(57)【要約】  本発明は、スキャベンジャー受容体システインリッチ5(SRCR5)ドメイン(CD163ドメイン5としても知られる)が欠失しているCD163タンパク質を産生する遺伝子編集されたブタに関する。そのようなブタは健康であることが分かっており、否定的な特性を示さず、PRRSV感染に抵抗性である。編集されたブタにおいて発現されたCD163は、ヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能する能力の保持も示す。そのようなブタを作出する方法も提供される。
2019533445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
編集されたゲノムを含む遺伝子編集されたブタであって、編集により、ブタによって産生されるCD163タンパク質からSRCR5ドメインが欠失している、遺伝子編集されたブタ。
【請求項２】
ブタが、編集されたゲノムを含むことにより、ブタによって産生されるCD163タンパク質からSRCR5が欠失し、CD163タンパク質のその他のドメインのすべてが存在し、そのアミノ酸配列は変化していない、請求項1に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項３】
遺伝子編集されたブタによって産生されるCD163タンパク質が、依然として実質的に機能的である、請求項1又は2に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項４】
CD163タンパク質が、以下のアミノ酸配列:
HRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS(配列番号2)
を欠く、請求項1から3のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項５】
遺伝子編集されたブタによって産生されるCD163タンパク質に、野生型アミノ酸配列に対するさらなる変化がない、請求項4に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項６】
動物によって産生されるCD163タンパク質からのSRCR5ドメインの欠失をもたらすゲノム編集についてホモ接合性又は二対立遺伝子である、請求項1から5のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項７】
動物のすべての細胞が編集されたゲノムを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項８】
SRCR5をコードする配列が、編集されたCD163遺伝子から産生される成熟mRNAから存在しないように、ブタのゲノムが編集されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項９】
ブタが、CD163遺伝子のエキソン7が欠失している編集されたゲノムを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１０】
CD163遺伝子のエキソン7の5'に位置するスプライスアクセプター部位が不活性化されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１１】
CD163遺伝子のエキソン1から6及び8から16が、野生型配列と比べて変更されていない、請求項1から10のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１２】
エキソン7並びにエキソン7に隣接するイントロン6及び7の一部がCD163遺伝子から欠失しているが、CD163遺伝子の残りの領域には他の変更がない、請求項11に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１３】
編集されたゲノムが、イントロン6のスプライス部位ドナー配列及びイントロン7のスプライス部位アクセプター部位が変更されておらず、依然として機能的であるように編集されている、請求項1から12のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１４】
配列番号1に関して10466位から23782位まで伸びる、CD163遺伝子の領域の少なくとも一部が欠失しているように、ゲノムが編集されている、請求項1から13のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１５】
配列番号1に関して1位から10465位まで及び23783位から32908位までの領域が変更されないように、ゲノムが編集されている、請求項1から14のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１６】
エキソン7の5'末端の5'に伸びる最大5000塩基、適切には最大2000塩基、適切には最大1000塩基、適切には最大500塩基、適切には最大300塩基又は適切には最大100塩基と一緒にエキソン7が欠失しているように、ゲノムが編集されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１７】
エキソン7の3'末端の3'に伸びる最大75塩基と一緒にエキソン7が欠失しているように、ゲノムが編集されている、請求項1から16のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１８】
編集されたゲノムが、
a)配列番号1に関して、おおよそ23060位からおおよそ23760位まで、例えば、23065位から23753位まで、
b)配列番号1に関して、おおよそ23260位からおおよそ23760位まで、例えば、23268位から23753位まで、又は
c)配列番号1に関して、おおよそ23370位からおおよそ23760位まで、例えば、23374位から23753位まで
伸びる領域の欠失を含むように、ゲノムが編集されている、請求項1から17のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項１９】
編集されたゲノムが、挿入された配列を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項２０】
配列番号1に関して23378位から23416位まで伸びる領域が、イントロン6のスプライスアクセプター部位が不活性化されるように編集されるように、ゲノムが編集されている、請求項1から19のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項２１】
イントロン6のスプライスアクセプター部位が、もはや機能的ではなくなるように、部分的に若しくは完全に欠失している、又はその配列が他のいずれかの適切なやり方で変更されている、請求項1から20のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項２２】
スプライスアクセプター部位が、AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(配列番号3)からAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(配列番号4)に配列を変更するように編集されており、配列変化は小文字で示されている、請求項20又は21に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項２３】
遺伝子編集されたブタが、野生型ブタと比べてPRRSV感染に対する耐性又は抵抗性が改善されており、好ましくはこの動物がPRRS感染に対して抵抗性である、請求項1から22のいずれか一項に記載の遺伝子編集されたブタ。
【請求項２４】
編集により、ブタ細胞又は胚によって産生され得るCD163タンパク質からSRCR5ドメインが欠失している、遺伝子編集されたブタ細胞又は胚。
【請求項２５】
遺伝子編集されたブタを作出する方法であって、
a)ブタ細胞を用意する工程;
b)細胞のゲノムを編集して、CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム改変を生み出す工程;及び
c)前記細胞から動物を作製する工程
を含む方法。
【請求項２６】
CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム改変が、CD163遺伝子からのエキソン7の欠失又はCD163遺伝子のイントロン6でのスプライスアクセプター部位の不活性化である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
工程a)では、ブタ細胞が、体細胞、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、幹細胞(例えば、全能性幹細胞又は多能性幹細胞)又は接合子である、請求項25又は26に記載の方法。
【請求項２８】
工程a)では、ブタ細胞が単細胞接合子であり、単細胞段階の接合子において、方法の工程b)が少なくとも開始され、好ましくは、完了する、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
工程b)において、
-  CD163遺伝子中の適切な標的配列を標的にする部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入すること;
-  前記部位特異的ヌクレアーゼが前記標的配列で又はその近くでDNAに作用するのに適した条件下で、前記細胞をインキュベートする;及び
-  それによって、CD163遺伝子においてCD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらす編集事象を誘発すること
を含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらす編集事象は、CD163遺伝子からのエキソン7の欠失又はCD163遺伝子のイントロン6におけるスプライスアクセプター部位の不活性化が可能である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
工程b)が、エキソン7のどちらかの側に二本鎖DNA切断を誘発し、それによってその欠失を引き起こすようにCD163遺伝子のエキソン7に隣接する標的部位に標的されている部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することを含む、請求項29又は30に記載の方法。
【請求項３２】
1つの標的部位がイントロン6にあり、切断部位がエキソン6の3'末端のスプライスドナー部位の3'であり、別の標的部位がイントロン7にあり、切断部位がエキソン8の5'のスプライスアクセプター部位の5'である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
工程b)が、CD163のエキソン7の上流の標的部位を標的にする上流部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入すること、及びCD163のエキソン7の下流の標的部位を標的にする下流部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することを含む、請求項25から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程b)が、イントロン6においてスプライスアクセプター部位を標的にする部位特異的ヌクレアーゼを導入することを含む、請求項29又は30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
イントロン6のスプライスアクセプター部位を標的にする部位特異的ヌクレアーゼが、所望の切断部位で単一の二本鎖切断を生み出して、非相同末端結合(NHEJ)により又は相同性組換え修復(HDR)によりエキソン7に関連するスプライスアクセプター部位を不活性化する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
HDR鋳型、好ましくは以下の配列:
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(配列番号16)
を有するHDR鋳型を提供することを含み、小文字は、非変更配列と比べた変化を示す、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
部位特異的ヌクレアーゼが、少なくとも1つのZnフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、RNAガイドCRISPR/Casヌクレアーゼ(CRISPR/Csa)、又はメガヌクレアーゼを含む、請求項25から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
-  ブタ接合子を用意する工程;
-  CD163遺伝子中の適切な標的配列を標的にする部位特異的ヌクレアーゼを接合子に導入する工程;
-  前記部位特異的ヌクレアーゼが前記標的配列で又はその近くでDNAに作用し、それによってCD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらす編集事象をCD163遺伝子において誘発させるのに適した条件下で、前記接合子をインキュベートする工程;及び
-  前記遺伝子編集された接合子から動物を作製する工程
を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項３９】
起きた遺伝子編集事象を特徴付けることを含む、請求項25から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子編集されたブタ細胞又は胚を作出する方法であって、
-  ブタ細胞又は胚を用意する工程;
-  細胞又は胚内の細胞のゲノムを編集してCD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集を作り出す工程
を含む方法。
【請求項４１】
ブタを改変してPRRSVに対するその抵抗性又は耐性を増加する方法であって、ブタにおいて細胞のゲノムを編集してCD163タンパク質のSRCR5ドメインの欠失をもたらす改変を作り出すことを含む方法。
【請求項４２】
請求項25から41のいずれか一項に記載の方法に従って作出される動物、細胞若しくは胚、又は請求項25から39若しくは41のいずれか一項に従って作出される動物の子孫である動物。
【請求項４３】
SRCR5ドメインが欠失しているCD163タンパク質を保有する又は発現するブタ又はブタの細胞。
【請求項４４】
末梢血単球由来マクロファージ(PMM)又は肺胞マクロファージ(PAM)である、請求項43に記載される細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スキャベンジャー受容体システイン豊富な5(SRCR5)ドメインが欠失しているCD163タンパク質を産生する遺伝子編集されたブタに関する。そのようなブタは健康であることが分かっており、否定的な特性を示さず、PRRSV感染に抵抗性である。更に、SRCR5のないCD163タンパク質はヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能する能力を保持している。本発明は、そのようなブタを作出する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)は、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)と呼ばれる豚の疾患を引き起こすウイルスである。
【０００３】
この経済的に重大な疾患は、多くの豚生産国に固有であるが、種畜での生殖障害及び若い豚で呼吸器疾患を引き起こす。この疾患は、最初「ブタミステリー病」及び「ミステリー生殖症候群」と呼ばれていたが、1987年に北米及び中央ヨーロッパではじめて報告された。この疾患のせいで合衆国ブタ業界では毎年約6億5000万ドルの費用が掛かっていると推定されている。
【０００４】
PRRSVはマクロファージ細胞表面マーカーのセット、CD169とCD163を介してマクロファージに入る。CD169/シアロアドヘシンの役割は、ゲントのHans Nauwynckのグループにより発見された。CD163の役割はファイザーで働いている科学者らにより発見された(Calvert et al. 2007)。Calvertら、(2007)は、いかなる非感受性細胞にCD163をトランスフェクトしても細胞をPRRSVに感受性にすることが可能であることを実証した。そのおかげで、Marc-145細胞を使用しなくてもワクチン株を作製することが可能になった。
【０００５】
Van Gorp.ら(「Susceptible cell lines for the production of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection of sialoadhesin and CD163」、BMC Biotechnology 2010年、10巻:48頁)は、CD163タンパク質のドメイン5から9はPRRSVが非感受性細胞に侵入するのに重要であることを実証し、ドメイン5が極めて重要である可能性があることを強調した。
【０００６】
Dasら、(「The Minor Envelope Glycoproteins GP2a and GP4 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Interact with the Receptor CD163」、JOURNAL OF VIROLOGY、2010年2月、1731〜1740頁)は、PRRSV糖タンパク質GP2A及びGP4はCD163と物理的に相互作用することを実証した。
【０００７】
Pfizer社(Zoetis)が保持する米国特許出願公開第20050271685号は、CD163分子を使用すると細胞をPRRSV及びASFVに感受性にすることができることを示唆している。
【０００８】
国際公開第2012/158828号は、SIGLEC1及び/又はCD163遺伝子が不活性化されているPRRS抵抗性動物を記載している。しかし、CD163は正常な生理活性に役割を有する。したがって、この遺伝子は動物に対して望ましくない予見不可能なノックオン効果を及ぼすことがあるので、この遺伝子を不活性化するのは望ましくない。
【０００９】
PRRSVの予防及び処置を改善する必要性が残っている。
【００１０】
本発明者らは、スキャベンジャー受容体システインリッチ5(SRCR5)ドメイン(CD163ドメイン5としても知られる)が欠失しているCD163を産生する遺伝子編集されたブタを作製するのに成功している。本発明者らによって作出されたブタは健康であることが分かっており、否定的な特性を示さない。本発明者らが行った実験では、ブタがPRRSV感染に抵抗性を示すことが明らかにされた。編集されたブタで発現されたCD163は、ヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能する能力を保持していることも示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第20050271685号
【特許文献２】国際公開第2012/158828号
【特許文献３】米国特許第6,479,626号
【特許文献４】米国特許第6,534,261号
【特許文献５】米国特許第6,607,882号
【特許文献６】米国特許第6,746,838号
【特許文献７】米国特許第6,794,136号
【特許文献８】米国特許第6,824,978号
【特許文献９】米国特許第6,866,997号
【特許文献１０】米国特許第6,933,113号
【特許文献１１】米国特許第6,979,539号
【特許文献１２】米国特許第7,013,219号
【特許文献１３】米国特許第7,030,215号
【特許文献１４】米国特許第7,220,719号
【特許文献１５】米国特許第7,241,573号
【特許文献１６】米国特許第7,241,574号
【特許文献１７】米国特許第7,585,849号
【特許文献１８】米国特許第7,595,376号
【特許文献１９】米国特許第6,903,185号
【特許文献２０】米国特許第8,106,255号
【特許文献２１】米国特許出願公開第20030232410号
【特許文献２２】米国特許出願公開第20090203140号
【特許文献２３】米国特許第8420782号
【特許文献２４】米国特許第8470973号
【特許文献２５】米国特許第8440431号
【特許文献２６】米国特許第8440432号
【特許文献２７】米国特許第8450471号
【特許文献２８】米国特許第8586363号
【特許文献２９】米国特許第8697853号
【特許文献３０】欧州特許第2510096号
【特許文献３１】米国特許第8586526号
【特許文献３２】米国特許第8623618号
【特許文献３３】欧州特許第2464750号
【特許文献３４】米国特許出願公開第2011041195号
【特許文献３５】米国特許出願公開第2011247089号
【特許文献３６】米国特許出願公開第2013198878号
【特許文献３７】国際公開第2012/116274号
【特許文献３８】国際公開第2014110552号
【特許文献３９】国際公開第2014070887号
【特許文献４０】国際公開第2014022120号
【特許文献４１】国際公開第2013192316号
【特許文献４２】国際公開第2010008562号
【特許文献４３】米国特許第8,697,359号
【特許文献４４】米国特許出願公開第2010076057号
【特許文献４５】国際公開第2013/176772号
【特許文献４６】米国特許第8,771,945号
【特許文献４７】米国特許出願公開第2014186843号
【特許文献４８】米国特許出願公開第2014179770号
【特許文献４９】国際公開第2014179006号
【特許文献５０】国際公開第2014093712号
【特許文献５１】国際公開第2014093701号
【特許文献５２】国際公開第2014093635号
【特許文献５３】国際公開第2014093694号
【特許文献５４】国際公開第2014093655号
【特許文献５５】国際公開第2014093709号
【特許文献５６】国際公開第2013/188638号
【特許文献５７】国際公開第2013/142578号
【特許文献５８】国際公開第2013/141680号
【特許文献５９】国際公開第2013/188522号
【特許文献６０】米国特許第8546553号
【特許文献６１】国際公開第2014/089290号
【特許文献６２】国際公開第2014/093479号
【特許文献６３】米国特許第4,873,191号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Van Gorp.ら「Susceptible cell lines for the production of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection of sialoadhesin and CD163」、BMC Biotechnology 2010年、10巻:48頁
【非特許文献２】Dasら、「The Minor Envelope Glycoproteins GP2a and GP4 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Interact with the Receptor CD163」、JOURNAL OF VIROLOGY、2010年2月、1731〜1740頁
【非特許文献３】Congら、「Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems」、Science、2013年2月15日: 339巻  6121号  1819〜823頁
【非特許文献４】Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3巻、1803〜1814頁
【非特許文献５】Lavitranoら、25 (2002年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99巻、14230〜14235頁
【非特許文献６】Lavitranoら、(2006年) Reprod. Fert. Develop. 18巻、19〜23頁
【非特許文献７】Wilmutら、(1997年) Nature 385巻、810〜813頁
【非特許文献８】Wakayamaら、(1998年) Nature 394巻、369〜374頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第1の態様によれば、編集されたゲノムを含む遺伝子編集されたブタであって、編集により、ブタによって産生されるCD163タンパク質からSRCR5ドメインが欠失している、遺伝子編集されたブタが提供される。言い換えると、遺伝子編集されたブタは、SRCR5(文脈ではドメイン5とも呼ばれる)が存在しない改変型のCD163タンパク質を産生する。
【００１４】
好ましくは、ブタは、豚(イノシシ(Sus scrofa))であり、もっとも好ましくは、家畜豚(Sus scrofa domesticus又はSus domesticus)である。
【００１５】
好適には、ブタは、編集により、この動物によって産生されるCD163タンパク質からSRCR5が欠失し、その他のCD163ドメインのすべては存在し、そのアミノ酸配列は変化していない、編集されたゲノムを含む。したがって、ブタは、SRCR5が存在せず、膜貫通セグメント及び細胞質ドメインであるSRCRドメイン1から4及び6から9が変化していないCD163を適切に産生する。本発明者らは、驚くべきことに、SRCR5が欠失しているCD163タンパク質はヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとしてのその生理機能を保持することは可能であるが、改変CD163タンパク質を保有する細胞ではPRRSVによる感染に対して高レベルの抵抗性を生み出すことを見出した。
【００１６】
したがって、本発明のある特定の実施形態では、編集されたゲノムから発現されるCD163タンパク質は好ましくは、依然として実質的に機能的である。この文脈での「実質的に機能的な」とは、SRCR5ドメインに依存していない生理機能を保持しているタンパク質のことである。好適には、改変CD163タンパク質は、ヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能することができるという点で実質的に機能的である。ヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能するCD163タンパク質の能力は、本明細書に記載される方法論に従って、すなわち、編集されたブタ由来の末梢血単球由来マクロファージのヘモグロビン-ハプトグロビンを除去する能力に基づいて、容易に評価することが可能である。ヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能するCD163タンパク質の能力は、SRCR5ドメインが欠失しているにもかかわらずCD163タンパク質が適切に折り畳まれており機能的であることを示している。
【００１７】
CD163のSRCR5は以下のアミノ酸配列:HRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS(配列番号2)を有する。
【００１８】
したがって、編集されたブタにより産生される改変CD163タンパク質は、上記のアミノ酸配列、すなわち、配列番号2を欠くのが適切である。好適には、編集されたブタにより産生されるCD163タンパク質は、野生型アミノ酸配列にこれ以上の変化はない。
【００１９】
ブタは好ましくは、この動物によって産生されるCD163からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集についてホモ接合性又は二対立遺伝子である。この文脈での「ホモ接合性の」とは、ブタが、両方の染色体上のCD163遺伝子内に同じ編集を含む、すなわち、ブタは両方の染色体上に同一の対立遺伝子を有することを意味する。この文脈での「二対立遺伝子の」とは、ブタがそれぞれの染色体上に異なる編集を有するが、その編集の両方がCD163に対する望ましい編集をもたらす、すなわち、この動物によって産生されるCD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすことを意味する。
【００２０】
好ましくは、この動物の細胞すべてが編集されたゲノムを含む。しかし、一部の場合、この動物はモザイクを示すことがあり、一部の細胞は編集されたゲノムを含み、他の細胞は編集されたゲノムを含まない。PRRSVはマクロファージに感染し、したがって、マクロファージ及びその前駆細胞がSRCR5を含むCD163を発現しなければ、この動物はPRRSV感染に抵抗性になる。
【００２１】
ブタがSRCR5を含むいかなるCD163も産生しない、すなわち、この動物の細胞すべてが、ブタによって産生されるCD163からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集についてホモ接合性又は二対立遺伝子であることが一般には好ましい。
【００２２】
本発明の遺伝子編集されたブタは、本明細書に記載される遺伝子編集方法を直接受けたことのあるブタ、又は編集されたゲノムを保持するそのようなブタの子孫が可能であることは当業者には明らかであろう。実際、遺伝子編集方法を受けたことのあるブタは、一部の場合にはホモ接合性になり、ホモ接合性又は二対立遺伝子子孫に到達するまで繁殖されることになる。
【００２３】
好適には、SRCR5をコードする配列が、編集されたCD163遺伝子から産生されるmRNA(好ましくは、成熟mRNA)から存在しないように、ゲノムが編集されている。これは、CD163遺伝子から、CD163タンパク質のSRCR5ドメインをコードするエキソン7を欠失させる編集により、又は、例えば、mRNA形成中のスプライシングの結果として、編集されたCD163遺伝子由来の転写物からエキソン7によってコードされるRNA配列の除去をもたらす編集により達成可能である。
【００２４】
したがって、本発明のある特定の実施形態では、CD163遺伝子のエキソン7は欠失している。CD163遺伝子のエキソン7の欠失は、当然のことながら、コードされたCD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすことになる。
【００２５】
本発明のある特定の実施形態では、エキソン7の5'に位置するスプライスアクセプター部位は不活性化されている。エキソン7の5'末端のスプライスアクセプター部位の不活性化により、編集されたCD163遺伝子から産生されるmRNAからエキソン7がスプライスされ、したがって、翻訳された場合、mRNAから得られるCD163タンパク質からSRCR5が欠失している。
【００２６】
ブタがCD163遺伝子のエキソン7が欠失している編集されたゲノムを含む本発明の実施形態では、これは種々の方法で達成することが可能である。例えば、欠失は、エキソン7に限定してもよく、又は欠失は、エキソン7を超えて隣接するイントロン領域中(すなわち、イントロン6及び7中)に伸びていてもよい。典型的には、エキソン7の全体が欠失していることが好ましい。
【００２７】
好適には、編集されたゲノムは、エキソン7が欠失しているが、CD163領域の他のコード領域には他の変化がないように編集されている。特に、典型的には、非編集ゲノムと比べてCD163の他のエキソンには変更されていないことが好ましい。したがって、エキソン1から6及び8から16は変更されていないことが好ましい。
【００２８】
一部の実施形態では、エキソン7並びにエキソン7に隣接するイントロン6及び7の一部は欠失しているが、CD163遺伝子の残りの領域には他の変更がない。
【００２９】
エキソン7は、配列番号1に関して23392位から23706位にまたがっている。したがって、この領域は編集されたブタゲノムで欠失しているのが適切である。
【００３０】
CD163遺伝子中の位置又は領域は、本明細書では配列番号1に関して記載されるが、異なる個々のブタ間ではCD163の配列に変動があり(例えば、一塩基多型(SNP)又は他の多型が生じる場合)、したがって、個々のブタは配列番号1とはわずかに異なるCD163配列を含むことがあることは留意するべきである。配列番号1に関して位置又は領域に言及するのは、厳密に限定的であることを意味するのではなく、任意のそのような配列変動を有するブタのCD163遺伝子における対応する位置を表していると解釈するべきである。当業者であれば、従来の配列アライメント技法、例えば、BLASTを使用して配列変動を含むCD63遺伝子における対応する位置又は領域を容易に同定することができるであろう。
【００３１】
好適には、編集されたゲノムは、イントロン6におけるスプライス部位ドナー配列(すなわち、エキソン6とイントロン6のジャンクションに位置している)及びイントロン7におけるスプライス部位アクセプター部位(すなわち、イントロン7とエキソン8のジャンクションに位置している)が変更されておらず、依然として機能的であるように編集される。これは編集されたCD163遺伝子から産生される転写物の正確なスプライシングを促進する。したがって、本発明の実施形態では、配列番号1に関して10451位から10465位まで及び23783位から23824まで伸びる領域の配列は変更されていない。
【００３２】
好適には、配列番号1に関して10466位から23782位まで伸びる、CD163遺伝子の領域の少なくとも一部が欠失しており、その一部はエキソン7を含むように、ゲノムが編集されている。10466位は、イントロン6の予測されるスプライスドナー部位のすぐ3'側に(すなわち、エキソン6の3'末端に)ある。23782位は、イントロン7の予想されるスプライスアクセプター部位のすぐ5'側に(すなわち、エキソン8の5'末端に)ある。その領域は、エキソン7を含むことを前提として、当然のことながら、もっと小さくなることが可能である。
【００３３】
好適には、配列番号1に関して1位から10465位まで及び23783又は23754位から32908位までの領域が変更されないように、ゲノムが編集されている。
【００３４】
本発明のある特定の実施形態では、エキソン7は、エキソン7の5'末端の5'に伸びる最大5000塩基、適切には最大2000塩基、適切には最大1000塩基、適切には最大500塩基、適切には最大300塩基、又は適切には最大100塩基と一緒に欠失している。
【００３５】
本発明のある特定の実施形態では、エキソン7は、エキソン7の3'末端の3'に伸びる最大75塩基と一緒に欠失している。この領域は、エキソン7の3'末端からエキソン8の5'末端の予想されるスプライスアクセプター部位まで伸びる。好適には、エキソン7は、エキソン7の3'末端の3'に伸びる最大50塩基と一緒に欠失している。
【００３６】
一実施形態では、編集されたゲノムは、配列番号1に関して、おおよそ23060位からおおよそ23760位まで、例えば、23064又は23065位から23753又は23754位まで、適切には、20365位から23753位まで伸びる領域の欠失を含む。
【００３７】
別の実施形態では、編集されたゲノムは、配列番号1に関して、おおよそ23260位からおおよそ23760位まで、例えば、23267又は23268位から237543又は23754位まで、適切には、23268位から23753位まで伸びる領域の欠失を含む。
【００３８】
別の実施形態では、編集されたゲノムは、配列番号1に関して、おおよそ23370位からおおよそ23760位まで、例えば、23373又は23374位から237543又は23754位まで、適切には、23374位から23753位まで伸びる領域の欠失を含む。
【００３９】
本発明の一部の実施形態では、編集されたゲノムは、正常では関連する位置には見出されない挿入配列(すなわち、異種挿入配列)を含むことが可能である。例えば、CD163遺伝子のなかでエキソン7を含むセクションが欠失している場合、挿入配列は欠失が生じた位置に存在することが可能である。そのような挿入物は、遺伝子編集を通した配列の欠失の比較的一般的な人工産物である。そのような挿入物は、本文脈では典型的には重要ではなく、挿入配列は典型的には遺伝子から産生される転写物からスプライスされる。したがって、挿入配列は典型的にはいかなる特定の効果ももたらさない。挿入配列は一般的には、CD163遺伝子又は他のいかなる相同体又は他の関連配列由来の配列ではない。典型的には、そのような異種挿入配列は編集されたゲノムには存在しないことが好ましい。
【００４０】
一つの特に好ましい実施形態では、編集されたゲノムは、23268位から23753位まで伸びる領域の欠失を含み、欠失の位置には配列の挿入はない。そのような実施形態では、欠失エキソン7の以前の遺伝子座におけるブタの編集されたゲノムは以下の配列:
ATTGTCTCCAGGGAAGGACAGGGAGGTCTAGAATCGGCTAAGCCCAC||GTAGGGTTAGGTAGTCA-配列番号36を有する(||はその領域を切断するのに使用することができる2つの切断部位が隣接していることを表す)。
【００４１】
本発明のある特定の実施形態では、ブタは、CD163遺伝子のイントロン6における、すなわち、エキソン7の5'末端に位置しているスプライスアクセプター部位が不活性化されている編集されたゲノムを含む。上記のように、エキソン7の5'末端のスプライスアクセプター部位の不活性化により、編集されたCD163遺伝子から産生されるmRNAからエキソン7がスプライスされ、したがって、そのmRNAから翻訳されるCD163タンパク質からSRCR5が欠失する。
【００４２】
イントロン6での予測されるスプライスアクセプター部位は、配列番号1に関して23378位から23416位まで伸びている。したがって、この配列は、スプライスアクセプター部位を不活性化するよう適切に編集されている。
【００４３】
スプライスアクセプター部位は、もはや機能的ではなくなるように、部分的に若しくは完全に欠失している、又はその配列を他のいかなる適切なやり方でも変更させることが可能である。したがって、一実施形態では、スプライスアクセプター部位は欠失される。別の実施形態では、配列がスプライスアクセプター部位に挿入されて、その部位は不活性化される。別の実施形態では、スプライスアクセプター部位は、例えば、相同組換え修復(HDR)媒介遺伝子移入事象を通じて不活性化されるように、改変される。
【００４４】
一実施形態では、スプライスアクセプター部位の配列は、制限酵素部位を含むように変更される。例えば、変更配列は、NcoI制限酵素部位を含むように変更することが可能である。しかし、提供できると考えられる他の制限酵素部位は極めて数が多い。変更されたスプライスアクセプター部位での制限酵素部位の導入の利点は、その制限酵素部位のおかげで、成功した編集事象の発生について簡単に分析できることである。
【００４５】
一実施形態では、スプライスアクセプター部位は、AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(配列番号3)からAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(配列番号4)に配列を変更するように編集される。配列変化は小文字で示されている。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子編集されたブタは、PRRSV感染に対する耐性又は抵抗性が改善されている。好適には、この動物はPRRS感染に抵抗性である。CD163からSRCR5を欠失すると、CD163発現細胞、特に肺胞マクロファージ(PAM)及び末梢血単球由来マクロファージ(PMM)は、PRRSVでの感染に高度に抵抗性になることが明らかにされている。
【００４７】
本発明の第2の態様によれば、編集により、ブタ細胞又は胚によって産生されるCD163タンパク質からSRCR5ドメインが欠失している、遺伝子編集されたブタ細胞又は胚が提供される。この文脈での「細胞又は胚」は、体細胞、生殖細胞、幹細胞、配偶子、接合子、胚盤胞、胚、胎児及び/又はドナー細胞を包含する。
【００４８】
本発明の第1の態様に関して考察される種々の特長は必要な変更を加えて本発明の第2の態様に適用される。例えば、ブタに関して上で考察される種々の編集の性質は、編集された細胞又は胚に等しく適用される。
【００４９】
本発明の第3の態様によれば、遺伝子編集されたブタを作出する方法であって、
a)ブタ細胞を用意する工程;
b)細胞のゲノムを編集して、CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム改変を生み出す工程;及び
c)前記細胞から動物を作製する工程
を含む方法が提供される。
【００５０】
CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム改変は、CD163遺伝子からのエキソン7の欠失又はCD163遺伝子のエキソン7に関連するスプライスアクセプター部位、すなわち、エキソン7の5'末端に位置しているスプライスアクセプター部位の不活性化が可能である。
【００５１】
工程a)では、ブタ細胞はいかなる適切な細胞でも可能である。好適には、ブタ細胞は、体細胞、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、幹細胞(例えば、全能性幹細胞又は多能性幹細胞)又は接合子が可能である。
【００５２】
好ましくは、方法は接合子上で実施される。用語「接合子」は、配偶子の融合により形成される単細胞を指すのに厳密な意味で使用することが可能である。しかし、この用語は、真性接合子の最初の数回の分裂から生じる細胞束を指すのに本文脈ではより広く使用することも可能であり、これはより適切には桑実胚として知られている。
【００５３】
本方法は、単細胞段階の接合子において、少なくとも開始され、好ましくは、完了することが好ましい。これにより、同じ編集を含有するブタの細胞すべてが生じるはずである。しかし、編集過程が起きている間に接合子が分裂することが起こり得る。編集過程の段階に対して細胞分裂がいつ起こるかに応じて、
-  細胞のすべてが、分裂が起こる前に編集された単細胞に由来しているので同じ編集を含有することになること(編集は細胞中の1つの対立遺伝子又は両方の対立遺伝子に対して可能であり、一部の場合は、それぞれ対立遺伝子は同じ編集された配列を有することができ、他の場合には、対立遺伝子は異なる編集された配列を有することができた、すなわち、二対立遺伝子編集事象が起こっていた);
-  細胞のすべてが、分裂が生じた後娘細胞において同一の編集事象が起きたので同じ編集を含有することになること;
-  編集事象が起こる前に細胞が分裂し、1つの娘細胞のみが編集されたので、編集事象がある及びなしの細胞のモザイクが作り出されること;並びに
-  細胞が分裂し娘細胞において異なる編集事象が起きたので、異なる編集を有する細胞のモザイクが作り出されること
のうちの1つが生じる可能性がある。
【００５４】
編集は最初の細胞分裂後に行うことも可能であり、その結果は興味深いものになり得る。しかし、これは一般的には、所望の結果が非モザイク動物である場合にはあまり好ましくはない。
【００５５】
工程b)は適切には、
-  CD163遺伝子中の適切な標的配列を標的にする部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入こと;
-  前記部位特異的ヌクレアーゼが前記標的配列で又はその近くでDNAに作用するのに適した条件下で前記細胞をインキュベートすること;及び
-  それによって、CD163遺伝子において、CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらす編集事象を誘発すること
を含む。
【００５６】
CD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらす編集事象は、CD163遺伝子からのエキソン7の欠失又はエキソン7に関連する、すなわち、エキソン7の5'末端に位置しているスプライスアクセプター部位の不活性化が可能である。
【００５７】
ある特定の実施形態では、工程b)は適切には、エキソン7のいずれかの側に二本鎖DNA切断を誘発し、それによってその欠失を引き起こすようにCD163遺伝子のエキソン7に隣接する標的部位に標的されている部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することを含む。標的部位はイントロン6及び7においてが適切である。標的部位がイントロン6にある場合、切断部位は好ましくは、エキソン6の3'末端のスプライスドナー部位の3'である。標的部位がイントロン7にある場合、切断部位は好ましくは、エキソン8の5'のスプライスアクセプター部位の5'である。
【００５８】
ある特定の実施形態では、工程b)は適切には、CD163のエキソン7の上流の標的部位を標的にする上流部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入しすること、及びCD163のエキソン7の下流の標的部位を標的にする下流部位特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することを含む。
【００５９】
本文脈での「上流」とはCD163遺伝子のエキソン7の5'末端の上流に位置する部位のことである。好ましくは、上流標的部位はエキソン7の5'末端とエキソン6の3'末端に位置するスプライスドナー部位の間の領域に位置している。一部の実施形態では、上流標的部位はエキソン7の5'末端の上流2000塩基内(適切には1000塩基、500塩基、300塩基、200塩基又は100塩基内)に位置している。部位特異的ヌクレアーゼの切断部位は典型的には、その標的部位の内部又は極めて近くであり、したがって、部位特異的ヌクレアーゼはエキソン7の5'末端の上流2000、1000、500、300、200又は100塩基内にDNA切断を誘発する。部位特異的ヌクレアーゼの切断部位は適切には、エキソン7の5'末端とエキソン6の3'末端に位置するスプライスドナー部位の間の領域にある。
【００６０】
当業者であれば、既知の部位特異的ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9又は他のCRIPRヌクレアーゼ、TALEN若しくはZFN)を上で考察される領域に位置するいかなる所望の標的にも容易に向けることが可能である。CRISPR/Cas9又は他のCRIPRヌクレアーゼの場合、方法は適切には、Cas9タンパク質を所望の標的部位に向けるガイドRNAを提供することを含む。TALEN又はZFNの場合、部位特異的ヌクレアーゼの結合部位を決めるのは部位特異的ヌクレアーゼのタンパク質コードである。
【００６１】
部位特異的ヌクレアーゼがCRISPR/Cas9である場合に使用することが可能な例示的上流標的部位は、関連する切断位置及びsgRNAと共に下に与えられる(切断位置は「|」記号で示される):
-  sgRNA(sgSL25) TGAAAAATAGCATTTCGGTG(配列番号5)、CD163遺伝子標的部位及び切断場所:CAC|CGAAATGCTATTTTTCA(配列番号6)
-  sgRNA(sgSL26) GAATCGGCTAAGCCCACTGT(配列番号7)、CD163遺伝子標的部位及び切断場所:GAATCGGCTAAGCCCAC|TGT(配列番号8)
-  sgRNA(sgSL27) GTCCTCCATTTACTGTAATC(配列番号:9)、CD163遺伝子標的部位及び切断場所:GAT|TACAGTAAATGGAGGAC(配列番号10)。
【００６２】
本文脈での「下流」とはCD163遺伝子のエキソン7の3'末端に又はその近くに位置する部位のことである。典型的には、下流部位はイントロン7に位置している。好ましくは、下流標的部位は、エキソン7の3'末端とエキソン8の5'末端に位置するスプライスアクセプター部位の間の領域に位置する。一部の実施形態では、下流標的部位はエキソン7の3'末端から75塩基又は50塩基3'側内に位置している。したがって、部位特異的ヌクレアーゼの切断部位は適切には、切断がエキソン7の3'末端の3'、及びエキソン8の5'末端に位置するスプライスアクセプター部位の5'末端の3'で起こるように、この定義された領域内であり、例えば、部位特異的ヌクレアーゼの切断部位は典型的には、エキソン8の5'末端に位置するスプライスアクセプター部位の5'である。
【００６３】
部位特異的ヌクレアーゼがCRISPR/Cas9である場合に使用することが可能な例示的下流標的部位は、関連する切断位置及びsgRNA配列と共に下記に示す(切断位置は「|」記号で示される):
-  sgRNA(sgSL28) CCCATGCCATGAAGAGGGTA(配列番号11)、CD163遺伝子標的部位及び切断場所:CCCATGCCATGAAGAGG|GTA(配列番号11)
【００６４】
ある特定の実施形態では、工程b)は適切には、エキソン7に関連する、すなわち、エキソン7の5'末端に位置するスプライスアクセプター部位を標的にする部位特異的ヌクレアーゼを導入することを含む。
【００６５】
好適には、部位特異的ヌクレアーゼは、エキソン7に関連するスプライスアクセプター部位内又はその近くに二本鎖切断を誘発する。
【００６６】
一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、配列番号1に関して23378位から23416位まで伸びる領域に、又は5'若しくは3'方向に前記領域の200、100、50若しくは25塩基内の位置に切断を誘発する。言い換えると、部位特異的ヌクレアーゼは、エキソン7と関連する予測されるスプライスアクセプター部位に、又は隣接領域に二本鎖切断を誘発する。
【００６７】
当業者であれば、既知の部位特異的ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9、TALEN又はZFN等の)を上で考察される領域のいかなる所望の標的部位にも容易に向けることが可能である。CRISPR/Cas9及び他のCRIPRヌクレアーゼの場合、方法は適切には、Cas9又は他のCRIPRヌクレアーゼタンパク質を所望の標的部位に向けるガイドRNAを提供することを含む。TALEN又はZFNの場合、部位特異的ヌクレアーゼの結合部位を決めるのは部位特異的ヌクレアーゼのタンパク質コードである。
【００６８】
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集の場合、エキソン7に関連するスプライスアクセプター部位を標的にする適切なガイドRNA配列は以下の通りである:
sgRNA 1:AACCAGCCTGGGTTTCCTGT(配列番号12)
sgRNA 2:CAACCAGCCTGGGTTTCCTG(配列番号13)
【００６９】
これらの2つのガイド配列は、Cas9によるエキソン7の5'末端の以下の配列に二本鎖切断部位を誘発する(切断位置は「|」記号で示される):
ACA|GGAAACCCAGGCTGGTT(配列番号14) - sgRNA 1を使用
CAG|GAAACCCAGGCTGGTTG(配列番号15) - sgRNA 2を使用
【００７０】
部位特異的ヌクレアーゼは適切には、所望の切断部位に単一の二本鎖切断を生み出す。その場合、エキソン7に関連するスプライスアクセプター部位は、非相同末端結合(NHEJ)により又は相同組換え修復(HDR)により不活性化することが可能である。HDRが意図される活性化方法である場合、HDR鋳型が提供される。当技術分野で周知のように、HDR鋳型は、正常に存在する配列に取って代わるように意図されている配列を含有する中央部分、及び正常な配列に相同である隣接部分を含む。したがって、HDR鋳型は適切には、HDRによりCD163遺伝子に導入された場合、スプライスアクセプター部位を不活性化する配列を有する中央部分を含む。
【００７１】
例示的であるが、非限定的なHDR鋳型は以下の配列:
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(配列番号16)(小文字は、非変更配列と比べた変化を示す)
を有する。
【００７２】
上述の例示的標的部位はCRISPR/Cas9部位特異的ヌクレアーゼと関係があるが、多くの他の標的部位を使用することが可能だと考えられること、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ(本文脈では「エディター」又は「遺伝子エディター」と呼ばれることが多い)を使用することも可能だと考えられることは当業者には直ちに明らかになるであろう。別の部位特異的ヌクレアーゼに適した標的部位は当業者であれば容易に決定することが可能だと考えられる。
【００７３】
好ましい実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、少なくとも1つのZnフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、RNAガイドCRISPRヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Cas9又はCRISPR/Cpf等の他のCRISPRヌクレアーゼ)、又はメガヌクレアーゼを含む。
【００７４】
部位特異的ヌクレアーゼは典型的には、ゲノムDNA中に二本鎖切断を生み出すことができる。これは、CRISPR/Cas又は他のCRISPRヌクレアーゼ、ZFN及びTALENを含むがこれらに限定されないいくつかの部位特異的ヌクレアーゼを用いて達成することが可能である。
【００７５】
一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、協働し合う部位特異的ヌクレアーゼの対を含み、そのそれぞれが一本鎖切断を生み出すことができる。好適には、部位特異的ヌクレアーゼは、協働し合うZFN、TALEN又はCRISPR「ニッカーゼ」(例えば、1つのDNA鎖のみを切断することができる改変Cas9又は他のヌクレアーゼを有する)の対を含み、これらは協働し合ってゲノムDNA中に二本鎖切断を生み出す。そのような実施形態では、標的部位は適切には、半部位の対を含み、対の1つがそれぞれの半部位で結合する。したがって、一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ZFN、TALEN又はRNAガイドCRISPR「ニッカーゼ」(例えば、1つのDNA鎖のみを切断することができる改変Cas9又は他のヌクレアーゼを有する)の対を含み、対の両方のメンバーが存在しておりDNA分子の両方の鎖を切断することができるヘテロ二量体を形成する場合のみ二本鎖DNA切断を引き起こすことができる。一部の好ましい実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ZFNの対を含む。対応する部位特異的ヌクレアーゼの対を使用すれば、オフターゲット切断を低減する利点を持つことが可能である。
【００７６】
部位特異的ヌクレアーゼは、いかなる適切な形態でも細胞に導入することが可能であることは留意するべきである。例えば、ヌクレアーゼは機能的タンパク質として細胞中に直接提供することが可能である。代わりに、ヌクレアーゼは、活性ヌクレアーゼが細胞により産生される元の前駆体又は鋳型の形態で細胞中に提供することが可能である。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼをコードするmRNAが、例えば、注射により細胞中に導入される。次に、mRNAは細胞により発現されて機能するタンパク質を形成する。このようにmRNAを使用すれば、細胞内でヌクレアーゼの迅速であるが一過性の発現が可能になり、これは遺伝子編集という目的には理想的である。RNAを使用して部位特異的ヌクレアーゼを標的にする場合、これはいかなる適切な形態でも提供することが可能である。
【００７７】
用語「ヌクレアーゼ」は、標的核酸の一本鎖又は二本鎖切断を生み出すいかなる生物学的酵素でも包含することが意図されていることは留意するべきである。したがって、この用語はニッカーゼ及びリコンビナーゼ、並びに一本鎖又は二本鎖切断を引き起こすもっと多くの従来のヌクレアーゼを含む。
【００７８】
ZFN技術は文献に、特に、以下の特許文献:米国特許第6,479,626号、米国特許第6,534,261号、米国特許第6,607,882号、米国特許第6,746,838号、米国特許第6,794,136号、米国特許第6,824,978号、米国特許第6,866,997号、米国特許第6,933,113号、米国特許第6,979,539号、米国特許第7,013,219号、米国特許第7,030,215号、米国特許第7,220,719号、米国特許第7,241,573号、米国特許第7,241,574号、米国特許第7,585,849号、米国特許第7,595,376号、米国特許第6,903,185号、米国特許第6,479,626号、米国特許第8,106,255号、米国特許出願公開第20030232410号、及び米国特許出願公開第20090203140号に広範囲に記載されており、前記特許文献はすべて参照により組み込まれる。ZFNは、CompoZr(登録商標)Zinc Finger Nuclease Technology商標入りの製品及びサービスの元、Sigma-Aldrich社(St. Louis、MO、US)から商業的に入手可能である。
【００７９】
TALEN技術は文献に、特に、以下の特許文献:米国特許第8420782号、米国特許第8470973号、米国特許第8440431号、米国特許第8440432号、米国特許第8450471号、米国特許第8586363号、米国特許第8697853号、欧州特許第2510096号、米国特許第8586526号、米国特許第8623618号、欧州特許第2464750号、米国特許出願公開第2011041195号、米国特許出願公開第2011247089号、米国特許出願公開第2013198878号、国際公開第2012/116274号、国際公開第2014110552号、国際公開第2014070887号、国際公開第2014022120号、国際公開第2013192316号、及び国際公開第2010008562号に広範囲に記載されており、前記特許文献はすべて参照により組み込まれる。TALENは、GeneArt(登録商標)TALs商標入りの製品及びサービスの元(以前はLife Technologies商標の元で売られていた)、Thermo Fisher Scientific社(Waltham、MA、US)から商業的に入手可能である。
【００８０】
CRISPR/Cas技術は文献(例えば、Congら、「Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems」、Science、2013年2月15日: 339巻  6121号  819〜823頁)に、特に、以下の特許文献:米国特許第8,697,359号、米国特許出願公開第2010076057号、国際公開第2013/176772号、米国特許第8,771,945号、米国特許出願公開第2010076057号、米国特許出願公開第2014186843号、米国特許出願公開第2014179770号、国際公開第2014179006号、国際公開第2014093712号、国際公開第2014093701号、国際公開第2014093635号、国際公開第2014093694号、国際公開第2014093655号、国際公開第2014093709号、国際公開第2013/188638号、国際公開第2013/142578号、国際公開第2013/141680号、国際公開第2013/188522号、米国特許第8546553号、国際公開第2014/089290号、及び国際公開第2014/093479号に広範囲に記載されており、前記特許文献はすべて参照により組み込まれる。CRISPR/Casシステムは、CRISPR/Cas Nuclease RNA-guided Genome Editingスイートの製品及びサービスの元、Sigma-Aldrich社(St. Louis、MO、US)から、又はGeneArt(登録商標)CRISPR商標入りの製品及びサービスの元、Thermo Fisher Scientific社(Waltham、MA、US)から商業的に入手可能である。CRISPR/Cpfも文献に広く記載されてきた。
【００８１】
当然のことながら、この急速に発展する分野では、遺伝子編集のための他の技法も利用可能になる可能性がある。そのような技法は、多くの場合、本発明において使用するために容易に適応させることができると考えられる。
【００８２】
工程c)に関して、遺伝的変異を含む細胞から動物を作出するのに使用することが可能であるある範囲の周知の技法が当技術分野には存在する。そのような技法は、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号)又は胚のエレクトロポレーション(Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3巻、1803〜1814頁)、精子媒介遺伝子移入(Lavitranoら、25 (2002年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99巻、14230〜14235頁;Lavitranoら、(2006年) Reprod. Fert. Develop. 18巻、19〜23頁)、及び卵丘若しくは乳房細胞等の体細胞、又は成人、胎児、若しくは胚性幹細胞のin vitro形質転換、それに続く核移植(Wilmutら、(1997年) Nature 385巻、810〜813頁;及びWakayamaら、(1998年) Nature 394巻、369〜374頁)を限定せずに含む。標準繁殖技法を使用すれば、最初はヘテロ接合性ファウンダー動物(founder animals)から所望の遺伝子編集についてホモ接合性又は二対立遺伝子である動物を創造することが可能である。具体的な記述は、編集された接合子から動物を生み出すための例示的であるが限定的ではない方法の詳細を与える。本発明は、工程b)で作出される編集された細胞から動物を作製するいかなる具体的方法にも限定されてはいない。
【００８３】
方法の工程c)は任意選択により、クローニング、例えば、体細胞核移植(SCNT)を含むことが可能である。そのような実施形態では、遺伝子編集事象は体細胞で実行され、その後編集された核は除核された卵細胞に移される。典型的には、体細胞の集団が編集され、所望の編集事象が起きた細胞を使用してSCNTにドナー核を提供することになる。SCNTのための方法は当技術分野ではよく記載されており、当業者には公知だと思われる。しかし、編集がクローニングをせずとも実施可能であることは本発明の利点である。
【００８４】
方法は適切には、遺伝子編集された細胞から作出されたブタを別のブタと交配させて子孫ブタを得ることを含んでいてもよい。好ましくは、子孫ブタは、この動物によって産生されるCD163からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集についてホモ接合性又は二対立遺伝子である。これは、当技術分野では周知であるように、例えば、2頭のヘテロ接合性のブタを交配させることにより達成することが可能である。したがって、一部の実施形態では、方法は適切には、工程c)で生み出されたブタ(この動物によって産生されるCD163からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集についてヘテロ接合性であってもよい)を、この動物によって産生されるCD163からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集についてヘテロ接合性である別のブタと交配させる工程d)を含む。
【００８５】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、
-  ブタ接合子を用意する工程;
-  CD163遺伝子中の適切な標的配列を標的にする部位特異的ヌクレアーゼを接合子に導入する工程;
-  前記部位特異的ヌクレアーゼが前記標的配列で又はその近くでDNAに作用し、それによってCD163タンパク質からのSRCR5の欠失をもたらす編集事象をCD163遺伝子において誘発させるのに適した条件下で、前記接合子をインキュベートする工程;及び
-  前記遺伝子編集された接合子から動物を作製する工程
を含む。
【００８６】
遺伝子編集された接合子は、胚に、最終的には成獣動物になるように生育させることが可能である。上で考察されるように、編集事象が単細胞接合子で起きた場合、したがって、この動物の細胞はすべて改変CD163遺伝子を含む。なぜならば、動物の細胞すべてが単一の遺伝子編集された細胞に由来するからである。編集事象が1つ又は複数の細胞分裂後に起こる場合、この動物は一部の細胞は編集された細胞に由来し一部の細胞は非編集細胞に由来するので、得られた動物はおそらく編集事象についてモザイクになる。
【００８７】
方法は、起きた遺伝子編集事象を特徴付けることを含んでもよい。これを達成するための適切な方法は下に記載されている。
【００８８】
方法は複数の接合子で実施することが可能であり、方法は所望の遺伝的改変が達成されている接合子を選択することを含んでよい。
【００８９】
好ましくは、本発明の方法に従って作出されるブタは、この動物によって産生されるCD163からのSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集についてホモ接合性又は二対立遺伝子である。これは、直接的に工程b)の編集処理の結果として、又は2頭のヘテロ接合性ブタ間のそれに続く交配工程により達成することが可能である。
【００９０】
本発明の第4の態様によれば、遺伝子編集されたブタ細胞又は胚を作出する方法であって、
-  ブタ細胞又は胚を用意する工程;
-  細胞又は胚内の細胞のゲノムを編集してCD163のSRCR5の欠失をもたらすゲノム編集を作り出す工程
を含む方法が提供される。
【００９１】
本発明の第3の態様に関して考察された種々の特長は、必要な変更を加えて本発明の第4の態様に適用される。
【００９２】
本発明の第5の態様によれば、本発明の第3又は第4の態様に従って作出される動物、細胞又は胚が提供される。
【００９３】
本発明の第6の態様によれば、ブタを改変してPRRSVに対するその抵抗性又は耐性を増加する方法であって、ブタにおいて細胞のゲノムを編集してCD163タンパク質のSRCR5ドメインの欠失をもたらす改変を作り出すことを含む方法が提供される。
【００９４】
本発明の第7の態様によれば、SRCR5ドメインが欠失しているCD163タンパク質を発現する又は保有するブタ又はブタの細胞が提供される。細胞は適切には、マクロファージであってもよく、一部の場合、末梢血単球由来マクロファージ(PMM)又は肺胞マクロファージ(PAM)が可能である。
【００９５】
本発明の実施形態は、この時点で添付図面を参照して、非限定的例として記載されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】CRISPR/Cas9を使用するCD163におけるエキソン7欠失の作製A)第5染色体上の豚ゲノムにおけるCD163遺伝子の模式図。CD163 mRNAをコードする16のエキソンは赤で示しており、CD163タンパク質の「真珠の首飾り」構造を形成する9つのスキャベンジャー受容体システインリッチ(SRCR)ドメインは下の種々の色である。隣接するイントロンに位置する2つのガイドRNA(sgSL26及びsgSL28)を使用するエキソン7の切除はコードされたタンパク質からSRCR5を取り除くはずである。sgRNA SL25及びSL27の位置も示されている。B)ガイドRNA sgSL25、sgSL26、sgSL27、及びsgSL28のin vitro評価。PK15細胞はガイドRNA+Cas9をコードする単一プラスミドをトランスフェクトされる又は2つのそのようなプラスミドの組合せをトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞はGFP発現により同定されFACSにより単離された。単一ガイドRNAトランスフェクションの切断効率はCel1サーベイヤーアッセイにより評価された。二重トランスフェクションによるエキソン7欠失の相対的効率はPCRにより評価された。C)接合子中へのCas9/ガイドRNA注入の模式図。注入混合物は接合子の細胞質中に注入され、キャップのない非ポリアデニル化ガイドRNA sgSL26及びsgSL28、並びにキャッピングされたポリアデニル化Cas9 mRNAを含有していた。
【図２】エキソン7を切除すると豚においてSRCR5 CD163欠失が生じるA)生後5か月の3つの異なる△SRCR5遺伝子型を有するオス同胞豚の代表的写真。左、野生型豚628、中央、ヘテロ接合性豚627、及び右、二対立遺伝子豚629。B)肺胞マクロファージ(PAM)の遺伝子型判定。DNAはPAMから抽出し、遺伝子型はイントロン6からエキソン8にわたってPCRにより評価した。非改変ゲノムPCRは900bpの産物を生じると予想され、エキソン7欠失は450bpのPCR産物を生じるはずである。C)肺胞マクロファージのRNA表現型。RNAはPAMから抽出され、オリゴ(dT)プライマーを使用してcDNAに変換され、エキソン4〜9にわたりPCRにより分析した。非改変cDNAは1686bpの産物を生じるはずであり、エキソン7欠失は1371bpの産物をもたらすと予想される。D)PAM由来のCD163のタンパク質表現型。PAM細胞は還元性SDS試料バッファーで溶解され、CD163発現はウェスタンブロットにより分析した。E)PAMにおけるCD163 mRNAレベル。RNAは同数のPAM細胞から抽出され、DNAはDNアーゼ処理により取り除かれ、RNAは1工程RT-qPCRにより定量化した。発現レベルはβ-アクチン発現レベルを使用して、もっとも高いCD163発現動物に合わせて規準化された。エラーバーはSEMを表す、n=3*2。
【図３】△SRCR5肺胞マクロファージ(PAM)は完全に分化し、マクロファージ特異的マーカーを発現する。気管支肺胞洗浄により単離されるPAMは、種々のマクロファージマーカーを用いた染色及びFACS分析により評価した。アイソタイプ対照染色(左側ピーク)と比べた表面発現CD163(右側ピーク)の天然構造に対する染色。
【図４】△SRCR5肺胞マクロファージ(PAM)はPRRSV遺伝子型1を用いた感染に対して感受性がない。A〜C)野生型(wt、左側2棒グラフ)、ヘテロ接合性(het、中央2棒グラフ)、及び△SRCR5(二対立遺伝子又は相同SRCR5欠失)(右側2棒グラフ)動物由来のPAMは、PRRSV遺伝子型1、サブタイプ1(株H2、A)、サブタイプ2(株DAI、B)及びサブタイプ3(株SU1-Bel、C)のMOI(感染効率)=1で接種された。感染の19時間後(hpi)、細胞を切り離し、固定し、抗PRRSV-Nタンパク質抗体及びCD163で染色した。感染はFACS分析により定量化した。感染マクロファージの98%超がCD163陽性と見なされた。感染レベルは、全het又は全bia/homに対して全wtの独立t検定を使用して統計的に分析した。エラーバーはSEMを表す、n=3。D〜F)PRRSV遺伝子型1、サブタイプ1(株H2、C)、サブタイプ2(株DAI、D)及びサブタイプ3(株SU1-Bel、F)の複製成長曲線。野生型(628黒丸、633白丸)、ヘテロ接合性(627黒四角、633白四角)、及び△SRCR5(629三角形下指し、630三角形上指し)動物由来のPAMはそれぞれの株のMOI=0.1で接種された。細胞上澄みは指示時点に収集され、放出されたウイルスRNAをRT-qPCRにより測定した。エラーバーはSEMを表す、n=3*2。G〜J)48hpiに産生された感染粒子のTCID50分析による定量化。時間経過実験の感染の48hpi時点で収集された細胞上澄みは、50%組織培養感染量(TCID50)により定量化された感染ウイルス粒子産生について分析した。感染レベルは、全het又は全△SRCR5に対する全wtの独立t検定を使用して統計的に分析した。エラーバーはSEMを表す、n=3。棒グラフはパネルA〜Cについてと同じである。
【図５】△SRCR5末梢血単球由来マクロファージ(PMM)は完全に分化しマクロファージ特異的マーカーを発現する。末梢血単球は野生型、ヘテロ接合性、及び△SRCR5動物の血液から単離した。組換えヒトコロニー刺激因子1(rhCSF1)の存在下での7日間の培養に続いて、PMMはFACSにより分析した。A)アイソタイプ対照と比べたタンパク質(等高線プロット;628及び633=野生型、627及び364=ヘテロ接合性、629及び630=△SRCR5)の天然構造を認識するCD14-FITC及びCD16-PE抗体を用いた共染色(アイソタイプ対照はそれぞれのグラフで下方左の等高線プロットで表され、マクロファージ特異的マーカーは上方右等高線プロットである)。B)アイソタイプ対照(下方左)と比べたタンパク質(上方右等高線プロット)の天然構造を認識するCD169-FITC及びCD1172a-PE抗体を用いた共染色。C)アイソタイプ対照(下方左)と比べたタンパク質(上方右等高線プロット)の天然構造を認識するSWC9(CD203a)-FITC及びCD151-RPE抗体を用いた共染色。D)アイソタイプ対照染色(左側プロット)と比べた表面発現CD163(右側プロット)の天然構造に対する染色。
【図６】△SRCR5末梢血単球由来マクロファージ(PMM)はヘモグロビン-ハプトグロビン(Hb-Hp)スキャベンジャーとしてまだ機能する。A)Hb-Hp取込みによるヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)発現の誘導。PMMは100μg/mlのHb-Hpの存在下で24時間インキュベートした。RNAは細胞から単離し、ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)mRNAのレベルはRT-qPCRにより決定した(白抜きバーは非誘導、中黒バーHb-Hp取込み誘導されている;左側2つの棒グラフ=野生型、中央2つの棒グラフ=ヘテロ接合性、右側2つの棒グラフ=△SRCR5)。発現レベルはβ-アクチン発現レベルを使用し、それぞれの動物の非刺激HO-1 mRNA発現のレベルに合わせて規準化された。HO-1発現の非誘導対誘導レベルは独立t検定により分析した。エラーバーはSEMを表す、n=3。B)PMMは100μg/molのHb-Hpの存在下で24時間インキュベートした。PMMは還元性SDS試料バッファーで溶解され、HO-1タンパク質発現はウェスタンブロットにより分析した。C)Hb-Hp取込みの定量化。PMMは10μg/mlのHbAF488-Hpの存在下30分間インキュベートされた。HbAF488-Hpの取込み(右側ピーク)は、アイソタイプ対照(左側ピーク)と比べてFACS分析により測定した。Hb-Hp取込みも可視化した。PMMは10μg/mlのHbAF488-Hpと一緒に30分間インキュベートされた。細胞は固定し、透過処理し、CD163に対して及びDAPIを用いて染色した(データは示されず)。
【図７】△SRCR5末梢血単球由来マクロファージ(PMM)はPRRSV遺伝子型1での感染に感受性ではない。A〜C)野生型(左側2棒グラフ)、ヘテロ接合性(中央2棒グラフ)、及び△SRCR5(右側2棒グラフ)動物由来のPAMは、PRRSV遺伝子型1、サブタイプ1(株H2、A)、サブタイプ2(株DAI、B)及びサブタイプ3(株SU1-Bel、C)のMOI(感染効率)=1で接種された。19hpi細胞を切り離し、固定し、抗PRRSV-Nタンパク質抗体及びCD163抗体で染色した。感染はFACS分析により定量化した。感染レベルは、全het又は全△SRCR5に対して全wtの独立t検定を使用して統計的に分析した。エラーバーはSEMを表す、n=3。D〜F)遺伝子型1、サブタイプ1(株H2、D)、サブタイプ2(株DAI、E)及びサブタイプ3(株SU1-Bel、F)を用いた長期感染におけるPMM上でのPRRSVの複製。野生型(628黒丸、633白丸)、ヘテロ接合性(627黒四角、633白四角)、及び△SRCR5(629三角形下指し、630三角形上指し)動物由来のPAMはそれぞれの株のMOI=0.1で接種された。細胞上澄みは指示時点で収集され、放出されたウイルスRNAをRT-qPCRにより測定した。エラーバーはSEMを表す、n=3*2。
【図８】△SRCR5肺胞マクロファージ(PAM)のPRRSV感染は複製/転写複合体の形成に先立って停止される。野生型(上パネル)、ヘテロ接合性(中央パネル)、及び△SRCR5(下パネル)動物由来のPAMは、PRRSV遺伝子型1、サブタイプ1(株H2、上列)、サブタイプ2(株DAI、中央列)及びサブタイプ3(株SU1-Bel、下列)を用いてMOI=2で接種された。22hpi細胞を固定し、抗PRRSV-nsp2抗体、DAPI、及びファロイジンで染色した。
【図９】ファウンダー動物の遺伝子型。A)ファウンダー動物310(f)の遺伝子型。310の遺伝子型はイントロン6からエキソン8にわたるPCRにより評価した。DNA鋳型は2つの耳生検、テールクリッピングから及び軟膜から抽出した。非改変ゲノムPCRは900bpの産物をもたらすと予想され、エキソン7欠失は450bp PCR産物を生じるはずである。対照として非改変同胞(311)のうちの1つからのPCR結果も同様に示されている。B)イントロン6からエキソン8にわたるPCR産物のサンガー塩基配列決定により評価される310の特定の遺伝子型。C)ファウンダー動物345(m)、346(f)、及び347(f)の遺伝子型。動物の遺伝子型はイントロン6からエキソン8にわたるPCRにより評価した。DNA鋳型は2つの耳生検、そのうちの1つだけが耳の先(表皮及び真皮)を含有する、軟膜及び肺胞マクロファージから抽出した。異なる組織試料由来の遺伝子型によりヘテロ接合性とホモ接合性組織のモザイクが明らかにされる。非改変同胞対照動物342、343及び344からのPCR結果も同様に示されている。B)PCR産物のサンガー塩基配列決定により評価される345、346、及び347の特定の遺伝子型。
【図１０】310×345交配からのひと腹の仔の遺伝子型。A)仔豚627〜635及びovl/SB(Ovl=オーバーレイド豚、SB=死産の)仔豚の遺伝子型はイントロン6からエキソン8にわたるPCRにより評価した。DNA鋳型は耳生検から抽出した。非改変ゲノムPCRは900bpの産物をもたらすと予想され、エキソン7欠失は450bp PCR産物を生じるはずである。B)指示遺伝子型を有する家系図。画像では、310及び345のヘテロ接合性遺伝子型は濃淡で表され、濃い灰色は編集された対立遺伝子を示し、薄い灰色は非改変(対立遺伝子)を示す。310及び345は両方の動物にモザイクが見られるがヘテロ接合性として表される。なぜならば、これは生殖系列に見出される遺伝子型を表すからである。630は310由来の編集された対立遺伝子についてホモ接合性である。627、634、635、OVL/SB1、OVL/SB2、OVL/SB4は345由来の1つの編集された対立遺伝子を有する異種性であり、その他は非変更である。629は、345由来の1つの編集された対立遺伝子及び310由来の1つを有するヘテロ接合性である。
【図１１Ａ】△SRCR5豚の作製及び実験準備。△SRCR5豚を作製するためのゲノム編集。ゲノム編集ファウンダー動物は、CD163においてエキソン7の欠失を作製するための2つのガイドRNA、sgSL26及びsgSL28を組み合わせて使用するCRISPR/Cas9編集試薬の接合子注入により作製された。両方のガイドRNAの切断部位できれいな再ライゲーションを示す1つの遺伝子型に焦点を合わせて、動物を繁殖させてF1及びF2世代を生み出した。ホモ接合性のF2世代動物は両方の対立遺伝子にこの遺伝子型を保有する(下)。
【図１１Ｂ】△SRCR5ブタの作製及び実験準備。F2動物の肺胞マクロファージにおける△SRCR5の構造予測及び発現。左: RaptorXを使用するタンパク質構造予測は、SRCR5の欠失により未変化のタンパク質産物に対してずれている。
【図１１Ｃ】△SRCR5ブタの作製及び実験準備。負荷研究の実験設計。F1世代動物のヘテロ接合性/ヘテロ接合性交配由来の4つのホモ接合性(緑色)及び4つの野生型(オレンジ色)同胞は離乳から共同収容した。遺伝子型はエキソン7にわたるPCR増幅により(図1A参照)及びサンガー塩基配列決定により確かめた。仔豚は離乳後共同収容され、特定病原体除去ユニットに1週間環境順化された後、生後7〜8週で14日間負荷の0日目及び1日目に、5E6 TCID50のPRRSV-1、サブタイプ2株BOR-57を鼻腔内に接種された。
【図１２】△SRCR5豚は可溶性C163の正常な血清レベルを示す。負荷の2週間前及び0日目に収集された血清試料は、市販のELISAを使用して存在するsCD163のレベルについて評価した。n=2*2*3、最小/最大及び90パーセンタイルを示す。独立t検定を使用する統計的分析では有意差は示されなかった。
【図１３−１】図１３。△SRCR5豚はPRRSV-1感染の臨床徴候もウイルス複製も病態も示さない。A)BOR-57を用いた負荷中の△SRCR5(白丸)及び野生型仔豚(黒四角)の直腸温。直腸温は給餌中に毎日測定した。エラーバーはSEMを表す、n=4。B)負荷の0、7及び14日目の体重測定に基づく平均一日体重増加。A及びB;統計的分析は二元配置分散分析及びシダック多重比較検定を使用して実施した。C)BOR-57を用いた負荷中のウイルス血症。血清試料は0、3、7、10、及び14日目に真空チューブを使用して頸静脈から収集し、ウイルスRNAは単離しBOR-57のORF5に特異的であるプライマーを用いるRT-qPCRを使用して定量化した。D)負荷中のPRRSV-1に対する抗体応答。血清試料はIDEXX PRRSV X3 ELISA試験を使用してPRRSV抗体の存在について分析した。<0.40=陰性;≧0.4=陽性。E)肺及びリンパ節病態、病理組織学及び免疫組織化学スコア。左のバーは△SRCR5を表し、右のバーは野生型豚を表す。肺の病態は盲検様式で評価され、確立したスコアリング方式を使用する著しい肺病変の重症度を表す主観的スコアーを適用した(スケール0〜100)。肺病理組織学切片は、間質性肺炎の存在及び重症度について0から6までの範囲でスコアー化した(0、正常;1、穏やかな多巣性;2、穏やかな瀰漫性;3、中程度の多巣性;4、中程度の瀰漫性;5、重篤な多巣性;6、重篤な瀰漫性)。肺及びリンパ節切片のPRRSV-Nに対する免疫組織化学染色は0から3までの範囲でスコアー化した(0、シグナルなし;1、低い数の陽性細胞;2、中程度の数の陽性細胞;3、大量)。F)肺組織学及び免疫組織化学。上:負荷後14日目の剖検由来のホルマリン固定、パラフィン包埋、ヘマトキシリン及びエオシン染色肺切片。左:△SRCR5、右:野生型仔豚。スケールバーは100μmを表す。下:PRRSV抗原に対するホルマリン固定、パラフィン包埋免疫組織化学染色及びヘマトキシリン対比染色。左:△SRCR5、右:野生型仔豚。スケールバーは50μmを表す。G)肺病態。負荷14日後の剖検での豚由来の肺;左、2頭の△SRCR5豚由来の肺及び右、2頭の野生型豚由来の肺。
【図１３−２】図１３の続き。
【図１４−１】図１４。△SRCR5豚は正常なサイトカインレベルを示すがBOR-57 PRRSV感染に対するサイトカイン応答を示さない。負荷に先立って0日目に並びに負荷3、7、10、及び14日目に収集された血清試料のサイトカインレベルはサイトカイン抗体アレイを使用して測定した。△SRCR5=黒丸及び野生型仔豚=黒四角。A)インターフェロンα(IFNα)、B)インターロイキン17A(IL-17A)、C)インターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)、D)インターロイキン4(IL-4)、E)インターロイキン6(IL-6)、F)インターロイキン4(IL-4)、G)ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン(MIG/CXCL9)、H)マクロファージ炎症性タンパク質-1β(MIP-1β/CCL4)、I)ケモカインリガンド3様1(CCL3L1)、J)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、K)腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、L)インターロイキン12(IL-12)、M)インターロイキン1ベータ(IL-1β)、N)インターロイキン10(IL-10)、O)形質転換増殖因子ベータ1(TGFβ1)、P)インターフェロンガンマ(IFNγ)、Q)インターロイキン18(IL-18)、R)血小板内皮細胞接着分子(PECAM-1/CD31)、S)インターロイキン1アルファ(IL-1α)、T)インターロイキン13(IL-13)。エラーバーはSEMを表す。n=2*4。統計的分析は二元配置分散分析及びシダック多重比較検定を使用して実施した。
【図１４−２】図１４の続き。
【図１４−３】図１４の続き。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
本発明の種々の実施形態の作製及び使用は下で詳細に考察されるが、本発明は多種多様な特定の文脈で具体化することが可能な多くの適用可能で創意に富んだ発想を提供することは認識するべきである。本明細書で考察される特定の実施形態は、本発明を生み出し使用する特定の方法を説明するだけであり、本発明の範囲を定めるものではない。
【００９８】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語が下で定義される。本明細書で定義される用語は本発明に関連する分野の当業者が一般に理解している意味を有する。「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「その(the)」は単数の実体のみに言及することを意図しておらず、その特定の例を説明のために使用することがある一般的クラスを含む。本明細書の用語は本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、その使用は、特許請求の範囲で概要を述べる場合を除き、本発明の範囲を定めるものではない。
【００９９】
本明細書で使用される用語「ブタ(swine)」又はその変異形とは、イノシシ属(Sus)並びにペッカリー、バビルサ、及びイボイノシシを含む他の関連種の動物を含む偶蹄類のイノシシ科(Suidae)の動物のうちのいずれかのことである。
【０１００】
本明細書で使用される用語「豚(pig)」又はその変異形とは、イノシシ属の動物のうちのいずれかのことである。この用語は、家畜豚(Sus scrofa domesticus又はSus domesticus)及びその先祖である一般的なユーラシアイノシシ(Sus scrofa)を含む。本目的では、家畜豚は、Sus scrofa種の亜種と考えられている。家畜ブタはペッカリー、バビルサ、及びイボイノシシを含まない。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「家畜豚」とは、Sus scrofa domesticus亜種の動物のことである。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「部位特異的ヌクレアーゼ」又はその変異形とは、所望の位置でDNAを切断するように設計することが可能な操作されたヌクレアーゼのことである。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、操作ヌクレアーゼ、目標設定可能ヌクレアーゼ、ゲノム編集ヌクレアーゼ、分子ハサミ、及びこの種の物としても知られている。部位特異的ヌクレアーゼの例は、Znフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casシステム(CRISPR/Cas)、及びハイブリッドメガヌクレアーゼ等のメガヌクレアーゼを含む。
【０１０３】
主題の生物学的材料に関連して使用される場合の「遺伝子編集された」又は「遺伝子改変された」とは、主題の生物学的材料が、対照、例えば、野生型、生物学的材料と比べてその遺伝的改変を生み出すように処理されているという事実のことである。
【０１０４】
「標的部位」とは、部位特異的ヌクレアーゼが結合する核酸配列を有する部位のことである。部位特異的ヌクレアーゼが標的部位で結合する場合、このヌクレアーゼは標的部位内で又はその近くでDNAを切断するように作用し(これは単一の部位特異的ヌクレアーゼ、又は対応する対のヌクレアーゼにより達成することが可能であり、その場合には、必要に応じて2つのいわゆる「半部位」が存在することになる)、切断の場所は「カット部位(cut site)」又は「切断部位(cutting site)」と呼ばれる。標的部位が上の部位特異的ヌクレアーゼに対して定義される場合、カット部位は適切には、標的部位内に、又は標的部位の近くにある。標的部位がゲノムの特定のフィーチャー、例えば、編集事象において欠失される又は保存されるフィーチャー(エキソン7又はスプライス部位等の)近くに又は隣接してあると述べられる場合、切断部位は所望の成果を達成する、すなわち、必要に応じてフィーチャーの欠失又は保存をもたらすように位置しているはずである。部位特異的ヌクレアーゼはいかなる所望の標的部位でも標的にするように設計することが可能であり、例えば、CRISPR/Cas9を用いれば、適切なsgRNAを使用してこれを達成することが可能であり、ZFN又はTALENでは適切なタンパク質は設計する及び市販の供給源から得ることが可能である。
【０１０５】
「△SRCR5」とは、二対立遺伝子又はホモ接合性CD163 SRCR5欠失を含む動物、典型的にはブタのことである。
【０１０６】
核酸配列(ゲノムの領域又は遺伝子等の)に関連して「変更のない」とは、配列が野生型配列から変更されていないことを意味する。
【０１０７】
「耐性又は抵抗性」 - 動物は、動物をPRRSV感染で負荷したときに、死亡率、罹患率、著しい病的状態(例えば、体重減少又は成長率の減少)を示す動物の割合、病的状態のレベル又は病的状態の持続期間が低減された場合には、PRSSV感染に対してより耐性又は抵抗性であると言える。同じ病原性レベル(理想的には同じ分離菌)のPRRSVに曝露された場合の遺伝子編集された豚の集団と同等の編集されていない豚の集団の間の死亡率又は罹患率のいかなる統計的に有意な減少でも(例えば、適切な検定を使用して95%信頼度、又は99%信頼度)、耐性又は抵抗性が改善されたことを示す。改善された耐性又は抵抗性は、PRRSV感染に対する感受性の低減、又は感染が生じた場合の症状の減弱により示すことが可能である。ブタにおける感染に対する改善された抵抗性は、PAM及びPMM細胞について下に記載されている方法を使用してin vitroで試験することが可能である。
【０１０８】
本明細書で使用される「タンパク質」及び「ペプチド」は互換的に使用されることが可能であり(文脈が他の方法で示唆していなければ)、ペプチジル結合により連結されている少なくとも2つの共有結合されたアミノ酸を意味する。用語タンパク質は精製された天然産物、又は組換え若しくは合成技法を使用して部分的に若しくは全体的に産生することができる産物を包含する。用語ペプチド及びタンパク質とは、ダイマー又は他のマルチマー等のタンパク質の凝集体、融合タンパク質、タンパク質変異体、又はその誘導体のことでもよい。タンパク質は、核酸コドンによりコードされていないアミノ酸、すなわち、非天然アミノ酸を含んでもよい。
【０１０９】
導入
PRRSは、世界中で豚を冒すもっとも経済的に重大な感染性疾患である。「ミステリーブタ疾患」は1980年代後半にはじめて北米と欧州でほぼ同時に観察された[1、2]。PRRSの原因物質はウイルスであると同定され、後にPRRSウイルス(PRRSV)と名付けられた。感染した豚は、食欲不振、発熱、嗜眠、及び呼吸困難を含む症状を示す場合がある。しかし、PRRSV感染のもっとも壊滅的な効果は若い仔豚及び妊娠した雌豚において観察される。妊娠した雌豚では、PRRSVの感染は胎盤の部分的なずれを引き起こし、完全な妊娠中絶又は子宮内での胎仔の死亡及びミイラ化をもたらす[3]。後期妊娠中絶は感染した雌豚の最大30%で起き、同腹仔は最大100%の死産仔豚が入っている。出産前感染からの出生仔豚は多くの場合、虚弱で重篤な呼吸器症状を示し、最大80%の出生仔豚は離乳前の週単位で死亡する[4、5]。PRRSVに感染した若い仔豚は多くの場合、下痢及び肺では病変により引き起こされる重篤な呼吸困難を示す。離乳前仔豚では、感染は、感染した雌豚の乳腺分泌物を介して伝染することがある[6]。この年齢では、感染は最大80%の動物で致死性の結果が出る。離乳後、死亡率は低減するが、低減する1日増体量及び飼料効率のせいで続く経済損失が多くの場合、観察される[4、7、8]。すべてのPRRSV感染豚における妊娠の低減又は消失、若い仔豚の死亡、及び成長率の減少のせいで、合衆国だけでも豚肉生産者たちは毎年6億5000万ドルを超える損失を出していると推定されている[9、10]。
【０１１０】
PRRSVは、ニドウイルス(Nidovirales)目のアルテルウイルス(Arteriviridae)科に属するエンベローププラス鎖RNAウイルスである[11、12]。PRRSVゲノム(約15kb)は少なくとも12の非構造及び7つの構造タンパク質をコードする。ウイルスRNAはヌクレオカプシドタンパク質Nに包まれ、このタンパク質はリポタンパク質エンベロープに取り囲まれ、これは非グリコシル化膜タンパク質M及びE、並びに4つのグリコシル化糖タンパク質GP2、GP3、GP4、及びGP5を含有し、GP2、3、及び4は複合体を形成している[13〜17]。
【０１１１】
PRRSVは極めて狭い宿主範囲を有し、ブタマクロファージの特定のサブセットだけに感染する[18〜20]。イノシシ科の上科内でPRRSV感染がどれほど広範囲なのかはまだ分かっていない。ヨーロッパイノシシはPRRSVの保有体として作用することが明らかにされていたが[21]、赤川猪及びイボイノシシ等のアフリカイノシシでは感染についてはほとんど分かっていない。in vitroウイルス複製はアフリカミドリザル細胞株MARC-145により支持されている。マクロファージ内へのPRRSVの侵入は、pH依存性受容体媒介エンドサイトーシスを介して起こることが明らかにされている[22、23]。種々の付着因子及び受容体がPRRSV侵入過程に関与していることが指摘されてきた([24]に概説されている)。ヘパラン硫酸はウイルスの付着因子として初期に同定された[25〜27]。MARC-145細胞ではなく、肺胞マクロファージ(PAM)のin vitro感染は、マクロファージの表面で発現されるレクチンである、CD169(シアロアドヘシン)を標的にする抗体により阻害されることが明らかにされた[28]。以前は非許容PK-15細胞でのCD169の過剰発現はPRRSVの内部移行を示したが、増殖性複製は示さなかった[29]。最後に、CD169遺伝子がノックアウトされている遺伝子改変された豚のin vivo負荷により、PRRSV感染に対する抵抗性が増加していないことが明らかになり、CD169はPRRSV感染に不可欠ではない付着因子であることが示唆される[30]。細胞表面タンパク質発現はPRRSV結合及び内部移行の主な決定要因であるけれども、細胞表面付着因子の間には重複性が存在すると思われ、追加の未確認の受容体が関与している可能性がある[31]。スキャベンジャー受容体CD163は、ハプトグロビンスキャベンジャー受容体又はp155としても知られるが、マクロファージの特定のサブタイプ上で発現され、PRRSVに対する融合受容体として同定されていた。CD163の細胞外部分は、9つのスキャベンジャー受容体システインリッチ(SRCR)ドメインの真珠の首飾り構造を形成し、単一の膜貫通セグメント及び短い細胞質ドメインにより固定されている[32]。CD163は、全身性炎症を媒介する及び血漿からのヘモグロビンの除去を含む種々の生物学的機能を有する([33、34]に概論されている)。CD163が過剰発現されると非感受性細胞がPRRSV感染に対して許容性になり[35]、それによりCD163は内部移行を媒介しないが融合には極めて重要であることが見出された[36]。膜貫通アンカリング及びCD163のSRCRドメイン5(SRCR5)との相互作用が、PRRSVを用いた感染の成功には不可欠であることが見出された[34、35]。CD163ノックアウト豚を用いた最近のin vivo実験が実施された[37]。しかし、CD163は重要な生物学的機能を有するので、完全にノックアウトすると、特に、他の病原体による炎症及び/又は感染に関してマイナスの生理的影響豚が得られるおそれがある。
【０１１２】
この研究は定義されたCD163 SRCR5欠失のある豚を作製し、PRRSV感染に対するこれらの豚由来のマクロファージの感受性を評価することを目標とした。
【０１１３】
材料及び方法
すべての動物研究は、エジンバラ大学動物倫理委員会による審査後英国内務省ライセンス下で承認され、承認されたガイドラインに従って実行された。
【０１１４】
細胞及びウイルス
PRRSV遺伝子型1、サブタイプ1株H2(PRRSV H2)[52]、サブタイプ2株DAI(PRRSV DAI)[53]、及びサブタイプ3株SUI-Bel(PRRSV SUI-Bel)[54]の増殖のための主な肺胞マクロファージ(PAM)は、以前記載された通りに生後6〜9週の野生型余剰研究動物から収穫した[45]。手短に言えば、動物はスケジュール1方法に従って安楽死させた。肺は取り除いて氷上の無菌環境に移した。PAMは、マクロファージを放出するようマッサージしながら肺を温PBSで2度洗浄することにより肺から抽出した。細胞は400gで10分間の遠心分離により収集した。必要な場合は、赤血球は、PBSで再び洗浄する前に5分間赤血球溶解バッファー(10mMのKHCO3、155mMのNH4Cl、0.1mMのEDTA、pH8.0)を使用して取り除いた。細胞は以前と同様に遠心分離で収集し、90%のFBS(HI、GE Healthcare社)、10%のDMSO(Sigma社)で凍結させた。細胞は-150℃に移す前に-80℃冷凍庫で1℃/分で徐々に凍結させた。
【０１１５】
動物627、628、629、630、633、及び634由来のPAMは生後8週間で収集した。このため、仔豚はケタミン/アザペロン麻酔前投薬混合物を使用して鎮静させ、ケタミン/ミダゾランで麻酔した。手順中を通した麻酔はセボフルランを使用して維持した。PAMは、気流アクセス付きの挿管を通した気管支肺胞洗浄(BAL)により収集した。3つの肺切片はそれぞれの動物において2×20mlのPBSを使用して洗い流した。液体回収は60〜80%の間であった。細胞はBAL液体から400gで10分間遠心分離により収集し、上記の通りに凍結させた。
【０１１６】
末梢血単球(PBMC)は以前記載された通りに単離した[45]。手短に言えば、生後10週間の仔豚の頸静脈からEDTA被覆真空チューブを使用して収集した。血液は1200gで15分間遠心分離され、軟膜はPBSに移された。Lymphoprep(Axis-Shield社)は等容積の軟膜/PBSで表面を覆われ400gで45分間遠心分離した。単核細胞画分はPBSで洗浄し、細胞は上記の通りに収集し凍結した。
【０１１７】
PAM細胞は、RPMI-1640、Glutamax(Invitrogen社)、10%のFBS(HI、Ge Healthcare社)、100IU/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen社)(cRPMI)において培養した。PBMCは、rhCSF-1(1×104ユニット/ml;Chironより寄贈)を補充したcRPMIにおいて感染に先立つ6日間培養した。
【０１１８】
PK15細胞は、Glutamax(Invitrogen社)、10%のFBS(HI、Ge Healthcare社)、100IU/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen社)を補充したDMEMにおいて培養した。
【０１１９】
ガイドRNAの設計及びin vitro切断効率評価
200bpのイントロン6において3つの潜在的なガイドRNA配列を及び97bp長のイントロン7において1つを選択した。オリゴマー(Invitrogen社)を注文し、以前記載された通りにハイブリダイズし[72]、次にプラスミドpSL66のBbsl部位にライゲートした([42]により記載された通りにsgRNAスキャフォールドに改変を加えたp×458の誘導体)。作製されたプラスミドは、ガイドRNA配列の発現を駆動するhU6プロモーター並びにCas9のN終端にSV40核移行シグナル(NLS)及びC終端にヌクレオプラスミンNLSを有するCas9-2A-GFPを駆動するCBAプロモーターを含有する。それぞれのガイドの切断効率は、Neonトランスフェクションシステム(Invitrogen社)セットを1400mV、2パルスの20mSで使用する豚PK15細胞中へのプラスミドのトランスフェクションにより評価した。トランスフェクション48時間後GFP陽性細胞は、FACS AriaIII細胞選別機(Becton Dickinson社)を使用して収集し、ゲノムDNAの調製に先立って更に4日間培養した(DNeasy Blood & Tissues Kit、Qiagen社)。標的部位にわたるPCRは、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼHiFi(Life Technologies社)を使用してoSL46(ACCTTGATGATTGCGCTCTT-配列番号17)及びoSL47 (TGTCCCAGTGAGAGTTGCAG-配列番号18)を用い、940bpの産物を産生した。細胞アッセイ(Transgenomic社;サーベイヤー突然変異検出キット)は以前に記載された通りに実施した[73]。PK15細胞とエキソン7に隣接するガイドをコードするプラスミドの対の同時トランスフェクションは、細胞をGFP発現のための濃縮なしにトランスフェクション後40時間で収穫したこと以外、上記の通りに実行した。この例では、940bp断片に加えて切断型PCR産物が観察され、エキソン7の欠失を示していた。
【０１２０】
単一と二重切断効率の両方に基づいて、ガイドRNA SL26(GAATCGGCTAAGCCCACTGT-配列番号7)、エキソン7の121bp上流に位置している、及びSL28(CCCATGCCATGAAGAGGGTA-配列番号11)、エキソン7の30bp下流に位置している、をin vivo実験のために選択した。
【０１２１】
ガイドRNAの作製及び品質評価
全ガイドRNAスキャフォールド及びT7プロモーターを含有するDNAオリゴマー断片は、それぞれのプラスミド鋳型からPCRにより以下の通りに作製された。T7プロモーターを含有するフォワードプライマー続いて第1の18bpのそれぞれのガイドRNA及びリバースプライマーoSL6(AAAAGCACCGACTCGGTGCC-配列番号19)をPhusionポリメラーゼ(NEB社)と組み合わせて使用した。DNA断片は、MinEluteゲル抽出キット(Qiagen社)を製造業者の使用説明書に従って使用して1.5%アガロースゲル上で精製した。DNA溶出液は、10mMのトリスHCl pH8.0、0.5%のSDS中200μg/mlのプロテイナーゼK(Qiagen社)を用いて、50℃で30分間更に処理し、続いてフェノール/クロロホルム抽出を行った。ガイドRNAは得られたDNA断片から、MEGAshortscriptキット(Thermo Fisher社)を製造業者の使用説明書に従って使用して作製した。RNAはフェノール/クロロホルム抽出続いてエタノール沈殿を使用して精製し、EmbryoMax注射バッファー(Millipore社)に再懸濁した。RNAの純度及び濃度はAgilent TapeStation上でRNA Screen Tape(Agilent社)を製造業者の使用説明書に従って使用して評価した。
【０１２２】
接合子注入及び移送
胚は以前記載された通りにLarge White若雌豚から生み出した[73]。手短に言えば、若雌豚は、発情に続く11日目と15日目の間regumate/PMSG/Chorulonレジームを使用して過排卵させた。加熱に続いて、ドナー若雌豚は6時間間隔で2度受精させた。接合子は交配させたドナーからNCSU-23  HEPES基本培地に外科的に回収し、次に、EmbryoMax注射バッファー(Millipore社)中50ng/μlのそれぞれのガイド(SL26及びSL28)及び100ng/μlのCas9 mRNA(PAN Bio社又はTri-Link社)を含有する注射混合物を用いる単一2〜5pl細胞質注射を受けさせた。レシピエント雌はドナー若雌豚と同一に処理されたが交配されないままであった。手術中、生殖器系は露出され、24〜39の接合子を3.5フレンチスケールトムキャットカテーテルを使用してレシピエントの輸卵管に移した。産仔数は仔豚5〜12頭の範囲に及んだ。
【０１２３】
胚盤胞におけるゲノム編集のin vitro評価
非注入対照接合子及び注入過剰接合子は、システイン及びBSAを補充したNCSU-23 HEPES基本培地において38.5℃で5〜7日間培養する。胚盤胞は培養後7日目に収穫し、ゲノムはREPLI-gミニキット(Qiagen社)を製造業者の使用説明書に従って使用して増幅させた。遺伝子型判定は下に記載される通りに実施した。
【０１２４】
遺伝子型判定
ゲノムDNAは、DNeasy血液及び組織キット(Qiagen社)を使用して産後2日目の仔豚から採取した耳生検又はテールクリッピングから抽出した。イントロン6からエキソン8にまたがる領域は、プライマーoSL46(ACCTTGATGATTGCGCTCTT-配列番号17)及びoSL47(TGTCCCAGTGAGAGTTGCAG - 配列番号18)を使用して増幅させ、無傷の対立遺伝子から904bpの産物を、エキソン7の完全欠失が起きていた場合には454bpの産物を生み出した。PCR産物は、1%アガロースゲル上での分離及びそれに続くすべての切断型断片のサンガー塩基配列決定により分析した。野生型長に一致する断片はT7エンドヌクレアーゼI(NEB社)消化により製造業者の使用説明書に従って更に分析した。
【０１２５】
RNA表現型決定
RNAは、オンカラムDNアーゼ消化を含む、RNeasyミニキット(Qiagen社)を製造業者の使用説明書に従って使用して、上記の通りにBALにより単離された1E6 PAM細胞から単離した。第1鎖cDNAはOligo-dTプライマーをSuperScript IIリバース転写酵素(Invitrogen社)と組み合わせ、製造業者の使用説明書に従って使用して合成した。そのcDNAを使用して、プライマーP0083(ATGGATCTGATTTAGAGATGAGGC - 配列番号20)及びP0084(CTATGCAGGCAACACCATTTTCT - 配列番号21)を使用してエキソン4から9にわたるRNA表現型を評価し、無傷の対立遺伝子では1686bp長の及びエキソン7の正確な欠失に続いて1371bpのPCR産物が得られた。PCR産物は、1%アガロースゲル上での分離及びそれに続く欠失断片のサンガー塩基配列決定により分析した。
【０１２６】
ウェスタンブロットによるタンパク質表現型分析
BALにより単離された4E5 PAM細胞は300rcfで10分間の遠心分離により収集した。ペレットは100mMのDTTを含有するLaemmli試料バッファーに再懸濁し、95℃で10分間沸騰させ、7.5%のアクリルアミド(Bio-Rad社)ゲル上で電気泳動にかけた。ニトロセルロース膜(Amersham社)に移した後、細胞タンパク質の存在はCD163に対する抗体(rabbit pAb、abcam、ab87099)を1μg/mlで、βアクチン(HRPタグ付、マウスmAb、Sigma社、A3854)を1対2000で用いて探索した。CD163では、ブロットはそれに続いてHRP標識ウサギ抗マウス抗体(DAKO社、P0260)と一緒に1対5000でインキュベートした。HRP標識抗体の結合は、Pierce ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Fisher社)を製造業者の使用説明書に従って使用して視覚化した。
【０１２７】
RT-qPCRによるCD163 mRNAの定量化
RNAは、オンカラムDNアーゼ消化を含む、RNeasyミニキット(Qiagen社)を製造業者の使用説明書に従って使用して1E6 PAMから単離した。RNAレベルは、LightCycler 480(Roche社)上でGoTaq 1-Step RT-qPCRシステム(Promega社)を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。CD163のmRNAレベルは、プライマーP0074(CATGGACACGAGTCTGCTCT - 配列番号22)及びP0075 (GCTGCCTCCACCTTTAAGTC-配列番号23)を使用して定量化し、βアクチンの基準mRNAレベルはプライマーP0081(CCCTGGAGAAGAGCTACGAG - 配列番号24)及びP0082 (AAGGTAGTTTCGTGGATGCC-配列番号25)を使用して定量化した。
【０１２８】
フローサイトメトリーによるマクロファージの特徴付け
PAMは分析の1日前に播種した。PBMCは分析の7日前に播種し、CSF1刺激により分化させてPBMC由来マクロファージ(PMM)を得た。細胞はラバーポリスマンを用いた掻把により収穫し、室温で15分間4%のホルムアルデヒド/PBSに固定した。細胞は抗体で染色する前に45分間ブロッキング液(PBS、3%のBSA)と一緒にインキュベートした。細胞は、マウス抗豚CD14(AbD Serotec社、MGA1273F、1対50)及びマウス抗豚CD16(AbD Serotec社、MCA2311PE、1対200)、マウス抗豚CD169(AbD Serotec社、MCA2316F、1対50)及びマウス抗豚CD172a(SoutherBiotech社、4525-09、1対400)、マウス抗ヒトCD151(AbD Serotec社、MCA1856PE、1対50)及びマウス抗豚SWC9(CD203a)(AbD Serotec社、MCA1973F、1対50)、マウス抗豚CD163(AbD Serotec社、MCA2311PE、1対50)、又はマウスIgG1若しくはIgG2b負の対照(AbD Serotec社、MCA928PE、MCA691F、又はSigma社、F6397;一次抗体と同じ濃度)を標的にする抗体で染色した。細胞はPBSで3回洗浄し、FACSバッファー(PBS中2%のFBS、0.05MのEDTA、0.2%のNaN3)に再懸濁した。抗体標識により判定される遺伝子発現は、FlowJoソフトウェアを使用してFACS Calibur(Becton Dickinson社)上でFACS分析により評価した。
【０１２９】
高MOI一回ラウンド感染アッセイ
PAMは分析の1日前に播種した。PBMCは分析の7日前に播種し、CSF1刺激により分化してPBMC由来マクロファージPMMを得た。細胞は、37℃で3時間cRPMI中それぞれのウイルス株(PRRSV H2、DAI、又はSU1-Bel)のMOI=1で接種した。接種材料は温cRPMIで置き換えた。19hpiで、細胞は細胞こてを使用することにより引き離した。細胞は室温で15分間PBS(Gibco社)中4%のホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)に固定し、PBSで洗浄し、それに続いて0.1%のTriton-X-100(Alfa Aesar社)を含有するPBSで10分間透過処理した。細胞は、PBS中3%のBSAにおいて上記の通り、PRRSV-N(SDOW17-F、RTI、KSL0607、1対200)及びCD163(AbD Serotec社、MCA2311PE、1対50)又はマウスIgG1負の対照に対する抗体と一緒にインキュベートした。細胞はPBSで3回洗浄し、FACSバッファーに再懸濁した。感染レベルは、抗体標識により判定されるが、FlowJoソフトウェアを使用してFACS Calibur(Becton Dickinson社)上でFACS分析により評価した。
【０１３０】
低MOI複数回ラウンド感染アッセイ
PAMは感染の1日前に播種した。PBMCは分析の7日前に播種し、rhCSF1刺激により分化してPMMを得た。細胞は、37℃で3時間cRPMI中それぞれのウイルス株(PRRSV H2、DAI、又はSU1-Bel)をMOI=1で接種した。接種材料は取り除き、細胞は1×PBSで洗浄し、感染を続けた。指示された時点で接種試料を収穫して評価した。時間経過からすべての試料を収集した後は、すべての試料は凍結させ、処理した。
【０１３１】
ウイルスRNA(vRNA)はQIAmpウイルスRNAミニキットを製造業者の使用説明書に従って使用して上澄み試料から抽出した。ウイルスRNAレベルは、PRRSV H2及びSU1-BelにはGoTaq Probe 1-Step RT-qPCRシステム(Promega社)を、PRRSV DAIにはGoTaq 1-Step RT-qPCRシステム(Promega社)を製造業者の使用説明書に従って使用してRT-qPCRにより定量化した。このため、以下のプライマー及びプローブを使用した:H2 fwd(GATGACRTCCGGCAYC-配列番号26)、H2 rev(CAGTTCCTGCGCCTTGAT-配列番号27)、H2プローブ(6-FAM-TGCAATCGATCCAGACGGCTT-TAMRA-配列番号28)、(JP Frossard、AHVLAから得られた最適H2プライマー/プローブ配列)、SU1-Bel fwd(TCTTTGTTTGCAATCGATCC-配列番号29)、SU1-Bel rev(GGCGCACTGTATGACTGACT-配列番号30)、SU1-Belプローブ(6-FAM-CCGGAACTGCGCTTTCA-TAMRA-配列番号31)、DAI fwd(GGATACTATCACGGGCGGTA-配列番号32)、DAI rev(GGCACGCCATACAATTCTTA-配列番号33)。RNAレベルは、高タイターストックのvRNA分離物から作製した標準曲線を使用してLightCycler 480(Roche社)上で測定した。
【０１３２】
作製されたウイルスの感染力は、野生型過剰研究動物から単離されたPAMについての選択された時点でのTCID50アッセイを使用して評価した。
【０１３３】
PMMのHb-Hp刺激によるヘムオキシゲナーゼ1のmRNA及びタンパク質レベル
PBMCは分析の7日前に播種し、CSF1刺激により分化してPMMを得た。ヘモグロビン(Hb、Sigma-Aldrich社、A0、H0267)及びハプトグロビン(Hp、Sigma Aldrich社、表現型2-2、H9762)は、実験前に縦型ローラー上で15分間PBS中1対1 wt/wt比で混合した。PMMは37℃で24時間cRPMI中100μg/mlのHb-Hpと一緒にインキュベートした。細胞はラバーポリスマンを用いた掻把により収穫した。RNAは、オンカラムDNアーゼ消化を含む、RNeasyミニキット(Qiagen社)を製造業者の使用説明書に従って使用して1E6細胞から単離した。RNAレベルは、LightCycler 480(Roche社)上でGoTaq Probe 1-Step RT-qPCRシステム(Promega社)を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。ヘムオキシゲナーゼ(HO-1)のmRNAレベルは、プライマーP0239(TACATGGGTGACCTGTCTGG-配列番号34)及びP0240(ACAGCTGCTTGAACTTGGTG-配列番号35)を使用して並びにβアクチンの基準mRNAレベルはプライマーP0081及びP0082を使用して定量化した。HO-1のタンパク質レベルの分析では、細胞は、300rcfで10分間遠心分離により収集した。ペレットは100mMのDTTを含有するLaemmli試料バッファーに再懸濁し、95℃で10分間沸騰させ、12%のアクリルアミド(Bio-Rad社)ゲル上で電気泳動にかけた。ニトロセルロース膜(Amersham社)に移した後、細胞タンパク質の存在は、HO-1(マウスmAb、abcam、ab13248、1対250)、及びカルモジュリン(ウサギmAb、abcam、ab45689、1対1000)に対する抗体を用いて探索した。ブロットは、1対5000でHRP標識ヤギ抗ウサギ抗体(DAKO社、PI-1000)と一緒にインキュベートした。HRP標識抗体の結合は、Pierce ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Fisher社)を製造業者の使用説明書に従って使用して視覚化した。
【０１３４】
ヘモグロビン-ハプトグロビン取込みの定量化及び視覚化
PBMCは分析の7日前に播種し、CSF1刺激により分化してPMMを得た。蛍光顕微鏡では、細胞はガラスカバースリップ上に播種した。ヘモグロビン(Sigma-Aldrich社、A0、H0267)はタンパク質標識キット(Molecular Probes社)を製造業者の使用説明書に従って使用してAlexa Fluor 488(AF-488)で標識した。HbAF488及びHpは実験前に縦型ローラー上で15分間PBS中1対1 wt/wt比で混合した。PMMは37℃で30分間cRPMI中10μg/mlのHbAF488-Hpと一緒にインキュベートした。
【０１３５】
FACSによる定量化では、細胞は、以前記載された通りに、ラバーポリスマンを用いて収集しCa2+/Mg2+無しPBSで3回洗浄して表面結合HbAF488-Hpを取り除いた[60]。細胞は室温で15分間PBS(Gibco社)中4%(wt/v)のホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)に固定し、PBSで洗浄し、それに続いて0.1%のTriton-X-100(Alfa Aesar社)を含有するPBSで10分間透過処理した。細胞は上記の通りマウス抗豚CD163抗体(AbD Serotec社、MCA2311PE、1対50)で染色し、次に、PBSで3回洗浄し、FACSバッファーに再懸濁した。抗体標識により判定される遺伝子発現は、FlowJoソフトウェアを使用してFACS Calibur(Becton Dickinson社)上での分析により評価した。
【０１３６】
免疫蛍光撮像では、細胞はCa2+/Mg2+無しPBSで3回洗浄して、室温で15分間PBS(Gibco社)中4%(wt/v)のホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)に固定し、PBSで洗浄し、次に0.1%のTriton-X-100(Alfa Aesar社)を含有するPBSで10分間透過処理した。細胞はPBSで洗浄し、ブロッキング液(PBS、3%のFBS)中CD163に対する抗体(ウサギpAb、abcam、ab87099、5μg/ml)と一緒に1時間インキュベートし、洗浄し、二次ヤギ抗ウサギAF594抗体(A11037、1対100)、AF647ファロイジン(A22287、1対100)、及びDAPI(1対10,000;すべてLife Technologies社)と一緒にインキュベートした。試料は共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss社、LSM-710)を使用して分析した。
【０１３７】
感染PAMにおけるRTC形成の免疫蛍光分析
PAMは感染の1日前にカバーガラス上に播種した。細胞は37℃で3時間cRPMI中それぞれのウイルス株(PRRSV H2、DAI、又はSU1-Bel)のMOI-2で接種した。接種材料は温cRPMIで置き換えた。19hpiで、細胞は室温で15分間PBS(Gibco社)中4%のホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)に固定し、PBSで洗浄し、上記の通り透過処理した。細胞はPBSで洗浄し、ブロッキングバッファーにおいて1時間PRRSV nsp2に対する抗体(South Dakota State University、Ying Fangより寄贈[74]、1対400)と一緒にインキュベートし、洗浄して、二次ヤギ抗マウスAF488抗体(A11029、1対100)、AF568ファロイジン(A12380、1対100)、及びDAPI(1対10,000;すべてLife Technologies社)と一緒にインキュベートした。試料は共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss社、LSM-710)を使用して分析した。
【０１３８】
結果
接合子におけるCRISPR/Cas9編集による生きたCD163 SRCR5欠失豚の生成
CD163遺伝子は現在の豚基準ゲノム配列において正確に表されていない(Sscrofa10.2)[38]。標的塩基配列決定を通じて、我々はブタCD163遺伝子座の詳細なモデルを確立しており(未発表結果L. Zen/A. Archibald/T. Ait-Ali)、CD163遺伝子のゲノム配列は配列番号1として下に記述されている。手短に言えば、CD163は、タンパク質のSRCRドメインをコードすると予想されるエキソン2〜13を有する16のエキソンによりコードされている[39]。興味深いことに、SRCR5は単一のエキソン、すなわち、エキソン7によりコードされていると予想される(図1A)。したがって、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを使用してエキソン7を切り取る編集戦略が開発された[40、41]。2つのガイドRNA、1つはイントロン5'からエキソン7に位置し、1つはエキソン7と8の間の短いイントロンに位置している、の組合せにより、残りのエキソンの適切なスプライシングは可能にしつつエキソン7の欠失を生み出すと予想された。エキソン7と8の間のイントロンの短い長さ(97bp)のせいで、同定された対応するプロトスペーサー隣接モチーフを有する適切で独特のターゲティング配列(crRNA)は1つだけであった。3つの候補crRNA配列はエキソン7のすぐ上流領域で選択された。代わりの部位特異的ヌクレアーゼ(例えば、ZFN又はTALEN)を使用することも可能であることに留意するべきであり、当業者であれば適切な標的部位を容易に決定することができると考えられ、注目すべきことに、これらのエディターはPAM配列の存在を必要とせず、したがって、標的部位選択への制限が少なくなる。
【０１３９】
完全単一ガイド配列(sgRNA)をコードし、hU6プロモーターにより駆動されるp×458[42]及びNLS-Cas9-2A-GFPを駆動するCAGプロモーターに基づくプラスミドを用いたブタ腎臓PK15細胞のトランスフェクションにより、4つの配列すべてを切断効率についてin vitroで評価した。トランスフェクト細胞はGFPの蛍光標識細胞分取(FACS)により単離し、標的部位での切断効率はCel1サーベイヤーアッセイを使用して評価した。4つのガイドのうちの3つは予測通りDNAの切断を指示することが明らかにされた(エキソン7の2上流及び1下流)。二重トランスフェクションアッセイ及びそれに続くPCR分析に続いて、ガイドSL26とSL28を組み合わせるとCD163遺伝子においてエキソン7欠失を効果的に生み出すことが見出された(図1B)。これらの結果に基づいて、sgSL26とsgSL28のガイド組合せはin vivo実験のために使用した。
【０１４０】
sgRNA SL26及びSL28はCas9ヌクレアーゼをコードするmRNAと一緒に接合子のサイトゾル中にマイクロインジェクトした。編集効率は、胚盤胞期までのin vitro培養、ゲノムDNA抽出、全ゲノム増幅及びエキソン7にわたるPCR増幅により少数の注入接合子において評価した。分析によれば、17の胚盤胞のうちの2つが意図したサイズの欠失を含有していることが明らかになり、サンガー塩基配列決定によりエキソン7の欠失が確かめられた。編集された胚盤胞B2は、はっきりした欠失及びそれに続くsgSL26及びsgSL28の切断部位での再ライゲーションを示し、編集された胚盤胞B14は、意図された欠失に加えて、標的部位での25ヌクレオチドのランダムな挿入があることも示した。完全長PCR産物はどれも、T7エンドヌクレアーゼアッセイにおいていずれの切断部位でもヌクレオチドミスマッチを示さなかった。胚盤胞での編集率は全体の編集率11.7%に一致している。
【０１４１】
生きた豚を作製するため、sgSL26、sgSL28、及びCas9 mRNAと一緒に注入された24〜39の接合子はレシピエント若雌豚の輸卵管に移された。総数で32頭の生きた仔豚が生まれ、耳及びテール生検の遺伝子型決定により仔豚のうちの4頭がエキソン7欠失を有し、総数の12.5%に相当していた。エキソン7の意図された欠失に加えて、4頭の動物のうちの3頭が、おそらく非相同末端結合修復の結果として標的部位での新しいDNAの挿入を示した。豚347は、sgSL26切断部位での2bp切詰め及び切断部位間での66bp挿入を示し、豚346はsgSL26の切断部位の後の304bpの欠失を示し、豚310は切断部位での短い9bp挿入(配列TCAGTCACTを有する)を示した。豚345は、切断部位でのランダムヌクレオチドの挿入も欠失もないエキソン7の正確な欠失を有することが分かった(図9、B及びD)。興味深いことに、PCR増幅によれば、豚310、345、及び347はすべて編集事象がモザイク状態で、豚310は非編集細胞と比べて低頻度ヘテロ接合性を有し(1つの対立遺伝子が編集されている)、豚345及び347はホモ接合性(両方の対立遺伝子が編集されている)とヘテロ接合性細胞型の両方を有することが示された(図9、A及びC)。
【０１４２】
F1世代豚の遺伝子型及び表現型
完全なホモ接合性及びヘテロ接合性豚を作製するため、310を345と交配させた。この交配により、はひと腹の6頭のヘテロ接合性、2頭の二対立遺伝子/ホモ接合性CD163 SRCR5欠失(△SRCR5)、及び4頭の野生型CD163仔豚が得られた(図10)。動物の塩基配列決定により、すべてのヘテロ接合子が345からその編集された対立遺伝子を受け継いでいることが明らかになった。豚629はエキソン7欠失について二対立遺伝子であることが分かり、1つの対立遺伝子は345の遺伝子型を保有しもう1つの対立遺伝子は310由来の遺伝子型を保有していた。興味深いことに、630は、310ファウンダー/親において見られるsgSL26とsgSL28の切断部位間に9bpインサートを有する編集された対立遺伝子についてホモ接合性であることが分かった(表1)。このホモ接合性状態は接合子における遺伝子変換事象から生じたと我々は結論付けている。
【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
動物627、628、629、630、633、及び634はさらなる分析のために選択され、種々の遺伝子型(野生型、ヘテロ接合性、及び二対立遺伝子/ホモ接合性)及び性別を表す。△SRCR5とヘテロ接合性動物の両方の成長速度は野生型動物に匹敵していた(表1)。血液試料は生後10週で6頭の動物すべてから採取し、エジンバラ王立獣医(Dick)大学の診断研究室により行われた全血球数により分析した。すべての動物の血球数は基準値内であった(表1)。△SRCR5及びヘテロ接合性豚のサイズ、身長及び他の形態的特長はその野生型同胞に匹敵していた(図2A)。
【０１４５】
生後8週間で、肺胞マクロファージ(PAM)は、気管支肺胞洗浄(BAL)により6頭の動物すべてから単離した。DNAはPAMから抽出し、PCR及びサンガー塩基配列決定により分析した。PAM遺伝子型により、耳生検から得た結果が確かめられ、それぞれ628及び633は野生型、627及び633はヘテロ接合性、並びに629及び630は△SRCR5であった。PCR産物の塩基配列決定により、編集事象すべてがエキソン7の完全欠失をもたらしたことが確かめられた。豚627及び633は、1つの対立遺伝子ではsgSL26及びsgSL28切断部位での正確な再ライゲーションを起こしたエキソン7のくっきりした欠失を有するが、629では1つの対立遺伝子がくっきりした欠失を有し、1つの対立遺伝子が部位間に9bp挿入を有し、豚630では両対立遺伝子が9bp挿入を有した。RNAはPAMから抽出し、オリゴ(dT)プライムド逆転写を使用してcDNAに変換し、PCRにより増幅し、サンガー塩基配列決定により分析した。エキソン4から9にまたがるPCR産物は、両ヘテロ接合性と△SRCR5動物において予想された315bp欠失を示した(図2C)。627及び634での完全長とエキソン7欠失バンドの間に位置する第3の断片は、完全長とエキソン7欠失断片のハイブリッドであることが確かめられた。これは、エキソン7の欠失が、エキソン8の正確なスプライスアクセプター部位の使用を混乱させていなかったことを示している。CD163タンパク質の発現は、PAMライセートのウェスタンブロットにより評価した。野生型豚628及び633は予想されたサイズの120kDaを有する完全長タンパク質を発現したが、おそらくグリコシル化のせいで大体150kDaで流れると記載されており[43]、大体100kDaのタンパク質バンドは別のアイソフォームの発現を示している可能性があり、このアイソフォームは記載されているヒトアイソフォームCRA_a又はCRA_bに対応する可能性がある(GenBankリファレンスEAW88664.1及びEAW88666.1)。ヘテロ接合性動物627及び634は、完全長と△SRCR5タンパク質の両方を発現する(図2D)。完全長タンパク質のバンドのほうが明らかに強く、完全長タンパク質のほうが高い発現又は本研究で使用されるポリクローナルCD163抗体による完全長タンパク質の結合の増加を示している。これを更に調べるため、遺伝子発現をPAMから抽出されるRNAについてRT-qPCRにより定量化し、βアクチン発現に規準化して、野生型、ヘテロ接合性及び△SRCR5動物の間には全CD163 mRNA発現に有意差がないことを実証した(図2E)。
【０１４６】
△SRCR5豚の肺胞マクロファージは完全に分化しマクロファージ特異的表面タンパク質を発現する
BALにより単離されたPAMはマクロファージ特異的表面タンパク質の発現について特徴付けられた。CD14及びCD16は単球上では発現されないが、マクロファージに成熟するとレベルは増加する。PAMでは、CD14は中程度のレベルで見出され、CD16は強く発現される[44]。△SRCR5、ヘテロ接合性及び野生型動物由来のPAMのCD14/CD16染色はすべて以前観察され記述されたレベル内であり[45]、違いは種々の遺伝子型の間で観察された(データは示されず)。CD172a、又はSIRPαとしても知られる、は単球とマクロファージの両方で高いレベルで発現され[46]、すべての動物由来の細胞において高レベルで発現された。CD169はPRRSVの付着因子として記載されているが[29]、単球では発現されず、しかし、組織マクロファージでは高度に発現され[47]、我々の動物由来の細胞では予想されるレベルで発現された(データは示されず)。ヒトの場合と同じく、豚におけるCD163の発現は単球及びマクロファージに限定される。CD163は組織マクロファージでは高レベルで、しかし血液単球では及び骨髄由来マクロファージでは低レベルで発現される[48](ブタマクロファージマーカーは[49]で概説されている)。野生型とSRCR5欠失CD163の両方がPAMの表面で認識された(図3)。これは、CD163のSRCR5欠失バージョンが正しく折り畳まれている可能性が高いことを示している。なぜならば、クローン2A10/11抗体は非還元天然立体構造のタンパク質のみを認識するからである。豚628、633、627、634、629、630のCD163蛍光強度の中央値はそれぞれ、35.9、22.7、26.4、24.4、17.9及び26.7であり、アイソタイプ対照中央値は2.13〜3.84に範囲に及んだ。全体では、すべての動物から単離されたPAMは、その遺伝子型とは無関係に、完全に分化しており、PRRSV侵入において関係する機能を有するCD169及びCD163を含む、マクロファージ特異的表面マーカーを発現することが示された。
【０１４７】
△SRCR5肺胞マクロファージはPRRSV遺伝子型1の感染に感受性ではない
PRRSVははっきり異なる地理的分布を有する2つの異なる遺伝子型を有し、遺伝子型1は主にヨーロッパ及びアジアに見られ遺伝子型2はアメリカ大陸及びアジアに見られる。2つの遺伝子型は、抗原性と病態の重症度の両方に違いを示し、この2つの遺伝子型の間では>15%のゲノム相違を有する([50]に概説されている)。遺伝子型1は、ORF7配列及び地理的分布に基づいて、3つのサブタイプに更に分割することが可能であり、サブタイプ1は汎ヨーロッパであり、サブタイプ2及び3は現在東ヨーロッパに限られている[51]。この時点で、我々は、最初それぞれUK、リトアニア、及びベラルーシから単離された、サブタイプ1株H2(PRRSV H2)[52]、サブタイプ2株DAI(PRRSV DAI)[53]、及びサブタイプ3株SU1-Bel(PRRSV SU1-Bel)[54]により表されるPRRSVのすべての遺伝子型1サブタイプを試験した。
【０１４８】
PAMは1ラウンド感染においてMOI=1で感染させた。接種19時間後(hpi)、細胞を収穫し、PRRSV-Nタンパク質に対するFITC標識抗体で染色した。感染レベルはFACS分析により評価した。3つのウイルスサブタイプすべてが野生型及びヘテロ接合性動物において40〜60%の感染レベルを生じ、98%を超える感染細胞がCD163陽性として分類された。わずかに高い統計的に有意な感染は、PRRSV H2及びDAIを感染させたヘテロ接合性動物で観察された。この理由ははっきりしないが、ヘテロ接合性動物における変化したCD163タンパク質発現プロファイル又は他の未確認の遺伝的特性を反映している可能性がある。これとは対照的に、両△SRCR5動物(629及び630)由来の細胞はこのアッセイでは感染に対して高度に抵抗性であることが分かった(図4A〜C)。ウイルスがPAM中で複製し、次に複数ラウンド感染時間経過において隣接する細胞に感染することができるかどうかを評価する第2のアッセイを実施した。細胞はMOI=0.1で接種され、上澄み試料は指示時間に収集した。ウイルスRNAは上澄みから抽出し、RT-qPCRにより分析した。PRRSV H2及びSU1-Belでは、ORF7に対する特異的なプローブ及びプライマーを用いた。PRRSV DAI vRNAを評価するため、この株に関して入手可能なゲノム情報が限られていたせいで、ORF5に対する特異的なプライマー及びBRYT緑色色素結合を使用した。すべての野生型及びヘテロ接合性動物はウイルスを類似するレベルまで複製した。ウイルスレベルは12hpiまでに上昇し始め、36hpiまで指数関数的に増加し、そこで定常に達した。PRRSV SU1-Belレベルは48hpiでそのプラトーに達した。RT-qPCRの検出限界はCT値35に対応し、この値はPRRSV H2では1E4 TCID50/ml、PRRSV DAIでは1E3 TCID50/ml、及びPRRSV SU1-Belでは5E3に対応していた。この複数ラウンド感染において△SRCR5 PAM由来の上澄み中のウイルスRNA(vRNA)レベルは検出限界より上には増加しなかった(図4D〜F)。感染性ビリオンが作製されたかどうかを評価するため、TCID50アッセイを、3つのサブタイプすべてがプラトーに達していた48hpiで収集された上澄みで行った。連続希釈は、63 TCID50/mlの検出限界に対応している1対10希釈度で開始された。野生型又はヘテロ接合性起源のPAMから作製されたウイルスは感染性であり、測定されたレベルはvRNA抽出物について計算されたレベルに匹敵していた。これとは対照的に、ホモ接合性△SRCR5 PAMはこのアッセイの検出限界でウイルス作製を支持しなかった(図4G〜J)。要約すると、△SRCR5動物由来のPAMにはPRRSV遺伝子型Iは高MOIで感染することはできず、このPAMは72時間時間経過にわたりウイルスを複製しなかった。
【０１４９】
△SRCR5豚由来の末梢血単球は、CSF1-誘導によりCD163発現マクロファージに分化し、マクロファージ特異的マーカーを発現する
CD163発現マクロファージへの単球の分化潜在力を評価するため、全血から末梢血単球(PBMC)を単離し、次に7日間CSF1-誘導によりPBMCをマクロファージに分化させた。マクロファージ特異的マーカーの発現は、免疫蛍光標識及びFACS分析により評価した。CD14及びCD16レベルは末梢血単球の分化の明白な指標であり、両方のレベルは分化により著しく増加する[44、46]。マクロファージマーカーとしてのその役割が上で考察されている、CD172a、CD169、及びCD163に加えて、我々はPBMC分化マーカーであるSWC9、CD203aとしても知られている、及び推定PRRSV付着因子CD151を含めた[55、56]。
【０１５０】
△SRCR5、ヘテロ接合性、及び野生型動物由来のPMBC由来マクロファージ(PMM)のCD14/CD16染色はすべて以前観察され記述されたレベル内であり、遺伝子型間で違いは観察されなかった(図5A)。単球/マクロファージ系譜マーカーCD172aはすべての動物において高レベルで発現され、CD169は予想されるレベルで発現された(図5B)。SWC9の発現はPMMの完全分化を強調していた。CD151発現は以前明らかにされたCD169発現と共に、これらの推定PRRSV付着因子又は受容体の両方が△SRCR5動物由来のマクロファージ上でまだ発現されていることを実証した(図5C)。PAMの場合と同様に、非改変と△SRCR5 CD163タンパク質の両方がPMMの表面で検出された(図5D)。豚628、633、627、634、629、630のCD163蛍光強度の中央値はそれぞれ23.3、16.7、18.3、16.5、18.8、及び17.2であり、アイソタイプ対照中央値は1.88〜3.79の範囲に及んだ。これは、PAMと比べてPMM上のCD163の発現レベルがわずかに低いことを示している。全体では、すべての動物から単離されたPBMCは、その遺伝子型とは無関係に、rhCSF1誘導によりPMMに完全に分化していることが明らかにされた。PMMはすべて、CD169、CD151、及びCD163を含むマクロファージ特異的表面マーカーを発現しており、これらのマーカーはPRRSV侵入において推定機能を有する。
【０１５１】
△SRCR5末梢血単球由来マクロファージはまだCD163依存性ヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとして機能する。
CD163は、PRRSV感受性へのその寄与に加えて、種々の重要な生物学的機能を有すると記載されてきた。CD163は赤芽球結合因子であり、SRCRドメイン2との会合を通じて、未成熟赤芽球の生存、増殖及び分化を増強し、CD163発現マクロファージは老化した奇形の赤芽球も取り除く。SRCRドメイン3はヘモグロビン(Hb)-ハプトグロビン(Hp)スキャベンジャー受容体として極めて重要な役割を果たす。遊離のHbは酸化的で毒性があり、Hpと複合体化した後は、マクロファージの表面のSRCR3への結合及びそれに続くエンドサイトーシスを通じて取り除かれる。これは酸化的損傷を防ぎ、恒常性を維持し、鉄の再利用を支援する。CD163発現マクロファージは、アポトーシスのTNF様弱誘導因子(TWEAK)と名付けられたサイトカインの排除に関与していることも分かっており、SRCR5を除くすべてのSRCRがこの過程に関与している[57]。可溶性CD163は血液血漿中に高濃度で見出すことができるが、このニッチでのその機能はまだ知られていない([34、58]に概説されている)。これらの生物学的機能を維持することは、健康で遺伝子編集された動物の生産にとって重要になる可能性がある。興味深いことに、CD163に割り当てられた生物学的機能のどれ一つとしてまだSRCR5と結び付けられていない。△SRCR5マクロファージがHb-Hp複合体をまだ取り込むことができるかどうかを確かめるため、我々は種々のin vitro実験を実施した。in vitroでのPMMにおけるHb-Hp複合体取込みは従来より大規模に調査されており、PMMはCD163依存性様式でHbとHp複合体の両方を取り込むことができ、ヘムオキシゲナーゼの誘導性形態であるヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)はHb-Hp取込みにより上方調節される[59、60]。
【０１５２】
PBMCを7日間のCSF1誘導によりPMMに分化させ、それに続いてPMMはHb-Hpの存在下で24時間インキュベートしHO-1上方調節を刺激した。HO-1 mRNA上方調節は、RT-qPCRにより評価されるが、すべての動物由来のPMMにおいて2倍から6倍増加し(図6A)、異なる遺伝子型間には有意差はなかった。ウェスタンブロッティングによりHO-1レベルを評価するため、PMMをHb-Hpの存在下で24時間インキュベートし、還元性Laemmli試料バッファーを使用して溶解し、タンパク質はSDS-PAGEにより分離した。HO-1のレベルはタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用して評価し、負荷対照としてカルモジュリンに対するモノクローナル抗体を用いた。HO-1タンパク質発現はCD163遺伝子型とは無関係に、すべての動物において上方調節されていることが分かった(図6B)。Hb-Hp取込みを直接評価するため、HbをAlex Fluor 488(AF488)で標識した。PMMはHbAF488-Hpと一緒に30分間インキュベートし、続いてFACS分析した。CD163遺伝子型とは無関係に、HbAF488-HpはPMMにより効率的に取り込まれ、緑色蛍光の中央値は動物628、633、627、634、629、及び630についてそれぞれ329、305、329、366、340、及び405であり、バックグラウンドモック処理細胞中央値は2.41〜4.74の範囲に及んだ(図6C)。PMM中へのHbAF488-Hpの取込みは共焦点顕微鏡により確かめられた。さらなる実験では、PMMはHbAF488-Hpと一緒に30分間インキュベートし、続いて固定化しCD163について染色した。HbAF488-Hpは異なる地点、多分エンドソームで見出され、CD163との明白な共局在はなかった。共局在のこの欠如は驚くにあたらない。なぜならば、観察された大部分のHbAF488-Hp複合体はおそらくすでに後期エンドソーム及びリソソームに位置していたからであった。全体としては、このデータは、△SRCR5動物由来のマクロファージがヘモグロビン-ハプトグロビンスキャベンジャーとしてのその役割を果たす能力を保持していることを実証している。
【０１５３】
△SRCR5動物由来の末梢血単球由来マクロファージはPRRSV遺伝子型1の感染に感受性ではない
PMMがPRRSV感染をモニターする適切な代替法になり得る可能性を探索し、△SRCR5 PMMが、PAM同様に、PRRSV感染に対して抵抗性であるかどうかを調べるため、我々は上記の株により表されるPRRSVの3つの遺伝子型1サブタイプすべてを用いて感染性を試験した。
【０１５４】
PMMを1ラウンド感染においてMOI=1で感染させた。19hpi細胞を収穫しPRRSV-Nタンパク質に対するFITC標識抗体で染色し、感染レベルはFACSにより評価した。3つのサブタイプはすべて、野生型及びヘテロ接合性動物において35〜80%の感染レベルを示した。PAMにおいて観察されるように、わずかに高い統計的に有意な感染がPRRSV H2を感染させたヘテロ接合性動物において観察され、△SRCR5動物由来の細胞においては著しい感染は観察されなかった(図7A〜C)。ウイルスを異なるCD163遺伝子型由来のPMMで複製させるかどうかを評価するため、複数ラウンド感染を行った。細胞はMOI=0.1で接種され、試料は感染のプラトー段階の間の時点で収集した(PAM感染時間経過中同定される24、48、及び72hpi)。ウイルスRNAは上澄みから抽出しRT-qPCRにより分析した。野生型及びヘテロ接合性動物のすべてがウイルスを類似のレベルで複製した。興味深いことに、PMMはすべてのウイルスをPAMよりも高いレベルで複製し、PMMがPRRSVを用いたin vitro感染研究に適しているだけでなく、実際、優れたモデルである可能性があることを示唆している。RT-qPCRの検出限界は上記の検出限界と同じであった。△SRCR5動物ではPRRSVの複製は観察されなかった(図7D〜F)。
【０１５５】
△SRCR5肺胞マクロファージ(PAM)の感染の停止は複製/転写複合体の形成に先立って起こる
CD163発現を欠き、PRRSV付着因子CD169をトランスフェクトされたブタ腎臓細胞系統では、ウイルスは内部移行されるが脱コートを受けないことが見出された[36]。これは、CD163が、付着/内部移行因子との密接な相互作用で、PRRSVの侵入過程に大きな役割を果たしていることを示している。△SRCR5マクロファージにおける感染過程が複製に先立って停止されるのかどうかを評価するため、我々はPAM細胞に、上記の株により表される3つのPRRSV遺伝子型1サブタイプをMOI=2で接種した。接種材料は3hpiで取り除かれ、感染は22hpiまで続けさせた。細胞は固定し、複製が開始されるとPRRSVにより形成される複製-転写複合体(RTC)について染色した。PRRSV nsp2タンパク質は、二重膜ベシクルの形成に関与しているが([61]に概説されている)、RTCの代表マーカーとして選ばれた。細胞は透過処理され、PRRSV nsp2の存在について染色された。我々は、PRRSVを感染させた野生型とヘテロ接合性動物の両方由来のマクロファージがRTCを形成することを見出した。しかし、△SRCR5動物由来のマクロファージでは、RTC形成は観測されなかった。これは、PRRSV感染の侵入及び脱コート過程へのCD163の関与を強調している。これは、ウイルス又はウイルスタンパク質が増幅される前にPRRSV感染を抑制する効果的な方法としてのSRCR5の欠失も支持している(図8)。
【０１５６】
考察
本研究の結果は、CD163 SRCR5欠失を保有する生きた豚が健康であり、タンパク質の主な生物学的機能を維持しており、一方でその欠失のおかげでPRRSVの標的細胞はウイルスの感染に対して抵抗性になっていることを明らかにしている。接合子でのCRISPR/Cas9編集においてCD163のエキソン7に隣接する2つのsgRNAを使用することにより、我々は豚のゲノムから前記エキソンの切除を達成し、CD163△SRCR5遺伝子型を得た。切詰め遺伝子の発現は、CD163に対するcDNAのPCR、RT-qPCR及びウェスタンブロッティングにより確かめられた。野生型CD163、ヘテロ接合性及び△SRCR5動物の肺から単離されたマクロファージは、完全分化及び肺胞領域から単離されたマクロファージに特徴的なマクロファージ表面マーカーの発現を示した。PAMはPRRSV感染の主要標的細胞である。高用量、1ラウンド感染と低用量、複数ラウンド感染の両方での異なる遺伝子型動物由来のPAMの感染を評価すると、△SRCR5豚由来のPAMがin vitroでの感染に対して抵抗性であることが明らかにされた。遺伝子編集されたCD163動物由来の単球/マクロファージ系譜の細胞の分化能力は、PBMCの単離及び分化により更に確かめられた。△SRCR5豚由来のPMMもPRRSV感染に対して抵抗性であることが明らかにされた。PMMは極めて重大な生物学的役割を有し、血液中でHb-Hp複合体のスキャベンジャーとしての役割を果たす。蛍光標識されたHb-Hp複合体の取込み実験並びにHb-Hp刺激によるHO-1の増加をモニターする遺伝子上方調節アッセイを使用して、我々はこの重要な生物学的機能が△SRCR5動物から単離されたマクロファージにおいて維持されていることを確かめた。
【０１５７】
接合子でCRISPR/Cas9編集を使用してエキソン7 CD163欠失のある生きた豚を作製した。編集効率は、in vitro培養胚盤胞並びに生まれた動物の両方で、手術日に応じて、高度に変わりやすく、全体数が低いことを考量に入れる必要がある。種々の手術日に使用される試薬は同じであり、精子注入と手術時間の両方が一定に保たれた。しかし、ゲノム編集方法には高い技術力のある人間及び技術的再現性を頼りとする要素が数多く存在する。接合子でのゲノム編集のための核酸送達法の最近の発展により、ゲノム編集方法を標準化するための考えられる解決法が提供される可能性がある。種々のグループから、透明帯を取り除かずにマウス及びラットから単離された接合子中へのCRISPR/Cas9試薬のin vitroエレクトロポレーションによるゲノム編集に成功したことが最近報告された[62〜64]。ゲノム編集試薬をin vivoで送達するエレクトロポレーションを使用して、Takahasiらは、1.6日の妊娠期間後のマウス胚におけるこの方法の大きな成功を示した[65]。in vitroエレクトロポレーションを使用すれば、注入方法を標準化し、高度な訓練を受けた人間という必要条件を減らすことができると考えられる。代替案として、in vivoエレクトロポレーションにより、ドナー動物と再移植に先立つ接合子の長い取扱い方法という必要条件の両方がなくなると考えられるが、この手順はマウスに対してつい最近開発されたばかりである([66]に概説されている)。ファウンダー動物の4頭のうちの3頭がモザイクパターンで編集されたことが分かった。動物310では、モザイクはCRISPR/Cas9複合体の活性が遅延性のため、4-又は8-細胞段階で単細胞中の1つの対立遺伝子の編集をもたらすことから生じると思われる。動物345及び347では、最初の編集事象は1-細胞段階で1つの対立遺伝子で起こり、第2の編集事象は2-細胞段階で細胞の1つにおいて第2の対立遺伝子を改変し、ホモ接合性/ヘテロ接合性モザイク動物が生じると思われる。モザイクは、ブタ接合子中へのゲノムエディターの注入を用いる種々の研究において観察されてきた[67〜69]。導入されるmRNAの非対称拡散はSatoらの思いもよらない以下の結果だと思われる。彼らは、単為生殖で活性化された卵母細胞を使用してin vitro EGFP mRNA注入を実施し、比較的均質な蛍光パターンを観察することができた[69]。むしろ、モザイクは、数回の細胞分裂を通じてずっと活性のままであるCas9タンパク質/sgRNA複合体又はおそらく細胞分裂により引き金が引かれる遅延性のmRNA発現から生じると思われる。前者の説は遺伝子型345及び347により支持されており、これらの遺伝子型はおそらく、1細胞段階で1つの対立遺伝子において最初の編集工程及び2-細胞又は4-細胞段階細胞のうちの1つにおいて第2の対立遺伝子の編集から発生してきた。接合子の直接注入によりより多くの二対立遺伝子を作製するため、より活性の高い試薬セットのほうが有利である可能性がある。細菌の研究では、Cas9/sgRNAリボ核タンパク質(RNP)の注入のほうがmRNA注入よりも効率が良いことが示されている。その上、RNP注入はin vitroエレクトロポレーションと組み合わせることが可能である[70]。
【０１５８】
F0世代動物310と345の交配により、野生型、ヘテロ接合性及び二対立遺伝子編集動物が生じた。これは、モザイクにもかかわらず、両方の動物が生殖系列ヘテロ接合性であることを示していた。子孫はどれも標準畜産条件下でのゲノム編集由来のいかなる有害作用も示さなかった。興味深いことに、動物のうちの1頭、630は推定遺伝子変換事象を示した。対立遺伝子間遺伝子変換の仕組みに基づいて、この動物では、345の編集遺伝子型を示す1つの対立遺伝子と310の編集遺伝子型を示すもう1つの対立遺伝子の間で相同組換えが起きたと我々は仮定する。遺伝子変換は接合子段階で起きて、630は310の遺伝子型についてホモ接合性になったと思われる([71]で概説されている)。
【０１５９】
PRRSVは極めて狭い宿主細胞向性を示し、特定のブタマクロファージサブセットのみに感染する。我々の遺伝子編集動物及びその野生型同胞からこれらの細胞を単離してCD163 SRCR5ドメインを除去すると、PRRSV感染に対するマクロファージの完全な抵抗性がもたらされることを明らかにした。△SRCR5動物は遺伝子型1のすべてのヨーロッパサブタイプでの感染に抵抗性であることを更に実証した。これにより、SRCR5の標的除去はin vitroでのPRRSV感染に対する完全な抵抗性を達成するのに十分であることが示される。PRRSV付着因子CD151及びCD169はまだ△SRCR5マクロファージ上で発現され、これらのタンパク質がPRRSV感染に十分ではないことを強調している。△SRCR5動物由来のマクロファージ上のPRRSV感染は、複製転写複合体の形成前に停止され、CD163がPRRSV複製サイクルの侵入又は脱コード段階に関与していることを証明している。△SRCR5マクロファージは実物どおりの系においてこの過程を詳細に研究するための新しいツールを提供することになる。
【０１６０】
イノシシ上科内にはCD163の遺伝的変異が存在し得るので、我々はPRRSV感染に対するイボイノシシ(Phacocherus africanus)PMMの感受性を評価するin vitro対照実験を実施した。興味深いことに、イボイノシシPMMは、すべてのPRRSV遺伝子型1サブタイプでの感染に対して豚PMMと同じ程度の感受性であることが分かった。イボイノシシPMMはすべて、類似する速度で匹敵する力価までウイルスを複製した(データは示されず)。これは、イノシシ上科内のCD163の遺伝的変異はおそらく極めて限定されていることを示しており、PRRSV感染は広範である可能性がある。これは、このウイルスがアフリカの豚繁殖国にとり脅威となることも示している。△SRCR5動物はPRRSV感染に対して抵抗性である以前記載されたゲノム編集動物よりも有利な点がいくつかある。Whitworthらは、CD163遺伝子のエキソン3に中途での停止コドンを有する動物を作製し、CD163発現の消失をもたらした[37]。これとは対照的に、我々はin vivoでのゲノム編集ツールの特定の適用を使用すればCD163のエキソン7が正確に欠失した動物を効率よく作製できること、及びこれらの動物が特定の分化マクロファージの表面でCD163タンパク質の残部の天然の立体構造での発現を保持することを実証した。これらの△SRCR5動物由来のマクロファージは、PAM並びにCSF-1追加により分化するように刺激されたPBMCの両方で完全分化潜在力を保持していること、及び編集動物由来のマクロファージがヘモグロビン/ハプトグロビン取込み等のCD163発現に関連する極めて重大な生物学的機能を遂行する能力を保持していることを更に明らかにした。全体としては、本研究は、標的ゲノム編集アプローチを利用すれば、標的遺伝子の生物学的機能を保持したままでブタをPRRSV感染に対して抵抗性にすることが可能であることを実証している。豚繁殖においてCD163 SRCR5欠失動物を導入すれば、PRRSV感染に関連する経済的損失を著しく低減できると考えられる。
【０１６１】
イントロン6におけるスプライスアクセプター部位の不活性化
CD163のSRCR5ドメインを欠失させる別の戦略は、CD163遺伝子においてエキソン7の5'末端に位置するスプライスアクセプター部位を不活性化することである。
【０１６２】
エキソン7でのスプライスアクセプター部位の不活性化はいくつかの方法で達成することが可能であり、2つの適切な戦略が下で手短に考察され、1つは二本鎖切断を生み出して続いて非相同末端結合(NHEJ)を含み、もう1つは相同組換え修復(HDR)を使用する。第1の選択肢は適切には、標的細胞によるシングルガイドRNA及びNHEJを使用する。第2のアプローチ、HDRを使用して、配列改変を導入する細胞の二本鎖切断修復機械により使用される鋳型が提供される。それにより、一部のヌクレオチドは、HDR事象が起きたことを都合よく確かめることを可能にする制限部位(例では、NcoI)を導入する一方で、標的にされた様式でスプライスアクセプター部位を破壊するために置き換えられることになる。
【０１６３】
豚の胚において編集事象及び編集胚からの動物の生成を達成するための適切な方法が上で考察され、文献でも広範に考察されており、したがって、簡潔さのためにここでは繰り返さないことにする。
【０１６４】
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集の場合、スプライスアクセプターを標的にする適切なガイドRNA配列は、以下の通りである:
sgRNA 1:AACCAGCCTGGGTTTCCTGT(配列番号12)
sgRNA 2:CAACCAGCCTGGGTTTCCTG(配列番号13)
【０１６５】
これらの2つのガイド配列により、エキソン7の5'末端で以下の配列に二本鎖切断部位がCas9により導入されることになる:
ACA|GGAAACCCAGGCTGGTT(配列番号14) - sgRNA 1を使用
CAG|GAAACCCAGGCTGGTTG(配列番号15) - sgRNA 2を使用
【０１６６】
アプローチ1-NHEJ
Cas9とのsgRNA1又は2のRNP複合体はCD163遺伝子において標的部位に結合し二本鎖切断を引き起こす。切断が起こる場所では、NHEJ事象が生じ、一般には挿入又は欠失事象がもたらされる。挿入又は欠失事象はイントロン6スプライスアクセプター部位の不活性化をもたらすことは大いに起こり得る。その後は、スプライスアクセプター部位を無効にする必要条件を有する胚を同定するという問題だけである。
【０１６７】
アプローチ2-HDR
再び、Cas9とのsgRNA1又は2のRNP複合体はCD163遺伝子において標的部位に結合し二本鎖切断を引き起こす。しかし、この場合、HDR鋳型、例えば、一本鎖又は二本鎖DNA分子が提供され、この分子は、
AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(配列番号3)から
AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(配列番号4)への
CD163遺伝子における配列の変化をもたらす配列を含む。
【０１６８】
適切なHDR鋳型は以下の配列を有する:
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(配列番号16 - 小文字は変更のない配列と比べて加えられた変化を示す)
【０１６９】
CD163という文脈での変換配列は、スプライスアクセプター部位の不活性化及びNcoI制限部位の導入をもたらす。NcoI部位の存在は、所望のHDR編集が達成されている胚/動物の同定を促進する。
【０１７０】
さらなる実験研究
△SRCR5 CD163豚のための接合子におけるゲノム編集及び遺伝子型的に均一なF2世代のための繁殖
そのタンパク質のスキャベンジャー受容体システインリッチドメイン5(SRCR5)をコードするCD163遺伝子にエキソン7の欠失を保有するファウンダー世代F0動物は上記の通りCRISPR/Cas9遺伝子編集により作製された(75も参照されたい)。したがって、接合子に2つのガイドRNA、sgSL26及びsgSL28をCas9 mRNAと組み合わせてマイクロインジェクトして、エキソン7に隣接するCRISPR/Cas9媒介二本鎖切断(DSB)を達成した。それに続くDSB修復によりエキソン7を欠失させた(図11A)。ヘテロ接合性ファウンダー動物の繁殖及び野生型豚と一緒の繁殖により、第1世代のヘテロ接合性及び二対立遺伝子編集動物(F1世代)が得られた。この段階で、我々は、さらなる繁殖のためにsgSL26及びshSL28の切断部位に「きれいな」ライゲーションを示す、すなわち、この部位にいかなる挿入も欠失もないヘテロ接合性F1動物を選択した。半同胞ヘテロ接合性動物及び野生型動物を繁殖させて、「きれいに刈った」遺伝子型を保有するホモ接合性△SRCR5動物(図11A)及び類似する遺伝的背景を有する野生型同胞及び半同胞動物の系譜を得た。
【０１７１】
前述の通り、△SRCR5動物は、△SRCR5 CD163 mRNA及びタンパク質を野生型同胞と等しいレベルで発現する。更に、天然構造の△SRCR5 CD163はそれぞれの抗体により肺胞マクロファージ(PAM)の表面で認識される。RaptorXを使用する鋳型ベースのタンパク質構造予測が、サブドメイン及び完全な△SRCR5 CD163タンパク質の正しい折り畳みに対するこれらの所見を確証するかどうかを更に分析した(39)。図1Bに見られるように、完全長及び△SRCR5 CD163の両方におけるすべてのサブドメインが球状構造及び真珠の首輪立体配置を帯びていると予測される。これは、△SRCR5タンパク質の正しい折り畳み及び発現に対する我々の所見を支持している。
【０１７２】
以前、我々は、PAM及びin vitro分化末梢血単球が、ブタ生殖及び呼吸器症候群ウイルス1(PRRSV-1)並びにPRRSV-2の両方での感染に対して抵抗性であることを明らかにした。現在、我々は、in vivoでのPRRSV-1感染に対する抵抗性を評価することによりin vitro結果を確かめることを目指した。したがって、4頭のホモ接合性△SRCR5 F2動物及び4頭の野生型同胞及び半同胞を選択した。動物たちは離乳から共同収容された。生後6週間で、動物たちは特定病原体除去(SPF)ユニットに移し、負荷の期間中共同収容した(図11C)。
【０１７３】
△SRCR5豚は正常な全血球数及び可溶性CD163血清レベルを示す
SPFユニットに移動させる前に、血液試料を全8頭の豚から採取し、エジンバラ王立獣医大学の診断研究室により行われた全血球数により分析した。すべての動物の血球数は基準値内であり、良好な健康全般及び感染又は炎症が存在しないことを示していた。更に、すべての動物のヘモグロビンレベルは基準値内であり、CD163のヘモグロビン/ハプトグロビンスキャベンジャー活性の正常な機能を示していた(表2)。
【０１７４】
SPFユニットへの移動に先立って及びPRRSV-1での負荷に先立つ0日目の血清をすべての動物から収集した。可溶性CD163(sCD163)血清レベルは、可溶性ブタCD163を認識する市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して評価した。血清CD163レベルは、△SRCR5豚で463.5±68.99ng/ml、野生型豚で433.2±69.57ng/mlであることが分かった(図12)。これらのレベルはヒトでのsCD163レベルに匹敵し(例えば、(76))、互いに有意差はない。
【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
△SRCR5豚はPRRSV-1感染の徴候を示さない
生後7〜8週間で、豚にPRRSV-1、サブタイプ2株BOR-57を鼻腔内に接種した(77)。一般に、PRRSV-1、サブタイプ2株の感染は、穏やかな呼吸器症候群、体温上昇、広範な肺病態及び高ウイルス血症を伴う。負荷は、0日目及び1日目でのそれぞれウイルスの5E6 TCID50での接種に続く14日間行った。直腸温、呼吸器及び他の潜在的症候群、並びに振る舞いを毎日記録し、血清は0(負荷に先立って)、3、7、10、及び14(安楽死に先立って)日目に収集した。体重は0、7、及び14(安楽死に先立って)日目に記録した。負荷を行い、病態を分析した人間は動物の遺伝子型については盲検であった。
【０１７７】
直腸温は野生型動物では負荷の6〜9日目に著しい上昇を示し、体温上昇は△SRCR5動物では観察されなかった(図13A)。△SRCR5豚の平均一日体重増は全負荷期間にわたりその野生型対応物と比べて多く、7〜14日目では有意に多かった(図13B)。1頭の野生型豚のみが7日目から8日目に振る舞いの変化を示し、それ以外では呼吸器症候群も他の行動の異常も観察されなかった。ウイルスRNAは血清から単離し、ウイルスレベルは、DNA断片鋳型標準及び既知の感染性ウイルスストックから抽出したウイルスRNAを使用して定量化した。野生型豚は高ウイルス血症を示したが、△SRCR5豚の血清にはウイルスRNAは検出されなかった(図13C)。PRRSVに対する抗体の存在は、すべてのPRRSV-1サブタイプ及びPRRSV-2に対する抗体を検出できる市販のELISAを使用して評価した。PRRSV抗体は野生型豚で7日目から検出され、10日目及び14日目には有意なレベルで存在していた(図13D)。剖検中、肺を最初に評価し、詳細写真は背中側と腹側から撮った。肺は肺病変の存在についてスコアー化した。したがって、完全肺気量へのそれぞれの肺部分のおおよその寄与に基づいた確立したスコアー化方式を用いた(78)。野生型動物についての平均肺病変スコアーは、△SRCR5豚での0.25と比べて61であった(図13E及びG)。肺の試料はホルマリンに固定し、パラフィンに包埋して、切片に切断し、さらなる分析のために染色した。一般的な肺組織像を評価するため、試料はヘマトキシリン及びエオシンで染色した。それぞれの豚由来の切片は間質性肺炎の存在について0〜6のスケールで評価した(0、正常;1、軽度多巣性;2、軽度糜爛性;3、中等度多巣性;4、中等度糜爛性;5、重度多巣性;6、重度糜爛性)。野生型動物の肺組織像スコアーは△SRCR5豚肺での0と比べて平均で4であった(図13E及びF、上)。PRRSV抗原の存在は、以前記載したPRRSV-Nタンパク質に対する2つの異なる抗体の混合物を使用する肺切片及びリンパ節切片に関する免疫組織化学により評価した(79)。△SRCR5由来の切片ではPRRSV抗原は検出されず、野生型動物の4つの動物の肺切片のうちの3つ及び4つのリンパ節切片のうちの1つでPRRSV抗原が検出された(図13E及びF、下)。
【０１７８】
全体としては、高接種量及び感染脱粒野生型動物への曝露にもかかわらず△SRCR5動物では感染の徴候は検出されず、△SRCR5動物がPRRSV-1感染に抵抗性であることを示しており、PRRSV-1とPRRSV-2の両方を用いてin vitroで見出される結果を確証している。
【０１７９】
△SRCR5豚はPRRSV-1感染に対するサイトカイン応答を示さず一般的に正常なサイトカインレベルを示している
PRRSV-1感染に続く炎症及び感染応答を評価するため、20のサイトカインのパネルを豚の血清中でのそのレベルについて分析した。したがって、市販の定量抗体アレイ並びに負荷の0(負荷に先立って)、3、7、10、及び14日目に収集した血清試料を使用した。全体としては、0日目のサイトカインレベルは、ベースラインと見なされるが、△SRCR5と野生型豚の間で類似していた。ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン(MIG、CXCL9としても知られる)は14日まで野生型豚でのほうが一貫して高いレベルを示すことが分かり、14日目には有意差はもう検出されなかった。MIGは炎症部位へのT細胞化学誘引物質であり、組織損傷の修復に関与している。野生型動物では、MIGは負荷の7日目及び10日目には強く上方調節されていた(80)(図14H)。その上、ケモカインリガンド3様1(CCL3L1)は△SRCR5動物と比べて野生型のほうが高いことが分かった(図14J)。CCL3L1は炎症応答に関与しておりIL-10により下方調節されている。野生型動物では、CCL3L1は10日目と14日目に血清中で上昇しており、負荷期間にわたり有意なIL-10上昇は起こっていないことが分かった(図14O)。(80、81)
【０１８０】
他の点では、一連のサイトカイン応答を見ることができ、インターフェロンα(IFNα)及びインターロイキン-17A(IL-17A)、及びインターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)が初期に増加した(図14A、B、及びC)。これに続いて、接種後日数(dpi)7日目からウイルス血症の高いポイントでインターロイキン4、6、及び8(それぞれIL-4、IL-6、及びIL-8)が増加した(図14D、E、及びF)。MIG、及びマクロファージ炎症タンパク質1β(MIP-1β、CCL4としても知られる)のレベルの増加は10dpiで一時的に観察されるだけであった(図14G及びH)。負荷の最後の期間でのみ、中等度のウイルス血症レベルであるが、CCL3L1、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン12及び1β(IL-12及びIL-1β)が検出された(図14I、J、K、L、及びM)。野生型動物で上昇しているのが分かったこれらのサイトカインすべてで、△SRCR5豚ではサイトカイン応答は観察されなかった。IL-10、形質転換増殖因子β1(TGFβ1)、及びインターフェロンγ(IFNγ)はそれぞれの時点で△SRCR5豚でのレベルと比べて野生型では有意差を示さなかったが、野生型動物では経時的には有意に変化していることが分かった(二元配置分散分析を使用して計算)(図14N、O、P)。インターロイキン18(IL-18)レベルは野生型動物では経時的には有意に減少していたが、それぞれの時点での△SRCR5豚のレベルとは有意差はなかった(図14Q)。血小板内皮細胞接着分子(PECAM1)は、△SRCR5豚のレベルと比べて、負荷の3日目に有意に上昇しており10日目には減少した(図14R)。△SRCR5と野生型豚の間で又は経時的にインターロイキン1α(IL-1α)及びインターロイキン13(IL-13)には有意差は見られなかった(図14S及びT)。
(参考文献)
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【０１８１】
核酸配列
CD163ガイド配列:
sgSL25 TGAAAAATAGCATTTCGGTG(配列番号5)
CD163遺伝子切断位置:CAC|CGAAATGCTATTTTTCA(配列番号6)
sgSL26 GAATCGGCTAAGCCCACTGT(配列番号7)
CD163遺伝子切断位置:GAATCGGCTAAGCCCAC|TGT(配列番号8)
sgSL27 GTCCTCCATTTACTGTAATC(配列番号9)
CD163遺伝子切断位置:GAT|TACAGTAAATGGAGGAC(配列番号10)
sgSL28 CCCATGCCATGAAGAGGGTA(配列番号11)
CD163遺伝子切断位置:CCCATGCCATGAAGAGG|GTA(配列番号11)
切断位置は|記号で示す。
【０１８２】
large white豚でのCD163遺伝子座のゲノム配列(配列番号1)
太字=エキソン
一重下線及び破線下線=スプライスアクセプター部位予測
二重下線=スプライスドナー部位予測
sgRNA結合位置及び切断部位は小文字イタリック体で示し、その部位に結合する特定のsgRNA結合も示す。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
2019533445.tif 000040
【図１２】
2019533445.tif 000041
【図１３−１】
2019533445.tif 000042
【図１３−２】
2019533445.tif 000043
【図１４−１】
2019533445.tif 000044
【図１４−２】
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【図１４−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019533445.tif 000048
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