(57)【要約】  本発明は一般に、生物学的試料中の、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異、例えばＥＧＦＲ遺伝子中のＴ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失などの１つ又は複数のバイオマーカーを検出して、例えば癌などの疾患の診断、予後予測、モニタリング、又は治療法選択を補助するための方法及びキットに関する。この方法及びキットは、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断、予後予測、モニタリング、又は治療法選択を補助するのに有用である。
2019536456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患又は他の病状の診断、予後予測、モニタリング、又は治療法選択を必要とする対象における疾患又は他の病状の診断、予後予測、モニタリング、又は治療法選択のための方法であって、
（ａ）対象からの生物学的試料を提供する工程と、
（ｂ）生物学的試料から微小小胞を単離する工程と、
（ｃ）微小小胞から１つ又は複数の核酸を抽出する工程と、
（ｄ）抽出された核酸中の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子中のＴ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を検出して、値を得る工程と；
（ｅ）その値を所定のカットオフ閾値と比較して、抽出された核酸中のＴ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の有無を決定する工程と、を含み、
ここで、抽出された核酸中のＴ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の存在は、対象における疾患又は他の病状の存在を、又は疾患又は他の病状を発症する対象のより高い素因を示す、上記方法。
【請求項２】
工程（ｄ）で得られた値がサイクル閾値（Ｃｔ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）が、生物学的試料からの細胞外核酸及び循環核酸の同時単離をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が、微小小胞から抽出された１つ又は複数の核酸、同時単離された細胞外核酸と循環核酸の逆転写をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記逆転写工程が、１つ又は複数の増幅対照の使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅対照がＤＮＡなどの核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記逆転写工程が、１つ又は複数の阻害の対照の使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害の対照が外因性核酸である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記外因性核酸が、既知の量で逆転写工程又は抽出工程にスパイクされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、工程（ｃ）の後であって工程（ｄ）の前に予備増幅反応工程をさらに含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記予備増幅反応工程がマルチプレックス予備増幅反応工程である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記予備増幅反応工程が、一重予備増幅反応工程である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記予備増幅反応工程が、野生型ＥＧＦＲ核酸配列よりも変異体ＥＧＦＲ２０核酸配列の予備増幅を促進する条件ＰＣＲ条件下で行われる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マルチプレックス予備増幅反応物が、ＥＧＦＲのエクソン１９、エクソン２０、及び／又はエクソン２１に対する野生型遮断薬を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記野生型遮断薬が、疎水性核酸、架橋核酸、ペプチド核酸、３’末端ターミネーターを有する任意のオリゴヌクレオチド、又は野生型配列の効率的な増幅を妨げる任意の他の修飾塩基／ヌクレオチド／配列もしくは条件、又はこれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）が、ＰＣＲ技術もしくは次世代配列技術、又は任意の他のＰＣＲベースのもしくはＰＣＲを含まない検出法などの配列決定に基づく検出技術を含む、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）がｑＰＣＲを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｑＰＣＲが、変異体特異的増幅システム又は他の変異に偏った増幅システムに基づく、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｑＰＣＲが増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）に基づく、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＲＭＳ  ｑＰＣＲ工程が、修飾ヌクレオチド、塩基、もしくは配列を含むプライマー、修飾ヌクレオチド、塩基、もしくは配列を含むプローブ、又は修飾ヌクレオチド、塩基、もしくは配列を含むプライマーと修飾ヌクレオチドを含むプローブとの両方を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プライマーが、２−アミノプリン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、トリメトキシスチルベン、Ｃ−５プロピニル−デオキシシチジン、Ｃ−５プロピニル−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、逆ｄＴ、逆ジデオキシ−Ｔ、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＣ、５−メチルｄＣ、アミノエチル−フェノキサジン−デオキシシチジン、及びロックト核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される塩基修飾と、変異体特異的プライムの３’末端での核酸相互作用を増加させるための１つの塩基における少なくとも１つのミスマッチ塩基の包含と、及びこれらの組み合わせとを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）が、１つ又は複数の対照分子を検出することをさらに含む、請求項５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）が、所定のカットオフ閾値を介して１つ又は複数の突然変異を検出することをさらに含む、請求項５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｅ）における方法が、機械学習に基づくモデル化、データマイニング方法、及び／又は統計解析を使用してデータを分析して、所定のカットオフ閾値を得ることをさらに含む、請求項２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者の疾患転帰を同定又は予測するために前記データが分析される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者集団内の前記患者を層別化するために前記データが分析される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が抗ＥＧＦＲ療法による治療に対して感受性であるか又は耐性であるかを同定又は予測するために前記データが分析される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＥＧＦＲ療法がＥＧＦＲ阻害剤による治療を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象の無増悪生存期間を測定するために前記データが分析される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失が検出された場合に、対象に対する治療法選択肢を選択するためにデータが分析される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療法選択肢が、第２世代もしくは第３世代チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、又はＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を標的とする任意の他の薬物、による治療である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、第２又は第３世代チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、又はＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を特異的に標的とする他の任意の薬物、又はこれらの組み合わせの治療有効量を、前記対象に投与することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的試料が体液である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物学的試料が血漿又は血清である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患又は他の病状が癌である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患又は他の病状が肺癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患又は他の病状が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記抽出された核酸が細胞外核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記抽出された核酸が循環核酸（例えば、壊死性ＤＮＡ、又は無細胞ＤＮＡと壊死性ＤＮＡとの組み合わせ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記抽出された核酸が、細胞外核酸と循環核酸との組み合わせ、ＲＮＡと壊死性ＤＮＡとの組み合わせ、無細胞ＤＮＡと壊死性ＤＮＡとの組み合わせ、又はＲＮＡと無細胞ＤＮＡと壊死性ＤＮＡとの組み合わせである、請求項１に記載の方法。遊離。
【請求項４１】
前記工程（ｄ）が、表１で同定された配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（ｄ）が、表１で同定された配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチド遮断薬を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４２８，０５９号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列リスト
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列リストを含み、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。２０１７年１１月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＥＸＯＳ−０２９−００１ＷＯ＿３２２１４２−２２８９＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが２１，８７３バイトである。
【０００３】
本発明は、一般にバイオマーカー分析の分野に関し、特に血漿試料を含む生物学的試料からのゲノム変化を測定することに関する。
【背景技術】
【０００４】
癌細胞において生じる遺伝的及びエピジェネティック変化についての情報の増加は、腫瘍関連核酸配列及びプロファイルを分析することにより、腫瘍を検出し、性状解析し、そして追跡する機会を提供する。これらの変化は、様々な癌関連バイオマーカーのいずれかを検出することによって観察することができる。これらのバイオマーカーを検出し、患者、医師、臨床医、及び研究者にとって有益な情報を生み出すために、さまざまな分子診断アッセイが使用されている。これまでのところ、これらのアッセイは主に、外科的に切除された腫瘍組織又は生検によって得られた組織に由来する癌細胞に対して行われている。
【０００５】
しかし体液試料を使用してこれらの試験を実施する能力は、患者の組織試料を使用するよりも望ましい場合が多い。体液試料を用いるより侵襲性の少ないアプローチは、患者の福祉、長期的な疾患モニタリングを実施する能力、及び組織細胞に容易にアクセスできない場合でも発現プロファイルを得る能力の点で、広範囲の影響を有する。
【０００６】
従って、診断、予後予測、モニタリング、治療法選択、及び特定の疾患やその他の病状に関連する他の分野を補助するための、バイオマーカー、例えば血漿の微小小胞中のバイオマーカーを確実に検出する、新規の極めて低侵襲性又は非侵襲性の方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明はバイオテクノロジーの技術分野に属する。より詳細には、本発明は分子生物学の技術分野に属する。
【０００８】
分子生物学では、核酸などの分子は血漿や他の生体液などのヒト試料物質から単離することができ、さらに広範囲の方法で分析することができる。
【０００９】
ヒトの生体液は、細胞を、及び身体の全ての細胞によって分泌される無細胞の分子供給源を含む。無細胞供給源由来の核酸には、細胞外小胞（ＥＶ）、並びにアポトーシス性組織や壊死組織に由来すると思われる無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）由来のものが含まれる。直径３０〜２００ｎｍの小さいエクソソームは、アポトーシス小体や脱落微小小胞も含むＥＶの一種である。エクソソーム及び他のＥＶは、その起源の細胞からの遺伝物質及びタンパク質の安定した担体であるため、癌バイオマーカーとして特に興味深いが、死滅過程からのアポトーシス小体とは異なり、エクソソームは、腫瘍細胞を含むすべての生きた細胞により、多小胞体（ＭＶＢ）の形成又は原形質膜からの直接出芽のいずれかを介して、連続的かつ活発に生体液中に放出される。本発明を説明するために、微小小胞、ＥＶ、及びエクソソームの用語は互換的に使用することができる。
【００１０】
エクソソームや他のＥＶに含まれるＲＮＡ（ｅｘｏＲＮＡ）、エクソソームや他のＥＶに含まれるＤＮＡ（ｅｘｏＤＮＡ）、及び遊離の循環している核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）などの無細胞核酸は、正常な体細胞だけではなく異常な癌細胞によっても放出されるため、エクソソーム及び他のＥＶからの核酸及びヒト生体液試料からの無細胞核酸の組み合わせ単離の分析は、患者における癌細胞の存在及び種類を明らかにすることができる。
【００１１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は診断された全肺癌の約８５％を占め、標的化された上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤療法は、それらの腫瘍に既知のＥＧＦＲ変異を有する患者に利用可能である。ＥＧＦＲのエクソン２０上のＴ７９０Ｍ変異は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、並びにチロシンキナーゼドメインに結合する他の分子（例えば、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネラチニブ、及びネシツムマブ）などの第１世代ＥＧＦＲ阻害剤に対する獲得耐性の主要な機構である。この遺伝的変化は未治療の患者からの腫瘍にも見られるが、ＥＧＦＲ阻害剤療法に抵抗性のある患者の約６０％がこの突然変異を抱えている。従って治療前の患者層別化のための、及びオシメチニブなどの第２世代ＥＧＦＲ阻害剤の治療結果の予測のための、バイオマーカーとして使用されることに加えて、Ｔ７９０Ｍは耐性ＥＧＦＲ阻害剤の出現を追跡するために使用することができる。
【００１２】
ＥＧＦＲ内の他のゲノム変化は出現頻度が高いために、非常に興味深いものである。例えばエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ変異は、ＮＳＣＬＣ  ＥＧＦＲ変異肺腫瘍のエクソン１９の欠失の約４３％及びエクソン１９の挿入の４９％に存在する。これらの変化を抱える患者は、ゲフィチニブやエルロチニブなどのＴＫＩによる治療の候補である。
【００１３】
ＮＳＣＬＣから組織生検試料を入手することは困難であり、そして４９％もの患者がＥＧＦＲの分子分析のための組織を有していないため、液体生検試料として生体液中の突然変異を追跡することが有用であることがわかった。本発明において我々は、循環する核酸、すなわち「循環ＮＡ」からの死にかけている細胞プロセス（例えば、アポトーシス及び壊死）から得られた情報と、ＥＶ由来の核酸、すなわち「ｅｘｏＮＡ」からの生きたプロセスから得られた情報とを組み合わせた。このため、同量の生体液試料からのｅｘｏＮＡと循環ＮＡの同時単離は、非常に高感度なアッセイをもたらす。本明細書に提供された実施例はｅｘｏＮＡと循環ＮＡの同時単離を示すが、本明細書に提供された方法とキットはｅｘｏＮＡ、例えばｅｘｏＲＮＡ及び／又はｅｘｏＤＮＡ、及び生体液試料中見出されるＤＮＡとＲＮＡ、例えばｃｆＤＮＡ、壊死ＤＮＡ、又は例えば、血小板などの異なる画分の濃縮によって単離されたものを含む試料中に見られる又は任意の他の循環ＤＮＡ又はＲＮＡなどの、あらゆる組み合わせを同時単離するのに有用である。
【００１４】
患者におけるＥＧＦＲ中のエクソン１９、２０、及び／又は２１のうちの１つ又はそれ以上における修飾、特にＥＧＦＲ中のＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失、の存在及び量は、他の用途の中でも治療法選択肢を選択し、並びに疾患再発、分子残存疾患を追跡するために使用され得る。本明細書で使用される「修飾」は、１つ又は複数の塩基における突然変異、１つ又は複数の挿入、及び１つ又は複数の欠失を含む。
【００１５】
本発明者らは、ＥＧＦＲ中のＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を、高い感度及び高い特異性で検出する、ヒト生体液から単離したｅｘｏＮＡ及び循環ＮＡに対するＰＣＲに基づくアッセイの適用を記載する。
【００１６】
本発明は、ｅｘｏＮＡ及び循環ＮＡを使用する、試料抽出から突然変異の同定までの完全なワークフローに関する方法である。本発明は、予備増幅反応中に変異体濃縮戦略を使用して変異体配列を選択的に増幅する。増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）−トリプレックスｑＰＣＲ工程中の変異体特異的プライマーにおける追加の修飾は、修飾塩基［例えば、２−アミノプリン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、トリメトキシスチルベン、Ｃ−５プロピニル−デオキシシチジン、Ｃ−５プロピニル−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、逆ｄＴ、逆ジデオキシ−Ｔ、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＣ、５−メチルｄＣ、アミノエチル−フェノキサジン−デオキシシチジン、及びロックト核酸（ＬＮＡ）］の存在、並びに変異体特異的プライマーの３’末端での核酸相互作用を増大させるための１つの塩基における、少なくとも１つのミスマッチ塩基の包含を含む。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのミスマッチ塩基は、変異体特異的プライマーの最後から４番目、最後から三番目、最後から二番目、又は最後の塩基である。リアルタイムＰＣＲ機器によって生成されたｑＰＣＲデータに最新の機械学習及びデータマイニング（data-mining）技術を適用して、陽性試料と陰性試料とを識別するか、又は陽性試料もしくは陰性試料の強度を定量する。
【００１７】
本開示は、生物学的試料中の１つ又は複数のバイオマーカーを検出して、例えば癌などの疾患の診断、予後予測、モニタリング、又は治療法選択を支援する方法を提供する。本明細書に提供される方法及びキットは、血漿試料から１つ又は複数のバイオマーカーを検出するのに有用である。本明細書に提供される方法及びキットは、血漿試料の細胞外画分から１つ又は複数のバイオマーカーを検出するのに有用である。
【００１８】
本明細書に提供される方法及びキットは、生物学的試料中の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）変異を検出するのに有用である。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ変異は、エクソン２０のＴ７９０Ｍ変異を含む、ＥＧＦＲのエクソン１９、２０、及び／又は２１のうちの１つ又はそれ以上における修飾である。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ変異は、感作変異及び他のＥＧＦＲ変異、例えばＥＧＦＲのエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失である。
【００１９】
本開示は、生物学的試料中のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を検出するための方法及びキットを提供する。いくつかの実施態様において、生物学的試料は血漿である。
【００２０】
本開示は、ＥＶを捕捉及び濃縮し、対応する核酸を単離し、そして、ＢＥＡＭＩＮＧ又はＮＧＳなどの下流の分析プラットフォームとして、定量的ＰＣＲ及び他のＰＣＲに基づく又はＰＣＲフリーの方法を使用して、循環ＮＡ及びｅｘｏＮＡ中のＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の存在を、同時に検出するように設計された反応を提供する。
【００２１】
一般に、本開示の方法及びキットは以下の工程を含む：
１）生体液試料からのｅｘｏＮＡ及び循環ＮＡの単離：
ａ．ＩＥＸ、サイズ排除カラム、ビーズ、及び／又は他の固体表面への、エクソソーム及び他のＥＶ並びに循環ＮＡの結合；
ｂ．溶解条件並びに他の変性方法を使用するマトリックスからの放出；
ｃ．シリカカラム、ビーズ、及び他の表面に基づく方法を使用する、溶解物からの全核酸の単離；
２）循環ＮＡを含む単離された全ｅｘｏＮＡの逆転写（ＲＴ）：
ａ．単一又は混合したＲＴ酵素及びオリゴヌクレオチドを使用する第１鎖の合成；
ｂ．阻害の対照、外因性ＲＮＡスパイクの使用；
ｃ．他の対照（例：陽性対照と陰性対照、抽出対照など）の使用；
３）完全に単離され逆転写された物質の予備増幅：
ａ．以下に特異的なＰＣＲを用いる予備増幅反応
ｉ．ＥＧＦＲエクソン２０のＴ７９０Ｍ、及び／又はＥＧＦＲエクソン２１のＬ８５８Ｒ、及び／又はＥＧＦＲエクソン１９の１つ又は複数の欠失及び／又は挿入；
ｉｉ．断片化した物質を捕捉する（循環ＮＡと断片化したｅｘｏＮＡから）ための小さなアンプリコン；
ｉｉｉ．他のゲノム位置での複数の対照の増幅；
ｉｖ．阻害の対照及び他の対照（例えば抽出対照）；
ｖ．核酸分子の変異体画分を濃縮するための疎水性核酸及び他のブロッカー技術の包含；
４）予備増幅反応におけるＴ７９０Ｍ及び／又はＬ８５８Ｒ、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失及び／又はエクソン１９の挿入、及び対照アンプリコンの検出及び定量：
ａ．予備増幅反応物の一部は、Ｔ７９０Ｍ、及び／又はＬ８５８Ｒ、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又はエクソン１９の欠失、及び他の対照（例えば、阻害の対照、抽出対照、野生型対照など）を検出するために使用されるマルチプレックスｑＰＣＲ反応の鋳型として使用される。
ｂ．増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）−トリプレックスｑＰＣＲ工程中の突然変異特異的プライマー中の追加の修飾の存在［例えば、２−アミノプリン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、トリメトキシスチルベン、Ｃ−５プロピニル−デオキシシチジン、Ｃ−５プロピニル−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、逆ｄＴ、逆ジデオキシ−Ｔ、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＣ、５−メチルｄＣ、アミノエチル−フェノキサジン−デオキシシチジン、及びロックト核酸（ＬＮＡ）］、並びに突然変異特異的プライマーの３’末端での核酸相互作用を増大させるための塩基のうちの１つにおける、少なくとも１つのミスマッチ塩基の包含。
ｃ．突然変異特異的プライマーの塩基のうちの１つにおける追加のミスマッチの前記主張以外の組み込み。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのミスマッチ塩基は、変異体特異的プライマーの最後から４番目、最後から三番目、最後から二番目、又は最後の塩基である。
【００２２】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の検出及び定量のさらなる操作及び分析を使用する。いくつかの実施態様において、本方法はさらに以下の工程を含む；
５）機械学習モデルと統計解析：
ａ．患者の疾患転帰を同定又は定量し、初見の患者に一般化するために、最先端の機械学習モデルを、ｋ倍交差検証で臨床データについて訓練した。
ｂ．ｑＰＣＲ工程からモデルを訓練するために、各試料について、特に限定されるものではないが、ＣＴ値、デルタＣＴ値、生のＲｎ値、並びにＲＯＸ標準化ｄＲｎ値などのいくつかの特徴が使用される。
ｃ．各交差検証工程内で、モデルの最適パラメータを見つけるために、内部最適化工程を使用される。
ｄ．工程（ａ）〜（ｃ）をｎ回繰り返して、モデルが異なる訓練試験分割でどの程度うまく機能するかについての安定性の推定値を導き出すために、ブートストラッピングを使用される。
ｅ．試料分類の前に品質管理のためのフィルターを設定して、偽の挙動を示す試料を除外するために、本発明者らは内部対照のさまざまな境界条件を決定する。
【００２３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法及びキットは、細胞外小胞を表面に捕捉し、続いてＥＶを溶解して、その中に含まれる核酸、特にＲＮＡに限定されない核酸を放出させることによってＥＶ画分を単離する。
【００２４】
生物学的試料のＥＶ画分から核酸を単離及び抽出するために使用された以前の手順は、超遠心分離、例えば１０，０００×ｇ未満で１〜３時間遠心分離し、続いて上清を除去し、ペレットを洗浄し、ペレットを溶解し、核酸、例えばＲＮＡをカラム上で精製する方法に頼ってきた。これらの以前の方法は、遅く、面倒で、バッチ間の変動があり、スケール拡張には適していないなど、いくつかの欠点を示していた。本明細書で使用される単離及び抽出方法は、これらの欠点を克服し、迅速で、頑強であり、そして大容量に容易に拡張可能である単離及び抽出のための遠心分離に基づくカラムを提供する。
【００２５】
本方法及びキットは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／００７７５５及びＷＯ２０１４／１０７５７１（これらは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）に記載されている以下の抽出手順を使用して、生物学的試料から核酸、例えばｅｘｏＮＡ及び無細胞ＮＡを単離及び抽出する。簡単に説明すると、ＥＶ画分をメンブランフィルターに結合させ、そしてフィルターを洗浄する。次に、試薬を使用して、膜上での溶解及び核酸（例えば、ＲＮＡ及びｃｆＤＮＡ）の放出を実施する。次に抽出を行い、続いてコンディショニングが行う。核酸、例えばｅｘｏＮＡ及び循環ＮＡは、次にシリカカラムに結合され、洗浄され、次に溶出される。
【００２６】
いくつかの実施態様において、生物学的試料は体液である。体液は、対象の身体のいずれかの位置、例えば末梢（特に限定されるものではないが、例えば血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸器系、腸管、及び尿生殖路の液、涙液、唾液、母乳、リンパ系からの液、精液、脳脊髄液、臓器内液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、及びこれらの組み合わせを含む）から単離される流体であり得る。例えば体液は、尿、血液、血清、又は脳脊髄液である。
【００２７】
本開示の方法及びキットは、ヒト対象由来の試料での使用に適している。本開示の方法及びキットは、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ペット動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、及び／又は家畜（鶏など）などの非ヒト対象に由来する試料での使用に適している。
【００２８】
本明細書に記載の方法は、ＥＶからの核酸の抽出を提供する。いくつかの態様において、抽出される核酸はＲＮＡである。抽出されたＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子ＲＮＡ（非タンパク質コードＲＮＡ、非メッセンジャーＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、及びｓｎｏＲＮＡ、循環ＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００２９】
前述の方法のいずれにおいても、核酸は細胞外小胞画分から単離されるか又はそうでなければそれに由来する。
【００３０】
前述の方法のいずれにおいても、核酸は無細胞核酸であり、本明細書では循環核酸とも呼ばれる。いくつかの実施態様において、無細胞核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００３１】
いくつかの実施態様において、微小小胞の単離及び／又は核酸抽出の前に、１つ又は複数の対照粒子又は１つ又は複数の核酸を試料に加えて、微小小胞精製及び／又は核酸抽出の効率又は品質を評価するための内部対照として機能させることができる。本明細書に記載の方法は、効率的な単離と対照核酸を微小小胞画分と共に提供する。これらの対照核酸には、Ｑ−ベータバクテリオファージ由来の１つ又は複数の核酸、ウイルス粒子由来の１つ又は複数の核酸、又は天然に存在し得るか若しくは組換えＤＮＡ技術によって作成され得る他の任意の対照核酸（例えば、少なくとも１つの対照標的遺伝子）が含まれる。いくつかの態様において、対照核酸の量は試料への添加前に分かっている。対照標的遺伝子は、リアルタイムＰＣＲ及び／又は任意の他のＰＣＲに基づくもしくはＰＣＲフリーの下流の方法（液滴デジタルＰＣＲ、ＯＤ測定など）を使用して定量することができる。対照標的遺伝子の定量を使用して、細胞外小胞精製又は核酸抽出プロセスの効率又は品質を決定することができる。
【００３２】
いくつかの実施態様において、対照核酸はＱ−ベータバクテリオファージ由来の核酸であり、本明細書において「Ｑ−ベータ対照核酸」と称する。本明細書に記載の方法で使用されるＱ−ベータ対照核酸は、天然に存在するウイルス対照核酸、又は組換えもしくは工学作成された対照核酸であり得る。Ｑ−ベータは、レビウイルス科（leviviridae）のメンバーであり、４つのウイルスタンパク質（コートタンパク質、成熟タンパク質、溶解タンパク質、及びＲＮＡレプリカーゼ）をコードする３つの遺伝子からなる直鎖状の１本鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。Ｑ−ベータ粒子自体が対照として使用される場合、そのサイズが平均的な微小小胞と類似しているため、Ｑ−ベータは、本明細書に記載されるＥＶを単離するために使用されるものと同じ精製方法を使用して、生物学的試料から容易に精製され得る。さらに、それほど複雑ではないＱ−ベータウイルスの１本鎖遺伝子構造は、増幅に基づく核酸アッセイにおける対照として使用するのに有利である。Ｑ−ベータ粒子は、試料中のＱ−ベータ粒子の量の定量のために検出又は測定すべき対照標的遺伝子又は対照標的配列を含む。例えば対照標的遺伝子は、Ｑ−ベータコートタンパク質遺伝子である。Ｑ−ベータ粒子自体が対照として使用される場合、生物学的試料へのＱ−ベータ粒子の添加後、Ｑ−ベータ粒子からの核酸は、本明細書に記載の抽出方法を使用して生物学的試料からの核酸と共に抽出される。Ｑ−ベータ由来の核酸、例えばＱ−ベータ由来のＲＮＡが対照として使用される場合、Ｑ−ベータ核酸は本明細書に記載の抽出方法を使用して生物学的試料由来の核酸と共に抽出される。Ｑ−ベータ対照標的遺伝子の検出は、例えば目的のバイオマーカー（例えば、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を、それぞれ単独で、又は１つ又は複数の追加のバイオマーカーと組み合わせて）と同時に、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって行うことができる。対照標的遺伝子の１０倍希釈物中の少なくとも２、３、又は４つの既知濃度の標準曲線を使用してコピー数を決定することができる。検出されたコピー数、及び添加されたＱ−ベータ粒子の量、又は検出されたコピー数、及び添加されたＱ−ベータ核酸（例えばＱ−ベータＲＮＡ）の量を比較して、単離及び／又は抽出プロセスの品質を決定することができる。
【００３３】
いくつかの実施態様において、１０〜１０，０００コピー、例えば５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、又は５，０００コピーのＱ−ベータ粒子、又はＱ−ベータ核酸（例えばＱ−ベータＲＮＡ）が体液試料に添加される。いくつかの態様において、１００コピーのＱ−ベータ粒子又はＱ−ベータ核酸（例えばＱ−ベータＲＮＡ）が体液試料に添加される。Ｑ−ベータ粒子自体が対照として使用される場合、Ｑ−ベータ粒子のコピー数は、Ｑ−ベータバクテリオファージが標的細胞に感染する能力に基づいて計算することができる。従って、Ｑ−ベータ粒子のコピー数は、Ｑ−ベータバクテリオファージのコロニー形成単位と相関している。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法及びキットは、１つ又は複数のプロセス内対照を含む。いくつかの実施態様において、プロセス内対照は、血漿の質を示す内部参照遺伝子の検出及び分析である（すなわち、血漿試料の質の指標）。いくつかの実施態様において、参照遺伝子は血漿固有の転写体である。いくつかの実施態様において、参照遺伝子（及びそれらの対応する別名）は、以下：EML4, RPL4, NDUFA1, ベータアクチン, EGFRのエクソン７, ACADVL; PSEN1; ADSL; AGA; AGL; ALAD; ABCD1; ARSB; BCKDHB; BTD; CDK4; ERCC8; CLN3; CPOX; CST3; CSTB; DDB2; DLD; TOR1A; TAZ; EMD; ERCC3; ERCC5; ERCC6; ETFA; F8; FECH; FH; FXN; FUCA1; GAA; GALC; GALT; GBA; GBE1; GCDH; GPI; NR3C1; GSS; MSH6; GUSB; HADHA; HMBS; HMGCL; HPRT1; HPS1; SGSH; INSR; MEN1; MLH1; MSH2; MTM1; MTR; MUT; NAGLU; NF1; NF2; NPC1; OAT; OCRL; PCCA; PDHA1; PEPD; PEX12; PEX6; PEX7; PGK1; PHKA2; PHKB; PKD1; PLOD1; PMM2; CTSA; PPOX; PTEN; PTS; PEX2; PEX5; RB1; RPGR; ATXN1; ATXN7; STS; TCOF1; TPI1; TSC1; UROD; UROS; XPA; ALDH3A2; BLMH; CHM; TPP1; CYB5R3; ERCC2; EXT2; GM2A; HLCS; HSD17B1; HSD17B4; IFNGR1; KRT10; PAFAH1B1; NEU1; PAFAH2; PSEN2; RFX5; SOD1; STK11; SUOX; UBE3A; PEX1; APP; APRT; ARSA; ATRX; GALNS; GNAS; HEXA; HEXB; PCCB; PMS1; SMPD1; TAP2; TSC2; VHL; WRN; GPX1; SLC11A2; IFNAR1; GSR; ADH5; AHCY; ALDH2; ALDH9A1; BCKDHA; BLVRB; COMT; CRAT; CYP51A1; GART; GGCX; GRINA; GSTM4; GUK1; IGF2R; IMPDH2; NR3C2; NQO2; P4HA1; P4HB; PDHB; POLR2A; POLR2B; PRIM2; RPL4; RPL5; RPL6; RPL7A; RPL8; RPL11; RPL23; RPL19; RPL22; RPL23A; RPL17; RPL24; RPL26; RPL27; RPL30; RPL27A; RPL31; RPL32; RPL34; RPL35A; RPL37A; RPL36AL; ITSN1; PRKCSH; REEP3; NKIRAS2; TSR3; ZNF429; SMAD5; STX16; C16orf87; LSS; UBE2W; ATP2C1; HDGFRP2; UGP2; GRB10; GALK2; GGA1; TIMM50; MED8; ALKBH2; LYRM5; ZNF782; MAP3K15; MED11; C4orf3; RFWD2; TOMM5; C8orf82; PIM3; TTC3; PPARA; ATP5A1; ATP5C1; PLEKHA1; ATP5D; ATE1; USP16; EXOSC10; GMPR2; NT5C3; HCFC1R1; PUS1; ATP5G1; ECHDC1; ATP5G2; AFTPH; ANAPC11; ARL6IP4; LCLAT1; ATP5G3; CAPRIN2; ZFYVE27; MARCH8; EXOSC3; GOLGA7; NFU1; DNAJB12; SMC4; ZNF787; ZNF280D; BTBD7; THOC5; CBY1; PTRH1; TWISTNB; SMAD2; C11orf49; HMGXB4; UQCR10; SMAD1; MAD2L1BP; ZMAT5; BRPF1; ATP5J; RREB1; MTFP1; OSBPL8; ATP5J2; RECQL5; GLE1; ATP5H; STRADA; ERLIN2; NHP2L1; BICD2; ATP5S; HNRNPD; MED15; MANBAL; PARP3; OGDH; CAPNS1; NOMO2; ALG11; QSOX1; ZNF740; RNASEK; SREBF1; MAGED1; HNRNPL; DNM2; KDM2B; ZNF32; MTIF2; LRSAM1; YPEL2; NEURL4; SF3A1; MARCH2; PKP4; SF3B1; VPS54; NUMB; SUMO1; RYK; IP6K2; JMJD8; C3orf37; IP6K1; ERBB2IP; LRRC37A2; SIAH1; TSPAN17; MAPKAP1; WDR33; ARHGAP17; GTDC1; SLC25A25; WDR35; RPS6KA4; UHRF1BP1L; RPS4X; GOSR1; ALG8; SDCBP; KLHL5; ZNF182; ZNF37A; SCP2; ZNF484; L3MBTL3; DEPDC5; CACYBP; SPOP; METTL13; IFRD1; GEMIN7; EI24; RWDD1; TULP4; SMARCB1; LMBRD2; CSDE1; SS18; IRGQ; TFG; BUB3; CEPT1; COA5; CNOT4; TTC32; C18orf25; CISD2; CGGBP1; LAMTOR4; BCAP29; SLC41A3; SEPT2; TMEM64; MXI1; USP20; NUPL1; TPST2; PICALM; CCBL2; THAP7; TFIP11; C6orf1; PPP1CA; WDR89; ZNF121; FNIP1; C6orf226; CCT3; NIPA2; CUL4A; TCP1; STK16; RCHY1; CKAP5; RPS5; GEMIN2; CCT6A; PPP2CB; CCT7; VWA8; BRD9; KIAA0930; ZCCHC11; C12orf29; KIAA2018; VPS8; TMEM230; ANKRD16; SSBP3; ZNF655; C20orf194; FAM168B; DALRD3; SSBP4; KDM1A; RPS6; ZNF766; TTC7B; RNF187; IBA57; ERCC6L2; RAP1A; TNK2; RAP1B; GLT8D1; SPRTN; ATP11C; HERPUD1; RPS7; PDLIM5; FYTTD1; SEPT7; CDK5RAP2; TRAPPC2; PCGF6; CHCHD7; OLA1; NAA30; ARHGEF10L; BTBD1; RPS8; MSL1; MCRS1; ZNF302; CTNNBIP1; DNAJC21; AKTIP; FOXP4; SEC61G; U2AF2; CCDC66; GOSR2; CTBP1; MYPOP; SLC3A2; DCTD; ABI1; CTU2; RGMB; COA6; UBE2NL; C16orf88; RPS9; CCNC; KRIT1; SEH1L; FXR1; AGPHD1; ALG10B; C2orf68; GDPGP1; PTRHD1; SRRD; EIF2AK4; MAD1L1; EXOC7; SLTM; CXorf40B; EXOC6; SUPT20H; AKT1; CUTA; DBNL; CARS; USP21; DDX19B; ETFB; EMC6; ILK; FAM96A; TM9SF1; ZNF638; MRPL22; RPS11; FAM13A; MPG; DNAJC25; TAF9; RPS13; RFFL; SP3; TMCC1; ZNF2; MAEA; GOPC; SIRT3; ERMAP; C14orf28; ZHX1; C2orf76; CCDC58; OS9; RAB28; VMA21; C5orf45; OPA3; RPS15; SORBS3; TPM1; CMC4; VPS13A; POLR3H; BRCC3; SERBP1; CORO1B; FPGS; VPS13C; NARG2; GCOM1; POLR2M; FAHD1; SERF2; NME1-NME2; NME2; NAE1; HAX1; RPS16; PUM1; RPS20; ZSCAN26; ZNF805; IQCB1; RPS21; GPHN; ARF1; TM2D2; CANX; KALRN; LIN52; LRRC24; ZNF688; TNRC6B; CD82; ZNF197; CBWD5; EXOC1; MINK1; YIPF5; BRMS1; ARPC4; RPS23; RPS14; ABCF1; CSNK1A1; ADAR; U2AF1; AP2M1; IRAK1; TAF5L; DUT; RAB12; ANO6; NDEL1; ARFIP1; CELF1; VRK3; FAM108B1; RPS24; RPS25; CCM2; TCAIM; KCTD21; C6orf120; PLEKHG1; GLTPD1; WDR45; ZFAT; ZNF16; METTL17; ZNF181; AP2B1; AP1G1; ARHGAP5; COX19; ZNF451; RAB24; CTNS; SRSF7; TP53BP2; PLAA; PLD3; ELP6; ERGIC1; TRMT11; CCDC90A; INF2; CRELD1; DHRS12; ZNF613; DNAJB14; DDX59; C19orf12; MRI1; YTHDC1; FDX1L; TMEM150A; TIPRL; CSNK1G3; CPT1A; KLF10; TMPO; NR2C1; UBE2V1; SLC35A2; ZNF174; ZNF207; STK24; MINOS1; ZNF226; PQBP1; LCMT1; HNRNPH2; USP48; RRM1; RPAIN; FBXO7; TMEM259; CYFIP1; FAIM; GPR155; MTERFD3; AMD1; NGRN; PAIP2; SAR1B; WIPI2; CSTF1; BABAM1; PPM1B; PHF12; RHOT1; AMZ2; MYO19; ACOT9; BBS9; TRPT1; NOP2; TIAL1; UBA52; DMAP1; EIF2B4; NHP2; ITPRIPL2; RPL14; C18orf32; SRA1; UFD1L; VPS26A; BOLA3; SDHC; GTF3C2; HHLA3; EXOC4; AGAP1; FOXK1; ARL5A; GGPS1; EIF3B; THYN1; STAU1; USP14; RUFY3; GON4L; AGPAT3; SIL1; BTF3; PARL; EEF1B2; GATSL3; ZNF630; NPM1; NCKAP5L; HSD17B10; REV1; DIXDC1; SLC38A10; NARF; ALG13; ATP6V1E1; NDUFAF5; ATP6V0B; NPRL3; KIAA0317; ETNK1; DNAJB2; SEC14L1; CCNL2; PICK1; DPH2; USP9X; IAH1; CREBZF; PRMT5; ZMYM5; TIRAP; YIF1B; UNC45A; CHTF8; TYW5; SNAPC3; NBPF10; SDCCAG3; DEDD; C4orf29; CDC42; OXLD1; GPX4; STRN4; FKRP; ZNF808; C19orf55; ZNF674; ZNF384; INTS6; MLLT4; TCERG1; ARL16; MAPK3; FAM133B; MOSPD3; MLH3; NRF1; PQLC2; CEP44; H2AFY; C16orf13; FAM63A; PAPD5; DCUN1D4; PRDM15; U2AF1L4; HAGH; COA3; YARS2; PHF11; ASB1; MTMR12; RUFY1; SIDT2; RHBDD2; ERAP1; EFTUD1; TMEM70; LINS; CRCP; ACP1; ZXDC; METTL21D; PPAN-P2RY11; INCENP; UEVLD; ABCE1; TROVE2; PGP; CEP63; PPP4R1; CEP170; ANKZF1; PSPC1; WHSC1; ZNF205; FAM98B; CAST; TRAPPC5; TMEM80; PSAP; SUMF2; ABHD12; ACBD5; ZNF565; GEMIN8; DLGAP4; SMIM8; ZNF706; COASY; MINA; AGAP3; SLC9A6; MAZ; NCBP2; ATPAF1; FEZ2; NSL1; SMC2; TATDN3; FRS2; EIF4G2; CHD2; ENGASE; CRTC3; SNUPN; POT1; TTC14; KDM5A; XRN1; PIGY; PARP2; NGDN; TRAK1; MFSD12; SHPRH; ZSWIM7; GTPBP10; SEC24B; STAG2; TPM3; MSMP; SMAP1; ZNF557; NET1; DPH3; MUTYH; PHACTR4; HIPK3; CLCC1; SCYL1; UBL5; TNFRSF1A; TOP2B; ACSS2; TMUB2; CLTA; UBTF; QSER1; CDC14B; ATG9A; SREK1; SENP7; SEC31A; SPPL2B; RNF214; SLC25A45; NCOR2; ZFYVE19; RBM23; POMT1; DPH5; IRF2BP2; PNKD; BCLAF1; HNRNPC; PHF16; TSEN34; PPCS; SLC39A7; MTMR14; UBXN2B; APH1A; WTH3DI; URGCP; AGAP6; ALG9; MIER1; SRSF1; FAM127B; CDC16; TMEM134; UBN1; TBCE; MED24; FAM177A1; KTN1; PAICS; TRAPPC6B; HNRNPUL2; TMTC4; FNDC3A; KIAA1191; FKTN; TMEM183B; OCIAD1; CREBBP; TAX1BP1; BCS1L; CUL4B; KIAA1147; KIAA0146; U2SURP; ZNF629; UNK; FTO; WHAMM; SNED1; BEND3; GPR108; INTS1; ZNF697; PLEKHM3; USP45; USP6NL; ZNF823; TNRC18; RGP1; TMEM223; METTL23; SETD5; BAHCC1; UNC119B; MGA; CACTIN; TMEM218; C15orf57; DNLZ; COMMD5; JMJD6; NXF1; THOC2; CPSF4; PRKDC; ZNF623; ACD; TCTN1; PIH1D2; C11orf57; ZGPAT; CHMP1A; ZNF133; CEP57L1; RABEP1; TMEM214; NAA60; TMEM219; EARS2; RB1CC1; ZBTB40; ANKRD12; STRN3; DNAAF2; WBP1L; THADA; PLOD3; DDT; DDTL; MZT2A; C11orf83; NADKD1; CTNND1; FOXN3; MAP1LC3B2; MYSM1; C17orf89; AAMP; UQCRHL; TRAPPC13; FAM195B; TXNRD1; ACLY; RPP38; ACO2; HNRNPF; CTNNB1; LIG4; COPA; ZBTB21; ZNF621; DLG1; GRSF1; CRTC1; ZNF419; CHCHD4; DDX17; SGSM2; HTATIP2; CDK10; BAG6; USP5; TMBIM6; C1orf43; PCBP2; TMEM251; JKAMP; AKT1S1; C12orf44; RPP14; FAM89B; BET1L; MID1IP1; FAM160A2; FAM210A; INO80C; ATXN7L3; ZNF862; CCDC43; ZNF506; TINF2; COMMD7; CCNK; KAT6A; POM121C; BCAS3; ULK3; ZNF30; MTFR1L; ZNF146; FTSJD1; RPL22L1; GXYLT1; PTAR1; HIGD1A; C8orf59; EIF5AL1; REPIN1; WDR83; C4orf33; SYS1; IKBKG; C7orf25; SBNO2; IMMT; TMEM192; PDS5A; SENP6; DROSHA; C19orf60; SPATS2L; RAP1GDS1; RC3H2; KIAA0232; KDELR2; PLEKHB2; CENPN; ERLIN1; TMEM55B; MED7; PID1; MOB4; SLC9B1; PACS2; COMMD9; CXXC1; NRD1; ACOX3; PHF21A; FOXRED2; SIKE1; HNRNPR; TTI2; PCTP; ALPK1; ZFAND5; TBC1D8; PPAPDC1B; IFT43; SNX18; ZNF160; TUBGCP5; ZNF554; OTUD4; PSMA4; RRAS2; GIGYF2; RPP30; FAM118A; PCMTD2; ACVR1; FBRS; TMEM177; RUSC1; ASH2L; CORO1C; ARMC5; ZFYVE16; FAM135A; ZNF142; MYBBP1A; ZBTB10; UBE4B; KIF13A; NUDT19; FBXO45; NUDT7; HECTD4; ZNF250; C6orf136; ADAM10; TMEM87A; SLC35E2B; MECP2; NAA16; SUPT5H; UBE2K; DDX54; TLK2; ZSCAN30; FAM208A; FPGT-TNNI3K; BRD2; NACA; ECE1; TBC1D14; FANCI; FGGY; C17orf51; SEPT9; ARHGEF7; METTL15; ENTPD6; CDC27; THUMPD3; LSM14A; C17orf85; ELK1; NBEAL1; AEBP2; IRAK4; MTRF1L; CLCN7; PAPD4; DHX36; SZRD1; JMJD7; PLA2G4B; FANCL; LIN54; KANSL3; WDR26; GDI2; ADD1; LAMP2; HCCS; CCBL1; ABCD3; MICAL3; SET; GTF3C5; TTC13; NCOA7; BSCL2; BCKDK; SMEK2; ADK; ARIH2OS; MTO1; ZBTB1; PPP6C; PARK7; BCOR; ADPRH; HDGF; CASK; OSGIN2; POLG; THTPA; AP1B1; PIGG; CFLAR; CNBP; PCID2; HMOX2; SMARCAL1; ACSF3; POLD2; AURKAIP1; AUTS2; GPBP1; LRRC8A; TMEM129; UBAP2L; CBX5; MAD2L2; MED18; ZNF84; C14orf2; TSEN15; METTL21A; ERLEC1; CRY2; CRLS1; PAN2; SPRYD7; ASAH1; ING4; NMRK1; PEX26; MFN2; ATXN3; TMEM14B; STXBP5; SPG21; CEACAM19; AP4S1; RWDD3; TFRC; ORMDL1; VPS53; UBP1; NUDCD1; KCTD6; VGLL4; ZNF717; SLC39A13; DIS3; GNE; TPRN; LYRM1; LACC1; AP1AR; SMARCAD1; PSMG4; MAPKBP1; USP8; NUDT22; REPS1; LUZP6; DCAKD; SMARCA4; SRRT; GTPBP3; TOMM40; MARK3; INPP1; ENTPD4; NSDHL; TEX264; DNAJC2; KRBOX4; SYCE1L; KIAA1841; AES; GSPT1; ATP6V0A1; ZNF680; CLK3; ZNF562; SHC1; TBCEL; ATF7; MYO9B; EPN1; KARS; COL4A3BP; HSPBP1; FAM108A1; RFC5; SMARCC2; SPTAN1; SRP9; HRAS; SSFA2; HAUS2; THAP5; VRK2; ZNF195; AP1M1; SPAG9; CALU; EIF4E; STYX; C14orf93; LSM5; PSMB5; CCDC149; DNMT1; RTCA; AIFM1; CAB39; PPIP5K1; PWWP2A; SUGT1; ZNF720; TGFBR1; MEF2A; C7orf73; PLCD1; SUN1; HYOU1; FAM58A; PTPN12; SATB1; CIZ1; ATG10; ZCCHC9; SAP30L; ACP2; TMEM106B; EIF2AK1; PSMG3; MAP4; LRRFIP2; NT5C2; CCNJ; TBC1D5; IQSEC1; ZDHHC4; C7orf50; TBCCD1; CDV3; AZI2; C3orf58; GSE1; PARN; HS2ST1; TOMM6; TRMT10A; DERL1; FAM204A; DEK; ARFRP1; IPO11; CCDC152; FIP1L1; ELMOD3; PDHX; MFAP3; DCTN1; MAPK9; FAM160B1; FNDC3B; CRELD2; DNAJA3; NEDD1; ZNF397; ZDHHC3; AGFG1; FKBP2; GIT2; TAF12; LDHA; RBBP4; MKNK1; HDHD1; C12orf73; SMIM13; C5orf24; GDAP2; RPS27A; PPP1R21; PIP5K1A; INPP5K; DCTN4; FAM53C; PTPRK; EEF1E1; EIF2AK2; XPR1; MSRA; ATL2; C8orf40; VDAC3; YWHAZ; HMBOX1; NEIL2; ECD; RPN2; SPATA2; FDPS; RNF185; PHPT1; METTL20; S
LC46A3; KIAA1432; MADD; URM1; UCK1; NDUFB11; RUSC2; ABL2; ATG7; PUF60; TRMT1; NIF3L1; CPSF7; PTGES3L-AARSD1; TMUB1; TPRA1; R3HCC1; FBXO28; FAM178A; RPL28; RPS6KC1; CMPK1; ATF6B; ZNF507; OTUD5; FASTKD2; TNPO2; FZR1; ISOC2; CCDC124; RCOR3; SEC13; SGMS2; ATXN7L3B; AKIRIN1; ANP32E; CISD3; ACAD10; APOL1; LYSMD1; TLK1; GPR107; LANCL1; LRRFIP1; MCTS1; ANAPC5; MEMO1; POLR1B; ANAPC7; ILF3; ATXN1L; BCAP31; TTLL11; CNST; TBL1X; TRAF3IP1; PRKRA; DAXX; ATP13A2; TP53BP1; RAB11FIP3; CLASP1; APLP2; RNASEH2B; ARCN1; SMC6; EMC8; MGRN1; LMAN2L; ARFGAP3; SQSTM1; GTF2H1; TXNL4B; DMTF1; THOC6; PPP3CB; ALG5; PNPLA4; CTIF; CD164; AIMP1; MORF4L2; MGEA5; EDC3; SPNS1; DKC1; ECSIT; C6orf203; INTS12; FLYWCH2; MON1A; SLC35B3; ADCK1; RPUSD3; ADCK4; RRNAD1; RAD51D; ZNF669; NFYC; ITPK1; CLP1; KIAA0141; EFTUD2; ULK2; EHBP1; TGFBRAP1; GHDC; TNRC6C; FBRSL1; SAR1A; HNRPLL; ATG13; CHID1; ERI2; C1orf122; IL11RA; C17orf49; EYS; API5; DAGLB; MPC2; GSTK1; DIS3L; EIF5A; ZNF438; CTDNEP1; SLC25A39; PPHLN1; TPCN1; ZBTB14; MAPRE2; NFRKB; TMEM106C; TCHP; WIBG; COPS2; BSDC1; C12orf65; TRAFD1; LOC729020; C15orf61; PSMA1; LEMD2; TMEM30A; C2orf74; TBC1D7; CDYL; TCTN3; PTPMT1; BANF1; WRAP53; AMFR; AGAP5; CTPS2; TMX2; NAT10; COPB1; UBAC2; DET1; DNAJC7; CD58; DENND4A; PHB2; IMPA1; SMCR7; C11orf95; MYL12B; DTWD1; NFKBIL1; MTHFD2L; ZNF814; CCDC85C; ITGAV; COG2; GPN1; SLC44A2; USP27X; COG6; ZNF619; SKIL; RRP12; MKRN1; AKD1; RELA; VPS37A; HBS1L; INTS9; DOHH; PRMT3; KIAA1671; LAMTOR2; SLC35C1; FAM185A; NGLY1; ETV3; DSN1; ZNF566; ZNF576; KDM8; IPP; MKLN1; CBWD1; SIN3A; ABHD11; ZNF652; OXSM; TSEN2; TEF; NONO; NFE2L2; SETDB1; TMEM205; C4orf52; PGAP2; SCAF4; SPECC1L; EHMT1; TCP11L1; RBM17; ZDHHC7; KIAA0226; GLG1; SAE1; HOMER3; XPC; MEF2BNB; SH2B1; MTFR1; SARS2; SCAPER; SLC12A4; RDH13; TJAP1; FCHO2; HSDL1; TDRD3; RPAP3; FAN1; PARP9; DIP2A; GSK3B; MOGS; TATDN1; ZNF414; ZNF407; TBC1D15; WRB; PIP4K2C; TCF7L2; SRP54; LEPRE1; C1orf86; PQLC1; KDM3A; KDM4C; RBM19; KDM5C; SLC25A5; ANXA4; SCOC; ANXA6; ANXA7; ANXA11; MTHFSD; BIVM; BOD1; SYNCRIP; PLBD2; BUD13; RIOK2; CANT1; MPND; EBNA1BP2; EVI5L; EPS15; TXNDC16; ACOT13; C15orf40; RNF170; SPG11; SETD6; SETDB2; TRAPPC9; POLR3B; NUDT2; ARMC10; CHFR; NPTN; NDFIP2; JMJD4; WDR25; COG5; TNIP2; RBM34; TEX10; DUS3L; PPP2R5C; CLK1; PDCD6IP; TMEM189; RBMXL1; COX11; TYW3; RPTOR; HTATSF1; EWSR1; FBXL17; RAB2B; ZSCAN12; ZNF580; MYEOV2; TBCK; ZNF746; DCAF11; DCAF4; GTF2I; WDR81; KCNMB3; C10orf2; COPS7A; CHAMP1; PPP6R3; GPR75-ASB3; PLIN3; DHX16; C1orf27; WDR46; TRAF3IP2; FLNB; BRD8; THAP4; GPN3; STAU2; MTF2; TMED7-TICAM2; EIF4ENIF1; C16orf52; ASXL1; ENDOV; ZFHX3; BCAT2; SLC25A26; RBMX; PET117; ACIN1; DCAF17; SMIM12; LYRM4; TMEM41B; DTYMK; TMEM14C; NFKB1; SLC25A11; CD320; MKS1; DAG1; STARD3; IDE; ELAC2; BIRC2; ECI2; ERCC1; NDUFV1; TADA2A; PNPLA6; RBM28; LCORL; NDUFS2; UTP14A; CEP120; C22orf39; FHIT; MTIF3; HAUS4; DHX40; PIGX; SHMT2; HDAC8; WDR13; MPP1; SLC16A1; EIF2B3; FAM122B; TRAPPC1; AFF1; FAM104B; XIAP; RBM6; XPNPEP1; RAB35; RHBDD1; LEMD3; ATXN10; LPP; VARS2; SMYD3; TMED5; NSMCE4A; ATP5SL; LHPP; ANKRD50; TIMM17B; TRMT2B; TBC1D17; NDUFB4; ME2; NSUN5; CUL7; SLC35A1; TSPAN3; ARMCX5; CNDP2; TMEM48; IFT46; TXLNG; TMEM135; FAM21C; SCO2; STIM2; TJP2; CDK16; CDK17; ATAD3A; PGAM5; CXorf56; CHD8; FUS; LPPR2; SRGAP2; LAS1L; ZNHIT6; MIB2; GPR137; PIN4; LCOR; MFSD5; ATRAID; ZFAND1; LARP4; RBM41; SMPD4; UBXN6; FAM3A; STRBP; PET100; CAMTA2; UBAP1; MCFD2; TRIQK; PAPD7; PPARD; FGFR1OP2; VPRBP; NUDT16; CXorf40A; KXD1; RBFA; SETD9; MASTL; VANGL1; BAG1; RAB3GAP1; RRM2B; GOLGA3; MCPH1; NEO1; TECPR2; TK2; RAB40C; ZNF668; ZNF347; ZNF764; ZNF641; TSFM; PPARGC1B; SLC38A6; GGA3; GOLGA4; SEC23B; DPY19L3; ZNF555; YTHDF2; TFCP2; AAAS; CRBN; NKRF; MRRF; DGCR2; BANP; BRD7; SMG7; POLL; NCOA3; PCBP4; ZBED6; ARL13B; RABEPK; SAMD8; ARL1; ABHD16A; PPP2R2A; SUCLG2; CINP; RIF1; IFT27; KLF11; RANGRF; SRPR; SYCP3; MNAT1; ECI1; SF1; ZC4H2; ZFX; SYNJ2; MINPP1; SUFU; ATP6AP1; ATR; HADH; TIPARP; PIGT; CTTN; ZBTB33; PAFAH1B2; ZNF408; UHMK1; VDAC2; PEX11B; ESYT1; TMLHE; UBR2; CD99L2; GNL3L; PRMT7; KLHDC4; FLAD1; FBXL20; WDR44; PACSIN2; UQCC; NDUFS5; WNK1; NDUFC1; KIAA0430; RNF4; NCAPH2; NDUFA2; ZDHHC8; ACOX1; ZCCHC6; ZNF75D; FMR1; ARHGDIA; NIT1; MYNN; PFDN6; BAK1; DNAJC19; C1D; ATG16L1; FBXO11; DGCR8; TAF6; NCOR1; IKBKB; ZNF317; NCK1; DHX35; SMAD7; MRPS35; ORC4; HYI; FAM193B; ZMYM2; YAF2; IL6ST; SRSF11; SLC33A1; IPO8; ARPC1A; BCL2L1; GSTO1; SRSF10; CTCF; TNPO3; PSMD1; SIRT5; EML2; MSL3; RBBP5; SIRT6; SIRT2; TMEM127; VIPAS39; C9orf3; MRPS18A; NUP62; EXD2; DIDO1; NDUFA11; UCKL1; PPP2R4; DDX3X; NSUN2; KANSL1; LIMS1; SLC1A4; REST; TTC27; SLC30A6; CHMP3; FAM65A; SCRN3; NEK4; FBXL5; ENY2; TUBD1; DHRS4L2; PEX19; POGZ; EIF4G1; MATR3; MEPCE; MR1; PPIE; TMEM184B; ANKRD28; PTP4A2; COG4; NASP; CCDC107; YIPF6; DENND1B; APTX; SERPINB6; USB1; RAB9A; SRSF2; MICU1; CHMP5; CLINT1; CAMTA1; DICER1; SEPHS1; ZNF865; TOPORS; MLLT10; VAPB; THAP3; HSDL2; ANKHD1; ZFP91; MLL; GCLC; IRF3; BCL7B; ORC3; GABPA; MCL1; HIRIP3; ARNT; OXR1; ATP6V0C; JMJD7-PLA2G4B; ARHGEF12; LEPROT; RBBP7; PI4KB; CUL2; POU2F1; ARPC4-TTLL3; ASCC1; EIF4G3; MSANTD3; MSANTD3-TMEFF1; RBM14; RBM12; CCT2; RBM4; RBM14-RBM4; CPNE1; CAPN1; ATP5J2-PTCD1; YY1AP1; ATP6V1F; ABCC10; RNF103; RNF103-CHMP3; TMEM110-MUSTN1; NFS1; DCTN5; CDIP1; C15orf38-AP3S2; NT5C1B-RDH14; TBC1D24; TRIM39-RPP21; RPP21; COPS3; TANK; AMMECR1L; KAT7; USP19; PSMC5; MLST8; CCNH; ARMC6; TBC1D23; AK2; GPANK1; TOR1AIP2; UCHL5; CABIN1; LRBA; UIMC1; CNOT2; BLOC1S5; FPGT; RPL17-C18orf32; GBF1; RNF145; NEK1; TRAF3; NIP7; PDCD2; ISY1; ZSCAN9; C20orf24; TGIF2-C20orf24; SUN2; PTK2; PMF1; PMF1-BGLAP; SLC4A2; DHX33; PPP2R5A; PSMA5; CPD; POC1B; PSMB2; INTS7; GGCT; MDP1; NEDD8-MDP1; SMURF1; DAP3; AK3; BCL2L2-PABPN1; KIF16B; MARK4; GLRX3; B4GALT3; HYPK; PDK2; PGM3; SIAE; SESN1; DOPEY1; SH3GL1; NDUFB5; UQCRB; NDUFB6; GCFC2; SAFB; HMGN3; RNF14; RNF7; ZNF778; GORASP2; ZNF513; C18orf21; EIF2D; CORO7-PAM16; PIGO; RBM15; PLRG1; SEC22C; ASB3; ASB6; AKR1A1; TRMT1L; PRDX1; C10orf137; ZMYND11; RPS10-NUDT3; UBE2E1; HSPE1-MOB4; UBE2G2; UBE2H; CTDP1; CUX1; SYNJ2BP-COX16; PIGV; CHURC1-FNTB; WBSCR22; MTA1; NDUFC2-KCTD14; IL17RC; NDUFC2; COMMD3-BMI1; CHURC1; UBE4A; COX16; PPT2; MBD1; SPHK2; MDM4; ZHX1-C8ORF76; SRP19; ZNF670; SCARB2; PPP5C; ZNF664; PRPS1; BIVM-ERCC5; CCPG1; PSMC2; RBAK; RBM10; EIF4A1; RBAK-LOC389458; KIFAP3; RFC1; ZNF587; LIPT1; ANO10; TNFAIP8L2-SCNM1; SCNM1; TCEB1; URGCP-MRPS24; NPEPL1; BAG4; ISY1-RAB43; BNIP1; TTF1; KLF9; USMG5; MAVS; CAPZB; POLR1D; CHTOP; AKIP1; SH3GLB1; IGSF8; PRKAG1; NSFL1C; GTF3C3; ARID4B; MAP2K5; KAT5; RAB11A; TGOLN2; STRADB; FAM115A; DHPS; HNRPDL; PTPN2; M6PR; RNF40; PRMT1; ATRN; BACE1; VWA9; BZW1; C1QBP; ZNF48; CAMK2D; CASP6; CASP7; CASP9; CCNT1; CCNT2; PITRM1; ATAD2B; ODF2; ANAPC13; TWF1; WDR20; PIK3R1; EIF1AD; ZSWIM8; MIF4GD; MFSD11; NCOA6; ANAPC16; MAP4K4; RIN2; TMEM147; RBM39; RAB2A; AHCYL1; LOC100289561; ZNF691; TRIM26; BRF1; NUP93; ZNF322; ZNF790; DEF8; RNF41; ARFGAP2; AP2A2; RNF146; ARFIP2; ELP2; CARKD; ZBTB17; ZKSCAN3; PPP6R2; AKAP1; MPPE1; ASCC2; ZFAND6; EIF3L; ZNF410; SNX1; AKT2; PLD2; NFKBIB; PDE8A; TAF1C; PIM1; INPP5F; HIP1; RANBP6; PES1; NARS2; TIGD6; HINFP; NUB1; CLCN3; GLRX2; CLEC16A; PDIK1L; MTMR2; CD2BP2; GFOD2; LETMD1; RAB6A; SETMAR; LAMTOR3; RGL2; C7orf49; POMGNT1; BTF3L4; CEP57; SMUG1; CHST12; TOB1; TRA2B; TPD52L2; HDLBP; PRPSAP2; PPP3CC; KIAA0586; APEX1; HBP1; TRRAP; C7orf55-LUC7L2; LUC7L2; IMMP2L; CHMP2B; STX5; GFPT1; RAD23B; TMEM126A; FOXP1; DLST; PRPF4; TXN; PPP1CC; SEL1L; CTAGE5; ASAP1; TRIM3; NUDT9; SP1; USP4; ASPSCR1; APPL2; SLC30A5; PAPOLA; RAB5B; RAB5C; TAOK2; PCMT1; USP15; AP4E1; LSM4; GEMIN5; SEC24A; CEBPG; NT5C; TNIP1; URI1; ACSS1; BBS4; CDC5L; RPL15; ZNF444; SLC52A2; GMDS; AP4B1; YME1L1; UXS1; MED27; TBC1D1; CYB5D2; CREB3L4; PNPLA8; PSMC3IP; PIK3CB; ANKRD26; C9orf72; ATF2; NAA10; TRIM65; CERS6; ARL8A; CSE1L; TMCO1; ZNF620; ANKRD11; SNX12; ARAF; ETS2; STK3; PTGES2; CHD1L; UBE2L3; MCMBP; LRRC39; NOL8; ELOVL1; SLMO2; KDM2A; LRRC42; RAB18; CPSF3L; KAT6B; WDR92; GOLGB1; MAN2C1; SSBP1; C9orf69; SLC25A1; NOP16; PCGF5; MPP5; PPFIBP2; RPL10; C1orf85; TUBGCP2; R3HCC1L; NR1H2; FAM193A; DPP3; STOML1; KIAA0391; CSNK2A3; PRDM11; ANAPC10; CCT4; USP39; CNOT10; TMEM161A; GAPDH; RIT1; PAF1; SMG6; LOC100862671; POLD1; BTRC; RNF34; SRI; DDX21; CLCN6; CCDC51; FBXW7; NDUFB3; COX14; ITCH; DDX56; POM121; DDX6; CUL3; DIS3L2; HNRNPH1; SCFD1; ABCG2; CD63; TRMT2A; CCDC132; ANKFY1; COPS4; SERINC4; POLR3E; HARS; MIS12; NDUFA12; SPATA20; IDH3B; FAM173B; SMS; TARS; FBXO18; FASTK; CDK8; WDR4; ZNF155; SLC9A8; RDX; SRP68; CDK9; CALCOCO2; NOL10; PSMD9; TSN; SFSWAP; DCTN2; LPIN1; AARSD1; ADAM15; NSRP1; PDPK1; AP3D1; TBRG4; BRE; MORF4L1; CNOT1; MZF1; LARP7; ARMC8; PSME3; SNX17; PEMT; PDCD6; EIF3C; TOR1AIP1; UBOX5; FAM189B; ITPA; SRP72; CCDC61; ARSG; ING1; IFT20; AMBRA1; PAAF1; ILF2; EIF6; SLC12A9; ZNF839; CLOCK; SLIRP; HSD11B1L; SHOC2; CHD1; TMEM254; ANKRD46; FAM73A; RXRB; MAP4K3; PSMD5; CDK2AP1; UBE3B; WWP2; MCM3; PPP2R5D; PSMB6; PSMD11; CAMKK2; TAF11; RPL13A; LATS1; DAAM1; MED23; STOM; RNF111; WTAP; MED4; JOSD2; MARCH6; MCU; ARHGAP12; BCL2L13; NTAN1; STRIP1; TFAM; MEAF6; HAUS6; TRAPPC6A; TRAPPC3; UCHL3; NOSIP; IST1; ZFAND2B; MAX; VPS72; PCED1A; RAP2C; FAM173A; TTC19; EMC1; C21orf2; PEX11A; DNAJC10; LOC100129361; PPME1; HERC3; STX10; PPP1R12C; RQCD1; ZNF138; MTCH1; NSA2; LOC441155; PYCR2; SLC35A3; ABCB7; MKRN2; FBXO38; COPZ1; APEX2; AP3B1; PSMD6; DYNC1I2; MED21; DCLRE1A; PRELID1; RSRC1; RCN2; IKZF5; ZNF700; CDK2AP2; RRAGC; GTF2H3; AAR2; CUEDC1; KHDRBS1; AAGAB; TARS2; SEC11A; CEP164; RMND1; MEGF8; SLC39A1; HSP90AB1; STK25; PUS3; RAB4A; DOCK7; EPC1; LRRC14; RPS6KB1; TRAP1; C16orf91; MRFAP1; SHISA5; ABHD10; QARS; USP10; STX4; CHD4; WDTC1; RGS3; MBD4; PPIP5K2; PRKAR1A; NISCH; PPP1R3E; YOD1; C18orf8; USF1; ESF1; UNKL; SEC16A; KPNB1; ELF2; LONP1; CHUK; CIRBP; TBCB; AP1S1; AP3S1; CLNS1A; CLPTM1; CREBL2; MAPK14; CSNK1G2; CSNK2B; CSTF3; CTSO; CTSZ; DAD1; DGKQ; DARS; DHX9; DHX15; DECR1; DNASE2; DYNC1H1; DPAGT1; DPH1; DRG2; DYRK1A; ECH1; EEF1G; EIF2B1; EIF2S3; EIF4B; ELAVL1; ENO1; EP300; FBL; EXTL3; XRCC6; BLOC1S1; GDI1; GTF2B; GTF2H4; GTF3C1; HDAC2; HSBP1; DNAJA1; NDST1; ICT1; IL13RA1; ING2; INPPL1; EIF3E; AARS; ACVR2A; PARP1; AKR1B1; APEH; TRIM23; ARF4; ARF5; ARF6; RHOA; ARVCF; ATF4; ATP5B; ATP5F1; ATP6V1C1; ATP5O; AUH; POLR3D; BPGM; BSG; CAT; CBFB; CDK7; CENPB; CENPC1; CLTB; SLC31A1; COX4I1; COX5B; COX6B1; COX7A2; COX7C;
CSNK1D; CSNK2A1; CTNNA1; CTPS1; CTSB; CTSD; CYC1; DBT; DDB1; DLAT; DR1; DUSP7; E2F4; EEF2; EIF5; ELK4; STX2; ESD; ETV6; EYA3; FAU; FKBP3; FKBP4; FNTA; FNTB; FTH1; KDSR; GAB1; GABPB1; GARS; GCLM; GNAQ; GNB1; GNS; GOLGA1; GOT2; GTF2E2; GTF2F1; GTF3A; H2AFX; H2AFZ; HTT; HIVEP1; HMGB1; HNRNPA1; HNRNPA2B1; HNRNPK; HSPA4; HSPD1; HSPE1; IARS; ID2; ID3; ACO1; IRF2; ITGAE; ITGB1; ITPR2; JAK1; KPNA1; KPNA3; KPNA4; TNPO1; IPO5; LIG3; LRP1; LRP3; LRP6; LRPAP1; MAGOH; MAN2A1; CD46; MDM2; MAP3K3; MGAT2; MGMT; MIF; MAP3K11; MPI; MPV17; MSH3; MAP3K10; MTAP; MTRR; MTX1; MVD; NUBP1; NBN; NCBP1; NDUFA4; NDUFA6; NDUFS4; NDUFS8; NFX1; NFYA; NME3; NRAS; NTHL1; NUP88; NVL; TBC1D25; OAZ2; ODC1; OGG1; ORC5; OSBP; PEBP1; FURIN; PAK2; PBX2; PCNA; PDE6D; PER1; PEX10; PEX13; PFDN1; PFDN4; PFDN5; PFKL; PHB; SLC25A3; PHF1; PIGA; PIGC; PIGF; PIK3C2A; PIK3C3; PI4KA; PMM1; PNN; POLA2; POLR2E; POLR2G; PPAT; PPP1R7; PPP1R8; PPP1R10; PPP2CA; PPP4C; PREP; PRKACA; PRKCI; MAPK1; MAPK6; MAPK7; MAPK8; MAP2K1; MAP2K3; PRPSAP1; PSMA2; PSMA3; PSMA6; PSMA7; PSMB1; PSMB3; PSMB4; PSMB7; PSMC1; PSMC3; PSMC6; PSMD2; PSMD3; PSMD4; PSMD7; PSMD8; PSMD10; PSMD12; PSMD13; PSME2; PTBP1; PTPN1; PTPN11; PTPRA; RAD1; RAD17; RAD51C; RAF1; RALB; RANBP1; RANGAP1; RARS; RASA1; ARID4A; RCN1; NELFE; RECQL; UPF1; REV3L; RFC2; RFC4; RFNG; RFX1; RGS12; RING1; RNASEH1; RNH1; RORA; RPA1; RPA2; RPA3; MRPL12; RPN1; RXRA; SBF1; ATXN2; SDHB; SDHD; MAP2K4; SRSF3; SGTA; SKI; SMARCA2; SMARCC1; SMARCD1; SMARCE1; SNAPC1; SNAPC4; SNRNP70; SNRPB; SNRPB2; SNRPC; SNRPE; SNRPF; SNRPG; SNX2; SP2; UAP1; SPG7; SPTBN1; SRM; SRP14; SRPK1; SSB; SSR1; SSR2; SSRP1; STAT3; STIM1; STRN; SUPT4H1; SUPT6H; SUPV3L1; SURF1; SUV39H1; ADAM17; TAF2; TAF4; MAP3K7; TAPBP; TBCC; TCEB3; TCF12; TDG; TERF1; THOP1; SEC62; TRAPPC10; TOP1; TPP2; TPR; TPT1; NR2C2; TSPYL1; TSSC1; TSTA3; TTC1; TUFM; HIRA; TYK2; UBA1; UBE2A; UBE2B; UBE2D2; UBE2D3; UBE2G1; UBE2I; UBE2N; UBE2V2; UNG; UQCRC1; UQCRC2; USF2; UVRAG; VBP1; VDAC1; XPO1; XRCC4; YY1; YWHAB; ZNF7; ZNF35; ZNF45; ZNF76; ZNF91; ZNF131; ZNF134; ZKSCAN1; ZNF140; ZNF143; ZNF189; ZNF202; USP7; STAM; CUL5; MLL2; TAF15; NRIP1; TMEM187; AXIN1; HIST1H2BC; PIP4K2B; ULK1; EEA1; ANXA9; STX7; VAPA; ZNF282; DUSP11; CUL1; TTF2; SMARCA5; OFD1; PPM1D; RANBP3; PPFIA1; PARG; NDST2; IKBKAP; HAT1; DGKE; CAMK1; AGPS; BLZF1; MAPKAPK5; PRPF18; DEGS1; DENR; YARS; RRP1; KHSRP; AKR7A2; NOP14; RUVBL1; USO1; CDK13; RFXANK; SSNA1; NCOA1; TNKS; EIF3A; EIF3D; EIF3F; EIF3G; EIF3H; EIF3I; EIF3J; BECN1; MRPL40; B4GALT4; MBTPS1; EDF1; CTSF; SNX4; SNX3; EED; RNMT; RNGTT; GPAA1; RIPK1; CRADD; TNFSF12; ADAM9; CDS2; RIPK2; FADD; SNAP23; NAPG; NAPA; MTMR1; RIOK3; TNFRSF10B; DYRK4; SUCLG1; SUCLA2; CREG1; TRIM24; DPM1; DCAF5; DPM2; SAP30; CES2; TMEM11; HDAC3; KAT2B; SGPL1; FUBP1; ZNF259; MCM3AP; EIF2B5; EIF2S2; CPNE3; BUD31; PRPF4B; TIMELESS; HERC1; MBD3; MBD2; ST13; FUBP3; TOP3B; WASL; ATP6V0E1; SLC25A14; RPS6KB2; RNF8; UBA3; UBE2M; BTAF1; AIP; CLK2; RHOB; ATIC; ATOX1; BYSL; CCNG1; CDKN1B; AP2S1; COX8A; CRY1; CS; TIMM8A; DUSP3; ECHS1; EIF2S1; EIF4EBP2; FDX1; FEN1; GMFB; GPS1; GTF2F2; HSPA9; IDH3G; IREB2; NDUFB7; NINJ1; OAZ1; PRKAR2A; RAB1A; RAB5A; SDHA; SNRPD3; TARBP2; UXT; PIGQ; FIBP; EBAG9; RAB11B; UBE2L6; MFHAS1; CYTH2; MED14; SOCS6; ZNF235; TRIP12; TRIP11; JMJD1C; MED17; MED20; PIGL; PMPCB; GTPBP1; NFE2L3; MTRF1; ACTL6A; ACVR1B; ARHGAP1; ARL3; ASNA1; BAD; BCL9; BNIP2; BPHL; BRAF; PTTG1IP; CAD; CALR; CASP3; CD81; CDC34; COX6C; COX15; CREB1; CTBS; DDX5; DDX10; DFFA; RCAN1; DVL2; DVL3; E4F1; PHC2; ENDOG; ENSA; EPRS; ERH; ESRRA; ACSL3; ACSL4; BPTF; FARSA; FDFT1; FLOT2; FRG1; GALNT2; GOLGA2; GPS2; ARHGAP35; GTF2A2; HNRNPAB; HNRNPU; HUS1; IDI1; FOXK2; MGST3; MOCS2; NARS; NDUFA1; NDUFA3; NDUFA10; NDUFB1; NDUFB2; NDUFB10; NDUFS3; NDUFS6; NFATC3; YBX1; PARK2; PET112; PEX14; PIGH; PSPH; RABGGTA; RABGGTB; RPS6KA3; SCO1; SNRPA; SNRPD2; SREBF2; TAF1; TBCA; TOP3A; TRAF6; TTC4; RAB7A; PRRC2A; DDX39B; PABPN1; C21orf33; BAP1; CDC23; HERC2; PIAS2; MTMR6; MTMR4; ATP6V0D1; PRPF3; FAM50A; RRP9; PRKRIR; ATG12; PDCD5; HGS; NEMF; PCSK7; COX7A2L; SCAF11; AP4M1; ZW10; ETF1; MTA2; NOLC1; MAPKAPK2; ITGB1BP1; COPB2; ZNHIT3; MED1; B4GALT5; CNOT8; VAMP3; SNAP29; TXNL1; PPIG; KIF3B; TM9SF2; CIAO1; POLR2D; HS6ST1; NMT2; PEX16; SNRNP40; DDX23; SYMPK; EIF2AK3; SH3BP5; EIF4E2; ATG5; ROCK2; STX8; PIGB; CLTC; FXR2; MPDU1; TMEM59; CIR1; APBA3; ATP6V1G1; SPAG7; MRPL33; SEC22B; PRDX6; VPS9D1; SEC24C; ACTN4; MRPL49; DDX1; DHX8; MTOR; KRAS; MARS; MYO1E; NDUFA5; NDUFA7; NDUFA9; NDUFAB1; NDUFB8; NDUFB9; NUCB2; OXA1L; PCYT1A; PFN1; PGGT1B; PIK3R2; POLR2K; POLRMT; PPID; PRCP; PWP2; ABCD4; SFPQ; SIAH2; TLE1; TRIM25; NUP214; ZRSR2; SLC27A4; ZMYM4; RBM8A; OXSR1; WDR1; GOLGA5; MVP; THRAP3; MED12; MED13; NUP153; CCS; DOPEY2; THOC1; SART1; ABL1; ATF1; BMI1; CHKB; CRK; CRKL; DDOST; ERCC4; GAK; GFER; GLUD1; GNB2; RAPGEF1; PDIA3; HCFC1; HINT1; ZBTB48; HSPA5; JUND; SMAD4; NCL; NFIL3; NKTR; NUP98; PDCL; PHF2; RALA; ROCK1; SLC20A1; STAT2; YES1; CCDC6; MLF2; SMC3; ZRANB2; MED6; ACOT8; GNPDA1; MED16; PIGK; RANBP9; UBA2; CFL1; DMXL1; DOM3Z; GTF2E1; HSF1; DNAJC4; IDH3A; IFI35; IFNGR2; INPP5A; INPP5B; LAMP1; LMAN1; ALDH6A1; MRE11A; RBL2; RHEB; SRSF4; SOLH; SOS1; TAF13; TARBP1; ZNF354A; TCF20; TERF2; NELFA; EVI5; REEP5; TAF1B; SOX13; FARSB; ABCC5; DNM1L; ABCF2; COX17; SCAMP2; SCAMP3; ERAL1; TSSC4; PDCD7; GIPC1; ARPC3; ACTR3; PPIF; CTDSP2; ARPC2; RAD50; ACTR1B; ACTR1A; ZNF263; PDIA6; ARIH1; NAMPT; AKAP9; G3BP1; CEBPZ; TRIM28; ATP6AP2; LPCAT3; RCL1; CNIH; RBM5; LHFPL2; ALYREF; TXNDC9; MPHOSPH10; NME6; NUTF2; USPL1; EIF1; FLOT1; PSMD14; PRDX2; PRKD3; SLC35B1; DCAF7; AP3S2; MRPS31; POP7; SRRM1; STAM2; SF3B4; ZMPSTE24; AKAP8; PURA; STUB1; STAG1; SIGMAR1; CWC27; SAP18; SMNDC1; BCAS2; EIF1B; DNAJA2; APC2; KATNB1; ACAT2; CAPRIN1; NBR1; MCM7; MDH2; MAP3K4; MFAP1; MIPEP; MLLT1; MTHFD1; NAB1; HNRNPM; NAP1L4; PRCC; RNF6; TSPAN31; TBCD; TSNAX; UQCRFS1; UQCRH; CLPP; LAGE3; ARID1A; ALKBH1; CDC123; H1FX; PCNT; CDC42BPB; HDAC6; SNAPC5; DSCR3; SMYD5; RRAGB; AGFG2; TUBA1B; IK; IRF9; BPNT1; PIAS3; LUC7L3; TAB1; MAN2A2; TMEM50B; CAPZA2; DYNC1LI2; NEDD8; NFYB; NUCB1; NUMA1; ORC2; PA2G4; PCBP1; PCM1; PIK3CA; PIN1; PITPNA; POLE; POLR2H; POLR2I; POLR2J; PPP2R5B; PPP2R5E; PRKAA1; PRKAB1; PKN2; DNAJC3; PSME1; RAD21; RANBP2; DPF2; SRSF6; ITSN2; TAF10; TESK1; TSG101; VARS; XRCC1; ZKSCAN8; SHFM1; ANP32A; SMC1A; NPEPPS; PCGF3; CDIPT; PGRMC2; ARIH2; TUBGCP3; CFDP1; RAN; TIMM23; LYPLA1; EMG1; TIMM17A; ZER1; HMG20B; MERTK; SLC30A9; PIBF1; PPIH; ZNHIT1; TIMM44; ZBTB18; TADA3; UBE2E3; EIF3M; SEC23A; CREB3; LRRC41; VTI1B; ENOX2; APPBP2; CIB1; CHERP; IPO7; NOP56; SSSCA1; RNASEH2A; ANP32B; LAMTOR5; AGPAT1; SPTLC1; ARFGEF2; ARFGEF1; RABAC1; SLU7; SIVA1; MRPL28; NPC2; TXNRD2; DRAP1; DNPH1; PRPF8; PAIP1; TBL3; MXD4; HEXIM1; RBCK1; STAMBP; POLR3F; POLR3C; IVNS1ABP; TAF6L; ATP5L; GNAI3; LGALS8; POLH; PSMC4; TRIM27; RSC1A1; SARS; DYNLT1; DYNLT3; TFE3; SLBP; YEATS4; ELL; NCOA2; SPHAR; EXOC5; NPRL2; MTX2; YKT6; PMVK; FARS2; CGRRF1; RRAGA; DCTN6; GNA13; MAP4K5; GMEB1; CCT8; POLD3; HSPA8; SLC12A7; NUDC; PTGES3; MAP3K2; ZBTB6; POP4; VAMP5; ZNF460; RPP40; SDCCAG8; CLPX; SRCAP; JTB; MAN1A2; TXNL4A; NUDT3; GLO1; EHMT2; COPS8; RNPS1; SUB1; SMPDL3A; DIAPH2; PSKH1; SURF6; SYPL1; TALDO1; TCEA1; YWHAE; IFRD2; LZTR1; LMO4; DDX18; QKI; ZFPL1; WDR3; MALT1; RALBP1; PRDX3; AFG3L2; KDELR1; SF3A3; HNRNPA0; SEC61B; SERINC3; PNRC1; PSMF1; TMED2; STIP1; CKAP4; YWHAQ; TMED10; ASCC3; UQCR11; COPS6; GCN1L1; COPS5; METAP2; SF3B2; ILVBL; SNRNP27; TMED1; LIAS; CALM1; MYO9A; PPA2; RAC1; RBBP6; RNF5; RPE; SDF2; ST3GAL2; SKIV2L; SKP1; SUMO3; SNRPD1; SOS2; ZNF33A; ZNF33B; ZNF12; ZNF17; ZNF22; ZNF24; ZNF28; ZBTB25; RNF113A; NPM3; SLC35D2; ADRM1; NUDT21; CPSF6; RTN4; DDX52; WWP1; CYB561D2; TMEM115; DUSP14; TOPBP1; RER1; HNRNPUL1; KRR1; FAF1; POLR3A; CLASRP; KPTN; PWP1; CDC37; FICD; LSM6; ATP5I; RPL10A; UBL3; SSR3; TCEB2; TEP1; TFDP1; TMF1; TRIO; UTRN; VCP; ZNF41; VEZF1; ZNF175; ZXDA; ZXDB; SLMAP; ZMYM6; TESK2; NUP50; C14orf1; STRAP; CEP250; WBP4; ABCB8; SEC23IP; SUPT16H; POLI; PROSC; AKAP10; MRPL3; RPL35; PRAF2; SEC63; HPS5; RNF139; DCTN3; XPOT; CHP1; PXMP4; DUSP12; SNF8; ATXN2L; SYNRG; PNKP; B4GALT7; VPS45; LYPLA2; COPE; STXBP3; TUSC2; CBX3; EXOC3; GABARAP; RNF13; TWF2; GABARAPL2; STAT1; NUPL2; ZNF236; OGFR; ATF6; PAXIP1; CASC3; RALY; BRD3; DDX42; TARDBP; COMMD3; CCT5; DGAT1; ELL2; PGLS; ABCB10; MACF1; ADAT1; PRDX5; AP3M1; APPL1; CD3EAP; DNPEP; ARL2BP; AHSA1; CCRN4L; CD2AP; COPG2; FAM50B; AATF; SERGEF; CCNDBP1; FBXL3; FBXL4; FBXL6; FBXW2; FBXO22; FBXW8; FBXO3; FBXO8; FKBP8; TIMM10B; EIF2C1; GRHPR; GTF3C4; HNRNPH3; HARS2; MID2; NUBP2; MSRB2; POMZP3; PRDM2; RYBP; SCAP; SNW1; XRN2; ZNF212; HACL1; RHBDD3; ZNF346; FTSJ1; KEAP1; G3BP2; FBXW11; KIN; KPNA6; LETM1; PLA2G15; PIGN; DNAJB9; GTPBP4; NUFIP1; FBXO9; TTC33; BLOC1S6; PEF1; PFAS; PFDN2; CDK14; PITPNB; ANP32C; ICMT; PRDM4; ZMYND8; H2AFV; RAB3GAP2; RLF; RSU1; SF3B3; SEC22A; SNAPIN; STAT5B; TIMM10; TIMM13; TIMM8B; TIMM9; ATP6V0A2; PRPF6; TXN2; UCK2; WBP1; WBP2; YWHAG; ZNF281; EIF3K; DNAJC15; N6AMT1; C16orf80; VPS4A; HTRA2; NXT1; TBK1; SAP30BP; VPS51; MAT2B; POLM; GNL2; RBM15B; CPSF1; TRA2A; SAC3D1; CCDC106; EEF2K; SNX15; PRRC2B; UBIAD1; SNX8; SNX11; ATG4B; PAXBP1; NME7; GMPPB; GMPPA; SEC61A1; TIMM22; ALG6; TFPT; KCNJ14; NENF; CNOT7; ZNF225; ANAPC2; ANAPC4; ABT1; DPP7; PREB; NRBP1; FTSJ2; USP25; UBQLN1; STOML2; ST6GALNAC6; UBQLN2; BAZ1A; BAZ2A; BAZ2B; DHX38; CCDC22; SNRNP200; DEXI; SACM1L; MRPS28; WDR37; DCPS; OSTM1; ASF1A; SNX24; SPCS1; ANAPC15; UNC50; MRPS18B; C19orf53; MKL2; ACAD9; MRPL42; NOB1; NTMT1; ASTE1; FAM32A; MRPL13; ZNF770; C16orf72; ZC3H7A; ZBTB44; SETD2; MRPL18; NDUFAF4; CCDC59; METTL5; CHMP4A; GTPBP8; CRIPT; MRPL15; TIMM21; LGALSL; ORMDL2; DYNLRB1; CNIH4; TMEM208; SSU72; AP2A1; TMEM258; NDUFA8; PPP2R1A; VAMP2; HSD17B8; UBL4A; GNPAT; EIF2B2; RAPGEF2; RBX1; TMEM5; CNPY2; C11orf58; MGAT4B; DNAJC8; SUCO; EXOSC2; NOMO1; TRAM1; CAPN7; ETHE1; BRD4; ISCU; TGDS; C22orf28; TMEM50A; KLHDC2; PDSS1; PATZ1; EDC4; PPIL2; PISD; MTCH2; ZNF318; TBC1D22A; ZNF324; HIBCH; GNL3; FAM162A; AKAP8L; RNF11; ACAD8; DIEXF; PELP1; SND1; GHITM; VPS41; UQCRQ; ZBTB11; AFF4; INVS; SNX5; TUBGCP4; CHMP2A; RNF115; KLHL20; LSM1; LSM3; DIMT1; ZNF330; TNRC6A; GOLIM4; PRPF19; UTP20; RABGEF1; TOR1B; MCAT; CNOT3; ZNF232; TMOD3; ZKSCAN5; LATS2; BRD1; ERO1L; ZNRD1; DNTTIP2; MAGED2; PIK3R4; UBXN4; MDN1; FAM120A; FAF2; PSME4; ATP11B; ZNF592; SH3PXD2A; CTR9; TTC37; MDC
1; SAFB2; SLC25A44; TTI1; PHF14; KDM4A; UBE3C; EMC2; KIAA0100; KIAA0355; AQR; TMEM63A; CEP104; SART3; USP34; SETD1A; LAPTM4A; SLK; MLL4; MLEC; KIAA0195; EIF4A3; TM9SF4; MTSS1; SPCS2; BMS1; PTDSS1; SERTAD2; MAML1; SNX19; TATDN2; MRPL19; TOMM20; EFCAB14; URB2; TSC22D2; ARHGEF11; ZBTB24; PLEKHM1; C2CD5; ZNF518A; EPM2AIP1; C2CD2L; FARP2; CEP350; LRIG2; PJA2; TOMM70A; SEC24D; FCHSD2; URB1; ZC3H11A; TOX4; DDX46; ZBTB39; OSBPL2; ZBED4; FIG4; KIAA0196; AP5Z1; DENND4B; SUPT7L; FAM20B; RNF10; ZBTB5; JOSD1; HELZ; KIAA0020; N4BP2L2; PDAP1; SCAF8; ZFP30; DOLK; AAK1; LMTK2; ICK; R3HDM2; ZNF510; PPP6R1; MLXIP; TRAPPC8; MON1B; MORC2; ZHX2; KIAA0907; BAHD1; DHX30; TCF25; PDCD11; PCNX; HMGXB3; RALGAPA1; WDFY3; RAB21; SPEN; FBXO21; EXOSC7; KDM4B; USP33; PHLPP2; ZNF292; XPO7; MON2; PDXDC1; FRYL; PDS5B; ZHX3; KIAA0754; PIKFYVE; ZNF609; TBC1D9B; GGA2; WAPAL; SETX; SETD1B; FTSJD2; ERP44; RRP1B; MYCBP2; AVL9; PPRC1; ZC3H13; SARM1; CDK12; MRPS27; CUL9; FAM179B; SMG1; TAB2; PLXND1; ATG2A; RAD54L2; SMC5; MAST2; ZZEF1; ANKLE2; ZC3H3; GRAMD4; CIC; TBC1D9; WDR43; SNX13; MPRIP; NUP205; EFR3A; RTF1; TTLL12; METAP1; ZCCHC14; CEP68; PHF3; LARP4B; RCOR1; FAM168A; PMPCA; PLEKHM2; ZC3H4; RRS1; PRRC2C; TBC1D12; DNAJC9; KIAA0556; RPRD2; ATP11A; DNMBP; POFUT2; CLUH; NUP160; CSTF2T; ATMIN; KIF13B; FKBP15; SIN3B; NCAPD3; DNAJC13; MAN2B2; KIAA1033; USP22; DPY19L1; SZT2; WDR7; VPS39; DNAJC16; KHNYN; ANGEL1; USP24; FNBP4; KIAA1109; LARP1; PPP1R13B; PUM2; UFL1; RRP8; KIAA0947; SMG5; MAU2; NCSTN; NUDCD3; MED13L; ZDHHC17; ADNP; LARS2; PPWD1; ZFYVE26; TMEM131; GLTSCR1L; POFUT1; SUZ12; SCRIB; MORC3; SKIV2L2; R3HDM1; ELP5; PANX1; VPS13D; SAMM50; HECTD1; NIPBL; YIPF3; TECPR1; DCAF12; ABHD14A; EP400; C3orf17; DCAF13; TMEM186; AASDHPPT; POLR1A; CCDC28A; AHCTF1; CAMSAP1; CNOT6; NELFB; ZDHHC5; MTMR9; ATL3; NOL11; PTPN23; NIPSNAP3A; HEATR5A; FAM98A; SLC22A23; KBTBD2; SYF2; PNISR; KIAA1429; NECAP1; DHRS7B; IBTK; TBC1D10B; RNF167; C2CD3; DAK; ZZZ3; RPAP1; LRIG1; UPF2; PTCD1; GLCE; OPA1; UBXN7; LTN1; POLDIP2; GPATCH4; HERC4; CCDC9; CCZ1; LDLRAP1; PRPF31; EPC2; GAPVD1; TRPC4AP; IRF2BP1; C10orf12; NAT9; ZNF337; NOC2L; RSL1D1; GTPBP5; SENP3; TRUB2; WWC3; ZNF777; BRPF3; COQ2; GPKOW; MMADHC; RRP7A; DESI1; SGSM3; GLTSCR1; DCAF8; WARS2; UBXN1; GTF2A1; ZNF593; AZIN1; MBTPS2; PCF11; CDC40; ZBTB7A; UBR5; EIF5B; TRIM33; LAP3; NBAS; WDPCP; TXNDC12; TXNDC11; POP5; RPS27L; POMP; TMA7; NOP58; NMD3; TRMT6; ATP6V1H; MTERFD1; SLC35C2; PELO; GET4; MRPL2; DERA; MRPL4; APIP; CUTC; FCF1; NDUFA13; ERGIC3; MRPS17; MRPS7; TAF9B; UBE2D4; HEBP1; ATP6V1D; ADIPOR1; UTP18; ABHD5; NDUFAF1; PHF20L1; TFB1M; UBE2J1; RBMX2; LACTB2; SUV420H1; TRAPPC12; RMDN1; MRPS2; COQ4; UTP11L; SBDS; C14orf166; DERL2; FAHD2A; EXOSC1; SF3B14; ISOC1; EMC9; MRPL11; MRPL48; TMBIM4; TPRKB; PPIL1; MED31; FAM96B; MRPS16; MRPS18C; FIS1; PAM16; MRPS23; MRPS33; GOLT1B; BOLA1; VPS36; PTRH2; TVP23B; GLOD4; CDK5RAP1; STYXL1; RBM7; RPL26L1; COMMD2; IER3IP1; NAA20; ZFR; TELO2; RLIM; TMEM66; COPG1; RAB10; INSIG2; CHCHD2; DYNC1LI1; HSD17B12; COMMD10; WDR83OS; TRAPPC4; RAB4B; PIAS1; NOL7; HEMK1; SDF4; MRTO4; LSM7; NAA38; PDGFC; CPSF3; VPS28; TRAPPC2L; TRIP4; DBR1; POLK; MAN1B1; DDX41; SNX9; VPS29; NLK; BIRC6; FAM8A1; NAGPA; TUBE1; SELT; TAOK3; HP1BP3; PCYOX1; HSPA14; RSL24D1; SS18L2; DNAJB11; POLR3K; ATPIF1; WBP11; RAB14; ZNF274; ZNF639; SRRM2; ZDHHC2; DDX47; TACO1; ACP6; WWOX; AKAP7; C9orf114; CTDSPL2; TRIAP1; C11orf73; CWC15; TRMT112; UFC1; RTFDC1; GLRX5; RNF141; GLTP; RTEL1; NCKIPSD; EMC4; TMEM9; CXXC5; ANKRD39; C20orf111; CCDC174; ZC3HC1; C9orf156; PDZD11; VTA1; TMEM69; MRPL37; RNF181; MRPL51; PBDC1; MRPL27; ZCCHC17; KBTBD4; SCLY; C9orf78; KLF3; TM7SF3; SCAND1; BFAR; COA4; BCCIP; ERGIC2; RSF1; TIMMDC1; KDM3B; ARMCX3; TDP2; KRCC1; ZNF644; MRPL35; WAC; MRPS30; GDE1; CRNKL1; STX18; POLA1; RWDD2B; SEPSECS; USP18; NUP54; PTOV1; CPSF2; POLE3; CHRAC1; MRPL39; TMED9; HAUS7; ARID1B; MPHOSPH8; POGK; CNOT11; FOXRED1; MIER2; INO80; ZRANB1; UBE2Q1; TRIM44; WDR5; ZC3H7B; MED29; BMP2K; VEZT; ZCCHC8; RNPC3; ALKBH4; C17orf59; CNNM3; CDKN2AIP; KCTD9; KLHL24; TRIT1; FTSJ3; CNNM2; DYM; KLHL28; GATAD2A; ANKRD10; ZCCHC10; OTUB1; TRPM7; GIN1; MCM9; FBXL12; ANKRD49; WDR55; PGPEP1; TASP1; ZNF3; CC2D1A; TMEM104; QRICH1; THUMPD1; ZCCHC2; DPP8; ST7L; CWC25; UHRF1BP1; ALKBH5; PNRC2; MTMR10; SLC39A4; LRRC40; PXK; TBC1D22B; CDKAL1; CHD7; FAM208B; FOCAD; BTBD2; YTHDF1; HEATR2; OSGEP; ZSCAN32; UBE2R2; CHCHD3; IMPAD1; RAB20; WRAP73; TRMT10C; EXD3; KANSL2; MARCH5; ADPRHL2; COMMD4; CECR5; FAM206A; MRPL16; SDHAF2; SLC48A1; TRNAU1AP; FAM120C; C1orf109; PARP16; SSH3; INTS8; C4orf27; THG1L; SLC25A38; SLC35F6; ZNF416; CLN6; PINX1; C1orf123; VPS13B; PRPF40A; DDX27; GID8; HIF1AN; TMCO3; PAK1IP1; LAMTOR1; ZNF446; TRMT61B; CDC37L1; C19orf24; PIH1D1; PPP2R3C; STX17; NPLOC4; PRPF39; C14orf119; DENND4C; GPATCH2L; PHIP; USP47; PTCD3; TRMT12; VPS37C; IWS1; NRDE2; MRPL20; RUFY2; SCYL2; TMEM248; RNF31; TRMU; ARGLU1; C10orf118; MED9; YEATS2; WDYHV1; GPATCH1; SAMD4B; WDR6; LUC7L; WDR70; ATG2B; GPATCH2; SLFN12; AGGF1; RBM22; MAGOHB; PLEKHJ1; MANSC1; WDR60; VAC14; TMEM39B; IARS2; PRPF38B; AKIRIN2; GPN2; ARHGEF40; HEATR1; TRIM68; CCDC94; LARP1B; SRBD1; IPO9; ELP3; WDR74; GSPT2; NLE1; THAP1; MTPAP; LMBR1L; SDAD1; WDR11; ARMC1; DARS2; TMEM33; TSR1; PNPO; SHQ1; MRPS10; INTS10; RMDN3; RNMTL1; SMG8; RNF220; RIC8B; SLC4A1AP; NADSYN1; DNAJC17; ASUN; RPRD1A; MAP1S; N4BP2; GOLPH3L; ATF7IP; DHX32; ARL8B; ZFP64; DNAJC11; HMG20A; TBC1D13; TMEM57; VPS35; ARFGAP1; PANK4; USP40; COA1; SMU1; UBA6; AP5M1; NUP133; SLC38A7; OGFOD1; CCAR1; AGK; TMEM184C; CCDC25; WDR12; TTC17; TYW1; TMEM39A; WDR41; ADI1; THNSL2; TMEM19; NUDT15; IMP3; PHF10; QRSL1; ZNF654; CWF19L1; EXOC2; BRF2; PBRM1; CCDC91; RNF121; BRIX1; DDX19A; RFK; C6orf70; RSAD1; FGD6; TMA16; C5orf22; ABCF3; UFSP2; LIN7C; RSBN1; BLOC1S4; LMBRD1; SYNJ2BP; LSG1; METTL2B; DCP1A; COPRS; ST7; PI4K2A; TMEM63B; RRN3; UTP6; BDP1; RNF130; FBXO6; IMPACT; VIMP; EMC3; CAND1; UBAP2; TMEM242; EAPP; PPP2R2D; BRK1; ITFG2; CISD1; PLGRKT; USE1; TEX2; ZC3H15; TMEM165; ACTR10; ASH1L; TMCO6; LRRC59; KIAA1704; CSGALNACT2; WSB2; NOP10; SLC35E3; ZNF395; VPS33B; RNF114; CMAS; BIN3; FAM114A2; DHTKD1; COG1; MAML3; TRPV1; SLC25A40; MKKS; PCDHGB5; CLN8; NANS; UBB; DAZAP1; BRWD1; TERF2IP; SLC38A2; YIPF1; GAR1; SSH1; RBM27; KCTD5; FBXO42; MRPS21; FBXW5; ETAA1; ANKIB1; MIOS; SMCR7L; TOLLIP; TMX3; HEATR5B; DHX29; EXOSC4; ELP4; PUS7; CCDC93; ASNSD1; MRPL50; FAM35A; TOMM7; WDR5B; DDX49; ING3; TRMT13; VSIG10; GTPBP2; LIN37; C19orf10; SMG9; ALG1; UBFD1; TMEM234; PPP1R37; MOSPD1; YLPM1; RNF20; GPCPD1; FAM214A; WDR45B; METTL3; GSK3A; CHST7; DIABLO; INPP5E; POLE4; LARS; UGGT1; UGGT2; KCMF1; TM9SF3; UBQLN4; WRNIP1; GRIPAP1; BDH2; TMEM167B; PNO1; SH3GLB2; STARD7; EMC7; C1GALT1; EXOSC5; MCCC1; NCLN; FEM1C; DUSP22; CMC2; MRPS22; YAE1D1; C11orf30; MFF; SDR39U1; XAB2; CCDC47; C5orf15; NIT2; OTUD7B; PARP6; RNPEP; FAM20C; PRDM10; PPAN; PSMG2; ADPRM; MRPL1; TOMM22; CHPT1; CCNL1; MNT; CIAPIN1; C16orf62; ANKMY2; RARS2; RALGAPB; ZMIZ1; RALGAPA2; NKIRAS1; ENTPD7; PCNP; PITHD1; PARP11; UTP3; AVEN; C12orf4; C12orf5; MAN1C1; PDSS2; SETD8; REXO4; NUP107; MRPL47; ATP13A1; DDX24; SCYL3; SEPN1; ATP10D; TUBGCP6; LYRM2; SNX14; YIF1A; GALNT1; MCOLN1; CSRP2BP; TMEM9B; MRS2; CLK4; RAB22A; ANKHD1-EIF4EBP3; REXO1; KIAA1143; GATAD2B; LRRC47; ZNF512B; ZNF490; USP31; PRR12; ATXN7L1; NLN; ESYT2; KIDINS220; MTA3; AARS2; INTS2; XPO5; ARHGAP31; SERINC1; UBR4; NUFIP2; MIB1; ZNF398; KLHL42; PDP2; USP35; KLHL8; TMEM181; ARHGAP21; CRAMP1L; KIAA1430; WDFY1; ZNF687; WDR48; FNIP2; PITPNM2; SLAIN2; RANBP10; KIAA1468; VPS18; ZBTB2; SH3RF1; PHRF1; RDH14; FLYWCH1; ALS2; ZSWIM6; KIAA1586; DDX55; CWC22; GBA2; DENND1A; KIAA1609; ANO8; METTL14; EPG5; NCOA5; PPM1A; DHRS4; DEAF1; UBC; RAP2A; ZNFX1; MBNL1; ZNF253; NDUFV2; KAT2A; NMT1; ZNF8; MTMR3; MRPS12; POLR2L; PPA1; PPIA; MRPL23; TNFAIP1; TRAF2; KDM6A; XRCC5; ZNF273; TMX4; GATAD1; KIAA1967; LSM2; CCNB1IP1; C6orf47; SLC30A1; SRPRB; ENOPH1; RPRD1B; ZNF77; PRUNE; SCAF1; SELK; RBM25; WIZ; RRAGD; SNX6; TRIM39; C21orf59; ZFYVE1; SENP2; PDLIM2; KLHL12; GPBP1L1; C12orf10; UTP14C; ZNF500; VPS11; SAV1; CCDC90B; FASTKD5; GUF1; SPCS3; RINT1; RIC8A; MIIP; EEFSEC; TRAPPC11; ZFAND3; SRR; PPP1R11; ZNF148; POLR2F; ZNF277; ITM2B; TIA1; FBXW4; ABHD4; MRPL17; UBE2O; HEATR6; NSUN3; CERS2; GPATCH3; HPS4; GALNT11; ZNF335; MRPS14; PCIF1; FKBPL; RBM26; GOLPH3; MCCC2; SNX16; MAGEF1; TMBIM1; DUS1L; MRPL46; XYLT2; EIF4H; C11orf24; ZFYVE20; PDF; C17orf75; OSGEPL1; MMS19; DNAJC1; TFB2M; TOR3A; HERPUD2; NOC3L; RNF25; NSD1; LMBR1; XPO4; HS1BP3; IKZF4; ZMAT3; KLHL25; GZF1; C5orf28; TMEM168; ATG3; POLR1E; SUDS3; TTC31; NARFL; ZDHHC6; PCNXL4; ACTR6; MRPS25; DNMT3A; VPS52; GIGYF1; VPS16; ANAPC1; SNRNP35; DGCR14; COPS7B; NUCKS1; ACBD3; TNS3; FAM160B2; PARP12; ZNF574; SFXN1; IPPK; CCDC14; C6orf106; C11orf1; RMND5B; CERK; LMF1; OSBPL11; RMND5A; MPHOSPH9; ARV1; NMNAT1; MAP1LC3B; PORCN; MARCH7; YTHDC2; TUT1; MRPS11; RFX7; PAPOLG; C12orf43; ACTR8; CASD1; CCDC71; MRPL44; VPS33A; NOL6; KRI1; UPF3B; UPF3A; RSRC2; INTS3; FRY; ANKRA2; SPATS2; ZNF649; SELRC1; UBE2Z; C8orf33; CAPN10; ZNF747; FUNDC2; DDRGK1; MRPS34; MRPL34; CDK11A; MRP63; YIPF2; PRR14; C19orf43; CUEDC2; METRN; DDX50; DDA1; NUP37; SPATA5L1; PDCL3; ERI3; C7orf26; NABP2; SECISBP2; NOC4L; METTL16; FASTKD3; TMEM109; C2orf49; ASB8; DCTPP1; C1orf50; CCDC86; C11orf48; WDR18; WDR77; SLC25A23; SMIM7; ALG12; C9orf16; TAF1D; DHX58; TMEM185B; FAM134A; PHF23; PPDPF; DHRS11; GNPTAB; NOL12; LENG1; C1orf35; RBM42; ZNF343; FBXL15; DCAF10; NDUFS7; PGS1; IRF2BPL; LRFN3; HAUS3; CYP2R1; PAGR1; C2orf47; GCC1; ATP13A3; ABHD8; NKAP; CDC73; CARS2; MRPL24; C10orf76; MUL1; RNF219; ADIPOR2; FAM118B; TANGO6; SNRNP25; C6orf211; OCEL1; ARMC7; OSBPL9; ROGDI; CHMP6; SRD5A3; PANK3; HECTD3; NLRX1; FN3KRP; C22orf29; ZDHHC14; MSANTD2; NAA35; YRDC; MANEA; OGFOD3; BBS1; PRKRIP1; NOL9; TBL1XR1; ZNF768; THAP9; PALB2; TEFM; AAMDC; BBS10; SNIP1; ASB13; ASB7; KATNBL1; TXNDC15; CCDC82; KLHL36; FBXO31; HPS6; TTC21B; PTCD2; CAMKMT; METTL8; ZMYM1; GEMIN6; NHEJ1; ZBTB3; TMEM180; CSPP1; RPAP2; CBLL1; RABEP2; UBA5; TGS1; GGNBP2; ZNF672; NUP85; EIF2C3; PYROXD1; ACTR5; MRM1; KIAA0319L; SLC35E1; OBFC1; ZCCHC4; C10orf88; RMI1; FAM192A; PHC3; WWC2; NAA25; UBTD1; TMEM62; PANK2; FBXL18; GFM1; KLHL18; ZNF606; MZT2B; VCPIP1; RPF1; THOC7; CENPT; USP36; CTC1; MUS81; WDR19; CHD9; PROSER1; CCDC92; TM2D3; NAA50; COQ10B; ACSF2; C17orf70; SIK3; SLC35F5; FAM214B; C16orf70; EDE
M3; ITPKC; GRPEL1; MED28; DNAJC5; WDR82; WDR61; TNKS2; THUMPD2; NDFIP1; CYB5B; ZNF34; WDR59; KLHL15; INTS5; EEPD1; DUSP16; SH3BP5L; SETD7; ACAP3; KIAA1715; MAP2K2; RAI1; TMX1; ILKAP; SLC25A32; CLPTM1L; PTDSS2; HM13; ITFG1; SGPP1; WBSCR16; C1orf21; CSRNP2; MRPS26; ANKRD13C; CCDC130; PLA2G12A; CTNNBL1; APOL2; TRIM8; SNX27; C6orf62; ISCA1; TRIM56; SBF2; MED25; SHARPIN; ARPC5L; RAB1B; QTRT1; SLC25A28; HDHD3; NECAB3; MRPS15; SF3B5; INO80B; RAB33B; HUWE1; MRPL9; RILP; COG3; GUCD1; ZMIZ2; FAM103A1; SELO; RIOK1; GRWD1; L3MBTL2; LONP2; RBM4B; BBS2; GORASP1; MRPS5; MRPL32; FRMD8; ATAD3B; TAF3; RSPH3; TMEM120A; SNX25; MRPS24; RNF26; STK40; C10orf11; EIF2A; TM2D1; ITFG3; SRSF8; MRPL14; MRPL43; RBM48; MAGT1; HDHD2; TMEM222; SLC10A7; KBTBD7; ANKRD27; ENKD1; CEP192; PCBD2; ZNF394; ATRIP; WDR75; USP42; TOMM40L; UTP15; PHAX; SLC7A6OS; FAM175B; KAT8; RNASEH2C; RPF2; SON; ANKRD17; CHD6; PCNXL3; ZCCHC7; SETD3; SGK196; TMEM117; WDR24; ZNRF1; TRAF7; MAF1; MED10; SLC37A3; DCUN1D5; POLR3GL; C9orf64; CHCHD5; C9orf89; POLDIP3; YIPF4; NOA1; COQ5; NICN1; PRADC1; BTBD10; TMEM79; NTPCR; TMEM175; ZDHHC16; ING5; UTP23; LLPH; MIEN1; MNF1; PDCD2L; MRPL45; BRMS1L; VPS25; LSMD1; ACBD6; DNAJC14; LZIC; APOPT1; TMEM101; ELOF1; GFM2; COG8; HPS3; C5orf4; MKI67IP; BAZ1B; PINK1; HOOK3; MSANTD4; SYVN1; ZNF333; FAM120B; CC2D1B; ZNF527; PPIL3; MRPS6; MRPL41; MRPL38; MRPL36; C14orf142; JAGN1; ZC3H8; MAK16; GNPTG; USP38; HIATL1; SMEK1; GLYR1; DPY30; FAM126A; USP32; HINT2; MCEE; LOXL3; USP30; FUT10; PCGF1; MPV17L2; TUBA1C; MFSD9; TXNDC17; LMNB2; PHF5A; LRCH3; KLHL22; CCDC142; CBR4; ZC3H10; PARP10; ZBTB45; SYAP1; SPPL2A; ADO; GTDC2; FAM73B; ATAD1; TBRG1; NFATC2IP; CEP89; ZNF341; FAM136A; TMEM87B; CIRH1A; PPP1R15B; FIZ1; DIRC2; SPRYD3; TMEM209; C8orf76; C12orf52; ATG4C; MUM1; WDR73; LACTB; ABHD13; LTV1; SERAC1; TIGD5; PRPF38A; ALKBH6; LSM10; ATG4D; PPP1R16A; PYURF; UBL7; TMEM128; TMEM141; TMEM60; C9orf37; POLR2C; CSRNP1; HIAT1; SYNE1; SARNP; EAF1; ALG2; ZCCHC3; PNPT1; RRP36; ZCRB1; NEK9; RBM18; SURF4; PIGS; LMF2; PPP1R3F; PURB; DGCR6L; BTBD6; MRPS36; C22orf32; MICALL1; KIAA1731; ZNF622; IMP4; METTL18; PGAP3; C9orf123; CDK11B; TPGS1; MFN1; INTS4; TRIM41; TP53RK; N4BP2L1; MMAB; CCDC97; GADD45GIP1; ADCK2; ZNF830; RFT1; MGME1; VPS26B; NACC1; MBD6; ESCO1; SMYD4; ATG4A; WDFY2; DNTTIP1; RBM33; TMEM203; EGLN2; MRPL53; SNAP47; TADA1; THEM4; GLMN; ANKH; KLHDC3; NAA15; TSR2; UBE2J2; LOH12CR1; SMIM11; FAM207A; RPUSD1; ZNF354B; MYO18A; SLC36A1; SCAMP4; PIGU; SLC44A1; ZSWIM1; B3GALT6; MED30; TMEM41A; CDKN2AIPNL; SLC35A4; DYNLL2; UBE2F; SRXN1; B3GAT2; ROMO1; DTD1; FAM210B; OVCA2; SPSB3; SOCS4; PRRC1; ELMO2; LRPPRC; WIPF2; RSPRY1; ZNF526; ZNF721; SAT2; HELQ; MED22; RAD52; NUP35; SPTSSA; PYGO2; FAM122A; KLC4; KIAA2013; FAM105B; SAMD1; C19orf52; CEP95; PRMT10; TTC5; OXNAD1; MTG1; G6PC3; TMEM183A; MARS2; NOM1; MVB12A; GTF3C6; KTI12; FAM195A; SAAL1; CASC4; C12orf57; MFSD3; MALSU1; ACYP2; BATF2; NUS1; GLI4; CDAN1; CYHR1; TECR; HINT3; TAF8; HAS3; PPP1R14B; MPLKIP; NDNL2; RHOT2; SLC25A46; ALKBH8; WDR85; ZNF653; GINM1; LEO1; ANKRD54; MITD1; TAMM41; HIGD2A; MSI2; SPPL3; PPIL4; ALKBH3; FGD4; MTFMT; PPM1L; TSTD2; EHD4; ORMDL3; WDR36; PPTC7; RPIA; SLC39A3; ANGEL2; HN1L; MAPK1IP1L; L3HYPDH; TEX261; LRRC28; FOPNL; ZC3H18; FLCN; CYB5D1; TBC1D20; TMEM42; NACC2; FAM76B; ZNF18; ZNF480; ZNF420; ZNF558; ZNF570; BROX; LSM14B; PUS10; SEPT10; CCDC12; SPICE1; THAP6; ZMAT2; APOA1BP; MBNL2; FAM91A1; DENND5B; ZNF564; IMMP1L; ZFC3H1; LRRC45; TSNARE1; CCNY; UBLCP1; UPRT; FUK; ZUFSP; OARD1; NSMCE1; FAM200A; ZSCAN25; SFT2D1; MAP2K7; NAPRT1; CSNK1A1L; VTI1A; MRPL30; OMA1; FRA10AC1; UBALD1; MRPL10; CCDC127; NUDCD2; C6orf57; ZBTB49; SLC15A4; ATPAF2; KIFC2; ABTB2; ZNF511; MTPN; CRYZL1; ZNF23; ZSCAN21; ZNRF2; SGMS1; RPP25L; SVIP; RPUSD2; C12orf23; CHMP7; ZNF585B; ARRDC1; ORAI3; ZNF561; TADA2B; TRMT61A; SLC36A4; ARL14EP; C12orf45; TARSL2; SPATA2L; LSM12; ZNF491; ZNF440; C1orf131; KCTD18; METTL6; GRPEL2; ZNF786; NDUFAF6; TMEM68; HGSNAT; ARHGAP42; KBTBD3; CWF19L2; C12orf66; LYSMD4; ZSCAN29; ZNF785; TMEM199; ZNF417; C19orf25; B3GALNT2; ZNF362; MROH8; COMMD1; KANSL1L; XXYLT1; SCFD2; TRMT44; SRFBP1; SNRNP48; ZNF579; ZNF383; SDE2; RNF168; MIER3; TCEANC; ARID2; UBE2E2; NANP; DENND6A; RWDD4; CCDC111; HIPK1; SENP5; STT3A; PATL1; EFHA1; CPNE2; NT5DC1; C6orf89; HIBADH; BRAT1; RICTOR; YTHDF3; TMEM256; MFSD8; D2HGDH; TAB3; TMEM18; UHRF2; TANGO2; N4BP1; TCEANC2; EID2; NPHP3; ZNF461; LRRC57; CNEP1R1; PUSL1; TMEM161B; ZNF791; TAPT1; KIAA1919; LNX2; AGXT2L2; MED19; COG7; CRYBG3; CPNE8; PIGP; ZFP1; C2orf69; ZNF367; AAED1; KDELC2; TTL; CACUL1; ZFPM1; MLL3; MLX; C11orf31; PGBD3; TRIM35; HSCB; CBWD2; RC3H1; TNFSF12-TNFSF13; SUGP1; MMAA; MRPL54; PSENEN; RUNDC1; FAM149B1; MMGT1; DCUN1D3; CCDC117; ZNF584; KCTD20; PRR14L; ANKRD52; DIP2B; INO80E; HEXDC; RTTN; ZNF776; SLC9A9; C3orf33; DCBLD1; NSMCE2; PDZD8; BLOC1S2; TTC9C; FAM126B; C3orf38; RABL3; COX18; SREK1IP1; KRTCAP2; NDUFAF2; PPP4R2; CCDC50; TMEM167A; NOP9; UBR1; ADCK5; N6AMT2; GPATCH11; ZNF575; EMC10; DDX51; UBR7; TXLNA; EXOC8; ZADH2; CRIPAK; C5orf51; CDK5RAP3; CHMP4B; ZNF800; GATC; INADL; NR2C2AP; MIDN; NUDT14; CYP20A1; P4HTM; PDE12; PPM1G; TUBB; GGT7; ERC1; FAM134C; SLC35B2; ZNF598; MRPL52; GMCL1; DRAM2; PIGW; ZNF616; ZBTB8OS; ZNF678; ZDHHC21; MTDH; ARL5B; AGPAT6; STT3B; GPR180; ZACN; MRPL55; GCC2; ZNF445; EXOSC8; MRPL21; AUP1; C17orf58; OGT; QSOX2; LYRM7; DNAJC24; BCDIN3D; GRASP; UBXN2A; CRTC2; METTL2A; TMTC3; DPY19L4; AASDH; TMED7; ZSCAN22; ZSCAN2; COQ6; USP12; ZNF227; ZNF428; MTERFD2; C9orf85; CMC1; ZNF595; NSUN6; TMED4; BRICD5; PDDC1; C15orf38; MRPS9; TPRG1L; TRNT1; TICAM1; HEATR3; ZNF326; CYP2U1; C9orf142; ARRDC4; HNRNPA3; DND1; ISCA2; SPTY2D1; RPS19BP1; PHLPP1; RNF126; C7orf55; TSC22D3; GNPNAT1; COX20; C1orf52; CCZ1B; GANC; ARSK; E2F6; LYSMD3; GANAB; APOOL; RSBN1L; C19orf54; RPL7L1; CCDC84; FAM174A; NHLRC2; ZNF710; HDDC3; ATP9B; ZNF773; MIA3; TMEM110; ACACA; FAM120AOS; NUP43; SS18L1; DHX57; NELFCD; NSUN4; NDUFAF3; CARM1; TMEM189-UBE2V1; CCDC137; NACA2; PHF17; FAHD2B; TMEM179B; CCDC23; FAM86A; SLC25A35; RP9; POLR1C; CHCHD1; RAPH1; TMEM81; RBM12B; MBLAC1; MRFAP1L1; COMMD6; C19orf70; CLYBL; MRAP; RNF216; GTF2H5; FAM199X; ERICH1; ZDHHC24; TSEN54; CYP4V2; C1orf174; BLOC1S3; METTL10; ZNF543; ZNF789; ZNF517; SFXN4；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、参照遺伝子はさらなるｑＰＣＲ反応によって分析される。
【００３５】
いくつかの実施態様において、プロセス内対照は、逆転写酵素及び／又はＰＣＲ反応性能のための対照である。これらのプロセス内対照には、非限定例として、ＲＮＡ単離後及び逆転写前に添加される参照ＲＮＡ（本明細書ではｒｅｆ．ＲＮＡとも呼ばれる）が含まれる。いくつかの態様において、ｒｅｆ．ＲＮＡはＱｂｅｔａなどの対照である。いくつかの実施態様において、ｒｅｆ．ＲＮＡはさらなるＰＣＲ反応によって分析される。
【００３６】
いくつかの実施態様において、抽出された核酸、例えばＲＮＡ及び循環ＮＡは、Ｔ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の欠失、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の挿入の検出に基づいてさらに分析される。
【００３７】
Ｔ７９０Ｍ変異は、ゲートキーパー（gatekeeper）変異として同定されている。このいわゆるゲートキーパー変異は、治療中の選択圧によって現れると考えられるだけでなく、まれに（＜５％）ＴＫＩ未治療腫瘍にも見られ、潜在的にこれらの薬剤に対する１次耐性に寄与している（例えば、Gazdar et al., “Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors.” Oncogene, vol. 28 Suppl 1: S24-31 (2009), Suda et al., “EGFR T790M mutation: a double role in lung cancer cell survival?” J Thorac Oncol, vol. 4: 1-4 (2009); Mulloy et al., “Epidermal growth factor receptor mutants from human lung cancers exhibit enhanced catalytic activity and increased sensitivity to gefitinib.” Cancer Res., vol. 67(5): 2325-30 (2007)、及び Vikis et al., “EGFR-T790M is a rare lung cancer susceptibility allele with enhanced kinase activity.” Cancer Res., 67(10): 4665-70 (2007)を参照、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。より高感度の分子的方法の出現はまた、未治療の患者の腫瘍におけるこの突然変異の検出を容易にし、潜在的にＴＫＩに対する１次耐性にも同様に寄与している。最後に、治療前の患者におけるＴ７９０Ｍの存在は、Ｔ７９０Ｍが検出されない治療前の患者と比較して、有意な無増悪生存期間と関連していた（例えば、Pao et al., “Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain.” PLoS Med., vol. 2(3): e73 (2005), Maheswaran et al., “Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells.” N Engl J Med, vol. 359(4): 366-77 (2008)、及び Isobe et al., “Clinical significance of BIM deletion polymorphism in non-small-cell lung cancer with epidermal growth factor receptor mutation.” J Thorac Oncol, vol. 9(4): 483-87 (2014)に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３８】
他のＥＧＦＲ変異（例えば、エクソン２１、Ｌ８５８Ｒ、及びエクソン１９の挿入及び欠失）を有する患者は、無作為化第ＩＩＩ相試験を含む前向き試験において、より良好なＸ線撮影反応率を示した［Fukuoka et al. 2011;” Biomarker analyses and final overall survival results from a phase III, randomized, open-label, first-line study of gefitinib versus carboplatin/paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer in Asia (IPASS).”, Journal of Clinical Oncology, vol. 29(21):2866-74 (2011)］。Ｌ８５８Ｒ及びエクソン１９の挿入及び欠失については、インターネット上でそれぞれaccessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf16/p1060045b.pdf 及び accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf15/p150044b.pdfで入手可能な安全性及び有効性データの要約（ＳＳＥＤ）Ｐ１６００４５及びＰ１５００４４において、ゲフィチニブ及びエルロチニブについて有意な治療上の利点が証明された。
【００３９】
いくつかの実施態様において、機械学習に基づくモデル化、データマイニング方法、及び／又は統計解析を使用して追加の分析が行われる。いくつかの実施態様において、患者の疾患転帰を特定又は予測するためのカットオフ値を得るために、データが分析される。いくつかの実施態様において、患者集団内の患者を層別化するために、データが分析される。いくつかの実施態様において、非限定例として、ＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療などのＥＧＦＲ治療を用いた治療に、患者が耐性があるかどうかを特定又は予測するために、データが分析される。いくつかの実施態様において、データは対象の無増悪生存期間を測定するためのものである。
【００４０】
いくつかの実施態様において、Ｔ７９０Ｍ変異、Ｌ８５８Ｒ変異、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失が検出された場合に、対象に対する治療法選択肢を選択するために、データが分析される。いくつかの実施態様において、治療法選択肢はＥＧＦＲ阻害剤による治療である。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、又はチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせ、又は免疫療法薬を含む他の分子薬剤である。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は第１世代チロシンキナーゼ阻害剤又は第１世代チロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせである。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、第２世代チロシンキナーゼ阻害剤又は第２世代チロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせである。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、第３世代チロシンキナーゼ阻害剤又は第３世代チロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせである。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、第１世代のチロシンキナーゼ阻害剤、第２世代のチロシンキナーゼ阻害剤、及び／又は第３世代のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせである。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、別のチロシンキナーゼ阻害剤、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、次世代のチロシンキナーゼ阻害剤（すなわち、第４世代のチロシンキナーゼ阻害剤）、又はＥＧＦＲ内のＴ７９０Ｍ又は任意の突然変異もしくは遺伝子改変を標的とする別の分子薬である。さらなる実施態様において、上記のＥＧＦＲ阻害剤は、腫瘍細胞に対する患者自身の免疫応答を増強する免疫療法薬と組み合わせて使用される。
【００４１】
次に、本発明の様々な態様及び実施態様について詳細に説明する。本発明の範囲から逸脱することなくその詳細の変更がなされてもよいことは理解されるであろう。さらに、文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００４２】
特定された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載された方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供されている。この点に関しては、それらが先行発明であるために又は他の何らかの理由で、そのような開示に先行する権利がないことを、本発明者らが承認していると解釈するべきではない。日付に関するすべての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、本出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】試料抽出から変異コール（mutation calling）までのＴ７９０Ｍ検出アッセイワークフローの概略図である。
【図１Ｂ】試料抽出から変異コール（mutation calling）までのＴ７９０Ｍ検出アッセイワークフローの概略図である。
【図１Ｃ】試料抽出から変異コール（mutation calling）までのＴ７９０Ｍ検出アッセイワークフローの概略図である。
【００４４】
【図２】図１に示されるＴ７９０Ｍ検出アッセイの分析性能を示すグラフである。各データ点は、最大１４の独立した実験を表す。データはｌｏｇ１０スケールを使用してプロットされているが、１ｍＬ当たりのＴ７９０Ｍのコピーは視覚的な補助のために示されている。
【００４５】
【図３】図１に示されるＴ７９０Ｍ検出アッセイの臨床成績を示すグラフである。
【００４６】
【図４】高度に分解されたＤＮＡ中の変異を検出するための、大きいアンプリコン対短いアンプリコン（塩基修飾あり又はなし）の比較を示すグラフである。
【００４７】
【図５Ａ】塩基修飾を含むＡＲＭＳプライマーと塩基修飾を含まないＡＲＭＳプライマーとの比較を示す一連のグラフである。
【図５Ｂ】塩基修飾を含むＡＲＭＳプライマーと塩基修飾を含まないＡＲＭＳプライマーとの比較を示す一連のグラフである。
【００４８】
【図６】正常な健常血漿からの漸増量のｅｘｏＮＡ及び循環ＮＡに適応する本明細書に記載のアッセイの能力を証明するグラフである。
【００４９】
【図７】Ｌ８５８Ｒ及びＤｅｌ１９検出アッセイの性能を証明するグラフである。グラフに示されているように、野生型試料と変異体試料との間には明確な差がある。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（発明の詳細な説明）
本開示は、生物学的試料中の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）変異などの１つ又は複数のバイオマーカーを検出して、例えば癌などの疾患の診断、予後予測、モニタリング、又は治療法選択を補助する方法を提供する。いくつかの実施態様において、癌は肺癌である。いくつかの実施態様において、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００５１】
本明細書に提供される方法及びキットは、生物学的試料中のＥＧＦＲ耐性及び／又は感作変異を検出するのに有用である。いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０上のＴ７９０Ｍ変異である。いくつかの実施態様において、変異は、特に限定されるものではないが、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における１つ又は複数の挿入変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における１つ又は複数の欠失変異、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１上のＬ８５８Ｒ変異を含む、活性化変異である。本明細書に提供される方法及びキットは、血漿から細胞外ＮＡ及び無細胞ＮＡの両方を同時単離するものであり、細胞外ＮＡ及び無細胞ＮＡは逆転写される。逆転写工程では、増幅対照（ＤＮＡ）及び対照中のＲＮＡスパイクが加えられ、逆転写及びそれに続く増幅が起こることを確実にする。次の工程において、予備増幅反応が行われる。いくつかの実施態様において、予備増幅反応はマルチプレックス予備増幅反応である。いくつかの実施態様において、予備増幅反応は、野生型遮断薬を含むマルチプレックス予備増幅反応である。いくつかの実施態様において、マルチプレックス予備増幅反応は、ＥＧＦＲのエクソン１９、エクソン２０、及び／又はエクソン２１に対する野生型遮断薬を含み、これは、循環ＮＡ及びｃＤＮＡからの変異体分子の増幅を促進する。いくつかの態様において、野生型遮断薬は、疎水性核酸、架橋核酸、ペプチド核酸、３’末端ターミネーターを有する任意のオリゴヌクレオチド、野生型分子の効率的な検出を妨げる任意の他の修飾、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施態様において、予備増幅工程は、野生型配列よりも、変異体ＥＧＦＲ配列、例えば、変異体ＥＧＦＲエクソン１９配列、変異体ＥＧＦＲエクソン２０配列、及び／又は変異体ＥＧＦＲエクソン２１配列の予備増幅を促進する条件下で行われる。いくつかの実施態様において、予備増幅反応は１重予備増幅反応である。いくつかの態様において、予備増幅反応及び逆転写は単一工程で行われる。次の工程において、核酸は、ＮＧＳなどの配列決定に基づく検出技術を使用して分析される。いくつかの実施態様において、配列決定に基づく検出技術はＰＣＲに基づく技術を含む。いくつかの実施態様において、配列決定に基づく検出技術はまたｑＰＣＲを含む。いくつかの実施態様において、ｑＰＣＲは増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）に基づく。
【００５２】
本明細書に提供される方法及びキットは、この突然変異を有するＮＳＣＬＣ患者の治療を導くために使用することができ、これは、その結果として第１世代のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に耐性となるであろう。
【００５３】
本明細書に提供される方法及びキットは、現在の肺がんの診断よりも優れたいくつかの利点を有する。患者試料中のＴ７９０Ｍを検出する現在の方法は、例えば、Thress et al.（“EGFR mutation detection in ctDNA from NSCLC patient plasma: A cross-platform comparison of leading technologies to support the clinical development of AZD9291.” Lung Cancer, vol. 90(3): 509-15 (2015)）及びKarlovich et al.（“Assessment of EGFR Mutation Status in Matched Plasma and Tumor Tissue of NSCLC Patients from a Phase I Study of Rociletinib (CO-1686).” Clin. Cancer Res., vol. 22(10): 2386-95 (2016)）に記載されている。ＮＳＣＬＣ患者におけるＴ７９０Ｍを検出するこれらの方法の感度及び特異性の例を以下の表に示す。
【表１】
2019536456.tif 000003
以下の表は、ＡＵＲＡ３臨床試験（ＮＣＴ０２１５１９８１）からの３つすべての標的の感度と特異性を示す（J. Laskin により、国際肺癌学会（the International Association for Study of Lung Cancer）で発表された、“Detection of EGFR mutations from plasma ctDNA in the osimertinib Phase III trial (AURA3): comparison of three plasma assays”, 2017, これは、library.iaslc.org/search-speaker?search_speaker=51233 から入手できる)。
【表２】
2019536456.tif 000004
【００５４】
現在の肺がんの診断は病理学者によって行われており、そして腫瘍組織のサンプリングは重大な特有の制限を有し、例えば腫瘍組織はその時点の単一の採取物であり、腫瘍の不均一性から生じる選択バイアスの影響を受け、かつ入手困難な場合がある。場合によっては、一部の患者では十分な腫瘍組織試料が入手できないとか、及び／又は組織試料を入手することが気胸などの合併症を引き起こす可能性がある。しかしこれまでのところ、患者の層別化のための参照の非標準的方法は組織生検であった。
【００５５】
任意の所定の生体液への核酸（細胞外ＮＡ）の放出をもたらすプロセスはいくつかあるため、本明細書で提供されるキット及び方法は、疾患プロセス全体及び腫瘍環境全体を調べる能力を活用する。これらのプロセスの中には、例えばアポトーシス及び壊死がある。アポトーシス細胞又は壊死細胞は、異なるメカニズムによって（すなわちアポトーシス小胞又は循環ヌクレオソームとして）無細胞核酸を放出することができる。さらにＥＶは、原形質膜から直接生細胞により、又は核酸を循環流中に運搬する（ｅｘｏＮＡ）多小胞体経路を介して、活発に放出される。患者試料中のＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を検出する現在の方法とは対照的に、本明細書に提供される方法及びキットは、腫瘍内部で同時に起きているすべてのプロセスを分析することができる。
【００５６】
これらの方法及びキットは新規である：組織生検からのＤＮＡにおけるＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の検出はすでに日常的に行われているが、エクソソームＮＡ画分に加えて、循環ＮＡ中のＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失を検出することは、全く新規である。生体液が、診断アッセイに使用できる腫瘍由来のＮＡを含むことはごく最近になって理解されたため、これらの方法及びキットが、現在の方法に対して明白ではない。
【００５７】
本明細書に提供される実施例は、無細胞ＮＡ及び細胞外ＮＡを試料投入材料として使用して、試料抽出から変異コールまでの、ＥＧＦＲにおけるＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の検出のための完全なワークフローを記載する。実施例は１つの例示的な実施態様を提供するが、当業者が、そこで用いられる方法を修飾して、ＥＧＦＲにおけるＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の検出のための一般的方法を作成することができることは理解されたい。一般に、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の存在は、以下のように検出される：
１）細胞外ＮＡ及び循環ＮＡ中に存在するＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失は、非限定例として、例えばアフィニティー結合カラム又はビーズ、イオン交換結合カラム又はビーズ、又は遠心分離、超遠心分離、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を含む任意の適切な分離手段を使用することにより、血漿又は他の生体液から同時単離される。
２）単離された核酸が逆転写され、そしてこの工程で、既知量の対照核酸が阻害の対照として反応に添加される。本明細書で提供される方法では、任意の外因性核酸又は合成核酸を使用することができる。適切な対照には、非限定例として、Ｑ−ベータバクテリオファージ、ウイルス粒子、任意の他の外因性核酸配列、及び外部スパイクイン（spike-in）として作用する任意の他の非ヒト核酸配列由来の１つ又は複数の核酸が含まれる。スパイクインは、粒子全体（例えば、Ｑベータ又は他のウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質複合体）又はそれらの核酸のみであり得る。核酸単離前に生体液へのスパイクインが発生する場合は、粒子全体がより適しており、核酸精製後は、脂質複合体、タンパク質複合体などで保護されていない「遊離」核酸スパイクインが試料に添加するのに適している。
３）この段階で、逆転写（ＲＴ）反応物を予備増幅することができる。予備増幅工程は、野生型クランプ（clamp）又は遮断薬の存在下で行われ、変異体に偏った分子集団が生成される。この工程で使用するのに適した野生型クランプには、非限定例として、１つ又は複数の疎水性核酸、１つ又は複数のブリッジ核酸、１つ又は複数のペプチド核酸、３’末端ターミネーター（例えば、反転塩基、Ｃ３−スペーサー、リン酸塩）、又はこれらの組み合わせを有する任意のオリゴヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施態様において、予備増幅工程は、野生型配列よりも変異体配列の増幅を促進する任意のＰＣＲ条件下で行われる。いくつかの実施態様において、予備増幅工程は必要ではなく、本方法は直接下記のｑＰＣＲ工程に進む。
４）ｑＰＣＲ工程はマルチプレックス反応（内因性対照、Ｔ７９０Ｍ及び／又はＬ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失、及び阻害の対照）で行われる。Ｔ７９０Ｍ及び／又はＬ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失は、野生型分子よりも変異体分子の増幅を促進する方法を含む任意の適切な検出方法を使用して検出することができる。いくつかの実施態様において、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及びエクソン１９の挿入及び／又は欠失は、ＡＲＭＳアプローチを使用して検出される。逆進プライマーの３’塩基は、変異体配列（Ｔ７９０Ｍ及び／又はＬ８５８Ｒ及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失）と完全に一致しており、野生型鋳型とのミスマッチがある。３’末端付近の塩基修飾としては、２−アミノプリン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、トリメトキシスチルベン、Ｃ−５プロピニル−デオキシシチジン、Ｃ−５プロピニル−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、反転ｄＴ、反転ジデオキシ−Ｔ、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＣ、５−メチルｄＣ、アミノエチル−フェノキサジン−デオキシシチジン、及びロックト核酸（ＬＮＡ）などの修飾塩基、並びに変異体特異的プライマーの３’末端での核酸相互作用を増大させるための塩基の１つにおける少なくとも１つのミスマッチ塩基の包含が挙げられる。変異体特異的プライマーの一方の塩基における、追加のミスマッチもまた企図される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのミスマッチ塩基は、変異体特異的プライマーの最後から４番目、最後から３番目、最後から２番目、又は最後の塩基である。
５）患者の疾患転帰を同定又は定量するために、最先端の機械学習及びデータマイニング技術を使用して、ｑＰＣＲ工程からのいくつかの特徴、たとえば、特に限定されるものではないが、ＣＴ値、デルタＣＴ値、生Ｒｎ値、並びにＲＯＸ標準化ｄＲｎ値などについて、モデルが訓練される。
６）内部対照に関する様々な境界条件を決定して、試料分類の前に品質管理のためのフィルターを確立して、偽の挙動を示す試料を除外する。
【００５８】
いくつかの実施態様において、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失の存在は、以下のように検出される：
１）細胞外ＮＡ及び循環ＮＡ中に存在するＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失は、親和性結合カラムを使用することにより、血漿又は他の生体液から同時単離される。
２）単離された核酸は、第１鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して逆転写される。この工程で、４０００コピーのＱＢｅｔａ（合成ＲＮＡ、外因性スパイク）が、阻害の対照として反応に添加される。
３）ＲＴ反応物が予備増幅される。予備増幅工程は、野生型遮断薬（疎水性核酸）の存在下で行われ、変異体に偏った分子集団が生成される。
４）ｑＰＣＲ工程はマルチプレックス反応（内因性対照、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失、及び阻害の対照）で行われる。Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失は、ＡＲＭＳアプローチを使用して検出される。逆進プライマーの３’塩基は、変異体配列（Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、及び／又はエクソン１９の挿入及び／又は欠失）と完全に一致しており、野生型鋳型とのミスマッチがある。３’末端付近の塩基修飾としては、２−アミノプリン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、トリメトキシスチルベン、Ｃ−５プロピニル−デオキシシチジン、Ｃ−５プロピニル−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、反転ｄＴ、反転ジデオキシ−Ｔ、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＣ、５−メチルｄＣ、アミノエチル−フェノキサジン−デオキシシチジン、及びロックト核酸（ＬＮＡ）などの修飾塩基、並びに変異体特異的プライマーの３’末端での核酸相互作用を増大させるための塩基の１つに少なくとも１つのミスマッチ塩基の包含が挙げられる。変異体特異的プライマーの一方の塩基における、追加のミスマッチもまた企図される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのミスマッチ塩基は、変異体特異的プライマーの最後から４番目、最後から３番目、最後から２番目、又は最後の塩基である。
５）患者の疾病転帰を同定又は定量するために、最先端の機械学習及びデータマイニング技術を使用して、ｑＰＣＲ工程からのいくつかの特徴、たとえば、特に限定されるものではないが、ＣＴ値、デルタＣＴ値、生Ｒｎ値、及び受動的参照に対して標準化されたｄＲｎ値（又は受動的参照なし）などについてモデルが訓練される。
６）内部対照に関する様々な境界条件を決定して、試料分類の前に品質管理のためのフィルターを確立して、偽の挙動を示す試料を除外する。
【００５９】
本方法及びキットは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２０に見られる２３６９ＣからＴへの突然変異であるＴ７９０Ｍ変異；ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１に見られる２５７３ＴからＧへの変異であるＬ８５８Ｒ変異；及びＥＧＦＲ遺伝子の１つ又は複数のエクソン１９の挿入及び／又は欠失、を同定及び検出するように設計された。循環遊離ＮＡが高度に断片化されているため、本明細書に提供される方法及びキットは、短いアンプリコン（例えば、＜２００塩基対）を検出するように設計された。本明細書に提供される方法及びキットは、増幅可能なＥＧＦＲの量を規定するための対照アッセイ（野生型アッセイ）を含む。本明細書に提供される方法及びキットは、試料中の酵素阻害剤の存在／非存在を評価するための阻害の対照の使用を提供する。本明細書に提供される方法及びキットはまた、野生型増幅をさらに防ぐための野生型特異的遮断薬の使用も含む。
【００６０】
本方法及びキットは、プライマー中の修飾ヌクレオチドの使用を含む。３’末端付近の塩基修飾としては、２−アミノプリン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、トリメトキシスチルベン、Ｃ−５プロピニル−デオキシシチジン、Ｃ−５プロピニル−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、反転ｄＴ、反転ジデオキシ−Ｔ、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＣ、５−メチルｄＣ、アミノエチル−フェノキサジン−デオキシシチジン、及びロックト核酸（ＬＮＡ）などの修飾塩基、並びにＴmを上昇させるための、変異体特異的プライマーの３’末端での核酸相互作用を増大させるための塩基の１つに少なくとも１つのミスマッチ塩基の包含が挙げられる。２本鎖安定化塩基修飾の組み込みは、ＰＣＲに好ましい影響を与え、それによってより高い温度（Ｔａｑポリメラーゼが最大の活性を示すことが知られている範囲）でこれを行うことを可能する。
【００６１】
特定のプライマー及びプローブ配列が本明細書に提供されているが、本開示の方法及びキットはまた、表１に示された配列を含むプライマー及び／又はプローブ配列、あるいは表１に示された配列の修飾物であるプライマー及び／又はプローブ配列を使用し得る。これらのプライマー及び／又はプローブ配列の修飾物は、非限定例として、５’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、３’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、５’末端及び３’末端の両方への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、テイルの付加、配列の短縮、配列の伸長、数塩基上方又は下流への配列の移動、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００６２】
陽性対照及び阻害の対照のための特異的配列が本明細書中に提供されるが、本開示の方法及びキットはまた、これらの配列を含む対照配列、又はこれらの配列の修飾物である対照配列も使用し得ることが理解される。これらの対照配列の修飾物は、非限定例として、５’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、３’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、５’末端及び３’末端の両方への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、テイルの付加、配列の短縮、配列の伸長、数塩基上方又は下流への配列の移動、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００６３】
さらに、本明細書に提供される陽性対照配列及び阻害対照配列は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、陽性対照として作用する任意の適切な合成遺伝子配列を使用し得る。例えばいくつかの実施態様において、陽性対照配列は、ＥＧＦＲ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子の断片、又はＥＧＦＲ遺伝子に由来する配列でもよく、非限定例としては、ＥＧＦＲ遺伝子の修飾物が挙げられる。同様に本開示の方法及びキットは、阻害の対照として作用する任意の適切な遺伝子配列を使用し得る。例えばいくつかの実施態様において、阻害対照の配列は、Ｑ−ベータＲＮＡ配列、Ｑ−ベータＲＮＡ配列の断片、又はＱ−ベータＲＮＡ配列に由来する配列でもよく、非限定例としては、Ｑ−ベータＲＮＡ配列の修飾物、並びに任意の所定の生体液中にスパイクするために使用することができる任意の他の非ヒト配列（すなわち任意のウイルス／細菌配列）が挙げられる。これらの対照配列のいずれかの修飾物は、非限定例として、５’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、３’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、５’末端及び３’末端の両方への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、テイルの付加、配列の短縮、配列の伸長、数塩基上方又は下流への配列の移動、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００６４】
本明細書に記載の方法及びキットは、細胞外小胞を表面に捕捉し、その後微小小胞を溶解してその中に含まれる核酸、特にＲＮＡを放出させることにより、ＥＶを単離する。ＥＶは真核細胞によって放出されるか、又は原形質膜から出芽して、細胞の外側にいくことがある。これらの膜小胞は大きさが不均一であり、直径は約１０ｎｍ〜約５０００ｎｍの範囲である。これらの微小小胞には、微小小胞、微小小胞様粒子、プロスタソーム、デキソソーム、テキソソーム、エクトソーム、オンコソーム、アポトーシス小体、レトロウイルス様粒子、及びヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）粒子、並びにそのような細胞外構造を指す他の任意の用語が含まれる。小胞のエキソサイトーシスによって放出される小さい微小小胞（直径約１０〜５０００ｎｍ、しばしば直径３０〜２００ｎｍ）は、当該分野において「微小小胞」と呼ばれる。
【００６５】
微小小胞は、すべての細胞によって排泄され、すべてのヒト生体液中に存在する、高品質核酸の豊富な供給源である。微小小胞中のＲＮＡは、原発性腫瘍、転移巣、及び周囲の微小環境のトランスクリプトームの採取物をリアルタイムで提供する。従って、アッセイによる微小小胞のＲＮＡプロファイルの正確な評価は、コンパニオン診断及び疾患のリアルタイムモニタリングを提供する。この開発は、遅く、面倒で、変化し易く、診断環境には適さない、エクソソームを単離する現在の標準法によって停滞している。
【００６６】
本明細書に提供される単離及び抽出方法及び／又はキットは、微小小胞に結合する親和性膜を使用するスピンカラムに基づく精製プロセスを使用する。この単離及び抽出方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／００７７５５及びＷＯ２０１４／１０７５７１に詳細に記載されており、それぞれの内容は、その全体が本明細書に記載されている。本開示の方法及びキットは、単一のカラム上で０．２から８ｍＬまでの容量を使用して、多数の臨床試料を並行して実行する能力を可能にする。単離されたＲＮＡは純度が高く、溶解するまで小胞膜で保護されており、無傷の小胞は膜から溶出することができる。この単離及び抽出手順は、任意の所定の血漿投入物からすべてのｍＲＮＡを抽出することができ、そして超遠心分離又は直接溶解と比較した場合、ｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ収率は同等以上である。対照的に、本明細書に提供される方法及び／又はキットは、ｍｉＲＮＡの微小小胞結合画分を濃縮し、それらは容易に拡張可能であり、そして大量の投入材料への自動化に適している。このスケールアップする能力は、興味深い豊富に存在しない転写体に関する研究を可能にする。市場に出ている他の市販の製品と比較して、本開示の方法及びキットは、本明細書中に提供される実施例によって証明される独特の能力を提供する。
【００６７】
核酸の抽出前に生物学的試料から微小小胞を単離することは、以下の理由で有利である：１）微小小胞から核酸を抽出することは、流体試料内の疾患又は腫瘍特異的微小小胞を他の微小小胞から単離することによって得られる疾患又は腫瘍特異的核酸を選択的に分析する機会を提供する；２）核酸含有微小小胞は、最初に微小小胞を単離することなく流体試料から直接核酸を抽出することによって得られる収率／完全性と比較して、かなり高い収率の核酸種をより高い完全性で生成する；３）例えば、低レベルで発現された核酸を検出するためのスケーラビリティ、その感度は、本明細書に記載された方法を使用して大量の試料から微小小胞を濃縮することによって増加させることができる。４）生物学的試料内に天然に見られるタンパク質、脂質、細胞片、細胞、及び他の潜在的な汚染物質。及びＰＣＲ阻害剤が、核酸抽出工程の前に排除されている点で、より純粋又はより高い品質／完全性の抽出された核酸；５）単離された微小小胞画分は出発試料体積よりも小さい体積であり得るため、小体積カラムフィルターを使用してこれらの画分又はペレットから核酸を抽出することを可能にするため、核酸抽出方法におけるより多くの選択肢を利用することができる；そして６）微小小胞の単離は自動化に適している可能性があり、それは人的ミスを防止し、スケールアップする能力を提供するため有利である。
【００６８】
生体試料から微小小胞を単離するためのいくつかの方法が、当技術分野において記載されている。例えば、示差遠心分離法は、Raposo et al. (Raposo et al., 1996)による論文、Skog et al. (Skog et al., 2008)による論文、及び Nilsson et al. (Nilsson et al., 2009) による論文に記載されている。イオン交換及び／又はゲル浸透クロマトグラフィーの方法は、米国特許第６，８９９，８６３号及び第６，８１２，０２３号に記載されている。ショ糖密度勾配又はオルガネラ電気泳動の方法は、米国特許第７，１９８，９２３号に記載されている。磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）の方法は、Taylor and Gercel Taylor (Taylor and Gercel-Taylor, 2008)による論文に記載されている。ナノメンブレン限外濾過濃縮の方法は、Cheruvanky et al. (Cheruvanky et al., 2007) による論文に記載されている。パーコール勾配単離の方法は、Miranda et al. (Miranda et al., 2010) による刊行物に記載されている。さらに微小小胞は、マイクロ流体デバイス (Chen et al., 2010) によって対象の体液から同定及び単離され得る。研究開発並びに核酸バイオマーカーの商業的応用においては、一貫性、信頼性があり、実用的な方法で、生物学的試料から高品質の核酸を抽出することが望ましい。
【００６９】
核酸抽出
本明細書に開示された方法は、前記微小小胞からの高品質核酸の抽出のために、高度に濃縮された微小小胞画分を使用する。本明細書に記載の方法によって得られる核酸抽出物は、高品質の核酸抽出物が必要とされるか又は好まれる様々な用途、例えば疾患の診断、予後予測、又はモニタリングにおける使用、並びに例えば癌などの任意の病状に対する他の用途に有用であり得る。本明細書に提供される方法及びキットは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断のためのＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異、Ｌ８５８Ｒ  ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲの１つ又は複数のエクソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエクソン１９の欠失の検出に有用である。
【００７０】
単離された微小小胞の品質又は純度は、抽出された微小小胞核酸の品質に直接影響を及ぼし得、それは次に、疾患の診断、予後予測、及び／又はモニタリングのためのバイオマーカーアッセイの効率及び感度に直接影響を及ぼし得る。臨床分野における正確かつ高感度の診断試験の重要性を考えると、高度に濃縮された微小小胞画分を生物学的試料から単離するための方法が必要である。この必要性に取り組むために、本発明は、生物学的試料から高品質の核酸を抽出するために、生物学的試料から微小小胞を単離する方法を提供する。本明細書に示されるように、本明細書に記載される方法によって生物学的試料から高度に濃縮された微小小胞画分が単離され、次に高度に濃縮された微小小胞画分から高品質の核酸が抽出される。これらの抽出された高品質核酸は、疾患もしくは他の病状の診断、予後予測、及び／又はモニタリングを補助するためのバイオマーカーの有無を測定又は評価するのに有用である。
【００７１】
本明細書中で使用される用語「生物学的試料」とは、核酸及びタンパク質などの生物学的物質を含有する試料をいう。いくつかの実施態様において生物学的試料は、対象由来の体液を適切に含み得る。体液は対象の身体のどこから単離された流体でもよく、特に限定されるものではないが、例えば血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸器系、腸管、及び尿生殖路の液、涙液、唾液、母乳、リンパ系からの液、精液、臓器内液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、及び細胞培養上清、及びこれらの組み合わせを含む末梢位置由来でもよい。いくつかの実施態様において、体液は血漿である。約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの流体の試料容量の使用が適切である。流体の体積は、例えば使用される流体の種類などのいくつかの要因に依存し得る。例えば血清試料の容量は、約０．１ｍＬ〜約８ｍＬ、例えば約０．２ｍＬ〜８ｍＬであり得る。血漿試料の容量は、約０．１ｍＬ〜約４ｍＬ、例えば０．５ｍＬ〜４ｍＬであり得る。尿試料の量は、約１０ｍＬから約３０ｍＬ、例えば約２０ｍＬであり得る。生物学的試料はまた、糞便もしくは盲腸試料、又はこれらから単離された上清を含み得る。
【００７２】
「対象」という用語は、核酸含有粒子を有することが示されているか又は有すると予想されるすべての真核生物を含むことを意図している。特定の実施態様において、対象は哺乳動物、ヒト又は非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、他の家畜動物、又はげっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモットなど）である。ヒト対象は、観察可能な異常、例えば疾患のない正常なヒトであり得る。ヒト対象は、観察可能な異常、例えば疾患を有するヒトでもよい。観察可能な異常は、その人自身によって又は医療専門家によって観察され得る。「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」はＤＮＡ及びＲＮＡ（これらのすべての変種、例えばマイクロＲＮＡ、ロングＲＮＡを含む）を指す。核酸は１本鎖又は２本鎖であり得る。いくつかの例において核酸はＤＮＡである。いくつかの例において核酸はＲＮＡである。ＲＮＡとしては、特に限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びＨＥＲＶエレメントが挙げられる。
【００７４】
１つの態様において、有用なプライマー及びプローブは、表１に提供されるプライマー又はプローブと、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える同一性を有するヌクレオチド配列を含む。このようなプライマー及びプローブの修飾物もまた企図され、そして標準的な技術に従って調製され得る。
【００７５】
２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列の文脈において、用語「同一性％」は、以下の配列比較アルゴリズム又は目視検査のうちの１つを使用して測定したとき、一致が最大になるように比較及び整列されたときに、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定の割合を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。例えば同一性％は、比較されている配列のコード領域の全長に対するものである。
【００７６】
配列比較のために、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列はコンピューターに入力され、必要ならば部分配列同等物が指定され、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターが指定される。次に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴやＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの検索アルゴリズムを使用して決定することができる（Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25:17, 3389-402）。
【００７７】
いくつかの実施態様において、高品質核酸の抽出は、１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡを検出することができる抽出である。いくつかの実施態様において、抽出された１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの定量を使用して、核酸抽出の質を決定することができる。いくつかの実施態様において、１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの定量は、約１：１〜約１：２の比率であり、例えば約１：２である。理想的には、本明細書に記載の方法によって得られる高品質の核酸抽出物はまた、ＲＮＡ完全性数が、低タンパク質の生物学的試料（例えば、尿）については５以上であり、又は高タンパク質生物学的試料（例えば血清）については３以上であり、２０ｍｌの低タンパク質生物学的試料又は１ｍｌの高タンパク質生物学的試料からの核酸の収率は５０ｐｇ／ｍｌ以上である。
【００７８】
ＲＮＡ分解は、遺伝子発現及びｍＲＮＡ分析、並びに小型ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡなどの非コードＲＮＡの分析などにおいて、抽出されたＲＮＡの下流の評価に悪影響を及ぼす可能性があるため、高品質のＲＮＡ抽出が望ましい。本明細書に記載の新しい方法は、生物学的試料から単離された微小小胞から高品質の核酸を抽出することを可能にし、それにより微小小胞内の核酸の正確な分析を実施することができる。
【００７９】
生物学的試料からの微小小胞の単離後に、単離された又は濃縮された微小小胞画分から核酸を抽出することができる。これを達成するために、いくつかの実施態様において、まず微小小胞を溶解することができる。微小小胞の溶解及び核酸の抽出は、当技術分野において公知の様々な方法で、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／００７７５５及びＷＯ２０１４／１０７５７１（これらのそれぞれの内容はその全体が本明細書に記載されている）に記載の方法で達成することができる。そのような方法はまた、微小小胞内に含まれる核酸を捕捉するために核酸結合カラムを利用してもよい。核酸は一旦結合されると、核酸と結合カラムとの間の相互作用を破壊するのに適した緩衝液又は溶液を使用して、核酸を溶出させることができ、こうして核酸がうまく溶出される。
【００８０】
いくつかの実施態様において、核酸抽出方法はまた、生物学的試料からの高品質核酸の抽出を妨げる有害因子を除去又は軽減する工程を含む。そのような有害因子は、異なる生物学的試料が様々な種類の有害因子を含み得るという点で不均一である。一部の生物学的試料では、過剰なＤＮＡなどの要因が、そのような試料からの核酸抽出の質に影響を与える可能性がある。他の試料では、過剰な内因性ＲＮａｓｅなどの要因が、そのような試料からの核酸抽出の質に影響を与える可能性がある。これらの有害因子を除去するために、多くの化学物質及び方法使用することができる。これらの方法及び化学物質は、本明細書においてまとめて「抽出増強操作」と呼ぶ。場合によってはこの抽出増強操作は、生物学的試料への核酸抽出増強剤の添加を含み得る。内因性ＲＮａｓｅなどの有害因子を除去するために、本明細書で定義されるそのような抽出増強剤は、特に限定されるものではないが、Superase-In（Ambion Inc.から市販されている）又はRNaseINplus（Promega Corp. から市販されている）などのＲＮａｓｅ阻害剤、又は同様の方法で機能する他の作用物質；プロテアーゼ（これはＲＮａｓｅ阻害剤として機能し得る）；ＤＮａｓｅ；還元剤；合成ＲＮＡ及び／又は担体ＲＮＡのようなデコイ基質；ＲＮａｓｅに結合し得る可溶性受容体；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；ＲＮＡ結合分子、例えば抗ＲＮＡ抗体、塩基性タンパク質、又はシャペロンタンパク質；ＲＮａｓｅ変性物質、例えば高浸透圧溶液、界面活性剤、又はこれらの組み合わせを、含むことができる。
【００８１】
例えば抽出増強操作は、核酸を抽出する前に、生物学的試料及び／又は単離された微小小胞画分へのＲＮａｓｅ阻害剤の添加を含み得る。例えばいくつかの実施態様において、ＲＮａｓｅ阻害剤は、１μＬ以上の容量の試料について０．０２７ＡＵ（１×）を超える濃度；あるいは、１μｌ以上の試料について０．１３５ＡＵ（５×）以上；あるいは、１μｌ以上の試料について０．２７ＡＵ（１０倍）以上；あるいは、１μｌ以上の試料について０．６７５ＡＵ（２５×）以上；あるいは、１μｌ以上の試料について１．３５ＡＵ（５０×）以上、の濃度を有し；ここで、１Ｘ濃度は、１μｌ以上の体液から単離された微小小胞を処理するために０．０２７ＡＵ以上のＲＮａｓｅ阻害剤が使用される酵素条件を指し、５Ｘ濃度は、１μｌ以上の体液から単離された微小小胞を処理するために０．１３５ＡＵ以上のＲＮａｓｅ阻害剤が使用される酵素条件を指し、１０Ｘプロテアーゼ濃度は、１μｌ以上の体液から単離された粒子を処理するために０．２７ＡＵ以上のＲＮａｓｅ阻害剤が使用される酵素条件を指し、２５Ｘ濃度は、１μｌ以上の体液から単離された微小小胞を処理するために０．６７５ＡＵ以上のＲＮａｓｅ阻害剤が使用される酵素条件を指し、５０Ｘプロテアーゼ濃度は、１μｌ以上の体液から単離された粒子を処理するために１．３５ＡＵ以上のＲＮａｓｅ阻害剤が使用される酵素条件を指す。好ましくは、ＲＮａｓｅ阻害剤はプロテアーゼであり、この場合、１ＡＵは、１分あたり１μｍｏｌのチロシンに相当するフォリン陽性アミノ酸及びペプチドを放出するプロテアーゼ活性である。
【００８２】
これらの増強剤は様々な方法でその機能を発揮し、例えばＲＮａｓｅ活性の阻害（例えばＲＮａｓｅ阻害剤）、タンパク質の遍在的分解（例えばプロテアーゼ）、又はＲＮＡに結合して保護するシャペロンタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）を介するなどの、様々な方法でそれらの機能を発揮し得る。すべての場合において、そのような抽出増強剤は、生物学的試料中の有害因子の、又は本来は単離された粒子からの核酸の高品質抽出を防止又は妨害するであろう単離された粒子に関連する有害因子の、いくつか又はすべてを除去又は少なくとも軽減する。
【００８３】
核酸バイオマーカーの検出
単離された粒子中に存在する核酸の分析は定量的及び／又は定性的である。定量分析のために、単離された粒子内の目的の特定の核酸の量（発現レベル）（相対量又は絶対量）が、当技術分野で公知の方法（後述）により測定される。定性分析のために、単離された微小小胞内の目的の特定の核酸の種は、野生型であろうと変種であろうと、当技術分野で公知の方法により同定される。
【００８４】
本発明はまた、（ｉ）対象の診断を補助するための、（ｉｉ）対象における疾患又は他の病状の進行又は再発を追跡するための、又は（ｉｉｉ）疾患又は他の病状の治療を受けているか又は治療を考えている対象について治療有効性の評価を補助するための、高品質核酸の抽出のために、生物学的試料から微小小胞を単離する新規方法の様々な使用を含み、ここで、この方法から得られた核酸抽出物中の１つ又は複数のバイオマーカーの有無が決定され、そしてこの１つ又は複数のバイオマーカーは、疾患又は他の病状のそれぞれ診断、進行、もしくは再発、又は治療効果の予測に関連付けられる。
【００８５】
この目的のために本発明はさらに、陽性試料と陰性試料とを区別するための方法を使用することにより、上記目的のために臨床的に意味のあるカットオフ閾値を得ることを具体化する。カットオフ値は、エクソン２０ＣＴとエクソン７ＣＴとの間のデルタの絶対値に基づく。Ｅｘｏｎ２０、Ｅｘｏｎ７、ＱＢｅｔａのＣＴ値を推定するための強度閾値は、内部グリッド検索を使用して最適化されており、ここで、モデル群の中から最良のものがパラメータのグリッドによって選択される。陽性試料と陰性試料を区別するためのデルタＣＴカットオフは最適な強度閾値により学習され、ヨウデンのジェイ（Youden’s J）統計量に基づいて選択されている。
【００８６】
いくつかの実施態様において、微小小胞の核酸を分析する前に、これをを増幅することが有益であるか又は望ましい。核酸増幅の方法は、一般的に使用され、当該分野において公知であり、その多くの例が本明細書中に記載されている。所望であれば、増幅は、それが定量的であるように実施することができる。定量的増幅は、様々な核酸の相対量の定量的測定を可能にして、遺伝的又は発現プロファイルを作成することを可能にするであろう。
【００８７】
いくつかの実施態様において、抽出された核酸はＲＮＡを含む。この場合、ＲＮＡは、さらなる増幅の前に、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写される。このような逆転写は、単独で又は増幅工程と組み合わせて実施することができる。逆転写工程と増幅工程とを組み合わせた方法の一例は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、これは、例えば米国特許第５，６３９，６０６号（これは、この教示のために参照により本明細書に組み込まれる）に記載の定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、定量的であるようにさらに改変することができを参照。この方法の別の例は、２つの別々の工程、すなわちＲＮＡをｃＤＮＡに変換するための逆転写の第１工程と、定量的ＰＣＲを使用してｃＤＮＡの量を定量する第２工程とを含む。以下の実施例に示されるように、本明細書に開示された方法を使用して核酸含有粒子から抽出されたＲＮＡは、特に限定されるものではないが、リボソーム１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、疾患又は病状に関連する転写体、及び疾患又は病状の診断、予後予測、及びモニタリングに重要なバイオマーカー、を含む多くの種の転写体を含む。例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、各反応についてのＣｔ（サイクル閾値）値を決定する。ｑＰＣＲにおいて、陽性反応は、例えば蛍光シグナルの蓄積によって検出される。Ｃｔ値は、蛍光シグナルが閾値を超える（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）のに必要とされるｑＰＣＲサイクルの数として定義される。Ｃｔレベルは、試料中の標的核酸又は対照核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔレベルが低いほど、試料中の対照核酸の量は多い）。本発明を説明する目的のために、Ｃｔの意味はまた、当業者のために「交差点」を意味する「Ｃｐ」としても記載されるものも含む。Ｃｐは、増幅曲線が垂直閾値線／ノイズ帯域を横切る点を意味し、従ってＣｔとＣｐの両方を互換的に使用することができる。Ｃｔ又はＣｐを得る方法は、１）（ベースライン補正された）増幅曲線がある任意の閾値を横切るサイクル値を使用する従来の方法、２）２次導関数の極大値（ＳＤＭ）法であって、任意の閾値を定義する必要の無い方法、３）増幅曲線の対数−直線相の点を通る直線回帰フィットによる「「フィット点」法を含む。別の実施態様において、対照核酸のコピー数は、特に限定されるものではないが、ｑＰＣＲ又は任意の他のＰＣＲもしくはＰＣＲを含まない方法を含む当技術分野で認められている様々な技術のいずれかを使用して測定することができる。対照核酸のコピー数は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば較正曲線又は標準曲線を作成し利用することによって決定することができる。
【００８８】
いくつかの実施態様において、１つ又は複数のバイオマーカーは、核酸含有粒子内の核酸量及び核酸変種を指すために本明細書で使用される遺伝子異常の１つ又は集合であり得る。具体的には、遺伝子異常には、特に限定されるものではないが、転写体変種、遺伝子（例えば癌遺伝子）又は遺伝子パネルの過剰発現、遺伝子（例えばｐ５３又はＲＢなどの腫瘍抑制遺伝子）の過少発現、遺伝子又は遺伝子パネルのスプライス変種の代替産生、遺伝子コピー数変種（ＣＮＶ）（例えば、ＤＮＡ二重微小片（double minutes））（Hahn, 1993）、核酸修飾（例、メチル化、アセチル化、及びリン酸化）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、染色体再配列（例えば、反転、欠失、及び重複）、及び遺伝子又は遺伝子パネルの突然変異（挿入、欠失、重複、ミスセンス、ナンセンス、同義、又は他のヌクレオチド変化）が挙げられ、これらの突然変異は、多くの場合、最終的に遺伝子産物の活性や機能に影響を及ぼし、代替の転写スプライス変種及び／又は遺伝子発現レベルの変化、あるいは前述のいずれかの組み合わせをもたらす。
【００８９】
核酸増幅方法としては、特に限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第５，２１９，７２７号）、及びその変法、例えばインサイチュポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第５，５３８，８７１号）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第５，２１９，７２７号）、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第５，５５６，７７３号）、自立配列複製及びその変法 (Guatelli et al., 1990）、転写増幅系及びその変法 (Kwoh et al., 1989）、Ｑｂレプリカーゼ及びその変法（Miele et al., 1983）、コールドＰＣＲ（Li et al., 2008）、ＢＥＡＭｉｎｇ（Li et al., 2006）、又は他の任意の核酸増幅法が挙げられ、続いて増幅された分子は、当該分野で公知の技術を使用して検出される。このような分子が非常に少ない数で存在する場合、核酸分子の検出のために設計されたそれらの検出スキームは特に有用である。前述の参考文献は、これらの方法の教示のために本明細書に組み込まれる。他の実施態様において、核酸増幅の工程は行われない。代わりに、抽出核酸は直接分析される（例えば、次世代配列決定法により）。
【００９０】
このような遺伝子異常の決定は、当該分野で公知の様々な技術によって実施することができる。例えば、核酸の発現レベル、選択的スプライシング変種、染色体再配列、及び遺伝子コピー数は、マイクロアレイ分析（例えば、米国特許第６，９１３，８７９号、第７，３６４，８４８号、第７，３７８，２４５号、第６，８９３，８３７号、及び第６，００４，７５５号参照）及び定量的ＰＣＲによって決定され得る。特に、コピー数の変化は、Illumina Infinium II 全ゲノム遺伝子型判定アッセイ又はAgilent Human Genome CGH Microarray（Steemers et al, 2006）を使用して検出することができる。核酸修飾は、例えば米国特許第７，１８６，５１２号及び特許公開ＷＯ２００３／０２３０６５に記載されている方法によってアッセイすることができる。特に、メチル化プロファイルは、Illumina DNA Methylation OMA003 Cancer Panelによって決定することができる。ＳＮＰ及び突然変異は、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション、酵素的突然変異検出、ミスマッチヘテロ２本鎖の化学的切断（Cotton et al.，1988）、ミスマッチ塩基のリボヌクレアーゼ切断（Myers et al., 1985）、質量分析（米国特許第６，９９４，９６０号、第７，０７４，５６３号、及び第７，１９８，８９３号）、核酸配列決定、１本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）（Orita et al.，1989）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）(Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b)、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）(Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b)、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）（Kan and Dozy, 1978a; Kan and Dozy, 1978b）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）（米国特許第５，６３９，６１１号）、連結鎖反応（ＬＣＲ）及びその変法（Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994）、フローサイトメトリーヘテロ２本鎖分析（ＷＯ／２００６／１１３５９０）、及びこれらの組み合わせ／修飾法により検出することができる。特に遺伝子発現レベルは、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）技術によって決定され得る（Velculescu et al.，1995）。一般に、遺伝子異常を分析するための方法は、本明細書中に引用されたものに限定されず、多数の刊行物に報告されており当業者が利用可能である。適切な分析方法は、分析の具体的な目的、患者の状態／病歴、及び検出、追跡、又は治療すべき具体的な癌、疾患、又は他の病状に依存する。前述の参考文献は、これらの方法の教示のために本明細書に組み込まれる。
【００９１】
多くのバイオマーカーは、対象における疾患又は他の病状の有無に関連付けることができる。従って、本明細書に開示された方法による、単離された粒子からの核酸抽出におけるＥＧＦＲ中の遺伝的変種の存在又は非存在の検出は、対象における疾患又は他の病状、例えばＮＳＣＬＣの診断を助け得る。
【００９２】
さらに、多くのバイオマーカーは、対象における疾患又は病状のモニタリングを助け得る。従って、本明細書に開示された方法による、単離された粒子からの核酸抽出におけるそのようなバイオマーカーの存在又は非存在の検出は、対象における疾患又は他の病状の進行又は再発を追跡するのに助け得る。
【００９３】
多くのバイオマーカーはまた、特定の患者において治療の有効性に影響を与えることがわかっている。従って、本明細書に開示された方法による、単離された粒子からの核酸抽出におけるそのようなバイオマーカーの存在又は非存在の検出は、所定の患者における所定の治療の有効性を評価するのに役立ち得る。患者の生物学的試料から単離された粒子から抽出された核酸中のこれらのバイオマーカーの同定は、患者に対する治療の選択を指針となり得る。
【００９４】
本発明の前述の態様の特定の実施態様において、疾患又は他の病状は新生物性の疾患又は状態（例えば、癌又は細胞増殖性疾患）である。いくつかの実施態様において、疾患又は他の病状は肺癌である。いくつかの実施態様において、疾患又は他の病状は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００９５】
生物学的試料から微小小胞を単離するためのキット
本発明の１つの態様はさらに、本明細書に開示された方法で使用するためのキットに関する。 本キットは、生物学的試料から、さらに生物学的試料中に存在する不要な粒子、破片、および小分子から、微小小胞を分離するのに十分な捕捉表面装置、およびＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異、Ｌ８５８Ｒ ＥＧＦＲ変異、 １つ又は複数のエキソン１９の挿入、及び／又は１つ又は複数のエキソン１９の欠失を検出するための手段を含む。 本発明はまた、単離および任意のその後の核酸抽出プロセスにおいて前述の試薬を使用するための説明書を場合により含む。
【実施例】
【００９６】
表１は、本明細書に記載された研究において使用されたプライマー及びプローブ配列を提供する。
【表３−１】
2019536456.tif 000005
【表３−２】
2019536456.tif 000006
【表３−３】
2019536456.tif 000007
【表３−４】
2019536456.tif 000008
【００９７】
実施例１
Ｔ７９０Ｍ変異アッセイのワークフロー．図１Ａ〜１Ｃは、アッセイワークフロー設計及びｑＰＣＲ概要の一連の説明図である。図１Ａは、細胞外ＮＡ及び循環ＮＡの両方がどのようにして血漿から同時単離され、逆転写されるのかを示す。逆転写工程では、逆転写及びそれに続く増幅が確実に起きるように、増幅対照（ＤＮＡ）及びＲＮＡスパイクイン対照が添加される（予備増幅及びマルチプレックスｑＰＣＲ）。図１Ｂは、マルチプレックス予備増幅反応が、ＥＧＦＲのエクソン２０に対する野生型遮断薬（これは、循環ＮＡ及びｃＤＮＡからの変異体分子の増幅を促進する）をどのように含むかを示す。図１Ｃは、ｑＰＣＲが増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）にどのように基づいているかを示す。
【００９８】
このワークフローは、ＮＳＣＬＣを有する患者からの生体液中の細胞外ＮＡ及び循環ＮＡ中のＴ７９０Ｍの検出方法を提供する。
【００９９】
この実施例に記載のアッセイは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／００７７５５及びＷＯ２０１４／１０７５７１（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）に記載の抽出手順を使用して得られた、循環ＮＡ及び細胞外ＮＡにおけるＥＧＦＲのエクソン２０中のＴ７９０Ｍの定性的及び定量的検出のために、増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）を使用する。
【０１００】
表１は特定のプライマー及びプローブ配列を提示するが、本開示の方法及びキットはまた、上記表１に示された配列を含むプライマー及び／又はプローブ配列、又は上記表１に示された配列の修飾物であるプライマー及び／又はプローブ配列を使用し得ることが理解される。これらのプライマー及び／又はプローブ配列の修飾物は、非限定例として、５’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、３’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、５’末端及び３’末端の両方への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、テイルの付加、配列の短縮、配列の伸長、数塩基上方又は下流への配列の移動、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１０１】
さらに、表１に提供される濃度は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切な予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせを使用し得る。例えばいくつかの実施態様において、予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせは、約０．０５μＭ〜約１μＭの範囲内の濃度及びその間の任意の値である。
【０１０２】
本開示の方法及びキットは、任意の適切な濃度の予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせを使用することができる。例えばいくつかの実施態様において、予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせは、約０．０５μＭ〜約１００μＭ及びその範囲内の任意の濃度、例えば約０．０５μＭ〜約２０、約０．０５μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、より具体的には約１μＭ、約２μＭ、約４μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、又は約２０μＭである。
【０１０３】
表２及び３は、本明細書中に記載の試験において使用される予備増幅物及びｑＰＣＲプライマー混合物に使用される条件を示す。
【表４】
2019536456.tif 000009
【表５】
2019536456.tif 000010
【０１０４】
表２及び３に提供される濃度は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切な予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせを使用し得る。例えばいくつかの実施態様において、予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせは、約０．０５μＭ〜約１μＭの範囲の濃度、及びその間の任意の値である。
【０１０５】
表４及び５は、試料及び対照のＲＴ反応のための逆転写（ＲＴ）混合物を示す。以下のサイクリング条件を使用した：２５℃で１０分間；４２℃で７０分間；８５℃で５分間；４℃に保持。
【表６】
2019536456.tif 000011
【表７】
2019536456.tif 000012
【０１０６】
表４及び５に提供される反応物及び混合物は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切な反応物及び混合物を使用することができる。例えばいくつかの実施態様において、反応物及び／又は混合物は、表４及び５に提供される反応物及び混合物に基づき、例えば他の任意の適切な第１鎖ＤＮＡ合成キットと組み合わせた混合物及び／又は反応物を使用する。
【０１０７】
さらに、本明細書で提供される実施例は別々の逆転写工程及び予備増幅工程を組み込んでいるが、本開示の方法及びキットはまた、逆転写及び予備増幅の単一工程プロセスを使用し得ることが理解される。
【０１０８】
表６Ａ及び６Ｂは、予備増幅マスター混合物、及び予備増幅反応に使用されたサイクリング条件を提供する。
【表８】
2019536456.tif 000013
【表９】
2019536456.tif 000014
【０１０９】
表６Ａ中の混合物及び表６Ｂ中のサイクル条件は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切な混合物及び／又はサイクリング条件を使用することができる。例えばいくつかの実施態様において、混合物は、表６Ａに提供される混合物に基づき、例えば表６Ａに提供される混合物の修飾物を使用する。混合物の修飾物は、非限定例として、任意の適切な高忠実度酵素の使用、及び／又は任意の適切なＲＴ反応鋳型（特に限定されるものではないが、表６Ａに示されるＲＴ反応鋳型の断片を含む）の使用を含み得る。
【０１１０】
さらに、表６Ｂに提供されたサイクリング条件は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切なサイクリング条件を使用することができる。例えば、サイクル条件は、表６Ｂに示されるサイクル条件に基づいて修飾可能であり、例えば表６Ｂに示される値の約５〜１０％以内の温度、例えば表６Ｂに示される値の５℃以内、及び／又は表６Ｂに示される値の約５〜１０％以内の時間である。
【０１１１】
表７Ａ及び７Ｂは、ｑＰＣＲ反応混合物及びサイクリング条件を提供する。
【表１０】
2019536456.tif 000015
【表１１】
2019536456.tif 000016
【０１１２】
表７Ａの混合物及び表７Ｂのサイクル条件は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切な混合物及び／又はサイクリング条件を使用することができる。例えばいくつかの実施態様において、混合物は、表７Ａに提供される混合物に基づき、例えば表７Ａに提供される混合物の修飾物を使用する。混合物の修飾物は、非限定例として、任意の適切なマスター混合物の使用及び／又は任意の適切なＲＴ反応鋳型（特に限定されるものではないが、表７Ａに示されるＲＴ反応鋳型の断片を含む）の使用を含み得る。
【０１１３】
さらに、表７Ｂに提供されたサイクル条件は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切なサイクリング条件を使用することができる。例えば、サイクル条件は、表７Ｂに示されるサイクル条件に基づいて修飾可能であり、例えば表７Ｂに示される値の約５〜１０％以内の温度、例えば表７Ｂに示される値の５℃以内、及び／又は表７Ｂに示される値の約５〜１０％以内の時間である。
【０１１４】
アッセイは、２１０人の患者試料からの血漿について試験される。これらのうち１０５個のＮＳＣＬＣ試料は、組織分析によりベースライン（すなわち、ＥＧＦＲの変異選択的阻害剤による処理の前）でＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ陽性として分類され、１０５個はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織分析によりＮＳＣＬＣ陰性試料であるか、又は個々の若しくはプールされた健常ドナーから得られた。各分類からの試料の半分（組織分析によりＴ７９０Ｍ陽性又は陰性）を訓練コホートとして使用し、残りを検証コホートに使用する。
【０１１５】
ＦＦＰＥ分析によってＴ７９０Ｍ陽性として分類された検証コホートからの５１個の試料のうち、約３７％（１９／５１）は、循環ＮＡ分析単独で（細胞外ＮＡ成分なしで）検出することが歴史的に非常に困難であった胸腔内（Ｍ０〜Ｍ１ａ）疾患又は未知のＭ期（ＭＸ）を有する患者である。
【０１１６】
このアッセイについてのさらなる分析的検証を、健常プール血漿への異なる濃度のＴ７９０Ｍ（０．７５〜２６６０コピー／ｍＬ）の８９の個々のスパイクインを使用して、異なる実験者によってそして異なる日に行われた。
【０１１７】
臨床コホートの２１０個の試料は、段階適合訓練コホートと検証コホートに分けられる。最適なＣｔカットオフ閾値は、８０％のサブ訓練と２０％のサブテストの分割を有する訓練データの１００のブートストラップについて、ヨウデンのジェイ（Youden’s J）統計量を最大化することによって推定される。訓練コホートについての平均分析感度及び特異性は、それぞれ９１％（±９％）及び９５％（±６％）で、平均ＡＵＣは９４％（±６％）である。平均精度、ＮＰＶ、及びＰＰＶは、それぞれ９５％（±６％）、９２％（±７％）、及び９５％（±６％）であった。検証コホートは、９２％の感度及び８９％の特異性を有し、ＡＵＣが９６％、精度、ＮＰＶ、及びＰＰＶがそれぞれ８９％、９２％、及び８９％である。
【０１１８】
Ｔ７９０Ｍ試験における得られた臨床カットオフ閾値は、試料を陽性と呼ぶために満たされるべき一連の値を含む。例えば、陽性対照、陰性対照、及び／又はＱβ対照について、以下の品質フィルターを満たさなかった試料ウェルは除外された：Ｅｘｏｎ２０  Ｃｔが１０〜４０、好ましくは１５〜３５；Ｅｘｏｎ７  Ｃｔ値が１５〜３５、好ましくは２０〜３０；陰性対照（ＲＴ及びｑＰＣＲ工程）Ｃｔ値が３０より大きく、好ましくは３５より大きい；Ｑベータ対照Ｃｔ値が１５〜３０、好ましくは２０〜２５；Ｑベータアッセイ（阻害の対照）：デルタＣｔ（Ｃｔ試料−Ｃｔ対照ウェル）が２０未満、好ましくは１０；Ｔ７９０Ｍアッセイ陽性：デルタＣｔ（Ｃｔ試料−Ｃｔ対照ウェル）が３０未満、好ましくは２５の；エクソン７アッセイが有効：Ｃｔ試料が２５未満、好ましくは２０。
【０１１９】
図２は、この試験で使用されたＴ７９０Ｍ検出アッセイの分析性能を表すグラフである。Canchola et al. (“Limit of Detection (LoD) Estimation Using Parametric Curve Fitting to (Hit) Rate Data: The LoD_Est SAS（登録商標）Macro.” Working paper (2016)、DOI: 10.13140/RG.2.1.3622.9203で入手可能) は、一貫して検出可能な（ＣＩ  ９５％）物質、標的、又は分析物の最低濃度又は量として検出限界（ＬｏＤ）を定義している。図２に示すように、本明細書に記載の試験のＬＯＤは２１コピー／ｍＬ（９５％ＣＩ：９〜３８コピー／ｍＬ）である。１４％の時間で１．５コピー／ｍＬが検出され、１００％の時間で１２．５コピー／ｍＬが検出された。ＬＯＤは物質の存在によってのみ制限される。
【０１２０】
図３は、臨床的検証コホートに対するＴ７９０Ｍ検出アッセイの臨床成績を示すグラフである。検証コホートでのＡＵＣは９６％であった。
【０１２１】
これは、循環ＮＡと細胞外ＮＡとを組み合わせた、最初のＣＬＩＡ検証されたｑＰＣＲに基づく最初の方法であり、この試料選択（３７％の患者が胸腔内又は未知の病期を有した）においてＴ７９０Ｍを９２％の感度及び８９％の特異性で検出することができる。これは今日までに報告された最高レベルの感度と特異性である。
【０１２２】
実施例２
Ｔ７９０Ｍアッセイの開発．本明細書に記載される試験は、高度に断片化された試料物質を検出及び分析するために、ＡＲＭＳプライマーにおいて短いアンプリコン及び修飾ヌクレオチドを使用する利点を証明する。
【０１２３】
図４は、高度に分解されたＤＮＡ中の変異を検出するための、大きいアンプリコンと短いアンプリコン（塩基修飾あり又はなし）の比較を示すグラフである。既知％のＴ７９０Ｍ（野生型、５０％、２０％、６．５％）を有する市販のＦＦＰＥ、及び異なるサイズ１９２ｂｐのアンプリコン（例えば、Leelatian et al., “Highly sensitive EGFR mutation detection by specific amplification of mutant alleles.” Exp Mol Pathol., vol. 96(1): 85-91 (2014)を参照）と、プライマー上の塩基修飾のある及びない６２ｂｐアンプリコンを使用。図４は、塩基修飾を有する６２ｂｐが最も早いＣｔ値をもたらすことを証明する。
【０１２４】
図５Ａ及び５Ｂは、修飾ヌクレオチドを含むＡＲＭＳプライマーと修飾ヌクレオチドを含まないＡＲＭＳプライマーとの比較を示す一連のグラフである。これらのグラフは、塩基修飾がＡＲＭＳプライマーに組み込まれた場合の、Ｔ７９０Ｍに対する早期Ｃｔについての利点を証明する。最良の２つの条件についての効率と直線性を図５Ｂに示す。
【０１２５】
図６は、正常な健常血漿からの漸増量の細胞外ＮＡ及び循環ＮＡに適応する、本明細書に記載のアッセイの能力を証明するグラフである。
【０１２６】
実施例３
Ｌ８５８Ｒ及びエクソン１９の欠失／挿入変異アッセイのワークフロー．Ｌ８５８Ｒ及びエクソン１９の欠失／挿入変異検出のためのアッセイワークフローもまた、図１Ａ〜図１Ｃに開示されているものと一致する。図１Ａは、細胞外ＮＡ及び循環ＮＡの両方がどのようにして血漿から同時単離され、逆転写されるのかを示す。逆転写工程では、逆転写及びそれに続く増幅が確実に起きるように、増幅対照（ＤＮＡ）及びＲＮＡスパイクイン対照が添加される（予備増幅及びマルチプレックスｑＰＣＲ）。図１Ｂは、マルチプレックス予備増幅反応が、ＲＥＧＦＲのＬ８５８及びエクソン１９の欠失及び挿入突然変異の対応する野生型の野生型遮断薬（これは、循環ＮＡ及びｃＤＮＡからの変異体分子の増幅を促進する）をどのように含むかを示す。図１Ｃは、ｑＰＣＲが増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）にどのように基づいているかを示す。
【０１２７】
このワークフローは、ＮＳＣＬＣを有する患者からの生体液中の細胞外ＮＡ及び循環ＮＡ中のＬ８５８Ｒ並びにエクソン１９の欠失及び挿入変異の検出方法を提供する。
【０１２８】
この実施例に記載のアッセイは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／００７７５５及びＷＯ２０１４／１０７５７１（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）に記載の抽出手順を使用して得られた、循環ＮＡ及び細胞外ＮＡにおけるＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ並びにエクソン１９の欠失及び挿入変異の定性的及び定量的検出のために、増幅耐性突然変異検出システム（ＡＲＭＳ）を使用する。
【０１２９】
表１は特定のプライマー及びプローブ配列を提示するが、本開示の方法及びキットはまた、上記表１に示された配列を含むプライマー及び／又はプローブ配列、又は上記表１に示される配列の修飾物であるプライマー及び／又はプローブ配列を使用し得ることが理解される。これらのプライマー及び／又はプローブ配列の修飾物は、非限定例として、５’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、３’末端への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、５’末端及び３’末端の両方への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、テイルの付加、配列の短縮、配列の伸長、数塩基上方又は下流への配列の移動、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１３０】
さらに、本発明において開示された濃度は例示的であることが理解される。本開示の方法及びキットは、任意の適切な濃度の予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせを使用し得る。例えばいくつかの実施態様において、予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせは、約０．０５μＭ〜約１μＭの範囲内の濃度及びその間の任意の値である。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、ＰＣＲ増強剤又はＰＣＲ添加剤が、予備増幅物もしくはｑＰＣＲ反応物又はそれらの反応物の組み合わせに含まれる。増強剤び添加剤は、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、７−デアザｄＧＴＰ、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ホルムアミド、非イオン性界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００、ツイーン２０、又はノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、ＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム）、AmpFLSTR（商標）及びアプタマーから成るリストから選択される。
【０１３２】
本開示の方法及びキットは、任意の適切な濃度の予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせを使用することができる。例えばいくつかの実施態様において、予備増幅物濃度、ｑＰＣＲ反応物濃度、又はこれらの組み合わせは、約０．０５μＭ〜約１００μＭの範囲及びその間の任意の値、例えば約０．０５μＭ〜約２０、約０．０５μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、より具体的には約１μＭ、約２μＭ、約４μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、又は約２０μＭである。
【０１３３】
本開示の方法及びキットは、任意の適切な反応物及び混合物を使用することができる。
【０１３４】
さらに、本明細書で提供される実施例は別々の逆転写工程及び予備増幅工程を組み込んでいるが、本開示の方法及びキットはまた、逆転写及び予備増幅の単一工程プロセス、又は予備増幅なしの工程を使用し得ることが理解される。
【０１３５】
本開示の方法及びキットは、任意の適切な混合物及び／又はサイクリング条件を使用することができる。混合物は、非限定例として、任意の適切な高忠実度酵素の使用、及び／又は任意の適切なＲＴ反応鋳型（特に限定されるものではないが、ＲＴ反応鋳型の断片を含む）の使用を含み得る。
【０１３６】
混合物は、非限定例として、任意の適切なマスター混合物の使用及び／又は任意の適切なＲＴ反応鋳型（特に限定されるものではないが、ＲＴ反応鋳型の断片を含む）の使用を含み得る。
【０１３７】
表１は、Ｌ８５８Ｒ（エクソン２１）変異試験プローブに使用される配列のリスト、並びにエクソン１９の欠失／挿入変異試験プローブに使用される配列のリストである。
【０１３８】
図７は、Ｌ８５８Ｒ及びＤｅｌ１９検出アッセイの性能を証明するグラフである。グラフに示されているように、野生型試料と変異体試料との間には明確な区別がある。
【０１３９】
Ｌ８５８Ｒ及びエクソン１９の欠失／挿入試験において得られた臨床カットオフ閾値は、試料が陽性と呼ばれるために満たされるべき一連の値を含む。特に限定されるものではないが、陽性対照、陰性対照、及び／又はＱβ対照について、以下の品質フィルターを満たさなかった試料ウェルは除外された：Ｅｘｏｎ１９又はＥｘｏｎ２１  Ｃｔが１０〜４０、好ましくは１５〜３５；Ｅｘｏｎ７  Ｃｔ値が１５〜３５、好ましくは２０〜３０；陰性対照（ＲＴ及びｑＰＣＲ工程）Ｃｔ値が３０より大きく、好ましくは３５より大きい；Ｑベータ対照Ｃｔ値が１５〜３０、好ましくは２０〜２５；Ｑベータアッセイ（阻害の対照）：デルタＣｔ（Ｃｔ試料−Ｃｔ対照ウェル）が２０未満、好ましくは１０；Ｌ８５８Ｒ及びエクソン１９欠失／挿入アッセイが陽性：デルタＣｔ（Ｃｔ試料−Ｃｔ対照ウェル）が３０未満、好ましくは２５；エクソン７アッセイが有効：Ｃｔ試料が２５未満、好ましくは２０。
【０１４０】
他の実施態様
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び修飾は以下の請求項の範囲内である。
【図１Ａ】
2019536456.tif 000017
【図１Ｂ】
2019536456.tif 000018
【図１Ｃ】
2019536456.tif 000019
【図２】
2019536456.tif 000020
【図３】
2019536456.tif 000021
【図４】
2019536456.tif 000022
【図５Ａ】
2019536456.tif 000023
【図５Ｂ】
2019536456.tif 000024
【図６】
2019536456.tif 000025
【図７】
2019536456.tif 000026
【配列表】
2019536456000001.app
【国際調査報告】
2019536456.tif 000027
2019536456.tif 000028
2019536456.tif 000029