(57)【要約】本発明は、様々な免疫学的および非免疫学的な疾患および症状を処置するのに有用な新規免疫調節性マクロファージ細胞に関する。細胞は、他の細胞とは区別される特異なマーカーおよび活性パターンによって特徴付けられる。本発明はさらに、血液単球から免疫調節性マクロファージ細胞を作製するための方法を提供する。さらなる他の態様では、本発明は、本発明の免疫調節性マクロファージ細胞またはその細胞レベル以下の画分を含む医薬組成物に関する。本発明の免疫調節性マクロファージ細胞の細胞レベル以下の画分を作製するための方法も提供する。【選択図】  図１０Ａ
2019508067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象の血液試料からＣＤ１４陽性単球を単離することと；
（ｂ）該単球を気体透過性バッグ内で、（ｉ）Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦならびに（ｉｉ）ＣＤ１６リガンドを含有する培地中で培養することと；
（ｃ）該細胞をＩＦＮ−γと接触させることと；
（ｄ）該培地から該免疫調節性マクロファージ細胞を得ることと
を含む、免疫調節性マクロファージ細胞を作製するための方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）において該培地がヒト血清、例えばヒトＡＢ血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において該Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）において該単球がＩＦＮ−γ刺激に先立って少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間培養される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該気体透過性バッグがプラスチック、好ましくはポリオレフィンで作られている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）において該ＩＦＮ−γの濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法によって得られる免疫調節性マクロファージ細胞。
【請求項８】
以下のマーカー：ＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３のうちの１つ以上を発現しない、免疫調節性マクロファージ細胞。
【請求項９】
マーカーＣＤ１０３、ＣＤ１０およびＣｌｅｃ−９ａのうちの少なくとも１つを発現する、免疫調節性マクロファージ細胞。
【請求項１０】
マーカーＣＤ８５ｈおよびＣＤ２５８のうちの少なくとも１つをさらに発現する、請求項８または９に記載の免疫調節性マクロファージ細胞。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載の該免疫調節性マクロファージ細胞またはその細胞レベル以下の画分を含む医薬組成物。
【請求項１２】
移植拒絶反応を抑制しかつ／または移植物を受けている対象における移植生存期間を延ばす方法において使用するための、請求項７〜１０のいずれかに記載の免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記移植物が同種異系移植物である、請求項１２のいずれかに記載の方法において使用するための免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または医薬組成物。
【請求項１４】
生着または調節性Ｔ細胞に基づく医薬品の効果を促進させるかまたは持続させる方法において使用するための、請求項７〜１０のいずれかに記載の免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
自己免疫疾患、炎症性疾患または過敏性反応を処置または防止する方法において使用するための、請求項７〜１０のいずれかに記載の免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患が、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎およびその他の全身性自己免疫症状；関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチおよびその他の炎症性関節炎；潰瘍性大腸炎、クローン病およびその他の炎症性腸疾患；自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変およびその他の自己免疫性肝疾患；皮膚小血管性血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎、川崎病、および自己免疫を病因とするその他の大型、中型または小型の血管炎；多発性硬化症（ＭＳ）および神経免疫学的障害；Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺機能障害、自己免疫性下垂体機能障害およびその他の自己免疫性内分泌学的障害；溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、および血液および骨髄のその他の自己免疫障害；乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡およびその他の自己免疫性皮膚症状からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法において使用するための免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または医薬組成物。
【請求項１７】
前記炎症性疾患が、動脈閉塞性疾患、例えば末梢動脈閉塞性疾患（ｐＡＯＤ）、重症虚血肢、動脈硬化症、脳梗塞、心筋梗塞、腎梗塞、腸梗塞、狭心症および、動脈の閉塞または狭窄によって引き起こされるその他の症状；心臓シンドロームＸとしても知られる微小血管狭心症；ＩＩ型糖尿病および肥満関連メタボリックシンドロームを含めた全身的に代謝障害に関連する炎症；湿疹を含めた皮膚疾患からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法において使用するための免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または医薬組成物。
【請求項１８】
前記過敏性反応が、喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎、血管性浮腫、薬物過敏症および肥満細胞症の群から選択される、請求項１５に記載の方法において使用するための免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または医薬組成物。
【請求項１９】
組織再構築、組織再生、血管新生、血管発生、または線維症の防止／制限に関与することによって組織修復プロセスを促進する方法において使用するための、請求項７〜１０のいずれかに記載の免疫調節性マクロファージ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
（ａ）ＣＤ３ｅマイクロビーズを使用して対象のＴ細胞を得ることと；
（ｂ）該Ｔ細胞を、請求項１４〜１８のいずれかに記載の免疫調節性マクロファージ細胞またはその細胞レベル以下の画分と共に培養することと；
（ｃ）培地から該免疫調節性Ｔ細胞を得ることと
を含む、免疫調節性Ｔ細胞を作製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な免疫学的および非免疫学的な疾患および症状を処置するのに有用な新規免疫調節性マクロファージ細胞に関する。細胞は、他の細胞とは区別される特異なマーカーおよび活性パターンによって特徴付けられる。本発明はさらに、血液単球から免疫調節性マクロファージ細胞を作製するための方法を提供する。さらなる他の態様では、本発明は、本発明の免疫調節性マクロファージ細胞またはその細胞レベル以下の画分を含む医薬組成物に関する。本発明の免疫調節性マクロファージ細胞の細胞レベル以下の画分を作製するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
レシピエントに寛容性を確立する手段として寛容ドナーから不寛容レシピエントへ免疫調節細胞を移すことは、実験的免疫学において周知の技術であるが、その臨床的応用は現在になってようやく真剣な注目を集めている［１］。現在のところ、調節性Ｔ細胞［２］、寛容原性樹状細胞［３］および調節性マクロファージ［４］を含めたいくつかの免疫調節細胞種が前臨床開発の時点に到達しつつあり、そのことは、免疫抑制剤としてそれらを初期治験で調査するのを可能にするであろう。
【０００３】
Ｔ細胞およびＢ細胞によって媒介される自己免疫疾患、慢性炎症性障害、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応を含めた幅広い免疫学的症状が、細胞に基づく免疫調節療法による処置を受けることができる可能性がある。これらの症状では、細胞に基づく免疫調節療法は、全身的な免疫抑制療法または抗炎症療法の必要性を低減または除去さえしてそれによって患者をその付随合併症から救う可能性を有する。調節細胞によって支援される類の免疫寛容は優勢かつ自己持続性であるため、細胞に基づく免疫調節療法が、それ以外ならば長期の全身的な免疫抑制療法または抗炎症療法を必要とするであろう疾患において、治療選択肢を提供する、という可能性が存在する。
【０００４】
移植において補助的免疫抑制剤としての使用のためにとりわけ有望な１つの候補細胞種は、免疫調節性マクロファージ（本明細書中および文献中では「Ｍｒｅｇ」と呼ぶ）である。Ｍｒｅｇ細胞は、マクロファージ分化の特有の状態を反映しており、その堅牢な表現型および強力なＴ細胞抑制剤機能によって他の活性状態にあるマクロファージとは区別される［５］。ヒトＭｒｅｇは、試験管内でマイトジェン刺激によるＴ細胞増殖を強力に抑制し、それは、インターフェロン（ＩＦＮ）γ誘導性インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ活性と接触依存的な活性化Ｔ細胞除去とに起因するものであり得る。加えて、Ｍｒｅｇは、活性化誘導調節性Ｔ細胞の発達を促し、代わってそれはエフェクターＴ細胞の増殖を抑制しかつ樹状細胞の成熟を抑制する。したがって、Ｍｒｅｇをレシピエントに投与する場合には免疫調節のフィードフォワードループが開始されて外来移植物の長期の免疫許容性または免疫病態の防止をもたらすものと仮定される。一連の事例研究および２つの初期治験において、Ｍｒｅｇ含有細胞調合薬が補助的免疫抑制処置の一形態として合計１９名の腎移植レシピエントに投与された［５］〜［９］。これらの試験的研究は、固形臓器移植のためのこの技術の妥当性を明確に実証している。
【０００５】
別の２名の生体腎移植レシピエントは現在、約８．０×１０6細胞／ｋｇのより純粋なドナー由来Ｍｒｅｇで処置されている［５］。これら２名の患者は今や移植から６年超が経っており、彼らの単独の維持用免疫抑制としての低用量タクロリムス単剤療法において腎機能は安定している。生体腎移植におけるＭｒｅｇ療法のさらなる治験は今や、ＯＮＥ  Ｓｔｕｄｙ（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０２０８５６２９）の枠組み内で規制上の承認を得ている。この治験は、外科手術の７日前における５００ｍｇ／日のミコフェノール酸モフェチルによる援護下で用量２．５×１０6〜７．５×１０6個／ｋｇ体重のドナー由来Ｍｒｅｇ細胞によって１６名の患者を処置することを目的としている。
【０００６】
免疫調節細胞の分野において近年偉大な進歩が遂げられたにもかかわらず、治療目的のため、例えばレシピエントにおける外来移植物の免疫許容性を誘導するために使用することができる調節細胞、およびこれらの細胞を最も効率的な方法で作製する方法は必要とされ続けている。特に、通常患者に対する高毒性に関連した一般的に使用される免疫抑制医薬を減らすのを可能にする、細胞に基づく療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、以前に記載されたＭｒｅｇとは著しく異なる新規な類のＭｒｅｇ細胞を提供する。Ｍｒｅｇ細胞を製造するための改変された方法が新規な類のＭｒｅｇ細胞を生じさせることが予期せずして見出された。具体的には、本発明者らは、Ｍｒｅｇ細胞を作製するために使用する単球細胞を培養フラスコの代わりに気体透過性バッグ内で培養した場合、Ｍｒｅｇ細胞を細胞に基づく療法の手法に大いに適したものにする免疫調節特性を働かせる特有の表現型のＭｒｅｇ細胞が得られることを見出した。これらの細胞は、本明細書において、これらを既知のＭｒｅｇと区別するために「Ｍｒｅｇ−ｂｃ」と称される。
【０００８】
かくして、第１の態様において本発明は、対象の血液試料からの単球を気体透過性バッグ内でＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１６リガンド（例えば免疫グロブリン）およびＩＦＮ−γの存在下で培養することを含む、新規な類のマクロファージを作製する方法に関する。
【０００９】
第２の態様において本発明は、本発明の第１の態様において言及した方法によって得ることができる新規な類のＭｒｅｇ細胞、すなわちＭｒｅｇ−ｂｃ細胞に関する。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、従来技術ではみられなかった特有の表現型を有する。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、この細胞種に特有でありかつ従来技術では記述がなかった有用な治療特性をもたらす生物学的活動を媒介する。
【００１０】
第３の態様において本発明は、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞または上記細胞の細胞レベル以下の画分を含む医薬組成物に関する。本発明の新しい細胞種を含有する医薬組成物は、必要に応じてさらなる活性成分または賦形剤を含有していてもよい。
【００１１】
第４の態様において本発明は、治療目的のため、とりわけ有害な免疫学的反応の抑制のための、本発明の第２の態様に係るにＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る医薬組成物の使用に関する。
【００１２】
第５の態様において本発明は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を適切な条件下で分解することによって本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞の細胞レベル以下の画分を作製するための方法に関する。
【００１３】
最後に、第６の態様において本発明は、対象の血液試料からのＴ細胞を本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞またはその細胞レベル以下の画分と共に培養することによって免疫調節性Ｔ細胞を作製するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＦｃγＲＩＩＩライゲーションがＭｒｅｇの発達を促すことを示す。（Ａ）１０％のＨＡＢＳを補充した培地中で発生したヒトＭｒｅｇは特徴的な広がった形態を呈するが、１０％のＦＣＳを含有する培地中でそれ以外を同一にした条件下で成長させたＩＦＮ−γＭΦは、一様でない長細い形状を獲得する（バー＝５０μｍ）。（ＢおよびＣ）クロロホルムによるＨＡＢＳの処理（Ｃｈｌ−ＨＡＢＳ）の後、そのＭｒｅｇ誘導能は失われず、Ｍｒｅｇ発達に寄与するヒト血清の非脂質成分の存在を示唆していた（ｎ＝６）。（Ｄ）Ｉｇ除去ヒト血清中での単球の培養は、１０％のＨＡＢＳ中で成長させたＭｒｅｇに比べてＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡの発現を減少させた（ｎ＝４）。血清から精製したＩｇかＩＶＩＧかのどちらかを添加することでＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡの発現が回復した。（ＤおよびＥ）１０％のＦＣＳ中で培養したマクロファージによるＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡ発現は、精製ＩｇおよびＩＶＩｇのどちらによってもある程度誘導することができた。（Ｈ）ＦｃγＲＩＩＩに対する抗体は、Ｍｒｅｇ培養条件下で成長させたマクロファージによるＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡのＨＡＢＳ誘導性発現を防止するのに最も効果的であった（ｎ＝５）。（Ｇ）ＦｃγＲＩＩＩに対する遮断抗体の添加は、単球がＭｒｅｇ形態を獲得するのを防止したが、他のＦｃγ受容体の場合はそうならなかった（バー＝５０μｍ）。（Ｈ）ｓｉＲＮＡを使用したＦｃγＲＩＩＩ発現のサイレンシングは、血清免疫グロブリンによるＭｒｅｇ表現型の誘導におけるＦｃγＲＩＩＩの役割を裏付けた。全ての事例において、棒グラフは平均±ＳＥＭを表す。
【図２】図２は、フラスコ内で培養したＭｒｅｇとＭｒｅｇ−ｂｃとでの表現型の比較を示す。（Ａ）フラスコ内で培養したＭｒｅｇ（赤線）およびＭｒｅｇ−ｂｃ（青線）は、Ｍｒｅｇを特徴付ける細胞表面マーカー群ＣＤ１４-/low  ＣＤ１６-/low  ＣＤ８０-/low  ＣＤ８６+  ＣＤ８５ｈ+  ＣＤ２５８+を表した。アイソタイプ対照信号を灰色で示す。（Ｂ）ある割合のＭｒｅｇ−ｂｃは、抗原ＣＤ１０、Ｃｌｅｃ９ａおよびＣＤ１０３を発現したが、フラスコ内で培養したＭｒｅｇではそうならなかった。（Ｃ）フラスコ内で培養したＭｒｅｇは、高レベルの抗原ＣＤ２０９、シンデカン−３およびＣＤ３８を発現したが、Ｍｒｅｇ−ｂｃではそうならなかった。
【図３】図３は、デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲファミリー）メンバー９（ＤＨＲＳ９）発現が独特にＭｒｅｇ表現型を同定することを示す。（Ａ）ＡＳＯＴ１  ｍＡｂはＭｒｅｇによって発現される抗原を識別したが、他のマクロファージタイプではそうはならなかった。（Ｂ）約３５ｋＤの抗原がＡＳＯＴ１によって特異的に沈降した。沈降したこの抗原は、質量分析によってＤＨＲＳ９として同定された。（Ｃ）ＭｒｅｇではＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡの強い発現が検出されたが、他のマクロファージタイプではそうならなかった（ｎ＝６）。（Ｄ）ＡＳＯＴ１は、抗ＤＨＲＳ９ウサギｐＡｂおよびマウスｍＡｂによっても識別された抗原を沈降させ、ＡＳＯＴ１がＤＨＲＳ９を識別することが裏付けられた。（Ｅ）ウサギ抗ＤＨＲＳ９  ｐＡｂを使用するイムノブロットは、タンパク質レベルでのＤＨＲＳ９発現によってＭｒｅｇが他のマクロファージタイプとは区別されることを実証した。
【図４】図４は、ＭｒｅｇによるＩＤＯとアルギナーゼ−１との共発現を示す。（Ａ）Ｍｒｅｇ、ＩＦＮ−γ刺激なしで生成させたＭｒｅｇ、およびリポ多糖処理されたＭｒｅｇは、比較用のマクロファージタイプと比べて著しくより高いレベルのＡＲＧ１  ｍＲＮＡを発現した（ｎ＝３；平均±ＳＥＭ）。（Ｂ）フローサイトメトリー染色は、個々のＭｒｅｇ細胞によるＩＤＯおよびＡｒｇ１の共発現を明らかにする。
【図５】図５は、Ｍｒｅｇ−ｂｃと共に培養されたＴ細胞がＴ細胞増殖を阻害することを示す。同種異系ＣＤ３+Ｔ細胞におけるＭｒｅｇ−ｂｃへの曝露の機能的重大性を共培養実験で調査した。（Ａ）２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘおよび２５ｎｇ／ｍｌのｒｈＭ−ＣＳＦを補充したＸ−ｖｉｖｏ１０培地中で５日間、末梢血ＣＤ１４+単球から発生させたヒトＭｒｅｇ−ｂｃと、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離した同種異系ＣＤ３+Ｔ細胞とを１：１の比で共培養した。あるいは、Ｍｒｅｇ−ｂｃと、ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞負単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）マイクロビーズを使用して単離された同種異系ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞とを１：１の比で共培養し、次にそれをＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共にインキュベートした。５日間の共培養の後、フローサイトメトリーによる表現型決定のためにＴ細胞を再単離した。細胞表面および細胞内の染色のための従来の方法、例えばＦｏｘｐ３固定および透過用緩衝剤キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、共培養したＴ細胞をＣＤ４+  ＣＤ２５+  ＴＩＧＩＴ+  ＦｏｘＰ３+  Ｔｒｅｇについて濃縮する。あるいは、再単離したＴ細胞を、抗ＣＤ３によって刺激されるＣＦＳＥ希釈に基づく同種異系Ｔ細胞増殖アッセイにおいてサプレッサー細胞として使用した。（Ｂ）プレートに結合した抗ＣＤ３によって刺激される、ＣＦＳＥ標識された応答ＣＤ４+  Ｔ細胞の増殖は、単独で５日間培養されたＴ細胞による場合よりも、同種異系Ｍｒｅｇ共培養Ｔ細胞による場合の方が、より大きい度合いで阻害された（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ）。（Ｃ）同種異系Ｍｒｅｇ−ｂｃと共に５日間培養したＣＤ３+Ｔ細胞をＣＤ２５+  ＦｏｘＰ３+  Ｔｒｅｇについて濃縮したが、それは、αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズを使用して５日間刺激されたＣＤ２５+  ＦｏｘＰ３low  ポリクローナル活性化Ｔ細胞とは容易に区別がついた（データはｎ＝４ドナー対を表す）。
【図６】図６は、Ｍｒｅｇが特有の形態および細胞表面表現型を呈することを示す。（Ａ）培養されているＭｒｅｇは独特の形態を獲得する（バー＝５０μｍ）。（Ｂ）Ｍｒｅｇの透過型電子顕微鏡検査は、培養面への密着、十分豊富なクロマチンを伴った活動的な核、数多くの細胞プロセス、および脂質封入体を示す。（Ｃ）Ｍｒｅｇは、培養中でのそれらの特徴的形態によって他のマクロファージ分極状態とは確実に区別される。（Ｄ）Ｍｒｅｇは、細胞表面マーカー群：ＣＤ１４-/low  ＣＤ１６-  ＴＬＲ２-/lowおよびＣＤ１６３-によって比較マクロファージのパネルとは区別される（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ）。
【図７】図７は、マイクロアレイ分析によってヒトＭｒｅｇのマーカーとして同定されたＣＤ８５ｈ（ＬＩＬＲＡ２；ＩＬＴｌ）およびＣＤ２５８（ＴＮＦＳＦ１４；ＬＩＧＨＴ）の発現を示し、フローサイトメトリーで実証されるとおりそれらはＭｒｅｇによって細胞表面に発現するが、ＩＦＮ−γマクロファージによって発現することはない。
【図８】図８は、Ｍｒｅｇ−ｂｃが生体内でＩＬ−１０産生性ＴＩＧＩＴ＋  Ｔｒｅｇを生み出すことを示す。（Ａ）免疫不全（ＮＳＧ）マウスモデルを使用して、ヒトＭｒｅｇ−ｂｃ細胞が生体内でＴＩＧＩＴ＋  ｉＴｒｅｇを誘導する能力を調べた。ＮＳＧマウスを、（ｉ）５×１０6個のヒトナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞単独での静注かまたは、（ｉｉ）５×１０6個のヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の静注に加えて行う別個の５×１０6個の同種異系ヒトＭｒｅｇの静注かのどちらかに供した。５日後、ヒトＩＬ−１０の血清レベルおよび脾臓ヒトＴＩＧＩＴ＋  Ｔｒｅｇ頻度を評価した（ｎ＝１２ドナー対）。（Ｂ）Ｍｒｅｇ処置されたレシピエントは、未処置対照動物に比べてより高い脾臓Ｔｒｅｇ頻度およびいくぶんより高いＴＩＧＩＴ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞頻度を呈した。（Ｃ）Ｍｒｅｇ処置レシピエントでは、血清ヒトＩＬ−１０レベルが対照よりも著しく高かった。
【図９】図９は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞がモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）による刺激を受けると血管形成因子ＶＥＧＦ−Ａを産生するか否かを試験するための、実験の段取りを示す。
【図１０】図１０は、リポ多糖（ＬＰＳ）による刺激時または高張培養条件下での、Ｍｒｅｇによる血管内皮増殖因子ファミリーメンバーの発現を示す。（Ａ）ＬＰＳ刺激はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃの発現を誘発したが、ＶＥＧＦ−Ｄの発現は誘発せず；それにもかかわらずＬＰＳ刺激は、強力な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの発現も誘導した。（Ｂ）Ｍｒｅｇは、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄを分泌することではなくＶＥＧＦ−Ｃを分泌することによってＮａＣｌ濃度の上昇に応答し；極めて重要なことに、高張はＴＮＦ−α発現を誘発しなかった。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明によれば、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞はヒトＣＤ１４＋血液単球から誘導される。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の特徴的な生物学的特性を引き出すためには、単球を成長因子、サイトカインおよび受容体リガンドの特定の組み合わせで処理する。本発明の方法によって得られた細胞は、それらと血液単球、他の類の単球由来マクロファージ、単球由来樹状細胞、および従来技術において記載されているその他の抑制性骨髄単球細胞産物とを区別させる、特有の表現型によって特徴付けられる。
【００１６】
したがって、第１の態様において本発明は、新規な類の免疫調節性マクロファージ細胞を作製するための方法であって、
（ａ）対象の血液試料からＣＤ１４陽性単球を単離することと；
（ｂ）単球を気体透過性バッグ内で、（ｉ）Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦならびに（ｉｉ）ＣＤ１６のリガンドを含有する培地中で培養することと；
（ｃ）細胞をＩＦＮ−γと接触させることと；
（ｄ）培地から免疫調節性マクロファージ細胞を得ることと
を含む方法に関する。
【００１７】
本発明の方法は、出発物質として血液単球を使用する。ヒト血液単球からＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を生み出すために本発明の方法を用いることが好ましいであろうものの、本発明は、ヒト由来の細胞の分化に限定されない。事実、本発明は他の類の非ヒト細胞、とりわけ脊椎動物細胞、例えば非ヒト霊長類またはブタの細胞にも適用可能である。このように、本発明は、異種移植片移植医薬の分野に重要な寄与をもたらす。
【００１８】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、ヒトドナーのＣＤ１４陽性単球をＭｒｅｇ−ｂｃに分化させるために用いられる。本発明の方法の出発物質としての役割を果たす単球は、ヒトドナーの末梢血から得られる。ドナーは、健常な対象または、１つ以上の疾患に罹患している患者であり得る。一実施形態において、単球ドナーは、意図される分化Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞のレシピエントである（自家手法）。別の実施形態では、単球ドナーは、意図される分化Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞のレシピエントとは別個の人物である（同種異系手法）。後者の場合、ドナーおよびレシピエントは遺伝的な関連があってもなくてもよい。別の実施形態では、単球ドナーは、意図される分化Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞のレシピエントとは別個の人物であるが、同レシピエントへ移植される他の細胞、組織または臓器のドナーでもある。ドナーとレシピエントとの好ましい関係性は、臨床用途に依存する。自家Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の使用は、特定の有害反応を回避するために役立ち得る。したがって、再生療法または抗炎症療法の事例においては自家Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を使用することが好ましい。移植の場面においては、ドナー由来のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を免疫抑制療法として使用することが好ましい、というのも、ドナー抗原発現細胞はレシピエント由来細胞よりも効果的であるからである［１１］。
【００１９】
末梢血からの単核球の濃縮のためには当該技術分野において様々な方法が知られており、これらの方法の各々を本発明との関連において使用することができる。例えば、静脈穿刺によって得た血液を抗凝血剤で処理することができ、続いて分離用媒体、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓを使用することによって分離することができる。このためにはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ溶液上に抗凝血剤処理済み血液試料を積層して遠心分離し、それによって種々の細胞種を含有する層が形成されることになる。底層は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ試薬によって凝集および沈降した赤血球を含有する。赤血球層のすぐ上の層は、大部分において、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ層を通って移動した顆粒球を含有する。単球およびリンパ球は、それらのより低い密度のために、血漿とＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓとの間の界面に見つかる。単核球画分の濃縮は、層の単離ならびにそれに続く洗浄および遠心分離によって成し遂げることができる。
【００２０】
単核白血球を血液試料から分離するための別の慣例的に用いられている方法は、白血球搬出法を含む。白血球搬出法は、末梢血から白血球をそれらの相対密度によって連続工程で得る特異な類のアフェレーシスである。この手順において対象の血液は、選択された白血球の画分を収集して残りの血球および血漿をドナーに返す特別な遠心分離装置に通される。白血球搬出法は、今日においては白血球または幹細胞を末梢血から得るための慣例的な臨床手段である。本発明との関連において白血球搬出法を行うために使用することができる種々の装置はいくつかの製造業者から入手することができ、例えば、Ｔｅｒｕ ｍｏ  ＢＣＴからのＣＯＢＥ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒａ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍがある。ＣＯＢＥ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒａ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍの使用によって白血球搬出法を実施する場合、製造業者によって提供される操作説明書プロトコールを用いることが好ましい、というのも、このプロトコールはＡｕｔｏＰＢＳＣプロトコールに比べてより良い品質の単球をもたらすことが分かったからである。
【００２１】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓのような分離用媒体の使用および白血球搬出装置の使用はどちらも、単球だけでなくリンパ球も含有する細胞画分をもたらすものである。本発明によれば、単球は、本発明の作製方法に細胞を導入する前に既知の方法、例えば、磁気ビーズ分離、フローサイトメトリーによる選別、浄化、濾過またはプラスチック付着によってリンパ球から濃縮および分離され得る。しかしながら、本発明の方法で一様な単球画分を使用することは必須ではない。実際、単球画分における０．１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の量のリンパ球の存在は、調節性マクロファージへの単球の分化に良い影響を与え得る。
【００２２】
本発明の一実施形態では、本発明の方法で使用する単球画分は本質的に純粋であり、非単球性の有核血球、例えばリンパ球または顆粒球を１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満の割合で含有する。単球が濃縮された単核球製剤を得るためには、末梢血単核球を例えばＣＤ１４陽性単球と結合するＣＤ１４マイクロビーズに接触させてもよい。一実施形態では、ステップ（ａ）の単球を白血球搬出法によって単離し、続いてＣＤ１４親和性分子、好ましくはＣＤ１４抗体を使用する分離ステップに供する。そのような精製ステップは非単球による出発物質の汚染を大いに軽減する。Ｔ細胞汚染の軽減は、患者の安全性の視点から非常に価値がある、というのも、それはドナー対レシピエント反応の潜在的なリスクを最小限に抑えるからである。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法において使用されるＣＤ１４単球をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）によって単離した。
【００２３】
白血球搬出法および／またはその他の方法によって単離した単球画分は、Ｍ−ＣＳＦおよび／もしくはＧＭ−ＣＳＦならびにＣＤ１６リガンドと共にインキュベートすることによる分化のために直接使用することができ、またはそれをさらなる使用のときまで抗凝血性クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ−Ａ）中もしくはその他の任意の適切な緩衝剤を補充した自家血漿中に貯蔵することができる。単離した単球画分を別の分化工程実施場所へ輸送しなければならない場合には、細胞の単離から２４時間以内、好ましくは単球の単離から１８時間以内、１２時間以内、６時間以内、４時間以内または２時間以内に、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーションによる細胞の分化を開始する配慮がなされなければならない。長期間の貯蔵のためには、単球分画を適切な凍結保存溶液中に再懸濁させて２０℃未満の温度、好ましくは８０℃未満の温度で長期間貯蔵してもよい。
【００２４】
単球を単離した後、細胞をＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドの存在下でインキュベートする。例えば、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦならびにＣＤ１６リガンドを含有する培地中で細胞を懸濁させてもよい。あるいは、細胞培養の開始からしばらく経った後にＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドを添加することも可能である。上記方法のステップ（ｂ）で使用する培地は、単球および／またはマクロファージの培養での使用に適したものとして文献に記載されているいかなる培地であってもよい。適する培地としては、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌマクロファージ生成培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２混和物、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。培地は、化学的に規定された培地であることが好ましい。培地は、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの他に、Ｍｒｅｇの生存および分化を促進する他の因子、例えば、成長因子およびサイトカイン、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、またはＩＬ−４；脂肪酸、コレステロールおよびその他の脂質；ビタミン、トランスフェリンおよび微量元素；インスリン、グルココルチコイド；コレカルシフェロールまたはエルゴカルシフェロール、およびその他のホルモン；非特異的免疫グロブリンおよびその他の血漿タンパク質を含有してもよい。本発明の好ましい実施形態では、培地は、ＲＰＭＩ−１６４０またはそれに由来する培地である。
【００２５】
単離したＣＤ１４陽性単球をインキュベートするために使用する培地は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ１としても知られる）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはその両方を含有する。Ｍ−ＣＳＦは、当該技術分野において、単球、マクロファージおよび骨髄前駆細胞の増殖、分化および生存に影響を与える造血性成長因子として知られている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ２としても知られる）は、サイトカインとして機能し、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、上皮細胞および線維芽細胞によって分泌される、単量体型糖タンパク質である。様々な種からのＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦタンパク質について記述されており、様々な製造業者からの購入が可能である。本発明の方法において使用されるＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの選択は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞へと分化させる単球の由来に依存するであろう。例えば、本明細書に記載の方法を用いてヒト単球をＭｒｅｇ−ｂｃに分化させるのであれば、使用する培地はヒトＭ−ＣＳＦおよび／またはヒトＧＭ−ＣＳＦ、好ましくは組換えヒトＭ−ＣＳＦおよび／または組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを含有するであろう。同様に、分化方法においてブタ単球を使用するのであれば、培地に添加するＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦはブタ由来のものであろう。本発明の特に好ましい実施形態では、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦはヒト由来のもの、例えば組換えヒトＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦであり、単球はヒト単球である。
【００２６】
当業者であれば、慣例的方法によって高い割合の単球をＭｒｅｇ−ｂｃへと分化させるのに適するＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの量を見出すことができるであろう。大抵、上記方法のステップ（ｂ）の培地中のＭ−ＣＳＦの濃度は、培地１ｍｌあたり１〜１００ｎｇタンパク質の範囲である。培地中のＭ−ＣＳＦの量を測定する経過実験は、初期用量５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを使用した培養物が培養２日目までに生理学的レベル以下の濃度を含んでいたようにＭ−ＣＳＦが経時的に消費または分解され、それにひきかえ初期用量２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを使用した培養物が７日間の培養期間全体を通して１０ｎｇ／ｍｌを上回る濃度を維持したということを明らかにした。このことから、本発明の好ましい実施形態では、培地中のＭ−ＣＳＦの濃度は２０〜７５ｎｇ／ｍｌ、２０〜５０ｎｇ／ｍｌまたは２０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲である。培地１ｍｌあたり少なくとも２５ｎｇのＭ−ＣＳＦの濃度は特に好ましい。上記濃度は、好ましくは組換えヒトＭ−ＣＳＦを指す。
【００２７】
Ｍ−ＣＳＦの代わりにＧＭ−ＣＳＦを使用する場合、Ｍ−ＣＳＦに関して上に概説したのと同じ濃度を培地中で用いることができる。ＧＭ−ＣＳＦはＭ−ＣＳＦよりも強力であると思われることから、本発明においては培地１ｍｌあたり０．１〜１００ｎｇタンパク質のＧＭ−ＣＳＦの濃度が示唆される。Ｍ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦとの両方を培地で使用する場合、これら２つの成長因子の全体濃度は上記の範囲内、すなわち２０〜７５ｎｇ／ｍｌ、２０〜５０ｎｇ／ｍｌまたは２０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲内であろう。Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの全体濃度は、培地１ｍｌあたりＭ−ＣＳＦが２５ｎｇであることが特に好ましい。
【００２８】
上記方法のステップ（ｂ）で使用する培地は、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの他に、ＣＤ１６リガンドも含む。単球上のＣＤ１６細胞表面受容体の刺激はそれらのＭｒｅｇ−ｂｃ細胞への分化を誘導するために必要であることが分かった。より具体的には、本発明の過程で行った実験から、ヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）を補充した培地中で成長させた単球はＭｒｅｇへと発達するが、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した培地中で成長させた単球はＭｒｅｇへと発達しないということが明らかになった。両血清の等量混合物中で成長させた単球は、Ｍｒｅｇ表現型を発達させる。したがって、ＨＡＢＳは明確にＭｒｅｇ誘導活性を含んでいる（図１のＡおよびＢを参照のこと）。ＨＡＢＳのクロロホルム抽出可能な画分の除去は、ＨＡＢＳのＭｒｅｇ誘導活性が主にクロロホルム抵抗性画分中に存在していることを実証し、それゆえタンパク質である可能性があった（図１のＢおよびＣを参照のこと）。サイズ分画によって、Ｍｒｅｇ−ｂｃ発達を担うＨＡＢＳの主要タンパク質成分は１００ｋＤａを上回ることが分かり、未知の因子が免疫グロブリン（Ｉｇ）であるという仮説につながった。プロテインＡ／Ｇセファロースを使用してＩｇが除去されたＨＡＢＳは、Ｍｒｅｇ−ｂｃ形態の発達およびＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡ発現を支援することができなかった（図１Ｄを参照のこと）。浄化されたＩｇをＩｇ除去血清に再び添加し戻すこと（またはＩＶＩｇの添加）は、ＤＨＲＳ９発現を誘導するその能力を回復させた（図１Ｄを参照のこと）。同様に、ヒトＩｇを補充したＦＣＳ中で単球を培養した場合、ＦＣＳ単独の対照に比べてＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡ発現の増加が認められ、正常なＭｒｅｇ−ｂｃ形態が獲得された（図１のＤおよびＥ）。抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体で処理された単球は、抗ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、抗ＦｃγＲＩＩａ／ｂ（ＣＤ３２ａ／ｂ）または対照抗体で処理された単球に比べてより著しく低いレベルでＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡを発現し（図１Ｆを参照のこと）、Ｍｒｅｇ−ｂｃ形態を発達させなかった（図１Ｇを参照のこと）。ＦｃγＲＩＩｂまたはＤＣ−ＳＩＧＮを単独で、または両受容体共に遮断することは、ＤＨＲＳ９+Ｍｒｅｇの発生に何ら影響を与えなかった（図１Ｈを参照のこと）。Ｍｒｅｇ−ｂｃ発生にＦｃγＲＩＩＩが必要であるという見解を強化するために、ｓｉＲＮＡを使用してＦｃγＲＩＩＩ発現をサイレンシングした（図１Ｉを参照のこと）。１０％のＨＡＢＳ中で培養された単離して間もない単球では、ＦＣＧＲ３ＡおよびＦＣＧＲ３Ｂ転写産物発現の一過的な抑制が成し遂げられ、重要なことに、ＦＣＧＲ２Ｂ発現はこの操作によって減少しなかった。フローサイトメトリーによってタンパク質レベルでのＦｃγＲＩＩＩのノックダウンが実証された（陰性対照ｓｉＲＮＡを使用して３５．２％±４．４  ＣＤ１６+細胞であるのに対し、ＦＣＧＲ３  ｓｉＲＮＡでは１５．３％±３．７；ｎ＝４、ｐ＝０．００２）。ＦｃγＲＩＩＩ発現のサイレンシング（但し、ＭＡＰＫ１発現の抑制または陰性対照ｓｉＲＮＡによる処理ではない）は、ＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡ発現の著しい下方制御をもたらした（図１Ｉを参照のこと）。
【００２９】
上記知見から、血清ＩｇはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を介してＭｒｅｇ表現型を誘導するように作用すると結論付けられた。Ｍｒｅｇ分化のＦｃγＲＩＩＩへの依存は、Ｍｒｅｇと、従来技術において記述されているその他のＩｇ複合体誘導型マクロファージ類とを区別する。特に、誘導の様式は、ＦｃγＲＩＩＩ誘導性Ｍｒｅｇを、従来技術において記述されたＦｃγＲＩＩｂ誘導性マクロファージ、ＦｃγＲＩ誘導性マクロファージおよび免疫グロブリンの非存在下で発生したマクロファージと区別する。
【００３０】
ＣＤ１６細胞表面受容体の刺激は所望のＭｒｅｇ−ｂｃ表現型への分化にとって決定的となるため、本発明の方法は、ステップ（ｂ）において単球をＣＤ１６リガンドと共にインキュベートすることを含む。受容体に結合するリガンドは、好ましくは、ヒトまたは非ヒト免疫グロブリン、より好ましくはヒト免疫グロブリンまたはその断片であろう。免疫グロブリン断片は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ断片であり得る。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片は、無血清培地に添加することが好ましい。あるいは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の配列、例えばヒト免疫グロブリンの配列を含む組換えタンパク質を使用してもよい。別の実施形態では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ分化を促進するために、抗原認識ドメインによってＣＤ１６に特異的に結合する非ヒトもしくはヒト抗体またはその断片を使用する。さらに別の実施形態では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ分化を促進するために、小分子を使用してＣＤ１６シグナル伝達経路を刺激する。
【００３１】
好ましい実施形態では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を発生させるために使用する培地は、１〜２０％のヒト血清または当量の特定血清成分、例えば免疫グロブリンを含有する。より好ましくは、培地に１０％の血清を補充する。本発明の方法を実施するために血清含有培地を使用する場合、培地は５〜１５％、好ましくは１０％のヒト血清を含む。１０％のヒトＡＢ血清を含有する培地は特に好ましい。別の言い方をすれば、血清は約０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。ＣＤ１６リガンドとして免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を使用する場合にはわずかにより低い濃度を用いることができる。免疫グロブリンまたはその他のＣＤ１６リガンドを組織培養面上、ビーズ上またはその他の物理的母材上に固定する場合には実質的により低い濃度を用いてもよい。ヒト血清、例えばＡＢ血清は男性ドナー由来のものであることがさらに好ましい。女性ドナーからの血清を使用する場合には、ドナーがプロゲステロン避妊薬またはプロゲステロン−エストロゲン避妊薬を使用していないことの配慮をしなければならない。上記培地は、単球またはＭｒｅｇ−ｂｃ細胞、または任意の中間体形態、例えば主要組織適合分子に対する抗体を含有していないことがさらに好ましい。
【００３２】
培地中の抗体は、本発明の方法によって産生されたＭｒｅｇ−ｂｃの生存能、収率、表現型または抑制機能に対して測定可能な影響を何ら与えなかったことも見出された。したがって、本発明の方法のステップ（ｂ）で使用する培地はいかなる抗生物質も含有しないことが好ましい。
【００３３】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞が、血管新生の誘導が望まれる治療的用途（以下を参照）での使用のために意図される場合、本発明の方法のステップ（ｂ）で単球を培養するために使用する培地は、ＶＥＧＦ−Ａのような血管新生因子の産生を増強するためにＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦならびにＣＤ１６リガンドの他にｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）またはＨｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘタンパク質１（ＨＭＧＢ１）を含み得る。ＴＬＲリガンドは、１０００ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、または４００ｎｇ／ｍｌで培地に添加され得る。１つ以上のＴＬＲリガンドを添加する場合には、これらのリガンドの全体濃度を上記範囲内にしなければならない。ＴＬＲリガンドは、製造方法のいかなる段階で添加してもよい。単球を培養するために使用される初期培地中に、つまり培養の０日目にそれが存在していてもよいし、または後の段階、例えば培養の５、６もしくは７日目にそれを添加してもよい。好ましくは、ＴＬＲリガンドをＩＦＮ−γの添加と同時に添加する。
【００３４】
本発明によれば、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を作製する方法は、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドの存在下で単球を気体透過性バッグ内で培養することを含む。単球を適切な培地中に懸濁させたならばすぐに細胞懸濁液を培養および分化のために気体透過性バッグへ移す。細胞培養用のバッグは様々な提供元、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、ドイツ）、またはＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から入手することができる。バッグは、培養バッグの内面への培養細胞の接着を可能にする材料で作られることになる。プラスチック製のバッグ、例えば、ポリオレフィンまたはポリエチレンからなるバッグが好ましい。
【００３５】
バッグは、内部培養面１ｃｍ2あたり１〜２×１０6単球の細胞播種密度を可能にするように設計されることが好ましかろう。これは、少なくとも９０ｃｍ2でありかつ１８０ｃｍ2以下である内部表面積を有するバッグ内で１８０×１０6個の単球を含有する細胞懸濁液が好適に培養されることを意味する。懸濁液中の細胞の最適密度は、好ましくは約１×１０5細胞／ｍｌ〜１×１０7細胞／ｍｌ、より好ましくは１×１０6細胞／ｍｌである。バッグ容積に対する細胞懸濁液体積の比率は、培養の最後にＭｒｅｇ−ｂｃの濃縮が行われなければならない培地の量を最小限に抑えるために、少なくとも１．０、好ましくは０．２、より好ましくは０．０６である。これは、３Ｌの培養バッグに１Ｌ以下、好ましくは６００ｍｌ以下、より好ましくは１８０ｍｌ以下の細胞懸濁液を充填することになることを意味する。本発明の方法の好ましい実施形態では、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドを補充した培地中で単球を培養するために使用されるバッグの容積は少なくとも３Ｌである。
【００３６】
単球を培養バッグへ移した後、ＩＦＮ−γ刺激に先立って細胞をバッグ内で少なくとも３日間、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンド、例えばヒト血清またはヒト免疫グロブリンの存在下でインキュベートする。本明細書中で使用する場合、「１日」の培養期間は、２４時間の培養を指す。したがって、「少なくとも３日」の培養期間は７２時間以上の培養を指す。ＩＦＮ−γ刺激の最適期間は少なくとも１２時間、好ましくは１８時間、より好ましくは２４時間である。本発明によれば、合計培養期間、すなわち単球を培養バッグに導入してからＭｒｅｇ−ｂｃを採集するまでの期間は、少なくとも４日であるが、好ましくは少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、または少なくとも８日である。別の言い方をすれば、合計培養期間は４〜８日、好ましくは６〜８日、より好ましくは７日である。培養バッグ内の単球は、それらがＭｒｅｇ−ｂｃ細胞へと成長および分化するのを可能にする条件下でインキュベートされる。単球またはマクロファージを培養するための一般的条件は細胞培養の分野の業者に知られている。
【００３７】
例えば、懸濁液を含有するバッグを、規定された温度、湿度およびＣＯ2の条件の選択を可能にするインキュベーションチャンバに移すことができる。適する温度条件は、３０〜４０℃、好ましくは３２〜３８℃、より好ましくは３７〜３８℃の範囲、例えば３７℃である。培養に用いる湿度は、普通は３０〜７０％、好ましくは４０〜６０％、より好ましくは５０〜６０％の範囲、例えば湿度６０％である。インキュベーションチャンバは１０％以下のＣＯ2を含み得る。５％以下のＣＯ2、４％以下のＣＯ2、３％以下のＣＯ2、２％以下のＣＯ2、または１％以下のＣＯ2の含有量が特に好ましい。インキュベーションの間、バッグはインキュベーションチャンバの棚に平置きすることが好ましい。
【００３８】
バッグ内の単球は、培養バッグの下面へのそれらの半付着的な接着を可能にすべく時折緩やかに撹拌されることが好ましい。好ましくは、バッグの反対面へのそれらの付着を可能にすべく全培養期間内にバッグを少なくとも１回反転させる。別の実施形態では、全培養期間中にバッグを少なくとも２回反転させる。別の実施形態では、全培養期間中にバッグを少なくとも３回または４回反転させる。さらに他の実施形態では、全培養期間中にバッグを２４時間毎に反転させる。別の実施形態では、全培養期間中にバッグを３６時間毎に反転させる。さらに別の実施形態では、全培養期間中にバッグを４８時間毎に反転させる。
【００３９】
本発明の方法のステップ（ｃ）では、サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）に細胞を接触させる。サイトカインは、３０個超の遺伝子の転写を変化させてそれによって様々な生理学的応答および細胞応答を生じさせることが当該技術分野において既知である。ＩＦＮ−γタンパク質は、様々な種から単離されており、様々な製造業者から購入することができる。本発明の方法において使用するＩＦＮ−γの選択は、本発明の方法に供される単球の由来に依存するであろう。例えば、本明細書に記載の方法を用いてヒト単球をＭｒｅｇ−ｂｃへと分化させるのであれば、添加するＩＦＮ−γはヒトＩＦＮ−γ、好ましくは組換えヒトＩＦＮ−γであろう。同様に、分化方法においてブタ単球を使用するのであれば、培地に添加するＩＦＮ−γはブタ由来のものであろう。本発明の特に好ましい実施形態では、ＩＦＮ−γはヒトＩＦＮ−γであり、より好ましくは組換えヒトＩＦＮ−γである。
【００４０】
培養物における単球によるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を誘導するのに効果的ないかなる量のＩＦＮ−γを添加してもよい。好ましくは、単球培養物に添加すべきＩＦＮ−γの量は、５〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜８０ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは２０〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲であろう。本発明においては培地１ｍｌあたり２５ｎｇの量のＩＦＮ−γが特に好ましい。
【００４１】
ＩＦＮ−γは、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドと同時に培地に添加することができ、それは、例えば培養バッグ内へ単球を導入する時にサイトカインを添加してもよいことを意味する。そのような実施形態では、本発明の方法によって分化させる単球を培養期間全体にわたってＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１６リガンドおよびＩＦＮ−γの存在下で培養することになる。しかしながら、ＩＦＮ−γの存在下での培養期間はＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下での培養期間よりもかなり短いことが好ましく、それは、細胞をＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で少なくとも３日間培養してから初めてＩＦＮ−γを添加することを意味する。好ましい実施形態では、細胞をＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で３〜６日間培養した後にＩＦＮ−γを添加する。好ましくは、細胞をＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、または少なくとも６日間培養してからＩＦＮ−γを添加する。特に好ましい実施形態では、細胞をＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの存在下で３〜６日間培養した後にＩＦＮ−γを添加し、そしてさらに１８〜７２時間培養を継続する。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施形態では、分化させた細胞を７日目、例えば、Ｍ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドを含有する培地中での単球の６日間の培養に続いてＩＦＮ−γ刺激を１８〜２４時間行った後に、採集する。いくつかのバッグを並行して培養した場合には、バッグの中身を培養工程の最後にまとめ合わせてもよい。分化マクロファージは、マクロファージに使用するのに適合した緩衝液によって洗浄してもよい。例えば、遠心分離および上清のデカンテーションによって緩衝液を連続交換することにより細胞を洗浄するために、リンガー液またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、好ましくはそれに５％のヒト血清アルブミンを補充したものを使用することができる。本発明の過程において、トリプシンの使用は免疫調節性マクロファージの収率を向上させないことが分かった。それゆえ、本発明においてはトリプシンの添加を採集ステップに含まないことが好ましい。
【００４３】
これらのＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を輸血バッグ、ガラス製点滴装置、または処置施設もしくは患者のベッド脇への細胞搬送を可能にする別の閉鎖系容器に移して貯蔵することができる。このためには、分化細胞を適切な保存培地中に懸濁させることになる。保存培地は、例えば、５％のヒト血清アルブミンが補充されていることが好ましいリンガー液であり得る。特に好ましい実施形態では、保存培地は、無血清かつ／またはタンパク質不含の既製培地である。商業的に入手可能な適する既製培地は、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＲＬ、ケルン、ドイツ）である。好ましくは、培地のｐＨは６．５〜８．０、より好ましくは７．０〜７．５、例えば７．４である。細胞液は、エネルギー消費および細胞付着を最小限に抑えるために４℃で貯蔵しなければならない。あるいは、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を凍結保存溶液中に再懸濁させて最終的な使用まで凍結形態で貯蔵してもよい。
【００４４】
本発明の分化マクロファージ細胞の表現型および機能の安定性は、賦形剤および貯蔵温度の選択に依存する。ヒト血清アルブミンが補充されたリンガー液中に再懸濁させる場合、本発明のマクロファージは２０〜２５℃で、細胞採集後２４時間まで安定である。ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ中に再懸濁させる場合、マクロファージを２〜８℃、好ましくは４℃で、細胞採集後少なくとも７２時間貯蔵することができる。より長い貯蔵期間が要求される場合には細胞を冷凍または凍結保存に供してもよい。全般的に本発明の細胞はそれらの免疫抑制性の表現型で安定であることが分かった。炎症促進メディエーター、例えばリポ多糖による処理は、刺激性表現型の発達を促さない。
【００４５】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を作製する方法は、一般的な方法に従って、例えば、細胞処理の作業流れを効率化する統合的解決法を提供するＧＭＰに則した基盤を用いることによって自動化することができる。方法は、密封型消耗品、管一式と緩衝剤と試薬の任意選択的特注生産、滅菌フィルターを備えた多数の流入ライン、任意での工程内管理用流出ライン、および実質的に軽減されたクリーンルーム要件を活用する「閉鎖系」で起こることが好ましい。例えば、当該基盤には、白血球画分から単球を分離するのを可能にする細胞分離システムが備わっていてもよい。細胞分離システムは、開始体積１００〜１０００ｍｌのアフェレーシス済み液または全末梢血から単球を分離することができなければならない。その後、単離された単核性白血球画分中に含まれる単球は、例えばＣＤ１４＋細胞と結合する磁気ビーズによって単離され得る。その後、これらの細胞を適切な培地中で培養する。当該基盤は、多数の流入ポートを介して細胞培養物に培地、成長因子および／またはサイトカインを供給するのを可能にする。培養工程の最後に細胞は自動的に洗浄され、採集され、適切な無菌送達用バッグ内へ移される。ＰＶＣ管およびＥＶＡ管の無菌封止を可能にする特注生産された管封止材を使用してもよい。細胞性製品にはバーコードを付けてもよく、品質制御目的で製造業者による工程全体をオンラインで監視してもよい。
【００４６】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって得ることができる、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞と呼称される新規な類のＭｒｅｇ細胞に関する。本発明によって提供される細胞は、単球由来のヒトマクロファージであり、それゆえ一般的な白血球マーカーおよびマクロファージ系統のマーカー、とりわけＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３およびＨＬＡ−ＤＲを発現する。Ｍｒｅｇは、一群の系統マーカーおよび活性化マーカー−つまり、ＣＤ１４-/low  ＣＤ１６-/low  ＣＤ８０-/low  ＣＤ８６+  ＣＤ８５ｈ+  ＣＤ２５８+（図２Ａを参照のこと）によって単球、比較マクロファージのパネル（すなわち、休止マクロファージ、Ｍ１、Ｍ２ａおよびＭ２ｃマクロファージ）および単球由来ＤＣとは区別される。ＣＤ８５ｈは、Ｍｒｅｇおよび単球に発現するが、休止マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２ａマクロファージ、Ｍ２ｂ（Ｉｇ複合体によって刺激された）マクロファージ、Ｍ２ｃ（デキサメタゾンで処理された）マクロファージ、および単球由来樹状細胞においてその発現は失われる。ＣＤ２５８はＭｒｅｇおよびＭ２ｂマクロファージに発現するが、単球、休止マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２ａマクロファージ、Ｍ２ｃ（デキサメタゾンで処理された）マクロファージ、および単球由来樹状細胞においてそれは発現されない。
【００４７】
Ｍｒｅｇ−ｂｃすなわちバッグ内で培養された細胞と、それ以外は同等の条件下でフラスコ内で培養されたＭｒｅｇとを比較すると、Ｍｒｅｇ−ｂｃは常にフラスコ培養細胞よりも低いレベルのＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ８０を発現する。Ｍｒｅｇ−ｂｃは常にフラスコ培養Ｍｒｅｇよりも高いレベルのＣＤ８５ｈおよびＣＤ２５８を発現した。Ｍｒｅｇ−ｂｃは、マーカーＣｌｅｃ−９ａ、ＣＤ１０およびＣＤ１０３の発現によって、フラスコ内で培養されたものとは区別することができる（図２Ｂを参照のこと）。あるいは、一般的なＭｒｅｇとは対照的に、Ｍｒｅｇ−ｂｃはマーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３を発現しない（または低量でしか発現しない）（図２Ｃを参照のこと）。特徴として、バッグ培養であるかフラスコ培養であるかにかかわらず、あらゆるヒトＭｒｅｇは、レチノール脱水素酵素のＳＤＲファミリーのレチノール脱水素酵素であるＤＨＲＳ９を比較的高いレベルで発現する（図３を参照のこと）。バッグ培養であるかフラスコ培養であるかにかかわらず、単一のヒトＭｒｅｇ細胞は、従来技術において記述されている他の単球由来マクロファージの類にはみられないインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）とアルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）とを両方とも同時に発現する（図４を参照のこと）。
【００４８】
したがって、本発明は、マーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３のうちの１つ以上を発現しない（またはこれらのマーカーを低レベルでしか発現しない）Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を提供する。本明細書では、フローサイトメトリーで測定される細胞の蛍光強度が、対応するアイソタイプ対照染色試料の９９百分位点の蛍光強度未満である場合、細胞は特定の表面マーカーに関して陰性である。好ましくは、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞はＣＤ２０９に対して陰性である。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞はさらに、ＣＤ３８に対して陰性であるかまたはそれらが低レベルのＣＤ３８を発現するかのどちらかである。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を発生させる間、単球の初期集団は細胞表面でのＣＤ３８発現を下方制御する。Ｍｒｅｇ−ｂｃ発達中のＣＤ３８の下方制御は、培養０日目（ｄ０）の単球と比較したときの７日目のＭｒｅｇ−ｂｃでのＣＤ３８発現の百分率として表すことができる。ＣＤ３８の発現は、アイソタイプ対照染色細胞と特異的ＣＤ３８信号との間での平均蛍光強度の差に比例する。したがって、下方制御％＝１００−１００×（ＣＤ３８d7−Ｉｓｏd7）／（ＣＤ３８d0−Ｉｓｏd0）であり、ここで、ＣＤ３８d7は７日目の特異的信号であり；Ｉｓｏd7は７日目のアイソタイプ対照信号であり；ＣＤ３８d0は０日目の特異的信号であり；Ｉｓｏd0は０日目のアイソタイプ対照信号である。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞によるＣＤ３８の下方制御は、標準的なフローサイトメトリー法を用いて簡便に判定することができる。好ましい実施形態によれば、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞によるＣＤ３８の発現は、培養０日目の単球によるＣＤ３８の初期発現に比べて５０％より多く下方制御され、より好ましくは、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、または９９％より多く下方制御される。
【００４９】
同様に、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を発生させる間、単球の初期集団が細胞表面での低レベルのシンデカン−３発現を獲得するのに対し、フラスコ内で培養されたＭｒｅｇ細胞は細胞表面でのより高いレベルのシンデカン−３発現を獲得する。したがって、本発明の方法によって得られた分化Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、マーカーシンデカン−３を発現しないかまたは当該マーカーを比較的低いレベルでしか発現しない。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞によるシンデカン−３の発現は、フラスコ培養Ｍｒｅｇでのシンデカン−３発現と関係付けて表すことができる。シンデカン−３の発現は、アイソタイプ対照染色細胞と特異的シンデカン−３信号との間での平均蛍光強度の差に比例する。したがって、発現％＝（シンデカン−３Mreg-bc−ＩｓｏMreg-bc）／（シンデカン−３フラスコ−Ｉｓｏフラスコ）であり、ここで、シンデカン−３Mreg-bcは、７日目のシンデカン−３染色Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の特異的信号であり；ＩｓｏMreg-bcは、７日目のアイソタイプ対照染色Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の信号であり；シンデカン−３フラスコは、７日目のシンデカン−３染色フラスコ培養Ｍｒｅｇ細胞の特異的信号であり；Ｉｓｏフラスコは、７日目のアイソタイプ対照染色フラスコ培養Ｍｒｅｇ細胞の信号である。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞およびフラスコ培養Ｍｒｅｇによるシンデカン−３の相対発現は、標準的なフローサイトメトリー法を用いて簡便に判定することができる。好ましい実施形態によれば、フラスコ培養Ｍｒｅｇと比較したときのＭｒｅｇ−ｂｃ細胞によるシンデカン−３の相対発現は（％表示で表して）、５０％未満、より好ましくは４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である。
【００５０】
好ましくは、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、マーカーＣＤ８５ｈおよびＣＤ２５８のうちの少なくとも一方、より好ましくはその両方のマーカーを発現する。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、マーカーＣｌｅｃ−９ａ、ＣＤ１０３およびＣＤ１０のうちの１つ以上を発現することが好ましい。別の言い方をすれば、本発明は、マーカーＣｌｅｃ−９、ＣＤ１０３およびＣＤ１０のうちの１つ以上を発現するＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を提供する。好ましくは、上記細胞は、マーカーＣＤ８５ｈおよびＣＤ２５８のうちの少なくとも一方、より好ましくはその両方を発現する。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞はさらに、マーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３のうちの１つ以上を発現しない（またはこれらのマーカーのうちの１つ以上を比較的低いレベルでしか発現しない）ことが好ましい。特に好ましい実施形態では、本明細書において提供されるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、マーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３を発現せず、それと同時に、マーカーＣＤ８５ｈ、ＣＤ２５８、Ｃｌｅｃ−９、ＣＤ１０３およびＣＤ１０を発現する。したがって、本発明の方法によって提供されるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、以下のマーカーパターンのうちの１つによって表現されることができるマクロファージである：
（１）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ３８-/low；
（２）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２０９-/low；
（３）．  ＣＤ４５＋、ＣＤ８５ｈ＋、シンデカン３-/low；
（４）．  ＣＤ４５+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（５）．  ＣＤ４５+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（６）．  ＣＤ４５＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（７）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（８）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（９）．  ＣＤ４５＋、ＣＤ８５ｈ＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（１０）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low；
（１１）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、シンデカン３-/low；
（１２）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（１３）．  ＣＤ４５+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（１４）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ３８-/low；
（１５）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２０９-/low；
（１６）．  ＣＤ３３＋、ＣＤ８５ｈ＋、シンデカン３-/low；
（１７）．  ＣＤ３３＋  ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（１８）．  ＣＤ３３+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（１９）．  ＣＤ３３＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（２０）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（２１）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（２２）．  ＣＤ３３＋、ＣＤ８５ｈ＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（２３）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low；
（２４）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、シンデカン３-/low；
（２５）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（２６）．  ＣＤ３３+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（２７）．  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ３８-/low；
（２８）．  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２０９-/low；
（２９）．  ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ８５ｈ＋、シンデカン３-/low；
（３０）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（３１）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（３２）．  ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（３３）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（３４）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（３５）．  ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ８５ｈ＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（３６）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low；
（３７）．  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、シンデカン３-/low；
（３８）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（３９）．  ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（４０）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ３８-/low；
（４１）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２０９-/low；
（４２）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ８５ｈ＋、シンデカン３-/low；
（４３）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（４４）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（４５）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（４６）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low；
（４７）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low；
（４８）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ８５ｈ＋、ＣＤ２５８+、シンデカン３-/low；
（４９）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low；
（５０）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、シンデカン３-/low；
（５１）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low；
（５２）．  ＣＤ４５+  ＣＤ１１ｂ+  ＣＤ８５ｈ+  ＣＤ２５８+  ＣＤ２０９-/low  Ｃｌｅｃ−９ａ+
（５３）．  ＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ８５ｈ+、ＣＤ２５８+、ＣＤ３８-/low、ＣＤ２０９-/low、シンデカン３-/low。
【００５１】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、ＣＤ３４を発現しないかまたは顕著な程度にまで発現しないことが特に好ましい。ＣＤ３４は、臨床血液学において造血幹細胞および前駆細胞のために一般的に使用されるマーカーである。本発明の方法によって得られたＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、７日間の培養の後に好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満がＣＤ３４を発現する。本発明の一実施形態では、本発明のマクロファージ細胞は、ヒト対象由来、すなわちヒト起源である。
【００５２】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞のマーカープロファイルは、標準的なフローサイトメトリー法を用いて簡便に判定することができる。細胞の表面マーカーを決定するのに有用な方法および試薬は文献において幅広く記載されている。好ましくは、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞のマーカー表現型は、実施例の部で記載されているとおりに決定される。
【００５３】
本発明では、単球から調節性マクロファージへの遷移が徐々に起こることが分かった。細胞を発生させる間、ＣＤ１４＋単球の初期集団は細胞表面でのＣＤ１４発現が徐々に失われる。したがって、別の好ましい実施形態では、本発明の方法から得られた分化Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、単球系統に特徴的なマーカーＣＤ１４を発現しないかまたは顕著な程度にまで発現しない。Ｍｒｅｇ−ｂｃ発達中でのＣＤ１４の下方制御は、培養０日目の単球と比較したときの７日目のＭｒｅｇ−ｂｃにおけるＣＤ１４発現の百分率として表すことができる。ＣＤ１４の発現は、アイソタイプ対照染色細胞と特異的ＣＤ１４信号との間での蛍光強度の差に比例する。したがって、下方制御％＝１００−１００×（ＣＤ１４d7−Ｉｓｏd7）／（ＣＤ１４d0−Ｉｓｏd0）であり、ここで、ＣＤ１４d7は７日目の特異的信号であり；Ｉｓｏd7は７日目のアイソタイプ対照信号であり；ＣＤ１４d0は０日目の特異的信号であり；Ｉｓｏd0は０日目のアイソタイプ対照信号である。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞によるＣＤ１４の下方制御は、標準的なフローサイトメトリー法を用いて簡便に判定することができる。好ましくは、単球からＭｒｅｇ−ｂｃへの分化の工程中にＣＤ１４の発現は、２５％より多く下方制御され、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より多く下方制御され、より好ましくは９５％より多く下方制御される。
【００５４】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、以下により詳しく説明するように、治療目的のために使用するのに特に適している。概念上、Ｍｒｅｇ−ｂｃ療法は、免疫抑制機能、抗炎症機能または組織修復機能を有するＭｒｅｇ−ｂｃ細胞の投与がレシピエントにおけるそれらの細胞機能の欠如を補完することになるという意味で機能獲得型療法である。適切な多さの用量を適用することによって、レシピエントにおける上記活性を回復させるかまたは凌駕する事が可能であろう。移植モデルおよび自己免疫モデルにおいて、Ｍｒｅｇ−ｂｃ処置は、レシピエントにおいてそれら自身の寿命を超えて持続する治療効果を有する。この永久的な効果は、レシピエントＴ細胞に対するＭｒｅｇ−ｂｃ処理の影響によって説明することができる。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の投与は、３つの補完的方法でレシピエントＴ細胞応答に影響を与え得る。
（ａ）Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞はレシピエントＴ細胞と直接的に相互作用して、特異的なＴ細胞除去、または活性化された誘導性調節性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）への変換をもたらす。
（ｂ）Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、直接的相互作用または抗炎症メディエーターの放出によってレシピエント樹状細胞の挙動を改変する。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の１つの重要な機能は、適切に自己調節された環境において死滅して抗原をレシピエント樹状細胞へ受け渡し、それが今度はレシピエントＴ細胞を特異的に抑制する、ということであり得る。
（ｃ）Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞またはその細胞レベル以下の画分は、直接作用し得るかまたはレシピエント骨髄単球細胞を通じて作用を働かせ得る可溶メディエーターの放出によって、能動的または受動的な非特異的抑制を働かせる。
【００５５】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、それらのＴ細胞抑制作用に加えて、それらを治療的用途のために価値のあるものにするさらなる特徴的な特性を呈する。実施例６に示されているように、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）またはＨｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘタンパク質１（ＨＭＧＢ１）による刺激を受けると生物学的に妥当な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）およびその他の血管新生促進メディエーターを分泌する。結果として、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、血管新生の誘導が望まれる疾患および症状、例えば虚血性の疾患および症状を処置するのに適している。
【００５６】
第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞またはその細胞レベル以下の画分を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、第１成分として、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞またはその細胞レベル以下の画分を有効量含むことになる。本明細書中で使用する場合、患者に投与されるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞の有効量は、処置される患者に関して約１×１０4〜約１×１０8／ｋｇ体重、好ましくは約１×１０5〜約１×１０7／ｋｇ体重、より好ましくは約１×１０6〜約９×１０6／ｋｇ体重の範囲、例えば、約１×１０6／ｋｇ、約２×１０6／ｋｇ、約３×１０6／ｋｇ、約４×１０6／ｋｇ、約５×１０6／ｋｇ、約６×１０6／ｋｇ、約７×１０6／ｋｇまたは約８×１０6／ｋｇ体重であろう。同様に、本発明が本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞の細胞レベル以下の画分の投与を含む場合、これらの画分は、細胞の投与に関して上述した範囲のうちの１つに対応するＭｒｅｇ−ｂｃ細胞の量に基づいて調合されることが好ましかろう。本明細書中で使用する場合、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の細胞レベル以下の画分は、壊死細胞粒子、アポトーシス細胞粒子、または細胞の主要組織適合（ＭＨＣ）分子を含んだエクソームを含み得る。低浸透圧溶液による細胞の処理、洗浄剤もしくは酸を使用する溶解、凍結解凍もしくは加熱、音波処理、照射、機械的破壊または長期貯蔵によって調製される細胞溶解物を使用してもよい。細胞レベル以下の画分は、完全細胞タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質または精製ＭＨＣ分子を含有する細胞抽出物を含んでいてもよい。
【００５７】
医薬組成物は細胞または細胞の細胞レベル以下の画分の他に、賦形剤、例えば、緩衝剤、ｐＨ調整剤、保存料などをさらに含むことができる。本発明の医薬組成物に含められる賦形剤の性質および量は、意図される投与経路に依存するであろう。大抵、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞またはその細胞レベル以下の画分を処置が必要な患者に提供するのに様々な投与経路が利用可能である。好ましくは、本発明の医薬組成物は非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内への投与のために製剤化されることになる。特に好ましくは、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分、または上記細胞もしくは画分を含む組成物は静脈内投与によって患者に投与される。
【００５８】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞またはそれらの細胞レベル以下の画分を医薬組成物に製剤化することは、薬物製剤化の分野において知られている慣例的方法を適用することによって成し遂げることができる。適する方法は、例えば標準的な教本に記載されている。注射または輸注による静脈内投与に適する医薬組成物は、通常、無菌の溶液または懸濁液および、無菌の水溶液または懸濁液を即席で調製するための無菌粉末を含む。注射用に意図された組成物は、無菌でなければならず、かつシリンジまたは輸注バッグでの簡便な取り扱いを可能にすべく流体であるべきである。
【００５９】
組成物は、投与条件下で安定であるべきであり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを組成物中に含むことによって、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されることが好ましい。静脈内投与の場合、適する担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび脂質ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であってもよい。適度な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用すること、分散体の場合に必要な粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。無菌注射液は、必要な量の細胞または細胞レベル以下の画分を適切な溶媒中に１つ以上の上記成分と共に組み入れ、その後に滅菌濾過することによって、調製することができる。一般に、懸濁液は、基礎分散媒とその他の上記のものからの他の必要な成分とを含有する無菌ビヒクル中に活性合成物、すなわち細胞またはその細胞レベル以下の画分を組み入れることによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、細胞またはその細胞レベル以下の画分と、任意の所望の付加的成分を、前もって滅菌濾過されたその溶液から得たものとを加え合わせた粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。
【００６０】
輸注または注射が意図される組成物は、５０〜５００ｍＬの体積を有することとなり、この場合、９０ｍｌ〜２５０ｍｌの体積が特に好ましく、９０ｍｌ〜１５０ｍｌの体積がさらにいっそう好ましい。
【００６１】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、様々な投与計画による処置を必要とする患者に投与することができる。例えば、細胞または細胞画分を静脈内輸注によって患者に投与する場合、投与するＭｒｅｇ−ｂｃ細胞またはＭｒｅｇ−ｂｃ細胞画分の総量は１つまたは２つ以上の輸注によって供給されることができる。好ましい実施形態では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞または細胞画分は、２００μｍフィルターを備えた輸注器具一式によって患者へ供給される。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞またはＭｒｅｇ−ｂｃ細胞画分を含む懸濁液には０．９％のＮａＣｌで初回刺激を行ってもよい。懸濁液は単回輸注で与えられてもよく、より好ましくは、６０分未満、例えば６０分以内、３０分以内、２０分以内または１５分以内の短時間輸注で与えられてもよい。Ｍｒｅｇ−ｂｃ懸濁液を投与するためには中心静脈カテーテルを使用することが好ましい。
【００６２】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞または細胞画分の投与には、前もって、同時に、または後に他の活性剤を投与することを伴うことができる。例えば、臓器移植を受けている患者の免疫応答を防止するために本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞または細胞画分を投与する場合、免疫抑制薬を本発明の細胞または細胞画分と一緒に投与してもよい。移植医学の分野で慣例的に使用される免疫抑制薬としては、限定されないが例えば、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）、タクロリムス、アザチオプリン（ＡＺＡ）、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよびステロイド（ＳＴＥ）が挙げられる。一般に、レシピエントの血中における免疫抑制薬の存在は本発明の細胞または細胞画分の有効性に影響を与えない。
【００６３】
本発明の第１の態様において記載した方法から得られるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は安定な表現型を呈するが、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞またはＭｒｅｇ−ｂｃ細胞から得られる細胞レベル以下の画分は、それらを細胞培養物から採集してから２４時間以内に投与されることが安全性の理由から推奨される。好ましくは、細胞は、培養物から細胞を採集してから２０時間以内、１６時間以内、１２時間以内、８時間以内または４時間以内に投与される。
【００６４】
第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る組成物の治療的用途に関する。本明細書中の他の所に示されているように、本発明によって提供されるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、それらを免疫抑制療法、抗炎症療法または組織修復療法において使用されるのに大いに適したものにする数々の薬理特性、例えば、免疫抑制特性、免疫調節特性、血管新生特性および抗炎症特性を呈する。例えば、本発明の人工的に誘導したＭｒｅｇ−ｂｃ細胞はＴ細胞抑制性であり、活性化Ｔ細胞の能動的除去を媒介する。このように、当該細胞は様々な免疫介在性疾患、例えば臓器移植における補助的免疫抑制療法としての使用に大いに適している。
【００６５】
したがって、本発明の一実施形態において、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る医薬組成物は、移植拒絶反応を抑制しかつ／または移植物を受けている対象における移植物生存期間を延長する方法において使用される。かくして、本発明は、移植拒絶反応を抑制しかつ／または移植物を受けている対象における移植物生存期間を延長する方法であって、（ｉ）本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分を有効量投与すること、または（ｉｉ）本発明の第３の態様に係る医薬組成物を投与することを含む方法に関する。好ましくは、移植物は臓器、組織または細胞移植物である。移植される臓器の種類は本発明によって限定されないが、腎臓、肝臓、心臓、肺または膵臓であることが好ましかろう。特に好ましくは、レシピエントに移植される臓器はヒト臓器である。
【００６６】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃは、移植物が臓器移植物ではなく組織移植物である場合には、移植拒絶反応を抑制しかつ／または移植物生存期間を延長するために使用することもできる。この場合も、レシピエントへ移植される組織は特に限定されない。レシピエント内の同種異系ドナーに由来していたいかなる組織の拒絶反応も、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃによって防止または改善することができる。移植される組織は、ヒト組織、例えば、腸、角膜、皮膚、複合組織、骨髄、または膵島組織であることが好ましかろう。
【００６７】
本発明の方法に従って作製されるＭｒｅｇ−ｂｃはさらに、レシピエントにおける免疫応答の抑制によってレシピエント内への細胞移植物の導入を支援することができる。移植物が細胞移植物である場合、移植される細胞の性質は概して限定されないが、移植される細胞は、成体幹細胞移植物、単離肝細胞移植物、または白血球細胞移植物からなる群から選択されることが好ましい。本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞はさらに、成体幹細胞のホーミングおよび生着を促進する可溶性因子、例えばカテリシジンを産生することができる。本発明の好ましい実施形態では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、骨髄移植後またはＨＳＣ移植後の造血幹細胞（ＨＳＣ）の生着を促進するために使用される。
【００６８】
レシピエントにおける移植拒絶反応を抑制し、同種異系の臓器、組織または細胞移植物の許容性を誘導するために、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞または、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分を含む医薬組成物は、上記のように注射または輸注によって静脈内投与することができる。注射または輸注は、術前または術後のどちらかにおいて与えることができる。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を術前に投与する場合、それらを少なくとも１回、好ましくは２回、より好ましくは３回、術前にレシピエントに投与することになる。Ｍｒｅｇ−ｂｃは、術前１週間以内、例えば手術の６日前、５日前、４日前、３日前、２日前または１日前にレシピエントに投与されることが好ましい。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を術後に投与する場合には、１回目の投与は、好ましくは術後２４時間以内、より好ましくは術後３６時間以内、４８時間以内、６０時間以内、７２時間以内に与えることになる。あるいは、安定的に免疫抑制された移植レシピエントにおいては、Ｍｒｅｇ−ｂｃ療法を移植後のいかなる時間に投与してもよい。あるいは、急性または慢性の移植拒絶反応を被っている移植レシピエントにＭｒｅｇ−ｂｃを投与してもよい。Ｍｒｅｇ−ｂｃはその後、移植物に対するレシピエントの免疫系のＴ細胞応答を排除することができ、そしてレシピエントに長期間の移植許容性を付与するのに十分に長い間、レシピエントの体（特に、脾臓、肝臓、肺および骨髄）の中で存続することができる。
【００６９】
移植物を受けている対象において移植拒絶反応を抑制するかまたは移植物生存期間を延長するために本発明のＭｒｅｇ−ｂｃを使用する場合、移植物は普通は、同種異系移植物、すなわち、遺伝的には異なるがレシピエントと同一の種に属するドナーに由来する移植物であろう。この場合には、上記ドナーから得られた血液単球に基づいてＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を発生させる。単球は、生きているドナーまたは死亡したドナーから得ることができる。死亡したドナー、すなわち献体の場合、ドナーの身体には普通、臓器保存のために主動脈の疎通によって灌流媒体を流す。静脈血は、身体から除去され、本明細書に記載の方法に従ってＭｒｅｇ−ｂｃを作製するために採取されることができる。あるいは、ドナーの脾臓から単離される骨髄単核球からＭｒｅｇ−ｂｃを作製することもできる。死ドナーから作製されたＭｒｅｇ−ｂｃを術後適用する場合、臓器移植中にこの目的のために慣例的に使用される免疫抑制薬を投与することによって移植臓器の拒絶反応を防止することができる。
【００７０】
別の実施形態では、生着または調節性Ｔ細胞に基づく医薬品の効果を促進または維持する方法において、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る医薬組成物を使用する。したがって、本発明はさらに、対象における生着または調節性Ｔ細胞に基づく医薬品の効果を促進または維持する方法であって、（ｉ）本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分を有効量投与すること、または（ｉｉ）本発明の第３の態様に係る医薬組成物を投与することを含む方法に関するものである。
【００７１】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、免疫調節特性および免疫抑制特性の他に、慢性炎症的な免疫プロセスを無効にするのを可能にする抗炎症特性を有する。したがって、本明細書において提供されるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、調節解除された免疫状態または過剰な炎症反応によって特徴付けられる疾患または障害、特に慢性炎症性疾患を処置するのにも有用である。そのような疾患または障害としては、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患および過敏反応が挙げられる。
【００７２】
したがって、さらに別の実施形態では、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る医薬組成物は、自己免疫疾患、炎症性疾患または過敏反応を処置または防止する方法において使用される。
【００７３】
自己免疫疾患を処置するためにＭｒｅｇ−ｂｃを使用する場合、上記疾患は、（ａ）主にＴ細胞によって媒介されるもの、（ｂ）主に抗体によって媒介されるもの、または（ｃ）主に免疫系のその他の細胞成分によって媒介されるものであり得る。疾患は限局性または全身性の自己免疫症状であり得る。Ｍｒｅｇ−ｂｃ療法で処置される自己免疫症状の種類は本発明によって限定されないが、例えば、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎およびその他の全身性自己免疫症状；関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチおよびその他の炎症性関節炎；潰瘍性大腸炎、クローン病およびその他の炎症性腸疾患；自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変およびその他の自己免疫性肝疾患；皮膚小血管性血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎、川崎病、および自己免疫を病因とするその他の大型、中型または小型の血管炎；多発性硬化症（ＭＳ）および神経免疫学的障害；Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺機能障害、自己免疫性下垂体機能障害およびその他の自己免疫性内分泌学的障害；溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、および血液および骨髄のその他の自己免疫障害；乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡およびその他の自己免疫性皮膚症状が挙げられる。
【００７４】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、急性または慢性の炎症性疾患、および病態生理学的に重要な炎症性構成要素を有する疾患を処置するためにも有効である。処置される炎症性疾患は、限局性または全身性であり得る。Ｍｒｅｇ−ｂｃでの処置による恩恵を受ける炎症性の疾患または症状の種類としては、限定されないが、動脈閉塞性疾患、例えば末梢動脈閉塞性疾患（ｐＡＯＤ）、重症虚血肢、動脈硬化症、脳梗塞、心筋梗塞、腎梗塞、腸梗塞、狭心症および、動脈の閉塞または狭窄によって引き起こされるその他の症状；心臓シンドロームＸとしても知られる微小血管狭心症；ＩＩ型糖尿病および肥満関連メタボリックシンドロームを含めた全身的に代謝障害に関連する炎症；湿疹を含めた皮膚疾患が挙げられる。好ましくは、処置される炎症性疾患は、動脈壁の内膜の慢性炎症によって特徴付けられるもの、例えば、心筋梗塞、脳卒中、重症虚血肢性血管炎およびｐＡＯＤである。
【００７５】
過敏反応の処置が望まれる場合には、過敏反応は、好ましくは、喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎、血管性浮腫、薬物過敏症および肥満細胞症の群から選択される。
【００７６】
ｐＡＯＤの処置が特に好ましい。動脈閉塞の程度もしくは場所かまたは顕著な併存疾患かのどちらかのために血管再生術に適さない患者においてｐＡＯＤは、甚だしく消耗性であること、および切断術が唯一の治療選択肢となる一般的にみられる症状であることが知られている。切断術は、相変わらず最終手段の処置であり、比較的高い死亡率との関連があり、ごく少数の患者だけが後に完全な可動性を回復させる。本発明の過程において、本明細書に記載の方法によって得られるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、血管新生特性を有することが見出された。Ｍｒｅｇ−ｂｃは、ＶＥＧＦ、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、ＰＤＧＦＢおよびＭＤＫなどの血管新生促進性成長因子の基礎発現および刺激発現によって新生血管形成、すなわち新しい血管の形成を能動的に促進する。詳しくは、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、ＴＬＲ４リガンドで刺激されると高レベルの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生する。詳しくは、Ｍｒｅｇ−ｂｃは、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）の発現を誘導することが本発明において見出された。文献では、ＶＥＧＦ−Ｃは、生体内で新生血管形成を効果的に刺激する血管新生因子であることが報告されている［１６］。
【００７７】
一実施形態において、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、虚血肢内に筋肉内注射または皮下注射される。虚血組織内でＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、不可避的に、ＴＬＲ４作動物質として作用する細菌構成要素および壊死組織構成要素（例えばＨＭＧＢ１）に曝されることになる。それゆえ、Ｍｒｅｇ−ｂｃは、血管新生促進性成長因子の局所的分泌によって組織再生を促進するために使用することができる。別の実施形態では、製造工程中に生体外でＭｒｅｇ−ｂｃ細胞をＴＬＲリガンドで刺激して、それらによるＶＥＧＦの高レベルの産生を確保してもよい。上記ＴＬＲリガンドとしては、限定されないが、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）またはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）が挙げられる。本発明のＭｒｅｇ−ｂｃで処置されるｐＡＯＤは、いかなる等級または部類のｐＡＯＤであってもよい。例えば、ｐＡＯＤは、Ｉ度のｐＡＯＤ、区分１〜４、またはＩＩ〜ＩＶ度のｐＡＯＤであり得る。
【００７８】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃは、血管新生特性を有し、新生血管形成を必要とする他の疾患または症状におけるそれらの使用は本発明において企図される。それゆえ、本発明はさらに、低酸素組織における血管新生もしくは血管発生を誘導する方法、組織再構成、組織再生、線維症の防止もしくは軽減に関与することによって組織修復プロセスを促進する方法、虚血性疼痛を軽減する方法、または大幅な肢切断術を回避する方法において使用される、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る医薬組成物に関する。したがって、本発明は、低酸素組織における血管新生もしくは血管発生を誘導する方法、組織再構成、組織再生、線維症の防止もしくは軽減に関与することによって組織修復プロセスを促進する方法、虚血性疼痛を軽減する方法、または大幅な肢切断術を回避する方法であって、（ｉ）本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分を有効量投与すること、または（ｉｉ）本発明の第３の態様に係る医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【００７９】
自己免疫疾患、炎症性疾患または過敏反応の処置は、移植用途との関連において上に述べた、患者にとって同種異系である単球に由来するＭｒｅｇ−ｂｃか、または処置を必要とする患者にとって自家である単球かのどちらかによって達成することができる。可能な場合には、自己免疫疾患、炎症性疾患または過敏反応の処置は、自家単球を使用して行うことになる。この目的のために、Ｍｒｅｇ−ｂｃは、同時的な局所筋肉内注射を伴って、または伴わずに、静脈内投与されることができる。
【００８０】
さらに別の実施形態では、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞もしくはその細胞レベル以下の画分または本発明の第３の態様に係る医薬組成物は、遺伝子療法を送達するためのビヒクルとして使用する。したがって、本発明は、遺伝子療法を送達する方法であって、（ｉ）導入遺伝子を含んだ、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を有効量投与すること、または（ｉｉ）導入遺伝子を含んだ、本発明の第２の態様に係るＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を含む医薬組成物を投与することを含む、当該方法に関する。
【００８１】
第５の態様によれば、本発明は、免疫調節性マクロファージ細胞の細胞レベル以下の画分を作製するための工程であって、
（ａ）本発明の第１の態様との関連において記載した免疫調節性マクロファージを提供することと、
（ｂ）免疫調節性マクロファージ細胞を分解して細胞レベル以下の画分を提供することと、
（ｃ）細胞レベル以下の画分を得ることと
を含む工程に関する。
【００８２】
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞は、従来の方法にしたがって分解することができる。例えば、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を低浸透圧溶液、洗浄剤または酸で処理することによって細胞を溶解させることができる。あるいは、凍結解凍もしくは加熱、音波処理、照射、機械的破壊または長期貯蔵によって細胞を分解することができる。方法の最後のステップでは、完全タンパク質画分、膜タンパク質画分、細胞質タンパク質画分などの、細胞の細胞レベル以下の画分が得られる。これらの画分は、上記治療目的のために生Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の代わりに使用することができる。あるいは、画分をさらに精製して特定タンパク質、例えばＭＨＣタンパク質を単離することができる。
【００８３】
したがって、第６の態様によれば、本発明は、免疫調節性Ｔ細胞を作製するための工程であって、
（ａ）対象のＴ細胞を得ることと；
（ｂ）Ｔ細胞を、請求項１４〜１８のいずれかに記載の免疫調節性マクロファージ細胞またはその細胞レベル以下の画分と共に培養することと；
（ｃ）培地から免疫調節性Ｔ細胞を得ることと
を含む工程に関する。
【００８４】
本明細書中の他の所に記載されているように、Ｍｒｅｇ−ｂｃと共に培養されたＴ細胞は、Ｔ細胞増殖を阻害する。したがって、上記方法から得られた免疫調節性Ｔ細胞を、単独で、または本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞と組み合わせて、本明細書中の他の所で述べた疾患または障害のいずれかの処置のために使用することができる。最初のステップでは、対象の血液試料からのＴ細胞を得る。細胞は、例えば、血液試料もしくはアフェレーシス済み液から、または対象の組織から、例えば骨髄もしくは脾臓から、得ることができる。細胞は、従来の方法によって、例えば血液からの細胞の場合には静脈穿刺によって、得ることができる。上記方法で使用するＴ細胞は、例えば、ＣＤ３＋  Ｔ細胞またはそのサブセットであろう。ＣＤ３＋  Ｔ細胞は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞と共に培養する前に、従来の方法、例えば磁気マイクロビーズ分離またはフローサイトメトリー選別によって精製または濃縮することができる。
【００８５】
その後、Ｔ細胞を本発明のＭｒｅｇ−ｂｃと接触させる。様々なＭｒｅｇ：Ｔｒｅｇ比で細胞を接触させることができる。例えば、１：５〜５：１、好ましくは１：２〜２：１のＭｒｅｇ：Ｔｒｅｇ比で細胞画分を接触させることができる。より好ましくは、Ｍｒｅｇ：Ｔｒｅｇ比は約１：１である。共培養法のために様々な培地を使用することができる。培地は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を作製する方法との関連において上に記載したものであり得る。好ましい実施形態では、培地は、ＬｏｎｚａからのＸ−ｖｉｖｏ１０である。培地は、さらなる添加剤、例えばＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒト組換えＭ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦを含有し得る。Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの量は、本明細書中の他の所で言及した範囲、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜２５ｎｇ／ｍｌにあるであろう。培地はさらに、他の添加剤、例えばＧｌｕｔａｍａｘを１〜５ｍＭ、好ましくは２ｍＭの量で含有してもよい。
【００８６】
細胞は、１〜８日間、好ましくは少なくとも３日間、少なくとも４日間、または少なくとも５日間共培養されることになる。所定の培養期間の後、Ｔ細胞は、従来の方法、例えばＣＤ４+  ＣＤ２５+  ＴＩＧＩＴ+  ＦｏｘＰ３+  Ｔｒｅｇに関して細胞を濃縮することによって、再単離され得る。必要であれば、細胞をさらに医薬品として製剤化することができる。
【００８７】
第７の態様によれば、本発明は、免疫調節性マクロファージ細胞を検出する方法であって、
（ａ）マクロファージ細胞を含む試料を提供することと；
（ｂ）上記試料においてＤＨＲＳ９タンパク質の存在および／またはＤＨＲＳ９遺伝子の発現を検出することと
を含み、ＤＨＲＳ９タンパク質の存在および／またはＤＨＲＳ９遺伝子の発現が、免疫調節性マクロファージ細胞を試料中に含んでいることを指し示すものである方法に関する。
【００８８】
方法は、免疫調節性マクロファージ細胞（Ｍｒｅｇ）と、その他の活性化状態にあるマクロファージ、例えば単球由来マクロファージ（Ｍφ）、例えば、休止Ｍφ、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ刺激Ｍφ、ＩＬ−４刺激Ｍφおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）刺激Ｍφとを、区別するために使用することができる。ＤＨＲＳ９の発現はＭｒｅｇにおいてのみ認められたことから、このマーカーは、マクロファージの異種集団、例えばＭｒｅｇと少なくとも１つの以下のマクロファージ種：休止Ｍφ、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ刺激Ｍφ、ＩＬ−４刺激Ｍφおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）刺激Ｍφの中のＭｒｅｇを含む集団を識別するために使用することができる。ＤＨＲＳ９マーカーの検出は、ＤＨＲＳ９ポリペプチドまたはその断片に対する標準的な抗体を使用してフローサイトメトリーによって達成することができる。ＤＨＲＳ９の発現は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびその他の慣例的な方法によって検出することができる。
【００８９】
第８の態様において本発明は、マクロファージの異種集団から免疫調節性マクロファージ細胞を単離する方法であって、
（ａ）マクロファージの異種集団を提供することと；
（ｂ）免疫調節性マクロファージ細胞を、ＤＨＲＳ９タンパク質に特異的に結合する分子に対するそれらの親和性によって単離することと
を含む方法を提供する。
【００９０】
例えば、一実施形態において、マクロファージの異種集団の中の免疫調節性マクロファージ細胞は、ＤＨＲＳ９に対して向けられる抗体と結合させることによって単離することができる。そのような抗体は、モノクローナル由来のものであってもよいし、ポリクローナル由来ものであってもよい。好ましい実施形態では、抗ＤＨＲＳ９抗体は、固相、例えばマイクロタイタープレートウェルの底に固定され得る。マクロファージ集団は、免疫調節性マクロファージ細胞の表面に存在するＤＨＲＳ９に対する抗ＤＨＲＳ９抗体の結合を可能にすべくウェル内でインキュベートされる。未結合のマクロファージを洗い流した後、免疫調節性マクロファージ細胞の一様な集団が得られる。別の実施形態では、抗ＤＨＲＳ９抗体を磁気ビーズの表面に固定することができる。ビーズは、ＤＨＲＳ９に対する抗体の結合を可能にすべくマクロファージ集団と共にインキュベートされる。マクロファージ集団を含有する溶液からビーズを分離した後、免疫調節性マクロファージ細胞の一様な集団が得られる。
【００９１】
したがって、さらに別の態様において本発明は、ＤＨＲＳ９に特異的に結合する分子、特に抗ＤＨＲＳ９抗体の、免疫調節性マクロファージ細胞の検出または単離のための使用に関する。
【実施例】
【００９２】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、無菌医薬品の製造に関する現行のＧＭＰ原則に準拠して製造した。各処理ステップにおいて、製品、材料および設備を汚染物および不純物から保護する注意を払う。
【００９３】
実施例１：Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の作製
健常ヒトドナーを白血球搬出に供して、Ｍｒｅｇ−ｂｃ生成の出発物質として使用する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採集した。全てのドナーは、白血球搬出の３０日前までに感染性疾患を含めた該当する疾患マーカーに関してスクリーニングされた。ドナーは白血球搬出の日に同じ疾患マーカーに関して再スクリーニングされた。白血球搬出は、Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ  Ｃｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ装置またはそれに相当するものを使用して行った。
【００９４】
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを製造業者の使用説明書に従って使用してＣＤ１４＋単球を白血球搬出産物から単離した。簡単に述べると、０．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液で満たしたバッグ内に白血球搬出産物を移した。製造業者の使用説明書に従って、細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ１４試薬で標識する前に１回洗浄した。標識細胞懸濁液を無菌管材一式に連結し、磁気分離によってＣＤ１４＋単球を単離すべくＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置に取り付けた。正に単離されたＣＤ１４＋単球画分を培地で洗浄してＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離用緩衝剤を除去した。
【００９５】
その後、細胞培地の単球密度を１０6細胞／ｍｌに調製した。工程内管理としてのフローサイトメトリーによる分析のためにＣＤ１４＋単球を採取した。工程関連の計算において細胞数は、ＷＢＣパラメーターを全白血球数として用いて自動血液計数器を使用して決定した。全ての細胞種の生存能をフローサイトメトリーによって評価した。
【００９６】
１０％の男性限定ヒトＡＢ血清（まとめ合わせて熱不活性化させたもの）と、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）と２５ｎｇ／ｍｌの組換えヒト単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）とを補充したＲＰＭＩ培地中に、単離したＣＤ１４＋単球を１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。
【００９７】
この単球懸濁液をＭｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）細胞分化バッグ内へ、各バッグに１×１０6細胞／ｃｍ2内面積が播種されるように分配した。培養のために、３６〜３８℃、５±１％のＣＯ2、６０％以上の湿度に設定したインキュベータ内の棚に分化バッグを平置きした。単球を１日間にわたって培養バッグの下面上に沈降させた。１日目にバッグを反転させて反対側の面に単球を付着させた。培養物をさらに５日間インキュベータ内に維持した。
【００９８】
単球からＭｒｅｇ−ｂｃへの最終分化を誘導しかつインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を誘導するために、単球を２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの添加で刺激した。ＩＦＮ−γの添加後、分化バッグをもう１回反転させた。次いでバッグをさらに１８〜２４時間、３６〜３８℃、５±１％のＣＯ2、６０％以上の湿度でインキュベートした。
【００９９】
７日目に分化Ｍｒｅｇ−ｂｃを採集した。並行する全ての培養バッグからの細胞をまとめ合わせ、表現型および機能の分析に先立って洗浄した。
【０１００】
実施例２：Ｍｒｅｇ−ｂｃの表現型特性評価
実施例１の方法で得られたＭｒｅｇ−ｂｃの表現型を詳しく分析した。培養中、マクロファージは、細胞が敷き詰められた上皮様形態を採用した独特の形態を呈して、ほぼコンフルエントな単層を形成する（図６Ａを参照のこと）。個々のマクロファージは、突出した中央本体と培養容器の表面を対称的に覆って広がる細胞質の薄い裾部とを有する大型の密集した顆粒状の細胞である。透過型電子顕微鏡検査によるマクロファージの超微形態的調査によって、下地面に非常に密接して付着している大型の平坦な細胞の印象が確認される（図６Ｂを参照のこと）。大部分の点において、マクロファージの超微形態的外観は活性化マクロファージに典型的なものである：突起部が細胞の外周および上面から伸長し；核が十分豊富なクロマチンを伴って活動的に見受けられ；そして、細胞質が多数の細胞内小胞、脂質封入体および顕著な滑面小胞体を含有する。
【０１０１】
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞の細胞表面表現型はフローサイトメトリーによって特徴付けられた。フローサイトメトリーによる分析のためのＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を作製するために、細胞を採集してＣａ2+／Ｍｇ2+不含ＤＰＢＳで１回洗浄し、その後、１％のＢＳＡと０．０２％のＮａＮ3と１０％のＦｃＲ  ｂｌｏｃｋ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とを含有するＣａ2+／Ｍｇ2+不含ＤＰＢＳ中に１〜５×１０5細胞／１００μｌで再懸濁させた。次いで、試料を４℃で１５分間インキュベートした。様々な製造業者から蛍光色素結合抗体を入手し、細胞懸濁液と接触させ、試料を渦流撹拌してから暗所にて４℃で２０分間インキュベートした。１０μｌの７−ＡＡＤを添加した後、各試料をしばらく渦流撹拌し、さらに１０分間４℃で暗所にてインキュベートした。続いて、試料を冷たいＣａ2+／Ｍｇ2+不含ＤＰＢＳで２回洗浄し、分析のために再懸濁させた。製造業者の説明書に従ってＦＡＳＥＲ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を２回使用することを用いてＣｌｅｃ−９ａ信号を増強した。細胞内染色のために、細胞をまず上記の細胞表面抗原について染色し、その後、細胞内固定＆透過化用緩衝剤セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の説明書に従って使用して固定および透過化を行った。１０％のＦｃＲ  ｂｌｏｃｋを含有する透過化用緩衝液中に細胞を再懸濁させ、その後、暗所にて４℃で１５分間インキュベートした。蛍光色素結合抗体を細胞懸濁液と接触させ、試料をしばらく渦流撹拌し、その後、暗所にて３０分間４℃でインキュベートした。細胞を透過化用緩衝液で２回洗浄し、分析のために再懸濁させた。データはＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ７．６ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、米国）またはＫａｌｕｚａ１．１ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ドイツ）で解析した。
【０１０２】
このフローサイトメトリー分析は、本発明の生ヒトＭｒｅｇ−ｂｃ細胞がＣＤ１４-/low  ＣＤ２０９-/low  ＣＤ１６-/low  ＣＤ８０-/low  ＣＤ８６+  ＣＤ１０+/-  ＣＤ１０３+/-  ＣＤ３８-/low  ＣＤ８５ｈ+  ＣＤ２５８+  シンデカン−３-/low  Ｃｌｅｃ−９ａ+の表現型を呈することを明らかにした（図２）。
【０１０３】
実施例３：Ｍｒｅｇ表現型の特有性
形態学、細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生および全体的な遺伝子発現プロファイルの観点からＭｒｅｇと比較するためのマクロファージ種のパネルを生成することによって、Ｍｒｅｇと当該技術分野において既知のその他の活性化状態にあるマクロファージとの表現型の関係性をはっきりさせた。Ｍｒｅｇは、それらの特徴的な形態（図６Ｃを参照のこと）およびそれらの際立った細胞表面表現型（図６Ｄを参照のこと）によって容易にこれら全ての他のマクロファージ種と区別することができた。詳しくは、Ｍｒｅｇは、ＣＤ１４を下方制御する点およびそれらに細胞表面のＣＤ１６、ＴＬＲ２およびＣＤ１６３の発現が欠如している点において独特であることが分かった。
【０１０４】
Ｍｒｅｇと比較マクロファージのパネルは、それらのサイトカインおよびケモカインの産生プロファイルによっても区別された。Ｍｒｅｇは恒常的にごく少量のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を産生し、検出可能な量のＩＬ−１２ｐ４０を分泌しない。Ｍｒｅｇは、検出可能なレベルのＴＧＦ−βおよび多量のＩＬ−１Ｒａを発現するが、ＩＬ−１０については他のマクロファージ種に比べて発現が著しく少ない。このサイトカイン分泌プロファイルは、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳへの曝露後に比較的安定的に保たれる。
【０１０５】
Ｍｒｅｇによって排他的に発現されるマーカーを同定するために、以前に記載された方法［１０］に従って、健常ドナーからの血小板採集の副産物として得られる末梢血白血球からＭｒｅｇとＩＦＮ−γ−Ｍφとを発生させた。手短に述べると、抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ）による正の選択によって、Ｆｉｃｏｌｌにより調製されたＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を単離し、次いで、６ウェルＣｅｌｌ＋プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ）において、１０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｌｏｎｚａ）と２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）と１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｌｏｎｚａ）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）と、０．１％のヒトアルブミン（ＣＳＬ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｈａｔｔｅｒｓｈｅｉｍ−ａｍ−Ｍａｉｎ）を担体とした２５ｎｇ／ｍｌのｒｈＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｎｏｒｄｅｎｓｔａｄｔ）とを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ）中に１０5細胞／ｃｍ2で播種した。培養６日目に、２５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−γ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で細胞をさらに１８〜２４時間刺激した。ヒト血清を１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ベルリン）で置き換えた以外はＭｒｅｇの場合と同一の条件下でＣＤ１４＋単球を培養することによって、ＩＦＮ−γ刺激されたマクロファージ（ＩＦＮ−γ−Μφ）を発生させた。他の規定の分極状態にあるマクロファージ（Μφ）は、文献［１２］〜［１５］から採用したプロトコールに従って正の単離されたＣＤ１４＋単球から発生させた。手短に述べると、以下：休止Μφの場合、２０％のＦＣＳと１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとを補充、７日間；リポ多糖（ＬＰＳ）活性化Μφの場合、２０％のＦＣＳと１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとを補充、さらに６日目に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γとを添加；ＩＬ−４刺激Μφの場合、２０％のＦＣＳと１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとを補充、さらに６日目に２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加；Ｉｇ刺激Μφの場合、１０％のＦＣＳと１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとを補充、プラスチック製品内で成長した細胞をヒトＩＶＩｇ（ＰｒｉｖｉｇｅｎＴＭ、ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）で前コート、６日目に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加；グルココルチコイド（ＧＣ）刺激Μφの場合、２０％のＦＣＳと１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとを補充、さらに６日目に１０−７Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加、という補充された１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭとを含有するＲＰＭＩに基づく培地中で１０5細胞／ｃｍ2で単球を７日間、Ｃｅｌｌ＋プラスチック製品（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内で培養した。
【０１０６】
マウスにヒトＭｒｅｇ溶解物をワクチン接種することによって一連のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発生させた。これらのｍＡｂを免疫細胞化学によってスクリーニングすることによって、Ｍｒｅｇと強く反応するが休止ＭφとＬＰＳ＋ＩＦＮγ刺激ＭφとＩＬ−４刺激Ｍφと免疫グロブリン（Ｉｇ）刺激Ｍφとを含めた他の単球由来マクロファージ（Ｍφ）とは反応しないｍＡｂクローン（ＡＳＯＴ１）を同定した（図３Ａを参照のこと）。その抗原を免疫沈降させて配列決定することにより、ＡＳＯＴ１  ｍＡｂは、あまり研究されていないＳＤＲファミリーのレチノール脱水素酵素であるＤＨＲＳ９を認識することが示された（図３Ｂを参照のこと）。定量ＰＣＲは、ＤＨＲＳ９  ｍＲＮＡ発現がＭｒｅｇに限定されていることを裏付けた（図３Ｃ）。ＤＨＲＳ９のＮ末端エピトープに対して発生させたウサギポリクローナル抗体は、ＡＳＯＴ１によって免疫沈降させた約３５ｋＤのタンパク質と反応した（図３Ｄを参照のこと）。ＤＨＲＳ９を認識する市販のモノクローナル抗体（クローン３Ｃ６）も、ウサギ抗体によって検出された同タンパク質と反応したことから、ＡＳＯＴ１もウサギポリクローナル抗体もＤＨＲＳ９を認識すると確信を持って結論付けることができる。このウサギｐＡｂを使用して、ＤＨＲＳ９タンパク質発現はＭｒｅｇに独特のものであることが示された（図３Ｅ）。
【０１０７】
全ゲノム発現プロファイリングを用いて、Ｍｒｅｇと他の活性化状態のマクロファージとの間での表現型近縁性についての包括的見識を得た。３名の別個のドナーから並行して作製された９つの比較マクロファージ種のパネルについてマイクロアレイ分析を行った。任意の２つの試料間で２０倍超の差を有して発現される遺伝子を選択し、階層的にクラスター化させたところ、Ｍｒｅｇ試料は他のいかなるマクロファージ試料よりもＩＦＮ−γ未処理ＭｒｅｇおよびＬＰＳ刺激Ｍｒｅｇに最も類似していることが明らかになった。このクラスタリングパターンは、全ての顕著に異なる発現をするプローブを解析に使用した場合、安定したままであった。Ｍｒｅｇ試料は、他のマクロファージ種よりもＩｇ刺激Ｍ２ｂマクロファージにより類似しており、態様１のステップ（ｃ）に係るＭｒｅｇ表現型の発達におけるＩｇによる刺激の重要性が強調された。休止マクロファージおよびＩＦＮ−γ刺激マクロファージはＭ２ａマクロファージおよびＭ２ｃマクロファージと共にクラスター化された。古典的に活性化されたＭ１マクロファージと比較マクロファージ種との類似性は、比較マクロファージ同士の類似性よりも低かった。これらの観察結果から、Ｍｒｅｇは独特の活性化状態にあり、ＬＰＳでの刺激によるＭ１表現型への再分極に対して比較的不応性であると結論付けられ得る。
【０１０８】
マイクロアレイのアレイ結果は、Ｍｒｅｇとその他全ての比較マクロファージとを区別する下方制御遺伝子の一覧の中にＣＤ１６３、ＩＬ−１０およびＣＤ１４が見当たらなかった限りにおいて、フローサイトメトリーでの知見と一致していた。Ｍｒｅｇによって独特に上方制御された遺伝子セットの中でもＣＤ２５８（ＴＮＦＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ）およびＣＤ８５Ｈ（ＩＬＴ１、ＬＩＬＲＡ２）は、Ｍｒｅｇ同一性についての有用なマーカーであると同定された。ＩＦＮ−γ刺激マクロファージによるのではなくＭｒｅｇによるＣＤ２５８およびＣＤ８５ｂの発現がフローサイトメトリーによって確認された（図７）。
【０１０９】
ＣＤ４５+  ＣＤｌｌｂ+  ＣＤｌｌｃ+  ＣＤ１４-/low  ＣＤ２０９-/low  ＣＤ１６-/low  ＣＤ８０-/low  ＣＤ８６+  ＣＤ１０+/-  ＣＤ１０３+/-  ＣＤ３８-/low  ＣＤ８５ｈ+  ＣＤ２５８+  シンデカン−３-/low  Ｃｌｅｃ−９ａ+  ＤＨＲＳ９+およびＡｒｇ−１+およびＩＤＯ+の一群は、Ｍｒｅｇの表現型の厳密な安定した定義である。
【０１１０】
実施例４：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγnullマウスにおける同種異系Ｍｒｅｇ−ｂｃ処置による活性化末梢血由来ヒトＴｒｅｇの発生
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を実施例１に記載されているとおりに作製した。ヒトＴ細胞を使用して免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγnull（ＮＳＧ）マウスを再構成した。これらのマウスは、本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞で処置されたかまたは処置されなかったかのどちらかであった（図８Ａを参照のこと）。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞処置から５日後にヒトＴ細胞をレシピエントマウスの脾臓から回収した。Ｍｒｅｇ処置マウス中のＴ細胞集団は、Ｍｒｅｇ−ｂｃで処置されなかったレシピエントと比べてＦｏｘＰ３+  ＴｒｅｇおよびＴＩＧＩＴ+  ＦｏｘＰ３+  Ｔｒｅｇが富化されていた（図８Ｂを参照のこと）。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞で処置されたＮＳＧマウスでは、未処置動物に比べてヒトＩＬ−１０の血清レベルが有意に高かった（図８Ｃを参照のこと）。この実施例は、ヒトＭｒｅｇ−ｂｃが生体内で同種異系ヒトＴ細胞と直接相互作用してＴｒｅｇ発達を誘導することができることを実証している。
【０１１１】
実施例５：術前におけるＭｒｅｇ−ｂｃ細胞による腎移植レシピエントの処置
本発明のＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を実施例１に記載されているとおりに作製した。多発性嚢胞腎に起因する末期腎不全を有する４３歳の有望な生体ドナー腎移植レシピエントにＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を投与した。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞は、後に息子に腎提供したレシピエントの健常な６２歳の父親から採取した単球から作ったものである。ドナーおよびレシピエントは、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−ＤＲ遺伝子座に単一の不一致を有していた。
【０１１２】
合計４．７５×１０8個の生Ｍｒｅｇ−ｂｃを緩徐な中心静脈輸注によって投与した。副作用には遭遇しなかった。具体的には、肺血管閉塞、右心負荷、輸血反応、過敏反応または生化学的障害の兆候はなかった。Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞による処置は、抗ドナーＨＬＡ抗体をレシピエントが産生することを引き起こさなかった。
【０１１３】
レシピエントは今や同種異系移植片の機能が安定しており移植後から１５ヶ月以上経っている。レシピエントは現在、タクロリムスおよびＭＭＦを含む低用量免疫抑制計画で維持されている。この事例は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を術前腎移植レシピエントに投与することの妥当性を例証している。
【０１１４】
実施例６：Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞による血管新生因子の産生
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞がモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）によって刺激されると血管新生因子ＶＥＧＦ−Ａを産生するか否かを試験した。この実験の段取りを図９に描写する。
【０１１５】
１つ目の試験条件では、６日目の２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γによる標準的刺激を含めて、実施例１に記載しているとおりに７日目までＭｒｅｇ−ｂｃを成長させた。７日目にＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を採集し、２４ウェルプレートにおいて１ウェルあたり０．５×１０6個の細胞を、１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０＋１％のＨＡＢＳ＋Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ＋２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸの中に再播種した。次いで、これらの再播種したＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激するかあるいは刺激しなかった。並行して、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を採集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１４、ＣＤ１０、ＣＤ１６、ＣＤ３８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８５ｈ、ＣＤ１０３、ＣＤ２５８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３について調査した。
【０１１６】
２つ目の条件では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を培養６日目に１００ｎｇ／ｍｌのＭＰＬＡによって追加で刺激し、それと同時にＩＦＮ−γを添加した。７日目に、条件２から採集したＭｒｅｇ−ｂｃ細胞を条件１と同様に再播種および刺激した。さらに、条件２からのＭｒｅｇ−ｂｃ細胞をフローサイトメトリーによってマーカーＣＤ１４、ＣＤ１０、ＣＤ１６、ＣＤ３８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８５ｈ、ＣＤ１０３、ＣＤ２５８、ＣＤ２０９およびシンデカン−３について分析した。
【０１１７】
３つ目の条件では、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞を通常どおり６日目に２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γで刺激した。７日目に細胞をさらに２４時間、１００ｎｇ／ｍｌのＭＰＬＡでさらに刺激した。次いで８日目に、条件１および２と同様に分析のために細胞を採集した。
【０１１８】
３つ全ての条件からの細胞によるＶＥＧＦ−Ａの分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。３つ全ての条件からの細胞の表現型をフローサイトメトリーによって比較して、Ｍｒｅｇ−ｂｃを特徴付ける細胞表面表現型の試験条件下での安定性を評価した。
【０１１９】
結果：ＶＥＧＦ−Ａ判定の結果を図９に描写する。６日目または７日目における１００ｎｇ／ｍｌのＭＰＬＡによる処理は、ＬＰＳによって誘導されるＶＥＧＦ発現を増強することが分かった。１００ｎｇ／ｍｌのＭＰＬＡによる処理はＭｒｅｇ−ｂｃ表現型を２４時間以内に劇的に変化させず、ＣＤ８０発現のごく僅かな上方制御のみが認められた。これらの例は、Ｍｒｅｇ−ｂｃ培養中のＭＰＬＡ処理が、Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞によるＶＥＧＦ−Ａの産生を患者への適用前に増強する有用な方法であり得たことを指し示している。
【０１２０】
実施例７：Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞による血管新生因子の産生
Ｍｒｅｇ−ｂｃ細胞が血管新生関連因子を産生するか否かを試験した。この目的のために、５名の新たなドナーから３０×１０6ＣＤ１４＋単球／ドナーよりも多く単離した。培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％のＨＡＢＳ＋２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ＋ＰＳ＋２５  ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＭ−ＣＳＦ）を５個の５００ｍｌバッグのために調製した。ドナー１人あたり１つの５００ｍｌバッグに３０×１０6単球／バッグを充填した。６日目に全てのバッグをＩＦＮ−γで刺激した。７日目にＭｒｅｇを採集して数を数えた。
【０１２１】
続いて、Ｍｒｅｇ培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％のＨＡＢＳ＋２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ＋ＰＳ＋２５  ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＭ−ＣＳＦ）を再培養のために調製した。正確に１５ｍｌの培地を８本の５０ｍｌ管の各々に加えた。ＮａＣｌ溶液または１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅｎｚｏ）を以下のとおりに添加し、渦流撹拌した。
2019508067.tif 000003
【０１２２】
２４ウェルプレートに１×１０6細胞／ウェルのＭｒｅｇを播種した。１条件および１ドナーあたり１ウェルとした。
2019508067.tif 000004
【０１２３】
培養物を正確に４８時間インキュベートした。上清を採集して浄化した。５００μｌ以上のアリコート２つを調製した。試料は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＴＮＦ−αについてＥＬＩＳＡにより分析する時まで−８０℃で貯蔵した。
【０１２４】
結果：ＥＬＩＳＡの結果を図１０に示す。図１０Ａから分かるように、ＬＰＳと組み合わせたＭｒｅｇはＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＴＮＦ−αを誘導したが、ＶＥＧＦ−Ｄを誘導しなかった。高張条件下でＭｒｅｇは、ＶＥＧＦ−Ｃを発現するがＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＴＮＦ−αを発現しないように誘導された（図１０Ｂ）。
【０１２５】
文献
[1]   Geissler EK, Hutchinson JA. Cell therapy as a strategy to minimize maintenance immunosuppression in solid organ transplant recipients. Curr Opin Organ Transplant 2013; 18: 408-15.
[2]   Tang Q, Bluestone JA, Kang SM. CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cell therapy in transplantation. J Mol Cell Biol 2012; 4: 11-21.
[3]   Moreau A, Varey E, Bouchet-Delbos L, et al. Cell therapy using tolerogenic dendritic cells in transplantation. Transplant Res 2012; 1: 13.
[4]   Broichhausen C, Riquelme P, Geissler EK, et al. Regulatory macrophages as therapeutic targets and therapeutic agent in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant 2012; 17: 332-42.
[5]   Hutchinson JA, Riquelme P, Sawitzki B, et al. Cutting edge: immunological consequences and trafficking of human regulatory macrophages administered to renal transplant recipients. J Immunol 2011; 187: 2072-8.
[6]   Hutchinson JA, Riquelme P, Brem-Exner BG, et al. Tranplant acceptance-inducing cells as an immune-conditioning therapy in renal transplantation. Transpl Int 2008; 21: 728-41.
[7]   Hutchinson JA, Brem-Exner BG, Riquelme P, et al. A cell-based approach to the minimization of immunosuppression in renal transplantation. Transpl Int 2008; 21: 742-54.
[8]   Hutchinson JA, Roelen D, Riquelme P, et al. Preoperative treatment of a pre-sensitized kidney transplant recipient with donor-derived transplant acceptance-inducing cells. Transpl Int 2008; 21: 808-13.
[9]   Hutchinson JA, Govert F, Riquelme P, et al. Administration of donor-derived transplant acceptance-inducing cells to the recipients of renal transplants from deceased donors is technically feasible. Clin Transplant 2009; 23: 140-5.
[10]  Hutchinson JA, Riquelme P, Geissler EK, and Fandrich F. Human regulatory macrophages. Methods Mol. Biol. 2011; 677: 181-192.
[11]  Riquelme P, Tomiuk S, Kammler A, Fandrich F, Schlitt HJ, Geissler EK, Hutchinson JA. Mol Ther. 2013; 21(2):409-22.[12]    Martinez FO, Gordon S, Locati M, Mantovani A. J Immunol 2006;177: 7303-7311.
[13]  Munn DH, Shafizadeh E, Attwood JT, Bondarev I, Pashine A, Mellor AL. J Exp Med 1999;189: 1363-1372.
[14]  Sironi M, Martinez FO, D'Ambrosio D et al. J Leukoc Biol 2006;80: 342-349.
[15]  Kzhyshkowska J, Workman G, Cardo-Vila M et al. J Immunol 2006;176: 5825-5832.
[16]  Cao Y, Linden P, Farnebo J, Cao R, Eriksson A, Kumar V, Qi JH, Claesson-Welsh L, Alitalos K,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 14389-14394.
【図１】
2019508067.tif 000005
【図２】
2019508067.tif 000006
【図３】
2019508067.tif 000007
【図４】
2019508067.tif 000008
【図５】
2019508067.tif 000009
【図６】
2019508067.tif 000010
【図７】
2019508067.tif 000011
【図８】
2019508067.tif 000012
【図９】
2019508067.tif 000013
【図１０】
2019508067.tif 000014
【国際調査報告】
2019508067.tif 000015
2019508067.tif 000016
2019508067.tif 000017