(57)【要約】コントラストを増進する、および／または焦点を見出すために、干渉縞の使用を伴う透過照明撮像のシステムおよびそのための方法。例示的方法では、光のコヒーレンスが、光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流で低減され得る。サンプルは、低減されたコヒーレンスの光を用いて照射され得る。サンプルの画像が、検出され得、画像は、サンプルによって画定された平面を通過した低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成される。画像検出が、画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されたサンプルを用いて実施され得る。光のコヒーレンスを低減させるステップは、干渉縞を減衰させ得る。
2019536085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過照明撮像の方法であって、前記方法は、
光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流の前記光のコヒーレンスを低減させることと、
前記低減されたコヒーレンスの光を用いて前記サンプルを照射することと、
前記サンプルによって画定された平面を通過した前記低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成された前記サンプルの画像を検出することと
を含み、
前記検出するステップは、前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦された前記サンプルを用いて実施され、
前記低減させるステップは、前記干渉縞の強度を減少させる、方法。
【請求項２】
光源を用いて前記光の少なくとも一部を発生させるステップをさらに含み、前記低減させるステップは、少なくとも部分的に、前記光源と前記サンプルとの間の光学経路内に配置された拡散器を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光のビームを形成するステップと、
前記光のビームを前記拡散器の上流でビームの対に分割するステップであって、前記ビームの対の１つのビームのみが、前記拡散器上に入射する、ステップと、
前記ビームの対を前記拡散器の下流かつ前記サンプルの上流で相互と組み合わせるステップと
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記低減させるステップは、相互に異なるコヒーレンスを有する光ビームの対を組み合わせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光ビームの対は、少なくとも２つの光源によって発生される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記光ビームの対は、同一の光源からの光を使用して発生される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
撮像検出器を使用して、前記サンプルの複数の画像を収集するステップであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置されている、ステップと、
前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、
前記コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定するステップと、
前記サンプルが前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、前記判定された焦点位置に基づいて前記画像検出器上の前記サンプルの焦点を調節するステップと
をさらに含み、
前記検出するステップは、前記調節された焦点を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記焦点を調節するステップは、前記焦点を前記局所コントラスト最大値に調節するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の画像を収集するステップは、前記サンプルが定常のままである間に前記対物レンズを移動させ、前記対応する複数の異なる焦点位置のそれぞれを生み出すステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記光は、少なくとも１つの固体光源を用いて発生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出された画像に基づいて、前記サンプルの側面を列挙するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
その分解能が低減されるように前記画像を処理するステップをさらに含み、前記列挙するステップは、前記処理された画像に基づく、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記干渉縞は、一次の縞と、より高次の縞とを含み、前記画像を処理するステップは、前記一次の縞に対して前記より高次の縞を選択的に排除する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記画像を処理するステップは、前記画像を周波数領域に変換するステップと、前記変換された画像からより高い周波数情報を除去するステップと、前記変換された画像を前記周波数領域から空間領域に逆変換するステップとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記処理された画像をセグメント化するステップをさらに含み、前記列挙するステップは、前記セグメント化された画像に基づく、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルは、生物学的細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
撮像検出器を使用して、前記サンプルの複数の画像を収集するステップであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置され、前記収集するステップは、画像を検出するステップを含む、ステップと、
前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、
前記１つの画像のコントラストに基づいて、前記画像のうちの１つを選択するステップと、
前記選択された画像に基づいて、前記サンプルの側面を列挙するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
透過照明撮像のためのシステムであって、
少なくとも部分的にコヒーレントである光を発生させるための光源と、
サンプルを支持するためのステージと、
前記光源と前記ステージとの間の光学経路内に動作可能に配置された拡散器であって、前記拡散器は、前記光源によって発生された光を散乱させ、混合することによって、前記サンプル上に入射する光のコヒーレンスを低減させるように構成されている、拡散器と、
前記サンプルによって画定された平面を通過した光を収集するための対物レンズと、
前記ステージと前記対物レンズとの間の距離を調節するための合焦機構と、
前記対物レンズから受光された光を検出するように構成された撮像検出器と、
干渉縞が前記撮像検出器によって収集された画像内に形成されるように、前記合焦機構に前記サンプルを十分に非合焦させるように構成されている、プロセッサと
を備え、
前記拡散器は、前記干渉縞の形成を減少させるが、完全には排除しないように構成されている、システム。
【請求項２０】
前記プロセッサは、前記画像の分解能を低減させることと、前記低減された分解能の画像をセグメント化することと、前記セグメント化された画像を使用して前記サンプルの側面を列挙することとを行うように構成されている、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記プロセッサは、前記撮像検出器に複数の画像を収集させることであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置されている、ことと、前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算することと、前記コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定することと、前記サンプルが前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、前記判定された焦点位置に基づいて前記画像検出器上の前記サンプルの焦点を調節することとを行うように構成されている、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
撮像システムを合焦させる方法であって、前記方法は、
サンプルの１つ以上の画像を検出することであって、前記画像は、干渉縞を含有し、撮像検出器を用いて検出される、ことと、
前記１つ以上の画像のそれぞれを周波数領域に変換することと、
各変換された画像から１つ以上の値を判定することと、
各変換された画像からの前記１つ以上の値に基づいて、前記撮像検出器上の前記サンプルの焦点を調節することと、
前記調節された焦点における前記サンプルの画像を検出することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連技術）
本出願は、２０１６年１０月２６日に出願された米国出願第１５／３３５，０３２号に対して優先権を主張する。上記文献の内容は、その全体として参照することによって本明細書において援用される。
【０００２】
（導入）
平面基板上に支持される生物学的細胞の層が、撮像顕微鏡を用いて可視化されることができる。顕微鏡は、光が細胞を通して撮像検出器に透過される、透過照明撮像を実施するように設計され得る。細胞は、それらが撮像される前に染色される、または染色されないままであり得る。
【０００３】
細胞を染色することは、それらをはるかに検出しやすくし、より良好な画像品質をもたらすことができる。しかしながら、殆どの染料は、細胞が固定される、したがって、死滅されることを要求し、細胞生存能力が重要であるとき、これらの染料を不適切にする。生細胞のための生体染料が、開発されているが、限定された有用性を保有し、生体染料は、生細胞の中の死細胞のみを選択的に染色する、または細胞生理機能を修正する。
【０００４】
染色されていない生細胞を撮像することが、多くの場合、好ましい。細胞は、細胞の状態およびそれらの培地の組成が、あるとしても最小限にしか影響を受けないように直接撮像されることができる。しかしながら、染色されていないと、細胞は、細胞の境界線およびその中の細胞小器官を検出することが困難であり、背景との不良なコントラストを呈し、細胞およびその中の特徴を不明瞭にし得る。故に、細胞の画像を電子的に処理することは、画像内に存在する細胞の数等の細胞パラメータに関する不正確な値を産出し得る。光学技法（例えば、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト（Ｎｏｍａｒｓｋｉ））が、コントラストを改良するために撮像顕微鏡によって活用され得るが、これらの技法は、光学設計の費用および複雑性を実質的に増加させる。染色されていない細胞を撮像することに対する他のアプローチが、必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要約）
本開示は、コントラストを増進する、および／または焦点を見出すために、干渉縞の使用を伴う透過照明撮像のシステムおよびそのための方法を提供する。例示的方法では、光のコヒーレンスが、光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流で低減され得る。サンプルは、低減されたコヒーレンスの光を用いて照射され得る。サンプルの画像が、検出され得、画像は、サンプルによって画定された平面を通過した低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成される。画像検出が、画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されたサンプルを用いて実施され得る。光のコヒーレンスを低減させるステップは、干渉縞を減衰させ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、局所コントラスト最大値における細胞の焦点を伴い、いかなる可視である干渉縞も伴わない、インコヒーレント光を用いて照射される生物学的細胞の不鮮明画像を検出する透過照明撮像システムの概略図である。
【図２】図２は、局所コントラスト最大値における細胞の焦点を伴い、過剰な数の可視である干渉縞を伴い、細胞が少なくとも部分的にコヒーレントである光を用いて照射されることを除いて、図１のように生物学的細胞の画像を検出する別の透過照明撮像システムの概略図である。
【図３】図３は、本開示の側面による、画像の品質が改良されるように、局所コントラスト最大値における細胞の焦点を伴い、図１および２の中間の数の可視である干渉縞を伴い、細胞が図１および２の中間のコヒーレンスのレベルを有する光を用いて照射されることを除いて、図１および２のように生物学的細胞の画像を検出する例示的透過照明撮像システムの概略図である。
【図４】図４は、本開示の側面による、照射光が２つの光源によって生み出されることを除いて、図３のように図１および２の中間のコヒーレンスのレベルを有する光を用いて照射される細胞を伴い、図３のように生物学的細胞の改良された画像を検出する透過照明撮像システムの概略図である。
【図５】図５は、本開示の側面による、２つの光源が異なるコヒーレンスの光を発生させることを除いて、図４のように生物学的細胞の改良された画像を検出する透過照明撮像システムの概略図である。
【図６】図６は、本開示の側面による、照射光が細胞の上流で２つのビームに分割されないことを除いて、図３のように生物学的細胞の改良された画像を検出する透過照明撮像システムの概略図である。
【図７】図７は、本開示の側面による、透過照明撮像の方法の例示的ステップを列挙するフローチャートである。
【図８】図８は、本開示の透過照明撮像システムのための焦点メトリック（すなわち、コントラスト）と焦点位置との間の例示的関係を図示するグラフである。
【図９】図９は、本開示の側面による、図３の構成を有する例示的透過照明撮像システムのより詳細な概略図である。
【図１０】図１０および１１は、本開示の側面による、より低い開口数の照射（図１０）およびより高い開口数の照射（図１１）に関する光学経路が示される、図６の透過照明撮像システムのための例示的照明サブシステムのより詳細な概略図である。
【図１１】図１０および１１は、本開示の側面による、より低い開口数の照射（図１０）およびより高い開口数の照射（図１１）に関する光学経路が示される、図６の透過照明撮像システムのための例示的照明サブシステムのより詳細な概略図である。
【図１２】図１２は、本開示の側面による、透過照明撮像システムを合焦させる方法の例示的ステップを列挙するフローチャートである。
【図１３】図１３および１４は、生物学的細胞がインコヒーレント光のみを用いて照射される（図１３）、またはインコヒーレント光および部分的にコヒーレントな光の配合物を用いて照射される（図１４）、図９の撮像システムの作業モデルを用いて検出される生物学的細胞の同一の視野の画像である。
【図１４】図１３および１４は、生物学的細胞がインコヒーレント光のみを用いて照射される（図１３）、またはインコヒーレント光および部分的にコヒーレントな光の配合物を用いて照射される（図１４）、図９の撮像システムの作業モデルを用いて検出される生物学的細胞の同一の視野の画像である。
【図１５】図１５および１６は、本開示の側面による、撮像システムが図１０の照明サブシステムを具備し、干渉縞が減衰されないように拡散器が除去される、図６の撮像システムの作業モデルを用いて検出される生物学的細胞の単層の個別のより低い倍率の画像およびより高い倍率の画像である。
【図１６】図１５および１６は、本開示の側面による、撮像システムが図１０の照明サブシステムを具備し、干渉縞が減衰されないように拡散器が除去される、図６の撮像システムの作業モデルを用いて検出される生物学的細胞の単層の個別のより低い倍率の画像およびより高い倍率の画像である。
【図１７】図１７および１８は、照明サブシステムの拡散器が光学経路内に動作可能に位置したままであることを除いて、図１６と同一の作業モデル、照射光学経路、および倍率を用いて検出される生物学的細胞の単層の画像である。
【図１８】図１７および１８は、照明サブシステムの拡散器が光学経路内に動作可能に位置したままであることを除いて、図１６と同一の作業モデル、照射光学経路、および倍率を用いて検出される生物学的細胞の単層の画像である。
【図１９】図１９は、より低い倍率にあることを除いて、図１７および１８のように検出される生物学的細胞の別の画像である。
【図２０】図２０は、より高次の（高周波数）干渉縞が選択的に除去されている、図１９の画像の処理された形態である。
【図２１】図２１は、本開示の側面による、各画像が高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムを使用して周波数領域に変換された後、異なる焦点位置において検出される生物学的細胞の同一の視野の一連の画像である。
【図２２】図２２は、図２１の各画像の対応する領域からのピクセルデータをプロットすることによって発生されるグラフである。
【図２３】図２３は、図２２のグラフによって定義され、焦点位置の関数としてプロットされる２つの異なるパラメータのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
本開示は、コントラストを増進する、および／または焦点を見出すために、干渉縞の使用を伴う透過照明撮像のシステムおよびそのための方法を提供する。例示的方法では、光のコヒーレンスが、光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流で低減され得る。サンプルは、低減されたコヒーレンスの光を用いて照射され得る。サンプルの画像が、検出され得、画像は、サンプルによって画定された平面を通過した低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成される。画像検出が、画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されたサンプルを用いて実施され得る。光のコヒーレンスを低減させるステップは、干渉縞を減衰させ得る。
【０００８】
透過照明撮像のためのシステムが、提供される。本システムは、少なくとも部分的にコヒーレントである光を発生させるための光源と、サンプルを支持するためのステージとを備えてもよい。本システムはまた、拡散器と、対物レンズと、合焦機構と、撮像検出器と、プロセッサとを備えてもよい。拡散器は、光源とステージとの間の光学経路内に動作可能に配置されてもよく、光源によって発生された光を散乱させ、混合することによって、サンプル上に入射する光のコヒーレンスを低減させるように構成されてもよい。対物レンズは、サンプルによって画定された平面を通過した光を収集するように構成されてもよい。合焦機構は、ステージと対物レンズとの間の距離を調節するように構成されてもよい。撮像検出器は、対物レンズから受光された光を検出するように構成されてもよい。プロセッサは、干渉縞が撮像検出器によって収集された画像内に形成されるように、合焦機構にサンプルを十分に非合焦させるように構成されてもよい。拡散器はまた、干渉縞の形成を減少させるが、完全には排除しないように構成されてもよい。
【０００９】
撮像システムを合焦させる方法が、提供される。本方法では、サンプルの１つ以上の画像が、検出されてもよい。画像は、干渉縞を含有し、撮像検出器を用いて検出されてもよい。１つ以上の画像のそれぞれは、周波数領域に変換されてもよい。１つ以上の値が、各変換された画像から取得されてもよい。撮像検出器上のサンプルの焦点が、各変換された画像からの１つ以上の値に基づいて調節されてもよい。サンプルの画像が、調節された焦点において検出されてもよい。
【００１０】
本開示のシステムおよび方法は、従来技術に優る種々の利点を提供する。利点は、とりわけ、以下：（ａ）染色されていない生細胞のより鮮明な画像、（ｂ）細胞パラメータのより正確な測定、（ｃ）経済的かつロバストである光学設計、および／または（ｄ）より少ない検出された画像に基づく自動化合焦の任意の組み合わせを含み得る。
【００１１】
本開示のさらなる側面が、以下の節：（Ｉ）減衰された干渉縞を用いた透過照明撮像システム、（ＩＩ）減衰された干渉縞を用いた透過照明撮像の方法、（ＩＩＩ）透過照明撮像のための例示的システム構成、（ＩＶ）変換された画像を使用する自動化合焦を用いた撮像の方法、および（Ｖ）実施例に説明される。
【００１２】
Ｉ．減衰された干渉縞を用いた透過照明撮像システム
本節は、コントラストを増進するために減衰された干渉縞を利用する例示的透過照明撮像システムの概観を提供する（図１−６参照）。図１および２は、図３−６との比較のために提示され、減衰された干渉縞を利用しない。
【００１３】
図１は、撮像検出器５６を用いてサンプル５４（ここでは、生物学的細胞）の画像５２を検出する透過照明撮像システム５０を示す。細胞は、インコヒーレント光源５８によって発生された光を用いて照射される。光は、光源５８から、細胞を通して、検出器５６まで、６０に示される光学経路を辿る。細胞は、オフセットされた位相外れ波形６２によって図式的に示されるインコヒーレント光を用いて照射されるため、細胞の縁および／またはその中の細胞小器官（例えば、細胞核）との相互作用によって生み出される、いかなる光の空間的に区分された干渉も存在しない。故に、細胞は、画像５２内に背景との低いコントラストを有し、眼によって、または画像のデジタル処理を通してのいずれかでも確実に同定することが困難である。
【００１４】
図２は、撮像検出器５６を用いてサンプル５４の画像７２を検出する別の透過照明撮像システム７０を示す。図１の撮像システム５０と対照的に、細胞は、同相波形７６によって図式的に示される、少なくとも部分的にコヒーレントな光源７４によって発生される光を用いて照射される。細胞、特に、その外部および内部特徴（例えば、膜）による光の散乱、屈折、ならびに／もしくは回折は、図１の画像５２に対して画像７２のコントラストを増加させる干渉縞７８をもたらす。しかしながら、干渉縞は、これらの特徴に最も近接する一次の縞だけではなく、また、特徴からより遠く、画像の解釈を複雑にする二次、三次、四次、およびさらに高次の縞も含む。干渉縞は、強め合う干渉および／または弱め合う干渉によって生成され得る。
【００１５】
図３は、干渉縞７８が存在するが、図２の撮像システム７０に対して減衰される、画像８２を検出する例示的透過照明撮像システム８０を示す。サンプル５４の細胞は、図１を上回るコヒーレンスかつ図２を下回るコヒーレンスの光を用いて照射され、より低次の縞よりも弱い、より高次の干渉縞を選択的に排除する。その結果、画像８２は、より鮮明であり、細胞またはその特徴をより正確に同定するためにデジタル的に処理されることができる。
【００１６】
撮像システム８０は、拡散器８４を用いて中間コヒーレンスの光を生成する。部分的にコヒーレントな光源７４によって発生される光のビームが、サンプル５４の細胞の上流で分割される。８６に示される、分割ビームの１つの部分は、少なくとも部分的にコヒーレントなままである。８８に示される、分割ビームの別の部分は、拡散器８４と相互作用し、光のコヒーレンスを低減させる。分割ビームの部分は、細胞において、またはその上流で再結合される。
【００１７】
図４は、図３の撮像システム８０のように、干渉縞７８が存在するが、図２の撮像システム７０に対して減衰される、画像８２を検出する別の例示的透過照明撮像システム９０を示す。図３のように単一の少なくとも部分的にコヒーレントな光源７４からの光のビームを分割するのではなく、撮像システム９０は、少なくとも部分的にコヒーレントな光源の対７４ａ、７４ｂを利用する。光源７４ａからの光は、拡散器８４を迂回する光学経路をサンプル５４の細胞まで辿る一方、光源７４ｂからの光は、拡散器と相互作用する。異なるコヒーレンスの２つのビームは、細胞において、またはその上流で組み合わせられ、中間コヒーレンスのビームを生成する。
【００１８】
図５は、図３の撮像システム８０のように、干渉縞７８が存在するが、図２の撮像システム７０に対して減衰される、画像８２を検出するさらに別の例示的透過照明撮像システム１００を示す。中間コヒーレンスの光ビームが、インコヒーレント光源５８によって発生されたインコヒーレントビームを光源７４によって発生された少なくとも部分的にコヒーレントなビームと組み合わせることによって生み出される。
【００１９】
図６は、図３の撮像システム８０のように、干渉縞７８が存在するが、図２の撮像システム７０に対して減衰される、画像８２を検出するなおも別の例示的透過照明撮像システム１１０を示す。拡散器８４（例えば、図３および４参照）に対して低減された効率の部分的拡散器８４ａが、光源７４とサンプル５４の細胞との間の光学経路内に位置する。拡散器８４ａは、細胞を照射する光のコヒーレンスを低減させるが、完全には排除しない。
【００２０】
ＩＩ．減衰された干渉縞を用いた透過照明撮像の方法
本節は、より高次の縞の可視性を選択的に低減させながら、より低次の縞を用いてコントラストを増進するために、減衰された干渉縞を利用する透過照明撮像の方法を説明する（図７および８参照）。
【００２１】
図７は、例示的撮像方法１２０のフローチャートを示す。図７に提示される、および／または本明細書の別の場所に説明されるステップは、本開示のシステム構成要素および特徴のうちのいずれかを使用して、任意の好適な順序ならびに組み合わせで実施されてもよい。
【００２２】
光が、１２２に示されるように、発生され得る。光は、１つ以上の光源を使用して発生されてもよい。各光源は、とりわけ、エレクトロルミネッセンス、誘導放出、熱放射、および／またはフォトルミネッセンスを含む、任意の好適な機構によって光を発生させてもよい。故に、光源は、固体デバイス、レーザ、アーク灯、または同等物を含んでもよい。例示的固体デバイスは、とりわけ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード、およびレーザダイオード等の半導体光源を含む。光源によって発生される光は、時間的および空間的に、少なくとも部分的にコヒーレントであり得る。光は、とりわけ、少なくとも約５、１０、２５、５０、または１００μｍのコヒーレンス長を有し得る。
【００２３】
発生された光の少なくとも一部の空間的および／または時間的コヒーレンスが、１２４に示されるように、低減され得る。コヒーレンスは、光を散乱させ、混合する任意の光学要素である、少なくとも１つの拡散器を用いて低減されてもよい。各拡散器は、例えば、光を反射する反射性拡散器、それを通して光が通過する透過性拡散器、または同等物であってもよい。例示的拡散器は、サンドブラスト／すりガラス拡散器、ホログラフィック拡散器、乳白ガラス拡散器、または同等物を含む。拡散器は、光を完全にインコヒーレントにし得る、または光のコヒーレンスを低減させるが、完全には排除し得ない。
【００２４】
各拡散器は、光源からサンプルまでの光学経路内の任意の好適な位置に位置してもよい。拡散器は、光源からサンプルまでの光学経路上にのみ、または２つ以上のそのような光学経路のうちの１つの上にのみ位置してもよい。故に、拡散器は、とりわけ、２つ以上の光源のサブセットのみによって発生された光と相互作用し得る、または分割ビームの１つの分岐のみと相互作用し得る。
【００２５】
光の少なくとも一部のコヒーレンスはまた、バンドパスフィルタ用いる等、光をスペクトル的に濾光することによって増加されてもよい。光は、（例えば、光ビームが分割される、または異なるコヒーレンスの２つの光源が使用される場合）拡散器の上流および／または下流で、もしくは拡散器を含有しない光学経路内で濾光されてもよい。
【００２６】
サンプルが、１２６に示されるように、低減されたコヒーレンスの光を用いて照射され得る。サンプルは、任意の好適なアセンブリ、材料、物質、単離物、抽出物、粒子、または同等物を含んでもよい。例えば、サンプルは、撮像される生物学的細胞を含んでもよい。生物学的細胞は、真核細胞または原核細胞であってもよく、生細胞または死細胞（例えば、固定細胞）であってもよい。例示的生物学的細胞は、株細胞系（細胞株）、一次細胞、組織サンプルの細胞、臨床サンプル（例えば、血液サンプル、吸引液体、組織切片等）からの細胞、細菌細胞、または同等物を含む。
【００２７】
サンプルは、少なくとも１つのサンプルまたは空間的に単離されたサンプルの任意のアレイを保持するための任意のデバイスである、サンプル保持器によって保持されてもよい。サンプル保持器は、サンプルの生物学的細胞が静置する、および／または付着され得る、少なくとも１つの水平な上向きに面する表面領域を有する基板を提供してもよい。サンプル保持器は、細胞付着のための１つのみの表面領域または相互から分離される複数の表面領域もしくはコンパートメントを有してもよい。各表面領域は、細胞／組織付着を促すためのコーティングを含んでもよい。コーティングは、例えば、ポリリジン、コラーゲン、または同等物であってもよい。コーティングは、とりわけ、透明プラスチックまたはガラスから形成され得る、サンプル保持器の本体上に位置してもよい。例示的サンプル保持器は、スライド、培養皿、マルチウェル板（例えば、とりわけ、４、６、８、１２、２４、３２、４８、または９６個のウェルを有する）、もしくは同等物を含む。
【００２８】
１２８に示されるように、減衰された干渉縞を含む画像が、検出され得る。（画像「検出」および画像「収集」は、本開示では同義的に使用される。）干渉縞は、とりわけ、拡散器を用いてサンプルの上流の光のコヒーレンスを低減させることによって、異なるコヒーレンスの光ビームを組み合わせることによって、またはそれらの組み合わせによって減衰されてもよい。いくつかの実施形態では、より高次の干渉縞は、下記にさらに説明されるように、画像が収集されるときにまだ選択的に減衰されていない場合があるが、収集後に画像の処理を通して減衰されてもよい。
【００２９】
画像は、検出面積を横断する光の空間的変動（例えば、強度の変動）を検出することが可能な任意のデバイスである、撮像検出器を用いて検出され得る。撮像検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ、アクティブピクセルセンサ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサ、Ｎ型金属酸化膜半導体（ＮＭＯＳ）センサ等）、または同等物等のアレイ検出器であってもよい。撮像検出器は、色画像、グレースケール（モノクロ）画像、または両方を検出するように構成されてもよい。
【００３０】
画像は、干渉縞を生み出すように十分に非合焦されたサンプルを用いて収集され得る。サンプルは、焦点位置（例えば、光軸に沿った相互に対するサンプルおよび対物レンズの位置（すなわち、分離距離））が、局所コントラスト最大値にある、局所コントラスト最小値よりも局所コントラスト最大値に近接する、および／または局所コントラスト最大値ならびに局所コントラスト最小値の中間にある等、局所コントラスト最小値からオフセットされると、非合焦される。これらの変曲点は、図８によって図示される。
【００３１】
図８は、少なくとも部分的にコヒーレントな光を用いてサンプルを照射する撮像システムを用いて収集される透過照明画像に関する焦点位置の関数として、焦点メトリック（コントラスト）をプロットするグラフを示す。同一のサンプルおよび視野に関して検出される画像のコントラストは、焦点位置とともに変動する。より具体的には、コントラストは、局所コントラスト最大値１３０ａ、１３０ｂ等の少なくとも１つの局所最大値と、コントラスト最大値の間に位置する局所コントラスト最小値１３２とを有し得る。異なる焦点位置において測定されるコントラストの変動は、干渉縞の間隔および強度の変化によって生み出され得る。縞の検出可能性は、局所コントラスト最小値における低い点まで局所的に低下し、最大値１３０ａ、１３０ｂに到達するまで、局所コントラスト最小値から両方の焦点方向に増加する。検出可能性は、次いで、焦点位置が局所コントラスト最小値からさらに異なるにつれて、漸進的に減少する。局所コントラスト最小値と各コントラスト最大値との間の距離は、概して、本システムの対物レンズの開口数によって定義される。故に、いったんこれらの距離のうちの少なくとも１つが、本システムの所与の対物レンズに関して（例えば、経験的に、または計算のみによって）判定されると、サンプルおよび視野に関するコントラスト最大値の焦点位置は、そのサンプルおよび視野に関する局所コントラスト最小値の測定された焦点位置に基づいて計算されることができる。
【００３２】
サンプルの１つ以上の画像が、１つ以上の焦点位置において自動的に収集されてもよい。これらの画像の収集は、画像検出ステップ１２８の前に実施されてもよい、または画像の収集は、方法１２０の１つ以上の後続ステップにおいて使用するための十分な品質／コントラストの画像を取得することによって、画像検出ステップ１２８を実施してもよい。より具体的には、１つ以上の画像は、画像のうちのいずれかが、コントラスト閾値を超える、および／または局所コントラスト最大値からオフセットされる閾値未満において検出された場合、方法１２０の後続ステップにおいて使用するための最も高いコントラストの画像を選定するように処理されてもよい。（局所コントラスト最大値の焦点位置、したがって、その最大値からの各画像の焦点位置のオフセットは、１つ以上の画像を使用して判定されてもよい。）代替として、または加えて、１つ以上の画像は、撮像システムが画像検出ステップ１２８の後続実施のために自動的に調節されるべきである焦点位置を判定するように処理されてもよい。
【００３３】
１つ以上の画像は、撮像システムの一連の異なる焦点位置において収集された画像のセットであってもよい。焦点位置は、対物レンズからサンプルまでの距離によって定義されてもよく、例えば、サンプルが定常のままである間に対物レンズを移動させることによって、対物レンズが定常のままである間にサンプルを移動させることによって、またはサンプルおよび対物レンズの両方を差動的に移動させることによって変動されてもよい。焦点位置は、少なくとも１つの局所コントラスト最大値および／または局所コントラスト最小値に及ぶ範囲を網羅し得る。コントラスト等の焦点メトリックの値は、画像から取得され得る。適切に構成される撮像検出器を用いて、焦点位置を変化させることは、サンプルを合焦（および非合焦）させる。異なる焦点位置は、相互から均一に離間され得る。
【００３４】
他の場合では、画像検出ステップ１２８に関する好適な焦点位置は、空間領域から周波数領域に変換された１つ以上の収集された画像に基づいて判定されてもよい。好適な焦点位置（したがって、焦点）を見出すための本アプローチのさらなる側面が、第ＩＶ節における、および第Ｖ節の実施例２における下記等の本明細書の別の場所に説明される。
【００３５】
図７の方法１２０に再び目を向けると、ステップ１２８において検出された画像は、デジタル的に処理されてもよい。より高次の縞等の高周波数空間情報が、画像を簡略化し、さらなる処理を促進するために、画像から選択的に排除されてもよい。本排除は、例えば、ローリングボールアルゴリズムを用いて、画像のフーリエ変換後に、および／または同等物で実施されてもよい。いくつかの実施形態では、画像は、空間領域から周波数領域に変換され、周波数に従ってフィルタ処理され、次いで、空間領域に戻るように変換されてもよい。
【００３６】
画像は、随意に、高周波数縞を選択的に排除するためのデジタル処理後、１３４に示されるように、セグメント化され得る。セグメント化は、複数のセグメント（ピクセルのセット）への画像の任意のパーティション化であり得る。セグメントの少なくともサブセットは、個々の細胞、細胞の群、細胞小器官（例えば、細胞核）、または同等物に対応し得る。
【００３７】
サンプルの側面が、側面に関する値を提供するために、１３６に示されるように、セグメント化された画像を使用して列挙され得る。側面は、例えば、細胞の数、細胞小器官、所与の特性を有する細胞、または同等物であってもよい。
【００３８】
ＩＩＩ．透過照明撮像のための例示的システム構成
本節は、第Ｉ節の透過照明撮像システムのさらなる例示的側面を説明する（図９−１１参照）。本節において説明される構成要素および側面のうちのいずれかは、第Ｉ節の本システムのうちのいずれかに含まれる、または本明細書別の場所に説明され得、本明細書に説明される方法のうちのいずれかの実施において利用され得る。
【００３９】
図９は、図３の透過照明撮像システム８０の例示的なより詳細な構成を示す。撮像システム８０は、とりわけ、ステージ１４０、照明サブシステム１４２、検出サブシステム１４４、および制御／処理サブシステム１４６を含んでもよい。サブシステム１４２、１４４、１４６は、サンプル５４の透過照明撮像を可能にするように協働的に機能する。
【００４０】
ステージ１４０は、サンプル保持器１４８を支持するように構成され、これは、ひいては、１つ以上のサンプル５４を含有する、または別様に保持する。サンプルは、本システムによって（例えば、ステージによって）画定されるｘｙ平面（水平面）に平行であり、随意に、近接し得る、サンプル平面１５２（試料平面とも呼ばれる）の検査領域１５０においてステージ１４０およびサンプル保持器１４８によって支持され得る。ステージは、検査領域１５０の直下に光学的に透明な領域（例えば、開口部）を画定し、サンプル平面１５２の対向する側上に位置する照明および検出サブシステム１４２、１４４を使用して、サンプルの照明および検出を可能にし得る。他の実施形態では、検出サブシステム１４４は、サンプル平面１５２の上方に位置し、照明サブシステム１４２は、サンプル平面の下方に位置してもよい。
【００４１】
光源７４からサンプル５４まで、およびサンプル５４から撮像検出器５６まで個別に進行する光学放射によって辿られる例示的光学経路が、破線矢印を用いて表される。用語「光学放射」および「光」は、本明細書では同義的に使用され、可視放射、紫外線放射、赤外線放射、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００４２】
照明サブシステム１４２は、１つのみの光源７４を含んでもよい、または（動作可能に関連付けられる光学系の随意の補助によって）サンプル５４を照射するための複数の光源を含む源アセンブリを含んでもよい。用語「照射する」および「照明する」ならびにそれらの対応する形態は、同一の意味を有し、本開示では同義的に使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上の光源が、同時に、異なるコヒーレンスの光を用いて、検査領域におけるサンプルを照射してもよい（図４および５も参照）。２つ以上の光源は、異なるコヒーレンスの光を発生させてもよい、および／または光源のうちの少なくとも１つからの光のコヒーレンスは、サンプルの上流に位置する１つ以上の光学要素によって修正されてもよい。代替として、または加えて、２つ以上の光源は、スペクトル的に異なる光を用いてサンプルを照射してもよい。２つ以上の光源は、異なるスペクトルを有する光を発生させてもよい、および／または光源のうちの少なくとも１つからの光のスペクトルは、スペクトルフィルタを用いてサンプルの上流で修正されてもよい。
【００４３】
照明サブシステム１４２は、光源７４と検査領域１５０との間の光学経路内に配置される１つ以上の光学要素を含んでもよい。光学要素は、光を収集する、指向する、および／または集束させる、ならびに／もしくは光を少なくとも部分的に遮断する、任意のデバイスまたは構造であってもよい。光学要素は、とりわけ、反射、屈折、散乱、回折、吸収、および／または濾光等の任意の好適な機構によって機能してもよい。例示的光学要素は、レンズ、鏡、拡散器、格子、プリズム、フィルタ、開口、マスク、ビームスプリッタ、透過性繊維（光ファイバ）、および同等物を含む。
【００４４】
照明サブシステム１４２は、ビームスプリッタ１５４を用いて光源７４からの光学放射を部分またはビームの対８６、８８に分割し得る。ビーム８６は、反射性拡散器８４に反射され、これは、ビーム８６の光を散乱させ、混合し、その空間的および時間的コヒーレンスを低減させる。拡散器８４は、ビーム８６の少なくとも一部をビームスプリッタ１５４に反射し、それを通して、ビームの一部が、レンズ１５６、１５８の上流を通過する。ビーム８６は、光学経路上のサンプル５４の上流のレンズを通してサンプルまで通過する。ビーム８６と対照的に、ビーム８８は、ビームスプリッタ１５４およびレンズ１６０を通過し、鏡１６２によってビームスプリッタに戻るように反射される。ビーム８８の一部は、ビームスプリッタ１５４によってレンズ１５６、１５８に反射され、したがって、（低減されたコヒーレンスを伴う）ビーム８６の光をビーム８８の光と組み合わせ、サンプル５４を照射する中間コヒーレンスの組み合わせられたビームを生成する。
【００４５】
検出サブシステム１４４は、撮像検出器５６と、対物レンズ１６４とを含み、対物レンズは、検査領域１５０から検出器までの光学経路内に配置される。対物レンズ１６４は、サンプルからの光を集光し、光を集束させ、検出される画像を生み出す任意の光学要素または光学要素の組み合わせと、任意の関連付けられる支持構造とを含んでもよい。対物レンズは、例えば、単一のレンズ、２つ以上のレンズ、単一の鏡、２つ以上の鏡、および／または同等物を含むことができる。対物レンズ１６４は、とりわけ、少なくとも４倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍等の任意の好適な倍率を提供してもよい。
【００４６】
制御／処理サブシステム１４６は、光源７４および撮像検出器５６等のシステム８０のデバイスの任意の好適な組み合わせと通信してもよい、および／またはその動作を制御してもよい。サブシステム１４６は、撮像検出器５６からの画像データを受信および処理し得、画像検出のタイミング等の撮像検出器の動作を制御し得る、プロセッサ１６６を含んでもよい。プロセッサ１６６はさらに、対物レンズとステージとの間の距離を変化させるために、相互に対して（例えば、ｚ軸に沿って）対物レンズ１６４およびステージ１４０を移動させることによって本システムの焦点を変化させる、合焦機構１６８を制御してもよい。プロセッサはまた、ステージを試料平面１５２に平行な２次元において移動させるステージ駆動機構を制御してもよい。これらの機構のうちの一方または両方の制御は、本システムが、サンプル合焦、複数のサンプルの撮像、および／または同一のサンプルの複数の視野の撮像を自動化することを可能にし得る。
【００４７】
プロセッサ１６６は、コンピュータによって提供されてもよい。コンピュータは、ディスプレイ１７０、ユーザインターフェース１７２、アルゴリズムおよびデータを記憶するためのメモリ、ならびに同等物を含んでもよい。
【００４８】
撮像システムはまた、そのデバイス（例えば、各光源、撮像検出器、プロセッサ、駆動機構等）のそれぞれの動作を駆動するための電源を有する。電力は、例えば、ライン電力、バッテリ電力、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４９】
図１０および１１は、図６の透過照明撮像システム１１０の照明サブシステム１４２のみの例示的なより詳細な構成を示す。照明サブシステムは、個別のより低い開口数の照射（図１０）（より低い開口数を有する対物レンズを用いたより低い倍率の撮像に関する）およびより高い開口数の照射（図１１）（より高い開口数を有する対物レンズを用いたより高い倍率の撮像に関する）のために異なる部分的に重複する光学経路を介してサンプルを照射するために、光源の対７４ａ、７４ｂを有する。
【００５０】
光源７４ａの通電は、透過性拡散器８４ａ−１を通過する少なくとも部分的にコヒーレントな光を生み出し、コヒーレンスを低減させるが、完全には排除しない。光は、次いで、レンズ１８０を通過し、鏡１８２によってビームスプリッタ１８４に反射される。光の一部は、サンプルに到達する前に、ビームスプリッタおよびレンズの対１８６、１８８を通過する。
【００５１】
光源７４ｂの通電は、透過性拡散器の対８４−２および８４ａ−３を通過する少なくとも部分的にコヒーレントな光を生み出し、コヒーレンスを低減させるが、完全には排除しない。拡散器の対は、図１０の光学経路内で利用される単一の拡散器よりもコヒーレンスを低減させ得る。光は、次いで、レンズの対１９０、１９２を通して光学経路を辿り、ビームスプリッタ１８４によって部分的に反射され、サンプルに到達する前にレンズ１８６、１８８を通過する。
【００５２】
ＩＶ．変換された画像を使用する自動化合焦を用いた撮像の方法
本節は、周波数領域において分析される干渉縞に基づく自動化合焦を用いる撮像の例示的方法２００を説明する（図１２参照）。図１２に提示される、および／または本明細書の別の場所に説明されるステップは、本明細書に説明されるシステム構成要素および特徴のうちのいずれかを使用して、任意の好適な順序ならびに組み合わせで実施されてもよい。
【００５３】
サンプルが、２０２に示されるように、照射され得る。サンプルは、第Ｉ節および第ＩＩ節において上記に説明されるように、空間的および時間的に、少なくとも部分的にコヒーレントである光を用いて照射され得る。
【００５４】
サンプルの少なくとも１つの画像が、２０４に示されるように、収集され得る。画像は、干渉縞が画像内に存在するように十分に非合焦されたサンプルを用いて収集され得る。ステップ２０４のための好適な焦点位置または一連の焦点位置は、とりわけ、異なるサンプル（または同一のサンプルに関する異なる視野）を撮像することによって、またはサンプル保持器上の基準マークを検出することによって判定された焦点位置に基づいて選択されてもよい。
【００５５】
各画像は、２０６に示されるように、空間領域から周波数領域に変換され得る。変換は、変換された画像をもたらし、フーリエ変換アルゴリズムによって実施されてもよい。
【００５６】
１つ以上の値が、２０８に示されるように、各変換された画像から取得され得る。１つ以上の値は、変換された画像全体またはその一部のみ（例えば、画像の中心から半径方向に延在する部分）から取得されてもよい。いくつかの実施形態では、値のうちの１つは、変換された画像が画像の中心から周辺まで延在する際のピクセル強度の変化率に対応してもよい。いくつかの実施形態では、値のうちの１つは、変換された画像の中心から半径方向に外向きに離間される第１の局所強度最大値と、中心および第１の局所強度最大値の中間に位置する第１の局所強度最小値との間の強度の差異に対応してもよい。いずれにしても、１つ以上の値は、画像の焦点位置をコントラスト曲線上の特定の場所と相関させ得る（例えば、例示的コントラスト曲線に関して図８参照）。
【００５７】
各値は、２１０に示されるように、試験され、２１２に示されるように、値が少なくとも１つの条件を満たすかどうかを判定し得る。例えば、値は、ある閾値と、または少なくとも１つの他の画像から判定された少なくとも１つの値と比較されてもよい。値が条件を満たさない場合、本システムの焦点は、随意に、値に基づいて、２１４に示されるように、調節され得る。本方法は、次いで、調節された焦点における別の画像の収集のために、ステップ２０４に折り返し得る。代替として、値が条件を満たす場合、画像は、（例えば、図７に関して上記に説明されるように）画像からサンプルの側面を判定するため等、２１６に示されるように、さらなる処理のために選択されてもよい。
【００５８】
他の実施形態では、１つ以上の値は、１つ以上の値に基づいて、画像に関する焦点位置が透過照明撮像のための標的焦点位置と異なる程度を判定するアルゴリズムを用いて処理されてもよい。例えば、標的焦点位置が局所コントラスト最大値１３０ａ（図８参照）に対応する場合、画像焦点位置と標的焦点位置との間の差異は、システム較正後、１つ以上の値に基づいて計算されることができる。本システムは、次いで、相互に対してステージおよび対物レンズを移動させることによって、焦点を標的焦点位置に自動的に調節し得る。方法２００のさらなる側面が、第Ｖ節の実施例２において下記に説明される。
【００５９】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、コントラストを増進する、または焦点を見出すために、干渉縞を利用する透過照明撮像システムおよび方法に関連する本開示の選択された側面ならびに実施形態を説明する。これらのシステムおよび方法の任意の好適な側面は、相互と、および本明細書の別の場所に（例えば、第Ｉ−ＩＶ節に）説明されるシステムならびに方法と組み合わせられ得る。これらの実施例は、例証のために含まれ、本開示の全範囲を限定または定義するように意図されない。
【００６０】
実施例１．生物学的細胞の例示的画像
本実施例は、第ＩＩＩ節の透過照明撮像システムを用いて収集される例示的画像を説明する（図１３−２０参照）（図９−１１も参照）。
【００６１】
図１３および１４は、図９の撮像システム８０の作業モデルを用いて検出される生物学的細胞の同一の視野の画像を示す。図１３の画像は、細胞がインコヒーレント光のみを用いて照射されるように、鏡１６２が除去されて（図９参照）検出された。画像では、細胞は、背景に対して不鮮明である。細胞が相互と接触する、細胞の縁は、不良コントラストに起因して区別することが困難である。図１４の画像は、細胞がインコヒーレント光および部分的にコヒーレントな光の配合物を用いて照射されるように、動作可能に位置する鏡１６２（図９参照）を用いて検出された。画像では、細胞の背景とのコントラストは、図１３よりもはるかに高く、各細胞の境界線は、より明確に描写される。
【００６２】
図１５および１６は、撮像システム１１０（図１０参照）の作業モデルを用いて検出されるＣＨＯ細胞の画像を示すが、拡散器は、干渉縞が減衰されないように除去される。図１５の画像は、より低い倍率を表し、サンプル平面上の透過照明光および板密閉材料投影陰影の回折効果に起因して、非均一性を呈する。対物レンズの開口数制限およびサンプル平面の上方の位置における透過照明光の屈折に起因して、画像の上部において空間分解能の損失が存在する。図１６の画像は、より高い倍率を表す。画像内の物体の周囲の輪が、容易に明白である。特に、サンプル平面からオフセットされる焦点外れの物体が、多数の回折縞とともに可視である。
【００６３】
図１７および１８は、図１６のように撮像システム１１０の作業モデルを用いて検出されるＣＨＯ細胞の画像を示すが、拡散器は、干渉縞が減衰されるが、完全には排除されないように動作可能に位置する。画像品質は、縞減衰がない場合よりも実質的に良好である（図１６と比較）。
【００６４】
図１９は、より低い倍率にあることを除いて、図１７および１８のように撮像システム１１０の作業モデルを用いて検出されるＣＨＯ細胞の別の画像である。低開口数照射を用いて生み出された非合焦画像は、増加された被写界深度を有する。細胞内で可視である明るいスポットは、細胞の細胞核の周囲の優先的な回折、屈折、および散乱に起因する。
【００６５】
図２０は、図１９の画像の処理された形態を示す。１０ピクセル半径のローリングボールアルゴリズムが、適用され、４〜２０ピクセルを適用する高速フーリエ変換バンドパスフィルタが後に続いた。本処理は、画像から高周波数干渉縞を選択的に除去し、したがって、画像の分解能を低減させる。高速フーリエ変換は、空間周波数によって物体を正規化するであろうため、標準的な二値化が、次いで、使用された。細胞は、おおよそのサイズの非合焦細胞核を有する粒子を同定するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してカウントされた。
【００６６】
実施例２．自動化焦点を用いた透過照明撮像システムの較正
本実施例は、周波数領域への画像の変換に基づく自動化合焦機構を有する透過照明撮像システムのための例示的較正データを説明する（図２１−２３参照）。
【００６７】
図２１は、異なる焦点位置において検出される生物学的細胞の同一の視野の一連の周波数画像（回折パターン）を示し、細胞は、干渉縞が形成されるように、少なくとも部分的にコヒーレントな光を用いて照射される。空間画像が、撮像検出器を用いて検出され、次いで、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムを使用して周波数領域における周波数画像に変換された。各画像が検出された焦点位置は、透過照明撮像のための局所コントラスト最小値（０μｍ）に関して列挙される。故に、画像ＡおよびＢは、局所コントラスト最小値からの負の焦点オフセットを用いて収集され、画像Ｃは、局所コントラスト最小値において収集され、画像Ｄは、局所コントラスト最小値からの正の焦点オフセットを用いて収集された。空間画像内の各次数の干渉縞は、回折パターンにおいて中心スポット（ゼロ次）または対応する輪（一次およびより高次）を生成する。
【００６８】
図２２は、図２１の各画像の対応する領域に関する、各画像の中心からのピクセル距離の関数として、正規化された強度をプロットすることによって発生されたグラフを示す。領域は、各画像の中心から延在する半径方向配向長方形２２０によって境界される。
【００６９】
図２３は、図２２のグラフによって定義され、焦点位置の関数としてプロットされる、２つの異なるパラメータの値のグラフを示す。パラメータのうちの一方は、概して、図２２の線２２２によって示される、傾斜である。他方のパラメータは、変曲点の対、すなわち、局所最大値２２４と局所最小値２２６との間のピクセル位置の差異（「ｄｘ」）である。図２３では、傾斜は、干渉縞の検出可能性が局所最小値にある焦点位置（０ミクロン）に関してゼロに最も近接し、その焦点位置から両方の焦点方向においてより負になる。また、ピクセル位置の差異であるｄｘは、その焦点位置において局所最小値を呈し、その焦点位置から両方の焦点方向において増加する。故に、アルゴリズムは、焦点を漸進的に調節する（図１２参照）、変曲点の間の間隔を最小限にする、および／または傾斜を最小限にするように動作し得る。
【００７０】
実施例３．選択された実施形態
本実施例は、一連の索引付き段落として本開示の選択された実施形態を説明する。
【００７１】
段落Ａ１．透過照明撮像の方法であって、方法は、光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流の光のコヒーレンスを低減させることと、低減されたコヒーレンスの光を用いてサンプルを照射することと、サンプルによって画定された平面を通過した低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成されたサンプルの画像を検出することとを含み、検出するステップは、画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されたサンプルを用いて実施され、低減させるステップは、干渉縞の強度を減少させる、方法。
【００７２】
段落Ａ２．光源を用いて光の少なくとも一部を発生させるステップをさらに含み、低減させるステップは、少なくとも部分的に、光源とサンプルとの間の光学経路内に配置された拡散器を使用して実施される、段落Ａ１に記載の方法。
【００７３】
段落Ａ３．低減させるステップは、拡散器を通して光を通過させるステップおよび／または拡散器を用いて光を反射させるステップを含む、段落Ａ２に記載の方法。
【００７４】
段落Ａ４．光のビームを形成するステップと、光のビームを拡散器の上流でビームの対に分割するステップであって、ビームの対の１つのビームのみが、拡散器上に入射する、ステップと、ビームの対を拡散器の下流かつサンプルの上流で相互と組み合わせるステップとをさらに含む、段落Ａ２またはＡ３に記載の方法。
【００７５】
段落Ａ５．低減させるステップは、相互に異なるコヒーレンスを有する光ビームの対を組み合わせるステップを含む、段落Ａ１−Ａ４のいずれかに記載の方法。
【００７６】
段落Ａ６．光ビームの対は、少なくとも２つの光源によって発生される、段落Ａ５に記載の方法。
【００７７】
段落Ａ７．光ビームの対は、同一の光源からの光を使用して発生される、段落Ａ５に記載の方法。
【００７８】
段落Ａ８．撮像検出器を使用して、サンプルの複数の画像を収集するステップであって、サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置される、ステップと、複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定するステップと、サンプルが画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、判定された焦点位置に基づいて画像検出器上のサンプルの焦点を調節するステップとをさらに含み、検出するステップは、調節された焦点を用いて実施される、段落Ａ１−Ａ７のいずれかに記載の方法。
【００７９】
段落Ａ９．焦点を調節するステップは、焦点を局所コントラスト最大値に調節するステップを含む、段落Ａ８に記載の方法。
【００８０】
段落Ａ１０．複数の画像を収集するステップは、サンプルが定常のままである間に対物レンズを移動させ、対応する複数の異なる焦点位置のそれぞれを生み出すステップを含む、段落Ａ８またはＡ９に記載の方法。
【００８１】
段落Ａ１１．光は、少なくとも１つの固体光源を用いて発生される、段落Ａ１−Ａ１０のいずれかに記載の方法。
【００８２】
段落Ａ１２．光は、１つのみの固体光源を用いて発生される、段落Ａ１１に記載の方法。
【００８３】
段落Ａ１３．検出された画像に基づいて、サンプルの側面を列挙するステップをさらに含む、段落Ａ１−Ａ１２のいずれかに記載の方法。
【００８４】
段落Ａ１４．その分解能が低減されるように画像を処理するステップをさらに含み、列挙するステップは、処理された画像に基づく、段落Ａ１３に記載の方法。
【００８５】
段落Ａ１５．干渉縞は、一次の縞と、より高次の縞とを含み、画像を処理するステップは、一次の縞に対してより高次の縞を選択的に排除する、段落Ａ１４に記載の方法。
【００８６】
段落Ａ１６．画像を処理するステップは、画像を周波数領域に変換するステップ、変換された画像からより高い周波数情報を除去するステップ、および変換された画像を周波数領域から空間領域に逆変換するステップを含む、段落Ａ１４またはＡ１５に記載の方法。
【００８７】
段落Ａ１７．処理された画像をセグメント化するステップをさらに含み、列挙するステップは、セグメント化された画像に基づく、段落Ａ１４−Ａ１６のいずれかに記載の方法。
【００８８】
段落Ａ１８．サンプルは、生物学的細胞を含む、段落Ａ１−Ａ１７のいずれかに記載の方法。
【００８９】
段落Ａ１９．撮像検出器を使用して、サンプルの複数の画像を収集するステップであって、サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置され、収集するステップは、検出するステップを含む、ステップと、複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、１つの画像のコントラストに基づいて、画像のうちの１つを選択するステップと、選択された画像に基づいて、サンプルの側面を列挙するステップとをさらに含む、段落Ａ１−Ａ７またはＡ１１−Ａ１８のいずれかに記載の方法。
【００９０】
段落Ｂ１．透過照明撮像のためのシステムであって、少なくとも部分的にコヒーレントである光を発生させるための光源と、サンプルを支持するためのステージと、光源とステージとの間の光学経路内に動作可能に配置される、拡散器であって、拡散器は、光を散乱させ、混合することによって、サンプル上に入射する光のコヒーレンスを低減させるように構成される、拡散器と、サンプルによって画定された平面を通過した光を収集するための対物レンズと、ステージと対物レンズとの間の距離を調節するための合焦機構と、対物レンズから受光された光を検出するように構成される、撮像検出器と、干渉縞が撮像検出器によって収集された画像内に形成されるように、合焦機構にサンプルを十分に非合焦させるように構成される、プロセッサとを備え、拡散器は、干渉縞の形成を減少させるが、完全には排除しないように構成される、システム。
【００９１】
段落Ｂ２．プロセッサは、画像の分解能を低減させ、低減された分解能の画像をセグメント化し、セグメント化された画像を使用してサンプルの側面を列挙するように構成される、段落Ｂ１に記載のシステム。
【００９２】
段落Ｂ３．プロセッサは、（ａ）撮像検出器に複数の画像を収集させることであって、サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置される、ことと、（ｂ）複数の画像のそれぞれのコントラストを計算することと、（ｃ）コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定することと、（ｄ）サンプルが画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、判定された焦点位置に基づいて画像検出器上のサンプルの焦点を調節することとを行うように構成される、段落Ｂ１またはＢ２に記載のシステム。
【００９３】
段落Ｃ１．撮像システムを合焦させる方法であって、方法は、サンプルの１つ以上の画像を検出することであって、画像は、干渉縞を含有し、撮像検出器を用いて検出される、ことと、１つ以上の画像のそれぞれを周波数領域に変換することと、各変換された画像から１つ以上の値を判定することと、各変換された画像からの１つ以上の値に基づいて、撮像検出器上のサンプルの焦点を調節することと、調節された焦点におけるサンプルの画像を検出することとを含む、方法。
【００９４】
段落Ｃ２．変換するステップは、フーリエ変換アルゴリズムを用いて実施される、段落Ｃ１に記載の方法。
【００９５】
段落Ｃ３．１つ以上の値を判定するステップは、各変換された画像の少なくとも一部によって定義される傾斜および／または少なくとも１つの変曲点を判定するステップを含む、段落Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
【００９６】
上記に記載される開示は、独立した有用性を伴う複数の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態において開示されたが、本明細書に開示および例証されるようなその具体的実施形態は、多数の変形例が可能性として考えられるため、限定的意味において考慮されるものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および／または性質の全ての新規かつ非自明な組み合わせならびに副次的組み合わせを含む。以下の請求項は、特に、新規かつ非自明と見なされるある組み合わせおよび副次的組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および／または性質の他の組み合わせならびに副次的組み合わせにおいて具現化される発明は、本願または関連する出願から優先権を主張する出願において請求され得る。異なる発明または同一の発明を対象とするかにかかわらず、および範囲において元々の請求項よりも広い、狭い、それに等しい、またはそれと異なるかにかかわらず、そのような請求項もまた、本開示の発明の主題内に含まれると見なされる。さらに、識別される要素のための第１、第２、または第３等の序数指標は、要素間を区別するために使用され、別様に具体的に記載されない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月25日(2019.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過照明撮像の方法であって、前記方法は、
光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流の前記光のコヒーレンスを低減させることと、
前記低減されたコヒーレンスの光を用いて前記サンプルを照射することと、
前記サンプルによって画定された平面を通過した前記低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成された前記サンプルの画像を検出することと
を含み、
前記検出するステップは、前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦された前記サンプルを用いて実施され、
前記低減させるステップは、前記干渉縞の強度を減少させる、方法。
【請求項２】
光源を用いて前記光の少なくとも一部を発生させるステップをさらに含み、前記低減させるステップは、少なくとも部分的に、前記光源と前記サンプルとの間の光学経路内に配置された拡散器を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低減させるステップは、前記拡散器を通して光を通過させるステップおよび／または前記拡散器を用いて光を反射させるステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
光のビームを形成するステップと、
前記光のビームを前記拡散器の上流でビームの対に分割するステップであって、前記ビームの対の１つのビームのみが、前記拡散器上に入射する、ステップと、
前記ビームの対を前記拡散器の下流かつ前記サンプルの上流で相互と組み合わせるステップと
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記低減させるステップは、相互に異なるコヒーレンスを有する光ビームの対を組み合わせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光ビームの対は、少なくとも２つの光源によって発生される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記光ビームの対は、同一の光源からの光を使用して発生される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
撮像検出器を使用して、前記サンプルの複数の画像を収集するステップであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置されている、ステップと、
前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、
前記コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定するステップと、
前記サンプルが前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、前記判定された焦点位置に基づいて前記画像検出器上の前記サンプルの焦点を調節するステップと
をさらに含み、
前記検出するステップは、前記調節された焦点を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記焦点を調節するステップは、前記焦点を前記局所コントラスト最大値に調節するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の画像を収集するステップは、前記サンプルが定常のままである間に前記対物レンズを移動させ、前記対応する複数の異なる焦点位置のそれぞれを生み出すステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記光は、少なくとも１つの固体光源を用いて発生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出された画像に基づいて、前記サンプルの側面を列挙するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
その分解能が低減されるように前記画像を処理するステップをさらに含み、前記列挙するステップは、前記処理された画像に基づく、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記干渉縞は、一次の縞と、より高次の縞とを含み、前記画像を処理するステップは、前記一次の縞に対して前記より高次の縞を選択的に排除する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記画像を処理するステップは、前記画像を周波数領域に変換するステップと、前記変換された画像からより高い周波数情報を除去するステップと、前記変換された画像を前記周波数領域から空間領域に逆変換するステップとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記処理された画像をセグメント化するステップをさらに含み、前記列挙するステップは、前記セグメント化された画像に基づく、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルは、生物学的細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
撮像検出器を使用して、前記サンプルの複数の画像を収集するステップであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置され、前記収集するステップは、画像を検出するステップを含む、ステップと、
前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、
前記１つの画像のコントラストに基づいて、前記画像のうちの１つを選択するステップと、
前記選択された画像に基づいて、前記サンプルの側面を列挙するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
透過照明撮像のためのシステムであって、
少なくとも部分的にコヒーレントである光を発生させるための光源と、
サンプルを支持するためのステージと、
前記光源と前記ステージとの間の光学経路内に動作可能に配置された拡散器であって、前記拡散器は、前記光源によって発生された光を散乱させ、混合することによって、前記サンプル上に入射する光のコヒーレンスを低減させるように構成されている、拡散器と、
前記サンプルによって画定された平面を通過した光を収集するための対物レンズと、
前記ステージと前記対物レンズとの間の距離を調節するための合焦機構と、
前記対物レンズから受光された光を検出するように構成された撮像検出器と、
干渉縞が前記撮像検出器によって収集された画像内に形成されるように、前記合焦機構に前記サンプルを十分に非合焦させるように構成されている、プロセッサと
を備え、
前記拡散器は、前記干渉縞の形成を減少させるが、完全には排除しないように構成されている、システム。
【請求項２０】
前記プロセッサは、前記画像の分解能を低減させることと、前記低減された分解能の画像をセグメント化することと、前記セグメント化された画像を使用して前記サンプルの側面を列挙することとを行うように構成されている、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記プロセッサは、前記撮像検出器に複数の画像を収集させることであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置されている、ことと、前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算することと、前記コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定することと、前記サンプルが前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、前記判定された焦点位置に基づいて前記画像検出器上の前記サンプルの焦点を調節することとを行うように構成されている、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
撮像システムを合焦させる方法であって、前記方法は、
サンプルの１つ以上の画像を検出することであって、前記画像は、干渉縞を含有し、撮像検出器を用いて検出される、ことと、
前記１つ以上の画像のそれぞれを周波数領域に変換することと、
各変換された画像から１つ以上の値を判定することと、
各変換された画像からの前記１つ以上の値に基づいて、前記撮像検出器上の前記サンプルの焦点を調節することと、
前記調節された焦点における前記サンプルの画像を検出することと
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
（要約）
本開示は、コントラストを増進する、および／または焦点を見出すために、干渉縞の使用を伴う透過照明撮像のシステムおよびそのための方法を提供する。例示的方法では、光のコヒーレンスが、光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流で低減され得る。サンプルは、低減されたコヒーレンスの光を用いて照射され得る。サンプルの画像が、検出され得、画像は、サンプルによって画定された平面を通過した低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成される。画像検出が、画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されたサンプルを用いて実施され得る。光のコヒーレンスを低減させるステップは、干渉縞を減衰させ得る。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
透過照明撮像の方法であって、前記方法は、
光の少なくとも一部を散乱させ、混合することによって、サンプルの上流の前記光のコヒーレンスを低減させることと、
前記低減されたコヒーレンスの光を用いて前記サンプルを照射することと、
前記サンプルによって画定された平面を通過した前記低減されたコヒーレンスの光の少なくとも一部を用いて作成された前記サンプルの画像を検出することと
を含み、
前記検出するステップは、前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦された前記サンプルを用いて実施され、
前記低減させるステップは、前記干渉縞の強度を減少させる、方法。
（項目２）
光源を用いて前記光の少なくとも一部を発生させるステップをさらに含み、前記低減させるステップは、少なくとも部分的に、前記光源と前記サンプルとの間の光学経路内に配置された拡散器を使用して実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
光のビームを形成するステップと、
前記光のビームを前記拡散器の上流でビームの対に分割するステップであって、前記ビームの対の１つのビームのみが、前記拡散器上に入射する、ステップと、
前記ビームの対を前記拡散器の下流かつ前記サンプルの上流で相互と組み合わせるステップと
をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記低減させるステップは、相互に異なるコヒーレンスを有する光ビームの対を組み合わせるステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記光ビームの対は、少なくとも２つの光源によって発生される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記光ビームの対は、同一の光源からの光を使用して発生される、項目５に記載の方法。
（項目８）
撮像検出器を使用して、前記サンプルの複数の画像を収集するステップであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置されている、ステップと、
前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、
前記コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定するステップと、
前記サンプルが前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、前記判定された焦点位置に基づいて前記画像検出器上の前記サンプルの焦点を調節するステップと
をさらに含み、
前記検出するステップは、前記調節された焦点を用いて実施される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記焦点を調節するステップは、前記焦点を前記局所コントラスト最大値に調節するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記複数の画像を収集するステップは、前記サンプルが定常のままである間に前記対物レンズを移動させ、前記対応する複数の異なる焦点位置のそれぞれを生み出すステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記光は、少なくとも１つの固体光源を用いて発生される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記検出された画像に基づいて、前記サンプルの側面を列挙するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
その分解能が低減されるように前記画像を処理するステップをさらに含み、前記列挙するステップは、前記処理された画像に基づく、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記干渉縞は、一次の縞と、より高次の縞とを含み、前記画像を処理するステップは、前記一次の縞に対して前記より高次の縞を選択的に排除する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記画像を処理するステップは、前記画像を周波数領域に変換するステップと、前記変換された画像からより高い周波数情報を除去するステップと、前記変換された画像を前記周波数領域から空間領域に逆変換するステップとを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記処理された画像をセグメント化するステップをさらに含み、前記列挙するステップは、前記セグメント化された画像に基づく、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記サンプルは、生物学的細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
撮像検出器を使用して、前記サンプルの複数の画像を収集するステップであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置され、前記収集するステップは、画像を検出するステップを含む、ステップと、
前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算するステップと、
前記１つの画像のコントラストに基づいて、前記画像のうちの１つを選択するステップと、
前記選択された画像に基づいて、前記サンプルの側面を列挙するステップと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
透過照明撮像のためのシステムであって、
少なくとも部分的にコヒーレントである光を発生させるための光源と、
サンプルを支持するためのステージと、
前記光源と前記ステージとの間の光学経路内に動作可能に配置された拡散器であって、前記拡散器は、前記光源によって発生された光を散乱させ、混合することによって、前記サンプル上に入射する光のコヒーレンスを低減させるように構成されている、拡散器と、
前記サンプルによって画定された平面を通過した光を収集するための対物レンズと、
前記ステージと前記対物レンズとの間の距離を調節するための合焦機構と、
前記対物レンズから受光された光を検出するように構成された撮像検出器と、
干渉縞が前記撮像検出器によって収集された画像内に形成されるように、前記合焦機構に前記サンプルを十分に非合焦させるように構成されている、プロセッサと
を備え、
前記拡散器は、前記干渉縞の形成を減少させるが、完全には排除しないように構成されている、システム。
（項目２０）
前記プロセッサは、前記画像の分解能を低減させることと、前記低減された分解能の画像をセグメント化することと、前記セグメント化された画像を使用して前記サンプルの側面を列挙することとを行うように構成されている、項目１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記プロセッサは、前記撮像検出器に複数の画像を収集させることであって、前記サンプルおよび対物レンズは、相互に対して対応する複数の異なる焦点位置に配置されている、ことと、前記複数の画像のそれぞれのコントラストを計算することと、前記コントラストが局所最大値または局所最小値を有する焦点位置を判定することと、前記サンプルが前記画像内に干渉縞を形成するように十分に非合焦されるように、前記判定された焦点位置に基づいて前記画像検出器上の前記サンプルの焦点を調節することとを行うように構成されている、項目１９に記載のシステム。
（項目２２）
撮像システムを合焦させる方法であって、前記方法は、
サンプルの１つ以上の画像を検出することであって、前記画像は、干渉縞を含有し、撮像検出器を用いて検出される、ことと、
前記１つ以上の画像のそれぞれを周波数領域に変換することと、
各変換された画像から１つ以上の値を判定することと、
各変換された画像からの前記１つ以上の値に基づいて、前記撮像検出器上の前記サンプルの焦点を調節することと、
前記調節された焦点における前記サンプルの画像を検出することと
を含む、方法。
【国際調査報告】
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