(57)【要約】  単離されたペプチド又はペプチド模倣体であって、α−ネメルチド部分を含み、ａ）前記α−ネメルチド部分は、配列番号１に示される配列を有し；又はｂ）前記α−ネメルチド部分は、合計で９以下を数える、残基の置換、欠失、もしくは挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有する、ペプチド又はペプチド模倣体。医療、有害生物防除、及びそれらの研究用途。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたペプチド又はペプチド模倣体であって、α−ネメルチド部分を含み：
ａ）前記α−ネメルチド部分は、配列番号１に示される配列を有し；又は
ｂ）前記α−ネメルチド部分は、配列番号１と異なる配列として、残基の置換、欠失、又は挿入が合計数で９箇所以下であることにより異なる配列を有する、ペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項２】
α−ネメルチド部分が、残基の置換、欠失、又は挿入が合計数で６箇所以下であることにより配列番号１と異なる配列を有する、請求項１に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項３】
α−ネメルチド部分が、配列番号１におけるＣ残基の位置とアラインする位置に６つのＣ残基を含む、請求項１又は２に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項４】
α−ネメルチド部分が、配列番号２に従うコンセンサスに示される配列を有する、請求項１から３のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項５】
α−ネメルチド部分が、配列番号１の位置２及び位置１６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋、配列番号１の位置９及び位置２０とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋、ならびに／又は配列番号１の位置１５及び位置２６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項６】
α−ネメルチド部分が、配列番号１の位置２及び位置１６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋、配列番号１の位置９及び位置２０とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋、ならびに配列番号１の位置１５及び位置２６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項７】
以下を含む請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体：
配列番号１の位置４とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＡ、Ｋ、Ｓ、及びＰからなる群から選択される；
配列番号１の位置５とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＴ及びＶからなる群から選択される；
配列番号１の位置８とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＦ、Ｖ、Ｇ、及びＭからなる群から選択され；
配列番号１の位置１１とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＬ及びＩからなる群から選択される；
配列番号１の位置１３とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＮ及びＫからなる群から選択される；
配列番号１の位置２５とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＫ、Ｈ、及びＡからなる群から選択される；かつ／又は
配列番号１の位置２８とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＰ及びＫからなる群から選択される。
【請求項８】
配列番号１の位置４及び位置８とアラインするα−ネメルチド部分の残基が疎水性である、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項９】
配列番号１の位置８とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＦである、請求項１〜８のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１０】
配列番号１の位置３とアラインするα−ネメルチド部分の残基がＩである、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１１】
α−ネメルチド部分が配列番号１又は配列番号３〜９のいずれかに示される配列からなる、請求項１から１０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１２】
α−ネメルチド部分が配列番号６に示される配列からなる、請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１３】
α−ネメルチド部分が配列番号１又は配列番号３に示される配列からなる、請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１４】
α−ネメルチド部分が配列番号１の位置４、位置２８、及び／又は位置２９とアラインする位置にヒドロキシプロリンを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１５】
医薬として用いられる請求項１〜１４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の有害生物防除剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学、医学、及び有害生物防除における、生物活性ペプチド／ペプチド模倣体（peptide mimetics）の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の毒液及び毒素に由来するペプチド及びタンパク質は、生物活性化合物の興味深い源である。当該毒素は、薬物又は薬理学的ツールとして市場に出てきたものもあれば、バイオテクノロジー及び農業に応用されているものもある。ヘビ、サソリ、クモ、トカゲ、及びムカデがペプチド毒素の産生生物として知られる一方、他のクラスの生物には化学、生物学、及び生態学についてほとんど知られていないまま存在しているものもある。本発明者らが探索を行ったのは、そのような無視されたままの毒素源の１つについてである。すなわち紐形動物（ｎｅｍｅｒｔｅａｎ）又はヒモムシ（ｒｉｂｂｏｎ  ｗｏｒｍ）である。
【０００３】
紐形動物又はヒモムシは、主に海洋性の動物の門であり、最もよく研究されている有毒性動物の群の１つ、すなわち、イモガイ科（Ｃｏｎｉｄａｅ）のイモガイ（ｃｏｎｅ  ｓｎａｉｌ）と共通点がある。双方とも、餌の捕獲及び／又は防御に吻を用いて、そしてまた、紐形動物の一クラスには、イモガイの歯舌（ｒａｄｕｌａ  ｔｏｏｔｈ）と同じ明白な機能（毒液注入）を有するスティレット（ｓｔｉｌｅｔｔｏ）が備わっている。しかしながら、紐形動物の最も顕著な化学物質源であると思われるのは、当該動物の表皮を覆う粘液である。すでに１９００年に、Ｗｉｌｓｏｎは、舌の上に垂らしたほんの一滴の粘液が、何時間も感覚を麻痺させたと報告している（Ｗｉｌｓｏｎ  ＱＪ，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｓｃｉ．１９００，４３，９７−Ｕ３３）。この活性は後に、アナバシン、ピリジルアルコール（Ｋｅｍ  ＷＲ，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．１９８５，２５，９９−１１１）、及びテトロドトキシン（Ａｓａｋａｗａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２００３，４１，７４７−５３）が挙げられる、一部の紐形動物由来の低分子量毒素の単離によって、説明された。
【０００４】
対照的に、紐形動物由来の、タンパク質又はペプチドベースのあらゆる毒素に対する関心は、限られてきた。報告は、細胞溶解性の１０ｋＤａの「Ａ毒素」、ミルキーリボンワーム、セレブラトゥルス・ラクテウス（Ｃｅｒｅｂｒａｔｕｌｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）の粘液から単離された６ｋＤａの神経毒性「Ｂ毒素」（Ｋｅｍ  ＷＲ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６，２５１，４１８４−９２）、及びパルボルラシア・コッルガトゥス（Ｐａｒｂｏｒｌａｓｉａ  ｃｏｒｒｕｇａｔｕｓ）において最近発見された１０ｋＤａのパルボルリシン（ｐａｒｂｏｒｌｙｓｉｎ）（Ｂｕｔａｌａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｎ，２０１５，１０８，３２−７）に限られている。これらの可能性のあるペプチド毒素の分子標的は、未だ知られていない。
【０００５】
紐形動物（Ｎｅｍｅｒｔｅａ）門は、おおよそ１３００種を含む。より壮大な種の１つが、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）である。これは、地球上で最も長い動物として知られており、最長３０から５０ｍの体長を有する。北半球では、深さ１０ｍ以下の海底に生息していることが見出されており、一部の地域では、潮間帯の海岸で見られることもある。Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）は、テトロドトキシンの可能性のある源として、発明者らの関心を呼び起こしたが（Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．２００３，２８８，５１−６３）、代わりに、本明細書中に開示される新規の化合物の予想外の発見に至った。
【０００６】
ゆえに、本発明の目的は、医学、獣医学、バイオテクノロジー、農業、研究等の用途に用いられる、電位依存性ナトリウムチャネル、他のイオンチャネル、又は他の標的に影響を及ぼす化合物の向上を実現し、又は当該化合物の選択肢を与えることである。
【０００７】
定義
本出願の文脈における用語「ペプチド模倣体」は、ペプチドを構造的に模倣するが、いくつかの点で異なる特性、又は向上した特性を有するように設計されたペプチド様ポリマー鎖として定義される。
【０００８】
本出願の文脈における用語「非天然残基」は、ペプチド又はペプチド模倣鎖の一部としての、天然に存在する生物中で産生されるペプチド又はタンパク質中に存在しないアミノ酸又はアミノ酸類似体を指す。
【０００９】
本明細書における用語「処置」は、処置されるべき症状に苦しむ対象に有益な効果（あらゆる緩和の程度が挙げられ、軽度の緩和、実質的な緩和、大規模な緩和、及び治癒が挙げられる）をもたらす処置を指す。好ましくは、緩和の程度は、少なくとも軽度の緩和である。
【００１０】
本明細書における用語「予防」は、予防されるべき症状を発症する可能性のあらゆる程度の低下（症状を発症する可能性の軽度の、実質的な、又は大規模な低下、及び完全な予防が挙げられる）をもたらす予防措置を指す。好ましくは、可能性の低下の程度は、少なくとも軽度の低下である。
【００１１】
本出願の文脈における用語「電位依存性ナトリウムチャネル」は、細胞の原形質膜を通してナトリウムイオンを伝えるイオンチャネルの形成よりも、内在性膜タンパク質を指す。定義上、電位依存性チャネルの開閉状態は通常、原形質膜内外の電位差によって主に支配される。ヒトでは、ＮａＶ１．１から１．９と呼ばれる型定義α−サブユニットを含有する９つの既知の型の電位依存性ナトリウムチャネルが、調節型ベータ−サブユニットＮａＶβ１−４と関連して、存在する。いくつかの既知の毒素、例えばテトロドトキシン、サクソトキシン、及びいくつかのコノトキシンは、それらの作用を、電位依存性ナトリウムチャネルへの結合を介して発揮する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、以下の項目に関する。以下の項目に開示されている主題は、当該主題が特許請求の範囲において開示されているのと同じように開示されているとみなされるべきである。
【００１３】
１．単離されたペプチド又はペプチド模倣体であって、α−ネメルチド部分を含み：
ａ）前記α−ネメルチド部分は、配列番号１に示される配列を有し；又は
ｂ）前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９を数える、残基の置換、欠失、もしくは挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有する、ペプチド又はペプチド模倣体。
【００１４】
２．前記α−ネメルチド部分は、合計で０、１、２、３、４、５、又は６を数える、残基の欠失又は挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有する、項目１に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００１５】
３．前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９を数える、アラニンによる置換だけ、配列番号１と異なる配列を有する、項目１に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００１６】
４．前記α−ネメルチド部分は、合計で０、１、２、３、４、５、又は６を数える、残基の置換、欠失、又は挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有する、項目１に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００１７】
５．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１におけるＣ残基の位置とアラインする位置に６つのＣ残基を含む、項目１から４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００１８】
６．前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、又は６を数える、残基の置換、欠失、又は挿入だけ、配列番号２と異なる配列を有する、項目１から５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００１９】
７．前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、又は６を数える、アラニンの置換だけ、配列番号２と異なる配列を有する、項目１から６のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２０】
８．前記α−ネメルチド部分は、配列番号２に従うコンセンサスに示される配列を有する、項目１から７のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２１】
９．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置２及び位置１６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間にジスルフィド架橋を含む、項目１から８のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２２】
１０．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置９及び位置２０とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間にジスルフィド架橋を含む、項目１から９のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２３】
１１．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置１５及び位置２６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間にジスルフィド架橋を含む、項目１から１０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２４】
１２．配列番号１の位置４とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＡ、Ｋ、Ｓ、及びＰからなる群から選択され、好ましくはＡである、項目１から１１のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２５】
１３．配列番号１の位置５とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＴ及びＶからなる群から選択され、好ましくはＴである、項目１から１２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２６】
１４．配列番号１の位置８とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＦ、Ｖ、Ｇ、及びＭからなる群から選択され、好ましくはＦである、項目１から１３のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２７】
１５．配列番号１の位置１１とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＬ及びＩからなる群から選択され、好ましくはＬである、項目１から１４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２８】
１６．配列番号１の位置１３とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＮ及びＫからなる群から選択され、好ましくはＫである、項目１から１５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００２９】
１７．配列番号１の位置２５とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＫ、Ｈ、及びＡからなる群から選択され、好ましくはＫである、項目１から１６のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３０】
１８．配列番号１の位置２８とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＰ及びＫからなる群から選択され、好ましくはＰである、項目１から１７のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３１】
１９．配列番号１の位置３とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＩである、項目１から１８のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３２】
２０．配列番号１の位置８とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基がＦである、項目１から１９のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３３】
２１．配列番号１の位置５とアラインする、前記α−ネメルチド部分の残基は、Ｔである、項目１から２０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３４】
２２．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１又は配列番号３から９のいずれかに示される配列からなる、項目１から２１のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３５】
２３．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１に示される配列からなる、項目１から２２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３６】
２４．前記α−ネメルチド部分は、配列番号３に示される配列からなる、項目１から２３のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３７】
２５．前記α−ネメルチド部分は、配列番号６に示される配列からなる、項目１から２４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３８】
２６．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、配列番号１に示される配列からなる、項目１から２５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００３９】
２７．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、配列番号３に示される配列からなる、項目１から２６のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４０】
２８．前記ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、前記α−ネメルチド部分の配列からなる、項目１から２７のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４１】
２９．前記α−ネメルチド部分におけるＰ残基の１つ以上がヒドロキシル化されている、項目１から２８のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４２】
３０．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置２８とアラインする位置にヒドロキシプロリンを含む、項目１から２９のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４３】
３１．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置２９とアラインする位置にヒドロキシプロリンを含む、項目１から３０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４４】
３２．前記α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置４とアラインする位置にヒドロキシプロリンを含む、項目１から３１のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４５】
３３．前記α−ネメルチド部分は、非ヒドロキシル化プロリン残基を含まない、項目１から３２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４６】
３４．アミド化されたＣ末端等の修飾されたＣ末端を有する、項目１から３３のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４７】
３５．アシル化されたＮ末端等の修飾されたＮ末端を有する、項目１から３４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４８】
３６．環状骨格を有する、項目１から３５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００４９】
３７．１つ以上の非天然残基を含む、項目１から３６のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５０】
３８．１つ以上のＤ−アミノ酸残基を含む、項目１から３７のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５１】
３９．骨格中に１つ以上の非ペプチド結合を含む、項目１から３８のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５２】
４０．検出可能なマーカー、好ましくはビオチン、蛍光マーカー、又は放射性標識に結合されている、項目１から３９のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５３】
４１．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、天然に存在するあらゆるペプチド配列と比較して、少なくとも１つの差異を含む配列を有するペプチドである、項目１から４０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５４】
４２．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、配列番号１又は配列番号３〜９のいずれかに記載の配列のいずれかと比較して、少なくとも１つの差異を含む配列を有するペプチドである、項目１から４１のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５５】
４３．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、電位依存性ナトリウムチャネルに結合する、項目１から４２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５６】
４４．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、電位依存性ナトリウムチャネルに持続的な非不活化電流を誘導する、項目１から４３のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５７】
４５．前記ペプチド又はペプチド模倣体は、電位依存性ナトリウムチャネルに持続的な非不活化電流を誘導し、ＥＣ５０が、５μＭ未満、より好ましくは０．５μＭ未満、さらにより好ましくは０．０５μＭ未満である、項目１から４４のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５８】
４６．前記電位依存性ナトリウムチャネルは、脊椎動物の電圧依存性ナトリウムチャネルである、項目４３から４５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００５９】
４７．前記脊椎動物は、ヒト、ラット、又はマウスであり、好ましくはヒトである、項目４６に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００６０】
４８．前記電位依存性ナトリウムチャネルは、ヒトＮａＶ１．５、マウスＮａＶ１．６、ラットＮａＶ１．４、及びラットＮａＶ１．１から選択される、脊椎動物の電圧依存性ナトリウムチャネルである、項目４３から４５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００６１】
４９．前記電位依存性ナトリウムチャネルは、無脊椎動物の電圧依存性ナトリウムチャネルである、項目４３から４５のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００６２】
５０．前記無脊椎動物の電位依存性ナトリウムチャネルは、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）ＮａＶ１、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＮａＶ１、及びミツバチヘギイタダニ（Ｖｅｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）ＮａＶ１から選択される、項目４９に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００６３】
５１．ペプチドである、項目１から５０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００６４】
５２．ペプチド模倣体である、項目１から５０のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００６５】
５３．項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体を製造する方法であって：
ａ．項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の構造を選択することと；
ｂ．前記ペプチド又はペプチド模倣体を、好ましくは固相ペプチド合成を用いて、インビトロで合成することと
を含む方法。
【００６６】
５４．前記合成は、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成に続いて酸化的折畳み（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ）を用いて実行される、項目５３に記載の方法。
【００６７】
５５．項目１から５２のいずれかに記載のペプチドをコードする、ＤＮＡ配列等の核酸配列。
【００６８】
５６．プロモータに作動可能に連結された、項目５５に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【００６９】
５７．項目５５に記載の核酸配列又は項目５６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００７０】
５８．項目５５に記載の核酸配列又は項目５６に記載のベクターを含むトランスジェニック生物。
【００７１】
５９．前記生物は植物である、項目５８に記載のトランスジェニック生物。
【００７２】
６０．医薬として用いられる、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００７３】
６１．疼痛、神経因性疼痛、糖尿病性疼痛、癌性疼痛、神経痛、神経障害、肢端紅痛症、骨関節炎、気道狭窄に関連する咳及び呼吸器疾患から選択される症状の処置に用いられ、麻酔薬として用いられ、又は咳反射を阻止するのに用いられる、項目６０に従うペプチド又はペプチド模倣体。
【００７４】
６２．寄生生物感染、好ましくは蠕虫感染又は外部寄生生物感染の処置又は予防に用いられる、項目６０に記載のペプチド又はペプチド模倣体。
【００７５】
６３．好ましくは農業の有害生物防除における、有害生物防除剤としての、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の使用。
【００７６】
６４．殺虫剤、殺軟体動物剤、又は殺ダニ剤としての、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の使用。
【００７７】
６５．駆虫剤、好ましくは殺線虫剤としての、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の使用。
【００７８】
６６．アッセイ、好ましくはインビトロアッセイにおける電位依存性ナトリウムチャネル結合試薬としての、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の使用。
【００７９】
６７．電位依存性ナトリウムチャネルの活性の判定を含むアッセイにおける、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の使用。
【００８０】
６８．電位依存性ナトリウムチャネルの位置の判定を含むアッセイにおける、項目１から５２のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体の使用。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】紐形動物リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）である。Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）の標本である。
【図１Ｂ】紐形動物リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）である。無針（ａｎｏｐｌａ）網種及び有針（ｅｎｏｐｌａ）綱種は双方とも吻を有するが、有針種のみスティレット（ｓｔｙｌｅｔ）を備えている。下部には、冠輪動物（Ｌｏｐｈｏｔｒｏｃｈｏｚｏａ）上門の簡略化した系統樹があり、イモガイが見られる軟体動物（ｍｏｌｌｕｓｃａ）との関係を示している。
【図２Ａ】リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）の粘液のサイズ排除クロマトグラフィ後の高分子画分のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＵＶ追跡の図である。ネメルチドα−１、α−２、及びβ−１に印を付けている。
【図２Ｂ】３つのペプチド、α−１（Ｍ＋Ｈ＋、３３０８．３５、モノアイソトピック質量）、α−２（Ｍ＋Ｈ＋３２６０．４０、モノアイソトピック質量）、及びβ−１（Ｍ＋Ｈ＋６４１９．００、平均質量）のＭＳスペクトルの図である。多荷イオンに、そのｍ／ｚで印を付けている。
【図３Ａ】α−ネメルチドの配列決定の図である。ネメルチドα−１及びα−２のＮ末端フラグメントのＭＳＭＳ配列決定である。Ｎ末端トリプシンフラグメントは、位置８でのＦのＶへの置換を示している。ピークが重なるｂ及びｙイオン系列を、明るい灰色のボックス内で強調表示している。位置８をボックスで囲んでいる。全てのＣｙｓ残基を、ＩＡＭ（Ｃｙｓ＋５７）を用いてアルキル化した。
【図３Ｂ】α−ネメルチドの配列決定の図である。ネメルチドα−１及びα−２のＮ末端フラグメントのＭＳＭＳ配列決定である。Ｎ末端トリプシンフラグメントは、位置８でのＦのＶへの置換を示している。ピークが重なるｂ及びｙイオン系列を、明るい灰色のボックス内で強調表示している。位置８をボックスで囲んでいる。全てのＣｙｓ残基を、ＩＡＭ（Ｃｙｓ＋５７）を用いてアルキル化した。
【図３Ｃ】酵素切断したペプチドのイオンマップである。＊：ヒドロキシプロリン。
【図３Ｄ】ｃｏｎｏｐｒｅｃによって予測される、ＥＲシグナル、プロ領域、及び成熟毒素の印を付けたα−１の前駆体の図である。＊＊：プレ配列切断部位、及び＊＊＊：成熟配列リジン切断部位。α−１配列及びα−２配列のＣ末端部分（．．．ＣＮ（Ｈｙｐ）（Ｈｙｐ）ＮＱ−ＣＯＯＨ）は、酵素消化産物において、配列決定され得るいかなるピークも生じず、かつ完全ペプチドのフラグメントにおいても生じなかった。Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｎ−Ｑ  Ｃ末端と一致する４８７ｍ／ｚのイオンが、天然のα−１、α−２、及び合成α−１において見出され得、かつ共溶出実験によって確認された。α−１及びα−２のＧｌｕ−Ｃ切断により、いかなるフラグメントも生じなかった。このことは、Ｇｌｕ残基が配列中に存在しないことを示唆している。
【図３Ｅ】利用可能なトランスクリプトームのＢＬＡＳＴ検索の結果の図であり、配列中のジスルフィド結合性が、ネメルチドα−１  ＮＭＲ構造から推測される。アラインメントの下方にある灰色のボックスは、完全な類似性を示す。注釈：１（配列番号１）は、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）、Ｌ．ラクテウス（Ｌ．ｌａｃｔｅｕｓ）、及びＬ．ルベル（Ｌ．ｒｕｂｅｒ）中に；２（配列番号３）は、Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）、Ｌ．ルベル（Ｌ．ｒｕｂｅｒ）中に；３（配列番号４）は、Ｌ．ラクテウス（Ｌ．ｌａｃｔｅｕｓ）；Ｌ．ラクテウス（Ｌ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｌ．シュードラクテウス（Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｌａｃｔｅｕｓ）中に；４（配列番号５）は、ミドリヒモムシ（Ｌ．ｓａｎｇｕｉｅｎｅｕｓ）中に；５（配列番号６）は、Ｌ．シュードラクテウス（Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｌａｃｔｅｕｓ）中に；６は、ミドリヒモムシ（Ｌ．ｓａｎｇｕｉｅｎｅｕｓ）中に；７（配列番号８）は、Ｌ．ルベル（Ｌ．ｒｕｂｅｒ）中に存在する。一部分配列が、Ｒ．オクルトゥス（Ｒ．ｏｃｃｕｌｔｕｓ）中に見出された（８（配列番号９））。
【図４Ａ】チチュウカイミドリガニ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ）における折畳み、同時注射、及び用量推定の図である。折畳み開始後０〜１６時間での折畳みプロセスのＨＰＬＣ−ＵＶの図であり、全ての追跡を２１５ｎｍにて記録した。
【図４Ｂ】チチュウカイミドリガニ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ）における合成α−１（Ｓ）及び天然（Ｎ）α−１のＵＰＬＣ−ＱＴｏＦ同時注射、Ｓ及びＮの単回注射についての、個々の追跡の図である。
【図４Ｃ】チチュウカイミドリガニ（Ｃ．ｍａｅｎａｓ）アッセイにおけるα−１の有効用量推定の表である。全ての注射を二反復で行った。＊注射したカニは、アッセイの時間枠において、生存しなかった。
【図４Ｄ】左：濾過滅菌した海水を注射した健常な対照、右：α−１の注射に対する典型的な応答の図である。
【図５Ａ】脊椎動物ＮａＶチャネル（ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．４、ＮａＶ１．５、ＮａＶ１．６、及びＮａＶ１．８）に及ぼすα−１の活性プロフィールである。各サブタイプについて、左のパネルは、対照及び毒素条件における代表的な細胞全体の電流追跡を示している。点線は、ゼロ電流レベルを示している。アスタリスク（＊）は、６μＭの毒素の投与後の定常状態の電流追跡を示す印である。示される追跡は、少なくとも３つの独立した実験（ｎ≧３）の代表的な追跡である。右のパネルは、定常状態の活性化（四角）及び不活化（円）の曲線を、対照（白抜きの記号）及び毒素条件（６μＭ  α−１、塗潰し記号）で示している。
【図５Ｂ】α−１誘導作用の濃度依存性を示す、ＮａＶ１．６についての濃度−応答曲線である。
【図６Ａ】チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（ＢｇＮａＶ１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＤｍＮａＶ１）、ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（ＶｄＮａＶ１）の無脊椎動物ＮａＶチャネルに及ぼすα−１の活性プロフィールである。対照及び毒素条件における代表的な細胞全体の電流追跡を示している。点線は、ゼロ電流レベルを示している。アスタリスク（＊）は、１μＭの毒素の投与後の定常状態の電流追跡を示す印である。示される追跡は、少なくとも３つの独立した実験（ｎ≧３）の代表である。
【図６Ｂ】α−１誘導作用の濃度依存性を示す、ＢｇＮａｖ１についての濃度−応答曲線である。ＥＣ５０値は、８．６±２．９ｎＭであることが見出された。
【図６Ｃ】正規化した電圧−電流関係である。
【図６Ｄ】定常状態の活性化及び不活化の曲線を、対照（白抜きの記号）及び毒素条件（１０μＭ  α−１、塗潰し記号）で示す図である。活性の有意な変化は認められなかった。というのも、Ｖ１／２値が、対照において−２９．１±２．２ｍＶを、そして１０ｎＭ  α−１の投与後で−３２．５±３．２ｍＶを与えたからである。不活化曲線について、Ｖ１／２は、対照及び毒素状況においてそれぞれ−６０．４±０．６ｍＶから−５４．５±１．６にシフトした。
【図６Ｅ】対照（白抜きの記号）における、そして１０ｎＭ  α−１の存在下（塗潰し記号）での、不活化からの回復の図である。Ｖ１／２値は、対照、及び１０ｎＭ  α−１の投与後において、それぞれ１１．６±０．４ｍｓ及び３．８±０．５ｍｓを与えた。
【図６Ｆ】双方とも、対照（左）、及び１０ｎＭ  α−１の付加後（右）において、５ｍＶの５０ｍｓの脱分極によって、−９０ｍＶから−３０ｍＶまで誘発された電流追跡を示すパネルである。
【図６Ｈ】阻害の状態依存性を調査するために、以下のプロトコルを用いた。対照として、一連の脱分極パルスを、ＢｇＮａＶチャネルを発現する卵母細胞に加えた。その後、１０ｎＭ  α−１を加えて、パルス化を２分間実行しなかった。次に、同様の一連のパルスを実行した。２分のインキュベーション後に、予想される不活化の遅延が観察された。これは、チャネルとの毒素相互作用には開状態が必要とされないことを示している。
【図７Ａ】ネメルチドα−１の三次元構造である。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアが最も低い２０個のモデルのライン表現である。
【図７Ｂ】ネメルチドα−１の三次元構造である。ジスルフィド（ローマ数字）、標識したＣ末端及びＮ末端を有する、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアが最も低いモデルのリボン表現である。
【図７Ｃ】図７Ｂにおけるモデルの表面表示であり、塩基性の残基を青色、無極性の残基を緑色、シスチンを黄色、そしてヒドロキシプロリンをシアン色で示す。芳香族アミノ酸Ｆ８、Ｆ２２、及びＷ２４が標識されている。Ｆ８が、α−１とα−２との間で唯一異なる。図７Ａの２０個のモデルをＭＯＬＭＯＬに重ねて、ＰｙＭＯＬで表示した。他の図は全て、ＰｙＭＯＬで作成した。
【図７Ｄ】Ｄａｌｉｓｅｒｖｅｒによって同定したＰＤＢにおいて見られるネメルチドα−１及びその最も近い構造類似体のリボン表現である。ネメルチドα−１、肝臓で発現される抗菌ペプチド２（ＬＥＡＰ−２、ＰＢＤ：２ｌ１ｑ）、ω−アトラコトキシン−ＨＶＩａ（ω−ＡＣＴＸ−ＨＶ１、ＰＢＤ：１ａｘｈ）、及びκ−セラフォトキシン−Ｓｃｇ１ａ（ＳＧＴｘ１、ＰＢＤ：１ｌａ４）である。
【図８】表１に要約したＮＭＲ統計値である。
【図９】ブラインシュリンプ（Ａ．ｓａｌｉｎａ）マイクロウェルアッセイにおける、ネメルチドα−１、α−２、ａ−５、及びα−６の作用を示す図である。表示される値は全て、平均値である；実験は二反復で実行した。
【図１０】ブラインシュリンプ（Ａ．ｓａｌｉｎａ）マイクロウェルアッセイにおける、ネメルチドα−１、α−３、及びα−４の作用を示す図である。表示される値は全て、平均値である；実験は二反復で実行した。
【図１１】ブラインシュリンプ（Ａ．ｓａｌｉｎａ）マイクロウェルアッセイにおける、ネメルチドα−１突然変異体Ｉ３Ａ、Ｔ５Ａ、Ｓ７Ａ、及びＦ８Ａと、対照ネメルチドα−１（「アルファ−１」）の作用を示す図である。表示される値は全て、平均値である；実験は三反復で実行した。
【図１２】ブラインシュリンプ（Ａ．ｓａｌｉｎａ）アッセイにおける、還元（折り畳まれていない）ネメルチドα−３及びα−４と、対照ネメルチドα−１（「アルファ−１」）の作用を示す図である。表示される値は全て、平均値である；実験は二反復で実行した。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本発明は、添付の例１から例６に記載されるような、ネメルチド（ｎｅｍｅｒｔｉｄｅ）プロテオーム及びトランスクリプトームに対する本発明者の研究に基づく、α−ネメルチドと名付けた新規のペプチドクラスを開示する。
【００８３】
ペプチド又はペプチド模倣体
第１の態様において、α−ネメルチド部分を含む単離されたペプチド又はペプチド模倣体が提供され、
ａ）前記α−ネメルチド部分は、配列番号１に示される配列を有し；又は
ｂ）前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６を数える、残基の置換、欠失、もしくは挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有する。
【００８４】
好ましくは、第１の態様のペプチド又はペプチド模倣体は、ペプチドであってよい。
【００８５】
これ以外にも、第１の態様のペプチド又はペプチド模倣体は、ペプチド模倣体であってよい。
【００８６】
α−ネメルチド部分は、より大きなペプチド又はペプチド模倣体の一部であってもよいし、ペプチド又はペプチド模倣体は、α−ネメルチド部分からなってもよい。
【００８７】
前記α−ネメルチド部分は、合計で０、１、２、３、４、５、又は６を数える、残基の欠失又は挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有してよい。
【００８８】
前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、又は９を数える、アラニンによる置換だけ、配列番号１と異なる配列を有してよい。
【００８９】
前記α−ネメルチド部分は、合計で０、１、２、３、４、５、又は６を数える、残基の置換、欠失、又は挿入だけ、配列番号１と異なる配列を有してよい。
【００９０】
α−ネメルチド部分は、６つのＣ残基を、配列番号１におけるＣ残基の位置とアラインする位置に含んでよい。理論によって拘束されるものではないが、Ｃ残基は、相同体間で最も保存されている残基である場合が多いことに留意されたい。
【００９１】
前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、又は６を数える、残基の置換、欠失、又は挿入だけ、配列番号２に従うコンセンサス配列と異なる配列を有してよい。
【００９２】
前記α−ネメルチド部分は、合計で１、２、３、４、５、又は６を数えるアラニン置換だけ、コンセンサス配列（配列番号２）と異なる配列を有してよい。
【００９３】
好ましくは、前記α−ネメルチド部分は、配列番号２のコンセンサス配列に示される配列を有する。
【００９４】
好ましくは、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、α−ネメルチド部分の配列からなり、又は当該配列から本質的になる。当該配列は、α−ネメルチド部分の配列に加えて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０残基を有してよく、好ましくは０である。
【００９５】
ジスルフィド架橋
α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置２及び位置１６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋を含んでよい。α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置９及び位置２０とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋を含んでよい。α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置１５及び位置２６とアラインする位置に位置決めされたＣ残基間のジスルフィド架橋を含んでよい。好ましくは、上述のジスルフィド架橋は全て、ペプチド又はペプチド模倣体中に存在する。ジスルフィド架橋の上述の配置は、例１に示すように、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）の、天然に存在するα−ネメルチドに対応する。例６に示されるように、ジスルフィド架橋の還元は、活性を大きく低下させる。
【００９６】
好ましい配列の特徴
種々の種由来のα−ネメルチド間の配列アラインメント（図３Ｅ参照）、ならびに例５及び例６として示される比較実験に基づいて、特定の位置の特定の残基が、以下で詳述されるように、特に好ましいと考えられる。
【００９７】
配列番号１の位置４及び位置８とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、疎水性であってよく、例えばそれぞれＡ及びＦであってよい。
【００９８】
配列番号１の位置４とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ａ、Ｋ、Ｓ、及びＰからなる群から選択されてよく、好ましくはＡである。
【００９９】
配列番号１の位置５とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ｔ及びＶからなる群から選択されてよく、好ましくはＴである。
【０１００】
配列番号１の位置８とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ｆ、Ｖ、Ｇ、及びＭからなる群から選択されてよく、好ましくはＦである。
【０１０１】
配列番号１の位置１１とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ｌ及びＩからなる群から選択されてよく、好ましくはＬである。
【０１０２】
配列番号１の位置１３とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ｎ及びＫからなる群から選択されてよく、好ましくはＫである。
【０１０３】
配列番号１の位置２５とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ｋ、Ｈ、及びＡからなる群から選択されてよく、好ましくはＫである。
【０１０４】
配列番号１の位置２８とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、Ｐ及びＫからなる群から選択されてよく、好ましくはＰである。
【０１０５】
配列番号１の位置３とアラインする、α−ネメルチド部分の残基は、好ましくはＩである。
【０１０６】
α−ネメルチド部分は、配列番号１又は配列番号３〜９のいずれかに示される配列からなってよく、好ましくは配列番号１（α１）、配列番号３（α２）、又は配列番号６（α５）、最も好ましくは配列番号６（α５）である。
【０１０７】
ペプチド又はペプチド模倣体は、配列番号１又は配列番号３〜９のいずれかに示される配列からなってよく、好ましくは配列番号１（α１）、配列番号３（α２）、又は配列番号６（α５）、最も好ましくは配列番号６（α５）である。
【０１０８】
プロリンヒドロキシル化
例１に示すように、天然Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）α−ネメルチドのプロリンは、翻訳後にヒドロキシプロリンに修飾される。ゆえに、第１の態様のα−ネメルチド部分中の１つ以上のＰ残基は、好ましくはヒドロキシル化されている。
【０１０９】
好ましくは、α−ネメルチド部分は、配列番号１の位置２８とアラインする位置に、配列番号１の位置２９とアラインする位置に、及び／又は配列番号１の位置４とアラインする位置に、ヒドロキシプロリンを含む。最も好ましくは、α−ネメルチド部分は、非ヒドロキシル化プロリン残基を含有しない。
【０１１０】
非天然の特徴
ペプチドの特性を修飾し、かつ向上させるような、ペプチド及びペプチド模倣体に対する種々の修飾は、本明細書中の教示に基づいて当業者によって達成されるので、本発明の範囲内であるとみなされる。以下は、いくつかの好ましい修飾に関するが、多くの他の修飾もまた、本発明の特許請求の範囲内で可能であることが理解される。
【０１１１】
ペプチド又はペプチド模倣体は、修飾されたＣ末端又はＮ末端、例えばアミド化されたＣ末端又はアシル化されたＮ末端を有してよい。
【０１１２】
ペプチド又はペプチド模倣体は、環状骨格を有してよい。
【０１１３】
ペプチド又はペプチド模倣体は、１つ以上の非天然残基を含んでよい。
【０１１４】
ペプチド又はペプチド模倣体は、１つ以上のＤ−アミノ酸残基を含んでよい。
【０１１５】
ペプチド又はペプチド模倣体は、骨格中に１つ以上の非天然結合を含んでよい。
【０１１６】
ペプチド又はペプチド模倣体は、検出可能なマーカー、好ましくはビオチン、蛍光マーカー、又は放射性標識に結合されていてよい。
【０１１７】
ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、天然に存在するあらゆるペプチド配列と比較して、少なくとも１つの差異を含んでよい。好ましくは、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、配列番号１又は配列番号３から９に示される配列のいずれかと比較して、少なくとも１つの差異を含む。
【０１１８】
機能的特徴
第１の態様のペプチド又はペプチド模倣体は、好ましくは選択的に、電位依存性ナトリウムチャネルに結合する特性を有し得る。
【０１１９】
当該ペプチド又はペプチド模倣体は、電位依存性ナトリウムチャネルに持続的な非不活化電流を誘導する特性を有し得る。
【０１２０】
好ましくは、誘導は、インビボモデルにおいて実証される。甲殻類を用いる例２に示される方法論を用いて判定すると、ＥＣ５０は５μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、さらにより好ましくは０．１μＭ未満である。ＥＣ５０の判定は、昆虫又は脊椎動物、例えば魚においてなされてもよい。ＥＣ５０はまた、ブラインシュリンプ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）のアッセイ（例５及び例６参照）におけるブラインシュリンプ死滅効果によって判定されてもよく、そこではＥＣ５０は、１００μＭ未満、好ましくは１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、最も好ましくは０．３μＭ未満であり得る。
【０１２１】
好ましくは、誘導は、卵母細胞において発現される電位依存性ナトリウムチャネル受容体で達成される。パッチクランプ技術を用いて測定すると、ＥＣ５０は、５μＭ未満、より好ましくは０．５μＭ未満、さらにより好ましくは０．０５μＭ未満である。ＥＣ５０は、例３の方法論を用いて判定されてもよい。
【０１２２】
前記電位依存性ナトリウムチャネルは、脊椎動物の電圧依存性ナトリウムチャネルであり得、好ましくはヒト、ラット、又はマウスの、最も好ましくはヒトの電位依存性ナトリウムチャネルである。
【０１２３】
電位依存性ナトリウムチャネルは、ヒトＮａＶ１．５、マウスＮａＶ１．６、ラットＮａＶ１．４、及びラットＮａＶ１．１から選択される脊椎動物の電位依存性ナトリウムチャネルであってよい。
【０１２４】
電位依存性ナトリウムチャネルは、代わりに、好ましくはチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）ＮａＶ１、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＮａＶ１、及びミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）ＮａＶ１から選択される無脊椎動物の電位依存性ナトリウムチャネルであってよい。
【０１２５】
製造方法
第２の態様において、先の請求項のいずれかに記載のペプチド又はペプチド模倣体を製造する方法が提供され：
ａ．第１の態様に従う構造又は配列を有するペプチド又はペプチド模倣体を選択することと；
ｂ．前記ペプチド又はペプチド模倣体をインビトロで合成することと
を含む。
【０１２６】
ペプチド鎖のアセンブリは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、好ましくはＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を用いて、実行され得る。ＳＰＰＳ合成の後に、完全に還元されたペプチドの酸化的折畳みが、好ましくは還元グルタチオン及び酸化グルタチオン（例えば、それぞれ２及び４ｍＭ）の混合物を含有する溶液中で、続く。
【０１２７】
ペプチド鎖のアセンブリはまた、組換え発現によって、好ましくは細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、真菌（例えば酵母）、又は植物中で、実行され得る。酸化的折畳みは、前述の発現系を用いてインビボで、又は上記のようにインビトロでなされ得る。
【０１２８】
トランスジェニック態様
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のペプチドをコードする核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を提供する。
【０１２９】
第４の態様において、プロモータに作動可能に連結された、第３の態様に従う核酸配列を含む発現ベクターが提供される。
【０１３０】
第５の態様において、第３の態様に従う核酸配列又は第４の態様に従うベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０１３１】
第６の態様において、第３の態様に従う核酸配列又は第４の態様に従うベクターを含むトランスジェニック生物が提供される。好ましくは、トランスジェニック生物は、細菌、真菌、又は植物である。第１の態様のペプチドを発現するように操作された植物は、植物を食べて生きる無脊椎動物に対して毒性のあるペプチドを生成するので、有害生物、特に昆虫及び蠕虫に対する耐性を付与することとなる。
【０１３２】
医療用途
第７の態様において、医薬として用いられる、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体が提供される。言い換えれば、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、処置を必要とする対象に投与することを含む、疾患の処置方法が提供される。さらに、医薬の製造における、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供される。
【０１３３】
第８の態様において、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体は、疼痛、神経因性疼痛、糖尿病性疼痛、癌性疼痛、神経痛、神経障害、肢端紅痛症、骨関節炎、気道狭窄に関連する咳及び呼吸器疾患から選択される症状の処置に用いられ得、かつ麻酔薬として用いられ得、又は咳反射を阻止するのに用いられ得る。
【０１３４】
第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体はまた、寄生生物の感染又は侵入、好ましくは蠕虫病又は外部寄生生物による感染もしくは侵入の処置又は予防に用いられ得る。
【０１３５】
蠕虫病は、以下から選択され得る：
ａ）土壌伝染性蠕虫（ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、及びズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、小型条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、ギョウチュウ（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）属種、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、犬回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ）、猫回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｔｉ）が挙げられる）による感染症、
ｂ）回虫による感染症（線虫症）（フィラリア症（バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）感染症）、糸状虫症（回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）感染症）、毛様線虫症（トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）属種感染症）、メジナ虫症（メジナ虫感染症）が挙げられる）、
ｃ）サナダムシによる感染症（条虫症）（エキノコックス症（エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属感染症）、膜様条虫症（膜様条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ）属感染症）、テニア症／嚢虫症（タエニア（Ｔａｅｎｉａ）属感染症）、共尾虫症（多頭条虫（Ｔ．ｍｕｌｔｉｃｅｐｓ）、連節条虫（Ｔ．ｓｅｒｉａｌｉｓ）、Ｔ．グロメラータ（Ｔ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、及びＴ．ブラウニ（Ｔ．ｂｒａｕｎｉ）感染症）が挙げられる）、
ｄ）吸虫による感染症（吸虫症）（両虫症（アムフィストメス（Ａｍｐｈｉｓｔｏｍｅｓ）属感染症）、肝吸虫症（肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）感染症）、筋膜症（カンテツ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）属感染症）、肥大吸虫症（肥大吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ  ｂｕｓｋｉ）感染症）、オピストルキス症（肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）属感染症）、肺吸虫症（パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）属感染症）、住血吸虫症／ビルハルチア病（住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属感染症）が挙げられる）、及び
ｅ）鉤頭動物による感染症（モニリフォルミス（Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）感染症が挙げられる）。
【０１３６】
外部寄生生物の感染又は侵入は、シラミ、例えばケジラミ（陰部のシラミ）又はシラミ寄生症（アタマジラミ）、レルナエオセラ・ブランキアリス（Ｌｅｒｎａｅｏｃｅｒａ  ｂｒａｎｃｈｉａｌｉｓ）感染症（タラ）、リンガタ症（ｌｉｎｇｕａｔｕｌｏｓｉｓ）、ポロケファリッド感染症（ｐｏｒｏｃｅｐｈａｌｉａｓｉｓ）、ノミ、ダニ（ｔｉｃｋｓ）、又はコダニ（ｍｉｔｅ）の感染症、例えば疥癬から選択され得る。
【０１３７】
処置のために、ペプチド又はペプチド模倣体は、適切な組成物中に入れられて、処理されることとなる寄生生物とペプチド又はペプチド模倣体を接触させることで、感染した対象に投与されてよい。予防のために、ペプチド又はペプチド模倣体は、寄生生物に感染する危険性のある対象に、ペプチド又はペプチド模倣体を、前記潜在的寄生生物によって典型的に影響を受ける身体の部分と、又は身体に侵入するのに寄生生物によって典型的に用いられる身体の部分と接触させることで、投与される。
【０１３８】
ペプチド又はペプチド模倣体は、適切なあらゆる様式で、例えば全身的、経腸的、非経口的、又は局所的に、投与され得る。外部寄生生物の処理用の好ましい投与様式は、感染部位、例えば皮膚、粘膜、又は毛髪への局所的なものである。局所投与用のペプチド又はペプチド模倣体は、クリーム、膏薬、粉末、軟膏、ゲル、液体等として製剤化される組成物中に存在してよい。
【０１３９】
言い換えれば、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、処置を必要とする対象に投与することを含む、前述のリストから選択される症状の処置方法、又は前述の使用が提供される。さらに、前述のリストから選択される症状用の医薬の製造における、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用、又は前述の使用が提供される。
【０１４０】
有害生物の防除用途
第９の態様において、特に農業、林業、園芸、芝生管理、及び建物保護での、有害生物防除における、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供される。また、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、有害生物又はその環境に投与することを含む方法も提供される。
【０１４１】
第１０の態様において、殺虫剤、殺軟体動物剤、又は殺ダニ剤としての、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供される。また、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、昆虫、軟体動物、クモ形類動物、又はその環境に投与することを含む方法も提供される。
【０１４２】
第１１の態様において、駆虫剤、例えば殺線虫剤としての、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供される。また、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、蠕虫又はその環境に投与することを含む方法も提供される。
【０１４３】
好ましくは、そのような投与は、ペプチド又はペプチド模倣剤を、様々な物理的形態、例えば餌、スプレー、ゲル、粉末、含浸フィルム、顆粒、又は液体で提供される組成物に製剤化して、当該組成物を、濃縮又は希釈された形態で、問題の有害生物又はその環境、例えば、植物又は樹木、土、種子、貯蔵作物、及び建築材料に、一度に、そして予防的かつ／又は治療的に作用する方法で投与することによって、なされる。前記有害生物として、とりわけ、害虫、病害生物、例えば、ゴキブリ、蚊、及びダニ、ならびに植物の有害生物、例えば、甲虫、イナゴ及びバッタ、鱗翅目、ハエ、半翅目、アザミウマ、アブラムシが挙げられる節足動物、線虫が挙げられ得、それらの全てのライフステージが含まれると常に理解される。
【０１４４】
研究用途
第１２の態様において、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の、イオンチャネル活性の薬理学的もしくは生理学的役割を研究するための、アッセイにおける研究ツールとしての電位依存性ナトリウムチャネル結合リガンドとしての、又はイオンチャネル結合部位を提示するための、マーカー化合物としての使用が提供される。また、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、電位依存性ナトリウムチャネルと接触させることと、結合の程度を判定することとを含む方法も提供される。
【０１４５】
第１３の態様において、電位依存性ナトリウムチャネルの活性の判定を含むアッセイにおける、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供される。また、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、電位依存性ナトリウムチャネルと接触させることと、ナトリウムチャネル活性を判定することとを含む方法も提供される。
【０１４６】
ペプチド又はペプチド模倣体の結合の特異性は、その特定の標的、例えば、サンプル中の、例えば組織切片上の電位依存性ナトリウムチャネルを、インビボイメージングアッセイにおいて位置特定するためのプローブとして、用いられ得る。第１４の態様において、電位依存性ナトリウムチャネルの位置の判定を含むアッセイにおける、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供される。また、第１の態様に従うペプチド又はペプチド模倣体を、電位依存性ナトリウムチャネルを含むサンプルと、ペプチド又はペプチド模倣体が電位依存性ナトリウムチャネルに結合し得る条件下で、接触させることと、続いてペプチド又はペプチド模倣体の位置を判定することとを含む方法も提供される。この用途において、ペプチド又はペプチド模倣体は、検出可能なマーカー、例えば蛍光マーカー又は放射性標識で標識されていることが特に好ましい。
【０１４７】
第１２、第１３、又は第１４の態様のアッセイは、インビトロアッセイ又はインビボアッセイであり得る。
【０１４８】
本発明に関する更なる詳細
本出願において、本発明者らは、紐形動物由来のペプチド毒素の新規なファミリーを開示し、かつその構造及び活性を説明する。リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）の粘液及び表皮中に、ペプチドが発見された。α−ネメルチドと名付けたこの新規ファミリーは、最近入手可能となった一連の紐形動物トランスクリプトームのデータマイニングによって判断されるように、リネウス（Ｌｉｎｅｕｓ）属に限られているようである（Ｒｏｍｉｇｕｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５，２６１−３；Ａｎｄｒａｄｅ  ＳＣＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２０１４，３１，３２０６−１５；Ｗｈｅｌａｎ  ＮＶ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２０１５，６，３３１４−２５）。
【０１４９】
バイオインフォマティクスが、α−ネメルチドの発見の一助となったが、この発見の鍵は、生化学的分析：ペプチドの抽出、ＬＣ−ＭＳを用いた分析、及びＭＡＬＤＩイメージングとの組合せであった。ペプチドミクスの（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｃ）アプローチの使用であったこと、そしてペプチドレベルでの詳細な分析の必要性が、翻訳後修飾の数と共に、そして配列の長さの縮小と共に増大することが明らかである。
【０１５０】
本開示に従えば、α−ネメルチドのファミリーは、少なくとも７つの、３１アミノ酸残基長のペプチドを含む。発見されたペプチドは、阻害性シスチンノット（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｙｓｔｉｎｅ  ｋｎｏｔ；ＩＣＫ）モチーフ内に配置された３つのジスルフィドを含有する。α−１の溶液構造は、Ｎ末端がＣｙｓ２−Ｃｙｓ１６ジスルフィドによって安定化された、コンパクトな折畳みを明らかにしている。Ｃ末端は、よりフレキシブルであるようであり、かつ２つのＨｙｐ残基を含有する。リネウス・ロンギッシウムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｕｍｕｓ）から単離された２つのα−ネメルチド（α−１及びα−２）は、位置８でのＰｈｅからＶａｌへの置換でしか異なっていない；Ｐｈｅは、Ｐｈｅ  ２２及びＴｒｐ  ２８と共に、疎水性パッチの一部である。α−ネメルチドのファミリーにおいて、残基４、８、及び２５は、変異体（４、ＡＫＳＰ；８、ＦＶＧＭ；２５、ＫＨＡ）の主体となっている：これらの位置は全て、分子の同じ側に提示される。これらの構造的変異が、イオンチャネルのタイプ又はサブタイプ間の選択（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を制御することはありそうもなく、本発明では、位置４及び位置８における疎水性残基の重要性が実証される。これらの位置における単一の突然変異は、桁（ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の範囲で異なる活性を付与することが示される。ヒモムシの性質、その吻（場合によっては、スティレットを備える）の使用は、ペプチドのＩＣＫモチーフ及びサイズとあわせて、イモガイ及びその毒素との類似（ｐａｒａｌｌｅｌ）を示唆している。しかしながら、違いは相当ある：分子レベルで、α−１からα−７の配列は、他のあらゆるペプチド又はタンパク質と相同性がない。また、イモガイ毒は、数百から数千もの様々なペプチドの複雑なライブラリを含有する（Ｂｉａｓｓ  Ｄ，Ｖｉｏｌｅｔｔｅ  Ａ，Ｈｕｌｏ  Ｎ，Ｌｉｓａｃｅｋ  Ｆ，Ｆａｖｒｅａｕ  Ｐ  ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋｌｉｎ  Ｒ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２０１５，１４（２），ｐｐ  ６２８−６３８）が、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）は明らかに、ペプチド及びＲＮＡレベルで判断して、２つのα−ネメルチドしか発現していない。同様に、本出願において、アルファネメルチドの存在について分析された他の種もまた、僅か２つ又は３つのペプチドの存在を示した（表２）。
【０１５１】
表２：研究された種におけるα−ネメルチドの存在。
【表１】
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【０１５２】
リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）では、α−１及びα−２は、ＨＰＬＣ−ＵＶによって判断して、類似の量で現れる。このことは、それらが同等に重要であるが、異なる標的に作用することを示唆しているのかもしれない。本明細書中に記載される、ブラインシュリンプにおけるアッセイでの活性は、そのアッセイにおいて、これらの２つのペプチド間で１桁異なっており、このことは、その理論を支持している。興味深いことに、このパターンは、同じアッセイにおいて、他の種について再現される：全てについて、この特定のアッセイにおいて、より強力な一ペプチドが発現されるようである。
【０１５３】
しかしながら、タガヤサンミナシ（Ｃｏｎｕｓ  ｔｅｘｔｉｌｅ）由来の提唱されるペプチド成熟酵素ｔｅｘ−３１に類似する配列が、Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）トランスクリプトームにおいて見出された。Ｔｅｘ−３１は、Ｐ１位置及びＰ２位置において２つの塩基性残基、好ましくはＰ４位置においてロイシンを有するコノトキシンプロペプチドを切断する；その存在が、そしておそらく、成熟α−１ネメルチドのＮ末端側上の類似のプロセシング部位が、可能性のある共通した初期の翻訳後プロセシング経路を示唆している。
【０１５４】
α−１の三次元構造に最もよく一致するのは、ヒト肝臓発現抗菌ペプチド−２、ＬＥＡＰ−２、続いて２つのＩＣＫクモ毒素、ω−ＨＸＴＸ−Ｈｖ１ａ（以前はω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ）及びκ−ＴＲＴＸ−Ｓｃｇ１ａ（以前はＳＧＴｘ１）である。ＬＥＡＰ−２とα−１の骨格類似性が顕著であるが、ＬＥＡＰ−２は、２つのジスルフィドしか含有せず、表面疎水性のパターンは重複しない。ＬＥＡＰ−２の生理学的機能は、その名前に反して明らかでないが、相同なクモ毒素は、電位依存性カルシウムチャネル（ω−ＨＸＴＸ−Ｈｖ１ａ）及び電圧活性化カリウムチャネル（κ−ＴＲＴＸ−Ｓｃｇ１ａ）を標的としている。
【０１５５】
では、ネメルチドの機能及び標的は何であるのか。ネメルチドが餌の捕獲のために、防御のために、又はその両方のために用いられるのかは、明らかでない。だが、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）によって放出される大量の粘液は、（物理的な）脅威によって感作誘発された（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）場合、かなりの量のネメルチドα−１、α−２、及びβ−１を含有することが明らかである；そして、粘液が及ぼす作用は、手のひらでワームを握った場合に経験する皮膚のしびれ感によって、明らかである。
【０１５６】
甲殻類は、紐形動物の周知の餌であり、かつ可能性のある捕食者である。ロブスター（Ｈｏｍａｒｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）及びチチュウカイミドリガニ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ）の双方が、紐形動物化学のインビボでの活性をアッセイするのに用いられてきた。現在の研究では、ネメルチドα−１の活性は、カニについて詳細に特徴付けられており、１μｇ／ｋｇの用量にて即時の神経毒性活性を、そして１０μｇ／ｋｇにて数分以内の死滅を明らかにしている。これは、神経毒Ｂ−ＩＶ（麻痺用量：２．１μｇ／ｋｇ、致死用量：２３μｇ／ｋｇ）（Ｋｅｍ  ＷＲ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６，２５１，４１８４−９２）テトロドトキシン（致死量１０μｇ／ｋｇ）の活性に匹敵し得る。
【０１５７】
ネメルチドα−１は、その神経毒性活性を、ＮａＶチャネルの不活化を遅くすることによって発揮する。定常状態の不活化のα−１誘導変化は、部位３への毒素結合に起因する可能性が高い。多くのα−サソリ毒、クモ毒、及びイソギンチャク毒が、この部位に結合することが知られている；結合して直ぐに、これらはＤＩＶの電圧センサＳ４を、その内向き姿勢又は不活化姿勢でトラップし、これによって、速い不活化に必要とされる構造運動を妨げる（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２，７１）。部位３に結合することができるいくつかの毒素が、海洋生物、主にイソギンチャクから単離されている。α−１の昆虫特異性は、昆虫のＮａＶチャネルＤｍＮａｖ１及びＢｇＮａ１の不活化の完全な阻害によって実証されており、そしてこれはさらに、哺乳動物（Ｎａｖ１．６）と昆虫（ＤｍＮａｖ１）のチャネル間のＥＣ５０値の１００倍（０．８μＭ対８ｎＭ）の差異によって強調される。
【０１５８】
無脊椎動物のＮａＶチャネルについての選択、及び節足動物におけるインビボでの効力は、殺虫剤としての、又は新規な殺虫剤の開発における先駆的な化合物としての、ネメルチドα−１の潜在的な用途を示唆している。殺虫性の先駆体として適していると示唆されているクモ毒素は、胸腔内注射された場合、１０から１００ｐｍｏｌ／ｇの範囲で、即時の神経毒性作用を有する；比較において、１μｇ／ｋｇでのα−１の作用は、約３００フェムトモル／ｇの量に等しい。ネメルチド毒素は、他の門由来の毒素と比較して、数が限られているように思われるが、新規の配列及び構造を表す。当該ネメルチドはそれぞれ、ＮａＶチャネル選択性が異なっている可能性が高い：このことが、α−１及びα−２が粘液中で類似の存在量で存在する理由を説明する。
【０１５９】
本開示に関連する一般的な態様
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含むがそれに限定されないと解釈されるべきである。全ての参考文献が、参照により本明細書に組み込まれる。本開示を、見出し及び小見出しを有する節に配置したのは、単に読み易さを向上させるためだけのことで、いかなる形であれ限定として解釈されるべきでない。特に、分割（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）は、異なる見出し及び小見出しの下にある特徴について、互いの組合せを、いかなる形であれ排除も限定もしない。特許保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ決定される。
【０１６０】
例
以下の例は、限定としてみなされるべきでない。実験の詳細についての更なる情報については、これを読む当業者に、「材料及び方法」と題した別の節で示す。
【０１６１】
例１：ネメルチドの発見
リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）の体を覆う粘液を回収して、凍結乾燥して、ＬＣ−ＭＳに適した溶媒中に再懸濁させて、毒素の化学的性質を調査した。ＴＴＸが粘液中に存在しないことが以前に確立されているので、より高い分子量の化合物に注目した。分析により、デコンボリューションされた（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量（Ｍ＋Ｈ＋）が３３０８．３５、３２６０．４０（ｍｏ）、及び６４１９．００（ａｖ．）である３つの顕著なピークが明らかとなった。続いて、これらの化合物を、ゲル濾過及びＲＰ−ＨＰＬＣの組合せを用いて、μグラム量で単離した。ＭＡＬＤＩイメージングは、ペプチドの存在が表皮及び粘液層に限られることを実証している。１つの標本の中央部を横切る横断切断の結果を、図２Ｃに示す：全てのペプチドが、同じ分布を示している。
【０１６２】
単離されたペプチドを、ヨードアセトアミドを用いて還元かつアルキル化し、これにより分子量は、２つのより小さな化合物については３４８Ｄａ、より大きな化合物については４６４Ｄａ増大した。これらの質量増分は、それぞれ３つ及び４つのジスルフィド結合の存在に対応している。２つのより小さな化合物間の、比較的小さな質量差（Δ４７．９５）とあわせて、これらの結果は、粘液中に２つのクラスのペプチドが存在することを示した。定量的アミノ酸分析は、この指摘を支持した。これに応じてこれらのペプチドをグループ分けして命名した：３ｋＤａペプチドを、それぞれネメルチドα−１及びα−２と呼び、より大きなペプチドをネメルチドβ−１と呼ぶ。αクラスについて、ＭＳによる分析由来の実験質量は、アミノ酸分析由来の正味の組成から計算した質量と３２Ｄａだけ異なった。これは、更なる翻訳後修飾を示唆している。
【０１６３】
別の実験において、トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃを用いて、アルキル化されたペプチドを酵素消化に供して、ＬＣ−ＭＳＭＳ配列決定に適したペプチドフラグメントを生成した。α−１及びα−２の一部のフラグメントは、同一の質量及び保持時間を示し、ペプチド間の相同性が示された。これらのうちの２つ、ｍ／ｚ４６３２＋及び６７９２＋が、同一の１４残基長の配列を明らかにした。他のフラグメントは、ペプチド間で異なった（Δ４７．９５である２つのイオン：α−１のトリプシン７０１２＋フラグメント及びα−２の６７７２＋フラグメントを含んだ）。これらのフラグメントのＭＳＭＳ配列決定は、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、これらのペプチドフラグメントがＰｈｅからＶａｌへの置換によって異なる（Δ−４８．００）ことを示した。全体として、ＭＳＭＳ配列決定は、α−１及びα−２の３１残基のうち、２５残基を明らかにした。β−１については配列決定しなかった。次に、トランスクリプトーム配列決定法に着目して、ペプチドの欠損部分を決定した。
【０１６４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００上の単一標本の体に沿う横方向切開から単離したＲＮＡの組合せプールを用いて、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）のトランスクリプトームを配列決定した。アセンブルしたトランスクリプトームは、８１５９７個のコンティグを含有し、全長は９１，８５１，７４７ｂｐである。ＭＳＭＳによってクエリとして決定した配列を用いるｔＢＬＡＳＴｎ検索は、α−１の全長配列を示唆した。これは、プロリンがヒドロキシル化されていれば、ＭＳデータに対して良好な適合を示す。ゆえに、アミノ酸の正味の組成と、ペプチド又はペプチド模倣体の分子量との間の３２Ｄａの差は、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の存在によって説明され得る。また、ネメルチドβ−１の配列を、トランスクリプトームによって決定することができた。ネメルチドβ−１の配列は、以前にＢｌｕｍｅｎｔｈａｌ（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２５６，９０６３−７）によって報告されたように、神経毒ＢＩＶに相同である：ペプチドは、５７残基及び５５残基、４つのジスルフィド結合及び２つのヒドロキシプロリンをそれぞれ含む。ネメルチドα−２の配列を、本発明者らのトランスクリプトームから最終的に決定することはできなかったが、Ｗｈｅｌａｎ及び共同研究者ら（Ｗｈｅｌａｎ  ＮＶ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２０１４，６，３３１４−２５）によって最近公開されたトランスクリプトームにおいて同定することができた。
【０１６５】
これまでに配列決定された１７個の紐形動物トランスクリプトームのＢＬＡＳＴ検索は、α−ネメルチド及びβ−ネメルチドの双方との相同体を明らかにした。同定された配列の数は、限られている：７つの完全なα−ネメルチド配列しか同定されなかった。特に、αクラスの毒素は、Ｌｉｎｅａｎ系統（全てのサンプリングした種における代表であるリネウス（Ｌｉｎｅｕｓ）属及びリセリエルス（Ｒｉｓｅｒｉｅｌｌｕｓ）属）において、非常によく保存されているようである。α−ネメルチドに属する部分配列もまた、Ｒ．オクルトゥス（Ｒ．ｏｃｃｕｌｔｕｓ）のトランスクリプトーム中に見出され得る。α毒素中に見出された小さな差異は、大部分がＮ末端部分に存在し、位置４（残基：ＡＫＳＰ）及び位置８（残基：ＦＶＧＭ）における変異が最も高かった。位置２５もまた、変異をいくらか有する（残基：ＫＨＡ）。おそらく部分的なα−８（Ｒ．オクルトゥス（Ｒ．ｏｃｃｕｌｔｕｓ））を外した場合、配列の７７％が重複する。
【０１６６】
他のいかなるデータベースにおいても、α−１配列又はα−２配列との相同体は見出されなかった。次に、ネメルチドα−１をプロトタイプとして用いて、この新規のクラスのペプチドを詳細に特徴付けることにした。
【０１６７】
例２：ネメルチドα−１は、甲殻類に対する強力な毒素である
手元にα−ネメルチドの配列があったので、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に着目して、生物学的かつ構造的な特徴付けに十分な材料を用意した。ネメルチドα−１を、ＦＭＯＣ化学を用いて、ＨＭＰＡ樹脂上にアセンブルした。手動での、そしてマイクロ波補助によるＳＰＰＳの組合せを用いて、粗ペプチドの良好な収率をもたらした（９２％）。修飾されたＰｒｏ残基を有する、そして有していない、還元されたペプチド、及び還元かつアルキル化されたペプチドの保持時間及びＭＳ／ＭＳＭＳスペクトルを比較することによって、２つのＨｙｐ残基の存在が明瞭に確認された。
【０１６８】
図４Ａに示すように、２ｍＭ還元グルタチオン、０．４ｍＭ酸化グルタチオン、０．１Ｍ重炭酸水素アンモニウム、及び２０％イソプロパノール中での酸化的折畳みに、粗ペプチドを直接供した。ペプチドの最終収率は９％であった。合成及び天然のα−１を混合して、２つの異なる分離系に同時注入した：同一の保持時間及び質量は、これらのペプチドの一致性（ｃｏｎｆｏｒｍｉｔｙ）を実証している。
【０１６９】
紐形動物粘液の、甲殻類に及ぼす作用は、十分に実証されている。イソガニ（ｓｈｏｒｅ  ｃｒａｂ）が、インビボでの生物学的活性を評価するモデルシステムとして用いられてきた。ネメルチドα−１の活性濃度で注射した場合、四肢の震えが１から２分以内に見られた。これに続いて筋緊張亢進（ｈｙｐｅｒｔｏｎｕｓ）があり、爪と脚が体の内側に引っ張られて、カニは前方に傾いた。この時点から、カニは麻痺状態のままであった。２０から３０分後に筋緊張亢進が解放されたが、麻痺が残った。作用を示したあらゆる用量について、回復は観察され得なかった：用量が高いほど致命的であることが証明されたが、用量が低いと、後発性の部分麻痺が導かれた。これは、最も低い用量（１μｇ／ｋｇ）が作用を引き起こした場合であったが、高用量の注射（５から５０μｇ／ｋｇ）では、上記のような迅速な応答が観察された。
【０１７０】
例３：ネメルチドα−１は、脊椎動物Ｎａｖと比較して、無脊椎動物ＮａＶを優先的に標的とする
ネメルチドα−１の、５つの脊椎動物及び３つの無脊椎動物の電位依存性ナトリウムチャネルアイソフォーム（Ｎａｖ）に及ぼす活性について、調査した。哺乳類Ｎａｖについて、ネメルチドα−１の濃度が６μＭであると、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、及びＮａｖ１．６の不活化を有意に遅延させた（図５Ａ）。Ｎａｖ１．８では作用が見られなかった。定常状態の活性化曲線及び不活化曲線を構築して、毒素結合して直ぐのＮａｖチャネルの調節を特徴付けた。Ｎａｖ１．１チャネルについて、ゲート制御の動態に大きな変化は観察されなかった。Ｎａｖ１．４についての活性化の中点は、大きくシフトしなかったが、不活化のＶ１／２は、対照における−３８．１±０．２ｍＶから、α−１の存在下で、−４８．６±０．４ｍＶにシフトした。Ｎａｖ１．６について、活性化のＶ１／２値は、対照において−２０．８±０．１ｍＶであり、６μＭのα−１の投与後では−１７．３±０．３ｍＶであった。同様に、不活化のＶ１／２は、対照及び毒素条件において、それぞれ−５３．６±０．５ｍＶから−４９．８±０．２ｍＶにシフトした。Ｎａｖ１．５チャネルの活性化曲線及び不活化曲線の双方が変化した。活性化の中点は、対照における−４２．４±０．１ｍＶから、毒素を投与した後に−３６．３±０．１ｍＶにシフトしたが、不活化曲線の値については、対照において−６２．２±０．２ｍＶが、そして毒素の存在下で５０．６±０．１ｍＶが観察された。Ｎａｖ１．６チャネルに及ぼすα−１誘導調節作用の濃度依存性を評価するために、濃度−応答曲線を構築した（図５Ｂ）。ＥＣ５０値は、０．８±０．１μＭと判定された。
【０１７１】
α−１は、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（ＢｇＮａＶ１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＤｍＮａＶ１）、及びミツバチヘギイタダニ（Ｖｅｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（ＶｄＮａＶ１）の、無脊椎動物ＮａＶチャネルの不活化に及ぼす重大な作用を示した（図６）。１μＭでは、α−１は、不活化を完全に阻害し、非不活化電流の持続をもたらした。ＢｇＮａｖ１チャネルを用いて、α−１活性の機構をさらに特徴付けた。α−１は、濃度依存的に作用し、ＥＣ５０値は８．６±２．９ｎＭである（図６）。
【０１７２】
活性の有意な変化は認められなかった：Ｖ１／２値は、対照において−２９．１±２．２ｍＶであり、１０ｎＭ  α−１の投与後で−３２．５±３．２ｍＶであると判定された（図６）。不活化曲線について、Ｖ１／２は、対照における−６０．４±０．６ｍＶから、１０ｎＭ  α−１による−５４．５±１．６ｍＶにそれぞれシフトした。α−１は、不活化からの回復を有意に増強した。τ値は、対照及び１０ｎＭ  α−１の投与後において、それぞれ１１．６±０．４ｍｓ及び３．８±０．５ｍｓをもたらした（図６）。阻害の状態依存性を調査するために、以下のプロトコルを用いた。対照として、一連の脱分極パルスを、ＢｇＮａＶチャネルを発現する卵母細胞に加えた。その後、１０ｎＭ  α−１を加えて、パルス化を２分間実行しなかった。次に、同様の一連のパルスを実行した。２分のインキュベーション後に強い不活化の遅延が観察された。これは、チャネルとの毒素相互作用には開状態（ｏｐｅｎ  ｓｔａｔｅ）が必要とされないことを示している（図６）。図６は、５０ｍｓ脱分極によって喚起された、対照における、そして１０ｎＭ  α−１の投与後の、−９０ｍＶから−３０ｍＶへの電流追跡を示す。ゲート制御のチャネル動態の毒素調節後の、ナトリウム流入の大量の増大が認められ得る（図６）。
【０１７３】
例４：α−ネメルチドが、新しい毒素ファミリーを定義する
溶液ＮＭＲを用いて、α−１の三次元構造を決定した。標準的な方法（Ｗｕｔｒｉｃｈ  Ｋ，タンパク質及び核酸のＮＭＲ（ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ），１９８６，Ｗｉｌｅｙ）を用いて、同核及び異核の二次元スペクトルを、連続ピーク割当て（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｐｅａｋ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）用に収集した。ＴＯＣＳＹスペクトル及びＮＯＥＳＹスペクトルが補足情報として見出される。全体として、スペクトルは良好な品質であり、シグナルが十分に分散して、明確な構造を示した。プロトン間距離及び二面角拘束の決定後、構造を計算して、水素結合を、温度勾配実験から同定した。
【０１７４】
図７Ａ及び図７Ｂは、ネメルチドα−１の２０個の最良の構造のオーバーレイ、及びジスルフィド結合を含むリボン表現を示す。当該構造は、分子のコアに位置決めされた３つのジスルフィドの周りで、コンパクトな折畳みを構成している。ジスルフィドは、Ｃｙｓ２〜Ｃｙｓ１６、Ｃｙｓ９〜２０、及びＣｙｓ１５〜２６の連結により、阻害性シスチンノット（ＩＣＫ）モチーフにインターロッキングされている。システイン間の配列ループが、分子の表面に露出されている。ＣｙｓＩＩとＣｙｓＩＩＩ間のループ中の短いαヘリックスが、二次構造の唯一の例である。当該構造は、Ｎ末端から明確に定義され、Ｃ末端はよりフレキシブルである。互いに近接した芳香族残基Ｆ８、Ｗ２２、及びＦ２４を含む疎水性パッチを認めることができた。ＮＭＲ統計値を表１に要約する（図８）。
【０１７５】
ＤＡＬＩサーバ（Ｈｏｌｍ  Ｌ，Ｒｏｓｅｎｓｔｒｏｍ，Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０，３８，Ｗ５４５−９）を介した、タンパク質データバンクに対するα−１の溶液ＮＭＲ構造の構造比較を実行した。Ｚスコア（Ｚ：３．７、ｒｍｓｄ：１．１、２１％の配列同一性）について最も近い一致は、ヒト肝臓発現抗菌ペプチド２（ＬＥＡＰ−２）であり、クモ毒素ω−ＨＸＴＸ−Ｈｖ１ａ  Ｚ３．４（ｒｍｓｄ：０．８、３０％の配列同一性）、及びκ−ＴＲＴＸ−Ｓｃｇ１ａ  Ｚ：３．３（ｒｍｓｄ：１．６、２０％の配列同一性）が続く。
【０１７６】
例５：複数のアルファ−ネメルチドペプチドの、甲殻類に対する相対毒性
アルファ−ネメルチドを、上記の例２に記載するように、又は下記の材料及び方法の節に記載するように、２−クロロトリチル樹脂上での手動合成によって調製した。イソガニを用いたネメルチドα−１の強力な毒性を実証して、更なる実験により、ブラインシュリンプ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）バイオアッセイにおけるネメルチドα−１及び他の５種のα−ネメルチドペプチドの毒性を評価した。ブラインシュリンプアッセイは、毒性アッセイとして一般に用いられているが、特に、本研究において、甲殻類のモデルシステムとして適している。第１ラウンドの実験において、ネメルチドα−１、α−２、α−５、及びα−６を評価した。図９に見られるように、ネメルチドα−５は、α−１よりもさらに強力であった。ネメルチドα−２及びα−６は、効力が僅かに弱かったが、依然として甲殻類に対する毒性が強かった。
【０１７７】
ネメルチドα−１及びα−５のＩＣ５０は、１μＭ未満であるのに対し、ネメルチドα−２及びα−６のＩＣ５０は、１桁高い。
【０１７８】
第２ラウンドの実験において、ネメルチドα−１、α−３、及びα−４を評価した。図１０に見られるように、ネメルチドα−４の活性は、α−１と同等であった。ネメルチドα−３は、効力がより低いことを示したが、依然として高い毒性を示す。
【０１７９】
例６：アルファ−ネメルチドペプチドの構造−活性の解明
ブラインシュリンプアッセイ（上記の例５参照）において試験した天然のペプチドの配列は、位置４、位置８、及び位置２５にて異なる（図３Ｅ参照）。ブラインシュリンプアッセイにおいて最も活性のあるペプチドは、ネメルチドα−１、α−４、及びα−５であった。これらはそれぞれ、位置８にＰｈｅを、そして位置４に小さな残基（Ａｌａ又はＳｅｒ）を有する。より低い活性を示すペプチドについて、ネメルチドα−２は、位置４に小さなＡｌａ残基を有するが、位置８にてＰｈｅを欠く；ネメルチドα−３は、位置４に大きな、正に帯電したＬｙｓを有し、そしてまた位置８にてＰｈｅを欠く；そしてネメルチドα−６もまた、位置４において大きな、正に帯電したＬｙｓを有するが、位置８にＰｈｅを有する。
【０１８０】
評価した全てのペプチドに共通するのは、位置２５のＬｙｓ又はＨｉｓであり、これは、この部分が、少なくとも甲殻類の毒性にとって、あまり重要でないかもしれないことを示している。
【０１８１】
構造−活性関係をさらに調べるために、ネメルチドα−１を、これらの位置にてＡｌａで突然変異させた。この目的のために、固相ペプチド合成を用いて、２つの全長ペプチドを調製し、位置３にて疎水性アミノ酸Ｉｌｅを、そして位置８にてＰｈｅをＡｌａで置換した。図１１に見られるように、Ｎ末端に疎水性残基があると、毒性に直接関係するようである。この特徴を欠いている突然変異体Ｉ３Ａ及びＦ８Ａは、活性が、天然のネメルチドα−１よりも１００倍超低く、そしてブラインシュリンプアッセイにおいて本質的に不活性である。
【０１８２】
また、変異体Ｔ５Ａ及びＳ７Ａを調製した。これらは双方とも、小さな残基（それぞれＴｈｒ、Ｓｅｒ）がＡｌａによって置換されていた。これらの突然変異体は、ネメルチドα−１よりも約１０倍低い活性を示したが、活性があった。
【０１８３】
アルファ−ネメルチドの、毒性にとって重要な位置及び残基を実証して、更なる実験で、折り畳まれたペプチド及び折り畳まれていないペプチドを比較した。ネメルチドα−３及びα−４を、ジチオトレイトールを用いて還元して、折り畳まれていないペプチドを生成した。実験バージョンは、誤って折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、そしておそらくは少量の、正しく折り畳まれたペプチドの混合物を含むであろう。それらの活性を、ブラインシュリンプアッセイにおいて、天然の折畳みネメルチドα−１に対して評価した。図１２に見られるように、天然の折畳みの欠如は、１０から１００倍低い活性をもたらした。
【０１８４】
材料及び方法
リネウス・ロンギッシウムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｕｍｕｓ）の収集。スウェーデンが、特許請求した本発明に組み込まれる生物学的材料の起源国である。Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）の生きた標本を、スウェーデンの西海岸（スウェーデン、Ｔｊａｒｎｏ、Ｓｖｅｎ  Ｌｏｖｅｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ近くのＫｏｓｔｅｒｆｊｏｒｄ、深さ３５ｍ）のスウェーデン領海内で収集して、Ｔｊａｒｎｏ  Ｌｏｖｅｎ  ＣｅｎｔｅｒのＭａｌｉｎ  Ｓｔｒａｎｄ博士によって同定された。海水を含有する小さな容器内に標本を置いて、動物をガラス棒で穏やかに撹拌することによって、粘液を収集した。次に、粘液を収集して、凍結乾燥した。一標本を切断して破片にし、これを液体窒素中で急速凍結するか、ＲＮＡ−ｌａｔｅｒ溶液中に入れた。急速凍結サンプルは、−８０℃にて保存した。ＲＮＡ−ｌａｔｅｒ保存サンプルは、４℃にて一晩保存した後、更なる処理まで−２０℃にて保存した。
【０１８５】
ペプチドの単離。一収集物由来の凍結乾燥粘液を、１２．５ｍｌの水中３０％アセトニトリル（ＡｃＮ）及び０．１％ギ酸（ＦＡ）中に溶解した。２．５ｍｌのアリコートを、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ；ＰＤ−１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。高分子量の溶出液を収集して凍結乾燥してから、水中１０％ＡｃＮ、０．１％ＦＡ中に再溶解して、ＵＶ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０システムを用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（５μ  Ｃ１８  ３００Å、２５０ｘ４．６ｍｍ）上でＲＰ−ＨＰＬＣに供した。勾配は、２５分にわたる、５％ＡｃＮ、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から５５％ＡｃＮに及んだ。３つの主要なペプチドを、ウプサラ大学生化学部アミノ酸分析センター（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）での定量的アミノ酸分析に供した。
【０１８６】
先で報告したように、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を用いて、ペプチドを還元かつアルキル化した。別の実験において、アルキル化したペプチドを、ＳＥＣを用いて脱塩して、トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃで消化してから、ＭＳ配列決定を行った。要するに、乾燥した、還元かつアルキル化されたペプチドを、４μｇ／ｍｌの酵素を含有する５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶液中に溶解した。溶液を３７℃にて一晩インキュベートしてから、ＬＣ−ＭＳ分析及びＬＳ−ＭＳＭＳ分析を行った。
【０１８７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳＭＳ。ＵＰＬＣ−ＱＴｏＦナノスプレーＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ，ＱＴｏＦ  Ｍｉｃｒｏ；７５μｍ×２５０ｍｍ  １．７μｍ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８）を用いて、ペプチドを分析した。ＬＣ勾配は、０．３００μｌ／分の流量にて５０分にわたって、１％から９０％のＡｃＮ（０．１％ＦＡ）に及んだ。検出を陽イオンモードで行って、ｍ／ｚ  ２００〜２０００の間でデータを収集した。質量分析計を、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ．４．１の下で操作した。データ指向分析（ｄａｔａ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＤＤＡ）をＭＳＭＳに用いた。調査スキャンウインドウを２００〜２５００ｍ／ｚに設定し、そしてＭＳＭＳスキャンを５０〜２０００ｍ／ｚに設定した。衝突エネルギープロフィールは、２５から７０Ｖに及んだ。
【０１８８】
総ＲＮＡの抽出、及び転写データの生成。Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、急速凍結サンプル、及びＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）中に保存したサンプルの双方から、総ＲＮＡを抽出した。組み合わせた総ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００ベースのＲＮＡ−ｓｅｑペアエンド分析のためにＭａｃｒｏｇｅｎ（韓国）に送って、ＭａｃｒｏｇｅｎがＴｒｉｎｉｔｙ（ｖ  ２０１１−１１−２６）を用いてアセンブルした。
【０１８９】
アセンブルしたトランスクリプトームは、ＥＭＢＯＳＳ  ｇｅｔｏｒｆツールを、グラフィックユーザインターフェースｅＢｉｏＸ（ｖ．１．５．１）に利用されるように用いて、タンパク質配列に翻訳し、又はＵｎｉｐｒｏ  ｕＧＥＮＥ（ｖ．１．１４．０）の、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ＋のインプリメンテーションによる、ローカルヌクレオチドＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ＋データベースの整備のために、翻訳した。配列決定したトリプシン／キモトリプシンペプチドを、ローカルＬ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）トランスクリプトームデータベースにおけるｔＢＬＡＳＴｎ又はＢＬＡＳＴｐ  ＢＬＡＳＴ＋検索のクエリとして用いて、配列を確認して完了した。
【０１９０】
α−１、α−２、及びβ−１と注釈を付けた配列を、ｐｕｂｌｉｃ  ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔｉｃデータベース（ＮＣＢＩ、ＵｎｉＰｒｏｔ）及び専門のデータベースＣｏｎｏｓｅｒｖｅｒ及びＡｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒに対してブラストした。後者の２つのデータベースは、それぞれイモガイ（Ｃｏｎｕｓ）属種及びクモ形類動物由来の毒素様ペプチドに焦点を当てている。ｃｏｎｏｓｅｒｖｅｒ由来のＣｏｎｏＰｒｅｃツールを用いて、完全な前駆体配列を、Ｃｏｎｏｓｅｒｖｅｒ基準に従って予測かつ分類した。
【０１９１】
紐形動物（Ｎｅｍｅｒｔｅａ）門種データ由来の公開されているトランスクリプトームデータを、ｆｔｐ：／／ｐｏｐｐｈｙｌ．ｕｎｉｖ−ｍｏｎｔｐ２．ｆｒ／ｃｏｎｔｉｇｓ／（リネウス・ラクテウス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｌ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）、Ｌ．シュードラクテウス（Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｌａｃｔｅｕｓ）、Ｌ．ルベル（Ｌ．ｒｕｂｅｒ）、及びミドリヒモムシ（Ｌ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ））（Ｒｏｍｉｇｕｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５，２６１−３）；ｈｔｔｐ：／／ｆｉｇｓｈａｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／Ｎｅｍｅｒｔｅａｎ＿Ｔｒｉｎｏｔａｔｅ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ＿ｒｅｐｏｒｔｓ／１２０３５８０（２０１５年１０月１４日にアクセスした）（ケファロツリックス・ホンコンエンシス（Ｃｅｐｈａｌｏｔｈｒｉｘ  ｈｏｎｇｋｏｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ホソヒモムシ（Ｃｅｐｈａｌｏｔｈｒｉｘ  ｌｉｎｅａｒｉｓ）、オロチヒモムシ（Ｃｅｒｅｂｒａｔｕｌｕｓ  ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ）、リネウス・ラクテウス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、リネウス・ロンギッシムス（Ｌｉｎｅｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）、リネウス・ルベル（Ｌｉｎｅｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、マラコブデラ・グロッサ（Ｍａｌａｃｏｂｄｅｌｌａ  ｇｒｏｓｓａ）、オナンドヒモムシ（Ｐａｒａｎｅｍｅｒｔｅｓ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）、及びタブラヌス・ポリモルフス（Ｔａｂｕｌａｎｕｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ））（Ｗｈｅｌａｎ  ＮＶ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２０１５，６，３３１４−２５）からダウンロードした。タブラヌス・プンクタートゥス（Ｔａｂｕｌａｎｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、カリノーマ・ハマナコ（Ｃａｒｉｎｏｍａ  ｈａｍａｎａｋｏ）、Ｃ．ホンコンエンシス（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｉｅｎｓｉｓ）、イイジマヒモムシ（Ｈｕｂｒｅｃｈｔｅｌｌａ  ｉｊｉｍａｉ）、バセオディスクス・ユニコロル（Ｂａｓｅｏｄｉｓｃｕｓ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、オロチヒモムシ（Ｃ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ）、リセリエルス・オクルトゥス（Ｒｉｓｅｒｉｅｌｌｕｓ  ｏｃｃｕｌｔｕｓ）、アルゴネメルテス・アウストラリエンシス（Ａｒｇｏｎｅｍｅｒｔｅｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｍ．グロッサ（Ｍ．ｇｒｏｓｓａ）、ニッポネメルテス（Ｎｉｐｐｏｎｅｍｅｒｔｅｓ）属種、パラネメルテス・ペレグリン（Ｐａｒａｎｅｍｅｒｔｅｓ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）、及びＰ．ビーベイ（Ｐ．ｂｅｅｂｅｉ）のアセンブルされたトランスクリプトームは、Ａｎｄｒａｄｅ（Ａｎｄｒａｄｅ  ＳＣＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２０１４，３１，３２０６−１５）の好意によって提供された。全ての配列を、単一のｆａｓｔａファイル内に組み合わせて、結合データベースを、ＢＬＡＳＴ＋及びｆｕｚｚ−ｐｒｏ／ｔｒａｎを用いてマイニングした。
【０１９２】
ＭＡＬＤＩイメージング。クリオスタット−ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、凍結したＬ．ロンギッシムス（Ｌ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ）組織を、１４μｍの厚さに切断して、導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）ガラススライド（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）上に融解マウント（ｔｈａｗ−ｍｏｕｎｔ）して、−８０℃にて保存した。切片を、窒素流下で穏やかに乾燥させて、室温にて１５分間乾燥させた後、フォトスキャナ（Ｅｐｓｏｎ  ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  Ｖ５００）を用いて光学的に画像化した。次に、自動噴霧器（ＴＭ−Ｓｐｒａｙｅｒ；ＨＴＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｒｂｏｒｏ，ＮＣ）を用いて、サンプルを２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）（５０％ＡｃＮ、０．２％ＴＦＡ中３５ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。陽イオンモードのＳｍａｒｔｂｅａｍ  ＩＩ  ２ｋＨｚレーザを備えたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）質量分析計を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ実験を実行した。レーザ出力を、各ランの開始時にて最適化してから、ＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ実験の間、一定に保持した。この系の構成の設定におけるペプチドの質量の確立のために、精製したペプチドα−１、α−２、及びβ−１を、インサイチュ基準として切片の１つの上にスポットした。
【０１９３】
ペプチド合成。ネメルチドα−１は、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて、ＴｅｎｔａＧｅｌ  ＸＶ  ＨＭＰＡ樹脂（０．２１ｍｍｏｌ／ｇ）上に０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。最初の４つのＣ末端アミノ酸のカップリングを、手動で行った。Ｌｉｂｅｒｔｙ１マイクロ波ペプチドシンセサイザ（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＮＣ）上のマイクロ波補助ＳＰＰＳを用いて、残留残渣をアセンブルした。Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（残基１２及び残基１３）を、シュードプロリンジペプチドとして導入して、ペプチド鎖の凝集を防ぎ、そして手動でカップリングした。樹脂の高い膨潤特性のために、０．２５ｍｍｏｌの試薬スケール（２０倍過剰）を用いて、樹脂の完全な被覆を確実にした。４倍過剰の試薬を用いるが、樹脂を覆うように容量を調整して合成を繰り返して、０．１ｍｍｏｌのペプチドを樹脂上に得た。最終的なＦｍｏｃ脱保護の後に、ペプチドを切断して、側鎖の保護基を、９５％ＴＦＡ／２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／２．５％Ｈ２Ｏ（２時間、室温）の混合物を用いて、除去した。ＴＦＡをＮ２流下で除去して、ペプチドを低温ジエチルエーテルで沈殿させて、５０％ＡｃＮ／０．１％ＴＦＡによる液体−液体抽出によって収集した。水層を凍結乾燥した。
【０１９４】
粗ペプチドを、２０％イソプロパノールを含有する０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ  ８．５）中のＧＳＨ：ＧＳＳＧ  ２ｍＭ：０．４ｍＭ中で酸化的折畳みに供した。折り畳んだ混合物を、６％イソプロパノールの最終濃度に希釈して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０×１０ｍｍ  ５μ）を、５％ＡｃＮ、０．０５％から９７％ＴＦＡの４５分での勾配により、４ｍｌ／ｓの流量にて用いるＲＰ−ＨＰＬＣ−ＵＶを用いて、ペプチド又はペプチド模倣体を精製した。折り畳まれて精製されたペプチドのアリコートを、ＬＣ−ＭＳに天然のα−１と同時注入して、合成ペプチドと天然ペプチド間の一致性を証明した。
【０１９５】
ペプチドα−２からα−６及びアラニン突然変異体を、ＦＭＯＣベースのＳＰＰＳを用いて、ＨＭＰＡ又は２−クロロトリチル樹脂上に、類似の方法で合成した。一部のペプチド（例えば、α−２及びアラニン突然変異体）の合成を、手動で、そしてジペプチドを用いずに、アセンブルした。イソプロパノールの代わりにＤＭＳＯを含めて、折畳みプロトコルを最適化した。折畳み混合物のクロマトグラフィプロフィールは、ネメルチドアルファ−１のものと類似しており、折畳み混合物中の最後のピークとして溶出する、顕著な鋭いピークを含んだ。このピークの収率は、ＨＰＬＣ−ＵＶで判断して、約５０〜６０％であった。これらの後期溶出ピークは、正しいＩＣＫ足場、及び天然の折畳みを有すると考えられた。アルファ−ネメルチド１及び２の他に、天然ペプチド及び合成ペプチドの同時注入に参照物質を利用しなかったが、天然の折畳みは、ペプチドの強力な活性によって裏付けられた。
【０１９６】
ＮＭＲ構造決定。ＮＭＲ分析のために、合成したα−１をＨ２Ｏ中１０％Ｄ２Ｏ中に溶解して、冷凍プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００ＭＨｚ分光計上でデータを収集した。２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−スルホナート（ＤＳＳ）を加えて、内部標準（０．０ｐｐｍ）として用いた。２次元スペクトル（すなわち、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、１３ＣＨＳＱＣ、１５ＮＨＳＱＣ）を２９８Ｋにて記録した。水素結合の予測に用いる温度係数を確立するために、ＴＯＣＳＹスペクトルを、５Ｋ増分する５つの温度２８８〜３０８にて収集した。
【０１９７】
ＮＭＲスペクトルを、先に記載したように、ＣＡＲＡに割り当てた。手短に言えば、ＣＹＡＮＡ  ３．０を用いて、ＮＯＥカップリングを自動的に割り当てて、距離制限を生成して、割り当てて積分したピークから予備構造を計算した。ＣＮＳを用いて、水分子に関する構造を洗練（ｒｅｆｉｎｅ）した。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて、全体エネルギーが最も低い５０個の構造を評価して、スコアが最も低く、かつ共有結合の幾何学的配置が良好な２０個の構造を選択した。ＭＯＬＭＯＬを用いて、最初のシステイン残基と最後のシステイン残基との間の残基全体にわたって、原子ＲＭＳＤＣを計算した。図をＰｙＭＯＬで作成した。タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ；ＰＤＢ）中の構造に対するＮＭＲ構造を、配列類似性に関係なく、関連する構造と比較するために、Ｄａｌｉサーバを用いた。デフォルト設定を用いた。
【０１９８】
チチュウカイミドリガニ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ）アッセイ。イソガニ（２０から５０ｇ）の右側部上の第１及び第２の歩行脚の間の頭胸甲中に、対照（濾過滅菌海水５００μｌ）、又は濾過滅菌海水中に溶解したネメルチドα−１を注射した。用量は、５００μｌの最大量中０．１から５０μｇ／ｋｇに及んだ。カニを、海水で満たした容器内に入れて観察した。全ての注射を二反復で行った。
【０１９９】
クセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）属卵母細胞における異種発現。ＮａＶチャネルをコードする相補的ＤＮＡを、対応するベクター中にサブクローニングした：α−サブユニットｒＮａＶ１．１／ｐＬＣＴ１（ＮｏｔＩ）、ｒＮａＶ１．４／ｐＵＩ−２（ＮｏｔＩ）、ｈＮａＶ１．５／ｐｃＤＮＡ３．１（ＸｂａＩ）、ｍＮａＶ１．６／ｐＬＣＴ（ＮｏｔＩ）、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）ＢｇＮａＶ１．１／ｐＧＨ１９（ＮｏｔＩ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＤｍＮａＶ１、ミツバチヘギイタダニ（Ｖｅｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）ＶｄＮａＶ１、ならびに対応するβサブユニットｒβ１／ｐＳＰ６４Ｔ（ＥｃｏＲＩ）及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＴｉｐＥ／ｐＧＨ１９（ＮｏｔＩ）。線形化したプラスミド（各制限酵素を括弧内に示している）を、Ｔ７（ｒＮａＶ１．１、ｒＮａＶ１．４、ｍＮａＶ１．６、ＢｇＮａＶ１．１、ＴｉｐＥについて）又はＳＰ６（ｈＮａＶ１．５及びｒβ１について）ｍＭＥＳＳＡＧＥ−ｍＭＡＣＨＩＮＥ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて転写した。麻酔した雌アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）からの、ステージＶ〜ＶＩの卵母細胞の採取は、以前に記載されている（２８）。卵母細胞に、１から３ｎｇ／ｎｌの濃度の５０から７０ｎｌのｃＲＮＡを、マイクロインジェクタ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）を用いて注射した。ＮａＣｌ、９６ｍＭ；ＫＣｌ、２ｍＭ；ＣａＣｌ２、１．８ｍＭ；ＭｇＣｌ２、２ｍＭ、及びＨＥＰＥＳ、５  ｍＭ（ｐＨ７．４）を含有し、５０ｍｇ／ｌ硫酸ゲンタマイシン及び０．５ｍＭテオフィリンを補充したＮＤ９６溶液中で、卵母細胞をインキュベートした。卵母細胞を、ＮａＶの十分な発現が達成されるまで、１６℃にて１から５日間保存した。
【０２００】
電気生理学。ｐＣｌａｍｐデータ取得システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって制御されるＧｅｎｅＣｌａｍｐ  ５００増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いる２電極電圧クランプ技術によって、卵母細胞由来の細胞全体の電流を、室温（１８から２２℃）にて記録した。卵母細胞を、ＮＤ９６溶液を含有する浴槽内に入れた。電圧及び電流電極を、３Ｍ  ＫＣｌで満たして、双方の電極の抵抗を、０．７ＭΩから１．５ＭΩの間に維持した。誘発した電流を２０ｋＨｚにてサンプリングして、４極ローパスベッセルフィルタを用いて２ｋＨｚにてフィルタリングした。浴槽接地電極間の電圧降下の影響を排除するために、浴槽電位を、２電極浴槽クランプによって能動的に制御した。リークサブトラクションを、−Ｐ／４プロトコルを用いて実行した。−９０ｍＶの保持電位から開始して、制御条件において、ＮａＶサブタイプの最大活性化に相当する電圧までの１００ｍｓの脱分極によって、細胞全体の電流追跡を５秒ごとに誘発した。様々な毒素濃度を浴槽溶液に直接加えることによって、濃度−応答曲線を構築した。ＮａＶ遮断のパーセンテージを、加えた濃度の対数に対してプロットして、ヒルの式：ｙ＝１００／［１＋（ＩＣ５０／［毒素］）ｈ］と適合させた（式中、ｙは、毒素誘導作用の大きさであり、ＩＣ５０は、最大有効性の半分の毒素濃度であり、［毒素］は、毒素濃度であり、ｈは、ヒル係数である）。活性化の電圧依存性に及ぼす影響を調べるために、−９０ｍＶの保持電位から６５ｍＶに５ｍＶ増分する１００ｍｓの脱分極によって、電流追跡を誘導した。定常状態の不活化プロセスに及ぼす影響を調べるために、卵母細胞を、標準的な２段階プロトコルを用いて脱分極させた。−９０ｍＶの保持電位から、１００ｍｓのプレパルスを（−９０ｍＶから５ｍＶ増分して６５ｍＶに及ぶ）、直後に−１０ｍＶに至る１００ｍｓの試験パルスを生成した。データを、最大Ｎａ＋電流振幅に正規化して、プレパルス電位に対してプロットして、ボルツマンの式：ＩＮａ／Ｉｍａｘ＝［（１−Ｃ）／（１＋ｅｘｐ（（Ｖ−Ｖｈ）／ｋ））］＋Ｃを用いて適合させた（式中、Ｉｍａｘは、最大ＩＮａであり、Ｖｈは、最大不活化の半分に相当する電圧であり、Ｖは、試験電圧であり、ｋは、勾配係数であり、Ｃは、非不活化残留性画分（ｎｏｎ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を表す定数（対照ではゼロに近い）である）。対応のあるステューデントのｔ検定を用いて、２つのサンプルの平均の比較を行った（ｐ＜０．０５）。全てのデータを、ｐＣｌａｍｐ  Ｃｌａｍｐｆｉｔ  １０．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標），Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）及びＯｒｉｇｉｎ  ７．５ソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎｌａｂ（登録商標），Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて分析して、少なくとも３回の独立した実験（ｎ≧３）の平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として表す。
【０２０１】
アルファ−ネメルチドのブラインシュリンプ（Ａｒｔｅｍｉａ  ｓａｌｉｎａ）アッセイ。約２０から３０匹のブラインシュリンプを含む１００μｌの海水を、９６ウェルマイクロプレートの各実験ウェルに加えた。次に、１００μｌのペプチド溶液を、各ウェルに加えた。対照として、一部のウェルを、エビを含む１００μｌの海水、及び１００μｌのｍｉｌｌｉＱ水で満たした。プレートを覆って、暗所で室温にて２４時間インキュベートした。２４時間後、各ウェルの１０秒のビデオクリップを、顕微鏡を通して撮影した。その後、エビを、死滅（動いていない）、影響を受けた（大部分はウェルの底で、ゆっくりと動く）、又は正常（対照と比較して、ウェルの全ての水位にて正常に動く）として、計数かつ分類した。次に、１００μｌのメタノールを加えることによって、エビを動けなくした。１時間後、各ウェル中のエビの総数を計数して、比率（死滅＋影響あり）／合計を算出した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３ＤＥ】
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【図４ＡＢ】
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【図４ＣＤ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ａ−３】
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【図５Ａ−４】
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【図５Ａ−５】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｈ】
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【図７ＡＢ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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