(57)【要約】  セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼなどの多糖分解酵素を発現するように、および必要に応じてそれらを分泌するように、遺伝子改変された乳酸（ＬＡ）利用細菌、ならびにその使用が提供される。多糖分解酵素は、有機廃棄物を処理するのに有利であり、その結果、工業的発酵プロセス（特に、個別の乳酸エナンチオマー（複数可）の工業生産）において基質として有機廃棄物を使用できる。ＬＡ利用細菌を遺伝子改変するのに有用なベクターとコンストラクトも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された乳酸（ＬＡ）利用細菌であって、前記１種以上の外因性の多糖分解酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを含む、ＬＡ利用細菌。
【請求項２】
前記多糖分解酵素が、細菌の酵素である、請求項１に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項３】
前記細菌の多糖分解酵素が、好熱性細菌に由来する、請求項２に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項４】
前記好熱性細菌が、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、パエニバチルス属の種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ゲオバチルス属の種（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、クロモハロバクター属の種（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）およびロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）からなる群より選択される、請求項３に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項５】
前記細菌の多糖分解酵素が、中温細菌に由来する、請求項２に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項６】
前記中温細菌が、クレブシエラ属の種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、コーネラ属の種（Ｃｏｈｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アセチビブリオ・セルロリチカス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）およびラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）からなる群より選択される、請求項５に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項７】
前記多糖分解酵素が、真菌の酵素である、請求項１に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項８】
前記真菌の酵素が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・フェルタナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｅｌｌｕｔａｎｕｍ）およびサーモマイセス・ラヌギノス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕ）からなる群より選択される真菌に由来する、請求項７に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項９】
前記多糖分解酵素が、前記ＬＡ利用細菌の増殖に適しているのと同じ温度とｐＨの範囲において好適な活性を有する、請求項１に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項１０】
前記多糖分解酵素が、前記ＬＡ利用細菌の好適な増殖温度よりも高い温度において好適な活性を有する、請求項１に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項１１】
前記多糖分解酵素が、前記ＬＡ利用細菌の好適な増殖ｐＨよりも高い、または低い、ｐＨにおいて好適な活性を有する、請求項１に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項１２】
前記ＬＡ利用細菌が、プロピオニバクテリウム属の種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、メガスフェラ属の種（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、セレノモナス属の種（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）およびベイロネラ属の種（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）からなる群より選択される、請求項１に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項１３】
前記ＬＡ利用細菌が、プロピオニバクテリウム属の種である、請求項１２に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項１４】
前記プロピオニバクテリウム属の種が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である、請求項１３に記載のＬＡ利用細菌。
【請求項１５】
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを含む複数の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された乳酸（ＬＡ）利用細菌の集団であって、前記集団は、ＬＡ利用細菌の亜集団を複数含み、各亜集団は、異なる多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されている、ＬＡ利用細菌の集団。
【請求項１６】
前記多糖分解酵素が、細菌の酵素である、請求項１５に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項１７】
前記多糖分解酵素が、好熱性細菌に由来する、請求項１６に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項１８】
前記好熱性細菌が、クロストリジウム属の種、パエニバチルス属の種、サーモビフィダ・フスカ、バチルス属の種、ゲオバチルス属の種、クロモハロバクター属の種およびロドサーマス・マリナスからなる群より選択される、請求項１７に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項１９】
前記多糖分解酵素が、中温細菌に由来する、請求項１６に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２０】
前記中温細菌が、クレブシエラ属の種、コーネラ属の種、ストレプトマイセス属の種、アセチビブリオ・セルロリチカス、ルミノコッカス・アルブス、バチルス属の種およびラクトバチルス・ファーメンタムからなる群より選択される、請求項１９に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２１】
前記多糖分解酵素が、真菌の酵素である、請求項１５に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２２】
前記真菌の酵素が、トリコデルマ・リーゼイ、フミコーラ・インソレンス、フサリウム・オキシスポラム、アスペルギルス・オリゼ、ペニシリウム・フェルタナムおよびサーモマイセス・ラヌギノスからなる群より選択される真菌に由来する、請求項２１に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２３】
前記亜集団が、同じ細菌種の亜集団である、請求項１５に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２４】
前記亜集団が、異なる細菌種の亜集団である、請求項１５に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２５】
前記ＬＡ利用細菌が、プロピオニバクテリウム属の種から選択される、請求項１５に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２６】
前記プロピオニバクテリウム属の種が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである、請求項２５に記載のＬＡ利用細菌の集団。
【請求項２７】
有機廃棄物を処理するための方法であって、
前記方法は、前記有機廃棄物を、請求項１に記載のＬＡ利用細菌と、または請求項１５に記載の乳酸利用細菌の集団と、前記ＬＡ利用細菌によって乳酸が消費される条件であって前記多糖分解酵素の発現および活性に適している条件の下で接触させることを含み、
前記処理は、前記有機廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去し、且つ前記廃棄物中の多糖を分解して可溶性の還元糖を遊離させる、
方法。
【請求項２８】
前記廃棄物からの乳酸の除去が、可溶性の還元糖への多糖の分解と同時に行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記廃棄物からの乳酸の除去が、可溶性の還元糖への多糖の分解の前に行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記多糖分解酵素が、前記ＬＡ利用細菌の好適な増殖温度よりも高い温度において好適な活性を有し、
前記方法が、（ｉ）前記ＬＡ利用細菌の増殖および前記多糖分解酵素の発現に適している第１の温度において前記有機廃棄物を、前記廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、前記ＬＡ利用細菌と接触させることと、（ｉｉ）前記多糖分解酵素の活性に適している第２の温度まで温度を上昇させることと、を含む、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記多糖分解酵素が、前記ＬＡ利用細菌の好適な増殖ｐＨよりも高い、または低い、ｐＨにおいて好適な活性を有し、
前記方法が、（ｉ）前記ＬＡ利用細菌の増殖および前記多糖分解酵素の発現に適している第１のｐＨにおいて前記有機廃棄物を、前記廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、前記ＬＡ利用細菌と接触させることと、（ｉｉ）前記多糖分解酵素の活性に適している第２のｐＨにｐＨを調整することと、を含む、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触の前に前記有機廃棄物中のデンプン、セルロースおよびヘミセルロースのうちの少なくとも１つのパーセンテージを決定することと、前記有機廃棄物と接触させるＬＡ利用細菌またはＬＡ利用細菌の集団を、決定されたパーセンテージに応じて選択することと、をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記決定が、可溶性の還元糖のパーセンテージを決定することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記処理が、１つの容器内で実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
有機廃棄物から個別の乳酸エナンチオマーを生産するための方法であって、
（ｉ）前記有機廃棄物を、請求項１に記載のＬＡ利用細菌と、または請求項１５に記載のＬＡ利用細菌の集団と、前記ＬＡ利用細菌による乳酸の消費ならびに前記多糖分解酵素の発現および活性に適した条件の下で接触させることによって前記有機廃棄物を処理して、前記廃棄物中に存在するＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはそれらの組み合わせを除去するとともに前記廃棄物中の多糖を分解して可溶性の還元糖を遊離させることと、
（ｉｉ）前記ＬＡ利用細菌を不活性化することと、
（ｉｉｉ）Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸のうちの一方のみを産生する乳酸生成微生物を用いて、（ｉ）で得られた可溶性の還元糖を発酵させて個別の乳酸エナンチオマーを得ることと、
（ｉｖ）発酵ブロスから前記個別の乳酸エナンチオマーを回収することと、
を含む、方法。
【請求項３６】
前記廃棄物中に存在するＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはそれらの組み合わせの除去が、前記廃棄物中の多糖の分解と同時に、または逐次に、行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
有機廃棄物からポリ乳酸を生産するための方法であって、請求項３５に記載の方法によって個別の乳酸エナンチオマーを生産することを含み、前記個別の乳酸エナンチオマーをポリ乳酸に重合することをさらに含む、方法。
【請求項３８】
プロピオン酸菌による外因性の多糖分解酵素の発現および分泌のための発現ベクターであって、
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、
少なくとも１つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする少なくとも１つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも１つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも１つの発現カセットと、
を含む発現ベクター。
【請求項３９】
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号８４の核酸配列を含む、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
前記プロモーターの核酸配列が、配列番号２７〜３２およびそれらのホモログからなる群より選択される、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
前記ＳＰのアミノ酸配列が、配列番号８７〜１７９の配列からなる群より選択される、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４２】
前記多糖分解酵素の配列が、配列番号１４〜２６およびそれらのホモログからなる群より選択される、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４３】
前記発現カセットが、配列番号３３〜４９またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表される核酸配列を含む、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４４】
前記発現カセットが、配列番号３３〜４９のうちのいずれか１つによって表される核酸配列からなる、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４５】
請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、プロピオニバクテリウム属の乳酸（ＬＡ）利用細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼなどの多糖分解酵素を分泌するように遺伝子改変された、二通りに作用する乳酸（ＬＡ）利用細菌に関し、これらは、有機廃棄物を処理して廃棄物中に存在する乳酸を除去するとともに複合多糖を分解し、従って、特定の乳酸のエナンチオマー（複数可）を含む、様々な生化学物質を生成する工業的発酵プロセスのための基質を提供するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
乳酸発酵（すなわち微生物発酵を介した炭水化物源からの乳酸の生産）は、バイオプラスチックの製造において乳酸を構成単位として使用できるため、近年注目を集めている。乳酸を重合させて、生分解性でリサイクル可能なポリエステルであるポリ乳酸（ＰＬＡ）を形成させることができ、これは、石油から製造されるプラスチックの有望な代替物と考えられている。ＰＬＡは、食品包装、使い捨て用品、織物の繊維および衛生用品産業などを含む、様々な製品の製造において使用される。
【０００３】
発酵バイオプロセスによる乳酸の生産は、環境問題、コストおよび鏡像異性的に純粋な乳酸を化学合成によって生成することの困難性を含む、様々な検討事項に関して化学合成法よりも好ましく、これは、大部分の工業用途に望ましい。従来の発酵プロセスは通常、炭水化物発酵の主要代謝最終生成物として乳酸を産生する乳酸生成微生物（例えば、ラクトバチルス属の種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の細菌）によるバッチ式、流加式、連続式または半連続式のリアクター中での嫌気性発酵に基づく（Ａｂｄｅｌ−Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，  ３１：８７７−９０２；Ｇｈａｆｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ７（２）：２２２−２２９）。ＰＬＡの製造のために、発酵中に生成された乳酸は、様々なプロセス（例えば、溶媒抽出、電気透析、蒸留または１つ以上のプロセスの組み合わせを伴うプロセス）によって発酵ブロスから分離される。精製された乳酸は、その後、重合に供される。
【０００４】
乳酸は、キラル炭素原子を有し、従って２種のエナンチオマー形態（Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸）で存在する。工業用途に適しているＰＬＡを生成するためには、重合プロセスは、一方のエナンチオマーのみを利用すべきである。不純物またはＤ−乳酸とＬ−乳酸のラセミ混合物の存在は、望ましくない特性（低い結晶化度および低い融解温度など）を有するポリマーをもたらす。従って、Ｌ−乳酸エナンチオマーのみ、またはＤ−乳酸エナンチオマーのみを産生する乳酸菌が必要とされる。
【０００５】
現在利用可能な商業的プロセスでは、炭水化物源は通常、デンプンを含有する再生可能資源（トウモロコシおよびキャッサバの根など）である。セルロースが豊富なサトウキビバガスなど、さらなる資源も提案されている。典型的には、乳酸菌は、グルコースおよびフルクトースのような還元糖を利用できるが、デンプンおよびセルロースのような多糖を分解する能力を有さない。従って、そのような多糖を利用するためには、プロセスは、典型的には化学的処理と組み合わせて、糖分解酵素を添加して多糖を分解し還元糖を遊離させることを必要とする。
【０００６】
Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，  ７（３−４）：６３−７４は、発酵と化学的プロセスを組み合わせてポリ−Ｌ−ラクテート（ＰＬＬＡ）を生産する、自治体の食品廃棄物のためのリサイクルシステムについて報告している。食品廃棄物は通常、様々な比率の還元糖（グルコース、フルクトース、ラクトース等）、デンプンおよびリグノセルロース系材料を含む。Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．におけるプロセスは、細かく刻まれ、滅菌された食品廃棄物をグルコアミラーゼで処理して食品廃棄物中のデンプンを可溶性のグルコースに分解すること、Ｌ体を形成する乳酸菌を用いたＬ−乳酸発酵、およびＰＬＬＡを得るための精製ステップと重合ステップを伴う。Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．において使用される特定の炭水化物源（すなわち、食品廃棄物）に関しては、最終的な純粋なＬ−乳酸またはＤ−乳酸を得るために除去する必要のある内在性のＤ，Ｌ−乳酸（例えば、乳製品由来のもの）を食品廃棄物が含有するという事実に起因してプロセスが複雑である。従って、Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．におけるプロセスは、乳酸発酵ステップの前に、炭素源として乳酸を消費するプロピオン酸菌による食品廃棄物からの内在性のＤ，Ｌ−乳酸の除去をさらに含んだ。食品廃棄物中の炭素含有量のわずか５０％が、Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．の方法によって利用され、乳酸に変換された。さらに、食品廃棄物は還元糖、デンプンおよびリグノセルロースを含むが、後者は、Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．の方法によっては利用されない。これは、乳酸菌が、この炭水化物源を直接利用できないためである。
【０００７】
ＵＳ７，５０７，５６１は、出発材料として使用される糖蜜またはサトウキビバガスを含む再生可能な農産物原料の発酵からポリ乳酸を生産するためのプロセスを開示する。
【０００８】
ＵＳ８，１１９，３７６は、デンプンが同時的な糖化と発酵のプロセスに供される、乳酸またはその塩の生産のための方法を開示し、この方法は、少なくともグルコアミラーゼを含む培地においてデンプンを糖化すると同時に微生物を用いてデンプンを発酵させることと、必要に応じて培地から乳酸を単離することと、を含み、中程度に好熱性の乳酸生成微生物が使用されることを特徴とする。この発明はさらに、作用ｐＨにおいてその最高性能を有するように適合された、中程度に好熱性の乳酸生成微生物の存在下で前記プロセスを実施する方法に関する。
【０００９】
ＥＰ２８４３０３９は、Ｌ−乳酸生産株においてＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＬＤＨ）の活性を阻害するとともにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＬＤＨ）の活性を導入するように改変されたＤ−乳酸生産株を作製するための方法、上記方法によって作製された変異型Ｄ−乳酸生産株、およびその株を培養するステップと培養培地からＤ−乳酸を回収するステップとを含むＤ−乳酸を生産するための方法を開示する。
【００１０】
ＷＯ２０１１／０９８８４３は、乳酸またはその塩を生産するための手順を開示する。この手順は、デンプン分解酵素を産生する選択された細菌による、同時に行われるデンプン材料からのデンプンの糖化およびそれらの糖の乳酸への発酵を記載する。
【００１１】
Ｍｏｒａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ７９（１７）：５２４２−５２４９は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）へのセルラーゼまたはキシラナーゼをコードする遺伝子の導入、ならびにセルラーゼおよびキシラナーゼの両方を分泌する、２種の株の細胞に基づくコンソーシアム（two-strain cell-based consortium）の確立について報告している。この細胞コンソーシアムの酵素活性が、小麦ワラにおいて評価された。
【００１２】
ＷＯ２０１５０１１２５０は、細菌による目的の物質の産生と分泌のためのベクターおよびその用途を開示する。
【００１３】
ＷＯ２０１５／０９７６８５は、リグノセルロースを処理するための乳酸細胞培養物を開示する。この細菌培養物は、バイオマス組成物、および（ｉ）分泌性セルラーゼを発現するように遺伝子改変された乳酸菌の第１の集団と（ｉｉ）分泌性キシラナーゼを発現するように遺伝子改変された乳酸菌の第２の集団とを含む乳酸菌の集団を含んでよく、第１の集団：第２の集団の比は、培養物中のセルラーゼ：キシラナーゼの比活性が４：１より大きいか１：４より小さいように選択される。
【００１４】
ＷＯ２０１５／０９７６８６は、リグノセルロースからエタノールを生成するための乳酸菌培養物、細胞集団およびそれを含む製品を開示する。
【００１５】
これまでに説明された、再生可能資源から乳酸を生産する方法は、低い炭素−乳酸変換率、多くの別個のステップを必要とする複雑な手順、比較的高いコスト、および利用できる炭水化物源の制限など、いくつかの欠点を有する。さらに、これらの方法のいくつかは、人間の食物として価値の高い原材料を使用するため不利である。
【００１６】
従って、様々な炭水化物含有資源（デンプンの豊富な材料、リグノセルロースの豊富な材料またはそれらの組み合わせを含む有機廃棄物など）を効率的に処理して工業的発酵プロセスにおける使用に適した可溶性の還元糖を大量に得るための細菌、組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１７】
一部の態様によれば、本発明は、１種以上の多糖分解酵素（特に、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼなどのグリコシドヒドロラーゼ）を産生するように遺伝子操作された乳酸（ＬＡ）利用細菌を提供する。遺伝子操作され、二通りに作用する、本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、特定の条件下で、他の還元糖を実質的に利用することなく、選択的に乳酸を消費および代謝するその天然の能力に加えて、有機廃棄物（食品廃棄物および農業廃棄物など）中に見出される複合多糖の分解を促進する。そのような遺伝子操作されたＬＡ利用細菌は、驚くべきことに、廃棄物中に存在する内在性の乳酸の除去とともに廃棄物の糖化を可能にする、有機廃棄物を処理するための改善された手段をもたらす。処理された廃棄物は、その後、工業的発酵プロセスにおいて（特に、乳酸生成微生物による特定の個別の乳酸エナンチオマー（複数可）の生産において）基質として使用できる。
【００１８】
本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、多種多様な食品廃棄物ならびに植物材料および人工材料（紙など）を含む、多種多様な有機廃棄物を処理するのに有利である。一部の実施形態において、本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、商業起源、工業起源および自治体起源の混合食品廃棄物での使用に特に適している。本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、有機廃棄物の効率的で費用対効果の高い処理を可能にし、一部の実施形態によれば、他の方法と比較して向上した炭素−乳酸変換率を特徴とする、乳酸の効率的で費用対効果の高い生産を可能にする。本明細書で開示されるＬＡ利用細菌のさらなる利点は、廃棄物を処理するために使用される際に、プロセスへの外部からの分解酵素の添加をプロセスが必要としないということであり、これは、そのような酵素が細菌によって産生されるためである。従って、（プロセスへの外部からの酵素混合物の添加に伴う）汚染の危険性が著しく低減されるため、そのような外部からの酵素を添加する（すなわち、その中でプロセスが起こる容器に酵素を添加する）必要性を回避することによって、遥かに費用効率が良く、遥かに頑強である有利なプロセスが達成される。さらに、（細菌が産生する分解酵素によって達成される）糖化が粘性を減少させるため、本明細書で開示されるＬＡ利用細菌を廃棄物の処理のために利用することによって、処理された廃棄物の粘性の低下が得られる。これは、より効率的な廃棄物の混合を可能にし、最終産物（乳酸の個別のエナンチオマーなど）の高収量生産をもたらす。
【００１９】
一態様によれば、本発明は、１種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された乳酸（ＬＡ）利用細菌を提供し、ここで、１種以上の外因性の多糖分解酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを含む。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「外因性」なる用語は、ＬＡ利用細菌によって発現される多糖分解酵素に対して適用される際には、その多糖分解酵素が、細菌細胞に導入された外来性の核酸によってコードされるということを意味する。一部の実施形態において、外因性の多糖分解酵素は、細菌に導入された核酸によってコードされ、細菌細胞から分泌されることが可能である。一部の実施形態において、核酸は、細菌において一時的に発現されてもよい（すなわち、細菌に導入される発現ベクターの利用）。一部の実施形態において、核酸は、細菌のゲノムに組み込まれてもよい。一部の実施形態において、外因性の多糖分解酵素は、これらの細菌に天然には見出されないか、それらから天然には分泌され得ない。
【００２１】
本明細書で使用される「多糖分解酵素」は、グリコシドヒドロラーゼ、多糖リアーゼおよび炭水化物エステラーゼからなる群より選択される、糖類（二糖、オリゴ糖、多糖および複合糖質が包含される）の分解を触媒する加水分解酵素（またはその酵素的に活性な部分）を指す。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。本発明で使用するための多糖分解酵素は、有機廃棄物（食品廃棄物および植物材料が包含される）中に見出される糖類（多糖など）に対して活性のあるものから選択される。一部の実施形態において、多糖分解酵素は、改変された酵素（すなわち、改変されており、それらの対応する野生型の酵素とは異なっている酵素）であってもよい。一部の実施形態において、改変は、改善された酵素活性をもたらす１つ以上の変異を含んでもよい。一部の実施形態において、多糖分解酵素は、野生型（ＷＴ）の酵素である。
【００２２】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム属の種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、メガスフェラ属の種（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、セレノモナス属の種（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）およびベイロネラ属の種（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）からなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム属の種である。一部の特定の実施形態では、ＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを含む複数の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された乳酸（ＬＡ）利用細菌の集団を提供し、ここで、この集団は、ＬＡ利用細菌の亜集団を複数含み、各亜集団は、異なる多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されている。
【００２４】
例えば、一部の実施形態では、複数の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたＬＡ利用細菌の集団が提供され、ここで、この集団は、
第１の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたＬＡ利用細菌の第１の亜集団と、
第２の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたＬＡ利用細菌の第２の亜集団と、
第３の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変されたＬＡ利用細菌の第３の亜集団と、
を含み、第１の多糖分解酵素はセルラーゼであり、第２の多糖分解酵素はヘミセルラーゼであり、第３の多糖分解酵素はアミラーゼである。一部の実施形態において、ヘミセルラーゼはキシラナーゼである。
【００２５】
一部の実施形態において、これらの亜集団は、同じ細菌種の亜集団である。他の実施形態では、これらの亜集団は、異なる細菌種の亜集団である。
【００２６】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム属の種、メガスフェラ属の種、セレノモナス属の種およびベイロネラ属の種からなる群より選択される。一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム属の種から選択される。一部の特定の実施形態では、プロピオニバクテリウム属の種は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである。
【００２７】
本発明に従って使用するための多糖分解酵素は、細菌の酵素であってもよい。一部の実施形態において、多糖分解酵素は、好熱性細菌に由来する。一部の実施形態において、好熱性細菌は、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、パエニバチルス属の種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ゲオバチルス属の種（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、クロモハロバクター属の種（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）およびロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）からなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【００２８】
他の実施形態では、多糖分解酵素は、中温細菌に由来する。一部の実施形態において、中温細菌は、クレブシエラ属の種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、コーネラ属の種（Ｃｏｈｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アセチビブリオ・セルロリチカス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、バチルス属の種およびラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）からなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【００２９】
さらなる実施形態では、多糖分解酵素は、真菌の酵素である。一部の実施形態において、真菌は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・フェルタナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｅｌｌｕｔａｎｕｍ）およびサーモマイセス・ラヌギノス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕ）からなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【００３０】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌に導入操作される多糖分解酵素は、それらが、ＬＡ利用細菌の増殖に最適であるのと同じ温度とｐＨの範囲において最適活性を有するように選択される。本明細書で使用される場合、ＬＡ利用細菌の増殖に最適である温度とｐＨの範囲は、ＬＡ利用細菌が炭素源として乳酸を選択的に消費する温度とｐＨも意味する（選択的消費のために特定の条件が必要とされる場合）。
【００３１】
他の実施形態では、多糖分解酵素は、それらが、ＬＡ利用細菌の増殖に最適な温度とｐＨの範囲とは異なる温度および／またはｐＨの範囲において最適活性を有するように選択される。例えば、一部の実施形態では、多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌の最適増殖温度よりも高い温度において最適活性を有する。さらなる実施形態では、多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌の最適増殖ｐＨよりも高い／低いｐＨにおいて最適活性を有する。一部の実施形態において、多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌が不活性化される温度および／またはｐＨの範囲において最適活性を有する。
【００３２】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌は乳酸を、後者が実質的に枯渇するまで選択的に消費でき、その後にしか、還元糖を消費（発酵）できない。
【００３３】
さらなる態様によれば、本発明は、有機廃棄物を処理するための方法を提供し、この方法は、有機廃棄物を、１種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された本発明のＬＡ利用細菌と、ＬＡ利用細菌によって乳酸が消費される条件であって前記１種以上の多糖分解酵素の発現および活性に適している条件の下で接触させることを含み、ここで、前記処理は、有機廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去し、且つ多糖を少なくとも部分的に分解して還元糖を遊離させる。一部の実施形態において、処理は、１つの容器内で実施される（１ポット処理）。
【００３４】
さらなる態様によれば、本発明は、有機廃棄物を処理するための方法を提供し、この方法は、有機廃棄物を、複数の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された本発明のＬＡ利用細菌の集団と、ＬＡ利用細菌によって乳酸が消費される条件であって前記複数の多糖分解酵素の発現および活性に適している条件の下で接触させることを含み、ここで、前記処理は、有機廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去し、且つ多糖を少なくとも部分的に分解して還元糖を遊離させる。一部の実施形態において、処理は、１つの容器内で実施される（１ポット処理）。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「除去」は、有機廃棄物由来のＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方に対して適用される際には、個別の乳酸エナンチオマー（複数可）を生産する下流のプロセス、およびその後の、工業用途に適しているポリ乳酸への重合、を妨げないような残存量への減少を指す。「残存量」は、約５％未満の乳酸、好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満、さらには約０．５％未満の乳酸（ｗ／ｗ）を意味する。
【００３６】
本発明の方法で使用するための有機廃棄物は、複合多糖（デンプン、セルロース、ヘミセルロースおよびそれらの組み合わせが包含される）を含む。一部の実施形態において、有機廃棄物は、食品廃棄物、自治体の廃棄物、農業廃棄物、植物材料およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。本発明に従った食品廃棄物は、植物起源の食品廃棄物を包含する。本発明に従った食品廃棄物は、家庭の食品廃棄物、商業的食品廃棄物および工業的食品廃棄物を包含する。本発明に従った植物材料は、農業廃棄物および人工の製品（紙の廃棄物など）を包含する。
【００３７】
還元糖は通常、Ｃ５糖（ペントース）、Ｃ６糖（ヘキソース）またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、前記還元糖は、グルコースを含む。一部の実施形態において、前記還元糖は、キシランを含む。
【００３８】
一部の実施形態において、廃棄物からの乳酸の除去は、糖化（可溶性の還元糖への多糖の分解）と同時に行われる。これらの実施形態によれば、ＬＡ利用細菌は、ＬＡ利用細菌の増殖に最適であるのと同じ温度とｐＨの範囲において最適活性を有する多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変される。これらの実施形態によれば、方法は、ＬＡ利用細菌の増殖および多糖分解酵素の分泌に最適な温度とｐＨにおいて有機廃棄物をＬＡ利用細菌と接触させることを含む。接触は、廃棄物から乳酸（Ｄ体、Ｌ体、またはその両方）を除去するとともに所望のレベルの還元糖を得るのに十分な時間、行われる。
【００３９】
他の実施形態では、廃棄物からの乳酸の除去は、糖化とは別々に（糖化の前に）行われる。これらの実施形態によれば、ＬＡ利用細菌は、ＬＡ利用細菌の増殖に最適な温度および／またはｐＨの範囲とは異なる温度および／またはｐＨの範囲において最適活性を有する多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変される。
【００４０】
一部の実施形態において、廃棄物中に存在するＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはそれらの組み合わせの除去は、廃棄物中の多糖の分解と同時に、または逐次に、行われる。
【００４１】
一部の実施形態において、多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌の最適増殖温度よりも高い温度において最適活性を有する。これらの実施形態によれば、方法は、（ｉ）ＬＡ利用細菌の増殖および多糖分解酵素の発現に適している第１の温度において有機廃棄物を、廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、ＬＡ利用細菌と接触させることと、（ｉｉ）多糖分解酵素の活性に最適である第２の温度まで温度を上昇させることと、を含む。典型的には、ＬＡ利用細菌は、第２の温度において不活性化される。
【００４２】
一部の実施形態において、多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌の最適（あるいは好適）増殖ｐＨよりも高い／低いｐＨにおいて最適（または向上した）活性を有してもよい。これらの実施形態によれば、方法は、（ｉ）ＬＡ利用細菌の増殖および多糖分解酵素の発現に適している第１のｐＨにおいて有機廃棄物を、廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、ＬＡ利用細菌と接触させることと、（ｉｉ）多糖分解酵素の活性に最適である第２のｐＨまでｐＨを低下／上昇させることと、を含む。典型的には、ＬＡ利用細菌は、第２のｐＨにおいて不活性化される。
【００４３】
一部の実施形態において、方法は、前記接触の前に有機廃棄物中のデンプン、セルロースおよびヘミセルロースのうちの少なくとも１つのパーセンテージを決定することと、有機廃棄物と接触させるＬＡ利用細菌またはＬＡ利用細菌の集団を、決定されたパーセンテージに応じて選択することと、をさらに含む。一部の実施形態において、決定は、可溶性の還元糖のパーセンテージを決定することをさらに含む。
【００４４】
別の態様によれば、本発明は、有機廃棄物から個別の乳酸エナンチオマー（複数可）を生産するための方法を提供し、この方法は、
（ｉ）有機廃棄物を、多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変された本発明のＬＡ利用細菌または本発明のＬＡ利用細菌の集団と、ＬＡ利用細菌による乳酸の消費ならびに多糖分解酵素の発現および活性に適した条件の下で接触させることによって有機廃棄物を処理して、廃棄物中に存在するＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはそれらの組み合わせを除去するとともに廃棄物中の多糖を少なくとも部分的に分解して可溶性の還元糖を遊離させることと、
（ｉｉ）ＬＡ利用細菌を不活性化することと、
（ｉｉｉ）Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸のうちの一方のみを産生する乳酸生成微生物を用いて、（ｉ）で得られた可溶性の還元糖を発酵させて乳酸の個別のエナンチオマー（複数可）を得ることと、
（ｉｖ）発酵ブロスから個別の乳酸エナンチオマー（複数可）を回収することと、
を含む。
【００４５】
典型的には、発酵ステップは、嫌気性または微好気性の条件の下で実施される。発酵ステップは、典型的には、バッチ発酵、流加発酵、連続発酵および半連続発酵からなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【００４６】
一部の実施形態において、多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌の増殖に最適（あるいは好適）な温度／ｐＨの範囲とは異なる温度および／またはｐＨにおいて最適（あるいは好適）な活性を有してもよい。これらの実施形態によれば、ＬＡ利用細菌による乳酸の消費および多糖分解酵素の発現に適した条件は、酵素の活性に適した条件とは異なる。これらの実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、ＬＡ利用細菌による乳酸の消費および多糖分解酵素の発現に適している第１の温度／ｐＨにおいて有機廃棄物を、廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するのに十分な時間、接触させることと、（ｉｉ）多糖分解酵素の活性に最適である第２の温度／ｐＨに温度／ｐＨを調整することと、を含む。典型的には、ＬＡ利用細菌は、第２の温度／ｐＨにおいて不活性化される。
【００４７】
一部の実施形態において、乳酸生成微生物は細菌である。一部の実施形態において、乳酸生成細菌は、ラクトバチルス属の種である。他の実施形態では、乳酸生成細菌は、バチルス属の種である。
【００４８】
一部の実施形態において、異なる種の乳酸菌のコンソーシアムである。
【００４９】
乳酸の回収は、典型的には、発酵ブロスからの乳酸の分離および乳酸の精製を含む。乳酸の分離と精製は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。
【００５０】
方法は、典型的には、粒子サイズを減少させるとともに表面積を増大させるための、そしてまた、廃棄物中の内在性細菌を不活性化するための、有機廃棄物の前処理をさらに含む。前処理は、廃棄物をＬＡ利用細菌で処理する前に実施される。一部の実施形態において、有機廃棄物は、ＬＡ利用細菌で処理する前に細断化、細分化および滅菌を受ける。
【００５１】
滅菌は、例えば高圧スチーム、ＵＶ照射または超音波処理を含む、当技術分野で公知の方法によって実施されてもよい。
【００５２】
一部の実施形態において、方法は、有機廃棄物を処理する前に有機廃棄物の組成（特に糖の含有量）を分析することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、有機廃棄物中のデンプン、セルロースおよびヘミセルロースのうちの少なくとも１つのパーセンテージを分析することを含む。さらなる実施形態では、方法は、還元糖のパーセンテージを分析することを含む。
【００５３】
一部の実施形態において、方法は、発酵ステップの前に多糖分解酵素によって遊離した可溶性の還元糖の合計量を決定することをさらに含む。
【００５４】
一部の実施形態において、有機廃棄物から立体特異的な乳酸を生産するための方法が提供される。本明細書で使用される場合、乳酸に関しての「立体特異的」なる用語は、乳酸のエナンチオマー（複数可）（または個別のエナンチオマー（複数可））に関する。
【００５５】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、さらに、ＬＡ利用細菌により再処理される（発酵ブロスからの乳酸の回収の後に残留物として残った）残存乳酸であってＬＡ生成微生物を培養することにより次の乳酸生産サイクルのために多糖分解酵素を多量に生産するために使用される残存乳酸をリサイクルすることによって有機廃棄物からの乳酸生産の全収率を増加させるために有利に利用されてもよい。
【００５６】
さらに別の態様によれば、本発明は、有機廃棄物からポリ乳酸を生産するための方法を提供し、この方法は、上述の方法によって個別の乳酸エナンチオマー（複数可）を生産することを含み、さらに、個別の乳酸エナンチオマー（複数可）をポリ乳酸に重合させることを含む。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明は、有機廃棄物からポリ乳酸を生産するための方法を提供し、この方法は、上述の方法によって立体特異的な乳酸を生産することを含み、さらに、立体特異的な乳酸をポリ乳酸に重合させることを含む。
【００５８】
さらなる態様によれば、プロピオン酸菌による外因性の多糖分解酵素の発現および分泌のための発現ベクターが提供され、前記ベクターは、
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、
少なくとも１つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする少なくとも１つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも１つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも１つの発現カセットと、
を含む。
【００５９】
一部の実施形態において、プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８４の核酸配列を含む。一部の実施形態において、プロモーターの核酸配列は、配列番号２７〜３２およびそれらのホモログからなる群より選択されてもよい。一部の実施形態において、ＳＰのアミノ酸配列は、配列番号８７〜１７９の配列からなる群より選択されてもよい。一部の実施形態において、多糖分解酵素の配列は、配列番号１４〜２６およびそれらのホモログからなる群より選択されてもよい。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号３３〜４９および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表される核酸配列を含んでもよいか、それからなってもよい。
【００６０】
さらなる実施形態では、発現ベクターを含むプロピオニバクテリウム属の乳酸（ＬＡ）利用細菌が提供される。
【００６１】
一部の実施形態において、配列番号３３〜４９および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表される配列を含むか、それからなる、発現カセットが提供される。さらなる実施形態では、発現カセットを含むプロピオニバクテリウム属の乳酸（ＬＡ）利用細菌が提供される。
【００６２】
本発明のこれらの、およびさらなる、態様と特徴は、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００６３】
例示的な実施形態が、参照される図面で説明されている。図面中に示される構成要素および特徴の寸法は、一般に、表示の便宜および明確性のために選択されており、必ずしも一定の縮尺で示されているわけではない。図面を以下に列挙する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】一部の実施形態に従った、光学的に純粋な乳酸の生産および残存乳酸廃棄物のリサイクルのための発酵システムの概略図。
【図２Ａ】一部の実施形態に従ったベクターの概略図。
【図２Ｂ】一部の実施形態に従った発現ベクターの概略図。
【図３】対照ルゴールアッセイ（control Lugol assay）のピクトグラム：ルゴール溶液に曝露させた後の、ＹＥＬ培地と０．５％のデンプンとを含む寒天プレート。デンプンを含む領域は全て、黒く見える。（グルコアミラーゼ酵素によって）分解されたデンプンのサークルは無色に見える。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明は、様々な外因性の多糖分解酵素（特に、食品廃棄物およびリグノセルロース系廃棄物などの有機廃棄物中に存在する複合多糖を分解することが可能な酵素）を産生するように遺伝子改変されたＬＡ利用細菌を初めて開示する。本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、様々な起源の有機廃棄物を、乳酸の個別のエナンチオマー（複数可）の生産のための基質として廃棄物を使用する前に、およびその使用のために、処理するのに特に有利である。そのような遺伝子操作されたＬＡ利用細菌は、驚くべきことに、廃棄物中に存在する内在性の乳酸の除去とともに廃棄物の糖化を可能にする、有機廃棄物を処理するための改善された手段を提供する。従って、本発明の新規の二通りに作用する細菌は、「１容器」（「１ポット」）プロセスでプロセスの２つの段階を一緒に実施することを可能にする。「１容器プロセス」は、２つではなく１つの容器（リアクター、発酵槽または他の好適な稼働ユニットなど）を使用することを可能にし、従って、より経済的な工業プロセスをもたらす。これにより、１つのリアクター（１つの容器）内で２つの段階を同時に実施することが可能となる。２つの段階の最適反応温度および最適反応ｐＨが異なることがあるため、１ポットプロセスを逐次的様式（まず、廃棄物中に存在する内在性の乳酸の除去（その最適温度と最適ｐＨで行われる）、次いで、同じリアクター内での、しかし、その特有の最適温度と最適ｐＨでの、廃棄物の糖化）で実施することが推奨される場合がある。
【００６６】
遺伝子改変された乳酸（ＬＡ）利用細菌
ＬＡ利用細菌は、１種以上の外因性の多糖分解酵素を産生するように本発明に従って操作される。本明細書で使用される場合、外因性の多糖分解酵素に関しての「産生する」は、発現（細胞内でのタンパク質の生成）を、および必要に応じて分泌を、意味する。一部の実施形態において、１種以上の外因性の多糖分解酵素は、分泌性酵素として細菌に導入操作される。これらの実施形態によれば、ＬＡ利用細菌は、１種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子改変される。他の実施形態では、１種以上の外因性の多糖分解酵素は、ＬＡ利用細菌の細胞の溶解の後にのみ有機廃棄物中の多糖に対して活性があるように、非分泌性酵素として細菌に導入操作される。これらの実施形態によれば、ＬＡ利用細菌は、１種以上の外因性の多糖分解酵素を発現するように遺伝子改変される。
【００６７】
本発明に従った遺伝子改変のためのＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム属の種、メガスフェラ属の種、セレノモナス属の種およびベイロネラ属の種から選択されてもよい。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【００６８】
本発明に従った遺伝子改変のための好適なＬＡ利用細菌は、典型的には、それがその範囲内で炭素源として選択的に乳酸を消費する画定された温度および／またはｐＨの範囲を特徴とする。本明細書で使用される場合、ＬＡ利用細菌による炭素源としての乳酸の消費に関しての「選択的」は、その環境中で利用可能な還元糖の消費を伴わない、または利用可能な還元糖を僅かなレベルが数時間にわたって消費されるような非常に遅い速度で消費する、細菌による乳酸の消費を意味する。従って、それが乳酸を選択的に消費する条件の下で有機廃棄物と接触させた場合、ＬＡ利用細菌は、廃棄物中に存在する還元糖の量に実質的に影響することなく廃棄物から乳酸を除去する。あるいは、好適なＬＡ利用細菌は、特定の条件およびその環境中の還元糖の存在に関係なく、炭素源として選択的に乳酸を消費する。
【００６９】
一部の特定の実施形態では、ＬＡ利用細菌は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉは、酸性条件（最適には、ｐＨ＝５．５〜６．５の範囲内のｐＨ（例えばｐＨ＝５．５など）の酸性条件）など、特定の条件下における炭素源としての乳酸の選択的消費を特徴とする。
【００７０】
本発明に従った遺伝子改変のためのＬＡ利用細菌は、乳酸のエナンチオマー（複数可）のうちの一方のみを消費する細菌または両方を消費する細菌であってもよい。
【００７１】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたＬＡ利用細菌は、典型的には、多糖分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。一部の実施形態において、発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列が転写および翻訳されると、分泌性多糖分解酵素が生成されるように、多糖分解酵素と、インフレームで融合されたシグナルペプチドと、をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、発現ベクターは、選択される好適なプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたＬＡ利用細菌は、そのゲノム中に組み込まれた、多糖分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたＬＡ利用細菌は、そのゲノム中に組み込まれた、多糖分解酵素と、インフレームで融合されたシグナルペプチドと、をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
一部の実施形態において、用語「遺伝子改変された」、「遺伝子操作された」および「組換え」は、互換的に使用され得る。従って、遺伝子改変されたＬＡ利用細菌は、本明細書では、組換え細菌または組換えＬＡ利用細菌とも呼称される。
【００７３】
ＬＡ利用細菌の遺伝子改変は、例えばＫｉａｔｐａｐａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｏｏｋａ（２００１）  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５６（１−２）：１４４−９；Ｂｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１（１２）：８０７７−８４；Ｍｕｋｄｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８０（２）：７５１−７５６；およびＷＯ２０１５／０１１２５０に記載される、ＬＡ利用細菌のための当技術分野で公知の発現ベクター、シグナルペプチドおよび方法を用いて行うことができる。
【００７４】
本明細書で言及される場合、用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用され得る。これらの用語は、別個の断片の形態の、またはより大きなコンストラクトの構成要素としての、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマー、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーおよびそれらの修飾された形態のポリマーを対象とする。これらの用語は、天然に存在する塩基、糖、および共有結合性のヌクレオシド間結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれの天然に存在する部分と同様に機能する天然には存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドをさらに包含する。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換えＤＮＡまたは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が包含され得る。ＲＮＡには、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が包含され得る。一部の実施形態において、核酸配列は、コード配列（すなわち、タンパク質またはペプチドなどの細胞内の最終産物をコードし得る配列）であってもよい。一部の実施形態において、核酸配列は、調節配列（例えば、プロモーターなど）であってもよい。
【００７５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。「アミノ酸配列」なる用語は、天然に存在するアミノ酸、化学修飾されたアミノ酸、または合成アミノ酸のうちのいずれか１つで構成される配列に関する。この用語は、ペプチドおよびタンパク質、ならびにペプチドおよびタンパク質の断片、類似体、誘導体および組み合わせに関する。
【００７６】
一部の実施形態において、参照配列と「類似」または「相同」である配列（核酸配列およびアミノ酸配列など）は、本明細書では、配列間のパーセント同一性を指す。パーセント同一性は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であってもよい。パーセント同一性は、配列の全長にわたってランダムに分布していてよい。従って、相同配列には、例えば、変異（少なくとも１つのアミノ酸または少なくとも１つのヌクレオチドのトランケーション、置換、欠失および／または付加など）に関する変種が包含され得る。類似配列には、コドン使用頻度および遺伝暗号の縮重に関する変種も包含され得る。例えば、配列は、相同性（同一性／類似性）がそれらの配列の全長にわたって少なくとも８０％であれば、別の配列と相同であると言われる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「コンストラクト」なる用語は、１つ以上の核酸配列を含んでもよい人工的に構築または単離された核酸分子を指し、ここで、核酸配列は、コード配列（すなわち、多糖分解酵素などの最終産物をコードする配列）、調節配列（プロモーターなど）、非コード配列、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。コンストラクトなる用語は、例えば、プラスミドおよびベクターを包含するが、それらに限定されるとみなされるべきではない。
【００７８】
「発現ベクター」および「組換えベクター」は、互換的に使用されてよく、細菌細胞中で異種性（外因性）の核酸を発現する能力を有するコンストラクトを指す。一部の実施形態において、発現ベクターは、細胞内で自律的に複製できる。一部の実施形態において、核酸は、細菌細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「導入」および「形質転換」は、互換的に使用されてよく、細菌細胞（複数可）内への、より具体的には、標的細胞（複数可）の膜で囲まれた空間の内部への、分子（例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクター等など）の移行を指す。これらの分子は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）により教示されるような、当業者に公知である任意の手段によって標的細胞（複数可）に「導入」できる。
【００８０】
「プロモーター」なる用語は、細胞内でｍＲＮＡを生成するためのコード配列の転写を制御できるか導くことができる調節性ＤＮＡ配列を対象とする。通常、プロモーターは、コード配列の５’領域に位置する（すなわち、コード配列に先行する、コード配列の上流に位置する）。プロモーターは、天然源にその全体が由来してもよいか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよいか、あるいは、合成のヌクレオチドセグメントを含んでもよい。プロモーターは、恒常的なもの（すなわち、プロモーターの活性化が誘導物質によって調節されず、従って、転写速度が一定である）または誘導性のもの（すなわち、プロモーターの活性化が誘導物質によって調節される）であってよい。一部の実施形態において、様々なタイプおよび配列のプロモーターが、本発明の発現ベクターにおいて利用されてもよい。一部の実施形態において、プロモーターは、様々な起源、種および生物に由来してもよい。一部の実施形態において、特定のプロモーターおよびシグナルペプチド配列の組み合わせが、本発明の発現ベクターにおいて利用されてもよい。
【００８１】
一部の例示的な実施形態において、プロモーターは、配列番号２７〜３２および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表される核酸配列を有するプロモーターから選択されてもよいが、これらに限定されない。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【００８２】
一部の実施形態において、プロモーター配列は、配列番号２７〜３２および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列を含むか、それからなる。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【００８３】
一部の例示的な実施形態において、プロモーター配列は、配列番号３１またはそのホモログによって表される核酸配列を含むか、それからなる。一部の例示的な実施形態において、プロモーター配列は、配列番号２７またはそのホモログによって表される核酸配列を含むか、それからなる。一部の例示的な実施形態において、プロモーター配列は、配列番号２８またはそのホモログによって表される核酸配列を含むか、それからなる。
【００８４】
用語「シグナルペプチド」および「ＳＰ」は、タンパク質のＮ末端に存在して細菌細胞からのタンパク質の分泌を導くことができる短い（通常は５〜３０アミノ酸の長さの）ペプチドを指す。一部の実施形態において、分泌は、細胞外の培地中へのものである。一部の実施形態において、ＳＰ配列は、天然源から取得されてもよい（そのままのもの、または改変されたもの）。一部の実施形態において、ＳＰ配列は、インシリコで設計されてもよい。一部の例示的な実施形態において、ＳＰ配列は、プロピオニバクテリウム属の細菌源に由来する。一部の実施形態において、ＳＰ配列は、プロピオン酸菌のシグナルペプチドに相同である。一部の実施形態において、ＳＰのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、分泌されるべきタンパク質をコードする配列とインフレームであるように発現ベクターに含まれてもよい。一部の実施形態において、本開示で開示されるＳＰのアミノ酸配列に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列も、機能し、本明細書に包含される。一部の実施形態において、本開示で開示されるＳＰをコードする核酸配列に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である核酸配列も本明細書に包含される。
【００８５】
一部の例示的な実施形態において、ＳＰは、配列番号８７〜１７９および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を有するＳＰから選択されてもよいが、これらに限定されない。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【００８６】
一部の実施形態において、ＳＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８７〜１７９および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるアミノ酸配列をコードする核酸から選択されてもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【００８７】
一部の実施形態において、ＳＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８０〜１８９および／またはそれらのホモログによって表される核酸のうちのいずれか１つによって表される核酸から選択されてもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【００８８】
一部の例示的な実施形態において、ＳＰは、配列番号８７またはそのホモログによって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなる。一部の例示的な実施形態において、ＳＰは、配列番号８８またはそのホモログによって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなる。一部の例示的な実施形態において、ＳＰをコードする核酸は、配列番号１８０またはそのホモログによって表される核酸配列を含むか、それからなる。一部の例示的な実施形態において、ＳＰをコードする核酸は、配列番号１８１またはそのホモログによって表される核酸配列を含むか、それからなる。
【００８９】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌の遺伝子改変は、（目的のタンパク質（例えば、多糖分解酵素）の好適なコード配列、好適なシグナルペプチド配列（使用する場合）および／または好適なプロモーターを含む）好適な発現ベクター、ならびに、例えばＫｉａｔｐａｐａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｏｏｋａ（２００１）  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５６（１−２）：１４４−９；Ｂｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１（１２）：８０７７−８４；Ｍｕｋｄｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８０（２）：７５１−７５６；およびＷＯ２０１５／０１１２５０に記載される、ＬＡ利用細菌のための当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。一部の実施形態において、発現ベクターは、細菌のゲノムへの目的のタンパク質（および、使用される場合にはＳＰ）の組み込みを可能にする。
【００９０】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌を遺伝子操作するために利用される様々な核酸配列を決定する際、細菌細胞内での多糖分解酵素および／またはＳＰの最適な発現および／または機能を可能にするために、好適なコドン使用頻度が使用されてもよい。
【００９１】
一部の実施形態によれば、細菌細胞内で多糖分解酵素を発現させるための発現ベクターが提供され、このベクターは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列に翻訳可能に融合されているシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする少なくとも１つの核酸配列に機能可能に連結された少なくとも１つの好適なプロモーターの核酸配列を含む発現カセット（本明細書では「インサート」とも呼称される）を含む。
【００９２】
一部の実施形態において、発現ベクターは、プラスミド骨格と、１つ以上の好適な複製開始点（Ｏｒｉ）の配列と、１つ以上の抗生物質耐性遺伝子の配列と、１つ以上の発現カセットと、を含む。一部の実施形態において、発現カセット（インサート）を有さない発現ベクターは、本明細書では、「シャトルベクター」と呼称される。一部の実施形態において、シャトルベクターは、様々な細菌細胞のタイプにおいて複製されることが可能である。
【００９３】
一部の実施形態において、発現ベクターは、プロピオン酸菌における外因性の多糖分解酵素の発現に適している。一部の実施形態において、プロピオン酸菌は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒである。一部の実施形態において、プロピオン酸菌における外因性の多糖分解酵素の発現に適した発現ベクターは、プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００９４】
一部の例示的な実施形態において、発現ベクターは、以下でさらに例示されるように、ｐＯＷＲ３ベクターである。一部の実施形態において、そのような発現ベクターは、プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする核酸配列（配列番号８４によって表されるものなど）を含む。一部の実施形態において、そのような発現ベクターは、１つ以上のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ｐＴ１０プラスミドに由来するｃｍｘ（Ａ）およびｃｍｌ（Ａ）など）をさらに含む。一部の実施形態において、そのような発現ベクターは、プロピオン酸菌の複製開始点（Ｏｒｉ）の配列をさらに含む。
【００９５】
一部の実施形態において、プロピオン酸菌による外因性の多糖分解酵素の発現および分泌のための発現ベクターが提供され、前記ベクターは、
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、
少なくとも１つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド（ＳＰ）（またはそのホモログ）をコードする少なくとも１つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも１つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも１つの発現カセットと、
を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、本明細書でさらに例示されるように、プロピオン酸菌において外因性の多糖分解酵素を発現させるための発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ（そのままで、あるいは発現カセット無しで）およびプロピオン酸菌の両方において複製されることが可能であるため、有利である。さらに、そのようなベクターは、その構造およびコンパクトなサイズ（約５．６ｋｂ（発現カセット無し））に起因して、細菌における多糖分解酵素の発現の改善（高い収量および品質など）を可能にするため、有利である。さらに、発現された多糖分解酵素は、細菌細胞から首尾よく分泌されて基質中の多糖の分解において機能することが可能である。さらに、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉにおける発現のために使用される他のベクターよりも小さいことは、細菌細胞への形質転換を容易にするとともに、制限酵素によらない方法（restriction free method）によるクローニングのために使用することを容易にするため、有利である。さらに、発現カセットを挿入するためのクローニング領域は、極性効果の干渉を妨げるとともに細菌細胞内で産生される多糖分解酵素のｍＲＮＡ転写物を安定化させることが可能である終結シグナルによって（上流および下流の）境界が定められており、それによって、細胞内でのタンパク質の発現の改善をもたらす。
【００９７】
一部の実施形態において、発現ベクターは、それぞれが、同じまたは異なるプロモーターと、同じまたは異なるＳＰ配列と、異なる多糖分解酵素の配列と、を含む、２つ以上の発現カセットを含んでもよい。
【００９８】
一部の例示的な実施形態において、発現カセットは、配列番号３３〜４９および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列を含んでもよいか、それからなってもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【００９９】
一部の実施形態において、発現カセットが提供され、前記発現カセットは、配列番号３３〜４９および／またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列を含むか、それからなる。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１００】
一部の例示的な実施形態において、カセットは、配列番号４３によって表されるヌクレオチド配列を含むか、それからなる。
【０１０１】
一部の実施形態において、前記発現カセットが標的細菌細胞において発現カセットのプロモーター配列の制御下で発現されると、シグナルペプチドが多糖分解酵素にインフレームで翻訳可能に連結される。従って、シグナルペプチドの配列と多糖分解酵素の配列とを含むキメラタンパク質が細菌細胞内で発現され、これは、細菌細胞から分泌されることが可能である。
【０１０２】
一部の実施形態において、本明細書で開示される１つ以上の発現ベクター（複数可）を含むＬＡ利用細菌が提供される。
【０１０３】
一部の実施形態において、本明細書で開示される１つ以上の発現カセット（複数可）を含むＬＡ利用細菌が提供される。
【０１０４】
一部の実施形態において、１つ以上の発現ベクターを含むプロピオン酸菌であって、
発現ベクターが、
プロピオン酸菌の複製タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、
少なくとも１つのプロピオン酸菌の複製開始点のヌクレオチド配列と、
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびアミラーゼから選択される多糖分解酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列に翻訳可能に融合されているプロピオン酸菌のシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする少なくとも１つの核酸配列に機能可能に連結されている少なくとも１つのプロモーターの核酸配列を含む、少なくとも１つの発現カセットと、
を含む、
プロピオン酸菌が提供される。
【０１０５】
一部の実施形態において、配列番号３３〜４９およびそれらのホモログからなる群より選択される配列を含むか、それからなる、単離された核酸分子が提供される。
【０１０６】
一部の実施形態において、多糖分解酵素の配列は、配列番号１４〜２６およびそれらのホモログからなる群より選択される。
【０１０７】
一部の実施形態において、多糖分解酵素をコードする核酸配列は、配列番号１〜１３およびそれらのホモログからなる群より選択される。
【０１０８】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌は、単一の多糖分解酵素を産生するように遺伝子操作される。他の実施形態では、ＬＡ利用細菌は、複数の異なる多糖分解酵素を産生するように遺伝子操作される。「複数」は、少なくとも２つを意味する。一部の実施形態において、複数の酵素が細菌に導入操作される場合に各多糖分解酵素の発現レベルを制御するために、各酵素は、当技術分野で知られているように、異なる効力のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）で操作される。
【０１０９】
一部の実施形態において、多糖分解酵素の各々は、類似の、または異なる、プロモーターで操作されてもよい。一部の実施形態において、多糖分解酵素の各々は、類似の、または異なる、シグナルペプチドで操作されてもよい（そのようなものが使用される場合）。
【０１１０】
一部の実施形態において、複数の亜集団を含むＬＡ利用細菌の集団が作製され、ここで、各亜集団は、異なる多糖分解酵素を発現および分泌するように遺伝子操作される。「複数」の亜集団は、少なくとも２つの亜集団（例えば、２つ、３つ、４つの亜集団）を意味する。亜集団は、有機廃棄物の処理において共培養系として使用するためのものである。一部の実施形態において、集団は、実質的に等しい量の各亜集団を含む。他の実施形態では、集団は、様々な比率で亜集団を含む（すなわち、各亜集団は、集団内で異なるパーセンテージを占めてもよい）。
【０１１１】
上述のように、ＬＡ利用細菌に導入操作される多糖分解酵素は、グリコシドヒドロラーゼ、多糖リアーゼおよび炭水化物エステラーゼから選択されてもよい。多糖分解酵素の広範なグループは、標準的な分類系に従って、酵素のクラスに分けられ、さらに酵素のファミリーに分けられる（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３７：Ｄ２３３−２３８）。そのような酵素の有益かつ最新の分類は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＣＡＺｙ）サーバ（ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）において利用可能である。
【０１１２】
一部の実施形態において、多糖分解酵素は、デンプンおよびデンプン以外の植物多糖から選択される多糖を分解する酵素である。
【０１１３】
一部の実施形態において、ＬＡ利用細菌に導入操作される多糖分解酵素は、グリコシドヒドロラーゼである。
【０１１４】
一部の実施形態において、グリコシドヒドロラーゼは、セルラーゼを含む。セルラーゼは、エキソセルラーゼまたはエンドセルラーゼであってよい。一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、単一のセルラーゼを発現および分泌するように遺伝子改変される。他の実施形態では、ＬＡ利用細菌は、複数の異なるセルラーゼを発現および分泌するように遺伝子改変される。一部の実施形態において、セルラーゼは、エンド−（１，４）−β−Ｄ−グルカナーゼ、エキソ−（１，４）−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅ）、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アビセラーゼ、セルデキストリナーゼ（celludextrinase）、セルラーゼＡ、セルロシンＡＰ、アルカリセルラーゼおよびパンセラーゼＳＳから選択されてもよいが、これらに限定されない。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１１５】
一部の実施形態において、セルラーゼをコードする核酸は、配列番号１２〜１３またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表される核酸配列を有してもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。一部の実施形態において、セルラーゼは、配列番号２５〜２６またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を有してもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。一部の実施形態において、セルラーゼは、配列番号２５〜２６またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなる。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１１６】
さらなる実施形態では、グリコシドヒドロラーゼは、ヘミセルラーゼを含む。一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、単一のヘミセルラーゼを発現および分泌するように遺伝子改変される。他の実施形態では、ＬＡ利用細菌は、複数の異なるヘミセルラーゼを発現および分泌するように遺伝子改変される。一部の実施形態において、ヘミセルラーゼは、キシラナーゼである。さらなるヘミセルラーゼの非限定的な例としては、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、マンナナーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アセチル−マンナンエステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−アラビナナーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１７】
一部の実施形態において、キシラナーゼをコードする核酸は、配列番号１１またはそのホモログによって表される核酸配列を有してもよい。一部の実施形態において、キシラナーゼは、配列番号２４またはそのホモログによって表されるアミノ酸配列を有してもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１１８】
さらに別の実施形態では、グリコシドヒドロラーゼは、アミラーゼを含む。一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、単一のアミラーゼを発現および分泌するように遺伝子改変される。他の実施形態では、ＬＡ利用細菌は、複数の異なるアミラーゼを発現および分泌するように遺伝子改変される。一部の実施形態において、アミラーゼは、α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ；グリコゲナーゼ）、β−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカンマルトヒドロラーゼ；グリコゲナーゼ；サッカロゲンアミラーゼ）、γ−アミラーゼ（グルカン１，４−α−グルコシダーゼ；アミログルコシダーゼ；エキソ−１，４−α−グルコシダーゼ；グルコアミラーゼ；リソソーマルα−グルコシダーゼおよび１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）から選択されてもよいが、これらに限定されない。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１１９】
一部の実施形態において、アミラーゼをコードする核酸は、配列番号１〜１０またはそれらのホモログのうちのいずれか１つによって表される核酸配列を有してもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。一部の実施形態において、アミラーゼは、配列番号１４〜２３またはそれらのホモログによって表されるアミノ酸配列を有してもよい。それぞれの可能性が別個の実施形態である。一部の実施形態において、アミラーゼは、配列番号１４〜２３またはそれらのホモログによって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなる。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１２０】
本発明に従ってＬＡ利用細菌に導入操作される多糖分解酵素は、細菌源に由来してもよい。一部の実施形態において、細菌源は、好熱性細菌である。「好熱性細菌」なる用語は、本明細書で使用される場合、約４５℃よりも高い（好ましくは約５０℃を超える）温度で増殖する細菌を意味する。典型的には、本発明に従った好熱性細菌は、約４５℃〜約７５℃（好ましくは約５０〜７０℃）の最適増殖温度を有する。多糖分解酵素のための好熱性細菌源の非限定的な例としては、セルラーゼおよびヘミセルラーゼについては、クロストリジウム属の種（例えば、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ））、パエニバチルス属の種、サーモビフィダ・フスカ；アミラーゼについては、バチルス属の種（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ゲオバチルス属の種（例えば、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ））、クロモハロバクター属の種、ロドサーマス・マリナスが挙げられる。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１２１】
さらなる実施形態では、多糖分解酵素の細菌源は、中温細菌である。「中温細菌」なる用語は、本明細書で使用される場合、約２０℃〜約４５℃の温度で増殖する細菌を意味する。多糖分解酵素のための中温細菌源の非限定的な例としては、セルラーゼおよびヘミセルラーゼについては、クレブシエラ属の種（例えば、クレブシエラ・プネウモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、コーネラ属の種、ストレプトマイセス属の種、アセチビブリオ・セルロリチカス、ルミノコッカス・アルブス；アミラーゼについては、バチルス属の種（例えば、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、ラクトバチルス・ファーメンタムが挙げられる。当業者は、一部の中温細菌（例えば、いくつかのバチルス属の種）が、熱に安定な酵素を産生するということを理解する。
【０１２２】
本発明に従ってＬＡ利用細菌に導入操作される多糖分解酵素はまた、真菌源に由来してもよい。多糖分解酵素のための真菌源の非限定的な例としては、セルラーゼおよびヘミセルラーゼについては、トリコデルマ・リーゼイ、フミコーラ・インソレンス、フサリウム・オキシスポラム；アミラーゼについては、アスペルギルス・オリゼ、ペニシリウム・フェルタナム、サーモマイセス・ラヌギノスが挙げられる。
【０１２３】
本発明に従って使用するための多糖分解酵素のさらなる供給源は、例えば、上述のＣＡＺｙサーバにおいて見出すことができる。
【０１２４】
一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、ＬＡ利用細菌の増殖に適しているのと同じ温度および／またはｐＨの範囲において好適な活性を有する多糖分解酵素を産生するように遺伝子操作される。一部の実施形態において、好適な活性は、最適活性である。一部の実施形態において、好適な増殖は、最適な増殖である。一部の実施形態において、好適な条件は、準最適なものである。
【０１２５】
一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、ＬＡ利用細菌の増殖に最適であるのと同じ温度および／またはｐＨの範囲において最適活性を有する多糖分解酵素を産生するように遺伝子操作される。
【０１２６】
一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、ＬＡ利用細菌の増殖に好適な温度および／またはｐＨの範囲とは異なる温度および／またはｐＨの範囲において好適な活性を有する多糖分解酵素を産生するように遺伝子操作される。
【０１２７】
一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌は、ＬＡ利用細菌の増殖に最適な温度および／またはｐＨの範囲とは異なる温度および／またはｐＨの範囲において最適活性を有する多糖分解酵素を産生するように遺伝子操作される。例えば、好熱性の供給源に由来する多糖分解酵素が、典型的には中温菌であるＬＡ利用細菌に導入操作されてもよい。
【０１２８】
有機廃棄物の処理
一部の実施形態において、処理される有機廃棄物は、典型的には、内在性のＤ，Ｌ−乳酸を含む。
【０１２９】
一部の実施形態において、個別の乳酸エナンチオマー（複数可）の生産のための基質として有機廃棄物を利用するためには、乳酸発酵の前に少なくとも不要なエナンチオマーを選択的に除去することが必要である（工業用途に適したポリ乳酸に乳酸を重合させるためには、乳酸は、少なくとも約９５％光学的に純粋（好ましくは少なくとも約９９％光学的に純粋）であるべきである）。有機廃棄物からの少なくとも不要なエナンチオマーの除去は、原料の総糖含有量への影響が最小であるように実施されるべきである。
【０１３０】
一部の実施形態において、処理される有機廃棄物はまた、複合多糖および還元糖を様々な比率で含む。その組成は、一部の有機廃棄物はデンプンがより豊富である可能性があり（例えば、パン屋からの食品廃棄物、自治体からの混合食品廃棄物）、他のものはリグノセルロース系材料が豊富である可能性がある（例えば、農業廃棄物）、廃棄物の供給源に依存する。一部の実施形態において、処理される有機廃棄物には、異なる供給源からの廃棄物の組み合わせが包含される。
【０１３１】
一部の実施形態では、還元糖および多糖に関しての有機廃棄物の組成が、処理の前に、当技術分野で公知の方法（例えば、フルクトースの測定のためのグルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼまたはホスホグルコースイソメラーゼを用いた酵素アッセイ（比色分析、蛍光分析）を含む）を用いて決定されてもよい。あるいは、ＨＰＬＣおよび／または還元糖の連続センサー（continuous sensors）を利用できる。全糖分析を、例えばフェノール−硫酸アッセイによって、行ってもよい。有機廃棄物の組成（例えば、デンプン、セルロースおよびヘミセルロースのうちの少なくとも１つのパーセンテージ）を、有機廃棄物と接触させるべきＬＡ利用細菌またはＬＡ利用細菌の集団を選択するために使用してもよい。例えば、セルロースと比較してより高いパーセンテージのデンプンを含む有機廃棄物については、アミラーゼを産生する第１の亜集団とセルラーゼを産生する第２の亜集団とを含む細胞コンソーシアムが選択されてもよく、ここで、これらの亜集団間の比率は、有機廃棄物中のデンプンとセルロースの比率に合わせて調整される。また、必要な酵素を全て産生する単一の細菌が使用されてもよく、上述のように、異なる効力のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を用いて酵素の量と比率を変更および調整できる。
【０１３２】
一部の実施形態において、本発明に従った有機廃棄物の処理は、典型的には、粒子サイズを減少させるとともに表面積を増大させるための、そしてまた、廃棄物内の内在性細菌を不活性化するための、有機廃棄物の前処理から始まる。前処理は、例えば、当技術分野で公知の方法による細断化および滅菌を含んでもよい。前処理はまた、例えば押出機、超音波破砕機、シュレッダーまたはブレンダーなど、廃棄物粉砕機（例えば、押出機、超音波破砕機、シュレッダーまたはブレンダーなど）を用いて等量の水とともに細分化することを含んでもよい。
【０１３３】
一部の実施形態によれば、前処理に続いて、有機廃棄物をリアクター（発酵槽）内で本発明のＬＡ利用細菌と混合し、この細菌培養物を、ＬＡ利用細菌による乳酸の消費および操作された多糖分解酵素の産生に適した条件の下で増殖させる。一部の実施形態において、そのような条件には、約３０〜４０℃の範囲内およびその任意の部分範囲内の温度が包含され得る。それぞれの可能性が別個の実施形態である。一部の実施形態において、そのような条件には、約５．５〜６．５の範囲内およびその任意の部分範囲内のｐＨが包含され得る。それぞれの可能性が別個の実施形態である。
【０１３４】
一部の実施形態において、多糖分解酵素が分泌され、それが、ＬＡ利用細菌の増殖に好適なもの（最適なものなど）に類似する好適な温度および／またはｐＨ（最適なものなど）を有する場合、乳酸の除去と有機廃棄物の糖化が同時に起こるという結果になる。
【０１３５】
一部の実施形態において、多糖分解酵素が分泌され、それが、ＬＡ利用細菌の増殖に好適なもの（最適なものなど）とは異なる好適な温度および／またはｐＨ（最適なものなど）を有する場合、酵素は、分泌されるが、条件が酵素活性に適したものに調整されるまで不活性または部分的に活性なままであり、乳酸の除去と有機廃棄物の糖化が別々に起こるという結果になる。
【０１３６】
一部の実施形態において、多糖分解酵素が分泌されず、ＬＡ利用細菌の細胞の溶解の後にのみ放出される場合も、乳酸の除去と有機廃棄物の糖化が別々に起こるという結果になる。
【０１３７】
一部の実施形態において、培養物は、（ＬＡ利用細菌のタイプに応じて）廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するのに、および必要に応じて所望のレベルの還元糖を得るのに（乳酸の除去と有機廃棄物の糖化が同時に起こる場合）、十分な時間維持される。
【０１３８】
一部の実施形態において、その時間は、約２時間〜約１５時間またはその間の任意の期間の範囲であってよく、好ましくは、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間および１０時間など、２〜１２時間または２〜１０時間の範囲であってよい。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「約」なる用語は、測定可能な値に対して適用される際には、指定された値から±１０％（好ましくは±５％、より好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％）の変動を包含することが意図される。
【０１４０】
有機廃棄物は、典型的には、窒素源およびＬＡ生成細菌に必要とされる他の栄養素を含むが、そのような栄養素はまた、必要に応じて別個に補充されてもよい。
【０１４１】
一部の実施形態では、上記の処理に続いて、還元糖の量が決定される。そのような決定は、還元糖を利用する下流の発酵プロセスに有用である可能性があり、供給される糖の濃度の制御を可能にする。
【０１４２】
個別の乳酸エナンチオマー（複数可）の生産
一部の実施形態において、有機廃棄物の還元糖（廃棄物中に元々見出されるもの、および多糖分解酵素の作用によって遊離したもの）は、ＬＡ生成微生物によって乳酸に発酵されてもよい。乳酸の一方の個別のエナンチオマーのみを生成するために、使用されるＬＡ生成微生物は、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸のエナンチオマーのうちの一方のみを産生する。ＬＡ生成微生物は、天然に一方のエナンチオマーのみを産生してもよいか、あるいは、例えば望ましくないエナンチオマーの合成に関与する１種以上の酵素をノックアウトすることによって、一方のエナンチオマーのみを産生するように遺伝子改変されてもよい。
【０１４３】
一部の実施形態では、乳酸発酵の前に、ＬＡ利用細菌は、発酵中に産生される乳酸の消費を避けるために不活性化される。不活性化は、例えば、ＬＡ利用細菌が不可逆的に不活性化される温度／ｐＨに温度を上昇させるかｐＨを変化させることによって行われてもよい。代替的に、または追加的に、ＬＡ利用細菌の不活性化は、例えば超音波処理を用いた、細胞溶解によって行われてもよい。後者は、ＬＡ利用細菌が、非分泌性多糖分解酵素を産生するように操作されている場合に使用されることがあり、細胞溶解は、酵素を放出させると同時に細菌を不活性化する。一部の実施形態において、不活性化は、滅菌またはパスチャライゼーションを包含する。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「不活性化された」は、死んだ細胞または死んでいる細胞を意味する。典型的には、少なくとも８０％の細胞が不活性化され、例えば、少なくとも８５％の細胞が不活性化され、少なくとも９０％の細胞が不活性化され、少なくとも９５％の細胞が不活性化され、または１００％の細胞が不活性化される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４５】
一部の実施形態において、乳酸発酵は、ＬＡ利用細菌および多糖分解酵素による有機廃棄物の処理が実施されたのと同じリアクター（発酵槽）において実施される。他の実施形態では、発酵は、別のリアクターにおいて実施される。一部の実施形態において、処理された有機廃棄物は、固形物質を除去するために濾過され、濾過されたブロスは、発酵段階のためにＬＡ生成微生物と混合される。
【０１４６】
ＬＡ生成微生物には、様々な細菌（例えば、ラクトバチルス属の種およびバチルス属の種が包含される）および真菌が包含される。
【０１４７】
典型的には、発酵ステップは、バッチ発酵、流加発酵、連続発酵または半連続発酵を用いて、嫌気性条件または微好気性条件の下で実施される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４８】
バッチ発酵では、炭素基質および他の構成成分がリアクターに充填され、発酵が完了すると生成物が回収される。ｐＨ制御のための中和剤を除き、他の成分は、反応が完了する前には反応に添加されない。種菌の量は、典型的には、リアクター内の液体体積の約５〜１０％である。発酵は、実質的に一定の温度とｐＨで維持され、ここで、ｐＨは、好適な中和剤（アルカリ、炭酸塩またはアンモニアなど）の添加によって維持される。
【０１４９】
流加発酵では、発酵ブロスを除去することなく、リアクターに連続的または順次に基質が供給される（すなわち、生成物（複数可）は、稼働が終了するまでリアクター内に残る）。一般的な供給方法には、断続的な供給、定常的な供給、パルス供給（pulse-feeding）および指数関数的供給が包含される。
【０１５０】
連続発酵では、一定速度で連続的にリアクターに基質が添加され、発酵産物は連続的に取り出される。
【０１５１】
半連続的プロセスでは、間隔をおいて培養物の一部が取り出され、新鮮な培地が系に添加される。無期限に維持できる反復流加培養は、半連続的プロセスの別の名称である。
【０１５２】
乳酸発酵は、典型的には、約１〜４日またはその間の任意の期間（例えば、１〜２日、または２〜４日、または３〜４日）にわたって実施される。
【０１５３】
一部の実施形態によれば、多糖分解酵素は、それらを分泌するＬＡ利用細菌の増殖に最適なものとは異なる最適な温度および／またはｐＨを有してもよく、従って、酵素は、ＬＡ利用細菌での処理の間に分泌されてもよいが、それらは、不活性（または部分的に活性）なままであり、実質的に有機廃棄物中の多糖を分解しないか、または分解速度が低い。一部の実施形態において、多糖分解酵素の最適な温度および／またはｐＨは、ＬＡ生成微生物による乳酸発酵に最適であるものと同様である。これらの実施形態によれば、酵素は、ＬＡ生成微生物が添加され、それらの活性化を可能にするように条件が調整されるまで、ブロス中で不活性なままであってもよい。これにより、糖化と発酵が同時に生じ得る。
【０１５４】
一部の実施形態において、多糖分解酵素は、分泌されず、ＬＡ利用細菌の細胞の溶解の後にのみ培地中に放出されてもよい。一部の実施形態では、糖化と発酵が同時に起こるように、ＬＡ利用細菌の細胞の溶解の後にＬＡ生成微生物が培地に添加される。
【０１５５】
上記の実施形態によれば、個別の乳酸エナンチオマーを生産するための方法は、（ｉ）有機廃棄物を本発明のＬＡ利用細菌または本発明のＬＡ利用細菌の集団と、ＬＡ利用細菌による乳酸の消費および多糖分解酵素の産生に適した条件の下で接触させることによって、有機廃棄物を処理して廃棄物中に存在するＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはそれらの組み合わせを除去することと、（ｉｉ）ＬＡ利用細菌を不活性化することと、（ｉｉｉ）（ｉ）で得られた有機廃棄物を、Ｄ−乳酸エナンチオマーおよびＬ−乳酸エナンチオマーのうちの一方のみを産生する乳酸生成微生物と、（ｉ）で産生された多糖分解酵素の活性およびＬＡ生成微生物による乳酸発酵に適した条件の下で接触させることによって、廃棄物中の多糖を分解して還元糖を遊離させると同時に、遊離した糖を個別の乳酸エナンチオマーに発酵させることと、（ｉｖ）発酵ブロスから個別の乳酸エナンチオマーを回収することと、を含む。
【０１５６】
他の実施形態では、有機廃棄物は、乳酸発酵の前に糖化される（別に行われる加水分解と発酵）。
【０１５７】
これらの実施形態によれば、個別の乳酸エナンチオマーを生産するための方法は、（ｉ）有機廃棄物を本発明のＬＡ利用細菌または本発明のＬＡ利用細菌の集団と、ＬＡ利用細菌による乳酸の消費および多糖分解酵素の分泌と活性に適した条件の下で接触させることによって、有機廃棄物を処理して、廃棄物中に存在するＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはそれらの組み合わせを除去するとともに廃棄物中の多糖を分解して可溶性の還元糖を遊離させることと、（ｉｉ）ＬＡ利用細菌を不活性化することと、（ｉｉｉ）Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸のうちの一方のみを産生する乳酸生成微生物を用いて、（ｉ）で得られた可溶性の還元糖を発酵させて個別の乳酸エナンチオマーを得ることと、（ｉｖ）発酵ブロスから個別の乳酸エナンチオマーを回収することと、を含む。
【０１５８】
発酵が完了した後、発酵された液体から固形残渣を分離するために、乳酸を含むブロスは、典型的には、遠心分離によって清澄化されてもよいか、フィルタープレスに通されてもよい。濾液は、例えば回転真空蒸発器（rotary vacuum evaporator）を用いて、濃縮されてもよい。
【０１５９】
ブロスからの乳酸の分離と精製は、蒸留、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、結晶化およびこれらの方法の組み合わせを含む、当技術分野で公知の方法によって実施されてもよい。いくつかの方法が、例えばＧｈａｆｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）（上記を参照）；およびＬｏｐｅｚ−Ｇａｒｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．，３２（５）：８７３−９０４）において概説されている。あるいは、１段階での、乳酸の回収とラクチドへの変換が用いられてもよい（Ｄｕｓｓｅｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４９（６２４３）：７８−８０）。
【０１６０】
一部の実施形態において、廃棄物の処理のための本明細書で開示されるシステムと方法は、商業起源、工業起源および自治体起源の混合食品廃棄物での使用に特に適している。基質としての混合食品廃棄物の使用は、混合食品廃棄物が雑多なものであり、従って第一胃由来の細菌での発酵に必要とされるミネラルおよびビタミンの大部分を含むであろうから、大規模な工業的発酵に特に適している。さらに、本明細書で開示されるシステムと方法は、化石燃料の使用量が少なく、原料用の作物を栽培するために貴重な耕地を使用することがなく、水の使用量が少なく、ＧＨＧの排出量も同様であり、さらに、得られる生成物が生分解性であるため、現在使用されている方法よりも有利である。
【０１６１】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示されるシステムと方法はさらに、工業的プロセスのために複数の単位操作を１つにまとめることを可能にするため、有利である。これは、廃棄物を利用するために外部からの多糖分解酵素の添加を必要としないからである。むしろ、そのような酵素の産生は、発酵が生じるのと同じ容器内で行われる。
【０１６２】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）の生産
工業用途に適しているＰＬＡを生成するためには、重合プロセスは、一方のエナンチオマーのみを利用すべきである。不純物またはＤ−乳酸とＬ−乳酸のラセミ混合物の存在は、望ましくない特性（低い結晶化度および低い融解温度など）を有するポリマーをもたらす。従って、Ｌ−乳酸エナンチオマーのみ、またはＤ−乳酸エナンチオマーのみを産生する乳酸菌が必要とされる。
【０１６３】
ＰＬＡの重合は、当技術分野で公知の方法によって実施されてもよい。公知の方法には、ラクチド（ジ−乳酸）の形成を介した重合、および乳酸モノマーの直接縮合が包含される。いくつかの方法が、例えば、「Ｐｏｌｙ（Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｅｄｓ  Ｒ．Ａｕｒａｓ，  Ｌ．−Ｔ．Ｌｉｍ，  Ｓ．Ｅ．Ｍ．Ｓｅｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｔｓｕｊｉ）」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）の中のＳｏｄｅｒｇａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｔ（２０１０）  「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｐｏｌｙ（Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）」において、概説されている。一部の実施形態において、ＰＬＡは、ポリ−Ｌ乳酸（ＰＬＬＡ）である。一部の実施形態において、ＰＬＡは、ポリ−Ｄ乳酸（ＰＤＬＡ）である。
【０１６４】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示されるシステムと方法は、廃棄物から完全にリサイクル（すなわち、１００％リサイクル）される最終産物、すなわちポリ乳酸（ＰＬＡ）、をもたらすことができる。
【０１６５】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示されるＬＡ利用細菌は、外付けの屋外設備（external outdoors）、様々な発酵槽とリアクター、リサイクル工場等を含む様々な商業的環境によって実施できる、乳酸およびＰＬＡの生産のための様々な方法とシステムにおいて首尾よく利用され得る。
【０１６６】
一部の実施形態において、方法中の様々なステップは、独立した１つの場所で行われてもよい。一部の実施形態において、方法中の様々なステップは、１つ以上の稼働ユニット（発酵槽およびリアクターなど）において行われてもよい。一部の実施形態において、方法中の様々なステップは、同時に、または逐次に、行われてもよい。例えば、有機廃棄物のサイズの低減は、時間的および／または空間的に、滅菌ステップと組み合わされてもよい。
【０１６７】
一部の実施形態において、本発明のＬＡ利用細菌を用いて有機廃棄物からポリ乳酸を得る方法の中のステップは、以下のステップのうちの１つ以上を含んでもよい。
１．有機廃棄物を得るステップ。有機廃棄物は、住宅からの食品廃棄物、商業的食品廃棄物または工業的食品廃棄物から選択されてもよい。有機廃棄物は、供給元で分別されてもよいか、機械で分別されてもよい。
２．有機廃棄物のサイズを低減するステップ：均質な半固体の原料を達成するために、有機廃棄物の細分化および粉砕を適用してよい。さらに、超音波処理を用いて、それにより、サイズの低減と滅菌を１つにまとめることもできる。これは、同じ稼働ユニットにおいて行うことができる。
３．滅菌ステップ：例えば超音波処理、熱、ＵＶおよび／または圧力を用いて、達成できる。これは、発酵槽稼働ユニット内でそのまま、または外部から、行うことができる。一部の実施形態では、上述のように、このステップは、サイズを低減するステップと１つにまとめることができる。
４．遺伝子操作されたＬＡ利用細菌を播種するステップ：遺伝子操作されたＬＡ利用細菌を種発酵槽稼働ユニットに植菌して酵素を産生させることができる。さらに、下流の処理からのラクテート副生成物を、このステップで原料として添加できる（以下でさらに詳述する）。ＬＡ利用細菌はまた、ＹＥＬなど、合成培地で培養することもできる。
５．植菌および多糖分解酵素とＣＯ２の同時産生およびラセミ体ラクテートの消費のステップ：ＬＡ利用細菌の種を生産発酵槽に植菌して、酵素をさらに産生させるとともに有機廃棄物中のラセミ体ラクテートを消費させる。
６．ＬＡ利用細菌を不活性化するステップ：発酵槽内の温度を（例えば、４５〜５５℃に）上昇させて、ＬＡ利用細菌の不活性化（滅菌）をもたらしてもよい。有利には、そのような上昇した温度が、それらの活性のために改善された条件（最適条件など）をもたらすＬＡ利用細菌によって分泌された、分泌性多糖分解酵素の活性をさらに亢進してもよい。
７．乳酸生成生物（純粋なＬ体または純粋なＤ体の生産者）を植菌するステップ：結果として、発酵培地は、ラセミ体ラクテートが枯渇し、（分泌された分解酵素によって生じた）還元糖は、乳酸発酵プロセスに利用可能となる。
８．乳酸を回収および精製するステップ：様々な精製方法（またはそれらの組み合わせ）を利用して鏡像異性的に純粋な乳酸を精製できる。そのような方法には、例えば、マイクロ／ナノ濾過、遠心分離、イオンクロマトグラフィー、沈殿、結晶化等が包含される。
９．ＰＬＬＡまたはＰＤＬＡに重合させるステップ：精製された乳酸のＰＬＡへの重合は、ラクチド（ジ−乳酸）の形成を介した重合および乳酸モノマーの直接縮合を含む、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。
【０１６８】
一部の実施形態において、純粋な乳酸（およびＰＬＡ）を得るプロセスにおいて生じた下流の残存乳酸またはラクテート廃棄物のリサイクルおよび再利用が、本発明のＬＡ利用細菌を用いて有利に利用されてもよい。そのような、プロセスにおいて生じた下流の残存乳酸またはラクテート廃棄物は、例えば、（例えば、膜濾過または遠心分離を用いた）発酵ブロスからの固形物の除去から生じる可能性があり、残った固形物は、分離しなかった有用なラクテートを含む。さらに、ラクチドを合成する際、一部の乳酸分子は、ラセミ化を起こし得る。そのような残存乳酸および／またはラクテート廃棄物の発酵は、例えばＬＡ利用細菌の酵素の産生のための原料として利用されることによって、プロセス中で有利にリサイクルされ得る。乳酸などの有機酸が発酵ブロスから回収される場合、通常、その収率は１００％ではなく、希釈された乳酸が残存する。残存する有機酸の回収はコストがかかるため、その代わりに、それは、別の発酵バッチのためにリサイクルおよび使用され得る。残留物のリサイクルは、新しい発酵バッチに必要とされる可能性がある、やはり残留物中に存在するミネラルと塩を再導入する。連続発酵および半連続発酵の乳酸生産プロセスは、細菌と乳酸が豊富な発酵ブロスのサンプルが、入ってくる無菌の発酵用原料に播種するために使用されることを必要とする。乳酸の生産のための連続的プロセスまたは半連続的プロセスにおける有機廃棄物の利用の問題は、入ってくる原材料中に存在する、望ましくないエナンチオマーである。豊富な発酵ブロスを原料に播種すれば、乳酸の生産が直ちに始まり、望ましくないエナンチオマーが不純物としてプロセス中に残る。従って、乳酸生産プロセスにおけるラクテート利用細菌の使用は、そのような資源の全てを効率的にリサイクルすることを可能にする。回収プロセスからの残存乳酸および／またはパスチャライズ／滅菌された乳酸の豊富なブロスを使用して、別の生産サイクルのために、細菌を培養するとともに大量の酵素を産生させることができる。これは、そのまま、あるいは、より小さな別の種発酵槽において、達成できる。一部の実施形態において、乳酸の豊富な発酵ブロスからのサンプルは、２つの部分に分けられてよく、一方はパスチャライズされ、酵素産生細菌を培養するために使用される。２つ目の部分は、パスチャライズされず、細菌の細胞を多量に含み、これは、エナンチオマーを除去するためにＬＡ利用細菌で処理された、および／または酵素で糖化された、原料に播種するために用いることができる。
【０１６９】
ここで図１を参照するが、これは、一部の実施形態に従った、乳酸の個別のエナンチオマーを生産するとともに残存ラクテート廃棄物をリサイクルするための発酵システムの概略図である。図１に示されるように、発酵システムは、遺伝子操作されたＬＡ利用細菌が植菌される種発酵槽（１０）を含む。培養用の培地／ブロスは、サイズを小さくして滅菌／パスチャライズした上記で詳述されるような様々な供給源からの有機廃棄物（１４）、合成培地（ＹＥＬなど）（１６）および／またはサイズを小さくして滅菌／パスチャライズした有機廃棄物とＬＡ利用細菌の増殖に有益である適切な栄養素との組み合わせ（１８）であってよい。種チャンバー内で、（ＬＡ利用細菌が産生する）分泌性多糖低減酵素（polysaccharide reducing enzymes）とＣＯ２の同時生成ならびに（ＬＡ利用細菌による）ラクテートの消費が達成される。ＬＡ利用細菌の種は、その後、生産発酵槽（１２）に移され、多糖低減酵素をさらに産生および分泌するとともにラセミ体ラクテートを消費する。追加的に、サイズを小さくした、および／または滅菌した、有機廃棄物のさらなるバッチ（２０）を生産発酵槽に添加してもよい。次に、（例えば、温度を４５〜６５℃（例えば５５℃）に上昇させることによって）生産発酵槽内の条件（温度またはｐＨなど）を変更して、それにより、ＬＡ利用細菌の不活性化を生じさせ、および必要に応じて、向上した作用条件を分泌された多糖分解酵素に対して与える。この結果、発酵培地からラセミ体ラクテートが枯渇するとともに、発酵培地は、発酵に利用可能な還元糖が豊富になる。この培地にＬＡ生成微生物を植菌して、光学的に純粋な乳酸エナンチオマーを産生させるが、その後、この乳酸エナンチオマーを精製し、例えばＰＬＡへの重合によって、さらに処理してもよい。有利なことに、プロセスにおいて生じた下流の残存乳酸および／またはラクテート廃棄物（２２）は、（曲がった矢印によって示されるように）種発酵槽および／または生産発酵槽に添加することによって、再利用およびリサイクルできる。
【０１７０】
従って、一部の実施形態によれば、光学的に純粋な乳酸エナンチオマーを調製するプロセスにおいて生じた残存乳酸および／またはラクテート廃棄物をリサイクルするシステムと方法が提供される。
【０１７１】
一部の実施形態において、システムは、有機廃棄物の１つ以上の供給源と、１つ以上の発酵槽と、１種以上の外因性の多糖分解酵素を発現および分泌するように改変された、遺伝子改変されたＬＡ利用細菌と、を含んでもよく、ここで、発酵槽は、ＬＡ利用細菌によって乳酸が消費される条件であって多糖分解酵素の発現と活性に適している条件の下でＬＡ利用細菌の増殖を可能にするように構成されており、前記処理は、有機廃棄物からＤ−乳酸、Ｌ−乳酸またはその両方を除去するとともに廃棄物中の多糖を分解して可溶性の還元糖を遊離させ、発酵槽は、さらに、ＬＡ利用細菌、および発酵槽内に植菌できるＬＡ生成微生物、を不活性化する条件を可能にするように構成されており、前記ＬＡ生成微生物は、乳酸の個別のエナンチオマーを得るために、分泌された多糖分解酵素によって生じた可溶性の還元糖を発酵してＤ−乳酸およびＬ−乳酸のうちの一方のみを産生することが可能であり、プロセスにおいて生じた下流の残存乳酸および／またはラクテート廃棄物は、１つ以上の発酵槽に戻されてプロセス中で基質として再利用される。
【０１７２】
用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「包含する（includes）」、「包含する（including）」、「有する（having）」およびそれらの同根語は、「含むがそれに限定されない（including but not limited to）」を意味する。用語「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、一部の実施形態では、それぞれ、「からなる（consists）」および「からなる（consisting）」に限定される。用語「からなる（consisting of）」は、「含み、且つそれに限定される（including and limited to）」を意味する。用語「から本質的になる（consisting essentially of）」は、追加的な成分、ステップおよび／または部分が、特許請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変更しない場合にのみ、その組成物、方法または構造が、その追加的な成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいということを意味する。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうではないことが明確に指示されない限り、複数への言及を包含する。例えば、用語「化合物（a compound）」または「少なくとも１つの化合物（at least one compound）」は、それらの混合物を含む、複数の化合物を包含してもよい。
【０１７４】
特定の実施形態についての前述の説明は、他の者が、現在の知識を適用することによって、過度の実験を伴うことなく、および一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を容易に改変する、および／または様々な用途に適合させる、ことができるという本発明の一般的性質を完全に明らかにするであろう。従って、そのような適合および改変は、開示される実施形態の均等物の意味および範囲の内に包含されるべきであり、そのように意図される。本明細書で使用される表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではないということが理解されるべきである。開示される様々な化学構造および機能を実施するための手段、材料およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとってもよい。
【０１７５】
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、それらは決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：細菌を遺伝子改変するための好適なベクターの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉシャトルベクターの構築：
構築されるベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの両方において使用できる。
以下のようにｐＯＷＲ３ベクター（図２Ａに概略図を示す）を調製した：プロピオン酸菌の複製タンパク質の配列（配列番号８４）とクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ｐＴ１０プラスミドに由来するｃｍｘ（Ａ）（配列番号８５）とｃｍｌ（Ａ）（配列番号８６））をタンデムに合成して、Ｅ．ｃｏｌｉの複製開始点（ｏｒｉ）とアンピシリン耐性カセット（ＡｍｐＲ）とを含むベクターに導入した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの両方において複製可能な約５．６ｋｂｐのプラスミドをもたらす。このベクターは、ＰＢの複製開始点の配列をさらに含む。得られたｐＯＷＲ３ベクターは、他の公知のＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ用発現ベクターよりも小さく（５．６ｋｂｐ対６．２〜８ｋｂｐ）、これは、（例えばエレクトロポレーションによる）細菌細胞への形質転換をより容易にするとともに、制限酵素によらない方法によるクローニングのために使用することをより容易にする。さらに、ｐＯＷＲ３のＡｍｐＲ遺伝子の配列の領域は、（以下で詳述するように）発現カセットを挿入するためのクローニング部位として使用される。この領域は、極性効果の干渉を妨げるとともに細菌細胞内で産生される（多糖分解酵素の）ｍＲＮＡ転写物を安定化させる、終結シグナルによって（上流および下流の）境界が定められている。
【０１７７】
Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉへのｐＯＷＲ３ベクターの形質転換
エレクトロポレーションによってｐＯＷＲ３をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉに形質転換した。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの混濁培養液を１：１２５の希釈となるように新鮮なＹＥＬ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのラクテート）に加え、好気性条件下で３０℃において一晩培養した。この培養液（Ｏ．Ｄ６００＝０．２〜１．９）を氷上に３０分間置いた後、同じ体積の氷冷水で２回洗浄した（３０００ｒｐｍ、１０分）。３回目の洗浄は、同じ体積の冷１０％グリセロールでおこなった（３０００ｒｐｍ、１０分）。ペレットを冷１０％グリセロール中に濃縮した（元の培養液の０．０１％）。５０μｌのエレクトロコンピテントのＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉをチューブ内で１０００ｎｇのｐＯＷＲ３ベクターと混合した。この細菌とベクターの混合物を０．１ｃｍの間隙のキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に移し、以下の条件を用いてエレクトロポレーションした。電界強度：２００００Ｖ／ｃｍ、抵抗：５００オーム、コンデンサ：２５μＦ。９００μｌのＹＥＬ培地を添加し、細菌を好気性条件下で３０℃において３時間インキュベートした後、ＹＥＬ培地＋１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの寒天プレート上に広げた。
【０１７８】
多糖分解酵素の発現と分泌を可能にする好適な発現ベクターを構築するために、多糖分解酵素をコードするヌクレオチド配列（ｉｉｉ）に翻訳可能に連結されているシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする核酸配列（ｉｉ）に機能可能に連結されているプロモーター配列（ｉ）を含む「発現カセット」でアンピシリン耐性遺伝子を置き換えることによってｐＯＷＲ３ベクターを改変した（図２Ｂ）。標的細胞内においてプロモーター配列の制御下で前記発現カセットが発現されると、シグナルペプチドは、多糖分解酵素にインフレームで翻訳可能に連結される。言い換えれば、ＳＰのペプチド配列と多糖分解酵素のペプチド配列とを含むキメラタンパク質が細胞内で発現される。
【０１７９】
そのような発現カセットを利用することによって、プロモーター−ＳＰ−多糖分解酵素の好適な組み合わせのマトリックスを利用できる。
【０１８０】
実施例２：多糖分解酵素を発現および分泌するように細菌を遺伝子改変するための好適な発現カセットと発現ベクターの構築
【０１８１】
以下に列挙されるのは、発現ベクターにおいて使用される発現カセットを作製するために使用される、例示的な多糖分解酵素（グルコアミラーゼ、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ（キシラナーゼ））、シグナルペプチドおよびプロモーターである。
【０１８２】
以下で表１において列挙されている以下の例示的な酵素が、細菌を遺伝子改変するための発現カセットと発現ベクターにおいて使用される。これらの酵素の配列は、種々の供給源（生物）から得られる。列挙されている酵素の各々の元のシグナルペプチドは、除去され、外来の（異なる）シグナルペプチドで置き換えられている。
【０１８３】
表１：例示的な多糖分解酵素
【表１】
2019503688.tif 000002
【０１８４】
以下のプロモーター領域を、様々な発現カセットと発現ベクターの構築において利用する。
・Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ９６１４由来のＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーター（配列番号２７）；
・Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＢＩＡ１１８由来のＰＦＲＵＤ＿０４８５０プロモーター（配列番号２８）；
・Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ９６１４由来のＰＦＲＥＵＤ＿２２１５０プロモーター（配列番号２９）；
・Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ９６１４由来のＰＦＲＥＵＤ＿０８４５０プロモーター（配列番号３０）；
・Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ９６１４由来のＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０（配列番号３１）；
・ｐＧＲＯプロモーター（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ由来のｐｇｒｏプラスミド）（配列番号３２）。
【０１８５】
以下の例示的なシグナルペプチド（ＳＰ）のアミノ酸配列を、様々な発現カセットの構築において利用する。
＞ＣＢＬ５７３３８  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）  ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号８７（アミノ酸配列）、配列番号１８０（ヌクレオチド配列））。
＞ＣＢＬ５６０１６．１  ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，  ＮｌｐＣ／Ｐ６０  ｆａｍｉｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号８８（アミノ酸配列）、配列番号１８１（ヌクレオチド配列））。
＞ＣＢＬ５６３６０．１  ＤＳＢＡ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号８９（アミノ酸配列）、配列番号１８２（ヌクレオチド配列））。
ＣＢＬ５７３３３．１  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１８２５０［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９０（アミノ酸配列）、配列番号１８３（ヌクレオチド配列））
ｇｉ｜２９６９２１７９９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６３５９．１｜  ｔｈｉｒｅｄｏｘｉｎｅ  ｌｉｋｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９１（アミノ酸配列）、配列番号１８４（ヌクレオチド配列））
＞ｇｉ｜２９６９２３３１１｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７９１１．１｜  ｄｒｕｇ  ｅｘｐｏｒｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＤ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９２（アミノ酸配列）、配列番号１８５（ヌクレオチド配列））
＞ｇｉ｜２９６９２１４０５｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９５８．１｜  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１（配列番号９３（アミノ酸配列）、配列番号１８６（ヌクレオチド配列））。
ｇｉ｜２９６９２１６８０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６２３７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９４（アミノ酸配列）、配列番号１８７（ヌクレオチド配列））。
＞ｇｉ｜２９６９２２５３２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７１０５．１｜  Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９５（アミノ酸配列）、配列番号１８８（ヌクレオチド配列））。
＞ｇｉ｜２９６９２２２３３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６８０５．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］  ＭＲＬＡＲＲＶＡＡＶＬＬＡＳＶＬＡＬＴＶＡＳＣＡＧＡＡＲＳＡＰＳＬ（配列番号９６（アミノ酸配列）、配列番号１８９（ヌクレオチド配列））。
＞ＣＢＬ５７３２４．１  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１８１７０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９７）。
＞ＣＢＬ５７８０５．１  ｐｏｌａｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９８）。
＞ＣＢＬ５７４１３．１  Ｓｏｒｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号９９）。
＞ＣＢＬ５７２７１．１  Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ＭＦＳ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１００）。
＞ＣＢＬ５７３３７．１  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１８２８０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０１）。
ｇｉ｜２９６９２２３０２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６８７４．１｜  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，  ＦＫＢＰ−ｔｙｐｅ  （Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１（配列番号１０２）。
ｇｉ｜２９６９２３２５９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７８５６．１｜  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｌｕｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０３）。
ｇｉ｜２９６９２３１４６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７７３３．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿２２３００  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０４）。
ｇｉ｜２９６９２１３７８｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９３１．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０３９８０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０５）。
ｇｉ｜２９６９２１９２７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６４８７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］  （配列番号１０６）。
ｇｉ｜２９６９２２９４７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７５２９．１｜  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （ｓｅｒｉｎｅ−ｔｙｐｅ  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）  （Ｄ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０７）。
＞ｇｉ｜２９６９２３３２６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７９２６．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０８）。
＞ｇｉ｜２９６９２３３２２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７９２２．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿２４０６０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１０９）。
＞ｇｉ｜２９６９２２６１７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７１９４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１６８３０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１０）。
＞ｇｉ｜２９６９２２９１５｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７４９７．１｜  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１１）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３７７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９３０．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０３９７０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１２）。
＞ｇｉ｜２９６９２２３０１｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６８７３．１｜  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１３）。
＞ｇｉ｜２９６９２２８６６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７４４６．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１９５３０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１４）。
＞ｇｉ｜２９６９２２３４６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６９１８．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１４１９０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１５）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３４４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５８９７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０３６３０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１６）。
＞ｇｉ｜２９６９２２６５３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７２３０．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１７１９０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１７）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１１３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５６６０．１｜  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１８）。
＞ｇｉ｜２９６９２１６８７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６２４４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０７１３０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１１９）。
＞ｇｉ｜２９６９２１５９３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６１４７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０６１７０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２０）。
＞ｇｉ｜２９６９２２５２３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７０９６．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１５９８０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２１）。
＞ｇｉ｜２９６９２１０１８｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５５５６．１｜  ｌａｒｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２２）。
＞ｇｉ｜２９６９２２８５３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７４３３．１｜  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ／ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２３）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１９０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７３９．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０２２４０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２４）。
＞ｇｉ｜２９６９２２８４７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７４２７．１｜  ｍｕｌｔｉｃｏｐｐｅｒ  ｏｘｉｄａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２５）。
＞ｇｉ｜２９６９２３００３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７５８５．１｜  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２６）。
＞ｇｉ｜２９６９２３２０９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７８０３．１｜  ｐｏｌａｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２７）。
＞ｇｉ｜２９６９２３２１０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７８０４．１｜  ｐｏｌａｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２８）．
＞ｇｉ｜２９６９２１８８４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６４４４．１｜  ＡＢＣ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍｅｔａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１２９）。
＞ｇｉ｜２９６９２１６４９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６２０６．１｜  ｉｒｏｎ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ，  ｓｏｌｕｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３０）。
＞ｇｉ｜２９６９２２５００｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７０７３．１｜  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｍ２３Ｂ  ｆａｍｉｌｙ  ／  ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３１）。
＞ｇｉ｜２９６９２２０６１｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６６２５．１｜  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３２）。
＞ｇｉ｜２９６９２１９７７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６５３９．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１０１５０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３３）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３１０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５８６３．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０３３２０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３４）。
＞ｇｉ｜２９６９２１９６７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６５２７．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３５）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１９６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７４５．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０２３００  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３６）。
＞ｇｉ｜２９６９２１６６６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６２２３．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３７）。
＞ｇｉ｜２９６９２１２３０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７８０．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３８）。
＞ｇｉ｜２９６９２３１０２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７６８９．１｜  ｐｏｌａｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１３９）。
＞ｇｉ｜２９６９２３０７９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７６６３．１｜  Ｓｕｌｆａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４０）。
＞ｇｉ｜２９６９２１５６９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６１２３．１｜  ｓｏｌｕｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４１）。
＞ｇｉ｜２９６９２２９０６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７４８８．１｜  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４２）。
＞ｇｉ｜２９６９２０９７４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５５１１．１｜  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｓ−ｌａｙｅｒ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４３）。
＞ｇｉ｜２９６９２２５５１｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７１２４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４４）。
＞ｇｉ｜２９６９２３２７９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７８７９．１｜  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４５）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１１２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５６５９．１｜  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，  ＡＴＰａｓｅ−ｌｉｋｅ：Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ−ｌｉｋｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４６）
＞ｇｉ｜２９６９２２３１４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６８８６．１｜  Ｃｏｂａｌｔ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４７）。
＞ｇｉ｜２９６９２２６１４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７１９１．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１６８００  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４８）。
＞ｇｉ｜２９６９２１９５９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６５１９．１｜  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ＰＤＺ  ｄｏｍａｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１４９）。
＞ｇｉ｜２９６９２１８３５｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６３９５．１｜  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５０）。
＞ｇｉ｜２９６９２１０７９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５６２０．１｜  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｄａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５１）。
＞ｇｉ｜２９６９２２０４７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６６１１．１｜  Ｌｅｕｃｉｎｅ−，  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−，  ｖａｌｉｎｅ−，  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−，  ａｎｄ  ａｌａｎｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ］  （ＬＩＶＡＴ−ＢＰ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５２）。
＞ｇｉ｜２９６９２２６６７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７２４４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１７３４０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５３）。
＞ｇｉ｜２９６９２２３９５｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６９６７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１４６８０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５４）。
＞ｇｉ｜２９６９２１２２４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７７４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５５）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１２９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５６７６．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］  （配列番号１５６）。
＞ｇｉ｜２９６９２１９７４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６５３６．１｜  Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  （ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５７）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１６８｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７１７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０２０２０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５８）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３４０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５８９３．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１５９）。
＞ｇｉ｜２９６９２３１２３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７７１０．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６０）。
＞ｇｉ｜２９６９２２２８２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６８５４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６１）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３２４｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５８７７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６２）。
＞ｇｉ｜２９６９２２５７２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７１４５．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｅｔａｉｎｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６３）。
＞ｇｉ｜２９６９２２９４９｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７５３１．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿２０３８０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６４）。
＞ｇｉ｜２９６９２１６３８｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６１９４．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６５）。
＞ｇｉ｜２９６９２２５０７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７０８０．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿１５８２０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６６）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１３３｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５６８０．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０１６５０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６７）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１５７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７０４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６８）。
＞ｇｉ｜２９６９２１５９２｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６１４６．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１６９）。
＞ｇｉ｜２９６９２３１３１｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７７１８．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿２２１５０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７０）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３６０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９１３．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７１）。
＞ｇｉ｜２９６９２１４１６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９６９．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０４３５０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７２）。
＞ｇｉ｜２９６９２３１２０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７７０７．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿２２０４０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７３）。
＞ｇｉ｜２９６９２１００６｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５５４４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿００４４０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７４）。
＞ｇｉ｜２９６９２１４１５｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９６８．１｜  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７５）。
＞ｇｉ｜２９６９２２１５０｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５６７１８．１｜  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７６）。
＞ｇｉ｜２９６９２１１６７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５７１６．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７７）。
＞ｇｉ｜２９６９２３１２７｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５７７１４．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿２２１１０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７８）。
＞ｇｉ｜２９６９２１３７５｜ｅｍｂ｜ＣＢＬ５５９２８．１｜  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＦＲＥＵＤ＿０３９５０  ［Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ  ＣＩＲＭ−ＢＩＡ１］（配列番号１７９）。
【０１８６】
実施例３：シグナルペプチドとプロモーターの種々の組み合わせを利用した、ＰＢにおいて様々な多糖分解酵素を発現させるための発現カセットの調製
【０１８７】
（表２で列挙される）好適なプライマーおよび対応するテンプレートを利用したＰＣＲ反応を用いて、様々なプロモーターと多糖分解酵素のヌクレオチド配列のインサートを得た。ＰＣＲ反応には、Ｑ５  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｍ０４９１）を製造業者の指示に従って使用した。ＰＣＲの条件は以下の通りであった。最初の変性：９８℃で１分間、二次的変性：９８℃で３０秒間、アニーリング：６０℃で３０秒間、伸長：７２℃で５０秒間。ＰＣＲプログラムは３０サイクル実行される（二次的開始ステップ〜伸長ステップ）。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上でテストし、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎｕｐ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。
【０１８８】
実施例３．１：ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０プロモーターとＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０シグナルペプチドを備えたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ由来のグルコアミラーゼｇｉ１１３７９５の発現
プライマー１と２（以下の表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー３と４（表２）を用いてグルコアミラーゼを増幅した。グルコアミラーゼは全て、それらの増幅のために共通のリバースプライマー（プライマー４）を使用することを可能にするために、終止コドンの後に２１ヌクレオチドを加えて合成した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３３によって表される通りである。
【０１８９】
実施例３．２：ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０シグナルペプチドと組み合わせたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコアミラーゼｇｉ３００２５８５１の発現
プライマー１と５（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー６と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３４によって表される通りである。
【０１９０】
実施例３．３：ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＳＰ．５  Ｇ０００由来のグルコアミラーゼｇｉ２３１５４２の発現
プライマー１と７（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー８と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３５によって表される通りである。
【０１９１】
実施例３．４：ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｉｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ由来のグルコアミラーゼｇｉ４９０５３３５９６の発現
プライマー１と９（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー１０と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３６によって表される通りである。
【０１９２】
実施例３．５：ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のグルコアミラーゼｇｉ３４１４６７８５の発現
プライマー１と１１（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー１２と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３７によって表される通りである。
【０１９３】
実施例３．６：ＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿１８２９０シグナルペプチドと組み合わせたＰｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ９７９０由来のグルコアミラーゼｇｉ４８４３１２１２の発現
プライマー１と１３（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー１４と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３８によって表される通りである。
【０１９４】
実施例３．７：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ由来のグルコアミラーゼｇｉ１１３７９５の発現
プライマー１５と１６（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー３と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。グルコアミラーゼは全て、それらの増幅のために共通のリバースプライマー（プライマー４）を使用することを可能にするために、終止コドンの後に２１ヌクレオチドを加えて合成した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号３９によって表される通りである。
【０１９５】
実施例３．８：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコアミラーゼｇｉ３００２５８５１の発現
プライマー１５と１７（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー６と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４０によって表される通りである。
【０１９６】
実施例３．９：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＳＰ．５  Ｇ０００由来のグルコアミラーゼｇｉ２３１５４２の発現
プライマー１５と１８（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー８と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４１によって表される通りである。
【０１９７】
実施例３．１０：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｉｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ由来のグルコアミラーゼｇｉ４９０５３３５９６の発現
プライマー１５と１９（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー１０と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４２によって表される通りである。
【０１９８】
実施例３．１１：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のグルコアミラーゼｇｉ３４１４６７８５の発現
プライマー１５と２０（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー１２と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４３によって表される通りである。
【０１９９】
実施例３．１２：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＰｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ９７９０由来のグルコアミラーゼｇｉ４８４３１２１２の発現
プライマー１５と２１（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー１４と４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４４によって表される通りである。
【０２００】
実施例３．１３：ＰＦＲＥＵＤ＿０８４５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコアミラーゼｇｉ３００２５８５１の発現
プライマー２２と２３（表２）を用いてＰＦＲＥＵＤ＿０８４５０プロモーターの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。増幅されたオリゴ配列を、制限酵素によらないクローニング方法を用いて、ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドとグルコアミラーゼの配列を既に含むｐＯＷＲ３ベクター（実施例３．８のもの）にクローニングする。得られたベクターをＤＨ５α細菌に挿入して増幅する。その後、メチル化されていないベクターを生産するために、ｄａｍ／ｄｃｍ−のＥ．ｃｏｌｉ株に移し、増やし、精製する。インサートのＤＮＡ配列は、配列番号４５によって表される通りである。
【０２０１】
実施例３．１４：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿１８２５０シグナルペプチドと組み合わせたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコアミラーゼｇｉ３００２５８５１の発現
プライマー２４と２５（表２）を用いてＰＦＲＥＵＤ＿１８２５０シグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。増幅されたオリゴ配列を、制限酵素によらないクローニング方法を用いて、ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターとグルコアミラーゼの配列を既に含むｐＯＷＲ３ベクター（実施例３．８のもの）にクローニングする。得られたベクターをＤＨ５α細菌に挿入して増幅する。その後、メチル化されていないベクターを生産するために、ｄａｍ／ｄｃｍ−のＥ．ｃｏｌｉ株に移し、増やし、精製する。インサートのＤＮＡ配列は、配列番号４６によって表される通りである。
【０２０２】
実施例３．１５：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＴＭ５１由来のキシラナーゼＥＯＲ７００６９−Ｆの発現
プライマー１５と２６（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー２７と２８を用いてキシラナーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４７によって表される通りである。
【０２０３】
実施例３．１６：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａ由来のセルラーゼＰ２６２２２の発現
プライマー１５と２９（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー３０と３１を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４８によって表される通りである。
【０２０４】
実施例３．１７：ＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のセルラーゼＷＰ＿０１５９２４２７７．１の発現
プライマー１５と３２（表２）を用いてプロモーターとシグナルペプチドの配列をＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉから増幅した。プライマー３３と３４を用いてグルコアミラーゼを増幅した。このようにして得られた発現カセット（すなわち、インサート）のＤＮＡ配列は、配列番号４９によって表される通りである。
【０２０５】
表２．プライマー
【表２】
2019503688.tif 000003
2019503688.tif 000004
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【０２０６】
実施例４：ｐＯＷＲ３ベクターへの発現カセット（インサート）のクローニング、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉにおける発現、および様々な基質における多糖分解活性の試験
実施例３（実施例３．１〜３．１７）の様々な増幅されたヌクレオチド配列（発現カセット）を、制限酵素によらないクローニング方法（Ｐｅｌｅｇ  Ｙ，  Ｕｎｇｅｒ  Ｔ．  「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−Ｆｒｅｅ（ＲＦ）  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４；１１１６：７３−８７）を用いてｐＯＷＲ３ベクターにクローニングした。得られたベクターをＤＨ５α細菌に挿入して増幅した後、メチル化されていないベクターを生産するために、ｄａｍ／ｄｃｍ−のＥ．ｃｏｌｉ株に移し、増やし、精製した。
【０２０７】
精製されたベクターを、実施例１で説明されるようなエレクトロポレーションプロセスを用いてＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉに挿入した。得られた組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを、多糖分解酵素を発現および分泌する能力、ならびにその結果生じた、好適な糖類（デンプン、セルロースおよびキシランなど）を分解する活性について試験する。
【０２０８】
様々な基質におけるデンプン分解活性の試験：得られた組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを、グルコアミラーゼを発現および分泌する能力、ならびにその結果生じた、デンプンを分解するグルコアミラーゼ活性について試験する。
【０２０９】
ＹＥＬ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのラクテート）と０．５％のデンプンとを含む寒天プレートに組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉのコロニーを移し、一晩培養する。寒天プレート上にルゴール溶液を注いでデンプンを可視化することによってデンプンの分解を検出する。
【０２１０】
デンプンの存在下において、ルゴールは、黒色の沈殿物を形成する。グルコアミラーゼの存在下では、デンプンは分解され、無色のハローが観察される。対照ルゴールアッセイが図３で示されているが、これは、ルゴール溶液に曝されている、ＹＥＬ培地と０．５％のデンプンとを含む寒天プレートを示す。デンプンを含む領域は全て、黒色に可視化されているが、寒天プレート中にグルコアミラーゼ酵素が拡散している領域では、デンプンが存在しないことを示す無色のサークルが見て取れる。
【０２１１】
さらに、得られた組換え（遺伝子操作された）Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを、０．５〜５％のデンプンを含む液体ＹＥＬ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのラクテート）に移し、３０℃〜３７℃において一晩培養した後、５５℃において２時間培養する。まず、比色アッセイによって、インキュベーション後の培養液０．５ｍＬを、そのグルコース含有量について試験する。場合によっては、このアッセイは、同じ条件の下で処理された野生型（改変されていない）Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの培養物の対照培養液と、および／または添加される細菌を含まない同じ培地と、比較される。分泌されたグルコアミラーゼは、培地中のデンプンを分解し、比色法によって検出できるグルコースを生成する。第二に、同様のアッセイを行うが、このアッセイでは、インキュベーション後の培地が遠心分離され、その上清のみが、そのグルコース含有量について試験される。さらに、最適条件の下でのグルコアミラーゼ活性の活性を試験する。一晩培養した培養液０．１ｍＬを、１％のデンプン溶液０．４ｍＬとともに２時間インキュベートし、その後、チューブを遠心分離し、その上清を、比色法によりそのグルコース含有量について試験する。
【０２１２】
さらに、１０８ＣＦＵ／ｍｌの組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを、細断された有機廃棄物（ｐＨ５．５）に植菌し、３０℃〜３７℃において一晩培養した後、５５℃において約２時間培養する。一晩培養した培養液０．５ｍＬを遠心分離し、その上清を、比色法によりそのグルコース含有量について試験する。
【０２１３】
実施例４．１：Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉにおけるＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０プロモーターおよびＰＦＲＥＵＤ＿０４８５０シグナルペプチドと組み合わせたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のグルコアミラーゼｇｉ３４１４６７８５の発現、ならびにそのデンプン分解活性の試験
実施例３．１１において説明される発現カセット（配列番号４３）を、上述のように、ｐＯＷＲ３ベクターにクローニングしてＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉに形質転換した。
【０２１４】
得られた組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを、グルコアミラーゼを発現および分泌する能力について、ならびにデンプンを分解するグルコアミラーゼ活性を試験するために、調べた。
【０２１５】
１０６〜１０９ＣＦＵ／ｍｌの、得られた組換え（遺伝子操作された）Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉまたは対応する野生型細菌（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ対照）を、デンプンを含む液体ＹＥＬ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのラクテート）に移し、３０℃〜３７℃において培養した後、５５℃においてさらに培養した。
【０２１６】
インキュベーション期間の後、培養液を、（それぞれの温度および／または細菌のＣＦＵ／ｍｌについて）組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉと対照Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉでＣＦＵ量が同様であるかについて検証した。各培養液を、比色法によりそのグルコース含有量について試験した。組換えＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉで処理した培地では、野生型Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの対照と比較して、グルコース含有量の顕著な増加（３５倍超）が観察された。
【０２１７】
これらの結果は、遺伝子操作された細菌が、活性のある多糖分解酵素（この実施例ではグルコアミラーゼ）を首尾よく発現および分泌できるということ、ならびに分泌された酵素が、基質中のデンプンを首尾よく分解してグルコースを生成できるため、活性を有するということを示す。
【０２１８】
実施例５：逐次的な乳酸の利用と有機廃棄物の糖化
逐次的な稼働様式で、有機廃棄物において乳酸を利用し多糖類を糖化するために、ＬＡ利用細菌を使用する。
【０２１９】
混合食品廃棄物の粉砕は、１０００ｍｌの水に１０００グラムの食品廃棄物を含む複数のバッチでＯｐｔｉｍｕｍ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｂｌｅｎｄｅｒにおいて行う。１０Ｌ（作業体積）の半固体混合物を発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、容量１５Ｌ）に入れる。ｐＨは５．２と測定された。
【０２２０】
そのまま、培地を２００ｒｐｍで撹拌しながら１２１℃にて３０分間、（オートクレーブによる）培地の滅菌を行う。その後、発酵槽を３７℃まで冷却し、温度を維持する。発酵槽内で正圧を維持するために、ヘッドスペースに空気を流し続ける。
【０２２１】
乳酸利用細菌スターターの調製：乳酸利用細菌（この実施例では、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（ＡＴＣＣ  ９６１４））による発酵および乳酸の利用のための植菌は、３７℃にて低速１００ｒｐｍで１Ｌの振とうフラスコにおいて酵母エキスラクテート（ＹＥＬ）培地に行う。１×１０８という細胞密度まで細胞を増殖させる。
【０２２２】
発酵：１０．８Ｌに対して１５ｍｌを植菌し、培地中に存在する乳酸の利用が実質的に完了するまで、３７℃でｐＨ５．５（１０％のアンモニア溶液で調節）にて発酵させる。乳酸およびグルコースとフルクトースの総量の測定を行う。ブロスのサンプルを１５℃において６０００ｇで１０分間遠心分離し、上清をＲｅｆｌｅｃｔｏｑｕａｎｔ分析システム（ＲＱｆｌｅｘ  ｐｌｕｓ  １０）で分析する。
【０２２３】
次いで、発酵槽を５５℃に２時間加温して、細菌によって分泌される多糖分解酵素（例えば、グルコアミラーゼ）の活性に最適な条件にするとともに細菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）を滅菌する。糖化の後、発酵槽を３７℃まで冷却して、乳酸生成細菌（ＬＡＢ）の利用による、さらなる処理および乳酸の個別のエナンチオマーの生産を可能にする。
【０２２４】
ＬＡＢスターターの調製−Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ  １１４４３）によるＬ−ラクテート発酵のための植菌：１リットルの振とうフラスコ、条件は、３７℃の１００ｒｐｍで撹拌されるＭＲＳ培地を含む。１×１０９という密度まで細胞を増殖させる。１０Ｌの発酵のために１５ｍｌのスターター培養液を植菌する。温度を３７℃に調節し、アンモニア溶液（１０％）でｐＨを６．５に調節する。Ｌ−ラクテート発酵は、培地からグルコースが枯渇すると（典型的には２４〜４８時間後に）終了する。
【０２２５】
実施例６：同時に起こる乳酸の利用と有機廃棄物の糖化
有機廃棄物において乳酸の利用と多糖の糖化を同時に生じさせるために、ＬＡ利用細菌を使用する。
【０２２６】
混合食品廃棄物の粉砕は、１０００ｍｌの水に１０００グラムの食品廃棄物を含む複数のバッチでＯｐｔｉｍｕｍ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｂｌｅｎｄｅｒにおいて行う。１０Ｌ（作業体積）の半固体混合物を発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、容量１５Ｌ）に入れる。ｐＨは５．２と測定される。
【０２２７】
そのまま、培地を３００ｒｐｍで撹拌しながら１２１℃にて３０分間、（オートクレーブによる）培地の滅菌を行う。その後、発酵槽を３７℃まで冷却し、温度を維持する。
【０２２８】
乳酸利用細菌スターターの調製：乳酸利用細菌（この実施例では、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（ＡＴＣＣ  ９６１４））による発酵および乳酸の利用のための植菌は、３７℃にて低速１００ｒｐｍで１Ｌの振とうフラスコにおいて酵母エキスラクテート（ＹＥＬ）培地に行う。１×１０８という細胞密度まで細胞を増殖させる。
【０２２９】
発酵：１０．８Ｌに対して１５ｍｌを植菌し、細菌によって分泌される多糖分解酵素（例えば、グルコアミラーゼ）による多糖の糖化と同時に起こる培地中に存在する乳酸の利用が実質的に完了するまで、３７℃でｐＨ５．５（１０％のアンモニア溶液で調節）にて発酵させる。乳酸およびグルコースとフルクトースの総量の測定を行う。ブロスのサンプルを１５℃において６０００ｇで１０分間遠心分離し、上清をＲｅｆｌｅｃｔｏｑｕａｎｔ分析システム（ＲＱｆｌｅｘ  ｐｌｕｓ  １０）で分析する。
【０２３０】
発酵槽を５５℃に２時間加温して、細菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）を滅菌する。
【０２３１】
その後、発酵槽を３７℃まで冷却して、乳酸生成細菌（ＬＡＢ）の利用による、さらなる処理および乳酸の個別のエナンチオマーの生産を可能にする。
【０２３２】
ＬＡＢスターターの調製−Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ  １１４４３）によるＬ−ラクテート発酵のための植菌：１リットルの振とうフラスコの条件は、３７℃の１００ｒｐｍで撹拌されるＭＲＳ培地を含む。１×１０９という密度まで細胞を増殖させる。１０Ｌの発酵のために１５ｍｌのスターター培養液を植菌する。温度を３７℃に調節し、アンモニア溶液（１０％）でｐＨを６．５に調節する。Ｌ−ラクテート発酵は、培地からグルコースが枯渇すると（典型的には２４〜４８時間後に）終了する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月8日(2018.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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