(57)【要約】  一態様において、細胞の処理方法を開示し、この方法は、複数の細孔を含む膜の細孔に細胞を通過させると共に、この細胞を薬剤に暴露して、細胞内に変化を引き起こし、それにより前記薬剤を細胞に進入させることを含み、前記細孔の各々は、入口開口部から出口開口部に延び、前記細胞の直径未満の少なくとも１つの断面寸法、多くの実施形態では最大断面寸法を有する。例えば、細孔の少なくとも１つの断面寸法、多くの実施形態では細孔の最大断面寸法は、約４０ミクロン未満、又は約３０ミクロン未満、又は約２０ミクロン未満、又は約１５ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満であり得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞処理の方法であって：
複数の細孔を含む膜の１つ以上の細孔に複数の細胞を通過させると共に、前記細胞を薬剤に暴露して、前記細胞内に変化を引き起こし、それにより前記薬剤を前記細胞の少なくとも１つに進入させることを含み；
前記細孔の各々は、入口開口部から出口開口部に延び、約７ミクロン〜約９ミクロンの範囲内の最大断面寸法を有する、方法。
【請求項２】
前記最大断面寸法が約８ミクロン〜約９ミクロンの範囲内、場合により最大断面寸法が約７ミクロン、場合により最大断面寸法が約８ミクロン、場合により最大断面寸法が約９ミクロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が循環細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記循環細胞が、ＣＤ３４＋細胞、前駆細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、並びに造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記循環細胞が、免疫エフェクター細胞、ＣＤ３＋細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記循環細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記循環細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されることが可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細孔が、約７ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内の長さを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細孔が、約１８ミクロン〜約２１ミクロンの範囲内の長さを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜が、約７ｍｍ２〜約８０ｍｍ２の範囲内の活性表面積を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜が、約１ｘ１０５〜約２ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内の表面細孔密度を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞及び前記薬剤が液体担体中に配置され、前記液体担体が、前記液体担体に印加される圧力によって前記細孔を通して押される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体担体中の前記細胞の濃度が、約１０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内であり、場合により前記細胞の前記濃度が約５０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内であり、場合により前記細胞の前記濃度が約１００，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内であり、場合により前記細胞の前記濃度が約１５０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体担体に印加される前記圧力が、前記細胞が前記細孔を少なくとも約１０〜約２０ｍｌ（ミリリットル）／分の流速で通過するような圧力である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体担体に印加される前記圧力が、約５ｐｓｉ〜約２０ｐｓｉの範囲内である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記液体担体が、水、基本細胞培養培地、血清フリー培地、ＨＳＣブリュー、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の増殖因子、１つ以上の生存率向上剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、洗剤、膜安定剤及びそれらの組み合わせのいずれかを含み、場合により前記１つ以上の生存率向上剤が、ＵＭ１７１、ＳＲ１、（（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、及びそれらの組み合わせのいずれかである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上のサイトカインが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記変化が一過性変化である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記変化が、前記細胞の膜の透過性における変化を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記膜の前記細孔が、少なくとも部分的にポリビニルピロリドンで被覆されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、オリゴ糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ナノ粒子、色素、膜非透過性化合物、及びそれらの組み合わせのいずれかを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が遺伝子編集システムである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、ＺＦＮ遺伝子編集システム、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システム、メガヌクレアーゼ遺伝子編集システム又はＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子編集システムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子編集システムがＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムが１つ以上のＲＮＰを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＰがＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤が鋳型核酸を含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬剤が、前記細胞の膜が通常不透過性である化合物である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤が帯電している、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤が電気的に中性である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、約２ｋＤａを超える、場合により約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲内の分子量を有する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記膜が高分子材料を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記高分子材料が、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエステル及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細孔がイオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかによって、前記高分子材料内に形成される、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記膜が半導体、セラミック又は金属のいずれかを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細孔が、前記細孔の各々の長さに沿って実質的に均一の断面積を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細孔が実質的に円筒状である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細孔が規則的な断面形状を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細孔が不規則な断面形状を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記規則的な断面形状が、円形、長円形及び多角形形状のいずれかである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記多角形形状が、正方形、矩形、六角形及び八角形形状からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細孔が疎水性の内面を有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細孔が親水性の内面を有する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞を前記膜に通過させる前記ステップの前に、不均一細胞の収集物から前記細胞を選択することを更に含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記選択された細胞が、ＣＤ３４＋、造血性幹細胞、造血性前駆細胞、造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、免疫エフェクター細胞、ＣＤ３＋細胞、Ｔ細胞並びにＮＫ細胞からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記選択された細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され、場合により前記選択された細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記選択された細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されることが可能であり、場合により前記選択された細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞の少なくとも約４０％が、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞の少なくとも約５０％が、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞の少なくとも約６０％が、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞の少なくとも約７０％が、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞の少なくとも約８０％が、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞の少なくとも約９０％が、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、約５０％を超える細胞生存率で前記薬剤を取り込む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が、約６０％を超える細胞生存率で前記薬剤を取り込む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が、約７０％を超える細胞生存率で前記薬剤を取り込む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が、約８０％を超える細胞生存率で前記薬剤を取り込む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が、約９０％を超える細胞生存率で前記薬剤を取り込む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記膜が、前記細孔の最大長さと実質的に等しい最大厚さを有する、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細孔が実質的に均一の長さを有し、前記膜が、前記長さと実質的に等しい厚さを有する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記薬剤が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、オリゴ糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ナノ粒子、色素、膜非透過性化合物、膜不透過性小分子、及びそれらの組み合わせのいずれかを含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記薬剤が、５０グラム／リットルまでの濃度を有する、請求項１２〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞及び前記薬剤を含む前記液体担体を、流入チャンバを介して前記細孔内に導入することを更に含み、前記流入チャンバは、前記流入チャンバを介して前記細孔内に導入される前記液体担体の容積の約２０％未満の容積を有する、請求項８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞及び前記薬剤を含む前記液体担体を、流入チャンバを介して前記細孔内に導入することを更に含み、前記流入チャンバは、１０マイクロリットル以下の容積を有する、請求項８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記流入チャンバの前記容積が、約０．５〜約１０マイクロリットルの範囲内である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
細胞をトランスフェクトする方法であって：
約１０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内の細胞濃度で複数の細胞を含む液体担体に圧力を印加して、前記液体担体及び前記液体担体中に含まれる前記細胞を、１つ以上の多孔質膜の複数の細孔に通過させると共に、前記細胞を薬剤に暴露して、前記細胞の少なくともいくつかが、少なくとも約６０％の細胞生存率で、約４０億細胞／分を超える比率で、前記薬剤でトランスフェクトされるようにすることを含み；
前記細孔の各々は、約７ミクロン〜約９ミクロンの範囲内の最大断面寸法を有する、方法。
【請求項６７】
前記最大断面寸法が約８ミクロン〜約９ミクロンの範囲内である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記最大断面寸法が約７ミクロンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記最大断面寸法が約８ミクロンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記最大断面寸法が約９ミクロンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞生存率が、少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記細孔が、約７ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内の長さを有する、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
並行細胞処理のためのシステムであって：
流体担体、複数の細胞、及び前記細胞により内部移行されるべき少なくとも１つの薬剤を含む複数のサンプルを処理するための複数の開口部を有する入口支持要素と；
複数の開口部を有する出口支持要素と；
前記入口支持要素と前記出口支持要素との間に配置され、各々が約１５ミクロン未満の最大断面寸法を有する複数の細孔を有する複数の多孔質膜と；を備え、
前記多孔質膜の各々は、前記サンプルの１つを受容するように、前記入口支持要素内の前記開口部の１つに対して配置され、前記サンプルの少なくとも一部をそこに通過させて前記出口開口部へ到達させるように、前記出口支持要素内の開口部の１つに対して配置されている、システム。
【請求項７４】
前記最大断面寸法が約７ミクロン〜約９ミクロンの範囲内である、請求項７３に記載のシステム。
【請求項７５】
前記最大断面寸法が約８ミクロン〜約９ミクロンの範囲内である、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７６】
前記最大断面寸法が約７ミクロンである、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７７】
前記最大断面寸法が約８ミクロンである、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７８】
前記最大断面寸法が約９ミクロンである、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７９】
複数のメッシュを更に備え、前記メッシュの各々は、前記多孔質膜の１つに隣接して配置されて、前記多孔質膜に機械的支持を提供する、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８０】
前記メッシュがステンレス鋼から形成されている、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８１】
前記多孔質膜が高分子材料を含む、請求項７３〜８０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８２】
前記細孔が、イオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかによって、前記高分子材料内に形成される、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８３】
前記入口支持要素の前記開口部の少なくとも１つに連結された、圧力を前記サンプルに印加するための少なくとも１つの圧力アプリケーターを更に備える、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８４】
前記複数の多孔質膜の上流に配置され、前記流体担体を受容するための入口と、そこを通して前記流体担体が前記多孔質膜上に導入される出口とを有する、少なくとも１つの入口チャンバを更に備える、請求項７３〜８３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８５】
前記流入チャンバが、前記多孔質膜上に導入される前記流体担体の容積の約２０％未満の容積を有する、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８６】
前記流入チャンバが、約１０マイクロリットル以下の容積を有する、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８７】
前記流入チャンバが、約０．５〜約１０マイクロリットルの範囲内の容積を有する、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの入口チャンバが複数の入口チャンバを含み、前記入口チャンバの各々は、前記複数の多孔質膜の１つの上流に配置されている、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年９月２８日出願の米国特許仮出願第６２／４０１，０５３号による優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般に、細胞処理のためのシステム及び方法、より詳細には、細胞が生物学的薬剤のような薬物を外部環境から取り込むことを可能にするように細胞を操作することができるシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多様な治療的及び診断的用途は、細胞による多様な薬剤、例えば生物学的薬剤の取り込みを必要とする。多くの場合、細胞はそのような薬剤に対して透過性ではなく、従って細胞内へのそれらの送達は相当な困難を与える。例として、遺伝子編集技術は、細胞内への遺伝子編集構成要素の送達を必要とする。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）として一般的に既知の、そのような遺伝子編集技術の１つは、細胞へのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の送達を必要とする。しかしながら、細胞の膜を横切ってそのようなＲＮＰ複合体を送達することは困難である。
【０００４】
細胞内への外来性薬剤の送達を促進する多数の技術が開発されている。そのような技術のいくつかの例としては、電気穿孔法、オプトポレーション、ナノニードルによる直接穿刺等が挙げられる。しかしながら、これらの技術は、いくつかの欠点を有し得る。例えば、これらは低い効率及び／又は低い細胞生存率を示す場合がある。場合によっては、そのような技術は、特別な緩衝液を使用する必要がある。また、多くのそのような技術は、非常に多数の細胞の並行処理には好適ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、薬剤を細胞内に送達するための改良されたシステム及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、細胞処理の方法を開示し、この方法は、複数の細孔を含む膜の１つ以上の細孔に複数の細胞を通過させると共に、細胞を薬剤に暴露して、細胞内に変化を引き起こし、それにより前記薬剤を細胞の少なくとも１つに進入させることを含み、前記細孔の各々は、流入開口部から流出開口部に延び、約７マイクロメートル（ミクロン）〜約９ミクロンの範囲内、好ましくは約８ミクロン〜約９ミクロンの範囲内の最大断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、各細孔の最大断面寸法は、約７ミクロン、又は約８ミクロン、又は約９ミクロンである。いくつかの実施形態では、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％又はそれを超える細孔は、所望の範囲内又は特定の値の、例えば、約７ミクロン〜約９ミクロンの範囲内、又は約８ミクロン〜約９ミクロンの範囲内、又は７ミクロン、又は８ミクロン、又は９ミクロンの断面寸法を有する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、細胞は、循環細胞であってもよい。好適な循環細胞のいくつかの例としては、非限定的に、幹細胞、前駆細胞、免疫エフェクター細胞、造血性幹細胞、造血性前駆細胞、造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞であってもよい。別の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されてもよく、又は操作されることが可能であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物のものであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞であってもよい。
【０００８】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細孔は、約７ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内、例えば約８〜９ミクロンの範囲内の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、細孔は、約１８〜約２１ミクロンの範囲内の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、膜は、約７ｍｍ２〜約８０ｍｍ２の範囲内、例えば、約１０〜２０ｍｍ２の範囲内、又は約３０〜約４０ｍｍ２の範囲内、又は約５０〜６０ｍｍ２の範囲内、又は約７０ｍｍ２〜約８０ｍｍ２の範囲内の活性表面積を有することができる。更に、いくつかのそのような実施形態では、膜は、約１ｘ１０５〜約２ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内の表面細孔密度を有することができる。いくつかの実施形態では、膜の厚さは、細孔の長さと実質的に同様であってもよいが、別の実施形態では、より厚い膜を使用することができる。
【０００９】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細胞及び薬剤は、液体担体中に配置されてもよく、前記液体担体は、液体担体に対して圧力を印加することにより前記細孔を通して押され得る。いくつかのそのような実施形態では、液体担体中の細胞の濃度は、約１０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、液体担体中の細胞の濃度は、約５０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内、又は約１００，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内、又は約１５０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内、又は約１６０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内、又は約１７０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内、又は約１８０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内、又は約１９０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内であってもよい。いくつかのそのような実施形態では、液体担体に印加される圧力は、細胞が少なくとも約１０〜約２０ｍｌ（ミリリットル）／分の速度で細孔を通過するような圧力である。例として、液体担体に印加される圧力は、約５ｐｓｉ〜約２０ｐｓｉの範囲内であり得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、液体担体は、非限定的に、水、生理食塩水、基本細胞培養培地（例えば、ＳＦＥＭ−ＩＩ）、血清フリー培地、及び／又はＨＳＣブリュー（ｂｒｅｗ）のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、液体担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又は洗剤のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、液体担体は、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の増殖因子、１つ以上の生存率向上剤、及びそれらの組み合わせを更に含むことができる。例として、１つ以上のサイトカインは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及びそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。
【００１１】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細孔の通過によって細胞内に引き起こされる変化は、一過性変化、例えば、細胞の膜の透過性における一過性変化であってもよい。
【００１２】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、膜の細孔は、少なくとも部分的にポリビニルピロリドンで被覆され得る。
【００１３】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、薬剤は、細胞の膜が通常不透過性である化合物を含み得る。例として、いくつかの実施形態では、薬剤は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、プラスミド、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、オリゴ糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ナノ粒子、色素、及びそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。例として、薬剤は、遺伝子編集システムであってもよい。そのような遺伝子編集システムのいくつかの例としては、非限定的に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、ＺＦＮ遺伝子編集システム、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システム、メガヌクレアーゼ遺伝子編集システム又はＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子編集システムを挙げることができる。例えば、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムであってもよく、ここでＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、１つ以上のＲＮＰ、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を含む。例として、いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、例えばＰＣＴ国際公開第２０１７／１１５２６８号パンフレットに記載されているようなＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムであってもよく、この公開の全容は、参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、遺伝子編集システムは、遺伝子編集システム、例えばＰＣＴ国際公開第２０１７／０９３９６９号パンフレットに記載されているようなＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムであってもよく、この公開の全容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、細胞への薬剤の送達は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＡＲ又はＣＡＲをコードする核酸を含み得る。ＣＡＲを発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び核酸は、以下の国際公開に記載されており、各々の全容は参照により本明細書に組み込まれる：国際公開第２０１２／０７９００号パンフレット、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレット、国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット、国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレット、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレット及び国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレット、
【００１５】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、薬剤は帯電していてもよい。別の実施形態では、薬剤は電気的に中性であってもよい。いくつかの実施形態では、薬剤は、約２ｋＤａ超、又は約３ｋＤａ超、又は約１０ｋＤａ超、又は約２０ｋＤａ超、又は約３０ｋＤａ超、又は約４０ｋＤａ超、又は約５０ｋＤａ超、又は約６０ｋＤａ超、又は約７０ｋＤａ超、又は約８０ｋＤａ超、又は約９０ｋＤａ超、又は約１００ｋＤａ超の分子量を有することができる。
【００１６】
循環細胞を処理するための上記の方法において、膜は、多様な異なる材料から形成されていてもよい。例として、膜は、高分子材料を含むことができる。好適な高分子材料のいくつかの例としては、非限定的に、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエステル及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。いくつかのそのような実施形態では、細孔は、イオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかによって高分子材料内に形成され得る。別の実施形態では、膜は、半導体、セラミック又は金属のいずれかから形成され得る。
【００１７】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細孔は、細孔の各々に沿って実質的に均一の断面積を有することができる。細孔は、規則的な又は不規則な断面形状を有することができる。細孔は、多様な異なる形状を有することができる。例えば、細孔は、正方形、矩形、六角形又は八角形形状等の多角形の断面形状を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細孔は、実質的に円筒状であってもよい。
【００１８】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細孔は、疎水性又は親水性の内面を有することができる。
【００１９】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細胞を膜に通過させるステップの前に、細胞は不均一細胞の収集物から選択され得る。例として、選択された細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４９ｆマーカーのいずれかを有し得る。
【００２０】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％は、前記１つ以上の細孔を通過することによって前記薬剤を取り込む。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、約５０％超、又は約６０％超、又は約７０％超、又は約８０％超、又は約９０％超の細胞生存率で薬剤を取り込むことができる。
【００２１】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、膜は、細孔の最大長さと実質的に等しい最大厚さを有することができる。例として、細孔は、実質的に均一の長さを有することができ、膜は、細孔の長さと実質的に等しい厚さを有することができる。
【００２２】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、薬剤は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、プラスミド、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、オリゴ糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ナノ粒子、色素、膜非透過性化合物、及びそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。
【００２３】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細胞及び薬剤を多孔質膜に運ぶ液体担体中の薬剤の濃度は、５０グラム／リットルまでであってもよい。
【００２４】
循環細胞を処理するための上記の方法のいくつかの実施形態では、細胞及び薬剤を含む液体担体は、流入チャンバを介して前記細孔内に導入され、流入チャンバは、前記流入チャンバを介して細孔内に導入される液体単体の容積の約２０％未満の容積を有することができる。例として、いくつかの実施形態では、細胞及び薬剤を含む液体担体は、約１０マイクロリットル以下、例えば約０．５〜約１０マイクロリットルの範囲内の容積を有する流入チャンバを介して、細孔内に導入され得る。
【００２５】
関連する態様では、細胞、特に循環細胞をトランスフェクトする方法を開示し、この方法は、約１０，０００〜約２００，０００細胞／マイクロリットルの範囲内の細胞濃度で複数の細胞を含む液体担体に圧力を印加して、液体担体及びこの担体中に含まれる細胞を、１つ以上の多孔質膜の複数の細孔に通過させると共にこの細胞を薬剤に暴露して、前記細胞の少なくともいくつかが、少なくとも約６０％の細胞生存率で、約２０億細胞／分を超える、又は約４０億細胞／分を超える比率で、前記薬剤でトランスフェクトされるようにすることを含み、前記細孔の各々は、約７ミクロン〜約９ミクロンの範囲内、例えば約８ミクロン〜約９ミクロンの範囲内、又は約７ミクロン、又は約８ミクロン、又は約９ミクロンの最大断面寸法を有する。そのような方法のいくつかの実施形態では、細孔は、約７ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内の長さを有することができる。別の実施形態では、細孔は、約１８ミクロン〜約２１ミクロンの範囲内の長さを有することができる。更に、そのような方法のいくつかの実施形態では、トランスフェクション後の細胞生存率は、少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％であってもよい。
【００２６】
関連する態様では、並行細胞処理のためのシステムを開示し、このシステムは、流体担体、複数の細胞、及び細胞により内部移行されるべき少なくとも１つの薬剤を含む複数のサンプルを受容するための複数の開口部を有する入口支持要素と、複数の開口部を有する出口支持要素と、前記入口支持要素と前記出口支持要素との間に配置された複数の多孔質膜とを備え、多孔質膜の各々は、約９ミクロン未満、例えば約７ミクロン〜約９ミクロンの範囲内の最大断面寸法を有する複数の細孔を有し、多孔質膜の各々は、サンプルの１つを受容するように、入口支持要素内の開口部の１つに対して配置され、サンプルの少なくとも一部をそこに通過させて前記出口開口部へ到達させるように、出口支持要素内の開口部の１つに対して配置されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、システムは、複数のメッシュを更に備えることができ、このメッシュの各々は、前記多孔質膜の１つに隣接して配置されて、前記多孔質膜に機械的支持を提供する。例として、メッシュは、ステンレス鋼から形成されていてもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、細孔は、イオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかによって高分子材料内に形成され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、システムは、流入支持要素の開口部の少なくとも１つに連結された、圧力を前記サンプルに印加するための少なくとも１つの圧力アプリケーターを更に備える。
【００３０】
いくつかの実施形態では、システムは、前記複数の多孔質膜の上流に配置され、前記流体担体を受容する入口と、前記流体担体がそこを通して前記多孔質膜上に導入される出口とを有する少なくとも１つの入口チャンバを更に備える。いくつかのそのような実施形態では、流入チャンバは、前記多孔質膜上に導入される流体担体の容積の約２０％未満の容積を有する。例えば、流入チャンバは、約１０マイクロリットル以下、例えば約０．５〜約１０マイクロリットルの範囲内の容積を有することができる。
【００３１】
更に別の態様では、細胞の処理方法を開示し、この方法は、細胞を複数の細孔を含む膜の細孔に通過させると共に細胞を薬剤に暴露して、細胞内に変化を引き起こし、それにより前記薬剤を細胞に進入させることを含み、前記細孔の各々は、流入開口部から流出開口部に延び、前記細胞の直径未満の少なくとも１つの断面寸法、多くの実施形態では、最大断面寸法を有する。例えば、細孔の少なくとも１つの断面寸法、多くの実施形態では細孔の最大断面寸法は、約４０ミクロン未満、又は約３０ミクロン未満、又は約２０ミクロン未満、又は約１５ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満であってもよい。例えば、細孔の少なくとも１つの断面寸法、多くの実施形態では細孔の最大断面寸法は、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１２ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内、例えば約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内であってもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、膜は、細孔の最大長さと実質的に等しい最大厚さを有することができる。いくつかのそのような実施形態では、細孔は、実質的に均一の長さを有することができ、膜は、その長さと実質的に等しい厚さを有する。
【００３３】
場合によっては、膜の細孔を通した細胞の通過により引き起こされる変化は、一過性変化であってもよい。例えば、変化（又は撹乱）は、細胞の膜の透過性における一過性変化に相当し得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、約１ｘ１０５〜約２ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内の表面細孔密度を有することができる。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ポリビニルピロリドン等の高分子材料で、少なくとも部分的に被覆されてもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細胞及び薬剤は、液体担体中に配置されてもよく、液体担体は、前記液体担体に印加される圧力によって、膜の細孔を通して押される。例えば、少なくとも約５ｐｓｉ、例えば約５ｐｓｉ〜約１００ｐｓｉの範囲内の圧力が、液体担体に印加されて、多孔質膜を通した液体担体の流れを生じ、その結果として液体担体中に含まれる細胞及び薬剤の流れを生じる。いくつかの実施形態では、液体担体に印加される圧力は、約１０ｍｌ／分（ミリリットル／分）超、例えば約１０ｍｌ／分〜約２０ｍｌ／分の範囲内の流速の、膜の細孔を通した液体担体の流れを生じ得る。
【００３６】
本教示による方法を用いて、多様な異なる薬剤を多様な異なる細胞内に導入することができる。多くの実施形態では、本教示による方法は、細胞内に薬剤、例えば、細胞が通常不透過性である生物学的化合物を送達するのに使用することができる。例として、薬剤は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、プラスミド、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖、オリゴ糖、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ナノ粒子、色素、膜非透過性化合物、及び前記の組み合わせのいずれかであってもよい。
【００３７】
例として、いくつかの実施形態では、本教示による方法は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を細胞内に送達するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、帯電し得るが、別の実施形態では、薬剤は、電気的に中性である。薬剤は、多様な異なる分子量を有することができる。一態様では、遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集システム、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システム、メガヌクレアーゼ遺伝子編集システム、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子編集システム等を、細胞内に導入することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素であり得、例えば、ｇＲＮＡ分子及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９タンパク質等）を含むＲＮＰを含み又はこのＲＮＰである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエステル及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の高分子材料を含むことができる。細孔は、例えばイオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかによって、そのような高分子材料内に形成され得る。
【００３９】
いくつかの別の実施形態では、多孔質膜は、半導体又は金属のいずれかを含むことができる。
【００４０】
本教示による方法は、多様な異なる細胞タイプに適用することができる。そのような細胞のいくつかの例としては、前駆細胞、免疫エフェクター細胞、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、角化細胞及びヒト径気管支上皮細胞を挙げることができる。例えば、細胞は、Ｔ細胞であってもよい。
【００４１】
膜の細孔は、多様な異なる形状を有することができる。例えば、細孔は、規則的な又は不規則な、断面形状を有することができる。規則的な断面形状のいくつかの例としては、非限定的に、円形、長円形及び正方形、矩形、六角形、又は八角形形状等の多角形形状を挙げることができる。いくつかの実施形態では、膜の細孔は、それらの長さに沿って実質的に均一の断面寸法を有することができる。別の実施形態では、細孔の少なくとも１つの断面寸法は、それらの長さに沿って不均一であってもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、親水性の表面を有することができる。別の実施形態では、多孔質膜は、疎水性の表面を有することができる。例えば、細孔の内面は、親水性又は疎水性であってもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、細胞を多孔質膜の細孔に通過させるステップの前に、不均一細胞の収集物から１つ以上の細胞を選択するステップを更に含む。多様な選択基準を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、発現、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、及びそれらの組み合わせのいずれかの表面発現に基づいて選択される。
【００４４】
関連する態様において、細胞をトランスフェクトする方法を開示し、この方法は、複数の細胞及び薬剤を含む流体担体を、複数の細孔を有する多孔質膜に通過させることを含み、複数の細孔の各々は、前記細胞の最大直径未満の最大断面寸法を有し、従って、細孔を通した細胞の通過が、前記薬剤による細胞のトランスフェクションに十分な、細胞の物理的変形を引き起こす。いくつかの実施形態では、細孔の各々は、膜の上面に近接した流入口と、膜の下面に近接した流出口とを有することができる。いくつかの実施形態では、膜は、細孔の最大長さと実質的に等しい最大厚さを有することができる。いくつかの実施形態では、細孔は、実質的に均一の長さを有することができ、膜は、その長さと実質的に等しい厚さを有することができる。
【００４５】
多孔質膜は、上記に論じた特性を有することができる。例えば、細孔の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは最大断面寸法は、細胞の最大直径よりも小さくてもよい。例えば、細孔の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは最大断面寸法は、約４０ミクロン未満、又は約３０ミクロン未満、又は約２０ミクロン未満、又は約１５ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満、例えば約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内であってもよい。更に、いくつかの実施形態では、膜は、約１ｘ１０５〜約２ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内の表面細孔密度を有することができる。上記したように、上記に列挙したもの等の多様な細胞タイプ及び薬剤を使用することができる。更に、上記したように、多くの実施形態では、細胞及び細胞により内部移行されるべき薬剤は、液体担体中に取り込まれ（ｅｎｔｒａｉｎ）得、これは、圧力、例えば、約５ｐｓｉを超える圧力の印加によって膜を通して押され得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、細胞のトランスフェクションは、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のトランスフェクション率で達成され得る。更に、いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の薬剤でトランスフェクトされ得、得られた細胞は、約５０％超、又は約６０％超、又は約７０％超、又は約８０％超、又は約９０％超の細胞生存率を有する。細胞生存率は、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）計数器を使用して測定することができる。
【００４７】
別の態様において、細胞処理のためのシステムを開示し、このシステムは、
複数の細胞及び細胞により内部移行されるべき少なくとも１つの生物学的薬剤を含む流体担体を受容するための入口と、入口と連通して流体担体を受容する多孔質膜とを備え、前記多孔質膜は、約４０ミクロン未満の少なくとも１つの断面寸法を有する複数の細孔を有し、従って細孔を通した細胞の通過は、細胞の少なくとも一部内への薬剤の進入に十分な、細胞における変化を引き起こす。システムは、前記膜と連通してトランスフェクトされた細胞を受容する出口を更に備える。いくつかの実施形態では、細孔の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは細孔の最大断面寸法は、約４０ミクロン未満、又は約３０ミクロン未満、又は約２０ミクロン未満、又は約１５ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満、例えば約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内である。例えば、そのようなシステムにおいて、細孔の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは細孔の最大断面寸法は、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、多孔質膜の細孔は、約５ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内の通路長さを有することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、システムは、液体担体に圧力を印加して、液体担体が多孔質膜を通して流れるようにするための機構を更に備える。例として、機構は、内部に液体担体が配置されている注射器に連結したピストンと、液体担体をリザーバから多孔質膜に移動するポンプ、又は任意の他の好適な機構を含むことができる。いくつかの実施形態では、圧力機構は、約５ｐｓｉを超える圧力を液体担体に印加して、例えば約１０ｍｌ／分超、例えば約１０〜約２０ｍｌ／分の範囲内の流速で、各細孔を通して、液体担体が多孔質膜を通して流れるようにすることができる。
【００４９】
多孔質膜は、金属、半導体又はポリマー等の多様な異なる材料から形成され得る。例として、いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエステル及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の高分子材料から形成され得る。いくつかのそのような実施形態では、細孔は、イオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング、又はフォトリソグラフィーのいずれかによって、高分子材料内に形成され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、システムは、多孔質支持体を更に備えることができ、多孔質支持体は、多孔質膜に隣接して配置されて、膜を通したサンプルの流れに関連した圧力に膜が耐えられるように、膜に機械的強度を提供する。多孔質支持体は、多様な異なる材料から作製することができる。いくつかの実施形態では、多孔質支持体は、金属、例えばステンレス鋼から形成されたメッシュである。いくつかの実施形態では、メッシュは、約１ｍｍを超えるサイズ（例えば、直径）を有する開口部を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、システムは、流入チャンバを更に備えることができ、この流入チャンバは、多孔質膜の上流に配置され、細胞及び１つ以上の薬剤が含まれる液体担体を受容する入口と連通している。流入チャンバは、出口を含むことができ、この出口を通して液体担体が多孔質膜に導入される。いくつかの実施形態では、流入チャンバは、約５０μＬ〜約１Ｌの範囲内の容積を有することができる。システムは、液体担体を保管するための保管リザーバも備えることができる。保管リザーバは、液体担体を流入チャンバに送達するために流入チャンバと流体連通していてもよい。更に、トランスフェクトされた細胞を収集するための流出チャンバが多孔質膜の下流に配置されてもよい。
【００５２】
関連する態様では、並行細胞処理のためのシステムを開示し、このシステムは
流体担体、複数の細胞、及び細胞により内部移行されるべき少なくとも１つの薬剤を含む複数のサンプルを受容するための複数の開口部を有する入口支持要素を備える。システムは、複数の開口部を有する出口支持要素と、入口支持要素と出口支持要素との間に配置され、各々が少なくとも１つの断面寸法、好ましくは約４０ミクロン未満の最大断面寸法を有する複数の細孔を有する複数の多孔質膜とを更に備えることができる。多孔質膜の各々は、サンプルの１つを受容するように、入口支持要素内の開口部の１つに対して配置されてもよく、サンプルの少なくとも一部をそこに通過させて前記出口開口部へ到達させるように、出口支持要素内の開口部の１つに対して配置されてもよい。流入支持要素に連結された圧力アプリケーターを使用して、圧力、例えば約５ｐｓｉを超える圧力をサンプルに印加して、流入支持要素の入口内へサンプルを押すことができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、システムは、複数の多孔質支持体（メッシュ）を更に備えることができ、多孔質支持体の各々は、前記多孔質膜の１つに隣接して配置されて、多孔質膜に機械的強度を提供する。多孔質支持体は、例えばステンレス鋼メッシュ等の金属メッシュから形成されてもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、上記に論じたもの等の高分子材料を含むことができる。更に、上記したように、いくつかの実施形態では、細孔は、イオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかによって、そのような高分子材料内に形成され得る。更に、多孔質膜の細孔は、それらの長さに沿って実質的に均一又は不均一の断面寸法を有することができる。多孔質膜の細孔は、膜の上面と実質的に面一の入口と、膜の下面と実質的に面一の出口とを有することができる。
【００５５】
関連する態様において、１つ以上の遺伝子編集システム及び／又は構成要素を細胞に送達する方法を開示し、この方法は、複数の細孔を有する膜の細孔に少なくとも１つの細胞を通過させることであって、細孔の各々は、細胞の直径よりも小さい少なくとも１つの断面寸法、好ましくは最大断面寸法を有する、通過させることと、細胞が細孔を通過するときに、この細胞を少なくとも、例えば本明細書に記載されるような遺伝子編集構成要素及び／又はシステムに暴露することと、を含み、細胞は、この細胞が細孔を通過するときに、この細胞が前記少なくとも１つの遺伝子編集構成要素及び／又はシステムを取り込むことが十分可能な変化を受ける。例えば、細孔の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは最大断面寸法は、約４０ミクロン未満（例えば、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内）、又は約３０ミクロン未満（例えば、約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内）、又は約２０ミクロン未満（例えば、約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内）、又は約１５ミクロン未満（例えば、約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内）、又は約１０ミクロン未満（例えば、約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内）、例えば約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内であってもよい。上記の遺伝子編集方法のいくつかの実施形態では、膜は、約１ｘ１０５〜約２ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内の表面細孔密度を有する。更に、いくつかの実施形態では、膜は、少なくとも部分的に、ポリビニルピロリドン等の高分子材料で被覆されてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分子（例えば、１つ以上の遺伝子構成要素及び／又は遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素）の取り込みは、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％及び２５０％のいずれかの遺伝子、例えば導入遺伝子又は標的遺伝子の発現の調節をもたらす。いくつかの実施形態では、調節は、発現の低減である。別の実施形態では、調節は、発現の向上である。
【００５７】
例えば本明細書に記載されるような、多様な異なる遺伝子編集システム及び構成要素を使用することができる。多くの実施形態では、細胞の膜は、上記の方法によって細胞に送達される遺伝子編集構成要素及び／又はシステムに対して通常不透過性である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集構成要素及び／又はシステムは、タンパク質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド、脂質、非透過性化合物、プラスミド及びリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）、例えば、例えば本明細書に記載されるような１つ以上のＲＮＰを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、及びそれらの組み合わせのいずれかを含むことができる。例として、ＲＮＰは、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子編集構成要素及び／又はシステムの取り込みを促進するという細胞内に誘導される変化は、物理的及び／又は化学的変化であってもよい。例として、そのような変化は、細胞の膜の透過性における変化であってもよい。いくつかの実施形態では、変化は一過性であってもよい。
【００５８】
上記の遺伝子編集方法を含む、本明細書に記載される遺伝子編集方法のいくつかの実施形態では、細胞及び少なくとも１つの遺伝子編集構成要素及び／又はシステムは、液体担体中に配置されてもよく、液体担体は、この液体担体に印加される圧力によって、細孔を通して押される。場合によっては、印加される圧力は、液体担体が少なくとも約１０ｍｌ／分、例えば約１０〜約２０ｍｌ／分の範囲内の流速で膜の各細孔を通して流れるようにすることができる。
【００５９】
本明細書に記載される遺伝子編集方法は、遺伝子編集構成要素及び／又はシステムを多様な異なる細胞に送達するのに使用することができる。例えば、細胞は、前駆細胞、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、角化細胞及びヒト径気管支上皮細胞のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、細胞は、造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋細胞である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、上記の遺伝子編集方法を含む本明細書に記載される遺伝子編集方法は、不均一細胞の収集物から１つ以上の細胞を選択した後、多孔質膜に細胞を通過させると共に、細胞を１つ以上の遺伝子編集薬剤に暴露して、それらの遺伝子編集薬剤が細胞内に送達されるようにするステップを更に含むことができる。多様な選択基準を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、及びそれらの組み合わせ等の１つ以上の細胞マーカーを使用して、細胞を選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞の選択は、それらのサイズに基づいてもよい。
【００６１】
関連する態様において、細胞処理のためのシステムを開示し、このシステムは、複数の細胞を受容するための入口と、互いに対して連続して配置されて、前記入口を介して前記細胞の少なくとも一部を連続して受容する複数の多孔質膜とを備え、前記多孔質膜の各々は、約４０ミクロン未満、例えば、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内の少なくとも１つの断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、多孔質膜の各々は、約４０ミクロン未満の最大断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、システムは、複数の液体送達モジュールを更に備えることができ、この液体送達モジュールの各々は、細胞が多孔質膜の１つを通過するときに細胞の少なくともいくつかが薬剤を取り込むように、細胞を薬剤に暴露するように構成されている。いくつかのそのような実施形態では、液体送達モジュールは、細胞が多孔質膜の異なる１つを通過するときに、細胞を異なる薬剤に暴露するように構成されている。
【００６２】
本発明の様々な態様の更なる理解は、以下の詳細な説明を、下記に記載される関連する図面と共に参照して得ることができる。図面は必ずしも等尺に描かれていない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】薬剤を細胞内に送達するための、本教示の実施形態による方法のステップを示すフローチャートである。
【図２】不均一細胞の収集物から細胞を選択し、選択された細胞に１つ以上の薬剤を送達するための、本教示の別の実施形態による方法のステップを示すフローチャートである。
【図３Ａ】遺伝子編集のための、本教示の実施形態による方法のステップを示すフローチャートである。
【図３Ｂ】本教示による遺伝子編集技術の例示的な臨床使用におけるサイクルの様々なステップの例を概略的に示す。
【図３Ｃ】本教示による遺伝子編集技術の例示的な臨床使用におけるサイクルの様々な手順の別の例を概略的に示す。
【図４Ａ】細胞を処理する、例えば薬剤を細胞内に送達するための本教示の実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図４Ｂ】処理細胞を収集するための複数のウェルを示す、図４Ａに示したシステムの概略部分図である。
【図５Ａ】図４Ａに示したシステムに使用される細胞処理アセンブリーを概略的に示す。
【図５Ｂ】図５Ａに示した細胞処理アセンブリーと、細胞サンプルを収容する注射器に細胞処理アセンブリーを流体連結するための、継手、管及び針の分解組立図である。
【図５Ｃ】注射器に連結された細胞処理アセンブリーの概略断面図である。
【図５Ｄ】細胞処理アセンブリーの別の概略断面図である。
【図６Ａ】細胞処理アセンブリーの流入ブロックの概略図である。
【図６Ｂ】細胞処理アセンブリーの流出ブロックの概略図である。
【図７】本教示による細胞処理システムで使用される多孔質膜の実施形態の概略図である（図示を容易にするために、少数の細孔のみ示す）。
【図８】矩形の断面形状を有する細孔を有する、多孔質膜の別の実施形態の概略図である。
【図９】その長さに沿って不均一の断面寸法を有する、多孔質膜の細孔を概略的に示す。
【図１０】細胞処理システム内で多孔質膜に隣接して配置され得るメッシュを概略的に示す。
【図１１Ａ】本教示による細胞処理システムの別の実施形態を概略的に示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａに示した細胞処理システムの概略分解組立図である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ及び１１Ｂに示したシステムの部分概略断面図である。
【図１２Ａ】細胞選択モジュールと、細胞選択モジュールと連通した細胞処理モジュールとを備える、実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図１２Ｂ】細胞を分離するのに磁力を用いる例示的な細胞選別デバイスを概略的に示す。
【図１３Ａ】薬剤を細胞に送達するための微小流体デバイスを備える、本教示の実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図１３Ｂ】互いに連続して配置された複数の多孔質膜を備える、本教示の別の実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図１４】５０μＬの送達容積当たりの様々な細胞密度の、ＮＧＳによるインデル％、ＦＡＣＳ分析によるＢ２Ｍ  ＫＤ、及びＶｉ−Ｃｅｌｌによる細胞回収率により示される、本教示の実施形態によるプロトタイプデバイスの送達効率を示す。（ここでＲＮＰ濃度は、２００μｇのＣａｓ９／５０μｇ  ｓｇ  ＲＮＡである。）
【図１５】１０００万細胞／５０μＬまでの細胞密度に関する、本教示の実施形態によるプロトタイプデバイスの拡張性を示す、インデル形成及びＢ２Ｍノックダウンデータを示す。（ここでＲＮＰ濃度は、２００μｇのＣａｓ９／５０μｇ  ｓｇ  ＲＮＡである。）
【図１６】５００万細胞／５０μＬでの、５０μｇ又は２００μｇ  Ｃａｓ９におけるＲＮＰ複合体の用量応答を示す。
【図１７】本教示の実施形態によるプロトタイプデバイスを使用した、５００万細胞を有する５０μＬの送達容積及び２００μｇのＣａｓ９／５０μｇ  ｓｇＲＮＡのＲＮＰ濃度に関する、ＮＧＳによるインデル％、ＦＡＣＳ分析によるＢ２Ｍ  ＫＤ、及びＶｉ−Ｃｅｌｌによる細胞回収率による膜の送達効率を示す。
【図１８】本教示の実施形態による多孔質膜を通した細胞の通過のための印加圧力の関数としての、２００μｇのＣａｓ９でのＣａｓ９／ＲＮＰ複合体の、５００万細胞／５０μＬの濃度でのヒト造血性幹細胞内への送達に関する編集及び細胞回収率を示すデータを示す。
【図１９Ａ】ＴＲＩＡＭＦ又はネオン電気穿孔法による偽処理から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のフローサイトメトリーによるＨＳＣ表面マーカーを示す。フローサイトメトリー染色によるＣＤ３４及びＣＤ９０百分率の比較も示す。
【図１９Ｂ】ＴＲＩＡＭＦ又はネオン電気穿孔法の偽処理から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ細胞数を示す。フローサイトメトリー染色を有するＶｉＣｅｌｌによる合計、ＣＤ３４＋、及びＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞数の比較も示す。
【図１９Ｃ】ＴＲＩＡＭＦ又はネオン電気穿孔法による偽処理から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ倍数増殖を示す。
【図２０】ＷＴ、偽処理、ＨＢＧ編集、及びＵＮＣ０６３８ポジティブコントロール処理細胞の赤血球分化プロトコルのＤ７及びＤ１４におけるＨｂＦ細胞の百分率を示す。細胞を、固定化とＣＤ２３５ａ、ＣＤ７１及びＨｂＦ染色により分析した。
【図２１Ａ】ＷＴ細胞、偽ＴＲＩＡＭＦ処理細胞、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集細胞の回収から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のフローサイトメトリーによるＨＳＣ表面マーカーを示す。フローサイトメトリー染色によるＣＤ３４及びＣＤ９０百分率の比較も示す。
【図２１Ｂ】ＷＴ細胞、偽ＴＲＩＡＭＦ処理細胞、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集細胞の回収から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ細胞数を示す。フローサイトメトリー染色を有するＶｉＣｅｌｌによる合計、ＣＤ３４＋、及びＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞数の比較も示す。
【図２１Ｃ】ＷＴ細胞、偽ＴＲＩＡＭＦ処理細胞、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集細胞の回収から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ倍数増殖を示す。
【図２２】異なる系譜に関与するＴＲＩＡＭＦ処理ＨＳＣの能力を決定するためのコロニー形成アッセイの結果を示す。メソカルト（ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ）上で１４日間増殖後の、異なる造血性（ｈａｅｍａｔａｐｏｅｉｔｉｃ）系譜のコロニー数を示す（プレートをＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎで撮像及び分析した）。
【図２３】ＴＲＩＡＭＦ編集ＨＳＰＣがＮＳＧマウスにおいて長期間再構成を呈することを示すデータを提示する。７００ｋ  ＴＲＩＡＭＦ処理細胞を各マウスに静脈内注射した（ＷＴ：Ｎ＝４、偽：Ｎ＝５、ＨＢＧ：Ｎ＝６）。末梢血を４週間毎に収集し、抗ヒト及び抗マウスＣＤ４５並びにヒトＣＤ４５に関して染色した。
【図２４】本発明の実施形態による、６０μｇのｍＲＮＡの送達後の異なる時点でのＨＳＣにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析の結果を、２４時間後の細胞回収の百分率と共に示す。
【図２５】本発明の実施形態による、５、１０及び２０μｇのＤＮＡでの小環状ＤＮＡの送達後の異なる時点でのＨＳＣにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析の結果を、２４時間後の細胞回収の百分率と共に示す。
【図２６】３０μｇのＣＹ５−タグペプチドの送達後の異なる時点でのＨＳＣにおけるＣｙ５シグナルのフローサイトメトリー分析の結果を、２４時間後の細胞回収の百分率と共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本教示は一般に、細胞処理のための方法及びシステムに関し、より詳細には、細胞内に変化（例えば、一過性の物理的変形）を引き起こし、これは次いで、例えば細胞の膜の不透過性に起因して、通常細胞により内部移行され得ないものを含む化学的及び／又は生物学的化合物の取り込みを可能にする、方法及びシステムに関する。一態様において、処理を受けている細胞の直径よりも小さい最大断面寸法を有する複数の細孔を有する多孔質膜、例えば多孔質高分子膜を使用して、細胞による薬剤の取り込みを媒介するのに好適な変化を細胞内に引き起こすことができる。特定の実施形態では、膜は、本質的に平面状の互いに反対側の２つの表面を有する。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、そのような細孔を通したそのような細胞の通過は、多方向に沿った（例えば、少なくとも２つの直交する方法に沿った）圧縮力を細胞に付与することができ、これは細胞が同時に暴露されている薬剤を細胞が取り込むことを十分に可能にする変化を細胞に引き起こし得る。
【００６５】
本明細書で使用される様々な用語は、当業者により理解されるそれらの意味と一致する。更なる説明として、いくつかの用語は以下のように定義される。
【００６６】
本明細書で使用される用語「細胞」は、生命体の最小の構造及び機能単位を指す、その通常の意味と一致する。本発明の実施形態の教示の多くにおいて、哺乳動物細胞に対する適用に関連して論じられているが、本教示は、任意の原核生物又は真核生物細胞に広く適用可能である。
【００６７】
本明細書で使用される用語「細胞の直径」は、例えば細胞タイプに応じて多様な異なる形状を有し得る細胞の最大断面寸法を指す。
【００６８】
用語「細胞生存率」は、一般に、細胞の集団中の生細胞の比率の測定値を指す。細胞生存率の測定に使用される方法の例としては、Ｓｙｔｏｘ（登録商標）又はＴｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ染色等の死細胞染色が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）計数器で、標準的なプロトコルに従って測定される。用語「細胞回収率」は、一般に、処理から２４〜４８時間後に、Ｖｉ−Ｃｅｌｌにより計数された未処理群に対する処理群の生細胞の比率の測定値を指す。
【００６９】
用語「膜」は、多くの実施形態では、横軸（例えば、幅）よりも有意に小さい厚さを有する本質的に平面状の構造を指す。例えば、いくつかの実施形態では、膜の厚さは、膜の直径の１００倍又は１００分の１であってもよい。
【００７０】
本明細書で使用される用語「本質的に平面状の」は、互いに反対側の表面、例えば、互いに平行する、又は１０度、若しくは５度、若しくは３度、若しくは１度以内で互いに平行する、入口表面及び出口表面を有する構造を指す。
【００７１】
用語「トランスフェクション」は、本明細書では、薬剤、例えばリボ核酸タンパク質複合体を細胞内に導入するプロセスを広く指すのに使用される。
【００７２】
本明細書で使用される用語「トランスフェクション効率」は、薬剤を内部移行させた、本教示に従って、多孔質膜を通過すると共に少なくとも１つの薬剤に暴露された細胞の割合を指す。
【００７３】
本明細書で使用される用語「薬剤」は、任意の無機又は有機分子、化合物、及び分子複合体、生物学的生命体及びそれらの組み合わせを指す。薬剤の非限定的な例は、以下に提供される。
【００７４】
本明細書で使用される数値又は数字範囲に適用される用語「約」は、数値又は範囲の最大１０％のプラス又はマイナス変動を示す。
【００７５】
本明細書で使用される用語「実質的に」は、完全な条件又は状態に対する最大５％の偏差を示す。
【００７６】
用語「細胞膜」又は「細胞の膜」は、交換可能に使用されて、細胞の内部と、細胞の外部環境とを分離する半透過性膜を指す。
【００７７】
本明細書で使用される用語「タンパク質複合体」は、集合的に複合体を形成するタンパク質及び少なくとも１つの結合パートナーを指す。例として、結合パートナーは、１つ以上のタンパク質、１つ以上の核酸、１つ以上のタンパク質及び１つ以上の核酸の組み合わせであってもよい。タンパク質複合体における結合パートナーに対するタンパク質の結合は、共有結合又は非共有結合相互作用を介して達成され得る。例えば、タンパク質複合体は、ＲＮＡ／タンパク質リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）等のタンパク質−核酸複合体であってもよい。
【００７８】
用語「循環細胞」及びその複数形の「循環細胞」は、本明細書では、非接着性細胞、例えば造血性細胞、例えば、造血性幹細胞及び前駆細胞、骨髄内に見出される幹細胞、臍帯血、末梢血並びにＴ細胞等の免疫エフェクター細胞を指すように使用される。
【００７９】
本明細書で使用される用語、膜の「活性表面積」は、関心対象の細胞及び薬剤を含む液体担体に暴露される膜の表面積を指す。
【００８０】
本明細書で使用される用語「生存率向上剤」は、細胞、例えばＨＳＰＣ、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣを、前記化合物が存在しない同じ細胞タイプと比較して高速で増殖させる、例えば数を増大させる化合物を指す。例示的な一態様では、細胞タイプは、幹細胞、例えばＨＳＰＣであり、生存率向上剤は、アリール炭化水素受容体経路の阻害剤である。いくつかの実施形態では、増殖、例えば数の増大は、エクスビボで達成される。生存率向上剤の更なる例は、例えば、その全容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットに記載されており（例えば、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットの実施例１に記載されている分子）、また例えば、その全容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１１０１９８号パンフレットにも記載されている。いくつかの実施形態では、生存率向上剤は、（（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットによる化合物１５７Ｓである。いくつかの実施形態では、生存率向上剤は、４−［２−［［２−（１−ベンゾチオフェン−３−イル）−９−プロパン−２−イルプリン−６−イル］アミノ］エチル］フェノール）；国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットによる化合物１（ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １又はＳＲ１とも称される）である。いくつかの実施形態では、生存率向上剤は、ＵＭ１７１である。いくつかの実施形態では、生存率向上剤は、２つ以上の薬剤の組み合わせを含み、例えば、ＵＭ１７１及びアリール炭化水素受容体阻害剤、例えばＳＲ１の組み合わせを含む。
【００８１】
遺伝子編集システムに関連して本明細書で使用される用語「鋳型核酸」は、標的配列（例えば、遺伝子編集システムにより切断される配列）に挿入され得る配列を含む１つ以上の核酸分子を指す。理論に束縛されるものではないが、そのような挿入は、相同組換え修復（ＨＤＲ）により達成できると考えられる。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、単鎖オリゴヌクレオチド、例えば単鎖ＤＮＡ分子又は単鎖ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、二重鎖核酸、例えば二重鎖ＤＮＡ分子、例えばプラスミドである。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ベクター、例えばアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、鋳型核酸からの核酸配列の挿入により、ゲノム内の標的変異が修正される。いくつかの実施形態では、鋳型核酸からの核酸配列の挿入により、異種遺伝子又は発現カセットがゲノム内に挿入される。
【００８２】
本方法及びシステムは、方法及び／又はシステムの特定のパラメーターが本明細書に論じられるように調整される場合、循環細胞、特に造血性幹細胞（ＨＳＣ）をトランスフェクトするのに特に有効であり得る。例えば、細孔の最大断面寸法及び／又は長さを含む膜細孔サイズ、細胞の濃度、及び／又はトランスフェクション剤の少なくとも１つは、トランスフェクション率及びトランスフェクション後の細胞生存率の両方を多大に向上させるために、本明細書でより詳細に論じられるように選択され得る。いくつかの実施形態では、上記のパラメーターに加えて、膜の活性表面積及び／又は膜の細孔密度は、本明細書に論じたように選択されて、トランスフェクション率及び細胞生存率を向上させる。いくつかの実施形態では、上記のパラメーターの複数が本明細書に論じた範囲内となるように選択されて、特に造血性幹細胞のトランスフェクションに関して予想外に高いトランスフェクション率及び細胞生存率を確実にする。
【００８３】
図１は、薬剤を細胞内に送達するための本教示の実施形態による方法のステップを示すフローチャートである。図１のフローチャートを参照すると、細胞を処理するための本教示による方法のいくつかの実施形態では、細胞の直径未満の少なくとも１つの断面寸法を有する多孔質膜の細孔に少なくとも１つの細胞を通過させると共に、細胞を１つ以上の薬剤に暴露して、細胞内への薬剤の進入を媒介する変化（撹乱）を細胞内に引き起こし得る。いくつかの実施形態では、多孔質膜の各細孔は、細胞の直径未満の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは最大断面寸法を有し得る。下記でより詳細に論じるように、多孔質膜の使用により、複数の細胞を同時に処理することが可能となるため、従来の方法と比較してスループットが有意に増大し得る。
【００８４】
多孔質膜の細孔を通した細胞の通過により引き起こされる細胞変化は、細胞による薬剤の内部移行を媒介するのに好適な物理的及び／又は化学的変化のいずれかであってもよい。例えば、任意の特定の理論に束縛されるものではないが、細胞の直径未満の最大断面寸法を有する細孔を通した細胞の通過は、細孔壁により付与される圧縮力を細胞に課すことができる。そのような圧縮力は、細胞の物理的変形を引き起こすことができ、これは次いで細胞による薬剤の取り込みを媒介することができる。例えば、細胞の物理的変形は、例えば膜内に一過性細孔を生成することにより、薬剤に対する細胞の膜の透過性を変化させることができ、それにより細胞が薬剤を内部移行させる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、細孔の少なくとも１つの断面寸法（好ましくは最大断面寸法）は、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内、例えば約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内であってもよい。更に、いくつかの実施形態では、細孔の通路長さは、約５ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、例えば約７ミクロン〜約２１ミクロンの範囲内であってもよいが、他の長さを使用することもできる。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、約１ｘ１０５〜約１ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内の表面細孔密度を有することができる。いくつかの実施形態では、多孔質膜は、上記に論じたもの等の好適な高分子材料から形成され得る。
【００８６】
多孔質膜の細孔は、親水性又は疎水性の内面を有することができる。場合によっては、多孔質膜、及び特に細孔の内面は、１つ以上の化合物で被覆されてもよい。そのような表面被覆は、多様な理由により行われ得る。例えば、多孔質膜は、細孔の内面の滑らかさを向上させ、及び／又はそれらの表面の疎水性若しくは親水性の程度を向上させるために被覆され得る。例として、一実施形態では、多孔質膜は、ポリビニルピロリドンの薄いフィルム（例えば、約数ナノメートル〜数ミリメートルの範囲内の厚さを有するフィルム）で被覆されてもよい。他の好適な被覆材料としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＥＧ系化合物、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシエチルセルロース、ツイーン２０、オクタデシルシラン、Ｂｒｉｊ３５、ポリ（ｐ−キシレン）、フルオロポリマー、プルロニックＦ１２７を挙げることができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、膜の細孔は、実質的に均質であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、膜の全細孔は、実質的に均一の直径を有し得る（即ち、異なる細孔は、実質的に同一の直径を有し得る）。更に、いくつかの実施形態では、任意の所定の細孔の直径は、その全長に沿って実質的に均一であり得、即ち、細孔は、その全長に亘って実質的に同じ直径を有し得る。換言すれば、少なくともいくつかの細孔、いくつかの実施形態では全細孔は、任意の狭窄ゾーンを有さない。いくつかの実施形態では、全細孔はその全長に沿って均一の直径を有し、異なる細孔の直径は実質的に同一である。
【００８８】
上記の細胞処理の方法は、異なる細胞タイプに適用することができる。好適な細胞タイプのいくつかの例としては、中でも、非限定的に、前駆細胞、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、間葉系幹細胞、角化細胞及びヒト気管支上皮細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＤ３４＋細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。
【００８９】
更に、本教示の方法を用いて、有機及び無機化合物を含む多様な異なる生物学的及び非生物学的薬剤（例えば、分子及び／又は複合体）を細胞内に導入することができる。多くの実施形態では、細胞の膜は、薬剤に対して通常不透過性であってもよい。薬剤は、中性又は帯電していてもよい。更に、薬剤は、多様な異なる分子量を有することができる。
【００９０】
本教示を用いて細胞により内部移行され得る薬剤のいくつかの例としては、非限定的に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、プラスミド、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）、タンパク質、ペプチド、脂質、膜非透過性化合物及び色素が挙げられる。例えば、薬剤は、例えば本明細書に記載されるようなＣａｓ９−ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体であってもよい。例として、いくつかの実施形態では、本教示の方法及び装置は、例えば内在性遺伝子の発現を低減又は排除して、例えば、前記細胞及び／又はその子孫におけるタンパク質、例えば表面タンパク質の存在を低減又は排除するように、遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を細胞内に導入して、Ｔ細胞のゲノムを選択的に改変することにより、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を改変するのに使用することができる。更なる例として、いくつかの実施形態では、本教示の方法及び装置は、例えば内在性遺伝子の発現を低減又は排除して、前記細胞及び／又はその子孫におけるタンパク質、例えば表面タンパク質の存在を低減又は排除するように、遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を細胞内に導入して、ＨＳＰＣのゲノムを選択的に改変することにより、ＨＳＰＣを改変するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、１つを超える遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体は、本明細書に記載される方法及び装置を使用して、前記細胞内に同時に又は連続して導入されて、例えば、細胞のゲノム内の１つを超える遺伝子を選択的に改変し、又は単一遺伝子内の１つを超える部位を選択的に改変し得る。そのような方法に有用な遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、本明細書にて以下に更に詳細に記載される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、細胞の集団は、本教示に従ってシステムを連続して複数回通過し、各通過の間に細胞を休ませる任意のステップを有することができる。例えば、細胞は、システムを通過した後に収集され、システムに再導入されて、多孔質膜を再び通過してもよい。このプロセスは必要に応じて反復されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、細胞が暴露される薬剤及び／又は培地（担体液体）は、例えば異なる分子／複合体を細胞に導入するために、システムを通した細胞の通過において、場合により変更されてもよい。例えば、細胞のサンプルは、システムを通した第１の通過中に、分子／複合体を含む溶液に暴露されて、分子／複合体を細胞に送達してもよい。トランスフェクトされた細胞は、再びシステムを通過すると共に異なる分子／複合体を含む異なる溶液に暴露されて、第２の分子／複合体を細胞に送達することができる。このプロセスは、必要に応じた回数、反復することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、多孔質膜は、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のトランスフェクション率で、細胞の膜が通常不透過性である薬剤、例えば生物学的薬剤で複数の細胞をトランスフェクトするのに使用することができる。更に、いくつかの実施形態では、そのようなトランスフェクションは、約５０％超、又は約６０％超、又は約７０％超、又は約８０％超、又は約９０％超の細胞生存率を達成しながら行うことができる。
【００９３】
図２は、不均一細胞の収集物から細胞を選択し、選択細胞に１つ以上の薬剤を送達するための、本教示の別の実施形態による方法のステップを示すフローチャートである。図２のフローチャートを参照すると、関連した態様では、細胞の処理方法が開示され、この方法は、不均一細胞の収集物から複数の細胞を選択することを含む（ステップ１）。選択は、多様な異なる基準に基づいて達成され得る。例えば、場合によっては、特定の表面タンパク質を優先的に発現する複数の細胞が、更なる処理のために選択され得る。例えば、選択される細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、又はそれらの組み合わせのいずれかを有し得る。そのような選択は、例えば関心対象の１つ又は複数のマーカーに結合する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズ等の固体支持体を使用することにより行うことができる。場合によっては、特定の範囲内の直径を有する細胞のサブセットを、続く処理のために選択することができる。いくつかの実施形態では、選択される細胞はＨＳＰＣであってもよく、例えばＣＤ３４の単独の又は他のマーカー、例えばＣＤ９０と組み合わせた発現に基づいて選択されてもよい。いくつかの実施形態では、選択される細胞はＴ細胞であってもよく、例えばＣＤ３、ＣＤ４及び／又はＣＤ８の単独の又は他のマーカーと組み合わせた発現に基づいて選択されてもよい。
【００９４】
典型的には液体担体中に取り込まれている、選択細胞及び細胞により内部移行されるべき１つ以上の薬剤を含むサンプルは、複数の細孔を有する多孔質膜を通過してもよく、複数の細孔の各々は、細胞の最大直径未満の少なくとも１つの断面寸法（好ましくは最大断面寸法）を有し、従って細孔を通した細胞の通過は、細胞による薬剤の取り込みに十分な、細胞の変化（例えば、物理的変形）を引き起こす（ステップ２）。多孔質膜は、上記に論じた特性を有することができる。上記に論じたもの等の複数の細胞及び薬剤は、そのような方法において使用することができる。
【００９５】
図３Ａのフローチャートを参照すると、細胞のゲノムの編集方法が開示され、この方法は、液体担体、複数の標的細胞、及び細胞ゲノムの編集に好適な少なくとも１つの生物学的薬剤の混合物（例えば、溶液）を調製し（ステップ１）、多孔質膜の細孔に混合物を通過させ、細孔の各々は、細胞の最大直径未満の少なくとも１つの断面寸法を有して、細胞が生物学的薬剤を取り込むことを可能にする変化（例えば、物理的及び／又は化学的調節）を細胞内に引き起こすことを含む。細胞による生物学的薬剤の取り込みは、その細胞ゲノムの選択的編集をもたらすことができる。例えば、内部移行された生物学的薬剤は、ＤＮＡセグメントのゲノム内への選択的挿入、又はＤＮＡセグメント（例えば、１つ以上のヌクレオチド）のゲノムからの削除を媒介することができる。いくつかの実施形態では、上記の方法は、約２０％超、例えば約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超える効率でそのような挿入／削除編集を行うことを可能にし得る。換言すれば、例えば１つ又は複数の標的遺伝子座の次世代配列決定により測定して、膜を通過する全細胞のうち、少なくとも２０％、例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超えるそれらの細胞が、ゲノム編集を受けるであろう。例として、いくつかの実施形態では、本教示による遺伝子編集方法は、標的遺伝子の発現を少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％、又は２５％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は１００％、又は１１０％、又は１２０％、又は１３０％、又は１４０％、又は１５０％、又は１６０％、又は１７０％、又は１８０％、又は１９０％、又は２００％、又は２１０％、又は２２０％、又は２３０％、又は２４０％、又は２５０％調節するように使用することができる。いくつかの実施形態では、調節は、発現の低減であってもよい。別の実施形態では、調節は発現の向上であってもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集構成要素は、タンパク質−核酸複合体であってもよい。例として、そのようなタンパク質−核酸複合体は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むことができる。例えば、タンパク質−核酸複合体は、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡの複合体であってもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、中でも、例えば、亜鉛−フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、又はＣｒｅリコンビナーゼであってもよい。
【００９７】
遺伝子編集システム
本発明によれば、遺伝子編集システム又は遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素は、本明細書に記載される方法及び装置を使用して送達され得る。本明細書で使用される用語「遺伝子編集システム」は、システム、例えば前記システムにより標的とされるゲノムＤＮＡの部位の、又は部位付近の、１つ以上の核酸の変更又は改変、例えば挿入又は削除を案内及び達成する、１つ以上の分子又は分子複合体を指す。例示的な遺伝子編集システムは、当該技術分野で既知であり、以下により完全に記載される。
【００９８】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム
天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムは、配列決定された真正細菌ゲノムのおよそ４０％、及び配列決定された古細菌の９０％に見出される。Ｇｒｉｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ８：１７２。このシステムは、プラスミド及びファージ等の外来性遺伝子要素に対する耐性を付与し、後天性免疫の形態を提供する原核生物免疫系の一タイプである。Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：１７０９−１７１２；Ｍａｒｒａｇｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：１８４３−１８４５。
【００９９】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、マウス、霊長類及びヒト等の真核生物における遺伝子編集（特定の遺伝子のサイレンシング、増強又は変化）での使用のために改変されている。Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：３３１−８。これは、例えば、特異的に操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、真核生物ゲノムの配列に相補的な配列を含むｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のベクター及び１つ以上の適切なＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質を、真核生物細胞内に導入することにより達成される。ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと複合体を形成し、この複合体は次いで真核生物ゲノムの配列に相補的なｇＲＮＡの配列にハイブリダイズすることにより、標的ＤＮＡ部位に指向され、次いで、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ＤＮＡの二重鎖又は単鎖切断を誘導する。鎖切断部の、又は鎖切断部付近のヌクレオチドの挿入又は削除は、改変ゲノムを形成する。
【０１００】
これらは多くの異なるタイプの細菌に自然に生じるため、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置と、Ｃａｓ遺伝子及びそれらの産物の構造、機能及び数とは、種によって幾分異なる。Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０；Ｋｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．８：Ｒ６１；Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．６０：１７４−１８２；Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：２５５１−２５６１；Ｐｏｕｒｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：６５３−６６３；及びＳｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．２８：３３５−３４０。例えば、Ｃｓｅ（Ｃａｓサブタイプ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））タンパク質（例えば、ＣａｓＡ）は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、Ｃａｓｃａｄｅは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写産物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー反復単位に加工する。Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−９６４。他の原核生物では、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写産物を加工する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅ及びＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１又はＣａｓ２は必要としない。パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及び他の原核生物におけるＣｍｒ（Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール）タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、切断する。より単純なＣＲＩＳＰＲシステムはタンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖に対する２つの活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座ＲＮＡの組み合わせは、遺伝子編集のためのシステムにおいて使用できる。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８３３−８３６。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ分子、例えばＣａｓ９分子である。多様な種のＣａｓ９分子を、本明細書に記載される方法及び組成物に使用することができる。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は本明細書の開示の多くの対象であるが、本明細書に列挙した他の種のＣａｓ９タンパク質の、又はそれから誘導された、又はそれに基づくＣａｓ９分子も、同様に使用することができる。換言すれば、他のＣａｓ９分子、例えばストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及び／又はナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子を、本明細書に記載されるシステム、方法及び組成物に使用することができる。更なるＣａｓ９種としては：アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバシラス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ’  ｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｍｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラド（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｄ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｌｉｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリウム（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅ��ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｌｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｌｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバシラス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科バクテリウム（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスチス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、スポロラクトバシラス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．）、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｌｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）、又はベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用される用語としてのＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒのドメインの配列）と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協力して、標的配列及びＰＡＭ配列を含む部位に局在化する（例えば、標的化又は誘導される）ことができる分子を指す。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、活性Ｃａｓ９分子が標的核酸と相互作用し、この核酸を切断する能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸内の配列である。いくつかの実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で行われる。異なる細菌種由来の活性Ｃａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧを認識し、その配列の１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を指向させる。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｌ  ａｌ、ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧ及びＮＮＡＧ  ＡＡＷ（Ｗ＝Ａ又はＴ）を認識し、これらの配列の１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を指向させる。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０及びＤｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ又はＮＡＡＲ（Ｒ−Ａ又はＧ）を認識し、この配列の１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を指向させる。例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）を認識し、その配列の１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を指向させる。例えば、Ｒａｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、ＮＡＴＵＲＥ、ｖｏｌ．５２０、２０１５、ｐｐ．１８６−１９１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識し、その配列の１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を指向させる。例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ＥＡＲＬＹ  ＥＤＩＴＩＯＮ  ２０１３、１−６を参照されたい。Ｃａｓ９分子がＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ、ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２、３３７：８１６に記載されている形質転換アッセイを用いて決定することができる。
【０１０５】
天然に存在する例示的なＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３；１０：５、７２７−７３７に記載されている。そのようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、。クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、又はクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。
【０１０６】
天然に存在する例示的なＣａｓ９分子は、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分子を含む。例としては：ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、系統ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ  １０２７０、ＭＧＡＳ  １０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１及びＳＳＩ−１）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、系統ＬＭＤ−９）、ストレプトコッカス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、系統ＳＰＩＮ  ２００２６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、系統ＵＡ  １５９、ＮＮ２０２５）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、系統ＮＣＴＣ１  １５５８）、ストレプトコッカス・ギャロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｌｉｃｕｓ）（例えば、系統ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２０６９）、ストレプトコッカス・エキンス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、系統ＡＴＣＣ  ９８１２、ＭＧＣＳ  １２４）、ストレプトコッカス・ディスダラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、系統ＧＧＳ  １２４）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、系統ＡＴＣＣ  ７００３３８）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ｃｍｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば；系統Ｆ０２１  １）、ストレプトコッカス・アガラクティア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａ）＊（例えば、系統ＮＥＭ３１６、Ａ９０９）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、系統Ｆ６８５４）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、例えば、系統Ｃｌｉｐ  １１２６２）、エトウエロコッカス・イタリクス（ＥｔＵｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、系統ＤＳＭ  １５９５２）、又はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、系統１、２３、４０８）のＣａｓ９分子が挙げられる。追加の例示的なＣａｓ９分子は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３、１−６）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子又は不活性Ｃａｓ９分子は、本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列又は天然に存在するＣａｓ９分子配列、例えば、本明細書に列挙した、又はＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３、１０：５、’Ｉ２’Ｉ−Τ，１  Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３、１−６に記載されている種からのＣａｓ９分子：と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同性を有する；と比較した場合に、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、又は４０％以下のアミノ酸残基の相違を有する；とは少なくとも１、２、５、１０又は２０アミノ酸異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下異なる；又は、と同一である；アミノ酸配列を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２又はＣ２ｃ３タンパク質及びその改変物である。例えば、Ｃａｓ９と相同であり、かつＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含むＣｐｆ１の記載に関しては、その全容が参照により本明細書に組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１６３：１−１３（２０１５）を参照されたい。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、その全体が参照により組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ、表Ｓ１及びＳ３を参照されたい；また、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３（１１）：７２２−３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、６０：３８５−３９７（２０１５）を参照されたい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９９ＺＷ２）と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同性を有する；と比較した場合に、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、又は４０％以下のアミノ酸残基の相違を有する；とは少なくとも１、２、５、１０又は２０アミノ酸異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下異なる；又は、と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、それらの全容が本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月１日にＳｃｉｅｎｃｅ  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７でオンラインで入手可能なＳｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；２０１６年１月６日にｄｏｉにてオンラインで入手可能なＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、５２９、２０１６、ｐｐ．４９０−４９５：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６；又は米国特許第２０１６／０１０２３２４号明細書に記載されている変異体等のストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、触媒的に不活性であり、例えばｄＣａｓ９である。Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５６９−５７７；米国特許第：８，８７１，４４５号明細書；８，８６５，４０６号明細書；８，７９５，９６５号明細書；８，７７１，９４５号明細書；及び８，６９７，３５９号明細書、これらの全容は参照により本明細書に組み込まれる。触媒的に不活性なＣａｓ９、例えばｄＣａｓ９である分子は、転写モジュレーター、例えば転写抑制因子又は転写活性化因子と融合されてもよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９は、追加の活性を付与する１つ以上のアミノ酸配列を更に含むことができる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９分子は、例えば追加のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、又は転写活性化若しくは抑制ドメイン等の１つ以上の追加のポリペプチドドメインを含むことができる。更なる例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、５３３（７６０３）：４２０−４２０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４６に記載されている。いくつかの態様では、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超えるＮＬＳを含むことができる。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上に暴露された、正に帯電したリシン又はアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳも既知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を有する、ＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原のＮＬＳ：を含む又はこれに由来するＮＬＳ配列を含む。他の好適なＮＬＳ配列は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｏｒｏｋｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２００７）７２：１３、１４３９−１４５７；Ｌａｎｇｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：８、５１０１−５）。前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃａｓ９分子は、追加的に（又は代替的に）、例えばＮ末端又はＣ末端に、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ（６）タグ又はＨｉｓ（８）タグを含むことができる。
【０１１１】
従って、例えば、真核生物細胞内での遺伝子編集のために、操作されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、典型的には（１）標的ドメインを含むガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）（ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズ可能な）と、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９酵素に結合可能な配列とを含む、及び（２）Ｃａｓ、例えばＣａｓ９、タンパク質を含む。この第２のドメインは、ｔｒａｃｒドメインと称されるドメインを含むことができる。標的ドメイン及びＣａｓ、例えばＣａｓ９酵素に結合可能な配列は、同じ分子（時には単一ｇＲＮＡ、キメラｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡと称される）又は異なる分子（時には二重ｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡと称される）上に配置され得る。異なる分子上に配置されている場合、各々は、分子が例えばハイブリダイゼーションを介して関連することを可能にするハイブリダイゼーションドメインを含む。
【０１１２】
ｇＲＮＡ分子フォーマットは、当該技術分野で既知である。例示的なｇＲＮＡ分子、例えば本発明のｄｇＲＮＡ分子は、配列：
ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）
を有する第１の核酸を含み、例えばこの核酸からなり、
ここで、「ｎ」は、例えば本明細書に記載されるような標的ドメインの残基を指し、１５〜２５ヌクレオチドからなっていてもよく、例えば２０ヌクレオチドからなり；
及び下記の例示的な配列を有する第２の核酸配列を含み、例えばこの核酸からなり：
【化１】
2019532672.tif 000003
これは場合により３’末端に１、２、３、４、５、６、又は７（例えば、４又は７、例えば、７）個の追加のＵヌクレオチドを有する（配列番号３）。
【０１１３】
第２の核酸分子は、代替的に、上記の配列の断片からなっていてもよく、そのような断片は、第１の核酸にハイブリダイズすることが可能である。そのような第２の核酸分子の例は：
【化２】
2019532672.tif 000004
であり、これは場合により３’末端に１、２、３、４、５、６、又は７（例えば、４又は７、例えば、７）個の追加のＵヌクレオチドを有する（配列番号４）。
【０１１４】
本発明の別の例示的なｇＲＮＡ分子、例えば、ｓｇＲＮＡ分子は、下記の配列を有する第１の核酸を含み、例えばこの核酸からなり：
【化３】
2019532672.tif 000005
ここで「ｎ」は、例えば、本明細書に記載されるような標的ドメインの残基を指し、１５〜２５ヌクレオチドからなっていてもよく、例えば２０ヌクレオチドからなり、場合により３’末端に１、２、３、４、５、６、又は７（例えば、４又は７、例えば、４）個の追加のＵヌクレオチドを有する。
【０１１５】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの追加の構成要素及び／又は要素は、当該技術分野で既知であり、例えば、その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、国際公開第２０１５／０４８５７７号パンフレット及びＣｏｎｇ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３に記載されている。標的遺伝子を阻害するそのようなシステムは、例えば、標的遺伝子の配列にハイブリダイズする標的ドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを操作することにより生成することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子の１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドと完全に相補的な標的ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムのＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質により認識されるプロトスペーサー隣接モチーフモチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’に配置されている（例えば、システムがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質を含む場合、ＰＡＭ配列はＮＧＧを含み、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣのいずれかであってもよい）。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムのｇＲＮＡ分子及びＲＮＡガイドヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質は、複合体化してＲＮＰ複合体を形成することができる。そのようなＲＮＰ複合体は、本明細書に記載される方法及び装置に使用することができる。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素をコードする核酸は、本明細書に記載される方法及び装置に使用することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、外来ＤＮＡ、例えば所望の導入遺伝子をコードするＤＮＡは、標的細胞タイプにおけるプロモーター活性を有し又は有さずに、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムと共に細胞内に導入することができる。外来ＤＮＡの配列及びゲノムの標的配列に応じて、このプロセスを用いて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムにより標的化される部位又は部位の付近において、ゲノム内に外来ＤＮＡを一体化することができる。例えば、導入遺伝子に隣接する３’及び５’配列を外来ＤＮＡに含めることができ、これは遺伝子編集システムにより切断されるゲノム内の部位の３’及び５’（各々）の遺伝子配列に相同である。そのような外来ＤＮＡ分子は「鋳型ＤＮＡ」と称され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と、関心対象の遺伝子の配列にハイブリダイズする標的ドメインを含むｇＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、複合体化してＲＮＰを形成する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、ｇＲＮＡをコードする核酸と、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、ｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードする核酸とを含む。
【０１１９】
本方法及び装置で使用することができる追加のＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、例えば国際出願公開第２０１７／１１５２６８号パンフレット、及び、例えば国際出願公開第２０１７／０９３９６９号パンフレット（各々の全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを含む。
【０１２０】
ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システム
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することにより人工的に製造される。転写活性化因子様エフェクト（ｅｆｆｅｃｔ）（ＴＡＬＥ）は、任意の所望のＤＮＡ配列、例えば標的遺伝子に結合するように操作され得る。操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより、ＨＬＡ又はＴＣＲ配列を含む任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を製造することができる。これらは次いで、細胞内に導入されてもよく、ここでそれらはゲノム編集に使用され得る。Ｂｏｃｈ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５−６；及びＢｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１２；Ｍｏｓｃｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：３５０１。
【０１２１】
ＴＡＬＥは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２及び１３番目のアミノ酸を除く、反復した、高く保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２つの位置は、可変性が非常に高く、特異的ヌクレオチド認識との強い相関を示す。従って、それらは、所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。
【０１２２】
ＴＡＬＥＮを製造するために、ＴＡＬＥタンパク質を、例えば野生型又は変異型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ（Ｎ）に融合する。ＴＡＬＥＮにおける使用のために、ＦｏｋＩに対するいくつかの変異が為されている；これらは、例えば、切断特異性又は活性を改善する。Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅ８２；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−８；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：７３１−７３４；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：３０７；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７４−７９；Ｓｚｃｚｅｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：７８６−７９３；及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００：９６。
【０１２３】
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、２つのコンストラクトを必要とし、それらは適切な配向及び間隙を有する標的ゲノム内の部位のための独特のＤＮＡ結合ドメインを有する。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数と、２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数との両方は、高いレベルの活性を達成するために重要なパラメーターであると思われる。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−８。
【０１２４】
ＴＡＬＥＮ（又はＴＡＬＥＮの対）は、細胞内で使用されて、二本鎖の切断（ＤＳＢ）を生じることができる。修復機構が非相同末端結合によって切断を不適切に修復する場合、切断部位に変異を導入することができる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入することができる。代替的に、外来ＤＮＡは、ＴＡＬＥＮ、例えば導入遺伝子をコードするＤＮＡと共に、細胞内に導入することができ、外来ＤＮＡの配列及び染色体配列に応じて、このプロセスを用いて、ＴＡＬＥＮにより標的化される部位又は部位の付近に、導入遺伝子を一体化することができる。標的遺伝子に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー構成要素を使用する様々なスキームを含む、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて構築することができる。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４９−５３；Ｇｅｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ１９５０９；米国特許８，４２０，７８２号明細書；米国特許第８，４７０，９７３号明細書、これらの全容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集システム
「ＺＦＮ」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、例えば、所望の核酸配列の１つ以上の核酸を改変、例えば削除するように使用され得る人工ヌクレアーゼを指す。
【０１２６】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １８８：７７３−７８２；及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０。
【０１２７】
亜鉛フィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えばＣｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、およそ３ｂｐ配列を認識することができる。既知の特異性を有する様々な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５又は１８ｂｐ配列を認識する多フィンガーポリペプチドを生成することができる。特定の配列を認識する亜鉛フィンガー（及びそれらの組み合わせ）を生成するために、ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、並びに哺乳動物細胞を含む様々な選択及びモジュラーアセンブリー技術が入手可能である。
【０１２８】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するのに二量体化する必要がある。従って、非回文構造ＤＮＡ部位を標的とするのにＺＦＮの対が必要である。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に互いに離間して、ＤＮＡの反対側の鎖に結合する必要がある。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０５７０−５。
【０１２９】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮはＤＮＡ内に二本鎖切断を形成することができ、これは不適切に修復された場合、フレームシフト変異を形成することができ、細胞内での標的遺伝子の発現及び量の低減をもたらす。ＺＦＮはまた相同組換えと共に使用して、標的遺伝子又は遺伝子座を変異させ、又は標的配列若しくは標的配列付近に、所望の導入遺伝子をコードする核酸を導入することができる。
【０１３０】
標的遺伝子内の配列に特異的なＺＦＮは、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて構築することができる。例えば、それらの全容が参照により本明細書に組み込まれるＰｒｏｖａｓｉ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１８：８０７−８１５；Ｔｏｒｉｋａｉ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２２：１３４１−１３４９；Ｃａｔｈｏｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２００−７；及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００：９６；米国特許出願公開第２０１１／０１５８９５７号明細書；及び米国特許出願公開第２０１２／００６０２３０号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮ遺伝子編集システムは、ＺＦＮ遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素をコードする核酸も含む。
【０１３１】
上記の遺伝子編集方法は、多様な異なる標的細胞に適用することができる。例えば、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であってもよい。細胞は、中でも、前駆細胞、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、間葉系幹細胞、角化細胞又はヒト径気管支上皮細胞等の所望のタイプのものであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞はヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、この細胞が投与され得る対象に対して自家性である。別の実施形態では、細胞は、この細胞が投与され得る対象に対して同種である。
【０１３２】
図３Ｂは、遺伝子療法を行うための、本教示による遺伝子編集技術の例示的な臨床使用におけるサイクルの様々なステップの例を概略的に示す。図３Ｃは、遺伝子療法を行うための、本教示による遺伝子編集技術の例示的な臨床使用におけるサイクルの様々な手順の別の例を概略的に示す。図３Ｂ〜３Ｃに示す例では、患者（ドナー患者）（例えば、遺伝性疾患を患う患者）の細胞のサンプル（例えば、骨髄（図３Ｃに示すような）又は末梢血）を収集し、例えば抗体及び／又はサイズ選択を用いて造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋細胞を単離する。本教示による方法は、遺伝子編集複合体（例えば、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）をＨＳＣ細胞に送達して、遺伝子修正を達成するように使用される。次いで、例えば品質維持のために改変細胞を収集し、場合により冷凍保存する。次いで、収集した細胞を患者（レシピエント患者）への移植のために準備する。いくつかの実施形態では、患者は、細胞を収集した患者と同じであり、例えば、移植は自家性である。別の実施形態では、細胞は健康なドナー患者から収集され、異なるレシピエント患者、例えば遺伝性疾患を患う患者に送達され、例えば移植は同種間である。所望の細胞集団を含む細胞の集団をドナー患者から収集することにより、同様の方法をＴ細胞等の他の細胞タイプの臨床使用に使用することができる。
【０１３３】
薬剤を細胞内に送達する上記の方法は、多様な異なるシステムを使用して実施することができる。例えば、図４Ａ及び４Ｂは、細胞処理のための本教示の実施形態によるシステム１００を概略的に示し、システム１００は収集ブロック１０２（本明細書で収集プレートとも称される）を備え、収集ブロック１０２は、処理された細胞を受容するための複数のウェル１０４を含む。この実施形態では、収集プレートは２４個のウェルを含むが、別の実施形態では、収集プレート内に提供されるウェルの数は異なってもよい。
【０１３４】
システム１００は更に複数の細胞処理アセンブリー１０６を備え、細胞処理アセンブリー１０６の各々は、収集ブロック１０２内のウェル１０４の１つと流体連結している（図４Ａでは、細胞処理アセンブリー１０６は、カバー１０２ａにより隠されている；図４Ｂは、カバー１０２ａが除去された細胞処理アセンブリー１０６を示す）。下記でより詳細に論じるように、細胞処理アセンブリーの各々は、流体担体（典型的には液体担体）を受容することができ、流体担体中に上記に論じたもの等の複数の細胞及び１つ以上の薬剤が取り込まれている。細胞処理アセンブリー１０６を通した細胞の通過により、細胞の物理的及び／又は化学的特質の調節、例えば細胞の膜の透過性における変化をもたらすことができ、これは次いで細胞による薬剤の取り込みを可能にし得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、システムは、複数の注射器１０８を備えることができ、各注射器は、細胞処理アセンブリー１０６の１つと連結して、流体担体、複数の標的細胞及び１つ以上の薬剤の混合物（例えば、溶液）を含むサンプルを、対応する細胞処理アセンブリーに送達することができる。より詳細には、サンプルは注射器内に配置されてもよく、正圧インターフェースを使用して圧力をサンプルに印加して、注射器に連結した細胞処理アセンブリーを通してサンプルを押すことができる。
【０１３６】
より詳細には、この実施形態では、ガスライン１１０ａは、供給源（図示せず）からのガス（例えば、窒素）を調節器アセンブリー１１１に移動し、調節器アセンブリー１１１は、ガスライン１１０ｂを介して正圧インターフェース１１３へ印加されるガス圧を調節する。正圧インターフェース１１３は、注射器バレル上に密封を形成し、調節されたガス圧を注射器内のサンプルに提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも約５ｐｓｉ、例えば約５ｐｓｉ〜約１００ｐｓｉの範囲内の圧力が、注射器内のサンプルに印加されて、例えば約２０ｍｌ／分を超える流速で、細胞処理アセンブリーを通したサンプル通過をもたらすことができる。一般に、例えば印加されるガス圧を介してサンプルに印加される圧力は、細胞処理アセンブリーを通したサンプルの流速を変えるように調整することができる。いくつかの実施形態では、システム１００は、少なくとも約４０億細胞／分の流速で細胞を処理することが可能である。
【０１３７】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄを参照すると、細胞処理アセンブリー１０６（例えば、実例的な細胞処理アセンブリー１０６ａ）の各々は、流入ブロック１１２を含むことができ、流入ブロック１１２は、サンプルを入口ブロック１１２に送達する入口１１４を有する。入口ブロック１１２は更に流体通路１１６を含み、流体通路１１６は入口１１４から流入チャンバ１１８に延び、下記でより詳細に論じるように、流入チャンバ１１８の下方に多孔質膜１２０が配置されている。流入チャンバ１１８の容積は、例えば約５０μＬ〜約１Ｌの範囲内であってもよいが、他の容積も使用することができる。
【０１３８】
この実施形態では、フェルール１２２は、実例的な細胞処理アセンブリー１０６ａの入口１１４を、継手１２４（例えば、ポリエーテルケトン（ＰＥＥＫ）継手）及び管１２６を介して、サンプルを収容する注射器の針１２８に流体連結させる。より詳細には、入口は、雌ねじを含むことができ、これは継手の雄ねじと係合することができる。針は継手及びフェルールの中央開口部を通して延びて、注射器を入口１１４に流体連結することができる。
【０１３９】
細胞処理アセンブリー１０６ａは更に流出ブロック１３０を含み、流出ブロック１３０は、通路１３４の基端と流体連結した流出チャンバ１３２を有し、通路１３４は流出ブロック１３０の先端に出口１３６を提供する。いくつかの実施形態では、流出チャンバ１３２は、死容積を低減し、各収集ウェルへの移動を促進するように構成されている。例えば、流出チャンバ１３２は、例えば、膜１２０の内径、メッシュ１４２及び下記に論じるワッシャー１４６に基づいて選択された好適な容積を有することができる。例えば、流出チャンバ１３２の容積は、約７．９９立方ミリメートルであってもよいが、他のサイズも使用することができる。流体通路１３４は、任意の好適な長さ及び容積を有することができ、例えば約１３．５６立方ミリメートルの容積に対応する約２１．３２ｍｍの長さ及び約０．９ｍｍの穴径を有することができる。流出ブロック１３２は、複数の雄ねじ１３８（図６Ａも参照）を含み、これらは流入ブロック（図６Ｂも参照）の複数の雌ねじ１４０と係合して、２つのブロックを互いに接続することができる。
【０１４０】
上記したように、細胞処理アセンブリー１０６ａは、流入ブロックと流出ブロックとの間に配置された多孔質膜１２０を更に含んで、細胞及び細胞により内部移行されるべき１つ以上の薬剤を含むサンプルを流入ブロックを介して受容し、細胞の少なくとも一部を流入ブロックに通過させて、流出ブロックに到達させる。メッシュ１４２、例えばこの実施形態ではステンレスメッシュは、多孔質膜１２０に隣接して配置されて、多孔質膜１２０に機械的支持を提供する。特に、メッシュは、膜を通した圧力下での液体サンプルの通過に薄い膜が耐えることを助け得る。流入ブロックの凹部１４５（図６Ａ参照）により受容されるワッシャー１４４及び流出ブロックの凹部１５０（図６Ｂも参照）により受容される別のワッシャー１４６は、流入ブロックと流出ブロックとの間の多孔質膜１２０及びメッシュ１４２の固定された位置決めを助ける。
【０１４１】
図７を参照すると、この実施形態では、多孔質膜１２０は、本質的に平面状の構造及び円形の断面を有し、約１ｍｍ〜約１４２ｍｍの範囲内の直径（ＰＤ）を有するが、他の直径も使用することができる。多孔質膜１２０は、膜の上面１２０ａから下面１２０ｂに延びる複数の細孔２００を含む。換言すれば、各細孔は、膜の上面１２０と実質的に面一の入口（例えば、入口２０２）から、膜の下面１２０と実質的に面一の出口（例えば、出口２０４）に延びる。従って、この実施形態では、膜の厚さは、細孔の長さと実質的に同一であり、それは約５ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内であってもよい。この実施形態では、細孔は実質的に均一の長さを有するが、別の実施形態では、細孔の長さは不均一であってもよい。そのような実施形態では、膜の厚さは、細孔の長さと一致するように不均一であり得る。
【０１４２】
この実施形態では、細孔２００の各々は、細孔の長さに沿って実質的に均一の円形断面を有する実質的に円筒状である。一般に、各細孔の断面直径Ｄ（これはこの実施形態では、細孔の最大断面寸法に対応する）は、細孔を通した通過による変化を受けて流体担体中の１つ以上の薬剤を取り込むことが意図される細胞の直径未満であるように選択される。この実施形態では、各細孔の断面直径Ｄは、約４０ミクロン未満、又は約３０ミクロン未満、又は約２０ミクロン未満、又は約１５ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満であってもよい。例として、断面直径Ｄは、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、断面直径Ｄは、約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内であってもよい。
【０１４３】
膜の厚さ（これはこの実施形態では、細孔の長さに対応する）は、例えば、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロン、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、細孔の表面密度は、例えば約１ｘ１０５〜約２ｘ１０６細孔／ｃｍ２の範囲内であってもよい。細孔の表面密度は、細孔の数を、多孔質膜の上面又は下面の面積により除算して決定することができる。高い細孔密度は、印加された圧力下での多孔質膜の細胞の通過によるこの細胞の送達及び処理を可能にするため有利である。例えば、いくつかの実施形態では、多孔質膜を使用して、少なくとも約４０億細胞／分の速度で、細胞を薬剤でトランスフェクトすることができる。
【０１４４】
多孔質膜は、ポリマー、半導体又は金属等の多様な材料から形成され得る。多くの実施形態では、多孔質膜は、高分子材料から形成されている。好適なポリマーのいくつかの例としては、非限定的に、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエステル及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。
【０１４５】
多孔質膜１２０の細孔は、多様な異なる方法を用いて生成することができる。例として、細孔は、イオントラックエッチング、レーザー穿孔、プラズマエッチング又はフォトリソグラフィーのいずれかを用いて生成することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、膜の暴露表面の少なくとも一部、多くの実施形態では膜の暴露表面の全体は、材料で被覆されてもよい。例えば、細孔の内面を含む膜の暴露表面は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＥＧ系化合物、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシエチルセルロース、ツイーン２０、オクタデシルシラン、Ｂｒｉｊ−３５、ポリ（ｐ−キシレン）、フルオロポリマー、プルロニックＦ１２７等の高分子材料で被覆されてもよい。場合によっては細孔の内面は親水性であってもよいが、別の実施形態では、細孔の内面は疎水性であってもよい。いくつかの実施形態では、膜の表面を被覆する材料は、それらの表面の親水性又は疎水性を向上させるように選択され得る。
【０１４７】
別の実施形態では、細孔は、規則的及び不規則な形状を含む非円形断面形状を有することができる。例として、図８は、矩形の断面を有する複数の細孔３０２を有する別の多孔質膜３００の上面図を概略的に示す。この場合、矩形の対角線（ＤＤ）の寸法は、細孔の最大断面寸法に相当し、細胞が細孔の１つを通過するときに、細胞における所望の変化を達成するのに好適な閾値未満である。例えば、対角線ＤＤは、約４０ミクロン未満、又は約３０ミクロン未満、又は約２０ミクロン未満、又は約１５ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満であってもよい。以前の実施形態と同様、穴の長さは、例えば約５ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、例えば約７ミクロン〜約２１ミクロンの範囲内であってもよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、細孔の１つ以上の断面積は、細孔の全長に沿って均一でなくてもよい。例として、図９は、基部開口部４０１ａから先端部開口部４０１ｂに延びるそのような細孔４００を概略的に示す。細孔の断面積は、基部開口部から徐々に低下し、細孔の中間部で最小値に達し、次いで細孔の中間部からその先端へと増大する。別の実施形態では、細孔の断面積の他の変動も用いることができる。
【０１４９】
図５Ｂ及び図１０を参照すると、例えば、膜を通した液体サンプルの通過により、膜に印加される圧力に膜が耐えることを助けるために、支持体メッシュ１４２が膜１２０に隣接して配置されて、膜に機械的安定性を提供している。この実施形態では、メッシュ１４２はステンレス鋼から形成されているが、別の実施形態では、メッシュ１４２は他の材料から形成されていてもよい。メッシュ１４２は複数の開口部１４２ａを含み、これらは多孔質膜の細孔１２０の断面直径よりも有意に大きい断面直径を有する。例として、メッシュ開口部の直径は、約１ｍｍ〜約５ｍｍの範囲内であってもよい。多孔質膜を退出する細胞は、メッシュの穴を通過して流出ブロック１３０に到達する。
【０１５０】
上記したように、多くの実施形態では、多孔質膜は高分子材料から形成され、メッシュは好適な金属、例えばステンレス鋼から形成され得る。システムの他の構成要素、例えば流入及び流出ブロックは、任意の好適な材料、例えば高分子材料から形成され得る。
【０１５１】
図４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂを再び参照すると、使用時、各々が流体担体（例えば、緩衝溶液）、関心対象の複数の細胞及び細胞により内部移行されるべき１つ以上の薬剤を含む複数のサンプルは、注射器１０８の１つ以上を介して細胞処理アセンブリー１０６の１つ以上内に導入され得る。ピストン１１０によりサンプルに印加される圧力は、多孔質膜の細孔１２０を通したそれらの通過を促進し得る。細胞が細孔２００の１つを通過するとき、細孔の断面寸法が細胞の直径未満であるため、細孔の壁が細胞に圧縮力を印加する。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、このような圧縮力は細胞における変化を引き起こすことができ、例えば圧縮力は、細胞の膜の透過性を変化させることができる。そして、そのような細胞の変化は、次いで細胞による薬剤の取り込みを促進することができる。多くの実施形態では、本発明のシステム及び方法は、例えば細胞の膜は通常の条件下ではそれらの薬剤に対して透過性ではないため、通常細胞により内部移行できない多くの薬剤の細胞による取り込みを可能にする。
【０１５２】
多孔質膜１２０の１つを通過した後、流体担体中に取り込まれている細胞を含むサンプルは、メッシュ１４２の１つの開口部を通過して流出ブロック１３０に到達する。次いで、サンプルは、流出ブロック１３０の出口１３６の出口を通過して、収集ブロック１０２のウェル１０４の１つ内に収集され得る。
【０１５３】
図１１Ａ、１１Ｂ及び１１Ｃは、細胞処理のための本教示の別の実施形態によるシステム５００を概略的に示す。システム５００は、細胞処理アセンブリー５０２を備え、細胞処理アセンブリー５０２は、複数の細胞を同時に処理するための複数の平行チャネル５０４を含む。細胞処理アセンブリー５０２は、複数の入口５０８を有する入口支持要素（例えば、プレート）５０６を含み、複数の入口５０８を通して、各々が細胞及び細胞に送達されるべき１つ以上の薬剤を含む複数のサンプルが、アセンブリー内に導入され得る。細胞は、典型的には、細胞により内部移行されるべき１つ以上の薬剤と共に、液体担体（例えば、緩衝溶液）中に取り込まれている。この実施形態では、流入プレートは２４個の入口（図１１Ａでより明確に示す）を含むが、別の実施形態では、入口の数は、例えば特定の用途の要求に基づいて異なってもよい。
【０１５４】
図示した細胞処理アセンブリー５０２は更に出口支持要素（例えば、プレート）５１０（本明細書で出口ブロックとも称する）を含み、出口支持要素５１０は、処理サンプルを受容するための複数のウェル５１２を含む。下記でより詳細に論じるように、各サンプル受容ウェル５１２は、入口の１つと流体連通している。
【０１５５】
入口及び出口ブロックは、多様な異なる材料から形成することができる。好適な材料のいくつかの例としては、中でも、非限定的に、３１６ステンレス鋼、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）ポリマーが挙げられる。更に、入口及び出口プレートは、様々に異なる厚さ、例えば約１０〜約２０ｍｍの範囲内の厚さを有することができる。
【０１５６】
複数の多孔質膜５１４は、入口プレート５０６と出口プレート５１０との間に配置され、従って各多孔質膜は、その入口を介してアセンブリー内に導入される細胞を受容するように入口ブロックの入口に対して配置され、かつ膜を通過する細胞がウェル内に受容されるように出口ブロックの各ウェルに対して配置される。例として、多孔質膜５１４ａは、入口５０８ａを介してアセンブリー内に導入される細胞を含むサンプルを受容するように入口ブロックの入口５０８ａに対して配置され、かつ多孔質膜５１４ａは、サンプルが膜を通過した後に、サンプルがウェルに到達するようにウェル５１２ａに対して配置される。
【０１５７】
多孔質膜は、以前の実施形態に関連して上記に論じた特性を有することができる。例えば、多孔質膜の各々は、細胞（システム５００が細胞処理（例えば、細胞トランスフェクション）を提供することが意図される）の直径未満の最大断面寸法を有することができる。例として、多孔質膜５１４の細孔の最大断面寸法は、約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内、例えば、約５ミクロン〜約８ミクロンの範囲内であってもよい。以前の実施形態と同様、この実施形態では、多孔質膜の各細孔の入口は、膜の流入表面と実質的に面一であり、各細孔の出口は、膜の流出表面と実質的に面一である。更に、多孔質膜５１４は、上記に論じたもの等の多様な異なる高分子材料から形成することができる。
【０１５８】
図１１Ｂを参照すると、システム５００は更に複数のメッシュ５１６（例えば、ステンレスメッシュ）を備え、メッシュ５１６の各々は、多孔質膜５１４の１つに隣接して配置されている。以前の実施形態に関連して上記に論じたように、メッシュは、多孔質膜に機械的支持を提供することができる。メッシュは、約１ｍｍ〜約５ｍｍの範囲内の細孔を有することができ、この細孔は、膜の細孔５１４を通過する細胞の容易な通過を可能にする。更に、上記に論じたように、いくつかの実施形態では、メッシュ５１６は、例えば約０．１５ｍｍ〜約０．２５ｍｍの範囲内の厚さを有することができるが、他の厚さも使用することができる。
【０１５９】
入口シール５１８及び出口シール５２０、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）ワッシャーを使用して、入口ブロック５０６と出口ブロック５１０との間に液密シールを提供する。出口シールは、出口プレート内に設けられた対応する凹部５２２内に受容され、入口シールは、入口プレート５０６内に設けられた対応する凹部（図示せず）内に受容される（図１１Ｃ参照）。
【０１６０】
以前の実施形態と同様、この実施形態では、複数の注射器５２４が提供され、複数の注射器５２４の各々は、入口プレート５０６の入口の１つと流体連通して、細胞及び１つ以上の薬剤（細胞及び薬剤は、典型的には液体担体中に取り込まれている）を含むサンプルを細胞処理アセンブリー内に導入する。より詳細には、この実施形態では、各注射器はフェルール５２４の１つ、ねじ付継手５２６の１つ、袋ねじ（ＳＨＣＳ）５２８の１つ、管５３０の１つ、及び継手５３２の１つを介して対応する入口に連結されている。各々が注射器５２４の１つに連結されている複数のピストン５３４により、注射器内に収容されているサンプルを多孔質膜５１４上に押すことができる。別の実施形態では、加圧ガスを使用して、注射器内に収容されているサンプルを多孔質膜上に押すことができる。
【０１６１】
従って、細胞処理システム５００は多数の平行細胞処理チャネル（この実施形態では２４個のチャネル）を備え、平行細胞処理チャネルの各々は入口の１つから、多孔質膜を経由して出口の１つに延びて、複数の細胞を同時に処理する。例として、場合によっては、細胞処理システム５００の各ユニットは、少なくとも約４０億細胞／分で処理するように使用することができる。
【０１６２】
より詳細には、使用時、各々が典型的には液体担体中に取り込まれている細胞及び細胞により内部移行されるべき１つ以上の薬剤を含む複数のサンプルは、例えば、注射器のピストンに対する圧力の印加により、細胞処理アセンブリー内に同時に導入され得る。この実施形態では、細胞処理アセンブリー５０２は２４個の平行細胞処理チャネルを含むが、別の実施形態では、他の数の平行細胞処理チャネルが提供されてもよい。以前の実施形態と同様、場合によっては、注射器内に収容されているサンプルに印加される圧力は、約５ｐｓｉを超えてもよい。場合によっては、各細胞処理チャネルを通るサンプルの流速は、少なくとも約２０ｍｌ／分であってもよい。細胞処理アセンブリーを通るサンプルの総流速は、各細胞が処理チャネルを通る流速を、それらのチャネルの数で乗算することにより得ることができる。
【０１６３】
多孔質膜の各々を通した細胞の通過は、それらの細胞の少なくともいくつかにおける変化を引き起こすことができ、従って細胞は、流体担体中に存在する１つ以上の薬剤を取り込むことができる。例として、任意の特定の理論に束縛されるものではないが、上記に論じたように、膜の１つの細孔の１つを通した細胞の通過は、細孔の小さい断面寸法に起因して、細胞に圧縮力を付与することができ、これは次いで担体中に存在する薬剤の１つ以上の、細胞による取り込みを可能にする変化（例えば、細胞の膜の透過性における一過性変化）をもたらし得る。
【０１６４】
多孔質膜及び対応するメッシュを通過した後、膜を通した通過による形質転換を受けたものを含む細胞は、出口プレート内に設けられた出口を通過して、流出プレート５１０内に設けられた収集ウェルに到達する。
【０１６５】
上記のように、いくつかの実施形態では、所望の特性を有する１つ以上の細胞が、不均一細胞の収集物から選択され、次いで選択された細胞は、上記に記載した方法で処理されて、１つ以上の薬剤でトランスフェクトされる。例として、図１２Ａは、本発明の実施形態によるシステム６００を概略的に示し、システム６００は細胞選択（選別）デバイス６０２を備え、細胞選択（選別）デバイス６０２は、不均一細胞の収集物を受容することができる。デバイス６０２は、１つ以上の所望の特性に基づいて、受容した細胞を選別することができる。例えば、デバイス６０２は、表面タンパク質マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、及びそれらの組み合わせ等のマーカー）の優先的な存在、細胞サイズ、又は他の細胞特性に基づいて、細胞を選別することができる。システム６００は更に、細胞を関心対象の１つ以上の薬剤でトランスフェクトするための本教示による細胞処理デバイス６０２を備え、細胞処理デバイス６０２は細胞選別デバイス６０２に連結されて、細胞選別デバイス６０２から選択細胞を受容する。この実施形態では、細胞処理デバイス６０２は、約８ミクロンの細孔サイズを有する多孔質膜（図示せず）を含み、この多孔質膜を通して細胞が１つ以上の薬剤の存在下で通過する。上記に論じた、多孔質膜を通した細胞の通過は、細胞による薬剤の取り込みを媒介することができる。収集ユニット６０６は、処理細胞を収集することができる。拒絶された細胞（即ち、更なる処理のために選択されない細胞）は、廃棄物収集ユニット６０８により収集され、廃棄物として捨てられ得る。
【０１６６】
細胞選別デバイス６０２は、多様な異なる方法で実施することができる。例えば、図１２Ｂに概略的に示すように、デバイス６０２は、細胞チャンバ６０２ａ及び細胞チャンバに対して可動な磁石６０２ｂを含んで、磁気粒子に結合した細胞を未結合細胞から分離することができる。磁気粒子に結合した細胞に適用される磁力は、磁石６０２ａを細胞チャンバにより近く又はこのチャンバからより遠くへ移動することにより調節することができる。より詳細には、細胞を細胞チャンバ内に導入した後、磁石を細胞チャンバに接近するように移動して、磁気粒子に結合した細胞に磁力を適用することによって、この細胞の移動を制約することができ、従って他の細胞（磁気粒子に結合していない細胞）は細胞チャンバから除去され、非磁気画分中に収集され得る。次いで、磁石をチャンバの近傍から離すことにより磁気粒子結合細胞に適用されている磁力を低減又は好ましくは除去することができ、従ってそれらの細胞も細胞チャンバから除去され、別個の磁気画分に移動され得る。更に、いくつかの実施形態では、デバイス６０２は、分離プロセス中の磁力を最適に制御するように、様々な磁気配置、電磁石、活性流体制御及び細胞チャンバ設計を含むことができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、細胞を処理するためのシステムは、微小流体デバイスを備えることができ、微小流体デバイスは、細胞を含むサンプルをリザーバから受容し、それらの細胞を上記に論じた方法で処理することができる。例として、図１３Ａは、そのようなシステム１０００を概略的に示し、システム１０００は、サンプルリザーバ１００４と流体連通する微小流体デバイス１００２を有し、微小流体デバイス１００２は、液体担体中に含まれる複数の細胞及び１つ以上の薬剤を含む。ポンプ１００６は、液体担体の流れを、この担体中に含まれる細胞及び薬剤と共に微小流体デバイス１００２に送達することを促進する。微小流体送達デバイス１００２は、次いで、細胞及び薬剤を含む液体担体を複数のサンプル中に配分し、それらのサンプルを（典型的には同時に）、そこに流体連結する細胞処理アセンブリーの平行細胞処理チャネルに送達することができる。
【０１６８】
より詳細には、この実施形態では、微小流体デバイス１００２は流入チャンバ１００８を含み、流入チャンバ１００８は、リザーバ１００４からサンプルを受容することができる。複数の微小流体流入チャネル１０１０は、受容したサンプルの異なる部分を、並行して多孔質膜１０１２に運ぶことができる。多孔質膜１０１２は、複数の細孔を含むことができ、複数の細孔は、細胞の直径未満の少なくとも１つの断面寸法（好ましくは最大断面寸法）を有して、サンプル中に存在する１つ以上の薬剤の、細胞による取り込みを促進する。複数の流出チャネル１０１４は、処理された細胞を収集のための流出チャンバ１０１６に運ぶ。
【０１６９】
図１３Ｂを参照すると、いくつかの実施形態では、薬剤を細胞に送達するための本教示によるシステム２０００は、連続して配置されて複数の細胞を連続して受容する複数の多孔質膜２００２、２００４、２００６及び２００８を備える。多孔質膜は、別の実施形態に関連して論じたものと同様であり、細孔を通過する細胞が、この細胞が暴露されている１つ以上の薬剤を取り込むことを可能にするのに十分小さい断面直径を有する細孔を含む。例として、膜の細孔は、約４０ミクロン未満、例えば約２ミクロン〜約４０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約３０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約２０ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１５ミクロンの範囲内、又は約２ミクロン〜約１０ミクロンの範囲内の少なくとも１つの断面寸法、好ましくは最大断面寸法を有することができる。
【０１７０】
システムは更に複数のリザーバ２０１０、２０１２、２０１４及び２０１６（本明細書で液体交換モジュールとも称する）を備え、このリザーバの各々は、１つ以上の薬剤（例えば、液体担体中に含まれた）を収容する。各リザーバは、（例えば、複数のノズル２０１０ａ、２０１２ａ、２０１４ａ及び２０１６ａを介して）多孔質膜の１つと流体連結して、細胞を１つ以上の薬剤に暴露し、従って細胞の少なくともいくつかは、それらがその膜を通して横断するときに薬剤を取り込む。場合によっては、各リザーバは異なる薬剤を含み、従って細胞が多孔質膜を通して連続して通過するときに、この細胞は異なる薬剤に暴露され、それにより異なる薬剤を連続して取り込むであろう。
【０１７１】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を更に説明するために、例示を目的として提供され、必ずしも本発明の様々な態様を実践する最適な方法及び／又は得る可能性のある最適な結果を示すことを意図するものではない
【実施例】
【０１７２】
実施例１：ヒトＣＤ３４＋造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質の物理的送達
Ｃａｓ９タンパク質は、基礎研究のみならず、遺伝子のノックアウト、又は更には遺伝子修復のための治療用途に大きな可能性を有している。現在、関心対象の細胞内へのＣａｓ９送達の僅かな手法が存在し、それらには、Ｃａｓ９及びガイドのウイルス送達、脂質ナノ粒子を介したプラスミド及びｍＲＮＡ送達、又は電気穿孔法が挙げられる。これらの方法は、ゲノム内へのＣａｓ９／ガイドＲＮＡ配列のランダムな一体化の危険性をもたらし、これは望ましくない結果に繋がる場合がある。これらの方法論はまた、細胞内でＣａｓ９及びｇＲＮＡタンパク質の高い発現を生じ、これはＣａｓ９による細胞のタンパク質合成機構の負担をかけ、又は更にはオフターゲット及びランダム切断の危険性も上昇させ得る。理論的には、標的ゲノム配列に到達する単一のタンパク質のみを必要とする。加えて、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡは、非常に嵩高いことが証明されており、従ってヒト造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）及びＴ細胞のような縣濁細胞内への一過性送達が困難である。この例では、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ、本明細書でリボ核タンパク質複合体とも称される）としての、ｓｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質の送達が記載され、ここでカーゴはより小さく、寿命がより短く、ランダム一体化の危険性を有さない。限定された固有のエンドサイトーシス活性に起因して、ＨＳＰＣは、電気穿孔法のような物理的直接送達方法を必要とする。しかし、電気穿孔法は、細胞にとって非常に過酷であり、高い細胞傷害性及び増殖の低減をもたらす場合がある。
【０１７３】
この例では、代替的なシステム、膜濾過により援助される膜貫通内部移行（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＲＩＡＭＦ）が用いられ、これは低い細胞傷害性でＲＮＰ複合体の高い送達、及び高い編集効率を示すと共に、拡張性、及び他の細胞処理システムに組み込み可能なモジュール性を有する。
【０１７４】
方法：
装置の設定：上記に論じたもの等のシステムを使用した。ステンレス鋼デバイス（単一及び２４ウェルマニフォルド）及びステンレスディスク膜支持体を、本教示に従って特注した。他の全部品は、ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒから購入した。トラックエッチングされたポリカーボネートＰＶＰ被覆膜は、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈから購入した（品目番号ＰＣＴ８０１３１００（８μｍ、薄）、ＰＣＴＦ８０１３１００（８μｍ薄、疎水性）、ＰＣＴ１００１３１００（１０μｍ、薄）、及び様々な厚さを有する７μｍ（厚）、８μｍ（厚）、９μｍ（厚）細孔サイズを有するカスタム膜）。Ｃａｓ９タンパク質は、内部で製造し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１％ショ糖、ｐＨ７．５の１ｍＭ  ＴＣＥＰ又はｐＨ８．０の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で配合すると共に、ｓｇＲＮＡ分子を合成及びＡｘｏＬａｂｓ又はＴＲＩＬＩＮＫから購入し、Ｂ２Ｍ（Ｂ２Ｍ標的ドメイン配列：ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ（配列番号６））の配列に相補的な標的ドメインを含ませた。凍結骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＬｏｎｚａ又はＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ培地（０９６５５）、ＣＣ１００（０２６９０）は全て、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート化Ｂ２Ｍ抗体（クローン２Ｍ２）及びヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【０１７５】
ＴＲＩＡＭＦシステム設定
ケイ素ｏ−リング、次いでステンレス鋼メッシュ、次いでポリカーボネート膜（光沢のある面を上に）、次いでＴｅｆｌｏｎワッシャーを配置し、次いでキャップを取り付け、締め付けた（２４ウェルマニフォルドをねじにより、単一ホルダーをレンチにより）。次いで、３ｍｌ注射器を針に取り付けた。
【０１７６】
トランスフェクションに先立って、２ｍｌの無菌ＤＩ水、次いで１ｍｌの７０％エタノール、次いで別の２ｍｌの無菌ＤＩ水を５ｐｓｉで流すことによりマニフォルドを校正した。
【０１７７】
ヒト造血性幹細胞及び前駆細胞培養
凍結した骨髄由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＬｏｎｚａ又はＡｌｌＣｅｌｌｓから購入し、製造業者の説明書に従って解凍した。細胞をＣＣ１１０（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．７５ｕＭ  ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｎＭ  ＵＭ１７１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及びＰｅｎＳｔｒｅｐで補充したＳＦＥＭ  ＩＩ中で培養した。実験で使用する前に、細胞を３〜５日培養／増殖させた。
【０１７８】
ＴＲＩＡＭＦによるＲＮＰ送達
ヒト造血性幹細胞及び前駆細胞（０．５００万、１００万、２００万、４００万、５００万、又は１０００万細胞）を遠心沈殿させ、２０μＬのＳＦＥＭＩＩ培地に再懸濁した。２００μｇのＣａｓ９を、β−２ミクログロブリン（「Ｂ２Ｍ」）を標的とする４０μｇのｓｇＲＮＡと混合し、室温で５分間インキュベートすることにより複合体化させた。ＲＮＰ混合物を細胞と混合し、ＲＴで２分間インキュベートし、最終容積は５０μＬであった。次いで、この混合物をマニフォルドにより注射器コネクターの下部に移動した。次いで、混合物を５ｐｓｉの圧力で、注射器及び膜を通して強制的に移動した。
【０１７９】
フロースルーを約２〜５分間静止した後、膜を１ｍｌの完全培地で洗浄した。静止後、次いで細胞をＣＣ１００／ＡＨＲアンタゴニスト（（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットによる化合物１５７Ｓ又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １；４−［２−［［２−（１−ベンゾチオフェン−３−イル）−９−プロパン−２−イルプリン−６−イル］アミノ］エチル］フェノール）で補充した新鮮なＳＦＥＭ  ＩＩ培地で１００万細胞／ｍＬにて補充した。細胞を回収し、エクスビボで７２時間増殖させた後、下流分析を行った。
【０１８０】
次世代配列決定のための細胞溶解物調製
インデル形成を分析することによって、次世代配列決定により編集効率を決定した。およそ１００ｋ細胞を遠心沈殿させ、プロテイナーゼＫを有する約４０μＬ溶解緩衝液により細胞溶解物を抽出した。次いで、２μＬの細胞溶解抽出物を使用して、プライマー（フォワード：ｃｔｃｔｃａａａｃｃａｃａｇｇｇａｔｃａｃａ；リバース：ｃｔｃｃａｔｃａｃｃａａｇａｇａｇｃｃｔｔ及び白金Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により標的配列を増幅し、次世代配列決定に供した。
【０１８１】
Ｂ２Ｍノックダウンを検出するための抗体染色
ＦＩＴＣコンジュゲート化抗−Ｂ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）染色及びＦＡＣＳ分析によりＢ２Ｍノックダウンを評価することによって、機能的編集を決定した。細胞を遠心沈殿及び収集し、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸを有するＦＩＴＣコンジュゲート化Ｂ２Ｍ抗体で３０分間染色した。細胞を２回洗浄した後、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析し、非染色細胞と比較してＢ２Ｍノックダウン百分率を決定した。
【０１８２】
細胞回収率
トランスフェクションから７２時間後、５００μＬの細胞をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌに入れて生細胞を計数することにより細胞回収率を決定した。細胞回収率は、下記の等式を用いて、処理したサンプル中の生細胞の数を、同じ体積で播種した同じ細胞数の未処理細胞サンプルサイズと比較することにより決定した：
【数１】
2019532672.tif 000006
【０１８３】
結果：
ＣＤ３４＋造血性前駆細胞におけるＢ２ＭノックダウンのためのＣａｓ９／ＲＮＰの送達
５０マイクロリットルのサンプル容積を収容する単一膜ホルダーと、サンプルを２４個の膜に並行して通過させるのに使用され得る２４ウェルマニフォルドとを製作した。
【０１８４】
２４ウェルマニフォルドを使用して、Ｃａｓ９タンパク質と複合体化した単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を有するリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）の、６〜７日間増殖させた骨髄由来のヒトＣＤ３４＋造血性幹細胞内への標的化送達に関してデバイスを最適化した。最適化のために、フローサイトメトリー染色及び次世代配列決定（ＮＧＳ）によりアッセイできる標的として、β−２−ミクログロブリンをｓｇＲＮＡ  １２９（標的配列：ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ）で標的化した。次いで、フローサイトメトリーによる抗体細胞染色及び次世代配列決定を用いてＢ２Ｍノックダウンを測定し、送達から４８時間後に回収した細胞の数と、未処理サンプルとの比により、細胞回収率をＶｉ−Ｃｅｌｌにより計算した。
【０１８５】
細胞密度、印加圧力、ＲＮＰ濃度、膜厚及び膜細孔サイズ：を含む様々なパラメーターを最適化のために探索した。図１８は、本発明の実施形態による多孔質膜を通した細胞の通過のための印加圧力の関数としての、２００μｇのＣａｓ９でのＣａｓ９／ＲＮＰ複合体の、５００万細胞／５０μＬの濃度でのヒト造血性幹細胞内への送達に関する編集及び細胞回収率を示すデータを示す。室内窒素空気を使用して、様々な空気圧２．５、５、７．５、１０及び１５ＰＳＩを試験した。２．５ｐｓｉはＲＮＰの有効な送達には不十分であり、２０．５％  Ｂ２Ｍノックダウン及び７６％細胞回収であった。５ＰＳＩは４１．９％  Ｂ２Ｍノックダウン及び７７％細胞回収を示した。印加圧力を７．５、１０及び１５ＰＳＩに増大させることにより、送達効率は増大せず、送達効率は４０〜４５％に留まり、細胞回収は僅かに低下した。
【０１８６】
２００μｇのＣａｓ９（７．３６ｍｇ／ｍＬ）及び４０μｇのｓｇＲＮＡ（５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、ＲＴで５分間インキュベートすることにより互いに予め複合体化させた。次いで、ＲＮＰ複合体を、５０μＬのＳＦＥＭ  ＩＩの最終容積で、０．５００万、１００万、２００万、４００万、５００万又は１０００万細胞と混合した。次いで、ＲＮＰ／細胞混合物をＴＲＩＡＭＦシステム（８ミクロンの細孔サイズ及び７ミクロンの膜厚を有する）に負荷し、５ｐｓｉの窒素空気圧を使用して、サンプルをシステムに通して強制的に移動し、ウェルプレート内に収集した。７２時間後、細胞を次世代配列決定（ＮＧＳ）、ＦＡＣＳ分析、及びＶｉ−Ｃｅｌｌ計数のために収集して、インデル形成及び機能的Ｂ２Ｍノックダウン及び細胞回収による遺伝子編集の成功を示した。
【０１８７】
図１４において、ＮＧＳは、５５％、５０％、５０％、５４％及び５４％のインデル形成を示す。ＦＡＣＳ分析は、６３％、５６％、５２％、５７％及び５６％のＢ２Ｍノックダウンを示し、各々、５０万、１００万、２００万、４００万及び５００万細胞の３８％、４３％、５２％、６０％及び６５％の細胞回収率を示す。
【０１８８】
システムの拡張性を判定するために、単一マニフォルドシステムを使用して、５００万細胞及び１０００万細胞／５０μＬの細胞濃度を、５０μＬ中２００μｇのＣａｓ９で試験した。図１５において、５００万から１０００万細胞への細胞数のスケールアップにより、ＴＲＩＡＭＦは、各々、６８％インデル形成及び７０％  Ｂ２Ｍノックダウンと、７１％インデル形成及び７０％  Ｂ２Ｍノックダウンという同様の切断効率を達成した。これらの実験は、編集効率の大きな変化を有さずに、ＴＲＩＡＭＦシステムが５００万から１０００万細胞までの様々な細胞数及び密度で、ＲＮＰを送達するのに有効であることを示す。細胞はシステムを容易に通過することができ、目詰まりの兆候はなかった。
【０１８９】
ＴＲＩＡＭＦシステム（８ミクロンの細孔サイズ及び７ミクロンの膜厚を有する）を使用して、各々、５０μｇ又は２００μｇのＣａｓ９、及び１０μｇ又は４０μｇのｓｇＲＮＡにて、異なるＲＮＰ濃度を試験した。図１６は、５０μｇのＣａｓ９では、ＴＲＩＡＭＦは５７％  Ｂ２Ｍノックダウン、５５％インデル形成、及び５４％細胞回収を達成した一方、２００μｇのＣａｓ９では、７０％  Ｂ２Ｍノックダウン、６５％インデル形成、及び６２％細胞回収を達成したことを示す。この実験は、膜変形によって細孔が形成された後に、細胞内にＲＮＰが入るためにＲＮＰの受動拡散を必要とするため、溶液中のＲＮＰ濃度が有効な送達に重要であり得ることを示す。このことは、ＴＲＩＡＭＦを介した最も有効な送達には、Ｃａｓ９濃度の閾値が存在し、編集のレベルは高い及び低い濃度のＲＮＰの両方で得られるが、より高い濃度のＲＮＰは、より有効な編集をもたらすことを示す。
【０１９０】
使用した膜の多くは、下記の表１に示すように、様々な細孔サイズ及び膜厚を有した：
【０１９１】
【表１】
2019532672.tif 000007
【０１９２】
異なる膜パラメーター（厚さ及び細孔サイズを含む）を探索した。様々な膜を使用して、ＴＲＩＡＭＦはＨＳＰＣの最適編集を達成し、７（ミクロンの細孔サイズ）／１９（ミクロンの厚さ）、８／７、８／１８、８／７（疎水性）、９／１６及び１０／１０膜で各々、５５％インデル、５８％  Ｂ２Ｍノックダウン、及び３２％細胞回収；５６％インデル、６１％  Ｂ２Ｍノックダウン、及び６２％細胞回収；６７％インデル、５７％  Ｂ２Ｍノックダウン、及び４１％細胞回収；６２％インデル、５４％  Ｂ２Ｍノックダウン、及び６６％細胞回収；５６％インデル、５３％  Ｂ２Ｍノックダウン、及び５９％細胞回収；２６％インデル、１９％  Ｂ２Ｍノックダウン、及び８９％細胞回収であった。図１７は、５００万細胞を有する５０μＬの送達体積及び２００μｇのＣａｓ９／５０μｇ  ｓｇＲＮＡのＲＮＰ濃度に関する、ＮＧＳによるインデル％、ＦＡＣＳ分析によるＢ２Ｍ  ＫＤ、及びＶｉ−Ｃｅｌｌによる細胞回収率による膜のＴＲＩＡＭＦ送達効率を示す。これらの実験において、疎水性及び親水性膜の間の有意な相違は観察されなかった。これらのデータはまた、特定の細孔サイズの場合、膜が厚くなると細胞回収率が低下することを示す。７、８又は９ミクロンの膜細孔サイズが最適な効率を提供し、細胞は１０ミクロンサイズの膜を通して直接流れた可能性がある。この実験は、８ミクロンの細孔サイズと７ミクロンの膜厚で、ＨＳＰＣへのＲＮＰの最適な送達を示し、編集及び細胞回収の最適なバランスをもたらした。
【０１９３】
従って、上記の実験において、最適なパラメーターは、５０μＬ中の５００万細胞及び２００μｇのＣａｓ９、並びに７ミクロンの膜厚及び８ミクロンの細孔サイズを通した５ＰＳＩの印加圧力での通過を含む。
【０１９４】
図１９Ａは、ＴＲＩＡＭＦ又はネオン電気穿孔法による偽処理から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のフローサイトメトリーによるＨＳＣ表面マーカーを示す。フローサイトメトリー染色によるＣＤ３４及びＣＤ９０百分率の比較も示す。図１９Ｂは、ＴＲＩＡＭＦ又はネオン電気穿孔法の偽処理から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ細胞数を示す。フローサイトメトリー染色を有するＶｉ−Ｃｅｌｌによる合計、ＣＤ３４＋、及びＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞数の比較も示す。図１９Ｃは、ＴＲＩＡＭＦ又はネオン電気穿孔法による偽処理から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ倍数増殖を示す。データは、電気穿孔法は細胞の増殖能力に有意に影響するが、ＴＲＩＡＭＦ処理は、細胞の正常な増殖を可能にすることを示す。
【０１９５】
これらのデータは、有効な遺伝子編集をもたらす、ＴＲＩＡＭＦシステムを使用したヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ内へのＣａｓ９  ＲＮＰ複合体送達の成功を示す。また、これは更に、例えば鎌状赤血球貧血、地中海貧血症及びその他を含む様々な遺伝性疾患の遺伝子編集療法に適用することができる。
【０１９６】
実施例２：Ｃａｓ９／ＲＮＰの送達を介したＨＢＧノックダウンによるＨｂＦ上方調節
鎌状赤血球疾患は、世界中で３００，０００を超えて生誕する、サハラ以南のアフリカでは７０％を超える、衰弱させる多臓器全身性疾患である。鎌状赤血球疾患は、第１の分子疾病として特徴付けられ、患者はアデニンからチミンへの単一ヌクレオチド変異を有し、これはグルタミン酸からバリンへのアミノ酸の変化をもたらす。変異における変化は、低酸素条件下で鎌状成人βヘモグロビン（ＨＢＢ）の重合をもたらし、赤血球（ＲＢＣ）の鎌状変形が生じる。鎌状ＲＢＣは変形された性質を有し、即ち血管中を移動する能力が低下されており、卒中、腎症、急性胸部症候群、感染症、疼痛発作及び貧血がもたらされる。現在の標準的なケアは、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｕｒｅａ）の投与であるが、現在、１４〜４０％の患者は処置に応答せず、又は一生の処置を必要とする。ヒドロキシ尿素は、免疫系の抑制を含む重篤な副作用を有する可能性がある。ヒドロキシ尿素の免疫抑制効果により、この処置は、限られた健康管理及び衛生を有する国々では、感染症からの高い割合の死の原因となり得る。現在、鎌状赤血球疾患の唯一の治療法は、同種間骨髄移植（ＢＭＴ）によるものである。ＢＭＴは、資源及び一致するドナー（約２０％のみが適合する）のスクリーニング能力に起因して、発展途上国では制限されている。
【０１９７】
結果：
実施例１に関連して上記に論じたものと同様の方法及びシステム設定を使用した。特に、５０マイクロリットルのサンプル容積を収容する単一膜ホルダーと、サンプルを２４個の膜に並行して通過させるのに使用され得る２４ウェルマニフォルドとを製作した。
【０１９８】
２４ウェルマニフォルドを使用して、Ｃａｓ９タンパク質と複合体化した単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を有するリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）の、６〜７日間増殖させた骨髄由来のヒトＣＤ３４＋造血性幹細胞内への標的化送達に関してデバイスを最適化した。最適化のために、フローサイトメトリー染色及び次世代配列決定（ＮＧＳ）によりアッセイできる標的として、β−２−ミクログロブリンをｓｇＲＮＡ  １２９（標的化配列：ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ）で標的化した。次いで、フローサイトメトリーによる抗体細胞染色及び次世代配列決定を用いてＢ２Ｍノックダウンを測定し、送達から４８時間後に回収した細胞の数と、未処理サンプルとの比により、細胞回収率をＶｉ−Ｃｅｌｌにより計算した。
【０１９９】
本教示（簡略化のために本明細書でＴＲＩＡＭＦとも称する）を、ＨＢＧ遺伝子座を標的とするガイドからなるＲＮＰの送達に関して適用して、多くの患者に見られる遺伝性高胎児ヘモグロビン症の形態の遺伝子型を再現した。以前報告されたグロビン遺伝子座配列を標的とするＲＮＡ（Ｔｒａｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２２（９８７−９９０）；２０１６；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４１７０、これは参照により本明細書に組み込まれる）を、本発明の最適化プロトコル及び装置と共に使用して、エクスビボで３日間増殖させたＨＳＣを、ＨＢＧを標的とするｇＲＮＡを有するＲＮＰでトランスフェクトし、次いでアリコートを２−ステップ方法を使用して赤血球に直接分化させ、この２−ステップ方法は、最初に赤血球前駆細胞を１０日間誘導及び増殖させ、次いで赤血球前駆細胞を１１日間、赤血球に成熟させることを含んでいた。２日後に細胞の残りをＮＧＳ及びｑＰＣＲ用に収集して、インデル頻度及びパターンを決定した。次世代配列決定（ＮＧＳ）及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の組み合わせにより、標的部位における編集効率は、総平均６３％の総編集と決定された。
【０２００】
図２０は、ＷＴ、偽処理、ＨＢＧ編集、及びＵＮＣ０６３８（Ｂｌｏｏｄ．２０１５、Ｊｕｌｙ  ３０：１２６（５）：６６５−７２）ポジティブコントロール処理細胞の赤血球分化プロトコルのＤ７及びＤ１４におけるＨｂＦ細胞の百分率を示す。細胞を、固定化とＣＤ２３５ａ、ＣＤ７１及びＨｂＦ染色により分析した。細胞を７及び１４日目に収集し、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ７１、及び胎児ヘモグロビンで染色し、フローサイトメトリーで分析した。図２０に示すように、未処理細胞、偽処理細胞（即ち、Ｃａｓ９／ＲＮＰ等の薬剤に暴露されずに、膜を通過した細胞）、編集細胞、及びＵＮＣ０６３８を有するポジティブコントロールにおけるＨｂＦレベルを比較すると、各々２１％、２３％、６０％及び９２％の細胞がＨｂＦを発現した。
【０２０１】
図２１Ａは、ＷＴ細胞、偽ＴＲＩＡＭＦ処理細胞、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集細胞の回収から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のフローサイトメトリーによるＨＳＣ表面マーカーを示す。フローサイトメトリー染色によるＣＤ３４及びＣＤ９０百分率の比較も示す。図２１Ｂは、ＷＴ細胞、偽ＴＲＩＡＭＦ処理細胞、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集細胞の回収から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ細胞数を示す。フローサイトメトリー染色を有するＶｉ−Ｃｅｌｌによる合計、ＣＤ３４＋、及びＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞数の比較も示す。図２１Ｃは、ＷＴ細胞、偽ＴＲＩＡＭＦ処理細胞、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集細胞の回収から２日後の、５０ｋ／ｍＬ播種細胞の７日間増殖後のＨＳＣ倍数増殖を示す。
【０２０２】
トランスフェクトされた細胞を２日間休ませた後、細胞を計数し、５０ｋ細胞を７日間増殖させて、本教示によるトランスフェクション後の細胞の増殖能を決定した。７日後、ＣＤ３４＋及びＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋集団は、各々７０％及び２０％で同様のまま留まるように思われた。図２１Ａ〜２１Ｃに示すように、播種からの細胞数及び倍数増殖の観察は、本教示のトランスフェクション方法で処理したＨＳＣが未処理細胞と同等であることを示し、有意な変化を有さなかった。しかし、ＨＢＧ標的化ＲＮＰで処理した細胞に関しては、おそらく二重鎖切断によるＤＮＡ損傷により生じた毒性に起因して、細胞増殖に有意な低下が存在した。
【０２０３】
図２２は、異なる系譜に関与するＴＲＩＡＭＦ処理ＨＳＣの能力を決定するためのコロニー形成アッセイの結果を示す。メソカルト上で１４日間増殖後の、異なる造血性（ｈｅｍａｔａｐｏｅｉｔｉｃ）系譜のコロニー数を示す（プレートをＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎで撮像及び分析した）。またＴＲＩＡＭＦシステムが細胞の多分化能及び分化する能力を変化させないことを確認するために、トランスフェクションから２日後にＨＳＣに関してコロニー形成アッセイを行った。未処理、ＴＲＩＡＭＦによる偽処理、ＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集ＨＳＣは、各々、合計で７７、７３及び４６平均総コロニーを生じた（図２２に示すように）。これらのコロニーはまた、同様のパターンの赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球及びマクロファージ（ＧＭ）、マクロファージ（Ｍ）、並びに顆粒球、赤血球、単球及び巨核球（ＧＥＭＭ）多細胞コロニーを生じた。ＴＲＩＡＭＦにより送達された、ＨＢＧを標的とするｓｇＲＮＡを有するＲＮＰを有した細胞は、コロニー形成の大きな低下を示し、これはＣａｓ９媒介二重鎖切断によるＤＮＡ損傷の毒性の結果である可能性がある。
【０２０４】
図２３は、ＴＲＩＡＭＦ編集ＨＳＰＣがＮＳＧマウスにおいて長期間再構成を呈することを示すデータを提示する。７００ｋ  ＴＲＩＡＭＦ処理細胞を各マウスに静脈内注射した（ＷＴ：Ｎ＝４、偽：Ｎ＝５、ＨＢＧ：Ｎ＝６）。末梢血を４週間毎に収集し、抗ヒト及び抗マウスＣＤ４５並びにヒトＣＤ４５に関して染色した。改変ＨＳＣが機能的であることを完全に証明するために、野生型（ＷＴ）、偽ＴＲＩＡＭＦ、及びＴＲＩＡＭＦにより編集したＨＢＧ細胞を、亜致死的に照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウスに移植した。マウスに移植された全細胞は、１６週目に末梢血中でヒト生着を示し、ＷＴ、偽ＴＲＩＡＭＦ、及びＴＲＩＡＭＦによるＨＢＧ編集において、各々平均１．２％、２．５％及び２．１％ｈＣＤ４５＋であった（図２３に示す）。
【０２０５】
ＨＳＣに対するＴＲＩＡＭＦの効果を探索するために、電気穿孔法を用いた偽トランスフェクション（即ち、Ｃａｓ９／ＲＮＰ等の任意のカーゴの非存在下）とＴＲＩＡＭＦシステムを比較した。Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒにより市販されているネオン電気穿孔法システム及び上記に記載のＴＲＩＡＭＦシステムを使用して、いずれの薬剤も有さないシステムに細胞を供し、７日間増殖する細胞の能力を、２つのシステムに関して比較した。両方のシステムで処理された細胞は、６５％  ＣＤ３４陽性細胞及び約１７％  ＣＤ３４／ＣＤ９０二重陽性細胞の同様の集団パターンを示したが、ＴＲＩＡＭＦ処理細胞の細胞増殖数及び倍数増殖は、合計３３万、２０万ＣＤ３４＋、及び０．０６  ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞にて同様のまま留まった。ネオン偽処理細胞は、合計２４万、１６万ＣＤ３４＋、及び０．０４  ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞に低下した。７日後、ＷＴ細胞及びＴＲＩＡＭＦ偽処理細胞の倍数増殖は６．５倍であったが、偽電気穿孔細胞の倍数増殖は５倍のみであった（図１９Ａ〜１９Ｃに示す）。
【０２０６】
方法：
材料：ステンレス鋼デバイス（単一及び２４ウェルマニフォルド）及びステンレス鋼ディスク膜支持体を本教示に従って特注した。他の全部品は、ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒから購入した。トラックエッチングされたポリカーボネートＰＶＰ被覆膜をＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈから購入した（品目番号ＰＣＴ８０１３１００（８μｍ、薄）。Ｃａｓ９タンパク質を内部で製造し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１％ショ糖、ｐＨ７．５の１ｍＭ  ＴＣＥＰ又はｐＨ８．０の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で配合すると共に、ｓｇＲＮＡ分子を合成及びＡｘｏＬａｂｓから購入し、ＨＢＧ（ＣＵＵＧＵＣＡＡＧＧＣＵＡＵＵＧＧＵＣＡ）の配列に相補的な標的ドメインを含ませた。凍結骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＬｏｎｚａ又はＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ培地（０９６５５）、ＣＣ１００（０２６９０）は全て、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート化Ｂ２Ｍ抗体（クローン２Ｍ２）及びヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【０２０７】
ＴＲＩＡＭＦシステム設定
ケイ素ｏ−リング、次いでステンレス鋼メッシュ、次いでポリカーボネート膜（光沢のある面を上に）、次いでＴｅｆｌｏｎワッシャーを配置し、次いでキャップを取り付け、締め付けた（２４ウェルマニフォルドをねじにより、単一ホルダーをレンチにより）。次いで、３ｍｌ注射器を針に取り付けた。
【０２０８】
トランスフェクションに先立って、２ｍｌの無菌ＤＩ水、次いで１ｍｌの７０％エタノール、次いで別の２ｍｌの無菌ＤＩ水を５ｐｓｉで流すことによりマニフォルドを校正した。
【０２０９】
ヒト造血性幹細胞及び前駆細胞培養
凍結した骨髄由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＬｏｎｚａ又はＡｌｌＣｅｌｌｓから購入し、製造業者の説明書に従って解凍した。細胞をＣＣ１１０（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．７５ｕＭ  ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｎＭ  ＵＭ１７１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及びＰｅｎＳｔｒｅｐで補充したＳＦＥＭ  ＩＩ中で培養した。実験で使用する前に、細胞を３〜５日培養／増殖させた。
【０２１０】
ＴＲＩＡＭＦによるＲＮＰ送達
ヒト造血性幹細胞及び前駆細胞（５００万細胞）を遠心沈殿させ、２０μＬのＳＦＥＭＩＩ培地に再懸濁した。２００μｇのＣａｓ９を、ＨＢＧを標的とする４０μｇのｓｇＲＮＡと混合し、室温で５分間インキュベートすることにより複合体化させた。ＲＮＰ混合物を細胞と混合し、室温（ＲＴ）で２分間インキュベートし、最終容積は５０μＬであった。次いで、この混合物をマニフォルドにより注射器コネクターの下部に移動した。次いで、混合物を５ｐｓｉの圧力で、注射器及び膜を通して強制的に移動した。
【０２１１】
フロースルーを約２〜５分間静止した後、膜を１ｍｌの完全培地で洗浄した。静止後、次いで細胞を新鮮な培地で補充した。細胞を回収し、エクスビボで７２時間増殖させた後、下流分析を行った。
【０２１２】
次世代配列決定のための細胞溶解物調製
インデル形成を分析することによって、次世代配列決定により編集効率を決定した。およそ１００ｋ細胞を遠心沈殿させ、プロテイナーゼＫを有する約４０μＬ溶解緩衝液により細胞溶解物を抽出した。次いで、２μＬの細胞溶解抽出物を使用して、プライマー（ＨＢＧ１フォワード：ｃｇｃｔｇａａａｃｔｇｔｇｇｃｔｔｔａｔａｇａａａｔｔ；ＨＢＧ１リバース：ｇｇｃｇｔｃｔｇｇａｃｔａｇｇａｇｃｔｔａｔｔｇ；ＨＢＧ２フォワード：ｇｃａｃｔｇａａａｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔａｔａｇｇａｔ；ＨＢＧ２リバース：ｇｇｃｇｔｃｔｇｇａｃｔａｇｇａｇｃｔｔａｔｔｇ及び白金Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により標的配列を増幅し、次世代配列決定に供した。
【０２１３】
大きいＨｂＦ削除のｑＰＣＲ検出
大きい削除を検出するために、プライマー及びプローブセットを設計して、ＨＢＧ１プロモーター特異的配列の増幅を検出した。ＨＢＧ  Ｆｗｄ：ＡＣＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＧＣ、ＨＢＧ  Ｒｅｖ：ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧ、及びＴａｑＭａｎプローブ（ＦＡＭ）：ＡＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＧ。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＴａｑＭａｎ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＣＤ３４＋細胞からのゲノムＤＮＡサンプルに関してＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲを行った。ＨｂＧの平均ＣＴ値からＲＰＰＨ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の平均ＣＴを減算することにより、各ｇＤＮＡサンプルのコピー数参照に関する平均ΔＣＴ値を計算し、編集サンプルのΔＣＴ値から平均偽ΔＣＴを減算することにより、ΔΔＣｔ値を計算した。（２＾−ΔΔＣＴ）をとることにより倍数を計算した。
【０２１４】
細胞回収率
トランスフェクションから７２時間後、５００μＬの細胞をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌに入れて生細胞を計数することにより細胞回収率を決定した。細胞回収率は、下記の等式を用いて、処理サンプル中の生細胞の数を、同じ体積で播種した同じ細胞数の未処理細胞サンプルサイズと比較することにより決定した：
【数２】
2019532672.tif 000008
【０２１５】
赤血球分化及びＨｂＦ検出
赤血球分化をＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの二相法に従って行った。手短には、ＴＲＩＡＭＦによるＲＮＰ送達の直後、赤血球増殖サプリメント（０２６９２）及びＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐで補充したＳＦＥＭ  ＩＩ中で１０ｋ細胞／ｍＬを１０日間培養した。１０日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで３％ヒトＡＢ血清、３Ｕ／ｍＬの組換えヒトＥＰＯ、及びＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐで補充したＳＦＥＭ  ＩＩ中で培養した。０．５μｍの化合物ＵＮＣ０６３８をポジティブコントロールとして使用して、高いレベルのＨｂＦを誘導した。細胞を更に１１日間培養した。４日及び１１日後、細胞を収集し、固定化し、透過処理し、ＡＰＣコンジュゲート化抗−ＣＤ７１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗−ＧｌｙＡ（ＣＤ２３５ａ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＰＥコンジュゲート化抗−ＨｂＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＨＢＦ−１クローン）で染色した。
【０２１６】
ＣＦＵアッセイ
コロニー形成アッセイをＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｏｐｔｉｍｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の説明書に従って行った。手短には、ＴＲＩＡＭＦによるＲＮＰ送達の２日後、細胞を計数し、希釈し、３００細胞／６ウェルウェルで蒔いた。１４日後、コロニーを計数し、ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎシステム（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して自動的に点数化した。
【０２１７】
インビボ生着
細胞を解凍から２日後に回収し、次いでＨＢＧガイドを含むＲＮＰをＴＲＩＡＭＦにより送達した。回収から１日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、計数した。３つのグループを調製した：野生型、偽、及び編集。尾ＩＶ注射により、各グループからの７００ｋ細胞を各々６〜８週齢のＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に注入した。１６、２０及び２４週目に、末梢血サンプルを尾切断（ｔａｉｌ  ｓｎｉｐ）により収集し、又は後眼窩血液を採取し、ＲＢＣをＡＣＫ緩衝液で溶解し、次いで抗ヒト及びマウスＣＤ４５抗体で染色してヒト細胞生着及び寄与を定量化した。
【０２１８】
移植から２４週間後、マウスを安楽死させ、マウス骨（２ｘ大腿骨、２ｘ脛骨、２ｘ腸骨稜、及び脊椎）を収集し、乳鉢及び乳棒を使用して粉砕した。次いで、ＲＢＣをＡＣＫ緩衝液で溶解した。細胞の画分を、系譜マーカーに関するヒトＣＤ４５、マウスＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３３及びＣＤ７１に関して染色した。他の細胞画分を、造血性幹細胞マーカーに関するヒトＣＤ４５、マウスＣＤ４５、ＣＤ３４及びＣＤ９０に関して染色した。また細胞をＦＡＣＳ選別してヒトＣＤ３４細胞を単離し、これを編集及びインデル分析に関するＮＧＳと、ＨｂＦ上方調節を検出するための赤血球分化のために収集した。
【０２１９】
実施例３：ヒトＣＤ３４＋造血性幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）への核酸及びペプチドの物理的送達
限定されたエンドサイトーシス活性に起因して、ＨＳＰＣは、電気穿孔法のような物理的直接送達方法を必要とする。しかし、電気穿孔法は、細胞にとって非常に過酷であり、高い細胞傷害性及び増殖の低減をもたらす場合がある。
【０２２０】
本教示の方法及びシステム（本明細書では、膜濾過により援助される膜貫通内部移行（ＴＲＩＡＭＦ）とも称する））は、細胞内への異なるヌクレオチド及びペプチドの効果的な送達に使用できると共に、拡張性、及び他の細胞処理システムに組み込むモジュール性を可能にする。それにより、治療的用途のためのＨＳＣ内への核酸又はペプチドの導入が可能となる。
【０２２１】
方法：
図４Ｂ、５Ａに示したような装置を使用した。ケイ素ｏ−リング、次いでステンレス鋼メッシュ、次いでポリカーボネート膜（光沢のある面を上に）、次いでＴｅｆｌｏｎワッシャーを配置し、次いでキャップを取り付け、締め付けた（２４ウェルマニフォルドをねじにより、単一ホルダーをレンチにより）。次いで、３ｍｌ注射器を針に取り付けた。
【０２２２】
トランスフェクションに先立って、２ｍｌの無菌ＤＩ水、次いで１ｍｌの７０％エタノール、次いで別の２ｍｌの無菌ＤＩ水を５ｐｓｉで流すことによりマニフォルドを校正した。
【０２２３】
ヒト造血性幹細胞及び前駆細胞（４００万細胞）を遠心沈殿させ、２０μＬのＳＦＥＭＩＩ培地に再懸濁した。ｍＲＮＡ（６０ｕｇ）、小環状ＤＮＡ（５、１０、２０μｇ）、又はＣＹ５（３０ｕｇ）有するペプチドタグを細胞と混合し、ＲＴで２分間インキュベートし、最終容積は５０μＬであった。次いで、この混合物をマニフォルドにより注射器コネクターの下部に移動した。次いで、混合物を５ｐｓｉの圧力で、注射器及び膜を通して強制的に移動した。
【０２２４】
フロースルーを約２〜５分間静止した後、膜を１ｍｌの完全培地で洗浄した。静止後、次いで細胞を新鮮なＨＳＣ培地で１００万細胞／ｍＬにて補充した。細胞を回収し、エクスビボで増殖させた後、下流分析を行った。フローサイトメトリーを用いてＧＦＰ又はＣＹ５を検出して、様々な時点での送達効率を分析した。
【０２２５】
５００μＬの細胞を、トランスフェクションから２４又は４８時間後にＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌに入れて生細胞を計数することにより細胞回収率を決定した。細胞回収率は、この等式を用いて、処理サンプル中の生細胞の数を、同じ体積で播種した同じ細胞数の未処理細胞サンプルサイズと比較することにより決定した：細胞回収率％＝（（＃サンプルの生細胞））／（平均（＃未処理細胞からの生細胞））。
【０２２６】
材料：
単一及び２４ウェルマニフォルド並びにステンレス鋼ディスク膜支持体を特注した。他の全部品は、ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒから購入した。トラックエッチングされたポリカーボネートＰＶＰ被覆膜は、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈから購入した（品目番号ＰＣＴ８０１３１００（８ｕｍ、薄））。凍結骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをＬｏｎｚａ又はＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。ｍＲＮＡ及びＣｙ−５ペプチド（ＭＷ：２６３７）は、内部で製造した一方、ＧＦＰをコードする小環状ＤＮＡ（ＭＮ６０１ＭＣ）は、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【０２２７】
結果：ｍＲＮＡ送達
図２４は、本発明の実施形態による、６０μｇのｍＲＮＡの送達後の異なる時点でのＨＳＣにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析の結果を、２４時間後の細胞回収の百分率と共に示す。ＴＲＩＡＭＦを使用した、ＧＦＰをコードしたｍＲＮＡのＨＳＣ内への送達を示した。同じ８μｍ細孔サイズの膜を使用して、６０μｇのｍＲＮＡを４００万細胞に送達した。トランスフェクションから６時間後、細胞に関してＦＡＣＳを行った（図２４）。トランスフェクションから２４時間後に、ｍＲＮＡ  １で４１％効率、及びｍＲＮＡ  ２で２５％効率が観察され、約１０〜１５％の細胞回収率を有したが、偽処理細胞は６０％細胞回収率を有した。偽処理細胞の細胞回収率は６０％であったが、ｍＲＮＡ処理細胞に関する細胞回収率は有意により低く、これはおそらくＨＳＣの外来核酸応答に起因する。
【０２２８】
小環状送達
図２５は、本発明の実施形態による、５、１０及び２０μｇのＤＮＡでの小環状ＤＮＡの送達後の異なる時点でのＨＳＣにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析の結果を、２４時間後の細胞回収の百分率と共に示す。ＴＲＩＡＭＦを使用した、ＧＦＰをコードした小環状ＤＮＡのＨＳＣ内への送達を示した。８μｍ細孔サイズの膜を使用して、５、１０、又は２０ｕμｇのプラスミドＤＮＡを４００万細胞内に送達した。４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した（図２５）。５、１０及び２０μｇの場合、ＧＦＰ発現は、各々、５．７％、８．４％及び１％であり、細胞回収百分率は各々７５％、５７％及び１２％であった。偽処理細胞の細胞回収率は６０％であったが、小環状処理細胞に関する細胞回収率は有意により低く、これはおそらくＨＳＣの外来核酸応答に起因する。
【０２２９】
ペプチド送達
図２６は、３０μｇのＣＹ５−タグペプチドの送達後の異なる時点でのＨＳＣにおけるＣｙ５シグナルのフローサイトメトリー分析の結果を、２４時間後の細胞回収の百分率と共に示す。ＴＲＩＡＭＦシステム及び８ミクロンの細孔サイズの膜を使用して、３０μｇのＣｙ−５タグペプチドを４００万のＨＳＣに送達した。１０分後及び数回の洗浄後（図２６）、７８％の細胞がペプチドを内部移行させたことを観察したが、２４時間後、おそらくペプチドが消化されるにつれて、一定した低下が観察された。２４時間で、細胞の細胞回収率％は６８％であった。これは６０％であった偽と同等である。
【０２３０】
当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく上記の実施形態に様々な変更を為し得ることを理解するであろう。本明細書に引用した全ての刊行物は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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