(57)【要約】本明細書の実施形態は、生アルファウイルスを安定化するための組成物及び方法に関する。他の実施形態は、弱毒生アルファウイルスの分解を低減するための組成物及び方法に関する。ある実施形態は、改良された製剤を提供することにより、アルファウイルスを安定化する賦形剤に対する対象の免疫反応を低減させつつ、安定化組成物を提供することに関する。更に他の実施形態は、生アルファウイルスの分解を低減する本明細書で開示された組成物を、携帯可能な用途のためのキット及び方法に使用することに関する。
2019513138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒生アルファウイルス組成物であって、
１つ又は複数の生アルファウイルス；
ヒスチジンを含む１つ又は複数のアミノ酸；及び
２つ以上の炭水化物作用剤を含み、
血清及びゼラチンのいずれも含まず、生アルファウイルスを安定化するアルファウイルス組成物。
【請求項２】
ＨＥＰＥＳバッファを更に含み、ＨＥＰＥＳバッファ濃度が１．０ｍＭ〜２００．０ｍＭである、請求項１に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項３】
前記１つ又は複数の生アルファウイルスが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎、及び西部ウマ脳炎、他のセムリキ森林熱ウイルス、又は他のトガウイルス、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１又は２に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項４】
前記１つ又は複数の生アルファウイルスがチクングニヤ（ＣＨＩＫ）ウイルスである、請求項１又は２に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項５】
前記生アルファウイルスが弱毒生アルファウイルスを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項６】
含水形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項７】
部分的に又は完全に脱水されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項８】
前記２つ以上の炭水化物作用剤が、トレハロース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、キトサン、ソルビトール、マンニトール、及びそれらの組み合わせの１つ又は複数からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項９】
前記２つ以上の炭水化物作用剤が、スクロース及びマンニトールを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１０】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度の濃度が、１０．０ｍＭ〜１５０．０ｍＭである、請求項２〜９のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１１】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１０．０ｍＭ〜３０．０ｍＭであり、２つ以上の炭水化物作用剤濃度が、１０．０〜１００．０ｍｇ／ｍｌであり、アミノ酸濃度が、１．０ｍｇ／ｍｌ〜２０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１２】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１５．０ｍＭであり、２つ以上の炭水化物作用剤濃度が、各々２０．０〜７０．０ｍｇ／ｍｌであり、アミノ酸濃度が、１．０ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１３】
ＨＥＰＥＳバッファ、ヒスチジン、スクロース、及びマンニトールを含む、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１４】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１５．０ｍＭであり、ヒスチジン濃度が、１．０ｍｇ／ｍｌ〜２０．０ｍｇ／ｍｌであり、スクロース濃度が、２０．０ｍｇ／ｍｌ〜９０．０ｍｇ／ｍｌであり、マンニトール濃度が、１０．０ｍｇ／ｍｌ〜５０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項１３に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１５】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１５．０ｍＭであり、ヒスチジン濃度が、５．０〜２０．０ｍｇ／ｍｌであり、スクロース濃度が、４０．０〜９０．０ｍｇ／ｍｌであり、マンニトール濃度が、１５．０〜４０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項１３又は１４に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１６】
ヒスチジン濃度が、５．０〜１５．０ｍｇ／ｍｌであり、スクロース濃度が、４０．０〜８０．０ｍｇ／ｍｌであり、マンニトール濃度が、１５．０〜４０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項１５に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１７】
塩を更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項１８】
弱毒生アルファウイルス組成物であって、
１つ又は複数の生アルファウイルス；
１つ又は複数の塩作用剤；及び
スクロースを含む１つ又は複数の炭水化物作用剤を含み、
血清及びゼラチン及び他の哺乳動物タンパク質産物のいずれも含まず、生アルファウイルスを安定化する組成物。
【請求項１９】
ＨＥＰＥＳバッファを更に含み、ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１．０ｍＭ〜２００．０ｍＭである、請求項１８に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２０】
前記１つ又は複数の生アルファウイルスが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎、及び西部ウマ脳炎、他のセムリキ森林熱ウイルス、又は他のトガウイルス、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１８又は１９に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２１】
前記１つ又は複数の生アルファウイルスが、弱毒生アルファウイルスを含む、請求項１７又は１８に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２２】
前記１つ又は複数の生アルファウイルスが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２３】
含水形態である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２４】
部分的に又は完全に脱水されている、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２５】
トレハロース、ガラクトース、フルクトース、キトサン、ソルビトール、マンニトール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の炭水化物作用剤を更に含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２６】
前記１つ又は複数の塩作用剤が、塩化ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２７】
ＨＥＰＥＳ濃度が、１．０ｍＭ〜４０．０ｍＭである、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２８】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１．０〜３０．０ｍＭであり、１つ又は複数の炭水化物作用剤濃度が、１．０％〜１０．０％であり、１つ又は複数の塩濃度の各々が、０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項２９】
ＨＥＰＥＳ、スクロース、塩化ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、及び塩化カリウムを含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項３０】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が１５ｍＭであり、スクロース濃度が、１．０％〜１５．０％（ｗ／ｖ）であり、塩化ナトリウム濃度が、０．１％〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、グルタミン酸一ナトリウム濃度が、０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）であり、リン酸ナトリウム濃度が、０．０１〜０．１５％（ｗ／ｖ）であり、リン酸カリウム濃度が、０．０１％〜０．１％（ｗ／ｖ）であり、塩化カリウム濃度が、０．０１％〜０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項２９に記載のアルファウイルス組成物。
【請求項３１】
生アルファウイルスの不活化を低下させるための方法であって、１つ又は複数の生アルファウイルスを、２つ以上の炭水化物作用剤；及びヒスチジンを含む１つ又は複数のアミノ酸を含む組成物と組み合わせることを含み、前記組成物が前記生アルファウイルスの不活化を低下させる方法。
【請求項３２】
ＨＥＰＥＳバッファを更に含み、ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１．０ｍＭ〜２００．０ｍＭである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生アルファウイルスが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、他のセムリキ森林熱ウイルス群、東部ウマ脳炎、及び西部ウマ脳炎、及びそれらの組み合わせを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記組み合わせたものを、部分的に又は完全に脱水することを更に含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物を、投与前に部分的に又は完全に再水和することを更に含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、含水ウイルス組成物の保管寿命を延長させる、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１．０〜３０．０ｍＭであり、２つ以上の炭水化物作用剤濃度が、各々１．０〜１００．０ｍｇ／ｍｌであり、アミノ酸濃度が、１．０〜４０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、ＨＥＰＥＳ、ヒスチジン、スクロース、及びマンニトールを含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１５ｍＭであり、ヒスチジン濃度が、５．０ｍｇ／ｍｌ〜２０．０ｍｇ／ｍｌであり、スクロース濃度が、２０．０ｍｇ／ｍｌ〜９０．０ｍｇ／ｍｌであり、マンニトール濃度が、１０．０ｍｇ／ｍｌ〜４０．０ｍｇ／ｍｌである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
塩作用剤を更に含む、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生アルファウイルス組成物が、アルファウイルス感染症の発症を低減し、又はアルファウイルス感染症を予防するために対象に投与するための薬剤として使用されるように更に製剤化されている、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
生アルファウイルスの不活化を低下させるための方法であって、１つ又は複数の生アルファウイルスを、０．１ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ；１つ又は複数の塩作用剤；及びスクロースを含む２つ以上の炭水化物作用剤を含む組成物と組み合わせることを含み、前記組成物が前記生アルファウイルスの不活化を低下させる方法。
【請求項４３】
前記生アルファウイルスが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、他のセムリキ森林熱ウイルス群、東部ウマ脳炎、及び西部ウマ脳炎、及びそれらの組み合わせを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組み合わせたものを部分的に又は完全に脱水することを更に含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物を、投与前に部分的に又は完全に再水和することを更に含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、含水ウイルス組成物の保管寿命を延長させる、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記２つ以上の炭水化物作用剤が、トレハロース、ガラクトース、フルクトース、キトサン、ソルビトール、マンニトール、及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを更に含む、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つ又は複数の塩作用剤が、塩化ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、及びそれらの組み合わせの１つ又は複数を含む、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１．０ｍＭ〜４０．０ｍＭである、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ＨＥＰＥＳバッファ濃度が、１．０〜３０．０ｍＭであり、２つ以上の炭水化物作用剤濃度が、各々１％〜１０％であり、塩作用剤濃度が、０．００１％〜０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物が、ＨＥＰＥＳ、スクロース、塩化ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、及び塩化カリウムを含む、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
生アルファウイルスの不活化を低下させるためのキットであって、
少なくとも１つの容器；
０．１ｍＭ〜４０．０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ、スクロースを含む２つ以上の炭水化物作用剤、及びヒスチジンを含む１つ又は複数のアミノ酸を含む組成物；及び
１つ又は複数の生アルファウイルス
を含むキット。
【請求項５３】
前記組成物が、ＨＥＰＥＳ、ヒスチジン、スクロース、及びマンニトールを含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む、請求項５２又は５３に記載のキット。
【請求項５５】
生アルファウイルスの不活化を低下させるためのキットであって、
少なくとも１つの容器；
０．１〜４０．０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ、スクロースを含む１つ又は複数の炭水化物作用剤、少なくともグルタミン酸一ナトリウムを含む１つ又は複数の塩作用剤を含む組成物；及び
生アルファウイルス
を含むキット。
【請求項５６】
前記組成物が、ＨＥＰＥＳ、スクロース、塩化ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、及び塩化カリウムを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記生アルファウイルスが、弱毒生アルファウイルスを含む、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記生アルファウイルスが、チクングニヤ（ＣＨＩＫ）ウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林熱ウイルス群、東部ウマ脳炎、及び西部ウマ脳炎、及びそれらの組み合わせを含む、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記アルファウイルス組成物が、弱毒生アルファウイルス組成物であり、薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
アルファウイルスへの曝露に起因する感染症から対象を保護する方法に使用するための、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
アルファウイルスへの曝露に起因する感染症から対象を保護するためのワクチンを製造するための、請求項５９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６２】
前記対象が、ヒト、家畜、又は他の飼育動物である、請求項６０で定義されている使用及び請求項６１に記載されている使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府資金援助
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金Ｒ０１ＡＩ０９３４９１に基づく政府支援でなされたものである。政府は、本発明に関してある権利を有する。
【０００２】
技術分野
本明細書の実施形態は、アルファウイルスを安定化するための組成物及び方法に関する。ある実施形態では、本明細書で開示された組成物及び方法は、生アルファウイルスを安定化すること、又は弱毒生アルファウイルスを安定化することに関する。他の実施形態は、アルファウイルスの分解を低減するための組成物及び方法に関する。更に他の実施形態は、安定化のための改良された製剤及び本明細書で開示された組成物を対象に送達するための改良された製剤を提供することにより、弱毒生又は生アルファウイルスの賦形剤に対する対象の免疫反応が低減された弱毒生又は生アルファウイルスの製剤を提供することに関する。他の実施形態は、ＨＥＰＥＳバッファ中にマンニトール、ヒスチジン、及びスクロースを含み、タンパク質等のヒト又は他の哺乳動物に由来する副産物を有していない製剤に関する。更に他の実施形態は、携行可能な用途のためのキット及び方法に有用なアルファウイルス製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルス感染症からの保護をもたらすワクチンは、ヒト又は動物ウイルス疾患の発生率を低減するために有効に使用されている。ウイルスワクチンの最も成功した技術の１つは、標的ウイルスの弱体化又は弱毒化株（「弱毒生ウイルス」）で、動物又はヒトを免疫することである。対象の免疫後は複製が制限されるため、弱毒化株は、宿主中で増殖及び継代することができないため、ウイルス関連疾患を引き起こさない。しかしながら、弱毒ウイルスは、依然としてウイルス抗原を発現することが可能であり、曝露された対象に、ウイルスに対する強力で長期持続性の免疫応答を生成することができる。したがって、免疫された個体は、後にそのウイルスに曝露されても、ウイルス感染に関連する疾患を発症する可能性が低減される。
【０００４】
弱毒生ウイルスがワクチンとして有効であるためには、弱毒生ウイルスは、免疫後に複製可能でなければならず、有効に及び正確に使用されるためには、ウイルス自体が分解から保護されなければならない。幾つかのワクチンは、極端な温度に感受性であり、過度の熱又は偶発的な凍結はいずれもウイルスを不活化する場合がある。流通の全体にわたって有効で保護的な環境を維持することは、開発途上国において、あるいは僻地の患者を治療する場合には特に困難である。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書の実施形態は、生アルファウイルスを安定化するための組成物及び方法に関する。他の実施形態は、アルファウイルスにより引き起こされる感染に対して対象を免疫するための免疫原性組成物に有用であり、弱毒生アルファウイルスの分解を低減又は安定化するための組成物及び方法に関する。他の実施形態は、弱毒生アルファウイルスを安定化する賦形剤に対する対象の免疫反応を低減するために、ヒト又は他の哺乳動物副産物を含まない安定化組成物を提供することに関する。これらの実施形態によると、安定化製剤は、アルファウイルス感染症に対する免疫原性組成物として対象に使用される場合、動物性副産物を含まない。更に他の実施形態は、携帯可能な用途のためのキット及び方法における、本明細書で開示された安定化組成物の使用に関する。
【０００６】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示されたある組成物は、弱毒生アルファウイルスの分解を低減させつつ、対象への投与時に対象によるアレルギー反応を低減する製剤を提供する成分の組み合わせを含んでいてもよい。本明細書で開示されたある製剤は、免疫原性アルファウイルス製剤に有用なアルファウイルスを安定化するために使用される原料の純度を考慮することにより、より高いレベルの安全性の免疫原性アルファウイルス製剤を提供するように設計された。過去の幾つかの製剤では、ウイルス及び他の作用剤を安定化するための動物由来賦形剤が使用される。ある状況では、これらの動物由来賦形剤及びタンパク質の幾つかは、これらの作用剤への曝露時に対象に有害反応を引き起こす場合がある外来性作用剤（例えば、ＢＳＥ又はアレルゲン）を持っている場合がある。ヒト又は他の哺乳動物に由来する賦形剤を含まない製剤は、未知の又は危険な作用剤（例えば、これらの作用剤に付随する不純物）を対象に導入するリスクを低減する。本明細書では、動物由来作用剤を含む製剤と同様に又はより良好に安定化をもたらす、動物由来作用剤を含まない製剤が提供される。本明細書で開示された他の実施形態は、弱毒生アルファウイルスの安定性を大幅に増強する賦形剤の組み合わせに関する。更なる実施形態は、ウイルス製剤の僻地への安定輸送を容易にするために、保管の全温度範囲でウイルス製剤の安定性を増強するための及びより低い温度（例えば、冷蔵又は冷凍保管）の必要性を低減するための他の組成物及び方法に関する。他の実施形態では、本明細書で開示された組成物及び方法は、これらの組成物を含まない他の製剤と比較して、組成物の再懸濁時間を低減すること、並びに／又は含水及び／若しくは再構成生アルファウイルスの生理学的特性を向上させること、また保管寿命を延長させることに関する。
【０００７】
ある実施形態では、本明細書で開示された製剤は、液体、凍結、凍結乾燥、及び再水和製剤でのウイルス力価損失を防ぐ安定化効果を付与することが可能である。他の実施形態では、本明細書で開示された組成物は、以下に限定されないが、１つ又は複数の生アルファウイルス、ＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数のアミノ酸、及び１つ又は複数の炭水化物作用剤を含む、生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルス組成物に関する。他の実施形態では、本明細書で開示された安定化組成物は、ＨＥＰＥＳバッファ中の生アルファウイルス；ヒスチジンを含むアミノ酸；並びにスクロース及びマンニトールのうちの１つ又は複数を含む１つ又は複数の炭水化物作用剤を含んでいてもよい。更に他の実施形態では、生アルファウイルス製剤は、ヒスチジン、マンニトール、及びスクロースを含むＨＥＰＥＳ系バッファ中に生アルファウイルスを含んでいてもよい。
【０００８】
幾つかの実施形態では、アルファウイルス製剤は、以下に限定されないが、１つ又は複数の弱毒生アルファウイルスを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、１つ又は複数の弱毒生アルファウイルスは、マンニトール、ヒスチジン、及び／又はスクロースを有するバッファと組み合わせることができる。ある実施形態では、ベースバッファ等のバッファがＨＥＰＥＳバッファを含み得る。これらの実施形態によると、弱毒生アルファウイルス組成物中、緩衝化ＨＥＰＥＳは、約１．０〜約２００．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳの濃度を有する約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１０．０であってもよく、ヒスチジンは、約０．１％から約５．０％（ｗ／ｖ）までの濃度（約１〜約５０ｍｇ／ｍｌ）であってもよく、スクロースは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）（約１〜約２００ｍｇ／ｍＬ）であってもよく、マンニトールは、約１．０％〜約１５％（ｗ／ｖ）（約１〜約１５０ｍｇ／ｍＬ）であってもよい。他の実施形態では、ＨＥＰＥＳバッファ濃度は、約５．０ｍＭから約５０．０ｍＭまで、約１０．０ｍＭから約３０ｍＭまで、又は約１０．０ｍＭから約２０ｍＭまでであってもよい。
【０００９】
ある実施形態では、弱毒生アルファウイルス組成物中、アルファウイルス製剤バッファは、ｐＨが約６．５から約８．０までの、約７．０から約７．５までの、又は約７．２の約１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファであってもよく、ヒスチジンは、約５．０ｍｇ／ｍｌから約２０．０ｍｇ／ｍｌまでであってもよく、スクロースは、約３５．０ｍｇ／ｍｌから約５０．０ｍｇ／ｍｌまでであってもよく、マンニトールは、約２５．０ｍｇ／ｍｌから約４０．０ｍｇ／ｍｌまでであってもよい。他の実施形態では、生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスを安定化するために、本明細書で開示された製剤は、約１５．０ｍＭ溶液の濃度を有するｐＨ７．２のＨＥＰＥＳバッファを含んでいてもよく、ヒスチジンは、約５．０ｍｇ／ｍＬから約１２．５ｍｇ／ｍＬまでであってもよく、スクロースは、約３５．０ｍｇ／ｍＬから約５０．０ｍｇ／ｍＬまでであってもよく、マンニトールは、約２５．０ｍｇ／ｍＬから約４０．０ｍｇ／ｍＬまでであってもよい。
【００１０】
他の実施形態では、１つ又は複数の弱毒生アルファウイルスは、種々の条件下で弱毒生アルファウイルスを安定化するために、以下に限定されないが、スクロース、塩化ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、及び塩化カリウムを含む、１つ又は複数の作用剤と組み合わせてもよい。これらの実施形態によると、ＨＥＰＥＳバッファは、アルファウイルスが安定化されており、アルファウイルスの分解が低減されている生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、以下に限定されないが、約１．０％〜約１０．０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するスクロース；約０．０５％〜約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する塩化ナトリウム；約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するグルタミン酸一ナトリウム；約０．０１〜約０．１５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するリン酸ナトリウム；約０．０１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するリン酸カリウム；及び約０．００５％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する塩化カリウムの１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００１１】
別の実施形態では、生アルファウイルスが安定化され、分解が低減され、保管寿命が延長されている生アルファウイルスと組み合わせた場合に、スクロースの濃度は、約５．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化ナトリウムの濃度は、約０．６４％（ｗ／ｖ）であってもよく、グルタミン酸一ナトリウムの濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸ナトリウムの濃度は、約０．０９％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸カリウムの濃度は、約０．０１６％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化カリウムの濃度は、約０．０１６％（ｗ／ｖ）であってもよい。本明細書で開示された幾つかの実施形態は、生アルファウイルスの不活化を低下させるための方法に関する。これらの実施形態によると、方法は、以下に限定されないが、生アルファウイルスを、０．１ｍＭ〜２００．０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数の炭水化物作用剤（例えば、単糖及び糖アルコール等）、及び１つ又は複数のアミノ酸を含むがそれらに限定されない組成物と組み合わせることを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、ＨＥＰＥＳバッファは、約ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０で、濃度が約１．０ｍＭから約２００ｍＭまでであってもよく、ヒスチジンは、約０．１％〜約５．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、スクロースは、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）であってもよく、マンニトールは、約１．０％〜約１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。
【００１２】
本明細書で開示された幾つかの実施形態は、生アルファウイルスの不活化を低下させるための方法に関する場合がある。これらの実施形態によると、１つ又は複数の生アルファウイルスは、以下に限定されないが、０．１〜２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数の炭水化物作用剤、及び１つ又は複数の塩作用剤を含む組成物と組み合わせてもよい。これらの実施形態によると、アルファウイルスの分解を低減するために生アルファウイルスと組み合わせた場合に、スクロース濃度は、約１．０％〜約１０．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化ナトリウム濃度は、約０．１％〜約１．５％（ｗ／ｖ）であってもよく、グルタミン酸一ナトリウム濃度は、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸ナトリウム濃度は、約０．０１〜約０．１５％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸カリウム濃度は、約０．０１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化カリウム濃度は、約０．０１％から約０．０５％（ｗ／ｖ）であってもよい。別の実施形態では、生又は弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、スクロース濃度は、約５．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化ナトリウム濃度は、約０．６４％（ｗ／ｖ）であってもよく、グルタミン酸一ナトリウム濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸ナトリウム濃度は、約０．０９％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸カリウム濃度は、約０．０１６％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化カリウム濃度は、約０．０１６％（ｗ／ｖ）であってもよい。
【００１３】
ある実施形態では、本明細書で開示された組成物は、凍結乾燥された生アルファウイルスを再構成又は再水和するために使用することができる。例えば、脱水又は凍結乾燥又は凍結生アルファウイルスを、凍結温度から室温まで等の種々の温度で輸送した後。本明細書で使用される組成物は、種々の保管温度にて及び凍結−解凍サイクル中、生又は弱毒生アルファウイルスの安定化を増強し、並びに／又は不活化及び／若しくは分解を低下させることができる。
【００１４】
ある実施形態では、本明細書で開示された組成物から利益を得ることができる生又は弱毒生アルファウイルスとしては、以下に限定されないが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、及び西部ウマ脳炎、又はコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルスを挙げることができる。他のセムリキ森林熱ウイルス群としては、以下に限定されないが、ベバルウイルス、マヤロウイルス、亜型：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：亜型：イグボ−オラ（Ｉｇｂｏ−Ｏｒａ）ウイルス、ロスリバーウイルス：亜型：ベバルウイルス；亜型：ゲタウイルス；亜型：サギヤマウイルス、及びセムリキ森林熱ウイルス：亜型：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスが挙げられる。
【００１５】
本明細書で開示された他の実施形態は、本明細書で企図されているアルファウイルスの１つ又は複数により引き起こされる医学的状態を軽減又はその発症を予防することが可能なワクチン又は免疫原性組成物を生成するための弱毒生アルファウイルス組成物及び方法に関する。ある実施形態では、本明細書で企図されている組成物の１つ又は複数の弱毒生ウイルスは、医薬組成物の一部であってもよく、薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。本明細書で開示された医薬組成物は、医薬組成物を対象に投与した場合、アルファウイルス感染症の発症、及びアルファウイルス感染症により引き起こされる状態を軽減させるのに有用であり得る。対象は、例えば、哺乳動物、飼育動物、ペット、家畜、他の動物、又はヒト対象（成人又は小児）であってもよい。
【００１６】
他の実施形態は、以下に限定されないが、容器及び本明細書で開示された組成物を含む、弱毒生ウイルスの不活化を低下させるためのキットに関する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書の特定の実施形態のある態様を更に示すために添付されている。こうした実施形態は、これらの図面の１つ又は複数を、本明細書に提示されている詳細な説明と組み合わせて参照することにより、より良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】種々の液体及び凍結乾燥組成物を使用して、本明細書で開示された一実施形態の例示的な生アルファウイルスの安定性を試験した実験を示す例示的なヒストグラムプロットである。
【図２】種々の液体及び凍結乾燥組成物を使用して、本明細書で開示された一実施形態の例示的な生アルファウイルスの、凍結−解凍処理後の安定性を試験した実験を示す例示的なヒストグラムプロットである。
【図３】種々の組成物を使用して、本明細書で開示された一実施形態の例示的な生アルファウイルスの安定性を約４０℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図４】種々の組成物を使用して、本明細書で開示された一実施形態の例示的な生アルファウイルスの安定性を約２５℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図５】種々の組成物を使用して、本明細書で開示された一実施形態の例示的な生アルファウイルスの安定性を約４℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図６】種々の組成物を使用して、本明細書で開示された一実施形態の例示的な生アルファウイルスの安定性を種々の温度で試験した実験の累積的概要を示すヒストグラムプロットである。
【図７】本明細書で開示された一実施形態で使用される種々の作用剤の濃度範囲を示すヒストグラムであり、生アルファウイルスを安定化するためのこれらの例示的な組成物に含まれる作用剤は、マンニトール、ヒスチジン、及びスクロースである。
【図８】本明細書で開示された一実施形態において、本明細書で開示された種々の組成物を液体又は凍結乾燥状態で使用して、生アルファウイルスに対する効果を試験した実験を示すヒストグラムである。
【図９】本明細書で開示された一実施形態において、本明細書で開示された種々の組成物を凍結−解凍条件下で使用して、生アルファウイルスに対する効果を試験した実験を示すヒストグラムである。
【図１０】本明細書で開示された一実施形態の種々の製剤中での生アルファウイルスの安定性を約４０℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図１１】本明細書で開示された一実施形態の種々の製剤中での生アルファウイルスの安定性を約２５℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図１２】本明細書で開示された一実施形態の種々の製剤中での例示的な生アルファウイルスの安定性を約４℃又は冷蔵温度付近で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図１３】本明細書で開示された一実施形態において、種々の組成物を使用して、例示的な弱毒生アルファウイルスの安定性を種々の温度で試験した実験の累積的概要を示すヒストグラムプロットである。
【図１４】本明細書で開示された一実施形態において、作用剤自体、及び弱毒生アルファウイルスに望ましい安定化組成物を予想するために有用な他の作用剤と比較した、異なる条件下の種々の作用剤のグラフである。
【図１５】本明細書で開示された一実施形態に有用な種々の作用剤の濃度範囲を示すヒストグラムであり、生アルファウイルスを安定化するためのこれらの例示的な組成物に含まれる作用剤は、マンニトール、ヒスチジン、及びスクロースである。
【図１６】本明細書で開示された一実施形態において、本明細書で開示された種々の組成物を液体及び凍結乾燥状態で使用して、生アルファウイルスに対する効果を試験した実験を示すヒストグラムである。
【図１７】本明細書で開示された一実施形態の種々の製剤中での生アルファウイルスの安定性を約４０℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図１８】本明細書で開示された一実施形態の種々の製剤中での生アルファウイルスの安定性を約２５℃で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図１９】本明細書で開示された一実施形態の種々の製剤中での例示的な生アルファウイルスの安定性を約４℃又は冷蔵温度付近で試験した実験を示す例示的なグラフである。
【図２０】本明細書で開示された一実施形態において、種々の組成物を使用して、例示的な弱毒生アルファウイルスの安定性を種々の温度で試験した実験の累積的概要を示すヒストグラムプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本明細書で使用される場合、「１つ」は、１つ又は１つよりも多くのものを意味する場合がある。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「約」は、最大でプラス又はマイナス５パーセント（５パーセントを含む）を意味する場合があり、例えば、約１００は、９５及び最大１０５を意味する場合がある。
【００２０】
本明細書で使用される場合、ＣＨＩＫＶは、チクングニヤウイルスを意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、ＴＣＩＤ５０は、５０％組織培養感染用量を意味する場合がある。
【００２１】
本明細書で使用される場合、ＨＢは、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、ＨＢＳは、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水＋スクロースを意味する場合がある。
【００２２】
本明細書で使用される場合、ＤＭＥＭは、ダルベッコ改変最少必須培地を意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水を意味する場合がある。
【００２３】
本明細書で使用される場合、ＦＢＳは、ウシ胎仔血清を意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、Ｌｙｏは、参照されている製剤に応じて、凍結乾燥又は脱水されたことを意味する場合がある。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「弱毒アルファウイルス」又は「弱毒生アルファウイルス」は、対象（例えば、動物又はヒト）に投与すると、低減された疾患の臨床徴候を示すか又は疾患の臨床徴候を示さないアルファウイルスを意味する場合がある。
【００２５】
詳細な説明
以下の節では、種々の実施形態を詳述するために、種々の例示的な組成物及び方法が説明される。当業者であれば、種々の実施形態の実施にあたり、本明細書で概説されている具体的な詳細の全てを使用することも、又はその一部を使用することさえも必要とされるわけではなく、むしろ、濃度、時間、及びその他の具体的な詳細は、通常の実験により改変することができることは明らかであろう。幾つかの場合では、この説明には、周知の方法又は成分は含まれていない。
【００２６】
ある実施形態では、免疫原性製剤又はワクチン製剤に有用な弱毒生アルファウイルスの安定性を、本明細書で開示された種々の製剤中で観察した。幾つかの実施形態では、液体、凍結、凍結乾燥、及び再構成又は再水和された弱毒生アルファウイルスの力価損失を低減することによりアルファウイルス安定性を増強するための製剤が示された。ある実施形態では、生アルファウイルス製剤は、以下に限定されないが、１つ又は複数の生又は弱毒生アルファウイルス、ＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数のアミノ酸、及び１つ又は複数の炭水化物作用剤を含んでいてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示された組成物は、ＨＥＰＥＳバッファ中のアルファウイルス；ヒスチジンを含む１つ又は複数のアミノ酸；並びにスクロース及び／又はマンニトールのうちの少なくとも１つを含む１つ又は複数の炭水化物作用剤を含んでいてもよい。本明細書で開示されたある組成物は、塩又は塩溶液を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、本明細書で開示された製剤は、生又は弱毒生ルファウイルスを、約−８０度から約４０℃まで又はそれよりも高い温度で、組成物中のアルファウイルスの力価を著しく損失させずに、液体保管、凍結保管、又は凍結乾燥保管するために使用することができる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された製剤を使用して、例えば、４℃での長期保管を達成することができる。ある実施形態では、本明細書で企図されている組成物は、部分的に又は完全に脱水又は水和されていてもよい。
【００２７】
幾つか実施形態では、本明細書で開示された組成物から利益を得る生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスとしては、以下に限定されないが、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、及び西部ウマ脳炎、又はコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルスを挙げることができる。他のセムリキ森林熱ウイルス群としては、以下に限定されないが、ベバルウイルス、マヤロウイルス、亜型：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：亜型：イグボ−オラウイルス、ロスリバーウイルス：亜型：ベバルウイルス；亜型：ゲタウイルス；亜型：サギヤマウイルス、及びセムリキ森林熱ウイルス：亜型：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスが挙げられる。
【００２８】
本明細書で開示されたある実施形態は、チクングニヤウイルスに関する。チクングニヤウイルスは、およそ１１．６ｋｂのプラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有するアルファウイルスである。チクングニヤウイルスは、セムリキ森林熱ウイルス群のメンバーであり、ロスリバーウイルス、オニョンニョンウイルス、及びセムリキ森林熱ウイルスと近縁にある。本明細書で開示された組成物は、生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスの分解を低減することにより、セムリキ森林熱ウイルス群変種のウイルスを安定化するために使用することができる。
【００２９】
ある実施形態では、本明細書で企図されている弱毒生アルファウイルスは、キメラアルファウイルスを含んでいてもよい。他の実施形態では、弱毒生アルファウイルスは、弱毒生チクングニヤウイルス又はキメラチクングニヤウイルスを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、１つの例示的キメラアルファウイルスは、哺乳動物細胞では発現され得るが、昆虫細胞では発現され得ないものである。ある実施形態では、弱毒生アルファウイルスは、蚊及び蚊細胞で複製不能な弱毒生アルファウイルスを含んでいてもよい。他の実施形態では、本明細書で開示された組成物から利益を得ることが企図されている弱毒生アルファウイルスは、真核生物の制御下となるように遺伝子操作されているものである（例えば、ＩＲＥＳ配列等の真核生物エレメントの挿入、及び／又はアルファウイルスのサブゲノムプロモーターの不活化）。他の実施形態では、弱毒生アルファウイルスは、（ｉ）非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端と、アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が挿入されており、（ｉｉ）サブゲノムプロモーターが不活化されている、弱毒化されているアルファウイルスのアルファウイルス核酸を含んでいてもよい。ある実施形態では、ＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳであってもよく、又はワクチン組成物に有用な生存可能な弱毒アルファウイルス構築体を生成することが可能な他の類似ＩＲＥＳであってもよい。
【００３０】
本明細書の実施形態は、弱毒生アルファウイルスの分解及び／又は不活化を低下させ又は防止するための方法及び組成物に関する。これらの実施形態によると、ある組成物は、弱毒生アルファウイルスの分解及び／又は不活化を低下させる成分の組合せを含んでいてもよい。本明細書の他の実施形態は、弱毒生アルファウイルスの安定性を増強することが可能な作用剤の組み合わせに関する。本明細書の更に他の組成物及び方法は、より低い温度（例えば、冷蔵保管又は冷凍保管）の必要性を低減しつつ、含水及び／又は再構成生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスの保管寿命を延長させることに関する。
【００３１】
幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスは、１つ又は複数のアミノ酸及び１つ又は複数の炭水化物と組み合わせることができる。ある実施形態では、本明細書で開示されたアルファウイルス製剤は、ＨＥＰＥＳバッファ、炭水化物、及びアミノ酸の少なくとも３つの成分を含んでいてもよい。他の実施形態では、本明細書で開示された生アルファウイルスの安定化を増強するための製剤は、タンパク質等のヒト又は哺乳動物に由来する作用剤を含まない（例えば、血清もゼラチンも含まない）組成物を含んでいてもよい。他の実施形態では、製剤の緩衝能力又は他の所望の特性を増強するために、塩作用剤を、これらの組成物に添加してもよい。
【００３２】
本明細書で開示された他の実施形態は、対象に投与すると、１つ又は複数のアルファウイルスにより引き起こされる感染症の発症又は曝露による副作用を軽減又は予防することが可能な免疫原性組成物又はワクチン組成物の調製に使用される生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルス組成物に関する。これらの免疫原性組成物又はワクチン組成物から利益を得ることが企図される対象としては、ヒト（例えば、成人、青少年、小児、及び幼児）、及びペット、家畜、又は他の飼育動物若しくは野生動物等の動物が挙げられる。
【００３３】
幾つかの実施形態は、以下に限定されないが、１つ又は複数の生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスを、１つ又は複数のタンパク質作用剤、１つ又は複数のアミノ酸、１つ又は複数の炭水化物、１つ又は複数のサッカライド又はポリオール作用剤、及び任意選択でＨＥＰＥＳバッファを含むが、それらに限定されない、アルファウイルスの不活化を低下させることが可能な組成物と組み合わせることを含み、上記組成物がアルファウイルスの不活化を低下させる、生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスの不活化を低下させるための方法に関する。これらの実施形態によると、弱毒生ウイルスは、チクングニヤ（例えば、セムリキ森林群ウイルス）と類似した特徴を有するもの並びにアルファウイルスチクングニヤと類似した遺伝子構造又は構造及び非構造タンパク質レイアウト及び／若しくは二次構造等を有する他のアルファウイルス等の、特定のアルファウイルスを含んでいてもよい。
【００３４】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された製剤に有用な炭水化物は、糖又はポリオール又は糖アルコールであってもよい。これらの実施形態によると、糖としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、リボース、マンノース、ラムノース、タロース、キシロース、又はアロースアラビノース）、二糖（例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セリビオース（ｃｅｌｌｉｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース、ラミナリボース（ｌａｍｉｎａｒｉｂｏｓｅ）、キシロビオース、マンノビオース、ラクトース、又はフルクトース）、三糖（例えば、アカルボース、ラフィノース、メリジトース、パノース、又はセロトリオース）、又は糖ポリマー（例えば、デキストラン、キサンタン、プルラン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、セロオロゴサッカライド（ｃｅｌｌｏｏｌｏｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、セルロース、マルトオリゴ糖、グリコーゲン、キトサン、又はキチン）。ポリオールとしては、これらに限定されないが、以下のものを挙ることができる：マンニトール、ソルビトール、アラビトール、エリトリトール、マルチトール、キシリトール、グリシトール、グリコール、ポリグリシトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、イソマルト、水素化デンプン加水分解物、及びグリセロール等の糖アルコール。
【００３５】
ある実施形態では、本明細書で開示された製剤に有用な他の炭水化物作用剤は、本明細書の組成物での使用を企図することができ、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：スクロース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アミロース、アミロペクチン、デンプン、セルロース、マルトオリゴ糖、グリコーゲン、キトサン、又はキチン。他の実施形態では、本明細書での使用が企図されているアミノ酸は、少なくともヒスチジン及び任意選択でグリシンを含む。
【００３６】
幾つかの実施形態では、弱毒生アルファウイルス組成物中、ＨＥＰＥＳバッファは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１０のｐＨで、約１．０ｍＭから約２００ｍＭまでの濃度を有していてもよく、１つ又は複数のアミノ酸濃度は、約１．０ｍｇ／ｍｌから約４０ｍｇ／ｍｌまでであってもよく、１つ又は複数の炭水化物作用剤濃度は、約１．０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌまでであってもよい。他の実施形態では、弱毒生アルファウイルス組成物中、ＨＥＰＥＳバッファ濃度は、約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．０までのｐＨで、約１．０ｍＭ〜約４０ｍＭの濃度であってもよく、１つ又は複数のアミノ酸濃度は、約１．０ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌまでであってもよく、１つ又は複数の炭水化物作用剤濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌまでであってもよい。
【００３７】
ある実施形態では、弱毒生アルファウイルス組成物は、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳバッファ、マンニトール、ヒスチジン、及びスクロースを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、ＨＥＰＥＳバッファは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１０．０のｐＨ、約１．０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度であってもよく、ヒスチジンは、約０．１％〜約５．０％の濃度であってもよく、スクロースは、約０．１％〜２０．０％の濃度であってもよく、マンニトールは、約１．０％〜約１０％の濃度であってもよく、１つ又は複数の弱毒生アルファウイルス。ある実施形態では、製剤は、１０ｍＭ〜１５０ｍＭの塩（例えば、塩化ナトリウム又は他の適切な塩）を更に含んでいてもよい。
【００３８】
弱毒生アルファウイルス組成物の不活化を低下させるための組成物及び方法に関する幾つかの実施形態は、以下に限定されないが、１つ又は弱毒生アルファウイルスを、０．１ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数の炭水化物作用剤、及び１つ又は複数のアミノ酸を含むがそれらに限定されない組成物と組み合わせることを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、緩衝化ＨＥＰＥＳの濃度は、約ｐＨ６．０〜ｐＨ１０で、約１〜約２００ｍＭであってもよく、ヒスチジンの濃度は、約０．１％〜約５．０％であってもよく、スクロースの濃度は、約０．１％〜約２０％であってもよく、マンニトールの濃度は、約１．０％〜約１０％であってもよい。幾つかの実施形態では、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、緩衝化ＨＥＰＥＳは、約ｐＨ６．０〜ｐＨ１０で、約１〜約４０ｍＭであってもよく、ヒスチジンは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌであってもよく、スクロースは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌであってもよく、マンニトールは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。他の実施形態では、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、ＨＥＰＥＳバッファは、約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５で、約１〜約３０ｍＭであってもよく、ヒスチジンは、約５〜約３０ｍｇ／ｍｌであってもよく、スクロースは、約１０〜約５０ｍｇ／ｍｌであってもよく、マンニトールは、約５〜約４０ｍｇ／ｍｌであってもよい。他の実施形態では、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、ＨＥＰＥＳバッファは、約ｐＨ７．２で、約１０〜約２０ｍＭであってもよく、ヒスチジンは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌであってもよく、スクロースは、約２０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌであってもよく、マンニトールは、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約４０ｍｇ／ｍｌであってもよい。他の実施形態では、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、ＨＥＰＥＳバッファは、ｐＨ７．２の１５ｍＭ溶液であってもよく、ヒスチジンは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌであってもよく、スクロースは、約３５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌであってもよく、マンニトールは、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約４０ｍｇ／ｍｌであってもよい。別の実施形態では、弱毒生アルファウイルスと組み合わせた場合に、ＨＥＰＥＳバッファは、ｐＨ７．２の１５ｍＭ溶液であってもよく、ヒスチジンは、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜１２．５ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは、約３５．０ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍＬであり、マンニトールは、約２５．０ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０ｍｇ／ｍＬである。
【００３９】
本明細書で開示された幾つかの実施形態は、生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスの不活化を低下させるための組成物に関する場合があり、組成物及び方法は、以下に限定されないが、１つ又は複数のアルファウイルスを、０．１ｍＭ〜２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数の炭水化物作用剤、及び１つ又は複数の塩作用剤を含むがそれらに限定されない組成物と組み合わせることを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、アルファウイルスの分解を低減するために、スクロース濃度は、約１．０％〜約１０．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化ナトリウム濃度は、約０．１％〜約１．５％（ｗ／ｖ）であってもよく、グルタミン酸一ナトリウム濃度は、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸ナトリウム濃度は、約０．０１〜約０．１５％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸カリウム濃度は、約０．０１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化カリウム濃度は、約０．０１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）であってもよい。別の実施形態では、生アルファウイルスと組み合わせた場合に、スクロース濃度は、約５．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化ナトリウム濃度は、約０．６４％（ｗ／ｖ）であってもよく、グルタミン酸一ナトリウム濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸ナトリウム濃度は、約０．０９％（ｗ／ｖ）であってもよく、リン酸カリウム濃度は、約０．０１６％（ｗ／ｖ）であってもよく、塩化カリウム濃度は、約０．０１６％（ｗ／ｖ）であってもよい。
【００４０】
ある実施形態では、本明細書で開示された組成物は、部分的に又は完全に凍結乾燥されている生アルファウイルスを再水和するために使用してもよく、又は様々な温度からの生アルファウイルスを種々の温度で輸送するために使用してもよい。本明細書で企図されている組成物は、製造、調製、又は精製中、輸送、配送中、及び凍結−解凍サイクル中、種々の保管温度で、弱毒生アルファウイルスの安定化を増強し、並びに／又は不活化及び／若しくは分解を低下させることができる。
【００４１】
ある実施形態では、本明細書で企図されている組成物は、部分的に又は完全に脱水又は水和されていてもよい。更に、本明細書で開示された組成物は、生アルファウイルスの凍結乾燥中及び凍結乾燥後に使用することができる。これらの実施形態によると、組成物は、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上、脱水されていてもよい。本明細書に記載の組成物は、含水又は再水和弱毒生アルファウイルスの保管寿命を延長させることが可能である。更に、本明細書で開示された組成物は、凍結乾燥又は液体／凍結状態の下、室温、氷点下の温度、高温等の幅広い温度（例えば、−８０℃から４０℃まで及びそれを超える温度）において弱毒生アルファウイルスの安定性を増強する。他の実施形態では、本明細書で開示された組成物は、生アルファウイルスの安定性を、ＨＥＰＥＳバッファ、１つ又は複数の炭水化物作用剤、及び１つ又は複数のアミノ酸の組成物で製剤化されていない生アルファウイルスよりも、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、又は１０倍、又はそれを超えて、増強することができる。
【００４２】
他の実施形態では、本明細書で開示された方法は、本開示の組成物中のアルファウイルスを保存するためのフリーズドライ法又は他の脱水法を含み得る。これらの実施形態によると、本明細書で開示された組成物は、フリーズドライ処理された又は部分的に若しくは完全に脱水された生アルファウイルスの不活化を低下させることが可能である。他の方法では、生アルファウイルスの不活化を低下させるための組成物は、含水組成物を含んでいてもよく、又は脱水後に再水和された組成物を含んでいてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示された組成物は、アルファウイルスの分解を低減することにより、含水又は再構成アルファウイルス製剤の保管寿命を延長させることが可能である。
【００４３】
ある実施形態では、本明細書で企図されている組成物は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃又は更に４０℃という高温）又は冷蔵温度（例えば、約０℃〜約１０℃又は最大２０℃）にて、１２時間よりも長期間から２４時間よりも長期間、水和弱毒生アルファウイルスの不活化及び／又は分解を低下させることが可能である。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物は、２４時間以上にわたって９０％以上の弱毒生アルファウイルスを維持することが可能である。加えて、本明細書で開示された組成物は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、又はそれよりも多くの回数の凍結−解凍サイクル中、水和生アルファウイルスの不活化を低下させることが可能である。他の実施形態は、冷蔵温度（例えば、約０℃〜約１０℃）で約２４時間〜２６週間を超える期間にわたって、水和又は含水アルファウイルスの不活化を低下させることが可能な組成物に関する。これらの方法で企図されている組成物は、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳバッファ、ヒスチジン、スクロース、及びマンニトールを含んでいてもよい。ある実施形態では、生アルファウイルス組成物は、およそ４０℃で２４時間を超える期間後、約１００％、約９０％、又は約８０％、又は約７０％のウイルス力価を維持し、４℃付近の冷蔵温度で４週間後に９０％を超えるウイルス力価を維持する。本明細書の他の実施形態は、およそ２５℃で１２週間後に、約９０％若しくは約８０％のウイルス又は約７０％のウイルス力価を維持し、４℃付近の冷蔵温度で約２６週間後に、約９０％若しくは約８０％のウイルス力価又は約７０％を維持する。本明細書で企図されている他の実施形態は、およそ４０℃で数時間（例えば、２０時間）後に、当技術分野で公知の他の組成物と比較して、約３倍〜約１０倍のウイルス力価の濃度で残存する生アルファウイルス組成物を含む。
【００４４】
他の実施形態では、本明細書で企図されている組成物は、微量の２価カチオンを含んでいてもよく、又は２価カチオンを含んでいなくともよい。例えば、本明細書で企図されている組成物は、微量のカルシウム／マグネシウム（Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）を有していてもよく、又はカルシウム／マグネシウム（Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）を有していなくともよい。
【００４５】
他の弱毒生ウイルスの製剤は、以前に記載されている（例えば、Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年を参照）。ＳＰＧＡと呼ばれる１つの一般的な安定化剤は、２〜１０％のスクロース、リン酸塩、グルタミン酸カリウム、及び０．５〜２％の血清アルブミンの混合物である（例えば、Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ、Ｍｉｌｌｅｒら、１９５０年を参照）。この基本製剤の種々の改変は、陽イオンが異なること、スクロースの代わりにデンプン加水分解物又はデキストランを用いること、及び血清アルブミンの代わりにカゼイン加水分解物又はポリビニルピロリドンを用いることであることが特定されている。他の製剤では、血清アルブミンの代わりに加水分解ゼラチンがタンパク質源として使用されている（Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年）。しかしながら、ゼラチンは、免疫した小児及び成人にアレルギー反応を引き起こす場合があり、ワクチン関連有害事象の原因となり得る。加えて、ゼラチンは、ウシ又はブタの骨及び脊髄物質に由来する場合がある。これらの供給源は、外来性作用剤（レトロウイルス及び／又はプリオン−ＢＳＥ）の供給源であり、安全性が懸念される。加えて、アルブミンは、ヒトから収集される場合があり、これも危険な外来性作用剤を導入する潜在的リスクをもたらす。したがって、本明細書で開示された１つの目標は、対象においてゼラチン及び／又は血清アルブミン等の作用剤に対する有害アレルギー反応を起こさずに又は考え得る安全性の懸念を喚起することなく、弱毒生又は生アルファウイルスに対して同じ又は向上した効果を示す製剤を特定することであった。ある実施形態では、本明細書で開示された製剤は、ゼラチンを含む製剤と比較することができ、本製剤は、ゼラチン含有製剤の有害効果がなく、アルファウイルスに対して同じ又は優れた安定化効果を示す。
【００４６】
本明細書の実施形態は、従来技術のものと比較して、生アルファウイルス組成物の安定性を増強し、及び／又は分解を低減し、又はアレルギー反応の可能性を低減する組成物を開示する。本明細書で開示されたある組成物は、４０℃又はその付近で、最大１日間、最大２日間、最大４日間、及び６週間よりも長期間にわたって含水ウイルスの安定性を提供する。本明細書で開示されたある組成物は、室温（例えば、２５℃）又はその付近で最大１日間〜約１２週間よりも長期間にわたって、含水ウイルスの安定性を提供する。本明細書で開示された実施形態は、例えば凍結及び／又は解凍及び／又は高温状態からの生ウイルスの保護を強化する。ある実施形態では、本明細書で開示された組成物は、脱水弱毒生ウイルス製品を、室温条件（例えば、約２５℃）で安定化することができ、分解を低減することができ、及び／又は不活化を防止することができる。他の実施形態では、本明細書で企図されている組成物は、含水弱毒生ウイルス製品を、約２５℃又は最大約４０℃又はそれよりも高い温度で安定化することができ、分解を低減することができ、及び／又は不活化を防止することができる。本明細書で開示された組成物は、先進地域及び発展途上地域における、アルファウイルスワクチンの保管、流通、配送、及び正確な投与を容易にすることができる。
【００４７】
当業者であれば、本明細書で開示された組成物又は処方は、以下に限定されないが、細胞培養継代／選択、遺伝子再集合、感染性クローンへの突然変異の組み込み、リバースジェネティクス、挿入、欠失、キメラ構築体、他の組換えＤＮＡ又はＲＮＡ操作を含む任意の方法により、生であるか、生かつ弱毒化されているかのいずれかであるウイルスに関することを認識するであろう。加えて、当業者であれば、本明細書で開示された製剤の保護効果から利益を得ることができるあるアルファウイルスは、以下に限定されないが、組換えアルファウイルス構築体を含む他のタンパク質又はＲＮＡを発現するように遺伝子操作されていてもよいことを認識するであろう。これらのウイルスは、感染性疾患のワクチン、腫瘍学的状態を治療又は発症を低減するためのワクチン、又はタンパク質若しくはＲＮＡを発現するためのアルファウイルス（例えば、遺伝子療法、アンチセンス療法、リボザイム療法、又は低分子抑制性ＲＮＡ療法）として使用することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物は、トガウイルス、又はコロナウイルス、又はトガウイルス科の任意のアルファウイルスの膜エンベロープ（例えば、エンベロープウイルス）を有する１つ又は複数のウイルスを含んでいてもよい。他の実施形態では、本明細書の組成物は、トガウイルス科又はコロナウイルス科の１つ又は複数のエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスを含んでいてもよい。ある実施形態では、組成物は、ワクチン組成物に使用されるウイルスの弱毒化を誘導するために、１つ又は複数の挿入、欠失、又は突然変異を有する１つ又は複数の弱毒生アルファウイルス（例えば、チクングニヤ、ＶＥＥＶ、又はＥＥＥＶ等）を含んでいてもよい。
【００４９】
ある実施形態では、生アルファウイルス組成物は、以下の文献に記載されている１つ又は複数の弱毒生アルファウイルス構築体又はウイルスを含んでいてもよい：２００９年１月２３日出願の米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００４５８号、発明の名称「ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＬＰＨＡＶＩＲＵＳＥＳ  ＩＮＣＡＰＡＢＬＥ  ＯＦ  ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＮＧ  ＩＮ  ＭＯＳＱＵＩＴＯＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ（蚊で複製不能な弱毒化組換えアルファウイルス及びその使用）」及び２０１０年７月２３日出願の米国特許出願第１２／８０４，５３５号。これらの出願並びにそれらの応答及び分割出願は、それらの全体があらゆる目的で参照により組み込まれる。
【００５０】
医薬組成物
本明細書の幾つかの実施形態は、含水又は凍結乾燥形態の弱毒生ウイルスの医薬組成物に関する。当業者であれば、本明細書で開示された医薬組成物の熱的ウイルス安定性を向上させ、凍結−解凍不活化を低下させる製剤が、含水形態であるか、当技術分野で公知の方法により粉末化、フリーズドライ又は凍結乾燥されて調製された製品を改良しうることを理解するであろう。再構成後、そのような安定化免疫原性組成物は、以下に限定されないが、皮内投与、皮下投与、筋内投与、鼻腔内投与、経肺投与、又は経口投与を含む様々な経路で投与することができる。
【００５１】
他の実施形態では、本明細書で開示された任意の医薬組成物を送達するためのデバイスが企図される。これらの実施形態によると、以下に限定されないが、注射器及び針注射、二股針投与、皮内パッチ又はポンプによる投与、皮内無針ジェット送達（皮内等）、皮内粒子送達、又はエアロゾル粉末送達を含む、ワクチン又は他の免疫原性組成物を送達するための様々なデバイスが、当技術分野で公知である。
【００５２】
ある実施形態では、本明細書で開示された組成物は、典型的には、生理学的に許容されるバッファを含む。幾つかの実施形態では、ＨＥＰＥＳバッファは、アルファウイルス組成物に対して、他のバッファと比較して、予想外の安定効果を示すことが見出された。ある実施形態では、６．０を超えるｐＨ〜約ｐＨ１０の緩衝培地が企図され、幾つかの弱毒生又は生ウイルス（例えば、アルファウイルス）は、低ｐＨで不安定である。
【００５３】
本明細書の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの医薬品投与に好適な生物学的適合形態で組成物を対象に投与することを提供する。「ｉｎ  ｖｉｖｏでの医薬品投与に好適な生物学的適合形態」は、活性作用剤の治療利益があらゆる毒性効果を上回る、投与しようとする活性作用剤（例えば、ある実施形態の弱毒生ウイルス）の形態を意味する場合がある。
【００５４】
本明細書で開示された治療的活性量の医薬組成物の投与は、所望の結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量であると定義することができる。例えば、化合物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する製剤の能力等の要因に応じて様々であり得る。投与レジメンは、特定の個体に最適な治療応答を提供するように調整することができる。
【００５５】
幾つかの実施形態では、組成物（例えば、医薬品）は、任意の公知の様式、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経口投与、吸入、経皮塗布、膣内塗布、局所塗布、鼻腔内、又は直腸内投与で対象に投与することができる。一実施形態では、化合物は、吸入等、鼻腔内投与してもよい。ある実施形態では、本明細書で開示された免疫原生組成物は、皮下又は皮内に投与してもよい。
【００５６】
本明細書で開示された化合物又は活性作用剤（例えば、弱毒生アルファウイルス）は、上記組成物と同時投与される適切な担体又は希釈剤に入れて対象に投与してもよい。用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、生理食塩水及び緩衝水溶液等の希釈剤を含むことが意図されている。また、活性作用剤は、非経口投与してもよく又は腹腔内投与してもよい。
【００５７】
注射用途に好適な医薬組成物は、当技術分野で公知の手段により投与することができる。例えば、無菌水性溶液（水溶性である場合）又は分散系、及び無菌注射溶液又は分散系で即時調製するための無菌粉末を使用することができる。全ての場合で、組成物は、無菌とすることができ、注射容易性が存在する程度に流動性とすることができる。組成物は、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から更に保存されていてもよい。薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することにより、分散系の場合には、必要とされる粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、維持することができる。
【００５８】
溶液は、製剤化すれば、その投与製剤と適合する様式により、治療上有効な量で投与することができる。製剤は、上記に記載の注射溶液のタイプ等の様々な剤形で容易に投与される。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された製剤は、本発明のアルファウイルスへの曝露前、曝露中、及び／又は曝露後に投与することができる。
【００５９】
キット
他の実施形態は、本明細書で開示された組成物及び方法と共に使用するためのキットに関する。組成物及び生ウイルス製剤は、科学研究で使用するための、又は対象に送達するための及び／又は対象への投与に使用するためのキットに提供されていてもよい。これらの実施形態によると、キットは、以下に限定されないが、好適な容器、アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルス組成物、及び他の抗ウイルス剤、抗真菌剤、又は抗細菌剤等の１つ又は複数の追加の作用剤を含んでいてもよい。
【００６０】
他の実施形態では、キットは、本明細書で開示された、適切に等分されたアルファウイルス組成物を更に含んでいてもよい。加えて、本明細書の組成物は、部分的に又は完全に脱水されていてもよく又は含水されていてもよい。本明細書で企図されているキットは、特定の製剤に応じて、本明細書で開示されているような室温又は冷蔵温度で保管することができる。
【００６１】
他の実施形態では、キットは、通常、少なくとも１つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、注射器、又は組成物を入れて、適切に等分することができる他の容器を含んでいてもよい。また、追加の成分が提供されている場合、キットは、通常、その作用剤又は成分を入れることができる１つ又は複数の追加の容器を含んでいてもよい。また、本明細書のキットは、組成物及び任意の他の試薬を、商業的販売用の容器に含んでいてもよい。そのような容器は、所望のバイアル（例えば、免疫原性組成物又はワクチン組成物）が保持される射出成形又はブロー成形プラスチック容器を含んでいてもよい。
【００６２】
実施例
以下の実施例は、本明細書で提示されたある実施形態を示すために記載されている。当業者であれば、以下の実施例で開示された技法は、本明細書で開示された実施において良好に機能することが発見された技法であり、したがって、その実施の好ましい様式を構成するとみなすことができることが理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本明細書の趣旨及び範囲から逸脱せずに、開示されている具体的な実施形態に対して多数の変更をなすことができ、同様の又は類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
【００６３】
実施例１
バッファのスクリーニング
ある例示的な方法では、前臨床及び臨床試験、並びにアルファウイルス免疫原性組成物又はワクチンでの使用に好適な液体組成物及び凍結乾燥可能な組成物が特定される。これらの例示的な組成物による液体組成物に関する１つの留意点は、幾つかのアルファウイルスがｐＨ感受性である（例えば、低ｐＨに対して）ということである。したがって、本明細書で開示された組成物の成分は、ｐＨに関する注意深い考慮を含む。ある例示的な組成物では、製剤のｐＨは、約ｐＨ６．０〜約１０．０であり、幾つかの製剤は、ｐＨ６．５〜７．５付近に維持されていた。
【００６４】
幾つかの方法では、弱毒生チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）を、前臨床及び臨床試験のためのアルファウイルス組成物の例として使用する。これらの方法のための組成物を提供する。１つの例示的な実験では、所定量のＣＨＩＫ−ＩＲＥＳワクチン（ｐＭＶＳ）、挿入されたＩＲＥＳの制御下に構造遺伝子を有する弱毒生チクングニヤウイルスを使用する。任意の弱毒又は生アルファウイルスを、これらの例示的な組成物に使用して、アルファウイルスの安定性を増強し、分解を低減することができることが企図される。まず、ＤＭＥＭ、ＰＢＳ、及びＨＥＰＥＳ等の、多数の異なるバッファを試験した。
【００６５】
他の例示的な方法では、４０℃で最大６週間にわたってインキュベーションすること等の、ある試験を実施して、弱毒生ウイルスの安定性を試験した。試料を採取し、９６ウェルプレートでベロ細胞を滴定し、ＴＣＩＤ５０により感染性ウイルスの存在を決定した。インプット（インキュベートしなかった）アルファウイルス組成物対照と比較した残存ウイルスのパーセントを算出した。例えば、ＰＢＳのみ、２０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ緩衝デキストロースを含む１０５  ＴＣＩＤ５０の生アルファウイルスをインキュベーションすると、アルファウイルス（例えば、ＣＨＩＫ）の効力が急速に失われることが示された。弱毒生アルファウイルス（例えばＣＨＩＫ）、例えば、約１．０〜約２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳのＨＥＰＥＳバッファ（４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む組成物等の、ある例示的な組成物は、弱毒生アルファウイルスの安定化に有効であることが示された（データ非表示）。１つの例では、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水−ＨＳ）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む組成物は、対照と比較して、弱毒アルファウイルスワクチンに安定性の増強をもたらすことが見出された（データ非表示）。
【００６６】
実施例２
タンパク質アレルゲンを欠如する製剤の安定化のスクリーニング
ある方法では、幾つかの製剤には、血清アルブミンの代わりに加水分解ゼラチンがタンパク質源として使用される（Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年）及び本発明と関連する以前に開示されている発明。しかしながら、ゼラチンは、弱毒生ウイルスに安定性をもたらすものの、対象に投与されるとアレルギー反応を引き起こす場合があり、時にはワクチン関連有害事象の原因となり得る。本明細書で開示されたある組成物は、弱毒生アルファウイルスの劣化を低減するためにゼラチンを含むものと同等の結果を提供しつつ、対象に投与した際のアレルギー反応が低減される製剤を提供する組成物の組み合わせを含んでいてもよい。
【００６７】
幾つかの例では、生アルファウイルス又は弱毒生アルファウイルスに同等の又は更に増強された安定性を提供することができる、アルブミン又はゼラチンを有していない製剤を説明する。これらの製剤は、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳバッファ、１つ若しくは複数の炭水化物作用剤、１つ若しくは複数のアミノ酸、１つ若しくは複数のタンパク質作用剤、及び／又は１つ若しくは複数の塩作用剤を含む。
【００６８】
例示的な製剤を下記に示す（下記の試験した製剤は全て、ｐＨ７．２＋／−０．２であった）：
Ｉ．  １５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％スクロース、１％ゼラチン、及び０．９％塩化ナトリウム（陽性対照）。１５．０ｍＭ及び１５０．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳは、アルファウイルスの安定化に関して同様の挙動を示すことが示された
ＩＩ．  ７％スクロース、３％ヒト血清アルブミン、及び１．５％マンニトール（タンパク質を含有する潜在的なアレルゲン）
ＩＩＩ．  ２．５％スクロース及び３％ヒスチジン
ＩＶ．  １．５％スクロース及び２％グリシン
Ｖ．  １．５％スクロース、２％グリシン、０．４４％塩化ナトリウム
ＶＩ．  ２％スクロース、４％マンニトール、０．５％ヒスチジン
ＶＩＩ．  ５％スクロース、０．６４％塩化ナトリウム、０．１％グルタミン酸一ナトリウム、０．０９％リン酸ナトリウム、０．０１６％リン酸カリウム、及び０．０１６％塩化カリウム
ＶＩＩＩ．  ２．５％マンニトール及び４．５％ペプトン
【００６９】
【表１】
2019513138.tif 000003
【００７０】
これらの組成物で製剤化された弱毒生アルファウイルス試料を、制御された温度で保管した。１製剤当たり１８、１５、及び９個の試料を、それぞれ４℃、２５℃、及び４０℃の各々で保管した。試料を、表１及び例示的な図３〜５に示されている時点で観察して、効力を評価した。４〜２６週間の期間にわたって安定性の傾向を観察するために、２５℃及び４℃（それぞれ図４〜５）でインキュベートした試料を、４０℃（図３）でインキュベートした試料と並行して分析した。
【００７１】
表２は、製剤Ｉ〜ＶＩＩＩを使用した実験の０週目の例示的な結果をまとめたものである。平均再懸濁時間、ｐＨ、ケーキ外観スコア（ｃａｋｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｓｃｏｒｅ）、外観描写、予想浸透性、及び残留水分等の生理学的特徴を、製剤毎に測定及び記録した。製剤Ｉ、ＩＩ、及びＶＩＩＩは、タンパク質作用剤（例えば、ゼラチン、アルブミン、及びペプトン）を含み、対照として使用し、タンパク質作用剤を含まない製剤と比較した。例えば、製剤ＩＩＩ、ＶＩ、及びＶＩＩは、タンパク質を含まず、３を超えるケーキ外観スコアを示し、約０．４７％〜約１．１５％の残留水分パーセントを有していた。
【００７２】
【表２】
2019513138.tif 000004
【００７３】
実施例３
液体及び凍結乾燥製剤
他の例示的な方法では、凍結乾燥した弱毒アルファウイルス製剤（例えば、ＣＨＩＫ）の安定性を評価した。製剤はいずれも、０週目の凍結乾燥時に著しい力価の損失を示さなかった。しかしながら、製剤Ｖ及びＶＩＩＩは、処理時に、液体安定性の指標である力価の著しい損失を示した（図１を参照）。更に、製剤Ｖは、液体製剤の凍結−解凍サイクル時に著しい力価の損失を示した（図２）。凍結乾燥製剤Ｉ〜ＶＩＩＩを、４０℃（図３）、２５℃（図４）、又は４℃（図５）で保管した。指定の時点で採取した試料を再構成し、ベロ細胞でＴＣＩＤ５０により滴定した。例示的なアルファウイルス製剤（例えば、弱毒生ＣＨＩＫ製剤）ＶＩ（２％スクロース、４％マンニトール、０．５％ヒスチジン）及び製剤ＶＩＩ（５％スクロース、０．６４％塩化ナトリウム、０．１％グルタミン酸一ナトリウム、０．０９％リン酸ナトリウム、０．０１６％リン酸カリウム、及び０．０１６％塩化カリウム）は、４０℃で４週間にわたって、対照製剤Ｉ及びＩＩと同等の安定化特徴を示した（図３）。また、これらの製剤は、２５℃及び４℃で１２週間を超える期間にわたって、ウイルス力価の損失が最小限であった（図４及び５）。
【００７４】
図６は、加速及びリアルタイム安定性実験中の力価の損失を例示するヒストグラムプロットである。試験した製剤は全て、４℃で１週目から２６週目まで弱毒生ウイルスに安定性を提供したが、製剤ＩＶ、Ｖ、及びＶＩＩＩは、４０℃で４週間後に著しい力価の損失を示した。製剤ＶＩ及びＶＩＩは、４０℃、２５℃、及び４℃で弱毒生ウイルスに安定化組成物を提供した。製剤ＶＩ（２％スクロース、４％マンニトール、０．５％ヒスチジン）を、更なる評価及び展開の製剤候補として選択した。
【００７５】
実施例４
ヒト及び哺乳動物タンパク質作用剤を欠如する安定化製剤
他の例示的な方法では、４０℃、２５℃、及び４℃での長期安定性実験を実施して、弱毒生アルファウイルス安定性に対する、様々な濃度の炭水化物（例えば、スクロース及びマンニトール）及びアミノ酸（例えば、ヒスチジン）の効果を分析した。例えば、１つ又は複数の炭水化物及び１つ又は複数のアミノ酸を有する製剤は、ＣＨＩＫ安定性に肯定的な効果を示した（上記を参照）という観察に基づき、弱毒生ＣＨＩＫを使用した。上記で提示した製剤ＶＩを基本製剤として使用して、様々な濃度のスクロース、マンニトール、及びヒスチジンを有する製剤を、ｐＨ７．２＋／−０．２の１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファで製剤化した。
【００７６】
例示的な製剤：
１．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１２．５ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３５．０ｍｇ／ｍｌスクロース
２．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１２．５ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び２０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
３．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
４．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、２０．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３５．０ｍｇ／ｍｌスクロース
５．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び２０．０ｍｇ／ｍｌスクロース（上記で考察した製剤ＶＩと同じ）
６．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１２．５ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３５．０ｍｇ／ｍｌスクロース
７．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、２０．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び２０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
８．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３５．０ｍｇ／ｍｌスクロース
９．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１２．５ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１０．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、２０．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１１．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、２０．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び２０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１２．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１２．５ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３５．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１３．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、２０．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び４０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１４．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び２０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１５．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１２．５ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３５．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１６．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び４０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１７．  （陽性対照）スクロース及びゼラチンを含む１５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＳＧ）１５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％スクロース、１％ゼラチン、及び０．９％塩化ナトリウム。１５．０ｍＭ及び１５０．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳは、アルファウイルスの安定化に関する挙動が同様であることが示された。
【００７７】
【表３】
2019513138.tif 000005
【００７８】
これらの組成物で製剤化した弱毒生アルファウイルス試料を保管した。１製剤当たり１５個の試料を、４℃、２５℃、又は４０℃で保管した。試料製剤は、表３に示されている時点で効力評価を試験した。例示的な結果は、図１０〜１２に例示されている。４℃及び２５℃でインキュベートした試料（図１１〜１２）を、４０℃でインキュベートした試料（図１０）と並行して分析した。それぞれ１２及び６週間を超える期間にわたって力価が残存する傾向があることが示された。
【００７９】
実施例５
液体及び凍結乾燥製剤
別の例示的な方法では、凍結乾燥された弱毒生アルファウイルス（例えば、ＣＨＩＫ）の安定性を評価した。０週目に、組成物１〜１６全てを、生理学的特徴について分析した。それらは、３よりも高いケーキ外観スコアを示し、約０．４６％〜約１．４６％の残留水分パーセントを示した（データ非表示）。
【００８０】
これらの製剤の幾つかは、０週目の凍結乾燥時に、より高い残存力価を示した（図８）。これらの製剤の幾つかは、凍結−解凍サイクル時に、より高い残存力価を示した（図９）。他の実験では、凍結乾燥したワクチン製剤１〜１６を、４０℃（図１０）、２５℃（図１１）、又は４℃（図１２）で保管し、種々の温度での全体的な力価損失を評価した。指定の時点で採取した試料を再構成し、指示薬を使用してベロ細胞で滴定し、ＴＣＩＤ５０を算出した。陽性対照１７と比較して、この試験群の例示的な生アルファウイルス（例えば、弱毒生ＣＨＩＫ）製剤１、３、９、及び１０は、４０℃で最大少なくとも６週間にわたって安定であり、回復率は＞４５％であったことが見出されたが、他の製剤２、５、７、１１、１２、１３、１４は、室温、約４０℃で保管した場合、１、３、９、１０、及び対照製剤１７と比較して、少なくとも６週目までに回復率の低減を示した（図１０）。陽性対照製剤１７と比較して、製剤１、３、９、及び１５は、約２５℃で保管した場合、少なくとも１２週間にわたって安定していたが、製剤５、１１、及び１３は、２５℃で約８〜１２週間後に、著しい力価損失を示した（図１１）。２５℃でのこの同様な損失にも関わらず、試験した製剤（１〜１６）は全て、約４℃の冷蔵温度で保管した場合、１２週間を超える期間にわたって、ウイルス力価の損失が最小限であった（図１２）。
【００８１】
図１３は、上述の安定性試験中の力価損失を例示するヒストグラムプロットである。製剤は全て、約４℃の冷蔵温度で少なくとも１２週目まで、生アルファウイルスの安定的力価を維持したことが観察された。室温、およそ４０℃では、製剤２、５、７、１１、１２、１３、及び１４は、約６週目までに著しい損失を示した。製剤１、３、９、１０、及び１５は、製剤５（上記の実施例１の製剤６と同じ）と比較して、室温、約４０℃で６週間を超える長期間にわたって、安定性の増強を示した。
【００８２】
図１４は、種々の製剤を使用して、例示的な生アルファウイルスの製剤に望ましい特性を予測した実験のデータを例示するアウトプットを表す。このデータは、ある炭水化物作用剤を高濃度で有し、あるアミノ酸を低濃度で有する製剤が、約４０℃の室温で数週間にわたって安定性の向上を示したことを支持している。したがって、これらの特定された製剤を、輸送、配送、及び最終的には対象への投与中の生アルファウイルスの安定性を増強するために使用することができる。加えて、これらの例示的な製剤は、レシピエントにおける有害な免疫効果及び他の効果を低減することができるヒト又は動物タンパク質作用剤を含んでいない。
【００８３】
実施例６
ヒト及び動物タンパク質作用剤を欠如する安定化製剤
他の例示的な方法では、４０℃、２５℃、及び４℃での長期安定性実験を実施して、生アルファウイルス安定性に対する、様々な濃度の炭水化物（例えば、スクロース及びマンニトール）及びアミノ酸（例えば、ヒスチジン）の効果を分析した。例えば、１つ又は複数の炭水化物及び１つ又は複数のアミノ酸を有する製剤は、ＣＨＩＫ安定性に肯定的な効果を示した（上記を参照）という観察に基づき、弱毒生ＣＨＩＫを使用した。上記で提示した製剤ＶＩを基本製剤として使用して、様々な濃度のスクロース、マンニトール、及びヒスチジンを有する製剤を、ｐＨ７．２＋／−０．２の１５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファで製剤化した。更に、マンニトール、ヒスチジン、及びスクロースの組成物を含むこれらの目標作用剤の展開は、上記の１７試料試験での観察に基づいていた。マンニトール、スクロース、ヒスチジン、及びＨＥＰＥＳは、１７製剤試験におけるこれらの性能や非動物由来であることに基づき、組み合わせて選択した。この１０製剤のグループにおいてマンニトール及びスクロースについて選択した目標濃度は、以前の実験で生成されたデータを使用した統計的予想に基づいていた。
【００８４】
例示的な製剤：
１．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
２．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
３．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び３０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
４．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
５．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び７０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
６．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び２１．７２ｍｇ／ｍｌスクロース
７．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０．８６ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
８．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び７８．２８ｍｇ／ｍｌスクロース
９．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５．０ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び７０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
１０．  １５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３９．１４ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．０ｍｇ／ｍｌヒスチジン、及び５０．０ｍｇ／ｍｌスクロース
【００８５】
【表４】
2019513138.tif 000006
【００８６】
実施例７
液体及び凍結乾燥製剤
これらの組成物で製剤化した弱毒生アルファウイルス試料を保管した。この試験では、上記の１７試料試験に基づく種々の製剤中での弱毒生チクングニヤウイルス安定性を分析した。上記試験の試料１７を、陽性対照として選択した。１製剤当たり１５個の試料を、４℃、２５℃、又は４０℃で保管した。試料製剤は、表４に示されている時点で効力評価を試験した。例示的な結果は、図１６〜２０に例示されている。４℃及び２５℃でインキュベートした試料（それぞれ図１９及び１８）を、４０℃でインキュベートした試料（図１７）と並行して分析した。６〜１２週間の期間にわたって力価が保持される傾向があることが示された。
【００８７】
実施例８
別の例示的な方法では、凍結乾燥した弱毒生アルファウイルス（例えば、ＣＨＩＫ）の安定性を評価した。０週目に、組成物１〜１０全てを、生理学的特徴について分析した。それらは、３よりも高いケーキ外観スコアを示し、＜０．５％の残留水分パーセントを示した（データ非表示）。２５ｍｇ／ｍｌマンニトール及び５０ｍｇ／ｍＬスクロースを含む中間点製剤（この試験では、Ｒｘ１及び４）は、ケーキ美観による陽性物理基準を満たしつつ、輸送中の安定性の限界温度である２５℃及び４０℃の両方において、製剤の中でもより高い安定性を依然として達成した。１つの例では、これらの試料は、より信頼できる統計データを生成するために、実験計画の賦形剤濃度中間点付近では重複して調製した。
【００８８】
これらの製剤の幾つかは、０週目の凍結乾燥時に、より高い残存力価を示した（図１６）。例えば、１、４、５、８、及び９は、液体形態でより高い力価を示した。一方、処方５及び８は、凍結乾燥状態でより高い力価を示した（図１６）。これらの製剤の幾つかは、凍結−解凍サイクル時に、より高い残存力価を示した（データ非表示）。他の実験では、凍結乾燥したワクチン製剤１〜１０を、４０℃（図１７）、２５℃（図１８）、又は４℃（図１９）で保管し、種々の温度で指定の期間にわたって全体的な力価損失を評価した。指定の時点で採取した試料を再構成し、指示薬を使用してベロ細胞で滴定し、ＴＣＩＤ５０を算出した。この試験群の例示的な生アルファウイルス（例えば、弱毒生ＣＨＩＫ）製剤１、３、４、５、８、９、及び１０は、４０℃で最大少なくとも６週間にわたって安定であり、回復率は＞６０％であったことが見出されたが、他の製剤２、６、及び７は、約４０℃の室温で保管した場合、製剤１、３、４、５、８、９、及び１０と比較して、少なくとも６週間までに回復率のわずかな低下を示した（図１７）。試験した処方は全て、この期間にわたって約４０℃の室温に曝露された少なくとも６週間後に少なくとも５０％の回復率を示した。これは、当技術分野の他の製剤及び本明細書で試験した他の製剤と比べて著しい向上である。
【００８９】
製剤１、２、４、５、８、及び１０は、約２５℃で保管した場合、少なくとも１２週間は少なくとも８０％の回復率を示したが、製剤３、６、７、９、及び１３は、２５℃で約８〜１２週間後の他の試験した製剤と比較して、わずかな力価損失を示した（図１８）。２５℃でのこの同様な損失にも関わらず、試験した製剤（１〜１０）は全て、約２５℃で保管した場合、少なくとも１２週間は、少なくとも７０％の回復率を示した（図１８）。試験した製剤（１〜１０）は全て、約４℃の冷蔵温度で少なくとも１２週間にわたって保管した場合、ほんのわずかな損失しか示さず、９０％を超える回復率を示した（図１９）。
【００９０】
図２０は、上述の安定性試験中の力価損失を例示するヒストグラムプロットである。製剤は全て、約４℃の冷蔵温度で少なくとも１２週目まで、生アルファウイルスの安定的力価を維持したことが観察された。室温、およそ４０℃では、製剤２、３、６、及び７は、約６週目までに著しい損失を示した。製剤１、８、及び９は、製剤２と比較して、室温、約４０℃で６週間を超える長期間にわたって、安定性の増強を示した。
【００９１】
【表５】
2019513138.tif 000007
【００９２】
材料及び方法
所定用量のＣＨＩＫ−ＩＲＥＳワクチン（ｐｒｅ−ＭＶＳ及びマスターウイルスシード）の個々のアリコートを、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢ）、スクロースを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、スクロース及びゼラチンを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＳＧ）を含むバッファを含む組成物で製剤化した。製剤化した水和又は液体ワクチンを、室温２５℃及び４０℃並びに冷蔵温度４℃等のある温度でインキュベートした。これらの製剤から所定の間隔でアリコートを取り出し、例えばベロ細胞を有する９６ウェルプレートで、ＴＣＩＤ５０により感染性アルファウイルスの存在を滴定した。
【００９３】
細胞株及び組織培養
これらの実験を実施するために、本出願人のｃＧＭＰ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋに由来する研究等級ベロ細胞バンクを用意した。ベロ細胞：Ｖｅｒｏ（ＷＨＯ）Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ継代：１４２（ロット＃ＩＮＶ−ＶＥＲＯ−ＷＣＢ−００１；５×１０６）を得、液体窒素に保管した。バイアルを水浴で急速解凍し、ペニシリン−ストレプトマイシン、４０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１０％ＦＢＳを含む、予め加温した約１９ミリリットルのｃＤＭＥＭ（ダルベッコ改変最少必須培地）に、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中で直接播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞をコンフルエントまで増殖させ、ＰＢＳ、トリプシン（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）、例えば、カタログ＃ＳＨ３００４２．０１）、及びｃＤＭＥＭ−１０を使用して継代培養した。このフラスコを２つのＴ−１８５ｃｍ２フラスコに増やし、細胞が１００％コンフルエントに達するまで増殖させた。細胞をトリプシン処理で回収し、８００×ｇで１０分間遠心分離し、２０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに、１×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。
【００９４】
ベロを、ペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含むダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ）で増殖させ維持した。トリプシンを使用して細胞を維持した。ウイルス吸着の２日前に、９６ウェルプレートを、１ウェル当たり１００ｕＬのＤＭＥＭ−ＦＢＳ−１０％に１．４×１０５細胞／ｍＬでプレーティングした。インキュベーターを毎日モニタリングして、指定の温度を維持した。ウイルス希釈、吸着、及びＴＣＩＤ５０アッセイは、ｃＤＭＥＭ−ＦＢＳ  ２％で実施した。
【００９５】
ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳ：弱毒生アルファウイルス
記載されている種々の方法で使用される弱毒生ＣＨＩＫウイルスの分子生成物を、ＣＨＩＫ−００２（以前に記載されている）と称する。ＣＨＩＫ−００２を、ＩＲＥＳ挿入により生成し、ベロ細胞で増殖させた。プレマスターウイルスシードストックを、１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬの濃度でこれらの実験に使用した。簡潔に述べると、ＣＨＩＫ  Ｐｒｅ−ＭＶＳは、ベロ細胞の単層の感染後に生成された。ＣＨＩＫ−ウイルスは上清に分泌される。清澄化／死ベロ細胞除去後にウイルスを培地から回収する。ＣＨＩＫ−ｐｒｅ−ＭＶＳを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで安定化させ、−８０℃で保管した。
【００９６】
アッセイ方法
ＴＣＩＤ５０アッセイ法を使用して、ウイルス含有調製物中の存在する感染性ウイルスの量（効力又は安定性）を定量化した。ＴＣＩＤ５０は、９６ウェルプレートの感染ウェルの一連の重複試料の半分が、例えば、ＣＰＥ（細胞変性効果）により明らかなウイルス感染の徴候を示す、ウイルスの希釈レベルであると定義される。ベロ細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含むダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ）で増殖させ維持した。製剤化した試料のアリコートを、水浴で急速解凍し、混合した。ｐｒｅ−ＭＶＳの作業濃度への初期稀釈を実施し、これらの試料の１０倍系列稀釈を、例えば、９６ウェルプレートのｃＤＭＥＭ−２％ＦＢＳで製作した。希釈したウイルスを、ベロ細胞単層の接種前に４℃で維持した。アッセイ時には、増殖培地を９６ウェルプレートから吸引し、１００μＬの各ウイルス希釈物をウェルに添加した。プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で３〜５日間インキュベートした。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を使用して力価を算出した。
【００９７】
ワクチン製剤
安定性実験は、研究等級のワクチン調製物を含むワクチン、及び自前のＣＨＩＫ−ＩＲＥＳ  ｐＭＶＳを用いて準備した。本明細書で提供されている種々の組成物を使用した賦形剤のスクリーニング及び安定性試験では、アルファウイルス製剤を、１試料当たり１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルスを含む５００μＬの最終容積に調製した。試料を、指定のバッファ／製剤でバルク調製し、試験を始める前に、初期力価の基準としてインプット試料を採取した。試料をＭＣＴに等分し、指定の時間及び温度で保管した。４つの製剤の各々を、１試料当たり１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルスを有する最終５００μＬに調製した。１製剤当たり６０個の試料をバルクで調製し、５００ｕＬを含む１．５ｍＬ  ＭＣＴに等分する前に、インプット試料を採取した。
【００９８】
製剤化された免疫原性構築体の保管
免疫原性ウイルス製剤を、４℃（マイクロ人工気候室；モデル＃ＭＣＢ−１２−３３−３３−Ｈ／ＡＣ）及び−８０℃（ＲＥＶＣＯ  Ｅｌｉｔｅ  Ｐｌｕｓ；モデル＃ＵＬＴ２１８６−６−Ｄ４３）で保管した。両システムを、Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｗｉｚａｒｄ２−９００ＭＨＺ自動記録装置（４℃ではモデル＃ＷＴ−２２０及び−８０℃ではＷＴ−２４０）でモニタリングした。
【００９９】
本明細書で開示及び特許請求された組成物及び方法は全て、本開示に照らして、過度な実験作業を行わずに製作及び実施することができる。組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点で記載されているが、当業者であれば、本明細書の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに、本明細書に記載されている組成物及び方法並びに方法のステップ又はステップの順序に変更を加えることができることは明白である。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある作用剤を、本明細書に記載されている作用剤の代わりに使用することができ、その場合も同じ又は同様の結果が達成されるであろう。当業者に明白なそのような類似の代用品及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により定義されている趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【図１】
2019513138.tif 000008
【図２】
2019513138.tif 000009
【図３】
2019513138.tif 000010
【図４】
2019513138.tif 000011
【図５】
2019513138.tif 000012
【図６】
2019513138.tif 000013
【図７】
2019513138.tif 000014
【図８】
2019513138.tif 000015
【図９】
2019513138.tif 000016
【図１０】
2019513138.tif 000017
【図１１】
2019513138.tif 000018
【図１２】
2019513138.tif 000019
【図１３】
2019513138.tif 000020
【図１４】
2019513138.tif 000021
【図１５】
2019513138.tif 000022
【図１６】
2019513138.tif 000023
【図１７】
2019513138.tif 000024
【図１８】
2019513138.tif 000025
【図１９】
2019513138.tif 000026
【図２０】
2019513138.tif 000027
【国際調査報告】
2019513138.tif 000028
2019513138.tif 000029
2019513138.tif 000030