(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞活性化及び特異的標的細胞への再指向のための二重特異性抗原結合分子に関する。本発明はさらに、二重特異性抗原結合分子を生成するための方法、及び疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。特定の実施態様では、第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており、１２３位のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）によって置換されており、第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、第２の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、又は第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
第１及び／又は第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
第２の抗原結合部分が、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、請求項１から３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
第１の抗原がｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原が活性化Ｔ細胞抗原である、請求項１から４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
活性化Ｔ細胞抗原が、ＣＤ３、特にＣＤ３イプシロンである、請求項１から５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
（ａ）の第１の抗原結合部分が、第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子であり、（ｂ）の第２の抗原結合部分が、第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）若しくはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）若しくはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置換されており；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）若しくはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）若しくはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項１から８の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置換されている、請求項９又は１０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９から１１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９から１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９から１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアルギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアルギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９又は１５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９、１５及び１６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９及び１５から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている、請求項９及び１５から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分
をさらに含む、請求項１から１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
第３の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項２０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
第３の抗原結合部分が第１の抗原結合部分と同一である、請求項２０又は２１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
第１及び第３の抗原結合部分が標的細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンに特異的に結合する、請求項２０から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
ｄ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
をさらに含む、請求項１から２３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
第１及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合されている、請求項１から２４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項１から２５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項１から２５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合されている、請求項２６又は２７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合されている、請求項２４記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項２４、２９又は３０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
第１、第２及び第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
第１、第２及び第３の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合されており、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項２４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
第１及び第３の抗原結合部分及びＦｃドメインが、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリンの一部である、請求項３４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
ＦｃドメインがＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項２４から３５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項２４から３６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項２４から３７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３９】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられており、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能である、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられており、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞が生成され、その内部に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である、請求項３８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４０】
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択され、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される、請求項３９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４１】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的にＦｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換されており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）、請求項３９又は４０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４２】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに３４９位のチロシン残基がシステイン残基（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）、請求項３９から４１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４３】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項３９から４２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４４】
Ｆｃドメインが、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する、請求項２４から４３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４５】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項２４から４４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４６】
前記一又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（カバットＥＵインデックス番号付け）の群から選択される一又は複数の位置にある、請求項４５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４７】
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（カバットＥＵインデックス番号付け）である、請求項２４から４６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４８】
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項４４から４７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４９】
エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項４４から４８の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５０】
請求項１から４９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクター、特に発現ベクター。
【請求項５２】
請求項５０に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５３】
ａ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項５２に記載の宿主細胞を培養する工程、及びｂ）任意選択的にＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、ｐ９５ＨＥＲ２及び活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法によって生成されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５５】
請求項１から４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５６】
医薬としての使用のための、請求項１から４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、請求項１から４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
疾患ががんである、請求項５７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
【請求項５９】
それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項１から４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項６０】
薬学的に許容される形態の請求項１から４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む治療有効量の組成物を個体に投与することを含む、前記個体の疾患を治療する方法。
【請求項６１】
前記疾患ががんである、請求項５９に記載の使用又は請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を請求項１から４９又は５４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
【請求項６３】
上記に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するための方法、及び疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、しばしば種々の臨床的状況において望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することががん治療の主要目的である。
【０００３】
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、しかしながら、従来の治療抗体のＦｃドメインにより媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
【０００４】
これに関し、標的細胞上の表面抗原に１つの「アーム」で結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に第２の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、何れかの傷害性Ｔ細胞の活性化、続いて標的細胞の溶解を引き起こす。したがって、免疫応答は、標的細胞に再指向され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はＴ細胞の特異性とは無関係である。この文脈において、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示しているとき、即ち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を誘発するために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
【０００５】
複数の二重特異性抗体のフォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの適性が調査されている。これらの中でも、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子は、きわめて詳細な特徴付けが済んでおり、臨床の分野で既に何らかの見通しを示している（Nagorsen及びBauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 （2011）に概説がある）。ＢｉＴＥは、２つのｓｃＦｖ分子が可動性リンカーにより融合したタンデム型のｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞結合について評価されたさらなる二重特異性フォーマットには、ダイアボディ（Holliger等, Prot Eng 9, 299-305 （1996））及びそれらの誘導体、例えば、タンデム型ダイアボディ（Kipriyanov等, J Mol Biol 293, 41-66 （1999））が含まれる。さらに最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づくが、さらなる安定性のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする、いわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore等, Blood 117, 4542-51 （2011））。全部がハイブリッドマウス／ラットのＩｇＧ分子であり、なお現在臨床治験において評価の対象である、いわゆるトリオマブは、より大きなサイズのフォーマットを表している（Seimetz等, Cancer Treat Rev 36, 458-467 （2010）に概説がある）。
【０００６】
開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞の再指向及び活性化に起因する大きな可能性を示す。しかしながら、それに適した二重特異性抗体を生成するというタスクは決して簡単ではなく、抗体の有効性、毒性、実現可能性、及び生産可能性に関して克服されなければならない複数の困難性を伴う。
【０００７】
例えば、ＢｉＴＥ分子などの小さなコンストラクトは、エフェクター及び標的細胞を効率的に架橋することができる一方で、非常に短い血清半減期を有し、持続的注入により患者に投与されなければならない。他方、ＩｇＧ様フォーマットは、半減期が長いという大きな利益を有するが、ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連付けられる毒性を欠点として有する。これらの免疫原性は、治療法開発の成功にとって、特に非ヒトフォーマットのＩｇＧ様二重特異性抗体の、別の好ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的開発においてこれまで主に問題であったのは、臨床的に十分な量及び純度で二重特異性抗体コンストラクトを生産することであり、これは、共発現した際に異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖とが誤対合してしまうことにより、正しく構築されたコンストラクトの収量が低減し、所望の二重特異性抗体の分離が困難な複数の非機能性副産物が生じてしまう。
【０００８】
Ｔ細胞抗原と標的細胞抗原の両方のための標的抗原及び適切な結合剤の選択は、治療的用途のためのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の生成において、さらなる重要な側面である。
【０００９】
チロシンキナーゼ受容体ＨＥＲ２は、乳がんの約２０％において過剰発現されている。現在、ＨＥＲ２陽性乳がんは、トラスツズマブなどのＨＥＲ２の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体、又はそのチロシンキナーゼ活性を阻害する合成分子を含むレジメンを用いて治療されている。ＨＥＲ２を標的とした現在利用可能な薬物の成功にもかかわらず、進行性乳がんのほとんどの症例は最終的に進行する。さらに、ＨＥＲ２の認識を介してＴリンパ球を腫瘍に再指向させることは、恐らく、正常な上皮におけるＨＥＲ２の生理学的レベルに起因して、重度の毒性をもたらし得る。例えば、ＨＥＲ２を標的とするＴ細胞活性化二重特異性抗体を用いた第Ｉ相臨床試験中に重篤な有害事象が観察された（Kiewe等, Clin Cancer Res (2006) 12, 3085-3091）。したがって、追加の抗ＨＥＲ２療法が必要とされる。
【００１０】
乳房腫瘍のサブグループは、ｐ９５ＨＥＲ２と総称される、検出可能なレベルの異種グループのＨＥＲ２断片を発現する（Arribas等, Cancer Res 71 (2011) 1515-1519に概説がある）。６１１−ＣＴＦ又は１００−１１５ｋＤａのｐ９５ＨＥＲ２（以降、簡単にするためにｐ９５ＨＥＲ２と呼ぶ）として知られるこれらの断片の１つは、分子間ジスルフィド結合によって維持されるホモ二量体を形成するその能力のために特に発がん性である（Pedersen等, Mol Cell Biol 29, 3319-31 (2009)）。ｐ９５ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２陽性乳がんの均一なサブグループで発現されるようであるが（Parra-Palau等, J Natl Cancer Inst 106, dju291 (2014)）、ＨＥＲ２断片は抗体によって認識されるエピトープを欠いているため（Pedersen等, Mol Cell Biol 29, 3319-31 (2009)）、例えば、トラスツズマブによって認識されない。
【００１１】
本発明は、良好な有効性及び生産可能性を低い毒性及び好ましい薬物動態的特性と組み合わせた、ＣＤ３及びｐ９５ＨＥＲ２を標的とする、Ｔ細胞の活性化及び再指向のために設計された新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、ｐ９５ＨＥＲ２を標的とする、新規なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を開発した。
【００１３】
したがって、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、第１の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、第２の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であるか、又は第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１４】
第１の態様において、本発明は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部分；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第１の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり、第２の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、又は第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原であり；
ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１５】
一実施態様において、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００１６】
特定の実施態様において、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。特定の実施態様において、第２の抗原結合部分は、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている（即ちこのような実施態様によれば、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。
【００１７】
特定の実施態様において、第１の（及び存在する場合、第３の）Ｆａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。さらなる特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる１を超えないＦａｂ分子が、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する（即ちＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＴ細胞活性化抗原に対して一価の結合を提供する）。
【００１８】
一実施態様において、第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原である。さらに具体的な実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３、特にＣＤ３イプシロンである。
【００１９】
特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ並びに定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互い置き換えられている第２のＦａｂ分子
を含み、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり；
（ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、望ましくない副産物、特にそれらの結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗体に起こるベンスジョーンズ型副産物と比較した場合の所望の二重特異性抗体の比率は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに（本明細書において「荷電修飾」という場合がある）より改善することができる。
【００２１】
したがって、いくつかの実施態様において、（ａ）の第１の抗原結合部分は、第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子であり、（ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であり；
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）若しくはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）若しくはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置換されており；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）若しくはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２２】
このような一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）（好ましい一実施態様において、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置換されている。
【００２３】
さらなる一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２４】
さらに別の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）により置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、１２３位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）により置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２５】
特定の一実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２６】
別の特定の実施態様において、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２７】
代替的な一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２８】
さらなる一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００２９】
さらに別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、１２３位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００３０】
一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００３１】
別の実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ｂ）のる第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ（カバットＥＵインデックスによる番号付け））によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００３２】
特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子
を含み、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり；
（ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含み；
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）により置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、１２３位のアミノ酸は、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）により置換されており（好ましい一実施態様において、独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００３３】
いくつかの実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分をさらに含む。特定の実施態様において、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。一実施態様において、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
【００３４】
特定の実施態様において、第３及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である。したがって、これら実施態様において、第３のＦａｂ分子は、存在する場合、第１のＦａｂ分子と同じアミノ酸置換を含む。第１のＦａｂ分子と同様に、第３のＦａｂ分子は特に、従来のＦａｂ分子である。
【００３５】
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様において、第１及び第３の抗原部分は特異的にｐ９５ＨＥＲ２に結合し、第２の抗原結合部分は、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンに特異的に結合する。
【００３６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの実施態様において、ａ）の第１の抗原結合部分及びｂ）の第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合されている。特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。代替的なこのような一実施態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。（ｉ）第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、又は（ｉｉ）第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている実施態様において、さらにＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合され得る。
【００３７】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインをさらに含む。
【００３８】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有することができ、即ち第１、第２の（及び任意選択的に第３の）抗原結合部分は、互いに、及びＦｃドメインに、異なる方法で融合され得る。成分は、互いに直接、又は、好ましくは一又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、融合され得る。Ｆａｂ分子の融合がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に対するものである場合、それは、典型的には、免疫グロブリンのヒンジ領域を介している。
【００３９】
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。このような実施態様において、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインのサブユニットの他方のＮ末端に融合され得る。
【００４０】
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に免疫グロブリン分子を含み、Ｆａｂアームの１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬ（又は本明細書に記載される荷電修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていない実施態様において定常領域ＣＨ１及びＣＬ）が交換されている／互いによって置き換えられている（図１Ａ、Ｄを参照されたい）。
【００４１】
代替的な実施態様において、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。特定のこのような実施態様において、第２及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に免疫グロブリン分子を含み、Ｆａｂアームの１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬ（又は本明細書に記載される荷電修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていない実施態様において定常領域ＣＨ１及びＣＬ）が交換されている／互いによって置き換えられており、追加の（従来の）Ｆａｂ分子は前記ＦａｂアームにＮ末端融合されている（図１Ｂ、Ｅを参照されたい）。別のこのような実施態様において、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。この実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリンのＦａｂアームの１つにＮ末端融合された追加のＦａｂ分子とともに免疫グロブリン分子を本質的に含み、前記追加のＦａｂ分子において、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬ（又は本明細書に記載される荷電修飾がＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていない実施態様において定常領域ＣＨ１及びＣＬ）が交換されている／互いによって置き換えられている（図１Ｃ、Ｆ参照を参照されたい）。
【００４２】
特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様において、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。
【００４３】
特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子はａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００４４】
別の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており、
（ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００４５】
さらなる実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；ならびび
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
（ｉ）第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンである；又は
（ｉｉ）第２の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第１の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｂ）の第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており；
ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００４６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の様々な構成のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインのいずれかに存在しうる。好ましくは、それらは、第１及び（存在する場合）第３のＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換はいずれも第２のＦａｂ分子では行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子で行われる場合、このようなアミノ酸置換はいずれも第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子では行われない。アミノ酸置換は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子では行われない。
【００４７】
特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子において行われる、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２のＦａｂ分子で行われる、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の他の実施態様において、第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。いくつかの実施態様において、第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。
【００４８】
特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；並びに
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子はａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており；
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており、
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００４９】
さらにより特定の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；及び
ｄ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
ｃ）の第３のＦａｂ分子はａ）の第１のＦａｂ分子と同一であり；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており；
ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｄ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
別の実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており；
（ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ａ）の第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており、
ａ）の第１のＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００５１】
さらなる実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；及び
ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
（ｉ）第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンである；又は
（ｉｉ）第２の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第１の抗原はＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンであり；
ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており；
ａ）の第１のＦａｂ分子及びｂ）の第２のＦａｂ分子がそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されており；
ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合するＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１５のＨＣＤＲ２及び配列番号１６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１８のＬＣＤＲ２及び配列番号１９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
【００５２】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。さらにより特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（カバット番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【００５３】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＦｃドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含む。このような特定の一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられており、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能である、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられており、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞が生成され、その内部に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。
【００５４】
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。ある種の実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を有するように操作される。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様において、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン内の一又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（カバットＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される一又は複数の位置にある。特定の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）である。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。他の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる２つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はＬ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）である。このような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ（ＳＰＬＥ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００５５】
一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【００５６】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号５のＨＣＤＲ２、配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。さらにより特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分はＦａｂ分子である。特定の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、ＣＤ３、さらに特にＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらにより特定の実施態様において、前記第２の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００５７】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のさらに特定の実施態様において、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらにより特定の一実施態様において、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合し、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらにより特定の実施態様において、前記第１（及び存在する場合前記第３）の抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００５８】
特定の態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子；
ｃ）第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子；並びに
ｄ）安定に結合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、
（ｉ）第１の抗原はｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原はＣＤ３、特にＣＤ３イプシロンであり；
（ｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ｂ）の第２のＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含み；
（ｉｉｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の第２のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている。
【００５９】
一実施態様において、ｂ）の第２のＦａｂ分子において、可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置き換えられており、さらに（ｉｖ）ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、特にアルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子及びｃ）の第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【００６０】
本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む一又は複数の発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００６１】
別の態様において、ａ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及びｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって生成されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する。
【００６２】
本発明はさらに、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００６３】
本発明にはまた、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法が包含される。一態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。一態様において、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
【００６４】
また、それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬を製造するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用、並びに前記個体に、薬学的に許容される形態で本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む治療的有効量の組成物を投与することを含む、個体において疾患を治療するための方法が提供される。特定の実施態様において、疾患はがんである。上記の実施態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【００６５】
本発明はまた、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ−Ｆ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的な立体配置を示す図である。（Ａ，Ｄ）「１＋１  ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図である。（Ｂ，Ｅ）選択的順序のＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「逆位」）を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｃ，Ｆ）「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋，−−：ＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子はＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むように示すが、ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では、ＣＨ１及びＣＬドメインの交換を選択的に含み得る。
【図１Ｇ−Ｎ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的な立体配置を示す図である。（Ｇ，Ｋ）選択的順序のＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（「逆位」）を有する「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｈ，Ｌ）「１＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｉ，Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｊ，Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂ並びに選択的順序のＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分（逆位）を有する「２＋１  ＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋，−−：ＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子はＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むように示すが、ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では、ＣＨ１及びＣＬドメインの交換を選択的に含み得る。
【図１Ｏ−Ｖ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的な立体配置を示す図である。（Ｏ，Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｐ，Ｔ）「Ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ」分子の図である。（Ｑ，Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｒ，Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図である。＋＋，−−：ＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子はＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むように示すが、ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では、ＣＨ１及びＣＬドメインの交換を選択的に含み得る。
【図１Ｗ−Ｚ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的な立体配置を示す図である。（Ｗ，Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図である。（Ｘ，Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図である。＋＋，−−：ＣＨ１及びＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子はＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むように示すが、ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では、ＣＨ１及びＣＬドメインの交換を選択的に含み得る。
【図２】実施例で調製されたＴＣＢの図である。（Ａ）荷電修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」抗ｐ９５ＨＥＲ２／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子の図である（ＣＤ３結合因子におけるＶＨ／ＶＬ交換、ｐ９５ＨＥＲ２結合因子における荷電修飾、分子Ａ）。（Ｂ）荷電修飾のない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」抗ｐ９５ＨＥＲ２／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子の図である（ＣＤ３結合因子におけるＣＨ１／ＣＬ交換、分子Ｂ）。ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ。
【図３】実施例で調製されたＴＣＢ分子（最終精製調製物）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示す図である。（Ａ）荷電修飾を有する「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」の電気泳動図である（ＣＤ３結合因子におけるＶＨ／ＶＬ交換、ｐ９５ＨＥＲ２結合因子における荷電修飾、分子Ａ）。（Ｂ）荷電修飾のない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」抗ｐ９５ＨＥＲ２／抗ＣＤ３  ＴＣＢ分子の電気泳動図である（ＣＤ３結合因子におけるＣＨ１／ＣＬ交換、分子Ｂ）。レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元。
【図４】実施例１で調製されたＴＣＢ分子ＡのプロテインＡクロマトグラフィーからの画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である（４〜１２％  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ、ＮｕＰａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；クマシー染色；レーン１＝サイズマーカー  Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））；レーン２〜７：分子ＡのプロテインＡクロマトグラフィーからの画分。
【図５】（Ａ）ベクター、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２又は組合せを安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞のウェスタンブロットを示す図である。（Ｂ）（Ａ）に示した細胞は、２μｇ／ｍｌのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｃ）フローサイトメトリーによって分析した、ｐ９５ＨＥＲ２を安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞（「ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２」）とＨＣＣ−１９５４細胞におけるｐ９５ＨＥＲ２発現レベルの比較。
【図６】ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比  １０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ抗体（「ｐ９５−ＴＣＢ」）との４８時間インキュベーション後の、ベクター、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２又は組合せを安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の溶解を示す図である。
【図７】ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比  １０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又は非標的コントロールＴＣＢとの４６時間のインキュベーション後の、（Ａ，Ｂ）ｐ９５ＨＥＲ２（Ａ）若しくはベクター（Ｂ）を安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞、又は（Ｃ）ＨＣＣ−１９５４細胞の溶解を示す図である。
【図８】フローサイトメトリーによって分析した、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介された４６時間後のｐ９５ＨＥＲ２若しくはベクターを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞又はＨＣＣ−１９５４細胞の死滅時のＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５（Ａ，Ｂ）及びＣＤ６９（Ｃ，Ｄ）発現を示す図である。（Ａ，Ｃ）平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）、（Ｂ，Ｄ）％陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞。
【図９】フローサイトメトリーによって分析した、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介された４６時間後のｐ９５ＨＥＲ２若しくはベクターを発現するＭＣＦ１０Ａ又はＨＣＣ−１９５４の死滅時のＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５（Ａ，Ｂ）及びＣＤ６９（Ｃ，Ｄ）発現を示す図である。（Ａ，Ｃ）平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）、（Ｂ，Ｄ）％陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞。
【図１０】フローサイトメトリーによって分析した、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５ＨＥＲ２、ＭＣＦ１０Ａ＿ベクター、ＭＣＦ１０Ａ＿ＨＥＲ２及び心筋細胞上のｐ９５ＨＥＲ２−ＴＣＢ、ＨＥＲ２−ＴＣＢ及び非標的コントロールＴＣＢの結合を示す図である。
【図１１】心筋細胞の存在下でのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞のＣＤ３刺激を示す図である。
【図１２】ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比  １０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢとの〜４８時間のインキュベーション後の、ｐ９５ＨＥＲ２（ＭＣＦ１０Ａ−ｐ９５Ｈｅｒ２）又はＨＥＲ２（ＭＣＦ１０Ａ−Ｈｅｒ２）を安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞、及び心筋細胞の溶解を示す図である。
【図１３】ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比  １０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢとの〜４８時間インキュベーション後の、ＭＣＦ１０Ａ−ｐ９５ＨＥＲ２又はＭＣＦ１０Ａ−ＨＥＲ２及び心筋細胞の溶解時の、ＣＤ８＋（Ａ）及びＣＤ４＋（Ｂ）Ｔ細胞のＣＤ２５発現レベルを示す図である。
【図１４】（Ａ）それにより初代培養が生成された、ｐ９５ＨＥＲ２陽性（ＰＤＸ６７）及びｐ９５ＨＥＲ２陰性（ＰＤＸ１１８）患者由来異種移植片（ＰＤＸ）のｐ９５ＨＥＲ２抗体による免疫組織化学を示す図である。（Ｂ）（Ａ）に示したＰＤＸ由来及び三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）ＰＤＸ由来の初代培養を、２μｇ／ｍｌのｐ９５ＨＥＲ２−ＴＣＢとインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｃ）（Ａ）のＰＤＸ由来の初代培養を、ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比  １０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢと４８時間インキュベートした。細胞溶解はＬＤＨ放出によって決定した。
【図１５Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢのインビボ試験のための実験ワークフローを示す図である。ＰＤＸ１７３、ｐ９５ＨＥＲ２＋を、ＮＳＧマウスの乳脂肪パッドに移植した。腫瘍が平均２００ｍｍ３に達すると、動物を新しく単離された１０７個のＰＢＭＣによってヒト化し、４つの実験群に無作為化した。処置はＰＢＭＣ注射の４８時間後に開始した。（Ｂ）各実験群及び個々の動物の腫瘍体積の変化の割合の平均を示す図である。
【図１５Ｃ】（Ｃ）実験の終わりの腫瘍重量を示す図である。
【図１５Ｄ】（Ｄ）実験の終わりの腫瘍重量を示す図である。ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ、有意でない。
【図１６Ａ−Ｂ】腫瘍浸潤性免疫細胞の決定を示す図である。腫瘍を切除し、単一細胞懸濁液を、ｍｓＣＤ４５、ｈｕＣＤ４５（Ａ）及びｈｕＣＤ３（Ｂ）を含有する抗体混合物によって染色した。試料はフローサイトメトリーによって分析した。ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｃ−Ｄ】腫瘍浸潤性免疫細胞の決定を示す図である。腫瘍を切除し、単一細胞懸濁液を、ｈｕＣＤ８（Ｃ）及びｈｕＣＤ４（Ｄ）を含有する抗体混合物によって染色した。試料はフローサイトメトリーによって分析した。ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｅ】（Ｅ）免疫組織化学分析によって決定したＦＦＰＥ腫瘍試料におけるｈｕＣＤ８の割合を示す図である。
【図１７】ｐ９５ＨＥＲ２を発現する細胞の異種移植片の増殖へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す図である。（Ａ−Ｃ）ＭＣＦ７細胞は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でｐ９５ＨＥＲ２によって、及び独立したドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下で非標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＮＴ）又はｐ２１標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ｐ２１）によって安定に形質導入した。細胞溶解物は、ウェスタンブロット法（Ａ）によって評価し、増殖アッセイを実施した（Ｂ）。代表的な細胞の明視野像は（Ｃ）に示す。（Ｄ）ＮＳＧマウス（群当たりｎ＝６）に、１０６個のＭＣＦ７  Ｔｅｔ−Ｏｎ  ｐ９５ＨＥＲ２  ｓｈ−ｐ２１細胞を注射した。腫瘍が〜２００ｍｍ３に達すると（影で表す）、健常人由来のヒトＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射によって移植した（１０７個の細胞／マウス）。マウスをビヒクル（コントロール）又は１ｍｇ／ｋｇのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（矢印）によって処置した。腫瘍体積は、ノギスによって測定した。グラフは平均を示す；エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｅ）ＰＢＭＣ注射後のヒトＣＤ４５＋のレベルを示す図である。（Ｄ）で分析したマウス由来の白血球を、ＰＢＭＣ注射の１５日後に得て、抗ｈｕＣＤ４５によって染色し、フローサイトメトリーによって定量した。箱ひげ図は、（Ｄ）で分析したマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の割合を示す。低い及び高いひげは、それぞれ１０百分位及び９０百分位を示し、箱の低い及び高い端は、それぞれ２５百分位及び７５百分位を示し、箱の内線は５０百分位を示す。（Ｆ）腫瘍重量へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す図である。（Ｄ）に示す実験の終わりに、腫瘍を除去し、計量した。結果は平均として表し、エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５。
【図１８】ｐ９５ＨＥＲ２陽性患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の増殖へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す図である。（Ａ）研究に使用したＰＤＸにおける免疫組織化学によるｐ９５ＨＥＲ２の発現の分析。（Ｂ）腫瘍増殖へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果。指示したＰＤＸを担持するＮＳＧマウス（群当たりｎ＝６）を、腫瘍が〜３００ｍｍ３に達するまでモニターした（影で表す）。次いで、健常人由来のヒトＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射によって移植した（１０７個の細胞／マウス）。マウスを、ビヒクル（コントロール）又は１ｍｇ／ｋｇのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（矢印）によって処置した。腫瘍体積は、ノギスによって測定した。グラフは平均を示す；エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を使用して算出した；＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＰＢＭＣ注射後のヒトＣＤ４５＋のレベル。（Ｂ）で分析したマウス由来の白血球は、ＰＢＭＣ注射の１５日後に得て、抗ｈｕＣＤ４５によって染色し、フローサイトメトリーによって定量した。箱ひげ図は、（Ｂ）で分析したマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の割合を示す。低い及び高いひげは、それぞれ１０百分位及び９０百分位を示し、箱の低い及び高い端は、それぞれ２５百分位及び７５百分位を示し、箱の内線は５０百分位を示す。（Ｄ）腫瘍重量へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果。（Ｂ）に示す実験の終わりに、腫瘍を除去し、計量した。結果は平均として表し、エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）Ｔ細胞浸潤へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果。（Ｂ）に示す実験の終わりに、（Ｂ）に示す実験に相当する腫瘍試料を単一細胞に脱凝集し、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４によって染色し、陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって定量した。箱ひげ図は、指示したマーカーに陽性な細胞の割合を示す。低い及び高いひげは、それぞれ１０百分位及び９０百分位を示し、箱の低い及び高い端は、それぞれ２５百分位及び７５百分位を示し、箱の内線は５０百分位を示す。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｆ）腫瘍細胞へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果。（Ｂ）に示す実験の終わりに、腫瘍の矢状断を抗ヒトサイトケラチン抗体によって染色し、陽性細胞の％を定量した。結果は平均として表し、エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を使用して算出した；＊＊＊Ｐ＜０．００１。代表的な染色を（Ｇ）に示す。
【図１９】ＨＥＲ２  ＴＣＢ及びｐ９５ＨＥＲ−ＴＣＢ誘導性Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞溶解を示す図である。（Ａ，Ｂ）ＭＣＦ１０Ａ細胞及びＭＣＦ７細胞を漸増濃度のＨＥＲ２  ＴＣＢ（Ａ）又はｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（Ｂ）と、及び１０：１の比でＰＢＭＣとインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、溶解物はＬＤＨ放出によって測定した。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）のＭＣＦ１０Ａ−ベクター由来のＰＢＭＣを回収し、ｈｕＣＤ４５／ＣＤ８／ＣＤ４／ＣＤ６９／ＣＤ２５を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは３回の独立した実験の平均を表し、活性化マーカーＣＤ２５又はＣＤ６９に陽性であるＣＤ８又はＣＤ４細胞の割合を示す。
【図２０】（Ａ）野生型ＨＥＲ２又はＭ６１１Ａ変異を有するＨＥＲ２によってトランスフェクトされたＭＣＦ１０Ａ細胞の溶解物は、抗ＨＥＲ２抗体によるウェスタンブロットによって分析した。（Ｂ）（Ａ）と同じ細胞は、指示した抗体によるフローサイトメトリーによって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
定義
以下で他に定義されない限り、用語は、当該技術分野において一般的に使用されるように、本明細書において使用される。本明細書において使用するとき、用語「抗原結合分子」とは、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及びそれらの誘導体、例えばそれらの断片である。
【００６８】
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的である２つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００６９】
用語「価」とは、本明細書において使用するとき、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を示す。したがって、用語「抗原に対する一価の結合」とは、抗原結合分子内において、抗原に特異的な１つの（及び１を超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
【００７０】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般的に２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、一般的に単一の抗原結合部位を有する。
【００７１】
本明細書において使用するとき、用語「抗原結合部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様において、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと指向させることができる。別の実施態様において、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、本明細書においてさらに定義される抗体及びそれらの断片が含まれる。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。ある種の実施態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに定義され、当該技術分野において公知である抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμの何れかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。
【００７２】
本明細書において使用するとき、用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり、又は非連続的アミノ酸の別個の領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。別途指示がない限り、本明細書において抗原というタンパク質（例えばＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様において、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質に言及する場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、及び細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的ヒトタンパク質は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２参照）、又はｐ９５ＨＥＲ２（以下参照）である。ある種の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる種由来のＣＤ３又はｐ９５ＨＥＲ２抗原の間で保存されているＣＤ３又はｐ９５ＨＥＲ２のエピトープに結合する。特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３又はヒトｐ９５ＨＥＲ２に結合する。
【００７３】
がん原遺伝子ＨＥＲ２（ヒト上皮細胞増殖因子受容体２）は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体に関連し、それにある程度相同なタンパク質チロシンキナーゼ（ｐ１８５ＨＥＲ２）をコードする（Coussens, L.等, Science 230:1132-1139 (1985)； Yamamoto, T.等, Nature 319:230-234 (1986)； King, C. R.等, Science 229:974-976 (1985)を参照されたい）。ＨＥＲ２はまた、ｃ−ｅｒｂＢ−２として、時として、ラットホモログ、ｎｅｕという名前で当該技術分野において公知である。ＨＥＲ２の増幅及び／又は過剰発現は、複数のヒト悪性腫瘍と関連し、ヒトの乳がん及び卵巣がんの２５−３０％の進行に完全に関与しているようである（Slamon, D. J.等, Science 235:177-182 (1987), Slamon, D. J.等, Science 244:707-712 (1989)）。さらに、増幅の程度は、観察された患者の生存期間の中央値と反比例に相関する（Slamon, 前掲, Science 1989）。
【００７４】
本明細書において使用される用語「ｐ９５ＨＥＲ２」とは、「６１１−ＣＴＦ」又は「１００−１１５ｋＤａ  ｐ９５ＨＥＲ２」としても公知である、ＨＥＲ２受容体タンパク質のカルボキシ末端断片（ＣＴＦ）を指す。ｐ９５ＨＥＲ２断片は、全長ＨＥＲ２分子のコドン位置６１１におけるＨＥＲ２  ｍＲＮＡの翻訳の開始を介して細胞中に生成される（Anido等, EMBO J 25；3234-44 (2006)）。それは１００から１１５ｋＤａの分子量を有し、細胞膜で発現され、分子間ジスルフィド結合により維持されたホモ二量体を形成することができる（Pedersen等, Mol Cell Biol 29, 3319-31 (2009)）。ヒトｐ９５ＨＥＲ２の例示的な配列は、配列番号３０に示されている。
【００７５】
「特異的に結合すること」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器上での解析）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様において、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。ある種の実施態様において、抗原に結合する抗原結合部分、又はその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００７６】
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）の間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。特に断らない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗原結合部分及び抗原、又は受容体及びそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表され、これは、解離速度定数の結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）に対する比である。したがって、同等な親和性は、速度定数の比が同じである状態である限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載されているものを含む当該技術分野で公知のよく確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７７】
例えば、Ｆｃ受容体への結合低下といった「結合低下」とは、例えばＳＰＲによって測定した場合、各相互作用に対する親和性の低下を指す。明確に示すために、この用語はまた、ゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）への親和性の低下、即ち相互作用の完全な消失を含む。逆に、「結合増大」とは、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
【００７８】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」とは、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原の相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを引き起こすことによりＴ細胞活性化を誘導し得る。特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてＵｎｉＰｒｏ  ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１；カニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２参照）。
【００７９】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。
【００８０】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」とは、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞などの腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様において、標的細胞抗原は、ｐ９５ＨＥＲ２、特にヒトｐ９５ＨＥＲ２である。
【００８１】
本明細書において使用するとき、Ｆａｂ分子などに関して使用される用語「第１の」、「第２の」又は「第３の」は、各タイプの部分が１を超えて存在するときに区別を簡便にするために使用される。これらの用語の使用は、明瞭に述べていない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は配向を付与することを意図しているのではない。
【００８２】
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメイン、並びに軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインからなるタンパク質を指す。
【００８３】
「融合した」とは、成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインのサブユニット）が、直接的に又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により連結されていることを意味する。
【００８４】
本明細書において使用するとき、用語「単鎖」とは、ペプチド結合により線形に連結されたアミノ酸モノマーを含む分子を指す。ある種の実施態様において、抗原結合部分の１つは、単鎖Ｆａｂ分子、即ちＦａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様において、単鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
【００８５】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いに置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味する。即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ−ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖、並びに重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ−ＣＬ）で構成されるペプチド鎖を含む。明瞭には、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書において（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバー分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書において（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
【００８６】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、即ち重鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ−ＣＨ１）で構成される重鎖、並びに軽鎖の可変ドメイン及び定常領域（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ−ＣＬ）で構成される軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００８７】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常ドメインとも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常ドメイン（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的になる。
【００８８】
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を呈する限りにおいて抗体断片を含む。
【００８９】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、及びインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまたＨｕｄｓｏｎ等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照されたい）。抗体断片は、様々な技術によって作製することができ、このような技術には、限定されないが、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による生成が含まれる。
【００９０】
用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、それに相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００９１】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。一般的に、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む類似構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ等，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインでは、抗原結合特異性を付与するには十分である。
【００９２】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、本明細書において使用するとき、配列が超可変である、及び／又は構造的に画定されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４本鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書において交換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）及びＣｈｏｔｈｉａ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７（１９８７）に記載され、それらの定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及して何れかの定義が適用される場合、本明細書において画定され及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記の引用された文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに記載される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。本明細書に提供されるＣＤＲ配列は、一般的には、カバットの定義による。
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【００９３】
Ｋａｂａｔ等はまた、いずれもの抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超える任意の実験データに頼らなくとも、この「カバット番号付け」のシステムをいずれもの可変領域配列に明確に割り当てることができる。可変領域配列と関連して本明細書において使用されるとき、「カバット番号付け」とは、カバット等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従っている。
【００９４】
本明細書で使用するとき、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、本明細書において「カバットによる番号付け」又は「カバット番号付け」と呼ばれる、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されるカバット番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、カバット番号付けシステム（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のp.647-660参照）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、カバットＥＵ指数番号付けシステム（p.661-723参照）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用され、本明細書において、この場合、「カバットＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことによりさらに分類される。
【００９５】
配列表のポリペプチド配列は、カバット番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列表の番号付けをカバット番号付けに変換することは、十分に当該技術分野の通常の技術範囲内にある。
【００９６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の順番で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。このような可変ドメインは、本明細書において「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性若しくは親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を遂げている抗体を指す。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生じさせるように元の抗体の定常領域から追加的に修飾され又は変更されているものである。
【００９８】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９９】
本明細書における用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長するものとして定義される。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体には、重鎖のＣ末端から、一又は複数の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断が生じ得る。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により、宿主細胞によって生成される抗体は、完全長重鎖を含み得る、又は完全長重鎖の切断された変異体（本明細書において「切断された変異型重鎖」とも呼ばれる）を含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、カバットＥＵインデックスによる番号付け）である場合であり得る。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）は、存在し得る又は存在し得ない。Ｆｃドメイン（又は本明細書において定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書において、特に断らない限りＣ末端グリシン−リジンジペプチドを有さないものとして示される。本発明の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、カバットのＥＵ指数による番号付け）を含む。本発明の一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、カバットのＥＵ指数による番号付け）を含む。本明細書に記載される薬学的組成物などの本発明の組成物は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子、及び切断された変異型重鎖を含み得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異型重鎖を有する分子の混合物からなり得、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断された変異型重鎖を有する。本発明の一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、カバットのＥＵ指数による番号付け）を有する、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、カバットのＥＵ指数による番号付け）を有する、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様において、このような組成物は、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子からなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、カバットのＥＵ指数による番号付け）を有する、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；及び追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、カバットのＥＵ指数による番号付け）を有する、本明細書において特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子を含む。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記も参照）に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、即ち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【０１００】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促進する修飾には、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合をそれぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合されたさらなる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味において非同一であり得る。いくつかの実施態様において、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内におけるアミノ酸突然変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸突然変異、特にアミノ酸置換を含む。
【０１０１】
用語「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【０１０２】
本明細書において使用するとき、用語「操作する、操作された、操作」は、ペプチド骨格の何れかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むものとして考慮される。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらの手法の組合せが含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「アミノ酸突然変異」とは、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入、及び修飾のいずれの組み合わせも、最終的なコンストラクトが所望の特徴特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低下、又は別のペプチドとの会合の増加を保持することを条件に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、即ち、１つのアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸又は２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸突然変異体は、当該技術分野において周知である遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。遺伝子操作以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書において、同じアミノ酸突然変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
【０１０４】
本明細書において使用するとき、用語「ポリペプチド」とは、アミノ結合（ペプチド結合としても公知である）により線形に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特異的な長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の何れかの代わりに、又は何れかと交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことが意図され、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から誘導されるか、又は組換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、サイズが約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上であるアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有し得るが、必ずしもこのような構造を有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、規定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとり得るポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
【０１０５】
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルの精製は必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
【０１０６】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のため、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はプログラム、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる必要がある。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて、変更しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
画分Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることは理解される。特に他には記述されない限り、本明細書において使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で記載したように得られる。
【０１０７】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるものなどのアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１０８】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ鎖及びネガティブ鎖の形態、及び二重鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたこのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの制御要素を含んでもよく又は含まなくてもよい。
【０１０９】
例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含み得る点以外は同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよく、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置で、又はこれら末端の間の位置の何れかで、参照配列に含まれる残基中において個々に又は参照配列内の一又は複数の近接する群中において散在して、発生してよい。特定の事項として、何れか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上記で検討したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの公知のコンピュータプログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１１０】
「［例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」とは、単一のベクター又は別々のベクター中のこのようなポリヌクレオチド分子、及び宿主細胞内の一又は複数の位置に存在するこのような核酸分子を含む、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチド分子を指す。
【０１１１】
用語「発現カセット」とは、標的細胞において特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて、組換えにより又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列のうちで、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。ある種の実施態様において、発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１１２】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、細胞においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び指定するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１１３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それらには、継代の数に関係なく、それらに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよいが、突然変異を含み得る。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかのタイプの細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞などの哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、いくつか例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内に含まれる細胞もまた含まれる。
【０１１４】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を誘発させるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【０１１５】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体で被覆された標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にはＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書において使用するとき、用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む培地中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び／又はＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要とされる、標的細胞を囲む培地中の抗体濃度の上昇の何れかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に公知である）を用いるが、但し操作されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと比較される。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野において周知である（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８２５１５号又はＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照されたい）。
【０１１６】
「有効量」の薬剤とは、それが投与される細胞又は組織において生理的変化をもたらすために必要とされる量を指す。
【０１１７】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的な結果を達成するために必要とされる用量及び期間での有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１１８】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１１９】
用語「薬学的組成物」とは、その中に含有される活性成分の生物活性が有効であることを可能にするこのような形態であって、組成物が投与される対象にとって許容できない毒性を有する追加の成分を含まない調製物を指す。
【０１２０】
「薬学的に許容される担体」とは、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定しないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含む。
【０１２１】
本明細書において使用するとき、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的変形）は、治療されている個体において疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症候の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させる又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１２２】
用語「添付文書」とは、治療製品の市販の包装に通例含まれる説明書を指すために用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、このような治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含有する。
【０１２３】
実施態様の詳細な説明
本発明は、特に改善された有効性及び安全性（例えば、心筋細胞などの正常細胞に対して腫瘍細胞の選択性に関して）、並びに改善された生産可能性に関し（例えば純度、収率に関して）、治療的用途に好ましい特性を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１２４】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のＴ細胞活性化抗原結合分子が、低レベルのＨＥＲ２の発現によって特徴付けられる心筋細胞を保護しながら、ｐ９５ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の死滅を誘導することができることを発見した。心筋細胞上のこのような低レベルのＨＥＲ２は、ＨＥＲ２標的化Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、例えば、トラスツズマブに基づいて、インビトロで心筋細胞を死滅させることができるため、非常に強力なＴ細胞活性化抗原結合分子の使用には不可能であると考えられる。実際に、ＨＥＲ２を標的とする現在の薬物は、心筋細胞におけるＨＥＲ２の発現が原因であると考えられるため、心毒性を誘導することが知られている（Valachis等, Int. J. Cancer (2013) 133, 2245-2252）。同様に、不死化されているが形質転換されていない、正常レベルのＨＥＲ２を発現するヒト上皮細胞株であるＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＨＥＲ２標的化Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子によって死滅するが、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子によっては死滅しない。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はまた、ｐ９５ＨＥＲ２に陽性であるが、細胞外ＨＥＲ２発現を喪失し、したがって、従来のＨＥＲ２標的化治療に対して耐性である腫瘍細胞を死滅させるために使用することができる。
【０１２５】
荷電修飾
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるＦａｂ分子に、特にそれらの結合アームの１つ（又は２を超える抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合は１を超える）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生成において生じ得る、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンスジョーンズ型副産物）を減少させる上で有効なアミノ酸置換を含み得る（またＰＣＴ国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその実施例を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２６】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ分子
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている第２のＦａｂ分子
を含み、
第１の抗原がＴ細胞活性化抗原であり、第２の抗原がｐ９５ＨＥＲ２である、又は第１の抗原がｐ９５ＨＥＲ２であり、第２の抗原がＴ細胞活性化抗原であり；
ｉ）ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており（カバットによる番号付け）、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており（カバットによる番号付け）、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１２７】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｉ）及びｉｉ）に記載の修飾の両方を含まない。第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられない（即ち変化しないままである）。
【０１２８】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様では、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており（好ましい実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１２９】
さらなる実施態様では、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１３０】
特定の一実施態様では、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており（好ましい実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、１２３位のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており（好ましい実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による）、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１３１】
より特定の実施態様では、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１３２】
さらにより特定の実施態様では、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
【０１３３】
特定の実施態様では、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０１３４】
代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ａ）の第１のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われ得る。このような特定の実施態様では、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【０１３５】
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子をさらに含み得る。特定の実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は、ａ）の第１のＦａｂ分子と同一である。これら実施態様では、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子の各々の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、ｂ）の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われ得るが、第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
【０１３６】
特定の実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインをさらに含む。
【０１３７】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子フォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な立体配置で互いに融合され得る。例示的な立体配置を図１に示す。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。そのような実施態様では、第１、第２、第３の等の抗原結合部分は、本明細書においてそれぞれ第１、第２、第３の等のＦａｂ分子と呼ばれ得る。さらに、特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定な会合が可能な第１及び第２サブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。
【０１３８】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
１つのそのような実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｇ及び１Ｋに模式的に示す。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【０１３９】
別のそのような実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にそれぞれ融合されている。そのような立体配置を、図１Ａ及び１Ｄに模式的に示す。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接又はペプチドリンカーを介して融合され得る。特定の実施態様では、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインにそれぞれ融合されている。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特にＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０１４０】
他の実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
１つのそのような実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｈ及び１Ｌに模式的に示す。任意選択的に第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、互いにさらに融合され得る。
【０１４１】
Ｆａｂ分子は、Ｆｃドメインに、又は互いに直接又は一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合され得る。ペプチドリンカーは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載する。好適な、非免疫原性ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、通常、１から１０までの整数であり、典型的には２から４である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さを有し、一実施態様では、５から１００の長さであり、さらなる実施態様では１０から５０アミノ酸である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施態様では、ｘ＝４及びｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様では、ｘ＝４及びｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するための特に好適なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を連結するために好適な例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２を含む（配列番号１１及び１２）。別の好適なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。さらに、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の部分）を含み得る。特に、Ｆａｂ分子はＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されており、さらなるペプチドリンカー有り又は無しで免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分を介して融合され得る。
【０１４２】
特に標的細胞抗原の内部移行が高親和性抗原結合部分の結合に続くと予測される場合に、標的細胞抗原に特異的に結合可能な単一の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を有するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は有用である（例えば図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示すように）。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な１を超える抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を増強し、それによりその利用可能性を減少し得る。しかしながら、多くの他の場合、例えば、標的部位への標的化を最適化し、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２又はそれ以上の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ分子）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を持つことは有利である（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ又は１Ｎに示す例を参照）。
【０１４３】
したがって、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子をさらに含む。第１の抗原は、好ましくは、標的細胞抗原、すなわちｐ９５ＨＥＲ２である。一実施態様では、第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。一実施態様では、第３のＦａｂ分子は第１のＦａｂ分子と同一である（すなわち、第１及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じ配置のドメインを有する（すなわち従来の又はクロスオーバー））。特定の実施態様では、第２のＦａｂ分子は活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３に特異的に結合し、第１及び第３のＦａｂ分子はｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する。
【０１４４】
代替的な実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子をさらに含む。これらの実施態様では、第２の抗原は、好ましくは標的細胞抗原、すなわちｐ９５ＨＥＲ２である。１つのそのような実施態様では、第３のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子（Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子）である。１つのそのような実施態様では、第３のＦａｂ分子は第２のＦａｂ分子と同一である（すなわち、第２及び第３のＦａｂ分子は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じ配置のドメインを有する（すなわち従来の又はクロスオーバー））。１つのそのような実施態様では、第１のＦａｂ分子は活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３に特異的に結合し、第２及び第３のＦａｂ分子はｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する。
【０１４５】
一実施態様では、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
特定の実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にそれぞれ融合されており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｂ及び１Ｅ（第３のＦａｂ分子が従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である、特定の実施態様）並びに図１Ｉ及び１Ｍ（第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である、代替的な実施態様）に模式的に示す。第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接又はペプチドリンカーを介して融合され得る。特定の実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインにそれぞれ融合されている。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特にＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【０１４６】
別の実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にそれぞれ融合されており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｃ及び１Ｆ（第３のＦａｂ分子が従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である、特定の実施態様）並びに図１Ｊ及び１Ｎ（第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である、代替的な実施態様）に模式的に示す。第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接又はペプチドリンカーを介して融合され得る。特定の実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインにそれぞれ融合されている。特定の実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特にＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【０１４７】
Ｆａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットのそれぞれのＮ末端に融合されているＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の立体配置において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインが免疫グロブリン分子を本質的に形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらなる特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンはキメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０１４８】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかでは、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている。第１及び第２のＦａｂ分子の立体配置によって、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合され、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合され得る。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、非対応のＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに減らし、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの発現に必要なプラスミドの数も減らす。
【０１４９】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次にＦｃドメインサブユニット（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド、並びに第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合されている。特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次にＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド、並びに第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合されている。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次にＦｃドメインサブユニット（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次にＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。
【０１５０】
これらの実施態様のいくつかでは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドをさらに含む。他のこれらの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第１のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次いで第２のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１５１】
これらの実施態様に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含み得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合されている。
【０１５２】
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次にＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次にＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。
【０１５３】
これらの実施態様のいくつかでは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドをさらに含む。他のこれらの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第１のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１５４】
これらの実施態様に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含み得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合されている。
【０１５５】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインを含まない。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｏ及び１Ｓに模式的に示す。
【０１５６】
他の実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインを含まない。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｐ及び１Ｔに模式的に示す。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載のようにクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｑ及び１Ｕに模式的に示す（第３のＦａｂ分子が従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１５８】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載のようにクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｗ及び１Ｙに模式的に示す（第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第２のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１５９】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載のようにクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｒ及び１Ｖに模式的に示す（第３のＦａｂ分子が従来のＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は本明細書に記載のようにクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような実施態様では、前記第３のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような立体配置を、図１Ｘ及び１Ｚに模式的に示す（第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ分子であり、好ましくは第１のＦａｂ分子と同一である特定の実施態様）。
【０１６１】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチドを含む（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１６２】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１６３】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１６４】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチドを含む（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドをさらに含む。
【０１６５】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチドを含む（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＬ（２））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドをさらに含む。
【０１６６】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドをさらに含む。
【０１６７】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドをさらに含む。
【０１６８】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチドを含む（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１６９】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチドを含む（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（３）−ＣＬ（３））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１７０】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））のＦａｂ軽鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１７１】
特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む（ＶＨ（３）−ＣＬ（３）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））のＦａｂ重鎖定常領域及び第１のＦａｂ分子（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
【０１７２】
上記実施態様の何れかに従って、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接又は本明細書に記載の又は当該技術分野で公知の、様々なリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されている。好適な、非免疫原生ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられ、ｎは通常１から１０の整数であり、典型的には２から４である。
【０１７３】
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、１以下のＦｃドメインを含む。
【０１７４】
本発明に記載の一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバットＥＵ指数番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch等、Drug Metabolism and Disposition 38、84-91 (2010)参照）。さらなる特定の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。さらにより特定の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の例示的な配列は配列番号１３に示す。
【０１７５】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つ又は他方に融合され得る異なる抗原結合部分を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現、及び続く二量体化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組合せをもたらす。組換え生産におけるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するため、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは有利である。
【０１７６】
したがって、特定の実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も強いタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内である。したがって、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内である。ヘテロ二量体化を強化するためにＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号によく記載されている。典型的には、全てのそのような手法では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは両方とも、相補的に操作されるため、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）はそれ自体とはホモ二量体化できないが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化される（そのため、第１及び第２のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２つの第１の又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間でホモ二量体が形成されない）。改善された重鎖ヘテロ二量体化のこれらの異なる手法は、軽鎖誤対合及びベンスジョーンズ型副産物を減らす、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子における、重−軽鎖修飾（１つの結合アームでのＶＨ及びＶＬ交換／置換及びＣＨ１／ＣＬ接触面での反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる代替手法として考えられる。
【０１７７】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１の及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つにおける「ノブ」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方の１つにおける「ホール」修飾を含む。
【０１７８】
「ノブ・イントゥー・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ等，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面で隆起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを伴い、それにより、空洞は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置され得る。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作製される。
【０１７９】
したがって、特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられていて、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能である、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられていて、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞が生成し、その内部で第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が位置決め可能である。
【０１８０】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【０１８１】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【０１８２】
隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発又はペプチド合成により、改変させることによって作製することができる。
【０１８３】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
【０１８４】
さらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている）、及びＦｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに３４９位のチロシン残基がシステイン残基（カバットＥＵインデックスによる番号付け）で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、さらに二量体を安定化する（Carter、J Immunol Methods 248、7-15 (2001)）。
【０１８５】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１８６】
特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子は、（任意選択的に標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子を介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合されている。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原をＦｃドメインのノブ含有サブユニットに特異的に結合するＦａｂ分子の融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つのＦａｂ分子を含む抗原結合分子の生成を（さらに）最小にする（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。
【０１８７】
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾の他の技術は、本発明に記載の代替技術として考えられ、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
【０１８８】
一実施態様では、欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載のヘテロ二量体化手法が、代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン接触面における特定のアミノ酸位置で反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１つの好ましい実施態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方の１つにおけるアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）である。
【０１８９】
別の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、並びにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるさらなるアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９０】
別の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、又は前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ並びにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるさらなるアミノ酸突然変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（全て、カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９１】
一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｄを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ，Ｙ３４９Ｄ、及びＬ３６８Ｅから選択される（好ましくはＬ３６８Ｅ）、さらなるアミノ酸突然変異を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９２】
一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択される、Ｔ４１１位、Ｄ３９９位、Ｓ４００位、Ｆ４０５位、Ｎ３９０位、又はＫ３９２位にさらなるアミノ酸突然変異を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９３】
さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸突然変異Ｋ３９２Ｅ，Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９４】
一実施態様では、例えば、３６８及び４０９（カバットＥＵインデックスによる番号付け）からなる群から選択される位置におけるアミノ酸修飾によって、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
【０１９５】
一実施態様では、上記のノブ・イントゥー・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ｔを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９６】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はＩｇＧ２サブクラスのそのＦｃドメイン及び国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
【０１９７】
代替的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１の及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００９／０８９００４号に記載のように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、荷電アミノ酸残基によって２つのＦｃドメインサブユニットの接触面で１又は複数のアミノ酸残基の置き換えを含み、ホモ二量体形成は静電気的に好ましくないが、ヘテロ二量体化は静電気的に好ましい。１つのそのような実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは負に荷電したアミノ酸によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）、第２のＣＨ３ドメインは正に荷電したアミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７のアミノ酸置換を含む（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、並びにより好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは負に荷電したアミノ酸によるＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換をさらに含む（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは負に荷電したアミノ酸によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換をさらに又は代替的に含む（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））（全て、カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９８】
さらなる実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸突然変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９９】
さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用され得る。
【０２００】
一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０１】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に好ましい薬物動態特性を付与し、そのような特性には、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び好ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、それは同時に、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の好ましくない標的化、即ち、好ましい抗原保持細胞よりむしろ、Ｆｃ受容体を発現する細胞への標的化に繋がる。
さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、サイトカイン放出をもたらし、Ｔ細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わせて、全身投与時にサイトカイン受容体の過度の活性化及び重度の副作用を生じ得る。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を持つ）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊能によって、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性さえも低下させ得る。
したがって、特定の実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。そのような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％より低い、好ましくは２０％より低い、より好ましくは１０％より低い、及び最も好ましくは５％より低いＦｃ受容体への結合親和性、及び／又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％より低い、好ましくは２０％より低い、より好ましくは１０％より低い、及び最も好ましくは５％より低いエフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメインドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインドメインは、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメインと比較して、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に類似する結合親和性を呈する。Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が約７０％より高い、特に約８０％より高い、より特に約９０％より高い天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎへの結合親和性を呈する場合、ＦｃＲｎへの実質的に類似する結合が達成される。
【０２０２】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を有するように操作される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍低下させる。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる１より多くのアミノ酸突然変異がある実施態様では、これらのアミノ酸突然変異の組合せは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又はさらに少なくとも５０倍低下させ得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、非操作Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％より低い、特に１０％より低い、より特に５％より低いＦｃ受容体への結合親和性を呈する。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合は低下する。いくつかの実施態様では、補体成分への結合親和性、具体的にはＣ１ｑへの結合親和性も低下する。一実施態様では、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似する結合、すなわち前記受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎへのＦｃドメイン（又はＦｃドメインの前記非操作形態を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の非操作形態の約７０％を超える結合親和性を呈する場合、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約８０％を超える、及び約９０％さえも超えるそのような親和性を呈し得る。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、エフェクター機能の低下を有するように操作される。エフェクター機能の低下としては、限定はされないが、以下の一又は複数が挙げられる：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、標的結合抗体の架橋の低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣ低下、ＡＤＣＣ低下、ＡＤＣＰ低下、及びサイトカイン分泌低下の群から選択される一又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、非操作Ｆｃドメイン（又は非操作Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％より低い。
【０２０３】
一実施態様では、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置でのアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置でのアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、及びＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５位にアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。特に、特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（カバットＥＵ指数番号付け）、すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基はアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）で置換され、２３５位のロイシン残基はアラニン残基で置換され（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基はグリシン残基によって置換される（Ｐ３２９Ｇ）（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。そのような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組合せは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号にはまた、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法が記載されている。
【０２０４】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。したがって、いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体へのその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能のさらなる低下のため、一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が出典明示により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
【０２０５】
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０６】
特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮグリコシル化が除去されている。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位にアミノ酸突然変異、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０７】
上記及びＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９（米国特許第６７３７０５６号）の一又は複数の置換を有するものも含む（カバットＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２０８】
突然変異Ｆｃドメインは、当該技術分野において周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば、配列決定により確認することができる。
【０２０９】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器、及び組換え発現により得ることができるようなＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体に対する、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価され得る。
【０２１０】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野において公知の方法により測定することができる。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に又は追加的に、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【０２１１】
いくつかの実施態様において、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが操作されているいくつかの実施態様において、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003)；Cragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい）。
【０２１２】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、すなわち２つの異なる抗原決定基に特異的に結合可能な少なくとも２つの抗原結合部分を含む。本発明の特定の実施態様により、抗原結合部分はＦａｂ分子である（すなわち、それぞれ可変及び定常ドメインを含む、重及び軽鎖から構成される抗原結合ドメイン）。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。さらに別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重及び軽鎖定常ドメインを含む。
【０２１３】
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。そのような修飾は、異なるＦａｂ分子からの重及び軽鎖の誤対合を減らし、それにより組換え生産における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）の可変ドメインを交換する。しかしながら、このドメイン交換でも、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合した重及び軽鎖間のいわゆるベンスジョーンズ型相互作用によって特定の副産物を含み得る（Schaefer等、PNAS、108 (2011) 11187-11191参照）。異なるＦａｂ分子からの重及び軽鎖の誤対合をさらに減らし、したがって所望のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を上げるため、本発明に従って、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子又は活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子の何れかのＣＨ１及びＣＬドメインにおける特定のアミノ酸位置に、反対の電荷を有する荷電アミノ酸が導入され得る。荷電修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば図１Ａ〜Ｃ、Ｇ〜Ｊ）、又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば図１Ｄ〜Ｆ、Ｋ〜Ｎ）の何れかで行われる（しかし、両方ではない）。特定の実施態様では、荷電修飾は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（特定の実施態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子で行われる。
【０２１４】
本発明に記載の特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及び活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３に同時に結合することができる。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原と活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することによってＴ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらにより特定の実施態様では、そのような同時結合は標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様では、そのような同時結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。他の実施態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞障害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３への結合は、標的細胞抗原への同時結合無しで、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
【０２１５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞へのＴ細胞の細胞傷害活性を再指向することができる。特定の実施態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性に非依存的である。
【０２１６】
特に、本発明の任意の実施態様に記載のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２１７】
活性化Ｔ細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む（本明細書では、「活性化Ｔ細胞抗原結合部分、又は活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合可能な１以下の抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原への一価の結合を提供する。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原を特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。そのような実施態様では、標的細胞抗原を特異的に結合する抗原結合部分は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合する、１を超える抗原結合部分、特にＦａｂ分子がある実施態様では、好ましくは活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２１８】
代替的な実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原を特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様では、標的細胞抗原を特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号１）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２）、最も特にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に交差反応性である（すなわち特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３エプシロン）である。
【０２１９】
いくつかの実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、ＣＤ３、特にＣＤ３エプシロンに特異的に結合し、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに配列番号８、配列番号９、配列番号１０の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０２２０】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２２１】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、並びに配列番号７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
【０２２２】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２２３】
一実施態様では、ＣＤ３結合抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号３の重鎖可変領域配列及び配列番号７の軽鎖可変領域配列を含む。
【０２２４】
標的細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｐ９５ＨＥＲ２（標的細胞抗原）に特異的に結合する、少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する、２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定のそのような実施態様では、それぞれのこれらの抗原結合部分は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。さらにより特定の実施態様では、全てのこれらの抗原結合部分は同一である、すなわち、それらは本明細書に記載のＣＨ１及びＣＬドメインにおける同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む（もしあれば）。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する、２以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
【０２２５】
特定の実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原を特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。
【０２２６】
代替的な実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子であり、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換えられているＦａｂ分子である。そのような実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原を特異的に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
【０２２７】
ｐ９５ＨＥＲ２結合部分は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位、例えば、ｐ９５ＨＥＲ２を発現する特定の型の腫瘍細胞へと指向させることができる。
【０２２８】
一実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号１４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域、及び配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域を含む。さらなる実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子は、配列番号２０の重鎖可変領域配列及び配列番号２１の軽鎖可変領域配列を含む。別の実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２抗原結合部分は、配列番号２０の重鎖可変領域配列のヒト化型及び配列番号２１の軽鎖可変領域配列のヒト化型を含む。一実施態様では、ｐ９５ＨＥＲ２抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３、及びヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク配列を含む。
【０２２９】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号２４のポリペプチド配列、及び配列番号２５のポリペプチド配列を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２６のポリペプチド配列、配列番号２７のポリペプチド配列、配列番号２８のポリペプチド配列、及び配列番号２９のポリペプチド配列を含む。
【０２３０】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載されているＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様では、前記断片は抗原結合断片である。
【０２３１】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能的Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、Ｆａｂ分子の軽鎖部分は、Ｆａｂ分子の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意選択的に別のＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分からの別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現した場合、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合し、Ｆａｂ分子を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの１つ及び任意選択的に一又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現した場合、Ｆｃドメインサブユニットは会合し、Ｆｃドメインを形成する。いくつかの実施態様では、単離したポリヌクレオチドは、本明細書の本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２３２】
ある種の実施態様において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【０２３３】
組換え方法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え生産によって取得し得る。組換え生産のために、例えば上記のようなＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードしている一又は複数のポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞における発現のために一又は複数のベクターに挿入する。そのようなポリヌクレオチドは、容易に単離され、一般的手順を使用して配列決定され得る。一実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳コントロールシグナルと共にＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＧＲＥＥＮＥ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載の技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってよく、又は核酸断片であってよい。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）（つまり、コード化領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳コントロールエレメントと作動可能に結合してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用されるとき、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合、コード化領域の一部とされうる。一方、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクターに存在してもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターが、単一のコード化領域又は二以上のコード化領域を含んでもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解的切断を介して最終的なタンパク質に翻訳後又は同時翻訳的に分離される一又は複数のポリペプチドをコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合された又は融合されていない異種コード化領域をコードしてもよい。異種コード化領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特別のエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能に結合しているとは、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコード化領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響又はコントロール下に置くように一又は複数の調節配列と結合しているときである。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード化領域とそれに結合したプロモーター）は、プロモーター機能の誘導によって所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされる場合、及び２つのＤＮＡ断片の間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力に干渉しない又はＤＮＡ鋳型が転写される能力に干渉しない場合、「作動可能に結合」している。そのように、プロモーターが核酸の転写を有効にすることができる場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターに加えて、他の転写コントロールエレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するために、ポリヌクレオチドに作動可能に結合していてもよい。
【０２３４】
適切なプロモーター及び他の転写コントロール領域は本明細書に開示されている。様々な転写コントロール領域が、当業者に既知である。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞で機能する転写コントロール領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来（例えば、イントロンＡと接続された即時早期プロモーター）、シミアンウイルス４０由来（例えば、早期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写コントロール領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する領域、並びに真核細胞の遺伝子発現をコントロールすることができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写コントロール領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター）が含まれる。同様に、様々な転写コントロールエレメントが、当業者に既知である。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、転写開始及び終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、つまりＩＲＥＳ、又はＣＩＴＥ配列と言及される）が含まれる。発現カセットには、複製開始点及び／又は染色体統合エレメント、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴が含まれてもよい。
【０２３５】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合していてもよい。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置してもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横切る増殖タンパク質鎖のエクスポートが開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般にポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。翻訳されたポリペプチドからこのシグナルペプチドが切断されて、分泌ポリペプチド、つまりポリペプチドの「成熟」形態が生じる。ある特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又は、作動可能に結合されたポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体を使用する。代替的に異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。
【０２３６】
後の精製を容易にするために使用し得る短いタンパク質配列（例えばヒスチジンタグ）又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化を援助するために使用し得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、ポリヌクレオチドをコードするＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子内又はその末端に含めてもよい。
【０２３７】
本発明のさらなる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載の任意の特徴が、個々に或いは組み合わせて、組み込まれていてもよい。そのような一態様では、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクターを含む（例えば、そのベクターで形質転換されている又はそのベクターをトランスフェクトされている）。本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を複製又はその発現を支持するために適切な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。そのような細胞に、特定の発現ベクターを適宜にトランスフェクト又は形質導入してもよく、大量のベクターを含有する細胞を増殖させて大規模な発酵装置に播種し、臨床適用のために十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を取得してもよい。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの様々な真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌で生産されてもよい。発現後、ポリペプチドは、細菌細胞ペーストから可溶型画分で単離され、さらに精製されうる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核生物は、ポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。例えば、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生産をもたらす真菌及び酵母株が挙げられる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２、１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４、２１０−２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用し得る様々なバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も宿主として利用し得る。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生産のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用し得る。例えば、懸濁液で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham等、J Gen Virol 36、59(1977)に記載の２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（���ＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather、Biol Reprod 23、243-251(1980)に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等、Annals N.Y. Acad Sci 383、44-68(1982)に記載の細胞）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等、Proc Natl Acad Sci USA 77、4216(1980)）並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質生産に適切な特定の哺乳動物宿主細胞株については、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２５、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えば、いくつか挙げると哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられ、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは培養動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞として、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）が挙げられる。これらの系で外来遺伝子を発現するための標準技術は、当該技術分野で既知である。抗体など抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖の何れかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗体であるように、他方の抗体鎖も発現するように操作され得る。
【０２３８】
一実施態様では、本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、本方法は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下で、本明細書で提供される、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること及び任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
【０２３９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、通常互いに融合され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計され得る。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法によって決定され、有効性が試験され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供する配列において見出される。必要であれば、さらなる配列も含み、融合の個々の成分を分離する切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列が組み込まれ得る。
【０２４０】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合可能な少なくとも１つの抗体可変領域を含む。可変領域は、天然の又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成し得る又はそれに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築してもよく、組換えにより生産してもよく（例えば、米国特許第４１８６５６７号に記載）、又は、例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより取得してもよい（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０２４１】
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子において使用され得る。本発明において有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒト由来である抗体のキメラ形態が使用され得る。抗体のヒト化又は完全ヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製し得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、例えば限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域に、重要なフレームワーク残基（例えば良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要な残基）の保持の有り又は無しでグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はＣＤＲ；抗体−抗原相互作用のために重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトすること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するがヒト様切片で表面残基の置き換えにより「クローキング」することが挙げられる。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３、１６１９−１６３３（２００８）に総説が記載されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６、１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１、６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４、６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３）、１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８、４８９−４９８（１９９１）（「表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３、２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「ガイド付き選択」手法を記載）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して製造し得る。ヒト抗体は、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５、３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０、４５０−４５��（２００８）において全体的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成していてもよく又はそれから誘導されてもよい（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、pp.51-63(Marcel Dekker, Inc.、New York、1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して無傷なヒト抗体又はヒト可変領域を有する無傷な抗体を生じるように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製されてもよい（例えば、Lonberg、Nat Biotech 23、1117-1125(2005)参照。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されてもよい（例えば、Hoogenboom等、Methods in Molecular Biology 178、1-37(O’Brienら編、Human Press、Totowa、NJ、2001);及びMcCafferty等、Nature 348、552-554;Clackson等、Nature 352、624-628(1991)を参照）。ファージは、通常、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として抗体断片を提示する。
【０２４２】
特定の実施態様では、本発明で有用な抗原結合部分は、例えば、その全体が出典明示により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示された方法により結合親和性を増強するように操作される。特異的な抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００  ｓｙｓｔｅｍで分析される）（Liljeblad等、Glyco J 17、323-329 (2000)）、及び伝統的な結合アッセイ（Heeley、Endocr Res 28、217-229 (2002)）の何れかによって測定され得る。競合アッセイは、特定の抗原に結合する参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えば、ＣＤ３に結合するＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用され得る。ある特定の実施態様では、そのような競合抗体は、参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープ（例えば、線状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原（例えばＣＤ３）を、抗原に結合する第１の標識抗体（例えば米国特許第６０５４２９７号に記載されているＶ９抗体）と、抗原の結合について第１の抗体と競合する能力が試験される第２の未標識抗体とを含む溶液で、インキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。コントロールとして、固定化された抗原を、第１の標識抗体を含むが第２の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合が許容される条件下でインキュベートした後、過剰の未結合抗体を除去し、固定化された抗原と結合した標識の量を測定する。固定化された抗原と結合した標識の量が、試験試料において、コントロール試料と比較して実質的に減少している場合に、第２の抗体は、第１の抗体と抗原の結合に対して実質的に競合していることが示される。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照。
【０２４３】
本明細書に記載されるように調製されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの既知の技術によって精製し得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部において、正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依存し、それらの条件は当業者にとって明らかである。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧとのマトリックスが使用されうる。シーケンシャルプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に本質的に記載されるようなＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離することができる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む周知の様々な分析方法の何れかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、無傷であり、適切に組み立てられていることが示された（例えば図４を参照されたい）。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測される分子量に相当する、およそＭｒ２５，０００、Ｍｒ５０，０００及びＭｒ７５，０００に３つのバンドが分離された。
【０２４４】
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイにより、同定され、スクリーニングされ、又は特徴付けされる。
【０２４５】
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原へのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器、及び組換え発現により得ることができるような受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することもできる。代わりに、異なる受容体又は標的抗原へのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価され得る。結合親和性を測定するための代表的及び例示的実施態様は、以下に記載されている。
【０２４６】
一実施態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２５℃で使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。
【０２４７】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体の間の相互作用を分析するため、ヒスタグ付けした組換えＦｃ受容体は、ＣＭ５チップに固定された抗Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって捕捉され、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用した。簡潔に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化する。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で、流速５μｌ／分での注入前に４０μｇ／ｍｌまで希釈し、およそ６５００反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。リガンドの注入後、１Ｍ  エタノールアミンを、ブロック未反応群に注入する。続いて、Ｆｃ受容体を、４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度論的な測定のため、二重特異性抗原結合部分の４倍の段階希釈（５００ｎＭと４０００ｎＭの間の範囲）を、１２０秒間、流速３０μｌ／分、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４）に注入する。
【０２４８】
標的抗原への親和性の決定のため、二重特異性抗原結合分子が、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体について記載したように活性化ＣＭ５−センサーチップ表面に固定されている抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉される。結合タンパク質の最終量は、およそ１２０００ＲＵである。二重特異性抗原結合分子は、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原は、流速３０μｌ／分で、２５０から１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過させる。解離は１８０秒間モニターする。
【０２４９】
バルク屈折率差は、参照フローセルで得られた応答を引くことにより補正する。定常状態応答を使用して、ラングミュラーの結合等温式の非線形曲線適合によって、解離定数ＫＤを導きだした。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離センサーグラムを同時に適合することによって、単純な１対１のラングミュラー結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ１．１．１）を使用して算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３，８６５−８８１（１９９９）参照を参照されたい。
【０２５０】
活性アッセイ
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載のように様々なアッセイによって測定され得る。生物活性としては、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、標的細胞、例えば腫瘍細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍縮小の誘導及び／又は生存の改善が挙げられる。
【０２５１】
組成物、製剤及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、下記の治療方法の何れかで使用するための、本明細書で提供される何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される何れかのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、例えば、下記に記載の少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
【０２５２】
インビボでの投与に好適な形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法がさらに提供され、本方法は、（ａ）本発明に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される担体によってＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製剤化することを含み、それによりＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物がインビボでの投与のために製剤化される。
【０２５３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解又は分散している治療的有効量の一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的に又は薬理的に許容される」という表現は、採用される投薬量及び濃度で一般的にレシピエントに対して非毒性であり、つまり、動物、例えばヒトに適切に投与されたとき、有害なアレルギー性又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と任意選択的にさらなる活性成分とを含む薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に記載されているように、本開示に照らして当業者に明らかである。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のため、調製物は、ＦＤＡ生物標準局（FDA Office of Biological Standards）又は他の国の相当する当局によって必要とされるように、無菌状態、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たさなければならないことが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」としては、当業者に公知のように、任意の及び全ての溶媒、バッファー、分散培地、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、このような材料及びそれらの組合せが挙げられる（例えば、出典明示により本明細書に援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences、18th Ed. Mack Printing Company、1990、ｐ．1289-1329参照）。任意の従来の担体が有効成分と矛盾する場合を除き、治療組成物又は薬学的組成物においてその使用が考えられる。
【０２５４】
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるかどうか、及び注射の場合のような投与経路のために滅菌される必要があるかどうかに依存する異なる型の担体を含み得る。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び任意のさらなる治療剤）は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、血管内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所的、局在的に、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリーム中、脂質組成物（例えば、リポソーム）中で局在した灌流にかけ、又は他の方法若しくは当該業者に公知のように、上記の任意の組合せによって投与され得る（例えば、出典明示により本明細書に援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences、18th Ed. Mack Printing Company、1990を参照）。非経口投与、特に静脈注射が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子など、ポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
【０２５５】
非経口組成物には、注射、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による投与のために設計される組成物が含まれる。注射のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液中、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩バッファー中で製剤化されてもよい。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。代替的に、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水と共に構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて下記に列挙される種々の他の成分と共に、必要な量で適切な溶媒に組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通じて濾過することにより、容易に達成されうる。一般に、分散体は、基礎の分散媒及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに、種々の滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分と任意のさらなる望ましい成分との粉末を、事前に滅菌濾過したその液体媒体からうる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化され、希釈液体は、注射の前に、十分な生理食塩水又はグルコースで最初に等張化されるべきである。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の混入に対して保護されていなければならない。エンドトキシン混入は、安全レベルで最小、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持されるべきであることが理解されよう。適切な、薬学的に許容される担体としては、限定されないが、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及び他の糖（炭水化物）、例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる化合物、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどを含んでもよい。任意選択的に、懸濁液は、高濃度の溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、エチルクリート（ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド若しくはリポソームが含まれる。
【０２５６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されていてもよい。適切な技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの成形品の形態であるマトリックスが含まれる。特定の実施態様では、注射用組成物の延長された吸収が、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せを組成物で使用することによりもたらされてもよい。
【０２５７】
先に記載の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、持効性製剤として製剤化されてもよい。そのような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下若しくは筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切な重合性又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂と共に、又は難溶型誘導体、例えば、難溶型塩として製剤化されうる。
【０２５８】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用し得る調製物へのタンパク質の処理を容易にする佐剤を使用して、従来の様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。
【０２５９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離の酸若しくは塩基、中性、又は塩の形態で、組成物中に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と共に形成される塩、又は例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸と共に形成される酸などが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化物鉄、又は有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインに由来するものでもよい。薬学的な塩は、対応する遊離の塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒により溶解し易い。
【０２６０】
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用され得る。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、がんの治療において、免疫療法薬剤として使用され得る。
【０２６１】
治療法において使用する場合、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適正な医療行為と一致させて製剤化、投薬、及び投与される。この状況で考慮される要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に既知の他の要因が含まれる。
【０２６２】
一態様では、医薬として使用するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療において使用するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。ある種の実施態様では、治療法に使用するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための、本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある種の実施態様では、本発明は、治療的有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療するための方法において使用するためのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある種の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。ある種の実施態様では、本方法はさらに、治療的有効量の少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を個体に投与することを含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用するための、本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法に使用するための、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０２６３】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体の疾患を治療するためである。さらなる実施態様では、本医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療するための方法に使用するためである。ある種の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、本方法はさらに、治療的有効量の少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を個体に投与することを含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。なおさらなる実施態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために有効量の医薬を個体に投与することを含む、個体において標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法において使用するためである。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２６４】
さらなる態様では、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、このような疾患を有する個体に、治療的有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に投与される。ある種の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。ある種の実施態様では、本方法はさらに、治療的有効量の少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を個体に投与することを含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２６５】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む。さらなる態様では、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。このような実施態様では、本方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０２６６】
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん状態又は病変及びがん転移もまた含まれる。特定の実施形態において、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がんからなる群から選ばれる。一実施形態において、がんは固形腫瘍である。一実施形態において、がんは、ＨＥＲ２陽性がん（すなわち、ＨＥＲ２を発現するがん）である。特定の実施形態において、がんは乳がん、特にＨＥＲ２陽性乳がんである。他の実施形態において、がんは胃がん、特にＨＥＲ２陽性胃がんである。なお別の実施態様では、がんは、結腸直腸がん、特にＨＥＲ２陽性結腸直腸がんである。当業者は、多くの場合において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的な利益を提供するだけであり得ることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、いくつかの利益を有する生理的変化はまた、治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
【０２６７】
いくつかの実施態様では、有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、治療的有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、疾患の治療のために個体に投与される。
【０２６８】
疾患の予防又は治療について、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な投薬量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用される場合）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防目的又は治療目的のいずれかで投与されるか、前に又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及びＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定される。投与の責任を負う医師は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度、及び個別の対象に適切な用量を決定する。様々な投与スケジュール、例えば限定されないが、様々な時間点にわたる単回又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス点滴が、本明細書で企図されている。
【０２６９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、単回又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の約１μｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）を、例えば、一若しくは複数の別個の投与によって又は連続注入によって、患者へ投与するための最初の候補用量とすることができる。一つの典型的な一日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でありうる。数日間以上にわたる繰り返し投与について、病徴の望まれる抑制が生じるまで、条件に応じて、治療が一般的に持続される。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。他の非限定的な実施例において、用量はまた、１回の投与で、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ又はそれを超えて、及びそこで導かれる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラムから体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムなどが投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの任意の組み合わせ）が患者に投与され得る。そのような用量は、（例えば、患者に約２−約２０用量又は例えば６用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が投与されるように）例えば毎週又は３週間毎に間欠的に投与されてもよい。最初に高負荷用量が投与され、その後、一又は複数の低い負荷用量が投与されてもよい。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２７０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、意図された目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用について、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２７１】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、初期には細胞培養アッセイなどのインビトロでのアッセイに基づいて推定することができる。次に、用量は、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０２７２】
初期投薬量はまた、インビボのデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野において周知である技術を用いて推定することができる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０２７３】
投薬の量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整され得る。注射による投与のための通常の患者への投薬量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日、複数の用量を投与することにより達成され得る。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣにより測定され得る。
【０２７４】
局所投与又は選択的取り込みの場合において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくてもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、治療的に有効な局所投薬量を最適化することができる。
【０２７５】
本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、一般的に、実質的な毒性なしに治療的利益を提供する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を致死させる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比と表すことができる。大きな治療指数を呈するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投薬量の製剤化に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性を殆ど有さない又は全く有さないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投薬量は、種々の要因、例えば、用いられる投薬形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl等, 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p.1参照。この全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２７６】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、どのようにして及びいつ投与を終了し、中断し、又は調整するかが分かる。逆に、主治医はまた、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することが分かる。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動する。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価され得る。さらに、用量及び恐らくは投薬頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動する。
【０２７７】
他の薬剤及び治療
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、治療上の一又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共投与されてもよい。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症候又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。そのようなさらなる治療剤は、治療される特定の症状に適切な任意の活性成分を含んでよく、好ましくは、それらは互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものである。ある種の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。
【０２７８】
そのような他の薬剤は、特定の目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、並びに上記で説明した他の要因に依存する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書の記載と同じ投薬量及び投与経路、又は本明細書の記載の投薬量の約１−９９％、又は実験的に／臨床的に適切と判断される任意の投薬量及び投与経路で使用される。
【０２７９】
上記のそのような併用療法には、混合投与（二以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）並びに別個の投与が含まれ、この場合に、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与は、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に生じうる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はまた、放射線療法と組み合わせて使用することができる。
【０２８０】
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器、並びに容器上の又は容器に付随している標識又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、単独で又は別の組成物との組合せで症状の治療、予防及び／又は診断に有効な組成物を保持しており、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。組成物における少なくとも１つの活性剤は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。標識又は添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が含まれる第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害剤又は他の治療剤を含む組成物が含まれる第２の容器を含んでもよい。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用し得ることを示す添付文書をさらに含んでもよい。代替的に又はさらに、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでもよい。さらに市販の及び使用者の観点から好ましい他の材料、例えば、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及び注射器を含んでもよい。
【実施例】
【０２８１】
本発明の方法及び組成物の例を以下に示す。上記の一般的説明で示されたように他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２８２】
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されるような標準方法を使用して、ＤＮＡを操作した。分子生物系試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する全体的な情報は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．等、（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２に示されている。
【０２８３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定法により決定した。
【０２８４】
遺伝子合成
所望される遺伝子セグメントは、必要な場合に適切な鋳型を使用してＰＣＲにより生成又は合成オリゴヌクレオチド及び自動化遺伝子合成によるＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が利用可能でない場合は、オリゴヌクレオチドプライマーを、最も近いホモログ由来の配列に基づいて設計し、遺伝子を、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位によって隣接された遺伝子セグメントを、標準クローニング／シーケンシングベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを、形質転換された細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターにサブクローニングされるように適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞で分泌するためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０２８５】
実施例１
抗ｐ９５ＨＥＲ２／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子の調製
以下の分子は、本実施例で調製し；その概略図は図２に示す。
Ａ．荷電修飾のある「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」（ＣＤ３結合因子におけるＶＨ／ＶＬ交換、ｐ９５ＨＥＲ２結合因子における荷電修飾）（図２Ａ、配列番号２２〜２５）。
Ｂ．荷電修飾のない「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」（ＣＤ３結合因子におけるＣＨ１／ＣＬ交換）（図２Ｂ、配列番号２６〜２９）。
【０２８６】
ＣＤ３の様々な重鎖及び軽鎖領域をコードするＤＮＡ配列及びｐ９５ＨＥＲ２結合因子は、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入したそれぞれの定常領域を有するフレームにサブクローニングした。タンパク質発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動する。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動する。さらに、各ベクターは、常染色体複製のＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有する。
【０２８７】
分子の生産のため、懸濁液中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞に、トランスフェクション試薬としてｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ）を使用してそれぞれの発現ベクターをコトランスフェクトした。細胞に、１：２：１：１の比で相当する発現ベクターをトランスフェクトした（Ａ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」；Ｂ：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ−ＣＨ）」）。
トランスフェクションのため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｅｖｉＭａｋｅ培地（Ｅｖｉｔｒｉａ）中で無血清で懸濁培養した。５％  ＣＯ２雰囲気を有するインキュベータ中３７℃で７日間後、遠心分離による精製のために上清を回収し、滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、４℃で維持した。培地中の分子の力価は、プロテインＡ−ＨＰＬＣ（表２）によって決定した。力価の算出は、二段階プロセスに基づき、ｐＨ８．０でのＦｃ含有分子のプロテインＡへの結合、及びｐＨ２．５の溶出ステップでの放出を含む。分析に使用した両方のバッファーは、Ｔｒｉｓ（１０ｍＭ）、グリシン（５０ｍＭ）、及びＮａＣｌ（１００ｍＭ）を含有し、それぞれｐＨを調整した（８及び２．５）。カラム本体は、ＰＯＲＯＳ  ２０Ａを詰めた内容積〜６３μｌを有するＵｐｃｈｕｒｃｈ２×２０ｍｍプレカラムであった。最初の較正の後、１００μｌの各試料を０．５ｍｌ／分の流速で注入した。０．６７分後、ｐＨ２．５へのｐＨステップで試料を溶出した。定量は、２８０ｎｍの吸光度の決定及び１６から１６６ｍｇ／ｌのヒトＩｇＧ１の濃度範囲の標準曲線を使用する算出によって行った。
【０２８８】
分泌タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーステップを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのため、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  プロテインＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。未結合のタンパク質を、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄することによって除去し、標的タンパク質を６カラム容積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。タンパク質溶液は、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０を添加することによって中和した。プロテインＡクロマトグラフィー後のインプロセス分析のため、単一画分の分子の純度及び分子量を、還元剤の不在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）による染色によって分析した。ＮｕＰａｇｅ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示書に従って使用した。標的タンパク質の選択した画分を濃縮し、濾過し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０（分子Ａ）又は２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０（分子Ｂ）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。精製タンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定することによって決定した。
【０２８９】
分子の凝集含有量を、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで、２５℃でＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０２９０】
最終精製ステップ後の分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び不在下でＣＥ−ＳＤＳ分析によって分析した。製造業者の指示書に従って、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した（図３及び表２）。
【０２９１】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分子の質量分析を行った。クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）をＡｇｉｌｅｎｔ  ６２２４  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ装置と組み合わせた。約５μｇの試料を、１ｍｌ／分の流速で、４０℃でＮＵＣＬＥＯＧＥＬ  ＲＰ１０００−８、２５０ｍｍ×４．６ｍｍカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注入した。移動相は以下の通りである。Ａ：５％アセトニトリル、０．０５％ギ酸、及びＢ：９５％アセトニトリル、０．０５％ギ酸。溶出勾配を適用するため、１０分以内で１５％  Ｂを６０％  Ｂに、次いで２．５分で１００％Ｂに上げた。質量分析計は、高分解能モード４ＧＨｚ陽性で測定し、５００から３２００ｍ／ｚの範囲で記録した。ｍ／ｚスペクトルを、Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｌｔｄ）のＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒ２．４．１により手動でデコンボリューションした。
【０２９２】
分子Ａ及びＢを、本質的に同じ方法に従って生産及び精製した。最終的な回収は、分子Ｂで最も高かったが（１３％、表１参照）、軽鎖誤対合のＬＣ−ＭＳ分析により、その分子の１０〜２０％のみが正確にアセンブルしたことが明らかになった。分子Ａの質は明らかに良く、ＬＣ−ＭＳ分析においておよそ９５％が正確にアセンブルした分子であった。
【０２９３】
非還元ＣＥ−ＳＤＳプロファイルも、分子Ｂよりも副産物が少ない分子Ａが良く（表２、図３）、最終的な質は９９％モノマー含有量で非常に良好であった（表１）。プロテインＡ精製後の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥも、分子Ａのわずかな副産物を示した（図４、この分析は分子Ｂでは得られない）。
2019533441.tif 000004
2019533441.tif 000005
実施例で調製される分子Ａは、以下でｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢと呼ばれる。
【０２９４】
実施例２
異なる標的細胞上でのｐ９５ＨＥＲ２の発現レベル及びｐ９５ＨＥＲ２陽性標的細胞へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの結合
ｐ９５ＨＥＲ２をトランスフェクトしたＭＣＡ１０Ａ（ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２）及びＨＣＣ−１９５４におけるｐ９５ＨＥＲ２の発現は、抗ｐ９５ＨＥＲ２  ＩｇＧクローン３２Ｈ２を使用するフローサイトメトリーによって決定した（Parra-Palau等、Cancer Res 70、8537-46 (2010)）。異なる標的細胞（ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、両方又は空ベクターの何れかを発現するようにトランスフェクトしたＭＣＦ１０Ａ）のｐ９５ＨＥＲ２又はＨＥＲ２の発現を、抗ＨＥＲ２抗体を使用するウェスタンブロットによって決定した。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、又は両方若しくは空ベクターの何れかを発現するようにトランスフェクトしたＭＣＦ１０Ａへの結合をフローサイトメトリーによって試験した。
【０２９５】
ウェスタンブロット分析のため、タンパク質抽出物を、溶解したＭＣＦ１０Ａトランスフェクタントから得た。試料をＤＴＴ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５ｍＭ  １．４−ジチオトレイトールＤＴＴ（Ｒｏｃｈｅ、♯１０７８０９８４００１）、０．２％ブロモフェノールブルー）を含有するローディングバッファーと混合し、５分間９９℃でインキュベートし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってタンパク質を分離し、それらをニトロセルロース膜に転写した。タンパク質は、イモビロンウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（＃ＷＢＫＬＳ０５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加して、オートラジオグラフィーによって検出した。ＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）（ＣＢ１１）（マウスモノクローナル、１：１０００）、（♯ＭＵ１３４−ＵＣＥ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を一次抗体として使用した。二次抗体：ＥＣＬマウスＩｇＧ，ＨＲＰ連結全Ａｂ（１：４０００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、♯ＮＡ９３１）。フローサイトメトリーによるｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ結合の分析のため、ＭＣＦ１０ＡトランスフェクタントをＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１１１０５−０１）によって収集し、１時間ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとインキュベートし、抗ヒトＡｌｅｘａ４８８二次抗体によって３０分間染色した。試料は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で得た。ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５ＨＥＲ２及びＨＣＣ−１９５４における発現レベルを、４℃で３０分間、抗ｐ９５ＨＥＲ２クローン３２Ｈ２による細胞の染色、続いて４℃で３０分間、ＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）による染色によって決定した。蛍光は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して測定した。
【０２９６】
ＭＣＦ１０Ａトランスフェクタントのウェスタンブロットにより、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、又は組合せの発現を確認した（図５Ａ）。図５Ａに示す細胞を、２μｇ／ｍｌのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した（図５Ｂ）。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢのｐ９５ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２−ＨＥＲ２発現ＭＣＦ１０Ａへの有意な結合が検出可能であったが、ＭＣＦ１０Ａ−ベクター細胞への結合はなかった。図５Ｃは、フローサイトメトリーによって分析したＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２及びＨＣＣ−１９５４細胞におけるｐ９５ＨＥＲ２発現レベルの比較を示す。ＨＥＲ２過剰発現乳腺由来細胞株ＨＣＣ−１９５４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２２３８）と比較して、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２は細胞表面におよそ５倍のｐ９５ＨＥＲ２を発現した。
【０２９７】
実施例３
ＭＣＦ１０Ａトランスフェクタント及びＨＣＣ−１９５４の溶解並びにその後のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介されるＴ細胞活性化
標的細胞の溶解及びその後のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介されるＴ細胞活性化は、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２、ＭＣＦ１０Ａ＿Ｈｅｒ２、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ２及びＭＣＦ１０Ａ＿ベクター並びにＨＣＣ−１９５４を使用して評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、４６〜４８時間のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又は非標的コントロールＴＣＢとのインキュベーションで、腫瘍溶解を検出した。簡潔に述べると、標的細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ又はトリプシン／ＥＤＴＡの何れかによって回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートに播種した。細胞は終夜置き、接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、リッチリンパ球調製物（バフィーコート）又は健常ヒトドナーから得た新鮮なヘパリン添加血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心によって調製した。新鮮血は、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配又はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重ねた。遠心分離後（４５０×ｇ又は４００×ｇ、３０分間、室温、ブレーキ無し）、ＰＢＭＣ含有界面相の上の血漿を捨て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移した後、ＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ  ５分間又は３５０×ｇ  １０分間、室温、ブレーキ有り）、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。生じたＰＢＭＣ集団を計数し、さらなる使用まで（２４時間を超えない）、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータ内で、１０％  ＦＣＳ及び１％  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存した。腫瘍溶解アッセイのため、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はコントロールＴＣＢを指示した濃度で添加した（１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲、三重）。ＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比１０：１で標的細胞に添加した。腫瘍細胞溶解は、３７℃、５％ＣＯ２での４６〜４８時間のインキュベーション後、アポトーシス／ネクローシス細胞により細胞上清に放出されたＬＤＨの定量によって評価した（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１又はＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ１７８０）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とのインキュベーションによって達成した。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクト無しでエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解時に生じるＴ細胞活性化の評価のため、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、４００×ｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。ＣＤ８（ＡＰＣＣｙ７抗ヒトＣＤ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３０１０１６）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３００５０６）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３１０９３０）及びＣＤ２５（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ２５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３０２６１２）の表面染色は、供給業者の指示に従って実施した。細胞は０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、２％ＰＦＡを使用し��固定した。試料は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して分析した。
【０２９８】
ＰＢＭＣ及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ抗体との４８時間インキュベーション後のベクター、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２又は組合せを安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の溶解の決定は、ｐ９５ＨＥＲ２陰性コントロール細胞株ＭＣＦ１０Ａ＿ベクターの溶解を示さず、ＭＣＦ１０Ａ＿Ｈｅｒ２細胞の非常にわずかな溶解のみを示した（図６）。対照的に、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによるＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２及びＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ標的細胞の有意な溶解が検出可能であった。これらの結果は、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢが標的特異的腫瘍細胞溶解を誘導することを示す。ＰＢＭＣ（エフェクター：標的  １０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとの４６時間インキュベーション後、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２（図７Ａ）及びＨＣＣ−１９５４（図７Ｃ）の溶解は、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２標的細胞の有意な溶解を示した（ＥＣ５０  ３７０ｐＭ、最大放出７０％）。非標的化コントロールＴＣＢによって誘導される溶解はなかった。ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２よりも５倍少ないｐ９５ＨＥＲ２を発現するＨＣＣ−１９５４細胞のため、高ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ濃度（２５〜１００ｎＭ）でＴＣＢはいくらかの腫瘍細胞溶解を示した（最大４０％まで）。ＥＣ５０は決定できなかった。また、非標的化ＴＣＢによる溶解は検出されなかった。さらに、陰性コントロール細胞株ＭＣＦ１０Ａ＿ベクターの溶解はなかった（図７Ｂ）。これらの結果は、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ媒介腫瘍細胞溶解の有効性がｐ９５ＨＥＲ２発現レベルに依存することを示す。低量で天然のｐ９５ＨＥＲ２を発現する細胞も好適な標的であるが、ｐ９５ＨＥＲ２陰性細胞は溶解されない。
【０２９９】
ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介される４６時間後のｐ９５ＨＥＲ２若しくはベクターを発現するＭＣＦ１０Ａ又はＨＣＣ−１９５４の死滅時の、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図８）並びにＣＤ８＋Ｔ細胞（図９）におけるＣＤ２５及びＣＤ６９発現を図８及び９に示す。腫瘍細胞溶解に則して（図７）、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２細胞のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ媒介溶解時に検出可能な有意なＴ細胞活性化があった。ＣＤ４＋並びにＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＢ濃度に依存してＣＤ２５及びＣＤ６９を上方制御した。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢは、ＨＣ−１９５４のいくらかの溶解を誘導するが（図７Ｃ）、陰性コントロール細胞株ＭＣＦ１０Ａ＿ベクターと比較して、検出可能な特異的Ｔ細胞活性化はなかった。
【０３００】
実施例４
ＨＥＲ２  ＴＣＢと比較した、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって誘導される心筋細胞の溶解及びその後のＴ細胞活性化
ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ及びＨＥＲ２  ＴＣＢ（配列番号２４、３１、３２及び３３；ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢと類似の構造）の心筋細胞及びＭＣＦ１０Ａトランスフェクタントへの結合を、両ＴＣＢの標的としてこれらの細胞型を使用する機能活性アッセイの前に決定した（図１０）。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介される、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴにおけるＣＤ３シグナル伝達の誘導（図１１）並びにＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２細胞と比較した心筋細胞の溶解（図１２）及びその後のＴ細胞活性化（図１３）を調べた。
【０３０１】
ＴＣＢの結合を決定するため、心筋細胞（ｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＃ＣＭＣ−１００−１１０−００）を供給業者の指示書に従って培養した。１０日間培養後、心筋細胞並びにＭＣＦ１０Ａトランスフェクタントを細胞解離バッファーによって収集し、２０ｎＭ  ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢにより４℃で３０分間染色した。洗浄後、１：２０希釈のＡＦ６４７−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＃１０９−６０６−０９８）を、暗所、４℃で３０分間細胞に添加した。洗浄後、細胞はＰＩを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーによる以下の測定値から死細胞を除外した。結合実験と並んで、９６ウェルプレートで１０日間増殖した心筋細胞を標的として使用し、ＣＤ３シグナル伝達、標的細胞溶解及びＴ細胞活性化を決定した。簡潔に述べると、ＣＤ３シグナル伝達アッセイの２日前、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５ＨＥＲ２を細胞解離バッファーにより収集して、同じプレートの心筋細胞の隣に播種した（ウェル当たり２５０００細胞）。２日後、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞を収集し、１０００００個の細胞を播種した標的細胞に添加した。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢ（０．４ｐＭ〜１００ｎＭ、最終容積１００μｌ／ウェル）の添加後、細胞は３７℃のインキュベータ内で５．５時間インキュベートした。非接着Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ｌｕｃ細胞を含有する１００μｌ／ウェルの細胞懸濁液を、白壁の９６ウェルプレートに移し、１００μｌ／ウェルのＯｎｅ  Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加した。室温で５分間インキュベーション後、蛍光はＶｉｃｔｏｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｐｒｏ．を使用して決定した。標的細胞溶解及びＴ細胞活性化アッセイの１日前に、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２を細胞解離バッファーによって収集し、同じプレートの心筋細胞の隣に播種した（２５０００個の細胞／ウェル）。実施例３に記載のように単離したＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比１０：１で添加した。ＴＣＢはアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ）で希釈し、細胞に添加した。標的細胞溶解は、３７℃、５％ＣＯ２でのインキュベーションの４７時間後にアポトーシス／ネクローシス細胞による細胞上清へのＬＤＨ放出の定量により評価した（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とのインキュベーションよって達成される。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクト無しでエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解時に生じるＴ細胞活性化の評価のため、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、４００×ｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。ＣＤ８（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８、ＢＤ  ♯５５５３６）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３００５０６）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３１０９３０）及びＣＤ２５（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ２５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ♯３０２６１２）の表面染色は、供給業者の指示に従って実施した。細胞は１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液を使用して固定した。試料は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して分析した。
【０３０２】
図１０は、フローサイトメトリーによって分析した、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２、ＭＣＦ１０Ａ＿ベクター、ＭＣＦ１０Ａ＿Ｈｅｒ２及び心筋細胞におけるｐ９５ＨＥＲ２−ＴＣＢ、ＨＥＲ２−ＴＣＢ及び非標的コントロールＴＣＢの結合を示す。ＨＥＲ２  ＴＣＢは、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとは対照的に、心筋細胞への有意な結合を示した。
【０３０３】
図１１は、心筋細胞の存在下で、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞のＣＤ３刺激を示す。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとは対照的に、ＨＥＲ２  ＴＣＢは、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとは対照的に標的細胞として心筋細胞を使用するＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ｌｕｃにおいて有意なＣＤ３シグナル伝達を誘導した。
【０３０４】
図１２は、ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比１０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢとの４７時間インキュベーション後の、ｐ９５ＨＥＲ２を安定に発現するＭＣＦ１０Ａ細胞及び心筋細胞の溶解を示す。ＨＥＲ２  ＴＣＢは、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２標的の検出可能な溶解のみを誘導するｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとは対照的にＭＣＦ１０Ａ＿Ｈｅｒ２細胞並びに心筋細胞の有意な溶解を誘導した。
【０３０５】
図１３は、ＰＢＭＣ（エフェクター：標的比１０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢとの４７時間インキュベーション後の、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２及び心筋細胞の溶解時のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２５発現レベルを示す。ＨＥＲ２  ＴＣＢは、心筋細胞ではなく、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２標的細胞の存在下で検出可能なＴ細胞の活性化のみを誘導するｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢとは対照的に、ＭＣＦ１０Ａ＿Ｈｅｒ２細胞並びに心筋細胞の溶解時に有意なＴ細胞活性化を誘導する。
【０３０６】
これらのインビトロでの結果は、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢがＨＥＲ２  ＴＣＢと比較して、インビボでの心臓の問題の減少をもたらし得ることを示す。
【０３０７】
実施例５
ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ特徴付けのためのインビトロ及びインビボＰＤＸ（患者由来異種移植片）モデル
本試験に使用したヒト乳房腫瘍は、Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（スペイン）での外科的切除からのものであり、研究機関のガイドラインに従って得た。Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの機関審査委員会（ＩＲＢ）は、ヘルシンキ宣言に従って、この研究の許可を提供した。腫瘍分子研究の実施のための文書でのインフォームドコンセントを、組織を提供した全ての患者から得た。乳がんＰＤＸのため、患者試料の断片をマウスの４つの脂肪パッドに移植した。１７β−エストラジオール（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＢａｙｔｒｉｌを飲料水に添加した。ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスは、チャールズリバーラボラトリーズ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ＰＤＸに由来する細胞培養物の構築のため、腫瘍を切除し、外科用メスで可能な最小のピースにカットし、コラゲナーゼＩＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ９８９１−１Ｇ）と３０分間インキュベートし、洗浄し、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（＃Ｐ４３３３−Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃ｓｃ−２８６９６１）及び１．７５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２４００６２）中に６時間再懸濁した。次いで、夾雑するマウス線維芽細胞に関して、上皮細胞の増殖を促進するため、培地を注意して除き、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１．７５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含む、１０％ＦＢＳ補足−Ｍａｍｍｏｃｕｌｔヒト培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃５６２０）に１週間変更した。ｐ９５ＨＥＲ２陽性及び陰性ＰＤＸに由来する細胞は、インビトロでのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ媒介性溶解のための標的として使用した。簡潔に述べると、標的細胞はＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ  １０：１）及びｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢと、加湿したインキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間インキュベートした。ＬＤＨ放出は、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ１７８０）によって決定した。アッセイの４５分前に、２０μｌの溶解溶液を最大放出コントロールに添加した。４５分後、各９６ウェルプレートを４２０×ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの各上清を新しい９６ウェルプレートに移した。５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ  Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに添加し、プレートは光から覆って室温で３０分間インキュベートした。次いで、５０μｌの停止液を添加し、４９０ｎｍで吸光度を測定した。培地のバックグラウンドは各測定値から引いた。細胞傷害性の割合は以下のように算出した：％細胞傷害性＝（実験吸光度−エフェクター自然吸光度−標的自然吸光度）／（標的最大吸光度−標的自然吸光度）。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ、ＰＤＸ１７３のインビボ試験のため、腫瘍をＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）において先に記載されたように移植した。腫瘍が平均サイズ１５０〜２００ｍｍ３に達すると、ＮＳＧマウスに、２００μｌの１×ＰＢＳに再懸濁した１０×１０６個のＰＢＭＣを腹腔内に注射した。腫瘍異種移植片は週３回ノギスによって測定し、腫瘍体積は、式：（長さ×幅２）×（ｐｉ／６）を使用して決定した。体重は週２回モニターした。インビボ試験の終わりに、腫瘍を計量し、次いで切除した。単一細胞懸濁液を生成するため、腫瘍を小さなピースにカットし、５ｍｌのＲＰＭＩ培地中５０μｌのコラゲナーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮＡｓｅ  ５０μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍｌチューブに移した。これを３７℃で１時間インキュベートした。混合物を１００μ細胞濾過器で濾過し、次いで、４００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、赤血球溶解を実施し、ＰＢＳによる洗浄後、細胞をＰＢＳ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ及び５％ウマ血清中に再懸濁した。２０分後、試料を遠心分離し、細胞は以下の抗体混合物と４５分間インキュベートした：ｈｕＣＤ４５−ＰＥ、クローンＨＩ３０（♯３０４００８）；ｍｓＣＤ４５ＡＦ４８８、クローン３０−Ｆ１１（♯１０３１２２）；ｈｕＣＤ３Ｐｅｒｃｐｃｙ５．５、クローンＵＣＨＴ１（♯３００４３０）；ＣＤ８  ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＳＫ１（♯３４４７１２）；ＣＤ４ＢＶ４２１，クローン  ＯＫＴ４（＃３１７４３４）；全て１：３００希釈で使用した（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）。ＰＢＳによる洗浄後、試料をＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【０３０８】
図１４Ａは、それにより初代培養が生成された、ｐ９５ＨＥＲ２陽性及びｐ９５ＨＥＲ２陰性ＰＤＸのｐ９５ＨＥＲ２抗体による免疫組織化学を示す。図１４Ａに示したＰＤＸ由来及び三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）ＰＤＸ由来の初代培養を、２μｇ／ｍｌのｐ９５ＨＥＲ２−ＴＣＢとインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した（図１４Ｂ）。図１４Ａに示すようにＰＤＸ由来の初代培養を、ＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）及び漸増濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢと４８時間インキュベートした（図１４Ｃ）。細胞溶解はＬＤＨ放出によって決定した。ｐ９５ＨＥＲ２陽性ＰＤＸ６７は、ＰＢＭＣの存在下で高濃度のｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢで溶解したが、ｐ９５ＨＥＲ２陰性ＰＤＸ１１８の溶解はなかった。これらの結果は、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによる標的抗原特異的溶解を確認した。
【０３０９】
図１５Ａは、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢのインビボ試験のための実験ワークフローを示す。ＰＤＸ１７３、ｐ９５ＨＥＲ２＋を、ＮＳＧマウスの乳脂肪パッドに移植した。腫瘍が平均体積２００ｍｍ３に達すると、動物を新しく単離された１０７個のＰＢＭＣによってヒト化し、４つの実験群に無作為化した。処置はＰＢＭＣ注射の４８時間後に開始した。図１５Ｂは、各実験群及び個々の動物の腫瘍体積の変化の割合の平均を示す。図１５Ｃ及び図１５Ｄは、実験の終わりの腫瘍重量を示す。ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ、有意でない。トラスツズマブ及びｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢは両方とも、処置マウスの腫瘍サイズを優位に減少する。
【０３１０】
図１６Ａ〜Ｄは、腫瘍浸潤性免疫細胞の決定を示す。腫瘍を切除し、単一細胞懸濁液を、ｍｓＣＤ４５、ｈｕＣＤ４５、ｈｕＣＤ３、ｈｕＣＤ４及びｈｕＣＤ８を含有する抗体混合物によって染色した。試料はフローサイトメトリーによって分析した。ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ、有意でない。図１６Ｅは、免疫組織化学分析によって決定したＦＦＰＥ腫瘍試料におけるｈｕＣＤ８の割合を示す。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ及びトラスツズマブによる処置は、ＣＤ４５細胞並びにＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤の増強をもたらした。
【０３１１】
実施例６
ｐ９５ＨＥＲ２を発現する細胞の異種移植片及び患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の増殖におけるｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果
材料及び方法
細胞株
ＭＣＦ７は、ＡＴＣＣ−ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄから得て、ダルベッコ最小必須培地：１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＃１０２７０−１０６（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１％  Ｌ−グルタミン（＃Ｍ１１−００４（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を補足したＦ１２（ＤＭＥＭ：Ｆ１２）（１：１）＃２１３３１−０４６（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）内で、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ＭＣＦ７  ＴｅｔＯｎ−ｐ９５ＨＥＲ２細胞株は、ｐＩｎｄｕｃｅｒ−ｐ９５ＨＥＲ２のレンチウイルス伝達によって生成した。簡潔に述べると、ｐ９５ＨＥＲ２の配列をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＥＮＴＲ１Ａ  Ｄｕａｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ベクターに、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ（５’）及びＮｏｔＩ（３’）制限部位を使用してクローニングし、エントリーベクターとして使用して、配列をデスティネーションベクターｐＩｎｄｕｃｅｒ２０−Ｎｅｏ−Ｌｕｃ（＃４４０１２，Ａｄｄｇｅｎｅ）に、ＧａｔｅＷａｙ  ＬＲ反応を使用して導入した。ポリクローナル集団を選択し、２００μｇ／ｍｌのジェネテシンで維持した。ｐ９５ＨＥＲ２及びｓｈｐ２１のＭＣＦ７二重ＴｅｔＯｎ又はｐ９５ＨＥＲ２及びｓｈ−ｎｔ細胞株を、前もってｐＴＲＩＰｚ−ｓｈｐ２１又はｐＴＲＩＰｚ−エンプティーベクターによって生成したＭＣＦ７  ＴｅｔＯｎ−ｐ９５ＨＥＲ２のレンチウイルス伝達によって生成した。簡潔に述べると、ｐ２１  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００３８９）を標的化する短いヘアピン配列を、ＸｈｏＩ及びＭｌｕＩ制限酵素を使用して、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＲＨＳ４４３０−２００２８１１７２クローンＶ３ＬＨＳ−３２２２３４）のｐＧＩＰＺ  ＣＤＫＮ１Ａ  ｓｈＲＮＡから除去し、標準的なクローニング技術を使用してｐＴＲＩＰｚベクター（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の同じ部位に挿入した。ポリクローナル集団を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで少なくとも４８時間選択し、二重耐性集団を２００μｇ／ｍｌのジェネテシン及び１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで維持した。
【０３１２】
増殖アッセイ
増殖は細胞計数によって分析した。簡潔に述べると、ウェル当たり１×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。指示した時間：０（１０時間を時間０として数えた）、２４時間、４８時間、７２時間及び１４４時間で、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡによって剥離し、生細胞をトリパンブルー色素排除法によって決定し、ノイバウエル計算盤上で計数した。
【０３１３】
ＭＣＦ７−ｐ９５ＨＥＲ２異種移植片でのインビボアッセイ
ＮＳＧマウスに３×１０６個のＭＣＦ７  Ｔｅｔ−Ｏｎ−ｐ９５ＨＥＲ２  ｓｈ−ｐ２１細胞を同所に注射した。腫瘍が２００ｍｍ３に達すると、動物に健常ドナーから得た１×１０７個のＰＢＭＣを注射した。４８時間後、動物は２．５ｍｇ／ｋｇのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（ｉ．ｖ．）による２週間に１回の処置を開始した。動物は、飲料水中のドキシサイクリン（１ｇ／Ｌ）の存在下で維持した。
【０３１４】
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）におけるインビボアッセイ
ＰＤＸを確立するために使用したヒト腫瘍は、Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（スペイン）での生検又は外科的切除からのものであり、研究機関のガイドラインに従って得た。Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの機関審査委員会（ＩＲＢ）は、この研究の許可を与えた。腫瘍分子研究の実施のための文書でのインフォームドコンセントを、組織を提供した全ての患者から得た。
【０３１５】
患者腫瘍試料の断片をＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の４つの脂肪パッドに移植した。１７β−エストラジオール（１μＭ）（＃Ｅ８８７５−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＢａｙｔｒｉｌを飲料水に添加した。腫瘍異種移植片を週３回ノギスによって測定し、腫瘍体積は式：（長さ×幅２）×（ｐｉ／６）を使用して決定した。体重は週２回モニターした。腫瘍が平均２５０ｍｍ３に達すると、マウスを実験群に無作為化し、健常ドナーから得た１０７個のＰＢＭＣをマウスに注射した（ｉ．ｐ．）。ＰＢＭＣ注射の４８時間後に処置を開始した。
【０３１６】
腫瘍における免疫細胞浸潤
インビボ試験の終わりに、腫瘍を計量し、次いで切除した。単一細胞懸濁液を生成するため、腫瘍を小さなピースにカットし、５ｍｌのＲＰＭＩ培地中５０μｌのコラゲナーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮＡｓｅ  ５０μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍｌチューブに移した。これを３７℃で１時間インキュベートした。混合物を１００μｍ細胞濾過器で濾過し、次いで、４００ｇで５分間遠心分離した。次いで、赤血球溶解を実施し、１×ＰＢＳによる洗浄後、細胞を１×ＰＢＳ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ及び５％ウマ血清中に再懸濁した。２０分後、試料を遠心分離し、細胞は以下の抗体混合物と４５分間インキュベートした：ｈｕＣＤ４５−ＰＥ、クローンＨＩ３０、（♯３０４００８）；ｍｓＣＤ４５ＡＦ４８８、クローン３０−Ｆ１１（♯１０３１２２）；ｈｕＣＤ３Ｐｅｒｃｐｃｙ５．５、クローンＵＣＨＴ１（♯３００４３０）；ＣＤ８  ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＳＫ１（♯３４４７１２）；ＣＤ４ＢＶ４２１、クローン  ＯＫＴ４（＃３１７４３４）；全て１：３００希釈で使用した（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）。１×ＰＢＳによる洗浄後、試料をＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【０３１７】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
腫瘍試料は、４％ホルムアルデヒド（＃２５２９３１１３１５、Ｐａｎｒｅａｃ）で固定し、次いでパラフィン包埋した。染色は、製造業者の指示書に従って、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ｄａｋｏ）で５μｍパラフィンカットに実施した。抗体：抗ＣＤ８（ウサギモノクローナル）クローンＳＰ５７（＃５９３７２４８００１、Ｖｅｎｔａｎａ、Ｒｏｃｈｅ）。認定病理学者は、腫瘍試料中のＣＤ８の割合を定量した。抗ヒトサイトケラチン（モノクローナルマウス）、クローンＡＥ１／ＡＥ３（＃Ｍ３５１５、Ｄａｋｏ）。
【０３１８】
結果
図１７は、ｐ９５ＨＥＲ２を発現する細胞の異種移植片の増殖へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。
ＭＣＦ７細胞は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でｐ９５ＨＥＲ２によって、及び独立したドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下で非標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＮＴ）又はｐ２１標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ｐ２１）によって安定に形質導入した（図１７Ａ）。先に示されたように（Angelini等、Cancer Res 73、450-8 (2013)）、制御ＭＣＦ７細胞でのｐ９５ＨＥＲ２の発現は、がん遺伝子誘導性老化、したがって、細胞増殖の阻害（図１７Ｂ、ｓｈ−ＮＴ  ＋Ｄｏｘ）及び重大な形態変化（図１７Ｃ、ｓｈ−ＮＴ  ＋Ｄｏｘ）をもたらす。ｐ２１の発現低下により老化を克服する（図１７Ｂ、ｓｈ−ｐ２１；図１７Ｃ、ｓｈｐ２１）。
【０３１９】
図１７Ｄは、ＭＣＦ７  ｐ９５ＨＥＲ２細胞の増殖への異種移植片としてのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。ＮＳＧマウス（群当たりｎ＝６）に、１０６個のＭＣＦ７  Ｔｅｔ−Ｏｎ  ｐ９５ＨＥＲ２  ｓｈ−ｐ２１細胞を注射した。腫瘍が〜２００ｍｍ３に達すると（影で表す）、健常人由来のヒトＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射によって移植した（１０７個の細胞／マウス）。マウスをビヒクル（コントロール）又は１ｍｇ／ｋｇのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（矢印）によって処置した。腫瘍体積は、ノギスによって測定した。グラフは平均を示す；エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０３２０】
図１７Ｅは、ＰＢＭＣ注射後のヒトＣＤ４５＋のレベルを示す。図１７Ｄで分析したマウス由来の白血球を、注射の１５日後に得て、それらを抗ｈｕＣＤ４５によって染色し、フローサイトメトリーによって定量した。箱ひげ図は、図１７Ｄで分析したマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の割合を示す。低い及び高いひげは、それぞれ１０百分位及び９０百分位を示し、箱の低い及び高い端は、それぞれ２５百分位及び７５百分位を示し、箱の内線は５０百分位を示す。
【０３２１】
図１７Ｆは、腫瘍重量へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。図１７Ｄに示す実験の終わりに、腫瘍を除去し、計量した。結果は平均として表し、エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５。
【０３２２】
図１８は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の増殖へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。
図１８Ａは、免疫組織化学によるｐ９５ＨＥＲ２の発現の分析を示す。指示したＰＤＸ由来の試料を、先に記載されたように特異的抗ｐ９５ＨＥＲ２抗体によって染色した（ParraPalau等、Cancer Res 70、8537-46 (2010)）。
【０３２３】
図１８Ｂは、腫瘍増殖へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。指示したＰＤＸを担持するＮＳＧマウス（群当たりｎ＝６）は、腫瘍が〜３００ｍｍ３に達するまでモニターした（影で表す）。次いで、健常人由来のヒトＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射によって移植した（１０７個の細胞／マウス）。マウスを、ビヒクル（コントロール）又は１ｍｇ／ｋｇのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（矢印）によって処置した。腫瘍体積は、ノギスによって測定した。グラフは平均を示す；エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊ｐ＜０．０５。
【０３２４】
図１８Ｃは、ＰＢＭＣ注射後のヒトＣＤ４５＋のレベルを示す。Ｂで分析したマウス由来の白血球を、注射の１５日後に得て、それらを抗ｈｕＣＤ４５によって染色し、フローサイトメトリーによって定量した。箱ひげ図は、図１８Ｂで分析したマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の割合を示す。低い及び高いひげは、それぞれ１０百分位及び９０百分位を示し、箱の低い及び高い端は、それぞれ２５百分位及び７５百分位を示し、箱の内線は５０百分位を示す。
【０３２５】
図１８Ｄは、腫瘍重量へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。図１８Ｂに示す実験の終わりに、腫瘍を除去し、計量した。結果は平均として表し、エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５。
【０３２６】
図１８Ｅは、Ｔ細胞浸潤におけるｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。図１８Ｂに示す実験の終わりに、図１８Ｂに示す実験に相当する腫瘍試料は単一細胞に脱凝集し、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４によって染色し、陽性細胞の数はフローサイトメトリーによって定量した。箱ひげ図は、指示したマーカーに陽性な細胞の割合を示す。低い及び高いひげは、それぞれ１０百分位及び９０百分位を示し、箱の低い及び高い端は、それぞれ２５百分位及び７５百分位を示し、箱の内線は５０百分位を示す。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【０３２７】
図１８Ｆは、腫瘍細胞へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの効果を示す。図１８Ｂに示す実験の終わりに、腫瘍の矢状断を抗ヒトサイトケラチン抗体によって染色し、陽性細胞の割合を定量した。結果は平均として表し、エラーバーは９５％信頼区間に相当する。Ｐ値は、両側スチューデントのｔ検定を使用して算出した；＊＊＊Ｐ＜０．００１。代表的な染色を、図１８Ｇに示す。
【０３２８】
これらのデータにより、本発明者らはｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢは循環性白血球のレベルを増加することなく（図１８Ｃ）、患者由来の異種移植片の増殖を損なうと結論付けることができる（図１８Ｂ及びＤ）。ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢは、Ｔリンパ球を効果的にリクルートする（腫瘍へのＣＤ４−及びＣＤ８−陽性Ｔリンパ球両方）（図１８Ｅ）。
サイトケラチンのレベル（処置後の腫瘍における乳房腫瘍細胞のマーカー）（図１８Ｆ及び１８Ｇ）は、腫瘍体積（図１８Ｂ）又は腫瘍重量（図１８Ｄ）の測定が、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢにおける残りの病変が腫瘍細胞を大きく欠くため、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの抗腫瘍効果の過小評価をもたらすことを示す（図１８Ｆ及びＧ）。
【０３２９】
実施例７
ＨＥＲ２  ＴＣＢと比較した、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって誘導される、ＭＣＦ１０Ａトランスフェクタントの溶解及びその後のＴ細胞活性化
ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢによって媒介される標的細胞の溶解及びその後のＴ細胞の活性化は、本質的に先の実施例に記載のように、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２、ＭＣＦ１０Ａ＿Ｈｅｒ２、ＭＣＦ１０Ａ＿ｐ９５Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ２及びＭＣＦ１０Ａ＿ベクタートランスフェクタント並びにＭＣＦ７細胞を使用して評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、腫瘍溶解は、ｐ９５ＨＥＲ−ＴＣＢ又はＨＥＲ２  ＴＣＢとのインキュベーションの４６〜４８時間で検出した。ＭＣＦ１０Ａ細胞及びＭＣＦ７細胞は漸増濃度のＨＥＲ２  ＴＣＢ（図１９Ａ）又はｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢ（図１９Ｂ）と、及び１０：１の比でＰＢＭＣとインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、ＬＤＨ放出によって溶解物を測定した。ＭＣＦ１０Ａ−ベクター細胞による実験由来のＰＢＭＣを回収し、ｈｕＣＤ４５／ＣＤ８／ＣＤ４／ＣＤ６９／ＣＤ２５を染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図１９Ｃ）。
【０３３０】
実施例８
ＨＥＲ２又はＨＥＲ２（Ｍ６１１Ａ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞へのｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの結合
ｐ９５ＨＥＲ２を発現する細胞への結合の明らかな嗜好性にもかかわらず、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢはＨＥＲ２を発現する細胞にも結合する（図５Ｂ）。この残存する結合は、全長受容体との相互作用又は代わりにＨＥＲ２を過剰発現する細胞におけるｐ９５ＨＥＲ２の低レベルの発現により得る。ｐ９５ＨＥＲ２は、メチオニン６１１をコードするＡＵＧコドンからの翻訳の選択的開始によってＨＥＲ２をコードするｍＲＮＡから合成されるため（Pedersen等、(2009) Mol Cell Biol 29、3319-3331）、本発明者らは６１１位にメチオニンからアラニンへの変異（Ｍ６１１Ａ）を有するｃＤＮＡコンストラクトを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞へのｐ９５ＨＥＲ２−ＴＣＢの結合を分析した。結果は、ｐ９５ＨＥＲ２−ＴＣＢのＨＥＲ２を過剰発現する細胞への結合が、主にメチオニン６１１からの翻訳の選択的開始によって合成された低レベルのｐ９５ＨＥＲ２の生成によることをはっきりと示した（図２０Ａ及びＢ）。この結果は、ｐ９５ＨＥＲ２  ＴＣＢの特異性をハイライトする。
【０３３１】
先の発明は、理解を明確にする目的のため、図及び実施例によって詳しく記載されているが、記載及び実施例は本発明の範囲を制限するものと考えるべきではない。本明細書に引用した全ての特許及び科学論文の開示は、出典明示によりその全体がはっきりと援用される。
【図１Ａ−Ｆ】
2019533441.tif 000006
【図１Ｇ−Ｎ】
2019533441.tif 000007
【図１Ｏ−Ｖ】
2019533441.tif 000008
【図１Ｗ−Ｚ】
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【図２】
2019533441.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019533441.tif 000034