(57)【要約】本開示は、ヒト体細胞から目的の特殊化細胞種、例えば心臓細胞、肝細胞、血液細胞、神経細胞および他の細胞を発生させるために最初の細胞（例えば体細胞）をリプログラミングするための組成物および方法に関する。一部の実施形態では、最初の（例えば体）細胞は、ヒト細胞であり、したがって目的のヒト誘導細胞種を生成する。一部の実施形態では、組成物および方法は、生物学的活性分子（ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドおよび他の小分子）で機能化したナノ粒子を組み込む。これらの新しく発生させた（すなわち「誘導した」）特殊化細胞は、器官機能および／または組織再生（心臓、肝臓など）を改善するため、および機能活性について薬物をスクリーニングするために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心ナノ粒子にコンジュゲートした少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤を含む、体細胞の、目的の特殊化細胞種への分化を誘導する組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、前記ナノ粒子上の第１の機能化基を介して前記中心ナノ粒子にコンジュゲートされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する剤またはその機能ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する分子またはそれらの機能ドメインのうちの２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれよりも多くを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する剤またはそれらの機能ドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する１つもしくは複数のタンパク質もしくはＲＮＡ分子またはそれらの機能ドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）であり、１つまたは複数の特殊化細胞種誘導剤が、Ｇａｔａ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＭＥＳＰ１、Ｈａｎｄ２、ＭＹＯＣＤ、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３から選択される、請求項４から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ナノ粒子上の第２の機能化基を介して前記ナノ粒子にコンジュゲートした貫通ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、直径約１００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、直径約７５、５０、４０または３０ｎｍ未満の大きさを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記中心ナノ粒子が、鉄または金分子を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記中心ナノ粒子が、ポリマー分子を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、ポリマーコーティングを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、ポリマーコーティングを含み、第１および／または第２の官能基が、前記ポリマーコーティングに結合している、請求項９から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の官能基と表１に列挙する前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤とを連結する第１のリンカー分子をさらに含む、請求項２から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２の官能基と前記ＣＰＰとを連結する第２のリンカー分子をさらに含む、請求項９から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１のリンカー分子が、第１の長さを有し、前記第２のリンカー分子が、第２の長さを有し、前記第２の長さが、前記第１の長さより長い、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＣＰＰが、少なくとも５個の塩基性アミノ酸を含む、請求項９から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＣＰＰが、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多い塩基性アミノ酸を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＣＰＰが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多い連続する塩基性アミノ酸を含む、請求項１９および２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項２３】
体細胞に由来する、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
線維芽細胞に由来する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
目的の誘導特殊化細胞種である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２６】
前記目的の誘導特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
ヒト細胞である、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
体細胞の、表１に列挙する目的の特殊化細胞種への分化を誘導する方法であって、前記体細胞を請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２９】
前記目的の誘導特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記体細胞が、線維芽細胞である、請求項２８および２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記体細胞を、前記体細胞の分化を可能にするのに十分な培養条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記体細胞が、ヒト細胞である、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
目的の誘導特殊化細胞種における活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補医薬組成物をスクリーニングする方法であって、
前記誘導特殊化細胞を前記候補医薬組成物と接触させることと、
前記誘導特殊化細胞を活性の徴候について観察することと
を含む方法。
【請求項３４】
前記誘導特殊化細胞が、表１に列挙する細胞種のうちの１つから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記誘導特殊化細胞が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、請求項３３および３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
体細胞から前記特殊化細胞の発生を誘導することをさらに含む、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記特殊化細胞が、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法に従って誘導される、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記体細胞が、正常な対象または特定の病理状態を有する対象から得られ、活性の前記徴候が、前記対象における前記病理状態の処置のための前記医薬組成物の活性の徴候である、請求項３６および３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年６月３日に出願された米国仮出願第６２／３４５３６０号の利益を主張し、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、細胞リプログラミングのための、ならびにヒト体細胞から様々なヒト細胞種、例えば心臓細胞、肝細胞、血液細胞、神経細胞および他の細胞を発生させるための方法および組成物に関する。これらの新しく発生させた特殊化細胞（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）は、器官機能および／または組織再生（心臓、肝臓など）を改善するため、ならびに機能活性について薬物をスクリーニングするために有用である。
【０００３】
政府ライセンス権の陳述
本発明は、米国立科学財団によって授与された小企業革新研究（ＳＢＩＲ）フェーズＩ  ＩＩＰ−１２１４９４３のもとの政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
正常に増殖し、遊走し、かつ様々な細胞種に分化する細胞の能力は、胚発生において、ならびに様々な遺伝性または後天性疾患における心血管系および／または造血系の細胞を含むが、これらに限定されない成熟細胞の機能において重要である。幹細胞および／またはより分化した特殊化細胞種のこの機能的能力は、様々な病理状態で変わるが、生物学的活性成分の細胞内導入によって、または代替的に、修復もしくは機能改善を必要とする特殊化細胞種への他の細胞種の分化転換により正常化することができる。例えば、異常な細胞機能、例えば骨髄幹細胞／前駆細胞の生存および／または好中球への分化の不全は、重度の命にかかわる感染を患う場合があり、かつ急性骨髄性白血病または他の悪性病変を発症するように進行し得る周期性または重度の先天性好中球減少症を有する患者において観察される（Carlssonら、Blood、１０３巻、３３５５頁（２００４年）；Carlssonら、Haematologica、（２００６年））。別の例は、患者が、造血細胞の異常な生存および心筋症と呼ばれる心機能不全を有し得るバース症候群である（Makaryanら、Eur.  J.  Haematol.、（２０１２年））。
【０００５】
バース症候群のような他の遺伝性疾患である、おそらくミトコンドリアＴＡＺ遺伝子の機能喪失変異により誘導される多系幹細胞障害は、再発性の重度の、ときには命にかかわる致命的感染を引き起こし得る好中球減少症（血液好中球レベルの低減）および／または心臓移植により解決され得る心不全を引き起こし得る心筋症を伴い得る。
【０００６】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）での好中球減少症患者の処置は、細胞表面上に位置するＧ−ＣＳＦ受容体分子のコンフォメーション変化を誘導し、続いて、最終的に好中球の生成を正常レベル近くまで復元し、患者のクオリティ・オブ・ライフを改善する細胞内事象の連鎖を誘発する（WelteおよびDale、Ann.  Hematol.  ７２巻、１５８頁（１９９６年））。それにもかかわらず、Ｇ−ＣＳＦで処置した患者は、白血病を発症するように進行する場合があり（Aprikyanら、Exp.  Hematol.  ３１巻、３７２頁（２００３年）；Rosenbergら、Br.  J.  Haematol.  １４０巻、２１０頁（２００８年）；Newburgerら、Genes.  Pediatr.  Blood  Cancer、５５巻、３１４頁（２０１０年）、AprikyanおよびKhuchua、Br.  J.  Haematol.  １６１巻、３３０頁（２０１３年））、これは、好中球減少症の処置のための骨髄もしくは造血幹細胞移植；または心不全と闘い、心筋機能を復元もしくは改善するためのヒト誘導多能性幹細胞の分化による心臓細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ発生および続く新しく発生させた心臓細胞の、患者の心臓への移植；などの代替の細胞治療アプローチが、探索されている理由である。
【０００７】
代替の細胞治療アプローチとして、患者の体細胞（例えば線維芽細胞）の、機能的心筋細胞への直接リプログラミングが挙げられ、これは、心筋の構造的完全性を支持し、ヒト心臓機能を正常化し得る。最近、かかる直接リプログラミングアプローチとして、心臓特異的転写因子、小分子およびマイクロＲＮＡを含むが、これらに限定されない様々な心臓特異的因子を有するレトロウイルスまたはレンチウイルス（ウイルスベクター）の使用が挙げられる。マイクロＲＮＡを伴うか、または伴わない様々な組の心臓遺伝子のかかるウイルス送達は、心臓特異的遺伝子の誘導発現により証明されるように、ヒト線維芽細胞の、誘導心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）への直接リプログラミングにおいて有効であった（Dopplerら、Int.  J.  Mol.  Sci.  １６巻、１７３６８〜１７３９３頁（２０１５年）で概略されている）。それにもかかわらず、かかるウイルスリプログラミングは、細胞ゲノムへのウイルスＤＮＡのランダム組込みを伴い、これは、宿主細胞において様々な変異を誘導し、正常な遺伝子発現パターンを変え、がん遺伝子発現を誘発し、それによってがんまたは他の有害な結果をもたらすことが公知である。それゆえ、ウイルスリプログラミングは、細胞リプログラミングおよび続くヒトにおける使用のために妥当なアプローチではない。
【０００８】
直接リプログラミングにより誘発される細胞内事象は、明白に組込みを起こさない（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）機能化ナノ粒子を使用する様々な生物学的活性分子（ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、タンパク質、ペプチドおよび他の小分子）の混合物の細胞内送達によって、より有効に影響され、調節され得る。細胞膜は、細胞内事象のカスケードを外因性刺激により影響されることから保護する活性障壁として働くが、これらの生物活性機能化ナノ粒子は、細胞膜を貫通して細胞機能を改変し、必要な場合、不必要な細胞を除去し、かつ／またはヒト体細胞を目的の他の細胞種に直接リプログラミングすることができる。
【０００９】
当技術分野での進展にもかかわらず、染色体構造への損傷を避ける一方で、細胞のリプログラミングを効率的に誘導するために生物学的活性分子を細胞内部へ送達する効率的なアプローチが必要とされている。本発明は、様々な細胞種への、組込みを起こさない直接リプログラミング、インタクトなヒト細胞ゲノムの保存の要求を満たし、さらに関連する利点についての新しい手段を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】WelteおよびDale、Ann.  Hematol.  ７２巻、１５８頁（１９９６年）
【非特許文献２】Aprikyanら、Exp.  Hematol.  ３１巻、３７２頁（２００３年）
【非特許文献３】Rosenbergら、Br.  J.  Haematol.  １４０巻、２１０頁（２００８年）
【非特許文献４】Newburgerら、Genes.  Pediatr.  Blood  Cancer、５５巻、３１４頁（２０１０年）
【非特許文献５】AprikyanおよびKhuchua、Br.  J.  Haematol.  １６１巻、３３０頁（２０１３年）
【非特許文献６】Dopplerら、Int.  J.  Mol.  Sci.  １６巻、１７３６８〜１７３９３頁（２０１５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、一部の実施形態では、細胞機能を調節し、ヒト体細胞を、選択された（所定の）系統の機能細胞へ直接リプログラミングするための、タンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡ分子を生体適合性ナノ粒子に連結する機能化方法を対象とする。かかる機能細胞は続いて、ヒトにおける細胞機能および／または器官機能を改善するための研究および開発、薬物スクリーニングならびに治療適用において使用することができる。選択された（所定の）細胞種の例として、誘導心臓細胞、肝細胞、神経細胞などが挙げられる。一部の実施形態では、本発明は、機能化生体適合性ナノ粒子それ自体を対象とする。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照すると、当業者に、より容易に明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
生物学的活性分子を細胞内に送達するために、本発明は、共有結合した生物学的活性分子を伴う細胞膜貫通ナノ粒子を含む組成物に基づく汎用プラットホームを提供する。この目標を達成するために、ナノ粒子へのタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）分子の共有結合を確実にする機能化方法を、本明細書で示す。本発明の改変した細胞浸透性ナノ粒子は、一般的な細胞機能の調節および／または正常化のための生物学的活性分子の細胞内送達ならびにヒト体細胞の、選択された（所定の）系統の機能細胞への直接リプログラミングのための汎用機構を提供し、これは続いて、ヒトにおける細胞機能および／または器官／組織機能を改善するための研究および開発、薬物スクリーニングならびに治療適用において使用することができる。選択された（所定の）細胞種の例として、心臓細胞、肝細胞、神経細胞などが挙げられる。
【００１４】
本明細書で開示する方法は、例えば科学文献（Lewinら、Nat.  Biotech.  １８巻、４１０〜４１４頁、（２０００年）；Shenら、Magn.  Reson.  Med.  ２９巻、５９９〜６０４頁（１９９３年）；Weisslederら  Am.  J.  Roentgeneol.、１５２巻、１６７〜１７３頁（１９８９年）；各参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む）で以前に説明されているものと同様の超常磁性酸化鉄もしくは金ナノ粒子またはポリマーナノ粒子を含む、生体適合性ナノ粒子を利用する。かかるナノ粒子は、例えば、骨髄細胞、リンパ節、脾臓および肝臓の磁気共鳴画像化のために臨床環境で使用され得る（例えばShenら、Magn.  Reson.  Med.  ２９巻、５９９頁（１９９３年）；Harisinghaniら、Am.  J.  Roentgenol.  １７２巻、１３４７頁（１９９９年）を参照のこと；各参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む）。例えば、５０ｎｍ未満の大きさの、かつ架橋結合した細胞膜浸透性ＴＡＴ由来ペプチドを含有する磁性酸化鉄ナノ粒子は、細胞当たり最大３０ｐｇの超常磁性鉄ナノ粒子の量で造血前駆細胞および神経前駆細胞に効率的に内部移行する（Lewinら、Nat.  Biotechnol.  １８巻、４１０頁（２０００年））。さらに、ナノ粒子組み込みは、ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋原始前駆細胞の増殖および分化特徴または細胞生存能力に影響しない（Maite  Lewinら、Nat.  Biotechnol.  １８巻、４１０頁（２０００年））。したがって、開示するナノ粒子は、標識細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ追跡のために使用することができる。
【００１５】
標識細胞は、それらの分化能力を保持し、また、磁気共鳴画像化を使用して組織試料中で検出することができる。ここで、本発明者らは、生物学的活性分子の細胞内送達のための優れた媒体として働いて、ヒト体細胞の、様々な目的の細胞種への直接リプログラミングのために細胞内事象を標的化し、細胞機能および特性を調節することができる、様々な組のＲＮＡ（例えば、例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチドおよび他の小分子を運搬するように機能化した新しいナノ粒子ベースの組成物を示す。
【００１６】
ナノ粒子−ペプチド／タンパク質／ＲＮＡコンジュゲートの一般説明：
ナノ粒子は、様々な長さのリンカーが結合している、Ｘ／Ｙ官能基を有する生体適合性ポリマーコーティング（例えばデキストラン多糖）を伴う鉄または他の材料に基づいてもよく、そしてこれは次に、タンパク質、ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）分子および／またはペプチド（または他の小分子）にそのＸ／Ｙ官能基を介して共有結合している。リンカー構造は、周知であり、開示する機能化ナノ粒子設計に慣用的に適用することができる。リンカーは、結合した生理活性化合物、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドがその適切な三次元構造を維持し、その細胞内パートナーとより効率的に相互作用および結合するように回転することができるように、結合した生物活性化合物にコンフォメーション柔軟性を提供することができる。
【００１７】
架橋のために使用され得る官能基の例示的、非限定的な例として：
−  ＮＨ２（例えばリジン、ａ−ＮＨ２）；
−  ＳＨ；
−  ＣＯＯＨ；
−  ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）；
炭水化物；
−  ヒドロキシル（ＯＨ）；および
リンカー上のアジド基の光化学による結合
が挙げられる。
【００１８】
架橋試薬の例示的、非限定的な例として：
架橋アミノ基およびチオール基のスルホスクシンイミジル誘導体である、スルホ−ＳＭＣＣを含む、ＳＭＣＣ［スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート］；
スルホ−ＬＣ−ＳＭＣＣを含む、ＬＣ−ＳＭＣＣ（長鎖ＳＭＣＣ）；
アミンと反応し、チオール基を提供する、スルホ−ＳＰＤＰを含む、ＳＰＤＰ［Ｎ−スクシンイミジル−３−（ピプリジルジチオ（pypridyldithio））−プロピオネート］；
スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを含む、ＬＣ−ＳＰＤＰ（長鎖ＳＰＤＰ）；
−ＣＯＯＨ基を−ＮＨ２基と連結するために使用する試薬であるＥＤＣ［１−エチルヒドロクロリド（Hydrocholride）−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］；
スルホ−ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ誘導体を含む、ｎ＝１、２、３、４．．．２４グリコール単位であるＳＭ（ＰＥＧ）ｎ；
スルホ−ＳＰＤＰ（ＰＥＧ）ｎ誘導体を含む、ｎ＝１、２、３、４．．．１２グリコール単位であるＳＰＤＰ（ＰＥＧ）ｎ；
カルボキシル基およびアミン基の両方を含有するＰＥＧ分子；ならびに
カルボキシル基およびスルフヒドリル基の両方を含有するＰＥＧ分子
が挙げられる。
【００１９】
キャッピングおよびブロッキング試薬の例示的、非限定的な例として：
ＮＨに特異的なシトラコン酸無水物；
ＳＨに特異的なエチルマレイミド；および
マレイミドに特異的なメルカプトエタノール
が挙げられる。
【００２０】
かかる目的に有用なナノ粒子は、酸化鉄もしくは金などの金属コアを含有してもよく、または金属コアを伴わないが、経時的に放出され、長期持続効果をもたらす内側に閉じ込められた生物活性分子を含有するポリマーナノ粒子であってもよい。
【００２１】
上記の観点から、本発明者らは、その全体を参照により本明細書に組み込むＵ．Ｓ．２０１４／０３４２００４で説明するように、タンパク質、核酸および短いペプチドを化学的に結合するために、生体適合性ナノ粒子を表面上で官能アミンで処理した。簡単に説明すると、超常磁性または代替のナノ粒子は、大きさが５０ｎｍ未満またはそれよりも大きくてもよく、１ｍｌ当たり１０１５〜１０２０ナノ粒子で、ナノ粒子当たり１０またはそれよりも多いアミン基でもよい。
【００２２】
ＳＭＣＣ（例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから）は、例えばＡＣＲＯＳ（密閉バイアルおよび無水物）から得たジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解してもよい。試料は、ほぼ即座に密閉および使用する。
【００２３】
１０マイクロリットルの溶液を、２００マイクロリットル体積のナノ粒子に添加する。これは、存在する使用可能なアミン基に大過剰のＳＭＣＣを提供し、反応を約１〜２時間進行させる。過剰のＳＭおよびＤＭＦを、３，０００ダルトンのカットオフの遠心分離フィルターカラム（例えばＡｍｉｃｏｎから）を使用して除去してもよい。適切な緩衝剤交換を確実にするために、５回の容量交換が一般的に必要とされる。過剰のＳＭＣＣがこの段階で除去されることが重要である。
【００２４】
任意のＲＮＡまたはペプチドベースの分子、例えば市販されている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは精製組換えＧＦＰまたは任意の他の目的のタンパク質を、活性化ナノ粒子に添加してもよい。生物活性分子−ナノ粒子溶液を反応させ、未反応分子を、適切なＭＷカットオフの遠心分離フィルターユニットにより除去する（ＧＦＰを伴う例では、それは５０，０００ダルトンカットオフまたはそれよりも大きい）。試料を、−８０℃の冷凍庫で、または４℃で保存する。Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターカラムを使用する代わりに、また、固体サイズ濾過構成要素を含有する小スピンカラム、例えばＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｐサイズ排除カラムを使用してもよい。また、ＳＭＣＣは、それをより水溶性にするために、スルホ誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）として購入してもよいことも留意すべきである。また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、標識化試薬に対する溶媒担体としてＤＭＦに置換してもよく、ここでもまた、それは無水であるべきである。
【００２５】
全ての他の架橋試薬は、同様の様式で適用することができる。また、ＳＰＤＰは、ＳＭＣＣと同じ様式でタンパク質／適用可能なペプチドに適用される。それは、ＤＭＦ中で易溶性である。ジチオールは、ＤＴＴとの１時間またはそれよりも長い反応により切断される。副産物および未反応材料の除去後、それを、３，０００ＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターカラムの使用により精製する。
【００２６】
ナノ粒子を、ペプチド、ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）またはタンパク質分子で標識化する別の手段は、本発明者らが、それ全体を参照により本明細書に組み込むＵＳ２０１４／０３４２００４で説明するように、２つの異なる二官能性カップリング試薬を使用することである。
【００２７】
ナノ粒子上のペプチド、ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）およびタンパク質の結合。一実施形態では、様々な比のＳＭＣＣ標識タンパク質およびペプチドを、ビーズに添加し、反応させる。タンパク質およびペプチドの例は、以下により詳細に説明する。
【００２８】
別の態様では、また、本発明は、ヒト体細胞の、他の細胞種（例えばｉＣＭ）への直接リプログラミングを目的とした細胞内活性の調節のための、機能化ナノ粒子に結合した生物活性分子を送達する方法を対象とする。例えば、市販されているか、または標準もしくは改変した実験手技を使用して得られるヒト細胞、線維芽細胞または他の細胞種を最初に、細胞が接着する、基質を伴うか、または伴わない固体表面（フィーダー細胞、ゼラチン、マトリゲル（martigel）、フィブロネクチン、ラミニンなど）上に滅菌条件下で播種する。播種した細胞を、細胞分裂／増殖または許容される細胞生存能力の維持を可能にする特異的因子の組合せと共にしばらく培養する。例は、その細胞種に適切な血清および／または様々な増殖因子／サイトカインであり、これらは後に取り除かれるか、または新たにされてもよく、培養を継続する。播種した細胞を、磁場の存在下または非存在下で、本明細書および別のもの（例えばその全体を参照により本明細書に組み込むＵＳ２０１４／０３４２００４を参照のこと）で簡単に説明する様々な方法を使用して結合した、共有結合した細胞特異的リプログラミング因子（目的の細胞種に特異的なリプログラミング因子、例えば心臓、肝細胞および神経特異的リプログラミング因子）を伴う機能化生体適合性細胞浸透性ナノ粒子の存在下にて培養する。超常磁性ナノ粒子の場合の磁石の使用は、細胞とナノ粒子との間の接触表面積の重要な増大を与え、それによってペプチド、タンパク質またはＲＮＡ分子で機能化したナノ粒子の細胞膜を通る貫通のさらなる改善を強化する。必要な場合、細胞集団を、生物活性分子を細胞内に送達するための機能化ナノ粒子で反復して処理する。
【００２９】
細胞を、培養培地中で付着、または懸濁して維持し、組み込まれていないナノ粒子を、遠心分離または細胞分離により除去し、クラスターとして存在する細胞を残してもよい。その後、細胞を再懸濁し、新しい培地中で好適な期間、再培養する。機能化ナノ粒子に連結した特異的生物活性分子により誘発される結果としての直接リプログラミング効果が観察されるまで、細胞を、多数の周期の分離、再懸濁および再培養に供してもよい。本発明は、ある種類の細胞の、別のものへの直接リプログラミングのみでなく、元の細胞種の保存を伴う細胞運命を制御または調節するための新しい手段としても適用可能である。ヒト線維芽細胞、血液細胞、上皮細胞、間葉系細胞などの広範囲の細胞種を使用することができる。
【００３０】
細胞リプログラミングは、直接的であるか、または間接的であるかにかかわらず、様々なタンパク質、ペプチド、小分子、ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）などを含み得る生物活性分子での様々な細胞種または組織の処理に基づく。かかる生物活性分子は、細胞膜を効率的に貫通しないか、または全く貫通せず、特別な送達媒体および／または特殊な実験条件なしでは細胞核に到達しない場合がある。さらに、これらの生物活性分子は、短い半減期を有し、様々なプロテアーゼおよびヌクレアーゼへの曝露によって分解を受け得る。これらの不利益は、生物活性分子の有効性の低減をもたらし、たとえ有効性があるとしても、顕著な細胞リプログラミング効果を達成するために、もっと高いか、または反復される処理用量を必要とする。それゆえ、本発明では、上記に挙げる不利益を克服するために、機能化ナノ粒子を使用する。より具体的には、これらの生物活性分子は、ナノ粒子と連結し、元の「ネイキッド」状態と比較すると、細胞貫通および細胞核標的化能力、より大きなサイズおよび全体的な三次元コンフォメーションの変化ならびに目的の標的遺伝子の発現を調節する能力の獲得を与える新しい物理的、化学的、生物学的機能特性を得る。
【００３１】
今日までに、いくつかの遺伝子産物および生物活性分子が、リプログラミング効果を示すことが報告されており、そのリストは増え続けている。例えば、様々な組の生物活性分子および／または遺伝子産物は、ヒト線維芽細胞の、心筋細胞への直接リプログラミングを誘導することが報告された。１つのかかる組は、１群の転写因子である。別の組は、これらの因子の一部ならびにマイクロＲＮＡ分子ｍｉＲ１およびｍｉＲ１３３を伴う追加の遺伝子を含む。さらに他の組は、報告される生物活性分子の様々な組合せを含む（Fu  JDら、Direct  Reprogramming  of  Human  Fibroblasts  toward  a  Cardiomyocyte-like  State.  Stem  Cell  Reports、１巻、２３５〜２４７頁（２０１３年）；Nam  YJら、Reprogramming  of  human  fibroblasts  toward  a  cardiac  fate.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  １１０巻、５５８８〜５５９３頁（２０１３年）；Wada  Rら、Induction  of  human  cardiomyocyte-like  cells  from  fibroblasts  by  defined  factors.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  １１０巻、１２６６７〜１２６７２頁、（２０１３年）；およびCao  Nら、Conversion  of  human  fibroblasts  into  functional  cardiomyocytes  by  small  molecules.  Science.  ３５２巻、１２１６〜１２２０頁（２０１６年）；各々を、その全体を参照により本明細書に組み込む）。これらの生物活性分子を有するウイルスを形質導入したヒト線維芽細胞は、元の線維芽細胞において存在しない心臓特異的マーカーの存在により証明されるように、誘導心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）へ直接的にリプログラミングされた。それにもかかわらず、生ずるリプログラミングされた細胞は、細胞ゲノムへのウイルスおよび遺伝子産物をコードするＤＮＡの挿入のための異常な遺伝子発現パターンを有する。さらに、かかる直接リプログラミングの効率は、非常に低く、これは一部には、これらの生物活性分子の短い半減期のためである。これらの問題に、本開示は取り組み、本開示は、追加の分解保護化合物、例えば組込みを起こさないペプチド、タンパク質およびＲＮＡ分子で機能化したナノ粒子もしくはＰＥＧまたは他の化合物もしくは分子の使用を提供し、それによって細胞ゲノムをインタクトに保つ。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えばマイクロＲＮＡ、転写因子をコードするＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどであってもよい。
【００３２】
直接的な線維芽細胞から心筋細胞へのリプログラミングに加えて、直接リプログラミングは、様々な組の生物活性分子を使用して肝細胞および神経細胞の発生のために可能であると報告されている。例えば、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１ＡおよびＨＮＦ４Ａ遺伝子は、レンチウイルスベクターを使用してヒト線維芽細胞で発現すると、急性肝不全の動物モデルにおける肝遺伝子の発現および肝機能の復元により証明されるように、細胞の直接リプログラミングおよび機能的肝細胞の発生をもたらす。ウイルス媒介直接心臓リプログラミングと同様に、このアプローチは、ヒト細胞ゲノムへのウイルスＤＮＡのランダム組込みおよびがんの発症のために有害な結果をもたらし得る。本発明は、組込みを起こさない分子としての上記に挙げるリプログラミング因子および／または他のリプログラミング因子を使用して機能化したナノ粒子の発生および使用によってこの問題を克服し、それによって細胞ゲノムを完全にインタクトに保つ。
【００３３】
線維芽細胞から神経細胞への直接リプログラミングの成功は、単一の因子、Ｓｏｘ−２での胎児線維芽細胞の処理に際して報告された（Ringら、Cell  Stem  Cell、１１巻、１００〜１０９頁、（２０１２年）；その全体を参照により本明細書に組み込む）。生ずる新しくリプログラミングされた細胞は、神経細胞表現型および遺伝子発現パターンを示し、他の神経細胞種、例えば乏突起膠細胞および星状膠細胞にさらに分化する能力を有する。より最近では、Ｓｏｘ２およびＰａｘ６遺伝子の発現は、ヒト成人線維芽細胞の、神経細胞へのリプログラミングにおいて有効であることが報告された（Connorら、Direct  Conversion  of  Adult  Human  Fibroblasts  into  Induced  Neural  Precursor  Cells  by  Non-Viral  Transfection.  Protocol  Exchange（２０１５年）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｐｒｏｔｅｘ．２０１５．０３４；その全体を参照により本明細書に組み込む）。線維芽細胞から直接的に神経細胞などのリプログラミングしたヒト体細胞の、様々な因子またはそれらの組合せがある（例えばSonら  Cell  Stem  Cell.、９巻、２０５〜２１８頁（２０１１年）；Pfistererら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、１０８巻、１０３４３〜１０３４８頁（２０１１年）；Ambasudhanら、Cell  Stem  Cell.、９巻、１１３〜１１８頁、（２０１１年）を参照のこと；各参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む）。
【００３４】
分化転換についての他の報告と同様に、また、上記に示す直接リプログラミングアプローチは、レンチウイルスもしくはレトロウイルスベクターまたはプラスミドＤＮＡのいずれかを使用して細胞に送達した遺伝子産物の発現に基づく。ここでもまた、ＤＮＡの使用は、宿主細胞のゲノムＤＮＡへの予測できないヌクレオチドのランダム挿入を誘発しやすく、それによって有害な結果または異常な表現型をもたらす可能性がある。しかしながら、リプログラミング因子、例えば細胞リプログラミングのための細胞貫通能力を有するＴＡＴ様ペプチドに融合したタンパク質を使用して細胞リプログラミングを実行する試みは、目的の遺伝子のウイルス送達と比較して非常に非効率的であり（Kimら、Cell  Stem  Cell.、４巻、４７２〜４７６頁（２００９年）；Zhouら、Cell  Stem  Cell.、４巻、３８１〜３８４頁（２００９年）；各参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む）、これは、このアプローチが放棄され、追従されなかった主な理由である。
【００３５】
今日までに、様々な因子またはそれらの様々な組合せが、直接リプログラミングに有効であると報告されており、同様の特性を有する可能性のある因子のリストは、増え続けている。以下の表１は、本発明に記載の直接リプログラミングにおける使用に好適な様々な生理活性因子またはそれらの組合せのいくつかの例示的かつ非限定的な例を含有する。
【表１−１】
2019517531.tif 000002
【表１−２】
2019517531.tif 000003
【表１−３】
2019517531.tif 000004
【表１−４】
2019517531.tif 000005
【表１−５】
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【表１−６】
2019517531.tif 000007
【００３６】
本発明は、曝露すると、ある種の細胞の、別の細胞種へのリプログラミングをもたらし得る上記に挙げるか、または他の生物活性分子のいずれかで機能化したナノ粒子（金属コア（例えば超常磁性鉄ベースの、または金ベースのナノ粒子）であるか、またはコアのないもの（例えばポリマーナノ粒子）であるかにかかわらず）を使用することにより挿入変異誘発および異常な遺伝子型／表現型課題を克服する。列挙した細胞種、因子および／または因子の組合せは、限定することを意図せず、追加の因子および／または組合せは、新しく発見され、それらの組合せは、本出願で説明するのと同じように働き得る。
【００３７】
本発明の１つの使用は、細胞リプログラミングに対する効果についての生物活性分子（化合物（複数可））のスクリーニング／試験である。これは、本明細書で開示する方法を使用してナノ粒子に結合した化合物を、目的の細胞集団（線維芽細胞、血液細胞、間葉系細胞などにかかわらず）と混合することと、好適な期間培養することと、その後化合物（複数可）から得られる任意の調節効果を決定することとを含む。これは、直接細胞リプログラミングおよび目的の特殊化細胞種、例えば心臓細胞、肝細胞（肝臓細胞）または神経細胞の発生；毒性、代謝変化または収縮活性および／もしくは他の機能に対する効果についての細胞の検査を含む。
【００３８】
本発明の別の使用は、ヒトまたは動物の身体の処置のために意図される医薬としての、または送達装置における特殊化細胞の製剤である。これは、臨床医が、脈管構造から、または筋肉もしくは器官組織に直接的に、損傷した器官（例えば心臓、脳または肝臓）組織内に、またはその周辺に機能化ナノ粒子を投与することを可能にし、それによって特殊化細胞が、生着し、損傷を限定し、組織筋系の再生／再増殖、および特殊化された機能の復元に参加することを可能にする。あるいは、誘導心臓細胞（ｉＣＭ）または他の細胞種は、本明細書で説明するように、説明する機能化ナノ粒子によりｅｘ  ｖｉｖｏで生成し、その後対象の疾患組織または損傷組織の周辺領域に投与することができる。
【００３９】
本開示の別の適用は、心疾患環境における治療効果または薬理学効果について１つまたは複数の候補組成物を試験するためのスクリーニングスキャフォールドとして、本明細書で説明するｉＣＭを発生および／または使用することである。例えば、ｉＣＭ（または目的の細胞種、例えば肝細胞および神経細胞）を発生させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、候補医薬剤と接触させてもよく、その後、効果について細胞を観察してもよい。一部の実施形態では、ｉＣＭまたは他の細胞種は、心臓障害または他の疾患を有する対象に由来する体細胞から発生させてもよい。したがって、心臓状態についての医薬活性のスクリーニングを、医薬剤への対象の応答性を査定する必要のある対象の特定の遺伝的バックグラウンドについて行うことができる。
【００４０】
本明細書で具体的に定義しない限り、本明細書で使用する全ての用語は、それらが当業者にとって有するのと同じ意味を有する。実施者は、各々を参照により本明細書に組み込む、Sambrook  J.ら（編）  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Press、Plainsview、New  York（２００１年）；およびAusubel  F.M.ら（編）、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York（２０１０年）を特に対象とする。
【００４１】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみについて言及すると明白に示されない限り、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢および「および／または」のみについて言及する定義を支持する。
【００４２】
長年の特許法に従って、「ａ」および「ａｎ」という単語は、特許請求の範囲または明細書で「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と共に使用する場合、具体的に示されない限り、１つまたは複数を示す。
【００４３】
文脈が明らかに別のように必要としない限り、説明および特許請求の範囲全体を通して、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などという単語は、排他的または網羅的意味とは反して包括的な意味で、すなわち、「〜を含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」の意味で示すと解釈するべきである。また、単数または複数を使用する単語は、それぞれ、複数および単数を含む。加えて、「本明細書中」、「上記」および「以下」という用語ならびに同様の意味の単語は、本出願で使用する場合、全体としての本明細書について言及し、本出願の任意の特定の部分について言及しない。
【００４４】
開示する方法および組成物に使用され得るか、それらと共に使用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの生成物である材料、組成物および構成成分を開示する。これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の各およびどの単一の組合せおよび並べ替えについての特定の言及が明白に開示されていない場合であったとしても、様々な個々の、および集合的な組合せの各々が具体的に企図されることが理解される。この概念は、非限定的に、説明する方法におけるステップを含む、本開示の全ての態様に適用する。したがって、任意の上記実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせてもよく、または置換してもよい。例えば、行われ得る様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップの各々は、開示する方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組合せで行ってもよいこと、および各かかる組合せまたは組合せのサブセットが具体的に企図され、開示されていると考えられるべきであることが理解される。加えて、本明細書で説明する実施形態は、任意の好適な材料、例えば本明細書のどこかで説明するか、または当技術分野で公知の材料を使用して実施することができることが理解される。
【００４５】
本明細書で引用する刊行物およびそれらが引用される主題は、それら全体を参照により本明細書に具体的に組み込む。
【００４６】
さらなる例示のために、限定ではなく、以下の実施例は、本発明の他の態様を開示する。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
組込みを起こさないナノ粒子を、１組の心臓特異的転写因子（例えば、最近説明されたＧａｔａ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＭＥＳＰ１およびＭＹＯＣＤを含む組１（その全体を参照により本明細書に組み込むNamら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  １１０巻、５５８８〜５５９３頁、（２０１０年）））で機能化する。簡単に説明すると、ヒト体細胞を、機能化ナノ粒子で１回または反復して（２回またはそれよりも多い回数）処理し、これは、処理した細胞の細胞質および核への心臓特異的因子の送達をもたらす。細胞を、適切な培養培地中で長期間維持し、ヒト体細胞の、機能的心臓細胞へのかかる直接リプログラミングの結果を、様々な分子生物学、生化学および細胞生物学技術を使用してモニターする。具体的には、心臓特異的トロポニンＴまたはトロポミオシンの発現は、ＲＮＡ単離および続くリアルタイムもしくは逆転写ＰＣＲ、適切な抗体を使用する細胞の免疫染色により、または培養した細胞のフローサイトメトリー分析により決定することができる。
【００４８】
（実施例２）
ヒト体細胞の直接リプログラミングのための心臓特異的因子の異なる組は、心臓特異的転写因子およびマイクロＲＮＡで機能化したナノ粒子を含み得る。例えば、組２は、４つのタンパク質Ｇａｔａ４、Ｈａｎｄ２、ＴＢＸ５、ＭＹＯＣＤならびに２つのマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３を含有する。ウイルスベクターを使用して細胞に導入したこの生物活性分子の組合せは、機能的に活性、かつ収縮性の心筋細胞様細胞の発生を伴うヒト線維芽細胞の直接リプログラミングにおいて効率的である（Wadaら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  １１０巻、１２６６７〜１２６７２頁、（２０１３年））。ここで、ヒト線維芽細胞を、組換えタンパク質およびマイクロＲＮＡの組２で機能化したナノ粒子で処理し、培養して、ヒトｉＣＭの発生を誘導する。これらおよび／または他の組の心臓特異的因子の代替の組合せは共に、ヒト体細胞の、心臓細胞へのリプログラミングを誘発する。
【００４９】
これらの組込みを起こさない機能化ナノ粒子の調製は、細胞ゲノムに組み込まれ、正常な遺伝子発現パターンを破壊し得る任意のＤＮＡ分子を含まない。本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施してもよい。
【００５０】
列挙した細胞種、因子および／または因子の組合せは、例示であり、限定することを意図しない。新しく発見されるものを含む追加の因子および／または組合せは、本発明に包含され、本明細書で説明するのと同じように機能する。
【００５１】
（実施例３）
組込みを起こさないナノ粒子を、例として、最近説明されたＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１ＡおよびＨＮＦ４Ａを含む１組の肝細胞リプログラミング転写因子で機能化する（その全体を参照により本明細書に組み込むHuangら、Cell  Stem  Cell.、１４巻、３７０〜３８４頁、（２０１４年））。簡単に説明すると、ヒト体細胞を、機能化ナノ粒子で１回または反復して（２回またはそれよりも多い回数）処理し、これは、処理した細胞の細胞質および核への肝臓特異的因子の送達をもたらす。細胞を、適切な培養培地中で長期間維持し、ヒト体細胞の、機能的肝細胞へのかかる直接リプログラミングの結果を、様々な分子生物学、生化学および細胞生物学技術を使用してモニターする。具体的には、アルブミン（ＡＬＢ）、ａ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素の発現は、ＲＮＡ単離および続くリアルタイムもしくは逆転写ＰＣＲ、適切な抗体を使用する細胞の免疫染色により、または培養した細胞のフローサイトメトリー分析により決定することができる。さらに、また、新しく発生した肝細胞の機能性を、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法を使用して誘導ＣＹＰ酵素の代謝活性を評価することにより確認することができる。これらの種類の肝細胞は、レンチウイルスベクターを使用してリプログラミングしても、急性肝不全の動物モデルにおいて肝機能の復元を示す（Huangら、Cell  Stem  Cell.、１４巻、３７０〜３８４頁（２０１４年））。
【００５２】
列挙した細胞種、因子および／または因子の組合せは、例示であり、限定することを意図しない。新しく発見されるものを含む追加の因子および／または組合せは、本発明に包含され、本明細書で説明するのと同じように機能する。
【００５３】
（実施例４）
組込みを起こさないナノ粒子を、最近説明された１組の神経リプログラミング転写因子ＰＡＸ６および／またはＳＯＸ２で機能化する（その全体を参照により本明細書に組み込むConnor、Protocol  Exchange  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｐｒｏｔｅｘ．２０１５．０３４（２０１５年））。簡単に説明すると、ヒト体細胞を、機能化ナノ粒子で１回または反復して（２回またはそれよりも多い回数）処理し、これは、処理した細胞の細胞質および核へのリプログラミング因子の送達をもたらす。細胞を、適切な培養培地中で長期間維持し、ヒト体細胞の、神経前駆細胞へのかかる直接リプログラミングの結果を、様々な分子生物学、生化学および細胞生物学技術を使用してモニターする。具体的には、新しく発生させた神経細胞におけるニューロン特異的ＴＵＪ１、ＭＡＰ２またはＮＳＥ表現型マーカーと共にチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ｖＧｌｕｔ１、ＧＡＤ６５／６７およびＤＡＲＰＰ３２の発現は、ＲＮＡ単離および続くリアルタイムもしくは逆転写ＰＣＲならびに／もしくは適切な抗体を使用する細胞の免疫染色により、またはヒト線維芽細胞から直接的にリプログラミングした培養した神経細胞のフローサイトメトリー分析により決定することができる。
【００５４】
列挙した細胞種、因子および／または因子の組合せは、例示であり、限定することを意図しない。新しく発見されるものを含む追加の因子および／または組合せは、本発明に包含され、本明細書で説明するのと同じように機能する。
【００５５】
（実施例５）
人々が、医薬に対して様々に反応することは十分に確立されている。細胞は、個体の中で細胞の遺伝子型またはバリアント発達歴に基づいて医薬に対して様々に反応するので、これらの差は、細胞レベルで現れ得る（その全体を参照により本明細書に組み込むTurner  RMら、Parsing  interindividual  drug  variability:  an  emerging  role  for  systems  pharmacology.  Rev  Syst  Biol  Med.  ２０１５年  ７巻（４号）、２２１〜４１頁）。生殖細胞系バリアントは、遺伝性の変異であり、多くの場合、薬物動態ならびに最終的には薬物有効性および／または毒性を含む、薬物の薬力学的挙動と関連付けられ、一方で、体細胞変異は多くの場合、薬物への薬力学的応答を予測することにおいて有用である。薬理民族性（Ｐｈａｒｍａｃｏｅｔｈｎｉｃｉｔｙ）または薬物応答もしくは毒性の民族多様性は、薬物応答の個人間変異を説明する、益々認識されている因子である。薬理民族性は多くの場合、生殖細胞系薬理ゲノミクス因子および様々な集団にわたる単一のヌクレオチド多型の分布により決定される（その全体を参照により本明細書に組み込むPatel  JN、Cancer  pharmacogenomics:  implications  on  ethnic  diversity  and  drug  response.  Pharmacogenet  Genomics.  ２０１５年  ２５巻（５号）、２２３〜３０頁）。
【００５６】
したがって、患者の体細胞の直接リプログラミングによって発生した患者特異的心臓細胞を利用する医薬スクリーニングは、医薬への個体の独特な反応のための偏りを反映する。最初の薬物スクリーニングは、１つの供給源または個体からの細胞で行われ得るが、一般集団への薬物の適用性を広げるために、様々な個体からの細胞のさらにより広い選択が必要とされる場合がある。供給源個体の数が多ければ多いほど、薬物が一般集団において均一な応答を有するようになる可能性が大きくなる。このより広いスクリーニング努力なしでは、薬物は、集団のある割合、例えば５０、４０または２０％についてのみ有効である場合があり、この割合は、薬物の収益性を低減する。薬物スクリーニングで使用される心臓細胞の発生のための供給源個体の数が多ければ多いほど、所与の薬物で有効に処置される人の割合は大きくなる。
【００５７】
同様に、臨床試験の参加者を、参加候補者の体細胞の直接リプログラミングによって生成した心臓細胞での細胞アッセイで、臨床試験について事前に認定してもよい。細胞が、臨床試験で査定する薬物に十分に応答する場合、個体を臨床試験に含め得る。細胞が、十分に応答しなかった場合、個体は、試験から除外され得る。参加者の事前確証により、臨床試験のより良い結果が保証され得る。
【００５８】
したがって、当技術分野における進歩にもかかわらず、本開示は、結果が全体として全標的集団をより正確に反映し、個体応答の偏りを避けるような、心血管障害および他の障害のための薬物の包括的医薬スクリーニングを実行するため、および臨床試験の参加者を事前認定するための組成物および技術を提供する。
【００５９】
それゆえ、上記の実施形態は、本明細書で説明する本発明の限定ではなく、例示であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく付属の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に入る全ての変化は、本明細書に包含されると意図する。
【００６０】
さらに、本開示の範囲に従う一部の方法および組成物の説明の例示的、非排他的な例を、以下の番号付けした段落で示す。以下の段落は、説明の網羅的な組であることは意図せず、本開示の最小範囲もしくは最大範囲または必要な要素もしくはステップを定義するとは意図しない。むしろ、それらは、本開示の範囲内の選択された方法および組成物の例示的な例として提供され、本明細書で具体的に列挙されていない、より広いか、もしくはより狭い範囲の他の説明またはそれらの組合せは、やはり本開示の範囲内である。
【００６１】
Ａ１．中心ナノ粒子にコンジュゲートした少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤を含む、体細胞の、目的の特殊化細胞種への分化を誘導する組成物。
【００６２】
Ａ２．前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、前記ナノ粒子上の第１の機能化基を介して前記中心ナノ粒子にコンジュゲートしている、段落Ａ１に記載の組成物。
【００６３】
Ａ３．前記特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、段落Ａ１およびＡ２のいずれか１つに記載の組成物。
【００６４】
Ａ４．前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する剤またはその機能ドメインのうちの少なくとも１つを含む、段落Ａ１からＡ３のいずれか１つに記載の組成物。
【００６５】
Ａ５．前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する分子またはそれらの機能ドメインのうちの２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれよりも多くを含む、段落Ａ１からＡ４のいずれか１つに記載の組成物。
【００６６】
Ａ６．前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤が、表１に列挙する１つもしくは複数のタンパク質もしくはＲＮＡ分子またはそれらの機能ドメインを含む、段落Ａ１からＡ５のいずれか１つに記載の組成物。
【００６７】
Ａ７．前記特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）であり、１つまたは複数の特殊化細胞種誘導剤が、Ｇａｔａ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＭＥＳＰ１、Ｈａｎｄ２、ＭＹＯＣＤ、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３から選択される、段落Ａ１からＡ６のいずれか１つに記載の組成物。
【００６８】
Ａ８．前記ナノ粒子上の第２の機能化基を介して前記ナノ粒子にコンジュゲートした貫通ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含む、段落Ａ１からＡ７のいずれか１つに記載の組成物。
【００６９】
Ａ９．前記ナノ粒子が、直径約１００ｎｍ未満の大きさを有する、段落Ａ１からＡ８のいずれか１つに記載の組成物。
【００７０】
Ａ１０．前記ナノ粒子が、直径約７５、５０、４０または３０ｎｍ未満の大きさを有する、段落Ａ１からＡ９に記載の組成物。
【００７１】
Ａ１１．前記中心ナノ粒子が、鉄または金分子を含む、段落Ａ１からＡ１０のいずれか１つに記載の組成物。
【００７２】
Ａ１２．前記中心ナノ粒子が、ポリマー分子を含む、段落Ａ１からＡ１１のいずれか１つに記載の組成物。
【００７３】
Ａ１３．前記ナノ粒子が、ポリマーコーティングを含む、段落Ａ１からＡ１２のいずれか１つに記載の組成物。
【００７４】
Ａ１４．前記ナノ粒子が、ポリマーコーティングを含み、第１および／または第２の官能基が、前記ポリマーコーティングに結合している、段落Ａ８からＡ１３のいずれか１つに記載の組成物。
【００７５】
Ａ１５．前記第１の官能基と表１に列挙する前記少なくとも１つの特殊化細胞種誘導剤とを連結する第１のリンカー分子をさらに含む、段落Ａ２からＡ１４のいずれか１つに記載の組成物。
【００７６】
Ａ１６．前記第２の官能基と前記ＣＰＰとを連結する第２のリンカー分子をさらに含む、段落Ａ８からＡ１５のいずれか１つに記載の組成物。
【００７７】
Ａ１７．前記第１のリンカー分子が、第１の長さを有し、前記第２のリンカー分子が、第２の長さを有し、前記第２の長さが、前記第１の長さより長い、段落Ａ１８に記載の組成物。
【００７８】
Ａ１８．前記ＣＰＰが、少なくとも５個の塩基性アミノ酸を含む、段落Ａ８から１７のいずれか１つに記載の組成物。
【００７９】
Ａ１９．前記ＣＰＰが、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多い塩基性アミノ酸を含む、段落Ａ８から１８のいずれか１つに記載の組成物。
【００８０】
Ａ２０．前記ＣＰＰが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多い連続する塩基性アミノ酸を含む、段落Ａ８から１９のいずれか１つに記載の組成物。
【００８１】
Ｂ１．段落Ａ１からＡ２０のいずれか１つに記載の組成物を含む細胞。
【００８２】
Ｂ２．体細胞に由来する、段落Ｂ１に記載の細胞。
【００８３】
Ｂ３．線維芽細胞に由来する、段落Ｂ１およびＢ２のいずれか１つに記載の細胞。
【００８４】
Ｂ４．目的の誘導特殊化細胞種である、段落Ｂ１からＢ３のいずれか１つに記載の細胞。
【００８５】
Ｂ５．前記目的の誘導特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、段落Ｂ４に記載の細胞。
【００８６】
Ｂ６．ヒト細胞である、段落Ｂ１からＢ５のいずれか１つに記載の細胞。
【００８７】
Ｃ１．体細胞の、表１に列挙する目的の特殊化細胞種への分化を誘導する方法であって、前記体細胞を段落Ａ１からＡ２０のいずれか１つに記載の組成物と接触させることを含む方法。
【００８８】
Ｃ２．前記目的の誘導特殊化細胞種が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、段落Ｃ１に記載の方法。
【００８９】
Ｃ３．前記体細胞が、線維芽細胞である、段落Ｃ１およびＣ２のいずれか１つに記載の方法。
【００９０】
Ｃ４．前記体細胞を、前記体細胞の分化を可能にするのに十分な培養条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる、段落Ｃ１からＣ３のいずれか１つに記載の方法。
【００９１】
Ｃ５．前記体細胞が、ヒト細胞である、段落Ｃ１からＣ４のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
Ｄ１．  目的の誘導特殊化細胞種における活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補医薬組成物をスクリーニングする方法であって、
前記誘導特殊化細胞を前記候補医薬組成物と接触させることと、
前記誘導特殊化細胞を活性の徴候について観察することと
を含む方法。
【００９３】
Ｄ２．前記誘導特殊化細胞が、表１に列挙する細胞種のうちの１つから選択される、段落Ｄ１に記載の方法。
【００９４】
Ｄ３．前記誘導特殊化細胞が、心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）、肝細胞、神経、ベータ細胞、血液前駆細胞、筋細胞、骨芽細胞または他の細胞種である、段落Ｄ１またはＤ２の１つに記載の方法。
【００９５】
Ｄ４．体細胞から特殊化細胞の発生を誘導することをさらに含む、段落Ｄ１からＤ３のいずれか１つに記載の方法。
【００９６】
Ｄ５．前記特殊化細胞が、段落Ｃ１からＣ５のいずれか１つに記載の方法に従って誘導される、段落Ｄ１からＤ４のいずれか１つに記載の方法。
【００９７】
Ｄ６．前記体細胞が、正常な対象または特定の病理状態を有する対象から得られ、活性の徴候が、前記対象における病理状態の処置のための医薬組成物の活性の徴候である、段落Ｄ４およびＤ５のいずれか１つに記載の方法。
【００９８】
排他的な所有権または権利を請求する本発明の実施形態を、以下のように定義する。
【国際調査報告】
2019517531.tif 000008
2019517531.tif 000009