(57)【要約】  本発明は、新生血管形成を調節するために人工的に操作された新生血管形成関連因子およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、新生血管形成を調節するために人工的に操作された新生血管形成関連因子および／または新生血管形成関連因子を人工的に操作するための組成物を含む、新生血管形成を人工的に調節するための系に関する。特定の態様では、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１、またはＡＮＧＰＴＬ４などの新生血管形成関連因子および／またはその発現産物を含む新生血管形成調節系が提供される。
2019524847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工的に操作された新生血管形成関連因子であって、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択され、核酸配列が改変されている、人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項２】
前記核酸配列における前記改変が、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって人工的に引き起こされる、請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項３】
前記新生血管形成関連因子が、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数である、請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項４】
前記遺伝子が、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって人工的に操作された新生血管形成関連因子であり、
前記人工的に操作された新生血管形成関連因子が、核酸の１または複数の改変を含み、前記改変が、
前記新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列かまたは前記ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域内の、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、および１または複数の外来ヌクレオチドの挿入の少なくとも１つであるか、
あるいは
前記新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内の１または複数のヌクレオチドの化学修飾である、
請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項５】
前記核酸の改変が、前記遺伝子のプロモーター領域で起こる、請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項６】
前記核酸の改変が、前記遺伝子のエクソン領域で起こる、請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項７】
前記核酸の改変が、前記遺伝子のイントロン領域で起こる、請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項８】
前記核酸の改変が、前記遺伝子のエンハンサー領域で起こる、請求項１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項９】
前記ＰＡＭ配列が、例えば、次の配列（５'から３'方向に記載）
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、および
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
のうち１または複数である、請求項４に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項１０】
前記編集タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数を含む、請求項２に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
【請求項１１】
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦＡ遺伝子の前記核酸配列内の配列番号３、４、７、９、１０および１１の前記標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
前記ＨＩＦ１Ａ遺伝子の前記核酸配列内の配列番号１４、１８、１９、２０、２６、２９および３１の前記標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
前記ＡＮＧＰＴ２遺伝子の前記核酸配列内の配列番号３３、３４、３７、３８、３９および４３の前記標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
前記ＥＰＡＳ１遺伝子の前記核酸配列内の配列番号４７、４８、４９、５０、５３、５４および５５の前記標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、ならびに
前記ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の前記核酸配列内の配列番号６４、６６、６７、７３、７６および７９の前記標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
からなる群から選択される１または複数のガイド核酸を含む、請求項１１に記載のガイド核酸。
【請求項１３】
前記ガイド核酸が、１８〜２３ｂｐのヌクレオチドである、請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
遺伝子操作のための組成物であって、
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、あるいは前記ガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または前記編集タンパク質をコードする核酸配列と
を含む、遺伝子操作のための組成物。
【請求項１５】
前記編集タンパク質が、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む、請求項１４に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項１６】
前記遺伝子操作が、
新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列かまたは前記ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域内の、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、および１または複数の外来ヌクレオチドの挿入の少なくとも１つであるか、
あるいは
前記新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内の１または複数のヌクレオチドの化学修飾である、
核酸の１または複数の改変を含む、請求項１４に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項１７】
前記ＰＡＭ配列が、次の配列（５'から３'方向に記載）
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、および
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
のうち１または複数を含む、請求項１６に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項１８】
前記遺伝子操作のための組成物が、ウイルスベクター系で形成される、請求項１４に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、請求項１８に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２０】
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の配列を分析することによって、被験体における人工的に操作可能な標的部位の配列に関する情報を提供するための方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって提供される前記情報を用いてライブラリーを構築するための方法。
【請求項２２】
遺伝子操作のためのキットであって、
（ａ）ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜７９の標的配列の各々に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸配列と、
（ｂ）それぞれ、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む編集タンパク質、または前記編集タンパク質をコードする核酸配列と
を含む、遺伝子操作のためのキット。
【請求項２３】
血管障害を治療するための組成物であって、
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の１または複数の標的配列の各々に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または前記編集タンパク質をコードする核酸配列と
を含む、血管障害を治療するための組成物。
【請求項２４】
前記標的配列が、配列番号１〜７９の標的配列のうち１または複数を含む、請求項２３に記載の治療用組成物。
【請求項２５】
前記編集タンパク質が、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３に記載の治療用組成物。
【請求項２６】
前記血管障害が、虚血性網膜症または未熟児網膜症である、請求項２３に記載の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生血管形成を調節するために人工的に操作された新生血管形成関連因子およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、新生血管形成を調節するために人工的に操作された新生血管形成関連因子および／または新生血管形成関連因子の人工的操作において使用され得る組成物を含む、新生血管形成を人工的に調節する能力がある系に関する。
【背景技術】
【０００２】
重篤な疾患の多くの例で見られる過剰な新生血管形成は、癌、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節炎および乾癬などの疾患において起こる。そのような状態では、新しい血管は疾患を有する組織に提供され、その結果正常な組織が破壊される。そして癌の場合には、新しい血管は腫瘍細胞が循環系に入り、したがって別の器官に定着する（腫瘍転移）ことを可能にする。
【０００３】
特に、癌細胞は新生血管形成によって栄養分を受け取って、別の器官に転移するので、新生血管形成は癌の増殖および転移に必須である。癌組織で生成される毛細血管の密度と様々な種類の癌の癌転移の確率との間には、実際に密接な関係があることが知られている。さらに、炎症性疾患の中でも代表的な疾患である関節リウマチは、自己免疫障害によって引き起こされるが、疾患の発症の間に、関節間の滑膜腔に生じる慢性的な炎症が新生血管形成を引き起こし、軟骨を破壊する。毎年、世界中の数百万人の人々の失明を招く様々な眼科疾患も、新生血管形成によって引き起こされる。代表的な例として、糖尿病性失明は糖尿病性合併症であり、新生血管形成によって網膜に発生した毛細血管が硝子体に侵入し、失明することをさす。そのため、新生血管形成阻害物質は、持続的な新生血管形成が起こる、癌、慢性関節リウマチ、糖尿病性失明などの様々な疾患の治療薬および予防薬として有用に用いることができる。
【０００４】
一方、従来、新生血管形成を阻害するための血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のシグナル伝達の阻害が活発に研究されてきた。しかし、従来技術では、当初、新生血管形成は阻害されているように思われたが、その後、癌細胞に対する抗癌剤の経路も阻害されるために、癌細胞がより攻撃的になるという副作用があった。
【０００５】
したがって、新生血管形成によって誘発される疾患を治療するための様々な研究が進行しているが、そのような疾患を治療するための根本的な方法はほとんどない。
【０００６】
特に、新生血管形成に起因する癌または癌転移などの重篤な疾患、網膜または角膜編成に起因する失明を治療する方法はなく、そのため、新生血管形成関連疾患を治療するための根本的な方法を開発することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の問題を解決するため、本発明は、新生血管形成作用が改善された、人工的に操作された新生血管形成系に関する。より詳細には、本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子およびその因子によって人工的に改変された機能を有する新生血管形成系に関する。
【０００８】
本発明はまた、特定の目的のために遺伝子操作または改変された新生血管形成関連因子にも関する。
【０００９】
例示的な実施形態として、本発明は、人工的に操作された新生血管形成調節系を提供することに向けられる。
【００１０】
例示的な実施形態として、本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子およびその発現産物を提供することに向けられる。
【００１１】
例示的な実施形態として、本発明は、新生血管形成関連因子を操作するために遺伝子を操作するための組成物およびこれを利用する方法を提供することに向けられる。
【００１２】
例示的な実施形態として、本発明は、新生血管形成を調節するための方法を提供することに向けられる。
【００１３】
例示的な実施形態として、本発明は、新生血管形成関連疾患を治療するための医薬組成物およびその様々な使用を提供することに向けられる。
【００１４】
例示的な実施形態として、本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１、ＡＮＧＰＴＬ４等、および／またはその発現産物を提供することに向けられる。
【００１５】
例示的な実施形態として、本発明は、新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１、ＡＮＧＰＴＬ４等の人工的操作を可能にする遺伝子を操作するための組成物を提供することに向けられる。
【００１６】
例示的な実施形態として、本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１、ＡＮＧＰＴＬ４等の治療的使用、および／または人工的操作を可能にするための遺伝子を操作するための組成物を提供することに向けられる。
【００１７】
例示的な実施形態として、本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１、ＡＮＧＰＴＬ４等のさらなる用途、および／または人工的操作を可能にするための遺伝子を操作するための組成物を提供することに向けられる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
これらの問題を解決するために、本発明は、新生血管形成を調節するために人工的に操作された新生血管形成関連因子および／または新生血管形成関連因子を人工的に操作するための組成物を含む、新生血管形成を人工的に調節するための系に関する。
【００１９】
本発明は、特定の目的のために人工的に操作された新生血管形成関連因子を提供する。
【００２０】
用語「新生血管形成関連因子」は、新生血管形成に直接関与するかまたは間接的に影響を与える新生血管形成調節機能を有することができる多様な非天然の人工的に操作された物質を包含する。この物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。例えば、この物質は、免疫細胞で発現される遺伝子操作されたかまたは改変された遺伝子またはタンパク質であってよい。新生血管形成関連因子は、新生血管形成を促進するかまたは増加させることができる、あるいは逆に、新生血管形成を抑制または阻害することができる。
【００２１】
さらに、これは新生血管形成環境または新生血管形成を阻害する環境を誘導するか、活性化するか、または不活性化することがある。
【００２２】
本発明の例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子は、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子であってよい。
【００２３】
本発明の例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子は、２またはそれ以上の人工的に操作された遺伝子を含むことがある。例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される２またはそれ以上の遺伝子は、人工的に操作されていてよい。
【００２４】
そのため、本発明の例示的な実施形態では、核酸配列に改変がなされた、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の人工的に操作された新生血管形成関連因子が提供される。
【００２５】
核酸配列における改変は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって非限定的に、人工的に操作され得る。
【００２６】
用語「ガイド核酸−編集タンパク質複合体」とは、ガイド核酸と編集タンパク質の間の相互作用によって形成された複合体をさし、核酸−タンパク質複合体にはガイド核酸および編集タンパク質が含まれる。
【００２７】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、対象を改変するのに役立ち得る。対象は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であってよい。
【００２８】
例えば、遺伝子は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって人工的に操作された新生血管形成関連因子であってよく、
該人工的に操作された新生血管形成関連因子は、核酸の１または複数の改変を含み、その改変は、
新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列かまたはＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域内の、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、および１または複数の外来ヌクレオチドの挿入の少なくとも１つであるか、
あるいは
新生血管形成関連因子を構成する核酸配列の１または複数のヌクレオチドの化学修飾である。
【００２９】
核酸の改変は、遺伝子のプロモーター領域で起こり得る。
【００３０】
核酸の改変は、遺伝子のエクソン領域で起こり得る。１つの例示的な実施形態では、改変の５０％は、遺伝子のコード領域の上流部分で起こり得る。
【００３１】
核酸の改変は、遺伝子のイントロン領域で起こり得る。
【００３２】
核酸の改変は、遺伝子のエンハンサー領域で起こり得る。
【００３３】
ＰＡＭ配列は、例えば、次の配列（５'から３'方向に記載）、  ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、  ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、  ＮＮＡＧＡＡＷ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、  ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）、  ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、および  ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）のうち１または複数であってよい。
【００３４】
編集タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス属菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスチネスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティレドセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属菌（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属菌（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属菌（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラバチカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェックス・デゲンシイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ）、カンジデイタス・デサルホルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕ���  ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属菌（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクター・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック属菌（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属菌（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、リングビア属菌（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属菌（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、またはアカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ）に由来し得る。
【００３５】
例示的な一実施形態では、編集タンパク質は、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数であってよい。一例として、編集タンパク質は、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質またはカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質であってよい。
【００３６】
さらに、別の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力がある、ガイド核酸を提供する。
【００３７】
ガイド核酸は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列の一部と相補的結合を形成することができる。それは０〜５、０〜４、０〜３、または０〜２個のミスマッチを作ることがある。一つの例示的な例として、ガイド核酸は、それぞれ、配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列のうち１または複数との相補的結合を形成するヌクレオチドであってよい。
【００３８】
例えば、本発明は、下に記載される群から選択される１または複数のガイド核酸を提供することができる。
ＶＥＧＦＡ遺伝子の核酸配列内の配列番号３、４、７、９、１０および１１の標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
ＨＩＦ１Ａ遺伝子の核酸配列内の配列番号１４、１８、１９、２０、２６、２９および３１の標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
ＡＮＧＰＴ２遺伝子の核酸配列内の配列番号３３、３４、３７、３８、３９および４３の標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
ＥＰＡＳ１遺伝子の核酸配列内の配列番号４７、４８、４９、５０、５３、５４および５５の標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、ならびに
ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の核酸配列内の配列番号６４、６６、６７、７３、７６および７９の標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸。
【００３９】
ガイド核酸は、非限定的に、１８〜２５ｂｐ、１８〜２４ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、または２０〜２３ｂｐヌクレオチドであってよい。
【００４０】
さらに、本発明は、特定の目的のために新生血管形成関連因子の人工的操作に用いることのできる、遺伝子操作のための組成物を提供する。
【００４１】
遺伝子操作のための組成物には、ガイド核酸−編集タンパク質複合体またはそれをコードする核酸配列が含まれてよい。
【００４２】
遺伝子操作のための組成物には、
（ａ）ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列の各々に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸配列、
（ｂ）化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む編集タンパク質または編集タンパク質をコードする核酸配列
が含まれてよい。
【００４３】
例示的な一実施形態では、ガイド核酸は、それぞれ、配列番号３、４、７、９、１０および１１（ＶＥＧＦＡ）、配列番号１４、１８、１９、２０、２６、２９および３１（ＨＩＦ１Ａ）、配列番号３３、３４、３７、３８、３９および４３（ＡＮＧＰＴ２）、配列番号４７、４８、４９、５０、５３、５４および５５（ＥＰＡＳ１）、および配列番号６４、６６、６７、７３、７６および７９（ＡＮＧＰＴＬ４）の標的配列のうち１または複数に対して相補的結合を形成する核酸配列であってよい。
【００４４】
例示的な一実施形態では、遺伝子操作のための組成物は、ウイルスベクター系であってよい。
【００４５】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される１または複数が含まれてよい。
【００４６】
例示的な実施形態では、本発明は、細胞を人工的に操作するための方法を提供し、この方法には、（ａ）ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸配列、ならびに
（ｂ）化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群からそれぞれ選択される１または複数のタンパク質を含む編集タンパク質または編集タンパク質をコードする核酸配列を、細胞に導入することが含まれる。
【００４７】
ガイド核酸および編集タンパク質は、１または複数のベクター中に核酸配列の形で存在していてもよいし、ガイド核酸と編集タンパク質とのカップリングによって形成された複合体中に存在していてもよい。
【００４８】
導入は、インビボまたはエクスビボで実施されてよい。
【００４９】
導入は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質トランスロケーションドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって実施されてよい。
【００５０】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される１または複数であってよい。
【００５１】
別の例示的な実施形態では、本発明は、新生血管形成関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００５２】
医薬組成物には、新生血管形成関連因子の人工的操作において用いることのできる、遺伝子操作のための組成物が含まれてよい。
【００５３】
遺伝子操作のための組成物の製剤は、上記と同じである。
【００５４】
例示的な実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子を配列決定することによって対象から人工的に操作された標的部位の配列に関する情報を得るための方法を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は、それによって得た情報を用いてライブラリーを構築するための方法を提供する。
【００５６】
例示的な実施形態では、本発明は、遺伝子操作のためのキットを提供し、それには次の構成部品、
（ａ）ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸またはガイド核酸をコードする核酸配列、ならびに
（ｂ）化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群からそれぞれ選択される１または複数のタンパク質を含む編集タンパク質または編集タンパク質をコードする核酸配列が含まれる。
【００５７】
目的の遺伝子は、そのようなキットを使用して人工的に操作されてよい。
【００５８】
例示的な一実施形態では、本発明は、新生血管形成関連障害を治療するための組成物を提供することができ、それには、
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の１または複数の標的配列と相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または編集タンパク質をコードする核酸配列
が含まれる。
【００５９】
標的配列は、配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の１または複数の配列であってよい。
【００６０】
例示的な一実施形態では、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質が、編集タンパク質として用いられ得る。
【００６１】
例示的な一実施形態では、新生血管形成関連障害は、虚血性網膜症または未熟児網膜症であり得る。
【００６２】
例示的な一実施形態では、本発明は、標的において疾患を治療するための新生血管形成関連因子の人工操作に用いられる、人工的に操作された新生血管形成関連因子または遺伝子操作のための組成物の使用の全ての態様を提供する。
【００６３】
治療のための標的は、ヒト、サル等などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、および同類のものを含む哺乳動物であってよい。
【発明の効果】
【００６４】
人工的に操作された新生血管形成関連因子およびそれによってその機能が人工的に改変された新生血管形成系は、新生血管形成関連疾患、例えば、新生血管形成関連眼疾患を治療するために効果的に使用され得る。新生血管形成系の効率は、様々な新生血管形成関連因子が関与している多様なインビボ機構の調節によって改善することができる。
【００６５】
例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の１または複数の遺伝子を利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を有するマウスモデルにおける、ＶｅｇｆａまたはＨｉｆ１ａを標的化するＣｊＣａｓ９に起因するレーザー誘発性脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）領域への減少効果を示す図である。（Ａ）ＶｅｇｆａおよびＨｉｆ１ａ／ＨＩＦ１Ａ遺伝子内のＣｊＣａｓ９標的配列（ＰＡＭ配列およびｓｇＲＮＡの標的配列はそれぞれ点線および実線で示される）、（Ｂ）ＣｊＣａｓ９をコードするオールインワンＡＡＶベクターおよびインビボ試験スケジュール、（Ｃ）ＲＰＥ細胞中のＲｏｓａ２６、Ｖｅｇｆａ、およびＨｉｆ１ａ標的部位でのインデル頻度のグラフ（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．（ＡＡＶを注射されていない対照：ｎ＝４、ＡＡＶ−ＣｊＣａ９を注射した試験群：ｎ＝５）、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）、（Ｄ）ＲＰＥ細胞においてＥＬＩＳＡによって測定されたＶｅｇｆａ発現量のグラフ（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．（ＡＡＶを注射されていない対照：ｎ＝４、ＡＡＶ−ＣｊＣａ９を注射した試験群：ｎ＝５）、一元配置分散分析およびチューキー事後検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）、（Ｅ）オフターゲット部位でのインデル頻度のグラフ（ミスマッチ塩基配列は実線で示され、ＰＡＭ配列は点線で示される）、（Ｆ）イソレクチンＢ４で染色した、Ｒｏｓａ２６、Ｖｅｇｆａ、またはＨｉｆ１ａを標的化するＡＡＶ９−ＣｊＣａ９を注射したマウスの眼球のレーザー誘発性ＣＮＶ領域（スケールバー＝２００μｍ）、ならびに（Ｇ）レーザー誘発性ＣＮＶ領域（％）のグラフ（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１７〜１８）、一元配置分散分析およびチューキー事後検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない）。
【図２】マウスＲＰＥ細胞におけるＣｊＣａｓ９によるｅＧＦＰのインビボ発現の画像を示す図である（ｎ＝６、抗ＧＦＰ抗体（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）、スケールバー＝２０μｍ）。
【図３】ＡＡＶ／ＣｊＣａｓ９注入マウスの網膜におけるオプシン陽性領域を示す図である。（Ａ）Ｒｏｓａ２６、Ｖｅｇｆａ、またはＨｉｆ１ａに特異的なＣｊＣａｓ９注入マウスにおいてＨＡタグをつけたＣｊＣａｓ９を発現するＲＰＥ細胞に対応するオプシン陽性領域の画像（オプシン：赤色、ＨＡ：緑色、およびＤＡＰＩ：青色、スケールバー＝２０μｍ、ＯＮＬ：外核層、ＩＳ：光受容細胞の内節、ＯＳ：光受容細胞の外節）、ならびに（Ｂ）相対オプシン陽性領域（％）のグラフ（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）、一元配置分散分析およびチューキー事後検定、＊ｐ＜０．０５）。
【図４】網膜組織におけるＶｅｇｆａまたはＨｉｆ１ａを標的化するＣｊＣａｓ９によるＶＥＧＦの発現の低下を示す図である。（Ａ）網膜細胞におけるＲｏｓａ２６、ＶｅｇｆａおよびＨｉｆ１ａの標的部位でのインデル頻度のグラフ（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．（ＡＡＶを注射されていない対照：ｎ＝４、ＡＡＶ−ＣｊＣａ９を注射した試験群：ｎ＝５）、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）、（Ｂ）ＥＬＩＳＡを用いて測定された、網膜細胞におけるＶｅｇｆａ発現量のグラフ（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝６〜７）、一元配置分散分析およびチューキー事後検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５】Ｖｅｇｆａを標的化するＣｊＣａｓ９の糖尿病性網膜症マウスモデルの網膜における血管漏出および血液漏出の減少作用を示す図であり、（ａ）インビボ試験スケジュール、（ｂ）Ｖｅｇｆａを標的化するＡＡＶ２−ＣｊＣａ９を注射したマウス網膜における血管漏出および血液漏出の減少作用の画像を示す。
【図６】Ｖｅｇｆａを標的化するＣｊＣａｓ９の糖尿病性網膜症マウスモデルの網膜における血管漏出および血液漏出の減少作用を示す図である。図６のＡは、インビボ試験スケジュール（ａ）、Ｖｅｇｆａを標的化するＡＡＶ２−ＣｊＣａ９を注射したマウス網膜における血管漏出および血液漏出の減少作用の画像（ｂ）であり、図６のＢは、Ｒｏｓａ２６またはＶｅｇｆａを標的化するＣｊＣａｓ９に起因する相対血管漏出率（％）のグラフである。
【図７】遺伝子操作のためのヒトＶＥＧＦＡのＣｊＣａｓ９標的部位スクリーニング結果およびインデル頻度を示す図である。
【図８】遺伝子操作のためのヒトＨＩＦ１ＡのＣｊＣａｓ９標的部位スクリーニングの結果を示す図である。（Ａ）ヒトＨＩＦ１ＡのＣｊＣａｓ９標的部位スクリーニング結果およびインデル頻度、ならびに（Ｂ）様々な哺乳動物間で保存されているＨＩＦ１Ａの標的部位。
【図９】遺伝子操作のためのヒトＡＮＧＰＴ２のＣｊＣａｓ９標的部位スクリーニング結果およびインデル頻度を示す図である。
【図１０】遺伝子操作のためのヒトＥＰＡＳ１のＣｊＣａｓ９標的部位スクリーニング結果およびインデル頻度を示す図である。
【図１１】遺伝子操作のためのヒトＡＮＧＰＴＬ４のＣｊＣａｓ９標的部位スクリーニング結果およびインデル頻度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同一の方法および材料を本発明の実践または試験に使用することができるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、その全文が参照により援用される。さらに、材料、方法および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【００６８】
本発明の一態様は、調節された新生血管形成作用を有する、人工的に操作された新生血管形成系に関する。
【００６９】
具体的には、本発明は、新生血管形成関連因子を人工的に操作することによって、新生血管形成を調節するかあるいは新生血管形成関連疾患を改善または治療する能力がある、様々な態様の組合せに関する。本発明には、機能が人工的に改変されている新生血管形成関連因子、それを製造する方法、それを含む組成物、およびその治療用途が含まれる。
【００７０】
本発明の別の態様は、機能が人工的に改変されている特定の因子（例えば、新生血管形成関連因子等として公知の遺伝子）の様々な機能が付随する第３のインビボ機構を有するさらなる調節系に関する。
【００７１】
具体的には、人工的に操作された特定の因子が関与する新生血管形成機能と同様に第３のインビボ機能の標的化は、対応する機構の調節をもたらし得る。本発明には、第３の機能に関連する疾患を改善または治療するための、機能が人工的に改変されている新生血管形成関連因子、それを製造するための方法、それを含む組成物、およびその治療用途が含まれる。
【００７２】
［新生血管形成］
本発明の例示的な実施形態は、新生血管形成に関連する系の改善および改変に関する。
【００７３】
用語「新生血管形成」とは、新しい血管の発生、発達および／または分化を含む、組織の新生血管形成の過程をさす。ここで、新生血管形成は、血管新生および脈管形成を包含する。新生血管形成は、血管内皮細胞の増殖を促進または阻害する様々な因子と密接に関連し得る。
【００７４】
新生血管形成は、既存の血管からの拡張、前駆細胞からの血管の新生、および／または既存の小血管の直径の増大のための全ての機構を包含する。
【００７５】
さらに、新生血管形成は、血管漏出または損傷した血管の修復に関与する、新しい血管の形成に関連する全ての機構を包含する。
【００７６】
新生血管形成には、様々な重篤な疾患状態における過剰および／または異常な新生血管形成が付随する機構が含まれる。
【００７７】
例えば、癌、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節炎および乾癬などの疾患では、過剰な新生血管形成が起こる。そのような疾患状態では、新しい血管が疾患を有する組織に提供され、正常な組織は損傷される。癌の場合には、新しい血管は腫瘍細胞が循環系に入ることを許容し、したがって腫瘍細胞は別の器官に定着することができる（腫瘍転移）。
【００７８】
例示的な一実施形態では、新生血管形成は、眼性新生血管形成であり得る。
【００７９】
例えば、新生血管形成は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症および同類のものなどの眼疾患に見出され得る。特に、ＡＭＤは、米国、カナダ、イングランド、ウエールズ、スコットランドおよびオーストラリアにおいて６５歳以上の高齢者の法的な不可逆的失明の最も一般的な原因であり、患者の約１０％〜１５％が滲出性（湿性）疾患を示す。滲出性ＡＭＤは、新生血管形成および疾患発症性の血管新生を特徴とする。
【００８０】
例えば、眼性新生血管形成には、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）、角膜新生血管形成および／または虹彩血管新生が含まれ得る。
【００８１】
ＣＮＶは、脈絡膜層の新血管形成であり、脈絡膜の最内層であるブルッフ膜に欠損がある人々に急速に起こる。さらに、ＣＮＶは、過剰な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に関連している。ＣＮＶは、強度近視、悪性近視、または新生血管変性性の黄斑変性症（例えば、湿性黄斑変性症）を引き起こし得る。
【００８２】
角膜新生血管形成は、酸素欠乏に起因する角膜周辺部の角膜周囲神経叢から無血管角膜組織への新しい血管の成長であり、主に、先天性または炎症性疾患（例えば、角膜移植後拒絶、移植組織または宿主疾患、アトピー性結膜炎、注射、眼類天疱瘡、ライエル症状群、およびスティーブンス・ジョンソン症状群）、感染性疾患（例えば、細菌性（クラミジア、梅毒、シュードモナス（ｐｓｅｄｕｏｍｏｎａｓ））、ウイルス性疾患（単純ヘルペスウイルスおよび帯状疱疹ウイルス）、真菌性疾患（カンジダ、アスペルギルス、フサリウム、寄生虫感染症（ｐａｒａｓｉｓｔｉｃ）（回旋糸状虫（ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｏｌｕｓ））、変性疾患、外傷性疾患および医原性疾患（例えば、コンタクトレンズの装用）によって引き起こされ得る。
【００８３】
虹彩血管新生は、糖尿病性網膜症に関連した虹彩表面の新血管形成であり、網膜中心静脈閉塞症、眼虚血症候群、慢性網膜剥離、および同類のものによって引き起こされることも知られている。
【００８４】
特定の実施形態では、新生血管形成は、血管内皮細胞の生存、増殖、持続、細胞毒性、およびサイトカイン放出機能に関連し得る。
【００８５】
特定の実施形態では、新生血管形成は、血管新生サイトカインの発現の増加に関連し得る。
【００８６】
特定の実施形態では、新生血管形成は、血管内皮細胞の受容体の機能に関連し得る。
【００８７】
特定の実施形態では、新生血管形成は、血管内皮細胞の遊走能に関連し得る。
【００８８】
特定の実施形態では、新生血管形成は、血管内皮細胞の付着能に関連し得る。
【００８９】
［新生血管形成関連因子］
［新生血管形成関連因子］  本発明の一実施形態は、人工的に操作されたかまたは改変された新生血管形成関連因子に関する。
【００９０】
用語「新生血管形成関連因子」は、脈管形成または血管新生に直接関与するかまたは間接的に影響を及ぼす全てのエレメントを含む。ここで、エレメントには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が含まれてよい。
【００９１】
例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子には、非天然、すなわち人工的に操作された、新生血管形成調節機能を有することができる様々な物質が含まれてよい。例えば、それは免疫細胞で発現する遺伝子操作されたかまたは改変された遺伝子またはタンパク質であってよい。
【００９２】
用語「人工的に操作された」とは、天然に存在する状態でない、人工的に改変された状態を意味する。
【００９３】
用語「遺伝子操作された」とは、遺伝子組み換えが本発明において言及される生物学的または非生物学的物質に人工的に導入されることを意味し、例えば、そのゲノムが特定の目的のために人工的に改変されている遺伝子および／または遺伝子産物（ポリペプチド、タンパク質等）であり得る。
【００９４】
例示的な例として、本発明は、特定の目的のために遺伝子操作または改変された新生血管形成関連因子を提供する。
【００９５】
下に列挙する機能を有する遺伝子またはタンパク質は、１種類の新生血管形成に関連する機能だけでなく、複数種類の機能を有していてよい。さらに、必要に応じて、２またはそれ以上の新生血管形成機能および因子が提供され得る。
【００９６】
新生血管形成関連因子は、新生血管形成を促進または増加させることができる。
【００９７】
新生血管形成関連因子は、新生血管形成を抑制または阻害することができる。
【００９８】
新生血管形成関連因子は、新生血管形成環境を誘導または活性化することができる。
【００９９】
新生血管形成関連因子は、新生血管形成が阻害される環境を誘導するかまたは新生血管形成環境を不活性化することができる。
【０１００】
新生血管形成関連因子は、新生血管形成を調節（促進、増大、抑制および／または阻害等）することができる。
【０１０１】
新生血管形成関連因子は、新生血管形成関連疾患の改善および治療に利用され得る。
【０１０２】
例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子は、ＡＢＣＡ１、ＡＣＡＴ、ＡＣＣ２、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＣＹ２、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＡＤＲＢ２、ＡＧＰＡＴ５、ＡＩＰ４、ＡＫＡＰ２、ＡＫＲ１Ｃ２、ＡＭＰＫ、ＡＮＧ２、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＫ１、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＡＴＰ１０Ａ、ＡＵＨ、ＡＵＴＯＴＡＸＩＮ、ＢＡＩ３、ＢＣＡＲ１、ＢＩＮ１、ＢＭＰ３Ａ、ＣＡ１０、ＣＡＭＫ１Ｄ、ＣＡＭＫＫ２、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤＣ４２、ＣＤＨ１３、ＣＨＡＴ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＴ、ＣＳＨ１、ＣＴＮＮ、ＣＵＢＮ、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＣＹＳＬＴＲ２、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＺ、ＤＨＣＲ７、ＤＨＦＲ、ＤＲＤ２、ＤＲＤ５、ＥＤＧ１、ＥＤＧ２、ＥＤＧ３、ＥＤＧ４、ＥＤＧ５、ＥＤＧ６、ＥＤＧ７、ＥＤＧ８、ＥＤＮＲＡ、ＥＨＨＡＤＨ、ＥＮＰＰ６、ＥＰＡＳ１、ＥＲＢＢ４、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＳＲＲＧ、ＥＴＦＡ、Ｆ２、ＦＤＰＳ、ＦＧＦ２、ＦＬＮＡ、ＦＬＴ４、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３Ａ、ＦＴＯ、ＧＡＢＢＲ２、ＧＡＴＡ３、ＧＨ１、ＧＮＡ１２、ＧＮＡ１３、ＧＲＫ２、ＧＲＫ５、ＧＲＭ５、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＨＣＲＴＲ２、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＤ１１Ｂ１、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、ＫＤＲ、ＬＡＭＡ１、ＬＤＬＲ、ＬＥＰＲ、ＬＥＰＴＩＮ、ＬＩＦＲ、ＬＩＰＬ２、ＬＫＢ１、ＬＲＰ、ＬＴＢＰ２、ＭＡＴ２Ｂ、ＭＥ１、ＭＥＧＡＬＩＮ、ＭＥＲＬＩＮ、ＭＥＴ、ＭＧＳＴ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴＯＲ、ＭＴＲ、ＮＣＫ２、ＮＥＤＤ９、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢＩＢ、ＮＯＳ２Ａ、ＮＯＳ３、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲＧ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＯＰＲＳ１、ＯＳＢＰＬ１０、ＯＳＢＰＬ３、ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、Ｐ２ＲＹ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＰＡＩ１、ＰＡＩ２、ＰＡＫ１、ＰＡＫ６、ＰＡＬＬＤ、ＰＡＰ１、ＰＡＲ１、ＰＡＸＩＬＬＩＮ、ＰＣ、ＰＣＴＰ、ＰＤＥ１１Ａ、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＰＫＡ、ＰＫＣＤ、ＰＬＡ１Ａ、ＰＬＡ２、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＣＢ１、ＰＬＤ１、ＰＬＤ２、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＰＲＫＧ１、ＰＲＬ、ＰＴＧＳ２、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＹＫ２、ＲＡＣ１、ＲＡＳ、ＲＨＥＢ、ＲＨＯＡ、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＨＩＰ１、ＳＧＰＰ２、ＳＬＣ２５Ａ２１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＮＣＡ、ＳＯＲＢＳ２、ＳＰＬＡ２、ＳＰＯＣＫ１、ＳＲＤ５Ａ１、ＳＲＥＢＦ１、ＳＲＥＢＦ２、ＳＴＡＴ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＨＥＭ２、ＴＨＲＢ、ＴＩＡＭ１、ＴＩＭＰ２、ＴＬＬ２、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＰＯ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ１、およびＹＥＳ１からなる群から選択される１または複数であってよい。
【０１０３】
本発明の例示的な例として、新生血管形成関連因子は、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１、およびＡＮＧＰＴＬ４からなる群から選択される１または複数であってよい。
【０１０４】
特定の実施形態では、新生血管形成関連因子は、ＶＥＧＦＡであり得る。
【０１０５】
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）遺伝子は、ＭＶＣＤ１、ＶＥＧＦまたはＶＰＦとも呼ばれるＶＥＧＦＡタンパク質をコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）である。一例では、ＶＥＧＦＡ遺伝子は、次の遺伝子からなる群から選択される１または複数であってよいが、本発明はこれに限定されない。ヒトＶＥＧＦＡをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０２０５３７．２またはＮＰ＿００１０２０５３８．２）、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２、ＮＭ＿００１０２５３６７．２、ＮＭ＿００３３７６、またはＮＧ＿００８７３２．１で表されるＶＥＧＦＡ遺伝子。
【０１０６】
特定の実施形態では、新生血管形成関連因子は、ＨＩＦ１Ａであり得る。
【０１０７】
低酸素誘導因子１−アルファ（ＨＩＦ−１−α；ＨＩＦ１Ａ）遺伝子とは、ＨＩＦ１、ＭＯＰ１、ＰＡＳＤ８またはｂＨＬＨｅ７８とも呼ばれるＨＩＦ１Ａタンパク質をコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）をさす。一例では、ＨＩＦ１Ａ遺伝子は、次の遺伝子からなる群から選択される１または複数であってよいが、本発明はこれに限定されない。ヒトＨＩＦ１Ａをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２３００１３．１またはＮＰ＿００１５２１．１）、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２４３０８４．１、ＮＭ＿００１５３０．３、ＮＭ＿１８１０５４．２、またはＮＧ＿０２９６０６．１によって表されるＨＩＦ１Ａ遺伝子。
【０１０８】
特定の実施形態では、新生血管形成関連因子は、ＡＮＧＰＴ２であり得る。
【０１０９】
アンジオポエチン−２（ＡＮＧＰＴ２）遺伝子とは、ＡＧＰＴ２またはＡＮＧ２とも呼ばれるＡＮＧＰＴ２タンパク質をコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）をさす。一例では、ＡＮＧＰＴ２遺伝子は、次の遺伝子からなる群から選択される１または複数であってよいが、本発明はこれに限定されない。ヒトＡＮＧＰＴ２をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１１１２３５９．１、ＮＰ＿００１１１２３６０．１またはＮＰ＿００１１３８．１）、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１１１８８８７．１、ＮＭ＿００１１１８８８８．１、ＮＭ＿００１１４７．２またはＮＧ＿０２９４８３．１によって表されるＡＮＧＰＴ２遺伝子。
【０１１０】
特定の実施形態では、新生血管形成関連因子は、ＥＰＡＳ１であり得る。
【０１１１】
内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１（ＥＰＡＳ１）遺伝子とは、ＥＣＹＴ４、ＨＩＦ２Ａ、ＨＬＦ、ＭＯＰ２、ＰＡＳＤ２またはｂＨＬＨｅ７３とも呼ばれるＥＰＡＳ１タンパク質をコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）をさす。一例では、ＥＰＡＳ１遺伝子は、次の遺伝子からなる群から選択される１または複数であってよいが、本発明はこれに限定されない。ヒトＥＰＡＳ１をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１４２１．２等）、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１４３０．４またはＮＧ＿０１６０００．１によって表されるＥＰＡＳ１遺伝子。
【０１１２】
特定の実施形態では、新生血管形成関連因子は、ＡＮＧＰＴＬ４であり得る。
【０１１３】
アンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）遺伝子とは、ＡＲＰ４、ＦＩＡＦ、ＨＡＲＰ、ＨＦＡＲＰ、ＮＬ２、ＰＧＡＲ、ＴＧＱＴＬまたはＵＮＱ１７１とも呼ばれるＡＮＧＰＴＬ４タンパク質をコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）をさす。一例では、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子は、次の遺伝子からなる群から選択される１または複数であってよいが、本発明はこれに限定されない。ヒトＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０３４７５６．１またはＮＰ＿６４７４７５．１）、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０３９６６７．２、ＮＭ＿１３９３１４．２、またはＮＧ＿０１２１６９．１によって表されるＡＮＧＰＴＬ４遺伝子。
【０１１４】
新生血管形成関連因子は、ヒト、サルおよび同類のものなどの霊長類、ラット、マウスおよび同類のものなどのげっ歯類等を含む哺乳動物に由来し得る。
【０１１５】
遺伝子に関する情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＧｅｎｅＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができる。
【０１１６】
本発明の例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＨＩＦ１Ａ、ＡＮＧＰＴ２、ＥＰＡＳ１またはＡＮＧＰＴＬ４は、人工的に操作された新生血管形成関連因子であり得る。
【０１１７】
特定の実施形態では、人工的に操作された新生血管形成関連因子は、遺伝子操作されていてよい。
【０１１８】
遺伝子操作または改変は、野性型遺伝子のゲノム配列の一部または全部の領域で起こる人工的な挿入、欠失、置換または反転によって達成され得る。さらに、遺伝子操作または改変は、２またはそれ以上の遺伝子の操作または改変の融合によって達成され得る。
【０１１９】
例えば、遺伝子は、遺伝子からコードされるタンパク質が生来の機能を有するタンパク質の形態で発現されないように、そのような遺伝子操作または改変によって不活性化される。
【０１２０】
例えば、遺伝子は、遺伝子からコードされるタンパク質が生来の機能と比較して改善された機能を有するタンパク質の形態で発現されるように、そのような遺伝子操作または改変によってさらに活性化され得る。一例では、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能がＡである場合、操作された遺伝子によって発現されるタンパク質の機能は、Ａと全く異なっていてもよいし、Ａを含む付加機能（Ａ＋Ｂ）を有していてもよい。
【０１２１】
例えば、２またはそれ以上のタンパク質の融合は、そのような遺伝子操作または改変に起因する、異なっているかまたは相補的な機能を有する２またはそれ以上の遺伝子を用いて発現させることができる。
【０１２２】
例えば、２またはそれ以上のタンパク質は、そのような遺伝子操作または改変に起因する、異なっているかまたは相補的な機能を有する２またはそれ以上の遺伝子を用いて、細胞において別々にまたは独立に発現させることができる。
【０１２３】
操作された新生血管形成関連因子は、新生血管形成を促進または増加させることができる。
【０１２４】
操作された新生血管形成関連因子は、新生血管形成を抑制または阻害することができる。
【０１２５】
操作された新生血管形成関連因子は、新生血管形成環境を誘導または活性化することができる。
【０１２６】
操作された新生血管形成関連因子は、新生血管形成を阻害する環境を誘導するかまたは新生血管形成環境を不活性化することができる。
【０１２７】
操作された新生血管形成関連因子は、新生血管形成を調節（促進、増大、抑制および／または阻害）することができる。
【０１２８】
操作された新生血管形成関連因子は、新生血管形成関連疾患の改善および治療に利用され得る。
【０１２９】
操作には、新生血管形成関連因子の全ての種類の構造上または機能上の改変が含まれる。
【０１３０】
新生血管形成関連因子の構造上の改変には、自然状態に存在する野性型のものと同じではない、全ての種類の改変が含まれる。
【０１３１】
例えば、新生血管形成関連因子がＤＮＡ、ＲＮＡまたは遺伝子である場合、構造上の改変は、１または複数のヌクレオチドの喪失であり得る。
【０１３２】
構造上の改変は、１または複数のヌクレオチドの挿入であってもよい。
【０１３３】
ここで、挿入されたヌクレオチドには、新生血管形成関連因子を含む対象の全ておよび対象の外部から入るヌクレオチドが含まれる。
【０１３４】
構造上の改変は、１または複数のヌクレオチドの置換であってもよい。
【０１３５】
構造上の改変には、１または複数のヌクレオチドの化学修飾が含まれてよい。
【０１３６】
ここで、化学修飾には、化学官能基の付加、除去および置換の全てが含まれる。
【０１３７】
別の例として、新生血管形成関連因子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である場合、構造上の改変は、１または複数のアミノ酸の喪失であり得る。
【０１３８】
構造上の改変は、１または複数のアミノ酸の挿入であってもよい。
【０１３９】
ここで、挿入されたアミノ酸には、新生血管形成関連因子を含む対象の全ておよび対象の外部から入るアミノ酸が含まれる。
【０１４０】
構造上の改変は、１または複数のアミノ酸の置換であってもよい。
【０１４１】
構造上の改変には、１または複数のアミノ酸の化学修飾が含まれてよい。
【０１４２】
ここで、化学修飾には、化学官能基の付加、除去および置換の全てが含まれる。
【０１４３】
構造上の改変は、異なるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の部分的または全体の結合であってよい。
【０１４４】
ここで、異なるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、新生血管形成関連因子、あるいは異なる機能を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０１４５】
新生血管形成関連因子の機能的改変には、自然状態に存在する野性型と比較して改善されたかまたは減少した機能、および第３の異なる機能を有する全ての種類が含まれてよい。
【０１４６】
例えば、新生血管形成関連因子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である場合、機能上の改変は、新生血管形成関連因子の突然変異であり得る。
【０１４７】
ここで、突然変異は、新生血管形成関連因子の機能を増強するかまたは抑制する突然変異であり得る。
【０１４８】
機能上の改変は、新生血管形成関連因子のさらなる機能を有し得る。
【０１４９】
ここで、さらなる機能は、同じまたは異なる機能であり得る。さらに、さらなる機能を有する新生血管形成関連因子は、異なるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合してもよい。
【０１５０】
機能上の改変は、新生血管形成関連因子の発現の増加による機能性の増強であってよい。
【０１５１】
機能上の改変は、新生血管形成関連因子の発現の低下による機能性の低下であってよい。
【０１５２】
例示的な実施形態では、操作された新生血管形成関連因子は、以下の突然変異のうち１または複数によって誘導され得る。
新生血管形成関連因子、つまり、操作される遺伝子（以降、標的遺伝子と呼ぶ）の全部または一部の欠失、例えば、標的遺伝子の１ｂｐまたはそれ以上のヌクレオチド、例えば、１〜３０、１〜２７、１〜２５、１〜２３、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、または１ヌクレオチドの欠失、
野性型とは異なるヌクレオチドを有する標的遺伝子の１ｂｐまたはそれ以上のヌクレオチド、例えば、１〜３０、１〜２７、１〜２５、１〜２３、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、または１ヌクレオチドの置換、および
１または複数のヌクレオチド、例えば、１〜３０、１〜２７、１〜２５、１〜２３、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、または１ヌクレオチド（各々独立にＡ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される）標的遺伝子の特定の位置への挿入。
【０１５３】
改変された標的遺伝子の部分（「標的領域」）は、遺伝子の塩基配列の連続した１ｂｐまたはそれ以上、３ｂｐまたはそれ以上、５ｂｐまたはそれ以上、７ｂｐまたはそれ以上、１０ｂｐまたはそれ以上、１２ｂｐまたはそれ以上、１５ｂｐまたはそれ以上，１７ｂｐまたはそれ以上、または２０ｂｐまたはそれ以上、例えば、１ｂｐ〜３０ｂｐ、３ｂｐ〜３０ｂｐ、５ｂｐ〜３０ｂｐ，７ｂｐ〜３０ｂｐ、１０ｂｐ〜３０ｂｐ、１２ｂｐ〜３０ｂｐ、１５ｂｐ〜３０ｂｐ、１７ｂｐ〜３０ｂｐ、２０ｂｐ〜３０ｂｐ、１ｂｐ〜２７ｂｐ、３ｂｐ〜２７ｂｐ、５ｂｐ〜２７ｂｐ、７ｂｐ〜２７ｂｐ、１０ｂｐ〜２７ｂｐ、１２ｂｐ〜２７ｂｐ、１５ｂｐ〜２７ｂｐ、１７ｂｐ〜２７ｂｐ、２０ｂｐ〜２７ｂｐ、１ｂｐ〜２５ｂｐ、３ｂｐ〜２５ｂｐ、５ｂｐ〜２５ｂｐ、７ｂｐ〜２５ｂｐ、１０ｂｐ〜２５ｂｐ、１２ｂｐ〜２５ｂｐ、１５ｂｐ〜２５ｂｐ、１７ｂｐ〜２５ｂｐ、２０ｂｐ〜２５ｂｐ、１ｂｐ〜２３ｂｐ、３ｂｐ〜２３ｂｐ、５ｂｐ〜２３ｂｐ、７ｂｐ〜２３ｂｐ、１０ｂｐ〜２３ｂｐ、１２ｂｐ〜２３ｂｐ、１５ｂｐ〜２３ｂｐ、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、２０ｂｐ〜２３ｂｐ、１ｂｐ〜２０ｂｐ、３ｂｐ〜２０ｂｐ、５ｂｐ〜２０ｂｐ、７ｂｐ〜２０ｂｐ、１０ｂｐ〜２０ｂｐ、１２ｂｐ〜２０ｂｐ、１５ｂｐ〜２０ｂｐ、１７ｂｐ〜２０ｂｐ、２１ｂｐ〜２５ｂｐ、１８ｂｐ〜２２ｂｐ、または２１ｂｐ〜２３ｂｐ領域であってよい。
【０１５４】
一方、本発明の異なる実施形態は、機能が人工的に改変されている上記の新生血管形成関連因子の様々な機能が付随する第３のインビボ機構を調節するためのさらなる系に関する。
【０１５５】
例示的な一実施形態では、ＶＥＧＦは、第３のインビボ機構の調節に関与し得る。
【０１５６】
ＶＥＧＦによる血管透過性の増加は、浮腫、ならびに腫瘍増殖の原因となり得るため、人工的に操作されたＶＥＧＦは、様々な種類の腫瘍（例えば、脳腫瘍、子宮癌、前庭シュワン細胞腫等）において生存率を増加させることがあるか、または、例えばＶＥＧＦを不活性化する操作によって難聴を回復することがある。さらに、人工的に操作されたＶＥＧＦによる血管透過性の低下は、腎不全、関節炎、乾癬、冠動脈疾患等に治療効果を付与することがある。
【０１５７】
さらに、人工的に操作されたＶＥＧＦは、自己免疫疾患に治療効果を付与することがある。例えば、炎症誘発活性は、ＶＥＧＦによって人工的に調節され、それによってブドウ膜炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、乾癬、全身性硬化症、多発性硬化症等に治療効果を付与することがある。
【０１５８】
さらに、人工的に操作されたＶＥＧＦは、精神疾患に治療効果を付与することがある。例えば、鬱病への治療効果は、ＶＥＧＦによって神経伝達関連因子の発現を人工的に調節することにより付与されることがある。
【０１５９】
別の実施形態では、人工的に操作されたＶＥＧＦは、ＨＩＦの第３のインビボ機構の調節に関与し得る。ＨＩＦはＨＩＦ１またはＨＩＦ２であり得る。
【０１６０】
人工的に操作されたＨＩＦは、炎症誘発活性を調節し、それによってブドウ膜炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、乾癬、全身性硬化症、多発性硬化症等に治療効果を付与することがある。
【０１６１】
さらに、人工的に操作されたＨＩＦは、自己免疫疾患に治療効果を付与することがある。
【０１６２】
同様に、人工的に操作されている本発明の実例となる因子は、第３のインビボ機能ならびに新生血管形成機能を標的化することによって、対応する機構を調節し得る。本発明の例示的な一実施形態には、第３の機能に関連する疾患を改善または治療するための、機能が人工的に改変されているそのような新生血管形成因子およびそれを製造するための方法、それを含む組成物、ならびに因子および組成物の使用が含まれる。
【０１６３】
［新生血管形成系］
［新生血管形成調節系］  本発明の一態様では、新生血管形成関連因子を人工的に操作することによって新生血管形成を調節するための新生血管形成調節系が提供される。
【０１６４】
本明細書において使用される用語「新生血管形成調節系」には、人工的に操作された新生血管形成関連因子の機能の変化による新生血管形成の促進、増加、抑制および／または阻害に影響を及ぼす全ての現象が含まれ、さらに、そのような新生血管形成調節系に直接的または間接的に関与する全ての物質、組成物、方法および使用も含まれる。
【０１６５】
そのような新生血管形成調節系を構成する各々の因子は、通常「新生血管形成調節因子」とも呼ばれる。本発明の系には、人工的に操作された新生血管形成関連因子に関連する改変されたインビボ機構が含まれる。
【０１６６】
特定の実施形態では、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３等などの造血幹細胞表面抗原およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２等などの血管内皮細胞抗原の発現は、人工的に操作された新生血管形成関連因子によって調節され得る。
【０１６７】
特定の実施形態では、出芽によって新しい血管が形成される血管新生と、血管を構成する細胞の成長が調節され得る。
【０１６８】
特定の実施形態では、内皮細胞を直接刺激する直接的新血管形成因子（ＤＡＦ）の活性が調節され得る。内皮細胞の成長および／または遊走は、促進または阻害され得る。
【０１６９】
例えば、ＤＡＦには、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、チミジンホスホリラーゼ（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、プロリフェリン、サイトカインのインターロイキン−８、アンギオゲニン（血管新生誘導タンパク質）、フィブリン、ニコチンアミド（ビタミンＢ複合体）、アンジオポエチン（血管新生促進タンパク質）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、１２−ヒドロキシエイコサトラエノエート（１２−ＨＥＴＥ；上皮細胞の血管新生促進因子であるアラキドン酸の毒性分解生成物）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、スフィンゴシン１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、およびレプチンが含まれ得る。
【０１７０】
特定の実施形態では、血管細胞で動作する２つの異なる細胞間シグナル伝達経路、すなわち、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦシグナル伝達経路が利用され得る。
【０１７１】
特定の実施形態では、ＤＡＦの形成によって血管新生を誘導する間接的新血管形成因子（ＩＡＦ）の活性は、血管周皮細胞を刺激することによって調節され得る。
【０１７２】
特定の実施形態では、血管内皮細胞は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）から分化し得る、したがって原子血管叢を形成する機構が調節され得る。
【０１７３】
特定の実施形態では、内皮細胞の遊走に対する細胞外マトリックス成分の分解性が調節され得る。
【０１７４】
特定の実施形態では、細胞遊走関連シグナル伝達経路が調節され得る。
【０１７５】
特定の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１；ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）、およびＶＥＧＦＲ−３などのＶＥＧＦ受容体、ならびに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、またはニューロピリン−１（ＮＰ−１）の活性が調節され得る。
【０１７６】
例示的な実施形態では、新生血管形成調節系には、新生血管形成関連因子を操作するための組成物が含まれる。
【０１７７】
操作のための組成物は、新生血管形成関連因子を人工的に操作する能力がある組成物、および好ましくは、遺伝子操作のための組成物であってよい。
【０１７８】
以下、遺伝子操作のための組成物について説明する。
【０１７９】
［新生血管形成関連因子を操作するための組成物］  本発明の新生血管形成関連因子および新生血管形成系に関与する物質の操作または改変は、好ましくは、遺伝子操作によって達成される。
【０１８０】
一態様では新生血管形成関連因子の一部または全部の非コード領域またはコード領域を標的化することによって遺伝子を操作するための組成物および方法が提供され得る。
【０１８１】
例示的な実施形態では、組成物および方法は、望ましい新生血管形成系の形成に関与する１または複数の新生血管形成調節遺伝子の操作または改変で使用され得る。操作または改変は、遺伝子を構成する核酸の改変によって実施され得る。操作の結果、ノックダウン、ノックアウト、およびノックインの全てが含まれる。
【０１８２】
例示的な実施形態では、操作は、プロモーター領域、または転写配列、例えば、イントロンまたはエクソン配列を標的化することによって実施され得る。コード配列、例えばコード領域、具体的には初期コード領域は、発現の改変およびノックアウトについて標的化され得る。
【０１８３】
例示的な実施形態では、核酸の改変は、１または複数のヌクレオチド、例えば、１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐ、または１ｂｐのヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入であってよい。
【０１８４】
例示的な実施形態では、１または複数の新生血管形成関連遺伝子のノックアウト、遺伝子のうち１または複数の発現の排除、あるいは１または２の対立遺伝子の１または複数のノックアウトのために、上述の領域は、１または複数の新生血管形成関連遺伝子が欠失または突然変異を含むように標的化され得る。
【０１８５】
例示的な実施形態では、遺伝子のノックダウンは、望ましくない対立遺伝子またはトランスクリプトームの発現を低下させるために使用され得る。
【０１８６】
例示的な実施形態では、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３'ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナルの非コード配列は、新生血管形成機能に影響を及ぼす新生血管形成関連遺伝子を改変する際に使用されるように標的化され得る。
【０１８７】
例示的な実施形態では、新生血管形成関連遺伝子の活性は、遺伝子の核酸の改変によって調節され得る、例えば、活性化または不活性化され得る。
【０１８８】
例示的な実施形態では、遺伝子の核酸の改変は、一本鎖または二本鎖の切断、すなわち、標的遺伝子の特定の領域内の核酸鎖のガイド核酸−編集タンパク質複合体による切断を触媒し得、その結果標的遺伝子が不活性化され得る。
【０１８９】
例示的な実施形態では、核酸鎖の切断は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの機構によって修復され得る。
【０１９０】
この場合、ＮＨＥＪ機構が起こると、切断部位でＤＮＡ配列の変化が誘導され、その結果、遺伝子の不活性化がもたらされる。ＮＨＥＪによる修復は、短い遺伝子断片の置換、挿入または欠失を誘導することができ、対応する遺伝子ノックアウトの誘導で使用することができる。
【０１９１】
別の態様では、本発明は、新生血管形成関連因子を操作するための組成物を提供する。
【０１９２】
操作のための組成物は、新生血管形成関連因子を人工的に操作することのできる組成物、および好ましくは、遺伝子操作のための組成物である。
【０１９３】
組成物は、望ましい新生血管形成調節系の形成に関与する１または複数の新生血管形成関連因子の遺伝子操作に用いられてよい。
【０１９４】
遺伝子操作は、遺伝子発現調節過程を考慮して実施されてよい。
【０１９５】
例示的な実施形態では、それは転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡ輸送、ＲＮＡ分解、翻訳、およびタンパク質改変調節段階の各段階に適した操作手段を選択することによって実施され得る。
【０１９６】
例示的な実施形態では、スモールＲＮＡ（ｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングを用いてｍＲＮＡに干渉するかまたはその安定性を低下させ、場合によっては、ｍＲＮＡを分割してタンパク質合成情報の伝達を中断し、その結果、遺伝情報の発現を調節する。
【０１９７】
遺伝子操作は、新生血管形成関連因子を構成する核酸の改変によって実施され得る。操作結果として、ノックダウン、ノックアウト、およびノックインの全てが含まれる。
【０１９８】
特定の実施形態では、核酸の改変は、１または複数のヌクレオチド、例えば、１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐ、または１ｂｐのヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入であってよい。
【０１９９】
特定の実施形態では、１または複数の新生血管形成関連因子のノックアウト、１または複数の因子の発現の排除、あるいは１または２の対立遺伝子の１または複数のノックアウトのために、１または複数の新生血管形成関連因子が欠失または突然変異を含むように遺伝子が操作され得る。
【０２００】
特定の実施形態では、新生血管形成関連因子のノックダウンは、望ましくない対立遺伝子またはトランスクリプトームの発現を低下させるために使用され得る。
【０２０１】
特定の実施形態では、核酸の改変は、１または複数の核酸断片または遺伝子の挿入であってよい。ここで、核酸断片は、１または複数のヌクレオチドからなる核酸配列であってよく、核酸断片の長さは、１〜４０ｂｐ、１〜５０ｂｐ、１〜６０ｂｐ、１〜７０ｂｐ、１〜８０ｂｐ、１〜９０ｂｐ、１〜１００ｂｐ、１〜５００ｂｐまたは１〜１０００ｂｐであってよい。ここで、挿入される遺伝子は、新生血管形成関連因子の１つであるか、または異なる機能を有する遺伝子であってよい。
【０２０２】
例示的な実施形態では、核酸の改変には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒する能力がある野性型または変異型酵素を用いることができる。ガイド核酸−編集タンパク質複合体を用いてもよい。
【０２０３】
例えば、遺伝子は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１タンパク質）およびＴＡＬＥ−ヌクレアーゼからなる群から選択される１または複数のヌクレアーゼを用いて操作され、それによって遺伝情報の発現を調節することができる。
【０２０４】
特定の実施形態では、非限定的に、遺伝子操作は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるＮＨＥＪまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）によって媒介され得る。
【０２０５】
この場合、ＮＨＥＪ機構が起こると、ＤＮＡ配列の変化が切断部位で誘導され、それによって遺伝子が不活性化され得る。ＮＨＥＪによる修復は、短い遺伝子断片の置換、挿入または欠失を誘導することができ、対応する遺伝子のノックアウトの誘導で使用することができる。
【０２０６】
別の態様では、本発明は、遺伝子操作部位を提供し得る。
【０２０７】
例示的な実施形態では、遺伝子がＮＨＥＪ媒介改変によって改変される場合、遺伝子操作部位は、遺伝子内の部位であり得、新生血管形成を調節する遺伝子産物の発現の減少または排除を引き起こす。
【０２０８】
例えば、部位は、初期コード領域中、
プロモーター配列中、
エンハンサー配列中、
特定のイントロン配列中、または
特定のエクソン配列中であり得る。
【０２０９】
例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子を操作するための組成物は、
新生血管形成の調節に影響を及ぼす新生血管形成関連因子、例えばＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を、操作対象として標的化することができる。
【０２１０】
標的領域、すなわち遺伝子操作が行われるかまたは遺伝子操作について認識される領域の標的配列の例は、表１、表２、表３、表４および表５に要約される。
【０２１１】
標的配列は、１または複数の遺伝子を標的化することができる。
【０２１２】
標的配列は、２またはそれ以上の遺伝子を同時に標的化することができる。ここで、２またはそれ以上の遺伝子は、相同遺伝子または異種遺伝子であり得る。
【０２１３】
遺伝子は、１または複数の標的配列を含み得る。
【０２１４】
遺伝子は、２またはそれ以上の標的配列で同時に標的化され得る。
【０２１５】
遺伝子は、部位および標的配列の数に応じた遺伝子操作の数が変更されてよい。
【０２１６】
遺伝子操作は、標的配列の数および位置に応じて様々な形態で設計され得る。
【０２１７】
遺伝子操作は、２またはそれ以上の標的配列で同時に行われ得る。ここで、２またはそれ以上の標的配列は、相同遺伝子または異種遺伝子に存在し得る。
【０２１８】
遺伝子操作は、２またはそれ以上の遺伝子に関して同時に実施され得る。ここで、２またはそれ以上の遺伝子は、相同遺伝子または異種遺伝子であり得る。
【０２１９】
以下、本発明の実施形態で用いることのできる標的配列の例を、以下の表に示す。  表１  ＶＥＧＦＡ遺伝子の標的配列  表２  ＨＩＦ１Ａ遺伝子の標的配列  表３  ＡＮＧＰＴ２遺伝子の標的配列  表４  ＥＰＡＳ１遺伝子の標的配列  表５  ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列
【表１】
2019524847.tif 000003
【表２】
2019524847.tif 000004
【表３】
2019524847.tif 000005
【表４】
2019524847.tif 000006
【表５】
2019524847.tif 000007
【０２２０】
［操作のための組成物−遺伝子ハサミ系］
本発明の新生血管形成調節系には、ガイド核酸−編集タンパク質複合体が新生血管形成関連因子を操作するための組成物として含まれてよい。
【０２２１】
［ガイド核酸−編集タンパク質複合体］
用語「ガイド核酸−編集タンパク質複合体」とは、ガイド核酸と編集タンパク質の間の相互作用によって形成された複合体をさし、核酸−タンパク質複合体にはガイド核酸および編集タンパク質が含まれる。
【０２２２】
用語「ガイド核酸」とは、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識する能力がある核酸をさす。
【０２２３】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの形態で存在してよく、５〜１５０塩基の核酸配列を有し得る。
【０２２４】
ガイド核酸には、１または複数のドメインが含まれてよい。
【０２２５】
ドメインは、限定されるものではないが、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、またはテールドメインであり得る。
【０２２６】
ガイド核酸には、同じドメイン反復であってもよいし異なるドメインであってもよい、２またはそれ以上のドメインが含まれてよい。
【０２２７】
ガイド核酸は、１つの連続した核酸配列を有し得る。
【０２２８】
例えば、１つの連続した核酸配列は、（Ｎ）ｍであってよく、式中、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、またはＡ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍは１〜１５０の整数である。
【０２２９】
ガイド核酸は、２またはそれ以上の連続した核酸配列を有し得る。
【０２３０】
例えば、２またはそれ以上の連続した核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであってよく、式中ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、あるいはＡ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍおよびｏは１〜１５０の整数であり、かつ、ｍおよびｏは互いと同じであっても異なっていてもよい。
【０２３１】
用語「編集タンパク質」とは核酸と直接結合することができるか、または直接結合せずに相互作用することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をさす。
【０２３２】
編集タンパク質は酵素であってよい。
【０２３３】
編集タンパク質は融合タンパク質であってよい。
【０２３４】
ここで、「融合タンパク質」とは、酵素をさらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合することによって生成されるタンパク質をさす。
【０２３５】
用語「酵素」とは、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を切断する能力があるドメインを含有するタンパク質をさす。
【０２３６】
さらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同じかまたは異なる機能を有する機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０２３７】
融合タンパク質には、さらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が酵素のアミノ末端（Ｎ末端）またはその近傍、カルボキシル末端（Ｃ末端）またはその近傍、酵素の中央部分、およびそれらの組合せの１または複数の領域に含まれてよい。
【０２３８】
融合タンパク質には、機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素のＮ末端またはその近傍、Ｃ末端またはその近傍、酵素の中央部分、およびそれらの組合せの１または複数の領域に含まれてよい。
【０２３９】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、対象を改変するのに役立ち得る。
【０２４０】
対象は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であってよい。
【０２４１】
例えば、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、目的のタンパク質の発現の最終的な調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）、タンパク質の除去、または新しいタンパク質の発現をもたらし得る。
【０２４２】
ここで、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
【０２４３】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、遺伝子転写および翻訳段階で作用し得る。
【０２４４】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、タンパク質レベルで作用し得る。
【０２４５】
１．ガイド核酸
ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識する能力があり、ガイド核酸−タンパク質複合体を形成する核酸である。
【０２４６】
ここで、ガイド核酸は、ガイド核酸−タンパク質複合体によって標的化された核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識するかまたは標的化するように設定される。
【０２４７】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ混合物の形態で存在してよく、５〜１５０の核酸配列を有する。
【０２４８】
ガイド核酸は、線状または環状の形状で存在し得る。
【０２４９】
ガイド核酸は、１つの連続した核酸配列であり得る。
【０２５０】
例えば、１つの連続した核酸配列は、（Ｎ）ｍであってよく、式中、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、またはＡ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１〜１５０の整数である。
【０２５１】
ガイド核酸は、２またはそれ以上の連続した核酸配列であり得る。
【０２５２】
例えば、２またはそれ以上の連続した核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであってよく、式中ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、あるいはＡ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍおよびｏは１〜１５０の整数であり、かつ、互いと同じであっても異なっていてもよい。
【０２５３】
ガイド核酸には、１または複数のドメインが含まれてよい。
【０２５４】
ここで、ドメインは、限定されるものではないが、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、またはテールドメインであり得る。
【０２５５】
ガイド核酸には、同じドメイン反復であってもよいし異なるドメインであってもよい、２またはそれ以上のドメインが含まれてよい。
【０２５６】
ドメインを以下に説明する。
【０２５７】
ｉ）ガイドドメイン
用語「ガイドドメイン」は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成することができ、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用する働きをする相補ガイド配列を有するドメインである。
【０２５８】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり、これは例えば、少なくとも５０％またはそれ以上、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相補性または完全な相補性を有する。
【０２５９】
ガイドドメインは、５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２６０】
一例では、ガイドドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２６１】
別の例では、ガイドドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２６２】
ガイドドメインは、ガイド配列を有し得る。
【０２６３】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成することができる相補的な塩基配列であり得る。
【０２６４】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０２６５】
ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２６６】
一例では、ガイドドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２６７】
別の例では、ガイド配列は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２６８】
さらに、ガイドドメインには、ガイド配列とさらなる塩基配列が含まれ得る。
【０２６９】
さらなる塩基配列は、ガイドドメインの機能を改善するかまたは低下させるために利用され得る。
【０２７０】
さらなる塩基配列は、ガイド配列の機能を改善するかまたは低下させるために利用され得る。
【０２７１】
さらなる塩基配列は、１〜３５塩基の配列であり得る。
【０２７２】
一例では、さらなる塩基配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０２７３】
別の例では、さらなる塩基配列は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０２７４】
さらなる塩基配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
【０２７５】
さらなる塩基配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０２７６】
ｉｉ）第１の相補的ドメイン
用語「第１の相補的ドメイン」は、第２の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含む核酸配列であり、第２の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。
【０２７７】
第１の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であり得る。
【０２７８】
一例では、第１の相補的ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、または３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０２７９】
別の例では、第１の相補的ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０２８０】
ｉｉｉ）リンカードメイン
用語「リンカードメイン」は、２またはそれ以上の同一または異なるドメインである２またはそれ以上のドメインを連結する核酸配列である。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって２またはそれ以上のドメインと連結されるか、または共有結合または非共有結合によって２またはそれ以上のドメインを連結することができる。
【０２８１】
リンカードメインは、１〜３０塩基の配列であり得る。
【０２８２】
一例では、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、または２５〜３０塩基の配列であり得る。
【０２８３】
別の例では、リンカードメインは、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、または２５〜３０塩基の配列であり得る。
【０２８４】
ｉｖ）第２の相補的ドメイン
用語「第２の相補的ドメイン」は、第１の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含む核酸配列であり、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。
【０２８５】
第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインと相補的な塩基配列、および第１の相補的ドメインと相補性を有さない塩基配列、例えば、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を有し得、かつ、第１の相補的ドメインよりも長い塩基配列を有し得る。
【０２８６】
第２の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列を有し得る。
【０２８７】
一例では、第２の相補的ドメインは、１〜３５、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、または３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０２８８】
別の例では、第２の相補的ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、または３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０２８９】
ｖ）近位ドメイン
用語「近位ドメイン」は、第２の相補的ドメインに隣接して位置する核酸配列である。
【０２９０】
近位ドメインは、相補的な塩基配列をその中に有することがあり、相補的な塩基配列に起因して二本鎖に形成されることがある。
【０２９１】
近位ドメインは、１〜２０塩基の配列であり得る。
【０２９２】
一例では、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０または１５〜２０塩基の配列であり得る。
【０２９３】
別の例では、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５または１５〜２０塩基の配列であり得る。
【０２９４】
ｖｉ）テールドメイン
用語「テールドメイン」は、ガイド核酸の両端の一方または両方の端部に位置する核酸配列である。
【０２９５】
テールドメインは、相補的な塩基配列をその中に有することがあり、相補的な塩基配列に起因して二本鎖に形成されることがある。
【０２９６】
テールドメインは、１〜５０塩基の配列であり得る。
【０２９７】
一例では、テールドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２９８】
別の例では、テールドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２９９】
一方、ドメイン、すなわち、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよびテールドメインに含まれる核酸配列の一部または全部は、選択的にまたは付加的に化学修飾を含み得る。
【０３００】
化学修飾は、限定されるものではないが、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得る。
【０３０１】
ガイド核酸には、１または複数のドメインが含まれる。
【０３０２】
ガイド核酸には、ガイドドメインが含まれてよい。
【０３０３】
ガイド核酸には、第１の相補的ドメインが含まれてよい。
【０３０４】
ガイド核酸には、リンカードメインが含まれてよい。
【０３０５】
ガイド核酸には、第２の相補的ドメインが含まれてよい。
【０３０６】
ガイド核酸には、近位ドメインが含まれてよい。
【０３０７】
ガイド核酸には、テールドメインが含まれてよい。
【０３０８】
ここで、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のドメインが存在し得る。
【０３０９】
ガイド核酸には、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のガイドドメインが含まれてよい。
【０３１０】
ガイド核酸には、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の第１の相補的ドメインが含まれてよい。
【０３１１】
ガイド核酸には、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のリンカードメインが含まれてよい。
【０３１２】
ガイド核酸には、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の第２の相補的ドメインが含まれてよい。
【０３１３】
ガイド核酸には、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の近位ドメインが含まれてよい。
【０３１４】
ガイド核酸には、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のテールドメインが含まれてよい。
【０３１５】
ここで、ガイド核酸において、１種類のドメインが、重複していてもよい。
【０３１６】
ガイド核酸には、重複の有無にかかわらず、数個のドメインが含まれてよい。
【０３１７】
ガイド核酸には、同じ種類のドメインが含まれてよい。ここで、同じ種類のドメインは、同じ核酸配列かまたは異なる核酸配列を有してよい。
【０３１８】
ガイド核酸には、２種類のドメインが含まれてよい。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列かまたは同じ核酸配列を有してよい。
【０３１９】
ガイド核酸には、３種類のドメインが含まれてよい。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列かまたは同じ核酸配列を有してよい。
【０３２０】
ガイド核酸には、４種類のドメインが含まれてよい。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列かまたは同じ核酸配列を有してよい。
【０３２１】
ガイド核酸には、５種類のドメインが含まれてよい。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列かまたは同じ核酸配列を有してよい。
【０３２２】
ガイド核酸には、６種類のドメインが含まれてよい。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列かまたは同じ核酸配列を有してよい。
【０３２３】
例えば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］からなってよい。ここで、２つのガイドドメインには、異なるかまたは同じ標的に対するガイド配列が含まれてよく、２つの第１の相補的ドメインおよび２つの第２の相補的ドメインは、同じまたは異なる核酸配列を有し得る。
【０３２４】
ガイドドメインが異なる標的に対するガイド配列を含む場合、ガイド核酸は、２つの異なる標的と特異的に結合することができ、ここで、特異的結合は、同時にまたは順次に実施され得る。さらに、リンカードメインは、特定の酵素によって切断され得、ガイド核酸は、特定の酵素の存在下で２分割または３分割され得る。
【０３２５】
本発明のガイド核酸の具体例として、ｇＲＮＡを以下に記載する。
【０３２６】
［ｇＲＮＡ］
用語「ｇＲＮＡ」とは、標的遺伝子または核酸に対して、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化する能力がある核酸をさす。さらに、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合し、ＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子または核酸に導くことができる、核酸特異的ＲＮＡである。ｇＲＮＡには、複数のドメインが含まれてよい。
【０３２７】
各ドメインに起因して、相互作用は、三次元構造または活性型のｇＲＮＡ鎖、またはこれらの鎖の間で起こり得る。
【０３２８】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または二本鎖ｇＲＮＡ（２以上、一般に２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と呼ばれることがある。
【０３２９】
例示的な一実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡには、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸と相補的結合を形成する能力があるガイド配列を含むドメイン、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメイン、近位ドメイン、および所望によりテールドメインを５'から３'方向に含まれ得る。
【０３３０】
別の実施形態では、二本鎖ｇＲＮＡには、ガイドドメイン、すなわち標的遺伝子または核酸と相補的結合を形成する能力があるガイド配列を含むドメインおよび第１の相補的ドメインを含む第１の鎖、および、第２の相補的ドメイン、第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと二本鎖核酸を形成するドメイン、近位ドメイン、ならびに所望によりテールドメインを５'から３'方向に含む第２の鎖が含まれてよい。
【０３３１】
ここで、第１の鎖は、ｃｒＲＮＡと呼ばれることがあり、第２の鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡ呼ばれることがある。ｃｒＲＮＡには、ガイドドメインおよび第１の相補的ドメインが含まれてよく、ｔｒａｃｒＲＮＡには、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよび所望によりテールドメインが含まれてよい。
【０３３２】
さらに別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡには、ガイドドメイン、すなわち標的遺伝子または核酸と相補的結合を形成する能力があるガイド配列を含むドメイン、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメイン、および第１の相補的ドメイン配列に相補的な配列を有し、それによって第１の相補的ドメインと５'から３'方向に二本鎖核酸を形成するドメインが含まれてよい。
【０３３３】
ｉ）ガイドドメイン
ガイドドメインには、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある相補ガイド配列が含まれる。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する核酸配列であり得る。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体が標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
【０３３４】
ガイドドメインは、５〜５０塩基の配列であり得る。
【０３３５】
例示的な実施形態として、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であり得る。
【０３３６】
例示的な実施形態として、ガイドドメインには、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列が含まれてよい。
【０３３７】
ここで、ガイドドメインには、ガイド配列が含まれてよい。
【０３３８】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある相補塩基配列であり得る。
【０３３９】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０３４０】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子標的配列に相補的な核酸配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０３４１】
ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であり得る。
【０３４２】
例示的な一実施形態では、ガイド配列には、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列が含まれてよい。
【０３４３】
例示的な実施形態では、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であり得る。
【０３４４】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列である、ＶＥＧＦＡ遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０３４５】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列である、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０３４６】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列である、ＡＮＧＰＴ２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０３４７】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列である、ＥＰＡＳ１遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０３４８】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列である、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０３４９】
ここで、ガイド配列のための標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子の標的配列が、上でそれぞれ表１、表２、表３、表４および表５に記載されているが、本発明はこれらに限定されない。
【０３５０】
ここで、ガイドドメインには、ガイド配列とさらなる塩基配列が含まれ得る。
【０３５１】
さらなる塩基配列は、１〜３５塩基の配列であり得る。
【０３５２】
例示的な一実施形態では、さらなる塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基の配列であり得る。
【０３５３】
例えば、さらなる塩基配列は、一塩基配列、グアニン（Ｇ）、または二塩基配列、ＧＧであり得る。
【０３５４】
さらなる塩基配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
【０３５５】
さらなる塩基配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０３５６】
選択的に、ガイドドメインの塩基配列の一部または全部には、化学修飾が含まれてよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０３５７】
ｉｉ）第１の相補的ドメイン
第１の相補的ドメインには、第２の相補的ドメインに相補的な核酸配列が含まれ、そしてそれが第２の相補的ドメインと二本鎖を形成することが可能なように十分な相補性を有する。
【０３５８】
ここで、第１の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であり得る。第１の相補的ドメインには、５〜３５塩基の配列が含まれてよい。
【０３５９】
例示的な一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基の配列であり得る。
別の実施形態では、第１の相補的ドメインには、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基の配列が含まれてよい。
【０３６０】
第１の相補的ドメインは、天然の第１の相補的ドメインと相同性を有してもよく、または天然の第１の相補的ドメインに由来してもよい。
【０３６１】
さらに、第１の相補的ドメインは、天然に存在する種に依存して、第１の相補的ドメインの塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０３６２】
例示的な一実施形態では、第１の相補的ドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌の第１の相補的ドメインあるいはそれに由来する第１の相補的ドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
例えば、第１の相補的ドメインが化膿性連鎖球菌の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'であるか、あるいは５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、５〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返しであるか、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物であり得る。
【０３６３】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'であるか、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、５〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３６４】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインは、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属菌（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）、ラクノスピラ細菌（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）（２３７）、スミセラ属菌（Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ細菌（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）またはユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）の第１の相補的ドメインあるいはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０３６５】
例えば、第１の相補的ドメインが、パルクバクテリア細菌の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインである場合、第１の相補的ドメインは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'であるか、または５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、１〜５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３６６】
選択的に、第１の相補的ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。
【０３６７】
化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０３６８】
ｉｉｉ）リンカードメイン
リンカードメインは、２またはそれ以上のドメインを連結する核酸配列であり、２またはそれ以上の同一または異なるドメインを連結する。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって、２またはそれ以上のドメインと連結されるか、あるいは２またはそれ以上のドメインを連結することができる。
【０３６９】
リンカードメインは、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインを連結して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列であり得る。  リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインと連結され得る。
【０３７０】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインと連結することができる。
【０３７１】
リンカードメインは、１〜３０塩基の配列であり得る。リンカードメインには、１〜３０塩基の配列が含まれてよい。
【０３７２】
例示的な実施形態では、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基の配列であり得る。
【０３７３】
例示的な実施形態では、リンカードメインには、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基の配列が含まれてよい。
【０３７４】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子で使用されるのに適しており、共有結合または非共有結合によって、二本鎖ｇＲＮＡの第１の鎖および第２の鎖と連結されるか、または第１の鎖を第２の鎖と連結することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと連結されるか、またはｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと連結することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。
リンカードメインは、天然の配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの部分配列と相同性を有し得るか、またはそれに由来し得る。
【０３７５】
選択的に、リンカードメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０３７６】
ｉｖ）第２の相補的ドメイン  第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するように十分な相補性を有する。第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインと相補的な塩基配列、および第１の相補的ドメインと相補性を有さない塩基配列、例えば、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を含み得、かつ、第１の相補的ドメインよりも長い塩基配列を有し得る。
【０３７７】
ここで、第２の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であり得る。
【０３７８】
第１の相補的ドメインには、５〜３５塩基の配列が含まれてよい。
【０３７９】
例示的な実施形態では、第２の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であり得る。
【０３８０】
例示的な実施形態では、第２の相補的ドメインには、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列が含まれてよい。
【０３８１】
さらに、第２の相補的ドメインは、天然の第２の相補的ドメインと相同性を有してもよく、または天然の第２の相補的ドメインに由来してもよい。さらに、第２の相補的ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２の相補的ドメインの塩基配列に相違を有するか、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインに由来するか、または天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有することがある。
【０３８２】
例示的な実施形態では、第２の相補的ドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌の第２の相補的ドメイン、あるいはそれに由来する第２の相補的ドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
例えば、第２の相補的ドメインが、化膿性連鎖球菌の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であるか、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成する塩基配列に下線を引く）と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み、５'−（Ｘ）ｎＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択することができ、ｎおよびｍの各々は、ｎが１〜１５の整数であってよく、ｍが１〜６の整数であってよい塩基の数を表すことができる。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。さらに、（Ｘ）ｍは、同じ塩基のｍ回の繰り返し、またはｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３８３】
別の例では、第２の相補的ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'であるか、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成する塩基配列に下線を引く）と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み、５'−（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択することができ、ｎおよびｍの各々は、ｎが１〜１５の整数であってよく、ｍが１〜６の整数であってよい塩基の数を表すことができる。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。さらに、（Ｘ）ｍは、同じ塩基のｍ回の繰り返し、またはｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３８４】
別の実施形態では、第１の相補的ドメインは、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属菌（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）、ラクノスピラ細菌（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）（２３７）、スミセラ属菌（Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ細菌（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）またはユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）の第１の相補的ドメインあるいはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０３８５】
例えば、第２の相補的ドメインがパルクバクテリア細菌の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインである場合、第２の相補的ドメインは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'であるか、または５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'（第１の相補的ドメインと二本鎖を形成する塩基配列に下線を引く）と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第２の相補的ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍをさらに含み、５'−（Ｘ）ｎＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択することができ、ｎおよびｍの各々は、ｎが１〜１０の整数であってよく、ｍが１〜６の整数であってよい塩基の数を表すことができる。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。さらに、（Ｘ）ｍは、同じ塩基のｍ回の繰り返し、またはｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３８６】
選択的に、第２の相補的ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０３８７】
ｖ）近位ドメイン
【０３８８】
近位ドメインは、第２の相補的ドメインに隣接して位置する１〜２０塩基の配列であり、第２の相補的ドメインの３'末端方向に位置するドメインである。ここで、近位ドメインは、その中の相補的な塩基配列間で二本鎖を形成するために使用され得る。
【０３８９】
例示的な一実施形態では、近位ドメインは、５、６、７、８、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基の配列であり得る。
【０３９０】
別の実施形態では、近位ドメインには、５、６、７、８、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基の配列が含まれてよい。
さらに、近位ドメインは、天然の近位ドメインと相同性を有してもよく、または天然の近位ドメインに由来してもよい。さらに、近位ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれる近位ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０３９１】
例示的な実施形態では、近位ドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌の近位ドメインあるいはそれに由来する近位ドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０３９２】
例えば、近位ドメインが化膿性連鎖球菌の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインである場合、近位ドメインは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'であるか、あるいは５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、１〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３９３】
さらに別の例では、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインである場合、近位ドメインは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'であるか、あるいは５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、１〜４０の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０３９４】
選択的に、近位ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０３９５】
ｖｉ）テールドメイン  テールドメインは、一本鎖ｇＲＮＡまたは二本鎖ｇＲＮＡの３'末端に選択的に付加されることのできるドメインである。
【０３９６】
テールドメインは、１〜５０塩基の配列であり得るか、または１〜５０塩基の配列を含み得る。ここで、テールドメインは、その中の相補的な塩基配列間で二本鎖を形成するために使用され得る。  例示的な実施形態では、テールドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０３９７】
例示的な実施形態では、テールドメインには、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０塩基の配列が含まれてよい。
【０３９８】
さらに、テールドメインは、天然のテールドメインと相同性を有してもよく、または天然のテールドメインに由来してもよい。さらに、テールドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれるテールドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれるテールドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０３９９】
例示的な一実施形態では、テールドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌のテールドメインあるいはそれに由来するテールドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０４００】
例えば、テールドメインが化膿性連鎖球菌のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインである場合、テールドメインは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'であるか、あるいは５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、テールドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'となり得る。
【０４０１】
Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、１〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはＡ、Ｔ、ＵおよびＧなどの塩基の混合物を表し得る。
【０４０２】
別の例では、テールドメインがカンピロバクター・ジェジュニのテールドメインまたはそれに由来するテールドメインである場合、テールドメインは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'であるか、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、テールドメインは、（Ｘ）ｎをさらに含み、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ−３'となり得る。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧからなる群から選択され得、ｎは、１〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同じ塩基のｎ回の繰り返し、またはｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混合物を表し得る。
【０４０３】
別の実施形態では、テールドメインには、１〜１０塩基の配列がインビトロまたはインビボでの転写方法に関与する３'末端に含まれてよい。
【０４０４】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写に使用される場合、テールドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。さらに、Ｕ６プロモーターがインビボ転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインには、数個のウラシル塩基または代替塩基が含まれてよい。
【０４０５】
選択的に、テールドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４０６】
ｇＲＮＡには、上記のように複数のドメインが含まれてよく、そのため、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに応じて調節され得、相互作用は、各ドメインに起因して、三次元構造もしくは活性型のｇＲＮＡの鎖で、またはこれらの鎖間で起こり得る。
【０４０７】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または二本鎖ｇＲＮＡ（２以上、一般に２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と呼ぶことができる。
【０４０８】
［二本鎖ｇＲＮＡ］
二本鎖ｇＲＮＡは、第１の鎖および第２の鎖からなる。
【０４０９】
ここで、第１の鎖は、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−３'からなってよく、
第２の鎖は、
５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または
５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'からなってよい。
【０４１０】
ここで、第１の鎖は、ｃｒＲＮＡと呼ばれることがあり、第２の鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡ呼ばれることがある。
【０４１１】
第１の鎖  ［ガイドドメイン］
第１の鎖において、ガイドドメインには、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成することができる相補ガイド配列が含まれる。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体が標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
【０４１２】
ここで、ガイドドメインは、５〜５０塩基の配列であり得るか、または５〜５０塩基の配列を含む。例えば、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４１３】
さらに、ガイドドメインには、ガイド配列が含まれ得る。
【０４１４】
ここで、ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成することができる相補的な塩基配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０４１５】
例示的な実施形態では、ガイド配列は、標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子標的配列に相補的な核酸配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０４１６】
ここで、ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であり得るか、または５〜５０塩基の配列を含む。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４１７】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列である。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４１８】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４１９】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４２０】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列である。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４２１】
例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４２２】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列である。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４２３】
ここで、ガイド配列に関して、標的遺伝子、すなわち、例えばＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子の標的配列が、上の表１、表２、表３、表４および表５に記載されているが、本発明はこれらに限定されない。  選択的に、ガイドドメインには、ガイド配列とさらなる塩基配列が含まれ得る。
【０４２４】
ここで、さらなる塩基配列は、１〜３５塩基の配列であり得る。例えば、さらなる塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基の配列であり得る。
【０４２５】
例示的な一実施形態では、さらなる塩基配列には、１個の塩基、グアニン（Ｇ）、または２個の塩基、ＧＧが含まれてよい。
【０４２６】
ここで、さらなる塩基配列は、ガイドドメインの５'末端、またはガイド配列の５'末端に位置し得る。
【０４２７】
さらなる塩基配列は、ガイドドメインの３'末端、またはガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０４２８】
［第１の相補的ドメイン］
第１の相補的ドメインは、第２の鎖の第２の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有するドメインである。
【０４２９】
ここで、第１の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、第１の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４３０】
第１の相補的ドメインは、天然の第１の相補的ドメインと相同性を有してもよく、または天然の第１の相補的ドメインに由来してもよい。さらに、第１の相補的ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０４３１】
例示的な一実施形態では、第１の相補的ドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌の第１の相補的ドメインあるいはそれに由来する第１の相補的ドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０４３２】
選択的に、第１の相補的ドメインには、第２の鎖の第２の相補的ドメインとの相補的結合を行わないさらなる塩基配列が含まれてよい。
【０４３３】
ここで、さらなる塩基配列は、１〜１５塩基の配列であり得る。例えば、さらなる塩基配列は、１〜５、５〜１０、または１０〜１５塩基の配列であり得る。
【０４３４】
選択的に、ガイドドメインおよび／または第１の相補的ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４３５】
そのため、第１の鎖は、上記のように、５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−３'からなり得る。
【０４３６】
さらに、第１の鎖には、所望により、さらなる塩基配列が含まれ得る。
【０４３７】
一例では、第１の鎖は、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−３'、または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−３'
であり得る。
【０４３８】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に応じて変更され得る塩基配列領域である。
【０４３９】
例示的な一実施形態では、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子の標的配列と相補的結合を形成する能力がある塩基配列であり得る。
【０４４０】
ここで、（Ｑ）ｍは、第１の相補的ドメインを含む塩基配列であり、これは第２の鎖の第２の相補的ドメインと相補的結合を形成することができる。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変更され得る。Ｑは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｍは、５〜３５の整数である塩基の数を表し得る。
【０４４１】
例えば、第１の相補的ドメインが、化膿性連鎖球菌の第１の相補的ドメインまたは化膿性連鎖球菌由来の第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'であるか、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４２】
別の例では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１の相補的ドメインまたはカンピロバクター・ジェジュニ由来の第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'であるか、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４３】
さらに別の例では、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの第１の相補的ドメインまたはストレプトコッカス・サーモフィルス由来の第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'であるか、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４４】
さらに、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃの各々は、選択的に、さらなる塩基配列であり、Ｘは、各々独立にＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ａ、ｂおよびｃの各々は、０または１〜２０の整数である塩基の数であり得る。
【０４４５】
［第２の鎖］
第２の鎖は、第２の相補的ドメインおよび近位ドメインからなり、選択的にテールドメインを含み得る。
【０４４６】
［第２の相補的ドメイン］
第２の鎖において、第２の相補的ドメインは、第１の鎖の第１の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインと相補的な塩基配列、および第１の相補的ドメインに相補的でない塩基配列、例えば、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を含み得、かつ、第１の相補的ドメインよりも長い塩基配列を有し得る。
【０４４７】
ここで、第２の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であり得るか、または５〜３５塩基の配列を含み得る。例えば、第２の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４４８】
第２の相補的ドメインは、天然の第２の相補的ドメインと相同性を有してもよく、または天然の第２の相補的ドメインに由来してもよい。さらに、第２の相補的ドメインは、天然に存在する種に応じて、その塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０４４９】
例示的な一実施形態では、第２の相補的ドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）またはナイセリア髄膜炎菌あるいはそれに由来する第２の相補的ドメインの第２の相補的ドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０４５０】
選択的に、第２の相補的ドメインには、第１の鎖の第１の相補的ドメインとの相補的結合を行わないさらなる塩基配列がさらに含まれてよい。
【０４５１】
ここで、さらなる塩基配列は、１〜２５塩基の配列であり得る。例えば、さらなる塩基配列は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０または２０〜２５塩基の配列であり得る。
【０４５２】
［近位ドメイン］
第２の鎖において、近位ドメインは、１〜２０塩基の配列であり、第２の相補的ドメインの３'末端方向に位置するドメインである。例えば、近位ドメインは、５、６、７、８、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４５３】
ここで、近位ドメインは、その中の相補的な塩基配列間に二本鎖結合を有し得る。
【０４５４】
さらに、近位ドメインは、天然の近位ドメインと相同性を有してもよく、または天然の近位ドメインに由来してもよい。さらに、近位ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種の近位ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種の近位ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０４５５】
例示的な一実施形態では、近位ドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌の近位ドメインあるいはそれに由来する近位ドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０４５６】
［テールドメイン］
選択的に、第２の鎖において、テールドメインは、第２の鎖の３'末端に選択的に付加されたドメインであり得、テールドメインは、１〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、テールドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４５７】
ここで、テールドメインは、その中の相補的な塩基配列間に二本鎖結合を有し得る。
【０４５８】
さらに、テールドメインは、天然のテールドメインと相同性を有してもよく、または天然のテールドメインに由来してもよい。さらに、テールドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれるテールドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれるテールドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０４５９】
例示的な一実施形態では、テールドメインは、化膿性連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌のテールドメインあるいはそれに由来するテールドメインと、部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０４６０】
別の実施形態では、テールドメインには、１〜１０塩基の配列がインビトロまたはインビボでの転写方法に関与する３'末端に含まれてよい。
【０４６１】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写に使用される場合、テールドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。さらに、Ｕ６プロモーターがインビボ転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインには、数個のウラシル塩基または代替塩基が含まれてよい。
【０４６２】
選択的に、第２の相補的ドメイン、近位ドメインおよび／またはテールドメインの塩基配列の各々の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４６３】
そのため、第２の鎖は、上記のように、５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または５'−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'からなってよい。
【０４６４】
さらに、第２の鎖には、選択的に、さらなる塩基配列が含まれ得る。
【０４６５】
例示的な一実施形態では、第２の鎖は、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'または５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'であり得る。
【０４６６】
別の実施形態では、第２の鎖は、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'または５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０４６７】
ここで、（Ｚ）ｈは、第２の相補的ドメインを含む塩基配列であり、これは第１の鎖の第１の相補的ドメインと相補的結合を形成することができる。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｚは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｈは、５〜５０の整数である塩基の数を表し得る。
【０４６８】
例えば、第２の相補的ドメインが、化膿性連鎖球菌の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であるか、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４６９】
別の例では、第２の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'であるか、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７０】
さらに別の例では、第２の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７１】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインと部分的または完全な相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｐは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｋは、１〜２０の整数である塩基の数を表し得る。
【０４７２】
例えば、近位ドメインが、化膿性連鎖球菌の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７３】
別の例では、近位ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７４】
さらに別の例では、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７５】
（Ｆ）ｉは、テールドメインを含み、天然に存在する種のテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する塩基配列であり得、テールドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｆは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｉは、１〜５０の整数である塩基の数を表し得る。
【０４７６】
例えば、テールドメインが、化膿性連鎖球菌のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７７】
別の例では、テールドメインが、カンピロバクター・ジェジュニのテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７８】
さらに別の例では、テールドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスのテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'、または５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４７９】
さらに、（Ｆ）ｉには、１〜１０塩基の配列がインビトロまたはインビボでの転写方法に関与する３'末端に含まれてよい。
【０４８０】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写に使用される場合、テールドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。さらに、Ｕ６プロモーターがインビボ転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインには、数個のウラシル塩基または代替塩基が含まれてよい。
【０４８１】
さらに、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に付加された塩基配列であり得、Ｘは、各々独立にＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｄ、ｅおよびｆの各々は、０または１〜２０の整数である塩基の数であり得る。
【０４８２】
［一本鎖ｇＲＮＡ］
一本鎖ｇＲＮＡは、２つの種類に分類され得る。
【０４８３】
ｉ）一本鎖ｇＲＮＡ
まず、二本鎖ｇＲＮＡの第１の鎖または第２の鎖がリンカードメインによって連結されている一本鎖ｇＲＮＡがあり、ここで一本鎖ｇＲＮＡは、５'−［第１の鎖］−［リンカードメイン］−［第２の鎖］−３'からなる。
【０４８４】
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または
５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'
からなり得る。
【０４８５】
リンカードメインを除く各ドメインは、二本鎖ｇＲＮＡの第１および第２の鎖の各ドメインの説明と同じである。
【０４８６】
［リンカードメイン］
一本鎖ｇＲＮＡにおいて、リンカードメインは、第１の鎖および第２の鎖を連結するドメインであり、具体的には、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインを連結して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列である。ここで、リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインと連結されるか、または第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインと連結し得る。
【０４８７】
リンカードメインは、１〜３０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０４８８】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子で使用されるのに適しており、一本鎖ｇＲＮＡの製造に使用される共有結合または非共有結合によって、二本鎖ｇＲＮＡの第１の鎖および第２の鎖と連結され得るか、または第１の鎖を第２の鎖と連結し得る。リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡの製造に使用される共有結合または非共有結合によって、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと連結され得るか、またはｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと連結し得る。
【０４８９】
リンカードメインは、天然の配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの部分配列と相同性を有し得るか、またはそれに由来し得る。
【０４９０】
選択的に、リンカードメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４９１】
そのため、一本鎖ｇＲＮＡは、上記のように、５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または５'−［ガイドドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［近位ドメイン］−［テールドメイン］−３'からなり得る。
【０４９２】
さらに、一本鎖ｇＲＮＡには、選択的に、さらなる塩基配列が含まれ得る。
【０４９３】
例示的な一実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'、または
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【０４９４】
別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'、または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０４９５】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に応じて変更される能力がある塩基配列領域である。
【０４９６】
例示的な一実施形態では、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子の標的配列と相補的結合を形成する能力がある塩基配列である。
【０４９７】
（Ｑ）ｍは、第２の相補的ドメインと相補的結合を形成することができる、第１の相補的ドメインを含む塩基配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変更され得る。Ｑは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｍは、５〜３５の整数である塩基の数を表し得る。
【０４９８】
例えば、第１の相補的ドメインが、化膿性連鎖球菌の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４９９】
別の例では、第１の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５００】
さらに別の例では、第１の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'、または５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５０１】
さらに、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含み、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインを連結し、それによって一本鎖ｇＲＮＡを生成する塩基配列である。ここで、Ｌは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｊは、１〜３０の整数である塩基の数を表し得る。
【０５０２】
（Ｚ）ｈは、第１の相補的ドメインと相補的結合を有することができる、第２の相補的ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変更され得る。Ｚは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｈは、５〜５０の整数であり得る塩基の数を表し得る。
【０５０３】
例えば、第２の相補的ドメインが、化膿性連鎖球菌の第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であるか、または５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５０４】
別の例では、第２の相補的ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'であるか、または５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５０５】
さらに別の例では、第２の相補的ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの第２の相補的ドメインまたはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'、または５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５０６】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインと部分的または完全な相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｐは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｋは、１〜２０の整数である塩基の数を表し得る。
【０５０７】
例えば、近位ドメインが、化膿性連鎖球菌の近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５０８】
別の例では、近位ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'、または５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５０９】
さらに別の例では、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの近位ドメインまたはそれに由来する近位ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'、または５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５１０】
（Ｆ）ｉは、テールドメインを含み、天然に存在する種のテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する塩基配列であり得、テールドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｆは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｉは、１〜５０の整数である塩基の数を表し得る。
【０５１１】
例えば、テールドメインが、化膿性連鎖球菌のテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'、または５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。  別の例では、テールドメインが、カンピロバクター・ジェジュニのテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'、または５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５１２】
さらに別の例では、テールドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスのテールドメインまたはそれに由来するテールドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'、または５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５１３】
さらに、（Ｆ）ｉには、１〜１０塩基の配列がインビトロまたはインビボでの転写方法に関与する３'末端に含まれてよい。
【０５１４】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写に使用される場合、テールドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。さらに、Ｕ６プロモーターがインビボ転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵＵＵであり得、Ｈ１プロモーターが転写に使用される場合、テールドメインは、ＵＵＵＵであり得、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、テールドメインには、数個のウラシル塩基または代替塩基が含まれてよい。
【０５１５】
さらに、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に付加された塩基配列であり得、Ｘは、各々独立にＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆの各々は、０または１〜２０の整数である塩基の数であり得る。
【０５１６】
ｉｉ）一本鎖ｇＲＮＡ
第２に、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインからなる一本鎖ｇＲＮＡであり得、ここで、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−［第２の相補的ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'または
５'−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'からなり得る。
【０５１７】
［ガイドドメイン］
一本鎖ｇＲＮＡにおいて、ガイドドメインには、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある相補ガイド配列が含まれる。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補性を有する核酸配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体が標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
【０５１８】
ここで、ガイドドメインは、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５１９】
さらに、ガイドドメインには、ガイド配列が含まれ得る。
【０５２０】
ここで、ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある相補的な塩基配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０５２１】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子標的配列に相補的な核酸配列であり得、これは例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０５２２】
ここで、ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５２３】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５２４】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５２５】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５２６】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５２７】
例示的な一実施形態では、ガイド配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５２８】
ここで、ガイド配列のための標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子の標的配列が、上でそれぞれ表１、表２、表３、表４および表５に記載されているが、本発明はこれらに限定されない。
【０５２９】
選択的に、ガイドドメインには、ガイド配列とさらなる塩基配列が含まれ得る。
【０５３０】
ここで、さらなる塩基配列は、１〜３５塩基の配列であり得る。例えば、さらなる塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基の配列であり得る。
【０５３１】
例示的な一実施形態では、さらなる塩基配列は、一塩基配列、グアニン（Ｇ）、または二塩基配列、ＧＧであり得る。
【０５３２】
ここで、さらなる塩基配列は、ガイドドメインの５'末端、またはガイド配列の５'末端に位置し得る。
【０５３３】
さらなる塩基配列は、ガイドドメインの３'末端、またはガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０５３４】
［第１の相補的ドメイン］
第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２の相補的ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有するドメインである。
【０５３５】
ここで、第１の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、第１の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５３６】
第１の相補的ドメインは、天然の第１の相補的ドメインと相同性を有してもよく、または天然の第１の相補的ドメインに由来してもよい。さらに、第１の相補的ドメインは、天然に存在する種に依存して、第１の相補的ドメインの塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれる第１の相補的ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０５３７】
例示的な一実施形態では、第１の相補的ドメインは、パルクバクテリア細菌（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ細菌（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア細菌（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属菌（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラ細菌（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボボクリ（２３７）、スミセラ属菌（Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラ細菌（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第１の相補的ドメインあるいはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０５３８】
選択的に、第１の相補的ドメインには、第２の相補的ドメインとの相補的結合を行わないさらなる塩基配列が含まれてよい。
【０５３９】
ここで、さらなる塩基配列は、１〜１５塩基の配列であり得る。例えば、さらなる塩基配列は、１〜５、５〜１０、または１０〜１５塩基の配列であり得る。
【０５４０】
［第２の相補的ドメイン］
第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成するように十分な相補性を有する。第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインと相補的な塩基配列、および第１の相補的ドメインと相補性を有さない塩基配列、例えば、第１の相補的ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を含み得、かつ、第１の相補的ドメインよりも長い塩基配列を有し得る。
【０５４１】
ここで、第２の相補的ドメインは、５〜３５塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、第２の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であり得る。
【０５４２】
第２の相補的ドメインは、天然の第２の相補的ドメインと相同性を有してもよく、または天然の第２の相補的ドメインに由来してもよい。さらに、第２の相補的ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２の相補的ドメインの塩基配列に相違を有し得るか、天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインに由来し得るか、または天然に存在する種に含まれる第２の相補的ドメインと部分的もしくは完全な相同性を有し得る。
【０５４３】
例示的な一実施形態では、第２の相補的ドメインは、パルクバクテリア細菌（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ細菌（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア細菌（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属菌（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラ細菌（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボボクリ（２３７）、スミセラ属菌（Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラ細菌（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第２の相補的ドメインあるいはそれに由来する第２の相補的ドメインと部分的な、すなわち少なくとも５０％またはそれ以上の、または完全な相同性を有し得る。
【０５４４】
選択的に、第２の相補的ドメインには、第１の相補的ドメインとの相補的結合を行わないさらなる塩基配列が含まれてよい。
【０５４５】
ここで、さらなる塩基配列は、１〜１５塩基の配列であり得る。例えば、さらなる塩基配列は、１〜５、５〜１０、または１０〜１５塩基の配列であり得る。
【０５４６】
［リンカードメイン］
選択的に、リンカードメインは、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインを連結して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列である。ここで、リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインと連結されるか、または第１を第２の相補的ドメインと連結し得る。
【０５４７】
リンカードメインは、１〜３０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。例えば、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基の配列であるか、またはそれらを含み得る。
【０５４８】
選択的に、ガイドドメイン、第１の相補的ドメイン、第２の相補的ドメインおよびリンカードメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有してよい。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０５４９】
そのため、一本鎖ｇＲＮＡは、上記のように、５'−［第２の相補的ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'または５'−［第２の相補的ドメイン］−［リンカードメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'からなり得る。
【０５５０】
さらに、一本鎖ｇＲＮＡには、選択的に、さらなる塩基配列が含まれ得る。
【０５５１】
例示的な一実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｚ）ｈ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'
であり得る。
【０５５２】
別の実施形態では、一本鎖ｇＲＮＡは、
５'−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'または
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'
であり得る。
【０５５３】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的結合を形成する能力がある塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に応じて変更され得る塩基配列領域である。
【０５５４】
例示的な一実施形態では、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子、すなわち、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの新生血管形成関連因子の標的配列と相補的結合を形成する能力がある塩基配列であり得る。
【０５５５】
（Ｑ）ｍは、第１の相補的ドメインを含む塩基配列であり、これは第２の鎖の第２の相補的ドメインと相補的結合を形成することができる。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第１の相補的ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変更され得る。Ｑは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｍは、５〜３５の整数である塩基の数を表し得る。
【０５５６】
例えば、第１の相補的ドメインが、パルクバクテリア細菌の第１の相補的ドメインまたはそれに由来する第１の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｑ）ｍは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'、または５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５５７】
（Ｚ）ｈは、第２の相補的ドメインを含む塩基配列であり、これは第１の鎖の第１の相補的ドメインと相補的結合を形成することができる。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２の相補的ドメインと部分的または完全な相同性を有する配列であり得、第２の相補的ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｚは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｈは、５〜５０の整数である塩基の数を表し得る。
【０５５８】
例えば、第２の相補的ドメインが、パルクバクテリア細菌の第２の相補的ドメインまたはパルクバクテリア細菌由来の第２の相補的ドメインと部分的なまたは完全な相同性を有する場合、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'、または５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'と少なくとも５０％またはそれ以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０５５９】
さらに、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含む塩基配列であり、これは第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインを連結する。ここで、Ｌは、各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ｊは、１〜３０の整数である塩基の数を表し得る。
【０５６０】
さらに、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃの各々は、選択的に、さらなる塩基配列であり、Ｘは、各々独立にＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され得、ａ、ｂおよびｃは、０または１〜２０の整数である塩基の数であり得る。
【０５６１】
２．編集タンパク質
編集タンパク質とは、核酸と直接結合することができるか、または直接結合せずに相互作用することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をさす。
【０５６２】
核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体に含まれる核酸であり得る。
【０５６３】
核酸は、ガイド核酸であり得る。
【０５６４】
編集タンパク質は酵素であってよい。
【０５６５】
編集タンパク質は融合タンパク質であってよい。
【０５６６】
ここで、融合タンパク質とは、酵素をさらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合することによって生成されるタンパク質をさす。
【０５６７】
酵素とは、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を切断することができるドメインを含むタンパク質をさす。
【０５６８】
酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０５６９】
さらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同じかまたは異なる機能を有する機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０５７０】
融合タンパク質には、さらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素の１または複数のＮ末端またはその近傍、酵素のＣ末端またはその近傍、酵素の中央領域、およびそれらの組合せに含まれてよい。
【０５７１】
融合タンパク質には、機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素の１または複数のＮ末端またはその近傍、酵素のＣ末端またはその近傍、酵素の中央領域、およびそれらの組合せに含まれてよい。
【０５７２】
ここで、機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性または核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグまたはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０５７３】
機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。
【０５７４】
タグには、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれ、レポーター遺伝子には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるが、本発明はこれらに限定されない。
【０５７５】
さらに、機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核移行配列またはシグナル（ＮＬＳ）または核外輸送配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０５７６】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを含むＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを含むヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを含むｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを含むｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチンα由来のＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、肝炎ウイルスδ抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、あるいはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０５７７】
編集タンパク質には、完全活性酵素が含まれ得る。
【０５７８】
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の機能と同等の機能を持つ酵素をさし、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素は、ＤＮＡの二本鎖を完全に切断する完全な酵素活性を有する。
【０５７９】
さらに、完全活性酵素は、野性型酵素の機能と比較して改善された機能を有する酵素を含み、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特定の改変または操作のタイプは、野性型酵素と比較して改善された十分な酵素活性、すなわちＤＮＡの二本鎖を切断する活性を有する。
【０５８０】
編集タンパク質には、不完全または部分的に活性な酵素が含まれてよい。
【０５８１】
ここで、「不完全または部分的に活性な酵素」とは、野性型酵素の機能の一部を有する酵素をさし、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特定の改変または操作のタイプは、二本鎖の一部、すなわちＤＮＡの一本鎖を切断する不完全または部分的な酵素活性を有する。
【０５８２】
編集タンパク質には、不活性酵素が含まれてよい。
【０５８３】
ここで、「不活性酵素」とは、野性型酵素の機能が完全に不活性化されている酵素をさす。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特定の改変または操作のタイプは、ＤＮＡ二本鎖を完全に切断しないように不活性を有している。
【０５８４】
編集タンパク質は、天然の酵素または融合タンパク質であり得る。
【０５８５】
編集タンパク質は、部分的に改変された天然の酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０５８６】
編集タンパク質は、天然に存在しない、人工的に生成された酵素または融合タンパク質であり得る。
【０５８７】
編集タンパク質は、天然に存在しない、部分的に改変された人工の酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０５８８】
ここで、改変は、編集タンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、付加、またはそれらの組合せであり得る。
【０５８９】
さらに、改変は、編集タンパク質をコードする塩基配列中の一部の塩基の置換、除去、付加、またはそれらの組合せであり得る。
【０５９０】
本発明の編集タンパク質の１つの例示的な実施形態として、ＣＲＩＳＰＲ酵素を下に説明する。
【０５９１】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素］
用語「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の主なタンパク質成分であり、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系となる。
【０５９２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド（またはタンパク質）であり、代表的に、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が広く使用されている。
【０５９３】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス属菌、黄色ブドウ球菌、ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ、ストレプトマイセス・プリスチネスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム・ロセウム、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エキシグオバクテリウム・シビリカム、ラクトバチルス・デルブリュッキ、ラクトバチルス・サリバリウス、ミクロシラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス属菌、クロコスファエラ・ワトソニイ、シアノセイス属菌、ミクロキスティス・エルギノーサ、シネココッカス属菌、アセトハロビウム・アラバチカム、アンモニフェックス・デゲンシイ、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｓｃｉｉ）、カンジデイタス・デサルホルディス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノサム、マリノバクター属菌、ニトロソコッカス・ハロフィルス、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガータム、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属菌、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属菌、リングビア属菌、ミクロコレウス・クソノプラステス、オシラトリア属菌、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌス、およびアカリオクロリス・マリナなどの様々な微生物に由来し得る。
【０５９４】
用語「Ｃａｓ９」は、標的遺伝子または核酸上の標的配列または位置を切断または改変するようにｇＲＮＡと結合する酵素であり、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する核酸鎖を切断する能力があるＨＮＨドメイン、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する核酸鎖を切断する能力があるＲｕｖＣドメイン、標的を認識するＲＥＣドメインおよびＰＡＭを認識するＰＩドメインからなり得る。Ｃａｓ９の具体的な構造的特徴については、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｃｅｌｌ  １５６：９３５〜９４９が参照され得る。
【０５９５】
さらに、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃｐｆ１であり得、これはストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スファエロカエタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピトゥトゥス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）に由来し得る。
【０５９６】
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似しこれに対応するＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインを含まないＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣドメイン、ＷＥＤドメインおよびＰＡＭを認識するＰＩドメインからなり得る。Ｃｐｆ１の具体的な構造的特徴については、Ｃｐｆ１、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５：９４９〜９６２が参照され得る。
【０５９７】
Ｃａｓ９のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣｐｆ１タンパク質は、天然に存在するかあるいは組換えまたは合成方法によって非天然に生成された微生物から単離され得る。
【０５９８】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素  ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子に関する研究（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４）およびｇＲＮＡと複合体化した化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関する研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４およびＡｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定された。
【０５９９】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素には、２つのローブ、すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブが含まれ、各ローブには数個のドメインが含まれる。
【０６００】
ＲＥＣローブには、アルギニンに富むブリッジヘリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメインおよびＲＥＣ２ドメインが含まれる。
【０６０１】
ここで、ＢＨドメインは、長いα−ヘリックスとアルギニンに富む領域であり、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインは、ｇＲＮＡ、例えば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡで形成された二本鎖を認識する際に重要な役割を果たす。
【０６０２】
ＮＵＣローブには、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ−相互作用（ＰＩ）ドメインが含まれる。ここで、ＲｕｖＣドメインはＲｕｖＣ様ドメインを包含するか、またはＨＮＨドメインはＨＮＨ様ドメインを含めるために使用される。
【０６０３】
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、時々、当技術分野でＲｕｖＣＩドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメインまたはＲｕｖＣＩＩＩドメインと呼ばれることがあり、一般にＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩまたはＲｕｖＣＩＩＩと呼ばれる。例えば、ＳｐＣａｓ９の例では、ＲｕｖＣドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９および９０９〜１０９８の配列にそれぞれ位置する３つの分割されたＲｕｖＣドメインの各々（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩおよびＲｕｖＣＩＩＩ）から構築される。
【０６０４】
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば標的核酸分子の相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩモチーフとＩＩＩモチーフの間に位置する。例えば、ＳｐＣａｓ９の例では、ＨＮＨドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列７７５〜９０８に位置する。
【０６０５】
ＰＩドメインは、標的遺伝子または核酸中の特定の塩基配列、すなわちプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するか、またはＰＡＭと相互作用する。例えば、ＳｐＣａｓ９の例では、ＰＩドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１０９９〜１３６８の配列に位置する。
【０６０６】
ここで、ＰＡＭは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に従って変動し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５'−ＮＧＧ−３'であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素が髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）である場合、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣあるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣであり得る。
【０６０７】
［Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素］
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する類似のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりのＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメイン、およびＰＡＭを認識するＰＩドメインからなり得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の具体的な構造的特徴については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２が参照され得る。
【０６０８】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し、それによってｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得、ｇＲＮＡと協働してＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近することを可能にし得る。ここで、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的遺伝子または核酸と相互作用する能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
【０６０９】
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または核酸中に存在する配列であり、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に従って変動し得る。つまり、種に応じて特異的に認識され得る異なるＰＡＭ配列がある。
【０６１０】
一例では、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は、５'−ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり得る。
【０６１１】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素活性］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を切断し、二本鎖または一本鎖の切断または除去を引き起こすヌクレアーゼ活性を有する。一般に、野性型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を切断する。
【０６１２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素の上記のヌクレアーゼ活性を操作または改変するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素は操作または改変されてよく、そのような操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全にまたは部分的に活性なまたは不活性な酵素に改変されてよい。
【０６１３】
［不完全にまたは部分的に活性な酵素］
酵素活性を変更し、それによって不完全なまたは部分的な活性を示すように改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素はニッカーゼと呼ばれる。
【０６１４】
用語「ニッカーゼ」とは、標的遺伝子または核酸の二本鎖の１本の鎖だけを切断するように操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素をさし、ニッカーゼは、一本鎖、例えば、標的遺伝子または核酸のｇＲＮＡと相補的でないかまたは相補的である鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。そのため、二本鎖を切断するために、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要とされる。
【０６１５】
例えば、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。つまり、ニッカーゼには、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が含まれてよく、この目的のために、ＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
【０６１６】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとすると、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異している場合、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化されてニッカーゼとして使用される。それによって産生されるニッカーゼはＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸、すなわち、ｇＲＮＡの非相補鎖と相補的結合を形成しない鎖を切断することができる。
【０６１７】
別の例示的な実施形態では、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異している場合、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化されてニッカーゼとして使用される。それによって産生されるニッカーゼはＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し、したがって標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断することができる。
【０６１８】
例えば、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。つまり、ニッカーゼには、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が含まれてよく、この目的のために、ＲｕｖＣドメインは操作または改変され得る。
【０６１９】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとすると、例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異している場合、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化されてニッカーゼとして使用される。それによって産生されるニッカーゼはＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有し、したがって標的遺伝子または核酸、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖の相補鎖を切断することができる。
【０６２０】
別の例示的な実施形態では、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異している場合、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化されてニッカーゼとして使用される。それによって産生されるニッカーゼはＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有し、したがって標的遺伝子または核酸、すなわち、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖の相補鎖を切断することができる。
【０６２１】
［不活性酵素］
酵素活性を完全に不活性にするように改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。
【０６２２】
用語「不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素」とは、標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に切断しないように改変されているＣＲＩＳＰＲ酵素をさし、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメイン中の突然変異に起因するヌクレアーゼ不活性を有する。不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されているＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０６２３】
例えば、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性なヌクレアーゼ活性となるようにＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインにおいて操作または改変され得る。
【０６２４】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとすると、例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基１０および８４０がそれぞれアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異している場合、二本鎖が標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に切断しないように、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化されている。
【０６２５】
別の例示的な実施形態では、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基８および５５９がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異している場合、二本鎖が標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に切断しないように、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化されている。
【０６２６】
［その他の活性］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、上記のヌクレアーゼ活性に加えて、エンドヌクレアーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性またはヘリカーゼ活性、すなわち二本鎖核酸のヘリックス構造をアニールする能力を有し得る。
【０６２７】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、エンドヌクレアーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性またはヘリカーゼ活性を完全に、不完全に、または部分的に活性化するように改変され得る。
【０６２８】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素のターゲティング］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し、それによってｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得、ガイド配列がｇＲＮＡと協働してＰＡＭ配列を含む標的配列に接近することを導く。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的遺伝子または核酸と相互作用する能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
【０６２９】
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または核酸中に存在する配列であり、これはＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて変動し得る。つまり、種に従って特異的に認識され得る様々なＰＡＭ配列がある。
【０６３０】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとすると、
ＳｐＣａｓ９の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'であり得、
ＳｔＣａｓ９の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧＮＧ−３'および／または５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴである）であり得、
ＮｍＣａｓ９の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'であり得、
ＣｊＣａｓ９の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡであり、Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｙ＝ＣまたはＴである）であり得、
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９（ＳｍＣａｓ９）の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧ−３'および／または５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧ）であり得、そして
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡである）であり得る。
【０６３１】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとすると、
Ｃｐｆ１の例では、ＰＡＭ配列は、５'−ＴＴＮ−３'であり得る。
【０６３２】
ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣであり得る。
【０６３３】
特定のＰＡＭ配列を認識する能力があるＣＲＩＳＰＲ酵素は、種に従って特異的に認識される能力があるＰＡＭ配列を用いて操作または改変され得る。例えば、ＳｐＣａｓ９のＰＩドメインは、ＳｐＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を有し、ＣｊＣａｓ９特異的ＰＡＭ配列を認識するようにＣｊＣａｓ９のＰＩドメインに置き換えられ得、それによってＣｊＣａｓ９特異的ＰＡＭ配列を認識するＳｐＣａｓ９を産生する。特異的に認識されるＰＡＭ配列は、ＰＩドメインの置換または置換によって変更され得る。
【０６３４】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ｇＲＮＡと相互作用する能力、および標的遺伝子または核酸に接近する能力、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＡＭ認識能力などの様々な特徴を改善または阻害するように修飾され得る。
【０６３５】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ｇＲＮＡと相互作用してｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、標的遺伝子または核酸に接近または局在する場合に、標的特異性を改善するために改変または操作され、その結果、ｇＲＮＡとの相補的結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖、およびそれとの相補的結合を形成しない非標的遺伝子または核酸を切断せずに、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖だけが切断される、ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０６３６】
ここで、ｇＲＮＡとの相補的結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖およびそれとの相補的結合を形成しない非標的遺伝子または核酸を切断する効果はオフターゲット効果と呼ばれ、ｇＲＮＡとの相補的結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸およびそれとの相補的結合を形成しない非標的遺伝子または核酸の位置または塩基配列はオフターゲットと呼ばれる。ここで、１または複数のオフターゲットが存在し得る。一方、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖の切断効果は、オンターゲット効果と呼ばれ、標的遺伝子または核酸の位置または標的配列は、オンターゲットと呼ばれる。
【０６３７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸の少なくとも１つが改変され、未修飾のＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、改質され得る、例えば、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ｇＲＮＡと相互作用する能力、標的遺伝子または核酸に接近する能力、および標的特異性などの様々な特徴の１または複数が改善または阻害され得る。ここで、改変は、アミノ酸の置換、除去、付加、またはそれらの混合であり得る。
【０６３８】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、
改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する正電荷を有するアミノ酸からなる領域に位置する１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６３９】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）などの正荷電アミノ酸の１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６４０】
改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非正荷電アミノ酸からなる領域に位置する１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６４１】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非正荷電アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）の１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６４２】
別の例では、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非荷電アミノ酸、すなわち、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）の１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６４３】
さらに、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する疎水性残基を有するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６４４】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）の１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６４５】
改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する極性残基を有するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６４６】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）の１または２またはそれ以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０６４７】
さらに、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）を含むアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６４８】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）を含むアミノ酸の１または２またはそれ以上の置換であり得る。
【０６４９】
改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６５０】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸の１または２またはそれ以上の置換であり得る。
【０６５１】
改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６５２】
例えば、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸の１または２またはそれ以上の置換であり得る。
【０６５３】
さらに、改変は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の改変であり得る。
【０６５４】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに存在するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩまたはＲｕｖＣＩＩＩドメインであり得る。
【０６５５】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインに存在するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６５６】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣドメインに存在するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６５７】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインに存在するアミノ酸の１または２またはそれ以上であり得る。
【０６５８】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインの少なくとも２またはそれ以上のドメインに含まれるアミノ酸の２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６５９】
一例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＲｕｖＣドメインに含まれるアミノ酸の２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６０】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣドメインおよびＲｕｖＣドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｄ９６５およびＦ１０３８アミノ酸の少なくとも２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６１】
別の例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＨＮＨドメインに含まれるアミノ酸の２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６２】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣドメインおよびＨＮＨドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１およびＫ８９０アミノ酸の少なくとも２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６３】
一例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣドメインおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の少なくとも２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６４】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣドメインおよびＰＩドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６５】
別の例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインに含まれるアミノ酸の３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６６】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５およびＦ１０３８アミノ酸の少なくとも３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６７】
一例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素に含まれるＲＥＣ、ＲｕｖＣおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６８】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣおよびＰＩドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６６９】
別の例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７０】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｋ８９０、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７１】
一例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７２】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるＭ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７３】
別の例では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の４またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７４】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも４またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７５】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性に関与するアミノ酸の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７６】
例えば、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、アミノ酸Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３およびＤ９８６からなる群の１または２またはそれ以上、あるいはその他のＣａｓ９オーソログに対応するアミノ酸からなる群の１または２またはそれ以上の改変であり得る。
【０６７７】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を部分的に不活性化するための改変であり得、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体はニッカーゼであり得る。
【０６７８】
ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断し得ない。
【０６７９】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９の例では、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異している場合、すなわちＤ１０Ａに変異している場合、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、したがってＳｐＣａｓ９は、ニッカーゼとして使用され得る。それによって産生されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断し得ない。
【０６８０】
別の例示的な実施形態では、ＣｊＣａｓ９の例では、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異している場合、すなわちＤ８Ａに変異している場合、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、したがってＣｊＣａｓ９は、ニッカーゼとして使用され得る。それによって産生されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成しない鎖を切断し得ない。
【０６８１】
さらに、ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断し得ない。
【０６８２】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９の例では、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異している場合、すなわちＨ８４０Ａに変異している場合、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、したがってＳｐＣａｓ９は、ニッカーゼとして使用され得る。それによって産生されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断し得ない。
【０６８３】
別の例示的な実施形態では、ＣｊＣａｓ９の例では、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異している場合、すなわちＨ５５９Ａに変異している場合、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、したがってＣｊＣａｓ９は、ニッカーゼとして使用され得る。それによって産生されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわちｇＲＮＡと相補的結合を形成する鎖を切断し得ない。
【０６８４】
さらに、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化するための改変であり得、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０６８５】
ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を切断し得ない。
【０６８６】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９の例では、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基１０および８４０がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異している場合、すなわち、それぞれＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに変異している場合、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、標的遺伝子または核酸の二本鎖は、完全に切断され得ない。
【０６８７】
別の例示的な実施形態では、ＣｊＣａｓ９の例では、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列中の残基８および５５９がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異している場合、すなわち、それぞれＤ８ＡおよびＨ５５９Ａに変異している場合、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、したがって標的遺伝子または核酸の二本鎖は、完全に切断され得ない。
【０６８８】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の固有の特徴に加えて所望により機能性ドメインをさらに含んでもよく、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、固有の特徴に加えてさらなる特徴を有し得る。
【０６８９】
ここで、機能性ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性または核酸結合活性を有するドメインであるか、または、タンパク質（ペプチドを含む）を単離および精製するためのタグまたはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０６９０】
機能性ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。
【０６９１】
例えば、不完全または部分的なＣＲＩＳＰＲ酵素には、機能性ドメインとしてシチジンデアミナーゼがさらに含まれてよい。例示的な一実施形態では、シチジンデアミナーゼ、例えば、アポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼに付加され、それによって融合タンパク質を産生し得る。それによって形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＰＯＢＥＣ１］は、ＣのＴまたはＵへの、あるいはＧのＡへの塩基修復または編集で使用され得る。
【０６９２】
タグには、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれ、レポーター遺伝子には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるが、本発明はこれらに限定されない。
【０６９３】
さらに、機能性ドメインは、核移行配列またはシグナル（ＮＬＳ）または核外輸送配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０６９４】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素には、１または複数のＮＬＳが含まれてよい。ここで、１または複数のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端またはその近傍、酵素のＣ末端またはその近傍、あるいはそれらの組合せに含まれてよい。ＮＬＳは、以下のＮＬＳから誘導されるＮＬＳ配列であり得るが、本発明はこれらに限定されない。アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチンα由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、肝炎δウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、あるいはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列由来のＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ。
【０６９５】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体には、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２またはそれ以上の部分に分割することによって調製されるスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれてよい。用語「スプリット」とは、２またはそれ以上の部分へのタンパク質の機能的または構造的分割またはタンパク質のランダム分割をさす。
【０６９６】
ここで、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全、不完全、または部分的な活性酵素または不活性酵素であり得る。
【０６９７】
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基６５６、チロシン、と残基６５７、トレオニンとの間で２つの部分に分割され、それによってスプリットＳｐＣａｓ９を生成し得る。
【０６９８】
さらに、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、再構成のためのさらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を選択的に含んでよい。
【０６９９】
ここで、「再構成」とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と構造的に同じであるかまたは類似する分割型ＣＲＩＳＰＲ酵素の形成をさす。
【０７００】
再構成のためのさらなるドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量体形成ドメイン、インテイン、ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン、あるいは特定の条件下でヘテロ二量体を形成するドメインであり得る。
【０７０１】
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３、セリン、と残基７１４、グリシンとの間で２つの部分に分割され、それによってスプリットＳｐＣａｓ９を生成し得る。ＦＲＢドメインは、２つの部分のうちの１つと連結され得、およびＦＫＢＰドメインは、もう一方と連結され得る。それによって産生されたスプリットＳｐＣａｓ９では、ＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境で二量体中に形成され得、それによって再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素を産生し得る。
【０７０２】
本発明に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、それをコードする配列を有するポリペプチド、タンパク質または核酸であり得、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を導入するために対象に対してコドン最適化され得る。
【０７０３】
用語「コドン最適化」とは、宿主細胞における発現を改善するために、天然のアミノ酸配列を維持すると同時に、天然配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンに置き換えることによって、核酸配列を改変する過程をさす。多様な種が特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを有しており、そのコドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の違い）は、翻訳されたコドンの特徴および特定のｔＲＮＡ分子の利用可能性に依存すると考えられるｍＲＮＡの翻訳の効率としばしば相関する。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成に最も頻繁に使用されるコドンの反映である。そのため、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現によってカスタマイズされ得る。
【０７０４】
３．標的配列
用語「標的配列」は、標的遺伝子または核酸中に存在する塩基配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補性を有する。標的配列は、標的遺伝子または核酸、すなわち遺伝子操作または修正の対象に従って変動し得る塩基配列であり、標的遺伝子または核酸に応じて様々な形態に設計され得る。
【０７０５】
標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的結合を形成することができ、標的配列の長さはガイド配列の長さと同じであり得る。
【０７０６】
標的配列は、５〜５０塩基の配列であり得る。
【０７０７】
一実施形態では、標的配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基の配列であり得る。
【０７０８】
標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的な核酸配列であり得、これは例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相補性または完全な相補性を有する。
【０７０９】
一例では、標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的でない、１〜８塩基の配列であるか、またはそれを含み得る。
【０７１０】
さらに、標的配列は、編集タンパク質によって認識されることのできる核酸配列に隣接する塩基配列であり得る。
【０７１１】
一例では、標的配列は、編集タンパク質によって認識されることのできる核酸配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した５〜５０塩基の配列であり得る。
【０７１２】
例示的な一実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的配列を以下に記載する。
【０７１３】
標的遺伝子または核酸がｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって標的化される場合、標的配列は、ｇＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列に相補性を有する。標的配列は、標的遺伝子または核酸、すなわち遺伝子操作または修正の対象に従って変動する塩基配列であり、標的遺伝子または核酸に応じて様々な形態に設計され得る。
【０７１４】
さらに、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１によって認識されることのできるＰＡＭ配列に隣接する塩基配列であり得る。
【０７１５】
一例では、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した５〜５０塩基の配列であり得る。
【０７１６】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、標的配列は、５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。
【０７１７】
別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９である場合、標的配列は、５'−ＮＧＧＮＧ−３'および／または５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴであり、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。
【０７１８】
さらに別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９である場合、標的配列は、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。
【０７１９】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９である場合、標的配列は、連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡであり、Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｙ＝ＣまたはＴであり、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する。
【０７２０】
別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｍＣａｓ９である場合、標的配列は、５'−ＮＧＧ−３'および／または５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。
【０７２１】
さらに別の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９である場合、標的配列は、５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡであり、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。
【０７２２】
例示的な一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１である場合、標的配列は、５'−ＴＴＮ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであるか、あるいはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１６〜２５塩基の配列であり得る。
【０７２３】
本発明の１つの例示的な実施形態では、標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。
【０７２４】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。
【０７２５】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。
【０７２６】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。
【０７２７】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。
【０７２８】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。
【０７２９】
あるいは、
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の部分核酸配列であり得る。
【０７３０】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の部分核酸配列であり得る。
【０７３１】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の部分核酸配列であり得る。
【０７３２】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子の部分核酸配列であり得る。
【０７３３】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子の部分核酸配列であり得る。
【０７３４】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の部分核酸配列であり得る。
【０７３５】
あるいは、標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７３６】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７３７】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７３８】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７３９】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４０】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４１】
あるいは、標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４２】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４３】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４４】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４５】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４６】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４７】
あるいは、標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子のエクソン、イントロンまたはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４８】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子のエクソン、イントロンまたはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７４９】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子のエクソン、イントロンまたはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７５０】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子のエクソン、イントロンまたはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７５１】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子のエクソン、イントロンまたはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７５２】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子のエクソン、イントロンまたはその混合物の核酸配列であり得る。
【０７５３】
あるいは、標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の変異領域を含むかまたはそれに隣接する核酸配列（例えば、野性型遺伝子とは異なる領域）であり得る。
【０７５４】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の変異領域を含むかまたはそれに隣接する核酸配列であり得る。
【０７５５】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の変異領域を含むかまたはそれに隣接する核酸配列であり得る。
【０７５６】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子の変異領域を含むかまたはそれに隣接する核酸配列であり得る。
【０７５７】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子の変異領域を含むかまたはそれに隣接する核酸配列であり得る。
【０７５８】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の変異領域を含むかまたはそれに隣接する核酸配列であり得る。
【０７５９】
あるいは、標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の連続した５〜５０核酸配列であり得る。
【０７６０】
標的配列は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の連続した５〜５０核酸配列であり得る。
【０７６１】
標的配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の連続した５〜５０核酸配列であり得る。
【０７６２】
標的配列は、ＡＮＧＰＴ２遺伝子の連続した５〜５０核酸配列であり得る。
【０７６３】
標的配列は、ＥＰＡＳ１遺伝子の連続した５〜５０核酸配列であり得る。
【０７６４】
標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の連続した５〜５０核酸配列であり得る。
【０７６５】
本発明の１つの例示的な実施形態として、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の上記の標的配列は、表１、表２、表３、表４および表５に要約されている。
【０７６６】
［新生血管形成関連因子操作産物］  ４．ガイド核酸−編集タンパク質複合体およびその使用  ガイド核酸−編集タンパク質複合体は標的を改変し得る。
【０７６７】
標的は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
【０７６８】
例えば、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、目的のタンパク質の発現を最終的に調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、または新しいタンパク質を発現させるために使用され得る。
【０７６９】
ここで、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
【０７７０】
例えば、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的ＤＮＡの操作または改変によって、標的ＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、または改変されたタンパク質を発現させ得る。
【０７７１】
別の例では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的ＲＮＡの操作または改変によって、標的ＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、または改変されたタンパク質を発現させ得る。
【０７７２】
一例では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的遺伝子の操作または改変によって、標的ＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、または改変されたタンパク質を発現させ得る。
【０７７３】
別の例では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的染色体の操作または改変によって、標的ＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）し、または改変されたタンパク質を発現させ得る。
【０７７４】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、遺伝子転写および翻訳段階で作用し得る。
【０７７５】
一例では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的遺伝子の転写を促進または抑制することができ、それによって標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）する。
【０７７６】
別の例では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または抑制することができ、それによって標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現を調節する（例えば、阻害する、抑制する、減少させる、増加させるかまたは促進する）。
【０７７７】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、タンパク質レベルで作用し得る。
【０７７８】
一例では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、標的タンパク質を操作または改変することができ、それによって標的タンパク質を除去するかまたはタンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、減少、増加または促進）する。
【０７７９】
例示的な一実施形態では、本発明は、新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を操作するために使用されるガイド核酸−編集タンパク質複合体を提供する。好ましくは、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が提供される。
【０７８０】
特に、本発明は、遺伝子、例えば単離されたかまたは非天然のｇＲＮＡおよびそれをコードするＤＮＡの標的配列と相補的結合を形成する能力があるガイドドメインを含むｇＲＮＡを提供することができる。ｇＲＮＡおよびそれをコードするＤＮＡ配列は、表１、表２、表３、表４および表５に記載の標的配列と相補的に結合することができるように設計され得る。
【０７８１】
さらに、ｇＲＮＡの標的領域は、第３の遺伝子を提供するように設計され、第３の遺伝子は核酸の改変、例えば二本鎖または一本鎖切断、またはＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的部位での特異的機能を有する。
【０７８２】
さらに、２またはそれ以上のｇＲＮＡを用いて標的遺伝子において２またはそれ以上の切断イベント、例えば二本鎖または一本鎖切断を誘導する場合、２またはそれ以上の切断イベントが同じまたは異なるＣａｓ９タンパク質に起因して起こり得る。
【０７８３】
ｇＲＮＡは、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の２またはそれ以上、あるいは
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の各々の２またはそれ以上の領域を標的化することができ、かつ
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の二本鎖および／または一本鎖の切断を独立して誘導することができるか、あるいは
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の切断部位への１つの外来ヌクレオチドの挿入を誘導することができる。
【０７８４】
さらに、本発明の別の例示的な実施形態では、ガイド核酸−編集タンパク質複合体を構成する核酸には、
（ａ）本明細書に記載されるＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列に相補的なガイドドメインを含むガイド核酸をコードする配列、および
（ｂ）編集タンパク質をコードする配列
が含まれ得る。
【０７８５】
ここで、（ａ）は標的領域に応じて２またはそれ以上あってもよく、（ｂ）は同一または２またはそれ以上の編集タンパク質を用いてもよい。
【０７８６】
一実施形態では、核酸は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の発現を減少（ｒｅｄｕｃｅ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）または阻害するために、酵素的に不活性な編集タンパク質またはその融合タンパク質（例えば、転写リプレッサードメイン融合）を標的としてそのタンパク質をノックダウン標的部位に十分に隣接させるように設計され得る。
【０７８７】
加えて、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の上記の構造、機能、および全ての用途が、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の操作に利用されることは明らかであるはずである。
【０７８８】
［ガイド核酸−編集タンパク質複合体の使用］
本発明のガイド核酸−編集タンパク質複合体の使用のための一実施形態における、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用する標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体の操作または改変を下に説明する。
【０７８９】
［遺伝子操作］
標的遺伝子または核酸は、上記のｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または修正され得る。ここで、標的遺伝子または核酸の操作または修正には、ｉ）標的遺伝子または核酸を切断および損傷すること、およびｉｉ）損傷した標的遺伝子または核酸を修復することの全ての段階が含まれる。
【０７９０】
ｉ）標的遺伝子または核酸の切断および損傷
ｉ）標的遺伝子または核酸の切断および損傷は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いる標的遺伝子または核酸の切断および損傷、特に、標的遺伝子または核酸中の標的配列切断または損傷であり得る。
【０７９１】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いる標的遺伝子または核酸の切断および損傷は、標的配列の二本鎖に対する完全な切断または損傷であり得る。
【０７９２】
例示的な一実施形態では、野性型ＳｐＣａｓ９を使用する場合、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の二本鎖は、完全に切断され得る。
【０７９３】
別の例示的な実施形態では、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用される場合、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、およびｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、切断は順次にまたは同時に行われ得る。
【０７９４】
さらに別の例示的な実施形態では、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）と、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡを使用する場合、第１のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、第２のｇＲＮＳと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、切断は順次にまたは同時に行われ得る。
【０７９５】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いる標的遺伝子または核酸の切断および損傷は、標的配列の一本鎖だけに対する切断または損傷であり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖であるか、またはｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖であり得る。
【０７９６】
例示的な一実施形態では、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）が使用される場合、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得るが、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖は切断され得ない。
【０７９７】
別の例示的な実施形態では、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用される場合、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得るが、ｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖は切断され得ない。
【０７９８】
さらに別の例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いる標的遺伝子または核酸の切断または損傷は、核酸断片の部分的な除去であり得る。
【０７９９】
例示的な一実施形態では、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡと野性型ＳｐＣａｓ９を使用する場合、第１のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の二本鎖は、切断され得、および第２のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の二本鎖は、切断され得、その結果、第１および第２のｇＲＮＡとＳｐＣａｓ９によって核酸断片が除去される。
【０８００】
別の例示的な実施形態では、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、野性型  ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）を使用する場合、第１のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の二本鎖は、野性型ＳｐＣａｓ９によって切断され得、第２のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、その結果、第１および第２のｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって核酸断片が除去される。
【０８０１】
さらに別の例示的な実施形態では、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）を使用する場合、第１のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、第２のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な二本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、その結果、第１および第２のｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって核酸断片が除去される。
【０８０２】
さらに別の例示的な実施形態では、異なる標的配列を有する３つのｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）を使用する場合、第１のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の二本鎖は、野性型ＳｐＣａｓ９によって切断され得、第２のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、第３のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、その結果、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって核酸断片が除去される。
【０８０３】
さらに別の例示的な実施形態では、異なる標的配列を有する４つのｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）を使用する場合、第１のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、非第２のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、第３のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得、第４のｇＲＮＡと相補的結合を形成する標的配列の非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得、その結果、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、第４のｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって核酸断片が除去される。
【０８０４】
ｉｉ）損傷した標的遺伝子または核酸の修復または回復
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断または損傷した標的遺伝子または核酸は、ＮＨＥＪおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復または回復され得る。
【０８０５】
［非相同末端結合（ＮＨＥＪ）］
ＮＨＥＪは、切断された二本鎖または一本鎖の両端を一緒に連結することにより、ＤＮＡの二本鎖切断を回復または修復する方法であり、一般に、二本鎖の破壊（例えば、切断）により形成された２つの適合する端部が互いに頻繁に接触して２つの端部を完全に結合する場合、破壊された二本鎖は回復される。ＮＨＥＪは全細胞周期で使用されることのできる回復方法であり、通常、Ｇ１期のように細胞内で鋳型として使用される相同ゲノムが存在しない場合に行われる。
【０８０６】
ＮＨＥＪを使用する損傷した遺伝子または核酸の修復プロセスでは、核酸配列中のいくつかの挿入および／または欠失（インデル）がＮＨＥＪ修復領域に生じ、そのような挿入および／または欠失は、リーディングフレーム（ｌｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）をシフトさせ、その結果フレームシフトされたトランスクリプトーム  ｍＲＮＡをもたらす。結果として、ナンセンス変異依存分解機構または正常なタンパク質を合成できなかったために生来の機能が失われる。さらに、リーディングフレーム（ｌｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）は維持されているものの、配列のかなりの量が挿入または欠失され得る突然変異はタンパク質の機能性を破壊する原因となり得る。重要な機能ドメインでの突然変異は、タンパク質の重要でない領域での突然変異よりも許容されない可能性が高いので、突然変異は遺伝子座依存的である。
【０８０７】
自然状態においてＮＨＥＪにより産生されるインデル突然変異を予想することは不可能であるが、特定のインデル配列は、所与の破壊された領域において好ましく、マイクロホモロジーの小さな領域に由来し得る。慣習的に、欠失の長さは１ｂｐ〜５０ｂｐの範囲であり、挿入はそれよりも短い傾向があり、破壊された領域を直接取り囲む短い反復配列を頻繁に含む。
【０８０８】
さらに、ＮＨＥＪは突然変異を引き起こす過程であり、特定の最終配列を産生する必要がない場合は、小さな配列のモチーフを削除するために使用され得る。
【０８０９】
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって標的化される遺伝子の特異的ノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して実施され得る。標的遺伝子または核酸の二本鎖または２つの一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して切断され得、標的遺伝子または核酸の破壊された二本鎖または２つの一本鎖はＮＨＥＪによってインデルを有し得、それによって標的遺伝子または核酸の特異的ノックアウトを誘導する。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって切断される標的遺伝子または核酸の部位は、非コード領域またはコード領域であり得、およびさらに、ＮＨＥＪによって回復された標的遺伝子または核酸の部位は、非コード領域またはコード領域であり得る。
【０８１０】
［相同組換え修復（ＨＤＲ）］
ＨＤＲは、損傷した遺伝子または核酸を修復するまたは回復するための、一般に破壊されたＤＮＡを修復するまたは回復するための、すなわち細胞の生得的な情報を回復するための鋳型として相同配列を使用する、誤りのない修正方法であり、破壊されたＤＮＡは、改変されていない相補的な塩基配列の情報または姉妹染色分体の情報を用いて修復される。ＨＤＲの最も一般的な種類は、相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、活発に分裂する細胞のＳまたはＧ２／Ｍ期に通常行われる修復または回復方法である。
【０８１１】
細胞の相補的な塩基配列または姉妹クロマチンを使用するのではなく、ＨＤＲを使用して損傷したＤＮＡを修復または回復するために、相補的な塩基配列または相同的な塩基配列の情報を用いて人工的に合成されたＤＮＡ鋳型、すなわち、相補的な塩基配列または相同的な塩基配列を含む核酸鋳型を細胞に提供し、それによって破壊されたＤＮＡを修復することができる。ここで、核酸配列または核酸断片を核酸鋳型にさらに付加して破壊されたＤＮＡを修復する場合、破壊されたＤＮＡにさらに付加された核酸配列または核酸断片は、ノックインを受ける可能性がある。さらに付加された核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子または核酸に対する突然変異によって改変された標的遺伝子または核酸を補正するための核酸配列または核酸断片、あるいは、細胞で発現させる遺伝子または核酸であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８１２】
一例では、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて切断され得、切断部位に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得、標的遺伝子または核酸の切断された塩基配列は、ＨＤＲによって修復または回復され得る。
【０８１３】
ここで、相補的な塩基配列を含む核酸鋳型は、破壊されたＤＮＡ、すなわち、相補的な塩基配列の切断された二本鎖または一本鎖を有してよく、破壊されたＤＮＡに挿入される予定の核酸配列または核酸断片をさらに含む。さらなる核酸配列または核酸断片は、相補的な塩基配列に挿入させる核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を用いて、破壊されたＤＮＡ、すなわち標的遺伝子または核酸の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片およびさらなる核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子または核酸に対する突然変異によって改変された標的遺伝子または核酸を補正するための核酸配列または核酸断片、あるいは、細胞で発現させる遺伝子または核酸であり得る。相補的な塩基配列は、破壊されたＤＮＡと相補的結合を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または一本鎖の左右の塩基配列であり得る。あるいは、相補的な塩基配列は、破壊されたＤＮＡと相補的結合を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端であり得る。相補的な塩基配列は、１５〜３０００塩基の配列であり得、相補的な塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型または標的遺伝子のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖核酸が、使用され得るか、またはそれは、線状または環状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８１４】
別の例では、二本鎖または一本鎖の標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて切断され、切断部位に隣接する塩基配列を有する相同的な塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され、標的遺伝子または核酸の切断された塩基配列は、ＨＤＲによって修復または回復され得る。
【０８１５】
ここで、相同的な塩基配列を含む核酸鋳型は、破壊されたＤＮＡ、すなわち、切断された二本鎖または一本鎖の相同的な塩基配列であり得、破壊されたＤＮＡに挿入される予定の核酸配列または核酸断片をさらに含む。さらなる核酸配列または核酸断片は、相同的な塩基配列を含む核酸鋳型および挿入される予定の核酸配列または核酸断片を用いて、破壊されたＤＮＡ、すなわち標的遺伝子または核酸の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片およびさらなる核酸配列または核酸断片は、正常な遺伝子または核酸に対する突然変異によって改変された標的遺伝子または核酸を補正するための核酸配列または核酸断片、あるいは、細胞で発現させる遺伝子または核酸であり得る。相同的な塩基配列は、破壊されたＤＮＡ、すなわち標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖塩基配列または左右の一本鎖塩基配列と相同性を有する塩基配列であり得る。あるいは、相補的な塩基配列は、破壊されたＤＮＡと相同性を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端であり得る。相同的な塩基配列は、１５〜３０００塩基の配列であり得、相同的な塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型または標的遺伝子または核酸のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖核酸が使用され得、それらは線状または環状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８１６】
ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外に、破壊されたＤＮＡを修復または回復する方法がある。
【０８１７】
［一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）］
ＳＳＡは、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する一方法であり、一般に３０塩基超の反復配列を使用する。反復配列は、破壊された末端の各々で標的核酸の二本鎖に対して一本鎖を有するように（粘着末端を有するように）切断され、切断後、反復配列を含む一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質でコーティングして、反復配列が互いに不適切にアニーリングされることのないようにする。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的な反復配列をアニーリングする能力がある配列が配置される。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップが切断され、新しいＤＮＡの合成が特定のギャップを埋めてＤＮＡ二本鎖を回復させる。この修復の結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が除去され、欠失長さは、本明細書において使用される２つの反復の位置、および切断の経路または進行の程度を含む様々な因子に依存し得る。
【０８１８】
ＳＳＡは、ＨＤＲと同様に、相補的配列、すなわち相補的な反復配列を利用し、逆に、標的核酸配列を改変または修正するための核酸鋳型を必要としない。
【０８１９】
［一本鎖切断修復（ＳＳＢＡ）］
ゲノム内の一本鎖切断は、上記の修復機構とは別個の機構である、ＳＳＢＲによって修復される。一本鎖ＤＮＡ切断の場合は、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２が切断を認識し、修復機構を動員する。ＤＮＡ切断に関するＰＡＲＰ１の結合および活性は一時的であり、ＳＳＢＲは損傷領域でのＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することによって促進される。ＳＳＢＲ複合体において最も重要なタンパク質はＸＲＣＣ１であり、これはＤＮＡの３'および５'末端プロセシングを促進するタンパク質と相互作用して、ＤＮＡを安定化させる。末端プロセシングは、通常、損傷した３'末端をヒドロキシル化状態に、および／または損傷した５'末端をリン酸部分に修復することに関与し、末端がプロセシングされた後に、ＤＮＡギャップ充填が起こる。ＤＮＡギャップ充填には２つの方法、すなわち短いパッチ修復と長いパッチ修復があり、短いパッチ修復は単一塩基の挿入を伴う。ＤＮＡギャップ充填の後、ＤＮＡリガーゼが末端結合を促進する。
【０８２０】
［ミスマッチ修復（ＭＭＲ）］
ＭＭＲは、ミスマッチしたＤＮＡ塩基で働く。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体の各々は、ＡＴＰアーゼ活性を有するので、ミスマッチの認識および修復の開始において重要な役割を果たし、ＭＳＨ２／６は主に塩基−塩基ミスマッチを認識し、１または２の塩基ミスマッチを識別するが、ＭＳＨ２／３は主にそれよりも大きいミスマッチを認識する。
【０８２１】
［塩基除去修復（ＢＥＲ）］
ＢＥＲは、全細胞周期を通して活性であり、小さい非ヘリックス歪み塩基（ｎｏｎ−ｈｅｌｉｘ−ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇ  ｂａｓｅ）損傷領域をゲノムから除去するために使用される修復方法である。損傷したＤＮＡでは、損傷した塩基は、塩基とリン酸塩−デオキシリボース骨格を連結しているＮ−グリコシド結合を切断することによって除去され、その後ホスホジエステル骨格が切断され、それにより一本鎖ＤＮＡの切断が生じる。それにより形成された破壊された一本鎖末端を除去し、除去された一本鎖によって生じたギャップを新しい一本鎖相補的な塩基で充填し、その後新たに充填された相補的な塩基の末端をＤＮＡリガーゼによって骨格と連結され、その結果損傷したＤＮＡが修復される。
【０８２２】
［ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）］
ＮＥＲは、大きなヘリックス歪み損傷をＤＮＡから除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されると、損傷領域を含有する短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、２２〜３０塩基の一本鎖ギャップが生じる。生じたギャップは新しい相補的な塩基で充填され、新たに充填された相補的な塩基の末端をＤＮＡリガーゼによって骨格と連結され、その結果損傷したＤＮＡが修復される。
【０８２３】
遺伝子操作効果  標的遺伝子または核酸の操作または修正は、主にノックアウト、ノックダウン、およびノックインの効果をもたらし得る。
【０８２４】
［ノックアウト］
用語「ノックアウト」とは、標的遺伝子または核酸の不活性化をさし、および「標的遺伝子または核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳が起こらない状態をさす。疾患の原因となる遺伝子または異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトによって阻害され得、その結果、タンパク質発現が阻止される。
【０８２５】
例えば、標的遺伝子または核酸をｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて編集または修正する場合、標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて切断され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるＮＨＥＪによって修復され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＮＨＥＪに起因するインデルを有し得、それにより、標的遺伝子または核酸に対する特異的ノックアウトが誘導され得る。
【０８２６】
［ノックダウン］
用語「ノックダウン」とは、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳あるいは標的タンパク質の発現の低下をさす。ノックダウンによって遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することによって、疾患の発症が予防され得るか、または疾患が治療され得る。
【０８２７】
例えば、標的遺伝子または核酸が、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素−転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち、転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を用いて編集または修正される場合、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は標的遺伝子または核酸と特異的に結合し得、標的遺伝子または核酸の転写は、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され得、それによって対応する遺伝子または核酸の発現が阻害されるノックダウンが誘導される。
【０８２８】
［ノックイン］
用語「ノックイン」とは、標的遺伝子または核酸への特定の核酸または遺伝子の挿入をさし、ここで、「特定の核酸」とは、挿入または発現させる目的の遺伝子または核酸をさす。疾患を誘発する変異遺伝子は、ノックインによって正常な遺伝子の発現を誘導するための、正常への修正または正常な遺伝子の挿入によって疾患治療に利用され得る。
【０８２９】
その上、ノックインは、ドナーをさらに必要とし得る。
【０８３０】
例えば、標的遺伝子または核酸をｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて編集または修正する場合、標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて損傷した標的遺伝子または核酸は、ＨＤＲによって修復され得る。ここで、特定の核酸は、ドナーを用いて損傷した遺伝子または核酸に挿入され得る。
【０８３１】
用語「ドナー」とは、損傷した遺伝子または核酸のＨＤＲに基づく修復を助ける核酸配列をさし、ここで、ドナーは、特定の核酸を含み得る。
【０８３２】
ドナーは、二本鎖または一本鎖核酸であってよい。
【０８３３】
ドナーは、線状または環状の形状で存在し得る。
【０８３４】
ドナーには、標的遺伝子または核酸と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。
【０８３５】
例えば、ドナーには、特定の核酸が挿入される位置、例えば損傷した核酸の上流（左）および下流（右）の塩基配列の各々と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。ここで、挿入される特定の核酸は、損傷した核酸の下流の塩基配列と相同性を有する核酸配列と、損傷した核酸の上流の塩基配列と相同性を有する核酸配列との間に位置し得る。ここで、相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相同性または完全な相同性を有し得る。
【０８３６】
ドナーには、所望により、さらなる核酸配列が含まれてよい。ここで、さらなる核酸配列は、ドナー安定性、ノックイン効率またはＨＤＲ効率を増加させるのに役立ち得る。
【０８３７】
例えば、さらなる核酸配列は、Ａ、Ｔに富む核酸配列、すなわちＡ、Ｔに富むドメインであり得る。さらに、さらなる核酸配列は、スキャフォールド／マトリックス結合領域（ＳＭＡＲ）であり得る。
【０８３８】
本発明の遺伝子操作効果に関する１つの例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を用いて得られる操作された標的遺伝子、すなわち、操作された新生血管形成関連因子は、以下の構成を有し得る。
【０８３９】
例示的な一実施形態では、新生血管形成関連因子が遺伝子である場合、
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって人工的に操作された新生血管形成関連因子の構成には、
新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内のＰＡＭ配列中に位置するか、またはその５'末端および／または３'末端に隣接する、塩基配列中の連続した１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐまたは１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、３ｂｐ〜２５ｂｐの領域における
１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、
野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、および
１または複数の外来ヌクレオチドの挿入
の中の１または複数の核酸の改変が含まれてよい。
【０８４０】
さらに、１または複数のヌクレオチドの化学修飾が、新生血管形成関連因子を構成する核酸配列に含まれてよい。
【０８４１】
ここで、「外来ヌクレオチド」は、新生血管形成関連因子に生来含まれるヌクレオチド以外の、全ての外因的な、例えば、異種のまたは人工的に合成されたヌクレオチドを含む概念である。外来ヌクレオチドには、５０ｂｐ以下のサイズをもつ小さいオリゴヌクレオチドだけでなく、特定の機能を有するタンパク質を発現するために数百、数千または数万ｂｐのサイズをもつヌクレオチドも含まれる。そのような外来ヌクレオチドは、ドナーであり得る。
【０８４２】
化学修飾には、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化、例えば、ヌクレオチドに含まれる一部の官能基の、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、およびアミノ基のいずれか１つによる置換、が含まれ得るが、本発明はこれらに限定されない。さらに、核酸分子の転写性を高めるために、官能基はまた、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｒ、−Ｒ'ＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−Ｎ３および−ＣＮ（Ｒ＝アルキル、アリール、アルキレン）のいずれか１つによって置換され得る。さらに、少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸塩骨格は、アルキルホスホナート形態、ホスホロアミダート形態およびボラノホスフェート形態のいずれか１つで置換され得る。さらに、化学修飾は、核酸分子に含まれるヌクレオチドの少なくとも１つの種類の、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれか１つによる置換であり得、化学修飾は、であり得る。脂質、細胞透過性ペプチドと細胞標的リガンドからなる群から選択される１または複数と核酸分子の結合であり得る。
【０８４３】
望ましい新生血管形成調節系を形成するために、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を用いる人工的な改変は、新生血管形成関連因子を構成する核酸に適用され得る。
【０８４４】
新生血管形成関連因子の核酸改変を含む領域は、標的領域または標的配列であり得る。
【０８４５】
そのような標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的であり得、標的配列には、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列が含まれていてもよいし含まれていなくてもよい。そのような標的配列は、ｇＲＮＡ設計段階における重要な基準を当業者に提供し得る。
【０８４６】
そのような核酸の改変には核酸の「切断」が含まれる。
【０８４７】
用語「切断」とは、標的領域において、リポリヌクレオチドの共有結合骨格の切断をさす。切断には、ホスホジエステル結合の酵素または化学加水分解が含まれるが、本発明はそれに限定されず、様々なその他の方法も含む。切断は一本鎖および二本鎖の両方で行うことができ、二本鎖の切断は別個の一本鎖切断に起因し得る。二本鎖切断は、平滑末端またはスタガー末端を生成し得る。
【０８４８】
不活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素が使用される場合、それは、切断プロセスを行わずに標的領域または新生血管形成関連因子の特定の領域に接近するための特定の機能を有する因子を誘導し得る。新生血管形成関連因子の核酸配列内の１または複数のヌクレオチドの化学修飾は、そのような特定の機能に従って含められ得る。
【０８４９】
一例では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって形成された核酸切断による標的および非標的活性に起因する様々なインデルが起こり得る。
【０８５０】
用語「インデル」は、ＤＮＡ塩基配列中のいくつかの塩基間に存在する挿入または欠失突然変異の総称である。ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が上記のように新生血管形成関連因子の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を切断する場合、インデルはＨＤＲまたはＮＨＥＪ機構によって修復中に標的配列に導入され得る。
【０８５１】
本発明の人工的に操作された新生血管形成関連因子とは、そのような核酸のドナーを使用する切断、インデル、または挿入による元の遺伝子の核酸配列の改変をさし、望ましい新生血管形成調節系、例えば、新生血管形成を促進または抑制する効果の提示に寄与する。
【０８５２】
例えば、
特定のタンパク質が発現され得、その活性は、人工的に操作された新生血管形成関連因子によって刺激され得る。
【０８５３】
特定のタンパク質は、人工的に操作された新生血管形成関連因子によって不活性化され得る。
【０８５４】
一例では、ゲノムの各々の新生血管形成関連因子の特定の標的領域、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子などの逆調節遺伝子（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ）が切断され、その結果、遺伝子のノックダウンまたはノックアウトが起こり得る。
【０８５５】
別の例では、標的ノックダウンは、転写を変える、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の転写を阻止する、負に調節する、または減少させるために転写抑制ドメインまたはクロマチン修飾タンパク質に融合した、酵素的に不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して媒介され得る。
【０８５６】
新生血管形成は、人工的に操作された新生血管形成関連因子によって調節され得る。
【０８５７】
新生血管形成関連疾患は、人工的に操作された新生血管形成関連因子によって改善または治療され得る。
【０８５８】
本発明の例示的な一実施形態では、人工的に操作された新生血管形成関連因子は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の構造的特徴（例えば、新生血管形成関連因子の標的領域に含まれるか、または隣接する主なＰＡＭ配列が異なる）に従って、様々な人工的に操作された新生血管形成関連因子を提供し得る。
【０８５９】
以下、ＣＲＩＳＰＲ酵素および新生血管形成調節遺伝子の代表的な例が例示されたが、これらは具体例にすぎず、したがって本発明はこれらに限定されない。
【０８６０】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質である場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧ−３'（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子内の５'−ＮＧＧ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐまたは２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０８６１】
本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を提供することができ、これらは、新生血管形成関連因子の核酸配列中の、
ａ）５'−ＮＧＧ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、
ｂ）野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含む５'−ＮＧＧ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、
ｃ）５'−ＮＧＧ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、あるいは
ｄ）ａ）からｃ）から選択される２またはそれ以上の組合せ
によって調製される。
【０８６２】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質である場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子内の５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐまたは２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０８６３】
本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を提供することができ、これらは、新生血管形成関連因子の核酸配列中の、
ａ'）５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、
ｂ'）野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含む５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、
ｃ'）５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、あるいは
ｄ'）ａ'）からｃ'）から選択される２またはそれ以上の組合せ
によって調製される。
【０８６４】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質である場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子内の５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐまたは２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０８６５】
本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を提供することができ、これらは、新生血管形成関連因子の核酸配列中の、
ａ''）５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、およびＷはＡまたはＴである）の５'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、
ｂ''）野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含む５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、
ｃ''）５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、あるいは
ｄ''）ａ''）からｃ''）から選択される２またはそれ以上の組合せ
によって調製される。
【０８６６】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質である場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子内の５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐまたは２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０８６７】
本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を提供することができ、これらは、新生血管形成関連因子の核酸配列中の、
ａ'''）５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、
ｂ'''）野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含む５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、
ｃ'''）５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'配列に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、あるいは
ｄ'''）ａ'''）からｃ'''）から選択される２またはそれ以上の組合せ
によって調製される。
【０８６８】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質である場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、（Ｔ）は無作為に付加可能な配列である）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子内の５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐまたは２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０８６９】
本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を提供することができ、これらは、新生血管形成関連因子の核酸配列中の、
ａ''''）５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列（各々のＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、（Ｔ）は無作為に付加可能な配列である）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、
ｂ''''）野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含む５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、
ｃ''''）５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、あるいは
ｄ''''）ａ''''）からｃ''''）から選択される２またはそれ以上の組合せ
によって調製される。
【０８７０】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質である場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、５'−ＴＴＮ−３'配列の５'末端または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐ、１７ｂｐ〜３０ｂｐまたは１７ｂｐ〜２６ｂｐの領域であり得る。
【０８７１】
Ｃｐｆ１タンパク質は、パルクバクテリア細菌（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ細菌（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア細菌（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属菌（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラ細菌（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボボクリ（２３７）、スミセラ属菌（Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラ細菌（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスなどの微生物、例えば、パルクバクテリア細菌（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ペレグリニバクテリア細菌（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属菌（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラ細菌（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボボクリ（２３７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラ細菌（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、またはユーバクテリウム・エリゲンスに由来し得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８７２】
本発明は、人工的に操作された新生血管形成関連因子、例えば、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を提供することができ、これらは、新生血管形成関連因子の核酸配列中の、
ａ'''''）５'−ＴＴＮ−３'配列（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、
ｂ'''''）野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを含む５'−ＴＴＮ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、
ｃ'''''）５'−ＴＴＮ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの挿入、あるいは
ｄ'''''）ａ'''''）からｃ'''''）から選択される２またはそれ以上の組合せ
によって調製される。
【０８７３】
別の例示的な実施形態では、新生血管形成関連因子がタンパク質である場合、  人工的に操作されたタンパク質には、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の直接または間接作用によって新たなまたは改変された血管の形成に関与する全てのタンパク質が含まれる。
【０８７４】
例えば、人工的に操作されたタンパク質は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって人工的に操作された新生血管形成関連因子（遺伝子）によって発現したタンパク質あるいはそのようなタンパク質活性による影響によって増加または減少した別のタンパク質であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８７５】
人工的に操作された新生血管形成関連因子（タンパク質）は、人工的に操作された新生血管形成関連因子（遺伝子）の組成物に対応するアミノ酸組成物および活性を有し得る。
【０８７６】
一実施形態として、（ｉ）発現特性が変更されている人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
【０８７７】
例えば、タンパク質の改変は、１または複数の特徴、すなわち
新生血管形成関連因子の核酸配列内のＰＡＭ配列中のまたはその５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、および好ましくは３ｂｐ〜２５ｂｐ領域の１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入による発現量の低下または増加、
野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換による発現量の低下または増加、
１または複数の外来ヌクレオチドの挿入による発現量、融合タンパク質の発現または特定のタンパク質の独立した発現の低下または増加、ならびに
上記タンパク質の発現特性に影響される第３のタンパク質の発現量の低下または増加
を有することがある。
【０８７８】
（ｉｉ）構造特性が変更されている人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
【０８７９】
例えば、タンパク質の改変は、１または複数の特徴、すなわち
新生血管形成関連因子の核酸配列内のＰＡＭ配列中のまたはその５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、および好ましくは３ｂｐ〜２５ｂｐ領域の１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入によるコドン、アミノ酸および三次元構造の変更、
野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換によるコドン、アミノ酸および三次元構造の変更、
１または複数の外来ヌクレオチドの挿入による、コドン、アミノ酸および三次元構造、または特定のタンパク質との融合構造または特定のタンパク質が分離されている独立構造の変更、ならびに
構造特性の変更された上記のタンパク質に影響される第３のタンパク質のコドン、アミノ酸および三次元構造の変更
を有することがある。
【０８８０】
（ｉｉｉ）機能特性が変更されている人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
【０８８１】
例えば、タンパク質の改変は、１または複数の特徴、すなわち
新生血管形成関連因子の核酸配列内のＰＡＭ配列中のまたはその５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列中の連続した１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、および好ましくは３ｂｐ〜２５ｂｐ領域の１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入に起因するタンパク質の改変による特定の機能の活性化または不活性化あるいは新しい新生血管形成機能の導入、
野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換に起因するタンパク質の改変による特定の機能の活性化または不活性化あるいは新しい機能の導入、
１または複数の外来ヌクレオチドの挿入に起因するタンパク質の改変による特定の機能の活性化または不活性化あるいは新しい機能の導入、特に、特定のタンパク質の融合または独立した発現による既存の機能への第３の機能の導入、ならびに
機能特性の変更された上記のタンパク質に影響される第３のタンパク質の機能の変更
を有することがある。
【０８８２】
さらに、新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内の１または複数のヌクレオチドの化学修飾によって人工的に操作されたタンパク質が含まれ得る。
【０８８３】
例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって引き起こされるタンパク質の発現、構造および機能特性のうち１または複数が変更され得る。
【０８８４】
例えば、第３の構造および機能は、ヌクレオチドの化学修飾による遺伝子の核酸配列への第３のタンパク質の結合によって達成され得る。
【０８８５】
５．その他のさらなる成分
ガイド核酸−編集タンパク質複合体の効率を高めるため、または損傷した遺伝子もしくは核酸の修復効率を高めるために、さらなる成分が選択的に添加され得る。
【０８８６】
さらなる成分は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の効率を高めるために、選択的に使用され得る。
【０８８７】
［活性化因子］
ガイド核酸−編集タンパク質複合体の標的核酸、遺伝子または染色体の切断効率を高めるために、さらなる成分が活性化因子として使用され得る。
【０８８８】
用語「活性化因子」とは、ガイド核酸−編集タンパク質複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との結合を安定化するため、あるいはガイド核酸−編集タンパク質複合体を標的核酸、遺伝子または染色体により容易に接近させるために役立つ核酸をさす。
【０８８９】
活性化因子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸であってよい。
【０８９０】
活性化因子は線状であっても環状であってもよい。
【０８９１】
活性化因子は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との結合を安定化させる「ヘルパー」と、ガイド核酸−編集タンパク質複合体を標的核酸、遺伝子または染色体により容易に接近させるために役立つ「エスコーター」に分けられ得る。
【０８９２】
ヘルパーは、標的核酸、遺伝子または染色体に関してガイド核酸−編集タンパク質複合体の切断効率を高め得る。
【０８９３】
例えば、へルパーには、標的核酸、遺伝子または染色体と相同性を有する核酸配列が含まれる。そのため、ガイド核酸−編集タンパク質複合体が標的核酸、遺伝子または染色体と結合すると、へルパーに含まれる相同核酸配列は、標的核酸、遺伝子または染色体とさらなる相補的結合を形成してガイド核酸−編集タンパク質複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との結合を安定化させ得る。
【０８９４】
エスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体に関してガイド核酸−編集タンパク質複合体の切断効率を高め得る。
【０８９５】
例えば、エスコーターには、標的核酸、遺伝子または染色体と相同性を有する核酸配列が含まれる。ここで、エスコーターに含まれる相同核酸配列は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体のガイド核酸と相補的結合を部分的に形成し得る。そのため、ガイド核酸−編集タンパク質複合体と相補的結合を部分的に形成しているエスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体と相補的結合を部分的に形成し得、結果として、ガイド核酸−編集タンパク質複合体が標的核酸、遺伝子または染色体の位置に正確に接近することを可能にし得る。
【０８９６】
相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相同性または完全な相同性を有し得る。
【０８９７】
さらに、さらなる成分を選択的に使用して、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を高めることができ得る。
【０８９８】
［アシスター］
さらなる成分をアシスターとして使用して、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を高めることができ得る。
【０８９９】
用語「アシスター」とは、損傷した遺伝子または核酸、例えば、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって切断された遺伝子または核酸の修復プロセスに関与するかまたは修復効率を高めるのに役立つ核酸をさす。
【０９００】
アシスターは、二本鎖核酸または一本鎖核酸であってよい。
【０９０１】
アシスターは、線状または環状の形状で存在し得る。
【０９０２】
アシスターは、ＮＨＥＪを使用して修復プロセスに参加するかまたは修復効率を向上させる「ＮＨＥＪアシスター」と、ＨＤＲを使用して修復プロセスに参加するかまたは修復方法に応じて修復効率を向上させる「ＨＤＲアシスター」に分けられ得る。
【０９０３】
ＮＨＥＪアシスターは、修復プロセスに参加するか、またはＮＨＥＪを使用して損傷した遺伝子または核酸の修復効率を向上させ得る。
【０９０４】
例えば、ＮＨＥＪアシスターには、損傷した核酸配列の一部と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。ここで、相同核酸配列には、損傷した核酸配列の一方の末端（例えば、３'末端）の核酸配列と相同性を有する核酸配列が含まれてよく、損傷した核酸配列のもう一方の末端（例えば、５'末端）の核酸配列と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。さらに、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々と相同性を有する核酸配列が含まれ得る。そのような相同性を有する核酸配列は、損傷した核酸配列２つの部分が非常に近接して配置されることを助けることができ、それにより、ＮＨＥＪによって損傷した核酸の修復効率を高めることができる。
【０９０５】
ＨＤＲアシスターは、修復プロセスに参加するか、またはＨＤＲを使用して損傷した遺伝子または核酸の修復効率を向上させ得る。
【０９０６】
例えば、ＨＤＲアシスターには、損傷した核酸配列の一部と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。ここで、相同核酸配列には、損傷した核酸配列の一方の末端（例えば、３'末端）の核酸配列と相同性を有する核酸配列、および損傷した核酸配列のもう一方の末端（例えば、５'末端）の核酸配列と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。あるいは、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々と相同性を有する核酸配列が含まれ得る。このような相同性を有する核酸配列は、ＨＤＲによる損傷した核酸の修復効率を高めるための損傷核酸配列の鋳型として役立ち得る。
【０９０７】
別の例では、ＨＤＲアシスターには、損傷した核酸配列および特定の核酸、例えば、挿入する核酸または遺伝子の一部と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。ここで、相同核酸配列には、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々と相同性を有する核酸配列が含まれてよい。特定の核酸は、損傷した核酸の下流の塩基配列と相同性を有する核酸配列と、損傷した核酸の上流の塩基配列と相同性を有する核酸配列との間に位置し得る。そのような相同性を有する核酸配列および特定の核酸は、特定の核酸を損傷した核酸に挿入し、それによってノックインのためのＨＤＲ効率を高めるドナーとして役立ち得る。
【０９０８】
相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の相同性または完全な相同性を有し得る。
【０９０９】
６．対象
用語「対象」とは、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体が動作する生物、あるいは生物から得た標本または試料をさす。
【０９１０】
対象は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物であり得る。
【０９１１】
生物は、細胞、組織、植物、動物またはヒトであり得る。
【０９１２】
細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。
【０９１３】
真核細胞は、植物細胞、動物細胞またはヒト細胞であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０９１４】
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳または筋肉組織などの動物または人体組織であり得る。
【０９１５】
対象は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む標本または試料であり得る。
【０９１６】
標本または試料は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物から得られてもよく、唾液、血液、皮膚組織、癌細胞または幹細胞であってもよい。
【０９１７】
本発明において、具体例として、対象には、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の標的遺伝子または核酸が含まれてよい。
【０９１８】
ここで、標的遺伝子は、新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子であり得る。
【０９１９】
標的遺伝子は、野性型、または野性型における改変型であり得る。
【０９２０】
本発明の例示的な一実施形態では、対象には、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって操作された遺伝子または核酸が含まれてよい。
【０９２１】
ここで、操作された遺伝子は、新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子であり得る。
【０９２２】
ここで、ガイド核酸は、新生血管形成関連因子、例えば、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子を標的とし得る。
【０９２３】
ガイド核酸は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子、および／またはＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０９２４】
ガイド核酸は、１または複数の遺伝子を標的とし得る。
【０９２５】
ガイド核酸は同時に２またはそれ以上の遺伝子を標的とし得る。ここで、２またはそれ以上の遺伝子は、相同遺伝子または異種遺伝子であり得る。
【０９２６】
ガイド核酸は、１または複数の標的配列を標的とし得る。
【０９２７】
ガイド核酸は、標的配列の数または位置に従って様々な形態で設計され得る。
【０９２８】
本発明の例示的な一実施形態では、ガイド核酸は、表１、表２、表３、表４および表５に記載の配列の１または複数の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０９２９】
特定の実施形態では、各々の遺伝子の人工的操作のために、配列番号１〜７９の標的配列のいずれか１つに対応するガイド核酸配列。
【０９３０】
特定の実施形態では、各々の遺伝子の人工的操作のために、配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列のいずれか１つに対応する、例えばそれと複合体を形成するガイド核酸配列と相互作用する編集タンパク質が提供される。
【０９３１】
特定の実施形態では、配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９のいずれか１つの標的配列領域で人工的操作が行われる各々の遺伝子の核酸改変産物、およびその発現産物が提供される。
【０９３２】
７．送達
ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体は、様々な送達方法および様々な形態によって対象に送達または導入され得る。
【０９３３】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは混合形態の形態で対象に送達または導入され得る。
【０９３４】
編集タンパク質は、編集タンパク質、またはタンパク質をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、ペプチド、ポリペプチドの形態で対象に送達または導入され得る。
【０９３５】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、各々の成分、すなわち、ガイド核酸または編集タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態で標的に送達または導入され得る。
【０９３６】
ガイド核酸−編集タンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形を有するガイド核酸と、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形を有する編集タンパク質の複合体として対象に送達または導入され得る。
【０９３７】
さらに、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の効率を増大または阻害する能力があるさらなる成分は、様々な送達方法および様々な形態によって対象に送達または導入され得る。
【０９３８】
さらなる成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
【０９３９】
ｉ）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態での送達
ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態は、当技術分野で公知の方法によって対象に送達または導入され得る。
【０９４０】
あるいは、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態は、ベクター、非ベクターまたはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０９４１】
ベクターは、ウイルスもしくは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であり得る。
【０９４２】
非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
【０９４３】
［ベクターに基づく導入］
ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。
【０９４４】
ベクターには、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９４５】
例えば、ベクターは、ガイド核酸および編集タンパク質をそれぞれコードする核酸配列を同時に含み得る。
【０９４６】
例えば、ベクターには、ガイド核酸をコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９４７】
一例として、ガイド核酸に含まれるドメインは、全て１つのベクターに含まれていてもよいし、分割された後に異なるベクターに含まれていてもよい。
【０９４８】
例えば、ベクターには、編集タンパク質をコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９４９】
一例では、編集タンパク質の場合、編集タンパク質をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれてもよいし、分割されて数個のベクターに含まれてもよい。
【０９５０】
ベクターには、１または複数の調節／制御成分が含まれてよい。
【０９５１】
ここで、調節／制御成分には、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列が含まれてよい。
【０９５２】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０９５３】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０９５４】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０９５５】
プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
【０９５６】
プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【０９５７】
プロモーターは、制御領域（すなわちガイド核酸または編集タンパク質をコードする核酸配列）に応じて適したプロモーターを使用することができる。
【０９５８】
例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、編集タンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。
【０９５９】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【０９６０】
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０９６１】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【０９６２】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【０９６３】
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０９６４】
一般に、ウイルスは、宿主（例えば、細胞）を感染させ、それによってウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入するか、または遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入し得る。ガイド核酸および／または編集タンパク質は、そのような特徴を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／または編集タンパク質は、対象（例えば、細胞）において一時的に発現し得る。あるいは、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／または編集タンパク質は、対象（例えば、細胞）において長期間（例えば、１、２または３週、１、２、３、６または９カ月、１または２年、または永久に）連続的に発現し得る。
【０９６５】
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に応じて少なくとも２ｋｂから５０ｋｂまで変動することがある。そのようなウイルスのパッケージング能力に応じて、ガイド核酸または編集タンパク質を含むウイルスベクターあるいはガイド核酸と編集タンパク質の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。あるいは、ガイド核酸、編集タンパク質およびさらなる成分を含むウイルスベクターが設計され得る。
【０９６６】
一例では、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【０９６７】
別の例では、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【０９６８】
さらに別の例では、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【０９６９】
さらに別の例では、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書中に記載されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
【０９７０】
非ベクターに基づく導入  ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターを使用して対象に送達または導入され得る。
【０９７１】
非ベクターには、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９７２】
非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡ、またはその混合物であり得る。
【０９７３】
非ベクターは、エレクトロポレーション、微粒子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、一時的な細胞圧縮または細胞スクイージング（例えば、文献に記載［Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］）、脂質媒介性トランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、またはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０９７４】
一例として、エレクトロポレーションによる送達は、細胞と、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列をカートリッジ、チャンバまたはキュベット内で混合し、所定の持続時間および振幅の電気刺激を細胞に加えることによって実施され得る。
【０９７５】
別の例では、非ベクターは、ナノ粒子を使用して送達され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子、シリカ等）または有機ナノ粒子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコーティングした脂質等）であり得る。ナノ粒子の外面は、付着可能な正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン等）と共役され得る。
【０９７６】
特定の実施形態では、非ベクターは、脂質シェルを使用して送達され得る。
【０９７７】
特定の実施形態では、非ベクターは、エキソソームを使用して送達され得る。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡを輸送するための内因性ナノ小胞であり、これはＲＮＡを脳およびその他の標的器官に送達することができる。
【０９７８】
特定の実施形態では、非ベクターは、リポソームを使用して送達され得る。リポソームは、内部の水性区画を囲む単一または複数のラメラ脂質二重層と、比較的不透明な外部の親油性リン脂質二重層からなる球状小胞構造である。リポソームは、数種類の異なる脂質から製造され得るが、最も一般的に、リン脂質はリポソームを薬物担体として製造するために使用される。  その他の添加剤が含まれてもよい。
【０９７９】
ｉｉ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態の送達  ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態の編集タンパク質は、当技術分野で公知の方法によって対象に送達または導入され得る。
【０９８０】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質形態は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一時的な細胞圧縮または細胞スクイージング（例えば、文献に記載［Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］）、脂質媒介性トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介性送達またはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【０９８１】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列とともに送達され得る。
【０９８２】
一例では、エレクトロポレーションによる輸送は、編集タンパク質が導入される細胞をガイド核酸の有無にかかわらずカートリッジ、チャンバまたはキュベット内で混合し、所定の持続時間および振幅の電気刺激を細胞に加えることによって実施され得る。
【０９８３】
ｉｉｉ）核酸−タンパク質混合物の形態の送達  ガイド核酸および編集タンパク質は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【０９８４】
例えば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物であり得る。編集タンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０９８５】
一例では、ガイド核酸および編集タンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸およびタンパク質型編集タンパク質、すなわち、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を含有するガイド核酸−編集タンパク質複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【０９８６】
本発明では、ガイド核酸および／または編集タンパク質を対象に送達するための方法の実施形態として、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の送達を以下に説明する。
【０９８７】
本発明の一実施形態では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ベクターを使用して対象に送達または導入される。
【０９８８】
ベクターには、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９８９】
例えば、ベクターは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を同時に含み得る。
【０９９０】
例えば、ベクターには、ｇＲＮＡをコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９９１】
一例では、ｇＲＮＡに含められるドメインは、１つのベクターに含まれていてもよいし、分割された後に異なるベクターに含まれていてもよい。
【０９９２】
例えば、ベクターには、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列が含まれてよい。
【０９９３】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ酵素の場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれてもよいし、分割されて数個のベクターに含まれてもよい。
【０９９４】
ベクターには、１または複数の調節／制御成分が含まれてよい。
【０９９５】
ここで、調節／制御成分には、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列が含まれてよい。
【０９９６】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０９９７】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０９９８】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０９９９】
プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
【１０００】
プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【１００１】
プロモーターは、制御領域（すなわちｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列）に応じて適したプロモーターを使用することができる。
【１００２】
例えば、ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。
【１００３】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【１００４】
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【１００５】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【１００６】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【１００７】
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【１００８】
一般に、ウイルスは、宿主（例えば、細胞）を感染させ、それによってウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入するか、または遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入し得る。ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、そのような特徴を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されたｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象（例えば、細胞）において一時的に発現し得る。あるいは、ウイルスを使用して導入されたｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象（例えば、細胞）において長期間（例えば、１、２または３週、１、２、３、６または９カ月、１または２年、または永久に）連続的に発現し得る。
【１００９】
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に応じて少なくとも２ｋｂから５０ｋｂまで変動することがある。そのようなウイルスのパッケージング能力に応じて、ｇＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ酵素だけを含むウイルスベクターあるいはｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。あるいは、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素およびさらなる成分を含むウイルスベクターが設計され得る。
【１０１０】
一例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【１０１１】
別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【１０１２】
さらに別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【１０１３】
さらに別の例では、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
【１０１４】
本発明の例示的な一実施形態では、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、対象に送達または導入され得る。
【１０１５】
例えば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態で存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で存在し得る。
【１０１６】
一例では、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ型ｇＲＮＡおよびタンパク質型ＣＲＩＳＰＲ、すなわち、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を含むｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【１０１７】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、一時的な細胞圧縮または細胞スクイージング（例えば、文献に記載［Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１２，６３２２−６３２７］）、脂質媒介性トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介性送達またはそれらの組合せによって対象に送達または導入され得る。
【１０１８】
８．形質転換体  用語「形質転換体」とは、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体が発現する生物、あるいは生物から得た検体または試料をさす。
【１０１９】
形質転換体は、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体がＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態で導入される生物であり得る。
【１０２０】
例えば、形質転換体は、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターが導入される生物であり得る。ここで、ベクターは、非ウイルスベクター、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。
【１０２１】
別の例では、形質転換体は、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸配列が非ベクター形態で導入される生物であり得る。ここで、非ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ  複合体、ｍＲＮＡまたはその混合物であり得る。
【１０２２】
形質転換体は、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で導入される生物であり得る。
【１０２３】
形質転換体は、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその混合物の形態で導入される生物であり得る。
【１０２４】
例えば、形質転換体は、ＲＮＡ型ガイド核酸およびタンパク質型編集タンパク質を含むガイド核酸−編集タンパク質複合体が導入される生物であり得る。
【１０２５】
形質転換体は、ガイド核酸−編集タンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物であり得る。
【１０２６】
生物は、細胞、組織、植物、動物またはヒトであり得る。
【１０２７】
細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。
【１０２８】
真核細胞は、植物細胞、動物細胞、またはヒト細胞であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【１０２９】
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、または筋肉組織などの動物または人体組織であり得る。
【１０３０】
形質転換体は、ガイド核酸、編集タンパク質またはガイド核酸−編集タンパク質複合体が導入されるかまたは発現する生物であるか、あるいは生物から得られた標本または試料であり得る。
【１０３１】
標本または試料は、唾液、血液、皮膚組織、癌細胞または幹細胞であり得る。  ［使用］
【１０３２】
本発明の例示的な一実施形態は、新生血管形成関連因子を人工的に操作するための組成物または人工的に操作された新生血管形成関連因子を対象に投与する方法を用いて新生血管形成関連疾患を治療するための使用に関する。
【１０３３】
治療のための標的は、ヒトまたはサルなどの霊長類、マウスまたはラットなどのげっ歯類等を含む哺乳動物であってよい。
【１０３４】
［治療される疾患］
一実施形態では、治療される疾患は、新生血管形成関連疾患であり得る。
【１０３５】
用語「新生血管形成関連疾患」とは、過剰および／または異常な新生血管形成を含む全ての状態をさす。新生血管形成関連疾患は、腫瘍形成または腫瘍性形質転換、すなわち癌を除いて、変更または調節されていない新生血管形成を特徴とする障害をさす。新生血管形成関連疾患には、眼性新生血管形成疾患が含まれる。
【１０３６】
血管新生疾患としては、新生血管形成依存性の癌、例えば、固形腫瘍、白血病および腫瘍転移などの血腫、血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍、関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾性加齢性黄斑変性症および湿性加齢性黄斑変性症を含む黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシスなどの眼性血管新生疾患、オスラー・ウェーバー症候群、心筋の新生血管形成による失明、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節症、血管線維芽腫、および創傷肉芽形成が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
【１０３７】
特定の実施形態では、新生血管形成関連疾患は、関節リウマチ、乾癬、オスラー・ウェーバー症候群、心筋の新生血管形成による失明、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節症、血管線維芽腫、および創傷肉芽形成からなる群から選択される１または複数の疾患であり得る。
【１０３８】
一実施形態では、新生血管形成関連疾患は、過剰および／または異常な新生血管形成を含む疾患であり得る。
【１０３９】
一実施形態では、新生血管形成関連疾患は、新生血管形成依存性の癌であり得る。
【１０４０】
ここで、新生血管形成依存性の癌には、固形腫瘍、白血病および腫瘍転移などの血液腫瘍が含まれる。
【１０４１】
新生血管形成依存性の癌は、例えば、固形腫瘍、白血病および腫瘍転移などの血液腫瘍、血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍であり得る。
【１０４２】
特定の実施形態では、新生血管形成関連疾患は、良性腫瘍であり得る。
【１０４３】
良性腫瘍には、血管腫、聴神経腫瘍、トラコーマおよび化膿性肉芽腫が含まれ得る。
【１０４４】
特定の実施形態では、新生血管形成関連疾患は、眼性新生血管形成疾患であり得る。
【１０４５】
用語「眼性新生血管形成疾患」とは、過剰および／または異常な新生血管形成を含む全ての眼性疾患をさす。眼性新生血管形成疾患には、眼において変更または調節されていない新生血管形成を特徴とする障害が含まれる。
【１０４６】
一例として、眼性新生血管形成疾患には、
虚血性網膜症、視神経乳頭血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パヌス（ｐａｎｕｓ）、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性症、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患、および増殖性硝子体網膜症が含まれ得る。
【１０４７】
例示的な一実施形態では、眼性新生血管形成疾患は、糖尿病性網膜症または黄斑変性症であり得る。
【１０４８】
［糖尿病性網膜症］
糖尿病性網膜症は、１型糖尿病または２型糖尿病のいずれかと診断された患者の約４０〜４５％に起こる糖尿病性合併症である。
【１０４９】
糖尿病性網膜症は通常両眼に発症し、一般に４段階で進行する。第１段階、すなわち軽度の非増殖性網膜症は、眼の毛細血管瘤を特徴とする。小規模の腫脹が、網膜の毛細管チューブおよび小血管で生じる。第２段階、すなわち中程度の非増殖性網膜症では、網膜に供給される血管が閉塞し始める。第３段階、すなわち重度の非増殖性網膜症では、閉塞は網膜への血液供給の低下を招き、網膜に血液供給を提供するために網膜は眼に新生血管形成シグナルを送る。第４段階、すなわち最も進行した段階である増殖性網膜症では、血管新生が起こるが、新しい血管は異常で弱く、網膜と眼に含まれる硝子体ゲルの表面に成長する。
【１０５０】
糖尿病性網膜症には、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、網膜剥離、糖尿病性網膜症、および硝子体出血が含まれる。
【１０５１】
［黄斑変性症］
黄斑変性症は、黄斑変性症は、視覚障害が黄斑変性によって引き起こされる疾患をさし、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）とも呼ばれる。
【１０５２】
ＡＭＤには、初期、中期および進行型ＡＭＤが含まれ、乾性ＡＭＤ、例えば地図状萎縮、および血管新生または滲出性ＡＭＤとしても公知の湿性ＡＭＤの全ても含まれる。
【１０５３】
乾性黄斑変性症は、ドルーゼ（老廃物が黄斑に蓄積されている状態）または網膜色素上皮萎縮などの病変が網膜に生成された場合に、ＡＭＤの約９０％を占める一般的な種類である。湿性黄斑変性症は、網膜下の脈絡膜新生血管形成の産生を特徴とする。
【１０５４】
乾性黄斑変性症には、免疫調節性補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子のミスセンス変異によって引き起こされる黄斑変性症が含まれる。
【１０５５】
別の例示的な実施形態では、機能が人工的に改変された特定の因子（例えば、新生血管形成関連因子等として公知の遺伝子）の様々な機能を伴う、さらなる第３のインビボ機構を調節するための系の使用が提供され得る。
【１０５６】
例えば、機能が人工的に改変された特定の因子は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の１または複数の遺伝子であり得る。
【１０５７】
第３の機構は、新生血管形成以外の、遺伝子が関与するインビボ機構であり得る。
【１０５８】
［医薬組成物］
本発明の例示的な一実施形態は、人工的に操作された新生血管形成関連因子を使用する疾患の治療で使用される組成物に関する。
【１０５９】
組成物には、人工的に操作された新生血管形成関連因子または新生血管形成関連因子を人工的に操作する能力がある操作組成物が含まれてよい。組成物は、治療用組成物または医薬組成物と呼ばれ得る。
【１０６０】
例示的な実施形態では、組成物には、人工的に操作された新生血管形成関連因子、すなわち、遺伝子および／またはタンパク質が含まれ得る。
【１０６１】
例示的な実施形態では、組成物には、新生血管形成関連因子を人工的に操作する能力がある操作組成物が含まれてよい。
【１０６２】
操作組成物には、ガイド核酸−編集タンパク質複合体が含まれてよい。
【１０６３】
操作組成物には、ガイド核酸および／または編集タンパク質が含まれてよい。
【１０６４】
操作組成物には、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸が含まれてよい。
【１０６５】
操作組成物には、ガイド核酸および／または編集タンパク質をコードする核酸を含むウイルスが含まれてよい。
【１０６６】
別の例示的な実施形態では、組成物は、さらなる要素をさらに含んでよい。
【１０６７】
さらなる要素には、対象の身体への送達に適した担体が含まれ得る。
【１０６８】
例示的な一実施形態では、組成物には、操作された新生血管形成関連因子発現産物が、血管障害（ａｎｇｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を抑制するのに十分な量で含まれてよい。
【１０６９】
「血管障害を抑制するのに十分な量」とは、血管障害またはその症状を治療または予防するために必要な有効量をさす。
【１０７０】
例示的な一実施形態では、以下の治療用組成物が提供される。
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列、またはそれをコードする核酸配列内の１または複数の標的配列の各々と相補的結合を形成する能力があるガイド核酸と、
編集タンパク質またはそれをコードする核酸配列を含む、血管障害を治療するための組成物、
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列、またはそれをコードする核酸配列の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列の各々と相補的結合を形成する能力があるガイド核酸と、
編集タンパク質またはそれをコードする核酸配列を含む、血管障害を治療するための組成物、および
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列またはそれをコードする核酸配列の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列の各々と相補的結合を形成する能力があるガイド核酸と、編集タンパク質から形成される複合体を含む血管障害を治療するための組成物。
【１０７１】
ここで、ガイド核酸またはそれをコードする核酸配列と、編集タンパク質をコードする核酸配列は、１または複数のベクターの形態で存在し得る。ガイド核酸またはそれをコードする核酸配列と、編集タンパク質をコードする核酸配列は、同種または異種のベクターの形態で存在し得る。
【１０７２】
［治療方法］
本発明の別の例示的な実施形態では、上記の組成物を製造し、有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、患者において疾患を治療するための方法が提供される。
【１０７３】
［遺伝子操作治療］
生物の遺伝子を操作することによって新生血管形成を調節するための治療方法が、使用され得る。そのような治療方法は、生物の遺伝子を操作するために遺伝子を操作するための組成物を生物に直接注入することによって達成され得る。
【１０７４】
遺伝子操作のための組成物には、ガイド核酸−編集タンパク質複合体が含まれてよい。
【１０７５】
遺伝子操作のための組成物は、身体の特定の部位に注入され得る。
【１０７６】
ここで、身体の特定の部位は、新生血管形成が過剰にかつ／または異常に起こる組織、またはそれに近い部位であり得る。例えば、身体の特定の部位は、例えば、眼球であり得る。
【１０７７】
組成物の投与のための対象は、ヒトまたはサルなどの霊長類、マウスまたはラットなどのげっ歯類等を含む哺乳動物であってよい。
【１０７８】
組成物は、注射、輸血、移植または移植などの任意の便宜な方法によって投与され得る。組成物は、皮下に、皮内に、眼内に、硝子体内に、腫瘍内に、節内に、髄室内に、筋肉内に、静脈内に、リンパ管内に、または腹腔内に投与され得る。
【１０７９】
組成物の用量（所定の望ましい効果を得るための薬剤的有効量）は、投与対象１ｋｇあたり１０４〜１０９細胞、例えば、１０５〜１０６細胞／ｋｇ（体重）の値域内の全ての整数から選択され得るが、本発明はこれらに限定されない。組成物は、投与対象の年齢、健康状態および体重、もしあれば同時に受けた治療の種類、同時治療の頻度、および望ましい効果の特徴を考慮して適切に処方され得る。
【１０８０】
一態様では、本発明は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで達成され得る、原核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供する。
【１０８１】
一部の実施形態では、方法には、ヒトまたはヒト以外の動物から細胞または細胞集団をサンプリングすること、および１個または複数の細胞を改変することが含まれ得る。培養はエクスビボでの任意のステップで行われてよい。１個または複数の細胞がヒト以外の動物または植物に再導入されてもよい。再導入される細胞は最も好ましくは幹細胞である。
【１０８２】
さらに別の例示的な実施形態では、本発明は、細胞を人工的に操作するための方法を提供することができ、この方法には、（ａ）ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列の配列番号１〜１５２２、例えば、配列番号１〜７９の標的配列と相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む編集タンパク質または編集タンパク質をコードする核酸配列を、細胞に導入することが含まれる。
【１０８３】
ガイド核酸および編集タンパク質は、１または複数のベクター中に核酸配列の形で存在していてもよいし、ガイド核酸と編集タンパク質との組合せの複合体中に存在していてもよい。
【１０８４】
導入ステップは、インビボまたはエクスビボで実行されてよい。
【１０８５】
上記の「７．送達」の項の手法を導入ステップの前に参照してもよい。
【１０８６】
例えば、導入段階は、エレクトロポレーション、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質トランスロケーションドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって達成されてよい。
【１０８７】
例えば、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される１または複数であってよい。
【１０８８】
本発明の一部の実施形態の方法および組成物を用いて新生血管形成関連因子を人工的に操作すると、新生血管形成を調節する、例えば、阻害する、抑制する、刺激する、かつ／または増加させることが可能であり、したがって過剰および／または異常な新生血管形成を抑制または改善する効果を得ることができる。
【１０８９】
［さらなる使用］
特定の実施形態では、本発明は、ＡＭＤまたは糖尿病性網膜症を治療するための組成物を調製するためのキットを提供することができる。
【１０９０】
キットは、当技術分野で公知の従来の調製方法によって調製され得る。
【１０９１】
キットには、検出可能な標識がさらに含まれてよい。用語「検出可能な標識」とは、標識を含まない同じ種類の分子のうち、標識を含む分子を特異的に検出するための原子または分子をさす。検出可能な標識は、タンパク質またはそのフラグメント、相互作用タンパク質、リガンド、ナノ粒子、またはアプタマーに特異的に結合する抗体に付着させることができる。検出可能な標識には、放射性核種、フルオロフォア、および酵素が含まれてよい。
【１０９２】
特定の実施形態では、本発明は、人工的に操作されたＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の１または複数の遺伝子の発現量を調節する能力がある材料をスクリーニングするための方法を提供することができる。
【１０９３】
特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の配列を分析することによって、対象における人工的に操作されることのできる標的部位の配列に関する情報を提供するための方法を提供することができる。
【１０９４】
さらに、そのような方法によって得られる情報を用いてライブラリーを構築するための方法。
【１０９５】
ここで、公知のデータベースが使用され得る。
【１０９６】
特定の実施形態では、本発明の方法を用いる研究に使用され得る動物または細胞が提供され得る。
【１０９７】
疾患に関連する１または複数の核酸配列に染色体編集を含む動物または細胞は、上記の方法を用いて調製され得る。そのような核酸配列は、疾患関連タンパク質配列をコードし得るか、または疾患と関連し得る参照配列であり得る。
【１０９８】
例示的な一実施形態では、本発明の方法によって調製された動物または細胞を用いる疾患研究で慣習的に使用されている測定値を使用して、突然変異の作用ならびに疾患の発生および／または進行が動物または細胞において研究され得る。あるいは、そのような動物または細胞を用いて、疾患における活性化合物の薬学的効果が研究され得る。
【１０９９】
別の例示的な実施形態では、可能性のある遺伝子療法の戦略の効果は、本発明の方法によって調製された動物または細胞を用いて評価され得る。すなわち、対応する疾患の発症および／または進行は、疾患関連タンパク質をコードする染色体配列を改変することによって抑制または軽減され得る。特に、この方法は、疾患関連タンパク質をコードする染色体配列を編集することによって改変されたタンパク質を形成することを含み、その結果、動物または細胞の応答の改変が実現される。そのため、一部の実施形態では、遺伝子改変動物は、対応する疾患の発症に弱い動物と比較され得、それによって遺伝子療法プロセスの効果が評価され得る。
【１１００】
そのような用途には、疾患モデル、薬理学的モデル、発生モデル、細胞機能モデル、およびヒト化モデルが含まれてよい。例えば、新生血管形成関連疾患モデル、薬理学的モデル、発生モデル、細胞機能モデル、およびヒト化モデルが含まれてよい。
【１１０１】
人工的に操作された新生血管形成関連因子およびそれによって機能が人工的に改変された新生血管形成系は、新生血管形成関連疾患、例えば、新生血管形成関連眼（ｏｃｕｌａｒ）疾患（眼（ｅｙｅ）疾患）を治療するために効果的に使用され得る。新生血管形成系の効率は、様々な新生血管形成関連因子が関与している多様なインビボで機構の調節によって改善することができる。新生血管形成系の効率は、様々な新生血管形成関連因子が関与している様々なインビボ機構を調節することによって改善され得る。
【１１０２】
以下、本発明を実施例に関してさらに詳細に説明する。
【１１０３】
実施例は、本発明をさらに詳細に説明するためだけに提供されているものであり、本発明の範囲が下の実施例に限定されないことは当業者に明らかであろう。
【１１０４】
［実験方法］
１．ｓｇＲＮＡの設計  ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２）、ＨＩＦ１Ａ遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２４３０８４．１）、ＡＮＧＰＴ２遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１１１８８８７．１）、ＥＰＡＳ１遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１４３０．４）およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０３９６６７．２）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域を、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）を用いて選択した。遺伝子の標的領域は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じて異なり得る。ＣｊＣａｓ９のための遺伝子の標的配列を、上記の表１〜５と表６〜９にまとめ、ＳｐＣａｓ９のための遺伝子の標的配列を表１０〜１４にまとめる。
［表６］
ＶＥＧＦＡ遺伝子の標的配列
【表６】
2019524847.tif 000008
［表７］
ＨＩＦ１Ａ遺伝子の標的配列
【表７】
2019524847.tif 000009
［表８］
ＥＰＡＳ１遺伝子の標的配列
【表８−１】
2019524847.tif 000010
【表８−２】
2019524847.tif 000011
［表９］
ＡＮＧＰＴ２遺伝子の標的配列
【表９】
2019524847.tif 000012
［表１０］
ＳｐＣａｓ９のためのＶＥＧＦＡ遺伝子の標的配列
【表１０−１】
2019524847.tif 000013
【表１０−２】
2019524847.tif 000014
【表１０−３】
2019524847.tif 000015
【表１０−４】
2019524847.tif 000016
【表１０−５】
2019524847.tif 000017
【表１０−６】
2019524847.tif 000018
【表１０−７】
2019524847.tif 000019
［表１１］
ＳｐＣａｓ９のためのＨＩＦ１Ａ遺伝子の標的配列
【表１１−１】
2019524847.tif 000020
【表１１−２】
2019524847.tif 000021
【表１１−３】
2019524847.tif 000022
【表１１−４】
2019524847.tif 000023
【表１１−５】
2019524847.tif 000024
【表１１−６】
2019524847.tif 000025
［表１２］
ＳｐＣａｓ９のためのＥＰＡＳ１遺伝子の標的配列
【表１２−１】
2019524847.tif 000026
【表１２−２】
2019524847.tif 000027
【表１２−３】
2019524847.tif 000028
【表１２−４】
2019524847.tif 000029
【表１２−５】
2019524847.tif 000030
【表１２−６】
2019524847.tif 000031
【表１２−７】
2019524847.tif 000032
【表１２−８】
2019524847.tif 000033
【表１２−９】
2019524847.tif 000034
【表１２−１０】
2019524847.tif 000035
【表１２−１１】
2019524847.tif 000036
【表１２−１２】
2019524847.tif 000037
【表１２−１３】
2019524847.tif 000038
【表１２−１４】
2019524847.tif 000039
［表１３］
ＳｐＣａｓ９のためのＡＮＧＰＴ２遺伝子の標的配列
【表１３−１】
2019524847.tif 000040
【表１３−２】
2019524847.tif 000041
【表１３−３】
2019524847.tif 000042
【表１３−４】
2019524847.tif 000043
［表１４］
ＳｐＣａｓ９のためのＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の標的配列
【表１４−１】
2019524847.tif 000044
【表１４−２】
2019524847.tif 000045
【表１４−３】
2019524847.tif 000046
【表１４−４】
2019524847.tif 000047
【表１４−５】
2019524847.tif 000048
【表１４−６】
2019524847.tif 000049
【表１４−７】
2019524847.tif 000050
【表１４−８】
2019524847.tif 000051
【１１０５】
２．ＣｊＣａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミドの構築
ヒトコドン最適化ＣｊＣａｓ９（カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニＮＣＴＣ１１１６８由来）をコードする配列を、Ｃ末端に核移行シグナル（ＮＬＳ）およびＨＡエピトープを有するように合成し（ＧｅｎｅＡｒｔＴＭ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、合成された核酸配列を以前の研究に記載されるｐ３ｓプラスミドを用いて複製した（Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．＆Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，２３０−２３２（２０１３））。
【１１０６】
ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ）配列およびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（前駆体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）配列を、ＧＡＡＡまたはＴＧＡＡリンカーを用いて連結し、それによってｓｇＲＮＡを作製した。ｓｇＲＮＡはＵ６プロモーターによる転写を調節した。
【１１０７】
３．細胞に基づくレポーター分析を用いるＰＡＭの特徴付け
Ｘの位置にランダム配列を含む可変性ＰＡＭ配列（５'−ＮＮＮＮＸＣＡＣ−３'、５'−ＮＮＮＮＡＸＡＣ−３'、５'−ＮＮＮＮＡＣＸＣ−３'、および５'−ＮＮＮＮＡＣＡＸ−３'）を有するＡＡＶＳ１標的部位（ＡＡＶＳ１−ＴＳ１）を合成した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、合成された核酸配列は、ＲＦＰおよびＧＦＰをコードする代替レポータープラスミドを用いて複製され得る。
【１１０８】
適したＰＡＭ配列を決定するために、構築されたレポータープラスミド（１００ｎｇ）、ならびにＣｊＣａｓ９（２２５ｎｇ）およびｓｇＲＮＡ（６７５ｎｇ）をコードするプラスミドを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞（１×１０５）に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞の分画をフローサイトメトリー（ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６、ＢＤ）によって測定した。
【１１０９】
４．細胞培養および変異解析
ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）細胞およびマウスＮＩＨ  ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５８）細胞を、１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【１１１０】
ｓｇＲＮＡプラスミド（７５０ｎｇ）およびＣｊＣａｓ９プラスミド（２５０ｎｇ）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞（０．５〜１×１０５）にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ＆ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを分離し、オンターゲットまたはオフターゲット部位を、標的化されたディープシークエンシングのために増幅した。ディープシークエンシングライブラリーはＰＣＲによって作製した。ＴｒｕＳｅｑ  ＨＴ  Ｄｕａｌ  Ｉｎｄｅｘプライマーを用いてそれぞれの試料を標識した。混合ライブラリーをペアエンドシークエンシング（ＬＡＳ、Ｉｎｃ．）に付し、インデル頻度を計算した。
【１１１１】
５．ＣｊＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ配列をコードするＡＡＶベクターの構築
ｓｇＲＮＡ配列と、Ｃ末端にＮＬＳおよびＨＡタグを有するＣｊＣａｓ９遺伝子とを含有するＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に基づくベクタープラスミドを構築した。ｓｇＲＮＡ転写をＵ６プロモーターによって誘導し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣ２Ｃ１２筋芽細胞のＥＦＳプロモーターによるか、またはＴＡ筋肉のＳｐｃ５１２プロモーターによってＣｊＣａｓ９発現を調節した。
【１１１２】
網膜送達のために、Ｖｅｇｆａ遺伝子およびＨｉｆ１ａ遺伝子に特異的なＥＦＳプロモーターの制御下、Ｕ６プロモーター誘導ｓｇＲＮＡおよびＣｊＣａｓ９をコードするＡＡＶベクターを構築した、この際、ＣｊＣａｓ９は自己切断Ｔ２Ａペプチドを用いてＣ末端にｅＧＦＰを連結させた。
【１１１３】
６．ＡＡＶベクターの産生、精製および特徴付け
ＡＡＶベクターを産生するために、ＡＡＶＤＪまたはＡＡＶ９キャプシッドのシュードタイプを使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＡＡＶ−ＩＴＲ−ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ、ｐＡＡＶＥＤ２／９、およびへルパープラスミドとともにトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてポリプラストランスフェクション（ＰＥＩｐｒｏ）、トリプルトランスフェクションおよびプラスミドを１：１：１のモル比で混合することによるＰＥＩ共沈を用いて、組換えＡＡＶベクターストックを作製した。７２時間の培養の後、細胞を溶解し、粒子を単離し、ステップ勾配超遠心分離によってイオジキサノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製した。ベクターゲノムの数を定量的ＰＣＲによって定量した。
【１１１４】
７．マウス筋芽細胞におけるＡＡＶ形質導入
マウス筋芽細胞を様々なウイルス量のＡＡＶＤＪ−ＣｊＣａｓ９（感染多重度（ＭＯＩ）１、５、１０、５０、および１００（定量的ＰＣＲにより決定））で感染させ、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。標的ディープシークエンシングのために、細胞を異なる時点で入手した。ＭＯＩ１は、定量的ＰＣＲによって決定される、合計１００個のウイルス粒子のうちの１個のウイルス粒子による感染とみなされる。
【１１１５】
８．動物
本研究で使用された全ての動物の管理、使用および処置は、ソウル大学校動物実験委員会、眼科学および安全研究によって提供されるガイダンス、ならびに獣医学における動物使用に関するＡＲＶＯの声明に従う厳格な合意の下で実施された。本研究において、特定の雄病原体フリー（ＳＰＦ）−６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。マウスを１２時間の明／暗サイクルで維持した。
【１１１６】
［糖尿病モデル］
マウスを、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を１回腹腔内に注射することによって誘導した。対照として、クエン酸緩衝液を注射した。ＳＴＺ注射の４日後、マウスの血糖値が３００ｍｇ／ｄｌまたはそれ以上になった場合、糖尿病が誘発されたと考えられた。
【１１１７】
９．硝子体へのＡＡＶの注射
チレタミンおよびゾラゼパムの１：１（各２．２５ｍｇ／ｋｇ（体重））の比の混合物、および０．７ｍｇ／ｋｇ（体重）の塩酸キシラジンを、６週齢のマウスの硝子体に麻酔のために注射した。手術用顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．）下、３３Ｇブラントニードルを有するＮａｎｏｆｉｌシリンジ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて２μｌ（２×１０１０ウイルスゲノム）のＡＡＶ９−ＣｊＣａｓ９を硝子体に注射した。
【１１１８】
糖尿病マウスモデルの場合、マウスにＳＴＺを注射して糖尿病を誘発し、１週間後または７週間後に麻酔し、０．８×１０８ｖｇ／μｌのＣｊＣａｓ９：Ｖｅｇｆａまたは１．５×１０９ｖｇ／μｌのＲｏｓａ２６を含有する２μｌの混合物を硝子体に注射した。
【１１１９】
１０．網膜組織の免疫蛍光染色およびイメージング
注射の４２日後、試料をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した（ｎ＝４）。試料を包埋したパラフィンを横に切って得た試料を抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ、３Ｆ１０、１：１０００）、抗オプシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５４０５、１：１０００）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５９４抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）で免疫染色した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ソフトウェア（１．４７ｖ、ＮＩＨ）を使用してＨＡタグをつけたＣｊＣａｓ９を発現しているＲＰＥ細胞においてオプシン陽性部位を検出した。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して、ＣｊＣａｓ９およびｅＧＦＰの分布をＲＰＥフラットマウント上で視覚化した。
【１１２０】
１１．ゲノムＤＮＡの抽出
ＤＮＡをＲＰＥおよび網膜から抽出するために、ＲＰＥおよび網膜フラットマウントの画像を得た後、組織試料をＰＢＳで洗浄した。溶解バッファー（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）中で３０秒間ボルテックスすることによって、ＲＰＥ細胞を脈絡膜／強膜から分離した。ゲノムＤＮＡを分析して、残っている脈絡膜／強膜組織からのＲＰＥ細胞の完全な単離を同定した。ゲノムＤＮＡは標的ディープシークエンシングによって分析された。
【１１２１】
１２．マウスＶｅｇｆａのＥＬＩＳＡ
注射の４２日後、全ＲＰＥ混合物を神経網膜組織から単離し、２種類の組織をその後の分析のために凍結した。試料組織を１２０μｌの細胞溶解バッファー（ＣＳＴ＃９８０３）に溶解し、Ｖｅｇｆａタンパク質の量をマウスＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（ＭＭＶ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
【１１２２】
１３．レーザー誘発性ＣＮＶモデル
マウスの麻酔後、０．５％フェニレフリンおよび０．５％トロピカミドを含有する点眼薬を注入して瞳孔を拡張させた。レーザー光凝固を、間接的ヘッドセットデリバリーシステム（Ｉｒｉｄｅｘ）およびレーザーシステム（Ｉｌｏｏｄａ）を用いて実施した。レーザーのパラメータは、５３２ｎｍの波長、２００μｍのスポットサイズ、８００ｍＷの出力および７０ｍｓの露光時間である。レーザーによる熱傷が視神経の近くで３〜４回誘発された。硝子体から出血することなく泡が発生する火傷は研究にのみ使用された。７日後、眼球を４％パラホルムアルデヒドで室温で１時間固定した。イソレクチン−Ｂ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｉ２１４１３、１：１００）および抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５５６、１：１００）を用いて、ＲＰＥ混合物（ＲＰＥ／脈絡膜／強膜）を４℃で一晩免疫染色した。ＲＰＥ混合物をフラットマウントし、蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ、Ｎｉｋｏｎ）または共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を１００倍の倍率で使用して可視化した。ＣＮＶ部位は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ソフトウェア（１．４７ｖ、ＮＩＨ）を用いて検出した。１個の眼球あたり平均３〜４個のＣＮＶ部位を分析した。各群は、１７〜１８個の眼球からなる。
【１１２３】
１４．網膜血管の破裂の定量的および定性的分析
血管漏出を検出するため、ＳＴＺ誘発性糖尿病マウスモデルを使用した。ＰＢＳに溶解した２００μｌのエバンスブルー染料（２０ｍｇ／ｍｌ）を麻酔下のマウスに静脈注射した。灌流の２時間後、眼球を摘出して４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。網膜を２×ＰＢＳ中で切除し、フラットマウントし、網膜の画像を蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて４０倍および１００倍の倍率で得た。
【１１２４】
血管漏出を定量的に分析するために、各マウスの中央周辺網膜（０．５μｍ×０．５μｍ）での血管漏出の代表的な４つの部位を選択した。中央周辺網膜は、視神経乳頭から毛様体までの網膜の中央１／３と指定され、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ソフトウェア（１．４７ｖ、ＮＩＨ）を使用して自動ＩＳＯＤＡＴＡアルゴリズムに基づく色閾値に従って画像を調節し、エバンスブルー染料を含む目的の領域を赤色でマークした。その後、赤色でマークした領域を検出した。対照マウスのデータを用いてデータを正規化し、血管漏出（％）として表した。
【１１２５】
１５．データ分析
インビトロまたはインビボで試料サイズを事前に決定するために、統計的方法は使用しなかった。統計解析のために、一元配置分散分析およびチューキー事後検定を使用した。
【１１２６】
［実施例１．マウス網膜組織におけるＡＡＶによるＣｊＣａｓ９発現の確認］
９８４アミノ酸からなるＣｊＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりも相当にサイズが小さいので（２．９５ｋｂｐ）、ＣｊＣａｓ９遺伝子とｓｇＲＮＡの両方を１つのＡＡＶベクターにパッケージすることが可能である。そのため、この実施例では、ＡＭＤを治療するための方法としてＣｊＣａｓ９を使用する遺伝子操作の可能性を確認するために、ＣｊＣａｓ９発現ＡＡＶを使用した。
【１１２７】
マウスの網膜などの組織におけるＡＡＶによるＣｊＣａｓ９の発現を確認するために、〜Ｕ６プロモーター誘導ｓｇＲＮＡと、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）関連Ｖｅｇｆａ遺伝子およびＨｉｆ１ａ遺伝子に特異的なＥＦＳプロモーターの制御下で、ＣｊＣａｓ９をコードするＡＡＶ９ベクターを構築した。ここで、自己ＣｊＣａｓ９は切断Ｔ２Ａペプチドを使用してＣ末端でｅＧＦＰと連結した（図１のＡおよび図１のＢ）。構築したウイルスを硝子体への注射によって眼球に注射し、６週間後、眼球においてＣｊＣａｓ９発現を確認し、標的ディープシークエンシングを用いてインデル頻度を測定し、ＥＬＩＳＡによってＶｅｇｆａタンパク質の量を測定した（図１のＤ）。
【１１２８】
ＣｊＣａｓ９結合ｅＧＦＰの発現は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞で確認された（図２）。
【１１２９】
さらに、ＣｊＣａｓ９によって誘導されたインデルをＲＰＥ細胞のＲｏｓａ２６、Ｖｅｇｆａ、およびＨｉｆ１ａ標的部位で認め、それぞれ１４±５％、２２±３％、および３１±２％のインデル頻度を確認した（図１のＣ）。さらに、注目すべきオフターゲットインデルは、細胞内のＶｅｇｆａ−またはＨｉｆ１ａ特異的ｓｇＲＮＡによって誘導されなかった（図１のＥ）。
【１１３０】
予想したように、Ｖｅｇｆａタンパク質の発現量は、Ｖｅｇｆａ特異的ＣｊＣａｓ９をコードするＡＡＶで処理したＲＰＥ細胞（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｖｅｇｆａ）で低下したが、Ｈｉｆ１ａまたはＲｏｓａ２６特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｈｉｆ１ａまたはＲｏｓａ２６）をコードするＡＡＶで処理した場合には低下しなかった（図１のＤ）。特に、Ｈｉｆ１ａタンパク質は酸素正常状態で分解されるため、タンパク質の発現量を測定することはできなかった。
【１１３１】
［実施例２．ＣＮＶ誘導マウスを用いるＶｅｇｆａまたはＨｉｆ１ａ特異的ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９の効果］
ＣＮＶを誘導するために眼球にＡＡＶを注射し、６週間後にレーザー治療に付し、それに続いてレーザー治療の１週間後にＣＮＶ部位を検出した（図１のＦ）。ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：ＶｅｇｆａおよびＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｈｉｆ１ａをそれぞれの眼球に注射した場合、ＡＡＶを含まない陰性対照と比較して、ＣＮＶ部位がそれぞれ２４±４％および２０±４％減少したことが確認された（図１のＦおよび図１のＧ）。その他の陰性対照、すなわちＲｏｓａ２６特異的ＣｊＣａｓ９の場合も、治療効果は確認されなかった。
【１１３２】
［実施例３．ＡＭＤ治療に対するＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９の効果］
錐体機能不全はマウスＲＰＥ細胞内のＶｅｇｆａ遺伝子のコンディショナルノックアウトに引き起こされるので、ＲＰＥ細胞におけるＡＡＶ誘導性遺伝子ノックアウトによる副作用の原因を調査した。この目的のために、網膜の錐体機能関連オプシン陽性部位のサイズを測定した。結果として、Ｖｅｇｆａ特異的ＣｊＣａｓ９は、ＡＡＶを含まない対照の約３０±１０％サイズが減少した（図３）。しかし、予想したように、Ｈｉｆ１ａまたはＲｏｓａ２６特異的ＣｊＣａｓ９は錐体機能不全を誘発しなかった。そのような結果は、ＡＭＤの治療のためのＨｉｆｌａ不活性化が新生血管形成を阻害して錐体機能不全を引き起こさないことを示唆し得る。
【１１３３】
ＨＩＦ１Ａは低酸素症誘導転写因子であり、ＶＥＧＦＡ転写を活性化するのに役立つ。ＡＭＤ治療の主な治療標的および分泌タンパク質であるＶＥＧＦＡとは違って、ＨＩＦ１Ａは薬物標的とはみなされず、一般に、ＨＩＦ１Ａなどの転写因子は抗体またはアプタマー、または小分子によって直接に標的にされない場合がある。この研究では、Ｈｉｆ１ａ遺伝子が、マウスの眼球上のＨｉｆ１ａ遺伝子を標的化するＣｊＣａｓ９を用いてＲＰＥ細胞で効果的に不活性化されたため、ＣＮＶ部位がＡＭＤマウスモデルにおいて減少することが確認された（図３）。
【１１３４】
［実施例４．網膜疾患の治療に対するＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９の効果］
糖尿病性網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症、等などの網膜疾患への適用を拡大するため、構築したウイルスを硝子体への注射によって眼球に注射し、６週間後、網膜組織におけるインデル頻度により引き起こされるインビボゲノム編集効果を標的ディープシークエンシングによって観察し、それに続いてＶｅｇｆａタンパク質の発現量をＥＬＩＳＡによって確認した（図１のＢ）。網膜組織において、ＣｊＣａｓ９によって誘導されたインデルを網膜細胞のＲｏｓａ２６、Ｖｅｇｆａ、およびＨｉｆ１ａ標的部位で認め、それぞれ４４±８％、２０±２％、および５８±５％のインデル頻度を確認した（図４のＡ、図４のＢ、および図４のＣ）。予想したように、Ｖｅｇｆａタンパク質の発現量は、網膜細胞において、Ｖｅｇｆａ−またはＨｉｆ１ａ特異的ＣｊＣａｓ９をコードするＡＡＶ（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：ＶｅｇｆａまたはＨｉｆ１ａ）で処理した場合に低下したが、Ｒｏｓａ２６特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｒｏｓａ２６）をコードするＡＡＶで処理した場合には低下しなかった（図４のＤ）。
【１１３５】
［実施例５．糖尿病性網膜症の治療に対するＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９の効果］
糖尿病性網膜症は、血管漏出および血液漏出の症状を特徴とする。そのため、この実施例では、血管漏出または血液漏出症状をＳＴＺを用いる糖尿病誘導マウスを用いて確認し、ＣｊＣａｓ９によって引き起こされる改善または治療効果を確認した。結果として、血管漏出および破裂によって引き起こされる血液漏出が、Ｖｅｇｆａ特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｖｅｇｆａ）を注射した網膜において減少したことを確認した。Ｒｏｓａ２６特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｒｏｓａ２６）注入マウスと比較して、Ｖｅｇｆａ特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｖｅｇｆａ）注入マウスの血管漏出および血液漏出は減少し、したがって同年齢の正常マウスと同様のレベルに回復した。そのような結果は、ＳＴＺを注射した実験、つまり、ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９を７週間後に注射し、６週間後に観察を行った実験（図５）と、ＳＴＺを注射した実験、つまりＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９を１４週間後に注射し、７週間後に観察を行った実験（図６）の両方において同様に示された。上の結果によれば、Ｖｅｇｆａ特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｖｅｇｆａ）が血管漏出および血液漏出を減少させる効果を有することが確認された、したがってＶｅｇｆａ特異的ＣｊＣａｓ９（ＡＡＶ−ＣｊＣａｓ９：Ｖｅｇｆａ）は糖尿病性網膜症を効果的に治療することができると期待される。
【１１３６】
［実施例６．ヒト新生血管形成関連因子の標的部位のスクリーニング］
前述の実施例の適用を拡大するため、ヒトＶＥＧＦＡ（図７）およびヒトＨＩＦ１Ａ（図８のＡ）に加えて、ヒトＡＮＧＰＴ２（図９）、ヒトＥＰＡＳ１（図１０）およびヒトＡＮＧＰＴＬ４（図１１）を、ＡＭＤおよびＤＲ治療のためのゲノム編集の可能性のある標的として選択して、ＣｊＣａｓ９系を用いてヒト細胞で効果的に編集される能力のある各遺伝子の標的部位をスクリーニングした。特に、マウスＨｉｆ１ａ遺伝子のＣｊＣａｓ９標的部位は、ヒトまたは異なる哺乳動物において完全に保存された（図８のＢ）。さらに、保存された標的部位の高い編集効率がヒト細胞において観察された（図８のＡ、ｓｇＲＮＡ  ＃７）。そのため、この研究で示唆されたＨｉｆｌａのＡＡＶまたはその変異体は将来のヒト患者の治療に使用できると予想される。
【産業上の利用可能性】
【１１３７】
人工的に操作された新生血管形成関連因子およびそれによって機能が人工的に改変された新生血管形成系は、血管新生疾患、例えば、血管新生関連眼疾患の治療において効果的に使用され得る。
【１１３８】
新生血管形成系の効率は、様々な新生血管形成関連因子の特性、例えば生存、増殖、残留性、細胞毒性、およびサイトカイン放出などを調節することによって改善することができる。
【１１３９】
【図１ａ】
2019524847.tif 000052
【図１ｂ】
2019524847.tif 000053
【図１ｃ】
2019524847.tif 000054
【図１ｄ】
2019524847.tif 000055
【図１ｅ】
2019524847.tif 000056
【図１ｆ】
2019524847.tif 000057
【図１ｇ】
2019524847.tif 000058
【図２】
2019524847.tif 000059
【図３ａ】
2019524847.tif 000060
【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
2019524847.tif 000064
【図６ａ】
2019524847.tif 000065
【図６ｂ】
2019524847.tif 000066
【図７】
2019524847.tif 000067
【図８ａ】
2019524847.tif 000068
【図８ｂ】
2019524847.tif 000069
【図９】
2019524847.tif 000070
【図１０】
2019524847.tif 000071
【図１１】
2019524847.tif 000072
【配列表】
2019524847000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月17日(2019.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作のための組成物であって、
１または複数の標的配列を標的とする能力があるガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸配列であって、
前記１または複数の標的配列が、１または複数の新生血管形成関連因子の核酸配列内の配列番号１〜１５２２から選択され、
前記新生血管形成関連因子が、眼性新生血管形成疾患において活性化され、
前記１または複数の新生血管形成関連因子が、１または複数のＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択され、
前記ガイド核酸が、ガイドドメインと、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、およびテールドメインからなる群から選択されるドメインの少なくとも１つとを含む、ガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または前記編集タンパク質をコードする核酸配列であって、前記遺伝子操作は、前記新生血管形成関連因子の核酸の１または複数の改変を含む人工的操作である、編集タンパク質または前記編集タンパク質をコードする核酸配列と
を備える
遺伝子操作のための組成物。
【請求項２】
前記編集タンパク質が、１または複数の化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む、請求項１に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項３】
前記編集タンパク質が、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質またはカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１または２に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項４】
前記１または複数の改変が、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子のヌクレオチドとは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、１または複数の外来ヌクレオチド、および１または複数のヌクレオチドの化学修飾の少なくとも１つであり、
前記１または複数の改変が、前記新生血管形成関連因子の核酸内のプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）に、または前記ＰＡＭの５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１ｂｐ〜５０ｂｐの領域に位置付けられる、請求項１に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項５】
前記ＰＡＭ配列が、次の配列（前記５'末端から３'末端方向に記載）
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧである）、および
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
のうち１または複数を含む、
請求項４に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項６】
前記遺伝子操作のための組成物は、ウイルスベクター系で形成される、請求項１に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、請求項６に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ガイド核酸と編集たんぱく質との複合体であるリボヌクレオタンパク質に形成され、前記ガイド核酸が、ガイドＲＮＡである、請求項１に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項９】
前記眼性新生血管形成疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、虚血性網膜症または未熟児網膜症である、請求項１に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項１０】
１または複数の新生血管形成関連因子を人工的に操作するための配列番号１〜１５２２である標的配列からなる群のうち少なくとも１つを標的とする能力があるガイド核酸であって、
配列番号１〜１５２２である前記標的配列が、前記新生血管形成関連因子にあり、
前記新生血管形成関連因子が、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子であり、
前記新生血管形成関連因子が、眼性新生血管形成疾患において活性化され、前記ガイド核酸が、ガイドドメインと、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、およびテールドメインからなる群から選択されるドメインの少なくとも１つとを含み、
前記ガイド核酸が、前記遺伝子を人工的に操作するための編集タンパク質と複合体化される、
ガイド核酸。
【請求項１１】
前記ＶＥＧＦＡ遺伝子の前記核酸配列内の配列番号３，４，７，９，１０，および１１から選択される前記標的配列のうち少なくとも１つを標的とする能力があるガイド核酸と、
前記ＨＩＦ１Ａ遺伝子の前記核酸配列内の配列番号１４，１８，１９，２０，２６，２９，および３１から選択される前記標的配列のうち少なくとも１つを標的とする能力があるガイド核酸と、
前記ＡＮＧＰＴ２遺伝子の前記核酸配列内の配列番号３３，３４，３７，３８，３９，および４３から選択される前記標的配列のうち少なくとも１つを標的とする能力があるガイド核酸と、
前記ＥＰＡＳ１遺伝子の前記核酸配列内の配列番号４７，４８，４９，５０，５３，５４，および５５から選択される前記標的配列のうち少なくとも１つを標的とする能力があるガイド核酸と、
前記ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の前記核酸配列内の配列番号６４，６６，６７，７３，７６，および７９から選択される前記標的配列のうち少なくとも１つを標的とする能力があるガイド核酸と
からなる群から選択される１または複数のガイド核酸を含む請求項１０に記載のガイド核酸。
【請求項１２】
対象に組成物を導入（投与）する段階を備える、眼性新生血管形成疾患を治療するための方法であって、
前記組成物は、
１または複数の標的配列を標的とする能力があるガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸配列であって、
前記１または複数の標的配列が、１または複数の新生血管形成関連因子の核酸配列内の配列番号１〜１５２２から選択され、
前記新生血管形成関連因子が、眼性新生血管形成疾患において活性化され、
前記１または複数の新生血管形成関連因子が、１または複数のＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択され、
前記ガイド核酸が、ガイドドメインと、第１の相補的ドメイン、リンカードメイン、第２の相補的ドメイン、近位ドメイン、およびテールドメインからなる群から選択されるドメインの少なくとも１つとを含む、ガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または前記編集タンパク質をコードする核酸配列と
含む、
方法。
【請求項１３】
前記眼性新生血管形成疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、虚血性網膜症または未熟児網膜症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記編集タンパク質が、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記導入する段階が、眼球を介して行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、ウイルスベクター系で形成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１１３８】
新生血管形成系の効率は、様々な新生血管形成関連因子の特性、例えば生存、増殖、残留性、細胞毒性、およびサイトカイン放出などを調節することによって改善することができる。
［項目１］
人工的に操作された新生血管形成関連因子であって、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択され、核酸配列が改変されている、人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目２］
前述核酸配列における前述改変が、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって人工的に引き起こされる、項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目３］
前述新生血管形成関連因子が、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数である、項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目４］
前述遺伝子が、ガイド核酸−編集タンパク質複合体によって人工的に操作された新生血管形成関連因子であり、
前述人工的に操作された新生血管形成関連因子が、核酸の１または複数の改変を含み、前述改変が、
前述新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列かまたは前述ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域内の、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、および１または複数の外来ヌクレオチドの挿入の少なくとも１つであるか、
あるいは
前述新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内の１または複数のヌクレオチドの化学修飾である、
項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目５］
前述核酸の改変が、前述遺伝子のプロモーター領域で起こる、項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目６］
前述核酸の改変が、前述遺伝子のエクソン領域で起こる、項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目７］
前述核酸の改変が、前述遺伝子のイントロン領域で起こる、項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目８］
前述核酸の改変が、前述遺伝子のエンハンサー領域で起こる、項目１に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目９］
前述ＰＡＭ配列が、例えば、次の配列（５'から３'方向に記載）
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、および
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
のうち１または複数である、項目４に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目１０］
前述編集タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数を含む、項目２に記載の人工的に操作された新生血管形成関連因子。
［項目１１］
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸。
［項目１２］
前述ＶＥＧＦＡ遺伝子の前述核酸配列内の配列番号３、４、７、９、１０および１１の前述標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
前述ＨＩＦ１Ａ遺伝子の前述核酸配列内の配列番号１４、１８、１９、２０、２６、２９および３１の前述標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
前述ＡＮＧＰＴ２遺伝子の前述核酸配列内の配列番号３３、３４、３７、３８、３９および４３の前述標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
前述ＥＰＡＳ１遺伝子の前述核酸配列内の配列番号４７、４８、４９、５０、５３、５４および５５の前述標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、ならびに
前述ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の前述核酸配列内の配列番号６４、６６、６７、７３、７６および７９の前述標的配列に対してそれぞれ相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、
からなる群から選択される１または複数のガイド核酸を含む、項目１１に記載のガイド核酸。
［項目１３］
前述ガイド核酸が、１８〜２３ｂｐのヌクレオチドである、項目１１に記載のｇＲＮＡ分子。
［項目１４］
遺伝子操作のための組成物であって、
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜７９の標的配列に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、あるいは前述ガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または前述編集タンパク質をコードする核酸配列と
を含む、遺伝子操作のための組成物。
［項目１５］
前述編集タンパク質が、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む、項目１４に記載の遺伝子操作のための組成物。
［項目１６］
前述遺伝子操作が、
新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列かまたは前述ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続した１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域内の、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換、および１または複数の外来ヌクレオチドの挿入の少なくとも１つであるか、
あるいは
前述新生血管形成関連因子を構成する核酸配列内の１または複数のヌクレオチドの化学修飾である、
核酸の１または複数の改変を含む、項目１４に記載の遺伝子操作のための組成物。
［項目１７］
前述ＰＡＭ配列が、次の配列（５'から３'方向に記載）
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各々のＮは、独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、および
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
のうち１または複数を含む、項目１６に記載の遺伝子操作のための組成物。
［項目１８］
前述遺伝子操作のための組成物が、ウイルスベクター系で形成される、項目１４に記載の遺伝子操作のための組成物。
［項目１９］
前述ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、項目１８に記載の遺伝子操作のための組成物。
［項目２０］
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の配列を分析することによって、被験体における人工的に操作可能な標的部位の配列に関する情報を提供するための方法。
［項目２１］
項目２０に記載の方法によって提供される前述情報を用いてライブラリーを構築するための方法。
［項目２２］
遺伝子操作のためのキットであって、
（ａ）ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の配列番号１〜７９の標的配列の各々に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、または前述ガイド核酸をコードする核酸配列と、
（ｂ）それぞれ、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトクックス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、髄膜炎菌由来Ｃａｓ９タンパク質、およびＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される１または複数のタンパク質を含む編集タンパク質、または前述編集タンパク質をコードする核酸配列と
を含む、遺伝子操作のためのキット。
［項目２３］
血管障害を治療するための組成物であって、
ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＥＰＡＳ１遺伝子およびＡＮＧＰＴＬ４遺伝子からなる群からそれぞれ選択される１または複数の遺伝子の核酸配列内の１または複数の標的配列の各々に対して相補的結合を形成する能力があるガイド核酸、または前述ガイド核酸をコードする核酸配列と、
編集タンパク質または前述編集タンパク質をコードする核酸配列と
を含む、血管障害を治療するための組成物。
［項目２４］
前述標的配列が、配列番号１〜７９の標的配列のうち１または複数を含む、項目２３に記載の治療用組成物。
［項目２５］
前述編集タンパク質が、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質である、項目２３に記載の治療用組成物。
［項目２６］
前述血管障害が、虚血性網膜症または未熟児網膜症である、項目２３に記載の治療用組成物。
【国際調査報告】
2019524847.tif 000073
2019524847.tif 000074
2019524847.tif 000075
2019524847.tif 000076
2019524847.tif 000077
2019524847.tif 000078
2019524847.tif 000079
2019524847.tif 000080
2019524847.tif 000081
2019524847.tif 000082