(57)【要約】目的の細胞または組織にタンパク質を送達させる（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）標的配列を含む治療用融合タンパク質を産生するための組成物および方法が開示されている。
2019503341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の疾患または障害を治療するために、被験体の目的（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の組織または細胞に、治療用タンパク質を標的化送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するための方法であって、
ａ）融合ペプチド配列に作動可能に連結された前記治療用タンパク質をコードする、プラスチドを発現する核酸を含む、有効量の植物細胞またはその残渣（ｒｅｍｎａｎｔｓ）を投与する。ここで、前記核酸の発現は、前記プラスチド中で治療用融合タンパク質の産生を引き起こす；そして、
ｂ）インビボで、非標的細胞を実質的に排除して（ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）、前記治療用融合タンパク質の前記目的の組織または細胞への選択的浸透によって引き起こされる、前記疾患または障害に関連する症状を改善または緩和すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記植物が、レタス、タバコ、ホウレンソウ、ケール、キャベツ、ナス、ニンジンおよびトマトからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＰＴＤペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、ＤＣペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、抗微生物ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、ＰＧ１ペプチドまたはＲＣ１０１ペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＣＴＢペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療用融合タンパク質が、内分泌障害の治療用であり、そして、インスリン、ソマトトロピン、およびインスリン様増殖因子からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療用融合タンパク質が、止血の維持または血栓症の予防のためのものであり、そして、前記タンパク質が、血液凝固因子、抗トロンビン、プロテインＣおよび組織プラスミノーゲンアクティベーターからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が、酵素欠損を有し、そして、前記治療用融合タンパク質が、βグルコセレブロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼおよびプロテイナーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療用融合タンパク質が、既存の治療プロトコールを増強し、そして、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、αインターフェロン、インターフェロンＢ、ＰＤＧＦ、ケラチノサイト成長因子および骨形成タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療用タンパク質が、表４で提供されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の治療用融合タンパク質を含む植物または植物細胞。
【請求項１７】
凍結乾燥され、所望により粉末形態である、請求項１６に記載の植物細胞。
【請求項１８】
封入された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）請求項１６に記載の植物細胞。
【請求項１９】
前記治療用融合タンパク質が周囲温度で安定である、請求項１６に記載の植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月１６日に提出された米国仮出願第６２／２５６，０５３号に対する優先権を主張し、その全ての開示は、参照により本明細書に完全に記載されているものとする。
米国政府は、国立衛生研究所の助成金番号Ｒ０１  ＧＭ６３８７９、Ｒ０１  ＨＬ  １０９４４２、およびＲ０１  ＨＬ  １０７９０４からの資金を使用した本発明の権利を有している。
【０００２】
発明の分野
本発明は、トランスプラストミック植物（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｐｌａｎｔｓ、遺伝子操作された葉緑体を有する植物）の分野および低コストのタンパク質医薬品の生産および供給に関する。より具体的には、本発明は、融合タンパク質を封入した植物細胞を、腸内での処理時に、目的の組織に向かわせる標的配列に作動可能に連結された、治療タンパク質およびペプチドをコードするトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ、導入遺伝子）を発現する葉緑体を含む植物を提供する。
【０００３】
発明の背景
本発明が関係する技術水準を説明するために、いくつかの刊行物および特許文献が、明細書全体にわたって引用されている。これらの引用の各々は、完全に述べられているように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
現行のシステムで製造されたバイオ医薬品は、非常に高価であり、世界人口の大多数にとって手頃な価格ではない。米国では、タンパク質医薬品の年間平均費用は、小分子薬の２５倍も高い。タンパク質医薬品のコスト（２０１３年には、１，４００億ドル）は、世界中の国々の７５％を超えるＧＤＰを上回っており、これらの国では手が届かない［１］。１日あたり＄２未満の収入を有する世界人口の３分の１は、いかなるタンパク質医薬品を購入することはできない。組換えインスリンは、５０年間、商業的に販売されているが、世界人口の大多数にとって、依然として、手頃な価格ではない。これは、そのような薬物の産生が法外に高価であり、しばしば高価な発酵槽、多段階精製手順、冷蔵／輸送、滅菌送達の手段を必要とすることが多いからである。さらに、これらの薬物の貯蔵寿命が短いことは、コストの増加に関連する。タンパク質医薬品の経口送達は、消化器系でのそれらの分解および標的細胞への送達のために腸上皮を横切ることができないために、数十年間、注目（ｅｌｕｓｉｖｅ）を浴びなかった。
【０００５】
しかしながら、いくつかの最近の研究では、植物細胞壁が、生物学的封入化を介して、胃の酸および酵素から、発現されたタンパク質医薬品を保護することを間接的に示した［２、３］。ヒトの消化酵素は、植物の細胞壁を構成する炭水化物のグリコシド結合を分解することができない。しかし、タンパク質医薬品を含有する自然の植物細胞が腸に達すると、共生（ｃｏｍｍｅｎｓａｌ）微生物は、植物の細胞壁を消化し、そして、腸管腔内のタンパク質医薬品を放出する。ヒトの腸内に生息する細菌は、複雑な炭水化物を植物の細胞壁内で利用するように進化し、そして、ほぼすべての植物グリカンを利用することができる［４，５］。
葉緑体に発現され、植物細胞にバイオ封入された、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）に対する（無毒の）コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）の融合体は、ＧＭ１受容体を介して腸上皮を通過送達され、そして、ＧＦＰは循環系に放出された［６］。治療用タンパク質に対するＣＴＢの融合は、経口免疫寛容（ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）［７−１１］または機能性タンパク質の血清への誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）［１２−１４］、さらには血液脳または網膜障壁さえ通じた、効果的な経口送達を容易にする［１５，１６］。
【０００６】
外来タンパク質は、また、特異的受容体を必要としない、細胞膜浸透特性を有する、タンパク質形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメイン（ＰＴＤｓ）との融合によって、生存細胞に送達することもできる［１７］。ペプチドおよびタンパク質形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメイン（ＰＴＤ）は、８〜１６個のアミノ酸を含む、小さなカチオン性ペプチドであり、そして、ほとんどの場合、巨大分子の送達のためのトランスポーターとして機能する［１７］。
【０００７】
ＰＴＤは、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の特別な形態である、受容体非依存性の液相マクロ−ピノサイトーシス（ｆｌｕｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｍａｃｒｏ−ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞内に分子を運ぶ。異なるＰＴＤは、同様の細胞取り込み特性を示すが、それらはタンパク質分子を細胞に輸送する効率が異なる。
【０００８】
細胞取込みの有効性は、塩基性アミノ酸残基の数と強く相関することが見出されている。ＰＴＤは、培養哺乳動物細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの動物モデルにおいて、生物学的に活性なタンパク質を送達することが示されているので［１８−２０］、ＰＴＤ融合タンパク質の送達方法は、大きな治療薬物の送達の可能性を有する。
【０００９】
Ｔリンパ球およびＢリンパ球は、適応（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫応答の主要な細胞成分であるが、それらの活性化および恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）は、樹状細胞によって制御される。Ｂ細胞は、それらの表面上のＢ細胞レセプターを介して直接的に天然のＡｇを認識し、抗体を分泌することができる。しかし、Ｔ細胞は、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子によって示されるペプチドのみを認識することができる。
マクロファージは、慢性炎症における死細胞および細胞破片の除去および免疫応答の開始を含む、多くの重要な役割を有する、「プロフェッショナルな」抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の１つのタイプである［２１，２２］。
【００１０】
マクロファージは、一次および二次免疫応答のオーケストレーション（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｏｎ）に関与する。肥満細胞は、感染の間に、最初の炎症応答を生成することに関与し、これは自然免疫および適応免疫を開始するために重要である。活性化されると、肥満細胞は、その特有の顆粒および種々のホルモン媒介物質を間質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ）に迅速に放出する。したがって、肥満細胞は、創傷治癒、アレルギー疾患、アナフィラキシーおよび自己免疫において重要な役割を果たす。
【００１１】
樹状細胞は重要な免疫調節細胞である。樹状細胞は、多機能性ＡＰＣと複合体を形成し、そして、抗病原体活性において重要な役割を果たす。さらに、樹状細胞は、異なるタイプの機能細胞に分化し、異なる抗原によって刺激され、そして、体液性（ｈｕｍｏｒａｌ）免疫または細胞性免疫を誘導する。
逆に、ＤＣは、また、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のホメオスタシス、Ｔｒｅｇの胸腺外（ｅｘｔｒａｔｈｙｍｉｃ）誘導、移植における免疫寛容の誘導（ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）、およびアレルギーまたは自己免疫疾患の治療にも重要である。
【００１２】
組織の微小環境、活性化シグナル、およびＤＣのサブセットは、ＤＣによる抗原提示が免疫または耐性をもたらすかどうかを決定する重要なパラメーターである［２３−２５］。
したがって、抗原のＤＣへの標的インビボ送達は、腫瘍特異的免疫応答を誘導し、ワクチン開発、癌免疫療法のための新規の戦略を確立するために有用であるだけではなく、寛容誘導プロトコル（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）にも有用である［２６−２８］。
例えば、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）は、抗原の体内への侵入のための最大表面積、および、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０およびＴＧＦ−bの発現を含む、寛容原性特性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する、非常にユニークな微小環境を提供する［２９−３１］。
【００１３】
腸管腔からの、腸管上皮細胞およびＣＸ１ＣＲ５＋マクロファージのサンプル抗原（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｓａｍｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）。特に、パイエル板の内皮において、小襞細胞（ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ  ｃｅｌｌｓ）（Ｍ細胞）は、抗原を、取込み（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅ）および食菌して（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｅ）、これらをＤＣに導く（ｃｈａｎｎｅｌ）。
腸内のＣＤ１１ｃ＋  ＤＣは、優先的に、Ｔｒｅｇ細胞［３２］を誘導するＴＧＦ−βを発現するＣＤ１０３＋  ＤＣの高い割合を含む。
【００１４】
最近、我々は、バイオ封入化された（ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）ＣＴＢ融合抗原の送達時、血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ）マウスにおける凝固因子（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）に対する経口寛容誘導（ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）が、増加したＣＤ１０３＋ＤＣ頻度、ＣＤ１０３＋ＤＣによる抗原の取り込み、およびＴｒｅｇのいくつかのサブセットの誘導と関連していたことを実証した［９、１０］。
【００１５】
また、重要な免疫調節機能を有する、形質細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣも増加した［３３］。ＤＣペプチド（ＤＣｐｅｐ）は、粘膜ＤＣへのリガンドとして開発された［２６］。この小さなペプチドは、ＤＣ特異的受容体に結合し、そして、巨大分子のＤＣへの輸送を促進する。
【００１６】
発明の概要
本発明によれば、それを必要とする対象の、目的の組織または細胞への治療用タンパク質の標的送達方法が開示される。例示的な方法は、融合ペプチド配列に作動可能に連結された前記治療タンパク質をコードするプラスチド発現核酸を含む、有効量の植物細胞またはその残渣を投与することを含み、
前記核酸の発現は、前記植物またはその残渣（ｒｅｍｎａｎｔ）を摂取（ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）または服用する際に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、目的の標的細胞または組織に選択的に送達する治療融合タンパク質の産生を引き起こし、それによって、前記対象の標的細胞または組織に、前記治療タンパク質を選択的に送達する。好ましくは、植物は、限定されないが、レタス、低ニコチンたばこ、ホウレンソウ、キャベツおよびケールを含む、緑色の葉野菜である。他の植物は、ナス、ニンジン、およびトマトを含む。
【００１７】
一実施形態では、融合ペプチド配列は、ＰＴＤである。別の実施形態では、融合ペプチド配列は、ＤＣペプチドである。融合ペプチドは、ＰＧ１またはＲＣ１０１のような抗菌ペプチドであってもよい。特定の実施形態では、融合ペプチドは、ＣＴＢペプチドである。
本発明の他の実施形態では、特に、標的化がより特異的である必要がある場合、ＣＴＢ融合ペプチドの使用は除外される。
標的化される細胞には、免疫細胞、体細胞および樹状細胞が含まれるが、これらに限定されない。表２、３および４は、本発明のプラスチド産生融合タンパク質に有用な治療分子を提供する。
【００１８】
一態様では、治療用融合タンパク質は、内分泌障害の治療用であり、そして、そのタンパク質は、インスリン、ソマトトロピン、およびインスリン様成長因子からなる群から選択される。
治療用融合タンパク質はまた、止血の維持または血栓の予防のために使用され得る。
この実施形態では、治療用融合タンパク質は、血液凝固因子、抗トロンビン、プロテインＣおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる群から選択される。
本発明の方法はまた、酵素欠損を有する対象の治療に使用することができ、そして、治療用融合タンパク質は、β−グルコ−セレブロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、およびプロテイナーゼ阻害剤からなる群から選択されるタンパク質を含む。
【００１９】
治療用融合タンパク質は、既存の生物学的経路を増大させることができ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、αインターフェロン、インターフェロンＢ、ＰＤＧＦ、ケラチノサイト増殖因子および骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群から選択される。
【００２０】
本発明の別の態様は、上記治療用融合タンパク質を含む植物または植物細胞を含む。植物は凍結乾燥されていてもよい。これらは、粉末状であっても、任意に封入されていてもよい。
好ましい実施形態では、治療用融合タンパク質は、周囲温度で数カ月間安定である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図１Ａ〜１Ｆ．
予測されるタンパク質構造およびＧＦＰ融合タンパク質を発現するトランスプラストミック株（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｌｉｎｅｓ）の特性の概略図
【図１Ａ】ＣＴＢ融合タンパク質とＧＭ１受容体との相互作用、ならびにＰＴＤおよびＤＣｐｅｐの両方の予測された３Ｄ構造。ＧＭ１受容体のペンタサッカライド部分は、ＣＴＢの五量体（ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ）構造との相互作用を確立する。立体障害を避けるためのヒンジ配列（Ｈｉｎｇｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および繋がれたタンパク質（ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を放出するためのフューリン開裂部位（ｆｕｒｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）を、ＣＴＢと融合タンパク質との間に配置した。ＰＴＤとＤＣｐｅｐの両者の、計算的に予測された３次元構造は、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）サーバ［４０］から得た。この構造は、虹色で示され、Ｎ末端からＣ末端の残基へと徐々に青色から赤色に色変化する（青−緑−黄−橙−赤）。予測された構造の中で、信頼スコア（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｓｃｏｒｅ）（Ｃ−スコア）、二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有する高分解能モデル（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）、およびテンプレートモデリングスコア（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｃｏｒｅ）（ＴＭ−スコア）などのパラメータ計算からの組み合わせた結果に基づいて選択された、各ペプチドについての最高に信頼できる構造を有するモデルを提示した。
【図１Ｂ】ＧＦＰ融合キャリアタンパク質発現カセットおよび隣接領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）の概略図。Ｐｒｒｎ：ｒＲＮＡオペロンプロモーター；ａａｄＡ：アミノグリコシド  ３’−アデニリトランスフェラーゼ遺伝子；ＰｐｓｂＡ：プロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子の５’ＵＴＲ；ＣＴＢ：非毒性コレラＢサブユニットのコード配列；ＰＴＤ：タンパク質形質導入ドメインのコード配列；ＤＣｐｅｐ：樹状細胞結合ペプチド配列；ｓｍＧＦＰ：可溶性修飾緑色蛍光タンパク質の遺伝子配列；ＴｐｓｂＡ：ｐｓｂＡ遺伝子の３’ＵＴＲ；ｔｒｎＩ：イソロイシル−ｔＲＮＡ；ｔｒｎＡ：アラニル−ｔＲＮＡ。サザンブロット分析のために使用される制限酵素は、プローブの生成のための、ＢａｍＨＩ／のＢｇｌＩＩ、およびゲノムＤＮＡの消化のためのＨｉｎｄＩＩＩとして示した。
【図１Ｃ】ＧＦＰ融合タグタンパク質を発現する、各トランスプラストーミック株（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｌｉｎｅ）のサザンブロット分析。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｇＤＮＡを、上記の隣接領域断片（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）とプローブ化（ｐｒｏｂｅｄ）された。
【図１Ｄ】各トランスプラストーミック株からのＧＦＰ蛍光シグナルを、ＵＶ光下で確認した。写真は、発芽の２ヶ月後に撮影された。バーは０．５ｃｍを表す。
【図１Ｅ】ＧＦＰ標準タンパク質を用いた、濃度測定用ウェスタンブロット分析。凍結乾燥した（１０ｍｇ）、そして新鮮な葉材料（１００ｍｇ）を、３００μＬの抽出バッファーで抽出した。１Ｘは、１００ｍｇ対３００μＬの比で、抽出緩衝液に再懸濁した、ホモジネート１μＬを表す。
【図１Ｆ】新鮮な（Ｆ）および凍結乾燥した（Ｌ）葉における、ＧＦＰ融合タンパク質の量。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂ．異なるタグと融合したＧＦＰの経口送達および生体内分布の効率。ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰを発現している葉材料を給餌したマウス（Ｎ＝６匹／群）における血清（図２Ａ）および組織（図２Ｂ）のＧＦＰレベル。成体マウスに、遺伝子組み換えのタバコ植物からの葉材料を、ＧＦＰ発現レベルに調整した量で、３日間連続して経口投与した。対照群（Ｎ＝６匹）は未給仕のままであった。最後の胃管栄養投与（ｇａｖａｇｅ）の２時間後および５時間後に、血液サンプルを採取し、マウスを屠殺し、そして、組織サンプルをタンパク質単離のために収集した。血清および組織中のＧＦＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。データは平均±ＳＥＭとして示した。統計的有意性は、対応のあるスチューデントｔ検定によって決定され、そして、０．０５未満のｐ値は有意であるとみなされた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１（ＣＴＤ、ＰＴＤおよびＤＣｐｅｐは、未処理を対照とする。）
【図３】図３Ａ〜３Ｌ．植物細胞の経口送達後、マウスの回腸および肝臓の細胞における、ＧＦＰの可視化。（左パネル）小腸へのＧＦＰ送達。抗ＧＦＰ（緑色シグナル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８）、ＵＥＡ−１（他の細胞の中でも、Ｍ細胞を染色、赤色シグナル、ローダミン）、およびＤＡＰＩ（核染色、青色）で染色された断面が示されている。（図３Ａ〜図３Ｃ）．ＰＴＤ−ＧＦＰ送達。（図３Ｂ）一次抗体なし（ＮＣ：陰性対照）。（図３Ｄ〜３Ｅ）ＣＴＢ−ＧＦＰ送達。（図３Ｆ）ＤＣｐｅｐ送達。オリジナルの倍率：２００倍（図３Ａ、Ｂ、Ｄ〜Ｆ、Ｃにおける挿入）または４０倍（図３Ｃ）。（右パネル）肝臓の凍結切片に示されるＧＦＰ染色、撮像時と同一の露光時間。一次抗体：１：１０００のウサギ抗ＧＦＰ抗体および二次抗体：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧをＧＦＰ染色に使用した。（Ｇ、ＩおよびＫ）形質転換されていない、凍結乾燥された植物細胞を給仕したマウスの肝臓切片。（図３Ｈ、ＪおよびＬ）ＤＣＰｅｐ−ＧＦＰ（図３Ｈ）、ＰＴＤ−ＧＦＰ（図３Ｊ）およびＣＴＢ−ＧＦＰ（図３Ｌ）を発現する、凍結乾燥した植物細胞で給仕されたマウスからの肝臓切片のＧＦＰシグナル。オリジナルの倍率：１００倍。
【図４】図４Ａ〜４Ｆ．精製されたＧＦＰ融合タンパク質の特性。（図４Ａ）精製されたＧＦＰ融合タンパク質の定量、およびクマシー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）および蛍光画像。ウエスタンブロット画像による、濃度測定アッセイを、既知量のＧＦＰ標準タンパク質を用いて行い、精製された、タグが融合したＧＦＰタンパク質を定量した。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、そして、抗ＧＦＰ抗体で免疫プローブ化（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｂｅｄ）した。負荷量は図示の通りであった。純度は、総負荷量に対する、イムノブロットアッセイで検出された量のパーセンテージとして計算した。（図４Ｂ）精製されたＧＦＰタグ化タンパク質のクマシー染色。Ｍ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＰＴＤ−ＧＦＰ（１０μＬ、２．３７μｇ）：レーン２：Ｄｃｐｅｐ−ＧＦＰ（４０μＬ、３．１２μｇ）：、レーン３：ＣＴＢ−ＧＦＰ（１０μＬ、３２．８μｇ）：およびレーン４：ＧＦＰ（４００ｎｇ）。（図４Ｃ）ＧＦＰの蛍光を測定するための、精製されたＧＦＰ融合タンパク質の非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１（ＰＴＤ−ＧＦＰ  １０μｌ、９．１７μｇ  ＴＳＰ負荷）、レーン２（ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ  １５μｌ、４．６μｇ  ＴＳＰ負荷）および、レーン３（ＣＴＢ−ＧＦＰ  ２０μｌ、３３μｇ  ＴＳＰ負荷）。（図４Ｄおよび４Ｅ）精製されたＧＦＰ−タグ付きタンパク質を、ＧＭ１受容体に対するそれらの結合親和性について調べた。ＧＭ１とＧＦＰ融合タンパク質との間の相互作用を検出するために、抗ＣＴＢ（図４Ｄ）および抗ＧＦＰ（図４Ｅ）抗体を使用した。アッセイに用いたタンパク質の量は以下の通りである。ＣＴＢ：１０ｐｇ；ＣＴＢ−ＧＦＰ：１．２５ｎｇ；ＰＴＤ−ＧＦＰ：１０ｎｇ；ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ：１０ｎｇ；ＧＦＰ：１０ｎｇ：およびＵＴ、未形質転換野生型総タンパク質：１００ｎｇ。（図４Ｆ）五量体構造を決定するための、精製されたＣＴＢ−ＧＦＰの非変性トリス−トリシンＰＡＧＥ。精製したＣＴＢ−ＧＦＰの五量体構造を、抗ＣＴＢ抗体（１万分の１）を用いて免疫プローブ化した（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｂｅｄ）。ＣＴＢ−ＧＦＰの負荷量を図に示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂ．ヒトの免疫および非免疫細胞による、異なるタグと融合したＧＦＰの取り込み。（図５Ａ）ヒト細胞株での、精製されたＧＦＰ融合タンパク質の転移。培養したヒト樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞および肥満細胞の２ｘ１０４の細胞を、精製したＧＦＰ融合体とインキュベートした。ＣＴＢ−ＧＦＰ（８．８μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）、ＰＴＤ−ＧＦＰ（１３μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ（１．３μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）および市販の標準ＧＦＰ（２．０μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）と、それぞれ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、Ｂ、Ｔおよび肥満細胞ペレットを、１：３０００に希釈したＤＡＰＩで染色し、そして、２％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞をスライド上に密封し、そして、共焦点顕微鏡法で検査した。生存するＤＣｓを、１：３０００に希釈したＨｏｅｃｈｓｔで染色し、そして、共焦点顕微鏡下で直接検出した。２９３Ｔ、膵臓細胞（ＰＡＮＣ−１およびＨＰＤＥ）およびマクロファージ細胞については、８ウェルチャンバースライドを、３７℃で、一晩、細胞培養に使用した。精製したＣＴＢ−ＧＦＰ（８．８μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）、ＰＴＤ−ＧＦＰ（１３μｇ／１００μｌＰＢＳ）、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ（１．３μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）および市販標準ＧＦＰ（２．０μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）で、それぞれ、３７℃で、１時間、インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、そして、１：３０００のＤＡＰＩで核を染色した。（図５Ｂ）ヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ）における、ＰＴＤ−ＧＦＰの核の局在化。緑色蛍光はＧＦＰ発現を示す。青色の蛍光は、ＤＡＰＩによる細胞核標識を示す。画像は、倍率１００倍で観察した。スケールバーは１０μｍを表す。すべての画像研究は三重に分析した。
【図６】図６Ａおよび６Ｂ．異なるタグと融合したＧＦＰの、異なるヒト体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ）および幹細胞型による、取り込み。（図６Ａ）ヒト膵臓細胞（ＰＡＮＣ−１およびＨＰＤＥ）、ヒト歯周靭帯幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＨＰＤＬＳ）、上顎間葉系幹細胞（ｍａｘｉｌｌａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（ＭＭＳ）、ヒト頭頸部扁平上皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）（ＳＣＣ）、網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｃｅｌｌ）（ＲＰＥ）、歯肉由来間葉系間質細胞（ｇｉｎｇｉｖａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ），（ＧＭＳＣ）、成人歯肉ケラチノサイトａｄｕｌｔ  ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）（ＡＧＫ）および骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）（ＯＢＣ）における、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰ、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰおよびＧＦＰ−プロテグリン１（ＧＦＰ−ＰＧ１）およびＧＦＰ−Ｒｅｔｒｏｃｙｃｌｉｎ  １０１（ＧＦＰ−ＲＣ１０１）の精製した融合タンパク質の形質転換の共焦点顕微鏡を用いたインビトロの評価。ヒト細胞株である、ＰＡＮＣ−１、ＨＰＤＥ、ＨＰＤＬＳ、ＭＭＳ、ＳＣＣ、ＲＰＥ、ＧＭＳＣ、ＡＧＫおよびＯＢＣの２ｘ１０４個の細胞を、３７℃で、一晩、８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）で培養し、続いて、精製したＧＦＰ融合タンパク質とインキュベ―ションした。：ＣＴＢ−ＧＦＰ（８．８μｇ）、ＰＴＤ−ＧＦＰ（１３μｇ）、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ（１．３μｇ）、ＧＦＰ−ＰＧ１（１．２μｇ）、ＧＦＰ−ＲＣ１０１（１７．３μｇ）、をそれぞれ、１００μｌのＦＢＳを補充された１％ＰＢＳを一緒にして、３７℃で、１時間、インキュベートした。ＰＢＳで、３回ウェルを洗浄した後、細胞を、１：３０００  ＤＡＰＩで、室温、１０分間、染色し、そして、次いで、２％のパラホルムアルデヒドで、室温で、１０分間、固定した。ネガティブコントロールのウェルについては、細胞を、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中の市販のＧＦＰ（２μｇ）と共にインキュベートしたか、または処置をしなかった。インキュベーションの１時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。すべての固定された細胞を、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。緑色の蛍光は、ＧＦＰ発現を示す。青色の蛍光は、ＤＡＰＩによる細胞核標識を示す。画像は１００倍の対物レンズで観察された。スケールバーは１０μｍを表す。すべての画像研究は三重に分析された。（図６Ｂ）ヒト膵臓細胞（ＰＡＮＣ−１およびＨＰＤＥ）、ヒト歯周靱帯幹細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ）（ＨＰＤＬＳ），  上皮間葉系幹細胞（ＭＭＳ）、ヒト頭頸部扁平上皮細胞（ＳＣＣ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、歯肉由来間葉系間質細胞（ＧＭＳＣ）、成人歯肉ケラチノサイト（ＡＧＫ）、骨芽細胞（ＯＢＣ）における、精製した融合タンパク質である、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰ、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ、ＰＧ１−ＧＦＰおよび抗菌ペプチド（ＰＧ１−ＧＦＰおよびＲＣ１０１−ＧＦＰ）の、共焦点顕微鏡を用いたＩｎ  ｖｉｔｒｏでの形質転換の評価。
【００２２】
発明の詳細な説明
ＧＭ１受容体結合タンパク質（ＣＴＢ）またはヒト細胞浸透性ペプチド（ＰＴＤ）または樹状細胞ペプチド（ＤＣｐｅｐ）と融合したＧＦＰの標的化経口送達を調べた。
回腸絨毛間のＧＦＰ＋インタクトな植物細胞の存在は、酸／酵素からの消化系におけるそれらの保護を確認する。
ＰＴＤまたはＣＴＢによる、腸管上皮細胞へのＧＦＰの効率的送達、および、これら全ての融合タグによる、Ｍ細胞へのＧＦＰの効率的送達は、小腸におけるＧＦＰの取り込みを確認する。
ＰＴＤ融合は、他の２つのタグよりも、ほとんどの組織または器官に、ＧＦＰをより効率的に送達した。
ＧＦＰは、おそらく腸肝軸（ｇｕｔ−ｌｉｖｅｒ  ａｘｉｓ）を介して、すべての融合タグによって肝臓に効率的に送達された。
精製された、異なるタグで融合したＧＦＰを用いた、ヒト細胞株の共焦点画像研究において、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰのＧＦＰシグナルは、樹状細胞内でのみ検出された。
ＰＴＤ−ＧＦＰは、腎臓細胞または膵臓細胞内でのみ検出されたが、免疫調節細胞（マクロファージ、樹状細胞、Ｔ、Ｂ、または肥満細胞）では検出されなかった。
対照的に、ＣＴＢ−ＧＦＰは、試験した全ての細胞型で検出され、ＧＭ１受容体の遍在的存在（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ）を確認した。
【００２３】
血清、免疫系または非免疫細胞に対する、タンパク質医薬品のこのような低コストの経口送達は、非常に高価な発酵、タンパク質の精製、冷蔵／輸送を排除することによって、それらのコストを劇的に低下させ、および患者のコンプライアンスを向上するはずである。
【００２４】
定義：
本明細書中で使用される場合、薬剤、医薬またはペプチドの対象への「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、その意図された機能を果たす化合物を、被対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）または投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、経口的、鼻腔内的、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、直腸内または局所的などの任意の適切な経路によって行うことができる。投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）または投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、自己投与および他者による投与が含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される、「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」、「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」または「合併症（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、対象における、正常状態からの任意の逸脱を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、「有効量（ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」などの用語は、所望の結果を達成するのに必要な１回の投薬量および時間の期間での有効量を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される、「阻害する」または「治療する」という用語は、疾患状態に曝露されるか、または疾患状態に罹りやすいが、疾患状態の症状をまだ経験していないか、または示していない対象において、疾患状態の臨床症状を悪化させずまたは発症させない、たとえば、疾患の発症を阻害する、ことを意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、遺伝子またはポリヌクレオチドの文脈における、用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、遺伝子またはポリヌクレオチドのＲＮＡへの転写を含む。この用語はまた、必ずしもそうではないが、その後のＲＮＡのポリペプチド鎖への翻訳およびそれらのタンパク質への組み込みを含むことができる。
【００２８】
「形質転換植物」は、少なくとも１つの異種核酸分子の導入によって、ゲノムが改変された植物を指す。
【００２９】
本明細書で使用される、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指し、そして、一本鎖の場合、線状または環状のいずれかの相補的配列の分子を指す。
核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’方向の配列を提供する通常の慣例に従って、本明細書に記載され得る。
本発明の核酸に関して、「単離された核酸」という用語が使用されることがある。
ＤＮＡに適用される場合、この用語は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、直ぐ連続している配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されるか、または原核または真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、ＤＮＡ分子を含み得る。
【００３０】
ＲＮＡに適用される場合、「単離された核酸」という用語は、主に、上で定義したような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、該用語は、その自然状態（すなわち、細胞または組織中）で関与されるであろう、他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を指してもよい。
【００３１】
「単離された核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、生物学的または合成的手段によって直接産生され、そして、その産生の間に存在する他の成分から分離された分子をさらに表してもよい。
【００３２】
ウィスコンシン大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ）ＧＣＧソフトウェアプログラムに記載されているように、特定の配列に言及する場合、用語「パーセント類似性」、「同一性パーセント」および「相同性パーセント」は、使用される。
【００３３】
「実質的に純粋」という用語は、所定の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）の少なくとも５０〜６０重量％を含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は、所与の化合物の少なくとも７５重量％、そして、最も好ましくは、９０〜９５重量％を含む。純度は、所定の化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００３４】
「レプリコン」は、たとえば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスのような、ほぼ、それ自身の制御下で複製することができる、任意の遺伝子エレメントである。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってもよく、そして、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【００３５】
「ベクター」は、別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が付加して、付加した配列またはエレメントの複製を引き起こす任意のビヒクルである。
【００３６】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのような、転写および翻訳制御配列を有することができる核酸セグメントを指し、そして、宿主細胞または生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する。
【００３７】
本明細書で使用する、「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の配列、プライマーおよびプローブを指し、そして、２つ以上のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上の核酸分子を含む核酸分子として定義される。
オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の因子、ならびにオリゴヌクレオチドの特定の用途および使用に依存する。
【００３８】
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般的に使用される、所定の条件下（時には「実質的に相補的」と呼ばれる）で、このようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相補的な配列の２本の一本鎖核酸分子の間の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。
特に、この用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、および、非相補的配列の一本鎖核酸とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的排除を指す。
【００３９】
「プロモーター領域」という用語は、遺伝子の５’調節領域（例えば、５’ＵＴＲ配列（例えば、ｐｓｂＡ配列、プロモーター（例えば、形質転換されるべき植物に内在する普遍的ＰｒｎｎプロモーターまたはｐｓｂＡプロモーター）および所望によるエンハンサー要素）を示す。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」または「レポーター遺伝子産物」は、核酸が、発現される際、容易に測定可能なレポーターシグナル（例えば、生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または比色定量ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ、蛍光発色ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ、化学発光ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔまたは他の方法によって）を産生する産物をコードする遺伝子を含む、作動可能な遺伝子システム（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）を意味する。
【００４１】
核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、線状または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンスまたはセンス極性（ｓｅｎｓｅ  ｐｏｌａｒｉｔｙ）のいずれかであり得、そして、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに作動可能に連結される。
必要な制御エレメントは、レポーターシステムの性質およびレポーター遺伝子がＤＮＡまたはＲＮＡの形態であるかどうかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどのエレメントを含み、これらに限定されない。
【００４２】
「形質転換する（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）」、「トランスフェクションする（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）」、「形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）」という用語は、核酸が、細胞または宿主生物に導入される任意の方法または手段を指し、そして、同じ意味を伝達するために交換可能に使用され得る。そのような方法には、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧ融合などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
「選択可能なマーカー遺伝子（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ）」という用語は、形質転換された細胞または植物上での、抗生物質耐性のような、発現されると、選択可能（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）な表現型を付与する遺伝子を指す。
【００４４】
用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を有効にするために、コード配列に関して適切な位置における、ＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。
この同じ定義は、発現ベクター中の転写ユニットおよび他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に適用されることがある。
【００４５】
「ＤＮＡ構築物（ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」という用語は、植物を形質転換し、形質転換された植物の子孫を生成するために使用される遺伝子配列を指す。これらの構築物は、ウイルスまたはプラスミドベクターで、植物に投与することができる。しかしながら、本発明での使用に最も好ましいのは、色素体形質転換ベクター（ｐｌａｓｔｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ）である。
【００４６】
アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ媒介形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−ＤＮＡ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）プロセスを用いる形質転換などの他の送達方法も、また、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００４７】
形質転換ＤＮＡは、「分子生物学の最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５年、に記載されているような標準プロトコルに従って調整される。
【００４８】
二本鎖ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」という語句は、それにより、標的遺伝子発現が、その後分解されるｍＲＮＡをコードする標的遺伝子を有する二本鎖ＲＮＡ構造を形成する分子をコードする核酸構築物の導入を介して、植物細胞において、抑制されるプロセスを指す。
【００４９】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を指す場合、「〜から本質的になる」なる語句は、所定の配列番号の特性を有する配列を意味する。たとえば、アミノ酸配列に関して使用される場合、この句は、配列自体および配列の基本的および新規な特性に影響を及ぼさない分子修飾を含む。
【００５０】
「タグ」、「タグ配列（ｔａｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「タンパク質タグ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇ）」という用語は、別の配列に付加された場合に、さらなる有用性を提供するか、または、有用な特性を付与する（関心のあるタンパク質を、所望の細胞型に対して特異的に標的化するような）、オリゴヌクレオチド、または、より好ましくはペプチドまたは他の化学物質のいずれかの化学的部分を指す。このようなタグはまた、それらを含有する融合タンパク質を単離および精製するために有用であり得る。
本明細書に記載されているような、または当該分野で一般的に使用されるような、タンパク質タグは、目的のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに付加され得る。
【００５１】
「免疫応答」は、機能する免疫系を有する宿主において、ウイルスまたは植物抗原のような抗原によって産生される任意の反応を意味する。免疫応答は、天然における体液性であってもよく（すなわち、免疫グロブリンまたは抗体の産生を含む）、天然における細胞性であってもよく（様々なタイプのＢおよびＴリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞などを含む）、またはその両方であってもよい。免疫応答はまた、サイトカイン、リンホカインなどの様々なエフェクター分子の産生または精緻化を含み得る。免疫応答は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび様々な細胞性または動物系の両方で測定することができる。
【００５２】
「抗体」または「抗体分子」は、特異的抗原に結合する任意の免疫グロブリン（抗体およびそのフラグメントを含む）である。表４に列挙された薬物のいくつかは抗体である。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および二重特異性抗体が含まれる。本明細書で使用される、抗体または抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、および、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）などの当技術分野で知られているこれらの一部のような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意味する。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、融合ペプチドは、特異的受容体を必要とせずに、細胞膜と融合することによって、タンパク質が細胞に入る能力を増加させる。他の融合タンパク質は、細胞受容体を標的とすることができる。特定の融合タンパク質は、免疫細胞を特異的に標的とする。他のものは、ＤＣペプチドのように、樹状細胞を標的とする。
いくつかの融合タンパク質は、かなり非特異的であり、そして、目的の様々な細胞型に、治療用タンパク質を送達するために使用することができる。
【００５４】
植物残留物（ｐｌａｎｔ  ｒｅｍｎａｎｔ）は、目的のタンパク質が発現された植物に由来する、１つ以上の分子（限定されないが、タンパク質およびその断片、鉱物、ヌクレオチドおよびその断片、植物構造成分など）を含み得る。したがって、植物材料全体（例えば、植物の葉、茎、果実などの全部または一部）または粗植物抽出物に関連する組成物は、高濃度の植物残留物、および１つ以上の検出可能な植物残留物を有する、目的の精製タンパク質を含む組成物を確実に含むであろう。特定の実施形態では、植物残留物は、ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）である。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、治療用融合タンパク質を、目的の標的細胞または組織に送達する、タグを含む植物葉緑体で産生される治療用融合タンパク質の投与を介して、疾患を治療または予防するための投与可能な組成物に関する。該組成物は、植物および植物残留物によって発現される、融合タンパク質の治療有効量を含む。
【００５６】
植物および植物細胞を形質転換するための方法、ベクターおよび組成物は、たとえば、国際公開第０１／７２９５９号パンフレット、国際公開第０３／０５７８３４号パンフレット；および国際公開第０４／００５４６７号パンフレットに教示されている。国際公開第０１／６４０２３号パンフレットは、マーカーフリー遺伝子構築物の使用を議論している。
本明細書中に教示された特定の実施形態に従って発現されるタンパク質は、様々な方法で、対象、ヒトまたは動物、に投与することによって、インビボで使用され得る。医薬組成物は、経口または非経口、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内に投与することができるが、経口投与が好ましい。
目的の治療用タンパク質のリストを、実施例ＩＩに提供する。
【００５７】
本発明の実施形態によって生成される経口組成物は、プラスチド由来の治療用融合タンパク質を産生する形質転換植物を用いて、製造された食品の消費によって投与することができる。植物の可食部またはその一部は、食物成分として使用される。
治療組成物は、所望の投与様式に適した、固体または液体ビヒクル、希釈剤および添加剤を使用して、古典的な様式で処方することができる。経口的には、組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末などの形態で、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどの少なくとも１つのビヒクルと一緒に投与することができる。製剤は、乳化されていてもよい。
活性な免疫原性または治療用成分は、しばしば、薬学的に許容され、有効成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバントなどの少量の補助物質を含有してもよい。
好ましい実施形態において、製薬用形質転換植物の食用植物、ジュース、穀粒、葉、塊茎、茎、種子、根または他の植物部分は、ヒトまたは動物によって摂取され、したがって、疾患に対する治療または免疫の非常に安価な手段を提供する。特定の実施形態において、治療用融合タンパク質を発現することができる葉緑体を含む植物材料（たとえば、レタス、トマト、ニンジン、低ニコチンタバコ材料など）は、均質化され、封入化される。特定の一実施形態では、レタス材料の抽出物が封入される。別の実施形態では、レタス材料は、封入化する前に粉末化する。別の実施形態では、投与の便宜のために、組成物は、形質転換植物の果汁で提供される場合がある。
この目的のために、形質転換される植物は、とりわけ、トマト、ニンジンおよびリンゴからなる食用植物から選択されることが好ましく、これらは、通常、ジュースの形態で消費される。
【００５８】
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書中に開示される、治療用融合タンパク質またはペプチドを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換葉緑体ゲノムに関する。
本明細書のタンパク質配列への参照は、公知の全長アミノ酸配列、ならびに、そのようなアミノ酸配列またはその生物学的に活性な変異体から選択される、少なくとも、１２，１５，２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０または２６５の連続したアミノ酸に関連する。典型的には、ポリペプチド配列は、その配列の既知のヒトのバージョンに関する。
【００５９】
生物学的に活性な変異体は、経口免疫寛容（ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の場合には、免疫抑制性サイトカイン（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）（ＩＬ１０およびＩＬ４など）および血清抗体（ＩｇＧ１のような）のアップレギュレーションを特徴とする、Ｔ細胞を活性化し、および／またはＴｈ２細胞応答を誘導する変異体、または、タンパク質の天然機能を望む場合には、タンパク質の天然機能を維持する変異体を指す。
好ましくは、天然又は非天然に起こったポリペプチド変異体は、完全長アミノ酸配列またはそのフラグメントに対して、少なくとも、約５５，６０，６５又は７０、好ましくは、約７５，８０，８５，９０，９６，９６又は９８％が同一である、アミノ酸配列を有する。
推定ポリペプチド変異体と完全長アミノ酸配列との間の同一性パーセントは、Ｂｌａｓｔ２  アライメント  プログラム（Ｂｌａｓｔ２  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、標準遺伝子コード）を用いて決定される。
パーセント同一性における変化は、たとえば、アミノ酸の置換、挿入、または欠失によるものであり得る。アミノ酸置換は、１対１のアミノ酸置換のものとして定義される。置換アミノ酸が類似の構造的および／または化学的特性を有する場合、それらは、自然に保存的である。保存的置換の例は、ロイシンをイソロイシンまたはバリンと置換、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換、またはスレオニンをセリンとの置換である。
アミノ酸の挿入または欠失は、アミノ酸配列への変化またはアミノ酸配列内の変化である。
それらは、典型的には、約１〜５アミノ酸の範囲内にある。
どのアミノ酸残基が、ポリペプチドの生物学的活性または免疫学的活性を消失させることなく、置換、挿入または欠失され得るかを決定するための指針は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのような当該分野で周知のコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。
【００６０】
アミノ酸の変化が、生物学的に活性な治療用融合ポリペプチドをもたらすかどうかは、たとえば、以下の特定の実施例に記載されるように、天然の活性についてアッセイすることによって容易に決定することができる。
本明細書の遺伝子配列への言及は、一本鎖または二本鎖の核酸配列を意味し、そして、目的のポリペプチドのコード配列またはそのコード配列の相補体を含む。
【００６１】
ポリペプチドならびにｃＤＮＡと、少なくとも、約５０，５５，６０，６５，６０、好ましくは、約７５，９０，９６、または９８％同一である、相同ヌクレオチド配列をコードする、縮重核酸配列は、本明細書におけるポリヌクレオチドの教示に従って使用することができる。
２つのポリヌクレオチドの配列間の配列同一性パーセントは、ギャップオープンペナルティ−１２（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｏｆ  −１２）およびギャップ伸長ペナルティ−２（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｏｆ  −２．）を用いた、アフィンギャップサーチ（ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ  ｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを採用するＡＬＩＧＮなどのコンピュータプログラムを用いて決定される。
生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸配列の、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体、および変異体はまた有用なポリヌクレオチドである。
上記の核酸配列の変異体および相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）もまた有用な核酸配列である。
典型的には、相同なポリヌクレオチド配列は、当技術分野で知られているように、ストリンジェントな条件下で、候補ポリヌクレオチドと既知のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって同定することができる。
たとえば、以下の洗浄条件を使用する：
２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温でそれぞれ２回、各３０分間；
次に、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分間；
次いで、２ＸＳＳＣ、室温で２回、各１０分間、
多くとも、約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列を同定することができる。
【００６２】
より好ましくは、相同核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、さらにより好ましくは、５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
本明細書中で言及される、ポリヌクレオチドの種相同体はまた、適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。
相同性が１％低下するごとに、二本鎖ＤＮＡのＴｍが、１〜１．５℃低下することはよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１，１２３（１９７３））。関心対象のポリヌクレオチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従う、それらの相補体もまた、有用なポリヌクレオチドである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、１９８９年、９．５０から９．５１頁において、ストリンジェントな洗浄条件は周知であり、そして、当技術分野で理解され、そして、開示されている、
【００６３】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件については、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２〜２０℃低い、温度および塩濃度の組み合わせを選択すべきである。目的のポリヌクレオチドまたはその相補体と、少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％、それらのヌクレオチド配列と同一であるポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴｍは、たとえば、ＢｏｌｔｏｎとＭｃＣａｒｔｈｙの方程式を用いて、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８，１３９０（１９６２）、計算することができる：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
ここで、ｌ＝塩基対におけるハイブリッドの長さ。
ストリンジェントな洗浄条件は、たとえば、６５℃で、４×ＳＳＣ、または４２℃で５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、または、６５℃で、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
高度にストリンジェントな洗浄条件は、たとえば、６５℃で０．２×ＳＳＣを含む。
本発明の実施を容易にするために、以下の材料および方法が提供される。
【００６４】
異なるタグ化ＧＦＰ融合タンパク質を発現する、トランスプラストミックス株（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｌｉｎｅｓ）の作製
【００６５】
ＣＴＢ−ＧＦＰおよびＰＴＤ−ＧＦＰを発現する、形質転換植物体（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｐｌａｎｔｓ）は、以前の研究［６，３４］に記載されているように作製された。ＤＣ特異的ペプチドは、Ｐｈ．Ｄ．のスクリーニングから同定された。ＧＦＰのＣ末端に、１２−ｍｅｒのファージ  ディスプレイ  ライブラリー［２６］をコンジュゲートし、そして、葉緑体形質転換ベクターにクローニングし（ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）、そして、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰを発現するトランスプラストミックス株（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｌｉｎｅｓ）を作製し、そして、以前に記載されたサザンブロットアッセイを用いて、ホモプラスミー株（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｎｅｓ、同一内部構造系統）を確認した［３５］。
また、ＧＦＰタグ化タンパク質の発現は、ＵＶ照射下で、各構築物の葉からの緑色蛍光を可視化することによって確認した。
【００６６】
凍結乾燥
収穫した成熟した葉を、−８０℃で保存し、そして、凍結乾燥機（Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３５ＸＬ、ＶｉｒＴｉｓ  ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて凍結乾燥し、それにより、凍結および粉砕した（ｃｒｕｍｂｌｅｄ）、葉の小片を、真空の条件下（４００ｍＴｏｒｒ）、３日間、−４０℃〜２５℃で、チャンバー温度を徐々に上昇させる条件下で昇華させた。
次いで、凍結乾燥させた葉を、コーヒー粉砕機（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂｅａｃｈ）で、最高速度で、３回（各１０秒）で粉砕した。
粉末化された植物細胞は、シリカゲルを用いて、室温、気密で湿気のない状態で保存した。
【００６７】
ＧＦＰ融合タンパク質の定量およびＧＭ１結合アッセイ
ＧＦＰ融合タンパク質の定量のための、デンシトメトリー（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ  濃度測定）アッセイおよびＧＭ１  ＥＬＩＳＡアッセイは、ＧＦＰ標準タンパク質（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＭＢ−０７５２−１００）およびマウスモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（ＥＭＤ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＭＡＢ３５８０）を用いたことを除いて、以前の方法［１４］に従って行われた。ＣＴＢ−ＧＦＰの五量体構造（ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を同定するために、非変性トリストリシンゲル（Ｔｒｉｓ−ｔｒｉｃｉｎｅ  ｇｅｌ）を、以前の研究［３６］に従って実施した。
【００６８】
タグ融合ＧＦＰタンパク質の精製
ＧＦＰ融合ペプチド、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰのタンパク質精製は、前出の［３７］に記載された有機抽出／ＦＰＬＣに基づく方法によって実施した。
約２００ｍｇの凍結乾燥植物細胞を、１０ｍｌの植物抽出緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ、４００ｍＭ  スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、２％ｖ／ｖのＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤１錠を全容量１０ｍｌ中に含む）に均質にした（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）。超音波処理後、ホモジネートを回転沈降（ｓｐｕｎ  ｄｏｗｎ）させ、上清を回収した。
上清を、５０ｍｌのファルコンチューブ（ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅ）に移し、そして、以前に行ったように有機抽出（ｏｒｇａｎｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）に付した［３７］。
植物抽出物を、抽出物中の最終濃度が７０％になるように、飽和硫酸アンモニウムで、処理した。次いで、１００％エタノールの総抽出量の４分の１を添加し、２分間激しく混合し、そして、次いで回転沈降（ｓｐｕｎ  ｄｏｗｎ）した。
得られた有機相（上相）を、新しい５０ｍｌのファルコンチューブ（ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅ）に集めた。残りの水相に、１００％エタノールを総容量の１／１６加え、２分間激しく振とうし、次に再び回転沈降した。
両方の回転物（ｓｐｉｎｓ）からの有機相を、一緒にプールし、そして、５Ｍ  ＮａＣｌを総容量の１／３およびｎ−ブタノールを得られた体積の１／４添加し、２分間激しく振盪し、回転沈降した。
管の底に得られた有機抽出層（下相）を回収し、そして、次いで、７ＫＤａ  ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｚｅｂａスピンカラム  ８９８９３）に通して、脱塩した。有機抽出物を、脱塩カラムに負荷し、そして、製造業者の指示に従って回転沈降させた。
次いで、脱塩した有機抽出物（約５ｍｌ容量）を、ＦＰＬＣカラム（ＬＫＢ−ＦＰＬＣ精製システム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ；４８ｍＬカラム容量）上に負荷した。精製プロセスの間に、試料を、２０％硫酸アンモニウムで飽和した、３．５カラム容量の緩衝液Ａ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２９１ｇｍ  硫酸アンモニウム  セット、ｐＨ７．８に設定）で洗浄した。
次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ硫酸塩、ｐＨ７．８に設定した）を段階的に増加させて、ＧＦＰ融合体を溶出させた。
タンパク質は、レコーダー上にプロットされた単一のピークに対応する、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって検出された。そのピークに相当する画分を、全容量９ｍｌの単一チューブに集めた。
次いで、精製された画分を、０．０１ｘＰＢＳの２Ｌで、３回透析し、そして、次いで凍結乾燥した（Ｌａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥器）。次いで、凍結乾燥した精製ＧＦＰ融合物を、ウェスタンブロット／デンシトメトリー法により定量した。
ＣＴＢ−ＧＦＰの精製のために、凍結乾燥した葉材料（４００ｍｇ）を、２０ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０；１ｔｂのＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁させた。
再懸濁物を超音波処理し、そして、次いで、１０，０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離した。上清を、１ｍｌの、Ｈｉｓ６０  Ｎｉ樹脂（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、６３５６５７）と混合し、そして、製造者の指示に従って精製を行った。
【００６９】
純度測定およびクマシー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）
ブラッドフォードアッセイを用いて、各ＧＦＰタグ画分から精製された全タンパク質を定量し、次いで定量セクションに記載されるように、デンシトメトリーアッセイを実施して、画分中のＧＦＰ融合タンパク質の量を定量した。
次に、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイから得られたタンパク質の総量に対する、ＧＦＰ融合タンパク質の量の百分率を計算することにより、純度を評価した。
非変性条件下で、１０％ＳＤＳゲルを通過させることにより、ＧＦＰ融合タンパク質の蛍光を調べるために、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥもまた行った。
【００７０】
ＧＦＰ発現の評価
血清および組織中のＧＦＰの存在を、我々の社内のＧＦＰ  ＥＬＩＳＡによって定量化した。我々の以前の報告［６、１６］のように、最後の経口強制飼養（ｇａｖａｇｅ）の２および５時間後に、血液および組織サンプルを採取し、そして、血清を−８０℃で保存した。
組織を、ＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズし、そして、ＧＦＰ  ＥＬＩＳＡアッセイのために上清を収集した。我々の社内ＥＬＩＳＡプロトコルが確立され、そして、標準は、ＧＦＰ  ＥＬＩＳＡキット（ＡＫＲ１２１；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂ）に基づいて較正された。
簡単に説明すると、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中のヤギのポリクローナルＧＦＰ抗体（２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で、４℃で、一晩被覆した
プレートを、３７℃で、２時間、３％のＢＳＡを含むＰＢＳでブロックした。
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の、血清の連続２倍希釈液を、２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で加え、そして、４℃で一晩インキュベートした。
次いで、プレートを、ビオチン融合ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ  １：５０００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）とともに、４℃で一晩インキュベートし、続いて、１：２０００に希釈されたストレプトアビジン  ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を添加した。
３７℃で、１時間さらにインキュベートした後、プレートを洗浄し、そして、基質溶液を加え、そして、室温で１０分間インキュベートした。
１ウェルあたり、１００μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止させ、そして、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果を平均±ＳＥＭとして示す。
【００７１】
マウスおよび経口送達実験
８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＩ）を、無作為に、４群に分け（各群につき６匹）、そして、凍結乾燥したバイオ封入された、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ植物細胞を用い、経口で、２０ｍｇ／マウス／日を、３日間連続して投与した。全ての凍結乾燥材料を、２００μｌのＰＢＳに懸濁した。３日目に、最後の経口強制飼養の２時間後および５時間後に、血液サンプルを採取した。
５時間の時点で、全てのマウスを屠殺し、そして、器官（肝臓、腎臓、肺、脳、前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｍｕｓｃｌｅ（ＴＡ）））を採取し、そして、−８０℃で保存した。
対照群（ｎ＝６）には、形質転換されていない凍結乾燥植物細胞を与えた。マウスを、制御された湿度および温度条件下で、フロリダ大学およびペンシルベニア大学の動物施設に収容し、そして、実験は、動物実験および使用委員会のガイドラインに従って行った。
【００７２】
免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）
我々が、以前に記載したように［８，１６］、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＧＦＰ発現植物細胞を、２時間間隔で、２回、経口食餌した。最後の摂食から２時間後に、マウスを犠牲にし、肝臓および腸を除去した。腸を縦に切り開き、そして、ＰＢＳで洗浄した後、次いで、ロールアップし（ｒｏｌｌｅｄ  ｕｐ）、４℃で、４％パラホルムアルデヒドで、一晩、固定した。肝組織も同様に固定した。
続いて、固定した組織を、ＰＢＳ中３０％のスクロース中で、４℃で、さらにインキュベートし、そして、ＯＣＴに包埋した。連続切片を、１０μｍの厚さに切断した。
ＧＦＰ発現の分析のために、切片を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で浸透処理し、そして、ＰＢＳ中の５％ロバ血清を用いて３０分間ブロックし、続いて、１：１０００（ａｂ２９０、Ａｂｃａｍ）で、ウサギ抗ＧＦＰ抗体と共に、４℃で一晩、インキュベートした。次に、切片を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で、３０分間または、ローダミン標識Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓアグルチニン（ＵＥＡ−１；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ；１０μｇ／ｍＬ）で、１０分間、インキュベートしてから、洗浄し、そして、ＤＡＰＩ（４，６ジアミジノ−２−フェニルインドール）で、または無しで、マウントした。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ蛍光顕微鏡およびＲｅｔｉｇａ  ２０００Ｒデジタルカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ）を用いて画像を捕捉し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアで分析した。
【００７３】
精製タグ融合ＧＦＰタンパク質の、ヒト細胞株による取り込み
免疫調節細胞における３つのタグ、ＣＴＢ、ＰＴＤおよびＤＣペプチドの取り込みを決定するために、成熟樹状細胞、ヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）、ヒトＢ細胞（ＢＣＢＬ１）、マクロファージ細胞（ｍφ）、肥満細胞および非免疫調節性細胞、ヒト腎臓細胞（２９３Ｔ）、ヒト膵臓上皮様癌細胞（ＰＡＮＣ−１）およびヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ）を培養し、そして、精製されたタグ融合タンパク質のインビトロの形質転換に使用した。
細胞（２×１０４）を、それぞれ、精製されたＣＴＢ（８．８μｇ）、ＰＴＤ（１３．５μｇ）およびＤＣｐｅｐ（１．３μｇ）の融合タンパク質と合わせて、１００μｌＦＢＳで補充された１％ＰＢＳ中でインキュベートし、３７℃で、１時間インキュベートした。
ＰＢＳ洗浄後、細胞ペレットを、１：３０００に希釈したＤＡＰＩで染色し、そして、室温で、１０分間、２％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞をスライドガラス上で、細胞質（ｃｙｔｏｓｅａｌ）でシールし、共焦点顕微鏡法で調べた。
ライブイメージ研究のために、精製したＧＦＰ融合タンパク質とのインキュベーション後、樹状細胞をガラス底のマイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）上に載せ、そして、共焦点顕微鏡下で観察し、続いてＤＡＰＩで核染色した。
２９３Ｔ、ＰＡＮＣ−１およびマクロファージ細胞については、細胞を、３７℃で、８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）で一晩培養し、続いて、精製した、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ（上記と同じ）と共に、３７℃で、１時間、インキュベートした。
ＰＢＳで、ウェルを洗浄した後、細胞を、１：３０００  ＤＡＰＩで染色し、そして、室温で、１０分間、２％パラホルムアルデヒドで固定した。
ネガティブコントロール群では、細胞を、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で、市販のＧＦＰ（２μｇ）とともにインキュベートしたか、または処置をしなかった。
インキュベーションの１時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。生存している、非固定細胞を、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。
【００７４】
異なるヒト細胞株における、精製ＧＦＰ融合タンパク質の取り込み効率を決定するために、ＧＦＰシグナルを示す細胞の数を数え、そして、観察された細胞の総数に対するパーセンテージとして表した。
３つの独立した試料中の各細胞株について、合計１５〜２０枚の画像を、１００倍の倍率で共焦点顕微鏡下に記録した。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。これらは、本発明を、いかようにも限定するものではない。
【００７６】
実施例Ｉ
異なるタグと融合したＧＦＰの、ヒト細胞による取り込み
本研究では、葉緑体において異なるタグを融合させたＧＦＰを発現する植物細胞の経口投与を検討し、そして、細胞の標的化とその生体分布を評価する。
ＰＴＤ、ＤＣｐｅｐおよびＣＴＢ融合物の、異なる経路を利用した、腸上皮を横断する送達は、全身送達、生体分布、およびおそらく最も重要なことに、非免疫細胞または免疫調節細胞による異なるパターンの取り込みを齎す。
これらのペプチドは、治療タンパク質を、血清、免疫調節細胞または特定の組織に送達するために使用され得る。
【００７７】
３つの別個の経粘膜担体を試験した。
ＣＴＢ五量体とＧＭ１受容体との相互作用は、図１Ａに示すように、よく研究されている。ＧＭ１受容体のペンタ糖構造は、水素結合を介して、ＣＴＢのアミノ酸と相互作用する［３８］。対照的に、ＰＴＤ（図１Ａ）またはＤＣｐｅｐ（図１Ａ）について示された、構造の機構は完全には研究されていない。
細胞浸透性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（ＣＰＰ）の二次構造は、円二色性（ＣＤ）によって研究されてきた。そのようなペプチドは、二次構造の誘導をもたらす、負に電荷したリン脂質小胞と相互作用する。このような研究では、小さな単層小胞（Ｓｍａｌｌ  ｕｎｉ−ｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（ＳＵＶ）が使用される。しかし、転座プロセスに関する、ＣＰＰの任意の二次構造の正確な役割を定義することは、困難である。ＣＰＰは、単純なモデル系であっても、実験条件に応じて、αヘリックスからベータシートへ構造を変化させることが示されている。したがって、それらは、その構造を変化させ、急速に膜環境に適応する“カメレオン”と記述されている（３９）。
したがって、我々の研究では、二次構造は研究されなかったが、しかし、計算上の３−Ｄ構造を予測するために、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ(ｉｎｔｅｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔプログラム）を用いた［４０］。
【００７８】
図１Ａにおいて、代表モデルは、信頼スコア（Ｃ−スコア）、二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を有する高分解能モデル、およびテンプレートモデリングスコア（ＴＭ−スコア）のようなパラメーターの計算に基づいて選択された。
たとえば、最初のＩ−ＴＡＳＳＥＲモデルと、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）ライブラリの対応する構造との位相的類似性を評価する、ＴＭ−スコアが、０．５より大きい場合、予測されるトポロジーは正しい［４０］。予測モデルから、ＰＴＤのＴＭ−スコアは０．６０±０．１４であり、そして、ＤＣｐｅｐのＴＭ−スコアは０．５８±０．１４であった。予測構造では、ＰＴＤはらせん構造を有するが、ＤＣｐｅｐはループ構造を示す。予想通り、２つのペプチド間に類似性はない。
３つのタグ全てを緑色蛍光タンパク質（ｓｍＧＦＰ）に融合させて、その効率および特異性を評価した。
ＣＴＢ（ＭＩＫＬＫＦＧＶＦＦＴＶＬＬＳＳＡＹＡＨＧＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬＮＤＫＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫＲＥＭＡＩＩＴＦＫＮＧＡＴＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＡＹＬＥＡＫＶＥＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＨＡＩＡＡＩＳＭＡＮ；配列番号１）を、フーリン切断部位Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号２）を介して、Ｎ末端でＧＦＰと融合させた［６］。
膵臓および十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ−１）［４１］に由来する、１６個のアミノ酸（ＲＨＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号３）を、Ｎ末端で、ＧＦＰと融合し、そして、この研究ではＰＴＤ−ＧＦＰと呼ぶ。
核標的化のためには、さらなる局在化シグナルが必要である。
１６ａａ−ＰＴＤの６つのアミノ酸（ＲＨ、ＲＲ、およびＫＫ）は、ＰＤＸ−１の核局在化に重要である（４２）。
１２−ｍｅｒのファージ  ディスプレイ  ライブラリー［２６］のスクリーニングから同定された、ヒト樹状細胞特異的ペプチドリガンド（ＦＹＰＳＹＨＳＴＰＱＲＰ（配列番号４））を、ＧＦＰのＣ末端に融合させる。
ＰＴＤおよびＤＣ−ペプチドの両方を、フーリン切断部位が無いように操作して、侵入および組織分布を研究した。
材料・方法のセクションで記載するように、すべてのこれら三つの融合構築物は、葉緑体を形質転換するために使用された、葉緑体形質転換ベクターにクローニングされた（ｐＬＤ）。
【００７９】
ＧＦＰ融合タンパク質を発現する植物を作製するために、タバコ葉緑体を、バイオリスティック粒子送達システム（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて形質転換した。
図１Ｂに見られるように、各タグ融合ＧＦＰは、同一の調節配列−ｐｓｂＡ  プロモーターおよび光によって制御される５’ＵＴＲ、そして、転写されたｍＲＮＡは、３‘  ｐｓｂＡ  ＵＴＲにより安定化される−により駆動される。ｐｓｂＡ遺伝子は、最も高発現の葉緑体遺伝子であり、そして、従って、ｐｓｂＡ調節配列は、我々の実験室での導入遺伝子発現のために使用されている［７、３５］。
発現カセットの葉緑体ゲノムへの組み込みを容易にするために、イソロイシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ｔｒｎＩ）およびアラニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ｔｒｎＡ）遺伝子の２つの隣接配列が、天然の葉緑体ゲノム配列と同一である発現カセットに隣接する。
選択培地からの新芽（ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｓｈｏｏｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）は、ｔｒｎＩおよびｔｒｎＡのスペーサー領域での、導入遺伝子カセット（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）の特異的組込みについて、そして、次いで、ｔｒｎＩおよびｔｒｎＡの隣接配列を含む、Ｄｉｇ標識プローブを用いた、サザンブロット分析によって、各植物細胞中のすべての葉緑体ゲノムの形質転換（非形質転換の野生型の葉緑体ゲノムが不存在）が調べられた。（図１Ｃ）。
図１Ｃに見られるように、各ＧＦＰ植物の３系統由来のＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｇＤＮＡは、プローブとハイブリダイズした場合に、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰについて、それぞれ、７．０６，６．７９および６．７８ｋｂｐの、形質転換された大きなＤＮＡ断片および、未形質転換のより小さい断片（４．３７ｋｂｐ）の不存在を示した。
従って、３つの異なるＧＦＰ発現カセットの安定な組み込みと、導入遺伝子との葉緑体ゲノムのホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｙ）が確認された。
さらに、ＵＶ光下で緑色蛍光を視覚化することにより、ＧＦＰ発現を表現型的に（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ）モニターした（図１Ｄ）。
【００８０】
各ＧＦＰでタグ化された植物葉材料のバイオマスをスケールアップするために、各ホモプラスミック株（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｎｅ）を、温度および湿度制御自動化温室内で生育させた。完全に成長した成熟葉を、光調節された制御配列によって駆動されるＧＦＰ融合タンパク質の蓄積を最大にするために、遅い夕方に収穫した。乾燥重量ベースで、融合タンパク質の含有量をさらに増加させるために、凍結した葉を、真空下、−４０℃で、凍結乾燥させた。凍結乾燥は、タンパク質の濃縮効果に加えて、室温で、１年以上、植物で発現される治療用タンパク質の貯蔵寿命を延長した［１３］。
したがって、この実施例では、ＧＦＰ融合タグタンパク質を発現する、凍結乾燥および粉末化された植物細胞を、マウスの経口送達に使用した。ＧＦＰ融合タグタンパク質のイムノブロットアッセイは、新鮮な、および、４月齢の凍結乾燥した葉で、同一サイズのタンパク質を示し（図１Ｅ）、凍結乾燥中の融合タンパク質の安定性および室温での延長された保存を確認した。
イムノブロットイメージにおいて、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰの、それぞれ、３９．５ｋＤａ、２９．２ｋＤａおよび２８．３ｋＤａの単量体に加えて、ＰＴＤ−ＧＦＰ（５８．４ｋＤａ）およびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ（５６．６ｋＤａ）の二量体もまた検出された（図１Ｅ）。ホモダイマー化は、溶液中および結晶中に生じる、ＧＦＰの物理化学的特徴の１つである。モノマー間の接触は、各モノマーからの疎水性側鎖のコアおよび多数の親水性接触からなる広範な相互作用のために非常に堅い［４３］。
また、ＣＴＢモノマーは、水素結合、塩橋および疎水性相互作用［４４］によって媒介される、五量体構造内のサブユニット間相互作用により、非常に安定で、熱および変性剤に抵抗性である五量体構造に自己集合することができる。
ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰについて、粉末凍結乾燥葉材料におけるＧＦＰタンパク質濃度は、それぞれ、５．６μｇ／ｍｇ、２４．１μｇ／ｍｇおよび２．１６μｇ／ｍｇであった（図１Ｃ）。凍結乾燥後のＧＦＰタンパク質濃度は、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰについて、それぞれ、１７．１倍、１２．７倍および１８．８倍増加した（図１Ｆ）。凍結乾燥による新鮮な葉からの水の除去は、重量で９０〜９５％の減少に帰する。この効果は、次いで、乾燥葉１グラム当たり、タンパク質の１０〜２０倍の増加として現れる［１３，１５，４５］。
【００８１】
植物細胞の経口送達後における、異なる組織でのＧＦＰの取り込み
経口送達のために、凍結乾燥した植物細胞（２０ｍｇ）を、均一容量（２００μｌ）および同様の期間で再水和させた。分散された植物細胞は、成熟した植物細胞のサイズが均一であるため、そのサイズが変化しない。図２に示すように、ＧＦＰの生体分布は、有意な変化を示さない。ＧＦＰを発現する凍結乾燥された植物細胞（ＰＴＤまたはＣＴＢまたはＤＣペプチドと融合した）の経口送達後、全身ＧＦＰレベルは、試験した他の任意のタグよりも、ＰＴＤ−ＧＦＰ給餌動物においてより高かった（図２Ａ）。
肝臓および肺への体内分布は、他の組織（骨格筋、腎臓）よりも実質的に高かった。これらの組織におけるＧＦＰレベルは、ＰＴＤ融合タンパク質について一貫して最高であった（図２Ｂ）。ＧＦＰ特異的抗体を用いた、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）的研究は、送達ルートについて更なる洞察を提供した。
図３Ａ（３Ｃの挿入）に示されるように、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８  標識二次抗体を用いた、ＧＦＰの高感度検出方法は、ＰＴＤタグが、腸上皮細胞による、あるＧＦＰ取り込みを齎すことを明らかにした。
一次抗体が使用されていない場合、または形質転換されていないタバコ細胞を給餌されたマウス由来の組織では、ＧＦＰは検出されなかった（図３Ｂ）。植物細胞が位置し、そして、抗原取込みが観察され得る、腸の領域をより容易に見出すために、固定前に小腸を丸めて、近位および遠位部分が同じスライド上で見えるようにした（図３Ｃ）。
回腸絨毛（ｖｉｌｌｉ  ｏｆ  ｉｌｅｕｍ）の間に、ＧＦＰを発現する植物細胞が存在すると（図３ＣおよびＥ）、植物細胞を消化器系から保護する最初の直接的証拠が得られる。ＣＴＢタグを使用した場合、上皮細胞へのＧＦＰのより広範な送達もまた見られ（図３Ｄ）、そして、これは、ＣＴＢペンタマーによるＧＭ１受容体の効率的な標的化によるものである。我々は、上皮細胞への送達に加えて、全ての融合タグによって、Ｍ細胞によるＧＦＰの取り込みについての証拠も見出した（図３Ｃ〜Ｆの実線の矢印）。
再び、これらの所見は、腸内での溶解後の上部腸におけるタンパク質の取り込みについての直接的な証拠を提供するものである。
図３Ｅは、特に、回腸の上皮細胞（「ＥＣ」）およびＭ細胞（黒矢印）への放出されたＧＦＰの送達部位の近くのＣＴＢ−ＧＦＰのトランスプラストミック植物の、ＧＦＰ＋植物細胞（「ＰＣ」）の存在を示す。ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰについては、ＧＦＰ＋上皮細胞は観察されなかった。しかし、ＧＦＰおよびＭ細胞の共局在化の例を見出し（図３Ｆ）、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰの全身送達が、Ｍ細胞を介する腸管腔からの輸送によって、可能であることを示唆する。
血液は、腸から門脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）（肝臓−肝臓軸（ｇｕｔ−ｌｉｖｅｒ−ａｘｉｓ）を介して、腸から肝臓に抗原を運ぶことができるので、期待されるように、全ての３つのタグと共に送達されたＧＦＰは、肝臓における蓄積を示した（図３Ｈ、ＪおよびＬ）。
【００８２】
異なるタグと融合したＧＦＰの精製
異なる細胞型によるＧＦＰの取り込みを研究するために、ＰＴＤ−ＧＦＰおよび、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰについてはｔｏｙｏ  ｐｅａｒｌ  ｂｕｔｙｌカラムを使用し、そして、ＣＴＢ−ＧＦＰについてはＮｉ２＋カラムを使用して、ＧＦＰ融合タンパク質を精製した。純度を調べるために、ウェスタンブロットおよびＧＦＰ標準を用いて、デンシトメトリーを行った（図４Ａ）。各タグと融合したＧＦＰの純度は、ＰＴＤ−ＧＦＰについては〜９５％、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰについては〜５２％、および、ＣＴＢ−ＧＦＰについて〜１３％であった。
純度レベルの変動は、精製後に回収されたＧＦＰ融合タンパク質に反映される、各タグの発現レベルの差に帰する。タンパク質は、疎水性相互作用に基づいて精製されるので、他の疎水性タンパク質が、精製画分に存在する可能性がある。
ＣＴＢ−ＧＦＰの精製は親和性Ｎｉ２＋カラムを用いて行った。ＣＴＢの五量体構造が形成されると、ヒスチジンクラスターが生成され、そして、ヒスチジンクラスターのイミダゾール環はＮｉ２＋と相互作用する［４６］。ＣＴＢ−ＧＦＰの低純度は、より程度のストリンジェントな洗浄工程のためであるが、ストリンジェンシーを増加させることは、融合タンパク質のより高い損失を伴う。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色したゲル（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎｅｄ  ｇｅｌｓ）中の、精製したＧＦＰ融合タンパク質は、ＰＴＤ−ＧＦＰ、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰおよびＣＴＢ−ＧＦＰ、それぞれについて、予想されるサイズ（２９．２ｋＤａ、２８．３ｋＤａおよび３９．５ｋＤａ）で、各融合タンパク質について明確なバンドを示した（図４Ｂ）。ＰＴＤ−ＧＦＰの場合、期待されるサイズの周りに２つのバンドがあり、それらは２９．２および２８．３ｋＤａであった。ＧＦＰのＣ末端テール（Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）は、カルボキシペプチダーゼおよび、プロテイナーゼＫおよびプロナーゼおよび種々のアイソフォームを含む非特異的プロテアーゼによって、タンパク質的分解に極めて切断されやすく、部分的なタンパク質分解切断により引き起こされ、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、およびネイティブゲル電気泳動によって生成されることが報告されている［４７］。
ＧＦＰ蛍光を定量するために、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われ、蛍光強度は、ＰＴＤ−ＧＦＰ（レーン１）が最強であった（図４Ｃ）。
ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ（レーン２）において、二量体化したＧＦＰを示す可能性が最も高いトップバンドを有する［４７］、３つの異なるタンパク質が見られ、、それはＰＴＤ−ＧＦＰでも同様に観察されたが、それははるかに高い強度であった。
ＣＴＢ−ＧＦＰ融合物は、ＣＴＢ融合ＧＦＰの五量体化およびおそらく多量体を示す他のより高いバンドに対応する１９０ｋＤａから始まる一組のより大きな蛍光バンド（レーン３）を示した。同じレーンでは、ＰＴＤ−ＧＦＰおよびＤＣｐｅｐ−ＧＦＰで観察されたものと同様に、異なる折り畳み産物であり得る、ＧＦＰ標準よりわずかに低い、より小さな断片が観察された。
精製されたＣＴＢ−ＧＦＰの五量体構造（ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の適切な形成を評価するために、抗ＣＴＢおよび抗ＧＦＰ抗体を用いて、ＧＭ１結合アッセイを行った。ＣＴＢの五量体構造（ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、哺乳類細胞の表面上に遍在する、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＭ１受容体に強い結合親和性を有することはよく知られている［４８］。図４Ｄに見られるように、ＣＴＢおよびＣＴＢ−ＧＦＰのみが結合親和性を示し、ＣＴＢとＧＭ１との間の複合体の形成を示した。
また、抗ＧＦＰ抗体を用いて、ＧＭ１−ＣＴＢ−ＧＦＰの相互作用を再確認した。
ＣＴＢ−ＧＦＰのみが検出され得る（図４Ｅ）。
ＣＴＢ−ＧＦＰの五量体構造を、さらに確認するために、精製されたＣＴＢ−ＧＦＰを、非変性条件下で、修飾Ｔｒｉｓ−トリシン  ゲル上に流し［３６］、そして、抗ＣＴＢ抗体を用いて精査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
予想された五量体ＣＴＢ−ＧＦＰ形態は、〜２００ｋＤａで、３９．５ｋＤａの単量体形態と並んで（ａｌｏｎｇ  ｗｉｔｈ）検出された（図４Ｆ）。
ゲルおよび電気泳動緩衝液中に添加された、ＳＤＳに起因して、実行中に、モノマーがオリゴマー構造から解離する可能性がある。したがって、ＣＴＢ−ＧＦＰ融合タンパク質は、五量体構造を形成し、そして、ＧＭ１受容体に結合する能力を保持したが、ＰＴＤ−ＧＦＰまたはＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ融合タンパク質に対する、ＧＭ１結合親和性はない。
【００８３】
異なるタグと融合したＧＦＰの、ヒト免疫および非免疫細胞による、取り込み
精製されたＧＦＰ融合タンパク質を、ヒト培養細胞と共にインキュベートした。血液単球由来の成熟ＤＣ、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）、Ｂ細胞（ＢＣＢＬ１）、分化マクロファージおよびマスト細胞を、インビトロの研究のために培養した。非免疫細胞の例として、ヒト腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）およびヒト膵上皮癌細胞（ＰＡＮＣ−１）を並行して試験した。細胞（２×１０４）を、精製したＣＴＢ、ＰＴＤおよびＤＣ標的ペプチド融合ＧＦＰと共に、３７℃で、１時間インキュベートした。ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰとのインキュベーションで、細胞内ＧＦＰシグナルは、ＤＣのみで検出され、そして、他の細胞型では検出されず、その特異性が確認された（図５Ａ）。
ＰＴＤ−ＧＦＰは、腎臓細胞または膵臓細胞に入ったが、いずれの免疫調節細胞にも入らなかった（図５Ａ）。
ＰＴＤ配列は、膵臓細胞での、インスリン発現を誘導するＰＤＸ１に由来し、そして、外因性ＰＤＸ１は、マウスの膵島細胞腫株（インスリノーマ細胞株）に侵入することができ、そして、インスリン遺伝子を活性化した［４１］。予想通り、精製されたＰＴＤ−ＧＦＰと共にインキュベートした場合、ＰＡＮＣ−１細胞から強いＧＦＰのシグナルが観察された。また、ＰＴＤ−ＧＦＰは、膵管上皮細胞の核で観察された（図５Ｂ）。ＰＴＤの細胞浸透能は、また、ヒト腎細胞株においても明らかであった（図５Ａ）。
極めて対照的に、ＧＦＰシグナルは、全ての細胞型において、ＣＴＢ−ＧＦＰとインキュベーションすると検出され、ＧＭ１受容体の遍在（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ）と一致した（図５Ａ）。
脊髄由来のマウス肥満細胞（創傷治癒、病原体に対する防御、およびアレルギー反応において重要な役割を果たす細胞型）は、ＤＣｐｅｐまたはＰＴＤによって送達されるＧＦＰの内部移行を示さないが、ＣＴＢ融合ＧＦＰは効率的に取り込まれた（図５Ａ）。
本明細書には、一つの代表的な画像だけが提示されているが、取り込み研究は、三重に行われ、そして、各細胞株について、１５−２０の画像が、共焦点顕微鏡の下で記録された。検査した全ての細胞型の７０〜９２％において、ＣＴＢ−ＧＦＰが観察され、そして、その変動は、それらの取り込みに対する、ＧＦＰの低い利用可能性を齎す、細胞密度の差に起因する。ＰＴＤ−ＧＦＰの場合、腎細胞および膵臓細胞を除く、他の任意の細胞型では、取り込みは観察されなかった（０％）。ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰは、樹状細胞以外の、他の細胞型では観察されなかった（０％）（表１）。
この研究は、タンパク質医薬品を、血清、免疫系または特定の器官または組織に送達する特異性を提供し、それによって、この新規概念のさらなる進歩を促進する。
【００８４】
表１：ヒト細胞株における、精製されたＧＦＰ融合タンパク質の取り込み効率
異なる３つのタグによる、ヒト細胞株に対する、ＧＦＰの相対的な送達効率を、共焦点顕微鏡下、１００倍の倍率でＧＦＰシグナルを示す細胞の数を数えることによって比較した。
合計１５−２０の画像が各細胞株について観察された。
すべての細胞株を三重に検査した。
2019503341.tif 000003
【００８５】
４．議論
我々の以前の出版物［６−１６］では、ＣＴＢと融合した、植物細胞由来のタンパク質が、循環系への機能性タンパク質および免疫系へのタンパク質抗原の送達を含む、様々な適用のために、腸管上皮を介して送達することができることを示した（経口寛容誘導またはブースターワクチン（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ）として）。
これは、腸上皮細胞およびＭ細胞の表面上の、ＧＭ１受容体にＣＴＢペンタマーが結合し、続いてトランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が起こるために可能である。しかし、ＧＭ１は、多くの異なる細胞型によって広く発現されており、そして、特定の細胞型を標的とすることは困難である。したがって、この研究では、より細胞型特異的および／またはより効率的な経粘膜送達のいずれかを齎す、代替タグを開発することを模索した。
プロフェッショナル抗原（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）提示細胞への特異的送達の例として、ＤＣｐｅｐを選択し、そして、その特異性を確認することができた。ＰＴＤは、腸上皮細胞の侵入を介して、ＧＦＰカーゴ（ｃａｒｇｏ）を、循環へより効果的に送達するだけでなく（図３Ａおよび３Ｃ）、免疫細胞への送達を完全に回避する（図５Ａ）。
我々の意見では、ここで、ＰＴＤについて示されたデータは、非特異的であるという、従来の仮定とは全く対照的であり、薬物送達におけるパラダイムシフトである。
ＰＴＤによる細胞浸透のメカニズム（マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）  対  直接移動）および、ＰＴＤ対それらの運ぶカーゴの効果についての、文献における最近の意見の不一致を考えると（４９）、これはこの分野への極めてタイムリーな貢献である。ＰＴＤの特定の選択によって、身体の免疫系が、タンパク質医薬品送達から除外でき、一方、他の細胞型および循環系に効率的に送達されることを、我々のデータは、示している。したがって、この研究は、予め選択されたＰＴＤを使用して、選択された組織型への、治療剤の特異的標的化を増加させるための新しいアプローチを提供する。配列と構造的知識とを組み合わされて、カスタム設計されたＰＴＤを生成することができる。本発明者らは、標的細胞型の機能としての、異なるタグ間のタンパク質形質導入における差異を実証するために、規定されたインビトロシステムを使用した。このアプローチはまた、ＧＦＰの代わりに、疾患特異的抗原および対応する動物モデルが使用される場合、免疫学的結果を評価するためにも使用され得る。
【００８６】
ＧＦＰ融合タンパク質が、腸上皮層を通過し、そして、循環への送達および他の器官への生体内分配されるルートを明らかにするために、３つのＧＦＰタグタンパク質を発現する葉材料の経口送達後の小腸組織切片の免疫染色研究が行われた。
ＣＴＢは、上皮細胞上のＧＭ１受容体に、Ｍ細胞によって、標的化できることが確認された。我々の研究は、ＰＴＤが、非免疫細胞に浸透することができ、なぜこのタグがまた、ＧＦＰを上皮細胞に転移させるのかを説明できることを見出だした。
対照的に、ＤＣペプチドは、樹状細胞に対する特異的リガンドであり、そして、したがって上皮細胞を標的化しない。しかし、我々のデータは、Ｍ細胞による取り込みが、ＤＣｐｅｐ融合物の進入のメカニズムであることを示し、したがって、経口経路を介したＤＣｐｅｐ−ＧＦＰの全身的送達がどのようにして可能であるかを説明する。
樹状細胞はまた、上皮細胞間のそれらの突起（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ）を介して、ＤＣｐｅｐによって直接標的化される。
しかしながら、この機作によって採取された、腸管内抗原の量は、可視化するには小さすぎる。
【００８７】
我々は、トランスサイトーシス後に、ＣＴＢから放出されるタンパク質抗原は、腸内免疫系において、ＤＣによって（そして、より狭い範囲ではあるが、マクロファージによって）取り込まれ（広範囲に公開されているように）、そして、Ｍ細胞によって転移されるＤＣｐｅｐ−ＧＦＰも、また、ＤＣによって、取り込まれることを予期する。しかしながら、免疫細胞との相互作用の初期の研究のために、我々は、より高感度で、かつ、培養ヒト細胞を用いた、規定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチを利用した。
ＣＴＢ融合物は、非免疫および免疫細胞を含む、試験される全ての組織および細胞型に、ＧＦＰを送達した。我々の研究室では、ＣＴＢが、ＧＭ１ガングリオシドと特異的に結合し、そして、葉緑体で発現される様々なＣＴＢ融合タンパク質も、また、ＧＭ１と強い結合親和性を示すことは十分に確立されている［６，８，９，１３−１６］。一旦、ＣＴＢが、腸上皮細胞の膜脂質ラフト（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）に富化された、ＧＭ１と結合すると、細胞侵入のために、トランスゴルジネットワーク（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）を介して、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）（ＥＲ）に逆行（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ）移動する［５０，５１］。
実際、ＣＴＢは、ＧＭ１およびその細胞および細胞内分布を、定量的に研究するために、プローブとして広く使用されてきた［５２］。ＣＴＢを、経粘膜担体として使用することにより、ＧＭ１およびヒト腸の大きな粘膜領域（体重に対して、約１．８−２．７ｍ２）に対する、強力な結合親和性を介して、コンジュゲートしたタンパク質の循環への輸送を促進することができる［５３］。
最大１５，０００のＣＴＢ分子が、一度に、１つの腸上皮細胞に結合することができ［５４］、そして、ＧＭ１受容体は、細胞表面上で急速に交換する（ｔｕｒｎｓ  ｏｖｅｒ）［５５］。さらに、ＧＭ１ガングリオシドは、また、神経系および網膜において、特に豊富な、他の多くの細胞型の原形質膜にも見出されており［５６，５７］、したがって、これらの細胞におけるＣＴＢ融合タンパク質の効率的な取り込みを導く。
自己抗原および遺伝性疾患（血友病およびリソソーム蓄積障害など）の置換療法に使用される治療用タンパク質に対する、我々の経口寛容誘導の戦略は、ＣＴＢタグからの抗原の放出、およびＤＣによる取り込み［７，９，１０，１１，３３］を齎す、経粘膜送達およびタンパク質分解性切断に続く、ＣＴＢによる腸管上皮細胞の効率的な標的化に、部分的に依拠する。
しかしながら、ＤＣおよびマクロファージは、また、腸管腔内の抗原を直接的にも採取し、そして、Ｍ細胞は、上皮を横切って無傷の抗原を、ＤＣに富む領域に運ぶことができる。本発明者らの新たなデータは、ＣＴＢ融合物が、ＤＣ、マクロファージ、および他の免疫細胞によって効率的に取り込まれることを示し、植物ベースの免疫調節プロトコルにおける、ＣＴＢ融合抗原の有効性についてのさらなる説明を提供する。
【００８８】
免疫系への送達に理想的な、ＤＣｐｅｐによる樹状細胞の特異的ターゲティング
ここでは、免疫療法の可能性の高い、代替の、および、より特異的なペプチド配列を紹介する。ＤＣｐｅｐは、ＤＣを、特異的に、標的とするが、他の免疫細胞または非免疫細胞を標的としない。翻訳の影響を評価するために、我々は、融合タグの標的特性を区別するために、主として、ヒト免疫細胞を使用した。ＤＣｐｅｐは、完全なＧＦＰ抗原のみを、ＤＣに送達したが、他のいずれのＡＰＣまたは免疫細胞または非免疫細胞には送達しなかった。この発見と一致して、ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰは、インビボで、腸管上皮細胞を標的化することはできなかった。全身送達は、Ｍ細胞による取込みに起因する可能性が最も高い。今後は、活性化シグナルに依存して、Ｔｒｅｇ誘導および免疫刺激において、重要な機能を有する、ＤＣに対する特異的送達に基づいて、免疫寛容およびワクチンプロトコルを設計することができる。
【００８９】
我々が、知っているように、リンパ節への抗原の送達は、免疫療法にとって非常に重要である。しかし、この側面は、抗原をＴ細胞に提示するために、ＤＣがリンパ節に移動するまで、粘膜固有層（ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ）またはパイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ａ）内のＤＣによって取り込まれたタンパク質が、小ペプチドに断片化され、そして、ＭＨＣ分子に負荷されるため、ＧＦＰシグナルによって直接的に証明することはできない。
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）が、摂取した抗原に対する応答において、重要であるという考えに同意して、我々は最近、トランスプラストミック植物細胞の経口送達を受けたマウスの異なるＤＣサブセットにおける増加およびＭＬＮにおける、Ｔｒｅｇの誘導を実証した［１０］。
【００９０】
ＰＴＤは、免疫系を除く、経口経路による効率的な全身送達に理想的である
ＣＴＢ融合物は、効果的に、腸内免疫系を標的とし、そして、寛容誘導に有用であるが、免疫合併症（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を回避する代替戦略は、免疫系との相互作用を最小限に抑えることである。
ＰＤＸ−１のタンパク質形質導入ドメインは、ＧＦＰの、異なる細胞型への移行において独特の選択性を示した。ＰＴＤ−ＧＦＰは、抗原を、ＡＰＣおよびリンパ球に送達することに完全に失敗したが、（ｉｎ  ｖｉｖｏでの、腸上皮細胞を含む）非免疫細胞に、ＧＦＰを、転送することができた。骨髄系およびリンパ系の細胞は造血細胞であるため、ＰＤＸ−１はこの特定の細胞株に形質導入できない可能性がある。ＰＤＸ−１は、レセプター媒介性取り込みとは異なる、特殊な形態のエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）であるマクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介したタンパク質形質導入時に、インスリン発現を誘導する［５９，６０］。
マクロピノサイトーシスはまた、腎臓における巨大分子の取り込みの主なメカニズムであるので、精製したＰＴＤ−ＧＦＰとのインキュベーションした後、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＧＦＰシグナルの観察は、ＰＴＤによるエンドサイトーシス誘発の結果であり得る。
ＰＴＤ−ＧＦＰとのインキュベーション後の免疫細胞におけるＧＦＰシグナルの欠如は、
ｉ）細胞表面への結合もまた欠如しており、および
ｉｉ）マクロピノサイトーシス機構をも利用する、ＨＩＶ  ｔａｔのＰＴＤは、ＨＩＶ  ｔａｔのＰＴＤによって、インタクトなＧＦＰを、ヒトＤＣおよび他のＡＰＣに容易に送達する［６１−６３］ために、取り込み後の分解の増強によって説明することはできない、むしる、これらの細胞のタンパク質の形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の失敗を反映する。
ＰＤＸ−１由来のＰＴＤは、おそらくは、標的細胞膜の表面特性に関連する、細胞形質導入の明確な選択性を明らかに示す。
両方のＰＴＤが、マクロピノサイトーシスによって、細胞に入るが、それらのアミノ酸配列は非常に異なり、これは細胞表面結合に影響を及ぼす可能性が高い。リンパ球の感染は、ＨＩＶのライフサイクルの重要な段階であるが、インスリンの発現は、厳密に制御され、そして、環境刺激に反応する必要がある。［６４］これは、一部、ＰＤＸ−１からのＰＴＤの選択性に関与する可能性がある。
同時に、ＰＴＤ−ＧＦＰは、高血圧およびホルモンまたはサイトカイン療法の治療の公表された例のように、血液中の特定のタンパク質レベルを必要とする治療に利用できる、全身性タンパク質送達において、インビボで優れていた［９、１１，１４，１５］。
興味深いことに、全身送達の顕著な差異にもかかわらず、ＣＴＢ−、ＤＣｐｅｐ−およびＰＴＤ−タグは、全て、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡによってより定量的に証明されるように、肝臓において非常に類似したＧＦＰ抗原レベルを齎した。
腸および肝臓における応答間の関連は、長い間知られており、そして、しばしば「腸管肝臓軸（ｇｕｔ−ｌｉｖｅｒ  ａｘｉｓ）」と呼ばれている。
腸による取り込まれると、抗原は、腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）を通過する経路である、移動性（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）ＤＣを介して、間接的に、肝臓に輸送され得る。あるいは、血液は、門脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）を介して、腸から肝臓に抗原を運ぶことができる。肝臓におけるＧＦＰの定量可能なレベルの広範な分布を考えると、後者の説明は、我々の送達システムに対して、より可能性が高いようである。
データは、肝臓が、経口送達された抗原を、タグにあまり依存しない飽和レベルまで、取り込むことを示唆する。
【００９１】
植物細胞にバイオ封入されたタンパク質の送達のユニークな利点
植物細胞の凍結乾燥にはいくつかの利点がある。凍結乾燥された粉末葉は、注射可能なタンパク質医薬品に必要とされる、高価な冷蔵保存および輸送を排除して、室温で数年保存することができる［１３，６５］。また、治療タンパク質の濃縮効果は、凍結乾燥された植物細胞を含むカプセルのサイズにおいて、１０〜２０倍の減少を促進するように増加する。
凍結乾燥技術は、製薬産業による、血液凝固因子の保存を含む、タンパク質医薬品の保存に広く使用されている。したがって、凍結乾燥プロセスはタンパク質を変性させない。実際、私たちは、凍結乾燥は、適切な折り畳みおよびジスルフィド結合を保存することを、繰り返し示してきた。（１１、１３−１６、６６）。経口送達の際に、凍結乾燥された植物細胞は腸に到達し、そして、植物細胞壁の消化により、腸内微生物によって、生体封入されたタンパク質が放出される。その時、放出されたタンパク質および植物の細胞壁は、腸内微生物によって分解され得る。しかし、腸内微生物は、タンパク質分解よりも植物細胞壁を分解するために、より多くの酵素を放出する、嫌気性細菌によって豊富化される可能性がある。ヒトの腸内に生息する細菌は、実際に、植物の細胞壁の複雑な炭水化物を利用するように進化し、ほぼすべての植物グリカンを利用することができる［４，５］。我々の以前に発表された研究では、植物の細胞壁を分解するために必要な酵素が同定されている［６７、６８］。
いくつかの機能性タンパク質の送達は、それらが腸内腔で保護されるか、または腸管内プロテアーゼに耐えられる適切な量のタンパク質医薬品が放出されることを示す。
【００９２】
ＤＣｐｅｐ−ＧＦＰ含量は、３つの融合タンパク質の中で最も低い、２．１６μｇ／ｍｇで、これはＰＴＤ−ＧＦＰの１０倍低いことが分かった。一般に、外来タンパク質の葉緑体の発現は、葉緑体ゲノムのコピー数が高いために、葉タンパク質全体の非常に高いレベル、７０％まで、に達する可能性がある［７］。しかしながら、発現レベルは、タンパク質、Ｎ末端融合、タンパク質分解における切断および安定性に基づいて変化する。この研究では、すべてのキメラ遺伝子は、ｐｓｂＡプロモーターおよびｐｓｂＡ  ５‘ＵＴＲによって駆動され（ｄｒｉｖｅｎ）、そして、ｐｓｂＡ  ３’ＵＴＲによって安定化された。
ＧＦＰ配列もまた、３つ全ての構築物の間で同じであるので、発現レベルの差に影響を及ぼす寄与因子は、融合構築物のＮ末端配列に起因する可能性がある。
ＰＴＤとＣＴＢタグと対照的に、ＤＣｐｅｐは、ＧＦＰのＣ末端に融合させた。したがって、ＤＣｐｅｐ融合のより低いレベルのＧＦＰ発現についての可能な説明の１つは、Ｎ末端の保護が不十分であることである。
【００９３】
結論
上記に説明したように、遺伝的に改変された植物細胞で発現されるタンパク質薬剤の経口送達の生物学的利用能は、現在、自己免疫疾患に対する寛容性を誘導するため［７］、または注射によるタンパク質医薬品の毒性を排除し［８−１０］、または糖尿病［１２，１３］、高血圧［１４］、網膜症に対する防御［１５］、またはアルツハイマーの脳におけるプラークの除去［１６］を治療するために、機能的血液タンパク質を送達することは、新しい概念として、現在、話題沸騰である。インスリンまたはエキセンディン−４を使用して、血糖値を低下させるために、経口送達が注射可能な送達と同じくらい効果的であった、糖尿病の研究で見られるように、これらの新規なアプローチは、ヘルスケアの経費を顕著に低下させることに加えて、患者のコンプライアンスを改善するはずである［１２，１３］。
この研究は、免疫系に干渉することなく、免疫調節細胞または非免疫細胞に、または、直接、血清に、送達するために、異なる融合タグの利用を可能にした。これは、代謝経路を調節するために、免疫または機能性タンパク質を増強または抑制させるために、低コストの経口送達の可能性を開くものである。タンパク質医薬品のコストは、現在、国々の７５％を超えるＧＤＰを上回っており、それらに手が届かない。これは、それらの非常に高価な発酵槽での生産、精製、冷蔵貯蔵／輸送、貯蔵寿命の短さ、および滅菌送達方法のためである。
モデルとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、本発明者らは、この研究において、植物細胞がＧＦＰを消化系から保護し、それが上皮細胞によって吸収される腸管腔内に放出することを実証する。ＧＦＰに融合された送達タグに基づいて、それらは、循環系、免疫細胞または非免疫細胞、特定の器官または組織に到達する。
このような低コストのタンパク質医薬品の経口送達は、患者のコンプライアンスを増加させ、そして、現在使用されている、極めて高価なプロセス／注射を排除することによってコストを劇的に低下させる。
【００９４】
参考文献
[1] Walsh, G.  Biopharmaceutical benchmarks 2014. Nature Biotechnology 2014; 32:  992-1000.
[2] Jin S, Daniell H. Engineered chloroplast genome just got smarter. Trends in Plant Science 2015; 20: 622-640.
[3] Chan HT, Daniell H. Plant-made vaccines against human infectious diseases-Are we there yet? Plant Biotechnol J 2015; 13: 1056-1070.
[4] Martens EC, Lowe EC, Chiang H, Pudlo NA, Wu M, McNulty NP, et al. Recognition and degradation of plant cell wall polysaccharides by two human gut symbionts. PLoS Biol 2011; 9, e1001221 
[5] Flint HJ, Bayer EA, Rincon MT, Lamed R. White BA. Polysaccharide utilization by gut bacteria: potential for new insights from genomic analysis. Nat Rev Microbiol 2008; 6: 121-131.
[6] Limaye A, Koya V, Samsam M, Daniell H. Receptor-mediated oral delivery of a bioencapsulated green fluorescent protein expressed in transgenic chloroplasts into the mouse circulatory system. FASEB J 2006; 20:959-961.
[7] Ruhlman T, Ahangari R, Devine A, Samsam M, Daniell H. Expression of cholera toxin B-proinsulin fusion protein in lettuce and tobacco chloroplasts--oral administration protects against development of insulitis in non-obese diabetic mice. Plant Biotechnol J 2007; 5: 495-510.
[8]  Verma D, Moghimi B, LoDuca PA, Singh HD, Hoffman BE, Herzog RW, et al. (2010) Oral delivery of bioencapsulated coagulation factor IX prevents inhibitor formation and fatal anaphylaxis in hemophilia B mice. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 7101-7106.
[9]  Sherman A, Su J, Lin S, Wang X, Herzog RW, Daniell H.  Suppression of inhibitor formation against FVIII in a murine model of hemophilia A by oral delivery of antigens bioencapsulated in plant cells. Blood 2014 ; 124: 1659-1668.
[10] Wang X, Su J, Sherman A, Rogers GL, Liao G, Hoffman BE, et al.  Plant-based oral tolerance for hemophilia results from a complex immune regulatory mechanism including LAP+CD4+T cells.  Blood 2015; 125: 2418-2427.
[11] Su J, Sherman A, Doerfler PA, Byrne BJ, Herzog RW, Daniell H. Oral delivery of Acid Alpha Glucosidase epitopes expressed in plant chloroplasts suppresses antibody formation in treatment of Pompe mice. Plant Biotechnol J. 2015; 13: 1023-1032. 
[12] Boyhan D, Daniell H (2011) Low-cost production of proinsulin in tobacco and lettuce chloroplasts for injectable or oral delivery of functional insulin and C-peptide. Plant Biotechnol. J 2011; 9: 585-598.
[13]  Kwon KC, Nityanandam R, New JS, Daniell H. Oral delivery of bioencapsulated exendin-4 expressed in chloroplasts lowers blood glucose level in mice and stimulates insulin secretion in beta-TC6 cells. Plant Biotechnol J 2013; 11: 77-86
[14]  Shenoy V, Kwon KC, Rathinasabapathy A, Lin S1, Jin G, Song C, et al. Oral delivery of Angiotensin-converting enzyme 2 and Angiotensin-(1-7) bioencapsulated in plant cells attenuates pulmonary hypertension. Hypertension 2014;  64: 1248-1259.
[15]  Shil PK, Kwon KC, Zhu P, Verma A, Daniell H, Li Q. Oral Delivery of ACE2/Ang-(1-7) Bioencapsulated in Plant Cells Protects against Experimental Uveitis and Autoimmune Uveoretinitis. Molecular Therapy 2014; 22: 2069-2082.
[16]  Kohli N, Westerveld DR, Ayache AC, Verma A, Shil P, Prasad T, et al. Oral Delivery of Bioencapsulated Proteins Across Blood-Brain and Blood-Retinal Barriers. Molecular Therapy 2014; 22: 535-546.
[17]  Zahid M, Robbins PD. Protein transduction domains: applications for molecular medicine. Curr Gene Ther  2012; 12: 374-380. 
[18] Khaja K, Robbins P. Comparison of Functional Protein Transduction Domains Using the NEMO Binding Domain Peptide. Pharmaceuticals 2010; 3: 110-124.
[19]  Embury J, Klein D, Pileggi A, Ribeiro M, Jayaraman S, Molano RD, et al. Proteins linked to a protein transduction domain efficiently transduce pancreatic islets. Diabetes 2001; 50: 1706-1713.
[20] Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A, Dowdy SF. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 1999; 285: 1569-1572
[21] Mills CD. M1 and M2 Macrophages: Oracles of Health and Disease. Critical Reviews in immunology. 2012; 32: 463-488. 
[22] Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392: 245-252.
[23] Ingulli E, Mondino A, Khoruts A, Jenkins MK. In vivo detection of dendritic cell antigen presentation to CD4+ T cells. J Exp Med 1997; 185: 2133-2141.  
[24]  Luther SA, Gulbranson-Judge A, Acha-Orbea H, Maclennan ICM. Viral superantigen drives extrafollicular and follicular B differentiation leading to virus-specific antibody production.  J Exp Med 1997; 185: 551-562.
[25]  Kudo S, Matsuno K, Ezaki T, Ogawa M. A novel migration pathway for rat dendritic cells from the blood: Hepatic sinusoids-lymph translocation.  J Exp Med 1997; 185: 777-784. 
[26]  Curiel TJ, Morris C, Brumlik M, Landry SJ, Finstad K, Nelson A, et al. Peptides identified through phage display direct immunogenic antigen to dendritic cells. J Immunol 2004; 172: 7425-7431. 
[27]  Banchereau J, Palucka AK. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol 2005; 5: 296-306.
[28]  Celluzzi CM, Mayordomo JI, Storkus WJ, Lotze MT, Falo LD Jr. Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific CTL-mediated protective tumor immunity.  J Exp Med 1996; 183: 283-287.
[29]  Kraehenbuhl JP, Corbett M. Immunology. Keeping the gut microflora at bay. Science 2004; 303: 1624-1625.  
[30]  von Boehmer H. Oral tolerance: is it all retinoic acid? J Exp Med 2007; 204: 1737-1739.
[31]  Weiner HL. Oral tolerance: immune mechanisms and treatment of autoimmune diseases.  Immunol Today 1997; 18: 335-343.  
[32] Annacker O, Coombes JL, Malmstrom V, Uhlig HH, Bourne T, Johansson-Lindbom B, et al. Essential role for CD103 in the T cell-mediated regulation of experimental colitis.  J Exp Med 2005; 202: 1051-1061.  
[33] Biswas M, Sarkar D, Kumar SR, Nayak S, Rogers GL, Markusic DM, et al. Synergy between rapamycin and FLT3 ligand enhances plasmacytoid dendritic cell-dependent induction of CD4+CD25+FoxP3+ Treg. Blood2015; 125: 2937-2947. 
[34] Kwon KC, Verma D, Jin S, Singh ND, Daniell H. Release of proteins from intact chloroplasts induced by reactive oxygen species during biotic and abiotic stress. PLoS One. 2013c;8:e67106. 
[35] Verma D, Samson NP, Koya V, Daniell H. A protocol for expression of foreign genes in chloroplasts. Nat Protoc 2008; 3: 739-758.
[36] Haider SR, Sharp BL, Reid HJ. A comparison of Tris-glycine and Tris-tricine buffers for the electrophoretic separation of major serum proteins. J Sep Sci 2011; 34: 2463-2467. 
[37] Lee S, Li B, Jin S, Daniell H. Expression and characterization of antimicrobial peptides Retrocyclin-101 and Protegrin-1 in chloroplasts to control viraland bacterial infections. Plant Biotechnol J 2011; 9: 100-115.  
[38] Sanchez J, Holmgren J. Cholera toxin - a foe & a friend. Indian J Med Res 2011; 133:153-163. 
[39]  Magzoub M, Eriksson LE, Graslund A. Conformational states of the cell-penetrating peptide penetratin when interacting with phospholipid vesicles: effects of surface charge and peptide concentration. Biochim Biophys Acta. 2002; 1563: 53-63.
[40] Roy A, Kucukural A, Zhang Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nature Protocols 2010; 5: 725-738.
[41] Noguchi H, Kaneto H, Weir GC, Bonner-Weir S. PDX-1 protein containing its own antennapedia-like protein transduction domain can transduce pancreatic duct and islet cells. Diabetes 2003; 52: 1732-1737.
[42] Hessabi B, Ziegler P, Schmidt I, Hessabi C, Walther R. The nuclear localization signal (NLS) of PDX-1 is part of the homeodomain and represents a novel type of NLS. Eur J Biochem. 1999; 263:170-177.
[43] Phillips GN Jr. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol 1997; 7: 821-827.
[44]  Miyata T, Oshiro S, Harakuni T, Taira T, Matsuzaki G, Arakawa T, et al. Physicochemically stable cholera toxin B subunit pentamer created by peripheral molecular constraints imposed by de novo-introduced intersubunit disulfide crosslinks. Vaccine 2012; 30: 4225-4232. 
[45]  Lakshmi PS, Verma D, Yang X, Lloyd B, Daniell H. Low cost tuberculosis vaccine antigens in capsules: expression in chloroplasts, bio-encapsulation, stability and functional evaluation in vitro. PLoS One 2013;8:e54708.
[46] Davoodi-Semiromi A, Schreiber M, Nalapalli S, Verma D, Singh ND, Banks RK, et al. Chloroplast-derived vaccine antigens confer dual immunity against cholera and malaria by oral or injectable delivery. Plant Biotechnol J 2010; 8: 223-242.
[47] William WW. Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In: 
Chalfie M, Kain SR (eds). Green fluorescent protein, 2nd edn. Hoboken, New Jersey 2006;  pp 39-65. 
[48] Daniell H, Lee SB, Panchal T, Wiebe PO. Expression of the native cholera toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts. J Mol Biol 2001; 311: 1001-1009.  
[49] Durzynska J, Przysiecka L, Nawrot R, Barylski J, Nowicki G, Warowicka A, Musidlak O, Gozdzicka-Jozefiak A. Viral and other cell-penetrating peptides as vectors of therapeutic agents in medicine.  J Pharmacol Exp Ther. 2015; 354: 32-42. 
[50] Wernick NL, Chinnapen DJ, Cho JA, Lencer WI. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins (Basel) 2010; 2: 310-325.
[51] Cho JA, Chinnapen DJ, Aamar E, te Welscher YM, Lencer WI, Massol R. Insights on the trafficking and retro-translocation of glycosphingolipid-binding bacterial toxins. Front Cell Infect Microbiol 2012; 2: 51 
[52] Critchley DR, Kellie S, Streuli CH, Patel B, Ansell S, Pierce E, et al. The use of cholera toxin as a probe to study the organisation of ganglioside GM1 in membranes. Prog Clin Biol Res 1982; 102 pt A: 397-407.
[53] Wilson JP. Surface area of the small intestine in man. Gut 1967; 8: 618-621.
[54]  Holmgren J, Lonnroth I, Mansson J, Svennerholm L. Interaction of cholera toxin and membrane GM1 ganglioside of small intestine.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975; 72: 2520-2524.
[55]  Fishman PH, Bradley RM, Hom BE,  Moss J. Uptake and metabolism of exogenous gangliosides by cultured cells: effect of choleragen on the turnover of GM1. J Lipid Res 1983; 24: 1002-1011.
[56] Hadjiconstantinou M, Neff NH. GM1 ganglioside: in vivo and in vitro trophic actions on central neurotransmitter systems. J Neurochem 1998; 70: 1335-1345. 
[57] Yu RK, Tsai YT, Ariga T. Functional roles of gangliosides in neurodevelopment: an overview of recent advances. Neurochem Res 2012; 37: 1230-1244.
[58] Yu J, Langridge WH. A plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases. Nat Biotechnol 2001; 19: 548-552
[59]  Noguchi H, Matsushita M, Matsumoto S, Lu YF, Matsui H, Bonner-Weir S, et al. Mechanism of PDX-1 protein transduction. Biochem Biophys Res Commun 2005; 332: 68-74.
[60]  Noguchi H, Matsumoto S, Okitsu T, Iwanaga Y, Yonekawa Y, Nagata H, et al. PDX-1 protein is internalized by lipid raft-dependent macropinocytosis. Cell Transplant 2005; 14: 637-645.
[61] KaplanIM, Wadia JS, Dowdy SF. Cationic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis.  J Control Release 2005; 102: 247-253. 
[62]  Batchu RB, Moreno AM, Szmania SM, Bennett G, Spagnoli GC, Ponnazhagan S, et al.  Protein transduction of dendritic cells for NY-ESO-1-based immunotherapy of myeloma. Cancer Res 2005; 65: 10041-10049.
[63]  Su Y, Zhang AH, Li X, Owusu-Boaitey N, Skupsky J, Scott DW.  B cells "transduced" with TAT-fusion proteins can induce tolerance and protect mice from diabetes and EAE.  Clin Immunol 2011;140: 260-267.
[64] CalderPC, Dimitriadis G, Newsholme P.  Glucose metabolism in lymphoid and inflammatory cells and tissues. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2007; 10: 531-540.
[65]  KwonKC, Verma D, Singh ND, Herzog R, Daniell H. Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65: 782-799.
[66]  Su J, Zhu L, Sherman A, Wang X, Lin S, Kamesh A, Norikane JH, Streatfield SJ, Herzog RW, Daniell H. Low cost industrial production of coagulation factor IX bioencapsulated in lettuce cells for oral tolerance induction in hemophilia B. Biomaterials. 2015; 70: 84-93
[67]  Agrawal P, Verma D, Daniell H. Expression of Trichoderma reesei β-mannanase in tobacco chloroplasts and its utilization in lignocellulosic woody biomass hydrolysis. PLoS One. 2011; 6: e29302. 
[68]  Verma D, Jin S, Kanagaraj A, Singh ND, Daniel J, Kolattukudy PE, Miller M, Daniell H. Expression of fungal cutinase and swollenin in tobacco chloroplasts reveals novel enzyme functions and/or substrates. PLoS One. 2013; 8: e57187. 
【００９５】
実施例ＩＩ
異なるタグで融合されたＧＦＰの取り込みの評価：さらなるヒト細胞株における、ＣＴＢ−ＧＦＰ、ＰＴＤ−ＧＦＰ、ＰＧ１−ＧＦＰおよびＲＣ１０１−ＧＦＰ
本明細書に記載のタンパク質治療剤を使用して、首尾よく標的化することができる細胞のタイプを拡大するために、我々はヒト体細胞系および幹細胞系の両方を使用して評価した。良性および悪性組織への、治療用タンパク質の標的送達を達成することを目的として、６つの細胞株が選択された。これらの株には、ヒトの歯科、頭頸部および軟部組織由来の正常および癌細胞株が含まれていた。発達障害および未成熟／幹細胞腫瘍に対する、機能的タンパク質ベースの治療法を開発するために、３つのヒト幹細胞株を選択した。
【００９６】
図６Ａおよび６Ｂは、異なる細胞型およびタグで得られた研究結果を示す。これらのヒト体細胞には、膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ−１）；ヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ）；ヒト頭頚部扁平上皮細胞癌細胞（ＳＣＣ−１）；網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）；成人歯肉ケラチノサイト（ＡＧＫ）；骨芽細胞（ＯＢＣ）を含む。特定のタイプのヒト幹細胞もまた評価された。これらは、ヒト歯周靭帯幹細胞（ＨＰＤＬＳＣ）；Ｍａｘｉｌｌａｒ間葉系幹細胞（ＭＭＳＣ）およびＧｉｎｇｉｖａ由来間葉系間質細胞（ＧＭＳＣ）を含む。
ＣＴＢ、ＰＴＤおよびＤＣ−ペプチド融合タグは、実施例Ｉに記載されている。プロテグリン（ＰＧ）およびレトロサイクリン（ＲＣ）は、抗菌性ペプチドであり、Ｌｅｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９：１００−１１５（２０１１）に詳細に記載されている。
プロテグリン１：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ―Ａｒｇ（配列番号５）、
プロテグリン２：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ（配列番号６）
プロテグリン３は、４位のアルギニンをグリシンに置換し、そして、また、１つ少ない正電荷を有する。プロテグリン４は、１４位のバリンをフェニルアラニンに置換し、βターンで配列が異なる。この相違は、プロテグリン４を、他のものよりも極性が低く、正荷電が少なくする。プロテグリン５は、アルギニンをプロリンで置換し、１つ少ない正電荷を有する。
さらなるレトロサイクリン変異体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１２３５３に提供されている。
【００９７】
結果
ＰＡＮＣ−１細胞：
ヒト膵癌細胞では、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞膜に中程度の蓄積を示し、細胞質には散乱した焦点（ｆｏｃｉ）が見られる。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜において同様に局在化するが、シグナルはＣＴＢ−ＧＦＰのそれよりも細胞質においてより強い。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜で非常に強い蓄積を示すが、細胞質においては散乱した弱いシグナルしか示さない。ＲＣ１０１−ＧＦＰは、細胞膜および細胞質の両方において、最も強いＧＦＰレベルを示す。
【００９８】
ＨＰＤＥ細胞：
ヒト膵管上皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）において、ＣＴＢ融合ＧＦＰは、細胞膜および細胞質において比較的強い、高密度のシグナルを示す。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜で明確なシグナルを与えないが、細胞質および核に、高密度で中程度のシグナルを有する。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜において強い蓄積を示すが、細胞質中では散乱した焦点のみを示す。ＲＣ１０１−ＧＦＰは、細胞膜でのみ点状の（ｐｕｎｃｔａｔｅ）ＧＦＰ局在を示した。
【００９９】
ＨＰＤＬＳＣ細胞：
ヒト歯周靱帯幹細胞において、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞膜においてのみ比較的強い信号を示す。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜で、非常に弱い蓄積を示すが、細胞質では、散乱された、中程度に明るいＧＦＰシグナルを有する。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜および細胞質の両方で強い局在を示す。ＲＣ１０１−ＧＦＰは、これらの細胞の、細胞膜および細胞質の両方に局在化することができない。
【０１００】
ＭＭＳＣ細胞：
ｍａｘｉｌｌａｒ間葉系幹細胞において、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞膜で、比較的強い密な局在と、細胞質での散在スポットを示す。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜に蓄積しないが、細胞質で、中程度の明るい焦点を示す。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜で非常に強いＧＦＰシグナルを示し、そして、細胞質中で散乱した強いシグナルを示す。ＲＣ１０１−ＧＦＰは、これらの細胞のどこにでも局在していないようである。
【０１０１】
ＳＳＣ−１細胞：
ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞（ｈｕｍａｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，）において、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞膜及び細胞質の両方で、弱いＧＦＰシグナルを示す。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜に比較的強い局在を示し、細胞質に強いシグナルを示す。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜において中程度の蓄積を示し、細胞質中で散乱したシグナルを示す。ＲＣ１０１−ＧＦＰは、細胞膜において弱いＧＦＰ局在化を示し、細胞質においては少数の散乱した焦点を示す。
【０１０２】
ＲＰＥ細胞：
網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｃｅｌｌｓ，）において、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞膜で連続状の（点状とは対照的に）局在化および細胞質における比較的強いＧＦＰの焦点を示す。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜において比較的強い蓄積を示し、細胞質において強いクラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を示す。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜および細胞質の焦点の両方において、これらの細胞における任意のペプチドの最も強いシグナルを示す。
【０１０３】
ＧＭＳＣ細胞：
ｇｉｎｇｉｖａ由来間葉系間質細胞において、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞膜と細胞質の両方に局在する。ＰＴＤ−ＧＦＰは、細胞膜において比較的強いＧＦＰ蓄積および細胞質における強力なクラスター化された焦点を示す。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞膜においてＧＦＰの中程度の蓄積および細胞質における強い、クラスター化したシグナルを示す。
【０１０４】
ＡＧＫ細胞：
成人歯肉ケラチノサイト（ａｄｕｌｔ  ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，）において、ＣＴＢ−ＧＦＰは細胞質で、多くの比較的強い、高密度の信号を示す。ＰＴＤ−ＧＦＰはまた、細胞質において比較的強いシグナルを示すが、比較的少ない焦点が存在する。ＰＧ１−ＧＦＰは、細胞質においてはるかに強い蓄積を示す。
【０１０５】
ＯＢＣ細胞：
骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）で、ＣＴＢ−ＧＦＰは、細胞質で強い、点状局在を示す。ＰＴＤ−ＧＦＰもまた、細胞質に強く局在する。ＰＧ１−ＧＦＰのみが、細胞膜において高密度で連続的な局在性ＧＦＰを示す。
【０１０６】
議論
ＣＴＢ−ＧＦＰとのインキュベーションで、ＧＦＰ信号は、全ての細胞株で検出され、、そして、これらの細胞における発現パターンは同様であり、これらの細胞の膜上のＧＭ１受容体の遍在的存在と一致していた。タンパク質の形質導入ドメイン（ＰＴＤ）もまた、これらの細胞株へのＧＦＰの送達を効果的に促進し、そして、さらにＧＦＰを、ＨＰＤＥ細胞の核にさえ送達した。これらの結果は、ＰＴＤが、膜受容体なしで、外来タンパク質を直接的に送達し得ることを確認する。
プロテグリン１（ＰＧ１）融合ＧＦＰは、ほとんどの細胞株の細胞膜および細胞質に、強い局在を示す。３つの発現パターンがある：
１．ＰＧ−１が、細胞膜を浸透することができることを示す、細胞膜および細胞質（ＭＭＳＣ、ＲＰＥ）の両方での強力なＧＦＰシグナル。
２．細胞膜で強いＧＦＰシグナルを有するが、弱いまたは存在しない細胞質のシグナル（ＰＡＮＣ−１、ＨＰＤＥおよびＯＢＣ）は、ＰＧ−１がこれらの細胞の膜を浸透できないことを示す。
３．細胞膜では弱いＧＦＰシグナルであるが、細胞質では強いシグナル（ＳＣＣ−１、ＨＰＤＬＳＣ、ＧＭＳＣおよびＡＧＫ）。
このパターンは、ＰＧ１が、これらの細胞の膜を最も容易かつ効率的に貫通し、タンパク質医薬品を細胞質に効率的に輸送することを示す。これらの結果は、ＰＧ１−ＧＦＰの浸透の効率は、細胞型によって異なることを示す。
【０１０７】
融合タグを用いた、タンパク質医薬品送達標的
ＣＴＢと治療用タンパク質間の融合は、経口寛容の誘導、血清への送達、または、血液−脳または網膜関門を透過するためでさえ、治療用タンパク質の効果的な経口送達を促進する。外来タンパク質は、特定の受容体とは独立して、細胞膜に侵入することができる、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）とそれを融合させることによって、生存細胞に送達することができる。ＰＴＤは、生物学的に活性なタンパク質を、培養した哺乳動物細胞および動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達し、ＰＴＤ融合タンパク質に治療薬物送達の大きな可能性を与える。抗菌性ペプチドは、微生物を殺すことが知られているが、ヒト細胞特異的標的化は新規かつ予想外の観察である。ここでは、我々は、抗菌ペプチドは、この二重の機能を実行することができ、抗菌ぺプチドを、ペプチド抗生物質として使用できる理想的な候補とすること、ならびに、細胞特異的な方法で、他のタンパク質薬剤の効果的な送達のためである。追加のタンパク質医薬品のいくつかの例を以下に示す。
ＧＦＰレポータータンパク質のアミノ酸配列は、抗炎症機能薬、膵炎、歯周炎と歯周炎の治療、膵臓癌及び頭頸部扁平上皮癌の新しい治療を含む、表４に記載されている治療用タンパク質をコードする核酸と置き換えることができる。
歯周再生の分野において、いくつかのタンパク質ベースの治療薬が有効性を有することが示されている。このようなタンパク質と本発明のタグとの融合、、さらに、このような融合タンパク質を発現する、植物細胞または植物部分の投与は、様々な歯の障害の治療のための有効性を提供する。
【０１０８】
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【０１０９】
表３は、本発明の異なるタグとの融合によって、選択的に標的化され得る細胞のリストを提供する。
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【０１１０】
加えて、本明細書に記載されるアプローチは、記載されている医学的適応症のために有用な医薬を送達するために使用することができる。
【０１１１】
列挙された障害の欠損タンパク質の置換（Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｉｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）
内分泌障害（ホルモン欠乏症）
インスリン（より速い作用、より長い持続時間を有する類似体）
成長ホルモン（ソマトトロピン）
インスリン様増殖因子
【０１１２】
止血および血栓症（翻訳後変化）（Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  （ｐｏｓｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ））
血液凝固因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ）
抗トロンビン（外科手術）
プロテインＣ（静脈血栓症）
組織プラスミノゲン活性化因子（塞栓症、脳卒中）
【０１１３】
不完全な酵素の置換（Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅｓ）
酵素欠損
β−グルコセレブロシダーゼ
α−グルコシダーゼ
【０１１４】
肺／胃腸障害
プロテイナーゼ阻害剤（抗トリプシン欠乏症）
ラクターゼ
リパーゼ
アミラーゼ
プロテアーゼ
【０１１５】
本発明の治療用融合タンパク質はまた、造血および受精（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）に関与するもののような、既存の経路を拡張させるために使用することができる。したがって、エリスロポエチン（貧血、化学療法）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、アデノシンデアミナーゼ、ヒト血清アルブミン（ネフローゼ症候群）、免疫グロブリン、卵胞刺激ホルモンおよび絨毛性ゴナドトロピンを含む融合タンパク質を作製することができる。インターフェロンα（Ｃ型肝炎、Ｂ型抗ウイルス）およびインターフェロンβ（多発性硬化症）のような異なるインターフェロンは、本明細書に記載されるように製造および投与され得る。
副甲状腺ホルモンおよびエキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）などのホルモンもまた、本発明にしたがって、選択的に標的化された融合タンパク質として産生され得る。
【０１１６】
脊髄固定（ｓｐｉｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎｓ）の治療のための骨形成タンパク質、思春期の使用のためのゴナトロピン放出ホルモン、化学療法に関連する口腔粘膜炎のケラチノサイト成長因子、および創傷治癒のための血小板由来増殖因子が使用され得る。
他のタンパク質に基づく薬物も、また、標的送達を改善するために、本発明の融合ペプチドに融合させることができる。
【０１１７】
これらには、限定するものではないが、ジストニアおよび化粧品用途のためのボツリヌス毒素、重度の火傷治療のためのコラゲナーゼ、嚢胞性線維症のＤＮａｓｅ、火傷および潰瘍のためのパパイン、白血病のアスパラギナーゼ、冠動脈形成術のためのヒルジンおよびＤＶＴまたは塞栓症のためのストレプトキナーゼが含まれる。
さらなる有効な薬剤も、本発明の融合タンパク質の形態で使用することができ、そして、表４に列挙する。
【０１１８】
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【０１１９】
この表および他のタンパク質医薬品の詳細については、Ｗａｌｓｈ、Ｇ（２０１４）、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ  ２０１４年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，９９２−１０００を参照されたい。
【０１２０】
以上、本発明の好ましい実施形態のいくつかについて説明し、具体的に実施したが、本発明はそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。添付の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変を行うことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019503341.tif 000019
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