(57)【要約】罹患または損傷した組織、例えば炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎を処置するための方法および組成物は、幹細胞または損傷した組織への幹細胞遊走を刺激する組織移植片を用いる組織再生を含む。組織移植片は、組織特異的細胞外マトリックス（ＴＳ−ＥＣＭ）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料であることができる。本方法は、移植片の配置に先だって、損傷または罹患した組織の粘膜切除も含むことができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の下部腸管組織の状態もしくは疾患または前記組織の損傷を処置し、改善し、または治療するための方法であって、罹患または損傷した組織の再建的組織リモデリングをもたらすために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）移植片または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）足場組成物を前記罹患または損傷した組織の部位に適用することで、結腸切除を行うことなく前記罹患または損傷した組織の処置、改善または治療を達成する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＥＣＭが、小腸、大腸および膀胱から選択される組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＣＭが小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組織に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＣＭが膀胱マトリックス（ＵＢＭ）組織に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＵＢＭが上皮基底膜層を含まない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＣＭが、固形のシートまたはチューブとして送達用に調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭが、溶液、懸濁液およびゲルから選択される流動体として送達用に調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＣＭが薬物または生物製剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流動体の前記ＥＣＭが内視鏡的に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記下部腸管組織が、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性腺腫性ポリポーシス、ヒルシュスプルング病、狭窄、直腸炎、直腸粘膜炎、結腸がんもしくは直腸がん、または瘻孔の結果として罹患または損傷している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物の下部腸管組織の状態もしくは疾患または前記組織の損傷を処置し、改善し、または治療するための方法であって、
ａ．小腸組織、大腸組織および膀胱組織から選択される組織に由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）移植片を調製する工程、および
ｂ．前記ＥＣＭ移植片を罹患または損傷した下部腸管組織に埋植し、移植し、投与し、適用し、または付着させ、もしくは貼付する工程
によって、前記罹患または損傷した組織を置換する工程を含み、前記下部腸管組織の状態、疾患または損傷が、結腸切除を行うことなく、再建的組織リモデリングによって、処置され、改善され、または治療される方法。
【請求項１２】
前記状態、疾患または損傷を呈する組織が結腸中にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織の状態、疾患または損傷が、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性腺腫性ポリポーシス、ヒルシュスプルング病、狭窄、結腸がんもしくは直腸がん、直腸炎、直腸粘膜炎または瘻孔に起因する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＣＭ移植片の組成物が、シート状またはチューブ状の固形移植片または固形足場として、調製され、送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＣＭ移植片の組成物が流動化ゲル、溶液または懸濁液として調製され、送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＣＭが浣腸によって送達される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥＣＭが内視鏡的に送達される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＣＭ移植片が小腸粘膜下層（ＳＩＳ）に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＣＭ移植片を前記罹患または損傷した下部腸管組織に埋植し、移植し、投与し、適用し、または付着させもしくは貼付する前に、前記状態、疾患または損傷を呈する前記組織を切除またはアブレートする工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記切除またはアブレートする工程が内視鏡的粘膜切除を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記切除またはアブレートする工程がＥＤＴＡ洗浄を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための方法であって、
ａ）腸組織に由来する細胞外マトリックス組成物を用意する工程、および
ｂ）罹患または損傷した組織の健常下部腸組織によるインサイチュー置換を誘発するために、ＩＢＤを呈する患者の腸組織に前記組成物を適用または投与する工程
を含む方法。
【請求項２３】
前記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎およびクローン病から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞外マトリックス組成物の適用または投与が、結腸組織への幹細胞の遊走を刺激し、前記幹細胞がインサイチューで発生することで、潰瘍性大腸炎またはクローン病を呈する結腸粘膜組織の再建的組織リモデリングを達成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＥＣＭ移植片組成物が流動化ゲル、溶液または懸濁液として調製される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＥＣＭが固形のシートまたはチューブである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＥＣＭが、浣腸によって投与される溶液または懸濁液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＣＭが、内視鏡的に投与される溶液または懸濁液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記適用または投与の工程ｂ）に先だって、罹患または損傷した結腸粘膜組織を切除またはアブレートする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記切除工程が、内視鏡的粘膜切除（ＥＭＲ）またはＥＤＴＡを使ったアブレーションを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）前記患者に回腸瘻を造設する工程、および
ｂ）新しい結腸粘膜が形成または発生する間は、完全静脈栄養を使って前記患者に静脈内に栄養供給する工程
からなる群より選択される任意の工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
下部腸組織に由来する、大腸粘膜を置換するための移植片として使用するための組織特異的細胞外マトリックス組成物。
【請求項３３】
下部腸粘膜が結腸である、請求項２９に記載の組織特異的細胞外マトリックス組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）は、２つの独立した疾患、クローン病（ＣＤ：Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ：Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ）からなり、８３３，０００人の米国人を冒している。
【０００３】
ＣＤは消化管（口から肛門まで）のどの位置にも現れる可能性があり、消化管壁の全層を冒すことが多いのに対して、ＵＣは結腸および直腸に限局され、壁の粘膜（内層）だけを冒す。
【０００４】
医学的処置は、重篤な副作用を有しうる抗炎症薬の使用を含めて、ＵＣの症状を処置できない場合があり、患者が他のどの医学的処置にも不応性である場合は、結腸の全摘（結腸切除術）が、ＵＣにとって唯一公知の「治療法」になる。結腸切除術は十分に確立されてはいるものの大手術であり、廃棄物の除去を容易にするために回腸瘻造設を必要とすることが多い。
【０００５】
ＵＣを含むＩＢＤを処置し、治療するために、第一選択処置（潜在的に有害な副作用を伴う投薬）および第二選択処置（結腸切除術）に代わる処置が、必要とされている。
【０００６】
低侵襲外科手術に向かう傾向が、組織再生に役立つ人工的足場の開発を促してきた。精製されたコラーゲン、ゼラチン、自家脂肪、ヒアルロン酸、および合成材料が、尿失禁、逆流症、咽頭異常、および新生児心筋細胞を処置するために、再生医学において、注射可能な足場として臨床使用されている。しかし、過度に精製された材料、化学修飾された材料または合成材料は、宿主による有害な免疫応答につながって、マトリックスへの細胞遊走を制限する場合がある。
【０００７】
天然に見いだされる細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）由来の足場は、多くの生物活性特性を有し、下部尿路構造、食道、心臓組織、および筋腱構造を含むさまざまな組織の修復に使用されてきた。しかし、これらの足場の多くは非ヒト組織に由来し、結腸組織などの下部腸組織の処置または再生における使用について、特にＵＣの処置について、記載されたものはない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、結腸切除を行わずに罹患または損傷した粘膜組織を置換することによってＵＣを処置するための新規組織移植片および方法に関する。
【０００９】
一実施形態において、本発明の方法は、結腸の粘膜内層の疾患もしくは損傷の症状を有するか結腸の粘膜内層の疾患もしくは損傷を患っている患者において、（１）任意に、結腸の罹患または損傷した粘膜内層に対して粘膜切除を行う工程、および（２）結腸の粘膜内層に幹細胞または前駆細胞を播種するか、または罹患もしくは損傷した結腸組織への幹細胞および前駆細胞の遊走を刺激する工程によって、損傷または罹患した下部腸組織を処置する工程を含む。結腸の粘膜内層の疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であることができ、本方法はＩＢＤを処置、改善、または治療するために使用することができる。
【００１０】
したがって本発明は、損傷または罹患した結腸組織への直接的な幹細胞または前駆細胞の送達による幹細胞または前駆細胞の播種を含むことができ、例えばこの場合、幹細胞または前駆細胞は、結腸の粘膜内層の再建的組織リモデリングを開始または刺激するために、幹細胞または前駆細胞が結腸の管腔壁と接触して、少なくとも一時的にはその上に滞留するように、結腸の内腔への注射または注入によって結腸組織に送達するための溶液、懸濁液、またはゲルなどの流動性組成物に調製される。こうして本発明の方法は、損傷または罹患した結腸組織の、新しい健常結腸組織による置換を果たすことができる。
【００１１】
あるいは、結腸管腔壁上に、または結腸管腔壁と接触させて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物、例えばＥＣＭ移植片またはＥＣＭ足場を、固形物（シートもしくはチューブ）または流動体（溶液、懸濁液もしくはゲル）の形態で導入することにより、幹細胞または前駆細胞は、損傷または罹患した結腸組織の部位へと刺激されうる。
【００１２】
本発明の別の一実施形態では、幹細胞または前駆細胞を固形または流動性ＥＣＭ組成物に組み込んで、幹細胞または前駆細胞を含むＥＣＭ組成物を、本明細書に記載するように、組成物に適した送達手段によって、結腸の粘膜内層に送達することができる。例えば、固形ＥＣＭを結腸内層上に内視鏡的に埋植するか、流動性ＥＣＭを結腸中に注入、注射または噴霧することができる。
【００１３】
損傷した結腸組織の部位に播種されるか遊走させられると、幹細胞または前駆細胞は特殊化し、インサイチューで発生し、結腸の粘膜内層を置換する。本方法は、（３）回腸瘻を造設する追加工程、および（４）新しい粘膜が形成されて、罹患した粘膜内層を置換する間、患者には消化管を迂回して静脈内に栄養供給することにより、患者に完全静脈栄養（ＴＰＮ：Ｔｏｔａｌ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）を提供する追加工程、のうちの１つ以上を、さらに含みうる。
【００１４】
本発明の方法の一部として用いられる場合、移植片の埋植、移植または投与に先だって罹患または損傷した組織を除去する粘膜切除工程は、組織切除または組織アブレーションによって実行されうる。
【００１５】
切除法またはアブレーション法は、内視鏡的もしくは外科的粘膜切除（摘除）、内視鏡レーザー療法、光線力学的療法、アルゴンプラズマ凝固療法を使った内視鏡熱凝固、ラジオ波アブレーション、冷凍アブレーション、またはＥＤＴＡもしくは他のアブレーション剤の使用を含む。これらの粘膜切除手法は当技術分野では詳細に記録されている。切除工程またはアブレーション工程が用いられる本発明の方法では、上記の技法または手法のいずれか１つ以上が使用されうる。
【００１６】
本発明は、疾患または外傷によって損傷した組織を、処置される組織と同じ組織に由来する組織移植片、例えば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）足場を使って処置するための方法および組成物をさらに含む。処置される組織と同じ組織に由来するＥＣＭを含む組織移植片を、本明細書では、「組織特異的細胞外マトリックス」（ＴＳ−ＥＣＭ：ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）という。
【００１７】
好ましいＴＳ−ＥＣＭは、同じタイプの組織に由来する（すなわち結腸組織処置のための結腸由来ＥＣＭ）だけでなく、処置される種と同じ種にも由来する。例えばヒトにおけるＵＣの処置は、ＴＳ−ＥＣＭ足場組成物としてヒト結腸粘膜組織を用いることになる。組織移植片は同種移植片または異種移植片であることができる。刺激および情報の相互交換（当技術分野では「動的相互作用（ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｃｉｐｒｏｃｉｔｙ）」として知られ、そのように呼ばれている）が、ＥＣＭと細胞との間には存在することができ、それがＥＣＭ移植片の使用を有利にする。この動的相互作用は、ＴＳ−ＥＣＭ移植片の使用によって助長または改善されうる。
【００１８】
したがって本発明は、限定するわけではないが、罹患または損傷した大腸組織を置換するための大腸組織由来の組織移植片組成物を含む。大腸組織由来のＥＣＭは、好ましくは、結腸粘膜を含むことができ、処置される大腸組織または結腸組織は、好ましくは、結腸粘膜であることができる。
【００１９】
一実施形態において、組織移植片組成物は、結腸粘膜上に設置または固定されうる固形のシートまたはチューブとして形成されたＥＣＭ足場であることができる。固形のシート状またはチューブ状の足場は、機械的手段または外科的手段によって、例えば限定するわけではないが、縫合糸、ステープル、ステントまたはクリップなどによって、患者中の所望の部位に埋植もしくは移植し、または当技術分野において認識されているとおり、貼付し、適用し、もしくは取り付けることができるか、または、生体付着剤を含む、許容される付着剤、例えば薬学的に許容されるまたは治療上許容される付着剤などによって、粘膜に付着させることができる。ＥＣＭ組成物を結腸に送達するための好ましい一手法では、侵襲的外科手術を都合よく最小限に抑えうる内視鏡を用いることができる。
【００２０】
あるいは、ゲル、溶液または懸濁液などの流動体の形態で提示するために、ＥＣＭは粉末化または消化され、可溶化または懸濁されうる。流動性組成物は、処置される部位にゲル、溶液または懸濁液を注射、注入、噴霧することなどによって、都合よく投与されうる。例えば流動化ＥＣＭは、例えば浣腸療法として、流動性ＥＣＭが結腸の粘膜内層を覆うか、粘膜切除を受けた結腸の場合は、流動性ＥＣＭが結腸の露出した内腔壁を覆うように、結腸の内腔に注射、注入、または噴霧されることによって、投与または適用されうる。そのような投与は数回、例えば所望に応じて、生存可能なまたは健常な組織の許容される再成長または置換を監視している処置医によって決定されるとおり、１日１回以上、数日間、数週間、または数ヶ月間、最大約１年にわたって、繰り返すことができる。
【００２１】
流動化ＥＣＭの噴霧可能なゲル、溶液または懸濁液の好ましい一実施形態は、噴霧による投与のために組成物をエアロゾル化することである。エアロゾル化スプレーは、そのような流動化ＥＣＭを所望の部位または場所に送達するために製造または改変された内視鏡内にもうけられた、またはそのような内視鏡を備えた、カニューレまたは他の導管を通して、供給タンクからポンプ送出されうる。
【００２２】
好都合なことに、幹細胞または前駆細胞は、ＥＣＭ配置部位またはＥＣＭ投与部位に遊走することが知られており、時間をかけて、組織を、当該細胞または組織の正常な特性および機能を有する健常なまたは非症候性の細胞および組織で置換することができる。したがって、本発明の組成物の代替的実施形態は、固形ＥＣＭのチューブ状またはシート状足場のみ；幹細胞もしくは前駆細胞がコーティングまたは埋込された固形ＥＣＭ足場；流動化ＥＣＭ（例えばゲル）のみ；あるいは、固形もしくは流動性ＥＣＭがコーティングまたは埋込または混合された幹細胞もしくは前駆細胞を伴う、または伴わない、流動化ＥＣＭをさらに含む固形ＥＣＭ足場を含む。
【００２３】
ＥＣＭ組成物は、一部が天然組織に由来し、合成ポリマーまたは天然ポリマーと混合もしくは組み合わされた、ハイブリッドでありうることも理解されるであろう。合成ポリマーまたは天然ポリマーを含む本発明のＥＣＭ組成物では、生分解性ポリマーが使用されることが好ましいが、その必要があるわけではない。
【００２４】
本発明の別の一実施形態において、例えば固形のシート状またはチューブ状ＥＣＭ組成物は、三次元（３Ｄ）プリンター技術を使って形成または作製されうる。
【００２５】
本組成物は、ＥＣＭに特定の望ましい特性をもたらすための添加剤をさらに含むことができる。例えばＥＣＭ組成物は、１つ以上の薬物または生物製剤、例えば抗生物質、抗炎症薬、免疫抑制薬、モノクローナル抗体、または成長因子などを含むことで、追加された薬物または生物製剤の望ましい活性を提供することができる。これらの添加剤は、局所環境を順調な組織リモデリングに資するようにすることができる。本組成物への他の添加剤は、例えば増粘剤、またはゲルの形成を開始させもしくは遅らせることができる薬剤を包含しうる。ゲルの粘度が高いほどゲルの付着性および粘着性が改良されうることは、当技術分野では一般に認められている。したがって増粘剤は、標的組織への付着を助長することにも役立ちうる。付着助長剤は当技術分野において周知であるが、増粘剤または付着強化剤として血液成分、例えば血液凝固薬または血液凝固因子をさらに含むことができる。
【００２６】
事前の切除またはアブレーションを伴わずに、本明細書に記載するＥＣＭ移植片またはＥＣＭ足場を使って、罹患または損傷した結腸組織を処置する方法も、本発明の一部として含まれる。例えば、組織の疾患または損傷が、組織の露出面または出血面などといった病変または組織傷害を作る場合、ＥＣＭ足場組成物またはＥＣＭ移植片組成物の埋植、移植、適用、または投与に先だつ組織の切除は、省略されてよい。したがって、本方法の一実施形態は、
ａ）腸組織、生殖組織、外皮組織、膵臓組織、腎臓組織、循環組織および呼吸組織から選択される組織を使って、ＥＣＭ足場、ＥＣＭ移植片またはＥＣＭ組成物を調製する工程、および
ｂ）腸組織を冒す疾患、損傷または状態を患っている患者において、下部腸管組織を冒す疾患または状態を患っている患者の組織に、ＥＣＭ移植片組成物またはＥＣＭ足場組成物を埋植、移植、適用または投与する工程
を含み、前記腸組織は、ＥＣＭ組成物の埋植、移植、適用または投与に先だって、切除またはアブレーションに付されない。
【００２７】
好ましい一実施形態において、この方法は、潰瘍性大腸炎またはクローン病；家族性腺腫性ポリポーシス；ヒルシュスプルング病；狭窄；直腸炎（ｐｒｏｃｔｉｔｉｔｓ）；結腸がん；直腸粘膜炎または直腸瘻などのＩＢＤを呈する損傷または罹患した結腸組織を処置する工程、より好ましくは結腸粘膜組織の疾患または損傷を処置する工程を含む。
【００２８】
本発明の別の一実施形態は、事前の切除またはアブレーションを伴って、または伴わずに、本明細書に記載する組織特異的ＥＣＭ（ＴＳ−ＥＣＭ）足場を使って、罹患または損傷した組織を処置する方法である。したがって、本方法の一実施形態は、
ａ．任意に、損傷または罹患した組織に対して粘膜切除を行う工程；
ｂ．腸組織、（膣組織以外の）生殖組織、外皮組織、膵臓組織、直腸組織、循環組織および呼吸組織から選択される組織を使って、ＴＳ−ＥＣＭ移植片組成物またはＴＳ−ＥＣＭ足場組成物を調製する工程、および
ｃ．同じ腸組織、（膣以外の）生殖組織、外皮組織、膵臓組織、腎臓組織、循環組織および呼吸組織を冒す疾患または状態を患っている患者における組織に、ＴＳ−ＥＣＭ足場またはＴＳ−ＥＣＭ組成物を、埋植し、移植しまたは投与する工程
を含む。
【００２９】
本発明のＥＣＭまたはＴＳ−ＥＣＭ移植片、足場または組成物が、幹細胞またはＥＣＭゲル、ＥＣＭ溶液もしくはＥＣＭ懸濁液がそこに分散されうる生体適合性の多孔性、マクロ多孔性またはマイクロ多孔性マトリックスでありうることは、理解されるであろう。加えて、本発明のＥＣＭまたはＴＳ−ＥＣＭはゲル化されうる。
【００３０】
移植片として使用される細胞成長マトリックスまたは足場として有用な、チューブ状ＥＣＭ組成物、シート状ＥＣＭ組成物、およびゲル化、可溶化ＥＣＭ組成物を調製する方法は、当技術分野において記載されている。ゲル状ＥＣＭ組成物は、患者への埋植または投与に先だって、ゲル化されていない形態で成形されてから、ゲル化を起こすことができ、この場合、組成物はインサイチューでゲル化する。ＥＣＭ移植片を形成させるこれらの方法および他の方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３６１，５０３号に記載されている。
【００３１】
好ましい一実施形態において、ゲル状ＥＣＭ組成物は、記載する１つ以上のプロセスによって調製される。例えば、ゲル状ＥＣＭは、
ｉ）固形のＥＣＭを粉砕する工程、
ｉｉ）酸性溶液における酸性プロテアーゼを使った消化によって、無傷の透析されていないまたは架橋されていないＥＣＭを可溶化することで、消化物溶液を生成させる工程、
ｉｉｉ）前記消化物溶液のｐＨを７．２〜７．８のｐＨに調節することで、中和された消化物溶液を生成させる工程、および
ｉｖ）２５℃を上回る温度において前記溶液をゲル化する工程
を含む方法によって調製されうる。
【００３２】
一実施形態において、ＥＣＭ組成物の調製は、工程（ｉｉ）によって生成した可溶化ＥＣＭをさらに加工する工程であって、可溶化ＥＣＭが乾燥または凍結乾燥されることで、液状の可溶化ＥＣＭよりも長期間にわたって貯蔵されうる乾燥粉末を形成する工程を含みうる。次に、乾燥粉末ＥＣＭは水性溶液または緩衝液に再構成されて、上記工程（ｉｉｉ）と同様に中性ｐＨにされうる。
【００３３】
別の一実施形態において、ＥＣＭ移植片組成物またはＥＣＭ足場組成物を調製する方法は、足場を超音波処理する工程をさらに含む。本発明のさらなる一方法は、ＴＳ−ＥＣＭ足場を患者の組織に取り付ける工程であって、足場の表面は、患者の細胞、例えば幹細胞が埋込またはコーティングされたゲル化可溶化ＥＣＭを含み、埋込またはコーティングされた細胞は、組織への足場の埋植、移植または投与に先だって、足場への患者の細胞の内殖のために十分な時間が与えられる工程を含む。
【００３４】
本発明の方法を実行する際に、足場または移植片は、本明細書に記載するように、または他の公知のＥＣＭ調製方法を使って調製され、次に罹患または損傷している組織の少なくとも一区画に埋植、移植または投与され、置換細胞が成長して罹患または損傷した細胞を置換するように、十分な期間にわたって、罹患または損傷した組織と接触した状態に保たれる。十分な期間とは、１日〜約６ヶ月でありうる。
【００３５】
好都合なことに、ＥＣＭ移植片の埋植、移植、または投与は、ＥＣＭ移植片の埋植、移植または投与部位への幹細胞の遊走のための刺激を与える。例えばＵＣを処置する際に、ＥＣＭ移植片は、罹患または損傷した結腸粘膜が存在した（粘膜切除後の場合）または存在する（粘膜切除が行われない場合）結腸の少なくとも一区画と接触させて埋植、移植または投与され、結腸粘膜細胞の成長および置換が可能になるようにある期間にわたって粘膜と接触した状態に保たれ、その結果、罹患または損傷した細胞の健常な細胞による置換が起こる。ＥＣＭ移植片は、結腸の内壁に、同時に、または逐次的に、埋植、移植または投与される１〜１０センチメートル程度の比較的短い固形セグメントとして提供されうる。あるいは、結腸全体に対応する複数の区画または長さを有するＥＣＭ移植片が、調製されうる。
【００３６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）または細胞外マトリックスヒドロゲル（ＥＣＭＨ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）、すなわち液状または流動体状、ゲル化可能な形態にあるＥＣＭ）は、放射線照射または化学療法を受けた患者に存在しうる自己免疫関連ではない疾患または状態、例えば直腸粘膜炎の処置または防止にも役立ちうる。例えばＥＣＭＨ療法により、例えば放射線照射処置または化学療法処置が開始される前に、浣腸によってＥＣＭＨを投与し、その放射線照射または化学療法の全体を通じて、ＥＣＭＨ投与を継続することにより、患者における直腸粘膜炎の発症を防止することができる。
【００３７】
ＥＣＭＨ投与が、患者の必要性および医師または他の介護者による決定に依存する異なる投与レジメンを使って実行されうることは、理解されるであろう。例えばＥＣＭＨ投与は、放射線照射または化学療法が始まる前に開始することができ、その場合、医師または介護者は、ＥＣＭＨ投与の必要性を監視し、そのようなＥＣＭＨ療法の必要性について直腸粘膜の状態を評価することができる。
【００３８】
ＥＣＭＨを投与するための投与レジメンは、患者の必要性および状態にも依存しうる。例えば患者は、１日あたり１回以上、例えば１日あたり４回まで、ＥＣＭＨ投与を受けるか、ＥＣＭＨを使った浣腸を毎日受けることができる。あるいは患者は、１週間に１〜５回、好ましくは１週間に３〜５回、１日置き、または３日ごとに、ＥＣＭＨ投与を受けることができる。本療法または投与レジメンは、主治医もしくは専門家によって決定されるとおり、約８〜１２週間まで、またはそれ以上にわたって、患者に提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本明細書に記載するように小腸粘膜下層細胞外マトリックス（ＳＩＳ−ＥＣＭ：Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ）で処置されたイヌから取り出した結腸切片（下側の写真）の結果を表す；顕微鏡像（上側の写真Ａ〜Ｄ）は、顕微鏡細胞検査を、結腸切片の遠位→近位勾配に沿って示し、この勾配に沿った粘膜被覆度の増加を表している。すなわち、遠位吻合部では不完全な粘膜被覆がみられ（Ａ）、近位端（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に向かって粘膜被覆度が増加している。
【図２】実施例３に記載するラット研究の計画および測定の概略図を表す。
【図３】実施例３に記載するラット研究に関する基準決定の表を表す。表１は臨床症状スコア化のための基準を表し、表２は結腸検体の肉眼解剖学的スコア化に関する基準を表し、表３は結腸検体の組織学的スコア化に関する基準を表している。
【図４】使用したＤＳＳモデル、すなわち飲料水中の５％ＤＳＳを使った疾患状態の誘発のバリデーションを支持するデータを表す。図４Ａは、１日ごとの体重減少（ｗｅｉｇｈｔ  ｌｏｓｓ／ｐｅｒ  ｄａｙ）のグラフであり、図４Ｂは１日ごとの便血スコアのグラフであり、図４Ｃは１日ごとの便硬度のグラフであり、図４ＤはＤＳＳ処置ラットと非ＤＳＳ処置ラットの結腸長のグラフであり、図４ＥはＤＳＳ処置ラットと非ＤＳＳ処置ラットに関するＴＲＩＴＣ濃度のグラフである。
【図５】ＥＣＭＨ処置が組織学的スコアを低下させることを示す、実施例３に記載のラット結腸に関する組織学的結果を表す。図５Ａ〜５Ｄは、ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置シャム対照ラットまたは健常ラットにおける遠位および近位結腸切片に関する炎症スコアを表す。図５Ｅ〜５Ｈは、ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置シャム対照ラットまたは健常ラットにおける遠位および近位結腸切片に関する潰瘍形成スコアを表す。
【図６】ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクルシャム対照ラットまたは健常ラットからの結腸における潰瘍形成および炎症を示す、結腸粘膜の組織再生を表す。
【図７】ＥＣＭＨ処置が疾患活動度を低減することを示す、疾患の臨床症状の結果を表す。図７Ａは１日ごとの体重スコアを表し、図７Ｂは１日ごとの便血スコアを表し、図７Ｃは１日ごとの便硬度スコアを表し、図７ＤはＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置シャムラットおよび健常ラットの結腸の結腸長を表し、図７ＥはＥＣＭＨ処置ラット結腸とビヒクル処置シャムラット結腸における疾患状態の肉眼的スコアのグラフを表す。
【図８】ビヒクル処置シャムラットおよび健常（無処置）ラットとの対比で、ＥＣＭＨ処置がＥＣＭＨ処置ラットにおけるＴＮＦα＋マクロファージを低減することを示すグラフ表現である。
【図９】ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置ラットおよび健常（無処置）ラットにおけるマクロファージの総数のグラフを表す。
【図１０】ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置シャムラットと健常ラットからの、マクロファージ表現型マーカーについて免疫標識した、組織切片からの代表的画像を表す。
【図１１】ＥＣＭＨが炎症を媒介することを示す、炎症尺度のグラフ表現を表す。図１１Ａは、ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置ラットおよびＮＴ（処置なし：ｎｏｔ  ｔｒｅａｔｅｄ）ラットにおいて粘膜固有層単核球（ＬＰＭＣ）が分泌するＴＮＦαの濃度を表し、図１１Ｂは、ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置ラットおよびＮＴラットにおいてＬＰＭＣが分泌するＰＧＥ２の濃度を表し、図１１Ｃは、ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置ラットおよび健常ラットのラット結腸からの器官型培養から分泌されたＰＧＥ２のレベルを表す。
【図１２】ＥＣＭＨの粘膜付着をグラフと写真で表す。図１２Ａは、ペプシン処置ラット結腸と４ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、および１２ｍｇ／ｍｌ濃度のＥＣＭＨにおける引張付着強さのグラフであり、図１２Ｂは、健常ラット結腸と罹患ラット結腸における引張強さのグラフを表し、図１２Ｃは、１４Ｃ標識ＥＣＭＨ投与の２時間後、１２時間後および２４時間後に残存しているパーセントＥＣＭＨを表し、図１２Ｄは、ＥＣＭＨ投与の１時間後、２時間後、１２時間後および２４時間後に結腸に存在するＦＩＴＣ標識ＥＣＭＨの写真表現である。
【図１３】ＥＣＭＨ投与によって障壁機能が回復することを表す。図１３Ａは、ＥＣＭＨ処置ラットとビヒクル処置シャムラットおよび健常ラットにおけるＴＲＩＴＣ濃度のグラフ表現であり、図１３Ｂは、ＥＣＭＨ処置細胞培養とＬＰＳ＋ＥＣＭＨ処置細胞培養、ＬＰＳ単独処置細胞培養、およびＮＴ細胞培養におけるＴＥＥＲの相対変化のグラフ表現であり、図１３Ｃは、ＬＰＳ＋ＥＣＭＨ処置ラットとＬＰＳ単独処置ラットおよびＮＴラットにおけるパーセントＥ−ｃａｄ細胞のグラフ表現であり、図１３Ｄは、健常細胞培養とＬＰＳ損傷細胞培養とＬＰＳ＋ＥＣＭＨ処置細胞培養における細胞の写真表現を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、結腸切除を行うことなく、罹患または損傷した粘膜細胞および粘膜組織を置換すること、あるいは罹患または損傷した粘膜細胞および粘膜組織の置換を刺激することによって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）などを処置することに関する。
【００４１】
一実施形態において、本発明の方法は、結腸の粘膜内層の疾患もしくは損傷の症状を有するか腸の粘膜内層の疾患もしくは損傷を患っている患者において、（１）任意に、結腸の罹患または損傷した粘膜内層に対して粘膜切除を行う工程、および（２）結腸の粘膜内層に幹細胞または前駆細胞を播種するか、または罹患もしくは損傷した結腸組織への幹細胞および前駆細胞の遊走を刺激する工程によって、損傷または罹患した下部腸組織を処置する工程を含む。結腸の粘膜内層の疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であることができ、本方法はＩＢＤを処置、改善、または治療するために使用することができる。
【００４２】
したがって本発明は、損傷または罹患した結腸組織への直接的な幹細胞または前駆細胞の送達による幹細胞または前駆細胞の播種を含むことができ、例えばここで、幹細胞または前駆細胞は、結腸の粘膜内層の再建的組織リモデリングを開始または刺激するために、幹細胞または前駆細胞が結腸の管腔壁と接触して、少なくとも一時的にはその上に滞留するように、結腸の内腔への注射または注入によって結腸組織に送達するための溶液、懸濁液、またはゲルなどの流動性組成物に調製される。こうして本発明の方法は、損傷または罹患した結腸組織の、新しい健常結腸組織による置換を果たすことができる。
【００４３】
あるいは、結腸管腔壁上に、または結腸管腔壁と接触させて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物、例えばＥＣＭ移植片またはＥＣＭ足場を、固形物（シートもしくはチューブ）または流動体（溶液、懸濁液もしくはゲル）の形態で導入することにより、幹細胞または前駆細胞は、損傷または罹患した結腸組織の部位へと刺激されうる。
【００４４】
本発明の別の一実施形態では、幹細胞または前駆細胞を固形または流動性ＥＣＭ組成物に組み込むことができ、幹細胞または前駆細胞を含むＥＣＭ組成物を、本明細書に記載するように、組成物に適した送達手段によって、結腸の粘膜内層に送達することができる。例えば、固形ＥＣＭを結腸内層上に内視鏡的に埋植するか、流動性ＥＣＭを結腸中に注入、注射または噴霧することができる。
【００４５】
ＥＣＭはインサイチューでは意図的にすばやく分解して、その部位へのマクロファージの遊走を含む炎症応答を促すことができる。ＥＣＭのユニークな特徴の一つは、これらのマクロファージの表現型の、Ｍ１型（炎症誘発性、例えばＵＣを患っている患者に見られるであろうもの）からＭ２型（組織リモデリング誘発性、例えば炎症誘発状態が根底にない人に見られるであろうもの）へ切換えを促すことである。このＭ１表現型からＭ２表現型への切換えの重要な派生効果は、本来であれば炎症を起こしやすい組織を健常に保つことを可能にすることである。
【００４６】
移植片の埋植、移植または投与に先だって、罹患または損傷した組織、例えば結腸粘膜組織を除去するために実行される、任意の粘膜切除工程は、組織切除または組織アブレーションなど、一般に許容されている任意の方法を使って行うことができる。公知の切除法またはアブレーション法は、内視鏡または外科的粘膜切除（摘除）、内視鏡レーザー療法、光線力学的療法、アルゴンプラズマ凝固を使った内視鏡熱凝固、凍結療法、ラジオ波アブレーション、またはＥＤＴＡもしくは他のアブレーション剤を使ったアブレーションを包含する。
【００４７】
粘膜切除を受けた組織への幹細胞または前駆細胞の播種は、医学文献に記載されているように、その部位への幹細胞の注射など、公知の方法によって実行されうる。例えば、Ｌａｎｚｏｎｉ，  Ｇ．「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｏｖｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４（２９）：４６１６−４６２６（Ａｕｇｕｓｔ  ７，２００８）を参照されたい。この文献は、ＩＢＤの処置における造血幹細胞および間葉系幹細胞の使用を要約しているが、事前の粘膜切除は教示も示唆もしていない。
【００４８】
好ましくは、幹細胞は、粘膜切除を受けた組織に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物をＥＣＭ足場またはＥＣＭ移植片として配置および／または固定、例えば埋植、移植または投与することによって、導入されうる。粘膜切除を受けた部位へのＥＣＭ組成物の導入は、固形のシートまたはチューブの形態で行われるか、溶液、懸濁液またはゲルなどの流動体の形態で行われうる。固形ＥＣＭ材料の配置または固定は、縫合糸、クリップ、ステープル、接着剤、または他の周知の固定手段によることができる。
【００４９】
あるいは、流動化ＥＣＭは、注射、注入または灌注（その部位への「噴射」）など、一般に用いられる流動体投与プロセスまたは流動体送達プロセスによって、またはその部位に流動体を噴霧することによって、投与されうる。好ましい噴霧技法は、例えば内視鏡的に送達されるエアロゾル化ＥＣＭ流動体を使って実行される。
【００５０】
ＥＣＭを指して本明細書において使用される用語「組成物」、「材料」、「足場」および「移植片」は、相互可換的に使用することができ、固形、液状、流動性または他の形態であるなどの特定の構成を意味しない。例えば「ＥＣＭ足場」は固形または流動性であることができる。
【００５１】
好ましくは、流動化ＥＣＭ組成物は、粘稠な特性を有し、かつその流動体が体内の所望の場所に自己付着するのに十分な粘度を有するように、ゲルとして形成される。好ましい一実施形態において、流動化ＥＣＭは、適用時または投与時には比較的粘稠でない液状の特性を有するヒドロゲルであり、それが、投与部位または適用部位で身体と接触すると、またはその後まもなく、都合よく濃厚になり、または粘稠さを増して、付着性のゲルを形成する。ゲル化は、投与後に、体温などの温度上昇によって、開始されうる。流動性ＥＣＭは、十分な粘度を与えるように、別個の粘稠剤、例えばヒドロゲルまたは他の一般に知られるゲル化剤と混合されてもよい。あるいは、２種の流動体であって、流動体のうちの少なくとも１種はＥＣＭ材料を含有し、互いに接触するか混合された時に、それら２種の流動体がゲル化するような流動体が投与されてもよい。
【００５２】
組織が十分に血管化していて、細胞がその部位に遊走するための適当な導管を、それらの血管が提供する場合、ＥＣＭ組成物が幹細胞のその部位への遊走を引き起こしうることは、十分に確立されている。加えて、ＥＣＭは化学的シグナリングを介して隣接組織または下部組織と連絡しており、それら隣接組織または下部組織は、ＥＣＭが使用される細胞および組織の置換または再生を最適化する「動的相互作用」と呼ばれる現象によって、ＥＣＭと連絡する。したがってＥＣＭ組成物は、配置部位、投与部位または適用部位において、新しい細胞成長および組織成長のための固形、液状またはゲル状の足場として役立ちうる。
【００５３】
さらなる一実施形態において、ＥＣＭ由来組成物は、ＥＣＭ組成物が埋植部位における組織の新しい成長を促進するための足場として役立つ組織移植片であることができる。足場は、所望の部位に配置されたＥＣＭチューブまたはＥＣＭシートであることができる。足場は、幹細胞またはＥＣＭゲル、ＥＣＭ溶液もしくはＥＣＭ懸濁液がそこに分散されうる生体適合性の多孔性、マクロ多孔性またはマイクロ多孔性マトリックスであることができる。また、ＥＣＭはその後、幹細胞またはＥＣＭ溶液もしくはＥＣＭ懸濁液の分散に続いて、ゲル化されうる。
【００５４】
一実施形態において、ＥＣＭは、当技術分野において一般に使用される組織に由来しうる。例えばＥＣＭは、小腸粘膜下層（ＳＩＳ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａ）組織または膀胱マトリックス（ＵＢＭ：ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｍａｔｒｉｘ）組織に由来したものである。ＵＢＭを使用する好ましい一実施形態は、上皮基底膜層を伴わないＵＢＭ組織である。
【００５５】
より好ましい一実施形態において、「組織特異的細胞外マトリックス」または「ＴＳ−ＥＣＭ」と呼ばれる、処置される組織と同じ組織タイプに由来するＥＣＭは、動的相互作用によって起こりうる有利な結果、例えばより効率的なまたはより高い応答性の再建的組織リモデリングを与えうることが見いだされた。
【００５６】
したがって本発明は、疾患または外傷によって損傷した下部腸管組織、（膣以外の）生殖組織、外皮組織、膵臓組織、腎臓組織、循環組織または呼吸組織を、ＴＳ−ＥＣＭ移植片を使って処置するための方法および組成物を、さらに包含する。一実施形態では、ＴＳ−ＥＣＭが、処置される種と同じ種に由来する。例えばヒトにおけるＵＣの処置は、ＴＳ−ＥＣＭ足場組成物としてヒト結腸粘膜組織を用いることになる。組織移植片は、上述のように自家移植片、もしくは同種移植片であるか、または異種移植片であることができる。
【００５７】
好ましい一実施形態において、本発明は、罹患または損傷した大腸組織を置換するための、大腸組織由来の組織移植片組成物の使用方法、および大腸組織由来の組織移植片組成物を含む組成物を包含する。得られた大腸組織または処置される大腸組織は、結腸組織であることができ、好ましくは結腸粘膜であることができる。
【００５８】
好都合なことに、開放性または出血性の病変を引き起こす組織の疾患、損傷または状態、例えばＣＤまたはＵＣなどのＩＢＤを患っている患者における結腸組織が呈するものなどでは、処置または治療は、事前の粘膜切除または粘膜アブレーション工程を伴わない、ＴＳ−ＥＣＭの埋植、移植または投与を含む方法によって達成されうると考えられる。したがって、組織の疾患または損傷が、露出したまたは出血した組織表面などの病変を作り出すような場合は、事前の組織切除は省略されうる。
【００５９】
本明細書において使用される、埋植するまたは埋植、移植するまたは移植、適用するまたは適用、投与するまたは投与、注入するまたは注入、注射するまたは注射、送達するまたは送達という用語は、いずれも、処置部位にＥＣＭを提供するプロセスを指し、その部位へのＥＣＭの送達を実行するために用いられる組成物の特性および手法に依存して、同じ意味を有すると、当業者には理解されるであろう。これらの用語は相互可換的に使用することができ、決して本発明の方法に対する限定ではない。
【００６０】
したがって、本方法の一実施形態は、
下部腸管組織、（膣以外の）生殖組織、外皮組織、膵臓組織、腎臓組織、循環組織および呼吸組織から選択される組織を使ってＴＳ−ＥＣＭ足場を調製する工程、および
同じ下部腸管組織、（膣以外の）生殖組織、外皮組織、膵臓組織、腎臓組織、下部腸管組織、循環組織および呼吸組織を冒す疾患または状態を患っている患者の組織に、前記ＴＳ−ＥＣＭ足場を埋植し、移植しまたは投与する工程
を含む。
【００６１】
任意に、結腸を処置する場合は、本方法は、（３）回腸瘻を造設する追加工程、および（４）新しい粘膜が形成される間、患者には静脈内に栄養供給することにより、患者に完全静脈栄養（ＴＰＮ）を提供する追加工程、のうちの１つ以上を、さらに含みうる。
【００６２】
好ましい一実施形態において、この方法は、損傷または罹患した結腸組織を処置する工程を含む。本方法は、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、家族性腺腫性ポリポーシス、ヒルシュスプルング病、狭窄、直腸炎、直腸粘膜炎または瘻孔に起因する結腸組織の損傷または疾患を処置するために、より好ましくは、結腸粘膜組織の疾患または損傷を処置するために、用いられうる。
【００６３】
細胞成長の足場として有用な、チューブ状ＥＣＭ組成物、シート状ＥＣＭ組成物、およびゲル化、可溶化ＥＣＭ組成物を調製する方法は、当技術分野において記載されている。ゲル状ＥＣＭ組成物は、患者への埋植または投与に先だって、ゲル化されていない形態で成形されてから、ゲル化を起こすことができ、この場合、組成物はインサイチューでゲル化する。
【００６４】
ＥＣＭ移植片を形成させるこれらの方法および他の方法は、例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第８，３６１，５０３号に記載されている。好ましい一実施形態において、ゲル状ＥＣＭ組成物は、記載する１つ以上のプロセスによって調製される。例えばゲル状ＥＣＭは、
ｉ．  ＥＣＭを粉砕する工程、
ｉｉ．  酸性溶液における酸性プロテアーゼを使った消化によって、無傷の透析されていないまたは架橋されていないＥＣＭを可溶化することで、消化物溶液を生成させる工程、
ｉｉｉ．  前記消化物溶液のｐＨを７．２〜７．８のｐＨに調節することで、中和された消化物溶液を生成させる工程、および
ｉｖ．  ２５℃を上回る温度において前記溶液をゲル化する工程
を含む方法によって調製されうる。
【００６５】
別の一実施形態において、ＥＣＭ足場を調製する方法は、足場を超音波処理する工程をさらに含む。さらなる別の一実施形態において、工程（ｉｉ）における粉砕ＥＣＭの可溶化後に、可溶化されたＥＣＭは、粉末状態に乾燥されうる。乾燥は、凍結乾燥によって、または当技術分野において公知の他の乾燥プロセスによって、達成されうる。この乾燥工程は、好都合なことに、液状の可溶化された形態での貯蔵よりも長い貯蔵時間を組成物に与えることができる。使用準備が整ったら、乾燥された粉末物は、水性溶液または緩衝液で再構成され、ｐＨ調節（例えばｐＨの中和）プロセスが工程（ｉｉｉ）において実行され、プロセスが継続されうる。あるいは、工程（ｉｉｉ）のｐＨ調節は、乾燥プロセスの前に実行されうる。
【００６６】
本発明のさらなる一方法は、ＴＳ−ＥＣＭ足場を患者の組織に取り付ける工程であって、足場の表面は、患者の細胞、例えば幹細胞が埋込またはコーティングされたゲル化可溶化ＥＣＭを含み、埋込またはコーティングされた細胞は、組織への足場の埋植、移植または投与に先だって、足場への患者の細胞の内殖のために十分な時間が与えられる工程を含む。
【００６７】
本発明の方法を実行する際に、足場移植片は、本明細書における説明に従って調製され、次に罹患または損傷している組織の少なくとも一区画に埋植、移植または投与され、置換細胞が成長して罹患または損傷した細胞を置換するように、十分な期間にわたって、罹患または損傷した組織と接触した状態に保たれる。
【００６８】
十分な期間とは、そのような処置方法に対する患者の応答性に依存して、１日〜数週間または数ヶ月であることができる。組織再建がうまく行かないままの１年間の処置は、そのような処置の継続に関する上限となりうる。ＥＣＭ材料は体内では自然に生分解し、除去されることを必要としない。それにもかかわらず、ＥＣＭＨは、予想外かつ好都合なことに、処置される病変上に障壁を提供する。この特性は予想外である。なぜなら、液状物または結果として生じるゲルの粘度特徴または粘着特徴または付着特徴の１つ以上が、処置される患者の腸内での蠕動運動もしくは自動運動、または腸を通って移動する摂取された液状物をもってしても、腸からの排除に抵抗することがわかったからである。
【００６９】
したがって、ＥＣＭＨは、それが腸内に滞留している間は、障壁層または保護層を形成する。ＥＣＭＨの滞留時間は、有効な組織の治癒および修復を与えるのに足りる長さであり、少なくとも２時間、最大で４８時間程度である。好ましくは、投与後のＥＣＭＨの滞留時間は約４〜約２４時間であり、より好ましくは約６時間〜約１２時間である。
【００７０】
ＵＣを処置する本方法を実行するために、ＥＣＭ移植片は、罹患または損傷した結腸の少なくとも一区画と接触した状態で、埋植、移植または投与され、結腸粘膜細胞の成長および置換が可能になるように、ある期間にわたって粘膜と接触した状態に保たれ、その結果、炎症またはＵＣ罹患細胞の他の所見を呈さない健常な粘膜細胞による、罹患または損傷した細胞の置換が起こる。
【００７１】
ＥＣＭ移植片は、結腸の内壁に埋植、移植または投与される長さ１〜１０センチメートル程度の比較的短いチューブ状またはシート状のセグメントとして提供されうる。あるいは、ＥＣＭ移植片は、結腸の全長に対応する１つ以上の長さを含むことができる。固形のチューブ状またはシート状ＥＣＭは、処置される組織に、縫合、クリップ、ステープル、接着剤などによって固定されうる。あるいは、結腸組織は、液状の溶液、懸濁液、またはゲル状組成物を処置される部位に投与、例えば噴霧することによって処置されうる。
【００７２】
ＵＣは粘膜内に限局されるので、粘膜切除工程を含むＵＣの処置方法では、ＵＣの症状を呈する組織が除去される。粘膜切除工程は、内視鏡的に行うことができ、開腹手術または腹腔鏡下手術の必要はない。（ＴＳ−ＥＣＭ移植片の導入による）幹細胞刺激工程は、新しい健常粘膜が結腸内腔に形成されることを可能にする。粘膜切除は、結腸の部分的なもしくは短いセグメントに対して、またはより長い結腸の長さに対して行われうる。
【００７３】
結腸のセグメントで実行されるか、結腸の全長で実行されるかを問わず、本発明は、結腸切除術の必要性を排除して、本来の直腸組織カフをインサイチューに残す利益を提供することができる。これは、増殖性（悪性）異常、例えばＵＣまたは家族性ポリポーシスから、保持された直腸における悪性の可能性を排除して、医療専門家が、より長い直腸Ｓ状部セグメントを本来の場所に残すことを可能にするという利益を含み、以下の機能的利益を伴う：
−下部切離に付随する括約筋破損（失禁）または仙骨神経損傷（インポテンス）のリスクの低下、および
−水分吸収が増加し貯蔵容量が改善されるので、より正常な排便習慣を可能にする、リザーバー機能の改善；
−結腸切除術または類似の手法、例えばＩＰＡＡ（回腸肛門吻合を伴う直腸結腸全切除：ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｃｔｏｃｏｌｅｃｔｏｍｙ  ｗｉｔｈ  ｉｌｅｏａｎａｌ  ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）よりも、比較的簡単で、侵襲性が低いこと；粘膜切除は、かなり簡単な手法であって、貫通／回腸瘻造設と同時に、またはそれ以後の任意の時点で、下から行うことができる。幹細胞は、「植えられ」て、便流を変更する回腸瘻がまだ現存している間に粘膜を再生することができるだろう。
−結腸を残すことで、結腸なしの生活の生涯にわたる懸念（例えば回腸嚢炎、腸閉塞、脱水、直腸のリザーバー容量の減少に起因して頻繁な排便が必要になることによる睡眠不足など）が取り除かれる；
−回腸瘻の造設は一時的（すなわち新しい粘膜が生存可能になるまで）であってよい；および
−本来であればＩＢＤを処置するために別々に機能することになるであろうさまざまな学問分野（外科、内科、内視鏡および組織工学）を集約する。
【００７４】
結腸に幹細胞を送達するには、例えば足場に載せる、浣腸によって送達されるブロスに入れる、カテーテルに基づく送達系によるなど、さまざまな方法および手法が使用されうることは、理解されるであろう。好都合なことに、ＥＣＭ材料は、回腸瘻が造設される手術と同じ外科手術中に適用することができ、体内パウチ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｏｕｃｈ）が治癒する間に、粘膜を増殖または再生させることができる。
【実施例】
【００７５】
実施例１−結腸組織を置換するための固形ＥＣＭの外科的配置
小腸粘膜下層細胞外マトリックス（ＳＩＳ−ＥＣＭ）移植片を４匹の生きたイヌの結腸組織に移植した。約３〜４センチメートル長のＳＩＳ−ＥＣＭ移植片を、公知の技法に従って調製した。層の数が異なる移植片、すなわち２層、４層、６層および８層のシートまたはチューブを調製し、経肛門環状粘膜切除後に試験した。
【００７６】
４匹の健常な雑種メス成犬（体重約２０ｋｇ）を環状結腸粘膜ＥＭＲに付した。全身麻酔下のイヌで外科的粘膜切除を行った。あるいは、ＥＭＲなどの粘膜組織アブレーションを、例えば治療用内視鏡（ＥＧ−３４３０、Ｐｅｎｔａｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ニュージャージー州モントヴェール）および市販のキット（ＥＭＲキット、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、ペンシルバニア州センターバレー）を使って行うこともできる。４ｃｍ環状切除が完了するまで、分割粘膜切除を逐次的に行った。
【００７７】
次に、ブタ小腸粘膜下層（ＳＩＳ）由来の管状のＥＣＭ移植片またはＥＣＭ足場を、４匹のイヌに、内視鏡を使って外科的に配置した。ＳＩＳ−ＥＣＭ生体足場材料は既述のとおり調製し、管状に構成させた。簡単に述べると、ブタＳＩＳを市場体重のブタ（約１１０〜１３０ｋｇ）から死後直ちに収穫した。脂肪組織を含む残存外側結合組織を刈り込み、水道水で繰り返し洗浄することによってすべての残存汚物を除去した。粘膜下層を小腸組織から機械的に離層させた。次に、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酢酸（類）、４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール、および９６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）脱イオン水に２時間浸漬することによって、粘膜下層を脱細胞化し、消毒した。
【００７８】
次に、ＳＩＳ−ＥＣＭ材料をリン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ７．４）で１５分ずつ２回洗浄し、脱イオン水で１５分ずつ２回洗浄した。イヌ結腸の解剖学的構造に合うように管状の足場を製作した。簡単に述べると、アンビリカルテープ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｔａｐｅ）で覆われた２２ｍｍ有孔チューブ／心棒の周りに、水和したＳＩＳシートを全部で数回転分巻くこと（すなわち多層チューブ）によって、多層チューブを作出した。次に、この構築物をプラスチック袋に入れて、凝縮トラップと直列にして、真空ポンプ（モデルＤ４Ｂ、Ｌｅｙｂｏｌｄ、ペンシルバニア州エクスポート）に取り付けた。
【００７９】
これらの構築物を１０〜１２時間にわたって、７１０〜７４０ｍｍＨｇの減圧に付すことで、水を除去し、密に結合した多重膜構築物を形成させた。各ＥＣＭデバイスを心棒から取り出した後、それらをエチレンオキシドで最終滅菌した。
【００８０】
ＳＩＳ−ＥＣＭ移植片の内視鏡的配置のために、管状の足場を食塩溶液浴中で５分間水和させてから、３０ｍｍアカラシアバルーン（Ｃｏｏｋエンドスコピーアカラシアバルーン、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ノースカロライナ州ウィンストン・セーレム）上に置いた。このＳＩＳ−ＥＣＭデバイスを、２本の４−０絹縫合糸を使って、バルーンを膨らませた時に放出することになる外科結びで束縛した。０．０３５インチのワイヤ（Ｊａｇｗｉｒｅ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ナティック）を、イヌの結腸に内視鏡で配置した。次に、バルーンをそのワイヤに通し、ＳＩＳ−ＥＣＭが粘膜切除の長さをまたぐように、内視鏡誘導下に位置決めした。
【００８１】
次に、滑りを防止するために、結腸壁とＳＩＳ−ＥＣＭとの間に、デバイスの両側にある２つの別々の条片として、分解可能なリジン由来のウレタン系（ＬＤＵ：ｌｙｓｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｕｒｅｔｈａｎｅ）外科用接着剤（ＴｉｓｓｕＧｌｕ、Ｃｏｈｅｒａ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）１ｍｌを、６Ｆ内視鏡用誘導カテーテル（Ｏａｓｉｓステント挿入システム、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を通して注射した。次に、バルーンを最大容量まで用手的に膨張させることで、足場を結腸壁に向かって拡張した。バルーンの膨張を１５分間維持してから、収縮させて取り除くことにより、ＳＩＳ−ＥＣＭ足場を結腸内の所定の場所に残した。
【００８２】
手術後に、イヌを麻酔から回復させ、抜管し、イヌが伏臥位で安楽に休息するようになるまで、回復室中で監視した。イヌを一晩ケージに入れておき、手術後１日目に、それぞれのより大きな囲い場（ｒｕｎ  ｈｏｕｓｉｎｇ）に戻した。すべてのイヌに、セファロチン／セファレキシンからなる経口予防抗生物質（３５ｍｇ／ｋｇ）を、７〜９日間、毎日２回与えた。
【００８３】
静脈内アセプロマジン（０．１ｍｇ／ｋｇ）およびブトルファノール（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を２日間投与した後、その後は、鎮痛のために必要に応じて１２時間ごとに皮下または筋肉内ブプレノルフィン（０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
【００８４】
すべてのイヌにオメプラゾール２０ｍｇを毎日与えた。経口摂取は手術の３６時間後に開始した。イヌには高さのある／高くなった台から採餌させた。１日栄養所要量を算出し、それを３回の別個の給餌に分割した。術後１週間はかゆ／柔らかい食べ物を与えてから、その後２週間かけて、徐々に固形食に変えていった。イヌは、毎週体重測定し、およそ１０〜１４フィートの大きさの飼育場（ｒｕｎ）に収容して自由に動き回ることができるようにした。
【００８５】
結腸粘膜の外観と狭窄を評価するために、手術の１ヶ月後と、１２週時の安楽死の直前に、内視鏡検査を行った。結腸内視鏡検査と生検収集とを使って経時的リモデリング応答を監視した。２、８、１０または１２週時に動物を屠殺した。外植片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにアルシアンブルーで染色し、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ：ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）について免疫標識した。外植片の肉眼的分析により、粘膜切除だけのイヌでは狭窄形成が起こったのに対し、ＥＣＭ処置されたイヌはいずれも狭窄を発症しなかったことがわかった。組織学的検査により、ＥＣＭは、適切な部位にある杯細胞および適切に配置されたＰＣＮＡ＋増殖細胞部位の再編成を促進することがわかった。ＥＣＭ処置されたイヌの粘膜は、元々の組織とほとんど区別がつかなかったのに対し、粘膜切除だけのイヌは、新しい粘膜被覆の徴候を示さなかった。
【００８６】
安楽死の直後に、足場配置部位と足場配置部位に対して近位および遠位にある元々の結腸組織とを収穫した。切り取ったセグメントを縦方向に裂き、露出した粘膜表面を検査すると共に、寸法測定のために写真撮影した。狭窄の程度を決定するために、リモデリングされた部位の上縁から近位側３ｃｍの位置と移植片の中間部分とにおいて、結腸の管腔円周を測定した。結果を、リモデリングされた部位と近位の正常組織との間の円周の減少百分率（平均±ＳＤ）として表した。
【００８７】
切り取った組織をコルク板に平らにピン留めし、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。この検体を、正常組織とリモデリングされた組織の両方を含むように縦方向に刈り込み、薄切し、ヘマトキシリン−エオシン染料とマッソン三色染料の両方で染色した。検査する区域には、元々の組織、リモデリングされた区域と元々の組織との間の近位および遠位境界面、リモデリングされた区域の中間領域を含めた。データの分布を調べたところ、データは正規分布しているようである。そこで、結果を比較するために使用する統計的アプローチは、パラメトリックｔ検定とした（ｎ＝４）。
【００８８】
検定した仮説は、ＳＩＳ−ＥＣＭによるＥＭＲ欠損の処置により、無処置と比較して円周の低減が少なくなるというものである。個々の試験動物からのデータを複数の統計解析（すなわち円周低減および体重）に付したと認識されたい。イヌにおける管腔円周の低減の比較を、多重検定を伴わない主要統計解析とした。他の統計的検定はすべて副次的であるとみなし、言明するそれらのＰ値は反復測定について補正していないので、記述的でしかないと解釈すべきである。
【００８９】
結果および結論
処置を行わない場合は、瘢痕化および狭窄形成が、予想されるアウトカムである。しかし、ＥＣＭ処置は、肉眼でも顕微鏡でも正常に見える切除組織の粘膜被覆をもたらした。アウトカムは管状デバイス中のＥＣＭ層の数に基づいてわずかに変動し、一般的には、ＥＣＭ層の数の多さは、粘膜被覆の増加と関連した。ＥＣＭ足場で処置されたどのイヌにも、狭窄の徴候は存在しなかった。
【００９０】
イヌモデルにおける本研究は、環状ＥＭＲ後に内視鏡的に配備されたＳＩＳ−ＥＣＭ足場が、狭窄形成を伴わない結腸粘膜リモデリングを助長することを示した（図１）。リモデリングされた組織は、密な組織化された膠原性粘膜下層と正常な外観を持つ外筋層とを有する完全に上皮化した内腔からなった。
【００９１】
したがって、イヌモデルを使用し、結腸粘膜内層組織の再生にＳＩＳ−ＥＣＭ移植片を用いるこれらの研究は、ＥＣＭがＵＣまたはＣＤなどのＩＢＤの処置に使用することができることを明示している。
【００９２】
こうして本発明を記載したので、異なる実施形態であるように見えうるものも、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく提供されうることは、明らかである。したがって上記の明細は、限定という意味合いではなく、例示的であると解釈されるものとする。
【００９３】
実施例２−結腸組織を置換するためのゲルＥＣＭの適用
本発明によれば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置にＥＣＭゲル組成物を使用することの実行可能性は、ラットにおいて、インビボで試験することができる。ラットは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などのヒトＩＢＤのモデルとして確立させることができ、この場合、飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を数日間にわたって自由摂取で投与することにより、ＵＣ様の炎症をラット結腸組織に誘発することができる。
【００９４】
自由摂取させる飲料水に入れて５％ＤＳＳを７日間投与した後、通常の水を投与することによって、急性ＵＣ様炎症を誘発することができる。自由摂取させる飲料水に５％ＤＳＳを入れて連続７日間の投与を１回以上行った後、通常の水を投与することによって、ラットにおいて慢性ＵＣ様炎症を誘発することができる。
【００９５】
ＵＣの処置は、浣腸によって結腸に導入される小腸粘膜下層（ＳＩＳ）由来のゲル状細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を使って実行することができる。ゲル状ＳＩＳ−ＥＣＭは、少なくとも１週間、好ましくは約１ヶ月までの期間、１日につき１回以上投与することができる。ＳＩＳ  ＥＣＭの好ましい投与レジメンは、１〜３０日にわたって１日１回である。
【００９６】
ＥＣＭからゲルを調製する方法
小腸のセグメントからのＳＩＳの調製は、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第５，２７５，８２６号および米国特許第５，５１４，５３３号に詳述されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。まず、外側の層（特に漿膜および筋層）と内側の層（粘膜の管腔部分）をどちらも除去するために、腸のセグメントを、縦に拭う動作による研磨に付す。典型的には、ＳＩＳを食塩水ですすぎ、任意に、水和状態または脱水和状態で、以下に記載するように使用するまで、保存しておく。
【００９７】
粘膜下層を粉砕し、かつ／または前記組織を可溶化して実質的に均一な溶液を形成させるのに十分な期間にわたって、トリプシンまたはペプシンなどのプロテアーゼで消化することにより、本流動化組成物を、腸粘膜下層の溶液または懸濁液として調製する。腸粘膜下層出発材料を、引裂、切断、摩砕、せん断などによって粉砕する。凍結状態または凍結乾燥状態の粘膜下層を摩砕することは好ましいが、粘膜下層の断片の懸濁液を高速（高せん断）ブレンダーでの処理に付し、必要であれば、遠心分離して過剰の水を傾瀉することで脱水することによっても、同様に良好な結果を得ることができる。粉砕した腸粘膜下層を乾燥させて粘膜下層粉末を形成させることができる。その後は、それを水和させることにより、すなわち水または緩衝食塩水および任意に他の薬学的に許容される賦形剤と合わせることにより、組織移植片組成物を、２５℃で約２〜約３００，０００ｃｐｓの粘度を有する流動体として形成させることができる。これより粘度が高い移植片組成物は、ゲルまたはペーストの硬度を有しうる。本組成物は、電離放射線への曝露など、当技術分野において認識されている滅菌技法を使って滅菌することができる。
【００９８】
本発明の流動化粘膜下層は、最も典型的には外傷または疾患が誘発する組織欠損を矯正するために修復または増強を必要とする組織、例えば軟組織のための、注射可能な異種移植片としても役立つ。
【００９９】
ＳＩＳ懸濁液
上述のように調製したＳＩＳ検体を、組織剪刀、片刃かみそり、または他の適当な切断器具を使って任意の小片に刻むか細断する。検体を平底ステンレス鋼容器に入れ、容器に液体窒素を導入することで、粉砕の準備として検体を凍結させる。
【０１００】
次に、その凍結ＳＩＳ検体を粉砕することで、ＳＩＳ粗粉末を形成させる。このような加工は、例えばＷｉｌｅｙミルを使って、または手動式アーバープレスを使用し、凍結した検体の上に円柱状の黄道インゴットを置いて、実行することができる。インゴットは、検体とアーバープレスとの間の接触面として役立つ。ＳＩＳ検体を凍結した状態に保つために、ＳＩＳ検体には液体窒素を定期的に加えることができる。
【０１０１】
ＳＩＳ検体を粉砕するための他の方法を利用して、本発明に従って使用することができるＳＩＳ粉末を生成させてもよい。例えばＳＩＳ検体を凍結乾燥してから、アーバープレスまたは他の摩砕手段を使って、それを摩砕することができる。あるいは、脱水および乾燥後にＳＩＳ粉末が生成するように、高せん断ブレンダーでＳＩＳを加工することもできる。
【０１０２】
前もって冷却しておいた乳鉢および乳棒を使ってＳＩＳ粉末をさらに摩砕することで、より微細な一貫した生成物を生成するのに使用することができる。ここでも、最終的摩砕の間、固形の凍結粒子を維持するために、必要に応じて液体窒素を使用する。本発明の流動化組織移植片材料を所望の粘度で生成させるために、この粉末を、例えば緩衝食塩水を使って容易に水和させることができる。
【０１０３】
ＳＩＳ溶液
金網を通してＳＩＳ粉末を任意の好都合な器に篩分する。次に、その粉末をタンパク質分解消化に付すことで、実質的に均一な溶液を形成させる。一実施形態では、粉末を、ＨＣｌでｐＨ２．５に調節した０．１Ｍ酢酸中、１ｍｇ／ｍｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）により、室温で４８時間にわたって消化する。ペプシン活性を不活化するために反応媒体を水酸化ナトリウムで中和する。次に、可溶化された粘膜下層を溶液の塩析によって濃縮し、さらなる精製および／または凍結乾燥のために分離することで、粉末状のプロテアーゼ可溶化腸粘膜下層を形成させてもよい。
【０１０４】
本発明の流動化粘膜下層組成物の粘度は、粘膜下層成分の濃度および水和度を制御することによって操作することができる。粘度は２５℃で約２〜約３００，０００ｃｐｓの範囲に調節することができる。関節内適用または体腔内での適用には、低粘度粘膜下層組成物の方が適している。ＳＩＳ消化物溶液からは、そのような溶液のｐＨを約６．０〜約７．０に調節することによって、高粘度製剤、例えばゲルを調製することができる。ゲル型の本組成物は、粘膜下層懸濁液または粘膜下層消化物溶液と同様に、通例、シリンジまたはカテーテルを使った皮下または筋肉内適用に好ましい。
【０１０５】
ＳＩＳゲルは、適当な量の０．１Ｎ  ＮａＯＨ（消化物溶液の体積の１／１０）および１０×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（消化物溶液の体積の１／９）を４℃で混合することによって、ゲルに形成されるとの記載もある。ゲル化を起こすために、冷（４℃）１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４を使って溶液を所望の体積および濃度にして、３７℃のインキュベータに入れた。
【０１０６】
ＥＣＭは、溶液中で４０分後に、マトリックスを形成することができた。ＥＣＭ由来のゲルは２０℃未満の温度では液状であったが、温度を３７℃に上げるとゲルになる。
【０１０７】
ＥＣＭからゲルを調製する際には、すべての溶液を氷上に保つべきであると共に、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３６１，５０３号に従って、以下の変量を決定しなければならない：
Ｃｆ＝最終ゲルの濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）
ＣＳ＝ＥＣＭ消化物溶液の濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）
Ｖｆ＝実験に必要な最終ゲル溶液の体積
Ｖｄ＝ＥＣＭ消化物溶液からの必要な体積（単位：ｍｌ）
Ｖ１０×＝必要な１０×ＰＢＳの体積（単位：ｍｌ）
Ｖ１×＝必要な１×ＰＢＳの体積（単位：ｍｌ）
ＶＮａＯＨ＝必要な０．１Ｎ  ＮａＯＨの体積（単位：ｍｌ）
【０１０８】
まず、必要なＥＣＭゲルの最終濃度（Ｃｆ）および体積（Ｖｆ）を決定する。次に、Ｃｆ（ｍｇ／ｍｌ）×Ｖｆ（ｍｌ）のかけ算によって必要なＥＣＭの質量を算出する。この値によって、必要なＥＣＭ消化物溶液からの体積（Ｖｄ）が得られることになり、Ｖｄ＝［Ｃｆ（ｍｇ／ｍｌ）×Ｖｆ（ｍｌ）］／ＣＳである。
【０１０９】
算出された体積Ｖｄを９で割ることによって必要な１０×ＰＢＳの体積を算出する（Ｖ１０×＝Ｖｄ／９）。算出された体積Ｖｄを１０で割ることによって必要な０．１Ｎ  ＮａＯＨの体積を算出する（ＶＮａＯＨ＝Ｖｄ／１０）。溶液を適当な濃度／体積にするのに必要な１×ＰＢＳの量を、次のように算出する：Ｖ１×＝Ｖｆ−Ｖｄ−Ｖ１０×−ＶＮａＯＨ。適当な容器（通常は１５ｍｌまたは５０ｍｌの遠心チューブ）に、ＥＣＭ消化物（Ｖｄ）を除くすべての試薬（Ｖ１×＋Ｖｄ＋Ｖ１０×＋ＶＮａＯＨ）を加える。溶液は氷上に置き、常に氷上に保つ。
【０１１０】
ＥＣＭ消化物溶液からの適当な体積（Ｖｄ）を、上で調製したＰＢＳ／ＮａＯＨ混合物に加え、注意深く、溶液中に気泡ができることを避けながら、１ｍｌマイクロピペットでよく混合する。ＥＣＭ消化物溶液の粘度によっては、移動中に多少の体積減少があるかもしれない。総体積を監視し、最終体積に達するまで適当量を加える。このプレゲル溶液のｐＨを測定する。ここでｐＨは７．４前後であるべきである。
【０１１１】
プレゲル溶液を鋳型または適当なウェルに加える。鋳型またはウェルを最低４０分間は３７℃のインキュベータに入れておく。ＣＯ２制御付きのインキュベータの使用は避ける。水分の蒸発が懸念される場合は、インキュベータに入れる前に鋳型をプラスチック製のジップロックバッグの内側に入れる。ゲル化後は、ゲルを鋳型から取り出して、１×ＰＢＳに置くことができる。ゲルを組織培養プレート中で作った場合は、ゲルを水和された状態に維持するために、使用時まで、ゲルの上に１×ＰＢＳを乗せておくことができる。
【０１１２】
ＳＩＳ−ＥＣＭ投与手順
ＳＩＳ−ＥＣＭ溶液またはＳＩＳ−ＥＣＭ懸濁液は、ＵＣ誘発ラットの結腸に浣腸によって投与することができる。移植片投与後の宿主動物の拒絶、感染または異常な生理学的応答は、いずれも予想されない。溶液または懸濁液は内視鏡および腹腔鏡によって結腸に投与してもよい。本発明の予想外の結果は、ＳＩＳ溶液材料またはＳＩＳ懸濁液材料を使って結腸粘膜の増強を達成することができるような、適当な組織リモデリングの刺激であるだろうと考えられる。
【０１１３】
本発明の流動化組成物は、組織置換および組織修復をもたらすことができ、さらにＵＣを含むＩＢＤの処置または治療をもたらすこともできる。流動化粘膜下層組成物は、天然結腸粘膜組織の再成長を誘発するために、本発明に従って使用される。有効量の流動化ＥＣＭ組成物を欠陥組織の場に注射することにより、より侵襲的な外科的技法を必要とすることなく、生体栄養特性（ｂｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を実現することができる。
【０１１４】
実施例３−ラットにおける結腸組織のリモデリングにＥＣＭヒドロゲル（ＥＣＭＨ）を使用するインビボ研究
ＵＣ療法への非外科的かつ非薬学的なアプローチは、局所的先天免疫細胞集団の代替的活性化を促進することによって炎症性フレアを軽減することができ、粘膜上皮構造を回復させることによって結腸粘膜障壁機能の迅速な置換を誘発することができる。本研究は、ＵＣを処置するためのヒドロゲル型哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭＨ）の局所送達の効力を明示する。複数のインビボおよびインビトロアウトカム測定によって、総合的臨床症状、炎症および上皮障壁機能に対するＥＣＭＨの効果を評価した。
【０１１５】
この実施例で提示する研究は、ＥＣＭで構成された浣腸ヒドロゲルがＵＣの齧歯類モデルを効果的に処置することを示す。ＥＣＭＨ処置がよい方向に向かわせる以下の２つの基本的生理過程に従って、有効な療法を決定した：１）炎症誘発性の管腔内容物の容赦ない集中攻撃から宿主を保護する結腸上皮障壁機能の回復、および２）炎症性サイトカインを放出することによって炎症を蔓延させる組織マクロファージの炎症誘発性状態の解消。この戦略は、プロアクティブ（ｐｒｏａｃｔｉｖｅ）な治療アプローチであり、ＵＣを処置するために現在使用されている免疫抑制（防御）および外科的（サルベージ）方法からの明確な逸脱である。
【０１１６】
いくつかの以前の報告とは異なり、この研究の結果は、ＥＣＭＨが、Ｍ２様マクロファージ表現型を直接促進することによってではなく、Ｍ１様炎症誘発性マクロファージの数を低減することによって、自然免疫炎症応答を媒介できることを示している。ＥＣＭＨ処置動物の結腸では、（必要な組織修復の媒介物質である）マクロファージの低減はないが、炎症性マクロファージが減少している。ＥＣＭＨのこのような免疫調節特性は、単独で使用した場合でさえ、負の副作用を伴うことなく、現在の薬物療法と同等に有効であることができる。加えて、ＥＣＭＨ療法は、結腸粘膜の上皮細胞に対する保護効果も有することができる。この研究は、上皮障壁機能を回復し、炎症誘発性マクロファージを軽減し、粘膜組織再生のための環境を確立することによる、ＥＣＭＨを使った結腸炎症の効果的な処置を明示する。
【０１１７】
方法
実験計画
妥当性が確認されたＵＣ齧歯類モデルにおいてＥＣＭＨの効力および安全性を決定するために、雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに疾患を誘発し、連続７日間にわたる毎日の浣腸注入により、ＥＣＭＨ溶液または加工残渣を含むＥＣＭＨ希釈剤を模倣した対照溶液のどちらか一方で処置した。経時的応答を評価するために、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）後、７日および１４日の時点で、動物を屠殺した（１処置あたり１時点あたりｎ＝１４）。ＤＳＳも浣腸注入剤も投与されていない健常ラットを、７日および１４日の両方において、比較のために含めた（１時点あたりｎ＝６）。主要試験エンドポイントには、臨床的応答、組織学的スコア、炎症応答、および障壁機能を含めた。炎症および上皮障壁機能に対するＥＣＭＨの効果は、それぞれ粘膜固有層単核球（ＬＰＭＣ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）において、インビトロで測定した。
【０１１８】
ＥＣＭヒドロゲルの調製および製剤
小腸粘膜下層（ＳＩＳ）ＥＣＭをブタ小腸から調製した。安楽死の直後に腸を収穫し、脱イオン水で内容物をすすぎ落とし、凍結した。組織を融解し、粘膜の浅層を機械的に除去した。同様に漿膜および外筋層も機械的に除去して、粘膜下層および粘膜の基底部分を残した。残ったＳＩＳ材料を脱イオン水中で２４〜７２時間すすいでから、０．１％過酢酸／４％エタノールによる処理を行い、次いで食塩水および水ですすいだ。ＳＩＳ−ＥＣＭを凍結し、凍結乾燥し、＃６０メッシュスクリーンを使ってＷｉｌｅｙミルで粉末化し、乾燥重量１０ｍｇ／ｍＬで、０．０１Ｎ  ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬペプシン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）により、撹拌しながら、２１〜２３℃で２０〜２６時間消化した。消化物を小分けして−２０℃で保存し、使用前に中和した。すべてのインビボ研究に８ｍｇ／ｍＬのＥＣＭＨ濃度を使用し、すべてのインビトロ研究に５００μｇ／ｍＬのＥＣＭＨ濃度を使用した。
【０１１９】
１４Ｃ標識ＥＣＭＨは、既述のとおり、１４Ｃタグ付きプロリンを注射したブタの腸を使って、上述のように調製した。ＦＩＴＣ標識ＥＣＭＨは、タンパク質標識キットを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  ＰｉｅｒｃｅＮｅｔ；＃５３０２７）どおりに使って、調製した。
【０１２０】
ＥＣＭヒドロゲルの特徴づけ
Ｈ＆ＥおよびＤＡＰＩ染色における核の非存在によって脱細胞化効率を決定した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって残存ＤＮＡを測定し、ゲル電気泳動を使ってＤＮＡの断片化を可視化した。ＥＣＭ中の硫酸化グリコサミノグリカン含量は、Ｂｌｙｓｃａｎ硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｌｔｄ．）を製造者の指針どおりに使って測定した。既述（参考文献）のとおり、ＥＣＭＨのレオロジー的特徴は、４０ｍｍパラレルプレートジオメトリで作動するレオメーター（ＡＲ２０００、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）を使って決定し、定常ずり粘度は、０．１５９Ｈｚの振動数で１Ｐａの応力を負荷することによって測定した。特徴アッセイはすべて、４つの独立したＥＣＭ調製物で履行した（ｎ＝４）。
【０１２１】
ＥＣＭＨ付着試験
変更を加えた剥離力測定を使ってＥＣＭＨの粘膜付着を測定した。１０Ｎロードセルを装備した一軸引張試験機（ＭＴＳ  Ｉｎｓｉｇｈｔ；ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ．、ミネソタ州イーデンプレーリー）を、すべての引張強さ測定に使用した。２つの結腸切片を粘膜が外側を剥くように鋼製ワッシャ（直径１２．７ｍｍ）に接着し、一方のワッシャを２４ウェルプレート（直径１５．６ｍｍ）に接着した。１／１０体積の０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび１／９体積の１０×ＰＢＳで中和することによってＥＣＭＨを調製し、次に０．５ｍＬを下部ワッシャに加え、上部ワッシャを加えて、所定の深さまでゲル中に進入させてから、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、表面間に破断が生じるまで、５ｍｍ／分の一定速度で粘膜をゆっくり上向きに引いた。Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ  ＆  Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ（１９９５）（Ｋａｍｍｅｒ  １９８３）。
【０１２２】
動物および飼育
すべての手順および動物実験は、ピッツバーグ大学放射線安全委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）および施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従って承認され、実行された。８〜１２週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎから入手し、個別に収容して、７〜１０日間、環境に馴化させた。動物は、温度２１〜２３℃で１２時間暗/明周期の標準条件下に収容した。研究の全体を通してラットには食べ物と水を自由に摂取させた。
【０１２３】
疾患の誘発および監視
５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）塩（３６，０００〜５０，０００ＭＷ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を、毎日脱イオン水中に調製し、自由飲水によって７日間ラットに投与し、動物を毎日監視した。動物の体重および食料と水の消費量を、動物ごとに追跡した。疾患活動度（すなわち便硬度、便中の血液の存在および体重減少）を１日置き（すなわち１日目、３日目、５日目、７日目など）に測定し、表１に従って０〜４の範囲でスコア化した。便硬度（０＝正常、２＝軟便、４＝下痢）および血液の存在（０＝なし、２＝潜血、４＝肉眼的出血）によってスコア化した。ＣｏｌｏＳｃｒｅｅｎ  ＥＳ  Ｌａｂ  Ｐａｃｋ  Ｆｅｃａｌ  Ｏｃｃｕｌｔ  Ｔｅｓｔｓを使って、便を血液の存在について調べた。ベースラインと比較した体重減少は、次のようにスコア化した：０＝なし、１＝１〜５％、２＝５〜１０％、３＝１０〜２０％、および４＝＞２０％。
【０１２４】
浣腸注入剤投与
ラットを２〜４％吸入イソフルランで麻酔し、フレキシブルＳｕｒｆｌｏウイング付き注入カテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ、ＯＤ＝２ｍｍ）を使って浣腸注入剤を送達した。カテーテルに取り付けたシリンジを利用して浣腸剤（５ｍＬ）を結腸に沿った３つの部位に、肛門まで８ｃｍの位置から初めて、５ｃｍおよび３ｃｍと、カテーテルを徐々に動かして、約６０秒の総注入時間（すなわち各部位２０秒）で投与した（各部位につき約１．６ｍＬ）。
【０１２５】
ＦＩＴＣ−および１４Ｃ−ＥＣＭＨによるＥＣＭＨ保持の研究
ヒドロゲルの保持時間を決定するために、ＤＳＳによる疾患誘発後に、ラットにＦＩＴＣ標識物または１４Ｃ標識物を投与した。１８匹のラットをＥＣＭＨ製剤（ＦＩＴＣ−ＥＣＭＨおよび１４Ｃ−ＥＣＭＨ）に基づいて２群に分割し、浣腸後２時間、１２時間、および２４時間の時点で屠殺した（１ＥＣＭＨ製剤あたり１時点あたりｎ＝３）。蛍光イメージングによって管腔内容物を見ることができるように、ＦＩＴＣ−ＥＣＭＨ処置ラットからの外植結腸を光学的に透明になるように加工した。ＦＩＴＣコンジュゲートの光退色を防止するために、屠殺後直ちに、すべての試料を遮光した。結腸の光学的透明化は、Ｄｅｎｔの固定液（Ｄｅｎｔ’ｓ  ｆｉｘａｔｉｖｅ）（１：４ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：アセトン）中で２時間インキュベートすることによって開始した。次に、結腸をＤｅｎｔの漂白剤（Ｄｅｎｔ’ｓ  ｂｌｅａｃｈ）（１：４：１  ＤＭＳＯ：アセトン：Ｈ２Ｏ２）中で１時間、透過処理および漂白した。次に、光学的に透明な結腸を（ゲルイメージャー）で撮像した。露出時間は、ＦＩＴＣ−ＥＣＭＨの対照試料に設定し、その後の画像のすべてで一定に保った。
【０１２６】
１４Ｃ測定の場合は、各ラットの結腸全体を個別に液体窒素中で瞬間凍結し、ホモジナイズした。組織を乳鉢と乳棒で摩砕し、均一になるまで混合した。約４０ｍｇの組織試料を加速器質量分析法（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＡＭＳ）によって分析した。無処置対照を使って、元々の組織におけるバックグラウンド１４Ｃレベルを差し引いた。
【０１２７】
結腸組織の外植およびスコア化
動物を既述のとおり決められた時点で屠殺した。米国獣医師会（ＡＶＭＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に従ってＣＯ２吸入とそれに続く頸椎脱臼によって安楽死を達成した。安楽死に続いて正中切開によって結腸を切除した。直腸から盲腸に及ぶ連続した結腸セグメントを収集し、写真撮影した。疾患活動度の指標として結腸の長さを測定した。結腸を縦方向に開き、肉眼で損傷を評価した。スコアは、処置群を伏せた研究者によって決定された。
【０１２８】
長さ９ｃｍの結腸の遠位領域を三等分し、縦方向に開いた。次に、組織学的検査、体外器官培養およびミエロペルオキシダーゼ測定のために検体を収集した。切片をパラフィン包埋し、遠位結腸から近位結腸まで、２〜８ｃｍから得た切片（５μｍ）を、代表的な組織学的スコア化のために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。遠位部分および近位部分を２つのスライド上に分離し、組織学的スコア化を、６人の盲検化した研究者によって行った。
【０１２９】
ＴＲＩＴＣ−デキストラン透過性アッセイ
ＴＲＩＴＣ−デキストラン（分子量４．４ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ）の腸投与によって腸透過性を評価した。屠殺の４時間前にラットにＴＲＩＴＣ−デキストラン（１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）を投与した。屠殺時に心臓接合部（ｃａｒｄｉａｃ  ｊｕｎｃｔｕｒｅ）から全血を得て、血清チューブに収集した。ＴＲＩＴＣ−デキストラン測定は、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、三つ一組にして行い、ＴＲＩＴＣ−デキストランの段階希釈液を標準曲線として使用した。
【０１３０】
器官培養
各実験動物および対照動物の結腸から７日目および１４日目に既述のとおり３ｍｍ皮膚パンチを使って全層生検を得た。組織検体を３７℃、５％ＣＯ２（５％ＣＯ−２）、９５％Ｏ２で、４８時間培養した。上清を収穫し、ＴＮＦ−αアッセイおよびＰＧＥ２  ＥＬＩＳＡアッセイのために、−８０℃で保存した。
【０１３１】
ＬＰＭＣの単離および培養
上述のように飲料水中の５％ＤＳＳによる７日間の大腸炎誘発に続いて、ラットからＬＰＭＣを単離した。結腸を外植し、腸管膜脂肪組織を取り除き、パイエル板の領域を切り取った。次に結腸を縦方向に半分に分割し、細かく切り刻み、粘膜固有層解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造者の説明書に従って使用することにより、単一細胞懸濁液に解離させた。次にその懸濁液を４０／７０％パーコール勾配に沿って分離させた。細胞を、１０％ＦＢＳならびに１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、２×１０５細胞／ウェルで、５００μｇ／ｍＬ  ＥＣＭＨおよび対照緩衝液の添加ありまたはなしで、９６ウェルプレートに加えた。４８時間インキュベートした後、上清を収集し、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２に関するＥＬＩＳＡアッセイを行うまで、−８０℃で保存した。
【０１３２】
腸上皮細胞（ＩＥＣ）培養
インビトロ障壁機能アッセイのために、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中で、ＩＥＣ（Ｃａｃｏ−２、継代第２４〜２８代、ＡＴＣＣ）を約８０％コンフルエンスまで培養した。迅速分化系（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ＨＴＳ  Ｃａｃｏ−２アッセイ）を製造者の説明書に従って使用することにより、ＥＣＭＨに対するＩＥＣの機能的応答を評価した。コンフルエントな分化細胞単層を１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳで２時間攻撃してから、ＥＣＭＨで４８時間処置した。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）により、上皮カドヘリン（Ｅ−カドヘリン）細胞付着タンパク質の存在下で、ＩＥＣの機能的応答を測定した。
【０１３３】
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定
Ｃａｃｏ−２単層のＴＥＥＲは、上皮電圧抵抗計（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖｏｌｔｏｈｍｍｅｔｅｒ）（ＥＶＯＭ２、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で、定型的に測定した。Ｃａｃｏ−２細胞を播種する前に支持フィルターおよび緩衝媒体の電気抵抗を測定し、単層を使って決定された総電気抵抗から差し引くことで、単層のＴＥＥＲを算出した。研究には３００Ω×ｃｍ２を上回るＴＥＥＲを持つ分化単層だけを使用した。
【０１３４】
免疫標識
ＥＣＭＨ処置に続くマクロファージの応答を決定するために、パラフィン包埋組織切片を、Ｍ１様およびＭ２様マクロファージ表現型の指標ＴＮＦαおよびＣＤ２０６について免疫標識した。キシレンを使って組織切片を脱パラフィンし、段階的エタノール系列を使って再水和した。０．００１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）を使って９５℃で２０分間、熱による抗原回復を行った。組織切片をトリス緩衝食塩Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｔｗｅｅｎ）に１５分間付した後、ブロッキング緩衝液（２％ウマ血清／１％ウシ血清アルブミン／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０／０．０５％ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００）中で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体を、湿潤チャンバ中、４℃で１６時間、スライドに加えた。次にスライドをＴＢＳで３回洗浄してから、湿潤チャンバ中、室温で、二次抗体を１時間添加した。核を可視化するためにスライドを４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。使用した一次抗体は、汎マクロファージマーカーとして１：１５０希釈のマウス抗ラットＣＤ６８（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ノースカロライナ州ローリー）、Ｍ１様マーカーとして１：２００希釈のＴＮＦαに対するウサギポリクローナル（Ａｂｃａｍ）、および１：１００希釈のヤギポリクローナルＣＤ２０６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンタクルズ）である。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒロバ抗マウス５９４（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒロバ抗ヤギ４８８（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒロバ抗ウサギ５４６（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。一次抗体はいずれもラットエピトープと交差反応することを確認した。１組織切片あたり５つの無作為な視野で組織切片を撮像した。マーカーの定量は、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ画像解析ソフトウェアを使って開発したカスタム画像解析アルゴリズムを使って達成した。
【０１３５】
統計解析
標本サイズは、パイロット試験データと以前に公表された関連研究とを併用した検出力分析に基づいて決定した。すべての動物に番号を付け、無作為に群に割り当てた。実験群分けは、スコア化を担うどの研究者にも、伏せておいた。定量的アウトカムを一元配置または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）および事後チューキー検定で比較することで、群間の差を決定した。統計的解析はいずれもＳＰＳＳ統計解析ソフトウェア（ＳＰＳＳ、ＩＢＭ）を使って行った。データは、別段の言明がある場合を除き、平均±標準誤差として報告する。
【０１３６】
結果
ＥＣＭＨは結腸組織に対して付着性である
ＥＣＭＨは逆熱ゲル化（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｇｅｌａｔｉｏｎ）というユニークな特性を有し、ヒドロゲル特性は、材料の特徴に依存する。浣腸は、軽度〜中等度大腸炎では、炎症を起こした結腸への標的送達の基本的形式として、日常的に使用されている。ＥＣＭＨの治療効力は、結腸壁に付着して炎症を起こした細胞と連係するというその能力に依存している。付着試験の結果は、ＥＣＭＨが粘膜付着性であり、健常結腸で試験すると、付着力は用量依存的に増加することを示している（図１２Ａ）。この研究に使用した８ｍｇ／ｍＬ  ＥＣＭＨという用量は、大腸炎ラット結腸において、健常組織と比較して等価な付着強さを維持する（図１２Ｂ）。粘膜付着はすべての熱可逆性ゲルの特性ではない。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（２０％；Ｓｉｇｍａ）は、陰性対照より大きな付着強さを示さなかったからである（データ省略）。浣腸によって大腸炎ラットに送達した場合、ＥＣＭＨの滞留時間は２４時間を上回っている。浣腸剤投与の２時間後に約５０％の１４Ｃ−ＥＣＭＨが残っており、初期ＥＣＭＨ浣腸剤の１０％前後が２４時間後に残っている（図１２Ｃ）。これらの結果はＦＩＴＣ−ＥＣＭＨの可視化によって確証された（図１２Ｄ）。総合すると、これらの知見は、ＥＣＭＨ材料の特性は液体としての注入を可能にし、その後のゲル化によって処置が少なくとも２４時間は局在化したままであることを保証することを明示している。上記の知見によれば、毎日の浣腸処置を使ってＥＣＭＨの治療効力を測定することができる。
【０１３７】
ＥＣＭＨ処置は疾患状態を軽減する
ＤＳＳ実験モデルは、広く受け入れられた、上皮障壁欠損を伴うＵＣ様の自然治癒疾患性大腸炎表現型である。大腸炎の臨床徴候（例えば体重減少、便血、および便硬度）は、飲料水中の５％ＤＳＳへの３日間の曝露後に現れた。また、６日後にはそれぞれのピークに達する（図４）。ＥＣＭＨ処置はＵＣの臨床症状を減じる。動物は、対照と比較して、体重減少が少なくなり（１日目および３日目）、便中の血液が減った（３日目および５日目）。０日目に存在した結腸の短縮（図４Ｄ）は、すべての群で、７日目および１４日目までにはもはや明白でなくなる（図８Ｄ）。ＥＣＭＨ処置は、７日目に、対照と比較して結腸の肉眼解剖学的スコアの減少をもたらす（図８Ｅ）。組織形態学的解析も、代表的画像において明白であるとおり、ＥＣＭＨが本モデルにおいて治療的であることを示した（図６）。ＥＣＭＨ処置は、７日時点および１４日時点で、遠位組織切片でも近位組織切片でも、炎症の徴候の減少および潰瘍形成の程度の低下をもたらした（図５）。これらのデータは、ＥＣＭＨ浣腸注入レジメンがＵＣのモデルにおいて疾患の臨床的徴候および組織学的徴候を効果的に低減することを示している。
【０１３８】
ＥＣＭＨは上皮障壁機能を回復させる
結腸における上皮障壁は疾患の進行に重要な役割を果たしうる。腸障壁の欠陥および透過性の増加は、無傷の免疫系が存在する場合でさえ、炎症性腸疾患につながりうる。ＴＲＩＴＣ−デキストラン透過性アッセイの結果は、ＥＣＭＨ処置動物の障壁機能が７日時点で健常動物と類似しており、一方、対照における結腸上皮障壁は健常対照と比較して損なわれたままであったことを示した（図１３Ａ）。ＩＥＣの分化ＬＰＳ損傷単層はＥＣＭＨ処置に応答して、ＴＥＥＲの読みによって示される機能回復を示す（図１３Ｂ）。障壁機能の増加は、腸における最も重要な細胞間接着タンパク質の一つであるＥ−カドヘリンの存在量の増加に対応する。ＥＣＭＨ処置は、陰性対照と比較してＥ−カドヘリン陽性細胞の約５０％増加につながる（図１３Ｃ〜Ｄ）。これらのデータは、ＥＣＭＨが上皮障壁機能の機能的改良を助長することと、上皮細胞損傷を制限することによってまたは粘膜強度を能動的に回復することによって、ＥＣＭＨが治療的に作用できることとを示している。
【０１３９】
炎症におけるＥＣＭＨの役割
炎症はＵＣの病理発生過程の一部でありうるから、効果的な療法は炎症応答を媒介する。炎症に対するＥＣＭＨの効果を評価するために、ＩＢＤの炎症性メディエーター（すなわちＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２）を使用した。大腸炎ラットから単離されたＬＰＭＣをプレーティングし、ＥＣＭＨに曝露した。ＥＣＭＨ処置はＬＰＭＣによるＴＮＦ−α生産の本質的低減をもたらしたが（図１１Ａ）、ＰＧＥ２生産には影響しなかった（図１１Ｂ）。しかしＥＣＭＨまたは対照の１週間浣腸レジメン後にラットから収集した器官培養は、分泌されるＰＧＥ２が、ＥＣＭＨ処置動物では健常対照と類似しており、一方、ビヒクル対照は、粘膜ＰＧＥ２のレベルが有意に上昇していることを示した（図１１Ｃ）。ＴＮＦ−αの分泌レベルは、調べた時点で実験条件とは無関係に、器官培養では検出限界未満（ｂｅｌｏｗ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）だった。
【０１４０】
ＴＮＦ−αまたはＣＤ２０６を同時発現する結腸中のＣＤ６８＋マクロファージの数を定量することによって、マクロファージ表現型に対するＥＣＭＨの効果を評価した（図１０の代表的画像参照）。興味深いことに、ＣＤ６８＋、ＣＤ２０６＋、およびＴＮＦ−α＋細胞の数は、すべての処置群で同じであったが（図９）、ＥＣＭＨ処置は、７日目にＣＤ６８＋／ＴＮＦ−α＋炎症性マクロファージの数の低減をもたらした（図８）。ＥＣＭＨは全体的なＴＮＦ−α＋細胞の量には影響を及ぼさなかったが、ＣＤ６８＋／ＴＮＦ−α＋細胞の数は低減させたので、ＥＣＭＨは、結腸組織中に存在する炎症性マクロファージの数を低減することによってマクロファージ応答を調整する直接的な役割を有しうる。
【０１４１】
一定の好ましい実施形態に関して本発明を詳しく説明したが、添付の特許請求の範囲に記載され規定される本発明の範囲および要旨内で、変形および変更実施形態が存在する。
【図１】
2019513038.tif 000003
【図２】
2019513038.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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