(57)【要約】  核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブと設計方法である。当該プローブはセンス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブからなる。センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブはいずれも非重畳プローブ設計であり、長さが塩基３０〜８９個分である。また、プローブ３’又は５’はビオチン標識を有しており、磁性ビーズ上のアビジンと結合可能である。前記双方向プローブによれば、キャプチャーの特異性を向上可能である（即ち、非標的位置のゲノムＤＮＡに対するキャプチャーが減少する）。よって、サンプルの突然変異型ＤＮＡに対するキャプチャーが明らかに向上し、且つ、キャプチャーする核酸サンプルの初期コピー数が増加する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブであって、
当該プローブは双方向プローブであり、センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブを含み、センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブは非重畳プローブ設計であり、長さはいずれも塩基３０〜８９個分であり、プローブの３’又は５’はビオチン標識を有しており、磁性ビーズ上のアビジンと結合可能であることを特徴とするプローブ。
【請求項２】
前記双方向プローブの配列を設計する方法として、
（１）リファレンスゲノムにおける遺伝子突然変異点の対応位置に応じて、エクソン上の点突然変異、挿入突然変異又は欠失突然変異の場合には当該エクソンの長さのリファレンス配列を、融合突然変異の場合には融合切断点のイントロン及びエクソンの長さのリファレンス配列を選択し、
（２）センス鎖のテンプレートとしてリファレンス配列を取得して等しい長さのセンス鎖非重畳プローブを設計し、
（３）アンチセンス鎖のテンプレートとしてリファレンス配列の逆相補配列を取得して等しい長さのアンチセンス鎖非重畳プローブを設計し、アンチセンス鎖非重畳プローブは、センス鎖非重畳プローブと同じ長さであるとともにセンス鎖非重畳プローブに対し位置ずれしており、アンチセンス鎖非重畳プローブの長さをｎとすると、ｎが奇数の場合の位置ずれは（ｎ＋１）／２、ｎが偶数の場合の位置ずれはｎ／２であり、
（４）ソフトウェア分析によって反復配列を含むプローブを除去し、前記ソフトウェア分析はプローブ配列分析と標的配列分析を含み、ソフトウェア分析では反復配列識別ソフトウェアを用いて分析可能であり、
（５）プローブでＤＮＡサンプルをキャプチャーするハイスループットシーケンシングの結果から、キャプチャーにより得られた非特異的断片を全プローブと照合し、非特異的断片と照合の結果一致したプローブを除去し、
（６）リファレンス配列へ最終的に適用されるキャプチャープローブを取得することを特徴とする請求項１に記載の核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブ。
【請求項３】
特異的なプローブ配列は、順に、突然変異点の上流一致配列、塩基を持たないスペーサー及び突然変異点の下流一致配列であり、前記特異的なプローブ配列の長さをｎとすると、ｎが奇数の場合には上流一致配列又は下流一致配列の長さは（ｎ＋１）／２となり、ｎが偶数の場合には上流一致配列又は下流一致配列の長さはｎ／２となることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブ。
【請求項４】
前記突然変異型配列の突然変異点に対し、特異的なプローブを設計する際には、塩基を持たないラジカルで突然変異点の変異塩基を置き換えることを特徴とする請求項３に記載の核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子シーケンシングの分野に関し、特に、核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブと設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの配列はあまりにも膨大なことから、標的遺伝子における特定位置での塩基の変異状況を研究するためには、標的遺伝子を濃縮する必要がある。一般的な濃縮方法としては、ＰＣＲ濃縮とハイブリダイゼーション濃縮がある。ＰＣＲ濃縮には、主としてマルチプレックスＰＣＲとデジタルＰＣＲが含まれる。しかし、ＰＣＲには、増幅バイアス、マルチプレックス増幅におけるプライマー同士の影響、及び未知の配列（例えば遺伝子組換え）を検出できないといった限界がある。また、ハイブリダイゼーション濃縮には主としてチップハイブリダイゼーション法と溶液ハイブリダイゼーション法が含まれる。しかし、ハイブリダイゼーションは小さな領域の濃縮には適さず、必要サンプル量も多い。チップハイブリダイゼーションは初期の技術に属し、サンプル量を増やすことでハイブリダイゼーション反応を促進する。一方、溶液ハイブリダイゼーションはプローブ量を増加することでハイブリダイゼーション反応を促進するため、サンプル使用量を減少させられる。また、ハイブリダイゼーション法は標的遺伝子に対応する特異的なプローブを設計し、プローブとゲノムをハイブリダイズさせることで標的遺伝子のキャプチャーを実現する。濃縮により得られた標的遺伝子は、ハイスループットシーケンシングによって標的遺伝子の変異状況を分析可能である。
【０００３】
キャプチャー用プローブの設計や合成を行っている会社としては、主に、エフ・ホフマン・ラ・ロシュ（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）がある。プローブは標的領域の１本鎖に対して設計され、異なる長さ（特許文献１に記載の２９〜３９ｂｐ、非特許文献１に記載の＞６０ｂｐ、アジレント社の特許文献２に記載の＞１００ｂｐ、非特許文献２に記載の１２０ｂｐ）や、異なる重畳数のプローブ（非特許文献３に記載の１×、１．５×、２×又は４×タイリング）として設計される。しかし、プローブは一方向設計であるためキャプチャー過程で相補鎖の核酸ライブラリーをキャプチャーできず、キャプチャーコピー数に欠失が生じてしまう。また、プローブは正常なゲノム配列に基づき設計され、突然変異配列ではなく正常なゲノム配列を優先的にキャプチャーするため、シーケンシング結果において突然変異の頻度に齟齬が生じてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７６３６６３７号明細書
【特許文献２】米国特許第２０１１０１８４１６１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｒｏｃｈｅ．ｃｏｍ／ｗｃｓｓｔｏｒｅ／ＲＡＳＣａｔａｌｏｇＡｓｓｅｔＳｔｏｒｅ／Ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡ＿３＿０９＿ｐ１３−１４．ｐｄｆ＞
【非特許文献２】ＰＭＩＤ  １９１８２７８６
【非特許文献３】ＰＭＩＤ  １９８３５６１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、キャプチャーの特異性を向上可能であるとともに、キャプチャーする核酸サンプルの初期コピー数が増加する核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を実現すべく、本発明は、核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブを提供する。当該プローブは双方向プローブであり、センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブを含む。センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブは非重畳プローブ設計であり、長さはいずれも塩基３０〜８９個分である。プローブの３’又は５’はビオチン標識を有しており、磁性ビーズ上のアビジンと結合可能である。
【０００８】
更に、前記双方向プローブの配列は次の方法で設計される。
【０００９】
（１）リファレンスゲノムにおける遺伝子突然変異点の対応位置に応じて、エクソン上の点突然変異、挿入突然変異又は欠失突然変異の場合には当該エクソンの長さのリファレンス配列を、融合突然変異の場合には融合切断点のイントロン及びエクソンの長さのリファレンス配列を選択する。
【００１０】
（２）センス鎖のテンプレートとしてリファレンス配列を取得し、等しい長さのセンス鎖非重畳プローブを設計する。
【００１１】
（３）アンチセンス鎖のテンプレートとしてリファレンス配列の逆相補配列を取得し、等しい長さのアンチセンス鎖非重畳プローブを設計する。アンチセンス鎖非重畳プローブはセンス鎖非重畳プローブと同じ長さであり、且つ、センス鎖非重畳プローブに対し位置ずれしている。アンチセンス鎖非重畳プローブの長さをｎとすると、ｎが奇数の場合の最適な位置ずれは（ｎ＋１）／２、ｎが偶数の場合の最適な位置ずれはｎ／２となる。
【００１２】
（４）ソフトウェア分析により、反復配列を含むプローブを除去する。前記ソフトウェア分析にはプローブ配列分析と標的配列分析が含まれる。また、ソフトウェア分析では、反復配列識別ソフトウェアを用いて分析すればよい。
【００１３】
（５）プローブでＤＮＡサンプルをキャプチャーするハイスループットシーケンシングの結果から、キャプチャーにより得られた非特異的断片を全プローブと照合し、非特異的断片と照合の結果一致したプローブを除去する。
【００１４】
（６）リファレンス配列へ最終的に適用されるキャプチャープローブを取得する。
【００１５】
更に、野生型配列と突然変異型配列を同時にキャプチャーするために、特異的なプローブ配列を増やす。当該特異的なプローブ配列は、順に、突然変異点の上流一致配列、塩基を持たないスペーサー及び突然変異点の下流一致配列である。前記特異的なプローブ配列の長さをｎとすると、ｎが奇数の場合には上流一致配列又は下流一致配列の長さは（ｎ＋１）／２となり、ｎが偶数の場合には上流一致配列又は下流一致配列の長さはｎ／２となる。
【００１６】
更に、前記突然変異型配列の突然変異点に対し、特異的なプローブを設計する際には、塩基を持たないラジカル（ｒａｄｉｃａｌ  ｇｒｏｕｐ）で突然変異点の変異塩基を置き換える。
【００１７】
２本鎖ゲノムの標的配列をより良好にキャプチャーするために、キャプチャーしたいゲノムの標的配列に基づいて双方向プローブを設計する（センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブをそれぞれ設計する）。センス鎖プローブは非重畳プローブ設計であり、アンチセンス鎖プローブもまた非重畳プローブ設計である。センス鎖とアンチセンス鎖のプローブの相補的対合を減らすために、センス鎖は対応するアンチセンス鎖プローブに対して位置ずれするよう設計される。即ち、各センス鎖とアンチセンス鎖プローブとの間には１／２のプローブ長さの相補が存在しているため、テンプレートの２本鎖に対するキャプチャーを保証しつつ、プローブ間の相互作用が最大限減少する。
【００１８】
プローブの長さは塩基３０〜８９個分となっている。また、プローブの３’又は５’はビオチン標識を有しており、磁性ビーズ上のアビジンと結合可能なため、後段の磁性環境下において標的配列のキャプチャーに用いられる。
【００１９】
また、野生型配列と突然変異型配列を同時にキャプチャーするために、双方向プローブをベースとして特異的プローブを補足する。特異的プローブの変異点は塩基を持たないスペーサー（ｄＳｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ９又はＳｐａｃｅｒ１８等）で置き換えられる。また、塩基を持たないスペーサー修飾の両側は突然変異型と野生型の共通配列となる。
【００２０】
本発明におけるプローブの設計原理を図１に示す。ヒトリファレンスゲノム（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３））における遺伝子突然変異点の対応位置に応じて、対応長さのリファレンス配列を選択し、プローブ設計を行う。ゲノムの相補２本鎖に基づいて、センス鎖非重畳プローブとアンチセンス鎖非重畳プローブをそれぞれ設計する。各センス鎖プローブと対応位置のアンチセンス鎖プローブとの間には、１／２のプローブ長さの相補が存在している。また、各アンチセンス鎖プローブと対応位置のセンス鎖プローブとの間には、１／２のプローブ長さの相補が存在している。且つ、必要に応じてゲノムの突然変異を検出し、バイアスのないプローブを対応位置に設計する。設計されるプローブとＤＮＡサンプルのハイブリッドキャプチャーについては図２を参照する。
【００２１】
プローブの設計ステップは以下の通りである。
【００２２】
１．ヒトリファレンスゲノム（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３））における遺伝子突然変異点の対応位置に応じて、対応長さのリファレンス配列を選択する。エクソン上の点突然変異、挿入突然変異又は欠失突然変異の場合には当該エクソンの長さを選択し、融合突然変異の場合には融合切断点のイントロン及びエクソンの長さを選択する。例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍ点突然変異の場合にはＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０を選択し、ＥＧＦＲ遺伝子のＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ欠失の場合には、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９を選択する。また、例えば、ＡＬＫ遺伝子のイントロン１９に発生した遺伝子融合の場合には、ＡＬＫのエクソン１９、イントロン１９、エクソン２０を選択する。
【００２３】
２．リファレンス配列（センス鎖のテンプレート）を取得して、等しい長さのセンス鎖非重畳プローブを設計する。なお、プローブの設計はソフトウェア（Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒなど）又は手動で実施する。
【００２４】
３．リファレンス配列の逆相補配列（アンチセンス鎖のテンプレート）を取得し、等しい長さのアンチセンス鎖非重畳プローブを設計する。アンチセンス鎖プローブはセンス鎖プローブと同じ長さであり、且つ、センス鎖プローブに対し位置ずれしている。なお、プローブの設計はソフトウェア（Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒなど）又は手動で実施する。プローブの長さをｎとすると、位置ずれとしては１〜（ｎ−１）が可能である。ｎが奇数の場合には最適な位置ずれは（ｎ＋１）／２となり、ｎが偶数の場合には最適な位置ずれはｎ／２となる。このような位置ずれによって、センス鎖非重畳プローブとアンチセンス鎖非重畳プローブとの相互作用は最低限まで低下する。
【００２５】
４．ソフトウェア分析又は（及び）試験結果から、反復配列を含むプローブを除去する。ソフトウェア分析にはプローブ配列分析と標的配列分析が含まれる。また、ソフトウェア分析では、オンラインソフトウェアのＲｅｐｅａｔ  ＭａｓｋｅｒやローカルソフトウェアのＢｌａｓｔ、ＢＷＡといった反復配列識別ソフトウェアを用いて分析すればよい。試験結果としては、プローブでＤＮＡサンプルをキャプチャーするハイスループットシーケンシングの結果に基づき、キャプチャーにより得られた非特異的断片を全プローブと照合して（ローカルソフトウェア）、非特異的断片と照合の結果一致したプローブを除去する。
【００２６】
５．リファレンス配列へ最終的に適用されるキャプチャープローブを特定する。
【００２７】
本発明のプローブによりＤＮＡサンプルをハイブリッドキャプチャーする場合の原理を図２に示す。ＤＮＡサンプルには、野生型のセンス鎖テンプレート、野生型のアンチセンス鎖テンプレート、突然変異型のセンス鎖テンプレート及び突然変異型のアンチセンス鎖テンプレートが存在する。また、プローブには、野生型センス鎖プローブ、野生型アンチセンス鎖プローブ、非バイアスセンス鎖プローブ及び非バイアスアンチセンス鎖プローブが含まれる。特定の条件下において、野生型アンチセンス鎖プローブは野生型のセンス鎖テンプレートをハイブリッドキャプチャー可能であり、野生型センス鎖プローブは野生型のアンチセンス鎖テンプレートをハイブリッドキャプチャー可能であり、野生型アンチセンス鎖プローブと非バイアスアンチセンス鎖プローブはセンス鎖の野生型テンプレートをハイブリッドキャプチャー可能であり、センス鎖プローブと非バイアスセンス鎖プローブはアンチセンス鎖の突然変異型テンプレートをハイブリッドキャプチャー可能である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明における双方向プローブによれば、キャプチャーの特異性を向上（即ち、非標的位置のゲノムＤＮＡに対するキャプチャーを減少）可能であるとともに、キャプチャーする核酸サンプルの初期コピー数を増加させられる。また、本発明における双方向プローブ、及び塩基を持たないスペーサーを含む非バイアスプローブによれば、サンプルの突然変異型ＤＮＡに対するキャプチャーを顕著に向上可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明のプローブ設計の原理図である。
【図２】図２は、本発明のプローブによりＤＮＡサンプルをハイブリッドキャプチャーする場合の原理図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明の実施例について詳細に述べる。なお、これら実施例は図面に例示しており、図中の一貫して同じ又は類似の符号は、同じ又は類似の要素、或いは、同じ又は類似の機能を有する要素を示している。下記の図面を参照して記載する実施例は例示であり、本発明を説明するためのものであって本発明を制限するものと解釈すべきではない。また、実施例において具体的な技術又は条件を明記していないものについては、当該分野の文献に記載される技術又は条件、或いは製品説明書に基づき実施される。また、試薬又は計器についてメーカー名を明記していないものについては、いずれも市販のものを購入して得られる一般的な製品である。
【００３１】
実施例１：ＧＣ含量別断片のオンターゲット率に対する双方向プローブの影響
【００３２】
６つのゲノム領域を取得し（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ２：２９４４６４７６〜ｃｈｒ２：２９４４６７７５、ｃｈｒ２：２９４４７２２６〜ｃｈｒ２：２９４４７５２５、ｃｈｒ２：２９４４８０６５〜ｃｈｒ２：２９４４８３６４、ｃｈｒ６：１１７６４２６４１〜ｃｈｒ６：１１７６４２９４０、ｃｈｒ６：１１７６４５３２３〜ｃｈｒ６：１１７６４５６２２、ｃｈｒ６：１１７６４１０３８〜ｃｈｒ６：１１７６４１３３７）、一方向プローブによる３倍重畳カバー又は双方向プローブによる位置ずれカバーとなるようプローブを設計した。プローブの長さはいずれも５９ｂｐとし、プローブの３’端をビオチンで修飾した。具体的なプローブ配列は多数存在したが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ２：２９４４６４７６〜ｃｈｒ２：２９４４６７７５領域を一例とし、一方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５の５本、双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６−１０の５本を取り上げた。そして、白血球ＤＮＡを各３０ｎｇ取り、カパ（ＫＡＰＡ）の試薬キットでライブラリー調製を行った後、ハイブリダイゼーション試薬を用いて２ｈ及び２４ｈのハイブリッドキャプチャーを１回実施した。ハイブリッドキャプチャーにはロシュ社のＳｅｑＣａｐ  ＥＺハイブリダイゼーション＆ウォッシュキットを用い、キットの説明書にしたがって操作した。表１にシーケンシング結果を示す。
【００３３】
【表１】
2019517774.tif 000003
【００３４】
ｏｎ  Ｔａｒｇｅｔとは、総シーケンシング結果（即ち、標的配列と非標的配列のシーケンシング結果）に占める標的配列のシーケンシング結果の割合をいう。ｃｏｖｅｒａｇｅとは、シーケンシングにより得られた標的配列部分が標的配列全体に占める割合をいう。Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙとは、キャプチャーされた標的配列における各塩基の均一性状況を示しており、平均深度の２０％を閾値とした場合、標的配列のうち平均深度の２０％に達した塩基が標的配列の総塩基に占める割合のことをいう。Ｄｅｐｔｈとは、シーケンシング結果における標的配列の各塩基の平均深度を示す。ＵＩＤとは、分子標識により推定される初期のテンプレートのコピーである。
【００３５】
表１から明らかなように、双方向プローブによる位置ずれカバーの場合には、生成量（キャプチャー後に増幅したライブラリー生成量）が一方向の重畳カバーよりも明らかに高く、且つ、ハイブリッドキャプチャーのオンターゲット率も著しく向上した。また、２４ｈハイブリッド群の効果は２ｈハイブリッド群よりも明らかであった。ただし、各群のＣｏｖｅｒａｇｅは一致していた。また、双方向プローブはＵｎｉｆｏｒｍｉｔｙが低かった。また、シーケンシングのデータ量に限りがあったため、双方向プローブによる位置ずれカバーのＵＩＤはオンターゲット率の向上に伴い増加した。Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙの数値については双方向プローブが一方向の重畳プローブよりも低かったが、これは、主として各プローブの配列の違いによってキャプチャー効果に差が出るためである。したがって、プローブによるカバー頻度を増やせば、各位置の塩基に対するプローブのキャプチャー能力の差を効果的に低下させることができ、均一性がより良好となる。また、プローブの一方向設計では２本鎖の核酸ライブラリーをキャプチャーできず、キャプチャーコピー数に欠失が生じてしまう。しかし、双方向プローブは対応する欠失を補足するため、ＤｅｐｔｈとＵＩＤが大幅に向上する。また、シーケンシングデータ量は一方向の場合より高い場合もあれば低い場合もある。これは、ハイスループットシーケンシングの場合、予測データ量に基づいてサンプル投入質量を換算し、複数のサンプルを混合してからシーケンシングするためである。よって、サンプル抽出と混合の過程でズレが生じることがあり、絶対的な精度は保証できない。また、サンプルはシーケンシング機器でＰＣＲ増幅過程を経る必要があり、各サンプルの増幅効率が完全に一致するよう保証することも不可能である。
【００３６】
実施例２：染色体別のオンターゲット率に対する双方向プローブの影響
【００３７】
５つのゲノム領域としてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ２：２９４４６２０１〜２９４４８３６４、ｃｈｒ７：５５２４１６３５〜５５２４１７４８、ｃｈｒ７：５５２４２３９６〜５５２４２５３９、ｃｈｒ７：５５２４９０２９〜５５２４９１０７、ｃｈｒ７：５５２５９４６２〜５５２５９５７６を取得し、一方向プローブによる非重畳カバーと双方向プローブによる位置ずれカバーとなるようプローブを設計した。プローブの長さは３５〜８０ｂｐ、プローブＴｍは７２〜７８℃とし、プローブの３’端はビオチンで修飾した。具体的なプローブ配列は多数存在したが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ２：２９４４６２０１〜２９４４８３６４領域を一例とし、表２に示すように、一方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１５の５本、双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６〜２０の５本を取り上げた。そして、白血球ＤＮＡを各３０ｎｇ取り、カパ（ＫＡＰＡ）の試薬キットでライブラリー調製を行った後、ハイブリダイゼーション試薬を用いて２ｈのハイブリッドキャプチャーを１回実施した。ハイブリッドキャプチャーにはロシュ社のＳｅｑＣａｐ  ＥＺハイブリダイゼーション＆ウォッシュキットを用い、キットの説明書にしたがって操作した。表２にシーケンシング結果を示す。
【００３８】
【表２】
2019517774.tif 000004
【００３９】
表２から明らかなように、双方向プローブによる位置ずれカバーの場合には、生成量（キャプチャー後に増幅したライブラリー生成量）が一方向の非重畳カバーよりも明らかに高く、且つ、ハイブリッドキャプチャーのオンターゲット率も著しく向上した。ただし、各群のＣｏｖｅｒａｇｅとＵｎｉｆｏｒｍｉｔｙは同じであった。また、シーケンシングのデータ量に限りがあったため、双方向プローブによる位置ずれカバーのＵＩＤはオンターゲット率の向上に伴い増加した。
【００４０】
実施例３  ＵＩＤに対する双方向プローブの影響
【００４１】
複数のゲノム領域を取得してプローブ設計を行った。複数のゲノム領域には、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３１、イントロン３１及びエクソン３２、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９等が含まれた。プローブ設計は、一方向プローブによる３倍重畳カバー、双方向プローブによる位置ずれカバーとなるよう実施した。プローブの長さはいずれも５９ｂｐとし、プローブの３’端はビオチンで修飾した。また、ソフトウェア分析及び試験結果から、反復配列を含むプローブを除去した。具体的なプローブ配列は多数存在したが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９を一例とし、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ７：５５２４２４１５〜５５２４２５１３から、リファレンス配列に最終的に適用される一方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２５の５本、リファレンス配列に最終的に適用される双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６〜２９の４本を取り上げた。また、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３１、イントロン３１及びエクソン３２を一例とし、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ６：１１７６５０４９２〜１１７６５８５０３領域から、リファレンス配列に最終的に適用される一方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜３４の５本、リファレンス配列に最終的に適用される双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５〜３９の５本を取り上げた。また、ソフトウェアにより除去した反復配列を含む双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０〜４４の５本、試験結果により除去した反復配列を含む双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５〜４９の５本を取り上げた（表参照）。また、突然変異型テンプレートに対するキャプチャーが増加するよう、ＥＧＦＲのエクソン１９が欠失した変異タイプＮＭ＿００５２２８：ｅｘｏｎ１９：ｃ．２２３５＿２２４９ｄｅｌ：ｐ．７４５＿７５０ｄｅｌに対し、塩基を持たないスペーサーを含む非バイアスプローブを設計した。非バイアスプローブは塩基を持たないスペーサーＳｐａｃｅｒ１８で置き換えられ、配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０−Ｓｐａｃｅｒ１８−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−３’−Ｂｉｏｔｉｎで示された。
【００４２】
このうち、ＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１となった。
【００４３】
よって、具体的には、ＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡ−Ｓｐａｃｅｒ１８−ＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡ−３’−Ｂｉｏｔｉｎであった。そして、人体の白血球ＤＮＡ又は血漿ＤＮＡを各３０ｎｇ取り、カパ（ＫＡＰＡ）の試薬キットでライブラリー調製を行った後、ハイブリダイゼーション試薬を用いて２４ｈ＋２４ｈのハイブリッドキャプチャーを２回実施した。ハイブリッドキャプチャーにはロシュ社のＳｅｑＣａｐ  ＥＺハイブリダイゼーション＆ウォッシュキットを用い、キットの説明書にしたがって操作した。表３にシーケンシング結果を示す。
【００４４】
【表３】
2019517774.tif 000005
【００４５】
表３から明らかなように、双方向プローブによる位置ずれカバーの場合には、生成量（キャプチャー後に増幅したライブラリー生成量）が一方向プローブの各群よりも明らかに高く、且つ、ハイブリッドキャプチャーのオンターゲット率もやや向上した。また、各群のＣｏｖｅｒａｇｅとＵｎｉｆｏｒｍｉｔｙは同じであった。データ量とｏｎＴａｒｇｅｔが類似の条件において、双方向プローブによる位置ずれカバーは一方向プローブによる３倍重畳カバー群と比べて白血球ＤＮＡのＵＩＤが約６．８％向上し、血漿ＤＮＡのＵＩＤが約１２．９％向上した。また、双方向プローブのＤｅｐｔｈは一方向プローブよりも高かった。これより、１倍、２倍又は３倍カバーの一方向プローブと比較して、双方向プローブはＤＮＡサンプルに対してより良好なハイブリッドキャプチャー能力を有することが示された。
【００４６】
双方向プローブによれば標的塩基に対するプローブのカバー頻度が増加するため、双方向プローブが設計的に一方向プローブよりも優れていることを説明するために比較を導入した。
【００４７】
実施例４  突然変異検出に対する双方向プローブの影響
【００４８】
複数のゲノム領域を取得してプローブ設計を行った。複数のゲノム領域には、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３１、イントロン３１及びエクソン３２、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９等が含まれた。プローブ設計は、双方向プローブによる位置ずれカバーとなるよう実施した。プローブの長さはいずれも５９ｂｐとし、プローブの３’端はビオチンで修飾した。また、ソフトウェア分析及び試験結果から、反復配列を含むプローブを除去した。具体的なプローブ配列は多数存在したが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９を一例とし、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ７：５５２４２４１５〜５５２４２５１３から、双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６〜２９の４本を取り上げた。また、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３１、イントロン３１及びエクソン３２を一例とし、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｒｅｌｅａｓｅ  １９（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）のｃｈｒ６：１１７６５０４９２〜１１７６５８５０３から、双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５〜３９の５本を取り上げた。また、ソフトウェアにより除去した反復配列を含む双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０〜４４の５本、試験結果により除去した反復配列を含む双方向プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５〜４９の５本を取り上げた（表参照）。また、突然変異型テンプレートに対するキャプチャーが増加するよう、ＥＧＦＲのエクソン１９が欠失した変異タイプＮＭ＿００５２２８：ｅｘｏｎ１９：ｃ．２２３５＿２２４９ｄｅｌ：ｐ．７４５＿７５０ｄｅｌに対し、塩基を持たないスペーサーを含む非バイアスプローブを設計した。非バイアスプローブは塩基を持たないスペーサーＳｐａｃｅｒ１８で置き換えられ、配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０−Ｓｐａｃｅｒ１８−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−３’−Ｂｉｏｔｉｎで示された。
【００４９】
このうち、ＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１となった。
【００５０】
よって、具体的には、ＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡ−Ｓｐａｃｅｒ１８−ＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡ−３’−Ｂｉｏｔｉｎであった。
【００５１】
また、２０ｎｇのＨ１６５０細胞系（ＮＭ＿００５２２８：ｅｘｏｎ１９：ｃ．２２３５＿２２４９ｄｅｌ：ｐ．７４５＿７５０ｄｅｌ。ＡＴＣＣから購入可能）を取り、カパ（ＫＡＰＡ）の試薬キットでライブラリー調製を行った。
【００５２】
そして、ハイブリダイゼーション試薬を用いて２４ｈ＋２４ｈのハイブリッドキャプチャーを２回実施した。ハイブリッドキャプチャーにはロシュ社のＳｅｑＣａｐ  ＥＺハイブリダイゼーション＆ウォッシュキットを用い、キットの説明書にしたがって操作した。シーケンシング結果は以下のようになった。また、キャプチャーの照合にはカスタマイズされた商用キャプチャー試薬キット（ロシュ社のＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  Ｓｙｓｔｅｍカスタマイズ製品）を用いた。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
上表から明らかなように、双方向プローブによる位置ずれカバーの場合には、突然変異率が商用試薬キットの場合よりも高かった。また、デジタルＰＣＲ法による検出結果から、Ｈ１６５０の突然変異含有量は約６２％であった。当該データは、本発明によれば変異ＤＮＡ断片をより良好にハイブリッドキャプチャー可能であり、突然変異のコピーが効果的にキャプチャーされることから、突然変異の検出率がより高まることを示している。
【００５５】
なお、上記では本発明の実施例を提示及び記載したが、上記の実施例は例示にすぎず、本発明を制限するものと解釈すべきではない。当業者であれば、本発明の原理と主旨を逸脱しないことを前提に、本発明の範囲において上記の実施例を変更、修正、置き換え及び変形可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブを提供可能である。これによれば、キャプチャーの特異性を向上可能であるとともに、キャプチャーする核酸サンプルの初期コピー数が増加するため、塩基の変異状況を迅速に特定し、検出することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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