(57)【要約】クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のリポ多糖（ＬＰＳ）抗原構造体の交差反応性エピトープ、すなわちＯ３ｂエピトープを特異的に認識し、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する、交差中和モノクローナル抗体であり、その抗体は特異的ＣＤＲ配列、またはＶＨおよびＶＬ配列を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のリポ多糖（ＬＰＳ）抗原構造体の交差反応性エピトープであるＯ３ｂエピトープを特異的に認識し、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する、交差中和モノクローナル抗体であって、該抗体が、
ａ）表１ａもしくは表１ｂに挙げるいずれか１つの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列を含む抗体；または
ｂ）図２ｂに示すいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体；または
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のうちいずれか１つである親抗体の機能活性バリアントである抗体であって、該機能活性バリアントは親抗体と同じエピトープを結合する特異性を有し、いずれかのＣＤＲ中に少なくとも１つの点変異を含み、ここで、点変異の数はそれぞれのＣＤＲ配列において０、１、２、もしくは３つの点変異のいずれかであり、それぞれのＣＤＲ配列における配列同一性は親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列と比較して少なくとも６０％である；
のいずれかから選択される、上記抗体。
【請求項２】
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｖ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２２からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２３からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３３からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３４からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３５からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２６からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３６からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３８からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２７からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２８からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２９からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３９からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４０からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４１からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３０からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３１からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３２からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４２からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３４からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４３からなるＣＤＲ６；
ならびに
ｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２２からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７４からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３３からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３４からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３５からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体；
である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｖ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４６からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５６からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５８からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４７からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４８からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４９からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５９からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６０からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６１からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５０からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５１からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５２からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６２からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６３からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６４からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５３からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５４からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５５からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６５からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６６からなるＣＤＲ６；
ならびに
ｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６７からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５６からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５８からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＩＭＧＴのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体；
である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
機能活性バリアントがＣＤＲ１〜６を含み、
ａ）ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ７５を含む；
ｂ）ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ７６を含む；
ｃ）ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ７７を含む；
ｄ）ＣＤＲ４はＳＥＱ  ＩＤ  ７８を含む；
ｅ）ＣＤＲ５はＳＥＱ  ＩＤ  ５７を含む；および
ｆ）ＣＤＲ６はＳＥＱ  ＩＤ  ７９を含む；
これらのＣＤＲ配列はＩＭＧＴによるものであり、
これらにおいてそれぞれのＣＤＲ配列は親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、
請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｖｉｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １１からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １２からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １７からなるＶＬ；
ｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １３からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １８からなるＶＬ；
ｉｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １４からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １９からなるＶＬ；
ｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １５からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２０からなるＶＬ；
ｖｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６８からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
ｖｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６９からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
ならびに
ｖｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７０からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体；
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
ａ）Ｏ３ｂエピトープが、１以上のＯ３ｂ抗原トリマンノースホモポリマー反復単位を含有する式（Ｉ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のＬＰＳ  Ｏ３ｂ抗原に組み込まれており、式（Ｉ）は下記のものである：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ；
ｂ）Ｏ３ａエピトープが、１以上のＯ３ａ抗原テトラマンノースホモポリマー反復単位を含有する式（ＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原に組み込まれており、式（ＩＩ）は下記のものである：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ；
および
ｃ）Ｏ３エピトープが、１以上のＯ３抗原ペンタマンノースホモポリマー反復単位を含有する式（ＩＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原に組み込まれており、式（ＩＩＩ）は下記のものである：
ＭｅＰ(R)３）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)３）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)［３）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)３）−  a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)］ｎ
［式中の
ＭｅＰはメチルホスフェートであり；
ｎは０〜５０である］
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
二価結合についてのバイオレイヤー干渉法により測定して、Ｏ３ａエピトープを１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満のＫＤで結合する親和性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、またはＯ３エピトープのいずれかを含むＬＰＳ分子を発現するクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae）株のエンドトキシンを中和する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
完全長抗体、その抗体フラグメント、または融合タンパク質のいずれかであり、それぞれが少なくとも、交差反応性エピトープを認識する結合部位を含むＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト由来のもの、またはその親和性成熟バリアントであって特に抗体が人工アミノ酸配列を含む非天然抗体であり、特に抗体がＩｇＡ抗体またはそのＩｇＡからＩｇＧへのアイソタイプスイッチバリアントである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae）の感染または定着のリスクがあるかまたはそれに罹患している対象を処置して、該対象における感染を制限し、または該感染から生じる病状を改善するのに使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための抗体であって、特に対象が免疫無防備状態または免疫抑制状態の患者、またはそれに接触する者である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
非経口配合物において請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体、および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質構築体を発現するコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体の発現カセットまたはプラスミドを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を製造する方法であって、該抗体を産生する条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養または維持する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎杆菌）(Klebsiella pneumoniae)のリポ多糖（ＬＰＳ）抗原構造体の交差反応性エピトープ、すなわちＯ３ｂエピトープを特異的に認識し、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する、交差中和モノクローナル抗体(cross-neutralizing monoclonal antibody)に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレブシエラ・ニューモニエは、著しい罹患率および死亡率を生じる院内感染に関与する重大な腸内細菌性病原体である。多剤耐性（ＭＤＲ）菌株が最近出現し、世界的に拡大しており、それらに対する療法選択肢は限られている。現在の目的は、ＭＤＲクレブシエラ菌株により引き起こされる感染症の予防および治療のための療法用モノクローナル抗体を開発することである。意図するｍＡｂの分子ターゲットは、クレブシエラの表面にある数少ない（唯一ではないとしても）抗原のうちの１つであると考えられるＬＰＳ  Ｏ−抗原である。
【０００３】
Ｏ−型の分布に関して公表された疫学データ(1,2)に基づけば、大部分の臨床関連分離株は４つの血清型、すなわちＯ１、Ｏ２、Ｏ３およびＯ５に属する。Ｏ１およびＯ２抗原はガラクトースのホモポリマー（すなわち、ガラクタン）により構築されており、一方、Ｏ３およびＯ５血清グループはマンノースホモポリマー（すなわち、マンナン）から構成される(3)。
【０００４】
Ｏ３血清型は、図３ａにも示す“古典的な”ペンタ−マンノース構造を特徴とする（(3)に公表）。
【０００５】
【表１】
2019531708.tif 000002
【０００６】
ＮおよびＱにより形成される二糖構造は、ペンタマンノース  Ｏ−抗原サブユニットを共通部分(common part)（ＣＰ）に架橋するいわゆるアダプターである。最後のＯ−抗原リピートはターミネーター分子（Ｔ）によりキャッピングされており、それは実際にはKubler-Kielb et al. (4)が解明したように３−連結したメチルホスフェートである。
【０００７】
クレブシエラＯ３抗原のペンタ-マンノース構造が解明された(10)。このＯ３抗原をコードするｒｆｂオペロンは、登録番号ＡＢ７９５９４１．１でＧｅｎｂａｎｋに寄託されている。
【０００８】
大腸菌(E. coli)血清型Ｏ８およびＯ９は、それぞれクレブシエラ血清型Ｏ５およびＯ３と構造的に同じＯ−特異的マンノースホモ多糖をもつ。大腸菌Ｏ９のサブタイプである大腸菌Ｏ９ａを大腸菌Ｏ９から血清型として区別するモノクローナル抗体が記載されている(Sugiyama et al. 1998, J. Bacteriol. 180(10):2775-2778)。大腸菌Ｏ９とＯ９ａは構造的および血清学的に互いに類似する。
【０００９】
大腸菌Ｏ９の構造およびその遺伝学的決定因子は、クレブシエラＯ３抗原のものと同一である。血清グループＯ９のサブタイプ、すなわち大腸菌Ｏ９ａは、ＷｂｄＡ内の点変異から生じることが証明された(7)。Ｏ９ａの構造はテトラ−マンノース構造であることが示された(8)。
【００１０】
表：Ｏ−特異的マンノースホモ多糖の反復単位の構造(Sugiyama et al.に公表)
【００１１】
【表２】
2019531708.tif 000003
【００１２】
抗−大腸菌Ｏ９ａモノクローナル抗体はクレブシエラＯ３多糖と交差反応すると記載されており、これはクレブシエラＯ３株に大腸菌Ｏ９ａ型のＯ多糖が存在することを示唆する(Kido et al. 1997, Microbiol. Immunol. 41:519-525)。その抗体は大腸菌Ｏ９ａ多糖を認識したが、大腸菌Ｏ９を認識しなかった。Ｏ９およびＯ９ａ多糖を規定するために必要なマンノース残基の最少数は４であると決定され、４−マンノース構造はエピトープに抗体が結合するための最も短かい候補であると記載されている。
【００１３】
Van der Meer et al. (Infection and Immunity 1994, 62(3):1052-1057)は、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)Ｒ５９５に対して産生され、内部コア(inner core)の構造体、すなわちα−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクタウロソン酸(α-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid)に対して特異的であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を記載している。その抗体はクレブシエラ・ニューモニエのほとんどすべてのＯ−血清型と反応し、それはそのＬＰＳのコアのエピトープがサルモネラ・ミネソタの内部コアのものと類似することを示唆する。
【００１４】
Trautmann et al. (Infection and Immunity 1994, 62(4):1282-1288)は、クレブシエラのリポ多糖（ＬＰＳ）を指向するネズミモノクローナル抗体を記載しており、それは平滑な無莢膜(nonencapsulated)クレブシエラ菌株（血清グループＯ１）について産生されたものであり、クレブシエラＯ血清グループＯ１、Ｏ２ａｂ、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ３、Ｏ５、およびＯ１２と交差反応した。
【００１５】
WO2008/135446A2には、ペプチド系クレブシエラ抗原および抗体が開示されている。
Pollack et al. (Journal of Clinical Investigation 1987, 79(5):1421-1430)は、コア−リピドＡ領域のＬＰＳにおけるエピトープを認識するｍＡｂを記載している。
【００１６】
Yokochi et al. (Infection and Immunity 1992, 60(11):4953-4956)は、クレブシエラ・ニューモニ由来のＬＰＳのアジュバント活性を記載している。クレブシエラＯ３  ＬＰＳのアジュバント性はクレブシエラのリピドＡ部分とマンノースホモ多糖部分の組合わせを必要とする可能性があることが示唆される。
【００１７】
Curvall et al. (Acta Chemica Scandinavica 1973, 27:2645-2649)は、クレブシエラＯ３  ＬＰＳ中のＯ−特異的側鎖の構造を開示している。クレブシエラＯ３：Ｋ５８  ＬＰＳは五糖反復単位から構成されると記載されている。
【００１８】
クレブシエラ・ニューモニエのターゲットを認識する、各種クレブシエラ・ニューモニエ血清型に広く適用される新たな抗体、特に有効な療法の開発に対するニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】WO2008/135446A2
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Trautmann M, Ruhnke M, Rukavina T, Held TK, Cross AS, Marre R, Whitfield C. 1997. O-antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolates and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Clin.Diagn.Lab Immunol. 4:550-555.
【非特許文献２】Hansen DS, Mestre F, Alberti S, Hernandez-Alles S, Alvarez D, Domenech-Sanchez A, Gil J, Merino S, Tomas JM, Benedi VJ. 1999. Klebsiella pneumoniae lipopolysaccharide O typing: revision of prototype strains and O-group distribution among clinical isolates from different sources and countries. J.Clin.Microbiol. 37:56-62.
【非特許文献３】Vinogradov E, Frirdich E, MacLean LL, Perry MB, Petersen BO, Duus JO, Whitfield C. 2002. Structures of lipopolysaccharides from Klebsiella pneumoniae. Eluicidation of the structure of the linkage region between core and polysaccharide O chain and identification of the residues at the non-reducing termini of the O chains. J.Biol.Chem. 277:25070-25081.
【非特許文献４】Kubler-Kielb J, Whitfield C, Katzenellenbogen E, Vinogradov E. 2012. Identification of the methyl phosphate substituent at the non-reducing terminal mannose residue of the O-specific polysaccharides of Klebsiella pneumoniae O3, Hafnia alvei PCM 1223 and Escherichia coli O9/O9a LPS. Carbohydr.Res. 347:186-188.
【非特許文献５】Curvall M, Lindberg B, Lonngren J, Nimmich W. 1973. Structural studies on the Klebsiella O group 3 lipopolysaccharide. Acta Chem.Scand. 27:2645-2649.
【非特許文献６】Sugiyama et al. 1998, J. Bacteriol. 180(10):2775-2778
【非特許文献７】Kido N, Kobayashi H. 2000. A single amino acid substitution in a mannosyltransferase, WbdA, converts the Escherichia coli O9 polysaccharide into O9a: generation of a new O-serotype group. J.Bacteriol. 182:2567-2573.
【非特許文献８】Parolis LA, Parolis H, Dutton GG. 1986. Structural studies of the O-antigen polysaccharide of Escherichia coli 09a. Carbohydr.Res. 155:272-276.
【非特許文献９】Kido et al. 1997, Microbiol. Immunol. 41:519-525
【非特許文献１０】Van der Meer et al. (Infection and Immunity 1994, 62(3):1052-1057)
【非特許文献１１】Trautmann et al. (Infection and Immunity 1994, 62(4):1282-1288)
【非特許文献１２】Pollack et al. (Journal of Clinical Investigation 1987, 79(5):1421-1430)
【非特許文献１３】Yokochi et al. (Infection and Immunity 1992, 60(11):4953-4956)
【非特許文献１４】Curvall et al. (Acta Chemica Scandinavica 1973, 27:2645-2649)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、クレブシエラ・ニューモニエ感染症の予防または治療に使用するための、病原体をターゲティングする改良された適合性を備えた、クレブシエラ・ニューモニエを指向する抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この目的は本発明の対象によって解決される。
本発明によれば、クレブシエラ・ニューモニエＬＰＳの抗原構造体の交差反応性エピトープ、すなわちＯ３ｂエピトープを特異的に認識し、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する、交差中和モノクローナル抗体が提供され、抗体は
ａ）図１、特に表１ａもしくは表１ｂに挙げる、いずれかの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列；または
ｂ）図２ｂに示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬ配列；
のいずれか１つを含み、あるいは
ｃ）ａ）もしくはｂ）の配列を特徴とする親抗体の機能活性バリアントである；
その機能活性バリアントは親抗体と同じエピトープを結合するかまたは親抗体と競合する特異性を有し、親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６（親ＣＤＲ配列）のうちいずれか１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含み、その機能活性バリアントは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異を含み、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００２３】
特に、本発明の抗体はクレブシエラ・ニューモニエのリポ多糖（ＬＰＳ）抗原構造体の交差反応性エピトープ、すなわちＯ３ｂエピトープを特異的に認識し、Ｏ３ａエピトープおよびＯ３エピトープと交差反応する、交差中和モノクローナル抗体であり、その抗体は下記のいずれかから選択される：
ａ）表１ａもしくは表１ｂに挙げるいずれか１つの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列を含む抗体；または
ｂ）図２ｂに示すいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体；または
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のうちいずれか１つである親抗体の機能活性バリアントである抗体；その機能活性バリアントは親抗体と同じエピトープを結合する特異性を有し、いずれかのＣＤＲ中に少なくとも１つの点変異を含み、その点変異の数はそれぞれのＣＤＲ配列において０、１、２、もしくは３つの点変異のいずれかであり、親ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する。
【００２４】
特に、それぞれのＣＤＲ配列における配列同一性が親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列と比較して少なくとも６０％である、機能活性バリアントが提供される。
特に、抗体は図１に挙げるいずれかの抗体の抗原結合部位を特徴とする抗体、殊に下記の抗体である：
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｖ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２２からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２３からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３３からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３４からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３５からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２６からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３６からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３８からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２７からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２８からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２９からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３９からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４０からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４１からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３０からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３１からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３２からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４２からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３４からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４３からなるＣＤＲ６；
ならびに
ｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２２からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７４からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３３からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３４からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３５からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体。特に、機能活性バリアントは本明細書中にさらに記載する特色を特徴とする。
【００２５】
具体的には、本明細書に述べるＫａｂａｔによるＣＤＲ配列はＫａｂａｔ命名法に従って決定した抗体のアミノ酸配列であると解釈される(参照：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S.Department of Health and Human Services. (1991))。
【００２６】
特に、抗体は下記のものである：
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｖ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４６からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５６からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５８からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４７からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４８からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４９からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５９からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６０からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６１からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５０からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５１からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５２からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６２からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６３からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６４からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５３からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５４からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５５からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６５からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６６からなるＣＤＲ６；
ならびに
ｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ４５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６７からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５６からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５７からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５８からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＩＭＧＴのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体。特に、機能活性バリアントは本明細書中にさらに記載する特色を特徴とする。
【００２７】
特に、グループメンバーｉ）〜ｖ）のそれぞれを親抗体として用いて機能活性バリアント抗体を作製できる。特に、機能活性バリアントはＣＤＲ１〜６を含み、
ａ）ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ７５を含む；
ｂ）ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ７６を含む；
ｃ）ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ７７を含む；
ｄ）ＣＤＲ４はＳＥＱ  ＩＤ  ７８を含む；
ｅ）ＣＤＲ５はＳＥＱ  ＩＤ  ５７を含む；および
ｆ）ＣＤＲ６はＳＥＱ  ＩＤ  ７９を含む；
これらのＣＤＲ配列はＩＭＧＴによるものであり、
これらにおいてそれぞれのＣＤＲ配列はその親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する。
ＳＥＱ  ＩＤ  ７５：  ＧＦＸＦＳＲＸＷ，
位置３のＸは、ＴまたはＤである；
位置７のＸは、ＮまたはＨである；
ＳＥＱ  ＩＤ  ７６：  ＩＫＸＤＧＳＥＸ，
位置３のＸは、ＡまたはＫである；
位置８のＸは、ＫまたはＥである；
ＳＥＱ  ＩＤ  ７７：  ＡＲＧＰＳＹＧＤＲＸＤＹＬＤＸ，
位置１０のＸは、ＣまたはＳである；
位置１５のＸは、ＨまたはＮである；
ＳＥＱ  ＩＤ  ７８：  ＱＸＬＬＥＸＮＧＨＮＹ
位置２のＸは、ＳまたはＷである；
位置６のＸは、ＰまたはＳである；
ＳＥＱ  ＩＤ  ７９：  ＭＱＰＬＸＴＰＹＴ
位置５のＸは、ＱまたはＫである；
位置６のＸは、ＴまたはＬである。
【００２８】
具体的には、本明細書に述べるＩＭＧＴによるＣＤＲ配列はＩＭＧＴ方式に従って決定した抗体のアミノ酸配列であると解釈される(The international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212)。
【００２９】
特定の態様によれば、抗体は下記のものである：
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｖｉｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １１からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １２からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １７からなるＶＬ；
ｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １３からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １８からなるＶＬ；
ｉｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １４からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １９からなるＶＬ；
ｖ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １５からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２０からなるＶＬ；
ｖｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６８からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
ｖｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６９からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
ならびに
ｖｉｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７０からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＶＬ；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体。特に、機能活性バリアントは本明細書中にさらに記載する特色を特徴とする。
【００３０】
特に、本明細書に記載する抗体の機能活性バリアントは、そのような抗体の機能性バリアントである；たとえば、図１の表に例示した抗体と実質的に同じ結合特異性をもつ機能性バリアントであって、そこに提示される６つのＣＤＲ配列により形成される、および／またはＶＨおよびＶＬ抗体ドメインそれぞれ、たとえば図２に提示する配列を特徴とするＶＨおよびＶＬドメインの対合により形成される、結合部位を含むもの。
【００３１】
バリアントを提供する目的で、そのような抗体を本明細書中で親抗体と呼び、ＣＤＲまたはフレームワーク（ＦＲ）配列を本明細書中で親ＣＤＲまたは親フレームワーク配列と呼ぶ。本明細書に記載するいずれかの抗体配列を“親”配列とみなし、それらをたとえば１以上の点変異により変異させることができるのは十分に理解されるであろう。
【００３２】
特定の側面によれば、機能性バリアント抗体は親抗体と同じエピトープを結合する。
さらなる特定の側面によれば、機能性バリアント抗体は親抗体と同じ結合部位を含む。
一般に、そのようなバリアント抗体は交差反応性エピトープに競合結合する。結合の競合は好ましくは競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはＢＬＩもしくはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定される。
【００３３】
いずれかの親抗体と競合して結合する抗体または例示した抗体（親抗体）のいずれかの機能性バリアントは、特に競合ＥＬＩＳＡ分析またはＢＬＩもしくはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定した結合の相対的な阻害を特徴とし、その相対的な阻害は好ましくは３０％より大きい。
【００３４】
特に、例示した抗体およびその機能性バリアントは、Ｏ３ｂエピトープを指向する結合特異性、ならびにＯ３ａおよびＯ３構造にも含まれている構造を特徴とし、その結果、交差反応性（汎−Ｏ３特異性(pan-O3 specificity)とも呼ばれる）が生じる。特に、例示した抗体はこれらのＯ３グループ血清型に明らかに含まれているマンナン構造を認識する。
【００３５】
そのほか、交差反応性エピトープは、他のいずれかのクレブシエラ・ニューモニエ、たとえば血清型Ｏ５により発現する可能性もある。ある例において、抗体はＯ５  ＬＰＳと交差反応することが見出された；たとえばｍＡｂ  ＵａＬＰＬＯ３−０９５（本明細書中でＭＰＧ−０９５とも呼ぶ）は、マンノース反復単位を特徴とするマンナンＬＰＳ分子であるクレブシエラ・ニューモニエＯ５抗原とも反応した。したがって、本明細書に記載する抗体と他の生物（微生物、たとえばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)またはＨＩＶ）、さらに癌細胞などにおけるマンナンとの交差反応性の可能性がある。
【００３６】
さらなる特定の側面によれば、抗体はクレブシエラ・ニューモニエの非マンナンＬＰＳ分子のエピトープとは交差反応しない。そのような非マンナンＬＰＳ分子は、たとえばＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１２  ＬＰＳ分子である。特に、その抗体は他のいずれのクレブシエラ・ニューモニエ抗原とも交差反応せず、および／またはその抗体はより低い親和性でクレブシエラ・ニューモニエの他のいずれかの非マンナンＬＰＳ抗原に結合し、その際、他のクレブシエラ・ニューモニエ抗原（Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、またはＯ３抗原のいずれか以外のもの）よりもＯ３ｂ、Ｏ３ａ、またはＯ３エピトープのいずれかまたはすべてを優先的に結合するＫＤ差は、少なくとも２  ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３  ｌｏｇである。
【００３７】
特に、非−交差反応は、イムノアッセイ  ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、フローサイトメトリー、ＢＬＩ）により、Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、もしくはＯ３抗原のいずれかもしくはすべて、または抗原を発現する細菌、およびその抗体が有意には結合しない追加の対照抗原（単数また複数）を用いて判定される。
【００３８】
機能活性バリアント抗体は、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかにおいて異なる可能性、あるいは共通のＶＨおよびＶＬ配列を共有し、各ＦＲに修飾を含む可能性がある。親抗体から変異形成により誘導されるバリアント抗体は、当技術分野で周知の方法により作製できる。
【００３９】
ある抗体の機能性バリアントは、たとえば抗体の親和性を改善するために、特にＣＤＲ変異抗体（少なくとも１つのＣＤＲバリアントを含む）を得るように工学操作することができる。特に、機能活性バリアントは機能活性ＣＤＲバリアントであり、それは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異をもち、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００４０】
具体的バリアントは、たとえば親抗体のヒトバリアントまたは人工バリアントであり、その際、親ＣＤＲ配列がヒトまたは人工のフレームワーク配列（たとえば非ヒト由来のもの、たとえば１以上の点変異を含むヒト  フレームワーク配列）に組み込まれ、その際、親抗体またはヒト化抗体の安定性、特異性および親和性を改善するために、場合により点変異の導入によって親ＣＤＲ配列それぞれの１、２、３、または４つのアミノ酸残基がさらに変異していてもよい。
【００４１】
特定の側面によれば、抗体は人工のＣＤＲおよびフレームワーク配列、たとえば非ヒト由来のものを含み、その際、人工の非天然配列が得られるように少なくとも１つのＣＤＲおよびフレームワーク配列が１以上の点変異を含む。
【００４２】
特定の側面によれば、
ａ）Ｏ３ｂエピトープが、１以上のＯ３ｂ抗原トリマンノースホモポリマー反復単位を含有する式（Ｉ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のＬＰＳ  Ｏ３ｂ抗原に組み込まれており、その際、式（Ｉ）は下記のものである：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ；
ｂ）Ｏ３ａエピトープが、１以上のＯ３ａ抗原テトラマンノースホモポリマー反復単位を含有する式（ＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３ａ抗原に組み込まれており、その際、式（ＩＩ）は下記のものである：
ＭｅＰ→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→［３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→］ｎ；
および
ｃ）Ｏ３エピトープが、１以上のＯ３抗原ペンタマンノースホモポリマー反復単位を含有する式（ＩＩＩ）の構造を含むクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ  Ｏ３抗原に組み込まれており、その際、式（ＩＩＩ）は下記のものである：
ＭｅＰ(R)３）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)３）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)［３）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)２）−a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)３）−  a−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１(R)］ｎ
［式中の
ＭｅＰはメチルホスフェートであり；
ｎは０〜５０である］。
【００４３】
特に、メチルホスフェート基はマンノース残基の非還元末端に位置する。
Ｏ３ｂエピトープは、具体的には式（Ｉ）に示すトリマンノース反復単位を特徴とする。
【００４４】
Ｏ３ａエピトープは、具体的には式（ＩＩ）に示すテトラマンノース反復単位を特徴とする。
Ｏ３エピトープは、具体的には式（ＩＩＩ）に示すペンタマンノース反復単位を特徴とする。
【００４５】
そのような交差反応性抗体はＯ３グループ特異性を特徴とし、それはＯ３ｂエピトープを指向し、さらにＯ３ａとＯ３の両方のエピトープを指向する（すなわち、交差反応性）。特に、抗体は汎−Ｏ３特異的抗体であり、特にＯ３ｂ−エピトープを認識し、またはそれに結合し、かつＯ３ａ−エピトープおよびＯ３−エピトープと交差反応する。交差反応性は、特にＯ３ａおよびＯ３  ＬＰＳ抗原中にＯ３ｂ−エピトープが存在することに基づく。
【００４６】
特に、抗体は交差反応性抗体により認識されるエピトープ（本明細書中で交差反応性エピトープと呼ぶ）を結合する高親和性抗体である；たとえば、１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満のＫＤをもつＯ３ａ抗原を用い、二価結合（たとえば、全長ＩｇＧ抗体）についてのバイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)により、殊に実施例２に記載の方法を用い、ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ計測器およびｆｏｒｔｅＢＩＯ分析を利用して測定。そのような方法により、特に結合のアビディティー、すなわち本明細書中で“アビッド(avid)結合親和性”とも呼ぶものが測定される。
【００４７】
結合の高親和性は、各Ｆａｂフラグメントについての親和性（一価結合）を測定した場合に確認できる。
本明細書に記載する高い結合親和性は、特にアビッド結合親和性（二価結合剤について決定したもの）および／または親和性（アフィニティー）（一価結合剤について決定したもの）のいずれかに関するものである。
【００４８】
特定の態様によれば、抗体は、Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、またはＯ３抗原のいずれかまたはすべて、特にＯ３ａ抗原またはエピトープを、１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満、よりさらに好ましくは１０−８Ｍ未満、もしくは好ましくは１０−９Ｍ未満、もしくは好ましくは１０−１０Ｍ未満のＫＤで、たとえばピコモル濃度の範囲の親和性（たとえば、二価結合に際してのアビッド結合親和性を測定する場合に、アビッド結合親和性の尺度としてのＫＤ）、および／または１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＫＤ（一価結合に際しての親和性を測定する場合）で結合する親和性をもつ。
【００４９】
特に、汎−Ｏ３特異的抗体はＯ３ｂ−エピトープ、Ｏ３ａ−エピトープおよびＯ３−エピトープのそれぞれを高親和性で、たとえば１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、よりさらに好ましくは１０−９Ｍ未満（二価結合に際してのアビッド結合親和性を測定する場合、または一価結合に際しての親和性を測定する場合）のＫＤで、結合することができる。
【００５０】
さらに、抗体はＯ３ｂ、Ｏ３ａ、またはＯ３抗原のいずれかを他のＯ３グループ抗原より優先的に結合することができる（たとえば、１または２  ｌｏｇのＫＤ差で）。
標準的な変異形成法を用いる親和性成熟により作製される、親抗体（たとえば、例示ｍＡｂを親ｍＡｂとして使用）のバリアント、すなわち本明細書中で親和性成熟バリアントと呼ぶものは、親抗体と比較して少なくとも１  ｌｏｇ、または２  ｌｏｇ、または３  ｌｏｇの差で増大した（アビッド）結合親和性をもつ可能性がある。親和性成熟バリアントは一般にＯ３ｂ−抗原を１０−７Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満のＫＤで結合する親和性をもつ。親抗体が１０−７Ｍ未満または１０−８Ｍ未満のＫＤの親和性をもち、その親抗体が親和性成熟を受ければ、親和性成熟バリアントはよりさらに高い、それぞれ１０−８Ｍ未満および１０−９Ｍ未満のＫＤの親和性をもつ可能性がある。
【００５１】
Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、もしくはＯ３エピトープ、またはそれぞれの抗原を、本明細書中でＯ３グループのエピトープまたは抗原（またはＯ３グループタイプ）と呼ぶ。特に、本明細書に記載する抗体はたとえばフローサイトメトリーにより測定してクレブシエラ・ニューモニエ表面Ｏ３グループ抗原を結合することができ、本明細書中でＯ３グループ交差反応性抗体と呼ばれる。
【００５２】
特に、その抗体は交差中和抗体であり、クレブシエラ・ニューモニエ株血清型Ｏ３ｂ、Ｏ３ａおよびＯ３のエンドトキシンを中和する中和力価をもつ。特に、たとえばインビトロまたはインビボ検出法により測定して、その抗体はいずれかのＯ３グループのエピトープまたはそれぞれの抗原を含むＬＰＳ分子を発現するクレブシエラ・ニューモニエ株のエンドトキシンを中和する。
【００５３】
特に、その抗体は対応する特異的ＬＰＳ分子を発現する細菌のエンドトキシン作用をインビボで中和する。それの機能はインビトロアッセイにより測定できる。その抗体は、エンドトキシン機能を中和することによりＯ３グループタイプのクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である；たとえばインビトロＬＡＬアッセイ、またはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）レポーターアッセイにより測定して、対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）と比較して少なくとも２０％のエンドトキシン活性低減。
【００５４】
その抗体は特に、致死的なエンドトキセミアを中和することができる。そのような機能活性は適切なインビボモデル、たとえばGalanos et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. 1979, 76:5939-5943)に記載されているエンドトキセミアのＧａｌＮモデルにおいて判定できる。特定の側面によれば、抗体はヒトおよび非ヒト動物の両方を含めた動物においてターゲット病原体を中和し、インビボで、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかのモデルにおいて、発病を阻止する。
【００５５】
特に、中和力価は少なくとも、図１に定めたＣＤＲ配列を特徴とする、および／または図２に定めたＶＨおよびＶＬ配列を特徴とする、いずれかの例示抗体の力価であり、例示抗体は機能性バリアントの中和力価を決定する際の基準抗体として用いられる。
【００５６】
特定の側面によれば、抗体は完全長抗体、その抗体フラグメント、または融合タンパク質のいずれかであり、それぞれが少なくとも交差反応性エピトープを認識する結合部位を含むＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む。特に、抗体は全長ＩｇＧ１、二重特異性ＩｇＧ１、またはＦ（ａｂ’）２−フラグメントのいずれかである。
【００５７】
特に、抗体はヒト抗体、またはその誘導体であって人工配列もしくは動物配列（ヒト以外のもの）が組み込まれたものである；たとえば、ヒトＩｇＧ抗体、またはヒトＣＤＲ配列もしくはそのいずれかの機能性ＣＤＲバリアントおよび動物化（たとえばイヌ化）抗体を得るための動物（非ヒト）フレームワークを含む抗体。
【００５８】
特に、本明細書に記載する抗体は完全ヒト抗体である。
例に記載する抗体はヒト由来のもの、またはその親和性成熟バリアントであり、特に抗体は人工アミノ酸配列を含む非天然抗体である。人工配列（非天然）を含むバリアントは、変異形成により、または本明細書にさらに記載するように得ることができる。
【００５９】
特に、抗体はＩｇＡ抗体、またはそのＩｇＡからＩｇＧへのアイソタイプスイッチバリアント(isotype switch variant)である。Ｆｃ部分はいかなる免疫グロブリンアイソタイプのものであってもよく、殊にＩｇＧ（たとえばＩｇＧ１）抗体のものである。
【００６０】
特定の側面によれば、本発明の抗体はＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、それらにおいてフレームワーク配列にはヒト、人工または動物配列が含まれる。特に抗体は１以上の定常ドメインを含み、それらはＩｇＧ抗体のもの、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプのもの、またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体のものである。
【００６１】
図２ｂに示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬそれぞれ（本明細書中で“親”ＶＨまたは“親ＶＬ”と呼ぶ）と比較してそれぞれのＦＲまたはＣＤＲ配列に修飾をもつバリアントＶＨまたはＶＬドメインであって、機能活性であり、たとえば親抗体と同じエピトープに結合し、あるいは同じ結合部位を含み、あるいは同じ結合特性をもつものを使用できる。本明細書に記載する抗体のＦＲまたはＣＤＲ配列のうちあるものを他の抗体のものと交換することもできる。
【００６２】
特に、下記のものを含むバリアントＶＨまたはバリアントＶＬを提供することができる：
ａ）親ＶＨもしくはＶＬの６つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）配列のセット、または本明細書にさらに記載するように特に少なくとも１つのＣＤＲ配列が親ＣＤＲの機能活性ＣＤＲバリアントである６つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）配列のセット；および
ｂ）親ＶＨまたはＶＬのＦＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を特徴とするＦＲ配列。
【００６３】
特に、抗体は図１に挙げるＣＤＲ配列のいずれかの機能活性ＣＤＲバリアントを含み、その機能活性ＣＤＲバリアントは下記のうち少なくとも１つを含む：
ａ）親ＣＤＲ配列における１、２、もしくは３つの点変異；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列中の４つのＣ−末端もしくは４つのＮ−末端もしくは４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１または２つの点変異；および／または
ｃ）ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列それぞれにおける、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％の配列同一性；
好ましくは、その際、機能活性ＣＤＲバリアントは４または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列中に１または２つの点変異を含む。
【００６４】
特に、機能活性バリアントは、好ましくはＣＤＲ中のアミノ酸配列における少なくとも１つの点変異において親抗体と異なり、その際、それぞれのＣＤＲアミノ酸配列における点変異の数は０、１、２または３のいずれかである。
【００６５】
特定の側面によれば、点変異は１以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失および／または挿入のいずれかである。
特定の側面によれば、クレブシエラ・ニューモニエの感染または定着のリスクがあるかまたはそれに罹患している対象を処置して、その対象における感染を制限し、またはその感染から生じる病状を改善するのに使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎を治療または予防するための、抗体が提供される。
【００６６】
したがって、本発明はさらに、それぞれの適応症において有効量の抗体を投与することにより対象を処置する方法を提供する。
特に、対象はヒトである。特に、対象は健康であるかまたは疾病に罹患しているいずれかのヒトである。特に、ヒトは免疫不全状態、殊に免疫無防備状態または免疫抑制状態の患者、またはそれに接触する者である。
【００６７】
特に、対象は食細胞の数および／または機能が損なわれていることを特徴とするホストグループの対象であり、そのホストグループは下記のいずれかである：
ａ）遺伝性または後天性の原発性または続発性免疫不全に罹患している患者；
ｂ）２８日齢未満の新生児、６５歳より高齢の患者、糖尿病、腎不全、肝硬変、トリソミー２１、外傷もしくはＨＩＶに罹患している患者、または外科的介入もしくはコルチコステロイドによる全身処置を受けた患者からなる群から選択される患者；あるいは
ｃ）特に緊急治療室または集中治療室の入院患者または病院関係者であって、クレブシエラ・ニューモニエ疾患に罹患している患者に曝露された際に感染を受けるリスクを伴なう者。
【００６８】
特に、抗体はクレブシエラ・ニューモニエ疾患の院内または医原性アウトブレイクを阻止するために用いられる。
特に、本発明に従って使用するための抗体が提供され、その際、その対象の生体試料をその抗体と接触させることにより対象におけるＯ３タイプのクレブシエラ・ニューモニエの全身的な感染または定着をエクスビボ判定し、その際、抗体の特異的な免疫反応により感染または定着が決定される。
【００６９】
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を非経口（たとえば、ｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．）配合物中に含む、医薬製剤を提供する。
【００７０】
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体をコードする単離核酸を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体の結合部位あるいはＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質構築体、たとえばポリペプチドもしくはタンパク質またはタンパク質誘導体を含むかまたはそれからなるものを発現するためのコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミドを提供する。
【００７１】
本発明はさらに、本明細書に記載する発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体を製造するための方法であって、その抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養または維持する方法を提供する。
【００７２】
特に好ましいのは、宿主細胞が下記のものを含む、宿主細胞およびそのような宿主細胞を用いる製造方法である：
−  抗体軽鎖を発現するためのコード配列が組み込まれた、本発明のプラスミドまたは発現カセット；および
−  抗体重鎖を発現するためのコード配列が組み込まれた、本発明のプラスミドまたは発現カセット。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１−１】図１：表１ａおよび１ｂ：  表１ａ：例示モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＤＲ配列；これらのＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表記されている；  表１ｂ：例示モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＤＲ配列；これらのＣＤＲ配列はＩＭＧＴのナンバリングシステムに従って表記されている；  本明細書中で用いる名称は下記の意味をもつ：ＶＨ  ＣＤＲ１  ＝  ＣＤＲ１ＶＨ  ＣＤＲ２  ＝  ＣＤＲ２ＶＨ  ＣＤＲ３  ＝  ＣＤＲ３ＶＬ  ＣＤＲ４  ＝  ＣＤＲ４  ＝  ＶＬ  ＣＤＲ１ＶＬ  ＣＤＲ５  ＝  ＣＤＲ５  ＝  ＶＬ  ＣＤＲ２ＶＬ  ＣＤＲ６  ＝  ＣＤＲ６  ＝  ＶＬ  ＣＤＲ３  表１ａおよび１ｂに挙げる抗体のＶＨおよびＶＬ配列を図２に提示する；  ＵａＬＰＬＯ３−６０１と表記する抗体は、本明細書中でＭＰＧ−６０１、ｍＡｂ  ６０１またはＭＰＧＯ３−６０１とも呼ばれる；  ＵａＬＰＬＯ３−０９５と表記する抗体は、本明細書中でＭＰＧ−０９５またはＭＰＧＯ３−０９５とも呼ばれる；  ＵａＬＰＬＯ３−２０８Ｌと表記する抗体は、本明細書中でＭＰＧ−２０８ＬまたはＭＰＧＯ３−２０８Ｌとも呼ばれる；  ＵａＬＰＬＯ３−５４７と表記する抗体は、本明細書中でＭＰＧ−５４７またはＭＰＧＯ３−５４７とも呼ばれる；  ＵａＬＰＬＯ３−５５５と表記する抗体は、本明細書中でＭＰＧ−５５５またはＭＰＧＯ３−５５５とも呼ばれる；  ＭＰＧ６０１  Ｃ１０８Ｓと表記する抗体は、実施例７に記載するように、ＶＨ配列中に点変異Ｃ１０８Ｓを含む、ＭＰＧ−６０１の変異体である。ＭＰＧ６０１  Ｃ１０８Ｓと表記する抗体の軽鎖（ＶＬ−ＣＤＲおよびＶＬ）配列は、ＭＰＧ−６０１と表記する抗体のものと同じである；  ＭＰＧ６０１  Ｈ９７Ｙと表記する抗体は、実施例７に記載するように、ＶＨ配列中に点変異Ｈ９７Ｙを含む、ＭＰＧ−６０１の変異体である。ＭＰＧ６０１  Ｈ９７Ｙと表記する抗体の軽鎖（ＶＬ−ＣＤＲおよびＶＬ）配列は、ＭＰＧ−６０１と表記する抗体のものと同じである；  ＭＰＧ６０１  Ｃ１０８Ｓ／Ｈ９７Ｙと表記する抗体は、実施例７に記載するように、ＶＨ配列中に点変異Ｃ１０８ＳおよびＨ９７Ｙを含む、ＭＰＧ−６０１の変異体である。ＭＰＧ６０１  Ｃ１０８Ｓ／Ｈ９７Ｙと表記する抗体の軽鎖（ＶＬ−ＣＤＲおよびＶＬ）配列は、ＭＰＧ−６０１と表記する抗体のものと同じである。
【図１−２】同上。
【図２−１】図２：例示ｍＡｂのＶＨおよびＶＬ配列：ヌクレオチド配列（図２ａ）、およびアミノ酸配列（図２ｂ）。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図３−１】図３：完全ヒト抗−クレブシエラ・ニューモニエＯ３  Ｏ−抗原抗体の同定；（ａ）推定ビオチニル化部位を含むＯ３  Ｏ−抗原ベイト（釣り餌）(bait)の模式的な線状化学構造；四角は反復単位を示す；ＣＰ＝共通部分；＊＝（４−１）  αＨｅｐまたはＨ。（ｂ）シングルＯ３  Ｏ−抗原ベイト（中実黒丸）または非反応性（中空灰色丸）７−ＡＡＤ−、ＣＤ１９＋粘膜固有層(lamina propria)細胞の蛍光強度およびソートゲート（四角で囲んだ）。（ｃ）ＩｇＡ粘膜固有層プラズマ細胞芽球のＩＧＨＶ体細胞超変異(somatic hypermutation)の数。ＥＬＩＳＡによる、ビオチニル化Ｏ３−抗原ベイトへのモノクローナルＩｇＧ１抗体の濃度依存性結合（ｄ）、およびイムノブロットによる全Ｏ３ａ  ＬＰＳへの結合（ｅ）；ｍＧＯ５３＝陰性対照。（ｆ）（ｄ）に示したＥＬＩＳＡデータからのビオチニル化Ｏ３  Ｏ−抗原およびストレプトアビジン（ＳＡ）に対する曲線下面積（ＡＵＣ）値；線は同一抗体をつないでいる；ｂ，ｆ−ｈ：少なくとも２つの独立した実験からの代表的データ；実線は平均を示す；誤差バー＝標準偏差；破線＝陰性カットオフ；  図３：Ｉｇ遺伝子特徴（表）。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【図４−１】図４：Ａ）菌株ＰＣＭ−１１（Ｏ３ａ）、Ｂ）菌株Ｋｐ１４（Ｏ３）、およびＣ）菌株Ｋｐ８１（Ｏ３ｂ）についての表面染色におけるヒトＯ３  ｍＡｂの力価測定。
【図４−２】同上。
【図５−１】図５ａ：インビトロアッセイにおけるＯ３  ｍＡｂによるＬＰＳ中和。ＰＭＢは、陽性対照として用いた有効なＬＰＳ中和剤であるポリミキシンＢを示す。
【図５−２】図５ｂ．ＣＤＣ活性を決定するための血清殺細菌アッセイ。クレブシエラ・ニューモニエ臨床分離株Ａ）Ｋｐ１４およびＢ）Ｋｐ８１を、５０％枯渇(depleted)ヒト血清中において２．５μｇ／ｍｌの特異的または対照ｍＡｂの存在下で培養した。殺細菌活性を、播種時点（Ｔ０）に対比した３時間のインキュベーション後に回収された細菌のパーセントとして表示する；両方の時点でアリコートを平板培養することにより決定したもの。グラフは４つの実験（両方のドナー血清について２回反復）の結果を合わせたものを示す。棒はＳＥＭ付き平均を示す。対照ｍＡｂとｍＡｂ  ６０１との差は、マン−ホイットニー(Mann-Whitney)検定でｐ＜０．０５であれば統計的に有意であるとみなされた（＊で示す）。
【図６】図６：ＧａｌＮ感作した菌血症のマウスモデルにおいて、クレブシエラ・ニューモニエ生菌による致死的攻撃に対してＯ３特異的ｍＡｂ（２００および２０μｇ／マウス）により誘導された防御。グラフはマウス５匹のグループについての１つの代表的実験の結果を示す。
【図７】図７：Ｏ３グループまたはＯ５クレブシエラ・ニューモニエ株から精製したＬＰＳを用いてイムノブロットにおいて判定した反応性に基づく、およびインビトロで判定したＯ３ｂ  ＬＰＳの中和に基づく、５つのｍＡｂの選択。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、抗体ドメイン（免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインであると解釈される）からなるかまたはそれらを含み、リンカー配列を含むかまたは含まない、ポリペプチドまたはタンパク質を表わすものとする。ポリペプチドは、抗体ドメイン構造体の少なくとも２つのベータ鎖がループ配列により連結したものからなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインであると解釈される。抗体ドメインは天然構造のものであってもよく、あるいはたとえば抗原結合特性または他のいずれかの特性、たとえば安定性または機能特性、たとえばＦｃ受容体であるＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために、変異形成または誘導体化により修飾されていてもよい。
【００７５】
本明細書中で用いる抗体は、１以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープを結合する特異的結合部位をもち、具体的には下記のものがそれに含まれる：単一の可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨの、ＣＤＲ結合部位；あるいは可変抗体ドメイン対、たとえばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対と定常抗体ドメインを含む抗体、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、または完全長抗体の結合部位。
【００７６】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、特に、下記のものを含むかまたはそれらからなる抗体フォーマットを表わすものとする：単一の可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨ；あるいは可変および／または定常抗体ドメインの組合わせであって連結配列またはヒンジ領域を含むかまたは含まないもの：これには可変抗体ドメイン対、たとえばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対と定常抗体ドメインを含むかまたはそれらからなる抗体、たとえば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または完全長抗体、たとえばＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ（たとえば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２サブクラス）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭアイソタイプ抗体が含まれる。用語“完全長抗体”は、少なくとも天然抗体モノマーに一般的にみられるＦｃドメインおよび他のドメインの大部分を含むいずれかの抗体分子を表わすために使用できる。この句は本明細書中で特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられる。
【００７７】
用語“抗体”は、特に単離された形態の抗体を含むものとし、それらは他の抗体、すなわち異なるターゲット抗原に対する抗体または異なる構造アレンジメントの抗体ドメインを含む抗体を実質的に含まない。ただし、単離された抗体は、単離された抗体と、たとえば少なくとも１種類の他の抗体、たとえば異なる特異性をもつモノクローナル抗体または抗体フラグメントとの組合わせを含有する組合わせ製剤に含まれていてもよい。
【００７８】
用語“抗体”は、ヒト種を含む動物、たとえばヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、リャマ、ウシおよびウマを含む哺乳類、または鳥類、たとえばニワトリに由来する抗体に適用されるものとし、この用語は特に、動物由来の配列、たとえばヒトの配列をベースとする組換え抗体を含むものとする。
【００７９】
用語“抗体”はさらに、異なる種に由来する配列、たとえばネズミおよびヒトに由来する配列を含む、キメラ抗体に適用される。
抗体に関して用いる用語“キメラ”は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列それぞれの一部が特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に対して相同であり、一方、その鎖の残りのセグメントは他の種またはクラスにおける対応する配列に対して相同である抗体を表わす。一般に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は哺乳動物のある種に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部は他の種に由来する抗体の配列と相同である。たとえば、非ヒト宿主生物由来の容易に入手できるＢ細胞またはハイブリドーマを用いて現在既知の供給源から可変領域を誘導し、たとえばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせることができる。
【００８０】
用語“抗体”は、さらにヒト化抗体に適用できる。
抗体に関して用いる用語“ヒト化”は、実質的に非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位をもち、その分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列をベースとする分子を表わす。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが可変ドメイン中の適宜なフレームワーク領域にグラフトしたもののいずれを含むこともできる。抗原結合部位は、野生型、またはたとえば１以上のアミノ酸置換により修飾されたもの、好ましくはヒト免疫グロブリンにいっそう近似するように修飾されたものであってもよい。ある形態のヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列を保存している（たとえば、マウス抗体由来の６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は元の抗体に対して変異した１以上のＣＤＲをもつ。
【００８１】
用語“抗体”はさらに、ヒト抗体に適用される。
抗体に関して用いる用語“ヒト”は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域をもつ抗体を含むと解釈される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異形成により、またはインビボでの体細胞変異により、導入された変異）を、たとえばＣＤＲ中に含むことができる。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体、あるいはヒトＢ細胞から免疫グロブリン遺伝子クローニングおよび組換え抗体発現によりまたは不死化したヒトヒトＢ細胞系から誘導された抗体が含まれる。
【００８２】
本明細書中で用いる用語“完全ヒト抗体”は、それぞれがヒト源、たとえばヒト抗体配列を発現する細胞、ヒト抗体配列を提示するライブラリー、またはヒト抗体配列をコードする遺伝子に由来するヒト部分、特にヒトＣＤＲ、ヒトＦＲ、およびヒト定常領域のみから構成されるヒト抗体を表わす。完全ヒト抗体は、天然抗体であってもよく、あるいはそれぞれ異なる起源から得られる部分で構成され、したがって自然界には存在しないと解釈される人工抗体であってもよい。代表的な人工の完全ヒト抗体はヒト抗体のヒトスイッチバリアントであり、その際、少なくとも１つの定常領域が異なるアイソタイプのヒト抗体から得られる。
【００８３】
用語“抗体”は、具体的にはいかなるクラスまたはサブクラスの抗体にも適用される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を主要クラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに配属することができ、これらのうち幾つかはさらにサブクラス、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類できる。
【００８４】
この用語はさらに、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、特に組換え抗体に適用され、この用語には、組換え手段により製造、発現、作製または単離されたすべての抗体および抗体構造体、たとえば動物、たとえばヒトを含めた哺乳類に由来する抗体であって、異なる由来の遺伝子または配列を含むもの、たとえばネズミ、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来の抗体が含まれる。さらなる例は、その抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングまたは融合することを伴なう他のいずれかの手段により製造、発現、作製または単離された抗体を表わす。
【００８５】
用語“抗体”は抗体の誘導体、特に機能活性誘導体をも表わすと解釈される。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメインもしくは抗体のいずれかの組合わせおよび／または融合タンパク質であると解釈され、それらにおいては抗体のいずれかのドメインを１以上の他のタンパク質、たとえば他の抗体のいずれかの位置に融合させることができる；たとえば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチド、ただしリガンド、足場タンパク質、酵素、トキシンなどをも含む、結合構造体。抗体の誘導体は、種々の化学的手法、たとえば共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合などにより他の物質に会合または結合させることによって得ることができる。抗体に結合した他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機もしくは無機の分子、またはそのいずれかの組合わせ（たとえば、ＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であってもよい。特定の態様において、抗体は生物学的に許容できる化合物との特異的な相互作用を可能にする追加タグを含む誘導体である。抗体のターゲットへの抗体の結合に対するタグの負の影響が無いかまたは耐容できる限り、本発明に使用できるタグに関して特別な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、およびＳ−タグが含まれる。他の特定の態様において、抗体は標識を含む誘導体である。本明細書中で用いる用語“標識”は、“標識した”抗体を作製するために抗体に直接または間接的にコンジュゲートさせた検出可能な化合物または組成物を表わす。標識はそれ自体が検出可能であってもよく（たとえば放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合は基質である化合物または組成物の化学変化を触媒し、それが検出可能であってもよい。
【００８６】
本明細書に記載する好ましい誘導体は抗原結合に関して機能活性であり、好ましくは、たとえばＳＢＡ、ＯＰＫまたはＬＡＬアッセイで判定してクレブシエラ・ニューモニエと戦う効力、あるいは細菌攻撃に対して防御し、またはエンドトキセミアを中和する効力をもつ。
【００８７】
特に、本発明の抗体から誘導した抗体は、他の抗原と比較してＯ３グループ抗原に差示的、選択的または特異的に結合することにおいて機能活性である、少なくとも１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域またはそのＣＤＲバリアントを含むことができる。
【００８８】
親抗体または親抗体配列、たとえば親ＣＤＲまたは親ＦＲから誘導される抗体は、本明細書において特に、たとえばインシリコ(in silico)または組換え工学あるいは化学的な誘導体化または合成により得られた変異体またはバリアントであると解釈される。
【００８９】
用語“抗体”は抗体のバリアントをも表わすと解釈され、それには親ＣＤＲ配列の機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体、および親抗体の機能活性バリアント抗体が含まれる。
特に、本明細書に記載する抗体から誘導される抗体は重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲおよび軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲもしくはＦＲ領域のうち少なくとも１つまたはＨＣもしくはＬＣの定常領域に少なくとも１つの点変異をもち、機能活性であり、たとえばＯ３グループ抗原を特異的に結合することができる。
【００９０】
用語“バリアント”は特に、たとえば定常ドメインにおいて抗体の安定性、エフェクター機能もしくは半減期を工学操作するために、または可変ドメインにおいてたとえば当技術分野で利用できる親和性成熟法により抗原結合特性を改善するために、たとえば変異形成法、特に特定の抗体のアミノ酸配列もしくは領域における欠失、交換、挿入配列導入、またはアミノ酸配列の化学的誘導体化により得られた、変異抗体または抗体フラグメントなどの抗体を表わすものとする。既知のいずれかの変異形成法を使用でき、それには希望する位置においてたとえばランダム化法により得られる点変異が含まれる。ある場合には、位置はランダムに、たとえば抗体配列をランダム化するために可能なアミノ酸または選択した好ましいアミノ酸のいずれかについて選択される。用語“変異形成”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更するために当技術分野で認識されているいずれかの手法を表わす。好ましいタイプの変異形成には、エラープローンＰＣＲ(error prone PCR)変異形成、飽和変異形成(saturation mutagenesis)、または他の部位特異的変異形成が含まれる。
【００９１】
用語“バリアント”は、特に機能活性バリアントを包含するものとする。
本明細書中で用いる、ＣＤＲ配列の“機能活性バリアント”という用語は、“機能活性ＣＤＲバリアント”であると解釈され、本明細書中で用いる、抗体の“機能活性バリアント”という用語は、“機能活性抗体バリアント”であると解釈される。機能活性バリアントは、この配列（親抗体または親配列）を１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾することから得られる配列、あるいはアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドを、すなわち配列の一端または両端の、たとえばＣＤＲ配列においてＮ末端および／またはＣ末端の１、２、３または４個のアミノ酸、および／または中心（すなわち、ＣＤＲ配列の中央）の１、２、３または４個のアミノ酸を化学的に誘導体化することから得られる配列であって、その修飾がこの配列の活性に影響しないもの、特に、損なわないものを意味する。選択したターゲット抗原に対する特異性をもつ結合部位の場合、これが変化する可能性、たとえば特定のエピトープに対する微細な特異性、親和性（アフィニティー）、アビディティー、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度などが変化する可能性はあるけれども、抗体の機能活性バリアントはなお前決定した結合特異性をもつであろう。たとえば、特に親和性成熟抗体は機能活性バリアント抗体であると解釈される。したがって、親和性成熟抗体における修飾されたＣＤＲ配列は機能活性ＣＤＲバリアントであると解釈される。
【００９２】
たとえば、ＣＤＲバリアントは、ＣＤＲ領域における少なくとも１個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列を含み、その際、その修飾はアミノ酸配列の化学変化または部分的変更であってもよく、その修飾によりバリアントは非修飾配列の生物学的特性を保持することができる。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の欠失もしくは置換によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の付加もしくは挿入によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の化学的誘導体化によるもの、あるいはその組合わせであってもよい。
【００９３】
機能活性バリアントは、たとえば親抗体の配列を変化させることにより得ることができる；たとえば、図１に挙げるいずれかの抗体と同じ結合部位を含むけれども結合部位以外の抗体領域に修飾を伴なう抗体、またはそのような親抗体から結合部位内ではあるけれども抗原結合性を損なわない修飾により誘導される抗体であって、好ましくはＯ３グループ抗原を特異的もしくは選択的に結合する能力を含めて親抗体と実質的に同じ生物活性もしくは改善すらされた活性を備えた抗体。
【００９４】
特に、機能活性バリアントはＬＡＬアッセイまたはＴＬＲ−４レポーター細菌ベースのアッセイにおける中和効力、たとえばエンドトキシン中和機能をもち、たとえばターゲットであるクレブシエラ・ニューモニエに対する特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性を備えている。
【００９５】
本明細書中でターゲット抗原の結合または生物活性に関して用いる用語“実質的に同じ”は、匹敵する抗体または親抗体について判定して、実質的に同じ活性により示される活性、すなわち少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、たとえば少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、もしくはたとえば２００％に及ぶ活性、またはよりいっそう高い活性を表わす。
【００９６】
特に、本発明の抗体の機能活性バリアントは、Ｏ３グループ抗原のそれぞれを結合する効力、あるいはクレブシエラ・ニューモニエの他のもの（非マンナンＬＰＳまたは非−Ｏ３グループ抗原）と対比してＯ３グループ抗原のそれぞれに優先的に結合する特異性または選択性をもつ。好ましいバリアントは、クレブシエラ・ニューモニエの他の抗原には結合せず、ＫＤ値の差は少なくとも２  ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３  ｌｏｇであり、さらにＬＡＬまたはＴＬＲ４シグナル伝達アッセイにおいてたとえばその抗体を含まない対照試料と対比して有意のエンドトキシン活性低減を達成するエンドトキシン中和機能を含み、たとえばクレブシエラ・ニューモニエをターゲティングする特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性を備えている。機能性インビトロアッセイにおける有意の活性低減は、一般に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％、最大で約１００％（±１％）の完全低減に及ぶ低減を意味する。
【００９７】
好ましい態様において、親抗体の機能活性バリアントは 
ａ）親抗体の生物活性フラグメントであり、そのフラグメントは親分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは９７％、９８％または９９％を含む；
ｂ）親抗体から少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失により誘導され、その機能活性バリアントは親分子またはそれの一部に対して配列同一性をもつ；たとえば少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性をもつ抗体；および／または
ｃ）親抗体またはその機能活性バリアント、およびさらにそのポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対してヘテロロガス（非相同）である少なくとも１個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる。
【００９８】
本発明の好ましい一態様において、本発明による抗体の機能活性バリアントは本質的に前記のバリアントと同一であるが、それが異なる種の相同配列に由来するという点において、それぞれそれのポリペプチドまたはヌクレオチド配列と異なる。これらは天然のバリアントまたはアナログと呼ばれる。
【００９９】
用語“機能活性バリアント”には、天然のアレルバリアント、および変異体または他のいずれかの非天然バリアントも含まれる。当技術分野で知られているように、アレルバリアントは別形態の（ポリ）ペプチドであって、それはそのポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加をもつことを特徴とする。
【０１００】
機能活性バリアントは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列変更により、たとえば１以上の点変異により得ることができ、その際、本発明の組合わせに用いた場合にその配列変更は変化していないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持または改善する。そのような配列変更には（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入を含めることができるが、これらに限定されない。
【０１０１】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連性があるアミノ酸のファミリー内で行なわれるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小型側鎖、大型側鎖などを備えたアミノ酸である。
【０１０２】
点変異は、特にポリヌクレオチドの工学操作であって、１以上の単一（不連続）または二重のアミノ酸が異なるアミノ酸に置換もしくは交換され、欠失し、または挿入されている点において、工学操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすものであると解釈される。
【０１０３】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を表わす。これに関してアミノ酸は６４のトリプレットコドンによりコードされる２０種類の天然アミノ酸を表わす。これら２０種類のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷をもつものに分類できる：
“中性”アミノ酸をそれらのそれぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ，Ａ）  非極性，中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ，Ｎ）  極性，中性；
システイン：（Ｃｙｓ，Ｃ）  非極性，中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ，Ｑ）  極性，中性；
グリシン：（Ｇｌｙ，Ｇ）  非極性，中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ，Ｉ）  非極性，中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ，Ｌ）  非極性，中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ，Ｍ）  非極性，中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ，Ｆ）  非極性，中性；
プロリン：（Ｐｒｏ，Ｐ）  非極性，中性；
セリン：（Ｓｅｒ，Ｓ）  極性，中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ，Ｔ）  極性，中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ，Ｗ）  非極性，中性；
チロシン：（Ｔｙｒ，Ｙ）  極性，中性；
バリン：（Ｖａｌ，Ｖ）  非極性，中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ，Ｈ）  極性，正（１０％）  中性（９０％）
“正”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アルギニン：（Ａｒｇ，Ｒ）  極性，正；および
リジン：（Ｌｙｓ，Ｋ）  極性，正
“負”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ，Ｄ）  極性，負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ，Ｅ）  極性，負。
【０１０４】
本明細書に記載する抗体配列およびホモログに関する“アミノ酸配列同一性パーセント（％）”は、最大の配列同一性パーセントが達成されるように配列をアラインさせ、必要であればギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、候補配列中において特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の百分率と定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するのに適したパラメーターを決定できる。
【０１０５】
用語“抗原結合部位”または“結合部位”は、抗体の抗原結合に関与する部分を表わす。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）鎖および／または軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域の、すなわちその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の“超可変領域”と呼ばれる３つの高度に多様性である範囲が、より保存されたフレームワーク領域として知られるフランキング範囲間に挟まれている。抗原結合部位は結合したエピトープまたは抗原の三次元表面に対して相補的な表面を備えており、超可変領域は“相補性決定領域”、すなわち“ＣＤＲ”と呼ばれる。ＣＤＲに内包されている結合部位を本明細書中では“ＣＤＲ結合部位”とも呼ぶ。
【０１０６】
本明細書中で“ターゲット”または“ターゲット抗原”と互換性をもって用いる用語“抗原”は、ターゲット分子全体、またはそのような分子の、抗体の結合部位により認識されるフラグメントを表わすものとする。特に、一般に“エピトープ”、たとえばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと呼ばれる、抗原の免疫に関連する下部構造、たとえばポリペプチドまたは炭水化物構造を、そのような結合部位が認識できる。種々のＯ３抗原のような特定の抗原は炭水化物（マンナン）構造を含み、場合により人工的キャリヤー上に付与した単離された抗原として、あるいはそれらの抗原を発現するクレブシエラ・ニューモニエ細胞またはその細胞画分の形態で提供できる。
【０１０７】
本明細書中で用いる用語“エピトープ”は、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成するかまたは特異的結合パートナーの一部であってもよい分子構造体を表わすものとする。エピトープは炭水化物、ペプチド構造体、脂肪酸、有機物、生化学物質もしくは無機物またはその誘導体、およびそのいずれかの組合わせから構成される可能性がある。エピトープがペプチド構造体、たとえばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合、それは通常は少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、より好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸を含むであろう。エピトープは線状または立体構造のいずれかのエピトープの可能性がある。線状エピトープはポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントから構成される。線状エピトープは連続的でもオーバーラップしていてもよい。
【０１０８】
立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて三次構造を形成することによって互いに近づいたアミノ酸または炭水化物から構成され、それらのアミノ酸は線状配列中で必ずしも互いに隣接してはいない。特に、ポリペプチド抗原に関して、立体構造または不連続エピトープは、一次配列中では離れていたけれどもポリペプチドが折り畳まれて天然タンパク質／抗原になった際にその分子の表面で調和のとれた構造に組み立てられる２個以上の不連続なアミノ酸残基の存在を特徴とする。
【０１０９】
本明細書中で用語“エピトープ”は、特に、ある抗体によって認識される単一エピトープ、または少なくとも２つの異なる抗原によって共有され、場合により交差反応性抗体によって認識される交差反応性エピトープを表わすものとする。
【０１１０】
用語“発現”は、下記のように解釈される。目的とする発現生成物（たとえば本明細書に記載する抗体）のコード配列および作動可能な状態で連結した制御配列（たとえばプロモーター）を含む核酸分子を、発現の目的に使用できる。これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を産生することができる。形質転換を行なうために、発現系をベクターに含有させることができる；しかし、関連ＤＮＡを宿主染色体に組み込むこともできる。特にこの用語は、たとえば、そのベクターにより運ばれて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡがコードするタンパク質の発現に適した条件下にある、宿主細胞および適合するベクターに関連する。
【０１１１】
コーディングＤＮＡは、特定のポリペプチドまたはタンパク質、たとえば抗体についての特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、調節、または他の形で仲介または制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとコーディングＤＮＡは同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来するものであってよく、同じ生物または異なる生物に由来するものであってよい。組換えクローニングベクターはしばしば、クローニングまたは発現のための１以上の複製系、宿主における選択のための１以上のマーカー、たとえば抗生物質耐性、および１以上の発現カセットを含むであろう。
【０１１２】
本明細書中で用いる“ベクター”は、適切な宿主生物において、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子を転写し、それらのｍＲＮＡを翻訳するのに必要な、ＤＮＡ配列と定義される。
【０１１３】
“発現カセット”は、発現生成物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントであって、既定の制限部位においてベクターに挿入できるものを表わす。カセットの制限部位は、カセットを適正なリーディングフレームに確実に挿入するようにデザインされる。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１以上の制限部位に挿入され、次いでベクターによって、伝達可能なベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞内へ運ばれる。ＤＮＡが挿入または付加された、ＤＮＡのセグメントまたは配列、たとえば発現ベクターを、“ＤＮＡ構築体”と呼ぶこともできる。
【０１１４】
発現ベクターは発現カセットを含み、さらに通常は宿主またはゲノム組込み部位における自己複製のための起点、１以上の選択マーカー（たとえば、アミノ酸合成遺伝子、またはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素開裂部位、適切なプロモーター配列、および転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は作動可能な状態で互いに連結している。本明細書中で用いる用語“ベクター”は、自己複製ヌクレオチド配列およびゲノム組込みヌクレオチド配列を含む。一般的なタイプのベクターは“プラスミド”であり、それは一般に追加（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子(self-contained molecule)であり、かつ適切な宿主細胞に容易に導入できる。プラスミドベクターは、しばしばコーディングＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを収容し、かつ外来ＤＮＡの挿入に適した１以上の制限部位をもつ。特に、用語“ベクター”または“プラスミド”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、それによりその宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを表わす。
【０１１５】
本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、特定の組換えタンパク質、たとえば本明細書に記載する抗体を産生するために形質転換された初代対象細胞およびそのいずれかの子孫を表わすものとする。必ずしもすべての子孫が厳密に親細胞と同一であるとは限らない（環境における故意のまたは意図しない変異または相異のため）が、そのような変異した子孫は最初に形質転換された細胞のものと同じ機能性をその子孫が保持している限りこれらの用語に含まれると解釈すべきである。用語“宿主細胞系”は、組換え遺伝子を発現させて、組換えポリペプチド、たとえば組換え抗体を産生させるために用いる宿主細胞の細胞系を表わす。本明細書中で用いる用語“細胞系”は、特定の細胞タイプの樹立したクローンであって、長期間にわたって増殖する能力を獲得したものを表わす。そのような宿主細胞または宿主細胞系を細胞培養において維持および／または培養して、組換えポリペプチドを産生させることができる。
【０１１６】
本明細書中で核酸、抗体または他の化合物に関して用いる用語“単離された”または“単離”は、自然状態でそれに付随していたであろう環境から十分に隔離され、それによって“実質的に純粋な”形態で存在する化合物を表わすものとする。“単離された”は、必ずしも他の化合物または物質との人為的もしくは合成による混合物の排除、または基本的活性を妨害しない、たとえば精製不完全のため存在する可能性のある不純物の存在の排除を意味するわけではない。特に、本発明の単離された核酸分子は、自然界に存在しないもの、たとえばコドン最適化した核酸もしくはｃＤＮＡ、または化学合成したものをも含むものとする。
【０１１７】
同様に、本発明の単離された抗体は、特に、自然界に存在しないもの、たとえば他の抗体または活性物質との組合わせ製剤で提供されるもの（その組合わせは自然界に存在しない）、または天然抗体の最適化もしくは親和性成熟バリアント、または抗体の加工適性を改善するために工学操作されたフレームワーク領域を備えた抗体である。そのような最適化または工学操作により、抗体はその抗体に関して自然界ではみられない１以上の合成配列または特徴を含む。
【０１１８】
本発明の核酸に関して、用語“単離された核酸”を時に用いる。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、それが由来する生物の天然ゲノム中でそれが隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を表わす。たとえば、“単離された核酸”は、ベクター、たとえばプラスミドもしくはウイルスベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用された場合、用語“単離された核酸”は主に、前記に定義した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を表わす。あるいは、この用語は、それの自然状態で（すなわち、細胞または組織において）それに付随していたであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を表わすことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的手段または合成手段で直接製造され、それの製造中に存在する他の成分から分離された分子を表わすことができる。
【０１１９】
ポリペプチドまたはタンパク質、たとえば単離された本発明の抗体またはエピトープに関して、用語“単離された”は、特に自然状態でそれらに付随する物質、たとえばそれらの自然環境または製造がインビトロもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ法による場合にはそれらが産生される環境（たとえば、細胞培養）でそれらと共にみられる他の化合物を含まないかまたは実質的に含まない化合物を表わすものとする。単離された化合物に希釈剤または佐剤を配合してもなお実用上の目的では単離されているということができる−たとえば、診断または療法に用いる際にそれらのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と混合することができる。特に、本発明の単離された抗体は単離された純粋な形態で提供され、好ましくは単離された抗体を唯一の活性物質として含む製剤で提供されるので、クレブシエラ・ニューモニエ株に対して形成されたポリクローナル血清製剤とは異なる。ただし、これは単離された抗体を限られた数のさらなる十分に規定された（単離された）抗体を含む組合わせ製剤で提供することを排除しない。単離された抗体を固体、半液体または液体キャリヤー、たとえばビーズ上において提供することもできる。
【０１２０】
用語“中和する”または“中和”は、本明細書においては最も広い意味で用いられ、中和が達成されるメカニズムには関係なく、病原体、たとえばクレブシエラ・ニューモニエが対象に感染するのを阻害するいずれかの分子、または病原体がエンドトキシン産生により感染を促進するのを阻害すること、またはエンドトキシンがそれらの生物活性を発揮するのを阻害することを表わす。中和は、たとえば宿主において粘膜表面におけるクレブシエラ・ニューモニエの定着、無菌状態の身体部位への侵入、および有害な生物学的シグナルの誘発（最悪の場合には敗血症性ショックの誘導）を阻害する抗体により達成できる。
【０１２１】
厳密な意味で、中和は、特定のＬＰＳがそれのコグネイト受容体(cognate receptor)（たとえば、Ｔｏｌｌ様受容体−４複合体）に結合してそれにより生物活性を誘発するのを阻害することを意味する。この中和力価は一般に標準アッセイ、たとえばインビトロまたはインビボ中和アッセイ、たとえばＬＡＬ試験、またはＴＬＲ−４ベースのアッセイで決定され、その際、エンドトキシンの生物活性の阻害はたとえば比色法により測定される。
【０１２２】
クレブシエラ・ニューモニエを攻撃または中和する抗体は、病原体および病原性反応を妨害し、よって感染を制限もしくは阻止し、および／またはそのような感染から生じる病状を改善し、あるいはクレブシエラ・ニューモニエの病理発生、特に宿主の無菌身体コンパートメント／部位内への播種およびその内部での複製を阻害することができる。これに関して、中和抗体は“防御抗体”であるとも解釈され、これはその抗体が感染物質に対する能動または受動免疫にみられる免疫に関与することを意味する。特に、本明細書に記載する中和または防御抗体は、病原体により誘発される疾患の症状、副作用または進行を阻止し、改善し、治療し、または少なくとも部分的に停止する療法目的のために、たとえば予防または治療のために使用できる。特に、防御抗体は、療法適用に伴って、たとえば血清殺細菌活性またはオプソニン食作用活性を誘導することによりクレブシエラ・ニューモニエ生細胞を死滅させ、またはその複製を妨害し、あるいは細菌細胞全体またはそのＬＰＳ分子を無菌身体部位から排除することができる（すなわち、樹立した感染症に投与した場合）。あるいは、予防的に適用された防御抗体は、上記または他のメカニズムの１つにより、感染の樹立（すなわち、非無菌部位から無菌の身体コンパートメント内へのクレブシエラ・ニューモニエの拡散）を阻害する。
【０１２３】
本明細書に記載する抗体の“交差中和”性は、Ｏ３グループ抗原それぞれのクレブシエラ・ニューモニエだけでなく、特にＯ３ｂ、Ｏ３ａ、およびＯ３血清型それぞれの１以上の株を中和することを含むと解釈される。
【０１２４】
本明細書中でクレブシエラ・ニューモニエの株、抗原、またはエピトープに関して用いる用語“Ｏ３グループ”は、Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、およびＯ３のグループ、特にそれぞれの血清型および抗原構造を特徴とするクレブシエラ・ニューモニエに由来する物質を意味するものとする。Ｏ３グループ抗原は、本明細書中で“Ｏ３−抗原”とも呼ばれる。
【０１２５】
本明細書中で用いる用語“Ｏ３ｂ−抗原”（“Ｏ３ｂ−タイプ”とも呼ばれる）は、式（Ｉ）に示すクレブシエラ・ニューモニエの（メチルホスフェート含有）炭水化物構造のＬＰＳ  Ｏ−抗原、特に式（Ｉ）に含まれるマンナンポリマーおよび少なくとも１つのトリマンノース反復単位を含む構造を含むものを表わすものとする。そのような構造およびトリマンノース反復単位はこれまで同定されていなかった。この構造はＯ３ａ−抗原（式（ＩＩ））またはＯ３−抗原（式（ＩＩＩ））のものと類似するが、それらとは区別される。このように、新たに同定されたＯ３ｂ構造が別個のエピトープを含むことは意外である。
【０１２６】
注目すべきことに、これと同じ種類のマンナン構造および交差反応性エピトープ構造は、クレブシエラ・ニューモニエ以外の生物またはそれぞれの細胞が発現する可能性もあり、よってそのような生物または細胞により媒介される疾患と戦う際の重要なターゲットとなる可能性がある。
【０１２７】
Ｏ３−抗原のペンタマンノース構造を特異的に認識する抗体はＯ３ａ−抗原（テトラマンノース構造）を認識しないことが先に見出された。Ｏ３ａおよびＯ３多糖を規定する最少のマンノース残基数は４であると先行技術に記載され、抗体エピトープについての最短候補はテトラマンナンであると認められていた（参照：(7)）。Ｏ３ｂは新規な血清型決定因子であることが本明細書において理解される；それは、Ｏ３ａまたはＯ３血清型、すなわち他のＯ３−抗原の存在およびＯ３ｂ（トリマンノース）構造の非存在を特徴とするものに類似するが、それらと別個のものである。
【０１２８】
Ｏ３ｂ構造を含むそれぞれのＯ−抗原を本明細書中で“Ｏ３ｂ−抗原”と呼ぶ；それは本発明のＯ３ｂ−特異的抗体により認識される“Ｏ３ｂ−エピトープ”を含む。Ｏ３ｂ−抗原はＯ３ｂ  Ｏ−タイプのクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳの外側部分であると解釈され、それはそれらに組み込まれた１以上の特異的Ｏ３ｂ−エピトープを含む、表面アクセス可能な抗原性炭水化物構造体である。
【０１２９】
少なくとも１つのＯ３ｂ構造を含むＬＰＳ  Ｏ−抗原を特徴とするクレブシエラ・ニューモニエをいずれも、本明細書中でＯ３ｂ−タイプのクレブシエラ・ニューモニエと呼ぶ。Ｏ３ｂ−タイプのクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳは、Ｏ３ｂ構造、あるいはＯ３ｂとＯ３ａおよび／またはＯ３の両方の構造を含む可能性がある。
【０１３０】
Ｏ３ａ−抗原はＯ３ａ−タイプのクレブシエラ・ニューモニエの外側部分のＬＰＳであると解釈され、それは１以上の特異的Ｏ３ａ−エピトープが含まれる表面アクセス可能な抗原性炭水化物構造体であり、それはＯ３ｂ−構造を少しも含まない。
【０１３１】
Ｏ３−抗原はＯ３−タイプのクレブシエラ・ニューモニエの外側部分のＬＰＳであると解釈され、それは１以上の特異的Ｏ３−エピトープが含まれる表面アクセス可能な抗原性炭水化物構造体であり、それはＯ３ｂ−構造またはＯ３ａ−構造を少しも含まない。
【０１３２】
“汎−Ｏ３−抗体”が認識するターゲット抗原に関して本明細書中で用いる用語“汎−Ｏ３”は、Ｏ３ｂ−抗原、Ｏ３ａ−抗原およびＯ３抗原のすべてを表わすものとし、交差反応性であってなおＯ３−特異的である抗体はＯ３ｂ−抗原、Ｏ３ａ−抗原およびＯ３抗原のそれぞれを認識する。
【０１３３】
本明細書中で用いる“特異的”な結合、認識またはターゲティングは、結合剤、たとえば抗体またはその抗原結合部分が不均質な分子集団中のターゲット抗原またはそれぞれのエピトープに対して明らかな親和性を示すことを意味する。よって、指示した条件下で（たとえば、イムノアッセイ）、ある結合剤はターゲットＯ３ｂ抗原に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子に有意量では結合しない。特異的結合は、選択に応じてターゲットの素性、高い、中等度または低い結合親和性またはアビディティーに関して、結合が選択的であることを意味する。通常は、他のターゲットと比較して結合定数または結合動態が少なくとも１０倍の差（少なくとも１  ｌｏｇの差と解釈される）であれば、好ましくは差が少なくとも１００倍（少なくとも２  ｌｏｇの差と解釈される）、より好ましくは少なくとも１０００倍（少なくとも３  ｌｏｇの差と解釈される）であれば、選択的結合が達成される。
【０１３４】
用語“特異性”は、１以上の分子に結合する結合剤、たとえば交差特異的結合剤にも適用すると解釈される。少なくとも２つの異なるターゲットまたはそのようなターゲットのエピトープもしくはヌクレオチド配列をターゲティングする、あるいは少なくとも２つの異なるターゲット上の交差反応性エピトープまたはクレオチド配列をターゲティングする、好ましい交差特異性（多重特異性または交差反応性とも呼ばれる）結合剤は、特にそれらのターゲットを実質的に類似の結合親和性で、たとえば１００倍未満の差で、または１０倍未満の差ですら、あるいは実質的に異なる結合親和性で、たとえば少なくとも１０倍または少なくとも１００倍の差で結合する。
【０１３５】
Ｏ３グループ抗原のそれぞれを認識する交差特異的結合剤は、それぞれの抗原に実質的に等しい親和性で結合することができ、あるいは１つの抗原を他の抗原と対比して優先的に結合する差示的な結合親和性で１または２つのターゲットを他のターゲット（単数また複数）より優先的に結合することができ、それはたとえば同等より高く、たとえば少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。そのような同等または差示的な結合は、イムノアッセイ、好ましくはイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または他の免疫学的方法により判定できる。
【０１３６】
本明細書に記載する好ましい抗体は、Ｏ３グループ抗原のそれぞれを高親和性で、特に高いオン（結合）速度および／または低いオフ（解離）速度で、あるいは高いアビディティーまたは結合性（アビッド結合親和性）で結合する。抗体の結合親和性は、通常は、抗原結合部位の半分が占有される抗体濃度、すなわち解離定数（Ｋｄ、またはＫＤ）として知られているものによって特性づけられる。通常は、結合剤は、一価結合剤または二価結合剤を用いて測定してＫＤ＜１０−６ＭまたはＫＤ＜１０−７Ｍで、ある場合には、たとえば療法目的では、より高い親和性、たとえばＫＤ＜１０−８ＭもしくはさらにＫＤ＜１０−９Ｍ（一価結合剤を用いて測定）、またはＫＤ＜１０−９ＭもしくはさらにＫＤ＜１０−１０Ｍ（二価結合剤を用いて測定）で、高親和性結合剤とみなされる。
【０１３７】
さらに、特に好ましい態様において、個々の抗原結合親和性はたとえば１０−６より高いＫＤをもつ中等度の親和性のもの、たとえばアビッド結合親和性（二価結合剤を用いて測定）である。
【０１３８】
中等度の親和性の結合剤を提供し、必要であれば親和性成熟させることができる。
親和性成熟は、ターゲット抗原に対する親和性が増大した抗体を製造する方法である。当技術分野で利用できる親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するいずれか１以上の方法を、本明細書に開示する発明の種々の態様に従って親和性成熟抗体を作製するために採用できる。代表的なそのような親和性成熟の方法および使用、たとえばランダム変異形成、細菌ミューテーター(mutator)株の継代、部位特異的変異形成、変異ホットスポットターゲティング(mutational hotspots targeting)、倹約変異形成(parsimonious mutagenesis)、抗体シャフリング(shuffling)、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異形成、ならびに本明細書に開示する本発明の種々の態様に従った方法および使用を実施できる親和性成熟ライブラリーを調製および使用する方法には、たとえば下記に開示されたものが含まれる: Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679。
【０１３９】
アミノ酸変異形成を含めた、または免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞変異の結果としての、抗体の構造変化で、抗原への結合部位のバリアントを製造し、より大きな親和性について選択した。親和性成熟抗体は、親抗体より数ｌｏｇ倍大きい親和性を示す可能性がある。単一の親抗体を親和性成熟させることができる。あるいは、ターゲット抗原に対して類似の結合親和性を備えた抗体のプールを親構造体とみなすことができ、それらを変異させて親和性成熟した単一の抗体またはそのような抗体の親和性成熟したプールを得ることができる。
【０１４０】
本明細書に記載する抗体の好ましい親和性成熟バリアントは、少なくとも２倍の結合親和性増大、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。親分子のライブラリーそれぞれを用いる選択活動の過程で、中等度の結合親和性をもつ抗体について親和性成熟を採用して、結合親和性ＫＤ＜１０−８Ｍ（たとえば、二価結合剤を用いて測定したアビッド結合親和性）の特異的ターゲット結合特性をもつ本発明の抗体を得ることができる。あるいは、本発明による抗体の親和性成熟によって親和性（たとえば、二価結合剤を用いて測定したアビッド結合親和性）をよりいっそう増大させて、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらには１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル濃度範囲のＫＤに相当する高い値を得ることができる。
【０１４１】
ある態様において、結合親和性は親和性ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。ある態様において、結合親和性はＢＩＡｃｏｒｅ、ＢＬＩ、ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイにより決定される。ある態様において、結合親和性は動力学的方法により決定される。ある態様において、結合親和性は平衡／溶解法により決定される。
【０１４２】
用語“ 同じ特異性をもつ”、“同じ結合部位をもつ”または“同じエピトープを結合する”の使用は、同等のモノクローナル抗体が同じ、または本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、前選択したターゲット結合配列への結合に対して競合することを示す。特定のターゲットに対する抗体分子の相対的特異性は、競合アッセイ、たとえば Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)に記載されたものにより相対的に決定できる。
【０１４３】
本明細書中で抗体に関して用いる用語“競合する”は、第１抗体またはその抗原結合性部分が第２抗体またはその抗原結合性部分の結合と十分に類似した様式でエピトープに結合し、したがって第１抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合の結果が第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して第２抗体の存在下では検出可能なほど低減することを意味する。その逆、すなわち第２抗体がそれのエピトープに結合する場合も第１抗体の存在下で検出可能なほど低減する可能性はあるが、必ずしもそうではない。すなわち、第１抗体は第２抗体がそれのエピトープに結合するのを阻害し、第２抗体は第１抗体がそれ自身のエピトープに結合するのを阻害しないという可能性がある。しかし、それぞれの抗体が他方の抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合を検出可能なほど（同じ、より大きい、またはより少ない程度であっても）阻害する場合、それらの抗体はそれらの各エピトープ（単数または複数）への結合に対して互いに“競合する”と言われる。Ｏ３グループ抗原のすべてまたはそれぞれの結合に対して例示抗体のいずれかと競合する抗体は、特に本発明に包含される。
【０１４４】
本明細書中で“競合結合”または“競合”は、競合ＥＬＩＳＡ分析またはバイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)（ＢＬＩ）分析により判定して約３０％より大きい相対的阻害を意味する。
【０１４５】
特に、Ｏ３グループ抗原（交差反応性エピトープを含むもの）のいずれかをターゲティングするアビッド結合親和性は、本明細書に例示するようにｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ計測器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（たとえば、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＢＬＩにより測定される。
【０１４６】
特定の状況で、たとえば意図する抗原結合機能をもつようにデザインした新規抗体を選択またはスクリーニングするために競合分析を用いる場合、競合の適切なレベルである基準として、相対的阻害のより高い閾値を設定することが望ましいであろう。よって、たとえば、抗体を十分に競合性であるとみなす前に、競合結合について少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくはさらに少なくとも１００％の相対的阻害が検出される基準を設定することができる。
【０１４７】
用語“クレブシエラ・ニューモニエ感染”および“クレブシエラ・ニューモニエ定着”は、下記のように解釈される：クレブシエラ・ニューモニエは腸内細菌科(Enterobacteriaceae)のグラム陰性細菌である。それは遍在性細菌であり、ヒト宿主にも一般に腸または上気道に定着する可能性がある。日和見病原体であるため、それは免疫系によって適正に抑制されない場合にこれらの部位から無菌の身体部位に侵入する可能性がある。他の場合には無菌状態であるこれらの部位における抑制されない細菌複製は、大部分がクレブシエラ・ニューモニエから放出されるエンドトキシン（すなわち、ＬＰＳ）分子により仲介される炎症を誘発するであろう。菌血症の症例では、エンドトキシン分子は敗血症性ショックの引き金となる可能性がある。
【０１４８】
クレブシエラ・ニューモニエ定着は、対象のある部位にそれらを検出できるほど十分に高い濃度のクレブシエラ・ニューモニエ細菌があるけれどもまだその細菌が徴候または症状を引き起こしていないことを意味する。定着は長期間にわたって持続する可能性があり、消散はその生物に対する免疫応答、その部位における他の生物からの競合、および時には抗微生物薬の使用によって影響される。
【０１４９】
一般に、クレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされる菌血症を既知の一般的な抗細菌療法、たとえば抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系の炎症阻害薬による治療で処置するのに成功する可能性がある。本発明は、クレブシエラ・ニューモニエを特異的に認識する抗体を場合により抗細菌または抗炎症療法と組み合わせて用いる新規免疫療法を提供する。クレブシエラ・ニューモニエ感染症を伴なう患者を処置するために用いる代表的な抗生物質は、アミノグリコシド類、セファロスポリン類、アミノペニシリン類、カルバペネム類、フルオロキノロン類、チゲサイクリン、コリスチンなどである。
【０１５０】
多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエは、特に、３クラス以上の抗生物質、たとえば下記の薬剤／グループに対して耐性を示す株であると解釈される：ペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、フルオロキノロン類、ニトロフラントイン、トリメトプリム（およびそれの組合わせ）、ホスホマイシン(fosfomycin)、ポリミキシン類、クロラムフェニコール、アズトレオナム(azthreonam)、またはチゲサイクリン。
【０１５１】
最近の抗生物質耐性株の出現に伴って、この性質をもつ菌血症の処置が著しくいっそう困難になった。クレブシエラ・ニューモニエ疾患を発症している患者は、クレブシエラ・ニューモニエ疾患を伴わない患者より入院およびＩＣＵ滞在が長く、死亡率が高く、ヘルスケアコストが大きい。患者にクレブシエラ・ニューモニエが多量に定着している場合、治療よりむしろ防止、すなわちクレブシエラ・ニューモニエ疾患予防により、患者のケアを改善し、院内感染を減らすことができる。
【０１５２】
クレブシエラ・ニューモニエ疾患は、具体的にはクレブシエラ・ニューモニエ感染により引き起こされる疾患であると解釈される。そのような疾患には、局所性および全身性の疾患が含まれる。重篤な症例は、たとえば原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎である。
【０１５３】
本明細書中で用いる用語“組換え（体）(recombinant)”は、“遺伝子工学操作により製造すること、またはその結果”を意味するものとする。組換え宿主は特に発現ベクターまたはクローニングベクターを含み、あるいはそれは特にその宿主に対して外来であるヌクレオチド配列を用いて組換え核酸配列を収容するように遺伝子工学的に操作されている。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることにより製造される。本明細書中で用いる用語“組換え抗体”には、組換え手段で製造、発現、作製または単離された抗体、たとえば下記のものが含まれる：（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから作製されたハイブリドーマについてトランスジェニックまたは染色体導入(transchromosomal)状態である動物（たとえば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマ(transfectoma)から、単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル−ヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合性配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴なう他のいずれかの手段で製造、発現、作製または単離された抗体。そのような組換え抗体には、たとえば抗体成熟に際して起きる再配列および変異形成を含むように遺伝子工学操作された抗体が含まれる。本発明によれば、当業者がなしうる範囲の一般的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ手法を採用できる。そのような手法は文献に十分に説明されている。たとえば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)を参照。
【０１５４】
選択的結合は、当技術分野で知られている組換え抗体最適化法によってさらに改善できる。たとえば、本明細書に記載する免疫グロブリン鎖の可変領域の特定領域に、軽鎖シャフリング、デスティネーション変異形成(destinational mutagenesis)、ＣＤＲ融合(CDR amalgamation)、ならびに選択したＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の特異的変異形成(directed mutagenesis)を含む１以上の最適化方策を施すことができる。 
【０１５５】
本明細書中で用いる用語“対象”は、温血哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物を表わすものとする。クレブシエラ・ニューモニエはきわめて重大なヒト病原体であり、動物医薬において出現しつつある関心事でもある。それは広範な非ヒト動物種に存在する。よって、用語“対象”は特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含めた動物をも表わす可能性がある。特に、本発明の医療用途またはそれぞれの処置方法は、クレブシエラ・ニューモニエ感染に関連する病状の予防または治療を必要とする対象に適用される。対象は、クレブシエラ・ニューモニエ感染のリスクをもつ患者、または初期もしくは後期疾患を含めた疾患に罹患している患者であってもよい。用語“患者”には、予防処置または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象が含まれる。よって、用語“処置”は予防処置および治療処置の両方を含むものとする。
【０１５６】
対象は、たとえばクレブシエラ・ニューモニエ病状の予防または治療のために処置される。特に、感染またはそのような疾患の発症もしくは疾患再発のリスクをもつ対象、あるいはそのような感染および／またはそのような感染に関連する疾患を伴なう対象を処置する。
【０１５７】
特に、用語“予防”は防止措置を表わし、それは発病の防止または発病のリスクを低減するための予防措置を含むものとする。
特に、その処置はその状態の原因物質としてのクレブシエラ・ニューモニエの病的発生を妨害することによるものであってもよい。
【０１５８】
本明細書中で用いる用語“実質的に純粋な”または“精製した”は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、たとえば核酸分子または抗体を含む調製物を表わすものとする。純度はその化合物に適した方法（たとえば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定される。
【０１５９】
本明細書中で化合物、たとえば本発明の抗体の“有効量”または“十分な量”のいずれかと互換性をもって用いる“療法有効量”という用語は、対象に投与した際に、臨床結果を含めて有益または希望する結果を及ぼすのに十分な量または活性であり、したがって有効量またはその同義語はそれが適用される状況に依存する。
【０１６０】
有効量は、そのような疾患または障害を治療、防止または阻止するのに十分な化合物量を意味するものとする。疾患に関して、本明細書に記載する抗体の療法有効量は、特に、クレブシエラ・ニューモニエの病的発生、たとえば粘膜表面における付着および定着、無菌身体部位内での無制御な複製、ならびに細菌産物による宿主細胞傷害の阻害が有益である疾患または状態を治療し、調節し、減弱させ、反転させ、または影響を及ぼすために用いられる。
【０１６１】
そのような有効量に相当する化合物量は、種々の要因、たとえば投与する薬物または化合物、医薬配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置される対象または宿主の素姓などに応じて異なるであろうが、それにもかかわらず当業者がルーティンに決定できる。
【０１６２】
その必要があるヒト対象に投与される本明細書に記載する抗体の療法有効量は、特に０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲、よりいっそう好ましくは最大２０ｍｇ／ｋｇ、最大１０ｍｇ／ｋｇ、最大５ｍｇ／ｋｇであってもよいが、たとえば急性病状を処置するためにはより高い用量を処方してもよい。効力の高い抗体を用いる場合、用量はこれよりはるかに低くてもよい。そのような場合、有効量は０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
【０１６３】
さらに、療法有効量の本発明の抗体による対象の治療または防止計画は、単回投与からなることができ、あるいは一連の適用からなることができる。たとえば、抗体を少なくとも年１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも月１回、投与することができる。しかし、他の態様において、特定の処置について週に約１回から約１日１回まで、抗体を対象に投与することができる。処置期間の長さは、多様な要因、たとえば疾患の重症度、急性または慢性のいずれの疾患であるか、患者の年齢、抗体フォーマットの濃度および活性に依存する。治療または予防のために用いる有効量が特定の治療または予防計画のコースにわたって増加または減少する可能性があることも認識されるであろう。投与量の変更が生じる可能性があり、それは当技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって明らかになる。ある場合には、長期投与が必要になる可能性がある。
【０１６４】
Ｏ３グループ抗原のいずれかに対して高特異性であるモノクローナル抗体、特に汎−Ｏ３抗体は、クレブシエラ・ニューモニエ感染症の予防（たとえば、高リスクグループについて）および治療のために大きな可能性をもつ。一般に予防処置のための用量はより低い範囲（たとえば、少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ未満）であり、特に、対象が免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態および／またはクレブシエラ・ニューモニエと接触する危険性があると同定された場合には１回、あるいは長期処置計画により、たとえば１年間または半年間に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回、投与される。治療処置のための用量は、一般に疾患の急性期または慢性期に、一般に、より高い範囲（たとえば、少なくとも０．０５または０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ未満）で投与され、具体的には疾患の治癒まで、１回以上の投与により、たとえば規則的間隔で、たとえば少なくとも１日に１、２、３、もしくは４回の投与、または少なくとも１週に１、２、３、４、５、もしくは６回の投与、または少なくとも１月に１、２、３、もしくは４回の投与により、投与される。
【０１６５】
Ｏ３血清グループは単一の均一な構造であると以前は考えられていたが、それは実際には反復単位内のマンノース残基の数が異なる３つの異なるサブタイプを含む。
Ｏ３血清グループに特異的なモノクローナル抗体の反応性パターンにより証明されるように、これらの構造の相違は抗原性の差を表わす。Ｏ３血清グループ内の３種類すべての異なる血清型と交差反応するモノクローナル抗体の選択は、推定製品の開発に関して重要性が高い可能性がある。さらに、交差反応性ｍＡｂの関連作用様式の立証により、それらは有望な療法選択肢となる。Ｏ３、Ｏ３ａおよびＯ３ｂ間で交差反応する抗体は免疫療法にとって価値ある手段となる可能性がある。Ｏ３交差反応性（汎−Ｏ３反応性）ｍＡｂは、全クレブシエラ分離株のほとんど四分の一（２３．２％）に対して特異的であり、よって療法製品候補としてのそのようなｍＡｂのさらなる開発の正当性を示すことができる。
【０１６６】
希望する結合特性を備えた抗体が同定されると、そのような抗体（抗体フラグメントを含む）は、たとえばハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ技術を含めた当技術分野で周知の方法により製造できる。
【０１６７】
組換えモノクローナル抗体は、たとえば必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクター、たとえば抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミドまたは発現カセット（単数または複数）を用いて、発現のために組換え宿主細胞にそのコード配列をトランスフェクトすることにより製造できる。組換え宿主細胞は原核細胞または真核細胞、たとえば前記のものであってもよい。
【０１６８】
特定の側面によれば、たとえば抗体の親和性もしくは他の特性を改善するために、ヌクレオチド配列を遺伝子操作に用いて人工配列を含む抗体を得ることができる。たとえば、抗体をヒトの臨床試験および処置に用いる場合、免疫応答を避けるために定常領域を工学操作してヒト定常領域にいっそう近似させることができる。抗体配列を遺伝子操作して、Ｏ３ｂターゲットに対してより大きい親和性、およびクレブシエラ・ニューモニエに対してより大きい有効性を得ることが望ましいであろう。抗体に対して１以上のポリヌクレオチド変化を行なってもなおターゲットＯ３ｂ抗原に対するそれの結合能力を維持できることは当業者に明らかであろう。
【０１６９】
種々の手段による抗体分子の製造は一般に十分に理解されている。たとえばUS Patent 6331415 (Cabillyら)には、抗体を組換え製造するための方法が記載され、その場合、重鎖および軽鎖を同時に単一ベクターから、または２つの別個のベクターから、シングル細胞において発現させている。Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191 -202)およびLee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198)には、プラスミドを用いて別個の宿主細胞培養物中で発現させて別個に産生された重鎖および軽鎖からモノクローナル抗体を製造することが記載されている。抗体の製造に関する他の種々の手法が、たとえばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提示されている。
【０１７０】
所望により、本明細書に記載する抗体、たとえば実施例に述べる、または図１もしくは図２に挙げるいずれかのｍＡｂまたはそのバリアントを配列決定し、そのポリヌクレオチド配列を次いで発現または増殖のためにベクター中へクローニングすることができる。抗体をコードする配列を宿主細胞においてベクター内に維持し、その宿主細胞を次いで増殖させ、将来の使用のために凍結することができる。細胞培養における組換えモノクローナル抗体の産生は、当技術分野で既知の手段によるＢ細胞からの抗体遺伝子のクローニングにより実施できる。
【０１７１】
他の側面において、本発明は、本明細書に記載する組換え抗体の産生をコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
抗体をコードする核酸は、いずれか適切な特性をもち、いずれか適切な特徴またはその組合わせを含むことができる。よって、たとえば抗体をコードする核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形態であってもよく、非天然塩基、修飾されたバックボーン、たとえば核酸の安定性を増強するホスホロチオエートバックボーン、または両方を含むことができる。有利には、ターゲット宿主細胞（単数または複数）における希望する発現、複製および／または選択を増強するフィーチャーを含む本発明の発現カセット、ベクターまたはプラスミドに、核酸を収容することができる。そのようなフィーチャーの例には、複製起点構成要素、選択遺伝子構成要素、プロモーター構成要素、エンハンサーエレメント構成要素、ポリアデニル化配列構成要素、終止構成要素などが含まれ、その多数の適切な例が知られている。
【０１７２】
本開示はさらに、本明細書に記載するヌクレオチド配列のうち１以上を含む組換えＤＮＡ構築体を提供する。これらの組換え構築体は、開示したいずれかの抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されるベクター、たとえばプラスミド、ファージミド(phagemid)、ファージまたはウイルスベクターとの組合わせで用いられる。
【０１７３】
モノクローナル抗体は、培養細胞系により、たとえば組換え真核（哺乳類または昆虫）または原核（細菌）宿主細胞を培養することにより抗体分子を産生する、いずれかの方法を用いて製造される。モノクローナル抗体を製造するのに適した方法の例には、 Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497)のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; およびBrodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63)が含まれる。
【０１７４】
本明細書に記載する抗体は、ハイブリドーマ法を用いて、またはシングルＢ細胞からの免疫グロブリン遺伝子の直接増幅、クローニングおよび組換え発現（たとえば、本明細書に例示するように特定の抗原を用いるスクリーニング法を含む）により、同定または入手できる。そのようなハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適宜な宿主動物、たとえばハムスターを免疫化して、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、適切な融合剤、たとえばポリエチレングリコールを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することができる。
【０１７５】
ハイブリドーマ細胞または組換え抗体を産生する細胞が増殖している培地を、抗原を指向したモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞または抗体を組換え産生する細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはインビトロ結合アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により判定する。
【０１７６】
次いでｍＡｂを、それのＯ３グループ抗原のいずれかの特異的結合について、およびおそらく交差反応性について、特にＯ３グループ抗原を（実質的に）同等に結合する親和性もしくはそれらのうちいずれか１または２つを他より優先的に結合する差示結合親和性についてさらに試験するために、ハイブリドーマ上清から、および組換え抗体を産生している細胞からの培養上清から、精製することができ、抗体をたとえば種々の診断または療法の目的で工学操作することができる。
【０１７７】
交差反応性であるＯ３グループ抗原特異的抗体は、場合により単一Ｏ３ｂ、Ｏ３ａ、またはＯ３抗原のいずれか１つに対するスクリーニングによって明らかになる。差示結合するクローンを分離する可能性を高めるために、異なる抗原に対して漸次スクリーニングすることによって多重選択圧を適用する。特別なｍＡｂ選択方策は、Ｏ３ｂおよびＯ３ａまたはＯ３成分のそれぞれ、あるいは他のクレブシエラ・ニューモニエ抗原を、交互に使用する。
【０１７８】
希望する選択的結合特性を備えた抗体を同定するためのスクリーニング法は、抗体配列またはその抗原結合性配列をディスプレーするライブラリーを用いるディスプレー技術により行なうことができる（たとえば、ファージ、細菌、酵母もしくは哺乳動物の細胞を使用；または核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するインビトロディスプレーシステム）。ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング、またはフローサイトメトリーを伴なう表面染色に基づいて、たとえば標準アッセイを用いて、反応性を査定することができる。
【０１７９】
単離された抗原（単数または複数）は、たとえば抗体ライブラリー、たとえば酵母ディスプレーされた抗体ライブラリーから抗体を選択するために使用できる。
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は本発明に従ってボーラス注射もしくは注入として、または連続注入により投与できる。そのような投与手段を容易にするのに適したキャリヤーは当技術分野で周知である。
【０１８０】
医薬的に許容できるキャリヤーには、一般に、本発明により提供される抗体または関連の組成物もしくは組合わせと生理的に適合するすべての適切な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容できるキャリヤーのさらなる例には、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそのいずれかの組合わせが含まれる。
【０１８１】
そのような一側面において、抗体を希望する投与経路に適した１種類以上のキャリヤーと組み合わせることができ、抗体をたとえばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールと混合し、場合によりさらに好都合な投与のために打錠またはカプセル封入することができる。あるいは、抗体を生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガントゴム、および／または種々の緩衝液に溶解することができる。他のキャリヤー、佐剤、および投与様式は医薬技術分野で周知である。キャリヤーには、制御放出材料または遅延材料、たとえばモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリル単独もしくはろうを含むもの、または当技術分野で周知である他の材料を含めることができる。
【０１８２】
さらに他の医薬的に許容できるキャリヤーが当技術分野で知られており、たとえばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESに記載されている。液体配合物は液剤、乳剤または懸濁液剤であってもよく、賦形剤、たとえば懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート化剤を含有することができる。
【０１８３】
本明細書に記載する抗体および１種類以上の療法有効薬剤を配合した医薬組成物が考慮される。希望する純度をもつ前記の免疫グロブリンを任意選択的な医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥配合物または水性液剤の形態で、本明細書に記載する抗体の安定配合物を貯蔵のために調製する。インビボ投与に用いるための配合物は、特に無菌、好ましくは無菌水性液剤の形態である。これは、無菌濾過膜による濾過または他の方法によって容易に達成される。本明細書に開示する抗体および他の療法有効薬剤を、免疫リポソームとして配合し、および／またはマイクロカプセルに封入することもできる。
【０１８４】
本明細書に記載する抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、粘膜、局所（たとえば、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤など）、腹腔内、筋肉内、肺内（たとえば、吸入法または肺送達システムを採用）、膣、非経口、直腸または眼内を含めた多様な方法で行なうことができる。
【０１８５】
非経口投与に用いる代表的配合物には、皮下、筋肉内または静脈内注射に適したもの、たとえば無菌の液剤、乳剤または懸濁液剤が含まれる。
一態様において、本明細書に記載する抗体は、たとえば疾患の改変または防止用の単剤療法として対象に投与する唯一の療法有効薬剤である。
【０１８６】
他の態様において、クレブシエラ・ニューモニエをターゲティングするために、本明細書に記載する抗体をさらなる抗体とカクテル中で組み合わせ、たとえば、混合物またはキットのパーツ中で組み合わせ、それによりカクテルはたとえば疾患の改変または防止の併用療法として対象に投与される１種類より多い療法有効薬剤を含有する。
【０１８７】
さらに、本明細書に記載する抗体を１種類以上の他の治療薬または予防薬との組合わせで投与することができ、それには標準処置、たとえば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症阻害薬、および／または他の抗体ベースの療法、たとえば抗細菌薬または抗炎症薬を用いるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８８】
併用療法は特に標準的な計画を用いるもの、たとえばクレブシエラ・ニューモニエによる感染を処置するために用いるものである。これには、非ベータラクタム系阻害薬を含むかまたは含まない抗生物質、たとえばチゲサイクリン、コリスチン、ポリミキシンＢ、およびベータラクタム類を含めることができる。
【０１８９】
併用療法において、抗体を混合物として、または１種類以上の他の療法計画と併せて、たとえば併用する療法の前、同時または後に投与することができる。
本明細書に記載する抗体またはそれぞれの医薬製剤の生物学的性質を、エクスビボで細胞、組織、および全生物体(whole organism)実験において解明することができる。当技術分野で知られているように、疾患もしくは疾患モデルに対する処置についての薬物の有効性を測定するために、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性および他の特性を測定するために、薬物をしばしばインビボで、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含めた動物（これらに限定されない）において試験する。それらの動物を疾患モデルと呼ぶことができる。療法薬はしばしばマウスにおいて試験され、それにはヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）が含まれるが、これらに限定されない。そのような実験により、適切な半減期、エフェクター機能、（交差−）中和活性、および／または能動もしくは受動免疫療法に際しての免疫応答性を備えた治療薬または予防薬としてその抗体を使用する可能性を判定するための有意義なデータを得ることができる。いずれかの生物、好ましくは哺乳動物を試験に使用できる。たとえば、霊長類であるサルはヒトに対するそれらの遺伝学的類似性のため適切な療法モデルとなることができ、よって被験薬または組成物の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または他の特性を試験するために使用できる。薬物として承認されるためにはヒトにおける試験が最終的には要求されるので、もちろんこれらの実験も考慮する。よって、本明細書に記載する抗体およびそれぞれの療法用組成物をヒトにおいて試験して、それらの治療または予防効果、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または臨床特性を判定することができる。
【０１９０】
特定の場合、患者は免疫無防備状態の患者である。ある免疫無防備状態の患者は、原発性免疫不全または続発性（後天性）免疫不全に罹患する可能性がある。ある免疫無防備状態の患者は免疫抑制療法または化学療法薬で処置されているか、あるいは処置されたことがある。ある免疫無防備状態の患者は移植患者である。
【０１９１】
免疫無防備状態の患者は、食細胞障害に罹患している可能性があり、たとえば食細胞の数の減少および／または機能障害を特徴とする。
以下の障害は食細胞活性の損傷または喪失を引き起こす可能性がある：
原発性の食細胞免疫不全：
１．慢性好中球減少症：
ａ．周期性好中球減少症
ｂ．重篤な先天性好中球減少症
ｃ．シュワヒマン−ダイアモンド(Shwachman-Diamond)症候群
２．白血球接着不全
ａ．１型
ｂ．２型
ｃ．Ｒａｃ  ２欠損症
３．シグナル伝達欠損
ａ．インターフェロン−γおよびインターロイキン−１２の欠損
４．細胞内殺菌作用の欠損
ａ．小児の慢性肉芽腫性疾患
ｂ．ミエロペルオキシダーゼ欠乏症
ｃ．チェディアック-東(Chediak-Higashi)症候群
ｄ．好中球特異的顆粒欠乏症
続発性の食細胞免疫不全：
１．好中球減少症／顆粒球減少症：血中の好中球／顆粒球数の減少（＜１５００個／ｍｌ）
ａ．骨髄疾患（腫瘍浸潤、再生不良性貧血、血液悪性腫瘍、肉芽腫性疾患、放射線照射、骨髄線維症）
ｂ．免疫介在性好中球減少症（ハプテンとして作用する薬物、自己免疫疾患）
ｃ．感染症（細菌性敗血症、マラリア、トキソプラズマ症、ウイルス感染症、たとえばＥＢＶ、ＣＭＶ、インフルエンザ）
ｄ．栄養欠乏症（栄養不良、Ｂ−１２欠乏症）
ｅ．薬物、化学薬品（マクロライド類、プロカインアミド類、フェノチアジド、スルホンアミド類、クロラムフェニコール、アミノピリン、抗−甲状腺薬、たとえばチオウラシル、メチマゾール(methimazol)、チオシアネート、重金属）
ｆ．化学療法、免疫抑制（自己免疫疾患の処置、移植後）
２．食細胞の機能／走化性障害、または食細胞の産生をアップレギュレートする能力の低下
ａ．新生児（ストレス状態下において、新生児期ＰＭＮが正常な食細胞活性および殺微生物活性で機能しない。満期新生児の血液から分離したＰＭＮが走化能および接着能の低下を示す
ｂ．高齢者（食作用能の低下、細胞傷害性、酵素放出、接着性低下
ｃ．糖尿病（ＰＭＮによる殺菌性の低下、単球／マクロファージ機能障害、腎不全および肝硬変
ｄ．トリソミー２１
ｅ．外科手術、外傷
ｆ．コルチコステロイド
ｇ．ＨＩＶ
食細胞の数および機能の障害を伴なう患者を同定するためには、当業者に既知であるいずれか適切な手法を適用できる。これらには完全血球計数、白血球分類計数、末梢血スミア、接着性、走化性、食作用、食細胞の細胞内殺菌性の測定、特異的好中球酵素を測定するための、または好中球に対する自己抗体を検出するためのアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明がそれらに限定されることはない。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：末梢メモリーおよび腸エフェクターＢ細胞からの完全ヒト抗−クレブシエラ・ニューモニエ  リポ多糖Ｏ３−抗原抗体の作製
方法
１．組換え完全ヒト  クレブシエラ・ニューモニエＯ−抗原結合抗体の単離および作製
図３ａに示すビオチニル化Ｏ３−抗原を検出するための蛍光体コンジュゲートしたストレプトアビジンを用いるフローサイトメトリーにより、または腸粘膜固有層由来のＢ細胞が結合したＯ３  Ｋ−株から、Ｏ−抗原結合Ｂ細胞を同定した。
【０１９４】
その後、蛍光活性化セルソーティング(fluorescence-activated cell sorting)を用いてシングルＯ−抗原結合Ｂ細胞を単離した。
１．１  粘膜固有層リンパ球の単離
ヒト末端回腸外科手術試料から粘膜固有層リンパ球(lamina propria lymphocyte)（ＬＰＬ）を直接単離した。すべての細胞を、腫瘍または炎症領域から少なくとも３ｃｍ離れた健康な表現型の粘膜から単離した。ピンセットとメスを用いて粘膜および固有層を粘膜筋層(lamina muscularis)から切除した。ＰＢＳ＋（１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２％  ＦＣＳ、１×抗真菌剤／抗生物質（Ｇｉｂｃｏ））中において室温で組織を十分に洗浄した。別に記載しなければ、処理期間全体を通して組織を氷上に保持した。組織を３〜５ｍｍの切片に切断し、残存する結合組織を可能な限り十分に除去した。組織を５０ｍｌ遠心チューブに移し、１×ＰＢＳ＋で３回洗浄し、その後、３７℃の水浴に入れたボトル内で１ｍＭのジチオエリトリオールを含有するＰＢＳと共に定常攪拌下で２×１５分間インキュベートして、残存する粘液を除去した。その後、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳで組織を３回洗浄し、続いて０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳと共に上記に従って３７℃で３分間インキュベートして、上皮を除去した。１×ＰＢＳ＋で洗浄した後、０．２％（ｗ／ｖ）のＤｎａｓｅＩおよび０．５％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼＤ（両方ともＲｏｃｈｅ）を含有する１×ＰＢＳ＋を用いて３７℃で定常攪拌しながら１時間、組織を消化した。不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（４０％／７０％，１×ＰＢＳ中に希釈）によりＬＰＬを単離した。４０％／７０％境界面をより良く識別するために、７０％希釈液にフェノールレッドを添加した（１：１０００；Ｇｉｂｃｏ）。それぞれ１５ｍｌの希釈液を５０ｍｌ遠心チューブに添加し、２０ｍｌの細胞懸濁液を勾配の上に徐々に添加した。遠心した後、パスツールピペットを用いてＬＰＬを４０％／７０％境界面から単離し、新たな遠心チューブに入れた最少限２５ｍｌのＲＰＭＩ中へ添加した。すべての後続工程を４℃で氷上において実施した。細胞を４００ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞を１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ中で洗浄した。Ｔｈｏｍａチャンバーを用いてトリパンブルー対比染色（Ｇｉｂｃｏ）により細胞を計数し、その後、４００ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞をさらにフローサイトメトリー用に処理し、あるいは凍結プロトコルに従って直ちに凍結した。
【０１９５】
１．２  末梢血単核細胞の単離
別の供給源として、採取したばかりのヒト末梢血を使用できる。代表的プロトコルに従って、ヒト末梢血を室温においてたとえばＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）で１：１希釈し、５０ｍｌ遠心チューブ内の１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上へ徐々に添加する。細胞を室温で４０分間、最低加速、ブレーキなしで遠心する。水／Ｆｉｃｏｌｌ境界面に存在する細胞をパスツールピペットにより分離し、室温で５０ｍｌ遠心チューブ内の最少限２５ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁する。すべての後続工程を４℃で氷上において実施する。細胞を４００ｇで１０分間遠心する。上清を廃棄し、細胞を１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ中で洗浄する。トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を対比染色し、Ｔｈｏｍａチャンバーを用いて計数し、その後、４００ｇで１０分間遠心する。上清を廃棄し、細胞をさらにフローサイトメトリー用に処理し、あるいは凍結プロトコルに従って直ちに凍結する。
【０１９６】
１．３  哺乳動物細胞の凍結
細胞を計数し、熱不活性化したＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈して１×１０７細胞／ｍｌの濃度にした。細胞培養に適したＦＣＳ含有２０％（ｖ／ｖ）無菌ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を新たに調製し、５００μｌを１．８ｍｌのクライオチューブ（凍結保存チューブ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加した。５００μｌの細胞懸濁液を添加して最終濃度５×１０６細胞／ｍｌにし、バイアルを−８０℃でＣｏｏｌｃｅｌｌ（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）を用いて凍結した。
【０１９７】
１．４  フローサイトメトリーのための細胞染色
１．５ｍｌチューブ内で、２％のＦＣＳを含有する１×ＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を用いて、または１種類より多いＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ色素を用いる場合にはＨｏｒｉｚｏｎ染色用緩衝液（ＢＤ）を用いて、フローサイトメトリー細胞染色を実施した。５×１０６細胞／ｍｌを５０μｌの染色ミックス中で３０分間、４℃において暗所で、下記の抗体を用いて染色した：
マウス抗−ヒトＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＣＤ２７−ＰＥ（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＣＤ２７−ＢＶ６０５（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＩｇＧ  ＢＶ５１０（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｖ４５０（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＩｇＡ−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ヤギ抗−ヒトＩｇＡ−ＦＩＴＣ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マウス抗−ヒトＣＤ４５−ＶｉｏＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびマウス抗−ヒトＣＤ１１ｂ−ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。死細胞を７−ＡＡＤ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により排除した。ビオチニル化Ｏ３−抗原画分を２０μｇ／ｍｌの最終濃度で用い、０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検出した。その後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を５００ｇで５分間、４℃で遠心した。上清を廃棄し、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、再び遠心した。ペレットを５０μｌの染色ミックスに再懸濁し、細胞を４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。洗浄のために１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した後、遠心工程を実施した。上清を廃棄し、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、遠心を実施した。上清を除去した後、ＦＡＣＳ緩衝液（２５０〜１０００μｌ）を用いて細胞を希釈し、メッシュ付きキャップを備えたチューブ（ＢＤ）内へ濾過した後に分析またはソーティングした。
【０１９８】
１．５  シングルＯ−抗原結合Ｂ細胞ソーティング
粘膜固有層プラズマ細胞芽球をシングル７−ＡＡＤ−、ＣＤ１９＋、ＣＤ４５＋，Ｏ３−抗原＋として単離した。Ｏ３−抗原結合メモリーＢ細胞を、シングル７−ＡＡＤ−、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、Ｏ−抗原＋細胞として同定することができる。シングルセルをＡｒｉａ  ＩＩ計測器（ＢＤ）上で３８４ウェルＰＣＲプレート（４ｔｉｔｕｄｅ）内へソーティングした。シングルセルソーティングの後、プレートを直ちにドライアイス上で凍結して−８０℃で保存し、あるいは直接処理した。
【０１９９】
１．６  シングル  ヒトＢ細胞のＩｇ遺伝子シーケンシング
シングル  ヒトＢ細胞の全長Ｉｇ遺伝子を、Tiller et alが記載し、Murugan et al.が改変した方法により得た(T. Tiller et al., Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cell by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods. 329, 112-24 (2008); R. Murugan, K. Imkeller, C. E. Busse, H. Wardemann, Direct high-throughput amplification and sequencing of immunoglobulin genes from single human B cell. Eur. J. Immunol. 45, 2698-700 (2015))。シングルＢ細胞の完全ｃＤＮＡを３８４ウェルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内での逆転写により合成した。ｃＤＮＡを一次３８４ウェルＰＣＲプレートに移した。一次増幅工程の後、一次ＰＣＲ生成物を二次ＰＣＲミックス中に移した。全長Ｉｇ遺伝子を増幅するために用いたプライマーは、先に他の人々が公表している(T. Tiller et al., Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B細胞 by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods. 329, 112-24 (2008), R. Murugan, K. Imkeller, C. E. Busse, H. Wardemann, Direct high-throughput amplification and sequencing of immunoglobulin genes from single human B cells. Eur. J. Immunol. 45, 2698-700 (2015); H. Wardemann et al., Predominant autoantibody production by early human B cell precursors. Science. 301, 1374-7 (2003); J. Benckert et al., The majority of intestinal IgA+ and IgG+ plasmablasts in the human gut are antigen-specific. J. Clin. Invest. 121, 1946-55 (2011))。配列情報はＳａｎｇｅｒシーケンシングにより得られた。
【０２００】
１．７  組換え完全ヒト  クレブシエラ・ニューモニエＯ−抗原抗体のクローニング
完全ヒト抗体を製造するために、Ｉｇ重鎖および対応するＩｇ軽鎖の遺伝子をまず、それぞれヒトＩｇγ１およびＩｇκまたはＩｇλ発現ベクター内へクローニングした。そのために、Ｉｇ重鎖および対応するＩｇ軽鎖の遺伝子を、一次ＰＣＲ生成物から適切な制限部位を含むＶ−セグメントおよびＪ−セグメント特異的プライマーを用いて特異的に増幅した。Ｉｇ遺伝子ＰＣＲフラグメントを精製し、それぞれの制限酵素を用いて消化した。その後、特異的ＰＣＲ  Ｉｇ遺伝子フラグメントを、それぞれのヒトＩｇ定常領域を含むヒトＩｇγ１およびＩｇκまたはＩｇλ発現ベクター内へライゲートした。Ｉｇγ１発現ベクターはＩｇ定常領域の分泌型スプライスバリアントを備えており、細胞培養上清中への抗体の分泌を可能にした。
【０２０１】
首尾よくライゲートした発現ベクターを増幅するために、ベクターを化学的コンピテント大腸菌(chemically competent E.coli)（ＤＨ１０Ｂ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ形質転換した。陽性クローンを選択するために、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレートに溶液全体を播種し、３７℃で最低１６時間インキュベートした。それぞれの発現ベクター内へ適正に挿入されたことを確認するために、細菌コロニー上で適切なプライマー対を用いてインサートチェックＰＣＲ(Insert check PCR)を実施し、生成物を精製およびＳａｎｇｅｒシーケンシングによる配列決定のために送った（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。まず、得られた配列をそれぞれのＩｇ遺伝子のインフレーム挿入(in-frame insertion)について検査した。その後、配列を二次ＰＣＲ生成物の配列と比較し、インサートチェックＰＣＲ配列中に追加のＰＣＲ−プローン(PCR-prone)点変異が見出されれば除外した。二次ＰＣＲ生成物中に見出された点変異がインサートチェックＰＣＲ配列中に存在しなければ、これらの変異は二次ＰＣＲプロセスの初期に発生した可能性が高いため、これらの変異は解析に含めなかった。適正にクローニングされた発現ベクターを増幅するために、適正なプラスミドを保有する細菌を、１３ｍｌの培養チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内の７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４ｍｌのＴＢ（Ｇｉｂｃｏ）中へ接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで最低１６時間、増殖させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ）を用い、製造業者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２０２】
１．８  組換え完全ヒト  クレブシエラ・ニューモニエＯ３−抗原抗体の発現
それぞれ接着性および非接着性ヒト胎児腎(human embryonic kidney)２９３細胞であるＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクションにより、完全ヒトＩｇＧ１抗体を製造した。
【０２０３】
１．８．１  哺乳動物細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔは３７℃で５％  ＣＯ２中において、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳおよび１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を含有する２５ｍｌのＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ培地中で培養され、それに対しＨＥＫ２９３Ｓは３７℃で５％  ＣＯ２中において、２０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養された；１８０ｒｐｍで５０ｍｌのＢｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＴＰＰ）内において。
【０２０４】
１．８．２  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＰＥＩ仲介トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過性の遺伝子伝達にカチオンポリマーＰＥＩを用いた。そのために、１０〜１５μｇのＩｇＨベクターをそれに対応する等量のＩｇＬベクターと混合し、総ＤＮＡ  ５０μｌ／μｇの１５０ｍＭ無菌塩化ナトリウム溶液を添加した。その後、ＰＥＩ［０．６ｍｇ／ｍｌ］を３：１（ｗ／ｗ）のＤＮＡ：ＰＥＩ比で添加した。溶液を直ちに１０秒間ボルテックス攪拌し、室温で１０分間インキュベートした。その間に、予め３７℃に加温した１０ｍｌのＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘでプレートを洗浄して、残存するウシ血清抗体を除去した。そうして、予め加温した２５ｍｌの発現培地（ＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ；１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）および１×無血清培地サプリメントＮｕｔｒｉｄｏｍａ（Ｒｏｃｈｅ）を含有）を添加し、さらに使用するまで細胞を３７℃で５％  ＣＯ２中においてインキュベートした。そして、トランスフェクションミックスを細胞に滴加し、細胞を３．５日間インキュベートした。その後、上清中に分泌された抗体を採集し、細胞を再び２５ｍｌの発現培地と共にインキュベートした。上清を４０００ｇで遠心して細胞屑を除去し、無菌の５０ｍｌ遠心チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内へ移した。
【０２０５】
１．８．３  ＨＥＫ２９３Ｓ細胞のＰＥＩ仲介トランスフェクション
カチオンポリマーＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｓ細胞を一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、１０ｍｌのＨＥＫ２９３Ｓ細胞を１．５×１０６細胞／ｍｌでＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地に播種した。１６時間後、Ｔｈｏｍａチャンバーを用いて細胞数はおおよそ２．５×１０６細胞／ｍｌと判定された。そうして、１０〜１５μｇのＩｇＨベクターをそれに対応する等量のＩｇＬベクターと混合し、細胞懸濁液に添加した。その後、細胞をさらに５分間インキュベートした。調製した細胞をトランスフェクションするために、ＰＥＩ［０．６ｍｇ／ｍｌ］を３：１（ｗ／ｗ）のＤＮＡ：ＰＥＩ比で添加した。２４時間後、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する１０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）を細胞に添加し、３７℃で５％  ＣＯ２中において５日間、インキュベートした。上清を４０００ｇで遠心して細胞屑を除去し、無菌の５０ｍｌ遠心チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内へ移した。
【０２０６】
１．９  抗体精製
分泌された抗体を細胞培養上清から精製するために、抗体を含有する上清１０ｍｌ当たり１２．５μｌのプロテイン−Ｇ結合ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、４０００ｇ、４℃で１０分間の遠心により５０ｍｌの氷冷した無菌１×ＰＢＳ，ｐＨ＝７．４（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。上清を慎重にビーズから分離し、１００μｌ／試料の適宜な体積を遠心チューブ内に残し、抗体上清に添加した。この混合物を少なくとも１２時間、４℃でローテータ(rotator)上においてインキュベートした。その後、４０００ｇ、４℃で１０分間、遠心し、上清を慎重に分離することによりビーズを採集し、必要であれば新たな無菌の５０ｍｌ遠心チューブ内へ添加した。２ｍｌの氷冷ＰＢＳで平衡化したクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にビーズを添加した。重力流により、または親指で圧力をかけることによりカラムを空にした。ビーズを１．５ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗浄した。そうして、４５０μｌの無菌０．１Ｍグリシン，ｐＨ＝３を３分間適用する低ｐＨパルスにより、抗体はプロテイン−Ｇから１．５ｍｌチューブ内へ放出され、１：１０当量の無菌１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液，ｐＨ＝８を添加することによりその溶液を緩衝化した。２２５μｌのグリシン溶液を用いてこの操作を繰り返し、第２の無菌１．５ｍｌチューブ内へ溶離した。おおよそ１０μｌの溶液をｐＨ指示薬小片（Ｓｉｇｍａ）上に添加することにより、溶液のｐＨ＝７．４〜８．０を確認した。
【０２０７】
１．１０  抗体濃度測定
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により精製画分中の抗体濃度を測定した。そのために、９６ウェル高結合性プレート（Ｃｏｓｔａｒ）をヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−フラグメント特異的捕獲抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）の１：５００希釈液５０μｌで、４℃において少なくとも１２時間コーティングした。そうして、プレートを脱イオン水で３回洗浄し、ウェル当たり２００μｌのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ，０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０および１ｍＭのＥＤＴＡ）を１時間添加した。さらに３回洗浄した後、プレートを８つの５０μｌ  １：２．５抗体系列希釈液（ＰＢＳ中）と共にインキュベートし、１時間インキュベートした。１μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌから出発したヒト血漿由来ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の２つの系列希釈液を基準として用いた。洗浄した後、５０μｌの１：１０００  ＨＲＰカップリングしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ二次抗体を１時間添加した。追加洗浄工程の後、１００μｌのＨＲＰ  ＡＢＴＳ基質を添加し、結合した抗体の量を４０５ｎｍにおける光学濃度として検出した。
【０２０８】
２．  抗体反応性測定
精製したモノクローナル抗体を、クレブシエラ・ニューモニエＬＰＳ  Ｏ−抗原への結合についてＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにより試験した。
【０２０９】
２．１  Ｏ−抗原ＥＬＩＳＡ
ビオチニル化Ｏ−抗原試料を固定化するために、高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）をＰＢＳ中１ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＮＥＢ）５０ｕｌで一夜コーティングした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した後に１μｇ／ｍｌのビオチニル化したクレブシエラ・ニューモニエ株Ｏ−抗原５０μｌを添加した。Ｏ−抗原は下記の株から調製された：それぞれ、Ｏ３：Ｋ−またはＯ１（４３８１６，ＡＴＣＣ）、Ｏ２  ｇｔｒ−  Ｋｐ２６（臨床分離株）およびＯ２  ｇｔｒ＋（ＰＣＭ−２７，Ｐｏｌｉｓｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）。
【０２１０】
室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ  ２００μｌと共に室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、出発濃度４μｇ／ｍｌの組換えヒトＩｇＧ１抗体の１：４系列希釈液をプレートに室温で１時間添加した。追加洗浄工程の後、ブロッキング緩衝液中に希釈した１：１０００のＨＲＰカップリングしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ）二次抗体５０μｌを用いて、濃度依存性結合を検出した。洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ  ＡＢＴＳ基質を添加し、４０５ｎｍにおける光学濃度として抗体結合を検出した。先に解明された非−多重反応性成熟ナイーブ抗体(Wardemann et al. Science 2003, 301(5638):1374-7)を陰性対照として用いた。
【０２１１】
２．２  ストレプトアビジンＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡにより、無関係なタンパク質であるストレプトアビジンへの結合によって抗原結合の特異性を判定した。Ｏ−抗原ＥＬＩＳＡセクションの記載に従ってＥＬＩＳＡを実施し、ただしプレートをビオチニル化Ｏ−抗原希釈液と共にインキュベートする代わりに１×ＰＢＳを用いた。
【０２１２】
２．３  全ＬＰＳイムノブロット：
２ｕｇ  ＬＰＳ／試料のクレブシエラ・ニューモニエＯ−血清型をＳＤＳ含有−装填色素（ＮＥＢ）中に希釈し、９５℃に５分間加熱した後、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａｎｙＫｄ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に適用した。ＬＰＳをニトロセルロース膜上へ転写し、膜の完全乾燥により固定した。膜の再活性化および追加洗浄工程の後、膜をＴＢＳ中の４％  ＢＳＡ溶液に一夜入れた。そうして、膜をメスで適宜な切片に切断し、ＴＢＳ中２ｕｇ／ｍｌのモノクローナルヒトＩｇＧ１抗体溶液中において室温で１．５時間インキュベートした。その後、膜をＴＢＳで５分間、２回洗浄し、ＨＲＰカップリングした抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体（１：１００００；１％  ＢＳＡを含有するＴＢＳ中）と共にインキュベートした。ＴＢＳで５分間、３回洗浄した後、ルミノールベースの検出（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて結合を検出した。
【０２１３】
２．４  Ｉｇ遺伝子解析：
ＩＭＧＴまたはＫａｂａｔ  ＣＤＲ定義を用いるＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔに埋め込まれたＩＧＭＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２．１のＩｇ遺伝子基準データベースを用いて、ヒトＩｇ遺伝子を同定した(M.-P. Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp. Immunol. 27, 55-77 (2003))。ベストマッチ(best matched)生殖細胞系列ヒットを同定した。プライマー結合領域の末端からＩＧＨＶ、ＩＧＫＶ、またはＩＧＬＶ遺伝子の末端までの体細胞超変異(somatic hypermutation)（ＳＨＭ）を計数した。挿入または欠失は、それらの長さに関係なく１つのＳＨＭとして計数された。
【０２１４】
２．５  バイオインフォマティクス：
ＢＤ  ＦＡＣＳＤＩＶＡ  ７  Ｖ８．０．１ソフトウェアを用いてシングルセルソーティング蛍光指数データを記録し、ＲについてのｆｌｏｗＣｏｒｅパッケージを用いて抽出した(P. Ellis et al., flowCore: Basic structures for flow cytometry data (2016))。Ｐｒｉｓｍ  ｖ６，Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ６  ｖ１６．０．３（Ａｄｏｂｅ）、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６（Ａｄｏｂｅ）、およびＲを用い、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いて、プロットを作成した(H. Wickham, ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis (Springer-Verlag New York, 2009))。
【０２１５】
結果
完全ヒト抗−クレブシエラ・ニューモニエ  リポ多糖Ｏ３−抗原抗体
ビオチニル化抗原は、それらの検出のために蛍光体カップリングしたストレプトアビジンと組み合わせて、フローサイトメトリーを用いるタンパク質抗原反応性Ｂ細胞の同定および単離のために広く適用されている(J. F. Scheid et al., A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. J. Immunol. Methods. 343, 65-7 (2009); O. L. Rojas, C. F. Narvaez, H. B. Greenberg, J. Angel, M. A. Franco, Characterization of rotavirus specific B cells and their relation with serological memory. Virology. 380, 234-42 (2008); P. F. Kerkman et al., Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 75, 1170-1176 (2016))。
【０２１６】
ここでは、ビオチニル化クレブシエラ・ニューモニエＯ３  Ｏ−多糖をベイトとして用い、ストレプトアビジンコンジュゲートした蛍光体をＯ３  Ｏ−抗原反応性Ｂ細胞の同定および単離のために用いた。ヒト腸粘膜固有層Ｂ細胞プール内の稀なＯ−抗原結合性プラズマ細胞芽球の集団をフローサイトメトリーにより検出した（図３ｂ）。シングルＯ−抗原結合Ｂ細胞を蛍光活性化セルソーティングにより単離し、それらのそれぞれのＩｇ重鎖および関連するＩｇ軽鎖の遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＳａｎｇｅｒシーケンシングによりＩｇ遺伝子情報を得た。データは、大部分のＯ−抗原反応性粘膜固有層プラズマ細胞芽球が、種々の程度のＩＧＨＶ遺伝子体細胞超変異を伴なうＩｇＡ抗体を発現することを示す（図３ｃ）。１０のモノクローナル抗体をクローニングし、ＩｇＡプラズマ細胞芽球からＩｇＧ１として組換え発現させた。すべての抗体が、ＥＬＩＳＡにおいてビオチニル化Ｏ３−抗原ベイトに（図３ｄ）、およびウェスタンブロットにおいて全Ｏ３ａ  ＬＰＳに（図３ｄおよび図３ｅ）濃度依存性結合を示したが、ＥＬＩＳＡにより検出可能なレベルの、ストレプトアビジンとの反応性はなかった（図３ｆ）。Ｉｇ遺伝子フィーチャーを図３ｇに示す表に提示する。
【０２１７】
実施例２：Ｏ３グループ交差反応性抗体の表面結合
選択した抗体への３つの異なるＯ３血清グループに属するクレブシエラ・ニューモニエ生菌株の結合を、フローサイトメトリーで確認した。一夜増殖させた細菌を希釈し、対数増殖期中期まで増殖させ（ＯＤ６００＝０．５）、ＨＢＳＳ中で洗浄し、表面染色に用いた。２×１０６個の細菌を、０．５％のＢＳＡ＋０．０１％のナトリウムアジドを含有するＨＢＳＳに再懸濁し、ｍＡｂで３０分間、氷上で染色した。ＢＳＡおよびナトリウムアジドを含有するＨＢＳＳ緩衝液中で試料を２回洗浄し、４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートしたヤギ抗−ヒトＩｇ二次抗体を含有するＨＢＳＳに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。洗浄した後、５ｎＭのＳＹＴＯ−６２色素を含有するＨＢＳＳに試料を再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした後、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーターで分析した。
【０２１８】
試験したすべてのｍＡｂが、３つの異なるＯ３タイプ抗原のうちの１つを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ生菌株への結合を示した；ただし、異なる強度で（図４）。ｍＡｂ  ＭＰＧ−５４７（本明細書中でＵａＬＰＬＯ３−５４７とも呼ぶ）、５５５（本明細書中でＵａＬＰＬＯ３−５５５とも呼ぶ）、および６０１（本明細書中でＵａＬＰＬＯ３−６０１とも呼ぶ）は１μｇ／ｍｌという低い濃度ですら強い結合を示したが、抗体ＭＰＧ−０９５（本明細書中でＵａＬＰＬＯ３−０９５とも呼ぶ）および２０８Ｌ（本明細書中で  ＵａＬＰＬＯ３−２０８またはＵａＬＰＬＯ３−２０８Ｌとも呼ぶ）はこれらよりかなり低い強度で前記菌株を結合した。最高の信号強度はＭＰＧ−６０１で検出された。
【０２１９】
抗体結合特性をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により調べた。 
ビオチニル化Ｏ３ａ多糖抗原（菌株ＰＣＭ−１１から精製したもの）をストレプトアビジンセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化して約０．３ｎｍの装填量にし、この予め装填したセンサーへのヒトｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の会合を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤＰＢＳ，ｐＨ７．２中で１０分間モニターし、続いて同じ緩衝液中で解離（１０分間）させることにより、抗体結合を測定した。すべての実験を３０℃で実施した。Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、会合曲線と解離曲線を同時に１対１結合モデルに当てはめることにより、ＫＤ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を決定した。０．０５ｎｍ未満の応答値を陰性とみなした。
【０２２０】
ＫＤ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を次表にまとめる。表面染色実験の結果が確認され、ｍＡｂ  ＭＰＧ−６０１、５４７および５５５はビオチニル化Ｏ３ａ抗原に対して最高の親和性（ＫＤ＜１．００Ｅ−０８）を示した。ｍＡｂ  ＭＰＧ−０９５および２０８Ｌは、それらのより高いＫＤ値のほかに、最速の解離、および二相動態曲線プロファイルをも示し、したがってこれらのｍＡｂについては部分曲線当てはめを実施した。いずれのｍＡｂについても陰性対照抗原への結合はみられなかった。
【０２２１】
【表３】
2019531708.tif 000004
【０２２２】
実施例３：Ｏ３  ＬＰＳのインビトロ中和
Ｏ３特異的ｍＡｂの機能活性をインビトロアッセイにおいて試験した。
市販のレポーター細胞株（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  ＴＬＲ４，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従って、精製ＬＰＳにより誘発したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）シグナル伝達を検出した。２５μｌのｍＡｂ（ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ（商標）  培地中に希釈したもの）を、２５μｌの融解したばかりの精製ＬＰＳと混合した。Ｏ３  ＬＰＳは種々のＯ３サブグループ（ＰＣＭ−１１（Ｏ３ａ）、Ｋｐ１４（Ｏ３）、Ｋｐ８１（Ｏ３ｂ））に属する菌株に由来していた。ＬＰＳ溶液をＨＥＫ  Ｂｌｕｅ（商標）  培地中にそれぞれ４、１０および０．８ｎｇ／ｍｌの最終濃度で調製した。混合物を透明９６ウェル  ハーフエリア(half-area)プレートに移し、室温で３０分間インキュベートした。その後、５０μｌのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  細胞懸濁液を反応ミックスに添加した（約５０，０００細胞／ウェル）。プレートをアルミニウムホイルに包み、３７℃で５％  ＣＯ２中において一夜（１６〜１８時間）インキュベートした。翌日、６３０ｎｍで光学濃度を測定し、モック(mock)を上回るレポータータンパク質レベル（分泌された胎児アルカリホスファターゼ(secreted embryonic alkaline phosphatase)−ＳＥＡＰ）を計算した。種々のｍＡｂ濃度において無抗体対照に対比したＳＥＡＰ誘導の阻害率を計算し、プロットした。陽性対照として、ポリミキシンＢ（硫酸ＰＭＢ，ＦＬＵＫＡ  カタログ＃８１３３４）を被験ｍＡｂと同様に用いた。陰性対照として、無関係なｍＡｂを含めた。
【０２２３】
中和効率は異なるが、すべての抗体が試験したすべてのＬＰＳの中和により用量依存性のＴＬＲ−４シグナル伝達阻害を示した（図５ａ）。その効率は、ＢＬＩにより測定した親和性との良好な相関性も示した。重要なことに、ｍＡｂ  ＭＰＧ−６０１は  ポリミキシンＢのものを２  ｌｏｇ上回る最高の中和力価を示した。
【０２２４】
実施例４：血清殺細菌活性
Ｏ３  ｍＡｂの食細胞−非依存性の殺細菌活性を調べるために、ＭＰＧ−６０１をいわゆる血清殺細菌アッセイ(serum bactericidal assay)（ＳＢＡ）において試験した。クレブシエラ・ニューモニエの臨床分離株（Ｋｐ１４およびＫｐ８１）を、既存の特異的抗体を枯渇させた５０％ヒト血清中において、２．５μｇ／ｍｌのＭＰＧ−６０１または無関係な対照ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂの存在下でインキュベートした。２人の健康な個体からの血清を試験した。これらの実験により、無関係な特異性をもつアイソタイプマッチしたｍＡｂと比較して、ＭＰＧ−６０１が両方のヒト血清において有意の補体仲介殺細菌性を誘発することが確認された（図５ｂ）。
【０２２５】
実施例５：インビボでのＯ３  ｍＡｂの防御効果
マウス５匹のグループを、２００または２０μｇのＯ３特異的ｍＡｂまたは陰性対照としての無関係なｍＡｂで腹腔内受動免疫化した。２４時間後、マウスを２０ｍｇのＧａｌＮの腹腔内投与によりエンドトキシンに対して感作し、同時に致死量のクレブシエラ・ニューモニエ株Ｋｐ８１（Ｏ３ｂ）で攻撃した。致死率を１４日間モニターした。
【０２２６】
高い方の用量ではＭＰＧ−２０８Ｌ以外のすべてのｍＡｂが防御を示した（図６Ａ）。それに対し、ＭＰＧ−６０１は２０μｇ／マウスの用量ですら防御を示し（図６Ｂ）、これはそれの高い親和性および卓越したインビトロＬＰＳ中和力価と良好に相関する。
【０２２７】
実施例６：５つの代表的ｍＡｂの選択
Ｂ細胞ソーティングから得られたｍＡｂの特異性をイムノブロットにおいて判定した。Ｏ３、Ｏ３ａ、Ｏ３ｂおよびＯ５株から精製したＬＰＳ分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いてポリジフッ化ビニリデン膜へ転写した。膜を１μｇ／ｍｌのヒトｍＡｂおよび二次ＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧと反応させた。ブロットをＥＣＬ試薬で現像した。種々のＬＰＳ分子へのｍＡｂの結合を表にまとめる。
【０２２８】
Ｏ３グループ交差反応性であると同定された抗体の機能をインビトロＬＰＳ中和アッセイで比較した。実施例３に記載したものと同じ方法を用いた。
中和アッセイに用いたＬＰＳは、菌株Ｋｐ８１（Ｏ３ｂ）由来のものであった。１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度で無抗体対照に対比したＳＥＡＰ誘導の阻害率を計算し、プロットした。
【０２２９】
中和能に基づいて、ＳＥＡＰ誘導の最高阻害を伴なう５つのｍＡｂを、先の実施例に記載した後続試験のために選択した。
実施例７：潜在的な配列ライアビリティーを排除するための抗−クレブシエラ・ニューモニエＯ３−抗原抗体の機能性配列バリアントの作製
インシリコ配列分析により同定した潜在的な製造可能性問題に対処するために、ＭＰＧ−６０１の変異体を作製する：ＭＰＧ−６０１  Ｃ１０８Ｓ：ＨＣＤＲ３中の非対合Ｃｙｓを排除するため；ＭＰＧ−６０１  Ｈ９７Ｙ：この位置にみられる稀なＨｉｓ残基を、より一般的にみられるＴｙｒで置き換えるため；最後に、変異ＭＰＧ−６０１  Ｃ１０８ＳとＨ９７Ｙの両方を含む二重変異体。この変異形成は、標準法に従ってＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的変異導入キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，＃  ２００５２１）を用いて実施される。
【０２３０】
これら３つの変異体および元の野生型（親）ｍＡｂを、標準的なモノクローナル抗体発現法に従ってＣＨＯ細胞において発現させる。変異体の発現収率（ＣＨＯ細胞の上清からウェスタンブロットにより測定）およびモノマー含量（標準法に従ってＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定）を野生型（親）ｍＡｂのものと比較する。さらに実施例２に記載したように、変異体をＯ３、Ｏ３ａもしくはＯ３ｂ  Ｏ−抗原または無関係なＯ−抗原のうちの１つを発現する菌株の表面への結合につきフローサイトメトリーにおいて試験する。導入した変異による結合または効力の大きな変化を除外するために、実施例３の記載に従ってインビトロＬＰＳ中和アッセイにおいて変異体の機能活性を野生型（親）ｍＡｂの活性と比較する。
【０２３１】
参考文献
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3. Vinogradov E, Frirdich E, MacLean LL, Perry MB, Petersen BO, Duus JO, Whitfield C. 2002. Structures of lipopolysaccharides from Klebsiella pneumoniae. Eluicidation of the structure of the linkage region between core and polysaccharide O chain and identification of the residues at the non-reducing termini of the O chains. J.Biol.Chem. 277:25070-25081.
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6. Greenfield LK, Richards MR, Vinogradov E, Wakarchuk WW, Lowary TL, Whitfield C. 2012. Domain organization of the polymerizing mannosyltransferases involved in synthesis of the Escherichia coli O8 and O9a lipopolysaccharide O-antigens. J.Biol.Chem. 287:38135-38149.
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【図１−１】
2019531708.tif 000005
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
2019531708.tif 000009
【図２−４】
2019531708.tif 000010
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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