(57)【要約】  開示されるビーズベクターは、単球起源の細胞に侵入するように仕向けられ、かつPD-1の細胞外ドメイン、抗CTLA4抗体、またはチェックポイントタンパク質に特異的な抗体の発現を引き起こす。ビーズベクターは、核酸成分、リソソーム回避成分および貪食されることができるビーズ粒子を含むことができる。開示されるベクターは、癌療法、治療、および予防の種々の方法で有用である。単球細胞が腫瘍を標的化する能力に起因して、開示されるベクターは、抗腫瘍用途での使用および腫瘍関連マクロファージ中での標的遺伝子の発現を仕向けるために特に非常に好適である。【選択図】図２
2019524144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成要素：
(i) 抗CTLA4抗体をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 貪食されることができるビーズ粒子
を含む、ビーズベクター。
【請求項２】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項３】
前記非感染性ウイルスがアデノウイルスである、請求項2に記載のビーズベクター。
【請求項４】
前記アデノウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求項3に記載のビーズベクター。
【請求項５】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項2に記載のビーズベクター。
【請求項６】
前記抗CTLA4抗体をコードする核酸が、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項７】
前記抗CTLA4抗体をコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターが、核プロモーターを含む、請求項7に記載のビーズベクター。
【請求項９】
前記核プロモーターがT7プロモーターを含む、請求項8に記載のビーズベクター。
【請求項１０】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項7に記載のビーズベクター。
【請求項１１】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項10に記載のビーズベクター。
【請求項１２】
前記発現ベクターが、図8に示される配列を含む、請求項7に記載のビーズベクター。
【請求項１３】
抗CTLA4抗体が単一ドメイン抗体である、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項１４】
核酸保護成分をさらに含む、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項１５】
前記核酸保護成分が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性高分子および該核酸配列中に含められる適切なパッケージング配列を含むレトロウイルスのコア粒子からなる群より選択される、請求項14に記載のビーズベクター。
【請求項１６】
抗CTLA4抗体をコードする核酸およびリソソーム回避成分が、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用によりビーズ粒子に連結される、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項１７】
抗CTLA4抗体をコードする核酸およびリソソーム回避成分が、抗体結合によりビーズ粒子に連結される、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項１８】
前記リソソーム回避成分がアデノウイルスペントンタンパク質を含む、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項１９】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項２０】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項２１】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項1に記載のビーズベクター。
【請求項２２】
以下の構成要素：
(i) 抗CTLA4抗体をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであり、かつ組成物が単球細胞により貪食されることを可能にするビーズ粒子
を含む、単球細胞への標的化された侵入のためのビーズベクター。
【請求項２３】
前記単球細胞がマクロファージである、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項２４】
前記マクロファージが腫瘍関連マクロファージ（TAM）である、請求項23に記載のビーズベクター。
【請求項２５】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項２６】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項２７】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項２８】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項２９】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項３０】
前記抗CTLA4抗体をコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項３１】
前記発現ベクターが、図8に示される配列を含む、請求項31に記載のビーズベクター。
【請求項３２】
前記抗CTLA4抗体が単一ドメイン抗体である、請求項22に記載のビーズベクター。
【請求項３３】
以下の構成要素：
(i) 抗CTLA4抗体をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであるビーズ粒子
を含むビーズベクターを、癌を有する患者に投与するステップを含む、患者での癌を治療する方法であって、該ビーズベクターの投与が該患者の癌を治療する、上記方法。
【請求項３４】
前記癌がCTLA4リガンドを発現する、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が、低酸素微小環境を含む少なくとも1種の腫瘍を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも1種の腫瘍が腫瘍関連マクロファージ（TAM）をさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３８】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項４０】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項33に記載の方法。
【請求項４１】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項33に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗CTLA4抗体をコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項33に記載の方法。
【請求項４３】
前記発現ベクターが、T7プロモーターを含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記発現ベクターが、図8に示される配列を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗CTLA4抗体が単一ドメイン抗体である、請求項33に記載の方法。
【請求項４６】
前記ビーズベクターが、皮内または皮下に投与される、請求項33に記載の方法。
【請求項４７】
前記ビーズベクターが、標的リンパ節に近接して投与される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
以下の構成要素：
(i) PD-1細胞外ドメインをコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 貪食されることができるビーズ粒子
を含む、ビーズベクター。
【請求項４９】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項５０】
前記非感染性ウイルスがアデノウイルスである、請求項49に記載のビーズベクター。
【請求項５１】
前記アデノウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求項50に記載のビーズベクター。
【請求項５２】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項49に記載のビーズベクター。
【請求項５３】
前記PD-1細胞外ドメインをコードする核酸が、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項５４】
前記PD-1細胞外ドメインをコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項５５】
前記発現ベクターが、核プロモーターを含む、請求項54に記載のビーズベクター。
【請求項５６】
前記核プロモーターがCMVプロモーターを含む、請求項55に記載のビーズベクター。
【請求項５７】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項54に記載のビーズベクター。
【請求項５８】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項57に記載のビーズベクター。
【請求項５９】
前記PD-1細胞外ドメインが哺乳動物PD-1細胞外ドメインを含む、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６０】
前記PD-1細胞外ドメインがヒトPD-1細胞外ドメインを含む、請求項59に記載のビーズベクター。
【請求項６１】
前記PD-1細胞外ドメインがマウスPD-1細胞外ドメインを含む、請求項59に記載のビーズベクター。
【請求項６２】
核酸保護成分をさらに含む、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６３】
前記核酸保護成分が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性高分子および該核酸配列中に含められる適切なパッケージング配列を含むレトロウイルスのコア粒子からなる群より選択される、請求項62に記載のビーズベクター。
【請求項６４】
PD-1細胞外ドメインをコードする核酸およびリソソーム回避成分が、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用によりビーズ粒子に連結される、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６５】
PD-1細胞外ドメインをコードする核酸およびリソソーム回避成分が、抗体結合によりビーズ粒子に連結される、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６６】
前記リソソーム回避成分がアデノウイルスペントンタンパク質を含む、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６７】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６８】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項６９】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項48に記載のビーズベクター。
【請求項７０】
以下の構成要素：
(i) PD-1細胞外ドメインをコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであり、かつ組成物が単球細胞により貪食されることを可能にするビーズ粒子
を含む、単球細胞への標的化された侵入のためのビーズベクター。
【請求項７１】
前記単球細胞がマクロファージである、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項７２】
前記マクロファージが腫瘍関連マクロファージ（TAM）である、請求項71に記載のビーズベクター。
【請求項７３】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項７４】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項７５】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項７６】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項７７】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項76に記載のビーズベクター。
【請求項７８】
前記PD-1細胞外ドメインをコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項７９】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項78に記載のビーズベクター。
【請求項８０】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項79に記載のビーズベクター。
【請求項８１】
前記PD-1細胞外ドメインが哺乳動物PD-1細胞外ドメインを含む、請求項70に記載のビーズベクター。
【請求項８２】
前記PD-1細胞外ドメインがヒトPD-1細胞外ドメインを含む、請求項81に記載のビーズベクター。
【請求項８３】
前記PD-1細胞外ドメインがマウスPD-1細胞外ドメインを含む、請求項81に記載のビーズベクター。
【請求項８４】
以下の構成要素：
(i) PD-1細胞外ドメインをコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであるビーズ粒子
を含むビーズベクターを、癌を有する患者に投与するステップを含む、患者での癌を治療する方法であって、該ビーズベクターの投与が該患者の癌を治療する、上記方法。
【請求項８５】
前記癌がPD-1リガンドを発現する、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
前記癌が、低酸素微小環境を含む少なくとも1種の腫瘍を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８７】
前記少なくとも1種の腫瘍が腫瘍関連マクロファージ（TAM）をさらに含む、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８９】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項84に記載の方法。
【請求項９０】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項９１】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項84に記載の方法。
【請求項９２】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
前記PD-1細胞外ドメインをコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項84に記載の方法。
【請求項９４】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
前記PD-1細胞外ドメインが哺乳動物PD-1細胞外ドメインを含む、請求項84に記載の方法。
【請求項９７】
前記PD-1細胞外ドメインがヒトPD-1細胞外ドメインを含む、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
前記PD-1細胞外ドメインがマウスPD-1細胞外ドメインを含む、請求項96に記載の方法。
【請求項９９】
以下の構成要素：
(i) 抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 貪食されることができるビーズ粒子
を含む、ビーズベクター。
【請求項１００】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１０１】
前記非感染性ウイルスがアデノウイルスである、請求項100に記載のビーズベクター。
【請求項１０２】
前記アデノウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求項100に記載のビーズベクター。
【請求項１０３】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１０４】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸が、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１０５】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１０６】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項105に記載のビーズベクター。
【請求項１０７】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項106に記載のビーズベクター。
【請求項１０８】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片が、抗PD-L1抗体またはその結合性断片である、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１０９】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸およびリソソーム回避成分が、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用によりビーズ粒子に連結される、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１１０】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸およびリソソーム回避成分が、抗体結合によりビーズ粒子に連結される、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１１１】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１１２】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１１３】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項99に記載のビーズベクター。
【請求項１１４】
以下の構成要素：
(i) 抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであり、かつ組成物が単球細胞により貪食されることを可能にするビーズ粒子
を含む、単球細胞への標的化された侵入のためのビーズベクター。
【請求項１１５】
前記単球細胞がマクロファージである、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１１６】
前記マクロファージが腫瘍関連マクロファージ（TAM）である、請求項115に記載のビーズベクター。
【請求項１１７】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１１８】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１１９】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１２０】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１２１】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項120に記載のビーズベクター。
【請求項１２２】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１２３】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項122に記載のビーズベクター。
【請求項１２４】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項123に記載のビーズベクター。
【請求項１２５】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片が、抗PD-L1抗体またはその結合性断片である、請求項114に記載のビーズベクター。
【請求項１２６】
以下の構成要素：
(i) 抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであるビーズ粒子
を含むビーズベクターを、癌を有する患者に投与するステップを含む、患者での癌を治療する方法であって、該ビーズベクターの投与が該患者の癌を治療する、上記方法。
【請求項１２７】
前記癌がPD-1リガンドを発現する、請求項126に記載の方法。
【請求項１２８】
前記癌が、低酸素微小環境を含む少なくとも1種の腫瘍を含む、請求項126に記載の方法。
【請求項１２９】
前記少なくとも1種の腫瘍が腫瘍関連マクロファージ（TAM）をさらに含む、請求項128に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ビーズ粒子が強磁性粒子を含む、請求項126に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ビーズ粒子がマイクロビーズまたはミクロスフェアを含む、請求項126に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ビーズ粒子が酵母細胞壁粒子（YCWP）を含む、請求項126に記載の方法。
【請求項１３３】
前記リソソーム回避成分が、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分である、請求項126に記載の方法。
【請求項１３４】
前記非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分が、非複製性である、請求項133に記載の方法。
【請求項１３５】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸が、発現ベクター中にコードされる、請求項126に記載の方法。
【請求項１３６】
前記発現ベクターが、低酸素誘導型プロモーターを含む、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
前記低酸素誘導型プロモーターが、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含む、請求項136に記載の方法。
【請求項１３８】
前記抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片が、抗PD-L1抗体またはその結合性断片である、請求項126に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が全体で参照により本明細書中に組み入れられる2016年8月17日出願の米国特許仮出願第62/376,033号に基づく利益および優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本開示は、一般的には癌療法の分野に関し、特に、単球特異的ビーズベクターを用いる標的化型癌療法に関する。本開示は、腫瘍関連マクロファージを活性化させて、それによりプログラムされた細胞死1（PD-1）の細胞外ドメインまたは抗チェックポイントタンパク質抗体もしくはその結合性断片（細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA4）に結合する単一ドメイン抗体など）を発現させることにより、腫瘍を効果的に治療するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察は、単に本開示を理解する上で読者を助けるために提供され、本開示に対する先行技術を記載または構成することを認めるものではない。
【０００４】
単球細胞は、正常時には、細菌などの外来性非自己抗原を探して身体をパトロールする。単球細胞は細菌を貪食し、続いてこれをリソソーム中でさらに小さな抗原性部分へと消化する。生じた細菌抗原を、免疫系の体液性および細胞性戦闘部隊に対する提示のために、これらの細胞の細胞表面へと逆戻りさせる。
【０００５】
単球は、血流から特定の組織へと移動した後に、マクロファージまたは樹状細胞へと分化することができる。重要なことには、多数の固形腫瘍が、腫瘍床内に、多量のマクロファージ細胞を存在させている。これらの腫瘍関連マクロファージ（TAM）は、腫瘍の低酸素かつ/または壊死性微小環境に誘引され、ここで、核因子κB（NF-κB）の活性化および血管新生促進シグナル（例えば、VEGF）の放出などの種々の経路を介して、腫瘍生長および進行を促進するために機能し得る。
【０００６】
つまり、TAMに、代わりに治療的タンパク質を発現させることにより、それらの生来的な腫瘍促進活性を逆転させるであろう方法で、TAMを利用することが、有益であると予測される。
【発明の概要】
【０００７】
治療的タンパク質の発現を仕向けるための単球特異的ビーズベクターを用いる、腫瘍を治療するための組成物および方法が、本明細書中に記載される。
一態様では、本開示は、以下の構成要素：
(i) PD-1細胞外ドメインまたは細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA4）に結合する単一ドメイン抗体をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分（lysosome evading component）、および
(iii) 貪食されることができるビーズ粒子
を含む、ビーズベクターを提供する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、以下の構成要素：
(i) PD-1細胞外ドメインまたはCTLA4に結合する単一ドメイン抗体をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであり、かつ単球細胞により組成物が貪食されることを可能にする、ビーズ粒子
を含む、単球細胞への標的化型侵入のためのビーズベクターを提供する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、以下の構成要素：
(i) PD-1細胞外ドメインまたはCTLA4に結合する単一ドメイン抗体をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 酵母細胞壁粒子などの約0.5〜約2.5ミクロンであるビーズ粒子
を含むビーズベクターを、癌を有する患者に投与するステップを含む、患者での癌を治療する方法を提供し、このとき、該ビーズベクターの投与が、患者の癌を治療する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、以下の構成要素：
(i) 抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 貪食されることができるビーズ粒子
を含む、ビーズベクターを提供する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、以下の構成要素：
(i) 抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 約0.5〜約2.5ミクロンであり、かつ単球細胞により組成物が貪食されることを可能にする、ビーズ粒子
を含む、単球細胞への標的化型侵入のためのビーズベクターを提供する。
【００１２】
別の態様では、本開示は、以下の構成要素：
(i) 抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片をコードする核酸、
(ii) リソソーム回避成分、および
(iii) 酵母細胞壁粒子などの約0.5〜約2.5ミクロンであるビーズ粒子
を含むビーズベクターを、癌を有する患者に投与するステップを含む、患者での癌を治療する方法を提供し、このとき、該ビーズベクターの投与が、患者の癌を治療する。
【００１３】
一部の実施形態では、リソソーム回避成分（lysosome evading component）は、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分であり得る。例えば、非感染性ウイルスは、アデノウイルスまたは組み換えアデノウイルスであり得る。加えて、一部の実施形態では、非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性成分は、非複製性であり得る。
【００１４】
一部の実施形態では、PD-1細胞外ドメインまたはCTLA4に結合する単一ドメイン抗体をコードする核酸は、DNAおよびRNAからなる群より選択されることができる。一部の態様では、抗チェックポイントタンパク質抗体またはその結合性断片は、抗PD-L1抗体またはその結合性断片であり、一方で、一部の実施形態では、抗チェックポイントタンパク質抗体は、抗CTLA4抗体またはその結合性断片である。一部の実施形態では、抗チェックポイント抗体は、単一ドメイン抗体であり得る。
一部の実施形態では、PD-1細胞外ドメインは、ヒトまたはマウスPD-1細胞外ドメインなどの、哺乳動物PD-1細胞外ドメインを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、PD-1細胞外ドメイン、CTLA4に結合する単一ドメイン抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体もしくはその結合性断片をコードする核酸は、発現ベクター中にコードされることができる。一部の実施形態では、発現ベクターは、CMVプロモーターなどの核プロモーターを含むことができる。一部の実施形態では、発現ベクターは、キメラ型プロモーターであるHREx3＋Basal SV40プロモーターなどの、低酸素誘導型プロモーターを含むことができる。一部の実施形態では、発現ベクターは、T7プロモーター、FSV非構造的タンパク質遺伝子、および/またはFSVサブゲノムプロモーターを含むことができる。
【００１６】
一部の実施形態では、ビーズベクターは、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性高分子、または核酸配列（例えば、DNAまたはRNA配列）中に含められた適切なパッケージング配列を有するウイルスのコア粒子などの核酸保護成分を含むことができる。
【００１７】
一部の実施形態では、PD-1細胞外ドメイン、CTLA4に結合する単一ドメイン抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体もしくはその結合性断片をコードする核酸およびリソソーム回避成分は、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用により、ビーズ粒子へと連結させることができる。一部の実施形態では、PD-1細胞外ドメイン、CTLA4に結合する単一ドメイン抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体もしくはその結合性断片をコードする核酸およびリソソーム回避成分は、抗体結合によりビーズ粒子へと連結させることができる。
【００１８】
一部の実施形態では、ビーズ粒子は、強磁性粒子、マイクロビーズ、ミクロスフェア、または酵母細胞壁粒子（YCWP）を含むことができる。
一部の実施形態では、ビーズベクターを貪食する単球細胞は、腫瘍関連マクロファージ（TAM）などのマクロファージである。
【００１９】
一部の実施形態では、治療される癌は、PD-1リガンドまたはCTLA4を発現する。また、一部の実施形態では、癌は、低酸素微小環境を有し得る少なくとも1種の腫瘍を含み、かつ、腫瘍関連マクロファージ（TAM）をさらに含むことができる。
【００２０】
一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、皮内投与または皮下投与される。例えば、一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、標的リンパ節（すなわち、治療される腫瘍に最も近いリンパ節）の近傍に、皮内投与または皮下投与することができる。
上述の一般的説明および以下の詳細な説明は例示的または説明的なものであり、本開示を制限しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】(A) ヒトPD-1および(B) マウスPD-1の全長アミノ酸配列を示す図である。各タンパク質の細胞外ドメインが、太字で示されている。
【図２】マウスPD-1エクトドメインを発現するための例示的ウイルス侵入ベクターを示す図である。
【図３−１】組み換えウイルスベクターをビーズ粒子に連結させて、例示的ビーズベクター送達システムを形成させるための例示的な段階的スキームを示す図である。
【図３−２】組み換えウイルスベクターをビーズ粒子に連結させて、例示的ビーズベクター送達システムを形成させるための例示的な段階的スキームを示す図である。
【図３−３】組み換えウイルスベクターをビーズ粒子に連結させて、例示的ビーズベクター送達システムを形成させるための例示的な段階的スキームを示す図である。
【図４−１】開示されるビーズ粒子に対する連結のための組み換えウイルス粒子を生成させるための例示的な段階的スキームを示す図である。
【図４−２】開示されるビーズ粒子に対する連結のための組み換えウイルス粒子を生成させるための例示的な段階的スキームを示す図である。
【図５】対照粒子（GFP発現用）およびPD-1細胞外ドメインを発現させるための粒子の腫瘍内注入後の、B16マウス黒色腫異種移植片を有するマウスの腫瘍体積を示す図である。
【図６】対照粒子（GFP発現用）およびPD-1細胞外ドメインを発現させるための粒子のいずれかの単回腫瘍内注入から4週間後の、B16黒色腫異種移植片を有する例示的マウスを示す図である。パネル(A)のマウスは対照マウスであり、パネル(B)のマウスはPD-1細胞外ドメインを発現させるためのビーズ粒子を投与されている。
【図７】抗CTLA4単一ドメイン抗体を発現させるための例示的ベクターを示す図である。
【図８−１】抗CTLA4単一ドメイン抗体を発現させるための例示的ベクターの全長配列を示す図である。
【図８−２】抗CTLA4単一ドメイン抗体を発現させるための例示的ベクターの全長配列を示す図である。
【図８−３】抗CTLA4単一ドメイン抗体を発現させるための例示的ベクターの全長配列を示す図である。
【図８−４】抗CTLA4単一ドメイン抗体を発現させるための例示的ベクターの全長配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
一般的に、本開示は、新規な標的化型遺伝子送達ベクターおよびその使用方法を提供する。特に、本開示は、腫瘍関連マクロファージ（TAM）細胞内および腫瘍の微小環境中で、CTLA4に結合する単一ドメイン抗体を発現させるためか、またはPD-1のエクトドメインもしくは細胞外ドメインを発現させるための、ビーズまたは酵母細胞壁粒子（YCWP）ベースの送達ベクターを提供し、該抗体またはPD-1エクトドメインもしくは細胞外ドメインの発現は、腫瘍微小環境中の低酸素状態により誘導され得る。
【００２３】
本開示全体を通して、引用情報を特定することにより、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が参照される。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本開示が属する技術分野の技術水準をより完全に説明するために、本開示中に参照により組み込まれる。
【００２４】
定義
本明細書中で用いられる技術用語および科学的用語は、特に定義しない限り、当業者により一般的に理解される意味を有する。当業者に公知のいずれかの好適な材料および/または方法論を、本明細書中に記載される方法を行なう上で利用することができる。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、用語「約」は、当業者により理解され、かつそれが用いられる文脈に応じてある程度まで変化するであろう。用いられる文脈を考慮しても当業者に明確でなく、この用語が用いられる場合には、「約」とは、最大で特定の用語の±10％を意味するであろう。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、用語「含む」（comprising）とは、組成物および方法が、明記された要素を含有するが、それ以外の要素を除外しないことを意味することが意図される。組成物および方法を規定するために用いられる場合の「本質的に〜からなる」とは、該組成物または方法に対していずれかの必須の重要性を有するその他の要素を除外することを意味するであろう。「からなる」とは、特許請求される組成物および実質的な方法ステップに対して、微量元素のその他の成分以外の成分を除外することを意味するであろう。これらの遷移用語のうちのいずれかにより規定される実施形態は、本開示の範囲内に含まれる。したがって、方法および組成物は、追加のステップおよび構成要素を含有する（含む）か、あるいは重要でないステップおよび組成物を含有する（本質的に〜からなる）か、あるいは記載された方法ステップまたは組成物のみを意図する（からなる）ことができることが意図される。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、語句「治療上有効量」とは、開示されるビーズ粒子の用量が、そのような治療を必要とする被験体に薬物が投与される目的の具体的な薬理学的効果、すなわち、癌/腫瘍生長、進行、もしくは再発を減少、改善、または排除することを提供することを意味する。ビーズ粒子の治療上有効量は、そのような投与量が当業者によって治療上有効量であると見なされてもなお、すべての個別の被験体で癌/腫瘍を治療する上で常に有効ではないであろうことが強調される。当業者は、具体的な被験体および/または具体的な癌もしくは腫瘍のタイプを治療するために必要とされる通りの標準的実務に従って、治療上有効量であると見なされるものを調整できる。治療上有効量は、投与経路および剤型、被験体の年齢および体重、ならびに/または進行、ステージ、および/もしくは治療時の癌もしくは腫瘍の分類をはじめとする被験体の状態に基づいて変化し得る。
【００２８】
用語「治療」または「治療する」とは、癌または腫瘍に関して本明細書中で用いる場合、癌/腫瘍生長および/もしくは進行を減少、改善または排除すること、あるいは癌/腫瘍細胞死を引き起こすことを指す。
用語「予防」または「予防する」とは、本明細書中で用いる場合、癌/腫瘍細胞の形成を中止させることまたは癌/腫瘍生長の再発を阻害することを指す。
用語「個体」、「被験体」および「患者」は、本明細書中で相互に交換可能に用いられ、かついずれかの個別の哺乳動物被験体（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒト）を指す。
【００２９】
本開示の組成物および方法は、本明細書中に具体的に開示されていない、いずれかの要素（1つまたは複数）、制限（1つまたは複数）の非存在下で、好適に実行することができる。つまり、例えば、用語「含む」、「包含する」、「含有する」等は、拡張的かつ制限なく読み取られるであろう。加えて、本明細書中で用いられる用語および表現は、説明の用語として用いられ、制限の用語として用いられておらず、かつ明示され説明される特徴およびその一部分のいずれかの等価物を排除する意図はそのような用語および表現の使用にはなく、種々の改変が、請求される本開示の範囲内で可能であることが認識される。
【００３０】
プログラムされた細胞死-1（PD-1）
PD-1は、50〜55kDaのI型膜貫通型受容体であり、元々は、活性化により誘導されるアポトーシスを受けるT細胞株中で特定された。PD-1は、T細胞、B細胞、およびマクロファージで発現される。PD-1に対するリガンドは、B7ファミリーメンバーであるPD-L1（B7-H1）およびPD-L2（B7-DC）である。
【００３１】
PD-1は、その細胞外領域に単一のIgのV様ドメインを含む、免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーのメンバーである。PD-1細胞質ドメインは、ITIM（免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ）内に位置する（マウスPD-1中のVAYEEL）、最も膜に近接したチロシンを含む2個のチロシンを含有する。PD-1でのITIMの存在は、この分子が細胞質ホスファターゼをリクルートさせることにより抗原受容体シグナル伝達を減衰させるために機能することを示す。
実験データにより、中枢および末梢免疫応答のダウンレギュレーションでのPD-1とそのリガンドとの相互作用が暗示されている。
【００３２】
本開示は、腫瘍関連マクロファージ（TAM）を遺伝子操作して、PD-1の細胞外ドメインを産生および分泌させることにより、免疫系を活性化させるための組成物および方法を提供する。腫瘍床内でのPD-1細胞外ドメインの発現は、腫瘍表面でのPD-1リガンド（すなわち、PD-L1およびPD-L2）のすべてを競合的に遮断し得る。そのようにするに当たって、開示される組成物および方法は、強力な腫瘍特異的腫瘍内チェックポイント阻害を生起させ、このことが、腫瘍の破壊および疾患の治療をもたらす。
【００３３】
細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA4）
CD152（分化クラスター152）としても知られるCTLA4は、免疫チェックポイントとして機能することにより、免疫応答をダウンレギュレーションさせるタンパク質受容体である。CTLA4は、Treg中で構成的に発現されるが、従来型のT細胞中では活性化後にのみアップレギュレーションされる。これは、抗原提示細胞の表面上でCD80またはCD86に結合した場合に、「オフ」スイッチとして働く。CTLA4タンパク質は、マウスではCtla4遺伝子により、ヒトではCTLA4遺伝子によりコードされる。
【００３４】
CTLA4は、T細胞共刺激タンパク質であるCD28に対して相同であり、両方の分子が、抗原提示細胞上で、それぞれB7-1およびB7-2とも称されるCD80およびCD86に結合する。CTLA4は、CD28よりも高い親和性および結合力を有してCD80およびCD86に結合し、つまりこのことは、CTLA4がそのリガンドに関してCD28に競り勝つことを可能にする。CTLA4はT細胞に対して阻害的なシグナルを伝達する一方で、CD28は刺激性シグナルを伝達する。CTLA4は制御性T細胞中でも見出され、その阻害機能に寄与する。T細胞受容体およびCD28を介したT細胞活性化は、CTLA4の発現の増大につながる。
【００３５】
T細胞中でCTLA4が機能するメカニズムは、幾分か議論が残るものである。生化学的証拠は、CTLA4がT細胞受容体（TCR）へとホスファターゼを集結させること、つまり、シグナルを減衰させることを示唆した。より最近の研究では、CTLA4が、B7-1およびB7-2を捕捉して抗原提示細胞の膜から除去し、つまり、それらがCD28をトリガーすることを不可能にすることにより、in vivoで機能し得ることが示唆されている。
【００３６】
加えて、樹状細胞（DC）-Treg相互作用がFascin-1の隔離を引き起こし、Treg細胞接着領域に向けて抗原を提示しているDCでのFascin-1依存的アクチン極性化を歪ませることが見出されている。このことはT制御性細胞の離脱により可逆的であるが、この必須の細胞骨格成分の隔離は、DCの不活性状態を引き起こし、このことが、T細胞プライミングの減少を生じさせる。このことは、Treg媒介免疫抑制が多段階プロセスであることを示唆する。CTLA-4 CD80/CD86相互作用に加えて、DC-Treg免疫シナプスに向かう細胞骨格のFascin依存的極性化は、主軸的役割を果たし得る。
【００３７】
本開示は、腫瘍関連マクロファージ（TAM）を遺伝子操作して、CTLA4に結合する抗体、具体的には単一ドメイン抗体を産生および分泌させることにより、免疫系を活性化させるための組成物および方法を提供する。腫瘍床内での抗CTLA4抗体の発現は、腫瘍表面でCTLA4のリガンドのすべてが受容体に結合するのを競合的に遮断し得る。そのようにするに当たって、開示される組成物および方法は、強力な腫瘍特異的腫瘍内チェックポイント阻害を生起させ、このことが、腫瘍の破壊および疾患の治療をもたらす。
【００３８】
ビーズベクター
本開示は、単球細胞への標的化型侵入のための固体マトリックスに基づく組成物（本明細書中、以下では「ビーズベクター」）を提供する。本開示に従う基本的ビーズベクターは、一般的に、核酸成分、リソソーム回避成分および単球細胞により貪食されることができるビーズ粒子から構成される。ビーズベクターは、樹状細胞およびマクロファージをはじめとする、単球細胞様の貪食細胞に対して非常に特異的である。単球細胞のためのこの高い選択性は、癌治療などの、単球系統の細胞への遺伝子の導入および発現を必要とする遺伝子療法および他の遺伝子医薬法に対して、ビーズベクターを極めて有用なものとする。
本明細書中で用いられるビーズベクターの基本構造は、米国特許第6,875,612号（参照により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。
【００３９】
ビーズ粒子
開示されるビーズベクターは、細菌のように「見せかける」ことにより、単球細胞の貪食活性を利用する。つまり、ビーズ粒子に好ましいサイズは、単球細胞が典型的に取り込む細菌抗原のサイズに近似するサイズである。一般的に、ベクター粒子は、約0.5〜約2.5ミクロン、または約0.5〜約1ミクロンであろう。つまり、ベクター粒子は、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、または約2.5ミクロンであり得る。
【００４０】
取り込みの観点からは、細菌のサイズにより近く近似するので、上記範囲のうちの小さい方の端が好ましい。一方で、製造目的のためには、互いにくっつきにくく、したがって結合成分を含まない洗浄ステップは、より大きいビーズの方がより容易であるので、若干大きめのビーズが好ましい。
【００４１】
さらに、ビーズ粒子は、形状または材料により限定されない。ビーズ粒子は、ビーズベクターが単球細胞により貪食されることを可能にする、いかなる形状、サイズ、または材料のものでもあり得る。
【００４２】
例えば、ビーズ粒子は、高分子コーティングにより覆われた強磁性中心部を含むことができる。有用である可能性がある強磁性粒子としては、限定するものではないが、マイクロビーズ、ミクロスフェア、およびケイ酸ビーズが挙げられる。そのようなビーズは、加工中にビーズに結合した成分から遊離成分を分離するために磁性による分離を利用することができるので、特定の用途では好ましい場合がある。しかしながら、開示されるビーズベクターで用いるためのビーズ粒子は、特定の種類の材料に限定されず、ポリスチレンその他のプラスチックなどの合成材料、ならびに生物学的材料から製造することができる。
【００４３】
ビーズ粒子として好適であり得るまた他の粒子としては、酵母グルカン粒子などの酵母細胞壁粒子（YCWP）が挙げられる。YCWPは、ベータグルカンを含む場合があり、これが粒子のマクロファージ貪食を促進するので、開示されるビーズベクターでは特に有益であり得る。
【００４４】
YCWPは、酵母細胞壁から調製することができ、それにより粒子が種々の高分子の送達に対して多孔性となる。一実施形態では、YCWPは、サッカロマイセス・セレビシエから調製することができる。別の実施形態では、YCWPは、ザイモサン粒子であり得る。別の実施形態では、YCWPは、単核食細胞系の細胞および他の貪食細胞が典型的に取り込む微生物構造（例えば、細菌）のサイズに近似する。具体的な実施形態では、YCWPは、約1〜5μmであり得る。
【００４５】
一部の実施形態では、YCWPは、(a) 酵母を懸濁して懸濁物を作製するステップ、(b) 該懸濁物をインキュベートするステップ、(c) 該懸濁物を遠心分離し、上清を除去するステップ、および(d) 得られたYCWPを回収するステップ、により調製することができる。一部の実施形態では、ステップ(a)〜(d)は、少なくとも1、2、3または4回繰り返される。
【００４６】
一部の実施形態では、YCWPは、(a) 酵母を溶液中に懸濁して第1の懸濁物を作製するステップ、(b) 該第1の懸濁物をインキュベートするステップ、(c) 該第1の懸濁物を遠心分離し、上清を除去するステップ、(d) 得られたペレットを懸濁して第2の懸濁物を作製するステップ、(e) 該第2の懸濁物をインキュベートするステップ、(f) 該第2の懸濁物を遠心分離し、上清を除去するステップ、および(g) 得られたペレットを洗浄してYCWPを回収するステップ、により調製することができる。一部の実施形態では、YCWPは滅菌される。
【００４７】
一部の実施形態では、酵母は、1M NaOHをはじめとするNaOH中に懸濁される。一部の実施形態では、第1の懸濁物は、約1時間または1時間、約80℃でインキュベートされる。一部の実施形態では、遠心分離は、重力の約2000倍で約10分間、または重力の2000倍で10分間行なわれる。一部の実施形態では、ペレットは、pH約4.5またはpH4.5の水をはじめとする水の中に懸濁される。一部の実施形態では、第2の懸濁物は、約55℃で約1時間、または55℃で1時間インキュベートされる。一部の実施形態では、ペレットは、水の中で少なくとも1、2、3または4回洗浄される。一部の実施形態では、ペレットは、1回洗浄される。
【００４８】
一部の実施形態では、YCWPは、ペレットの洗浄に続いて、イソプロパノールおよび/またはアセトンを用いて滅菌される。具体的な実施形態では、他の公知のアルコールが適切である。一部の実施形態では、YCWPは、滅菌後に完全に乾燥させられる。一部の実施形態では、YCWPは、乾燥させられた後に再懸濁される。一部の実施形態では、YCWPは、一部は1×PBSなどのPBS中にある。一部の実施形態では、YCWPは、乾燥させられ、続いて凍結され、その後に腫瘍溶解物がYCWP中へとロードされ、それにより使用まで保管庫に入れられる。一部の実施形態では、YCWPは、凍結乾燥されて、約4℃以下で保存される。一部の実施形態では、YCWPは、凍結乾燥され、4℃で保存される。
【００４９】
核酸成分
本開示の基本的なビーズベクターは、核酸成分に連結されていることができる。核酸成分は、典型的には、治療的核酸またはタンパク質をコードする。核酸成分は、DNA、RNA、またはDNAおよびRNAの両方から構成される。この成分は、典型的には、翻訳および/または転写のために必要なシグナルを含有する（すなわち、標的細胞上に発現されるか、または該細胞により分泌されることができるタンパク質またはRNA生成物をコードすることができる）。
【００５０】
当業者は、本ベクターシステム中で用いることができる多数の治療的タンパク質を理解するであろう。典型的には、治療的タンパク質は抗腫瘍タンパク質であろう。例えば、一部の実施形態では、核酸成分は、PD-1の細胞外ドメインをコードするであろう。PD-1細胞外ドメインは、ヒト（NP_005009、NM_005018）由来、マウス（NP_032824、NM_008798）由来、ウシ（NP_001277851、NM_001290922）由来または他の動物由来であり得る。当業者は、好適なPD-1の細胞外ドメインを特定できるであろう。例えば、ヒトPD-1は288アミノ酸長であり、アミノ酸14〜130が細胞外ドメインを表わし、一方で、マウスPD-1もまた288アミノ酸であるが、アミノ酸21〜169が細胞外ドメインを表わす（図1を参照されたい）。
【００５１】
一部の実施形態では、核酸成分は、抗CTLA4抗体をコードするであろうが、特に、CTLA4に結合する単一ドメイン（すなわち、短鎖）抗体をコードすることができる（図7に示される通り）。多数の抗CTLA4抗体が当技術分野で公知であり、限定するものではないが、イピリムマブ（YERVOY(登録商標)）およびトレメリムマブが挙げられ、当業者は、開示されるビーズベクター中で、これらの抗体またはこれらの抗体の可変領域を含む単一ドメイン抗体を発現させる方法を容易に理解するであろう。1つの例示的な抗CTLA4抗体が、US 2011/0044953（参照により本明細書中に組み入れられる）に開示され、この抗体の単一ドメイン型を発現させるための発現ベクターの配列が図8に示されている。
【００５２】
あるいは、一部の実施形態では、核酸成分は、免疫チェックポイントタンパク質に特異的な抗体またはその結合性断片をコードし得る。免疫チェックポイントは抑制性経路であり、正常な条件下では、自己寛容を維持するために、かつ病原体感染に対する応答での副次的組織損傷を最小限にするために、周辺組織での生理的免疫応答の持続時間および強度を調整するために重要である。しかしながら、免疫チェックポイントタンパク質の発現は、多くの場合に、重要な免疫抵抗性および回避メカニズムとして腫瘍により異常調節される。
【００５３】
免疫チェックポイントのうちの多くがリガンド-受容体相互作用により開始されるので、それらは、チェックポイントリガンドおよび/もしくは受容体に特異的な抗体または結合性断片により容易に遮断することができる。つまり、開示されるビーズベクターの核酸成分は、限定するものではないが、表1に示されるタンパク質をはじめとするチェックポイントタンパク質に特異的である抗体またはその結合性断片を発現することができる。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
チェックポイントタンパク質を標的とする抗体またはその結合性断片は、特に限定されない。例えば、核酸成分によりコードされる抗体または結合性断片は、ヒト、キメラ型、ヒト化型、または非ヒトのもの（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ等）であり得る。抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgM、またはその変異体もしくは断片であり得る。
【００５６】
開示されるビーズベクターおよび方法で有用な抗チェックポイントタンパク質抗体配列は、in vitro供給源（例えば、ハイブリドーマまたは組み換え的に抗体を産生する細胞系）およびin vivo供給源を介するなどして、いずれかの手段により取得することができる。ヒト抗体、部分的ヒト化型抗体、完全ヒト化型抗体、およびキメラ型抗体を、核酸成分により発現させることができる。
【００５７】
典型的には、抗体は、以下の4種類のポリペプチドからなる：重（H）鎖ポリペプチドの2本の同一コピーおよび軽（L）鎖ポリペプチドの2本のコピー。典型的には、各重鎖は、1個のN末端可変（VH）領域および3個のC末端定常（CH1、CH2およびCH3）領域を含み、各軽鎖は、1個のN末端可変（VL）領域および1個のC末端定常（CL）領域を含む。軽鎖および重鎖の各ペアの可変領域が、抗体の抗原結合性部位を形成する。
【００５８】
しかしながら、一部の実施形態では、核酸成分は、抗体全体ではなく、結合性断片をコードし得る。結合性断片とは、本明細書中で用いる場合、標的タンパク質に結合する能力を保持する抗チェックポイントタンパク質抗体の1個以上の断片を意味する。結合性断片の例としては、(i) Fab断片（VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片）；(ii) F(ab')2断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結される2個のFab断片を含む二価断片）；(iii) Fd断片（VHおよびCH1ドメインを含む）；(iv) Fv断片（抗体の単腕のVLおよびVHドメインを含む）、(v) dAb断片（VHドメインを含む）；および(vi) 単離された相補性決定領域（CDR）（例えば、VH CDR3）が挙げられる。結合性断片の他の例としては、単鎖Fv（scFv）構築物が挙げられる。例えば、Bird et al., Science, 242:423-26 (1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-83 (1988)を参照されたい。
【００５９】
一部の実施形態では、核酸成分は、単一の単量体可変抗体ドメインを含む、単一ドメイン抗体をコードし得る。わずか12〜15kDaの分子量を有して、単一ドメイン抗体は、2本のタンパク質重鎖および2本の軽鎖から構成される一般的な抗体（150〜160kDa）よりもはるかに小さく、Fab断片（約50kDa、1本の軽鎖および重鎖の半分）および単鎖可変断片（約25kDa、一方は軽鎖由来、他方は重鎖由来の2個の可変ドメイン）よりさえ小さい。そのような「単一ドメイン」抗体は、最初にラクダで見出された重鎖抗体から遺伝子操作され、VHH断片と称されたが、これらの抗体は、同様に組み換え的に発現させることができる。
【００６０】
つまり、一部の実施形態では、開示されるビーズベクターの核酸成分は、抗PD-L1抗体もしくはその結合性断片、抗CTLA4抗体もしくはその結合性断片、または表1に開示されるチェックポイントタンパク質のうちのいずれか1種に対して特異的である別の抗体もしくはその結合性断片を発現するための配列を含むことができる。
【００６１】
一部の実施形態では、核酸成分は、核酸成分のRNAおよび/またはタンパク質生成物を発現することが可能である発現ベクター中にコードされる。コードされるタンパク質生成物は、標的細胞上に発現されるか、または標的細胞から分泌されることができる。ベクターは、典型的には、コード配列に機能的に連結された、例えば、プロモーターをはじめとする調節配列をさらに含む。ベクターは、例えば、in vitro細菌または細胞培養システム中での増殖のために、選択マーカー配列をさらに含むことができる。
【００６２】
好ましい発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配列もまた含む。SV40またはサイトメガロウイルス（CMV）ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を、必要とされる非転写遺伝的エレメントを提供するために用いることができる。例示的なウイルス侵入ベクターは、図2および図7に示される。一部の実施形態では、プロモーターは、T7プロモーターであり得る。
【００６３】
特異的開始シグナルもまた、挿入された標的遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。一部の実施形態では、核酸成分は、それ自体の開始コドンを含み、隣接配列が適切な発現ベクターへと挿入される場合があり、追加の翻訳制御シグナルは必要でない場合がある。しかしながら、一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム（ORF）の一部分のみが用いられ、例えば、ATG開始コドンをはじめとする外因的翻訳制御シグナルを提供することができる。さらに、開始コドンは、標的全体の翻訳を確実にするための、所望のコード配列のリーディングフレームと一致させる（in phase）ことができる。
【００６４】
これらの外因的翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、種々の起源のものであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることにより強化することができる（Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:516-544 (1987)を参照されたい）。一部の適切な発現ベクターが、Sambrook, et al.によりMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載され、その開示は参照により本明細書中に組み入れられる。所望である場合、発現を強化し、かつ適正なタンパク質のフォールディングを促進するために、配列のコドンコンテキストおよびコドン対形成を、Hatfield et al.（米国特許第5,082,767号）により説明される通りに、最適化することができる。
【００６５】
プロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルス由来のLTR、ならびにマウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。好ましいプロモーターは、CMVプロモーターである。例示的なベクターとしては、pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene社）、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Pharmacia社）が挙げられる。選択マーカーとしては、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）が挙げられる。好ましいベクターとしてはまた、T7ベクターシステムのような細胞質ベクターも挙げられる。Wagner et al.、米国特許第5,591,601号（1997年1月7日）を参照されたい。
【００６６】
一部の実施形態では、ベクターは、図7に示される通りの、FSV非構造タンパク質遺伝子および/またはFSVサブゲノムプロモーターなどの他の機能的配列を追加で含むことができる。
【００６７】
一部の実施形態では、プロモーターは誘導性であり得る。誘導性プロモーターは、標的遺伝子（例えば、PD-1エクトドメインまたは抗CTLA4抗体）の発現を、特異的シグナルまたは特定の生物性因子もしくは非生物性因子に機能的に連結する。開示される発現系で用いることができる誘導性プロモーターの種類としては、限定するものではないが、化学物質誘導性プロモーター（すなわち、抗生物質、ステロイド、金属等）、光誘導性プロモーター、熱誘導性プロモーター、および低酸素誘導性プロモーターが挙げられる。
【００６８】
一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、PD-1エクトドメインまたは抗CTLA4抗体）の転写は、低酸素誘導性プロモーターにより制御することができる。低酸素条件下での遺伝子発現の転写調節は、低酸素誘導型因子1（HIF1）により媒介できる。HIF1とプロモーターのエンハンサー配列中のHIF1応答性エレメント（HRE）との結合が、遺伝子発現を生じさせる。数種類の遺伝子プロモーターが、低酸素誘導性であることが見出されており、限定するものではないが、エリスロポエチン遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼ-1、およびVEGFが挙げられる（The Journal of Experimental Biology 201, 1153-1162, 1998）。
【００６９】
生来型のプロモーターは複数の転写因子により調節されるので、低酸素に対してさらに特異的なキメラ型プロモーターを作製することが可能である（Gene Therapy (2002) 9, 1403-1411）。つまり、一部の実施形態では、キメラ型プロモーターは、SV40およびCMVなどのエンハンサー不要な基底状態ウイルスプロモーター、および数コピーのHREを含んで構築することができる。例えば、一部の実施形態では、開示される発現系は、HREx3＋Basal SV40プロモーターのキメラ型プロモーターを含むことができる。
【００７０】
開示されるビーズベクターの核酸成分への低酸素誘導型プロモーターの組み込みは、腫瘍の微小環境が一般的に、それ以外は健康な身体中での唯一の低酸素環境であるので、腫瘍標的化を増強することができる。つまり、開示されるビーズベクターが、全身性に被験体へと投与され、かつ循環中で単球細胞により貪食される場合、核酸成分は、単球細胞が腫瘍床へと浸潤し、低酸素条件に曝露されるまでは、標的遺伝子（1つまたは複数）を発現しないであろう。このことは、核酸成分の、腫瘍に標的化された発現を生じるであろう。
【００７１】
リソソーム回避成分
ビーズ粒子および核酸成分に加えて、本開示のビーズベクターはまた、リソソーム回避成分も含むことができる。ビーズベクターに関するリソソーム回避成分の役割は、単球細胞による貪食後に、リソソームの過酷な環境を回避する上でベクターを補助するためのものである。本明細書中に開示されるもの以外に、当業者は、リソソーム回避成分として働くことができる多数の分子に気づくであろう。
【００７２】
単球細胞が大型の抗原を取り込んだ場合には、貪食ベシクル（ファゴソーム（phagasome））が形成され、これが抗原を飲み込む。次に、単球細胞中に含まれる特殊なリソソームが、新規に形成されたファゴソームと融合する。融合すると、貪食された抗原は、数種類の非常に反応性が高い分子ならびにリソソームヒドロラーゼの濃縮混合物に曝露される。これらの反応性が高い分子およびリソソームヒドロラーゼは、ファゴソームの内容物を消化する。したがって、粒子にリソソーム回避成分を結合させることにより、これもまた粒子に結合している核酸が、リソソーム中の物質による消化を免がれ、完全な状態で単球の細胞質に侵入する。従前のシステムは、この特徴の重要性を認識しておらず、つまり、本開示の発現系よりもはるかに低い発現レベルであった。Falo et al.、国際公開第97/11605号（1997）を参照されたい。用語「リソソーム回避成分」は、上述の融合型リソソーム/ファゴソームを包含することに留意すべきである。
【００７３】
リソソーム回避成分は、リソソームを回避または破壊することが可能であるいずれかの成分である。例えば、リソソーム回避成分としては、タンパク質、炭水化物、脂質、脂肪酸、生体模倣高分子、微生物およびそれらの組み合わせが挙げられる。用語「タンパク質」は、いずれかのアミノ酸数を含む多量体分子を包含することに留意する。したがって、当業者は、「タンパク質」が、一般的には「短い」タンパク質であると理解されるペプチドを包含することを知っているであろう。一部の実施形態では、リソソーム回避成分としては、限定するものではないが、タンパク質、ウイルスまたはウイルスの一部分が挙げられる。
【００７４】
一部の実施形態では、リソソーム回避成分は、核酸成分によりコードされる標的遺伝子（1つまたは複数）を発現したウイルスである。ウイルスは、レトロウイルスのようなRNAウイルス、またはアデノウイルスのようなDNAウイルスであり得る。一部の実施形態では、ウイルスは、組み換えかつ/または非複製性かつ/または非感染性であり得る。当業者は、ウイルスを非複製性かつ/または非感染性にするために一般的に使用される方法を知っているであろう。
【００７５】
一部の実施形態では、リソソーム回避成分は、特定のウイルスタンパク質を含むことができる。例えば、アデノウイルスペントンタンパク質は、ウイルスがリソソーム/ファゴソームを回避/破壊することを可能にさせる複合体である。つまり、完全なアデノウイルスもしくは単離されたペントンタンパク質、またはその一部分（例えば、Bal et al., Eur J Biochem 267:6074-81 (2000)を参照されたい）を、リソソーム回避成分として利用することができる。一部の実施形態では、インフルエンザウイルスヘマグルチニンサブユニットHA-2のN末端配列由来の融合性ペプチドもまた、リソソーム回避成分として用いることができる（Wagner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7934-7938, 1992）。
【００７６】
他のリソソーム回避成分としては、限定するものではないが、対象となるプラスミドを含むコンジュゲートのエンドソーム放出の増強に起因して、細胞トランスフェクション効率を高めることが示されているポリ(2-プロピルアクリル酸)（PPAAc）などの生体模倣高分子が挙げられる（Lackey et al., Abstracts of Scientific Presentations: The Third Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy, Abstract No. 33, May 31, 2000-Jun. 4, 2000, Denver, Colo.を参照されたい）。本発明により想定される他のリソソーム回避成分の例は、Stayton, et al. J. Control Release, 1;65(1-2):203-20, 2000により議論されている。
【００７７】
上述の成分に加えて、本開示のビーズベクターはまた、直接的に、または互いに対する結合を介して（例えば、核酸成分をコードする組み換えアデノウイルス）、核酸保護成分も含むことができる。例えば、DNA保護成分を、特に核酸成分がウイルスまたはその一部分に会合していない場合に、上述の基本的ビーズベクターへと任意により追加することができる。一般的に、DNA保護成分は、ビーズ粒子に直接的に連結されないであろう。核酸保護成分としては、リソソーム破壊に先立って、またはその最中に、溶解酵素への短い曝露中の消化からビーズ結合DNAまたはRNAを保護することができるいずれかの成分が挙げられる。一部の実施形態では、核酸保護成分としては、限定するものではないが、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性高分子および核酸配列（すなわち、DNAまたはRNA配列）中に含められる適切なパッケージング配列を有するレトロウイルスのコアタンパク質が挙げられる。
【００７８】
本開示の一部の実施形態では、核酸保護成分は、(1) 貪食されることができるビーズ粒子に連結している抗原をコードする核酸または治療的遺伝子を含有する、組み換え的な、任意により非複製性かつ/または非感染性形態のウイルスを含む。ウイルスは、レトロウイルスのようなRNAウイルス、またはアデノウイルスのようなDNAウイルスであり得る。一部の実施形態では、ウイルス自体が、リソソーム破壊が可能なものであり得る。したがって、核酸保護成分およびリソソーム回避成分は、両方ともビーズ粒子に連結したウイルスの成分である。あるいは、ウイルスは、リソソーム破壊が可能でない場合がある。そのような場合には、別個のリソソーム回避成分を追加することができる。好ましいウイルスとしては、HIV、アデノウイルス、シンドビスウイルス、ならびにそれらのハイブリッドおよび組み換え型（HIV抗原を発現するように遺伝子操作された、基本的には組み換えアデノウイルスである、HIV-アデノウイルスハイブリッドなど）が挙げられる。ウイルスは、慣用の方法を用いて直接的に、または間接的にビーズに連結させることができる。Hammond et al., Virology 254:37-49 (1999)を参照されたい。
【００７９】
例えば、一部の実施形態では、標的核酸は、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介してビーズベクターにコンジュゲート化されている組み換えアデノウイルス中で送達することができる。ビーズ粒子は、ストレプトアビジンを含むリンカーを連結するために改変することができ、組み換えウイルスは図3に示される通りにビオチン化することができる。
【００８０】
開示されるビーズベクターのヌクレオチド成分が単球細胞の細胞質に到達するためにウイルス感染は必須ではないので、ウイルスは、複製/感染欠損でもあり得る。例えば、複製/感染欠損アデノウイルスを作製するための1つの方法は、ウイルスファイバータンパク質を変化させることにより達成できる。つまり、一部の実施形態では、ファイバータンパク質が抗体に結合することを可能にするが、その同族細胞受容体には結合することを可能にしない特定の突然変異によりファイバータンパク質が遺伝子操作されているウイルスを、本開示の粒子中で用いることができる。
【００８１】
複製/感染欠損ウイルスを生成するための別の方法は、感染性を担うウイルス成分の変性を意図的に引き起こすことによる。アデノウイルスの場合、例えば、ファイバータンパク質を、ウイルス調製中に破壊することができるであろう。HIVに関しては、これにはエンベロープ（env）タンパク質が含められるであろう。つまり、一部の実施形態では、開示されるビーズ粒子に対する連結のための感染欠損ウイルスを作製する方法は、ウイルスの外膜を除去して、ウイルスコアのみが残るようにするステップを含む。上記の通りに調製された複製/感染欠損ウイルスをビーズ粒子に連結させる場合、上記の通りの核酸保護成分もまた、粒子に連結させることができる。
【００８２】
一部の実施形態では、標的細胞染色体へとベクターを安定的にインテグレートすることが有益であり得る。例えば、安定的なインテグレーションを達成するための1つの様式は、アデノウイルスハイブリッドの使用を介する。そのようなアデノウイルスハイブリッドは、例えば、治療的核酸またはタンパク質（例えば、PD-1エクトドメインまたは抗CTLA4抗体）をコードするDNA成分に隣接するレトロウイルスの5'および3'の長い末端反復（LTR）配列およびレトロウイルスインテグラーゼ遺伝子を担持するアデノウイルスベクターを含むことができる（Zheng, et al. Nature Biotechnology, 18:176-180, 2000を参照されたい）。
【００８３】
一部の実施形態では、一時的発現が好ましい場合があり、したがって、例えば、シンドビスウイルスのような細胞質ウイルスを用いることができる。
一部の実施形態では、リソソーム回避成分がウイルス上に天然に存在しない場合には、それを追加することができる。例えば、シンドビスウイルスまたは他のそのようなウイルスの場合には、ウイルスを、リソソームを回避する目的のために、アデノウイルスペントンタンパク質の全部または一部を発現するように遺伝子操作することができる。
【００８４】
粒子に成分を連結させるための方法
ビーズベクター粒子への上述の成分の連結は、いずれかの公知の手段により達成することができる。上記で説明した通り、種々の成分が、標的核酸（例えば、PD-1エクトドメインまたは抗CTLA4抗体）、リソソーム回避成分（これらは両方ともウイルス中に存在し得る）、および核酸保護成分を含むことができる。そのような成分を連結する多数の方法が当技術分野で公知であるが、連結のための具体的な方法としては、限定するものではないが、抗体結合、ビオチン-アビジン/ストレプトアビジン相互作用、および化学的架橋が挙げられる。ビーズ粒子は、化学的に連結された抗体、アビジン、ビオチン、または他の選択的連結部位を含んで調製することができる。
【００８５】
抗体結合は、いずれかの抗体相互作用を介して生じさせることができる。抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、ヒト化型またはキメラ型抗体、単鎖Fv（scFv）断片をはじめとする単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリーから生成される断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、エピトープ結合性断片、単一ドメイン抗体、および上記のいずれかのヒト化型形態が挙げられる。
【００８６】
一般的に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびに所望の抗体を産生することが可能なハイブリドーマを調製するための技術は、当技術分野で周知である（Campbell, A. M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984)；St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1-21 (1980)；Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), pp. 77-96）。
【００８７】
包含される抗体結合の1つの例は、ビーズベクター粒子に化学的に取り付けられている単一の抗体を含むことができる。抗体は、粒子に結合される成分に対して特異的である。
【００８８】
あるいは、2種類以上の抗体を用いることができる。この場合、ビーズに結合された一方の抗体は、第2の抗体に特異的であり得る。第2の抗体は、ビーズに結合される成分に特異的である。つまり、成分特異的抗体が成分に結合し、その抗体が、次に、ビーズに結合した抗体により結合される。例えば、ヤギまたはウサギ-抗マウス抗体は、ビーズおよび特異的成分に結合するために用いられるマウスモノクローナル抗体に対して結合することができる。または、別の代替的形式では、2種類以上の抗体が、粒子に結合する異なる成分に対してそれぞれ特異的であることができ、それにより、粒子には、2種類以上の異なる成分（すなわち、2種類の異なるウイルス粒子、2種類の異なるタンパク質等）が施される。
【００８９】
抗体結合の別の例では、プロテインA、または抗体に対する親和性を有するいずれかの類似の分子が利用される。この例では、ビーズがプロテインAを用いてコーティングされ、これが抗体に結合し、次に、ビーズに結合される成分に結合する。
【００９０】
ビオチン-アビジン/ストレプトアビジン相互作用を介した結合は、例えば、ビーズベクター粒子にアビジン/ストレプトアビジンを結合させ、かつ、結合される成分に対してビオチンを結合させることにより、達成することができる。化学的架橋は、当業者に公知の慣用的手段により達成することができる。例えば、図3を参照されたい。
【００９１】
別の結合メカニズムは、多重結合性ビヒクルとして機能する核酸を含むことができる。合成「グリッパー」（gripper）タンパク質核酸（PNA）オリゴヌクレオチドは、種々の核酸配列に特異的に結合するために設計される。PNAは、デオキシリボースリン酸骨格ではなくペプチド骨格を含むポリ核酸アナログである。PNAは、ビーズに対して直接的に連結されるか、または利便性の高い結合のために誘導体化して、それにより、核酸に結合する配列特異的手段を提供することができる。各グリッパーオリゴヌクレオチドは、誘導体化されるか、または異なるリガンドもしくは分子に結合し、かつ異なる核酸配列に結合するように設計することができる。PNAは、Hoogsteen型塩基対形成相互作用を介してDNAと相互作用し、かつ安定なPNA-DNA-PNA三重鎖クランプが形成されると考えられている（Zelphati, et al. BioTechniques, 28:304-316, 2000）。
【００９２】
つまり、一実施形態では、一方のグリッパーを、ビーズに対して核酸成分を結合させるために用い、他方を、核酸成分に対してリソソーム回避成分を結合させるために用いる。多数のそのような繰り返し（iterations）が考えられる。例えば、ビオチンを含む「グリッパー」は、核酸に対して1つの箇所で配列特異的に結合し得る。アビジンを用いてコーティングされた粒子に対する連結は、ビオチン-アビジン相互作用を介して生じる。核酸の別の箇所では、リソソーム/ファゴソーム回避成分を含む別の「グリッパー」が、配列特異的に結合し得る。任意により、DNA保護成分を含む「グリッパー」は、また別の箇所で核酸に配列特異的に結合し得る。例示的なグリッパーオリゴヌクレオチドは、以前に説明されている。
【００９３】
ビーズ粒子にウイルスを結合させる場合には、これはまた、その表面に特定のタンパク質を発現させるようにウイルスを遺伝子操作することによって達成することもできる。例えば、HIV envタンパク質は、アデノウイルスペントンタンパク質、またはその一部分と置き換え得るであろう。続いて、組み換えウイルスを、例えば、別の抗体またはプロテインAにより、媒介するビーズに対する結合を用いて、抗ペントン抗体を介して連結させることができる。一部の実施形態では、ペントンタンパク質はまた、リソソーム回避成分としても働くであろう。
【００９４】
製剤
本明細書中で説明される方法で用いるために好適な医薬組成物は、開示されるビーズベクターおよび製薬上許容される担体または希釈剤を含むことができる。
組成物は、静脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋内投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、眼内投与、膣内投与、または直腸投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋内投与のために、溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤などとして、製剤化される。一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、経口投与のために、経口投与に好適な錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、または液剤などとして、製剤化される。医薬組成物は、即時放出組成物、持続放出組成物、遅延放出組成物等になるように、当技術分野で公知の技術を用いて製剤化することができる。
【００９５】
一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、例えば、静脈内注入、筋内注入または皮下注入による、非経口投与のために製剤化することができる。注入用の製剤は、例えば、アンプル中に単位投与剤型として、または、任意により保存料が添加されて複数用量容器中に、存在することができる。組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液剤、溶液剤、またはエマルジョン剤などの剤型を採ることができ、懸濁化剤、安定化剤および/または分散化剤などの製剤化剤を含有することができる。ビーズベクターはまた、製薬上許容される賦形剤を用いて製剤化することもできる。そのような賦形剤は、当技術分野で周知であるが、典型的には、生理学的に耐容される水溶液であろう。生理学的に耐容される溶液は、基本的に無毒のものである。好ましい賦形剤は、不活性または増強性のいずれかであろう。
【００９６】
一部の実施形態では、ビーズベクターは、別の治療剤と同時に投与される目的で製剤化することができる。一部の実施形態では、ビーズベクターは、別の治療剤と順番に投与される目的で製剤化することができる。例えば、ビーズベクターは、被験体が化学療法の処置を受ける前または後のいずれかに投与することができる。
【００９７】
治療方法
開示されるビーズベクターを用いる、腫瘍、癌、悪性疾患、または癌細胞増殖を治療する方法が、本明細書中に提供される。より具体的には、本開示は、PD-1の細胞外ドメインまたはPD-L1特異的抗体もしくはその結合性断片の発現を介して、腫瘍/癌細胞中でのPD-1チェックポイントを阻害する方法を提供する。同様に、抗CTLA4抗体または単一ドメイン抗体をはじめとするその結合性断片の発現を介して、腫瘍/癌細胞中でのCTLA4チェックポイントを阻害する方法が、本明細書中に提供される。一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、表1に示されるタンパク質標的に対して特異的な抗体または断片などの、他のチェックポイント阻害剤の発現を駆動するために用いることができる。そのような方法は、PD-1細胞外ドメイン、抗CTLA4抗体、またはチェックポイントタンパク質に対して特異的である抗体もしくは結合性断片の発現のための核酸成分を含有する、治療上有効量の開示されるビーズベクターを投与するステップを含むことができる。
【００９８】
開示されるビーズベクターは、単球細胞（例えば、マクロファージまたはTAM）に対して非常に選択的である。したがって、単球細胞へと核酸成分を選択的に導入することを含むいずれかの用途に対して有用である。一部の実施形態では、開示されるベクターは、癌、特に固形腫瘍を治療するために投与される。典型的な方法は、単球細胞をビーズベクターと接触させるステップを含む。ビーズベクターの投与は、開示されるビーズベクターが機能する様式に起因して、特に制限されない。
【００９９】
ビーズベクターは、腫瘍に直接的に注入できるか、または、皮内的、皮下的、もしくは全身的に（すなわち、被験体の腹腔内へと）投与することができる。固形腫瘍へはマクロファージの定常的な流入があり、したがって、全身的にビーズ粒子を貪食するマクロファージであっても、腫瘍床に浸潤し、かつ腫瘍を治療するかもしくは腫瘍生長を防止するために機能することができる。さらに、一部の実施形態では、ビーズベクターの核酸成分は、低酸素誘導性プロモーターの制御下にあり得、この場合、それを貪食した単球細胞が腫瘍床に浸潤した際にのみ、標的遺伝子（1種または複数種類）（すなわち、PD-1細胞外ドメイン、抗CTLA4抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体）が発現されるであろう。
【０１００】
あるいはまたはそれに加えて、ビーズベクターは、治療される対象である腫瘍または癌に近接するリンパ節中で発現されることにより、マクロファージによって貪食されると機能することができる。これらの実施形態では、開示されたビーズベクターは、治療のために標的化される腫瘍に最も近いリンパ節（すなわち、「標的リンパ節」）に対して近接している領域中に皮内的または皮下的に投与することができる。この意味では、標的リンパ節に近接した投与とは、標的リンパ節中への、または可能な限り近くでの投与を意味するが、少なくともいずれかの他のリンパ節よりも標的リンパ節に近いことを意味する。標的リンパ節中に入ったら、ビーズベクターを貪食したマクロファージは、PD-1細胞外ドメイン、抗CTLA4抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体を産生する核酸を発現して、これが、腫瘍部位へと移動して、腫瘍微小環境内で標的とされるチェックポイントを阻害するであろう。
【０１０１】
開示されるビーズベクターのこの独特な作用機序は、チェックポイント阻害治療剤の現行の水準に対して劇的な改善を有する。現在では、ペンブロリズマブ（Keytruda）、ニボルマブ（Opdivo）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、およびイピリムマブ（Yervoy）などのチェックポイント阻害剤が、種々のタイプの癌の治療で有効である。しかしながら、これらの薬物は、全身的に投与され、したがって、生命を脅かし得る標的外効果を引き起こす。実際に、チェックポイント阻害剤は、免疫関連悪性事象（irAE）と称される独特の副作用のスペクトルを引き起こすことが知られており、これは、皮膚科的、胃腸の、肝臓の、内分泌の、および他の臓器系の作用を含むことができる。開示されるビーズベクターは、コードされるチェックポイント阻害剤を腫瘍微小環境内またはその近傍のみで発現し、それにより腫瘍標的化を通じて副作用を減少させることにより、これらの標的外作用を予防または最小限にする。上記の通り、腫瘍床への新規マクロファージの定常的な浸潤に起因して、開示されるビーズベクターは、全身的に（例えば、非経口的に）、皮内的に、皮下的に投与されるか、あるいは腫瘍または標的リンパ節中へと直接的に注入される場合に、これらの改善された作用を提供することができる。
【０１０２】
ビーズベクターは、in vivoまたはin vitroのいずれかで単球細胞と接触させることができる。それゆえ、in vivoおよびex vivoの方法の両方が本明細書中で考慮される。
【０１０３】
一部の実施形態では、in vivo法は、非経口的に、例えば、静脈内、筋内、皮下的または皮内的にビーズベクターを投与するステップを含む。一部の実施形態では、ビーズベクターは、腫瘍中に直接的に注入される。一部の実施形態では、ビーズベクターは、ボーラス注入または持続点滴により投与することができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、ex vivo法は、身体外で単球細胞を接触させるステップ、および続いて、それを必要とする患者に接触させた細胞を投与するステップを含む。細胞はまた、非経口的に、例えば、点滴を介して投与することもできる。ex vivo法でビーズベクターにより接触される単球細胞は、自家的または同種異系であり得る。ex vivo法での使用のための単球細胞は、ドナー由来または患者（すなわち、開示されるビーズベクターと接触させる対象である単球細胞の最終的なレシピエント）由来の白血球分離（leukapheresis）の公知の方法により単離することができる。
【０１０５】
開示されるビーズベクターは、患者に直接的に注入することができ、それでもなお、TAMなどの、癌を治療する目的のための身体の単球細胞に標的遺伝子（1種または複数種類）（すなわち、PD-1エクトドメイン、抗CTLA4抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体）を送達することが可能である。これらの細胞を標的化した従前の方法は、原則として、単離された患者の単球細胞ならびにin vitroでそれらを操作するステップおよび患者に細胞を戻すステップに依存する。そのような実施形態が本開示中で意図されるが、開示されるビーズベクターは、それらをin vivoおよびex vivoの方法の両方で用いることができるので、実質的な改善を提供する。さらに、投与経路を変更することにより、標的とする単球細胞を変更することができる。例えば、静脈内注入の場合、マクロファージを標的とすることができ、皮下注入の場合、樹状細胞を標的とすることができる。
【０１０６】
つまり、一部の実施形態では、開示されるビーズベクターを用いる、単球細胞系統へのPD-1エクトドメインまたは抗CTLA4抗体の遺伝子発現の標的化は、癌治療のために有効である。本開示に包含される癌治療の1つのタイプは、固形腫瘍へとPD-1エクトドメインまたは抗CTLA4抗体の発現を標的化することを含む。一部の実施形態では、開示されるビーズベクターを用いる、単球細胞系統への抗チェックポイントタンパク質抗体（すなわち、抗PD-L1抗体または抗CTLA4抗体）の遺伝子発現の標的化は、癌治療のために有効である。
【０１０７】
腫瘍（原発腫瘍および転移の両方で同様に）は直径数ミリメートルを超えて生長するにつれて、酸素が欠乏し、腫瘍内で低酸素微小環境が生成されることが知られている。そのような腫瘍が酸素欠乏に陥った場合、腫瘍の低酸素領域への血液供給を増大させるための、血管新生因子などのシグナルタンパク質を分泌する。
【０１０８】
血管新生誘導のメカニズムの一部分として、低酸素腫瘍は、腫瘍へと単球を誘引するシグナル伝達性ケモカインタンパク質を分泌する。続いて、生長中の腫瘍の部位へと誘引された単球はマクロファージになり、腫瘍血管新生の誘導を補助する。したがって、腫瘍標的化の有効な方法は、PD-1エクトドメイン配列、抗CTLA4抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体配列を含有する治療上有効量のビーズベクターを、直接的に、または単球細胞とのex vivoでの接触を介するかのいずれかにより、癌患者に投与するステップを含む。貪食されたビーズベクターを含有する単球細胞は、腫瘍部位へと誘引され、腫瘍微小環境中で、PD-1エクトドメイン、抗CTLA4抗体、または抗チェックポイントタンパク質抗体配列を選択的に発現するであろう。
【０１０９】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、PD-1エクトドメインまたは細胞外ドメインをコードすることができる。PD-1配列は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、または他の哺乳動物形態のPD-1由来であり得る。PD-1配列は、シグナルドメイン、細胞外ドメイン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、表1中のタンパク質のうちの1種に特異的に結合する抗体または結合性断片などの、抗チェックポイントタンパク質抗体または結合性断片をコードすることができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、治療対象である腫瘍または癌は、PD-L1およびPD-L2などのPD-1リガンドを発現することができる。つまり、一部の実施形態では、開示されるビーズベクターの投与は、腫瘍関連マクロファージによる、PD-1細胞外ドメインまたはエクトドメインタンパク質の発現を生じさせるであろう。腫瘍微小環境でのそのようなPD-1細胞外ドメインまたはエクトドメインタンパク質の発現は、腫瘍微小環境中のすべてのPD-1リガンドを隔離することができ、PD-1チェックポイントの阻害をもたらすことができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、抗CTLA4抗体（例えば、単一ドメイン抗体）をコードすることができる。抗CTLA4抗体は、いずれかの公知の抗CTLA4抗体、例えば、U.S. 2011/0044953に開示される抗CTLA4抗体から誘導することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、治療対象である腫瘍または癌は、CTLA4またはCD80および/もしくはCD86などのCTLA4リガンドを発現することができる。つまり、一部の実施形態では、開示されるビーズベクターの投与は、腫瘍関連マクロファージによる抗CTLA4および/または抗CTLA4リガンド（例えば、CD80またはCD86）抗体の発現をもたらすであろう。腫瘍微小環境でのそのような抗体（例えば、単一ドメイン抗体）の発現は、腫瘍微小環境中のすべてのCTLA4またはCTLA4リガンドを隔離することができ、CTLA4チェックポイントの阻害をもたらすことができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、ビーズベクターの投与は、腫瘍関連マクロファージによる抗チェックポイントタンパク質抗体の発現を生じさせるであろう。例えば、ビーズベクターを貪食したTAMは、腫瘍微小環境中で抗PD-L1および/または抗CTLA4抗体を発現させ、それにより、PD-1および/またはCTLA4チェックポイントの阻害をもたらすであろう。
【０１１４】
一部の実施形態では、治療対象である腫瘍または癌としては、限定するものではないが、神経学的癌、乳癌、消化器癌（例えば、結腸癌）、腎細胞癌（例えば、明細胞腎細胞癌）、または泌尿生殖器癌（例えば、卵巣癌）が挙げられる。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、頭頚部癌、肝癌、膵臓癌、骨癌、前立腺癌、膀胱癌、または血管癌である。実際には、開示される方法は、腫瘍、癌、悪性疾患、または癌細胞増殖を治療するための広範なアプローチを提供するので、治療対象の疾患の種類は特に限定されない。
【０１１５】
投与レジメンは、最適な望ましい応答（例えば、腫瘍退縮または寛解などの治療的応答）を提供するために調整することができる。例えば、一部の実施形態では、ビーズベクターの単回ボーラスを投与することができ、一方、一部の実施形態では、数回に分割された用量が時間をかけて投与されるか、または状況によって指示される通りに用量を相対的に減少もしくは増加させることができる。例えば、一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、皮下または静脈内注入により、週1回または2回投与することができる。一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、皮下注入により、月に1回または2回投与することができる。一部の実施形態では、開示されるビーズベクターは、週1回、隔週で1回、3週間に1回、4週間に1回、2ヵ月に1回、3ヵ月に1回、4ヵ月に1回、5ヵ月に1回、または6ヵ月に1回投与することができる。
【０１１６】
さらに、開示される治療方法は、開示されるビーズベクターに加えて、第2の治療用化合物の投与を追加的に含むことができる。例えば、一部の実施形態では、追加的な治療用化合物は、CAR-T細胞、腫瘍標的化抗体、免疫応答増強モダリティ、チェックポイント阻害剤、または小分子薬物、例えばBTK阻害剤（例えば、イブルチニブ）、EGFR阻害剤（例えば、CK-101）、BET阻害剤（例えば、CK-103）、PARP阻害剤（例えば、オラパリブまたはCK-102）、PI3Kdelta阻害剤（例えば、TGR-1202）、BRAF阻害剤（例えば、ベムラフェニブ）など、または当技術分野で公知の他の化学療法薬であり得る。
【０１１７】
特定の治療レジメンが、所与の患者の帰結を改善するであろうか否かに従って評価される場合があり、このことは、治療が、所与の癌または腫瘍の再発のリスクを低減するかまたは無進行生存率の尤度を増大させるであろうことを意味する。
【０１１８】
つまり、本開示の目的のために、所望の臨床的結果をはじめとする1種以上の有益または所望の結果が得られる場合に、被験体が治療される。例えば、有益または所望の臨床的結果としては、限定するものではないが、以下のうちの1種以上が挙げられる：疾患に起因する1種以上の症状の軽減、疾患に罹患した人物のQOLの上昇、疾患を治療するために必要とされる他の投薬の用量の減少、疾患の進行の遅延、および/または個体の生存の延長。
【０１１９】
さらに、本方法の被験体は、一般的に癌患者であるが、患者の年齢は限定されない。開示される方法は、すべての年齢群およびコホートにわたって、種々の再発および予後帰結を有する腫瘍、癌、悪性疾患、または癌細胞増殖を治療するために有用である。つまり、一部の実施形態では、被験体は、小児科の被験体であり得るが、他の実施形態では、被験体は成人被験体であり得る。
【０１２０】
以下の実施例は、本開示を例示するために与えられる。本発明は、これらの実施例に記載される具体的条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１２１】
実施例1：PD-1細胞外ドメインを発現させるための組み換えウイルスの作製
少なくとも5μgのpAd-DEST発現構築物の精製済みプラスミドDNAを、PacI制限酵素を用いて消化し、消化されたプラスミドDNAをゲル精製した。
【０１２２】
精製されたプラスミドを、TEバッファー（pH8.0）中に再懸濁して、最終濃度0.1〜3.0μg/μLとした。概ね5×105個のAD293細胞を6ウェルプレート中の1ウェルに入れ、一晩培養した。
【０１２３】
リポフェクタミン2000を用いて、約1μgのPacI消化プラスミドDNAを、AD293細胞にトランスフェクションした。細胞変性作用（CPE）の可視的領域が観察されるまで（典型的にはトランスフェクション後7〜10日間）、培養培地を、新鮮な完全培養培地と2〜3日間毎に交換した。アデノウイルス含有細胞を、10mL組織培養ピペットを用いて細胞をプレートから吹き飛ばすことにより、約80％CPEで回収した。細胞および培地を、滅菌15mLキャップ付きチューブに移した。
【０１２４】
粗精製ウイルス溶解物を、少なくとも3回の凍結融解サイクルを行なうことにより調製した。溶解物を3000rpmで15分間、室温で遠心分離して、細胞残渣をペレット化した。ウイルス粒子を含有する上清を、1mLアリコートでクライオバイアルへと移し、ウイルスストックとして−80℃で保存した。このストックを、ウイルス増幅のために用いた。
【０１２５】
図4は、本方法に従って組み換えウイルスを作製するための例示的スキームを示す。そのような組み換えウイルスは、いずれかの手段、例えば、図3に示される通りのビオチン/ストレプトアビジンコンジュゲート化により、本開示のビーズ粒子に連結させることができる。
【０１２６】
実施例2：黒色腫を有するマウスの治療
C57 B6マウスに、1×106個のB16マウス黒色腫細胞を注入した。12日後、マウスは触診可能な異種移植片腫瘍を有した。
B16マウス黒色腫細胞の注入の12日間後に、マウスを、2種類のビーズ粒子のうちの一方を用いて治療した。対照マウスには、1×107個の緑色蛍光タンパク質（GFP）発現アデノウイルスを含有する1×106個のビーズ粒子の直接的腫瘍内注入を施した。実験群のマウスには、マウスPD-1の細胞外ドメインを発現するように設計された1×107個のPD-1アデノウイルスを含有する1×106個のビーズ粒子の直接的腫瘍内注入を施した。
【０１２７】
各マウスの腫瘍の体積を、腫瘍内注入後に測定した。腫瘍体積を図5に示す。対照群のすべてのマウスは、腫瘍内注入後の28日目またはその前に死亡した。PD-1細胞外ドメインを発現するためのビーズ粒子を投与された実験群のすべてのマウスは、腫瘍内注入後の45日目を超えて生存し、その腫瘍体積は減少した。
【０１２８】
図6は、それぞれ対照粒子または実験的粒子の単回投与治療の4週間後の、(A) 対照マウスおよび(B) PD-1細胞外ドメインを発現するビーズ粒子を投与されたマウス、を示す。図面から見て取れる通り、対照マウスが大きな腫瘍を有する一方で、治療群由来のマウスはわずかであるかまたは視認できない腫瘍生長を有する。
【０１２９】
実施例3：予言的ヒト治療
本実施例は、癌の治療での開示されるビーズベクターを用いる方法を例示する。
癌を有することが既知であるかまたは癌を有すると疑われる患者に、静脈内、皮内、または皮下注入により、PD-1細胞外ドメインまたは抗CTLA4抗体（例えば、単一ドメイン抗体）をコードする核酸を含む、治療上有効量のビーズベクターが投与される。患者は、限定するものではないが、疼痛、衰弱、腫瘍サイズ等をはじめとする癌に関連する徴候および症状の存在および/または重症度について評価され、患者は、1種以上の徴候/症状が減少、改善、または排除されるまで、治療される。任意により、治療後の癌進行をモニタリングするために、患者からサンプルを採取することができる。任意により、徴候/症状が持続するか、かつ/または癌が進行もしくは再発する場合には、PD-1細胞外ドメインまたは抗CTLA4抗体をコードする核酸を含むビーズベクターの追加の用量が投与される。
【０１３０】
当業者は、本開示が、対象物を実行するためならびに言及される結果および利点、ならびにそれに内在されるものを取得するために、十分に適合されていることを容易に理解する。その中での改変および他の用途が、当業者には思い当たるであろう。これらの改変は、本開示の精神に包含され、かつ本開示の非限定的実施形態を説明する特許請求の範囲により規定される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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