(57)【要約】本開示は、非機能性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現するＴ細胞（すなわち、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む）を生成するための試薬、当該試薬及びＴ細胞を含む組成物、ならびに治療（例えば、養子療法）における当該ＣＡＲ−Ｔ細胞の使用に関する。【選択図】図１
2019531718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸を含むＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトであって、それぞれのｓｈｍｉＲが、
少なくとも１７のヌクレオチドの長さのエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）骨格と、
を含み、
それぞれのｓｈｍｉＲの前記エフェクター配列が、ＣＤ３−ε、ＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−δからなる群から選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的である、前記ｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２】
それぞれのｓｈｍｉＲが、５’から３’の方向で、
前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の５’隣接配列と、
前記エフェクター相補配列と、
前記ステムループ配列と、
前記エフェクター配列と、
前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の３’隣接配列と、
を含む、請求項１に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３】
前記ステムループ配列が、配列番号９７に示される配列である、請求項２に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項４】
前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格が、ｐｒｉ−ｍｉＲ−３１ａ骨格である、請求項２または請求項３に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５】
前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の前記５’隣接配列が、配列番号９８に示されるものであり、前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の前記３’隣接配列が、配列番号９９に示されるものである、請求項４に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項６】
前記２つ以上の核酸が、
（ｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項７】
（ｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む、請求項６に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項８】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが、配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが、配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含む、
請求項６または請求項７に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項９】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが、配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが、配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含む、
請求項６〜８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１０】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１５３に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが、配列番号１４６に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが、配列番号１４４に示される配列を含むか、または前記配列からなる、
請求項６〜９のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１１】
前記２つ以上の核酸が、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１２】
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む、請求項１１に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１３】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１００に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが、配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む、
請求項１１または請求項１２に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１４】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが、配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む、
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１５】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１３６に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが、配列番号１４４に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１５３に示される配列を含むか、または前記配列からなる、
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１６】
前記２つ以上の核酸が、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１７】
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む、請求項１６に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１８】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１００に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが、配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む、
請求項１６または請求項１７に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１９】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが、配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む、
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２０】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１３６に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが、配列番号１４６に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１５３に示される配列を含むか、または前記配列からなる、
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２１】
前記２つ以上の核酸が、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２２】
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または前記ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む、請求項２１に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２３】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１００に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δが、配列番号１２６に示されるエフェクター配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む、
請求項２１または請求項２２に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２４】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δが、配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含み、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む、
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２５】
（ｉ）ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが、配列番号１３６に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δが、配列番号１４９に示される配列を含むか、または前記配列からなり、
（ｉｉｉ）ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが、配列番号１５３に示される配列を含むか、または前記配列からなる、
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２６】
ｓｈｍｉＲをコードするそれぞれの核酸の上流にＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２７】
それぞれのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターから選択される、請求項２６に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２８】
それぞれのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、Ｕ６−９プロモーター、Ｕ６−１プロモーター、及びＵ６−８プロモーターから選択されるＵ６プロモーターである、請求項２６または請求項２７に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２９】
（ａ）請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトと、
（ｂ）ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトと、
を含む、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項３０】
前記ＣＡＲが、抗原結合ドメインを含む、請求項２９に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３１】
前記抗原結合ドメインが、結合タンパク質である、請求項３０に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３２】
前記抗原結合ドメインが、抗体またはその抗原結合ドメインである、請求項３１に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３３】
前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３４】
前記抗原結合ドメインが、感染細胞の表面に見られるウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原に特異的に結合する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３５】
前記ＣＡＲコンストラクトに含められ、前記ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡ配列の上流に配置されるプロモーターに対して、前記ＣＡＲをコードする前記ＤＮＡ配列が機能可能なように連結される、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３６】
前記ＤＮＡコンストラクトが、５’から３’の方向で、前記ｄｄＲＮＡｉコンストラクト及び前記ＣＡＲコンストラクトを含む、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３７】
前記ＤＮＡコンストラクトが、５’から３’の方向で、前記ＣＡＲコンストラクト及び前記ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項３８】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトを含む、発現ベクター。
【請求項３９】
前記発現ベクターが、プラスミドまたはミニサークルである、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター、及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項３８または請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、Ｔ細胞。
【請求項４２】
前記Ｔ細胞が、機能性のＴＣＲを発現しない、請求項４１に記載のＴ細胞。
【請求項４３】
前記Ｔ細胞が、ＴＣＲ複合体の少なくとも２つの構成要素の細胞表面発現の減少を示す、請求項４１または請求項４２に記載のＴ細胞。
【請求項４４】
前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに発現する、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項４５】
前記ＣＡＲが、抗原結合ドメインを含む、請求項４４に記載のＴ細胞。
【請求項４６】
前記抗原結合ドメインが、結合タンパク質である、請求項４５に記載のＴ細胞。
【請求項４７】
前記抗原結合ドメインが、抗体またはその抗原結合ドメインである、請求項４５または請求項４６に記載のＴ細胞。
【請求項４８】
前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項４９】
前記抗原結合ドメインが、感染細胞の表面に見られるウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原に特異的に結合する、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項５０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項４１〜４９のいずれか１項に記載のＴ細胞を含む、組成物。
【請求項５１】
１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
機能性のＴＣＲを発現しないＴ細胞の生成方法であって、前記方法が、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項５０もしくは請求項５１に記載の組成物をＴ細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項５３】
機能性のＴＣＲを発現しないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の生成方法であって、前記方法が、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト、または前記ＤＮＡコンストラクトを含む請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の発現ベクター、または前記ＤＮＡコンストラクトを含む請求項５０もしくは請求項５１に記載の組成物をＴ細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項５４】
５２で生成した前記Ｔ細胞のＨＬＡタイピングをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｔ細胞における２つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニットの発現の抑制方法であって、前記方法が、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクト、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項５０もしくは請求項５１に記載の組成物を前記Ｔ細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
エクスビボで実施される、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
それを必要とする個体におけるがん、移植片対宿主病、感染症、１つもしくは複数の自己免疫障害、移植拒絶、または放射線宿酔の予防方法または治療方法であって、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載のＴ細胞、または前記Ｔ細胞を含む請求項５０もしくは請求項５１に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項５８】
前記個体に投与される前記Ｔ細胞が、同種Ｔ細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記個体に投与される前記Ｔ細胞が、非自家Ｔ細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
機能性のＴＣＲを発現しない異なるＨＬＡ型の複数のＴ細胞を含む細胞バンクであって、前記細胞バンクが、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載のＴ細胞を少なくとも１つ含む、前記細胞バンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１６年９月１４日出願の米国仮出願第６２／３９４，５５９号の優先権を主張し、当該文献の内容はすべて、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、非機能性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現するＴ細胞（すなわち、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む）を生成するための試薬、当該試薬及びＴ細胞を含む組成物、ならびに治療（例えば、養子療法）における当該ＣＡＲ−Ｔ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、対象のがんを治療できるように対象自身の免疫細胞を改変する能力をもたらすことによって、特に腫瘍学の分野において素晴らしい進歩を遂げている。治療現場においては自家養子細胞移入手法が成功裏に利用されているものの、同種手法によって製造プロセスが大幅に合理化する可能性がある。結果としてこのことは、患者にとってより利用しやすい選択肢を与えると共に、移植片対宿主病が生じる可能性の低減によって安全性を高め得るものである。改変されたＴ細胞でのＴＣＲの発現を制限することは、レシピエントにおける主要組織適合抗原及び副組織適合抗原の認識能力を除去する上で役立つものである。
【０００４】
ＣＡＲを発現するように操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞を含めて、非機能性のＴＣＲを含むＴ細胞の生成には、さまざまな方針が利用可能である。しかしながら、方針の改良が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、低分子ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する１つまたは複数の核酸を含むＤＮＡ依存性（指向性）ＲＮＡ干渉（ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトを提供し、唯一またはそれぞれのｓｈｍｉＲは、
少なくとも１７のヌクレオチドの長さのエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）骨格と、
を含み、
唯一またはそれぞれのｓｈｍｉＲのエフェクター配列は、ＣＤ３−ε、ＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−δからなる群から選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的である。本開示のｓｈｍｉＲが標的とし得るＴＣＲ複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物の例は、本明細書に記載されている。ＴＣＲ複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲの例には、表２及び表３に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３が含まれる。表２及び表３に記載のｓｈｍｉＲの追加例も企図される。
【０００６】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸を含む。ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲの例、及び当該ｓｈｍｉＲをコードする核酸は、本明細書に記載されており、別段の具体的な記載がない限り、この例、及びＣＤ３−εを標的とするｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉを説明する本開示の任意の他の例に準用されるものとする。１つの特定の例では、ＣＤ３−εを標的とするｓｈｍｉＲは、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３である。
【０００７】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸を含む。ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αと命名されたｓｈｍｉＲの例、及び当該ｓｈｍｉＲをコードする核酸は、本明細書に記載されており、別段の具体的な記載がない限り、この例、及びＴＣＲ−αを標的とするｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉを説明する本開示の任意の他の例に準用されるものとする。１つの特定の例では、ＴＣＲ−αを標的とするｓｈｍｉＲは、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１である。
【０００８】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸を含む。ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βと命名されたｓｈｍｉＲの例、及び当該ｓｈｍｉＲをコードする核酸は、本明細書に記載されており、別段の具体的な記載がない限り、この例、及びＴＣＲ−βを標的とするｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉを説明する本開示の任意の他の例に準用されるものとする。１つの特定の例では、ＴＣＲ−βを標的とするｓｈｍｉＲは、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５である。
【０００９】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸を含む。ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γと命名されたｓｈｍｉＲの例、及び当該ｓｈｍｉＲをコードする核酸は、本明細書に記載されており、別段の具体的な記載がない限り、この例、及びＣＤ３−γを標的とするｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉを説明する本開示の任意の他の例に準用されるものとする。１つの特定の例では、ＣＤ３−γを標的とするｓｈｍｉＲは、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２である。
【００１０】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸を含む。ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δと命名されたｓｈｍｉＲの例、及び当該ｓｈｍｉＲをコードする核酸は、本明細書に記載されており、別段の具体的な記載がない限り、この例、及びＣＤ３−δを標的とするｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉを説明する本開示の任意の他の例に準用されるものとする。１つの特定の例では、ＣＤ３−δを標的とするｓｈｍｉＲは、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３である。
【００１１】
１つの例では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトは、低分子ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸を含み、それぞれのｓｈｍｉＲは、
少なくとも１７のヌクレオチドの長さのエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）骨格と、
を含み、
それぞれのｓｈｍｉＲのエフェクター配列は、ＣＤ３−ε、ＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−δからなる群から選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的である。
【００１２】
ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む１つの例によれば、それぞれのｓｈｍｉＲのエフェクター配列は、異なるＴＣＲ複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物を標的とする。ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む別の例によれば、それぞれのｓｈｍｉＲのエフェクター配列は、同一のＴＣＲ複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物を標的とする。ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する少なくとも３つの核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む別の場合によれば、少なくとも２つのｓｈｍｉＲのエフェクター配列が、異なるＴＣＲ複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物を標的とする。
【００１３】
本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのそれぞれの例では、それぞれのｓｈｍｉＲは、５’から３’の方向で、
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の５’隣接配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
エフェクター配列と、
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の３’隣接配列と、
を含む。
【００１４】
１つの例では、ステムループ配列は、配列番号９７に示される配列である。
【００１５】
１つの例では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格である。しかしながら、他のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格が使用されることもあり得、本明細書にその使用が記載及び企図される。
【００１６】
１つの例では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の５’隣接配列は、配列番号９８に示されるものであり、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の３’隣接配列は、配列番号９９に示されるものである。
【００１７】
ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む１つの例によれば、２つ以上の核酸は、
（ｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される。
【００１８】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００１９】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−β、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのエフェクター配列及び関連エフェクター相補配列の例は、表２に記載され、本明細書で企図される。
【００２０】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ＣＤ３−γは、配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含む。
【００２１】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００２２】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００２３】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含む。
【００２４】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００２５】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００２６】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−β、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのｓｈｍｉＲ配列の例は、表３に記載され、本明細書で企図される。
【００２７】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１５３に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１４４に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１４６に示される配列を含む。
【００２８】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１４４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００２９】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１４４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００３０】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７５に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。別の例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７８に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。
【００３１】
ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む別の例によれば、２つ以上の核酸は、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される。
【００３２】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＴＣＲ−βサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００３３】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのエフェクター配列及び関連エフェクター相補配列の例は、表２に記載され、本明細書で企図される。
【００３４】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む。
【００３５】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００３６】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００３７】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む。
【００３８】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００３９】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００４０】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのｓｈｍｉＲ配列の例は、表３に記載され、本明細書で企図される。
【００４１】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１３６に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１４４に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１５３に示される配列を含む。
【００４２】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００４３】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００４４】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７２に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。別の例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７６に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。
【００４５】
ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む別の例によれば、２つ以上の核酸は、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される。
【００４６】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００４７】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−α、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのエフェクター配列及び関連エフェクター相補配列の例は、表２に記載され、本明細書で企図される。
【００４８】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ＣＤ３−γは、配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む。
【００４９】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００５０】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００５１】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む。
【００５２】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００５３】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００５４】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−α、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのｓｈｍｉＲ配列の例は、表３に記載され、本明細書で企図される。
【００５５】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１３６に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１４６に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１５３に示される配列を含む。
【００５６】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００５７】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００５８】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７３に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。別の例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７７に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。
【００５９】
ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸をｄｄＲＮＡｉコンストラクトが含む別の例によれば、２つ以上の核酸は、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される。
【００６０】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）ＴＣＲ−αサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００６１】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−α、ＣＤ３−δ、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのエフェクター配列及び関連エフェクター相補配列の例は、表２に記載され、本明細書で企図される。
【００６２】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ＣＤ３−δは、配列番号１２６に示されるエフェクター配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含む。
【００６３】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２６に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００６４】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２６に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００６５】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含む。
【００６６】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００６７】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００６８】
ＴＣＲサブユニットであるＴＣＲ−α、ＣＤ３−δ、及びＣＤ３−εのｍＲＮＡ転写物を標的とするｓｈｍｉＲのｓｈｍｉＲ配列の例は、表３に記載され、本明細書で企図される。
【００６９】
１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１３６に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１４９に示される配列を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１５３に示される配列を含む。
【００７０】
したがって、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４９に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
のうちの少なくとも２つを含む。
【００７１】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号１３６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）配列番号１４９に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含む。
【００７２】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７４に示されるＤＮＡ配列を有する核酸を含むか、または当該核酸からなる。
【００７３】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈｍｉＲをコードするそれぞれの核酸の上流にＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含む。例えば、唯一またはそれぞれのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターから選択される。例えば、唯一またはそれぞれのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６−９プロモーター、Ｕ６−１プロモーター、及びＵ６−８プロモーターから選択されるＵ６プロモーターである。例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのうちの１つまたは複数は、Ｕ６−９プロモーター、Ｕ６−１プロモーター、及びＵ６−８プロモーターから選択されるＵ６プロモーターであり、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのうちの１つまたは複数は、Ｈ１プロモーターである。
【００７４】
本開示は、
（ａ）本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトと、
（ｂ）ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトと、
を含むＤＮＡコンストラクトも提供する。
【００７５】
１つの例では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。
【００７６】
１つの例では、抗原結合ドメインは、結合タンパク質である。例えば、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合ドメインである。
【００７７】
１つの例では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。腫瘍抗原の例は、本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されるものとする。１つの例では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む。
【００７８】
別の例では、抗原結合ドメインは、感染細胞の表面に見られるウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原に特異的に結合する。１つの例では、ウイルス抗原は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザ及びＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガム（ＪＣ）ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ菌、ライノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１、ＨＳＶ  ＩＩ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）６、ＨＨＶ８、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス  エボラウイルス、ジカウイルス、ハンタウイルス、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からなる群から選択される。
【００７９】
１つの例では、ＣＡＲコンストラクトに含められ、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列の上流に配置されるプロモーターに対して、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列が機能可能なように連結される。１つの例では、ＤＮＡコンストラクトは、５’から３’の方向で、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト及びＣＡＲコンストラクトを含む。別の例では、ＤＮＡコンストラクトは、５’から３’の方向で、ＣＡＲコンストラクト及びｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む。
【００８０】
本開示は、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトまたは本明細書に記載のＤＮＡコンストラクトを含む発現ベクターも提供する。
【００８１】
本開示は、複数の発現ベクターも提供し、発現ベクターのうちの１つは、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含み、発現ベクターのうちの１つは、本明細書に記載のＤＮＡコンストラクトのＣＡＲコンストラクトを含む。
【００８２】
１つの例では、発現ベクター（複数可）は、プラスミド（複数可）またはミニサークル（複数可）である。
【００８３】
１つの例では、発現ベクター（複数可）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター、及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。
【００８４】
複数の発現ベクターが提供される例によれば、発現ベクターは、同一または異なるものであり得る。
【００８５】
本開示は、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、または本明細書に記載の１つもしくは複数の発現ベクターを含むＴ細胞も提供する。
【００８６】
１つの例では、本開示のＴ細胞は、機能性のＴＣＲを発現しない。例えば、Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体の少なくとも２つの構成要素の細胞表面発現の減少を示し、その結果、機能性のＴＣＲは構築されない。
【００８７】
１つの例では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。例えば、機能性（内在性）のＴＣＲを発現せず、ＣＡＲを発現するＴ細胞（本明細書ではＣＡＲ−Ｔ細胞とも称される）が提供される。
【００８８】
１つの例では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。
【００８９】
１つの例では、抗原結合ドメインは、結合タンパク質である。例えば、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合ドメインである。
【００９０】
１つの例では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。腫瘍抗原の例は、本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されるものとする。
【００９１】
別の例では、抗原結合ドメインは、感染細胞の表面に見られるウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原に特異的に結合する。１つの例では、ウイルス抗原は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザ及びＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガム（ＪＣ）ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ菌、ライノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１、ＨＳＶ  ＩＩ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）６、ＨＨＶ８、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス  エボラウイルス、ジカウイルス、ハンタウイルス、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からなる群から選択される。
【００９２】
本開示は、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、または本明細書に記載の１つもしくは複数の発現ベクター、または本明細書に記載のＴ細胞を含む組成物も提供する。
【００９３】
１つの例では、組成物は、１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体をさらに含む。ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、本明細書に記載の１つもしくは複数の発現ベクターを含む組成物の例によれば、担体は、細胞培養において例えばエクスビボで、細胞に投与する上で適切なものであり得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む組成物の例によれば、担体は、治療において例えばヒトなどの対象に投与する上で適切なものであり得る。適切な担体は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載されている。
【００９４】
本開示は、機能性のＴＣＲを発現しないＴ細胞の生成方法も提供し、当該方法は、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、本明細書に記載の発現ベクター（複数可）、または本明細書に記載の組成物をＴ細胞に導入することを含む。
【００９５】
本開示は、機能性のＴＣＲを発現しないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の生成方法も提供し、当該方法は、本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、当該ＤＮＡコンストラクトを含む本明細書に記載の発現ベクター、または当該ＤＮＡコンストラクトを含む本明細書に記載の組成物をＴ細胞に導入することを含む。
【００９６】
本開示は、Ｔ細胞における２つ以上のＴＣＲ複合体サブユニットの発現の抑制方法も提供し、当該方法は、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、本明細書に記載の発現ベクター（複数可）、または本明細書に記載の組成物をＴ細胞に投与することを含む。
【００９７】
前述の例のそれぞれでは、方法は、生成したＴ細胞のＨＬＡタイピングをさらに含み得る。
【００９８】
本明細書に記載の方法はそれぞれ、エクスビボで実施され得る。
【００９９】
１つの例では、Ｔ細胞は、方法の実施前に個体または細胞バンクから取得される。
【０１００】
例のそれぞれでは、方法は、Ｔ細胞の亜集団を選択するためにＴ細胞に対して１つまたは複数の選択段階を実施することを含み得る。１つの例では、方法は、免疫抑制剤に抵抗性のＴ細胞を選択するために免疫抑制剤の存在下でＴ細胞を培養することを含む。
【０１０１】
本開示は、治療における本明細書に記載のＴ細胞の使用も提供する。
【０１０２】
１つの例では、本開示は、それを必要とする個体におけるがん、移植片対宿主病、感染症、１つもしくは複数の自己免疫障害、移植拒絶、または放射線宿酔の予防方法または治療方法を提供し、当該方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、機能性（内在性）のＴＣＲを発現せず、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞）を当該個体に投与することを含む。１つの例では、方法は、製剤においてＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することを含む。
【０１０３】
１つの例では、方法は、個体または細胞バンクからのＴ細胞の取得と、本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、当該ＤＮＡコンストラクトを含む本明細書に記載の発現ベクター、または当該ＤＮＡコンストラクトを含む本明細書に記載の組成物をＴ細胞に導入することによるエクスビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の生成と、個体へのＣＡＲ−Ｔ細胞の投与と、を含む。
【０１０４】
１つの例では、個体に投与されるＴ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、同種Ｔ細胞である。
【０１０５】
１つの例では、個体に投与されるＴ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、非自家Ｔ細胞である。
【０１０６】
１つの例では、個体に投与されるＴ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、自家Ｔ細胞である。
【０１０７】
本開示は、機能性のＴＣＲを発現しない異なるＨＬＡ型の複数のＴ細胞を含む細胞バンクも提供し、細胞バンクは、本明細書に記載のＴ細胞を少なくとも１つ含む。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】５’隣接領域、ｓｉＲＮＡセンス鎖（エフェクター相補配列）、ステム／ループジャンクション配列、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖（エフェクター配列）、及び３’隣接領域を含む代表的なｓｈｍｉＲコンストラクトの予測二次構造を示す。
【図２】個別のｓｈｍｉＲコンストラクトによるＴＣＲサブユニットの発現抑制を示す。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照に対する抑制率をｑＰＣＲによって測定したものが棒グラフ形式で示されており、対応するｓｈｍｉＲ及び標的サブユニットが下に示される。このグラフは、設計したｓｈｍｉＲのすべてが、その標的サブユニットの発現を下方制御したことを示す。
【図３】三重ｓｈｍｉＲコンストラクトの例をグラフ表示したものを示す。コンストラクトは、この図に示されるように、３つのｓｈｍｉＲ配列に隣接するレンチウイルス長鎖末端反復配列を含み、異なるポリメラーゼ−ＩＩＩプロモーターの制御下でそれぞれのｓｈｍｉＲが発現するものである。
【図４】実施例３の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトを形質導入したジャーカットＴ細胞の表面でのＴＣＲディスプレイをＦＡＣＳで分析したものを示す。ＦＡＣＳプロットによって示されるように、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトによって細胞表面でのＴＣＲの構築が約９５％低減された。
【図５】三重ｓｈｍｉＲコンストラクトを形質導入したジャーカットＴ細胞の活性化が抑制されることをＩＬ−２分泌によって測定したものを示す。このグラフは、分析した三重コンストラクトのそれぞれについて非処理細胞のＩＬ−２分泌に対する抑制率を示すものである。使用したコンストラクトは、コンストラクトが標的とするＴＣＲのサブユニットと共にそれぞれの棒の下の括弧内に示される。
【図６】三重ｓｈｍｉＲコンストラクトを形質導入したジャーカットＴ細胞においてＩＬ−２のｍＲＮＡ発現が抑制されることを示す。形質導入ジャーカットＴ細胞におけるＩＬ−２の発現レベルは、ｑＰＣＲによって測定し、非処理細胞と比較することで発現の抑制率を計算した。使用したコンストラクト及びその標的ＴＣＲサブユニットは、グラフの下に示される。
【図７】抗原提示細胞によるＴ細胞の活性化を三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが抑制する能力を示す。形質導入細胞が分泌するＩＬ−２の濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、非処理細胞に対する抑制率として示した。使用したコンストラクト及びその標的ＴＣＲサブユニットは、グラフの下に示される。
【図８】三重ｓｈｍｉＲコンストラクトがＴＣＲ非依存性のＴ細胞活性化をかく乱しないことを示す。形質導入細胞が分泌するＩＬ−２の濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、非処理細胞に対する割合として示した。使用したコンストラクト及びその標的ＴＣＲサブユニットは、グラフの下に示される。
【図９】形質導入細胞の細胞周期移行に対して三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが顕著に影響を与えないことを示す。ＢｒｄＵ  ＦＩＴＣ  アッセイに従い、２色のＦＡＣＳ分析を使用してＧ２／Ｍ期、Ｓ期、またはＧ０／Ｇ１期の細胞集団（ならびにアポトーシス細胞）の数を数えた。それぞれの細胞周期に同定された細胞の割合は、それぞれの棒に示されており、対応する期は、グラフの右に示される。
【図１０】ＴＣＲ発現のノックダウンと抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）での置換とを同時に行うための臨床コンストラクトの図を示す。この例では、抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードする配列は、レンチウイルスベクターにおいて三重ｓｈｍｉＲコンストラクトの上流に配置される。ＣＡＲは、ＥＦ１プロモーターの下で発現し、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン及びグナル伝達ドメインを含む。三重ｓｈｍｉＲコンストラクトについては、実施例３に記載されている。
【図１１】三重コンストラクトである（Ａ）ｐＢＬ５１３、（Ｂ）ｐＢＬ５１４、及び（Ｃ）ｐＢＬ５１６から発現したＴＣＲｓｈｍｉＲの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）データを示す。
【図１２】三重コンストラクトである（Ａ）ｐＢＬ５１３、（Ｂ）ｐＢＬ５１４、及び（Ｃ）ｐＢＬ５１６から発現したＴＣＲｓｈｍｉＲの細胞当たりのコピー数に関するデータであり、Ｑｕａｎｔｉｍｉｒアッセイによって決定したものを示す。
【図１３】Ｈ１プロモーターで改変されたコンストラクトである（Ａ）ｐＢＬ５２８、（Ｂ）ｐＢＬ５２９、及び（Ｃ）ｐＢＬ５３０のそれぞれにおいて、元の三重コンストラクト（それぞれｐＢＬ５１３、ｐＢＬ５１４、及びｐＢＬ５１６）と比較してＣＤ−３イプシロンレポーターコンストラクトに対する抑制活性が顕著に増加したことを示すルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示しており、この結果は、Ｈ１プロモーターで改変されたコンストラクトからのＣＤ３−ε＿１ｓｈｍｉＲの発現が増加したことと整合する。
【図１４】レンチウイルス三重コンストラクトであるｐＢＬ５１３、ｐＢＬ５１４、ｐＢＬ５１６、ｐＢＬ５２８、ｐＢＬ５２９、またはｐＢＬ５３０を形質導入したジャーカットＴ細胞におけるＩＬ−２の抑制率をＥＬＩＳＡによって決定したものを示す。
【図１５】三重ヘアピン型ｐＢＬ５３１コンストラクトを示す模式図である。
【０１０９】
配列リスト一覧
配列番号１：ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２：ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３：ＴＣＲ−α＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４：ＴＣＲ−α＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５：ＴＣＲ−α＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６：ＴＣＲ−α＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号７：ＴＣＲ−α＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号８：ＴＣＲ−α＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号９：ＴＣＲ−α＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１０：ＴＣＲ−α＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１１：ＴＣＲ−α＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２：ＴＣＲ−α＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３：ＴＣＲ−β＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１４：ＴＣＲ−β＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１５：ＴＣＲ−β＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１６：ＴＣＲ−β＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１７：ＴＣＲ−β＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１８：ＴＣＲ−β＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１９：ＴＣＲ−β＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２０：ＴＣＲ−β＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２１：ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２２：ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２３：ＴＣＲ−β＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２４：ＴＣＲ−β＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２５：ＴＣＲ−β＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２６：ＴＣＲ−β＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２７：ＴＣＲ−β＿８と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２８：ＴＣＲ−β＿８と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２９：ＴＣＲ−β＿９と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３０：ＴＣＲ−β＿９と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３１：ＣＤ３−ε＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３２：ＣＤ３−ε＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３３：ＣＤ３−ε＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３４：ＣＤ３−ε＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３５：ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３６：ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３７：ＣＤ３−ε＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３８：ＣＤ３−ε＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３９：ＣＤ３−ε＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４０：ＣＤ３−ε＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４１：ＣＤ３−ε＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４２：ＣＤ３−ε＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４３：ＣＤ３−ε＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４４：ＣＤ３−ε＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４５：ＣＤ３−ε＿８と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４６：ＣＤ３−ε＿８と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４７：ＣＤ３−ε＿９と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４８：ＣＤ３−ε＿９と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４９：ＣＤ３−ε＿１０と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５０：ＣＤ３−ε＿１０と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５１：ＣＤ３−ε＿１１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５２：ＣＤ３−ε＿１１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５３：ＣＤ３−ε＿１２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５４：ＣＤ３−ε＿１２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５５：ＣＤ３−ε＿１３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５６：ＣＤ３−ε＿１３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５７：ＣＤ３−δ＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５８：ＣＤ３−δ＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５９：ＣＤ３−δ＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６０：ＣＤ３−δ＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６１：ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６２：ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６３：ＣＤ３−δ＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６４：ＣＤ３−δ＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６５：ＣＤ３−δ＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６６：ＣＤ３−δ＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６７：ＣＤ３−δ＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６８：ＣＤ３−δ＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６９：ＣＤ３−δ＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号７０：ＣＤ３−δ＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号７１：ＣＤ３−δ＿８と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号７２：ＣＤ３−δ＿８と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号７３：ＣＤ３−δ＿９と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号７４：ＣＤ３−δ＿９と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号７５：ＣＤ３−δ＿１０と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号７６：ＣＤ３−δ＿１０と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号７７：ＣＤ３−δ＿１１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号７８：ＣＤ３−δ＿１１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号７９：ＣＤ３−δ＿１２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号８０：ＣＤ３−δ＿１２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号８１：ＣＤ３−δ＿１３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号８２：ＣＤ３−δ＿１３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号８３：ＣＤ３−γ＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号８４：ＣＤ３−γ＿１と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号８５：ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号８６：ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号８７：ＣＤ３−γ＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号８８：ＣＤ３−γ＿３と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号８９：ＣＤ３−γ＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号９０：ＣＤ３−γ＿４と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号９１：ＣＤ３−γ＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号９２：ＣＤ３−γ＿５と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号９３：ＣＤ３−γ＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号９４：ＣＤ３−γ＿６と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号９５：ＣＤ３−γ＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号９６：ＣＤ３−γ＿７と命名されたｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号９７：ｓｈｍｉＲのＲＮＡステムループ配列
配列番号９８：ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の５’隣接配列。
配列番号９９：ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の３’隣接配列
配列番号１００：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１０１：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１０２：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１０３：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１０４：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１０５：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１０６：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１０７：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１０８：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１０９：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１１０：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１１１：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１１２：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１１３：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１１４：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１１５：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１１６：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１１７：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１１８：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１１９：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１２０：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２１：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１２２：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２３：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１２４：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２５：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１２６：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２７：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１２８：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２９：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４というｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３０：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１３１：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３２：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１３３：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３４：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１３５：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３６：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１３７：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１３８：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１３９：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４０：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４１：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４２：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４３：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４４：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４５：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４６：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４７：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４８：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１４９：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１５０：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１５１：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１５２：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１５３：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号１５４：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１５５：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１５６：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１５７：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１５８：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１５９：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６０：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６１：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６２：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６３：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６４：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６５：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６６：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６７：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６８：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１６９：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１７０：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１７１：ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号１７２：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５１３のＤＮＡ配列。
配列番号１７３：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５１４のＤＮＡ配列。
配列番号１７４：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５１５のＤＮＡ配列。
配列番号１７５：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５１６のＤＮＡ配列。
配列番号１７６：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５２８のＤＮＡ配列。
配列番号１７７：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５２９のＤＮＡ配列。
配列番号１７８：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲをコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５３０のＤＮＡ配列。
配列番号１７９：ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βと命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γと命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたｓｈｍｉＲ、ならびに抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする三重コンストラクトであるｐＢＬ５３１のＤＮＡ配列。
配列番号１８０：ヒトＴＣＲ−アルファｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８１：マウスＴＣＲ−アルファｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８２：予測されるマカクＴＣＲ−アルファｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８３：ヒトＴＣＲ−ベータｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８４：マウスＴＣＲ−ベータｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８５：マカクＴＣＲ−ベータｍＲＮＡ転写物（定常領域）のＲＮＡ配列。
配列番号１８６：ヒトＣＤ３−ガンマｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８７：マウスＣＤ３−ガンマｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８８：マカクＣＤ３−ガンマｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１８９：ヒトＣＤ３−デルタｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１９０：マウスＣＤ３−デルタｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１９１：マカクＣＤ３−デルタｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１９２：ヒトＣＤ３−イプシロンｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１９３：マウスＣＤ３−イプシロンｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
配列番号１９４：マカクＣＤ３−イプシロンｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
一般説明
本明細書を通じて、別段の具体的な記載がない限り、または文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単一の段階、特徴、組成物、段階の群、または特徴もしくは組成物の群に対する参照は、１つ及び複数（すなわち、１つまたは複数）のそうした段階、特徴、組成物、段階の群、または特徴もしくは組成物の群を包含するものとする。
【０１１１】
本開示は、具体的に記載されるもの以外に変形形態及び改変形態が許容されるものであることを当業者なら理解するであろう。そのような変形形態及び改変形態はすべて、本開示に含まれると理解されることになる。個別またはまとめて本明細書で言及または示される段階、特徴、組成物、及び化合物のすべて、ならびに当該段階または特徴のいずれか２つ以上の組み合わせのいずれか及びすべてもまた、本開示に含まれる。
【０１１２】
本明細書に記載の特定の例によって本開示の範囲が限定されることにはならず、こうした特定の例は、例示のみを目的とすることが意図されるものである。機能的に同等の生成物、組成物、及び方法は、本開示の範囲に明確に含まれる。
【０１１３】
本明細書の本開示の任意の例が、別段の具体的な記載がない限り、本開示の任意の他の例に準用されるものとする。
【０１１４】
別段の具体的な定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生物化学の当業者）によって一般に理解される意味と同一の意味を有するものとする。
【０１１５】
別段の記載がない限り、本開示で利用される組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学の手法は、当業者によく知られる標準的な手順のものである。そのような手法は、情報源の文献を通じて記載及び説明されており、こうした文献は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの改定をすべて含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの改定をすべて含む）などである。
【０１１６】
本明細書を通じて、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載の段階もしくは要素もしくは整数または段階もしくは要素もしくは整数の群を含むが、任意の他の段階もしくは要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を除外しないことを暗示すると理解される。
【０１１７】
「及び／または」（例えば、「Ｘ及び／またはＹ」）という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸもしくはＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な裏付けを与えるものとする。
【０１１８】
選択的な定義
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子が意図される。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドが意図される。こうした用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えで生成したＲＮＡなど）、ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／または改変によって天然起源のＲＮＡと異なる改変ＲＮＡを含む。そのような改変には、非ヌクレオチド物質の付加（ｓｉＲＮＡの末端（複数可）への付加、または例えばＲＮＡの１つもしくは複数のヌクレオチドに対する内部的な付加など）が含まれ得る。本開示のＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非標準ヌクレオチドも含み得、こうした非標準ヌクレオチドは、非天然起源のヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどである。こうした改変ＲＮＡは、類似体または天然起源のＲＮＡの類似体と称され得る。
【０１１９】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、一般に、細胞の細胞質において二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって開始される、遺伝子発現のＲＮＡ依存性のサイレンシングを指す。ｄｓＲＮＡ分子は、標的核酸配列の転写産物の蓄積を低減または抑制し、それによってその遺伝子のサイレンシングまたはその遺伝子の発現低減を引き起こす。
【０１２０】
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、二本鎖構造を有し、互いに同様の長さを有するエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むＲＮＡ分子を指す。エフェクター配列及びエフェクター相補配列は、単一のＲＮＡ鎖に存在するか、または別々のＲＮＡ鎖に存在し得る。「エフェクター配列」（「ガイド鎖」と称されることが多い）は、標的配列に実質的に相補的であり、この場合、こうした標的配列は、ＴＣＲ−α転写物、ＴＣＲ−β転写物、ＣＤ３−γ転写物、ＣＤ３−δ転写物、またはＣＤ３−ε転写物の一領域である。「エフェクター配列」は、「アンチセンス配列」とも称され得る。「エフェクター相補配列」は、エフェクター配列に十分に相補的なものであることになり、その結果、エフェクター配列にアニーリングして二本鎖を形成することができる。この点に関して、エフェクター相補配列は、標的配列の一領域に実質的に相同的であるということになる。当業者には明らかであろうが、「エフェクター相補配列」という用語は、「エフェクター配列の相補体」またはセンス配列とも称され得る。
【０１２１】
本明細書で使用される「二本鎖」という用語は、相補的もしくは実質的に相補的な２つの核酸（例えば、ＲＮＡ）における領域、または一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ）の相補的もしくは実質的に相補的な２つの領域における領域であって、ワトソン・クリックの塩基対形成、または相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列の間に安定化された二本鎖が生じる任意の他の様式によって互いが塩基対を形成する領域を指す。二本鎖領域内では１００％の相補性は必要ではないことを当業者なら理解するであろうし、実質的な相補性は許容可能である。実質的な相補性は、７９％以上の相補性を含み得る。例えば、１９の塩基対からなる二本鎖領域に単一のミスマッチ（すなわち、１８の塩基対及び１つのミスマッチ）が存在すると、結果的に相補性は９４．７％であり、その二本鎖領域は実質的に相補的となる。別の例では、１９の塩基対からなる二本鎖領域に２つのミスマッチ（すなわち、１７の塩基対及び２つのミスマッチ）が存在すると、結果的に相補性は８９．５％であり、その二本鎖領域は実質的に相補的となる。さらに別の例では、１９の塩基対からなる二本鎖領域に３つのミスマッチ（すなわち、１６の塩基対及び３つのミスマッチ）が存在すると、結果的に相補性は８４．２％であり、その二本鎖領域は実質的に相補的となるなどである。
【０１２２】
ｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造またはステムループ構造として提供され得るものであり、ステムループと呼ばれる少なくとも２つのヌクレオチドの配列によって連結されるエフェクター配列及びエフェクター相補配列から二本鎖領域が構成される。ｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造またはステムループ構造として提供されるとき、「ヘアピン型ＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡｉ物質」または「ｓｈＲＮＡ」と称され得る。ヘアピン構造もしくはステムループ構造で提供される他のｄｓＲＮＡ分子、またはヘアピン構造もしくはステムループ構造を生じさせる他のｄｓＲＮＡ分子には、一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）及び前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が含まれる。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ  ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成する一次ｍｉＲＮＡ転写物の領域を認識及び遊離させる酵素であるドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）及びパシャ（Ｐａｓｈａ）の作用によってｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから天然に生成され得る。あるいは、天然のステムループ構造が人工／組換えのステムループ構造で置換されるようにｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物が操作され得る。すなわち、その天然のステムループ構造を含まないｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格配列に人工／組換えのステムループ構造が挿入またはクローニングされ得る。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ分子の一部として発現するように操作されたステムループ配列の場合、ドローシャ及びパシャは、人工のｓｈＲＮＡを認識及び遊離させる。この手法を使用して生成されるｄｓＲＮＡ分子は、「ｓｈｍｉＲＮＡ」、「ｓｈｍｉＲ」、または「マイクロＲＮＡフレームワークｓｈＲＮＡ」として知られる。
【０１２３】
配列に関して本明細書で使用される「相補的」という用語は、グアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対形成し、アデニン（Ａ）がウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のいずれかと対形成するワトソン・クリックの塩基対形成によって配列の相補が生じることを指す。配列は、別の配列の全長に相補的であり得るか、または別の配列の特定の部分もしくは長さに相補的であり得る。ＵはＲＮＡに存在し得、ＴはＤＮＡに存在し得ることを当業者なら認識するであろう。したがって、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列のいずれにも含まれるＡは、ＲＮＡ配列ではＵと対形成し、ＤＮＡ配列ではＴと対形成し得る。Ｇもまた、ＲＮＡ分子ではＵと対形成することができる。
【０１２４】
本明細書で使用される「実質的に相補的」という用語は、核酸配列の間（例えば、エフェクター配列とエフェクター相補配列との間、またはエフェクター配列と標的配列との間）に安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性または明確な対形成を示すために使用される。核酸の配列が、その標的または相補体の配列に１００％相補的である必要はないと理解される。この用語は、別の配列に対してオーバーハングを除いて相補的な配列を包含する。場合によっては、配列は、もう一方の配列に対して１〜２つのミスマッチを除いて相補的である。場合によっては、配列は、１つのミスマッチを除いて相補的である。場合によっては、配列は、２つのミスマッチを除いて相補的である。他の場合では、配列は、３つのミスマッチを除いて相補的である。さらに他の場合では、配列は、４つのミスマッチを除いて相補的である。標的配列の一領域に「実質的に相補的」であり、それに対する１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチ塩基（複数可）を含むエフェクター配列を本開示のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡが含む例によれば、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡのシード領域（すなわち、エフェクター配列の２〜８つ目のヌクレオチド）に対応する領域内にミスマッチ（複数可）が位置しないことが好ましい。
【０１２５】
本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲとの関連で使用される「コードされる（ｅｎｃｏｄｅｄ）」または「をコードする（ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ）」という用語は、ＤＮＡ鋳型から転写される能力を有するｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡを意味すると理解されるものとする。したがって、本開示のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコード（ｅｎｃｏｄｅｓ）またはコード（ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ）する核酸は、それぞれのｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡを転写するための鋳型として働くＤＮＡ配列を含むことになる。
【０１２６】
「ＤＮＡ依存性（指向性）ＲＮＡｉコンストラクト」または「ｄｄＲＮＡｉコンストラクト」という用語は、ＲＮＡｉを誘発するｓｈｍｉＲ分子またはｓｈＲＮＡ分子（好ましくはｓｈｍｉＲ）を転写時に生成するＤＮＡ配列を含む核酸を指す。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも２つのヌクレオチドのステムループによって連結される二本鎖領域を有するヘアピン構造へと自体がアニーリングする能力を有する単一のＲＮＡ（すなわち、ｓｈｍｉＲもしくはｓｈＲＮＡ）として転写される核酸を含むか、または複数のｓｈｍｉＲもしくはｓｈＲＮＡを含む単一のＲＮＡとして転写される核酸を含むか、またはそれぞれ単一のｓｈｍｉＲもしくはｓｈＲＮＡとしてフォールディングする能力をそれぞれが有する複数のＲＮＡ転写物として転写される核酸を含み得る。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、１つまたは複数の追加のＤＮＡ配列を含む、より大きな「ＤＮＡコンストラクト」に含めて提供され得る。例えば、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、機能性の非ＴＣＲ受容体（例えば、キメラ抗原受容体）をコードする追加のＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトにおいて提供され得る。ｄｄＲＮＡｉコンストラクト及び／またはｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含むＤＮＡコンストラクトは、発現ベクターに含められ得るものであり、こうした発現ベクターは、例えば、１つまたは複数のプロモーターを含む。
【０１２７】
本明細書で使用される「機能可能なように連結された」もしくは「機能可能な結合」という用語（または同様のもの）は、コード核酸配列が、そのコード配列の発現が促進される様式で制御配列（例えば、プロモーター）に連結または結び付けられることを意味する。制御配列には、プロモーター、エンハンサー、及び当該技術分野において認識されており、コード配列の発現を誘導するために選択される他の発現制御要素が含まれる。
【０１２８】
「ベクター」は、核酸を細胞に導入するための媒体を意味すると理解されることになる。ベクターには、限定はされないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、細菌、及びウイルス源または細菌源に由来する媒体が含まれる。「プラスミド」は、環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。本開示に従う使用に有用な型のベクターはウイルスベクターであり、この場合、１つまたは複数のウイルス遺伝子またはその部分が欠失するように改変することができるウイルスゲノムに異種ＤＮＡ配列が挿入される。ある特定のベクターは、宿主細胞において自己複製する能力を有する（例えば、宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞のゲノムへの安定的な組み込むが生じ得るものであり、それによって宿主ゲノムと共に複製される。本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、本開示のＲＮＡ分子を発現する能力を有するベクターを意味すると理解されることになる。
【０１２９】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」という用語、あるいは「ＣＡＲ」は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに後に定義される刺激分子及び／または共刺激分子に由来する機能性のシグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を少なくとも含む組換えポリペプチドコンストラクトを指す。いくつかの例では、ＣＡＲポリペプチドコンストラクトにおけるドメインは、同一のポリペプチド鎖に存在し、例えば、キメラ融合タンパク質を構成する。他の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドコンストラクトにおけるドメインは、互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖に存在する。
【０１３０】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原を認識し、それに結合するタンパク質またはその領域を意味すると理解されるものとする。抗原結合ドメインの例は、細胞表面に発現する腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合するものである。
【０１３１】
「腫瘍抗原」または「がん関連抗原」という用語は、正常細胞と比較して、全体または断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）としてがん細胞の表面に選択的に発現する分子（典型的には、タンパク質、糖質、または脂質）を指し、こうした分子は、がん細胞を選択的に薬剤の標的とする上で有用である。いくつかの例では、腫瘍抗原は、特定の増殖性障害に一般に見られる抗原である。いくつかの例では、がん関連抗原は、正常細胞と比較してがん細胞に過剰発現（例えば、正常細胞と比較して１〜３５倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍の過剰発現、またはそれ以上の過剰発現）する細胞表面分子である。いくつかの例では、がん関連抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子であり、例えば、正常細胞に発現する分子と比較して欠失、付加、または変異を含む分子である。いくつかの例では、がん関連抗原は、全体または断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）としてがん細胞の細胞表面に排他的に発現し、正常細胞の表面には合成または発現しないものということになる。腫瘍抗原の例は、本明細書に記載されている。
【０１３２】
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜を貫通するポリペプチドを指す。１つの例では、膜貫通ドメインによって、細胞外配列（例えば、スイッチドメイン、細胞外認識要素（例えば、抗原結合ドメイン）、抑制性カウンターリガンド結合ドメイン、または共刺激ＥＣＤドメイン）が細胞内配列（例えば、スイッチドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメイン）に連結される。膜貫通ドメインの例は、本明細書に記載されている。
【０１３３】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。いくつかの例では、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特定の機能を発揮するように誘導する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特定の機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることもできるが、多くの場合、必ずしも鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断型部分が使用される限りにおいては、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりにそのような切断型部分が使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断型部分を含むことが意図される。１つの例では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例には、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子に由来するものが含まれる。１つの例では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含む。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例には、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子に由来する細胞質配列を含み得る。
【０１３４】
本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、標的細胞に存在するその関連カウンターリガンドに結合すると免疫エフェクター応答を増進（例えば、増加）させる、ＣＡＲ−Ｔ細胞の分子（例えば、内在性分子）の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。「共刺激分子」は、「共刺激シグナル伝達ドメイン」を含む分子を指す。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分に由来し得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、その由来元である分子の細胞内部分全体、もしくはその由来元である分子の天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能性断片を含み得る。共刺激分子の例は、本明細書に記載されている。
【０１３５】
「Ｔ細胞」は、リンパ球として知られる白血球の一群に属しており、細胞性免疫において中心的役割を担い、それには及ばないものの適応免疫応答においても役割を担う。一般に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することによって他のリンパ球（例えば、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞）と区別される。Ｔ細胞は多様な役割を有しており、こうした役割は、個別の遺伝子発現プロファイルによって認識可能な異なるＴ細胞集団が分化することによって達成される。
【０１３６】
「ＣＡＲ−Ｔ細胞」、「ＣＡＲＴ細胞」という用語、または同様のものは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞を意味すると理解されるものとする。
【０１３７】
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語、及びその変形形態は、臨床病理学の過程の間に治療中の個体または細胞の自然経過が変わるように設計される臨床的介入を指す。望ましい治療作用には、疾患進行速度の低減、病状の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。
【０１３８】
本明細書で使用される「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖によって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的に拡散するか、または血流及びリンパ系を介して体の他の部分に拡散することができる。さまざまながんの例には、限定はされないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、血液癌（例えば、白血病）、肺癌、及び同様のものが含まれる。がんの追加例は、本明細書に記載されている。「がん」という用語は、侵襲性の病理組織学的な型または段階とは無関係に、すべての型のがん性増殖もしくは発がんプロセス、転移組織、または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは臓器を含む。「腫瘍」及び「がん」という用語は、本明細書で互換的に使用される。用語は両方共、固形及び液性（例えば、びまん性または循環性）の腫瘍を包含する。本明細書で使用される「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性のがん及び腫瘍、ならびに悪性のがん及び腫瘍を含む。
【０１３９】
本明細書で使用される「自家」という用語は、その材料が後に再導入（例えば、治療の間に行われる）されることになる個体と同一の個体に由来する任意の材料（例えば、Ｔ細胞）を指す。
【０１４０】
本明細書で使用される「非自家」という用語は、その材料が導入されることになる個体とは異なる個体に由来する任意の材料（例えば、Ｔ細胞）を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される「同種」という用語は、その材料が導入される個体と同一の種の異なる個体に由来する任意の材料（例えば、Ｔ細胞）を指す。２つ以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一ではないときに互いに同種であると言われる。いくつかの態様では、同一の種の個体に由来する同種材料（例えば、Ｔ細胞）は、抗原性に相互作用する上で遺伝子学的に十分に異なり得る。
【０１４２】
「治療的に有効な量」は、治療すべき疾患または症状（例えば、がんまたはウイルス感染症）に測定可能な改善をもたらすために必要な最低限の濃度または量である。そのような量は、例えば、治療すべき疾患（例えば、がんの場合は特定の型のがん及び／またはその段階、あるいはウイルス感染症の場合はウイルスの型）、及び／または特定の対象及び／または治療中の症状の型もしくは重症度に応じて異なることになることを当業者なら認識するであろう。したがって、本開示を特定の量（例えば、本開示の組成物の細胞集団の重量または数）に限定するものとしてこの用語が解釈されることにはならない。
【０１４３】
本明細書で使用される「対象」または「患者」は、例えば、がん、移植片対宿主病、感染症（例えば、ウイルス感染症）、１つもしくは複数の自己免疫障害、移植拒絶、または放射線宿酔を患うヒトまたは非ヒト動物であり得る。「非ヒト動物」は、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ及びネコなどのペット）、実験室の試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュ）、パフォーマンス動物（例えば、競走馬、ラクダ、グレーハウンド）、または捕獲野生動物であり得る。１つの例では、対象または患者は、哺乳類である。特定の好ましい例では、対象または患者は、ヒトである。
【０１４４】
ＴＣＲ、ＴＣＲ複合体、またはそのサブユニットと関連する「発現の抑制」、「発現の低減」という用語、または同様のものは、ＴＣＲ複合体またはそのサブユニットに対応するタンパク質及び／またはｍＲＮＡ転写物が存在しないか、またはそのレベルが観測可能なほど減少することを指す。減少または低下は、絶対的なものである必要はなく、ＴＣＲが非機能性となる上で十分な部分的減少であり得る。
【０１４５】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト
１つの例では、本開示は、低分子ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸を含むＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトを提供し、それぞれのｓｈｍｉＲは、
少なくとも１７のヌクレオチドの長さのエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）骨格と、
を含み、
それぞれのｓｈｍｉＲのエフェクター配列は、ＣＤ３−ε、ＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、ＣＤ３−δ、及びＣＤ３−γからなる群から選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニットのｍＲＮＡ転写物における対応する長さの領域に実質的に相補的である。例えば、それぞれのｓｈｍｉＲのエフェクター配列は、３０未満のヌクレオチドの長さを有することになる。例えば、適切なエフェクター配列は、１７〜２９のヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。例えば、エフェクター配列は、２１のヌクレオチドの長さを有することになる。例えば、エフェクター配列は、２１のヌクレオチドの長さを有することになり、エフェクター相補配列は、２０のヌクレオチドの長さを有することになる。
【０１４６】
ＴＣＲ複合体サブユニットであるＣＤ３−εを標的とするｓｈｍｉＲは、ＣＤ３−εサブユニットのＲＮＡ転写物内の対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むことになる。非限定的な例として、ヒト、マウス、及びマカクのＣＤ３−εサブユニットのＲＮＡ転写物は、配列番号１９２〜１９４のいずれか１つまたは複数に関して記載されている。この例に従ってＣＤ３−εサブユニットを標的とするＳｈｍｉＲは、まとめて「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε」と称される。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εのエフェクター配列は、ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εのエフェクター配列は、ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εのエフェクター配列は、ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εのエフェクター配列は、ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εのエフェクター配列は、ＣＤ３−εサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に１００％相補的であり得る。
【０１４７】
ＴＣＲ複合体サブユニットであるＴＣＲ−αを標的とするｓｈｍｉＲは、ＴＣＲ−αサブユニットの定常領域のＲＮＡ転写物内の対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むことになる。非限定的な例として、ヒト、マウス、及びマカクのＴＣＲ−αサブユニットのＲＮＡ転写物は、配列番号１８０〜１８２のいずれか１つまたは複数に関して記載されている。この例に従ってＴＣＲ−αサブユニットを標的とするＳｈｍｉＲは、まとめて「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α」と称される。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αのエフェクター配列は、ＴＣＲ−αサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αのエフェクター配列は、ＴＣＲ−αサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αのエフェクター配列は、ＴＣＲ−αサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αのエフェクター配列は、ＴＣＲ−αサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αのエフェクター配列は、ＴＣＲ−αサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に１００％相補的であり得る。
【０１４８】
ＴＣＲ複合体サブユニットであるＴＣＲ−βを標的とするｓｈｍｉＲは、ＴＣＲ−βサブユニットの定常領域のＲＮＡ転写物内の対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むことになる。非限定的な例として、ヒト、マウス、及びマカクのＴＣＲ−βサブユニットのＲＮＡ転写物は、配列番号１８３〜１８５のいずれか１つまたは複数に関して記載されている。この例に従ってＴＣＲ−βサブユニットを標的とするＳｈｍｉＲは、まとめて「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β」と称される。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βのエフェクター配列は、ＴＣＲ−βサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βのエフェクター配列は、ＴＣＲ−βサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βのエフェクター配列は、ＴＣＲ−βサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βのエフェクター配列は、ＴＣＲ−βサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βのエフェクター配列は、ＴＣＲ−βサブユニットの定常領域のｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に１００％相補的であり得る。
【０１４９】
ＴＣＲ複合体サブユニットであるＣＤ３−γを標的とするｓｈｍｉＲは、ＣＤ３−γサブユニットのＲＮＡ転写物内の対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むことになる。非限定的な例として、ヒト、マウス、及びマカクのＣＤ３−γサブユニットのＲＮＡ転写物は、配列番号１８６〜１８８のいずれか１つまたは複数に関して記載されている。この例に従ってＣＤ３−γサブユニットを標的とするＳｈｍｉＲは、まとめて「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ」と称される。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γのエフェクター配列は、ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γのエフェクター配列は、ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γのエフェクター配列は、ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γのエフェクター配列は、ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γのエフェクター配列は、ＣＤ３−γサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に１００％相補的であり得る。
【０１５０】
ＴＣＲ複合体サブユニットであるＣＤ３−δを標的とするｓｈｍｉＲは、ＣＤ３−δサブユニットのＲＮＡ転写物内の対応する長さの領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むことになる。非限定的な例として、ヒト、マウス、及びマカクのＣＤ３−δサブユニットのＲＮＡ転写物は、配列番号１８９〜１９１のいずれか１つまたは複数に関して記載されている。この例に従ってＣＤ３−δサブユニットを標的とするＳｈｍｉＲは、まとめて「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ」と称される。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δのエフェクター配列は、ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δのエフェクター配列は、ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δのエフェクター配列は、ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δのエフェクター配列は、ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に実質的に相補的であり、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δのエフェクター配列は、ＣＤ３−δサブユニットのｍＲＮＡ配列内の対応する長さの領域に１００％相補的であり得る。
【０１５１】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１３５に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１３５に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３４に示されるエフェクター配列と、配列番号１３４に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１３４に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１３５に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−εサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３」と呼ばれる。
【０１５２】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１３１に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１３１に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３０に示されるエフェクター配列と、配列番号１３０に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１３０に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１３１に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−εサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１」と呼ばれる。
【０１５３】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１３３に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１３３に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１３２に示されるエフェクター配列と、配列番号１３２に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１３２に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１３３に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−εサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２」と呼ばれる。
【０１５４】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１０１に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１０１に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１００に示されるエフェクター配列と、配列番号１００に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１００に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１０１に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１」と呼ばれる。
【０１５５】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１０３に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１０３に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１０２に示されるエフェクター配列と、配列番号１０２に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１０２に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１０３に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２」と呼ばれる。
【０１５６】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１０５に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１０５に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１０４に示されるエフェクター配列と、配列番号１０４に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１０４に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１０５に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３」と呼ばれる。
【０１５７】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１０７に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１０７に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１０６に示されるエフェクター配列と、配列番号１０６に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１０６に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１０７に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４」と呼ばれる。
【０１５８】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１１７に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１１７に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１６に示されるエフェクター配列と、配列番号１１６に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１１６に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１１７に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５」と呼ばれる。
【０１５９】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１０９に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１０９に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１０８に示されるエフェクター配列と、配列番号１０８に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１０８に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１０９に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１」と呼ばれる。
【０１６０】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１１１に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１１１に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１０に示されるエフェクター配列と、配列番号１１０に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１１０に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１１１に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２」と呼ばれる。
【０１６１】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１１３に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１１３に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１２に示されるエフェクター配列と、配列番号１１２に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１１２に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１１３に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３」と呼ばれる。
【０１６２】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１１５に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１１５に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１１４に示されるエフェクター配列と、配列番号１１４に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１１４に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１１５に示される配列であり得る。この例に従ってＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４」と呼ばれる。
【０１６３】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１２１に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１２１に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１２０に示されるエフェクター配列と、配列番号１２０に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１２０に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１２１に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−γサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２」と呼ばれる。
【０１６４】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１１９に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１１９に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１１８に示されるエフェクター配列と、配列番号１１８に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１１８に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１１９に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−γサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１」と呼ばれる。
【０１６５】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１２７に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１２７に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１２６に示されるエフェクター配列と、配列番号１２６に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１２６に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１２７に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３」と呼ばれる。
【０１６６】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１２３に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１２３に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１２２に示されるエフェクター配列と、配列番号１２２に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１２２に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１２３に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１」と呼ばれる。
【０１６７】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１２５に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１２５に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１２４に示されるエフェクター配列と、配列番号１２４に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１２４に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１２５に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２」と呼ばれる。
【０１６８】
１つの例では、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、（ｉ）１つ、２つ、３つ、または４つの塩基ミスマッチを除き、配列番号１２９に示される配列に実質的に相補的なエフェクター配列（但し、エフェクター配列が配列番号１２９に示される配列と二本鎖を形成する能力を有することが条件である）と、（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列と、を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１２８に示されるエフェクター配列と、配列番号１２８に示される配列に実質的に相補的であり、それと二本鎖を形成する能力を有するエフェクター相補配列と、を含み得る。配列番号１２８に示される配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号１２９に示される配列であり得る。この例に従ってＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、これ以後は「ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４」と呼ばれる。
【０１６９】
本明細書に記載の例のいずれかでは、ｓｈｍｉＲは、５’から３’の方向で、
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の５’隣接配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
エフェクター配列と、
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の３’隣接配列と、
を含む。
【０１７０】
適切なループ配列は、当該技術分野において知られるものから選択され得る。しかしながら、配列番号９７にステムループ配列の例が示される。
【０１７１】
本開示の核酸における使用に適した一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−Ｒ）骨格は、当該技術分野において知られるものから選択され得る。例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１５５骨格、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２１骨格、及びｐｒｉ−ｍｉＲ−１３６骨格から選択され得る。例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格である。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格がｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格である例によれば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の５’隣接配列は、配列番号９８に示されるものであり、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格の３’隣接配列は、配列番号９９に示されるものである。したがって、本開示のそれぞれのｓｈｍｉＲをコードする核酸は、配列番号９８に示される配列をコードするＤＮＡ配列と、配列番号９９に示される配列をコードするＤＮＡ配列と、を含み得る。
【０１７２】
本明細書に記載のｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格及び配列番号９７に示されるステムループ配列をｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εが含む例によれば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εは、配列番号１５３、配列番号１５１、または配列番号１５２のうちの１つに示される配列を含むか、または当該配列からなり得る。したがって、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号１７１、配列番号１６９、または配列番号１７０のうちの１つに示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。１つの例では、ＣＤ３−εサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１５３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３であり、当該配列は、配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＣＤ３−εサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１５１に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿１であり、当該配列は、配列番号１６９に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＣＤ３−εサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１５２に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿２であり、当該配列は、配列番号１７０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１７３】
本明細書に記載のｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格及び配列番号９７に示されるステムループ配列をｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αが含む例によれば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αは、配列番号１３６〜１３９のうちの１つに示される配列を含むか、または当該配列からなり得る。したがって、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号１５４〜１５７のうちの１つに示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。１つの例では、ＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１３６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１であり、当該配列は、配列番号１５４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１３７に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿２であり、当該配列は、配列番号１５５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１３８に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿３であり、当該配列は、配列番号１５６に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−αサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１３９に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿４であり、当該配列は、配列番号１５７に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１７４】
本明細書に記載のｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格及び配列番号９７に示されるステムループ配列をｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βが含む例によれば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βは、配列番号１４４または配列番号１４０〜１４３のうちの１つに示される配列を含むか、または当該配列からなり得る。したがって、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号１６２または配列番号１５８〜１６１のうちの１つに示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。１つの例では、ＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４４に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５であり、当該配列は、配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４０に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿１であり、当該配列は、配列番号１５８に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４１に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２であり、当該配列は、配列番号１５９に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４２に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿３であり、当該配列は、配列番号１６０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＴＣＲ−βサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４３に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿４であり、当該配列は、配列番号１６１に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１７５】
本明細書に記載のｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格及び配列番号９７に示されるステムループ配列をｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γが含む例によれば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γは、配列番号１４６または配列番号１４５のうちの１つに示される配列を含むか、または当該配列からなり得る。したがって、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号１６４または配列番号１６３のうちの１つに示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。１つの例では、ＣＤ３−γサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４６に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２であり、当該配列は、配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＣＤ３−γサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４５に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿１であり、当該配列は、配列番号１６３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１７６】
本明細書に記載のｐｒｉ−ｍｉＲ−３０ａ骨格及び配列番号９７に示されるステムループ配列をｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δが含む例によれば、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δは、配列番号１４９、配列番号１４７、配列番号１４８、または配列番号１５０のうちの１つに示される配列を含むか、または当該配列からなり得る。したがって、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号１６７、配列番号１６５、配列番号１６６、または配列番号１６８のうちの１つに示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。１つの例では、ＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４９に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３であり、当該配列は、配列番号１６７に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４７に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿１であり、当該配列は、配列番号１６５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１４８に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿２であり、当該配列は、配列番号１６６に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。１つの例では、ＣＤ３−δサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲは、配列番号１５０に示される配列を含むｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４であるか、または当該配列からなるｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿４であり、当該配列は、配列番号１６８に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１７７】
本明細書に記載のように、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＴＣＲ複合体のサブユニットを標的とするｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を有する２つ以上の核酸を含む。いくつかの例では、少なくとも２つの核酸によってコードされるｓｈｍｉＲは、単一のＴＣＲサブユニットに対応する同一のｍＲＮＡ転写物の異なる領域を標的とし得る。他の例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＴＣＲ複合体の異なるサブユニットのｍＲＮＡ転写物を標的とし得るエフェクター配列を含む少なくとも２つのｓｈｍｉＲをコードする。このようにして、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトによってＴＣＲ複合体の複数のサブユニットがＲＮＡｉの標的となり得る。
【０１７８】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｖ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｖ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される２つ以上の核酸を含む。
【０１７９】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、本明細書にそれぞれ記載されるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δから選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む１つもしくは複数の追加の核酸または当該ＤＮＡ配列からなる１つもしくは複数の追加の核酸と、を含む。
【０１８０】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、本明細書にそれぞれ記載されるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εから選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む１つもしくは複数の追加の核酸または当該ＤＮＡ配列からなる１つもしくは複数の追加の核酸と、を含む。
【０１８１】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、本明細書にそれぞれ記載されるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εから選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む１つもしくは複数の追加の核酸または当該ＤＮＡ配列からなる１つもしくは複数の追加の核酸と、を含む。
【０１８２】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、本明細書にそれぞれ記載されるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εから選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む１つもしくは複数の追加の核酸または当該ＤＮＡ配列からなる１つもしくは複数の追加の核酸と、を含む。
【０１８３】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、本明細書にそれぞれ記載されるｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εから選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む１つもしくは複数の追加の核酸または当該ＤＮＡ配列からなる１つもしくは複数の追加の核酸と、を含む。
【０１８４】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される２つ以上の核酸を含む。
【０１８５】
例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含み得る。
【０１８６】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される２つ以上の核酸を含む。
【０１８７】
例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−βをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含み得る。
【０１８８】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される２つ以上の核酸を含む。
【０１８９】
例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含み得る。
【０１９０】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
から選択される２つ以上の核酸を含む。
【０１９１】
例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−αをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、
を含み得る。
【０１９２】
ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−γ、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−δ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−εと命名されたＳｈｍｉＲは、これらのＳｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含めて、本明細書に記載されており、本開示のそれぞれの例に準用されるものとする。
【０１９３】
１つの例では、少なくとも２つの核酸は、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６２に示されており、配列番号１４４に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６４に示されており、配列番号１４６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６７に示されており、配列番号１４９に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
からなる群から選択される。
【０１９４】
例えば、１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６２に示されており、配列番号１４４に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６４に示されており、配列番号１４６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
からなる群から選択される少なくとも２つの核酸を含む。
【０１９５】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６２に示されており、配列番号１４４に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６４に示されており、配列番号１４６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
を含む。
【０１９６】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６２に示されており、配列番号１４４に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
からなる群から選択される少なくとも２つの核酸を含む。
【０１９７】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１１６に示されるエフェクター配列及び配列番号１１７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６２に示されており、配列番号１４４に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
を含む。
【０１９８】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６４に示されており、配列番号１４６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
からなる群から選択される少なくとも２つの核酸を含む。
【０１９９】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２０に示されるエフェクター配列及び配列番号１２１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６４に示されており、配列番号１４６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
を含む。
【０２００】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６７に示されており、配列番号１４９に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
からなる群から選択される少なくとも２つの核酸を含む。
【０２０１】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
配列番号１００に示されるエフェクター配列及び配列番号１０１に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１５４に示されており、配列番号１３６に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１２６に示されるエフェクター配列及び配列番号１２７に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１６７に示されており、配列番号１４９に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
配列番号１３４に示されるエフェクター配列及び配列番号１３５に示されるエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸（例えば、配列番号１７１に示されており、配列番号１５３に示される配列を有するｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸）と、
を含む。
【０２０２】
本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの例によれば、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする２つ以上の核酸（本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする２つ、または３つ、または４つ、または５つの核酸など）を含み得る。
【０２０３】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本開示のｓｈｍｉＲをコードする核酸のうちの１つまたは複数に連結された転写ターミネーターを含む。ｓｈｍｉＲをコードするそれぞれの核酸に連結されるターミネーターは、同一または異なるものであり得る。例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが利用される本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトでは、ターミネーターは、４つ以上、または５つ以上、または６つ以上のＴ残基の連続ストレッチであり得る。しかしながら、異なるプロモーターが使用される場合、ターミネーターは、異なるものであり得、ターミネーターの由来元である遺伝子に由来するプロモーターに適合するものとされる。そのようなターミネーターには、限定はされないが、ＳＶ４０ポリＡ、ＡｄＶ  ＶＡ１遺伝子、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、及びヒトｔ−ＲＮＡのターミネーターが含まれる。
【０２０４】
あるいは、またはさらに、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトに含まれる核酸は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターへのこうした核酸（複数可）のクローニングを促進するために、１つまたは複数の制限酵素認識部位を含み得る。例えば、本明細書に記載の核酸は、本開示のｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列の上流及び／または下流に制限酵素認識部位を含み得る。当業者なら適切な制限酵素認識配列を認識しているであろう。しかしながら、１つの例では、本開示の核酸（複数可）は、５’末端（すなわち、ｓｈｍｉＲをコードする配列の上流）にＢａｍＨ１制限酵素認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含み、３’末端（すなわち、ｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列の下流）にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位（ＡＡＧＣＴＴ）を含み得る。
【０２０５】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、コンストラクトまたはベクターのサイズを最適化するためにスタッファー配列を含み得る。発現コンストラクト及びベクターの構築において使用するための適切なスタッファー配列は、当該技術分野において知られており、本明細書での使用が企図される。１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）スタッファー配列を含む。本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを説明する前述の例のそれぞれでは、そこに含まれるそれぞれの核酸は、プロモーターに機能可能ように連結され得る。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、例えばｄｄＲＮＡｉコンストラクトからの２つ以上のｓｈｍｉＲの発現を誘導するために、そこに含まれるそれぞれの核酸に機能可能なように連結された単一のプロモーターを含み得る。
【０２０６】
別の例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトに含まれる本開示のｓｈｍｉＲをコードするそれぞれの核酸は、個別のプロモーターに機能可能なように連結される。
【０２０７】
複数のプロモーターが存在する例によれば、プロモーターは、同一または異なるものであり得る。例えば、コンストラクトは、同一のプロモーターの複数のコピーを含み、それぞれのコピーは、本開示の異なる核酸に機能可能なように連結され得る。別の例では、本開示の核酸に機能可能なように連結されるそれぞれのプロモーターは異なるものである。例えば、ｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける少なくとも２つの核酸は、異なるプロモーターにそれぞれが機能可能なように連結され得る。
【０２０８】
１つの例では、プロモーターは、構成的プロモーターである。「構成的」という用語は、プロモーターに関して使用されるとき、特定の刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）が存在しなくても、機能可能なように連結された核酸配列の転写を誘導する能力をプロモーターが有することを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞及び任意の組織においてコード配列の発現を誘導する能力を有する。本開示の核酸（複数可）からｓｈｍｉＲを転写するために使用されるプロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって制御されるユビキチン、ＣＭＶ、β−アクチン、ヒストンＨ４、ＥＦ−１α、もしくはｐｇｋの遺伝子のプロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩによって制御されるプロモーター要素が含まれる。
【０２０９】
１つの例では、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｕ１、β−アクチンなど）、またはハイブリッドＰｏｌ  ＩＩプロモーターが利用される。他の適切なＰｏｌ  ＩＩプロモーターは、当該技術分野において知られており、本開示のこの例に従って使用され得る。例えば、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター系は、酵素であるドローシャ及びパシャの作用によってプロセシングを受けることで１つまたは複数のｓｈｍｉＲとなるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを発現する本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおいて望ましくあり得る。Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター系は、単一のプロモーターの制御下に複数のｓｈｍｉＲをコードする配列を含む本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおいても望ましくあり得る。Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター系は、組織特異性が望まれる場合にも使用され得る。
【０２１０】
別の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって制御されるプロモーターが使用され、こうしたプロモーターは、Ｕ６プロモーター（Ｕ６−１、Ｕ６−８、Ｕ６−９）、Ｈ１プロモーター、７ＳＬプロモーター、ヒトＹプロモーター（ｈＹ１、ｈＹ３、ｈＹ４（Ｍａｒａｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２（１５）：３０４５−５２（１９９４）を参照のこと）、及びｈＹ５（Ｍａｒａｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４（１８）：３５５２−５９（１９９４）を参照のこと））、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、ヒトｔＲＮＡプロモーター、または５ｓリボソームＲＮＡプロモーターなどである。
【０２１１】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける使用に適したプロモーターは、米国特許第８，００８，４６８号及び米国特許第８，１２９，５１０号に記載されている。
【０２１２】
１つの例では、プロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。例えば、プロモーターは、Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、またはＵ６−９プロモーター）である。別の例では、プロモーターは、Ｈ１プロモーターである。
【０２１３】
本明細書に記載の本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの場合、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける核酸はそれぞれ、Ｕ６プロモーター（例えば、個別のＵ６プロモーター）に機能可能なように連結され得る。
【０２１４】
１つの例では、コンストラクトにおけるプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。例えば、プロモーターは、Ｕ６−１プロモーターである。例えば、プロモーターは、Ｕ６−８プロモーターである。例えば、プロモーターは、Ｕ６−９プロモーターである。
【０２１５】
１つの例では、コンストラクトは、少なくとも１つのＵ６プロモーター及び少なくとも１つＨ１プロモーターを含み、本開示のｓｈｍｉＲをコードする個別のＤＮＡにそれぞれが機能可能なように連結される。例えば、Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−１プロモーターであり得る。例えば、Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−８プロモーターであり得る。例えば、Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−９プロモーターであり得る。
【０２１６】
いくつかの例では、強度が可変のプロモーターが利用される。例えば、強力なプロモーター（Ｐｏｌ  ＩＩＩ型プロモーターなど）を２つ以上使用すると、例えば利用可能なヌクレオチドまたは転写に必要な他の細胞成分のプールが枯渇することによって、細胞に負荷がかかり得る。さらに、またはあるいは、強力なプロモーターをいくつか使用すると、細胞において毒性レベルのｓｈｍｉＲ発現が生じ得る。したがって、いくつかの例では、プロモーターが複数利用されるｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおけるプロモーターのうちの１つもしくは複数は、コンストラクトにおける他のプロモーターと比較して弱いものであるか、またはコンストラクトにおけるプロモーターはすべて、最大速度未満でｓｈｍｉＲを発現し得る。プロモーターは、転写のレベル低減またはレベル強化を達成するために、さまざまな分子手法を使用するか、あるいは、例えばさまざまな制御要素を改変することによっても改変され得る。転写低減を達成する１つの手段は、プロモーター活性を制御することが知られるプロモーター内の配列要素を改変することである。例えば、近位配列要素（ＰＳＥ）は、ヒトＵ６プロモーターの活性に影響を与えることが知られている（Ｄｏｍｉｔｒｏｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２３４４−２３５２（２００３）を参照のこと）。強力なプロモーター（ヒトのＵ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、またはＵ６−９プロモーターなど）に存在するＰＳＥ要素を、弱いプロモーター（ヒトＵ６−７プロモーターなど）に由来する要素で置換すると、これによって生じるハイブリッドのＵ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、またはＵ６−９プロモーターの活性は減少する。この手法は、この用途で記載される例において使用されているが、この結果を達成するための手段は、当該技術分野において他にも知られている。
【０２１７】
本開示のいくつかの例において有用なプロモーターは、組織特異的または細胞特異的なものであり得る。「組織特異的」という用語は、プロモーターに適用されるとき、特定の型の組織に目的核酸の選択的な転写を誘導する能力を有し、異なる型の組織では同一の目的ヌクレオチド配列の発現を相対的に生じさせないプロモーターを指す。「細胞特異的」という用語は、プロモーターに適用されるとき、特定の型の細胞において目的核酸の選択的な転写を誘導する能力を有し、同一の組織内の異なる型の細胞では同一の目的ヌクレオチド配列の発現を相対的に生じさせないプロモーターを指す。
【０２１８】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載の核酸によってコードされるｓｈｍｉＲの発現を増加させるために１つまたは複数のエンハンサーを追加で含み得る。本開示の例における使用に適したエンハンサーには、Ａｐｏ  Ｅ  ＨＣＲエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１−１７（２００３））、及び当業者に知られる他のエンハンサーが含まれる。本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける使用に適したエンハンサーは、米国特許第８，００８，４６８号に記載されている。
【０２１９】
追加の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本開示のｓｈｍｉＲをコードする核酸に連結された転写ターミネーターを含み得る。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおけるそれぞれの核酸に連結されるターミネーターは、同一または異なるものであり得る。例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが利用される本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトでは、ターミネーターは、４つ以上、または５つ以上、または６つ以上のＴ残基の連続ストレッチであり得る。しかしながら、異なるプロモーターが使用される場合、ターミネーターは、異なるものであり得、ターミネーターの由来元である遺伝子に由来するプロモーターに適合するものとされる。そのようなターミネーターには、限定はされないが、ＳＶ４０ポリＡ、ＡｄＶ  ＶＡ１遺伝子、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、及びヒトｔ−ＲＮＡのターミネーターが含まれる。プロモーターとターミネーターとの他の組み合わせは、当該技術分野において知られており、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける使用が企図される。
【０２２０】
さらに、プロモーター及びターミネーターは、混在使用及び適合が行われ得るものであり、このことは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩのプロモーター及びターミネーターでは一般に実施されることである。
【０２２１】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおけるそれぞれの核酸に使用されるプロモーターとターミネーターとの組み合わせは、要素間でＤＮＡ組換え事象が生じる可能性を低減するために、異なるものであり得る。
【０２２２】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの１つの例は、（ｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、及びＵ６−９プロモーターから選択され得る。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−８プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７５に示されるＤＮＡ配列を含むか、当該ＤＮＡ配列からなり得る。本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｈ１プロモーター及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲ���ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７８に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。
【０２２３】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの別の例は、（ｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、及びＵ６−９プロモーターから選択され得る。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１５４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−８プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７２に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの別の例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１５４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｈ１プロモーター及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓ���ｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７６に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。
【０２２４】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの別の例は、（ｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、及びＵ６−９プロモーターから選択され得る。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１５４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−８プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７３に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの別の例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１５４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｈ１プロモーター及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓ���ｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７７に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。
【０２２５】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの別の例は、（ｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）プロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）及び転写ターミネーター配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に機能可能なように連結された本明細書に記載のｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。Ｕ６プロモーターは、Ｕ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーター、及びＵ６−９プロモーターから選択され得る。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの例は、（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１５４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６７に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−８プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むものである。例えば、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−α＿１と命名されたｓｈｍｉＲ、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−δ＿３と命名されたｓｈｍｉＲ、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３と命名されたｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１７４に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなり得る。
【０２２６】
さらに、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、戦略的に配置された１つまたは複数のマルチクローニング部位及び／または特有の制限酵素認識部位を含み得、その結果、プロモーター、ｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び／または他の制御要素は、容易に除去または置換される。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、戦略的に配置された制限酵素認識部位及び／または相補的粘着末端を使用して、より小さなオリゴヌクレオチド要素から構築することができる。本開示による手法の１つのための基本ベクターは、すべての部位が特有（しかしながら、これは絶対条件ではない）のマルチリンカーを有するプラスミドを含む。次に、それぞれのプロモーターが、その指定の特有部位の間に挿入されることで、１つまたは複数のプロモーターを有する基本カセットが得られ、こうしたプロモーターはすべて、方向が可変であり得る。さらに引き続き、個別のプロモーターのそれぞれの下流に位置する特有部位へと、アニーリングしたプライマー対が挿入されることで、一重、二重、または多重の発現カセットコンストラクトが得られる。この挿入断片は、この二重、三重、または多重の発現カセット挿入断片に隣接する２つの特有の制限酵素部位（同一または異なるもの）を使用して適切なベクター骨格に移すことができる。
【０２２７】
ｄｄＲＮＡｉコンストラクトの生成は、当該技術分野において知られる任意の適切な遺伝子工学手法を使用して達成することができ、こうした遺伝子工学手法には、限定はされないが、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びＤＮＡシークエンシングの標準的な手法が含まれる。コンストラクトがウイルスコンストラクトであるならば、コンストラクトは、例えば、ウイルス粒子へのｄｄＲＮＡｉコンストラクトのパッケージングに必要な配列、及び／または標的細胞ゲノムへのｄｄＲＮＡｉコンストラクトの組み込みを可能にする配列を含む。いくつかの例では、ウイルスコンストラクトは、ウイルスの複製及び増殖を可能にする遺伝子を追加で含むが、そのような遺伝子は、トランスで提供されることになる。さらに、ウイルスコンストラクトは、任意の既知の生物のゲノムに由来する遺伝子または遺伝子配列が天然形態で組み込まれたものまたは改変されたものを含み得る。例えば、ウイルスコンストラクトは、細菌におけるコンストラクトの複製に有用な配列を含み得る。
【０２２８】
ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、追加の遺伝要素も含み得る。コンストラクトに含められ得る要素の型は、いずれの観点においても限定されるものではなく、当業者によって選択され得る。例えば、追加の遺伝要素には、蛍光マーカータンパク質（ＧＦＰもしくはＲＦＰ）の１つもしくは複数の遺伝子、アッセイが容易な酵素（ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、クロラムフェニカール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃａｌ）アセチルトランスフェラーゼ、もしくは分泌型胚性アルカリホスファターゼなど）の１つもしくは複数の遺伝子、または免疫アッセイが容易に利用可能なタンパク質（ホルモンもしくはサイトカインなど）の１つもしくは複数の遺伝子などのレポーター遺伝子が含まれ得る。
【０２２９】
本開示の実施形態において利用し得る他の遺伝要素には、細胞に対して選択的増殖優位性を付与するタンパク質（アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼなど）をコードするもの、薬剤耐性を付与するタンパク質をコードするもの、または栄養要求株から失われている生合成能力を付与するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。コンストラクトと共にレポーター遺伝子が含められるのであれば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含めることができる。１つの例では、追加の遺伝要素は、独立したプロモーター／エンハンサーと機能可能なように連結されるか、または独立したプロモーター／エンハンサーによって制御される。さらに、細菌におけるコンストラクトの増幅に適した複製起点が利用され得る。複製起点の配列は、一般に、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト及び他の遺伝子配列とは分離されている。そのような複製起点は、当該技術分野において知られており、そのような複製起点には、ｐＵＣ、ＣｏｌＥ１、２−ミクロン、またはＳＶ４０の複製起点が含まれる。
【０２３０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むＣＡＲコンストラクトも提供する。
【０２３１】
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトにおいてＣＡＲコンストラクトが提供される。したがって、本開示は、
（ａ）本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトと、
（ｂ）ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むＣＡＲコンストラクトと、
を含むＤＮＡコンストラクトを提供する。
【０２３２】
１つの例では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン（例えば、結合タンパク質）を含む。
【０２３３】
１つの例では、ＣＡＲは、抗体またはその抗原結合ドメインであり得る。
【０２３４】
１つの例では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載のもの）に特異的に結合する。別の例では、抗原結合ドメインは、感染細胞の表面に見られるウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原（例えば、本明細書に記載のウイルスに由来する抗原など）に特異的に結合する。
【０２３５】
１つの例では、ＣＡＲコンストラクトに含められ、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列の上流に配置されるプロモーターに対して、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列が機能可能なように連結される。プロモーターは、ＣＡＲの発現誘導に適した、当該技術分野において知られる任意のプロモーター（例えば、ＥＦ１ｐプロモーター要素）であり得る。
【０２３６】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトにおいてＣＡＲコンストラクトが提供される例によれば、ＤＮＡコンストラクトは、５’から３’の方向で、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト及びＣＡＲコンストラクトを含み得る。
【０２３７】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトにおいてＣＡＲコンストラクトが提供される別の例によれば、ＤＮＡコンストラクトは、５’から３’の方向で、ＣＡＲコンストラクト及びｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含み得る。
【０２３８】
本明細書に記載のように、本開示は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むＣＡＲコンストラクト、または当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトを提供し、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、例えば、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原）に特異的に結合する結合タンパク質（例えば、抗体、または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）であり、抗原結合ドメインの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と隣接し、当該核酸配列と同一のリーディングフレームに存在する。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ゼータ鎖）を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部分を含むＣＡＲの一部分を指す。
【０２３９】
ある特定の例では、本開示のＣＡＲコンストラクトは、ｓｃＦｖをコードする配列を含み、ｓｃＦｖの上流には、任意選択のリーダー配列が存在し、ｓｃＦｖの下流には、任意選択のヒンジ配列、膜貫通領域、及び／または細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン）が存在し得る。こうしたドメインは、隣接し、同一のリーディングフレームに存在することで単一の融合タンパク質を形成し得る。
【０２４０】
１つの例では、本開示のＣＡＲコンストラクトは、任意選択のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞内刺激ドメインをコードする配列を含む。
【０２４１】
１つの例では、本開示のＣＡＲコンストラクトは、任意選択のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン）、及び／または細胞内一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２４２】
１つの例では、本開示のＤＮＡコンストラクトは、
（ａ）（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉｉ）Ｈ１プロモーター及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含む、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクトと、
（ｂ）ＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むＣＡＲコンストラクトと、
を含む。
【０２４３】
例えば、本開示のＤＮＡコンストラクトは、
（ａ）５’レンチウイルス末端反復（ＬＴＲ）配列と、
（ｂ）（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６２に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｉ）スタッファー配列（例えば、ＨＰＲＴ由来のスタッファー配列）と、（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１６４に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、（ｉｖ））スタッファー配列（例えば、ＨＰＲＴ由来のスタッファー配列）と、（ｖ）Ｈ１プロモーター及び転写ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴに機能可能なように連結された配列番号１７１に示されるＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３）を含む核酸または当該ＤＮＡ配列からなる核酸と、を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトと、
（ｃ）ＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むＣＡＲコンストラクトと、
（ｄ）３’ＬＴＲ配列と、
を含み得る。
【０２４４】
本開示のＤＮＡコンストラクトの１つの例は、配列番号１７９に示されるＤＮＡ配列を含むか、または当該ＤＮＡ配列からなるものであり得る。
【０２４５】
本開示のＤＮＡコンストラクトに含められ得る追加のＣＡＲコンストラクト及びその構成要素は、本明細書に記載されている。
【０２４６】
抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲは、抗原結合ドメインを細胞外領域に含むことになる。
【０２４７】
１つの例では、抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインを含むマウスの抗体または抗体断片である。１つの例では、抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインを含むヒト化された抗体または抗体断片である。１つの例では、抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインを含むヒトの抗体または抗体断片である。
【０２４８】
抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドまたは受容体の型及び数に依存し得る。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞に存在する細胞表面マーカーとして働く抗原を認識するように選択され得る。リガンドまたは受容体として働き得る細胞表面マーカーの例には、特定の病状と関連する細胞表面マーカーが含まれ、こうした細胞表面マーカーは、例えば、ウイルス性疾患、細菌性疾患、寄生虫感染症、自己免疫疾患、及び望ましくない細胞増殖と関連する障害（例えば、がん（例えば、本明細書に記載のがん））に対する細胞表面マーカーである。
【０２４９】
ある特定の例では、抗原結合ドメインは、増殖性障害（例えば、がん）の抗原を認識するものであり、こうしたがんには、限定はされないが、原発性または転移性のメラノーマ、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ）、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、子宮癌、子宮頸癌、腎癌、甲状腺癌、膀胱癌、腎癌及び腺癌（乳癌など）、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、結腸癌、ならびに同様のものが含まれる。いくつかの実施形態では、がんは、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、１つまたは複数の慢性白血病（限定はされないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む）、追加の血液癌または血液学的症状（限定はされないが、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性症状、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）である。
【０２５０】
１つの例では、抗原結合ドメインは、哺乳類のがん腫瘍に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって免疫学的に認識される１つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む腫瘍抗原に特異的に結合する。
【０２５１】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞介在性の免疫応答を誘発する腫瘍細胞が産生するタンパク質であり得る。本開示の抗原結合ドメインの選択は、治療対象のがんの特定の型に依存することになる。腫瘍抗原は、当該技術分野においてよく知られており、こうした腫瘍抗原には、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−ｌ  ｌＲａ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ−ＩＸ、ＣＳ−１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＥＲ２、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、サイログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵｌ、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＬＣＫ、ＯＹ−ＴＥＳｌ、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ−１、フコシルＧＭ１、グロボＨ、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸（ｐｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＡＣ１、ＲＵｌ、ＲＵ２（ＡＳ）、腸のカルボキシルエステラーゼ、ルイスＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、変異ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐｌＯＯ、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−ベータ、サバイビン及びテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ−４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ１、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転座切断点、ＮＹ−ＢＲ−１、エフリンＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体ベータ、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ  Ａｇ、Ｔｉｅ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２、及びメソテリンが含まれる。１つの例では、腫瘍抗原は、葉酸受容体（ＦＲａ）、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＣＡ−ＩＸ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。１つの例では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。
【０２５２】
１つの例では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として役立ち得るタンパク質を多く発現する。こうした分子には、限定はされないが、組織特異的抗原が含まれ、こうした組織特異的抗原は、メラノーマにおけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、及びＧＰ１００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などである。他の標的抗原には、がん遺伝子であるＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子が含まれる。さらに別の群の標的抗原は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児抗原である。Ｂ細胞性リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７など）は、Ｂ細胞性リンパ腫における他の標的抗原候補である。
【０２５３】
いくつかの例では、腫瘍抗原は、ＷＯ２０１５／１２００９６、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１６／０１９３００、ＷＯ２０１６／０１１２１０、ＷＯ２０１６／１０９４１０、及びＷＯ２０１６／０６９２８３に記載の腫瘍抗原であり、これらの文献の内容は、それらの全体が参照によって援用される。
【０２５４】
標的となる所望の抗原に応じて、ＣＡＲをコードする配列は、その所望の抗原標的に特異的な適切な抗原結合ドメインを含むように操作することができる。
【０２５５】
本明細書に記載のＣＡＲコンストラクトは、ＭＨＣによって提示されるペプチドに結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）をコードするＤＮＡ配列を含み得る。通常、内在性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットにはまり、ＣＤ８＋Ｔリンパ球に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、すべての有核細胞が構成的に発現するものである。がんでは、ウイルス特異的及び／または腫瘍特異的なペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法にとって特有のクラスの細胞表面標的となっている。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＡｌまたはＨＬＡ−Ａ２と関連してウイルス抗原または腫瘍抗原から得られるペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体について記載されている（例えば、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１１  ８５（５）：１９３５−１９４２、Ｓｅｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｏｄ，２０１１，１１７（１６）：４２６２−４２７２、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０  １８４（４）：２１５６−２１６５、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１  ８（２１）：１６０１−１６０８、Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１３  ５（１７６）：１７６ｒａ３３、Ｔａｓｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  １９（２）：８４−１００を参照のこと）。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ライブラリー（ヒトｓｃＦｖのファージディスプレイライブラリーなど）をスクリーニングすることで同定することができる。したがって、本明細書に記載のＣＡＲは、細胞内に発現する上記のいずれかの腫瘍抗原から選択される分子（例えば、ｐ５３、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、及びｃ−ｍｅｔ）のＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメインを含み得る。
【０２５６】
１つの例では、ＣＡＲコンストラクト、または当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、第２のＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を有する追加の核酸を含み得、例えば、こうした第２のＣＡＲは、例えば同一の標的（本明細書に記載のがん関連抗原）または異なる標的（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−ｌ  ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸（Ｐｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＡＣ１、グロボＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−ｌ／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、変異ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、もしくはＩＧＬＬ１）に対する異なる抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲである。２つ以上の異なるＣＡＲをコードする核酸をＤＮＡコンストラクトが含む例によれば、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、それらの抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第１のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、断片としてのもの（例えば、ｓｃＦｖ））は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインとの集合体を形成することはない。１つの例では、第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
【０２５７】
ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含むＤＮＡコンストラクトによってコードされるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体分子に由来するものであり得、こうした抗体分子は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（例えば、ヒト由来のもの）、及び可変ドメイン（ＶＨＨ））のうちの１つまたは複数である。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用される種と同一の種に由来するものであることが有利であり、例えば、ヒトにおける使用については、本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒトの抗原結合ドメインまたはヒト化された抗原結合ドメインを含むことが有利であり得る。
【０２５８】
いくつかの例では、抗原結合ドメインは、標的抗原に対する認識及び特異的結合を付与する上で十分な抗体断片を含む。抗体断片の例には、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダＶＨＨドメインなど）、及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【０２５９】
１つの例では、抗原結合ドメインは、「ｓｃＦＶ」であり、ｓｃＦＶは、抗体のＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む融合タンパク質を含み得、ＶＨとＶＬとは、例えば、短い可動性ポリペプチドリンカー（例えば、本明細書に記載のリンカー）を介して連結される。ｓｃＦｖは、単鎖ポリペプチドとして発現する能力を有しており、その由来元であるインタクトな抗体の特異性を保持する。さらに、ＶＬ可変鎖とＶＨ可変鎖とは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれの順序においても連結することができ、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るか、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【０２６０】
いくつかの例では、ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／またはアミノ酸組成を有する可動性ポリペプチドリンカーを含む。可動性ポリペプチドリンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域のフォールディング及び相互作用がどのように生じるかいうことに大いに影響を与え得る。実際、短いポリペプチドリンカー（例えば、５〜１０のアミノ酸）が利用されるのであれば、鎖内フォールディングは阻止される。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、第２００５／０１７５６０６号、第２００７／００１４７９４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８号及び第ＷＯ２００７／０２４７１５号を参照のこと。これらの文献は、参照によって本明細書に援用される。
【０２６１】
いくつかの例では、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合（ｓｄＡｂ）分子である。ｓｄＡｂ分子には、その相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子が含まれる。例には、限定はされないが、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、通常の４つの鎖の抗体に由来する単一ドメイン、操作されたドメイン、及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン骨格（例えば、以下により詳細に記載されるもの）が含まれる。ＳＤＡＢ分子は、当該技術分野のいずれかのもの、または将来の任意の単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、任意の種に由来するものであり得、こうした種には、限定はされないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシが含まれる。
【０２６２】
ある特定の例では、ＳＤＡＢ分子は、相補的可変ドメインまたは免疫グロブリン定常部（例えば、Ｆｃ領域）を含まない１つまたは複数の単一ドメイン分子（例えば、ナノボディ）を含み、１つまたは複数の標的抗原に結合する単鎖融合ポリペプチドである。
【０２６３】
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはインビトロでの生成（例えば、ファージディスプレイによる選択）が行われたものであり得る。
【０２６４】
１つの例では、抗原結合ドメイン部分は、ヒト抗体またはその断片を含む。
【０２６５】
いくつかの例では、非ヒト抗体は、ヒト化され、ヒトにおいて天然に産生する抗体との類似性が増加するように抗体の特定の配列または領域が改変される。１つの実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化されたものである。
【０２６６】
別の例では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）またはその断片（例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ））である。そのようなＴＣＲの調製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１３６９−１３７７（２０００）、Ｚｈａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：４８７−４９６（２００４）、Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９（４）：３６５−７４（２０１２）（参考文献は、その全体が本明細書に援用される）を参照のこと。例えば、ｓｃＴＣＲは、Ｔ細胞クローンに由来するＶα遺伝子とνβ遺伝子とがリンカー（例えば、可動性ペプチド）によって連結されたものを含むように操作することができる。この手法は、それ自体は細胞内に存在するが、ＭＨＣによってそのような抗原の断片（ペプチド）ががん細胞の表面に提示されるがん関連標的に非常に有用である。
【０２６７】
別の例では、本開示のＣＡＲコンストラクトは、感染細胞の表面に見られるウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む。例えば、ウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザ及びＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガム（ＪＣ）ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ菌、ライノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１、ＨＳＶ  ＩＩ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）６、ＨＨＶ８、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス  エボラウイルス、ジカウイルス、ハンタウイルス、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からなる群から選択されるウイルスに由来するものであり得る。
【０２６８】
二重特異性ＣＡＲ
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、二重特異性ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。
【０２６９】
１つの例では、二重特異性ＣＡＲは、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、によって特徴付けられる。１つの例では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、同一の抗原（例えば、同一のタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット））に存在する。１つの例では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、重複する。１つの例では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、重複しない。１つの例では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、異なる抗原（例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット））に存在する。１つの例では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、を含む。１つの例では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体（ｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体と、を含む。１つの例では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片と、を含む。１つの例では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片と、を含む。
【０２７０】
１つの例では、二重特異性ＣＡＲは、多特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体分子である。
【０２７１】
二重特異性抗体分子のそれぞれの抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）の中で、ＶＨは、ＶＬの上流または下流に位置し得る。１つの例では、上流の抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨｌ）がそのＶＬ（ＶＬｌ）の上流に配置され、下流の抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流に配置され、その結果、二重特異性抗体分子全体は、ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２という配置を有する。別の例では、上流の抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬｌ）がそのＶＨ（ＶＨｌ）の上流に配置され、下流の抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流に配置され、その結果、二重特異性抗体分子全体は、ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２という配置を有する。任意選択で、２つの抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖｓ）の間にリンカーが配置され、例えば、コンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置されるのであれば、ＶＬ１とＶＬ２との間にリンカーが配置され、またはコンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置されるのであれば、ＶＨ１とＶＨ２との間にリンカーが配置される。一般に、２つのｓｃＦｖの間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメインの間で誤った対形成が生じることを回避するために十分な長さを有するべきである。
【０２７２】
任意選択で、第１のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間にリンカーが配置される。任意選択で、第２のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間にリンカーが配置される。複数のリンカーを有するコンストラクトでは、リンカーのいずれか２つ以上は、同一または異なるものであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、本明細書に記載の配置で、ＶＬ、ＶＨ、及び任意選択で１つまたは複数のリンカーを含む。
【０２７３】
１つの例では、二重特異性抗体分子は、第１のがん関連抗原に対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列（例えば、ｓｃＦｖ）（例えば、本明細書に記載のｓｃＦｖを含むか、あるいは本明細書に記載のｓｃＦｖに由来する軽鎖ＣＤＲ及び／または重鎖ＣＤＲを含む）と、異なる抗原に存在する第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、によって特徴付けられる。
【０２７４】
キメラＴＣＲ
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、キメラＴＣＲをコードするＤＮＡ配列を含む。例えば、がん関連抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを創出するために、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖（例えば、ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖）の１つまたは複数の定常ドメインにＣＡＲの抗原結合ドメインが連結され得る。理論によって拘束されるものではないが、キメラＴＣＲは、抗原結合時にＴＣＲ複合体を介してシグナルを発することになると考えられる。例えば、ＴＣＲ鎖（例えば、ＴＣＲアルファ鎖及び／またはＴＣＲベータ鎖）の定常ドメイン（例えば、細胞外定常ドメインの少なくとも一部分）、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインに本明細書に開示のｓｃＦｖが移植され得る。別の例として、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインに抗体断片（例えば、本明細書に記載のＶＬドメイン）が移植され得、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに抗体断片（例えば、本明細書に記載のＶＨドメイン）が移植され得る（あるいは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにＶＬドメインが移植され得、ＴＣＲアルファ鎖にＶＨドメインが移植され得る）。別の例として、がん関連抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを創出するために、ＴＣＲのアルファ鎖及び／またはベータ鎖に抗体または抗体断片のＣＤＲが移植され得る。例えば、ＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインに本明細書に開示のＬＣ  ＣＤＲが移植され得、ＴＣＲベータ鎖の可変ドメインに本明細書に開示のＨＣ  ＣＤＲが移植され得、逆の場合もあり得る。
【０２７５】
非抗体骨格
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、非抗体骨格を有する抗原結合ドメインを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含み、こうした非抗体骨格は、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュラー免疫薬剤（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｙ）、プロテインＡ、またはアフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）である。非抗体骨格は、細胞に存在する標的抗原に結合する能力を有する。１つの例では、抗原結合ドメインは、細胞に発現する天然起源のタンパク質のポリペプチドまたはその断片である。１つの例では、抗原結合ドメインは、非抗体骨格を含む。標的細胞に存在する標的抗原に特異的に結合する結合領域を少なくとも１つ含むポリペプチドが得られる限り、多種多様な非抗体骨格が利用され得る。
【０２７６】
非抗体骨格には、フィブロネクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、及びＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ，Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、小型モジュラー免疫薬剤（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。
【０２７７】
フィブロネクチン骨格は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型の第１０モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づくものであり得る。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、２つのベータシート（それら自体が互いに相対する形でパッキングされることでタンパク質のコアを形成する）の間に分布する７つまたは８つのベータ鎖を有すると共に、これらのベータ鎖を互いに連結する溶媒露出ループ（ＣＤＲと類似したもの）をさらに含む。ベータシートサンドイッチのそれぞれのエッジにそのようなループが少なくとも３つ存在し、このエッジは、ベータ鎖の方向に対して直角に交わるタンパク質境界である（米国６，８１８，４１８を参照のこと）。この構造が理由で、この非抗体骨格は、抗体のものと性質及び親和性が類似した抗原結合特性を再現している。
【０２７８】
アンキリン技術は、異なる標的への結合に使用することができる可変領域を持たせるための骨格として、アンキリン由来の反復モジュールを有するタンパク質を使用することに基づくものである。アンキリン反復モジュールは、２つの逆平行α−ヘリックスと１つのβ−ターンとからなる３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することによって主に最適化される。
【０２７９】
Ａｖｉｍｅｒは、ＨＥＲ３などの天然のＡ−ドメイン含有タンパク質に由来するものである。こうしたドメインは、本来はタンパク質間相互作用に使用されており、ヒトでは２５０を超えるタンパク質が構造的にＡ−ドメインに基づいている。Ａｖｉｍｅｒは、アミノ酸リンカーによって連結された多くの異なる「Ａ−ドメイン」単量体（２〜１０）からなる。標的抗原に結合することができるＡｖｉｍｅｒは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、第２００５００５３９７３号、第２００５００４８５１２号、及び第２００６０００８８４４号に記載の方法論を使用して創出することができる。
【０２８０】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの骨格に基づく３つのヘリックスの束から構成される小さな単純タンパク質である。プロテインＡは、細菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来する表面タンパク質である。この骨格ドメインは、５８のアミノ酸からなり、これらのアミノ酸うちの１３のアミノ酸が無作為化されることで、非常に多くのリガンド変異体を含むａｆｆｉｂｏｄｙライブラリーが得られる（例えば、米国５，８３１，０１２を参照のこと）。Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は、抗体を模倣する分子であり、抗体の分子量が１５０ｋＤａであるに対し、Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子の分子量は６ｋＤａである。そのサイズの小ささにもかかわらず、ａｆｆｉｂｏｄｙ分子の結合部位は、抗体のものと類似している。
【０２８１】
タンパク質エピトープ模倣物（ＰＥＭ）は、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、サイズが中程度のペプチド様環状分子（ＭＷ１〜２ｋＤａ）であり、この主要な二次構造は、タンパク質間相互作用に必要なものである。抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、またはラクダ抗体を含むもの）は、本明細書に記載の任意の標的受容体／リガンドを対象にすることができる。
【０２８２】
１つの例では、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面に存在するカウンターリガンドに結合する分子の細胞外ドメインまたはそのカウンターリガンド結合断片を含む。
【０２８３】
抗原結合ドメインは、抑制性受容体の細胞外ドメインを含み得る。共抑制分子のカウンターリガンドと結合すると、免疫エフェクター応答が最適化するように再誘導される。
【０２８４】
抗原結合ドメインは、共刺激分子の細胞外ドメイン（共刺激ＥＣＤドメインと称される）を含み得る。共刺激分子のカウンターリガンドと結合すると、免疫エフェクター応答が最適化される。
【０２８５】
膜貫通ドメイン
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、抗原結合ドメイン、抑制性カウンターリガンド結合ドメイン、または共刺激ＥＣＤドメインを含み得る細胞外配列（例えば、細胞外認識要素）に融合した膜貫通ドメインを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。１つの例では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に関連するものである。１つの例では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つとは天然に関連しないものである。
【０２８６】
膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接するアミノ酸を追加で１つまたは複数含み得、こうしたアミノ酸は、例えば、膜貫通部の由来元であるタンパク質の細胞外領域と関連する１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０〜１５のアミノ酸）、及び／または膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞内領域と関連する１つもしくは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０〜１５のアミノ酸）である。１つの例では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインのうちの１つと関連するものであり、例えば、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、またはヒンジドメインの由来元であるタンパク質と同一のタンパク質に由来するものであり得る。別の例では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲのいずれかの他のドメインの由来元であるタンパク質と同一のタンパク質に由来するものではない。
【０２８７】
１つの例では、膜貫通ドメインは、他の要素（例えば、他の膜貫通ドメイン）との相互作用を最小化するものである。場合によっては、膜貫通ドメインは、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を最小化することで、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化する。適切な例は、既知の膜貫通ドメインのアミノ酸置換を選択または改変することによって導き出すことができる。１つの例では、膜貫通ドメインは、細胞表面に存在する別のＣＡＲとのホモ二量体化を促進する能力を有する。別の例では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同一のＣＡＲ発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用が最小化するように改変または置換され得る。
【０２８８】
膜貫通ドメインは、天然起源のものまたは非天然起源の合成配列を含み得る。天然起源ものの場合、膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであり得る。
【０２８９】
本開示の組換えＤＮＡコンストラクトによってコードされるＣＡＲは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のいずれか１つまたは複数に由来する膜貫通領域を含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦｌ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み得る。
【０２９０】
１つの例では、膜貫通ドメインと、その融合対象である別の配列またはドメインと、の間に配列（例えば、ヒンジまたはスペーサーの配列）を配置することができる。いくつかの例では、ヒトのさまざまなヒンジ（「スペーサー」としても知られる）を利用することもでき、例えば、こうしたヒンジには、限定はされないが、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジが含まれる。１つの例では、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）、ＧＳリンカー（例えば、本明細書に記載のＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであり得る。任意選択で、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、ＣＡＲの別のドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメイン）と、の間の結合は、２〜１０のアミノ酸の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって形成され得る。グリシン−セリンダブレットからは、特に適切なリンカーが得られる。
【０２９１】
１つの例では、膜貫通ドメインは、非天然起源の配列であり得、この場合、疎水性残基（ロイシン及びバリンなど）を主に含み得る。１つの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、膜貫通ドメインのそれぞれの末端に見られることになる。
【０２９２】
任意選択で、ＣＡＲの膜貫通ドメインとＣＡＲの細胞質領域との間の結合は、２〜１０のアミノ酸の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって形成され得る。グリシン−セリンダブレットからは、特に適切なリンカーが得られる。
【０２９３】
細胞内シグナル伝達ドメイン
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、その融合対象である細胞外ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）がカウンターリガンドに結合すると、細胞内シグナルを生成する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。１つの例では、ＣＡＲ分子は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）で発現するように構築することができ、その結果、ＣＡＲ分子は、免疫細胞と典型的には関連するポリペプチドに由来するドメイン（例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、抑制ドメインなど）を含む。一例にすぎないが、Ｔ細胞において発現させるためのＣＡＲは、４１ＢＢドメイン及びＣＤ３ゼータドメインを含み得る。この例によれば、４１ＢＢドメインとＣＤ３ゼータドメインとは両方共、Ｔ細胞と関連するポリペプチドに由来するものである。さらに別の例では、Ｔ細胞において発現させるためのＣＡＲは、ＣＤ２８ドメイン及びＣＤ３ゼータドメインを含み得る。別の例では、Ｔ細胞において発現させるためのＣＡＲは、ＩＣＯＳドメイン及びＣＤ３ゼータドメインを含み得る。別の例では、Ｔ細胞において発現させるためのＣＡＲは、ＣＤ２７ドメイン及びＣＤ３ゼータドメインを含み得る。別の例では、ＣＡＲ分子は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）において発現するように構築することができ、その結果、ＣＡＲ分子は、免疫細胞と典型的には関連しないポリペプチドに由来するドメインを含む。
【０２９４】
一次細胞内シグナル伝達ドメイン
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、その融合対象である細胞外ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）が関連抗原に結合すると、細胞内シグナルを生成する。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激分子に由来し、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激分子の細胞内配列を含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、例えばその融合対象である抗原結合ドメインが関連抗原に結合したときに、細胞内シグナルを生成する上で十分な一次刺激分子配列を含む。
【０２９５】
一次刺激分子は、関連リガンドに結合すると、例えばそれが発現する細胞において、免疫エフェクター応答を媒介する分子である。典型的には、一次刺激分子は、抗原を含む関連リガンドへの結合に依存する細胞内シグナルを生成する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、一次刺激分子の例であり、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、関連リガンド（例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子）に結合すると細胞内シグナルを生成する。典型的には、例えばＴＣＲ／ＣＤ３一次刺激分子の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインによる細胞内シグナルの生成は、抗原への一次刺激分子の結合に依存する。
【０２９６】
一次刺激は、ある特定の分子の発現改変（ＴＧＦ−βの下方制御など）及び／または細胞骨格構造の再編成、ならびに同様のものを媒介し得る。
【０２９７】
刺激は、例えば共刺激の存在下で、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能の最適化（例えば、増加）をもたらし得る。刺激は、例えばＣＡＲＴ細胞との関連では、Ｔ細胞応答（例えば、増殖、活性化、分化、及び同様のもの）を媒介し得る。
【０２９８】
１つの例では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達モチーフ（例えば、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭ）を含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、（例えば）ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、共通ＦｃＲガンマ、（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲｌｌａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）、ＦｃｓＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列を含み得る。
【０２９９】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激分子（例えば、ＣＤ３ゼータ）の機能性断片または類似体を含む。一次細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内領域全体を含むか、またはその融合対象である抗原結合ドメインが関連抗原に結合するときに細胞内シグナルを生成する上で十分な細胞内領域の断片を含み得る。いくつかの例では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然起源の一次刺激分子の細胞内領域全体または細胞内シグナルの生成に十分な細胞内領域の断片との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり、上記の天然起源の一次刺激分子は、例えば、ヒト、または他の哺乳類（例えば、非ヒト種、（例えば、げっ歯類、サル、類人猿、またはマウス））の細胞内一次刺激分子である。
【０３００】
いくつかの例では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、天然起源のヒト一次刺激分子（例えば、天然を起源とする本明細書に開示のヒト一次刺激分子）の細胞内領域全体または細胞内シグナルの生成に十分な細胞内領域の断片の対応する残基との同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％であるか、または上記の対応する残基と異なるアミノ酸残基数が３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、もしくは１以下である。
【０３０１】
共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、共刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含み、この共刺激シグナル伝達ドメインは、その融合対象である細胞外ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）が関連リガンドに結合すると細胞内シグナルを生成するものである。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子に由来するものである。共刺激シグナル伝達ドメインは、例えばその融合対象である細胞外ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）が関連リガンドに結合するときに、細胞内シグナルを生成する上で十分な一次共刺激分子配列を含む。
【０３０２】
共刺激ドメインは、その共刺激ドメインを含むＣＡＲを含むＴ細胞の能力（例えば、持続性）または免疫エフェクター機能を最適化するものであり得る。
【０３０３】
共刺激分子は、免疫エフェクター応答を促進する抗原受容体またはそのカウンターリガンド以外の細胞表面分子である。場合によっては、共刺激分子は、効率的な免疫応答または免疫応答の増進に必要である。典型的には、共刺激分子は、ある特定の例では、抗原（例えば、ＣＡＲＴ細胞の抗原結合ドメインによって認識される抗原）以外の関連リガンドへの結合に依存する細胞内シグナルを生成するものある。典型的には、一次刺激分子に由来するシグナル伝達及び共刺激分子に由来するシグナル伝達は、免疫エフェクター応答に寄与し、場合によっては、免疫エフェクター応答の効率的生成または生成増進には両方が必要である。
【０３０４】
共刺激ドメインは、共刺激分子（例えば、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、または４−１ＢＢ）の機能性断片または類似体を含む。共刺激ドメインは、細胞内領域全体を含むか、または例えばその融合対象である抗原結合ドメインが関連抗原に結合するときに、細胞内シグナルを生成する上で十分な細胞内領域の断片を含み得る。ある特定の例では、共刺激ドメインは、天然起源の共刺激分子の細胞内領域全体または細胞内シグナルの生成に十分な細胞内領域の断片との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり、上記の天然起源の共刺激分子は、例えば、ヒト、または他の哺乳類（例えば、非ヒト種、（例えば、げっ歯類、サル、類人猿、またはマウス））の細胞内共刺激分子である。
【０３０５】
共刺激ドメインの例には、限定はされないが、ＣＤ２７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＱＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＱＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤｌ１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭｆ７、ＮＫＰ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、Ｃ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭｌ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（Ｃ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭｌ、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬｌ、ＣｌＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦｌ、ＣＤ１５０、ＩＰ０−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、及びＰＡＧ／Ｃｂｐから選択されるものが含まれる。
【０３０６】
いくつかの例では、共刺激シグナル伝達ドメインは、天然起源のヒト共刺激分子（例えば、天然を起源とする本明細書に開示のヒト共刺激分子）の細胞内領域全体または細胞内シグナルの生成に十分な細胞内領域の断片の対応する残基との同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％であるか、または上記の対応する残基と異なるアミノ酸残基数が３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、もしくは１以下である。
【０３０７】
共刺激分子リガンド結合ドメイン
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、免疫エフェクター応答を促進する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、共刺激分子の細胞外リガンド結合ドメイン（共刺激ＥＣＤドメインと称される）を含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。したがって、共刺激分子のカウンターリガンドと結合すると、免疫エフェクター応答が最適化される。
【０３０８】
共刺激分子に由来する共刺激ＥＣＤドメインの例（共刺激ＥＣＤドメインの由来元の共刺激分子によって示される）には、限定はされないが、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、及びＣＤ２２６が含まれる。
【０３０９】
いくつかの例では、共刺激ＥＣＤドメインは、天然起源のヒト抑制分子（例えば、天然を起源とする本明細書に開示のヒト共刺激分子）の細胞外領域全体またはカウンターリガンドとの結合に十分な細胞外領域の断片の対応する残基との同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％であるか、または上記の対応する残基と異なるアミノ酸残基数が３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、もしくは１以下である。
【０３１０】
抑制性ＣＡＲメンバー
いくつかの例では、ＣＡＲコンストラクトまたは当該ＣＡＲコンストラクトを含む組換えＤＮＡコンストラクトは、抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）メンバーを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。ｉＣＡＲメンバーは、非標的（例えば、非がん細胞）に存在する抗原を認識する抗原結合ドメイン（または他の細胞外ドメイン）と、膜貫通ドメインと、抑制分子に由来するドメイン（例えば、抑制分子に由来する細胞内ドメイン）と、を含む。１つの例では、ｉＣＡＲメンバーは、第２の抑制性細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０３１１】
ｉＣＡＲメンバーの抗原結合ドメイン（または他の細胞外ドメイン）がその標的抗原（またはカウンターリガンド）と結合すると、ｉＣＡＲは、そのｉＣＡＲを含む細胞の活性化の抑制（例えば、可逆的な抑制、または最小化）に寄与する。したがって、ＣＡＲにｉＣＡＲメンバーを含めること、及び例えば、そのＣＡＲをＣＡＲ−Ｔ細胞が発現することで、非標的（例えば、バイスタンダー細胞）への損傷を限定することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ｉＣＡＲメンバーは、その抗原（またはカウンターリガンド）と結合すると、サイトカイン分泌、細胞傷害性、及び増殖のうちの１つまたは複数を限定すると考えられる。ある特定の例では、この作用は一時的なものであり、次に標的細胞と結合すると、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、活性化され、標的細胞を攻撃する。
【０３１２】
ｉＣＡＲメンバーの標的抗原は、標的細胞及び非標的細胞に対する発現プロファイルを有する抗原であり得、その結果、標的細胞に対しては許容可能な高レベルの攻撃が達成され、非標的細胞には許容可能な低レベルの攻撃が達成される。オンターゲット／オフターゲット応答の比を最適化するために、抗原の選択だけでなく、ｉＣＡＲの抗原（またはカウンターリガンド）に対するｉＣＡＲの親和性、ＣＡＲの抗原に対するＣＡＲの親和性、ｉＣＡＲの発現レベル、またはＣＡＲの発現レベルも利用することができる。
【０３１３】
１つの例では、抗原は、腫瘍細胞に存在しないか、または腫瘍細胞では下方制御されている。１つの例では、抗原は、ＨＬＡ分子を含む。１つの例では、抗原は、細胞表面腫瘍抑制抗原を含む。１つの例では、抗原は、ＰＣＭＬ（またはリンパ腫、乳癌、もしくは前立腺癌において下方制御される別の抗原）、ＨＹＡＬ２、ＤＣＣ、あるいはＳＭＡＲ１を含む。
【０３１４】
１つの例では、抗原は、タンパク質、糖質、脂質、または細胞表面部分の翻訳後修飾（例えば、ムチン型Ｏ−グリカン（コア３  Ｏ−グリカン））を含む。
【０３１５】
１つの例では、抗原は、上皮間葉移行が生じている腫瘍細胞によって下方制御される部分を含む。
【０３１６】
１つの例では、抗原は、Ｅ−カドヘリンを含む。
【０３１７】
１つの例では、抑制分子に由来するドメインは、その融合対象である細胞外ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）が関連抗原（またはカウンターリガンド）に結合すると、細胞内シグナルを生成する。抑制性細胞内シグナル伝達ドメインは、抑制分子に由来するものであり、例えば、抑制性細胞内シグナル伝達ドメインは、抑制分子の細胞内配列を含む。抑制性細胞内シグナル伝達ドメインは、例えばその融合対象である抗原結合ドメインがその関連抗原に結合するときに、細胞内シグナルを生成する上で十分な抑制分子配列を含む。
【０３１８】
１つの例では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達モチーフ（例えば、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＴＴＩΜ）を含む。
【０３１９】
抑制分子に由来するドメインは、抑制分子の細胞内ドメインの機能性断片または類似体を含む。このドメインは、細胞内領域全体を含むか、またはその融合対象である抗原結合ドメインが関連抗原に結合するときに細胞内シグナルを生成する上で十分な細胞内領域の断片を含み得る。１つの例では、抑制性細胞内シグナル伝達ドメインは、天然起源の抑制分子の対応する残基との配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％であるか、または上記の対応する残基と異なるアミノ酸残基数が３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、もしくは１以下であり、こうした天然起源の抑制分子は、例えば、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、及びＴＧＦ−ベータ受容体から選択される分子などである。
【０３２０】
したがって、１つの例では、本開示の組換えＤＮＡコンストラクトは、ｉＣＡＲメンバーを含むＣＡＲを含む。ｉＣＡＲメンバーは、非標的（例えば、非がん細胞）に存在する抗原を認識する抗原結合ドメイン（または他の細胞外ドメイン）と、膜貫通ドメインと、抑制分子（例えば、本明細書に記載のもの）に由来するドメインと、を含み得る。
【０３２１】
発現ベクター
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトもしくはＣＡＲコンストラクト、または本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト及びＣＡＲコンストラクトを含むＤＮＡコンストラクトは、１つまたは複数の発現ベクター（複数可）に含められる。
【０３２２】
１つの例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトとＣＡＲコンストラクトとは、単一の発現ベクターに別々に含められる。別の例では、ＤＮＡコンストラクトは、単一の発現ベクターに含められる。別の例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトとＣＡＲコンストラクトとは、別々の発現ベクターに含められる。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトとＣＡＲコンストラクトとが別々の発現ベクターに含められる例によれば、それぞれの発現ベクターは、同一または異なるものであり得る。
【０３２３】
１つの例では、唯一またはそれぞれの発現ベクターは、プラスミド（例えば、当該技術分野において知られるもの）である。１つの例では、適切なプラスミド発現ベクターは、ｐＢＬベクターである。本明細書に記載のように、プラスミドは、本開示のｓｈｍｉＲの発現を誘導するために、１つまたは複数のプロモーター（その適切な例は記載されている）を含み得る。
【０３２４】
１つの例では、唯一またはそれぞれの発現ベクターは、ミニサークルＤＮＡである。ミニサークルＤＮＡについては、米国特許公開第２００４／０２１４３２９に記載されている。ミニサークルＤＮＡは、高レベルの核酸転写を持続的に生じさせる上で有用である。こうした環状ベクターは、発現をサイレンシングする細菌配列を欠いていることによって特徴付けられる。例えば、ミニサークルベクターは、複製起点を欠いており、細菌プラスミドに一般に見られる薬剤選択マーカー（例えば、β−ラクタマーゼ、ｔｅｔ、及び同様のもの）を欠いているという点において、細菌プラスミドベクターとは異なる。結果的に、ミニサークルＤＮＡは、サイズが小型化していることで、送達効率性が向上している。
【０３２５】
１つの例では、唯一またはそれぞれの発現ベクターは、ウイルスベクターである。
【０３２６】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト及び／またはＣＡＲコンストラクトを送達するために、任意の適切なウイルスに基づくウイルスベクターが使用され得る。さらに、ハイブリッドウイルス系が有用であり得る。ウイルス送達系の選択は、さまざまなパラメーターに依存することになり、こうしたパラメーターは、送達標的となる組織、系の形質導入効率、病原性、免疫学的な懸念及び毒性の懸念、ならびに同様のものなどである。
【０３２７】
遺伝子治療において使用されるもので一般的に使用されるクラスのウイルス系は、そのゲノムが宿主細胞のクロマチンに組み込まれるか（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）、または染色体外エピソームとして細胞核において主に存続するか（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びヘルペスウイルス）によって２つの群に分類することができる。１つの例では、本開示のウイルスベクターは、宿主細胞のクロマチンに組み込まれる。別の例では、本開示のウイルスベクターは、染色体外エピソームとして宿主細胞の核において存続する。
【０３２８】
いくつかの例では、本開示のウイルスベクターは、レンチウイルスである。レンチウイルスベクターは、水疱性ステアタイトウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でシュードタイプ化されることが多く、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ビスナ−マエディ（ヒツジにおいて脳炎（ビスナ）または肺炎を引き起こす）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）（ウマにおいて自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こす）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）（ネコにおいて免疫不全を引き起こす）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）（ウシにおいてリンパ節症及びリンパ球増加症を引き起こす）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（非ヒト霊長類において免疫不全及び脳症を引き起こす）から得られている。ＨＩＶに基づくベクターが一般に保持する親ゲノムの割合は＜５％であると共に、パッケージングコンストラクトに組み込まれるゲノムの割合は＜２５％であり、これによって、複製能力を有するＨＩＶが復帰生成する可能性が最小化される。下流の長鎖末端反復配列に制御要素の欠失を含む自己不活性化ベクターが開発され、ベクターの動員に必要なパッケージングシグナルの転写が生じないようにすることによってバイオセイフティーがさらに向上している。レンチウイルスベクターを使用することの主な利点の１つは、ほとんどの組織または細胞型において遺伝子導入が持続し、形質導入細胞が細胞分裂した後でさえ、この遺伝子導入が持続することである。
【０３２９】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトからのｓｈｍｉＲの発現に使用され、及び／または本開示のＣＡＲコンストラクトからのＣＡＲの発現に使用される（本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトと共にＤＮＡコンストラクトにおいて提供されるときを含む）レンチウイルスベースのコンストラクトは、レンチウイルスの５’及び３’の長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）に由来する配列を含む。１つの例では、ウイルスコンストラクトは、レンチウイルスに由来する不活性化または自己不活性化した３’ＬＴＲを含む。この３’ＬＴＲは、当該技術分野において知られる任意の方法によって自己不活性化され得る。例えば、この３’ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１、及びＮＦ−カッパーＢ部位）に欠失を含む。自己不活性化３’ＬＴＲが存在する結果として、宿主ゲノムに組み込まれるプロウイルスは、不活性化５’ＬＴＲを含むことになる。ＬＴＲ配列は、任意の種に由来する任意のレンチウイルスに由来するＬＴＲ配列であり得る。レンチウイルスベースのコンストラクトは、ＭＭＬＶもしくはＭＳＣＶ、ＲＳＶ、または哺乳類遺伝子の配列も含み得る。さらに、レンチウイルスの５’ＬＴＲに由来するＵ３配列は、ウイルスコンストラクトにおいてプロモーター配列で置換され得る。これによって、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価が増加し得る。エンハンサー配列も含められ得る。
【０３３０】
１つの例では、ウイルスベクターは、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターである。アデノウイルスは、２６〜４８Ｋｂｐの線状ゲノムを有する中サイズの二本鎖の非エンベロープＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、受容体介在性の結合及び内部移行によって標的細胞に入り、非分裂細胞と分裂細胞との両方の核に侵入する。アデノウイルスは、その生存及び複製を宿主細胞に重度に依存しており、宿主の複製機構を使用して脊椎動物細胞の核において複製することができる。
【０３３１】
１つの例では、ウイルスベクターは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに由来するものである。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅは、約５０００のヌクレオチドの長さのゲノムを有する小サイズの一本鎖の非エンベロープＤＮＡウイルスのファミリーである。このファミリーのメンバーには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が含まれる。１つの例では、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶである。ＡＡＶは、増殖性の感染サイクルを開始及び維持するには別のウイルス（典型的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との同時感染が一般に必要になる依存性パルボウイルスである。そのようなヘルパーウイルスが存在しない場合でも、ＡＡＶは、受容体介在性の結合及び内部移行によって標的細胞に感染または形質導入する能力を依然として有しており、非分裂細胞と分裂細胞との両方の核に侵入する。ヘルパーウイルスの非存在下ではＡＡＶが感染しても子孫ウイルスは産生しないため、そのウイルスが感染する最初の細胞のみに形質導入の範囲が限定される。この特徴によって、ＡＡＶは、本開示のベクターとして望ましいものとなっている。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス、及び単純ヘルペスウイルスとは異なり、ＡＡＶは、ヒトに病原性及び毒性を及ぼさないものと思われる（Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４２４：２５１（２００３））。ゲノムがコードする遺伝子は、通常、２つのみであるため、送達媒体として、ＡＡＶのパッケージング容量が４．５一本鎖キロベース（ｋｂ）に制限されることは驚くべきことではない。しかしながら、このサイズ制限によって、遺伝子置換療法のために送達することができる遺伝子は制限され得るものの、より短い配列（ｓｈｍｉＲ及びｓｈＲＮＡなど）のパッケージング及び発現に有害な影響が及ぶことはない。
【０３３２】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、及び／またはＤＮＡコンストラクトで有用な別のウイルス送達系は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに由来するウイルスに基づく系である。レトロウイルスは、２つの特有の特徴によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡ動物ウイルスを構成する。第１に、レトロウイルスのゲノムは、二倍体であり、ＲＮＡの２つのコピーからなる。第２に、このＲＮＡは、ビリオン関連酵素である逆転写酵素によって転写されることで二本鎖ＤＮＡとなる。その後、この二本鎖ＤＮＡまたはプロウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ、安定的に組み込まれた宿主ゲノム成分として親細胞から子孫細胞に受け継がれ得る。
【０３３３】
目的細胞への本開示のｄｄＲＮＡｉまたは核酸の送達には当業者に知られる他のウイルス系または非ウイルス系が使用され得、こうした系には、限定はされないが、遺伝子が欠失したアデノウイルス−トランスポゾンベクター（Ｙａｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９９９−１００４（２００２）を参照のこと）、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルスに由来する系（Ｐｅｒｒｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９８０２−０７（２００２）を参照のこと）、ニューカッスル病ウイルスまたはセンダイウイルスに由来する系が含まれる。
【０３３４】
コンストラクトまたはベクターの試験
ｄｄＲＮＡｉコンストラクト
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトがＴＣＲ複合体サブユニットの発現を抑制する活性は、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトまたは当該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む発現ベクターをＴ細胞に導入した後、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおけるｓｈｍｉＲが標的とするＴＣＲ複合体サブユニットによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定することによって決定され得る。発現レベルは、Ｔａｑｍａｎ（商標）アッセイもしくは特定のＴＣＲサブユニットを対象として設計された他のリアルタイムＰＣＲアッセイ、あるいは例えば市販の抗体及び／またはＥＬＩＳＡキットを使用する、ＴＣＲを対象とするＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
【０３３５】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトによってコードされる個別のｓｈｍｉＲによるＴＣＲサブユニット発現の下方制御を決定するための方法の例は、実施例３に記載されている。
【０３３６】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトによってコードされる個別のｓｈｍｉＲによってＴＣＲサブユニットの表面発現（すなわち、細胞表面でのＴＣＲの発現及び構築）の下方制御を決定するための方法の例は、実施例５に記載されている。
【０３３７】
ＣＡＲコンストラクト及び当該ＣＡＲコンストラクトを含むＤＮＡコンストラクト
本開示のＣＡＲコンストラクトまたはＤＮＡコンストラクトがＣＡＲを発現する活性は、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、または当該コンストラクトを含む発現ベクターをＴ細胞（例えば、非機能性の内在性ＴＣＲを含むＴ細胞）に導入した後、ＣＡＲによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定することによって決定され得る。発現レベルは、Ｔａｑｍａｎ（商標）アッセイもしくは他のリアルタイムＰＣＲアッセイ、またはＣＡＲを対象とするＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
【０３３８】
組成物及び担体
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクター（複数可）は、１つまたは複数の組成物において提供される。例えば、組成物は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団に導入できるように製剤化される。
【０３３９】
例えば、本開示の組成物は、（ｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む発現ベクター、（ｉｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む発現ベクター、及び本開示のＣＡＲコンストラクトを含む発現ベクター、または（ｉｉｉ）本開示のＤＮＡコンストラクトを含む発現ベクターを含み得る。異なる発現ベクターにおいてｄｄＲＮＡｉコンストラクト及びＣＡＲコンストラクトが提供される例によれば、発現ベクターはそれぞれ、個別の組成物（例えば、一緒に包装される）として提供され得る。
【０３４０】
本開示の組成物は、例えばＴ細胞での使用に適した、１つまたは複数の担体または希釈剤も含み得る。１つの例では、担体（複数可）または希釈剤（複数可）は、医薬的に許容可能なものであり得る。１つの例では、担体は、Ｔ細胞（例えば、細胞培養におけるもの）への本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクター（複数可）の導入が支援されるように製剤化され得る。
【０３４１】
いくつかの例では、担体は、脂質ベースの担体、陽イオン性脂質、もしくはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子、またはそれらの混合物である。
【０３４２】
いくつかの例では、担体は、陽イオン性ポリマー−核酸複合体を形成するような生分解性ポリマーベースの担体である。細胞への送達組成物のために陽イオン性ポリマーを使用することは、当該技術分野において知られており、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２５：４５７−４６２（２００５）などに記載されている。当該文献の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【０３４３】
別の例では、担体は、シクロデキストリンベースの担体（シクロデキストリンポリマー−核酸複合体など）である。
【０３４４】
別の例では、担体は、タンパク質ベースの担体（陽イオン性ペプチド−核酸複合体など）である。
【０３４５】
別の例では、担体は、脂質ナノ粒子である。ナノ粒子の例は、例えば、米国７５１４０９９に記載されている。
【０３４６】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクター（複数可）は、陽イオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ（例えば、４０／４８／２／１０の比のもの）、陽イオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ（例えば、４０／４８／２／１０の比のもの）、または陽イオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ（例えば、６０／３８／２の比のもの）を含む脂質ナノ粒子組成物を用いて製剤化され得る。いくつかの例では、陽イオン性脂質は、オクチルＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、Ｌ−２７８、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、またはＭＣ３である。
【０３４７】
別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び発現ベクター（複数可）は、ＷＯ２０１０／０２１８６５、ＷＯ２０１０／０８０７２４、ＷＯ２０１０／０４２８７７、ＷＯ２０１０／１０５２０９、またはＷＯ２０１１／０２２４６０に記載の陽イオン性脂質製剤のいずれかを用いて製剤化され得る。
【０３４８】
別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び発現ベクター（複数可）は、例えば送達を促進するために、別の化合物と結合または複合化され得る。そのような複合体の例は、限定はされないが、米国２００８／０１５２６６１及び米国２００４／０１６２２６０に記載されている（例えば、ＣＤＭ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐｉｐ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−ＰＥＧ、ＣＤＭ−ＮＡＧなど）。
【０３４９】
別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び発現ベクター（複数可）にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が共有結合で結合される。結合したＰＥＧは、任意の分子量を有し得、例えば、約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する。
【０３５０】
さらに他の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び発現ベクター（複数可）は、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面改変リポソーム（ＰＥＧで改変されたリポソームもしくは長期循環性リポソーム、またはステルスリポソーム）を含む担体を用いて製剤化され得、こうしたものは、例えば、ＷＯ９６／１０３９１、ＷＯ９６／１０３９０、またはＷＯ９６／１０３９２に開示されるものなどである。
【０３５１】
他の担体には、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４、またはＷＯ０３／４６１８５を参照のこと）、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、及びＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国２００２１３０４３０を参照のこと）が含まれる。
【０３５２】
組成物は、好ましくは、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び発現ベクター（複数可）の生物学的安定性を向上させる材料、及び／または組成物がＴ細胞に局在化する能力を向上させる材料を含むことになる。本開示の治療組成物は、医薬的に許容可能な担体（例えば、生理食塩水）において投与され得る。
【０３５３】
Ｔ細胞及び当該Ｔ細胞を含む製剤
１つの例では、本開示は、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または本明細書に記載のＤＮＡコンストラクト、または本明細書に記載の発現ベクターを含むＴ細胞を提供する。この例によるＴ細胞は、機能性のＴＣＲを発現せず、すなわち、内在性ＴＣＲを発現しない。１つの例では、Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体の少なくとも２つの構成要素の細胞表面発現の減少を示す。１つの例では、Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体の少なくとも３つの構成要素の細胞表面発現の減少を示す。１つの例では、Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲコンストラクトを含み、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。したがって、Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞であり得る。
【０３５４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のもの）を発現し得る。１つの例では、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合ドメイン（例えば、本明細書の前述のもの）である。１つの例では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原（例えば、本明細書の前述のもの）に特異的に結合する。別の例では、抗原結合ドメインは、細胞の表面に発現するウイルス抗原（例えば、本明細書の前述のウイルス抗原）に特異的に結合する。
【０３５５】
１つの例では、Ｔ細胞は、例えばＨＬＡタイピング及び／免疫抑制剤に対する抵抗性に基づいて、特定の特性について選択されたＴ細胞の亜集団に存在し得る。
【０３５６】
本開示のＴ細胞は、養子Ｔ細胞療法において投与するために製剤化され得る。
【０３５７】
投与すべき組成物の製剤は、選択される投与経路及び製剤（例えば、溶液、乳濁液）に応じて異なることになる。投与すべき本開示の組成物を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容可能な担体において調製することができる。組成物の混合物を使用することもできる。溶液または乳濁液については、適切な担体には、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含めて、水性またはアルコール性／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、デキストロース含有リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれ得る。適切な水性担体は、さまざまなものが当業者に知られており、こうした水性担体には、水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液、及びグリシンが含まれる。静脈内媒体は、さまざまな添加剤、保存剤、もしくは液体、栄養素、または電解質補給剤を含み得る（一般的なものとして、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照のこと）。組成物は、生理学的な状態に近づける必要に応じて医薬的に許容可能な補助物質を任意選択で含み得、こうした補助物質は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤ならびに毒性調整剤（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウム）などである。
【０３５８】
選択される媒体における細胞集団の最適濃度は、当業者によく知られる手順に従って経験的に決定することができ、最終的な所望の医薬製剤に依存することになる。
【０３５９】
Ｔ細胞の生成方法
本開示は、本開示のＴ細胞の生成方法も提供する。
【０３６０】
１つの例では、機能性のＴＣＲを発現しないＴ細胞の生成方法が提供され、この方法は、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または当該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む発現ベクターもしくは組成物（本明細書に記載のもの）をＴ細胞に導入することを含む。
【０３６１】
別の例では、Ｔ細胞における２つ以上のＴＣＲ複合体サブユニットの発現の抑制方法が提供され、この方法は、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または当該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む発現ベクターもしくは組成物（本明細書に記載のもの）をＴ細胞に導入することを含む。
【０３６２】
別の例では、機能性のＴＣＲを発現せず、ＣＡＲを発現するＴ細胞の生成方法が提供され、この方法は、本開示のＤＮＡコンストラクト、または当該ＤＮＡコンストラクトを含む発現ベクターもしくは組成物（本明細書に記載のもの）をＴ細胞に導入することを含む。
【０３６３】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターは、当該技術分野に知られる任意の適切な方法を使用してＴ細胞に導入され得る。
【０３６４】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターは、感染性の組換えウイルス粒子（例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターなど）を使用してＴ細胞に導入される。
【０３６５】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター（ガンマ−レトロウイルスベクター（例えば、本明細書に記載のもの）など）を使用してＴ細胞に導入される。レンチウイルスによる形質導入方法は、当該技術分野において知られており、本明細書で企図される。方法の例は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１、Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０１：１６３７−１６４４、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５０６：９７−１１４、及びＣａｖａｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０２（２）：４９７−５０５に記載されている。
【０３６６】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターは、電気穿孔を介してＴ細胞に導入される｛例えば、Ｃｈｉｃａｙｂａｍ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（３）：ｅ６０２９８、及びＶａｎＴｅｄｅｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７（１６）：１４３１−１４３７を参照のこと）。他の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターは、転位を介してＴ細胞に導入される（例えば、Ｍａｎｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１（４）：４２７−４３７、Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  ２，ｅ７４、及びＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５０６：１１５−１２６を参照のこと）。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に遺伝物質を導入し、発現させる他の方法には、リン酸カルシウムを用いる遺伝子導入（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載のもの）、プロトプラスト融合、陽イオン性リポソーム介在性の遺伝子導入、タングステン粒子促進性の微粒子銃法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６−７７７（１９９０））、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿（Ｂｒａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：２０３１−２０３４（１９８７））が含まれる。
【０３６７】
いくつかの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターをＴ細胞に導入するに先立って、例えば対象または細胞バンクから、Ｔ細胞を得ることができる。多くの供給源からＴ細胞を得ることができ、こうした供給源には、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、ならびに腫瘍が含まれる。あるいは、Ｔ細胞株は、当該技術分野において市販されており、そうしたものが使用され得る。
【０３６８】
いくつかの例では、当業者に知られる任意の数の手法（Ｆｉｃｏｌｌ（商標）での分離など）を使用し、対象から収集された血液単位からＴ細胞を得ることができる。別の例では、個体の循環血液に由来する細胞がアフェレーシスによって得られる。アフェレーシスによって収集されるＴ細胞は、洗浄されることで血漿画分が除去され、任意選択で、次の処理段階のための適切な緩衝液または媒体に含められ得る。洗浄段階は、製造者の説明に従って半自動「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ５）を使用するなどして、当業者に知られる方法によって達成され得る。
【０３６９】
いくつかの例では、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントを介する遠心分離または対向流遠心溶出法によって、単球を枯渇させることによって末梢血リンパ球からＴ細胞が単離され得る。
【０３７０】
Ｔ細胞集団の例には、ナイーブＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、最終分化エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が含まれる。
【０３７１】
いくつかの例では、陽性選択手法または陰性選択手法によってＴ細胞の特定の亜集団（ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など）をさらに単離することができる。
【０３７２】
いくつかの例では、例えば本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ＣＡＲコンストラクト、ＤＮＡコンストラクト、及び／または発現ベクターの導入前または導入後に、陽性選択によってＴ細胞の亜集団が単離される。例えば、対象の血液から単離されたＴ細胞を、抗体結合に適した条件下で特定の細胞表面タンパク質を特異的に認識する抗体と共にインキュベートすることができる。いくつかの例では、蛍光分子（例えば、ＦＩＴＣ）に抗体が複合化され得、フローサイトメトリーを使用してＴ細胞が選別される。
【０３７３】
１つの例では、免疫抑制剤の存在下でＴ細胞を培養し、生存するＴ細胞を選択することによって、免疫抑制剤に抵抗性のＴ細胞の亜集団が単離され得る。
【０３７４】
本明細書に記載のＴ細胞の調製方法は、複数の選択段階を含み得る。例えば、上記の陽性選択に加えて、例えば陰性に選択される細胞（例えば、制御性Ｔ細胞または腫瘍細胞）に特有の表面マーカーに対する抗体を組み合わせて、陰性選択によってＴ細胞集団の追加濃縮を達成することができる。そのような方法の１つは、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の混合物を使用するフローサイトメトリーを介する細胞の選別及び／または選択である。そのような抗体には、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ２５抗体、または抗腫瘍抗原抗体が含まれる。
【０３７５】
いくつかの例では、対象に由来する血液試料またはアフェレーシス産物の収集物は、増殖した細胞が必要とされ得る時点より前の期間に調製される。したがって、増殖すべき細胞の源は、必要な任意の時点で収集され得、例えばＴ細胞療法から恩恵を得ると想定される任意の数の疾患または症状のためのそのようなＴ細胞療法において後に使用するために所望のＴ細胞が単離及び凍結され得る。
【０３７６】
本明細書に記載の方法に従って生成するＴ細胞は、同種のものであり得、例えば、機能性のＴＣＲを発現せず、及び／またはＣＡＲを発現する同種Ｔ細胞である。
【０３７７】
方法は、Ｔ細胞（複数可）（例えば、本明細書に記載のもの）のＨＬＡタイピングをさらに含み得る。
【０３７８】
例えば、方法は、エクスビボで実施される。
【０３７９】
いくつかの例では、方法は、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）（例えば、Ｔ細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ））、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、及び／または活性化が生じるように最初に刺激すること、次に、活性化した細胞の形質導入を行うこと、臨床用途に十分な数に培養で増やすこと、を含む。
【０３８０】
Ｔ細胞のバンク化
１つの例では、複数の本明細書に記載のＴ細胞または当該Ｔ細胞を含む組成物は、バンクに存在する。１つの例では、バンクに存在するＴ細胞は、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含み、非機能性のＴＣＲを有する。さらに、バンクに存在するＴ細胞は、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞であり得る。
【０３８１】
この例によれば、細胞バンク施設もしくは寄託施設もしくは保管施設、または細胞を安全に保管するために、例えば液体窒素中で、凍結保存状態を保つなどする任意の場所において、将来の使用に向けて本開示のＴ細胞が「バンク化」され得る。さらに、ドナー情報に関する記録を維持し、保管リポジトリからの細胞の迅速かつ効率的な検索を確保するために適切なデータ処理用コンピューターシステムを使用することができる。
【０３８２】
１つの例では、本開示に従ってバンクに保管する前に、ドナー、株、または細胞型と関連する特有の特性に基づく確実な同定情報を保管容器（例えば、バッグまたはチューブ）のそれぞれに付与することができる。例えば、マイクロチップ、磁気ストリップ、及び／またはバーコード標識を使用する許容可能な方法などの、安全性が保障された同定機構を用いてＤＮＡ遺伝子指紋及びＨＬＡタイピングが使用され得る。この同定段階は、バンク化処理に含められ得る。
【０３８３】
１つの例では、バンクに存在するそれぞれの組成物におけるＴ細胞のＨＬＡ対立遺伝子の少なくとも１つが同定されている。１つの例では、ＨＬＡは、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子である。
【０３８４】
使用時には、必要な保管単位のみが検索され、所望の投与量を満たす上で必要な単位数を選択することが可能である。ある特定の疾患では、一連の反復治療を含む細胞療法が必要であり得る。バンクから細胞集団が抽出され、細胞増殖によって増やされた後、医薬組成物が調製され、対象に投与され得る。
【０３８５】
本明細書に記載の非機能性のＴＣＲを有するＴ細胞、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞、及び当該細胞を含む組成物の調製における使用に適した細胞は、現存する細胞バンクから入手され得るか、または一個体もしくは複数個体のドナー対象から直接的に収集され、後にバンク化され得る。１つの例では、細胞は、健康な対象から収集される。例えば、対象にとって不可欠ではない組織に由来する細胞は、自己免疫疾患を誘導するリスクを低減するため、こうした細胞もまた適切であり得る。
【０３８６】
ドナーを選択するための基準は、収集に先立って行う下記の考慮事項のうちの１つまたは複数を含み得る。（ａ）特定の疾患を有さないこと、（ｂ）特定の疾患または全身の疾患、（ｃ）ある疾患に関するドナーのパラメーター（例えば、ある特定の疾患、ある前治療歴及び／または予防治療などに関する、ある年齢、ある健康状態、及び／または症状）、（ｄ）１つまたは複数の確立された統計学的及び／または人口統計学的なモデルまたはプロファイルにドナーが該当するかどうか（例えば、ある疾患に罹る可能性が統計学的に低い）、ならびに（ｅ）普及している医療行為などに基づいて認知される、ある許容可能な健康状態をドナーが有するかどうか、など。
【０３８７】
１つの例では、細胞は、ドナーの末梢血からアフェレーシスによって収集され、（収集細胞の量及び品質を最適化するために）処理され、任意選択で、適切な条件下で、極低温保存されるか、または培養して維持される。
【０３８８】
１つの例では、ドナーは、幹細胞ドナーである。例えば、細胞は、幹細胞供与の一環としてアフェレーシスによって収集される。１つの例では、単独でＧ−ＣＳＦがドナーに投与されるか、または化学療法もしくは幹細胞動員剤と組み合わせてＧ−ＣＳＦがドナーに投与された後に、細胞が収集される。１つの例では、細胞は、骨髄採取によって収集される。
【０３８９】
１つの例では、細胞は、ドナーの末梢血からアフェレーシスによって収集されるか、または骨髄採取によって骨髄から収集され、収集された細胞の数が幹細胞移植の目的に必要な数を上回るのであれば、組成物の調製に使用される。例えば、組成物を調製するために収集される細胞数は、幹細胞移植に必要な細胞数を上回る。
【０３９０】
収集された細胞は、定義された投与量画分へと一定分量として分けることができる。細胞は、培養または凍結保存状態などの、任意の適切な条件下で保存され得る。細胞の保管方法は、当業者には明らかであろう。例えば、細胞の凍結保存は、さまざまな凍結保護物質（ＤＭＳＯなど）を使用して達成することができる。
【０３９１】
本開示のＴ細胞は、養子Ｔ細胞移入のために凍結保存され得る。例えば、生理食塩水を４０％、Ａｌｂｕｍｅｘ２０を４０％、及びＤＭＳＯを２０％含む凍結用混合物が調製される。ＤＭＳＯに生理食塩水が添加され、冷却された後にＡｌｂｕｍｅｘ２０が添加される。凍結用混合物は、必要になるまで冷却状態で保たれる。
【０３９２】
凍結保存のための細胞は、再浮遊され、プールされ、完全に混合にされる。細胞の数は、血球計算盤を使用して数えられ、細胞濃度及び全細胞生存率が決定される。
【０３９３】
細胞は、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離され、無菌性及びマイコプラズマの試験を実施するために上清１０ｍｌが取り出される。残りの上清は廃棄される。
【０３９４】
Ａｌｂｕｍｅｘ２０が添加された最大２００ｍｌの０．９％生理食塩水で細胞が洗浄され、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離される。
【０３９５】
細胞は、２ｘ１０７個細胞／ｍｌの濃度で０．９％の生理食塩水に再浮遊される。
【０３９６】
Ｔ細胞の凍結保存については、バッグ当たりに添加すべき最大細胞体積は、下記の式を使用して計算されることになる：バッグ当たりの最大体積（ｍＬ）＝バッグ当たりに必要な最大細胞数／１ｘ１０７／ｍｌ。
【０３９７】
凍結保存すべきバッグ及び品質保証試料の数が決定される。等体積の凍結用混合物がＴリンパ球浮遊液に添加され、混合される。必要な体積の細胞が凍結保存バッグ及び／またはバイアルに移される。事前冷却された速度制御型フリーザーにバッグ及びバイアルが迅速に入れられることで凍結保存が開始される。
【０３９８】
治療及びバンク化において使用するための細胞の表現型の決定
１つの例では、本開示のＴ細胞は、ＨＬＡ−対立遺伝子の表現型が決定される。例えば、細胞は、ＨＬＡ−対立遺伝子の表現型が部分的に決定される。
【０３９９】
１つの例では、細胞は、メジャーなＨＬＡ（クラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩの任意のＨＬＡなど）、マイナーなＨＬＡ、及び非多型対立遺伝子（ＣＤ１ファミリーメンバーの任意のメンバーなど）から選択される対立遺伝子を有する。
【０４００】
メジャーなＨＬＡ対立遺伝子は、より具体的には、クラスＩの任意のＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３２、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｃの１群、ＨＬＡ−Ｃの２群など）、例えば、クラスＩＩの任意のもの（ＨＬＡ−ＤＰＢ９、ＨＬＡ−ＤＰＢ１１、ＨＬＡ−ＤＰＢ３５、ＨＬＡ−ＤＰＢ５５、ＨＬＡ−ＤＰＢ５６、ＨＬＡ−ＤＰＢ６９  ＨＬＡ−ＤＰＢ８４  ＨＬＡ−ＤＰＢ８７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１）、またはクラスＩＩＩの任意のＨＬＡから選択され得る。ＨＬＡ表現型の知見が得られると、本開示の組成物を調製するための細胞を次に選択することが容易になり得る。
【０４０１】
１つの例では、少なくとも１つのクラスＩＩ  ＨＬＡの表現型が決定される。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、またはＨＬＡ−ＤＱのうちの少なくとも１つの表現型が決定される。
【０４０２】
１つの例では、本開示の細胞の少なくとも１つのＨＬＡ−対立遺伝子は、組成物が投与される対象の少なくとも１つのＨＬＡ−対立遺伝子と一致する。例えば、少なくとも１つのクラスＩＩ  ＨＬＡが一致する。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、及びＨＬＡ−ＤＱのうちの少なくとも１つが一致する。
【０４０３】
１つの例では、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲである。例えば、本開示の細胞のＨＬＡ−ＤＲの表現型は、組成物が投与される対象のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子と一致する。１つの例では、対象の治療方法は、対象のＨＬＡ対立遺伝子の決定と、当該ＨＬＡ対立遺伝子とバンクに存在する組成物におけるＴ細胞のＨＬＡ対立遺伝子とのマッチングと、対象のものと同一のＨＬＡ対立遺伝子を有するＴ細胞を含む組成物の、対象への投与と、を含む。
【０４０４】
治療方法
本開示は、治療において本開示のＤＮＡコンストラクトを含むＴ細胞（すなわち、ＣＡＲ−Ｔ細胞）（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを発現する）を使用することも企図する。
【０４０５】
１つの例では、本開示は、それを必要とする個体におけるがん、移植片対宿主病、感染症、１つまたは複数の自己免疫障害、移植拒絶、及び放射線宿酔のから選択される疾患または症状の治療方法または予防方法を提供し、この方法は、本明細書に記載ＣＡＲ−Ｔ細胞または当該ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む製剤を個体に投与することを含む。
【０４０６】
１つの例では、本開示は、本明細書に記載のがん関連抗原（または腫瘍抗原）の発現と関連する疾患または症状の治療方法を提供する。１つの例では、治療対象の疾患は、がんである。例えば、方法は、がん関連抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するように操作されている本開示のＴ細胞を対象に投与することを含み得る。その表面に発現する少なくとも１つのがん関連抗原を有する腫瘍細胞と本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞が接触すると、腫瘍細胞がＣＡＲＴの標的となり、腫瘍の増殖が抑制される。
【０４０７】
１つの例では、本開示は、がんの増殖の抑制方法を提供し、この方法は、がん細胞と、本明細書に記載ＣＡＲ−Ｔ細胞と、の接触を含む。この例によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、がん細胞の表面に発現する抗原に反応して活性化し、がん細胞を標的としてその増殖を抑制する。
【０４０８】
本明細書で使用される「がん」という用語は、侵襲性の病理組織学的な型または段階とは無関係に、すべての型のがん性増殖もしくは発がんプロセス、転移組織、または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは臓器を含むことが意図される。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍、例えば、さまざまな臓器系の肉腫、腺癌、及び癌腫（肝臓、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、尿生殖路（例えば、腎細胞、尿路上皮細胞）、前立腺、及び咽頭に影響を与えるものなど）が含まれる。腺癌には、悪性腫瘍（ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、及び食道癌など）が含まれる。１つの例では、がんは、メラノーマ（例えば、ステージの進行したメラノーマ）である。前述のがんの転移性病変もまた、本開示の方法及び組成物を使用して治療または予防することができる。治療することができる他のがんの例には、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部癌または頸部癌、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、腟癌、外陰部癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性または急性の白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境的に誘導されるがん（アスベストによって誘導されるものを含む）、及びこうしたがんの組み合わせが含まれる。
【０４０９】
本開示の方法を使用して治療され得るがんの例には、免疫療法に典型的には応答性のがんが含まれる。治療対象のがんの例には、限定はされないが、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、乳癌、結腸癌、及び肺癌（例えば、非小細胞肺癌）が含まれる。
【０４１０】
本方法は、血液癌症状の治療に特に有用であり得る。血液癌症状は、血液、骨髄、及びリンパ系に影響を与える型のがん（白血病及び悪性のリンパ増殖性症状など）である。白血病は、急性白血病及び慢性白血病として分類することができる。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）としてさらに分類することができる。慢性白血病には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。他の関連症状には、骨髄血液細胞の産生不良（または異形成）及びＡＭＬへの形質転換リスクによってまとめられる血液学的症状の多様な一群である骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病」として知られていた）が含まれる。
【０４１１】
したがって、１つの例では、本明細書に記載のがんの治療方法は、限定はされないが、白血病またはリンパ腫である血液癌を含む、血液癌の治療方法である。１つの例では、がん及び悪性腫瘍（限定はされないが、例えば、急性白血病（限定はされないが、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含む）など）、１つまたは複数の慢性白血病（限定はされないが、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む）、追加の血液癌または血液学的症状（限定はされないが、例えば、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性症状、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ならびに骨髄血液細胞の産生不良（または異形成）によってまとめられる血液学的症状の多様な一群である「前白血病」を含む）、ならびに同様のものの治療に本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞が使用され得る。
【０４１２】
１つの例では、本開示は、本明細書に記載のがん関連抗原を発現するがん細胞集団を増殖抑制または低減するための方法を提供し、この方法は、がん関連抗原を発現する細胞と、本明細書に記載のがん関連抗原に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞と、の接触を含む。ある特定の例では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、対象における細胞及び／またはがん細胞の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、数、量（ａｍｏｕｎｔ）、または割合を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減する。１つの例では、対象は、ヒトである。
【０４１３】
さらに、不応性または再発性の悪性腫瘍は、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞及び当該ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む製剤を使用して治療することができる。本明細書で使用される「不応性」という用語は、治療に応答しない疾患（例えば、がん）を指す。いくつかの例では、不応性がんは、治療前または治療開始時点で治療に抵抗性であり得る。他の例では、不応性がんは、治療の間に抵抗性となり得る。１つの例では、こうした治療は、化学療法、造血幹細胞移植、または免疫除去である。例えば、対象は、化学療法及び／または造血幹細胞移植及び／または免疫除去療法を受けているところであるか、または開始間近であるか、または終了している。
【０４１４】
移植片対宿主病または移植拒絶の治療方法または予防方法が提供される例の１つによれば、治療すべき対象は、固形臓器の移植を受ける間近であるか、または受けたことがあり得、こうした固形臓器は、腎臓、肝臓、膵臓、膵島、心臓、肺、小腸、または他の固形臓器などである。
【０４１５】
別の例によれば、本開示の方法で治療すべき対象は、疾患のための免疫抑制剤治療または抗体治療または可溶性受容体治療または別の免疫調節治療を受けているところであるか、または受けたことがあり、こうした疾患は、限定はされないが、炎症性腸疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、肝炎、糸球体腎炎及び腎不全、がん、リンパ腫、白血病、骨髄異形成、骨髄腫などである。
【０４１６】
別の例によれば、本開示の方法で対象が治療すべきである場合、治療すべき対象は、免疫系の欠陥を生まれつき有するか、または免疫系の欠陥を伴って生まれており、こうした免疫系の欠陥は、限定はされないが、重症複合免疫不全症、分類不能型免疫不全症、無リンパ球症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、ディ・ジョージ症候群、白血球粘着不全、免疫グロブリン欠損症などである。
【０４１７】
別の例によれば、本開示の方法で対象が治療すべきである場合、対象は、ヒト免疫不全ウイルスまたは免疫系の機能不全につながっている別の病原生物による感染を介して後天性免疫不全症を有している。
【０４１８】
１つの例では、本開示は、本明細書に記載のウイルス抗原の発現と関連する疾患または症状の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞または当該ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む製剤を個体に投与することを含む。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現する。１つの例では、対象にＴ細胞を投与することによって、ウイルスに対する治療免疫応答が得られる。１つの例では、対象にＴ細胞を投与することによって、ウイルスに対する防御免疫応答が得られる。例えば、ウイルス抗原またはウイルス誘導性抗原は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザ及びＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガム（ＪＣ）ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ菌、ライノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１、ＨＳＶ  ＩＩ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）６、ＨＨＶ８、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス  エボラウイルス、ジカウイルス、ハンタウイルス、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からなる群から選択されるウイルスに由来するものであり得る。
【０４１９】
本開示の方法は、特定のＣＡＲを発現するように遺伝的に改変されている本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を、治療すべき個体に注入することを含み得る。注入された細胞は、レシピエントにおいて異常細胞（例えば、がん細胞またはウイルス感染細胞）を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲで改変されたＴ細胞は、インビボで増殖することができ、その結果、治療（例えば、腫瘍制御）の維持に繋がり得る長期の持続性が得られる。さまざまな態様において、患者に投与されるＴ細胞またはその子孫は、患者へのＴ細胞の投与から、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１３ヶ月間、少なくとも１４ヶ月間、少なくとも１５ヶ月間、少なくとも１６ヶ月間、少なくとも１７ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも１９ヶ月間、少なくとも２０ヶ月間、少なくとも２１ヶ月間、少なくとも２２ヶ月間、少なくとも２３ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、患者において存続する。
【０４２０】
本開示は、本明細書に記載の非機能性のＴＣＲを有するＴ細胞が、例えば本開示のＣＡＲコンストラクトに由来するＲＮＡがインビトロで転写されることによって、ＣＡＲを一過性に発現するようにさらに改変され、その後、ＣＡＲ−Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入されるという型の細胞療法も企図する。注入された細胞は、レシピエントにおいて異常細胞（例えば、がん細胞）を死滅させることができる。しかしながら、本開示のＣＡＲコンストラクトでＴ細胞が安定的に遺伝子導入または形質導入されている例とは対照的に、この例による患者に投与されるＴ細胞の存在期間は、Ｔ細胞が患者に投与されてから１ヶ月未満であり、例えば、Ｔ細胞が患者に投与されてから３週間、２週間、１週間である。
【０４２１】
１つの治療方法によれば、Ｔ細胞は、哺乳類（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト及びＣＡＲコンストラクトを発現するベクター（例えば、本開示のＤＮＡコンストラクトを含むベクター）で遺伝的に改変される（すなわち、インビトロで形質導入または遺伝子導入される）。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、哺乳類レシピエントに投与することで治療効果を得ることができる。哺乳類レシピエントは、ヒトであり得、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、レシピエントに対して自家であり得る。
【０４２２】
あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種または同系であり得る。この例によれば、Ｔ細胞は、レシピエントとの適合性を決定するためにＨＬＡの型が決定済であり得る。
【０４２３】
一般に、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞は、免疫が損なわれた状態の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。具体的には、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載のがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、及び症状の治療において使用される。ある特定の例では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載のがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、及び症状の発症リスクを有する患者の治療において使用される。したがって、本開示は、本明細書に記載のがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、及び症状の治療方法または予防方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞または当該ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む製剤を治療的に有効な量で投与することを含む。
【０４２４】
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、単独で投与されるか、あるいは希釈剤及び／または他の成分（ＩＬ−２もしくは他のサイトカインまたは細胞集団など）と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。
【０４２５】
併用療法
本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞及び当該ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む製剤は、特定の疾患または症状を治療するための他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるは、障害で生じる対象の苦痛の経過中に、２つ（またはそれを超える数）の異なる治療が対象に送達されることを意味し、例えば、対象が障害を有すると診断された後、及び障害が治癒もしくは消滅するか、または他の理由で治療が中止される前に、２つ以上の治療が送達されることを意味する。１つの例では、第２のものの送達開始時に１つの治療の送達が依然として行われており、その結果、治療実施の上で重複が存在する。このことは、「同時」または「同時送達」と本明細書で称されることがある。他の例では、１つの治療の送達は、他の治療の送達開始時より前に終了する。いずれかの場合のいくつかの例では、治療は、組み合わせて実施されるため、より効果的である。例えば、第２の治療は、より効果的であり、例えば、第２の治療が少なくても同等の作用が見られるか、または第１の治療を実施せずに第２の治療を実施したとすると見られるであろうものと比較して第２の治療によって症状が大幅に低減するか、または同様の状況が第１の治療で見られる。いくつかの例では、送達は、症状の減少または他の障害関連パラメーターの減少が、もう一方を送達せずに一方の治療を送達すると観測されるであろうものと比較して大きくなるものである。２つの治療の作用は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加を超えるものであり得る。送達は、送達される第１の治療の作用が、第２のものの送達時に依然として検出可能なものであり得る。
【０４２６】
１つの例では、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞または当該ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む製剤と、少なくとも１つの追加の治療薬剤とを、同一もしくは別々の組成物において同時に投与するか、または連続的に投与することができる。連続投与については、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞と追加の薬剤とは、いずれの順序で投与することもできる。
【０４２７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法及び／または他の治療薬剤、手順、もしくは様式は、障害が活性である期間、または寛解期間もしくは疾患活性が低い期間に実施することができる。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、別の治療の前、治療と同時、治療後、または障害の寛解中に実施することができる。
【０４２８】
組み合わせて投与されるとき、例えば単独療法として個別に使用されるそれぞれの薬剤の量または投与量と比較して多い、少ない、または同一の量または用量で、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法及び追加の薬剤（例えば、第２の薬剤もしくは第３の薬剤）、またはすべてを投与することができる。ある特定の例では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、追加の薬剤（例えば、第２の薬剤もしくは第３の薬剤）、またはすべての投与される量または投与量は、例えば単独療法として個別に使用されるそれぞれの薬剤の量または投与量と比較して（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）少ない。他の例では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、追加の薬剤（例えば、第２の薬剤もしくは第３の薬剤）、またはすべてが所望の作用（例えば、がんの治療）をもたらす量または投与量は、同一の治療作用の達成に必要な、例えば単独療法として個別に使用されるそれぞれの薬剤の量または投与量と比較して少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少ない）。
【０４２９】
治療すべき疾患または症状ががんである例によれば、追加の治療薬剤または治療レジメンには、限定はされないが、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、抗体、免疫除去剤、ステロイド、及び照射が含まれ得る。
【０４３０】
投与量及び投与
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞製剤の投与の投与量範囲は、所望の作用を得る上で十分な多さのものである。例えば、製剤は、対象に治療免疫応答または防御免疫応答を付与する上で十分なＣＡＲ−Ｔ細胞量を含むべきである。
【０４３１】
投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くあるべきではなく、こうした副作用は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、及び同様のものなどである。一般に、投与量は、対象の年齢、症状、性別、及び疾患の程度に応じて異なることになり、当業者によって決定され得る。投与量は、任意の合併症が生じた際には個々の医師によって調節され得る。投与量は、約１ｘ１０３個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０１０個細胞／ｋｇの間で変動し得る。例えば、約１ｘ１０３個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０４個細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０４個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０５個細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０５個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０６個細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０６個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０７個細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０７個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０８個細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０８個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０９個細胞／ｋｇ、または約１ｘ１０９個細胞／ｋｇ〜約１ｘ１０１０個細胞／ｋｇ。投与量は、約１ｘ１０５個細胞／ｍ２〜約１ｘ１０１０個細胞／ｍ２の間で変動し得る。例えば、約１ｘ１０５個細胞／ｍ２〜約１ｘ１０６個細胞／ｍ２、または約１ｘ１０６個細胞／ｍ２〜約１ｘ１０７個細胞／ｍ２、または約１ｘ１０７個細胞／ｍ２〜約１ｘ１０８個細胞／ｍ２、または約１ｘ１０８個細胞／ｍ２〜約１ｘ１０９個細胞／ｍ２、または約１ｘ１０９個細胞／ｍ２〜約１ｘ１０１０個細胞／ｍ２。例えば、約１ｘ１０７個細胞／ｍ２、または約２ｘ１０７個細胞／ｍ２、または約３ｘ１０７個細胞／ｍ２、または約４ｘ１０７個細胞／ｍ２、または約５ｘ１０７個細胞／ｍ２。１つの例では、投与量は、１つまたは複数の用量の投与で投与され得る。１つの例では、投与量は、少なくとも１回反復投与され得る。例えば、投与量の反復投与間隔は、対象の免疫状態及び前回の注入に対する応答に依存する。この点に関して、反復投与量（複数可）は、前回の投与量（複数可）と同一である必要はなく、例えば、増減される可能性がある。
【０４３２】
１つの例では、製剤は、静脈内に投与される。
【０４３３】
治療に適切に応答しない対象の場合、複数の用量が投与され得る。あるいは、またはさらに、用量を増やして投与され得る。
【実施例】
【０４３４】
実施例１−ＴＣＲサブユニットを標的とするｓｈＲＮＡ及びｓｈｍｉＲの設計及びスクリーニング
ＴＣＲ構成要素の発現をサイレンシングする能力を有するコンストラクトを定義するために、ＴＣＲ−α、ＴＣＲ−β、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−δ、及びＣＤ３−γのｍＲＮＡの領域を標的とするようにｓｈＲＮＡを設計した。標的領域は、ヒト、マウス、及びマカクのｍＲＮＡ配列の間で配列が絶対的に保存されている領域から選択した。この理由は、保存された配列を使用することで、コンストラクトの安全性及び有効性の前臨床試験が潜在的に単純化するためである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットのｍＲＮＡ配列：ＴＣＲ−α（配列番号１８０〜１８２）、ＴＣＲ−β（配列番号１８３〜１８５）、ＣＤ３−δ（配列番号１８６〜１８８）、ＣＤ３−γ（配列番号１８９〜１９１）、及びＣＤ３−ε（配列番号１９２〜１９４）から、ｓｈＲＮＡコンストラクト及びｓｈｍｉＲコンストラクトを設計する上で有望な標的となる配列を同定した。公的に利用可能なアルゴリズム（Ａｍｂｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｏｒｉｇｅｎｅ、及びＭＷＧを含む）を使用して配列を選択した。ＴＣＲ−αサブユニット及びＴＣＲ−βサブユニットを標的とする配列は、そうしたサブユニットの定常領域を対象とするもののみを設計した。
【０４３５】
ＴＣＲ−αを標的とする６つのｓｈＲＮＡ、ＴＣＲ−βを標的とする９つのｓｈＲＮＡ、ＣＤ３−εを標的とする１３のｓｈＲＮＡ、ＣＤ３−δを標的とする１３のｓｈＲＮＡ、ＣＤ３−γを標的とする７つのｓｈＲＮＡの活性をスクリーニングした。これらのｓｈＲＮＡのエフェクター配列及びエフェクター相補配列は、表１に記載されている。これらのコンストラクトのサイレンシング活性は、ｓｈＲＮＡの標的部位がルシフェラーゼレポーターコンストラクトの３’ＵＴＲにクローニングされたセンサーコンストラクトを使用するデュアルルシフェラーゼアッセイを用いてアッセイした。センス配向またはアンチセンス配向のいずれかで標的部位がそれぞれクローニングされた個別のセンサーコンストラクトを使用し、エフェクター配列とエフェクター相補配列との両方の活性を決定した。コンストラクトの活性及び鎖特異性は、かなり異なるものであった。さらなる特徴付けには、ＴＣＲ−αについては３つのエフェクター配列、ＴＣＲ−βについては３つ、ＣＤ３−εについては３つ、ＣＤ３−δについては４つ、及びＣＤ３−γについては２つを選択した。
【０４３６】
次に、選択したエフェクター配列／エフェクター相補配列を使用してｓｈｍｉＲ発現コンストラクトを構築した。場合によっては、個別のｓｈｍｉＲコンストラクトの変異体を設計し、試験した。こうした変異体については、活性及び／または鎖特異性が増進したコンストラクトが得られるように、元のｓｈＲＮＡ標的指向性部位の上流または下流へとエフェクター配列及びエフェクター相補配列を数塩基対分移動させた。こうしたｓｈｍｉＲコンストラクトの活性及び鎖特異性は、下記のようにデュアルルシフェラーゼアッセイ及び鎖特異的センサーコンストラクトを使用して決定した。次に、こうしたコンストラクトの相対活性を、「高機能性アッセイ（ｈｙｐｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ）」を使用して決定した。そのような実験では、一定量のセンサーコンストラクトに対して、異なる量のｓｈｍｉＲコンストラクトを滴定し、ルシフェラーゼのノックダウンを定量化した。最低量のＤＮＡで強力なノックダウンを生じさせたコンストラクトが最も活性を有すると見なした。こうしたコンストラクトの活性は、ｑＲＴ  ＰＣＲアッセイを使用し、遺伝子導入ジャーカット細胞における個々の標的遺伝子についてｍＲＮＡのノックダウンをアッセイすることによって、内在性遺伝子標的に対しても決定した。さらに、遺伝子導入ジャーカット細胞おける標的タンパク質のノックダウンを、ウエスタンブロットを使用してアッセイした。
【０４３７】
次に、こうしたデータを、次の解析に向けて個別のｓｈｍｉＲ（表２及び表３に記載のもの）の選択に使用した。
【０４３８】
実施例２−内在性のＴ細胞受容体を標的とするｓｈｍｉＲの設計
５’隣接領域（配列番号９８）、センス鎖、ステム／ループ配列（配列番号９７）、アンチセンス鎖、及び３’隣接領域（配列番号９９）を含む低分子ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）を創出するために、実施例１において選択したｓｈＲＮＡをコードする配列をｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ骨格に組み込んだ。代表的なｓｈｍｉＲの予測二次構造は、図１に示される。候補ｓｈｍｉＲのそれぞれのエフェクター配列（アンチセンス鎖）及び相補配列（センス鎖）は、表２に示されており、完全なｓｈｍｉＲ配列は、表３に示される。
【表１】
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2019531718.tif 000005
【表２】
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【表３】
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【０４３９】
実施例３−個別のｓｈｍｉＲによるＴＣＲサブユニット発現の下方制御
この実施例は、ｓｈｍｉＲが、その標的ＴＣＲサブユニットの内在性の発現をインビトロでノックダウンする能力を示す。
【０４４０】
細胞
３７Ｃ、５％のＣＯ２雰囲気下でＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）においてジャーカットＴ細胞を増殖させた。
【０４４１】
処理
Ｎｅｏｎ電気穿孔システム（電圧＝１３５０Ｖ、パルス長＝１０、パルス番号＝３）を使用して細胞の電気穿孔を実施し、ＴＣＲのサブユニットを標的とする個別のｓｈｍｉＲで細胞の形質導入を実施した。対照として、非標的指向性ｓｉＲＮＡ配列を発現するｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミドでジャーカットＴ細胞の遺伝子導入を実施した。
【０４４２】
次に、形質導入細胞を抗ＣＤ３（抗ＣＤ３ｅ（ＯＫＴ３）の５ｕｇ／ｍＬの溶液）及び抗ＣＤ２８抗体（可溶性抗ＣＤ２８を２ｕｇ／ｍＬで細胞に添加）で４８時間処理することで、当該Ｔ細胞を活性化した。活性化後、ＲＮＡを収集し、ｑＰＣＲによって分析することで、標的ＴＣＲサブユニットの発現を測定し、ノックダウンを決定した。
【０４４３】
ｑＰＣＲ分析
４８時間後にＱｉａｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡを収集し、ＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡ試料を定量化した。ＡＢＩの「高用量ｃＤＮＡ逆転写キット」（製品番号４３６８８１３）及びＡｍｂｉｏｎの「Ｓｕｐｅｒａｓｅ阻害剤」を使用し、逆転写によってｃＤＮＡを生成した。総反応体積が１０ｕｌのＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲマスター混合液を使用する定量的ＰＣＲ反応にｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は、下記のように実施した：５０℃で２分、９５℃で１０分、次に、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル。プライマーは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＴａｑＭａｎプライマー設計ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ−ｂｉｎ／ａｐｐ／ｐｒｉｍｅｒ）を使用して設計した。
【０４４４】
それぞれのｍＲＮＡの発現レベルは、ＧＡＰＤＨに正規化した。発現レベルは、標準曲線によって決定した総コピー数に従って計算し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照に対する抑制率に変換した。
【０４４５】
ジャーカットＴ細胞におけるＴＣＲサブユニットの内在性の発現の、ｓｈｍｉＲによる抑制率の結果は、図２に示される。図２に示されるように、ＴＣＲサブユニットの発現は、ｓｈｍｉＲによって下方制御され、抑制率の範囲は、５０％〜８８％であった。
【０４４６】
実施例４−ＴＣＲサブユニットを標的とする３つのｓｈｍｉＲを同時発現する三重ｓｈｍｉＲコンストラクトの調製
リード候補ｓｈｍｉＲを、そのＴＣＲサブユニット発現抑制に基づき、３つのｓｈｍｉＲを同時発現するレンチウイルスコンストラクトに組み込んだ。それぞれのコンストラクトは、５’レンチウイルス末端反復（ＬＴＲ）配列と、第１の候補ｓｈｍｉＲのコード配列の上流に位置するポリメラーゼ−ＩＩＩプロモーターＵ６−９と、第２のｓｈｍｉＲのコード配列の上流に位置するＵ６−１プロモーターと、第３のｓｈｍｉＲの上流に位置するＵ６−８プロモーターと、これに続く３’ＬＴＲ配列と、から構成されるものを用いた。それぞれのコンストラクトに組み込んだｓｈｍｉＲは、表４に示されており、図３には、そのようなコンストラクトの１つの例が示される。
【表４】
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【０４４７】
実施例５−ＴＣＲの表面発現の下方制御
この実施例は、異なるＴＣＲサブユニットを同時に標的とすることで細胞表面でのＴＣＲの発現及び構築を三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが阻止する能力を示す。
【０４４８】
実施例３に上記のようにジャーカットＴ細胞を培養した。Ｎｅｏｎ電気穿孔システム（電圧＝１３５０Ｖ、パルス長＝１０、パルス番号＝３）を使用して細胞の電気穿孔を実施し、異なるＴＣＲサブユニットに対する複数のｓｈｍｉＲを発現する表４に示される三重ｓｈｍｉＲベクターのうちの１つで細胞の形質導入を実施した。ＭＨＣクラスＩ分子であるＨ−２Ｋｋの切断型を表面マーカーとして発現するＫｋＤＮＡコンストラクトで細胞の同時形質導入を実施することで、遺伝子導入細胞を選択した。Ｃ型肝炎を標的とする無関係の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトを形質導入した野生型ジャーカットＴ細胞に加えて、非処理の野生型ジャーカットＴ細胞及び変異（ＴＣＲ複合体を欠く）ジャーカットＴ細胞も対照として使用した。
【０４４９】
２０時間後、陽性に形質導入された細胞を選択するために、Ｋｋに対するＭＡＣＳｅｌｅｃｔビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で細胞を選別した後、選択した細胞を４８時間培養して回復させた。
【０４５０】
ＴＣＲ−α／βに対する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、抗ヒトアルファベータＴＣＲ  ＦＩＴＣ；カタログ番号１１−９９８６）または対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マウスＩｇＧ１  Ｋアイソタイプ対照ＦＩＴＣ；カタログ番号１１−４７１４）を含むＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＣＳ、１Ｘ  ＰＢＳ）を使用し、フローサイトメトリー用に細胞を染色した。細胞は、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）で分析した。
【０４５１】
得られたＦＡＣＳプロットは、図４に示される。三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが、ＴＣＲ複合体の構築をほぼ完全に消失させ、ＴＣＲ複合体が細胞表面にディスプレイされることを阻止でき、消失率は、９５％を超えたことが分析によって示された。
【０４５２】
実施例６−抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で活性化したＴ細胞におけるＴＣＲ介在性のシグナル伝達の抑制
この実施例は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって活性化したジャーカットＴ細胞においてＴＣＲシグナル伝達が媒介するＴ細胞の活性化を三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが阻止する能力を示す。
【０４５３】
実施例３に上記のようにジャーカットＴ細胞を培養し、実施例５に記載の方法を使用して実施例４に記載の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトでジャーカットＴ細胞の電気穿孔を実施した。次に、２０時間後、陽性に形質導入された細胞を得るために、Ｋｋに対するＭＡＣＳｅｌｅｃｔビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で細胞を選別した。選択した細胞は、４８時間培養して回復させた。
【０４５４】
次に、Ｔ細胞に活性化刺激を与えるために、抗ＣＤ３（抗ＣＤ３ε（ＯＫＴ３）の５ｕｇ／ｍＬの溶液）及び抗ＣＤ２８抗体（可溶性抗ＣＤ２８を２ｕｇ／ｍＬで細胞に添加）で形質導入細胞を４８時間処理した。
【０４５５】
ＥＬＩＳＡ
ＴＣＲ介在性のシグナル伝達を測定するために、活性化Ｔ細胞によって分泌されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）の濃度を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。上記の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による活性化の後、細胞を４８時間インキュベートしてから上清を回収した。次に、活性化細胞の培養上清におけるＩＬ−２を対象とするＥＬＩＳＡによってＴＣＲ介在性のＴ細胞活性化を測定した。非処理の野生型ジャーカットＴ細胞及び変異（ＴＣＲを欠く）ジャーカットＴ細胞を対照として使用した。
【０４５６】
結果は、図５に示される。ＩＬ−２分泌によって測定すると、試験した三重ｓｈｍｉＲコンストラクトはすべて、ＴＣＲ介在性のシグナル伝達を抑制した。抑制率の範囲は、７９％（ｐＢＬ５１４）〜１００％（ＩＬ−２検出不可能）（ｐＢＬ５１６）であった。
【０４５７】
ｑＰＣＲ分析
ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルを測定するために、４８時間後にＱｉａｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡを収集し、ＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡ試料を定量化した。ＡＢＩの「高用量ｃＤＮＡ逆転写キット」（製品番号４３６８８１３）及びＡｍｂｉｏｎの「Ｓｕｐｅｒａｓｅ阻害剤」を使用し、逆転写によってｃＤＮＡを生成した。総反応体積が１０ｕｌのＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲマスター混合液を使用する定量的ＰＣＲ反応にｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は、下記のように実施した：５０℃で２分、９５℃で１０分、次に、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル。プライマーは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＴａｑＭａｎプライマー設計ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ−ｂｉｎ／ａｐｐ／ｐｒｉｍｅｒ）を使用して設計した。
【０４５８】
ＩＬ−２のｍＲＮＡの発現レベルは、ＧＡＰＤＨに正規化した。発現レベルは、標準曲線によって決定した総コピー数に従って計算し、非処理の野生型ジャーカットＴ細胞対照に対する抑制率に変換した。
【０４５９】
ジャーカットＴ細胞におけるＩＬ−２の内在性の発現の、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトによる抑制率の結果は、図６に示される。ＩＬ−２の発現は、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトによってノックダウンされ、抑制率の範囲は、７８％〜９７％であった。
【０４６０】
実施例７−抗原提示細胞との共培養を介して活性化したＴ細胞におけるＴＣＲ介在性のシグナル伝達の抑制
この実施例は、抗原提示細胞によって活性化したジャーカットＴ細胞においてＴＣＲシグナル伝達が媒介するＴ細胞の活性化を三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが阻止する能力を示す。
【０４６１】
実施例３に上記のようにジャーカットＴ細胞を培養し、実施例５に記載の方法を使用して実施例４に記載の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトでジャーカットＴ細胞の電気穿孔を実施した。次に、２０時間後、陽性に形質導入された細胞を得るために、Ｋｋに対するＭＡＣＳｅｌｅｃｔビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で細胞を選別した。選択した細胞は、４８時間培養して回復させた。
【０４６２】
次に、ＴＣＲ介在性のシグナル伝達を介してＴ細胞を活性化するために、ブドウ球菌エンテロトキシンが負荷されたラージＢ細胞（抗原提示細胞）と共に形質導入細胞を５時間共培養した。ブドウ球菌エンテロトキシンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによって産生される外毒素であり、この外毒素は、催吐特性を有すると共に、多種多様なＴ細胞を刺激するというその特有の能力によって定義されるスーパー抗原特性を有する。そのようなスーパー抗原は、ＴＣＲシグナル伝達を介するサイトカイン（ＩＬ−２など）の産生を刺激する。
【０４６３】
したがって、実施例６において観測された結果を確認すると共に、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトによってＴＣＲがノックダウンされたときのＴ細胞の機能性を測定するために、ジャーカットＴ細胞によって分泌されるＩＬ−２の濃度を測定した。ラージＢ細胞と共に共培養しない非処理の野生型ジャーカットＴ細胞に加えて、非処理の野生型ジャーカットＴ細胞及び変異（ＴＣＲを欠く）ジャーカットＴ細胞も対照として使用した。
【０４６４】
ジャーカットＴ細胞とラージＢ細胞との共培養を５時間実施した後、上清を回収し、ＩＬ−２を対象とするＥＬＩＳＡによってＴ細胞の活性化を測定した。図７は、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトを形質導入したジャーカットＴ細胞によるＩＬ−２分泌の抑制率を示す。ＩＬ−２分泌によって測定すると、試験した三重ｓｈｍｉＲコンストラクトはすべて、Ｔ細胞の活性化を最大で９２％抑制した。実施例６と併せると、こうした結果によって、表４に示される三重ｓｈｍｉＲコンストラクトがＴＣＲ介在性のシグナル伝達を抑制できることが確認された。
【０４６５】
実施例８−三重ｓｈｍｉＲコンストラクトは、ＴＣＲ非依存性の活性化を阻止しない
実施例６及び実施例７に記載の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトによって、ＴＣＲ介在性の活性化が強力に抑制されたことを考慮し、形質導入Ｔ細胞がＴＣＲ非依存性経路を介して依然として活性化できるかどうかを評価した。
【０４６６】
実施例３に上記のようにジャーカットＴ細胞を培養し、実施例５に記載の方法を使用して実施例４に記載の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトでジャーカットＴ細胞の電気穿孔を実施した。次に、２０時間後、陽性に形質導入されたものを得るために、Ｋｋに対するＭＡＣＳｅｌｅｃｔビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で細胞を選別した。選択した細胞は、４８時間培養して回復させた。
【０４６７】
活性化刺激を与えるために、培養液においてホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ  番号Ｐ８１３９、１０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ  番号Ｉ０６３４、１ｕｇ／ｍＬ）で細胞を４時間処理した。活性化後、上清を回収し、次に、ＩＬ−２を対象とするＥＬＩＳＡによってＴ細胞の活性化を測定した。Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質を標的とする無関係のｓｈＲＮＡを形質導入した野生型ジャーカットＴ細胞に加えて、非処理の野生型ジャーカットＴ細胞及び変異（ＴＣＲを欠く）ジャーカットＴ細胞を対照として使用した。
【０４６８】
図８には、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトを形質導入した細胞によって分泌されたＩＬ２の濃度（非処理細胞との対比）が示される。こうしたデータは、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトがＴＣＲ非依存性のＴ細胞活性化経路に顕著に影響を与えなかったことを示す。ｐＢＬ５１３コンストラクトを形質導入した細胞では、非処理細胞と比較してＩＬ−２の分泌が２５％増加した。一方で、ｐＢＬ５１４で処理した細胞及びｐＢＬ５１６で処理した細胞では、非処理細胞によって分泌されたＩＬ−２のレベルの約８０％が維持された。
【０４６９】
実施例９−三重ｓｈｍｉＲコンストラクトは、細胞周期の分布をかく乱しない
この実施例は、ＦＡＣＳ分析によって測定すると、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトが形質導入細胞の周期に有害作用を与えないことを示す。
【０４７０】
実施例３に上記のようにジャーカットＴ細胞を培養し、実施例５に記載の方法を使用して実施例４に記載の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトでジャーカットＴ細胞の電気穿孔を実施した。次に、２０時間後、陽性に形質導入されたものを得るために、Ｋｋに対するＭＡＣＳｅｌｅｃｔビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で細胞を選別した。選択した細胞は、４８時間培養して回復させた。
【０４７１】
次に、チミジン類似体であるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（新たに合成されるＤＮＡに取り込まれる）を細胞にパルスした。細胞を１時間インキュベートした後、フローサイトメトリー向けに７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）（全ＤＮＡに結合する）で染色した。ＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＣＳ、１Ｘ  ＰＢＳ）において抗ＴＣＲ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＣＲ−ＰＥ；カタログ番号１２−９９８６−４２）と共に、ＢｒｄＵに対する蛍光抗体及び７ＡＡＤに対する蛍光抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で細胞を標識した。ＴＣＲ陰性集団で細胞をゲートした後、ＢｒｄＵ  ＦＩＴＣアッセイに従って細胞周期集団を分析した。分析は、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ  ＦＡＣＳ装置で実施した。
【０４７２】
図９の棒グラフは、細胞周期の各段階（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）にあるＴＣＲ非存在細胞の割合を上記アッセイによって決定したもの示す。非処理細胞と比較して、三重ｓｈｍｉＲコンストラクトによるノックダウンに起因してＴＣＲ複合体を欠くＴ細胞の細胞周期の分布に顕著な変化は存在しなかった。
【０４７３】
実施例１０−ＴＣＲのノックダウンとキメラ抗原受容体での置換とを同時に行うための臨床コンストラクトの調製
内在性ＴＣＲの遺伝子サイレンシングとキメラ抗原受容体での置換とを同時に誘導するために、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて選択ｓｈｍｉＲの３つを発現するレンチウイルスベクターを創出した。ＣＡＲは、操作された受容体であり、この受容体によって、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）に任意の特異性を移植することが本質的に可能となる。ＣＤ１９は、Ｂ細胞に特異的な抗原であり、Ｂ細胞性悪性腫瘍を治療するためのＣＡＲの標的である。
【０４７４】
上記のコンストラクトの例は、図１０に示される。コンストラクトは、ＣＡＲをコードする配列の上流または下流のいずれかに位置するように実施例４の三重ｓｈｍｉＲコンストラクトの配列をレンチウイルスベクターにサブクローニングすることによって生成した。図１０に示されるコンストラクト例は、５’ＬＴＲ、これに続くＥＦ１プロモーター、ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ；可変重（ＶＨ）、リンカー、可変軽（ＶＬ））、スペーサードメイン、シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４１ＢＢ、及びＣＤ３ζを含む）、ならびに転写終結配列、これらに続くＵ６−９プロモーター、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿２（配列番号１５９）をコードする配列、Ｕ６−１プロモーター、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−γ＿２（配列番号１６４）をコードする配列、Ｕ６−８プロモーター、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３ｓｈｍｉＲ（配列番号１７１）をコードする配列、転写終結配列、及び３’ＬＴＲから構成される。
【０４７５】
実施例１１−三重ヘアピンコンストラクトに由来するｓｈｍｉＲの発現レベル
この実施例は、ジャーカットＴ細胞において三重ヘアピンコンストラクトによって発現するときの、それぞれの個別のｓｈｍｉＲのヘアピンの発現レベルを示すと共に、ＣＤ３−ε−１ｓｈｍｉＲの発現レベルが予想外に低かったことを示す。
【０４７６】
実施例３に記載のようにジャーカットＴ細胞を培養し、ｐＢＬ５１３、ｐＢＬ５１４、またはｐＢＬ５１６（実施例４及び表４の記載のもの）と命名した三重ｓｈｍｉＲコンストラクトでジャーカットＴ細胞の電気穿孔を実施した。選択した細胞を４８時間培養して回復させた。
【０４７７】
次に、形質導入細胞を収集し、Ｑｉａｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡを収集し、精製したＲＮＡ試料をヌクレアーゼ非含有水に再懸濁した。ＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡ試料を定量化した。
【０４７８】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）
ＤＮａｓｅ処理した全ＲＮＡ１００ｎｇ（濃度５ｎｇ／ｕｌ）を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を行うために、ＳｅｑＭａｔｉｃ（４４８４６  Ｏｓｇｏｏｄ  Ｒｄ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ９４５３９）に送った。
【０４７９】
Ｑｕａｎｔｉｍｉｒ  ＲＴアッセイ
Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）の「ＱｕａｎｔｉＭｉｒ  ＲＴキット」（カタログ番号ＲＡ４２０Ａ−１）を使用し、逆転写によってｃＤＮＡを生成した。１０ｕＭのユニバーサルリバースプライマー及び１０ｕＭのヘアピン特異的プライマーを含む総反応体積が１０ｕｌの２ｘＳＹＢＲ  ＰＣＲマスター混合液を使用する定量的ＰＣＲ反応にｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は、下記のように実施した：５０Ｃで２分、９５Ｃで１０分、次に、９５Ｃで１５秒及び６０Ｃで１分を４０サイクル。プライマーは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＴａｑＭａｎプライマー設計ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ−ｂｉｎ／ａｐｐ／ｐｒｉｍｅｒ）を使用して設計した。それぞれのヘアピンの発現レベルは、総細胞数に正規化した。発現レベルは、標準曲線によって決定した総コピー数に従って計算した。
【０４８０】
ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３の発現レベルは、ＱｕａｎｔｉｍｉｒアッセイとＮＧＳとの両方によって決定すると、その他の２つのヘアピンと比較して顕著に低かった。図１１及び図１２に示されるように、コンストラクトの他の位置にどのｓｈｍｉＲが存在したかとは無関係に、ヘアピンの発現レベルは低く観測された。
【０４８１】
実施例１２−ＴＣＲサブユニットを標的とする３つのｓｈｍｉＲを同時発現する三重ｓｈｍｉＲコンストラクトにおける第３のプロモーターの置換
ｐＢＬ５１３、ｐＢＬ５１４、及びｐＢＬ５１６において観測された低レベルのｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε−３発現を克服するために、これらのコンストラクトの最後の位置でｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３の発現を誘導していたＵ６−８プロモーターをＨ１プロモーターで置換してから、レンチウイルスベクター（ＣＤ５１２Ｂ−１；ＳＢＩ）へのクローニングを行うことで、コンストラクトであるｐＢＬ５２８（配列番号１７６）、ｐＢＬ５２９（配列番号１７７）、及びｐＢＬ５３０（配列番号１７８）を生成した。
【０４８２】
実施例１３−Ｈ１プロモーターで改変された三重ヘアピンコンストラクトの生物学的活性の増進
この実施例は、Ｕ６−８プロモーターを使用する対応する三重コンストラクトと比較して、Ｈ１プロモーターで改変された三重ｓｈｍｉＲコンストラクト（ｐＢＬ５２８、ｐＢＬ５２９、及びｐＢＬ５２９）がＴＣＲ構成要素をより効率的に下方制御する能力を示す。このことは、デュアルルシフェラーゼアッセイと、遺伝子導入ジャーカット細胞におけるＩＬ−２産生の抑制と、の両方を使用して示された。
【０４８３】
ジャーカットＴ細胞を培養し、プラスミドＤＮＡであるｐＢＬ５２８、ｐＢＬ５２９、またはｐＢＬ５３０を形質導入し、実施例３に上記のように選択した。デュアルルシフェラーゼアッセイについては、適切なルシフェラーゼレポーターコンストラクトでも細胞の形質導入を実施した。図１３に示されるように、Ｈ１プロモーターで改変されたコンストラクトでは、元のコンストラクトと比較して、ＣＤ−３レポーターコンストラクトに対する抑制を伴う活性が顕著に増加することが示され、このことは、ｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３の発現が増加したことと整合するものであった。
【０４８４】
Ｈ１を含むコンストラクトの生物学的活性の増進は、実施例６に記載の形質導入細胞におけるＩＬ−２分泌の抑制を使用して確認した。ｐＢＬ５２８、ｐＢＬ５２９、またはｐＢＬ５３０を細胞に遺伝子導入し、細胞を選択し、抗体で刺激した後、実施例６に記載のＥＬＩＳＡアッセイを使用してＩＬ−２分泌をアッセイした。図１４に示されるように、Ｕ６−８プロモーターの代わりにＨ１プロモーターを使用するコンストラクトでは、ＩＬ−２分泌の抑制が強まることが示された。
【０４８５】
実施例１４−臨床候補の調製
実施例１３に概要が示されるデータに基づき、ｐＢＬ５３０に由来する三重ｓｈｍｉＲ挿入断片を、ＣＡＲコンストラクトを含むレンチウイルスベクター（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングすることでｐＢＬ５３１（配列番号１７９）を生成した。ｐＢＬ５３１は、５’レンチウイルス末端反復（ＬＴＲ）配列、ｓｈｍｉＲ−ＴＣＲ−β＿５の上流に位置するポリメラーゼ−ＩＩＩプロモーターＵ６−９、ＨＰＲＴ由来のスタッファー配列、ｓｈｍｉＲ  ＣＤ３−γ＿２の上流に位置するＵ６−１プロモーター、第２のＨＰＲＴスタッファー、及びｓｈｍｉＲ−ＣＤ３−ε＿３の上流に位置するＨ１プロモーター、これらに続く抗ＣＤ１９ＣＡＲ（ＥＦ１プロモーター、ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ；可変重（ＶＨ）、リンカー、可変軽（ＶＬ））、スペーサードメイン、シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４１ＢＢ、及びＣＤ３ゼータを含む）ならびに転写終結配列）、これらに続く３’ＬＴＲ配列を含む。ｐＢＬ５３１のマップは、図１５に示される。
【０４８６】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、機器、論文、または同様のものに関する議論はいずれも、こうした事項のいずれかまたはすべてが、添付の特許請求の範囲のそれぞれの優先権データより前にそれが存在したという理由で、先行技術分野の基礎の一部を形成するか、または本開示と関連する分野における共通の一般知識であったということを承認するものとして扱われることにはならない。
【０４８７】
本開示の幅広い一般的範囲から逸脱することなく、上記の実施形態に対して多くの変形及び／または改変を実施できることを当業者なら理解するであろう。したがって、本実施形態は、すべての点において、例示的あり、限定的なものではないと考えられることになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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