(57)【要約】  本発明は、組換え融合タンパク質抗原を含む呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンを提供する。一実施形態において、上記組換え融合タンパク質抗原は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドであるリンタンパク質（Ｐ）部分と、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドであるフラジェリン部分とを含む。上記Ｐ部分とフラジェリン部分とは共有結合して直鎖状ポリペプチドを形成する。【選択図】図２（ａ）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンであって、
組換え融合タンパク質抗原を含み、
前記組換え融合タンパク質抗原は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドであるリンタンパク質（Ｐ）部分と、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドであるフラジェリン部分とを含み、
前記Ｐ部分と前記フラジェリン部分とは、共有結合して直鎖状ポリペプチドを形成する、
ことを特徴とする、ＲＳＶワクチン。
【請求項２】
前記Ｐ部分は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドであり、
前記フラジェリン部分は、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドである、
ことを特徴とする、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項３】
前記Ｐ部分は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドであり、
前記フラジェリン部分は、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドである、
ことを特徴とする、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項４】
前記Ｐ部分は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドであり、
前記フラジェリン部分は、配列番号８によって表されるポリペプチドである、
ことを特徴とする、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項５】
前記組換え融合タンパク質抗原は、前記Ｐ部分と前記フラジェリン部分とを結合する第１のリンカーをさらに含み、
前記第１のリンカーは、アミノ酸、又は２〜１５個のアミノ酸を含有するポリペプチドである、
ことを特徴とする、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項６】
前記組換え融合タンパク質抗原は、前記組換え融合タンパク質抗原の精製を促進するための精製タグをさらに含み、
前記精製タグは、組換え融合タンパク質抗原のＮ−末端又はＣ−末端のいずれかに配置される、
ことを特徴とする、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項７】
前記精製タグは、６個のヒスチジン残基からなる、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項８】
前記組換え融合タンパク質抗原は、前記精製タグと前記Ｐ部分又は前記フラジェリン部分とを直鎖状に結合する第２のリンカーをさらに含む、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項９】
前記第２のリンカーは、アミノ酸又はアミノ酸配列からなり、そのＣ−末端で化学的又は酵素的に切断され得る切断可能なリンカーである、
ことを特徴とする、請求項８に記載のＲＳＶワクチン。
【請求項１０】
前記組換え融合タンパク質抗原は、配列番号１０によって表される、
ことを特徴とする、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する予防剤及び治療剤に関し、より具体には、リンタンパク質（Ｐ）を含有する組換え融合タンパク質抗原を含むＲＳＶワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、世界中の乳幼児、免疫不全患者及び高齢者において気管支炎及び重度の呼吸器疾患を引き起こす主要な原因である。幼児が自然にＲＳＶに感染した場合、長期持続性の免疫力を誘発せず、個体が生涯にわたって依然としてＲＳＶ感染を繰り返し受けやすい。半世紀前に、ホルマリンで不活性化したＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）ワクチンは、乳児で試験されたが、その後、自然のＲＳＶ感染にさらされた時に罹患率の上昇および２人の死亡をもたらした。ＦＩ−ＲＳＶワクチンが投与された乳児及び小児は、自然にウイルスに感染した後に、中和抗体のレベルが低かった（Yang and Varga, 2014）。
【０００３】
安全で効果的なＲＳＶワクチンの開発に多くの努力及び資源が費やされてきたが、現在までに許可されたＲＳＶワクチンはなかった。これまでの研究では、安全で効果的なＲＳＶワクチンの開発は困難な課題であることが示されている。
【０００４】
したがって、ＲＳＶに対して安全かつ有効なワクチンを開発するための新しい方法の開発が急務となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、組換え融合タンパク質抗原を含む呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンを提供する。一実施形態において、前記組換え融合タンパク質抗原は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドであるリンタンパク質（Ｐ）部分と、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドであるフラジェリン部分とを含み、前記Ｐ部分とフラジェリン部分とは、共有結合して直鎖状ポリペプチドを形成する。
【０００６】
前記ＲＳＶワクチンの別の実施形態において、前記Ｐ部分は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドであり、前記フラジェリン部分は、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドである。
【０００７】
前記ＲＳＶワクチンの別の実施形態において、前記Ｐ部分は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドであり、前記フラジェリン部分は、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドである。
【０００８】
前記ＲＳＶワクチンの別の実施形態において、前記Ｐ部分は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドであり、前記フラジェリン部分は、配列番号８によって表されるポリペプチドである。
【０００９】
前記ＲＳＶワクチンの別の実施形態において、前記組換え融合タンパク質抗原は、前記Ｐ部分と前記フラジェリン部分とを結合する第１のリンカーをさらに含み、前記第１のリンカーは、アミノ酸、又は２〜１５個のアミノ酸を含有するポリペプチドである。
【００１０】
前記ＲＳＶワクチンの別の実施形態において、前記組換え融合タンパク質抗原は、前記組換え融合タンパク質抗原の精製を促進するための精製タグをさらに含み、前記精製タグは、組換え融合タンパク質抗原のＮ−末端又はＣ−末端のいずれかに配置される。さらなる実施形態において、前記精製タグは、６個のヒスチジン残基からなる。さらに別の実施形態において、前記組換え融合タンパク質抗原は、前記精製タグと前記Ｐ部分又は前記フラジェリン部分とを直鎖状に結合する第２のリンカーをさらに含む。さらに別の実施形態において、前記第２のリンカーは、アミノ酸又はアミノ酸配列からなり、そのＣ−末端で化学的又は酵素的に切断され得る切断可能なリンカーである。
【００１１】
前記ＲＳＶワクチンの別の実施形態において、前記組換え融合タンパク質抗原は、配列番号１０によって表される。
【００１２】
以下に示すように、添付図面を参照しながら好ましい実施形態を詳細に説明することにより、本発明の目的及び利点が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下、添付図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明する。ここで、同一の参照符号は同一の要素を示す。
【００１４】
【図１】図１は、以下の配列を示す。      （ａ）配列番号１、ＲＳＶ Ａ２株Ｐタンパク質のヌクレオチド配列      （ｂ）配列番号２、ＲＳＶ Ａ２株Ｐタンパク質のアミノ酸配列      （ｃ）配列番号３、ＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８ Ｐタンパク質のヌクレオチド配列      （ｄ）配列番号４、ＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８ Ｐタンパク質のアミノ酸配列      （ｅ）配列番号５、組換えＰタンパク質のヌクレオチド配列、Ｈｉｓタグに下線が引かれている      （ｆ）配列番号６、Ｈｉｓタグを有する組換えＰタンパク質のアミノ酸配列、配列番号４によって表されるＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８ Ｐタンパク質のアミノ酸配列に下線が引かれ、Ｈｉｓタグが太字で示される      （ｇ）配列番号７、組換えフラジェリンＫＦＤ１のヌクレオチド配列      （ｈ）配列番号８、組換えフラジェリンＫＦＤ１のアミノ酸配列      （ｉ）配列番号９、組換えＰ−ＫＦＤ１のヌクレオチド配列、配列番号３によって表されるＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８ Ｐタンパク質に下線が引かれ、配列番号７によって表されるヌクレオチド配列に二重下線が引かれ、Ｈｉｓタグが太字で示される      （ｊ）配列番号１０、組換えＰ−ＫＦＤ１のアミノ酸配列、配列番号４によって表されるＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８ Ｐタンパク質に下線が引かれ、配列番号８によって表されるアミノ酸配列に二重下線が引かれ、Ｈｉｓタグが太字で示される
【図２】図２（ａ）は、本発明の一実施形態に係る組換えＰ−ＫＦＤ１タンパク質の機能ブロック概略図を示し、図２（ｂ）は、精製したＰ−ＫＦＤ１タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図３】図３は、免疫及びチャレンジのシーケンス図を示す。
【図４】図４は、Ｐ＋ＣＴＢ又はＰ−ＫＦＤ１免疫群からの血清及び膣サンプルにおけるＰ−特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体力価を示すグラフである。
【図５】図５は、チャレンジ後の鼻又は肺におけるウイルス負荷を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｐ−特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。
【図７】図７は、（ａ）正常、非感染、（ｂ）生理食塩水で免疫化し、ＲＳＶに感染した対照群、（ｃ）ＲＳＶに感染したＦＩ−ＲＳＶ免疫群、（ｄ）ＲＳＶに感染したＰ＋ＣＴＢ免疫群、及び（ｅ）ＲＳＶに感染したＰ−ＫＦＤ１免疫群の肺組織写真である。
【図８】図８は、チャレンジ後の体重変化を示すグラフである。
【図９】図９は、チャレンジ後の異なる群における（ａ）吸気抵抗（ＲＩ）と異なる濃度のメタコリン（ＭＣＨ）との相関性、及び（ｂ）呼気抵抗（ＲＥ）と異なる濃度のメタコリン（ＭＣＨ）との相関性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、チャレンジ後８日目の肺組織へのリンパ球浸潤を（ａ）免疫細胞数、（ｂ）好中球の比率、（ｃ）好酸球の比率、及び（ｄ）マクロファージの比率として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、以下のように特定の実施形態の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解され得る。
【００１６】
本出願において、本発明に係る技術分野の現状をより十分に記述するために、刊行物が参照される場合、これらの刊行物の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当技術分野の技術範囲における分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来技術を用いる。これらの技術は、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Mannual」第２版（Sambrook and Russel, 2001）、「Current Protocols in Molecular Biology」（F.M. Ausubel et al., eds., 1987）などの文献に完全に説明されている。
【００１８】
ＲＳＶは、直鎖状の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。当該直鎖状の一本鎖ＲＮＡゲノムは、非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、大ポリメラーゼ（Ｌ）（large polymerase）、リンタンパク質（Ｐ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、表面付着糖タンパク質（Ｇ）（surface attachment glycoprotein）、表面融合糖タンパク質（Ｆ）（surface fusion glycoprotein）、小さな疎水性タンパク質（ＳＨ）（small hydrophobic protein）、転写因子（Ｍ２−１）、及びアクセサリータンパク質（Ｍ２−２）を含む１１種類のタンパク質をコードする１０個の遺伝子を有する。Ｇタンパク質及びＦタンパク質は、体内に中和抗体の産生を誘導する２つの主要な防御抗原であると考えられている。Ｇタンパク質は、高度にグリコシル化されたものであり、宿主細胞へのウイルスの付着に関与し、Ｆタンパク質は、細胞融合を仲介し、ウイルスを細胞の細胞質に導入させ、合胞体を形成する（Yang and Varga, 2014）。
【００１９】
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、粘膜免疫を誘導できる非常に重要な中和抗原であるため、ＲＳＶワクチン開発の焦点となっている。融合前のＦにおいて非常に強力な中和抗原部位が発見される最近の研究によると、次世代ＲＳＶワクチンの候補は、融合前の形態で発現されるＦタンパク質を含むべきである（Yang and Varga, 2014）。
【００２０】
ＲＳＶ感染は気道に限定されるので、ＲＳＶ感染を最も効果的に予防するために、ＲＳＶワクチンは、上気道及び下気道で粘膜免疫を誘発すべきである（Yang and Varga, 2014）。粘膜免疫応答の効率的な誘導には、適切な投与経路及び特異的アジュバント及び／又は送達系が必要である。経鼻投与は、粘膜投与の他の経路と比較して、複数の粘膜部位において効果的で広範な粘膜免疫応答を誘発する最も有効な経路である（Yang and Varga, 2014）。
【００２１】
ＲＳＶワクチンは、主に、不活化ワクチン、弱毒化生ワクチン、遺伝子ベクター、及びサブユニットを含む４つの種類がある。近年では、弱毒化生ＲＳＶワクチンの鼻腔内投与、並びにサブユニットＲＳＶ融合後のＦタンパク質ワクチン及びアルミニウムアジュバントの筋肉内投与が、いくつかの臨床試験で広く評価されている。しかしながら、弱毒化生ＲＳＶワクチンによって誘発される応答は、弱毒化の過程において免疫原性が喪失されることにより、自然感染よりも応答の程度が弱い（Yang and Varga, 2014）。
【００２２】
全身免疫によって供給されるＦタンパク質ベースのＲＳＶワクチンは、年長児及び成人にとって安全であることが証明されたが、それらの免疫原性が控えめであり、有効な粘膜免疫を誘導できなかった（Groothuis JR, et al. 1998）。
【００２３】
＜抗原の選択＞
ＶＬＰとして発現するＦ又はＧタンパク質は、ＲＳＶチャレンジ時にマウスを保護できるが、ＶＬＰ Ｇワクチンは、単独で使用した場合に病状を悪化させる。１つの興味深い結果は、説得力のある説明が提供されていないにもかかわらず、混合ＶＬＰ Ｆ＋ＶＬＰ Ｇがワクチン誘導免疫病理を有しないことであった（Lee S., et al. 2014）。
【００２４】
ＲＳＶ Ｆ、Ｎ及びＭ２−１タンパク質をコードするチンパンジーアデノウイルス及び改変ワクシニアウイルスについて、第Ｉ相臨床試験を行った（Green C. A., 2015）。
【００２５】
融合前の形態のＦタンパク質を含有するＶＬＰは、コトンラットにおいてＲＳＶに対する防御について試験された（Cullen L. M., et al. 2015）。
【００２６】
Ｂ型肝炎コアタンパク質のウイルス様粒子（ＨＢｃ−ＳＨｅＢ）に化学的に結合したＨＲＳＶ Ｂウイルス表面の疎水性小ペプチド（ＳＨ）の細胞外ドメインに対応するペプチド（ＣＧＧＧＳ−ＮＫＬＳＥＨＫＴＦＳＮＫＴＬＥＱＣＱＭＹＱＩＮＴ）は、チャレンジされたマウス及びコトンラットにおいてウイルス複製の減少を示した（Schepens, B. et al. 2014）。
【００２７】
＜アジュバントの選択＞
アルミニウムアジュバントを含有するＦＩ−ＲＳＶワクチンは、アジュバントを有しないＦＩ−ＲＳＶと比較してＲＳＶに対する防御を高めるものの、体重減少、好酸球増加症、及び肺組織病理を含む重篤なワクチン強化ＲＳＶ疾患を引き起こした（Kim KH, et al. 2015）。
【００２８】
ＬＰＳ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）又はＰｏｌｙＵアジュバントを含有する不活化ＲＳＶは、生きたＲＳＶのチャレンジに対する防御免疫を誘導した（Delgado MF, et al. 2009）。しかしながら、全てのアジュバントは、ＲＳＶの成分に応じて選択され、例えば、Ｆタンパク質がＬＰＳと同様にＴＬＲ４経路を活性化でき、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＰｏｌｙＵは、ウイルスゲノムとして機能する。
【００２９】
＜ウシＲＳＶ＞
ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）は、ウシ呼吸器疾患症候群のキープレーヤであり、工業化された肉牛の生産において最も重要な経済問題及び顕著な福祉問題の１つである。ＢＲＳＶゲノムは、ＲＳＶゲノムに非常に類似している（Hagglund S., et al. 2014）。
【００３０】
ＢＲＳＶ−免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が子ウシの免疫に使用される場合、Ｆ、Ｇ、Ｎ及びＳＨに特異的ＩｇＧは高力価であった。注意すべき点は、Ｍ及びＰに対する顕著な抗体応答が検出されなかったことである（Hagglund S., et al. 2014）。
【００３１】
本発明は、組換え融合タンパク質抗原を含む安全かつ有効なＲＳＶワクチンを発見した。上記組換え融合タンパク質抗原は、リンタンパク質（Ｐ）部分とフラジェリン部分とを含む。ここで、上記Ｐ部分とフラジェリン部分とは、共有結合して直鎖状ポリペプチドを形成する。「融合タンパク質」は、構成部分がすべてポリペプチドであり、連続した一本鎖を形成するように互いに連結（融合）されているキメラ分子である。様々な構成成分は、互いに直接結合してもよく、１つ以上のペプチドリンカーを介して結合してもよい。キメラ分子を示すために使用される場合、「リンカー」とは、キメラ分子の構成部分を連結又は結合する任意の分子を指す。キメラ分子が融合タンパク質である場合、リンカーは、融合タンパク質を含むタンパク質に結合するペプチドであり得る。
【００３２】
ここで、図1を参照すると、Ｐタンパク質の例示的な配列は、ＲＳＶ Ａ２株（配列番号１はそのヌクレオチド配列であり、配列番号２はそのアミノ酸配列である）、及びＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８（配列番号３はそのヌクレオチド配列であり、配列番号４はそのアミノ酸配列である）を含む。注意すべき点は、ＲＳＶ変異株ｃｐｔ−２４８のＰタンパク質は、他のＲＳＶ Ａ株と９８〜９９％の同一性、ＲＳＶ Ｂ株と９０％以上の同一性を有することである。
【００３３】
ここで、図２（ａ）を参照すると、本発明の一実施形態に係る組換え融合タンパク質抗原の機能ブロック概略図を示す。組換えタンパク質抗原１は、リンタンパク質（Ｐ）部分１０と、フラジェリン部分２０とを含む。ここで、Ｐ部分１０とフラジェリン部分２０とは、直鎖状に共有結合している。いくつかの実施形態において、フラジェリン部分２０は、そのN末端によってＰ部分１０のＣ末端と結合する（図２（ａ）に示すように）。いくつかの実施形態において、フラジェリン部分２０は、そのＣ末端によってＰ部分１０のN末端と結合する（図２（ａ）に対して位置が交換される）。
【００３４】
いくつかの実施形態において、Ｐ部分１０は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｐ部分１０は、配列番号２又は配列番号４によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％、好ましくは９８％、より好ましくは９９％の同一性を有するポリペプチドである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、フラジェリン部分２０は、配列番号８によって表されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、フラジェリン部分２０は、配列番号８によって表されるポリペプチドと少なくとも９０％、好ましくは９８％、より好ましくは９９％の同一性を有するポリペプチドである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、当該組換え融合タンパク質抗原１は、Ｐ部分１０とフラジェリン部分２０とを結合する第１のリンカー３０をさらに含む。ここで、第１のリンカー３０は、１つのアミノ酸、又は２つ以上のアミノ酸を含有するペプチドである。第１のリンカー３０におけるアミノ酸は、免疫応答を避けるために柔軟性を有し、大きな側基を持たないべきである。また、第１のリンカー３０は、このようなワクチンを使用する場合、組換え融合タンパク質抗原を安定化させるために、酵素消化に対して耐性を持つべきである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、組換え融合タンパク質抗原１は、組換え融合タンパク質抗原１の精製を促進するための精製タグ４０をさらに含む。精製タグ４０は、組換え融合タンパク質抗原１のＮ−末端又はＣ−末端に配置することができる。例えば、６個のヒスチジン残基をそのＮ−末端又はＣ−末端に融合して位置させることにより、Ｎｉ２＋カラムを用いた精製が可能になる。精製後、化学的又は酵素的切断によって６個のヒスチジン残基を除去することができる。実際には、ここで、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇペプチド、ＫＴ３エピトープ、α−チューブリンエピトープ、Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｓｔｒｅｐタグ、ウシトリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含む任意の既知の精製タグが適用可能である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、当該組換え融合タンパク質抗原１は、精製タグ４０とＰ部分１０又はフラジェリン部分２０とを直鎖状に結合する第２のリンカー５０をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のリンカー５０は、アミノ酸又はアミノ酸配列からなり、そのＣ−末端で化学的又は酵素的に切断され得る切断可能なリンカーである。発現ベクターにおいて、切断可能なリンカーは、そのＣ−末端で化学的又は酵素的に切断され得るアミノ酸又はアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００３９】
タンパク質を切断するための化学剤の例として、臭化シアン、２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−ブロモ−３'−メチルインドリニウム（ＢＮＰＳ−スカトール）、ヒドロキシルアミンなどが挙げられる。臭化シアンは、メチオニン残基のカルボキシル末端でタンパク質を切断する。ＢＮＰＳ−スカトールは、トリプトファン残基のカルボキシル末端を切断する。ヒドロキシルアミンは、−Ａｓｎ−Ｚ−（ここで、Ｚはグリシン、ロイシン又はアラニンである）部分のＣ−末端を切断する。
【００４０】
切断に使用される酵素試薬の例として、トリプシン、パパイン、ペプシン、プラスミン、トロンビン、エンテロキナーゼなどが挙げられる。各酵素試薬は、それが認識する特定のアミノ酸配列に作用する。例えば、エンテロキナーゼは、アミノ酸配列−（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ−（ここで、ｎは２〜４の整数である）を認識する。
【００４１】
上述のように、発現ベクターのクローニング、構築及び増幅のための技術は、当技術分野で周知である。したがって、組換え融合タンパク質抗原の発現ベクターは、常法により構築することができる。本発明の原理を不明瞭にしないために、さらなる詳細は提供されない。
【００４２】
本発明のＲＳＶワクチンは、生理食塩水及びＰＢＳなどを含む薬学的に許容される溶液をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ＲＳＶの他のタンパク質のような他の成分を含み得る。
【実施例】
【００４３】
実施例１  ウイルスの調製
Ｈｅｐ−２細胞でＲＳＶ Ａ２株を増幅し、超音波処理した後、１０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上澄みを取り出し、８００００ｇ、４℃で２時間超遠心分離してウイルスを精製した。精製したウイルスをプラークアッセイによってその力価を測定し、チャレンジのために保存した。
【００４４】
実施例２  ＦＩ−ＲＳＶの調製
精製したＲＳＶ Ａ２ウイルスの懸濁液に１：４０００の比率で中性ホルマリンを加え、３７ｏＣで回転させながら３日間インキュベートした後、３００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットを元の体積の１／２５になるように再懸濁した。その後、ＦＩ−ＲＳＶをアルミニウムアジュバント（４ｍｇ／ｍｌ）と混合し、室温で２４時間インキュベートした。
【００４５】
実施例３  組換えタンパク質の調製
図１を参照すると、Ｈｉｓタグを有する組換えＰタンパク質の配列（配列番号５がヌクレオチド配列であり、配列番号６がアミノ酸配列である）、組換えフラジェリンＫＦＤ１の配列（配列番号７がヌクレオチド配列であり、配列番号８がアミノ酸配列である）、及び組換えＰ−ＫＦＤ１の配列（配列番号９がヌクレオチド配列であり、配列番号１０がアミノ酸配列である）が示される。プライマー（配列番号１１〜１６）を用いて、ＤＮＡ断片をｐＥＴ２８ａベクターにクローニングし、得られたｐＥＴ２８ａ−Ｐ、ｐＥＴ２８ａ−ＫＦＤ１及びｐＥＴ２８ａ−Ｐ−ＫＦＤ１発現プラスミドを常法に従って細菌に形質転換した。発現したすべての組換えタンパク質をウェスタンブロット法により検証し（図２（ｂ））、それらのＨｉｓタグを用いて精製した。使用前にエンドトキシンを除去した。
【００４６】
実施例４  免疫
図３を参照すると、免疫及び操作のシーケンス図が示される。（ａ）〜（ｄ）のＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝１８）を０、２５、又は５０日目にそれぞれ３回免疫化した。（ａ）１０μｌの生理食塩水、鼻腔内投与（ｉ．ｎ）；（ｃ）１０μｌのＰタンパク質（４０ｕｇ）と２ｕｌのＣＴＢアジュバント（２ｕｇ、Ｓｉｇｍａ）との混合液、鼻腔内投与（ｉ．ｎ）;（ｄ）１２ｕＬのＰ−ＫＦＤ１タンパク質（２４ｕｇ）、鼻腔内投与（ｉ．ｎ）。（ｂ）群について、４２日目に最初に免疫し、２週間後に、２μｇのＦＩ−ＲＳＶ及び４００μｇのアルミニウムアジュバントを含有する１００μｌのＦＩ−ＲＳＶワクチンを筋肉注射（ｉ．ｍ）によって追加免疫した。２１日目、３９日目又は６４日目に採血し、血清における抗体力価を測定した。
【００４７】
実施例５  チャレンジ
最後の免疫後２５日目にチャレンジを行った。すべてのマウスをＡｖｅｒｔｉｎ（ｔｅｒｔ−アミルアルコールに溶解したトリブロモエタノール）で麻酔した後、１×１０７のＰＦＵ ＲＳＶ Ａ２を５０μｌの体積で鼻腔内投与してチャレンジを行った。免疫及びチャレンジの抗原及び条件を表１にまとめた。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
実施例６  免疫プラークアッセイによる鼻及び肺組織におけるウイルス力価の測定
チャレンジ後４日目に、マウスを屠殺し、鼻及び肺組織を摘出し、ホモジナイザーで粉砕した。Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートに接種し、１００％コンフルエンスまで成長したときに、希釈した粉砕液サンプルを加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、２％ＦＢＳと１％Ｐ＋Ｓと０．７５％メチルセルロースとを含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地を加え、インキュベーターで４〜５日間インキュベートした。その後、ウェルにおける培地を穏やかに捨て、パラホルムアルデヒド及びＴｒｉｏｎ Ｘ−１００でウェルを２０分間固定した。ウェルにＰタンパク質特異的モノクローナル抗体を加えて２時間インキュベートした後、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰを加えて１時間インキュベートした。最後にＡＥＣ基質で発色させ、プラークを計数した。
【００５０】
実施例７  血清中和抗体力価の測定
血清を不活性化した後、順次２倍連続希釈した。希釈した血清サンプル（１００μｌ）を２００ ＰＦＵ ＲＳＶ Ａ２（１００μｌ）とともに３７℃で１時間インキュベートした後、Ｖｅｒｏ細胞単層に添加した。１時間付着させた後、３日間インキュベートし、上記のように免疫プラークアッセイによってウイルス力価を測定した。血清中和抗体力価は、プラークが半分に減少するときの血清希釈倍率、即ち５０％プラーク減少中和力価（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ、ＰＲＮＴ）として表される。
【００５１】
実施例８  マウス気道応答性の測定
チャレンジ後４日目に、ペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔し、手術用ハサミでマウスの頸部皮膚を切開し、気管を取り除いた。マウスに対して気管挿管を行い、気管挿管の他端を人工呼吸器に接続し、呼吸比を１．５：１に設定し、呼吸器の受動呼吸頻度を９０回／分間に設定した。
【００５２】
その後、マウスを迅速にボリュームスキャンボックスに移し、気管挿管をボリュームスキャンボックスの気道に接続した。ＡｎｉＲｅｓ２００５オペレーティングソフトウェアを起動し、気道圧力変化曲線を観察し、マウスの自発呼吸が呼吸器の受動呼吸による影響に抵抗できないレベルまでマウスへの空気量を調節した。圧力変化曲線が円滑で規則的になった後、マウスの頸部側の皮膚と筋肉を分離し、外頸静脈内投与経路を確立するように静脈穿刺を行って針を固定した。０．０２５、０．０５、０．１、０．２ｍｇＭＣＨ／ｋｇの連続濃度でメタコリン（ＭＣＨ）を順に静脈注射してメタコリン誘発を行った。分析ソフトウェアによってマウス気道の吸気抵抗（Ｒｉ）、呼気抵抗（Ｒｅ）及び肺の適応性（Ｃｄｙｎ）の変化曲線を同時に記録した。
【００５３】
実施例９  肺組織の消化
マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔してから解剖し、心臓を右心房から５ｍＬのＰＢＳで灌流した。肺組織を分離して１〜２ｍｍ２に切断し、２ｍＬの消化液で３７℃、４０分間消化した。消化液の組成は、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ I（１２５Ｕ／ｍＬ）及びＤＮａｓｅ I（３０Ｕ／ｍＬ）を含有するＨＢＳＳ培地である。消化した肺組織を軽く粉砕した後、濾過して単個細胞浮遊液を得た。その後、ｐｅｒｃｏｌｌ分離溶液で分離することにより、リンパ球及び単核細胞を得た。
【００５４】
実施例１０  フローサイトメトリーによる検出
肺における各種の細胞浸潤を検出するために、特異的モノクローナル抗体、すなわち、ＦＩＴＣ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｆ４／８０、ＰＥ−Ｃｙ７ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｇｒ−１、ＡＰＣ−ＥＦ７８０ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｂ、ＡＰＣ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５、ＰＥ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｓｉｇｌｅｃ Ｆによって表面染色を行い、４℃で３０分間染色してから固定した。
【００５５】
実施例１１  ＥＬＩＳＰＯＴによるＴ細胞応答の分析
チャレンジ後４日目に、肺及び脾臓を摘出し、リンパ球を分離した。プレコートしたＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴプレートを活性化した後、それに肺リンパ球及び脾臓リンパ球をそれぞれ接種し、Ｐタンパク質によって刺激した。陽性対照及び陰性対照を設置した。そして、プレートをインキュベーターにおいて４８時間インキュベートした後、二次抗体をインキュベートし、ＡＥＣ基質で発色させ、多機能細胞分析及び酵素結合スポット分析システムによってプラークを計算した。
【００５６】
実施例１２  組織学
肺組織をホルマリンで固定した。固定後、標準手順に従って組織切片を用意した。いくつかの切片をｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｅｏｓｉｎ（Ｈ & Ｅ）で染色して細胞浸潤を確定した。
【００５７】
実施例１３  結果
図４を参照すると、Ｐ＋ＣＴＢ又はＰ−ＫＦＤ１免疫群からの血清及び膣サンプルにおけるＰ−特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体力価が示される。Ｐ＋ＣＴＢ免疫群は、Ｐ−ＫＦＤ１よりも高い力価を示したことは明らかである。
【００５８】
図５を参照すると、グラフには、チャレンジ後の鼻又は肺におけるウイルス負荷が示される。
【００５９】
図６を参照すると、グラフには、Ｐ−特異的Ｔ細胞応答が示される。Ｐ＋ＣＴＢ免疫群は、顕著なＴ細胞応答を示したことに対して、Ｐ−ＫＦＤ１免疫群は顕著でないＴ細胞応答を示した。
【００６０】
図７を参照すると、（ａ）正常、非感染、（ｂ）生理食塩水で免疫化し、ＲＳＶに感染した対照群、（ｃ）ＲＳＶに感染したＦＩ−ＲＳＶ免疫群、（ｄ）ＲＳＶに感染したＰ＋ＣＴＢ免疫群、及び（ｅ）ＲＳＶに感染したＰ−ＫＦＤ１免疫群の肺組織写真が示される。すべての免疫群の切片は、感染後７日目のマウスに由来するものであった。生理食塩水群及びＦＩ−ＲＳＶ群では、間質性肺炎及び気管支炎が多く示された。Ｐ＋ＣＴＢ群では多数のリンパ球浸潤が示されたが、意外にもＰ−ＫＦＤ１群では明らかな病理学的変化が見られなかった。
【００６１】
図８を参照すると、グラフには、チャレンジ後の体重変化が示される。Ｐ−ＫＦＤ１群では、他の群より明らかに少ない体重減少が示された。
【００６２】
図９を参照すると、グラフには、チャレンジ後の異なる群における（ａ）吸気抵抗（ＲＩ）と異なる濃度のメタコリン（ＭＣＨ）との相関性、及び（ｂ）呼気抵抗（ＲＥ）と異なる濃度のメタコリン（ＭＣＨ）との相関性が示される。Ｐ−ＫＦＤ１群では、ＦＩ−ＲＳＶ群及びＰ＋ＣＴＢ群より良好なＲＩ及びＲＥ値が示された。
【００６３】
図１０を参照すると、グラフには、チャレンジ後８日目の肺組織へのリンパ球浸潤が（ａ）免疫細胞数、（ｂ）好中球の比率、（ｃ）好酸球の比率、及び（ｄ）マクロファージの比率として示される。Ｐ−ＫＦＤ１群では、Ｐ＋ＣＴＢ群より少ないリンパ球浸潤が示された。Ｐ−ＫＦＤ１群では、好酸球及びマクロファージの顕著な浸潤が見られなかった。
【００６４】
本発明は、特定の実施形態を参照して説明されたが、その実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲はこれに限定されないことを理解されたい。本発明の代替的な実施形態は、当業者にとって自明である。そのような代替的な実施形態は、本発明の要旨及び範囲内に包含されるとみなされる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、前述の説明によって支持される。
【参考文献】
【００６５】
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【図１ａ−１ｃ】
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【図１ｄ−１ｆ】
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【図１ｇ−１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図１ｊ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ−１０ｂ】
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【図１０ｃ−１０ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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