(57)【要約】  本発明の実施形態は、神経性疾患または障害の治療および／または予防における幹細胞およびその治療的使用に関する。本明細書に提供されるのは、ｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞を含む組成物、ならびに神経性疾患または障害の治療および／または予防においてｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞を調製し、用いる方法である。
2019508502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防する方法であって、単離された神経幹細胞を前記被験者に投与することを含み、前記神経幹細胞が神経組織検体から単離され、かつｃ−ｋｉｔ陽性である、方法。
【請求項２】
前記神経幹細胞が成体神経幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞が前記神経組織検体の歯状回から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞が前記神経組織検体の脳室下帯から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経幹細胞が系統陰性細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記神経幹細胞が前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前駆細胞がＳｏｘ２を発現する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記神経幹細胞が系統陽性細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記系統陽性細胞が、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮまたはグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離された神経幹細胞が、前記被験者への投与前に、培養下で拡大される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離された神経幹細胞が、前記被験者への投与前に、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離された神経幹細胞が、前記被験者への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および／または神経成長因子（ＮＧＦ）に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経組織検体が前記被験者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離された神経幹細胞が、前記被験者に、前記組織に血管を通じてまたは直接的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離された神経幹細胞が、注射によりかつ／またはカテーテルシステムにより、前記被験者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経性疾患または障害が、脳卒中、脳出血、脊髄損傷および／または神経変性疾患を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経変性疾患が、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
損傷神経組織を修復および／または再生するための治療有効量の単離された神経幹細胞および薬学的に許容できる担体を含み、前記単離された神経幹細胞がｃ−ｋｉｔ陽性である、医薬組成物。
【請求項１９】
前記神経幹細胞が成体神経幹細胞である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記単離された神経幹細胞が、クローン原性、多能性および自己複製性である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記神経幹細胞が、神経組織の歯状回から単離される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記神経幹細胞が、神経組織の脳室下帯から単離される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記単離された神経幹細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記単離された神経幹細胞が自家細胞である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記単離された神経幹細胞が系統陰性細胞を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記単離された神経幹細胞が前駆細胞を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記前駆細胞がＳｏｘ２を発現する、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記単離された神経幹細胞が系統陽性細胞を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記系統陽性細胞が、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、約１０６個の単離された神経幹細胞を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記単離された神経幹細胞が、インビトロで培養および拡大される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記単離された神経幹細胞がニューロスフェアを形成する能力があり、かつ各ニューロスフェアがコアおよび１つ以上の外層を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ニューロスフェアが系統陰性細胞を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記系統陰性細胞が各ニューロスフェアのコア内に存在する、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ニューロスフェアが前駆細胞を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記前駆細胞がＳｏｘ２を発現する、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記ニューロスフェアが系統陽性細胞を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記系統陽性細胞が各ニューロスフェアの１つ以上の外層内に存在する、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記系統陽性細胞が、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子をさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦをさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、カテーテル媒介性または直接注射用に製剤化される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
常在神経幹細胞を神経組織から単離する方法であって、
（ａ）前記神経組織からの組織検体を培養下で培養し、それにより組織外植片を形成することと；
（ｂ）ｃ−ｋｉｔ陽性である前記培養外植片から細胞を選択することと、
（ｃ）前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、
を含み、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が常在神経幹細胞である、方法。
【請求項４４】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が前記神経組織の歯状回から得られる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が前記神経組織の脳室下帯から得られる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が系統陰性細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が前駆細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記前駆細胞がＳｏｘ２を発現する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が系統陽性細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記系統陽性細胞が、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で拡大することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、クローン原性、多能性および自己由来である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に培養下で曝露することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに培養下で曝露することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法であって、神経幹細胞を健常神経組織から抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞である前記神経幹細胞を培養および拡大することと；前記抽出および拡大された神経幹細胞の１用量を前記被験者における損傷神経組織の領域に投与することと、を含み、それは前記損傷神経組織を修復および／または再生するのに有効である、方法。
【請求項５６】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記健常神経組織の歯状回から得られる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記健常神経組織の脳室下帯から得られる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が系統陰性細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が前駆細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が系統陽性細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記系統陽性細胞が、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記損傷神経組織への投与前に、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記損傷神経組織への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに曝露される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、カテーテル媒介性または直接注射により投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
前記神経幹細胞が自己由来である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
前記神経幹細胞が同種である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
[0001]本願は、２０１６年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３０５，７３４号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下での優先権の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
[0002]本開示は、神経性疾患または障害の治療および／または予防における幹細胞およびその治療的使用に関する。本明細書に提供されるのは、神経性疾患または障害の治療および／または予防のための、ｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞を含む組成物およびｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞を調製し、用いる方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
[0003]脳は、複雑な臓器であり、脊髄とともに、個体の認知、感情、社会性および運動能力に関与する。異なる種類の脳機能を専門にするニューロンは、グリア細胞によって支持される。脳の適切な機能は、ニューロン間の電気的シグナル伝達に依存し、ニューロンまたはグリア細胞へのいずれかの侵襲は、脳および／または脊髄における機能不全をもたらし得る。損傷神経組織に関連した神経性疾患および障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、パーキンソン病、脳卒中およびバッテン病を含む。
【０００４】
[0004]アルツハイマー病は、脳の幾つかの領域内での細胞死によって引き起こされる。それは記憶および認知能力の喪失をもたらす進行性障害であり、現在、治療法は存在しない。最終的には、アルツハイマー病は致命的である。アルツハイマー病によって苦しめられる脳の特徴は、神経細胞と細胞内部で構築されるタウのもつれとの間の空間内に蓄積するβアミロイドプラークである。治療法の研究では、プラークおよび／またはもつれを低減することが注目されている。
【０００５】
[0005]ハンチントン病（ＨＤ）は、治療法が現在存在しない、遺伝性の変性脳障害である。ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子におけるトリヌクレオチドリピートの拡大によって引き起こされる。どういうわけか、遺伝子拡大は、大脳基底核および大脳皮質を含む脳の領域内での神経細胞の損傷をもたらす。これは、漸進的な身体的、精神的および感情的変化をもたらす。
【０００６】
[0006]筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病または運動ニューロン疾患としても公知）では、脊髄内および脳内双方に位置する、運動を制御する神経細胞が変性し、死ぬ。結果として、それら神経細胞が接続される筋肉は、最終的に衰弱し、痩衰える。患者は、その筋力やその腕、脚および身体を動かす能力を失う。最終的には、横隔膜および胸壁における筋肉が損なわれ、患者はサポートなしには呼吸できなくなる。
【０００７】
[0007]多発性硬化症は、患者の免疫系が神経を包んで保護する鞘であるミエリンを破壊する、炎症性の自己免疫介在性疾患である。結果として、脳内および脊髄内での情報の流れは中断される。最終的には、実際の神経細胞が冒され、死ぬ。多発性硬化症を有する患者は、攣縮、歩行困難、膀胱や腸の問題および疲労を含む、中枢神経系を含む種々の症状を示す。
【０００８】
[0008]パーキンソン病は、黒質と称される脳の領域内でのドーパミン作動性ニューロンが徐々に失われる結果として生じる慢性および進行性運動障害である。パーキンソン病を有する患者は、ドーパミンの欠如に起因し、自由な動き、姿勢の保持、話し、書くことが困難である。パーキンソン病を有する個体は、中脳、脳幹および／または嗅球において、レビー小体とも称される、αシヌクレインタンパク質の凝集塊を有する。
【０００９】
[0009]脳卒中は、脳の領域への血液供給の妨害（虚血性脳卒中）により、または脳内の血管が破裂し、血液を脳細胞周囲の空間に溢流するとき（出血性脳卒中）、引き起こされる。脳細胞は、それらがもはや酸素および栄養分を血液から受け取らないかまたは脳へのまたは脳周辺での突然の出血があるとき、死ぬ。冒される脳の領域に依存し、歩行、会話および認知能力を含む幾つかの機能が障害され得る。
【００１０】
[0010]バッテン病（スピールマイヤー−フォークト−シューグレン−バッテン病としても公知）は、典型的には小児期に始まる、神経系の致死性の遺伝性障害である。発症した小児は、認識機能障害、発作悪化、ならびに進行性の視力および運動能力の低下を患う。バッテン病は、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）と称される障害のグループの最も一般的形態である。脂肪およびタンパク質からなるリポフスチン（脂肪色素）は、脳および眼の細胞内、ならびに皮膚、筋肉、および多くの他の組織内で構築される。現在まで、８つの遺伝子がＮＣＬの異なる形態に関連づけられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[0011]したがって、損傷神経組織内の細胞のさらなる損傷からの修復、再構成、再生または保護が可能になる治療から恩恵を被ることになる種々の神経性疾患および障害が存在する。しかし、幹細胞治療における十分な数での神経組織からの神経幹細胞の単離および拡大は、課題のままである。したがって、当該技術分野では、神経性疾患または障害の治療において拡大し、使用できるような幹細胞を単離するために使用可能な神経幹細胞のマーカーを同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
[0012]本発明の実施形態は、幹細胞およびそれを調製し、用いる方法に関する。
【００１３】
[0013]本発明の実施形態は、幹細胞に典型的な特徴を有する神経組織内でのｃ−ｋｉｔ陽性細胞の集団の発見に基づく。幹細胞の基本的特性は、インビトロおよびインビボでの自己複製能（self-renewal）、クローン形成能および多分化能(multipotentiality)である。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系統陰性細胞、前駆細胞および／または系統陽性細胞を含んでもよい。
【００１４】
[0014]本発明の実施形態は、損傷神経細胞を置換し、かつ／または、神経性疾患または障害、例えば限定はされないが、脳卒中、脳出血、脊髄損傷、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症によるさらなる損傷から神経細胞を保護する課題に対して解決策を提供する。詳細には、それらの課題は、神経組織修復および再生を促進し、かつ、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害、例えば限定はされないが、脳卒中、脳出血、脊髄損傷、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症を治療または予防するため、神経幹細胞を欠損および／または損傷神経組織に移植することにより解決される。
【００１５】
[0015]したがって、一態様では、本発明は、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防する方法であって、単離された神経幹細胞を被験者に投与することを含み、ここで神経幹細胞は神経組織検体から単離され、ｃ−ｋｉｔ陽性である、方法を提供する。一実施形態では、神経幹細胞は、成体神経幹細胞である。別の実施形態では、神経組織検体は、被験者から得られる。別の実施形態では、神経幹細胞は、神経組織検体の歯状回から得られる。さらなる実施形態では、神経幹細胞は、神経組織検体の脳室下帯から得られる。
【００１６】
[0016]それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防する方法の一実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、前駆細胞を含む。別の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。さらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現する。
【００１７】
[0017]それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防する方法の一実施形態では、前記単離された神経幹細胞は、被験者への投与前に培養下で拡大される。別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、被験者への投与前に１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。さらに別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、被験者への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および／または神経成長因子（ＮＧＦ）に曝露される。
【００１８】
[0018]一実施形態では、単離された神経幹細胞は、血管を通じてまたは組織に直接的に被験者に投与される。別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、直接注射によりかつ／またはカテーテルシステムにより、被験者に投与される。
【００１９】
[0019]それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防する方法の一実施形態では、神経性疾患または障害は脳卒中である。別の実施形態では、神経性疾患または障害は脳出血である。別の実施形態では、神経性疾患または障害は神経変性疾患である。さらに別の実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症である。
【００２０】
[0020]別の態様では、本発明は、損傷神経組織を修復および／または再生するための、治療有効量の単離された神経幹細胞および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、前記単離された神経幹細胞がｃ−ｋｉｔ陽性である、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、神経幹細胞は、成体神経幹細胞である。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。
【００２１】
[0021]医薬組成物の一実施形態では、神経幹細胞は、神経組織の歯状回から単離される。別の実施形態では、神経幹細胞は、神経組織の脳室下帯から単離される。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、ヒト細胞である。さらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、自己由来である。
【００２２】
[0022]医薬組成物の一実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、前駆細胞を含む。別の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。さらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００２３】
[0023]医薬組成物の一実施形態では、組成物は、約１０６個の単離された神経幹細胞を含む。別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、インビトロで培養および拡大される。別の実施形態では、組成物は、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子をさらに含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦをさらに含む。
【００２４】
[0024]一実施形態では、組成物は、カテーテル媒介性または直接注射用に製剤化される。
【００２５】
[0025]医薬組成物の一実施形態では、単離される神経幹細胞は、ニューロスフェアを形成する能力があり、各ニューロスフェアは、コアおよび１つ以上の外層を含む。別の実施形態では、ニューロスフェアは、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、系統陰性細胞は、各ニューロスフェアのコア内に存在する。さらなる実施形態では、ニューロスフェアは、前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。別の実施形態では、ニューロスフェアは、系統陽性細胞を含む。さらなる実施形態では、系統陽性細胞は、各ニューロスフェアの１つ以上の外層内に存在する。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００２６】
[0026]別の態様では、本発明は、常在神経幹細胞を神経組織から単離する方法であって、（ａ）培養下の前記神経組織からの組織検体を培養し、それにより組織外植片を形成することと；（ｂ）培養外植片からｃ−ｋｉｔ陽性である細胞を選択することと、（ｃ）前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、を含み、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が常在神経幹細胞である、方法を提供する。
【００２７】
[0027]一実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、神経組織の歯状回から得られる。別の実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、神経組織の脳室下帯から得られる。
【００２８】
[0028]神経組織から常在神経幹細胞を単離する方法の一実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、単離される神経ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、前駆細胞を含む。別の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。さらなる実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００２９】
[0029]一実施形態では、神経組織から常在神経幹細胞を単離する方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で拡大することをさらに含む。別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露することをさらに含む。さらに別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下でＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに曝露することをさらに含む。
【００３０】
[0030]別の態様では、本発明は、それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法であって、健常神経組織から神経幹細胞を抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞である前記神経幹細胞を培養および拡大することと；前記抽出および拡大された神経幹細胞の１用量を被験者における損傷神経組織の領域に投与することと、を含み、それは損傷神経組織を修復および／または再生するのに有効である、方法を提供する。
【００３１】
[0031]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、健常神経組織の歯状回から得られる。別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、健常神経組織の脳室下帯から得られる。
【００３２】
[0032]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００３３】
[0033]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷神経組織への投与前に培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。さらに別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷神経組織への投与前にＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに曝露される。
【００３４】
[0034]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、カテーテル媒介性または直接注射により投与される。
【００３５】
[0035]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、神経組織は、ヒトから得られる。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、神経組織は、成体神経組織である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陰性細胞を含む。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、前駆細胞を含む。記載される組成物および方法のすべての態様のさらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陽性細胞を含む。記載される組成物および方法のすべての態様のさらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、神経幹細胞は、自己由来である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、神経幹細胞は、アロジェニックである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】[0036]図１Ａは、マウス脳の歯状回のインサイチュでの代表的な免疫標識を示す。ｃ−ｋｉｔは緑色に標識され、ＧＦＡＰは赤色に標識される。細胞核はＤＡＰＩで染色される。
【図１Ｂ】[0037]図１Ｂは、マウス脳組織切片のインサイチュでの代表的な免疫標識を示す。ｃ−ｋｉｔは赤色に標識され、ＧＦＡＰは緑色に標識される。細胞核はＤＡＰＩで染色される。
【図２】[0038]図２は、マウス脳組織切片のインサイチュでの代表的な免疫標識を示す。ｃ−ｋｉｔは緑色に標識され、Ｓｏｘ２は白色に標識される。細胞核はＤＡＰＩで染色される。
【図３Ａ】[0039]図３Ａは、マウス脳組織切片のインサイチュでの代表的な免疫標識を示す。ｃ−ｋｉｔは緑色に標識され、βＩＩＩチューブリンは赤色に標識される。細胞核はＤＡＰＩで染色される。赤色矢印は、βＩＩＩチューブリンおよびＮｅｕＮの双方を発現するｃ−ｋｉｔ陽性細胞を示す。
【図３Ｂ】[0040]図３Ｂは、マウス脳組織切片のインサイチュでの代表的な免疫標識を示す。ｃ−ｋｉｔは緑色に標識され、ＮｅｕＮは白色に標識される。細胞核はＤＡＰＩで染色される。
【図４】[0041]図４は、培養下で７〜１４日後、未選別細胞から得られるニューロスフェアの代表的画像を示す。
【図５】[0042]図５は、ｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドＳＣＦで刺激後の緻密で十分に分離されたニューロスフェアを示す。
【図６Ａ】[0043]継代２でのニューロスフェアの免疫標識を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色される。一方のニューロスフェアは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）、ＮｅｕＮ（灰色）およびＧＦＡＰ（赤色）を発現する。３つのマーカーにおけるシグナルのマージが図６Ｂに示される一方で、図６Ａは各マーカーシグナルを示す。他方のニューロスフェアは、３つ全部のマーカーについて陰性であり、核はＤＡＰＩ染色により見ることができる。
【図６Ｂ】継代２でのニューロスフェアの免疫標識を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色される。一方のニューロスフェアは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）、ＮｅｕＮ（灰色）およびＧＦＡＰ（赤色）を発現する。３つのマーカーにおけるシグナルのマージが図６Ｂに示される一方で、図６Ａは各マーカーシグナルを示す。他方のニューロスフェアは、３つ全部のマーカーについて陰性であり、核はＤＡＰＩ染色により見ることができる。
【図７】[0044]図７は、継代４でのニューロスフェアの免疫標識を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色される。ニューロスフェアのコアがｃ−ｋｉｔ陽性（緑色）の系統陰性細胞を含有する一方で、ニューロスフェアの外層は、神経細胞マーカーＧＦＡＰ（赤色）を発現する。
【図８】[0045]図８は、付着ディッシュに移された継代４のニューロスフェアを示す。
【図９】[0046]図９は、付着ディッシュに移されている継代４のニューロスフェアの免疫標識を示す。ｃ−ｋｉｔ陽性（緑色）細胞は、神経細胞の系統マーカー（ＧＦＡＰ、赤色；ＮｅｕＮ、灰色）を部分的に同時発現する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
[0047]本発明の実施形態は、幹細胞に典型的な特徴を有する、神経組織内のｃ−ｋｉｔ陽性細胞の集団の発見に基づく。幹細胞の基本的特性は、インビトロおよびインビボでの、自己複製するすなわちより多くの幹細胞を産生する能力、クローン形成能および多分化能である。この発見前に、幹細胞の３つ全部の特徴を示す、神経組織からの１つの細胞型の認識または単離はなされていない。
【００３８】
[0048]周知であるように、幹細胞は、その特性のおかげで、身体のすべての細胞および組織を発生させる。したがって、損傷および／または欠損神経組織を修復するかまたはそれらの修復を加速するため、幹細胞を用いることができる。神経幹細胞（ＮＳＣ）を十分な量で得ることができる場合、この量のＮＳＣは、損傷および／または欠損神経組織を脳および／または脊髄内に新しい組織を構築することによって修復するため、用いることができる。欠損および／または損傷神経組織では、ＮＳＣがほとんど存在しないかまたは欠如している場合がある。ＮＳＣが自己複製することから、インプラントされたＮＳＣは、欠損および／または損傷神経組織内でコロニー形成し、微小環境をつくることになる。インプラントされたＮＳＣはまた、クローン性および多能性により、分裂および分化し、あらゆる新しい神経細胞および組織を生成することになる。したがって、単離されたＮＳＣの集団または単離されたＮＳＣの集団を含む組成物は、被験者における神経性疾患または障害の治療または予防のため、用いることができる。
【００３９】
[0049]したがって、一実施形態では、本発明は、神経組織の試料から得られる単離細胞の集団を提供し、ここで単離細胞の集団はｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを含有する。ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣのこの集団は、有意に濃縮され、拡大され得る。
【００４０】
[0050]一実施形態では、本明細書に提供されるのは、損傷神経組織を修復および／または再生するための、単離され、拡大された神経幹細胞および薬学的に許容できる担体を治療有効量で含む医薬組成物であり、ここで前記単離された神経幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性である。一部の実施形態では、神経幹細胞は、成体神経幹細胞である。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。一部の実施形態では、神経幹細胞は、神経組織の歯状回から単離される。別の実施形態では、神経幹細胞は、神経組織の脳室下帯から単離される。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、ヒト細胞である。さらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、自己由来である。
【００４１】
[0051]一実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、前駆細胞を含む。別の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。さらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００４２】
[0052]一実施形態では、組成物は、約１０６個の単離された神経幹細胞を含む。別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、インビトロで培養および拡大される。別の実施形態では、組成物は、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子をさらに含む。さらなる実施形態では、組成物は、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦをさらに含む。
【００４３】
[0053]一実施形態では、組成物は、カテーテル媒介性または直接注射用に製剤化される。
【００４４】
[0054]一実施形態では、単離される神経幹細胞は、ニューロスフェアを形成する能力があり、ここで各ニューロスフェアは、コアおよび１つ以上の外層を含む。別の実施形態では、ニューロスフェアは、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、系統陰性細胞は、各ニューロスフェアのコア内に存在する。さらなる実施形態では、ニューロスフェアは、前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。別の実施形態では、ニューロスフェアは、系統陽性細胞を含む。さらなる実施形態では、系統陽性細胞は、各ニューロスフェアの１つ以上の外層内に存在する。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００４５】
[0055]一実施形態では、本明細書に提供されるのは、被験者における神経性疾患または障害を治療および／または予防するための薬剤の作製において用いられる組成物であり、組成物は、神経組織試料から単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの濃縮集団を含む。この組成物の別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。
【００４６】
[0056]一実施形態では、本発明は、常在神経幹細胞を神経組織から単離する方法であって、（ａ）培養下の前記神経組織からの組織検体を培養し、それにより組織外植片を形成することと；（ｂ）培養外植片からｃ−ｋｉｔ陽性である細胞を選択することと、（ｃ）前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、を含み、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が常在神経幹細胞である、方法を提供する。
【００４７】
[0057]一実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、神経組織の歯状回から得られる。別の実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、神経組織の脳室下帯から得られる。
【００４８】
[0058]一実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、単離される神経ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、前駆細胞を含む。別の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。さらなる実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００４９】
[0059]一実施形態では、常在神経幹細胞を神経組織から単離する方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で拡大することをさらに含む。別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露することをさらに含む。さらに別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下でＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに曝露することをさらに含む。
【００５０】
[0060]一実施形態では、本発明は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣについて実質的に濃縮された単離細胞の集団を得る方法であって、被験者から得られる神経組織の検体を凍結保存することと；後日、凍結保存された検体を解凍することと；神経組織の検体から１つ以上のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を選択することと；選択されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培地中で増殖することと、を含む、方法を提供する。
【００５１】
[0061]一実施形態では、本発明は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣについて実質的に濃縮された単離細胞の集団を増殖する方法であって、神経組織試料から１つ以上のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を選択することと；１つ以上のｃ−ｋｉｔ陽性の選択された細胞を培地に導入することと；選択されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培地中で増殖することと、を含む、方法を提供する。
【００５２】
[0062]別の実施形態では、本発明は、例えば、神経性疾患または障害、例えば、脳卒中、脳出血、脊髄損傷、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症の修復、再生および／または治療における、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣについて実質的に濃縮された単離細胞のこの集団の使用または単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの濃縮された集団を含む医薬組成物の使用に関する方法を提供する。理論によって拘束されることを望まないが、発明者は、神経組織内で同定されるｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、脳における特殊化した細胞、例えばコリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性（γアミノ酪酸）ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイトおよび／またはミクログリアの供給源を表し得ると考える。したがって、一実施形態では、インビトロで拡大されている単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、罹患／損傷神経組織に移植またはインプラントされ得る。次に、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、神経組織内に定住し、増殖し、通常は脳または脊髄に見出される様々なタイプの組織に分化し、脳および／または脊髄の特殊化した細胞を回復させかつ／または再構成する。目標は、罹患組織における疾患に起因する損傷神経組織の一部を交換することである。交換神経組織は、罹患被験者における既存または残存する神経組織を、全体としてその被験者における神経性疾患または障害を寛解、治療および／または予防するための脳および／または脊髄の適切な機能にとって十分な組織が存在するように補充するのに役立つ。
【００５３】
[0063]一実施形態では、分化したｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣが、特定の神経性疾患または障害の動物モデルに移植されることで、ＮＳＣが健常神経細胞に分化し、ひいては動物における神経性疾患または障害を寛解、治療および／または予防するか否かを確認することができる。例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、Adami at el. Front Cell Dev Biol. 2014; 2: 17に記載の通り、例えば、パーキンソン病、ＡＬＳ、および脳卒中の動物モデルに移植され得る。
【００５４】
[0064]成体幹細胞移植が、損傷組織および臓器の修復を刺激するための新たな選択肢として現れている。過去１０年間に、動物およびヒトにおける幾つかの試験では、成人骨髄由来幹細胞、すなわち造血幹細胞が、脳、骨格筋、軟骨細胞、肝臓、内皮、および心臓を含む非造血細胞型の拡張されたレパートリーに分化する能力が実証されている。
【００５５】
[0065]脳における真の多能性組織に特異的な成体ｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞の存在および患者における神経性疾患または障害を治療または予防するためのこれらのＮＳＣの使用について実証する文献は存在しない。本発明の利点は、神経疾患または障害の治療または予防に用いられるＮＳＣが治療または予防の成功率を大幅に高めることになる自家細胞であり得る点である。患者の神経組織の一部は、例えば生検中に外科的に除去される。わずか１ｃｍ３で十分である。組織片の治療により、単一細胞が結合組織から放出される。幹細胞の指標として幹細胞マーカーｃ−ｋｉｔを用いて、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が選択される。次に、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣがインビトロで拡大され、治療または予防に要求される十分な数の細胞が得られる。十分な細胞が存在するとき、細胞は回収され、同じ患者またはＮＳＣのドナーに対して遺伝的に適合した患者に戻し注射される。各移行段階で、例えば選択と拡大の間または拡大とインプラントの間に、任意選択的にはＮＳＣは凍結保存され得る。一実施形態では、患者は、インビトロで選択され、拡大されている患者自身のＮＳＣを元に戻す。別の実施形態では、患者は、遺伝的に適合したドナーから得られるＮＳＣを得る。一部の実施形態では、この方法はまた、神経組織を有する任意の哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サルなどに拡張され得る。
【００５６】
[0066]したがって、本発明は、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防する方法であって、単離された神経幹細胞を被験者に投与することを含み、ここで神経幹細胞は神経組織検体から単離され、ｃ−ｋｉｔ陽性である、方法を提供する。一実施形態では、神経幹細胞は、成体神経幹細胞である。別の実施形態では、神経組織検体は、被験者から得られる。別の実施形態では、神経幹細胞は、神経組織検体の歯状回から得られる。さらなる実施形態では、神経幹細胞は、神経組織検体の脳室下帯から得られる。
【００５７】
[0067]一実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、前駆細胞を含む。別の実施形態では、前駆細胞は、Ｓｏｘ２を発現する。さらなる実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００５８】
[0068]一実施形態では、前記単離された神経幹細胞は、被験者への投与前に培養下で拡大される。別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、被験者への投与前に１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。さらに別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、被験者への投与前にＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに曝露される。
【００５９】
[0069]一実施形態では、単離された神経幹細胞は、血管を通じてまたは直接的に被験者の組織に投与される。別の実施形態では、単離された神経幹細胞は、注射によりかつ／またはカテーテルシステムにより、被験者に投与される。
【００６０】
[0070]一実施形態では、神経性疾患または障害は脳卒中である。別の実施形態では、神経性疾患または障害は脳出血である。別の実施形態では、神経性疾患または障害は神経変性疾患である。さらに別の実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症である。
【００６１】
[0071]一実施形態では、ここで提供されるのは、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療および／または予防するための方法であり、本明細書に記載のｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を含む組成物を被験者に投与することを含む、方法である。
【００６２】
[0072]別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療および／または予防するための方法であって、神経組織の試料を被験者から得ることと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を神経組織試料から抽出することと；選択されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣをインビトロで拡大し、かかるＮＳＣの数を増加させることと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの拡大された集団を被験者に投与し、被験者の脳および／または脊髄における神経細胞および組織を修復、再構成または再生することと、を含む、方法を提供する。
【００６３】
[0073]別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療または予防するための方法であって、神経組織を第１の被験者から得ることと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を神経組織試料から抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を拡大することと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を第２の被験者に投与し、ｃ−ｋｉｔ  ＮＳＣが、脳および／または脊髄に定住し、第２の被験者の脳および／または脊髄における神経細胞および組織を修復、再構成、および／または再生させることと、を含む、方法を提供する。
【００６４】
[0074]別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法であって、神経幹細胞を健常神経組織から抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞である前記神経幹細胞を培養および拡大することと；前記抽出および拡大された神経幹細胞の１用量を被験者における損傷神経組織の領域に投与することと、を含み、それは損傷神経組織を修復および／または再生するのに有効である、方法を提供する。
【００６５】
[0075]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、健常神経組織の歯状回から得られる。別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、健常神経組織の脳室下帯から得られる。
【００６６】
[0076]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、系統陰性細胞を含む。別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、系統陽性細胞を含む。さらに別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【００６７】
[0077]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、１つ以上の神経細胞型を生成する能力がある。別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、コリン作動性ニューロンを含む。別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む。別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、グルタミン酸作動性ニューロンを含む。別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、ドーパミン作動性ニューロンを含む。さらなる実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、セロトニン作動性ニューロンを含む。別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、運動ニューロンを含む。さらなる実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、介在ニューロンを含む。別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、星状細胞を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、オリゴデンドロサイトを含む。一部の実施形態では、１つ以上の神経細胞型は、ミクログリアを含む。
【００６８】
[0078]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷神経組織への投与前に、培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。さらに別の実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷組織への投与前に、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦに曝露される。
【００６９】
[0079]それを必要とする被験者における損傷神経組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、カテーテル媒介性または直接注射により投与される。
【００７０】
[0080]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、主に単離細胞の集団を形成するｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、自己複製能、クローン形成能および多分化能を有する。これは、各々の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が分裂し、さらなるｃ−ｋｉｔ陽性細胞を生成し、培養下でコロニーを形成し得ることを意味する。特定条件下で刺激されるとき、各ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、コミットされるようになり（すなわち、分化するべき特定の細胞系統を選択し）、特定系統の細胞、例えば、ＧＡＢＡニューロン、ドーパミンニューロン、運動ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト（ミエリン産生）および／またはミクログリアにさらに分化し得る。これらの細胞およびそれらの子孫は、特異化および分化の際、決定された系統に特有の特定の細胞マーカーを発現することになる。さらに、委任細胞(committed cell)およびその子孫は、ｃ−ｋｉｔの発現を失うことになる。
【００７１】
[0081]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、神経組織はヒトから得られる。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、ヒトは成人である。
【００７２】
[0082]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、神経組織は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を選択する前に凍結保存される。
【００７３】
[0083]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの選択は、ｃ−ｋｉｔに対する抗体を用いて実施される。
【００７４】
[0084]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対する抗体は、モノクローナル抗体である。
【００７５】
[0085]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体は、ヒトｃ−ｋｉｔの抗原エピトープに対するマウスモノクローナルＩｇＧである。
【００７６】
[0086]記載される方法のいずれかの一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対する抗体は、蛍光色素コンジュゲートされる。
【００７７】
[0087]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対する抗体は、磁気粒子にコンジュゲートされる。
【００７８】
[0088]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の選択は、フローサイトメトリーによる。
【００７９】
[0089]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、該選択は、蛍光標識細胞分取または高勾配磁気選択による。
【００８０】
[0090]記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離される神経幹細胞は、系統陰性細胞、前駆細胞および／または系統陽性細胞を含む。
【００８１】
[0091]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、エクスビボでさらに拡大される。記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、インビトロでさらに拡大される。目標は、インプラントされたＮＳＣの損傷神経組織の微小環境への十分な生着を保証するため、インプラントする上で十分に多量のｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを有することである。基本的に、神経組織の損傷部分を修復および／または置換するのに必要とされるあらゆる細胞を提供するため、損傷神経組織内で成長および増殖するのに十分な細胞が存在する必要がある。
【００８２】
[0092]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、拡大または増殖ステップ後に数が少なくとも倍増する。記載される方法のすべての態様の一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の増加または増殖時の数が、増殖段階の終了時に少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍またはそれ以上増加することが望ましい。培養液中の細胞の数は、当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばコールター計数器の使用により測定され得る。これらの方法は、当業者に周知である。
【００８３】
[0093]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、選択されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、拡大前の貯蔵用に凍結保存される。
【００８４】
[0094]記載される方法のすべての態様の別の実施形態では、拡大されたＮＳＣは、貯蔵目的で凍結保存される。必要があるとき、凍結した細胞は、解凍され、次にそれを必要とする被験者への移植に用いられる。
【００８５】
[0095]記載される方法のすべての態様の一実施形態では、該方法は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を凍結保存することをさらに含む。
【００８６】
[0096]新たに神経性疾患または障害を有すると診断されている人においては、被験者の神経組織の生検試料が診断用に入手された場合、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、本明細書に記載される方法に従って調製され得、次に疾患がその人が神経幹細胞治療を必要とするような進行期に進行していた事象では、ＮＳＣはさらなる使用のために凍結保存され得る。
【００８７】
[0097]同様に、神経性疾患または障害を発症するリスクがある人は、その人自身の神経組織からのｃ−ｋｉｔ  ＮＳＣの集団の早期調製およびＮＳＣの凍結保存から利益を得ることができる。例えば、ハンチントン病に対する遺伝的素因を有する人であれば、利益を得ることになる。ハンチントン病（ＨＤ）は、現時点で治癒しない遺伝性の変性脳障害である。ハンチントン病は、ＣＡＧトリヌクレオチド配列のリピートに起因するハンチンチン遺伝子の拡大によって引き起こされる。平均的に、遺伝子の拡大が拡大すると、疾患発症の年齢が早まる。神経性疾患または障害を発症するリスクがある他の人々は、限定はされないが、早期発症型家族性アルツハイマー病を有するファミリーメンバーを伴う個体、アルツハイマー病におけるＡｐｏＥ感受性遺伝子を有する個体、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有するファミリーメンバーを伴う個体またはＡＬＳを引き起こすことで知られる遺伝子を有する個体を含む。
【００８８】
[0098]治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、治療する(treating)および治療(treatment)は、それを必要とする被験者における損傷神経組織に対して「構造的および機能的完全性を回復させること」を含む。
【００８９】
[0099]記載される方法のすべての態様の他の実施形態では、治療することは、損傷を受けたまたは不適切なヒト神経組織を修復することを含む。別の実施形態では、治療する(treating)および治療(treatment)は、損傷神経組織内の神経細胞の、さらなる損傷からの修復、再構成、再生または保護を含む。
【００９０】
[00100]その回復または修復は、健常者の神経組織の場合に対して１００％である必要はない。被験者における症状において改善が認められる限り、回復または修復は達成されている。熟練した医師であれば、治療の前および後に、また改善が認められるか否かの比較判定に基づき、症状の重症度を評価できるであろう。多くの場合、被験者は、症状において改善が認められるか否かについて述べることができる。幾らかの症状の例として、限定はされないが、記憶喪失、認知減退、運動機能低下、疲労、または膀胱および腸の問題が挙げられる。
【００９１】
[0100]治療方法のすべての態様の一実施形態では、予防する(preventing)および予防(prevention)は、疾患、例えば、脳卒中、脳出血、脊髄損傷または神経変性疾患に起因する神経組織の機能的能力および完全性の低下を緩徐化することを含む。
【００９２】
[0101]治療方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、神経組織内の神経細胞をさらなる損傷から修復、再構成、生成または保護する。
【００９３】
[0102]治療方法のすべての態様の一実施形態では、神経性疾患または障害を治療および／または予防する方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣに対して実質的に濃縮された細胞の集団を投与する前に、神経性疾患または障害を患う被験者、例えば、脳卒中、脳出血、脊髄損傷または神経変性疾患を患う被験者を選択することをさらに含む。
【００９４】
[0103]治療方法のすべての態様の一実施形態では、神経性疾患または障害を治療および／または予防する方法は、細胞を投与する前に、損傷神経組織の構造的および機能的完全性を回復させることを必要とする被験者、例えば、脳卒中、脳出血、脊髄損傷または神経変性疾患を患う被験者を選択することをさらに含む。
【００９５】
[0104]治療方法のすべての態様の一実施形態では、神経性疾患または障害を治療および／または予防する方法は、神経組織内の神経細胞の、さらなる損傷からの修復、再構成、再生または保護を必要とする被験者、例えば、脳卒中、脳出血、脊髄損傷または神経変性疾患を患う被験者を選択することをさらに含む。
【００９６】
[0105]例えば、選択された被験者は、特定形態もしくはタイプの神経性疾患もしくは障害に対して、伝統的治療に全く応答していないかまたは十分に応答している者、および／または当該技術分野で現在公知のあらゆる治療オプションに疲れ果てている者である。
【００９７】
[0106]神経性疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、投与は、直接注射により、カテーテルシステムにより、またはそれらを組み合わせて行われる。
【００９８】
[0107]神経性疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、被験者への投与は、血管を通じて、組織に直接的に、またはそれらを組み合わせて行われる。
【００９９】
[0108]神経性疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、自己細胞である。
【０１００】
[0109]神経性疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、１つ以上のドナーから得られる同種細胞である。
【０１０１】
[0110]治療方法のすべての態様の一実施形態では、該方法は、少なくとも１つの治療薬を、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ、例えば、脳卒中、脳出血、脊髄損傷または神経変性疾患を治療するためのものとともに投与することをさらに含む。
【０１０２】
[0111]治療方法のすべての態様の一実施形態では、少なくとも１つの治療薬は、ＮＳＣの集団のホーミング、生着、または生存を増強する。
【０１０３】
[0112]治療方法のすべての態様の一実施形態では、被験者は、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、被験者は成人である。一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、ｃ−ｋｉｔ陽性ヒトＮＳＣの集団である。
【０１０４】
神経発生
[0113]神経系は、胚の最外組織層である外胚葉から生じる。発生の第３週目、神経外胚葉が現れ、胚の背側に沿って神経板を形成する。この神経板は、成人におけるニューロンおよびグリア細胞の大半の源である。ニューロンおよびグリア細胞は、脳の主な細胞成分である。
【０１０５】
[0114]グリア細胞の３タイプ：星状細胞、オリゴデンドロサイトおよびミクログリア細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）において見出される。
【０１０６】
[0115]星状細胞は、ニューロンおよび血管と相互作用する異種起源の細胞集団である。これらの細胞は、ニューロン活動を検出し、神経回路網を調節する。星状細胞の原型の形態学的特徴は、細胞骨格を形成する中間径フィラメントのその発現である。アストログリア中間径フィラメントタンパク質の主なタイプは、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびビメンチンであり；ＧＦＡＰの発現は、一般に星状細胞の同定にとって特異的なマーカーとして用いられる。
【０１０７】
[0116]中枢神経系におけるオリゴデンドロサイトは、ミエリンを生成する。ミエリンは、軸索セグメントの絶縁体として作用し、高速な神経伝導のための必要条件である。すべての白質路は、ミエリンを形成するためのオリゴデンドロサイトを有する。ミエリン鞘に直接的に接続されないオリゴデンドロサイトも存在する。これらの衛星オリゴデンドロサイトは、灰白質内に優先的に見出され、星状細胞に類似のイオンホメオスタシスを調節するのに役立ち得る。
【０１０８】
[0117]ミクログリア細胞は、中枢神経系の免疫細胞であり、様々なタイプの病原性因子に対するＣＮＳ保護に関与する。ミクログリア細胞は、損傷部位に遊走し、増殖し、貪食細胞になり得、抗原提示により末梢免疫系と相互作用する。
【０１０９】
[0118]ニューロンは、ＣＮＳの脳および脊髄、ならびに末梢神経系（ＰＮＳ）の神経節のコア成分である。ニューロンは、相互に接続し、神経回路網を形成し得る。特殊化したタイプのニューロンは、触、音、光および感覚器官の細胞に影響する他のすべての刺激に応答し、次に脊髄および脳にシグナルを送る感覚ニューロン、脳および脊髄からのシグナルを受け取り、筋収縮を引き起こし、腺出力に影響する運動ニューロン、および神経回路網内、脳、または脊髄の同じ領域内でニューロンを他のニューロンに接続する介在ニューロンを含む。
【０１１０】
[0119]典型的なニューロンは、細胞体（神経細胞体）、樹状突起、および軸索からなる。樹状突起は、細胞体から生じる薄い構造であり、数百マイクロメータにわたり伸長し、複数回分岐することが多く、複雑な「樹状突起樹」を発生させる。軸索（有髄化されるとき、神経線維とも称される）は、細胞体から生じ、ヒトまたはさらに多くは他種において１メートルの範囲にわたる距離を移動する特殊な細胞伸長物である。
【０１１１】
[0120]ニューロンは、電気的および化学的シグナルを通じて情報を処理および伝達する電気的に興奮性の細胞である。ニューロン間のこれらのシグナルは、シナプスと称される特殊化された接続を介して生じる。シナプスの大半では、１つのニューロンの軸索から別のニューロンの樹状突起へシグナルが送られる。
【０１１２】
神経幹細胞（ＮＳＣ）
[0121]幹細胞は、有糸分裂細胞分裂を通じてそれ自身の種類を複製する能力を保持する細胞であり、その娘細胞は多様な範囲の特殊化した細胞型に分化し得る。その２つの広範な哺乳動物幹細胞型は、胚盤胞内で見出される胚性幹（ＥＳ）細胞、および成体組織内で見出される成体幹細胞である。発生する胚では、ＥＳは特殊化した胚性組織のすべてに分化し得る。成体臓器では、成体幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充するだけでなく、再生臓器、例えば血液、皮膚または腸管組織の正常な代謝回転を維持する、身体における修復系として作用する。多能性幹細胞（pluripotent stem cell）は、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化し得る。
【０１１３】
[0122]一部の実施形態では、用語「幹細胞」は、本明細書で用いられるとき、増殖し、多数の母細胞を生成し、次いで分化した、または前駆細胞として公知の分化可能な娘細胞を生成することができる能力を有するより多くの前駆細胞を生成する能力がある未分化細胞を指す。娘細胞自身は、親発生能を有する１つ以上の細胞を保持しつつも、増殖し、後に１つ以上の成熟細胞型に分化する子孫を生成するように誘導され得る。
【０１１４】
[0123]一部の実施形態では、用語「幹細胞」はまた、特定の環境下で、より特殊化したまたは分化した表現型に分化する能力または可能性を有する前駆体のサブセットを指し、特定の環境下で、実質的に分化することなく増殖する能力も保持する。
【０１１５】
[0124]本明細書に記載のＮＳＣは、ＥＳとは対照的に、体性幹細胞である。好ましい実施形態では、記載されるＮＳＣは、成体幹細胞である。
【０１１６】
[0125]一実施形態では、本明細書で用いられるとき、用語「ｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞」または「ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ」は、幹細胞、前駆細胞(progenitor cells)および前駆細胞(precursor cells)を包含し、それらすべてがｃ−ｋｉｔ陽性である。
【０１１７】
[0126]一実施形態では、本明細書で用いられるとき、用語「ｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞」または「ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ」は、系統陰性細胞、前駆細胞および／または系統陽性細胞を含むｃ−ｋｉｔ陽性細胞を包含する。さらに別の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【０１１８】
[0127]細胞分化は、典型的には多くの細胞分裂を通じて生じる複雑なプロセスである。分化細胞は、自らが多能性細胞などに由来する多能性細胞に由来してもよい。これらの多能性細胞の各々を幹細胞とみなしてよい一方で、各多能性細胞が生成し得る細胞型の範囲は大幅に変動してもよい。一部の分化細胞は、発生能がより大きい細胞を生成する能力も有する。かかる能力は、天然であってもよく、または様々な要素による治療時、人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的事例では、幹細胞は、２つ以上の異なる細胞型の子孫を生成し得ることから「多能性」であり、この文書内で用いられるとき、それは必要とされる。自己複製は、他の古典的な幹細胞定義の一部であり、この文書内で用いられるとき、それは必須である。理論上は、自己複製は、２つの主な機構のいずれかにより生じ得る。幹細胞は非対称的に分裂することがあり、一方の娘は幹細胞状態(stem state)を保持し、他方の娘は幾つかの異なる他の特定の機能および表現型を発現する。あるいは、集団内の幹細胞の一部が対称的に２つの幹細胞に分裂し、それにより集団内での幾つかの幹細胞を全体として維持し得る一方で、集団内のその他の細胞は、分化した子孫のみを生成する。
【０１１９】
[0128]一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞に対して実質的に濃縮される単離細胞の集団は、主にＮＳＣを含む。したがって、一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞について実質的に濃縮される単離細胞の集団は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団と称される。それは、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団が幾つかのｃ−ｋｉｔ陽性系統陰性細胞、ｃ−ｋｉｔ陽性前駆細胞(progenitor cells)および／またはｃ−ｋｉｔ陽性前駆細胞(precursor cells)を含み得ることを意味する。
【０１２０】
[0129]本明細書で用いられるとき、一部の実施形態では、用語「単離され、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団」または「単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団」は、ＮＳＣおよび／または神経前駆細胞(progenitor cells)および／または神経前駆細胞(precursor cells)の異質または均一集団を包含する。ＮＳＣは、多能性であり、多系統の細胞型を生成する。それに対し、神経前駆細胞(progenitor cells)および神経前駆細胞(precursor cells)は、系統決定細胞である。例えば、神経前駆細胞(progenitor cells)がグリア細胞系統について決定的である、すなわち将来的にグリア細胞を生成する場合、この神経前駆細胞(progenitor cell)は、神経細胞を転換および生成することはない。一部の実施形態では、神経前駆細胞(progenitor cells)および神経前駆細胞(precursor cells)は、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイトまたはミクログリアについて決定的である。
【０１２１】
[0130]少なくとも２つの異なる細胞型を含む単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、本明細書中で「異質集団」と称される。神経幹細胞または神経前駆細胞が移植前にエクスビボで単離され、拡大されることもまた、本明細書中で検討される。１つの細胞型のみ（例えば神経細胞）を含む単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、本明細書中で「細胞の均一集団」と称される。
【０１２２】
[0131]例の中で、ヒト神経組織内のこの細胞集団は、サイトカイン幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合するサイトカイン受容体である、ＫＩＴまたはＣＤ１１７とも称されるｃ−ｋｉｔを発現する。ＳＣＦは、細胞にシグナル伝達し、分裂および増殖させる。一般に、ｃ−ｋｉｔは、幹細胞ならびに有糸分裂による幹細胞からの子孫である前駆(progenitor)および前駆(precursor)細胞型の表面上で発現する。したがって、ｃ−ｋｉｔは幹細胞マーカーである。ヒト神経組織内のｃ−ｋｉｔに対する免疫染色により、発明者は、かかるｃ−ｋｉｔ陽性細胞を見出した（図１Ａ〜１Ｂ、図２、図３Ａ〜３Ｂ、図６Ａ〜６Ｂ、図７、図９）。この発見に先立ち、神経組織内のｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞の証拠は報告されていない。これらのｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系統陰性細胞、前駆細胞および／または系統陽性細胞を含む。一部の実施形態では、系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰを発現する。
【０１２３】
[0132]発明者は、これらのｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣがクローン原性特性を有することを示した。これらの細胞が単離され、超低付着プレート内に蒔かれ、継代されたとき、各継代時にニューロスフェアが形成され（図４、図５）、故にこれらのｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞のクローン原性特性が示された。
【０１２４】
[0133]さらに、ｃ−ｋｉｔの単独でのまたは系統マーカーとの組み合わせた発現がニューロスフェア内部に見出された（図６Ａ〜６Ｂ、図７、図９）。
【０１２５】
[0134]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、長期および短期複製能を有する細胞、ならびに委任された多能性、少能性および単能性の前駆細胞を含有する。
【０１２６】
[0135]したがって、本明細書で用いられるとき、用語「ＮＳＣ」は、多系統神経分化能および持続的な自己複製活性を有する細胞を指す。「自己複製」は、分裂し、親細胞と同一の（例えば自己複製する）特徴を有する少なくとも１つの娘細胞を生成する細胞の能力を指す。第２の娘細胞は、特定の分化経路にコミットする場合がある。例えば、自己複製するＮＳＣは、分裂し、１つの娘幹細胞と、神経組織の神経および／またはグリア細胞への分化にコミットしたもう１つの娘細胞とを形成する。委任前駆細胞は、典型的には自己複製能を失っており、細胞分裂時、より分化した（すなわち制限された）表現型を示す２つの娘細胞を生成する。
【０１２７】
[0136]したがって、「ＮＣＳ」は、本明細書に記載の方法で用いられるとき、限定はされないが、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性（γアミノ酪酸）ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイトおよび／またはミクログリアを含む、神経組織の幾つかの細胞型に分化する能力があるすべての多能性細胞を包含する。
【０１２８】
[0137]「神経前駆細胞」は、該用語が本明細書で用いられるとき、特定の神経細胞系統にコミットされ、一般に自己複製しないＮＳＣのサブセットを指し、例えば細胞表面マーカーまたは細胞内タンパク質により同定され得る。例えば、その神経細胞系統への委任を示すβＩＩＩチューブリンまたはＮｅｕＮ；またはグリア細胞系統への委任を示すＧＦＡＰが挙げられる。ＮｅｕＮ（神経核）は、モノクローナル抗体の抗ＮｅｕＮとの免疫反応性により同定されるニューロンに特異的な核タンパク質である。ＮｅｕＮは、スプライシング調節剤として機能するヘキサリボヌクレオチド(hexaribonucleotide)結合タンパク質３のＦｏｘ−３として同定されている。βＩＩＩチューブリン（クラスＩＩＩβ−チューブリンまたはβ−チューブリンＩＩＩとしても公知）は、ニューロン内でほぼ排他的に見出されるチューブリンファミリーの微小管因子である。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＮＳＣは、これらのさらなる細胞表面マーカーの１つ以上を用いて選択される。
【０１２９】
[0138]ＮＳＣの存在は、当該技術分野で公知の任意の方法により、または表現型的には当業者に公知のアッセイを用いての細胞表面マーカーまたはその例において記載されるものの検出を通じて判定され得る。
【０１３０】
ＮＳＣの単離
[0139]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＮＳＣは、以下の供給源：新たに死亡した被験者、生存被験者からの組織生検、または神経幹細胞株の神経組織試料から得られるかまたは単離される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＮＳＣは、エクスビボで他の細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または成体多能性細胞から得られる。
【０１３１】
[0140]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、ＮＳＣは、当業者に公知の任意の方法を用いて、または本明細書に記載の方法に従い、例えば生存被験者からの少量の神経組織試料に対する微小針吸引により単離され得る。
【０１３２】
[0141]ＮＳＣは、当該技術分野で公知の任意の方法により、神経組織試料から単離され得る。組織試料から各細胞を解離させる方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許７，５４７，６７４号、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２３９９８３号、米国特許出願公開第２００９／０１４８４２１号、および米国特許出願公開第２００９／０１８０９９８号が挙げられる。これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
【０１３３】
[0142]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、単離されるＮＳＣの集団は、以下の方法により単離される。当業者であれば、異なる供給源からの神経組織について必要とされる方法に対して微調節を行うことができるであろう。神経組織の小片（最小サイズが少なくとも１ｃｍ３）がコラゲナーゼを用いて酵素的に消化され、単一細胞が得られる。少量の無傷細胞が再懸濁され、細胞の凝集体がセルストレーナーを用いて除去される。このセルストレーナーステップは、任意選択的である。次に、細胞がマウスｃ−ｋｉｔ抗体とともにインキュベートされる。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、抗マウスＩｇＧでコーティングされた免疫磁気ビーズを用いて単離および収集される。
【０１３４】
[0143]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、得られる単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、以下の方法により培養される。当業者であれば、必要に応じた方法に対して微調節を行うことができるであろう。その培養方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを増殖し、その数を拡大するため、用いられる。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、５〜１０％ＦＢＳ(GIBCO)およびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物(SIGMA, St.Louis, MO)を添加したF12培地を含有する改変F12Ｋ培地(GIBCO, Grand Island, NY)に標準組織培養条件下で蒔かれる。コンフルエントに達してから、細胞は幾つかの他のプレートに継代され、細胞を取り扱う標準組織培養プロトコルを用いて培養が拡大される。
【０１３５】
[0144]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、本明細書に記載の神経組織からのＮＳＣは、本明細書に記載の方法における使用前、当業者にとって許容可能な任意の方法を用いてエクスビボで拡大される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、さらに選別され、分画され、処理されて、任意の望まれない細胞が除去されるか、またはその他として、患者を治療するため、移植用細胞を調製する、当業者にとって許容可能な任意の方法を用いて操作される。望まれない細胞の例が悪性細胞である。
【０１３６】
[0145]典型的には、神経組織の試料中に非常に少数のＮＳＣが存在し、例えば、１００万個の細胞あたり、わずか１個かまたは２個のｃ−ｋｉｔ陽性細胞が存在し得る。したがって、選択されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの拡大には、本明細書に記載の治療的使用にとって必要とされる細胞の数を増加させることが必要であることが多い。本明細書に記載の治療的使用において移植されるＮＳＣの数が増加すると、そこで用いられる治療の成功率が増加する。ＮＳＣは、被験者の神経組織内での損傷組織および細胞の一部を修復し、再構成し、作製し、かつ／またはさらなる損傷から保護するために用いられる。したがって、移植されるＮＳＣの増加は、新しい神経細胞および神経組織を修復、再構成および生成するかまたは既存の神経細胞または組織をさらなる損傷から保護するのに利用可能な細胞の増加を意味する。一部の実施形態では、移植治療の成功、例えば当該技術分野に精通した医師に理解される被験者の認知機能、運動機能および一般健康状態における改善は、当該技術分野で公知の任意の方法および本明細書に記載の方法により測定され得る。
【０１３７】
[0146]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＮＳＣを含む神経組織試料は、被験者から単離され、次に例えば細胞選別（例えばＦＡＣＳ）によりさらに処理され、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団が得られる。記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、拡大されたＮＳＣのインビトロまたはエクスビボ培養物を指す。
【０１３８】
[0147]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、様々な供給源からの神経組織試料は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの抽出または選択前の凍結試料、例えば凍結物または凍結保存物である。神経組織試料は、被験者または本明細書に記載の他の供給源から得られ、次に凍結保護物質とともに凍結保存される。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、神経組織試料から単離されたｃ−ｋｉｔ  ＮＳＣの集団は、使用前に凍結保護物質とともに凍結保存される。記載される組成物および方法のすべての態様のさらに別の実施形態では、インビトロ培養下で拡大されている単離されたｃ−ｋｉｔ  ＮＳＣの集団は、使用前に凍結保護物質とともに凍結保存される。凍結保護物質を加えての組織および細胞の凍結保存方法は、当該技術分野で周知である。さらに、使用のために凍結保存された組織または細胞を解凍するための方法もまた、当該技術分野で周知である。
【０１３９】
[0148]用語「単離する」および「入手または調製する方法」は、本明細書で用いられるとき、細胞または細胞の集団、例えばＮＳＣの集団が最初に見出された被験者または神経組織試料から除去される過程を指す。用語「単離された集団」は、本明細書で用いられるとき、生体試料、またはかかる試料中に見出される細胞の混合もしくは異質集団から除去および分離されている細胞の集団を指す。かかる混合された集団は、例えば神経組織試料から得られるＮＳＣの集団を含む。一部の実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮される元の異質集団と比べて実質的に純粋な細胞の集団である。一部の実施形態では、単離された集団は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団である。この態様および本明細書に記載のすべての態様の他の実施形態では、単離された集団は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの実質的に濃縮された集団を含む。一部の実施形態では、単離された細胞または細胞集団、例えばｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、インビトロまたはエクスビボで、例えば成長因子またはサイトカインの存在下でさらに培養され、単離された細胞集団または実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ細胞集団における細胞の数をさらに拡大する。一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、インビトロまたはエクスビボでＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦとともにさらに培養される。かかる培養は、当業者に公知の任意の方法を用いて実施され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法により得られた、単離または実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ集団は、後に第２の被験者に投与されるか、または細胞集団が最初に単離された被験者に再導入される（例えば、同種移植対自家投与）。
【０１４０】
[0149]特定の細胞集団に関する用語「実質的に濃縮される」は、全細胞集団を構成する細胞に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％純粋である細胞の集団を指す。換言すれば、本明細書に開示される方法にて用いるために単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団に関する用語「実質的に濃縮される」または「本質的に精製される」は、本明細書中の用語により定義される通り、ＮＳＣでない細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または１％未満を含有するｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を指す。これら態様の一部の実施形態は、実質的に純粋なまたは濃縮されたＮＳＣの集団を拡大するための方法をさらに包含し、ここでｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの拡大された集団は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの実質的に純粋なまたは濃縮された集団でもある。
【０１４１】
[0150]細胞集団内での特定マーカーの存在に関する用語「実質的に陰性な」は、全細胞集団を構成する細胞に関して、そのマーカーについて最高で約１０％まで、最高で約８％まで、最高で約６％まで、最高で約４％まで、最高で約２％まで、最高で約１％まで陽性である細胞の集団を指す。
【０１４２】
[0151]用語「濃縮する」または「濃縮された」は、本明細書で交換可能に用いられ、１つのタイプの細胞、例えば本明細書に記載の方法にて用いるためのＮＳＣの収量（画分）が、出発生体試料、培養液、または製剤の中のそのタイプの細胞の画分よりも、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％増加することを意味する。本明細書に記載の方法にて用いる場合に得られるＣ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、最も好ましくは、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣに対して少なくとも６０％濃縮される。
【０１４３】
[0152]一部の実施形態では、ＮＳＣに特異的なマーカーは、これらの細胞に対して単離または濃縮するため、用いられる。「マーカー」は、本明細書で用いられるとき、細胞の特徴および／または表現型を表す。マーカーは、意図する特徴を含む細胞の選択のために用いることができる。マーカーは、特定細胞に応じて変化するであろう。マーカーは、特徴、すなわち特定の細胞型またはその細胞型によって発現される分子の形態学的、機能的、または生化学的（酵素的）特徴である。好ましくは、かかるマーカーはタンパク質であり、またより好ましくは当該技術分野において利用可能な抗体に対するエピトープまたは他の結合分子を有する。しかし、マーカーは、限定はされないが、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸およびステロイドを含む、細胞内で見出される任意の分子からなってもよい。形態学的特徴または形質の例として、限定はされないが、形状、大きさ、外観（例えば、滑らか、半透明）、および核対細胞質比が挙げられる。機能的特徴または形質の例として、限定はされないが、特定の基質に対する接着能、特定色素の取り込み能または排除能、特定条件下での遊走能、および特定の系列に沿った分化能が挙げられる。マーカーは、当業者にとって利用可能な任意の方法によって検出されてもよい。
【０１４４】
[0153]したがって、本明細書で用いられるとき、「細胞表面マーカー」は、細胞の表面上に発現される任意の分子を指す。細胞表面での発現には、通常、分子が膜貫通ドメインを有することが必要である。通常、細胞表面上で見出されない一部の分子は、組換え技術により細胞の表面上に発現されるように改変され得る。多数の天然起源の細胞表面マーカーが、「ＣＤ」または「表面抗原分類」分子と称される。細胞表面マーカーは、抗体が結合し得る対象の抗原決定基を提供することが多い。本明細書に記載の方法に特に関連する細胞表面マーカーは、ＣＤ１１７またはｃ−ｋｉｔである。該組成物および方法に準じる有用なＮＳＣは、好ましくはｃ−ｋｉｔを発現する、または換言すればｃ−ｋｉｔ陽性である。
【０１４５】
[0154]細胞は、任意の細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して「陽性」または「陰性」と指定され得、かかる指定の双方は、本明細書に記載の方法を実施する上で有用である。ある細胞が、その細胞表面上または細胞内で、当業者に公知の方法を用いて、例えば細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合されるか否かを判定するため、かかる接触された細胞のフローサイトメトリー分析を実行することで、検出されるのに十分な量でマーカーを発現する場合、細胞は細胞表面マーカーに対して「陽性」とみなされる。ある細胞が、本明細書に記載の方法について陽性とみなされるように、細胞表面マーカーとしてメッセンジャーＲＮＡを発現し得る一方で、該細胞がその表面上でマーカーを発現する必要があることは理解されるべきである。同様に、ある細胞が、当業者に公知の方法を用いて、例えば細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合されるか否かを判定するため、かかる接触された細胞のフローサイトメトリー分析を実行することで、検出されるのに十分な量でマーカーを発現しない場合、細胞は細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して「陰性」とみなされる。
【０１４６】
[0155]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは陰性選択され、その選択では細胞表面マーカーに特異的な作用剤が用いられる。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、神経細胞系統またはグリア細胞系統などの系統に特異的なマーカーである。
【０１４７】
[0156]陰性選択との関連で、記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、系統マーカーに特異的な作用剤が用いられる場合、すべての薬剤は、同じ標識またはタグ、例えば蛍光タグを含み得、ひいてはその標識またはタグに対して陽性のすべての細胞が排除または除去され、本明細書に記載の方法にて用いられる、系統マーカー陰性のＮＳＣ、神経前駆細胞(progenitor cells)および／または神経前駆細胞(precursor cells)が残存し得る。これは、系統マーカーに特異的な作用剤と接触しなかった細胞について選択する、陰性選択である。
【０１４８】
[0157]したがって、本明細書で定義されるとき、「細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに特異的な作用剤」は、その細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して選択的に反応または結合可能な作用剤を指し、別の細胞表面マーカー、他の細胞内マーカーまたは抗原に対してほとんど検出不能な反応性を有する。例えば、ｃ−ｋｉｔに特異的な作用剤は、ＣＤ４９ｅに対して同定または結合することがない。したがって、細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに特異的な作用剤は、マーカーの固有の構造的特徴を認識する。一部の実施形態では、マーカーに特異的な作用剤は、マーカーに結合しても、そのマーカーによって媒介される下流シグナル伝達事象の開始を引き起こさない、例えば非活性化抗体である。細胞表面分子に特異的な作用剤は、限定はされないが、抗体またはその抗原結合断片、天然または組換えリガンド、小分子、核酸配列および核酸類似体、細胞内抗体、アプタマー、ならびに他のタンパク質またはペプチドを含む。
【０１４９】
[0158]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＮＳＣを単離するために用いられる細胞表面マーカーに特異的な好ましい薬剤は、細胞表面マーカーに特異的に結合し、かつポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらの抗原結合誘導体または断片を含み得る抗体薬である。周知の抗原結合断片として、例えば、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ；本質的に単一のＶＬまたはＶＨ抗体ドメインからなる）、Ｆｖ断片、例えば、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。かかる抗体分子を構成するための方法は、当該技術分野で周知である。したがって、本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、またはＦｃ（結晶化可能断片）領域もしくはＦｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合断片を指す。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製されてもよい。「抗原結合断片」は、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、およびポリペプチドに特異的な抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを含む。Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖという用語は、例えば、Klein, “Immunology”(John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W. R. (1986); in “The Experimental Foundations of Modern Immunology” (Wiley & Sons, Inc., New York);およびRoitt, I. (1991) “Essential Immunology”, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)における当業者に公知の標準の免疫学的な意味で用いられる。かかる抗体または抗原結合断片は、R&D Systems, BD Biosciences, e-BiosciencesおよびMiltenyiなどのベンダーから市販されており、または当業者に公知の方法により、これらの細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して産生され得る。
【０１５０】
[0159]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、細胞表面分子または他の細胞内マーカーに特異的な作用剤、例えば抗体または抗原結合断片は、神経幹細胞の単離を容易にするため、タグで標識される。用語「標識」または「タグ」は、本明細書で用いられるとき、標的の存在、例えば生体試料中での特定の細胞表面マーカーの存在を示す検出可能なシグナルを生成する能力がある組成物を指す。好適な標識は、蛍光分子、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、化学発光部分、磁気粒子、生物発光部分などを含む。それ故、標識は、ＮＳＣ、神経前駆細胞(progenitor cell)および神経前駆細胞(precursor cells)について単離および濃縮するための方法において必要とされる分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【０１５１】
[0160]用語「標識抗体」または「タグ化抗体」は、本明細書で用いられるとき、検出可能な手段により標識され、かつ限定はされないが、蛍光的、酵素的、放射活性的、および化学発光的に標識される抗体を含む、抗体を含む。抗体はまた、検出可能なタグ、例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、またはＨＩＳで標識され得、それらは、タグに特異的な抗体、例えば抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いて検出され得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該技術分野で公知であり、用いられてもよい。発明の方法において用いられる抗体を標識するための蛍光標識またはタグの非限定例として、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、スクシンイミジルエステル、メトキシクマリン、Cascade Blue、ヒドラジド、Pacific Blue、マレイミド、Pacific Orange、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、Ｒ−フィコエリトリン(PE)、PE-Cy5コンジュゲート(Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red)、PE-Cy7コンジュゲート、Red 613、PE-Texas Red, PerCP、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed (PerCP-Cy5.5コンジュゲート)、FluorX、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-Rhodamine (XRITC)、リサミンローダミンＢ、Texas Red、アロフィコシアニン(APC)、APC-Cy7コンジュゲート、ALEXA FLUOR（登録商標）350、ALEXA FLUOR（登録商標）405、ALEXA FLUOR（登録商標）430、ALEXA FLUOR（登録商標）488、ALEXA FLUOR（登録商標）500、ALEXA FLUOR（登録商標）514、ALEXA FLUOR（登録商標）532、ALEXA FLUOR（登録商標）546、ALEXA FLUOR（登録商標）555、ALEXA FLUOR（登録商標）568、ALEXA FLUOR（登録商標）594、ALEXA FLUOR（登録商標）610、ALEXA FLUOR（登録商標）633、ALEXA FLUOR（登録商標）647、ALEXA FLUOR（登録商標）660、ALEXA FLUOR（登録商標）680、ALEXA FLUOR（登録商標）700、ALEXA FLUOR（登録商標）750、ALEXA FLUOR（登録商標）790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5またはCy7が挙げられる。
【０１５２】
[0161]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、実質的に純粋なまたは濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団を単離するための種々の方法、例えば、免疫選択技術、例えばフローサイトメトリー法を用いるハイスループット細胞選別、磁気ビーズ、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズに対して標識された抗体、およびディッシュを含む表面にパニングされた抗体を用いる親和性法、ならびにかかる方法の組み合わせが当業者に利用可能である。
【０１５３】
[0162]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＮＳＣの集団に対する単離および濃縮は、磁気ビーズなどのビーズに基づく選別機構を用いて実施され得る。かかる方法では、消化された神経組織試料は、１つ以上の特異的な細胞表面抗原、例えばｃ−ｋｉｔに対する抗体でコーティングされた磁気ビーズと接触される。これが原因で、各抗原を発現する試料中の細胞が磁気ビーズに付着する。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がビーズに結合できるだけの時間経過後、細胞およびビーズの混合物は、強力な磁場、例えば磁石を有するカラムまたはラックに曝露される。（細胞表面マーカーを発現する）ビーズに付着された細胞がカラムまたは試料チューブ上に留まる一方で、（細胞表面マーカーを発現しない）他の細胞はフロースルーまたは溶液中に残存する。この方法を用いて、細胞は、特定の細胞表面マーカーに対して陽性または陰性にまたはその組み合わせを用いて分離され得る。
【０１５４】
[0163]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）方法が、ＮＳＣの単離および予備選択に用いられる。一部の実施形態では、ＮＳＣは、ヒト血漿またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、例えば２％ＨＳＡの存在下で単離される。
【０１５５】
[0164]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の好ましい実施形態では、ＮＳＣは、細胞表面マーカーｃ−ｋｉｔに対する陽性選択を用いて単離または濃縮される。
【０１５６】
[0165]本明細書で定義されるとき、「陽性選択」は、特定の細胞表面マーカーまたは細胞内タンパク質を発現する細胞の単離または濃縮をもたらす技術を指す一方で、「陰性選択」は、特定の細胞表面マーカーまたは細胞内タンパク質を発現しない細胞の単離または濃縮をもたらす技術を指す。陰性選択は、当該技術分野で公知の任意の方法により実施され得る。例えば、典型的な陰性選択は、目的のマーカーを確実に発現する細胞を除去することにより実施される。
【０１５７】
[0166]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、当該技術分野で公知の標準的技術、例えば市販のビーズコンジュゲーションキットを用いて、当業者により、ビーズが抗体でコーティングされ得る。一部の実施形態では、陰性選択ステップが、１つ以上の系統マーカーを発現する細胞を除去するために実施され、その後、１つ以上の特定の細胞表面マーカーを発現するＮＳＣを陽性選択するために蛍光標識細胞分取が行われる。
【０１５８】
[0167]幾つかの異なる細胞表面マーカーは、特定の分化細胞系統上での特異的発現を有し、本明細書に記載の方法において単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣによって発現されない。したがって、それら系統細胞マーカーに特異的な作用剤がｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣと接触されるとき、その細胞は「陰性」となる。
【０１５９】
[0168]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、フローサイトメトリー法は、単独でまたは磁気ビーズに基づく方法と組み合わせて、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣについて単離または濃縮するため、用いられる。本明細書で定義されるとき、「フローサイトメトリー」は、顕微粒子、例えば細胞およびＤＮＡを、流れる液体に懸濁し、電子検出装置を通過させることによって計数および検査するための技術を指す。フローサイトメトリーは、１秒あたり最大数千個の粒子の、蛍光パラメータなど、物理的および／または化学的パラメータの同時多パラメータ分析を可能にする。現代のフローサイトメトリー装置は通常、複数のレーザーおよび蛍光検出器を有する。レーザーおよび検出器の数の増加は、複数の抗体による標識を可能にし、標的集団をそれらの表現型マーカーによって、より正確に同定することができる。特定のフローサイトメトリー装置は、各細胞のデジタル画像を撮ることができ、細胞内または細胞表面上での蛍光シグナル位置の分析を可能にする。
【０１６０】
[0169]フローサイトメトリー技術に共通のバリエーションは、「蛍光標識細胞分取」を用いて、粒子をその特性に基づいて物理的に選別し、目的の集団を精製することである。本明細書で定義されるとき、「蛍光標識細胞分取」または「フローサイトメトリーに基づく選別」方法は、単一生体試料からの細胞の異質混合物を１つ以上の容器中に一度に細胞１個を各細胞に特異的な光散乱および蛍光特性に基づいて選別するためのフローサイトメトリー法を指し、各細胞からの蛍光シグナルの迅速、客観的かつ定量的な記録とともに、特に興味深い細胞の物理的分離をもたらす。したがって、細胞表面マーカーに特異的な作用剤がフローサイトメーターによって検出可能なタグで標識された抗体である場合の実施形態では、本明細書に記載の方法の中やそれと併せて、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、ＮＳＣの集団に対して単離および濃縮することができる。
【０１６１】
ＮＳＣの拡大
[0170]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、単離され、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、本明細書に記載の治療方法におけるその使用前、数が増加するようにさらに拡大される。
【０１６２】
[0171]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および技術を用いることにより単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、培養下で拡大される、すなわちその細胞数は、必要とする被験者への投与前、当業者に公知の方法を用いて被験者の身体外部で増加される。
【０１６３】
[0172]記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、得られる単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、以下の方法に従い、培養下で拡大される。当業者であれば、必要に応じて、該方法に対してマイナーな調節を行うことができるであろう。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、標準組織培養条件下、例えば、９５％空気、５％ＣＯ２、３７℃で、５〜１０％ＦＢＳ(Gibco)およびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物(SIGMA, St. Louis, MO)が添加されたF12培地を含有する修飾F12Ｋ培地(GIBCO, Grand Island, NY)に蒔かれる。コンフルエントに到達後、１つのコンフルエントプレートからの細胞が、幾つかの他のプレートに継代され、細胞を扱う標準組織培養プロトコルを用いて培養が拡大される。
【０１６４】
[0173]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、かかる増殖方法は、例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを、サイトカインおよび／または成長因子が添加された無血清培地中で、ＮＳＣ、例えば、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ｂＦＧＦおよび／またはＮＧＦの拡大を引き起こす条件下で培養することを含み得る。ＨＧＦは、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の発現および活性化を通じて細胞遊走に正の影響を与える。この酵素ファミリーは、細胞外マトリックスにおけるバリアーを破壊し、それにより幹細胞移動、ホーミングおよび組織回復を促進する。同様に、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、分裂促進的で抗アポトーシス的であり、神経幹細胞増殖および分化にとって必要である。同等な様式で、ＩＧＦ−１は、それらの数を増加させ、それらの生存度を保護することにより幹細胞に影響する。ｂＦＧＦは、中胚葉起源のすべての細胞、ならびに神経外胚葉、外胚葉および内胚葉起源の多数の細胞の増殖を刺激する。ｂＦＧＦは、インビトロでの内皮細胞に対する走化性剤および分裂促進剤であり、神経の分化、生存および再生を誘導する。それは、胚発生および分化を調節するのに重要であることが示されており、インビボで血管新生、組織修復、胚発生および神経機能の調節における役割を担う場合がある。ＮＧＦは、主に特定の標的ニューロンの成長、維持、増殖、および生存の調節に関与する神経ペプチドである。ＮＧＦを含む極めて多数の生物学的過程が同定されており、それらの２つが膵β細胞の生存および免疫系の調節である。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、例えばデキサメタゾンおよび／または成長因子とサイトカインとの組み合わせが添加された無血清培地を用いて、ＮＳＣの神経および／またはグリア細胞への分化を誘導することを意図した因子とともにかつ／または条件下でさらに培養され得る。
【０１６５】
[0174]記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、Lu J et al., “A Novel Technology for Hematopoietic Stem Cell Expansion using Combination of Nanofiber and Growth Factors.” Recent Pat Nanotechnol. 2010 4(2):125-35にレビューされるようなナノテクノロジーまたはナノエンジニアリングの方法を最高で約０．５％まで適応させることにより、拡大される。例えば、一部の実施形態では、幹細胞微小環境のナノエンジニアリングが実施され得る。本明細書で用いられるとき、分泌される因子、幹細胞−隣接細胞相互作用、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および機械的特性により、集合的に「幹細胞微小環境」が形成される。幹細胞微小環境ナノエンジニアリングは、マイクロ／ナノパターン化表面、ナノ粒子による放出成長因子および生化学物質の制御、ナノファイバーによる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の模倣、整列される生体材料のナノリットル規模の合成、自己組織化ペプチド系による幹細胞のシグナル群の模倣、ナノワイヤー、レーザー加工によるナノグルーブ、およびナノフェーズ薄膜によるＮＳＣの拡大、の使用を含み得る。
【０１６６】
[0175]記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、遺伝子操作される、例えば外因性核酸が遺伝子導入される。ＮＳＣにおける遺伝子導入および遺伝子操作、例えば、インビボ遺伝子送達のためのナノ粒子、ＮＳＣへの遺伝子送達のためのナノニードル、ＮＳＣ遺伝子導入のための自己組織化ペプチド系、ＮＳＣへの遺伝子送達のためのナノワイヤー、およびＮＳＣ電気穿孔のためのマイクロ／ナノ流体デバイスにおいて、ナノエンジニアリングを用いることができる。
【０１６７】
[0176]記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、該方法における使用のために単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、バイオリアクターを用いて拡大され得る。
【０１６８】
[0177]用語「増加した」、「増加する」または「拡大する」は、ＮＳＣの増加との関連で用いられるとき、一般に、ＮＳＣの数における統計学的に有意な量の増加を意味し、あらゆる疑いを回避するため、用語「増加した」、「増加する」、「拡大する」または「拡大された」は、参照レベルと比べての少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは１００％を含むそれ以下の増加、または少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約７倍、もしくは少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または対照または参照レベルと比べての１０倍以上の任意の増加を意味する。対照／参照試料またはレベルは、例えば本明細書に記載の方法を用いて拡大されていない、例えば拡大培養の開始または拡大培養に添加される細胞の初期数での同じ生物学的供給源から得られる細胞の集団を示すように本明細書で用いられる。
【０１６９】
神経組織試料および／または神経幹細胞の貯蔵
[0178]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、神経組織試料は、使用前、すなわちその中のｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの抽出、単離または選択前に貯蔵される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、消化された神経組織試料は、その中のｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの抽出または選択前に貯蔵される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは貯蔵される。記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、貯蔵前にまず単離および／または拡大される。一実施形態では、貯蔵は凍結保存による。ＮＳＣは、本明細書に記載の治療方法において必要であるとき、解凍される。
【０１７０】
[0179]記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、神経組織試料または単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ（拡大されるかまたはそれ以外）は、本明細書に記載の方法におけるそれらの使用前に凍結される。試料の凍結は、凍結−解凍プロセスの間、細胞損傷を最小化するため、１つ以上の異なる凍結保護物質の存在下で実施され得る。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トレハロース、またはスクロースを用いることができる。
【０１７１】
再生医療におけるＮＳＣの投与および使用
[0180]本明細書に記載の特定の実施形態は、マウス神経組織における体性幹細胞の発見に基づき、その上、これらのマウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）は、神経性疾患または障害のマウスモデルにおいて損傷神経組織を修復し得る。ｍＮＳＣが損傷神経組織を有するマウスに置かれるとき、投与されたｍＮＳＣの長期生着が生じ得、これらのｍＮＳＣはニューロンに分化し得、例えば、その後のニューロン再生および修復をもたらし得る。この実験は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣが神経性疾患または障害の神経組織再生および治療のために使用可能であるか否かを示し得る。
【０１７２】
[0181]したがって、本明細書に提供されるのは、それを必要とする被験者における神経性疾患または障害を治療および／または予防するための方法である。本明細書で用いられるとき、用語「神経性疾患または障害」、「神経性疾患」、「神経学的状態」および「神経学的障害」は交換可能に用いられる。これらの方法の一部は、注射により、カテーテルシステムにより、またはそれらの組み合わせで、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを治療有効量で被験者に投与することを含む。これらの方法の一部の態様では、治療有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、血管を通じて、直接的に組織に、またはそれらを組み合わせて、投与される。これらの方法は、特に、神経性疾患または障害を有するかまたはそれに対するリスクがあるヒト被験者、例えばアルツハイマー病または多発性硬化症を有する被験者の治療的および予防的処置が意図される。本明細書に記載の単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、任意の神経性疾患もしくは障害を有するかまたは神経性疾患もしくは障害を発症する素因になる選択された被験者に投与され得、その投与は、被験者における効果的治療をもたらす任意の適切な経路を介し得る。本明細書に記載の治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該細胞の投与前に最初に、神経性疾患または障害を有する被験者が選択される。
【０１７３】
[0182]用語「被験者」、「患者」および「個体」は、本明細書で交換可能に用いられ、本明細書に記載の方法にて用いるための細胞が入手可能な動物、例えばヒト（すなわちドナー被験者）、および／または本明細書に記載のような細胞を用いる予防的治療を含む治療が提供される動物、例えばヒト、すなわちレシピエント被験者を指す。特定動物、例えばヒト被験者に特異的であるような状態または病状の治療においては、被験者という用語は、その特定動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳類」は、本明細書で交換可能に用いられるとき、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、雌ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳類を含む。用語「被験者」はまた、限定はされないが、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類を含む任意の脊椎動物を包含する。しかし、有利には、被験者は、哺乳動物、例えばヒト、または他の哺乳類、例えば、家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、または食糧生産用哺乳動物(food production mammal)、例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタなどである。
【０１７４】
[0183]したがって、本明細書に記載の治療方法の一部の実施形態では、被験者は、レシピエント被験者、すなわち単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの投与対象である被験者、またはドナー被験者、すなわちｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを含む神経組織試料の入手元である被験者である。レシピエントまたはドナー被験者は、任意の年齢であり得る。一部の実施形態では、被験者は、１０歳未満の被験者として本明細書で定義される「若年被験者」である。他の実施形態では、被験者は、２歳未満の被験者として本明細書で定義される「幼児被験者」である。一部の実施形態では、被験者は、２８日齢未満の被験者として本明細書で定義される「新生児被験者」である。好ましい実施形態では、被験者は成人である。
【０１７５】
[0184]本明細書に記載の治療方法の一部の実施形態では、投与されている単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ集団は、１つ以上のドナーから得られる同種ＮＳＣを含む。本明細書で用いられるとき、「同種」は、１つ以上の遺伝子座での遺伝子が同一でない場合で、同種の１つ以上の異なるドナーから得られるＮＳＣまたはＮＳＣを含む神経組織試料を指す。例えば、被験者に投与されている単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ集団は、１つ以上の無関係のドナー被験者、または１つ以上の非同一同胞もしくは他の供給源から得られる神経組織から得ることができる。一部の実施形態では、同系の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ集団、例えば遺伝的に同一の動物、または一卵性双生児から得られるものが用いられる。本態様の他の実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、自家ＮＳＣである。本明細書で用いられるとき、「自家」は、被験者から入手または単離され、かつ同じ被験者に投与されている（すなわちドナーとレシピエントが同じである）ＮＳＣまたはｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを含む神経組織試料を指す。
【０１７６】
[0185]神経性疾患または障害は、神経組織内で発症するかまたは神経組織の不適切な作用を引き起こす任意の疾患または障害である。神経性疾患または障害は、限定はされないが、脳卒中、脳出血、脊髄損傷、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症を含み得る。
【０１７７】
[0186]本明細書に記載の方法は、症状を治療し、寛解させ、多数の神経性疾患またはそれらの症状、例えば神経構造に対して病理学的損傷をもたらすものの進行を予防および／または緩徐化するために用いることができる。用語「神経性疾患または障害」、「神経性疾患」、「神経学的状態」および「神経学的障害」は、本明細書で交換可能に用いられ、ニューロンおよびグリア細胞を含む神経組織の構造または機能に関連する任意の状態および／または障害を指す。かかる神経性疾患は、限定はされないが、脳卒中、脳出血、脊髄損傷、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、バッテン病および／または血管拡張性失調症を含む。
【０１７８】
[0187]これら条件の一部では、炎症が状態の病理学における役割を担う場合、ｃ−ｋｉｔ  ＮＳＣと一緒に用いられる治療薬は、炎症からの損傷を低減することにより、状態の進行を寛解または緩徐化し得る。その他の場合、ｃ−ｋｉｔ  ＮＳＣと一緒に用いられる治療薬は、病原体の複製または病原体に関連する神経組織損傷を制限するように作用し得る。
【０１７９】
[0188]本明細書で用いられるとき、用語「投与する」、「導入する」、「移植する」および「インプラントする」は、所望される効果が得られるように、所望される部位、例えば損傷または修復の部位への導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、本発明の細胞、例えばｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの被験者への配置との関連で交換可能に用いられる。細胞、例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ、またはそれらの分化子孫（例えばグリア細胞）は、神経組織に直接的に移植され得るか、またはその代わり、移植細胞または該細胞の成分の少なくとも一部が生存可能性を維持する場合に、被験者における所望される位置への送達をもたらす任意の適切な経路により投与され得る。細胞の被験者への投与後の生存可能期間は、数時間、例えば２４時間から数日に至る程度の短期間から、数年程度の長期間に至る（すなわち長期生着）可能性がある。例えば、本明細書に記載の治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの単離または濃縮された集団の有効量が、例えば脳卒中を患う個体の神経組織に、直接注射により直接的に投与される。本明細書に記載の治療方法のすべての態様の他の実施形態では、単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団は、間接的な全身投与経路、例えばカテーテル媒介性経路を介して投与される。
【０１８０】
[0189]本発明の一実施形態は、注射を送達するためのカテーテルに基づく手法の使用を含む。カテーテルの使用により、神経組織にアクセスする、身体の外科的開口などのより浸潤的な送達方法が排除される。当業者が理解する通り、ここで概説のように、カテーテル手法を含む、浸潤性がより最小限の手法により、最適な回復時間が可能となる。カテーテル手法は、ＮＯＧＡカテーテルまたは類似システムなどの技法の使用を含む。ＮＯＧＡカテーテルシステムは、対象領域の電気機械的マッピング、ならびに標的化注射を送達するかまたは標的化領域を治療薬で浸すのに使用可能な格納式の針を提供することにより、ガイド下投与を促進する。本発明の実施形態のいずれかは、注射を送達するかまたは治療薬を提供するようなシステムの使用を通じて投与され得る。当業者は、本発明とともに使用可能なイメージングおよびカテーテル送達システムの組込みを通じて、標的化治療を提供する能力ももたらす代替システムを理解するであろう。ＮＯＧＡおよび類似システムの使用に関する情報は、例えば、Sherman, W. (2003) Basic Appl. Myol. 13(1): 11-14; Patel, A.N. et al. (2005) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130(6): 1631-1638; およびPerrin, E.C. et al. (2003) Circulation 107: 2294-2302（それら各々のテキストはその全体が本明細書中に援用される）に見出すことができる。
【０１８１】
[0190]予防的に提供されるとき、単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、神経性疾患または障害の任意の症状に先立ち、被験者に投与され得る。したがって、単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ集団の予防的投与は、神経性疾患または障害、または本明細書に開示されるような神経性疾患または障害のさらなる進行を予防するのに役立つ。
【０１８２】
[0191]治療的に提供されるとき、単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、神経性疾患または障害の症状または徴候の発症時（または後）、例えばアルツハイマー病の発病時、提供される。
【０１８３】
[0192]本明細書で用いられるとき、用語「治療する(treat)」、「治療(treatment)」、「治療する(treating)」または「寛解」は、目的が、疾患または障害に関連した状態の進行または重症度を元に戻す、緩和する、寛解する、低下させる、阻害する、または緩徐化することであるような治療的処置を指す。用語「治療する(treating)」は、神経性疾患、例えば限定はされないがアルツハイマー病に関連した状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害作用または症状を低減または軽減することを含む。治療は、該用語が本明細書で定義されるように、１つ以上の症状または臨床マーカーが減少する場合、一般に「有効である」。あるいは、疾患の進行が低下または停止する場合、治療は「有効である」。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の不在下で予想されることになる症状の進行または悪化の休止または少なくとも緩徐化を含む。有益なまたは所望される臨床結果は、限定はされないが、検出可能または検出不能に限らず、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の低下、安定化された（すなわち悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の寛解または緩和、および緩解（部分的または全体的のいずれか）を含む。一部の実施形態では、「治療(treatment)」および「治療する(treating)」はまた、被験者が治療を受けなかった場合の予想される生存と比べて、被験者の生存が延長することを意味し得る。
【０１８４】
[0193]本明細書で用いられるとき、用語「予防」は、目的が、疾患もしくは障害の発病を予防もしくは遅延するか、または疾患もしくは障害に関連した症状の発症を遅延することであるような予防的(prophylactic)または予防的(preventative)手段を指す。一部の実施形態では、「予防」は、状態の進行もしくは重症度または神経性疾患もしくは障害に関連した神経機能の悪化を緩徐化することを指す。
【０１８５】
[0194]別の実施形態では、神経性疾患または障害の「治療」はまた、疾患の症状または副作用からの軽減を提供することを含む（対症治療を含む）。例えば、どんなにわずかであっても、記憶、認知能力および／または運動機能におけるいずれかの改善があれば、症状が軽減されたとみなされることになる。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、疾患または障害の症状または測定パラメータは、単離および濃縮されたＮＳＣの集団の投与時、対照または非治療被験者と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％軽減される。
【０１８６】
[0195]測定されるまたは測定可能なパラメータは、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、上昇または抑制されたレベルの臨床的または生物学的マーカー、ならびに疾患または障害における臨床的に認められる規模の症状またはマーカーに関するパラメータを含む。しかし、本明細書に開示されるような組成物の全体的使用が、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは理解されるであろう。要求される正確な量は、治療中の神経性疾患または障害のタイプ、損傷の程度、目標が治療または予防または双方のいずれであるか、被験者の年齢、利用可能な細胞の量などの要素に応じて変動することになる。したがって、当業者は、治療が病態を改善し得るが、疾患に対する完全な治癒でない場合があることを理解する。
【０１８７】
[0196]記載される治療方法のすべての態様の一実施形態では、用語「有効量」は、本明細書で用いられるとき、神経性疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を緩和するのに必要な単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団の量を指し、所望される効果を提供する、例えばパーキンソン病を有する被験者を治療するための薬理学的組成物の十分な量に関する。したがって、用語「治療有効量」は、典型的な被験者、例えばパーキンソン病を有するかまたはそのリスクがある者に投与されるとき、特定の効果をもたらすのに十分である、本明細書に開示されるような治療方法を用いて単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの量を指す。
【０１８８】
[0197]記載される方法のすべての態様の別の実施形態では、本明細書で用いられるときの有効量はまた、疾患の症状の発症を予防するかまたは遅延させる、疾患症状の経過を変更する（例えば限定はされないが、疾患の症状の進行を緩徐化する）、またはさらに疾患の症状を元に戻すのに十分な量を含むことになる。特定の効果にとって必要とされるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の有効量は、各個体とともに変動することになり、さらに対処されている神経性疾患または障害のタイプとともに変動することになる。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でない。しかし、ある特定の場合には、適切な「有効量」は、通常の実験を用いて当業者により決定され得る。
【０１８９】
[0198]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、被験者は、本明細書に記載の方法に従い、細胞を投与する前、神経組織に影響する疾患または障害を有するとして最初に診断される。記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、被験者は、細胞を投与する前、神経性疾患または障害を発症するリスクがあるとして最初に診断され、例えばアルツハイマー病に対する遺伝的素因を有するかまたはアルツハイマー病を有する近親者を有する個体である。
【０１９０】
[0199]本明細書に記載の治療方法のすべての態様における使用においては、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、１投与あたり、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、少なくとも２×１０５、少なくとも３×１０５、少なくとも４×１０５、少なくとも５×１０５、少なくとも６×１０５、少なくとも７×１０５、少なくとも８×１０５、少なくとも９×１０５、または少なくとも１×１０６のｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣまたはその倍数を含む。一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの２回以上の投与が被験者に対して実施される。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの複数回投与は、長期にわたり行うことができる。ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、１つ以上のドナーから単離または濃縮され得るか、または自系供給源(autologous source)から入手され得る。
【０１９１】
[0200]ＮＳＣおよび本明細書に記載の方法にて用いられる他の薬剤の例示的な投与様式は、限定はされないが、注射、注入、吸入（鼻腔内含む）、摂取、および直腸投与を含む。「注射」は、限定はされないが、静脈内、動脈内、管内、組織への直接注射、脳室内、心臓内、経気管注射および注入を含む。語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書で用いられるとき、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を指し、限定はされないが、静脈内、脳室内、心臓内、経気管注射および注入を含む。一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、カテーテルにより組織に投与され得る。
【０１９２】
[0201]記載される治療方法のすべての態様の好ましい実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、注射により被験者に投与される。他の実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、カテーテル媒介性システムにより被験者に投与される。他の実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、血管を通じて、組織に直接的に、またはそれらを組み合わせて、被験者に投与される。
【０１９３】
[0202]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、有効量の単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、全身投与、例えば静脈内投与により被験者に投与される。
【０１９４】
[0203]語句「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は、本明細書で用いられるとき、神経組織に直接的でない代わりに、被験者の循環系に侵入するようなＮＳＣの集団の投与を指す。
【０１９５】
[0204]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、被験者において明らかな効果を得るように、１つ以上の投与経路が用いられる。例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの単離または濃縮された集団は、損傷神経組織を治療または修復するため、直接注射およびカテーテル媒介性経路の双方により被験者に投与される。かかる実施形態では、異なる有効量の単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、各投与経路において用いることができる。
【０１９６】
[0205]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該方法は、単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの投与によって媒介される効果を強化または増強する、例えば、ＮＳＣのホーミングまたは生着を増強する、神経細胞の修復を増強する、または神経細胞の増殖および再生を増強する可能性がある１つ以上の治療薬、例えば薬物または分子の投与をさらに含む。治療薬は、タンパク質（抗体または抗原結合断片など）、ペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ウイルス、小分子、化合物、細胞、薬物などであり得る。
【０１９７】
[0206]本明細書で定義されるとき、「血管再生」は、限定はされないが神経性疾患を含む、本明細書に記載の通り、損傷または外傷後の新しい血管の新規形成または損傷した血管（例えば毛細管）の交換を指す。「血管新生」は、かかる現象を記述するため、交換可能に用いることができる用語である。
【０１９８】
[0207]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを、増殖、分化、および血管新生剤または神経組織内での細胞の増殖、分化、および血管新生を刺激するための当該技術分野で公知の因子と一緒に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、これら因子の任意の１つは、本明細書に記載の組成物を投与する前または後に送達され得る。生着、分化および／または血管新生を誘導および／または増強するため、これら因子の任意の１つの複数回のその後の送達もなされ得る。好適な成長因子は、限定はされないがトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む。その他の例が、Dijke et al., “Growth Factors for Wound Healing”, Bio/Technology, 7:793-798 (1989); Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF, eds. Clinicians’ Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4th ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85; Ziegler T.R., Pierce, G.F., and Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlagに記載されており、これらはそれら全体が参照によりここで援用される。
【０１９９】
[0208]一実施形態では、該組成物は、損傷組織の治癒または再生を誘導する、例えば血管形成細胞を周囲組織から動員して、新生血管における結合点を提供する１つ以上の生物活性剤を含み得る。好適な生物活性剤は、限定はされないが、医薬活性化合物、ホルモン、増殖因子、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルス、タンパク質、脂質、ポリマー、ヒアルロン酸、炎症促進性分子、抗体、抗生物質、抗炎症剤、アンチセンスヌクレオチドおよび形質転換核酸またはそれらの組み合わせを含む。他の生物活性剤は、細胞増殖および細胞分化のため、有糸分裂の増加を促進し得る。
【０２００】
[0209]極めて多数の増殖因子および分化因子は、幹細胞および前駆細胞の細胞の増殖および分化を刺激することが当該技術分野で公知である。好適な増殖因子およびサイトカインは、前駆細胞を刺激、維持、および／または動員する能力がある任意のサイトカインまたは増殖因子を含む。それらは、限定はされないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子１、造血幹細胞因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦβ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３、コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、ｆｉｔ３−リガンド、および腫瘍壊死因子αを含む。その他の例が、Dijke et al., “Growth Factors for Wound Healing”, Bio/Technology, 7:793-798 (1989); Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF, eds. Clinicians’ Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4th ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85; Ziegler T.R., Pierce, G.F., and Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlagに記載されている。
【０２０１】
[0210]記載される治療方法のすべての態様の一実施形態では、記載される組成物は、生理食塩水などの好適な生理学的担体溶液中のＮＳＣの懸濁液である。懸濁液は、限定はされないが、医薬活性化合物、ホルモン、増殖因子、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルス、タンパク質、脂質、ポリマー、ヒアルロン酸、炎症促進性分子、抗体、抗生物質、抗炎症剤、アンチセンスヌクレオチドおよび形質転換核酸またはそれらの組み合わせを含む、追加的な生物活性剤を含有し得る。
【０２０２】
[0211]記載される治療方法のすべての態様の特定の実施形態では、生物活性剤は、「血管新生促進因子」であり、新しい血管形成を直接的または間接的に促進する因子を指す。血管新生促進因子は、限定はされないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｅ−カドヘリン、ＶＥＧＦ、アンジオゲニン、アンジオポエチン−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘパラナーゼ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、アンジオポエチン、低酸素症誘導因子−１（ＨＩＦ−１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ、ＢＰ−３、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、血管透過性因子（ＶＰＦ）、ビトロネクチン、レプチン、トレフォイルペプチド（ＴＦＦ）、ＣＹＲ６１（ＣＣＮ１）、ＮＯＶ（ＣＣＮ３）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ｃ−Ｍｙｃ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）、散乱因子（ＳＦ）、オステオポンチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、プレイオトロフィン、プロリフェリン、フォリスタチン、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ミッドカイン、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）、およびフラクタルカイン、ならびに血管新生および血管分布増加の誘導因子である炎症性サイトカインおよびケモカイン、例えば、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を含む。１つ以上の治療薬の至適用量は、約０．１〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約３０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、または約８０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの濃度を含み得る。一部の実施形態では、１つ以上の治療薬の至適用量は、約１０、約２５、約４５、約６０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、または約５００ｎｇ／ｍｌである。他の実施形態では、１つ以上の治療薬の至適用量は、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、または約２．０μｇ／ｍｌである。
【０２０３】
[0212]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該方法は、１つ以上の界面活性剤の治療薬としての投与をさらに含むか、または１つ以上の界面活性剤治療法と併用されてもよい。界面活性剤は、本明細書で用いられるとき、任意の表面活性剤、例えば限定はされないが、浸潤剤、表面張力低下剤、洗剤、分散剤および乳化剤を指す。特に好ましいのは、肺胞表面上で単分子層を形成するもの、例えば限定はされないが、リポタンパク質、レシチン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＧ）、アポタンパク質Ａ、アポタンパク質Ｂ、アポタンパク質Ｃ、アポタンパク質Ｄ、パルミトイルオレオイル、ホスファチジルグリセロール、パルミチン酸およびスフィンゴミエリンである。例示的な界面活性剤は、限定はされないが、界面活性剤プロテインＡ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄ、ならびにそれらの混合物および組み合わせを含む。市販の界面活性剤は、限定はされないが、KL-4、SURVANTA（登録商標）、ウシ脂質抽出物界面活性剤(BLES)、INFASURF（登録商標）(CALFACTANT（登録商標）)、CUROSURF（登録商標）、HL-10、AEROSURF（登録商標）、SUBOXONE（登録商標）、ALVEOFACT（登録商標）、SURFAXIN（登録商標）、VENTICUTE（登録商標）、PUMACTANT（登録商標）／ALEC、およびEXOSURF（登録商標）を含む。
【０２０４】
[0213]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、１つ以上の他の標準治療薬の投与は、神経性疾患または障害、例えば脳卒中またはパーキンソン病を治療するための濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの投与と組み合わせることができ、抗コリン剤、β２アドレナリン受容体作動薬、例えばホルモテロールまたはサルメテロール、コルチコステロイド、抗生物質、抗酸化剤、降圧薬、一酸化窒素、カフェイン、デキサメタゾン、およびＩＬ−１０または他のサイトカインの使用を含む。一部の実施形態では、含まれる標準治療薬は、神経性疾患の症状を治療するために用いられる。
【０２０５】
[0214]例えば、パーキンソン病などの状態の進行を治療、寛解または緩徐化するための本明細書に記載の方法におけるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの使用は、任意選択的に他の好適な治療または治療薬と組み合わせることができる。パーキンソン病においては、これは、限定はされないが、レボドパ、カルビドパ・レボドパ、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤、抗コリン剤、アマンタジン、外科手術および／または運動、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２０６】
[0215]記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、標準治療薬は、詳述されているものであり、例えば、Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, 2001, E. Braunwald, et al., editors, McGraw-Hill, New York, N.Y., ISBN 0-07-007272-8, especially chapters 252-265 at pages 1456-1526; Physicians Desk Reference 54.sup.th edition, 2000, pages 303-3251, ISBN 1-56363-330-2, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J.を参照されたい。任意の神経性疾患または障害の治療は、本明細書に記載の治療計画を用いて達成され得る。慢性状態においては、治療の頻度を低減するため、間欠投与を用いることができる。間欠投与プロトコルは、本明細書に記載の通りである。
【０２０７】
[0216]本明細書に記載の方法の臨床的使用においては、本明細書に記載の濃縮されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの単離または濃縮された集団は、被験者における効果的治療をもたらす任意の薬学的に許容できる化合物、材料、担体または組成物とともに投与され得る。したがって、本明細書に記載の方法にて用いるための医薬製剤は、１つ以上の薬学的に許容できる成分と組み合わせたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの単離または濃縮された集団を含有し得る。
【０２０８】
[0217]用語「担体」は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。かかる医薬担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるとき、好ましい担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液用の液体担体として用いることができる。好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物はまた、必要に応じて、湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を少量含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取り得る。該組成物は、坐剤として、伝統的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドとともに製剤化され得る。経口製剤は、標準担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。好適な医薬担体の例が、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)に記載されている。製剤は、投与様式に適合する必要がある。
【０２０９】
[0218]一実施形態では、用語「薬学的に許容できる」は、動物、およびより具体的にはヒトにおける使用として、連邦もしくは州政府の規制当局によって認可される、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方において列挙されることを意味する。詳細には、それは、合理的なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の課題もしくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に適した、健全な医学的判断の範囲内に該当する化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【０２１０】
[0219]語句「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、ＮＳＣの単離または濃縮された集団の活性の維持、その保有、または１つの臓器もしくは身体の一部から別の臓器もしくは身体の一部へのその輸送に関与する、薬学的に許容できる材料、組成物または媒体、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体（例えば幹細胞媒体）、被包材料、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒被包材料を意味する。
【０２１１】
[0220]各担体は、製剤の他の成分と適合でき、患者に対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料の幾つかの例として、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）リン酸緩衝液；（３）パイロジェンフリー水；（４）等張食塩水；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（１７）トラガカント末；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２４）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；（２５）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；および（２６）医薬製剤中に用いられる他の非毒性親和性物質、が挙げられる。浸潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容できる担体」などの用語は、本明細書で交換可能に用いられる。
【０２１２】
定義
[0221]特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されている場合と同じ意味を有する。本明細書、実施例および特許請求の範囲においてここで用いられる特定の用語は、ここに集められる。
【０２１３】
[0222]本明細書で用いられるとき、インビボ（ラテン語で「生体内」）は、生体、例えばヒト被験者を全体として用いる方法を指す。本明細書で用いられるとき、「エクスビボ」（ラテン語で生体外）は、被験者の身体外で実施される方法を指し、例えば、ドナー被験者から得られる神経組織からｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣを単離し、次に単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣ試料をレシピエント被験者に投与する方法として、臓器、細胞、または組織が生存する被験者から採取される場合の方法を指す。本明細書で用いられるとき、「インビトロ」は、被験者の外部で実施される方法、例えばインビトロ細胞培養実験を指す。例えば、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣは、本明細書に記載の方法に従って用いられるかまたは投与される前に、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの数を拡大するまたは増加させるか、または特定の系統または細胞型、例えばグリア細胞へのＮＳＣの分化を導くため、インビトロで培養され得る。
【０２１４】
[0223]用語「多能性」は、本明細書で用いられるとき、異なる条件下で、１つ以上の特定細胞型の系統にコミットする、またコミットされた系統の２つ以上の分化された細胞型に分化する、好ましくは全部で３つの胚細胞層に特有の細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は主に、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いての、２つ以上の細胞型、好ましくは全部で３つの胚葉に分化するその能力によって特徴づけられる。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によって証明されるが、多能性についての好ましい試験は、３つの胚葉の各々の細胞に分化する能力の実証である。かかる細胞を単純に培養することにより、それらが自然に多能性を得ることがないことは注目すべきである。再プログラム化された多能性細胞（例えば、その用語が本明細書で定義されるときはｉＰＳ細胞）は、一般には培養下でほんの限られた数の分裂についての能力を有する初代細胞親に対して、増殖能力の低下を伴わない継代延長の能力の特徴も有する。
【０２１５】
[0224]用語「前駆」細胞は、本明細書で用いられるとき、それが分化により生成し得る細胞に対してより未分化である（すなわち、完全に分化されたまたは末期に分化された細胞であるよりも早期の発生経路または進行に沿うステップである）細胞表現型を有する細胞を指す。多くは、前駆細胞はまた、顕著なまたは非常に高い増殖可能性を有する。前駆細胞は、発生経路、および細胞が発生し、分化する環境に応じて、複数の明確な分化細胞型または単一の分化細胞型を生じ得る。前駆細胞は、特定の確定系統の前駆細胞を発生させる、例えば、特定の神経前駆細胞は、分裂し、神経細胞系統前駆細胞を発生させる。これらの前駆細胞は、分裂し、多数の細胞を発生させ、それは末期に例えばドーパミン作動性ニューロンに分化する。
【０２１６】
[0225]用語「前駆体」細胞は、本明細書で用いられるとき、末期に分化される細胞よりも未分化であるが、その同じ発生経路に沿って存在する幹細胞または前駆細胞ほどに未分化でない細胞表現型を有する細胞を指す。「前駆体」細胞は、典型的には、「幹細胞」の娘の一部である「前駆体」細胞の子孫細胞である。典型的な非対称細胞分裂中の娘の１つは、幹細胞の役割が想定される。
【０２１７】
[0226]用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すように用いられる（米国特許第５８４３７８０号、米国特許第６２００８０６号を参照）。かかる細胞は、同様に体細胞核導入から得られる胚盤胞の内部細胞塊から得ることができる（例えば、米国特許第５９４５５７７号、米国特許第５９９４６１９号、米国特許第６２３５９７０号を参照）。胚性幹細胞の顕著な特徴は、胚性幹細胞表現型を明確にする。したがって、細胞が、他の細胞と区別できるように胚性幹細胞の固有の特徴の１つ以上を有する場合、それは胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な顕著な胚性幹細胞の特徴は、限定はされないが、遺伝子発現特性、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などを含む。
【０２１８】
[0227]用語「成体幹細胞」は、胎生期、若年性、および成体組織を含む非胚性組織から得られる任意の多能性幹細胞を指すように用いられる。一部の実施形態では、成体幹細胞は、非胎生期の起源であり得る。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、神経組織、骨格筋、および心筋を含む多種多様な成体組織から単離されている。これらの幹細胞の各々は、培養下での遺伝子発現、因子応答性、および形態学に基づいて特徴づけることができる。例示的な成体幹細胞は、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、および神経幹細胞を含む。上に示されるように、幹細胞は、実質的にすべての組織内で常在性であることが見出されている。したがって、本発明では、幹細胞集団が実質的に任意の動物組織から単離され得ることが理解される。
【０２１９】
[0228]細胞個体発生との関連で、形容詞「分化された」または「分化する」は、比較されている細胞よりも発生経路をさらに下流に進行している細胞である「分化細胞」を意味する関連用語である。したがって、幹細胞は、系統が制限された前駆細胞（神経幹細胞など）に分化し得、次いで経路のさらに下流の他のタイプの前駆細胞（神経細胞またはグリア前駆体など）、次いで特定の組織タイプにおける特徴的役割を担う末期分化細胞に分化し得るが、さらに増殖する能力を保持するか否かは不明である。
【０２２０】
[0229]用語「分化細胞」は、その用語が本明細書で定義される通り、その天然形態で多能性でない任意の初代細胞を意味する。別の方法で述べると、用語「分化細胞」は、細胞分化過程において大して特殊化していない細胞型の細胞（例えば神経幹細胞などの幹細胞）から得られるより特殊化した細胞型の細胞を指す。理論に制限されることを望むものではないが、正常な個体発生の過程における多能性幹細胞は、最初にニューロンまたはグリア細胞に分化し得る。神経幹細胞のさらなる分化により、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイトおよび／またはミクログリアを含む様々な神経細胞型の形成がもたらされる。
【０２２１】
[0230]本明細書で用いられるとき、用語「体細胞」は、生殖系列細胞に対立するものとして、生物の身体を形成する任意の細胞を指す。哺乳類では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知）は、精子および卵子であり、それらは受精中に融合し、接合子と称される細胞を生成し、それから哺乳動物胚全体が発生する。哺乳動物身体におけるすべての他の細胞型（精子および卵子は別にして、それらが作られる元の細胞（生殖母細胞）および未分化幹細胞）は体細胞であり、内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織はすべてが体細胞から構成される。一部の実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、それは、胚内に存在しないかまたは胚から得られず、インビトロでのかかる細胞の増殖から得られない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、それは、胚または胎児以外の生命体に存在するかまたはそれから得られる、またはインビトロでのかかる細胞の増殖から得られる細胞を意味する。
【０２２２】
[0231]本明細書で用いられるとき、用語「成熟細胞」は、胚発生後に身体全体を通じて見出される細胞を指す。
【０２２３】
[0232]用語「表現型」は、実の遺伝子型とは無関係に、特定の環境条件および要素のセットの下での細胞または生物を規定する１つまたは幾つかの生物学的特性全体を指す。例えば、細胞内での細胞表面マーカーの発現が挙げられる。
【０２２４】
[0233]用語「細胞培地」（本明細書中で「培地(culture medium)」または「培地(medium)」とも称される）は、本明細書で言及されるとき、細胞生存度を維持し、増殖を支持する栄養分を含有する細胞を培養するための培地である。細胞培地は、以下：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、および他の成分、例えばペプチド成長因子などのいずれかを適切な組み合わせで含有してもよい。通常、特定の細胞型において用いられる細胞培地は、当業者に公知である。
【０２２５】
[0234]用語「複製能」または「自己複製能」または「増殖」は、本明細書で交換可能に用いられ、幹細胞が、長期間および／または多くの月数から年数にわたり、同じ非特殊化細胞型に分裂することにより自ら複製する能力を指すように用いられる。
【０２２６】
[0235]場合によっては、「増殖」は、単一細胞の２つの同一の娘細胞への分裂の反復による細胞の増殖を指す。
【０２２７】
[0236]用語「系統」は、本明細書で用いられるとき、共通の祖先を有する細胞または共通の発生運命を有する細胞を示す。
【０２２８】
[0237]用語「単離された細胞」は、本明細書で用いられるとき、最初に見出された生物から取り除かれている細胞またはかかる細胞の子孫を指す。任意選択的には、該細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。任意選択的には、該細胞は、後に第２の生物に導入されるか、またはそれ（またはその由来元である細胞）が単離された元の生物に再導入される。
【０２２９】
[0238]単離された細胞集団と関連する用語「単離された集団」は、本明細書で用いられるとき、細胞の混合または異質集団から除去および分離されている細胞の集団を指す。一部の実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮される元の異質集団と比べて実質的に純粋な細胞の集団である。
【０２３０】
[0239]用語「組織」は、特定の特別な機能を一緒に遂行する特殊化した細胞の群または層を指す。用語「組織特異的な」は、特定の組織からの細胞の供給源を指す。
【０２３１】
[0240]用語「低下する(decrease)」、「低下した(reduced)」、「低下(reduction)」、「低下する(decrease)」または「阻害する」はすべて、一般に統計学的に有意な量の低下を意味するように本明細書で用いられる。しかし、疑いを回避するため、「「低下した(reduced)」、「低下(reduction)」または「低下する(decrease)」または「阻害する」は、典型的には、参照レベルと比べて少なくとも約５％〜１０％の低下、例えば、参照レベルと比べて、少なくとも約２０％の低下、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の低下（すなわち、参照試料と比べて不在レベル）、または１０〜９０％の間の任意の低下を意味する。治療または予防との関連で、参照レベルは、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの集団の投与の不在下での被験者の症状レベルである。
【０２３２】
[0241]用語「上昇した(increased)」、「上昇する(increase)」または「増加する(enhance)」はすべて、一般に統計学的に有意な量の上昇を意味するように本明細書で用いられるが、あらゆる疑いを回避するため、用語「上昇した(increased)」、「上昇する(increase)」または「増加する(enhance)」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の上昇、例えば、参照レベルと比べて、少なくとも約２０％の上昇、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％もしくはそれ以上の上昇、もしくは１０〜９０％の間の任意の上昇、または参照レベルと比べて、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の上昇、もしくは２倍〜１０倍の間もしくはそれ以上の任意の上昇を意味する。インビトロでのｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの拡大との関連で、参照レベルは、神経組織試料から単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの初期数である。
【０２３３】
[0242]用語「最低レベルで発現する」は、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ、質量分析または当該技術分野で公知の他の分子定量技術による測定としての、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性神経幹細胞内でのβＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮおよび／またはＧＦＡＰなどの神経マーカーの限られた発現を指す。神経細胞および／またはグリアマーカーの最低レベルの発現は、典型的には、各マーカーが、当業者に公知の分子アッセイによる測定として、そのマーカーについて、ｃ−ｋｉｔの発現と比べて、最高で約１０％まで、最高で約８％まで、最高で約６％まで、最高で約４％まで、最高で約２％まで、最高で約１％までまたはそれ未満の陽性で発現することを意味する。
【０２３４】
[0243]用語「統計学的に有意な」または「有意に」は、統計学的有意性を指し、一般に、マーカーの正常未満、すなわち低い方の濃度の２標準偏差（２ＳＤ）を意味する。該用語は、差異があることの統計学的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真であるとき、帰無仮説を拒絶するという決定を下す確率として定義される。その決定は、Ｐ値を用いてなされることが多い。
【０２３５】
[0244]本明細書で用いられるとき用語「含む(comprising)」または「含む(comprises)」は、本発明にとって必須である場合に加え、必須であるか否かは別にして不特定要素の包含に開かれている組成物、方法、およびその各々の成分に関連して用いられる。
【０２３６】
[0245]用語「〜からなる」は、本実施形態のその記述中に列挙されない任意の要素を除く、本明細書に記載のような組成物、方法、およびその各々の成分を指す。
【０２３７】
[0246]特に説明されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されている場合と同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出してもよい。さらに、文脈によって特に要求されなければ、単数用語は複数を含むこととし、また複数用語は単数を含むこととする。
【０２３８】
[0247]特に指定のない限り、本発明は、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005)およびAnimal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)（すべてはそれら全体が参照により本明細書に援用される）における当業者に公知の標準的手順を用いて実施された。
【０２３９】
[0248]本発明が本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されることなく、それ故に変化し得ることは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、あくまで特定の実施形態を記述することを目的とし、あくまで特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０２４０】
[0249]運用事例中以外であるか、または特別に指示される場合、本明細書で用いられる成分の量または反応条件を表すすべての数は、あらゆる場合に用語「約」により変更されるものとして理解されるべきである。用語「約」は、百分率と組み合わせて用いられるとき、±１％を意味することになる。
【０２４１】
[0250]特定されるすべての特許および出版物は、例えば、本発明と関連して用いられてよいかかる出版物中に記載される方法を説明し、開示することを目的として、参照により本明細書中に明示的に援用される。これらの出版物は、あくまでそれらの本願の出願日前の開示を意図して提供される。これに関連する何であっても、先行発明の理由で、または任意の他の理由で、発明者にかかる開示に先立つ権利が与えられないことの承認として解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれら文書の内容に関する表現は、出願人に対する利用可能な情報に基づくもので、これら文書の日付または内容の訂正に関する承認では決してない。
【０２４２】
[0251]本発明は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに例示される。本願全体を通じて引用されるすべての参考文献の内容、ならびに図面は、参照により本明細書中に援用される。
【０２４３】
[0252]当業者は、せいぜい通常の実験を用いることで、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物、異なる培地および添加物が、単離された細胞を培養拡大するため、用いることができることを理解するか、または確認することができるであろう。当業者であれば、培地および添加物の選択を評価するための試験を実施することができるであろう。かかる均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０２４４】
[0253]本明細書中で、また本明細書全体を通じて引用される参考文献は、参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０２４５】
実施例
[0254]発明者は、幹細胞抗原ｃ−ｋｉｔを神経未分化細胞の同定および特徴づけのためのマーカーとして用いている。ｃ−ｋｉｔエピトープは、自己複製性、クローン原性および多能性である神経幹細胞（ＮＳＣ）のプールを容易に明らかにするため、用いた。これらのＮＳＣは、系統陰性細胞、前駆細胞、および／または系統陽性細胞を含む細胞に再生することができる。系統陽性細胞は、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮまたはＧＦＡＰを発現する。
【０２４６】
材料および方法
マウスＮＳＣ
[0255]幹細胞は、マウス脳試料の歯状回（ＤＧ）および脳室下帯（ＳＶＺ）から得た。神経発生がこれらの解剖学的領域内で生じることが報告されていることから、これらの領域を選択した。
【０２４７】
[0256]マウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）を単離するため、ヒト心臓幹細胞の収集および拡大のための発明者の研究室内で開発した適応プロトコルを用いて、組織断片を解離した。組織断片は、反復ピペット操作を通じて機械的および酵素的解離を行い、プロテアーゼを含有する溶液に曝露し、単一細胞懸濁液を得た。細胞をｃ−ｋｉｔ(Miltenyi)について磁気イムノビーズを用いて選別し、選別後、細胞表現型を免疫細胞化学により明らかにした。次に、推定上のマウスＮＳＣを、５〜１０％ＦＢＳ(Gibco)およびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物(Sigma)を添加したF12培地(Gibco)中で培養した。免疫細胞化学については、可能であれば、一次抗体を蛍光色素(Molecular Probes)で直接的に標識し、交差反応性を回避した。免疫標識を共焦点顕微鏡により分析した。
【０２４８】
クローニングアッセイ
[0257]未選別の単離された神経細胞を、限界希釈時に超低付着ディッシュに蒔き、多細胞凝集体、すなわちニューロスフェアの形成を支持した。次に、幹細胞内に高度に濃縮されたクローンのニューロスフェアを得るため、ニューロスフェアを脱凝集させ、単一細胞懸濁液を数回再び蒔いた（サブクローニング）。浮遊球体の形成は、前駆細胞が調製物中に存在することを示す。
【０２４９】
ｍＮＳＣの分化
[0258]サブクローン化されたニューロスフェア中に含有される細胞の表現型を、免疫細胞化学により明らかにした。異なる神経細胞型に特異的な系統マーカーの発現を評価した。
【０２５０】
実施例１
マウス脳の組織切片中のｃ−ｋｉｔ陽性細胞の同定
[0259]マウス脳の組織試料を免疫標識し、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が神経組織内に存在するか否かを判定した。細胞は、ｃ−ｋｉｔに対する、またＧＦＡＰ（星状細胞に対するマーカー）、Ｓｏｘ２（前駆細胞マーカー）、βＩＩＩチューブリン（ニューロンに特異的なマーカー）およびＮｅｕＮ（ニューロンに特異的なマーカー）に対する抗体を用いる免疫組織化学により分析した。
【０２５１】
[0260]ｃ−ｋｉｔの発現は、形状が円形の細胞およびサイズが小さい細胞においてインビボで検出した。これらの細胞は、系統コミットメントのマーカーを発現しない（図１）。図１Ａは、星状細胞に対するマーカーである（赤色の）ＧＦＡＰ陰性である、歯状回におけるｃ−ｋｉｔ陽性（緑色）細胞を示す。同様に、図１Ｂは、（緑色の）ＧＦＡＰ陰性であるｃ−ｋｉｔ陽性（赤色）細胞を示す。さらに、神経ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、前駆細胞マーカーを示し、これはこの細胞プールの未分化状態の観点を支持する知見である（図２）。図２は、前駆細胞マーカーＳｏｘ２についても陽性である（白点）ｃ−ｋｉｔ陽性（緑色）細胞を示す。
【０２５２】
[0261]時折、ｃ−ｋｉｔは、神経細胞の系統マーカーと関連して見出された。これらの観察結果は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞と分化した脳細胞との間に直線関係が存在することを示唆する（図３）。図３Ａ〜３Ｂは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）がβＩＩＩチューブリン（赤色、図３Ａ）およびＮｅｕＮ（白色、図３Ｂ）と一緒に発現されることを示す。
【０２５３】
実施例２
神経幹細胞のクローン形成能および多分化能
[0262]神経幹細胞のクローン形成能は、典型的にはニューロスフェアアッセイを実施することによって実証される。継代とともに球体を生成する長期的能力は、プール中での真の幹細胞の選択をもたらす。ｃ−ｋｉｔの単独でのまたは系統マーカーと組み合わせた発現が球体内で見出された。これらの観察結果は、神経ｃ−ｋｉｔ陽性細胞のクローン形成能および多分化能の証拠を提供する。
【０２５４】
[0263]図４は、培養下で７〜１４日後に未選別細胞から得られるニューロスフェアの例を提示する。
【０２５５】
[0264]ｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドＳＣＦで刺激後の継代２で、細胞集団は、緻密で十分に分離しているように見える（図５）。継代２でのニューロスフェアの免疫標識は、ｃ−ｋｉｔ（緑色）、ＮｅｕＮ（灰色）およびＧＦＡＰ（赤色）を発現する１つのニューロスフェアを示す一方で、その他のニューロスフェアは３つ全部のマーカーについて陰性である（図６Ａ、個別のマーカーシグナルおよびＤＡＰＩ染色；図６Ｂ、３つのマーカーシグナルの混合およびＤＡＰＩ染色）。
【０２５６】
[0265]継代４でニューロスフェアのコアはｃ−ｋｉｔ陽性（緑色）の系統陰性細胞を有する一方で、ニューロスフェアの外層は神経細胞マーカーＧＦＡＰ（赤色）を発現する（図７）。
【０２５７】
[0266]継代４でニューロスフェアを付着ディッシュに移し（図８）、その後、染色した。図９中の画像は、ニューロンの系統マーカー（ＧＦＡＰ、赤色；ＮｅｕＮ、灰色）を部分的に同時発現するｃ−ｋｉｔ陽性（緑色）細胞である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【国際調査報告】
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