(57)【要約】本発明は、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に対して優れた安定性を示す多量体コード核酸を提供するものである。一部の実施形態では、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）は、３’末端を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、該多量体コード核酸の化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする。本発明は、例えば、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）であって、３’末端を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、前記多量体コード核酸の化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、前記多量体コード核酸を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）であって、３’末端を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、前記多量体コード核酸の化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、前記多量体コード核酸。
【請求項２】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が合成ポリリボヌクレオチドである、請求項１に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が合成ポリデオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載のＭＣＮＡ。
【請求項４】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が、合成ポリデオキシリボヌクレオチド、またはポリリボヌクレオチドである、請求項１に記載のＭＣＮＡ。
【請求項５】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が関心対象のタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項６】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が同一のタンパク質をコードする、請求項５に記載のＭＣＮＡ。
【請求項７】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が異なるタンパク質をコードする、請求項５に記載のＭＣＮＡ。
【請求項８】
前記化合物が３つ以上のコードポリヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項９】
前記化合物が４つ以上のコードポリヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１０】
前記化合物が５つ以上のコードポリヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１１】
前記コードポリヌクレオチドのうちの１つ以上が、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び／または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１２】
前記コードポリヌクレオチドのうちの前記１つ以上が３’ＵＴＲを含む、請求項１１に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１３】
前記３’ＵＴＲが長さ５〜２，０００のヌクレオチドである、請求項１２に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１４】
前記３’ＵＴＲが、中間にスペーサーを備えた複数の多重Ａセグメントを含む、請求項１２または請求項１３に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１５】
前記多重Ａセグメントの各々が、８個〜５０個の連続するアデノシンを含む、請求項１４に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１６】
前記複数の多重Ａセグメントが１〜１００の範囲である、請求項１４または請求項１５に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１７】
前記スペーサーが５〜１００の範囲の様々な長さを有する、請求項１４から請求項１６のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１８】
前記スペーサーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／または修飾された塩基を含む、請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項１９】
前記修飾された塩基が、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンから選択される、請求項１８に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２０】
前記３’ＵＴＲがシュードノット構造を含む、請求項１２から請求項１９のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２１】
前記３’ＵＴＲにポリアデニル化（ポリＡ）テールが付加されていない、請求項１２から請求項２０のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２２】
前記コードポリヌクレオチドのうちの１つ以上がポリＡテールを含む、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２３】
前記ポリＡテールが長さ２５〜５，０００のヌクレオチドである、請求項２２に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２４】
前記３’ＵＴＲがポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）に結合している、請求項１２から請求項２３のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２５】
前記３’ＵＴＲが「キッシングループ」配列モチーフを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２６】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドの前記３’末端が、３’−３’逆方向ホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド架橋を介して連結されている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチド架橋を含む前記ヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンからなる群から選択される、請求項２６に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチド架橋が、活性部分への少なくとも１つの共有結合を含む、請求項２６に記載のＭＣＮＡ。
【請求項２９】
前記活性部分が、標的群、ペプチド、造影剤、小分子、タンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡである、請求項２８に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３０】
前記３’−３’逆方向結合の近位にあるヌクレオチドが、１つ以上の三分岐ＧａｌＮａｃ標的化剤で官能化されている、請求項２６から請求項２９のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３１】
前記コードポリヌクレオチドが１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３２】
前記修飾されたヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンからなる群から選択される、請求項３１に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３３】
前記修飾されたヌクレオチドが、対応する天然塩基の１％〜１００％を置換している、請求項３２に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３４】
ウリジンの少なくとも２５％が２−チオウリジンで置き換えられている、請求項３３に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３５】
シチジンの１００％が５−メチルシチジンで置き換えられている、請求項３３または請求項３４に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３６】
前記修飾されたヌクレオチドがそのリボース環上で４’−チオ置換によりさらに修飾されている、請求項３１から請求項３５のいずれか１項に記載のＭＣＮＡ。
【請求項３７】
前記天然ヌクレオチドがそのリボース環上で４’−チオ置換により修飾されている、請求項１〜３６のいずれかに記載のＭＣＮＡ。
【請求項３８】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドが、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３７のいずれかに記載のＭＣＮＡ。
【請求項３９】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドが、酵素、受容体、リガンド、抗体の軽鎖もしくは重鎖、ヌクレアーゼ、及び／またはＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３８にいずれかに記載のＭＣＮＡ。
【請求項４０】
前記２つ以上のコードポリヌクレオチドが、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載のＭＣＮＡ。
【請求項４１】
送達ビヒクルで封入された、または送達ビヒクルと複合体を形成した、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のＭＣＮＡを含む組成物。
【請求項４２】
前記送達ビヒクルが、リポソーム、脂質ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマー、ウイルス、ゾルゲル、及びナノゲルからなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生するためのＭＣＮＡの送達方法であって、送達を必要とする対象に請求項１〜４２のいずれか１項に記載のＭＣＮＡを投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
前記ＭＣＮＡが、静脈内送達、皮下送達、経口送達、真皮下送達、経眼送達、気管内注射肺送達（例えば、吸入投与）、筋肉内送達、髄腔内送達、または関節内送達からなる群から選択される送達経路を介して投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＭＣＮＡが嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｈＣＦＴＲ）ｍＲＮＡをコードするコードポリヌクレオチドを含む、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＭＣＮＡがヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）ｍＲＮＡをコードするコードポリヌクレオチドを含む、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＭＣＮＡがヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡをコードするコードポリヌクレオチドを含む、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年４月８日に出願された米国仮出願第６２／３２０，０７３号に対する優先権を主張するものであり、その仮出願の開示は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（「ＳＬ＿ＳＨＲ−１２３７ＷＯ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０１７年４月７日に電子的に提出されたもの）を参照する。このテキストファイルは、２０１７年４月７日に作成されたものであり、サイズは４９，２４９バイトである。配列表の全内容が、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
核酸を用いた技術は種々の治療用途にますます重要になっており、治療用途には、以下に限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ療法、遺伝子療法、及び遺伝子編集などが数例として挙げられる。こうした治療用途には、一般的に、外因性ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の投与が必要になるが、これらのポリヌクレオチドの安定性が乏しいことが支障になる場合が多い。例えば、対象に投与した後に、ポリヌクレオチドの多くがヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼ）分解を受ける可能性がある。ヌクレアーゼ分解は、ポリヌクレオチドを標的細胞に到達させる機能または転写及び／もしくは翻訳させる機能に悪影響を及ぼし、その結果、外因性ポリヌクレオチドが所定の治療効果をもたらすのを妨げる恐れがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に対して優れた安定性を示す多量体コード核酸を提供するものである。本発明はまた、核酸を用いた治療に対する複雜度と有効性とを増加させることも可能にする。
【０００５】
一部の態様では、本発明は、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）であって、ポリヌクレオチド（コードまたは非コード）のうちの２つ以上の間で３’末端結合を介して１つ以上の非コードポリヌクレオチドに連結された１つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、該ＭＣＮＡの化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、該多量体コード核酸を提供する。一部の実施形態では、５’末端のうちの１つ以上が、５’末端キャップ構造を含むように修飾されている。特定の実施形態では、５’末端を有するコードポリヌクレオチドの１つ以上が５’末端キャップ構造を備えて、コードポリヌクレオチドの翻訳を促進する。特定の実施形態では、５’末端構造を有するポリヌクレオチドの１つ以上が５’末端キャップ構造を備えて、ＭＣＮＡの安定性を高める。
【０００６】
一部の態様では、本発明は、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）であって、３’末端を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、該多量体コード核酸の化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、該多量体コード核酸を提供する。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリデオキシリボヌクレオチドか、またはポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、関心対象のタンパク質をコードする。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、同一のタンパク質をコードする。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、異なるタンパク質をコードする。
【０００７】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、３つ以上のコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、該化合物は４つ以上のコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、該化合物は５つ以上のコードポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、コードポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び／または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、コードポリヌクレオチドのうちの１つ以上は３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは長さ５〜２，０００のヌクレオチドである。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、中間にスペーサーを備えた複数の多重Ａセグメントを含む。一部の実施形態では、多重Ａセグメントの各々は、８個〜５０個の連続するアデノシンを含む。一部の実施形態では、複数の多重Ａセグメントは１〜１００の範囲である。一部の実施形態では、スペーサーは５〜１００の範囲の様々な長さを有する。一部の実施形態では、スペーサーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／または修飾された塩基を含む。一部の実施形態では、修飾された塩基は、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンから選択される。一部の実施形態では、３’ＵＴＲはシュードノット構造を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲには、ポリアデニル化（ポリＡ）テールが付加されていない。一部の実施形態では、コードポリヌクレオチドのうちの１つ以上がポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、長さ２５〜５，０００のヌクレオチドである。一部の実施形態では、３’ＵＴＲはポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）に結合している。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは「キッシングループ」配列モチーフを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの３’末端は、３’−３’逆方向ホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド架橋を介して連結されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋を含むヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋は、活性部分への少なくとも１つの共有結合を含む。一部の実施形態では、活性部分は、標的群、ペプチド、造影剤、小分子、タンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡである。一部の実施形態では、３’−３’逆方向結合の近位にあるヌクレオチドは、１つ以上の三分岐（ｔｒｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）ＧａｌＮａｃ標的化剤で官能化されている。
【００１０】
一部の実施形態では、コードポリヌクレオチドは１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、対応する天然塩基の１％〜１００％を置換している。一部の実施形態では、ウリジンの少なくとも２５％は２−チオウリジンで置き換えられている。一部の実施形態では、シチジンの１００％は５−メチルシチジンで置き換えられている。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、リボース環上で４’−チオ置換によりさらに修飾されている。一部の実施形態では、天然ヌクレオチドは、リボース環上で４’−チオ置換により修飾されている。
【００１１】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける１つ以上のコードポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける１つ以上のコードポリヌクレオチドは、酵素、受容体、リガンド、抗体の軽鎖もしくは重鎖、ヌクレアーゼ、またはＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける１つ以上のコードポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド部分を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける２つ以上のコードポリヌクレオチドはそれぞれ、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける２つ以上のコードポリヌクレオチドはそれぞれ、酵素、受容体、リガンド、抗体の軽鎖もしくは重鎖、ヌクレアーゼ、及び／またはＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける２つ以上のコードポリヌクレオチドはそれぞれ、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド部分を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける第一のコードポリヌクレオチドは、第一のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含み、ＭＣＮＡにおける第二のコードポリヌクレオチドは、第一のタンパク質と同一のタンパク質である第二のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡにおける第一のコードポリヌクレオチドは、第一のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含み、ＭＣＮＡにおける第二のコードポリヌクレオチドは、第一のタンパク質とは異なる第二のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。特定の実施形態では、ＭＣＮＡにおける第一のコードポリヌクレオチドは、酵素、受容体、リガンド、抗体の軽鎖もしくは重鎖、ヌクレアーゼ、またはＤＮＡ結合タンパク質に分類される第一のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含み、ＭＣＮＡにおける第二のコードポリヌクレオチドは、第一のタンパク質とは異なるが第一のタンパク質と同類である第二のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。特定の実施形態では、ＭＣＮＡにおける第一のコードポリヌクレオチドは、酵素、受容体、リガンド、抗体の軽鎖もしくは重鎖、ヌクレアーゼ、またはＤＮＡ結合タンパク質に分類される第一のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含み、ＭＣＮＡにおける第二のコードポリヌクレオチドは、第一のタンパク質とは異なりかつ第一のタンパク質と異なる種類である第二のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む。特定の実施形態では、ＭＣＮＡにおける第一のコードポリヌクレオチドは、抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド部分を含み、ＭＣＮＡにおける第二のコードポリヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド部分を含む。
【００１４】
一部の態様では、本発明は、多量体核酸（ＭＮＡ）であって、ポリヌクレオチドのうちの２つ以上の間で少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含み、該ＭＮＡの化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、該多量体核酸を提供する。一部の実施形態では、５’末端のうちの１つ以上は、ＭＮＡの安定性を高めるように修飾されている。特定の実施形態では、少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドはそれぞれ、非コードヌクレオチドである。
【００１５】
一部の態様では、本発明は、送達ビヒクルで封入されるかまたは送達ビヒクルと複合体化された、上記に記載のＭＣＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、リポソーム、脂質ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマー、ウイルス、ゾルゲル、及びナノゲルからなる群から選択される。
【００１６】
一部の態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生するためのＭＣＮＡの送達方法であって、送達を必要とする対象に、上記に記載のＭＣＮＡを投与することを含む、該方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、静脈内送達、皮下送達、経口送達、真皮下送達、経眼送達、気管内注射肺送達（例えば、吸入投与）、筋肉内送達、髄腔内送達、または関節内送達からなる群から選択される送達経路を介して投与される。
【００１７】
上記に記載の全ての実施形態は、本発明の全ての態様に適用可能であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
【００１９】
【図１】３’−３’逆方向ＲＮＡヌクレオチド二量体を介して連結された２つのＲＮＡ種を含むＭＣＮＡの例を示す。
【００２０】
【図２】３’−３’逆方向ＲＮＡヌクレオチド二量体を介して連結された２つのＲＮＡ種を含むＭＣＮＡであって、１つの三分岐ＧａｌＮａｃ標的化剤で官能化されている、該ＭＣＮＡの例を示す。
【００２１】
【図３】３’−３’逆方向ＲＮＡヌクレオチド二量体を介して連結された２つのＲＮＡ種を含むＭＣＮＡであって、２つの三分岐ＧａｌＮａｃ標的化剤で官能化されている、該ＭＣＮＡの例を示す。
【００２２】
【図４】ＭＣＮＡの合成に関する一般的なスキームを示す。
【００２３】
【図５】ゲル電気泳動により検出された合成ＥＰＯ  ＭＣＮＡの結果の例を示す。構築物は以下の条件下で合成された：ＲＮＡリガーゼ１（Ａ）；ＲＮＡリガーゼ１＋１０％ＰＥＧ（Ｂ）；ＲＮＡリガーゼ２（Ｃ）。
【００２４】
【図６】ゲル電気泳動により検出された合成ＥＰＯ  ＭＣＮＡの結果の例を示す。レーン１はテール無のキャップＥＰＯ  ＲＮＡを示す。レーン２はＤＮＡｓｅで処理していないＥＰＯ  ＭＣＮＡ混合物を示す。レーン３はＤＮＡｓｅで処理したＥＰＯ  ＭＣＮＡ混合物を示す。
【００２５】
【図７】テール無ＥＰＯ  ｍＲＮＡまたはｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡを含む、合成構築物（一構築物あたり１マイクログラム）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを行った後に分泌されたｈＥＰＯタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【００２６】
【図８】ゲル電気泳動により検出された合成ＥＰＯ  ＭＣＮＡの結果の例を示す。レーン１はＲＮＡラダーを含み、レーン２は未精製のＥＰＯ  ＭＣＮＡのライゲーション産物を含み、レーン３は精製済みの未反応／部分反応産物を含み、レーン４は精製済みのＥＰＯ  ＭＣＮＡライゲーション産物を含む。
【００２７】
【図９】テール無ＥＰＯ  ｍＲＮＡまたは精製済みのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡを含む、合成構築物（一構築物あたり２５０ナノグラム）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを行った後に分泌されたｈＥＰＯタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【００２８】
【図１０】テール無ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ（ｈＯＴＣ単量体）またはｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡを含む、合成構築物を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを行った後に、細胞溶解物において測定されたｈＯＴＣタンパク質活性レベルの例示的なグラフを示す。
【００２９】
【図１１】テール無ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ（ｈＰＡＨ単量体）またはｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡを含む、合成構築物を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを行った後に産生されたｈＰＡＨタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【００３０】
【図１２】テール無ｈＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ（ｈＣＦＴＲ単量体）、またはｈＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡを含む合成構築物を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを行った後のｈＣＦＴＲタンパク質の産生量を表す例示的なウェスタンブロットを示す。
【００３１】
【図１３】脂質ナノ粒子に封入されたｈＯＴＣ  ＭＣＮＡを用いて処置した後に、マウスの肝臓で測定されたシトルリンの産生量の例示的なグラフを示す。
【００３２】
【図１４】脂質ナノ粒子に封入されたｈＯＴＣ  ＭＣＮＡまたはｈＯＴＣ単量体を用いて処置した後に、マウスの肝臓で検出されたｈＯＴＣの産生量を表す例示的なウェスタンブロットを示す。
【００３３】
【図１５】脂質ナノ粒子に封入されたｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを用いて処置した後に、マウスの肝臓で測定されたシトルリンの産生量の例示的なグラフを示す。
【００３４】
【図１６】脂質ナノ粒子に封入されたｈＯＴＣ  ｍＲＮＡまたはｈＯＴＣ  ＭＣＮＡを用いて処置したマウスにおいて、投与１週間後のシトルリンの産生量を投与２４時間後のシトルリンの産生量の割合として比較した例示的なグラフを示す。
【００３５】
【図１７】脂質ナノ粒子に封入されたｈＰＡＨ  ＭＣＮＡまたはｈＰＡＨ単量体のいずれかをＰＡＨノックアウト（ＫＯ）マウスに投与した２４時間後に、該マウスの肝臓で検出されたｈＰＡＨタンパク質の例示的なグラフを示す。
【００３６】
【図１８】脂質ナノ粒子に封入されたｈＰＡＨ  ＭＣＮＡまたはｈＰＡＨ単量体のいずれかをＰＡＨノックアウト（ＫＯ）マウスに投与した２４時間後の、該マウスにおける血清フェニルアラニンレベルの例示的なグラフを示す。
【００３７】
【図１９】脂質ナノ粒子に封入されたｈＥＰＯ  ＭＣＮＡまたはｈＥＰＯ単量体のいずれかを野生型マウスに投与した２４時間後に、該マウスの血清で検出されたｈＥＰＯタンパク質の例示的なグラフを示す。
【００３８】
【図２０】脂質ナノ粒子に封入されたｈＣＦＴＲ  ＭＣＮＡでエアロゾル投与処置した２４時間後及び７日後の、ＣＦＴＲ  ＫＯマウスの肺におけるヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｈＣＦＴＲ）タンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を以下にまず定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物及び他の参考資料は、参照によって本明細書に援用される。
【００４０】
アミノ酸：本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を意味する。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態ではアミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態ではアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、一部の実施形態ではアミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに通常見られる２０個の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」は、合成して調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／または置換を含むがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチドにカルボキシ末端アミノ酸及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基によって修飾され、及び／またはその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変更することができる他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与する場合がある。アミノ酸は、１つ以上の化学成分（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合といった、一修飾または翻訳後の修飾を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指す場合がある。この用語が遊離アミノ酸かまたはペプチドの残基を指すか否かについては、用語が使用される文脈から明らかになるであろう。
【００４１】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【００４２】
およそまたは約：本明細書で使用される用語「およそ」または「約」は、関心対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値と同等の値を意味する。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特記されない限り、ないしは特に文脈から明らかでない限り、記述された参照値のいずれかの方向（超または未満）における２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に入る値の範囲を意味する（かかる数字が取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
【００４３】
生物学的活性：本明細書で使用される場合、用語「生物学的活性」は、生体系、特に生物体において活性を有する任意の作用剤の特徴を意味する。例えば、生物体に投与された場合に、その生物体に対して生物学的作用を有する作用剤は、生物学的活性があると見なされる。
【００４４】
送達：本明細書で使用される場合、用語「送達」は局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ＭＣＮＡの送達は、ＭＣＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が発現しかつ標的組織内で保持される（「局所分布」または「局所送達」とも称される）状態、及びＭＣＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が発現しかつ患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、系統的に分布し、他の組織によって取り込まれる（「全身分布」または「全身送達」とも称される）状態を包含する。
【００４５】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ＭＣＮＡをポリペプチドへと翻訳すること、複数のポリペプチドをインタクトなタンパク質（例えば、酵素）へと構築すること、及び／またはポリペプチドもしくは完全に構築されたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾をすることを意味する。この用途において、用語「発現」及び「産生」ならびに文法的等価物は互換的に使用される。
【００４６】
機能性：本明細書で用いられる場合、「機能性」生体分子は、それが特徴付けられる特性及び／または活性を呈する形態での生体分子である。
【００４７】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質の濃度または活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００４８】
改善、増加、または低減：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などの基準測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【００５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞ベース系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【００５１】
単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）最初に生成された際に（自然界において及び／または実験的な環境においてにかかわらず）会合した成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって生成、調製、及び／もしくは製造された、物質及び／または要素を意味する。単離された物質及び／または要素は、それらが最初に会合した他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質及び／または要素のパーセント純度の計算は、賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）を含むべきではない。
【００５２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」または「ｍＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾及び未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、自然源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、また任意選択的に精製、化学合成などをされてもよい。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。典型的なｍＲＮＡ分子は、５’末端と３’末端とを有している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）；修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。
【００５３】
核酸：本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を意味する。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を意味する。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を意味する。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。
【００５４】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。
【００５５】
薬学的に許容される：用語「薬学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合う物質を意味する。
【００５６】
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１−１９において薬学的に許容される塩について詳述している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、好適な無機酸及び有機酸ならびに無機塩基及び有機塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を用いて形成されたアミノ基の塩がある。他の薬学的に許容される塩として、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩として、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適宜、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される非毒性アンモニウムカチオン、４級アンモニウムカチオン、及びアミンカチオンが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な求電子物質（例えば、ハロゲン化アルキル）を使用して４級化アルキル化アミノ塩を形成する、アミンの４級化から形成される塩が含まれる。
【００５７】
全身分布または全身送達：本明細書で使用される場合、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物体全体に影響を及ぼす送達または分布のメカニズムまたはアプローチを意味する。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または局所送達」の定義と比較される。
【００５８】
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００５９】
実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【００６０】
標的組織：本明細書で使用される場合、用語「標的組織」は、治療される疾患の影響を受ける任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患関連病態、症状、または特徴を現す組織が含まれる。
【００６１】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは症状に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を治療する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延するのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されるのが典型的であることを理解するであろう。
【００６２】
治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」または「治療している」は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重症度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、該疾患に関連する病態を発症させる危険性を減らすために、治療が行われる場合もある。
[発明を実施するための形態]
【００６３】
本発明は、特に、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）の合成方法と、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）を含む組成物とを提供する。詳細には、本発明は、ＭＣＮＡ化合物であって、３’末端を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、２つ以上の５’末端を含むようにする該ＭＣＮＡ化合物と、その合成方法とを提供する。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、本発明の合成ポリリボヌクレオチドまたは合成ポリデオキシリボヌクレオチドは、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、または受容体をコードする。一部の実施形態では、本発明は、多量体核酸（ＭＮＡ）であって、ポリヌクレオチドのうちの２つ以上の間で少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含み、該ＭＮＡの化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、該多量体核酸を提供する。一部の実施形態では、５’末端のうちの１つ以上は、ＭＮＡの安定性を高めるように修飾されている。特定の実施形態では、少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドはそれぞれ、非コードヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＭＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、または受容体をコードしない合成ポリリボヌクレオチドまたは合成ポリデオキシリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドまたは合成ポリデオキシリボヌクレオチドを含むＭＮＡは、遺伝子発現を抑制する。一部の実施形態では、遺伝子発現を抑制する本発明の合成ポリリボヌクレオチドは、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
【００６４】
外因性ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の投与は疾患の治療を有意に促進させるが、こうした外因性ポリヌクレオチドの投与では、特にｉｎ  ｖｉｖｏ投与の後に、このポリヌクレオチドの安定性が乏しいことが支障になる場合が多い。例えば、対象に投与した後に、ポリヌクレオチドの多くがヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼ）分解を受ける可能性がある。ヌクレアーゼ分解は、ポリヌクレオチドを標的細胞に到達させる機能または転写及び／もしくは翻訳させる機能に悪影響を及ぼし、その結果、外因性ポリヌクレオチドが所定の治療効果をもたらすのを妨げる恐れがある。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明のＭＣＮＡは、３’末端で別のポリヌクレオチドに連結されていない単一ポリヌクレオチド（以下「単量体ポリヌクレオチド」とする）と比べて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増加させている。一部の実施形態では、本発明のＭＣＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達される場合、同一のタンパク質をコードする単量体ポリヌクレオチドと比べて増強されたタンパク質の産生をもたらす。一部の実施形態では、本発明のＭＣＮＡは、対象に送達される場合、対応する単量体ポリヌクレオチドに比べて対象の忍容性が良好である。
【００６６】
多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）
一部の実施形態では、本発明は多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）を含む組成物と、その合成方法とを提供する。詳細には、本発明は、ＭＣＮＡ化合物であって、３’末端を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、２つ以上の５’末端を含むようにする該ＭＣＮＡ化合物と、その合成方法とを提供する。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、合成ポリデオキシリボヌクレオチドか、またはポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、関心対象のタンパク質をコードする。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、同一のタンパク質をコードする。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々は、異なるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、異なるタンパク質をコードする２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が同数存在する。一部の実施形態では、異なるタンパク質をコードする２つ以上のコードポリヌクレオチドの各々が異なる数で存在する（例えば、関心対象のタンパク質＃１をコードするポリヌクレオチド２コピーと関心対象のタンパク質＃２をコードするポリヌクレオチド１コピーなど）。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は３つ以上のコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は４つ以上のコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は５つ以上のコードポリヌクレオチドを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、本発明は、多量体核酸（ＭＮＡ）であって、ポリヌクレオチドのうちの２つ以上の間で少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含み、該ＭＮＡの化合物が２つ以上の５’末端を含むようにする、該多量体核酸を提供する。一部の実施形態では、５’末端のうちの１つ以上は、ＭＮＡの安定性を高めるように修飾されている。特定の実施形態では、少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つがコードポリヌクレオチドであり、少なくとも１つの３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが非コードポリヌクレオチドであり、それによって、多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）を構成している。特定の実施形態では、コードポリヌクレオチドは関心対象のタンパク質をコードし、非コードポリヌクレオチドは遺伝子発現を抑制する（例えば、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）など）。
【００６８】
一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドを含むＭＣＮＡ化合物は、抗体または抗体断片の１つ以上の鎖をコードする。一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドは、抗体の重鎖と軽鎖とをコードする。一部の実施形態では、抗体は、インタクトな免疫グロブリン、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗体はＩｇＧである。一部の実施形態では、抗体は、抗ＣＣＬ２、抗リシルオキシダーゼ様−２（ＬＯＸＬ２）、抗Ｆｌｔ−１、抗ＴＮＦ−α、抗インターロイキン−２Ｒα受容体（ＣＤ２５）、抗ＴＧＦβ、抗Ｂ細胞活性化因子、抗アルファ−４インテグリン、抗ＢＡＧＥ、抗β−カテニン／ｍ、抗Ｂｃｒ−ａｂｌ、抗ＣＳ、抗ＣＡ１２５、抗ＣＡＭＥＬ、抗ＣＡＰ−１、抗ＣＡＳＰ−８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２５、抗ＣＤＣ２７／ｍ、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ８０、抗ＣＤＫ４／ｍ、抗ＣＥＡ、抗ＣＴ、抗ＣＴＬ４、抗Ｃｙｐ−Ｂ、抗ＤＡＭ、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥＬＦ２Ｍ、抗ＥＭＭＰＲＩＮ、抗ＥｐＣａｍ、抗ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、抗ＨＥＲ２、抗Ｇ２５０、抗ＧＡＧＥ、抗ＧｎＴ−Ｖ、抗Ｇｐ１００、抗ＨＡＧＥ、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、抗ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、抗ＩＧＦ−１Ｒ、抗ＩＬ−２Ｒ、抗ＩＬ−Ｓ、抗ＭＣ１Ｒ、抗ミオシン／ｍ、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＭ−１、抗ＭＵＭ−２、抗ＭＵＭ−３、抗プロテイナーゼ−３、抗ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌ、抗Ｐｍｌ／ＲＡＲα、抗ＰＲＡＭＳ、抗ＰＳＡ、抗ＰＳＭ、抗ＰＳＭＡ、抗ＲＡＧＥ、抗ＲＡＮＫＬ、抗ＲＵ１または抗ＲＵ２、抗ＳＡＧＥ、抗ＳＡＲＴ−１または抗ＳＡＲＴ−３、抗サバイビン、抗ＴＥＬ／ＡＭＬ１、抗ＴＰＩ／ｍ、抗ＴＲＰ−１、抗ＴＲＰ−２、抗ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、及び抗ＶＥＧＦまたは抗ＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。
【００６９】
一部の実施形態では、２つ以上のコードポリヌクレオチドを含むＭＣＮＡ化合物は、１つ以上のヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、１つ以上のヌクレアーゼの各々は、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ホーミングメガヌクレアーゼ、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される。ヌクレアーゼの例として、ＡｆｕウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ、アンタークティック熱不安定性（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ）ＵＤＧ、ＡＰＥ１、Ｃａｓ９ヌクレアーゼＮＬＳ（化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＤＮａｓｅ  Ｉ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ（ＲｅｃＢＣＤ）、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ（トランケート済み）、Ｆｐｇ、ｈＡＡＧ、ｈＯＧＧ１、ｈＳＭＵＧ１、ラムダエキソヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ＲｅｃＡｆ、ＲｅｃＪｆ、Ｔ４  ＰＤＧ（Ｔ４  エンドヌクレアーゼＶ）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、熱安定性ＦＥＮ１、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）が挙げられる。ホーミングヌクレアーゼの例として、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＩ、Ｉ−ＧｚｅＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ（ｍ）、Ｉ−ＭｓｏＩ（ｍ）、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｅ２）、Ｉ−ＡｎｉＩ／Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ／Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ／Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＧｚｅＩ／Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ／Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ／Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩＰ、Ｉ−ＡｐａＭＩＰ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩＰ、Ｉ−ＮｃｒＭＩＰ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＰ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＰ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩＰ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＰ、Ｉ−ＳｃｕＭＩＩＩＰ、Ｉ−ＳｃｕＭＩＩＰ、Ｉ−ＳｃｕＭＩＰ、及びＩ−ＳｃｕＭＩＶＰが挙げられる。
【００７０】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、１つ、２つ、またはそれを超えるコードポリヌクレオチドを含む２つ以上のポリヌクレオチドを含んでおり、各コードポリヌクレオチドは、表１、表２、表３、表４、表５、または表６から選択される遺伝子用及び／またはタンパク質用のｍＲＮＡ転写物となるポリヌクレオチド部分を含む。
表１
【表１−１】
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【表１−２】
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表２
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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表３
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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表４
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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表５
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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表６−分泌タンパク質
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【表６−１８】
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【表６−１９】
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【表６−２０】
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【表６−２１】
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【表６−２２】
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【表６−２３】
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【表６−２４】
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【表６−２５】
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【表６−２６】
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【表６−２７】
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【表６−２８】
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【表６−２９】
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【表６−３０】
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【表６−３１】
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【表６−３２】
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【表６−３３】
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【表６−３４】
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【表６−３５】
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【表６−３６】
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【表６−３７】
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【表６−３８】
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【表６−３９】
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【表６−４０】
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【表６−４１】
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【表６−４２】
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【００７１】
ある一連の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は２つのコードポリヌクレオチドを含む。例えば、ＭＣＮＡ化合物は、２つのコードポリヌクレオチドであって、その各々が同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を備えた該コードポリヌクレオチドを有する、パリンドロームコード核酸（ＰＣＮＡ）であってもよい。
【００７２】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｈＣＦＴＲ）ｍＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して非コードポリヌクレオチドに連結されたコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、該コードポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つがｈＣＦＴＲをコードする。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つのコードポリヌクレオチドを含むパリンドロームコード核酸（ＰＣＮＡ）であり、各コードポリヌクレオチドがｈＣＦＴＲをコードする。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのポリヌクレオチドがｈＣＦＴＲをコードするコードポリヌクレオチドであり、少なくとも１つのポリヌクレオチドが保護基として作用する。
【００７３】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）ｍＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して非コードポリヌクレオチドに連結されたコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、該コードポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つがｈＰＡＨをコードする。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つのコードポリヌクレオチドを含むパリンドロームコード核酸（ＰＣＮＡ）であり、各コードポリヌクレオチドがｈＰＡＨをコードする。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのポリヌクレオチドがｈＰＡＨをコードするコードポリヌクレオチドであり、少なくとも１つのポリヌクレオチドが保護基として作用する。
【００７４】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して非コードポリヌクレオチドに連結されたコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つ以上のコードポリヌクレオチドを含み、該コードポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つがｈＯＴＣをコードする。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つのコードポリヌクレオチドを含むパリンドロームコード核酸（ＰＣＮＡ）であり、各ポリヌクレオチドがｈＯＴＣをコードする。一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、ＭＣＮＡ化合物が２つ以上の５’末端を含むように、ポリヌクレオチド間で３’末端結合を介して連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのポリヌクレオチドがｈＯＴＣをコードするコードポリヌクレオチドであり、少なくとも１つのポリヌクレオチドが保護基として作用する。
【００７５】
架橋（３’−３’結合有）
一部の実施形態では、ＭＣＮＡ化合物は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドの３’末端は、３’−３’逆方向ホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド架橋（「架橋オリゴヌクレオチド」または「架橋オリゴ」とも言う）を介して連結されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋は修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋は２’−Ｏ−メチルＲＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋は長さ２〜１０００のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド架橋は、共有結合により該架橋に結合している１つ以上の活性部分を含む。一部の実施形態では、活性部分は、標的群、ペプチド、造影剤、小分子、タンパク質、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡである。一部の実施形態では、活性部分は、細胞表面受容体の受容体リガンドを結合させる。一部の実施形態では、活性部分は、１つ以上の三分岐ＧａｌＮａｃ標的化剤である。
【００７６】
ＭＣＮＡ合成
一部の実施形態では、本発明はＭＣＮＡの合成方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＣＮＡの合成は、各ポリヌクレオチドの３’末端がオリゴヌクレオチド架橋の５’末端にライゲーションされるように、２つ以上のポリヌクレオチドをライゲーションすることを含み、該オリゴヌクレオチド架橋は２つの５’末端と、内部３’−３’逆方向ホスホジエステル結合とを含む。一部の実施形態では、ＭＣＮＡの合成方法は、リガーゼがオリゴヌクレオチド架橋の５’末端に各ポリヌクレオチドを接合することができるように、２つ以上のポリヌクレオチドの領域に相補的なオリゴヌクレオチドスプリントを使用することを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドスプリントは、リガーゼがオリゴヌクレオチド架橋の５’末端に各ポリヌクレオチドの完全末端を接合するように、２つ以上のポリヌクレオチドの領域に相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドスプリントは、リガーゼがオリゴヌクレオチド架橋の５’末端に各ポリヌクレオチドの３’末端を接合するように、２つ以上のポリヌクレオチドの領域に相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドスプリントはＤＮＡを含む。一部の実施形態では、リガーゼはＲＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、リガーゼはＴ４  ＲＮＡリガーゼ１である。一部の実施形態では、リガーゼはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２である。
【００７７】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡを合成する際のポリヌクレオチド：オリゴヌクレオチド架橋：オリゴヌクレオチドスプリントのモル比は２：１：２である。一部の実施形態では、ＭＣＮＡを合成する際のポリヌクレオチド：オリゴヌクレオチド架橋のモル比は２：１である。一部の実施形態では、ＭＣＮＡを合成する際のポリヌクレオチド：オリゴヌクレオチドスプリントのモル比は２：２である。一部の実施形態では、ＭＣＮＡの合成にはＰＥＧがさらに含まれる。
【００７８】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、ＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製され得る。簡潔に述べると、ＲＮＡコード配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製する。続いて、この転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えた「架橋」オリゴヌクレオチドに、（Ａ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、（Ｂ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋ、または（Ｃ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２のいずれかと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴに相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションする。ライゲーション用の試料を調製するために、架橋オリゴを、５０μＭのオリゴと、ＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液と、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化する。リン酸化架橋オリゴを、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラムを用いて脱塩化して、キャップされたＲＮＡ転写物と、１×架橋オリゴと、２×スプリントオリゴとを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却する。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、（Ａ）１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液、ＡＴＰ、及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、（Ｂ）１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液、ＡＴＰ、１０％ＰＥＧ、及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、または（Ｃ）１×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２緩衝液及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ２と、を含むように調製する。各々を３７℃で９０分反応させる。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製する。次いで、精製されたＭＣＮＡ産物をＤＮＡｓｅ  Ｉで処理して、残留架橋オリゴヌクレオチドを除去する。
【００７９】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、ＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリント非依存性ライゲーションによって調製され得る。
【００８０】
非翻訳領域
ｍＲＮＡ合成には、５’末端への「キャップ」及び３’末端への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つものである。
【００８１】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡの１つ以上のポリヌクレオチドには、５’及び／または３’非翻訳領域が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【００８２】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるＭＣＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５〜２，０００のヌクレオチドであり得る。
【００８３】
例示的な３’及び／または５’ＵＴＲ配列は、安定な核酸分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）に由来して、センスＭＣＮＡ分子の安定性を増加させることができる。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するため、及び／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ポリヌクレオチド（例えば、ＭＣＮＡ）の３’末端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはその断片をコードする配列を含めることも想定される。一般に、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの未修飾の対応物に比べて改善するものであり、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ消化に対するポリヌクレオチド耐性を改善するように行われる修飾を含む。
【００８４】
３’ＵＴＲ
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、中間にスペーサーを備えた複数の多重Ａセグメントを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／または修飾された塩基を含む。一部の実施形態では、多重Ａセグメントの各々は、８個〜５０個の連続するアデノシンを含む。一部の実施形態では、複数の多重Ａセグメントの数は１〜１００の範囲である。一部の実施形態では、スペーサーは５〜１００の範囲の様々な長さを有する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲはシュードノット構造を含む。シュードノットは、一本鎖領域またはループにより連結された２つのヘリックスセグメントで最小限構成されているＲＮＡ構造として定義され得る（Ｓｔａｐｌｅ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，３，ｅ２１３）。これらは、ヘアピンまたはステムループなどの２次構造、及び遠位一本鎖領域から形成されている。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、「キッシングループ」配列モチーフを含む。広義では、キッシングループは、一ＲＮＡ分子のステム／ヘアピンループにおける不対ヌクレオチドが、異なるＲＮＡ分子の別のステム／ヘアピンループの不対ヌクレオチドと塩基対になる場合に形成される構造として説明され得る。一部の実施形態では、３’ＵＴＲには、ポリアデニル化（ポリＡ）テールが付加されていない。一部の実施形態では、３’ＵＴＲはポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）に結合している。
【００８５】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは長さ２５〜５，０００のヌクレオチドである。ＭＣＮＡの３’末端のポリＡテールは、約１０〜３００のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０のアデノシンヌクレオチド）を含むのが典型的である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ＭＣＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは、約１０〜２００のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０のシトシンヌクレオチド）を含むのが典型的である。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【００８６】
通例、「テール」の存在はエキソヌクレアーゼ分解からＭＣＮＡを保護するのに役立つ。ポリＡテールは、天然のメッセンジャーと合成センスＭＣＮＡとを安定させると考えられている。したがって、特定の実施形態では、長いポリＡテールは、ＭＣＮＡ分子に付加されることにより、ＭＣＮＡをさらに安定化することができる。ポリＡテールは、当該技術分野において認識されている様々な技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成ＲＮＡまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターが、長いポリＡテールをコードすることもできる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端にライゲーションすることもできる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。
【００８７】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡの１つ以上のポリヌクレオチドは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。典型的には、ポリＡテールの長さは少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、少なくとも５００のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ＭＣＮＡの３’末端のポリＡテールは、約１０〜３００のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０のアデノシンヌクレオチド）を含むのが典型的である。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、３’ポリＣテール構造を含む。ＭＣＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは、約１０〜２００のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０のシトシンヌクレオチド）を含むのが典型的である。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【００８８】
一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さは、本発明の修飾されたセンスＭＣＮＡ分子の安定性を制御するように、したがって、ＭＣＮＡのコードポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるタンパク質の転写を制御するように調節される。例えば、ポリＡテールの長さはセンスＭＣＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さは、ヌクレアーゼに対するＭＣＮＡの耐性のレベルを改変し、それによって、標的細胞におけるポリヌクレオチド発現及び／またはポリペプチド産生の時間経過を制御するように調節され得る。
【００８９】
５’ＵＴＲ
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
天然に存在するキャップ構造は７−メチルグアノシンを含み、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、キャップは酵素を用いて付加される。キャップは、核に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによる触媒作用を受ける。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に生じる。末端ヌクレオシドは、グアノシンであるのが典型的であり、全ての他のヌクレオチドとは逆の方向になっており、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成されたＭＣＮＡの１つのキャップはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これは、５’末端でキャップ構造を有するＭＣＮＡを得るために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写する際にジヌクレオチドキャップとして使用されていた。キャップされたＭＣＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法では、転写の開始因子として、形態がｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）である予め形成されたジヌクレオチドが用いられている。
【００９２】
従来より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験に使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、アンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡであり、これは、２’ＯＨ基または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される、修飾されたキャップ類似体であるのが一般的である。
【００９３】
さらなるキャップ類似体として、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照のこと）。
【００９４】
一部の実施形態では、好適なキャップは７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらすものである。本発明の実施形態に利用されるｍ７Ｇキャップの好適な実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【００９５】
一部の実施形態では、キャップはキャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１及び塩基２に結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く。一部の実施形態では、キャップはキャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。一部の実施形態では、キャップはキャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２及び塩基３の両方に結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【００９６】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体が当該技術分野において既知であり、その多くは市販されている。これらには、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ  ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体が含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用するためのさらなるキャップ類似体として、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、ならびに米国特許第８，０９３，３６７号及び同第８，３０４，５２９号（参照により本明細書に援用される）に記載されるキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が挙げられる。
【００９７】
ヌクレオチド修飾
一部の実施形態では、本発明のＭＣＮＡは、未修飾の核酸または修飾された核酸として合成することができる。典型的には、核酸は安定性を強化するために修飾される。ＭＣＮＡの修飾は、例えば、ＭＣＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。したがって、本発明の修飾されたＭＣＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））もしくはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むがこれらに限定されない天然に存在するヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成することができ、ならびにプリン及びピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）及び１−メチルプソイドウリジン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、７−メチルグアニン、イノシン、１−メチルイノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５−ウラシル）、ジヒドロウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチルシュードウラシル、キューオシン、ベータ−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、及びホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンならびにイノシン）として合成することができる。こうした類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４０１，７９６号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、同第５，２６２，５３０号、及び同第５，７００，６４２号から当業者に既知であり、これらの文献の開示はその全体が参照によって援用される。
【００９８】
一部の実施形態では、本発明のＭＣＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを有するコードポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つ以上の修飾されたヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、対応する天然塩基の１％〜１００％を置換している。一部の実施形態では、ウリジンの少なくとも２５％は２−チオウリジンで置き換えられている。一部の実施形態では、１００％のシチジンが、５−メチルシチジンで置き換えられている。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、リボース環上で４’−チオ置換によりさらに修飾されている。一部の実施形態では、天然ヌクレオチドはリボース環上で４’−チオ置換により修飾されている。
【００９９】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは核酸骨格修飾を含み得る。典型的には、骨格修飾は、ＭＣＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾として、典型的には、以下に限定されないが、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオフォスフェート））、ボラノリン酸塩、正荷電グアニジウム基などからなる群由来の修飾が挙げられ、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン基、カチオン基、または中性基で置き換えることに基づくことを意味する。
【０１００】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、ＭＣＮＡが有するヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも称される。こうした塩基修飾ヌクレオチドの例として、以下に限定されないが、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸、またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられる。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、２’−ＯＭｅ−Ａ、２’−ＯＭｅ−Ｇ、２’−ＯＭｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−Ｕ、２’−Ｆ−Ａ、２’−Ｆ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｃ、２’−Ｆ−Ｕ、ＬＮＡ−Ａ、ＬＮＡ−Ｇ、ＬＮＡ−Ｃ、ＬＮＡ−Ｕ、Ｎ６−メチルアデノシン、２−チオウリジン（２ｓＵ）、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン（ΨＵ）、及び１−メチルプソイドウリジンから選択される修飾された塩基を含む。
【０１０２】
送達ビヒクル
本発明によると、本明細書に記載のＭＣＮＡは、ネイキッドポリヌクレオチドとして、または送達ビヒクルを介して送達され得る。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「移入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語、または文法的等価物は、互換的に使用される。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、単一の送達ビヒクルを介して送達され得る。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、各々異なる組成の１つ以上の送達ビヒクルを介して送達され得る。様々な実施形態によると、好適な送達ビヒクルとして、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子、及びリポソームなどのポリマー系担体、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成由来のエキソソーム、天然層状体、合成層状体、及び半合成層状体、ナノ粒子、カルシウムリン−ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプンベース送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の指向性タグが挙げられる。
【０１０４】
リポソーム送達ビヒクル
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、リポソーム送達ビヒクルであり、例えば、脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子は、通常、１つ以上の二分子層の膜によって外部媒体から隔離された内部水空間を有する微細小胞として特徴付けられる。リポソームの二分子膜は、典型的には、空間的に離れた親水性ドメインと疎水性ドメインとを含む合成起源または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成されている（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの二分子膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソームなど）によっても形成され得る。本発明の状況では、リポソーム送達ビヒクルは、通例、所望のＭＣＮＡを標的細胞または標的組織に輸送するのに役立つ。
【０１０５】
カチオン性脂質
一部の実施形態では、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法に使用するのに特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号（具体的には、段落［００２２５］に記載されているＣＩ  ２−２００）及び同第ＷＯ２０１２／１７０９３０号に記載されているものを含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）など、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を用いている。
【０１０６】
一部の実施形態では、提供されるリポソームは、国際公開第ＷＯ２０１３／０６３４６８号と、「Ｌｉｐｉｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題する同日付けで本願と同時に出願された米国仮出願とに記載されるカチオン性脂質を含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。
【０１０７】
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式Ｉ−ｃ１−ａの化合物：
【化１】
2019513372.tif 000070
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ２は独立して水素またはＣ１−３アルキルであり；
各ｑは独立して２〜６であり；
各Ｒ’は独立して水素またはＣ１−３アルキルであり；
各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【０１０８】
一部の実施形態では、各Ｒ２は独立して水素、メチル、またはエチルである。一部の実施形態では、各Ｒ２は独立して水素またはメチルである。一部の実施形態では、各Ｒ２は水素である。
【０１０９】
一部の実施形態では、各ｑは独立して３〜６である。一部の実施形態では、各ｑは独立して３〜５である。一部の実施形態では、各ｑは４である。
【０１１０】
一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素、メチル、またはエチルである。一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素またはメチルである。一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素である。
【０１１１】
一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ１０アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ１０アルキルである。
【０１１２】
一部の実施形態では、各Ｒ２は独立して水素またはメチルであり、各ｑは独立して３〜５であり、各Ｒ’は独立して水素またはメチルであり、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【０１１３】
一部の実施形態では、各Ｒ２は水素であり、各ｑは独立して３〜５であり、各Ｒ’は水素であり、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【０１１４】
一部の実施形態では、各Ｒ２は水素であり、各ｑは４であり、各Ｒ’は水素であり、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【０１１５】
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式Ｉ−ｇの化合物：
【化２】
2019513372.tif 000071
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ１０アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬはｎ−Ｃ１０アルキルである。
【０１１６】
特定の実施形態では、提供されるリポソームは、カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２または（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）を含む。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造を以下に示す：
【化３】
2019513372.tif 000072
【０１１７】
カチオン性脂質のさらなる例として、式Ｉのカチオン性脂質と、
【化４】
2019513372.tif 000073
その薬学的に許容される塩とが挙げられ、
式中、
【化５】
2019513372.tif 000074
（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏｗｅｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．”Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ  Ａｌｋｅｎｙｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）を参照のこと）。
【０１１８】
一部の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質はＮ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、すなわち「ＤＯＴＭＡ」であってもよい（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化され得るか、あるいは中性脂肪、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンすなわち「ＤＯＰＥ」、または他のカチオン性脂質もしくは非カチオン性脂質と混合して、リポソーム移入ビヒクルまたは脂質ナノ粒子にすることができ、こうしたポソームは、核酸の標的細胞内への送達を強化するために使用することができる。他の好適なカチオン性脂質として、例えば、５−カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）すなわち「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウムすなわち「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。
【０１１９】
さらなる例示的なカチオン性脂質として、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドすなわち「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−（５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンすなわち「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンすなわち「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノレオイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−  −ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ  ２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第ＷＯ２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照のこと）、またはこれらの混合物が挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザへキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（国際公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＩＣＥ（国際公開第ＷＯ２０１１／０６８８１０号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、国際公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号に開示されるリピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）などのアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）から選択され得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームの約３０〜５０重量％（例えば、約３０〜４５重量％、約３０〜４０重量％、約３５〜５０重量％、約３５〜４５重量％、または約３５〜４０重量％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。
【０１２２】
非カチオン性／ヘルパー脂質
一部の実施形態では、提供されたリポソームは、１つ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含む。本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン脂質、またはアニオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたＨで正味の負電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
【０１２３】
一部の実施形態では、こうした非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソームに存在する総脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜約７０％のモル割合を含み得る。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化及び／または投与される条件下で正味の電荷を保有しない脂質である。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。
【０１２４】
コレステロール系脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。例として、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソームに存在する総脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％のモル割合を含み得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。
【０１２５】
ＰＥＧ化脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質と、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質とを、カチオン性脂質のうちの１つ以上と共に、一部の実施形態ではリポソームを含む他の脂質と共に、組み合わせて使用することも、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６−Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。こうした成分の付加は、複合体の凝集を阻止することができ、また循環寿命を増加させ、脂質−核酸組成物の標的細胞への送達を増加させるための手段を提供することができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）。あるいは、これらの成分はｉｎ  ｖｉｖｏで製剤の外へと速やかに交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。
【０１２６】
一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化された脂質は、リポソームに存在する総脂質の約０％〜約１５％、約０．５％〜約１５％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル割合を含み得る。
【０１２７】
様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を含む、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対モル割合の選択は、選択される脂質の特徴、意図する標的細胞の性質、送達されるＭＣＮＡの特徴に基づいて行われる。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性が含まれる。したがって、モル割合はそれらに応じて調節され得る。
【０１２８】
リポソームの形成
本発明の組成物で使用するためのリポソーム移入ビヒクルは、当該技術分野において現在既知である様々な技術により調製することができる。提供される組成物で使用するためのリポソームは、当該技術分野において現在既知である様々な技術により調製することができる。例えば、多重層ベシクル（ＭＬＶ）は、適切な溶媒に脂質を溶解することにより、選択された脂質を好適な容器または器の内壁に堆積させ、次いで、溶媒を蒸発させて器の内側に薄膜を残すか、または噴霧乾燥させることなどによる、従来技術に従って調製され得る。続いて、水相を渦動運動させながら器に添加し、その結果として、ＭＬＶを形成することができる。次に、単層ベシクル（ＵＬＶ）を、多重層ベシクルのホモジナイゼーション、超音波処理、または押出により形成することができる。加えて、単層ベシクルを、界面活性剤除去技術により形成することができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、提供される組成物はリポソームを含み、そこで、ＭＣＮＡはリポソームの表面で会合し、かつ該リポソーム内に封入されている。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりＭＣＮＡと会合し得る。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりＭＣＮＡと会合し得る。
【０１３０】
一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、リポソームに封入されたＭＣＮＡを含む。一部の実施形態では、１つ以上のＭＣＮＡ種は、同一のリポソームに封入され得る。一部の実施形態では、１つ以上のＭＣＮＡ種は、異なるリポソームに封入され得る。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは１つ以上のリポソームに封入され、該リポソームは、その脂質組成物、脂質成分のモル割合、大きさ、電荷（ゼータ電位）、標的リガンド、及び／またはこれらの組み合わせにおいて異なる。一部の実施形態では、１つ以上のリポソームは、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び／またはこれらの組み合わせの異なる組成物を有し得る。一部の実施形態では、１つ以上のリポソームは、リポソームを作製するために使用されるカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ修飾脂質の異なるモル割合を有し得る。
【０１３１】
所望のＭＣＮＡをリポソーム内に組み込むプロセスは、「装填」と称されることが多い。例示的な方法が、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。リポソーム組み込み核酸は、リポソームの内部空間、つまりリポソームの二分子膜内に完全にまたは部分的に位置するか、またはリポソーム膜の外表面と会合し得る。核酸のリポソーム内への組み込みは本明細書において「封入」とも称され、そこで、核酸がリポソームの内部空間内に完全に包含される。ＭＣＮＡをリポソームなどの移入ビヒクル内に組み込む目的は、多くの場合、核酸を分解する酵素もしくは化学物質及び／または核酸を急速排出する系もしくは受容体を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるＭＣＮＡの安定性を強化することができ、かつ／またはＭＣＮＡを標的細胞もしくは標的組織へ送達することを容易にする。
【０１３２】
リポソームの大きさ
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。一部の実施形態では、提供されるリポソームは、従来から知られているｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製され得る。一部の実施形態では、リポソームの大きさが減少すると、ＭＣＮＡの送達効率が上がるようになる。適切なリポソームの大きさは、標的細胞または標的組織の部位を考慮し、また作製されるリポソームの用途をある程度考慮して選択することができる。
【０１３３】
一部の実施形態では、リポソームの適切な大きさは、ＭＣＮＡによりコードされるポリペプチドの全身への分布を容易にするように選択される。一部の実施形態では、ＭＣＮＡのトランスフェクションを特定の細胞または組織に限定することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓よりも小さくなるように寸法決定されてもよく、こうした場合、リポソームは、その内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に達することができようになる。
【０１３４】
あるいはまたは加えて、リポソームは、リポソームの寸法が特定の細胞もしくは組織内への分布を制限するか、または意図的に分布しないようにするのに十分な直径であるように寸法決定されてもよい。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きくなるように寸法決定されてもよく、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。
【０１３５】
一部の実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜１００ｎｍの範囲（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。ある特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【０１３６】
リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において既知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の１つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）（参照によって本明細書に援用される）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって減少させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
【０１３７】
ポリマー
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、担体としてポリマーを使用して、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて製剤化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で使用されるリポソーム送達ビヒクルは、ナノ粒子を含むポリマーも包含する。好適なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート類、ポリアルキシアノアクリレート類、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー類、ポリカプロラクトン類、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン類、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられ得る。ＰＥＩを含む場合、ＰＥＩは１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量を持つ分枝状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  ＃４０８７２７）であり得る。
【０１３８】
本発明に好適なリポソームは、本明細書に記載のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ化脂質、及び／またはポリマーのいずれかのうちの１つ以上を様々な割合で含み得る。非限定的な例として、好適なリポソーム製剤は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋから選択されるある組み合わせを含み得る。
【０１３９】
種々の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）は、モル割合でリポソームの約３０〜６０％（例えば、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）の割合は、モル割合でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％以上である。
【０１４０】
一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれ約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、およそ５０：２５：２０：５である。
【０１４１】
医薬組成物
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＣＮＡの発現を容易にするために、リポソームなどの送達ビヒクルが、１つ以上の追加の核酸、担体、標的リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて製剤化されるか、またはＭＣＮＡが好適な賦形剤と混合されている薬理組成物中に製剤化され得る。薬物の製剤化及び投与の技術は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。
【０１４２】
一部の実施形態では、組成物は送達ビヒクルで封入されたＭＣＮＡ、または送達ビヒクルと複合体を形成したＭＣＮＡを含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、リポソーム、脂質ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマー、ウイルス、ゾルゲル、及びナノゲルからなる群から選択される。
【０１４３】
提供されるリポソーム封入ＭＣＮＡ、またはリポソーム結合ＭＣＮＡ、及びそれを含む組成物は、対象の臨床状態、投与の部位及び投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に重要性を持つ他の要因を考慮して、現在の医療行為により投与及び投薬され得る。本明細書における目的に適う「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医療分野の当業者に既知のこうした適切な考慮すべき事項により決定され得る。一部の実施形態では、投与される量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに有効である。例えば、好適な量及び投薬レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
【０１４４】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生するためのＭＣＮＡの送達方法であって、送達を必要とする対象にＭＣＮＡを投与することを含む、該方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＣＮＡは、静脈内送達、皮下送達、経口送達、真皮下送達、経眼送達、気管内注射肺送達（例えば、吸入投与）、筋肉内送達、髄腔内送達、または関節内送達からなる群から選択される送達経路を介して投与される。
【０１４５】
好適な投与経路として、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内投与もしくは吸入投与を含めた経肺投与、または経腸投与；皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射を含めた非経口送達、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内が挙げられる。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、及び心筋からなる群から選択される筋肉に行う。一部の実施形態では、投与の結果、ＭＣＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与の結果、ＭＣＮＡが肝細胞（すなわち肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与の結果、ＭＣＮＡが筋細胞に送達される。
【０１４６】
あるいはまたは加えて、本発明のリポソーム封入ＭＣＮＡ及び組成物は、全身的にではなく局所的に、例えば、好ましくは徐放性剤形で、医薬組成物を標的組織内へ直接注射することによって投与され得る。局所送達は、標的とされる組織により様々な形で用いることができる。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルを吸引する場合があり（鼻送達、気管送達、または気管支送達として）；本発明の組成物を、例えば、損傷、疾患出現、または痛みの部位内に注射する場合があり；組成物を、経口、気管、または食道用途にトローチ剤で提供する場合があり；胃もしくは腸への投与用に液体、錠剤またはカプセル形態で供給する場合があり；直腸もしくは膣用途に坐剤形態で供給する場合があり；またはクリーム、液滴、さらには注射を使用することにより眼に送達する場合もある。治療用の分子またはリガンドと複合体を形成した提供される組成物を含む製剤は、例えば、組成物を移植部位から周囲細胞に拡散させることができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と合わせて、外科的に投与することもできる。あるいは、これらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用され得る。
【０１４７】
本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療剤（例えば、ＭＣＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態の性質、重症度、及び程度によって規則的な間隔で投与され得る。一部の実施形態では、本発明の治療剤（例えば、ＭＣＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か月に１回）、毎月（毎月１回）、隔週（２週間に１回）、月２回、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、週２回、毎日、または連続して）、周期的に髄腔内に投与することができる。
【０１４８】
一部の実施形態では、提供されるリポソーム及び／または組成物は、その中に含まれるＭＣＮＡの徐放に適するように製剤化される。こうした徐放性組成物は、投薬間隔を延長させて対象に適宜投与することができる。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、毎日、または１日おきに対象に投与される。好適な実施形態では、本発明の組成物は、週２回、週１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回もしくはより好ましくは４週間に１回、１か月に１回、１か月に２回、６週間に１回、８週間に１回、隔月に１回、３か月に１回、４か月に１回、６か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、または毎年対象に投与される。長期間にわたるＭＣＮＡの送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化されている組成物及びリポソームも企図される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにＭＣＮＡに施される修飾と組み合わされている。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、疾患または障害を治療、調節、治癒、防止、及び／または寛解する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療作用及び／または予防作用を得るのに十分な量であり得る。通常、治療剤（例えば、ＭＣＮＡ）の量であって、治療剤を必要とする対象に投与される量は、対象の特徴によって決まることになる。こうした特徴には、対象の症状、疾患の重症度、一般的な健康状態、年齢、性別、及び体重が含まれる。当業者は、これらの及び他の関連する要因によって適正な用量を容易に決定することができるはずである。加えて、至適な用量の範囲を特定するために、客観的及び主観的アッセイの両方が任意選択的に採用され得る。
【０１５０】
治療有効量は、一般的に、複数単位用量が含まれ得る投与レジメンで投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関して、治療有効量（及び／または有効投与レジメン内での適正な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬作用剤との組み合わせに応じて変動し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度；採用される特定の医薬作用剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０１５１】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。
【０１５２】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）超である。特定の実施形態では、治療有効投与量は１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇの治療有効投与量は筋肉内または静脈内に投与される。
【０１５３】
また、本明細書に開示されるリポソームのうちの１つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物と、例えば、２０１１年６月８日に出願された米国仮出願第６１／４９４，８８２号（その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている、こうした組成物を使用するための関連方法とが、本明細書において企図される。例えば、本発明による凍結乾燥された医薬組成物は、投与前に戻されるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで戻され得る。例えば、凍結乾燥された医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に再水和されるように投与され得る。
【０１５４】
提供されるリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達されたＭＣＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織で発現する。一部の実施形態では、送達されたＭＣＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現する。送達されたＭＣＮＡが送達及び／または発現され得る組織の例としては、以下に限定されないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液が挙げられる。
【０１５５】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるＭＣＮＡの発現レベルが、処置前のベースライン発現レベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＭＣＮＡ発現レベルが、処置直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＭＣＮＡ発現レベルが、処置をしていない対象のＭＣＮＡ発現レベルと比較して増加する
【０１５６】
様々な実施形態によると、送達されたＭＣＮＡの発現の時期を特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されたＭＣＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソーム及び／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び／または９６時間後に検出可能である。一部の実施形態では、送達されたＭＣＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、投与の１週間、２週間、及び／または１か月後に検出可能である。
【実施例】
【０１５７】
本発明の特定の化合物、組成物、及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
【０１５８】
実施例１．多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）合成の例
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療用タンパク質をコードするＭＣＮＡを効果的に送達及び発現するための本出願に記載のＭＣＮＡを合成するスキームの例を提供する。
【０１５９】
３’−３’ホスホジエステル結合を含む合成オリゴヌクレオチドを、相補的ＤＮＡスプリントを用いて複数のポリヌクレオチドにライゲーションすることによって、ＭＣＮＡの合成を実施した。３’−３’ホスホジエステル結合を含む合成オリゴヌクレオチドを、相補的ＤＮＡスプリントを用いて複数のポリヌクレオチドにライゲーションする能力に関して、複数の異なるＴ４  ＲＮＡリガーゼを評価した。第一のＲＮＡリガーゼ（「ＲＮＡリガーゼ１」）は、一本ＲＮＡ鎖と、二本ＲＮＡ鎖と、一本鎖オーバーハングになるように設計された二本ＲＮＡ鎖とをライゲーションした「一本鎖」ＲＮＡリガーゼとした。第二のＲＮＡリガーゼ（「ＲＮＡリガーゼ２」）は、相補的オリゴヌクレオチドに結合したＲＮＡにおけるニックをライゲーションした「二本鎖」ＲＮＡリガーゼとした。ＲＮＡリガーゼ１とＲＮＡリガーゼ２の両方には、ライゲーション反応のアデニル化を進めるために、オリゴヌクレオチド架橋のリン酸化５’末端が必要であった。
【０１６０】
非限定的な実施例として、エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを、相補的ＤＮＡスプリントを用いて３’−３’ホスホジエステル結合を含む架橋オリゴにライゲーションした。３’−３’ホスホジエステル結合を含む架橋オリゴヌクレオチドとＤＮＡスプリントとの例を以下に記載する。本明細書の実施例で用いられるＥＰＯの配列の例を以下に列挙する。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを含む）：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU（配列番号１）
【０１６１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（２００Ａポリ（Ａ）テールを有する５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを含む）：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号２）
【０１６２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲに内部６５Ａポリ（Ａ）領域を有する５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを含む）：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU（配列番号３）
【０１６３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲに複数の短い内部ポリ（Ａ）領域を有する５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとを含む）：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAAAAAAAAAAAAAAAUCCCUGUGACCCCUCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAAAAAAAAAAAAAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU（配列番号４）
【０１６４】
架橋オリゴヌクレオチド１：
5'-CGA  CUC  UCG  G-3'-PO4-3'-G  GCU  CUC  AGC-5'（配列番号５）
配列番号５に含まれる塩基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、３’−３’架橋はＰＯ４を含む。
【０１６５】
架橋オリゴヌクレオチド２：
【化６】
2019513372.tif 000075
【０１６６】
架橋オリゴヌクレオチド３：
【化７】
2019513372.tif 000076
【０１６７】
架橋オリゴヌクレオチド４：
【化８】
2019513372.tif 000077
【０１６８】
スプリントオリゴヌクレオチド１：
5'-CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G-3'（配列番号９）
【０１６９】
スプリントオリゴヌクレオチド２：
5'-CCG  AGA  GTG  ATG  CAA  CTT  AAT  TTT  ATT  AGG-3'（配列番号１０）
【０１７０】
スプリントオリゴヌクレオチド３：
5'-TTT  TTT  TTT  TAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G-3'（配列番号１１）
【０１７１】
スプリントオリゴヌクレオチド４：
5'-CCG  AGA  GTC  GTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT-3'（配列番号１２）
【０１７２】
スプリントオリゴヌクレオチド５：
3'-G  GAT  TAT  TTT  AAT  TCA  ACG  TAG  TTC  GAG  CTG  AGA  GCC-5'-PO4-5'-CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G-3'（配列番号１３）
【０１７３】
スプリントオリゴヌクレオチド６：
3'-GGA  TTA  TTT  TAA  TTC  AAC  GTA  GTG  AGA  GCC-5'-PO4-5'-CCG  AGA  GTG  ATG  CAA  CTT  AAT  TTT  ATT  AGG-3'（配列番号１４）
【０１７４】
スプリントオリゴヌクレオチド７：
3'-G  GAT  TAT  TTT  AAT  TCA  ACG  TAG  TTC  GAT  TTT  TTT  TTT-5'-PO4-5'-TTT  TTT  TTT  TAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G-3'（配列番号１５）
【０１７５】
スプリントオリゴヌクレオチド８：
3'-TTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTG  CTG  AGA  GCC-5'-PO4-5'-CCG  AGA  GTC  GTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT-3'（配列番号１６）
【０１７６】
ＥＰＯ  ＭＣＮＡ＃１（ポリＡテール無）
MCNA1（配列番号17）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えた２’−ヒドロキシメチル化ＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）「架橋」オリゴヌクレオチド（架橋オリゴ１（配列番号５）；
【化９】
2019513372.tif 000078
、太文字で記した塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、（Ａ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋ、（Ｂ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、または（Ｃ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２のいずれかと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴ１（スプリントオリゴ１（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。あるいは、ＭＣＮＡを、スプリントオリゴヌクレオチド５（配列番号１３）、すなわち５’−５’ホスホジエステル結合に接続したオリゴ２の２つのコピーを含むパリンドローム配列を用いて調製した。ライゲーション用の試料を調製するために、５０μＭの架橋オリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、架橋オリゴ１を３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化架橋オリゴ１を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．２μＭのキャップされたｈＥＰＯ転写物と、１．５μＭの架橋オリゴ１と、３μＭのスプリントオリゴ１（または１．５μＭのスプリントオリゴ５）とを含む反応液中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、（Ａ）１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、（Ｂ）１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、または（Ｃ）１×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰ、２５℃でｐＨ７．５）、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ）と、を含むように調製した。各々を３７℃で９０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。次いで、精製されたＭＣＮＡ１産物の一部をＤＮＡｓｅ  Ｉで処理して、残留架橋オリゴヌクレオチドを除去し、細胞でＰＣＮＡ１の内因性ＲＮａｓｅ  Ｈ切断が生じる可能性を防いだ。
【０１７７】
別の方法では、MCNA1（配列番号１７）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えた２’−ヒドロキシメチル化ＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）「架橋」オリゴヌクレオチド（架橋オリゴ１（配列番号５）；
【化１０】
2019513372.tif 000079
、太文字で記した塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、（Ａ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋ、（Ｂ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、または（Ｃ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２のいずれかと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴ１（スプリントオリゴ１（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。あるいは、ＭＣＮＡを、スプリントオリゴヌクレオチド６（配列番号１４）と、５’−５’ホスホジエステル結合に接続したオリゴ２の２つのコピーを含むパリンドローム配列とを用いて調製した。ライゲーション用の試料を調製するために、５０μＭの架橋オリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、架橋オリゴ１を３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化架橋オリゴ１を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．２μＭのキャップされたｈＥＰＯ転写物と、１．５μＭの架橋オリゴ１と、３μＭのスプリントオリゴ１（または１．５μＭのスプリントオリゴ６）とを含む反応液中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、（Ａ）１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、（Ｂ）１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、または（Ｃ）１×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰ、２５℃でｐＨ７．５）、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ）と、を含むように調製した。各々を３７℃で９０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。次いで、精製されたＭＣＮＡ１産物の一部をＤＮＡｓｅ  Ｉで処理して、残留架橋オリゴヌクレオチドを除去し、細胞でＰＣＮＡ１の内因性ＲＮａｓｅ  Ｈ切断が生じる可能性を防いだ。
【０１７８】
ＭＣＮＡ１（ポリ（Ａ）テール無配列）：
【化１１】
2019513372.tif 000080
【０１７９】
ＥＰＯ  ＭＣＮＡ＃２
MCNA2（配列番号１８）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。続いて、このｈＥＰＯ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えたＲＮＡ「架橋」オリゴヌクレオチド（架橋オリゴ２（配列番号６）；
【化１２】
2019513372.tif 000081
、下線を引いた塩基はＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴ２（スプリントオリゴ３（配列番号１１）；  5'  TTT  TTT  TTT  TAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。あるいは、ＭＣＮＡを、スプリントオリゴ７（配列番号１５）、すなわち５’−５’ホスホジエステル結合に接続したスプリントオリゴ７の２つのコピーを含むパリンドローム配列を用いて調製した。ライゲーション用の試料を調製するために、架橋オリゴ２を、５０μＭのオリゴ３と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化架橋オリゴ２を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．２μＭのキャップされたｈＥＰＯ転写物と、１．５μＭの架橋オリゴ２と、３μＭのスプリントオリゴ３（または１．５μＭのスプリントオリゴ７）とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）とを含むように調製し、３７℃で９０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ＃２（１０Ａ−１０Ａ架橋）
【化１３】
2019513372.tif 000082
【０１８０】
ＥＰＯ  ＭＣＮＡ  ＃３
ＭＣＮＡ３（配列番号１９）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列の両側に隣接するＵＴＲである５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。構築物をさらに処理して、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて約２００Ａのポリ（Ａ）テール長さを組み込んだ。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えたＯＭｅＲＮＡ「架橋」オリゴヌクレオチド（架橋オリゴ１（配列番号５）；
【化１４】
2019513372.tif 000083
、太文字で記した塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴ１（スプリントオリゴ４（配列番号１２）；5'  CCG  AGA  GTC  GTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT  TTT  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。あるいは、ＭＣＮＡを、スプリントオリゴ８（配列番号１６）、すなわち５’−５’ホスホジエステル結合に接続したスプリントオリゴ４の２つのコピーを含むパリンドローム配列を用いて調製してもよい。ライゲーション用の試料を調製するために、架橋オリゴ１を、５０μＭのオリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化架橋オリゴ１を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．２μＭのキャップされたｈＥＰＯ転写物と、１．５μＭの架橋オリゴ１と、３μＭのスプリントオリゴ４とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）とを含むように調製し、３７℃で９０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
【０１８１】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃３（２００Ａポリ（Ａ）テールを含有）
【化１５】
2019513372.tif 000084
【０１８２】
ＥＰＯ  ＭＣＮＡ  ＃４
ＭＣＮＡ４（配列番号２０）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、３’−３’ホスホジエステル結合により連結された２つのＡを含む単一ジヌクレオチドの５’末端とのスプリント非依存性ライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列の両側に隣接するＵＴＲである５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。構築物をさらに処理して、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて約２００Ａのポリ（Ａ）テール長さを組み込んだ。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、別のＡ配列（架橋オリゴ３（配列番号７）；
【化１６】
2019513372.tif 000085
、下線を引いた塩基はＲＮＡ）の三量体リピートへの３’−３’ホスホジエステル結合を有するＡ配列の三量体リピートを備えたＲＮＡ架橋オリゴヌクレオチドに、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋ用いて二段階でライゲーションした。ライゲーション用の試料を調製するために、架橋オリゴ３を、５０μＭのオリゴ７と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化架橋オリゴ３を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、２．４μＭのキャップされたテール型ｈＥＰＯ転写物と、５０μＭの架橋オリゴ３とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって変性させた後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）とを含むように調製し、３７℃で９０分反応させた。次に、ライゲーション反応物の一部を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ライゲーション反応を、モル比が１：１のライゲーション産物の一部と追加のキャップされたテール型ｈＥＰＯ転写物とを用いて繰り返し、前述したように精製した。
【０１８３】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃４（３Ａ−３Ａ架橋を有する２００Ａポリ（Ａ）テールを含有）
【化１７】
2019513372.tif 000086
【０１８４】
ＥＰＯ  ＭＣＮＡ  ＃５
ＭＣＮＡ５（配列番号２１）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、３’−３’ホスホジエステル結合により連結された２つのＡを含む単一ジヌクレオチドの５’末端とのスプリント非依存性ライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列の両側に隣接するＵＴＲである５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。構築物をさらに処理して、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて約２００Ａのポリ（Ａ）テール長さを組み込んだ。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、別のＡ（架橋オリゴ４（配列番号８）；
【化１８】
2019513372.tif 000087
、下線を引いた塩基はＲＮＡ）への３’−３’ホスホジエステル結合を有するＡを備えたＲＮＡ「架橋」ジヌクレオチドに、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋ用いて二段階でライゲーションした。ライゲーション用の試料を調製するために、架橋オリゴ４を、５０μＭの架橋オリゴ４と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化架橋オリゴ４を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、２．４μＭのキャップされたテール型ｈＥＰＯ転写物と、５０μＭの架橋オリゴ４とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって変性させた後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）とを含むように調製し、３７℃で９０分反応させた。次に、ライゲーション反応物の一部を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ライゲーション反応を、モル比が１：１のライゲーション産物の一部と追加のキャップされたテール型ｈＥＰＯ転写物とを用いて繰り返し、前述したように精製した。
【０１８５】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃５（１Ａ−１Ａ架橋を有する２００Ａポリ（Ａ）テールを含有）
【化１９】
2019513372.tif 000088
【０１８６】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃６
ＰＣＮＡ６（配列番号２２）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製する。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列の両側に隣接するＵＴＲである、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と６５個の連続するＡの内部断片を備えた３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製する。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えたＯＭｅＲＮＡ「架橋」オリゴヌクレオチド（架橋オリゴ１（配列番号５）；
【化２０】
2019513372.tif 000089
、下線を引いた塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴ１（スプリントオリゴ１（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションする。ライゲーション用の試料を調製するために、架橋オリゴ１を、５０μＭの架橋オリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化する。リン酸化架橋オリゴ１を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．２μＭのキャップされたｈＥＰＯ転写物と、１．５μＭの架橋オリゴ１と、３μＭのスプリントオリゴ１とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却する。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）とを含むように調製し、３７℃で９０分反応させる。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製する。
【０１８７】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃６（内部６５Ａポリ（Ａ）領域を含有）
【化２１】
2019513372.tif 000090
【０１８８】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃７
ＰＣＮＡ７（配列番号２３）を、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製する。簡潔に述べると、ｈＥＰＯをコードするＲＮＡ配列の両側に隣接するＵＴＲである、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と１５個のＡの３つのストレッチ及び１６個のＡの１つのストレッチを備えた３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製する。続いて、ｈＥＰＯ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えたＯＭｅＲＮＡ「架橋」オリゴヌクレオチド（架橋オリゴ１（配列番号５）；
【化２２】
2019513372.tif 000091
、下線を引いた塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及び架橋オリゴ１（スプリントオリゴ１（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションする。ライゲーション用の試料を調製するために、オリゴ１を、５０μＭの架橋オリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化する。リン酸化架橋オリゴ１を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．２μＭのキャップされたｈＥＰＯ転写物と、１．５μＭの架橋オリゴ１と、３μＭのスプリントオリゴ１とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却する。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び１Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）とを含むように調製し、３７℃で９０分反応させる。次に、完了したライゲーションの反応物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製する。
【０１８９】
ＥＰＯ  ＰＣＮＡ  ＃７（複数の短い内部ポリ（Ａ）領域を含有）：
【化２３】
2019513372.tif 000092
【０１９０】
図５は、ゲル電気泳動により検出されたＭＣＮＡの結果を示す。レーン１〜１５で泳動したＭＣＮＡは、ＥＰＯ  ｍＲＮＡ：架橋オリゴヌクレオチド：ＤＮＡスプリント（配列番号９）をモル比２：１：２で含むライゲーション反応の結果である。ＥＰＯ  ｍＲＮＡとＲＮＡリガーゼのモル濃度量は以下の表に示されている。
【表７】
2019513372.tif 000093
図５は、評価条件下でＥＰＯ  ＲＮＡを含むＭＣＮＡを産生することにおいてＲＮＡリガーゼ１がＲＮＡリガーゼ２よりも有意であったことを示す。さらに、反応条件に１０％のＰＥＧを加えることにより、ライゲーションが促進した。
【０１９１】
図６は、ゲル電気泳動により検出されたＭＣＮＡを示す。レーン１は、キャップＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）テール無）を示す。レーン２は、完全長ＭＣＮＡライゲーション産物と未反応／部分反応ＥＰＯ  ＲＮＡ産物とを混合したＭＣＮＡ混合物（ＤＮＡｓｅ処理無）を示す。レーン３は、完全長ＭＣＮＡライゲーション産物と未反応／部分反応ＥＰＯ  ＲＮＡ産物とを混合したＭＣＮＡ混合物（ＤＮＡｓｅ処理有）を示す。
【０１９２】
図８は、ゲル電気泳動により検出されたＭＣＮＡを示す。レーン１は、ＲＮＡ大きさ決定用ラダーを示す。レーン２は、完全長ＭＣＮＡライゲーション産物と未反応／部分反応ＥＰＯ  ＲＮＡ産物とを混合したＭＣＮＡ混合物を示す。レーン３は、精製された未反応／部分反応ＥＰＯ  ＲＮＡ産物を示す。レーン４は、精製されたＥＰＯ  ＭＣＮＡライゲーション産物を示す。
【０１９３】
ＭＣＮＡ−ＯＴＣ調製
ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣ）ＲＮＡ（配列番号２４）を含むＭＣＮＡ−ＯＴＣを、ｈＯＴＣタンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＯＴＣをコードするＲＮＡ配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。続いて、ｈＯＴＣ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えた２’−ヒドロキシメチル化ＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）「架橋」オリゴヌクレオチド（オリゴ１（架橋）（配列番号５）；
【化２４】
2019513372.tif 000094
、太文字で記した塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及びオリゴ１（オリゴ２（スプリント）（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。ライゲーション用の試料を調製するために、オリゴ１を、５０μＭのオリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化オリゴ１（架橋）を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、３．３μＭのキャップされたｈＯＴＣ転写物と、１．５μＭのオリゴ１と、３．３μＭのオリゴ２とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び０．３３Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１とを含むように調製した。各々を３７℃で６０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物をＤＮＡｓｅ  Ｉと反応させた後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。反応産物をＴＢＥ／アガロースゲル電気泳動を用いてライゲーション効率について評価した。単離されたＭＣＮＡ−ＯＴＣ産物をリポフェクタミンで平衡化し、付着ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。次いで、未分画細胞溶解物を、オルニチンとカルバモイルリン酸とからのシトルリン産生についてアッセイした（図１０）。
【０１９４】
ＭＣＮＡ−ＯＴＣ
【化２５】
2019513372.tif 000095
【０１９５】
ＭＣＮＡ−ＰＡＨ調製
ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）ＲＮＡ（配列番号２５）を含むＭＣＮＡ−ＰＡＨを、ｈＰＡＨタンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＰＡＨをコードするＲＮＡ配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。続いて、ｈＰＡＨ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えた２’−ヒドロキシメチル化ＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）「架橋」オリゴヌクレオチド（オリゴ１（架橋）（配列番号５）；
【化２６】
2019513372.tif 000096
、太文字で記した塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及びオリゴ１（オリゴ２（スプリント）（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。ライゲーション用の試料を調製するために、オリゴ１を、５０μＭのオリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化オリゴ１（架橋）を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、２．７μＭのキャップされたｈＰＡＨ転写物と、１．２μＭのオリゴ１と、２．７μＭのオリゴ２とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び０．３３Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１とを含むように調製した。各々を３７℃で６０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物をＤＮＡｓｅ  Ｉと反応させた後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。反応産物をＴＢＥ／アガロースゲル電気泳動を用いてライゲーション効率について評価した。単離されたＭＣＮＡ−ＰＡＨ反応産物をリポフェクタミンで平衡化し、付着ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。次いで、未分画細胞溶解物を、ＰＡＨタンパク質発現について、ＰＡＨ特異的ＥＬＩＳＡを用いてアッセイした（図１１）。
【０１９６】
ＭＣＮＡ−ＰＡＨ
【化２７】
2019513372.tif 000097
【０１９７】
ＭＣＮＡ−ＣＦＴＲ調製
ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｈＣＦＴＲ）ＲＮＡ（配列番号２６）を含むＭＣＮＡ−ＣＦＴＲを、ｈＣＦＴＲタンパク質をコードするＲＮＡの２つのコピーの３’末端と、配列内に２つの５’末端及び連結された３’−３’ホスホジエステル結合を含む単一オリゴヌクレオチドの５’末端とのスプリントライゲーションによって調製した。簡潔に述べると、ｈＣＦＴＲをコードするＲＮＡ配列に隣接する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを含む５’キャップＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、５’−Ｃａｐ１構造を含むように酵素を用いてキャップし、精製した。続いて、ｈＣＦＴＲ転写物を、第１０番目と第１１番目のｎｔの間で３’−３’ホスホジエステル結合を有する２０ヌクレオチド（ｎｔ）のパリンドローム配列を備えた２’−ヒドロキシメチル化ＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）「架橋」オリゴヌクレオチド（オリゴ１（架橋）（配列番号５）；
【化２８】
2019513372.tif 000098
、太文字で記した塩基はＯＭｅＲＮＡ）に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１＋ＰＥＧ  ８Ｋと、３’−ＵＴＲ及びオリゴ１（オリゴ２（スプリント）（配列番号９）；5'  CCG  AGA  GTC  GAG  CTT  GAT  GCA  ACT  TAA  TTT  TAT  TAG  G  3'；全塩基がＤＮＡ）に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド「スプリント」とを用いて、単一段階でライゲーションした。ライゲーション用の試料を調製するために、オリゴ１を、５０μＭのオリゴ１と、１ｍＭのＡＴＰと、１×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ；７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）と、０．５Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを含む反応液中で、３７℃で１時間５’末端リン酸化した。リン酸化オリゴ１（架橋）を、次いで、セファデックスＧ−２５脱塩カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて脱塩化して、０．９２μＭのキャップされたｈＣＦＴＲ転写物と、０．４２μＭのオリゴ１と、０．９２μＭのオリゴ２とを含む反応物中で７５℃に５分間加熱することによって転写物とスプリントとにハイブリダイズした後、５分間にわたって室温まで徐々に冷却した。続いて、ＲＮＡライゲーション反応を、５０％の希釈されたハイブリダイゼーション反応物と、１×ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ、及び０．３３Ｕ／μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１とを含むように調製した。各々を３７℃で６０分反応させた。次に、完了したライゲーションの反応物をＤＮＡｓｅ  Ｉと反応させた後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。反応産物をＴＢＥ／アガロースゲル電気泳動を用いてライゲーション効率について評価した。単離されたＭＣＮＡ−ＣＦＴＲ産物をリポフェクタミンで平衡化し、付着ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。次いで、未分画細胞溶解物を、ＣＦＴＲタンパク質発現について、ＣＦＴＲ特異的ウェスタンブロット法を用いてアッセイした（図１２）。
【０１９８】
ＭＣＮＡ−ＣＦＴＲ
【化２９−１】
2019513372.tif 000099
【化２９−２】
2019513372.tif 000100
【化２９−３】
2019513372.tif 000101
【０１９９】
実施例２．ＭＣＮＡを用いたタンパク質産生の例
本実施例は、３’末端で架橋オリゴヌクレオチドに連結されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生を示す。
【０２００】
ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡを含むＭＣＮＡを上記に記載したとおりに合成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションするために使用した（１試料あたり１マイクログラムのＲＮＡトランスフェクション）。図７は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ａ）ポリＡテールを欠いたｈＥＰＯコードｍＲＮＡ、ｂ）ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡ、またはｃ）ＤＮＡｓｅで処理されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡのいずれかでトランスフェクションされた場合の、その細胞から分泌されたｈＥＰＯタンパク質の量を比較した実験結果を示している。細胞をｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡまたはＤＮａｓｅ処理済みｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡでトランスフェクションした場合に、タンパク質の産生が、テール無ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡに比べて明らかに増加した。
【０２０１】
図９は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ａ）ポリＡテールを欠いたｈＥＰＯコードｍＲＮＡ、ｂ）ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡと未反応／部分反応ＥＰＯ  ＲＮＡとの未精製混合物、ｃ）精製された未反応／部分反応ＥＰＯ  ＲＮＡ、またはｄ）精製されたＥＰＯ  ＭＣＮＡのいずれかでトランスフェクションされた場合の、その細胞から分泌されたｈＥＰＯタンパク質の量を比較した実験結果を示している。全ての試料を総量２５０ナノグラムのＲＮＡでトランスフェクションした。精製したＥＰＯ  ＭＣＮＡで細胞をトランスフェクションした場合に、混合物または未反応のｈＥＰＯ  ＲＮＡと比べて、タンパク質の産生が明らかに増加した。図１０は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ａ）ポリＡテールを欠いたｈＯＴＣコードｍＲＮＡ（ｈＯＴＣ単量体）、またはｂ）ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡのいずれかでトランスフェクションされた場合の、その細胞内のヒトＯＴＣタンパク質活性量（シトルリン産生により測定される）を比較した実験結果を示している。ｈＯＴＣ含有ＭＣＮＡで細胞がトランスフェクションされた場合のみ、ｈＯＴＣ単量体の場合と比較して、検出可能なタンパク質産生が得られた。
【０２０２】
図１１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ａ）ポリＡテールを欠いたｈＰＡＨをコードするｍＲＮＡ（ｈＰＡＨ単量体）、またはｂ）ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡのいずれかでトランスフェクションされた場合の、その細胞内に産生されたヒトＰＡＨタンパク質の量を比較した実験結果を示している。ｈＰＡＨ含有ＭＣＮＡで細胞がトランスフェクションされた場合、ｈＰＡＨ単量体の場合と比較して、有意に高いタンパク質の産生が得られた。
【０２０３】
図１２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ａ）ポリＡテールを欠いたｈＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡ（ｈＣＦＴＲ単量体）、またはｂ）ｈＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ含有ＭＣＮＡのいずれかでトランスフェクションされた場合の、その細胞内に産生されたヒトＣＦＴＲタンパク質の量を比較した実験結果を示している。ｈＣＦＴＲ含有ＭＣＮＡで細胞がトランスフェクションされた場合のみ、ｈＣＦＴＲ単量体の場合と比較して、検出可能なタンパク質産生が得られた。
【０２０４】
実施例３．ＭＣＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質産生の例
本実施例は、３’末端で架橋オリゴヌクレオチドに連結されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を示す。
【０２０５】
ヒトオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡを含むＭＣＮＡを上記に記載したとおりに合成した。ｓｐｆａｓｈマウスを、脂質ナノ粒子に封入されたｈＯＴＣ  ＭＣＮＡを用いて静脈を通して処置した。動物を屠殺し、それらの肝臓を、投与の２４時間後または７日後に単離した。肝臓試料におけるシトルリンの産生を測定し、投与７日後のｈＯＴＣタンパク質活性レベルが、投与２４時間後のｈＯＴＣタンパク質活性レベルと同等であることを見出した（図１３）。この両時点で、ｈＯＴＣタンパク質活性は、対照のｓｐｆａｓｈマウスの肝臓内よりも有意に高かった。さらに、投与１日後と８日後とにかなりの量のｈＯＴＣタンパク質をウェスタンブロットで検出したが、ｈＯＴＣ  ＭＣＮＡ  ＬＮＰで処置したｓｐｆａｓｈマウスに対しては検出され、ｈＯＴＣ単量体ＬＮＰで処置したマウスに対しては検出されず（図１４）、これは観察された活性データとも一致していた。比較すると、ｓｐｆａｓｈマウスをｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを用いて静脈を通して処置した場合に、ｈＯＴＣタンパク質活性レベルは、投与２４時間後の方が投与７日後よりも高かった（図１５）。図１６に明示されたように、投与７日後のｈＯＴＣタンパク質活性を２４時間後の活性レベルの割合として計算した場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ（２４時間後の活性の３８％）に対してよりもｈＯＴＣ  ＭＣＮＡ（２４時間後の活性の１０９％）に対して持続性が高いことが示されている。
【０２０６】
別の検討では、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）を含むＭＣＮＡを上述したとおりに合成した。脂質ナノ粒子に封入されたｈＰＡＨ  ＭＣＮＡまたはｈＰＡＨ単量体（５’キャップを有するがポリＡテールを有さないｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ）を用いて、ＰＡＨノックアウト（ＫＯ）マウスを静脈を通して処置した。動物を屠殺し、それらの肝臓を投与２４時間後に単離した。ｈＰＡＨ  ＭＣＮＡで処置したマウスの肝臓で検出されたｈＰＡＨタンパク質は、ｈＰＡＨ単量体で処置したマウスの肝臓で検出されたｈＰＡＨタンパク質よりも２７倍超多かった（図１７）。
【０２０７】
さらに、ｈＰＡＨ  ＭＣＮＡ  ＬＮＰでＰＡＨノックアウト（ＫＯ）マウスを処置した後の有効性を証明した。具体的には、ｈＰＡＨ  ＭＣＮＡで処置した２４時間後に血清フェニルアラニンレベルが有意に減少したが、ｈＰＡＨ単量体ＬＮＰで処置した２４時間後には血清フェニルアラニンの減少は見られなかった（図１８）。
【０２０８】
別の検討では、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）を含むＭＣＮＡを上述したとおりに合成した。脂質ナノ粒子に封入されたｈＥＰＯ  ＭＣＮＡまたはｈＥＰＯ単量体（５’キャップを有するがポリＡテールを有さないｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）を用いて、野生型マウスを静脈を通して処置した。該動物由来の血清試料を投与２４時間後に採取した。ｈＥＰＯ  ＭＣＮＡで処置したマウスの血清で検出されたｈＥＰＯタンパク質は、ｈＥＰＯ単量体で処置したマウスの血清で検出されたｈＥＰＯタンパク質よりも４８０倍超多かった（図１９）。
【０２０９】
別の検討では、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｈＣＦＴＲ）を含むＭＣＮＡを上述したとおりに合成した。ＣＦＴＲ  ＫＯマウスを脂質ナノ粒子に封入されたｈＣＦＴＲ  ＭＣＮＡのエアロゾル投与によって処置した。動物を屠殺し、それらの肺を、投与の２４時間後または７日後に単離した。図２０に示すように、投与の２４時間後及び７日後に、気管支上皮気道（上側の列）と肺胞領域（下側の列）でＭＣＮＡに由来するｈＣＦＴＲタンパク質を検出した（茶色の染色）。
【０２１０】
等価物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験方法を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019513372.tif 000106
【図６】
2019513372.tif 000107
【図７】
2019513372.tif 000108
【図８】
2019513372.tif 000109
【図９】
2019513372.tif 000110
【図１０】
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【図１１】
2019513372.tif 000112
【図１２】
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【図１３】
2019513372.tif 000114
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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