(57)【要約】  本開示は、少なくとも１種類のヒト化又はヒトＣＤ１２３結合ドメインを有し得るＣＤ１２３に特異的に結合するタンパク質分子に関する。そのような分子は、癌の治療に有用である。ＣＤ１２３に結合するタンパク質分子は、別の標的に結合する第２の結合ドメインを有し得る。一実施形態において、多特異性ポリペプチド分子は、ＣＤ１２３発現細胞とＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体の両方に結合し、標的依存的にＴ細胞の細胞傷害、活性化及び増殖を誘導する。本開示はまた、ＣＤ１２３結合ポリペプチド分子を含む医薬組成物、これらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの分子の作製方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドであって、前記ＣＤ１２３結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、及び（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８と異なる配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０と異なる配列を含み；
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２と異なる配列を含み；
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１４と異なる配列を含み；
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１６と異なる配列を含む、
組み換えポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、
（ａ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）配列番号１６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；及び
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、請求項１〜２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；及び
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドであって、前記結合ドメインが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２８と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３０と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３２と異なる配列を含むか；又は
（ｉｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３６と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３８と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４０と異なる配列を含むか；又は
（ｉｉｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４４と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号４６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４６と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４８と異なる配列を含むか；又は
（ｉｖ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１００に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１００と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０２と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０４と異なる配列を含むか；又は
（ｖ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１０８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０８と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１０と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１１２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１２と異なる配列を含むか；又は
（ｖｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１６と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１８と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２０と異なる配列を含むか；又は
（ｖｉｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２４と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２６と異なる配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２８と異なる配列を含む、
組み換えポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を含む、
請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｉｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｉｉｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｉｖ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｖ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｖｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｖｉｉ）（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１２６に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；かつ
（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号２０、３４、４２、９８、１０６、１１４、又は１２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｉｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｖ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号９８に記載のアミノ酸配列を含むか；
（ｖ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１０６に記載のアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｖｉｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドであって、前記結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５４と異なる配列を有し、
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５６と異なる配列を有し、
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号５８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５８と異なる配列を有し、
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号６０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６０と異なる配列を有し、
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号６１に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６１と異なる配列を有し、かつ
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号６２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６２と異なる配列を有する、
組み換えポリペプチド。
【請求項１１】
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号５０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；かつ
（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１０又は１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドであって、前記ＣＤ１２３結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号７０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７０と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号７２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７２と異なる配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７４と異なる配列を含み；
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号７６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７６と異なる配列を含み；
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号７８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７８と異なる配列を含み；かつ
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号８０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８０と異なる配列を含む、
組み換えポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、
（ｉ）配列番号６６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；及び
（ｉｉ）配列番号６８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、請求項１４又は１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドであって、前記ＣＤ１２３結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号８６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８６と異なる配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号８８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８８と異なる配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号９０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９０と異なる配列を含み；
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号９２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９２と異なる配列を含み；
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号９４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９４と異なる配列を含み；かつ
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９６と異なる配列を含む、
組み換えポリペプチド。
【請求項１９】
（ａ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｆ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号９６に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号８２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；かつ
（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１８又は１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
（ｉ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号８２に記載のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、ヒト可変重鎖及び軽鎖ドメインを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域が、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ末端にある、請求項２４に記載のＣＤ１２３結合ドメイン。
【請求項２６】
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域が、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ末端にある、請求項２４に記載のＣＤ１２３結合ドメイン。
【請求項２７】
前記結合ドメインが、薬物又は毒素にコンジュゲートされている、請求項１〜２２６のいずれか一項に記載のＣＤ１２３結合ドメイン。
【請求項２８】
さらに、免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
さらに、第２の結合ドメインを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）第２の結合ドメインを含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）第２の結合ドメインを含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）第２の結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）ＣＤ１２３結合ドメインを含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）ヒト又はヒト化ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合するヒト又はヒト化第２の結合ドメインを含む、組み換えポリペプチド。
【請求項３４】
（ｉ）前記ＣＤ１２３結合ドメインが、（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み；かつ
（ｉｉ）前記第２の結合ドメインが、（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、
請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ＣＤ１２３結合ドメインがｓｃＦｖであり、前記第２の結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記カルボキシル末端リンカーが、配列番号２８８を含むか、又はそれからなる、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２又はＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記免疫グロブリン定常領域が、ＥＵ番号付けシステムに従って置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＫ３２２Ａを含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を全く示さないか又はほとんど示さない、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記第２の結合ドメインが、Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合する、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記第２の結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含み；
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、
（ａ）配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列、を含み；かつ
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項２９〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記第２の結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含み；
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１５７又は配列番号１５８のアミノ酸配列を含み；かつ
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む、
請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記第２の結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含み；
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み；
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項２９〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記第２の結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含み；
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１６０のアミノ酸配列を含み；かつ
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、
請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記第２の結合ドメインが、
（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み；
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６４に記載のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６５、配列番号１６６、及び配列番号１６７に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記第２の結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７、ＨｕＭ２９１及びＩ２Ｃから選択されるモノクローナル抗体由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記第２の結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７に由来し、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６８、配列番号１６９、及び配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７１、配列番号１７２、及び配列番号１７３に記載のアミノ酸配列を有するか；又は
（ｂ）前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１６５、配列番号１６６、及び配列番号１６７に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記第２の結合ドメインが、Ｉ２Ｃに由来し、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７１、１７２及び１７３に記載のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７４、１７５及び１７６に記載のアミノ酸配列を有するか；又は
（ｂ）前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７６、１７７及び１７８に記載のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７９、１８０及び１８１に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記第２の結合ドメインが、ＨｕＭ２９１に由来し、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８２、１８３及び１８４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８５、１８６及び１８７に記載のアミノ酸配列を有するか；又は
（ｂ）前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８８、１８９及び１９０に記載のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１９１、１９２及び１９３に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
ＣＤ１２３結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメインを含むポリペプチドであって、
（ｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｉｖ）前記ポリペプチドが、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｖ）前記ポリペプチドが、配列番号１３８のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１４０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１４２のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｉｘ）前記ポリペプチドが、配列番号１４６のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｘ）前記ポリペプチドが、配列番号１４８のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｘｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１５０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｘｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｘｉｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；又は
（ｘｉｖ）前記ポリペプチドが、配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項５１】
（ｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｖ）前記ポリペプチドが、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むか；
（ｖ）前記ポリペプチドが、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１４０のアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１４２のアミノ酸配列を含むか；
（ｖｉｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか；
（ｉｘ）前記ポリペプチドが、配列番号１４６のアミノ酸配列を含むか；
（ｘ）前記ポリペプチドが、配列番号１４８のアミノ酸配列を含むか；
（ｘｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１５０のアミノ酸配列を含むか；
（ｘｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１５２のアミノ酸配列を含むか；
（ｘｉｉｉ）前記ポリペプチドが、配列番号１５４のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｘｉｖ）前記ポリペプチドが、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む、
請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、リダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘導する、請求項２９〜５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、約３０ｐＭ又はそれより低いＥＣ５０でＲＴＣＣを誘導する、請求項２９〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記ＣＤ１２３結合ポリペプチドが、Ｔ細胞活性化又はＴ細胞増殖を誘導する、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが、ＣＤ１２３発現細胞のＴ細胞依存性溶解を誘導する、請求項２９〜５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合した時に、ＯＫＴ３抗体対照と比較して、前記Ｔ細胞からのサイトカイン放出を低下させる、請求項２９〜５５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記第２の結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７、ＨｕＭ２９１及びＩ２Ｃから選択されるモノクローナル抗体とＣＤ３εへの結合について競合する、請求項２９〜４０及び４６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
前記第２の結合ドメインが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項２９〜５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
前記第２の結合ドメインが、ヒト化又はヒト結合ドメインである、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）第２の結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ＣＤ１２３結合ドメインが、配列番号２、配列番号４、配列番号１８、又は配列番号２０、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５２、配列番号６６、配列番号６８、配列番号８２、配列番号８４、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、又は配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６１】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含むｓｃＦｖであり；かつ前記軽鎖可変領域及び前記重鎖可変領域が、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中、ｎ＝１〜５（配列番号２１４）を含むアミノ酸配列によって結合されている、請求項１〜６０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
前記第２の結合ドメインが、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含むｓｃＦｖであり；かつ前記軽鎖可変領域及び前記重鎖可変領域が、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中、ｎ＝１〜５（配列番号２１４）を含むアミノ酸配列によって結合されている、請求項２９〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
前記カルボキシル末端リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中、ｎ＝１〜７（配列番号３１４）を含むアミノ酸配列を含む、請求項３０〜６２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ｎ＝３〜５である、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記ＣＤ１２３結合ドメインが、１２Ｆ１マウス抗体に由来しない、請求項１〜６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
請求項３０〜６５のいずれか一項に記載の２つの同一のポリペプチドを含む、二量体。
【請求項６７】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項６６に記載の二量体及び医薬として許容される担体、希釈材又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６８】
前記医薬組成物が、同一のｓｃＦｖを含有する抗ＣＤ１２３  ｓｃＦｖ×抗ＣＤ３  ｓｃＦｖポリペプチドよりも、対象に投与されたときに、より長い半減期を示す、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項７０】
前記核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号８１、配列番号８３、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、又は配列番号１５５に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６９に記載の単離核酸分子。
【請求項７１】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む発現ベクターであって、前記核酸セグメントが、宿主細胞において前記核酸セグメントの発現に適する調節配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項７２】
前記核酸セグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号８１、配列番号８３、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、又は配列番号１５５に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項７１に記載の発現ベクター。
【請求項７３】
請求項７１又は７２に記載の発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
【請求項７４】
ＣＤ１２３結合ポリペプチドを生成する方法であって、前記核酸セグメントが発現する条件下で、請求項７１又は７２に記載の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を培養し、それによって、前記ＣＤ１２３結合ポリペプチドを生成することを含む、方法。
【請求項７５】
前記組み換え宿主細胞が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、又はＣＯＳ宿主細胞株である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
さらに、前記ＣＤ１２３結合ポリペプチドを回収することを含む、請求項７４又は７５に記載の方法。
【請求項７７】
ＣＤ１２３を発現する細胞に対してリダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘導する方法であって、前記ＣＤ１２３発現細胞と請求項３０〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドとを接触させることを含み、前記第２の結合ドメインが、Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合し；かつ前記ＣＤ１２３発現細胞に対するＲＴＣＣが誘導される条件下で前記接触が起きる、方法。
【請求項７８】
ＣＤ１２３を発現する細胞のＴ細胞依存性溶解を誘導する方法であって、前記ＣＤ１２３発現細胞と請求項３０〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドとを接触させることを含み、前記第２の結合ドメインが、Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合し；かつ前記接触が、前記ＣＤ１２３発現細胞のＴ細胞依存性溶解が誘導される条件下で起きる、方法。
【請求項７９】
対象における障害を治療する方法であって、前記障害がＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられ、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の治療有効量のポリペプチド又は請求項６６に記載の二量体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８０】
前記障害が癌である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、芽球増加を伴う不応性貧血、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病又はホジキンリンパ腫である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる、対象における障害の治療用薬剤の製造のための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項６６に記載の二量体。
【請求項８３】
ＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる、対象における障害を治療する際に使用するための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項６６に記載の二量体。
【請求項８４】
前記障害が癌である、請求項８２又は８３に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、芽球増加を伴う不応性貧血、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病又はホジキンリンパ腫である、請求項８４に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチド。
【請求項８６】
前記ポリペプチドが、非ヒト霊長類ＣＤ１２３に特異的に結合する、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月２１日出願の米国仮特許出願第６２／３９７，７３６号及び２０１７年３月２日出願の米国仮特許出願第６２／４６６，１９２号の優先権及び利益を主張するものである。これらの出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子出願テキストファイルの説明
電子出願テキストファイル：配列表（ファイル名：ＡＰＶＯ＿０５４＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；記録日：２０１７年９月２１日；ファイルサイズ２５７，８６１バイト）のコンピューター可読フォーマットコピーの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示の分野
本開示は、少なくとも１種類のヒト化ＣＤ１２３結合ドメインを有し得るＣＤ１２３に特異的に結合する分子に関する。これらの分子は、癌などのＣＤ１２３過剰発現によって特徴付けられる障害の特徴付け又は治療に有用である。ＣＤ１２３に結合するタンパク質治療薬は、単一特異性タンパク質治療薬又は多特異性タンパク質治療薬であり得る。多特異性タンパク質治療薬は、ＣＤ１２３発現細胞とＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体の両方に結合し、標的依存的にＴ細胞の細胞傷害、活性化及び増殖を誘導することができる。
【背景技術】
【０００４】
本開示の背景
ＣＤ１２３は、ヒトインターロイキン３（ＩＬ−３）受容体のアルファ鎖としても知られている。ＣＤ１２３は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーである。インターロイキン３受容体は、ＣＤ１２３及びベータ鎖（ＣＤ１３１）によって形成されたヘテロ二量体である。ＩＬ−３はＣＤ１２３に結合し、シグナル伝達はＣＤ１３１によって提供される。ＩＬ−３は、造血細胞及び免疫細胞の機能並びに生成を調節し、内皮細胞の増殖を刺激する（Ｔｅｓｔａら、Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｒｅｓ．２：４（２０１４））。
【０００５】
ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）及び有毛細胞白血病のサブセットを含む多くの血液悪性腫瘍で過剰発現している（同文献）。ほとんどのＡＭＬ患者が最初の療法には十分に反応するが、最終的には、ＡＭＬ患者の大多数が再発疾患又は難治性疾患を有すると診断される（Ｒａｍｏｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．４：６６５−６９５（２０１５））。有効性及び効力が向上し、有害作用が低下し、ＣＤ１２３の調節不全と関連する障害を治療するために使用することができるＣＤ１２３標的分子が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドを包含し、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６と異なる配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８と異なる配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０と異なる配列を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２と異なる配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１４と異なる配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１６と異なる配列を含む。例えば、本開示は、ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドを包含し、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号６に記載のアミノ酸配列又は１又は２つのアミノ酸置換によって配列番号６と異なる配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列又は１又は２つのアミノ酸置換によって配列番号８と異なる配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は１又は２つのアミノ酸置換によって配列番号１０と異なる配列を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は１又は２つのアミノ酸置換によって配列番号１２と異なる配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は１又は２つのアミノ酸置換によって配列番号１４と異なる配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は１又は２つのアミノ酸置換によって配列番号１６と異なる配列を含む。本発明は、（ａ）配列番号６に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｂ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、（ｃ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、（ｄ）配列番号１２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｅ）配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、（ｆ）配列番号１６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＣＤ１２３結合ドメインを有する組み換えポリペプチドを含む。ＣＤ１２３に結合する組み換えポリペプチドは、（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むことができる。例えば、本発明は、請求項１に記載の組み換えポリペプチドを含み、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えＣＤ１２３結合ポリペプチドを含み、該結合ドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、（ｉ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２８と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３０と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３２と異なる配列を含むか、又は（ｉｉ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３６と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３８と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４０と異なる配列を含むか、又は（ｉｉｉ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４４と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４６と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４８と異なる配列を含むか、又は（ｉｖ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１００に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１００と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０２と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０４と異なる配列を含むか、又は（ｖ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１０８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０８と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１０と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１１２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１２と異なる配列を含むか、又は（ｖｉ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１６と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１８と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２０と異なる配列を含むか、又は（ｖｉｉ）（ａ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２４と異なる配列を含み、（ｂ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２６と異なる配列を含み、かつ（ｃ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２８と異なる配列を含む。本発明は、（ｉ）〜（ｖｉｉ）によって定義される重鎖可変領域、並びに（ａ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を含むＬＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む組み換えポリペプチドを含む。例えば、本発明は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号２０、３４、４２、９８、１０６、１１４、若しくは１２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、を含む組み換えポリペプチドを含む。
【０００８】
ある実施形態において、組み換えＣＤ１２３結合ポリペプチドは、（ａ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５４と異なる配列を有するＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５６と異なる配列を有するＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５８と異なる配列を有するＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６０と異なる配列を有するＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６１と異なる配列を有するＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６２と異なる配列を有するＨＣＤＲ３、を含む。例えば、本発明は、ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドを含み、（ｉ）該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）該免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
別の実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドは、（ａ）配列番号７０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７０と異なる配列を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７２と異なる配列を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７４と異なる配列を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号７６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７６と異なる配列を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７８と異なる配列を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号８０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８０と異なる配列を含むＨＣＤＲ３、を含む。例えば、本発明は、配列番号６６及び６８に記載の可変領域を含む組み換えポリペプチドを含む。
【００１０】
ある実施形態において、該組み換えポリペプチドは、（ａ）配列番号８６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８６と異なる配列を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号８８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８８と異なる配列を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号９０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９０と異なる配列を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号９２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９２と異なる配列を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号９４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９４と異なる配列を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号９６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９６と異なる配列を含むＨＣＤＲ３、を含む。例えば、本発明は、配列番号８２及び８４に記載の可変ドメインを含むポリペプチドを含む。
【００１１】
（ｉｉ）配列番号８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合する。ある実施形態において、該ポリペプチドは非ヒト霊長類ＣＤ１２３に結合する。さらなる実施形態において、該ポリペプチドはカニクイザルＣＤ１２３に結合する。本発明は、ヒトＣＤ１２３結合ドメインを含むＣＤ１２３結合ポリペプチド及びヒト化ＣＤ１２３結合ドメインを含むＣＤ１２３結合ポリペプチドを含む。一実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００１３】
本発明の組み換えポリペプチドは、第２の結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドを含む。一実施形態において、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合する。例えば、本発明は、ＣＤ３結合ｓｃＦｖを含む組み換えＣＤ１２３結合ポリペプチドを含む。本発明は、開示されるＣＤ１２３結合ｓｃＦｖのいずれか１つと開示されるＣＤ３結合ｓｃＦｖを組み合わせることを含む。一実施形態において、該ポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）第２の結合ドメインを含む。例えば、本発明は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）第２の結合ドメインを含む組み換えポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明の一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性をゼロ〜最小限しか示さないように工学処理された改変免疫グロブリン定常領域を含む。本発明の一実施形態において、該ＣＤ３結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７、ＨｕＭ２９１及びＩ２Ｃから選択されるモノクローナル抗体に由来する。
【００１５】
本発明のある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｖ）配列番号１３８のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｖｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｖｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｖｉｉｉ）配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１４６のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｘ）配列番号１４８のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｘｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｘｉｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、（ｘｉｉｉ）配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、又は（ｘｉｖ）配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列、を含む。
【００１６】
本発明の一実施形態において、該組み換えポリペプチドは、リダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘導する。ある実施形態において、該組み換えポリペプチドは、Ｔ細胞活性化又はＴ細胞増殖を誘導する。ある実施形態において、該ポリペプチドは、ＣＤ１２３発現細胞のＴ細胞依存性溶解を誘導する。
【００１７】
本発明のある実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合した時に、ＣＤ１２３結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドは、ＯＫＴ３抗体対照と比較して該Ｔ細胞からのサイトカイン放出を低下させる。本発明のある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン及びＣＲＩＳ−７由来のＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドは、ＯＫＴ３又はＩ２Ｃ由来のＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性と比較して該Ｔ細胞からのサイトカイン放出を低下させる。本発明のある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン（例えば、配列番号２及び／又は配列番号４と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＤ１２３結合ドメイン）並びにＣＲＩＳ−７由来のＣＤ３結合ドメインを含み、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖフォーマット又はダイアボディフォーマットでＣＤ１２３結合ドメイン及び１２Ｃ由来のＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドと比較して、非ヒト霊長類又はヒトにおいてサイトカイン放出を低下させる。
【００１８】
本発明のある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチド（例えば、配列番号１３０又は配列番号１３２と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチド）は、ＭＧＤ００６又はＴＲＩ１６８と比較して非ヒト霊長類又はヒトにおいてサイトカイン放出を低下させる。本発明の一実施形態において、配列番号１３０又は配列番号１３２と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドは、ＭＧＤ００６又はＴＲＩ１６８と比較してＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα及び／又はＩＬ−１０のレベルの低下を誘導する。
【００１９】
本開示は、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチド又は該ＣＤ１２３結合ポリペプチドの一部をコードする単離核酸分子を包含する。該単離核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号８１、配列番号８３、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、又は配列番号１５５に記載のヌクレオチド配列を含み得る。
【００２０】
本開示は、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む発現ベクターに関し、該核酸セグメントは、宿主細胞における核酸セグメントの発現に適する調節配列に作動可能に連結されている。発現ベクターの核酸セグメントは、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号８１、配列番号８３、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、又は配列番号１５５に記載のヌクレオチド配列を含み得る。
【００２１】
本開示は、本明細書に記載の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を含む。
【００２２】
本開示は、ＣＤ１２３結合ポリペプチドを生成する方法であって、ベクターの核酸セグメントが発現する条件下で本明細書に記載の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を培養し、それによってＣＤ１２３結合ポリペプチドを生成することを含む方法に関する。本発明は、さらに、ＣＤ１２３結合ポリペプチドを回収することを含み得る。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチド及び医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は、経口単位剤形、静脈内単位剤形、鼻腔内単位剤形、坐剤単位剤形、皮内単位剤形、筋肉内単位剤形、腹腔内単位剤形、皮下単位剤形、硬膜外単位剤形、舌下単位剤形、及び脳内単位剤形からなる群から選択される剤形に製剤化され得る。経口単位剤形として製剤化される医薬組成物は、錠剤、丸薬、小丸薬、カプセル、散剤、トローチ剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、徐放製剤、エアロゾル、及び噴霧剤からなる群から選択され得る。
【００２４】
本開示はまた、ＣＤ１２３を発現する細胞に対してリダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘導する方法であって、該ＣＤ１２３発現細胞と本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドとを接触させることを含み、第２の結合ドメインが、Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合し、該接触が、ＣＤ１２３発現細胞に対するＲＴＣＣが誘導される条件下で起きる方法に関する。
【００２５】
本開示は、ＣＤ１２３を発現する細胞のＴ細胞依存性溶解を誘導する方法であって、該ＣＤ１２３発現細胞と、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチド又はＣＤ１２３結合タンパク質とを接触させることを含み、該第２の結合ドメインがＴ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合し、該接触が、ＣＤ１２３発現細胞のＴ細胞依存性溶解が誘導される条件下で起きる方法を包含する。
【００２６】
本開示は、対象における障害（例えば、癌）を治療する方法であって、該障害がＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられ、本明細書に記載の治療有効量のＣＤ１２３結合ポリペプチドを該対象に投与することを含む方法を包含する。本開示はまた、対象における障害（例えば、癌）の治療用薬剤の製造のための、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドに関し、該障害はＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる。本開示は、対象における障害（例えば、癌）の治療における使用のための、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドを含み、該障害はＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる。本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドによって治療される癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）、又は有毛細胞白血病であり得る。
【００２７】
本開示のこれらの及び他の実施形態並びに／又は他の態様は、本開示の以下の詳細の記述及び添付図を参照すると明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、３回の独立実験における１３種の異なる二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子（ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２７、ＴＲＩ１２８、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３１、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３４、ＴＲＩ１３７、ＴＲＩ１３８及びＴＲＩ１３９）のＣＤ１２３（＋）Ｍｏｌｍ−１３ヒト腫瘍細胞株への結合を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｃ、２Ｂ及び２Ｃは、２回の独立実験における１３種の異なる二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子（ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２７、ＴＲＩ１２８、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３１、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３４、ＴＲＩ１３７、ＴＲＩ１３８及びＴＲＩ１３９）の、カニクイザルＣＤ１２３タンパク質安定発現ＣＨＯ細胞への結合を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、２回の独立実験における１３種の異なる二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子（ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２７、ＴＲＩ１２８、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３１、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３４、ＴＲＩ１３７、ＴＲＩ１３８及びＴＲＩ１３９）を用いて４時間目に測定したＭｏｌｍ−１３細胞株を用いるクロム５１放出アッセイの結果を示す。二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子の全ては、４時間の時点で、２４〜４８％の最大特異的溶解の範囲の効率的標的細胞溶解を示した。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、低濃度（１０ｐＭ）でのＴ細胞増殖の誘導を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、Ｍｏｌｍ−１３細胞の存在下でＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の標的依存性活性化を示す。
【図６】異なるＥＣＤ濃度でのＴＲＩ−１３０のＳＰＲ分析の例を示す。
【図７】ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０二重特異性分子の濃度対時間曲線を示す。
【図８】ＴＲＩ１２９で処置したマウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積の減少を示す。
【図９】ＴＲＩ１３０で処置したマウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積の減少を示す。
【図１０】ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０でのマウス腫瘍モデルの処置が生存の延長をもたらすことを示す。
【図１１】ＣＤ１２３結合ドメイン−ヒンジドメイン−免疫グロブリン定常ドメイン−ＣＤ３結合ドメイン構成でＲＴＣＣ可能な組み換えＣＤ１２３結合ポリペプチドの図である。
【図１２】ＴＲＩ１３０二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子を用いて４時間目に測定したＭｏｌｍ−１３、ＫＧ−１ａ及びＤａｕｄｉ細胞株を用いるクロム５１放出アッセイの結果を示す。このアッセイは、ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞株又はＣ１２３陰性腫瘍細胞株及び精製ヒトＴ細胞と共にインキュベートしたＴＲＩ１３０の細胞傷害を測定した。
【図１３】実施例１４に記載の、ＴＲＩ１３０で処置したカニクイザルの処置群についてのＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）非コンパートメント（ＮＣＡ）推定値及び半減期（ＨＬ）のフィットを示す。
【図１４】実施例１４に記載の、ＴＲＩ１３０で処置したカニクイザルにおけるリンパ球集団の経時変化を表すグラフを示す。
【図１５】実施例１４に記載の、ＴＲＩ１３０で処置したカニクイザルにおける好塩基球集団の経時変化を表すグラフを示す。
【図１６】実施例１５に記載の、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の播種性異種移植マウスモデルにおいて生物発光レベルによって測定した時の経時的な腫瘍負荷を表すグラフを示す。
【図１７】１４日目のマウスにおける腫瘍負荷の生物発光画像を示す。
【図１８】実施例１７に記載の、ＣＤ１２３＋Ｍｏｌｍ−１３標的細胞を用いてＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８誘導性Ｔ細胞活性化を測定したアッセイの結果を示す。
【図１９】実施例１７に記載の、ＣＤ１２３＋Ｍｏｌｍ−１３標的細胞のＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８誘導性Ｔ細胞の細胞傷害を測定したアッセイの結果を示す。
【図２０】実施例１７に記載の、ＣＤ１２３＋Ｍｏｌｍ−１３標的細胞を用いてＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８誘導性Ｔ細胞サイトカイン放出を測定したアッセイの結果を示す。
【図２１】実施例１７に記載の、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）培養物においてＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８誘導性Ｔ細胞サイトカイン放出を測定したアッセイの結果を示す。
【図２２】実施例１８に記載の、ＡＭＬ患者からのＡＭＬ細胞試料と共にインキュベートしたＴＲＩ１３０の細胞傷害を測定したアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示の詳細な説明
本開示は、ＣＤ１２３に特異的に結合する結合ドメイン（インターロイキン３受容体α鎖としても知られる）並びにＣＤ１２３に特異的に結合する結合分子（例えば、ポリペプチド及びタンパク質）を提供する。これらの結合分子は、ＣＤ１２３及び別の標的に特異的に結合することができる。治療有効量のＣＤ１２３結合ポリペプチド又はタンパク質を、それを必要すると患者に投与することは、いくつかの癌を含むＣＤ１２３の過剰発現と関連するいくつかの障害の治療に有用である。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ポリペプチド又はタンパク質は、ＣＤ１２３を過剰発現する標的細胞及びＴ細胞の両方に結合し、それによってＣＤ１２３を過剰発現する標的細胞とＴ細胞を架橋結合する。両方のドメインのそれらの標的への結合は、リダイレクトされた強力な標的依存性Ｔ細胞細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘発する（例えば、標的依存性Ｔ細胞細胞傷害性、Ｔ細胞活性化及び／又はＴ細胞増殖を誘導する）。本開示のＣＤ１２３結合治療薬は、患者の治療に様々な利点、例えば、ＣＤ１２３への効果的な結合、ＲＴＣＣ活性の効率的な誘導、サイトカイン放出のレベルの低下及び／又は有害事象（例えば、毒性）のリスクの低減を提供する。いくつかの態様において、ＣＤ１２３結合タンパク質が、いくつかの形式（例えば、親抗体と比較したｓｃＦｖ）及び／又はいくつかの配向（例えば、ＶＨ−ＶＬと比較したＶＬ−ＶＨ）でより効果的にＣＤ１２３に結合すると、ＣＤ１２３の過剰発現と関連する障害の治療により高い効力及び改善された有用性がもたらされる。
【００３０】
本明細書で使用する節の見出しは、単なる構成目的のためのものであり、記載される主題を制限するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、本、及び論文を含むが、これらに限定されない、本明細書で引用される全ての文章、又は文章の一部は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる。組み込まれる文章又は文章の一部の１以上が本出願中のその用語の定義と矛盾する用語を定義する場合、本出願に現れる定義が優先される。しかしながら、本明細書で引用される全ての参考文献、記事、出版物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、有効な先行技術を構成するか、若しくは世界中の全ての国における共通の一般知識の一部を形成するという承認、又は任意の形態の示唆ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【００３１】
本明細書において、全ての濃度範囲、割合の範囲、比の範囲、又は整数の範囲は、特に示さない限り、列挙される範囲内の全ての整数の値、必要であれば、その分数（整数の十分の一及び百分の一など）を含むと理解されるべきである。本明細書で使用する「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」という用語は、特に示さない限り、列挙される構成成分の「１以上」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「又は」）の使用は、選択肢の１つ、両方、又はその任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用する「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同意語として使用される。加えて、本明細書に記載の構成成分（例えば、ドメイン若しくは領域）及び置換基の様々な組み合わせを含むポリペプチドは、各ポリペプチドが個々に記載されるのと同程度まで本出願によって開示されることは理解されるべきである。したがって、個々のポリペプチドの特定の構成成分の選択は、本開示の範囲内である。
【００３２】
本明細書で使用する「結合ドメイン」又は「結合領域」という用語は、抗原、リガンド、受容体、基質、又は阻害剤（例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３）などの標的分子を特異的に認識し、結合する能力を保有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、若しくはペプチド若しくは抗体のドメイン、領域、一部、又は部位、又は抗体由来の結合ドメインを指す。代表的な結合ドメインには、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、受容体外部ドメイン、及びリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）が含まれる。ある実施形態において、結合ドメインは、（例えば、代替フレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、任意選択で１以上のアミノ酸置換を含むヒトＦＲ）に配置された抗体由来の可変重鎖配列及び可変軽鎖配列又は３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び３つの重鎖ＣＤＲを含む）抗原結合部位を含むか、又はそれからなる。ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ファージディスプレイライブラリースクリーニング、及びＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）相互作用分析を含めて、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを特定するための様々なアッセイが知られている。本明細書で使用するように、ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、「第１の結合ドメイン」及び任意選択で「第２の結合ドメイン」を有することができる。ある実施形態において、「第１の結合ドメイン」は、ＣＤ１２３結合ドメインであり、形式は、抗体又は抗体様タンパク質又はドメインである。第１の及び第２の結合ドメインの両方を含むある実施形態において、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３）に結合するマウスモノクローナル抗体（例えば、ＣＲＩＳ−７）又はファージディスプレイ（例えば、Ｉ２Ｃ）由来のｓｃＦｖなどのＴ細胞結合ドメインである。他の実施形態において、第２の結合ドメインは、第２のＣＤ１２３結合ドメインである。さらに他の実施形態において、第２の結合ドメインは、ＣＤ１２３結合ドメイン又はＴ細胞結合ドメイン以外の結合ドメインである。
【００３３】
「サイトカイン放出」又は「サイトカインストーム」又は「急性輸液反応」は、Ｔ細胞からのサイトカインの放出を指す。サイトカインが血液循環内に放出されると、発熱、吐き気、悪寒、低血圧、頻脈、無力症、頭痛、発疹、のどの痛み、及び呼吸困難などの全身症状が起こり得る。何人かの患者は、サイトカインの大量放出から生じる、重篤で、生命を脅かす応答を経験し得る。サイトカイン放出の「低下」は、ＯＫＴ−３抗体又は他のＣＤ３結合二重特異性分子と比較して、本発明の組み換えポリペプチドの投与後、少なくとも１種類のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα及び／又はＩＬ−１０）の放出の低下を指す。サイトカイン放出の低下は、インビトロアッセイを用いて、又はインビボで測定することができる。
【００３４】
結合ドメイン又はタンパク質は、１０５Ｍ−１以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍ単位での特定の結合相互作用の平衡結合定数）で標的に結合するが、試験試料中に存在する他の構成成分には顕著に結合しない場合、標的に「特異的に結合する」。結合ドメインは、「高親和性」結合ドメイン及び「低親和性」結合ドメインとして分類することができる。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、又は少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有するそれらの結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、１０７Ｍ−１まで、１０６Ｍ−１まで、１０５Ｍ−１までのＫａを有するそれらの結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍ単位（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義することができる。本開示による結合ドメインポリペプチド及び単鎖ポリペプチドの親和性は、従来技術を用いて容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９）  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；及び米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、又は同等物を参照されたい）。
【００３５】
「ＣＤ３」は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットである６つの鎖のマルチタンパク質複合体として当技術分野で知られている（例えば、Ａｂｂａｓ及びＬｉｃｈｔｍａｎ，２００３；Ｊａｎｅｗａｙら、ｐ．１７２及び１７８，１９９９を参照されたい）。哺乳類において、Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットは、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖は、単一免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、これらの鎖が正電荷のＴ細胞受容体鎖と結合するのを可能にする特徴である負に帯電している。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖の細胞内テールの各々は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られる単一保存モチーフを含有するが、各ＣＤ３ζ鎖は３つ有する。ＩＴＡＭがＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に重要であると考えられている。本開示で使用されるＣＤ３は、ヒト、サル、マウス、ラット、又は他の哺乳類を含む様々な動物種由来のものであり得る。
【００３６】
本明細書で使用する「保存的置換」は、１個のアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換として当技術分野で認識されている。代表的な保存的置換が当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ  ９７／０９４３３，１０ページ，１９９７年３月１３日公開；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ及びＣｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照されたい）。ある実施形態において、保存的置換は、ロイシンからセリンへの置換を含む。
【００３７】
本明細書で使用する「誘導体」という用語は、酵素の有無にかかわらず、化学的又は生物学的手段による、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成によるペプチドの１以上のアミノ酸残基の修飾を指す。
【００３８】
本明細書で使用する、指定されたポリペプチド若しくはタンパク質「由来の」ポリペプチド又はアミノ酸配列は、該ポリペプチドの原型を指す。ある実施形態において、特定の配列由来のポリペプチド又はアミノ酸配列（時には、「出発」配列若しくは「親」配列若しくは「親の」配列と呼ばれる）は、基本的に出発配列又はその一部と同一であるアミノ酸配列を有し、その中の一部は、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、若しくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸、若しくは少なくとも５０〜１５０個のアミノ酸からなるか、又はそうでなければ出発配列内にその原型を有するものとして当業者に同定され得るアミノ酸配列を有する。例えば、結合ドメインは、抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、単鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などに由来し得る。
【００３９】
別のポリペプチド由来のポリペプチドは、出発ポリペプチドに対して１以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基と置換されている１以上のアミノ酸残基を有し得るか、又は１以上のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失を有する。該ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含み得る。そのようなバリエーションは、必然的に、出発ポリペプチドと１００％未満の配列同一性又は類似性を有する。一実施形態において、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約６０％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性のあるアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００％未満、約９０％〜１００％未満、約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性のあるアミノ酸配列を有する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、特に提供されない限り、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置は、ＩＭＧＴ番号付け規則（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００８）３６，Ｗ５０３−５０８）に従って番号付けされ、免疫グロブリン分子の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、ＥＵ命名法（Ｗａｒｄら、１９９５  Ｔｈｅｒａｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４）に従って番号付けされる。他の番号付け規則は、当技術分野で公知である（例えば、Ｋａｂａｔ番号付け規則（Ｋａｂａｔ，免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），第５版．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  （１９９１））。
【００４１】
本明細書で使用する「二量体」という用語は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）及び他の相互作用（例えば、静電相互作用、塩橋、水素結合、及び疎水性相互作用）を含む分子内力の１以上の形態によって互いに結合した２つのサブユニットからなり、適切な条件下（例えば、生理学的条件下、組み換えタンパク質の発現、精製、及び／若しくは保存に適する水溶液中、又は非変性及び／若しくは非還元電気泳動のための条件下）で安定である生物学的実体を指す。本明細書で使用する「ヘテロ二量体」又は「ヘテロ二量体タンパク質」は、２つの異なるポリペプチドから形成される二量体を指す。ヘテロ二量体は、４つのポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖及び２つの重鎖）から形成される抗体を含まない。本明細書で使用する「ホモ二量体」又は「ホモ二量体タンパク質」は、２つの同一のポリペプチドから形成される二量体を指す。本発明の組み換えポリペプチドは、主に二量体形態で存在する。特徴及び活性（結合及びＲＴＣＣなど）を含むポリペプチドの全ての開示は、その二量体形態及び他の多量体形態のポリペプチドを含むことが理解されるべきである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、又はカルボキシル末端からアミノ末端の順で、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー（又はアミノ末端リンカー）、並びに（ｖ）第２の結合ドメインを含む。本明細書で使用し、文脈に依存する「ヒンジ領域」又は「ヒンジ」は、結合ドメイン（例えば、ＣＤ１２３結合ドメイン）と免疫グロブリン定常領域の間のポリペプチド領域を指す。本明細書で使用し、文脈に依存する「リンカー」は、（１）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）中のＶＨ領域とＶＬ領域の間のポリペプチド領域、又は（２）２つの結合ドメインを含むＣＤ１２３結合ポリペプチド内の免疫グロブリン定常領域と第２の結合ドメインの間のポリペプチド領域を指し得る。２つの結合ドメインを含むＣＤ１２３結合ポリペプチド内の免疫グロブリン定常領域と第２の結合ドメインの間のポリペプチド領域は、「カルボキシル末端リンカー」又は「アミノ末端リンカー」とも呼ばれ得る。カルボキシル末端リンカー及びアミノ末端リンカーの非限定的な例として、グリシン−セリン（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ））リピート（配列番号３１５）を含む可動性リンカー、（ａ）膜貫通タンパク質のドメイン間領域（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）；（ｂ）ＩＩ型Ｃレクチンのストーク領域；又は（ｃ）免疫グロブリンヒンジ由来のリンカーが挙げられる。ヒンジ及びリンカーの非限定的な例を表１及び表２に提供する。いくつかの実施形態において、「リンカー」は、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供し、その結果、生じたポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子への特異的結合親和性を保持する。ある実施形態において、リンカーは、５〜約３５個のアミノ酸、例えば、約１５〜約２５個のアミノ酸で構成される。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸又は少なくとも９個のアミノ酸で構成される。
【００４３】
「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖に見られる（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤについては）ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に挿入され、それらを連結している天然に存在する上及び真ん中のヒンジアミノ酸配列、又は（ＩｇＥ及びＩｇＭについては）ＣＨ１とＣＨ３ドメインの間に挿入され、それらを連結している天然に存在する上及び真ん中のヒンジアミノ酸配列を指す。ある実施形態において、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列は、ヒトであり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含むことができる。
【００４４】
「改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域」又は「改変された免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最高で３０％のアミノ酸変化（例えば、最高で２５％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％のアミノ酸置換又は欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は（ｂ）約５個のアミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸）、最大で約１２０個のアミノ酸の長さを有する（例えば、約１０〜約４０個のアミノ酸又は約１５〜約３０個のアミノ酸又は約１５〜約２０個のアミノ酸又は約２０〜約２５個のアミノ酸の長さを有する）、最大約３０％のアミノ酸変化（例えば、最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、若しくは１％のアミノ酸置換又は欠失又はそれらの組み合わせ）を有し、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号及び同第２０１３／００９５０９７号に開示されるＩｇＧコアヒンジ領域を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部を指す。
【００４５】
本明細書で使用する「ヒト化」という用語は、ヒトに対する免疫原性は低いが、なお元の抗体の抗原結合特性を保持している非ヒト種（例えば、マウス又はラット）由来の抗体又は免疫グロブリン結合タンパク質及びポリペプチドを、遺伝子工学技術を用いて作製する工程を指す。いくつかの実施形態において、抗体又は免疫グロブリン結合タンパク質及びポリペプチド（例えば、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）の結合ドメイン（複数可）はヒト化される。非ヒト結合ドメインは、ＣＤＲ移植（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６））として知られる技術、並びに「再形成」（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７；Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９１  ９：２６６−２７１）、「ハイパーキメラ化」（Ｑｕｅｅｎら、１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；Ｃｏら、１９９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃｏら、１９９２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４）、及びベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）（Ｍｅｔｃａｌｆ  ＢＷ，Ｄａｌｔｏｎ  ＢＪ（編）、細胞接着：治療的可能性に対する分子的定義（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の中のＭａｒｋら，「ヒト化及びベニアリングした治療活性のある抗ＣＤ１８抗体の誘導（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ１８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４：２９１−３１２）を含むそれらの変異体を用いてヒト化され得る。非ヒト供給源由来の場合、ヒンジ領域及び定常領域ドメインなどの抗体又は免疫グロブリン結合タンパク質及びポリペプチドの他の領域もヒト化され得る。
【００４６】
本明細書で使用する「免疫グロブリン二量体化ドメイン」又は「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」は、第２のポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリンドメインと優先的に相互作用するか、又は結合するポリペプチド鎖の免疫グロブリンドメインを指し、異なる免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの相互作用は、第１の及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化（すなわち、「ヘテロ二量体」とも呼ばれる、２つの異なるポリペプチド鎖間の二量体の形成）に実質的に寄与するか、又はヘテロ二量体化を効率的に促進する。免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間の相互作用は、第１のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン及び／又は第２のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの非存在下で、第１の及び第２のポリペプチド鎖の間の二量体化の統計的に有意な低下がある場合に、第１の及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化に「実質的に寄与するか、又は効率的に促進する」。ある実施形態において、第１の及び第２のポリペプチド鎖が共発現する場合、第１の及び第２のポリペプチド鎖の少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、互いにヘテロ二量体を形成する。代表的な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインには、本明細書に提供する野生型免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメイン並びに改変（又は変異）した免疫グロブリンＣＨ１及びＣＬドメインを含む免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、Ｃκ又はＣλアイソタイプ）、又はそれらの誘導体が含まれる。
【００４７】
「免疫グロブリン定常領域」又は「定常領域」は、１以上の定常領域ドメインの一部若しくは全てに対応するか、若しくは由来するペプチド又はポリペプチド配列を指すために本明細書で定義される用語である。ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域は１以上の定常領域ドメインの一部若しくは全てに対応するか、若しくは由来するが、供給源抗体の全ての定常領域ドメインではない。ある実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態において、定常領域はＣＨ１ドメインを含まない。ある実施形態において、定常領域を構成する定常領域ドメインはヒトである。いくつかの実施形態において（例えば、ＣＤ３又は別のＴ細胞表面抗原に特異的に結合する第２の結合ドメインを含むＣＤ１２３結合ポリペプチド又はタンパク質のいくつかのバリエーションにおいて）、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体活性化及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のエフェクター機能を欠くか、最小限有するが、いくつかのＦｃ受容体（ＦｃＲｎ、新生児Ｆｃ受容体など）に結合する能力を保持し、インビボで比較的長い半減期を保持している。他のバリエーションにおいて、本開示の融合タンパク質は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの一方又は両方のそのようなエフェクター機能を保持する定常ドメインを含む。ある実施形態において、本開示の結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合され、ＩｇＧ１定常領域は、以下の変異アミノ酸：（ＥＵに従って番号付けられた）２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリジン（Ｋ３２０）、３２２位のリジン（Ｋ３２２）、又は任意のそれらの組み合わせのうちの１以上を有する。例えば、これらのアミノ酸の任意の１以上をアラニンに変えることができる。さらなる実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、アラニンに変異された（ＥＵ番号付けに従う）Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、及びＫ３２２（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、及びＫ３２２Ａ）の各々、同様に必要に応じて、Ｎ２９７Ａ変異（すなわち、基本的にＣＨ２ドメインのグリコシル化を排除するため）を有する。別の実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＫ３２２Ａ変異の各々を有する。例えば、本発明は、配列番号１３０と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有するＣＤ１２３結合ドメイン又はｓｃＦｖ；変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＫ３２２Ａを含むＩｇＧ１ドメイン；並びにＣＤ３結合ドメインを含む組み換えポリペプチドを含む。本発明は、配列番号１３０と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＤ１２３結合ドメイン；変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＫ３２２Ａを含む���ｇＧ１ドメイン；並びに配列番号１９２又は配列番号１９３と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＤ３結合ドメイン、を含む組み換えポリペプチドを含む。
【００４８】
「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、細胞上の抗体受容体及び補体のＣ１ｑ構成要素への結合に関与する供給源抗体の一部に対応するか、又は由来するポリペプチド配列を指す。Ｆｃは、タンパク質結晶を容易に形成する抗体の断片である「結晶性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）」を表す。元々、タンパク質消化によって説明される個々のタンパク質断片は、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を定義し得る。文献で元々定義されるように、Ｆｃ断片は、ジスルフィド結合重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。しかしながら、より最近では、この用語は、ＣＨ３、ＣＨ２、及び第２のそのような鎖とジスルフィド結合二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部からなる単鎖に適用されている。免疫グロブリンの構造及び機能の概説については、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖ巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，１９８７），ｐｐ．４９−１４０；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７，１９９４を参照されたい。本明細書で使用するように、用語Ｆｃは、天然に存在する配列の変異体を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、及び同第２００５／０１３６０４９号に概説されているタンパク質骨格を含む。ＣＤ１２３結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、第１の結合ドメイン、ヒンジ領域、及び免疫グロブリン定常領域を含み得る。他の実施形態において、ＣＤ１２３結合タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８４４７号に概説されているタンパク質骨格を含む。ＣＤ１２３結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、免疫グロブリン定常領域、ヒンジ領域及び第１の結合ドメインを含み得る。
【００５０】
本明細書に開示するＣＤ１２３結合ポリペプチド及びタンパク質は、多特異性結合タンパク質骨格を取り込むことができる。骨格を用いる多特異性結合タンパク質及びポリペプチドは、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ２００７／１４６９６８、米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ２０１０／０４０１０５、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ２０１０／００３１０８、米国特許第７，１６６，７０７号、及び米国特許第８，４０９，５７７号に開示されており、それらは各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＤ１２３結合タンパク質は、２つの結合ドメイン（該ドメインは、同じ又は異なる標的に特異的に結合するように計画することができる）、ヒンジ領域、リンカー（例えば、カルボキシル末端リンカー又はアミノ末端リンカー）、及び免疫グロブリン定常領域を含み得る。ＣＤ１２３結合タンパク質は、２つの同一のジスルフィド結合ポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質であり得る。
【００５１】
本発明の一実施形態において、該ＣＤ１２３結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、第１の結合ドメイン、ヒンジ領域、免疫グロブリン定常領域及び第２の結合ドメインを含む。図１１に、この構成のＣＤ１２３結合タンパク質が図示されている。
【００５２】
本明細書で使用する「接合部アミノ酸」又は「接合部アミノ酸残基」という用語は、ヒンジと隣接免疫グロブリン定常領域又はヒンジと隣接結合ドメイン又はペプチドリンカーと隣接免疫グロブリン可変ドメイン若しくは隣接免疫グロブリン定常領域などの、ポリペプチドの２つの隣接領域又はドメインの間の１以上（例えば、約２〜１０個）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、ポリペプチドの構築物設計（例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子の構築中に制限酵素部位の使用から生じるアミノ酸残基）から生じ得る。
【００５３】
本明細書で使用する「必要とする患者」又は「必要とする対象」という用語は、本明細書に提供されるＣＤ１２３結合タンパク質又はポリペプチド又はその組成物での治療又は寛解に適する疾患、障害若しくは病状のリスクがあるか、又は罹患している患者を指す。必要とする患者は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、慢性骨髄性白血病及びホジキンリンパ腫などのＣＤ１２３発現と関連する疾患と診断された患者であり得る。
【００５４】
本明細書で使用する「医薬として許容される」という用語は、当技術分野で周知の経路を用いて投与した時に、一般に、アレルギー又は他の重篤な副作用を生じさせない分子実体及び組成物を指す。動物、より具体的には、ヒトにおける使用について、米国の連邦政府若しくは州政府の規制機関で承認されるか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に記載されている分子実体及び組成物は、「医薬として許容される」とみなされる。
【００５５】
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、転写を開始するのに関与するＤＮＡの領域を指す。
【００５６】
本明細書で使用する「核酸」、「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。具体的に制限しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を包含する。特に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列並びに明確に示される配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基と置換される配列の作製によって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、（１９８５）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌら、（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、（１９９４）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。核酸という用語は、遺伝子、遺伝子にコードされるｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡと互換的に使用される。本明細書で使用する「核酸」、「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて作製されるＤＮＡ若しくはＲＮＡの類似体、並びにその誘導体、断片及びホモログを含むことが意図される。
【００５７】
「発現」という用語は、核酸によってコードされる生成物の生合成を指す。例えば、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現は、核酸セグメントのｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳に関与する。
【００５８】
「発現単位」及び「発現カセット」という用語は、本明細書で互換的に使用され、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントを意味し、宿主細胞において該核酸セグメントの発現を提供することができる。発現単位は、典型的には、全て作動可能な構成で転写プロモーター、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写終結コドンを含む。転写プロモーター及び転写終結コドンに加えて、発現単位は、さらに、例えば、エンハンサー又はポリアデニル化シグナルなどの他の核酸セグメントを含むことができる。
【００５９】
本明細書で使用する「発現ベクター」という用語は、１以上の発現単位を含む、直鎖又は環状の核酸分子を指す。１以上の発現単位に加えて、発現ベクターはまた、例えば、１以上の複製開始点又は１以上の選択マーカーなどのさらなる核酸セグメントを含むことができる。発現ベクターは、一般に、プラスミド若しくはウイルスのＤＮＡに由来するか、又は両方の要素を含有することができる。
【００６０】
本明細書で使用する「配列同一性」という用語は、２以上のポリヌクレオチド配列間又は２以上のポリペプチド配列間の関係を指す。１つの配列の中の位置を、比較配列の対応する位置の中の同じ核酸塩基又はアミノ酸残基が占める場合、該配列はその位置で「同一」であると言われる。「配列同一性」の割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列内に生じて、「同一」の位置の数をもたらす位置の数を決定することによって計算される。次いで、「同一」の位置の数を、比較枠内の位置の合計数で割り、１００をかけると、「配列同一性」の割合が得られる。「配列同一性」の割合は、比較枠上で最適に配列させた２つの配列を比較することによって決定される。核酸配列のための比較枠は、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００以上の核酸長であり得る。ポリペプチド配列のための比較枠は、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００以上のアミノ酸長であり得る。比較のための最適な整列のために、比較枠内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部は、参照配列が一定に保たれている一方で、ギャップと呼ばれる付加又は欠失を含むことができる。最適整列は、ギャップがあっても、参照配列と比較配列の間で最高の可能な「同一」位置の数をもたらす整列である。２つの配列間の「配列同一性」の割合は、２００４年９月１日の米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から利用可能なプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」のバージョンを用いて決定することができ、そのプログラムにはプログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）及びＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列比較用）が組み込まれており、これらのプログラムはＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。「ＢＬＡＳＴ２配列」を利用する場合、２００４年９月１日のデフォルトパラメータであるパラメータは、ワードサイズ（３）、オープンギャップペナルティ（１１）、エクステンションギャップペナルティ（１）、ギャップドロップオフ（５０）、期待値（１０）及びマトリックス選択を含むが、これに限定されない任意の他の必要なパラメータに使用することができる。２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、２つの配列が、互いに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する場合、「実質的に類似の配列同一性」又は「実質的配列同一性」を有するとみなされる。
【００６１】
本明細書で使用する「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」は、共有結合アミノ酸の一本鎖で、線形の連続する配列である。ポリペプチドは、１以上の鎖内ジスルフィド結合を有するか、又は形成することができる。本明細書に記載のポリペプチドに関して、配列番号によって特定されるものに対応するアミノ酸残基への言及には、そのような残基の翻訳後修飾が含まれる。
【００６２】
本明細書で使用する「ＣＤ１２３結合タンパク質」は、「ＣＤ１２３結合ポリペプチド」、「ポリペプチド」、及び「組み換えポリペプチド」と互換的に使用され得る。そのような分子は、分化クラスター（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１２３、インターロイキン３受容体α鎖、及びＩＬ３ＲＡとしても知られるＣＤ１２３（例えば、ヒトＣＤ１２３）に特異的に結合する。ＣＤ１２３は、予想されるＩｇ様ドメインを含む細胞外ドメイン及び２つのＦｎＩＩＩドメインを有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。本開示のＣＤ１２３結合タンパク質は、ＣＤ１２３の細胞外ドメインに結合する。「ＣＤ１２３」という用語は、ＣＤ１２３の全てのアイソフォームを指し得る。例示的なヒトＣＤ１２３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２０５及び２０６並びに配列番号２０７及び２０８に提供する。ＣＤ１２３は、インターロイキン３受容体のベータ鎖と結合して、該受容体を形成する。
【００６３】
「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞によってタンパク質に付加され得、細胞の種類によって異なる。タンパク質は、それらのアミノ酸骨格の構造の観点から本明細書で定義される。炭水化物基などの置換基は、一般に特定されないが、それでもなお存在し得る。タンパク質は、抗体又は抗体の抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質はまた、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ二量体、又はダイアボディであり得る。
【００６４】
「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」という用語は、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書で使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、近接又は相対位置を示すために、特定の配列又はポリペプチドの一部を参照して使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に配置されるある配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置づけられるが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に存在する必要はない。
【００６５】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞表面上に見られる分子であり、ＣＤ３と共に、一般に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合した抗原を認識するのに関与する。Ｔ細胞受容体は、ほとんどのＴ細胞内で高度に可変のα鎖及びβ鎖のジスルフィド結合ヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞では、可変γ鎖及びδ鎖で構成される代替受容体が発現する。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端に短い細胞質テールを保有する（Ａｂｂａｓ及びＬｉｃｈｔｍａｎ、細胞及び分子免疫学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第５版）、編集者：Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００３；Ｊａｎｅｗａｙら、免疫学：健常及び疾患における免疫系（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、第４版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐ１４８、１４９、及び１７２、１９９９を参照されたい）。本開示で使用されるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、又は他の哺乳類を含む様々な動物種由来であり得る。
【００６６】
本明細書で使用する「ＴＣＲ複合体」は、ＣＤ３鎖と他のＴＣＲ鎖の結合によって形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、及びＴＣＲβ鎖で構成され得る。あるいは、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、及びＴＣＲδ鎖で構成され得る。
【００６７】
本明細書で使用する「ＴＣＲ複合体の構成成分」は、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ又はＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３ζ）、又は２以上のＴＣＲ鎖又はＣＤ３鎖によって形成される複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εの複合体、又はＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び２つのＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体）を指す。
【００６８】
本明細書で使用する「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞及びマクロファージなどの単球細胞）が、標的細胞上の結合抗体（又はＦｃγＲに結合できる他のタンパク質）を認識し、その後、標的細胞を溶解する細胞介在性プロセスを指す。原理上は、活性化ＦｃγＲを有する任意のエフェクター細胞が誘発されて、ＡＤＣＣを媒介し得る。ＡＤＣＣを媒介する主要細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するＮＫ細胞であるが、それらの活性化、局在、又は分化の状態に依存して、単球がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血細胞上のＦｃγＲ発現の概説については、Ｒａｖｅｔｃｈら、１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２を参照されたい。
【００６９】
ポリペプチド又はタンパク質を参照して、本明細書で使用する「ＡＤＣＣ活性を有する」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域並びにＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）などに由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常領域を含むもの）が、Ｆｃ受容体を発現する細胞溶解免疫エフェクター細胞上の細胞溶解Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）の結合を介して、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介できることを意味する。
【００７０】
本明細書で使用する「補体依存性細胞傷害」及び「ＣＤＣ」は、標的抗原に結合した抗体又は他のＣ１ｑ補体結合タンパク質と共に、正常血清中の構成成分（「補体」）が、標的抗原を発現する標的細胞の溶解を示すプロセスを指す。補体は、それらの作用を発揮するように協力して、順に作用する血清タンパク質の群からなる。
【００７１】
本明細書で使用する「古典的補体経路」及び「古典的補体システム」という用語は、同義であり、補体の活性化のための特定の経路を指す。古典的経路は、開始に抗原−抗体複合体を必要とし、順番にＣ１〜Ｃ９と命名された９つの主要タンパク質構成成分の活性化を伴う。活性化プロセス中のいくつかの工程については、生成物は、その後の工程を触媒する酵素である。このカスケードは、比較的小さい開始シグナルによって大量の補体の増幅及び活性化を提供する。
【００７２】
ポリペプチド又はタンパク質を参照して、本明細書で使用する「ＣＤＣ活性を有する」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）などに由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリンヒンジ領域並びに免疫グロブリン定常領域を含むもの）が、Ｃ１ｑ補体タンパク質の結合及び古典的補体経路の活性化を介して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することができることを意味する。本発明の一実施形態において、組み換えポリペプチドは、ＣＤＣ活性を軽減するように改変されている。
【００７３】
本明細書で使用する「リダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害」及び「ＲＴＣＣ」は、細胞傷害性Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞及び標的細胞の両方に特異的に結合できる多特異性タンパク質を用いて標的細胞にリクルートされ、それによって、標的依存性細胞傷害性Ｔ細胞応答が標的細胞に対して誘発されるＴ細胞媒介性プロセスを指す。本明細書に開示される抗ＣＤ１２３結合ドメイン及び抗ＣＤ３結合ドメインを含むポリペプチド並びにタンパク質は、ＲＴＣＣが可能である。
【００７４】
本明細書で使用する「治療」、「治療すること」、又は「寛解すること」という用語は、治療的処置又は予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置のいずれかを指す。処置が、処置を受ける個人の少なくとも１つの疾患症状が改善するか、又は処置が、個人における進行性疾患の悪化を遅らせるか、又はさらなる関連疾患の発症を予防することができる場合に治療的である。
【００７５】
本明細書で使用する、特異的結合分子又は化合物の「治療有効量（若しくは治療有効用量）」又は「有効量（若しくは有効用量）」という用語は、統計的に有意な方法で治療される疾患の１以上の症状を寛解させるか、又は臓器機能を時計的に有意に改善させるのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分について言及する場合、治療有効用量はその成分単独を指す。組み合わせについて言及する場合、治療有効用量は、連続して又は同時に（同じ製剤中で、又は別々の製剤で同時に）投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量を指す。
【００７６】
本明細書で使用する「形質転換」、「形質移入」、及び「形質導入」という用語は、細胞への核酸（すなわち、ヌクレオチドポリマー）の導入を指す。本明細書で使用する「遺伝子形質転換」という用語は、ＤＮＡ、特に、組み換えＤＮＡの細胞への導入及び組み込みを指す。導入される核酸は、発現ベクターを介して細胞に導入され得る。
【００７７】
本明細書で使用する「変異体」又は「変異体（複数）」という用語は、参照核酸又は参照ポリペプチドとは異なるが、その基本的な特性を保持している核酸又はポリペプチドを指す。一般に、変異体は、全体的によく似ており、多くの領域で、参照核酸又は参照ポリペプチドと同一である。例えば、変異体は、参照核酸又は参照ポリペプチドの活性部分又は全長と比較して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を示し得る。
【００７８】
「軽鎖可変領域」（「軽鎖可変ドメイン」又は「ＶＬ」又はＶＬとも呼ばれる）及び「重鎖可変領域」（「重鎖可変ドメイン」又は「ＶＨ」又はＶＨとも呼ばれる）という用語は、それぞれ抗体の軽鎖及び重鎖由来の可変結合領域を指す。可変結合領域は、一般に、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順で含まれる「相補性決定領域」（ＣＤＲ）及び「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる別々のよく定義されたサブ領域で構成されている。一実施形態において、ＦＲはヒト化される。「ＣＬ」という用語は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」又は「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。「ＣＨ」という用語は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」又は「重鎖定常領域」を指し、これは、抗体アイソタイプに依存して、さらにＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）に分けられる。「Ｆａｂ」（抗原結合断片）は、抗原に結合する抗体の一部であり、鎖間ジスルフィド結合により軽鎖と結合した重鎖の可変領域及びＣＨ１ドメインを含む。
【００７９】
本開示は、ＣＤ１２３（例えば、ヒトＣＤ１２３）に特異的に結合する結合ドメイン、並びにこれらの結合ドメインを含むポリペプチド及びタンパク質について説明する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合タンパク質及びポリペプチドは、ＣＤ１２３又は異なる標的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。この開示の結合ドメインを含むポリペプチド及びタンパク質は、さらに、免疫グロブリン定常領域、リンカーペプチド、ヒンジ領域、免疫グロブリン二量体化／ヘテロ二量体化ドメイン、接合アミノ酸、タグなどを含むことができる。開示されるポリペプチド及びタンパク質のこれらの構成成分については、以下でさらに詳細に説明する。
【００８０】
さらに、本明細書に開示されるＣＤ１２３結合ポリペプチド及びタンパク質は、様々な異なる形式のいずれかの抗体又は融合タンパク質の形態で存在し得る（例えば、融合タンパク質は、ＣＤ１２３結合二重特異性分子又は多特異性分子の形態で存在し得る）。二重特異性分子の非限定的な例としては、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子が挙げられる。いくつかの二重特異性分子は、第２の結合ドメインｓｃＦｖと連結した抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖを含むか、又はそれらからなり、免疫グロブリン定常領域などの他の配列を含まない。他の実施形態において、ＣＤ１２３結合タンパク質はダイアボディである。
【００８１】
本開示によるＣＤ１２３結合タンパク質は、一般に、（ａ）本明細書に記載のＣＤ１２３結合ドメインを含む少なくとも１つのＣＤ１２３結合ポリペプチド鎖を含む。いくつかのバリエーションにおいて、該ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、さらに、（ｂ）該ＣＤ１２３結合ドメインのカルボキシル末端にヒンジ領域、及び（ｃ）免疫グロブリン定常領域を含む。さらなるバリエーションにおいて、該ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、さらに、（ｄ）免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端にカルボキシル末端リンカー、及び（ｅ）カルボキシル末端リンカーのカルボキシル末端に第２の結合ドメインを含む。
【００８２】
さらに他のバリエーションにおいて、該ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、（ｂ）該ＣＤ１２３結合ドメインのアミノ末端にヒンジ領域、及び（ｃ）ヒンジ領域のアミノ末端に免疫グロブリンサブ領域を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、組み換えポリペプチドは、典型的には、免疫グロブリン定常領域及び／又はヒンジ領域による（例えば、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びにＩｇＧヒンジ領域を含む免疫グロブリン定常領域による）ジスルフィド結合を介してホモ二量体化できる。したがって、本開示のある実施形態において、２つの同一の一本鎖ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、ホモ二量体化し、二量体ＣＤ１２３結合タンパク質を形成する。本発明のホモ二量体の例を図１１に提供する。
【００８４】
他の実施形態において、ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、第２の非同一ポリペプチド鎖内の異なるヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化できるヘテロ二量体化ドメインを含む。いくつかのバリエーションにおいて、ヘテロ二量体化用の第２のポリペプチド鎖は、第２の結合ドメインを含む。したがって、本開示のある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインを含む一方の鎖と、任意選択で第２の結合ドメインを含む第２の鎖の２つの非同一ポリペプチド鎖は、二量体化し、ヘテロ二量体ＣＤ１２３結合タンパク質を形成する。ヘテロ二量体の種類の例としては、米国特許出願公開第２０１３／００９５０９７号及び同第２０１３／０１２９７２３号に記載のものが挙げられる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン、タンパク質又はポリペプチドは、薬物又は毒性部分とコンジュゲートされる。
【００８６】
本開示の薬物療法で使用されるＣＤ１２３結合ポリペプチド、タンパク質、及びそれらの様々な構成成分については、さらに以下で説明する。
【００８７】
上で示したとおり、本開示は、ＣＤ１２３に特異的に結合する結合ドメインに関する。いくつかのバリエーションにおいて、該ＣＤ１２３結合ドメインは、ＣＤ１２３への結合について、それぞれ配列番号１９４及び配列番号１９６に示すアミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨ領域を有する抗体（例えば、１２Ｆ１）と競合することができる。マウス抗ＣＤ１２３抗体の１２Ｆ１は、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０４１７３９号及びＫｕｏら、（２０１２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔ，ｐ１−９に記載されている。
【００８８】
ＣＤ１２３結合ドメインは、表３に示す配列を含むことができ、いくつかの関連する配列番号を表６にまとめる。ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１４と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１６と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合に、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。例えば、本発明は、（ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列又は１若しくは２個のアミノ酸置換によって配列番号６と異なる配列を有するＬＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列又は１若しくは２個のアミノ酸置換によって配列番号８と異なる配列を有するＬＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は１若しくは２個のアミノ酸置換によって配列番号１０と異なる配列を有するＬＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は１若しくは２個のアミノ酸置換によって配列番号１２と異なる配列を有するＨＣＤＲ１、（ｖ）配列番号１４に���載のアミノ酸配列又は１若しくは２個のアミノ酸置換によって配列番号１４と異なる配列を有するＨＣＤＲ２、かつ（ｖｉ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は１若しくは２個のアミノ酸置換によって配列番号１６と異なる配列を有するＨＣＤＲ３、を含む組み換えポリペプチドを含む。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。
【００８９】
関連実施形態において、本発明の組み換えポリペプチドは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号２）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号４）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。一実施形態において、組み換えポリペプチドのＣＤ１２３結合ドメインは、ＶＨＶＬ方向で配列番号４を含む可変重鎖及び配列番号２を含む可変軽鎖を含むｓｃＦｖである。別の実施形態において、組み換えポリペプチドのＣＤ１２３結合ドメインは、ＶＬＶＨ方向で配列番号２を含む可変軽鎖及び配列番号４を含む可変重鎖を含むｓｃＦｖである。例えば、ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１３０又は配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。本発明は、配列番号１３０又は配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である組み換えポリペプチドを含む。
【００９０】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２８と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３０と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３２と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【００９１】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号２０）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【００９２】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３６と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号３８と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４０と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【００９３】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号３４）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【００９４】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４４と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４６と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号４８と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【００９５】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号４２）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【００９６】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１００に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１００と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０２と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１０４と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【００９７】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号９８）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【００９８】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１６と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１１８と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２０と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【００９９】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１１４）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１００】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２２と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２４と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号２６と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２４と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号１２６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２６と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号１２８と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【０１０１】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号１２２）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１０２】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５４と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５６と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号５８と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６０と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６２と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号６４と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【０１０３】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号５０）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号５２）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１０４】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号７０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７０と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号７２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７２と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号７４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７４と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号７６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７６と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号７８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号７８と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号８０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８０と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【０１０５】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号６６）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号６８）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１０６】
ある実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかのそのような実施形態において、（ｉ）ＬＣＤＲ１は、配列番号８６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８６と異なる配列を有し、（ｉｉ）ＬＣＤＲ２は、配列番号８８に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号８８と異なる配列を有し、（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ３は、配列番号９０に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９０と異なる配列を有し、（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号９２に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９２と異なる配列を有し、（ｖ）ＨＣＤＲ２は、配列番号９４に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９４と異なる配列を有し、かつ（ｖｉ）ＨＣＤＲ３は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列又は少なくとも１つのアミノ酸置換によって配列番号９６と異なる配列を有する。上記のアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、列挙される配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が異なる。ある実施形態において、本開示のＣＤＲは、既知のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列と比較した場合、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換若しくは非保存的アミノ酸置換）、又は前述の変化の組み合わせを含有する。
【０１０７】
関連する実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号８２）又は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号８４）、又はその両方と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１０８】
ある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ヒト化免疫グロブリンＶＬ及び／又はＶＨ領域を含む。免疫グロブリンＶＬ及びＶＨ領域をヒト化する技術は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１５３８３７号で考察されている。ある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ヒト免疫グロブリンＶＬ及び／又はＶＨ領域を含む。
【０１０９】
「ヒト化」は、元の分子の抗原結合特性を完全に保持しながら、免疫原性が低い抗体をもたらすことが期待されている。元の抗体の抗原結合特性の全てを保持するために、その抗原結合部位の構造は、「ヒト化」バージョンに再生されるべきである。これは、決定的なフレームワーク残基の保持の有無にかかわらず、ヒト可変フレームワークドメイン及び定常領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３９（１９８８））、又は（リガンド結合特性を保存するために）非ヒト可変ドメイン全体を組み合わせるが、（抗原性を低減するために）暴露される残基の賢明な置換によりヒト様表面でそれらをクローキングすることによって（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１））達成することができる。
【０１１０】
基本的に、ＣＤＲ移植によるヒト化には、ヒト可変領域フレームワーク及びヒト定常領域上で非ヒト抗体のＣＤＲのみを組み替えることを伴う。理論的には、これは、免疫原性を実質的に低減又は除去するはずである（アロタイプ又はイディオタイプの違いが存在する場合を除いて）。しかしながら、元の抗体のいくつかのフレームワーク残基も保存される必要があり得ると報告された（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１０，０２９（１９８９））。
【０１１１】
保存される必要のあるフレームワーク残基は、コンピューターモデリングにより特定されやすい。もう１つの方法として、重要なフレームワーク残基は、既知の抗原結合部位の構造と比較することによって潜在的に特定することができる（参照により本明細書に組み込まれる（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１（３）：１６９−２１７（１９９４））。
【０１１２】
潜在的に抗原結合に影響を与える残基は、いくつかのグループに分類される。第１のグループは、抗原部位表面と近接している残基を含み、したがって、抗原と直接接触することができた。これらの残基は、アミノ末端残基及びＣＤＲと隣接している残基を含む。第２のグループは、抗体のＣＤＲ又は別のペプチド鎖のいずれかと接触することによって、ＣＤＲの構造又は相対的整列を変更することができた残基を含む。第３のグループは、可変ドメインの構造的完全性に影響を与えることができた埋め込み側鎖を有するアミノ酸を含む。これらのグループの残基は、通常同じ位置に見られる（Ｐａｄｌａｎ，１９９４，上記）が、特定されるそれらの位置は、番号付けシステムに依存して異なり得る（Ｋａｂａｔら，「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ），第５版，公開番号９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ＆  ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照されたい）。
【０１１３】
当技術分野におけるヒト化抗体についての知見は、これらのポリペプチドが抗体でなくとも、本開示によるポリペプチドに適用可能である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ１２３結合ドメインに関し、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｉｉｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｉｖ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｖ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｖｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号６６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号６８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｖｉｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号８２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｖｉｉｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｉｘ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号９８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；（ｘ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１０６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか；又は（ｘｉ）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
さらなる実施形態において、各ＣＤＲは、興味の標的（例えば、ＣＤ１２３）に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体のものと比較して、１、２、若しくは３個以下の置換、挿入又は欠失を含む。
【０１１６】
ある実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＣＤ１２３以外の標的に結合する１以上の追加の結合ドメイン（例えば、第２の結合ドメイン）を含むことができる。これらの他の結合ドメインは、例えば、特定のサイトカイン又は該結合ドメインポリペプチドを特定の細胞型、毒素、追加の細胞受容体、抗体などへ標的化する分子を含むことができる。
【０１１７】
ある実施形態において、ＣＤ１２３結合分子又はタンパク質は、ＣＤ１２３を発現する標的細胞へのＴ細胞の動員用のＴ細胞結合ドメインを含むことができる。ある実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１２３結合タンパク質は、（ｉ）ＴＣＲ複合体又はその構成成分（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε）に特異的に結合する結合ドメイン並びに（ｉｉ）ＣＤ１２３に特異的に結合する別の結合ドメインを含むことができる。ＣＤ１２３結合タンパク質は、基本的に、Ｔ細胞に結合する任意の結合ドメイン、例えば、抗体由来の結合ドメインを利用することができる。ＣＤ３結合ドメインが由来し得る例示的な抗ＣＤ３抗体は、ＣＲＩＳ−７モノクローナル抗体を含む（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．ら（編），白血球タイピングＩＩ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ）．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６）；それぞれ配列番号２０９（ＱＶＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＦＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＳＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＴＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＲＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＱＩＴＲ）及び配列番号２１０（ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＳＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＳＡＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＰＱＶＨＹＤＹＮＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）に示すＶＬ及びＶＨアミノ酸配列）；ＨｕＭ２９１（Ｃｈａｕら、（２００１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７１：９４１−９５０；それぞれ配列番号２１１（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）及び配列番号２１２（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＩＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＲＳＧＹＴＨＹＮＱＫＬＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に示すＶＬ及びＶＨアミノ酸配列））；ＢＣ３モノクローナル抗体（Ａｎａｓｅｔｔｉら、（１９９０）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１６９１）；ＯＫＴ３モノクローナル抗体（オルト多施設移植研究グループ（Ｏｒｔｈｏ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ）（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：３３７）及びＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ（ＯＫＴ３  ＡＡ−ＦＬ又はＯＫＴ３  ＦＬとも呼ばれる）などのその誘導体、２３４位及び２３５位にアラニン置換を有するヒト化Ｆｃ変異体（Ｈｅｒｏｌｄら、（２００３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１：４０９）；ビジリズマブ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、（２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９：２７１２），Ｇ１９−４モノクローナル抗体（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３９４５），１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体（Ｈｉｒｓｃｈら、（１９８８）  ���．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３７６６）及びＩ２Ｃモノクローナル抗体（例えば、米国特許公開第２０１１／０２９３６１９号及び同第２０１２０２４４１６２号を参照されたい）。例えば、ＣＤ３結合ドメインは、米国特許公開第２０１２／０２４４１６２号の配列番号１７、２１、３５、３９、５３、５７、７１、７５、８９、８３、１０７、１１１、１２５、１２９、１４３、１４７、１６１、１６５、１７９及び１８３から選択されるＶＬ領域並びに／又は米国特許公開第２０１２／０２４４１６２の配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７及び１８１から選択されるＶＨ領域を含むＣＤ３結合ドメインを含む、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１６２号に開示されているＣＤ３結合ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、米国特許公開第２０１２／０２４４１６２の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、及び１８７から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＷＯ２００４／１０６３８０、ＷＯ２００５／０４０２２０Ａ１、米国特許公開第２０１４／００９９３１８号に記載のもの又はそのＣＤ３結合ドメイン由来のものである。例示的な抗ＴＣＲ抗体は、ＢＭＡ０３１モノクローナル抗体である（Ｂｏｒｓｔら、（１９９０）  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：１７５−１８８）。ＣＤ３結合ドメインは、ＷＯ  ２０１３／１５８８５６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の抗体又は配列のいずれかに由来し得る。あるバリエーションにおいて、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドの第２の結合ドメインは、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、（ａ）該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１６２、１６３及び１６４に記載のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１６５、１６６及び１６７に記載のアミノ酸配列を有するか、又は（ｂ）該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１６８、配列番号１６９、及び配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１７１、配列番号１７２、及び配列番号１７３に記載のアミノ酸配列を有する。他の態様において、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドの第２の結合ドメインは、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、（ａ）該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１７１、１７２及び１７３に記載のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１��４、１７５及び１７６に記載のアミノ酸配列を有するか、又は（ｂ）該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１７６、１７７及び１７８に記載のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１７９、１８０及び１８１に記載のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドの第２の結合ドメインは、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、（ａ）該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１８２、１８３及び１８４に記載のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１８５、１８６及び１８７に記載のアミノ酸配列を有するか、又は（ｂ）該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１８８、１８９及び１９０に記載のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９１、１９２及び１９３に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、この項に列挙されたＣＤＲ配列を含む第２の結合ドメインはヒト化される。
【０１１８】
ＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合ドメインを含むＣＤ１２３結合タンパク質のいくつかの実施形態において、該第２の結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７、ＨｕＭ２９１又はＩ２Ｃモノクローナル抗体とＣＤ３εへの結合について競合する。あるバリエーションにおいて、該ＣＤ３結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７、ＨｕＭ２９１又はＩ２Ｃモノクローナル抗体由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（例えば、第２の結合ドメインのＶＬ及びＶＨは、それぞれモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲを含むヒト化可変領域であり得る）。第２の結合ドメインは、ＤＲＡ２２２、ＴＳＣ４５５、又はＴＳＣ４５６  ＣＤ３結合ドメインの軽鎖可変領域、重鎖可変領域、又はその両方を含み得る。ＤＲＡ２２２、ＴＳＣ４５５、又はＴＳＣ４５６のアミノ酸配列を表３に提供する。ＤＲＡ２２２結合ドメインはまた、ＷＯ  ２０１３／１５８８５６に記載されている。ＴＳＣ４５５はまた、ＴＳＣ３９４  Ｆ８７Ｙとも呼ばれ得る。ＴＳＣ４５５はまた、ＴＳＣ３９４  Ｅ８６Ｄ  Ｆ８７Ｙ又はＴＳＣ３９４  ＤＹとも呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、第２の結合ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合し、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列、又は配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一若しくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、該免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも約８２％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインをさらに含むＣＤ１２３結合ポリペプチド又はタンパク質は、該ポリペプチド又はタンパク質の組み換え発現中に生成される低レベルの高分子量凝集体を有し得る。ＣＤ３結合ドメインをさらに含むＣＤ１２３結合ポリペプチド又はタンパク質は、該ポリペプチド又はタンパク質に存在するＣＤ３結合ドメインに依存して、ヒト血清中に比較的長期の安定性を示し得る。
【０１１９】
あるバリエーションにおいて、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ポリペプチドの第２の結合ドメインは、ＣＤ３結合ドメインであり、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３／０１２９７３０号、同第２０１１／０２９３６１９号、米国特許第７，６３５，４７２号、ＷＯ  ２０１０／０３７８３６、ＷＯ  ２００４／１０６３８１、又はＷＯ  ２０１１／１２１１１０に開示されるＣＤ３結合配列（例えば、ＣＤＲ又は可変領域）の１以上を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、以下の配列のうちの１以上を含む：
【表１】
2019531764.tif 000003
【０１２０】
様々な実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、以下の配列のうちの１以上を含む：
【表２】
2019531764.tif 000004
【０１２１】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＣＤ１２３結合ポリペプチドは、ＣＤ１２３結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメインを含む二重特異性単鎖分子である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメイン及び／又はＣＤ３結合ドメインは、抗体由来であり、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含む。例えば、ｓｃＦｖはＶＨ及びＶＬを含む。これらの結合ドメイン及び可変鎖は、標的（複数可）へのある程度の結合を依然として保持する順番で配置され得る。例えば、可変ドメインは、ＶＨ  ＣＤ１２３−ＶＬ  ＣＤ１２３−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３；ＶＬ  ＣＤ１２３−ＶＨ  ＣＤ１２３−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３；ＶＨ  ＣＤ１２３−ＶＬ  ＣＤ１２３−ＶＬ  ＣＤ３−ＶＨ  ＣＤ３；ＶＬ  ＣＤ１２３−ＶＨ  ＣＤ１２３−ＶＬ  ＣＤ３−ＶＨ  ＣＤ３；ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３−ＶＨ  ＣＤ１２３−ＶＬ  ＣＤ１２３；ＶＬ  ＣＤ３−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ１２３−ＶＨ  ＣＤ１２３；ＶＨ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ３−ＶＬ  ＣＤ１２３−ＶＨ  ＣＤ１２３；又はＶＬ  ＣＤ３−ＶＨ  ＣＤ３−ＶＨ  ＣＤ１２３−ＶＬ  ＣＤ１２３などの順番で配置され得る。ＣＤ３に結合している結合ドメイン中のＶＨ領域とＶＬ領域の対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式で存在し得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの順で配置され得る。いくつかの実施形態において、該ｓｃＦｖは、同じ方向で同じＶＨ及びＶＬ領域配列を含む抗体よりもより効率的にＣＤ１２３に結合し得る。ある実施形態において、該ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ方向よりもＶＬ−ＶＨ方向でより効率的にＣＤ１２３に結合し得るか、又は逆もまた同様であり得る（例えば、実施例２を参照されたい）。ＶＨ領域は、リンカー配列のＮ末端に配置され得る。ＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端に配置され得る。二重特異性単鎖分子のＣＤ３結合ドメインにおけるドメイン配置はＶＨ−ＶＬであり得、該ＣＤ３結合ドメインは該ＣＤ１２３結合ドメインのＣ末端に位置する。二重特異性分子は、ＣＤ３に結合しているｓｃＦｖに連結されたＣＤ１２３に結合しているｓｃＦｖを含み得る。これらのｓｃＦｖは、短いペプチドと連結され得る。いくつかの実施形態において、二重特異性単鎖分子は、ヒンジ領域又は定常領域を含まない（例えば、各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３／０２９５１２１号、ＷＯ  ２０１０／０３７８３６、ＷＯ  ２００４／１０６３８１及びＷＯ  ２０１１／１２１１１０を参照されたい）。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、結合ドメインは、興味の標的に特異的なＶＨ及びＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、ヒトであるか、又はヒト化される。
【０１２３】
いくつかのバリエーションにおいて、結合ドメインは、ペプチドリンカーによって結合された免疫グロブリンＶＬ及びＶＨ領域を含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ＶＬ及びＶＨ領域を結合させるペプチドリンカーの使用は、当技術分野で周知であり、多くの出版物がこの特定の分野に存在する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸配列の３つのリピートからなる１５マーである（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号２１３）。他のリンカーが使用され、ファージディスプレイ技術、並びに選択的感染性ファージ技術が、適切なリンカー配列を多様化し、選択するために使用されてきた（Ｔａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５６８２−１５６８６，１９９６；Ｈｅｎｎｅｃｋｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１，４０５−４１０，１９９８）。ある実施形態において、ＶＬ及びＶＨ領域は、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５（配列番号２１４））を含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって結合される。他の適切なリンカーは、ランダム変異誘発により単一リンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）（配列番号３１５）を最適化することによって取得することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で（又はカルボキシル末端からアミノ末端の順で）、（ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー（又はアミノ末端リンカー）、及び（ｖ）第２の結合ドメインを含む。第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含むポリペプチド構築物の文脈中で、本明細書で使用される「ヒンジ領域」又は「ヒンジ」は、第１の結合ドメインとＦｃ領域の間のポリペプチド領域を指す。「カルボキシル末端リンカー」又は「アミノ末端リンカー」は、Ｆｃ領域と第２の結合ドメインの間のポリペプチド領域を指す。いくつかの実施形態において、カルボキシル末端リンカー（又はアミノ末端リンカー）は、配列番号２４８を含むか、又はそれからなる。ある実施形態において、ヒンジは、野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域である。ある他の実施形態において、１以上のアミノ酸残基を、融合タンパク質構築物設計の一部として、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に付加することができる。例えば、ヒンジアミノ末端の追加の接合アミノ酸残基が「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、「ＴＧ」、又は「Ｔ」であり得るか、又はヒンジカルボキシル末端の追加の接合アミノ酸残基が「ＳＧ」であり得るか、又はヒンジ欠失は、カルボキシル末端に付加される「ＳＧ」を有するΔＰなどの付加と組み合わせることができる。
【０１２５】
ある実施形態において、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、又はアミノ末端リンカーは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域中の１以上のシステイン残基が１以上の他のアミノ酸残基（例えば、セリン又はアラニン）と置換されている改変免疫グロブリンヒンジである。
【０１２６】
例示的な改変免疫グロブリンヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカーには、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ中に見られ、１、２又は３個の異なるアミノ酸残基（例えば、セリン又はアラニン）と置換されている１、２又は３個のシステイン残基を有する免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域が含まれる。改変免疫グロブリンヒンジは、さらに、別のアミノ酸（例えば、セリン又はアラニン）と置換されるプロリンを有することができる。例えば、上記の改変ヒトＩｇＧ１ヒンジは、さらに、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）と置換された野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３個のシステインのカルボキシル末端にプロリンを位置づけることができる。一実施形態において、コアヒンジ領域のプロリンは置換されない。
【０１２７】
ある実施形態において、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、又はアミノ末端リンカーポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、又は野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジなどの野生型免疫グロブリンヒンジ領域と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１２８】
さらなる実施形態において、ＣＤ１２３結合ポリペプチド内に存在するヒンジ、カルボキシル末端リンカー、又はアミノ末端リンカーは、免疫グロブリンヒンジに基づかないか、又は由来しない（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジ又は改変免疫グロブリンヒンジではない）ヒンジであり得る。そのようなヒンジ及びカルボキシル末端リンカーの例としては、膜貫通タンパク質のドメイン間領域又はＩＩ型Ｃレクチンのスターク領域由来の約５〜約１５０個のアミノ酸のペプチド、例えば、約８〜２５個のアミノ酸のペプチド及び約７〜１８個のアミノ酸のペプチドが挙げられる。別の実施形態において、カルボキシル末端リンカー又はアミノ末端リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＰＳ（配列番号３１６）などの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リピート（配列番号３１５）を含む。
【０１２９】
ある実施形態において、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカー配列は、約５〜１５０個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、１０〜２０個のアミノ酸、２０〜３０個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、４０〜５０個のアミノ酸、５０〜６０個のアミノ酸、５〜６０個のアミノ酸、５〜４０個のアミノ酸、８〜２０個のアミノ酸、又は１０〜１５個のアミノ酸を有する。ヒンジ又はリンカーは、主に可動性であり得るが、また、より強固な特徴を提供することができるか、又は主に最小のβシート構造を有するαヘリックス構造を含有することができる。ヒンジ及びリンカーの長さ又は配列は、ヒンジが直接的又は間接的に（ヘテロ二量体化ドメインなどの別の領域又はドメインによって）連結されている結合ドメインの結合親和性、並びにヒンジ又はリンカーが直接的又は間接的に連結されているＦｃ領域部分の１以上の活性に影響を与え得る。
【０１３０】
ある実施形態において、ヒンジ、カルボキシル末端リンカー、又はアミノ末端リンカー配列は、血漿及び血清中で安定しており、タンパク質切断に抵抗性がある。ＩｇＧ１上部ヒンジ領域中の第１のリジンは、タンパク質切断を最小限にするために変異させることができ、例えば、リジンは、メチオニン、スレオニン、アラニン又はグリシンと置換することができるか、又は除去される。
【０１３１】
本開示のいくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、第２のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成することができ、（ａ）免疫グロブリン定常領域のすぐアミノ末端（例えば、免疫グロブリン定常領域がＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＣＨ２ドメインのアミノ末端、又は免疫グロブリンサブ領域がＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含むＣＨ３ドメインのアミノ末端）にあるヒンジ領域、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの間に挿入され、連結されるヒンジ領域、（ｃ）免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと免疫グロブリン定常領域（例えば、免疫グロブリン定常領域がＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含む）の間に挿入され、連結されるヒンジ領域、（ｄ）免疫グロブリン定常領域と結合ドメインの間に挿入され、連結されるヒンジ領域、（ｅ）ポリペプチド鎖のアミノ末端にあるヒンジ領域、又は（ｆ）ポリペプチド鎖のカルボキシル末端にあるヒンジ領域を含む。本明細書に記載のヒンジ領域を含むポリペプチド鎖は、異なるポリペプチド鎖と結合して、本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質を形成することができ、形成されたヘテロ二量体は、その標的特異性又はその特異的標的結合親和性を保持する結合ドメインを含有する。
【０１３２】
本開示による使用に適するいくつかの例示的なヒンジ、カルボキシル末端リンカー、及びアミノ末端リンカーの配列を、以下の表１及び表２に示す。追加の例示的なヒンジ及びリンカー領域は、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号２４１〜２４４、６０１、７８、７６３〜７９１、２２８、３７９〜４３４、６１８〜７４９に記載されている（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【表３】
2019531764.tif 000005
2019531764.tif 000006
2019531764.tif 000007
【表４】
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【０１３３】
本明細書に示すように、ある実施形態において、本開示のポリペプチドは、ポリペプチド鎖中に免疫グロブリン定常領域（定常領域とも呼ばれる）を含む。免疫グロブリン定常領域の包含は、対象への投与後、２つのＣＤ１２３結合ポリペプチド鎖から形成されるホモ二量体及びヘテロ二量体タンパク質の循環からのクリアランスを遅くする。変異又は他の改変によって、免疫グロブリン定常領域は、さらに、二量体ポリペプチドエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体固定、及びＦｃ受容体への結合）の比較的容易な調節を可能にし、当技術分野で知られており、本明細書に記載の治療されている疾患に依存して増減し得る。ある実施形態において、本開示のポリペプチドホモ二量体及びヘテロ二量体のポリペプチド鎖の一方又は両方の免疫グロブリン定常領域は、これらのエフェクター機能の１以上を媒介することができる。他の実施形態において、これらのエフェクター機能の１以上は、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、本開示のポリペプチドホモ二量体及びヘテロ二量体のポリペプチド鎖の一方又は両方の免疫グロブリン定常領域において低下しているか、又は存在しない。例えば、ＣＤ３結合ドメインの包含などによりＲＴＣＣを誘発するように設計された二量体ＣＤ１２３結合ポリペプチドについて、免疫グロブリン定常領域は、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、エフェクター機能が低下され得るか、又はエフェクター機能がない。
【０１３４】
本開示のポリペプチドに存在する免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせの一部若しくは全てを含むことができるか、又はそれらに由来する。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの両方、ＣＨ３とＣＨ４ドメインの両方、２つのＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、２つのＣＨ４ドメイン、及びＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの一部を含むことができる。
【０１３５】
本開示のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成することができるＣＨ２ドメインは、野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメイン又はいくつかの免疫グロブリンクラス若しくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、又はＩｇＤ）からの、並びに様々な種（ヒト、マウス、ラット、及び他の哺乳類を含む）からのその改変された免疫グロブリンＣＨ２ドメインであり得る。
【０１３６】
ある実施形態において、ＣＨ２ドメインは、それぞれ米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１５、１９９〜２０１及び１９５〜１９７（該配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、又はＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメインなどの野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメインである。ある実施形態において、ＣＨ２ドメインは、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１５（該配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１３７】
ある実施形態において、ＣＨ２ドメインは、位置２９７のアスパラギンにアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからアラニン）を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン）である。そのようなアミノ酸置換は、この部位でのグリコシル化を低減又は排除し、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合を抑制する。２９７位にアスパラギンからアラニンへの置換を有する改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの配列は、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２４（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３８】
ある実施形態において、ＣＨ２ドメインは、位置２３４〜２３８に少なくとも１つの置換又は欠失を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２３４、２３５、２３６、２３７又は２３８、位置２３４及び２３５、位置２３４及び２３６、位置２３４及び２３７、位置２３４及び２３８、位置２３４〜２３６、位置２３４、２３５及び２３７、位置２３４、２３６及び２３８、位置２３４、２３５、２３７、及び２３８、位置２３６〜２３８、又は位置２３４〜２３８における２、３、４、又は５個のアミノ酸の任意の他の組み合わせにおける置換を含むことができる。加えて又はあるいは、改変ＣＨ２領域は、位置２３４〜２３８、例えば、位置２３６又は位置２３７における１以上（例えば、２、３、４又は５個）のアミノ酸欠失を含むことができる一方で、他の位置が置換される。上記の変異（複数可）は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性又はＦｃ受容体結合能を低減又は排除する。ある実施形態において、位置２３４〜２３８の１以上におけるアミノ酸残基は、１以上のアラニン残基と置き換えられている。さらなる実施形態において、位置２３４〜２３８におけるアミノ酸残基の１つのみが欠失しているが、位置２３４〜２３８における残りのアミノ酸の１以上は、別のアミノ酸（例えば、アラニン又はセリン）と置換することができる。
【０１３９】
ある他の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、及び３３１において１以上のアミノ酸置換を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、又は３３１、位置３１８及び３２０、位置３１８及び３２２、位置３１８、３２０及び３２２、又は位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、及び３３１における２、３、４、５又は６個のアミノ酸の任意の他の組み合わせにおける置換を含むことができる。上記の変異（複数可）は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減又は排除する。
【０１４０】
ある他の実施形態において、位置２９７におけるアミノ酸置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、さらに、位置２３４〜２３８に１以上の（例えば、２、３、４、又は５個の）追加の置換を含むことができる。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２３４及び２９７、位置２３４、２３５、及び２９７、位置２３４、２３６及び２９７、位置２３４〜２３６及び２９７、位置２３４、２３５、２３７及び２９７、位置２３４、２３６、２３８及び２９７、位置２３４、２３５、２３７、２３８及び２９７、位置２３６〜２３８及び２９７、又は位置２９７に加えて位置２３４〜２３８における２、３、４、又は５個のアミノ酸の任意の組み合わせにおける置換を含むことができる。加えて又はあるいは、改変ＣＨ２領域は、位置２３４〜２３８、例えば、位置２３６又は位置２３７において１以上（例えば、２、３、４又は５個）のアミノ酸欠失を含むことができる。追加の変異（複数可）は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性又はＦｃ受容体結合能を低減又は排除する。ある実施形態において、位置２３４〜２３８の１以上におけるアミノ酸残基は、１以上のアラニン残基と置き換えられている。さらなる実施形態において、位置２３４〜２３８におけるアミノ酸残基の１つのみが欠失しているが、位置２３４〜２３８における残りのアミノ酸の１以上は、別のアミノ酸（例えば、アラニン又はセリン）と置換することができる。
【０１４１】
ある実施形態において、位置２３４〜２３８における１以上（例えば、２、３、４、又は５個）のアミノ酸置換に加えて、本開示の融合タンパク質の変異ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、補体結合に関与する１以上の位置（例えば、位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、又はＰ３３１）において１以上の（例えば、２、３、４、５、又は６個）の追加のアミノ酸置換（例えば、アラニンでの置換）を含有することができる。変異免疫グロブリンＣＨ２領域の例としては、位置２３４、２３５、２３７（存在する場合）、３１８、３２０及び３２２においてアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２領域が挙げられる。例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、及びＫ３２２におけるアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃ  ＣＨ２領域である。
【０１４２】
なおさらなる実施形態において、位置２９７におけるアミノ酸置換及び位置２３４〜２３８における追加の欠失（複数可）又は置換（複数可）に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、さらに位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、及び３３１における１以上（例えば、２、３、４、５又は６個）の追加の置換を含むことができる。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）位置２９７における置換、（２）位置２３４〜２３８における１以上の置換又は欠失又はそれらの組み合わせ、及び位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、又はＰ３３１における１以上（例えば、２、３、４、５又は６個）のアミノ酸置換、例えば、位置Ｅ３１８、Ｋ３２０及びＫ３２２における１、２、３個の置換を含むことができる。上記の位置のアミノ酸は、アラニン又はセリンによって置換することができる。
【０１４３】
ある実施形態において、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、（ｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換及び位置２３４、２３５、２３６若しくは２３７における１個のアミノ酸置換；（ｉｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換及び位置２３４〜２３７のうちの２つにおけるアミノ酸置換；（ｉｉｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換及び位置２３４〜２３７のうちの３つにおけるアミノ酸置換；（ｉｖ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、位置２３４、２３５及び２３７におけるアミノ酸置換、並びに位置２３６におけるアミノ酸欠失；（ｖ）位置２３４〜２３７のうちの３つにおけるアミノ酸置換並びに位置３１８、３２０及び３２２におけるアミノ酸置換；又は（ｖｉ）位置２３４〜２３７のうちの３つにおけるアミノ酸置換、位置２３６におけるアミノ酸欠失、及び位置３１８、３２０及び３２２におけるアミノ酸置換を含む。
【０１４４】
位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換を有する例示的な改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＮ２９７におけるアラニン置換及びＧ２３６における欠失を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２５、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｖ２３４、Ｇ２３６、及びＮ２９７におけるアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２６、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＮ２９７におけるアラニン置換及びＧ２３６の欠失を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２２、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｆ２３４及びＮ２９７におけるアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４３、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｌ２３５及びＮ２９７におけるアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４４、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｇ２３６及びＮ２９７におけるアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４５、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）、並びにＧ２３７及びＮ２９７におけるアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４６、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）を含む。
【０１４５】
ある実施形態において、上記のアミノ酸置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、上述の位置以外の１以上の位置において１以上の追加のアミノ酸置換を含有することができる。このようなアミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であり得る。例えば、ある実施形態において、Ｐ２３３は、改変ＩｇＧ２  ＣＨ２領域においてＥ２３３に変えることができる（例えば、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２６、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）。加えて又はあるいは、ある実施形態において、改変ＣＨ２領域は、１以上のアミノ酸の挿入、欠失、又はその両方を含有することができる。挿入（複数可）、欠失（複数可）又は置換（複数可）は、免疫グロブリンＣＨ２領域のどこかに存在し得、例えば、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮ又はＣ末端において、ヒンジによるＣＨ２領域と別の領域（例えば、結合ドメイン又は免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）の連結から生じる。
【０１４６】
ある実施形態において、本開示のポリペプチド内の改変ＣＨ２領域は、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４、又はマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域などの野生型免疫グロブリンＣＨ２領域と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含むか、又はそのような配列である。
【０１４７】
本開示のＣＤ１２３結合ポリペプチド内の改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、様々な種（ヒト、マウス、ラット、及び他の哺乳類を含む）のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＤなどの様々な免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ２領域に由来し得る。ある実施形態において、本開示の融合タンパク質内の改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４、又はマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）に由来し得、その配列は、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１５、１９９、２０１、及び３２０に記載されている（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４８】
ある実施形態において、改変ＣＨ２ドメインは、位置２３５、３１８、３２０、及び３２２におけるアラニン置換、及び必要に応じて、（例えば、アラニンへの）Ｎ２９７変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（すなわち、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ及びＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号５９５、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）である。ある他の実施形態において、改変ＣＨ２ドメインは、位置２３４、２３５、２３７、３１８、３２０及び３２２におけるアラニン置換、及び必要に応じて、（例えば、アラニンへの）Ｎ２９７変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ及びＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号５９６、該配列は参照により本明細書に組み込まれる）である。
【０１４９】
ある実施形態において、改変ＣＨ２ドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣなどの免疫学的活性、補体結合、Ｆｃ受容体結合、又はその任意の組み合わせを高めることが当技術分野で知られている変異を有する改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１５０】
本開示のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成することができるＣＨ３ドメインは、様々な種（ヒト、マウス、ラット、及び他の哺乳類を含む）のある免疫グロブリンクラス又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）からの野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はその改変免疫グロブリンＣＨ３ドメインであり得る。ある実施形態において、ＣＨ３ドメインは、それぞれ米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１６、２０８〜２１０、２０４〜２０７、及び２１２（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメインなどの野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。ある実施形態において、ＣＨ３ドメインは、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１６（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである。ある実施形態において、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づくか、又は由来する改変ＣＨ３ドメインなどの改変ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。例えば、改変ＣＨ３ドメインは、位置Ｈ４３３及びＮ４３４（位置はＥＵ番号付けに従って番号付けされる）において１又は２個の変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。そのような位置における変異は、補体結合に関与し得る。ある他の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得るが、位置Ｆ４０５又はＹ４０７において１又は２個のアミノ酸置換を有する。そのような位置のアミノ酸は、別のＣＨ３ドメインとの相互作用に関与する。ある実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、その最後のリジンが欠失している改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。この改変ＣＨ３ドメインの配列は、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号７６１（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５１】
ある実施形態において、ポリペプチドヘテロ二量体を形成するＣＤ１２３結合ポリペプチドは、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」変異を含むＣＨ３対を含む（Ｍａｒｖｉｎ及びＺｈｕ，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２６：６４９−５８，２００５；Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：６１７−２１，１９９６を参照されたい）。より具体的には、変異を各ポリペプチド鎖の２つのＣＨ３ドメインのそれぞれに導入することができ、その結果、ＣＨ３／ＣＨ３結合に必要な立体相補性により、これらの２つのＣＨ３ドメインが互いに対を形成する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の１つの単鎖ポリペプチド内のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ変異（小さなアミノ酸を大きなアミノ酸で置換する「ノブ」変異）を含有することができ、ポリペプチドヘテロ二量体の他の単鎖ポリペプチド内のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ変異（大きなアミノ酸を小さなアミノ酸で置換する「ホール」変異）を含有することができる。他の例示的な「ノブ・イントゥ・ホール」変異は、（１）一方のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｙ変異及び他方のＣＨ３ドメイン内のＹ４０７Ｔ、並びに（２）一方のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｗ変異及び他方のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含む。
【０１５２】
本開示のＣＤ１２３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成することができるＣＨ４ドメインは、ＩｇＥ又はＩｇＭ分子からの野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメイン又はその改変免疫グロブリンＣＨ４ドメインであり得る。ある実施形態において、ＣＨ４ドメインは、それぞれ米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号２１３及び２１４（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のヒトＩｇＥ及びＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメインなどの野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。ある実施形態において、ＣＨ４ドメインは、ＩｇＥ又はＩｇＭ  Ｆｃ領域と結合することが知られている免疫学的活性を増減させる変異を有するヒトＩｇＥ又はＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づくか、又は由来する改変ＣＨ４ドメインなどの改変ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。
【０１５３】
ある実施形態において、本開示のＣＤ１２３結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４ドメインの組み合わせ（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４から選択される２以上の定常領域ドメイン）を含む。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はＣＨ３及びＣＨ４ドメインを含むことができる。ある他の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、２つのＣＨ３ドメインを含むことができ、ＣＨ２又はＣＨ４ドメインを含まない（すなわち、２以上のＣＨ３のみ）。免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、同じ免疫グロブリン分子、又は同じクラス若しくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくか、又は由来し得る。ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３、ＩｇＧ２  ＣＨ２ＣＨ３、及びＩｇＧ４  ＣＨ２ＣＨ３）であり、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。例えば、ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、（１）野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及び野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、又は（３）ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）及び最後のリジンが欠失している改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３を含む。
【０１５４】
あるいは、複数の定常領域ドメインは、異なる免疫グロブリン分子、又は異なるクラス若しくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくか、又は由来し得る。例えば、ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩｇＭ  ＣＨ３ドメインとヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの両方を含む。免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、１以上（例えば、約２〜１０個）のアミノ酸により共に直接連結することができるか、又は互いに連結することができる。
【０１５５】
例示的な免疫グロブリン定常領域は、米国特許公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３０５〜３０９、３２１、３２３、３４１、３４２、及び７６２（該配列は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５６】
ある実施形態において、ポリペプチド二量体のＣＤ１２３結合ポリペプチドの両方の免疫グロブリン定常領域は、互いに同一である。ある他の実施形態において、二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域は、二量体の他方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域と異なる。例えば、ヘテロ二量体タンパク質の一方の免疫グロブリン定常領域は、「ノブ」変異を有するＣＨ３ドメインを含有することができるが、ヘテロ二量体タンパク質の他方の免疫グロブリン定常領域は、「ホール」変異を有するＣＨ３ドメインを含有することができる。
【０１５７】
本開示は、表３に示す配列のいずれかを含むことができるＣＤ１２３結合タンパク質及びポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合タンパク質及びポリペプチドは、単一配列を含み得る。様々なクローン化配列及び構成成分の配列も表３に提示する。ポリペプチド構築物に与えられるアミノ酸配列は、ヒト又はウサギの免疫グロブリンリーダー配列を含まない。示されるＣＤＲ配列及びアミノ酸置換位置は、ＩＭＧＴ基準（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ，ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００８）  ３６，Ｗ５０３−５０８）を用いて定義されるものである。したがって、重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン又は領域のＦＲ１中の第１の残基は、位置１であるとみなされる。
【０１５８】
【表５】
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【０１５９】
ＣＤ１２３結合タンパク質は、上記のＣＤ１２３結合ドメインのいずれかを含み得る。いくつかの態様において、ＣＤ１２３結合タンパク質は、ヒト化ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列、又はその両方を含む。
【０１６０】
該ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号２及び配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１３０又は配列番号１３２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１３０又は配列番号１３２に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号１３０、又は配列番号１３２に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６１】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１３４、配列番号１３６、又は配列番号１３８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１３４、配列番号１３６、又は配列番号１３８に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号１３４、配列番号１３６、又は配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６２】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号３４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号３４、又は配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６３】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４２に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号４２、又は配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６４】
該ポリペプチドは、配列番号５０又は配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号５０及び配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号５０又は配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号５０、配列番号５２、又は配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６５】
該ポリペプチドは、配列番号６６又は配列番号６８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号６６及び配列番号６８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号６６又は配列番号６８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４６に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４６に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６６、配列番号６８、又は配列番号１４６に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６６】
該ポリペプチドは、配列番号８２又は配列番号８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号８２及び配列番号８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号８２又は配列番号８４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４８に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号８２、配列番号８４、又は配列番号１４８に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６７】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号９８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号９８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１５０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１４０に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号９８、又は配列番号１５０に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６８】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１０６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号１０６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１０６に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１０６、又は配列番号１５２に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１６９】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１１４、又は配列番号１５４に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１７０】
該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８及び配列番号１２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。該ポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号１２２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５６に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１５６に記載のアミノ酸配列のｓｃＦｖ部分と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１２２、又は配列番号１５６に記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【０１７１】
本明細書に開示されるポリペプチドは、他のＣＤ１２３結合ドメイン又はポリペプチドと比較して改良された特徴を有し得る。例えば、ＣＤ１２３結合ドメイン又はポリペプチドは、異なるＣＤ１２３結合ドメイン又はポリペプチドの等電点と比較して低下した等電点を示し得る。「等電点」又は「ｐＩ」は、正味の電荷がゼロであるｐＨである。タンパク質の等電点は、任意の適切な方法、例えば、分析用キャピラリー等電点電気泳動クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１７２】
本明細書に開示されるＣＤ１２３結合ドメイン又はタンパク質は、親抗体よりも高い親和性でＣＤ１２３（例えば、ヒトＣＤ１２３）と結合し得る。
【０１７３】
本発明の一実施形態において、該組み換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、（ｉ）ヒト又はヒト化ＣＤ１２３結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）カルボキシル末端リンカー、及び（ｖ）Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合するヒト又はヒト化第２の結合ドメインを含み、該ヒト又はヒト化ＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号２及び配列番号４と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｔ細胞、ＣＤ３、ＣＤ３ε又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体又はＴ細胞受容体複合体の構成成分に特異的に結合するヒト又はヒト化第２の結合ドメインは、配列番号３１１又は配列番号３１２と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
本発明の一実施形態において、該組み換えポリペプチドは、マウス抗体１２Ｆ１（配列番号１９５及び１９７）由来のＣＤ１２３結合ドメインを含有しない。例えば、一実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、１２Ｆ１の重鎖若しくは軽鎖可変ドメインと顕著に同一である重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含まない（例えば、１２Ｆ１の重鎖若しくは軽鎖可変ドメインと９５％以上同一ではない）か、又はマウス１２Ｆ１に含有されるような全６個のＣＤＲを含有しない。本発明の一実施形態において、該ＣＤ１２３結合ドメインは、ＣＤ１２３への結合についてマウス抗体１２Ｆ１（配列番号１９５及び１９７）と競合しない。本発明の一実施形態において、該組み換えポリペプチドはカニクイザルＣＤ１２３と交差反応するが、抗体１２Ｆ１（及びそのヒト化誘導体）はカニクイザルＣＤ１２３と交差反応しない。
【０１７５】
【表６】
2019531764.tif 000056
【０１７６】
一実施形態において、本発明のポリペプチド（二量体型を含む）は、ヒトＣＤ１２３及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＤ１２３に特異的に結合する。本発明の別の実施形態において、該ポリペプチドは、カニクイザルＣＤ１２３に結合する。
【０１７７】
本開示はまた、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ドメイン及びポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む。本開示の核酸は、下の表３に列挙したポリヌクレオチドと実質的に同一である領域を有する核酸を含む。ある実施形態において、本開示による核酸は、表３に列挙したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８０％、典型的には、少なくとも約９０％、及びより典型的には少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％の同一性を有する。本開示の核酸はまた、相補的な核酸を含む。場合によって、該配列は、整列させた時に、完全に相補的である（ミスマッチなし）。他の場合、配列のミスマッチは最大約２０％であり得る。本開示のいくつかの実施形態において、本開示のヘテロ二量体ＣＤ１２３結合タンパク質の第１の及び第２のポリペプチド鎖の両方をコードする核酸が提供される。本明細書に提供される核酸配列は、コドン最適化、縮重配列、サイレント変異、及び特定の宿主内での発現を最適化するための他のＤＮＡ技術を用いて利用することができ、本開示は、そのような配列変更を包含する。
【０１７８】
本発明は、配列番号１及び／又は配列番号３の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％及び少なくとも１００％同一の核酸配列を含む核酸がコードする組み換えポリペプチドを含む。本発明は、配列番号１３１の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％及び少なくとも１００％同一の核酸配列を含む核酸がコードする組み換えポリペプチドを含む。
【０１７９】
本開示は、本明細書に記載のＣＤ１２３結合ドメイン、タンパク質及びポリペプチド（又はその部分）をコードする単離核酸分子に関し、該核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号８１、配列番号８３、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、又は配列番号１５５に記載のヌクレオチ配列を含む。
【０１８０】
所望のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、該分子をベクター中に入れることによって増殖される。プラスミドを含む、ウイルス及び非ウイルスベクターを用いることができる。プラスミドの選択は、増殖が望まれる細胞の種類及び増殖の目的に依存する。いくつかのベクターが、大量の所望のＤＮＡ配列を増幅し、作製するのに有用である。他のベクターは、培養細胞内での発現に適する。さらに他のベクターは、動物又はヒト全体の細胞への導入及び発現に適する。適切なベクターの選択は、十分に当業者の範囲内である。多くのそのようなベクターは市販されている。部分又は全長のポリヌクレオチドは、典型的には、ベクター内の切断される制限酵素部位にＤＮＡリガーゼで接着させることによってベクター内に挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列を、インビボでの相同組み換えによって挿入することができる。典型的には、これは、ベクターに相同な領域を所望のヌクレオチド配列の隣接上で接着させることによって達成される。相同領域は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、又は相同領域と所望のヌクレオチド配列の部分の両方を含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって付加される。
【０１８１】
発現については、発現カセット又はシステムが用いられ得る。本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸を発現させるために、発現ベクター内の転写発現を制御する調節配列に作動可能に連結されるポリペプチドをコードする核酸分子が宿主細胞に導入される。プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列及び発現ベクターを保有する細胞の選択に適するマーカー遺伝子を含むことができる。本開示のポリヌクレオチドがコードする遺伝子産物は、例えば、細菌系、酵母系、昆虫系、両生類系及び哺乳類系を含む任意の便利な発現系で発現する。発現ベクターにおいて、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の発現特性を取得するために、必要に応じて、調節配列に連結される。これらには、プロモーター、エンハンサー、転写終結コドン、オペレーター、抑制因子、及び誘導因子が含まれ得る。プロモーターは、調節されるか（例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のプロモーター）、又は構成的であり得る（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、若しくはＬＴＲ配列のプロモーター）。これらは、ベクターへの連結用の上記の技術を用いて、所望のヌクレオチド配列に連結される。当技術分野で周知の任意の技術を用いることができる。したがって、発現ベクターは、一般に、転写開始領域及び翻訳開始領域を提供し、これらは誘導性又は構成的であり得、コード領域は、転写開始領域の転写制御下で、並びに転写終結領域及び翻訳終結領域に作動可能に連結される。
【０１８２】
発現カセット（「発現単位」）は、様々なベクター、例えば、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ラムダ、Ｐ１、Ｍ１３などのバクテリオファージ、及び植物又は動物のウイルスベクター（例えば、レトロウイルス系ベクター、アデノウイルスベクター）などに導入することができ、該ベクターは、一般的に、発現ベクターを含む細胞の選択を提供する能力によって特徴付けられる。該ベクターは、染色体外維持、特に、プラスミド又はウイルスとして、又は宿主染色体への組み込みを提供することができる。染色体外維持が望まれる場合、元の配列は、低コピー数又は高コピー数であり得るプラスミドの複製を提供する。多種多様なマーカー、特に、毒性、より特には、抗生物質に対して保護するものが、選択に利用できる。選ばれる特定のマーカーは、宿主の性質に従って選択され、場合によって、相補性は、栄養要求性宿主と共に用いることができる。ＤＮＡ構築物の導入は、例えば、接合、細菌形質転換、カルシウム沈殿ＤＮＡ、電気穿孔、融合、トランスフェクション、ウイルスベクターでの感染、及び遺伝子銃などを含む任意の便利な方法を使用することができる。本開示は、核酸セグメントを含む発現ベクターに関し、該核酸セグメントは、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号８１、配列番号８３、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、又は配列番号１５５に記載のヌクレオチド配列を含み得る。
【０１８３】
したがって、本開示で使用するためのタンパク質は、従来の技術に従って、遺伝子工学処理した宿主細胞内で生成することできる。適切な宿主細胞は、外来ＤＮＡで形質転換するか、又はトランスフェクトして、培養で増殖させることができる細胞型であり、細菌、真菌細胞、より高等な培養真核細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、特に培養哺乳類細胞を含む。クローン化ＤＮＡ分子を操作し、様々な宿主細胞に外来ＤＮＡを導入する技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）、並びにＡｕｓｕｂｅｌら，分子生物学の省略プロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）によって開示されている。例えば、本発明の組み換えポリペプチドは、ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞から発現させることができる。
【０１８４】
例えば、本明細書に記載の２つの同一のＣＤ１２３結合ポリペプチドを含むホモ二量体ＣＤ１２３結合タンパク質の組み換え発現については、発現ベクターは、一般に、プロモーターに作動可能に連結された、ＣＤ１２３結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む。異なる第１の及び第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＣＤ１２３結合タンパク質の組み換え発現については、第１の及び第２のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体タンパク質全体の発現用の宿主細胞内で別々のベクターから共発現させることができる。あるいは、ヘテロ二量体ＣＤ１２３結合タンパク質の発現については、第１の及び第２のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体タンパク質全体の発現用の宿主細胞内で同じベクター内の別々の発現単位から共発現する。発現ベクター（複数可）を従来の技術によって宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクト細胞を従来の技術によって培養すると、コードポリペプチド（複数可）が生成し、対応するＣＤ１２３結合タンパク質が生成する。
【０１８５】
組み換えタンパク質を宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、分泌シグナル配列（リーダー配列としても知られる）が発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列は、組み換えタンパク質の天然型の配列であり得るか、又は別の分泌タンパク質に由来し得るか、又は新規に合成され得る。分泌シグナル配列は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結される、すなわち、２つの配列は、正しい読み枠で結合され、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるように配置される。分泌シグナル配列は、一般に、関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に配置されるが、いくつかのシグナル配列は、関心のあるＤＮＡ配列中の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈら，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら，米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。いくつかのバリエーションにおいて、本開示に従って使用するための分泌シグナル配列は、アミノ酸配列ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１９８）を有する。
【０１８６】
培養哺乳類細胞は、本開示内で使用するための組み換えタンパク質の生成に適する宿主である。哺乳類宿主細胞への外来ＤＮＡの導入方法には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１：Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２），ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら，上記）、及びリポソーム媒介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ  １５：７３，１９９３；Ｃｉｃｃａｒｏｎｅら，Ｆｏｃｕｓ  １５：８０，１９９３）が含まれる。培養哺乳類細胞における組み換えポリペプチドの生成は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら，米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら，米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら，米国特許第４，５７９，８２１号；及びＲｉｎｇｏｌｄ，米国特許第４，６５６，１３４号によって開示されている。適切な哺乳類宿主細胞の例としては、アフリカミドリザルの腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胚腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１，ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４；ＣＨＯ  ＤＸＢ１１（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）；例えば、Ｃｈａｓｉｎら，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５，１９８６）も参照されたい）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２），ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝細胞癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）  ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）及びマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。さらなる適切な細胞株は、当技術分野で公知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）などの公的保管所から利用可能である。ＳＶ−４０又はサイトメガロウイルスのプロモーターなどの強力な転写プロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照されたい。他の適切なプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第４，５７９，８２１号及び同第４，６０１，９７８号）並びにアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。
【０１８７】
薬物選択は、一般に、外来ＤＮＡが挿入される培養哺乳類細胞について選択するために使用される。そのような細胞は、一般的に、「形質移入体」と呼ばれる。選択剤の存在下で培養され、関心のある遺伝子をそれらの子孫に渡すことができる細胞は、「安定な形質移入体」と呼ばれる。例示的な選択マーカーには、Ｇ−４１８などのネオマイシン型薬物の存在下で実行される選択を可能にする抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下での宿主細胞増殖を可能するキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｇｐｔ遺伝子；並びにゼオシン、ブレオマイシン、ブラストサイジン、及びハイグロマイシンに対する耐性を提供するマーカー（例えば、Ｇａｔｉｇｎｏｌら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：３４２，１９８７；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４００９，１９９０を参照されたい）が含まれる。選択システムは、関心のある遺伝子の発現レベルを増加させるために使用することもでき、プロセスは「増幅」と呼ばれる。増幅は、低レベルの選択剤の存在下で形質転換体を培養し、次いで、導入遺伝子の高レベルの生成物を生成する細胞について選択するために選択剤の量を増加させることによって実行される。例示的な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素である。他の薬物耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用することができる。
【０１８８】
昆虫細胞、植物細胞及び鳥細胞を含む他のより高等な真核細胞も、宿主として使用することができる。植物細胞内で遺伝子を発現させるためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）  １１：４７−５８，１９８７によって概説されている。昆虫細胞の形質転換及び外来ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏら，米国特許第５，１６２，２２２号及びＷＯ  ９４／０６４６３によって開示されている。
【０１８９】
昆虫細胞に、一般的に、オートグラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ））に由来する組み換えバキュロウイルスを感染させることができる。Ｋｉｎｇ及びＰｏｓｓｅｅ，バキュロウイルス発現系：実験室ガイド（Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  （Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，バキュロウイルス発現ベクター：実験室マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）；及びバキュロウイルス発現プロトコル、分子生物の方法（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５を参照されたい。組み換えバキュロウイルスはまた、Ｌｕｃｋｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９，１９９３）によって記載されるトランスポゾン系システムの使用により生成することができる。導入ベクターを利用するこのシステムは、キット形態で市販されている（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。導入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、「バクミド」と呼ばれる巨大プラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムへ、関心のあるタンパク質をコードするＤＮＡを移動させるＴｎ７トランスポゾンを含有する。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ及びＰｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１−９７６，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１−１５５６，１９９４；並びにＣｈａｚｅｎｂａｌｋ及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３−１５４９，１９９５を参照されたい。加えて、導入ベクターは、上記で開示されるポリペプチド伸張をコードするＤＮＡ又はアフィニティタグとのインフレーム融合を含むことができる。当技術分野で公知の技術を用いて、タンパク質コードＤＮＡ配列を含有する導入ベクターは、大腸菌宿主細胞に形質転換され、該細胞は、組み換えバキュロウイルスを示す割り込まれたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングされる。組み換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡは、一般的な技術を用いて単離され、Ｓｆ９細胞などのスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞をトランスフェクトするために使用される。その後、関心のあるタンパク質を発現する組み換えウイルスが生成される。組み換えウイルスストックは、当技術分野で一般的に使用される方法によって作製される。
【０１９０】
タンパク質生成については、組み換えウイルスを用いて、宿主細胞、典型的には、ツマジロクサヨトウのスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（例えば、Ｓｆ９若しくはＳｆ２１細胞）又はイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来の細胞株に感染させることができる。一般に、Ｇｌｉｃｋ及びＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｄ．Ｃ．，１９９４）を参照されたい。米国特許第５，３００，４３５号も参照されたい。血清を含まない培地は、細胞を成長及び維持するために使用される。適切な培地の製剤は、当技術分野で公知であり、商業的供給元から取得することができる。細胞を、約２〜５×１０５細胞の接種密度から１〜２×１０６細胞の密度まで成長させ、その時に、組み換えウイルスストックを、０．１〜１０、より典型的には、約３の感染多重度（ＭＯＩ）で添加する。使用する手順は、一般に、利用可能な実験室マニュアル（例えば、Ｋｉｎｇ及びＰｏｓｓｅｅ，上記；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，上記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，上記を参照されたい）に記載されている。
【０１９１】
酵母細胞を含む真菌細胞も、本開示内で使用することができる。この点での酵母種には、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びピキア・メタノリカが含まれる。外来ＤＮＡでサッカロマイセス・セレビシエ細胞を形質転換し、そこから組み換えポリペプチドを生成する方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら，米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ，米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら，米国特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙら，米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換細胞は、選択マーカーによって決定される表現型、一般的な薬物耐性又は特定の栄養（例えば、ロイシン）が存在しない状態で成長する能力によって選択される。サッカロマイセス・セレビシエで使用するための例示的なベクター系は、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されるＰＯＴ１ベクター系であり、これは形質転換細胞をグルコース含有培地での成長によって選択するのを可能にする。酵母で使用するための適切なプロモーター及び転写終結コドンには、解糖酵素遺伝子由来のもの（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，米国特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ，米国特許第４，９７７，０９２号を参照されたい）並びにアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。米国特許第４，９９０，４４６号、同第５，０６３，１５４号、同第５，１３９，９３６号、及び同第４，６６１，４５４号も参照されたい。メタノール資化性酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、及びカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）を含む他の酵母用の形質転換系が、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９−３４６５，１９８６；Ｃｒｅｇｇ，米国特許第４，８８２，２７９号；及びＲａｙｍｏｎｄら，Ｙｅａｓｔ  １４：１１−２３，１９９８を参照されたい。アスペルギルス細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら，米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って利用することができる。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換する方法は、Ｓｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。ニューロスポラを形質転換する方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ、米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。ピキア・メタノリカにおける組み���えタンパク質の生成は、米国特許第５，７１６，８０８号、同第５，７３６，３８３号、同第５，８５４，０３９号、及び同第５，８８８，７６８号に開示されている。
【０１９２】
細菌の大腸菌、バチルス、及び他の属の株を含む、原核生物宿主細胞も、本開示内で有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、その中でクローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現させる技術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、上記を参照されたい）。大腸菌などの細菌内で組み換えタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、典型的には、不溶性顆粒として細胞質内で保持され得るか、又は細菌分泌配列によって細胞膜周辺腔へと向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒、例えば、グアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて回収及び変性される。次いで、変性タンパク質は、尿素及び還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、その後の緩衝生理食塩水に対する透析などの、変性剤の希釈によってリフォールディング及び二量体化され得る。代替法では、タンパク質は、可溶化形態で細胞質から回収され、変性剤を使用することなく単離され得る。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中の水性抽出液として細胞から回収される。関心のあるタンパク質を捕捉するために、抽出物は、固定化抗体又はヘパリンセファロースカラムなどのクロマトグラフィー媒体に直接適用される。分泌タンパク質は、細胞膜周辺腔の含有物を放出させるために細胞を破壊し（例えば、超音波処理又は浸透圧ショックによって）、タンパク質を回収し、それによって、変性及びリフォールディングの必要性を取り除くことによって、可溶性で、機能的な形態で細胞膜周辺腔から回収することができる。一本鎖抗体を含む抗体は、既知の方法に従って、細菌宿主細胞で生成することができる。例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８；及びＰａｎｔｏｌｉａｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０１１７−１０１２５，１９９１を参照されたい。
【０１９３】
形質転換宿主細胞又はトランスフェクト宿主細胞は、選択される宿主細胞の成長に必要な栄養素及び他の構成成分を含有する培地中で、従来の手順に従って培養される。限定培地及び複合培地を含む様々な適切な培地が、当技術分野で公知であり、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地はまた、必要であれば、成長因子又は血清などの構成成分を含有することができる。成長培地は、一般に、例えば、発現ベクター上に保有されるか、又は宿主細胞に共トランスフェクトされる選択マーカーによって補完される薬物の選択又は必須栄養素の欠損によって、外来添加ＤＮＡを含有する細胞について選択される。
【０１９４】
ＣＤ１２３結合タンパク質は、従来のタンパク質精製法によって、典型的には、クロマトグラフィー技術の組み合わせによって精製され得る。一般に、アフィニティークロマトグラフィー：原理及び方法（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，１９８８）；Ｓｃｏｐｅｓ，タンパク質精製：原理及び実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４）を参照されたい。免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質は、固定化されたプロテインＡ又はプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ゲル濾過などの追加の精製工程を用いて、所望のレベルの純度を得るか、又は脱塩、及び緩衝液交換などを提供することができる。
【０１９５】
本開示は、ＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる障害を有する対象を治療する方法を提供する。一般に、そのような方法は、そのような治療を必要とする対象に、本明細書に記載のポリペプチド又はＣＤ１２３結合タンパク質を投与することを含む。いくつかの実施形態において、該ＣＤ１２３結合タンパク質は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含み、その結果、該ＣＤ１２３結合タンパク質は、対象においてＣＤ１２３発現細胞に対するＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを誘導する。
【０１９６】
他の実施形態において、該ポリペプチドがＴ細胞（例えば、ＴＣＲ複合体又はＣＤ３εなどのその構成成分）に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む場合、該ポリペプチド又はＣＤ１２３結合タンパク質は、対象においてＣＤ１２３発現細胞に対するリダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘導する。いくつかの実施形態において、ＲＴＣＣポリペプチド（例えば、ＲＴＣＣを誘導するポリペプチド）は、ＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣ活性を低減又は排除するための改変型定常ドメインを含む。
【０１９７】
本方法のいくつかのバリエーションにおいて、該障害は癌である。本開示に従って治療しやすい例示的な癌には、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、芽球増加を伴う不応性貧血、慢性骨髄性白血病及びホジキンリンパ腫が含まれる。
【０１９８】
本開示はまた、ＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる障害（例えば、癌）の治療のための薬剤製造のためのＣＤ１２３結合ポリペプチドの使用を包含する。一実施形態において、該ＣＤ１２３結合ポリペプチドはＲＴＣＣ活性を有し、例えば、ＣＤ１２３結合ポリペプチドは、抗ＣＤ１２３結合ドメイン及び抗ＣＤ３結合ドメインを含む。一実施形態において、本開示は、ＣＤ１２３の過剰発現によって特徴付けられる障害（例えば、癌）の治療に使用するためのＣＤ１２３結合ポリペプチドを含む。
【０１９９】
一実施形態において、本開示は、配列番号１３０又は１３２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％同一である組み換えポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を投与することによって、急性骨髄性白血病、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、芽球増加を伴う不応性貧血、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫又はＣＤ１２３の発現と関連する他の癌と診断された患者を治療する方法を提供する。
【０２００】
いくつかの実施形態において、本開示は、癌を有する患者を治療する方法であって、該患者に、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、又は配列番号１５６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ１２３結合ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法及び使用について、本発明のポリペプチドは、治療が求められる疾患又は障害の管理と関連する従来の方法論と一致した方法で送達される。本明細書の開示に従って、二量体型の治療有効量のポリペプチド又はＣＤ１２３結合タンパク質は、疾患若しくは障害の予防又は治療に十分な時間及び条件下で、そのような治療を必要とする対象に投与される。
【０２０２】
本明細書に記載のポリペプチドが投与される対象には、ＣＤ１２３過剰発現によって特徴付けられる特定の障害を発症するリスクの高い患者及び既にそのような障害を有することを示している患者が含まれる。典型的には、該対象は、治療が求められる障害を有すると診断されている。さらに、対象は、該障害の任意の変化（例えば、該障害の臨床症状の増減）について治療期間に監視され得る。また、いくつかのバリエーションにおいて、該対象は、ＣＤ１２３発現細胞を標的化することを伴う治療を必要としている別の障害を患っていない。
【０２０３】
予防的な適用において、医薬組成物又は医薬品は、障害のリスクを取り除くか、若しくは低下させるか、又は障害の発症を遅らせるのに十分な量で、特定の障害にかかりやすい、又はそうでなければリスクのある患者に投与される。治療的な適用において、組成物又は医薬品は、障害及びその合併症の症状を治癒、又は少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、そのような障害を患っていることが疑われるか、又はすでに患っている患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、治療有効用量又は治療有効量と呼ばれる。予防的及び治療的レジメンの両方において、薬剤は、通常、十分な反応（例えば、不適切な血管新生活性の抑制）が達成されるまで、いくつかの投与量で投与される。典型的には、反応は監視され、所望の反応が消え始めたら、反復投与が行われる。
【０２０４】
本開示の方法に従って治療のための対象患者を特定するために、受け入れられているスクリーニング方法を用いて、対象における特定の障害と関連するリスク要因を決定するか、又は対象において特定されている既存の障害の状態を決定することができる。そのような方法は、例えば、個人が特定の障害を有すると診断された親戚を有するかどうかを決定することを含むことができる。スクリーニング方法はまた、例えば、遺伝性構成成分を有することが知られている特定の障害についての家族状態を決定するための従来の精密検査を含むことができる。例えば、様々な癌はまた、特定の遺伝性構成成分を有することが知られている。癌の遺伝性構成成分は、例えば、複数のトランスフォーミング遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、及び他の物）における変異、いくつかのＨＬＡ及びキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲ）分子の有無、又は癌細胞がＮＫ細胞及びＴ細胞のような細胞の免疫抑制を直接的又は間接的に調節することができる機構を含む（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ及びＭａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３２９−３３９，２００７；Ｂｏｙｔｏｎ及びＡｌｔｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１−８，２００７を参照されたい）。この目的に向けて、関心のある特定の障害と関連する遺伝子マーカーを保有する個人を特定するために、通常、ヌクレオチドプローブを用いることができる。加えて、特異的障害のマーカーを特定するのに有用な多種多様な免疫学的方法が当技術分野で知られている。例えば、特異的腫瘍と関連する抗原を検出するためのモノクローナル抗体プローブを用いる様々なＥＬＩＳＡ免疫アッセイ法が利用可能であり、当技術分野で周知である。既知の患者の症状、年齢要因、関連するリスク要因などによって示されるように、スクリーニングを実行することができる。これらの方法により、臨床医は、治療のために本明細書に記載の方法を必要とする患者を日常的に選択することが可能になる。これらの方法に従って、病理学的なＣＤ１２３発現細胞の標的化は、独立した治療プログラムとして、又は補助的経過観察として、又は他の治療と協調的な治療レジメンとして実行することができる。
【０２０５】
投与のために、本発明の（例えば、二量体型の）ポリペプチドは、医薬組成物として製剤化され得る。医薬組成物は、（ｉ）ＣＤ１２３結合ポリペプチド、及び（ｉｉ）医薬として許容される担体、希釈材又は賦形剤を含み得る。ＣＤ１２３結合タンパク質を含む医薬組成物は、医薬として有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化することができ、それによって、治療用分子は、医薬として許容される担体、希釈材又は賦形剤との混合物で組み合わされる。担体は、その投与がレシピエント患者によって許容的であり得る場合に、「医薬として許容される担体」であると言われる。無菌のリン酸緩衝生理食塩水は、医薬として許容される担体の一例である。他の適切な担体、希釈材又は賦形剤は、当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，第１９版．１９９５）を参照されたい）。製剤は、さらに、１以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質喪失を防止するためのアルブミンなどを含むことができる。
【０２０６】
医薬組成物は、経口単位剤形、静脈内単位剤形、鼻腔内単位剤形、坐剤単位剤形、皮内単位剤形、筋肉内単位剤形、腹腔内単位剤形、皮下単位剤形、硬膜外単位剤形、舌下単位剤形、及び脳内単位剤形からなる群から選択される剤形で製剤化され得る。経口単位剤形は、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、液剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、徐放性製剤、エアロゾル剤、及びスプレー剤からなる群から選択され得る。
【０２０７】
本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、治療有効量で対象に投与され得る。本開示の方法に従って、ＣＤ１２３結合タンパク質は、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜内、髄腔内、及び経口の投与経路を含む様々な投与様式で対象に投与することができる。
【０２０８】
この文脈で有効な投与量の決定は、典型的には、ヒトの臨床試験が後に続く動物モデル研究に基づき、モデル対象における対象の障害の発症又は重症度を著しく低下させる有効な投与量及び投与プロトコルを決定することによって導かれる。本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒト又は動物であるか否か、投与される他の薬物、治療が予防的又は治療的であるか否か、並びに組成物それ自体の特異的活性及び個人において所望の反応を誘発する能力を含む多くの異なる要因に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患において、患者は非ヒト哺乳類であり得る。典型的には、投与レジメンは、最適な治療反応を提供するために、すなわち、安全性及び有効性を最適化するために調整される。したがって、治療有効量はまた、本明細書に記載のＣＤ１２３結合タンパク質を投与する有益な効果が望ましくない付随的な影響を上回る量である。ＣＤ１２３結合タンパク質の投与については、投与量は、例えば、対象の体重の約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又は１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２０９】
医薬組成物の投与量は、標的部位での所望の濃度を維持するために、担当医が変更することができる。
【０２１０】
特に固形腫瘍の治療に関しては、エンドポイント及び抗腫瘍活性を評価するためのプロトコルは、当技術分野で周知である。各プロトコルは、腫瘍応答評価を別々に定義し得、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍の応答評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ））基準は、現在、米国立癌センターによって推奨される腫瘍応答評価の指針であると考えられている（Ｔｈｅｒａｓｓｅら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６，２０００を参照されたい）。ＲＥＣＩＳＴ基準によると、腫瘍応答は、全ての測定可能な病変若しくは転移の低下又は除去を意味する。疾患は、一般に、医療写真又はＸ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、又は臨床検査（病変が表面にある場合）によって、縁がはっきりと定義された状態で、少なくとも１つの寸法において、従来技術で２０ｍｍ以上又はスパイラルＣＴスキャンで１０ｍｍ以上と正確に測定することができる病変を含む場合、測定可能であるとみなされる。測定可能ではない疾患は、該疾患が、従来技術で２０ｍｍ未満又はスパイラルＣＴスキャンで１０ｍｍ未満の病変、かつ本当に測定可能ではない（小さすぎて、正確に測定できない）病変を含むことを意味する。測定可能ではない疾患には、胸水、腹水、及び間接的な証拠によって文書化された疾患が含まれる。
【０２１１】
客観的な状態の基準は、固形腫瘍応答を評価するためのプロトコルに必要である。代表的な基準には、以下のもの：（１）全ての測定可能な疾患の完全な消失として定義される完全な応答（ＣＲ）；新しい病変なし；疾患関連症状なし；測定不能疾患の兆候なし；（２）標的病変の最長径の和の３０％減少として定義される部分応答（ＰＲ）；（３）任意の標的病変の最長径の和の２０％増加又は新しい病変の出現として定義される進行性疾患（ＰＤ）；（４）ＣＲ、ＰＲ、又は進行性疾患の基準を満たさないと定義される安定な応答又は無応答が含まれる（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、上記を参照されたい）。
【０２１２】
腫瘍学分野内で受け入れられている追加のエンドポイントには、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、奏功率（ＯＲＲ）、進行までの時間（ＴＴＰ）、及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）が含まれる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ａｐｒｉｌ  ２００５，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＦＤＡ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。
【０２１３】
医薬組成物は、本明細書に記載の医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給することができる。医薬組成物は、例えば、単回用量若しくは複数回用量用の注射溶液の形態で、又は注射前に再構成される無菌粉末として提供することができる。あるいは、そのようなキットは、乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生器、又は医薬組成物の投与用のネブライザーを含むことができる。そのようなキットは、さらに、適応症に関する書面による情報及び医薬組成物の使用を含むことができる。
【０２１４】
本開示は、本開示の純粋な例示であることが意図され、決して限定するものではない以下の実施例によってさらに明らかになる。
【０２１５】
実施例
実施例１：抗ＣＤ１２３抗体のヒト化変異体の作製並びに単一特異性及び二重特異性ＣＤ１２３結合分子の構築
ファージディスプレイによる単一特異性ＣＤ１２３結合分子の単離
抗ＣＤ１２３特異的ｓｃＦｖ結合分子を、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｂｉｏ社のプロトコルに従って、かつ以前にＡｙｒｉｓｓ，Ｊら，（２００７）Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｐ１０７２−８２に記載されている通りに、ビオチン化組み換えＣＤ１２３タンパク質（配列番号２００）に対する可溶性ファージディスプレイパニング技術を用いて、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｂｉｏ社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）のスーパーヒューマン（ＳｕｐｅｒＨｕｍａｎ）ライブラリーから単離した。クローンの結合特異性を、同一の精製タグを有するＣＤ１２３タンパク質及び無関係の組み換えタンパク質を用いてＥＬＩＳＡによって特徴付けた。それぞれ配列番号２０１及び配列番号２０３のＣＤ１２３のヒト変異体及びカニクイザル変異体でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いるフローサイトメトリーを用いて、細胞表面の状況でＣＤ１２３に結合するクローンを特定した。これらの実施例で言及する結合分子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、表５の中で見つけることができる。
【０２１６】
ハイブリドーマ作製による単一特異性ＣＤ１２３結合分子の単離
抗ＣＤ１２３特異的抗体を、組み換えヒトＣＤ１２３エクトドメイン（配列番号２００）でＯｍｎｉＭｉｃｅ（Ｌｉｇａｎｄ社，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を免疫した後に作製されたハイブリドーマライブラリーから単離した。個々のクローンの結合特異性を、それぞれ配列番号２０１及び配列番号２０３のＣＤ１２３のヒト変異体及びカニクイザル変異体でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にてフローサイトメトリーを用いて結合を試験することによって確認し、さらに親のＨＥＫ２９３細胞への結合の欠如によって確認した。配列を、製造業者のプロトコルの改変版に従って、ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって取得した。簡単に説明すると、各クローンのからの細胞を、凍結細胞バンクのバイアルから擦り取り、リボヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。次いで、この細胞懸濁液を、重鎖、カッパ又はラムダ可変ドメインに隣接する遺伝子特異的プライマーのセットを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。これらの断片の各々の定常ドメイン内のリバースプライマーを用いて配列決定を行った。次いで、配列を、重複配列を含有するプライマーを用いて可変ドメインを増幅することによってｓｃＦｖフォーマットに変換し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）  ＨｉＦ  ＤＮＡアセンブリークローニングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて哺乳類発現ベクター内にアセンブルした。
【表７】
2019531764.tif 000057
2019531764.tif 000058
2019531764.tif 000059
【０２１７】
二重特異性ＣＤ１２３結合分子の調製
ＣＤ１２３及びＣＤ３エプシロン、ＴＲＩ１２９（配列番号１２９（核酸）、配列番号１３０（アミノ酸））；ＴＲＩ１３０（配列番号１３１（核酸）、配列番号１３２（アミノ酸））；ＴＲＩ１１２３（配列番号１３３（核酸）、配列番号１３４（アミノ酸））；ＴＲＩ１２４（配列番号１３５（核酸）、配列番号１３６（アミノ酸））；ＴＲＩ１３７（配列番号１３７（核酸）、配列番号１３８（アミノ酸））；ＴＲＩ１２５（配列番号１３９（核酸）、配列番号１４０（アミノ酸））；ＴＲＩ１２６（配列番号１４１（核酸）、配列番号１４２（アミノ酸））；ＴＲＩ１２７（配列番号１４３（核酸）、配列番号１４４（アミノ酸））；ＴＲＩ１３４（配列番号１４５（核酸）、配列番号１４６（アミノ酸））；ＴＲＩ１２８（配列番号１４７（核酸）、配列番号１４８（アミノ酸））；ＴＲＩ１３１（配列番号１４９（核酸）、配列番号１５０（アミノ酸））；ＴＲＩ１３２（配列番号１５１（核酸）、配列番号１５２（アミノ酸））；ＴＲＩ１３８（配列番号１５３（核酸）、配列番号１５４（アミノ酸））；及びＴＲＩ１３９（配列番号１５５（核酸）、配列番号１５６（アミノ酸））を標的とする二重特異性ＣＤ１２３結合分子を、鋳型として既存の二重特異性結合分子から始める標準的な分子生物学技法及び例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ２００７／１４６９６８、米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１０／０４０１０５、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１０／００３１０８、及び米国特許第７，１６６，７０７号に一般的に開示されている方法を用いて作製した（表３も参照されたい）。Ｎ末端抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖ結合ドメインの挿入を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩでの親鋳型並びにｓｃＦｖインサートの消化により達成し、所望の断片を、アガロースゲル精製により特定及び単離し、ライゲーションした。Ｃ末端抗ＣＤ３エプシロンｓｃＦｖ結合ドメインの挿入を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでの親鋳型並びにｓｃＦｖインサートの消化により達成し、所望の断片を、アガロースゲル精製により特定及び単離し、ライゲーションした。
【０２１８】
ヒトｓｃＦｖドメインを有する構築物のアセンブリを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片、及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断した目的ベクターを用いて、３ピースのライゲーションによって達成した。これを用いて、表４に示すヒト化二重特異性分子に対応する遺伝子配列を生成した。
【表８】
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【０２１９】
ＣＤ１２３結合分子及び抗体の発現並びに精製
本明細書に開示される二重特異性ＣＤ１２３結合分子を、ヒトＨＥＫ２９３細胞の一過的トランスフェクションと、場合によっては、またＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクションの両方によって生成した。トランスフェクト細胞を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養物の上清から精製した。凝集物がアフィニティークロマトグラフィー後に検出された場合、タンパク質の均一性を確実にするために、第２の分子ふるいクロマトグラフィーも実行した。
【０２２０】
実施例２：ＣＤ１２３（＋）細胞株へのＣＤ１２３結合分子の結合
癌細胞の表面上のＣＤ１２３への結合活性が、抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子を保持し、カニクイザルＣＤ１２３に対する交差反応性を示すことを確認するために、フローサイトメトリーを用いて、構築したＣＤ１２３結合分子のＣＤ１２３発現細胞株への結合を定量化した。
【０２２１】
単一特異性及び二重特異性タンパク質のＣＤ１２３（＋）細胞株への結合
ＣＤ１２３（＋）Ｍｏｌｍ−１３（Ｍａｔｓｕｏ，Ｙ．ら，１９９７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１，１４６９−１４７７）癌細胞株及びカニクイザルＣＤ１２３発現ＣＨＯ細胞上での結合試験を、標準的なフローサイトメトリー系の染色手順によって行った。Ｍｏｌｍ−１３細胞株をＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。Ｍｏｌｍ−１３細胞株を、提供されたプロトコルに従って培養した。全長カニクイザルＣＤ１２３タンパク質を安定発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、研究室内で開発した。典型的な実験は、氷上で３０分間、０．２％のＢＳＡ及び２ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ緩衝液１００μｌ中０．０１２ｎＭ〜１，０００ｎＭの範囲の結合分子で、９６ウェルプレート中の１ウェルあたり１００，０００細胞を標識し、その後洗浄し、氷上で３０分間、ＰＥ標識した最小交差種反応性二次抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ、Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）とインキュベートするものである。結合分子からのシグナルを、ＬＳＲ−ＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出し、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリー分析ソフトウェアによって分析した。細胞上の結合分子の平均経口強度（ＭＦＩ）を、二重線の除外後に決定した。ＥＣ５０値の決定のための非線形回帰分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７（登録商標）グラフ化及び統計用ソフトウェアで行った。
【０２２２】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、３回の独立した実験で、ＣＤ１２３（＋）Ｍｏｌｍ−１３ヒト腫瘍細胞株への、１３種の異なる二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子（ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２７、ＴＲＩ１２８、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３１、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３４、ＴＲＩ１３７、ＴＲＩ１３８及びＴＲＩ１３９）の結合を示す。これらの実験では、一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から調製された二重特異性構築物を利用した。これらの分子のうちの４種が、飽和濃度で同等の最大レベルの結合を実証した。ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１３９について観察されたＥＣ５０値は、２〜１０ｎＭであった。類似の結果を有する安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からのＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０について、実験を繰り返した（データ示さず）。
【０２２３】
図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、２回の独立した実験で、カニクイザルＣＤ１２３タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞への、１３種の異なる二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子（ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２７、ＴＲＩ１２８、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３１、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３４、ＴＲＩ１３７、ＴＲＩ１３８及びＴＲＩ１３９）の結合を示す。これらの分子のうちの７種が、飽和濃度で同等の最大レベルの結合を実証した。ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３７及びＴＲＩ１３９について観察されたＥＣ５０値は、３〜３８ｎＭであった。
【０２２４】
これらの結果から、構築された抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子が、癌細胞表面上のヒトＣＤ１２３への結合活性を保持し、カニクイザルＣＤ１２３と交差反応を示すことが確認される。
【０２２５】
実施例３：ＣＤ１２３（＋）細胞株を用いたリダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害性アッセイ
ＣＤ１２３とＣＤ３εの両方への二重特異性分子結合がＣＤ１２３（＋）細胞株に対してＴ細胞の細胞傷害をリダイレクトできるかを確認するために、クロム５１放出アッセイを用いて、Ｔ細胞によって誘導される標的細胞の溶解を定量化した。
【０２２６】
ＣＤ１２３（＋）細胞株を用いたクロム５１放出アッセイ
Ｍｏｌｍ−１３ヒト腫瘍細胞株を、提供されたプロトコルに従って培養した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、標準的なフィコール勾配を用いて、ヒト血液から単離した。単離細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄した。ＰＢＭＣを、製造業者のプロトコルを用いて、Ｔ細胞を活性化するために、ヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（カタログ番号１１１３１Ｄ、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて２４時間培養した。培養２４時間後、ＰＢＭＣを収集し、磁場に置いて、ダイナビーズを除去した。単離細胞を、ＲＰＭＩ培地＋１０％ヒト血清で洗浄した。アッセイ中に、０．０６１ｐＭ〜１０００ｐＭの範囲の最終濃度で二重特異性分子の濃度を活性化ＰＢＭＣに添加した（１ウェルあたり約１００，０００）。
【０２２７】
約２．５×１０６のＭｏｌｍ−１３標的細胞を、０．１２５ｍＣｉの５１Ｃｒで処理し、９０分間、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をアッセイ培地（１０％ヒト血清を有するＲＰＭＩ）で３回洗浄し、１２．５ｍＬのアッセイ培地に再懸濁した。この懸濁液から、９６ウェルＵ底プレートに１ウェルあたり５０μＬを分注し（１ウェルあたり約１０，０００細胞）、全量を１ウェルあたり２００μＬにし、標的細胞に対するＰＢＭＣの比を１０：１にした。溶解させない対照を、ＰＢＭＣを取り除いて、標的細胞のみで作製した。全溶解対照を、標的細胞のみでの処理として０．２０％  ＮＰ−４０を含めることによって作製した。バックグラウンド溶解対照を、二重特異性分子の非存在下で、ＰＢＭＣを有する標的細胞によって作製した。
【０２２８】
プレートを、４時間、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートし、その後、３分間、１０００  ｒｐｍで遠心分離し、２５μＬの上清を、各ウェルから９６ウェルＬｕｍａ試料プレートの対応ウェルに移した。試料プレートを、１８時間、化学的安全キャビネット内で風乾させ、次いで、標準的なプロトコルを用いて、ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて放射活性を読み取った。
【０２２９】
特異的溶解率を、式：（（薬物処理試料のシグナル−標的細胞のみを有する試料のバックグラウンドシグナル）／（全溶解ウェルのシグナル−標的細胞のみを有する試料のバックグラウンドシグナル））×１００を用いて計算した。
【０２３０】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、２回の独立した実験で、１３種の異なる二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子（ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２５、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２７、ＴＲＩ１２８、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３１、ＴＲＩ１３２、ＴＲＩ１３４、ＴＲＩ１３７、ＴＲＩ１３８及びＴＲＩ１３９）を用いて、４時間の時点で測定したＭｏｌｍ−１３細胞株を用いたクロム５１放出アッセイを示す。二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε分子の全ては、４時間の時点で効率的な標的細胞溶解を示し、最大特異的溶解は２４〜４８％の範囲であった。測定されたＥＣ５０値は、４時間の時点で３〜３７ｐＭの範囲であった。
【０２３１】
リダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害性アッセイも、（ｉ）Ｍｏｌｍ−１３（ヒトＣＤ１２３＋細胞）及びヒトＴ細胞、（ｉｉ）Ｍｏｌｍ−１３（ヒトＣＤ１２３＋細胞）及びカニクイザルＴ細胞並びに（ｉｉｉ）カニクイザルＣＤ１２３及びヒトＴ細胞を安定発現するＣＨＯ細胞と共に、カニクイザルＣＤ１２３タンパク質（ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０）を安定発現するＣＨＯ細胞を用いて行った。データから、ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０が、ヒト及びカニクイザルＣＤ１２３＋細胞並びにＴ細胞に対して交差反応性であることが示される。
【０２３２】
これらの結果から、ＣＤ１２３とＣＤ３εの両方に結合する二重特異性分子が、ＣＤ１２３（＋）細胞株に対するＴ細胞の細胞傷害をリダイレクトできたことが確認される。
【０２３３】
実施例４：抗ＣＤ１２３二重特異性分子によってＣＤ１２３（＋）細胞株に対して誘導される標的依存性Ｔ細胞増殖
標的依存性Ｔ細胞増殖の誘導時の異なる二重特異性ＣＤ１２３結合分子の有効性を比較するために、ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３２及びＴＲＩ１３９を含む６種の異なる抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε二重特異性分子を、２回の独立した実験で試験した。
【０２３４】
ＣＤ１２３（＋）細胞株Ｍｏｌｍ−１３を用いるフローサイトメトリーによってＴ細胞増殖を評価した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、標準的な密度勾配分離法を用いてヒトの血液から単離した。単離細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄した。Ｔ細胞を、さらに、製造業者のプロトコルを用いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の汎Ｔ細胞単離キットＩＩを用いて単離した。Ｍｏｌｍ−１３細胞を、Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｂｉｏｐｔｉｃｓ  ＬＬＣ（Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）のＦａｘｉｔｒｏｎ−ＣｅｌｌＲａｄ  Ｘ線照射システムを用いて照射して、細胞分裂を防止した。
【０２３５】
単離Ｔ細胞集団をＣＦＳＥで標識することによって増殖を評価した。それぞれ、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を１２０，０００細胞／ウェルで、Ｍｏｌｍ−１３腫瘍細胞を３０，０００細胞／ウェルで、Ｕ底９６ウェルプレートにプレーティングし、腫瘍細胞に対するＴ細胞の比を約４：１にした。０．００２ｐＭ〜２，０００ｐＭの範囲の濃度の試験分子を、１０％ヒトＡＢ血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質及び非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中２００μＬ／ウェルの最終量まで細胞混合物に添加した。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。４日後、０．１％牛血清アルブミン及び２ｍＭのＥＤＴＡを有する生理食塩水緩衝液を用いて、元のプレート中で細胞喪失を最小限にするために、フローサイトメトリー分析用の抗体で細胞を標識した。遠心分離及び上清の除去後、細胞ペレットを、以下の色素標識抗体：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ８−パシフィックブルー、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、及び７ＡＡＤの混合物と５０μｌ容量で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでの各ウェルの５０％取得の直前に１２０μｌ容量に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、試料ファイルを分析し、少なくとも１回の細胞分裂を行ったＣＤ４＋（ＣＤ８−）又はＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合を、前方散乱対側方散乱で、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋  ＣＤ８−又は７ＡＡＤ−  ＣＤ５＋  ＣＤ８＋）を順次ゲーティングすることによってＣＦＳＥプロファイルに従って計算した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム７．０を用いてグラフをプロットした。
【０２３６】
Ｔ細胞集団の分裂の分析により（図４Ａ及び４Ｂ）、Ｍｏｌｍ−１３細胞の存在下で増殖細胞の割合が著しく増加したことが明らかになった。全分子は、低濃度（１０ｐＭ）でＴ細胞増殖のロバストな誘導を示し、増殖は、ＣＤ４＋（ＣＤ８−）（図４Ａ）Ｔ細胞集団よりもＣＤ８＋（図４Ｂ）においてわずかにより高かった。ＥＣ５０値を、ＣＤ４（図４Ｃ）集団及びＣＤ８（図４Ｄ）集団の両方についてＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１３９を用いて決定し、全３つの抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε二重特異性分子について類似の抗力を実証した。
【０２３７】
これらの結果から、ＣＤ１２３とＣＤ３εの両方への二重特異性分子結合が、ＣＤ１２３（＋）細胞株に対する標的依存性Ｔ細胞増殖を誘導できたことが確認される。
【０２３８】
実施例５：代表的な非臨床種における薬物動態の決定
関連する非臨床種における薬物動態を決定するために、二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３分子を、抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３分子の薬物動態（ＰＫ）評価及び毒性評価について非ヒト霊長類（ＮＨＰ）種（例えば、カニクイザル）において試験する。ＮＨＰ  ＣＤ１２３への抗ＣＤ１２３結合ドメインの交差反応性を、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイによって試験する（実施例２と同様）。ＮＨＰとヒトＣＤ１２３の間に８５．７％の配列同一性があるので、等しい結合が期待される。ＰＫ及び免疫原性アッセイが開発され、これを用いて、カニクイザル血清の存在下で抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３分子を検出及び定量化し、かつＮＨＰにおける免疫原性反応を評価することができる。ＣＤ１２３標的分子の関連毒種としてカニクイザルを正当化するこれらの作業が正常に完了したら、単回用量のＰＫ／耐容性実験を行う。研究は、有資格臨床研究機関（ＣＲＯ）で行うことができる。研究結果を、ＰＫパラメータ、及び薬物の作用機序又は抗薬物抗体（ＡＤＡ）に起因し得ない説明できない有害事象を含む任意の有害事象について調べる。毒物学者は、研究結果を検証及び解釈し、リードの継続的な開発を支持する。この研究由来のＰＫパラメータを用いて、非ヒト霊長類におけるさらなる毒性研究及び／又はヒト患者における臨床研究を計画する。
【０２３９】
実施例６：ヒト臨床投与の際の安全性及び耐容性の試験
ＣＤ１２３及びＣＤ３を標的とするリード二重特異性分子のヒトにおける安全性及び耐容性を決定するために、以下のフェーズ１臨床試験を実施することができた。抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３二重特異性分子の初のヒトでの研究は、ヒト投与における最大耐量（ＭＴＤ）を特定するための用量漸増研究であり得る。
【０２４０】
二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３分子はアゴニストであるので、出発用量は、抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３のインビトロ活性に基づく推定最小薬理作用量（ＭＡＢＥＬ）をもたらす用量に設定される。ヒトの薬物動態（ＰＫ）を、非臨床モデル（マウス又は非ヒト霊長類）において決定されるＰＫ値及びＭＡＢＥＬをもたらす用量を予測するアロメトリースケーリングを用いて推定する。二重特異性分子を、静脈内注入又は皮下注入のいずれかを用いて投与する。用量漸増は、期待される１２用量コホート（Ｎ＝２４〜７２人の患者）で、標準的な３＋３計画に従う。投与頻度は、非臨床研究で観察されるＰＫに依存するが、毎週（ＱＷ）、隔週（Ｑ２Ｗ）、３週間に１回（Ｑ３Ｗ）、又は毎月（Ｑ４Ｗ）であり得る。投与は、（免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）又は固形腫瘍の応答基準（ＲＥＣＩＳＴ）のいずれかによって定義される）疾患進行まで継続する。
【０２４１】
研究の主要評価項目は、ＭＴＤを定義する安全性及び毒性を制限する任意の用量である。研究の副次的評価項目は、ＰＫ、免疫原性、及びｉｒＲＣ又はＲＥＣＩＳＴ基準のいずれかによって評価される腫瘍体積の客観的応答である。血液悪性腫瘍を有する患者にとって、微小残存病変（ＭＲＤ状態）の存在などのさらなる基準が評価され得る。必要であれば、又は実行可能であれば、バイオマーカー試料を全血及びリンパ節又は骨髄生検から取得し、免疫系に対する効果及び癌又は悪性腫瘍に対する効果を監視する。
【０２４２】
フェーズ１研究の受け入れ基準は広く、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状新生物（ＢＰＤＣＮ）、及び有毛細胞白血病などのＣＤ１２３発現が以前に高いことが示された複数の兆候からの難治性疾患又は再発疾患を有する患者の包含を可能にし得る。研究に登録される患者には、原発性腫瘍のアーカイブ生検試料又は転移部位の再発腫瘍の処置前生検のいずれかからの免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析からＣＤ１２３発現の証拠が必要とされる。
【０２４３】
二重特異性抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３分子は、ｉｒＲＣ若しくはＲＥＣＩＳＴ基準からの主観的応答又はＣＴＣ、ＰＳＡ、若しくはＴＡＧ７２などの潜在的な予後血清バイオマーカーの変化のいずれかから臨床的利益の証拠を示すＭＴＤ又はＭＴＤ未満の用量レベルで患者に投与した場合に、十分に安全であると決定される。
【０２４４】
【表９】
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2019531764.tif 000062
2019531764.tif 000063
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【０２４５】
実施例７：抗ＣＤ１２３二重特異性分子によってＣＤ１２３（＋）細胞株に対して誘導される標的依存性Ｔ細胞活性化
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の標的依存性Ｔ細胞活性化の誘導時の異なる二重特異性ＣＤ１２３結合分子の有効性を比較するために、ＴＲＩ１２３、ＴＲＩ１２６、ＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０、ＴＲＩ１３２及びＴＲＩ１３９を含む６種の異なる抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε二重特異性分子を、２回の独立した実験で試験した。
【０２４６】
ＣＤ１２３（＋）細胞株Ｍｏｌｍ−１３を用いるフローサイトメトリーによってＴ細胞活性化を評価した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、標準的な密度勾配分離法を用いてヒトの血液から単離した。単離細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄した。Ｔ細胞を、さらに、製造業者のプロトコルを用いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の汎Ｔ細胞単離キットＩＩを用いて単離した。
【０２４７】
それぞれ、Ｔ細胞を１２０，０００細胞／ウェルで、Ｍｏｌｍ−１３腫瘍細胞を３０，０００細胞／ウェルで、Ｕ底９６ウェルプレートにプレーティングし、腫瘍細胞に対するＴ細胞の比を約４：１にした。０．００２ｐＭ〜２，０００ｐＭの範囲の濃度の試験分子を、１０％ヒトＡＢ血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質及び非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中２００μＬ／ウェルの最終量まで細胞混合物に添加した。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。２０時間後、０．１％牛血清アルブミン及び２ｍＭのＥＤＴＡを有する生理食塩水緩衝液を用いて、元のプレート中で細胞喪失を最小限にするために、フローサイトメトリー分析用の抗体で細胞を標識した。遠心分離及び上清の除去後、細胞ペレットを、以下の色素標識抗体：ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ８−パシフィックブルー、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、及び７ＡＡＤの混合物に５０μｌ容量で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでの各ウェルの５０％取得の直前に１２０μｌ容量に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、試料ファイルを分析し、ＣＤ６９及びＣＤ２５を上方制御したＣＤ４＋（ＣＤ８−）又はＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合を、前方散乱対側方散乱で、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋  ＣＤ４＋又は７ＡＡＤ−  ＣＤ５＋  ＣＤ８＋）を順次ゲーティングすることによって計算した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム７．０を用いてグラフをプロットした。
【０２４８】
２０時間後の活性化Ｔ細胞の分析（図５）は、Ｍｏｌｍ−１３細胞の存在下で活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合の著しい増加を明らかにした。試験した全分子は、１〜１００ｐＭの範囲の低濃度でＭｏｌｍ−１３標的細胞の存在下でＴ細胞の最大活性化を誘導した（図５）。ＥＣ５０値を、ＣＤ４＋（図５Ｃ）とＣＤ８＋（図５Ｄ）のＣＤ２５＋  ＣＤ６９＋集団の両方についてＴＲＩ１２９、ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１３９を用いて決定し、全３つの抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ε二重特異性分子について類似の抗力が実証された。
【０２４９】
これらの結果から、ＣＤ１２３とＣＤ３εの両方への二重特異性分子の結合はＣＤ１２３（＋）細胞株に対する標的依存性Ｔ細胞活性化を誘導できたことが実証される。
【０２５０】
実施例８：二重特異性タンパク質のＣＤ１２３への結合
ＣＤ１２３への二重特異性タンパク質の動態及び親和性を決定するために、ＴＲＩ−１２９及びＴＲＩ−１３０二重特異性タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞において一過的トランスフェクションによって発現させ、親和性精製とサイズ排除精製の組み合わせを用いて精製した。ＣＤ１２３の細胞外ドメインを、Ｃ末端上にアフィニティタグをつけて一過的に発現させ、親和性精製とサイズ排除精製の組み合わせを用いて精製した。分析を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて行った。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ２００は、リアルタイム動態結合データを提供するように設計されている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのバイオセンサーシステムである。
【０２５１】
組み換え単量体ＣＤ１２３外部ドメイン（ＥＣＤ）への二重特異性分子のＳＰＲ結合研究を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中で、２５℃で実施した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中２０μｇ／ｍＬでヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、標準的なアミンカップリング化学によってＣＭ５研究グレードセンサーチップ（Ｒ−１００５−３０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面上に３６００反応単位（ＲＵ）の密度で固定した。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中２００ｎＭの二重特異性分子を、安定な２０００ＲＵ反応に達するまで、３０μＬ／分の流速で、１２０秒間、固定した抗Ｆｃ  Ｆ（ａｂ’）２断片によって捕捉した。異なる濃度のＣＤ１２３  ＥＣＤ（２倍希釈による３〜４８ｎＭ、ブランクとして緩衝液を含む）を、１２０秒間、３０μＬ／分で捕捉した二重特異性分子上に流し、その後、３００秒間、解離期間を設けた。最適な再生を、１５秒間、３０μＬ／分の流速で、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．７）の１回注入、その後、１５秒間、３０μＬ／分で５０ｍＭのＮａＯＨの１回注入によって達成した。次の稼働前に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液での２分の安定化を完了した。
【０２５２】
動態学的ＳＰＲ測定から取得したセンサーグラムを、二重減算法によって分析した。参照フローセルからのシグナルを、固定又は捕捉したリガンドを有するフローセルから得られた検体結合反応から減算した。次いで、緩衝液参照反応を、複数の注入から平均化した。次いで、平均化した緩衝液参照反応を検体結合反応から減算し、最終的な二重参照データをＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェア（２．０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析し、動態パラメータを導くために包括的にデータを適合させた（表８）。全てのセンサーグラムを、単純な１対１結合モデルを用いて適合させた。
【０２５３】
【表１０】
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【０２５４】
３ｎＭ〜４８ｎＭの範囲の異なるＥＣＤ濃度でのＴＲＩ−１３０のＳＰＲ分析の例を表６に示す。結合の熱力学的及び動態学的速度定数をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）評価ソフトウェアを用いて計算した。例えば、ＣＤ１２３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するＴＲＩ−１３０の親和性（ＫＤ）は２．７４×１０−９Ｍであり、ｋａは１．７２×１０５  Ｍ−１ｓ−１であり、ｋｄは４．７２×１０−４  Ｓ−１であると決定した。ＣＤ１２３に対するＴＲＩ−１２９の親和性は１．１４×１０−８Ｍであり、ｋａは１．７９×１０５  Ｍ−１ｓ−１であり、ｋｄは２．０５×１０−３  ｓ−１であると決定した。
【０２５５】
実施例９：示差走査熱量測定
ＣＤ１２３結合ドメインの熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて評価した。ＤＳＣは、一定速度で加熱した時に、分子の熱変性と関連する熱容量変化を測定する。ＣＤ１２３結合ドメインｓｃｆｖのＴｍ（熱転移の中点）値は、安定性の尺度であり、融解曲線から導くことができる。
【０２５６】
ＤＳＣ熱安定性研究を、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて行った。緩衝液ＰＢＳ  ｐＨ７．４の正確な一致を基準として使用した。基準を有する０．５ｍｇ／ｍＬの各タンパク質試料溶液５００ｕＬを該装置にロードし、１分あたり摂氏１度の速度で、２５℃〜１００℃に加熱した。融解曲線をＯｒｉｇｉｎ７プラットフォームソフトウェア「ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−キャピラリーＤＳＣ自動分析ソフトウェア（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）」用いて分析した。各融解転移のＴｍを「ｎｏｎ−２状態カーソル積分（ｓｔａｔｅ  ｃｕｒｓｅｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」法を用いて計算した。
【０２５７】
【表１１】
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【０２５８】
実施例１０：薬物動態活性
二重特異性分子の薬物動態活性を決定するために、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに２００ｍｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＲＩ１２９又はＴＲＩ１３０のいずれかを静脈内（ＩＶ）注入した（各分子についてｎ＝３０、ＴＲＩ１２９又はＴＲＩ１３０）。各時点で、血液を３匹のマウスから心臓穿刺によって採取した。時点は、１５分、２、６、２４、４８、７２、９６、１６８、３３６及び５０４時間目であった。血液を血清に処理し、分注し、凍結した。血清試料中のＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０の濃度を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。経時的血清濃度を用いて、非コンパートメント解析（ＮＣＡ）及びコンパートメント解析によってＰＫパラメータ推定値を決定した。経時的血清濃度プロファイルを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ６４ソフトウェアを用いて解析した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０を用いてグラフをプロットした。得られたデータのＮＣＡパラメータ解析を表１０に提供する。
【０２５９】
【表１２】
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【０２６０】
図７は、ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０二重特異性分子についての濃度対時間曲線を示す。
【０２６１】
実施例１１：抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３結合分子のインビボ有効性
ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０が、インビボで腫瘍成長を阻害し、生存を延長することができるかどうかを決定するために、ヒト急性骨髄性白血病のげっ歯類モデルを利用した。ＭＯＬＭ−１３／ＬＵＣ細胞をドナーＴ細胞及びマトリゲルと混合し、研究の０日目にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に移植した。グループあたり１０匹のマウスのグループの動物に、研究０、４、及び８日目に全容量２００μｌ中１５、３及び０．６μｇのタンパク質の用量で、ビヒクル、ＴＲＩ１２９又はＴＲＩ１３０と共に１匹のドナーからのＴ細胞で処置した。研究中、経時的に腫瘍成長をノギスで測定し、マウスがエンドポイントに達した各時点で生存事象を記録し（腫瘍体積１５００ｍｍ３以上）、安楽死させた。図８及び図９に示すように、ドナーＴ細胞の非存在下でＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０の影響は最小限であり、ドナーＴ細胞のみによる腫瘍成長に対するＴ細胞の影響は最小限であった。ドナーＴ細胞の存在下で試験した全用量で、ＴＲＩ１２９とＴＲＩ１３０の両方での処置後に、腫瘍成長の顕著な阻害が見られた。生存曲線の比較のためのログランク検定と共にカプラン・マイヤー生存解析を用いて、マウスの生存期間中央値の顕著な違いを決定した。図１０に示すように、共移植ヒトＴ細胞の存在下で、ＴＲＩ１２９及びＴＲＩ１３０の全ての試験用量で処置したマウスの生存期間は、全対照グループに対して顕著に延びた。ビヒクル処置でのＴ細胞の共移植も、ヒトＴ細胞の非存在下でのＴＲＩ１２９又はＴＲＩ１３０での腫瘍の処置も、腫瘍細胞のみを移植し、ビヒクルで処置したマウスと比較して、生存期間は延長しなかった。この結果から、ＴＲＩ１２９とＴＲＩ１３０の両方が、急性骨髄性白血病の異種移植モデルにおいて腫瘍成長の阻害及び生存期間の延長を促進できることが実証される。
【０２６２】
実施例１２：ＴＲＩ１３０はＣＤ１２３発現細胞株に特異的である
ＴＲＩ１３０の特異性を確認し、異なるレベルのＣＤ１２３を発現する腫瘍細胞株に対するその細胞傷害活性を比較するために、クロム５１放出アッセイを用いて、Ｔ細胞によって誘導される標的細胞溶解を定量化した。ＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ−１３及びＫＧ−１ａ  ＡＭＬ腫瘍細胞株に対するＣＤ１２３発現レベルを、フローサイトメトリーによってＣＤ１２３陰性Ｄａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株と比較した。ＣＤ１２３発現を、市販のヒトＣＤ１２３フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体を用いて検出した。陽性ＣＤ１２３発現は、ＭＯＬＭ−１３及びＫＧ−１ａ上で検出されたが、Ｄａｕｄｉ細胞上では検出されなかった。ＭＯＬＭ−１３及びＫＧ−１ａ細胞は、それぞれ平均して細胞あたり１０，０００及び２，０００個の受容体を発現した（データ示さず）。異なる濃度のＴＲＩ１３０を、ＭＯＬＭ−１３、ＫＧ−１ａ又はＤａｕｄｉ細胞株とインキュベートし、ヒト末梢血から新たに単離したヒトＴ細胞を精製し、次いで、２４時間、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８結合ビーズと事前活性化した。ＴＲＩ１３０は、ＣＤ１２３発現について陽性である細胞株においてのみ細胞傷害を誘導し、ＭＯＬＭ−１３とＫＧ−１ａ  ＡＭＬ腫瘍細胞株の間で同等の効力を実証した（図１２）。細胞傷害を、４時間及び２４時間の時点でクロム５１放出アッセイを用いて推定した特異的腫瘍細胞溶解の割合として測定した（データ示さず）。これらの結果から、ＴＲＩ１３０によって誘導されたリダイレクトＴ細胞細胞傷害が、ＣＤ１２３発現標的細胞に特異的であることが確認され、異なるレベルのＣＤ１２３タンパク質を発現するＡＭＬ腫瘍細胞株に対して強力なＴＲＩ１３０細胞傷害を実証する。
【０２６３】
実施例１３：未処理Ｔ細胞を用いた異なるエフェクター対標的細胞比でのＴＲＩ１３０誘導性細胞傷害
異なるエフェクター対標的細胞比でＴＲＩ１３０誘導性細胞傷害活性を調べるために、中程度のレベルのＣＤ１２３を発現するＫＧ−１ａ細胞を、異なる濃度のＴＲＩ１３０とインキュベートし、事前活性化されていない５人の異なるヒトドナーからＴ細胞を精製した。ＫＧ−１ａ標的細胞を、１０：１、５：１及び１：１のエフェクター対標的細胞比でＴ細胞と培養した。全てのエフェクター対標的細胞比でのＴＲＩ１３０誘導性細胞傷害活性は、全５人のドナー間で同等であった（データ示さず）。細胞傷害を、特異的腫瘍細胞溶解の割合として測定し、２４時間のクロム５１放出アッセイを用いて推定した。これらの結果から、有力なＴＲＩ１３０は、未処理Ｔ細胞を用いて、異なるエフェクター対標的細胞比で細胞傷害を誘導し、正常ドナー間での活性の変動は最小限であることが実証される。
【０２６４】
実施例１４：カニクイザルにおける単回用量の薬物動態研究及び耐容性研究
単回用量の薬物動態研究及び耐容性研究を行い、ＴＲＩ１３０の静脈内投与後の耐容性、免疫原性及び薬物動態学的特性を決定した。研究計画を表１１に示す。意図されたヒト投与経路であるので、静脈内投与経路を本研究のために選択した。
【０２６５】
ＮＨＰ  ＣＤ３εへの結合を、単一特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合形式で抗ＣＤ３結合ドメインを用いて決定した。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｆｃを、フローサイトメトリーによってチャイニーズカニクイザルのＴ細胞において試験した。個々のサルで結合レベルは変化し、ヒト細胞と比較して高い、中程度又は低いレベルの結合を示した（データ示さず）。
【０２６６】
【表１３】
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ａ  ３６日目に動物を研究から解放した。
ｂ  グループ１及び２の投与を、グループ間で遅れることなく、継続的に開始した。投与は、グループ２の第３の動物の終わり及びグループ３の第１の動物の開始から２時間遅れた。グループ４の投与は、グループ１の投与の開始から２４時間遅れた。
【０２６７】
以下のパラメータ及びエンドポイントを、単回用量ＮＨＰ研究において評価した：臨床徴候、体重、摂餌量、臨床病理学的パラメータ（血液学、凝固、及び臨床化学）、薬物動態（ＰＫ）、免疫原性、サイトカインプロファイル、及びフローサイトメトリー。
【０２６８】
試験した投与レベルは、予想される最大のヒト用量から予想されるヒト用量の高い倍数の範囲であった（表１２）。ヒトにおいて予測される薬理学的活性用量（ＰＡＤ）は、インビボ異種移植モデルに基づく０．４ｍｃｇ／ｋｇの範囲内であり（実施例１１）、グループ２の用量の６２５倍下回る。しかしながら、インビトロ活性アッセイ（Ｔ細胞活性化、増殖及びサイトカイン放出）に基づくと、ヒトＴ細胞の応答と比較して、カニクイザルＴ細胞のＴＲＩ１３０への応答は１０〜１００倍低下する。したがって、グループ２の用量は、生物製剤の約６．２５〜６２．５倍でヒトＰＡＤと等しくなると予想される。グループ３及び４は、後者の用量の２〜４倍過剰であると評価される。
【０２６９】
ＴＲＩ１３０は、Ｔ細胞上でＣＤ３と、かつ高レベルのＣＤ１２３を発現するが、循環白血球の１％未満を構成する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及び好塩基球を含む免疫細胞集団上で標的分子ＣＤ１２３と相互作用する。ＣＤ１２３を標的にする他の二重特異性分子について記載されている公開データに、顕著なサイトカイン放出が記述された（Ｃｈｉｃｈｉｌｉら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  ２７；７（２８９）：２８９ｒａ８２）。
【０２７０】
サイトカイン放出の予想により、本研究を２フェーズで実施した。フェーズＩにおいて、処置グループ２〜４を含むフェーズＩＩの適切な用量レベルを決定するために、２匹のセンチネル動物にＴＲＩ１３０を与えた。（最初にフェーズＩＩの中間用量レベルとして予測された）０．０５ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、第１のセンチネルのために選択し、この動物を、投与後観察、体温、及びサイトカイン分析のための血液試料の収集を含めて、サイトカイン放出症候群の兆候について綿密に監視した。該用量は十分に耐容性を示し、２４時間後、第２のセンチネル動物に、また十分に耐容性を示す（最初にフェーズＩＩの高用量レベルとして予測された）０．２５ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０２７１】
フェーズＩＩの用量レベルを、ＴＲＩ１３０に対する段階的応答をもたらす試みで選択し、フェーズＩセンチネルの結果を組み入れた。センチネル動物によってフェーズＩの用量レベルが十分に耐容性を示し、異常な臨床観察、サイトカイン放出レベルの上昇、又は体温上昇がなかったので、選択されるフェーズＩＩ用量レベルは、予想されるヒトＰＡＤ等価物の２５００倍である０．２５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇであった（表１２）。この差を活性の最大１００倍の違いまで調節したので、この研究ではヒトＰＡＤよりも２５倍高い用量まで達した。
【０２７２】
【表１４】
2019531764.tif 000069
【０２７３】
カニクイザルにおける単回用量ＴＲＩ１３０の薬物動態
ＴＲＩ１３０を捕捉するためのＣＤ１２３の細胞外ドメイン、及び結合したＴＲＩ１３０を検出するための抗ＣＤ３結合ドメインを認識するビオチン化抗ＩＤ抗体（５Ｈ５）を用いる標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて、血清濃度を決定した。ほとんどの動物にとって、遅い時点での血清濃度の急速な低下は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在に相当した。ＴＲＩ１３０＋／−ビオチンを用いる標準的な架橋ＥＬＩＳＡを用いて、遅い時点で収集した血清試料中のＡＤＡ力価を測定した。ＴＲＩ１３０で処置した９匹中７匹の動物のＡＤＡ力価は比較的低く、力価の値は、経時的に増加する傾向にあった（データ示さず）。しかしながら、力価はまた、ＴＲＩ１３０の用量の増加と共に減少するように思われ、ＡＤＡの開始は高用量では遅く、通常、予想されるように、より高い用量は免疫原性のレベルの増加と相関しないことを意味した。ＴＲＩ１３０はヒトタンパク質であるので、ＮＨＰ血清試料における遅い時点でのＡＤＡの検出は正常応答とみなされ、ＮＨＰにおける免疫原性はヒト応答を予測しない。
【０２７４】
ＥＬＩＳＡアッセイで検出された血清濃度の非コンパートメント解析（ＮＣＡ）により、１ｍｇ／ｋｇで投与した動物において最大８４時間までのＴＲＩ１３０の平均終末半減期を計算した（表１３）。個々に、グループ４の１匹の動物は、ＴＲＩ１３０の明らかな皮下蓄積を有したが、このグループの別の動物は、ＡＤＡの顕著な初期誘導があり、半減期がはるかに短かった。まばらなサンプリング及び均一な重み付けをＮＣＡのために使用し、ＡＤＡが明らかに影響した血清濃度を解析から除外した。
【０２７５】
【表１５】
2019531764.tif 000070
【０２７６】
ＮＣＡに加えて、適切な投与及び重み付けスキームと共に、事前にコンパイルされたＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）２コンパートメントモデルを用いて、コンパートメント解析を個々の動物及び処置グループについて行った。結果は図１３に示してあり、ＮＣＡパラメータ推定値と類似しており、顕著なＡＤＡ又は部分皮下投与していないグループ４の１匹の動物（４００３）の半減期はほぼ８９時間であると決定された。グループ４の動物４００２では、経時的に血清薬物レベルが徐々に増加し、Ｔｍａｘは６時間であった（表１４）。したがって、そのデータを、ＩＶボーラス投与の代わりに、血管外投与用の２コンパートメントモデルを用いて最も良く適合させた。
【０２７７】
ＮＣＡ又はコンパートメント解析を用いて決定したＰＫパラメータ推定値は、おそらく、ＴＲＩ１３０の標的媒介性結合により、用量の増加と共に半減期は増加し、クリアランスは減少するという点で、処置群間で類似していなかった。
【０２７８】
【表１６】
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＊ＴＲＩ１３０用量ＳＣの少なく一部を与え、パラメータ推定値を、ＳＣモデルを用いて解析した。
グループ平均を、まばらなサンプリング及び適切な重み付けで、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）事前コンパイルモデル番号７を用いて解析した。
Ｖ１：第１の（中心）コンパートメントの体積
ＣＬ：中心又は第１のコンパートメントからのクリアランス
Ｖ２：第２のコンパートメントの体積
ＣＬＤ２：第２のコンパートメントからのクリアランス
ＡＵＣ：濃度−時間曲線下面積
アルファＨＬ：マクロ定数アルファと関連する半減期
ベータＨＬ：マクロ定数ベータと関連する半減期
Ｃｍａｘ：最大観測濃度
【０２７９】
カニクイザルにおける単回用量ＴＲＩ１３０の耐容性
カニクイザルへのＴＲＩ１３０の単回用量投与は、１ｍｇ／ｋｇ以下の用量レベルで臨床的に、十分に耐容性を示した。これらの用量では、臨床所見又は体重の変化、摂餌量、臨床化学又は凝固パラメータに関連する試験品はなかった。
【０２８０】
ＴＲＩ１３０の投与は、末梢血のリンパ球の減少と関連した（図１４）。ＴＲＩ１３０に関連する一過的なリンパ球の減少が、全用量での投与後２時間の時点で観察された。加えて、血液学的検査によってグループ２及び３の好塩基球数の低下がみられ（図１５）、ビヒクル対照と比較して、ベースラインレベルに戻る時間がわずかに長かった（グループ１）。リンパ球及び好塩基球の平均低下はグループ４でより低く、反応が制限された１匹の動物、及び静脈内注射よりはむしろ明らかに皮下注射を受けた１匹の動物に部分的に起因するものであり、したがって、グループ４を、図１４及び１５に示す平均リンパ球データ及び好塩基球データから除外した。ＴＲＩ１３０を投与した全グループは、ビヒクル対照グループと比較して好塩基球が増加した（データ示さず）。血液学パネルで指摘された変化は、投与後約１週間でほとんどベースラインレベルに戻った。
【０２８１】
ＴＲＩ１３０の投与は、ＣＲＰを含む臨床化学における変化又は凝固パラメータの変化に関連しなかった。
【０２８２】
血清サイトカイン測定により、Ｔ細胞サイトカインＩＬ−１０及びＩＬ−２並びにＭＣＰ−１などの二次サイトカインを含むいくつかのサイトカインにおいて最小の急上昇が示された。検出されたサイトカインのピークレベルは、投与後２又は６時間の時点であった。全体で、ビーズベースのマルチプレックスサイトカインキットを用いて、Ｔ特異的サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＴＮＦαなど）、及び他の細胞型によって作られたサイトカイン（ＭＣＰ−１など）を含む２３種の個々のサイトカインレベルを決定した。本研究で検出されたサイトカインの例を表１５に示す。とりわけ、１ｍｇ／ｋｇ用量で検出されたレベルは、中程度及び低い用量群よりも低かったが、より多くの正常ＩＶボーラス薬物動態パラメータを有する動物４００３は、他のグループとより類似した応答を有した。明らかな皮下用量を有するグループ４の他の動物（４００２）は、いくつかのサイトカインについてピーク応答が遅れ、より遅いＴｍａｘと一致した。概して、サイトカインレベルは、投与後９６時間までにベースラインレベルに戻った。最小サイトカイン分泌は、観察可能な臨床的投与後事象又は体重若しくは食物摂取量の変化に直接つながらなかった（上記のとおり）。サイトカイン分泌は、ＴＲＩ１３０の作用機序と一致し、標的タンパク質（ＣＤ１２３）が存在する場合、このシステムにおいてＴ細胞のある程度の活性化をもたらす。
【０２８３】
単回静脈内（遅いボーラス）注射によるＴＲＩ１３０の投与は、０．２５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇのレベルでカニクイザルにおいて十分に耐用性を示した。これらの結果に基づき、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は１ｍｇ／ｋｇとみなされた。ＴＲＩ１３０の血清半減期の推定値は８４時間で、高用量群においてクリアランス及び分布量は正常であった。より低い用量は、クリアランスがより速く、半減期の推定値がより短いことから、カニクイザルにおける標的細胞へのＴＲＩ１３０の標的媒介性結合が示唆された。これらの観察は、カニクイザルでの２８日の反復投与ＧＬＰ毒性研究において確認され、より高い用量レベルまで拡張される。
【０２８４】
【表１７】
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＊＊動物４００２のＴＲＩ１３０の血清濃度Ｔｍａｘは６時間であり、皮下投与経路が示唆され、該動物においてＴＲＩ１３０のより遅い蓄積が示された。この動物のピークサイトカインレベルは、他の動物と比較していくぶんか遅れた。
【０２８５】
実施例１５：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の播種性異種移植マウスモデルにおけるＴＲＩ１３０の治療有効性
確立した播種性腫瘍を有するマウスにおけるＴＲＩ１３０の治療有効性を調べるために、ヒト急性骨髄性白血病のげっ歯類モデルを利用した。ホタルルシフェラーゼを発現するように改変されたＭＯＬＭ−１３細胞を用いて、生物発光イメージングによる腫瘍定量化を可能にした。本研究のために、１００，０００  ＭＯＬＭ−１３  Ｌｕｃ細胞を、２４匹のＮＳＧ雄マウスの外側尾静脈に静脈内注射した。ＭＯＬＭ−１３  Ｌｕｃ細胞は、処置開始前の４日間、マウス内で確立させた。マウスを各８匹の３グループに割り当てた。１つのグループに、対照としてさらなる処置を施さなかった。残りの２グループに、第１の処置で７００万個のヒトＴ細胞を投与した。処置は、４、８及び１２日目で、ＰＢＳビヒクル対照又は３μｇのＴＲＩ１３０からなっていた。処置は、尾静脈を介して静脈内に施した。分子を含有しない（ビヒクル対照）又は３μｇのＴＲＩ１３０を含有する０．２ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置剤を送達した。注射液には、４日目の処置のみ、７００万個の精製ヒトＴ細胞を含んでいた。ＴＲＩ１３０処置は、骨格腫瘍量に急激で顕著な低下をもたらした（図１６、図１７及び表１６）。残存非骨格腫瘍量は、ＴＲＩ１３０処置後も増えた。剖検及び本研究の終了時に、この残存腫瘍量が雄の生殖管と関連し、ビヒクルとＴＲＩ１３０の両方のグループにおいて骨格腫瘍量の有無の間の主な違いとして観察されたと決定付けた。雄マウスにおける確立された播種性ＭＯＬＭ−１３  Ｌｕｃ腫瘍のＴＲＩ１３０での処置は、Ｔ細胞単独の対照に対して、腫瘍量の有意な（ｐ＜０．０００１）低下をもたらした（表１６）。ＭＯＬＭ−１３  Ｌｕｃ単独のグループとビヒクル対照グループの間に顕著な違いはなかった。腫瘍量分布は、ＴＲＩ１３０処置によって変わり、骨格部位では生物発光シグナルが消えた。
【０２８６】
【表１８】
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＊ｐ−値＜０．０５の有意差を示す。
【０２８７】
実施例１６：抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３  ＭＧＤ００６様分子の構築
ＴＲＩ１３０活性と別の二重特異性形式を比較するために、Ｃｈｉｃｈｉｌｉら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  ２７；７（２８９）：２８９ｒａ８２に報告された形式で、精製を可能にするためにアビジン−Ｆｌａｇ−ＨＩＳ配列が付加されたＷＯ  ２０１５／０２６８９２から取得したＭＧＤ００６のＣＤ１２３及びＣＤ３結合ドメイン配列（核酸配列は配列番号２及び４に対応し、アミノ酸配列は配列番号１及び３に対応する）を含有する抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３二重特異性分子を作製した。得られたＭＧＤ００６様構築物をＴＲＩ１６８と呼ぶ。
【０２８８】
実施例１７：ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８に応答するヒトＴ細胞活性化、細胞傷害及びサイトカイン放出
インビトロでＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８タンパク質の活性を比較するために、Ｔ細胞を、正常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、ＣＤ１２３＋腫瘍細胞（ＭＯＬＭ−１３）の存在下で様々な濃度のＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８とインキュベートした。
【０２８９】
Ｔ細胞活性化を、フローサイトメトリーによって、培養の２４時間後に評価した。遠心分離し、上清を除去した後、細胞ペレットを、以下の色素標識抗体：ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ８−パシフィックブルー、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、及び７ＡＡＤの混合物に５０μｌ容量で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでの各ウェルの５０％取得の直前に１２０μｌ容量に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、試料ファイルを分析し、ＣＤ６９及びＣＤ２５が上方制御されたＣＤ４＋（ＣＤ８−）又はＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合を、前方散乱対側方散乱で、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋  ＣＤ４＋又は７ＡＡＤ−  ＣＤ５＋  ＣＤ８＋）を順次ゲーティングすることによって計算した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム７．０を用いてグラフをプロットした。ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８は、試験した両方のドナーを用いて、ＣＤ１２３＋標的細胞の存在下で類似の用量依存性Ｔ細胞活性化を誘導した（表１８）。この図は、ＣＤ６９及びＣＤ２５陽性のＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合を示す。ＥＣ５０値を、ＣＤ４＋とＣＤ８＋のＣＤ２５＋  ＣＤ６９＋の両方の集団についてＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８を用いて決定し、両方の分子について類似の抗力が実証された。ＣＤ１２３＋標的細胞の非存在下では、Ｔ細胞活性化は観察されなかった（示さず）。
【０２９０】
Ｍｏｌｍ−１３細胞傷害を、上記のように、フローサイトメトリーによって培養２４時間後に評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、試料ファイルを分析し、前方散乱対側方散乱で、７ＡＡＤ−、ＣＤ５−細胞を順次ゲーティングすることによって細胞傷害を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム７．０を用いてグラフをプロットした。ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８は、試験した両方のドナーを用いて、類似の用量依存性Ｍｏｌｍ−１３細胞傷害を誘導した（図１９）。この図は、精製したＴ細胞、ＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８と共に、培養２４時間後の生存可能なＭｏｌｍ−１３細胞の合計数を示す。
【０２９１】
２４時間の培養上清における、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−１０を含む活性化Ｔ細胞によって一般的に生成される選択されたサイトカインのサブセットのレベルを、マルチプレックス検体アッセイを用いて測定した。ＴＲＩ１６８は、ＣＤ１２３＋Ｍｏｌｍ−１３標的細胞の存在下で、試験した両方のドナーを用いて、ＴＲＩ１３０と比較してより高いレベルのサイトカイン分泌を誘導した（図２０）。
【０２９２】
高レベルのＣＤ１２３を発現する形質細胞様樹状細胞及び好塩基球を含む稀な正常免疫細胞集団は、ＰＢＭＣ試料中に存在し、抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３二重特異性分子の標的を表す。外部から標的細胞を添加しない場合のＴＲＩ１３０及びＴＲＩ１６８によって誘導されるサイトカイン分泌のレベルを調べるために、正常ドナーのＰＢＭＣを様々な濃度のタンパク質とサイトカインの両方と２４時間培養し、マルチプレックス検体アッセイを用いて、得られた上清において測定した。精製したＴ細胞及びＭＯＬＭ−１３細胞との培養と同様に、ＴＲＩ１６８は、ＴＲＩ１３０と比較してより高いレベルのＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−１０を誘導した（図２１）。
【０２９３】
まとめると、これらの結果から、ＴＲＩ１３０及びＭＧＤ００６様抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３二重特異性ＴＲＩ１６８による外部添加ＣＤ１２３＋腫瘍細胞のインビトロＴ細胞活性化及び細胞傷害が、同等であることが実証される。とりわけ、ＴＲＩ１６８は、ＴＲＩ１３０と比較して、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞を有する精製Ｔ細胞と正常ドナーＰＢＭＣ試料の両方の培養物において、はるかにより高いレベルの分泌Ｔ細胞サイトカインを誘導した。診療所では、強いＴ細胞活性化を誘導する薬物は、過剰サイトカイン放出による「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）と呼ばれる一連の有害事象を引き起こし得る。放出されたサイトカインは、全身性炎症反応を引き起こし、薬物投与を制限し得る生命を脅かす合併症につながり得る。
【０２９４】
実施例１８：ＡＭＬ細胞試料のＴＲＩ１３０誘導性細胞傷害
ＴＲＩ１３０が原発性ＡＭＬ細胞において細胞傷害を誘導できるかどうかを決定するために、ＡＭＬ対象からのＰＢＭＣ試料を、様々な濃度のＴＲＩ１３０と数日間培養した。ＡＭＬの細胞傷害を、培養４日後に、フローサイトメトリーによって評価した。遠心分離し、上清を除去した後、細胞ペレットを、以下の色素標識抗体：ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、ＣＤ５−ＡＰＣ、ＣＤ１９−パシフィックブルー、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、及び７ＡＡＤの混合物に５０μｌ容量で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでの各ウェルの５０％取得の直前に１２０μｌ容量に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、試料ファイルを分析し、前方散乱対側方散乱で、７ＡＡＤ−、ＣＤ５−、ＣＤ１９−、ＣＤ２５−細胞を順次ゲーティングすることによって、非Ｂ細胞、非Ｔ細胞コンパートメントにおいて細胞傷害を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム７．０を用いてグラフをプロットした。ＴＲＩ１３０は、試験した両方のドナーにおいて、非Ｂ細胞、非Ｔ  ＡＭＬ細胞試料の用量依存性喪失を誘導した（図２２）。この図は、培養９６時間後、生存可能な非Ｂ細胞、非Ｔ細胞の合計数を示す。類似の結果が、２４時間及び４８時間の時点で得られた（データ示さず）。これらの結果から、ＴＲＩ１３０が、原発性ヒトＡＭＬ  ＰＢＭＣ試料の培養物において細胞傷害を誘導できることが実証される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019531764.tif 000089
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2019531764.tif 000092
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2019531764.tif 000095
【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月4日(2019.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019531764000001.app
【国際調査報告】
2019531764.tif 000097
2019531764.tif 000098
2019531764.tif 000099