(57)【要約】  本発明は、がんの治療法に使用するための、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株であって、ここでその治療法において、少なくとも１つのチェックポイント阻害薬、特にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択されたチェックポイント阻害薬、の投与をさらに含む、サルモネラの弱毒株に関する。本発明は、さらにがんの治療法に使用するための、ＷＴ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株を含む医薬組成物であって、ここでその治療法において、少なくとも１つのチェックポイント阻害薬、特にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択されたチェックポイント阻害薬、の投与をさらに含む、サルモネラの弱毒株を含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの治療法への使用のための、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株であって、ここでその治療法において少なくとも１つのチェックポイント阻害薬の投与をさらに含むサルモネラの弱毒株。
【請求項２】
前記チェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択される、請求項１に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項３】
前記サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）であって、特に、前記サルモネラの弱毒株はサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である、請求項１または２に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項４】
前記発現カセットは、真核生物発現カセットであって、特に、発現カセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項５】
（ａ）ＷＴ１は配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１および当該ヒトＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択され、
（ｂ）ＷＴ１は短縮されており、より具体的にはＷＴ１のジンクフィンガー領域が欠損しており、または
（ｃ）ＷＴ１は配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＷＴ１および当該ＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項６】
前記ＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、およびＣＭＶプロモーターを含み、特に前記ＤＮＡ分子は配列番号２において示されているＤＮＡ配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項７】
前記サルモネラの弱毒株は、前記少なくとも１つのチェックポイント阻害薬と同時に、その前に、またはその後に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項８】
前記治療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的がん療法を伴い、特に前記サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法の治療サイクル、または生物学的がん療法の前に、その間に、またはその後に投与され、あるいは化学療法または放射線療法の治療サイクル、または生物学的がん療法の前およびその間に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項９】
前記生物学的がん療法は、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含む１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒株を含み、特に前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である、請求項８に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原は、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＥＡ、およびＣＭＶ  ｐｐ６５から成る群から選択され、および／または、前記腫瘍間質抗原は、ＶＥＧＦ受容体タンパク質とヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）から成る群から選択される、請求項９に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１１】
前記腫瘍抗原は、配列番号５において示されているアミノ酸配列を有するＭＳＬＮと当該ＭＳＬＮと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号６において示されているアミノ酸配列を有するＣＥＡと当該ＣＥＡと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号７において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５と当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号８において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５と当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号９において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５と当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択され、および／または、
前記腫瘍間質抗原は、配列番号１０において示されているアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＲ−２と当該ＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）から成る群から選択される、
請求項１０に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１２】
前記サルモネラの弱毒株は、経口的に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１３】
前記がんは、白血病、特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、並びに固形腫瘍、特に、肺がん、乳がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、胆管がん、すい臓がん、グリア芽腫、頭頸部がん、滑膜肉腫、血管肉腫、骨肉腫、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、および前立腺がん、から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１４】
前記サルモネラの弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には、約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１５】
前記治療法は、患者におけるＷＴ１の発現および／または、ＷＴ１に対する免疫前反応を評価する工程を含む、個別化されたがん免疫療法である、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１６】
がんの治療法への使用のための、ＷＴ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株を含む医薬組成物であって、ここで治療法において少なくとも１つのチェックポイント阻害薬、特に、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する１つの抗体から選択されるチェックポイント阻害薬、の投与をさらに含む、医薬組成物。
【請求項１７】
前記サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）であって、ここで前記発現カセットは、真核生物発現カセットであって、特に、発現カセットがＣＭＶプロモーターを含み、およびＷＴ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１および当該ヒトＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択され、ここで特にヒトＷＴ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療法に使用するための、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株であって、ここでその治療法において、少なくとも１つのチェックポイント阻害薬、特にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択されたチェックポイント阻害薬、の投与をさらに含む、サルモネラの弱毒株に関する。本発明は、さらにがんの治療法に使用するための、ＷＴ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株を含む医薬組成物であって、ここでその治療法において、少なくとも１つのチェックポイント阻害薬、特にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択されたチェックポイント阻害薬、の投与をさらに含む、サルモネラの弱毒株を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）は、細胞の増殖および分化に関与するジンクフィンガー転写因子をコードする。ＷＴ１は、いくつかの種類の血液悪性腫瘍および種々の固形腫瘍を含む多様な悪性腫瘍において高度に発現される。対照的に、成人におけるＷＴ１の正常組織における発現は生殖腺、子宮、腎臓、中皮、および各種組織におけるＣＤ３４+前駆細胞に限られる。ＷＴ１はもともと腫瘍抑制遺伝子として提唱された。しかし、より最近のエビデンスはこの転写因子の発がん性機能に注目している。つまりＷｔ−１が分化に対しネガティブな影響を及ぼし、前駆細胞の増殖を促進する、という機能である。さらに、過剰発現したＷＴ１は免疫原性である。つまりＷＴ１特異的Ｔ細胞ならびにＩｇＧ型抗ＷＴ１抗体はがん患者において観察されている。したがって、ＷＴ−１はがんワクチンの開発において有望な候補である。
【０００３】
ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）拘束性ＷＴ１ペプチド断片に基づくＷＴ１ワクチンを用いたヒトでの臨床試験が報告されている。Ｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：２７８９−２７９６は、ＷＴ１をコードするアデノウイルスワクチンを開示している。
【０００４】
ＷＯ  ２０１４／１７３５４２は、がん免疫療法におけるＷＴ１をコードする組み換えＤＮＡ分子を含むサルモネラの弱毒株の使用を開示している。ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株は、マウス白血病細胞で負荷したマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を示すことが示された。したがって、ＷＴ１をコードする弱毒化サルモネラ株は、これらの適応症の治療のためのがんワクチンとして大きな可能性を秘めている。
【０００５】
ＷＯ  ２０１３／０９１８９は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠き、かつ組み換えＤＮＡ分子を有するサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の弱毒化変異株を生育する方法を開示している。
【０００６】
腫瘍は免疫原でありうるという知見は、正常組織を温存しながら悪性細胞を選択的に排除するために免疫系を使用するように設計された多数のがん免疫療法の開発をもたらした。しかしながら、腫瘍抗原単独に対するワクチン投与からの延命効果は中程度にとどまっている。抗がんワクチンは多数の課題に直面しており、それらのうちの１つは免疫抑制性の微小環境である。異常な腫瘍血管系は、炎症細胞を免疫抑制に向けて分極させる、低酸素性の微小環境を作り出す。そのうえ、腫瘍は、成長因子およびサイトカインの分泌を介して、全身的に、免疫細胞の増殖、分化、そして機能を変化させる。
【０００７】
がんの治療のために、がん幹細胞の完全な根絶は極めて重要である。ヒト腫瘍の多数の免疫逃避機構は、がん免疫治療法において、依然として主要な課題のままである。したがって、今までに満たされていない、改良されたがん治療アプローチに対する大きな必要性が存在する。
【０００８】
発明が解決しようとする課題
先行技術に鑑みて、本発明の目的は、新規のがん療法を提供することである。そのような新規の治療法はがん患者に対する治療選択肢の改善のための大きな利点をもたらすだろう。
【発明の概要】
【０００９】
一つの態様では、本発明は、がんの治療法への使用のための、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株であって、ここでその治療法において少なくとも１つのチェックポイント阻害薬の投与をさらに含むサルモネラの弱毒株に関する。
【００１０】
ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株および少なくとも一つのチェックポイント阻害薬を用いた併用治療は、驚くべきことに、強力かつ持続的な抗腫瘍効果を示すことが見出された。驚くべきことに、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株および、チェックポイント阻害薬である抗ＰＤ−Ｌ１ならびに抗ＣＴＬＡ−４のいずれかの併用投与は、全生存において相乗効果を示すことが認められた。
【００１１】
理論に縛られることを望むわけではないが、ＶＸＭ０６は、腫瘍の微小環境によって不活化されうるＷＴ−１特異的エフェクターＴ細胞を産生することができると考えられている。チェックポイント阻害薬モノクローナル抗体は、それぞれ、免疫細胞または腫瘍細胞の構造を標的にしており、そしてそれゆえにＴ細胞抑制効果を相殺し、あるいは阻止することが報告されている。
【００１２】
特定の実施形態では、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択される。
【００１３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）である。具体的には、当該サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。
【００１４】
特定の実施形態では、発現カセットは、真核生物発現カセットである。具体的には、発現カセットはＣＭＶプロモーターを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、ＷＴ１は、配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１および当該ヒトＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。具体的には、ＷＴ１は短縮されており、より具体的にはＷＴ１のジンクフィンガー領域が欠損している。特定のそのような実施形態では、ＷＴ１は配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＷＴ１および当該ＷＴ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。
【００１６】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子はカナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、およびＣＭＶプロモーターを含む。具体的には、ＤＮＡ分子は配列番号２において示されているＤＮＡ配列を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、上記少なくとも１つのチェックポイント阻害薬と同時に、その前に、またはその後に投与される。
【００１８】
特定の実施形態では、治療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的がん療法を伴い、特に、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法の治療サイクル、または生物学的がん療法の前に、その間に、またはその後に投与され、あるいは化学療法または放射線療法の治療サイクル、または生物学的がん療法の前およびその間に投与される。
【００１９】
特定の実施形態では、生物学的がん療法は、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含む、一つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒株の投与を含む。特定のそのような実施形態では、上記一つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。特に、上記腫瘍抗原は、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５から成る群から選択され、好ましくは、上記腫瘍抗原は、（ａ）  メソテリン（ＭＳＬＮ）、特に、配列番号５において示されているアミノ酸配列を有するＭＳＬＮおよび当該ＭＳＬＮと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、（ｂ）  ＣＥＡ、特に、配列番号６において示されているアミノ酸配列を有するＣＥＡおよび当該ＣＥＡと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、および、（ｃ）  ＣＭＶ  ｐｐ６５、特に、配列番号７において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５および当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号８において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５および当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、および、配列番号９において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５および当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、の群から選択される。特に、上記腫瘍間質抗原は、ＶＥＧＦ受容体およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択され、ここで好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−２であり、より好ましくは、ヒトＶＥＧＦＲ−２であり、そしてさらにより好ましくは、配列番号１０において示されているアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＲ−２、または、当該ＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、である。
【００２０】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、経口的に投与される。
【００２１】
特定の実施形態では、がんは、白血病、特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、並びに固形腫瘍、特に、肺がん、乳がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、胆管がん、すい臓がん、グリア芽腫、頭頸部がん、滑膜肉腫、血管肉腫、骨肉腫、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、および前立腺がん、から選択される。
【００２２】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には、約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、治療法は、患者におけるＷＴ１の発現および／または、ＷＴ１に対する免疫前反応を評価する工程を含む、個別化されたがん免疫療法である。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、がんの治療法への使用のための、ＷＴ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株を含む、医薬組成物であって、ここで治療法において少なくとも一つのチェックポイント阻害薬の投与をさらに含む、医薬組成物に関する。具体的には、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも１つの抗体から選択される。
【００２５】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）であり、発現カセットは、真核生物発現カセットであり、そして、ＷＴ１は配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１および当該ヒトＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。
【００２６】
具体的には、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。具体的には、ヒトＷＴ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１に含まれるＷＴ１  ｃＤＮＡによりコードされる、ジンクフィンガー領域が欠失している（配列番号１）、ヒトＷＴ１のアミノ酸配列である。
【図２】図２は、空の発現ベクターｐＶＡＸ１０に含まれる核酸配列である（制限部位ＮｈｅＩとＸｈｏＩとの間に位置するマルチクローニングサイトの部分を含まない発現ベクターｐＶＡＸ１０の配列（配列番号２））。
【図３】図３は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１に含まれ、配列番号１のヒトＷＴ１をコードする核酸配列である。
【図４】図４は、全長ヒトＷＴ１のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｒｅｆ  Ｐ１９５４４−７、配列番号４）である。
【図５】図５は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＭＳＬＮに含まれるＭＳＬＮ  ｃＤＮＡによりコードされる、ヒトＭＳＬＮのアミノ酸配列（配列番号５）である。
【図６】図６は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＣＥＡに含まれるＣＥＡ  ｃＤＮＡによりコードされる、ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号６）である。
【図７】図７は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＣＭＶｐｐ６５＿１に含まれるＣＭＶ  ｐｐ６５  ｃＤＮＡによりコードされる、ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図８】図８は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＣＭＶｐｐ６５＿２に含まれるＣＭＶ  ｐｐ６５  ｃＤＮＡによりコードされる、ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図９】図９は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＣＭＶｐｐ６５＿３に含まれるＣＭＶ  ｐｐ６５  ｃＤＮＡによりコードされる、ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号９）である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１に含まれるＶＥＧＦＲ−２  ｃＤＮＡによりコードされるＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図１１】図１１は、ｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１のプラスミドマップである。
【図１２】図１２は、播種性ＦＢＬ−３を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存に対する、ＶＸＭ０６ｍと抗ＣＴＬＡ−４の併用投与の効果である。
【図１３】図１３は、播種性ＦＢＬ−３を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存に対する、ＶＸＭ０６ｍと抗ＰＤ−Ｌ１の併用投与の効果である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の発明の詳細な説明およびその中に含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解されうる。
【００２９】
一つの態様では、本発明はがんの治療法への使用のための、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株であって、ここでその治療法において少なくとも１つのチェックポイント阻害薬の投与をさらに含むサルモネラの弱毒株に関する。
【００３０】
ジンクフィンガー転写因子ウィルムス腫瘍タンパク質１はＷＴ１遺伝子によってコードされている。このタンパク質は、Ｃ末端に４つのジンクフィンガーモチーフ、そしてＮ末端にプロリン／グルタミンリッチなＤＮＡ結合領域を含む。２つのコーディングエキソンにおける選択的スプライシングから生じる複数の転写変異体は、よく特性決定されている。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の発達において重要な役割を果たしており、細胞の増殖および分化に関与している。ＷＴ１遺伝子は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となる遺伝子として単離された。ＷＴ１は、いくつかの種類の血液悪性腫瘍および種々の固形腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍において、高度に発現される。対照的に、成人における正常な組織でのＷＴ１の発現は、生殖腺、子宮、腎臓、中皮、および各種組織における前駆細胞に限定されている。その発現プロファイル、発がん機能、および免疫原性のため、腫瘍抗原ＷＴ１は、がんワクチンの開発に有望な候補である。
【００３１】
本発明によれば、弱毒化されたサルモネラ株は、ＷＴ１をコードする発現カセットを含む組み換えＤＮＡ分子を、標的細胞内へと送達するための、当該組み換えＤＮＡ分子の細菌キャリアとして機能する。ＷＴ１−腫瘍抗原のような、異種抗原をコードするＤＮＡ分子を含む、そのような送達ベクターは、ＤＮＡワクチンと呼ばれる。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「ワクチン」は、投与で被験対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において免疫応答を引き起こすことができる薬剤を指す。ワクチンは、好ましくは、疾病を予防し、寛解させ、あるいは治療することができる。
【００３３】
本発明に係る弱毒生サルモネラ株は、ＷＴ１をコードする組み換えＤＮＡ分子を安定に運搬する。当該弱毒生サルモネラ株は、当該組み換えＤＮＡ分子の経口送達のための媒体として使用しうる。
【００３４】
遺伝的免疫化は、従来法のワクチン投与より有利でありうる。標的ＤＮＡは、かなりの長期間にわたって検出することができ、それゆえ抗原デポー（ｄｅｐｏｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）として機能する。いくつかのプラスミド中の配列モチーフは、ＧｐＣアイランドのように、免疫刺激性であり、そして、ＬＰＳおよび他の細菌成分による免疫刺激によって促進されたアジュバントとして機能しうる。
【００３５】
ＷＴ１タンパク質の小さな断片に対する免疫だけを媒介できるペプチドワクチンとは対照的に、遺伝子ワクチン投与はコードされたＷＴ１タンパク質の全長にわたって存在する種々のエピトープに対する免疫をもたらしうる。
【００３６】
それとは別に、臨床試験によく用いられるＷＴ１ペプチドワクチンは、ペプチドのＨＬＡ拘束性、すなわち抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）のＨＬＡ分子へのペプチドの結合能のために用途が限られている。対照的に、本発明のＤＮＡワクチンは、ＨＬＡ拘束性ではない。さらに、ＷＴ−１が陽性であるにも関わらず、コードされているペプチド断片が患者の腫瘍に存在しない可能性がある。ＶＸＭ０６はＷＴ１のジンクフィンガー領域を除いた全長のＷＴ−１タンパク質をコードしているので、免疫系に提示されるペプチド断片は患者によって産生される。
【００３７】
弱毒生サルモネラベクターは、リポ多糖類（ＬＰＳ）のような独自の免疫調節因子をｉｎ  ｓｉｔｕで産生し、そのことがマイクロカプセル化のような他の形態での投与を上回る利点となりうる。また、本発明による粘膜ワクチンは、リンパ管内作用機序を有し、それは有益であることが判明している。本発明による弱毒化ワクチンの摂取後に、腸内のパイエル板のマクロファージおよび他の細胞は、改変細菌によって侵入される。当該細菌は、これらの食細胞に取り込まれる。弱毒化変異によって、Ｓ．チフィＴｙ２１（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１）株の細菌は、これらの食細胞にとどまることはできず、この時点で死滅する。組み換えＤＮＡ分子は、放出され、引き続いて食細胞性免疫細胞の細胞基質内に、特異的輸送システムまたはエンドソームの漏出を介して移送される。最後に、組み換えＤＮＡ分子は核に入り、そこで転写され、食細胞の細胞基質内で大量のＷＴ１の発現を引き起こす。感染した細胞はアポトーシスを起こし、ＷＴ１抗原が負荷され、そして腸の免疫システムによって取り込まれて処理される。細菌感染の危険信号はこの過程において強いアジュバントとして機能し、全身および粘膜区画の両方のレベルにおいて、強い標的抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および抗体反応をもたらす。免疫応答はワクチン投与後およそ１０日でピークに達する。抗キャリア反応の欠如は、多数回にわたり同じワクチン投与で追加免疫をすることを許容する。
【００３８】
本発明の文脈において、用語「弱毒化」は、弱毒化変異を有さない親株に比べて減弱された病原性を持つ細菌株を指す。弱毒化細菌株は、好ましくは病原性を失っているが、防御免疫を誘導する能力を保持している。弱毒化は、病原遺伝子、調節遺伝子、および代謝遺伝子を含む、種々の遺伝子の欠失によって達成される。弱毒化された細菌は天然に見出されうるし、また、実験室において人工的に、たとえば新しい培地もしくは細胞培養液の適用によって産生されうるし、また、組み換えＤＮＡ技術によって産生されうる。本発明による約１０11ＣＦＵのサルモネラの弱毒株の投与は、好ましくは、５％未満、より好ましくは、１％未満、最も好ましくは１パーミル未満の被験者にサルモネラ症を引き起こす。
【００３９】
本発明の文脈において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「包含するが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ,  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）という意味である。この用語は、任意の記載された特徴、要素、整数、工程もしくは構成要素の存在を特定するため、オープンエンドであることを意図しているが、一つもしくはそれ以上の他の特徴、要素、整数、工程、構成要素、またはそれらの群の存在もしくは追加を排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、従って、より限定的な用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的に成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を包含する。一つの実施形態では、本願を通して、および特に特許請求の範囲内において使用される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」で置き換えられてもよい。
【００４０】
ＷＴ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子は、適切には組み換えＤＮＡ分子、すなわち、好ましくは異なる由来のＤＮＡ断片から成る、操作されたＤＮＡ構築物である。ＤＮＡ分子は直鎖状核酸、または好ましくは、発現ベクタープラスミドにＷＴ１をコードするオープンリーディングフレームを導入することによって作製した環状ＤＮＡでありうる。
【００４１】
本発明の文脈において、用語「発現カセット」は、発現を制御する調節配列の制御下の少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸単位を指す。発現カセットは、好ましくは標的細胞内のＷＴ１のような腫瘍抗原をコードする、一体化したオープンリーディングフレームの転写を媒介する。発現カセットは、一般的には、プロモーター、少なくとも一つのオープンリーディングフレームおよび転写終結シグナルを含む。
【００４２】
特定の実施形態では、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも一つの抗体から選択される。好ましくは、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＣＴＬＡ−４に対する少なくとも一つの抗体、またはそれらの組み合わせであり、より好ましくは、上記少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＣＴＬＡ−４に対する少なくとも一つの抗体、またはそれらの組み合わせである。
【００４３】
免疫系の一つの重要な部分は、体内の正常細胞と、それが「異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）」とみなすものを識別する能力である。これが、免疫系が正常細胞をそのままにしながらも異物細胞を攻撃することを可能にする。これを行うために、免疫系は「チェックポイント」、つまり、免疫応答を開始するために活性化（あるいは不活化）される必要がある、特定の免疫細胞上の分子を利用する。
【００４４】
がん細胞は、ときに、免疫系に攻撃されることを回避するためにこれらのチェックポイントを利用する方法を見出す。しかし、これらのチェックポイントを標的にする薬物はがん治療法としてかなり見込みがある。たとえば、ＰＤ−１はＴ細胞と呼ばれる免疫細胞上のチェックポイントタンパク質である。ＰＤ−１は、通常は、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃することを防ぐのに役立つ、一種の「オフスイッチ」として機能する。ＰＤ−１は、いくつかの正常（およびがん）細胞上のタンパク質であるＰＤ−Ｌ１に結合するときにこれをする。ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１に結合するとき、基本的に、Ｔ細胞に他の細胞はそのままにしておくよう伝達する。いくつかのがん細胞は、免疫攻撃から免れるのに役立つ、たくさんのＰＤ−Ｌ１を有する。
【００４５】
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とするモノクローナル抗体は、特定のがんの治療をするための有望な候補であることが示されている。驚くべきことに、これらのチェックポイント阻害薬は、ＷＴ１をコードする弱毒化サルモネラ株によって媒介される、ＷＴ−１を発現するがん細胞に対する免疫応答を増強することができることが見出された。
【００４６】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）である。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）の弱毒派生物は、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ）株は粘膜の免疫経路を介して、すなわち、経口的にあるいは経鼻的に、潜在的に送達されうるため、非経口的投与と比べて、簡便性および安全性の利点があるため、哺乳類の免疫系への異種抗原の送達のための魅力的な媒体である。さらに、サルモネラ株は、全身および粘膜区画の両方のレベルで、強い体液性および細胞性の免疫応答を誘発する。バッチ調製コストは低く、生細菌ワクチンの製剤は非常に安定している。弱毒化は病原遺伝子、調節遺伝子、および代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失によって得られうる。
【００４７】
ａｒｏ変異によって弱毒化されたいくつかのサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株は、動物モデルにおける異種抗原の安全かつ効果的な送達媒体であることが示されている。
【００４８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株および少なくとも一つの更なるサルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）の弱毒生菌株は、Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，  ａ  Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより製造される）としても知られているＴｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の活性成分である。それは現在、唯一認可されている、腸チフスに対する経口生ワクチンである。当該ワクチンは、広範に試験されており、患者に対する毒性ならびに第三者への感染に関して安全であることが示されている（Ｗａｈｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９８２，  １４５：２９２−２９５）。当該ワクチンは、４０を超える国々で認可されており、腸チフスに対する予防ワクチン投与のために、何千人もの小児を含む、数百万人の個人に対して使われてきた。それは比類のない安全実績を有する。Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）が全身的に血流に入ることができるということを示すデータはない。弱毒生Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）ワクチン株は、したがって、安全かつ耐用性良好である一方で、腸内の免疫系の特異的標的化を可能にする。Ｔｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の販売許可番号は、１９９６年１２月１６日付のＰＬ  １５７４７／０００１である。ワクチンの一回分の用量は、少なくとも２×１０9コロニー形成単位の生（ｖｉａｂｌｅ）Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）および少なくとも５×１０9個の非生（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）を含む。
【００４９】
この忍容性の高い、腸チフスに対する経口生ワクチンは、野生型の病原性細菌単離株Ｓ．チフィＴｙ２（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）の化学的変異誘発によって得られた。そしてｇａｌＥ遺伝子に、ガラクトースの代謝不能につながる機能欠失変異を有する。当該弱毒細菌株はまた、硫酸塩を硫化物に還元することもできず、それが当該弱毒細菌株と野生型のＳ．チフィＴｙ２（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）を差別化する。その血清学的特性に関しては、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）株は、細菌外膜の多糖であるＯ９抗原を含み、そして、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の特徴的成分であるＯ５抗原を欠く。この血清学的特性は、バッチリリースのための同定試験のパネルにそれぞれの試験を含むことについて、理論的根拠を裏付ける。
【００５０】
特定の実施形態では、発現カセットは真核生物発現カセットである。具体的には、発現カセットはＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「真核生物発現カセット」は、真核細胞内でオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。十分な免疫応答を引き起こすのに必要な異種抗原の量は、細菌に対しては有毒でありえ、そして細胞死、過剰な弱毒化または異種抗原の発現の欠失を引き起こしうることが示されている。細菌ベクター内では発現されず、標的細胞内でのみ発現される真核生物発現カセットを用いることで、この毒性問題を克服しうる。そして、典型的に発現されたタンパク質は真核生物の糖鎖付加パターンを示す。
【００５１】
真核生物発現カセットは、真核細胞内でオープンリーディングフレームの発現を制御することができる調節配列、好ましくは一つのプロモーターおよび一つのポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラの弱毒株に含まれる組み換えＤＮＡ分子に包含されるプロモーターとポリアデニル化シグナルは、好ましくは免疫化されるべき対象の細胞内で機能的であるよう選択される。特にヒト用のＤＮＡワクチンの製造に好適なプロモーターの例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：強力なＣＭＶ最初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）由来のプロモーター、ＨＩＶ長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、モロニーウイルス由来のプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のプロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー配列から構成される合成ＣＡＧプロモーター、トリβアクチン遺伝子のプロモーター、第一エキソンおよび第一イントロン、およびウサギβグロビン遺伝子のスプライス受容部位、ならびに、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのような、ヒト遺伝子由来のプロモーター。特定の実施形態では、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「ＣＭＶプロモーター」は、強力な前初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【００５２】
特にヒト用ＤＮＡワクチンの製造のために好適なポリアデニル化シグナルの例は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＬＴＲポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のサルモネラの弱毒株に含まれる組み換えＤＮＡ分子に含まれる真核生物発現カセットは、ＢＧＨポリアデニル化部位を含む。
【００５３】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルのような、ＷＴ１の発現に必要な調節因子に加え、他の配列もまた組み換えＤＮＡ分子に含まれうる。このような追加の配列は、エンハンサーを含む。エンハンサーは、たとえば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサー、および、ＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶ等由来のウイルスエンハンサーであってもよい。
【００５４】
調節配列とコドンは一般に種依存的であるので、タンパク質産生を最大化するために、調節配列とコドンは、好ましくは、免疫化されるべき種において有効であるよう選択される。当業者は、所与の対象種において機能的な組み換えＤＮＡ分子を製造することができる。
【００５５】
特定の実施形態では、ＷＴ１は、配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１および当該ヒトＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。具体的には、ＷＴ１は短縮されており、より具体的には、ＷＴ１のジンクフィンガー領域が欠失している。特にそのような実施形態において、ＷＴ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＷＴ１および当該ＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。具体的には、ＷＴ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有する。
【００５６】
ＷＴ１のＣ末端のジンクフィンガー領域は、４つのジンクフィンガーモチーフを含む。配列番号１において示されているアミノ酸配列の短縮ＷＴ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ｒｅｆ  Ｐ１９５４４−７のアミノ酸番号７４〜４４４に相当する。ジンクフィンガー領域の欠失は、他のジンクフィンガーを含む転写因子との免疫学的交差反応のリスクを最小化する。さらに、ジンクフィンガー領域を欠く、短縮ＷＴ１は、全長ＷＴ１より大きな免疫原性を有する。それに加え、ＤＮＡ結合に必須のジンクフィンガーモチーフの欠失は、ＷＴ１の発がん能を抑制し、それゆえ発がんのリスクを最小化する。
【００５７】
この文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値または範囲の８０％〜１２０％以内、あるいは９０％〜１１０％以内、を指し、９５％〜１０５％以内を含む。
【００５８】
本発明の文脈において、用語、所与のタンパク質、たとえば、配列番号１または配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、は、上記比較タンパク質、たとえば、それぞれ配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１と、アミノ酸配列、および／または、そのアミノ酸配列をコードする核酸配列において異なりうるタンパク質、を指す。そのタンパク質は、天然由来、たとえば野生型タンパク質の変異型、たとえば野生型ＷＴ１の変異型、または、異種のホモログ、または、改変タンパク質、たとえば改変ＷＴ１であってもよい。コドンの使用頻度は種間で異なることが知られている。したがって、対象の細胞において異種性のタンパク質を発現する際は、標的細胞のコドン使用頻度に核酸配列を適合させることが必要であるか、あるいは少なくとも有用でありうる。所与のタンパク質の誘導体を設計および構築する方法は、当業者に周知である。
【００５９】
所与のタンパク質、たとえば、配列番号１または配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質は、当該比較タンパク質、たとえば、それぞれ配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を有するＷＴ１、と比べて一つまたは複数のアミノ酸の、付加、欠失、および／または、置換を含む、一つまたは複数の変異を含んでもよい。本発明の教示によれば、上記欠失、付加および／または、置換されたアミノ酸は、連続するアミノ酸であってもよく、あるいは、比較タンパク質、たとえば、それぞれ配列番号１または配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質の全長にわたり散在していてもよい。本発明の教示によれば、上記比較タンパク質とのアミノ酸配列同一性が少なくとも約８０％であり、そして変異タンパク質が免疫原性である限り、任意の個数のアミノ酸が付加、欠失、および／または、置換されてもよい。好ましくは、所与の比較タンパク質、たとえば、配列番号１または配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質の免疫原性は、ＥＬＩＳＡ法により測定した場合、上記比較タンパク質、たとえば、それぞれ配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を有するＷＴ１の、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、あるいは１％未満少なくなっている。タンパク質ホモログを設計および構築するための方法、およびそのようなホモログの免疫原性について試験する方法は、当業者に周知である。特定の実施形態では、比較タンパク質、たとえば、配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を有するＷＴ１、との配列同一性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、あるいは最も具体的には、少なくとも約９５％である。親タンパク質と、親配列に対して欠失、付加、および／または、置換を有するその誘導体との比較を含む、配列同一性を決定するための方法およびアルゴリズムは、当業者にはよく知られている。ＤＮＡレベルでは、所与の比較タンパク質、たとえば、配列番号１または配列番号４において示されているアミノ酸配列を有するヒトＷＴ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列は、遺伝子コードの縮重のために、より大きな程度で異なっていてもよい。
【００６０】
本発明の文脈において、用語「短縮ＷＴ１」は、それぞれ一つのアミノ酸の、もしくは、二以上連続するアミノ酸の、一つまたは複数の欠失を有するＷＴ１を指す。本発明の教示によれば、変異タンパク質が免疫原性である限り、任意の数のアミノ酸が欠失してもよい。好ましくは、短縮ＷＴ１の免疫原性は、ＥＬＩＳＡ法により測定した場合、配列番号４（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｒｅｆ  Ｐ１９５４４−７）において示されているアミノ酸配列を有する全長ＷＴ１の、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、あるいは１％未満少なくなっている。タンパク質ホモログを設計および構築するための方法、ならびにそのようなホモログの免疫原性について試験する方法は、当業者に周知である。特定の実施形態では、５００未満、４００未満、３５０未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、７５未満、５０未満もしくは２５未満のアミノ酸が、配列番号４（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｒｅｆ  Ｐ１９５４４−７）において示されているアミノ酸配列を有する全長ヒトＷＴ１または当該ヒトＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から、欠失されている。具体的には、短縮ＷＴ１は、ＷＴ１のジンクフィンガー領域が欠失しており、そして好ましくは、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＷＴ１および当該ＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。
【００６１】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、およびＣＭＶプロモーターを含む。特定の実施形態では、組み換えＤＮＡ分子は、市販のｐＶＡＸ１ＴＭ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）由来である。この発現ベクターは、高コピーｐＵＣ複製起点を、ｐＢＲ３２２の低コピーｐＭＢ１複製起点に置き換えることで改変された。低コピー改変は、代謝負担を低減し、そして構築物をより安定にするために行われた。作製された発現ベクターの骨格は、ｐＶＡＸ１０と名付けられた。
【００６２】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、配列番号２（ベクター骨格  ｐＶＡＸ１０）において示されているＤＮＡ配列を含む。
【００６３】
配列番号３において示されている核酸配列を有するＯＲＦは、ジンクフィンガー領域が欠失しているヒトＷＴ１をコードする。このＯＲＦを発現ベクター骨格（ｐＶＡＸ１０）にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを介して挿入すると、発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１が得られた。発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１は、図１１において模式的に示される。発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１を有する、サルモネラの弱毒株Ｔｙ２１ａを含むＤＮＡワクチンは、ＶＸＭ０６と呼ばれる。
【００６４】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、上記少なくとも１つのチェックポイント阻害薬と同時に、その前に、またはその後に投与される。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「同時に」は、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株および少なくとも一つのチェックポイント阻害薬を、同日に、より具体的には１２時間以内に、より具体的には２時間以内に投与することを指す。
【００６６】
特定の実施形態では、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株および少なくとも一つのチェックポイント阻害薬の投与は、連続８週間以内に、より具体的には連続３〜６週間以内に行われる。ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株および少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、同じ経路または異なる経路を介して投与してよい。
【００６７】
特定の実施形態では、上記治療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的がん療法を伴う。がんの治癒のためには、がん幹細胞の完全な根絶が不可欠でありうる。最大効果のために、異なる治療法の組み合わせが有益でありうる。
【００６８】
本発明の文脈において、用語「生物学的がん療法」は、ウイルスを含む生物、生物由来の物質、またはそのような物質の実験室生産型の使用を含むがん療法を指す。がんに対するいくつかの生物学的療法は、がん細胞に抗するために身体の免疫システムを刺激することを目的とする（いわゆる生物学的がん免疫療法）。生物学的がん療法アプローチは、腫瘍抗原および腫瘍間質抗原の、たとえばサルモネラベースのＤＮＡワクチン、具体的には、Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）ベースのＤＮＡワクチンによる、送達、治療用抗体の薬としての送達、免疫刺激性サイトカインの投与、および改変されたＴ細胞を含む、免疫細胞の投与、を含む。治療用抗体は、腫瘍抗原または腫瘍間質抗原を標的とする抗体を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、生物学的がん療法は、腫瘍抗原および／または、腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含む、一つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒株の投与を含む。特にそのような実施形態において、上記の一つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。具体的には、上記腫瘍抗原は、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＥＡ、およびＣＭＶ  ｐｐ６５から成る群から選択され、好ましくは、上記腫瘍抗原は、（ａ）〜（ｃ）から成るグループから選択される。（ａ）メソテリン（ＭＳＬＮ）、具体的には、配列番号５において示されているアミノ酸配列を有するＭＳＬＮと当該ＭＳＬＮと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、（ｂ）ＣＥＡ、具体的には、配列番号６において示されているアミノ酸配列を有するＣＥＡと当該ＣＥＡと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、および（ｃ）ＣＭＶ  ｐｐ６５、具体的には、配列番号７において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５と当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号８において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５と当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号９において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５と当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質。具体的には、上記腫瘍間質抗原は、ＶＥＧＦ受容体タンパク質およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）から成る群から選択され、その中でも好ましくは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−２、より好ましくはヒトＶＥＧＦＲ−２、そしてさらにより好ましくは、配列番号１０において示されているアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ−２と当該ヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質である。
【００７０】
本発明のサルモネラの弱毒変異株と組み合わせて使用する化学療法の薬剤は、たとえば、以下のものでもよい：ゲムシタビン、アミホスチン（エチオール）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、フォリン酸、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ボルテゾミブ、サリドマイド、レナリドミド、およびそれらの組み合わせ。
【００７１】
本発明によると、ＶＸＭ０６および少なくとも一つのチェックポイント阻害薬との併用で最も好適な化学療法薬剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、エトポシド、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、５−フルオロウラシル、イホスファミドおよびブレオマイシンであり、特にゲムシタビンである。
【００７２】
具体的には、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法の治療サイクル、または生物学的がん療法の前に、その間に、またはその後に投与される。他の特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法の治療サイクル、または生物学的がん療法の前およびその間に投与される。
【００７３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、経口的に投与される。経口投与は、非経口投与よりも、より簡便、より安全、そして、より快適である。しかしながら、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株はまた、他の任意の好適な経路によっても投与されうることも留意すべきである。好ましくは、治療上有効な用量が患者に投与され、そしてこの用量は、特定用途、悪性腫瘍の種類、患者の体重、年齢、性別および健康状態、投与方法、ならびに製剤形態等に依存する。投与は、必要に応じ、単回投与または複数回投与であってもよい。
【００７４】
ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、および腸溶カプセル剤、または任意の他の好適な剤型で提供されてもよい。一般的に、サルモネラの弱毒株は、飲用溶液として処方される。この実施形態は、患者コンプライアンスの向上という利点を提供する。好ましくは、飲用溶液は、胃酸を少なくともある程度まで中和する、すなわち胃液のｐＨをｐＨ７に近づける、手段を含む。好ましくは、飲用溶液は、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株を含む、緩衝懸濁液である。特定の実施形態では、緩衝懸濁液は、好ましくは２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇのラクトース一水和物および１００ｍｌの飲用水を含む、好適な緩衝液に、サルモネラの弱毒株を懸濁することによって得られる。
【００７５】
少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、好ましくは、市販品の認可されたガレヌス製剤の中で投与される。
【００７６】
特定の実施形態では、がんは、白血病、特に、急性骨髄性白血病 （ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、並びに固形腫瘍、特に、肺がん、乳がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、胆管がん、すい臓がん、グリア芽腫、頭頸部がん、滑膜肉腫、血管肉腫、骨肉腫、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、神経芽腫、横紋筋肉腫、および前立腺がん、から選択される。
【００７７】
ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株は、比較的低用量で、驚くほど効果的である。さらに、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株と少なくとも一つのチェックポイント阻害薬の併用投与は、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株の比較的低用量で、驚くべきことに、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答、腫瘍の増殖および／または、全生存において相乗効果を示す。生細菌ワクチンの低用量投与は、排出のリスクを最小化し、したがって第三者への感染を最小化する。
【００７８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には、約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００７９】
この文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値または範囲の３倍以内、あるいは２倍以内（１．５倍以内を含む）を指す。
【００８０】
特定の実施形態では、治療法は、患者におけるＷＴ１の発現および／または、ＷＴ１に対する免疫前反応を評価する工程を含む、個別化されたがん免疫療法である。患者のＷＴ１発現および／または、ＷＴ１に対する免疫前反応は、最初の工程で、たとえばコンパニオン診断によって評価してもよい。ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでＷＴ１等の標的遺伝子の発現を評価する方法は、当業者に周知である。たとえば、免疫組織化学染色、フローサイトメトリー法もしくはＲＮＡ塩基配列決定法、または標識を用いる代替法を、腫瘍における標的発現レベルを同定するのに使用してもよい。同様に、ＷＴ１等の所与のタンパク質に対する患者の免疫前反応を評価する方法は、当業者に周知である。患者の既存のＷＴ−１特異的Ｔ細胞プールは、たとえばＥＬＩＳｐｏｔまたはマルチマーＦＡＣＳ解析によって検出することができる。高いＷＴ１発現および／または、ＷＴ１に対する免疫前反応の発生は、単独で、または少なくとも一つのチェックポイント阻害薬と組み合わせた、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株を用いる治療法に対して順調に反応することについての患者の素因の予後指標となる。
【００８１】
抗生物質または抗炎症剤による治療を含むことは、起こりうる副作用の発生に応じて好都合でありうる。
【００８２】
ヒスタミン、ロイコトリエンまたはサイトカインを介する過敏症反応に似た有害事象が発生した場合、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定、気管支痙攣、および呼吸困難に対する治療選択肢が有用である。望ましくないＴ細胞由来の自己攻撃性の場合の治療選択肢は、幹細胞移植後に適用される、急性および慢性の移植片対宿主病における標準治療のスキームから得られる。シクロスポリンおよびグルココルチコイドは、治療選択肢として提示される。
【００８３】
全身性のサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）型の感染という望ましくない状況の場合、たとえば、シプロフロキサシンまたはオフロキサシンを含むフルオロキノロンを用いた、適切な抗生物質療法が推奨される。消化管の細菌感染症は、リファキシミン等のそれぞれの薬剤で治療される必要がある。
【００８４】
更なる態様では、本発明は、がんの治療法への使用のための、ＷＴ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株を含む、医薬組成物であって、ここでその治療法において少なくとも一つのチェックポイント阻害薬の投与をさらに含む医薬組成物に関する。具体的には、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３に対する少なくとも一つの抗体から選択される。好ましくは、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４に対する少なくとも一つの抗体、あるいはそれらの組み合わせであり、より好ましくは、上記少なくとも一つのチェックポイント阻害薬は、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４に対する少なくとも一つの抗体、あるいはそれらの組み合わせである。
【００８５】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、腸溶カプセル剤、凍結乾燥粉末、または、用途に好適な他の任意の剤型であってもよい。
【００８６】
医薬組成物は、一つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。
【００８７】
本発明の文脈において、用語「賦形剤」は、医薬品の有効成分とともに製剤化された天然または合成の物質を指す。好適な賦形剤は、固結防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、香味剤、着色剤、滑沢剤、滑剤、吸着剤、防腐剤および甘味料を含む。
【００８８】
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容される」は、生理的に許容され、そして、哺乳類（例：ヒト）に投与したときに、通常は有害反応を引き起こさない、医薬組成物の分子性物質、および他の成分を指す。用語「薬学的に許容される」はまた、哺乳類、より具体的にはヒトへの使用のために、連邦政府または州政府の規制当局によって承認された、または、米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されている、ということも意味しうる。
【００８９】
特定の実施形態では、医薬組成物は飲用溶液として提供される。この実施形態は患者コンプライアンスの向上という利点を提供し、そして迅速で、実行可能かつ手ごろな価格の集団予防接種プログラムを可能にする。
【００９０】
具体的には、好適な飲用溶液は、胃酸を少なくともある程度まで中和する、すなわち胃液のｐＨをｐＨ７に近づける、手段を含む。特定の実施形態では、飲用溶液は、本発明によるサルモネラの弱毒株を、好適な緩衝液、好ましくは、胃酸を少なくともある程度まで中和する緩衝液、好ましくは、２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇのラクトース一水和物および１００ｍｌの飲用水を含む緩衝液に、懸濁させることによって得られる緩衝懸濁液である。
【００９１】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。
【００９２】
特定の実施形態では、発現カセットは、真核生物発現カセットである。
【００９３】
特定の実施形態では、ＷＴ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＷＴ１および当該ＷＴ１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。
【００９４】
特に、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。
【００９５】
特に、ＷＴ１は配列番号１において示されているアミノ酸配列を有する。
【００９６】
特定の実施形態では、治療法は、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株、または、当該サルモネラの弱毒株を含む医薬組成物、および／または、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬の、単回または複数回投与を含む。投与の単回投与量は同じであっても異なってもよい。具体的には、治療は、ＷＴ１をコードするサルモネラの弱毒株、および／または、少なくとも一つのチェックポイント阻害薬、の、１、２、３、４、５、または６回の投与を含み、好ましくは、ここで複数回の投与は、３〜６か月連続で行われる。
【実施例】
【００９７】
ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害薬遮断薬と組み合わせたＶＸＭ０６ｍの抗腫瘍活性の評価：
本研究の目的は、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害薬遮断薬と組み合わせた、ＶＸＭ０６ｍの抗腫瘍活性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内移植したマウス細胞株ＦＢＬ−３によって引き起こされた白血病の同系腫瘍モデルにおいて研究することである。
【００９８】
６０頭のオスの４〜６週齢の平均体重２０ｇ／マウスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、それぞれ１５頭の４つの群に無作為に分けた。
群１（対照群）：マウス（ｎ＝１５）は空ベクターＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙ（外来性発現プラスミドを有さない、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細菌ベクターコントロール）で１、３、５、７、１４および２２日目に処理された。２０日目に、腹腔内経路によって、ＦＢＬ−３腫瘍細胞がマウスに移植された。
群２：マウス（ｎ＝１５）はＶＸＭ０６ｍ（短縮マウスＷＴ１をコードする、ｐＶＡＸ１０．ｍＷＴ１を含む、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））で、１、３、５、７、１４および２２日目に、１０8ＣＦＵ／適用の用量で、処理された。その間、２４および２９日目に、腹腔内経路によって、マウスは１００μｇ／投与の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ＢＰ０１０１、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｌｕｓ  抗マウスＰＤ−Ｌ１、クローン１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）で処理された。２０日目に、腹腔内経路によって、ＦＢＬ−３腫瘍細胞がマウスに移植された。
群３：マウス（ｎ＝１５）はＶＸＭ０６ｍで、１、３、５、７、１４および２２日目に、１０8ＣＦＵ／適用の用量で、処理された。その間、１１および１８日目に、腹腔内経路によって、マウスは１００μｇ／投与の抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（抗ＣＴＬＡ−４抗体、クローンＵＣ１０−４Ｆ１０、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）で処理された。２０日目に、腹腔内経路によって、ＦＢＬ−３腫瘍細胞がマウスに移植された。
群４（対照群）：マウス（ｎ＝１５）は空ベクターＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙで（１０8ＣＦＵ／適用）、１、３、５、７、１４および２２日目に処理され、１１および１８日目に、抗ＣＴＬＡ−４（１００μｇ／用量）で処理された。２０日目に、腹腔内経路によって、ＦＢＬ−３腫瘍細胞がマウスに移植された。
【００９９】
ＦＢＬ−３は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する、フレンド白血病ウイルスによって引き起こされる赤白血病の細胞株である。この細胞株は、免疫系によって認識されうる固有な（ｕｎｉｑｕｅ）腫瘍特異移植抗原（ＴＳＴＡ)を発現する。同系マウスをＦＢＬ−３腫瘍細胞で抗原刺激することは、今後の生腫瘍負荷の、その後の拒絶につながる。ＦＢＬ−３は免疫原性であるにもかかわらず、未処理の同系マウスへのＦＢＬ−３生腫瘍の注入は腫瘍生殖という結果をもたらし、これは、ＦＢＬ−３腫瘍細胞は免疫認識および破壊を回避するための機構を有することを示唆する。重要なことには、ＦＢＬ−３は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を過剰発現することが示されている。
【０１００】
マウスの生存期間は、研究全体を通して注意深く監視され、図１２および１３に示されている。
おそらくワクチン投与日の食道の偶発的な穿孔が原因で、７日目に、空ベクターで処理した群１において、マウス１頭の死亡が観察された。
−２３日目に群４のマウスが１頭死亡した。
−２５日目に群４のマウスが１頭死亡した。
−２９日目に各群のマウスがそれぞれ５頭屠殺され、脾臓が採取された。
−３０日目に群２のマウスが１頭死亡した。
−３９日目に群１のマウスが１頭死亡した。
−５８日目に群１のマウスが３頭死亡した。
−６５日目に群１のマウスが２頭死亡した。
−７４日目に群１のマウスが２頭死亡した。
−８３日目に群１および群４のマウスが２頭死亡した。
−９０日目に群４のマウスが１頭死亡した。
このように、２０日目の最初の腫瘍細胞負荷の後、動物の死亡は群１、２および４のみで観察され、そして他の群に関しては、すべての動物は健常であり、そして腫瘍の成長は観察されなかった。
【０１０１】
これらの結果は、ＶＸＭ０６ｍとチェックポイント阻害薬抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−Ｌ１のいずれかの組み合わせが、ＦＢＬ−３モデルにおいて非常に有効であり、迅速かつ持続的な抗腫瘍効果を生み出すことを、明示している。ＶＸＭ０６ｍと抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせは、研究終了時（１９６日目）において、１００％の生存をもたらした。
対照的に、空ベクターを用いた処理は抗腫瘍効果を示さず、腫瘍負荷後の平均生存期間は４５日で回復は０％であった。抗ＣＴＬＡ−４による処理は研究終了時点で４０％の死亡をもたらした。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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