または約１０℃、または約１１℃、または約１２℃、または約１３℃、または約１４℃、または約１５℃、または約１６℃、または約１７℃、または約１８℃、または約１９℃、または約２０℃、または約２１℃、または約２２℃、または約２３℃、または約２４℃、または約２５℃、または約２６℃、または約２７℃、または約２８℃、または約２９℃、または約３０℃、または１℃〜２℃の間、または−２℃〜５℃の間、または−２℃〜７℃の間、または−２℃〜９℃の間、または−２℃〜１０℃の間、または１０〜１５℃の間、または１５〜１８℃の間である。いくつかの実施形態において、日中／夜間温度は、約１８℃／１４℃、または約３０℃／２５℃、または約３０℃／２６℃である。いくつかの実施形態において、コンディショニングのための時間の長さは、７〜３５日間、０〜２週間、または３〜４週間、または２〜１０ヶ月間、または３〜６ヶ月間、または４〜６ヶ月間、または９ヶ月間、またはこれより長い。いくつかの実施形態において、コンディショニングは、積算チルユニット（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｃｈｉｌｌｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）（ＡＣＵ）（℃  時間）に関して行われる（Ｔａｎｉｎｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （２００８））。いくつかの実施形態において、そのＡＣＵは、７０〜２００℃  時間の間、または１００〜６００℃  時間の間、または２００〜１５００℃  時間の間である。いくつかの実施形態において、光周期は、長日（ＬＤ）であり、ここでＬＤは、２４時間あたり約＞１２時間の照明である。いくつかの実施形態において、その光周期は、約１２時間、または約１３時間、または約１４時間、または約１５時間、または約１６時間、または約１７時間、または約１８時間、または約１９時間、または約２０時間、または約２１時間、または約２２時間、または約２３時間、または２４時間である。いくつかの実施形態において、その光周期は、短日（ＳＤ）であり、ここでＳＤは、２４時間あたり約＜１２時間の照明である。いくつかの実施形態において、ＳＤは、＜１２時間、または約１１時間、または約１０時間、または約９時間、または約８時間、または約８〜１２時間、または約７時間、または約６時間、または＜６時間である。いくつかの実施形態において、光周期は、条件的ＳＤであり、ここでその照明は、＜１４時間である。コンディショニングが行われる苗床は、圃場に限定されない。プラグ苗を育てるための基材は、土壌、圃場、または人工生育培地であり得る。コンディショニングのための通常の慣習的業界標準は、プラグ苗を、燻蒸農薬（例えば、臭化メチル）が使用される苗圃において生育させるためのプロセスに適合する。コンディショニングはまた、春化として公知である。いくつかの実施形態において、本出願の遺伝的に改変された植物は、春化とは無関係に開花する。いくつかの実施形態において、その遺伝的に改変された植物は、温度および／または光周期とは無関係に開花する。本明細書で使用される場合、用語「春化とは無関係に」または「温度および／または光周期とは無関係に」とは、その植物がコンディショニングを経験しない状況を指し、その状況は、その植物が、低温に短時間供されていてもよいが、十分な積算チルユニットを受けない（例えば、その植物は、７０℃  時間未満、１００℃  時間未満、または２００℃  時間未満のＡＣＵを受ける）状況、またはその植物が光周期条件に短時間供されていてもよいが、その継続時間がその植物の開花時期を実質的に変化させない程度に短い状況を包含する。
【００３５】
「交雑する」、「交雑（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）」、「他家授粉（ｃｒｏｓｓ  ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）」または「交雑育種（ｃｒｏｓｓ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ）」とは、１つの植物の１つの花の花粉が、もう１つの植物の花の胚珠（柱頭）に（人工的にまたは自然に）適用されるプロセスをいう。
【００３６】
「中日性」とは、光曝露の期間の長さに関係なく、花を生じる植物を指す。中日性品種はときおり、四季咲き品種、または反復性品種、または二季咲き品種（返り咲き（ｒｅｐｅａｔ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ））、または四季成り品種、または長日性品種ともいわれる。
【００３７】
「双子葉植物（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎ（ｄｉｃｏｔ））」は、胚が２枚の子葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）または子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）を有する開花植物である。双子葉植物の例としては、タバコ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、マメ科植物（アルファルファおよびダイズが挙げられる）、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、およびサボテンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「土（ｅａｒｔｈ）」とは、植物の発根が起こる任意の環境（自然植生または合成基材を含む）を意味する。土は、プラグ苗の根が根鉢を形成する基材に言及し得る。
【００３９】
「四季成り」とは、１年あたりに２回または３回のイチゴ果実収穫（１回は、春に、およびもう１回は、晩夏または秋に）、および理想的条件下では、３回目の収穫を生じるイチゴ品種をいう。
【００４０】
「圃場」とは、作物が生育または栽培される開けた土地の領域を指す。その作物は一般に、圃場の土壌に直接植え付けられる。
【００４１】
「果実生産圃場」または「商業的生産圃場」とは、イチゴ植物が果実生産のために生育される圃場または環境をいう。
【００４２】
核酸に関して「外来の」または「外因性の」とは、その核酸が非植物生物に由来するか、または形質転換されるべき植物と同じ種ではない植物に由来するか、または形質転換されるべき植物と交配できないかもしくは標的植物の種に属さない植物に由来することを意味する。本開示によれば、外来のＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類または鳥類、または同じ種ではない植物の遺伝的構成（genetic  makeup）の中に天然に存在するが、形質転換されるべき特定の植物には天然に存在しない、核酸を表す。従って、外来の核酸は、例えば、その形質転換された植物によって天然に生成されないポリペプチドをコードするものである。
【００４３】
「燻蒸農薬」とは、土壌中の害虫を管理するために作物圃場を処理するために旧来から使用される化学農薬である。商業的イチゴ生産圃場では、使用される燻蒸農薬の非限定的な例は、以下のうちの１種または以下の組み合わせである：臭化メチル、１，３−ジクロロプロペン、トリクロロニトロメタン、クロロピクリン、ヨウ化メチル、テトラヒドロ−３，５−ジメチル−２Ｈ−１，３，５−チアジアジン−２−チオン、Ｎ−メチルジチオカルバミン酸ナトリウム、およびＮ−メチルジチオカルバミン酸カリウム。
【００４４】
「遺伝子」とは、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントをいう。従って、遺伝子としては、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる調節配列が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質に関する認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または既知のもしくは推測される配列情報からの合成を含め、種々の供給源から得られてもよいし、所望のパラメーターを有するようにデザインされた配列を含んでいてもよい。
【００４５】
「ゲノム」とは、生物の完全なＤＮＡ構成要素をいう。植物では、ゲノムは、核ゲノム、葉緑体ゲノム、またはミトコンドリアゲノムであり得る。
【００４６】
「遺伝的に改変された」とは、生物のゲノムにおいて天然でない変化を指す。一実施形態において、改変は、変異原によって誘導される。いくつかの実施形態において、ゲノムに対する改変は、ゲノム編集によるものである。いくつかの実施形態において、ゲノムに対する改変は、一過性の形質転換に伴うものである。いくつかの実施形態において、ゲノムに対する改変は、安定な形質転換によるものである。いくつかの実施形態において、発現カセットは、その生物のゲノムへと組み込まれる。
【００４７】
「生育させる」とは、植物が種子から死滅が起こるときに至る、休眠が起こっているその間の任意のこのような時間を含めたプロセスを意味する。
【００４８】
「高地」とは、海抜約３０００〜６０００フィートの範囲内の、理想的には、海抜およそ５０００フィートの高度を指す。本明細書で使用される場合、高地は、イチゴ苗圃が位置する地理的高度に適合する。
【００４９】
「相同な」または「ホモログ」または「オルソログ」とは、当該分野で公知であり、共通する祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同な」、「実質的に類似」および「実質的に相当する」は、本明細書で交換可能に使用される。それらは、１もしくはこれより多くのヌクレオチド塩基の変化が、核酸フラグメントが遺伝子発現を媒介するかまたはある種の表現型を生じる能力に影響を与えない該核酸フラグメントに言及する。これらの用語はまた、本開示の核酸フラグメントの改変（例えば、最初の改変されていないフラグメントと比較して、得られる核酸フラグメントの機能的特性の質を実質的に変化させない１もしくはこれより多くのヌクレオチドの欠失または挿入）に言及する。従って、当業者が認識するように、本開示が特定の例示的な配列よりも多くの配列を包含することは、理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、品種、栽培品種または系統において見出される遺伝子と、別の種、亜種、品種、栽培品種または系統における相当するまたは等価な遺伝子との間の関係性を説明する。本開示の目的のために、相同な配列は、比較される。「相同な配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関連すると考えられるか、確かだと思われるか、または知られている。機能的関係性は、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは類似の生物学的機能が挙げられるが、これらに限定されない多くの方法のうちのいずれか１つにおいて示され得る。配列同一性の程度は変動し得るが、いくつかの実施形態において、少なくとも５０％（当該分野で公知の標準的配列アラインメントプログラムを使用する場合）、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９８．５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％である。相同性は、当該分野で容易に入手可能なソフトウェアプログラム（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９８７）  増刊３０，  ７．７１８節，  表７．７１において考察されるもの）を使用して決定され得る。いくつかのアラインメントプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用する、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。特定の配列が、定義された長さの参照配列に対して特定の���ーセント同一性を有するといわれる場合、そのパーセント同一性は、参照配列に対するものである。従って、１００アミノ酸（または１００ヌクレオチド長）である参照配列と５０％同一である配列は、参照ポリペプチドのうちの５０アミノ酸長の部分または参照ヌクレオチド配列のうちの５０ヌクレオチド長の部分に対して完全に同一である、５０アミノ酸のポリペプチドまたは５０ヌクレオチドの配列であり得る。その配列はまた、１００アミノ酸長のポリペプチド、または１００ヌクレオチドの配列であり得、これは、その全体の長さにわたってその参照ポリペプチドまたはその参照ヌクレオチド配列と５０％同一である。当然のことながら、特定されていない他の配列はまた、同じ基準を満たし得る。
【００５０】
「組み込む」とは、選択された植物種に由来するか、またはその選択された植物と同じ種からの植物に由来するか、またはその選択された植物種と生殖的に適合性である植物に由来する核酸配列を、選択された植物種の細胞のゲノムの中へと挿入することに言及する。「組み込み」とは、植物細胞ゲノムへと天然の遺伝的エレメントのみの組み入れ（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に言及する。天然の遺伝的エレメントを（例えば、相同組換えによって）組み込むために、本開示は、天然でないＤＮＡをこのようなプロセスにおける１工程として「使用」し得る。従って、本開示は、特定のＤＮＡ分子「の使用（ｕｓｅ  ｏｆ）」と、植物細胞ゲノムへの特定のＤＮＡ分子の「組み込み」との間を区別する。
【００５１】
「導入」とは、感染、トランスフェクション、形質転換または形質導入を含む方法によって、細胞へと核酸配列を挿入することに言及する。
【００５２】
「北緯」とは、イチゴ苗圃が位置し、そのイチゴ苗床植物が春化を受ける地球の北半球における地理的緯度である。本明細書で使用される場合、「南緯」とは、イチゴ苗圃が位置し、そのイチゴ苗床植物が春化を受ける地球の南半球における地理的緯度である。
【００５３】
「一季成り」（June-bearing）とは、６月あたりに結実するイチゴ品種を指す。その一季成りイチゴ品種は、いつ結実が始まるかという相対的なタイミングに照らして、「早生」、「中早生」、「中生」、「中晩生」、および「晩生」に分けられ得る。例えば、早生品種に関連して、中早生品種は、結実が約５日後に始まる；中生品種は、結実が約８日後に始まる；中晩生品種は、結実が約１０日後に始まる；そして晩生品種は、結実が約１４日後に始まる。一季成り品種は、短日性品種または一季咲き品種ともいわれ得る。
【００５４】
「遺伝子座」。  遺伝子座は、１もしくはこれより多くの形質（例えば、雄性不稔、除草剤耐性、耐虫性、耐病性、蝋状でんぷん（ｗａｘｙ  ｓｔａｒｃｈ）、改変された脂肪酸代謝、改変されたフィチン酸代謝、改変された炭水化物代謝、および改変されたタンパク質代謝のような）を付与する。その形質は、例えば、戻し交配、天然もしくは誘導性の変異、または遺伝的形質転換技術を通じて導入される導入遺伝子によって品種のゲノムへと導入される天然に存在する遺伝子によって付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体位置に組み込まれた１つもしくはこれより多くのアレルを含み得る。
【００５５】
「長日」とは、１２時間より長い光を有する２４時間周期（１日）である。
【００５６】
「低地」とは、海抜未満の高度から海抜約３０００フィート、理想的には、海抜約６００フィート未満を指す。本明細書で使用される場合、低地は、イチゴ生産圃場が位置する地理的高度に適合する。
【００５７】
「臭化メチル」とは、イチゴプラグ苗生長の間に農薬として一般に使用される燻蒸農薬である。臭化メチルは、化学式ＣＨ３ＢＲ、およびＣＡＳ番号７４−８３−９を有する。
【００５８】
「天然でない変異体（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｍｕｔａｎｔ）」とは、少なくともいくらかの最小限のヒトの介入を要する任意の手段によって作り出される変異体をいう。例えば、天然でない変異体は、直接的なヒトの介入または間接的な介入によって作り出され得る。天然でない変異体は、天然に存在しない少なくともいくらかの人工の（ｈｕｍａｎ−ｍａｄｅ）組成物、ツール、または手順を使用することによって作り出され得る。天然でない変異体は、当業者に公知の任意の適切な変異誘発方法、および所定の植物の１種または複数種の遺伝子の機能を変更するために使用され得る任意の適切な方法によって、作り出され得る。その遺伝子機能の変更は、種々のレベルにあり得、それらレベルとしては、遺伝子発現レベル、ＲＮＡ活性レベル、またはタンパク質活性レベルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ活性レベル」とは、ｍＲＮＡ存在量、合成速度、および／または安定性に言及する。本明細書で使用される場合、用語「タンパク質活性レベル」とは、タンパク質存在量、合成速度、安定性、酵素活性、リン酸化速度に言及する。
【００５９】
「苗床（ｎｕｒｓｅｒｙ）」または「苗圃（ｎｕｒｓｅｒｙ  ｆｉｅｌｄ）」とは、植物が繁殖されかつ生産圃場において使用できるサイズへと生育される場所に言及する。いくつかの実施形態において、苗床は、温室、スクリーンハウス、または他の制御された環境設備である。ある実施形態において、苗床は、圃場である。いくつかの実施形態において、苗圃における植物は、春化を受ける。他の実施形態において、苗圃における植物は、春化を受けない。いくつかの実施形態において、苗圃は、高地にある。いくつかの実施形態において、苗圃は、低地にある。いくつかの実施形態において、北緯にある苗圃は、植物が春化を受ける地球の北半球における地理的緯度にある。いくつかの実施形態において、南緯にある苗圃は、植物が春化を受ける地球の南半球における地理的緯度にある。環境によっては、イチゴプラグ苗は、苗床または苗圃で生産される。
【００６０】
「子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）」とは、１種または複数種の親植物またはこれらの派生物（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）の栄養繁殖または有性繁殖の後代として生じる任意の植物に言及する。例えば、子孫植物は、親植物のクローニングもしくは自殖によって、または２種の親植物を交雑することによって得られ得、自殖したものならびにＦ１もしくはＦ２またはさらに先の世代を含む。Ｆ１は、親から生じた第１世代の子孫であり、そのうちの少なくとも１種は、形質のドナーとして初めて使用される一方で、第２世代（Ｆ２）またはその後の世代（Ｆ３、Ｆ４）の子孫は、Ｆ１、Ｆ２の自殖から生じる標本である。Ｆ１は、従って、２つの純粋種（ｔｒｕｅ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ）の親（純粋種は、ある形質に関してホモ接合性である）の間の交雑から生じるハイブリッドであり得る（そして通常はそうである）一方で、Ｆ２は、上記Ｆ１ハイブリッドの自家受粉から生じる子孫であり得る（そして通常はそうである）。
【００６１】
「作動可能に連結される」とは、２またはこれより多くの分子を、組み合わせにおいてこれらが植物細胞において適切に機能するような様式で組み合わせることに言及する。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが構造遺伝子の転写を制御する場合、その構造遺伝子に作動可能に連結される。
【００６２】
「過剰発現する」または「過剰発現」とは、遺伝子／タンパク質の発現を、その正常な内因性活性を超えて誘導するプロセスに言及する。例えば、本明細書で記載されるとおりの遺伝子の過剰発現は、開花を増加させるために使用され得る。過剰発現するまたは過剰発現とは、チェック遺伝子（例えば、同じ植物種における野生型アレル）の活性と比較した場合に、標的遺伝子の活性を増加させ得る任意の手段に言及する。その増加は、遺伝子発現レベル、ＲＮＡ活性レベル、および／またはタンパク質活性レベルにあり得る（増加した遺伝子コピー数、増加した遺伝子増幅、増加したｍＲＮＡの存在量、合成速度、および／もしくは安定性、増加したタンパク質合成、タンパク質の存在量、安定性、酵素活性、もしくはリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない）。いくつかの実施形態において、過剰発現は、その標的遺伝子またはそのホモログのコピーが植物の中に導入される場合に起こる。いくつかの実施形態において、過剰発現は、余分な染色体（extra  chromosome）または標的遺伝子を有する染色体の一部が植物の中に導入される場合に起こる。いくつかの実施形態において、過剰発現は、発現のためのエンハンサーが使用される場合に起こる。その定義はまた、異所性の発現および遺伝子活性のアップレギュレーションをもたらす任意の手段を包含する。
【００６３】
「光周期」とは、植物が照明を受ける２４時間サイクルにおける時間の長さに言及する。いくつかの実施形態において、光周期は、２４時間周期につき１２時間未満の照明を伴う短日である。いくつかの実施形態において、光周期は、２４時間周期につき１２時間を超える照明を伴う長日である。
【００６４】
植物：  本開示は、野生型コントロール植物と比較した場合に改変された表現型を有する植物を生じる組成物および方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「植物」とは、特定されなければ、Ｒｏｓａｃｅａｅ科の植物（例えば、Ｒｏｓａ属またはＦｒａｇａｒｉａ属の植物）に言及する。
【００６５】
「植物の部分」とは、植物の任意の部分に言及し、胚、シュート（shoot）、根、茎、種子、托葉、葉（ｌｅａｆ）、葉柄、花弁、萼、萼片、花、胚珠、包葉、枝、節間（internode）、軟毛、分蘖枝、根茎、葉（ｆｒｏｎｄ）、葉身、胚珠、花粉、雄蕊、早出枝（runner）、匍匐茎（ｓｔｏｌｏｎ）、痩果が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
「プラグ苗」とは、第２の場所に植え替えられることを意図して生育される若苗である。プラグ苗は、移植後の生存の可能性を改善し、果実生産圃場への移植後の生育速度を増加させる特徴的な根鉢を有する。プラグ苗はまた、娘株（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｐｌａｎｔ）ともいわれる。
【００６７】
ポリヌクレオチド：  本開示は、単離されたか、キメラか、組換えか、または合成のポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸フラグメント」、および「単離された核酸フラグメント」は、本明細書で交換可能に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であり、必要に応じて、合成の、非天然の、または変更したヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり得る。ＤＮＡのポリマーの形態にあるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの混合物のうちの１またはこれより多くのセグメントから構成され得る。ヌクレオチド（通常は、それらの５’−モノホスフェート形態で見出される）は、以下のとおりの一文字表記によって言及される：（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡについて）アデニレートまたはデオキシアデニレートに対して「Ａ」、シチジレートまたはデオキシシチジレートに対して「Ｃ」、グアニレートまたはデオキシグアニレートに対して「Ｇ」、ウリジレートに対して「Ｕ」、デオキシチミジレートに対して「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対して「Ｙ」、ＧまたはＴに対して「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対して「Ｎ」。
【００６８】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御し得るＤＮＡ配列に言及する。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、より遠位の上流エレメントはしばしば、エンハンサーといわれる。よって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの生来のエレメントまたは、プロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、それらの全体において天然の遺伝子に由来してもよいし、天然において見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよいし、さらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞タイプにおいて、または発生の異なるステージにおいて、または異なる環境条件に応じて、遺伝子の発現を指向し得ることは、当業者によって理解される。大部分の場合に、調節配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、あるバリエーションのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることは、さらに認識される。
【００６９】
「植物プロモーター」とは、その起源が植物細胞であるか否かに拘わらず、植物細胞において転写を開始し得るプロモーターであり、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーターが植物細胞において機能的であることは周知である。従って、植物プロモーターとしては、植物、植物ウイルスおよび細菌（例えば、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌）から得られるプロモーターＤＮＡが挙げられる。植物プロモーターは、構成的プロモーターまたは非構成的プロモーターであり得る。
【００７０】
「構成的プロモーター」とは、大部分の条件下でおよび／または大部分の発生ステージの間に活性であるプロモーターである。植物バイオテクノロジーにおいて使用される発現ベクターの中で構成的プロモーターを使用することには、以下のようないくつかの利点がある：トランスジェニック細胞または植物を選択するために使用されるタンパク質の高レベルの生成；容易な検出および定量を可能にする、レポータータンパク質またはスコア化可能なマーカーの高レベルの発現；調節性転写システムの一部である転写因子の高レベルの生成；植物において遍在的な活性を要求する化合物の生成；および植物発生の全てのステージの間に要求される化合物の生成。非限定的な例としての構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、オパインプロモーター、ユビキチンプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられる。
【００７１】
「非構成的プロモーター」は、ある種の条件下で、ある種のタイプの細胞において、および／またはある種の発生ステージの間に活性であるプロモーターである。例えば、組織特異的、組織好適、細胞タイプ特異的、細胞タイプ好適、誘導性のプロモーター、および発生制御下にあるプロモーターが、非構成的プロモーターである。発生制御下にあるプロモーターの例としては、ある種の組織（例えば、茎、葉、根、または種子）において転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。
【００７２】
「誘導性」または「抑制性」のプロモーターは、化学因子または環境因子の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによって転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気条件、またはある種の化学物質、または光の存在が挙げられる。
【００７３】
「組織特異的」プロモーターは、ある種の組織においてのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なって、組織特異的発現は、いくつかの相互作用する遺伝子調節のレベルの結果である。よって、当該分野ではときおり、相同なまたは密接に関連した植物種に由来するプロモーターを使用して、特定の組織における導入遺伝子の効率的かつ信頼性のある発現を達成することは、好ましい。これは、特定の植物および組織から単離される多量の組織特異的プロモーターが科学文献および特許文献の両方において見出される主な理由のうちの１つである。
【００７４】
「合成プロモーター」とは、本来は天然には見出されないプロモーターをいう。そのヌクレオチド配列は、人工的または合成である。合成プロモーターは、構成的プロモーターであってもよいし、非構成的プロモーターであってもよいし、誘導性プロモーターであってもよいし、組織特異的プロモーターであってもよい。導入遺伝子発現に有用な例示的合成プロモーターは、米国特許第９，６７０，４９７号（その全体において本明細書に参考として援用される）に開示される。
【００７５】
組換え：  本開示はまた、植物において遺伝子機能を変更するためのキメラまたは組換えの分子を提供する。本明細書で使用される場合、核酸配列またはタンパク質配列を記載する場合の用語「キメラの」または「組換えの」とは、少なくとも２種の異種ポリヌクレオチドもしくは２種の異種ポリペプチドを、１つの高分子へと連結するか、または少なくとも１種の天然の核酸もしくはタンパク質配列のうちの１つもしくはこれより多くのエレメントを再配置する核酸またはタンパク質配列に言及する。例えば、用語「組換えの」とは、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作によって、配列の２種の他の別個のセグメントの人工的組み合わせに言及し得る。
【００７６】
「抑制する」または「抑制」とは、チェック遺伝子（例えば、同じ植物種における野生型アレル）の活性と比較した場合に、標的遺伝子の活性を低下させ得る任意の手段に言及する。低下は、遺伝子発現レベル、ＲＮＡ活性レベル、および／またはタンパク質活性レベルにおいてであり得、低下した遺伝子コピー数、低下した遺伝子増幅、低下したｍＲＮＡ存在量、合成速度、および／または安定性、低下したタンパク質合成、タンパク質存在量、安定性、酵素活性、またはリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抑制は、ＤＮＡ結合リプレッサーがプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合を遮断し、従って、メッセンジャーＲＮＡへのその遺伝子の転写を防止する場合に起こる。いくつかの実施形態において、抑制は、１またはこれより多くの変異が、標的遺伝子のプロモーター／コード／イントロンまたはターミネーター領域へと導入される場合に起こる。いくつかの実施形態において、抑制は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子を阻害するために植物へと導入される場合に起こる。その定義はまた、種々の程度の改変された遺伝子活性（例えば、遺伝子サイレンシング、機能喪失型変異体（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）、ノックアウト、ノックダウン、漏出型変異によって達成される改変された遺伝子活性）を包含する。標的遺伝子の機能が失われる程度は、変動し得る。例えば、その標的遺伝子は、その機能を完全に失い得る（例えば、ヌル変異）か、またはその機能を部分的に維持し得るが、野生型チェックアレルのレベルにはない（例えば、漏出型変異）。本開示において、例えば、ＴＦＬ遺伝子（例えば、ＴＦＬ１）の抑制は、公知の技術を使用して、低下したＴＦＬ活性を生じる。
【００７７】
「遺伝子活性」とは、遺伝子発現レベル、ＲＮＡ活性レベル、またはタンパク質活性レベルに言及する。本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ活性レベル」とは、ｍＲＮＡ存在量、合成速度、および／または安定性に言及する。本明細書で使用される場合、用語「タンパク質活性レベル」とは、タンパク質存在量、合成速度、安定性、酵素活性、リン酸化速度に言及する。
【００７８】
「根鉢」は、植物の根系の球状の塊である。本開示のために、イチゴプラグ苗は、植え替え後に植物の生存および健康を増加させる目的で、所望の根鉢を生じるような方法で育てる。
【００７９】
「時季」とは、植物がサイズにおいて活発に成長し、表現的変化を受けつつあり、かつ従って休眠状態ではない時期（the  time  of  the  year）に言及する。
【００８０】
２種の核酸配列またはポリペプチド配列の状況において「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較ウインドウに対して最大の一致のために整列される場合に、同じである２種の配列の中の残基への言及を包含する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質を参照して使用される場合、同一でない残基の位置がしばしば、保存的アミノ酸置換によって異なることが認識され、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従って、その分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、そのパーセント配列同一性は、その置換の保存的性質を修正するために上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。代表的には、これは、完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換をスコア化し、それによって、パーセンテージ配列同一性を増加させることを要する。従って、例えば、同一のアミノ酸がスコア１を与えられ、非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．，  ４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って計算される。
【００８１】
「短日性」とは、１２時間未満の光を伴う２４時間周期（１日）である。
【００８２】
「土壌（ｓｏｉｌ）」とは、作物が育つ圃場における土（ｅａｒｔｈ）の層をいう。いくつかの実施形態において、作物は、土壌に直接植え付けられる。他の実施形態において、その土壌は、コンテナ、例えば、ポットまたは高架式生育容器（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｖｅｓｓｅｌ）の中に入れられ、植物は、そのポットまたは高架式生育容器の中の土壌で生育される。いくつかの実施形態において、その土壌は、「天然のもの（ｎａｔｕｒａｌ）」で、圃場から直接採取したものを意味し得る。他の実施形態において、その土壌は、堆肥、ピート、砂、クレイ、有機物、無機物、肥料、または植物の生育を助ける他の組成物で改良され得る。いくつかの実施形態において、本開示の植物は、水耕条件で生育される。
【００８３】
「イチゴ」とは、植物であって、その果実は、多汁質で、食用の、背丈が低く生育する、そしてＦｒａｇａｒｉａ属のものである。本開示に拠れば、イチゴは、低地で生育されるプラグ苗から収穫される所望の生産品である。
【００８４】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」または「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、およびホルムアミド濃度）をいう。これらの条件は、その標的核酸配列へのプライマーまたはプローブの特異的結合を最大化しかつ非特異的結合を最小化するように経験的に最適化される。使用される場合のこれら用語は、プローブまたはプライマーが、他の配列より検出可能に大きな程度まで（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）その標的配列にハイブリダイズする条件への言及を包含する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、環境が異なれば異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般には、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。そのＴｍは、相補的な標的配列のうちの５０％が完全にマッチしたプローブまたはプライマーにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨの下で）である。代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン、代表的にはｐＨ７．０〜８．３において約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチドより長い）に関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の添加で達成され得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。しかし、厳密にストリンジェントな条件は、その熱融解点（Ｔｍ）より１℃、２℃、３℃、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、その熱融解点（Ｔｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシー条件は、その熱融解点（Ｔｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。例示的な低ストリンジェント条件または「低下したストリンジェンシーの条件」は、３７℃において３０％  ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳの緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および４０℃において２×標準クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃において５０％  ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０℃において０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は、当該分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９９８およびＳａｍｂｒｏｏｋら，  ２００１によって記載される。いくつかの実施形態において、ストリンジェントな条件は、４５℃において１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％  ドデシル硫酸ナトリウム（例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）を含む０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５５℃〜６５℃において０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含む５×ＳＳＣ中での洗浄である。本開示において、イチゴ遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするＴＦＬ遺伝子のホモログが、企図される。
【００８５】
「基材」とは、植物が育つ組成物に言及する。いくつかの実施形態において、基材は、土壌である。別の実施形態において、その基材は、圃場である。なお別の実施形態において、基材は、他の構成要素（例えば、堆肥、ピート、砂、クレイ、有機物、無機物、肥料、または植物の生育を助ける他の組成物）で改良された土壌である。いくつかの実施形態において、基材は、天然のもので、自然界に見出されるものを意味する。他の実施形態において、基材は、天然に見出されない組成物である。いくつかの実施形態において、基材は、天然の組成物および非天然の組成物の両方の混合物である。いくつかの実施形態において、その基材は、水耕栽培用溶液である。
【００８６】
ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ遺伝子、「ＴＦＬ」は、開花の抑制因子として機能する転写因子をコードする。イチゴにおいて、内因性ＴＦＬの発現は、温度および光周期によって調節される。例えば、短日性品種において、イチゴ植物を、低温においておよび短日の光周期でコンディショニングすると、ＴＦＬの発現が低下する。ＴＦＬの低下は、開花の抑制を解放し、花成誘導が進む。ＴＦＬを調節する温度および光周期の特異的パラメーターは、イチゴ品種によって様々であり、Ｈｅｉｄｅ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓｔｅｂｙ（２０１４）によって総説されている。本発明の方法は、内因性ＴＦＬの活性をダウンレギュレートする。従って、開花を抑制するために利用可能なＴＦＬ転写因子はあまりない。よって、ダウンレギュレートされたＴＦＬを有するこれらの遺伝的に改変されたイチゴは、温度および光周期とは無関係に開花する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、ＴＦＬは、ＴＦＬ遺伝子の機能的バリアントおよびホモログを包含する。ＴＦＬには３種のホモログが存在する：ＴＦＬ１（配列番号１および４（ゲノムＤＮＡ）、配列番号２、５、および７（ｃＤＮＡ）、ならびに配列番号３、６、および（ＰＲＴ）によって表されるとおり）、ＴＦＬ２（配列番号９（ＤＮＡ）および配列番号１０（ＰＲＴ）によって表されるとおり）、ならびにＴＦＬ３（配列番号１１（ＤＮＡ）および配列番号１２（ＰＲＴ）によって表されるとおり）。しかし他のホモログは、本明細書で開示される方法に従って使用され得る。従って、用語「ＴＦＬ遺伝子」はまた、配列番号１、４、２、５、７、９、または１１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれより高い同一性を有する配列、配列番号３、６、８、１０、および１２をコードする任意の配列、ならびにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上述の配列のうちのいずれかとハイブリッドを形成し得る配列であって、ここでその配列は、機能的ＴＦＬタンパク質をコードする配列に言及する。
【００８８】
Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔ遺伝子、「ＦＴ」は、開花の活性化因子として機能するタンパク質をコードする。イチゴにおいて、内因性ＦＴの発現は、温度および光周期によって調節される。例えば、短日性品種において、イチゴ植物を、低温においておよび短日の光周期でコンディショニングすると、ＦＴの発現が増加する。ＦＴの誘導は、開花を促進する。温度および光周期の特異的パラメーターは、Ｎａｋａｎｏら（Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１５  Ａｐｒ  １；１７７：６０−６）によって総説されている。本発明の方法は、ＦＴの活性をアップレギュレートする。よって、アップレギュレートされたＦＴを有するこれらの遺伝的に改変されたイチゴは、温度および光周期とは無関係に開花する。
【００８９】
本明細書で使用される場合、ＦＴは、ＦＴ遺伝子の機能的バリアントおよびホモログを包含する。従って、用語「ＦＴ遺伝子」はまた、配列番号２２、配列番号２４、もしくは配列番号２５と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い同一性を有する配列、または配列番号２３もしくは配列番号２６をコードする遺伝子、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上述の配列のうちのいずれかとハイブリッドを形成し得る配列であって、ここでその配列は、機能的ＦＴタンパク質をコードする配列に言及する。
【００９０】
「組織培養物（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」とは、同じもしくは異なるタイプの単離された細胞または植物の一部へと組織化されるこのような細胞の集まりを含む組成物に言及する。組織培養物の例示的タイプは、プロトプラスト、カルス、植物塊（ｐｌａｎｔ  ｃｌｕｍｐ）、および植物または植物の一部において無傷の組織培養物を生成し得る植物細胞（例えば、胚、花粉、花、種子、葉、茎、根、根端、葯、雌蕊、分裂組織細胞、脇芽、子房、種皮、胚乳、胚軸、子葉など）である。植物組織培養物を調製および維持するための手段は、当該分野で周知である。例示すると、器官を含む組織培養物は、再生植物を生産するために使用されている。米国特許第５，７５０，８７０号、同第５，９５９，１８５号、同第５，９７３，２３４号、および同第５，９７７，４４５号は、ある種の技術を記載する（これらの開示は、本明細書に参考として援用される）。
【００９１】
「春化」とは、イチゴ植物を、長期の低温処理（ｃｈｉｌｌｉｎｇ）および／または制御された光周期に曝すことによって開花を促進するプロセスである。春化というプロセスは、イチゴ生産において「コンディショニング」ともいわれ得る。
【００９２】
「収量」とは、収穫される果実の重量に言及する。収量は、所定の期間（例えば、時季または１年）内の、果実の数、果実の重量、または１植物あたりもしくは１エーカーの植物あたりで収穫された果実の数および重量によって測定され得る。
【００９３】
「５００フィート」とは、海抜５００フィートの高度を意味する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本開示の改変された遺伝子を有する植物は、イチゴ植物である。本明細書で使用される場合、用語イチゴは、Ｆｒａｇａｒｉａ属の中の植物種を包含する。イチゴ植物の遺伝的性質は、倍数性に関して他に類を見ないほど多様である。イチゴ植物種は、二倍体、四倍体、五倍体、六倍体、七倍体、八倍体、または十倍体であり得る（これらは、それぞれ、２セット、４セット、５セット、６セット、７セット、８セット、または１０セットの染色体を有する）。Ｆｒａｇａｒｉａのいくつかの種は、分類されない倍数性を有する。Ｆｒａｇａｒｉａ（イチゴとして公知）は、バラ科、Ｒｏｓａｃｅａｅの中の開花植物の属である。
【００９５】
Ｆｒａｇａｒｉａ種としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：  １）二倍体：  Ｆ．ｂｕｃｈａｒｉｃａ、Ｆ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｄａｌｔｏｎｉａｎａ、Ｆ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｆ．ｈａｙａｔａｉ、Ｆ．ｉｉｎｕｍａｅ、Ｆ．ｎｉｌｇｅｒｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｉｐｐｏｎｉｃａ、Ｆ．ｎｕｂｉｃｏｌａ、Ｆ．ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌａ、Ｆ．ｒｕｂｉｃｏｌａ、Ｆ．ｖｅｓｃａ、Ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｆ．ｖｅｚｏｅｎｓｉｓ、およびＦ．ｘ  ｂｉｆｅｒａ；  ２）四倍体：  Ｆ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｆ．ｍｏｕｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、およびＦ．ｔｉｂｅｔｉｃａ；  ３）五倍体：  Ｆ．ｘ  ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔｉｉ；  ４）六倍体：  Ｆ．ｍｏｓｃｈａｔａ；  ５）六倍体：  Ｆ．ｍｏｓｃｈａｔａ；  ６）七倍体：  Ｆ．ｘ  ｃｏｍａｒｕｍ；  ７）八倍体：  Ｆ．ｘ  ａｎａｎａｓｓａ、Ｆ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｆｏｒｍａ  ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｆｏｒｍａ  ｐａｔａｇｏｎｉｃａ、Ｆ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌｕｃｉｄａ、Ｆ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｓａｎｄｗｉｃｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｉｔｕｒｕｐｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｏｖａｌｉｓ、およびＦ．ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ；  ８）十倍体：  Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ、およびＣ．ｐｅｎｄｕｌｕｍ。より多くのＦｒａｇａｒｉａ種が、Ｌｉｓｔｏｎら（Ｆｒａｇａｒｉａ：  Ａ  ｇｅｎｕｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｅｐ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｒｏｏｔｓ  ａｎｄ  ｒｉｐｅ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  （２０１４）  １０１：１６８６−１６９９）およびＫｏｌｅ（Ｗｉｌｄ  Ｃｒｏｐ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ：  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ：  Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  Ｆｒｕｉｔｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  Ｆｒａｇａｒｉａ，  ２０１１）に記載される。
【００９６】
内因性ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ（ＴＦＬ）遺伝子（複数可）の低下した活性（例えば、低下した発現）、および／またはＦＴ遺伝子の誘導された活性を有するイチゴプラグ苗の生育は、開花が温度および光周期とは無関係である栽培を可能にし、収量を増加させ、プラグ苗生産における遅延時間を減少し、燻蒸農薬の使用の必要性を低下または排除し、そして望ましくない表現型または有害な副次的効果を生じない。従って、本開示は、内因性ＴＥＲＭＩＮＡＬ  ＦＬＯＷＥＲ（ＴＦＬ）遺伝子（複数可）の発現が低下した植物、およびこのような植物を作製するための方法を包含する。
【００９７】
本開示の植物において、その開花期シグナル伝達経路は、改変なしのコントロール植物と比較して、改変されている。いくつかの実施形態において、開花期シグナル伝達経路に関与する１種または複数種の遺伝子が改変される。
【００９８】
植物における開花は、栄養成長期から生殖成長期への推移のタイミングによって決定される。環境因子によって開始または変更される内因性シグナル伝達カスケードは、植物の生活環の間にこの相変化を引き起こす。シグナルカスケードに関与する一連の遺伝子は、開花への推移を精細に調節する。重要なプレイヤーの遺伝的および分子的相互作用は、開花期および花形態形成（ｆｌｏｒａｌ  ｏｒｇａｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を制御し得る。ＴＦＬは、花芽分裂組織決定遺伝子ＬＦＹ（Ｌｅａｆｙ）およびＡＰ１（Ａｐｅｔａｌａ１）を抑制する一方で、ＦＴは、長日に応じてＬＦＹおよびＡＰ１を活性化することによって開花を促進する。ＴＦＬ活性の抑制またはＴＦＬにおける変異は、その標的遺伝子であるＬＦＹおよびＡＰ１のアップレギュレーションを示し、早い開花を生じる。また、ＬＦＹまたはＡＰ１の異所性の発現は、ＴＦＬが変異される植物に似た頂花の形成をもたらす。ＴＦＬ遺伝子の抑制はまた、ＦＴの発現の増加を引き起こす。ＦＴの過剰発現に関するさらなる研究は、早い開花を例証し、これは、ｔｆｌ変異体表現型に類似する。従って、開花に対するＴＦＬ１およびＦＴの反対の効果は、ＦＴとＴＦＬ１との間の活性のバランスが、花成誘導シグナルの組み込みおよび開花期の決定を支配することに役割を果たすことを例証する。開花期シグナル伝達経路のさらなる概要に関しては、Ｂｒａｄｌｅｙら，  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：８０−８３；  Ｒｕｉｚ−Ｇａｒｃiａら  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１９２１−１９３４；  Ｃｏｒｂｅｓｉｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｕｐｌａｎｄ，  （２００５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ２８：５４−６６；  Ｍａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：５２２−５２４；  Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：４９５−５００；  Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙら，  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１９６２−１９６５；  Ｉｗａｔａら，  （２０１２）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６９：１１６−１２５；  Ｋｏｓｋｅｌａら，  （２０１２）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １５９：１０４３−１０５４；およびＮａｋａｎｏら，  （２０１５）  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １７７：６０−６６を参照のこと。本開示のいくつかの実施形態において、その改変された遺伝子は、ＴＦＬ遺伝子、ＴＦＬ活性を直接的もしくは間接的に調節する上流遺伝子、またはＴＦＬ遺伝子によって調節される下流遺伝子である。これら遺伝子は、ＴＦＬ遺伝子シグナル伝達カスケードを構成する。いくつかの実施形態において、その改変の結果として、改変なしのコントロール植物と比較した場合に、植物におけるＴＦＬの活性は抑制され、そして／またはＴＦＬによって負に調節される遺伝子は活性化される（例えば、ＬＦＹまたはＡＰ１）。いくつかの実施形態において、ＴＦＬ遺伝子は、配列番号１、２、４、５、７、９、もしくは１１の配列、これらの機能的バリアントもしくはホモログ、または配列番号３、６、８、１０、もしくは１２の配列を有するＴＦＬタンパク質をコードする配列を有する。いくつかの実施形態において��ＴＦＬ遺伝子は、配列番号１、２、４、５、７、９、および１１のうちのいずれかと少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはこれより高い同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＴＦＬ遺伝子は、配列番号３、６、８、１０、および１２のうちのいずれかと少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはこれより高い同一性を有する機能的ＴＦＬタンパク質をコードする。
【００９９】
あるいは、開花期シグナル伝達経路における遺伝子のアレル多様性は、同じ効果を達成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、開花期シグナル伝達経路遺伝子のプロモーターまたはコードまたはイントロンまたはターミネーター領域における遺伝的バリエーションは、相当するチェックアレルと比較した場合に増強または抑制された活性を有するアレルを同定するために使用され得る。例えば、コントロール植物におけるＴＦＬアレルと比較した場合にある植物の種（a  plant  species）で見出される活性が低下したＴＦＬアレルは、活性が低下したＴＦＬアレルを、ヒトの介入を介して遺伝子アレルのこのような組み入れによって生産される所望の植物へと組み込むことによって、抑制されたＴＦＬ活性を有する植物を生産するために利用され得、その種は、本開示の「改変された開花期シグナル伝達経路を有する植物」の定義の範囲内である。
【０１００】
本開示のイチゴ植物におけるＴＦＬ１シグナル伝達カスケードの抑制および／またはＦＴシグナル伝達カスケードのアップレギュレーションは、温度および光周期とは無関係に開花する（例えば、それらは、コンディショニングを要しない）高収量のプラグ苗を生じる。害虫のない苗木植物／プラグ苗は、有害な燻蒸剤を使用せずに、コンディショニングなしに生産され得、高収量である。内因性ＴＦＬ活性の抑制は、当該分野で公知の任意の適切な方法（ＲＮＡｉおよびゲノム編集が挙げられるが、これらに限定されない）によって、プロモーター、イントロン、ターミネーター、５’および３’ＵＴＲ領域を含むコード領域もしくは調節領域に関するマーカーを使用することによって、またはＴＦＬ遺伝子シグナル伝達カスケード活性をダウンレギュレートする任意の薬剤（例えば、ジベレリン）によって達成され得る。
【０１０１】
本開示において利用され得る遺伝子活性を改変するための方法としては、変異誘発（例えば、化学的変異誘発、放射線変異誘発、トランスポゾン変異誘発、挿入変異誘発、背番号付き変異誘発、部位特異的変異誘発、および自然変異誘発）、ノックアウト／ノックイン、アンチセンス、ＲＮＡ干渉、ならびに当業者に公知の任意の他の適切な方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術（ＺＦＮ−１、ＺＦＮ−２およびＺＦＮ−３（米国特許第９，１４５，５６５号（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）））、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（ＯＤＭ）、シスジェネシスおよびイントラジェネシス、ＲＮＡ依存性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）、接ぎ木（ＧＭ台木に）、逆育種、アグロインフィルトレーション（アグロインフィルトレーション「狭義」）、アグロイノキュレーション、フローラルディップ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、米国特許第８，５８６，３６３号および同第９，１８１，５３５号（それらの全体において参考として援用される）を参照のこと）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，７７１，９４５号；同第８，７９５，９６５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，８７１，４４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８９５，３０８号；同第８，９０６，６１６号；同第８，９３２，８１４号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９９３，２３３号；および同第８，９９９，６４１号（これらはすべて参考として本明細書によって援用される）を参照のこと）、操作されたメガヌクレアーゼ、再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導型ゲノム編集（Ｇａｏら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２０１６），  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｂｔ．３５４７（その全体において参考として援用される））、および合成ゲノミクス。植物における遺伝子改変のより多くの情報（例えば、薬剤、プロトコル）については、Ａｃｑｕａａｈら（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ２００７，  ＩＳＢＮ  １４０５１３６４６４，  ９７８１４０５１３６４６４（これは、その全体において本明細書に参考として援用される））を参照のこと。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、遺伝子活性は、植物へと変異を導入することによって改変される。内因性遺伝子へと変異を導入するか、または内因性遺伝子もしくはその一部を変異体遺伝子で置き換えるための方法は、当該分野で周知である。ある種の実施形態において、種々のＤＮＡヌクレアーゼは、内因性遺伝子へと変異を導入するために利用され得る。ある種の実施形態において、そのＤＮＡヌクレアーゼは、そのヌクレアーゼ活性が欠損している。ある種の実施形態において、その酵素は、ジンクフィンガーヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、そのジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＺＦ−ＦｏｋＩまたはＺＦ−Ｔｎ３である。ある種の実施形態において、その酵素は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。さらなる実施形態において、そのＴＡＬＥＮは、ＴＡＬ−ＦｏｋＩである。ある種の実施形態において、その酵素は、ホーミングエンドヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、そのホーミングエンドヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、またはＶｓｒ−ｌｉｋｅである。ある種の実施形態において、その酵素は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）酵素）である。さらなる実施形態において、そのＣＲＩＳＰＲ酵素は、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ酵素である。さらなる実施形態において、そのタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９である。ある種の実施形態において、そのＣＲＩＳＰＲ酵素は、そのヌクレアーゼ活性が欠損している。ある種の実施形態において、種々のＤＮＡインテグラーゼは、内因性遺伝子へと変異を導入するかまたは内因性遺伝子を変異体遺伝子で置き換えるために利用され得る。ある種の実施形態において、そのＤＮＡインテグラーゼは、λ−ｉｎｔまたはφＣ３１である。ある種の実施形態において、ＤＮＡリコンビナーゼは、内因性遺伝子へと変異を導入するかまたは内因性遺伝子を変異体遺伝子で置き換えるために利用され得る。ある種の実施形態において、そのＤＮＡリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、またはＲＭＣＥである。他の実施形態において、そのＣａｓ９ペプチドは、文献中に記載される変異のうちの１もしくはこれより多くを含み得る（以下に記載される機能的変異が挙げられるが、これらに限定されない：  Ｆｏｎｆａｒａら  （２０１４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４２（４）：２５７７−９０；  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  Ｈ．ら  （２０１４）  Ｃｅｌｌ．  １５６（５）：９３５−４９；  Ｊｉｎｅｋ  Ｍ．ら  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−２１；およびＪｉｎｅｋ  Ｍ．ら  （２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３（６１７６）；米国特許出願第１３／８４２，８５９号（２０１３年３月１５日出願（これは、参考として本明細書によって援用される））も参照のこと；さらに、米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，７７１，９４５号；同第８，７９５，９６５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，８７１，４４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８９５，３０８号；同第８，９０６，６１６号；同第８，９３２，８１４号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９９３，２３３号；および同第８，９９９，６４１号（これらは全て参考として本明細書によって援用される）を参照のこと。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、開花期シグナル伝達経路における１種または複数種の遺伝子の活性は、阻害性ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ干渉のためのヌクレオチド配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、および／または立体遮断オリゴヌクレオチド（ｓｔｅｒｉｃ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（Ｋｏｌｅら，  （２０１２）  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １１：１２５−１４０；  Ｏｓｓｏｗｓｋｉら  （２００８）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ，  ５３（４）：６７４−６９０；  Ｗａｎｇら  （２００２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５（２）：１４６−１５０；  Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら  （２００１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１４：３０８３−３０９１；  Ｓｔａｍら（１９９７）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７９（１）：３−１２；  Ｓｃｈｗａｂら  （２００６）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８（５）：１１２１−１１３３；  Ｃ．  Ｄａｖｉｄ  Ａｌｌｉｓら，  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （２００７）  ＩＳＢＮ  １０：  ０８７９６９７２４５，  ＩＳＢＮ  １３：  ９７８０８７９６９７２４；  Ｓｏｈａｉｌら，  Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２００５）  ＩＳＢＮ  ０８４９３２１４１７，  ９７８０８４９３２１４１２；  Ｅｎｇｅｌｋｅら，  ＲＡＮ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （２００５）  ＩＳＢＮ  ０１２１８２７９７６，  ９７８０１２１８２７９７７；およびＤｏｒａｎら，  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ，  ＣＡＢＩ  （２００９）  ＩＳＢＮ  １８４５９３４１０５，  ９７８１８４５９３４１０１（これらの各々は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）を使用することによって妨害される。いくつかの実施形態において、開花期シグナル伝達経路における１種または複数種の遺伝子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって妨害される。ＲＮＡｉは、サイレントにされる遺伝子に対して配列が相同な２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される、動物および植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングまたは転写遺伝子サイレンシングのプロセスである。本開示において有用な好ましいＲＮＡエフェクター分子は、本開示の方法のうちのいずれかが行われた後に、機能が妨げられないように意図される任意の宿主ポリヌクレオチド配列から配列が十分に異ならなければならない。コンピューターアルゴリズムは、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列と、宿主の、必須の、通常の配列との間の相同性の本質的欠如を定義するために使用され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、開花期シグナル伝達経路における１種または複数種の遺伝子は、２本鎖ＲＮＡによって妨害される。用語「ｄｓＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ分子」または「２本鎖ＲＮＡエフェクター分子」とは、２本鎖コンホメーションにある少なくとも約１９もしくはこれより多くのヌクレオチドの領域を含む少なくとも部分的に２本鎖リボ核酸分子に言及する。その２本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、２本の別個のＲＮＡ鎖から形成される二重の２本鎖ＲＮＡであってもよいし、少なくとも部分的に２本鎖のヘアピンコンホメーション（例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡまたはステム−ループｄｓＲＮＡ）をとり得る自己相補性の領域を有する単一のＲＮＡ鎖であってもよい。種々の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、完全にリボヌクレオチドからなるか、またはリボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物からなる（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）。そのｄｓＲＮＡは、分子の一方のセグメントにおけるヌクレオチドが、その分子の別のセグメントにおけるヌクレオチドと塩基対形成するように、自己相補性の領域を有する単一の分子であり得る。一局面において、自己相補性の領域は、少なくとも約３〜４ヌクレオチド、または約５、６、７、９〜１５ヌクレオチドまたはこれより多くのヌクレオチドの領域によって連結され、この領域は、その分子の別の部分に対する相補性を欠いているので、１本鎖のままである（例えば、「ループ領域」）。このような分子は、必要に応じて、短い１本鎖の５’および／または３’末端を有する部分的に２本鎖のステム−ループ構造をとる。一局面において、ヘアピンｄｓＲＮＡの自己相補性の領域または二重ｄｓＲＮＡの２本鎖の領域は、エフェクター配列およびエフェクター相補体を含む（例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡにおいて１本鎖のループ領域によって連結される）。エフェクター配列またはエフェクター鎖は、ＲＩＳＣに組み入れられるかまたはこれと会合する２本鎖領域または二重鎖のその鎖である。一局面において、２本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドエフェクター配列、好ましくは１９〜２９個、１９〜２７個、または１９〜２１個もしくはこれより多くのヌクレオチドを含み、標的遺伝子のＲＮＡに対する逆相補体であるか、または反対鎖複製の中間体である。いくつかの実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、「ヘアピンｄｓＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡヘアピン」、「ショートヘアピンＲＮＡ」、または「ｓｈＲＮＡ」（例えば、およそ４００〜５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、または１００〜２００ｎｔ未満のＲＮＡ分子）であり、ここで少なくとも１５〜１００ヌクレオチド（例えば、１７〜５０ｎｔ、１９〜２９ｎｔ）の少なくとも１つのストレッチが、同じＲＮＡ分子（単一のＲＮＡ鎖）に位置する相補的配列と塩基対形成され、上記配列および相補的配列が塩基相補性の２つの領域によって作られるステム構造より上に１本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチド（または約９〜約１５ｎｔ、約１５〜約１００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ）の対形成されない領域によって分離される。そのｓｈＲＮＡ分子は、約１７〜約５００ｂｐ；約１７〜約５０ｂｐ；約４０〜約１００ｂｐ；約１８〜約４０ｂｐ；または約１９〜約２９ｂｐの２本鎖ステム領域；阻害されるべき標的配列に相同かつ相補的な領域；および少なくとも約４〜７ヌクレオチド、または約９〜約１５ヌクレオチド、約１５〜約１００ｎｔ、約２５０〜５００ｂｐ、約１００〜約１０００ｎｔの対形成されていないループ領域（これは、塩基相補性の２つの領域によって作り出されるステム構造より上に１本鎖ループを形成する）を含む少なくとも１つのステム−ループ構造を含む。しかし、「ループ領域」または「ループ構造」を含むことが厳密に必要というわけではないことは認識される。なぜならその逆相補体が直後に続く配列を含むＲＮＡ分子は、無関係の「スタッファー（stuffer）」配列によって分離されていない場合すら、ステム−ループコンホメーションをとる傾向にあるからである。なお別の実施形態において、ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡ「トリガー」（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２１５６５６号；同第ＵＳ２０１３００６７６１８Ａ１号；同第ＵＳ２０１３０２８８８９５Ａ１号；同第ＵＳ２０１３０２５４９４０Ａ１号；同第ＵＳ２０１３００９７７２６号；同第ＵＳ２０１３０３２６７３１Ａ１号（これらはすべてそれらの全体において本明細書に援用される）に記載される）の使用を通じて行われる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡｉ構築物は、１またはこれより多くの逆方向反復を含む。その逆方向反復は、植物において干渉ＲＮＡ分子へと転写され得る。いくつかの実施形態において、その転写された干渉ＲＮＡ分子は、ＴＦＬシグナル伝達カスケードにおける遺伝子（例えば、ＴＦＬ遺伝子（ＴＦＬ１、ＴＦＬ２、および／またはＴＦＬ３））、またはＴＦＬ活性を誘導する上流にある遺伝子（例えば、ＣＯ）のプロモーター領域、コード領域、イントロン、５’  ＵＴＲ領域、および／または３’  ＵＴＲ領域を標的化し得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、逆方向反復は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに完全に相補的である。いくつかの実施形態において、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、全長にわたって互いに完全には相補的でないが、少なくとも部分的には相補的である。いくつかの実施形態において、そのセンス鎖は、その標的化された遺伝子と約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、またはこれより高い相同性を共有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、開花期シグナル伝達経路遺伝子が改変される植物は、１またはこれより多くの農業上重要な形質を有する。本明細書で使用される場合、「農業上重要な形質」は、ヒトの使用にとって有用または有利である植物または植物の一部における任意の表現型を含む。農業上重要な形質の例としては、バイオマス生産の増加、食物生産の増加、食物品質の改善、果実生産の増加を生じるものが挙げられるが、これらに限定されない。農業上重要な形質のさらなる例としては、害虫抵抗性、成長力、発育時間（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｉｍｅ）（収穫までの時間）、増強された栄養素含有量、新規な成長パターン、風味または色、塩耐性、熱耐性、乾燥耐性および寒耐性（cold  tolerance）、耐病性、果実サイズ、果実重量、果実の色、果実の栄養素、果実の味などが挙げられる。耐病性の非限定的例としては、以下に対する抵抗性が挙げられる：ラズベリーリングスポットウイルス（ＲｐＲＳＶ）、イチゴクリンクルウイルス（ＳＣＶ）、イチゴフェザーリーフウイルス（Strawberry  feather  leaf  virus）、イチゴ潜在「Ｃ」ウイルス（ＳＬＣＶ）、イチゴ潜在リングスポットウイルス（ＳＬＲＳＶ）、イチゴリーフロールウイルス、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）、イチゴ斑紋ウイルス（ＳＭＶ）、イチゴパリドーシスウイルス（Strawberry  pallidosis  virus）、イチゴベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）、タバコえそウイルス（ＴＮＶ）、タバコ輪点ウイルス（ＴＲＳＶ）、タバコ条斑ウイルス（ＴＳＶ）、イチゴえそショックウイルス（ＳＮＳＶ）、トマト黒色輪点ウイルス（ＴＢＲＶ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、トマト輪点ウイルス（ＴｏＲＳＶ）、およびＸａｎｔｈａｍｏｎａｓ  ｆｒａｇａｒｉａｅ（角斑病）。さらなる好ましい形質は、Ｙｕｅら（Ａｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．  Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ  Ｔｒａｉｔ  Ｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ａｕｄｉｅｎｃｅ  Ｓｕｒｖｅｙｓ，  ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  ４９（２）  １８８−１９３  （２０１４））に記載される。
【０１０８】
本開示の植物を生産するために使用され得る発現ベクターもまた、提供される。発現ベクターの骨格は、トランスジェニック植物を生産するために適した任意の発現ベクターであり得る。いくつかの実施形態において、その発現ベクターは、イチゴ植物において導入遺伝子を発現するために適切である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、その発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイナリーベクターである（Ｋａｒｉｍｉら，  （２００７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４５：  １１８３-１１９１；  Ｋｏｍａｒｉら，  （２００６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４３：  １５-４２；  Ｂｅｖａｎ  ＭＷ  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：  １８１１-１８２１；  Ｂｅｃｋｅｒ  （１９９２），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：  １１９５-１１９７；  Ｄａｔｌａら，  （１９９２），  Ｇｅｎｅ  １２２：  ３８３-３８４；  Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：９８９-９９４；  Ｘｉａｎｇ  （１９９９），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４０：  ７１１-７１７；  Ｃｈｅｎら，  （２００３）  Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄ  １１：  ２８７-２９３；  Ｗｅｉｇｅｌら，  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２２：  １００３-１０１３を参照のこと）。別の実施形態において、その発現ベクターは、共組み込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ベクターである（ハイブリッドＴｉプラスミドともいわれる）。より多くの発現ベクターおよびそれらを使用する方法は、米国特許第４９４０８３８号、同第５４６４７６３号、同第５１４９６４５号、同第５５０１９６７号、同第６２６５６３８号、同第４６９３９７６号、同第５６３５３８１号、同第５７３１１７９号、同第５６９３５１２号、同第６１６２９６５号、同第５６９３５１２号、同第５９８１８４０号、同第６４２０６３０号、同第６９１９４９４号、同第６３２９５７１号、同第６２１５０５１号、同第６３６９２９８号、同第５１６９７７０号、同第５３７６５４３号、同第５４１６０１１号、同第５５６９８３４号、同第５８２４８７７号、同第５９５９１７９号、同第５５６３０５５号、および同第５９６８８３０号に見出され得る。本明細書で言及される参考文献の各々は、その全体において参考として援用される。
【０１１０】
必要に応じて、目的の遺伝子をコードする核酸配列はまた、植物の３’非翻訳領域（３’  ＵＴＲ）に作動可能に連結される。植物の３’非翻訳配列は、植物遺伝子に必ず由来するわけではない。例えば、それは、ウイルス遺伝子もしくは細菌遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来するターミネーター配列であり得る。その３’非翻訳調節性ＤＮＡ配列は、約２０〜５０個、約５０〜１００個、約１００〜５００個、または約５００〜１，０００個のヌクレオチド塩基対を含み得、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現をもたらし得る任意の他の調節シグナルに加えて、植物の転写および翻訳終結配列を含み得る。適切な３’非翻訳配列の非限定的な例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル（Ｂｅｖａｎら，  １９８３，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １１：３６９）、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するＴ７転写物のターミネーターを含む、３’転写非翻訳領域である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本開示の発現カセットまたは発現ベクターは、１種または複数種の選択マーカーをコードする核酸をさらに含む。その選択マーカーは、正の選択マーカー、負の選択マーカー、またはこれらの組み合わせであり得る。「正の選択マーカー遺伝子」は、そのマーカー遺伝子を有する細胞の選択培地上での生育を可能にするが、そのマーカー遺伝子を有しない細胞の生育を可能にしないタンパク質をコードする。選択は、選択培地上で生育する細胞（マーカーの獲得を示す）に関するものであり、形質転換体を同定するために使用される。一般例は、薬物耐性マーカー（例えば、ＮＰＴ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ））であり、その遺伝子生成物は、リン酸化によってカナマイシンを解毒するので、その薬物を含む培地上での生育を可能にする。本開示に関連して使用するための他の正の選択マーカー遺伝子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎｅｏ遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，  １９８５）（これは、カナマイシン耐性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８を使用するために選択され得る）；ｂａｒ遺伝子（これは、ビアラホス（ｂａｓｔａ）耐性をコードする）；変異体ａｒｏＡ遺伝子（これは、変更されたＥＰＳＰシンターゼタンパク質をコードする（Ｈｉｎｃｈｅｅら，  １９８８）ので、グリホサート耐性を付与する）；ニトリラーゼ遺伝子（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅに由来するｂｘｎ）（これは、ブロモキシニルに対する耐性を付与する（Ｓｔａｌｋｅｒら，  １９８８））；変異体アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（これは、イミダゾリノン、スルホニルウレアまたは他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を付与する（欧州特許出願１５４，２０４，１９８５））；メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら，  １９８８）、または除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓに由来するｐａｔ遺伝子（これは、酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードし、除草剤ビアラホスにおける活性成分ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）を不活性化する）；または５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異アントラニレートシンターゼ遺伝子。さらなる正の選択マーカー遺伝子としては、環境因子（例えば、過剰な水分、低温処理、凍結、高温、塩、および酸化的ストレス）に対する耐性を提供するそれら遺伝子が挙げられる。当然のことながら、このような形質を「目的の遺伝子」として植物へと導入することが望ましい場合、その選択マーカーは、環境因子に対する耐性を提供するものではあり得ない。
【０１１２】
請求項に記載される開示の実施において有用なマーカーとしては、「不凍」タンパク質（例えば、冬ヒラメの不凍タンパク質（Ｃｕｔｌｅｒら，  １９８９））またはその合成遺伝子派生物；改善された耐冷性を提供する遺伝子（例えば、葉緑体におけるグリセロール−３−ホスフェートアセチルトランスフェラーゼの発現の増加を通じて付与されるもの）（Ｍｕｒａｔａら，  １９９２；  Ｗｏｌｔｅｒら，  １９９２）；スーパーオキシドジスムターゼの発現によって付与され（Ｇｕｐｔａら，  １９９３）、グルタチオンレダクターゼによって改善され得る（Ｂｏｗｌｅｒら，  １９９２）酸化的ストレスに対する耐性；「耐乾燥性（ｄｒｏｕｇｈｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」および「乾燥耐性（ｄｒｏｕｇｈｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」を提供する遺伝子（例えば、マンニトールデヒドロゲナーゼ（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｅｒ，  １９８２）およびトレハロース−６−ホスフェートシンターゼ（Ｋａａｓｅｎら，  １９９２）をコードする遺伝子）が挙げられる。
【０１１３】
「負の選択マーカー遺伝子」は、そのマーカー遺伝子を有する植物の、選択培地上での植物または植物細胞の生育を防止するが、そのマーカー遺伝子を有しない植物の生育を防止しないタンパク質をコードする。その選択培地上で生育する植物の選択は、その選択マーカー遺伝子を排除または追い出した植物の同定を提供する。一例は、ＣｏｄＡ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ）であり、その遺伝子生成物は、５−フルオロシトシン（これは通常、植物はシトシンを代謝しないことから、非毒性である）を毒性の５−フルオロウラシルへと脱アミノ化する。他の負の選択マーカーとしては、ジハロアルカン（例えば、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ））をハロゲン化アルコールおよび無機ハライドに加水分解する（Ｎａｅｓｔｅｄら  （１９９９）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １８  （５）：５７１−６）デハロゲナーゼをコードするＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＧＪ１０のハロアルカンデハロゲナーゼ（ｄｈｌＡ）遺伝子が挙げられる。本明細書で言及される選択マーカーに関する刊行物の各々は、その全体において参考として援用される。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、境界様配列を含む。境界様配列は、植物ゲノムから単離され得、効率を変化させるために改変または変異され得、それによって、境界様配列は、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列へと組み込み得る。
【０１１５】
本開示はまた、少なくとも1種の改変された開花期調節遺伝子を有するイチゴ植物を育種するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ｉ）ドナーとしての改変された遺伝子を含む本開示の植物のうちのいずれか１つを、レシピエント植物に交雑して、Ｆ１集団を作り出す工程；（ｉｉ）上記Ｆ１集団に由来する子孫における表現型を評価する工程；および（ｉｉｉ）長期化した開花期を有する子孫を選抜する工程を包含する。いくつかの実施形態において、そのレシピエント植物は、１またはこれより多くのある種の農業上重要な形質を有する優良系統である。
【０１１６】
新たな遺伝物質を植物ゲノムへと導入するための最も一般的な方法は、細菌病原体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの生細胞を使用して、一片のＤＮＡ（トランスファーＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡといわれる）を個々の植物細胞へと（通常は、組織を傷つけた後に）文字どおり注射することを伴う。ここでそのＤＮＡは、染色体組み込みのための植物核へと標的化される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの使用のために具体的にデザインされた特定のＤＮＡ送達プラスミドの基準となる（governing）多くの特許が存在する（例えば、ＵＳ４５３６４７５、ＥＰ０２６５５５６、ＥＰ０２７０８２２、ＷＯ８５０４８９９、ＷＯ８６０３５１６、ＵＳ５５９１６１６、ＥＰ０６０４６６２、ＥＰ０６７２７５２、ＷＯ８６０３７７６、ＷＯ９２０９６９６、ＷＯ９４１９９３０、ＷＯ９９６７３５７、ＵＳ４３９９２１６、ＷＯ８３０３２５９、ＵＳ５７３１１７９、ＥＰ０６８７３０、ＷＯ９５１６０３１、ＵＳ５６９３５１２、ＵＳ６０５１７５７およびＥＰ９０４３６２Ａ１）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換は、プラスミド上にクローニングされたＤＮＡフラグメントを生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞に配置すること（次いで、この細胞をその後、個々の植物細胞への形質転換に使用する）を第１工程として含む。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換は、従って、間接的な植物形質転換方法である。植物由来境界配列を有するベクターを使用することを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換の方法はまた、当業者に周知であり、本開示において適用可能性を有し得る。例えば、米国特許第７，２５０，５５４号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【０１１７】
Ｎｅｈｒａら（（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ９：２９３−２９８）およびＪａｍｅｓら（（１９９０）  Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ  ２８０：４９５−５０２）は、カルスまたはリーフディスク再生システムのいずれかを介する、イチゴのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換のための方法を記載する。それ以来、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介する再生および形質転換に関するさらなる研究が、種々のイチゴ栽培品種を使用して、成長調節因子および培養条件の異なる組み合わせにおいて行われてきた。なぜなら形質転換の成功は、栽培品種依存性であったからである。米国特許第６，２７４，７９１号は、イチゴ植物のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換および再生のための方法を記載する。例えば、米国特許第６，２７４，７９１号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【０１１８】
イチゴ植物を育種するための旧来の方法は、本開示に基づいてさらなるイチゴ植物を作り出すために利用され得る（例えば、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ；  Ｈｉｓｔｏｒｙ，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｄａｒｒｏｗ  ＧＭ  （１９６６）、および米国特許第６，５９８，３３９号（これは、その全体において参考として本明細書によって援用される）に記載されるもの）。栽培されたイチゴ（Ｆ．ｘ  ａｎａｎａｓｓａ）は、野生型八倍体種Ｆ．ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ  Ｌ．とＦ．ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ  Ｄｕｃｈ．（これは、１７５０年代に初めて導入された（Ｄａｒｒｏｗ，  １９６６））との間の種間ハイブリッドである。反復集団選抜（recurrent  meningeal  nerve）を使用して、種内交雑および種間交雑は、新たな栽培品種を作製するために利用されてきた。最近では、サイズ、色、風味、形状、稔性の程度、熟成期、疾患に対する感受性および植物の構成において変化する複数の倍数性を有する２０を超えるＦｒａｇａｒｉａ種が存在する（Ｂｉｓｗａｓら  （２００９）  Ｓｃｉ  Ｈｏｒｔｉｃ．  １２２：４０９−４１６）。栽培されたイチゴ品種（Ｆ．ｘ  ａｎａｎａｓｓａ）の種内交雑を用いると、改善された農業上の形質が、新たな栽培品種へと導入される。系統選抜、最良の遺伝子型の交雑、およびさらなる選抜が、新たなイチゴ栽培品種に関する育種のために使用される。なぜならイチゴ栽培品種は、ヘテロ接合性であり、近親交配に感受性であるからである。イチゴ栽培品種は、次いで、クローンとしての早出枝（または匍匐茎）を通じて栄養繁殖される（Ｈａｎｃｏｃｋ，  １９９９）。また、新たなイチゴ栽培品種は、インビトロ組織培養およびさらなる栽培のための適切なバリアントの選択からソマクローナルバリエーションの誘導を通じて開発され得る（Ｂｉｓｗａｓら，  ２００９）。ソマクローナルバリエーションは、染色体数（多倍数性）の変化または挿入、欠失、転座、もしくは変異による染色体再編成によって起こる。ソマクローナルバリエーションによる植物育種の成功は、遺伝的に安定なソマクローンの選択に依存する。
【０１１９】
古典的な育種法は、本開示の１種または複数種の改変された遺伝子を他の植物品種、または本開示のトランスジェニック植物と交雑されるのに適合した他の密接に関連した種へと導入するために、本開示の中に包含され得る。
【０１２０】
本開示のイチゴ植物は、高地においてコンディショニングされなくても、上方調節された開花サイクル経路を有する。このようなイチゴ植物は、コンディショニングの必要性なしに低地において生育され得る。さらに、このようなイチゴ植物は、燻蒸農薬（例えば、臭化メチル）の使用なしに生育され得る。本開示は、収量を増加させ、かつ環境的に安全な収容能力において害虫汚染を低減すると同時に、商業的に魅力的なイチゴをプラグ苗から育てるために必要な土地の量を低減する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝的に改変されたイチゴ植物は、プラグ苗が春化される圃場において事前の生育期なしに、生産圃場で直接生育され得る。この方法によって、プラグ苗生産に必要な時間が短縮される。いくつかの実施形態において、プラグ苗生産に必要な時間は、少なくとも０．５ヶ月間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、５．５ヶ月間、６ヶ月間、６．５ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、またはこれより長く短縮される。本開示の方法はまた、燻蒸農薬の使用を低減する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、内因性ＴＦＬ遺伝子（複数可）の発現が低下したイチゴ植物を使用し、これらの植物は、改変された開花期シグナル伝達経路なしのコントロール植物と比較した場合に、増加した収量を有する。いくつかの実施形態において、その方法は、その植物の果実生産を増加させる。いくつかの実施形態において、その収量は、所定の期間内の（例えば、時季あたりまたは１年あたり）、１植物あたりに生産される果実重量、または１植物あたり、または１エーカーあたりの果実数で測定される。いくつかの実施形態において、その収量は、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１倍、約２倍、約３倍、またはこれより多く増加する。
【０１２３】
本開示のイチゴ植物は、温室および／またはスクリーンハウスの中の滅菌土壌中で繁殖され得、気候条件に基づいて果実生産圃場に植え付けられ得る。また、そのイチゴ植物は、計画的に制御された温室および／またはスクリーンハウスの中で一年中育てられ得る。本開示は、年間（複数可）を通していかなる切れ目もなく、連続した果実生産を可能にする。
【０１２４】
本開示は、他のイチゴ品種に適用して、その品種を育て、日の長さおよび／または温度に関連した光周期のような環境信号（例えば、春化）とは無関係に果実を生産することができる。
【０１２５】
本開示の利益としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
１．栽培者が、コンディショニングを要しない害虫のない苗木またはプラグ苗にアクセスする助けになる。
【０１２６】
２．高地苗床に関わるイチゴ母株（stock  plant）生産の労働、土地、輸送、栄養分、燻蒸剤のコストを低減する。
【０１２７】
３．母株生産に関わる工程を低減することから、母株が栽培者または配送センターに提供され得る約６〜６．５ヶ月間という時間差を低減する。
【０１２８】
４．燻蒸農薬を使用する必要性を低減または排除する。
【０１２９】
５．ＴＦＬ１発現が低下している植物においてのように、生育期を延ばすと、果実製品をより早く（例えば、果実の価格が最も高いときにフロリダおよび南カリフォルニアで）または温室で一年中着手することができる。
【０１３０】
６．果実生産の切れ目なしに時季を通して果実生産（収量）を増加させる。
【０１３１】
７．長日または短日の下で、かつ温度とは無関係な生育に適した任意の品種を作製し、イチゴ品種の変遷（dynamics）に影響を及ぼす。
【０１３２】
本開示は、イチゴ苗床母株をどのように生産するかという業界の慣習を変化させ、輸送、植え付け、労働のコストおよび高地苗床と関連する土地のコストを低減する。その方法は、害虫、病原体および雑草を制御するための燻蒸農薬の必要性を低減することから、より環境に優しい。
【０１３３】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに本明細書で記載される細胞培養、分子遺伝学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該分野で周知かつ一般に使用されるものである。標準的な技術が、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、細胞培養、組織培養、形質転換、トランスフェクション、形質導入、分析化学、有機合成化学、化学合成、化学分析、ならびに薬学的製剤化および送達に関して使用される。一般に、酵素反応、ならびに精製および／または単離工程は、製造業者の仕様書に従って行われる。その技術および手順は概して、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．  （１９８９）に開示される従来の方法論に従って行われる。
【０１３４】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、本開示が関係する分野の当業者の水準を示す。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。本明細書中のいかなることも、本開示が、先の開示によってこのような刊行物より先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
【０１３５】
本明細書で示される開示の多くの改変および他の実施形態は、前述の説明および関連する図面に示される教示の利益をもって、これらの開示が関係する分野の当業者に想起される。従って、本開示が、開示される具体的実施形態に限定されないこと、および改変および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図されることは、理解されるべきである。特定の用語が本明細書で使用されるが、それらは、包括的および説明の意味でのみ使用されるのであって、限定目的ではない。
【０１３６】
本開示は、その具体的な実施形態に関連して記載されてきたが、さらなる改変が可能であり、一般に、本開示の原理に従いそして本開示からのこのような逸脱を含む本開示の任意のバリエーション、使用、または適合を、本開示が関係する分野内の公知のもしくは習慣的な実務の範囲内に入り、本明細書中以前に示される本質的な特徴に適用され得、そして添付の特許請求の範囲の範囲内で従うように、本出願が網羅することが意図されることは、理解される。
【０１３７】
任意の図面および付表、ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定される全ての核酸配列およびポリペプチド配列を含め、全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。
【０１３８】
前述の説明は、本開示を理解するにあたって有用であり得る情報を含む。それは、本明細書で提供される情報のうちのいずれかが先行技術であるか、または現請求項に記載される開示に直接関連がある、あるいは具体的にまたは言外に言及された任意の刊行物が先行技術であるという承認ではない。
【実施例】
【０１３９】
実施例１  植物形質転換ベクター
植物形質転換ベクターを、標準的な分子生物学技術を使用して構築した。基本ベクターはｐＳＩＭ２４０２であり、抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンチシン、およびパロモマイシン）に対する耐性を付与するＮｐｔＩＩ遺伝子を含む植物形質転換カセットを含む。左Ｔ−ＤＮＡ境界から右Ｔ−ＤＮＡ境界までの、およびＮｐｔＩＩ遺伝子カセットを含む挿入ＤＮＡセグメントは、長さが２３０４ｂｐであり、配列番号１３として示される。ｐＳＩＭ２４０２挿入ＤＮＡの遺伝的エレメントは表１に示され、図１に図示される。
【０１４０】
【表１】
2019532643.tif 000003
【０１４１】
ＴＦＬ１の発現を低下させるための形質転換ベクターは、ｐＳＩＭ２４４１であり、（１）ＮｐｔＩＩ遺伝子の発現のための発現カセット、および（２）ＴＦＬ１遺伝子サイレンシングカセットの発現のための発現カセット（ＦａＴＦＬ）を含む。ｐＳＩＭ２４４１ベクターの左Ｔ−ＤＮＡ境界から右Ｔ−ＤＮＡ境界までの挿入ＤＮＡセグメントは、長さが４３０７ｂｐであり、配列番号１４として示される。ｐＳＩＭ２４４１挿入ＤＮＡの遺伝的エレメントは表２に示され、図２に図示される。ＦａＴＦＬ発現カセットの逆方向反復領域は、表２に示されるように作動可能に連結される配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１を含む。
【０１４２】
【表２−１】
2019532643.tif 000004
【表２−２】
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【０１４３】
実施例２  イチゴ植物形質転換
イチゴ植物（ＬＦ９生殖質）を、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバ（Ｐｅｒｃｉｖａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｄｅｌ  ＣＵ−３６Ｌ４，  Ｐｅｒｒｙ，  ＩＡ）の内部にＦｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ発根（ＦａＲ）培地（１／２×  Ｍ５１９（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓｈａｗｎｅｅ，  ＫＳ）、１５ｇ／Ｌ  スクロース、６ｇ／Ｌ  アガー、ｐＨ５．７）を含むマゼンタボックス（ＭａｇｅｎｔａＴＭ，  Ｍｏｄｅｌ  ＧＡ−７，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の中で、１６時間光周期で２３℃において生育させた。４〜６週齢植物の葉を切断し、滅菌ＭＳ液体培地（１×  Ｍ５１９、３０ｇ／Ｌ  スクロース、ｐＨ５．７）で湿らせた濾紙の上に置いた。各葉の外縁部を除去し、各葉を、３〜５×３〜５ｍｍの矩形の外植セクター（explant  sector）へと切断した。外植片を、前培養培地（シュート再生培地４（ＳＲＭ４）：  １×  Ｍ５１９、３０ｇ／Ｌ  スクロース、６ｇ／Ｌ  アガー、ｐＨ５．７、２ｍｇ／Ｌ  チジアズロン、０．５ｍｇ／Ｌ  インドール−３−酪酸）上に、背軸面（裏側）を培地に接触させて配置した。前培養ＳＲＭ４培地上の外植片を、２３℃において７日間遮光して、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバの中に入れた。
【０１４４】
前培養期間後に、その外植片を、２００μＭ  アセトシリンゴン、および０．４％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１５〜２５ｍｌの形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物とともに、滅菌ペトリ皿の中に入れた。そのペトリ皿をパラフィルムでシールし、遮光して３０分間、室温においてオービタルシェイカー上で穏やかに振盪しながらインキュベートした。その形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１は、ｐＳＩＭ２４０２ベクターまたはｐＳＩＭ２４４１ベクターのいずれかで形質転換されており、培養物を光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）０．３まで生育させた。インキュベーションの最後に、その外植片を、滅菌濾紙に移して過剰なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを除去し、選択なしの共培養培地（ＳＲＭ４培地）上に置いた。これらの外植片を、２３℃で４８時間遮光して、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバの中に入れた。
【０１４５】
共培養期間後に、外植片を、植物選抜のために、１５０ｍｇ／Ｌ  チメンチン、１．２ｍｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＰＭ）、５０ｍｇ／Ｌ  バリダマイシンＡ、および５ｍｇ／Ｌ  カナマイシンを含む回復シュート再生培地（ＳＲＭ４）に移した。これらの外植片を、２３℃において７日間遮光して、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバの中に入れた。
【０１４６】
回復期間後、外植片を、１５０ｍｇ／Ｌ  チメンチン、１．２ｍｌ  ＰＰＭ、および２５ｍｇ／Ｌ  カナマイシンを含む選抜シュート再生培地（ＳＲＭ４）に移した。これらの外植片を、１６時間光周期で２３℃においてＰｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバの中に入れた。その外植片を、長さが少なくとも４〜５ｍｍのシュート塊が達成されるまで４週間ごとに新たな選抜ＳＲＭ４培地上で継代培養した。
【０１４７】
シュート塊が形成されたら、それらをカルスから切断し（１外植片あたり１〜２個の独立したシュート塊）、１５０ｍｇ／Ｌ  チメンチンおよび１．２ｍｌ  ＰＰＭを７５ｍｇ／Ｌ  カナマイシンとともに含むＦａＲ培地を含むマゼンタボックスに移した。マゼンタボックス中のシュート塊を、１６時間光周期で２３℃において、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバの中に入れた。シュート塊を、１５０ｍｇ／Ｌ  チメンチンおよび１．２ｍｌ  ＰＰＭを７５ｍｇ／Ｌ  カナマイシンとともに含む新たなＦａＲ培地上で、さらに２回の継代培養（２回目および３回目の継代培養）のために４週間ごとに継代培養した。３回目の継代培養における４週間後に、個々の発根したシュートを、１５０ｍｇ／Ｌ  チメンチンおよび１．２ｍＬ  ＰＰＭを含むＦａＲ培地上に１４日間集めた。
【０１４８】
組織サンプルを、１４日シュートから集め、ＰＣＲ分析のために使用した。ＤＮＡを、ハイスループットＤＮＡ抽出法（Ｘｉｎら  （２００３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：８２０−８２６）を使用してその組織サンプルから抽出した。ｐＳＩＭ２４０２での形質転換から再生されたシュートの分析のために、ＰＣＲプライマーは、配列番号１３の６７８〜１１７８位の領域にわたる５０１ｂｐフラグメントを増幅した。ｐＳＩＭ２４４１での形質転換から再生したシュートの分析のために、ＰＣＲプライマーは、配列番号１４の２，７１１〜３，３６２位の領域にわたる６５２ｂｐフラグメントを増幅した。表３は、ｐＳＩＭ２４０２ベクターまたはｐＳＩＭ２４４１ベクターでの形質転換から再生した植物をスクリーニングするためのＰＣＲプライマーおよびプライマー配列を列挙する。
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
２種のベクターｐＳＩＭ２４０２およびｐＳＩＭ２４４１の各々について、表４は、形質転換のために切断および使用される外植片の数、発根したシュートの数、ならびにＰＣＲ陽性植物の数を示す。ＰＣＲ陽性植物の全てを、６インチポットの中の土壌なしの生育培地に移し、温室へと移動した。
【０１５１】
【表４】
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【０１５２】
実施例３  温室評価
ｐＳＩＭ２４０２ベクターまたはｐＳＩＭ２４４１ベクターでの形質転換から再生し、ＰＣＲアッセイによって陽性としてスコア化されたイチゴ植物を、６インチポットの中の土壌なしの生育培地に移し、温室の中で育てた。その温室周囲温度は、日中は６０〜６５°Ｆおよび夜間は５０〜５５°Ｆで維持した。光を午前６時〜午後１０まで提供した（これは、長日光周期を構成する）。自然光が主な光源であったが、必要な場合には、高圧ナトリウムフィクスチャが補助照明を提供した。植物を、必要に応じて手で水遣りし、２週間ごとに施肥した。ｐＳＩＭ２４４１ベクターでの形質転換から（ＦａＴＦＬのダウンレギュレーションとともに）発生した系統は、植え付けの８週間後に花芽を付けた。コントロールベクターｐＳＩＭ２４０２での形質転換から発生した系統は、植え付けの１７週間後に花芽を付けた。植え付けの２０週間後に、野生型（ＷＴ）ＬＦ９植物（８個の別個の植物）、ｐＳＩＭ２４０２で形質転換した植物（１９個の独立した系統または事象）、およびｐＳＩＭ２４４１で形質転換した植物（２９個の独立した系統または事象）に関して、果実および花芽の形成を決定した。表５は、評価した遺伝的事象の数、ならびに果実および／または花芽を生じる植物のパーセンテージを示す。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１で形質転換した植物は、コントロールベクターｐＳＩＭ２４０２で形質転換した植物より９週間早く開花が始まったことを実証する。さらに、その結果は、ｐＳＩＭ２４４１で形質転換した植物が、ＷＴまたはコントロール形質転換植物のいずれかと比較して、植え付けの２０週間後に花および／または果実生産の増加を有したことを示す。
【０１５３】
【表５】
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【０１５４】
実施例４  初年度の圃場評価
温室において生育させた植物から繁殖した裸根の娘株を、低地の場所に輸送し、発根させるためにポットへと植え付けた。そのポット移植した娘株を、スクリーンハウスの中で維持し、必要に応じて水遣りおよび施肥した。そのポットの中で一旦発根したら、遺伝的事象１つあたり１つの複製物を、中部カリフォルニアにおいて２ヶ月後に地植えした。事象を、試験の中で無作為化した。この試験では、２５のＷＴ植物、ベクターｐＳＩＭ２４０２での形質転換に由来する２６の事象、およびベクターｐＳＩＭ２４４１での形質転換に由来する２５の事象があった。地植えの６週間後に、全ての花序を除去して、同時期に花をつけるようにした。花序の数を、植え付け後８週目、１２週目、１６週目、および２０週目に記録した。花序を、少なくとも１個の花が開花に達した場合に数えた。花序の数を数え、その後、各評価日に除去した。８週目、１２週目、１６週目、および２０週目に数えた１植物あたりの花序の総数をまとめ、１植物あたりの花序の総数を表６に示す。その結果は、ＷＴおよびコントロールベクターｐＳＩＭ２４０２に由来する事象が、１植物あたり本質的に同じ花序の総数を与えたことを示す（表６を参照のこと）。対照的に、形質転換ベクターｐＳＩＭ２４４１に由来する事象は、ＷＴおよびコントロールｐＳＩＭ２４０２事象のものの約２倍の１植物あたりの花序の平均総数を有した（表６を参照のこと）。２５個の個々のｐＳＩＭ２４４１事象に関して植え付け後の８〜２０週間の期間にわたる花序の総数は、少ないものは４（事象２４４１−１５）から多いものは４２（事象２４４１−３７）の範囲に及んだ（表７を参照のこと）。
【０１５５】
【表６】
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【０１５６】
【表７−１】
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【表７−２】
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【０１５７】
実施例５  第２年度の圃場評価
裸根の娘株を採取し、低地苗床（中部カリフォルニア）、および高地苗床（北部カリフォルニア）の両方から輸送し、生産圃場に植え付けた。その低地苗床植物は、低温処理を受けなかった（非低温処理供給源植物）一方で、高地苗床植物は、商業的品種に関する標準的慣行に類似の低温要求時間を受けた（低温処理供給源植物）。娘株は、標準的な商業的慣行に従って、２０１５年１１月１１日に旧来の果実生産領域へと植え付けた。植え付けのときに、１遺伝的事象あたり１区画が存在した（各区画は、１２個の植物を含んだ）。ＷＴ植物については、各々、１２個の植物の６区画が存在した。ｐＳＩＭ２４０２に由来する事象について評価される６つの個々の遺伝的事象（１事象あたり１区画）が存在した。ｐＳＩＭ２４４１に由来する事象について評価される１０個の個々の遺伝的事象（１事象あたり１区画）が存在した。その区画を、試験内で無作為化しなかった。開花期に達した少なくとも１つの花を有する１区画あたりの植物数を、１週目から開始して１６週目までずっと、毎週記録した。区画を、収量評価を開始する前に、３月中旬に１区画あたり１０個の植物に間引きした。全収量評価を２０１６年４月７日に開始し、２０１６年８月２９日に終了し、その期間にわたって２〜３日ごとに果実を収穫し、数えそして秤量した。
【０１５８】
低温処理供給源植物については、植え付け後１２週間で開花期に達した植物の数は、ＷＴ植物およびｐＳＩＭ２４０２植物に関してほぼ等しかった（それぞれ、全２４植物および全２９植物）。対照的に、開花期に達したｐＳＩＭ２４４１植物の総数では、２〜３倍の増加があった（７４植物）（表８を参照のこと）。個々の遺伝的事象に関して開花期に達したｐＳＩＭ２４４１植物の数は、５〜１１の範囲に及んだ（表９を参照のこと）。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１での形質転換によって生じたいくつかのイチゴの事象が、低温処理供給源植物において開花の増加をもたらすことを示す。
【０１５９】
【表８】
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【０１６０】
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１６１】
非低温処理供給源植物については、植え付け後１２週間で開花期に達した植物の数は、ＷＴ植物に関しては４であり、ｐＳＩＭ２４０２植物に関しては１であり、ｐＳＩＭ２４４１植物に関しては３７であった（表１０を参照のこと）。これらの数は、定着した植物の総数のうちの６％（ＷＴ）、１％（ｐＳＩＭ２４０２）、および３１％（ｐＳＩＭ２４４１）を表す。個々の遺伝的事象に関して開花期に達したｐＳＩＭ２４４１植物の数は、少ないものは１つの植物、または定着した植物数のうちの８％（事象ＩＤ  ２４４１−３５）から、高いものは７つの植物、または定着した植物数のうちの５８％（事象ＩＤ  ２４４１−３３）までの範囲に及んだ（表１１を参照のこと）。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１での形質転換によって生じたいくつかのイチゴの事象が、非低温処理供給源植物において開花の増加をもたらしたことを示す。
【０１６２】
【表１０】
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【０１６３】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０１６４】
低温処理供給源植物については、植え付け後４１週間での平均全収量は、ＷＴに関しては１７，２１９グラムであり；ｐＳＩＭ２４０２植物に関しては１５，８４８グラムであり；そしてｐＳＩＭ２４４１植物に関しては１８，９６７グラムであった（表１２を参照のこと）。ｐＳＩＭ２４４１植物の個々の遺伝的事象の平均全収量は、少ないものは８，３６０グラム（事象ＩＤ  ２４４１−２１）から多いものは２４，９４５グラム（事象ＩＤ  ２４４１−２５）の範囲に及んだ（表１３を参照のこと）。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１での形質転換によって生じたいくつかのイチゴの事象が、植え付け後４１週間で低温処理供給源植物において平均全収量の増加をもたらしたことを示す。
【０１６５】
【表１２】
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【０１６６】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【０１６７】
非低温処理供給源植物については、植え付け後４１週間での平均全収量は、ＷＴに関しては１４，７９５グラムであり；ｐＳＩＭ２４０２植物に関しては１４，１５２グラムであり；そしてｐＳＩＭ２４４１植物に関しては２０，３５４グラムであった（表１４を参照のこと）。ｐＳＩＭ２４４１植物の個々の遺伝的事象の平均全収量は、少ないものは１１，１０５グラム（事象ＩＤ  ２４４１−２１）から多いものは２４，０８５グラム（事象ＩＤ  ２４４１−２）の範囲に及んだ（表１５を参照のこと）。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１での形質転換によって生じたいくつかのイチゴの事象が、植え付け後４１週間で非低温処理供給源植物において平均全収量の増加をもたらしたことを示す。
【０１６８】
【表１４】
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【０１６９】
【表１５】
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【０１７０】
実施例６  第３年度の圃場評価
高地苗床（北部カリフォルニア）からの裸根の娘株を、２０１６年１１月１０日に標準的な商業的慣行に従って旧来の果実生産領域に植え付けた。植え付けのときに、１遺伝的事象あたり４つの区画が存在した（各区画は１２植物（高地苗床からの低温処理供給源植物）を含む）。ｐＳＩＭ２４０２植物に関して評価される５個の個々の遺伝的事象が存在し、ｐＳＩＭ２４４１植物に関して評価される９個の個々の遺伝的事象が存在した。区画を、試験内で無作為化した。開花期に達した少なくとも１つの花を有する１区画あたりの植物の数を、１週目に開始して１９週目までずっと毎週記録した。その区画を、収量評価を始める前に、４月上旬に１区画あたり１０植物に間引きした。全収量評価を、２０１７年４月１１日に開始した。そして２０１７年９月中まで継続し、その期間の間中、２〜３日ごとに果実を収穫し、数え、秤量する。
【０１７１】
第３年度の圃場試験での低温処理供給源植物について、植え付け後１９週間で開花期に達した植物の数は、ＷＴ植物に関しては１２３であり、ｐＳＩＭ２４０２植物に関しては１１２であり、ｐＳＩＭ２４４１植物に関しては２９６であった（表１６を参照のこと）。これらの数は、定着した植物の総数のうちの５２％（ＷＴ）、４７％（ｐＳＩＭ２４０２）、および８４％（ｐＳＩＭ２４４１）を表す。個々の遺伝的事象に関して開花期に達したｐＳＩＭ２４４１植物の数は、少ないものは１１植物、または定着した植物の数のうちの４６％（事象ＩＤ  ２４４１−３５）から多いものは４５植物、または定着した植物の数のうちの９６％（事象ＩＤ  ２４４１−２６）の範囲に及んだ（表１７を参照のこと）。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１での形質転換によって生じたいくつかのイチゴの事象が、低温処理供給源植物において開花の増加をもたらしたことを示す。
【０１７２】
【表１６】
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【０１７３】
【表１７】
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【０１７４】
低温処理供給源植物での第３年度の圃場試験に関して、植え付け後３４週間での平均全収量は、ＷＴに関しては１，００２グラムであり；ｐＳＩＭ２４０２植物に関しては１，０７９グラムであり；そしてｐＳＩＭ２４４１植物に関しては１，１２７グラムであった（表１８を参照のこと）。ｐＳＩＭ２４４１植物の個々の遺伝的事象の平均全収量は、植え付け後３４週間で少ないものは９８８グラム（事象ＩＤ  ２４４１−２）から多いものは１４４９グラム（事象ＩＤ  ２４４１−３２）の範囲に及んだ（表１９を参照のこと）。これらの結果は、ｐＳＩＭ２４４１での形質転換によって生じたいくつかのイチゴの事象が、移植後＃＃週間で低温処理供給源植物において平均全収量の増加をもたらしたことを示す。
【０１７５】
【表１８】
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【０１７６】
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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