(57)【要約】  アロエベラを使用して動物又はヒトの微生物叢の健全性を改善するための方法が、本明細書で開示される。また、脱色した乾燥アロエベラ葉液汁を精製する方法が、開示される。本方法は、アロエベラ植物からアロエベラ葉を除去する工程と、葉を洗浄及び/又は消毒する工程と、葉を粉砕してスラリーにする工程と、続いて活性炭で精製する工程とを含み得る。本方法は、アロエベララテックス中に存在する望ましくないフェノール化合物並びに特にアントロンであるアロインA及びアロインB、アロエシン(クロモン)及びアロエエモジン(アントラキノン)を含む色素性物質を除去することができる。精製後、次に、液体液汁を噴霧乾燥して、最終乾燥液汁粉末を形成することができる。
2019524707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果を誘導するための方法であって、哺乳動物に組成物を投与する工程を含み、前記組成物が、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物、及び1種以上の賦形剤を含む、方法。
【請求項２】
ヒトマイクロバイオームに対する前記有益な効果が、短鎖脂肪酸の産生の増大、結腸における総微生物個体数の増大、近位結腸における酢酸塩の産生の増大、近位結腸におけるプロピオン酸塩の産生の増大、近位結腸における全細菌の個体数の増大、近位結腸における一過性濃度のビフィズス菌の個体数の増大、腸における強い抗炎症応答、Caco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系における腸バリア透過性の減少、及び腸鎮静作用からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腸透過性が、Caco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系におけるルシファーイエローの傍細胞輸送により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物において、マイクロバイオームの健全性及び量を改善するため又は有益な効果を誘導するための方法であって、哺乳動物に組成物を投与する工程を含み、前記組成物が、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物、及び1種以上の賦形剤を含む、方法。
【請求項５】
哺乳動物に対する前記有益な効果が、抗酸化的利益である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗酸化的利益が、酸化的ストレス条件下での生物学的に有意義な抗酸化保護、免疫細胞へのシグナルの活性化及び阻害、抗炎症性化合物が比較的低用量でしか応答を示すことができず、一方で免疫活性化物質が異なる用量範囲で活性である、免疫細胞への二相性応答の誘導、並びに腸における強い抗炎症応答からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物に対する前記有益な効果が、ナチュラルキラー(NK)細胞、Tリンパ球、及びナチュラルキラーT(NKT)リンパ球を含む免疫細胞の活性化、並びに抗炎症性Th2型サイトカインの産生の増大からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記Th2型サイトカインが、IL-10又はIL-5である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物に対する前記有益な効果が、Th1型サイトカインであるIFN-γの減少又は炎症性M1マクロファージの抗炎症性M2マクロファージへの極性化の促進である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物、及び1種以上の賦形剤を含む、組成物。
【請求項１１】
酸度変更剤を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酸度変更剤が、クエン酸、クエン酸塩、リンゴ酸、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、乳酸、乳酸塩、酒石酸、酒石酸塩、蟻酸及び塩、プロピオン酸及び塩、酪酸及び塩、吉草酸及び塩、リン酸及び塩である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アロエベラ濃縮物が、純粋なアロエベラ液汁、アロエベラ液汁2倍濃縮物、アロエベラ液汁25倍濃縮物、アロエベラ液汁50倍濃縮物、アロエベラ液汁75倍濃縮物、アロエベラ液汁100倍濃縮物、アロエベラ液汁125倍濃縮物、アロエベラ液汁150倍濃縮物、アロエベラ液汁175倍濃縮物、又はアロエベラ液汁200倍濃縮物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記1種以上の賦形剤が、保存料又は香味剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記保存料が、ソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、乳酸、乳酸塩、クエン酸、クエン酸塩、リンゴ酸、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ローズマリー抽出物、ラベージ抽出物、キトサン、セージ精油、チモール油、ナイシン、e-ポリリジン、ブドウ種子抽出物、クコの実抽出物、又はそれらの組合せのうちの1つ以上である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記香味剤が、糖、蜂蜜、果糖、デキストロース、マルトデキストリン、ガム、天然若しくは人工香料、又はそれらの組合せのうちの1つ以上である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記1種以上の賦形剤が、セルロース粉末、加工デンプン、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメルロースナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、又は二酸化ケイ素である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アロエベラ液汁が、液体液汁、液汁濃縮物、又は乾燥液汁濃縮物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アロエベラ液汁が、約10ppm以下のアロインを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アロエベラ液汁が、少なくとも約5%のアセチル化アセマンナンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アロエベラは、とりわけ、創傷治癒、消化健康のサポート及び腸治癒のための伝統的な治療法として使用されてきた。しかしながら、アロエベラの生理活性及び作用機構については、ほとんど知られていない。天然成分のため、組成は、生育状態及び製造プロセスにより変動する。化学組成と生理活性とを相関させるのに利用可能である情報は、非常に限られている。本開示は、アロエベラの組成、生理活性及びその構造と機能性との間の相関を系統的に評価するための研究努力の一部である。
【０００２】
本開示は、精製した(脱色した)アロエベラ葉液汁成分の細菌発酵からの短鎖脂肪酸の優先的増大に関する。また、本開示は、腸における微生物叢群の復元又は特定の粘膜免疫機能の刺激に対する効果について考察し、それによって特定の状態の治療に寄与する。更に、本開示は、開示する組成物の生物学的に有意義な抗酸化保護及び免疫調節(すなわち、免疫向上及び抗炎症両方の)活性の可能性について考察する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト腸微生物生態系のシミュレータ(SHIME:Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)は、in vitro連続モデルであり、ヒト消化管の様々な部分をシミュレートする5個の反応器の連続物を含む。SHIMEは、科学及び産業プロジェクトの両方について15年を超えて広範に使用されており、in vivoパラメータにより検証されている。結腸の様々な領域における微生物群の安定化に際して、異なる結腸領域において組成及び機能性の両方が異なる代表的な微生物群が、3つの結腸区画において確立されている。本開示は、アロエベラの毎日の反復用量の可能性のある特性を評価する。SHIMEモデルは、比較的長期間にわたり、かつ代表的な条件下で複雑な腸微生物生態系の培養を可能にする。また、SHIMEは、試験材料の反復摂取をシミュレートすることを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある特定の発明の態様の要約
一態様では、例えば、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物及び1種又は複数種の賦形剤を含む組成物が開示される。一部の実施形態では、更に、組成物は、酸度変更剤を含む。一部の実施形態では、アロエベラ濃縮物は、純粋なアロエベラ液汁、アロエベラ液汁2倍濃縮物、アロエベラ液汁25倍濃縮物、アロエベラ液汁50倍濃縮物、アロエベラ液汁75倍濃縮物、アロエベラ液汁100倍濃縮物、アロエベラ液汁125倍濃縮物、アロエベラ液汁150倍濃縮物、アロエベラ液汁175倍濃縮物又はアロエベラ液汁200倍濃縮物である。
【０００５】
一部の実施形態では、賦形剤は、保存料である。一部の実施形態では、保存料は、ソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、乳酸、乳酸塩、クエン酸、クエン酸塩、リンゴ酸、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ローズマリー抽出物、ラベージ抽出物、キトサン、セージ精油、チモール油又はナイシンである。一部の実施形態では、賦形剤は、0.01〜2%の濃度を有する。一部の実施形態では、賦形剤は、0.01〜0.5%の濃度を有する。一部の実施形態では、賦形剤は、香味剤である。一部の実施形態では、香味剤は、糖、蜂蜜、果糖、デキストロース、マルトデキストリン又はガムのうちの1つ又は複数である。一部の実施形態では、香味剤は、0.1〜50%の濃度を有する。一部の実施形態では、香味剤は、0.1〜20%の濃度を有する。一部の実施形態では、賦形剤は、セルロース粉末、加工（化工）デンプン、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメルロースナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム又は二酸化ケイ素である。
【０００６】
一部の実施形態では、酸度変更剤は、クエン酸、クエン酸塩、リンゴ酸、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、乳酸、乳酸塩、酒石酸又は酒石酸塩である。一部の実施形態では、酸度変更剤は、0.1〜10%の濃度を有する。一部の実施形態では、酸度変更剤は、0.2〜5%の濃度を有する。
【０００７】
一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、液体液汁、液汁濃縮物又は乾燥液汁濃縮物である。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、アロエベラ葉全体に由来する。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、アロエベラ内部ゲルに由来する。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、10ppm以下のアロインを含む。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、3ppm以下のアロインを含む。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、少なくとも5%のアセチル化アセマンナンを含む。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、50,000ダルトン〜10,000,000ダルトンの分子量を有するアセチル化アセマンナンを含む。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、100,000〜5,000,000ダルトンの分子量を有するアセチル化アセマンナンを含む。
【０００８】
別の態様では、例えば、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物及び1種又は複数種の賦形剤を含む栄養補助食品が開示される。一部の実施形態では、栄養補助食品は、錠剤、カプセル、ソフトゲル、グミ、経口溶解錠剤、粉末又は液体である。一部の実施形態では、脱色アロエベラ液汁の量は、1〜500gである。一部の実施形態では、脱色アロエベラ液汁の量は、5〜300gである。一部の実施形態では、脱色アロエベラ乾燥液汁濃縮物の量は、10〜500mgである。一部の実施形態では、脱色アロエベラ乾燥液汁濃縮物の量は、50〜300mgである。
【０００９】
また、哺乳動物においてマイクロバイオームの健全性及び量を改善する方法が、本明細書で開示される。本方法は、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物及び1種又は複数種の賦形剤を含む有効量の組成物を投与する工程を含む。
【００１０】
また、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果を誘導するための方法が、本明細書で開示される。本方法は、哺乳動物に組成物を投与する工程であって、組成物が、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物及び1種又は複数種の賦形剤を含む、工程を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、短鎖脂肪酸の産生の増大である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、結腸における総微生物個体数の増大である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、近位結腸における酢酸塩の産生の増大である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、近位結腸におけるプロピオン酸塩の産生の増大である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、近位結腸における全細菌の個体数の増大である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、近位結腸における一過性濃度のビフィズス菌の個体数の増大である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、腸における強い抗炎症応答である。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、Caco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系における腸バリア透過性の減少である。一部の実施形態では、腸透過性は、Caco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系においてルシファーイエローの傍細胞輸送により測定される。一部の実施形態では、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果は、腸鎮静作用である。
【００１２】
別の態様では、また、哺乳動物に対する有益な効果を誘導するための方法が、本明細書で開示される。本方法は、哺乳動物に組成物を投与する工程であって、組成物が、脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物及び1種又は複数種の賦形剤を含む、工程を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、哺乳動物に対する有益な効果は、抗酸化的利益である。一部の実施形態では、抗酸化的利益は、酸化的ストレス条件下での生物学的に有意義な抗酸化保護である。一部の実施形態では、抗酸化的利益は、免疫細胞へのシグナルを活性化及び阻害することである。一部の実施形態では、抗酸化的利益は、免疫細胞への二相性応答の誘導である。一部の実施形態では、抗炎症性化合物は、より低用量で応答を示すことが許容されるのみであり、一方で、免疫活性化物質は、異なる用量範囲で活性である。一部の実施形態では、抗酸化的利益は、腸における強い抗炎症応答である。
【００１４】
一部の実施形態では、哺乳動物に対する有益な効果は、脱色アロエベラ葉液汁濃縮物、アロエベラ葉内部液汁濃縮物及び乾燥葉内部ゲルの抗炎症活性である。一部の実施形態では、ヒト免疫系に対する有益な効果は、リポ多糖(LPS:lipopolysaccharide)等の炎症促進性刺激と共に共培養された場合の、末梢血単核細胞(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)からの炎症性サイトカイン及びケモカインの産生の減少である。一部の実施形態では、哺乳動物に対する有益な効果は、それぞれ、脱色アロエベラ葉液汁濃縮物及びアロエベラ葉内部液汁濃縮物のアロエベラ葉内部濃縮物及び多糖類(すなわち、アセマンナン)富化画分の免疫調節、すなわち、免疫向上及び抗炎症両方の、活性である。一部の実施形態では、ヒト免疫系に対する有益な効果は、任意の炎症促進性刺激の非存在下での、炎症性サイトカイン及びケモカインの産生の増大並びに末梢血単核細胞(PBMC)からの抗炎症性サイトカインの産生の増大の両方である。
【００１５】
一部の実施形態では、哺乳動物に対する有益な効果は、脱色アロエベラ葉液汁の免疫向上活性である。一部の実施形態では、ヒト免疫系に対する有益な効果は、それぞれ、ナチュラルキラー(NK:natural killer)細胞、Tリンパ球及びナチュラルキラーT(NKT:natural killer T)リンパ球を含む免疫細胞の活性化である。
【００１６】
一部の実施形態では、哺乳動物に対する有益な効果は、脱色アロエベラ葉液汁の抗炎症活性である。一部の実施形態では、マウス免疫系に対する有益な効果は、樹状細胞(DC:dendritic cell)及びCD4(+)T細胞の共培養物からのIL-10及びIL-5等の抗炎症性Th2型サイトカインの産生における増大並びにまた、Th1型サイトカインであるIFN-γの減少である。一部の実施形態では、マウス免疫系に対する有益な効果は、炎症性M1マクロファージの抗炎症性M2マクロファージへの転換又は極性化の促進である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、ヒト腸管の様々な領域をシミュレートする5個の連続反応器を有する(SHIME)の標準設定を示す。
【図２】図2は、2個の並行SHIME系を有するTWINSHIME設定の概略を示す。各SHIME反応器は、それぞれ、胃、小腸、上行結腸、横行結腸及び下行結腸をシミュレートする5個の容器を含有する。
【図３】図3は、TWINSHIMEの標準の設定が、単一のデバイスにおいて3個の異なるアームを比較するために3個の近位結腸(PC:proximal colon)及び3個の遠位結腸(DC:distal colon)において変更されているTripleSHIMEの設計を示す。
【図４】図4は、頂端(AP:apical)及び基底(BL:basolateral)側からなるCaco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系を示す。
【図５】図5は、試験製品で処理したSHIMEの近位(PC)及び遠位(DC)結腸における酢酸塩濃度(mmol/L)を示す。データを、実験週ごとに示す(平均及び標準偏差;n=3)。棒グラフの棒は、示される通り、1〜6の数字で標識され、凡例中の標識に対応する。グラフ上の棒は、1)PCアロエ3杯;2)PCアロエ6杯;3)PC Epicor;4)DCアロエ3杯;5)DCアロエ6杯;及び6)DC Epicorの順序である。
【図６】図6は、試験製品で処理したSHIMEの近位及び遠位結腸におけるプロピオン酸塩濃度(mmol/L)を示す。データを、実験週ごとに示す(平均及び標準偏差;n=3)。棒グラフの棒は、示される通り、1〜6の数字で標識され、凡例中の標識に対応する。グラフ上の棒は、1)PCアロエ3杯;2)PCアロエ6杯;3)PC Epicor;4)DCアロエ3杯;5)DCアロエ6杯;及び6)DC Epicorの順序である。
【図７】図7は、試験製品で処理したSHIMEの近位及び遠位結腸における酪酸塩濃度(mmol/L)を示す。データを、実験週ごとに示す(平均及び標準偏差;n=3)。棒グラフの棒は、示される通り、1〜6の数字で標識され、凡例中の標識に対応する。グラフ上の棒は、1)PCアロエ3杯;2)PCアロエ6杯;3)PC Epicor;4)DCアロエ3杯;5)DCアロエ6杯;及び6)DC Epicorの順序である。
【図８】図8は、試験製品で処理したSHIMEの近位及び遠位結腸における総SCFA濃度(mmol/L)を示す。データを、実験週ごとに示す(平均及び標準偏差;n=3)。棒グラフの棒は、示される通り、1〜6の数字で標識され、凡例中の標識に対応する。グラフ上の棒は、1)PCアロエ3杯;2)PCアロエ6杯;3)PC Epicor;4)DCアロエ3杯;5)DCアロエ6杯;及び6)DC Epicorの順序である。
【図９】図9は、アロエ製品又はEpicorのいずれかで処理したSHIMEの近位結腸(PC)及び遠位結腸(DC)における乳酸塩/乳酸濃度を示す。データを、対照期間の、最初の3週間の処理の、及び最後の3週間の処理の、平均±標準偏差として示す。乳酸塩産生における有意差(CTRL対TREAT)は、観察されなかった(P>0.05)。棒グラフの棒は、示される通り、1〜6の数字で標識され、凡例中の標識に対応する。グラフ上の棒は、1)PCアロエ3杯;2)PCアロエ6杯;3)PC Epicor;4)DCアロエ3杯;5)DCアロエ6杯;及び6)DC Epicorの順序である。
【図１０Ａ】図10Aは、TripleSHIMEの近位及び遠位結腸におけるアンモニウム濃度(mg NH4+/L)を示す。データを、実験週ごとに示す。アンモニウム産生における有意差(CTRL対TREAT)は、P<0.05について*で示される。棒グラフの棒は、示される通り、1〜6の数字で標識され、凡例中の標識に対応する。グラフ上の棒は、1)PCアロエ3杯;2)PCアロエ6杯;3)PC Epicor;4)DCアロエ3杯;5)DCアロエ6杯;及び6)DC Epicorの順序である。
【図１０Ｂ】図10Bは、TripleSHIMEの近位及び遠位結腸におけるアンモニウム濃度(mg NH4+/L)を示す。データを、実験期間ごとに示す。アンモニウム産生における有意差(CTRL対TREAT)は、P<0.05について*で示される。棒グラフにおいて、対照(C:Control)及び処理(T:Treatment)は、棒の上に標識される。
【図１１Ａ】図11Aは、3杯のアロエで処理したSHIMEの近位(PC)及び遠位(DC)結腸(PC3又はDC3)における酸塩基消費を示す。データを、対照期間(C)、最初の3週間の処理(T1〜3)及び最後の3週間の処理(T4〜6)中の、平均消費として示す。標識される通り、1)PC3酸;2)PC3塩基;3)DC3酸;及び4)DC3塩基である。
【図１１Ｂ】図11Bは、6杯のアロエで処理したSHIMEの近位(PC)及び遠位(DC)結腸(PC6又はDC6)における酸塩基消費を示す。データを、対照期間(C)、最初の3週間の処理(T1〜3)及び最後の3週間の処理(T4〜6)中の、平均消費として示す。標識される通り、1)PC6酸;2)PC6塩基;3)DC6酸;及び4)DC6塩基である。
【図１１Ｃ】図11Cは、Epicoreで処理したSHIMEの近位(PC)及び遠位(DC)結腸(PCEpi又はDCEpi)における酸塩基消費を示す。データを、対照期間(C)、最初の3週間の処理(T1〜3)及び最後の3週間の処理(T4〜6)中の、平均消費として示す。標識される通り、1)PCPpi酸;2)PCPpi塩基;3)DCEpi酸;及び4)DCEpi塩基である。
【図１２Ａ】図12Aは、3杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおける全細菌の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１２Ｂ】図12Bは、3杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるバクテロイデス門(Bacteroidetes)の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１２Ｃ】図12Cは、3杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるファーミキューテス門(Firmicutes)の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１２Ｄ】図12Dは、3杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるラクトバシラス属の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１２Ｅ】図12Eは、3杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるビフィズス菌の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１３Ａ】図13Aは、6杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおける全細菌の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１３Ｂ】図13Bは、6杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるバクテロイデス門の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１３Ｃ】図13Cは、6杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるファーミキューテス門の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１３Ｄ】図13Dは、6杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるラクトバシラス属の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１３Ｅ】図13Eは、6杯のアロエで処理したTripleSHIMEのアームにおけるビフィズス菌の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１４Ａ】図14Aは、Epicorで処理したTripleSHIMEのアームにおける全細菌の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１４Ｂ】図14Bは、Epicorで処理したTripleSHIMEのアームにおけるバクテロイデス門の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１４Ｃ】図14Cは、Epicorで処理したTripleSHIMEのアームにおけるファーミキューテス門の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１４Ｄ】図14Dは、Epicorで処理したTripleSHIMEのアームにおけるラクトバシラス属の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１４Ｅ】図14Eは、Epicorで処理したTripleSHIMEのアームにおけるビフィズス菌の内腔濃度のqPCRデータを示す。データを、各結腸区画において実験週ごとに示す。処理:1)対照1;2)対照2;3)処理1;4)処理2;5)処理3;6)処理4;7)処理5;及び8)処理6は、グラフの棒の上に標識される。
【図１５】図15は、TEER(24時間)、ルシファーイエローの傍細胞輸送(24時間)及び免疫マーカー(6時間のLPS後)(すなわち、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及びNF-κB活性)を測定するための試料解析の設計を示す。
【図１６】図16は、TEER機能性のスキームを示す。
【図１７】図17は、リーキーガット症候群及び炎症カスケードを示す。
【図１８】図18は、炎症のTNF-αカスケードを示す。
【図１９−１】図19A及びBは、対照試験(gM及びNaB)についての、及び非発酵研究製品-アロエ1(0.507g/L)、アロエ2(1.014g/L)及びEpiCor(1.5g/L)についての、TEER(図19A)及びルシファーイエロー(LY:Lucifer Yellow)の傍細胞輸送(図19B)を示す。2回の独立した実験において、共培養物の前処理24時間後に、TEER及びLY輸送を測定した;ns:有意でない。LYの輸送について、統計的有意性は見られなかった。
【図１９−２】図19C及びDは、対照試験(gM、LPS、NaB及びHC)についての、及び非発酵研究製品-アロエ1(0.507g/L)、アロエ2(1.014g/L)及びEpiCor(1.5g/L)についての、IL-10(図19C)、IL-6(図19C及びD)、IL-8(図19C)及びTNF-α(図19C)を示す。最初に試験製品で24時間前処理した共培養物のLPS処理6時間後に、サイトカインを測定した;ns:有意でない。
【図１９−３】図19E及びFは、対照試験(gM、LPS、NaB及びHC)についての、及び非発酵研究製品-アロエ1(0.507g/L)、アロエ2(1.014g/L)及びEpiCor(1.5g/L)についての、IL-6(図19E)及びTNF-α(図19F)を示す。最初に試験製品で24時間前処理した共培養物のLPS処理6時間後に、サイトカインを測定した;ns:有意でない。
【図１９−４】図19Gは、対照試験(gM、LPS、NaB及びHC)についての、及び非発酵研究製品-アロエ1(0.507g/L)、アロエ2(1.014g/L)及びEpiCor(1.5g/L)についての、NF-κB活性を示す。最初に試験製品で24時間前処理した共培養物のLPS処理6時間後に、NF-κB活性を測定した;ns:有意でない。
【図１９−５】図19H及びIは、アロエ1(元々、0.507g/Lで投与した)、アロエ2(元々、1.014g/Lで投与した)及びEpiCor(元々、1.5g/Lで投与した)を与えたSHIMEから収集した試料で処理した共培養物についての、TEER(図19H)及びルシファーイエロー(LY)の傍細胞輸送(図19I)を示す。2回の独立した実験において、共培養物の前処理24時間後に、TEER及びLY輸送を測定した;ns:有意でない。
【図１９−６】図19J及びKは、アロエ1(元々、0.507g/Lで投与した)、アロエ2(元々、1.014g/Lで投与した)及びEpiCor(元々、1.5g/Lで投与した)を与えたSHIMEから収集した試料で処理した共培養物についての、IL-10(図19J)及びIL-6(図19K)を示す。最初に試験試料で24時間前処理した共培養物のLPS処理6時間後に、サイトカインを測定した;ns:有意でない。IL-6について、統計的有意性は見られなかった。
【図１９−７】図19L及びMは、アロエ1(元々、0.507g/Lで投与した)、アロエ2(元々、1.014g/Lで投与した)及びEpiCor(元々、1.5g/Lで投与した)を与えたSHIMEから収集した試料で処理した共培養物についての、IL-8(図19L)及びTNF-α(図19M)を示す。最初に試験試料で24時間前処理した共培養物のLPS処理6時間後に、サイトカインを測定した。IL-8について、統計的有意性は見られなかった。
【図１９−８】図19Nは、アロエ1(元々、0.507g/Lで投与した)、アロエ2(元々、1.014g/Lで投与した)及びEpiCor(元々、1.5g/Lで投与した)を与えたSHIMEから収集した試料で処理した共培養物についての、NF-κB活性を示す。最初に試験試料で24時間前処理した共培養物のLPS処理6時間後に、サイトカインを測定した;ns:有意でない。
【図２０】図20は、ジョイント主成分分析法(PCA:principal component analysis)/相関バイプロット(71.6%)を示す。
【図２１】図21は、ホストパラメータに対する試験製品の効果のグラフによる概要を示す。黄色セル(Y)は、=1.0であり、非消化製品について、又はSHIMEの対照期間に収集された試料について、対照:gM又はLPSを表す;緑色(G)セルは、1超の値、よって、対照に対する増大を表す;赤色(R)セルは、1未満の値、よって、対照に対する減少を表す。1.0からの変化の程度は、色強度により表される。ますに、Y、G又はRの文字が入れられ、黄色、赤色又は緑色を表す。表示なしは、ますが白色であることを意味する。
【図２２】図22は、細胞ベースの抗酸化保護アッセイを示す図解である。
【図２３】図23は、天然製品がPMN細胞ROSに影響を与え得る、機構を示す図である。
【図２４】図24は、試験した製品の全抗酸化能のグラフ描写である。上部グラフは、粗製品を示す。中間のグラフは、in vitro消化プロセスを通して得た製品及び対照を示す。下部グラフは、参照までに全てのデータを組み合わせてオーバーレイグラフにしたものを示す。
【図２５】図25は、試験した製品の細胞抗酸化保護(CAP-e:cellular antioxidant protection)のグラフ描写である。上部グラフは、粗製品を示す。中間のグラフは、in vitro消化プロセスを通して得た製品及び対照を示す。下部グラフは、参照までに全てのデータを組み合わせてオーバーレイグラフにしたものを示す。
【図２６】図26は、Attune音響フローサイトメーターからのデータ表示を示す。ドットプロットは、X軸に沿って相対的細胞サイズ及びY軸に沿って相対的細胞粒状性を表す。生存機能的PMN細胞は、ROS形成のデータ解析について、電気ゲートを規定する領域に位置する。左に示される例は、試験製品による細胞処理が細胞完全性を損なわず、大量の細胞が試料中に存在する、健康なPMN細胞の試料からのものである。右のドットプロットは、最高用量の葉全体IVDで処理したPMN細胞が、細胞死を経験し、細胞の10%未満が、生存機能的PMN細胞を規定する領域に残ったことを示す。実際のところ、それらのわずかな残りの細胞は、細胞死を経験しているようであり、正常に機能していないようであった。データは、細胞が、大量のROSを産生することを示した。この用量のWL IVDからのデータは、図27及び図30のデータグラフ上の「X」により表される。
【図２７】図27は、活性酸素種アッセイのグラフ描写である。酸化的ストレス下のROS形成に対する製品の効果を示すために、PMN細胞を使用した。これらは、各ドナーのPMN細胞を使用して試験した製品のオーバーレイグラフである。同様の応答は、試験した3人のドナーのうちの2人で見られ、葉内部製品及びそのIVDは、葉全体及びそのIVDより強い抗炎症活性を有した。より高用量のある特定の製品(例:WL-IVD)に曝露したときに一部の培養物で見られた細胞死のために、それらの培養物からのROSデータは有効でなく、図27におけるグラフ中のそれらのデータ点上の「X」により示される。
【図２８】図28は、酸化的ストレス下の健康なドナーからのヒトPMN細胞を使用した活性酸素種(ROS:Reactive Oxygen Species)アッセイのグラフ描写である。棒グラフは、非処理(UT:untreated)対照細胞及びH2O2処理(H2O2)陽性対照培養物と比較した、葉全体製品に曝露した細胞における細胞内ROS形成を示す。試験製品が、H2O2対照とは有意に異なるROS形成の増大又は減少を誘発した場合、それは、*p<0.05、**p<0.01により示される。棒グラフの上の細い線は、全ての製品試料の前(左)後(右)に通したH2O2対照についての経時的アッセイ内一貫性を示す。
【図２９】図29は、酸化的ストレス下の健康なドナーからのヒトPMN細胞を使用した活性酸素種(ROS)アッセイのグラフ描写である。棒グラフは、非処理(UT)対照細胞及びH2O2処理(H2O2)陽性対照培養物と比較した、葉内部製品に曝露した細胞における細胞内ROS形成を示す。試験製品が、H2O2対照とは有意に異なるROS形成の増大又は減少を誘発した場合、それは、*p<0.05、**p<0.01により示される。棒グラフの上の細い線は、全ての製品試料の前(左)後(右)に通したH2O2対照についての経時的アッセイ内一貫性を示す。
【図３０】図30は、酸化的ストレス下の健康なドナーからのヒトPMN細胞を使用した活性酸素種(ROS)アッセイのグラフ描写である。棒グラフは、非処理(UT)対照細胞及びH2O2処理(H2O2)陽性対照培養物と比較した、消化した葉全体製品に曝露した細胞における細胞内ROS形成を示す。試験製品が、H2O2対照とは有意に異なるROS形成の増大又は減少を誘発した場合、それは、*p<0.05、**p<0.01により示される。棒グラフの上の細い線は、全ての製品試料の前(左)後(右)に通したH2O2対照についての経時的アッセイ内一貫性を示す。
【図３１】図31は、酸化的ストレス下の健康なドナーからのヒトPMN細胞を使用した活性酸素種(ROS)アッセイのグラフ描写である。棒グラフは、非処理(UT)対照細胞及びH2O2処理(H2O2)陽性対照培養物と比較した、消化した葉内部製品に曝露した細胞における細胞内ROS形成を示す。試験製品が、H2O2対照とは有意に異なるROS形成の増大又は減少を誘発した場合、それは、*p<0.05、**p<0.01により示される。細い線は、H2O2対照についての経時的アッセイ内一貫性を示す。
【図３２】図32は、酸化的ストレス下の健康なドナーからのヒトPMN細胞を使用した活性酸素種(ROS)アッセイのグラフ描写である。棒グラフは、非処理(UT)対照細胞及びH2O2処理(H2O2)陽性対照培養物と比較した、消化緩衝液対照に曝露した細胞における細胞内ROS形成を示す。試験製品が、H2O2対照とは有意に異なるROS形成の増大又は減少を誘発した場合、それは、*p<0.05、**p<0.01により示される。細い線は、全ての製品試料の前(左)後(右)に通したH2O2対照についての経時的アッセイ内一貫性を示す。
【図３３Ａ（Ｉ）】図33A(I)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で100μg/mlの脱色アロエベラ葉乾燥液汁にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるケモカインであるMIP-1αの平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ａ（ＩＩ）】図33A(II)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で100μg/mlの脱色アロエベラ葉乾燥液汁にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるケモカインであるTNF-αの平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ａ（ＩＩＩ）】図33A(III)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で多糖(PS:polysaccharide)富化した100μg/mlの脱色アロエベラ葉乾燥液汁にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるサイトカインであるMIP-1αの平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ａ（ＩＶ）】図33A(IV)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で多糖(PS)富化した100μg/mlの脱色アロエベラ葉乾燥液汁にて処理した24時間後の、TNF-αの平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ｂ（Ｉ）】図33B(I)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で100μg/mlのアロエベラ葉内部液汁濃縮物にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるサイトカインであるMIP-1αの平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ｂ（ＩＩ）】図33B(II)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で100μg/mlのアロエベラ葉内部液汁濃縮物にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるケモカインであるTNF-αの平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ｂ（ＩＩＩ）】図33B(III)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬である50pg/mlのリポ多糖(LPS)の存在下で多糖(PS)富化した100μg/mlのアロエベラ葉内部液汁濃縮物にて処理した24時間後の、IL-10の平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ｃ−１】図33C(I)及び(II)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬の非存在下で100μg/mlのアロエベラ葉内部液汁濃縮物にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるサイトカイン及びケモカイン[IL-1β(I)及びTNF-α(II)]の平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３３Ｃ−２】図33C(III)、(IV)、及び(V)は、健康なドナーからのヒトPBMC細胞を使用したサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、細胞を、炎症性刺激薬の非存在下で100μg/mlのアロエベラ葉内部液汁濃縮物にて処理した24時間後に、PBMCから培養液に分泌されるサイトカイン及びケモカイン[IL-6(III)、IL-10(IV)、及びMIP-1α(V)]の平均濃度を示す。各サイトカインごとの2回の平均値を示す。
【図３４Ａ】図34Aは、それぞれ、細胞表面マーカーCD3、CD25、CD56及びCD69に特異的な蛍光モノクローナル抗体を用いた多パラメータフローサイトメトリーのグラフ描写である。抗CD3及び抗CD56モノクローナル抗体を、健康なドナーのPBMCにおいてCD3(-)CD56(+)NK細胞を分化させるために使用し、一方で、抗CD25及び抗CD69抗体を、活性化状態をモニターするために使用した。各濃度ごとの3回の平均値をプロットした。
【図３４Ｂ】図34Bは、それぞれ、細胞表面マーカーCD3、CD25、CD56及びCD69に特異的な蛍光モノクローナル抗体を用いた多パラメータフローサイトメトリーアッセイのグラフ描写である。抗CD3及び抗CD56モノクローナル抗体を、健康なドナーのPBMCにおいてCD3(+)CD56(+)NKT細胞を分化させるために使用し、一方で、抗CD25及び抗CD69抗体を、活性化状態をモニターするために使用した。各濃度ごとの3回の平均値をプロットした。
【図３５Ａ】図35Aは、CD4 Tリンパ球とアロエベラ葉液汁(アロエ1又はアロエ2)組成物の非存在下又は存在下でLPSにより活性化したマウス骨髄由来DCとの共培養物からの、Th1(IFN-γ)及びTh2型(IL-5及びIL-10)サイトカイン産生を測定するためのサイトカインアッセイのグラフ描写である。棒グラフは、24時間の間に共培養物から培地へ分泌された各サイトカインごとの3回の平均濃度を示す。
【図３５Ｂ】図35Bは、アロエベラ葉液汁(アロエ1又はアロエ2)組成物の非存在下又は存在下でLPSにより活性化したマウス骨髄由来マクロファージの極性化及び機能を測定するためのアルギナーゼ活性アッセイのグラフ描写である。棒グラフは、各アッセイごとの3回の尿素の平均産生(μg/500,000個の細胞)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
I. 序論
消化(GI:gastrointestinal)管及び腸微生物プロセスを研究するためのin vitroアプローチは、選択された食物成分の可能性のある特性を研究するための優れた実験環境を提供する。十分に設計された連続モデルの適用は、代表的な環境条件下での腸における選択された分子の生物学的活性の徹底的な研究を可能にする。更に、また、in vitroモデリングにおける最近の進歩によって、細菌-ホスト相互作用の研究を連続モデルと組み合わせることが可能となり、それにより、科学的な生産高及び商業的関連性関連の両方が更に増大される。
【００１９】
リーキーガットは、近年、一部の重篤な健康問題又は疾患、例えば慢性疲労症候群、IBS、代謝障害、炎症性腸疾患、1型糖尿病、アレルギー、喘息及び自己免疫疾患に関連していると考えられていることから研究されている。実際に、リーキーガットは、破壊された腸バリア機能と自己免疫疾患及び炎症性疾患の発症との間の関連を特定する。上皮は、隣接する細胞を機械的に連結し、細胞間空間を密閉する複雑なタンパク質-タンパク質ネットワークの形成を通して、その選択的バリア機能を維持する。タイトジャンクションの不適切な機能又は調節は、バリアを通る内腔要素の通過を伴う、より大きな細胞間空間をもたらし、継続的な局所性及び全身性炎症を伴い得る。
【００２０】
慢性炎症は、連続性の活性炎症応答及び組織破壊により特徴付けられる病態である。多くの研究が、慢性炎症は、糖尿病、心血管疾患及び自己免疫疾患を含む多種多様な加齢性疾患において、重要な役割を有し得ることを示唆する。炎症プロセスは、酸化的ストレスを誘導し、細胞抗酸化能を低減させる。過剰に産生されたフリーラジカルは、細胞膜脂肪酸及びタンパク質と反応し、それらの機能を永久に損なう。加えて、フリーラジカルは、がん及び加齢性障害の素因であり得る突然変異及びDNA損傷を引き起こし得る。
【００２１】
マクロファージ、好中球及び好酸球を含む免疫細胞の多くは、直接的に、又は慢性炎症の病理における炎症性サイトカイン産生の産生により関連する。アロエベラによる直接的な免疫調節効果並びに免疫及び炎症プロセスの調節は、NK細胞、NKT細胞、Tリンパ球、単球及びマクロファージの直接的な細胞活性化により測定することができる。
【００２２】
本開示は、アロエベラの毎日の反復用量の可能性のある特性を評価する。SHIMEモデルは、長期にわたり、かつ代表的な条件下で複雑な腸微生物生態系の近似及び培養を可能にする。また、SHIMEは、試験材料の反復摂取をシミュレートすることを可能にする。本開示において、アロエベラの反復用量による微生物群組成及び活性並びに腸バリア透過性及び炎症に対する効果を評価した。ホリン・シオカルトアッセイ法は、材料の抗酸化能の指標である、材料中の全フェノール含有量を測定するための方法である。抗酸化可能性を査定するために、細胞ベースの抗酸化保護アッセイを行い得る。この試験では、脂質二重層細胞膜を横断することができる抗酸化物質のみが、細胞に進入し、酸化的ストレスが測定される条件下で、生物学的に有意義な抗酸化保護を提供する。
【００２３】
本明細書で開示する組成物は、いくつかの利点を含む。1つの利点は、短鎖脂肪酸産生である。本開示の組成物は、全及び個々の短鎖脂肪酸産生の両方について直線的用量応答を示す。更に、投与された(又は摂取された)精製した(脱色した)アロエベラ葉乾燥液汁は、近位結腸において、より高い酢酸塩及びプロピオン酸塩産生をもたらす。本開示の組成物の別の利点は、腸微生物組成に対するその影響である。0.507g/L濃度で、試験試料は、主にバクテロイデス門の増大と関連付けられる、近位結腸における全細菌のわずかな増大をもたらした。処理2週間後に、ビフィズス菌の濃度は一過的なピークを示した。1.014g/L濃度では、精製した(脱色した)アロエベラ葉乾燥液汁は、全細菌(バクテロイデス門及びファーミキューテス門)の増大及びビフィズス菌の一過性濃度をもたらす。本開示の組成物のまた別の利点は、Caco-2バリア完全性に対するその正の効果である。1.014g/L濃度では、非発酵の精製した(脱色した)アロエベラ葉乾燥液汁は、Caco-2細胞をTHP1細胞により誘導される損傷から保護し、それによってCaco-2バリア完全性に対する正の効果を有することにより経上皮電気抵抗(TEER:trans-epithelial electrical resistance)を維持し得る。本明細書で開示する組成物の別の利点は、IL-10レベル、IL-6レベル、IL-8レベル及びTNF-αレベルに対するその正の効果を含む。1.014g/L濃度では、非発酵の精製した(脱色した)アロエベラ葉乾燥液汁は、LPS誘導IL-10レベル(真の抗炎症性サイトカイン)を増大させて、IL-6レベルを維持し、LPS誘導IL-8及びTNF-αレベルの両方を減少させることができる。本開示の組成物のまた別の利点は、それが、酸化的ストレス条件下で生物学的に有意義な抗酸化保護を提供することである。
【００２４】
本開示は、末梢血単核細胞(PBMC)と称される免疫細胞集団を用いたサイトカイン放出アッセイにおいて測定される通り、本明細書で開示する組成物の抗炎症及び免疫調節特性を更に評価する。細胞を、それぞれ、細菌感染及びウイルス侵襲を模倣する強い炎症性刺激薬である、リポ多糖(LPS)又はポリイノシン酸:ポリシチジル酸(ポリI:C)の存在下で培養し、アロエ試験材料で処理した。PBMCから分泌されたサイトカイン又はケモカインの濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA:Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)により測定した。PBMCベースの免疫学的アッセイは、アロエ組成物の後述の利点を明らかにした。第1に、10μg/ml〜100μg/mlの濃度範囲で、4.3〜55.9パーセントの多糖を含有するアロエベラ葉液汁濃縮物は、PBMCからのMIP-1α及び/又はTNF-αのLPS刺激された発現を減少させた通り、抗炎症及び/又は免疫調節活性(免疫向上及び抗炎症の両方)を示した。第2に、0.1μg/ml〜100μg/mlの間の濃度範囲では、8.8〜82パーセントの多糖を含有するアロエベラ葉内部液汁濃縮物は、PBMCからのTNF-α及びMIP-1αのLPS刺激された発現を減少させ、一方で、多糖含有量がより高い場合、IL-10を増大させた通り、抗炎症及び/又は免疫調節活性(免疫向上及び抗炎症の両方)を示した。
【００２５】
本明細書で開示する組成物の免疫調節活性を、免疫細胞の性質及びそれらの活性化状態を決定する多パラメータフローサイトメトリーにより更に査定した(図34A〜図34B)。健康なドナー由来のPBMCを、0.004mg/ml〜2mg/mlのアロエベラ葉液汁濃縮物を伴って培養した。ナチュラルキラー細胞(生得的な免疫応答のみでなく適応性の免疫応答に本質的である)[NK、CD3(-)/CD56(+)]及びNKT[CD3(+)/CD56(+)]を検出するために、抗CD3及び抗CD56モノクローナル抗体を使用した。他方で、これらの免疫細胞がアロエベラ葉液汁濃縮物により直接的に活性化され得るかどうかを決定するために、抗CD25及び抗69モノクローナル抗体を使用した。フローサイトメトリーは、アロエ組成物の後述の利点を明らかにした。第1に、アロエベラ葉液汁濃縮物は、病原性微生物及び体内で生ずるがん細胞等の異常な細胞に対する主要な防御に本質的であるNK細胞を直接的に活性化した。第2に、アロエ組成物は、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症及びがんを調節することにおいて重要な役割を果たすNKT細胞を直接的に活性化した。
【００２６】
本明細書で開示する組成物の抗炎症活性を、アロエベラ葉液汁濃縮物(0.507mg/ml)の非存在下又は存在下でLPSにより活性化した樹状細胞(DC)と共培養した、CD4 T細胞からのTh1及びTh2型サイトカイン産生により更に査定した(図35A)。サイトカインアッセイは、アロエ組成物の後述の利点を明らかにした。第1に、アロエ組成物は、IL-10及びIL-5等の抗炎症性Th2型サイトカインの産生を有意に上昇させた。第2に、アロエ組成物は、IFN-γ等の炎症性Th1型サイトカインの産生を有意に低減させた。第3に、アロエ組成物は、抗炎症性免疫寛容原性DCの分化を引き起こした。他方で、本明細書で開示する組成物の抗炎症活性を、アロエベラ葉液汁濃縮物(0.507mg/ml)の非存在下又は存在下でLPSにより活性化したマクロファージ(500,000個の細胞)からの尿素(μg)の産生を測定する、アルギナーゼ活性アッセイにより更に評価した。アルギナーゼアッセイは、アロエ組成物が、炎症性M1マクロファージの抗炎症性M2マクロファージへの転換又は極性化を促進したという、アロエ組成物の利点を明らかにした。
【００２７】
II. アロエ製品
本明細書で開示するアロエ製品は、脱色アロエベラ、アロエベラ液汁濃縮物、脱色アロエベラの、及びアロエベラ液汁濃縮物の多糖富化画分、アロエベラ葉内部並びに1種又は複数種の賦形剤を含む。
【００２８】
アロエベラ液汁は、液体液汁、液汁濃縮物又は乾燥液汁濃縮物であり得る。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、3ppm以下のアロインを含み得る。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、約10ppm以下のアロインを含み得る。一部の実施形態では、アロエベラ液汁は、約1ppm、2ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm又は9ppm以下のアロインを含み得る。
【００２９】
アロエベラ液汁は、少なくとも5%のアセチル化アセマンナンを含み得る。一部の実施形態では、アセチル化アセマンナンの分子量は、50,000ダルトン〜10,000,000ダルトンであり得る。一部の実施形態では、アセチル化アセマンナンの分子量は、100,000〜5,000,000ダルトンであり得る。一部の実施形態では、アセチル化アセマンナンの分子量は、50,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000、700,000、750,000、800,000、850,000、900,000、950,000、1,000,000、1,050,000、1,100,000、1,150,000、1,200,000、1,250,000、1,300,000、1,350,000、1,400,000、1,450,000、1,500,000、1,550,000、1,600,000、1,650,000、1,700,000、1,750,000、1,800,000、1,850,000、1,900,000、1,950,000、1,000,000、2,000,000、2,050,000、2,100,000、2,150,000、2,200,000、2,250,000、2,300,000、2,350,000、2,400,000、2,450,000、2,500,000、2,550,000、2,600,000、2,650,000、2,700,000、2,750,000、2,800,000、2,850,000、2,900,000、2,950,000、3,000,000、3,050,000、3,100,000、3,150,000、3,200,000、3,250,000、3,300,000、3,350,000、3,400,000、3,450,000、3,500,000、3,550,000、3,600,000、3,650,000、3,700,000、3,750,000、3,800,000、3,850,000、3,0900,000、3,950,000、4,000,000、4,050,000、4,100,000、4,150,000、4,200,000、4,250,000、4,300,000、4,350,000、4,400,000、4,450,000、4,500,000、4,550,000、4,600,000、4,650,000、4,700,000、4,750,000、4,800,000、4,850,000、4,900,000、4,950,000、5,000,000ダルトン又はこれらの値間の任意の数値であり得る。
【００３０】
アロエベラ濃縮物は、純粋なアロエベラ液汁であり得る。アロエベラ液汁は、アロエベラ液汁2倍濃縮物であり得る。アロエベラ液汁は、アロエベラ液汁約5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、105倍、110倍、115倍、120倍、125倍、130倍、135倍、140倍、145倍、150倍、155倍、160倍、165倍、170倍、175倍、180倍、185倍、190倍、195倍、200倍濃縮物又はこれらの値間のいずれかの数値であり得る。
【００３１】
また、アロエベラ製品は、酸度変更剤を含み得る。酸度変更剤は、クエン酸、クエン酸塩、リンゴ酸、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、乳酸、乳酸塩、酒石酸又は酒石酸塩、蟻酸及び塩、プロピオン酸及び塩、酪酸及び塩、吉草酸及び塩、リン酸及び塩であり得る。一実施形態では、酸度変更剤は、0.1〜10%の濃度を有し得る。一部の実施形態では、酸度変更剤は、0.2〜5%の濃度を有し得る。別の実施形態では、酸度変更剤は、正確に、又は約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5.0%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6.0%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7.0%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%又はこれらの値間のいずれかの数値の濃度を有し得る。
【００３２】
一部の実施形態では、賦形剤の濃度は、0.01〜2%である。一部の実施形態では、賦形剤の濃度は、0.01〜0.5%である。別の実施形態では、酸度変更剤は、正確に、又は約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%又はこれらの値間のいずれかの数値の濃度を有し得る。
【００３３】
一部の実施形態では、アロエベラ製品中の賦形剤は、保存料である。保存料は、ソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、乳酸、乳酸塩、クエン酸、クエン酸塩、リンゴ酸、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ローズマリー抽出物、ラベージ抽出物、キトサン、セージ精油、チモール油、ナイシン、e-ポリリジン、ブドウ種子抽出物、クコの実（ゴジベリー）抽出物及び又はそれらの組合せであり得る。
【００３４】
一部の実施形態では、賦形剤は、セルロース粉末、加工デンプン、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメルロースナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム又は二酸化ケイ素である。
【００３５】
一部の実施形態では、アロエベラ製品は、香味剤を含む。一部の実施形態では、香味剤は、1つ又は複数の糖、蜂蜜、果糖、デキストロース、マルトデキストリン又はガム、21 CFR 101.22(a)(3)及び(EC)No 1334/2008で規定されている天然及び/又は人工香料である。
【００３６】
一部の実施形態では、香味剤の濃度は、0.1〜50%である。別の実施形態では、香味剤は、正確に、又は約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5.0%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6.0%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7.0%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、11.1%、11.2%、11.3%、11.4%、11.5%、11.6%、11.7%、11.8%、11.9%、12.0%、12.1%、12.2%、12.3%、12.4%、12.5%、12.6%、12.7%、12.8%、12.9%、13.0%、13.1%、13.2%、13.3%、13.4%、13.5%、13.6%、13.7%、13.8%、13.9%、14.0%、14.1%、14.2%、14.3%、14.4%、14.5%、14.6%、14.7%、14.8%、14.9%、15.0%、15.1%、15.2%、15.3%、15.4%、15.5%、15.6%、15.7%、15.8%、15.9%、16.0%、16.1%、16.2%、16.3%、16.4%、16.5%、16.6%、16.7%、16.8%、16.9%、17.0%、17.1%、17.2%、17.3%、17.4%、17.5%、17.6%、17.7%、17.8%、17.9%、18.0%、18.1%、18.2%、18.3%、18.4%、18.5%、18.6%、18.7%、18.8%、18.9%、19.0%、19.1%、19.2%、19.3%、19.4%、19.5%、19.6%、19.7%、19.8%、19.9%、20.0%、20.1%、20.2%、20.3%、20.4%、20.5%、20.6%、20.7%、20.8%、20.9%、21.0%、21.1%、21.2%、21.3%、21.4%、21.5%、21.6%、21.7%、21.8%、21.9%、22.0%、22.1%、22.2%、22.3%、22.4%、22.5%、22.6%、22.7%、22.8%、22.9%、23.0%、23.1%、23.2%、23.3%、23.4%、23.5%、23.6%、23.7%、23.8%、23.9%、24.0%、24.1%、24.2%、24.3%、24.4%、24.5%、24.6%、24.7%、24.8%、24.9%、25.0%、25.1%、25.2%、25.3%、25.4%、25.5%、25.6%、25.7%、25.8%、25.9%、26.0%、26.1%、26.2%、26.3%、26.4%、26.5%、26.6%、26.7%、26.8%、26.9%、27.0%、27.1%、27.2%、27.3%、27.4%、27.5%、27.6%、27.7%、27.8%、27.9%、28.0%、28.1%、28.2%、28.3%、28.4%、28.5%、28.6%、28.7%、28.8%、28.9%、29.0%、29.1%、29.2%、29.3%、29.4%、29.5%、29.6%、29.7%、29.8%、29.9%、30.0%、30.1%、30.2%、30.3%、30.4%、30.5%、30.6%、30.7%、30.8%、30.9%、31.0%、31.1%、31.2%、31.3%、31.4%、31.5%、31.6%、31.7%、31.8%、31.9%、32.0%、32.1%、32.2%、32.3%、32.4%、32.5%、32.6%、32.7%、32.8%、32.9%、33.0%、33.1%、33.2%、33.3%、33.4%、33.5%、33.6%、33.7%、33.8%、33.9%、34.0%、34.1%、34.2%、34.3%、34.4%、34.5%、34.6%、34.7%、34.8%、34.9%、35.0%、35.1%、35.2%、35.3%、35.4%、35.5%、35.6%、35.7%、35.8%、35.9%、36.0%、36.1%、36.2%、36.3%、36.4%、36.5%、36.6%、36.7%、36.8%、36.9%、37.0%、37.1%、37.2%、37.3%、37.4%、37.5%、37.6%、37.7%、37.8%、37.9%、38.0%、38.1%、38.2%、38.3%、38.4%、38.5%、38.6%、38.7%、38.8%、38.9%、39.0%、39.1%、39.2%、39.3%、39.4%、39.5%、39.6%、39.7%、39.8%、39.9%、40.0%、40.1%、40.2%、40.3%、40.4%、40.5%、40.6%、40.7%、40.8%、40.9%、41.0%、41.1%、41.2%、41.3%、41.4%、41.5%、41.6%、41.7%、41.8%、41.9%、42.0%、42.1%、42.2%、2.3%、42.4%、42.5%、42.6%、42.7%、42.8%、42.9%、43.0%、43.1%、43.2%、43.3%、43.4%、43.5%、43.6%、43.7%、43.8%、43.9%、44.0%、44.1%、44.2%、44.3%、44.4%、44.5%、44.6%、44.7%、44.8%、44.9%、45.0%、45.1%、45.2%、45.3%、45.4%、45.5%、45.6%、45.7%、45.8%、45.9%、46.0%、46.1%、46.2%、46.3%、46.4%、46.5%、46.6%、46.7%、46.8%、46.9%、47.0%、47.1%、47.2%、47.3%、47.4%、47.5%、47.6%、47.7%、47.8%、47.9%、48.0%、48.1%、48.2%、48.3%、48.4%、48.5%、48.6%、48.7%、48.8%、48.9%、49.0%、49.1%、49.2%、49.3%、49.4%、49.5%、49.6%、49.7%、49.8%、49.9%、50.0%又はこれらの値間の任意の数値の濃度を有し得る。
【００３７】
アロエベラ組成物は、栄養補助食品の部分として使用することができる。栄養補助食品は、錠剤、カプセル、ソフトゲル、グミ、経口溶解錠剤、トローチ剤、粉末又は液体であり得る。
【００３８】
一部の実施形態では、栄養補助食品中の脱色アロエベラ液汁の量は、1〜500gである。一部の実施形態では、栄養補助食品中の脱色アロエベラ液汁の量は、5〜300gである。一部の実施形態では、栄養補助食品中の脱色アロエベラ液汁の量は、正確に、又は約1g、5g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、155g、160g、165g、170g、175g、180g、185g、190g、195g、200g、205g、210g、215g、220g、225g、230g、235g、240g、245g、250g、255g、260g、265g、270g、275g、280g、285g、290g、295g、300g、305g、310g、315g、320g、325g、330g、335g、340g、345g、350g、355g、360g、365g、370g、375g、380g、385g、390g、395g、400g、405g、410g、415g、420g、425g、430g、435g、440g、445g、450g、455g、460g、465g、470g、475g、480g、485g、490g、495g、500g又はこれらの値間の任意の数値である。
【００３９】
一部の実施形態では、栄養補助食品中の脱色アロエベラ液汁の量は、1〜5mgである。一部の実施形態では、栄養補助食品中の脱色アロエベラ液汁の量は、50〜300mgである。
【００４０】
III. アロエベラ製品の調製
一実施形態では、アロエベラ製品は、2000ガロン混合タンク等の大きな混合タンク中で調製することができる。タンクの内容物を混合しながら、アロエベラ液汁及び賦形剤をタンクに添加してもよい。次に、1種又は複数種の香味剤をタンクに添加してもよい。混合物の最終pHは、約2.9〜3.4であり得る。混合物の最終pHは、正確に、又は約2.9、3.0、3.1、3.2、3.3若しくは3.4又はこれらの値間の任意の数値であり得る。水を添加して、混合タンクを最大容量まで満たしてもよい。次に、タンクの内容物を、正確に、又は約195°Fの熱交換器を通して加工して、製品を形成することができる。製品を、瓶詰前に室温まで冷却してもよい。
【００４１】
別の実施形態では、アロエベラ製品は、40ガロンステンレススチール混合タンク等の大きな混合タンク中で調製することができる。タンクの内容物を混合しながら、アロエベラ液汁及び賦形剤をタンクに添加してもよい。混合しながら、精製したアロエベラ乾燥液汁粉末及び1種又は複数種の香味剤を添加してもよい。アロエベラ乾燥液汁粉末及び1種又は複数種の香味剤が完全に溶解されるまで、混合を継続してもよい。追加の香味剤及び/又は甘味料も添加してもよい。水を添加して、混合タンクを最大容量まで満たしてもよい。次に、タンクの内容物を、正確に、又は約195°Fの熱交換器を通して加工して、製品を形成してもよく、瓶詰前に室温まで冷却してもよい。
【００４２】
別の実施形態では、アロエベラ製品は、ブレンダー中で調製することができる。乾燥アロエベラ液汁粉末、マルトデキストリン及び糖を、ブレンダーに添加し、正確に、又は約5分間混合してもよい。混合は、正確に、又は約6、7、8、9又は10分間継続し得る。ポリエチレン袋又は他の好適な容器中で、賦形剤、固化防止剤、着色剤及び香味剤を混合してもよい。次に、ポリエチレン袋の内容物を、ブレンダーに添加することができる。ブレンダーの内容物を均質になるまで混合して、最終製品を形成することができる。最終製品は、消費のために、正確に、又は約4〜8オンスの水と混合してもよい。一部の実施形態では、最終製品は、消費のために、正確に、又は約5、6又は7オンスの水と混合してもよい。
【００４３】
一実施形態では、アロエベラ製品は、vブレンダー中で調製することができる。精製した乾燥アロエベラ液汁粉末、賦形剤及び固化防止剤を、ブレンダーに添加し、正確に、又は約10分間混合してもよい。内容物を、1、2、3、4、5、6、7、8若しくは9分間又はこれらの値間の任意の数値の間混合してもよい。潤滑剤をブレンダーに添加してもよく、内容物を、正確に、又は約追加の4分間混合して、粗粉末を形成してもよい。次に、粗粉末を、正確に、又は約474mgの標的化充填質量で、「0」ハードシェルカプセルに被包してもよい。充填質量は、正確に、又は約450.3mg〜497.7mgに及び得る。充填質量は、正確に、又は約450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg若しくは490mg又はこれらの値間の任意の数値であり得る。最終カプセルは、正確に、又は約30分以下の崩壊時間を有し得る。最終カプセルは、正確に、又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30分間又はこれらの値間の任意の数値の崩壊時間を有し得る。
【００４４】
別の実施形態では、アロエベラ製品は、vブレンダー中で調製することができる。精製した乾燥アロエベラ液汁粉末、賦形剤、充填剤及び結合剤を、ブレンダーに添加し、正確に、又は約15分間混合してもよい。内容物を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13若しくは14分間又はこれらの値間の任意の数値の間混合してもよい。潤滑剤をブレンダーに添加してもよく、内容物を、正確に、又は約追加の3分間混合して、粗製品を形成してもよい。打錠のために、粗製品を携帯容器に滴下してもよい。打錠は、標準の手技下で操作される打錠プレス機で進めることができる。プレス機は、正確に、又は約607mgの標的錠剤質量を有するように調節してもよい。プレス機は、正確に、又は約576.7mg〜637.4mgの標的錠剤質量を有するように調節してもよい。プレス機は、正確に、又は約575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg若しくは640mg又はこれらの値間の任意の数値の標的錠剤質量を有するように調節してもよい。錠剤の硬さは、正確に、又は約6〜12kpであり得る。錠剤の硬さは、正確に、又は約6kp、7kp、8kp、9kp、10kp、11kp若しくは12kp又は任意の2つの上述の値により規定される範囲間の任意のキロポンド(kp)であり得る。錠剤は、正確に、又は約30分間以下の崩壊時間を有し得る。錠剤は、正確に、又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30分間又はこれらの値間の任意の数値の崩壊時間を有し得る。
【００４５】
一部の実施形態では、アロエベラ葉全体液汁は、成熟アロエベラ葉から製造することができる。成熟アロエベラ葉は収穫され、収穫の正確に、又は約24時間以内に加工工場に輸送され得る。葉は、塩素処理水で洗浄及び消毒してもよい。葉の先端及び基部は、機械的に除去することができる。次に、葉の残りの部分を粉砕機に通し、次に、加工タンクに入れてもよい。正確に、又は約50〜60℃で、好適な量の酵素をタンクに添加してもよい。正確に、又は約30分後に、温度を、正確に、又は約85℃まで上昇させてもよい。次に、未加工の液汁を仕上げ機に通して、細胞繊維を除去することができる。次に、液汁を、活性炭に通して、正確に、又は約0.1ppm以下までアロインを除去してもよい。次に、液汁を、そのまま使用してもよい。一部の実施形態では、液汁を、真空蒸着により更に濃縮して、アロエベラ液汁濃縮物にしてもよい。
【００４６】
一部の実施形態では、アロエベラ乾燥葉液汁は、成熟アロエベラ葉から製造することができる。成熟アロエベラ葉は収穫され、収穫の正確に、又は約24時間以内に加工工場に輸送され得る。葉は、塩素処理水で洗浄及び消毒してもよい。葉の先端及び基部は、機械的に除去することができる。次に、葉の残りの部分を粉砕機に通し、次に、加工タンクに入れてもよい。正確に、又は約50〜60℃で、好適な量の酵素をタンクに添加してもよい。正確に、又は約30分後に、温度を、正確に、又は約85℃まで上昇させてもよい。次に、未加工の液汁を仕上げ機に通して、細胞繊維を除去することができる。次に、液汁を、活性炭に通して、正確に、又は約0.1ppm以下までアロインを除去してもよい。次に、液汁を、そのまま使用してもよい。液汁を、噴霧乾燥によりアロエベラ乾燥液汁粉末に更に加工してもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、アロエベラ葉内部液汁は、天然アロエベラ葉から製造することができる。成熟アロエベラ葉は収穫され、収穫の正確に、又は約24時間以内に加工工場に輸送され得る。葉は、塩素処理水で洗浄及び消毒してもよい。葉の先端及び基部は、機械的に除去することができる。次に、葉の残りの部分を粉砕機に通し、次に、加工タンクに入れてもよい。正確に、又は約50〜60℃で、好適な量の酵素をタンクに添加してもよい。正確に、又は約30分後に、温度を、正確に、又は約85℃まで上昇させてもよい。次に、未加工の液汁を仕上げ機に通して、細胞繊維を除去することができる。次に、液汁を、活性炭に通して、正確に、又は約0.1ppm以下までアロインを除去してもよい。次に、液汁を、そのまま使用してもよい。一部の実施形態では、液汁を、真空蒸着により更に濃縮して、アロエベラ液汁濃縮物にしてもよい。
【００４８】
一部の実施形態では、アロエベラ葉内部液汁は、天然アロエベラ葉から製造することができる。成熟アロエベラ葉は収穫され、収穫の正確に、又は約24時間以内に加工工場に輸送され得る。葉は、塩素処理水で洗浄及び消毒してもよい。葉の先端及び基部は、機械的に除去することができる。次に、葉の残りの部分を粉砕機に通し、次に、加工タンクに入れてもよい。正確に、又は約50〜60℃で、好適な量の酵素をタンクに添加してもよい。正確に、又は約30分後に、温度を、正確に、又は約85℃まで上昇させてもよい。次に、未加工の液汁を仕上げ機に通して、細胞繊維を除去することができる。次に、液汁を、活性炭に通して、正確に、又は約0.1ppm以下までアロインを除去してもよい。次に、液汁を、そのまま使用してもよい。液汁を、噴霧乾燥によりアロエベラ乾燥液汁粉末に更に加工してもよい。
【００４９】
一部の実施形態では、PS富化アロエベラ画分は、アロエベラ乾燥液汁を85%エチルアルコール中に溶解することにより作製することができる。次に、この溶液を遠心分離してもよく、上清を捨て、エタノール不溶性固体を収集することができる。固体は、凍結乾燥又はリフラクタンス・ウインドウ（refractance window）乾燥等の適切な乾燥法により乾燥させることができる。
【００５０】
IV. 処理
一部の実施形態では、本明細書で説明するアロエベラ組成物は、マイクロバイオームの健全性及び量を改善するために哺乳動物に投与され得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００５１】
一部の実施形態では、本明細書で説明するアロエベラ組成物は、ヒトマイクロバイオームに対する有益な効果を誘導するために哺乳動物に投与され得る。かかるヒトマイクロバイオームに対する有益な効果として、短鎖脂肪酸の産生の増大、結腸における総微生物個体数の増大、近位結腸における酢酸塩の産生の増大、近位結腸におけるプロピオン酸塩の産生の増大、近位結腸における全細菌の個体数の増大、近位結腸における一過性濃度のビフィズス菌の個体数の増大、腸における強い抗炎症応答、Caco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系における腸バリア透過性の減少又は腸鎮静作用が挙げられるが、これらに限定されない。腸透過性は、当業者に公知の任意の好適な方法により測定することができる。一部の実施形態では、腸透過性は、Caco-2細胞とTHP1マクロファージとの共培養系におけるルシファーイエローの傍細胞輸送により測定することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、本明細書で説明するアロエベラ組成物は、哺乳動物に対する有益な効果を誘導するために哺乳動物に投与され得る。有益な効果は、抗酸化的利益であり得る。かかる抗酸化有益効果として:酸化的ストレス条件下での生物学的に有意義な抗酸化保護;免疫細胞へのシグナルの活性化及び阻害;抗炎症性化合物が、より低用量で応答を示すことが許容されるのみであり、一方で、免疫活性化物質が、異なる用量範囲で活性である、免疫細胞への二相性応答の誘導;並びに腸における強い抗炎症応答が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書で開示するアロエベラ組成物は、リーキーガット又は他の関連する徴候を治療するために使用することができる。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書で開示するアロエベラ組成物は、慢性炎症、免疫不全、免疫障害又は他の関連する徴候を治療するために使用することができる。
【００５５】
V. SHIME(登録商標)実験
本開示のアロエ製品の毎日の反復用量の可能性のある特性を評価するために、SHIME系を使用することができる。SHIME系は、長期間にわたり、かつ代表的な条件下で複雑な腸微生物生態系の培養を可能にする、in vitro連続モデルである。更に、SHIME系は、試験製品の反復摂取のシミュレーションを可能にする。反応器設定は、ヒト成人の消化管を代表する。
【００５６】
SHIMEは、図1で示す通り、ヒト消化管の様々な部分をシミュレートする5個の反応器の連続物を有する。最初の2個の反応器は、胃(V1)及び十二指腸(V2)区画に、それぞれ、規定量のSHIME食物(140mL 3回/日)並びに膵液及び胆液(60mL 3回/日)を添加し、指定の間隔後に各々の反応器を空にする蠕動ポンプを伴う、食物取り込み及び消化における様々な工程をシミュレートするための充填-引き抜き原理のものである。最後の3つの区画は、一定体積及びpH制御で連続攪拌される反応器である。異なる容器の保持時間及びpHは、消化管の異なる部分におけるin vivo条件に似るように選択される。大腸をシミュレートする、最後の3個の容器の全滞留時間は、72時間である。便微生物叢の接種に際して、これらの反応器は、上行(V3)、横行(V4)及び下行(V5)結腸をシミュレートする。種菌調製、保持時間、pH、温度設定及び反応器供給組成物条件を、以下の表に示す。
【００５７】
【表１】
2019524707.tif 000003
【００５８】
SHIME系は、科学及び産業プロジェクトの両方について15年を超えて広範に使用されており、in vivoパラメータにより検証されている。結腸の様々な領域における微生物群の安定化に際して、異なる結腸領域において組成及び機能性の両方が異なる代表的な微生物群が、3つの結腸区画において確立されている。
【００５９】
A. 微生物群組成及び活性の解析
全実験を通して、いくつかの微生物パラメータをモニターすることができる。これらの測定は、モデルの性能を評価し、対照期間と比較した処理のための微生物群組成及び活性における基礎的変化のモニタリングを可能にするために必要であり得る。
【００６０】
全ての結腸区画から3回/週、短鎖脂肪酸(SCFA:short chain fatty acid)試料を採取して、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、イソカプロン酸及びカプロン酸の濃度を解析してもよい。更に、3回/週、胃及び小腸からの試料を収集して、製品中に保存されているSCFAが上部GITにおいて放出されているかどうかを評価してもよい。
【００６１】
アンモニウムは、タンパク質分解のマーカーの1つである。全ての結腸区画から3回/週、試料を採取して、アンモニウムについて試験してもよい。アンモニウム産生は、主にタンパク質分解の結果であり、直接的及び非直接的健康有害効果と関連付けられるので、したがって、アンモニウム産生の低減は、有益であると考えられ得る。加えて、また、SHIMEにおけるアンモニウム濃度は、処理期間中の細菌のための限定された基質利用可能性についてのマーカーとして、又は製品それ自体の特異的発酵についてのマーカーとして見なすことができる。
【００６２】
ヒト腸は、乳酸塩産生細菌及び乳酸塩利用細菌の両方を宿している。乳酸塩は、乳酸細菌により産生され、環境pHを減少させ、また、抗菌剤としても作用する。また、それは、他の微生物により酢酸塩、酪酸塩及びプロピオン酸塩に迅速に変換され得る。全ての結腸区画から1回/週、試料を採取してもよい。
【００６３】
酸及び塩基の消費を記録して、実験に沿って結腸酸性化を評価することができる。
【００６４】
追加の試料を収集して、ホスト-細菌相互作用並びに炎症及び腸透過性に関連する可能性のあるマーカーに対する試験製品の効果を解析してもよい。
【００６５】
B. 微生物群組成
定量的PCR(qPCR:quantitative PCR)は、特異的細菌配列(16S rRNA遺伝子)の増幅に基づき、様々な時点での微生物生態系におけるこれらの特異的配列の数の定量と組み合わせた分子技術である。qPCRは典型的に、全細菌群、特定の細菌群又は特定の細菌種を定量するために使用される。この技術は、細菌の培養能(の欠落)に依存しないので、この方法で生成したデータは、特定の処理のための、微生物群に対する定量的効果についてより信頼できる概要を提供する。
【００６６】
全細菌、ビフィズス菌、ラクトバシラス属、ファーミキューテス門及びバクテロイデス門をモニターするために、特定の定量的PCR(qPCR)プロトコールを使用することができる。
【００６７】
C. ホスト-微生物叢相互作用解析
SHIME系の様々な結腸領域から収集した試料を、腸炎症に対する試験製品の効果を評価するために使用した。例えば、図4は、共培養モデルを示す。
【００６８】
系を設定するために、Caco-2細胞を、腸細胞様成熟まで半透過性インサート中で生育させ得る。14日後、機能的極性化単層が形成する場合があり、次に、インサートを活性化THP-1マクロファージの上部上に置いてもよい。THP1の存在は、Caco-2上皮に対する損傷を誘導し、それによってバリア完全性に影響し得る(TEERの減少)。最後に、炎症を誘導する(炎症促進性サイトカインレベルの増大する)ために、LPSを基底(BL)側に添加してもよい。
【００６９】
このIBD様モデルは、(TEERの増大を誘導することにより)腸上皮バリア完全性を保護することができ、かつ(炎症促進性サイトカインを低減させ、抗炎症性サイトカインを増大させることにより)炎症を低減させ得る物質の効果を試験するために使用することができる。SHIME懸濁液を細胞層と接触させることにより、試験を行うことができる。このアプローチの独特な局面は、製品及び消化工程中に腸微生物叢により産生されるその代謝産物(純粋な製品単独のみではなく)により誘導される効果を評価することが可能であるという事実に存する。行われる試験は、
・腸細胞単層膜完全性及び透過性の減少の表示としての、経上皮電気抵抗(TEER)測定、
・単層透過性の表示としての、BL区画におけるルシファーイエロー透過の評価、
・SHIME懸濁液との接触後の、BL区画におけるサイトカイン産生(IL-8、IL-6、TGF-β、IL-10)及びNF-κB活性の測定
を含み得る。
【００７０】
D. 短鎖脂肪酸(SCFA)
SCFAは、腸細菌による主に糖分解発酵の典型的な最終産物である。SCFAプロファイルは主に、酢酸塩、プロピオン酸塩及び酪酸塩並びに少量のイソ酪酸、吉草酸及びイソ吉草酸からなる。酢酸塩は腸から吸収され、ホストによりエネルギー物資として使用され得るが、酪酸塩は腸上皮の主要なエネルギー源として作用し、炎症及び結腸がんに対する保護効果が証明されている。最後に、プロピオン酸塩は、酪酸塩と比較すると腸で同様の局所活性を有するが、また、それは肝臓に輸送されて、そこで正のコレステロール低下効果及び血糖コントロールに対する効果を有することが示された。この理由のために、酪酸塩及びプロピオン酸塩は、酢酸塩と比較するとホストにとってより健康に有益であると考えられ、酪酸塩及び/又はプロピオン酸塩産生の増大への腸における微生物発酵プロファイルの調節は、有益であると考えられる。
【００７１】
E. 乳酸塩解析
ヒト腸は、乳酸塩産生細菌及び乳酸塩利用細菌の両方を宿している。乳酸塩は、乳酸細菌により産生され、環境pHを減少させ、また、抗菌剤としても作用する。また、それは、他の微生物により酢酸塩、酪酸塩及びプロピオン酸塩に迅速に変換され得る。
【００７２】
乳酸塩は、他のSCFA産生の代謝中間体であり、したがって、その濃度は時間で変動する。また、乳酸塩の一過的な集積は、各結腸反応器における微生物群の代謝能に依存する。
【００７３】
F. 作動中のpH変化
最適環境条件が維持されることを確実にするために、SHIME系のpHを、pHコントローラーにより以下の範囲:5.6〜5.9(PC);6.5〜6.8(DC)で制御する。しかしながら、様々な反応器における微生物群の安定化(接種後2週間から開始する)に際して、微生物群は、それ自体で自己調節することができ、酸-塩基消費は、通常低い。
【００７４】
処理中、細菌が試験製品に適応し、例えば大量のSCFAを産生した場合、反応器の環境は酸性化し、これは、各々の反応器への塩基の更なる投与の手段により追加のpH制御をもたらす。これに関連して、実験中の酸性化の程度は、細菌代謝の強度の測定として使用することができる。
【００７５】
G. 微生物群組成の解析
qPCRは、特異的細菌配列(16S rRNA遺伝子)の増幅に基づき、様々な時点での微生物生態系におけるこれらの特異的配列の数の定量と組み合わせた分子技術である。この技術は、細菌の培養能(の欠落)に依存しないので、この方法で生成したデータは、微生物群に対する定量的効果についてより信頼できる概要を提供する。
【００７６】
H. 腸壁調節に対する効果
1. 腸バリア透過性及び炎症
腸透過性に対する試験製品及びその代謝産物の効果を評価するために、SHIMEの様々な区画から収集した試料を、Caco-2細胞の単層と接触させ得る。この効果は通常、タイトジャンクションのレベルで評価される。後者は、隣接する上皮細胞を一緒にし、それによって、流体に対して実質的に不透過性のバリアを形成するタンパク質である。経上皮電気抵抗(TEER)は、これらの構造の「堅固さ」の測定を可能にし、高いTEERは、より堅固なバリアに対応する。損傷が生じた場合、これらのタンパク質が変化し、バリア機能が失われる。この場合、図16で示す通り、TEERは低減し、流体の傍細胞輸送(細胞間)は増大し得る。更に、ルシファーイエロー(LY)の傍細胞輸送を解析することにより、腸バリア透過性に対する効果を観察することができる。化学的、機械的又は病原体誘発バリア破壊は、図17で示す通り、内腔から粘膜固有層への細菌の流入を引き起こし得る。これは、免疫系を活性化し、免疫系は、生理学的「免疫寛容原性」炎症から有害な病的炎症に転換する。
【００７７】
炎症性シグナル伝達カスケードは、炎症促進性サイトカイン(例えばTNF-α及びIL-1)等の警報分子の産生を開始する。これらは、ケモカイン(例えばIL-8)及び接着分子の産生を誘導し、これは、次に、好中球の動員及び活性酸素種(ROS)の産生を引き起こす。これらは、細菌を殺滅するために、及び上皮壁における可能性のある裂け目を塞ぐために必要であるが、しかしながら、また、それらは、組織破壊を引き起こし、炎症をもたらし得る。
【００７８】
したがって、炎症の消散に関連するサイトカインが活性化される。中でも、IL-6及びIL-10である。
- IL-6は、MCP-1の活性化を通して、単球/マクロファージ動員をもたらし、これは、好中球のクリアランスを促進する。また、IL-6は、IL-1等の炎症促進性サイトカインの産生を阻害することができる。更に、IL-6は、腸上皮の再生及び創傷治癒に対して正の効果を有する。
- IL-10は、生得的及び適応性免疫系の両方からのいくつかの細胞を抑制して、抗炎症性分子の活性化を誘導し、調節性T細胞(Treg:T regulatory cell)機能を向上させることができ、これは、次に、免疫ホメオスタシスを復元する。
【００７９】
これらのスイッチオフ機構が損なわれ、免疫ホメオスタシスが復元され得ない場合、腸病理が生じる場合があり、これは慢性炎症をもたらし得る。炎症に関して、TNF-αは、図18で示す通り、炎症を増幅することができるので、免疫系により産生される最も重要かつ危険なサイトカインの1つである。
【００８０】
相殺されない場合、TNF-αは、慢性炎症を引き起こし、急性炎症の場合、死さえ引き起こし得る。この理由のために、抗TNF-α療法は、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患(IBD:inflammatory bowel disease)及び乾癬等のいくつかの慢性炎症状態で広範に使用される。例えば、IBDでは、抗TNF-α療法は通常、慢性炎症を治療するために使用される。しかしながら、これらは、いくつかの副作用:長期応答喪失、感染へのより高い易感染性及び(TNF-αが抗腫瘍分子であるので)より高い悪性腫瘍の発生を有する。
【実施例】
【００８１】
(実施例1)
2000ガロン混合タンクに、7442.5kgの精製したアロエベラ液汁を添加した。ミキサーを作動させながら、7.72kgの安息香酸ナトリウム及び7.72kgのソルビン酸カリウムをタンクに添加した。バッチに香料を添加した。2.9〜3.4の間の最終pHになるように、23.2kgのクエン酸ナトリウム及び約120〜125kgのクエン酸を添加した。最終バッチ質量まで指定した体積に達するように水を添加する。2000ガロンの仕上がった製品が産生された。次に、ブレンドを195°Fの熱交換器に通し、瓶詰前に室温まで冷却した。
【００８２】
(実施例2)
110kgの精製水を、40ガロンステンレススチール混合タンクに注入した。ミキサーを作動させながら、0.12kgの安息香酸ナトリウム、0.12kgのソルビン酸カリウムをタンクに添加した。連続混合しながら、0.55kgの精製したアロエベラ乾燥液汁粉末及び2.66kgのクエン酸を添加し、完全に溶解するまで混合した。次に、香料及び甘味料を添加した。30ガロンの仕上がった製品が産生された。次に、ブレンドを195°Fの熱交換器に通し、瓶詰前に室温まで冷却した。
【００８３】
(実施例3)
ブレンダーに、66.8kgのマルトデキストリン、25kgの糖、5.63kgの精製した乾燥アロエ液汁粉末を添加し、5〜10分間混合した。ポリエチレン袋に、0.53kgのリンゴ酸、0.25kgのベータカロテン、二酸化ケイ素及び香料を混合し、次に、ブレンダーに添加した。混合物を均一になるまで混合した。4gの粉末を、4〜8液量オンスの水と混合した。
【００８４】
(実施例4)
vブレンダーに、383.6kgのセルロース粉末、72.3kgの精製した乾燥アロエベラ液汁粉末及び8.05kgの二酸化ケイ素を添加し、次に、10分間混合した。次に、5.05kgのステアリン酸マグネシウムをブレンダーに添加し、追加の4分間混合した。粉末を、被包のために保存瓶に滴下した。粉末を、標的化充填質量474mg(450.3mg〜497.7mgの範囲)で「0」ハードシェルカプセルに被包した。カプセルは、30分以下の崩壊時間を有した。
【００８５】
(実施例5)
Vブレンダーに、433.3kgの微結晶セルロース、72.3kgの精製した乾燥アロエベラ液汁粉末、16kgのクロスカルメルロースナトリウム及び79.8kgの炭酸カルシウムを添加した。混合物を15分間ブレンドした。次に、6kgのステアリン酸マグネシウムをブレンダーに添加し、混合物を追加の3分間混合した。ブレンドした混合物を、打錠のために携帯容器に滴下した。打錠プレス機を、標準の手技に従って操作した。プレス機を、576.7mg〜637.4mgの範囲で、607mgの標的錠剤質量を有するように調節した。錠剤硬度は6〜12kpであり、崩壊時間は30分以下であった。
【００８６】
(実施例6)
アロエベラ葉全体液汁又はアロエベラ乾燥葉全体液汁粉末を、後述の通り製造した。成熟葉を収穫し、収穫の24時間以内に加工工場に輸送した。葉は、塩素処理水で洗浄及び消毒した。葉の先端及び基部は、機械的に除去した。葉の残りの部分を粉砕機に通し、次に、加工タンクに入れた。室温〜60℃で、0〜500gの酵素をタンクに添加した。セルロース物質を除去した後、液汁の温度を、95℃まで上昇させた。液汁を、活性炭カラムに通して、0.1ppm以下までアロインを除去した。液汁を、そのまま使用することができた。しかしながら、液汁を、真空蒸着により更に濃縮して、アロエベラ液汁濃縮物にした。或いは、液汁は、噴霧乾燥、凍結乾燥又はリフラクタンス・ウインドウ乾燥によりアロエベラ乾燥液汁粉末に更に加工することができた。
【００８７】
(実施例7)
アロエベラ葉内部液汁又はアロエベラ乾燥葉内部液汁粉末を、後述の通り製造した。成熟葉を収穫し、収穫の24時間以内に加工工場に輸送した。葉は、塩素処理水で洗浄及び消毒した。葉の先端、基部及び外皮は、機械的に除去した。葉のフィレを粉砕機に通し、次に、加工タンクに入れた。室温〜60℃で、0〜100gの酵素をタンクに添加した。セルロース物質を除去した後、液汁の温度を、85℃まで上昇させた。液汁を、樹脂カラムに通して、0.1ppm以下までアロインを除去した。液汁を、そのまま使用することができた。しかしながら、液汁を、噴霧乾燥によりアロエベラ乾燥液汁粉末に更に加工した。
【００８８】
(実施例8)
SHIME(登録商標)技術プラットフォームを使用したヒト消化管におけるアロエベースの製品の効果の評価。
この実験の目的は、
・SHIME媒体中の1.5g/LのEpicor(Embria社、USA);免疫調節/抗炎症効果を示した陽性対照、
・バッチ培養物により規定される、アロエ材料、1日につき3杯(=SHIME媒体中の0.507g/L)及び
・バッチ培養物により規定される、アロエ材料、理想的には1日につき6杯(=SHIME媒体中の1.014g/L)
を比較することであった。
【００８９】
図2に示す通り、この実験における使用のためにTWINSHIMEをTripleSHIMEに改変した。図3で示す通り、TripleSHIMEでは、6つの結腸区画は、古典的な一連の上行、横行及び下行結腸の代わりに、一連のPC-DC、PC-DC及びPC-DC(PC=近位結腸;DC=遠位結腸)として作用した。
【００９０】
このSHIME実験は、3段階:開始;対照;及び処理を有した。適切な便試料(短期バッチ実験で使用したのと同じドナー)を結腸反応器に接種した後、2週間の開始期間は、微生物群が、局所環境条件によって様々な反応器で分化することを可能にした。実験は、標準のSHIME食物が14日間の期間の間モデルに投与される対照期間中に開始した。典型的な基礎媒体は、以下の通りに構成された:アラビノガラクタン(1g/L)、ペクチン(2g/L)、キシラン(1g/L)、デンプン(4.2g/L)、グルコース(0.4g/L)、酵母抽出物(3g/L)、ペプトン(1g/L)、ムチン(4g/L)、システイン(0.5g/L)。この期間中の試料の解析は、様々な反応器中の基線微生物群組成及び活性の決定を可能にし、次に、それを、処理からの結果と比較するための対照として使用した。実験期間中、SHIME反応器を、規準条件下で操作したが、各日に試験製品と共に改変した食物を補給した。各1杯の低投与量を考慮して、消化管における製品の効果の鮮明な概要を得る機会を最大限にするために、SHIME処理を6週間提供した。
【００９１】
図5、図6、図7及び図8は、様々なSHIME区画の実験週ごとの酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩及び総SCFA産生を示す。
【００９２】
腸細胞単層膜完全性及び透過性の減少の指標として、経上皮電気抵抗(TEER)測定試験を行った。
【００９３】
BL区画におけるルシファーイエロー透過の評価は、単層透過性の指標である。SHIME懸濁液との接触後の、BL区画におけるサイトカイン産生(IL-8、IL-6、TGF-β、IL-10)及びNF-κB活性の測定を評価した。
【００９４】
図22で示す通り、データをT試験解析の手段により比較して、対照期間と処理期間との間の変化を査定した。低投与量の試験製品のための処理効果の遅延の可能性を考慮して、対照と全処理期間又は処理の最後の5、4若しくは3週間のいずれかとの間で統計比較を行った。
【００９５】
全ての製品は、総SCFA産生の増大をもたらし、この増大は、6杯のアロエについてはPCにおいて、並びに3及び6杯のアロエの両方については遠位結腸においてのみ統計的に有意であった。
【００９６】
アロエ製品は、近位結腸においてより高い酢酸塩産生をもたらし、6杯は、3杯と比較してより強い効果を有した。対照的に、Epicorの存在下では、酢酸塩濃度における統計的に有意な変化は観察されなかった。
【００９７】
プロピオン酸塩を考慮すると、統計的に有意な増大をもたらした唯一の製品は、近位結腸における6杯のアロエであった。
【００９８】
最後に、アロエ製品及びEpicorは、酪酸塩に関するそれらの効果により更に区別された。実際に、3杯のアロエは、近位及び遠位結腸の両方における酪酸塩濃度の増大で有効であったが、Epicorは、DCにおいてのみ統計的に有意な効果をもたらした。3杯で観察されたものとは対照的に、6杯のアロエは、いずれの酪酸塩効果も示さなかった。
【００９９】
図5、図6、図7及び図8における単一の週の処理を見ると、全ての製品は、2週間の処理後に最大効果に達することができ、したがって、製品の反復用量がこれらの効果を誘導するために必要であるように見える。
【０１００】
実験過程全体を通した様々な結腸領域における乳酸塩濃度の解析を、図9に示す。TripleSHIMEへの試験製品の投与は、様々な結腸区画において乳酸塩濃度に対して主要な影響を有しなかった。
【０１０１】
実験過程全体を通した様々なシミュレートされた結腸領域におけるアンモニウム濃度の解析を、実験週及び実験期間の両方について(CTRL対TREAT)、図10A及び図10Bに示した。
【０１０２】
全ての試験製品は、近位及び遠位結腸区画の両方においてアンモニウム産生の同様の増大傾向をもたらした。この増大は、PCにおける3杯のアロエについて、及びDCにおける6杯のアロエ及びEpicorについて統計的に有意であった。
【０１０３】
実験過程全体を通した様々な結腸領域における酸塩基消費の解析を、図11A、図11Bに、TripleSHIMEのアームの各々についてのNaOH及びHClの消費として示した。対照期間、処理の最初の3週間及び処理の最後の3週間中の平均消費として、データを示した。
【０１０４】
全ての試験製品の存在下で、酸と比較して、塩基消費は常に高く、結腸酸性化に連結した代謝プロセスが起こったことを示した。
【０１０５】
しかしながら、対照と処理との間で大きな差は観察されなかったように、試験製品により誘導された変化は、様々な結腸セクターにおいて微生物代謝の強い不均衡をもたらさなかった。
【０１０６】
これは、SCFAの増大がタンパク質分解活性の増大により平衡した、以前に示したデータと一致する。
【０１０７】
微生物群組成の解析
SHIMEの各結腸区画から週に1回、試料を収集して、全細菌、バクテロイデス門、ファーミキューテス門、ビフィズス菌及びラクトバシラス属についての定量的PCR(qPCR)の手段により、内腔微生物群組成に対する処理の効果を評価した。内腔微生物群組成を、定量的PCR解析を使用して解析した。
【０１０８】
図12A〜図12E、図13A〜図13E及び図14A〜図14Eにおいて、データを実験週(2週間の対照及び6週間の処理)ごとに示した。図12A〜図12E、図13A〜図13E及び図14A〜図14Eで示すqPCRデータの解析は、以下の傾向を示した:
・アロエ(3杯)は、PCにおいて全細菌のわずかな増大をもたらしたが、一方で、DCにおいては、変化は観察されなかった。わずかな増大は主に、バクテロイデス門の増大と関連付けることができるが、一方で、ファーミキューテス門は影響を受けなかった。製品は、ラクトバシラス属生成（lactobacillogenic）効果を全く示さなかった。ビフィズス菌の濃度は、処理2週間後に一過的なピークを示した。
・アロエ(6杯)は、PC及びDCの両方において全細菌の増大をもたらした(+0.2ログ)。この増大は主に、バクテロイデス門及びファーミキューテス門の増大と関連付けることができる。3杯に関するかぎりでは、製品は、ラクトバシラス属生成効果を全く示さなかった。ビフィズス菌の濃度は、PC及びDCの両方において一過的な増大を示した。3杯と比較すると、この場合、効果が用量依存的であると観察することが可能である。実際に、6杯では、ビフィズス菌の濃度は、PCにおいて処理の週1、2及び3中に、並びにDCにおいて週2及び3中に(対照期間の基線と比較して)より高かった。
・Epicorは、PCにおいて全細菌の遅延した効果をもたらした(処理の週4、5及び6に沿って最大0.2ログ)。この増大は、バクテロイデス門(+0.7ログ)及びファーミキューテス門両方のより高い濃度に連結された。製品は、ラクトバシラス属生成効果を全く示さなかった。3杯のアロエに関するかぎりでは、ビフィズス菌の濃度は、PC及びDCの両方において処理2週間後に一過的なピークを示した。
【０１０９】
解析した様々な細菌群の量で起こったわずかな変化のために、また、質的変化(すなわち、種の変化)が起こった場合がある。可能性のある質的変化は、フィンガープリンティング技術(すなわち、DGGE)の手段により研究することができる。
【０１１０】
腸壁調節-腸バリア透過性及び炎症-に対する効果
データを、以下の様式で示す:
1. 第1の組のグラフ(図19A〜図19G)は、実験対照:増殖培地(gM:growth media)、リポ多糖(LPS)、酪酸ナトリウム(NaB:Sodium butyrate)及びヒドロコルチゾン(HC:hydrocortisone)並びにまた、未加工の(消化/発酵なし)研究製品(アロエ及びEpiCor)を示す:
・2つの濃度のアロエ:0.507g/L(Alo1)及び1.014g/L(Alo2)を、細胞上で直接的に試験した
・1つの濃度のEpiCor:1.5g/Lを、細胞上で直接的に試験した
・全ての製品を、細胞培養液中に新しく調製し、濾過滅菌した
・全てのグラフにおいて、結果を、対照(TEER及びLYについてはgM、並びに免疫マーカーについてはLPS)に対して正規化した;この様式において、対照を1.0に設定し、試験した条件を倍変化として示す
・一元配置分散分析及びダネットの事後検定を使用することにより、統計的有意性を試験した:*、**及び***は、それぞれ、p<0.05、p<0.01及びp<0.001を示す
2. 第2の組のグラフ(図19H〜図19N)は、SHIME試料について得られた結果を示す:
・全ての値を、対応する対照期間に対して正規化した。したがって、対照試料を1.0に設定し、処理を倍変化として示す
・スチューデントt検定(C対T)を使用することにより、統計的有意性を試験した:*、**及び***は、それぞれ、p<0.05、p<0.01及びp<0.001を示す
・全てのグラフにおいて:C:対照期間;T:処理期間;PC近位結腸;DC:遠位結腸
【０１１１】
予想される通り、増殖培地対照(gM)は、Caco-2細胞に対する活性化THP1細胞により誘導された損傷のために、24時間後にTEERのほとんど20%の減少を示した(図示せず)。酪酸ナトリウム(NaB;陽性対照)は、低用量で与えられた場合、この損傷からCaco-2細胞を保護すること、及び単層のTEERを維持することができた(p<0.05)(図19A〜図19N)。確認可能である通り、また、全ての純粋な試験製品-アロエ及びEpiCor-は、TEERを維持することにより(これはアロエ2及びEpiCorについてのみ有意であったが)この損傷から単層を保護することができ、両方ともNaBと同様のレベルを示した。
【０１１２】
しかしながら、LY等の小分子の傍細胞輸送は、試験製品のいずれによってもほとんど影響を受けなかった;それにもかかわらず、アロエ2は、TEERで観察された増大と一致する、LYの傍細胞輸送の軽度の減少を示した。
【０１１３】
図19C〜図19Fで示す通り、NaBは、NF-ΚB活性(クロマチンに対するヒストンデアセチラーゼ(HDAC:histone deacetylase)阻害活性の減衰により仲介される効果)を誘導した。これは、NF-ΚB等の転写因子のアセチル化の増大、及びその結果、転写活性の増大をもたらす。サイトカイン及びケモカインに対するNaBの効果は、細胞系依存的であり、炎症促進効果及び抗炎症効果の両方を有した。ここで、NaBは、おそらくNF-ΚB誘導遺伝子転写の増大により仲介される効果である、全てのサイトカインの増大を誘導した。
【０１１４】
アロエ及びEpiCorの効果は、サイトカイン依存的であるように見えた。例えば、アロエは、その抗炎症特性について公知であり、また、これはここで、特に試験した最高濃度(アロエ2)で明らかであった。一方で、アロエ(2)は、LPS誘導IL-10を増大させることができ、他方で、LPS誘導IL-6(たとえ有意でなくても)、IL-8及びTNF-αをわずかに低減させることができた。しかしながら、これは、NF-ΚB活性の調節に依存的であるように見えず、むしろ転写後又は翻訳後機構により仲介され得ることに留意されたい。純粋な製品としてのEpiCorは、高く誘導されるように見えるTNF-αを除いては、試験した用量でLPS誘導サイトカインに大きく影響を及ぼすように見えない。最後に、予想される通り、LPS(細菌由来分子)は、炎症促進性及び抗炎症性サイトカインの両方の分泌を増大させることができ、NF-ΚB活性を誘導することができた。対照的に、図19Gで示す通り、コルチコステロイドであるヒドロコルチゾン(HC)は、全てのLPS誘導免疫マーカーの分泌を弱めることにより(おそらくNF-ΚB活性を減少させることにより)免疫抑制剤として作用した。
【０１１５】
純粋な製品で得られた結果とは対照的に、アロエの発酵由来代謝産物は、THP-1細胞により誘導された損傷からCaco-2単層を保護することができなかった;それどころか、処理試料は、各々の対照試料と比較すると、TEERのわずかな減少を誘導するように見えた;図19H〜図19Iで示す通り、アロエ2についての遠位結腸からの試料のみが、例外であるように見えた(有意ではないが)。
【０１１６】
LYの傍細胞輸送は、アロエ由来試料についてTEER結果と一致した。
【０１１７】
対照的に、EpiCorの発酵由来代謝産物は、TEERに対して効果を示さなかったが、LY輸送に対して効果を示し、特に遠位結腸反応器から収集した試料は、各々の対照と比較すると、LYに対する透過性の減少を示した。
【０１１８】
サイトカイン産生を評価する場合、図19J〜図19Nで示す通り、TNF-αは、より不規則な結果を有するように見えた:それは、アロエ1_PCにより低減され、アロエ1_DCにより誘導されたが、一方で、アロエ2は、反対(アロエ2_PCにおける増大及びアロエ2_DCにおける減少)を示した。対照的に、IL-8及びNF-κB活性は、アロエ発酵由来代謝産物により中程度に影響を受けるか、又は全く影響を受けない。
【０１１９】
IL-10及びIL-6を考慮した場合、一方で、LPS誘導サイトカインに対するアロエ発酵由来製品の効果は、結腸反応器に依存的であるように見えた。他方で、2つの濃度は、ほとんど反対の結果を有するように見えた:IL-10及びIL-6は、PC及びDC試料の両方によりアロエ1によって誘導されたが、それらは、両方の結腸試料によりアロエ2によって低減された。未加工製品とは対照的に、EpiCor由来代謝産物は、以前に観察された通り、共培養物においてLPS誘導TNF-αレベルを低減することができた。
【０１２０】
最後に、観察(試料)間の類似性及び変数(測定)間の相関を調査するために、図20に示す通り、ジョイントPCA/相関バイプロットを作成した。バイプロットは、変数をベクトルとして、観察を点としてプロットした。
【０１２１】
データは、2つの成分に低減した場合、第1の2つの成分により約70%説明され、ここで、第1の成分は、元の7個の変数における偏差のほとんど40%を占める。第1の成分に大部分寄与する変数は、TEER、IL-8及びIL-10であり、一方で、NF-ΚB、TNF-α及びIL-6は、大部分は第2の成分に寄与する。第1の成分は主に、アロエ1及び2と共に分類されるアロエ2_DCを除いては、未加工製品を残りのものから分離した。
【０１２２】
この実験の目的は、腸微生物群組成及び活性並びに炎症及びバリア透過性に関するホスト腸壁の調節について、2用量のアロエ製品と示された免疫調節特性を有する製品(すなわち、Embria社のEpiCor)とを比較することであった。
【０１２３】
全ての製品は、総SCFA産生の増大をもたらした。より具体的には、アロエは、(3杯と比較してより強い効果を有する6杯で)PCにおいてより高い酢酸塩産生、PC(6杯)においてより高いプロピオン酸塩及びより高い酪酸塩(EpiCor及び3杯のアロエの両方)をもたらした。製品の反復用量は、これらの効果を誘導するために必要であった。
【０１２４】
試験製品の投与は、乳酸塩濃度に対して大きな影響を有しなかった。
【０１２５】
全ての試験製品は、近位及び遠位結腸区画の両方において、アンモニウム産生における同様の増大傾向をもたらした。この増大は、PCにおける3杯のアロエについて、並びにDCにおける6杯のアロエ及びEpicorについて統計的に有意であった。
【０１２６】
全ての試験製品の存在下で、塩基消費は常に、酸と比較してより高く、結腸酸性化に連結した代謝プロセスが起こったことを示した。しかしながら、試験製品により誘導された変化は、様々な結腸セクターにおいて微生物代謝の強い不均衡を引き起こさなかった。
【０１２７】
アロエ(3杯)は、バクテロイデス門の増大と主に関連付けられる、PCにおける全細菌のわずかな増大をもたらした。ビフィズス菌の濃度は、2週間の処理後に一過的なピークを示した。アロエ(6杯)は、バクテロイデス門及びファーミキューテス門の増大と主に関連付けられる、PC及びDCの両方における全細菌の増大をもたらした。ビフィズス菌の濃度は、PC及びDCの両方において一過的な増大を示した。Epicorは、PCにおいて全細菌に対する遅延した効果をもたらした。この増大は、バクテロイデス門(+0.7ログ)及びファーミキューテス門の両方のより高い濃度に連結された。ビフィズス菌の濃度は、2週間の処理後に一過的なピークを示した。
【０１２８】
観察された微生物パラメータは、総SCFA産生の増大、プロピオン酸効果及び腸微生物叢に対する阻害効果の非存在の点で、(SHIMEについて異なるドナーを使用して)EpiCorで以前に観察されたことと、及び様々な用量のアロエ製品で行われた短期前試験にて観察されたことと一致した。
【０１２９】
全ての測定についての正規化値を、図21で要約し、ここで、データを色勾配に変換した。未加工品を試験した場合、より高い濃度のアロエ(1.014g/L)は、低濃度のアロエ(0.507g/L)及びEpiCor(1.5g/L)と比較して、最も興味深い結果を示した:
・アロエは、(THP1細胞により誘導された損傷からCaco-2細胞を保護することにより)TEERを維持し、それによって、Caco-2バリア完全性に対する正の効果を有することができた。
・また、アロエは、図21で示す通り、LPS誘導IL-10レベル(真の抗炎症性サイトカイン)を増大させ、IL-6レベルを維持し、LPS誘導IL-8及びTNF-αレベルの両方を減少させることができ、最も注目に値するのは最後のサイトカインについての結果であった。
・得られた結果は、アロエの認識されている抗炎症効果と一致した。しかしながら、発酵させると、これらの結果の一部は、結果全体においてほとんどの未加工アロエ(2)に最もよく似たアロエ2_DCを除いては、もはや明らかではなかった。したがって、これらの結果は、製品がまだその最もインタクトな形態である小腸でより起こるようである。
【０１３０】
(実施例8)
2種のアロエベースの試験製品:アロエベースの葉全体(WL:whole leaf)製品及びアロエベースの葉内部(IL:inner leaf)製品の生物学的特性の考証。
この実験の目的は、選択抗酸化及び抗炎症バイオアッセイを使用して、2種のアロエベースの製品、葉全体製品及び葉内部製品の基礎的試験結果を比較すること、並びに2種の粗製品及びそれらのin vitro消化物の用量応答の理解を得ることであった。
【０１３１】
最初に、試験製品/画分中の化合物が生存細胞に進入するかどうか、又は細胞膜レベルで細胞シグナル伝達を介して作用を仲介するかどうかを理解することが重要であった。また、更なるバイオアッセイのための用量を最適化するために両方の種類の細胞事象について用量応答を知ることが必須であった。
【０１３２】
試験製品について以下の3種の試験を並行して行った:
1.  抗酸化能;
2.  CAP-eアッセイを使用した、細胞抗酸化保護及びバイオアベイラビリティ;
3.  活性酸素種(ROS)の細胞産生に対する効果。
【０１３３】
以下の試験製品を比較した:
【０１３４】
【表２】
2019524707.tif 000004
【０１３５】
粗粉末を細胞培養物に添加するための調製において、所与の試験日の使用前に、後述の手技を即座に行った。各粉末の500mg分を、5mL生理食塩水(PBS)中に分散し、振動機上に1時間置いて、水性化合物を緩衝液に可溶化させた。インキュベーション後、固体を遠心分離により除去し、次に0.22ミクロンフィルターを通して滅菌濾過した。
【０１３６】
in vitro消化した(IVD:in vitro digested)製品を、後述の通りに調製した。製品を(上述の通り)PBSと1時間混合した後、ヒト唾液アミラーゼ(3.9μ/mL)を添加し、製品を37℃に10分間置いた。次に、塩酸を添加して、試料のpHを2.0まで低下させ、ブタペプシン(1.3mg/mL)を添加して、胃の消化条件を模倣した。次に、胃内の消化をシミュレートするために、試料を37℃の振盪機に入れ、2時間振盪した。この後、重炭酸ナトリウムを使用して試料のpHを7.0まで上昇させることにより、ペプシン酵素を不可逆的に不活性化した。IVD製品の一定分量を、-20℃で凍結保存し、所与の試験日の使用前に、各製品の1つの一定分量を即座に融解した。
【０１３７】
全抗酸化能
製品を、ホリン・シオカルトアッセイ(全抗酸化能アッセイ又は全フェノール類アッセイとしても公知)で試験した。このアッセイは、抗酸化物質を測定するためにホリン・シオカルト試薬を利用する。ホリン・シオカルトフェノール試薬を抽出物の連続希釈物に添加し、完全に混合し、5分間インキュベートすることにより、アッセイを行う。炭酸ナトリウムを添加し、色を産生する化学反応を開始する。反応を、37℃で30分間継続させる。比色プレートリーダーで765nmの光学吸光度を測定する。参考標準として没食子酸を使用し、データを、製品のグラム当たりの没食子酸相当で報告した。
【０１３８】
細胞ベースの抗酸化保護アッセイ
使用した方法は、ORAC試験に匹敵する抗酸化可能性の査定を可能にしたが、脂質二重層細胞膜を横断し、細胞に進入し、酸化的ストレス条件下で生物学的に有意義な抗酸化保護を提供することができる抗酸化物質の測定のみを可能にした。
【０１３９】
CAP-eバイオアッセイは、天然製品及び成分を取り扱うために特に開発された。この方法は、査読科学文献において公表されている、多数の種類の天然製品及び成分について使用されている。
【０１４０】
赤血球(RBC:red blood cell)を、モデル細胞種として使用した。RBCは、PMN細胞等の他の細胞種とは対照的に、不活性細胞種である。このアッセイは、図22で示す通り、細胞ベースの系において複雑な天然製品からの抗酸化物質を査定することができるように特に開発された。
【０１４１】
新しく精製したヒトRBCを生理食塩水中で反復して洗浄し、次に、試験製品に曝露した。試験製品とのインキュベーション中、細胞膜を横断することができる任意の抗酸化化合物は、RBCの内部に進入することができた。次に、RBCを洗浄して、細胞により吸収されなかった化合物を除去し、活性酸素種への曝露に際して蛍光に変わるDCF-DA染料をロードした。ペルオキシル非含有ラジカル生成物質AAPHの添加により、酸化を誘発した。蛍光強度を評価した。非処理対照細胞の低い蛍光強度はベースラインの役割を果たし、AAPH単独で処理したRBCは最大酸化的損傷の陽性対照の役割を果たした。
【０１４２】
試験製品に曝露したRBCの蛍光強度の低減が観察され、続いてAAPHに曝露された場合、これは、試験製品が、細胞に透過し、それらを酸化的損傷から保護するために利用可能な抗酸化物質を含有したことを示した。
【０１４３】
炎症細胞によるフリーラジカル形成に対する効果
また、抗酸化能を有する多くの天然製品は、炎症細胞においてROS形成を低減する。しかしながら、他の製品は実際には、抗酸化能にもかかわらず、ROS形成を増大させる場合があり、これは、抗菌防御機構のサポートと抗酸化能との間の興味深い協調を示し得る。
【０１４４】
したがって、天然製品は、(図23で示す通り)3つの異なる機構:
1.  直接的な抗酸化効果によりROSを中和すること;
2.  抗炎症性細胞シグナルを誘発し、ROS形成の低減をもたらすこと;
3.  免疫反応を誘発し、ROS形成の向上をもたらすこと
によりPMN細胞ROS形成に影響を与え得る。
【０１４５】
ヒト多形核(PMN:polymorphonuclear)細胞を、ROS形成に対する製品の効果を試験するために使用する。この細胞種は、ヒトにおいて白血球の約70%を構成する。PMN細胞は、ある特定の炎症性刺激に際して大量のROSを産生する。
【０１４６】
新しく精製したヒトPMNを、試験製品に曝露した。試験製品とのインキュベーション中、細胞膜を横断することができる任意の抗酸化化合物は、PMN細胞の内部に進入することができ、シグナル伝達事象を誘発する化合物は、そうすることができる。次に、細胞を洗浄し、ROSへの曝露に際して蛍光に変わるDCF-DA染料をロードした。H2O2の添加により、ROS形成を誘発した。PMN細胞の蛍光強度を、フローサイトメトリーにより評価した。非処理対照細胞の低い蛍光強度はベースラインの役割を果たし、H2O2単独で処理したPMN細胞は陽性対照の役割を果たした。
【０１４７】
抽出物に曝露し、続いてH2O2に曝露したPMN細胞の蛍光強度が、H2O2単独と比較して低減した場合、これは、試験製品が抗炎症効果を有することを示した。
【０１４８】
対照的に、試験製品に曝露したPMN細胞の蛍光強度が、H2O2単独と比較して増大した場合、これは、試験製品が、抗菌免疫防御機構の炎症促進局面を向上させることによる炎症促進効果を有することを示した。
【０１４９】
異なる健康なドナーからの細胞について3回、試験を行った。
【０１５０】
全抗酸化能
図24の結果は、2種の粗製品(上部グラフ)、続いて消化プロセスを通して採取した2種の製品(中間のグラフ)及び全ての試験製品のオーバーレイ(下部グラフ)についての全抗酸化能を示す。粗製品を実線で示し、in vitro消化プロセス(IVD)を通して採取した製品を破線で示す。in vitro消化についての緩衝液/試薬対照を、点線として示す。
【０１５１】
葉全体製品(WL)は、葉内部製品(IL)より約2倍高い抗酸化能を示した。
【０１５２】
葉全体IVD及び葉内部IVDを、互いに、及びPBS-IVD緩衝液対照と比較した場合、葉全体IVDは優れた抗酸化能を有し、一方で、葉内部IVD製品はこのアッセイにおいてPBS-IVD緩衝液対照と非常に類似した結果を示した。
【０１５３】
細胞抗酸化保護アッセイ
図25の結果は、2種の粗製品(上部グラフ)、続いて消化プロセスを通して採取した2種の製品(中間のグラフ)及び全ての製品のオーバーレイ(下部グラフ)についての細胞抗酸化保護を示す。粗製品を実線で示し、in vitro消化プロセス(IVD)を通して採取した製品を破線で示す。in vitro消化についての緩衝液/試薬対照を、点線として示す。
【０１５４】
葉全体(WL)製品は、最高用量で軽度の細胞抗酸化保護を示した。しかしながら、細胞は、それらの用量でいくらかの溶解を示した。
【０１５５】
他の製品/消化画分のいずれも、このアッセイにおいて細胞抗酸化保護を示さなかった。
【０１５６】
このデータは、ROSアッセイにおける作用機構を解釈するための重大な根拠としての役割を果たした。
【０１５７】
炎症細胞によるフリーラジカル形成に対する効果
このアッセイでは、抽出物に曝露され、続いてH2O2に曝露されたPMN細胞の蛍光強度が、H2O2単独と比較して低減した場合、これは、試験製品が、抗炎症効果を有することを示した。
【０１５８】
対照的に、試験製品に曝露したPMN細胞の蛍光強度が、H2O2単独と比較して増大した場合、これは、試験製品が、抗菌免疫防御機構の炎症促進局面を向上させることによる炎症促進効果を有することを示した。注釈:WL-IVDは、より高い用量でPMN細胞死を誘導した。
【０１５９】
より高い用量のある特定の製品(例、WL-IVD 2g/L)に曝露した場合、一部の培養物において、ある程度の細胞死が見られた。図26は、乏しい生存率(細胞死の増大)に対して優れたPMN細胞生存率を有する試料のフローサイトメトリーヒストグラムの例を示す。広範な細胞死を伴う培養物からのROSデータは、妥当ではなく、図27及び図30におけるデータグラフのそれらのデータ点については「X」で示す。
【０１６０】
全抗酸化能
葉全体(WL)製品は、その粗形態及びその消化形態の両方で、葉内部(IL)製品より高い抗酸化能を示した。
【０１６１】
葉内部(IL)製品は、葉全体(WL)製品の約半分の抗酸化能しか示さず、消化すると、この抗酸化能は消滅した。
【０１６２】
細胞抗酸化保護アッセイ
CAP-eアッセイの結果は、葉全体(WL)粗製品のみが、脂質二重層細胞膜を横断し、細胞に進入し、酸化的ストレス条件下で生物学的に有意義な抗酸化保護を提供することができる抗酸化物質を含有することを示した。
【０１６３】
葉内部製品も、いずれかの製品の消化画分も、細胞抗酸化保護を提供することができる抗酸化物質を含有しなかった。
【０１６４】
炎症細胞によるフリーラジカル形成に対する効果
図23の図解で説明する通り、免疫細胞は、複雑な天然製品から活性化シグナル及び阻害シグナルの両方を受容することができ、多くの場合、強い抗炎症性化合物が、免疫活性化物質(典型的に異なる用量範囲で活性)がより希釈されており、もはや抗炎症性シグナルに優先しない、より低用量で応答を示すことが許容されるのみである、二相性用量応答が見られる。
【０１６５】
葉全体(WL)及び葉内部(IL)製品の両方は、3人の健康な血液ドナーのうちの2人からの細胞培養物においてU型の用量応答を示した。ILの抗炎症効果は、WLより強く、これは、ILにおけるより高レベルの抗炎症性化合物又はWLにおけるより高レベルの免疫活性化化合物のいずれかのためであり得る。
【０１６６】
注目すべきことに、WL IVDは、全ての3人のドナーからの細胞培養物においてWL粗製品より強い抗炎症応答を示した。
【０１６７】
(実施例9)
PBMCにおけるLPS刺激サイトカイン発現に対する様々なアロエ組成物の効果の評価
この実験の目的は、脱色アロエベラ葉液汁、アロエベラ葉内部液汁濃縮物及び高含有量の多糖(すなわち、アセマンナン)を含有するそれらの画分の抗炎症効果及び免疫調節効果を評価することであった。
【０１６８】
以下の製品を試験した。
【０１６９】
【表３】
2019524707.tif 000005
【０１７０】
50pg/mlのリポ多糖(LPS)により刺激された様々なサイトカインの発現に対する上記アロエ材料の効果を試験するために、健康な男性からのヒト末梢血単核細胞(PBMC)を使用した。PBMCは、リンパ球(T細胞、B細胞及びNK細胞)、単球及び樹状細胞を含む免疫細胞集団である。ヒトにおいて、これらのサブ集団の各々の出現頻度は、個体間で変動する。
【０１７１】
サイトカインアッセイを後述の通りに行った。各アロエ材料を培養液中に希釈し、1μg〜100μg/mlの最終濃度になるようにPBMCに添加した。37℃で1時間のインキュベーション後、一部の細胞を、炎症促進性刺激である50pg/mlのLPSで処理し、一方で、他の細胞はLPSの非存在下で培養し続けた。24時間のインキュベーション後、上清を回収し、サイトカイン(IL-1β、IL-6、MIP-1α、TNF-α、IL-8及びIL-10)について解析した。対照は、抗炎症活性についてアロエ調製物を試験する場合はLPS又はPBMCに対する直接的効果についてアロエ調製物を試験する場合は培養液のいずれかであった。各々の値は、試験したサイトカインごとの2回の読み出しの平均であった。
【０１７２】
PBMCにおけるサイトカイン分泌の炎症性LPS刺激に対するアロエ組成物の効果
図33A(I)〜図33C(V)の棒グラフは、アロエ試験材料、脱色アロエベラ葉液汁(アロエ100倍)並びに、それぞれ、脱色アロエベラ葉液汁及びアロエベラ葉内部液汁濃縮物から作製した多糖(PS)富化調製物(アロエ100倍PS及びアロエ200倍PS)でのPBMCの処理により引き起こされた、サイトカインのLPS刺激発現における有意な変化を示す。
【０１７３】
脱色アロエベラ葉液汁及びその多糖富化調製物(アロエ100倍PS)は、MIP-1α及びTNF-αの両方のLPS刺激発現を減少させ、アロエ材料が抗炎症効果を有することを示した。
【０１７４】
アロエベラ葉内部液汁濃縮物から作製した多糖富化調製物(アロエ200倍PS)は、MIP-1α及びTNF-αのLPS刺激発現を減少させ、IL-10のレベルを増大させ、アロエ材料が強い抗炎症効果を有することを示した。
【０１７５】
PBMCにおけるサイトカイン分泌に対するアロエ組成物の効果
図34A〜図34Bの棒グラフは、アロエ試験材料、脱色アロエベラ葉液汁(アロエ100倍)並びに、それぞれ、脱色アロエベラ葉液汁及びアロエベラ葉内部液汁濃縮物から作製した多糖富化調製物(アロエ100倍PS及びアロエ200倍PS)でのPBMCの処理により引き起こされた、サイトカインの定常状態発現における有意な変化を示す。
【０１７６】
外部炎症促進性刺激の非存在下では、高含有量の多糖(すなわち、アセマンナン)を含有する脱色アロエベラ葉液汁の画分(アロエ100倍PS)は、炎症促進性(IL-1β、TNF-α、IL-6、MIP-1α)及び抗炎症性(IL-10)サイトカインの両方の定常状態発現を有意に上昇させ、アロエ材料が免疫調節効果を有することを示した。
【０１７７】
外部炎症促進性刺激の非存在下では、高含有量の多糖(すなわち、アセマンナン)を含有するアロエベラ葉内部液汁濃縮物の画分(アロエ200倍PS)は、炎症促進性(IL-1β、TNF-α、IL-6、MIP-1α)及び抗炎症性(IL-10)サイトカインの両方の定常状態発現を有意に上昇させ、アロエ材料が免疫調節効果を有することを示した。
【０１７８】
脱色アロエベラ葉液汁の投与は、NK及びNKT細胞を直接的に活性化し、アロエ材料が、細菌及びウイルス等の病原性微生物への、並びに体内で生ずるがん細胞等の異常な細胞への生得的な免疫応答に対してのみでなく、糖尿病、アテローム性動脈硬化症及びがん等の自己免疫疾患への適応性の免疫応答に対しても、任意の刺激(例えば、LPS)の非存在下でさえも免疫調節効果を有することを示した。
【０１７９】
免疫ホメオスタシスに対する脱色アロエベラ葉液汁の効果
脱色アロエベラ葉液汁の投与は、LPSの存在下で抗炎症性免疫寛容原性DCの分化をもたらし、そのため、CD4 T細胞とのそれらの相互作用は、IL-10及びIL-5等の抗炎症性Th2サイトカインの有意に上昇した産生並びにTh1サイトカインである炎症性IFN-γの有意に低減した産生をもたらした。これらの結果は、アロエベラ葉液汁濃縮物のヒト消費が、消化管腸粘膜における末梢性免疫寛容を通して、免疫ホメオスタシスを向上させ得ることを示す。
【０１８０】
脱色アロエベラ葉液汁の投与は、LPS活性化マクロファージのアルギナーゼ活性に対するLPSの抑制効果を有意に打ち消し、アロエ組成物が、炎症性M1マクロファージの抗炎症性M2マクロファージへの転換又は極性化を促進し得ることを示した。
【０１８１】
(実施例10)
様々なin vitro技術を使用した脱色アロエベラ葉及び葉内部調製物の生物学的に関連する抗酸化効果及び免疫調節効果の評価
脱色した葉(L)及び葉内部(IL)アロエベラ調製物の抗酸化活性を、ホリン・シオカルト法により全抗酸化能について、及びヒト赤血球を使用して細胞抗酸化保護について査定した。3人の健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞(PBMC)を各アロエベラ調製物で24時間処理し、続いてCD3及びCD56に特異的なモノクローナル抗体での二重染色によりゲート分けされる様々な免疫細胞集団[ナチュラルキラー(NK)細胞(CD3-/CD56+)、NKT細胞(CD3+/CD56+)及びTリンパ球(CD3+/CD56-)]の活性化状態(すなわち、CD25及びCD69の発現)を評価する多パラメータフローサイトメトリーを行うことにより、直接的な免疫調節効果を査定した。PBMC培養物の上清中の炎症促進性及び抗炎症性サイトカインのレベルを測定するために、サイトカインパネルを使用した。各アロエベラ調製物の任意の抗炎症効果を調査するために、PBMCをアロエベラ調製物で前処理し、次に、細菌及びウイルス侵襲を模倣するために、それぞれ、リポ多糖(LPS)又はポリイノシン酸:ポリシチジル酸(ポリI:C)のいずれかにより刺激したことを除いては、同様のアッセイ方法を使用した。
【０１８２】
Lは、ILより高い全抗酸化能を示した。Lは、細胞ベースのアッセイにおいて抗酸化保護を示した。Lは、ILと比較して免疫細胞活性化及びサイトカインレベルの増大を含む、有意な非刺激免疫調節活性並びにLPS及びポリI:C刺激免疫調節活性を示した。脱色アロエベラ葉調製物は、葉内部調製物より高い抗酸化活性及び免疫調節活性を示した。
【０１８３】
上述の説明は、本明細書で開示する組成物及び方法のある特定の実施形態を詳述する。しかしながら、たとえどんなに詳細に本文中において上記が示されても、組成物及び方法は、多くの様式で実施することができることが理解される。上記にも示す通り、本発明のある特定の特質又は態様を説明する場合の特定の用語の使用は、用語が、その用語が関連付けられる技術の特質又は態様の任意の特定の特徴を含むことに限定されるように、本明細書で再定義されていることを意味するとは解釈されるべきでないことに留意すべきである。
【０１８４】
説明する技術の範囲から逸脱することなく、様々な改変及び変化を行うことができることを当業者は理解する。かかる改変及び変化は、実施形態の範囲内に入ると意図される。また、一実施形態に含まれる部分は、他の実施形態と相互変換可能であり、示される実施形態からの1つ又は複数の部分は、任意の組合せで他の示される実施形態に含まれ得ることを、当業者は理解する。例えば、本明細書で説明する、かつ/又は図で示す様々な成分のいずれかは、他の実施形態から組み合わせ、相互変換し、又は除外してもよい。上記の説明は、本発明のいくつかの組成物、方法及び材料を開示する。本発明は、組成物、方法及び材料における改変並びに製作方法及び設備における変化を受けやすい。かかる改変は、本開示の考慮又は本明細書で開示する本発明の実施から、当業者に明らかになる。その結果、本発明は、本明細書で開示する特定の実施形態に限定されるとは意図されず、それは、付属の特許請求の範囲で具体化される本発明の真の範囲及び趣旨に入る全ての改変及び代替物を包含すると意図される。出願人は、新しく、非自明であると考えられる開示する発明の組合せ及び下位の組合せを対象にする特許請求の範囲を提示する権利を保有する。性質、機能、要素及び/又は特性の他の組合せ及び下位の組合せで具体化される発明は、本出願又は関連出願におけるそれらの特許請求の範囲の補正又は新しい特許請求の範囲の提示を通して請求することができる。かかる補正又は新しい特許請求の範囲は、それらが同じ発明又は異なる発明を対象にしていても、及びそれらが元の特許請求の範囲に対して範囲が異なっても、より広くても、より狭くても、又は等しくても、本明細書で説明する本発明の主題に含まれると考えられるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図１９−７】
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【図１９−８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ（Ｉ）】
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【図３３Ａ（ＩＩ）】
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【図３３Ａ（ＩＩＩ）】
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【図３３Ａ（ＩＶ）】
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【図３３Ｂ（Ｉ）】
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【図３３Ｂ（ＩＩ）】
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【図３３Ｂ（ＩＩＩ）】
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【図３３Ｃ−１】
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【図３３Ｃ−２】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月1日(2019.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物、及び1種以上の賦形剤を含む、近位結腸においてヒトマイクロバイオームに対する有益な効果を誘導するための組成物であって、ヒトマイクロバイオームに対する前記有益な効果が、近位結腸における短鎖脂肪酸の産生の増大、近位結腸における総微生物個体数の増大、近位結腸における酢酸の産生の増大、近位結腸におけるプロピオン酸の産生の増大、近位結腸における全細菌の個体数の増大、及び近位結腸における一過性濃度のビフィズス菌の個体数の増大からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
前記有益な効果が、近位結腸における短鎖脂肪酸の産生の増大を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記有益な効果が、近位結腸における総微生物個体数の増大を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記有益な効果が、近位結腸における酢酸の産生の増大を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記有益な効果が、近位結腸におけるプロピオン酸の産生の増大を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記有益な効果が、近位結腸における全細菌の個体数の増大を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記有益な効果が、近位結腸における一過性濃度のビフィズス菌の個体数の増大を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
脱色アロエベラ液汁、アロエベラ濃縮物、及び1種以上の賦形剤を含む、哺乳動物において有益な効果を誘導するための組成物であって、前記有益な効果が、フリーラジカルに曝露された哺乳動物細胞内での抗酸化保護、ナチュラルキラー細胞の活性化、ナチュラルキラーTリンパ球の活性化、Th2型サイトカインの産生の増大、IFN-γの減少、及びM1マクロファージのM2マクロファージへの促進からなる群から選択される、組成物。
【請求項９】
前記Th2型サイトカインが、IL-10又はIL-5である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
酸度変更剤をさらに含み、前記酸度変更剤が、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、乳酸、乳酸塩、酒石酸、酒石酸塩、蟻酸、蟻酸塩、プロピオン酸、プロピオン酸塩、酪酸、酪酸塩、吉草酸、吉草酸塩、リン酸、及びリン酸塩からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アロエベラ濃縮物が、純粋なアロエベラ液汁、アロエベラ液汁2倍濃縮物、アロエベラ液汁25倍濃縮物、アロエベラ液汁50倍濃縮物、アロエベラ液汁75倍濃縮物、アロエベラ液汁100倍濃縮物、アロエベラ液汁125倍濃縮物、アロエベラ液汁150倍濃縮物、アロエベラ液汁175倍濃縮物、又はアロエベラ液汁200倍濃縮物である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記1種以上の賦形剤が、保存料又は香味剤である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
保存料をさらに含み、前記保存料が、ソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、乳酸、乳酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸、酢酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ローズマリー抽出物、ラベージ抽出物、キトサン、セージ精油、チモール油、ナイシン、e-ポリリジン、ブドウ種子抽出物及びクコの実抽出物のうちの1つ以上である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
香味剤をさらに含み、前記香味剤が、蜂蜜、果糖、デキストロース、及びマルトデキストリンのうちの1つ以上である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記1種以上の賦形剤が、セルロース粉末、加工デンプン、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメルロースナトリウム、炭酸カルシウム、及びリン酸二カルシウムからなる群から選択される、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アロエベラ液汁が、液体液汁、液汁濃縮物、又は乾燥液汁濃縮物である、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アロエベラ液汁が、約10ppm以下のアロインを含む、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アロエベラ液汁が、少なくとも約5%のアセチル化アセマンナンを含む、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2019524707.tif 000075
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