(57)【要約】  本開示は、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子、例えば、ＦｃγＲＩＩＡ活性を阻害可能であるヒト化モノクローナル抗体、及び例えば、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害の治療又は予防においてＦｃγＲＩＩＡ結合分子を使用する方法を提供する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する単離された結合分子であって、
ａ．（ｉ）配列番号１９及び配列番号２２、（ｉｉ）配列番号１９及び配列番号２３、（ｉｉｉ）配列番号１９及び配列番号２４、（ｉｖ）配列番号２０及び配列番号２５、（ｖ）配列番号２０及び配列番号２３、並びに（ｖｉ）配列番号２０及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）及び免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、
ｂ．配列番号２９を含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、
ｃ．配列番号３０又は配列番号４５を含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）、
ｄ．配列番号３１を含む免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）、並びに
ｅ．配列番号３２を含む免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）
を含む結合分子。
【請求項２】
配列番号１９及び配列番号２２を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
（ｉ）配列番号３３及び配列番号３４、（ｉｉ）配列番号３５及び配列番号３６、（ｉｉｉ）配列番号３７及び配列番号３８、（ｉｖ）配列番号３９及び配列番号４０、（ｖ）配列番号４１及び配列番号４２、並びに（ｖｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項４】
配列番号３３及び配列番号３４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項３に記載の結合分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合分子と競合又は交差競合する、単離された結合分子。
【請求項６】
マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体及びそれらの抗原結合断片から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項７】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド連結（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ又は一本鎖抗体から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項８】
免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖定常領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項９】
定常領域が、ヒトＩｇＧ定常領域である、請求項８に記載の結合分子。
【請求項１０】
定常領域が、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１にアミノ酸置換を含み、
ａ．Ｋａｂａｔ位置２３４のアミノ酸が、フェニルアラニン（Ｆ）で置換され、
ｂ．Ｋａｂａｔ位置２３５のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）で置換され、
ｃ．Ｋａｂａｔ位置３３１のアミノ酸が、セリン（Ｓ）で置換されている、
請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
定常領域が、野生型ヒトＩｇＧ定常領域に対して、２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９及び４２８〜４３６位のアミノ酸残基の１つ以上の置換を含み、アミノ酸位置番号付けが、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従う、請求項９又は１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
定常領域が、Ｋａｂａｔ位置２５２、２５４及び２５６にアミノ酸置換を含み、
ａ．Ｋａｂａｔ位置２５２のアミノ酸は、チロシン（Ｙ）で置換され、
ｂ．Ｋａｂａｔ位置２５４のアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）で置換され、
ｃ．Ｋａｂａｔ位置２５６のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている、
請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１３】
免疫グロブリン軽鎖定常領域を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１４】
軽鎖定常領域が、ヒトカッパ定常領域である、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１５】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、約０．１５ｎＭの解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でヒトＦｃγＲＩＩＡ  １３１Ｒと特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１６】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、約０．１３ｎＭの解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でヒトＦｃγＲＩＩＡ  １３１Ｈと特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１７】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩと特異的に結合しない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１８】
抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物応答修飾物質、医薬剤、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、毒素及び任意の前記薬剤のうち２種以上の組合せからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合分子及び担体を含む組成物。
【請求項２０】
診断試薬である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてリボヌクレオタンパク質−免疫複合体（ＲＮＰ−ＩＣ）媒介性Ｉ型ＩＦＮαを阻害する方法であって、ＰＢＭＣを、請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子と接触させることを含む方法。
【請求項２２】
抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）誘導性好中球活性化を阻害する方法であって、好中球を、請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子と接触させることを含む方法。
【請求項２３】
対象において炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、有効量の請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項１９に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２４】
対象において炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害を予防する方法であって、疾患又は障害に罹患しやすい対象に、有効量の請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項１９に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２５】
第２の活性薬剤を投与することを含む、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
疾患又は障害が、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、膜性腎炎、巨大細胞動脈炎（ＧＣＡ）血管炎、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、溶血性貧血、混合結合組織疾患、シェーグレン症候群、強皮症、自己抗体障害、免疫複合体媒介性障害、ＡＤＡ媒介性有害作用、ネトーシス並びに敗血症、血栓症、急性腎傷害、急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、糸球体腎炎、中毒性肝傷害、卒中、アテローム発生、Ｉ型糖尿病及びＩｇＧ媒介性過敏反応を含むネトーシス関連障害である、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
サンプル中のＦｃγＲＩＩＡを検出する方法であって、（ａ）サンプルを、請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子と接触させること、及び（ｂ）結合分子の、ＦｃγＲＩＩＡとの結合を検出し、それによって、サンプル中のＦｃγＲＩＩＡを検出することを含む方法。
【請求項２８】
診断方法である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３０】
調節配列に作動可能に連結された、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
請求項２９又は請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３２】
請求項２９若しくは請求項３０に記載の核酸分子又は請求項３１に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
哺乳動物宿主細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項２９若しくは請求項３０に記載の核酸分子、請求項３１に記載のベクター又は請求項３２若しくは請求項３３に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項３５】
ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する結合分子を作製する方法であって、請求項３２又は請求項３３に記載の宿主細胞を、結合分子を産生するのに適した条件下で培養することを含む方法。
【請求項３６】
結合分子を単離することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項２９若しくは請求項３０に記載の核酸分子を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＦｃγＲは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスの抗体のＦｃ部分と結合する細胞表面受容体のファミリーである。ヒトＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、機能、結合親和性、及びその細胞分布において異なっている１（非特許文献１）。
【０００２】
ヒトでは、５種のＦｃγＲ：単量体ＩｇＧと結合し得る高親和性受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、並びに単量体ＩｇＧと弱く結合するが、ＩｇＧの免疫複合体とは強く結合する低親和性受容体ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）がある。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢは、活性化特性を有すると考えられるが、ＦｃγＲＩＩＢは、主に阻害性である。ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢは、最も密接に関連する受容体である。ＩｇＧとの相互作用に関与するこれらの受容体の細胞外領域は、９０％を超える配列同一性を有する２（非特許文献２）。ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの細胞内シグナル伝達領域における配列相違は、代替細胞応答を媒介する。
【０００３】
ＦｃγＲは、抗原又は病原体取り込み、脱顆粒、抗原提示及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を含むいくつかの細胞プロセスを媒介する。さらに、ＦｃγＲは、その他の受容体と相互作用して、特定のサイトカインの産生に影響を及ぼし得る。ＦｃγＲの反応性を適宜制限する免疫系の不全は、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害の発生において役割を果たし得る３（非特許文献３）。
【０００４】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、異種性自己抗体によって駆動される免疫複合体媒介性自己免疫疾患である。ＳＬＥ患者の顕著な特徴は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ及び核酸関連タンパク質（例えば、ＲＮＰ、ヒストン、Ｓｍｉｔｈ、Ｒｏ）を含む、核内抗原に対する自己抗体の存在である。皮膚、肺及び腎臓における疾患徴候は、免疫複合体の蓄積と関連している４（非特許文献４）。ＦｃγＲＩＩＡの免疫複合体媒介性活性化は、ＳＬＥの病態形成において役割を果たすことが示唆されている５（非特許文献５）。ＳＬＥ患者のおよそ６０％は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子シグネチャーを有し、これは、重症疾患活性を有する患者において最も蔓延している。重要なことに、ＤＮＡ及びＲＮＡを含有する免疫複合体は、形質細胞様樹状細胞がＩ型ＩＦＮαをＦｃγＲＩＩＡ依存性に産生するように誘導する５、６、７（非特許文献５、６、７）。
【０００５】
抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）とは、複数システムにおける徴候を有する血管の炎症性疾患の不均一な群を指す８（非特許文献８）。ＡＡＶは、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、壊死性半月体形成性糸球体腎炎（ＮＣＧＮ）及び好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）を含む。ＡＡＶ患者の顕著な特徴は、好中球細胞質抗原に直接対する自己抗体の存在である。ＡＮＣＡの標的抗原として、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）、ラクトフェリン及びその他が挙げられる。ＧＰＡは、主にＰＲ３に対する抗体と関連しているが、ＭＰＡ及びＥＧＰＡは両方とも、ＭＰＯに対する抗体と関連している。ＡＮＣＡは、診断マーカーとして働くだけでなく、疾患において直接的病原性も担っている。ＡＮＣＡは、ＦｃγＲＩＩＡを介して好中球の直接活性化を誘導することができ、これは、血管傷害を進め得る９（非特許文献９）。さらに、ＡＮＣＡはまた、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）、サイトカイン及びケモカインのＦｃγＲＩＩＡ依存性誘導の引き金を引くことがあり、これらは炎症及び自己免疫応答に関与し得る１０（非特許文献１０）。したがって、ＦｃγＲＩＩＡは、ＡＡＶの発生及び病理において中心的な役割を果たすと思われる。
【０００６】
免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）は、血小板抗原に対して向けられた自己反応性抗体の産生を特徴とする自己免疫出血障害である。血小板の表面をコーティングしている自己抗体は、細網内皮系の貪食マクロファージによるそのクリアランスを促す。ＦｃγＲのレパートリー及び細胞内発現は、マウス及びヒトの間で異なり、ＦｃγＲＩＩは、ヒトでは最も広く発現されるＦｃγＲであるが、マウスでは存在しない。ヒトＦｃγＲＩＩＡについてトランスジェニックであり、マウス活性化ＦｃγＲについて欠損したマウスを使用して、受動的に投与された抗血小板抗体が、ＦｃγＲＩＩＡ依存性に免疫性血小板減少症の引き金となったことが実証された１１（非特許文献１１）。さらに、原発性ＩＴＰを有する患者の単球で有意に高いＦｃγＲＩＩＡ／Ｂ比が観察され、ＩＴＰ患者の第一選択治療として用いられる高用量デキサメタゾン治療は、ＦｃγＲＩＩＡ／Ｂ比を低下させた１２（非特許文献１２）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏデータは、ヒトＦｃγＲＩＩＡが、ＩＴＰの病態形成において大きな役割を果たすことを示す。
【０００７】
好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成は、細菌感染に対する宿主防御において重要であると考えられている１７（非特許文献１３）。その反面、ＮＥＴの形成はまた、血栓症、炎症及び内皮機能障害などの有害な効果と関連している１８、１９、２０（非特許文献１４、１５、１６）。ＡＮＣＡ関連血管炎において病原性を担うだけでなく、ＮＥＴは、敗血症、血栓症、急性腎傷害、急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、糸球体腎炎、中毒性肝傷害、卒中、アテローム発生及びＩ型糖尿病にも関与している可能性があるという示す証拠がある２１、２２（非特許文献１７、１８）。ＦｃγＲＩＩＡは、ＮＥＴの形成において重大な役割を果たすので１０（非特許文献１０）、ＦｃγＲＩＩＡを遮断することは、ＮＥＴ関連障害の治療において有益な役割を有する場合がある。
【０００８】
抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、治療抗体に応じてｉｎ  ｖｉｖｏで誘発され得る。治療的曝露に対するＡＤＡの影響に加えて、薬物及びＡＤＡの間の免疫複合体の形成が、潜在的に有害なＦｃＲ媒介性過敏反応を誘発し得る２３（非特許文献１９）。ＦｃγＲＩＩＡは、免疫複合体媒介性エフェクター機能に関与する主な活性化ＦｃγＲであるので、ＦｃγＲＩＩＡを遮断することは、ＡＤＡ媒介性有害作用を阻害し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．    Ｆｃ−ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．    Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．    ２００８  Ｊａｎ；  ８（１）：３４−４７
【非特許文献２】Ｈｏｇａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．    Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．    Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１２  Ｍａｒ  ３０；  １１（４）：３１１−３１
【非特許文献３】Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．    Ｂｌｏｏｄ．  ２０１２  Ｊｕｎ  １４；  １１９（２４）：５６４０−９
【非特許文献４】Ｓｃｈｉｆｆｅｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．    Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ，  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．    Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００４  Ａｕｇ；  ５０（８）：２４１５−２２
【非特許文献５】Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．    Ｈｕｍａｎ  ｌｕｐｕｓ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ＤＣｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３２  ａｎｄ  ＴＬＲ９．    Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００５  Ｆｅｂ；  １１５（２）：４０７−１７
【非特許文献６】Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．    Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｂｌｏｏｄ．    Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２００３  Ｍａｒ  １７；  １９７（６）：７１１−２３
【非特許文献７】Ｂａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．    Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩａ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  （ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｕｐｕｓ  ＩｇＧ．    Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３  Ｓｅｐ  １５；  １７１（６）：３２９６−３０２
【非特許文献８】Ｋａｌｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．    Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＡＮＣＡ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ：  ｎｅｗ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．    Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．  ２０１３  Ｄｅｃ；  ６２（６）：１１７６−８７
【非特許文献９】Ｐｏｒｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．    Ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｇａｇｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｖｉａ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩａ．    Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４  Ａｕｇ  １；  １５３（３）：１２７１−８０
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．    Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｂｙ  ＦｃγＲＩＩＩＢ  ｂｕｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｖｉａ  ＦｃγＲＩＩＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．    Ｂｌｏｏｄ．  ２０１２  Ｎｏｖ  ２２；  １２０（２２）：４４２１−３
【非特許文献１１】Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．    Ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ／ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＡ．    Ｂｌｏｏｄ．  ２００１  Ｏｃｔ  １５；  ９８（８）：２４４２−７
【非特許文献１２】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．    Ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｓｈｉｆｔｓ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．    Ｂｌｏｏｄ．  ２０１１  Ｆｅｂ  １０；  １１７（６）：２０６１−９
【非特許文献１３】Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．    Ａ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｋｉｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ．    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４  Ｍａｒ  ５；  ３０３（５６６３）：１５３２−５
【非特許文献１４】Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．    Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐ  （ＮＥＴ）  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．    Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．    Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２０１２；  ２０１２３２（８）：１７７７−１７８３
【非特許文献１５】Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｎｅｔｔｉｎｇ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄａｍａｇｅ，  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ，  ａｎｄ  ｅｘｐｏｓｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．    Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１；  １８７（１）：５３８−５５２
【非特許文献１６】Ｃａｒｍｏｎａ−Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２．    Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  ２０１５  Ｊｕｌ；  ７４（７）：１４１７−２４
【非特許文献１７】Ａｌｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．    Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｉｓｔｏｎｅｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．    Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  （Ｂｅｒｌ．）  ２０１４  Ｍａｙ；  ９２（５）：４６５−７２
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．    Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ３  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ＮＥＴｏｓｉｓ  ａｒｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  （３−ｃｅｌｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．    Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１４  Ｄｅｃ；  ６３（１２）：４２３９−４８
【非特許文献１９】Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  −  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ｄｒｕｇ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．    Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１６  Ｆｅｂ  ２；  ７：２１
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する組成物、及び例えば、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害の治療又は予防のための、このような組成物の使用方法を提供する。
【００１１】
本発明の主な態様の一部を以下に要約する。さらなる態様は、本開示の発明の詳細な説明、実施例、図面及び特許請求の範囲のセクションに記載されている。本開示の各セクションにおける説明は、その他のセクションとともに読まれように意図される。さらに、本開示の各セクションに記載される種々の実施形態は、種々の異なる方法で組み合されてもよく、すべてのこのような組合せは、本発明の範囲内に入ることが意図される。
【００１２】
本開示は、ＦｃγＲＩＩＡ−結合分子、例えば、ＦｃγＲＩＩＡ活性を阻害可能であるヒト化モノクローナル抗体、及び例えば、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害の治療又は予防においてＦｃγＲＩＩＡ結合分子を使用する方法を提供する。
【００１３】
一態様では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する単離された結合分子を提供し、結合分子は、配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）を含む。一態様では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する単離された結合分子を提供し、結合分子は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）を含む。特定の態様では、本発明の結合分子は、アミノ酸配列：（ｉ）配列番号１９及び配列番号２２、（ｉｉ）配列番号１９及び配列番号２３、（ｉｉｉ）配列番号１９及び配列番号２４、（ｉｖ）配列番号２０及び配列番号２５、（ｖ）配列番号２０及び配列番号２３又は（ｖｉ）配列番号２０及び配列番号２６をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
【００１４】
本発明は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する単離された結合分子を提供し、結合分子は、（ａ）アミノ酸配列：（ｉ）配列番号１９及び配列番号２２、（ｉｉ）配列番号１９及び配列番号２３、（ｉｉｉ）配列番号１９及び配列番号２４、（ｉｖ）配列番号２０及び配列番号２５、（ｖ）配列番号２０及び配列番号２３又は（ｖｉ）配列番号２０及び配列番号２６をそれぞれ含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）及び免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）、（ｂ）配列番号２９を含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）、（ｃ）配列番号３０又は配列番号４５を含む免疫グロブリン可変重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）、（ｄ）配列番号３１を含む免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）並びに（ｅ）配列番号３２を含む免疫グロブリン可変軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号１９及び配列番号２２を含む。
【００１５】
一実施形態では、結合分子は、（ｉ）配列番号３３及び配列番号３４、（ｉｉ）配列番号３５及び配列番号３６、（ｉｉｉ）配列番号３７及び配列番号３８、（ｉｖ）配列番号３９及び配列番号４０、（ｖ）配列番号４１及び配列番号４２並びに（ｖｉ）配列番号４３及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号３３及び配列番号３４を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、上記で記載される１種以上の結合分子と競合又は交差競合する単離された結合分子を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体及びそれらの抗原結合断片から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド連結（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ又は一本鎖抗体から選択される。
【００１９】
本発明の結合分子は、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖定常領域を含み得る。一態様では、定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域である。
【００２０】
特定の実施形態では、定常領域は、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１にアミノ酸置換を含み、Ｋａｂａｔ位置２３４のアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）で置換され、Ｋａｂａｔ位置２３５のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換され、Ｋａｂａｔ位置３３１のアミノ酸は、セリン（Ｓ）で置換されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ定常領域に対して、２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９及び４２８〜４３６位のアミノ酸残基の１つ以上の置換を含み、ここで、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従う。特定の実施形態では、定常領域は、Ｋａｂａｔ位置２５２、２５４及び２５６のアミノ酸置換を含み、Ｋａｂａｔ位置２５２のアミノ酸は、チロシン（Ｙ）で置換され、Ｋａｂａｔ位置２５４のアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）で置換され、Ｋａｂａｔ位置２５６のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【００２２】
本発明の結合分子は、免疫グロブリン軽鎖定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ定常領域である。
【００２３】
一態様では、本発明の結合分子は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、約０．１６ｎＭの解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でヒトＦｃγＲＩＩＡ  １３１Ｒと特異的に結合する。別の態様では、本発明の結合分子は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、約０．１３ｎＭの解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でヒトＦｃγＲＩＩＡ  １３１Ｈと特異的に結合する。好ましくは、結合分子は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩと特異的に結合しない。
【００２４】
本発明の結合分子は、薬剤、例えば、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物応答修飾物質、医薬剤、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、毒素及び任意の前記の薬剤のうち２種以上の組合せからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされ得る。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の結合分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、診断試薬である。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてリボヌクレオタンパク質−免疫複合体（ＲＮＰ−ＩＣ）媒介性Ｉ型ＩＦＮαを阻害する方法であって、ＰＢＭＣを、本発明の結合分子と接触させることを含む方法を提供する。また、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）誘導性好中球活性化を阻害する方法であって、好中球を、本発明の結合分子と接触させることを含む方法も提供される。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明は、対象において炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、治療を必要とする対象に、又は疾患若しくは障害に罹患しやすい対象に、有効量の本発明の結合分子又は組成物を投与することを含む方法を提供する。疾患又は障害は、好ましくは、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、溶血性貧血、混合結合組織疾患、シェーグレン症候群、強皮症、敗血症、血栓症、急性腎傷害、急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、糸球体腎炎、中毒性肝傷害、卒中、アテローム発生及びＩ型糖尿病、自己抗体障害及び免疫複合体媒介性障害から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、第２の活性薬剤を投与することを含む。
【００２８】
サンプル中のＦｃγＲＩＩＡを検出する方法であって、（ａ）サンプルを、本発明の結合分子を接触させること、及び（ｂ）結合分子のＦｃγＲＩＩＡとの結合を検出し、それによって、サンプル中のＦｃγＲＩＩＡを検出することを含む方法がさらに提供される。いくつかの場合では、方法は、診断方法である。
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明は、任意選択で、調節配列に連結された本発明の結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、該核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞、好ましくは、哺乳動物宿主細胞、及び該核酸分子を含むベクターを提供する。また、本発明の核酸分子、宿主細胞又はベクターを含む組成物も提供する。
【００３０】
本発明は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する結合分子を作製する方法であって、本発明の宿主細胞を、結合分子を製造するのに適した条件下で培養することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、結合分子を単離することをさらに含む。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、本発明の結合分子又は核酸分子を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】図１Ａ−Ｃは、コンセンサスＦｃγＲＩＩＡカニクイザル配列及びヒトＦｃγＲＩＩＡに対するアラインメントを示す図である。図１Ａは、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号１）を示す。カニクイザル集団の間の一塩基多型（ＳＮＰ）変異体は、太字で示されている。メジャーヒト対立遺伝子に対応するマイナー対立遺伝子に下線が引かれている。影付きの残基は、＞２０％のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を示す。図１Ｂは、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｐ１２３１８、１〜３１７アミノ酸、配列番号２）及びカニクイザルＦｃγＲＩＩＡ（配列番号３）のアラインメントを示す。ヒトに対して非相同であるカニクイザル（Ｃｙｎｏ）アミノ酸は、影付きである。マイナーカニクイザル（ｃｙｎｏ）対立遺伝子がヒトに対応するバリエーションには、下線が引かれている。図１Ｃは、コンセンサスＦｃγＲＩＩＡ全長カニクイザル転写物（配列番号４）を示す。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】ＩＶ．３のヒト化のエピトープ競合アッセイデータを示す図である。
【図３】マウスＩＶ．３  ＶＨ（配列番号５）及びＶＬ（配列番号８）の、ヒト化ＩＶ．３（ＣａｍＩＶ３  ＶＨ（配列番号６）及びＶＬ（配列番号９））並びに選択されたヒト生殖系列配列（配列番号７、配列番号１０）とのアラインメントを示す図である。
【図４】図４Ａ−Ｂは、ヒト化ＩＶ．３抗体のパネルのエピトープ競合アッセイデータを示す図である。図４Ａは、ヒトＦｃγＲＩＩＡ  １３１Ｈとの結合を示す。図４Ｂは、ヒトＦｃγＲＩＩＡ  １３１Ｒとの結合を示す。
【図５】図５Ａ−Ｅは、最適化ＩＶ．３  Ａｂが、ヒトＦｃγＲＩＩＡ結合に特異的であるが、その他のＦｃγＲに対して特異的ではないことを示す図である。図５Ａは、ヒトＦｃγＲＩＩＡの結合データを示す。図５Ｂは、ＦｃγＲＩＩＢの結合データを示す。図５Ｃは、ヒトＦｃγＲＩの結合データを示す。図５Ｄは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ〜１５８Ｆアロタイプの結合データを示す。図５Ｅは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ〜１５８Ｖアロタイプの結合データを示す。
【図６】ＭＥＤＩ９６００が、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）と、ＦｃγＲＩＩＡとの結合について競合することを示す図である。
【図７−１】図７Ａ−Ｃは、最適化ＩＶ．３  Ａｂが、ＦｃγＲＩＩＡを、ヒト１３１Ｈ／Ｈドナー（図７Ａ）、ヒト１３１Ｒ／Ｒドナー（図７Ｂ）及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）（図７Ｃ）由来の単球の表面から内部移行させることを示す図である。図７Ｄは、共焦点顕微鏡を使用するＭＥＤＩ９６００によるＦｃγＲＩＩＡの内部移行を示す図である。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】図８Ａ−Ｃは、ヒト１３１  Ｈ／Ｈドナー（図８Ａ）、ヒト１３１Ｒ／Ｒドナー（図８Ｂ）及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）（図８Ｃ）由来の細胞を使用して、最適化ＩＶ．３  Ａｂが、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＰＢＭＣからのＲＮＰ−ＩＣ誘導性ＩＦＮ−α発現を遮断することを示す図である。
【図９−１】図９Ａ−Ｇは、ＭＥＤＩ９６００（クローン３２ＬＯ０３５２）が、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）誘導性好中球活性化を特異的に遮断することを示す図である。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは、ＭＥＤＩ９６００が、マウスを抗血小板抗体誘導性血小板減少症から保護することを示す図である。
【図１１】図１１Ａ−Ｃは、ＭＥＤＩ９６００によるＦｃγＲＩＩＡの遮断が、好中球機能に対して有害作用がないことを示す図である。
【図１２】ＭＥＤＩ９６００単独を用いるヒト全血のｅｘ  ｖｉｖｏ処置が、タンパク質発現プロファイルに対して効果がないことを示す図である。
【図１３−１】図１３Ａ−Ｃは、ＭＥＤＩ９６００の単回用量薬物動態及び探索的薬物動態研究の結果を示す図である。図１３Ａは、単回用量後種々の時点でのカニクイザルにおけるＭＥＤＩ９６００の血清濃度を示す。カニクイザルから得た血液細胞のフローサイトメトリー解析は、ＭＥＤＩ９６００が、単球（図１３Ｂ）及び顆粒球（図１３Ｃ）でのＦｃγＲＩＩＡ蛍光強度の用量応答低減を誘導したことを示す。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ＦｃγＲＩＩＡに結合する分子を提供する。幾つかの実施形態では、そのような分子は、ＦｃγＲＩＩＡに特異的に結合する抗体、又はその抗原結合断片である。関連するポリヌクレオチド、抗ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を含む組成物、及び抗ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を作製する方法もまた提供する。新規抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体を使用する方法、例えば診断方法、及び炎症性、免疫媒介、又は自己免疫疾患又は障害などの治療方法が更に提供される。
【００３４】
本発明の実施には、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の技術の範囲内にある。かかる技法は、文献に十全に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２０１５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）；  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，  ｅｄ．  （２０１３）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｄｓ．  （２０１２），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （２０１２）  Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ  （１１ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  （２０１０）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  （６ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ）；  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  （１９９６）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ  （５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）；  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  ｅｄ．  （１９９５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，  ｅｄｓ．，  （１９９５）  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１ｓｔ  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．  （１９８７）  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）；  Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  （１９８４）  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ  （１９８４）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  （１ｓｔ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を参照されたい。
【００３５】
本発明を更に容易に理解し得るように、初めに特定の用語を定義する。追加的な定義は本開示全体を通じて示される。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ  ｅｄ．，２０１３）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２００８）、及びＴｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ−Ｓ．Ｊｕｏ，（２ｄ  ｅｄ．  Ｐ−Ｓ．  Ｊｕｏ，  ２００２）が、本明細書で用いられる一部の用語の一般的な定義を当業者に提供し得る。
【００３６】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」、並びに用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、同義的に使用することができる。
【００３７】
更に、「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示と解釈されるべきである。従って、用語「及び／又は」は、「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられるとき、Ａ及びＢ、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられるとき、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＢ；Ａ又はＣ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）を包含することが意図される。
【００３８】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載し、核酸配列は、左から右に５’から３’方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有され得る本発明の種々の態様又は実施形態の限定ではない。従って、この直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって更に十全に定義される。
【００３９】
実施形態が語句「含む」を用いて記載される場合には常に、「からなる」及び／又は「から本質的になる」によって記載される他の点で類似の実施形態が含まれる。
【００４０】
アミノ酸は、本明細書において、その一般に知られている三文字記号によるか、或いはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する一文字記号により参照される。ヌクレオチドも同様に、その一般に認められている一文字コードによって参照される。
【００４１】
「ＦｃγＲＩＩＡ」は、Ｆｃ受容体ガンマＩＩＡを指す。ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉ）ＦｃγＲＩＩＡの全長アミノ酸配列及び核酸配列は、本分野で公知である（例えば、図１を参照されたい）。用語「ＦｃγＲＩＩＡ」及び「ＣＤ３２Ａ」は、本開示を通して互換的に使用される。用語「ＦｃγＲＩＩＩＡ」と「ＣＤ１６Ａ」、並びに「ＦｃγＲＩＩＩＢ」と「ＣＤ１６Ｂ」、並びに「ＦｃγＲＩ」と「ＣＤ６４」がそれぞれ互換的に使用される様に、用語「ＦｃγＲＩＩＢ」及び「ＣＤ３２Ｂ」もまた、本開示を通して互換的に使用される。
【００４２】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介してタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又は前述の組み合わせなどの標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、その抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作製された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称されるその重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づき、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかのものであり得る。異なる免疫グロブリンクラスは異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。哺乳動物軽鎖には２つのクラス、ラムダ及びカッパが存在する。抗体は、ネイキッドであってもよく、又は毒素、放射性同位体等の他の分子にコンジュゲートしてもよい。
【００４３】
用語「抗原結合断片」は、抗体の相補性決定可変領域を含む抗体の一部分を指す。完全長抗体の断片は、抗体の抗原結合断片であり得る。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）、及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００４４】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル」は、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子に適用され得る。更に、「モノクローナル抗体」は、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物を含めた、任意の方法で作製されたかかる抗体を指す。
【００４５】
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含むように改変された非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はハムスター）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基によってＣＤＲの残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基で置き換えられる。
【００４６】
ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を洗練して最適化するため、Ｆｖフレームワーク領域にあるか、及び／又は置き換えられた非ヒト残基内にある更なる残基の置換によって更に修飾することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、一方、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部分も含み得る。ヒト化抗体の作製に用いられる方法の例が、米国特許第５，２２５，５３９号明細書及び同第５，６３９，６４１号明細書に記載される。
【００４７】
用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体、又は当該技術分野において公知の任意の技法を用いて作製されるヒトにより産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含むインタクトな又は完全長の抗体、例えば、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。
【００４８】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物の１つの種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、その種における免疫応答の誘発が回避するために、別のもの（通常、ヒト）に由来する抗体の配列と同種である。
【００４９】
「遮断」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原、例えば、ＦｃγＲＩＩＡの生物活性を阻害又は低減するものである。特定の態様では、遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に阻害する。望ましくは、生物活性は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はさらには１００％低減される。
【００５０】
用語「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」とは、抗体中の特定の位置のアミノ酸が、生殖系列におけるものに変異されて戻されることを意味する。
【００５１】
「ＩｇＧ１三重変異体」又は「ＩｇＧ１−ＴＭ」抗体形式は、下部ヒンジ及びＣＨ２ドメイン内に３つの単一アミノ酸置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓを含有するヒトＩｇＧ１アイソタイプである（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ６４：７００〜７０４、２００８）。ＴＭは、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＣ１ｑとの結合の激しい減少を引き起こし、その結果、極めて低いエフェクター機能を有するヒトアイソタイプをもたらす。
【００５２】
用語「ＹＴＥ」又は「ＹＴＥ変異体」とは、ヒトＦｃＲｎとの結合の増大をもたらすＩｇＧ１  Ｆｃにおける変異を指し、変異を有する抗体の血清半減期を改善する。ＹＴＥ変異体は、ＩｇＧｌの重鎖中に導入される、３つの変異、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＥＵ番号付けＫａｂａｔら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、ワシントンＤ．Ｃ．）の組合せを含む。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５８，９２１号を参照のこと。ＹＴＥ変異体は、抗体の血清半減期を、同一抗体の野生型バージョンと比較しておよそ４倍増大するとわかっている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８１：２３５１４〜２４（２００６）；Ｒｏｂｂｉｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５７、６１４７〜６１５３（２０１３））。参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，７８４号も参照のこと。
【００５３】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、本明細書において同義的に使用される。通常の抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ１からなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子との結合を媒介し得る。
【００５４】
ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク（ＦＷ）領域と呼ばれるより保存されている領域とともに散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分けることができる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＷ領域によって極接近して一緒に保持されており、その他の鎖に由来するＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に関与する。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＷからなる。
【００５５】
ＣＤＲの決定には少なくとも２つの技法がある：（１）異種間配列多様性に基づく手法（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．，（１９９１）））；及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７））。加えて、当該技術分野では、ＣＤＲの決定にこれらの２つの手法の組み合わせが用いられることもある。
【００５６】
Ｋａｂａｔにあるとおりのアミノ酸位置付番は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる付番方式を指す（おおよそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）。この付番方式を用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に対応するより少ない又は追加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含み、及び重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。
【００５７】
【表１】
2019524052.tif 000003
【００５８】
残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることにより決定し得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番したときのＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で異なる（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためである。３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わり；３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり；３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ  構造ループとの妥協案に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられている。表１を参照されたい。
【００５９】
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）も、ＣＤＲを含めた免疫グロブリン可変領域の付番方式を提供する。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）を参照されたい。ＩＭＧＴ付番方式は、５，０００を超える配列のアラインメント、構造データ、及び超可変ループの特徴付けに基づくものであり、あらゆる種の可変領域及びＣＤＲ領域の容易な比較を可能にする。ＩＭＧＴ付番スキームによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は２６〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５１〜５７位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ３は９３〜１０２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ１は２７〜３２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ２は５０〜５２位にあり、及びＶＬ−ＣＤＲ３は８９〜９７位にある。
【００６０】
本明細書全体を通じて用いられるとおり、記載されるＶＨ  ＣＤＲ配列は古典的Ｋａｂａｔ付番位置に対応し、即ち、Ｋａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ１は３１〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５０〜６５位にあり、及びＶＨ−ＣＤＲ３は９５〜１０２位にある。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３も古典的Ｋａｂａｔ付番位置、即ち、２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位にそれぞれ対応する。
【００６１】
「結合親和性」は、概して、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の一般的な方法によって計測することができる。低親和性抗体は、概して抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、概して抗原に速やかに結合し、結合したまま長く留まる傾向がある。
【００６２】
抗原に対する抗体の親和性又はアビディティは、当該技術分野において周知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は反応速度（例えば、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）を用いて実験的に決定することができる。直接結合アッセイ並びに競合的結合アッセイフォーマットは、容易に用いることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”  Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｐａｕｌ，  Ｗ．    Ｅ．，  ｅｄ．，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８４）；  Ｋｕｂｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９２））；及び本明細書に記載される方法を参照されたい。）特定の抗体抗原相互作用の親和性計測値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で計測した場合に異なり得る。従って、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ又はＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の計測は、抗体及び抗原の標準化した溶液、及び当該技術分野において公知のとおりの標準化した緩衝液で行われる。
【００６３】
「効力」は、通常、特に指定されない限りｎＭ又はｐＭのＩＣ５０値として表現される。ＩＣ５０は、抗体分子の阻害濃度中央値である。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的反応をその最大値の５０％低下させる濃度である。リガンド結合試験では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、当該技術分野において公知の任意の手段によって計算することができる。
【００６４】
参照抗体と比較したときの本発明の抗体又はポリペプチドの効力の改善倍数は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、又は少なくとも約１８０倍又はそれを超えることができる。
【００６５】
用語「阻害する」、「遮断する」及び「抑制する」は、同義的に使用され、活性の完全遮断を含む、生物活性の任意の統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の減少を指し得る。したがって、用語「阻害」又は「抑制」が、例えば、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達経路に対する効果を説明するために適用される場合には、この用語は、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子の、ＦｃγＲＩＩＡ誘導性細胞活性化又はシグナル伝達を、未処置（対照）細胞に対して統計的に有意に減少させる能力を指す。ＦｃγＲＩＩＡを発現する細胞は、天然に存在する細胞又は細胞株（例えば、マクロファージ、好中球、好酸球、血小板）であり得るか、又はＦｃγＲＩＩＡをコードする核酸を宿主細胞中に導入することによって組換えによって産生され得る。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡ発現細胞においてＦｃγＲＩＩＡ媒介性細胞活性化又はシグナル伝達を、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又は当業者に公知のその他のアッセイによって決定して、少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は約１００％阻害し得る。
【００６６】
「単離された」ポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞とは、天然には見られない形態である。単離されたポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、もはやそれらが天然に見られる形態ではない程度まで精製されているものを含む。いくつかの実施形態では、単離されているポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、実質的に純粋である。本明細書において使用される場合には、用語「実質的に純粋な」とは、７５％を超える、好ましくは、８０％又は９０％を超える、最も好ましくは、９５％を超える純度を指す。
【００６７】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は療法が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象として、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含む、ヒト、飼育動物、家畜動物、スポーツ用動物及び動物園の動物が挙げられる。
【００６８】
用語「医薬組成物」とは、有効成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態の、組成物が投与される対象にとって許容しがたく毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。このような組成物は、無菌である場合もあり、生理食塩水などの医薬上許容される担体を含み得る。適した医薬組成物は、バッファー、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収促進剤及び／又はその他の従来の可能化剤若しくは分散剤のうち１種以上を含み得る。
【００６９】
本明細書において開示される結合分子の「有効量」とは、具体的に記された目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、経験的に、日常的な方法で、記された目的に関連して決定できる。
【００７０】
本明細書において使用される、用語「標識」とは、「標識された」結合分子を作製するために結合分子に直接的又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は例えば、酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００７１】
「治療すること」又は「治療」又は「治療するために」又は「軽減すること」又は「軽減するために」などの用語は、診断された病理的状態又は障害の症状を治癒する、減速する、和らげる、及び／又はその進行を停止する治療的手段を指す。したがって、治療を必要とするものとして、すでに障害を有するものが挙げられる。特定の実施形態では、患者が、疾患又は障害と関連する症状の完全な、部分的な又は一過性の軽減又は排除を示す場合には、対象は、本明細書において提供される方法に従って、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害について成功裏に「治療される」。
【００７２】
「予防する」又は「予防」とは、標的とされる病理的状態又は障害の発症を防止する及び／又は減速する予防的又は防止的（prophylactic or preventative）手段を指す。したがって、予防を必要とするものは、障害を有する傾向がある、又は障害に罹患しやすいものを含む。特定の実施形態では、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害は、患者が、本発明の方法に供されていない患者よりも、例えば、疾患若しくは障害と関連する症状がより少ない、若しくはより重症ではない症状、又は疾患若しくは障害と関連する症状のより遅い発症を一過性に又は持続性に発症する場合、本明細書において提供される方法に従って成功裏に予防されている。
【００７３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってもよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、且つ非アミノ酸がそれを分断していてもよい。これらの用語はまた、天然で又は介入によって修飾されている（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作又は修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションなど）アミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義内には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、並びに当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。特定の実施形態において、ポリペプチドは一本鎖又は会合鎖として存在し得る。
【００７４】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含め、当該技術分野において定義されている。例えば、フェニルアラニンのチロシンとの置換は保存的置換である。特定の実施形態において、本発明の結合分子のアミノ酸配列における保存的置換は、そのその結合分子が結合する抗原、即ちＦｃγＲＩＩＡへの結合分子の結合を無効にしない。抗原結合性を消失させないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は当該技術分野において周知である。（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２：  １１８０−１  １８７  （１９９３）；  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １２（１０）：８７９−８８４  （１９９９）；及び  Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：．４１２−４１７  （１９９７））を参照されたい）。
【００７５】
「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の「核酸」、「核酸分子」、及び「核酸配列」を含むことができ、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、且つＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はこれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって重合体に組み込むことのできる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体など、修飾ヌクレオチドを含み得る。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含め、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００７６】
用語「ベクター」は、１つ以上の目的の遺伝子又は配列を宿主細胞に送達し、及び一部の実施形態では発現する能力を有する構築物を意味する。ベクターの例としては、限定はされないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。
【００７７】
２つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、最大の一致となるように比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入して）したとき、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮することなく、同じであるか、又は特定の割合の同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって計測することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために用い得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。
【００７８】
配列アラインメントアルゴリズムの１つのかかる非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３−５８７７（１９９３）によって修正され、且つＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９１）））に組み込まれた、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８（１９９０）に記載されるアルゴリズムである。特定の実施形態では、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）において記載されるとおり、ギャップ付きＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６））、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，カリフォルニア）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が、配列のアラインメントに用いることのできる更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。特定の実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列及びギャップ加重４０、５０、６０、７０、又は９０及び長さ加重１、２、３、４、５、又は６を使用して）決定される。特定の代替的実施形態において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み込むＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを（例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、及びギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さ加重１、２、３、４、５を使用して）決定することができる。或いは、特定の実施形態において、ヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用いて、及び残基テーブルのＰＡＭ１２０、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定することができる。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによる最大限のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【００７９】
特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列の第２の配列アミノ酸に対するパーセンテージ同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査によるか、又は特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントしたとき）において同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列の残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第１の配列の第２の配列に対するパーセント同一性は第２の配列の第１の配列に対するパーセント同一性より高くなる。
【００８０】
ＩＩ．  ＦｃγＲＩＩＡ結合分子
本発明は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合するＦｃγＲＩＩＡ結合分子、すなわち、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体及びその抗原結合断片を提供する。用語「ＦｃγＲＩＩＡ結合分子」又は「ＦｃγＲＩＩＡと結合する結合分子」又は「抗ＦｃγＲＩＩＡ」とは、十分な親和性でＦｃγＲＩＩＡと結合可能であり、その結果、結合分子が、ＦｃγＲＩＩＡを標的とすることにおいて治療剤又は診断試薬として有用である結合分子を指す。「ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する」結合分子は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（分析物として組換えＦｃγＲＩＩＡ及びリガンドとして結合分子を使用して、又はその逆）、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又は当技術分野で公知のその他の結合アッセイによって測定して、結合分子のＦｃγＲＩＩＡに対する結合の約１０％未満の程度で、非関連の非ＦｃγＲＩＩＡタンパク質と結合する。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡと結合する結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ又は≦０．１ｐＭの解離定数（ＫＤ）を有する。
【００８１】
本開示の例示的結合分子として、マウスモノクローナル抗体ＩＶ．３（Ｌｏｏｎｅｙ  ＲＪら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６（５）：１６４１（１９８６））の変異体（これらの抗体のヒト化、最適化、生殖系列化及び／又はその他のバージョンを含む）、抗ＦｃγＲＩＩＡ  ＴＭ抗体及び血清半減期が最適化された抗ＦｃγＲＩＩＡ  ＹＴＥ抗体（例えば、Ｋ４４ＶＨａ−Ｎ５６Ｑ、Ｋ４４ＶＨａ６−Ｎ５６Ｑ又はＫ２Ｈａ−Ｎ５６Ｑ）が挙げられる。本開示の例示的抗体として、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５及び３２ＬＯ０３５６が挙げられる。「クローン３２ＬＯ０３５２」及び「ＭＥＤＩ９６００」とは、同一分子を指し、この用語は、本明細書において同義的に使用される。本発明はまた、本明細書において示されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子と実質的に相同である変異体及び等価物も包含する。これらは、例えば、保存的アミノ酸置換を含有し得る。
【００８２】
特定の態様では、本開示は、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６のうちいずれか１種の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む結合分子と同一のＦｃγＲＩＩＡエピトープと特異的に結合し得るＦｃγＲＩＩＡ結合分子を提供する。用語「エピトープ」とは、本発明の結合分子と結合可能な標的タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団からなり、通常、特定の三次元構造特徴並びに特定の電荷特徴を有する。コンホメーションエピトープ及び非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者との結合は失われない点で区別される。このような結合分子は、標準的なＦｃγＲＩＩＡ結合又は活性アッセイにおいて、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６などの結合分子と交差競合する（例えば、統計的に有意な方法でその結合を競合阻害する）その能力に基づいて同定され得る。
【００８３】
したがって、一実施形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＡとの結合について、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６のうち１種などの本発明の別のＦｃγＲＩＩＡ結合分子と競合するＦｃγＲＩＩＡ結合分子を提供する。例えば、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６の結合を阻害する結合分子の能力は、試験結合分子が、ＦｃγＲＩＩＡとの結合についてクローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６と競合し得ること、このような結合分子は、非限定的な理論に従って、ＦｃγＲＩＩＡ上の、競合するＦｃγＲＩＩＡ結合分子と同一又は関連（例えば、構造的に同様の又は空間的に近位の）エピトープと結合し得ることを実証する。一実施形態では、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体又はその抗原結合断片は、ＦｃγＲＩＩＡ上の、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６のいずれかと同一のエピトープと結合する。用語「競合する」は、結合分子が、ＦｃγＲＩＩＡとの結合について、３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６のうちいずれか１種と一方向性に競合することを示す。用語「交差競合」とは、結合分子が、ＦｃγＲＩＩＡとの結合について、３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６のうちいずれか１種と二方向性に競合することを示す。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
【００８５】
本明細書において提供されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＶＨ及びＶＬに加えて、重鎖定常領域又はその断片を含み得る。特定の態様では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域である。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子の機能的及び／又は薬物動態特性を変更するためにＦｃ領域中に１つ以上の変更がなされている変更されたＦｃ領域を含むように製造される。このような変更は、エフェクター機能の変更、免疫原性の低減及び／又は血清半減期の増大をもたらし得る。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体、補体タンパク質Ｃｌｑ並びにプロテインＡ及びＧなどのその他の分子を含むいくつかのリガンドと相互作用する。これらの相互作用は、種々のエフェクター機能並びに抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を含む下流シグナル伝達事象にとって必須である。したがって、特定の実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、Ｆｃ領域中に修飾を含まないＦｃγＲＩＩＡ結合分子と比較して、エフェクター機能の促進に関与するＦｃリガンドに対する親和性が低減している、又は除去されている。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＡＤＣＣ活性を有さない、及び／又はＣＤＣ活性を有さない。特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、Ｆｃ受容体及び／又は補体因子と結合しない。特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、エフェクター機能を有さない。所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野における通常の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＩｇＧ１サブタイプのものであり、任意選択で、定義のセクションにおいて上記で開示されるＴＭ形式（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。
【００８７】
特定の態様では、重鎖定常領域又はその断片は、野生型ＩｇＧ定常ドメインに対して１つ以上のアミノ酸置換を含む場合があり、修飾されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して増大した半減期を有する。例えば、ＩｇＧ定常ドメインは、２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９及び４２８〜４３６位のアミノ酸残基のうち１つ以上のアミノ酸置換を含有する場合があり、アミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従う。特定の態様では、ＩｇＧ定常ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２５２のアミノ酸のチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）若しくはトレオニン（Ｔ）での置換、Ｋａｂａｔ位置２５４のアミノ酸の、トレオニン（Ｔ）での置換、Ｋａｂａｔ位置２５６のアミノ酸のセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はトレオニン（Ｔ）での置換、Ｋａｂａｔ位置２５７のアミノ酸のロイシン（Ｌ）での置換、Ｋａｂａｔ位置３０９のアミノ酸のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋａｂａｔ位置３１１のアミノ酸のセリン（Ｓ）での置換、Ｋａｂａｔ位置４２８のアミノ酸のトレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はセリン（Ｓ）での置換、Ｋａｂａｔ位置４３３のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）若しくはグルタミン（Ｑ）での置換又はＫａｂａｔ位置４３４のアミノ酸のトリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）若しくはチロシンでの置換のうち１つ以上を含み得る。より詳しくは、ＩｇＧ定常ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２５２のアミノ酸のチロシン（Ｙ）での置換、Ｋａｂａｔ位置２５４のアミノ酸のトレオニン（Ｔ）での置換及びＫａｂａｔ位置２５６のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）での置換などを含む、野生型ヒトＩｇＧ定常ドメインに対するアミノ酸置換を含有し得る。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＩｇＧ１サブタイプのものであり、任意選択で、定義のセクションにおいて上記で開示される三重変異体ＹＴＥを含む。
【００８８】
本明細書において提供されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、軽鎖定常領域又はその断片を含み得る。特定の態様では、軽鎖定常領域は、カッパ定常領域又はラムダ定常領域、例えばヒトカッパ定常領域又はヒトラムダ定常領域である。
【００８９】
本明細書において提供されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、有益な特性を有し得る。例えば、結合分子は、種々のＦｃγＲＩＩＡ媒介性活性、例えば、形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）における免疫複合体誘導性Ｉ型インターフェロン発現、ＤＣにおける免疫複合体誘導性サイトカイン／ケモカイン発現、免疫複合体誘導性血小板活性化、免疫複合体誘導性抗原提示、免疫複合体誘導性好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成及び好中球活性化における脱顆粒を阻害、抑制又は遮断し得る。
【００９０】
特定の態様では、本明細書において提供される結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡと、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイによって、又は結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＫｉｎＥｘＡ）３０００プラットフォームで測定して約１００ｎＭ〜約０．１ｎＭの解離定数（ＫＤ）を特徴とする結合親和性で結合し得る。
【００９１】
特定の態様では、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体又はその抗原結合断片は、ＦｃγＲＩＩＡ、例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＡ又はカニクイザルＦｃγＲＩＩＡ又はその抗原性断片と、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）又はＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって測定して１０−６Ｍ未満の、１０−７Ｍ未満の、１０−８Ｍ未満の、１０−９Ｍ未満の、１０−１０Ｍ未満の、１０−１１Ｍ未満の、１０−１２Ｍ未満の、１０−１３Ｍ未満の、１０−１４Ｍ未満の又は１０−１５Ｍ未満の解離定数又はＫＤで特異的に結合し得る。特定の態様では、ヒト化抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体ＭＥＤＩ９６００は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｒ）との約０．１５ｎＭのＫＤで、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｈ）と約０．１３ｎＭのＫＤで、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡと約３１．３ｎＭのＫＤで結合し得る。
【００９２】
別の実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡ又はその抗原性断片と、１×１０−３ｓ−１未満の、又は２×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。その他の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡ又はその抗原性断片と、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）又はＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって測定して１０−３ｓ−１未満の、５×１０−３ｓ−１未満の、１０−４ｓ−１未満の、５×１０−４ｓ−１未満の、１０−５ｓ−１未満の、５×１０−５ｓ−１未満の、１０−６ｓ−１未満の、５×１０−６ｓ−１未満の、５×１０−７ｓ−１未満の、１０−８ｓ−１未満の、５×１０−８ｓ−１未満の、１０−９ｓ−１未満の、５×１０−９ｓ−１未満の、又は１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆで結合する。特定の態様では、ヒト化抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体ＭＥＤＩ９６００は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｒ）と約７．３５ｘ１０−４ｓ−１のＫｏｆｆで、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｈ）と約３．３７ｘ１０−４ｓ−１のＫｏｆｆで、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡと約９．０４ｘ１０−２ｓ−１のＫｏｆｆで結合し得る。
【００９３】
別の実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡ又はその抗原性断片と例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）又はＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって測定して、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はＫｏｎ速度で結合する。特定の態様では、ヒト化抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体ＭＥＤＩ９６００は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｒ）と約４．９８ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１のＫｏｎで、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｈ）と約２．６０ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１のＫｏｎで、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡと約２．８８ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１のＫｏｎで結合し得る。
【００９４】
ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列又はその部分、例えばＣＤＲ配列は、本明細書において示される配列に対して、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％類似し、及び／又は本明細書において示される配列、例えば、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５又は３２ＬＯ０３５６のいずれかに由来する配列に対して０、１、２、３、４、５つ又はそれ以上の置換、例えば、保存的置換を含み得る。ＶＨ領域又はＶＬ領域に対して特定のパーセント類似性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する、又は１つ以上の置換、例えば、保存的置換を有するＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、本明細書において記載されるＶＨ及び／又はＶＬ領域をコードする核酸分子の変異誘発（例えば、部位指定又はＰＣＲ媒介変異誘発）と、それに続く、コードされる変更された結合分子のＦｃγＲＩＩＡとの結合についての試験及び任意選択で、本明細書において記載される機能アッセイを使用する保持される機能についての試験によって得ることができる。
【００９５】
本開示は、異種薬剤にコンジュゲートされているＦｃγＲＩＩＡ結合分子をさらに提供する。特定の態様では、薬剤は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物応答修飾物質、医薬剤、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は任意の前記薬剤のうち２種以上の組合せであり得る。ヘテロコンジュゲート抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体は、本明細書において別の場所でより詳細に論じられる。
【００９６】
用語「結合分子」は、抗体及びその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、抗体ではないポリペプチドである。高親和性でタンパク質標的と結合する非抗体ポリペプチドを同定し、製造する種々の方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：２９５〜３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１４〜２７（２００６）、Ｇｉｌｌら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：６５３〜６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ、ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５：２６６８〜７６（２００８）及びＳｋｅｒｒａ、ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５：２６７７〜８３（２００８）を参照のこと。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合ポリペプチドを同定及び／又は製造するために、ファージディスプレイ技術を使用することができる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン及びチオレドキシンからなる群から選択される種類のタンパク質スキャフォールドを含む。
【００９７】
ＩＩＩ．  ＦｃγＲＩＩＡ結合分子の調製
モノクローナル抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものなどのハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を免疫し、免疫抗原に特異的に結合し得る抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球はまた、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して好適な骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を形成し、次にそこから未融合のリンパ球及び骨髄腫細胞を選択によって除くことができる。免疫沈降、免疫ブロット法によるか、又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ＲＩＡ若しくはＥＬＩＳＡ）によって決定される、選択された抗原を特異的に対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、次に標準方法を用いたインビトロ培養か（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、或いは動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次に、モノクローナル抗体を培養培地又は腹水から精製することができる。
【００９８】
ＦｃγＲＩＩＡ結合分子はまた、例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるとおり組換えＤＮＡ方法を用いて作製することもできる。幾つかの場合、成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から、その抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるなどして、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、従来の手順を用いてその配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを好適な発現ベクターにクローニングし、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクトすると、宿主細胞によって結合分子が生成される。また、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４  （１９９０））；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８  （１９９１））；及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１））に記載されるとおり、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから、組換えＦｃγＲＩＩＡ結合分子を単離することもできる。ＦｃγＲＩＩＡ結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の生産及び発現は、次のセクションにおいてより詳細に論じられる。
【００９９】
結合分子をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を用いた何らかの種々の方法で更に修飾することができ、それにより代替的な結合分子を作製し得る。一部の実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインが、（１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作製されるか、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作製され得る。一部の実施形態では、定常領域がトランケートされるか、又は除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作製される。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
【０１００】
特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子はヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて直接調製することができる。インビトロで免疫されるか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球を作製することができる。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。
【０１０１】
例えば、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：３０９−３１４  （１９９６）），  Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５：６１５７−６１６２  （１９９８）），  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：３８１  （１９９１）），及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１  （１９９１））に記載されるとおり、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子はファージライブラリから選択することもでき、ここで、そのファージライブラリはヒト抗体を発現する）。抗体ファージライブラリを作製及び使用する技術は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；及びＲｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７５：１１８２−１２００  （２００７）にも記載されている。
【０１０２】
親和性成熟戦略及びチェインシャッフリング戦略が当該技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片の作製に用いることができる。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３  （１９９２）を参照されたい）。
【０１０３】
一部の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子はヒト化抗体又はその抗原結合分子であってもよい。非ヒト又はヒト抗体の改変、ヒト化又はリサーフェシング方法も用いることができ、当該技術分野において周知である。ヒト化抗体、リサーフェシング抗体、又は同様の改変抗体は、非ヒト、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物である供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称される残基によって置き換えられ、インポート残基は、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変、定常又は他のドメインから取られる。かかるインポートされた配列を用いて、免疫原性を低減し、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、アビディティ、特異性、半減期、若しくは当該技術分野において公知のとおりの任意の他の好適な特性を低減し、増強し、若しくは変更することができる。一般に、ＣＤＲ残基が、ＦｃγＲＩＩＡ結合への影響について、直接的且つ最も実質的に関与する。従って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持する一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸に置き換えることができる。
【０１０４】
抗体はまた、任意選択で、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持しつつ改変されたヒト化抗体、リサーフェシング抗体、改変抗体又はヒト抗体であってもよい。この目標を達成するため、任意選択で、ヒト化（又はヒト）又は改変抗ＦｃγＲＩＩＡ結合分子及びリサーフェシング抗体を、親配列、改変配列、及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物及び改変産物を分析することによって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元立体構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補結合分子配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、即ち、候補結合分子がＦｃγＲＩＩＡなどのその標的に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列及びインポート配列からフレームワーク（ＦＷ）残基を選択して組み合わせることにより、標的抗原に対する親和性の増加など、所望の結合分子特性を実現することができる。
【０１０５】
抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体又はその抗原結合断片のヒト化、リサーフェシング又は改変は、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）；米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９８／１６２８０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９６／１８９７８号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９１／０９６３０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願９１／０５９３９号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願９４／０１２３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願第８９／０１３３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願第９１／０１１３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；及び欧州特許第２２９２４６号明細書に記載されるものなど、任意の公知の方法を用いて実施することができる。
【０１０６】
抗ＦｃγＲＩＩＡ２ヒト化抗体及びその抗原結合断片はまた、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスでも作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。
【０１０７】
特定の実施形態において、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体断片が提供される。抗体断片の作製について様々な技法が公知である。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化によって得られている。例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７−１１７（１９９３）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３（１９８５）を参照されたい。特定の実施形態において、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体断片は組換えで作製される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は、いずれも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細胞で発現させて、そこから分泌させることができ、このようにしてこれらの断片を大量に作製することが可能である。かかる抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体断片はまた、上記で考察した抗体ファージライブラリから単離することもできる。抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるとおりの線状抗体であってもよい。抗体断片の他の作製技法が当業者に明らかであろう。
【０１０８】
本発明によれば、ＦｃγＲＩＩＡに特異的な一本鎖抗体の作製技法を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）。加えて、ＦｃγＲＩＩＡに対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリの構築方法を適合させることができる（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）を参照されたい）。抗体断片は、限定はされないが、（ａ）抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片；（ｃ）抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片；及び（ｄ）Ｆｖ断片を含め、当該技術分野で公知の技法によって作製することができる。
【０１０９】
幾つかの態様では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、エフェクター機能を低減又は排除するために改変され得る。これは、例えばＩｇＧ１のＦｃドメインにおけるトリプル変異（ＴＭ）であるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓによって達成され得る。エフェクター機能を低減する他の変異は本分野で公知である。例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：２６１３−２６２４，  １９９９；  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１−６６０４，  ２００１を参照されたい。
【０１１０】
特定の態様において、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、その血清半減期が増加するように修飾することができる。これは、例えば、適切な領域の突然変異によって結合分子にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによるか、又は後に結合分子にいずれかの末端若しくは中央で（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって）融合するペプチドタグにそのエピトープを組み込むことによるか、又はＹＴＥ突然変異によって達成し得る。抗体又はその抗原結合断片の血清半減期を増加させる他の方法、例えば、ＰＥＧなどの異種分子とのコンジュゲーションが、当該技術分野において公知である。
【０１１１】
ヘテロコンジュゲートＦｃγＲＩＩＡ抗体及びその抗原結合断片も、本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合によって接合された抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫細胞を不要の細胞に標的化させるために提案されている（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）。ヘテロコンジュゲート抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体及びその抗原結合断片は、架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学における公知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製できるということは考慮される。例えば、チオエーテル結合を形成することによってジスルフィド交換反応を使用して免疫毒素を構築できる。この目的のための適した試薬の例として、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１１２】
ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、通常は、タンパク質の一部ではないさらなる化学的部分を含有するように修飾できる。このような部分は、結合分子の特徴、例えば、溶解度、生物学的半減期又は吸収を改善し得る。部分はまた、結合分子の任意の望ましくない副作用を低減又は排除し得る。それらの部分の概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（２０００）に見出すことができる。
【０１１３】
特定の態様では、本開示は、本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子を含み、任意選択で、１種以上の担体、希釈剤、賦形剤又はその他の添加物をさらに含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【０１１４】
ＩＶ．  ＦｃγＲＩＩＡ結合分子をコードするポリヌクレオチド、その調製及び発現
本開示は、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子、例えば、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明は、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体をコードする、又はこのような抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含み、二本鎖である場合も一本鎖である場合もあり、一本鎖の場合には、コーディング鎖である場合も非コーディング（アンチセンス）鎖である場合もある。
【０１１５】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離できる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であり得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであり得るか、又はｃＤＮＡに由来する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えによって製造できる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現、及び任意選択で、分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、プロモーター又はその他の調節配列、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同一リーディングフレームで融合された成熟ポリペプチドのコード配列を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、宿主細胞によって切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質及びさらなる５’アミノ酸残基であるＦｃγＲＩＩＡ結合プロタンパク質をコードし得る。
【０１１６】
本開示は、本明細書において示されるアミノ酸配列に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の類似性を有し、及び／又は本明細書において示されるアミノ酸配列、例えば、クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５若しくは３２ＬＯ０３５６のうちいずれかに由来する配列に対して０、１、２、３、４、５つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、例えば、保存的置換を含む、ＶＨ及び／又はＶＬドメインに由来するアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩＩＡ結合分子をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１１７】
特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子のコード配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と同一リーディングフレームで融合される。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するように、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得るか、又は哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合には、マーカー配列は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来の血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。
【０１１８】
ポリヌクレオチド変異体も提供される。ポリヌクレオチド変異体は、コーディング領域、非コード領域又は両方において変更を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加又は欠失をもたらすが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を変更しない変更を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝暗号の縮重によるサイレント置換によってポリヌクレオチド変異体が製造される。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由のために、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの細菌宿主によって好まれるものに変更する）ために製造され得る。
【０１１９】
本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターを含む。適したベクターは、本明細書において別の場所に記載されており、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、ＶＨドメイン又はその部分をコードする核酸を含むポリヌクレオチド及びＶＬドメイン又はその部分をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、単一ベクター中にある場合も、別個のベクター上にある場合もあり得る。したがって、本開示は、上記のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを提供する。
【０１２０】
特定の態様では、本開示は、上記のようなポリヌクレオチド又はベクターを含み、任意選択で、１種以上の担体、希釈剤、賦形剤又はその他の添加物をさらに含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【０１２１】
本開示は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供し、ここで、宿主細胞は、いくつかの場合では、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合する結合分子を発現し得る。このような宿主細胞は、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を作製する方法において利用でき、方法は、（ａ）宿主細胞を培養すること及び（ｂ）宿主細胞から、又は結合分子が宿主細胞によって分泌される場合には培養培地から結合分子を単離することを含む。
【０１２２】
一部の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子をコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチド合成機を使用した化学合成によって構築することができる。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列、及び目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利なコドンの選択に基づき設計することができる。標準方法を適用して、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して逆翻訳遺伝子を構築することができる。更に、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するヌクレオチドオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードする幾つかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的アセンブリのための５’又は３’オーバーハングを含有する。
【０１２３】
アセンブル後（合成、部位特異的突然変異誘発又は別の方法による）、結合分子をコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、所望の宿主における結合分子の発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結され得る。適切なアセンブリは、例えば、ヌクレオチドシーケンシング、制限マッピング、及び／又は好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。宿主におけるトランスフェクトした遺伝子の高い発現レベルを達成するために、その遺伝子を、選択の発現宿主で機能する転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結するか又はそれに会合させ得る。
【０１２４】
特定の実施形態では、組換え発現ベクターを使用して、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子をコードするＤＮＡを増幅し、発現させる。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子のポリペプチド鎖をコードする合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写単位は、概して、以下で更に詳細に記載するとおり、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列との集合を含む。かかる調節エレメントは、転写を制御するためオペレーター配列を含み得る。一般に複製起点によって付与される宿主における複製能、及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子が、更に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが機能上互いに関係しているとき、作動可能に連結している。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している。プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結しているか、又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするような位置にある場合、コード配列に作動可能に連結している。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現する場合、このタンパク質はＮ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、任意選択で、後に発現した組換えタンパク質から切断されて、最終産物を提供し得る。
【０１２５】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存することになる。幅広い種類の発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ  １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を含めた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージなどのより広い宿主域のプラスミドが挙げられる。
【０１２６】
ＦｃγＲＩＩＡ結合分子の発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫又は高等真核生物細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が含まれる。高等真核生物細胞には、以下で記載するとおりの哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も用いられ得る。抗体作製を含めたタンパク質作製方法に関する更なる情報については、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書、及び同第６，６６０，５０１号明細書、並びに国際特許公開国際公開第０４００９８２３号パンフレットにおいて見出され得る。
【０１２７】
種々の哺乳類又は昆虫細胞培養系が、組換えＦｃγＲＩＩＡ結合分子の発現に有利に用いることができる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現を実施してもよく、なぜならかかるタンパク質は概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、且つ完全に機能性であるためである。好適な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，（１９８１）によって記載されるサル腎細胞のＣＯＳ−７株、及び他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させる遺伝子に連結した好適なプロモーター及びエンハンサー、及び他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、及び転写終結配列などを含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質産生用のバキュロウイルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８））によってレビューされている。
【０１２８】
形質転換宿主によって産生されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、任意の好適な方法によって精製することができる。かかる標準方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法によるものが含まれる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に付加すると、適切なアフィニティーカラムに通過させることによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴付けることもできる。
【０１２９】
例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌する系からの上清を、初めに市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮し得る。この濃縮ステップ後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用し得る。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に用いられる他のタイプであってもよい。或いは、陽イオン交換ステップが用いられてもよい。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を更に精製することができる。均一な組換えタンパク質を提供するため、前述の精製ステップの一部又は全てを様々に組み合わせて用いることもできる。
【０１３０】
細菌培養で産生された組換えＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、例えば、細胞ペレットからの初期抽出と、続く１つ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最終精製ステップには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル処理、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた、任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【０１３１】
抗体及び他のタンパク質を精製するための当該技術分野において公知の方法としてはまた、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号明細書、同第２００８／０１７７０４８号明細書、及び同第２００９／０１８７００５号明細書に記載されるものも挙げられる。
【０１３２】
Ｖ．  ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を使用する処理方法
不適切なＦｃγＲＩＩＡ活性化と関連する疾患又は障害、例えば、免疫複合体沈着、免疫複合体媒介性ネトーシス、ＡＮＣＡ誘導性ＦｃγＲＩＩＡ活性化及び抗血小板抗体誘発性ＦｃγＲＩＩＡ活性化を特徴とする疾患又は障害を有する患者を処置するためにＦｃγＲＩＩＡ結合分子を使用する方法が提供される。以下の考察は、ＦｃγＲＩＩＡと特異的に結合可能であり、ＦｃγＲＩＩＡ活性をアンタゴナイズするＦｃγＲＩＩＡ結合分子を用いる、種々の疾患及び障害の診断法及び治療方法を指す。
【０１３３】
一実施形態では、治療又は予防は、対象若しくは患者へのＦｃγＲＩＩＡ結合分子若しくはＦｃγＲＩＩＡ結合分子を含む組成物の適用若しくは投与、又は対象若しくは患者に由来する単離組織若しくは細胞株へのＦｃγＲＩＩＡ結合分子の適用若しくは投与を含み、対象若しくは患者は、疾患、疾患の症状又は疾患の素因を有する。組成物は、好ましくは、医薬組成物である。
【０１３４】
本明細書において提供されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、特定の炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害の治療又は予防にとって有用である。炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害の例として、それだけには限らないが、血管炎、例えば、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）又は巨大細胞動脈炎（ＧＣＡ）血管炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尋常性天疱瘡、ループス腎炎、乾癬、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、強直性脊椎炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、クローン病、重症筋無力症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、全身性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、強直性脊椎炎（ａｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、アトピー性皮膚炎、ブドウ膜炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発性筋炎、皮膚筋炎、膜性腎症、溶血性貧血、混合結合組織疾患、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｍａ）、敗血症、血栓症、急性腎傷害、急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、糸球体腎炎、中毒性肝傷害、卒中、アテローム発生、ＩｇＧ媒介性過敏反応、抗薬物免疫複合体媒介性有害作用及びその他の自己抗体又は免疫複合体媒介性障害が挙げられる。
【０１３５】
ＦｃγＲＩＩＡ結合分子の投与に対する臨床応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリー又は蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）解析、組織学、肉眼所見及びそれだけには限らないが、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどによって検出可能な変化を含む血液化学などのスクリーニング技術を使用して評価できる。さらに、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を用いる療法を受けている対象は、疾患又は障害と関連する症状の改善を経験し得る。
【０１３６】
ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を調製し、それを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であるが、又は当業者によって容易に決定され得る。ＦｃγＲＩＩＡ結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によって、又は局所であり得る。用語「非経口」は、本明細書において、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸及び経膣投与を含む。経口剤形として、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液及び溶液が挙げられる。鼻腔エアゾール又は吸入剤形は、ベンジルアルコール又はその他の適した保存料、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤及び／又はその他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を用いて、例えば、生理食塩水中の溶液として調製できる。
【０１３７】
通常、適した医薬組成物は、バッファー、任意選択で、界面活性剤、任意選択で、安定剤などを含み得る。医薬上許容される担体又は希釈剤の形態及び特徴は、組み合わされるべき有効成分の量、投与経路及び周知の変数によって左右され得る。本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子、例えば、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体又はその抗原結合断片、変異体又は誘導体のうち１種以上の種を含むカクテルも使用できる。その他の方法では、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を、有害な細胞集団の部位に直接送達し、それによって治療剤に対する罹患組織の曝露を増大できる。一実施形態では、投与は、気道に直接的に、例えば、吸入又は鼻腔内（経鼻）投与によってである。
【０１３８】
本明細書において論じられるように、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡ媒介性疾患、例えば、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害のｉｎ  ｖｉｖｏ治療のために治療上有効量で投与できる。この関連で、開示された結合分子は、活性薬剤の投与を容易にし、安定性を促すように製剤化できるということは認められよう。本発明に従う医薬組成物は、医薬上許容される、非毒性、滅菌担体、例えば、生理食塩水、非毒性バッファー、保存料などを含み得る。本出願の目的上、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子の「治療上有効量」とは、利益を達成するのに、例えば、疾患若しくは状態の症状を緩和させるのに、又は物質若しくは細胞を検出するのに十分な量を意味する。本明細書において開示される治療方法において使用するための適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（２０００）に記載されている。
【０１３９】
組成物は、単回用量、複数回用量として、又は確立された期間にわたって注入において投与できる。投与計画はまた、最適な所望の応答（例えば、治療的又は予防的応答）を提供するように調整できる。剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができるＦｃγＲＩＩＡ結合分子の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態（すなわち、疾患の重症度、病歴及び療法を受けている個体の年齢、身長、体重、健康状態及び体調）、治療が予防的であるか、治療的であるか、投与されるその他の医薬及び患者がヒトであるか、動物であるかを含む多数の異なる因子に応じて変わるだろう。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療できる。投与されるべきＦｃγＲＩＩＡ結合分子の量は、当業者ならば決定できる。安全性及び有効性を最適化するために、治療投与量を、当業者に公知の日常的な方法を使用して用量設定できる。
【０１４０】
本開示はまた、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害、例えば、ＡＮＣＡ又はＧＣＡ血管炎などの血管炎、免疫性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、クローン病、重症筋無力症、ＧＶＨＤ、ＡＤＡ媒介性有害作用、ネトーシス並びに敗血症、血栓症、急性腎傷害、急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、糸球体腎炎、中毒性肝傷害、卒中、アテローム発生、Ｉ型糖尿病及びＩｇＧ媒介性過敏反応を含むネトーシス関連障害を治療又は予防するための、本明細書において記載されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子の使用を提供する。
【０１４１】
本開示はまた、炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患又は障害、例えば、ＡＮＣＡ又はＧＣＡ血管炎などの血管炎、免疫性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、クローン病、重症筋無力症、ＧＶＨＤ、ＡＤＡ媒介性有害作用、ネトーシス並びに敗血症、血栓症、急性腎傷害、急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、糸球体腎炎、中毒性肝傷害、卒中、アテローム発生、Ｉ型糖尿病及びＩｇＧ媒介性過敏反応を含むネトーシス関連障害を治療又は予防するための医薬の製造における、本明細書において記載されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子の使用を提供する。
【０１４２】
ＶＩ．アッセイ及び診断
本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、ＦｃγＲＩＩＡ媒介性疾患、例えば、特定の炎症性、免疫媒介性又は自己免疫性疾患若しくは障害の診断に、及び／又は臨床試験手順の一部として、例えば、所与の治療計画の有効性を調べるためにタンパク質レベルを診断モニタリングするために使用できる。このような方法は、通常、発現レベルＦｃγＲＩＩＡをアッセイするために本明細書において記載されるＦｃγＲＩＩＡ結合分子を使用することを含む。「ＦｃγＲＩＩＡの発現レベルをアッセイする」とは、第１の生物学的サンプル中のＦｃγＲＩＩＡのレベルを直接的に（例えば、絶対タンパク質レベルを決定又は推定することによって）又は間接的に（例えば、第２の生物学的サンプル中の疾患関連ポリペプチドレベルに対して比較することによって）、質的又は量的に測定又は推定することを意味することを意図とする。第１の生物学的サンプル中のＦｃγＲＩＩＡ発現レベルは、測定又は推定し、標準ＦｃγＲＩＩＡレベルに対して比較でき、標準は、障害を有さない個体から得られた第２の生物学的サンプルからとられ、又は障害を有さない個体の集団から得られたレベルの平均をとることによって決定される。いくつかの態様では、標準サンプルと比較した試験サンプルのタンパク質レベルの増大は、本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子によって治療可能な疾患又は障害を示す。当技術分野では理解されるであろうが、ひとたび「標準」ＦｃγＲＩＩＡレベルが知られると、比較のための標準として反復して使用できる。
【０１４３】
「生物学的サンプル」は、潜在的にＦｃγＲＩＩＡを発現する個体、細胞株、組織培養物又は細胞のその他の供給源から得た任意の生物学的サンプルを意図する。哺乳動物から組織生体検体及び体液を得る方法は、当技術分野で公知である。
【０１４４】
本発明のＦｃγＲＩＩＡ結合分子を使用し、当業者に公知の伝統的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のＦｃγＲＩＩＡタンパク質レベルをアッセイできる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０１：９７６〜９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０５：３０８７〜３０９６（１９８７））。使用できるイムノアッセイとして、それだけには限らないが、いくつか例を挙げるとウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び免疫電子顕微鏡などの技術を使用する競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。このようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野で周知である。当業者ならば、日常的な実験を用いることによって各決定の作動する最適なアッセイ条件を決定できるであろう。
【０１４５】
ＦｃγＲＩＩＡの検出を、結合分子を検出可能な物質又は標識にカップリングすることによって容易することができる。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光物質、生物発光物質及び放射性物質が挙げられる。適した酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の一例として、ルミノールがある。生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる。適した放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが挙げられる。
【０１４６】
ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的試料、例えば、血液サンプルを回収すること、及び生物学的サンプル上に標識されたＦｃγＲＩＩＡ結合分子を重ね合わせることによって、それに標識されたＦｃγＲＩＩＡ結合分子を適用することによって遂行できる。このような手順の使用によって、ＦｃγＲＩＩＡの存在だけでなく、検査した組織におけるその分布も決定することが可能である。当業者ならば、本発明を使用して、さまざまな組織学的方法（染色手順など）のいずれも、このようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成するように修飾できることを容易に理解するであろう。
【０１４７】
単離されたＦｃγＲＩＩＡ結合分子の結合特徴を決定するのに適した方法及び試薬は、当技術分野で公知である、及び／又は市販されている。このような動態解析のために設計された機器及びソフトウェアが市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）ソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
【０１４８】
ＶＩＩ．  ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を含むキット
本開示は、本明細書において記載された方法を実施するために使用できる、ＦｃγＲＩＩＡ結合分子を含むキットをさらに提供する。特定の実施形態では、キットは、１つ以上の容器中に少なくとも１種の精製されたＦｃγＲＩＩＡ結合分子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイを実施するためのすべての制御、指示並びに結果の解析及び提示のための任意の必要なソフトウェアを含む、検出アッセイを実施するのに必要な及び／又は十分な成分のすべてを含有する。当業者ならば、開示されたＦｃγＲＩＩＡ結合分子は、当技術分野で周知である確立されたキット形式のうちの１種に容易に組み込むことができるということを容易に認識するであろう。
【０１４９】
本開示において引用された参考文献のすべては、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書において引用又は言及された任意の製品の任意の製造業者の説明書又はカタログは、参照により組み込まれる。参照により本明細書内に組み込まれた文書又はそれにおける任意の教示は、本発明の実施において使用できる。参照により本明細書内に組み込まれた文書は、先行技術であると認められない。
【０１５０】
本発明を以下の非限定的な例においてさらに説明する。
【実施例】
【０１５１】
本開示の実施形態は、本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体を使用する方法を詳細に説明する以下の非限定的な例を参照することによってさらに定義できる。本開示の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対する多数の改変を行うことができるということは当業者には明らかであろう。
【０１５２】
［実施例１］
抗ＦｃγＲＩＩＡマウスモノクローナル抗体のヒト化及び最適化
ヒト及びカニクイザル由来のＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢのクローニング、発現、精製
ヒト由来のＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ分子を、参照としてデータベース配列を使用するプライマー伸長ＰＣＲクローニングを用いて合成した（表２を参照のこと）。配列を、Ｃ末端で６ｘＨｉｓ＿Ｆｌａｇタグ（ＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１８）に融合されたｐＥＢＮＡ哺乳動物発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１０８９８）中にクローニングした。タンパク質をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｒ７９０−０７）において発現させた。上清中の発現されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−５２４８−０２））と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１０６９−０１））を使用して精製した。
【０１５３】
【表２】
2019524052.tif 000004
【０１５４】
カニクイザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））におけるＦｃγＲＩＩＡコンセンサス配列
カニクイザルＦｃγＲＩＩＡ中にはヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１２３１８）に対して非相同である３６個のアミノ酸があり、その結果、８８％の配列同一性（ａａ１〜３１７）となる。表３は、非相同アミノ酸を示す。
【０１５５】
【表３】
2019524052.tif 000005
2019524052.tif 000006
【０１５６】
マイナーカニクイザル対立遺伝子がヒトに対応する変動は、太字で示されている。
【０１５７】
＞２０％のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有する、カニクイザル集団の中のさらなる７つのコーディング多型を同定した。表４は、一塩基多型変動を示す。
【０１５８】
【表４】
2019524052.tif 000007
2019524052.tif 000008
【０１５９】
ヒトＦｃγＩＩＡに対するコンセンサスカニクイザル配列及びアラインメントが、図１Ａ〜１Ｃに示されている。
【０１６０】
カニクイザルＣＤ３２Ａタンパク質
ＩＶ３のエピトープの周囲の多型に基づいて、３つのバージョンのカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）ＣＤ３２Ａを作製した（Ｒａｍｓｌａｎｄら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８７：３２０８〜３２１７（２０１１））。これらのタンパク質を、ＧｅｎｅＡｒｔによってＨＥＫ細胞において発現させ、Ｃ末端６ｘｈｉｓタグを利用してＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１６１】
【化１】
2019524052.tif 000009
2019524052.tif 000010
【０１６２】
タンパク質修飾
本明細書において使用したＩｇＧ及び修飾されたタンパク質は、ＥＺ  ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３３５）を使用して遊離アミンを介してビオチン化した。ビオチン試薬を無水ジメチルホルムアミドに溶解し、ＰＢＳベースのタンパク質溶液を、Ｄ−ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）中、１ＭのＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ約８に調整した。本明細書において使用したＣＤ３２タンパク質は、ＥＺ  ｌｉｎｋビオチン−ＢＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号２１９００）を使用して遊離システインを介してビオチン化した。ビオチン試薬を無水ジメチルホルムアミドに溶解し、Ｄ−ＰＢＳタンパク質溶液と３：１で混合した。すべての場合においてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって標識組込みを評価し、未反応試薬をＤ−ＰＢＳ平衡化ディスポーザブルＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを使用するバッファー交換によって取り除いた。ビオチン化のために、アミノ酸配列から算出された吸光係数を使用して最終タンパク質濃度を２８０ｎＭ吸光度によって決定した。
【０１６３】
ＩｇＧ分子のクローニング及び発現
可変ドメインを、本質的にＰｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ  １８７（１）：９〜１８（１９９７））によって記載されるように、以下の改変を用いて全免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗体形式に変換した。ＯｒｉＰ断片を、発現ベクター中に含めて、ＣＨＯ一過性細胞との使用を容易にし、エピソーム複製を可能にした。重鎖可変（ＶＨ）ドメインを、ヒト重鎖定常ドメイン及び調節エレメントを含有するベクター中にクローニングして、発現させて、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ１重鎖を発現させた。重鎖定常ドメインは、全長抗体のＦｃ部分を介したＣＤ３２Ａの係合を避けるために、Ｆｃエフェクター機能を有意に低減すると示された３つの変異を含有していた（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  ＳｅｃｔｉｏｎＤ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６４（６）：７００（２００８））。同様に、ヒト軽鎖（カッパ）定常ドメイン及び調節エレメントの発現のために軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを、ベクター中にクローニングして、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。ＩｇＧを得るために、重鎖及び軽鎖ＩｇＧ発現ベクターを、ＣＨＯ一過性哺乳動物細胞中にトランスフェクトした（Ｄａｒａｍｏｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ３０（１）：１３２〜４１（２０１４））。ＩｇＧは発現され、培地中に分泌された。収集物を精製に先立って濾過し、次いで、プロテインＡクロマトグラフィーを使用してＩｇＧを精製した。培養上清を、適当な大きさのＣｅｒａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）のカラム上にロードし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて洗浄した。結合しているＩｇＧを、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用してカラムから溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ９．０）の添加によって中和した。溶出された材料を、Ｎａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号１７−０８５４−０２）を使用してＰＢＳにバッファー交換し、ＩｇＧの濃度を、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づいて吸光係数を使用して分光光度測定によって決定した（Ｍａｃｈら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００（１）：７４〜８０（１９９２））。精製されたＩｇＧを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって凝集及び分解純度について解析した。
【０１６４】
ＩＶ．３  Ａｂのヒト化
マウスモノクローナル抗体ＩＶ．３は、１９８６年に最初に記載された（Ｌｏｏｎｅｙ  ＲＪ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６（５）：１６４１）。ハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣから入手し、ＩＶ．３の重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）セグメントを配列決定した（配列番号５及び配列番号８）。
【０１６５】
マウスｍＡｂ  ＩＶ．３の可変ドメインのヒト化は、ＩＶ．３の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を、選択したヒト生殖系列フレームワーク（ＦＷ）にグラフトすることによって実施した。ＩＶ．３のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を、ＩＭＧＴデータベース中の公知のヒト生殖系列配列に対してアラインし（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３７（データベース号（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ））：Ｄ１００６−Ｄ１０１２（２００９））、重大な残基（バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）、カノニカルクラス残基及びＶＨ／ＶＬ界面残基）、免疫原性（生殖系列頻度）、安定性及び発現を対応させることを含む配列類似性によって適当なヒト生殖系列を同定した（ＩＶ．３抗体のＶＨドメインについては、選択されるヒト生殖系列は、ＩＧＨＶ１−３＊０１／ＩＧＨＪ４とした。ＶＬドメインについては、ＩＧＫＶ２−２８＊０１／ＩＧＫＪ２であった。
【０１６６】
同等の選択されたヒトＦＷと置き換えられた１つ以上のマウスＦＷ領域を用いて、一連のキメラ重鎖可変及び軽鎖を設計した。すべてのＣＤＲ及びＦＷ領域は、Ｋａｂａｔによって定義されたとおりとした。完全にマウス及びキメラＩＶ．３可変領域を、ＣＨＯ発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成した。続いて、これらを、上記のように全免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗体として発現させて、部分的及び全体的にヒト化されたＩＶ．３変異体のパネルを作製した。抗体を、実施例１１に記載されるようにエピトープ競合アッセイにおいて特性決定した。簡潔には、均一性時間分解蛍光法（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＨＴＲＦ（登録商標）、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、ＩＶ．３  ＩｇＧの結合を検出して（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０１４７０）、ヒトＣＤ３２Ａ  １３１Ｈをビオチン化した。ＩＶ．３及びＣＤ３２Ａの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を、それぞれ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９がコンジュゲートした抗マウス抗体及びストレプトアビジンテルビウムクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、製品番号６１０ＳＡＴＬＢ）を使用して検出した。シグナルは、ＣＤ３２Ａ結合についてＩＶ．３と競合するサンプルＩｇＧの添加によって破壊される。ＩＶ．３のＶＨ及びＶＬ鎖両方の完全ヒト化は、このアッセイにおける効力の１０倍喪失を伴った。標準分子生物学技術を使用して、ヒト軽鎖生殖系列フレームワーク中にマウス残基を導入し、これによって、マウスＩｇＧ（変異Ｙ３６Ｆ）の５倍内に効力を回復させた。得られたデータは、図２に例示されている。続いて、ＶＬ  ＣＤＲ１（Ｎ２８Ｌ）中の潜在的な脱アミノ化部位を除去して、製造の間の化学的修飾のリスクを低減した。親ＶＨ及びＶＬ鎖（ＩＶ．３）、最終ヒト化ＶＨ及びＶＬ鎖（ＣａｍＩＶ３）及び選択されたヒト生殖系列配列のアラインメントは、図３に示されている。
【０１６７】
ＣａｍＩＶ３  Ａｂの最適化
標準分子生物学技術を使用して、ＣａｍＩＶ．３のＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ１の選択位置で単一アミノ酸置換を行った。実施例１１に記載されるように、変異体を、ＩｇＧとして直接発現させ、ＩＶ．３エピトープ競合アッセイにおいて上清を定量化し、スクリーニングした。ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ１において有益な個々の変異を組み合わせ、ＩｇＧを発現させ、スクリーニングした。６種の最適化されたＣａｍＩＶ．３変異体をさらなる解析のために選択した、３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５及び３２ＬＯ０３５６。ＮＩＰ２２８  ＩｇＧ１ＴＭを陰性対照として使用した。ＩＶ．３エピトープ競合アッセイにおけるこれらの変異体の活性は、図４に示されている。表５に示されるように、最適化された変異体は、ＣａｍＩＶ３と、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ２配列においてのみ異なっていた。
【０１６８】
【表５】
2019524052.tif 000011
2019524052.tif 000012
【０１６９】
ＩＶ．３からのアミノ酸相違は、太字である。
【０１７０】
ＩＶ．３、ＣａｍＩＶ３、３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２（ＭＥＤＩ９６００）、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５及び３２ＬＯ０３５６に共通するＣＤＲ配列は、表６に示されている（図３も参照のこと）。
【０１７１】
【表６】
2019524052.tif 000013
【０１７２】
クローン３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５１、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４、３２ＬＯ０３５５及び３２ＬＯ０３５６のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列は、表７に示されている。
【０１７３】
【表７】
2019524052.tif 000014
2019524052.tif 000015
【０１７４】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３２Ａに対するＩＶ．３及び３２ＬＯ０３５２の親和性
ＩＶ．３及び３２ＬＯ０３５２に対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）解析によって測定した。簡潔には、ヒトＩｇＧｌ−ＴＭ（キメラＩＶ．３又は３２ＬＯ０３５２）をＣｌ−プロテインＧチップ上に捕捉した。ヒトＣＤ３２Ａ＿１３１  Ａｒｇ、ヒトＣＤ３２Ａ＿１３１Ｈ又はカニクイザルＣＤ３２Ａ（バージョン３）の段階希釈（ｌｏｇ２刻みで２５ｎＭ〜０．３９０６ｎＭ）を分析物として使用した。データは、１：１ラングミュア解離モデルにフィッティングされ、表８に示されている（２回の独立実験から得た平均データ）。
【０１７５】
【表８】
2019524052.tif 000016
【０１７６】
［実施例２］
ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）結合に対して特異的な最適化されたＩＶ．３  Ａｂ
ヒト化され、最適化されたＩＶ．３  Ａｂの特異性を調べるために、抗体の、組換えＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ−１３１Ｈ／Ｈアロタイプ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ−１５８Ｆアロタイプ又はＦｃγＲＩＩＩ−１５８Ｖアロタイプとの結合をＥＬＩＳＡによって評価した。Ｒ３４７  Ｔｍ  ＡｂをヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照として使用し、抗体Ｈ２Ｂ６−Ｔｍ、３Ｇ８、１６−１１５を、それぞれ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩの陽性対照として使用した。これら４種のヒト化され、最適化されたＩＶ．３クローン、３２ＬＯ０３５０、３２ＬＯ０３５２、３２ＬＯ０３５４及び３２ＬＯ０３５５は、結合特異性を示したが（図５Ａ）、その他のＦｃγＲに対しては示さなかった（図５Ｂ〜５Ｅ）。これらのデータは、ヒト化され、最適化された抗体変異体が、ＦｃγＲＩＩＡに対するその特異性を保持することを実証する。重要なことに、これらの抗体は、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインにおける類似性にもかかわらず、このアッセイでは、ＦｃγＲＩＩＡと結合するが、ＦｃγＲＩＩＢとは結合しない。
【０１７７】
［実施例３］
静脈内免疫グロブリンとのＭＥＤＩ９６００（３２ＬＯ０３５２）結合競合
ＭＥＤＩ９６００が、競合又は非競合作用様式を有すか否かを決定するために、ＩｇＧを用いて結合競合アッセイを実施した。全血中の循環免疫グロブリンの生理学的濃度を模倣する静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の存在下及び非存在下での、ＭＥＤＩ９６００の、ＦｃγＲＩＩＡを発現するヒト好中球との結合を、フローサイトメトリーによって評価した。図６に示されるように、ＭＥＤＩ９６００は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ発現性好中球と用量依存性に結合した。好中球表面でのヒトＦｃγＲＩＩＡとのＭＥＤＩ９６００結合のＥＣ５０値は、０．０３ｎＭであった（図６）。１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧの存在下で、好中球表面でのヒトＦｃγＲＩＩＡとのＭＥＤＩ９６００結合のＥＣ５０値は、３．３４ｎＭに増大し（図６）、ＭＥＤＩ９６００が、ＦｃγＲＩＩＡとの結合について免疫グロブリンと競合することを示唆した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプＲ３４７−ＴＭ対照を用いた場合には、結合は観察されなかった（図６）。これらのデータは、ＭＥＤＩ９６００が、リガンド遮断抗体であることを示す。
【０１７８】
［実施例４］
最適化されたＩＶ．３  Ａｂは、全血アッセイにおいてヒト及びカニクイザルＦｃγＲＩＩＡを内部移行させる
マウスＩＶ．３  Ａｂは、ＦｃγＲＩＩＡを内部移行させ、その後、リソソームにおいて受容体を分解するとわかっている１３。結果として、抗体結合の際の細胞の表面からのＦｃγＲＩＩＡの除去を、受容体内部移行の尺度として使用できる。本発明者らは、この作用様式を検証し、全血内部移行アッセイにおいて抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体変異体の効力を評価した。このアッセイ形式を使用して、生理学的条件下で見られる競合免疫グロブリンの細胞組成及びレベルを模倣した。ＦｃγＲＩＩＡの２種の共通ヒト多型変異体、１３１Ｈ及び１３１Ｒが、ＩｇＧサブクラスと異なって結合することが、これまでにわかっている１４。結果として、抗体の、１３１Ｈ及び１３１Ｒについてホモ接合性のドナーから得たＦｃγＲＩＩＡを内部移行させる能力も評価した。薬理学及び毒性学評価を容易にするために、カニクイザルから得た全血において、抗体の、単球からＦｃγＲＩＩを内部移行させる能力も評価した。
【０１７９】
キメラ及び最適化された抗体は、ヒト１３１Ｈ／Ｈドナー（図７Ａ）及びヒト１３１Ｒ／Ｒドナー（図７Ｂ）由来の単球の表面からＦｃγＲＩＩＡを内部移行させた。最適化されたＩＶ．３  Ａｂは、１３１Ｈ／Ｈ及び１３１Ｒ／Ｒドナーの両方について親ＩＶ．３キメラＡｂと比較して２〜５倍改善された効力を示した。最適化された抗体のＥＣ５０は、１３１Ｈ／ＨドナーについてのキメラＩＶ．３抗体の０．１９ｎＭと比較して０．０４ｎＭ〜０．０９ｎＭ及び１３１Ｒ／ＲドナーについてのキメラＩＶ．３抗体の０．２０ｎＭと比較して０．０４ｎＭ〜０．０６ｎＭの範囲であった（図７Ａ、７Ｂ）。最適化された抗体はまた、カニクイザルの単球の表面でＦｃγＲＩＩＡを内部移行させた（図７Ｃ）。最適化された抗体の効力は、キメラＩＶ．３  Ａｂよりも最大７倍大きかった。まとめると、これらのデータは、ＩＶ．３抗体の最適化された変異体中の重鎖及び軽鎖のＦａｂ領域に導入された変化が有益であることを実証する。ＦｃγＲＩＩＡ結合特異性は保持されており、マウス残基は除去されており、鍵となる変化を加えたことで、生理学的に関連するアッセイにおいて、抗体の親バージョンを越えて、上記の抗体の効力が増強された。
【０１８０】
さらなる実験では、ＭＥＤＩ９６００媒介性受容体内部移行が、共焦点顕微鏡によって確認された。時間０で、ＣＤ１４（陰性対照として）及びＦｃγＲＩＩＡは両方とも、細胞表面染色を示した。しかし、３７℃での１時間のインキュベーション後、ほぼ完全なＦｃγＲＩＩＡ内部移行が、ＭＥＤＩ９６００の結合によって刺激され、一方でＣＤ１４は、細胞表面上のままであった（図７Ｄ）。
【０１８１】
［実施例５］
最適化されたＩＶ．３  Ａｂは、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣからのＲＮＰ−ＩＣ誘導性ＩＦＮα発現を遮断した
本発明者らは、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体の、リボヌクレオタンパク質−免疫複合体（ＲＮＰ−ＩＣ）媒介性Ｉ型インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）産生を阻害する能力を評価した。抗体の活性を、１３１Ｈ／Ｈ又は１３１Ｒ／Ｒハプロタイプのいずれかを有する健常ドナーから得た細胞を用いて、及びカニクイザルから得た細胞を用いて調べた。最適化されたＩＶ．３  Ａｂは、１３１Ｈ／Ｈ及び１３１Ｒ／Ｒドナーから得た細胞を使用して親ＩＶ．３抗体と比較して、ＲＮＰ−ＩＣ誘導性Ｉ型ＩＦＮαアッセイにおいて最大約２倍の増大を示した（図８Ａ、８Ｂ）。最適化された抗体の効力は、１３１Ｈ／Ｈドナーを用いて、ヒト化ＣａｍＩＶ．３抗体よりも約３〜８倍大きく（図８Ａ）、１３１Ｒ／ＲについてはＣａｍＩＶ．３よりも約５〜１２倍大きかった（図８Ｂ）。カニクイザル細胞を使用するＲＮＰ−ＩＣ誘導性ＩＦＮαアッセイにおいて、ＩＶ．３の４種の最適化された抗体のうち３種も、親バージョン及びヒト化されたバージョンよりも大きな効力を示した（図８Ｃ）。
【０１８２】
これらの最適化されたヒト抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体の、Ｉ型ＩＦＮの免疫複合体媒介性誘導を遮断する効力の増大は、全血内部移行アッセイにおける抗体媒介性ＦｃγＲＩＩＡ取り込みの改善と一致する。ＩＦＮαは、ＳＬＥの病態形成において重要な役割を果たすと思われるので、これらのデータは、ＳＬＥの治療のための、これらのヒト化され、最適化された抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体の使用を支持する。
【０１８３】
［実施例６］
最適化されたＩＶ．３  Ａｂ、クローン３２ＬＯ０３５２（ＭＥＤＩ９６００）は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）誘導性好中球活性化を特異的に遮断する
好中球活性化のマーカーは、活性酸素種の放出であり、これは、フェリ−チトクロームＣ還元アッセイにおいて、又はフローサイトメトリーベースのＤＨ１２３アッセイによって測定できる１５。最適化されたＩＶ．３  Ａｂクローン３２ＬＯ０３５２（ＭＥＤＩ９６００）の、ＡＮＣＡ誘導性好中球活性化を阻害する能力を、フェリ−チトクロームＣ還元アッセイにおいて最初に調べた。ＭＥＤＩ９６００は、活性酸素種のＡＮＣＡ−（抗ＰＲ３  Ａｂ及び抗ＭＰＯ  Ａｂの両方）誘導性好中球産生を特異的に遮断した（図９Ａ、９Ｂ）。ＭＥＤＩ９６００が、好中球活性化に非特異的に影響を及ぼすか否かを決定するために、好中球を、ＦｃγＲＩＩＡ抗体の存在下及び非存在下でＰＭＡを用いて処置した。ＰＭＡは、活性酸素種を誘導したが、ＭＥＤＩ９６００を用いるＦｃγＲＩＩＡの阻害は、ＰＭＡ誘導性好中球活性化に対して効果がなかった（図９Ｃ）。これらのデータは、ＭＥＤＩ９６００が、好中球活性化の抗体媒介性誘導を特異的に遮断するが、好中球活性化のその他の機序は、この処置によって妨害されない場合があることを実証する。
【０１８４】
ＭＥＤＩ９６００の、ＡＮＣＡ誘導性好中球活性化を遮断する能力をまた、より高感度のフローサイトメトリーベースのＤＨＲ１２３アッセイによって評価した。このアッセイ形式を使用して、ＭＥＤＩ９６００は、やはり、抗ＭＰＯ及び抗ＰＲ３  Ａｂ誘導性好中球活性化を用量依存的に阻害したが、アイソタイプ対照抗体は、効果を有さなかった（図９Ｄ、９Ｅ）。これまでの実験は両方とも、市販の抗ＭＰＯ及び抗ＰＲ３  Ａｂを刺激として使用した。最適化されたＩＶ．３  Ａｂの、ＡＮＣＡ誘導性好中球活性化を阻害する能力を検証するために、ＰＲ３又はＭＰＯのいずれかに対する自己抗体を用いてＡＡＶ患者の血清からＩｇＧを精製し、好中球に対する刺激として使用した。フローサイトメトリーベースのＤＨＲ１２３アッセイを使用して、ＭＥＤＩ９６００は、ＡＡＶ患者のＩｇＧによって誘発された好中球活性化を有意に遮断した（図９Ｆ、９Ｇ）。
【０１８５】
まとめると、これらのデータは、ＭＥＤＩ９６００抗ＦｃγＲＩＩＡ  Ａｂは、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）誘導性好中球活性化を特異的に遮断できることを示し、ＡＮＣＡ関連血管炎の治療のための、ヒト化され、最適化されたＭＥＤＩ９６００抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体の使用を支持する。
【０１８６】
［実施例７］
最適化されたＩＶ．３  Ａｂ（ＭＥＤＩ９６００）は、抗血小板抗体誘導性血小板減少症からマウスを保護する
トランスジェニックヒトＦｃγＲＩＩＡマウス活性化ＦｃγＲ欠損マウスを使用して、最適化されたＩＶ．３  Ａｂ（ＭＥＤＩ９６００）の、抗血小板抗体誘導性血小板減少症を遮断する有効性を調べた。抗血小板抗体を用いる、ＦｃγＲＩＩＡトランスジェニックマウスの処置は、血小板の迅速な枯渇を引き起こした（図１０Ａ）。最適化されたＩＶ．３  Ａｂ（ＭＥＤＩ９６００）を用いる予防的投薬は、このモデルにおいて血小板クリアランスを有意に遮断した（図１０Ｂ、１０Ｃ）。重要なことに、ＭＥＤＩ９６００を用いる血小板枯渇の阻害は、血小板上のＦｃγＲＩＩＡの内部移行と関連していた。
【０１８７】
まとめると、これらのデータは、ヒト化抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体、ＭＥＤＩ９６００が、抗血小板抗体誘導性血小板減少症をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することを示し、免疫性血小板減少症の治療のためのこの抗体の使用を支持する。
【０１８８】
［実施例８］
ＭＥＤＩ９６００によるＦｃγＲＩＩＡの遮断は、好中球機能に対して有害作用を有さない
好中球は、感染及び組織傷害を感知し、白血球を補充し、感染を取り除き、適応免疫システムを関与させ、修復を促すように働く急性炎症応答を開始することによって宿主防御において重大な役割を果たす。好中球は、侵襲に対する曝露の際、病原体及び損傷を受けた宿主細胞に由来する化学的シグナルに従って、血管を通って組織傷害部位に迅速に遊走する。好中球は、パターン認識受容体、補体レセプター及び免疫グロブリン受容体との相互作用によって病原体を直接的に関与させ、これが、病原体を死滅させる毒性物質の放出及び／又は食作用による病原体のクリアランスをもたらす。好中球機能は、宿主防御において重要であるので、本発明者らは、種々の好中球機能に対する、ＭＥＤＩ９６００を用いるＦｃγＲＩＩＡ遮断の影響を評価した。
【０１８９】
第１に、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＡの遮断が、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）アゴニスト及び細菌リポタンパク質のアシル化アミノ末端の模倣物である、合成トリアシル化リポタンパク質Ｐａｍ３Ｓｋ４の存在下で、好中球活性化に影響を及ぼすか否かを調べた。抗ＴＬＲ２  Ａｂは、Ｐａｍ３Ｓｋ４誘導性好中球活性化を阻害したが、ＭＥＤＩ９６００抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体及びアイソタイプ対照ＩｇＧ抗体は、ＴＬＲ２媒介性好中球活性化に対して効果がなかった（図１１Ａ）。
【０１９０】
次いで、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＡの遮断が、ＩＬ−８誘導性好中球遊走に影響を及ぼすか否かを調べた。ＩＬ−８誘導性好中球遊走は、ＭＥＤＩ９６００又は対照抗体によって影響を受けなかった（図１１Ｂ）。
【０１９１】
最後に、本発明者らは、ＭＥＤＩ９６００が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の抗Ｐｓｌ  ｍＡｂ媒介性オプソニン作用性死滅（ＯＰＫ）に影響を及ぼすか否かを調べた。抗Ｐｓｌ  ｍＡｂは、これまでに、好中球の存在下で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の強力な補体依存性死滅を媒介するとわかった１６。このアッセイにおいて発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株を使用して、細菌死滅を評価した。発光のレベルは、生存細菌の頻度と相関する。好中球を、ＭＥＤＩ９６００、抗ＦｃγＲＩＩＢ  Ａｂ又は抗ＦｃγＲＩＩＩ  Ａｂとともにプレインキュベートし、次いで、それらを発光細菌とともに２時間インキュベートした。ＭＥＤＩ９６００は、好中球の、抗Ｐｓｌ  ｍＡｂ  Ｐｓ１００９６の存在下で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を死滅させる能力に対して最小効果しか有していなかったが、ＦｃγＲＩＩＩの遮断は、ＯＰＫ活性を明確に阻害した（図１１Ｃ）。これらのデータは、細菌の臨床的に抵抗性の株の抗体媒介性食作用は、ＦｃγＩＩＡとはほとんど独立していることを示し、この受容体の遮断は、好中球による細菌の食作用に有害な影響を及ぼさないと予測される。
【０１９２】
まとめると、これらのデータは、ＦｃγＲＩＩＡ遮断は、走化性、病原体関連分子パターンによって誘導される活性化及び食作用などの正常な好中球機能に有害な影響を及ぼさないことを示す。
【０１９３】
［実施例９］
ＭＥＤＩ９６００は、全血中の細胞からのタンパク質誘導に対して影響を有さない
サイトカインストームなどの抗体処置の有害作用は、全血のタンパク質プロファイルを調べることによって検出できる。ＭＥＤＩ９６００の影響を評価するために、非刺激全血、及びＭＥＤＩ９６００、Ｉｇ−ＩＣ又はＲＮＰ−ＩＣによって刺激された全血の遺伝子発現プロファイルを、５人の正常な健康なドナーにおいて評価した。Ｉｇ−ＩＣ又はＲＮＰ−ＩＣは、タンパク質発現プロファイルに対して顕著な影響を有していたが、予期されたように、未処置及びＭＥＤＩ９６００刺激状態の間に発現に相違はなかった（図１２）。これらのデータは、ＭＥＤＩ９６００は、全血において細胞を活性化しないことを示し、良好な安全性プロファイルの指標である。
【０１９４】
［実施例１０］
ＭＥＤＩ９６００：カニクイザルにおける単回用量薬物動態及び探索的薬物動態研究
この研究の目的は、静脈内注射によって単回用量として与えられた場合の、カニクイザルにおけるＭＥＤＩ９６００の薬物動態／薬物動力学関係を特性決定することであった。この研究の結果は、ヒトへのＭＥＤＩ９６００の投与を支持する薬物動態／薬物動力学モデリングの情報を得るために使用した。
【０１９５】
薬物動態は、非線形であり、Ｃｍａｘ／用量、ＡＵＣ（０〜∞）／用量及び半減期の調査は、用量とともに増大するこれらの明確な傾向を示す（図１３Ａ）。非コンパートメント解析から得られた最終半減期は、カニクイザルにおいてヒトＩｇＧ１抗体について予期されたものよりも短く、１ｍｇ／ｋｇを与えられた群のものは、１．０８〜１．２日でしかなく、１００ｍｇ／ｋｇを与えられた群のものは２．８４〜４．３日に増大した。しかし、用量とともに増大する半減期の傾向は、薬物動態曲線の調査とともに、抗体の標的によって媒介される排除と一致する薬物動態プロファイルを示す。標的によって媒介される排除からの干渉が少ない１００ｍｇ／ｋｇの最高用量については、ヒトＩｇＧ１抗体について予期されるように、０．０２４〜０．０５２Ｌ／ｋｇの分布の初期量は、血漿量と同様であった。薬物動態可変性は、低いと思われ、早期サンプルについては、およそ２０％以下の変動値の係数であった。薬物動態は、最終フェーズに近づくと顕著により可変性になった。
【０１９６】
１、１０又は１００ｍｇ／ｋｇで投与されたＭＥＤＩ９６００の単回用量は、単球及び顆粒球でのＦｃγＲＩＩＡ蛍光強度の用量応答低減を誘導した（図１３Ｂ、１３Ｃ）。この低減は、完全に可逆性であり、完全回復は、１ｍｇ／ｋｇを与えられた動物において最初に、続いて、１０ｍｇ／ｋｇを与えられた動物及び１００ｍｇ／ｋｇを与えられた動物において達成された。単球及び顆粒球でのＦｃγＲＩＩＡ発現は、ＭＥＤＩ９６００を用いる投薬に対して用量依存性抑制を示し、単球及び顆粒球について同様であった。抑制は、３０分の時点までで観察され、投薬における迅速な抑制を示す。この抑制は、群１（１ｍｇ／ｋｇ）については部分的のみであったが、その最下点でのこれらの用量レベルによって達成される同様の抑制によって判断すれば、群２及び３について最大抑制を引き起こすと思われた。ＦｃγＲＩＩＡ発現レベルは、数日から数週間の用量依存性期間にかけてベースラインに戻った。この迅速な抑制及び遅い回復が、ＭＥＤＩ９６００の薬物動態プロファイルを反映していることは、注目すべきことであった。特に、ＦｃγＲＩＩＡ発現のベースラインへの回復は、１，０００ｎｇ／ｍｌ未満の濃度に対する薬物動態曝露の低減と対応しており、これは、群１については投薬後およそ７日で、群２については投薬後およそ１４日で、群３については投薬後およそ４９日で起こり、これは、薬物動態曝露及びＦｃγＲＩＩＡ発現の形態での薬物動力学応答の間に強力な直接的な関係を示した。
【０１９７】
要約すると、雄のサルに、ＭＥＤＩ９６００を、静脈内注射によって２ｍＬ／ｋｇの用量容積を用いて１、１０又は１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで１回与えた。ＭＥＤＩ９６００の投与は、単球及び顆粒球でのＦｃγＲＩＩＡ発現の用量依存性抑制と、それに続く、ＭＥＤＩ９６００薬物動態曝露の期間と一致する、ベースラインレベルへの遅い回復をもたらし、これは、薬物動態曝露と薬物動力学反応の間の強力な関係を示す。
【０１９８】
さらに、研究の間に安全性エンドポイントも評価し、ＭＥＤＩ９６００の投与は、Ｄ−二量体濃度に対して、又は質的飼料消費、体重、血液学、血液凝固及び臨床化学検査を含む臨床観察に対して効果がなかった。注射部位でのＭＥＤＩ９６００関連一過性紅斑及び浮腫は、有害ではないと考えた。
【０１９９】
［実施例１１］
材料及び方法
カニクイザルＦｃγＲＩＩＡシーケンシング
ベトナム起源の単一動物に由来する入手可能なカニクイザルドラフトゲノム配列を使用してプライマーを設計した（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２０１１）。６０個体（中国産２０個体、ベトナム産２０個体、モーリシャス産２０個体）からなるＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｃｉｅｎｃｅカニクイザルゲノムＤＮＡバンクを利用して、ＦｃγＩＩＡをシーケンシングした。Ｑｉａｇｅｎ  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用してＰＣＲ増幅を実施し、続いて、ＰＣＲ産物を社内でシーケンシングした。ＳｅｑＭａｎ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）及びＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して、生配列アラインメント、コンセンサス転写物ビルド、ＳＮＰ変異体同定及び、ヒトＦｃγＩＩＡ（ＣＣＤＳ  ４４２６４／ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１２３１８）に対する比較を完了した。
【０２００】
４８個体（中国産１６個体、ベトナム産１６個体、モーリシャス産１６個体）から得た全エクソーム配列データを含有する内部カニクイザルゲノムブラウザを使用して、配列変動を確認した。この内部データベースに由来するマイナー対立遺伝子頻度は、表４に示されている。６個体から得た血液由来ｃＤＮＡを使用してＦｃγＩＩＡエキソン配置を確認した。
【０２０１】
Ｆｃγ受容体結合アッセイ
組換えＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ−１３１Ｈ／Ｈアロタイプ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ−１５８Ｆアロタイプ及びＦｃγＲＩＩＩ−１５８Ｖアロタイプは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅで作製した。抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体（３Ｇ８）は、Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から購入した。抗ＦｃγＲＩ  Ａｂ（１６−１１５）は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ（ジョージア州、アトランタ）から購入した。抗ＦｃγＲＩＩＢ  Ａｂ及びアイソタイプ対照Ｒ３４７−Ｔｍは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅで作製した。
【０２０２】
Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルマイクロプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州）を、２μｇ／ｍｌのＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ−１３１Ｈ／Ｈアロタイプ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ−１５８Ｆアロタイプ又はＦｃγＲＩＩＩ−１５８Ｖアロタイプ）を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、２００μｌの洗浄バッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）を用いて５回洗浄し、ＰＢＳ中、５％ミルクを含有するブロッキングバッファーを用いて室温で１時間ブロッキングし、洗浄バッファーを用いてさらに５回洗浄した。試験抗体又は対照抗体（Ｒ３４７−Ｔｍ）の３倍段階希釈をウェルに２連で添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄バッファーを用いて５回洗浄した。ウェルに５０μｌのヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州）を添加すること及び室温で１時間インキュベートすること、１０回洗浄すること及び５０μｌのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州）を添加することによって、抗体の、ＦｃγＲとの結合を検出した。５０μｌの０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて呈色反応を停止させ、Ａ４０５ｎｍで分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州）を使用して吸光度を測定した。
【０２０３】
エピトープ競合アッセイ
リード最適化の間のＩｇＧ改善を同定するために、抗体サンプルを、ＩＶ．３  ＩｇＧ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０１４７０）のビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈとの結合が測定される均一性時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ（登録商標）、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用するエピトープ競合アッセイを使用して評価した。
【０２０４】
ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９がコンジュゲートした抗マウス検出抗体ストレプトアビジンテルビウムクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６１０ＳＡＴＬＢ）検出を使用して、ＩＶ．３とビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈの間のＦＲＥＴシグナルを測定することによって、ＩＶ．３  ＩｇＧのビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈとの結合を評価した。本アッセイを使用して、ＩＶ．３  ＩｇＧとビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈの間の相互作用の阻害を測定することによって、粗ＩｇＧサンプルにおける改善を同定した。
【０２０５】
ＩＶ．３  ＩｇＧの８．０ｎＭ溶液を、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４１９０−１８５）、０．２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５７６）及び０．４Ｍ  ＫＦ（ＢＤＨ  １０３４４４Ｔ）からなるアッセイバッファーで調製する。アッセイプレート（３８４黒色、浅いウェル、Ｃｏｓｔａｒ、３６７６）に、５μｌを添加して、２．０ｎＭの最終濃度を得る。４０ｎＭのＤｙＬｉｇｈｔ６４９がコンジュゲートした抗マウス検出抗体の溶液を、アッセイバッファーで調製し、アッセイプレートに５μｌを添加して、１０ｎＭの最終濃度を得る。５μｌの各ＩｇＧサンプルを、ＭｉｎｉＴｒａｋ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してアッセイプレートに移す。４ｎＭのビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈ及び２．６７ｎＭのストレプトアビジンテルビウムクリプテートを含有する予め混合した溶液を、４ｘストックとして調製する。５μｌをアッセイプレートに添加して、１ｎＭのビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈ及び０．６７ｎＭのストレプトアビジンテルビウムクリプテートの最終濃度を得る。ビオチン化ヒトＣＤ３２ａ  １３１Ｈを省くことによって、各プレートについて非特異的結合ウェル（陰性対照）を規定した。アッセイプレートを室温で３時間インキュベートし、その後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して６２０ｎＭ及び６６５ｎＭ発光波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０２０６】
各サンプルの６６５／６２０ｎＭ比、続いて、デルタＦ％値を算出することによって、データを解析した。
【０２０７】
方程式１を使用して、６６５／６２０ｎＭ比を使用してサンプル干渉について補正した。
【０２０８】
方程式１：
【０２０９】
【数１】
2019524052.tif 000017
【０２１０】
次いで、方程式２を使用して各サンプルのデルタＦ％を算出した。
【０２１１】
方程式２：
【０２１２】
【数２】
2019524052.tif 000018
【０２１３】
方程式３を使用して、特異的結合％を算出した。
【０２１４】
【数３】
2019524052.tif 000019
【０２１５】
改善を確認するために、粗又は精製ＩｇＧサンプルを、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ７８１２８０）を使用してアッセイバッファーでサンプルを段階希釈することによって同一アッセイで評価した。Ｂｒａｖｏ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、２連でｓｃＦｖの各希釈の５μｌをアッセイプレート（３８４黒色、浅いウェル、Ｃｏｓｔａｒ、３６７６）に移した。次いで、上記のようにアッセイ試薬を添加した。
【０２１６】
これまでに記載したように、６６５／６２０ｎＭ比、続いて、デルタＦ％値を算出することによってデータを解析した。方程式１に記載したように、６６５／６２０ｎＭ比を使用してサンプル干渉について補正した。方程式２を使用してデルタＦ％を算出した。方程式３を使用して、各状態について特異的結合％を算出した。
【０２１７】
４パラメータロジスティック方程式（方程式４）を使用する曲線フィッティングによって、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＩＣ５０値を決定した。
【０２１８】
【数４】
2019524052.tif 000020
【０２１９】
選択性及び交差反応性についてのＨＴＲＦ結合アッセイ
リード抗体の選択性を、ＩｇＧのビオチン化ヒトＣＤ３２ｂとの結合が測定される均一性時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ（登録商標）、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して評価した。交差反応性を、ＩｇＧのカニクイザルＣＤ３２ａ及びＣＤ３２ｂとの結合が測定される均一性時間分解蛍光法を使用して評価した。
【０２２０】
精製ＩｇＧのビオチン化ＣＤ３２との結合を、ストレプトアビジンテルビウムクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６１０ＳＡＴＬＢ）及びＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６１ＨＦＣＸＬＢ）検出試薬とコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ抗体を使用して、ＩｇＧとビオチン化ＣＤ３２の間のＦＲＥＴシグナルを測定することによって評価した。
【０２２１】
ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４１９０−１８５）、０．２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５７６）及び０．４Ｍ  ＫＦ（ＢＤＨ１０３４４４Ｔ）からなるアッセイバッファーを調製し、５μｌをアッセイプレート（３８４黒色、浅いウェル、Ｃｏｓｔａｒ、３６７６）に添加する。ＣＤ３２を、４ｘ作業ストック溶液としてアッセイバッファーで希釈する。ヒトＣＤ３２ｂ、カニクイザルＣＤ３２ａ及びカニクイザルＣＤ３２ｂを、２０ｎＭで調製し、５μｌをアッセイプレートに添加して、５ｎＭの最終濃度を得る。Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ７８１２８０）を使用して、２連でアッセイバッファーでＩｇＧの段階希釈を調製し、ペプチドの各希釈の５μｌを、Ｂｒａｖｏ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してアッセイプレートに移す。ストレプトアビジンテルビウムクリプテート及び抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ  ＸＬ６６５を、アッセイバッファーでそれぞれ、０．６７ｎＭ及び１５ｎＭに希釈し（最終濃度）、５μｌのこの予め混合した溶液を、アッセイプレートに添加した。サンプルＩｇＧを、５μｌのアッセイバッファーと置き換えることによって、各プレートについて陰性対照を規定した。アッセイプレートを室温で３時間インキュベートし、その後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して６２０ｎＭ及び６６５ｎＭ発光波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０２２２】
これまでに記載されたように、６６５／６２０ｎＭ比、続いて、デルタＦ％値を算出することによって、データを解析した（方程式についてのエピトープ競合プロトコールを参照のこと）。方程式１に記載されるように、６６５／６２０ｎＭ比を使用して、サンプル干渉について補正した。方程式２を使用してデルタＦ％を算出した。方程式３を使用して、各状態の特異的結合％を算出した。
【０２２３】
Ｏｃｔｅｔ  ＩｇＧ定量
プロテインＡ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  （ＦｏｒｔｅＢｉｏ）をＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）とともに使用して、ＩｇＧサンプルを定量した。
【０２２４】
２５μｌのサンプルを、ＰＢＳ、０．０２  ％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（０．１％）からなる２５μｌのアッセイバッファーと混合する。サンプル中のＩｇＧの、プロテインＡバイオセンサーとの結合の速度を、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ  （ＢＬＩ）によって測定する。公知濃度の対照ＩｇＧを使用し、５００μｇ／ｍｌの最高最終濃度から２つの希釈系列中１つの１２点を調製してＩｇＧ標準曲線を作製する。Ｏｃｔｅｔシステムソフトウェアは、公知濃度を有する標準から結合速度を算出して、標準曲線を作製する。結合速度は、標準濃度に正比例する。
【０２２５】
ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４システムとともに提供されたデータ解析ソフトウェアパッケージを使用してデータを解析する。データをソフトウェアにアップロードし、初期傾斜及び用量応答４ＰＬ（デフォルト、重みなし）方程式を使用して解析を実施する。標準曲線との比較から未知濃度を算出する。
【０２２６】
ＩＶＩＧを用いる結合競合アッセイ
ヒト好中球を、ブロッキングバッファー［１０％ウシ胎児血清を補給したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］に再懸濁し、丸底９６ウェル培養プレート（０．５ｘ１０６個細胞／ウェル）に移した。細胞を、１０ｍｇ／ｍＬの静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の存在下又は非存在下で、漸増濃度の蛍光標識されたＭＥＤＩ９６００又はＲ３４７−Ｔｍ対照抗体（０．０００３〜６６．６７ｎＭの範囲）とともに４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、細胞が結合した抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ；ニュージャージー州、フランクリンレイクス）を使用してフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェア中の非線形適合方程式を使用して、結合のＥＣ５０を算出した。
【０２２７】
全血内部移行アッセイ
共焦点顕微鏡によってヒト単球におけるＭＥＤＩ９６００媒介性ＦｃγＲＩＩＡ内部移行を実証するために、ＣＰＴチューブ中に収集した全血からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣをまず、ＣＤ１４−Ａｌｅｘａ  ４８８を用いて染色し、ＣＤ１４陽性単球を選別した。次いで、細胞をＭＥＤＩ９６００−Ａｌｅｘａ  ６４７を用いて氷上で３０分間染色し、１回洗浄し、共焦点顕微鏡のために室温でインキュベートした。Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００  Ｂ倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなるＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点システムを使用して細胞イメージングを実施した。図説明文中に記された時点で画像を獲得し、ＬＡＳ  ＡＦバージョン２．２．１  Ｌｅｉｃａアプリケーションスーツソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。
【０２２８】
抗ＦｃγＲＩＩＡ−Ｔｍ  Ａｂ媒介性受容体内部移行を、ＦＡＣＳベースのアッセイによって調べた。ヒト又はカニクイザル血液を、ヘパリンチューブ中に収集した。非標識抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体又は対照抗体の３倍希釈系列を、５０μｌの全血に３７℃で添加し２時間置いた。全血をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中、５％ウシ胎児血清）で洗浄し、Ａｂカクテル（ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ２０−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ及びＩＶ．３−Ａｌｅｘａ  ６４７）を用いて氷上で１時間染色した。洗浄後、細胞を、１ｍｌのＲＢＣ溶解バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州）とともに室温で３分間インキュベートし、洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。ヒト又はカニクイザル単球上でのＦｃγＲＩＩＡ表面発現を、ＦＡＣＳ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州）で測定し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して解析を実施した。
【０２２９】
リボヌクレオタンパク質−免疫複合体（ＲＮＰ−ＩＣ）誘導性Ｉ型ＩＦＮαアッセイ
ＲＮＰ−ＩＣ誘導性ＩＦＮα発現に対するＦｃγＲＩＩＡ遮断の影響を、ＥＬＩＳＡによって調べた。簡潔には、１００μｌのヒト又はカニクイザルＰＢＭＣ（５ｘ１０６個細胞／ｍｌ）、組織培養フラスコ中で１時間インキュベートした。非接着細胞を収集し、この単球枯渇画分を、３倍希釈で３００μｇ／ｍｌ〜０．００１μｇ／ｍｌの抗ＦｃγＲＩＩＡ  Ａｂ又はそのアイソタイプ対照（Ｒ３４７−Ｔｍ  Ａｂ）とともに３７℃のインキュベーター中で２時間インキュベートした。次いで、細胞を、１００μｌのＲＮＰ−ＩＣ（１μ／ｍｌのＲＮＰ（Ｂｉｏｍｅｄａ）／２％抗ＲＮＰ抗体血清陽性ＳＬＥ血清）を用いて１６時間処置した。ヒトＩＦＮα  ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州）を使用して、細胞培養上清中のＩＦＮαの濃度を決定した。
【０２３０】
ヒト好中球の単離
正常なボランティアから得た末梢血を、ヘパリンを含有するバキュテナーチューブ中に採血し、血液をＨＢＳＳで１：１希釈した。好中球を、リンホプレップ（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）密度勾配上で遠心分離によって分離した。ＲＢＣ溶解バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州）によって赤血球を除去した。ヒト好中球濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）を使用して好中球をさらに濃縮した。
【０２３１】
フェリ−チトクロームＣ還元アッセイを使用するスーパーオキシド生成の検出
抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）又は酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）によって誘導された好中球スーパーオキシド生成を、フェリ−チトクロームＣ還元アッセイによって測定した。簡潔には、単離されたヒト好中球を、ＨＢＳＳ／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含バッファーに４ｘ１０６個細胞／ｍｌで懸濁し、組換え２ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州）を用いて１５分間刺激した。ＦｃγＲＩＩＡ遮断の効果を評価するために、好中球を、１０μｇ／ｍｌのＭＥＤ１９６００とともに室温で３０分間プレインキュベートし、その後、それらを９６ウェル組織培養プレートに添加した。９６ウェル組織培養プレートを、１００μｌの、ＨＢＳＳ／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ中０．５％ミルクを用いて室温で１時間前処置した。プレートを洗浄バッファー（ＨＢＳＳ／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含バッファー）を用いて３回洗浄した。５０マイクロリットルの２ｘチトクロームＣバッファー（０．２ｍＭチトクロームＣ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）を各ウェルに、続いて、１０μｌの刺激（１０μｇ／ｍｌの抗ＰＲ３  Ａｂ、３０μｇ／ｍｌの抗ＭＰＯ  Ａｂ又は２０ｎＭ  ＰＭＡで）及び５０μｌの好中球を添加した。プレートを直ちに予め加温したプレートリーダー（３７℃）中に入れ、ＯＤ（５５０ｎＭ及び４９０ｎＭ）を３７℃で２時間、連続して測定した。
【０２３２】
フローサイトメトリー（ＤＨＲ  １２３アッセイ）を使用するスーパーオキシド生成の検出
ＡＮＣＡによって誘導された好中球スーパーオキシド生成を、フローサイトメトリーによって測定した。好中球（１ｘ１０５個／ｍｌ）を、１μｇ／ｍｌのジヒドロローダミン（ｄｉｈｙｄｒｏｈｏｄａｍｉｎｅ）１２３（ＤＨＲ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）を含むＲＰＭＩ  １６４０バッファーに再懸濁した。一部の細胞を、１０μｇ／ｍｌのＭＥＤ１９６００、抗ＦｃγＲＩＩＩ  Ａｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州）又はアイソタイプ対照Ａｂとともに、室温で３０分間プレインキュベートした。次いで、細胞を、３０μｇ／ｍｌの抗ＭＰＯ  Ａｂ（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州）、１０μｇ／ｍｌの抗ＰＲ３  Ａｂ（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州）又は健常なボランティア又はＡＡＶ患者の血清から精製された８０μｇ／ｍｌのＩｇＧ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、英国）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、２００ｇでペレットにし、氷冷ＨＢＳＳに５ｘ１０６個細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。平均蛍光強度（Ｍ．Ｆ．Ｉ）をＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州）によって測定し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して解析を実施した。
【０２３３】
好中球遊走アッセイ
好中球遊走を、５μｍフィルター（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、メリーランド州）を備えた９６ウェルＣｈｅｍｏ  ＴＸシステムを使用して評価した。ヒトＩＬ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州）を、１％  ＢＳＡを２０ｎＭの最終濃度まで含有するＲＰＭＩ  １６４０で希釈し、下部チャンバー中に入れた。細胞を洗浄し、同一培地に懸濁した。ヒト好中球を、１０μｇ／ｍｌ  ＭＥＤ１９６００又はアイソタイプ対照抗体とともに３７℃で３０分間インキュベートし、その後、細胞を上部チャンバーに添加した。好中球を１時間遊走させた。下部チャンバーに遊走した細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げた。遊走指数は、走化性物質に応じて遊走する細胞数対その非存在下で遊走する細胞数の比である。
【０２３４】
好中球活性化アッセイ
ヒト血液をＥＤＴＡチューブ中に収集し、血液の５０μｌのアリコートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＬＲ２  Ａｂ、ＭＥＤＩ９６００又はアイソタイプ対照Ａｂとともに、３７℃で２時間インキュベートした。５０マイクロリットルのＰａｍ３ＣＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を全血に１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に添加し、４５分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中、３％  ＦＢＳ）で２回洗浄し、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州）を用いて氷上で３０分間染色し、ＦＡＣＳバッファーを用いて１回洗浄した。赤血球を、溶解／固定バッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州）を用いて溶解した。好中球におけるＣＤｌｌｂ発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【０２３５】
オプソニン作用性死滅（ＯＰＫ）アッセイ
発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を、ベクターｍｉｎｉ−ＣＴＸ−ｌａｃ−ｌｕｘを使用してこれまでに記載されたように（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０９：１２７３〜１２８７（２０１２））構築した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株を、トリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）の一晩プレート上、３７℃で単一コロニーに増殖させ、続いて、単一コロニーを１０  ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液中に播種し、６５０ｎＭで０．４の光学密度（およそ５ｘ１０８個コロニー形成単位［ＣＦＵ］／ｍＬ）に増殖させた。１４，０００ｘｇでの遠心分離によって１ミリリットルの細胞をペレットにし、続いて、ＯＰＫアッセイバッファーに懸濁し、１：２００にさらに希釈した（およそ２．５ｘ１０６個ＣＦＵ／ｍＬ）。すべてのＯＰＫ成分の調製が完了するまで、細菌を氷上で維持した。
【０２３６】
ベビーウサギ血清（ＢＲＳ）（ＣｅｄａｒＬａｎｅ、カナダ、オンタリオ州、ホーンビー）を、ＯＰＫアッセイのための補体供給源として使用した。１ミリリットルの凍結乾燥ＢＲＳを氷冷蒸留水を用いて復元し、続いて、ＯＰＫアッセイバッファーで１：１０希釈を調製した。希釈したＢＲＳは、すべてのＯＰＫ構成成分の調製が完了するまで氷上で維持した。
【０２３７】
ＭＥＤＩ９６００（抗ＦｃγＲＩＩＡ）、Ｈ２Ｂ（抗ＦｃγＲＩＩＢ）又は３Ｇ８（抗ＦｃγＲＩＩＩ）Ａｂを、白色平底９６ウェルプレートに添加し（ウェルあたり１２．５μｌ）、続いて、１２．５μｌの一次好中球調製物を添加した。ＦｃγＲ  ｍＡｂ及び一次好中球の最終濃度は、それぞれ、２μｇ／ｍｌ及び２ｘ１０７個細胞／ｍｌとした。室温で２０分のインキュベーション後、各ウェルに抗Ｐｓｌ抗体の希釈物、希釈した補体及び細菌を添加し、プレートを通気性のある密閉フィルムで覆った。抗Ｐｓｌ  ｍＡｂ抗体を欠くウェルは、アッセイ対照として働いた。プレートを、１分あたり２５０回転（ｒｐｍ）で振盪しながら３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。発光量は、培養物中に残る生存細菌の頻度と直接的に相関する。すべてのサンプルを２連で流した。以下の式を使用して、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の死滅パーセントを算出した：
死滅％＝１００−（［ＲＬＵ実験ウェル／ＲＬＵ対照ウェル］ｘ１００）
ＥＣ５０値は、曲線フィッティング解析のために４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用するＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５）を用いて算出した。
【０２３８】
全血プロテオミクス評価
ヒト血液を、ヘパリンチューブ中に収集した。５ミリリットルの血液を、抗ＦｃγＲＩＩＡ  Ａｂ（３０μｇ／ｍｌ）、ＲＮＰ−ＩＣ（１μｇ／ｍｌ  ＲＮＰ／２％抗ＲＮＰ抗体血清陽性ＳＬＥ血清）又はＩｇ−ＩＣ（１００μｇ／ｍｌビオチン化ＮＭＧＣ  Ａｂ−ストレプトアビジン、２：１ｍｏｌ：ｍｏｌ比）とともに３７℃で１６時間インキュベートした。血漿画分を１３００ｇで１０分間の遠心分離後に収集した。２００種を超えるタンパク質分析物を、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ−Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＭＡＰ（テキサス州、オースティン）を使用して測定した。データは、すべてのＦｃγＲＩＩＡ多型変異体を網羅する５個人のドナー：２人の１３１Ｈ／Ｈドナー、２人の１３１Ｒ／Ｒドナー及び１人の１３１Ｈ／Ｒドナーから作製した。
【０２３９】
受動免疫性血小板減少症動物モデル
抗血小板抗体誘導性血小板減少症に対する抗ＦｃγＲＩＩＡ  Ａｂの効果を、受動免疫性血小板減少症動物モデルにおいて測定した。野生型及びＦｃγＲＩＩＡトランスジェニックマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ラット抗マウスＣＤ４１（ＧｐＩＩａ）ＩｇＧ１  Ａｂ及び対照ラットＩｇＧ１  Ａｂは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。野生型及びトランスジェニックマウスに、０日目に２μｇの抗ＣＤ４１を用いて腹膜内注射した。一部のマウスを２４時間前に、１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＤＩ９６００により前処置した。血液を、後眼窩出血によって１日目、５日目、８日目及び１２日目に収集し、Ｓｙｓｍｅｘ血液分析器を使用して血小板をカウントした。血小板ＦｃγＲＩＩＡ発現は、フローサイトメトリーによって決定した。
【０２４０】
ＭＥＤＩ９６００：カニクイザルにおける単回用量薬物動態及び探索的薬動力学研究
雄のカニクイザルを、表９に示されるように、群に割り当て、ＭＥＤＩ９６００を投与した。動物に、静脈内注射によって投薬した。
【０２４１】
【表９】
2019524052.tif 000021
【０２４２】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（非ＧＬＰ）を使用するカニクイザル血清におけるＭＥＤＩ９６００定量的決定
この方法は、カニクイザル血清中のＭＥＤＩ９６００の濃度を測定するために間接ＥＬＩＳＡ形式を利用した。標準、対照及び試験サンプルを、マイクロタイタープレート上に固定されているヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とともにインキュベートした。インキュベーション後、結合していない材料を洗浄除去し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲートを使用してＭＥＤＩ９６００を検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の添加によって可視化した。色の発色を停止し、４５０／６５０ｎＭで色の強度を測定した。
【０２４３】
薬動力学−フローサイトメトリー
投薬前フェーズの１２及び２０日目に、投薬後およそ０．５時間、４時間、８時間及び２４時間に、投薬フェーズの３、４、５及び８日目に１回、その後毎週（投薬フェーズの１日目に基づいて）、すべての動物から大腿静脈を介してフローサイトメトリーのために血液（およそ１ｍＬ）を収集した。動物は、臨床病理サンプリングとともにサンプルを収集するまで絶食させなかった。抗凝固剤は、クエン酸デキストロースとした。パラメータはパーセンテージ（総ＣＤ４５＋白血球のうち）及び絶対値（細胞／μＬ）として表した。ＦｃγＲＩＩＡ発現レベルは、蛍光強度で、並びに中央値及び／又は幾何平均蛍光強度値を使用して算出した可溶性蛍光分子等量（ＭＥＳＦ）値で記載した。表１０に示されるリンパ球サブセットを、フローサイトメトリーを使用して定量化した。
【０２４４】
【表１０】
2019524052.tif 000022
【０２４５】
統計解析
２群の間の相違の統計的有意性は、独立スチューデントｔ検定又はノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用して解析した。ｐ＜０．０５の場合にデータに統計的有意性があるものとした。
【０２４６】
参考文献
2019524052.tif 000023
2019524052.tif 000024
2019524052.tif 000025
【０２４７】
特定の実施形態の前記の説明は、他のものが、当技術分野の技術内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、種々の適用のためにこのような特定の実施形態を容易に改変及び／又は適応させることができる本発明の一般的な性質を十分に示す。したがって、本明細書において提示される教示及び指針に基づいて、このような適応及び改変は、開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書の技術用語又は表現は、教示及び指針を鑑みて当業者によって解釈されるべきであるように、本明細書における表現又は技術用語は、説明目的であって、制限を目的するものではないということは理解されるべきである。本発明を以下の特許請求の範囲によってさらに説明する。
【図１−１】
2019524052.tif 000026
【図１−２】
2019524052.tif 000027
【図２】
2019524052.tif 000028
【図３】
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【図４】
2019524052.tif 000030
【図５】
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【図６】
2019524052.tif 000032
【図７−１】
2019524052.tif 000033
【図７−２】
2019524052.tif 000034
【図８】
2019524052.tif 000035
【図９−１】
2019524052.tif 000036
【図９−２】
2019524052.tif 000037
【図１０】
2019524052.tif 000038
【図１１】
2019524052.tif 000039
【図１２】
2019524052.tif 000040
【図１３−１】
2019524052.tif 000041
【図１３−２】
2019524052.tif 000042
【配列表】
2019524052000001.app
【国際調査報告】
2019524052.tif 000043
2019524052.tif 000044
2019524052.tif 000045
2019524052.tif 000046
2019524052.tif 000047