(57)【要約】  本開示の側面は、ハンチントン病を処置するのに有用な組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、ハンチントン遺伝子（ＨＴＴ）を標的にする干渉核酸（例として、人工ｍｉＲＮＡ）および同核酸を使用してハンチントン病を処置する方法を提供する。
2019533439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む、第１領域；および、
（ｉｉ）１種以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む、第２領域
を含む単離された核酸であって、
各ｍｉＲＮＡが、配列番号１に相補的なシード配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項２】
（ｉ）第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む、第１領域；および、
（ｉｉ）１種以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む、第２領域
を含む単離された核酸であって、
各ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡバックボーン配列に隣接して配列番号２〜１０のいずれか１つに規定される配列を含む配列によってコードされる、前記単離された核酸。
【請求項３】
（ｉ）第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む、第１領域；および、
（ｉｉ）１種以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む、第２領域
を含む単離された核酸であって、
各ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡバックボーン配列に隣接して配列番号１に規定される配列のうち少なくとも２個の（例として、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の）連続した塩基に相補的な配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項４】
各ｍｉＲＮＡバックボーン配列が、ｍｉｒ−１５５バックボーン配列、ｍｉｒ−３０バックボーン配列、またはｍｉｒ−６４バックボーン配列である、請求項２または３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
導入遺伝子が、プロモーターを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項６】
プロモーターが、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＵ６プロモーターである、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
導入遺伝子が、タンパク質をさらにコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項８】
１以上のｍｉＲＮＡが、導入遺伝子の非翻訳部分に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項９】
非翻訳部分が、イントロンである、請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
非翻訳部分が、タンパク質をコードする核酸配列の最後のコドンとポリＡテール配列との間にあるか、またはプロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基とポリＡテール配列との間にある、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
第２アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む第３領域をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
ＩＴＲバリアントが、機能的な末端解離部位（ＴＲＳ）を欠き、任意にＩＴＲバリアントが、ΔＴＲＳ ＩＴＲである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
ｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種が、ヒトハンチントン（例として、配列番号１）とハイブリダイズしてその発現を阻害する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１５】
ベクターが、プラスミドである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された核酸あるいは請求項１４または１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
（ｉ）カプシドタンパク質；および、
（ｉｉ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された核酸
を含む、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
【請求項１８】
カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項１７に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１９】
カプシドタンパク質が、配列番号２０に規定される配列を含む、請求項１７または１８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２０】
ｒＡＡＶが、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２１】
ｒＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化されている、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２２】
ハンチントン病の処置を、これを必要とする対象において行うための方法であって、方法が、治療的有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを、ハンチントン病を有する対象またはこれを発症するリスクのある対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
対象が、３６超のＣＡＧ反復、４０超の反復、または１００超の反復を有するハンチントン遺伝子を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
対象が、２０年齢未満である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
投与が、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）への単離された核酸またはｒＡＡＶの送達をもたらす、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
投与が、注射、任意に静脈内注射または線条体内注射を介する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号２〜１０または２１〜２２のいずれか１つに規定される配列をコードする、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2016年9月22日に出願され、表題が「ハンチントン病のＡＡＶ処置」である米国仮出願第62/398,487号（この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）の出願日の利益を35 U.S.C. 119(e)の下、主張するものである。
【０００２】
連邦政府により支援された研究
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたNS038194下の政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチントン遺伝子のエキソン１中ＣＡＧ反復領域の拡大によって引き起こされる深刻な遺伝性神経変性疾患である。ハンチントンタンパク質（ＨＴＴ）が全身で発現されている間、ポリグルタミンが伸長したタンパク質は、線条体の中型有棘ニューロン(medium spiny neurons)およびそれらの皮質結合(cortical connections)に対し、とくに毒性を示す。患者は、落ち込み(depression)および不安(anxiety)を包含する情動性症状(emotional symptoms)に、ならびに特徴的な運動障害(movement disturbances)および舞踏病に、苦しむ。これまでのところ、ハンチントン病に対する治療法はない；治療の選択肢は、病徴を和らげることに限定されている。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示の側面は、ハンチントン病（ＨＤ）を処置するのに有用な組成物および方法に関する。いくつかの態様において、ヒトハンチントン（ＨＴＴ）に対し特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する阻害性核酸（例として、人工ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡ）が提供される。
【０００５】
その結果、いくつかの側面において、本開示は、配列番号２〜１０または２１〜２２のいずれか１つに規定される配列を含むかまたはこれをコードする、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、ヒトハンチントンは、配列番号１に規定されるとおりの配列を含む。いくつかの態様において、本開示は、配列番号１のうち、少なくとも２個の（例として、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の）連続した塩基に相補的な核酸（例として、ｍｉＲＮＡ）を提供する。
【０００６】
いくつかの側面において、本開示は、第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む第１領域；および１種以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２領域を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡをコードする配列は、ｍｉＲＮＡバックボーン(backbone)配列をコードする配列に隣接して配列番号２〜１０のいずれか１つに規定される配列を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡバックボーン配列は、ｍｉｒ−１５５バックボーン配列、ｍｉｒ−３０バックボーン配列、またはｍｉｒ−６４バックボーン配列である。
いくつかの態様において、導入遺伝子はさらに、プロモーターをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＵ６プロモーターである。
【０００８】
いくつかの態様において、導入遺伝子はさらに、タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、タンパク質は、治療用タンパク（例として、非変異ハンチントン）またはレポータータンパク質（例として、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）である。
【０００９】
いくつかの態様において、１以上のｍｉＲＮＡは、導入遺伝子の非翻訳部分に位置する。いくつかの態様において、非翻訳部分は、イントロンである。いくつかの態様において、非翻訳部分は、タンパク質をコードする核酸配列の最後のコドンとポリＡテール配列との間にある。いくつかの態様において、非翻訳部分は、プロモーター配列の最後の核酸塩基とポリＡテール配列の最初の塩基との間にある。
【００１０】
いくつかの態様において、単離された核酸はさらに、第２アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む第３領域を含む。
いくつかの態様において、第１または第２ＩＴＲバリアントは、機能的な末端解離部位（ＴＲＳ）を欠き、任意にＩＴＲバリアントは、ΔＴＲＳ ＩＴＲである。
【００１１】
いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種は、ヒトハンチントンとハイブリダイズしてその発現を阻害する。
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載されるとおりの単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドである。
【００１２】
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載されるとおりの、単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質；および本開示によって記載されるとおりの単離された核酸、を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。
【００１３】
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号２０に規定される配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化されている。
【００１４】
本開示の側面は、病原性のハンチントンの発現を低減させる（例として、阻害する）ことができる単離された核酸に関し、よってハンチントン病の処置に有用であり得る。その結果、いくつかの側面において、本開示は、ハンチントン病の処置を、これを必要とする対象において行う方法を提供するが、方法は、本開示によって記載されるとおりの単離された核酸またはｒＡＡＶの治療的に有効な量を、ハンチントン病を有する対象またはこれを発症するリスクのある対象へ投与することを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、対象は、３６超のＣＡＧ反復、４０超の反復、または１００超の反復を有するハンチントン遺伝子を含む。いくつかの態様において、対象は、２０年齢(years of age)未満であるか、または若年性ＨＤを有すると診断される。
【００１６】
いくつかの態様において、投与は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）への単離された核酸またはｒＡＡＶの送達をもたらす。いくつかの態様において、投与は、注射、任意に静脈内注射または線条体内注射を介する。
【００１７】
いくつかの側面において、本開示は、１以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を提供するが、ここで各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列は、ｍｉＲＮＡバックボーン配列に隣接して配列番号７または８に規定される配列を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡバックボーン配列は、ｍｉｒ−１５５バックボーン配列、ｍｉｒ−３０バックボーン配列、またはｍｉｒ−６４バックボーン配列である。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＵ６プロモーターである。
【００１９】
いくつかの態様において、導入遺伝子は、配列番号２１または２２に規定される配列を含む。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはそれらのバリアントに隣接する。いくつかの態様において、ＩＴＲバリアントは、機能的な末端解離部位（ＴＲＳ）を欠く。いくつかの態様において、ＴＲＳを欠くＩＴＲバリアントは、ΔＴＲＳ ＩＴＲである。
【００２０】
いくつかの側面において、本開示は、１以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を含むベクターを提供するが、ここで各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列は、ｍｉＲＮＡバックボーン配列に隣接して配列番号７または８に規定される配列を含む。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドである。
【００２１】
いくつかの態様において、導入遺伝子の各ｍｉＲＮＡバックボーン配列は、ｍｉｒ−１５５バックボーン配列、ｍｉｒ−３０バックボーン配列、またはｍｉｒ−６４バックボーン配列である。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＵ６プロモーターである。
【００２２】
いくつかの態様において、導入遺伝子は、配列番号２１または２２に規定される配列を含む。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはそれらのバリアントに隣接する。いくつかの態様において、ＩＴＲバリアントは、機能的な末端解離部位（ＴＲＳ）を欠く。いくつかの態様において、ＴＲＳを欠くＩＴＲバリアントは、ΔＴＲＳ ＩＴＲである。
【００２３】
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質；および１以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸、を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供するが、ここで各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列は、ｍｉＲＮＡバックボーン配列に隣接して配列番号７または８に規定される配列を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、導入遺伝子は、完全長ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する。いくつかの態様において、導入遺伝子は、完全長ＡＡＶ ＩＴＲおよびΔＴＲＳ ＩＴＲに隣接する。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号２０に規定される配列を含む。
【００２５】
いくつかの側面において、本開示は、ハンチントン病の処置を、これを必要とする対象において行う方法を提供し、方法は、本明細書に記載のとおりのｒＡＡＶ（例として、１以上のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶ）の治療的に有効な量を、ハンチントン病を有する対象またはハンチントン病を発症するリスクのある対象へ投与することを含むが、ここで各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列は、ｍｉＲＮＡバックボーン配列に隣接して配列番号７または８に規定される配列を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、単離された核酸の導入遺伝子は、完全長ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する。いくつかの態様において、導入遺伝子は、完全長ＡＡＶ ＩＴＲおよびΔＴＲＳ ＩＴＲに隣接する。
【００２７】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、対象は、３６超のＣＡＧ反復、４０超の反復、または１００超の反復を有するハンチントン遺伝子を含む。いくつかの態様において、対象は、２０年齢未満である。
【００２８】
いくつかの態様において、投与は、注射を介する。いくつかの態様において、注射は、静脈内注射または線条体内注射である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図面の簡単な記載
【図１】図１は、mir-HTT-6433（ヒトハンチントンを標的にする）を発現するプラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を示す。トランスフェクションから４８時間後に細胞が回収され、ＲＮＡが定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）のために抽出された。結果は、mir-HTT-6433が内在性ヒトハンチントンを最大５０％まで低減させることを指し示す。
【００３０】
【図２】図２は、ＡＡＶ９ベクター中へパッケージングされて、変異ヒトハンチントンを発現するトランスジェニックマウス（Yac128マウス）の線条体中へ直接注射されたmir-HTT-6433を示す。注射から１カ月後、ヒトハンチントンｍＲＮＡのレベルがｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された。ワンセットの動物（ｎ＝５）において、ヒトハンチントンの注射側のレベルが、非注射側のレベルと比較された。ハンチントンｍＲＮＡの有意な（ｐ＝0.0017）低減が、注射側で観察された。第２セットの動物（ｎ＝５／群）において、mir-HTT-6433が注射された動物におけるハンチントンｍＲＮＡのレベルが、ビヒクルの注射しか受けなかった動物と比較された。ハンチントンの有意な（ｐ＝0.0004）低減が、これらの動物においても観察された。第３セットの動物（ｎ＝５／群）において、mir-HTT-6433が注射された動物におけるハンチントンｍＲＮＡのレベルが、ＡＡＶ９−ＧＦＰが注射された動物と比較された。これらの動物においても、ハンチントンｍＲＮＡは、有意に（ｐ＝0.0064）低減した。要するに、データは、mir-HTT-6433が、脳中in vivoでハンチントンｍＲＮＡを５０％まで低減することを指し示す。
【００３１】
【図３】図３は、AAV9-mir-HTT-6433またはＰＢＳを片側に(unilaterally)、変異ハンチントン（ヒト）を発現するトランスジェニックマウスに注射したことを示す。注射から６カ月後、マウスが平均台(a balance beam)上で試験された。データは、mir-HTT-6433で処置されたマウスが、ＰＢＳで処置されたＨＤマウスと比較したとき、平均台(the beam)を渡るのに掛かる時間が減少することを示すことを指し示す。
【００３２】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ヒトハンチントンを標的にする人工ｍｉＲＮＡが、細胞培養物中およびin vivoでハンチントンｍＲＮＡを低減することを示す。図４Ａは、ヒトハンチントンｍＲＮＡ上の標的部位の位置を示す。図４Ｂは、ヒトハンチントンを標的にする人工ｍｉＲＮＡを発現するプラスミドがトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞；ハンチントンｍＲＮＡレベルが、４８時間後ｑＰＣＲによって測定されたことを示す。ハンチントン発現が、細胞数のウェル毎の変動(well to well variation)の影響をなくすため(account for)、ＨＰＲＴに対して標準化された。またハンチントン発現は、未処置／ナイーブ対照と比べて表現されている。エラーバーは標準誤差を表す。図４Ｃは、細胞培養の結果に基づきin vivoで試験するために選択された候補ｍｉＲＮＡを示す。マウスの線条体の片側に注射された。注射から１カ月後に線条体が回収されて、ＧＦＰ陽性組織が別々にされた(dissected out)。データはＨＰＲＴに対して標準化され、ＧＦＰのみの対照と比べて表現されている。
【００３３】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、Ｕ６プロモーターからの人工ｍｉＲＮＡの発現が、マウス線条体におけるハンチントンのサイレンシングを改善しないことを示す。図５Ａは、ＣＢＡ（ｐｏｌＩＩ）およびＵ６プロモーターからｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶ９コンストラクトに関するデータを示す。ＣＢＡ−プロモーター推進の(driven)ｍｉＲＮＡは、ＧＦＰ遺伝子の３’−ＵＴＲに位置するが、Ｕ６プロモーター推進の人工ｍｉＲＮＡを含有するコンストラクトは、離れた(separate)プロモーターからＧＦＰを共発現する。図５Ｂは、部位５１５５（左）および６４３３（右）を標的にするＵ６およびＣＢＡ−プロモーター推進の人工ｍｉＲＮＡの注射後の、注射された線条体中のハンチントンｍＲＮＡの相対量を示す。データは、非注射側と比べて表現されている。図５Ｃは、部位６４３３を標的にするＵ６およびＣＢＡ−プロモーター推進のｍｉＲＮＡが片側に注射されたマウス中のハンチントンｍＲＮＡの相対量を示す。データは、ＧＦＰ発現対照ベクターが注射されたマウスの群と比べて表現されている。
【００３４】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、Ｕ６プロモーターからのmir-HTT-6433の長期線条体発現が、行動異常を引き起こすことを示す。図６Ａは、注射から６カ月後、Ｕ６−プロモーター推進のmir-HTT-6433が注射されたマウスが、巣を作り損ねたことを示す。像は、ケージ中に新しい小さな巣(nestlets)を置いてから２４時間後に撮られた。図6Bは、ＰＢＳ、CBA-mir-HTT-6433またはU6-mir-HTT-6433で処置されたYac128マウスのケージモニタリングを示す。ケージを動き回るのに費やされた時間(The amount of time)が、２４〜２７時間記録された。１時間あたりの平均時間が、総時間(the total amount of time)を記録していた時間数(the number of hours)で割ることによって算出された。
【００３５】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、Ｕ６プロモーターからのmir-HTT-6433の長期発現が、線条体萎縮を引き起こすことを示す。図７Ａは、注射から１カ月後（上）および６カ月後（下）でのYac128マウスにおける注射側に対するＤＡＲＰＰ−３２染色の代表的な画像を示す。図７Ｂは、注射から６カ月後のＤＡＲＰＰ−３２陽性面積の定量化を示す。
【００３６】
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、Ｕ６プロモーターからのmir-HTT-6433の長期発現が、ミクログリアの持続的活性化を引き起こすことを示す。図８Ａは、注射から１カ月後（上）および６カ月後（下）でのYac128マウスにおける注射側に対するＩｂａ１染色の代表的な画像を示す。イメージが注射部位にて撮られた。注射から６カ月後での総身（図８Ｂ）、活性化ミクログリア（図８Ｃ）および静止ミクログリア（図８Ｄ）の定量化が示される。
【００３７】
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ｍｉｒ１５５をベースとした人工ｍｉＲＮＡのＵ６プロモーターからの発現が、ハンチントンを標的にするガイド鎖および他の配列の過剰発現をもたらすことを示す。図９Ａは、ハンチントンを標的にする人工ｍｉＲＮＡヘアピン（ｍｉｒ−１５５バックボーン）に対してマッピングする読み取りの出発位置を示す。位置は成熟鎖と比べて報告されており、読み取りは、各試料においてマッピングされた内在性ｍｉＲＮＡの総数に対して標準化されている。横線は、対照試料から見出された人工ｍｉＲＮＡのバックグラウンドレベルを表す。図９Ｂは、定量ＲＴ−ＰＣＲによる成熟ｍｉＲ−ＨＴＴ（ｍｉｒ−１５５バックボーンから）の相対的な定量化を示す。図９Ｃは、ｍｉｒ−３０バックボーンに組み入れられてＵ６プロモーターから発現される、ハンチントンを標的にする人工ｍｉＲＮＡに対してマッピングする読み取りの出発位置を示す。
【００３８】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、mir-HTT-6433の発現が、標的部位をもつｍＲＮＡを優先的に減少させることを示す。図１０Ａは、ｍＲＮＡが、人工ｍｉＲＮＡ部位（凡例）とマッチするカノニカルな(canonical)ｍｉＲＮＡ結合を含有するものと、それがないものとに分けられたことを示す。AAV-CbA-mir-HTT-6433が注射されたマウスの群において、かかる部位があるｍＲＮＡとそれがないｍＲＮＡとの間に差異はない。図１０Ｂは、対照的に、AAV-U6-mir-HTT-6433群において、適合する(perfect)８mer部位をもつｍＲＮＡを抑止する方にシフトする。
【００３９】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ベクター用量を低減させることは、マウス線条体において低減された拡散およびノックダウンをもたらすことを示す。図１１Ａは、マウスの線条体中のＧＦＰ染色が、ハンチントンを標的にする人工ｍｉＲＮＡとＥＧＦＰとの両方をコードするベクターが注射されたことを示す。ImageJが、ＧＦＰ陽性であった線条体のパーセントを測定するために使用された。図１１Ｂは、Yac128マウスの線条体中のヒトハンチントンｍＲＮＡを測定する定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。図１１Ｃは、ハンチントンを標的にするｍｉＲＮＡとＥＧＦＰとの両方をコードするベクターが３つの異なる用量にて注射されたマウスの代表的な写真を示す。データは、ベクター用量を低減することが、低減された拡散およびノックダウンをもたらすことを指し示す。
【００４０】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、Yac128マウスが、ハンチントンを標的にするＵ６−プロモーター推進の人工ｍｉＲＮＡの注射後に平均台を渡る能力が衰退することを示すことを指し示すデータを示す。図１２Ａは、２〜３カ月目に注射されたマウスが、平均台を渡る時間が明確に増加すること、およびそれらのいくつかが、全く渡れなかったことを示す。図１２Ｂは、ＰＢＳまたはCBA-mir-HTT-6433のいずれかが７月齢(months of age)にて注射されたYac128マウスが、平均台上の行動において加齢による衰退を示すことを示す。U6-mir-HTT-6433での注射（赤色ドット）は、この衰退を加速させる。
【００４１】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、C57BL/6マウスが、ハンチントンを標的にするＵ６−プロモーター推進の人工ｍｉＲＮＡの注射後に、平均台上の行動において最初の悪化を示すことを示す。図１３Ａは、対照（ナイーブ）マウスと、AAV-U6-mir-HTT-6433およびAAV-CbA-mir-HTT-6433が注射されたマウスとについて、平均台を渡るのに掛かる時間(the amount of time)を示す。図１３Ｂは、対照（ナイーブ）マウスと、AAV-U6-mir-HTT-6433およびAAV-CbA-mir-HTT-6433が注射されたマウスとにおけるＤＡＲＰＰ−３２陽性線条体面積の定量化を示す。
【００４２】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、内在性ｍｉＲＮＡの分布が、mir-HTT-6433の注射後に概ね影響がないことを示す。図１４Ａは、AAV-CbA-mir-HTT-6433が注射されたマウスにおける分布を示す；mir-HTT-6433ガイドおよびパッセンジャー鎖のレベルが緑色で示され、AAV-CbA-mir-HTT-6433が注射されたマウスにおいて有意な変化を示すすべての内在性ｍｉＲＮＡ種が赤色である。図１４Ｂは、AAV-U6-mir-HTT-6433が注射されたマウスにおける分布を示す。
【００４３】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、mir-HTT-6433で処置されたマウスにおけるｍＲＮＡプロファイルを示す。図１５Ａは、AAV-CbA-mir-HTT-6433が注射されたマウスが、ｍＲＮＡ発現における変化がほとんどないことを示すことを示す；有意なｐ値を示すすべての遺伝子が緑色であり、多重比較のために調整後でも有意なままである遺伝子が青色である。図１５Ｂは、AAV-U6-mir-HTT-6433が注射されたマウスが、ＣＢＡと比較してｍＲＮＡ発現における変化がより多いことを示すことを示す。図１５Ｃは、mir-HTT-6433で処置されたマウスにおけるｍＲＮＡプロファイルを示す；７種のＲＮＡが、Ｕ６処置群とＣｂＡ処置群との間で有意に差次的に発現される。
【００４４】
【図１６】図１６は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）、scAAV9 U6-mir-HTT（「Ｕ６プロモーター」）、または空のscAAV9対照ベクターのいずれかの線条体内注射から１カ月後、ハンチントン病のヒツジモデルの尾状中央部(the middle caudate)におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射対照ヒツジのｈｔｔ発現レベルについてのデータもまた示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。注記：ｍｉｒ１５５バックボーンが、ＣＢＡおよびＵ６コンストラクトの各々において使用された。
【００４５】
【図１７】図１７は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）、scAAV9 U6-mir-HTT（「Ｕ６プロモーター」）、または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から１カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの被殻中央部(the middle putamen)におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射対照ヒツジの発現レベルについてのデータもまた示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００４６】
【図１８】図１８は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの尾状中央部の内側におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射側および注射側の発現レベルについてのデータが示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００４７】
【図１９】図１９は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの尾状中央部の側面(the lateral side)におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射側および注射側の発現レベルについてのデータが示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００４８】
【図２０】図２０は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）、scAAV9 U6-mir-HTT（「Ｕ６プロモーター」）、または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの尾状中央部におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射対照ヒツジのｈｔｔ発現レベルについてのデータもまた示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００４９】
【図２１】図２１は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの被殻中央部の側面におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射側および注射側の発現レベルについてのデータが示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００５０】
【図２２】図２２は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの被殻中央部の内側におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射側および注射側の発現レベルについてのデータが示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００５１】
【図２３】図２３は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）、scAAV9 U6-mir-HTT（「Ｕ６プロモーター」）、または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの被殻中央部におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射対照ヒツジのｈｔｔ発現についてのデータもまた示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００５２】
【図２４】図２４は、scAAV9 CBA-mir-HTT(「CBAプロモーター」)、scAAV9 U6-mir-HTT(「Ｕ６プロモーター」)、または空のscAAV9対照ベクターいずれかの線条体内注射から６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの前線条体(the anterior striatum)におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対発現に関するデータを示す。非注射対照ヒツジのｈｔｔ発現レベルについてのデータもまた示されている。相対ｈｔｔ発現レベルが、ヒツジカルネキシンに対して標準化された。
【００５３】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、ヒトハンチントンを標的にする人工ｍｉＲＮＡの予測ヘアピン構造を示す。図２５Ａは、mir-155-6433（配列番号２３）の予測ヘアピン構造を示す。図２５Ｂは、mir-30-6433（配列番号２４）の予測ヘアピン構造を示す。
【００５４】
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、ヒツジ脳へのＡＡＶベクターの送達を示す。図２６Ａは、線条体全体が４、６ｍｍブロック内に含有されるように、前頭面において切開されたヒツジ脳の図式的概観を示す（上）。前ブロックは、内包によって分かれない線条体の前部分を含有する（中央）。注射の標的にされる内側ブロックは所定の被殻を有し、尾状は下に示されている。図２６Ｂは、対照（AAV9）および処置（AAV9miRHTT）の処置された動物におけるＡＡＶベクターゲノムを示す。ベクターゲノムは、ゲノムHPRTを参照遺伝子として使用するデジタルドロップレット(digital droplet)ＰＣＲによって測定された。値は、ｌｏｇ目盛り上にプロットされている。
【００５５】
【図２７】図２７は、人工ｍｉＲＮＡガイド鎖が、デジタルドロップレットＰＣＲによって定量化されたことを示す。ｍｉＲＮＡ相対レベルが、let-7e*に対して標準化することによって算出された。またこの値はｌｏｇ目盛り上にプロットされた。ＲＱＮ＜５の試料が除外された。報告されている数字は、この品質閾値(this quality threshold)を乗り越えて(survived)ｍｉＲＮＡ分析に使用された試料の総数である。Ｐ値は、多重検定(multiple testing)のためにテューキーの検定(Tukey’s correction)とともに２要因分散分析(2 -way ANOVA)を使用して算出された。
【００５６】
【図２８】図２８は、scAAV9-anti-HTT-6433が、線条体中ヒト変異ヒトハンチントンｍＲＮＡを低減することを示す。示されたデータは、ヒトカルネキシンに対して標準化されたＨＴＴ ｍＲＮＡのシグナルである。星印は、処置群（AAV9またはAAV9miRHTT）間の平均において、対応のないｔ検定で0.03以下のｐでの有意差を指し示す。Ｕ６−プロモーター推進の人工ｍｉＲＮＡは、注射から１カ月後にてヒト変異ＨＴＴ ｍＲＮＡ尾状および被殻を、被殻においては注射から６カ月にて、有意に低下させる。ＣＢＡ−プロモーター推進の人工ｍｉＲＮＡは、尾状、被殻および前線条体中のＨＴＴ ｍＲＮＡを注射から１カ月にて、尾状および被殻においては注射から６カ月にて、低下させる。尾状の内側領域、外側被殻および前線条体が、その分析において検査された。
【００５７】
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂは、AAV9およびAAV9miRHTTで処置されたヒツジにおける、内在性ヒツジｈｔｔ ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを示す。図２９Ａは、ヒツジｈｔｔ ｍＲＮＡレベルが、方法に記載のとおりに決定されたこと、および前記レベルが、ヒツジカルネキシン（Canx）と比べて表現されていることを示す。スタディ２からの結果が示されている。AAV9およびAAV9miRHTTで処置された群間で内在性ヒツジｈｔｔ ｍＲＮＡレベルにおける差異はない。図２９Ｂは、スタディ２から、注射から６カ月に、抗ｈｔｔ１−１７抗体（Ab1）を用いて被殻から検出された内在性ヒツジハンチントンおよびヒトｍＨＴＴタンパク質のレベルを示す。ウェスタンブロット試料は、AAV9miRHTTが片側に注射された４匹の種々のヒツジの脳の注射側および非注射側について、ｗｔ ｈｔｔ（矢印）およびヒト変異ｈｔｔ（矢頭）のシグナルを示す。グラフは、非注射側に対する注射側パーセントとしてデンシトメトリーから決定されたヒツジｈｔｔおよびヒトｍＨＴＴの平均シグナルを示す。AAV9miRHTTでの処置が、内在性ヒツジハンチントンタンパク質のレベルには影響を及ぼさないが、ヒトｍＨＴＴのレベルは有意に低減させることを注記する。星印は、対応のないｔ検定でｐ＝0.005であることを指し示す。
【００５８】
【図３０】図３０は、AAV9-miRHTTが、線条体中ヒト変異ハンチントンタンパク質を低減することを示す。スタディ１および２からの被殻のウェスタンブロット試料は、抗体3B5H10で検出された変異ＨＴＴおよびローディング対照としてのアクチンを示す（上）。グラフは、AAV9（対照）またはAAV9-miRHTTのいずれかで処置されたヒツジについての個々の数値の分布および平均（水平バー）を示す（下）。示されているのは、スタディ１および２ならびに注射から１カ月後および６カ月後の、異なる線条体領域（尾状、被殻および前線条体）についての結果である。スタディ２において、注射から６カ月後、２つの面積（面積１および２）が、各領域において検査された。星印は、対応のないｔ検定に基づきｐ＜0.05未満にてAAV9とAAV9-miRHTTとの間の注射側に有意差を指し示す。
【００５９】
【図３１】図３１は、スタディ１（Ｕ６プロモーター）およびスタディ２（ＣＢＡプロモーター）において、注射から１カ月後および６カ月後にてＭＳＤアッセイによって検出されたヒト変異ＨＴＴレベルを示す。グラフは、AAV9（対照）またはAAV9-miRHTTのいずれかで処置されたヒツジについての個々の数値の分布および平均（水平バー）を示す。結果は、種々の線条体領域（尾状、被殻および前線条体）について示されている。星印＊は、対応のないｔ検定に基づきｐ＜0.05未満にてAAV9とAAV9-miRHTTとの間の注射側に有意差を指し示す。
【００６０】
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｂは、ｍＨＴＴレベルが、ｍｉＲＨＴＴが注射されたヒツジ線条体の同側の皮質および反対側の尾状被殻において変化しないことを示す。図３２Ａは、ｍｉＲＨＴＴが注射された線条体と同側の皮質中のアクチンに対して標準化されたｍＨＴＴの平均レベルを指し示すグラフを示す。データは、対応のないｔ検定に基づく、ＮＳ、注射から１カ月後および６カ月後の、スタディ１からのものである。図３２Ｂは、ｍｉＲＨＴＴが注射された線条体とは反対側の尾状および被殻中のアクチンに対して標準化されたｍＨＴＴの平均レベルを指し示す棒グラフを示す。データは、対応のないｔ検定に基づく、ＮＳ、注射から１カ月後および６カ月後の、スタディ１からのものである。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
詳細な記載
本発明の側面は、対象へ送達されたとき、対象における病原性のハンチントンタンパク質（ＨＴＴ）の発現を低減させるのに有効な、ある干渉ＲＮＡ（例として、人工ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡ）に関する。その結果、本開示によって記載される方法および組成物は、いくつかの態様において、ハンチントン病の処置に有用である。
【００６２】
ハンチントン病を処置するための方法
対象へ導入遺伝子（例として、ｍｉＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ）を送達するための方法は、本開示によって提供される。方法は、典型的には、有効量の、ハンチントン（ｈｔｔ）タンパク質の発現を低減することができる干渉ＲＮＡをコードする単離された核酸、またはハンチントンタンパク質の発現を低減することができる阻害性ＲＮＡを発現するための核酸を含むｒＡＡＶを、対象へ投与することを伴う。
【００６３】
いくつかの側面において、本開示は、ヒトハンチントン(例として、配列番号１)の連続する少なくとも２個の（例として、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個の、またはそれ以上の）塩基へ特異的に結合する（例として、ハイブリダイズする）阻害性ｍｉＲＮＡを提供する。本明細書に使用されるとき、「連続する塩基」は、互いに（例として、核酸分子の一部として）共有結合する（例として、１以上のホスホジエステル結合等々によって）２以上のヌクレオチド塩基を指す。いくつかの態様において、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、配列番号１の２個以上（例として、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、またはそれ以上）の連続するヌクレオチド塩基と約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％同一である。いくつかの態様において、阻害性ＲＮＡは、配列番号２〜１０のいずれか１つに規定される配列を含むか、前記配列によってコードされるｍｉＲＮＡである。
【００６４】
本明細書に使用されるとき、「ハンチントン病」または「ＨＤ」は、病原性の変異ハンチントンタンパク質（ＨＴＴまたはｍＨＴＴ）の生成をもたらすＨＴＴ遺伝子中のトリ−ヌクレオチド反復伸長（例として、翻訳されてポリ−グルタミンまたはポリＱの束(tract)になる、ＣＡＧ）によって引き起こされる、徐々に悪化する運動、認知および行動の変化によって特徴付けられる神経変性疾患を指す。いくつかの態様において、変異ハンチントンタンパク質は、脳のある領域におけるニューロンの細胞死の速度を加速させる。一般に、ＨＤの重症度は、対象におけるトリ−ヌクレオチド反復伸長のサイズと相関する。例えば、ＣＡＧ反復領域を有し３６反復と３９反復との間に含む対象は、「不完全浸透(reduced penetrance)」ＨＤを有するとして特徴付けられるが、４０反復超を有する対象は、「完全浸透(full penetrance)」ＨＤを有するとして特徴付けられる。よって、いくつかの態様において、ＨＤを有する対象またはＨＤを有するリスクのある対象は、ＨＴＴ遺伝子を有し約３６ＣＡＧ反復と約３９ＣＡＧ反復との間（例として、３６、３７、３８または３９反復）に含む。
【００６５】
いくつかの態様において、ＨＤを有する対象またはＨＤを有するリスクのある対象は、４０以上（例として、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、またはそれ以上）のＣＡＧ反復を含むＨＴＴ遺伝子を有する。いくつかの態様において、１００超のＣＡＧ反復を含むＨＴＴ遺伝子を有する対象は、１００未満のＣＡＧ反復を有する対象より早くＨＤを発症する。いくつかの態様において、１００超のＣＡＧ反復を含むＨＴＴ遺伝子を有する対象は、約２０年齢前にＨＤ症状を発症することがあり、若年性ＨＤを有すると言及される（また、寡動(akinetic-rigid)ＨＤまたはウェストファールバリアントＨＤとも言及される）。対象のＨＴＴ遺伝子アレル中のＣＡＧ反復数は、当該技術分野において知られているいずれの好適なモダリティによっても決定され得る。例えば、核酸(例として、DNA)は、対象の生体試料（例として、血液）から単離され得、およびＨＴＴアレルのＣＡＧ反復数は、ＰＣＲまたは核酸シークエンシング（例として、イルミナシークエンシング(Illumina sequencing)、サンガーシークエンシング、ＳＭＲＴシークエンシング等々）などのハイブリダイゼーションをベースとする方法によって決定され得る。
【００６６】
物質の「有効量」は、所望の効果を生み出すのに充分な量である。いくつかの態様において、単離された核酸の有効量は、対象の標的組織の充分な数の標的細胞に、トランスフェクトする（またはｒＡＡＶを媒介する送達という文脈において、感染する）のに充分な量である。いくつかの態様において、標的組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）組織（例として、脳組織、脊髄組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）等々）である。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、ｒＡＡＶを介して送達されてもよいもの）の有効量は、対象において治療効果(a therapeutic benefit)を有するのに、例として、病原性の遺伝子またはタンパク質（例として、ＨＴＴ）の発現を低減するのに、対象の寿命を延ばすのに、対象において疾患の１以上の症状（例として、ハンチントン病の症状）を改善するのに等々、充分な量であってもよい。有効量は、様々な因子、例えば、対象の種、年齢(age)、重量、健康状態、および標的にされる組織などに依存するであろう。よって、本開示の他所に記載のとおりの対象および組織の間で変動してもよい。
【００６７】
単離された核酸
いくつかの側面において、本開示は、ヒトハンチントン（ＨＴＴ）の発現を低減させる（例として、阻害する）のに有用な単離された核酸を提供する。「核酸」配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書に使用されるとき、用語「単離された(isolated)」は、人工的に生産されたことを意味する。核酸に関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、以下を意味する：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、in vitroで増幅された；（ｉｉ）クローニングによって、組み換えで生産された；（ｉｉｉ）たとえば切断およびゲル分離によって、精製された；または（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成された。単離された核酸は、当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技法による容易な操作が可能なものである。
【００６８】
よって、ベクター（その５’および３’の制限部位が知られているか、またはそのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されている）に含有されるヌクレオチド配列は、単離されているとみなされるが、その自然宿主中その天然状態で存在する核酸配列は、そうではない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内に単離された核酸は、これが存在している細胞中の材料をごくわずかなパーセンテージで含み得るという点で、純粋ではない。しかしながら、かかる核酸は、その用語が本明細書に使用されるとき、単離されたものである。なぜなら、それは、当業者に知られている標準的な技法によって容易に操作され得るものであるからである。タンパク質またはペプチドに関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、それの自然環境から単離されたか、または人工的に（例として、化学合成によって、組み換えＤＮＡ技術によって等々）生産された、タンパク質またはペプチドを指す。
【００６９】
熟練者はまた、保存的アミノ酸置換が、カプシドタンパク質の機能的に等価なバリアントまたはホモログを提供するようになされ得ることも認識するであろう。いくつかの側面において、本開示は、保存的アミノ酸置換をもたらす配列変異(sequence alterations)を活用する。本明細書に使用されるとき、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の電荷またはサイズの相対的な特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を改変するための方法（かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., 第２Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkから見出されるものなど）に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の間でなされる置換を包含する：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。したがって、本明細書に開示のタンパク質およびポリペプチドのアミノ酸配列に対し、保存的アミノ酸置換を生じさせ得る。
【００７０】
本発明の単離された核酸は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）であってもよい。いくつかの態様において、本開示による記載のとおりの単離された核酸は、第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む領域（例として、第１領域）を含む。単離された核酸（例として、組み換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質中へパッケージングされて対象へ投与されてもよく、および／または選択された標的細胞へ送達されてもよい。「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５’および３’のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から最低限構成される。導入遺伝子は、本明細書の他所に開示のとおり、対象の内在性ｍＲＮＡを標的にする核酸を含む１以上の阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）をコードする１以上の領域を含んでいてもよい。導入遺伝子はまた、本開示の他所に記載のとおり、例えば、タンパク質および／または発現制御配列（例として、ポリＡテール）をコードする領域をも含んでいてもよい。
【００７１】
一般に、ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐ長である。好ましくは、実質的に、ＩＴＲをコードする配列全体が分子に使用されるが、これらの配列のある程度の小さな改変は許容される。これらＩＴＲ配列の改変能は、当該技術分野における知識の範囲内にある。（例として、Sambrook et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などのテキストを参照）。本発明に採用されるかかる分子の例は、選択された導入遺伝子配列および結び付けられた調節エレメントが、５’および３’のＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接して導入遺伝子を含有する「シス作用(cis-acting)」プラスミドである。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型を包含する、知られているいずれのＡＡＶからも得られ得る。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびそれらのバリアントから選択される血清型を有する少なくとも１種のＩＴＲを含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲをコードする領域（例として、第１領域）を含む。
【００７２】
いくつかの態様において、単離された核酸は、第２ＡＡＶ ＩＴＲを含む領域（例として、第２領域、第３領域、第４領域等々）をさらに含む。いくつかの態様において、第２ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびそれらのバリアントから選択される血清型を有する。いくつかの態様において、第２ＩＴＲは、機能的な末端解離部位(terminal resolution site)（ＴＲＳ）を欠く変異ＩＴＲである。用語「末端解離部位を欠く」は、ＩＴＲの末端解離部位（ＴＲＳ）の機能を無効化する突然変異（例として、非同義変異などのセンス変異、またはミスセンス変異）を含むＡＡＶ ＩＴＲを指すか、あるいは機能的なＴＲＳをコードする核酸配列を欠く切断型(truncated)ＡＡＶ ＩＴＲ（例として、ΔＴＲＳ ＩＴＲ）を指し得る。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、機能的なＴＲＳを欠くＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクター、例えばMcCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656によって記載のとおりのものを生産する。
【００７３】
組み換えＡＡＶベクターについて上に同定された主要なエレメントに加えて、ベクターはまた、導入遺伝子のエレメントと作動可能に(operably)連結された従来の制御エレメントも包含するが、前記連結は、ベクターでトランスフェクトされた細胞中、または本発明によって生産されたウイルスに感染した細胞中、その転写、翻訳および／または発現を許容する形で、なされている。本明細書に使用されるとき、「作動可能に連結された」配列は、着目した遺伝子を制御するための、着目した遺伝子に近接する発現制御配列と、トランスに(in trans)作用するかまたは少し離れたところから(at a distance)作用する発現制御配列との両方を包含する。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；および、望ましいときには、コードされた産物の分泌を向上させる配列を包含する。天然、構成的、誘導性および／または組織特異的プロモーターを包含する数多の発現制御配列が当該技術分野において知られており、利用されることもある。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、核酸配列（例として、コード配列）と調節配列とが、作動可能に連結されたと言われるのは、核酸配列の発現または転写が、調節配列の影響下または制御下に置かれるように、それらが共有結合的に連結されたときである。核酸配列が翻訳されて機能的なタンパク質になることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列が作動可能に連結されたと言われるには、５’調節配列におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらす場合であって、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域の、コード配列の転写に向かわせる能力と干渉せず、（３）対応するＲＮＡ転写産物の、翻訳されてタンパク質になる能力と干渉しない場合である。
【００７５】
よって、プロモーター領域が核酸配列の転写を行うことができる場合、プロモーター領域は、そのＤＮＡ配列へ作動可能に（その結果得られた転写産物が翻訳されて所望のタンパク質またはポリペプチドになるように）連結されるであろう。同様に、２以上のコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写が、インフレームで翻訳された２以上のタンパク質の発現をもたらすように連結されるとき、作動可能に連結される。いくつかの態様において、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を産み出す。いくつかの態様において、作動可能に連結されたコード配列は、機能的なＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）を産み出す。
【００７６】
いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を含む単離された核酸を提供するが、ここで導入遺伝子は、１以上のマイクロＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、転写または翻訳後の遺伝子サイレンシングを媒介することが可能な、小分子非コード(small non-coding)ＲＮＡ分子である。典型的には、ｍｉＲＮＡは、ヘアピンまたはステムループ（例として、自己相補的な一本鎖バックボーンを有する）二本鎖構造として転写され、一次ｍｉＲＮＡ（pri-miRNA）として言及されるが、これは、酵素処理されて（例として、Drosha、DGCR8、Pasha等々によって）pre-miRNAになる。pri-miRNAの長さは変動し得る。いくつかの態様において、pri-miRNAは、約１００塩基対から約５０００塩基対（例として、約１００、約２００、約５００、約１０００、約１２００、約１５００、約１８００，または約２０００塩基対）長まで及ぶ。いくつかの態様において、pri-miRNAは、２００塩基対長を超える（例として、２５００、５０００、７０００、９０００、またはそれ以上の塩基対長）。
【００７７】
Pre-miRNAはまた、ヘアピンまたはステムループ二重鎖構造によってもまた特徴付けられるが、長さも変動し得る。いくつかの態様において、pre-miRNAは、約４０塩基対長から約５００塩基対長までのサイズに及ぶ。いくつかの態様において、pre-miRNAは、約５０から１００塩基対長のサイズに及ぶ。いくつかの態様において、pre-miRNAは、約５０から約９０塩基対長まで（例として、約５０、約５２、約５４、約５６、約５８、約６０、約６２、約６４、約６６、約６８、約７０、約７２、約７４、約７６、約７８、約８０、約８２、約８４、約８６、約８８、または約９０塩基対長）のサイズに及ぶ。
【００７８】
一般に、pre-miRNAは、細胞質中へ輸送されてDicerによって酵素処理されることで、最初に不完全なｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖を、次いで一本鎖成熟ｍｉＲＮＡ分子を生成するが、これはその後、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RISC）中へロードされる。典型的には、成熟ｍｉＲＮＡ分子は、約１９から約３０塩基対長までのサイズに及ぶ。いくつかの態様において、成熟ｍｉＲＮＡ分子は、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または３０塩基対長である。いくつかの態様において、本開示の単離された核酸は、pri-miRNA、pre-miRNA、または配列番号２〜１０または２１〜２２のいずれか１つに規定される配列を含む成熟ｍｉＲＮＡをコードする配列を含む。
【００７９】
単離された核酸またはベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）は、いくつかの態様において、１より多い（例として、２、３、４、５、１０、またはそれ以上などの複数の）ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むことが解されるべきである。いくつかの態様において、１より多いｍｉＲＮＡの各々は、同じ標的遺伝子（例として、３つのユニークなｍｉＲＮＡをコードする単離された核酸、ここで各ｍｉＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子を標的にする）を標的にする（例として、ハイブリダイズする、または特異的に結合する）。いくつかの態様において、１より多いｍｉＲＮＡの各々は、異なる標的遺伝子を標的にする（例として、ハイブリダイズする、または特異的に結合する）。
【００８０】
いくつかの側面において、本開示は、１以上の人工ｍｉＲＮＡをコードする単離された核酸およびベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）を提供する。本明細書に使用されるとき「人工ｍｉＲＮＡ」または「ａｍｉＲＮＡ」は、内在性pri-miRNAまたはpre-miRNA（例として、機能的な成熟ｍｉＲＮＡを生成することが可能な前駆ｍｉＲＮＡである、ｍｉＲＮＡバックボーン）を指すが、ここでｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊（例として、ｍｉＲＮＡ二重鎖のパッセンジャー鎖）配列は、例えばEamens et al. (2014), Methods Mol. Biol. 1062:211-224によって記載されるとおり、標的化遺伝子の高効率のＲＮＡサイレンシングへ向かわせる対応するａｍｉＲＮＡ／ａｍｉＲＮＡ＊配列と置き換えられる。例えば、いくつかの態様において人工ｍｉＲＮＡは、miR-155 pri-miRNAバックボーンを含むが、成熟ＨＴＴ特異的ｍｉＲＮＡ（例として、配列番号２〜１０のいずれか１つ）をコードする配列は、内在性miR-155成熟ｍｉＲＮＡコード配列の代わりに、前記バックボーン中へ挿入されている。いくつかの態様において、本開示によって記載のとおりのｍｉＲＮＡ（例として、人工ｍｉＲＮＡ）は、miR-155バックボーン配列、miR-30バックボーン配列、mir-64バックボーン配列、またはmiR-122バックボーン配列を含む。
【００８１】
導入遺伝子を含む領域(例として、第２領域、第３領域、第４領域等々)は、単離された核酸のいずれの好適な場所に位置してもよい。領域は、核酸のいずれの非翻訳部分（例えば、イントロン、５’または３’の非翻訳領域等々を包含する）に位置してもよい。
【００８２】
いくつかのケースにおいて、タンパク質をコードする核酸配列(例として、タンパク質コード配列)の最初のコドンの上流の領域（例として、第２領域、第３領域、第４領域等々）に位置するのが望ましいこともある。例えば、領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと、その最初のコドンの上流２０００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと、その最初のコドンの上流１０００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと、その最初のコドンの上流５００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと、その最初のコドンの上流２５０ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと、その最初のコドンの上流１５０ヌクレオチドとの間に位置してもよい。
【００８３】
いくつかのケースにおいて（例として、導入遺伝子が、タンパク質コード配列を欠くとき）、導入遺伝子のポリＡテール上流の領域（例として、第２領域、第３領域、第４領域等々）に位置するのが望ましいこともある。例えば、領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流２０００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流１０００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流５００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流２５０ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流１５０ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流１００ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流５０ヌクレオチドとの間に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と、その最初の塩基の上流２０ヌクレオチドとの間に位置してもよい。いくつかの態様において、領域は、プロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基と、ポリＡテール配列の最初のヌクレオチド塩基との間に位置する。
【００８４】
いくつかのケースにおいて、領域は、導入遺伝子のポリＡテールの最後の塩基の下流に位置してもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と、その最後の塩基の下流２０００ヌクレオチドの位置との間であってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と、その最後の塩基の下流１０００ヌクレオチドの位置との間であってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と、その最後の塩基の下流５００ヌクレオチドの位置との間であってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と、その最後の塩基の下流２５０ヌクレオチドの位置との間であってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と、その最後の塩基の下流１５０ヌクレオチドの位置との間であってもよい。
【００８５】
導入遺伝子が１より多くのｍｉＲＮＡをコードするケースにおいて、各ｍｉＲＮＡが、導入遺伝子内のいずれの好適な場所に位置してもよいことは、解されるべきである。例えば、第１ｍｉＲＮＡをコードする核酸は、導入遺伝子のイントロンに位置してもよく、第２ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列は、別の非翻訳領域（例として、タンパク質コード配列の最後のコドンと、導入遺伝子のポリＡテールの最初の塩基との間）に位置してもよい。
【００８６】
いくつかの態様において、導入遺伝子はさらに、１以上の発現制御配列（例として、プロモーター等々）をコードする核酸配列を含む。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；および、所望されるとき、コードされた産物の分泌を向上させる配列、を包含する。天然の、構成的、誘導性および／または組織特異的なプロモーターを包含する数多の発現制御配列が当該技術分野において知られており、利用されることもある。
【００８７】
「プロモーター」は、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識され、遺伝子の特定の転写を開始するのに要求されるＤＮＡ配列を指す。句「作動可能に位置する」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、核酸との関係で、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御するための正しい位置と向きにあることを意味する。
【００８８】
タンパク質をコードする核酸において、ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後であってかつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示において有用なｒＡＡＶコンストラクトはまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置するイントロンも含有していてもよい。１つの考え得るイントロン配列は、ＳＶ−４０に由来し、ＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と言及される。使用されてもよい別のベクターエレメントは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写物から１つよりも多くのポリペプチドを生産するのに使用される。ＩＲＥＳ配列は、１つよりも多くのポリペプチド鎖を含有するタンパク質を生産するのに使用されるであろう。これらのおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は従来続けられており、数多くのかかる配列が入手可能である［例として、Sambrook et al.,およびこれに引用される参考文献、例えば頁3.18 3.26および16.17 16.27、ならびにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989を参照］。
【００８９】
いくつかの態様において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列が、ポリタンパク質に包含される；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示された小ペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を包含する人工的な系において先に実証された（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873;およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.；およびKlump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。
【００９０】
構成的プロモーターの例は、限定せずに、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意に、ＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意に、ＣＭＶエンハンサーとともに）［例として、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Invitrogen］を包含する。いくつかの態様において、プロモーターは、強化ニワトリβ−アクチンプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。
【００９１】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外から供給された化合物、温度などの環境因子、または特定の生理学的状態（例として、急性期、細胞の具体的な分化状態）の有無(the presence)によって、あるいは細胞を複製する際のみ、調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導系は、限定せずにInvitrogen、ClontechおよびAriadを包含する、様々な商業的供給源から入手可能である。数多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外から供給されたプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例は、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)もまた参照）、ＲＵ４８６誘導系（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）を包含する。この文脈において有用であり得るさらに他の誘導性プロモーターのタイプは、特定の生理学的状態、例として、温度、急性期、細胞の具体的な分化状態によって、あるいは細胞を複製する際のみ、調節されるものである。
【００９２】
別の態様において、導入遺伝子のために天然プロモーターが使用されるであろう。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが所望されるとき、好ましいこともある。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的にもしくは発達に応じて、または組織特異的なやり方で、または特定の転写刺激に応答して、調節されなければならないときに、使用されてもよい。さらなる態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列などの、他の天然発現制御エレメントもまた、天然の発現を模倣するのにも使用されてもよい。
【００９３】
いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能(capabilities)を付与する。いくつかのケースにおいて、組織特異的な調節配列は、組織特異的なやり方で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。かかる組織特異的な調節配列（例として、プロモーター、エンハンサー等々）は、当該技術分野において周知である。例示の組織特異的な調節配列は、以下の組織特異的なプロモーター：肝臓特異的サイロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン−１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物のデスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α−ミオシン重鎖（ａ−ＭＨＣ）プロモーター、または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターに限定されないが、これらを包含する。
【００９４】
他の例示のプロモーターは、ベータ−アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター（Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)）、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α−鎖プロモーター、ニューロンのたとえば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）、当業者には明らかであろうものなどを包含する。
【００９５】
本開示の側面は、１種より多くのプロモーター（例として、２、３、４、５種、またはそれより多くのプロモーター）を含む単離された核酸に関する。例えば、タンパク質をコードする第１領域および阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）をコードする第２領域を含む導入遺伝子を有するコンストラクトの文脈において、第１プロモーター配列（例として、タンパク質コード領域へ作動可能に連結された第１プロモーター配列）を使用してタンパク質コード領域の発現を推進すること、および第２プロモーター配列をもつ阻害性ＲＮＡコード領域（例として、阻害性ＲＮＡコード領域へ作動可能に連結した第２プロモーター配列）の発現を推進することが所望されることもある。一般に、第１プロモーター配列および第２プロモーター配列は、同じプロモーター配列であっても、または異なるプロモーター配列であってもよい。
【００９６】
いくつかの態様において、第１プロモーター配列（例として、タンパク質コード領域の発現を推進するプロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列の非限定例は、Ｕ６およびＨ１プロモーター配列を包含する。いくつかの態様において、第２プロモーター配列（例として、阻害性ＲＮＡの発現を推進するプロモーター配列）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌＩＩプロモーター配列の非限定例は、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ＲＳＶ、およびサイトメガロウイルスプロモーター配列を包含する。いくつかの態様において、ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列は、阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）コード領域の発現を推進する。いくつかの態様において、ｐｏｌＩＩプロモーター配列は、タンパク質コード領域の発現を推進する。
【００９７】
いくつかの態様において、核酸は、タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。タンパク質は、治療用タンパク質（例として、哺乳動物対象における病態の処置または予防に有用なペプチド、タンパク質、またはポリペプチド）またはレポータータンパク質であり得る。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、ハンチントン病の処置または予防に有用な、例えば、Marelli et al. (2016) Orphanet Journal of Rare Disease 11:24; doi: 10.1186/s13023-016-0405-3に記載のとおりの、ポリグルタミン結合性ペプチド１（ＱＢＰ１）、ＰＴＤ−ＱＢＰ１、ＥＤ１１、Ｃ４細胞内抗体、ＶＬ１２．３細胞内抗体、ＭＷ７細胞内抗体、Ｈａｐｐ１抗体、Ｈａｐｐ３抗体、ｍＥＭ４８細胞内抗体、あるモノクローナル抗体（例として、１Ｃ２）、およびペプチドＰ４２およびそれらのバリアントである。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、野生型ハンチントンタンパク質（例として、３６未満の反復を含むポリＱ反復領域を有するハンチントンタンパク質）である。
【００９８】
いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、変異ハンチントン（ＨＴＴ）のアレル特異的サイレンシングは、非アレル特異的サイレンシング（例として、野生型および変異ＨＴＴアレルの両方のサイレンシング）と比較して、対象の改善された安全性プロファイルを提供し得る。これは、野生型ＨＴＴの発現および機能が、細胞に保存されているからである。本発明の側面は、固い(hardened)野生型ＨＴＴ遺伝子（ｍｉＲＮＡによって標的にされない野生型ＨＴＴ遺伝子）の発現を推進しながら、非アレル特異的なやり方でＨＴＴ遺伝子を標的にする１種以上の阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）配列を組み込む単離された核酸およびベクターが、野生型ＨＴＴの増大した発現と同時に変異ＨＴＴのノックダウン（例として、ＣＮＳ組織において）を達成することができるという本発明者らの認識および見解に関する。
【００９９】
一般に、内在性野生型、変異ＨＴＴ ｍＲＮＡをコードする核酸の配列と、「固い」野生型ＨＴＴ ｍＲＮＡをコードする導入遺伝子の核酸の配列とは、「固い」野生型ＨＴＴ導入遺伝子ｍＲＮＡが１種以上の阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）によって標的にされないよう充分に異なるものである。これは、例えば、１種以上のサイレント変異をＨＴＴ導入遺伝子配列中へ（それが、内在性野生型ＨＴＴ遺伝子と同じであるが異なる核酸配列を有するタンパク質をコードするように）導入することによって、成し遂げられ得る。このケースにおいて、その外因性ｍＲＮＡは、「固い」と言及され得る。代替的に、阻害性ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）は、内在性野生型ＨＴＴ ｍＲＮＡの５’および／または３’の非翻訳領域を標的にし得る。そのときは、導入遺伝子ｍＲＮＡ中のこれら５’および／または３’の領域は、導入遺伝子ｍＲＮＡが１種以上の阻害性ＲＮＡによって標的にされないように、除去されるか、または置き換えられる。
【０１００】
導入遺伝子中に提供されてもよいレポーター配列(例として、レポータータンパク質をコードする核酸配列)は、限定せずに、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知のその他をコードするＤＮＡ配列を包含する。それらの発現を推進する調節エレメントに結び付けられたとき、レポーター配列は、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光学的なアッセイ、蛍光活性化細胞分取アッセイおよび免疫学的アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する）を包含する従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列が、ＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを伝えるベクターの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを伝えるベクターは、ルミノメーターにおける色または光の産生によって視覚的に測定され得る。かかるレポーターは、例えば、核酸の組織特異的な標的能(targeting capabilities)および組織特異的なプロモーター調節活性を検証するのに有用であり得る。
【０１０１】
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
いくつかの側面において、本開示は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、人工的に生産されたかまたは得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組み換え方法を使用して生産されてもよい。かかるＡＡＶは、本明細書中「組み換えＡＡＶ」として言及される。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は好ましくは、ｒＡＡＶのヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子が１以上の既定組織（単数または複数）へ特異的に送達されるような、組織特異的な標的能を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的な標的能を決定するのに重要な要素である。よって、標的にされる組織にとって適切なカプシドを有するｒＡＡＶが、選択され得る。
【０１０２】
所望のカプシドタンパク質を有する組み換えＡＡＶを得るための方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、US 2003/0138772を参照。この内容はこれら全体を参照することより本明細書に組み込まれる）。典型的には、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的なｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成された組み換えＡＡＶベクター；およびＡＡＶカプシドタンパク質中への組み換えＡＡＶベクターのパッケージングを許容するのに充分なヘルパー機能、を含有する宿主細胞を培養することを伴う。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１〜３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と名付けられている）を含み、これらのすべては、選択的スプライシングを介して、単一のｃａｐ遺伝子から転写される。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は夫々、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。いくつかの態様において、翻訳されると、カプシドタンパク質は、球状の６０ｍｅｒのタンパク質シェルをウイルスゲノムの周りに形成する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、宿主と相互作用させることである。いくつかの側面において、カプシドタンパク質は、組織特異的なやり方で宿主へウイルスゲノムを送達する。
【０１０３】
いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、霊長目の非ヒト動物(a non-human primate)に由来する血清型、例えばＡＡＶｒｈ８血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型のものである。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２０に規定される配列を含む。
【０１０４】
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシド中にパッケージングするための宿主細胞において培養されるべき構成成分は、宿主細胞へトランスに提供されてもよい。代替的に、要求される構成成分（例として、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１以上は、当業者に知られている方法を使用して、要求される構成成分の１以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供されてもよい。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導プロモーターの制御下で要求される構成成分（単数または複数）を含有するであろう。しかしながら、要求される構成成分（単数または複数）は、構成的プロモーターの制御下であってもよい。
【０１０５】
好適な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子とともに使用するのに好適な調節エレメントの考察において、本明細書に提供される。さらに別の代替において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下で選択された構成成分（単数または複数）および１以上の誘導性プロモーターの制御下で選択された他の構成成分（単数または複数）を含有していてもよい。例えば、２９３細胞に由来する（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）安定な宿主細胞が生成され得るが、これは、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する。さらに他の安定な宿主細胞も、当業者によって生成されてもよい。
【０１０６】
いくつかの態様において、本開示は、タンパク質（例として、野生型ハンチントンタンパク質、任意に「固い」野生型ハンチントンタンパク質）をコードするコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。いくつかの態様において、本開示は、上に記載の宿主細胞を含む組成物に関する。いくつかの態様において、上の宿主細胞を含む組成物は、凍結保存剤をさらに含む。
【０１０７】
本開示のｒＡＡＶを生産するのに要求される、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、いずれの適切な遺伝子エレメント（ベクター）も使用して、パッケージング宿主細胞へ送達されてもよい。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載されたものを包含する、いずれの好適な方法によっても送達されてもよい。本開示のいずれの態様をも構築するのに使用される方法は、核酸操作の知識を有する者に知られており、遺伝子工学的、組み換え工学的、および合成的技法を包含する。例として、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本開示に対する限定ではない。例として、K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第5,478,745号を参照。
【０１０８】
いくつかの態様において、組み換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション方法（米国特許第6,001,650号において詳細に記載される）を使用して生産されてもよい。典型的には、組み換えＡＡＶは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子中へパッケージングされるべき組み換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターで、トランスフェクトすることによって生産される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製およびカプシド形成(encapsidation)のためにトランスに機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いずれの検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成せずに効率的なＡＡＶベクター生産を後押しする。
【０１０９】
本開示とともに使用するのに好適なベクターの非限定例は、米国特許第6,001,650号に記載のpHLP19、および米国特許第6,156,303号に記載のpRep6cap6ベクターを包含するが、それらはともに全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。補助機能ベクターは、非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／またはＡＡＶが複製のために依存する細胞機能（すなわち、「補助機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、ＡＡＶ複製に要求されるそれらの機能を包含するが、限定せずに、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階(stage)特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分(those moieties)も包含する。ウイルスをベースとする補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの知られているヘルパーウイルスのいずれにも由来し得る。
【０１１０】
いくつかの側面において、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すのに使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されているときに、細胞は「トランスフェクトされ」ている。数々のトランスフェクション技法が、当該技術分野において一般に知られている。例として、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技法は、ヌクレオチド組込み型(integration)ベクターおよび他の核酸分子などの１以上の外因性の核酸を、好適な宿主細胞中へ導入するのに使用され得る。
【０１１１】
「宿主細胞」は、着目した物質を内部に持っているか、または内部に持つことができる、いずれの細胞をも指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組み換えＡＡＶの生産に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用されてもよい。用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。よって、「宿主細胞」は、本明細書で使用されるとき、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指してもよい。単一の親細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異または意図的変異に起因して、元の親と形態学的にまたはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において、必ずしも完全に同一ではないこともあることが理解される。
【０１１２】
本明細書に使用されるとき、用語「細胞株」は、in vitroで継続的または長期的に成長および分裂することができる細胞の集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。かかるクローン集団の保管または移動の間の、核型における自然発生的なまたは誘導された変化が生じ得ることが、当該技術分野においてさらに知られている。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と厳密に同一でないこともあり、言及される細胞株は、かかるバリアントを包含する。
【０１１３】
本明細書に使用されるとき、用語「組み換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写または生物学的に活性なＲＮＡなどの核酸の生産に繋がるＤＮＡセグメントなどの、外来性ＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。
【０１１４】
本明細書に使用されるとき、用語「ベクター」は、適した制御エレメントに結び付けられたときに複製することができ、かつ遺伝子配列を細胞間で移動し得る、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等々のいずれの遺伝子エレメントをも包含する。よって、用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置するところのそれらのベクターであることが企図される。「プロモーター」は、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列であって、遺伝子の特定の転写を開始するのに要求されるものを指す。
【０１１５】
句「作動可能に位置する」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、核酸との関係で、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御するための正しい位置と向きにあることを意味する。用語「発現ベクターまたはコンストラクト」は、核酸コード配列の一部またはすべてが転写されることができる核酸を含有する遺伝的コンストラクトのいずれのタイプをも意味する。いくつかの態様において、発現は、例えば生物学的に活性なポリペプチド産物または機能的なＲＮＡ（例として、ガイドＲＮＡ）を転写された遺伝子から生成するための、核酸の転写を包含する。
【０１１６】
本開示のｒＡＡＶを生産するための所望のＡＡＶカプシド中に組み換えベクターをパッケージングするための前述の方法は、限定されることを意図しておらず、他の好適な方法も、当業者に明らかであろう。
【０１１７】
いくつかの態様において、本明細書に提供される配列（配列表に提供される配列を包含する）中のいずれか１以上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例として、ワトソン−クリック塩基対）に好適ないずれか他のヌクレオチドと置き換えられてもよい。例えば、いくつかの態様において、本明細書に提供される配列中のいずれか１以上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（配列表に提供される配列を包含する）は、ウリジン（Ｕ）ヌクレオチドと好適に置き換えられてもよく、その逆もまたしかりである。
【０１１８】
投与の様式
本開示のｒＡＡＶは、組成物中、当該技術分野において知られているいずれの適切な方法にも従って、対象へ送達されてもよい。例えば、ｒＡＡＶは、好ましくは、生理学的に適合性のある担体中に（すなわち、組成物中に）懸濁されており、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または霊長目の非ヒト動物（例として、マカク）などの宿主動物へ投与されてもよい。いくつかの態様において、宿主動物は、ヒトを包含しない。
【０１１９】
哺乳動物対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、筋肉内注射によってもよく、または哺乳動物対象の血流中への投与によってもよい。血流中への投与は、静脈、動脈、またはいずれか他の血管(vascular conduit)中への注射によってもよい。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、外科術(the surgical arts)において周知の技法である分離式肢灌流(isolated limb perfusion)（ｒＡＡＶビリオンの投与に先立ち、熟練者(the artisan)に、体循環から肢を分離することが本質的にできるようにする方法）を経て、血流中へ投与される。米国特許第6,177,403号に記載の分離式肢灌流技法の変法(A variant)もまた、筋肉細胞または組織中への形質導入を潜在的に強化するよう分離された肢の血管系中へビリオンを投与するために当業者によって採用され得る。
【０１２０】
その上、ある実例において、対象のＣＮＳへビリオンを送達することが望ましいこともある。「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳および脊髄のすべての細胞および組織を意味する。よって、用語は、これらに限定されないが、ニューロン(neuronal cells)、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨等を包含する。組み換えＡＡＶは、当該技術分野において知られている脳神経外科の技法を使用して、針、カテーテルまたは関連デバイスとともに、例として、脳室領域中への注射ならびに線条体（例として、線条体の尾状核または被殻）、脊髄および神経筋接合部または小脳の小葉(cerebellar lobule)への注射によって（定位的注入(stereotactic injection)によって、など）ＣＮＳまたは脳へ直接送達されてもよい（例として、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999；Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000；Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993；およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照)。
【０１２１】
いくつかの態様において、本開示に記載のとおりのｒＡＡＶは、静脈内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、脳内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、髄腔内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、線条体内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、頭蓋内注射によって投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、大槽注射によって送達される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、側脳室注射によって送達される。
【０１２２】
本開示の側面は、カプシドタンパク質および導入遺伝子をコードする核酸を含む組み換えＡＡＶを含む組成物に関し、ここで導入遺伝子は、１種以上のｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡは、配列番号２〜１０のいずれか１つに規定される配列を含む。いくつかの態様において、核酸はさらに、ＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、配列番号１６〜１９のいずれか１つに規定される配列またはその一部によって表されるｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの態様において、組成物はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。
【０１２３】
本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１種以上の他のウイルス（例として、１以上の異なる導入遺伝子を有するコードする第２ｒＡＡＶ）と組み合わせて、含んでいてもよい。いくつかの態様において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なるｒＡＡＶ（各々が、１種以上の異なる導入遺伝子を有する）を含む。
【０１２４】
好適な担体は、ｒＡＡＶが向けられる適応を考慮し当業者によって容易に選択されてもよい。例えば、１つの好適な担体は、様々な緩衝溶液（例として、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化されてもよい生理食塩水を包含する。他の例示の担体は、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油、および水を包含する。担体の選択は、本開示の限定ではない。
【０１２５】
任意に、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（単数または複数）に加えて、保存剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有していてもよい。好適な例示の保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを包含する。好適な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【０１２６】
ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞にトランスフェクトするのに、ならびに不当な逆効果なく遺伝子の導入および発現の充分なレベルを提供するのに、充分な量で投与される。従来のおよび薬学的に許容し得る投与ルートは、これらに限定されないが、選択された器官への直接送達（例として、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（経鼻および気管内送達を包含する）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口投与ルートを包含する。投与ルートは、所望に応じて組み合わされてもよい。
【０１２７】
具体的な「治療効果」を達成するのに要求されるｒＡＡＶビリオンの用量、例として、ゲノムコピー／キログラム体重あたり（ＧＣ／ｋｇ）での用量の単位は、以下を包含するがこれらに限定されない複数の因子に基づき変動するであろう：ｒＡＡＶビリオンの投与ルート、治療効果を達成するのに要求される遺伝子またはＲＮＡの発現レベル、処置される特定の疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡの産物安定性。当業者は、具体的な疾患または障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオン用量範囲を、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づき容易に決定し得る。
【０１２８】
ｒＡＡＶの有効量は、動物を標的感染させ、所望の組織を標的にするのに充分な量である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞トランスジェニック動物モデルを生産するのに充分な量である。有効量は、対象の種、年齢(age)、重量、健康状態、および標的にされるべき組織などの因子に主に依存し、よって動物および組織間で変動し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０９から１０１６までのゲノムコピーを含有する溶液の約１ｍｌから約１００ｍｌまでの範囲にある。いくつかのケースにおいて、約１０１１〜１０１３ｒＡＡＶゲノムコピーの間の投薬量が適切である。ある態様において、１０１２または１０１３ｒＡＡＶゲノムコピーが、ＣＮＳ組織を標的にするのに有効である。いくつかのケースにおいて、安定したトランスジェニック動物は、ｒＡＡＶの複数回用量によって生産される。
【０１２９】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、１暦日（例として、２４時間の期間）あたり１回しか対象へ投与されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回しか対象へ投与されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、１暦週（例として、７暦日）あたり１回しか対象へ投与されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、隔週（例として、２暦週の期間に１回）しか対象へ投与されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、１暦月（例として、３０暦日に１回）あたり１回しか対象へ投与されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、６暦月あたり１回しか対象へ投与されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、１暦年（例として、３６５日または閏年において３６６日）あたり１回しか対象へ投与されない。
【０１３０】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は、その組成物において、具体的にはｒＡＡＶが高濃度（例として、〜１０１３ＧＣ／ｍｌまたはそれ以上）で存在する組成物において、ＡＡＶ粒子の凝集を低減させるように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減させるための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整等々を包含する。（例として、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。）
【０１３１】
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤化は、様々な処置レジメンにおいて本明細書に記載の具体的な組成物を使用するための好適な投薬および処置レジメンの開発がそうであるように、当業者に周知である。
【０１３２】
典型的には、これらの製剤は、活性化合物の少なくとも約０．１％またはそれ以上を含有してもよいが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージはもちろん変動してもよく、便宜的に、総製剤の重量または体積の約１または２％と約７０％または８０％またはそれ以上との間であってもよい。当然のことながら、治療的に有用な各組成物中の活性化合物の量は、好適な投薬量が化合物のいかなる単位用量でも得られるように、調製されてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、製品有効期間、ならびに他の薬理学的な検討事項などの因子が、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。これを踏まえて、様々な投薬量および処置レジメンが所望され得る。
【０１３３】
ある状況においては、好適に製剤化された本明細書に開示の医薬組成物中のｒＡＡＶをベースとする治療用コンストラクトを、皮下に、膵臓内に、鼻腔内に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、髄腔内に、または経口で、腹腔内に、または吸入によって、送達することが所望されるであろう。いくつかの態様において、米国特許第5,543,158号；第5,641,515号および第5,399,363号（各々は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載のとおりの投与手法(the administration modalities)が、ｒＡＡＶを送達するのに使用されてもよい。いくつかの態様において、好ましい投与モードは、門脈注射による。
【０１３４】
注射可能な使用に好適な医薬形態は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製のための、滅菌された水性溶液または分散液および滅菌された粉末を包含する。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中でも、ならびに油中でも、調製されてもよい。保管および使用の通常の条件下、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。数多くのケースにおいて、その形態は滅菌されており、注射針が楽に通過する程度に(to the extent that easy syringability exists)流動性がある。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。
【０１３５】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液のケースにおいては要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。数多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期的な吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノアステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの、組成物における使用によってもたらされ得る。
【０１３６】
注射可能な水性溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要ならば、好適に緩衝化されてもよく、液体の希釈剤は、充分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にされる。これらの具体的な水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとくに好適である。これに関連して、採用され得る滅菌水性媒体は、当業者に知られているであろう。例えば、１投薬量が、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍｌの皮下注入用流体へ加えられるかまたは提案の注入部位にて注射されるかのいずれかであってもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038および1570〜1580頁を参照）。投薬量のある程度の変動は、宿主の状態に応じて、必然的に生じるであろう。投与に対して責任を持つ者は、いずれにしても、個々の宿主にとって適切な用量を決定するであろう。
【０１３７】
滅菌された注射可能な溶液は、要求される量の活性ｒＡＡＶを、本明細書に列挙された他の様々な成分とともに（そう要求されるとき）、適切な溶媒に組み込むこと、その後に濾過滅菌が続くことによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒および上に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクル中へ、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末のケースにおいて、好ましい調製の方法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法であるが、これらは、先に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末を、いずれか所望の追加成分を加えて生み出す。
【０１３８】
本明細書に開のｒＡＡＶ組成物はまた、中性または塩の形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成された）、ならびに、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸とともに形成された酸付加塩を包含する。遊離カルボキシル基とともに形成された塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基にも由来し得る。製剤化されると、溶液は、投薬製剤に適合可能なやり方で、かつ治療的に有効であるような量で、投与されるであろう。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル等などの様々な剤形(dosage forms)で楽に投与される。
【０１３９】
本明細書に使用されるとき、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を包含する。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助的な活性成分もまた、組成物中へ組み込まれ得る。句「薬学的に許容し得る」は、宿主へ投与されたとき、アレルギーまたは同様の有害反応を生み出さない分子実体および組成物を指す。
【０１４０】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクル等などの送達ビヒクルは、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用されてもよい。とりわけ、ｒＡＡＶベクターによって送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子等のいずれかにカプセル化されて送達されるために製剤化されてもよい。
【０１４１】
かかる製剤は、本明細書に開示の核酸またはｒＡＡＶコンストラクトの薬学的に許容し得る製剤の導入のために、好ましいこともある。リポソームの形成および使用は一般に、当業者に知られている。近年、改善された血清安定性および循環半減時間をもつリポソームが開発された（米国特許第5,741,516号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号および第5,795,587号）。
【０１４２】
リポソームは、普通は他の手順によるトランスフェクションに抵抗性である数々の細胞型とともに、首尾よく使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長に制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物中へ導入するのに効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を検査する数件の成功した臨床試験が完了している。
【０１４３】
リポソームは、水媒体に分散されたリン脂質から形成され、自然に多重膜同心二層ベシクル（また多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍから４μｍまでの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水性溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲の直径をもつ小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０１４４】
代替的に、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセルは一般に、物質を安定かつ再現性のあるように封入し得る。細胞内ポリマー過負荷(intracellular polymeric overloading)に起因する副作用を避けるために、かかる超微細粒子（およそ０．１μｍのサイズである）が、in vivoで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリラートナノ粒子が、使用のために企図される。
【０１４５】
上に記載の送達の方法に加えて、以下の技法もまた、宿主へｒＡＡＶ組成物を送達するための代替方法として企図される。ソノフォレーシス(Sonophoresis)（すなわち、超音波）が使用されており、循環系中へのおよび循環系を通した薬物透過の速度および効率を強化するためのデバイスとして米国特許第5,656,016号に記載されている。企図される他の薬物送達の代替は、骨内注射（米国特許第5,779,708号）、マイクロチップデバイス（米国特許第5,797,898号）、眼科製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス(transdermal matrices)（米国特許第5,770,219号および第5,783,208号）およびフィードバック制御送達（米国特許第5,697,899号）である。
【０１４６】
キットおよび関連する組成物
本明細書に記載の剤は、いくつかの態様において、治療の、診断のまたは調査の用途におけるそれらの使用を容易にするための、医薬または診断または調査キットにまとめられてもよい。キットは、本開示の構成成分および使用のための指示を収容する１以上の容器を包含していてもよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載の１以上の剤を、これらの剤の意図する適用および適した使用を記載する指示と一緒に包含していてもよい。ある態様において、キットにおける剤は、具体的な適用におよび剤の投与の方法に好適な医薬製剤および投薬量であってもよい。調査目的のためのキットは、様々な実験を実行するのに適切な濃度または分量で構成成分を含有していてもよい。
【０１４７】
いくつかの態様において、本開示は、ｒＡＡＶを生産するためのキットに関し、キットは、配列番号２〜１０のいずれか１つに規定される配列を含むかまたはこれによってコードされるｍｉＲＮＡを含む単離された核酸を収容する容器を含む。いくつかの態様において、キットは、ＡＡＶカプシドタンパク質、例えばＡＡＶ９カプシドタンパク質をコードする単離された核酸を収容する容器をさらに含む。
【０１４８】
キットは、研究者らによって本明細書に記載の方法の使用を容易にするように設計されていてもよく、多数の形態を取り得る。キットの組成物の各々は、適用可能な場合、液体形態で（例として、溶液で）、または固体形態（例として、乾燥粉末）で提供されてもよい。あるケースにおいて、組成物のいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもされなくてもよい好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、構成可能(constitutable)または別様に処理可能（例として、活性型へと）であってもよい。本明細書で使用されるとき、「指示」は、指示および／または販売促進の構成成分を定義し得、典型的には、本開示のパッケージ上にまたはこれと結び付けられた書面での指示を伴う。指示はまた、その指示がキットに関連すべきものであることをユーザーが明確に認識するであろういずれのやり方でも提供される、いずれの口頭または電子的指示、例えば、オーディオビジュアル（例として、ビデオテープ、ＤＶＤ等々）、インターネット、および／またはウェブに基づく通信等々をも包含し得る。書面での指示は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形態であってもよく、これらの指示はまた、動物投与のための製造、使用または販売の当局による承認をも反映し得る。
【０１４９】
キットは、本明細書に記載の構成成分のいずれか１以上を、１以上の容器中に含有していてもよい。例として、一態様において、キットは、キットの１以上の構成成分を混合するための、および／または試料を単離および混合して対象へ適用するための、指示を包含していてもよい。キットは、本明細書に記載の剤を収容する容器を包含していてもよい。剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であってもよい。剤は、無菌的に調製され、シリンジ中にパッケージングされて冷蔵で出荷されてもよい。代替的に、それは、保管のためにバイアルまたは他の容器中に収容されていてもよい。第２容器は、無菌的に調製された他の剤を有していてもよい。代替的に、キットは、予め混合されて、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器中にて出荷される活性薬剤を包含していてもよい。
【０１５０】
本発明の例示態様は、以下の例によってより詳細に記載されるであろう。これらの態様は、本発明の例示であって、当業者はこれらが例示態様に限定されないことを認識するであろう。
【０１５１】
例
例１：材料および方法
細胞培養物およびスクリーニングアッセイ
ＨｅＬａ細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ高グルコース（ThermoFisher）中に維持した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を０．８〜１．０×１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの日、増殖培地は、１．６ｍｌのOpti-MEM（ThermoFisher）と交換した。プラスミドは、２μｌ／ウェルのDharmaFECT Duo（Dharmacon）を使用してトランスフェクトした。各ウェルは、０．６μｇのプラスミドＤＮＡを受容した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、全RNAを、MirVana RNA単離キットを使用して抽出した。ｃＤＮＡをoligo-dTおよびSuperscript III（Invitrogen）を使用する、１μｇのＲＮＡ／反応を使用して産生した。ハンチントンｍＲＮＡは、TaqMan assay（ThermoFisher）を使用して測定した。ハンチントンｍＲＮＡの相対的なレベルは、ハウスキーピング遺伝子としてヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いるΔΔＣ（Ｔ）方法を使用して計算した。
【０１５２】
マウス住居、注射および維持
YAC128および野生型FVBマウスを得た。マウスは、野生型雄性マウスとYAC128雌性マウスを交配することにより、FVBバックグラウンドで飼育した。得られた異種接合YAC128および野生型マウスを、１２：１２明スケジュールで維持し、食餌および水は自由にアクセスさせた。遺伝子型を、尾小片(tail snip)または耳パンチ(ear punch)から抽出したＤＮＡのＰＣＲによって確認した。マウスは、UMPC3またはUMPC4微量注入器（World Precision Instruments, Sarasota, FL）によって補助した小動物定位固定(stereotax)SAS-4100（ASI Instruments, Warren, MI）の手段により、線条体に選択したＡＡＶを直接注射した。マウスは、２８４ｍｇ／ｋｇのトリブロモエタノールで麻酔して、定位固定に配置した。前側１．０ｍｍ、外側２．０ｍｍを計測し、３３ゲージの針を線条体に３．０ｍｍ低下させて、０地点として、前項を使用して手術を実施した。１２５ｎｌ／分の速度で３．０ｕｌを送達するように、ポンプを設定した。注射後に、マウスを加温パッド上で回復させ、次いで、住居領域内のケージに戻した。
【０１５３】
組織抽出
適切な時点で、マウスを屠殺して、組織をＲＮＡ分析または免疫組織化学のために抽出した。ＲＮＡ抽出のために、マウスは麻酔して、頸部脱臼により殺傷した。脳を取り出し、線条体を解剖した。利用可能な場合、ＧＦＰ発現を使用して、ＧＦＰ陽性組織のみが分析できるように、解剖を誘導した。組織は直ぐに、RNALater（Ambion）に配置した。引き続き、これらを−８０°Ｃに凍結貯蔵した。実験の終わりに、免疫組織化学を意味したマウスを深く麻酔し、心臓内に生理食塩水、続いて、４％パラホルムアルデヒドを灌流させた。サンプルを、冷２％パラホルムアルデヒド中で終夜固定し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水に貯蔵した。冠状切片を、Leica VT1000sビブラトーム上で４０ミクロンの切片をスライスすることにより、作製した。
【０１５４】
マウス行動
平均台渡り(beam walking)：マウスは、平均台（平均台の大きさ(size of beam)）を渡るように訓練された。訓練後、マウスは、平均台の一端から他端へと渡る際に記録した。１匹のマウス当たり３回の試験を記録した。記録に基づいて、マウスが平均台の一端の印から他端へ渡るのにかかる時間を測定した。
【０１５５】
ホームケージ活動：マウスは、自動化ホームケージ遺伝子型決定走査システム（Clever Sys, Inc., Reston VA）に２６時間、一匹で配置した。１時間当たりの平均活動時間を計算するために、マウスが新たな環境に慣れる間の最初の１時間のデータは除去した；次いで、（総記録時間−１時間）によって除した渡りに費やされた総時間を計算した。
【０１５６】
免疫組織化学および定量化
固定化組織切片を３％過酸化水素で３分間ブロックし、次いで、０．５％トリトンｘと共に２０分間インキュベートした。免疫組織化学を、DARPP32（Abcam ab40801；１：１０，０００希釈）、Iba1（Wako 019-19741；１：１，０００希釈）、ＧＦＰ（Life Technologies G10362；１：１０００希釈）およびNeuN（EMD Millipore MAB377；１：１０００希釈）に対するウサギまたはマウス由来抗体について、Laboratories Elite ABCキット試薬を使用して実施した。切片は、Metal Enhanced DAB Substrate Kit（Pierce）を使用するジアミノベンジジンを用いて２分間染色した。
【０１５７】
小分子ＲＮＡライブラリークローニングおよび分析
全ＲＮＡを、MirVana RNA単離キットを使用して抽出した。１８〜３０ヌクレオチドＲＮＡのサイズ選択を、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で、５μｇの全ＲＮＡを使用して実施した。サイズ選択後、小分子ＲＮＡを、エタノール沈殿し、アデニル化前の３’−アダプター（５’−rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/−３’；配列番号１１）に連結させた。連結生成物を、ＲＴプライマー（５’−CCTTGGCACCCGAGAATTCCA−３’；配列番号１２）にアニーリングし、５’−アダプター（ＲＮＡ：５’−GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC−３’；配列番号１３）に連結した。逆転写を、AMV Reverse transcriptase mix（NEB）を使用して実施し、１つのユニバーサルプライマー（５’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA−３’；配列番号１４）および１つのバーコードプライマー（５’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA−３’；配列番号１５）とともにAccuPrime Pfx DNA Polymerase（Invitrogen）を使用してＰＣＲ増幅した。ライブラリーは、配列決定し、ｍｍ９ゲノムおよびＡＡＶゲノムに対してマッピングした。ｍｉＲＮＡ種は、ｍｉＲＮＡヘアピンに関する５’末端マッピングの位置に基づいて分類し、したがって、各種は、共通のシード配列を有する全ての小分子ＲＮＡからなる。３’末端は、種の割り当てにおいて考慮しなかった。内因性ｍｉＲＮＡの差次的発現を、edgeRパッケージを使用して分析した。
【０１５８】
ｍＲＮＡライブラリークローニングおよび分析
ＲＮＡは、上記のとおり抽出した。ライブラリーは、標準的な方法によって構築した。読み取りデータは、topHat2を使用してマッピングし、差次的発現は、deseq2パッケージを使用して計算した。
【０１５９】
ヒツジ実験
ハンチントン病のトランスジェニックヒツジモデル（例として、病原性ヒトハンチントンタンパク質を発現するトランスジェニックヒツジ）に、scAAV9-CBA-mir-HTT（mir-155バックボーンにmiRNA 6433を含む）、scAAV-U6-mir-HTT（mir-155バックボーンにmiRNA 6433を含む）、または空のscAAV9対照ベクターのいずれかを注射した。ヒツジを注射の１カ月後または６カ月後のいずれかに屠殺した。組織および核酸サンプルを調製し、定量的ＰＣＲおよび免疫組織化学によって分析した。
【０１６０】
例２：インビボ実験におけるマウス
ハンチントン標的化人工ｍｉＲＮＡの設計および選択
ヒトハンチントンｍＲＮＡを標的化する９つの配列（表１、図１）を試験した。９つの標的化配列の位置を示す概略図を図４Ａに提供する。２コピーの人工ｍｉＲＮＡを、内因性miRNA-155またはmiR-30に基づくバックボーンに直列にクローニングし、人工ｍｉＲＮＡ全体を、ＥＧＦＰの３’−ＵＴＲに挿入した（図５Ａ、上図）。mir-155ベースの、およびmir-30ベースの抗HTT amiRNAの予想されるヘアピン構造をそれぞれ図２５Ａ〜２５Ｂに示す。得られたプラスミドを、Ｈｅｌａ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を収集し、内因性ハンチントンｍＲＮＡのレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＴ）によって測定した。９つの人工ｍｉＲＮＡのうちの３つが、５０％を超えてハンチントンを減少させた（図１〜２および４Ｂ〜４Ｃ）。
【０１６１】
表１：ハンチントンｍｉｒ標的
【表１】
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【０１６２】
最初のスクリーニングからの３つの配列を、in vivo実験のために選択した。公知のｓｉＲＮＡ（Ｅ１．４）に基づく人工ｍｉＲＮＡもまた試験した。候補配列を、自己相補的なＡＡＶ９ベクターにパッケージングし、約１２８個のポリグルタミンコード反復の区間を有するヒトハンチントンを発現するトランスジェニックマウス（Yac128マウス）の線条体にそれを直接注射した。１カ月後、ＡＡＶ９の分布およびＧＦＰレポーターの発現を、３つの異なる用量で評価した。最も高い用量では、ＧＦＰ染色は、線条体全体に存在し（図１１Ａ）、そして、ヒトハンチントンｍＲＮＡは、AAV9-CβA-抗HTT-6433（p=0.006）またはAAV9-CβA-抗HTT-5155のいずれかで処置したマウスにおいて有意に低減した（p=0.013、図４Ｃ；mir-155バックボーンを使用した）。ベクターの用量を低減させることにより、ＧＦＰ発現が低減し（図１１Ａ）、そして、１：１０希釈において、ヒトハンチントンｍＲＮＡにおける有意な低減は達成されなかった（図１１Ｂ）。図１１Ｃは、３つの異なる用量で、ｍｉＲＮＡおよびＥＧＦＰを標的化するハンチントンを両方コードするベクターを注射したマウスの例示的な写真を提供する。
【０１６３】
Ｕ６プロモーターからの人工ｍｉＲＮＡの発現はハンチントンのサイレンシングを改善しない
単一コピーの最も強力なｍｉＲＮＡ（HTT-6433）を、Ｕ６プロモーターの制御下でＡＡＶ９ベクターにクローニングした（図５Ａ、下図）。マウスを、最初の２コピーのAAV9-CBA-抗HTT-6433（配列番号ＸＸを含む）、AAV9-CBA-抗HTT-5155、AAV9-U6-抗HTT-6433（配列番号ＸＸを含む）またはAAV9-U6-抗HTT-5155のいずれかを片側注射した。１カ月後、線条体を回収し、ＧＦＰ発現を確認し、ハンチントンｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。人工ｍｉＲＮＡの配列に関わらず、AAV9-U6-抗HTTおよびAAV9-CBA-抗HTTで処置したマウス間で、ノックダウンにおける有意差は観察されなかった。AAV9-U6-抗HTT-6433およびAAV9-CBA-抗HTT-6433で処置したマウスの両方において、注射した側のハンチントンｍＲＮＡの量は、非注射側の量の約５０％であった（図５Ｂ）。
【０１６４】
各動物についての対照として、反対側（非注射側）を使用することにより、動物 対 動物の変動性が低減することに留意すべきである。AAV9-GFPを片側注射したマウスにおいて、少数のＧＦＰ陽性ニューロンが反対側で時々観察され、いくつかのウイルスが非注射側に伝播することが示された。したがって、対照として反対側を使用することは、ノックダウンを過小評価し得る。対照として反対側を使用することによる潜在的な交絡効果を除去するために、実験は、対象としてＰＢＳのみを注射した動物群を使用して反復した。データにより、AAV9-U6-抗HTT-6433およびAAV9-CBA-mir-HTT-6433の両方が、ハンチントンｍＲＮＡを約５０％低減させたことが示された（図５Ｃ）。
【０１６５】
Ｕ６プロモーターからのmir-HTT-6433の線条体の長期発現はマウスにおいて毒性である
AAV9-U6-抗HTT-6433またはAAV9-CBA-抗HTT-6433を、Yac128マウスの線条体に片側注射した。注射の６カ月後、AAV9-U6-抗HTT-6433を注射したマウスは、巣作りせず(not nesting)、いくつかは活動亢進表現型を示したことが観察された。これらの異常を実証するために、各ケージの小さな巣を置き換えた。２４時間後、AAV9-U6-抗HTT-6433の新しい小さな巣は未使用であったが、ＰＢＳおよびAAV9-CBA-抗HTT-6433を注射されたマウスは、予想されたとおり、巣を作製した（図６Ａ）。ホームケージモニタリングシステムを使用して、マウスは、２４時間記録された。AAV9-U6-抗HTT-6433処置したマウスは、ＰＢＳまたはAAV9-CBA-抗HTT-6433処置したマウスよりも、ホームケージを動き回るのに有意に多くの時間を費やした（図６Ｂ）。
【０１６６】
マウスが平均台を渡るのにかかる平均時間もまた測定した。この試験のために、マウスは、平均台の渡りを３回完了する必要がある。平均して、AAV9-CBA-抗HTT-6433処置マウスは、ＰＢＳ注射のみを受容したマウスよりも速く渡る傾向があった（図３および１２Ａ）。AAV9-U6-抗HTT-6433群の４匹の残りのマウスの中で、２匹が首尾よく渡ることはできず、平均台をジャンプするかまたは落下するかのいずれかであった（図１２Ａ）。高齢のYac128マウス（７カ月齢）について実施した第二の実験において、平均台を渡る時間の年齢に関連する増加が観察された。この増加は、ナイーブマウスおよびAAV9-CBA-抗HTT-6433で処置したマウスの両方において存在し、AAV9-U6-抗HTT-6433で処置したマウスにおいて促進された（図１２Ｂ）。
【０１６７】
神経病理学的知見は、上記の行動結果と相関していた。注射側では、AAV9-U6-抗HTT-6433マウスは、脳室の拡大、DARPP-32陽性ニューロンの喪失、および線条体萎縮を示した（図７Ａ〜７Ｂ）。残りの線条体において、これらは、Iba1染色の増加（図８Ａ、下図）、全活性型ミクログリアの増加、および休止ミクログリアの数の減少（図８Ｂ〜８Ｄ）を示した。野生型C57Bl/6マウスおよびFVBマウスに同じベクターを注射し、Ｕ６推進ｍｉＲの結果を評価して、毒性がこの文脈で、変異ハンチントンの存在に依存するかどうかを決定した。FVBマウスにおいて、効果は、平均台についての迅速な変性、および重篤に拡大した脳室を有する、Yac128マウスの効果と類似していた。しかしながら、C57BL6マウスにおいて、効果は存在したがあまり明白ではなかった。Ｕ６コホートにおいて平均台を渡る時間は最初増加したが、スタディの終わりでは、群間で有意差はなかった（図１３Ａ）。線条体萎縮は、C57BL6マウスにおいてあまり重篤ではなかった（図１３Ｂ）。
【０１６８】
Ｕ６プロモーターからのハンチントン標的化人工ｍｉＲＮＡの発現はハンチントン標的化小分子ＲＮＡの過剰発現を生じる
マウスの群に、Ｕ６およびＣβＡプロモーターから人工ｍｉＲＮＡを発現するscAAV9ベクターで片側注射した。注射の２週間に生成された小分子ＲＮＡをクローニングして配列決定した。両方の群において、ＡＡＶゲノムにマッピングする配列の９６パーセントは、予想される小分子ＲＮＡ産物にマッピングし、わずか数パーセントのみが不正確なDicerまたはDrosha切断を表していた。Ｕ６プロモーター推進人工ｍｉＲＮＡを注射した群において、ハンチントン標的化配列は、配列決定の結果を支配し、マッピング可能な全ての配列の半分（５０％）を占めていたが、ＣＢＡベクターを注射したマウスでは、配列の５％のみが、ベクターにコードされる小分子ＲＮＡに適合していた（図９Ａ）。よって、潜在的に、センス鎖および翻訳スリップ生成物を含む、代替的なシード配列を有する小分子ＲＮＡは、機能的な内因性ｍｉＲＮＡのものと比較可能なレベルで存在し得る（図９Ａ）。ハンチントン標的化小分子ＲＮＡの相対的な量は、ｑＰＣＲによって測定し、ハンチントン標的化配列の過剰発現を確認した。小分子ＲＮＡの発現は、Ｕ６プロモーター推進構築物で注射したマウスにおけるよりも１５０〜２５０倍高いことが観察された（図９Ｂ）。
【０１６９】
内因性ｍｉＲＮＡ ３０配列を、人工ｍｉＲＮＡのための足場として一般的に使用する。この足場由来のisomirプロファイルがより好ましいかどうかを決定するために、我々は、miR-30バックボーンに抗HTT-6433配列を包埋させ、１０週齢のYac128マウスに注射した（図９Ｃ）。mir-30足場は、ＣβＡプロモーターによって産生されるものと比較可能なレベルの成熟人工ｍｉＲＮＡを生成し（図９Ａ）、ヒトハンチントンを５０％近くまで低減させる。mir-155足場とは異なり、mir-30足場は、アンチセンス（ガイド）鎖と比較可能なレベルで、成熟センス（パッセンジャー）鎖を生成する。ＣβＡプロモーターとmir-155バックボーンとの組合せにより、バックグラウンドを超える意図されたアンチセンス鎖のみを生成する（図９Ａ）。
【０１７０】
サンプル中の読み取りデータの半分超が、ＡＡＶコード人工ｍｉＲＮＡにマッピングされ得るが、ハンチントンを標的化する人工ｍｉＲＮＡの過剰発現は、内因性ｍｉＲＮＡの分布に対する影響は最小限であった（図１４Ａ〜１４Ｂ）。実際に、最も大きな差異は、注射群を非注射側（反対側）と比較した場合に観察され、注射自体が、ｍｉＲＮＡプロファイルにおける局所変化を生成することが示唆された。このことは、経時的に解消し得る傷害に対する局所的な免疫応答を反映し得る。
【０１７１】
Ｕ６プロモーターからのハンチントン標的化人工ｍｉＲＮＡの発現は複数のｍＲＮＡの発現を妨害する
AAV9-U6-抗HTT-6433またはAAV9-CBA-抗HTT-6433のいずれかで処理したマウスの線条体のＲＮＡ配列分析を実施して、ハンチントン標的化ｍｉＲＮＡの過剰発現の結果を調査した。注射の２週間後、注射側および非注射側の線条体ｍＲＮＡプロファイルを比較した。データは、CBA-mirHTT-6433で処置したマウスにおいて有意差がほとんどないことを示す（図１４Ａ）。AAV9-U6-抗HTT-6433で処置したマウスにおいて、処置に応答して、増加するｍＲＮＡおよび減少するｍＲＮＡの両方が観察された（図１４Ｂ）。AAV9-U6-抗HTT-6433およびAAV9-CBA-抗HTT-6433のプロファイルが、２週間の時点で比較される場合、８つのみのｍＲＮＡが、２つの群間で、有意に差次的に発現されることが観察された。
【０１７２】
ＲＮＡは、人工ｍｉＲＮＡについて予測される標的部位の存在または非存在に従って分類し、標的部位が存在するかまたは存在しないｍＲＮＡの累積的分布の変化をプロットした。AAV-U6-6433を注射したマウスにおいて、最も豊富なＡＡＶ由来小分子ＲＮＡ種に適合する完全８マー標的部位を、その３’−ＵＴＲにおいて含む遺伝子のダウンレギュレーションに向かう小さなシフトが観察された（図１０Ｂ）。このシフトは、AAV-CBA-6433を注射したマウスでは明らかではなかったし（図１０Ａ）、他のＡＡＶ由来小分子ＲＮＡ種のいずれの注射でも明らかではなかった（図１５Ａ〜１５Ｃ）。
【０１７３】
例３：ヒツジインビボ実験
ヒトハンチントン病のヒツジモデルをこの例において使用した。簡潔には、ヒトハンチントン（ヒトhtt）タンパク質を発現するトランスジェニックヒツジを作製した。ヒツジに、scAAV9 CBA-mir-HTT（「CBAプロモーター」）、scAAV9 U6-mir-HTT（「Ｕ６プロモーター」）、または空のscAAV9対照ベクターのいずれかを線条体内注射した。各構築物は、それぞれＣＢＡプロモーターまたはＵ６プロモーターとβグロブリンポリアデニル化配列との間に存在するイントロン内に位置するmir-155バックボーンに挿入された、単一コピーの抗ハンチントン mir-6433配列（配列番号７）を含む。この実験において投与されたｒＡＡＶを生成するために使用された構築物は、配列番号１８（scAAV9 CBA-mir-HTT）および１９（scAAV9 U6-mir-HTT）に規定される。
【０１７４】
ヒツジは、注射の１カ月後または６カ月後のいずれかに屠殺した。組織および核酸サンプルを調製し、定量的PCRおよび免疫組織化学によって分析した。
【０１７５】
データは、１カ月の時点において、Ｕ６プロモーター下で発現されるmir-HTTの注射により、非注射および空のscAAV9注射対照マウスと比較して、ヒツジの尾状中央部および被殻中央部の両方において、htt発現の低減を生じたことを示す。図１６は、scAAV9 U6-mir-HTTの注射の１カ月後のヒツジの尾状中央部におけるヒトｈｔｔ発現の低減に関するデータを示す。図１７は、scAAV9 U6-mir-HTTの注射の１カ月後のヒツジモデルの被殻中央部におけるヒトハンチントン発現の低減に関するデータを示す。先の例に記載されたマウスモデルと異なり、Ｕ６プロモーターから発現されたmir-HTTは、ハンチントン病のヒツジモデルにおいて毒性ではなかったことに留意すべきである。
【０１７６】
データは、６カ月の時点において、ＣＢＡプロモーター下で発現するmir-HTTの注射により、非注射および空のscAAV9注射対照マウスと比較して、ヒツジの尾状中央部および被殻中央部の両方において、ｈｔｔ発現の低減を生じたことを示す。
【０１７７】
図１８および図１９は、ヒツジの尾状中央部の内側（図１８）および外側（図１９）におけるヒトｈｔｔ発現の低減に関連するデータを示す。データは、ＣＢＡプロモーターから発現されるmir-HTTが、脳の非注射側および空のscAAV9注射対照マウスと比較して、脳の注射側におけるｈｔｔ発現の低減を引き起こすことを示す。ＣＢＡおよびＵ６プロモーターからのmir-HTTの発現の尾状中央部におけるｈｔｔのサイレンシングに対する影響はまた、注射の６カ月後と比較した。データは、Ｕ６プロモーターまたはＣＢＡプロモーターのいずれかから発現されたmir-HTTは、非注射および空のscAAV9注射対照動物と比較して、尾状中央部におけるヒトhtt発現の低減を生じたことを示す（図２０）。
【０１７８】
図２１および２２は、注射の６カ月後のヒツジの被殻中央部の外側（図２１）および内側（図２２）におけるヒトｈｔｔ発現の低減に関するデータを示す。データは、ＣＢＡプロモーターから発現されたmir-HTTが、脳の非注射側および空のscAAV9注射対照マウスの非注射側と比較した場合、脳の注射側においてヒトｈｔｔ発現の低減を引き起こすことを示す。ＣＢＡおよびＵ６プロモーターからのmir-HTTの発現の尾状中央部におけるｈｔｔのサイレンシングに対する影響はまた、注射の６カ月後と比較した。データは、Ｕ６プロモーターまたはＣＢＡプロモーターのいずれかから発現されたmir-HTTは、非注射および空のscAAV9注射対照動物と比較した場合、被殻中央部におけるヒトｈｔｔ発現の低減を生じたことを示す（図２３）。
【０１７９】
図２４は、scAAV9 CBA-mir-HTT（「ＣＢＡプロモーター」）、scAAV9 U6-mir-HTT（「Ｕ６プロモーター」）、または空のscAAV9対照ベクターのいずれかの線条体内注射の６カ月後の、ハンチントン病のヒツジモデルの線条体の前側におけるヒトハンチントン（ヒトｈｔｔ）ＲＮＡの相対的な発現を示す。
【０１８０】
例４：人工ｍｉＲＮＡはハンチントン病のトランスジェニックヒツジモデルにおける線条体全体でヒト変異体ハンチントンを低減させる
動物および動物手順
メリノヒツジをこの例において使用した。麻酔の投与前に、動物は、終夜約８時間絶食させた。動物は、心拍数、呼吸数、体温および重量を含む手術前の身体的特徴を得た。血清（５ｍｌ）およびＣＳＦのベースラインサンプルを収集した。
【０１８１】
スタディは、２つの異なるヒツジのコホートを用いて二部で行った。第一のスタディについて、約８カ月齢の４１匹のトランスジェニック動物（２１匹の去勢した雄羊(Wether)、２０匹の出産を経験した雌羊(Ewes)）に、３００μｌの自己相補的なAAV9（scAAV9）ベクターを、全３×１０１２ゲノムコピーについて１×１０１３ｇｃ／ｍｌの力価で片側注射した。第二のスタディのために、１４週齢の１４匹の動物にこのベクターを注射し、１４匹の動物に対照ベクターを注射した。ガドリニウムをベクター処方物に添加して、注射伝播の手術後のイメージングを可能にした。動物は手術室に移動させ、手術のために準備した。これらは、低反発クッションに四肢を折りたたみスフィンクス位置に休息させるか、または四肢をぶらぶらさせて休息させた。定位フレーム（Kopf、大動物）を使用して動物の頭を固定した。脳脊髄液を、１９ゲージの脊髄穿刺カニューレを使用して、脊椎穿刺を介して収集した。ｒＡＡＶを、線条体に直接送達して、内部嚢を標的化した。動物の頭は剃毛し、ベタダインを用いて調製し、透明なプラスチックでドレープした。
【０１８２】
曲線切開は、＃１５メスを使用して行い、前項を露出させた。一旦前項を同定すると、３〜４ｍｍの穿頭孔を、電気ドリルを使用して、前項の１０ｍｍ吻側、および正中線の１１ｍｍ外側に配置した。対流強化送達（ＣＥＤ）カニューレ（MRI Interventions, Irvine, CA）をマニピュレーターに固定し、注射される剤を用いてプライミングして線から空気を除去した。硬膜を＃１１メスを使用して１．５ｍｍ切開を用いて開け、ＣＥＤカメラを硬膜表面から標的の深さまで２５ｍｍ進めた。外側カニューレ（１．６５ｍｍ）は、硬膜切開を密封し、灌流の間のＳＣＦ漏出を防いだ。灌流は、カニューレ挿入の５分後に開始し、先端の周りの組織が安定化させた。灌流速度は、総容積３００μｌが注射されるまで、３．３３μｌ／分に設定した。注入完了の１０分後、カニューレをゆっくり取り出し、骨ろうプラグを使用して頭蓋骨を修復し、ＣＳＦ漏出を防いだ。創傷を生理食塩水で清浄し、３．０ビクリル縫合を使用して閉鎖した。標準的な麻酔の起床および回復手順に従った。
【０１８３】
手術後ＭＲＩを実施して、ガドリニウムの拡散を測定した。第一のスタディからの１匹の動物は、画像化の際にガドリニウムが可視化できなかったので、以下の手術から除外し、第二のスタディからの第二の動物は、ガドリニウムが主に脳室に存在するようであったので除外した。手術後、動物は、３日間の観察下に維持し、５日間室内に収容した。次いで、これらを室外および屋外の小屋のパドックにスタディの残りの期間移した。動物は、スタディの間ずっと不安の兆候および行動の変化について視覚によりモニタリングした。二匹の動物は、外科的合併症に罹患し、部分的な肢の麻痺を生じた。これは、麻酔下の動物のポジショニングに起因すると考えられた。一匹は初期に麻酔され、一匹は、６カ月から１カ月のコホートに移された。動物は、注射後の期間ずっと周期的に重量測定し、脳脊髄液、血液および血清のサンプルを採取し、さらなる分析のために保存した。
【０１８４】
細胞の計数および差次(differential)のために、血液を、頸静脈穿刺を介してカリウムＥＤＴＡ血液採取管（Lavender top；ＬＴ）に収集し、差次（CBE differential）を用いて完全な血液調査を実施した。臨床化学のために、血液を、経静脈穿刺を介して血清収集チューブ（red top；ＲＴ）に採取した。サンプルは、複数の生化学的分析（ＭＢＡ）のために提出した。
【０１８５】
注射の１カ月後および６カ月後、動物を回収して、組織学的または生化学的分析のいずれかに使用した。動物は、手術テーブルに移して、約６ｍＬのＣＳＦが回収される間、腹側横臥位に配置した。動物は、背側横臥位に再配置した。頸動脈を露出させ、カニューレの先端から４ｃｍの深さでカニューレ処置した。頸静脈を露出させ、２００〜５００Ｕヘパリン／ｋｇを頸静脈に注射した。ヘパリン投与の５分後、ヒツジは、１ｍｌ／２ｋｇ重量で、Lethabarb（３２５ｍｇペントバルビタールナトリウム／ｍｌ）の静脈内注射によって安楽死させた。注入ポンプは、冷９％ＮａＣｌでプライミングし、頸動脈カニューレに接続した。動物は、５００ｍｍＨｇの圧力で、約８Ｌの冷９％ＮａＣｌを用いて灌流した。組織学のために、注入は、５００ｍｍＨｇの圧力で、８Ｌの４％パラホルムアルデヒドに切り替えた。脳および肝臓を抽出した。組織は、４℃で２４時間、４％パラホルムアルデヒドに後固定(post-fixed)し、４℃で最小１４日間、１×リン酸緩衝化生理食塩水中の３０％スクロースに移した。
【０１８６】
ＲＮＡ、タンパク質、およびＤＮＡアッセイのために、ヒツジは、上記のように、冷９％ＮａＣｌで灌流させた。末梢組織の収集は、以下の順序で実施した：肝臓、副腎、卵巣（適用可能な場合）、筋肉および心臓。相互混入は、異なる機器の使用、並びに、１０％漂白剤および７０％エタノールを用いる剖検表面の洗浄によって防止した。臓器は、身体から取り出し、３ｍｍの生検パンチを使用してサンプルを収集した。全１０サンプルを各器官から収集し；２つのサンプルを液体窒素で即座に凍結し、８つのサンプルを、後に４℃で２４時間、ＲＮＡで保存した（肝臓、筋肉および心臓サンプルについて後に３００μｌのＲＮＡ、副腎および卵巣サンプルについて後に５００μｌのＲＮＡ）。
【０１８７】
脳は、環状のこぎりおよび骨鉗子を使用して頭蓋骨から取り出した。抽出後、脳を秤量して、カスタムメードのプレキシガラス脳マトリックス中に腹側配置した。９回の切断を脳に行い、４つの６ｍｍブロックで線条体を完全に含んでいた。第一の切断を、嗅球付着の後側に行い（マトリックスの始まりから約１８ｍｍ）、引き続く４回の切断を６ｍｍ間隔で行った。線条体を、後側から前側に４つの６ｍｍブロックに分割した：２ｐ（後側）、２ｍ１（内側１）、２ｍ２（内側２）および２ａ（前側）。線条体切開は、次の順序で実施した：２ｐ、２ｍ１、２ａ。右（非注射）半球の線条体は、全てのブロックで最初に切開し、メスは半球間で交換した。切開は、ドライアイス上のペトリ皿中で実施し、線条体組織からできるだけ多くの白質を取り出すように注意した。一旦切開されると、線条体断片（尾状および被殻）を半分に分割した；中央の断片（ブロックの正中線に最も近い）は、後に４℃で１ｍｌのＲＮＡで貯蔵し、外側切片は、液体窒素で即時凍結した。ＣＢＡスタディにおける６カ月のコホートについての線条体切開は、尾状および被殻の両方から４つの線条体サンプルを生成する様式で行った。背側切片（内側および外側の両方）は液体窒素で即時凍結させ、腹側切片（内側および外側）は後に４℃で１ｍｌのＲＮＡに貯蔵した。ＲＮＡは、後に２４時間後に取り出し、サンプルは、−８０℃で貯蔵した。
【０１８８】
２ｍ２ブロックは、ＯＣＴを用いてカバーし、２−メチルブタンおよび乾燥氷浴中で凍結した。残りの２ａ、２ｍ１、および２ｐブロックは、同様に凍結した。１０の皮質サンプルは、各ブロックから背側から腹側の様式で採取した；２つは液体窒素中に凍結し、８つは、後に４℃で１ｍｌ ＲＮＡで貯蔵した。
【０１８９】
組織学的分析のための組織の薄片作成
組織学的分析のための組織の薄片作成の前に、線条体を、ＯＣＴで優しくカバーした脳から単離し、２４時間、−２０℃で貯蔵した。４０μｍの厚みのある冠状切片を、線条体全体を通して、スライドするミクロトーム（Reichert-Jung Tetrander sliding microtome）用いて切断した。切片は、４℃で１×リン酸緩衝化生理食塩水中の０．０１％アジ化ナトリウム中に貯蔵した。
【０１９０】
ベクタークローニングおよびｒＡＡＶ９産生
第一のスタディのために、試験ベクターは、内因性mir155バックボーン（AAV9-U6-miRHTT）に基づいて人工ｍｉＲＮＡを推進するＵ６プロモーターを含んでいた。この人工ｍｉＲＮＡは、ヒツジではなく、ヒトハンチントンを標的化する。キメラサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター推進キメライントロンは、ＡＡＶパッケージングを改善するために含まれた。対照ベクター（ＡＡＶ９）は、空のＣＢＡプロモーターのみおよびイントロンを含んでいた。第二のスタディのために、試験ベクターは、ＣＭＶエンハンサーおよびＣＢＡプロモーター、イントロンおよびmiRNA-155ベースの人工ｍｉＲＮＡ（AAV9-CBA-miRHTT）を含んでいた。
【０１９１】
パッケージングのために、ｒＡＡＶベクタープラスミド、パッケージングプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドを、HEK293細胞に同時トランスフェクトした。パッケージングプラスミドは、制御性およびＡＡＶ９カプシドタンパク質を発現し、ｒＡＡＶベクタープラスミドからＡＡＶビリオンへの組み換えゲノムの切除、複製、およびパッケージングを導く。組換えウイルスは、標準的なＣｓＣｌ勾配沈降によって精製され、透析によって脱塩される。
【０１９２】
ハンチントンｍＲＮＡレベルの分析
後に保存されたＲＮＡサンプル中のＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ｂＤＮＡ）を使用して分析した。サンプルは、後にＲＮＡで貯蔵される組織からの組織ホモジネートの調製のための製造業者のガイドラインに従って処理した（Affymetrix eBioscience, Quantigene（登録商標）Sample Processing Kit）。ホモジナイズしたサンプルは、ｂＤＮＡアッセイのための製造業者のガイドラインに従って分析した（QuantiGene（登録商標） 2.0 Reagent System）。サンプルは、ヒトハンチントン（Human HD、QuantigeneからのSA-50339 from）、ヒツジハンチントン（Sheep Huntingin、QuantigeneからのSF-10586 from）、およびハウスキーピング遺伝子としてのヒツジカルネキシン（Sheep Calnexin、QuantigeneからのSF-10622 from）を検出するためのプローブを用いて分析した。アッセイ結果は、Tecan Infinite M1000 PRO ルミノメーター（統合時間は２００ｍｓに設定）を用いて測定した。
【０１９３】
miR-Httレベルの分析
生検パンチ（２ｍｍ）を、凍結ブロックからの、外側尾状および内側被殻からサンプリングした。ＲＮＡ抽出は、いくらか改変したTRIzol製造業者ガイドライン（Ambion）を使用して実施した。TRIzol抽出中の相分離後、水相をRNA Clean & Concentrator（Zymo）カラムに移し、そのプロトコールに従った。ＲＮＡは分析まで−８０℃に貯蔵した。ＲＮＡの量および濃度は、Fragment Analyzer  （Advanced Analytical Technologies Inc.）に基づいて測定した。分析の直前に、ＲＮＡを２０ｎｇ／μｌに希釈した。人工ｍｉＲＮＡガイド鎖は、製造業者の指示書に従って、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Cat# 4366596、Thermo Scientific）、２μｌのＲＮＡおよびガイド鎖特異的ステムループプライマー（ThermoFisher custom assay targeting UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCU（配列番号２５）またはassay id 002407、let7e*）を使用して逆転写した。ｄｄＰＣＲ反応は、５μｌのＲＴ生成物、１×濃度のmiR-Httアッセイおよび０．３×濃度のlet-7e*アッセイを使用して設定し、マルチプレックスを可能にした。液滴は、QX200 Droplet Generator（Cat# 1864002、Biorad）を用いて産生し、エンドポイントＰＣＲ増幅（４０サイクル）後の陽性シグナルについてモニタリングした。miRHTTの相対発現を、miRHTTおよびlet-7e*の絶対濃度間の比を算出することによって決定した。
【０１９４】
ベクターゲノム分布
ゲノムＤＮＡは、Gentra Puregene Tissue kit（Qiagen）を使用して、液体窒素中で即時凍結したサンプルから抽出した。ゲノムＤＮＡ濃度は、NanoDrop ONEc分光光度計を使用して測定した。Droplet Digital PCR  （ｄｄＰＣＲ、Biorad）を、インプットとしての５０ｎｇのＤＮＡおよびTaqManアッセイを使用して、製造業者の推薦に従って実施し、ベクター特異的ＣＢおよびＵ６プロモーターおよびＨＰＲＴ参照遺伝子を検出した。結果は、二倍体ゲノム当たりのベクターゲノム（ｖｇ／ｄｇ）として表す。
【０１９５】
ハンチントンタンパク質レベルの分析-ｍＨＴＴについてのMesoscale Detection Assay（MSD）
線条体サンプルは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤（Roche）から構成される緩衝液中でホモジナイズし、１０％振幅で１０秒間超音波処理した。タンパク質濃度は、Bradfordアッセイを使用して測定した。９６ウェルQuicPlex標準プレート（MSD）を、４℃で終夜、ＰＢＳ中ウサギモノクローナル抗HTTプロリン1220領域抗体（D7F7、Cell Signaling、１：２５０）でコーティングした。プレートは、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ Tween20）を用いて、３×１０分洗浄し、ＲＴで２時間、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。ＰＢＳＴで３×１０分洗浄した後、２５μＬの均質化緩衝液またはブランク（均質化緩衝液）中に２０μｇのタンパク質を含む技術的二連のサンプルをプレートに分配して、オービタルシェイカー上で、４℃で終夜インキュベートした。プレートは、ＰＢＳＴ中で３×１０分洗浄し、以下のとおり、二次／検出抗体ミックス中でインキュベートした：ｍＨＴＴの検出のために、マウスモノクローナル抗ポリＱ抗体MW1（DSHB）を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬの各抗体で、抗マウスSulfoTag検出抗体（MSD）と混合した。１ウェル当たり３０μＬの検出抗体ミックスを適用し、オービタルシェイカー上で、ＲＴで３時間インキュベートした。プレートは、ＰＢＳＴ中３×１０分洗浄し、１ウェル当たり１５０μＬの２×Read Buffer（MSD）を、QuickPlex SQ120（MSD）での読み取りの直前に適用した。
【０１９６】
ウエスタンブロッティング
組織小片を、凍結ブロックから取り出し、２００μｌ １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ＋プロテアーゼ阻害剤タブレット（mini, complete, EDTA-free Roche #11836170001）中、氷上でホモジナイズした。サンプルは、１０秒間超音波処理し、タンパク質濃度は、Bradford方法（BioRad #500-0006）を使用して決定した。同濃度のタンパク質（２５μｇ）を３〜８％Tris-Acetateゲル（Life Technologies #EA03785BOX）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、TransBlot Turbo（BioRad）を使用してニトリセルロースに移した。ブロットは、トリス緩衝化生理食塩水中の５％脱脂粉乳＋０．１％ Tween-20（ＴＢＳＴ）中で１時間ブロックし、ブロッキング溶液中で４℃で、一次抗体中に終夜インキュベートした。使用された一次抗体は以下であった：抗ポリＱ（MW1、Coriell、１：５００または3B5H10、Sigma、１：１０００）、抗ハンチントン（MAB2166、EMD Millipore、１：１０００またはAb1、DiFiglia et al., 1995、１：１０００）、抗DARPP32（#ab40801、Abcam、１：１０，０００）、抗アクチン（A4700、Sigma、１：１０００）、および抗スペクトリン（MAB1622、EMD Milliopore、１：４０００）。ブロットは、ＴＢＳＴ中で洗浄し、ブロッキング溶液中１：５０００希釈したペルオキシダーゼ標識二次抗体中に室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で洗浄し、そして、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Pierce #34080）中でインキュベートした。画像は、ＣＣＤ画像化システム（Alpha Innotech）およびHyperfilm ECL（GE Healthcare）を用いて得た。濃度測定は、ImageJ software（NIH）を使用するデジタル画像で実施した。統計学的分析は、独立ｔ検定を使用して実施し、結果は、注射側の平均値として表した。
【０１９７】
DARPP32、NeuN、およびIba1についての免疫組織化学
DARPP32陽性細胞を定量するために、２０番目毎の切片を、１×ＰＢＳ中３％過酸化水素中で３分間、０．５％ Triton-X-100中で２０分間、次いで、１×ＰＢＳ中１．５％正常ヤギ血清（Vector Labs、S-1000）中で４時間インキュベートした。切片は、４℃で終夜、１．５％正常ヤギ血清中抗DARPP32（AbCam、ab40801、１：１，０００希釈）中にインキュベートした。次いで、切片は、１×ＰＢＳ中ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Vector Labs、AP-1000、１：２００希釈）中に１０分間インキュベートした。切片は、１×ＰＢＳ中、Vectastain Elite ABC Kit（Vector Labs、PK-6100）からの２％ Elite Aおよび２％ Elite B試薬とともに５分間インキュベートした。Metal Enhanced DAB kit（ThermoFisher Scientific、34065）を使用して、DARPP32陽性細胞を可視化した。切片は、安定なペルオキシド緩衝液中の１×３，３’−ジアミノベンジジン中にインキュベートした。
【０１９８】
NeuN陽性細胞を定量するために、２０番目毎の切片を、１×ＰＢＳ中３％過酸化水素中に３分間、０．５％ Triton-X-100中に２０分間、次いで、１×ＰＢＳ中１．５％正常ヤギ血清（Vector Labs、S-1000）中に４℃で終夜インキュベートした。切片は、１．５％正常ヤギ血清中抗NeuN（Chemicon、MAB377、１：１，０００希釈）中で４℃で１時間インキュベートした。次いで切片は、蛍光AF594ヤギ抗マウスＩｇＧ（ThermoFisher Scientific、A-11005、１：２，０００希釈）中に４０分間インキュベートし、NeuN陽性細胞を可視化した。
【０１９９】
Iba1陽性細胞を定量するために、２０番目毎の切片を、１×ＰＢＳ中、５％正常ヤギ血清（Vector Labs、S-1000）、１％ウシ血清アルブミン（Sigma、A-3059）、０．２％ Triton-X-100、および０．０３％過酸化水素の溶液に１時間インキュベートした。切片は、５％正常ヤギ血清（Vector Labs、S-1000）中の抗Iba1（Wako Chemicals、019-19741、１：１，０００希釈）および１％ウシ血清アルブミン（Sigma、A-3059）中に終夜４℃でインキュベートした。切片を、１×ＰＢＳ中ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Vector Labs、AP-1000、１：２００希釈）で１０分間インキュベートした。切片は、１×ＰＢＳ中の、Vectastain Elite ABC Kit（Vector Labs、PK-6100）からの２％ Elite Aおよび２％ Elite B試薬とともに５分間インキュベートした。Metal Enhanced DABキット（ThermoFisher Scientific、34605）を使用して、安定なペルオキシド緩衝液中の１×３’，３−ジアミノベンジジン中に切片をインキュベートすることにより反応を可視化した。
【０２００】
脳の左および右半球におけるDARPP32およびIba1陽性細胞の定量は、Nikon Eclipse E600顕微鏡を用いる各切片の画像（DARPP32について２０×およびIba1について４０×）を撮影することにより行った。異なる切片間の画像を一貫して捕捉するために、第一の画像を線条体の内側の背側端で捕捉し、ステージを腹側に０．５ｃｍ移した。一旦腹側端に達すると、ステージは、１０の画像が捕捉されるまで、０．５ｃｍ外側におよび０．５ｃｍ背側に移動した。ランダムな数字を各画像に割り当て、細胞を定量化する際の偏見を除去した。細胞は、ImageJ software（NIH）を使用して計数した。
【０２０１】
NeuN陽性細胞の定量は、６０×でChiu Technical Corporation Mercury 100-W lampを用いて、Nikon Eclipse E600を使用して実施した。DARPP32およびIba1画像を捕捉するために使用した立体解析学的方法もまた使用して、NeuN陽性細胞を定量化した。
【０２０２】
各切片についての線条体、尾状および被殻の領域を、線条体全体にわたる（１動物当たり１つの側あたり２９〜３５切片）２０番目毎の切片の注射側および非注射側について、ImageJソフトウェア（NIH）を使用してDARPP32染色領域を手動で循環させることによって測定した。観察者は、条件を知らされていない(blinded)。各領域についての総容積は、面積に、スライド間の切片の数（２０）を乗じ、切片の厚さ（４０ミクロン）を乗じ、各動物について一緒に足すことによって決定した。統計学的分析は、マイクロソフトエクセル、対応および不対ｔ検定、１群あたりN=3または４動物を使用して実施した。
【０２０３】
ベクターゲノムおよび注射後のmiRNA分布
ＨＤのノックインモデルにおける拡大されたマウスハンチントンおよびＨＤのトランスジェニックマウスモデルにおけるヒトｍＨＴＴ導入遺伝子ｍＲＮＡのサイレンシングを観察した。この例において、２つのコホートのＨＤヒツジ（スタディ１およびスタディ２）は線条体に片側注射した。スタディ１において、scAAV9-U6-miRHTT（AAV9miRHTT）または非コードスタッファー配列がプロモーターとポリＡシグナルとの間に挿入されているscAAV9-CBA-empty（ＡＡＶ９）を、８〜９カ月齢のヒツジに注射した。スタディ２において、ヒツジは、１４カ月齢で、scAAV9-CBA-miRHTTまたはscAAV9-CBA-empty（ＡＡＶ９）を注射した。脳は、AAV9-miRHTT投与の１カ月後または６カ月後に回収した。
【０２０４】
ゲノムコピーを、液滴デジタルＰＣＲ（ddPCR、図２６Ｂ）によって、サブセットの領域（図２６Ａ）において決定した。ゲノムコピーは、非注射側と比較して、尾状および被殻において最も高く、注射の１カ月後および６カ月後にscAAV9-U6-miRHTT処置群において最もレベルが高かった。少量のベクターゲノムが、皮質および肝臓に存在し、副腎においては検出不可であった（図２６Ｂ）。
【０２０５】
ＲＮＡ量は、RNA Quality Number（ＲＱＮ）と呼ばれるスコアを生じるフラグメントアナライザーを使用して測定した。ＲＱＮは、電気フェログラムを分析することによって生成され、２８Ｓリボソームと１８Ｓリボソームとの間のピークの鋭さおよびベースラインの比率などの、ＲＮＡ完全性の異なる多数の測定値を統合する。スコアは一般に、０（完全に分解）から１０まで変化する。５を超えるスコアを有するサンプルを使用して、人工ｍｉＲガイド鎖のレベルを分析した。スタディ１からの２匹の動物およびスタディ２からの２匹の動物は、低いＲＱＮスコアのために分析から除外した。人工ｍｉＲＮＡガイド鎖のレベルは、ｄｄＰＣＲを使用して測定し、内因性let7e*に対して正規化した（図２７）。人工ｍｉＲアンチセンス鎖の相対的な量は、非注射側よりも注射側で３．５〜１０００倍高く、注射の６カ月後と比較して１カ月後で高かった。ｍｉＲＮＡガイド鎖は、AAV9-miRHTTの注射と反対側に低レベルで検出された。
【０２０６】
scAAV9-miRHTTの単一長期投与により尾状および被殻におけるヒト変異ハンチントンmRNAを低減させる
前線条体および線条体中央部におけるＨＴＴ ｍＲＮＡは、ヒツジではなくヒトＨＴＴ ｍＲＮＡを特異的に認識する分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイを使用して測定した。このアッセイは、ＲＮＡ単離を必要とせず、全てのサンプルが分析に含まれる。注射の１カ月後、ブロック中央部における注射に最も近く、scAAV9-U6-miRHTT（スタディ１）は、尾状および被殻の両方において、５０％を超えて、ヒトＨＴＴ ｍＲＮＡを低減させた（図２８）。有意なサイレンシングは、注射部位からさらに離れている、前線条体において検出されなかった（図２８）。注射の６カ月後、ｍＲＮＡサイレンシングは、尾状において明白であった（図２８）。scAAV9-CβA-miRHTTコホートにおいて（スタディ２）、ＨＴＴ ｍＲＮＡの顕著なサイレンシングが、注射の１カ月後、尾状中央部、被殻中央部、および前線条体において発生し（図２８）、注射の６カ月後、尾状中央部においておよび被殻中央部の一部において発生した。前線条体は、６カ月において有意な低下を示さなかった。内因性ヒツジＨＴＴ ｍｉＲＮＡの有意なサイレンシングは存在しなかった（図２９Ａ）。
【０２０７】
ウエスタンブロットアッセイおよび電気化学発光（MSDアッセイ）は、scAAV9-miRHTTが尾状および被殻においてヒト変異ハンチントンタンパク質を低減させることを示す
ＨＴＴタンパク質は、同じサンプル調製物において、ウエスタンブロット（図３０）および電気化学発光（Meso Scale Discovery（MSD、図３０））によって検出された。スタディ１では、野生型ＨＴＴと比較してｍＨＴＴ（変異ＨＴＴ）を優先的に検出する3BH510抗体を使用して、ウエスタンブロット（図３０）によりｍＨＴＴタンパク質を検出した。scAAV9-U6-miRHTTを用いる処置の１カ月後、尾状、被殻、よび前線条体において、そして、処置の６カ月後に被殻において、ｍｉＲＨＴＴを欠くＡＡＶ９での処置と比較して、ｍＨＴＴタンパク質の有意な低減が存在した。スタディ２（図３０、下図）において、scAAV9-CβA-miRHTT処置は、尾状において注射の一カ月後、そして、尾状、被殻および前線条体において注射の６カ月後、ｍＨＴＴを有意にサイレンシングした。
【０２０８】
検出のためにＭＷ１を使用するＳＭＤアッセイの結果は、scAAV9-U6-miRHTT処置（スタディ１）が、処置の１カ月および６カ月後に、尾状、被殻および前線条体において、ｍＨＴＴタンパク質レベルを有意に低下させたことを示す。scAAV9-CBA-miRHTTは、注射の１カ月後に尾状において、そして、処置の６カ月後に尾状、被殻および前線条体において、ｍＨＴＴタンパク質を顕著にサイレンシングした（図３１）。これらの結果は、ＭＳＤアッセイの結果（図３１）とウエスタンブロットアッセイによって得られた結果（図３０）との間に良好な一致が存在することを示す。
【０２０９】
表２:スタディ１および２におけるウエスタンブロットおよびMSDアッセイによる変異ハンチントンタンパク質の低下の平均割合。ヒト変異ハンチントンタンパク質は、スタディ１において抗httポリQ抗体3B5H10、およびスタディ２において、ヒツジHTTを認識しない抗体3B5H10、MAB2166（抗HTT443-456）（Reid et al., 2013）および抗ポリQモノクローナル抗体MW1を用いるウエスタンブロットによって測定した。MSDアッセイにおいて、MW1は、検出抗体として使用した。この表は、尾状、被殻および前線条体についてのｍHTT低下の平均割合を報告する。低下の割合は、AAV9miRHTT処置したヒツジにおける注射側についての平均シグナルを、AAV9単独処置動物における注射側についての平均シグナルで除算することによって計算した。
【０２１０】
【表２】
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【０２１１】
ｍＨＴＴを検出する抗体は異なる感受性を有し得るので、ウエスタンブロットによってヒトｍＨＴＴタンパク質を検出するための他の２つの抗体、MAB2166およびMW1を、スタディ２に含めた（表２）。ＨＤトランスジェニックヒツジにおいて、MAB2166は、ヒトハンチントンのみを認識し、ヒツジＨＴＴを認識しない。MW1は、ＨＴＴにおける拡大ポリグルタミン領域を優先的に認識し、MSDアッセイにおいてｍＨＴＴの検出にも使用された。表２は、３つの抗ｍＨＴＴ抗体（3B5H10、2166、およびMW1）を用いるウエスタンブロットによって、そして、スタディ１および２におけるMW1を用いるMSDアッセイによって検出されるｍＨＴＴの平均低下割合を比較する。ウエスタンブロット分析における３つ全ての抗体は、スタディ２における複数の新線条体領域における有意なｍＨＴＴの低下を検出した（４９％〜８１％）。MSDアッセイによるｍＨＴＴ低下の結果は、同じ線条体領域からの２つのサンプルがスタディ２において使用された場合、一貫していた。ウエスタンブロットによる結果とスタディ２においてMW1を用いるMSDアッセイによる結果との比較はまた、注目に値する。ｍＨＴＴ低下の大きさにおいて、ｍＨＴＴ検出のこれら２つの異なる方法間で、良好な一致が存在していた。
【０２１２】
ウエスタンブロット分析により、AAV9-miRHTTを注射した線条体を覆う皮質は、ＡＡＶ９注射皮質と比較して、ｍＨＴＴタンパク質レベルの減少を示さなかった（図３２Ａ）。低レベルのｍＲＮＡガイド鎖は、AAV9-miRHTT注射線条体の反対側の尾状および被殻において検出された。これらの領域は、ウエスタンブロット分析によってｍＨＴＴタンパク質レベルの減少を示さなかった（図３２Ｂ）。
【０２１３】
ヒトＨＤ遺伝子に対するAAV9-miRHTTを用いる処置が、内因性ヒツジＨＴＴのレベルに影響するかどうかを調査するために、ヒト導入遺伝子ｍＨＴＴのレベルと、内因性ヒツジＨＴＴのレベルを、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上の２つのタンパク質の移動の差異を利用するウエスタンブロット分析を使用して、直接比較した（図２９Ｂ）。htt1-17を認識するAb1抗体を用いるウエスタンブロット分析は、ヒトｍＨＴＴではなく、内因性ヒツジＨＴＴが、miRHTTでの処置によって低下されないことを示した（図２９Ｂ）。
【０２１４】
DARPP32標識ニューロンおよび線条体容積はｍｉＲＮＡ処置によって影響されない
ＡＡＶベクターの注射の安全性を調査するために、中型有棘神経細胞のマーカーであるDARPP32についての免疫組織化学を実施して、DARPP32陽性細胞の数を計数した。AAV9-miRHTT処置群の細胞数とAAV9処置群の細胞数との間に有意差は存在せず（表３）、神経細胞のマーカーであるNeuNについて染色された細胞の数の処置群間に有意差は存在しなかった。線条体容積は、DARPP32標識切片における線条体の断面領域の測定値を使用して決定し、ｍｉＲＮＡ処置後、対照と比較して変化していないことが見い出された（表４）。
【０２１５】
表３：DARPP32およびNeu N陽性細胞の数。データは、片側ｔ検定によって分析した（非注射側に注射）。注射の６カ月後に、AAV9-CBA-miRHTTを注射されたＷＴヒツジのみにおいて、注射側と非注射側との間に有意差が見られた。対応ｔ検定による1p=0.002。
【表３】
2019533439.tif 000005
【０２１６】
表４：線条体容積。容積は、１群あたりN=3ヒツジ、１匹の動物あたりの１側あたりの２９〜３５の４０μｍ切片の断面積から決定した。対応ｔ検定を使用して1p=0.01、2p=0.03、3p=0.02。
【表４】
2019533439.tif 000006
【０２１７】
scAAV9での直接注射後に、活性型マイクログリアの一過性の増加が生じる
マイクログリアに局所化して活性化の際にアップレギュレートされるタンパク質である、Iba1の免疫組織化学的局在化を調査した。標識された細胞は、休止または活性型マイクログリアとして形態に基づいて同定された（表５）。scAAV9-U6-miRHTTまたは対応する対照ベクターの注射により、注射の１カ月後に注射部位における活性型マイクログリアの数を増加させたが、注射の６カ月後、注射側および非注射側は区別できなかった。第二のスタディにおいて、マイクログリア応答は、スタディのエンドポイント（６カ月）においてのみ調査し、この時点では、群間で有意差は存在しなかった。この発見は、活性型マイクログリアにおける一過性の増加は、ＡＡＶカーゴと独立しており、ベクターまたは手術単独で生じ得ることを示唆する。
【０２１８】
表５:IBA1陽性細胞の数および形態に基づく分類。統計学的分析は、対応ｔ検定によって行った（注射側 対 非注射側）。非注射側と比較して注射側上の活性型マイクログリアの有意な増加は、AAV9-U6-miRHTTを注射したＨＤヒツジ（1p=0.01）および６カ月においてＡＡＶ９を注射したＷＴヒツジ（2p=0.006）において見出された。得られたマイクログリアにおける有意な減少は、ＡＡＶ９（3p=0.05）およびAAV9-U6-miRHTT（4p=0.04）の両方を注射したＨＤヒツジにおいて１カ月で見出され、全マイクログリアにおける有意な増加が、スタディ２において、６カ月において、ＡＡＶ９を注射したＨＤヒツジにおいて見出された（4p=0.04）。全ての分析は、注射側を非注射側と比較して、対応ｔ検定によって行われた。
【０２１９】
【表５】
2019533439.tif 000007
【０２２０】
scAAV9-miRHTT処置は血球数、電解質、または肝臓および腎臓機能に影響しない
血液サンプルは、４回採取した：ベースライン（処置前）、処置後２８（または３０）日、９０日、および１８０日。完全な血球数、電解質を測定し、肝臓および腎臓機能試験を実施した（表６）。これらの測定値のいずれにおいても、AAV9-miRHTT注射ヒツジと対照との間で、変化は見出されなかった。さらに、これらの時点で重量の変化は存在しなかった。
【０２２１】
表６：臨床病理学および全てのヒツジについての完全な血球数
【表６−１】
2019533439.tif 000008
【０２２２】
【表６−２】
2019533439.tif 000009
【０２２３】
配列
>配列番号１  ハンチントンｍＲＮＡ；NCBI Ref. Seq NM_002111.8)
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【０２２４】
>配列番号２
TAAATGTGCCTGTTGAAGGGC
【０２２５】
>配列番号３
AAGAGGTGCAGAGTCATCATC
【０２２６】
>配列番号４
TTCTGGAGGACATCAAACCAT
【０２２７】
>配列番号５
TGAACTGGCCCACTTCAATGT
【０２２８】
>配列番号６
TTCCATTGGCAACTGGGCCAT
【０２２９】
>配列番号７
TAAGCATGGAGCTAGCAGGCT
【０２３０】
>配列番号８
TAGCGTTGAAGTACTGTCCCC
【０２３１】
配列番号９
TTGAGGCAGCAGCGGCTGTGC
【０２３２】
>配列番号１０
TTCATCAGCTTTTCCAGGGTC
【０２３３】
>配列番号１１
TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
【０２３４】
>配列番号１２
CCTTGGCACCCGAGAATTCCA
【０２３５】
>配列番号１３
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
【０２３６】
>配列番号１４
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【０２３７】
>配列番号１５
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【０２３８】
>配列番号１６
LOCUS    dsCB-GFP-mir155-    5483 bp    DNA    circular SYN 11-OCT-2012
DEFINITION  Ligation of 6433 into dsCB-GFP-mirFlank-ployA*
ACCESSION   dsCB-GFP-mir155-
KEYWORDS    .
SOURCE      Unknown.
ORGANISM  Unknown
Unclassified.
REFERENCE   1  (bases 1 to 5483)
AUTHORS   Self
JOURNAL   Unpublished.
COMMENT    SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT     SECNOTES|Vector molecule:  dsCB-GFP-mirFlank-ployA*
Fragment ends: BsmBI
Fragment size: 5419
Insert molecule:  6433
Fragment ends:
Fragment size: 64
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/product=“Chicken"
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/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature    2341..2357
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/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    complement (2788..2917)
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/SECDrawAs=“Region”
CDS             3680..4537
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/SECDrawAs=“Gene”
ORIGIN
【０２３９】
1 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct
61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg
121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc
181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc
241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct
301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac
361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac
421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat
481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa
541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt
601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc
661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt
721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tcacgcgtgg
781 atctgaattc aattcacgcg tggtacctct ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc
841 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat
901 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc
961 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga
1021 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg
1081 gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca
1141 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg
1201 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg
1261 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg
1321 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagc gggatcagcc
1381 accgcggtgg cggcctagag tcgacgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt
1441 ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact
1501 gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta
1561 aaagctgcgg aattgtaccc gcggccgatc caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg
1621 aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc
1681 acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga
1741 agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga
1801 cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca
1861 agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca
1921 actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc
1981 tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact
2041 acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact
2101 tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga
2161 acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt
2221 ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga
2281 ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc cctagcgttt
2341 ccggcgacgg tgctagcgtc gaccagtgga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg
2401 taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac
2461 aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccagatc tggccgcact
2521 cgaaaacggg ccctctagac tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt
2581 tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta
2641 ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg
2701 aagcaattcg ttgatctgaa tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt
2761 agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct
2821 ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct
2881 ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg
2941 ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg
3001 cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt
3061 cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg
3121 cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg
3181 ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc
3241 taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa
3301 aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc
3361 ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac
3421 tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt
3481 ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc
3541 ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt
3601 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata
3661 atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt
3721 tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc
3781 tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat
3841 ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct
3901 atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca
3961 ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg
4021 catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa
4081 cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg
4141 ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga
4201 cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg
4261 cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt
4321 tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg
4381 agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc
4441 ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca
4501 gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc
4561 atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat
4621 cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc
4681 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg
4741 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct
4801 accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct
4861 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct
4921 cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg
4981 gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc
5041 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga
5101 gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg
5161 cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta
5221 tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg
5281 ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg
5341 ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat
5401 taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc
5461 agtgagcgag gaagcggaag agc
【０２４０】
>配列番号１７
//LOCUS   pdsU6-Mir-htt-64   5686 bp   DNA   circular SYN 17-SEP-2013
DEFINITION  Ligation of 6433 into pU6-miRNAFlank-GFP*
ACCESSION   pdsU6-Mir-htt-64
KEYWORDS    .
SOURCE      Unknown.
ORGANISM  Unknown
Unclassified.
REFERENCE   1  (bases 1 to 5686)
AUTHORS   Self
JOURNAL   Unpublished.
COMMENT     SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT     SECNOTES|Vector molecule:  pU6-miRNAFlank-GFP*
Fragment ends: BsmBI
Fragment size: 5622
Insert molecule:  6433
Fragment ends:
Fragment size: 64
FEATURES             Location/Qualifiers
misc_feature    662..767
/gene=“mutated ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    777..1041
/gene=“U6 promotor”
/SECDrawAs=“Region”
misc_signal     1041..1041
/gene=“Pol III Start”
/product=“Transcriptional Start”
/SECDrawAs=“Label”
CDS             1042..1065
/gene=“5' miR Flank'”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS             1130..1175
/gene=“miR 3' Flank”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_signal     1176..1181
/gene=“Pol III term”
/product=“pol III terminator”
/SECDrawAs=“Label”
misc_feature    1199..1478
/gene=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1255..1284
/gene=“tentative for”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1485..1754
/gene=“B- Actin promotor”
/product=“Chicken”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1485..1511
/gene=“Probe”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    complement (1553..1575)
/gene=“rev"
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1820..1916
/gene=“modSV40_late_16s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1820..1850
/gene=“SV40_late_19s_int”
/SECDrawAs=“Region”
CDS             1990..2699
/gene=“GFP'”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature    2726..2737
/gene=“'MCS'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    2776..2902
/gene=“Poly A signal”
/product=“Rabbit globin poly A”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    complement (2991..3120)
/gene=“3' ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS             3883..4740
/gene=“Amp(R)”
/SECDrawAs=“Gene”
ORIGIN
【０２４１】
1 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct
61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg
121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc
181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc
241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct
301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac
361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac
421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat
481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa
541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt
601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc
661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt
721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tctataaagg
781 tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg
841 ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata
901 cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa
961 tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct
1021 tgtggaaagg acgaaacacc gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga
1081 gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag
1141 gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccttttt tctagtggta cctctggtcg
1201 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga
1261 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat
1321 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa
1381 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca
1441 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctactc gaggccacgt tctgcttcac
1501 tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt
1561 ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg
1621 cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct
1681 ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc
1741 gcggcgggcg ggagcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga
1801 aaaaccagaa agttaactgg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc
1861 cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct
1921 gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgcggc cgatccaccg
1981 gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc
2041 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat
2101 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc
2161 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac
2221 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc
2281 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc
2341 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc
2401 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag
2461 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg
2521 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc
2581 gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat
2641 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg
2701 tacaagtaaa gcggccctag cgtttccggc gacggtgcta gactcgagga cggggtgaac
2761 tacgcctgag gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc
2821 cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg
2881 aattttttgt gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat
2941 acccattacc ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct
3001 agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc
3061 aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag
3121 ccttaattaa cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg
3181 cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga
3241 agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc
3301 gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac
3361 acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt
3421 cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc
3481 tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc
3541 gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact
3601 cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg
3661 gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc
3721 gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc
3781 ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa
3841 taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc
3901 cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa
3961 acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa
4021 ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg
4081 atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa
4141 gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc
4201 acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc
4261 atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta
4321 accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag
4381 ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca
4441 acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata
4501 gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc
4561 tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca
4621 ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca
4681 actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg
4741 taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa
4801 tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt
4861 gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat
4921 cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg
4981 gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga
5041 gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac
5101 tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt
5161 ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag
5221 cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc
5281 gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag
5341 gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca
5401 gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt
5461 cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc
5521 tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc
5581 cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc
5641 cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagc
【０２４２】
>配列番号１８
LOCUS    pCVscAsaq+-mir64    5155 bp    DNA    circular SYN 17-SEP-2013
DEFINITION  Ligation of 6433 into pCVscAsaq+-mirFlank*
ACCESSION   pCVscAsaq+-mir64
KEYWORDS    .
SOURCE      Unknown.
ORGANISM  Unknown
Unclassified.
REFERENCE   1  (bases 1 to 5155)
AUTHORS   Self
JOURNAL   Unpublished.
COMMENT     SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT     SECNOTES|Vector molecule:  pCVscAsaq+-mirFlank*
Fragment ends: BsmBI
Fragment size: 5090
Insert molecule:  6433
Fragment ends:
Fragment size: 64
FEATURES             Location/Qualifiers
misc_feature    1..105
/gene=“ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    182..449
/gene=“CMV”
/product=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
CDS             448..753
/gene=“CB promotor”
/product=“Promotor Eukaryotic”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS             754..1819
/gene=“Intron”
/product=“Intron”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS             1820..1839
/gene=“MCS”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature    1843..1847
/gene=“''MCS”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1862..1885
/gene=“5'miR Flank'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1950..1994
/gene=“3'miR Flank”
/SECDrawAs=“Region”
CDS             2002..2128
/gene=“RBG pA”
/product=“PolyA Signal”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature    complement (2002..2128)
/gene=“RBG\pA”
/SECDrawAs=“Info only”
misc_feature    2139..2281
/gene=“3'ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS             2317..2509
/gene=“lacZ”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS             2510..2965
/gene=“f1 ori”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature    3097..3957
/gene=“bla-AmpR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    4117..4731
/gene=“rep-pMB1”
/SECDrawAs=“Region”
ORIGIN
【０２４３】
1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt
61 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg
121 aagatcaatt caattcacgc gtcgacattg attattgact agctctggtc gttacataac
181 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa
241 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt
301 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc
361 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac
421 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg
481 tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt
541 atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg
601 cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg
661 cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc
721 ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg
781 tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc
841 cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat
901 gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt
961 tgtgcggggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg
1021 tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg
1081 ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cggggggggc
1141 tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg
1201 ggcgcgtcgg tcgggctgca accccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc
1261 ccggcttcgg gtgcggggct ccgtacgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg
1321 gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg
1381 ggggaggggc gcggcggccc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc
1441 cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgt
1501 gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg ggcgaagcgg
1561 tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt
1621 ccccttctcc ctctccagcc tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga
1681 cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac
1741 catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg
1801 tctcatcatt ttggcaaaga attcatcgat accgtcgacg atctagcgtc gaccagtgga
1861 tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc
1921 actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag gcctgttact agcactcaca
1981 tggaacaaat ggcccagatc cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg
2041 aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg
2101 tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgat cagatctgag gaacccctag tgatggagtt
2161 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg
2221 tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc
2281 cccccccccc ccccccccct gcattctaga gagctccaat tcgccctata gtgagtcgta
2341 ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac
2401 ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc
2461 ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaagc
2521 gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa
2581 taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt
2641 gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg
2701 cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt
2761 ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga
2821 gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg
2881 ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg
2941 cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc
3001 cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc
3061 tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc
3121 gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg
3181 gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat
3241 ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc
3301 acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa
3361 ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa
3421 aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt
3481 gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct
3541 tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat
3601 gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg
3661 cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg
3721 atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt
3781 attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg
3841 ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg
3901 gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg
3961 tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa
4021 aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt
4081 tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt
4141 tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt
4201 ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag
4261 ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta
4321 gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat
4381 aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg
4441 ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg
4501 agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac
4561 aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga
4621 aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt
4681 ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta
4741 cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat
4801 tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg
4861 accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct
4921 ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa
4981 gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct
5041 ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac
5101 acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt aaggccttaa ttagg
【０２４４】
>配列番号１９
LOCUS    U6-mir6433-BGHpA    5223 bp    DNA    circular SYN 12-SEP-2013
DEFINITION  Ligation of dsAAV CB MCS** into U6-MiRBA-6433-GFP**
ACCESSION   U6-mir6433-BGHpA
KEYWORDS    .
SOURCE      Unknown.
ORGANISM  Unknown
Unclassified.
REFERENCE   1  (bases 1 to 5223)
AUTHORS   Self
JOURNAL   Unpublished.
COMMENT     SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT     SECNOTES|Vector molecule:  U6-MiRBA-6433-GFP**
Fragment ends: blunt and EagI
Fragment size: 4954
Insert molecule:  dsAAV CB MCS**
Fragment ends: EagI and blunt
Fragment size: 269
FEATURES             Location/Qualifiers
misc_feature    662..767
/gene=“mutated ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    777..1041
/gene=“U6 promotor”
/SECDrawAs=“Region”
misc_signal     1041..1041
/gene=“Pol III Start”
/product=“転写al Start”
/SECDrawAs=“Label”
CDS             1042..1065
/gene=“5' miR Flank'”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS             1130..1175
/gene=“miR 3' Flank”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_signal     1176..1181
/gene=“Pol III term”
/product=“pol III terminator”
/SECDrawAs=“Label”
misc_feature    1199..1478
/gene=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1255..1284
/gene=“tentative for”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1485..1511
/gene=“Probe"
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1485..1754
/gene=“B-Actin promotor”
/product=“Chicken”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    complement (1553..1575)
/gene=“rev”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1820..1850
/gene=“SV40_late_19s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    1820..1916
/gene=“modSV40_late_16s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    2034..2230
/gene=“BGHpA”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    2263..2274
/gene=“'MCS'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    2313..2439
/gene=“Poly A signal”
/product=“Rabbit globin poly A”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature    complement (2528..2657)
/gene=“3' ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS             3420..4277
/gene=“Amp(R)”
/SECDrawAs=“Gene”
ORIGIN
【０２４５】
1 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct
61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg
121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc
181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc
241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct
301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac
361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac
421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat
481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa
541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt
601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc
661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt
721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tctataaagg
781 tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg
841 ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata
901 cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa
961 tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct
1021 tgtggaaagg acgaaacacc gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga
1081 gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag
1141 gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccttttt tctagtggta cctctggtcg
1201 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga
1261 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat
1321 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa
1381 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca
1441 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctactc gaggccacgt tctgcttcac
1501 tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt
1561 ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg
1621 cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct
1681 ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc
1741 gcggcgggcg ggagcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga
1801 aaaaccagaa agttaactgg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc
1861 cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct
1921 gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgcggc cgcgtttaaa
1981 ccctgcaggt ctagaaagct tatcgatacc gtcgactaga gctcgctgat cagcctcgac
2041 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct
2101 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct
2161 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg
2221 ggaagacaat agcagggtac aagtaaagcg gccctagcgt ttccggcgac ggtgctagac
2281 tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg
2341 gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca
2401 ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aagcaattcg ttgatctgaa
2461 tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt
2521 aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc
2581 actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg
2641 agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt
2701 gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc
2761 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg
2821 aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg
2881 cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct
2941 tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta
3001 gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt
3061 tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg
3121 ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat
3181 tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt
3241 taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt
3301 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt
3361 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta
3421 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg
3481 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac
3541 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg
3601 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc
3661 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg
3721 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat
3781 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg
3841 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg
3901 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc
3961 ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt
4021 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct
4081 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc
4141 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca
4201 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct
4261 cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt
4321 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga
4381 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca
4441 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac
4501 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg
4561 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag
4621 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac
4681 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt
4741 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg
4801 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc
4861 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc
4921 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc
4981 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa
5041 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt
5101 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg
5161 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag
5221 agc
【０２４６】
>配列番号２０  ＡＡＶ９カプシドタンパク質
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
【０２４７】
>配列番号２１
GCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTAAGCATGGAGCTAGCAGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCTGCTCTCCTAGCTTACAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATAACAAATGGCCCTTTT
【０２４８】
>配列番号２２
GCTCGAGTGAGCGCAGCCTGCTAGCTCCATGCTTACTGTAAAGCCACCAGATGGGTAAGCATGGAGCTAGCAGGCTTCGCCTACTAGTTTT
【図１】
2019533439.tif 000010
【図２】
2019533439.tif 000011
【図３】
2019533439.tif 000012
【図４Ａ】
2019533439.tif 000013
【図４Ｂ−４Ｃ】
2019533439.tif 000014
【図５Ａ−５Ｂ】
2019533439.tif 000015
【図５Ｃ】
2019533439.tif 000016
【図６Ａ】
2019533439.tif 000017
【図６Ｂ】
2019533439.tif 000018
【図７Ａ】
2019533439.tif 000019
【図７Ｂ】
2019533439.tif 000020
【図８Ａ】
2019533439.tif 000021
【図８Ｂ】
2019533439.tif 000022
【図８Ｃ】
2019533439.tif 000023
【図８Ｄ】
2019533439.tif 000024
【図９Ａ】
2019533439.tif 000025
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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