(57)【要約】抗腫瘍活性を増強するためのクラスＩ  ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤の組み合わせを含む組成物が開示される。さらに、腎細胞がんにおいて制御性Ｔ細胞を抑制するための免疫療法としてこれらの組成物を投与する方法が開示される。【選択図】図１Ｅ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含む組成物。
【請求項２】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤が、エンチノスタット（ピリジン−３−イルメチルＮ−［［４−［（２−アミノフェニル）カルバモイル］フェニル］メチル］カルバメート）、ボリノスタット（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド）およびトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド）、ダシノスタット（（Ｅ）−３−（４−（（（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）フェニル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド）、ブチラート、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ベリノスタット（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（フェニルスルファモイル）フェニル］プロパ−２−エナミド）、パノビノスタット（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリルアミド）、ピロキサミド、ＳＫ−７０４１（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［［４−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］ベンズアミド）、ＳＫ−７０６８（Ｎ−［［４−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］−４−ピロリジン−１−イルベンズアミド）、トラポキシンＡ（シクロ（（Ｓ）−ガンマ−オキソ−Ｌ−アルファ−アミノオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−２−ピペリジンカルボニル））、環状テトラペプチドヒドロキサム酸類似体（ＣＨＡＰ）、デプデシン（４，５：８，９−ジアンヒドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−Ｄ−スレオ−Ｄ−イド−ウンデカ−１，６−ジエニトール）、モセチノスタット（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
約０．５μＭ〜約２μＭの前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤がエンチノスタットである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
約０．５μＭのエンチノスタットを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
約１．０μＭのニボルマブを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
必要とする個体において制御性Ｔ細胞を抑制する方法であって、クラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含む組成物を前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤が、エンチノスタット（ピリジン−３−イルメチルＮ−［［４−［（２−アミノフェニル）カルバモイル］フェニル］メチル］カルバメート）、ボリノスタット（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド）およびトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド）、ダシノスタット（（Ｅ）−３−（４−（（（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）フェニル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド）、ブチラート、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ベリノスタット（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（フェニルスルファモイル）フェニル］プロパ−２−エナミド）、パノビノスタット（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリルアミド）、ピロキサミド、ＳＫ−７０４１（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［［４−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］ベンズアミド）、ＳＫ−７０６８（Ｎ−［［４−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］−４−ピロリジン−１−イルベンズアミド）、トラポキシンＡ（シクロ（（Ｓ）−ガンマ−オキソ−Ｌ−アルファ−アミノオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−２−ピペリジンカルボニル））、環状テトラペプチドヒドロキサム酸類似体（ＣＨＡＰ）、デプデシン（４，５：８，９−ジアンヒドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−Ｄ−スレオ−Ｄ−イド−ウンデカ−１，６−ジエニトール）、モセチノスタット（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が約０．５μＭ〜約２μＭの前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤がエンチノスタットである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
エンチノスタットが約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＤ−１阻害剤がニボルマブである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ニボルマブが約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記個体が腎細胞がんを有する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月２８日に出願された米国仮出願第６２／２８８，１２１号に対する優先権を主張し、それは全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表を提出するための支持の声明
８７８バイトのサイズ（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＥＸＰＬＯＲＥＲで測定した場合）である、ファイル名「ＩＵＲＴＣ＿２０１６−０８６−０２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」を含む配列表のコンピュータ可読形態が、本明細書に提供され、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表は配列番号１〜３からなる。
【０００３】
本開示は、概して、クラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤の組み合わせを含む組成物に関する。さらに、制御性Ｔ細胞を抑制し、腎細胞がんにおける免疫療法を増強するためのこれらの組成物の使用を開示する。
【背景技術】
【０００４】
この１０年の間、免疫療法は、固形腫瘍の治療のための最も魅力的で広範に研究される手法の１つになってきている。しかしながら、現在のがん免疫療法の臨床研究は依然として非常に制限された効果を示す。がんに対する免疫寛容が主な障壁であることが示されている。腫瘍成長および間質樹立は、局所微小環境だけでなく、複数のレベルの耐性機構を誘導する免疫系の周辺構成要素：制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来免疫抑制細胞および腫瘍関連マクロファージなどの免疫抑制細胞；免疫チェックポイント；および循環サイトカインの異常レベルもまた、調節する。これらの免疫抑制因子の間で、Ｔｒｅｇは主要なプレーヤーの１つとして識別されている。Ｔｒｅｇの数または機能は通常、がん患者において促進される。また、前臨床データにより、腫瘍関連抗原に対する耐性を誘導する際のＴｒｅｇの役割も示唆される。より重要なことに、サイトカインおよびワクチン自体などの免疫療法は、患者においてＴｒｅｇの数または機能の促進を誘導することができる。まとめると、Ｔｒｅｇのターゲティングは免疫療法の有効性を改善することができるという強力な証拠が存在する。
【０００５】
Ｔｒｅｇを標的とするほとんどの現在のストラテジーは、細胞表面受容体２５に結合するモノクローナル抗体もしくはリガンド指向性毒素（ｌｉｇａｎｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｘｉｎ）による、またはメトロノミックシクロフォスファミド治療によるＴｒｅｇの枯渇を目的とする。これらの枯渇アプローチは、活性化Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）を除去するそれらの副作用およびＴｒｅｇ補充の誘導に恐らく起因して臨床的利点を制限する。他の表面マーカーも標的とするストラテジーもまた、特定の問題を有する。通常、可能な臨床応用に対して制限および重要なかい離がある、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡアプローチなどの、Ｔｒｅｇ細胞内タンパク質発現、機能またはシグナリングに影響を与える多くの方法が動物において試験されている。
【０００６】
さらに、腎細胞がん（ＲＣＣ）を有する患者の治療における最近の進歩により、ニボルマブ、ＰＤ−１阻害剤などの、免疫チェックポイント阻害剤の使用についての扉が開かれた。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸は、細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍活性を減少させるように作用することによって腫瘍の免疫回避能力において中心的役割を果たす。ＲＣＣにおいて異常に発現されると報告されている、この免疫チェックポイントの遮断は、最近、ｃｃＲＣＣ患者の３０〜４０％において客観的反応を生じる見込みがあると示されている。第ＩＩＩ相臨床試験結果により、進行性腎細胞がんを有する患者における抗ＰＤ−１治療からの明白な利点を示すことによってニボルマブが承認された。標準治療と比較して、エベロリムス、ニボルマブ患者は、治療関連有害作用が制限された全生存の７８％の増加を示した。しかしながら、これらの優れた臨床的進歩にも関わらず、ＲＣＣおよび多くの他の固形腫瘍についての免疫療法は患者のサブセットに有益なだけである。免疫学的監視からの腫瘍回避は、ＲＣＣを有する患者からの腫瘍を効果的に治療する際に大きな障害のままである。
【０００７】
上記に基づいて、当該技術分野において、上記の制限を克服できるようにＴｒｅｇの抑制をターゲティングできる代替の免疫療法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、概して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を抑制し、腎細胞がんにおいて免疫療法を増強するためのクラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含む組成物に関する。特に、一実施形態において、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、エンチノスタットはＰＤ−１阻害の抗腫瘍効果を増強することが見出される。
【０００９】
一態様において、本開示は、クラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含む組成物を対象とする。
【００１０】
別の態様において、本開示は、必要とする個体における制御性Ｔ細胞を抑制する方法を対象とする。その方法は、クラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含む組成物を個体に投与する工程を含む。
【００１１】
本開示は、以下の詳細な説明を考慮して、より良く理解され、上記以外の特徴、態様および利点が明白になるであろう。そのような詳細な説明は以下の図面に対する参照となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、同系腎細胞がんマウスモデルにおけるエンチノスタットにより改善された免疫療法を示す。（図１Ａ）実験タイムライン、メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、−８日目に１×１０４ＲＥＮＣＡ−Ｌｕｃ細胞を同所性注射した。注入後１週間で、毎週、生物発光イメージングを開始し、実施例２の期間継続した。処置を実施例２の１日目に開始した。
【図１Ｂ】上部：ベースライン生物発光イメージング。下部：エンドポイント生物発光イメージング。まとめると、これらの画像はｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す。
【図１Ｃ】実施例２の期間にわたる、対照、エンチノスタット、抗ＰＤ−１、およびエンチノスタット＋抗ＰＤ−１コホートにおける各マウスの平均放射輝度［ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ］。
【図１Ｄ】各群についてのエンドポイント腫瘍の画像。実験１および２は結果を実証するために連続的に実施した。
【図１Ｅ】エンチノスタット＋抗ＰＤ−１免疫療法による腫瘍サイズの有意な減少を示すエンドポイント腫瘍重量（ｇ）。
【図１Ｆ】左：１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１を用いた生存研究により、対照および抗ＰＤ−１免疫療法単独と比較したエンチノスタット＋抗ＰＤ−１で処置したマウスの生存曲線の有意な変化が示される。右：２０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１を用いた生存研究により、対照およびエンチノスタットコホートと比較したエンチノスタット＋抗ＰＤ−１におけるさらなる有意な変化が示され、さらに増加した投薬量の抗ＰＤ−１免疫療法により、マウスの生存率が延びた。結果は平均±ＳＥＭとして示し（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、ウェルチ補正による独立ｔ検定を使用して腫瘍重量統計値を算出し；ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して生存統計値を算出した。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、エンチノスタットが同系ｃｃＲＣＣマウスモデル、ＲＥＮＣＡにおけるＴ細胞および腫瘍関連マクロファージ反応を調節したことを示す。血液および腫瘍試料を実施例２の終わりにマウスから単離し、フローサイトメトリー分析のために処理した。（図２Ａ）左：血液のＦＡＣＳ分析はＣＤ４およびＦｏｘＰ３レベルに対するビヒクルおよび組み合わせ処置の効果を示す。右：血液に存在する制御性Ｔ細胞および平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示されるタンパク質発現の定量化により、制御性Ｔ細胞についての機能的転写因子である対照と比較して、組み合わせコホートにおいてＦｏｘＰ３の減少に伴い制御性Ｔ細胞の存在の有意な増加が示される。
【図２Ｂ】左：対照またはエンチノスタット処置後のＲＥＮＣＡマウス由来の腫瘍細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析。右：ＴＭＥに存在する制御性Ｔ細胞および平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示されるタンパク質発現の定量化により、制御性Ｔ細胞にいての機能的転写因子であるＦｏｘＰ３の有意な減少を伴う対照と比較して、組み合わせコホートにおいて制御性Ｔ細胞の存在のわずかな増加が示される。
【図２Ｃ】ＴＭＥへのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の定量的ＦＡＣＳ分析を示す。結果は、ＣＤ８＋浸潤およびＣＤ８＋：制御性Ｔ細胞比の有意な増加を示す。
【図２Ｄ】ＴＭＥへの腫瘍関連マクロファージ浸潤の定量的ＦＡＣＳ分析結果を示し、マクロファージ浸潤の有意な減少が示され、ＨＤＡＣｉが先天性免疫系に影響を及ぼし得ることを示す。ｎ＝３〜５の腫瘍／血液試料／コホート／パネル。結果は平均±ＳＥＭとして示し（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、ウェルチ補正による独立ｔ検定を使用して統計値を計算した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆは、エンチノスタットがＲＥＮＣＡ腫瘍から採取されたＭＤＳＣの免疫抑制能を阻害したことを示す。（図３Ａ）右：エンチノスタット、抗ＰＤ−１免疫療法、または組み合わせによる処置後のＲＥＮＣＡ腫瘍由来の腫瘍細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析。左：ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の全集団におけるＬｙ６Ｃ＋およびＬｙ６Ｇ＋細胞のパーセンテージとして表されるＴＭＥへの単球および顆粒球ＭＤＳＣ浸潤物の定量的分析により、対照と比較して組み合わせコホートにおいてＭ−ＭＤＳＣおよびＧ−ＭＤＳＣの両方の存在下で有意な増加が示された（ｎ＝３〜５の腫瘍）。
【図３Ｂ】血液中のＧ−ＭＤＳＣおよびＭ−ＭＤＳＣの存在の定量的ＦＡＣＳ分析により、Ｇ−ＭＤＳＣの対照と比較して組み合わせにおいて有意な減少が示され、対照と比較して組み合わせにおいてＭ−ＭＤＳＣの有意な増加が示される（ｎ＝３〜５の血液試料）。対照と比較して、組合せにおいてＭ−ＭＤＳＣの有意な増加を示す（ｎ＝３−５血液サンプル）。
【図３Ｃ】ＴＭＥから分離したＭ−ＭＤＳＣ細胞を、１６〜１８時間、ＣＦＳＥ標識化ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、その時点でそれらを収集し、ＣＤ８およびグランザイムＢ抗体で染色し、Ｔ細胞増殖についてＦＡＣＳ分析に供した。結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエンチノスタットで処置した場合、Ｍ−ＭＤＳＣ抑制能の顕著な障害を示す（ｎ＝３〜５の腫瘍）。
【図３Ｄ】ＴＭＥから分離したＧ−ＭＤＳＣ細胞を、１６〜１８時間、ＣＦＳＥ標識化ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、その時点でそれらを収集し、ＣＤ８およびグランザイムＢ抗体で染色し、Ｔ細胞増殖についてＦＡＣＳ分析に供した。細胞を以前に記載されるように収集し、共培養し、結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエンチノスタットで処置した場合、Ｇ−ＭＤＳＣ抑制能の顕著な阻害が明らかとなる（ｎ＝３〜５の腫瘍）。
【図３Ｅ】対照、エンチノスタット、または組み合わせで処置したコホート由来のＭＤＳＣと共培養したＴ細胞由来の細胞傷害性ＣＤ８＋活性タンパク質のグランザイムＢのＦＡＣＳ分析。
【図３Ｆ】ＦＡＣＳ分析の定量的表現は、エンチノスタットおよび組み合わせで処置したマウス由来のＭＤＳＣが、対照よりグランザイムＢによるＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の阻害能が低いことを示す。結果は平均±ＳＥＭとして示し（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、ウェルチ補正による独立ｔ検定を使用して統計値を計算した。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、エンチノスタットがＭＤＳＣ様細胞株Ｊ７７４Ｍの阻害能を減少させたことを示す。（図４Ａ）Ｊ７７４Ｍ細胞株の特徴的ＦＡＣＳ分析により、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の中で、細胞の約９０％がＬｙ６Ｇ＋Ｇ−ＭＤＳＣ様であり、１０％がＬｙ６Ｃ＋Ｍ−ＭＤＳＣ様細胞であり、代表的なものはＴＭＥにおいて典型的に見られるものであることが明らかとなった。Ｊ７７４Ｍ細胞をエンチノスタットにより２４時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置し、続いて６８〜７２時間、事前活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。
【図４Ｂ】６８〜７２時間の共培養時のＴ細胞の代表的な画像（スケールバー：４００ｕｍ）。
【図４Ｃ】１：１の比でＪ７７Ｍ細胞とインキュベートしたゲートしたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光ヒストグラム。Ｊ７７４Ｍ細胞をエンチノスタットの濃度を増加させて処置した。右から左：対照（未処置）、０．０１ｕＭ、０．０５ｕＭ、０．２５ｕＭ、０．３７ｕＭ、０．５ｕＭ。
【図４Ｄ】図４Ｂの定量的表現；棒は、増殖しているＣＤ８Ｔ＋細胞の平均パーセンテージを示す（ｎ＝３の技術的複製）。この実験は独立して３回繰り返した。
【図４Ｅ】定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、Ｊ７７４Ｍ細胞をエンチノスタットで処置した場合、重要なＭＤＳＣ機能調節因子アルギナーゼ−１の有意な減少が示される。
【図４Ｆ】エンチノスタット処置の４８時間後のＪ７７４Ｍ細胞増殖または生存率の分析。
【図４Ｇ】Ｊ７７４Ｍ細胞をエンチノスタットで処置した場合のｉＮＯＳの倍率変化を示す定量分析。結果は平均±ＳＥＭとして示し（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、ウェルチ補正による独立ｔ検定を使用して統計値を計算した。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、エンチノスタットによる処置が、ＲＥＮＣＡ腫瘍において見出される高度な免疫抑制環境を有意に変化させたことを示す。実施例２の終わりにマウスから採取した腫瘍および血液試料を処理し、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  ＸＬ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｒｒａｙ  ｋｉｔ（Ａｒｙ０２８）を使用して検査した。（図５Ａ）対照およびエンチノスタット処置コホートにおける腫瘍溶解物からのマウスサイトカイン／ケモカインアレイ結果（ｎ＝２の腫瘍／コホートおよび１つの腫瘍当たり３データ点）。腫瘍内微小環境分析により、腫瘍抑制環境の有意な変化が生じた。
【図５Ｂ】エンチノスタットの存在下で有意に下方制御したＭＤＳＣ関連またはｐｒｏ−腫瘍サイトカイン／ケモカインの定量。
【図５Ｃ】エンチノスタット処置の存在下で有意に上方制御した抗腫瘍ケモカイン／サイトカインの定量。
【図５Ｄ】左：対照およびエンチノスタット処置マウスの血清試料からのＡｒｙ０２８アレイ結果（ｎ＝２の腫瘍／コホートおよび１つの腫瘍当たり３データ点）。エンチノスタット処置単独は、図５Ｄの右パネルに示されるように循環中のＭＤＳＣ関連およびｐｒｏ−腫瘍サイトカインおよびケモカインの多くを阻害した。
【図５Ｅ】左：対照コホートと組み合わせコホートを比較したアレイ結果（ｎ＝２の腫瘍／コホートおよび腫瘍あたり３データ点）。組み合わせ処置は、図５Ｅの右パネルに示されるように、複数の抗腫瘍関連ケモカインおよびサイトカインを有意に上方制御した。結果は平均±ＳＥＭとして示し（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、多重ｔ検定を使用して統計値を計算し、Ｑ＝１％で、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、ＫｒｉｅｇｅｒおよびＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形上昇手順（Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｔｅｐ−ｕｐ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用して発見を決定した。
【図６】ｃｃＲＣＣに対する先天性および適応免疫応答者のエンチノスタット変化の概略図を示す。エンチノスタットがどのように制御性Ｔ細胞活性を阻害するかのモデルが含まれる。さらに、エンチノスタットがアルギナーゼ１を下方制御することによりＭＤＳＣ機能を阻害し、それにより細胞傷害性Ｔ細胞活性に必要とされるＬ−アルギニンのプールを遊離する、仮定された機構が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。
【００１４】
概して、本開示は、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤およびＰＤ−１阻害剤の組み合せを含む組成物を対象とする。ＨＤＡＣは、細胞周期の進行、増殖、およびアポトーシスに関与する遺伝子の転写調節を媒介することによって、発がん性形質転換に関与することが示されている。ＨＤＡＣ阻害剤は、現在、がん治療のために開発されており、異なる腫瘍において抗腫瘍活性を実証している。ＨＤＡＣは、標的および細胞内部位が異なる４つの異なるクラスに特徴付けられている。最近、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤がＳＴＡＴ３のアセチル化を誘導し、その結果、ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３転写を低下させることが見出された。この重要な転写因子の阻害により、Ｔｒｅｇの機能が低下し、抗腫瘍免疫応答が解放される。
【００１５】
本開示の組成物において使用するための１つの適切な選択的クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤は、合成ベンズアミド、エンチノスタット（ピリジン−３−イルメチルＮ−［［４−［（２−アミノフェニル）カルバモイル］フェニル］メチル］カルバメート）を含む。エンチノスタット、合成ベナミドは、いくつかの腫瘍モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で抗腫瘍活性を有する。特に、エンチノスタットは、腫瘍内微小環境と宿主免疫監視との間の動的相互作用を破壊することが示されている。腫瘍組織は、古典的に、腫瘍促進性炎症を可能にする、無数の免疫抑制因子および走化性因子の両方を放出することによって、免疫監視を回避する。クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤によるＨＤＡＣ処置は、腫瘍の免疫原性を増加させ、１つの免疫抑制機構に対抗することが示されている。他の適切なクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤としては、例えば、ボリノスタット（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド）およびトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド）、ダシノスタット（Ｄａｃｉｎｏｓｔａｔ）（ＬＡＱ８２４としても知られている）（（Ｅ）−３−（４−（（（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）フェニル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド）、ブチラート、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ベリノスタット（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）（ＰＸＤ１０１としても知られている）（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（フェニルスルファモイル）フェニル］プロパ−２−エナミド）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９としても知られている）（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリルアミド）、ピロキサミド、ＳＫ−７０４１（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［［４−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］ベンズアミド）、ＳＫ−７０６８（Ｎ−［［４−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］−４−ピロリジン−１−イルベンズアミド）、トラポキシンＡ（シクロ（（Ｓ）−ガンマ−オキソ−Ｌ−アルファ−アミノオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−２−ピペリジンカルボニル））、環状テトラペプチドヒドロキサム酸類似体（ＣＨＡＰ）、デプデシン（４，５：８，９−ジアンヒドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−Ｄ−スレオ−Ｄ−イド−ウンデカ−１，６−ジエニトール）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ−０１０１３としても知られている）（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド）などおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１６】
クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤の適切な投薬量は、例えば、個体の年齢および体重、治療を必要とする少なくとも１つの正確な状態、状態の重症度、組成物の性質、投与経路およびそれらの組み合わせを含む、多くの因子に依存する。最終的に、適切な投薬量は、例えば、医師、獣医師、科学者、ならびに他の医学および研究の専門家などの当業者によって容易に決定することができる。例えば、当業者は、所望の治療成果または結果に達するまで増加され得る低い投薬量で開始してもよい。あるいは、当業者は、所望の治療成果または結果を達成するのに必要とされる最小投薬量に達するまで減らすことができる高い投薬量で開始してもよい。クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤の例示的な適切な投薬量は、約０．５μＭを含む、約０．５μＭ〜約２μＭを含んでもよい。さらなる実施形態において、個体は、約５ｍｇ／ｋｇのクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤の投薬量で、ＰＤ−１阻害剤と組み合わせて、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤を投与され得る。
【００１７】
組成物は、概して、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせてＰＤ−１阻害剤を含む。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体であり、Ｔ細胞およびｐｒｏ−Ｂ細胞上で発現する。ＰＤ−１は２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。免疫チェックポイントとして機能するＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を防ぐことによって免疫系を下方制御する際に重要な役割を果たし、それにより次に自己免疫を低減させ、自己寛容を促進する。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節の抗原特異的Ｔ細胞においてアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に、Ｔｒｅｇにおけるアポトーシスを低下させるという二重機構によって達成される。本開示の組成物における使用に適したＰＤ−１阻害剤には、ニボルマブ、ペンブロリズマブなど、およびアテゾリズマブなどのＰＤ−Ｌ１阻害剤、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１８】
ＰＤ−１阻害剤の適切な投薬量は、例えば、個体の年齢および体重、治療を必要とする少なくとも１つの正確な状態、状態の重症度、組成物の性質、投与経路およびそれらの組み合わせを含む、多くの因子に依存する。最終的に、適切な投薬量は、例えば、医師、獣医師、科学者、ならびに他の医学および研究の専門家などの当業者によって容易に決定することができる。例えば、当業者は、所望の治療成果または結果に達するまで増加され得る低い投薬量で開始してもよい。あるいは、当業者は、所望の治療成果または結果を達成するのに必要とされる最小投薬量に達するまで減らすことができる高い投薬量で開始してもよい。ＰＤ−１阻害剤の１つの例示的な適切な投薬量は約１．０μＭを含んでもよい。さらなる実施形態において、個体は、約１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１阻害剤の投薬量で、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせてＰＤ−１阻害剤を投与されてもよい。
【００１９】
クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤およびＰＤ−１阻害剤の組み合わせは、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与されてもよい。本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される」という語句は、十分な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的なベネフィット／リスク比に相応して、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した、リガンド、材料、製剤、および／または投薬形態を指す。本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、活性化合物を身体の１つの器官または部分から、身体の別の器官または部分へ運搬または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、製剤またはビヒクルを指す。各担体は、組成物の他の成分（例えば、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤）と適合性があり、個体に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。再構成および投与され得る凍結乾燥組成物もまた、本開示の範囲内である。
【００２０】
薬学的に許容される担体は、例えば、賦形剤、ビヒクル、希釈剤、およびそれらの組み合わせであってもよい。例えば、組成物が経口投与される場合、それらは、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、もしくはシロップとして処方されてもよく；または非経口投与については、それらは、注射（筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、硝子体内、網膜下、結膜下）、滴下注入製剤、または座剤として処方されてもよい。これらの組成物は、従来の手段によって調製することができ、所望であれば、活性化合物（すなわち、クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤）を、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、コーティング剤、またはそれらの組合せなどの任意の従来の添加剤と混合することができる。
【００２１】
本開示の医薬組成物は、本明細書中に記載される疾患、障害、および状態を緩和、媒介、予防、および治療するために、さらなる公知の治療剤、薬物、合成化合物のプロドラッグへの修飾剤などをさらに含んでもよいことが理解されるべきである。
【００２２】
別の態様において、本開示は、概して、Ｔｒｅｇを抑制し、抗腫瘍効果を増強するための組成物の投与に関する。したがって、本開示の方法に使用されるクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤およびＰＤ−１阻害剤の組み合わせを含む組成物は、必要とする個体のサブセットに投与されてもよい。本明細書に使用される場合、「必要とする個体」とは、がん、特に腎細胞がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫などのリスクがあるか、またはそれらを有する個体を指す。さらに、「必要とする個体」はまた、本明細書において、がんを有するリスクがあるか、または医療専門家によってがんを有すると診断された個体を指すために使用される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は一般集団のサブセットを対象とし、したがってこれらの実施形態では、一般集団の全てがこの方法から恩恵を受けるとは限らない。上記に基づいて、本開示の方法の実施形態のいくつかは、同定された個体の特定のサブセットまたはサブクラス（すなわち、本明細書に記載される１つ以上の特定条件に対処する際に支援を「必要とする」個体のサブセットまたはサブクラス）を対象とするため、全ての個体が、本明細書に記載される個体のサブセットまたはサブクラスの範囲内に入るわけではない。特に、必要とする個体はヒトである。必要とする個体は、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ならびに当業者に公知の他の種類の研究動物および／またはペットなどの動物であってもよい。
【００２３】
当業者であれば、組成物を単回投薬または複数回投薬として長期間にわたって投与できることを理解すべきである。例えば、組成物は、３日間、５日間、７日間またはそれ以上の期間にわたって、毎日、隔日、３日毎、週１回などで投与することができる。さらに、組成物は、１日に１回または１日に２回、１日に３回もしくはそれ以上の回数を含む、１日に１回より多く投与されてもよい。
【００２４】
本開示のこれらおよび他の実施形態の様々な機能および利点は、以下に示す実施例からより十分に理解されるであろう。これらの実施例は、本開示の利益を例示することを意図しているが、本開示の全範囲を例示するものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１
この実施例において、抗ＰＤ−１抗体処置と組み合わせたエンチノスタット処置の免疫調節能を分析した。
【００２６】
材料および方法：
細胞株：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から購入した、ＲＥＮＣＡ−Ｌｕｃネズミ腎細胞がん細胞株を、Ｐｉｌｉ実験室においてルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトした。細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して培養した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２に維持したインキュベーター内でインキュベートした。７５〜８０％コンフルエント細胞を、０．２５％トリプシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用してＢａｌｂ／ｃマウスの腎臓への同所性注射のために収集し、１：１の比のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中に懸濁した。
【００２７】
Ｊ７７４Ｍ細胞株−Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒによる寄付／培養方法
Ｊ７７４Ｍ細胞株を、１０％ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）培地で培養した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２中でインキュベートした。７０〜８０％コンフルエントな細胞を、セルスクレーパーを使用して収穫し、ＡＴＣＣガイドラインに従って親細胞株について示唆されているように継代した。
【００２８】
腫瘍懸濁液および脾細胞調製物：生きた腫瘍切片を腫瘍から単離し、小片に切断し、マウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  −  １３０−０９６−７３０）からの酵素カクテル溶液で消化した。腫瘍を酵素カクテルと共に３７℃で３０分間撹拌しながらインキュベートした。酵素反応を、ＰＢＳを使用して停止させ、細胞を３００ｇ、４℃で７分間回転させ、ＰＢＳ中に再懸濁し、７０ｕｍセルストレーナーを通してすりつぶした。これらの腫瘍由来の細胞をフローサイトメトリー分析に使用するか、またはさらに処理して機能分析のために使用した。
【００２９】
Ｔ細胞単離および活性化：全脾臓をナイーブマウスから採取し、すりつぶし、７０μｍストレーナーに通した。次いで、細胞を洗浄し、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ００−４３３３−５７）で溶解し、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ（１００単位／ｍｌ）−Ｓｔｒｅｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５５μＭ  ＢＭＥを含むＲＰＭＩ培地中で、抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６−００３１−８５）および抗ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５０１２５０３）と共に約２４時間培養した。次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（１３０−１０４−０７５）からのＣＤ８ａ＋  Ｔ細胞単離キットを使用して単離し、製造業者のプロトコルに従ってＣＦＳＥ（ＮＣ９７５９７５７）で染色し、下記のようにＭＤＳＣと共培養した。
【００３０】
ＭＤＳＣ単離：ＭＤＳＣを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ’ｓ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（１３０−０９４−５３８）を使用して各群のＲＥＮＣＡ腫瘍から単離し、連続希釈濃度で単離したＣＤ８＋  Ｔ細胞と共培養した。
【００３１】
Ｔ細胞抑制アッセイ：Ｔ細胞（１×１０５；ＣＤ８ａ＋  Ｔ細胞単離キットで単離した；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を、ＲＥＮＣＡ腫瘍から単離した異なる数のＧ−ＭＤＳＣまたはＭ−ＭＤＳＣのいずれかを有するプレートで１６〜１８時間培養した。記載した方法で単離したＴ細胞を、エンチノスタット処置したＪ７７４Ｍ細胞と６８〜７２時間共培養した。次いで、細胞を回収し、染色し、ＦＡＣＳ分析により分析した。
【００３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖（ＲＥＮＣＡ）：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、およびＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに厳密に従って、全ての手順は実施され、承認された。
【００３３】
５〜６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ）を、１２／１２時間の明／暗スケジュールで温度制御された部屋に維持し、食物を自由に与えた。７０〜８０％コンフルエントなＲＥＮＣＡ−Ｌｕｃ細胞を、０．２５％トリプシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して回収し、１：１比のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）中に懸濁し、１×１０４細胞を含有する１０μｌを腎被膜下に注入した。注射後１週間の予備生物発光イメージング後、マウスを４つの群：対照、エンチノスタット、抗ＰＤ−１、または組み合わせに無作為化した。マウス腫瘍を、生物発光ＩＶＩＳイメージング装置を使用して連続的にイメージングした。
【００３４】
エンチノスタットおよび抗ＰＤ−１処置：処置群のマウスを、エンチノスタット５ｍｇ／ｋｇ  ５日／週で経口、ＢｉｏＸＣｅｌｌ製の１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ（２回目の生存研究）でのＩ．Ｐ．、または組み合わせ処置レジメンで処置した。
【００３５】
細胞染色およびフローサイトメトリー：脾細胞、腫瘍細胞懸濁液、および末梢血細胞を洗浄し、４℃にて１５分間、Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（抗マウスＣＤ１６／３２ｍＡｂ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロックし、表面マーカー：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、Ｇｒ１（クローンＲＢ６−８Ｃ５）、Ｌｙ６Ｃ（クローンＡＬ−２１）、Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８）、Ｆ４８０（クローンＢＭ８）、ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７）、ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）抗体に対する蛍光コンジュゲート抗体で染色した。次いで、細胞を固定／透過緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で固定し、ＦｏｘＰ３（ＮＲＲＦ−３０）およびグランザイムＢ（クローンＧＢ１１）を含む、細胞内タンパク質に対する抗体で染色した。抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、染色に使用した。染色細胞およびアイソタイプ対照染色細胞をＬＳＲ４またはＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でアッセイした。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）および／またはＭｏｄＦｉｔ  ＬＴ  ４．１ソフトウェアを使用して実施した。
【００３６】
プロテオームプロファイル：腫瘍組織を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジナイゼーション後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて最終濃度１％とし、−８０℃にて凍結し、解凍し、１０，０００ｇとして５分間遠心分離し、定量し、製造業者のプロトコルに従ってアッセイした。各コホートのマウスから血液試料を採取し、室温にて２時間凝固させ、２０００ｇにて１５分間遠心分離した。血清試料を分析時間まで−８０℃にて凍結し、その分析時間のときにそれらを製造業者のプロトコルに従って実行した。全ての試料を処理し、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓマウスＸＬサイトカインアレイキット（Ａｒｙ０２８）で実行した。
【００３７】
定量的リアルタイムＰＣＲ：標準的なＴｒｉｚｏｌプロトコルを使用して±エンチノスタットで処置したＪ７７４Ｍ細胞からｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度および純度は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈｉ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅリーダーを用いてＡ２６０／２８０比の測定により決定した。ｉＳｃｒｉｐｔキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡを調製し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用してｑＰＣＲを実施した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアｖ２．３を使用して、サイクル閾（Ｃｔ）値を同定し、遺伝子発現曲線を生成した。データをＧａｐｄｈ式に対して正規化し、倍数変化を計算した。標的遺伝子に使用したプライマーは以下の通りであった：Ｇａｐｄｈ＿フォワード５’−ＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧ−３’、Ｇａｐｄｈ＿リバース５’−ＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１）、アルギナーゼ１＿フォワード５’−ＧＴＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＧＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号２）、およびアルギナーゼ１＿リバース５’−ＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＴＴ−３’（配列番号３）。
【００３８】
結果：
エンチノスタットはネズミ腎細胞がんモデルにおいてＰＤ−１阻害の抗腫瘍効果を増強した。以前の研究は、エンチノスタット処置が、制御性Ｔ細胞を含む腫瘍内微小環境への直接的な影響を介して免疫療法処置を増強する可能性を有することを示している。さらに、エンチノスタットは、ＲＥＮＣＡモデルにおいて、ＳＴＡＴ３アセチル化によって制御性Ｔ細胞機能を調節することによって、ＩＬ−２免疫療法を増強することが以前に示された。先天性免疫系に対するエンチノスタットの免疫調節能を調べるために、ＲＥＮＣＡモデルにおいてエンチノスタットを、マウスチェックポイント阻害剤、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用した。抗ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤の使用は、腫瘍および先天性免疫細胞の両方に提示されるＰＤ−Ｌ１発現により全体として腫瘍内微小環境（ＴＭＥ）に影響を与える。ＲＥＮＣＡモデルは、抗腫瘍Ｔ細胞活性の抑制における重要な因子である、高度に免疫抑制性のＭＤＳＣを誘引することが示されている。Ｂａｌｂ／ｃマウスにルシフェリン標識化ＲＥＮＣＡ細胞を同所的に接種した。
【００３９】
腫瘍を有するマウスを、生物発光読み取りに基づいて無作為化し、４つの群に分けた：対照、エンチノスタット（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはエンチノスタットと抗ＰＤ−１の組み合わせ。エンチノスタット単独での処置は、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらしたが（５２．６％成長阻害；エンチノスタット対対照：ｐ＝０．００１５）、抗ＰＤ−１単独は、腫瘍成長を中程度に減少させたのみであった（３５．０５％成長阻害；抗ＰＤ−１対対照：ｐ＝０．０７６８）（図１Ａ〜１Ｅ）。さらに、エンチノスタットおよび抗ＰＤ−１処置の組み合わせは、対照および単一処置群の各々と比較して腫瘍成長阻害を増強した（８３．３％減少；組み合わせ対ビヒクル：ｐ＜０．０００１；組み合わせ対エンチノスタット：ｐ＝０．０１１５；組み合わせ対抗ＰＤ−１：ｐ＝０．００７６）（図１Ａ〜１Ｅ）。
【００４０】
臨床的に、抗ＰＤ−１免疫療法は、ＲＣＣを有する患者の最大４１％において疾患の長期安定化を示している。以前の研究に続いて、エンチノスタットおよび抗ＰＤ−１抗体の組み合わせの生存増強効果を分析した。以前に記載した処置濃度を使用して、マウスの生存率の有意な増加が観察された。組み合わせ処置は生存率の有意な増加をもたらした（組み合わせ対抗ＰＤ−１：ｐ＝０．００１２；組み合わせ対対照：ｐ＝０．０００９）（図１Ｆ）。次に、抗ＰＤ−１抗体処置の用量を増加させると、ＲＥＮＣＡ腫瘍モデルの応答がさらに増強するかどうかを調べた。その結果は、抗ＰＤ−１群の生存期間が延長し、対照群およびエンチノスタット群と比較して組み合わせ処置したコホートで効果が増強された（組み合わせ対対照：ｐ＝０．０４７１；組み合わせ対エンチノスタット：ｐ＝０．０３７２）（図１Ｆ）ことを示した。これらの研究の結果は、エンチノスタットと抗ＰＤ−１抗体免疫療法の組み合わせがネズミｃｃＲＣＣモデルＲＥＮＣＡにおいて生存を促進する可能性があることを示唆している。
【００４１】
増強した抗ＰＤ−１免疫療法は、抗腫瘍免疫応答の増加および免疫抑制細胞集団の存在の減少と関連している。ＰＤ／Ｌ−１軸は、活性化Ｔ細胞アポトーシスの促進を介して免疫監視の腫瘍回避を支援する際に中心的な役割を果たす。さらに、ＨＤＡＣ阻害（ＨＤＡＣｉ）処置は、Ｔｒｅｇ細胞活性を低下させ、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤を増強することによって、腫瘍内微小環境を変化させることが示されている。組み合わせ処置に起因している腫瘍成長の阻害が増強した免疫応答と関連しているかどうかを理解するために、循環および腫瘍浸潤免疫集団を調べた。エンドポイント血液および腫瘍試料を、この実施例の各アームにおけるマウスから採取し、免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析に供した。血液中に存在する、増加したＴｒｅｇ、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋が観察され、ＴＭＥにおいて有意差は観察されなかった。しかしながら、以前に示したように、ＨＤＡＣ阻害処置は、ＭＦＩ（平均蛍光強度）によって表されるように、循環ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞サブタイプにおいてＦｏｘＰ３のタンパク質レベルの有意な減少をもたらした。組み合わせ群は、ＦｏｘＰ３タンパク質レベルの低下も示したが、対照または血液試料における抗ＰＤ−１群単独と比較して有意に低下しなかった（図２Ａ）。ＴＭＥでは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞のＭＦＩの有意な減少が観察され、抗ＰＤ−１およびエンチノスタット組み合わせ処置に応答してＴｒｅｇ機能の阻害が示唆された（図２Ｂ）。
【００４２】
ＣＤ８  Ｔ細胞はＰＤ／Ｌ−１軸の重要な構成要素であり、腫瘍監視に不可欠である。ＰＤ／Ｌ−１チェックポイント軸が遮断されると、多くの場合、Ｔ細胞機能および腫瘍浸潤が増加する。エンチノスタットと抗ＰＤ−１免疫療法の併用効果は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加をもたらすことが見出された（対照対組み合わせ：ｐ＝０．０３５２）（図２Ｃ、左側）。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞：制御性Ｔ細胞比の統計的に有意な増加が観察され、少しの腫瘍抑制環境の生成が示唆された（対照対組み合わせ：ｐ＝０．０２１８）（図２Ｃ、右側）。
【００４３】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は免疫抑制性ＴＭＥを支持する。未熟骨髄細胞が腫瘍に移動すると、これらの細胞は、多くの場合、腫瘍細胞からのケモカインおよびサイトカインの放出に応答してＴＡＭになるようにプライミングされる。これらの細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋マーカーと組み合わせてｐａｎ−マクロファージマーカーＦ４／８０によってマークされる。したがって、エンチノスタットおよび抗ＰＤ−１免疫療法に応答するＴＡＭの存在を調べ、ＴＡＭ存在の有意な減少が対照およびエンチノスタット単独と比較して組み合わせ群において観察された（組み合わせ対対照：ｐ＝０．０２７２；組み合わせ対エンチノスタット：ｐ＝０．００９）（図２Ｄ）。まとめると、これらの結果は、抗ＰＤ−１免疫療法とのＨＤＡＣ阻害の組み合わせが、腫瘍内微小環境の抑制特性を有意に変化させ、ＲＥＮＣＡモデルにおける免疫応答の増加を可能にすることを示唆する。
【００４４】
骨髄由来サプレッサー細胞機能は、エンチノスタットと抗ＰＤ−１免疫療法の組み合わせによって損なわれる。骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を阻害することによって免疫抑制性ＴＭＥの一因となる未熟骨髄細胞に由来する。ＭＤＳＣは、明確に定義された２つの免疫抑制性亜集団、顆粒球Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋（Ｇ−ＭＤＳＣ）および単球Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−（Ｍ−ＭＤＳＣ）ＭＤＳＣに存在する。腫瘍は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、およびＣＸＣＬ１２などの、化学誘引物質の放出を介して、ＭＤＳＣ、単球、および未熟骨髄細胞を誘引する。ＭＤＳＣは、表面ＰＤ−Ｌ１の上方制御、免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）およびＴｒｅｇ誘引サイトカイン（ＣＣＬ４、ＣＣＬ５）の産生、アルギナーゼ１（Ａｒｇ１）およびｉＮＯＳの上昇、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞に対する抵抗性を含む、複数の機構を介して、腫瘍の免疫回避を保護し、増強することが示されている。
【００４５】
エンチノスタット単独処置では、腫瘍浸潤Ｇ−ＭＤＳＣおよびＭ−ＭＤＳＣ集団においてわずかな増加が観察されたが（エンチノスタット対対照：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．２０２５、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．１９０３）、抗ＰＤ−１単独薬剤での処置は、Ｇ−ＭＤＳＣ集団の減少がもたらされた（抗ＰＤ−１対対照：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．００４０２）（図３Ａ）。エンチノスタット群で最初に観察されたＭＤＳＣ集団のわずかな増加は組み合わせ群で増幅され、両集団にわたる存在の増加傾向（組み合わせ対対照：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０１９９、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０２２２；組み合わせ対エンチノスタット：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０１０２、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．５６１３；組み合わせ対抗ＰＤ−１：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０００１、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０１９８）が観察された（図３Ａ）。さらに、エンチノスタットまたは組み合わせ処置後、循環Ｇ−ＭＤＳＣのわずかな減少および循環Ｍ−ＭＤＳＣのわずかな増加を伴う循環ＭＤＳＣの変化（エンチノスタット対対照：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０４２１、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０１８８；エンチノスタット対組み合わせ：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０６０８、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０５００；抗ＰＤ−１対組み合わせ：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０４２４、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．０２２９；組み合わせ対対照：Ｇ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．００８０、Ｍ−ＭＤＳＣ  ｐ＝０．００４９）が観察された（図３Ｂ）。このように、エンチノスタットは、末梢免疫状態および腫瘍内微小環境の両方の変化を伴うＲＥＮＣＡモデルにおいて抗ＰＤ−１免疫療法処置の効果を増強し得ることが示された。この効果の機構をさらに調べるために、免疫系のＭＤＳＣコンパートメントにおいて見られる興味深い変化をさらに分析した。
【００４６】
ＭＤＳＣ浸潤物における処置特異的増加が、ＭＤＳＣ抑制能の機能の変化と関連するかどうかを決定するために、腫瘍関連ＭＤＳＣが腫瘍ナイーブマウス由来の事前活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制する能力をｅｘ  ｖｉｖｏで試験した。ＲＥＮＣＡ腫瘍を移植したマウスの生存率および腫瘍阻害の向上を示すｉｎ  ｖｉｖｏデータと一致して、エンチノスタットまたは組み合わせ処置後、ＭＤＳＣ（Ｇ−ＭＤＳＣまたはＭ−ＭＤＳＣ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害するそれらの能力の有意な減少を示すことが観察された。ＭＤＳＣ対Ｔ細胞比、１：１、０．５：１、および０．２５：１の各々において、前刺激した（抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激）細胞をＴＭＥから単離したＭＤＳＣと１６〜１８時間共培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のＭＤＳＣ阻害が統計的に有意に減少した（Ｇ−ＭＤＳＣおよびＭ−ＭＤＳＣ条件の各々についてｐ値≦０．０１）（図３Ｃおよび３Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＴＭＥからのこれらの細胞の免疫抑制状態の潜在的変化を回避するために、より短い共培養物時点をここで選択した。処置マウスの腫瘍から単離したこれらの細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害することができず、それらは対照刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞単独と同様に増殖した（約９０％の増殖）。これらの共培養実験からのＣＤ８＋Ｔ細胞のさらなる検査により、対照群と比較して約４０％のグランザイムＢ産生の増加が明らかになり、未処置腫瘍保有マウスからのＭＤＳＣを、前刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した（各々の条件およびＭＤＳＣ：Ｔ細胞比についてｐ値≦０．０１）（図３Ｅおよび３Ｆ）。まとめると、これらのデータは、エンチノスタット処置単独および抗ＰＤ−１免疫療法との組み合わせに応答して腫瘍浸潤ＭＤＳＣの機能の十分な変化を示している。エンチノスタットはＦｏｘＰ３機能を阻害することにより腫瘍内微小環境を変化させることができることが示されており、これらのデータは、ｃｃＲＣＣの同系マウスモデルにおいてＭＤＳＣの機能的阻害を介してＴＭＥのさらなる修飾を示す。
【００４７】
ＭＤＳＣ様細胞株、Ｊ７７４Ｍのエンチノスタット処置により、アルギナーゼ１が潜在的機構の標的であることが明らかになった。Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｕｇｕｓｔａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＫｅｂｉｎ  Ｌｉｕ研究所から好意的に供給されたＪ７７４Ｍ細胞株は、最近、安定なＭＤＳＣ様細胞株として特徴付けられている。これらの知見を本実施例の目的のために検証するために、これらの細胞をＬｙ６ＣおよびＬｙ６Ｇについて染色して、細胞のＭＤＳＣ様状態をさらに解明した。図４Ａにおいて、これらの細胞の亜集団比がＲＥＮＣＡ  ＴＭＥにおいて見出されるものと非常によく似ていることが示される。ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋集団のうち、約９０％の細胞がＧ−ＭＤＳＣ（Ｌｙ６Ｇ＋）であり、約１０％の細胞がＭ−ＭＤＳＣ（Ｌｙ６Ｃ＋）陽性細胞である。細胞表現型のこの検証の後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエンチノスタットの処置によって機能的に変化するこれらのＭＤＳＣ様細胞の能力を研究した。細胞を０．０１〜５ｕＭの範囲の濃度のエンチノスタットで４８時間まで処置したが、Ｊ７７４Ｍ細胞の増殖または生存率に有意な変化はなかった（図４Ｆ）。エンチノスタットで処置したＪ７７４Ｍ細胞を、予め活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞と６８〜７２時間共培養すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞単独のものに近いＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の有意な増加が明らかとなり、この実施例は３つの独立した複製を表す（図４Ｂ〜４Ｃ）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験からのＪ７７４Ｍ細胞のさらなる調査により、対照−未処置細胞と比較して、エンチノスタットで処置したＭＤＳＣ様細胞におけるアルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）発現の有意な阻害が明らかとなった（対照対０．５ｕＭエンチノスタット：ｐ＝０．００３；対照対１ｕＭエンチノスタット：ｐ＝０．００４１；対照対２ｕＭエンチノスタット：ｐ＝０．００４３）（図４Ｄ）。ＭＤＳＣは特徴としてアルギナーゼ１およびｉＮＯＳのレベルが高い。ｉＮＯＳの評価は決定的な結果をもたらさなかったが（図４Ｇ）、Ａｒｇ１の高い活性は、循環Ｌ−アルギニンプールの尿素およびＬ−オルニチンへのａｒｇ１変換を介して細胞傷害性Ｔ細胞集団における細胞周期停止の誘導を可能にし、これにより、細胞傷害性Ｔ細胞の生存に必要な細胞外Ｌ−アルギニンの存在を減少させる。これらのデータは、エンチノスタットが、アルギナーゼ１を潜在的な特異的標的として、ＭＤＳＣの腫瘍促進、Ｔ細胞阻害活性を直接損なうことを示す。
【００４８】
エンチノスタット処置は免疫療法に対する反応の増強のために腫瘍内微小環境（ＴＭＥ）を刺激する。腫瘍内微小環境は、免疫細胞を動員してその機能を変化させることにより、宿主免疫系を利用する。腫瘍または腫瘍浸潤細胞によって放出されるケモカインおよびサイトカインは腫瘍内微小環境への免疫細胞輸送を促進する。ＭＤＳＣ浸潤の増強をもたらすものの中には、ＣＣＬ２（ＪＥ／ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１２（ＭＣＰ−５）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）およびＶＣＡＭ−１がある。これらの細胞がＴＭＥに動員されると、それらは、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ５ａ、ＩＬ１−β、ＩＬ−１０、およびＩＬ−６を含む腫瘍由来因子に応答して増殖し、活性化する。次いで、ＭＤＳＣは、アルギナーゼ−１およびｉＮＯＳの上方制御、ならびに関連サイトカイン（すなわち、Ｔｒｅｇ促進ＩＬ−１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５）の産生を介して、成長、増殖、血管新生、および免疫監視の回避において、腫瘍を支援し得る。ＴＭＥは、腫瘍細胞および関連する免疫浸潤物の両方によって放出され、解釈されるサイトカインの連続したストームを伴う複雑なシステムである。この複雑なバランスならびにＨＤＡＣ阻害および免疫療法によってどのように変化するかを理解することは、重要な関心事である。
【００４９】
ＴＭＥ免疫状態に対するエンチノスタットの役割を調べるために、対照およびエンチノスタット処置コホートの腫瘍試料をプロテオームプロファイラー分析（Ａｒｙ０２８）に供し、対照およびエンチノスタット処置コホートの異なるプロファイルを含む１１１個のケモカインおよびサイトカインの読み取りを提供した。このプール内で、ＴＭＥにおけるＭＤＳＣ関連輸送／蓄積（ＣＣＬ２：ｐ≦０．０００１、ＶＣＡＭ−１／ＣＤ１０６：ｐ≦０．０００１／アンジオポエチン−２：ｐ≦０．００１）、拡大／活性化サイトカイン（Ｇ−ＣＳＦ：ｐ≦０．００１、ＧＭ−ＣＳＦ：ｐ≦０．０１、ＩＬ−１β：ｐ≦０．００１、およびＩＬ−１０：ｐ≦０．０００１）の有意な減少が観察された。抗腫瘍ケモカインおよびサイトカインの有意な上方制御も認められ、これらは抗腫瘍免疫記憶（ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０：ｐ≦０．０１）、Ｔ細胞誘引（Ｅ−セレクチン：ｐ≦０．０００１）、ｐｒｏ−ＭＤＳＣ阻害（ＩＬ−１ｒａ：ｐ≦０．０１）および先天性抗腫瘍応答（ＩＬ−４：ｐ≦０．００１およびＩＬ−１２ｐ４０：ｐ≦０．０１）の一因となる（図５Ａ）。これらの結果は、エンチノスタット処置が抗腫瘍状態に対してＴＭＥの免疫状態を変化させるのに十分であり、抗ＰＤ−１処置などの免疫療法介入によりよく応答するようにＴＭＥを刺激し得ることを示唆する。外来診療に変更可能な免疫療法処置に応答するための宿主免疫系をプライミングするエンチノスタット処置に関するこれらのデータについて、対照およびエンチノスタット処置マウス由来の血清試料を同じＡｒｙ０２８プロテオームプロファイラーに供した。複数の循環ｐｒｏ−腫瘍関連ケモカインおよびサイトカインの有意な減少が、対照とエンチノスタット処置コホートとの間で観察された。これらの中には、ＭＤＳＣ拡大調節因子、アディポネクチン（ｐ≦０．０１）；ｐｒｏ−腫瘍化学誘引物質、アンジオポエチン−２（ｐ≦０．００１）；炎症促進キチナーゼ３様１（ｐ≦０．００１）、ＣＣＬ１２（ｐ≦０．０１）、補体成分Ｃ５（ｐ≦０．００１）、ｃ−反応性タンパク質（ｐ＜０．００１）、ＩＬ−６（ｐ＜０．０００１）、ペントラキシン２／３（ｐ≦０．０１）およびペリオスチン（ｐ≦０．００１）；制御性Ｔ細胞ケモカイン、ＣＣＬ１７（ｐ≦０．００１）、ＭＤＳＣ化学誘引物質Ｍ−ＣＳＦ（ｐ≦０．００１）およびＧＭ−ＣＳＦ（ｐ≦０．０１）；ＥＭＴ／浸潤マトリクス−メタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ−２（ｐ≦０．００１）およびＭＭＰ−９（ｐ≦０．０００１）；ＣＣＬ２（ｐ≦０．０１）−オステオプロテグリンを含むＭＤＳＣ誘引物質（ｐ≦０．００１）；および白血球誘引物質ＶＣＡＭ（ｐ≦０．００１）があった。
【００５０】
抗腫瘍サイトカイン／ケモカインの上方制御がエンチノスタット処置群において観察されたが、複数のサイトカイン／ケモカインの有意な上方制御が組み合わせコホートにおいて見られ、抗ＰＤ−１免疫療法およびエンチノスタットが一緒に作用して、改善された免疫療法反応のために宿主免疫系が増強することが示唆された。以下の抗腫瘍関連サイトカイン／ケモカインの増加も観察された：Ｔ細胞誘引物質および抗内皮マーカー（ＣＸＣＬ９（ｐ≦０．００１）、ＣＸＣＬ１０（ｐ≦０．０００１））、腫瘍増殖抑制性サイトカイン（ＩＬ−４（ｐ≦０．０００１）およびＩＬ−１３（ｐ≦０．０００１））、Ｔ細胞化学誘引物質（Ｅ−セレクチン（ｐ≦０．０００１））、および抗腫瘍マーカー（ＩＬ−１２ｐ４０（ｐ≦０．０００１））。まとめると、これらの結果は、エンチノスタット処置が抗ＰＤ−１免疫療法処置の増強を可能にするように宿主環境およびＴＭＥを変化させることを示唆する。
【００５１】
上記の結果は、エンチノスタットによる処置が骨髄由来サプレッサー細胞の機能を調節し、それによってＴＭＥを調節することを示す。この調節により、免疫応答の増幅がもたらされ、免疫療法処置に対する抗腫瘍応答が増強される。さらに、明細胞腎細胞がんのマウスモデルにおいてエンチノスタットと抗ＰＤ−１免疫療法を組み合わせた場合、相乗的な抗腫瘍効果が観察された。腫瘍増殖の遅延に加えて、エンチノスタットおよび抗ＰＤ−１免疫療法がｃｃＲＣＣモデルにおいて相乗的に作用して生存期間を延長することが示された。
【００５２】
以前の結果と一致して、エンチノスタット処置は、制御性Ｔ細胞の存在および機能状態に対して直接的な効果を示した。組み合わせ処置は、抗ＰＤ−１処置でわずかに上昇した腫瘍関連ＦｏｘＰ３＋細胞を減少させ、細胞中のＦｏｘＰ３タンパク質の存在を有意に減少させ、相乗的な抗腫瘍活性を示唆した。エンチノスタット処置に起因する制御性Ｔ阻害は、ＴＭＥへのＣＤ８＋浸潤の増加、およびその後のＣＤ８＋対ＴＲｅｇ比の増加を伴った。これらの知見は、免疫療法処置と組み合わせたエンチノスタットが、腫瘍に対して直接的な細胞傷害性というよりむしろ、有意な免疫調節活性を有するという考えを支持する。
【００５３】
乳がん患者における第ＩＩ相臨床の最近の分析により、腫瘍内微小環境において単球および顆粒球ＭＤＳＣの両方の減少が示された。実験条件において、ＭＤＳＣ集団の単球および顆粒球サブセットの両方の有意な増加が見られた。これらのデータをまとめると、特異的腫瘍内微小環境が腫瘍種類を超えて見られる異なる観察において役割を果たしている可能性が示唆される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月27日(2018.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする個体において制御性Ｔ細胞を抑制する方法であって、クラスＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む組成物およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含む組成物を前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤が、エンチノスタット（ピリジン−３−イルメチルＮ−［［４−［（２−アミノフェニル）カルバモイル］フェニル］メチル］カルバメート）、ボリノスタット（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド）およびトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−２，４−ヘプタジエンアミド）、ダシノスタット（（Ｅ）−３−（４−（（（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）フェニル）−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド）、ブチラート、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ベリノスタット（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（フェニルスルファモイル）フェニル］プロパ−２−エナミド）、パノビノスタット（（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリルアミド）、ピロキサミド、ＳＫ−７０４１（４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［［４−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］ベンズアミド）、ＳＫ−７０６８（Ｎ−［［４−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］フェニル］メチル］−４−ピロリジン−１−イルベンズアミド）、トラポキシンＡ（シクロ（（Ｓ）−ガンマ−オキソ−Ｌ−アルファ−アミノオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−２−ピペリジンカルボニル））、環状テトラペプチドヒドロキサム酸類似体（ＣＨＡＰ）、デプデシン（４，５：８，９−ジアンヒドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−Ｄ−スレオ−Ｄ−イド−ウンデカ−１，６−ジエニトール）、モセチノスタット（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤組成物が、約０．５μＭ〜約２μＭの前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤がエンチノスタットである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤組成物が約０．５μＭのエンチノスタットを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＤ−１阻害剤がニボルマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＤ−１阻害剤組成物が約１．０μＭのニボルマブを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−１阻害剤組成物が注入により投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤組成物および前記ＰＤ−１阻害剤組成物のうちの少なくとも１つが、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記個体が腎細胞がんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記エンチノスタットが５ｍｇの用量で投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記エンチノスタットが１週間に１回投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤組成物および前記ＰＤ−１阻害剤組成物が、異なる時間間隔で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
腎細胞がんを治療する方法であって、エンチノスタットを含むクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤組成物およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤を含むプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１６】
前記エンチノスタットが５ｍｇの用量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記エンチノスタットが１週間に１回投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤組成物および前記ＰＤ−１阻害剤組成物が異なる時間間隔で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＤ−１阻害剤組成物が注入により投与される、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
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