(57)【要約】  本発明は、Ｃａｓヌクレアーゼによるゲノム編集に関する。本発明者らは、最小プロモーターと、少なくとも１つのアミノ酸応答エレメント（ＡＡＲＥ）核酸とを含む調節エレメント（これは、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌又はツニカマイシンに応答性である）を使用することによって、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を微細にコントロールし得ることを見出した。例えば、２９３Ｔ細胞において、ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９−ＧＦＰ融合物及びＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＲＦＰ融合物を発現させ得る。加えて、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するドナープラスミドの存在下で、２９３Ｔ細胞のゲノム上のセーフハーバー遺伝子座ＡＡＳＶ１の部位において、前記ピューロマイシン耐性遺伝子の組み込みを実施し得る。したがって、本発明は、個体におけるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸であって、（ｉ）最小プロモーターと、１〜２０個のＡＡＲＥ核酸とを含む調節ポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記調節ポリヌクレオチドのコントロール下に置かれた核酸を含む核酸に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の少なくとも１つのターゲット細胞におけるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸であって、
−最小プロモーターと、１〜２０個のＡＡＲＥ（アミノ酸応答エレメント）核酸とを含む調節ポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌の消費により、個体において活性化される調節ポリヌクレオチド；及び
−Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記調節ポリヌクレオチドのコントロール下に置かれた核酸
を含む、核酸。
【請求項２】
ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
アミノ酸応答エレメント（ＡＡＲＥ）核酸が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５の配列の核酸を含む群において選択される、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
調節ポリヌクレオチドが２〜１０個のＡＡＲＥ核酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
調節ポリヌクレオチドが２〜６個のＡＡＲＥ核酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸ベクターであって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸又は請求項６に記載の核酸ベクターを含む、送達粒子。
【請求項８】
ターゲット細胞の膜に露出したターゲットレセプターに対する結合に適切な１つ以上のリガンドをその表面に含む、請求項７に記載の送達粒子。
【請求項９】
（ｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸又は請求項６に記載の核酸ベクター又は請求項７若しくは８に記載の送達粒子と、（ｉｉ）薬学的に許容し得るビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸又は請求項６に記載の核酸ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
医薬として使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための活性剤として使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ターゲット細胞が少なくとも遺伝子突然変異を有する、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための方法であって、請求項９に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む、方法。
【請求項１５】
疾患を予防及び／又は治療するための活性剤として使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、請求項９に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む、方法。
【請求項１７】
疾患を治療及び／又は予防するためのキットであって、
−請求項９に記載の医薬組成物、及び
−薬学的に活性な化合物
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、個体におけるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸に関する。
【０００２】
特に、核酸の発現は、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌の消費により、コントロールされ得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ターゲティング可能なヌクレアーゼを使用したゲノム編集は、細菌から植物及び動物（ヒトを含む）に至る生物の正確なゲノム改変のための新たな技術である。その魅力は、他の種類の方法ではターゲットゲノム改変が不可能であったほぼ全ての生物に使用可能であることである。
【０００４】
例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びメガヌクレアーゼを実行するターゲットゲノム改変への最近のアプローチにより、科学界では、二本鎖切断を導入して修復経路を活性化することによって、永久的な突然変異を生成することが可能になった。
【０００５】
ゲノム中の所望の位置においてＤＮＡ二本鎖切断を生成するＺＦＮ及びＴＡＬＥＮのような設計ヌクレアーゼの能力は、遺伝子座特異的ゲノム操作の治療応用に対する楽観的な見方を作り出した。しかしながら、これらのアプローチは操作に費用及び時間がかかり、特に、大規模なハイスループットの研究では、それらの広範な使用が制限される。
【０００６】
より最近では、完全に別個の特異的な系（すなわち、Streptococcus pyogenes由来の細菌ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質−９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９））をベースとする新たなツールが大きな関心を生んでいる。
【０００７】
他の遺伝子編集方法とは異なり、それは安価で迅速で使いやすく、世界中の研究室で急速に広がった。この系の力は、ゲノム配列及び遺伝子発現の高効率なターゲット変化を実施することであり、間違いなく、バイオテクノロジーの全ての分野を変革し、ヒト疾患のための新規分子治療薬の開発を促すであろう。
【０００８】
２０１２年におけるその初期実証の後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は広く採用されている。この系は既に、ヒト(Mali et al., 2013, Science, Vol. 339: 823-826)、細菌(Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671)、ゼブラフィッシュ(Hwang et al., 2013, PLoS One, Vol. 8:e68708), C. elegans (Hai et al., 2014 Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11)、植物(Mali et al., 2013, Science, Vol. 339: 823-826)、Xenopus tropicalis (Guo et al., 2014, Development, Vol. 141: 707-714)、酵母(DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res., Vol. 41: 4336-4343)、ショウジョウバエ(Gratz et al., 2014 Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713)、サル(Niu et al., 2014, Cell, Vol. 156: 836-843)、ウサギ(Yang et al., 2014, J. Mol. Cell Biol., Vol. 6: 97-99)、ブタ(Hai et al., 2014, Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11)、ラット(Ma et al., 2014, Cell Res., Vol. 24: 122-125)及びマウス(Mashiko et al., 2014, Dev. Growth Differ. Vol. 56: 122-129)を含む多くの細胞株及び生物において、重要な遺伝子をターゲティングするために使用され成功している。
【０００９】
加えて、ゲノム編集は、前臨床レベル及び第Ｉ相臨床試験において数多くの疾患に適用され成功している（例えば、Cox et al., Nat Med. 2015 Feb;21(2):121-31による総説を参照のこと）。ゲノム編集ベースの治療の実行可能性の評価では、最初に、所望の遺伝子変化の治療効果を明確に立証すべきである。続いて、所定の戦略の成功は、治療改変「閾値」が達成される容易性、編集細胞の適性によって決定される基準、ゲノムを編集するために利用されるＤＳＢ修復経路、及びターゲット細胞型へのゲノム編集分子の送達効率に依存するであろう。
【００１０】
しかしながら、その能力にもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術は、現在、編集プロセスに関連するオフターゲット効果（すなわち、望ましくないゲノム位置におけるゲノム編集）によって、及び細菌ヌクレアーゼＣａｓ９の免疫原性によって大きく制限されている。
【００１１】
これまでは、Porteus (Genome Biology, 2015, 16:286)によって強調されているように、オフターゲット問題は、ヌクレアーゼ活性を支配する機構的特徴に固有のものであると思われている。Porteusは、「適切な送達戦略の決定において重要な検討事項は、遺伝子増大戦略とは対照的に、ゲノム編集がヒット・アンド・ランアプローチであることである」と考えている。さらに、Porteusは、「ヌクレアーゼの持続的発現は、不要であるだけではなく回避すべきであり、ヌクレアーゼの継続的発現は、有害なゲノム不安定性の確率を増加させ、編集細胞の適性を損ない得るか、又は細胞がトランスフォーメーションを受けやすくし得る」と考えている。最後に、Porteusは、「細胞のin vivo編集を必要とする治療適用では、課題がより大きく、解決策が決定されていない」と結論付けている。
【００１２】
いくつかの適用において有害であり得るオフターゲットを緩和するための直接的な手段は、より大きな特異性を有する新規ヌクレアーゼを同定／設計することである。
【００１３】
したがって、当技術分野では、特に、安全な遺伝子治療アプローチのために、個体におけるＣａｓヌクレアーゼ（特に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）をコードする核酸の発現のための新たな微調整コントロール発現系を提供する必要がある。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の一態様は、個体におけるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸であって、
−最小プロモーターと、少なくとも１個のＡＡＲＥ（アミノ酸応答エレメント）核酸とを含む調節ポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌の消費により、個体において活性化される調節ポリヌクレオチド；及び
−Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記調節ポリヌクレオチドのコントロール下に置かれた核酸
を含む核酸に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸ベクターであって、本明細書で定義される核酸を含む核酸ベクターに関する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、本明細書で定義される核酸又は核酸ベクターを含む送達粒子に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明はまた、（ｉ）本明細書で定義される核酸又は核酸ベクター又は送達粒子と、（ｉｉ）薬学的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義される核酸又は核酸ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、医薬として使用するための、本明細書で定義される医薬組成物に関する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明はまた、少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための活性剤として使用するための、本明細書で定義される医薬組成物に関する。
【００２１】
一態様では、本発明は、少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための方法であって、本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、疾患を予防及び／又は治療するための活性剤として使用するための、本明細書で定義される医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明の一態様はまた、疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む方法に関する。
【００２４】
最後に、さらなる態様では、本発明は、疾患を治療及び／又は予防するためのキットであって、
−本明細書で定義される医薬組成物、及び
−薬学的に活性な化合物
を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＧＣＮ２−ｅＩＦ２α−ＡＴＦ４シグナリング経路を示すスキーム。ＥＡＡ飢餓に応じて、活性化ＧＣＮ２はｅＩＦ２αをリン酸化し、転写因子ＡＴＦ４のアップレギュレーション及びＡＡＲＥ配列へのそのリクルートをもたらして、ターゲット遺伝子発現を誘導する。
【図２】ＡＡＲＥ−Ｃａｓヌクレアーゼ構築物の描写を示すスキーム：６コピーのＴｒｂ３由来ＡＡＲＥ（黒点）プロモーター及びＴｋ最小プロモーターがこの構築物を構成する。
【図３】ｐＴｒｉｐ−２×ＡＡＲＥ−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９プラスミドを示すスキーム。ｐＴＫは、最小ＴＫプロモーターの位置を示す；２×ＡＡＲＥは、ＡＡＲＥ核酸の位置を示す；矢印「ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９」は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸の位置を示す；矢印「ＡｍｐＲ」は、アンピシリン耐性をコードする核酸を表す。
【図４】ｐＴＲＩＰ  ｂｌａｓｔ＿Ｕ６  ＡＡＶＳ１＿２×ＡＡＲＥ−Ｃａｓ９−Ｆｌａｇ−ＲＦＰプラスミドを示すスキーム。下パネルは、上パネルの続きである。上パネルの右端のＥｃｏＲ１制限部位は、下パネルの左端のＥｃｏＲ１制限部位を指す。
【図５】ロイシンが欠乏した培地（２９３Ｔ−Ｃ９  Ｌｅｕ−；実線）又はツニカマイシンを含む培地（２９３Ｔ−Ｃ９ＴＵ；破線）のいずれかを用いて、Ｔ０の時点において誘導した際の２９３Ｔ細胞におけるＣａｓ９発現を示すプロット。Ｔ０の時点において誘導を実施し、２４時間の時点において除去する。誘導を除去した２４時間後及び４８時間後に（すなわち、それぞれＴ０＋４８時間及びＴ０＋７２時間の時点において）、発現をモニタリングする。横軸はタイムライン（時）を表し、縦軸はＣａｓ９ヌクレアーゼのバンド強度を表し、したがってＣａｓ９発現を表すものである。誘導の２４時間後に、Ｃａｓ９の最大発現（これが任意に１００％の発現を表す）が観察される。
【図６】２９３Ｔ細胞のゲノムのＡＡＶＳ１部位におけるドナーＤＮＡ（Ｄｏ）の組み込みを示すプロット。プラスミド「ｐＴＲＩＰ  ｂｌａｓｔ＿Ｕ６  ＡＡＶＳ１＿２×ＡＡＲＥ−Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰ」（Ｃ９）と、カセット「ＡＡＶＳ１切断部位−ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシン＿ＡＡＶＳ１切断部位」を含有するドナープラスミド（Ｄｏ）とで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。ツニカマイシン（２９３＋Ｄｏ＋Ｃ９ｉ  Ｔｕ）の存在下で、又はロイシン枯渇培地（２９３＋Ｄｏ＋Ｃ９ｉ  Ｌｅｕ−）を用いて誘導した際のピューロマイシン耐性細胞の数（縦軸）をカウントする。コントロールとして、誘導の非存在下（２９３＋Ｄｏ＋Ｃ９ｎｉ）、両プラスミド（Ｄｏ及びＣ９）でトランスフェクションした２９３Ｔ細胞をアッセイする。最後に、Ｃ９プラスミドのいかなるコピーも有しない２９３Ｔ細胞をドナープラスミド（Ｄｏ）でトランスフェクションし、ピューロマイシン耐性細胞の数をさらにカウントした。
【図７】図６と同様に、１コピーのＣ９プラスミドを含有する２９３Ｔ細胞（２９３−Ｃ９細胞）のゲノムのＡＡＶＳ１部位におけるドナーＤＮＡ（Ｄｏ）の組み込みを示すプロット。カセット「ＡＡＶＳ１切断部位−ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシン＿ＡＡＶＳ１切断部位」を含有するドナープラスミド（Ｄｏ）で２９３−Ｃ９細胞をトランスフェクションした。ツニカマイシン（２９３＿Ｃ９＋Ｄｏｉ  Ｔｕ）の存在下で、又はロイシン枯渇培地（２９３＿Ｃ９＋Ｄｏｉ  Ｌｅｕ−）を用いて誘導した際のピューロマイシン耐性細胞の数（縦軸）をカウントする。コントロールとして、誘導の非存在下（２９３＿Ｃ９＋Ｄｏ−ｎｉ）、プラスミドＤｏでトランスフェクションした２９３−Ｃ９細胞をアッセイする。最後に、誘導の非存在下、ドナープラスミド（Ｄｏ）でトランスフェクションしたピューロマイシン耐性２９３−Ｃ９細胞の数をさらにカウントした。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書で言及される引用は、参照により組み入れられる。
【００２７】
本発明者らは、遺伝子治療に理想的に適した調節系を達成するために、１つの必須アミノ酸が枯渇した食餌に対する栄養適応経路の顕著な特徴を評価した。本発明者らは、食餌特異的アミノ酸飢餓ベースの系が、合成転写因子又は調節タンパク質の発現も薬理学的誘導因子の投与も必要としないことを見出した。それは生理学的に非毒性であり、臨床適用に適切である。この新規な栄養ベースの調節系は、ヒト遺伝子治療における未解決の主要問題の１つを解決する能力を有する生理学的アプローチである。
【００２８】
理論に縛られるものではないが、本発明者らは、本明細書に開示されるコントロール発現系が、Ｃａｓヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)）関連タンパク質）の微調整発現のための特に適切な系であると考える。
【００２９】
国際公開公報第２０１３／０６８０９６号には、いくつかのタンパク質のためのこのようなコントロール発現系が開示されており、ルシフェラーゼタンパク質の発現を用いて概念実証が実施されたことに注目すべきである。Chaveroux et al. (Science Signaling, 2015, vol. 8(374), 1-10)では、ｅＩＦ２ａｌｐｈａ−ＡＴＦ４シグナリング経路の特性評価のためにこの系が利用された。
【００３０】
しかしながら、ターゲット宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼを発現させることに関する制約（例えば、漏出の非存在）により、国際公開公報第２０１３／０６８０９６号及びChaveroux et alに開示されている栄養ベースの調節系は、Ｃａｓヌクレアーゼのコントロール発現のための適切なツールを提供しないと予想され得る。
【００３１】
本明細書に開示されるように、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸は、効率的なコントロール発現系の欠如（発現の「漏出」）により通常観察されるオフターゲットを制限又は回避することを可能にする。
【００３２】
・Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸
本発明の第１の態様は、個体におけるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸であって、
−最小プロモーターと、少なくとも１個のＡＡＲＥ（アミノ酸応答エレメント）核酸とを含む調節ポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌の消費により、個体において活性化される調節ポリヌクレオチド；及び
−Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記調節ポリヌクレオチドのコントロール下に置かれた核酸
を含む核酸に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明はまた、個体の少なくとも１つのターゲット細胞におけるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸であって、
−最小プロモーターと、少なくとも１個のＡＡＲＥ（アミノ酸応答エレメント）核酸とを含む調節ポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌の消費により、個体において活性化される調節ポリヌクレオチド；及び
−Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記調節ポリヌクレオチドのコントロール下に置かれた核酸
を含む核酸に関する。
【００３４】
本発明の範囲内では、「コントロール発現」という表現は、誘導の瞬間、誘導の持続時間に関して、発現が正確に誘導されるか又は「オン」になり、停止するか又は「オフ」になることを意味することを意図する。
【００３５】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラスＩ  Ｃａｓヌクレアーゼ、クラスＩＩ  Ｃａｓヌクレアーゼ及びクラスＩＩＩ  Ｃａｓヌクレアーゼを含む群において選択される。
【００３６】
タイプＩ、タイプＩＩ又はタイプＩＩＩ  Ｃａｓタンパク質について、当業者であれば、Chylinski et al. (2014, Nucleic Acids Research, Vol. 42(10) : 6091-6105); Sinkunas et al. (2011, The EMBO Journal, Vol. 30(7) : 1335-1342); Aliyari et al. (2009, Immunological Reviews, Vol. 227(1) : 176-188); Cass et al. (Biosci Rep, doi:10.1042/BSR20150043), Makarova et al. (2011, Biology Direct, Vol. 6 : 38); Gasiunas et al. (2012, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 109(39) : E2579-E2586) ; Heler et al. (2015, Nature, Vol. 519(7542) : 199-202); Esvelt et al. (2013, Nat Methods, Vol. 10(11) : doi :10.138/nmeth.2681)、Zetsche et al. (Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71)又はChylinski et al. (2013, Biology, Vol. 10(5) : 726-737)を参照し得る。
【００３７】
いくつかの実施態様では、クラスＩ  Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１及びＣｓｙ１を含む群において選択される。
【００３８】
いくつかの実施態様では、クラスＩＩ  Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃｓｎ２及びＣａｓ４を含む群において選択される。
【００３９】
いくつかの実施態様では、クラスＩＩＩ  Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２及びＣｍｒ５を含む群において選択される。
【００４０】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
【００４１】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、細菌源、特に、Acaryochloris marina、Actinomyces naeslundii、Alcanivorax dieselolei、Belliella baltica、Campylobacter jejuni、Corynebacterium diphtheriae、Coriobacterium glomerans、Corynebacterium ulcerans、Desulfomonile tiedjei、Dickeya dadantii、Escherichia coli、Francisella tularensis、Lactobacillus kefiranofaciens、Listeria innocua、Methylobacterium extorquens、Micrococcus luteus、Myxococcus fulvus、Neisseria meningitidis、Pasteurella multocida、Prevotella intermedia、Prochlorococcus marinus、Psychroflexus torquis、Sphaerobacter thermophilus、Sphingobacterium sp.、Staphylococcus aureus、Streptococcus mutans、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilus及びStreptomyces bingchenggensisを含む群において選択される細菌に由来し得る。
【００４２】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、古細菌源、例えばMethanoculleus bourgensisなどに由来し得る。
【００４３】
限定されないが、本明細書に開示されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ９ヌクレアーゼのホモログ、パラログ及びオルソログ及び変異体を包含する。
【００４４】
特定の実施態様では、Ｃａｓ９変異体は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１(Kleinstiver et al.; Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5)、ｆＣａｓ９（これは、触媒的に不活性なＣａｓ９とＦｏｋＩヌクレアーゼと融合物である(Guilinger et al.; Nat. Biotechnol. 2014: 32(6): 577-582)）及びSlaymaker et al. (Science. 2016 Jan 1;351(6268):84-8)によって開示されているように改善された特異性を有する任意の合理的に操作されたＣａｓ９ヌクレアーゼ．を含み得る。
【００４５】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸及び／又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするベクターは、例えば、SIGMA-ALDRICH（登録商標）から市販されているものであり得る。
【００４６】
いくつかの他の実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼは、タンパク質の指向性進化のための方法によって同定され得る。Packer and Liu (Nat Rev Genet. 2015 Jul;16(7):379-94)。
【００４７】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡガイドＣａｓヌクレアーゼである。
【００４８】
本発明の範囲内では、「ＤＮＡ又はＲＮＡガイド」は、ガイドＤＮＡ又はＲＮＡの存在下で、Ｃａｓヌクレアーゼが核酸（この配列は、ガイドＤＮＡ及びＲＮＡと相補的である）にターゲティングされることを意味することを意図する。特定の実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸の発現は、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸の転写に起因するｍＲＮＡ発現の測定、及び／又はＣａｓヌクレアーゼ発現の測定を含む当技術分野で使用可能な任意の適切な方法によって測定され得る。
【００４９】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼ発現の測定は、前記Ｃａｓヌクレアーゼに特異的に結合する抗体(anti- antibodies)を用いて、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を測定することによって実施され得る。
【００５０】
本発明の範囲内では、誘導発現は、基本非誘導発現と比較した発現倍率として表され得る。
【００５１】
いくつかの実施態様では、誘導発現は、基本発現と比較して２倍〜１０，０００倍、好ましくは４倍〜５００倍、より好ましくは８倍〜２５０倍、最も好ましくは１０倍〜１００倍で変動し得る。
【００５２】
本発明の範囲内では、２倍〜１０，０００倍は、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１，０００倍、２，０００倍、３，０００倍、４，０００倍、５，０００倍、６，０００倍、７，０００倍、８，０００倍及び９，０００倍を含む。
【００５３】
本発明の範囲内では、「最小プロモーター」という表現は、下流に位置する目的の遺伝子の転写を適切に開始させるために必要な全てのエレメントを含むプロモーターを意味することを意図する。本発明の範囲内では、「最小プロモーター」及び「コアプロモーター」は、同等の表現であるとみなされる。当業者であれば、「最小プロモーター」が、少なくとも転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、及び一般的な転写因子のための結合部位（ＴＡＴＡボックス）を含むことを理解する。
【００５４】
適切な最小プロモーターは、当業者に公知である。
【００５５】
いくつかの実施態様では、本発明を行うために適切な最小プロモーターは、チミジンキナーゼのプロモーター、β−グロビンのプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどを含む群において選択され得る。
【００５６】
いくつかの実施態様では、個体は、ヒト又は非ヒト哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００５７】
いくつかの実施態様では、非ヒト哺乳動物は、ペット、例えばイヌ、ネコ、家畜ブタ、ウサギ、フェレット、ハムスター、マウス、ラットなど；霊長類、例えばチンパンジー、サルなど；経済的に重要な動物、例えばウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラットを含む群において選択される。
【００５８】
本発明の範囲内では、「ターゲット細胞」は、Ｃａｓヌクレアーゼの発現が有益な前記個体に由来する細胞を指すことを意図する。
【００５９】
本発明の範囲内では、「必須アミノ酸」という表現は、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００６０】
本発明の範囲内では、「少なくとも１つの必須アミノ酸」という表現は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つの必須アミノ酸を意味することを意図する。
【００６１】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、１時間、１時間３０分、２時間、２時間３０分、３時間、３時間３０分、４時間、４時間３０分、５時間、５時間３０分、６時間、６時間３０分、７時間、７時間３０分、８時間、８時間３０分、９時間、９時間３０分、１０時間、１０時間３０分、１１時間、１１時間３０分を含む５分〜１２時間の期間にわたって個体に投与され得る。
【００６２】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、個体に１日１回、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上投与され得る。
【００６３】
特定の実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、個体に１日１回又は２回投与され得る。
【００６４】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、早朝に、例えば朝食で個体に投与され得、次いで、個体は、昼食及び夕食で通常の食餌を投与され得る。
【００６５】
本発明の範囲内では、「通常の食餌」という表現は、いかなる必須アミノ酸も欠乏していない食餌を意味することを意図する。
【００６６】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、個体に毎日、隔日、週１回、週２回、週３回投与され得る。
【００６７】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、半日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日又はそれ以上の期間にわたって個体に投与され得る。
【００６８】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、毎週、隔週、毎月、又はそれ以上反復され得る。
【００６９】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した食餌は、MILUPA（登録商標）の名称でNUTRICA METABOLICS（登録商標）から市販されているイソロイシンフリー、ロイシンフリー及びバリンフリーの粉末食品によって提供され得る。この食餌は、メープルシロップ尿疾患（この疾患は、分枝鎖アミノ酸代謝に影響を及ぼすと思われる）を有する個体に適合される。
【００７０】
特定の実施態様では、ロイシンフリー、イソロイシンフリー又はバリンフリーの食餌は、イソロイシンフリー、ロイシンフリー及びバリンフリーの粉末を２つの他のアミノ酸の外部供給源と混合することによって得られ得る。
【００７１】
特定の実施態様では、フェニルアラニンフリーの食餌は、MEAD JOHNSON（登録商標）から市販されているフェニルアラニンフリーの粉末によって提供され得る。この食餌は、フェニルケトン尿症を有する個体に適合される。
【００７２】
実際には、粉末は、所望の必須アミノ酸を含まない適合された液体又は半固体食と混合される。
【００７３】
特定の実施態様では、アミノ酸飢餓は、ハロフジノン、又は分子「４（３Ｈ）−キナゾリノン，７−ブロモ−６−クロロ−３−［３−（３−ヒドロキシ−２−ピペリジニル）−２−オキソプロピル］−，trans−（±）−に対応する任意の他の名称のもの、又は例えばHalocur、Stenorol、Flavomycin、Lincomix、Stafacとして商品化されているものの投与によって模倣され得る。
【００７４】
一実施態様では、アミノ酸応答エレメント（ＡＡＲＥ）核酸は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５の配列の核酸を含む群において選択される。
【００７５】
本発明の範囲内では、「少なくとも１個のＡＡＲＥ核酸」という表現は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個及び少なくとも５個のＡＡＲＥ核酸を含む。したがって、「少なくとも１個のＡＡＲＥ核酸」という表現は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個及び２０個のＡＡＲＥ核酸を含む。
【００７６】
特定の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは、少なくとも２個のＡＡＲＥ核酸を含む。
【００７７】
いくつかの他の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは、１〜２０個のＡＡＲＥ核酸、好ましくは２〜１０個のＡＡＲＥ核酸を含む。
【００７８】
特定の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは、２〜６個のＡＡＲＥ核酸を含む。
【００７９】
いくつかの実施態様では、調節ポリヌクレオチドは、配列番号：２及び配列番号：４の配列の核酸を含む群において選択される２個のＡＡＲＥ核酸を含む。
【００８０】
いくつかの実施態様では、調節ポリヌクレオチドは、配列番号：１の配列の６個のＡＡＲＥ核酸を含む。
【００８１】
特定の実施態様では、２個のＡＡＲＥ核酸又はあるいは少なくとも２個のＡＡＲＥ核酸は、同一又は別個のものであり得る。
【００８２】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸に含まれる調節ポリヌクレオチドはまた、個体へのハロフジノン、ツニカマイシンなど（すなわち、ＡＡＲＥ核酸の活性化特性を有することが公知の化合物）の投与により活性化され得る。
【００８３】
・核酸ベクター
別の態様では、本発明はまた、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸ベクターであって、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸を含む核酸ベクターに関する。
【００８４】
いくつかの実施態様では、本発明のＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸は、遺伝子治療に適切なベクターに組み込まれる。
【００８５】
本発明の範囲内では、「遺伝子治療に適切なベクター」という表現は、ベクターが、ターゲット細胞におけるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸の発現を達成するための必須エレメントを含むことを意味することを意図する。
【００８６】
特定の実施態様では、ベクターは、ウイルスベクターである。
【００８７】
いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、非組み込み型レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスを含む群において選択される。
【００８８】
・送達粒子
いくつかの実施態様では、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクターは、特に他の化合物と一緒に、例えば脂質、タンパク質、ペプチド又はポリマーなどと共に粒子に含まれ得る。
【００８９】
本発明の範囲内では、前記粒子又は「送達粒子」は、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼをコードする前記核酸を含む核酸ベクターをターゲット細胞に提供又は「送達」することを意図する。
【００９０】
さらに他の態様では、本発明はさらに、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクターを含む送達粒子に関する。
【００９１】
特定の実施態様では、送達粒子は、カチオン性脂質を含むリポプレックス；脂質ナノエマルジョン；固体脂質ナノ粒子；ペプチドベースの粒子；特に天然及び／又は合成ポリマーを含むポリマーベースの粒子の形態であり得る。
【００９２】
いくつかの実施態様では、ポリマーベースの粒子は、タンパク質；ペプチド；多糖、特にキトサンを含み得る。
【００９３】
いくつかの実施態様では、ポリマーベースの粒子は、合成ポリマー、特に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、デンドリマー、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリメタクリレート及びポリホスホエステルを含み得る。
【００９４】
いくつかの実施態様では、送達粒子は、ターゲット細胞の膜に露出したターゲットレセプターに対する結合に適切な１つ以上のリガンドをその表面に含む、
【００９５】
・医薬組成物
本発明の別の態様は、（ｉ）本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子と、（ｉｉ）薬学的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【００９６】
本発明の医薬組成物の製剤化は、当業者に周知である。
【００９７】
本明細書で言及されるように、本開示で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子は、活性剤に相当し得る。
【００９８】
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、唯一の活性剤として、本開示で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子を含み得る。
【００９９】
いくつかの実施態様では、本発明の適切な薬学的に許容し得るビヒクルとしては任意の及び全ての従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水性溶液、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。
【０１００】
特定の実施態様では、適切な薬学的に許容し得るビヒクルとしては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びそれらの混合物が挙げられ得る。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得るビヒクルは、細胞の貯蔵寿命又は有効性を増強する微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤又はバッファーをさらに含み得る。薬学的に許容し得るビヒクルの調製及び使用は、当技術分野で周知である。
【０１０２】
任意の従来の媒体又は薬剤が有効成分と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、任意の経路によって、すなわち経口投与、局所投与又は非経口投与によって、例えば皮下投与、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、眼内投与及び耳介内投与を含む注射によって、それを必要とする個体に投与され得る。
【０１０４】
特定の実施態様では、注射による医薬組成物の投与は、特に、前記医薬組成物に含まれる核酸又は核酸ベクターの拡散を回避するために、目的のターゲット組織において直接実施され得る。
【０１０５】
本発明者らは、脳組織がターゲットである場合、これが特に重要であると考える。核酸ベクターの注入は、例えば、磁気共鳴断層撮影装置を利用して、特にフレームレス定位照準デバイスを使用して、脳組織の特定部分において非常に正確に行われ得る。今や、ＭＲＩガイダンス及び新たな定位照準デバイスの使用は、神経遺伝子治療のための強固な基盤を確立して、介入神経学において認められた手順になっている。
【０１０６】
他の投与様式は、肺製剤、座薬及び経皮適用を用いる。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、本発明の経口製剤は、通常の賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、有効量の前記化合物は、それを必要とする前記個体に投与される。
【０１０９】
本発明の範囲内では、「有効量」は、単独で所望の転帰を刺激する（すなわち、包含される疾患、特に遺伝性障害の症候を緩和又は根絶する）前記化合物の量を指す。
【０１１０】
所望の転帰を観察するために、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子の有効量を決定することは、当業者の通常の知識の範囲内である。
【０１１１】
本発明の範囲内では、投与すべき化合物の有効量は、医師又は当業者によって決定され得、処置の時間経過内において適切に適合され得る。
【０１１２】
特定の実施態様では、投与すべき有効量は、投与のために選択される材料、投与が単回投与又は複数回投与であるか、並びに年齢、身体状態、サイズ、体重、性別及び処置すべき疾患の重症度を含む個体のパラメータを含む様々なパラメータに依存し得る。
【０１１３】
特定の実施態様では、有効量の活性剤は、約０．００１mg〜約３０００mg/投与量単位、好ましくは約０．０５mg〜約１００mg/投与量単位を含み得る。
【０１１４】
本発明の範囲内では、約０．００１mg〜約３０００mgは、約
【表１】
2019517262.tif 000002
/投与量単位を含む。
【０１１５】
特定の実施態様では、活性剤は、被験体体重１ｋｇあたり、１日に、約０．００１mg/kg〜約１００mg/kg、約０．０１mg/kg〜約５０mg/kg、好ましくは、約０．１mg/kg〜約４０mg/kg、好ましくは、約０．５mg/kg〜約３０mg/kg、約０．０１mg/kg〜約１０mg/kg、約０．１mg/kg〜約１０mg/kg、より好ましくは約１mg/kg〜約２５mg/kg を送達するために十分な投与量レベルであり得る。
【０１１６】
いくつかの特定の実施態様では、有効量の活性剤は、本開示で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子 約１×１０５〜約１×１０１５コピー／投与量単位を含み得る。
【０１１７】
本発明の範囲内では、約１×１０５〜約１×１０１５コピーは、
【表２】
2019517262.tif 000003
コピー／投与量単位を含む。
【０１１８】
・ターゲット細胞及び宿主細胞
さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１９】
ターゲット細胞及び／又は宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞の中から選択され得る。
【０１２０】
本発明の範囲内では、「原核細胞」は、細菌細胞及び古細菌細胞を包含する。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、ターゲット細胞及び／又は宿主細胞は、真核細胞である。
【０１２２】
本発明の範囲内では、「真核細胞」は、酵母、藻類細胞、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を包含する。
【０１２３】
いくつかの好ましい実施態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
【０１２４】
特定の実施態様では、本発明のターゲット細胞及び／又は宿主細胞は、限定されないが、中枢神経系の細胞、上皮細胞、筋肉細胞、胚細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を包含する。
【０１２５】
いくつかの特定の実施態様では、ターゲット細胞及び／又は宿主細胞は、幹細胞、前駆細胞、胚芽細胞又は胚細胞ではない。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、ターゲット細胞及び／又は宿主細胞は、筋肉組織、神経組織、結合組織及び上皮組織を含む群において選択される組織に属し得る。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、ターゲット細胞及び／又は宿主細胞は、膀胱、骨、脳、乳房、中枢神経系、頸部、結腸、子宮内膜、腎臓、喉頭、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、胸膜、前立腺、直腸、網膜、唾液腺、皮膚、小腸、軟組織、胃、精巣、甲状腺、子宮、膣を含む群において選択される器官に属し得る。
【０１２８】
・使用
本発明の別の態様は、医薬として使用するための医薬組成物であって、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子と、薬学的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【０１２９】
一態様では、本発明はまた、医薬を調製又は製造するための、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸の使用に関する。
【０１３０】
さらに他の態様では、本発明は、少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための活性剤として使用するための医薬組成物であって、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子と、薬学的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【０１３１】
本発明の別の態様はさらに、少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための活性剤としての、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸の使用に関する。
【０１３２】
特定の実施態様では、ゲノムの編集は、in vivo、in vitro又はex vivoで実施され得る。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、ゲノムの編集は、Komor et al. Nature; 2016 Apr 20;533(7603):420-4のように実施され得る。
【０１３４】
一実施態様では、ターゲット細胞は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を有する。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、遺伝子突然変異は、
【表３】
2019517262.tif 000004
を含む群において選択される遺伝子中に存在する。
【０１３６】
一態様では、本発明は、疾患を治療及び／又は予防するための活性剤として使用するための医薬組成物であって、本明細書で定義されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子と、薬学的に許容し得るビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【０１３７】
いくつかの実施態様では、疾患は、遺伝性障害、感染性疾患及びガンを含む群において選択される。
【０１３８】
いくつかの実施態様では、疾患は、遺伝性障害である。
【０１３９】
特定の実施態様では、遺伝性障害は、無βリポタンパク血症；色覚異常；腸性先端皮膚炎；急性幼児肝不全；アシル−ＣｏＡオキシダーゼＩ欠損症；アデノシンデアミナーゼ欠損症；副腎白質ジストロフィー、Ｘ連鎖；アイカルディ−グティエール症候群；α−マンノシドーシス；α−サラセミア；α−サラセミア精神遅滞症候群；アルポート症候群；アルストレム症候群；アンダーマン症候群；アルギニノコハク酸尿症；アロマターゼ欠損症；関節拘縮症、精神遅滞及び発作；アスパラギンシンテターゼ欠損症；アスパルチルグルコサミン尿症；ビタミンＥ単独欠乏性運動失調症；毛細血管拡張性失調症；シャルルボア・サグネの常染色体劣性痙性運動失調症；バルデー・ビードル症候群；不全リンパ球症候群、タイプＩＩ；バター症候群、タイプ４Ａ；ベルナール・スーリエ症候群、タイプＡ１；β−グロビン関連異常ヘモグロビン症；３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプＩＩ欠損症；β−ケトチオラーゼ欠損症；両側前頭頭頂多小脳回症；ビオチニダーゼ欠損症；ブルーム症候群；カナバン病；カルバモイルホスフェートシンテターゼＩ欠損症；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＡ欠損症；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ欠損症；カーペンター症候群；軟骨毛髪形成不全症；脳クレアチン欠乏症候群１；脳クレアチン欠乏症候群２；脳腱黄色腫症；シャルコー・マリー・トゥース病、タイプ４Ｄ；シャルコー・マリー・トゥース病、タイプ５／Ａｒｔｓ症候群；シャルコー・マリー・トゥース病、Ｘ連鎖；有棘赤血球舞踏病；先天性脈絡膜欠如；慢性肉芽腫症；慢性肉芽腫症；シトリン欠損症；シトルリン血症、タイプ１；コーエン症候群；マロン酸性尿酸及びメチルマロン酸性尿酸の複合型；複合型酸化的リン酸化欠乏症１；複合型酸化的リン酸化欠乏症３；複合型下垂体ホルモン欠損症２；複合型下垂体ホルモン欠損症３；複合型ＳＡＰ欠損症；１７α−ヒドロキシラーゼ欠損による先天性副腎過形成；先天性無巨核球性血小板減少症；グリコシル化の先天性障害、タイプＩａ；グリコシル化の先天性障害、タイプＩｂ；グリコシル化の先天性障害、タイプＩｃ；全身無汗無痛症；先天性筋無力症候群；先天性筋無力症候群；先天性好中球減少症；先天性好中球減少症；角膜ジストロフィー及び感音性難聴；コルチコステロンメチルオキシダーゼ欠損症；嚢胞性線維症；シスチン症；Ｄ−二官能性タンパク質欠損症；難聴、常染色体劣性７７；デュシェンヌ筋ジストロフィー／ベッカー筋ジストロフィー；先天性角化異常症；栄養障害性表皮水疱症；エーラス・ダンロス症候群、タイプＶＩＩＣ；エリス・ファン・クレフェルト症候群；エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー１；Ｓ錐体増強症候群；エチルマロン酸脳症；ファブリー病；第ＩＸ因子欠損症；第ＸＩ因子欠損症；家族性自律神経失調症；家族性高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症、常染色体劣性；家族性高インスリン症；家族性地中海熱；ファンコニ貧血、グループＡ；ファンコニ貧血、グループＣ；ファンコニ貧血、グループＧ；脆弱性Ｘ症候群；フマラーゼ欠損症；ガラクトキナーゼ欠損症；ガラクトース血症；ゴーシェ病；ギテルマン症候群；グルタル酸血症、タイプＩ；グルタル酸血��、タイプＩＩａ；グルタル酸血症、タイプＩＩｃ；グリシン脳症；グリシン脳症；グリコーゲン貯蔵症、タイプＩａ；グリコーゲン貯蔵症、タイプＩｂ；グリコーゲン貯蔵症、タイプＩＩ；グリコーゲン貯蔵症、タイプＩＩＩ；グリコーゲン貯蔵症、タイプＩＶ／成人ポリグルコサン小体病；グリコーゲン貯蔵症、タイプＶ；グリコーゲン貯蔵症、タイプＶＩＩ；ＧＲＡＣＩＬＥ症候群及び他のＢＣＳ１Ｌ関連障害；ヘモクロマトーシス、タイプ２Ａ；ヘモクロマトーシス、タイプ３；遺伝性フルクトース不耐症；遺伝性痙性対麻痺４９；ヘルマンスキー・パドラック症候群、タイプ１；ヘルマンスキー・パドラック症候群、タイプ３；ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ欠損症；ホロカルボキシラーゼシンテターゼ欠損症；ホモシスチン尿症；ＭＴＨＦＲ欠損によるホモシスチン尿症；ホモシスチン尿症、ｃｂｌＥタイプ；Ｈｙｄｒｏｌｅｔｈａｌｕｓ症候群；高オルニチン血症−高アンモニア血症−ホモシトルリン尿症候群；無汗性外胚葉形成不全症１；低ホスファターゼ血症；封入体ミオパチー２；小児脳及び小脳萎縮症；イソ吉草酸血症；ジュベール症候群２；ジュベール症候群７／メッケル症候群５／ＣＯＡＣＨ症候群；接合部型表皮水疱症；接合部型表皮水疱症；接合部型表皮水疱症；クラッベ病；葉状魚鱗癬、タイプ１；レーバー先天性黒内障１０及び他のＣＥＰ２９０関連繊毛関連疾患；レーバー先天性黒内障１３；レーバー先天性黒内障２／網膜色素性色素症２０；レーバー先天性黒内障５；レーバー先天性黒内障８／網膜色素性色素症１２／色素性静脈傍網脈絡膜萎縮；リー症候群、フランス系カナダ人タイプ；致命性先天性拘縮症候群１／前角細胞疾患を伴う致死性関節拘縮症；白質の消失を伴う白質脳症；肢帯筋ジストロフィー、タイプ２Ａ；肢帯筋ジストロフィー、タイプ２Ｂ；肢帯筋ジストロフィー、タイプ２Ｃ；肢帯筋ジストロフィー、タイプ２Ｄ；肢帯筋ジストロフィー、タイプ２Ｅ；肢帯筋ジストロフィー、タイプ２Ｉ；リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症；リポイド副腎過形成；リポタンパク質リパーゼ欠損症；長鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；リシン尿性タンパク不耐症；メープルシロップ尿症、タイプ１ａ；メープルシロップ尿症、タイプ１ｂ；メッケル症候群１／バルデー・ビードル症候群１３；中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；皮質下嚢胞を伴う大頭型白質脳症；メンケス病；異染性白質ジストロフィー；３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症；３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症；３−メチルグルタコン酸性尿症、タイプＩＩＩ／白内障を伴う視神経萎縮３；メチルマロン酸血症；メチルマロン酸尿症及びホモシスチン尿症、コバラミンＣタイプ；小眼球症／無眼球症；ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症；ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症；ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群６／ナバホ神経性肝障害；ミトコンドリアミオパチー及び鉄芽球性貧血１；ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩＡ；ムコリピドーシスＩＩＩガンマ；ムコリピドーシスＩＶ；ムコ多糖症、タイプＩ；ムコ多糖症、タイプＩＩ；ムコ多糖症、タイプＩＩＩＢ；ムコ多糖症、タイプＩＩＩＣ；ムコ多糖症、タイプＩＩＩ��；ムコ多糖症、タイプＩＶｂ／ＧＭ１ガングリオシドーシス；ムコ多糖症、タイプＩＸ；ムコ多糖症、タイプＶＩ；複数スルファターゼ欠損症；筋肉−眼−脳疾患及び他のＰＯＭＧＮＴ１関連先天性筋ジストロフィー−ジストログリカノパシー；神経胃腸脳症；筋細管ミオパチー１；Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ欠損症；ネマリンミオパチー２；腎性尿崩症、タイプＩＩ；ネフローゼ症候群／先天性フィンランドネフローゼ；ネフローゼ症候群／ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群；神経セロイドリポフスチン症；神経セロイドリポフスチン症；ニーマン・ピック病、タイプＡ／Ｂ；ニーマン・ピック病、タイプＣ；ナイミーヘン切断症候群；非症候性難聴；歯牙−爪−皮膚異形成症／ショフ・シュルツ・パサージ症候群；オーメン症候群；オーメン症候群／重症複合型免疫不全症、アサバスカンタイプ；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；オルニチントランスカルボミラーゼ欠損症（Ornithine Transcarbomylase Deficiency）；大理石骨病１；ペンドレッド症候群；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症；３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；多発性嚢胞腎、常染色体劣性；多腺性自己免疫症候群、タイプ１；橋小脳低形成、タイプ１Ａ；橋小脳低形成、タイプ６；原発性カルニチン欠損症；原発性線毛運動障害；原発性高シュウ酸尿症、タイプ１；原発性高シュウ酸尿症、タイプ２；原発性高シュウ酸尿症、タイプ３；進行性小脳−脳萎縮症；進行性家族性肝内胆汁鬱滞、タイプ２；プロピオン酸血症；プロピオン酸血症；濃化異骨症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１−α欠損症；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１−β欠損症；６−ピルボイル−テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症；腎尿細管アシドーシス及び難聴；網膜色素変性症２５；網膜色素変性症２６；網膜色素変性症２８；網膜色素変性症５９；肢根型点状軟骨異形成症、タイプ１；肢根型点状軟骨異形成症、タイプ３；ロバーツ症候群；サラ病；サンドホフ病；シムケ免疫性骨形成不全；セガワ症候群；シェーグレン・ラルソン症候群；スミス・レムリ・オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；脊椎胸郭異骨症；スチール症候群；ステューブ・ヴィーデマン症候群；硫酸輸送体関連骨軟骨異形成症；テイ・サックス病；チロシン血症、タイプＩ；アッシャー症候群、タイプＩＢ；アッシャー症候群、タイプＩＣ；アッシャー症候群、タイプＩＤ；アッシャー症候群、タイプＩＦ；アッシャー症候群、タイプＩＩＡ；アッシャー症候群、タイプＩＩＩ；超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；ウォーカー・ワールブルク症候群及び他のＦＫＴＮ関連ジストロフィー；ウィルソン病；ウォルマン病／コレステリルエステル貯蔵症；Ｘ連鎖若年性網膜症；Ｘ連鎖重症複合型免疫不全症及びツェルヴェーガー症候群スペクトルを含む非限定的な群において選択される。
【０１４０】
いくつかの実施態様では、疾患は、感染性疾患である。
【０１４１】
特定の実施態様では、感染性疾患は、アナプラズマ病；炭疽病；バベシア症；ボツリヌス中毒症；ブルセラ症；Burkholderia mallei感染症（鼻疽）；Burkholderia pseudomallei感染症（類鼻疽症）；カンピロバクター症；カルバペネム耐性腸内細菌科感染症（ＣＲＥ）；軟性下疳；チクングニヤ感染症；クラミジア感染症；シガテラ中毒；Clostridium difficile感染症；Clostridium perfringens感染症（エプシロン毒素）；コクシジオイデス菌真菌感染症（バレー熱）；クロイツフェルト・ヤコブ病、伝染性海綿状（ＣＪＤ）；クリプトスポリジウム症；サイクロスポーラ症；デング熱；ジフテリア；E. Coli感染症；東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）；エボラ出血熱（エボラ）；エーリキア症；アルボウイルス脳炎又は傍感染性脳炎；非ポリオエンテロウイルス感染症；Ｄ６８エンテロウイルス感染症、（ＥＶ−Ｄ６８）；ジアルジア症；淋菌感染症（淋菌）；鼠径部肉芽腫；タイプＢ Haemophilus Influenza疾患（Ｈｉｂ又はＨ−ｆｌｕ）；ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）；溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）；Ａ型肝炎（Ｈｅｐ  Ａ）；Ｂ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｂ）；Ｃ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｃ）；Ｄ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｄ）；Ｅ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｅ）；ヘルペス；帯状ヘルペス、帯状ＶＺＶ（帯状疱疹）；ヒストプラスマ症；ヒト免疫不全ウイルス／ＡＩＤＳ（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）；ヒトパピローマリウス（ＨＰＶ）；インフルエンザ（Ｆｌｕ）；鉛中毒；レジオネラ症（レジオネラ病）；癩（ハンセン病）；レプトスピラ症；リステリア症；ライム病；Lymphogranuloma venereum感染症（ＬＶＧ）；マラリア；麻疹；ウイルス性髄膜炎；髄膜炎菌性疾患；中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）；ムンプス；ノロウイルス；麻痺性貝中毒；シラミ寄生症（シラミ、頭及び体のシラミ）；骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）；百日咳；腺ペスト、敗血症性ペスト又は肺ペスト；肺炎球菌性疾患；急性灰白髄炎（ポリオ）；オウム病；ケジラミ症（カニ；ケジラミの蔓延）；膿疱性発疹病（天然痘、サル痘、牛痘）；Ｑ熱；狂犬病；リシン中毒；リケッチア症（ロッキーマウンテンスポット熱）；先天性風疹を含む風疹（ドイツ麻疹）；Salmonellosis gastroenteritis感染症；疥癬の蔓延；サバ中毒；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）；Shigellosis gastroenteritis感染症；天然痘；メチシリン耐性ブドウ球菌感染症（ＭＲＳＡ）；ブドウ球菌食中毒；バンコマイシン中間ブドウ球菌感染症（ＶＩＳＡ）；バンコマイシン耐性ブドウ球菌感染症（ＶＲＳＡ）；連鎖球菌病、グループＡ；連鎖球菌病、グループＢ；連鎖球菌毒素ショック症候群（ＳＴＳＳ）；原発性、続発性、早期潜伏、後期潜伏又は先天性梅毒；破傷風感染症（破傷風）；旋毛虫病；結核（ＴＢ）；潜伏結核（ＬＴＢＩ）；野兎病（ウサギ熱）；腸チフス、グループＤ；チフス；膣症；水疱瘡（水痘）；Vibrio cholerae感染症（コレラ）；ビブリオ症（ビブリオ）；ウイルス性出血熱（エボラ、ラッサ、マールブルグ）；西ナイルウイルス感染症。黄熱；エルシニア感染症及びジカウイルス感染症を含む非限定的な群において選択される。
【０１４２】
いくつかの実施態様では、疾患は、ガンである。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、ガンは、膀胱ガン、骨ガン、脳ガン、乳ガン、中枢神経系のガン、頸部のガン、上気道消化管のガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、生殖細胞ガン、神経膠芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、腎臓ガン、喉頭ガン、白血病、肝臓ガン、肺ガン、骨髄腫、腎芽細胞腫（ウィルムス腫瘍）、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、食道ガン、骨肉腫、卵巣ガン、膵臓ガン、胸膜ガン、前立腺ガン、網膜芽細胞腫、皮膚ガン（メラノーマを含む）、小腸ガン、軟組織肉腫、胃ガン、精巣ガン及び甲状腺ガンを含む非限定的な群において選択される。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、当業者であれば、幹細胞及び前駆細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）並びに異なる種由来の成体細胞を含むex vivo操作及び／又は治療は、本発明の範囲内に包含され得ることを理解し得る。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、熟練技術者が再生医療を実施する際、これが特別な関心対象であると考える。
【０１４５】
特定の実施態様では、本発明によって包含される核酸及び核酸ベクターは、基本的な倫理原則を踏まえて、動物又は植物モデル、例えば前臨床研究のための動物モデルを操作するために用いられ得る。
【０１４６】
・方法
本明細書に開示される方法は、in vitro、in vivo又はex vivoで達成され得る。
【０１４７】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための方法であって、本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む方法に関する。
【０１４８】
一態様では、本発明は、疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む方法に関する。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、上記方法は、少なくとも１つの必須アミノ酸、特にヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む群において選択されるアミノ酸が欠乏した食餌を個体に提供する工程をさらに含む。
【０１５０】
特定の実施態様では、上記方法は、有利には、調節ポリヌクレオチドに含まれるＡＡＲＥ核酸を活性化することが公知の化合物、特にハロフジノン、ツニカマイシンなどを含む群において選択される化合物を投与する工程を含む。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、疾患は、遺伝性障害、感染性疾患及びガンを含む群において選択される。
【０１５２】
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、任意の経路によって、すなわち経口投与、局所投与又は非経口投与によって、例えば皮下投与、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、眼内投与及び耳介内投与を含む注射によって、それを必要とする個体に投与され得る。
【０１５３】
他の投与様式は、肺製剤、座薬及び経皮適用を用いる。
【０１５４】
いくつかの実施態様では、本発明の経口製剤は、通常の賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。
【０１５５】
いくつかの実施態様では、有効量の前記化合物は、それを必要とする前記個体に投与される。
【０１５６】
本発明の範囲内では、「有効量」は、単独で所望の転帰を刺激する（すなわち、包含される疾患、特に遺伝性障害の症候を緩和又は根絶する）前記化合物の量を指す。
【０１５７】
所望の転帰を観察するために、本明細書で定義される医薬組成物に含まれるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸又は核酸ベクター又は送達粒子の有効量を決定することは、当業者の通常の知識の範囲内である。
【０１５８】
本発明の範囲内では、投与すべき化合物の有効量は、医師又は当業者によって決定され得、処置の時間経過内において適切に適合され得る。
【０１５９】
特定の実施態様では、投与すべき有効量は、投与のために選択される材料、投与が単回投与又は複数回投与であるか、並びに年齢、身体状態、サイズ、体重、性別及び処置すべき障害の重症度を含む個体のパラメータを含む様々なパラメータに依存し得る。
【０１６０】
本発明の別の態様はまた、少なくとも１つのターゲット細胞中のゲノムを編集するための方法であって、
−該ターゲット細胞に、
ｏ本明細書に開示されるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸のコントロール発現のための核酸；
ｏ編集すべきゲノムターゲット核酸に特異的なガイドＤＮＡ又はＲＮＡ；
ｏ該ターゲットゲノム核酸を置き換えることを目的とする核酸を含むドナー核酸
を提供する工程；
−Ｃａｓヌクレアーゼの発現を誘導する工程
を含む方法に関する。
【０１６１】
Ｃａｓヌクレアーゼの誘導により、Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＤＮＡ又はＲＮＡの支援を得てゲノムターゲット核酸中で、及びドナー核酸上で一本鎖又は二本鎖切断を促進するであろう。続いて、ゲノムターゲット核酸に代えて、ドナー核酸由来の核酸がゲノムに組み込まれ得る。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、Ｃａｓヌクレアーゼの発現の誘導は、少なくとも１つの必須アミノ酸が欠乏した培地、又はハロフジノン及び／若しくはツニカマイシンを含む培地をターゲット細胞に提供することによって実施され得る。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、ターゲット核酸は、遺伝子突然変異を有する。
【０１６４】
・キット
さらなる態様では、本発明は、疾患を治療及び／又は予防するためのキットであって、
−本明細書で定義される医薬組成物、及び
−薬学的に活性な化合物
を含むキットに関する。
【０１６５】
いくつかの実施態様では、疾患は、遺伝性障害、感染性疾患及びガンを含む群において選択される。
【０１６６】
本発明の範囲内では、「薬学的に活性な化合物」という表現は、所定の疾患の予防及び／又は治療に対する利益を有する化合物を意味することを意図する。
【０１６７】
当業者であれば、「利益」という用語は、所定の疾患に関連する少なくとも１つの症候を軽減又は緩和するためのプラス効果を有することを理解する。また、当業者であれば、「利益」によって、所定の疾患の進行が減速又は停止し得ることを理解する。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、薬学的に活性な化合物は、感染性疾患、特に細菌感染症、真菌感染症又はウイルス感染症と闘うために一般的に用いられる化合物から当業者によって適切に選択され得る抗菌化合物である。
【０１６９】
特定の実施態様では、抗菌化合物は、ペニシリン、特にペニシリン及びアモキシシリン；カルバペネム、特にイミペネム；セファロスポリン、特にセファレキシン；アミノグリコシド、特にゲンタマイシン及びトブラマイシン；テトラサイクリン、特にテトラサイクリン及びドキシサイクリン；マクロライド、特にエリスロマイシン及びクラリスロマイシン；キノロン、特にシプロフロキサシン及びレボフロキサシン；並びにスルホンアミド、特にスルファメチゾール及びスルファメトキサゾールを含む群において選択される抗生物質である。
【０１７０】
特定の実施態様では、抗菌化合物は、ノイラミニダーゼ阻害剤；グアニンのヌクレオシド類似体；チミジンのヌクレオシド類似体；ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤；及びプロテアーゼ阻害剤を含む非限定的な群において選択される抗ウイルス剤である。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、薬学的に活性な化合物は、化学療法において一般的に用いられる化合物から当業者によって適切に選択され得る抗ガン化合物である。
【０１７２】
特定の実施態様では、抗ガン化合物は、アルキル化剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、トポイソメラーゼ１の阻害剤、トポイソメラーゼ２の阻害剤、タキサン、モノクローナル抗体、サイトカイン、プロテインキナーゼの阻害剤などを含む群において選択され得る。
【実施例】
【０１７３】
実施例１：必須アミノ酸飢餓によるＣＡＳ９発現の誘導
図１は、ＧＣＮ２−ｅＩＦ２α−ＡＴＦ４シグナル伝達経路を示す。ＥＡＡ飢餓に応じて、活性化ＧＣＮ２はｅＩＦ２αをリン酸化し、転写因子ＡＴＦ４のアップレギュレーション及びＡＡＲＥ配列へのそのリクルートをもたらして、ターゲット遺伝子発現を誘導する。
【０１７４】
図２は、Ｔｋ最小プロモーターのレギュレーション下にあるＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸と、６コピーのＴｒｂ３由来ＡＡＲＥ核酸（黒点）とを構築するための全体的戦略を示す。
【０１７５】
ＣＡＳ９活性に対処するために、単一コピーのＧＦＰ導入遺伝子を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の細胞モデルを使用する（２９３ＴＧＦＰ細胞株）。
【０１７６】
２つの異なるレンチウイルスベクターで、この細胞株をコトランスダクションする。
【０１７７】
第１のものは、２×ＡＡＲＥ−ＴＫレギュレーションプロモーター（配列番号：６及び配列番号：７）のコントロール下に置かれたＦＬＡＧタグ付バージョンのＣＡＳ９（Shen et al Cell Res. 2013 Apr 2. doi: 10.1038/cr.2013.46；配列番号：８）を発現する。
【０１７８】
第２のベクターは、Ｕ６プロモーター（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）(Ma, H et al. Mol Ther Nucleic Acids 2014 doi: 10.1038/mtna.2014.12)のコントロール下に置かれたＧＦＰレポーター遺伝子（ｇＲＮＡＧＦＰ）を特異的にターゲティングするガイドＲＮＡを発現する。
【０１７９】
ｐＴＲＩＰレンチウイルス骨格で、両レンチウイルスベクターを構築した(Zennou et al., 2000; Cell 101, 173-185)。
【０１８０】
ｐＴｒｉｐ−２×ＡＡＲＥ−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９プラスミドの核酸（配列番号：９）は、図３に表されている。
【０１８１】
コントロールとして、ＥＦ１ａユビキタスプロモーターのコントロール下でＦＬＡＧ−ＣＡＳ９を発現する第３のレンチウイルスベクターを作製する。
【０１８２】
培養液中で、トランスダクション細胞を増幅する。誘導の非存在下で、２×ＡＡＲＥ−ＣＡＳ９細胞及びＥＦ１ａ−ＣＡＳ９細胞を溶解し、定量的ＲＴ  ＰＣＲによってＣＡＳ９の発現をモニタリングし、続いて、ＦＬＡＧタグのウエスタンブロット検出によってＣＡＳ９タンパク質発現の量をモニタリングする。このような条件下で、遍在的に発現されるＣＡＳ９のみを検出及び定量する。
【０１８３】
次に、Ｌｅｕ又はＴｈｒのいずれかが枯渇した特定培地中で、トランスダクション細胞を培養下に置く。ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの両方で、２×ＡＡＲＥ−ＣＡＳ９細胞におけるＣＡＳ９発現の誘導を経時的にモニタリングする。それにより、最適な処置期間を決定する。
【０１８４】
最後に、２９３ＴＧＦＰ細胞がＣＡＳ９とｇＲＮＡＧＦＰの両方を発現している場合、これらの細胞におけるＧＦＰの発現は減少し、それゆえ、フローサイトメトリーによって測定されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、ＧＦＰ発現をノックアウトするＣＡＳ９効率に対処するための正確な手段である。
【０１８５】
したがって、アミノ酸飢餓なしの場合、ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９トランスダクション２９３ＴＧＦＰ細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の割合は、培養液中で一定である。枯渇ＡＡ培地を用いた培養における最適な誘導後、ＧＦＰ細胞の割合は劇的に減少する。全体的な有効性を、ＥＦ１ａ−ＣＡＳ９でトランスダクションした細胞におけるＣＡＳ９の連続発現と比較する。
【０１８６】
実施例２：必須アミノ酸飢餓によるＣＡＳ９発現の誘導
プロモーター２×ＡＡＲＥは、必須アミノ酸（ＥＡＡ）飢餓又は他の細胞ストレス、例えばツニカマイシン（Ｔｕ）によって小胞体に誘導されるストレスの条件で迅速に誘導される転写因子ＡＴＦ４のための６つの結合配列を含有する。
【０１８７】
プロモーター２×ＡＡＲＥによって細菌ヌクレアーゼＣａｓ９の発現をレギュレーションすることができるかを評価するために、ＦＬＡＧタグ、自己触媒Ｐ２Ａペプチド及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）に融合したStreptococcus pyogenesのＣａｓ９遺伝子（ｓｐＣａｓ９）を、ＡＴＦ４のための４つの結合部位を含有する２×ＡＡＲＥエンハンサーと、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；図４）由来のチミジンキナーゼ遺伝子の最小プロモーター（ＴＫｍ）とのコントロール下にクローニングした。
【０１８８】
このＨＩＶ由来のレンチウイルスベクターは、ベクターの組み込み事象の選択のための耐性遺伝子ブラストサイジンの安定発現を可能にする。第２のカセットは、Ｕ６プロモーター及びガイドＲＮＡ  ＡＡＶＳ１（配列番号：１０）及びＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ足場を含有し、ヒト遺伝子ＰＰＰ１Ｒ１２ＣのＡＴＧの後方における切断を可能にする。第３の発現カセットは、プロモーター２×ＡＡＲＥ−ＴＫｍのコントロール下にある遺伝子ｓｐＣａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰを含有する。
【０１８９】
このプラスミドを使用して、ベクタープラスミド＋ＶＳＶエンベロープをコードするプラスミド（ｐＶＳＶ）＋ＨＩＶ  Ｒｅｖ遺伝子をコードするプラスミド（ｐＲｅｖ）＋ＨＩＶのＧａｇ及びＰｏｌ遺伝子をコードするプラスミド（ｐ８．９）のコトランスフェクションの標準的なプロトコールにしたがって、２９３Ｔ細胞においてレンチウイルス粒子を生産した。４８時間後、細胞の上清を回収し、濃縮のために超遠心分離し、使用まで−８０℃で保存した。リアルタイム定量的ＰＣＲを用いてベクターストックを力価測定して、ゲノム/mlのウイルスＲＮＡコピーを測定した(Saeed et al.; Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Dec 2;3:e213)。
【０１９０】
ＥＡＡ飢餓（ロイシンを含まない培地、Ｌｅｕ−）又はツニカマイシン(Sigma-Aldrich（登録商標）)によって、ｓｐＣａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰの発現をモデュレーションすることができるかを評価するために、細胞当たり１００のｖＲＮＡｃで２９３Ｔ細胞をトランスダクションし、次いで、２μg/mlブラストサイジン(Sigma-Aldrich（登録商標）)で選択した。非トランスダクション２９３Ｔ細胞は全て死亡した一方で、トランスダクション細胞は正常に成長したが、これは、それらが全て、少なくとも１コピーのベクターｐＴＲＩＰ  ｂｌａｓｔ＿Ｕ６  ＡＡＶＳ１＿２×ＡＡＲＥ−Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰを含有していたことを示している。
【０１９１】
２９３−Ｃ９と称されるこの集団をエクスパンションし、さらなる実験に使用した。細胞を２４ウェルプレートにプレーティングし（細胞 １０５個／ウェル）、１０％血清を含むロイシン枯渇培養培地（ＤＭＥＭ  Ｌｅｕ−）、０，５μg/mlツニカマイシンを含む培養培地（ＤＭＥＭ完全＋Ｔｕ）又はコントロール培地（ＤＭＥＭ完全）を用いて、遺伝子Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰの発現を誘導した。
【０１９２】
誘導の数時間後（４時間、８時間、２４時間）に、並びに誘導培地を除去してそれを完全培地と交換した２４時間後（すなわち、誘導の４８時間後）及び４８時間後（すなわち、誘導の７２時間後）に、細胞を収集した。様々な時点において収集した細胞をペレット化し、タンパク質精製のために溶解した（抗プロテアーゼを含むトリス−ＨＣｌ  ０，０５Ｍ；ＳＤＳ  ０，５％；１mM ＤＴＴ；ｐＨ８．０）。
【０１９３】
ブラッドフォード試験を使用してタンパク質濃度を測定し、ローディングバッファー及びβ−メルカプトエタノールと混合して９５℃で５分間加熱した溶解物 ３０μgを変性ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動を用いて、タンパク質を分離した。色付のラダーを用いて、移動をモニタリングした。
【０１９４】
半乾燥転写によって、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  ＭＡＢ(Sigma-Aldrich（登録商標）)を使用したイムノブロットにこの膜を使用し、次いで、ＨＲＰにカップリングした二次抗マウス抗体を用いて検出した。化学発光ＨＲＰ基質(Luminata crescendo -Millipore（登録商標）)を用いて、ペルオキシダーゼ活性を明らかにし、化学発光検出器Fusion FX7 (Vilber（登録商標）)を用いて描写した。
【０１９５】
Fusion FX7検出器(Vilber（登録商標）)のソフトウェアを用いて、検出された１９３kDaのＳＰＣａｓ９−Ｆｌａｇ−ＲＦＰのバンドの密度を定量した。抗βアクチン一次抗体を使用する以外は同じ方法で、各サンプル中のβ−アクチンのレベルも測定した。β−アクチンの密度を用いて、Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰに対応するバンドの密度を正規化した。データを均一化するために、異なるゲルでこれらの実験を実施したので、（両方の場合において誘導の２４時間後の）最高密度のバンドを１００％の発現とみなし、低密度の他のバンドの値を、各ゲルにおける最も強い参照の割合として比較した。
【０１９６】
図５に見られるように、非誘導基本発現レベルの２×ＡＡＲＥ−Ｔｋｍでは、Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰ融合物は依然として検出不能である。しかしながら、Ｌｅｕ−培地を細胞に追加すると（実線）、又はＴｕを含有する完全培地を追加すると（破線）、融合物の発現が迅速に誘導される。（２４時間の時点において）誘導培地を除去して完全培地と交換すると、タンパク質Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰの発現は徐々に減少した（４８時間及び７２時間の時点を参照のこと）。これは、プロモーター２×ＡＡＲＥ−Ｔｋｍが、ＥＡＡ飢餓によって又はＥＲストレスの誘導を介して、Ｃａｓ９発現のコントロールを可能にすることを示している。タンパク質Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰの誘導が、ゲノム中のＡＡＶＳ１ゲノム位置において切断（すなわち、二本鎖切断の実施）を可能にするかを評価するために、ＤＭＥＭ完全又はＤＭＥＭ  Ｌｅｕ−のいずれかを用いて、２９３−Ｃ９細胞を２４時間培養した。２４時間後に細胞を回収し、ペレット化し、DNA easy Kit (Quiagen（登録商標）)を使用してゲノムＤＮＡを精製した。ＡＡＶＳ１切断部位の５’（配列番号：１１）及び３’（配列番号：１２）にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、ＰＣＲを実施した。５４０ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、配列決定し、ターゲットであることを確認した。
【０１９７】
Ｃａｓ９が切断されたかをさらに評価するために、本発明者らは、Ｔ７ヌクレアーゼ試験(New England Biolabs（登録商標）)を実施した。非誘導及び誘導２９３−Ｃ９の精製ゲノムＤＮＡからＡＡＶＳ１バンドを増幅するＰＣＲを変性させ、供給業者のガイドラインにしたがって徐々に再ハイブリダイゼーションした(https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i)。
【０１９８】
細胞機構によってＣａｓ９誘導性二本鎖切断が修復され、切断部位において挿入及び欠失（インデル（indels））が生じるので、異なるインデルの混合物を含有する細胞集団から得られたＰＣＲバンドの再ハイブリダイゼーションは、ミスマッチを含有するＤＮＡフラグメントを生じさせる。これらは、Ｔ７ヌクレアーゼによって切断され、より小さなバンドのＤＮＡが放出される。
【０１９９】
２９３−Ｃ９細胞において、ＤＭＥＭ  Ｌｅｕ−を用いてＣａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰ発現を２４時間誘導することにより、全ＤＮＡの約２０％に相当するＰＣＲバンドの中央に位置する切断部位ＡＡＶＳ１に対応する２５０ｂｐのより小さなバンドが生じることを観察することができた。非誘導２９３−Ｃ９細胞では、このようなバンドは見られないが、これは、遺伝子Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰの誘導まで、ＡＡＶＳ１部位が依然として未切断であることを示している。
【０２００】
したがって、本明細書に開示されるオン／オフモードによるＣａｓ９のコントロール発現のための系は、ゲノムを安全に編集するためのツールを提供する。実際、誘導の非存在下では、発現系のいかなる検出可能な漏出もないので、任意の望ましくないゲノム編集を防止するための安全機能が提供される。
【０２０１】
逆に、誘導の存在下では、誘導の除去が有効になり次第、迅速に発現が停止し得る。
【０２０２】
次いで、２つの機能試験を実施して、ドナーＤＮＡ（Ｄｏ）をＡＡＶＳ１部位に組み込んだ。
【０２０３】
第１の試験では、プラスミド「ｐＴＲＩＰ  ｂｌａｓｔ＿Ｕ６  ＡＡＶＳ１＿２×ＡＡＲＥ−Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰ」と、カセット「ＡＡＶＳ１切断部位−ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシン＿ＡＡＶＳ１切断部位」（これは、ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシン遺伝子の５’及び３’においてＣａｓ９＋ｇＲＮＡ  ＡＡＶＳ１による切断を受け入れる）を含有するドナープラスミドとで、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした（リン酸Ｃａ２＋法）。
【０２０４】
２９３Ｔ細胞のゲノム中のガイドＲＮＡによってターゲティングされる選択ＡＡＶＳ１部位は、遺伝子ＰＰＰ１Ｒ１２ＣのＡＴＧ開始コドンを含む。ターゲティングされると、それは、放出されたＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシンカセットがＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのエクソン１に代えて挿入され、続いて、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃプロモーターによって発現されることを可能にするであろう。この場合、リコンビナント細胞はＧＦＰを発現して、ピューロマイシン耐性となるので、それらを選択して、組み込み事象に対応するクローンをカウントすることが可能になる。
【０２０５】
図６に示されているように、完全培地（ｎｉ）ではなく（ｉ）ロイシン枯渇培地（ｉ  Ｌｅｕ−）又はツニカマイシン含有培地（ｉ  Ｔｕ）のいずれかを用いて、２×ＡＡＲＥ誘導と一緒に、プラスミド「ｐＴＲＩＰ  ｂｌａｓｔ＿Ｕ６  ＡＡＶＳ１＿２×ＡＡＲＥ−Ｃａｓ９−ｆｌａｇ−ＲＦＰ」（Ｃ９）及びドナー「ｐＡＡＶＳ１切断部位−ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシン＿ＡＡＶＳ１切断部位」（Ｄｏ）の両方を提供した場合にのみ、ドナー構築物は、ピューロマイシン耐性クローンを生じさせる。これは、ターゲット組み込みのためのＣａｓ９活性がプロモーター２×ＡＡＲＥの誘導を必要とすることを示している。
【０２０６】
２つのＡＡＶＳ１切断部位に隣接する−ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシンを含有するドナープラスミド（Ｄｏ）でトランスフェクションした２９３−Ｃ９細胞において、この実験を反復した。このようなプラスミドでは、ｐＡＡＶＳ１ガイドＣａｓ９活性は、ＧＦＰ−ｐ２ａ−ピューロマイシン配列を放出させるであろう。
【０２０７】
図５に見られるように、ドナープラスミド（Ｄｏ）で２９３−Ｃ９細胞をトランスフェクションした場合、誘導の非存在下（ｎｉ）では、ピューロマイシン耐性コロニーは生じない。対照的に、ドナープラスミド（Ｄｏ）で２９３−Ｃ９細胞をトランスフェクションし、ツニカマイシン又はロイシン枯渇培地の存在下で誘導した場合、両条件下で、これらの細胞はピューロマイシン耐性コロニーを生じさせた。
【０２０８】
これは、Ｃａｓ９発現の誘導により、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＡＡＶＳ１切断部位にガイドされると、（１）ドナープラスミド（ドナーカセットが放出される）及び（２）ゲノムＤＮＡ中のＡＡＶＳ１部位（ドナーカセットが組み込まれる）の両方において二本鎖切断を効率的に生成することをさらに裏付けている。
【０２０９】
上記実施例は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（この発現はＡＡＲＥに基づく）のコントロール発現のための系が誘導条件によって微調整され得ることを示す説得力のある実験データを提供する。
【０２１０】
実際、誘導の非存在下では、検出可能な発現は観察されないが、これは、漏出が観察されないことを意味する。
【０２１１】
加えて、ゲノム編集は、誘導時にのみ観察することができ、誘導条件の除去により迅速に停止させることができる。
【０２１２】
したがって、この系は、非常に正確にオン及びオフすることができるので、この系は、それを必要とする個体におけるゲノム編集及びそれ故に遺伝子治療を提供するための安全なツールを提供する。
【０２１３】
本発明に開示される核酸配列
以下の表１には、本明細書で使用される核酸配列が開示されている：
【表４】
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ＴＲＩＢ３遺伝子由来のＡＡＲＥ配列：配列番号：１
【表５】
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ＣＨＯＰ遺伝子由来のＡＡＲＥ配列：配列番号：２
【表６】
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ＡＳＮＳ遺伝子由来のＡＡＲＥ配列：配列番号：３
【表７】
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ＡＴＦ３遺伝子由来のＡＡＲＥ配列：配列番号：４
【表８】
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ＳＮＡＴ２遺伝子由来のＡＡＲＥ配列：配列番号：５
【表９】
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チミジンキナーゼ最小プロモーター核酸：配列番号：６
【表１０】
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２×ＡＡＲＥ核酸：配列番号：７
【表１１】
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ＮＬＳ−ＦＬＡＧ  ＣＡＳ９核酸：配列番号：８
【表１２】
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ｐＴｒｉｐ−２×ＡＡＲＥ−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＣＡＳ９プラスミドの核酸：配列番号：９
【表１３】
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ガイドＲＮＡ  ＡＡＳＶ１：配列番号：１０
【表１４】
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５’プライマー：配列番号：１１
【表１５】
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３’プライマー：配列番号：１２
【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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