(57)【要約】  それぞれヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質である血小板凝集抑制剤Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ａ鎖の遺伝子及びＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ｂ鎖の遺伝子を含む組換えプラスミド、前記組換えプラスミドを含む細胞株、及びヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質である血小板凝集抑制剤Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの発現方法を提供する。前記方法によれば、血小板凝集抑制剤の発現量は１０ｍｇ／Ｌを超え、２段階精製により純度は９５％以上に達することができる。
2019531734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ａ鎖の遺伝子配列が配列番号１に示される、図１に示すプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ａ。
【請求項２】
Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ｂ鎖の遺伝子配列が配列番号２に示される、図２に示すプラスミドｐＵＣＺ−Ｂ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプラスミドのうちの１つ又はそれらの組み合わせを含む、形質転換体。
【請求項４】
組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を発現し、前記ヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質は、Ａ鎖及びＢ鎖の２本のペプチド鎖から構成され、Ａ鎖のアミノ酸配列は配列番号３に示され、Ｂ鎖のアミノ酸配列は配列番号４に示される、請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
ピキア酵母菌株である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
寄託番号はＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０１６３５８であり、ピキアパストリスＧＳ１１５と命名される請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
血栓治療薬の製造における、請求項１又は２に記載のプラスミド、請求項３から６のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
【請求項８】
請求項４から６のいずれか１項に記載の形質転換体二次菌糸を取り、ｐＨ４．０〜６．０の基礎塩培地に接種し、グリセリンを４％になるまで添加し、菌体を増殖させ、溶存酸素量ＤＯが急激に上昇して終了するＢａｔｃｈ段階と、
湿重量が１９０−２００ｇ／Ｌになるまで１０−１５ｍｌ／ｈ／Ｌの流速で１０−１５ｍｌ／ＬのＰＴＭ１を含む５０％グリセリン溶液を連続的に補充する転換期と、
湿重量が１９０−２００ｇ／Ｌに達したらグリセリンの流加を停止し、一定のメタノール流速で１２ｍｌ／ＬのＰＴＭ１を含むメタノール溶液を制限的に流加するメタノール誘導段階であって、撹拌速度が８００−１２００ｒｐｍであり、合計７０−９０時間発酵させ、湿重量が４００−６００ｇ／Ｌになる段階と、
発酵終了後、発酵液のｐＨを８．０に調整し、高速遠心分離し、カラムに通し、精製することにより、組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を得るタンパク質精製と、
を含む、組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を大量に発現する方法。
【請求項９】
前記過程全体の温度は２８−３４℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の方法により製造された組換えタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質の製造方法に関し、特に血栓を治療する組換えタンパク質薬物であるヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患、特に血栓による脳梗塞及び心筋梗塞は、人間の健康にとって深刻な脅威であり、患者の生活の質に影響を及ぼしている。このような疾患は、現在致死率が世界で３番目に高く、急性発作により患者の命に大きな脅威をもたらすだけでなく、非常に予後不良が発生しやすいため、物と金の浪費に繋がっている。そこで、このような疾患に対する安全で効果的でかつ新規な薬物の開発が切望されている。また、ヘビ毒の血液凝固システムに対する作用がますます重要視されており、ヘビ毒における特定の成分は前記疾患を治療する有効な薬である。
【０００３】
ヒャッポダヘビ毒抗血小板凝集抑制剤は、中国科大生命学院によって長年にわたってヘビ毒タンパク質について成分分離、精製、活性研究を行うことにより発見されたＣ型レクチン様タンパク質（「Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ」と命名され、中国語名は「抗血小板溶栓素」である）である。Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは、ヘテロ二量体であり、２つのサブユニットの見かけの分子量はいずれも約１４−１５ｋＤａであり、非常に近い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより正確に測定した結果、Ａｇｋｉｓａｃｕｃｅｔｉｎの分子量は３０ｋＤａであった。アミノ酸Ｎ末端配列決定、ＬＣ−ＭＳ及びＡｇｋｉｓａｃｕｃｅｔｉｎタンパク質の結晶構造等の方法により、最終的にＡｇｋｉｓａｃｕｃｅｔｉｎの配列及び結晶構造が得られた。Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは、血小板凝集を抑制する活性を有する。これまでの研究は、このタンパク質の新規な抗血栓薬への開発のために重要な基盤を築いた。
【０００４】
現在、Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは、主に天然ヘビ毒から抽出したものである。しかし、天然ヘビ毒の供給源は限られており、精製工程が複雑であり、収率が低いため、Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの抗血栓薬としての科学的及び臨床的応用は制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、組換えプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ａ（図１に示すように、ＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎのＡ鎖の遺伝子配列は配列番号１に示される）、プラスミドｐＵＣＺ−Ｂ（図２に示すように、ＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎのＢ鎖の遺伝子配列は配列番号２に示される）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、組換えプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ａ、プラスミドｐＵＣＺ−Ｂのうちの１つ又はそれらの組み合わせを含む形質転換体をさらに提供する。
【０００７】
本発明は、組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を発現する形質転換体をさらに提供する。前記ヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質は、Ａ鎖とＢ鎖の２本のペプチド鎖から構成され、Ａ鎖アミノ酸配列は配列番号３に示され、Ｂ鎖アミノ酸配列は配列番号４に示される。
【０００８】
好ましくは、前記形質転換体は細胞株ピキア酵母菌株である。
【０００９】
特に、本発明の実施例において、寄託番号：組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を発現するＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０１６３５８の細胞株（「ピキアパストリスＧＳ１１５」と命名される）が提供される。前記ヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質は、Ａ鎖とＢ鎖の２本のペプチド鎖から構成され、Ａ鎖アミノ酸配列は配列番号３に示され、Ｂ鎖アミノ酸配列は配列番号４に示される。
【００１０】
本発明は、血栓治療薬の製造における前記プラスミド、前記形質転換体の使用をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、
請求項４から６のいずれか１項に記載の形質転換体二次菌糸を取り、ｐＨ４．０〜６．０の基礎塩培地に接種し、グリセリンを４％になるまで添加し、菌体を増殖させ、溶存酸素量ＤＯが急激に上昇して終了するＢａｔｃｈ段階と、
湿重量（ここで、湿重量ｇ／Ｌとは、培地１Ｌあたりに含まれる菌体の重量を指す。）が１９０−２００ｇ／Ｌになるまで１０−１５ｍｌ／ｈ／Ｌの流速で１０−１５ｍｌ／ＬのＰＴＭ１を含む５０％グリセリン溶液を連続的に補充する転換期と、
湿重量が１９０−２００ｇ／Ｌに達したらグリセリンの流加を停止し、一定のメタノール流速で１２ｍｌ／ＬのＰＴＭ１を含むメタノール溶液を制限的に流加するメタノール誘導段階であって、撹拌速度が８００−１２００ｒｐｍであり、合計７０−９０時間発酵させ、湿重量が４００−６００ｇ／Ｌになる段階と、
発酵終了後、発酵液のｐＨを８．０に調整し、高速遠心分離し、カラムに通し、精製することにより、組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を得るタンパク質精製と、
を含む、組換えヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質を大量に発現する方法をさらに提供する。
【００１２】
好ましくは、前記過程全体の温度は２８−３４℃である。
【００１３】
本発明は、前記方法により製造された組換えタンパク質をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、全遺伝子合成の方式を採用し、既知のＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎのタンパク質配列及び構造形態からそのコード遺伝子を取得し、メタノール資化性ピキア酵母が理想的なＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ発現系であることを発見した上で、組換え発現により大量の高純度のＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎを得る。実験により、酵母が発現した組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎはヘテロ二量体タンパク質であり、生物学的活性を有することが実証された。
【００１５】
本発明は、初めてピキアパストリスによりＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎを発現し、パイロットスケールの発酵プロセス研究を行ったところ、高密度発酵の条件下の発現量が１０ｍｇ／Ｌを超え、３段階の精製により、純度が９５％を超える。また、本発明は、Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの生産に簡単で安定的な発酵プロセスを提供する。
【００１６】
生物材料寄託の説明
寄託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０１６３５８の細胞株（ピキアパストリスＧＳ１１５（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５）と命名される）は、２０１６年６月３０日に中国典型培養物保存センター（住所：中国武漢市、武漢大学）に寄託されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ａ鎖発現ベクターの構造模式図である。
【図２】Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ｂ鎖発現ベクターの構造模式図である。
【図３】Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの発現菌株のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ検出結果である。
【図４】Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの高発現菌株のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ検出結果である。
【図５】組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎのパイロットスケールの発酵発現条件時間曲線である。
【図６】組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎのパイロットスケールの二本鎖、Ａ鎖、Ｂ鎖の異なる誘導時間の発現状況である。
【図７】タンパク質Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの同定である。
【図８】タンパク質Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの精製である。
【図９】組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎのＧＰ１ｂ結合活性の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ヘテロ二量体ヘビ毒タンパク質の製造方法を開示する。当業者であれば、本発明の内容に基づいてプロセスパラメータを適宜改良することができる。なお、すべての類似の置換及び変更は、当業者にとって自明なものであり、本発明に含まれるものとみなされる。本発明の製品、方法は、好適な実施例によって述べられており、本発明の内容、趣旨及び範囲を逸脱しない限り、当業者が本明細書に記載の方法及び応用について改良、変更及び組み合わせをすることにより本発明の技術を達成及び使用することができる。
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
【００２０】
１．実験材料
【００２１】
１．１  菌株及びプラスミド
【００２２】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株ＧＳ１１５、ｐＰＩＣ９ＫベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、ｐＵＣＺベクター（Ｚｅｏｃｉｎ耐性）は本実験室で構築した。
【００２３】
１．２  試薬
【００２４】
酵母ニトロゲンベース（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（ＹＮＢ））はＢＤ社から購入し、ＲＰＭＩ−１６４０培地はＨｙｃｌｏｎｅ社から購入し、ウシ胎児血清はＧｉｂｃｏから購入し、酵母エキス及びトリプトンはＯＸＯＩＤ社から購入し、ＢＣＡタンパク質検出キットはＰｉｅｒｃｅ社から購入し、ｄ−ソルビトール、ｄ−ビオチン、プラスミド抽出キット、ＰＣＲ生成物回収キット、接着剤回収キット、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、タンパク質マーカー及びＰＡＧＥ構成関連試薬は上海生工から購入し、ＰＨＡ及びエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ＥＺ−ＥＣＬ化学発光検出キットはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から購入し、他の化学試薬は国薬集団から購入した。シリコーン消泡剤は江蘇賽欧信越消泡剤有限公司から購入した。抗Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ抗体１Ｂ９は兆科社に由来する。
【００２５】
１．３  機器
【００２６】
電子分析天秤及びｐＨメーターはメトラー・トレド社から購入し、渦振動子はＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から購入し、電気泳動装置、縦型電気泳動タンク、横型電気泳動タンク、ゲルイメージングシステムは天能社から購入し、セミドライフィルム転写機、エレクトロポレーターはＢｉｏ−Ｒａｄ社から購入し、化学発光検出器はＵＶＩＴＥＣ社から購入し、オートクレーブはＨｉｒａｙａｍａ社から購入し、卓上冷蔵遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０Ｒ、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｒ）はｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社から購入し、クリーンベンチ、シェーカー、恒温インキュベーターは上海智誠社から購入し、ＰＣＲ装置はドイツＢｉｏｍｅｔｒａ社から購入し、マイクロプレートリーダー（ＢＬＸ−８００）はＢｉｏ−Ｔｅｋ社から購入し、マイクロピペットはフランスＧｉｌｓｏｎ社から購入し、細胞培養インキュベーターはＴｈｅｍｏ社から購入し、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ、ラボスケールＴＦＦシステム及びＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ（１０ｋＤ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入し、ＢｉｏＦｌｏ（登録商標）１１５ベンチトップ発酵タンクはＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入し、大型オートクレーブ、フレックススタンドシステム及び０．４５μｍ精密ろ過カートリッジはＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入し、ＬＴＱ  ｌｉｎｅａｒ  ＩＴ  ＭＳはＴｈｅｒｍｏから購入し、ＥｔｔａｎＴＭ  ＭＤＬＣ  ＨＰＬＣシステムはＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。
【００２７】
１．４  プライマー
１．  ＡｇｋｉＡ−Ｆｗ−Ｘｈｏ１：ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＧＴＣ
２．  ＡｇｋｉＡ−Ｒｖ−Ｎｏｔ１−ｎｇ：ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＡＧ
３．  ＡｇｋｉＢ−Ｆｗ−ＥｃｏＲ１：ＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＣＣＣＴＴＧＣＧＴＴＧＴＴＣＧ
４．  ＡｇｋｉＢ−Ｒｖ−Ｎｏｔ１−ｎｇ：ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＡＴＡＧ
【００２８】
２．  実験方法
【００２９】
２．１  Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ａ鎖の発現ベクターの構築
【００３０】
１、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１酵素切断部位を有するＡ鎖の遺伝子の増幅
【００３１】
Ａ鎖ＤＮＡ配列を全遺伝子合成し、プライマーＡｇｋｉＡ−Ｆｗ−Ｘｈｏ１及びＡｇｋｉＡ−Ｒｖ−Ｎｏｔ１−ｎｇのガイドによりＰＣＲ増幅させた。ここで、ＰＣＲ反応の条件は、まず９４℃×２分間、次いで９４℃×３０秒、５５℃×４０秒、７２℃×３０秒、合計３２サイクル、最後に７２℃×１０分間である。反応終了後、ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル電気泳動により検出したところ、約３９６ｂｐのバンドが得られ、予想通りの結果であった。ＰＣＲ生成物回収キットにより目的バンドを回収した。
【００３２】
２、組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ａ鎖のピキア酵母発現ベクターの構築
【００３３】
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１により前記工程で得られたＰＣＲ生成物を二重酵素消化し、さらに酵素消化断片と同じ酵素で二重酵素消化されたプラスミドｐＰＩＣ９ＫとＴ４  ＤＮＡリガーゼで結合し、結合生成物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換し、陽性組換え体をスクリーニングし、プラスミドを抽出し、酵素消化して同定した後、陽性クローンをｐＰＩＣ９Ｋ−Ａと命名し、上海生工に配列決定を行ってもらった。配列決定の結果は、ｐＰＩＣ９ＫのＥｃｏＲ１とＮｏｔ１の認識部位間のＤＮＡ配列が予想結果と完全に一致することを示した。
【００３４】
２．２  Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ｂ鎖の発現ベクターの構築
【００３５】
１、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１酵素切断部位を有するＢ鎖の遺伝子の増幅
【００３６】
Ｂ鎖ＤＮＡ配列を全遺伝子合成し、プライマーＡｇｋｉＢ−Ｆｗ−ＥｃｏＲ１及びＡｇｋｉＢ−Ｒｖ−Ｎｏｔ１−ｎｇのガイドによりＰＣＲ増幅させた。ここで、ＰＣＲ反応の条件は、まず９４℃×２分間、次いで９４℃×３０秒、５５℃×４０秒、７２℃×３０秒、合計３２サイクル、最後に７２℃×１０分間である。反応終了後、ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル電気泳動により検出したところ、約３８１ｂｐのバンドが得られ、予想通りの結果であった。ＰＣＲ生成物回収キットにより目的バンドを回収した。
【００３７】
２、組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ｂ鎖のピキア酵母発現ベクターの構築
【００３８】
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１により前記工程で得られたＰＣＲ生成物を二重酵素消化し、さらに酵素消化断片と同じ酵素で二重酵素消化されたプラスミドｐＰＩＣ９ＫとＴ４  ＤＮＡリガーゼで結合し、結合生成物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換し、陽性組換え体をスクリーニングし、プラスミドを抽出し、酵素消化して同定した後、陽性クローンをｐＰＩＣ９Ｋ−Ｂと命名し、上海生工に配列決定を行ってもらった。配列決定の結果は予想結果と完全に一致した。このクローンプラスミドをＢａｍＨ１及びＮｏｔ１で二重酵素消化し、小断片を回収し、回収された小断片と同じ酵素で二重酵素消化されたプラスミドｐＵＣＺとＴ４  ＤＮＡリガーゼで結合し、結合生成物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換し、陽性組換え体をスクリーニングし、プラスミドを抽出し、酵素消化して同定した後、陽性クローンをｐＵＣＺ−Ｂと命名し、上海生工に配列決定を行ってもらった。配列決定の結果は予想結果と完全に一致した。
【００３９】
２．３  組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ発現クローンのスクリーニング
【００４０】
ピキア酵母菌株ＧＳ１１５をＹＰＤプレートにストリークした。２日後、生成したモノクローンをＹＰＤ液体培地に移して培養した。２日後、酵母は乳白色になり、この一次菌糸をＹＰＤ液体培地に接種して二次菌糸とした。この二次菌糸を用いて酵母コンピテントセルを製造し、そこにＳａｌ１酵素により線形化されたｐＰＩＣ９Ｋ−Ａプラスミドをエレクトロポレーションし、ＭＤプレートに塗布した。４８−７２時間後、プレート上に生成したモノクローンをＭＧＹ液体培地に移して培養し、２日後、１５００ｇの培養物を遠心分離し、上澄みを捨て、ｐＨ５．０のＢＭＭＹ培地を加え、７２時間誘導した。この過程において、ＢＭＭＹ培地中のメタノール濃度が０．５％に維持されるように、２４時間毎に１００％のメタノールを補充した。誘導終了後、１２０００ｇを遠心分離し、上澄みを収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＡ鎖タンパク質を発現したか否かを検出し、Ａ鎖を発現したモノクローンをスクリーニングした。
【００４１】
Ａ鎖タンパク質を発現したＧＳ１１５モノクローンをＭＤプレートにストリークした。２日後、生成したモノクローンをＭＧＹ液体培地に移して培養した。２日後、酵母は乳白色になり、この一次菌糸をＹＰＤ液体培地に接種して二次菌糸とした。この二次菌糸を用いて酵母コンピテントセルを製造し、そこにＳｐｅ１酵素により線形化されたｐＵＣＺ−Ｂプラスミドをエレクトロポレーションし、抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを添加したＭＤプレートに塗布した。４８−７２時間後、プレート上に生成したモノクローンを抗生物質Ｚｅｏｃｉｎを添加したＭＧＹ液体培地に移して培養し、２日後、１５００ｇの培養物を遠心分離し、上澄みを捨て、ｐＨ５．０のＢＭＭＹ培地を加え、７２時間誘導した。この過程において、ＢＭＭＹ培地中のメタノール濃度が０．５％に維持されるように、２４時間毎に１００％のメタノールを補充した。誘導終了後、１２０００ｇを遠心分離し、上澄みを収集し、抗Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎモノクローン抗体を用いて二本鎖タンパク質を発現したか否かについてＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ検出を行った。二本鎖を発現したモノクローンピキア酵母ＧＳ１１５（寄託番号はＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０１６３５８であり、２０１６年６月３０日に中国典型培養物保存センターに寄託されており、ピキアパストリスＧＳ１１５（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５）と命名される。）をスクリーニングした。
【００４２】
２．４  組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの発酵発現
【００４３】
（１）一次菌糸：凍結保存されたワーキングセルバンクからＺｅｏｃｉｎを添加した４ｍｌのＭＧＹ培地（ＭＧＹ＋Ｚ）に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００＝２−６になるまで３６−４８ｈ培養したものを発酵一次菌糸とする。
【００４４】
（２）二次菌糸：１ｍｌの一次菌糸を２００ｍｌのｐＨ５．０ＢＭＧＹに接種し、３０℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００＝２−６になるまで１２−１８ｈ培養したものを発酵二次菌糸とする。
【００４５】
（３）発酵準備：発酵タンクの組み立て及び関連試薬の製造、滅菌など
【００４６】
（４）Ｂａｔｃｈ段階：二次菌糸を４ＬのｐＨ５．０の基礎塩培地を含む１４Ｌ発酵タンクに接種し、培養温度３０℃で４％グリセリンを含む基礎塩培地（ｐＨ  ５．０）を用いてｂａｔｃｈ段階で菌体を増殖させた。ＤＯが急激に上昇してｂａｔｃｈ段階が終了した。
【００４７】
（５）転換期：ＤＯが急激に上昇し始めると、元の培地におけるグリセリンが消耗しきったことを示し、１２ｍｌ／Ｌ  ＰＴＭ１を含む５０％グリセリン溶液を連続的に補充する必要がある。流速は１２ｍｌ／ｈ／Ｌであり、この過程において、湿重量が約１９０ｇ／Ｌに達するまで４ｈ維持した。
【００４８】
（６）メタノール誘導段階：湿重量が約１９０ｇ／Ｌに達したらグリセリンの流加を停止し、溶存酸素が急速に上昇し、一定のメタノール流速で１２ｍｌ／ＬＰＴＭ１を含むメタノール溶液を制限的に添加し始めた。温度は３０℃であり、撹拌速度は約１０００ｒｐｍであり、合計約８０時間発酵させ、湿重量は約５００ｇ／Ｌになった。
【００４９】
２．５  組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの精製
【００５０】
（１）固液分離：発酵終了後、ＮａＯＨを用いて発酵液のｐＨをゆっくりと８．０に調整し、１００００ｇを２０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを収集した。
【００５１】
（２）試料の清澄：使用フレックススタンドシステム０．２２μｍにより濾過して清澄した。
【００５２】
（３）タンパク質捕獲：イオン交換カラムにより発酵液における組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎを捕獲した。フレックススタンド限外ろ過／ろ過システムを用いて発酵液を透析して脱塩し、脱塩した後の試料をＣＭ  ＦＦカラムに通し、３０％の緩衝液Ｂで試料を溶出した。
【００５３】
（４）精密精製：３０％溶出液における試料の一部をＱ  ＨＰによりさらに精製し、勾配溶出し、各ピークに対応する試料を連続的に収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの純度を検出した。
【００５４】
（５）保存：ＰＢＳによりタンパク質を凍結保存して予備用とした。
【００５５】
２．６  組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの活性検出
【００５６】
（１）天然抽出されたＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎはＧＰ１ｂサイトに結合することができる。組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎと組換えＧＰＩｂとの結合能力の検出実験を行った。
【００５７】
（２）天然抽出されたＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは血小板凝集を抑制することができる。組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎによる血小板凝集の抑制の実験を行った。
【００５８】
３  実験結果
【００５９】
３．１  Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ発現ベクターの構築（図１、２）
【００６０】
Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ａ鎖は、全長１３２個のアミノ酸である。Ａ鎖のコード配列をピキア酵母α−Ｆａｃｔｏｒシグナルペプチド３’末端に結合し、ｐＰＩＣ９Ｋ酵母発現ベクターにクローンした。これにより、ＡＯＸＩプロモーターは、メタノールによりその下流にあるタンパク質の発現が駆動されるように誘導された。
【００６１】
Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ  Ｂ鎖は、全長１２７個のアミノ酸である。Ｂ鎖のコード配列をピキア酵母α−Ｆａｃｔｏｒシグナルペプチド３’末端に結合し、ｐＵＣＺ酵母発現ベクターにクローンした。これにより、ＡＯＸＩプロモーターは、メタノールによりその下流にあるタンパク質の発現が駆動されるように誘導された。
【００６２】
３．２  Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ発現菌株のスクリーニング
【００６３】
複数回のスクリーニングにより、Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎを発現したクローンを得た。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ検出結果を図３に示す。
【００６４】
そのうちのクローン１を再スクリーニングし、７つの発現クローンを得、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｌｏｔｔｉｎｇによりこれらのクローンにおけるＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの発現状況を検出した結果、いずれも組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎを効果的に発現した（図４）。
【００６５】
３．３  組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎパイロットスケールの発酵発現
【００６６】
一定のメタノール流速でメタノールを制限的に流加し、発現菌の流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）を行った。まず、４％グリセリンを含む基礎塩培地（ｐＨ５．０）を用いて培養温度３０℃でｂａｔｃｈ段階で菌体を増殖させた。ＤＯが急激に上昇してｂａｔｃｈ段階が終了し、菌体の湿重量は１３４．７ｇ／Ｌに達した。その後、転換期、即ちグリセリン流加期に入り、約４時間の増殖後、菌体の湿重量はさらに増大して１９３．６ｇ／Ｌに達した。このときにグリセリンの流加を停止し、菌体の呼吸活性が低下し、ＤＯが急激に上昇した。次いでメタノール誘導を行い、菌体の呼吸活性が回復し、ＤＯが次第に減少し始めた。メタノール誘導段階において、菌体のメタノールに対する適応段階（２−４時間）があるため、この時間内にメタノールの濃度を次第に増加させることによりメタノールの過剰な蓄積による菌体への毒性を回避する必要がある。発酵過程全体は非常に安定し、各パラメータはすべて設定範囲内にある。発酵終了後、ＯＤ６００は３００を超え、菌体の湿重量は５１１．５ｇ／Ｌに達した。この検出結果は、発酵過程全体において、菌体の死亡率が低いレベルに維持され、メタノールの濃度も極めて低いレベルに維持され、菌体の制限的増殖が維持されていた（図５、６）。菌体の湿重量が誘導過程において増加していたにもかかわらず、タンパク質の発現量は８０時間培養（又は６０時間誘導）したときに基本的にバランスが取れたため、これ以上累積しなかった。したがって、この時に発酵を終了させることが好ましい。
【００６７】
３．４  Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの精製及び同定
【００６８】
発酵終了後、発酵液をｐＨ８．０に調節し、高速遠心分離及びフレックススタンド０．２２ｕｍにより濾過して清澄し、ＢＣＡにより測定した発酵液中の総タンパク質含有量は１．６ｇ／Ｌであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推算したｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの濃度は１００ｍｇ／Ｌを超えた。本エンジニアリングセンターはｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ検出用のＥＬＩＳＡキットを所有しないため、一時的に正確に定量することができない。
【００６９】
ｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは如何なるタグも持っておらず、本エンジニアリングセンターはｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムを所有しないため、イオン交換カラムを用いて発酵液におけるｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの捕獲を試みた。Ｆｌｅｘｓｔａｎｄ限外ろ過／ろ過システムにより発酵液を透析して脱塩し、脱塩した後の試料をＣＭ  ＦＦカラムに通し、１０％及び３０％の緩衝液Ｂで試料を溶出した（初期段階では、１ｍｌの小型イオン交換カラムを使用して精製条件を調べた）。検出結果から分かるように、ｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは主に３０％の溶出液に存在する（還元条件下で＋ＤＴＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１５ｋＤａ位置に緊密に繋がっている２本のバンドがあるか否かに基づいて試料にｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎが含まれるか否かを確定し、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を推算する）。１０％の溶出液にも少量のｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎが含まれ、且つＡ鎖の含有量はＢ鎖よりも高いため、１０％溶出液に少量のＡＡホモ二量体が存在すると考えられる（図７Ａ）。３０％溶出液における試料の一部をＱ  ＨＰによりさらに精製し、勾配溶出により５つのピークが示され、そのうちの２つのピークについて２−３試験管の試料（Ｐ１及びＰ２）を連続的に収集した。還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１５ｋＤａ位置にある２本のバンドを観察することにより、ｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは主にＰ２ピーク、特にＰ２−２試料に存在し、且つ不純物が少ないこと、Ｐ３ピークにおけるＡ鎖の含有量がＢ鎖よりも高いためＡＡホモ二量体による汚染があること、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ５にＡ、Ｂ鎖が含まない（図７Ｂ）ことが分かった。
【００７０】
Ｐ２−２試料に主に２本のバンドが含まれ、且つ位置差が大きいため、モレキュラーシーブにより精製した。予想通り、この２本のバンドはよく分離することができた。検出したところ、モレキュラーシーブにおけるＰ２は所望の目的タンパク質ｒＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎであり、非還元条件下で１本の均一なバンドであり、還元条件下で含有量が基本的に一致する２本のバンドであることを確認した（図８には、Ｐ１’及びＰ２’はそれぞれＰ１及びＰ２のピーク点を示す）。現在、前記モレキュラーシーブにおけるＰ２及びＰ２’の純度を測定していないが、目視では純度は９０％に達することができる。推算すると、１Ｌの発酵液から約１０ｍｇの精製試料を得ることができる。
【００７１】
３．５  Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎの活性測定
【００７２】
精製生成物についてＧＰＩｂ結合活性検出及び抗血小板凝集活性検出の実験を行った。ＧＰＩｂ結合活性検出結果では、組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは組換えＧＰＩｂに良好に結合できることを示しており、推算した相対解離定数は１０−７Ｍであった（図９）。抗血小板凝集活性は兆科社によって検出された。実験結果では、タンパク質量が２ｕｇに達したとき、検出システムにおいて血小板凝集を１００％抑制することができ、タンパク質量が１ｕｇであるとき、抑制活性がないことが分かった。前記実験は、いずれも酵母由来の組換えＡｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎが生物学的活性及び生理的機能を有することを定性的に示している。
【００７３】
以上は本発明の好適な実施形態に過ぎず、本発明の原理を逸脱しない限り、当業者は、若干の改良及び修飾を加えることができ、これらの改良及び修飾は本発明の保護範囲に含まれるものとみなされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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