(57)【要約】  本発明は、対象の腫瘍のクローン性／サブクローン性変異プロファイルの理解、及び、典型的に単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）などの腫瘍変異のマルチプレックスＰＣＲによる、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）における変異の検出に基づいて、腫瘍の再発を検出する対象特異的方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において腫瘍の再発を検出するための対象特異的方法であって、
ａ）対象の腫瘍のゲノム又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングして、前記腫瘍におけるクローン性及び／又はサブクローン性変異を定義すること、
ｂ）前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を介して前記腫瘍からのＤＮＡの存在を検出する試薬のセットを定義すること、
ｃ）前記試薬のセットを使用して、腫瘍除去後に前記対象から得られた前記腫瘍からのＤＮＡを含む試料を解析して、前記試料中の前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の検出により、前記腫瘍が再発したか否かを判定すること
を含む、方法。
【請求項２】
対象における腫瘍の再発を検出するための試薬のセットを定義する対象特異的方法であって、
ａ）前記対象の腫瘍のゲノム又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングすること、
ｂ）前記腫瘍におけるクローン性及び／又はサブクローン性変異を定義すること、及び
ｃ）前記対象からの試料における前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を検出する試薬のセットを定義すること
を含む、方法。
【請求項３】
対象において腫瘍の再発を検出するための対象特異的方法であって、前記腫瘍からクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を検出する試薬の対象特異的セットを用いて、腫瘍の除去後の前記対象から得られた試料中のＤＮＡを解析して、前記試料中の前記腫瘍からの前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の検出により、前記腫瘍が再発したか否かを判定することを含む、方法。
【請求項４】
前記シークエンシングが、前記対象からの腫瘍生検、前記腫瘍若しくは前記腫瘍の１つ若しくは複数の小区分の全て若しくは一部、又は無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環性腫瘍ＤＮＡ、エキソソーム由来腫瘍ＤＮＡ若しくは循環性腫瘍細胞に対して実行される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記シークエンシングが、前記腫瘍の除去後に前記腫瘍又はその小区分に対して実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
解析される前記試料が、ｃｆＤＮＡ、循環性腫瘍ＤＮＡ、エキソソーム由来腫瘍ＤＮＡ又は循環性腫瘍細胞を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍の少なくとも２つの小区分のゲノム又はエクソームの全て又は一部がシークエンシングされ、且つ、クローン性及び／又はサブクローン性変異が、どの変異がどの腫瘍小区分において起こっているかに基づいて定義される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍における前記クローン性及び／又はサブクローン性変異が、前記腫瘍の最大１０の小区分のゲノム又はエクソームをシークエンシングすることによって定義される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記クローン性及び／又はサブクローン性変異が単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の変異である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬のセットがマルチプレックスＰＣＲプライマーのセットであり、且つ、前記解析がマルチプレックスＰＣＲである、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬のセットを合成することをさらに含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象の非腫瘍ゲノム又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングすること、及びこれを前記腫瘍のゲノム又はエクソーム配列と比較して、前記対象の腫瘍中に見出される前記クローン性／サブクローン性変異を定義することをさらに含む、請求項１、２、及び４〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出試薬のセットが、少なくとも１つ又は少なくとも２つのクローン性変異を検出するものである、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出試薬のセットが、前記腫瘍の各小区分に特徴的な少なくとも１つの変異を検出するものである、請求項４〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
クローン性及びサブクローン性変異が、前記腫瘍の前記クローン性／サブクローン性変異のプロファイルを定義する系統発生ツリーに集約される、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出試薬のセットが、系統発生ツリーの幹に特徴的な少なくとも１つの変異及び前記系統発生ツリーの各枝に特徴的な少なくとも１つの変異を検出することができるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍からの前記ＤＮＡの全ゲノム若しくはエクソーム及び／又は前記少なくとも２つの腫瘍小区分の全エクソーム及び／又は前記対象の全非腫瘍エクソームがシークエンシングされる、請求項１、２、及び４〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲノム又はエクソームの一部がシークエンシングされて、前記対象のｃｆＤＮＡにおける前記対象の腫瘍からの早期クローン性変異が同定される、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記早期クローン性変異が、高信頼性ゲノム倍加前事象として分類される遺伝子中の体細胞ＳＮＶ及び／又は高信頼性早期（ゲノム倍加前）増幅事象に関与するとして分類される染色体領域中の体細胞ＳＮＶである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
変異が、表１の遺伝子の１つ又は複数において検出される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍が、肺腫瘍、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍又は黒色腫である、請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記肺腫瘍が非小細胞肺腫瘍である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記非小細胞肺腫瘍が、扁平細胞癌、腺癌又は大細胞癌腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記シークエンシングが、前記対象から得られた血漿に対して実行され、又は、解析される前記試料が、前記対象からの血漿試料である、請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記解析が、前記腫瘍の除去から、少なくとも４８時間、４８時間〜７日、７〜１４日、１４日〜１ヶ月、１〜２ヶ月、２〜６ヶ月、６ヶ月〜１年又は１年を超えた時点で実行される、請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記（ｃ）の解析が、期間にわたって複数の時に、例えば定期的な間隔で、実行される、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象がヒト対象である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１、２、及び４〜２８の何れか１項に記載の方法により得られる又は得られ得る、対象のｃｆＤＮＡにおける腫瘍からのクローン性及び／又はサブクローン性変異を検出するための対象特異的検出試薬のセット。
【請求項３０】
マルチプレックスＰＣＲ反応において使用するためのマルチプレックスプライマーのセットである、請求項２９に記載の検出試薬のセット。
【請求項３１】
請求項１、及び３〜３０の何れか１項に記載の方法を行うことを含む、対象を治療する方法であって、治療が、前記対象からの前記試料において検出される前記クローン性及び／又はサブクローン性変異に基づいて患者に対して選択される、方法。
【請求項３２】
前記治療が前記患者に投与される、請求項３１に記載の対象を治療する方法。
【請求項３３】
前記治療がアジュバント療法である、請求項３１又は３２に記載の対象を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対象において腫瘍の再発を検出するための対象特異的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
がんは世界中で死の主要な原因であり、肺がんはがん関連死の主要な原因である。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は最もよく見られる組織学的サブタイプであり、肺がん症例の８５％〜９０％を占める。ＮＳＣＬＣの患者の大部分は、局所的に進行した又は転移性の疾患を示し、予後不良である。切除可能なステージで同定された場合でさえ、患者の３０％〜５０％までが術後の状況において疾患の再発を経験する。
【０００３】
非小細胞肺がんの外科的切除を受ける患者の４０％までが、がんの再発を経験する。現在、手術を受ける一部の患者は、再び肺がんとなるリスクを５〜１０％低減させるために術後の（アジュバント）化学療法又は放射線療法を与えられる。この処置は、患者が悪性腫瘍（すなわち、大腫瘍、リンパ腺転移）に合致する病理学的特徴を有するかどうか、及び患者が化学療法治療を受けるために充分に適するかどうかに基づいて与えられる。
【０００４】
化学療法後に患者は「サーベイランス」に置かれる。患者は３〜６ヶ月毎に診療所に戻り、肺がんの再発の徴候を臨床的に評価され、また胸部Ｘ線又はＣＴスキャンも受ける。肺がんの再発に合致するイメージング又は臨床的な特徴がある場合、患者は再発について正式に調べられる。肺がんの再発が確認された場合、治療は、再発した肺がんが転移しているかどうかに依存する。肺がんが単一の部位において再発した場合、放射線療法又は手術を用いる「根治」治療を実行して、患者の治癒を達成しようと試みることができる。複数の部位においてがんが再発している場合、化学療法での治療が通常与えられ、患者は治癒することができない。これが該当する場合、予後は通常、１年から１８ヶ月に限定される。
【０００５】
進行性がんの患者の血漿及び血清において無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出することができる。ｃｆＤＮＡプロファイリングへの複数のアプローチが臨床診断ツールとして確立されつつある。しかしながら、早期肺がんにおいて、ｃｆＤＮＡプロファイリングへのアプローチはあまり成功しておらず、血漿試料を確認するために汎用的な遺伝子パネルを通常使用する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、患者の血漿からのｃｆＤＮＡにおける患者特異的なクローン性及び／又はサブクローン性変異を検出することにより、非侵襲的な様式で腫瘍再発及び転移性サブクローンの性質を追跡するための「オーダーメイド」のアプローチを記載する。患者の腫瘍の「系統発生ツリー」のモデル化を通じて、方法は、個々の患者に特有のオーダーメイドのバイオマーカープロファイルを生成する。クローン性変異は、まさにそれらの性質により、腫瘍内のあらゆる細胞中に存在する。パネル中にクローン性変異を組み込むことにより、このアプローチは血漿変異の検出の感度を増加させる。患者の腫瘍の「系統発生ツリー」の血漿プロファイルの追跡は、再発した疾患の元となることに関与する腫瘍内のクローン／サブクローンの同定を可能とし、クローン性及びサブクローン性変異の減少を追跡することによりイメージング及びそのような療法への応答のモニタリングで巨視的疾患が明らかとなる前に介入治療的機会のための機会を開く。
【０００７】
したがって、任意の個々の患者において存在するかもしれないし、存在しないかもしれないマーカーの汎用的パネルに依拠するのではなく、患者特異的な変異を追跡することにより、及び患者の系統発生ツリーの幹（ｔｒｕｎｋ）からクローン性変異を表す変異を選択することにより、この方法論は、有利なことに、血漿変異が同定される感度及び特異性を増加させる。
【０００８】
したがって、本発明は、ロバストな治療レジメンを補助するための、患者の疾患進行及び／又は再発を追跡することを伴う、腫瘍、例えば肺がんにおけるｃｆＤＮＡプロファイリングの方法に関する。このアプローチは、アジュバント療法において、外科的切除の後の肺がん、特に非小細胞肺がんの再発の追跡において特に有用である。この方法を使用する再発の早期検出は、そのような残留疾患の治療への応答を追跡するための同じアプローチを使用して、治療（免疫療法など）の開始又は治療の変更を促し得る。このアプローチはまた、肺以外にあるがん及び／又は他の方法で除去されたがんにおいても有用性を有する。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様では、対象において腫瘍の再発を検出するための対象特異的方法が提供され、方法は、
（ａ）対象の腫瘍のゲノム又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングして、前記腫瘍におけるクローン性及び／又はサブクローン性変異を定義すること、
（ｂ）前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を介して前記腫瘍からのＤＮＡの存在を検出する試薬のセットを定義すること、
前記試薬のセットを使用して、腫瘍除去後に前記対象から得られた前記腫瘍からのＤＮＡを含む試料を解析して、前記試料中の前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の検出により、前記腫瘍が再発したか否かを判定することを含む。
本発明のさらなる態様では、対象における腫瘍の再発を検出するための試薬のセットを定義する対象特異的方法が提供され、方法は、
（ａ）前記対象の腫瘍のゲノム又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングすること、
（ｂ）前記腫瘍におけるクローン性及び／又はサブクローン性変異を定義すること、及び
前記対象からの試料における前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を検出する試薬のセットを定義すること
を含む。
【００１０】
本発明の別の態様では、対象において腫瘍の再発を検出するための対象特異的方法が提供され、方法は、前記腫瘍からクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を検出する試薬の対象特異的セットを用いて、腫瘍の除去後の前記対象から得られた試料中のＤＮＡを解析して、前記試料中の前記腫瘍からの前記クローン性及び／又はサブクローン性変異の検出により、前記腫瘍が再発したか否かを判定することを含む。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、本発明の方法により得られる又は得られ得る、対象のｃｆＤＮＡにおける腫瘍からのクローン性及び／又はサブクローン性変異を検出するための対象特異的検出試薬のセットが提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、本発明の方法を行うことを含む対象を治療する方法が提供され、治療は、前記対象からの試料において検出されるクローン性及び／又はサブクローン性変異に基づいて患者に対して選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】標的の選択、アッセイの設計及び血漿のＰＣＲを実例で説明するワークフローの図式である。
【図２】測定されたｃｆＤＮＡ濃度、腫瘍ステージ。各データポイントは１つの血漿試料を表す。
【図３】患者の腫瘍試料からのＤＮＡを使用するマルチプレックスＰＣＲ反応の検証。組織ＶＡＦ測定間で良好な相関を示した試料。各試料は別々のボックス中に示され、ＶＡＦのデータポイントは組織小区分によって色付けしている。
【図４】各試料について血漿中に検出された及び検出されなかったＳＮＶ。
【図５】腫瘍ステージによる血漿中のＳＮＶ検出（左）及び試料検出（右）。
【図６】腫瘍ステージ及びＳＮＶクローン性の関数としての血漿ＶＡＦ。
【図７】組織学的種類による血漿中に検出されたＳＮＶの数。
【図８】ｃｆＤＮＡインプット量の関数としての各試料からの血漿中に検出されたＳＮＶの数。
【図９】血漿中のＳＮＶの検出は腫瘍中のそれらのＶＡＦと相関した。
【図１０Ａ】結果として得られたコール（ｃａｌｌ）の関数としての読み取ったヒストグラムの深さ。
【図１０Ｂ】結果として得られたコールの関数としてのアッセイの推定される検出限界。各パネルにおいて、左の群は、予想される血漿ＳＮＶを検出しなかったアッセイを示し、右の群は、予想される血漿ＳＮＶを検出したアッセイを示す。
【図１１Ａ】ｃｆＤＮＡデータからの腫瘍系統発生ツリーを再現するための血漿中に検出されたＳＮＶの評価。１０より多くの血漿ＳＮＶを有する試料を示す。妥当な推定されるがん細胞率を有する血漿中に検出された枝の数。
【図１１Ｂ】ｃｆＤＮＡデータからの腫瘍系統発生ツリーを再現するための血漿中に検出されたＳＮＶの評価。１０より多くの血漿ＳＮＶを有する試料を示す。血漿ＶＡＦ値が腫瘍系統発生ツリー構造に従うＳＮＶのペアのパーセンテージ。
【図１２】上パネル  −  ドライバーのカテゴリーによって選別した、試料当たりの、プライマーによって標的化されたＳＮＶの総数。下パネル  −  クローン性によって選別した、試料当たりの、プライマーによって標的化されたＳＮＶの総数。
【図１３】組織学的サブタイプ、扁平細胞癌（ＬＵＳＣ）及び腺癌（ＬＵＡＤ）に基づいて選別した、患者当たりの検出されたクローン性及びサブクローン性変異の数を実証する棒グラフ。黒塗りの棒は検出された変異を示し、白塗りの棒はプロービングされた変異の数を示す。
【図１４Ａ】検出された肺腺癌（ＬＵＡＤ）は、検出されなかったＬＵＡＤよりも有糸分裂がより活性であり（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、ゲノムが不安定である（図１４Ｃ）。検出されたＬＵＡＤは、主に充実性（ｓｏｌｉｄ）の組織学的サブタイプ（図１４Ｄ）である。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１４Ｄ】同上。
【図１５Ａ】クローン性ＳＮＶはサブクローン性ＳＮＶよりも高い血漿変異アレル頻度を有し（図１５Ａ及び図１５Ｂ）、（患者当たりの）平均クローン性変異アレル頻度は腫瘍体積と相関する（図１５Ｃ）（スピアマンの順位Ｒｓ（４２）＝０．６０、Ｐ＜０．００１）。図１５Ｃにおける孤立値からのＰＥＴ  ＣＴはＰＥＴ集積腫瘍の周縁のみを実証する（図１５Ｄ）。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１５Ｄ】同上。
【図１６Ａ】コールされた変異の平均の正規化された変異アレル頻度（ＶＡＦ）は、全エクソームシークエンシングにより決定した変異コピー数と相関し、コールされた変異の平均の正規化されたＶＡＦは、複数領域シークエンシング（サブクローンサイズの推定）により同定される全ての転移した領域から取られた平均サブクローン性クラスターがん細胞率と相関する。
【図１６Ｂ】同上。
【図１７Ａ】本研究の間に疾患の再発を被った肺扁平細胞癌（ＬＵＳＣ）及び肺腺癌（ＬＵＡＤ）を有する患者における臨床的再発に先立つ血漿中のクローン性ＳＮＶの検出を実証する時間経過グラフ。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【図１７Ｄ】同上。
【図１７Ｅ】同上。
【図１７Ｆ】同上。
【図１７Ｇ】同上。
【図１７Ｈ】同上。
【図１７Ｉ】同上。
【図１７Ｊ】同上。
【図１７Ｋ】同上。
【図１７Ｌ】同上。
【図１７Ｍ】同上。
【図１８Ａ】本研究の時間経過内に疾患の再発を被らなかった肺扁平細胞癌（ＬＵＳＣ）及び肺腺癌（ＬＵＡＤ）を有する患者（対照症例）における臨床的再発に先立つ血漿中のクローン性ＳＮＶの検出を実証する時間経過グラフ。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１８Ｄ】同上。
【図１８Ｅ】同上。
【図１８Ｆ】同上。
【図１８Ｇ】同上。
【図１８Ｈ】同上。
【図１８Ｉ】同上。
【図１８Ｊ】同上。
【図１８Ｋ】同上。
【図１８Ｌ】同上。
【図１９Ａ】「ツリー」の上段はエクソームデータから構築された系統発生ツリーを表す。ツリーの下段は血漿系統発生ツリーを表す。この図は、腫瘍のサブクローン構造を表すために血漿遺伝子型判定をどのように使用できるかを実証する。
【図１９Ｂ】同上。
【図１９Ｃ】同上。
【図１９Ｄ】同上。
【図１９Ｅ】同上。
【図２０Ａ】腫瘍のサブクローン構造の経時的な追跡。ＬＴＸ０１９において、特定のサブクローン性クラスターが肺がん再発の時点で検出された。このサブクローン性クラスターは、転移ニッチの形成に関連するＣＤ４４を含有する。ＬＴＸ０３８において、１つのみの系統発生枝が再発時に検出され、再発クローンはこの枝から生じたことを示唆する。
【図２０Ｂ】同上。
【図２１】このｃｆＤＮＡ解析に関与する患者及び何故エクソーム研究からの４人の患者をｃｆＤＮＡ解析から除外したのかを説明するＣＯＮＳＯＲＴダイアグラム。
【図２２】ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ腫瘍における変異シグネチャーの頻度及び異なる変異カテゴリーの相関。スピアマンの順位からの有意性を指し示す。変異シグネチャーを使用して変異のクローン性を推測できることを指し示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
対象特異的方法
本発明は、対象において腫瘍の再発を検出するための対象特異的方法に関する。方法は、患者に合わせて調整されるため、対象特異的である。方法は、腫瘍を有すると診断された特定の患者に対して実行される。対象特異的はまた、患者特異的と称することもできる。腫瘍が患者において再発したかどうかを判定するために使用される、腫瘍において同定されるクローン性及び／又はサブクローン性変異は、個々の対象から切除され又は生検された腫瘍中に存在すると以前に判定された変異である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットである。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００１６】
本発明の方法は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）中の患者の腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇を検出することにより、特定の対象又は患者における腫瘍の再発を検出する。「クローン性変異」という用語は、早期クローン性変異及び／又はクローン性変異を含んでよいことが理解されるであろう。クローン性及び／又はサブクローン性変異は、個々の患者からの特定の腫瘍に特徴的である。患者の腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異は、典型的に腫瘍を患者から切除した後に、腫瘍からのＤＮＡの全ゲノム及び／又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングすることによって定義される。目的の特定の対象について同定される特定のクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を介して腫瘍からのＤＮＡの存在を検出するように設計又は定義された試薬のセットを使用して、患者から得られるｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇が解析される。
【００１７】
腫瘍に特徴的な患者からのｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍が再発したかどうかを指し示す。腫瘍に特徴的な特定の患者からのｃｆＤＮＡにおけるクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍の再発を指し示すことができる。
【００１８】
好ましい実施形態では、腫瘍に特徴的な患者からのｃｆＤＮＡにおけるクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍が再発したかどうかを指し示す。腫瘍に特徴的な特定の患者からのｃｆＤＮＡにおけるクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍の再発を指し示すことができる。
【００１９】
好ましい実施形態では、腫瘍に特徴的な患者からのｃｆＤＮＡにおける早期クローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍が再発したかどうかを指し示す。腫瘍に特徴的な特定の患者からのｃｆＤＮＡにおける早期クローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍の再発を指し示すことができる。
【００２０】
腫瘍に特徴的な患者からのｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍のどの部分が患者において腫瘍の再発の元となっているかを決定するために使用することができる。腫瘍に特徴的なｃｆＤＮＡにおけるサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍の再発の元となっている腫瘍の部分を決定することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、腫瘍に特徴的な患者からのｃｆＤＮＡにおけるサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍のどの部分が患者において腫瘍の再発の元となっているかを決定するために使用することができる。腫瘍に特徴的なｃｆＤＮＡにおけるサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍の再発の元となっている腫瘍の部分を決定することができる。
【００２２】
腫瘍の種類
本発明の対象特異的方法は、腫瘍の再発を検出することを目的とする。腫瘍は、任意の固形又は非固形腫瘍であってよい。腫瘍は、例えば、膀胱がん、胃がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎臓細胞）、肺がん（小細胞、非小細胞及び中皮腫）、脳がん（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、膠芽腫）、黒色腫、リンパ腫、小腸がん（十二指腸がん及び空腸がん）、白血病、リンパ腫、膵臓がん、肝胆道腫瘍、生殖細胞がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がん及び肉腫であってよい。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、腫瘍の種類は、肺がん、好ましくは非小細胞肺がんである。本発明のさらなる態様では、非小細胞肺がんは、扁平細胞腫瘍、腺癌又は大細胞癌腫である。好ましい実施形態では、非小細胞肺がんは扁平細胞癌である。
【００２４】
腫瘍は、当業者に公知の多数の異なる技術によって患者から除去することができる。例えば、腫瘍は、外科的切除、内視鏡切除、化学療法及び／又は放射線療法によって患者から除去又は取り除くことができる。
【００２５】
腫瘍ＤＮＡ
本発明の方法は、腫瘍又は腫瘍の小区分から単離されたがん細胞中に存在する変異を決定するステップを含む。腫瘍からの生検及び試料の単離は、当該技術分野において一般に実施されており、任意の好適な方法にしたがって行うことができ、そのような方法は当業者に公知であろう。
【００２６】
腫瘍試料は血液試料であってよい。例えば、血液試料は、ｃｆＤＮＡ、循環性腫瘍ＤＮＡ、循環性腫瘍細胞又は腫瘍ＤＮＡを含むエキソソームを含んでよい。
【００２７】
好ましい実施形態では、腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異は、１つ又は複数の腫瘍小区分から定義される。腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異は、腫瘍の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも又は最大１０の小区分から定義されてよい。
【００２８】
さらなる実施形態では、腫瘍におけるクローン性及び／又はサブクローン性変異は、単一領域から定義される。他のさらなる実施形態では、早期クローン性変異、すなわち、ゲノム倍加の前に起こるクローン性変化は、単一領域から定義される。
【００２９】
単一領域は、腫瘍生検、腫瘍の小区分、腫瘍全体、エクソームの選択領域若しくは単一領域、又は全ゲノム配列の選択領域若しくは単一領域を包含する。エクソームの又は全ゲノム配列の単一領域は、コピー数の増幅を受けたゲノム倍加前に起こる早期クローン性変異をコードする領域で選択することができる。エクソームの又は全ゲノム配列の単一領域は、一般的なクローン性体細胞及び早期増幅事象（例えば、表１を参照）並びに／又はクローン性及び／若しくはサブクローン性変異の起こり得る「変異シグネチャー」（例えば、表２を参照）をコードする領域で選択することができる。エクソームの又は全ゲノム配列の単一領域は、一般的なクローン性体細胞及び早期増幅事象（例えば、表１を参照）並びに／又はクローン性及び／若しくはサブクローン性変異の起こり得る「変異シグネチャー」（例えば、表２を参照）に関するデータから患者における腫瘍に特徴的な起こり得るクローン性変異を推定することによって選択することができる。
【００３０】
クローン性及びサブクローン性変異
「変異」は、同じ個体からの健常細胞と比較した、腫瘍細胞におけるヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の差異を指す。ヌクレオチド配列の差異は、同じ個体からの健常細胞によって発現されないタンパク質の発現を結果としてもたらすことがある。
【００３１】
本明細書における「本質的に全て」への言及は、対象中の腫瘍細胞の大部分を包含することを意図する。例えば、これは、細胞の６０〜１００％、例えば、対象中の腫瘍細胞の６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％を含むことがある。
【００３２】
腫瘍の異なる領域は、形態学的に異なることがある。加えて、腫瘍内の変異不均質性が起こることがあり、これが腫瘍予後の差異に関連することがあり、また、全ての又はほとんどの腫瘍細胞中に存在するものではない変異を標的化する免疫療法を腫瘍細胞が免れる潜在的な能力に関連することがある。
【００３３】
腫瘍内不均質性は、腫瘍の異なる領域における及び腫瘍の異なる細胞間での腫瘍変異の発現を引き起こす。腫瘍内で、ある特定の変異は腫瘍の全ての領域及び本質的に全ての細胞において発現される一方、他の変異は腫瘍領域及び細胞のサブセットにおいてのみ発現される。
【００３４】
「幹」又は「クローン性」変異は、腫瘍の全体を通じて効果的に発現され、本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされる変異である。「枝」又は「サブクローン性」変異は、腫瘍中の細胞又は領域のサブセット又は一部で発現される変異である。
【００３５】
「腫瘍の全体を通じて存在する」、「腫瘍の全体を通じて効果的に発現される」及び「本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされる」は、幹変異が、試料が解析される腫瘍の全ての領域において発現されることを意味することがある。
【００３６】
「本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされる」変異の判定は、統計計算を指し、したがって統計解析及び閾値に付されることが理解されるであろう。
【００３７】
幹変異が「腫瘍の全体を通じて効果的に発現される」という判定は、統計計算を指し、したがって統計解析及び閾値に付される。
【００３８】
「本質的にあらゆる腫瘍細胞又は本質的に全ての腫瘍細胞において効果的に発現される」は、適切な統計的方法を使用する決定で、試料中の解析される全ての腫瘍細胞中に変異が存在することを意味する。
【００３９】
例として、変異を宿すがん細胞の割合を示すがん細胞率（ＣＣＦ）を使用して、変異が幹であるのか、それとも枝であるのかを決定することができる。例えば、がん細胞率は、Ｌａｎｄａｕら（Ｃｅｌｌ  ２０１３年２月１４日；１５２巻（４号）：７１４〜２６頁）によって説明された通り、変異アレル頻度をコピー数及び純度の推定値と統合することによって決定することができる。
【００４０】
簡潔に述べれば、解析されるそれぞれの及びあらゆる腫瘍領域内で同定される全ての変異についてＣＣＦ値を算出する。１つの領域のみが使用される場合（すなわち、単一試料のみ）、１セットのみのＣＣＦ値が得られる。これは、どの変異がその腫瘍領域内の全ての腫瘍細胞中に存在するかに関する情報を提供し、それにより、変異が幹又は枝であるかどうかの指標を提供する。腫瘍領域中の全てのサブクローン性変異（すなわち、ＣＣＦ＜１）は枝であると決定される一方、ＣＣＦ＝１のクローン性変異は幹であると決定される。
【００４１】
上記の通り、幹変異の判定は、統計解析及び閾値に付される。そのため、０．７５以上、例えば、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００又は＞１．００の５のＣＣＦの９５％信頼区画を有すると決定された場合、変異は幹として同定することができる。反対に、解析された任意の試料において０．７５以下、例えば、０．７０、０．６５、０．６０、０．５５、０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３０、０．２５、０．２０、０．１５、０．１０、０．０５、０．０１のＣＣＦの９５％信頼区画を有すると決定された場合、変異は枝として同定することができる。幹変異を同定する方法の正確性は、腫瘍から単離された１つより多くの試料についてクローン性変異を同定することによって増加することが理解されるであろう。
【００４２】
変異は、アミノ酸配列の変化（コーディング変異）を結果としてもたらす単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、複数ヌクレオチド変異、欠失変異、挿入変異、転座、ミスセンス変異又はスプライス部位変異であってよい。
【００４３】
好ましい実施形態では、クローン性及び／又はサブクローン性変異は単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）である。
【００４４】
本発明の一部の実施形態では、クローン性変異は早期クローン性変異である。
【００４５】
ゲノム倍加ががん細胞において起こり得ることが公知である。ゲノム倍加事象の前に起こる変異は、したがって、倍加事象の後に起こる変異の２倍の相対コピー数でがん細胞中に存在する。早期クローン性変異は、ゲノム倍加の前に腫瘍中に生じる変異である。早期クローン性変異は、ゲノム倍加事象の前に起こる変異を包含し、倍加事象の後に起こる変異の２倍の相対コピー数でがん細胞中に存在し、すなわち、ゲノム倍加前に起こり、コピー数の増幅を受けた変異である。「クローン性」という用語は、早期クローン性変異及び／又はクローン性変異を含んでよいことが理解されるであろう。早期クローン性変異は、染色体領域中又は特定の遺伝子中に存在することができる。早期クローン性変異は、高信頼性ゲノム倍加前事象であるとして分類される遺伝子中の体細胞ＳＮＶ及び／又は高信頼性早期（ゲノム倍加前）増幅事象に関与するとして分類される染色体領域中の体細胞ＳＮＶであってよい。早期クローン性変異は、表１の遺伝子及び／又は染色体領域の１つ又は複数において検出され得る。
【００４６】
特定の患者における腫瘍に特徴的なｃｆＤＮＡにおける早期クローン性変異及び／又はクローン性変異の存在及び／又は上昇は、腫瘍の再発を指し示す。したがって、ｃｆＤＮＡにおいてこれらのクローン性及び／又は早期クローン性変異の存在を検出することは、腫瘍が再発したかどうかを検出する。早期クローン性変異は、ゲノム倍加前に起こり、コピー数の増幅を受け、及び血漿中で最も高い変異アレル頻度を有する変異を包含する。
【００４７】
腫瘍の早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異を含む変異プロファイルを使用して、各患者からの各腫瘍の系統発生ツリーを再現することができる。各腫瘍の系統発生ツリーは、腫瘍がどのように進展したかを表すことが理解されるであろう。腫瘍の進展はツリー中にコード化され、がんの不均質性の遺伝的多様性並びに早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の組成に関する重要な生物学的情報を提供する。腫瘍からの変異は系統発生ツリーに集約されて、腫瘍の早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異プロファイルを定義することができる。そのような系統発生ツリーは腫瘍に特異的なものとなり、腫瘍を切除した患者に特異的なものとなる。
【００４８】
系統発生ツリーは、患者に特異的な腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異を特徴付ける。
【００４９】
早期クローン性及び／若しくはクローン性の変異又はクローンは、ツリーの「幹」にある。クローン性変異は再発を指し示すものであり、試料、例えばｃｆＤＮＡにおけるそれらの存在及び／又は上昇を検出することは、腫瘍の再発を指し示す。早期クローン性変異は、ｃｆＤＮＡにおいて高い変異アレル頻度を有し、それらの存在及び／又は上昇は、手術後の腫瘍の再発を予測し又は指し示す高感度の方法を表す。
【００５０】
サブクローン性変異はツリーの「枝」にある。サブクローン性変異又はサブクローンの検出は、腫瘍の再発の元となっている枝の同定を可能とする。再発の元となっている枝を同定することは、患者特異的な治療オプションに密接な関連を有し得る。
【００５１】
バーコード
一部の実施形態では、実施例８及び９に例示されるように、患者特異的「バーコード」が早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異から生成される。患者特異的バーコードは、腫瘍系統発生ツリーを描写するためのクローン性又はサブクローン性の起源であり得る特定の患者における腫瘍に特徴的なＳＮＶ並びに／又は挿入及び／若しくは欠失変異を含む又はそれからなる。患者特異的バーコードのＳＮＶの検出は、特定の患者において腫瘍が再発したかどうかを指し示す。バーコードは、特定の患者における腫瘍に特異的である。したがって、バーコードは各患者に特有である。バーコードはまた、個体専用バーコードと称することもできる。
【００５２】
患者特異的バーコードは、１つ又は複数の変異を含んでよい。患者特異的バーコードは、１つ又は複数のＳＮＶ並びに／又は挿入及び／若しくは欠失変異を含んでよい。患者特異的バーコードは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも又は最大５００の、特定の患者の腫瘍に特徴的なＳＮＶ並びに／又は挿入及び／若しくは欠失変異を含んでよい。
【００５３】
バーコードのＳＮＶは、早期クローン性変異、クローン性変異及び／若しくはサブクローン性変異並びに／又は挿入及び／若しくは欠失変異であってよい。患者特異的バーコードは、したがって、早期クローン性変異、クローン性変異及び／若しくはサブクローン性変異並びに／又は挿入及び／若しくは欠失変異を含む又はそれからなるものであってよい。患者特異的バーコードはまた、早期クローン性変異のみを含んでもよい。患者特異的バーコードはまた、早期クローン性ドライバー遺伝子及び／若しくは早期クローン性増幅染色体アーム（表１）並びに／又は変異シグネチャー（表２）から生じたＳＮＶを含んでもよい。好ましい実施形態では、患者特異的バーコードを含む又はそれからなるＳＮＶは、腫瘍の再発を検出するために高い感度及び高い分解能を与えるＳＮＶである。
【００５４】
患者特異的バーコードは、単一領域に由来する早期クローン性変異、クローン性変異及び／又はサブクローン性変異を含んでよい。単一領域は上記されている。単一領域の患者特異的バーコードは、したがって、早期クローン性変異、クローン性変異及び／若しくはサブクローン性変異並びに／又は挿入及び／若しくは欠失変異を含む又はそれからなるものであってよい。単一領域の患者特異的バーコードはまた、早期クローン性変異のみを含んでもよい。単一領域の患者特異的バーコードはまた、早期クローン性ドライバー遺伝子及び／又は早期クローン性増幅染色体アーム（表１）並びに／又は変異シグネチャー（表２）から生じたＳＮＶを含んでもよい。好ましい実施形態では、単一領域の患者特異的バーコードを含む又はそれからなるＳＮＶは、腫瘍の再発を検出するために高い感度及び高い分解能を与えるＳＮＶである。
【００５５】
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）
本発明は、対象において腫瘍の再発を検出する対象特異的方法であって、クローン性及び／又はサブクローン性変異が試料において同定される方法に関する。試料は体液であってよい。体液は、ｃｆＤＮＡ、エキソソーム由来腫瘍ＤＮＡ、循環性腫瘍ＤＮＡ及び／又は循環性腫瘍細胞が存在し得る任意の体液を指し、体液としては、以下に限定されないが、全血、血清、血漿、骨髄、脳脊髄液、腹膜／胸膜液、リンパ液、腹水、漿液、痰、涙液、糞便、及び尿が挙げられる。典型的に、本発明にしたがって解析される体液は、全血の試料（すなわち、血液細胞及び血漿の両方を含む血液試料）に由来する。好ましくは、体液は血漿又は血清である。試料は、ｃｆＤＮＡ、循環性腫瘍ＤＮＡ、循環性腫瘍細胞又は腫瘍ＤＮＡを含むエキソソームを含んでよい。エキソソーム由来腫瘍ＤＮＡは、腫瘍細胞によって放出され、腫瘍ＤＮＡを含有するエキソソームを指すことが理解されるであろう。腫瘍ＤＮＡは、エキソソーム内に含有され、エキソソームに由来する。
【００５６】
試料は、任意の非侵襲的方法によって特定の患者から得ることができる。非侵襲的方法は、身体に侵入しない又は身体を切開しない任意の方法を包含する。そのような方法としては、静脈穿刺、液体生検を得る方法、腰椎穿刺、胸膜液吸引、心膜液吸引及び腹水吸引が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
好ましい実施形態では、試料はｃｆＤＮＡを含む。本明細書において無細胞ＤＮＡ又は「ｃｆＤＮＡ」は、対象中で細胞の外側に存在するＤＮＡ、又は典型的に体液中にある、そのようなＤＮＡの単離形態を指す。別に指し示さない限り又は文脈に矛盾しない限り、本明細書において「循環性ＤＮＡ」は、血液中に存在するｃｆＤＮＡを指す。
【００５８】
腫瘍シークエンシング
腫瘍試料中に存在する変異を決定することは、腫瘍試料及び同じ対象からの比較用健常試料から単離されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列を、例えば、エクソームシークエンシング、全ゲノムシークエンシング及び／又は標的化遺伝子パネルシークエンシングによって比較することによって行うことができる。
【００５９】
非腫瘍試料からのＤＮＡ及び／又はＲＮＡと比較して腫瘍試料からのＤＮＡ及び／又はＲＮＡにおけるヌクレオチドの差異（例えば、単一ヌクレオチド変異又はＳＮＶ）を同定する配列アライメントは、当該技術分野において公知の方法を使用して行うことができる。参照試料は、生殖細胞系列ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列であってよい。
【００６０】
本発明の方法は、好ましくは、複数領域高深度全エクソームシークエンシングを使用する。
【００６１】
本発明の方法は、対象における腫瘍の再発を検出するための試薬のセットを定義する対象特異的方法に関する。
【００６２】
本発明の一部の実施形態では、腫瘍の全ゲノム及び／又はエクソームがシークエンシングされる。本発明の他の実施形態では、腫瘍のゲノム及び／又はエクソームの一部がシークエンシングされる。したがって、腫瘍からのＤＮＡのゲノム及び／又はエクソームの全て又は一部がシークエンシングされてよい。シークエンシングされる腫瘍のゲノム及び／又はエクソームの一部は、特定の遺伝子又は染色体領域についてであってよい。例えば、シークエンシングされる腫瘍のゲノム及び／又はエクソームの一部は、表１に定義される遺伝子又は染色体領域のいずれかを含んでよい。
【００６３】
腫瘍のゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部がシークエンシングされ、健常試料からシークエンシングされたゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部と比較されてもよい。健常試料は、腫瘍を有さず又は腫瘍若しくは腫瘍増殖を被っていない患者の身体の一部分から採取された健常組織試料又は健常血液試料であってよい。
【００６４】
腫瘍又は健常試料のゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部をシークエンシングして、腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異を同定又は定義することができる。腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を判定することは、対象から採取されたｃｆＤＮＡにおける同等の早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の判定を可能とする。
【００６５】
腫瘍又は健常試料のゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部をシークエンシングして、腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異を同定又は定義することができる。腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を判定することは、対象から採取されたｃｆＤＮＡにおける同等の早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の判定を可能とする。
【００６６】
一部の実施形態では、腫瘍全体から又は腫瘍の小区分からゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部がシークエンシングされる。腫瘍の小区分は、患者から切除された腫瘍全体の切除された区分を指すことが理解されるであろう。１つ又は複数の腫瘍小区分からエクソームの全体又は一部がシークエンシングされてよい。少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも又は最大１０の小区分からエクソームの全体又は一部がシークエンシングされてよい。
【００６７】
本発明の一部の実施形態では、対象の非腫瘍ゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部がシークエンシングされる。一部の実施形態では、対象の非腫瘍ゲノム及び／又はエクソームの全体又は一部がシークエンシングされ、腫瘍ゲノム及び／又はエクソーム配列と比較されて、対象の腫瘍中に見出されるクローン性及び／又はサブクローン性変異を定義する。
【００６８】
本発明の一部の実施形態では、腫瘍からのＤＮＡのゲノム及び／又はエクソームの全て又は一部をシークエンシングして腫瘍におけるクローン性及び／又はサブクローン性変異を定義することは、定義される腫瘍からのｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を検出する試薬のセットを可能とする。
【００６９】
ｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の定義及び検出
試薬のセットが早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を介して腫瘍からのＤＮＡの存在を検出するために合成され、定義され及び／又は使用される。試薬のセットは、ヌクレオチド配列の増幅及びシークエンシングを行うために必要とされる任意の試薬を包含することが理解されるであろう。試薬のセットは、ｃｆＤＮＡの断片を捕捉するために必要とされる任意の試薬を包含することも理解されるであろう。例えば、試薬のセットは、ＣＡＰＰ−ＳＥＱアッセイを実行するための試薬のセット又はデジタルＰＣＲアッセイを実行するための試薬のセットであってよい。好ましい実施形態では、試薬のセットは、プローブ及び／又はプライマーを含む試薬のセットである。そのようなプローブ及び／又はプライマーは、当該技術分野において使用される公知及びルーチンの技術によって製造することができる。典型的に、プローブ及び／又はプライマーは、マルチプレックスＰＣＲのためのものである。好ましい実施形態では、試薬のセットは、マルチプレックスＰＣＲプローブ及び／又はプライマーのセットである。マルチプレックスＰＣＲを行うための試薬のセットは当業者に公知である。
【００７０】
本発明の一部の実施形態では、腫瘍からのｃｆＤＮＡ中に見出される変異を同定するために及びこれらの変異を使用して試薬のセットを定義するために、ｃｆＤＮＡは、腫瘍の除去の前に対象から得られる。
【００７１】
本発明の一部の実施形態では、早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異は、どの変異がどの腫瘍小区分において起こっているかに基づいて定義される。例えば、早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異は、同じ腫瘍小区分及び／又は異なる腫瘍小区分において起こっている変異に対して定義されてよい。好ましい実施形態では、腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異は、１つ又は複数の腫瘍小区分から定義される。腫瘍における早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも又は最大１０の小区分から定義されてよい。本発明の一部の実施形態では、検出試薬のセットは、１つ又は複数の変異を検出することができる。検出試薬のセットは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも又は最大５００の、腫瘍の各小区分に特徴的な変異を検出することができるものであってよい。
【００７２】
本発明の方法は、対象において腫瘍の再発を検出することに関し、検出することは、腫瘍からのクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を検出する試薬の対象特異的セットを用いてｃｆＤＮＡを解析することを含む。ｃｆＤＮＡは、腫瘍の除去に引き続いて又は腫瘍の除去の後に対象から得られ、ｃｆＤＮＡにおける腫瘍からのクローン性及び／又はサブクローン性変異の検出によって腫瘍が再発したか否かを判定するために解析される。好ましい実施形態では、ｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の解析はマルチプレックスＰＣＲである。
【００７３】
一実施形態では、方法は、ｃｆＤＮＡを解析して腫瘍からの早期幹変異を同定することによって対象において腫瘍の再発を検出することに関する。早期幹変異は腫瘍中に広範に存在し、ゲノム倍加事象により増幅されるので、ゲノム倍加前のこれらの早期事象の検出は、疾患活性及び再発を予測するバイオマーカーの点でより高い感度を提供する。早期変異を検出するさらなる利点は、複数の領域をシークエンシングする必要がなく、したがって方法を実行するために要する時間が低減されることである。
【００７４】
方法の感度をさらに増加させるために、早期幹変異は、高信頼性早期（ゲノム倍加前）事象として分類される遺伝子中又は高信頼性早期（ゲノム倍加前）増幅事象に関与するとして分類される染色体領域中の体細胞ＳＮＶであってよい。ＮＳＣＬＣについてのそのような遺伝子及び染色体領域の例は表１に与えられる。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在を介して腫瘍からのＤＮＡの存在を検出するために合成され、定義され及び／又は使用される試薬（ｒｅｇｅｎｔｓ）のセットは、マルチプレックスＰＣＲ反応においてｃｆＤＮＡにおけるクローン性及び／又はサブクローン性変異の解析に使用されるマルチプレックスＰＣＲプローブ及び／又はプライマーのセットである。検出試薬のセットは、マルチプレックスＰＣＲ反応において使用するためのマルチプレックスプライマーのセットであってよい。
【００７６】
本発明の一部の実施形態では、試薬のセットは、系統発生ツリーの幹に特徴的な１つ又は複数の変異を検出する。試薬のセットは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも又は最大５００の、系統発生ツリーの幹に特徴的な変異を検出するものであってよい。
【００７７】
本発明の一部の実施形態では、試薬のセットは、系統発生ツリーの枝に特徴的な１つ又は複数の変異を検出する。試薬のセットは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも又は最大５００の、系統発生ツリーの各枝に特徴的な変異を検出するものであってよい。
【００７８】
本発明の一部の実施形態では、試薬のセットは、系統発生ツリーの幹に特徴的な１つ又は複数の変異及び系統発生ツリーの枝に特徴的な１つ又は複数の変異を検出する。試薬のセットは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも又は最大５００の、系統発生ツリーの幹に特徴的な変異、及び少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも又は最大５００の、系統発生ツリーの各枝に特徴的な変異を検出するものであってよい。
【００７９】
一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡ試料解析は、腫瘍の除去から少なくとも４８時間、４８時間〜７日、７〜１４日、１４日〜１ヶ月、１〜２ヶ月、２〜６ヶ月、６ヶ月〜１年又は１年を超えた時点で実行される。
【００８０】
さらなる実施形態では、ｃｆＤＮＡ試料解析は、期間にわたって複数の時に、例えば定期的な間隔で、実行される。
【００８１】
腫瘍切除後に対象から得られるｃｆＤＮＡを解析することによる腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異の検出は、腫瘍の再発を指し示す。腫瘍切除後に対象から得られるｃｆＤＮＡを解析することによる腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異の非存在は、腫瘍が再発していないことを指し示す。
【００８２】
所見に基づく治療レジメン
本発明の方法は、患者に特異的な腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異のために、試料、例えば血液試料からのｃｆＤＮＡをプロファイルすることを必要とする。クローン性及び／又はサブクローン性変異は、腫瘍再発の感受性マーカーである。患者に投与される治療は、系統発生ツリーの「枝」におけるクローン性変異、例えばサブクローン性変異に基づいて決定されてよい。サブクローン性変異又はサブクローンの検出は、腫瘍の再発の元となっている枝の同定を可能とする。再発の元となっている枝を同定することは、患者特異的治療オプションに密接な関係を有し得る。
【００８３】
ｃｆＤＮＡにおける腫瘍に特徴的な早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の検出に基づいて、個体専用治療レジメンが作り出される。患者のｃｆＤＮＡ中に存在する再発性腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異は、異なる方法による治療に対してより敏感なことがある。腫瘍に特徴的なクローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇に基づいて、治療レジメンが設計される。治療としては、手術、標的化小分子療法、免疫療法、抗体療法、養子Ｔ細胞療法、ワクチン療法、化学療法及び／又は放射線療法を挙げることができるがこれらに限定されない。治療は、単独又は組合せで投与することができる。治療はアジュバント療法であってよく、アジュバント療法としては、養子Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン接種及びがんワクチン接種を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８４】
治療は、アジュバント化学療法、例えばシスプラチン及び／又はビノレルビンを含んでよい。治療はまた、免疫療法、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、養子免疫Ｔ細胞免疫療法、がんワクチン接種及び／又はＣＡＲ−Ｔ細胞を用いるものを含んでもよい。治療はまた、クローン性ネオ抗原に対するＴ細胞療法、又は患者特異的ネオ抗原をコードするクローン性変異、すなわち、該タンパク質を宿主免疫系に見えるようにする腫瘍変異を追跡することによってリアルタイムで養子Ｔ細胞療法をモジュレ―トすることを含んでもよい。治療は、ＥＧＦＲ変異体又はＥＲＢＢ２増幅などの標的化可能な変化に対する標的化療法、例えばアファタニブ（Ａｆａｔａｎｉｂ）を使用することを含んでよい。
【００８５】
ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性及び／又はクローン性変異の存在及び／又は上昇を使用して、治療への応答をモニターすることができる。ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性及び／又はクローン性変異の存在及び／又は上昇を使用して、アジュバント治療、例えばアジュバント化学療法への応答をモニターすることができる。ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性のクローン性変異の検出は、欠如又は治療への応答を指し示す。ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の非存在は、治療の成功アウトカムと相関する。
【００８６】
治療の間の特定の患者における腫瘍に特徴的なｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、治療レジメンを変化させることができる。アジュバント治療、例えばアジュバント化学療法の間の特定の患者における腫瘍に特徴的なｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在及び／又は上昇は、治療レジメンを変化させることができる。治療及び／又はアジュバント治療、例えばアジュバント化学療法の間の特定の患者における腫瘍に特徴的なｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異のそのような存在及び／又は上昇は、治療を中止し、代替的な治療を使用し、例えば臨床試験に向けて、治療を段階的に増大させ、及び／又は治療を段階的に減少させるためのツールとして使用することができる。例えば、治療又はアジュバント治療は、特定の患者において腫瘍を治療しないことがあり、又は、治療又はアジュバント治療は、特定の患者にとって毒性なことがある。治療を中止し、代替的な治療を使用し、治療を段階的に増大させ及び／又は治療を段階的に減少させることの根拠は、ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在、非存在、上昇及び／又は低下に基づくものであってよい。
【００８７】
ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在、非存在、上昇及び／又は低下は、特定の患者にどの治療を投与するかの決定において臨床医を促すことができる。ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在、非存在、上昇及び／又は低下に基づいて、臨床医（ｃｌｉｎｉｃａｌ）は、アジュバント化学療法を投与するか否かを決定することができる。ｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異の存在、非存在、上昇及び／又は低下に基づくアジュバント化学療法を投与するか否かの決定はまた、手術後の期間におけるｃｆＤＮＡにおける早期クローン性、クローン性及び／又はサブクローン性変異のレベルに基づくものであってもよい。ｃｆＤＮＡ試料解析は、手術後の期間にわたって複数の時に、例えば定期的な間隔で実行することができる。ｃｆＤＮＡ試料解析は、手術後、少なくとも４８時間、４８時間〜７日、７〜１４日、１４日〜１ヶ月、１〜２ヶ月、２〜６ヶ月、６ヶ月〜１年又は１年を超えた時点で実行することができる。ｃｆＤＮＡ試料解析は、手術後４〜６週間にわたって実行することができる。
【００８８】
本発明を例によりこれよりさらに説明するが、これらの例は、当業者が本発明を実施するのを補助するために役立つことを意図しており、本発明の範囲をいかなる意味でも限定することを意図しない。
【実施例】
【００８９】
実施例
材料及び方法
導入
試験は、がん患者の血漿におけるがん関連点変異の検出の成功を実証した。
【００９０】
４つの肺がん腫瘍の変異プロファイルを全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）又はＡｍｐｌｉＳｅｑにより決定し、マルチプレックスＰＣＲ−次世代シークエンシング（ｍＰＣＲ−ＮＧＳ）法を使用して対応する血漿試料においてこれらの変異のサブセットの検出に成功した。
【００９１】
ｍＰＣＲ−ＮＧＳ法を使用して、がん患者の血漿においてがん特異的変異を経時的に検出及び追跡し、治療を通じた疾患進行のモニタリングにおける方法の有用性を評価した。プロジェクトの第１相は、５０人の治療ナイーブの肺がん患者の血漿におけるベースライン変異プロファイルの決定であった。
【００９２】
いくつもの腫瘍領域（腫瘍当たり１〜７領域）からの精製されたゲノムＤＮＡ試料、精製された生殖細胞系列ＤＮＡ試料及び５０人の患者からのインタクトな血漿試料が提供された。全ての腫瘍領域の変異プロファイルを全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）及びＡｍｐｌｉＳｅｑにより以前に決定し、患者当たりの変異のサブセットを決定した。これらの変異は、ドライバー変異及びパッセンジャー変異の両方、並びにクローン性及びサブクローン性の両方の変異を含む。各腫瘍の全変異プロファイルを使用して各腫瘍の系統発生ツリーを再現した。
【００９３】
これらのデータに基づいてマルチプレックスＰＣＲアッセイを設計し、対応するプライマーを注文し、プライマープールを調製し、プライマープールを品質管理し、ｍＰＣＲプロトコールを各プールについて最適化した。血漿ｃｆＤＮＡを精製し、定量化し、ライブラリーに変換した。次にライブラリーをｍＰＣＲへのインプットとして使用し、生成物をシークエンシングし、解析した。腫瘍からのゲノムＤＮＡ及びマッチさせた正常試料に類似のプロトコールを適用した。
【００９４】
ワークフローの図式を図１に示す。試料当たりのＳＮＶの総数及びドライバーのカテゴリーによって選別した実際のアッセイを図２に示す。
【００９５】
試験集団
最初の５０患者のそれぞれについて、腫瘍切除の前及び任意の治療の前に得られた４〜５ｍＬの血漿を単離した。血漿試料を２ｍＬのチューブ中のアリコートとした。
【００９６】
最大７つの腫瘍小区分から、罹患したリンパ節から（利用可能な場合）、及び白血球画分から（マッチさせた正常物と称する）の精製されたゲノムＤＮＡを精製し、１０ｎｇ／ｕＬに正規化した各試料からの５００ｎｇの精製ＤＮＡを得た。
【００９７】
各腫瘍小区分について単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を含む変異プロファイルを全エクソームシークエンシングを使用して決定した。各腫瘍の全変異プロファイルを使用して各腫瘍の系統発生ツリーを再現した。
【００９８】
ＰｙＣｌｏｎｅを使用してＳＮＶのクラスターを同定し、それらのがん細胞率を算出した。これを使用して、ＳＮＶをクローン性又はサブクローン性のいずれかとして分類した。各ＳＮＶのドライバーのカテゴリーを決定し、ドライバーのカテゴリーとして提供した（１〜４；１はドライバー変異の可能性が最も高く、４は最も低い）。各患者について、全てのドライバーのカテゴリーにわたり、且つクローン性及びサブクローン性変異を含む最大１０８のＳＮＶを同定した。各腫瘍小区分、リンパ節及びマッチさせた正常ＤＮＡ試料における各ＳＮＶの検出されたアレル率をＰｙＣｌｏｎｅクローン性／サブクローン性クラスター情報と共に同定した。
【００９９】
各患者について、以下の情報が利用可能であった：腫瘍サイズ（ｍｍ）、腫瘍の場所（肺葉）、腫瘍ステージ、腫瘍の組織学的種類、罹患したリンパ節の数、血管浸潤状態の他に、回収した病院に関する不特定情報。
【０１００】
アッセイの設計及びプロトコールの最適化
標準的なアッセイ設計パイプラインを使用して、全ての所与のＳＮＶのための右及び左ＰＣＲプライマーを設計した。ＳＮＶを標的化する右及び左ＰＣＲプライマーのペアをその特定のＳＮＶのためのアッセイと称する。なお、１つのアッセイが１つより多くの標的ＳＮＶをカバーする（それらが近接している場合）ことがあり得る。アッセイのあらゆるペアについて、プライマー二量体を形成する確率を標準的なパイプラインを使用して算出した。各腫瘍におけるＳＮＶアレル率データを使用することにより、ＬＩＣＨｅＥ（Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して系統発生ツリーを再現した。各試料についてのアッセイのリストをフィルターにかけて、ドライバー１及び２のＳＮＶをカバーするアッセイに強い優先度を与えながらプライマー二量体を形成することが予測されるプライマーを除外した。残ったアッセイを使用して、５つのバランスの取れたプールを作り出し、各プールは１０患者のアッセイを含有した。一緒にプールされた全てのアッセイは適合性であり、すなわち、プール中にプライマー二量体を形成すると予測されるプライマーはなかった。各ステップにおいて、アッセイを以下のように選択した：
・ドライバー１及び２のＳＮＶをカバーするアッセイは最も高い優先度を有する。
・各患者について、枝当たりの選択されるＳＮＶの数は、再現された系統発生ツリーからのその枝のＳＮＶの総数に比例する。より具体的には、再現された系統発生ツリーにおいて枝からのＳＮＶの均一なサンプリングを有するようにし、選択されたアッセイが再現されたツリーの良好なカバーを提供することを確実にした。
【０１０１】
最終設計は、５つのプールの間で均等に分布し、各試料について１５〜２０のアッセイを含有する９７２のアッセイからなるものであった。
【０１０２】
プールの品質管理（ＱＣ）及び最適化
９７２のプライマーペアは個々のウェル中でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により合成され、それを脱塩し、１００ｕＭに正規化した。プーリングスキームにしたがってアッセイをプールし、各プールを組合せのＱＣ／最適化実験において使用した。最適化実験のために、いくつものＰＣＲパラメーターを変化させ、シークエンシング成績に対する効果の他に、失敗したアッセイの数を配列データから評価した。標的の読取りに対する最良のパーセンテージ、読取りの均一性の深さ、及び誤り率をもたらすＰＣＲ条件を決定した。プライマー二量体の大部分に関与するプライマーを同定し、各プールから除外した（除外された各プライマーについて、その対応するパートナーも除外した）。このステップ後に、計９０８のアッセイが残り、５つのプールの間で等しく分布した。
【０１０３】
ＤＮＡの抽出及びＱＣ
各患者からの全ての血漿アリコートをｃｆＤＮＡ抽出の前にプールし、各プールした血漿試料の溶血グレードを視覚的に評価した（溶血なし、軽い溶血、又は重度の溶血）。５ｍＬの血漿に最適化されたプロトコールにしたがってＱｉａｇｅｎ  ＮＡキットを使用してｃｆＤＮＡを抽出した。全てのｃｆＤＮＡ試料をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップで品質管理した。同じＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙの実行も使用して、以前に定量化した純粋なｃｆＤＮＡ試料から作製したキャリブレーション曲線に対するモノヌクレオソームピーク高さのインターポレーションによりｃｆＤＮＡ試料を定量化した。ｃｆＤＮＡは、チップ上の高サイズのマーカーと重なるインタクトなＤＮＡ部分を含有することがあり、これがモノヌクレオソームピークの定量化を信頼できないものにするので、これは必要であった。（腫瘍小区分、リンパ節及び白血球から）精製されたゲノムＤＮＡ試料の代表的なサブセットをＱｕａｎｔＩｔ  ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙキットを使用して定量化した。定量化した全ての試料は予想された範囲内（約１０ｎｇ／ｕＬ）にあった。
【０１０４】
ｃｆＤＮＡライブラリーの調製
キットの使用説明書にしたがってライブラリー調製キットを使用し、各血漿試料からの全ｃｆＤＮＡ量をＬｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへのインプットとして使用した。極めて多いｃｆＤＮＡ量を有する２つの試料について、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへのインプット量を約５０，０００ゲノム当量（１６５ｎｇ）に制限した。ライブラリーをプラトーまで増幅した後、製造者のプロトコールにしたがってＡｍｐｕｒｅビーズを使用して精製した。精製したライブラリーをＬａｂＣｈｉｐで品質管理した。
【０１０５】
ｃｆＤＮＡのマルチプレックスＰＣＲ及びシークエンシング
関連するアッセイプール及び最適化した血漿マルチプレックスＰＣＲ（ｍＰＣＲ）プロトコールを使用してｍＰＣＲへのインプットとして各血漿試料からのライブラリー材料を使用した。別々のＰＣＲステップにおいてｍＰＣＲ生成物をバーコード化し、バーコード化したＰＣＲ生成物をアッセイプーリング情報にしたがって５つのプールにプールした。製造者のプロトコールにしたがってＡｍｐｕｒｅビーズを使用してプールを精製し、品質管理し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップで定量化した。各プールは、１０個のがん血漿ライブラリー及び２０個の陰性対照（健常と推定されるボランティアから抽出したｃｆＤＮＡから調製）を含有した。全部で２０の対象検体は、Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＣＰ）に従う適切な患者の同意と共にＩＲＢ承認プロトコールの下で臨床研究部門によって得られた。試料は３つの供給源の１つから得た：健常ボランティア、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、又はＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ。５０サイクルのペアードエンドの単一指数の読取りを用いて別々のＨｉＳｅｑ２５００  Ｒａｐｉｄの実行で各プールをシークエンシングした。
【０１０６】
ｇＤＮＡのマルチプレックスＰＣＲ及びシークエンシング
関連するアッセイプール及び最適化したゲノムｍＰＣＲプロトコールを使用する類似のｍＰＣＲへのインプットとしてゲノムＤＮＡ試料を使用した。ｍＰＣＲ生成物を別々のＰＣＲステップでバーコード化し、バーコード化した全ての生成物を１つのプールに合わせた。製造者のプロトコールにしたがってＡｍｐｕｒｅビーズを使用してプールを精製し、ＱＣを行い、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップで定量化した。５０サイクルのシングルエンドの単一指数の読取りを用いて単一のＨｉＳｅｑ２５００  Ｒａｐｉｄの実行でプールをシークエンシングした。
【０１０７】
サブクローンの脱構築
変異がクローン性であるのか、それともサブクローン性であるのか、及び各腫瘍のクローン構造を決定するために、ＰｙＣｌｏｎｅの改良版を使用した。各変異について、ｏｂｓＣＣＦ及びｐｈｙｌｏＣＣＦという２つの値を算出した。ｏｂｓＣＣＦは、各変異の観察されたがん細胞率（ＣＣＦ）に対応する。反対に、ｐｈｙｌｏＣＣＦは、変異の系統発生ＣＣＦに対応する。これら２つの値の差異を明確にするために、腫瘍内のあらゆるがん細胞中に存在する変異を考える。１つの腫瘍領域中のサブクローン性のコピー数の事象は、がん細胞のサブセットにおいてこの変異の喪失に繋がることがある。したがって、この変異のｏｂｓＣＣＦは１未満であるが、系統発生の観点から、変異は、腫瘍の系統発生ツリーの幹で起こったのでクローン性であると考えることができ、そのため、ｐｈｙｌｏＣＣＦは１であってよい。
【０１０８】
各変異のｏｂｓＣＣＦを算出するために、局所的コピー数（ＡＳＣＡＴから得られた）、腫瘍純度（これもＡＳＣＡＴから得られた）、及び変異アレル頻度を統合した。簡潔に述べれば、所与の変異について、観察された変異コピー数ｎｍｕｔを最初に算出し、これは以下の式：
【０１０９】
【数１】
2019533464.tif 000002
【０１１０】
（式中、ＶＡＦは、変異した塩基における変異アレル頻度に対応し、ｐ、ＣＮｔ、ＣＮｎは、それぞれ、腫瘍純度、腫瘍遺伝子座特異的コピー数、及び正常遺伝子座特異的コピー数（ＣＮｎは、常染色体について２と仮定される）である）を使用して、所与の変異を持つ腫瘍細胞の割合にその遺伝子座での染色体コピー数を掛けたものを表す。ＶＡＦを使用して予想される変異コピー数ｎｃｈｒが算出され、最尤を使用して可能な局所的コピー数状態の１つへの変異が割り当てられる。この場合、整数のコピー数のみが考慮される。
【０１１１】
次に、ＰｙＣｌｏｎｅ  Ｄｉｒｉｃｈｌｅｔプロセスクラスタリングを使用して全ての変異をクラスター化した。各変異について、観察されたｖａｒ＿ｃｏｕｎｔを使用し、ＶＡＦがクラスタリング前ＣＣＦの半分に等しくなるようにｒｅｆ＿ｃｏｕｎｔを設定した。コピー数及び純度は既に訂正されていることを考慮して、メジャーアレルコピー数を２、マイナーアレルコピー数を０、純度を０．５に設定し、それらのクラスタリング前ＣＣＦ推定値に基づいてクローン性及びサブクローン性変異のグループに単純にクラスター化することを可能にした。１０，０００回の繰返し及び１０００のバーンイン、及びデフォルトのパラメーターを用い、−−ｖａｒ＿ｐｒｉｏｒを「ＢＢ」に設定し、−ｒｅｆ＿ｐｒｉｏｒを「ｎｏｒｍａｌ」に設定する例外と共にＰｙＣｌｏｎｅを実行した。
【０１１２】
各変異のｐｈｙｌｏＣＣＦを決定するために、変異をサブクローン性のコピー数事象について訂正することを除いて、上述したものと類似の手順を実行した。具体的には、観察された変異アレル頻度がクローン性変異に与えられると予想されるものと有意に異なる場合（Ｒにおいてｐｒｏｐ．ｔｅｓｔを使用してＰ＜０．０１）、サブクローン性のコピー数事象が、観察されたＶＡＦと予想されたＶＡＦとの間の有意でない（Ｐ＞０．０１）差異を結果としてもたらし得るかどうかを決定した。次に、ｎｍｕｔをｎｃｈｒ。で割ることにより各変異についてクラスタリング前ＣＣＦを算出した。ＡＳＣＡＴアウトプットからの生の値を使用してサブクローン性のコピー数事象を推定した。
【０１１３】
挿入欠失の信頼できない可能性があるＶＡＦが別々の変異クラスターに繋がらないことを確実にするために、各推定される挿入欠失ＣＣＦに領域特異的訂正係数を掛けた。全ての領域中に存在する遍在的な変異の大部分はクローン性であると仮定して、遍在的な変異のメジアン変異ＣＣＦを遍在的な挿入欠失のメジアン挿入欠失ＣＣＦで割ることによって領域特異的訂正係数を算出した。
【０１１４】
変異の時点決定
上記のＰｙＣｌｏｎｅクラスタリングを通じて個々の変異（ＳＮＶ、ＤＮＶ及び挿入欠失）をクローン性又はサブクローン性として時点決定した。クローン性の時点決定のために、ｐｈｙｌｏＣＣＦからの値を使用した。次に、早期、後期又は時点不定のクローン性としてクローン性変異をさらに時点決定した。これは、以前に記載された通り、重複するコピー数事象に対して各腫瘍領域内で最初に行った。簡潔に述べれば、メジャーアレルの少なくとも２コピーを有するゲノムの部分における変異を、（上記の）変異コピー数が１より大きい場合に早期、１以下の場合に後期として事前に分類した。次に、時点解析を全ての領域にわたって行った。クローン性と分類された変異は、所与の変異が全ての領域にわたって早期であるか、又は変異が領域の大部分において早期である場合に、「クローン性早期」と呼んだ。クローン性変異は、それが全ての領域にわたって後期と呼ばれるか、又はそれが領域の大部分にわたって後期である場合に、「クローン性後期」と呼んだ。早期又は後期のいずれかとして時点決定できなかった任意のクローン性変異は、「クローン性時点不定」として分類した。
【０１１５】
染色体アームＳＣＮＡの時点決定
全染色体アームの増加（ｇａｉｎ）及び減少（ｌｏｓｓ）を上記の通りにクローン性及びサブクローン性と呼んだ。クローン性染色体アームの増加を、所与のアームに対する全ての変異の変異コピー数によってさらに時点決定した。アームの増加への全ての変異のマッピングを同定し、メジャーアレルの１コピー内の変異コピー数との領域にわたる変異の平均比を決定した。変異の大部分がメジャーアレルの１コピー内のコピー数を示し、変異がコピー数の増加の前に起こり、染色体アームと共に増加したことを指し示した場合、染色体アームの増加を「クローン性後期」と呼んだ。変異の大部分がより低いコピー数を示し、染色体アームの増加後に変異が起こったことを指し示した場合、コピー数の増加を「クローン性早期」と呼んだ。染色体アームの増加の領域に対する充分な変異のマッピングがなかった場合、染色体アームの増加を「クローン性時点不定」と呼んだ。クローン性染色体アームの減少について、ゲノムが倍加した腫瘍におけるＬＯＨ状態に対して減少を時点決定した。ゲノム倍加の文脈においてＬＯＨを示す任意の染色体アームの減少は、２つの独立したヒットをそうでなければ必要とするので、ゲノム倍加前に起こったようである。したがって、ＬＯＨを示すゲノム倍加の文脈における染色体アームの減少を「クローン性早期」と呼び、ＬＯＨを伴わないゲノム倍加の文脈における染色体アームの減少を「クローン性後期」と呼び、ゲノム倍加の文脈にない染色体アームの減少を「クローン性時期不定」と呼んだ。
【０１１６】
系統発生ツリーの構築
上記の通りに腫瘍領域にわたって変異をクラスター化した。少なくとも５つの変異が割り当てられた変異クラスターを系統発生解析に含めた。良好なコピー数データ及び少なくとも２つの変異クラスターを有する少なくとも２つの領域を有する腫瘍のみを解析に含めた（９０個の腫瘍から２９２個の腫瘍領域）。変異のクラスター間の系統発生の関係性を推測するために、全ての腫瘍領域において、各変異クラスターペアのｐｈｙｌｏＣＣＦ値の間で片側ｔ検定を行った。０．０２５のｐ値の閾値を適用して、変異の所与のクラスターが別のクラスターより有意に小さいかどうかを判定した。少なくとも１つの領域においてクラスターＡがＢより有意に小さく、且つ任意の領域においてクラスターＢがクラスターＡより有意に小さい場合、クラスターＡはクラスターＢから派生したものと決定した。これは時々、不可能な系統発生の関係性を結果としてもたらし、例えば、クラスターＡが、共にＤから派生した２つの異なるクラスターＢ及びＣに派生すると注釈され、系統発生ツリーにおいて円を作り出した。これを解消するために、全ての円を同定し、系統発生ツリー構造に円が見られなくなるまで、最も少ない変異を含有するクラスターを逐次的に除外することによって解消した。ｐｙｃｌｏｎｅでクラスター化されたＣＣＦ値の領域毎の撒布プロットとツリー構造を比較することによって、全ての系統発生ツリーを手動で検証した。コピー数の変化のための訂正の前及び後の両方において領域にわたってＣＣＦ値を比較することによって、円を引き起こすために除去されたより小さい変異クラスターを戻し入れることを試みた。時々、特に、より小さい変異クラスターは、可能性としてはコピー数の変化により、特定の領域において大きい信頼区間を有し、系統発生ツリー構造において誤った配置を引き起こした。これは、手動の検証ステップにおいて解消した。
【０１１７】
変異シグネチャー解析
ＲのｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔＳｉｇｓパッケージを使用して変異シグネチャーを推定した。シグネチャー１Ａ、２、４、５、１３を考慮した。一時的に検討した変異シグネチャーについて、少なくとも１５の変異が存在する場合にのみ変異シグネチャー解析を適用した。同様に、サブクローン特異的変異シグネチャー解析は、少なくとも１５の変異を有するサブクローンに制限した。
【０１１８】
データ解析
血漿ＳＮＶコール
各血漿シークエンシングの実行は１０個のがん試料及び２０個の陰性対照試料を含有し、全てのシークエンシングは対応するｍＰＣＲプールを用いて行った。プール中のアッセイによってカバーされるＳＮＶのセットを、関連する実行のための標的ＳＮＶと考えた。各ＳＮＶの位置において、その特定のＳＮＶを含有するとは予想されない２０個の陰性対照試料及び９個のがん試料の全てを使用してエラーモデルを構築した。推定陰性の間で高い血漿ＶＡＦ（＞２０％）を有する試料は、生殖細胞系列の変異を有する可能性があると考え、バックグラウンドエラーモデル３から除外した。バックグラウンドエラーモデルに基づいて各標的ＳＮＶについて信頼度スコアを算出した。対応する血漿試料においてその変異について算出された信頼度が我々の信頼度閾値に合格した場合、陽性の血漿ＳＮＶコールとした。
【０１１９】
同じ信頼度閾値を用いる同じコーリング戦略を使用して、所与のＳＮＶを含有するとは予想されない残りの試料（他のがん試料及び対照試料を含む）に対してＳＮＶコールを行うことを試みた。このようにして検出されたＳＮＶを「偽陽性」と考えた。偽陽性率は、（変異レベルで）０．２４％であった。
【０１２０】
組織ＳＮＶコール
全ての腫瘍小区分、リンパ節試料及びマッチさせた正常試料を１回のシークエンシングの実行でシークエンシングした。各試料（組織小区分、リンパ節又はマッチさせた正常物）について、適切なｍＰＣＲプールのみを使用した。各予想される変異について組織ＶＡＦを（変異体ＤＯＲ）／（総ＤＯＲ）として配列データから直接的に決定した。組織ＶＡＦ＞５％の変異のみを陽性と考えた。
【０１２１】
ＳＮＶアッセイプールの作製及び検証
ｃｆＤＮＡの抽出
症例当たり最大５ｍｌの血漿がこの研究のために利用可能であった。血漿の全体積をｃｆＤＮＡ抽出のために使用した。ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃｆＤＮＡを抽出し、５０ｕｌのＤＮＡ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）に溶出した。精製したｃｆＤＮＡを使用まで−２０℃で冷凍して貯蔵した。
【０１２２】
ｃｆＤＮＡのＱＣ及び定量化
あらゆるｃｆＤＮＡ試料に対してＱＣを行い、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で定量化した。血漿ｃｆＤＮＡは、主となるモノヌクレオソームピーク（約１６０ｂｐ）からなり、一部の試料について、ジヌクレオソームピーク及びトリヌクレオソームピークが見られる（それぞれ約３２０ｂｐ及び約５００ｂｐ）。使用したライブラリー調製法は、ｃｆＤＮＡのモノヌクレオソーム画分を選択的に増幅する。高分子量ＤＮＡ画分はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで使用される上方マーカーと重複することがあるので、定量化は必ずしも信頼できない。結果として、解析されたｃｆＤＮＡの量は、標準曲線を使用してモノヌクレオソームピークのピーク高さから推定した。
【０１２３】
ＳＮＶアッセイの設計
Ｎａｔｅｒａの標準的なアッセイ設計パイプラインを使用して、腫瘍試料中に検出される全てのＳＮＶについてフォワード及びリバースＰＣＲプライマーを設計し、ＳＮＶを標的化する各ペアは、そのＳＮＶのためのアッセイを含む。２つのＳＮＶが近接している場合、単一のアッセイが１つより多くの標的ＳＮＶをカバーする可能性がある。一部のＳＮＶについて、アッセイを設計することができなかった。アッセイプールを作るときに、２つのアッセイのあらゆるペア形成がプライマー二量体を形成する確率を算出した。各患者試料について、ドライバーＳＮＶをカバーするアッセイに強い優先度を与えながら、予測されるプライマー二量体を有しないアッセイの最適なリストを選択した。これらの残ったアッセイを使用して、１０個のバランスの取れたプールを作り出し、これらのそれぞれは、１０患者のＳＮＶのためのアッセイ及び各患者当たり平均で２０アッセイを含有した。アッセイは常に以下のように選択した：１）ドライバーＳＮＶをカバーするアッセイは最も高い優先度を有した、及び２）再現された系統発生ツリーにおいて枝からのＳＮＶの均一なサンプリングがあった。ベースラインコホートのための最終設計は１８３５のアッセイからなり、１０個のプールの間で等しく分布し、各試料について１５〜２０のアッセイを含有した。
【０１２４】
縦断コホートについて、最大１０個の余分のアッセイを腺癌試料のために加えた。設計したアッセイを使用して、それぞれ５人の患者を含有する５つのバランスの取れたプールを作り出した。縦断コホートのために計５９８のアッセイを解析した。
【０１２５】
ＳＮＶプールのＱＣ
それぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるＳＮＶアッセイは、９６ウェルプレート中の個々のオリゴとしてＩＤＴ（コーラルビル、ＩＡ）に注文し、脱塩し、それぞれ１００ｕＭに正規化した。プーリングスキームにしたがってオリゴをプールし、健常対象からの１つの血漿ｃｆＤＮＡライブラリーを使用してマルチプレックスＰＣＲ及びシークエンシングプロトコールを実行することにより、各プールのＱＣを行った。各プールについてシークエンシングデータを解析して、プライマー二量体の読取りの量を決定し、ドロップアウトアッセイを同定した。シークエンシングの読取りの大きい割合がプライマー二量体の結果としてもたらされる場合、プライマー二量体の読取りを解析して、二量体形成に寄与するプライマーを決定し、ほとんどのプライマー二量体の読取りに寄与したプライマーを除去した。各プールからの機能アッセイのみからなる最終のプールを作り出し、対応する血漿試料におけるＳＮＶ検出のために使用した。
【０１２６】
解析的検証
２０の合成スパイクを等モル比で混合し、ライブラリーを調製するために使用した。正常細胞株（Ｃｏｒｉｅｌｌ、カムデン、ＮＪのＡＧ１６７７８）からのモノヌクレオソームＤＮＡ（１０，０００コピー）から調製されたライブラリーにこのライブラリーを滴定した。合成スパイクは、ベースライン試料のプール１にグループ化された２０個のＳＮＶにマッチした。各合成スパイクは、ヒトゲノム中のその位置における正常配列に挟まれた８０位のＳＮＶを有する１６０ｂｐのｄｓＤＮＡオリゴからなるものであった。
【０１２７】
２．５％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％（各三連）、及び０．０１％、０．００５％及び０．００１％（各四連）のモノヌクレオソームＤＮＡライブラリーに２０の合成スパイクのライブラリーを滴定し、また、モノヌクレオソームライブラリーを陰性対照としてスパイクなしで三連で流した。そのような低いレベルのスパイクされた試料を調製することは、サンプリングノイズ（１０，０００のゲノムコピーのバックグラウンドへの０．０１％のスパイクは１つの変異体コピーに相当する）にさらされるか、又は（０．０１％未満のレベルで）可能でないので、試料をライブラリーとして混合した。さらには、ライブラリー調製プロセスは約８０％の効率を有するので、低いコピーの変異体試料について、最終のライブラリー中に現れる変異体分子の数を知ることは不可能であった。ライブラリーの混合は、ライブラリー調製ステップからの干渉なしにＳＮＶ検出ステップを試験することを可能とする。
【０１２８】
ライブラリーの混合及びシークエンシング後、２０のスパイクしたＳＮＶを解析した。２．５％の名目上のインプットの試料について各スパイクの測定されたＶＡＦを使用して、インプット訂正係数（測定されたＶＡＦ／２．５％）を算出し、それを対応するスパイクの他のインプットに適用した。測定されたＶＡＦは名目上のインプット（例えば、２．５％）と異なっていたが、これはモノヌクレオソーム切断パターンが完全にはランダムでない（したがって、特定のＰＣＲアッセイで検出できるＤＮＡ断片の実際の数は１０，０００コピーの平均インプットと異なる）ためである可能性が最も高い。このため、実際のインプットレベルは名目上のインプットと異なり、感度はインプット間隔について測定される。インプット間隔は、意味のある数の試料が各間隔中にあるように選択した。
【０１２９】
血漿ＳＮＶ解析
各症例から抽出された４０マイクロリットルのｃｆＤＮＡをＮａｔｅｒａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用するライブラリー調製へのインプットとして使用し、これは、ブラント末端修復、Ａテーリング、ユニバーサルアダプターライゲーション、プラトーまでのＰＣＲ増幅及び増幅された材料の精製を含んでいた。ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  ５ｋ  ＤＮＡチップ上で全ての精製されたライブラリーのＱＣを行った。成功したライブラリーは約２５０ｂｐの単一ピークを有していた。
【０１３０】
次に、増幅したライブラリーをｍＰＣＲ−ＮＧＳにより解析した。ＳＮＶを標的化するＰＣＲプライマーは、腫瘍試料の解析（試料当たり最大２０の標的）において検出した。各プールのための最適なＰＣＲ条件は、Ｊａｍａｌ  Ｈａｎｊａｎｉら、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１６年に記載された通りであった。
【０１３１】
各ＰＣＲアッセイプールを使用して、１０個の対応する試料及び２０個の陰性対照試料（健常対象から調製した血漿ライブラリー）からのＳＮＶ標的を増幅した。アッセイ当たり約４０，０００の平均標的ＤＯＲでＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ  ｖ１キットを使用して５０サイクルのペアードエンドの読取りを用いて１つのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎで各アンプリコンプールをシークエンシングした。
【０１３２】
統計的方法
各血漿シークエンシングの実行は、１０個のがん試料及び２０個の陰性対照試料を含有し、全てのシークエンシングは対応するｍＰＣＲプールを用いて行った。プール中のアッセイによりカバーされるＳＮＶのセットを、関連する実行のための標的ＳＮＶと考えた。血漿試料中の１０００未満の読取りを有する標的アッセイは失敗と考え、さらなる解析をしなかった。各ＳＮＶの位置において、（腫瘍組織シークエンシングに基づいて）その特定のＳＮＶを含有するとは予想されない２０個の陰性対照試料及び９個のがん試料の全てを使用してエラーモデルを構築した。推定陰性の間で高い血漿ＶＡＦ（＞２０％）を有する試料は、生殖細胞系列の変異を有する可能性があると考え、バックグラウンドエラーモデルから除外した。バックグラウンドエラーモデルに基づいて各標的ＳＮＶについて信頼度スコアを算出した。対応する血漿試料においてその変異について算出された信頼度が我々の信頼度閾値に合格した場合、陽性の血漿ＳＮＶコールとした。
【０１３３】
同じ信頼度閾値を用いる同じコーリング戦略を使用して、所与のＳＮＶを含有するとは予想されない残りの試料（他のがん試料及び対照試料を含む）に対してＳＮＶコールを行うことを試みた。このようにして検出されたＳＮＶを「偽陽性」と考えた。偽陽性率は、（変異レベルで）０．２４％であった。
【０１３４】
腫瘍組織及び生殖細胞系列ＤＮＡのＳＮＶ解析
腫瘍小区分及び生殖細胞系列ＤＮＡ試料（ＣＲＵＫにより抽出し、１０ｎｇ／ｕｌに正規化）から精製されたｇＤＮＡを使用して、各患者における標的ＳＮＶを確認した。このために、対応するプライマープール及び血漿ライブラリーで使用したものと同じＰＣＲ条件を使用するｍＰＣＲへのインプットとしてｇＤＮＡ（７０ｎｇ／ｒｘｎ）を使用した。アッセイ当たり約４，０００の平均標的ＤＯＲでＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｅｎｄ  ｖ１キットを使用して５０サイクルのシングルエンドの読取りを用いて１つのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎで試料をシークエンシングした。配列データを使用して、各試料中の予想される各ＳＮＶの変異アレル頻度（ＶＡＦ）を決定した。このようにして決定されたＶＡＦをＣＲＵＫにより決定されたＶＡＦと比較した。
【０１３５】
実施例１−ｃｆＤＮＡの抽出及び解析
５０の血漿試料のｃｆＤＮＡ濃度の分布（図３）は、５ｍＬの血漿に基づいて予想される分布に従う（１ｍＬの血漿当たり２，２００ゲノムコピー当量のメジアン）。ｃｆＤＮＡ濃度、溶血グレード（視覚的に推定される）及びｃｆＤＮＡサイズプロファイルの定性的評価（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒのトレースから視覚的に推定される）を表３に示す。
【０１３６】
実施例２−腫瘍小区分における変異アレル頻度（ＶＡＦ）の解析
腫瘍小区分のそれぞれからの配列データを解析して、各腫瘍小区分、リンパ節及びマッチさせた正常試料における各ＳＮＶの変異アレル頻度を決定した。このデータを類似のデータと比較した。ほとんどの試料について、各腫瘍小区分からの組織ＶＡＦ値は、決定された組織ＶＡＦ値と緊密にマッチした（図４）。しかしながら、有意な不一致が見られた多数の試料があった（図５）。３種類の不一致が観察される：
・（ｉ）１つ又は２つの小区分について、解析において全てのＶＡＦは０又は０に近かったが、その後の解析において０ではなかった（同じ試料の他の小区分で見られたＶＡＦの範囲に及ぶ）（例えば、ＬＴＸ０４１、ＬＴＸ１１１）；
・（ｉｉ）いくつものアッセイについて、解析においてＶＡＦは０であったが、その後の解析において０ではなく（同じ試料の他の小区分で見られたＶＡＦの範囲に及ぶ）、この不一致のモードでは小区分によるクラスタリングは見られなかった（例えば、ＬＴＸ０９３、ＬＴＸ０７４）；
・（ｉｉｉ）いくつものアッセイ又は領域について、いずれのアッセイも失敗しなかったが、２つの解析において得られたＶＡＦ間の一致は概して乏しかった（例えば、ＬＴＸ０６３、ＬＴＸ０５９）。
【０１３７】
実施例３−血漿ＳＮＶの検出
１つの試料（ＬＴＸ２０６、１９のアッセイを用いる）はシークエンシングに失敗し、解析から除外した（この試料はその後の実験でレスキューされる）。９１１個のＳＮＶをカバーする８８９のアッセイが残った。１，０００未満の読取りの深さを有するアッセイを失敗と考え、それらの対応するＳＮＶを「コールなし」とマークした。計２１の「コールなし」においてＳＮＶを解析から除外し、計８９０のＳＮＶを解析した。
【０１３８】
血漿における全体的なＳＮＶ検出率は３５．５％（３１０／８９０）であり、これはパイロット試験で我々が観察したものと類似している。検出されなかったＳＮＶは恐らく、変異が血漿試料中に存在しなかったという事実による。高い信頼度で検出されたＳＮＶについての平均変異体アレル頻度は０．８７５％であった（範囲、０．０１１〜１３．９３％）。その試料中に存在すると予想される１以上のＳＮＶが確信をもって血漿中に検出された場合にがん試料は「血漿中に検出された」と考えた。この定義を使用して、血漿における全体的な試料検出率は６９％（３４／４９試料）であり、これらについて、血漿中に検出されたＳＮＶの平均数は９．１であった（範囲、１〜１９）。血漿中に検出されたＳＮＶの視覚的表示については図６を参照。ＳＮＶ及び試料による分類を図７に示す。各試料について血漿中に検出されたＳＮＶの数を表４に示し、解析した全てのＳＮＶについての全データを表５に示す。ＳＮＶクローン状態の関数としての各試料から検出されたＳＮＶについての血漿ＶＡＦを図８に示す。
【０１３９】
実施例４−追加の所見
標的ＳＮＶに加えて、腫瘍及び血漿の両方において我々のアッセイによって増幅したあらゆる位置を調べた。合計で、報告されていない１６体細胞新規ＳＮＶが組織試料から同定された。これらのうち、７つをそれらの対応する血漿試料ともコール解析した。潜在的な偽陽性を回避する非常に厳格な信頼度閾値を使用したので、検出された変異について我々は高い確信を持っている。それらを表６に示す。
【０１４０】
実施例５−血漿におけるＳＮＶ検出に影響する要因
いくつもの要因が血漿ＳＮＶ検出に影響を及ぼす可能性がある。そこで、我々は、最も大きな関連性を有する要因を決定することを目的とした。関連性について解析した要因は以下を含んだ：腫瘍サイズ（表５のＬｅｓｉｏｎ１ＳｉｚｅＤｅｒ値）、ステージ、腫瘍の組織学的種類、リンパ節の状態、血管浸潤、肺葉による場所、腫瘍小区分におけるＳＮＶ頻度、各ＳＮＶについてのクローン情報及びｃｆＤＮＡの量。試料レベル及び変異レベルの両方の血漿ＳＮＶ検出のための多変量解析を以下に記載する。試料レベルの解析は、血漿試料において検出されるＳＮＶの数に影響する要因を同定することを目的とした。変異レベルの解析は、血漿ＳＮＶについてのコールに影響する要因を同定することを目的とした。
【０１４１】
試料レベルの解析
分散にわたって調整されたポアソン回帰分析は、血漿中に検出されたＳＮＶの数と組織学的種類との間の高度に統計的に有意な関連性を指し示した。組織学的種類に対応する推定モデル係数は１．２９、標準誤差０．３０（ｐ値＝２．４８ｅ−０５）である。この関連性は、腫瘍サイズ、ステージ又は部位について調整したときに変化しなかった。
【０１４２】
血漿中に検出されたＳＮＶの数と腫瘍サイズとの間にも同じポアソン回帰モデルにおいて弱い関連性が見られた（腫瘍サイズについての推定モデル係数は０．０２、標準誤差０．０１、ｐ値＝０．０６８２）。腫瘍サイズ及びステージは相関し、血漿において検出可能なＳＮＶの数について類似の情報を提供するようである。腫瘍サイズを考慮すると、血漿中に検出されるＳＮＶの数のばらつきを説明する追加の情報を腫瘍ステージは加えないようであった（腫瘍ステージについてのモデル係数は、０．０５の標準有意性レベルで０と統計的に異ならなかった、ｐ値＝０．３６７７）。
【０１４３】
我々はモデル係数を以下の通りに解釈する。腺癌と比較して、同じ腫瘍サイズ、ステージ、及び部位を有する扁平細胞腫瘍は、平均でｅｘｐ（１．２９）（約３．７倍）多くのＳＮＶが血漿中に検出される。組織学的サブタイプ、腫瘍ステージ及び腫瘍部位の一定の値について、１単位（ｍｍ）の腫瘍サイズの増加は、ＳＮＶ数のｅｘｐ（０．０２）＝１．０２（約２％の平均増加）の乗法的増加を結果としてもたらす。
【０１４４】
要約すると、特定の腫瘍が血漿中に検出されるかどうかの最も重要な予測因子は、組織学的種類であったらしく、扁平細胞癌（ＳＱＣＣ）の１００％が血漿中に検出されたのに対し、腺癌（ＡＤＣ）は５２％（１５／２９）のみが検出された（図９）。
【０１４５】
このコホートは１つの癌肉腫腫瘍及び１つの腺扁平上皮腫瘍のみであったので、血漿におけるそれらの一般的な検出可能性に関する結論は、今回はそれらの腫瘍の種類について導出できなかった。
【０１４６】
ｃｆＤＮＡの量と、血漿試料中に検出されるＳＮＶの数及び割合との間に明白な相関はなかった。しかしながら、高いインプット（＞２５，０００コピー）を有する全ての試料は、１以上の、血漿中に検出されたＳＮＶを有した（図１０）。
【０１４７】
変異レベルの解析
回帰分析を行って、血漿における変異の検出を予測するために使用できる変数を決定した。より具体的には、二値応答変数を使用して、変異を「コールあり」又は「コールなし」として注釈した。腫瘍における平均ＶＡＦは、全ての腫瘍領域の間の平均変異ＶＡＦを指す。ＰｙＣｌｏｎｅを使用してクローン／サブクローン情報を決定した。ロジスティック回帰分析は、以下の変数が変異の検出と統計的に有意な関連性（ｐ値＜５％）を有することを示した：
・組織学的種類（ｐ＝８．３ｅ−３０）
・腫瘍における平均ＶＡＦ（ｐ＝４．３ｅ−６）
・クローン状態（ｐ＝１．６ｅ−４）
・腫瘍の大きさ（ｐ＝３．５ｅ−４）
【０１４８】
組織学的種類は最も低いｐ値を有して最も強い関連性を暗示し、試料レベルの解析からの観察を支持した（図９）。ＳＱＣＣからのＳＮＶについての検出率は７０％であったのに対し、ＡＤＣからのＳＮＶについては１４％であった。腫瘍における平均ＶＡＦは、血漿中のＳＮＶの検出と次に大きく関連する変数であった（図１１）。クローン状態もまた、血漿中のＳＮＶの検出と相関した（検出率はクローン性ＳＮＶについて４８％、サブクローン性ＳＮＶについて２２％であった）。そして、腫瘍の大きさもまた、血漿ＳＮＶ検出率に影響した（試料レベルの解析においても観察された）。
【０１４９】
残りの変数は検出率に対して統計的に有意な効果を有しないか、又は想定される効果は既にモデル中にある４つの変数によって説明することができた（例えば、腫瘍ＶＡＦは、ステージの間で検出率において観察された差異を説明するのに充分である）。
【０１５０】
実施例６−血漿中に検出されないＳＮＶの解析
血漿において予想されるＳＮＶの６０％より多く（９１１のうち５８０）が検出に失敗したことは、ｍＰＣＲ／ＮＧＳ法の一部の失敗と対照的に、ｃｆＤＮＡ試料中に存在しないそれらの変異による可能性があったという結論をいくつもの証拠が支持する。これらの証拠をここに記載する。
・読取り深さ（ＤＯＲ）分布は、予想される血漿ＳＮＶを検出したアッセイ及び検出しなかったアッセイについて類似であった（平均ＤＯＲは、予想されるＳＮＶを検出したアッセイについて４５，５５１であったのに対し、検出しなかったアッセイについて４５，１３３、図１０Ａ）。これは、偽陰性のＳＮＶコールに対応するアッセイは、真陽性コールについてのアッセイと同じくらい効率的であったことを示唆する。
・標的ＳＮＶ位置において読取り深さが高いにもかかわらず、変異体読取りの数は、検出されなかったほとんどの位置について低かった：検出されなかった５８０のＳＮＶのうち、２０７（３６％）は０の変異体読取りを有し、４１４（７１％）は５未満の変異体読取りを有した。さらに、検出されなかった位置の全ては、０．１％未満の変異体ＶＡＦが観察され、全ての場合における変異レベルは、それらの対応するバックグラウンド誤り率と区別できなかった。
・検出されなかった５８０のＳＮＶのうち２７５が、血漿変異を有しない試料に属し、検出されなかったのは血漿中の不充分なｃｔＤＮＡによる可能性があったことを暗示する。
・その位置における平均バックグラウンド変異体ＶＡＦから３標準偏差であると各位置の検出限界（ＬＯＤ）を推定することにより、真陽性及び偽陰性のＳＮＶ位置についての検出限界の分布は類似していた（図１０Ｂ）。これは、ＳＮＶが試料中に存在すれば検出されることを示唆する。
【０１５１】
実施例７−系統発生ツリー
ｃｆＤＮＡデータから腫瘍系統発生ツリーを再現できる可能性を調べるために、血漿から検出されたＳＮＶが腫瘍組織データから再現された腫瘍系統発生ツリーの構造と一致するかどうかを調べた。血漿から検出されたＳＮＶは、それらがツリーにおける充分な数の枝をカバーすることができる場合、腫瘍の系統発生を再現することができ、それらのＶＡＦ値はツリーにおけるＳＮＶの順序に従い、すなわち、より早期の枝に位置するＳＮＶは血漿においてより高いＶＡＦを有する必要がある。より具体的には、血漿から検出されたＳＮＶが組織データから再現された腫瘍系統発生ツリーの構造と一致するために成立すべき２つの制約を定義する：
制約１）血漿において検出されたＳＮＶを有するツリー中のあらゆる枝について、ツリー中のその子枝の推定されるがん細胞率（ＣＣＦ）の合計はその枝のＣＣＦを超えるべきではない。
制約２）血漿において検出されたＳＮＶ  Ａ及びＢのあらゆるペアについて、ＳＮＶ  ＡがＳＮＶ  Ｂの先祖枝に属する場合、それはＳＮＶ  Ｂと比較してより高い血漿ＶＡＦを有するべきである。
【０１５２】
各腫瘍試料についての組織データに基づくＳＮＶアレル率を使用し、ＬＩＣＨｅＥを使用して腫瘍系統発生ツリーを再現した。その後、検出されたＳＮＶについての血漿ＶＡＦデータを使用して、各試料について制約１及び２の正確性を評価した。制約１の正確性を評価するために、最初に、その枝において検出されたＳＮＶの血漿ＶＡＦに基づいてツリーにおける各枝についての血漿がん細胞率（ＣＣＦ）を推定した。次に、制約１が有効である血漿中で検出されたＳＮＶを有するツリー中の枝の数を数えた。制約２の正確性を評価するために、１つが他のものの先祖であり、且つ制約２が有効である全てのペアのＳＮＶの比を測定した。
【０１５３】
ここで試験した４９の全ての試料について血漿ＳＮＶデータと腫瘍系統発生ツリーとの間の相関についての結果を表７に要約する。血漿中に検出された非常に少ないＳＮＶを有する試料についてのこの研究は妥当でないので、図１１Ａ及び図１１Ｂにおいて、血漿中に検出された少なくとも１０個のＳＮＶを有する試料についての我々の結果を提示する。図１１Ａは、ツリー中の枝の総数及び血漿中に検出された枝の数を示す。１７試料のうちの７つについて、ツリーの全ての枝が血漿中に検出された。図１１Ａはまた、検出された枝の大部分が有効なＣＣＦ推定値を有し、すなわち、制約１は検出された枝について多くの場合に有効である。図１１Ｂは、１つが腫瘍ツリー中の別のものの先祖であるＳＮＶペアのパーセンテージを示し、それらの血漿ＶＡＦ値はツリー構造を確認し、すなわち、制約２はそれらにとって有効である。このパーセンテージは１７試料のうちの１２個について８０％以上であることが分かる。
【０１５４】
実施例８−バーコード
背景
切除したＮＳＣＬＣの複数領域全エクソームシークエンシング及びバイオインフォマティクスパイプラインを通じたシークエンシングデータの処理を通じて体細胞単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を同定し、サブクローン脱構築を行って変異がサブクローン性であるのか、それともクローン性であるのかを同定した。時点解析を使用してゲノム倍加事象に基づいて個々の変異を早期、後期又は時点不定として時点決定する。
【０１５５】
サブクローン性クラスターのバーコード化に基づく「オーダーメイド」の変異パネルを使用することによるＮＳＣＬＣの再発の系統発生の追跡
上記の実施例１〜７の通り、複数領域全エクソームシークエンシングデータ、サブクローン脱構築及び系統発生ツリー解析に基づいて、クローン性及びサブクローン性変異クラスターを同定する。未発表のデータは、ＮＳＣＬＣの再発はモノクローナル性であり、早期幹クローン若しくは特異的サブクローンを起源とし得ること、又は再発は複数のサブクローンを起源としてポリクローナル性であり得ることを示す。系統発生ツリー中に存在する全ての変異クラスターのバーコード化を通じて（すなわち、ＳＮＶをプライマーアッセイプール内に示される個々のクラスターに個々的なものとする）、腫瘍のどの「部分」、したがってサブクローン性集団が再発を生じさせるかをｃｆＤＮＡが予測できることが実証された。例えば、血漿中に検出されたＳＮＶが元々の系統発生ツリーの１つの枝にある特定のサブクローン性クラスターに対応する場合、この枝は疾患再発の「元となる」と推定することができる。我々の系統発生バーコードの使用を通じて、その特定の枝の生物学まで戻って追跡することができ、また早期疾患状況において療法を変化させ又は適合させるために使用され得る再発の治療的に関連するドライバーを同定することができる。疾患の大きさが小さいときに小分子又は免疫療法で再発のこれらのドライバーを標的化することで、疾患の体積によって推進される腫瘍内不均質性及び増大するがん細胞集団に関連するその後の問題を克服できる可能性があり、それによってより良好な患者アウトカムに繋がる可能性がある。
【０１５６】
翻訳に関連する「高感度」バーコードを生成することによる、再発、最小残留疾患、治療応答の予測並びに治療に関連する変異を含有するサブクローンのクローン性及び相対サイズの決定
上記の精密化として、標的化シークエンシング又は単一試料全エクソームシークエンシングを使用して、（ＮＳＣＬＣ生物学の合理的理解に基づいて）血漿において高い見込みの検出に対応すると決定されたＮＳＣＬＣのゲノム領域から「早期クローン性」バーコードを生成することができる。早期クローン性変異（ゲノム倍加前）はＮＳＣＬＣ腫瘍の全体を通じて存在し、ゲノム倍加事象により増幅されるので、ゲノム倍加前のこれらの早期事象に基づいて予測されるバーコードは、ＮＳＣＬＣ疾患活性及び再発を予測するバイオマーカーの点で最大の感度を提供する。このアプローチは、複数領域のシークエンシングの前提となる必要条件がないことからより臨床的に応用可能であり、上記よりも早い処理を有し、したがってアジュバント及び転移性疾患状況における再発及び疾患活性のバイオマーカーとしてより応用可能である。
【０１５７】
最小残留疾患の同定において最大の感度を得るために、「早期クローン性」バーコードは、ＮＳＣＬＣ発がんにおける高信頼性早期（ゲノム倍加前）事象として分類される遺伝子中の体細胞ＳＮＶを同定すること（表１の例）、そしてまた高信頼性早期（ゲノム倍加前）増幅事象に関与するとして分類される染色体領域中の体細胞ＳＮＶを同定すること（表１の例）にフォーカスする。さらには、変異シグネチャーを使用して、クローン性である可能性が統計的により高い変異（例えば、肺扁平細胞癌におけるシグネチャー４変異）を同定してもよい（表２を参照）。
【０１５８】
生成されたら、この「早期クローン性」バーコードを使用して、その患者の個人専用バーコードの一部分であると決定されるＳＮＶをカバーする３０〜４０ｂｐのアンプリコンサイズに基づくその患者のためのオーダーメイドのプライマーパネルを生成する。このプライマーパネルを使用して、無細胞ＤＮＡライブラリーを増幅する。次に、アンプリコンをシークエンシングし、変異体の変異を同定する。各パネルは術前の血漿試料（例えば、腫瘍が原位置にあるとき）において検証され得ることが想定される。次に、検証されたパネルを手術の２〜６週後に採取した血漿試料に対して使用して最小残留疾患を同定し、それにより、予後情報が提供され、アジュバント化学療法から利益を受けるであろう患者が同定される可能性がある。検証されたパネルはまた、腫瘍の大きさ及びアジュバント又は姑息的化学療法への応答の推定として使用される。変異体の変異アレル頻度がアジュバント又は姑息的化学療法の間に上昇する場合、応答の欠如が推定される可能性があり、治療を次第に増加させるか又は（異なる治療モダリティ―に）変化させることができる。変異体の変異アレル頻度がアジュバント又は姑息的化学療法の間に減少する場合、化学療法、免疫療法又は標的化療法の用量を、特に毒性の文脈内で、減少させることができる。選択患者についての再発検出の時点において、腫瘍のサブクローン構造を「バーコード」化するプライマーパネルを利用して、標的化療法、例えばＥＲＢＢ２増幅に適したものであり得る再発のサブクローン性ドライバーを同定することができる。また、早期クローン性バーコードを使用して、腫瘍の幹を特異的に標的化する免疫療法、標的化療法、養子細胞療法、化学療法及びがんワクチン接種をモニターする。
【０１５９】
原発性及び転移性の状況において、単一の生検は、実施可能な変更、ネオ抗原又は患者の疾患の大部分に存在する潜在的な抵抗機序の広がりに対する洞察を提供しないことがある。クローン性変化は、コピー数事象により特定の腫瘍領域中で失われることがあり、サブクローン性変化は単一の生検中に示されないことがある。汎用的ｃｔＤＮＡドライバーパネル、汎用的ｃｔＤＮＡ抵抗機序パネル又はｃｔＤＮＡのプローブとなる変異パネルをコードする汎用的ｃｔＤＮＡネオ抗原を利用して、単一の腫瘍生検中に示されない治療的に関連する変異を同定してもよい。オーダーメイドの早期クローン性バーコードは、組織において示されないが、汎用的パネルによって血漿中で同定される変異の治療的価値を決定するためのコンパニオン診断ツールとして作用し得る。例えば、早期クローン性バーコード中に存在する高い信頼度のクローン性変異の変異アレル頻度を汎用的パネルにより同定される未知のクローン状態の変異と比較することにより、非組織で示される変異のクローン性を推定することができる。さらには、組織中のサブクローン性変異のがん細胞率は、前記変異の血漿変異アレル頻度と相関する。したがって、比較診断ツールとして早期クローン性バーコードを利用することにより、腫瘍全体の大きさに対する、ドライバー、抵抗付与又はネオ抗原コード変異を含有するサブクローンの大きさを推定することができる。このアプローチは、治療の間のドライバー、抵抗機序及びネオ抗原の同定及びモニタリング並びに実行可能なドライバー、抵抗機序及び化学療法、標的化療法、樹状細胞ワクチン、自己Ｔ細胞療法及びＣＡＲ−Ｔ細胞療法を用いて標的化するためのネオ抗原の選択において治療的価値を有し得る。
【０１６０】
患者特異的バーコードにおけるネオ抗原をコードするクローン性ＳＮＶの追跡
細胞毒性ＣＤ８及びＣＤ４腫瘍浸潤性Ｔ細胞は、腫瘍ＳＮＶによってコードされるネオ抗原を認識することができる。クローン性ネオ抗原は、腫瘍内の不均質性に邪魔されない魅力的な治療標的となる（Ｍｃｇｒａｎａｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６年）。養子Ｔ細胞戦略及びがんワクチン接種を利用してクローン性ネオ抗原を標的化し得る。ネオ抗原は、バイオインフォマティクスのアプローチを使用して予測することができる。高い信頼度のネオ抗原によってコードされる合成ペプチドを提示するＭＨＣ多量体を使用してネオ抗原反応性Ｔ細胞を同定することができる。バイオインフォマティクス解析を通じて決定される高い信頼度のネオ抗原又はネオ抗原反応性Ｔ細胞の標的としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定されるネオ抗原をコードするＳＮＶを患者特異的ｃｆＤＮＡバーコードに組み込むことで、養子Ｔ細胞療法及びｃｆＤＮＡ遺伝子型判定を通じたがんワクチンアプローチの非侵襲的モニタリングが可能となり得る。
【０１６１】
実施例９
方法
患者
複数領域腫瘍試料を１００人の治療ナイーブ患者から回収した。適格患者は、１８歳以上で、腫瘍が術後組織構造に基づいてステージＩＩＩＢであることが判明した患者ＬＴＸ０１０３を除いて、ステージＩＡ〜ＩＩＩＡのＮＳＣＬＣの診断を有する者であった。５年以内に診断された又は再発した悪性腫瘍を有する患者、又はネオアジュバント治療を受けた患者は除外した。組織学的データを確認し、中央判定により標準化した。ベースラインのポジトロン断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）ＣＴスキャンを収集し、中央判定により標準化した。術前及び術後の血漿試料を回収し、処理した。
【０１６２】
ｃｆＤＮＡの遺伝子型判定
各患者のベースラインエクソーム系統発生ツリーからクローン性及びサブクローン性ＳＮＶを同定した。これらのＳＮＶを標準的なアッセイ設計パイプラインによって処理し、１０個のバランスの取れたアッセイプールを作り出し、それぞれは１０人の患者のＳＮＶ及び患者当たり平均で２０アッセイを含有した。最大５ｍｌの血漿が各症例及び時点について利用可能であった。ｃｆＤＮＡを血漿から抽出し、ライブラリー調製に付した。増幅したライブラリーをｍＰＣＲ−ＮＧＳによって解析した。各ＰＣＲアッセイプールを使用して１０個の対応する試料及び２０個の陰性対照試料（健常対象から調製した血漿ライブラリー）からのＳＮＶ標的を増幅した。アッセイ当たり約４０，０００の平均標的ＤＯＲでＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ  ｖ１キットを使用して５０サイクルのペアードエンドの読取りを用いて１つのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎで各アンプリコンプールをシークエンシングした。
【０１６３】
結果
患者特異的なマルチプレックスＰＣＲパネルの生成
先を見越して最初の１００患者のための個人専用マルチプレックスＰＣＲアッセイプールの生成を促進するためのワークフローを設計した（図１）。これらの患者の１００人中９６人のためにパネルを設計した（図１２）。パネル設計の間、アッセイプールを標的ドライバー（カテゴリー１ａ〜２ａ）変異について濃縮し、各個々の再現された腫瘍系統発生ツリーの均一なサンプリングを確実にするように設計した。各個人専用アッセイプール内のアッセイのメジアン数は１８（ＩＱＲ＝２）であり、これらのうち１１（ＩＱＲ＝８）アッセイのメジアンはエクソーム解析ワークフローによってクローン性と指定される幹変異を対象とし、６（ＩＱＲ＝８）アッセイのメジアンはサブクローン性と指定される枝特異的変異を対象とし、サブクローン性系統発生クラスターを「バーコード化」した（図１２）。エクソームで構築された系統発生ツリーの平均で６５％は、１つ又は複数のサブクローン性変異クラスターを標的化する変異によって表される。合計で１７４８の単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）をベースライン術前コホート内でプロービングし、３１７２のＳＮＶを再発コホートにおいてプロービングした。
【０１６４】
別個の生物学的要因は血漿において早期ＮＳＣＬＣの検出を予測する
患者特異的なマルチプレックスＰＣＲ  ＮＧＳワークフローを使用して術前血漿試料を解析した。患者のＮＳＣＬＣは、２つ又はそれより多くのクローン性ＳＮＶがそれらのｃｆＤＮＡのプロファイリングを通じて同定された場合、確信をもって検出されたとみなした。これに基づいて４５／９６のステージＩ〜ＩＩＩＡのＮＳＣＬＣを手術前に検出した（図１３）。検出されたＮＳＣＬＣにおいて、アッセイプール内で同定されたクローン性ＳＮＶのメジアンパーセンテージは９４％（ＩＱＲ＝３７％）であり、同定されたサブクローン性ＳＮＶのメジアンパーセンテージは２９％（ＩＱＲ＝５７％）であった（図１３）。クローン性ＳＮＶは、サブクローン性よりも血漿中に存在すると同定される可能性が高かった（Ｐ＜０．００１、ＯＲ＝５．２３７、［ＣＩ  ９５％  ３．９〜７．１］）。
【０１６５】
ＬＵＳＣ組織学的サブタイプは、ｃｔＤＮＡ検出の有意な予測因子であることが観察された（図１３）。３０／３１のＬＵＳＣを検出し、１０／５８のＬＵＡＤと比較した（Ｐ＜０．００１、ＯＲ＝１４４［９５％  ＣＩ  １７．５〜１１８２．６］）。この観察は、病理学的ＴＮＭステージ（腫瘍体積及びリンパ節転移）、各アッセイプールにおけるクローン性変異の数及び総ｃｆＤＮＡインプット（ｎｇ）の複合について調整した多変量解析（ＭＶＡ）において有意なままであった（Ｐ＜０．００１、ＯＲ＝１７８．３、［９５％  ＣＩ  １９．７−１６１２．１］）。リンパ節転移もまたこのモデルにおいて有意な予測因子であった（表２）。顕著なことに、マルチプレックスＰＣＲ  ＮＧＳプラットフォームは、４／３９のみのステージＩ  ＬＵＡＤと比較して、このコホート内で１６／１７のＴＮＭステージＩ  ＬＵＳＣを検出することができた（図１３）。
【０１６６】
これらの組織学的サブタイプを特徴付ける特徴の比較を通じてｃｔＤＮＡの放出に影響を及ぼす可能性がある生物学的要因を評価した。ＬＵＡＤとは対照的にＬＵＳＣは通常、壊死性のＮＳＣＬＣサブタイプであり、これに合致して、コホート内に存在するＬＵＳＣは、組織学的検査による決定でＬＵＡＤより壊死性であった（メジアンの壊死４０％対２％、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＜０．００１）。壊死の重要性に合致して、検出されたＬＵＡＤは検出されなかったＬＵＡＤよりも有意に壊死性であった（メジアンの壊死１７．５％対２％、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＝０．００４）。早期ＮＳＣＬＣの先行する研究に類似して、ＬＵＳＣはＬＵＡＤよりもＰＥＴ集積であり（メジアンの腫瘍バックグラウンド比（ＴＢＲ）９．０対４．６、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＜０．００１）（８、９）、検出されなかったＬＵＡＤと比較して検出されたＬＵＡＤにおいてＰＥＴ集積性は有意に高かった（メジアンＴＢＲは１０．２に対して３．６、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＝０．００１）。壊死及びＰＥＴ集積性の両方は、壊死、ＰＥＴ  ＴＢＲ、リンパ節転移、腫瘍体積、各アッセイプールにおけるクローン性変異の数及び総ｃｆＤＮＡインプット（ｎｇ）の効果を確認するために行ったサブグループのＭＶＡにおけるＬＵＡＤ検出の唯一の有意な予測因子であった（表３）。ステージＩのＮＳＣＬＣにおけるＰＥＴ集積性は腫瘍倍加時間と相関し、低酸素性壊死が迅速に増幅する腫瘍において起こるので、高い細胞ターンオーバーがこれらの観察に寄与した可能性があると我々は仮定した（１０）。コホートの組織マイクロアレイに対して行ったＫｉ６７免疫組織化学は、ＬＵＡＤと比較してＬＵＳＣにおいてより多くの数のＫｉ６７陽性細胞を明らかにし（Ｋｉ６７＋細胞のメジアンパーセントはＬＵＳＣにおける５０％に対してＬＵＡＤにおいて４％、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＜０．０００１）、検出されたＬＵＡＤは、検出されなかったＬＵＡＤよりも有意に高いＫｉ６７陽性度を実証した（Ｋｉ６７＋細胞のメジアンパーセントは、検出されたＬＵＡＤにおける６５％に対して検出されなかったＬＵＡＤにおいて３％、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＝０．００７）（図１４）。検出されたＬＵＡＤはまた、盲検の組織学的調査において検出されなかったＬＵＡＤよりも有意に高い数の、高倍率視野（ＨＰＦ）当たりの末端有糸分裂像を有することが観察された（マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＜０．００１）（図１４）。これらのデータを合わせると、ＴＮＭステージ又は技術的要因よりもむしろ、ＬＵＡＤの部分集団中に存在する、ＬＵＳＣに固有の腫瘍特異的細胞周期動態を支配する生物学的要因がｃｔＤＮＡの放出を支配することが示唆される。
【０１６７】
特に、８／１０の検出されたＬＵＡＤは、より高い速度の増殖及びより不良な予後に関連するＬＵＡＤサブタイプである充実性増殖有意型組織構造を実証し、置換性増殖有意型ＬＵＡＤは検出されなかった（図１４）。
【０１６８】
変異アレル頻度は腫瘍サイズ、クローン性及びコピー数の状態に関連する
確信をもって検出された腫瘍を有する確信をもって検出された患者の血漿内の変異検出の頻度に関与する要因を決定した。検出された変異の変異アレル頻度（ＶＡＦ）は、有意な患者間不均質性を示した（図１５Ａ）。平均クローン性ＶＡＦは腫瘍体積と強く有意に相関し（スピアマンの順位Ｒｓ（４２）＝０．６０、Ｐ＜０．００１）（図１５Ｃ）、ＬＴＸ２０１及びＬＴＸ２４０はこの観察の文脈において孤立値であった。ＬＴＸ２０１は腺扁平上皮癌であり、組織学的調査で優位にＬＵＡＤであると決定された。ＬＵＡＤからの限定されたｃｔＤＮＡ検出に関する我々の先行する観察を考慮すると、この腫瘍のＬＵＳＣ成分のみがｃｔＤＮＡを放出していたという可能性が出てくる。ＬＴＸ２４０は、放射線学的調査において大きい壊死性の空洞の周囲のＰＥＴ集積腫瘍の周縁からなることが示された大腫瘍であり、限定された生存可能な腫瘍体積を強調した（図１５Ｄ）。組織学的検査での壊死のパーセンテージ、リンパ節転移、ＰＥＴ  ＴＢＲ、組織学的サブタイプ、ｃｆＤＮＡインプット量及び腫瘍の場所（中心、末梢、上／中又は下葉）と、単変量解析における平均クローン性ＶＡＦとの間の関連性は観察されなかった。腫瘍サイズの効果を制御するためにＶＡＦの正規化を行ったところ、クローン性と指定されたＳＮＶは、サブクローン性と指定されたＳＮＶよりも有意に高い正規化されたＶＡＦを有することに気付いた（クローン性ＳＮＶについてメジアンＶＡＦは１±０．７４であったのに対し、サブクローン性ＳＮＶについては０．３２±０．６、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＜０．００１）（図１５Ｂ）。特に、ｍ−ｓｅｑについてサンプリングした領域にわたって検出されたサブクローン性変異の平均がん細胞率は正規化された血漿ＶＡＦと相関し、サブクローンの大きさは血漿ＶＡＦから推定できることを示唆し、また、検出されたＳＮＶのコピー数状態は正規化された血漿ＶＡＦと相関することが観察された（図１６）。
【０１６９】
クローン性変異とサブクローン性変異との間で観察されたＶＡＦの差異を考慮すると、検出されたドライバー変異のクローン性を推測するために単一領域生検のコンパニオン診断ツールとして血漿遺伝子型判定が作用し得るかどうかが決定される。
【０１７０】
ｃｔＤＮＡの検出はアジュバント療法において再発を予告する
２５患者の再発サブコホート（この９６患者のコホート内で本研究の時間枠内でＮＳＣＬＣの臨床的再発を被った１３患者及び１２人の対照）。術後状況内で定期的な間隔で供与されたこのコホートからの血漿試料を盲検でｃｆＤＮＡ遺伝子型判定に付した。１３のＮＳＣＬＣのうち１２で再発が血漿中に検出された（図１７）。検出されなかった再発症例（ＬＴＸ１０２）は特に、低いｗｇＩＩスコアを有する置換性増殖有意型ＬＵＡＤであり、我々のベースラインデータにおいて、ｃｔＤＮＡは類似の特徴を有する腫瘍を検出できないことに気付いた。術後状況における２つのクローン性ＳＮＶの検出として分子的再発を定義することで、他のＳＮＶ閾値を利用する場合と比較して、再発の同定の点で最も高い感度及び特異性が達成された（それぞれ９２％及び８３％）（表１０）。特に、２つのクローン性ＳＮＶが２つの対照症例ＬＴＸ０１３及びＬＴＸ２１０の血漿中に検出された。ＬＴＸ０１３の血漿における２つの時の増加している数の腫瘍特異的ＳＮＶの検出は、より長い追跡で臨床的に発現する可能性がある亜臨床的進行に関する（図１８Ａ）。ＬＴＸ２１０は手術の４８時間及び３８日後に検出可能な腫瘍特異的ＳＮＶを有する最小残留疾患の証拠を実証した。アジュバント化学療法及び放射線療法の開始後、完全な分子応答の証拠が観察された（図１８Ｌ）。残りの１０の対照症例では分子的再発の証拠は観察されなかった（図１８）。
【０１７１】
分子的再発の検出と臨床的再発との間のメジアン間隔（リード時間）は、ＬＵＡＤと比較してＬＵＳＣにおいて有意に長かった（ＬＵＳＣにおけるメジアンリード時間は１１６．５日（ＩＱＲ＝１２２．２５、ｎ＝４）であったに対し、ＬＵＡＤでは２０．５日（ＩＱＲ＝４４．２５、ｎ＝８）、マン・ホイットニーのＵ検定、Ｐ＝０．０４８）。特に、ＬＵＡＤコホートの孤立値はＬＴＸ０４６であり、これは臨床的再発の確認の２９０日前に血漿中に検出された。この症例において、肺結節のサーベイランスのために、胸部及び腹部ＣＴを再発の確認の１３３日前に行った（図１７Ｍに注釈）。このＣＴにより、胸椎における疑わしい硬化病巣が実証され、この病変をモニターするためのインターバルＣＴスキャンを準備した。この時点でのコンパニオンｃｆＤＮＡ遺伝子型判定は臨床的再発を支持した可能性があり、抗ＥＧＦＲ単剤療法のより早期の開始に繋がるかもしれない。
【０１７２】
血漿ｃｆＤＮＡ遺伝子型判定を通じた腫瘍進展の追跡
疾患再発の時点で起こっているＮＳＣＬＣの進展動態を非侵襲的にモニターするために使用したサブクローン節「バーコード化」戦略を決定した。術前血漿試料において、検出されたＬＵＳＣの血漿で５５％（ＳＤ±３５％、範囲０〜１００％）の平均パーセンテージのバーコード化サブクローン性クラスターが示され、検出されたＬＵＡＤの血漿で２６％（ＳＤ±３７％、範囲０〜１００％）の平均パーセンテージのバーコード化サブクローン節が示され、ｃｆＤＮＡ遺伝子型判定を利用して血漿における腫瘍の系統発生構造をモニターできることが示唆された（図１９）。ＬＴＸ０１９において、２つのＦ１サブクローン節（最近の先祖としてクローン節を共有するサブクローン節として定義される）をアッセイプールにおいてバーコード化した。これらの節の１つのみが術前血漿に示され、これは原発性腫瘍における系統発生ツリーの優勢な枝であることを示唆した。再発時に、検出されなかったＦ１サブクローン節は血漿中に普及していた（図２０）。興味深いことに、原発性腫瘍のエクソーム解析は、この節が、前転移ニッチの作製に関与すると考えられているＣＤ４４、リンパ球ホーミング受容体を伴う１１ｐ１３においてサブクローン特異的増幅を含有したことを明らかにした。ＬＴＸ０３８において、バーコード化されたエクソーム系統発生ツリーの両方の枝は、血漿においてベースラインで検出可能であった。再発時に単一の枝のみが検出可能であり、この枝におけるサブクローン節をバーコード化する変異は、血漿において有意により高い頻度で検出された。特に、再発の時点で血漿中に富化したＦ４サブクローン節はＮｏｔｃｈ１ドライバー変異を含有した（図２０）。不幸なことに、この患者は再発後に迅速に悪化し、この部位からの組織はエクソーム解析のために入手できなかった。
【０１７３】
【表１】
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【０１７４】
【表２】
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【０１７５】
【表３】
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【０１７６】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−３０】
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【表４−４０】
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【表４−４１】
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【表４−４２】
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【表４−４４】
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【０１７７】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−４６】
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【表５−６３】
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【表５−６５】
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【表５−６６】
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【表５−６７】
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【表５−６８】
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【表５−６９】
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【表５−７０】
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【表５−７８】
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【表５−７９】
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【表５−８０】
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【表５−８１】
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【表５−８２】
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【表５−８３】
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【表５−８４】
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【０１７８】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１７９】
【表７】
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【０１８０】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【０１８１】
【表９】
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【０１８２】
【表１０】
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【０１８３】
【表１１】
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【０１８４】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【表１２−２２】
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【表１２−２３】
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【表１２−２７】
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【表１２−３０】
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【表１２−３１】
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【表１２−３２】
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【表１２−３９】
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【表１２−４０】
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【表１２−４１】
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【表１２−４２】
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【表１２−４３】
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【表１２−４４】
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【表１２−４５】
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【表１２−４６】
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【表１２−４７】
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【表１２−４８】
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【表１２−４９】
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【表１２−５０】
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【表１２−５１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１８Ｋ】
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【図１８Ｌ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2019533464.tif 000260
2019533464.tif 000261
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