(57)【要約】  本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、（ｂ）試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、（ｃ）膜に電位を印加することと、（ｄ）複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。【選択図】【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を前記標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、前記ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、
（ｂ）前記試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、
（ｃ）前記膜にわたり電位差を印加することと、
（ｄ）前記複合体の存在または不在を決定し、それによって前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドを検出するように、前記複合体と前記膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在を監視することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ガイドポリヌクレオチドが、ガイドＲＮＡであり、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質が、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が無効化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの１つ以上の触媒ヌクレアーゼ部位が不活性化されている、および／または
（ｉｉ）前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ、Ｃｐｆ１、もしくはＣ２ｃ２である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖であるか、もしくは二本鎖領域を含み、および／またはＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、またはＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）の前に前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を選択的に変性させること、および／または前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、約５０℃〜約６０℃まで加熱することによって変性する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していないポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記試料中の前記ポリヌクレオチドをビーズまたはカラムに結合させることによって、前記ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドを含む前記複合体から分離される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩化ナトリウムを前記試料に添加し、前記試料をカルボキシル基でコーティングされた常磁性ビーズと、前記試料中に存在する前記ポリヌクレオチドが前記ビーズに結合するように接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合するヌクレオチド配列とを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを含むガイドＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガイドポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、または前記標的ポリヌクレオチドが、それに付着している前記膜に連結することができるアンカーを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンカーが、コレステロールを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンカーが、前記ガイドポリヌクレオチド上の伸長部にハイブリダイズされたポリヌクレオチドを介して前記ガイドポリヌクレオチドに付着している、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガイドポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、または前記標的ポリヌクレオチドが、それに付着している表面に結合することができる結合部分を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面が、ビーズの表面である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合部分が、前記ガイドポリヌクレオチド上の末端伸長部である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガイドポリヌクレオチドが、任意選択に前記ガイドポリヌクレオチド上の末端伸長部である、２つの結合部分を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ガイドポリヌクレオチドが、第１の末端伸長部および第２の末端伸長部を含み、前記方法が、ステップ（ｂ）の前に、
（ｉ）前記ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体が前記表面に結合するように、前記試料を、それに結合している前記第１の末端伸長部に相補的な配列を含む第１の捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面と接触させることと、
（ｉｉ）前記ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体が前記表面から放出されるように、前記表面に結合している前記ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体を、競合オリゴヌクレオチドと接触させることと、
（ｖ）前記ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体が前記ビーズに結合するように、前記ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体を、それに結合している前記第２の末端伸長部に相補的な配列を含む第２の捕捉オリゴヌクレオチドを有するビーズと接触させることと、任意選択に
（ｖｉ）前記ビーズを前記膜貫通ポアに送達することと、を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記膜および／またはビーズに連結していないガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および／またはポリヌクレオチドを洗い流すステップをさらに含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的ポリヌクレオチドが、リーダー配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ガイドポリヌクレオチドが、それに付着しているアダプターを有し、任意選択に前記アダプターがバーコードおよび／またはリーダー配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質が、リーダー配列に付着している、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｄ）が、前記ポアを通した前記アダプター、前記標的ポリヌクレオチド、または前記ガイドポリヌクレオチドの転座によって引き起こされる効果について監視することを含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）が、前記試料および膜貫通ポアを、
（ａ）第１のガイドポリヌクレオチドおよび第１のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質であって、前記第１のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の第１の配列に結合し、それに付着しているアダプターを有する、第１のガイドポリヌクレオチドおよび第１のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、ならびに
（ｂ）第２のガイドポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質であって、前記第２のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の第２の配列に結合し、前記第２のガイドポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、それに付着している表面に連結することができるアンカーを有する、第２のガイドポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、に接触させることを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）前記第１および第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が同じであり、前記第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、それに付着しているアンカーを有さないか、または
（ｉｉ）前記第１および第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、異なるＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アダプターの前記膜貫通ポアとの相互作用を検出することを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アダプターが、バーコードを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）が、前記試料を２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドと接触させることであって、前記２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチド配列に結合する、接触させることを含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチド複合体上の前記アダプターが、異なるバーコードを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記異なるポリヌクレオチド配列が、同じ標的ポリヌクレオチド内にあるか、または前記標的ポリヌクレオチド中に存在し得る代替配列である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記代替配列が、ＳＮＰを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ａ）が、前記試料を２つ以上の第２のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体と接触させることであって、前記２つ以上の第２のガイドポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチド配列に結合する、接触させることを含む、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記異なる標的配列が、異なる標的ポリヌクレオチド中に存在する、請求項３１、３２、または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、それに付着しているポリヌクレオチド結合タンパク質を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｃ）の前に、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記ポリヌクレオチドに沿って移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質の移動が、前記標的ポリヌクレオチドに結合しているガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体に到達すると停止する、ステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｄ）において前記膜貫通ポアが、前記標的ポリヌクレオチドに結合している前記ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体が前記ポアを通した前記標的ポリヌクレオチドの転座中に前記複合体から変位されるように寸法決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ガイドポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、それに付着しているビーズに連結することができる結合部分を有し、ステップ（ａ）において前記ガイドポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、ビーズに連結しているか、またはステップ（ａ）が、前記試料をビーズと接触させることをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ポリペプチドの量または前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を決定することをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の特徴が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的ポリヌクレオチドが、それに付着している膜に連結することができるアンカーを有し、前記ガイドポリヌクレオチドが、それに付着しているアダプターおよび／またはリーダー配列を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記アダプターの前記膜貫通ポアとの相互作用を検出することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記アダプターが、バーコードを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ａ）が、前記試料を２つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させることであって、前記２つ以上のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の異なる配列に、または異なる標的ポリヌクレオチドの配列に結合する、接触させることを含む、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポアが、前記複合体全体が前記ポアを通過するように寸法決定される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ａ）後に、前記試料中の前記ポリヌクレオチドが断片化される、および／または前記ガイドポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記標的ポリヌクレオチドに架橋される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
試料中の二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を第１のプローブおよび第２のプローブと接触させることであって、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが、前記試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成し、前記第１のプローブが、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第１の配列に結合し、表面に連結することができるアンカーを含み、前記第２のプローブが、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第２の配列に結合し、アダプター配列を含む、接触させることと、
（ｂ）前記試料を膜貫通ポアと接触させることと、
（ｃ）前記膜貫通ポアに電位を印加することと、
（ｄ）前記複合体の存在または不在を決定し、それによって前記試料中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを検出するように、前記複合体と前記膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在を監視することと、を含む、方法。
【請求項５０】
（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み、
（ｉｉ）任意の未結合プローブが、ステップ（ｃ）の前に洗い流され、
（ｉｉｉ）ステップ（ｄ）が、前記アダプターの前記膜貫通ポアとの相互作用について監視することを含み、
（ｉｖ）（ａ）前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブが、酵素を含み、任意選択に
前記第１のプローブおよび／もしくは前記第２のプローブが、ガイドＲＮＡ／ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質複合体であるか、または前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブが、ＲｅｃＡコーティングプローブであり、
（ｂ）前記プローブが、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、γＰＮＡ、三重螺旋ＤＮＡ、またはモルホリノプローブであり、
（ｖ）前記第２のプローブが、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含み、任意選択に前記アダプターがリーダー配列を含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記リーダー配列に結合しており、
（ｖｉ）前記アダプターが、バーコードを含み、
（ｖｉｉ）ステップ（ａ）が、前記試料および膜貫通ポアを２つ以上の第１のプローブと接触させることであって、前記２つ以上のプローブが、異なるヌクレオチド配列に結合し、任意選択に異なるバーコードを含み、任意選択に前記異なる配列が、同じ標的ポリヌクレオチド内に存在するか、前記標的ポリヌクレオチド中に存在し得る代替配列であるか、または異なる標的ポリヌクレオチド中に存在する、接触させることを含み、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ａ）が、前記試料および膜貫通ポアを２つ以上の第２のプローブと接触させることであって、前記２つ以上のプローブが異なるヌクレオチド配列に結合する、接触させることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料が断片化ゲノムＤＮＡを含むか、または前記試料がゲノムＤＮＡを含み、ステップ（ａ）が前記ゲノムＤＮＡを断片化することをさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料が、対象からの生物学的流体である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的ポリヌクレオチドが、疾患および／または微生物と関連しているポリヌクレオチドである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記疾患が、感染性疾患、心疾患、または癌である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料が、Ｔ細胞ＤＮＡを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、アダプター、および／または表面に連結することができるアンカーに結合するヌクレオチド配列を含む、ガイドポリヌクレオチド。
【請求項５７】
ガイドＲＮＡである、請求項５６に記載のガイドポリヌクレオチド。
【請求項５８】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、任意選択にｓｇＲＮＡ中に存在する、請求項５７に記載のガイドポリヌクレオチド。
【請求項５９】
（ｉ）前記アンカーまたは（ｉｉ）前記アダプターが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端、前記ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端、前記ｃｒＲＮＡの３’末端、または内部に存在し、前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡが、ｓｇＲＮＡに含まれる、請求項５７または５８に記載のガイドポリヌクレオチド。
【請求項６０】
それに付着しているポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記アンカーが、コレステロールである、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項５６〜６１のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質とを含む、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体。
【請求項６３】
前記ガイドポリヌクレオチドが、ガイドＲＮＡであり、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質である、請求項６２に記載の複合体。
【請求項６４】
前記ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質が、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が無効化されているＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項６３に記載の複合体。
【請求項６５】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの触媒ヌクレアーゼ部位のうちの１つ以上が不活性化されている、請求項６４に記載の複合体。
【請求項６６】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ、Ｃｐｆ１、またはＣ２ｃ２である、請求項６４または６５に記載の複合体。
【請求項６７】
前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９である、請求項６６に記載の複合体。
【請求項６８】
請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の２つ以上のガイドポリヌクレオチド、または請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の２つ以上の複合体のパネル。
【請求項６９】
（ａ）ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および表面に連結することができるアンカーを含む、キット。
【請求項７０】
アダプターおよび／または（ｉｉ）ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
請求項５６〜６１のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、または請求項６８に記載のガイドポリヌクレオチドもしくは複合体のパネルを含む、請求項６９または７０に記載のキット。
【請求項７２】
試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するためのシステムであって、
ナノポアと、
ガイドポリヌクレオチド結合ドメインを含むポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、
前記標的ポリヌクレオチドの一部分中の配列に相補的である第１の部分、および前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の前記ガイドポリヌクレオチド結合ドメインに結合するように適合されている構造物を含むガイドポリヌクレオチドと、を含む、システム。
【請求項７３】
標的ポリヌクレオチドおよび／または膜をさらに含み、前記ナノポアが前記膜中に存在する、請求項７２に記載のシステム。
【請求項７４】
前記標的ポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、複合体を形成する、請求項７３に記載のシステム。
【請求項７５】
前記標的ポリヌクレオチドが、膜に連結している、請求項７３または７４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、膜貫通ポアを用いて標的ポリヌクレオチドを検出および／または分析する方法に関する。本発明はまた、方法での使用のための新規プローブおよびプローブのパネル、ならびに方法を実施するためのキットに関する。方法は、多くの用途を有する。特に、方法は、診断、多型の検出、およびＶ（Ｄ）Ｊレパトア解析に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
幅広い用途にわたる迅速かつ安価なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が現在必要とされている。既存の技術は、主に、多量のポリヌクレオチドを生成するために増幅技法に依存し、信号検出のために多量の専門蛍光薬剤を必要とするため、時間がかかり、高価である。
【０００３】
膜貫通ポア（および他のナノポア）は、ポリマーおよび様々な小分子のための直接的な電気的バイオセンサーとして大きな可能性を有する。特に、最近は、潜在的なＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが注目されている。
【０００４】
ナノポアにわたって電位が印加されると、ヌクレオチドなどの分析物が特定の時間バレル中に一時的に滞留する場合、電流の流れに変化がある。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のシグネチャーおよび持続時間の電流変化をもたらす。鎖配列決定方法では、単一のポリヌクレオチド鎖はポアを通過させ、ヌクレオチドの同一性が誘導される。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するために分子ブレーキの使用を含み得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集機構の一部を形成するガイドＲＮＡおよびＤＮＡならびにＲＮＡ誘導型およびＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質の新規用途を同定した。本発明者らは、試料中の１つ以上の標的ポリヌクレオチドの存在、不在、または量について試験するために、関連ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質と共に使用することができる修飾ガイドＲＮＡ配列を設計した。本発明者らは、膜貫通ポアと共にガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質を用いて標的ポリヌクレオチドを検出する方法を開発した。方法は、様々な方法で実施することができるが、それらが標的ポリヌクレオチド（複数可）を選択するためにガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質を使用し、標的ポリヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、およびＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質を含む複合体の膜貫通ポアへの送達を含むという共通点を有する。方法は、Ｃ２ｃ２を使用するＲＮＡ編集システムを含む、他のポリヌクレオチド誘導型タンパク質エフェクターシステムに拡張することができる。ガイドＲＮＡなどのガイドポリヌクレオチドは、ナノポアに基づく検出方法における使用に特に適合され得る。
【０００６】
本発明者らによって開発された方法は、高感度であり、試料中の他の成分から標的ポリヌクレオチド（複数可）を抽出するために別々の分離ステップを必要とすることなく、試料中の微量のポリヌクレオチドを検出するために使用することができる。よって、方法は、簡単であり、富化または精製ステップなどの複雑なステップを必要としない。したがって、方法は、迅速であり、迅速な結果ならびに粗製および／または「汚れた」試料からの結果を得るために使用することができる。方法は、したがって、迅速な診断が必要とされる診断環境において特に有用である。方法はまた、遺伝子またはゲノムの特定の断片または領域を標的とするのに特に有用である。方法の主な利点は、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、標的またはアダプターの測定の前に標的ポリヌクレオチドから積極的に除去される必要がないことである。本発明のいくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に依然として付着している間に検出または特徴付けされ得る。本発明の他の態様では、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的の測定中に膜貫通ポアによって自動的に除去され得る。いくつかの実施形態では、方法は、試料中の他の成分からの標的ポリヌクレオチド（複数可）の分離を容易にするために特異的に設計されたガイドポリヌクレオチドを使用する。
【０００７】
方法は、本質的に分離ステップを含むので、多くの他のポリヌクレオチド配列を含有する試料において、ポリヌクレオチド配列の関心領域を特徴付ける、例えば配列決定することを可能にする。例えば、大きなゲノムに存在する関心遺伝子のみが配列決定され得る。配列決定は、ＳＮＰを含有する領域、またはＴ細胞中のＶ（Ｄ）Ｊ領域などの他の関心領域に限定することができる。これは、複雑なまたは時間のかかる断片化またはプルダウン試料調製方法を必要とせずに所望の情報にアクセスしながら、感度および効率を改善させる。それはまた、関心標的ポリヌクレオチド断片のみが測定されるか、またはその増加した割合が試料中の全ポリヌクレオチド断片に対して測定されるので、ナノポア実験の実施にかかる時間を短縮する。非標的ポリヌクレオチドの量が標的ポリヌクレオチドの量に対して過多である場合、標的ポリヌクレオチドを検出するのにかかる時間は、非標的ポリヌクレオチドの除去またはこれを測定する必要性の低下のため、有意に短縮され得る。方法はまた、ＰＣＲまたは他の標的富化アプローチを必要としないことから利益を得る。
【０００８】
したがって、本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、
（ｂ）試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、
（ｃ）膜を挟んで電位差を印加することと、
（ｄ）複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。
【０００９】
試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、
（ｂ）試料をナノポアと接触させることと、
（ｃ）ナノポアを挟んで電位差を印加することと、
（ｄ）複合体とナノポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法も提供される。
【００１０】
本発明はまた、
−標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質およびアダプター配列、ならびに／または表面に連結することができるアンカーに結合するヌクレオチド配列を含む、ガイドポリヌクレオチド、
−本発明の２つ以上のガイドポリヌクレオチドのパネル、
−本発明のガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を含む、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、
−ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および表面に連結することができるアンカーを含む、キット、ならびに
−試料中の二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的を検出する方法であって、
（ａ）試料を第１のプローブおよび第２のプローブと接触させることであって、第１のプローブおよび第２のプローブが、試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成し、第１のプローブが、標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第１の配列に結合し、表面に連結することができるアンカーを含み、第２のプローブが、標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第２の配列に結合し、アダプター配列を含む、接触させることと、
（ｂ）試料を膜貫通ポアと接触させることと、
（ｃ）膜貫通ポアに電位を印加することと、
（ｄ）複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。
【００１１】
図は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】伸長ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＤＮＡ）を担持する不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が特定のゲノムＤＮＡ配列「ａ」と接触するためにどのように使用され得るかの例を示す。この図では、Ｃａｓ９タンパク質Ａは、ゲノムＤＮＡ  Ｂ中の特定の遺伝子座ａと接触する。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  Ｃは、「ＰＡＭ」部位Ｄに先行するａの配列を担持する。Ｃａｓ９は、ａの融解を触媒し、非標的鎖ａ’にハイブリダイズする。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ  Ｅおよびアンカリングポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合タンパク質装填ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする伸長部Ｆに対する部分的相補性を担持する配列を保有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡはまた、アンカリングポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド結合タンパク質装填ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする伸長部Ｇを保有し得る。あるいは、Ｃａｓ９は、アンカレッジまたは精製のためのタンパク質の表面への結合またはプルダウンを可能にする、ペプチドタグ、またはポリヌクレオチド親和性タグ、または反応性部分Ｈを保有し得る。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標準的な開裂部位Ｉ、Ｊも示されており、その両方は「死んだ」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）において不活性化され、その一方はＣａｓ９の「ニッカーゼ」突然変異体において不活性化される（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓタンパク質中の残基Ｈ１０およびＤ８４０の突然変異）。
【図２】０または１つの不活性化ヌクレアーゼ部位を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が特定の遺伝子座に（図１のように）結合しており、酵素Ｂおよび配列ａに相補的な配列を保有するアダプターが伸長され、標的ＤＮＡに直接ライゲーションされる、図１の代替方法を示す。パネルＣは、活性または部分活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって、部位ＤおよびＥの一方または両方で誘導された標的における二本鎖切断を示す。パネルＦは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の変位された鎖への種Ｂの結合によって誘導されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の解離を示す。パネルＧは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩなどのポリメラーゼ−エキソヌクレアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼの存在下で種Ｂの３’末端を伸長する効果を示す。
【図３】酵素装填アダプター（「Ｙ−アダプター」）、種Ａが、適切な３’伸長部を担持するｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、種Ｂにどのようにハイブリダイズされ得るかを示す。種Ａは、種Ｂの３’伸長部、および酵素Ｄの装填のための５’伸長部に対する部分的相補性ａ＊を有するオリゴヌクレオチドＣ、種Ｃに対する部分的相補性を担持するオリゴヌクレオチドＥを含む。オリゴヌクレオチド種Ｂは、配列Ｓ１、ｔｒａｃｒＲＮＡ  Ｇに対して部分相補的な、ｃｒＲＮＡのプロトスペーサー配列、および配列ａ＊に対して相補的な、配列ａの３’伸長部を保有するオリゴヌクレオチドＦを含む。
【図４】コレステロール部分を保有するオリゴヌクレオチドなどのアンカリング種Ａが、適切な３’伸長部を担持するｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、種Ｂにどのようにハイブリダイズされ得るかを示す。全ての部分は、配列Ｓ２が種Ｂに固有のプロトスペーサー配列であり、図３に示されるハイブリッドとは異なる配列を標的とすること、アンカリング種Ａ上の、配列ｂ、配列ｂ＊に相補的であるｃｒＲＮＡに対する３’伸長部以外は、図３と同様である。種Ｂは、コレステロールまたはビオチンまたはデスチオビオチンなどのアンカリング部分Ｃを保有する。
【図５】二本鎖ＤＮＡ標的Ａが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体Ｃによる認識によって、どのように非特異的ＤＮＡ  Ｂと区別され得るかを示す。
【図６】混合物中の特異的および非特異的ＤＮＡが、ナノポアによる標的および非標的ＤＮＡの捕捉に使用され得るアダプター部分Ａで誘導体化され得ること以外は、図５と同一である。
【図７】アダプター部分Ａが、ナノポアを通る標的および非標的ＤＮＡの移動を制御するために使用されるポリヌクレオチド結合タンパク質Ｂを保有し得ること以外は、図６と同一である。
【図８】標的ＤＮＡ  Ｃ上の２つの隣接する遺伝子座に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体（Ａ、Ｂ）が試料を明確に同定するために使用され得る例を示す。図３のように、複合体Ａは、酵素装填伸長部を担持するｃｒＲＮＡを含有する。図４のように、複合体Ｂは、アンカリング伸長部を担持するｃｒＲＮＡを含有する。複合体Ｂに結合する遺伝子座を担持するＤＮＡは、トリブロックポリマー膜などの表面Ｄに結合する。複合体Ａに結合している酵素は、ナノポアを通るバーコード付きＤＮＡ分析物Ｅの移動を制御し得る。システムを洗い流すことによって、溶液から（標的遺伝子座を有さない種、Ｆを含む）非特異的分析物の除去後、２つの遺伝子座を担持する実体Ｇのみが検出され、実体Ｆ、Ｈ、またはＩは検出されないであろう。
【図９】アンカリング部分を含有する伸長部を担持する不活性Ｃａｓ９（「ｄＣａｓ９」）が、ナノポアを通るポリヌクレオチド結合タンパク質制御転座を介して標的分析物の配列を富化および決定するために使用され得る例を示す。この例では、酵素結合アダプター部分は、溶液中の全ＤＮＡの一方または両方の末端にライゲーションされる。標的遺伝子座を含有するＤＮＡのみがアンカリングｄＣａｓ９複合体に結合する。
【図１０】ナノポアを通るＤＮＡ分析物の移動を制御するために使用され得るライゲーションされた酵素結合アダプターを有するＤＮＡ分析物を示す。
【図１１】酵素の転座が、特定の遺伝子座に結合しているＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体によって一時的にストールされ得る、図１０と同様の、結合酵素を有するＤＮＡ分析物を示す。
【図１２】標的ポリヌクレオチド分析物に結合しているｄＣａｓ９の検出方法を示し、標的分析物および結合ｄＣａｓ９の両方の鎖は、ナノポアを通して転座され、ナノポアは、標的分析物および結合ｄＣａｓ９の通過を可能にする狭窄部を担持し、ｄＣａｓ９は、ナノポアを通して測定されたイオン電流における特徴的な偏向を生じる。
【図１３】標的ポリヌクレオチド分析物に結合しているｄＣａｓ９の検出方法を示し、標的分析物の両方の鎖は、ナノポアを通して転座されるが、ナノポアの狭窄部は、結合ｄＣａｓ９の転座を防止し、ナノポアを通して測定されたイオン電流における特徴的な偏向または滞留時間を生じる。
【図１４】標的ポリヌクレオチド分析物に結合しているｄＣａｓ９の検出方法を示し、標的分析物は、図６のように、ポリヌクレオチド結合タンパク質遊離アダプターで誘導体化され、ポリヌクレオチド分析物の２つの鎖の一方は、ナノポアを通して転座され、標的分析物に結合しているｄＣａｓ９は、ナノポアを通して測定されたイオン電流における特徴的な偏向または滞留時間を生じる。
【図１５】結合ｄＣａｓ９を有する標的分析物の配列決定方法を示し、標的分析物は、図７のように、ポリヌクレオチド結合タンパク質結合アダプターで誘導体化され、ポリヌクレオチド分析物の２つの鎖の一方の転座は、ポリヌクレオチド結合タンパク質によってナノポアを通して制御される。この例では、標的分析物に結合しているｄＣａｓ９は、ポリヌクレオチド結合タンパク質の転座における、およびしたがってナノポアを通して測定されたイオン電流における特徴的なストールを生じ得る。
【図１６】図４のようにコレステロール部分を担持する伸長型ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９を介して、図８のように膜にアンカリングされ、図３のように、伸長型ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体にハイブリダイズされたバーコード付きポリヌクレオチド結合タンパク質装填オリゴヌクレオチド分析物の制御された移動によって同定され、コレステロール伸長型ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９に隣接する遺伝子座に結合する、標的ＤＮＡの同定方法を示す。
【図１７】アンカリング部分が、例えば、ビオチンまたはデスチオチンであり得、アンカリング部分が、ストレプトアビジン誘導体化ビーズまたはナノ粒子に結合し得る、図１６の誘導体を示す。
【図１８】既知または一般的な遺伝子座に結合するコレステロール伸長ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を介して膜にアンカリングされる標的ＤＮＡの例を示し、同じ標的ＤＮＡは、その存在または不在が酵素伸長ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体によって決定される多数の未知の配列を含有する。この例では、各酵素伸長ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体は、図１６のように、組み合わせて遺伝子座の存在または不在を明確に同定するために使用され得る固有のバーコードを保有する。標的ＤＮＡはまた、コレステロール伸長ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を介するよりもむしろ膜に直接連結され得る。
【図１９】例となるポリヌクレオチド、λファージＤＮＡ、およびゲノムの末端から２，８５５ｂｐである特定の標的遺伝子座Ａの位置を示す。
【図２０】コレステロール伸長部を担持する結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９が１〜３ｋｂセグメントにランダムに断片化され、各セグメントが標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために一方または両方の末端にポリヌクレオチド結合タンパク質装填Ｙ−アダプターを担持する、図１９の標的遺伝子座を示す。アセンブリは、コレステロール部分を介して膜表面にアンカリングされる。
【図２１】ファージλＤＮＡが１〜３ｋｂセグメントにランダムに断片化され、酵素−Ｙ−アダプターが断片化ＤＮＡにライゲーションされ、コレステロール伸長型ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９が図１９に示される標的に結合された、実験からのファージラムダ参照に対して整列させた配列データのカバレッジプロットを示す。カバレッジプロットは、予想位置（λファージゲノムの末端から２８５５ｂｐ）における特定の遺伝子座Ａの富化を示す。上パネルは、フォワード（Ｂ）およびリバース（Ｃ）リード方向から累積されたアラインメントを示し、下パネルは、フォワードおよびリバース配向の集計を示す。
【図２２】図１９および２０に示される遺伝子座に結合コレステロール伸長型ｄＣａｓ９を担持する標的ＤＮＡのポリヌクレオチド結合タンパク質制御転座によって検出されたナノポア電流シグネチャーのトレース例を示す。この例では、ｄＣａｓ９は酵素の転座を一時的にストールさせる。電流トレースは、オープンポアレベルＡ、リーダーシグネチャーＢ、標的分析物シグネチャーＣ、およびストールＤを含む。
【図２３】図１６のように、酵素伸長型ｄＣａｓ９上のバーコード付きオリゴヌクレオチドの酵素制御移動によって検出されたナノポア電流シグネチャーのトレース例を示す。電流トレースは、オープンポアレベルＡ、リーダーシグネチャーＢ、およびバーコードシグネチャーＣを含む。
【図２４】ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、ポリヌクレオチド標的を膜貫通ポアを含む膜にもたらすためにどのように使用され得るかを示す。未結合ポリヌクレオチドは、膜貫通電位の印加および膜貫通ポアを用いるポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体の検出の前に洗い流され得る。
【図２５】アダプターおよびリーダー配列がガイドＲＮＡにどのように付着され得るかの例を示す。
【図２６】本発明の方法が、ポリヌクレオチドを膜にテザリングするための膜アンカーを含むガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および異なるＳＮＰに特異的であり、ＳＮＰ間を区別するためのバーコード付きアダプターを含むガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を用いて、ＳＮＰの存在または不在を検出するためにどのように使用され得るかを示す。
【図２７】一対のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドガイドエフェクタータンパク質を、関心領域（ＲＯＩ）を含むポリヌクレオチド断片を得るためにどのように使用することができるかを示す。第１のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、図１１に示されるようにポリヌクレオチド結合タンパク質をストールさせるように作用し、関心領域を膜貫通ポアを用いて特徴付けることを可能にするように、そのヌクレアーゼ活性を無効化することができた。
【図２８−１】図２８Ａは、両方の末端にライゲーションされ、両方の末端で各々がコレステロール部分（Ｄ）を担持するオリゴヌクレオチドを介して膜（Ｃ）表面上にテザリングされた酵素結合Ｙ−アダプター（Ｂ）を含む標的ＤＮＡ分析物（Ａ）の固定化を示す。コレステロールアンカー（Ｆ）を担持する結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９（Ｅ）は、分析物を第３の位置の膜にテザリングする。この図は、ＤＮＡ上の酵素転座を開始するためのＭｇＡＴＰの付加前のシステムを示す。
【図２８−２】図２８Ｂは、各々がコレステロール部分（Ｄ）を担持する両方の末端にライゲーションされた酵素結合Ｙ−アダプター（Ｂ）を含む標的ＤＮＡ分析物（Ａ）の固定化を示す。ビオチン部分（Ｆ）などの親和性タグを担持する結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９（Ｅ）は、分析物をストレプトアビジンなどのビーズ（Ｃ）にテザリングする。この図は、ＤＮＡ上の酵素転座を開始するためのＭｇＡＴＰの付加前のシステムを示す。
【図２８−３】図２８Ｃは、コレステロール部分（Ｄ）を担持する一方の末端にライゲーションされた酵素結合Ｙ−アダプター（Ｂ）を含む標的ＤＮＡ分析物（Ａ）の固定化を示す。他方の末端は、ヘアピン（Ｇ）を有する。ビオチン部分（Ｆ）などの親和性タグを担持する結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９（Ｅ）は、分析物をストレプトアビジンなどのビーズ（Ｃ）にテザリングする。この図は、ＤＮＡ上の酵素転座を開始するためのＭｇＡＴＰの付加前のシステムを示す。
【図２９】ＭｇＡＴＰの付加後の図２８によって導入されたシステムを示す。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体への酵素の転座は、ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体の遭遇（Ａ）後に停止される。
【図３０】膜にわたる電位の印加、およびナノポアによる標的分析物の末端の捕捉（Ａ）後の図２９によって導入されたシステムを示す。
【図３１】分析物に印加された電位がＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体に結合している酵素を放出し、酵素が転座を再開した（Ａ）後の図３０によって導入されたシステムを示す。
【図３２】初期のプレｄＣａｓ９転座事象（Ｂ）、ストーリング（Ｃ）、および転座の再開（Ｄ）を含む、ＭｇＡＴＰの付加の約２３５０秒後のトレース例を示す。ストールからの再開は、強調および拡大される（Ｅ）。
【図３３】ＤＮＡの一本鎖が通り抜けるのに十分なだけの大きさであるポアに遭遇する二本鎖ＤＮＡ鎖の概略図である。相補鎖は、第１の鎖が通過すると、ポアによって剥離される。
【図３４】ナノポアを通して転座するＤＮＡ鎖の電流対時間プロットを示す。トレースは、ポア中にＤＮＡが存在しないとき、オープンポアレベル、Ａで開始する。各末端にアダプターを有する二本鎖ＤＮＡ鎖は、次いでポアに遭遇し、転座を開始する。ポアは、二本鎖ＤＮＡが通過するには小さすぎるので、図３３のように一本鎖のみが転座する。ＤＮＡの転座は、特徴的な信号（領域Ｂ）を生成し、次いでオープンポアレベル、Ａに戻る。事象は、典型的には、０．５秒未満継続する。下パネルは、上パネルの拡大図である。
【図３５】図１４に示されるように、ＤＮＡ鎖がそれに結合しているｄＣａｓ９酵素を有すること以外は、図３４と同じ実験を示す。数十秒続くロングポーズは、ポア中のＤＮＡに関連する電流レベルで観察される。これらの事象のいくつかは、電位が逆転されるときにのみオープンポアレベルに戻る。
【図３６】図１４に示されるように、ＤＮＡ鎖がそれに結合しているｄＣａｓ９酵素を有すること以外は、図３４の実験を示す。それは、鎖が転座し、信号がオープンポアレベル、Ａに戻る事象を示す。第２および第３のパネルは、第１のパネルの拡大図であり、第２は事象の始まりを示し、第３は終わりを示す。このトレースから、その中の新たなロングポーズレベル、Ｃを有するが、信号が図３４と同じ特徴的なパターンを有することが分かる。これは、ＤＮＡ鎖に結合しているｄＣａｓ９がＤＮＡ単独で観察された信号の修飾を引き起こしていることを示す。
【図３７】それを収容するのに十分に大きいポアをインタクトで通過する二本鎖ＤＮＡ鎖の電流トレースの例を示す。オープンポア電流から、Ａ、電流はＤＮＡがそれを通過するにつれてより低いレベルまで低下し、Ｂ、次いでオープンポアレベルに戻る。
【図３８】それを収容するのに十分に大きいポアをインタクトで通過する二本鎖ＤＮＡ鎖の電流トレースの例を示す。この場合、ＤＮＡは、図１２に示されるようにそれに結合しているタンパク質を有する。ここで、タンパク質転座（Ｃ）を表すＤＮＡレベルからの電流には余分な偏向がある。
【図３９】複数のタンパク質がＤＮＡに結合している、それを収容するのに十分に大きいポアをインタクトで通過する二本鎖ＤＮＡ鎖の電流トレースの例を示す。各タンパク質は、電流に対して別々の偏向を引き起こす。
【図４０】複数のタンパク質が（図３９のものとは異なる位置で）ＤＮＡに結合しており、タンパク質がポアを通過するときに異なる信号を生成すように修飾または装飾された、それを収容するのに十分に大きいポアをインタクトで通過する二本鎖ＤＮＡ鎖の電流トレースの例を示す。
【図４１】配列ａを有する５’ＤＮＡ伸長部Ｄを担持するｃｒＲＮＡ  ＣおよびｔｒａｃｒＲＮＡでの、ビーズ表面ＢへのｄＣａｓ９接触標的Ａの富化および検出または配列決定方法の例を示す。標的Ａは、数十ヌクレオチドからメガベースを超える長さまでの範囲の任意のサイズであり得る。Ｂは、例えば（バルク溶液中またはカラムフォーマット中の）ビーズ表面または膜であり得る。Ｂへの付着は、Ｂがストレプトアビジンなどのタンパク質でコーティングされている場合にビーズＢへの付着を可能にするビオチンなどの化学部分を担持する、Ｄの伸長部に相補的な配列ａ’を担持する、オリゴヌクレオチドＥによって媒介される。非標的ＤＮＡは、その後Ｂから洗い流され得る。標的Ａの平滑または相補末端へのアダプターＦの酵素またはクリックケミストリーライゲーションは、過剰なアダプターが洗い流された標的をビーズに結合させて標的−ｄＣａｓ９−ビーズアセンブリＧをもたらしながら、達成され得る。標的Ａの配列決定または検出は、次いで、膜Ｈ、およびｔに相補的な配列ｔ’を介してアダプターＦにハイブリダイズするコレステロール修飾オリゴヌクレオチドテザーＩを含有するフローセルにアセンブリＧを送達することによって達成される。アセンブリＧは、重力によって、または例えばビーズＢが常磁性である場合には印加磁界によって膜に送達され得る。
【図４２】ｒｒｓＨ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、株ＭＧ１６５５、ピークｉの座標２２３７７１−２２５３１２）に対するｃｒＲＮＡプローブを用いて、全Ｅ．ｃｏｌｉゲノム試料からの全１  ６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子の富化を示すカバレッジプロットの例を示す。Ａ、上は、フォワード（正数）とリバース（負数）方向リードについてのカバレッジ対位置のプロットを示す。７つのターゲットピーク、ｉ〜ｖｉｉは、同定され、バックグラウンドＢに対して大きな比率を占める。Ａ、下は、フォワードおよびリバース方向リードの集計を示す。Ｃは、各ビンにマッピングされた塩基の数に対して正規化された、参照に首尾よくマッピングした全てのリードのリード長のヒストグラムを示す。Ｄは、プルダウンに使用される単一プローブの７つの予想結合位置を示す。ピークｖｉｉは、標準的な「オフターゲット」部位である標的配列に位置するが、プローブ配列に対して２０中１９の一致を担持する。
【図４３−１】ナノポア配列決定によって決定される、結合している標的対非標的分子の割合に対する、ｄＣａｓ９接触ＤＮＡ試料への熱ストレス、続いてその後のＳＰＲＩビーズクリーンアップ、およびビーズベースのｄＣａｓ９プルダウンを適用する効果を示す。
【図４３−２】ナノポア配列決定によって決定される、結合している標的対非標的分子の割合に対する、ｄＣａｓ９接触ＤＮＡ試料への熱ストレス、続いてその後のＳＰＲＩビーズクリーンアップ、およびビーズベースのｄＣａｓ９プルダウンを適用する効果を示す。
【図４３−３】ナノポア配列決定によって決定される、結合している標的対非標的分子の割合に対する、ｄＣａｓ９接触ＤＮＡ試料への熱ストレス、続いてその後のＳＰＲＩビーズクリーンアップ、およびビーズベースのｄＣａｓ９プルダウンを適用する効果を示す。
【図４４】２つの異なるオリゴヌクレオチド伸長部、ｄＣａｓ９接触標的分子ＡのそれぞれｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡからの配列［ａ−ｃ］およびｄを利用し、連続的にｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ（またはその逆）の存在について選択するために使用され得る、連続的な「プルダウン」および「トーホールド溶出」方法の例を示す。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部ａに部分的に相補的な配列ａ’−ｂ’を担持するオリゴヌクレオチドＢがまず精製表面Ｃに結合され、Ａが［Ｂ＋Ｃ］でインキュベートされ、任意の非標的ＤＮＡが洗い流される。［Ａ＋Ｂ＋Ｃ］でインキュベートされる場合、オリゴヌクレオチドＢと完全に相補的な配列［ａ＋ｂ］を担持するオリゴヌクレオチドＤは、［Ｂ＋Ｃ］からＡを放出する「トーホールド変位」として知られる現象によってＡのｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部からオリゴヌクレオチドＢを変位するであろう。Ａは、図４１に概説されるように、ナノポア配列決定もしくは検出のためにフローセルに適合および送達され得るか、または次いでｃｒＲＮＡ伸長部Ｇ（配列ｄ）に相補的であるオーバーハングｄ’を有する二重螺旋オリゴヌクレオチドＦを担持する、第２の種類の表面Ｅに結合させ、Ｆをもたらし得る。Ｆはまた、図４１に概説されるように、適合および配列決定または検出され得る。表面ＣおよびＥは、（バルクでもカラムフォーマットでも）ビーズまたは膜であり得る。
【図４５−１】実施例７に記載されるように、単一ｃｒＲＮＡプローブを用いる１６Ｓ  ｒｒｓ遺伝子のプルダウンからの、熱ストレス（５５℃、５分）、（該当する場合、１回の熱ストレス後に行われた）ＳＰＲＩ精製、および（ビーズ捕捉後に行われた）トーホールド変位方法のコンビナトリアル効果を示す。Ａ、熱ストレス、ＳＲＲＩ、またはトーホールドなしの対照。Ｂ、ＳＲＲＩのみ。Ｃ、熱ストレスのみ。Ｄ、熱ストレスおよびＳＰＲＩ。Ｅ、トーホールドのみ。Ｆ、ＳＰＲＩおよびトーホールド。Ｇ、熱ストレスおよびトーホールド。Ｈ、熱ストレス、ＳＰＲＩ、およびトーホールド。各パネル（Ａ〜Ｈ）は、図４２に示されるものと同様の、Ｅ．ｃｏｌｉカバレッジプロットの例を示す。
【図４５−２】実施例７に記載されるように、単一ｃｒＲＮＡプローブを用いる１６Ｓ  ｒｒｓ遺伝子のプルダウンからの、熱ストレス（５５℃、５分）、（該当する場合、１回の熱ストレス後に行われた）ＳＰＲＩ精製、および（ビーズ捕捉後に行われた）トーホールド変位方法のコンビナトリアル効果を示す。Ａ、熱ストレス、ＳＲＲＩ、またはトーホールドなしの対照。Ｂ、ＳＲＲＩのみ。Ｃ、熱ストレスのみ。Ｄ、熱ストレスおよびＳＰＲＩ。Ｅ、トーホールドのみ。Ｆ、ＳＰＲＩおよびトーホールド。Ｇ、熱ストレスおよびトーホールド。Ｈ、熱ストレス、ＳＰＲＩ、およびトーホールド。各パネル（Ａ〜Ｈ）は、図４２に示されるものと同様の、Ｅ．ｃｏｌｉカバレッジプロットの例を示す。
【図４５−３】実施例７に記載されるように、単一ｃｒＲＮＡプローブを用いる１６Ｓ  ｒｒｓ遺伝子のプルダウンからの、熱ストレス（５５℃、５分）、（該当する場合、１回の熱ストレス後に行われた）ＳＰＲＩ精製、および（ビーズ捕捉後に行われた）トーホールド変位方法のコンビナトリアル効果を示す。Ａ、熱ストレス、ＳＲＲＩ、またはトーホールドなしの対照。Ｂ、ＳＲＲＩのみ。Ｃ、熱ストレスのみ。Ｄ、熱ストレスおよびＳＰＲＩ。Ｅ、トーホールドのみ。Ｆ、ＳＰＲＩおよびトーホールド。Ｇ、熱ストレスおよびトーホールド。Ｈ、熱ストレス、ＳＰＲＩ、およびトーホールド。各パネル（Ａ〜Ｈ）は、図４２に示されるものと同様の、Ｅ．ｃｏｌｉカバレッジプロットの例を示す。
【図４５−４】実施例７に記載されるように、単一ｃｒＲＮＡプローブを用いる１６Ｓ  ｒｒｓ遺伝子のプルダウンからの、熱ストレス（５５℃、５分）、（該当する場合、１回の熱ストレス後に行われた）ＳＰＲＩ精製、および（ビーズ捕捉後に行われた）トーホールド変位方法のコンビナトリアル効果を示す。Ａ、熱ストレス、ＳＲＲＩ、またはトーホールドなしの対照。Ｂ、ＳＲＲＩのみ。Ｃ、熱ストレスのみ。Ｄ、熱ストレスおよびＳＰＲＩ。Ｅ、トーホールドのみ。Ｆ、ＳＰＲＩおよびトーホールド。Ｇ、熱ストレスおよびトーホールド。Ｈ、熱ストレス、ＳＰＲＩ、およびトーホールド。各パネル（Ａ〜Ｈ）は、図４２に示されるものと同様の、Ｅ．ｃｏｌｉカバレッジプロットの例を示す。
【図４６】実施例８に記載されるように、ｄＣａｓ９の野生型または「特異性強化型」突然変異体で行われたプルダウンを比較する。パネルＡは、そうでなければ野生型バックグラウンドにおける、ｄＣａｓ９突然変異体バリアントが、図４２および実施例６に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｓ  １６Ｓ遺伝子から引き出された、対照実験を示す。ピークは、図４２において同定される通りである。パネルＢは、野生型ｄＣａｓ９突然変異体バリアントが「特異性強化型」ｄＣａｓ９突然変異体、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａで置き換えられた同等の実験を示す。ピークＣおよびＤはまた、図４２のピークｖｉｉに対応し、ＰＡＭに対する位置−２に不一致を保有する、ｒｒｓＤ遺伝子に対応する。
【図４７】実施例９に記載されるように、触媒的に死んだ（ｄＣａｓ９、Ａ）または生きた（Ｂ）Ｃａｓ９で行われたプルダウンのナノポアＤＮＡ配列決定ランからのカバレッジプロットを示す。パネルＡは、そうでなければ野生型バックグラウンドにおける、ｄＣａｓ９突然変異体バリアントが、図４２および実施例６に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｓ  １６Ｓ遺伝子から引き出された、対照実験を示す。この実験におけるインキュベーション温度は３０℃であった。パネルＢは、ｄＣａｓ９突然変異体が触媒活性Ｃａｓ９で置き換えられた同様のプルダウン実験を示す。この実験におけるインキュベーション温度は３７℃であった。＊は、実施例６と比較してこの実験で使用されたより高いインキュベーション温度に起因するさらなるピークを示す。パネルＣおよびＤは、カバレッジがリードの方向性によってグループ化され、正数がフォワードリードを示し、負数がリバースリードを示す、ｄＣａｓ９および生きたＣａｓ９プルダウンのカバレッジプロットを示す。
【図４８】Ａは、図４１に示されるものと同様であるが、酵素装填アダプターと標的分子Ｃとの間にバーコードアダプターＢをさらに含有するビーズ−標的コンジュゲートを示す。他の成分は、図４１に記載される通りである。パネルＤは、７つの個別バーコード付き試料、ＮＢ０１〜ＮＢ０７を含有した単一の６時間配列決定ランからのカバレッジプロットを示す。各バーコードは、実施例１０の本文に記載されるように、ｃｒＲＮＡプローブの異なるセット、およびしたがってＥ．ｃｏｌｉゲノムの異なる標的領域と関連付けられる。プローブ組み合わせは、実施例１０の本文に列挙される。
【図４９】分析物がｄＣａｓ９を介してビーズに結合している間に、捕捉標的分析物へのアダプターの付着を含む３つのワークフロー例を示す。Ａ、ビーズに結合している捕捉標的分析物の末端への酵素フリーアダプターのライゲーションを介したｄＣａｓ９の酵素フリー検出、Ｂ、ビーズから標的を放出、増幅、および配列決定するための、上記のような、ＰＣＲアダプターのライゲーションによる標的の富化、続いて標的のＰＣＲ増幅、Ｃ、ｄＣａｓ９が標的に結合し、標的がビーズに結合している間の、高精度ナノポア配列決定のための、１Ｄ２バーコードアダプター、続いて配列決定アダプターの連続的なライゲーション。
【図５０】クリックケミストリーによってアダプターライゲーションのために粘着末端を同時に付加しながら、ＤＮＡのトランスポザーゼ媒介せん断による、高分子量ＤＮＡからの標的の迅速な富化のための、実施例１１に記載されるワークフローの例を示す。ｄＣａｓ９は、次いで、実施例１１に記載されるように、せん断ＤＮＡに結合しており、オフターゲット効果は、実施例６において前述されるように、ストレスステップによって最小化され、配列決定アダプターは、クリックケミストリーを介してライゲーションされる。このワークフローは、実施例１１に記載されるように、トランスポザーゼ断片化ステップとアダプター付着ステップとの間にＣａｓ９結合およびビーズ捕捉ステップの挿入を有する、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＱＫ−ＲＡＤ００３キットを利用する。
【図５１】配列ａを有する５’ＤＮＡ伸長部Ｃを担持するｃｒＲＮＡでの、ビーズ表面ＢへのＣｐｆ１またはｄＣｐｆ１接触標的Ａの富化および検出または配列決定方法の仮想例を示す。標的Ａは、数十ヌクレオチドからメガベースを超える長さまでの範囲の任意のサイズであり得る。Ｂは、例えば（バルク溶液中またはカラムフォーマット中の）ビーズ表面または膜であり得る。Ｂへの付着は、Ｂがストレプトアビジンなどのタンパク質でコーティングされている場合にビーズＢへの付着を可能にするビオチンなどの化学部分を担持する、Ｃの伸長部に相補的な配列ａ’を担持する、オリゴヌクレオチドＥによって媒介される。非標的ＤＮＡは、その後Ｂから洗い流され得る。標的Ａの平滑または相補末端へのアダプターＦの酵素またはクリックケミストリーライゲーションは、過剰なアダプターが洗い流された標的をビーズに結合させて標的−Ｃｐｆ１−ビーズアセンブリＧをもたらしながら、達成され得る。標的Ａの配列決定または検出は、次いで、膜Ｈ、およびｔに相補的な配列ｔ’を介してアダプターＦにハイブリダイズするコレステロール修飾オリゴヌクレオチドテザーＩを含有するフローセルにアセンブリＧを送達することによって達成される。アセンブリＧは、重力によって、または例えばビーズＢが常磁性である場合には印加磁界によって膜に送達され得る。
【図５２】実施例１３に記載されるものなどの、「ペアアダプター」プルダウンが行われる仮想例を示す。（標的配列ｙおよびｚを担持する）標的ＤＮＡ分析物Ａは、０〜数百ナノグラムの範囲のＡの様々な濃度で非標的ＤＮＡ分析物Ｂと混合される。実施例８に記載されるＣは、ナノポア配列決定アダプターおよび任意のバーコード配列ｂを保有するｃｒＲＮＡ上のＤＮＡ伸長部を担持するｄＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体である。Ｄは、ｃｒＲＮＡを表面にテザリングすることを可能にする配列ｔを保有するｃｒＲＮＡ上のＤＮＡ伸長部を担持するｄＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体である。ＡおよびＢの混合物への種ＣおよびＤの添加は、ＢのバックグラウンドにおけるＡの検出を可能にする。配列ｙおよびｚを担持する標的分子のみが、共に（Ｄの伸長部ｔに相補的な配列ｔ’を有する）コレステロール修飾オリゴヌクレオチドＥを介して膜表面Ｆにテザリングされ、標的分析物の検出を可能にする酵素アダプターを保有する。Ｇのナノポア捕捉は、したがってＨの捕捉よりも増強される。ナノポアＪによるＧおよびＨの捕捉は、電子的に測定される。Ｋは、捕捉事象Ｌ１およびオープンポア電流Ｌ２によって中断されたナノポア電流トレースの例を示す。Ｌ１の頻度は、膜上の種Ｇの濃度および溶液中のＨのバックグラウンドレベルに依存する。Ｍは、標的分析物Ａの濃度に対する事象Ｌ１の頻度の仮想プロットを示す。Ｎは、溶液からの種「Ｇ」のバックグラウンド捕捉のレベルを示し、よって「偽陽性」率である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示される生成物および方法の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に適合され得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
【００１４】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「アンカー」への言及は、２つ以上のアンカーを含み、「ヘリカーゼ」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含み、「膜貫通ポア」への言及は、２つ以上のポアなどを含む。
【００１５】
上記または下記の本明細書に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
方法
本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、（ｂ）試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、（ｃ）膜を挟んで電位差を印加することと、（ｄ）複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時にまたはいずれかの順序で連続して実施され得る。
【００１７】
方法は、（ａ）複合体を形成するために試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、試料が膜貫通ポアを含む膜と接触し、膜貫通ポアに電位が印加される、接触させることと、（ｂ）複合体の少なくとも一部分が膜貫通ポアに対して移動する際に１つ以上の測定を行って複合体の存在または不在を検出し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、（ｂ）膜を挟んで電位差を印加することと、（ｃ）膜貫通ポアを通過するイオン流、または試料、ガイドポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と膜貫通ポアとの相互作用から生じる他のシグナルを測定して、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドを含む複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む。イオン流の測定は、ポアを通した電流の測定を含み得る。
【００１９】
方法は、多数の異なる方法で実施することができる。方法は、様々な異なる適用を行うために使用することができる。方法は、例えば、単一の標的ポリヌクレオチドの、または多数の標的ポリヌクレオチドの存在または不在を決定するために使用され得る。方法は、定量的であり得る。例えば、試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの量（濃度など）を、本発明の方法を用いて決定することができ、および／または試料中に存在する異なるポリヌクレオチドの相対量を決定することができる。方法は、多型の存在もしくは不在および／または多型の同一性など、標的ポリヌクレオチドに関するさらなる情報を提供することができる。
【００２０】
方法は、ガイドポリヌクレオチドに付着しているアダプターが膜貫通ポアと相互作用するかを決定することを含み得る。方法は、標的ポリヌクレオチドに結合していないアダプターを含むガイドポリヌクレオチドが膜貫通ポアと相互作用しないように実施され得る。典型的には、かかる未結合ガイドポリヌクレオチドは、膜貫通電位が膜に印加される前に洗い流される。標的ポリヌクレオチドは、アダプターを含む結合ガイドポリヌクレオチドが洗い流されるのを防止するために、表面、例えば膜にテザリングされ得る。標的ポリヌクレオチドは、それに直接、例えば、その末端の一方に付着している膜アンカーなどのテザーを有し得る。あるいは、膜アンカーなどのテザーを含む第２のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を使用して、標的ポリヌクレオチドを表面、例えば膜にテザリングすることができる。
【００２１】
標的ポリヌクレオチドがテザリングされている表面は、ビーズであり得る。
【００２２】
アダプターは、典型的には標的ポリヌクレオチドに特有であり、膜貫通ポアと相互作用すると異なるシグナルを生じる。各々が異なる標的ポリヌクレオチドについて選択的であり、異なるアダプターを有する、複数のガイドポリヌクレオチドを試料に添加して、膜貫通ポアと相互作用する異なるアダプターによって引き起こされる異なるシグナルに基づいて異なる標的ポリヌクレオチドを検出および／または定量化することができる。この実施形態では、アダプターは、バーコードを含むと考えられ得る。
【００２３】
方法は、異なるポリヌクレオチド配列に結合する複数のガイドポリヌクレオチドを使用し得る。異なるポリヌクレオチド配列は、例えば、同じ標的ポリヌクレオチド中の異なる配列（例えば、標的ポリヌクレオチドの異なる部分）、異なる標的ポリヌクレオチドの配列または標的ポリヌクレオチド内の代替配列、例えば多型を包含する配列、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）であり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドをさらに特徴付けることを含み得る。例えば、方法は、標的ポリヌクレオチドの全部または一部を配列決定することを含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドの異なる領域に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチドおよび／または２つ以上のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を用いて標的ポリヌクレオチドの存在、不在、または量を検出することであって、標的ポリヌクレオチドへの２つの異なるガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の結合が、標的ポリヌクレオチドが試料中に存在する場合、膜貫通ポアを通して、検出可能なシグナル、例えば検出可能な電流変化をもたらす、検出することを含み得る。シグナルは、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクター複合体のうちの１つにおけるアダプターに特徴的であり得、シグナルは、そのガイドポリヌクレオチドが膜アンカーを含む第２のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に「連結される」場合のみ観察され、この「連結」は、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の両方が標的ポリヌクレオチドに結合している場合に生じる。言い換えれば、標的ポリヌクレオチドは、アダプターを含むガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクター複合体を、膜アンカーを含むガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクター複合体に「連結する」のに役立つ。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が膜アンカーを含む実施形態では、付着は、タンパク質自体を介して、例えばｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／ｆｌａｇ−ｔａｇ／ｈｉｓ−ｔａｇの使用によって行われ得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、方法は、試料を膜貫通ポアと接触させる前に、試料中の他のポリヌクレオチドから標的ポリヌクレオチドを分離する必要なしに、標的ポリヌクレオチドを選択的に配列決定することができるように、各標的ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドに特異的なガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体でマーキングすることによって膜貫通ポアを用いて標的ポリヌクレオチドを選択的に特徴付けること、例えば配列決定することを含み得る。
【００２７】
例えば、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドのみ膜にテザリングされるように膜アンカーでタグ付けされ得る。試料中の他のポリヌクレオチドは、洗い流され得る。あるいは、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質は、例えば当該技術分野で既知の技法を使用して、試料中のポリヌクレオチドの末端に結合させることができ、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質の移動に必要な補因子を付加することによって、複合体形成後にポリヌクレオチドに沿って移動させることができる。この実施形態では、結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチド結合タンパク質をストールさせる一方、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、非標的ポリヌクレオチドの末端からプロセシングされる。次いで、膜貫通電位が印加されると、電位の力およびポアとの接触は、標的ポリヌクレオチドがポアを通って転座するように、結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を標的ポリヌクレオチドから変位させる。ポリヌクレオチド結合タンパク質が結合していない非標的ポリヌクレオチドは、シグナルが検出されないように、または得られる任意のシグナルが標的ポリヌクレオチドとポアとの相互作用から生じるシグナルから容易に区別することができるように、急速にポアを通過する。標的および非標的ポリヌクレオチドの両方を含む、試料中のポリヌクレオチドの３’末端鎖は、例えばエキソヌクレアーゼを用いて分解され得る。このように、標的ポリヌクレオチドを選択的に特徴付け、例えば配列決定することができる。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、例えばＡＴＰまたは別のヌクレオシドなどの補因子およびγｓＧＴＰを付加することによってポリヌクレオチドに沿って移動させることができる。
【００２８】
別の実施形態では、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を使用して、選択された点でポリヌクレオチドを切断することができる。これは、関心領域に関する方法によって得られる、配列情報などの情報を限定するために使用され得る。例えば、ヌクレアーゼ活性を有する２つのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を用いて、図２７に示されるように目的のポリヌクレオチド断片を得ることができる。代替として、不活性化または無効化ヌクレアーゼ活性を有する修飾ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を用いて上記のようにポリヌクレオチド結合タンパク質をストールさせることができ、第２のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を用いて特徴付けられる断片を切断することができる。この実施形態は、例えば、特にＶ（Ｄ）Ｊレパトア解析用途において有用である。
【００２９】
さらに、いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドを、ポアを通過する電流に対するガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の効果を用いて標的ポリヌクレオチドの存在もしくは不在を決定、定量化、または同定することができるように、タグ付けまたは標識する。
【００３０】
例えば、アダプターは、膜にテザリングされた標的ポリヌクレオチドに結合している場合のみ膜貫通ポアと相互作用するので、ガイドポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、膜アンカーでタグ付けされた標的ポリヌクレオチドを同定するために使用され得るアダプターに付着させることができる。未結合ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、洗い流され得る。各々が異なる標的ポリヌクレオチドについて選択的であり、異なるアダプターを有する、複数のガイドポリヌクレオチドを試料に添加して、膜貫通ポアと相互作用する異なるアダプターによって引き起こされる異なるシグナルに基づいて異なる標的ポリヌクレオチドを検出および／または定量化することができる。
【００３１】
あるいは、標的ポリヌクレオチドに結合しているガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドが膜貫通ポアを通過するときに検出可能なシグナルを生成し得る。膜貫通ポアがガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の通過を可能にするには小さすぎる、例えば二本鎖ではなく一本鎖ポリヌクレオチドの通過を可能にするポアである場合、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質がポアに到達するとき、ポアを通したポリヌクレオチドの移動は遮断される。これはポアを通過する電流に影響を及ぼし、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体の存在を検出することを可能にする。例えば、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、ポアの力および印加電位によって標的ポリヌクレオチドから剥離され（標的ポリヌクレオチドが印加電位によってポアを通って引張られるとき、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体はポアと接触し、標的ポリヌクレオチドに対する継続的な引張は、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体が標的ポリヌクレオチドから締め出される（すなわち、結合解除される）ように、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体をポアに押し付け）、電流中に検出可能なスタッターを生じる。標的ポリヌクレオチドの異なる部分に結合する２つ以上のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、方法において使用され得る。結合ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の各々がポアに到達するとき、それはスタッターを引き起こすであろう。したがって、複数のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを同定することができる。例えば、１つ以上のガイドポリヌクレオチドは、特定の多型が標的ポリヌクレオチド中に存在する場合のみ標的ポリヌクレオチドに結合するように設計され得る。ポリヌクレオチドがポアを通過するときに観察されるスタッターの数、またはポリヌクレオチドがポアを通過するときの特定のスタッターの存在もしくは不在は、多型の存在または不在を示し得る。
【００３２】
膜貫通ポアが、二本鎖ポリヌクレオチドおよび結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の通過を可能にするのに十分に大きい場合、二本鎖ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体のポア通過は、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体がポアを通過するときに認識可能なシグナルを生成するであろう。したがって、１つ以上のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを同定することができる。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、特定の多型が標的ポリヌクレオチド中に存在する場合のみ結合するように設計され得る。標的ポリヌクレオチドがポアを通過するときに観察される結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体に起因するシグナルの数、または標的ポリヌクレオチドがポアを通過するときの特定のシグナルの存在もしくは不在は、多型の存在または不在を示し得る。二本鎖ポリヌクレオチドおよび結合ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の通過を可能にするナノポアとしては、例えば、ナノキャピラリーが挙げられる。したがって、この実施形態では、ポアは膜に含まれていなくてもよい。ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および／または標的ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、典型的には、方法を実施することを可能にするように修飾される。したがって、本発明はまた、修飾ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、ならびに本発明における使用に適したかかるポリヌクレオチドガイドおよびエフェクター分子のパネルを提供する。
【００３３】
方法は、標的ポリペプチドの量または標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を決定することをさらに含み得る。１つ以上の特徴は、典型的には（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。
【００３４】
ステップ（ａ）は、試料を複合体の１つ以上の成分が結合することができるビーズ（例えば、微粒子）と接触させることをさらに含み得る。あるいは、（ａ）で使用される成分のうちの１つ以上、例えば、標的ポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ビーズ（例えば、微粒子）に予備結合させることができる。
【００３５】
試料は、水性媒体中で提供されてもよく、あるいは試料は、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質およびガイドポリヌクレオチドを含む水性媒体に添加されてもよい。水性媒体は、典型的には、膜を挟む電位差の印加後に膜貫通ポアを通してイオン流を提供するためにイオンを含むであろう。水性媒体はまた、典型的にはバッファーを含むであろう。水性媒体は、典型的には、６〜９の範囲のｐＨおよび／またはＮａＣｌなどの１００〜２００ｍＭ塩の範囲のイオン濃度を有する。
【００３６】
ビーズは、典型的には、水性媒体よりも密度が高く、媒体に浸透して膜と接触し、よって膜表面でアンカーに付着している種の濃度を効果的に高める。
【００３７】
方法では、印加される電位は、電圧電位であり得る。代替的には、印加される電位は、化学的電位であり得る。この例は、両親媒性層にわたって塩勾配を使用することである。塩勾配は、例えば、Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７  Ｊｕｌ  １１：１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。
【００３８】
結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の変位が必要とされない実施形態では、ガイドポリヌクレオチドおよび／またはエフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチドに架橋され得る。
【００３９】
本発明の方法では、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドに結合するプローブによって置き換えられ得る。プローブは、酵素と会合していても、していなくてもよい。例えば、プローブは、ＲｅｃＡコーティングプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、γＰＮＡ、三重螺旋ＤＮＡ、またはモルホリノプローブであり得る。プローブは、典型的には、標的ポリヌクレオチド中の配列に相補的な一本鎖領域を含む。プローブは、ループ、例えばヘアピンループなどの二本鎖領域および／もしくは二次構造、または三重螺旋を含み得る。プローブは、典型的には、約８〜約５０、約１０〜約４０、例えば約１５〜約３０、好ましくは約１８〜約２５、例えば１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドの長さを有する。プローブは、それに付着している膜またはアダプターに連結することができるアンカー配列を有し得る。例えば、プローブは、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、またはＲｅｃＡコーティングプローブであり得る。プローブは、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、γＰＮＡ、三重螺旋ＤＮＡ、またはモルホリノプローブであり得る。プローブは、それに付着しているポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質を有し得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、アダプターに含まれるリーダー配列に結合させることができる。
【００４０】
方法では、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、特定のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合するタンパク質によって置き換えられ得る。特定のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合するタンパク質には、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが含まれる。かかるヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド内の特定の部位に結合するように操作することができる。
【００４１】
特定の実施形態では、方法は、試料中の二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）試料を第１のプローブおよび第２のプローブと接触させることであって、第１のプローブおよび第２のプローブが、試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成し、第１のプローブが、標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第１の配列に結合し、膜に連結することができるアンカーを含み、第２のプローブが、標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第２の配列に結合し、アダプター配列を含む、接触させることと、（ｂ）試料を膜貫通ポアと接触させることと、（ｃ）膜貫通ポアに電位を印加することと、（ｄ）複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法であり得る。任意の未結合プローブは、ステップ（ｃ）の前に洗い流され得る。ステップ（ｄ）は、アダプターと膜貫通ポアとの相互作用について監視することを含む。標的ポリヌクレオチド中の第１の配列および第２の配列は、典型的には各々二本鎖ポリヌクレオチドの一部分である。
【００４２】
第２のプローブは、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含み得る。第２のプローブ中のアダプターはリーダー配列を含んでもよく、ポリヌクレオチド結合タンパク質はリーダー配列に結合していてもよく、および／またはアダプターはバーコードを含んでもよい。
【００４３】
方法のステップ（ａ）は、試料を２つ以上の第１のプローブと接触させることであって、２つ以上のプローブが異なる配列に結合する、接触させることを含み得る。方法のステップ（ａ）は、試料および膜貫通ポアを２つ以上の第２のプローブと接触させることを含み得る。典型的には、２つ以上の第２のプローブは、異なるバーコードを含む。
【００４４】
異なる配列に結合するガイドポリヌクレオチドまたはプローブを使用する方法では、それらの配列は、同じ標的ポリヌクレオチド内の異なる標的ポリヌクレオチドに存在してもよく、または標的ポリヌクレオチドに存在し得るＳＮＰなどの代替配列であってもよい。
【００４５】
一実施形態では、方法は、第１および第２のプローブの複数対、例えば２〜５０、３〜４０、４〜３０、５〜２５、６〜１５、または８〜１０対を使用し、各対は、異なる標的ポリヌクレオチドに結合する。代替の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド内の異なるまたは代替の配列を同定するために使用することができる、単一の第１のプローブおよび複数の第２のプローブを使用し得る。
【００４６】
方法を用いて、標的分子のエンリッチメント後の複合体バックグラウンド中に１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０個以上の標的ポリヌクレオチドを検出することができる。一実施形態では、配列決定、例えば、ナノポア配列決定が検出に使用される。したがって、この実施形態では、標的ＤＮＡ分子は、主にその配列によって同定され得る。
【００４７】
方法は、マルチプレックスアッセイとして実施され得る。マルチプレックスアッセイは、異なるバーコードを利用し得る。バーコードは、例えば、各々バーコードをナノポアによって同定することを可能にする別個のヌクレオチド配列を有し得る。一実施形態では、バーコード配列は、試料をガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質と接触させる前に、試料中の全てのポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。第２のバーコードは、試料をガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質と接触させる前に、第２の試料に添加することができる。第１および第２の試料は、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質の添加の前または後、好ましくはガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合した後に組み合わせることができる。試料のプール化が、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合した後に起こる場合、精製ステップ（ストレス、非標的結合タンパク質の除去、および／または非標的ポリヌクレオチドの除去を含む）は、プール化の前または後に実施され得る。複数の試料、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０個の試料は、バーコードで標識され、この方法で組み合わせることができる。この実施形態では、全ての試料は、例えば同じフローセルを使用して、同時に配列決定し、それらのバーコードアダプターを使用して同定することができる。
【００４８】
別の実施形態では、バーコードおよび配列決定アダプターは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合した後に添加され得る。例えば、バーコードおよび配列決定アダプターは、ビーズ上でライゲーションされ得る。標的装填バーコード付き適合ビーズは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合した後、および任意に１つ以上の精製ステップ（ストレス、非標的結合タンパク質の除去、および／または非標的ポリヌクレオチドの除去など）が実施された後に、試料に添加され得る。
【００４９】
方法は、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない、任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および／またはガイドポリヌクレオチド、例えばガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を除去することを含み得る。試料中に存在する、標的ポリヌクレオチドに結合していない、過剰なポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および／またはガイドポリヌクレオチド、例えばガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体とポアとの相互作用を監視するときにバックグラウンドを生成することができる。標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していないガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および／またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／ガイドポリヌクレオチド複合体は、試料中のポリヌクレオチドを表面、例えばビーズまたはカラムに結合することによって、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドを含む複合体から分離され得る。標的ポリヌクレオチドはまた、試料中のガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および／またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／ガイドポリヌクレオチド複合体を表面、例えばビーズまたはカラムに結合することによって、試料中の非標的ポリヌクレオチドから分離され得る。標的ポリヌクレオチド（複数可）は、例えば、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離され得る。
【００５０】
方法は、ステップ（ｂ）の前に標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を選択的に変性することを含み得る。ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体結合の「オフターゲット」効果は、結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体に熱および／または化学ストレスを加えることによって低減され得る。典型的には、この実施形態では、非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、加えられた熱ストレスまたは化学ストレスによって選択的に変性される。適用された熱または化学処理は、遊離ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質（すなわち、試料中のポリヌクレオチドに結合していないが、ガイドポリヌクレオチドに結合していてもよいポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質）および非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質（すなわち、試料中のポリヌクレオチドに非特異的に結合しているポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、または「オフターゲット」ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質）のみが変性されるように選択することができる。標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、熱ストレスまたは化学ストレス中に標的ポリヌクレオチドに結合したままである。任意のオフターゲットポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、試料中のポリヌクレオチドへのその非特異的結合から放出される。一実施形態では、ガイドポリヌクレオチド中の対応する配列に正確に相補的である標的配列に結合しているポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質のみは、ストレス中にポリヌクレオチドに結合したままである。
【００５１】
尿素（例えば最大６Ｍ、５Ｍ、または４Ｍ）、塩酸グアニジニウム、極端なｐＨ（酸性またはアルカリ性、例えばｐＨ６、ｐＨ５、もしくはｐＨ４未満、またはｐＨ８、ｐＨ９、もしくはｐＨ１０超）、または高塩濃度などの任意の適切な化学ストレスを使用することができる。適切な条件は、当業者によって容易に決定され得る。
【００５２】
化学ストレスは、標的ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の特異的結合を破壊することなく、ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の非特異的結合の選択的破壊をもたらす任意の期間にわたって実施され得る。化学ストレスは、約３０秒〜約１０分間、例えば約１分、約２分、約３分、約５分、約６分、約７分、約８分、または約９分間実施されてもよい。
【００５３】
熱ストレスは、任意の適切な温度で実施することができる。典型的には、温度は、ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の非特異的結合を破壊するのに十分高いが、標的ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の特異的結合が破壊されないように十分に低い。例えば、試料は、約４０℃〜約６５℃、約４５℃〜約６５℃、約５０℃〜約６０℃、例えば約５５℃の温度に加熱することができる。
【００５４】
熱ストレスは、標的ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の特異的結合を破壊することなく、ポリヌクレオチドへのポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の非特異的結合の選択的破壊をもたらす任意の期間にわたって実施され得る。熱ストレスは、約３０秒〜約１０分間、例えば約１分、約２分、約３分、約５分、約６分、約７分、約８分、または約９分間実施されてもよい。
【００５５】
過剰の未結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および／またはガイドポリヌクレオチドを除去するために、精製ステップが用いられ得る。これは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩化ナトリウムを試料に添加し、試料中に存在するポリヌクレオチドがビーズに結合するように試料をカルボキシル基でコーティングされた常磁性ビーズと接触させることによって達成され得る。適切なビーズは市販のＳＰＲＩビーズを含み、当該技術分野で既知の標準的なプロトコルが使用され得る。一実施形態では、標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、その後、表面、例えば異なる捕捉ビーズを使用して、非標的ポリヌクレオチドから分離され得る。典型的には、ここで、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を表面に特異的に結合するために使用される結合部分を含有し得る。任意の非結合ポリヌクレオチドは、洗い流され得る。標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、任意の適切な手段によって表面から溶出させることができ、または表面は、例えば表面がビーズである場合、複合体をポアに送達するために使用することができる。
【００５６】
「オフターゲット」効果は、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質上、例えばガイドポリヌクレオチド上の第１の結合部分を用いる、捕捉表面上の標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の精製、標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を溶出すること、およびガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質上、例えばガイドポリヌクレオチド上の第２の結合部分を用いて標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を第２の特異的捕捉表面に移すことによってさらに最小化され得る。これは、例えば、第１の結合部分および第２の結合部分が共に末端伸長部、またはガイドポリヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドに結合することができる他の一本鎖ポリヌクレオチド配列である場合に達成され得る。ガイドポリヌクレオチド上の第１の末端伸長部は、第１の捕捉表面、例えばビーズ上の第１の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、ガイドポリヌクレオチド上の第２の末端伸長部は、第２の捕捉表面、例えばビーズ上の第２の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する。これを構成する１つの方法は、図４４に描写される。図４４では、ｃｒＲＮＡは、ビーズ、カラム、または表面上の標的分子の捕捉に使用される３’ＤＮＡ伸長部（図４４の配列ｄ）を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’ＤＮＡ伸長部（図４４の配列ａ・ｃ）を含む。第１の捕捉表面、例えばビーズからの標的の放出は、トーホールド変位として知られる現象によってもたらされ得る。
【００５７】
標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、まず、第１の末端伸長部に相補的な第１の捕捉オリゴヌクレオチドを担持するビーズ上での捕捉によって非標的ポリヌクレオチドから分離される。非標的ポリヌクレオチドは、洗い流される。標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、ガイドポリヌクレオチド上の第１の末端伸長部とビーズへの結合について競合する競合オリゴヌクレオチドの添加を介した、トーホールド変位によってビーズから溶出され得る。この実施形態では、第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の末端伸長部より長く、第１の配列および第２の配列を含み、第１の配列は、第１の末端伸長部中の配列と相補的であり、第１および第２の配列は、共に競合オリゴヌクレオチドの配列と相補的である。典型的には、第１の配列は、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有し、第２の配列は、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有する。競合オリゴヌクレオチドは、１０〜８０、例えば２０〜６０または３０〜５０ヌクレオチド、例えば４０ヌクレオチドの長さを有し得る。第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、１０〜８０、例えば２０〜６０または３０〜５０ヌクレオチド、例えば４０ヌクレオチドの長さを有し得る。捕捉オリゴヌクレオチドは競合オリゴヌクレオチドと同じ長さを有してもよく、または捕捉オリゴヌクレオチドおよび競合オリゴヌクレオチドが第１および第２の配列の両方にわたって相補的である配列を有するという条件で、捕捉オリゴヌクレオチドは競合オリゴヌクレオチドより長くても短くてもよい。この実施形態では、第１の末端伸長部は、５’末端伸長部の５’末端または３’末端伸長部の３’末端にある、第１の捕捉オリゴヌクレオチド中の配列と相補的でない配列を有する、末端部分、および第１の捕捉オリゴヌクレオチド中の第１の配列と相補的である配列を有する部分を含む。第１の末端伸長部の末端部分は、典型的には、２〜１０ヌクレオチド、例えば３、４、５、または６ヌクレオチドの長さを有し得る。第１の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な第１の末端伸長部の部分は、典型的には、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００５８】
標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の溶出後、複合体は、ガイドポリヌクレオチド上の第２の末端伸長部を介して第２の「送達」ビーズに結合させる。第２の「送達」ビーズは、第２の末端伸長部に相補的な第２の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、５〜４０、例えば１０〜３０もしくは１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さ、または１０〜８０、例えば２０〜６０もしくは３０〜５０ヌクレオチド、例えば４０ヌクレオチドの長さを有し得る。第２の末端伸長部は、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有し得る。第２の捕捉オリゴヌクレオチドは第２の末端伸長部と同じ長さを有してもよく、または第２の捕捉オリゴヌクレオチドおよび第２の末端伸長部が５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドにわたって相補的である配列を有するという条件で、第２の捕捉オリゴヌクレオチドは末端伸長部より長くても短くてもよい。第２末端伸長部は、第１捕捉ヌクレオチド、第１の末端伸長部、または競合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列を有する。第２の捕捉オリゴヌクレオチドはまた、第１の捕捉ヌクレオチド、第１の末端伸長部、または競合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列を有する。
【００５９】
したがって、ガイドポリヌクレオチドが第１の末端伸長部および第２の末端伸長部を含む場合、方法は、ステップ（ｂ）の前に
（ｉ）試料をそれに結合している第１の末端伸長部に相補的な配列を含む第１の捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面と、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体が表面に結合するように接触させることと、
（ｉｉ）表面に結合しているガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体を競合オリゴヌクレオチドと、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体が表面から放出されるように接触させることと、
（ｉｉｉ）ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体をそれに結合している第２の末端伸長部に相補的な配列を含む第２の捕捉オリゴヌクレオチドを有するビーズと、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／標的ポリヌクレオチド複合体がビーズに結合するように接触させることと、任意に
（ｉｖ）ビーズを膜貫通ポアに送達することと、を含み得る。
【００６０】
本発明の異なる実施形態では、（ｉ）熱もしくは化学ストレス、過剰な未結合および／もしくは非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去するための精製、またはトーホールド精製なし、（ｉｉ）熱または化学ストレスのみ、（ｉｉｉ）過剰な未結合および／または非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去するための精製のみ、（ｉｖ）トーホールド精製のみ、（ｖ）熱または化学ストレスならびに過剰な非結合および／または非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去するための精製、（ｖｉ）熱または化学ストレスおよびトーホールド精製、（ｖｉｉ）過剰な非結合および／または非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去するための精製ならびにトーホールド精製、あるいは（ｖｉｉｉ）熱または化学ストレス、過剰な非結合および／または非標的結合ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去するための精製、ならびにトーホールド精製があり得る。
【００６１】
標的ポリヌクレオチド／ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体が結合しているビーズは、複合体をポアに送達するために使用され得る。例えば、ビーズは、磁性であり得、ビーズに結合している標的ポリヌクレオチドは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってポアを含むフローセルのウェル中に引き込まれ得るか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、テザー、例えばビーズを膜にテザリングする、ビーズ上のアダプター末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド−コレステロールテザーを流すことによって開始することができる。あるいは、テザーは、ビーズ−標的ポリヌクレオチドコンジュゲートが添加される前に膜に導入することができる。例えば、アダプター末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド−コレステロールテザーは、ビーズ−標的ポリヌクレオチド（複数可）が添加される前に、泳動用バッファーおよびテザーをフローセルに流すことによってフローセル中の膜に組み込まれ得る。この状況では、ビーズ−標的ポリヌクレオチド（複数可）がフローセルに添加される場合、それらはコレステロールによって膜中にアンカリングされるオリゴヌクレオチドに遭遇するときに膜にテザリングされるようになる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ナノポア配列決定に適合され得る。例えば、試料中の全てのポリヌクレオチドは、方法のステップ（ａ）の前に一方または両方の末端に添加された配列決定アダプターを有し得る。試料中のポリヌクレオチドは、配列決定アダプターの添加の前に断片化され得る。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、ステップ（ａ）後に一方または両方の末端に添加された配列決定アダプターを有し得る。この実施形態では、配列決定アダプターは、非標的ポリヌクレオチドからの標的の分離前または後に添加され得る。配列決定アダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質を含む。配列決定アダプターがステップ（ａ）後に添加されるとき、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／ガイドポリヌクレオチド複合体は標的ポリヌクレオチドに結合したままである。アダプターの結合後、いくつかの実施形態では、一般に、標的ポリヌクレオチドがアダプター添加の前に非標的ポリヌクレオチドから分離された場合、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／ガイドポリヌクレオチド複合体は、アダプターに装填されたポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質によって変位され得る。ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質によるポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質／ガイドポリヌクレオチド複合体の変位は、ポリヌクレオチド結合タンパク質がポリヌクレオチドに沿って移動するのに必要な１つ以上の補因子の添加によって制御することができる。
【００６３】
標的ポリヌクレオチドは、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を介して、表面、例えば、カラムまたはビーズに結合しながら、その自由末端の一方または両方へのアダプターのライゲーションによって、ナノポア配列決定に適合され得る。末端は、アダプター結合を容易にするためにｄＡテール化され得る。
【００６４】
標的ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本の鎖にハイブリダイズされたＲＮＡの１本の鎖を含み得る。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーであり得る。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結した繰り返しＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されている。ＧＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって連結した繰り返しグリコール単位で構成されている。ＴＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって共に連結した繰り返しトレオース糖で構成されている。ＬＮＡは、上記のように、リボース部分における２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋を有するリボヌクレオチドから形成される。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡハイブリッド、最も好ましくはＤＮＡである。標的ポリヌクレオチドは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が結合する二本鎖領域を含む。標的ポリペプチドは、二本鎖であり得る。標的ポリペプチドは、一本鎖領域ならびに他の構造、例えばヘアピンループ、三重螺旋、および／または四重螺旋を有する領域を含み得る。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、同じ鎖上にＤＮＡとＲＮＡとを含み得る。好ましくは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮＡ鎖にハイブリダイズした１つのＤＮＡ鎖を含む。
【００６６】
標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、または少なくとも５００個ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。標的ポリヌクレオチドは、１０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、５０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または１０００００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。標的ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には５０個以下のヌクレオチド、例えば４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、または５個以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。標的オリゴヌクレオチドは、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド長、例えば約２０〜約２５ヌクレオチド長である。例えば、オリゴヌクレオチドは、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０ヌクレオチド長であり得る。
【００６７】
標的ポリヌクレオチドは、疾患および／または微生物に関連するポリヌクレオチドであり得る。
【００６８】
方法は、２〜５０個、３〜４０個、４〜３０個、５〜２５個、６〜１５個、または８〜１０個などの複数の標的ポリヌクレオチドを検出し得る。標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの群であり得る。例えば、群は、特定の表現型に関連付けられ得る。群は、特定の種類の細胞に関連付けられ得る。例えば、群は、細菌細胞を示し得る。群は、ウイルス、真菌、細菌、マイコバクテリウム、または寄生生物を示し得る。
【００６９】
標的ポリヌクレオチドは、特定の疾患または状態に関連するバイオマーカーであるかまたはそれを含む、２つ以上のポリヌクレオチドの群であり得る。バイオマーカーは、疾患または状態を診断または予後診断するために使用することができる。バイオマーカーの適切なパネルは、例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ７，ｐ１８２４−１８３７、Ｊａｃｑｕｅｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８，ｐ２６８７−２６９９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５６，１７７−１８５に記載されるように、当該技術分野で知られている。疾患または状態は、好ましくは、癌、冠状動脈性心疾患および心血管疾患を含む心疾患、または結核もしくは敗血症などの感染性疾患である。
【００７０】
標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、好ましくは、マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。２つ以上の標的ポリヌクレオチドの群は、２つ以上のｍｉＲＮＡの群であり得る。本発明での使用に適したｍｉＲＮＡは、当該技術分野で周知である。例えば、適切なｍｉＲＮＡは、公開されているデータベースに保存される（Ｊｉａｎｇ  Ｑ．，Ｗａｎｇ  Ｙ．，Ｈａｏ  Ｙ．，Ｊｕａｎ  Ｌ．，Ｔｅｎｇ  Ｍ．，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．，Ｌｉ  Ｍ．，Ｗａｎｇ  Ｇ．，Ｌｉｕ  Ｙ．，（２００９）ｍｉＲ２Ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｍａｎｕａｌｌｙ  ｃｕｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）。
【００７１】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドポリヌクレオチドに結合し、ガイドポリヌクレオチドが結合するポリヌクレオチドに結合する任意のタンパク質であり得る。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、非限定的な例として、標的ポリヌクレオチド認識ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。認識ドメインは、ガイドポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）および標的ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を結合する。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の鎖を切断する１つのヌクレアーゼドメインを含有し得るか、または第１のヌクレアーゼドメインが標的ポリヌクレオチドの一方の鎖の開裂のために配置され、第２のヌクレアーゼドメインが標的ポリヌクレオチドの相補鎖の開裂のために配置される、２つのヌクレアーゼドメインを含有し得る。ヌクレアーゼドメインは、活性または不活性であり得る。例えば、ヌクレアーゼドメイン、または２つのヌクレアーゼドメインの一方もしくは両方は、突然変異によって不活性化され得る。
【００７２】
ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むガイドであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、好ましくは、ガイドＲＮＡである。したがって、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、好ましくは、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質である。
【００７３】
ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡに結合する任意のタンパク質であり得る。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、標的ポリヌクレオチドに結合するガイドＲＮＡの領域ではないガイドＲＮＡの領域に結合する。例えば、ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合し、ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ポリヌクレオチドに結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドにも結合する。標的ポリヌクレオチドに結合するガイドＲＮＡの領域は、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質にも結合し得る。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域に結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質が結合する標的ポリヌクレオチドの領域は、典型的には、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする配列の近くに位置する。ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、複合体を形成し、この複合体は、次いでガイドＲＮＡの配列によって決定される部位で標的ポリヌクレオチドに結合する。
【００７４】
ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡが結合する配列の上流または下流に結合し得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡが結合する配列の隣に位置するＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に結合し得る。ＰＡＭは、５’−ＮＧＧ−３’（式中、Ｎは任意の塩基である）、５’−ＮＧＡ−３’、５’−ＹＧ−３’（式中、Ｙはピリミジンである）、５’ＴＴＮ−３’、または５’−ＹＴＮ−３’などの、短い（１０未満、典型的には２〜６塩基対）配列である。異なるＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、異なるＰＡＭに結合する。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、特に、標的がＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである場合、ＰＡＭを含まない標的ポリヌクレオチドに結合し得る。
【００７５】
ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、Ｃａｓタンパク質である。ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃｓｆ１、Ｃｍｒ５、Ｃｓｍ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｅ１、またはＣ２ｃ２であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、またはＣａｓ１０ｄであり得る。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。Ｃａｓ、Ｃｓｎ２、Ｃｐｆ１、Ｃｓｆ１、Ｃｍｒ５、Ｃｓｍ２、Ｃｓｙ１、またはＣｓｅ１は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡ領域を含む場合に使用される。Ｃ２ｃ２は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ領域を含む場合に使用される。
【００７６】
ＲｅｃＡファミリー由来のタンパク質などのＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、ＤＮＡを標的化するために使用され得る。使用され得るＲｅｃＡファミリー由来のタンパク質の例は、ＲｅｃＡ、ＲａｄＡ、およびＲａｄ５１である。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は、無効化され得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの１つ以上の触媒ヌクレアーゼ部位は、不活性化され得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが２つの触媒ヌクレアーゼ部位を含む場合、触媒部位の一方または両方は、不活性化され得る。典型的には、触媒部位の一方は、それが特異的に結合するポリヌクレオチドの一方の鎖を切断し、他方の触媒部位は、ポリヌクレオチドの反対の鎖を切断するであろう。したがって、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域の両方の鎖、一方の鎖を切断するか、またはどちらの鎖も切断しない場合がある。
【００７７】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、非限定的な例として、Ｃａｓ９であり得る。Ｃａｓ９は、標的認識およびヌクレアーゼローブを含む２ローブマルチドメインタンパク質構造を有する。認識ローブは、ガイドＲＮＡおよびＤＮＡを結合する。ヌクレアーゼローブは、標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の開裂のために配置されるＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含有する。Ｃａｓ９の構造は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９に詳述されている。Ｃａｓ９の関連ＰＤＢ参照は、５Ｆ９Ｒ（標的ＤＮＡ開裂のためにプライミングされた単一誘導型ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡと複合した触媒活性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶構造）である。
【００７８】
Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較して低減したオフターゲット結合を示す「特異性強化型」Ｃａｓ９であり得る。かかる「特異性強化型」Ｃａｓ９の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。ＯＮＬＰ１２２９６は、ＴＥＶ開裂可能なリンカーと共にＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグを有するＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａのアミノ酸配列である。
【００７９】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの触媒部位は、突然変異によって不活性化され得る。突然変異は、置換、挿入、または欠失突然変異であり得る。例えば、１つ以上、例えば２、３、４、５、または６つのアミノ酸が、置換または触媒部位に挿入または触媒部位から欠失され得る。突然変異は、触媒部位での単一のアミノ酸の場合、好ましくは置換挿入であり、より好ましくは置換である。当業者であれば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの触媒部位およびそれらを不活性化する突然変異を容易に同定することができるであろう。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、一方の触媒部位はＤ１０での突然変異によって、他方はＨ６４０での突然変異によって不活性化され得る。
【００８０】
標的ポリヌクレオチドを切断しない不活性化（「死んだ」）ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、したがって方向性バイアスを示さない。標的ポリヌクレオチドを切断する活性（「生きた」）ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、切断部位の２つの末端のうちの一方のみに結合したままであり得、したがっていくらかの方向性バイアスを示し得る。
【００８１】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、典型的には、長期間にわたって標的ポリヌクレオチドに結合したままである。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、好ましくは、膜貫通ポアおよび膜貫通電位の不在下で、少なくとも約１〜少なくとも約１０、例えば約２〜約８時間または約４〜約６時間にわたって標的ポリヌクレオチドに結合したままである。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、印加電位下で膜貫通ポアとの相互作用によって標的ポリヌクレオチドから変位され得る。
【００８２】
一実施形態では、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、それが変位されている短期間に標的ポリペプチドを膜貫通ポアに保持し得る。これは、ポアを通過する微量の電流においてスタッターとして見られ得るが、他の手段によって、例えば光学的測定またはトンネリングによっても検出することができる、検出可能なシグナルをもたらす。
【００８３】
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ポリヌクレオチドに沿って移動し、それを遅くする能力を有し得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、摺動分子ブレーキとして作用し得る。この実施形態では、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質は、膜貫通ポア通した標的ポリヌクレオチドまたはガイドＲＮＡの移動を制御するために、モータータンパク質として使用され得る。
【００８４】
ガイドポリヌクレオチド
ガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合することもできる配列を含む。ガイドポリヌクレオチドは、それが標的ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合することを可能にする任意の構造を有し得る。
【００８５】
ガイドポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチド中の約２０ヌクレオチドの配列にハイブリダイズする。ガイドＲＮＡが結合する配列は、約１０〜約４０、例えば約１５〜約３０、好ましくは約１８〜約２５、例えば１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチドの二本鎖領域の一本鎖に相補的である。ガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの配列、またはその中の配列に相補的な、約１０〜約４０、例えば約１５〜約３０、好ましくは約１８〜約２５、例えば１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。相補性の程度は、好ましくは、正確である。
【００８６】
ガイドＲＮＡは、ＰＡＭに対して５’である標的ポリヌクレオチド中の領域に相補的であり得る。これは、標的ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む場合、特にＲＮＡエフェクタータンパク質がＣａｓ９またはＣｐｆ１である場合に好ましい。ガイドＲＮＡは、グアニンに隣接する標的ポリヌクレオチド中の領域に相補的であり得る。これは、標的ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む場合、特にＲＮＡエフェクタータンパク質がＣ２ｃ２である場合に好ましい。
【００８７】
ガイドＲＮＡは、それが標的ポリヌクレオチドおよびＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質に結合することを可能にする任意の構造を有し得る。ガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質に結合する。ガイドＲＮＡの典型的な構造は、当該技術分野で知られている。例えば、ｃｒＲＮＡは、典型的には、一本鎖ＲＮＡであり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的には、一本鎖がｃｒＲＮＡの３’末端に付着している二本鎖領域およびｃｒＲＮＡに付着していない鎖の３’末端にヘアピンループを形成する部分を有する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一片ｓｇＲＮＡとしてインビトロで転写され得る。
【００８８】
ガイドＲＮＡは、追加のＲＮＡ塩基もしくはＤＮＡ塩基または他の核酸塩基などの他の成分を含み得る。ガイドＲＮＡ中のＲＮＡおよびＤＮＡ塩基は、天然塩基または修飾塩基であり得る。ガイドＲＮＡの代わりにガイドＤＮＡが使用され、ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質の代わりにＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質が使用され得る。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、ガイドＤＮＡおよびＤＮＡ誘導型エフェクタータンパク質の使用が好ましいことがある。
【００８９】
ガイドポリヌクレオチドは、本発明の方法における使用のために特異的に修飾され得る。本発明は、（ｉ）任意にリーダー配列を含む、アダプター配列または（ｉｉ）膜に連結することができるアンカーを含む、ガイドポリヌクレオチド、特にガイドＲＮＡを提供する。
【００９０】
本発明のガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）アダプターおよび／または（ｉｉ）膜に連結することができるアンカーが付着されている、本明細書で論じられるガイドポリヌクレオチドのいずれかであり得る。
【００９１】
（ｉ）アンカーまたは（ｉｉ）アダプターは、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端、ｃｒＲＮＡの３’末端、または内部に存在し得、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡはｓｇＲＮＡに含まれる。例えば、図２−４および２５を参照されたい。（ｉ）アンカーまたは（ｉｉ）アダプターは、例えば化学基またはスペーサーを介して、ｃｒＲＮＡの５’末端に添加され得る。（ｉ）アンカーまたは（ｉｉ）アダプターは、化学基またはスペーサーを介してガイドポリヌクレオチドに添加され得る。（ｉ）アンカーまたは（ｉｉ）アダプターは、化学基、例えばチオール、クリック基、ビオチンなどを介するか、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＴＮＡスペーサーを介する、任意の適切な手段、例えばライゲーションによって、ガイドポリヌクレオチドの５’または３’末端、例えばｔｒａｃｒＲＮＡの５’もしくは３’末端、またはｃｒＲＮＡの５’もしくは３’末端に付着してもよい。スペーサーがポリヌクレオチドである場合、スペーサーは、１〜３０、例えば２〜２０、３〜１５、４〜１０、例えば５、６、７、８、または９ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００９２】
アンカーは、ガイドポリヌクレオチド中の末端伸長部または内部ループ配列に相補的であるオリゴヌクレオチド（アンカーオリゴヌクレオチド）に付着してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端、ｃｒＲＮＡの３’末端、またはｃｒＲＮＡの５’末端は、例えば、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有する末端伸長部を有し得る。アンカーオリゴヌクレオチドは末端伸長部と同じ長さを有してもよく、またはアンカーオリゴヌクレオチドおよび末端伸長部が５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さにわたって相補的である配列を有するという条件で、アンカーオリゴヌクレオチドは末端伸長部より長くても短くてもよい。アンカーオリゴヌクレオチドは、例えば、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有し得る。内部ループ配列は、上で特定された長さのいずれかを有し得る。
【００９３】
ガイドポリヌクレオチドは、合成的に修飾され得る。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの５’および３’末端の両方を修飾することができる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｄｏｎｏｒ  ＤＮＡ  ａｒｅ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｅＬＩＦＥ；６：ｅ２５３１２を参照されたい。合成修飾は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＤＮＡスペーサー、ＲＮＡスペーサー、および脱塩基スペーサー、例えばＳｐ１８を含む、ガイドＲＮＡ（またはガイドＤＮＡ）への修飾または人工塩基の組み込みを含み得る。あるいは、修飾は、平面疎水性分子、化学タグ、蛍光分子、アプタマー配列、アミン、アジド、アルキン、チオール、クリック基、ビオチンなどのヌクレオチド塩基と構造的に無関係である化学部分での修飾を含み得る。
【００９４】
本発明のガイドポリヌクレオチドは、それに付着しているポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質を有し得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ガイドＲＮＡの鎖の一方の末端付近に、典型的には５’末端付近に結合させることができる。ポリヌクレオチド結合タンパク質が結合している末端は、典型的には、アダプター、好ましくはリーダー配列を含むアダプターの添加によって修飾される。ガイドＲＮＡがリーダー配列を含む場合、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、典型的には、リーダー配列に結合している。
【００９５】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡを含む場合、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ｃｒＲＮＡに沿って移動することができるように配置され得る。かかるガイドＲＮＡは、複合体の存在または不在を検出するために、ｃｒＲＮＡが膜貫通ポアを通って転座する方法において有用である。
【００９６】
ガイドポリヌクレオチドは、ビーズまたはカラムなどの表面上の標的ポリヌクレオチドの捕捉を可能にするように特異的に適合され得る。これは、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体が結合している標的ポリヌクレオチドを捕捉し、試料中の非標的ポリヌクレオチドから分離することを可能にし、次いでこれを洗い流すことができる。ガイドポリヌクレオチドは、ビーズまたはカラムなどの表面に結合している捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を有する、３’または５’末端の末端伸長部を含み得る。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、親和性タグによって表面に結合させることができる。任意の適切な親和性タグが使用され得る。１つの例は、ビオチン−ストレプトアビジン親和性タグである。捕捉オリゴヌクレオチドは、５〜４０、例えば１０〜３０もしくは１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さ、または１０〜８０、例えば２０〜６０もしくは３０〜５０ヌクレオチド、例えば４０ヌクレオチドの長さを有し得る。末端伸長部は、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有し得る。捕捉オリゴヌクレオチドは末端伸長部と同じ長さを有してもよく、または捕捉オリゴヌクレオチドおよび末端伸長部が５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さにわたって相補的である配列を有するという条件で、捕捉オリゴヌクレオチドは末端伸長部より長くても短くてもよい。
【００９７】
ガイドポリヌクレオチドは、第１の結合部分および第２の結合部分を含み得る。第１の結合部分および第２の結合部分は、共に、ガイドポリヌクレオチド上の、末端伸長部、またはオリゴヌクレオチドに結合することができる他の一本鎖ポリヌクレオチド配列であり得る。ガイドポリヌクレオチド上の第１の末端伸長部は、第１の捕捉表面、例えばビーズ上の第１の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し得、ガイドポリヌクレオチド上の第２の末端伸長部は、第２の捕捉表面、例えばビーズ上の第２の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し得る。これを構成する１つの方法は、図４４に描写される。図４４では、ｃｒＲＮＡは、ビーズ、カラム、または表面上の標的分子の捕捉に使用される３’ＤＮＡ伸長部（図４４の配列ｄ）を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’ＤＮＡ伸長部（図４４の配列ａ・ｃ）を含む。一実施形態では、第１の末端伸長部は、５’末端伸長部の５’末端または３’末端伸長部の３’末端にある、第１の捕捉オリゴヌクレオチド中の配列と相補的でない配列を有する、末端部分、および第１の捕捉オリゴヌクレオチド中の第１の配列と相補的である配列を有する部分を含む。第１の末端伸長部の末端部分は、典型的には、２〜１０ヌクレオチド、例えば３、４、５、または６ヌクレオチドの長さを有し得る。第１の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な第１の末端伸長部の部分は、典型的には、５〜４０、例えば１０〜３０または１５〜２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００９８】
第２末端伸長部は、第１捕捉ヌクレオチド、第１の末端伸長部、または競合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列を有する。第２の捕捉オリゴヌクレオチドはまた、第１の捕捉ヌクレオチド、第１の末端伸長部、または競合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列を有する。末端伸長部は、ガイドポリヌクレオチドの５’または３’末端、例えばｔｒａｃｒＲＮＡの５’もしくは３’末端またはｃｒＲＮＡの５’もしくは３’末端などに付着させることができる。末端伸長部は、任意の適切な手段によってガイドポリヌクレオチドに付着させることができる。末端伸長部は、例えば、化学基もしくはスペーサー、例えばライゲーションを介して、化学基、例えばチオール、クリック基、ビオチンなどを介して、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＴＮＡスペーサーを介して添加することができる。スペーサーがポリヌクレオチドである場合、スペーサーは、１〜３０、例えば２〜２０、３〜１５、４〜１０、例えば５、６、７、８、または９ヌクレオチドの長さを有し得る。末端伸長部は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端、ｃｒＲＮＡの３’末端、ｃｒＲＮＡの５’末端に存在してもよく、または例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれる場合、ガイドＲＮＡに内部的に添加された配列によって置換されてもよい。例については図４１および４４を参照されたい。内部配列が末端伸長部について本明細書に記載される機能を果たすために使用される場合、それは典型的にはガイドポリヌクレオチド内のループ構造中に存在するか、またはそうでなければ捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションのためにアクセス可能である。
【００９９】
本発明は、本明細書で定義されるポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合している本発明のガイドポリヌクレオチドも提供する。
【０１００】
本発明によって、ガイドポリヌクレオチド、好ましくは本発明のガイドＲＮＡのパネル、および本発明のガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、好ましくはガイドＲＮＡ／ＲＮＡ誘導型エフェクタータンパク質複合体のパネルも提供される。ガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体のパネルは、キットに含まれ得る。
【０１０１】
本発明のパネルは、本発明のガイドポリヌクレオチド、ならびに本発明の方法において共に使用され得るガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質のパネルを含み得る。ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体中に存在し得る。
【０１０２】
パネルは、膜に連結することができるアンカーを含む第１のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、およびアダプターを含む第２ガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を含むことができ、第１のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体および第２のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、同じ標的ポリヌクレオチド中の異なる配列に結合する。パネルは、２〜５０個、３〜４０個、４〜３０個、５〜２５個、６〜１５個、または８〜１０個などの、複数のかかる第１および第２のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を含み得る。パネルが複数の第１および第２のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を含む場合、各第２のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、典型的には異なるアダプターを含む。これは、パネルが試料中に存在する異なる標的ポリヌクレオチド間を区別することを可能にする。
【０１０３】
パネルは、標的ポリヌクレオチドの第１の配列に結合する第１のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、および標的ポリヌクレオチドの第２の配列に結合する第２のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を含み得る。同じ標的ポリヌクレオチドのさらなる配列に結合するさらなるガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体がパネルに含まれ得る。第１の、第２の、およびさらなるガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、同じもしくは異なるアダプターを含んでもよく、またはアダプターを含まなくてもよい。第１のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、膜アンカーを含むことができ、第２のおよび／またはさらなるガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、同じアダプターまたは、好ましくは異なるアダプターを含み得る。
【０１０４】
アダプターは、パネルが、信号、例えば標的ポリヌクレオチドのポアへの通過をストールさせるガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体によって、またはポアを通過する結合ガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体によって引き起こされる、ポアを通過する電流の変化を検出することによって、膜貫通ポアと相互作用する標的ポリヌクレオチドに結合しているガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体の効果を検出する方法における使用のためである、ガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体に含まれる必要はない。
【０１０５】
第１の、第２の、および／またはさらなるガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドの同じ部分に結合し得るが、各々標的ポリヌクレオチドのその部分に存在する異なる多型に特異的であり得る。この実施形態では、異なる多型に特異的な各ガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体は、異なるアダプターおよび／またはリーダー配列を含み得る。本発明の方法は、異なるアダプター間および／または異なるリーダー配列間で区別することができ、したがって多型を同定するために使用することができる。
【０１０６】
パネルは、第１の標的ポリヌクレオチドに結合する第１のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、および第２の標的ポリヌクレオチドに結合する第２のガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体を含み得る。さらなる標的ポリヌクレオチドに結合するさらなるガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体がパネルに含まれ得る。例えば、第１の、第２の、および／またはさらなるガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、各々アンカーおよび／または他の結合部分に連結され得る。かかるパネルは、例えば配列決定による、さらなる特徴付けのために、試料中の複数の目的のポリヌクレオチドを膜貫通ポアに送達するのに有用であろう。例えば、かかるパネルは、目的の複数のポリヌクレオチドについて選択し、それらを膜貫通ポアを含む膜に、試料中の他のポリヌクレオチドが膜電位の印加の前に洗い流され得るようにテザリングするであろう。
【０１０７】
試料
試料は、任意の適切な試料であり得る。試料は、典型的には、標的ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含有することが知られているか、または含有するらしいと疑われるものである。方法は、膜貫通ポアへの送達のための標的ポリヌクレオチドを選択するのに使用することができる。試料の他の成分は洗い流され得、例えば、それらは膜貫通ポアを含む細胞から洗い流され得る。かかる他の成分は、下記：折り畳まれても折り畳まれなくてもよいタンパク質、ペプチド、炭水化物、非標的ポリヌクレオチドなどのポリマー、および細胞破片のうちの１つ以上を含む。
【０１０８】
試料は、生体試料であり得る。本発明は、任意の有機体または微生物から得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。有機体または微生物は、典型的には、古細菌、原核生物、または真核生物であり、典型的には、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、および原生生物界の５つの界のうちの１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。
【０１０９】
試料は、好ましくは、流体試料である。試料は、典型的には、体液を含む。体液は、ヒトまたは動物から得ることができる。ヒトまたは動物は、疾患を有するか、それを有する疑いがあるか、またはその危険性がある場合がある。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、または羊水であり得るが、好ましくは、全血、血漿、または血清である。典型的には、試料は、ヒト由来であるが、代替的には、別の哺乳動物由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、もしくはブタなどの商業的家畜由来であってもよく、またはあるいは、ネコもしくはイヌなどの愛玩動物由来であってもよい。
【０１１０】
代替的には、植物由来の試料は、典型的には、穀物、豆果、果物、または野菜などの商業的作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿、茶、またはコーヒーから得られる。
【０１１１】
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは、液体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲料水、海水、または河川水、および臨床検査用の試薬が挙げられる。
【０１１２】
試料は、典型的には、アッセイされる前に、例えば、遠心分離によって、または不必要な分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜への通過によって処理され得る。試料は、採取された直後に測定されてもよい。試料はまた、典型的には、アッセイの前に、好ましくは−７０℃未満で保管され得る。
【０１１３】
試料は、ゲノムＤＮＡを含み得る。ゲノムＤＮＡは、断片化されてもよく、または方法のステップ（ａ）は、ゲノムＤＮＡを断片化することをさらに含んでもよい。ＤＮＡは、任意の適切な方法によって断片化され得る。例えば、ＤＮＡを断片化する方法は、当該技術分野で知られている。かかる方法は、ＭｕＡトランスポザーゼなどのトランスポザーゼを使用し得る。
【０１１４】
試料は、Ｔ細胞ＤＮＡを含み得る。
【０１１５】
試料は、非標的ポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、標的ポリヌクレオチドおよび非標的ポリヌクレオチドは、同じ遺伝子またはゲノムに由来し得る。
【０１１６】
複合体とポアとの相互作用の監視
方法は、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドによって形成された複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して、複合体の存在または不在を決定することを含む。効果は、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドが膜貫通ポアと相互作用することによって形成された複合体を示す。効果は、複合体、標的ポリヌクレオチド、またはガイドポリヌクレオチドの成分のうちの１つに付着しているアダプターのポアを通る転座によって引き起こされ得る。効果は、複合体、標的ポリヌクレオチド、またはガイドポリヌクレオチドの成分のうちの１つに付着しているアダプターのポアを通る転座を示す。
【０１１７】
効果は、電気的測定および／または光学的測定を使用して監視され得る。この場合、効果は、電気的または光学的量における１つ以上の測定された変化である。
【０１１８】
電気的測定は、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定であり得る。
【０１１９】
効果は、電流、抵抗、または光学特性の変化をもたらす膜貫通ポアを通るイオン流の変化であり得る。効果は、膜貫通ポアにわたる電子トンネル効果であり得る。効果は、複合体と膜貫通ポアとの相互作用による電位の変化であり得、効果は、ＦＥＴ測定において局在電位センサーを用いて監視される。
【０１２０】
アダプター
アダプターは、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド領域を含み得る。一本鎖ポリヌクレオチドは、それらがポアを通過することができ、異なる方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼす少なくとも２つの異なる領域に容易に分類することができるので、有用である。例えば、異なる配列を有するポリヌクレオチドの異なる領域は、典型的には異なる方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼす。少なくとも２つの異なる領域は、好ましくは異なるヌクレオチドの少なくとも２つのストレッチに対応する。例えば、一本鎖ポリヌクレオチド領域は、アデニンヌクレオチドのストレッチおよび脱塩基ヌクレオチドのストレッチを含み得る。各ストレッチは、異なる方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼすであろう。
【０１２１】
あるいは、異なるヌクレオチドの少なくとも２つのストレッチは、異なるポリヌクレオチドバーコードである。ポリヌクレオチドバーコードは、当該技術分野において周知である（Ｋｏｚａｒｅｗａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３，ｐ２７９−２９８）。バーコードは、特異的かつ既知の方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼすポリヌクレオチドの特異的な配列である。
【０１２２】
アダプターは、ポアを通過することができない二本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。かかる二本鎖領域の存在は、領域中の鎖のうちの１つが電位の影響下でプローブから剥離されるときにアダプターがポアを通って移動するのを遅延させ得る。かかる遅延は、検出可能なシグナル、例えばポアを通って流れる電流の変化を生じる。二本鎖領域の長さは、遅延の長さを使用してポアと相互作用するアダプターを同定することができるように、異なるポリヌクレオチドアダプター間で変動し得る。二本鎖領域の典型的な長さは、約４〜約５０塩基対、例えば５、６、７、８、９、もしくは１０〜２０、３０、もしくは４０塩基対、または４〜５０の任意の整数である。
【０１２３】
アダプター中に１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチド領域を含めることは、ガイドポリヌクレオチドのパネル中のアダプターの集団から得ることができる可能な信号の数を増加させ、よって本発明の方法を用いてアッセイすることができる標的ポリヌクレオチドの数を増加させる。
【０１２４】
二本鎖ポリヌクレオチド領域は、例えば、本発明に従って読みとられ得るように、ガイドポリヌクレオチドを示すバーコードなどのアダプターの特定の領域を、ポアのバレルまたはチャネル中に保持するために使用され得る。
【０１２５】
アダプターは、ヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は、典型的には、複素環である。核酸塩基には、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシンが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、典型的には、五炭糖である。ヌクレオチド糖は、リボースおよびデオキシリボースを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸、または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着され得る。
【０１２６】
ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、および５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。アダプター中のヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは、脱塩基であり得る（例えば、核酸塩基を欠く）。ヌクレオチドは、追加の修飾を含んでもよい。特に、好適な修飾ヌクレオチドには、２’−アミノピリミジン（例えば、２’−アミノシチジンおよび２’−アミノウリジン）、２’−ヒドロキシルプリン（例えば、２’−フルオロピリミジン（例えば、２’−フルオロシチジンおよび２’フルオロウリジン）、ヒロドキシルピリミジン（例えば、５’−α−Ｐ−ボラノウリジン）、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｏ−メチルウリジン）、４’−チオピリミジン（例えば、４’−チオウリジンおよび４’−チオシチジン）が含まれ、ヌクレオチドは、核酸塩基（例えば、５−ペンチニル−２’−デオキシウリジン、５−（３−アミノプロピル）−ウリジンおよび１，６−ジアミノヘキシル−Ｎ−５−カルバモイルメチルウリジン）の修飾を有するが、これらに限定されない。
【０１２７】
アダプターは、１つ以上の異なるヌクレオチド種を含み得る。例えば、Ｔ  ｋ−ｍｅｒ（例えば、ＴＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、およびＣＴＡなどの中心ヌクレオチドがチミンベースであるｋ−ｍｅｒ）は、典型的には、最も低い電流状態を有する。Ｔヌクレオチドの修飾版は、電流状態をさらに低減し、それによってアダプターがポアを通って移動するときに見られる全電流範囲を増加させるために、修飾ポリヌクレオチドに導入され得る。
【０１２８】
Ｇ  ｋ−ｍｅｒ（例えば、ＴＧＡ、ＧＧＣ、ＴＧＴ、およびＣＧＡなどの中心ヌクレオチドがグアニンベースであるｋ−ｍｅｒ）は、ｋ−ｍｅｒ中の他のヌクレオチドによって強く影響される傾向があり、したがって修飾ポリヌクレオチド中のＧヌクレオチドを修飾することは、それらがより多くの独立した電流位置を有するのを助け得る。
【０１２９】
３つの異なる種の代わりに同じヌクレオチド種の３つのコピーを含めることは、その後、例えば、修飾ポリヌクレオチド中の３ヌクレオチドｋ−ｍｅｒをマッピングすることのみ必要であるため、特徴付けを容易にし得る。しかしながら、かかる修飾は、アダプターによって提供される情報を低減する。
【０１３０】
脱塩基ヌクレオチドと共に１つ以上のヌクレオチド種をアダプター中に含めることは、特徴的な電流スパイクをもたらす。これは、アダプター中の１つ以上のヌクレオチド種の位置の明確な強調を可能にする。
【０１３１】
アダプター中のヌクレオチド種は、化学原子または基、例えばプロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基、またはプロパルギルアミン基を含み得る。化学基または原子は、蛍光分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）、光解離性基、アルキン、ＤＢＣＯ、アジド、遊離アミノ基、酸化還元色素、水銀原子、またはセレン原子であるか、それらを含み得る。
【０１３２】
アダプターは、ハロゲン原子を含むヌクレオチド種を含み得る。ハロゲン原子は、核酸塩基および／または糖などの異なるヌクレオチド種上の任意の位置に付着させることができる。ハロゲン原子は、好ましくは、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、またはヨウ素（Ｉ）である。ハロゲン原子は、最も好ましくは、ＦまたはＩである。
【０１３３】
アダプターは、四重螺旋を形成することができる配列を含み得る。四重螺旋は、４つの配列鎖から形成される三次元構造である。四重螺旋は、ポアの最も狭い部分を通って転座または移動することができない。四重螺旋は、ポアの最も狭い部分よりも広い。例えば、野生型α−ＨＬポアの最も狭い部分は、直径１．３ｎｍである。α−ＨＬ−ＮＮポアの最も狭い部分は、直径１．５ｎｍである。これらのポアのいずれかが本発明において使用される場合、四重螺旋は、好ましくは、１．３ｎｍ超、例えば１．５ｎｍ超、例えば２ｎｍ超、３ｎｍ超、または５ｎｍ超の幅を有する。当業者であれば、使用されているポアに適したサイズの四重螺旋を設計することができるであろう。四重螺旋形成配列は、それが四重螺旋に形成されない場合、ポアの最も狭い部分を通って転座または移動することができる。四重螺旋形成配列は、好ましくは、ポリヌクレオチドである。それは、本明細書で論じられるポリヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１３４】
四重螺旋は、任意の種類の四重螺旋であり得る。四重螺旋は、二分子四重螺旋または四分子四重螺旋などの分子間四重螺旋であり得る。四重螺旋形成配列は、好ましくは、分子内四重螺旋を形成することができる。
【０１３５】
四重螺旋形成配列は、好ましくは、（Ｇ−テトラッドまたはＧ４−ＤＮＡとしても知られる）Ｇ−四重螺旋を形成することができる。これらは、グアニンが豊富であり、四本鎖構造を形成することができるポリヌクレオチド配列である。４つのグアニン塩基は、フーグスティーン水素結合を通して会合してグアニンテトラッドと呼ばれる正方平面構造を形成することができ、２つ以上のグアニンテトラッドは、互いの上に重なってＧ−四重螺旋を形成することができる。四重螺旋構造は、各対のテトラッド間の中心チャネルに位置する、カチオン、特にカリウムの存在によってさらに安定化される。Ｇ−四重螺旋を形成することは、当該技術分野で周知である（Ｍａｒａｔｈｉａｓ  ａｎｄ  Ｂｏｌｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００；２８（９）：１９６９−１９７７、Ｋａｎｋｉａ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，１０７９９−１０８０４、およびＭａｒｕｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，１−１１）。
【０１３６】
四重螺旋形成配列は、より好ましくは、配列Ｇａ、続いてＮｂ、続いてＧｃ、続いてＮｄ、続いてＧｅ、続いてＮｆ、続いてＧｇを含み、Ｇは、グアニンを含むヌクレオチドであり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、ｂ、ｄ、およびｆは、２〜５０である。ａ、ｃ、ｅ、およびｇの値は、同一であり得る。Ｇは、好ましくは、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、ジデオキシグアノシン一リン酸、Ｎ２−メチル−ＧＭＰ、Ｎ２−メチル−ｃＧＭＰ、Ｎ２−メチル−ｄＧＭＰ、Ｎ２−メチル−ジデオキシグアノシン一リン酸、Ｎ２−メチル−０６−メチル−ＧＭＰ、Ｎ２−メチル−０６−メチル−ｃＧＭＰ、Ｎ２−メチル−０６−メチル−ｄＧＭＰ、Ｎ２−メチル−０６−メチル−ジデオキシグアノシン一リン酸、２’−Ｏ−メチル−ＧＭＰ、２’−Ｏ−メチル−ｃＧＭＰ、２’−Ｏ−メチル−ｄＧＭＰ、２’−Ｏ−メチル−ジデオキシグアノシン一リン酸、６−チオ−ＧＭＰ、６−チオ−ｃＧＭＰ、６−チオ−ｄＧＭＰ、６−チオ−ジデオキシグアノシン一リン酸、７−メチル−ＧＭＰ、７−メチル−ｃＧＭＰ、７−メチル−ｄＧＭＰ、７−メチル−ジデオキシグアノシン一リン酸、７−デアザ−ＧＭＰ、７−デアザ−ｃＧＭＰ、７−デアザ−ｄＧＭＰ、７−デアザ−ジデオキシグアノシン一リン酸、８−オキソ−ＧＭＰ、８−オキソ−ｃＧＭＰ、８−オキソ−ｄＧＭＰ、または８−オキソ−ジデオキシグアノシン一リン酸である。
【０１３７】
適切な四重螺旋形成配列は、ＷＯ２０１４／０７２７０３に開示されている。
【０１３８】
四重螺旋は、ポアの最も狭い部分を通って転座することができないので、ブレーキのように作用し、アダプターまたはガイドポリヌクレオチドの別の、典型的には一本鎖の領域をポアの最も狭い部分に保持する。アダプター領域は、次いで、ガイドポリヌクレオチド、したがって複合体中の標的ポリヌクレオチドを同定する特有の電流を生じる。しばらくすると、四重螺旋は、典型的には、印加電位の影響下で不安定化し、展開するであろう。四重螺旋のブレーキ作用は、したがって、典型的には一時的である。折り畳まれていない四重螺旋形成配列は、典型的には、印加電位の影響下でポアを通って転座または移動する。
【０１３９】
連結
ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドを含む複合体は、アンカーを用いて膜に連結させることができる。複合体を膜に連結するために、１つ以上のアンカーが使用され得る。典型的には、１つ以上のアンカーは、標的ポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質上などの複合体の同じ成分上に存在する。あるいは、１つ以上のアンカーは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質上などの異なる成分上に存在し得る。
【０１４０】
膜がトリブロックコポリマー膜などの両親媒性層である場合、１つ以上のアンカーは、好ましくは、膜に挿入することができるポリペプチドアンカーおよび／または疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質、またはアミノ酸、例えば、コレステロール、パルミチン酸、またはトコフェロールである。好ましい実施形態では、１つ以上のアンカーは、ポアではない。
【０１４１】
両親媒性分子、コポリマー、または脂質などの膜の成分は、１つ以上のアンカーを形成するように化学修飾または官能化され得る。好適な化学修飾および膜の成分の官能化の好適な方法は、以下により詳細に論じられる。任意の割合、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または１００％の膜成分が官能化され得る。
【０１４２】
１つ以上のアンカーは、好ましくはリンカーを含む。１つ以上のアンカーは、１つ以上、例えば２、３、４つ、またはそれ以上のリンカーを含み得る。１つのリンカーを用いて、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の両方を膜に連結させることができる。
【０１４３】
好ましいリンカーには、ポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、およびポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。これらのリンカーは、線状、分岐、または環状であり得る。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補的配列にハイブリダイズし得る。
【０１４４】
１つ以上のアンカーまたは１つ以上のリンカーは、切断または分解することができる成分、例えば制限部位または光解離性基を含み得る。
【０１４５】
官能化リンカー、およびそれらが分子に連結し得る方法は、当該技術分野で既知である。例えば、マレイミド基で官能化されたリンカーは、タンパク質中のシステイン残基と反応し、それに付着することになる。
【０１４６】
ポリヌクレオチドの架橋は、「鍵と鍵穴」配置を使用して回避することができる。各リンカーの一方の末端のみが共に反応してより長いリンカーを形成し得、リンカーの他方の末端は、それぞれポリヌクレオチドまたは膜と各々反応する。かかるリンカーは、ＷＯ２０１０／０８６６０２に記載されている。
【０１４７】
本発明の配列決定方法では、リンカーの使用が好ましい。ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用する際に切り離さないという意味で、永久的に膜に直接連結している場合、配列決定ランは膜とポアとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、いくらかの配列データは失われるであろう。リンカーが使用される場合、ポリヌクレオチドは完了するまで処理されることができる。
【０１４８】
連結は、永久的であるか、または安定であり得る。換言すれば、連結は、複合体がポアと相互作用する際に膜に連結したままであるようなものであり得る。
【０１４９】
連結は、一時的であり得る。換言すれば、連結は、複合体がポアと相互作用する際に膜から減連結し得るようなものであり得る。複合体検出およびポリヌクレオチド配列決定について、一時的性質の連結が好ましい。永久的または安定リンカーがポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに直接付着し、リンカーが膜と膜貫通ポアのチャネルとの間の距離よりも短い場合、配列決定ランはポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、いくらかの配列データは失われるであろう。連結が一時的である場合、連結した末端がランダムに膜から分離されると、ポリヌクレオチドは完了するまで処理することができる。永久的／安定または一時的連結を形成する化学基は、以下により詳細に論じられる。複合体は、コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜に一時的に連結され得る。ヘキサデカン酸などの６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を使用することができる。
【０１５０】
好ましい実施形態では、アンカーは、複合体をトリブロックコポリマー膜または脂質二分子層などの両親媒性層に連結させる。核酸の合成脂質二分子層への連結は、以前に、様々な異なるテザリング方法を用いて実施されてきた。これらを以下の表１にまとめる。
【表１】
2019532642.tif 000002
【０１５１】
合成ポリヌクレオチドおよび／またはリンカーは、コレステロール、トコフェロール、パルミチン酸、チオール、脂質、およびビオチン基などの好適なアンカー基の直接付加のために容易に適合可能である、修飾ホスホロアミダイトを合成反応中に使用して官能化され得る。これらの異なる結合化学は、ポリヌクレオチドへの付着のための一式のオプションを与える。欠く異なる修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドに連結し、連結は、必ずしも永久的ではないため、ポリヌクレオチドについて異なる滞留時間を膜に与える。
【０１５２】
ポリヌクレオチドのリンカーまたは官能化膜への連結はまた、いくつかの他の手段によって達成することができるが、但し、相補的反応性基またはアンカー基がポリヌクレオチドに付加され得ることを条件とする。ポリヌクレオチドのいずれかの末端への反応性基の付加は、以前に報告されている。チオール基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを使用して、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加することができる（Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｐ．Ｚ．Ｑｉｎ（２００７）．”Ａ  ｆａｃｉｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｔｔａｃｈｉｎｇ  ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ  ｓｐｉｎ  ｌａｂｅｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ５’  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５（１０）：ｅ７７）。Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用して、アジド基をｓｓＤＮＡのｄｓＤＮＡの５’−リン酸に付加することができる。チオールまたはクリックケミストリーを使用して、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳ、もしくはマレイミド基（チオールに対して反応性）、またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオキシチン（ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｘｔｙｎｅ））、もしくはアルキン基（アジドに対して反応性）のいずれかを含有するテザー（ｔｅｔｈｅｒ）は、ポリヌクレオチドに共有付着させることができる。ビオチン、チオール、およびフルオロフォアなどの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むために、ターミナルトランスフェラーゼを使用して付加することができる（Ｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｐ．Ｔｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）．”Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６９（２）：３７６−８２）。任意の他のポリヌクレオチドについて、ストレプトアビジン／ビオチンおよび／またはストレプトアビジン／デスチオビオチン連結を使用することができる。アンカーは、好適に修飾されたヌクレオチド（例えば、コレステロールまたはパルミチン酸塩）と共にターミナルトランスフェラーゼを使用して、ポリヌクレオチドに直接付加され得ることも可能であり得る。
【０１５３】
１つ以上のアンカーは、ハイブリダイゼーションを介して複合体を膜に連結させ得る。ハイブリダイゼーションは、１つ以上のアンカーと標的ポリヌクレオチドもしくはガイドポリヌクレオチドとの間、１つ以上のアンカー内、または１つ以上のアンカーと膜との間にあり得る。１つ以上のアンカーにおけるハイブリダイゼーションは、上記のような一時的な方法での連結を可能にする。例えば、リンカーは、共にハイブリダイズされた２つ以上のポリヌクレオチド、例えば３、４、または５つのポリヌクレオチドを含み得る。１つ以上のアンカーは、標的またはガイドポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る。１つ以上のアンカーは、標的またはガイドポリヌクレオチドに直接、ポリヌクレオチドに付着しているＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に直接、またはポリヌクレオチドに付着しているヘアピンループアダプターに直接ハイブリダイズし得る。あるいは、１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドに付着しているＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に、またはポリヌクレオチドに付着しているヘアピンループアダプターにハイブリダイズされる、１つ以上、例えば２または３つの中間ポリヌクレオチド（または「スプリント」）にハイブリダイズされ得る。
【０１５４】
１つ以上のアンカーは、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。アンカーの一部は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分析物にライゲーションされ得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用して報告されている（Ｔｒｏｕｔｔ，Ａ．Ｂ．，Ｍ．Ｇ．ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．”Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ＰＣＲ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９（２０）：９８２３−５）。代替的には、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかを、二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションし、その後２本の鎖を熱変性または化学的変性によって分離することができる。二本鎖ポリヌクレオチドに、一本鎖ポリヌクレオチドの片を二本鎖の末端の一方または両方に付加するか、または二本鎖ポリヌクレオチドを一方または両方の末端に付加するかのいずれかが可能である。一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加について、これは、一本鎖ポリヌクレオチドの他の領域へのライゲーションのためのＴ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用して達成することができる。二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加について、次いでライゲーションは、（コンカテマーまたはダイマー形成を防止するために多くの試料調製用途について日常的に行われるように）それぞれポリヌクレオチド上の相補的３’ｄＡ／ｄＴテールおよび付加されたポリヌクレオチドで、またはポリヌクレオチドの制限消化および適合性アダプターのライゲーションによって生成された「粘着末端」を使用して、「平滑末端化」することができる。次いで、二本鎖が融解すると、各一本鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに使用された場合、５’または３’修飾のいずれかを有することになり、二本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに使用された場合、５’末端、３’末端、またはその両方における修飾を有することになる。
【０１５５】
ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、ポリヌクレオチドの化学合成中に１つ以上のアンカーが組み込まれ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、反応性基が付着したプライマーを使用して合成することができる。
【０１５６】
アデニル化ポリヌクレオチドは、ライゲーション反応における中間体であり、アデノシン−一リン酸がポリヌクレオチドの５’−リン酸に付着している。この中間体の生成のために様々なキット、例えばＮＥＢの５’  ＤＮＡ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔが利用可能である。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、反応性基（例えばチオール、アミン、ビオチン、アジドなど）のポリヌクレオチドの５’への付加が可能となり得る。アンカーは、好適に修飾されたヌクレオチド（例えば、コレステロールまたはパルミチン酸塩）と共に５’ＤＮＡアデニル化キットを使用して、ポリヌクレオチドに直接付加することができることも可能であり得る。
【０１５７】
ゲノムＤＮＡの部分の増幅のための一般的な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することである。ここでは、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡの同じ区画のいくつかのコピーを生成することができ、各コピーについて、二本鎖中の各鎖の５’が、合成ポリヌクレオチドとなる。ポリメラーゼを用いることによって、単一または複数のヌクレオチドを一本鎖または二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加することができる。使用することができるポリメラーゼの例としては、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、コレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチン、または脂質などのアンカーが二本鎖ポリヌクレオチド内に組み込まれ得る。したがって、増幅ポリヌクレオチドの各コピーは、アンカーを含有することになる。
【０１５８】
理想的には、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを官能化することを必要とせずに膜に連結する。これは、ポリヌクレオチド結合タンパク質または化学基などの１つ以上のアンカーを膜に連結させ、１つ以上のアンカーをポリヌクレオチドと相互作用させることによって、または膜を官能化することによって達成することができる。１つ以上のアンカーは、本明細書に記載される方法のいずれかによって膜に連結し得る。とりわけ、１つ以上のアンカーは、マレイミド官能化リンカーなどの１つ以上のリンカーを含み得る。この実施形態では、ポリヌクレオチドは、典型的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡであり、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。この実施形態は、ゲノムＤＮＡポリヌクレオチドに特に適している。
【０１５９】
１つ以上のアンカーは、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列、もしくはポリヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドのパターンに連結（ｃｏｕｐｌｅ）するか、それに結合（ｂｉｎｄ）するか、もしくはそれと相互作用する任意の基、またはポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドを含み得る。
【０１６０】
アンカーにおける使用に適した結合タンパク質には、以下に列挙されるものを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ  Ｖ  ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質、および他の古細菌、原核生物、または真核生物の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（または核酸）結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
特定のヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、または複製開始因子によって認識される配列であり得る。修飾ヌクレオチドのパターンは、メチル化または損傷のパターンであり得る。
【０１６２】
１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドに連結（ｃｏｕｐｌｅ）するか、結合（ｂｉｎｄ）するか、それにインターカレートするか、またはそれと相互作用する任意の基を含み得る。基は、静電気、水素結合、またはファンデルワールス相互作用を介してポリヌクレオチドにインターカレートするかまたはそれと相互作用する。かかる基には、リジンモノマー、ポリ−リジン（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡと相互作用することになる）、臭化エチジウム（ｄｓＤＮＡにインターカレートすることになる）、ユニバーサル塩基またはユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る）、およびオスミウム錯体（メチル化塩基に対して反応し得る）が含まれる。ポリヌクレオチドは、したがって、膜に付着した１つ以上のユニバーサルヌクレオチドを使用して膜に連結し得る。各ユニバーサルヌクレオチドは、１つ以上のリンカーを使用して膜に連結し得る。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、以下の核酸塩基、ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール、またはフェニル（Ｃ６芳香族環）のうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、以下のヌクレオシド、２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース、およびピロリジンのうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２’−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、ＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは、ｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
【０１６３】
１つ以上のアンカーは、フーグスティーン水素結合（２つの核酸塩基が水素結合によって共に保持されている）、または逆フーグスティーン水素結合（一方の核酸塩基が他方の核酸塩基に対して１８０°回転している）を介して、ポリヌクレオチドに連結（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））し得る。例えば、１つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドとフーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合を形成する１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のオリゴヌクレオチド、または１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。これらの種類の水素結合は、第３のポリヌクレオチド鎖が二本鎖ヘリックスに巻き付き、三本鎖を形成することを可能にする。１つ以上のアンカーは、二本鎖構造と共に三本鎖を形成することによって、二本鎖ポリヌクレオチドに連結（ｃｏｕｐｌｅ）（または結合（ｂｉｎｄ））し得る。
【０１６４】
この実施形態では、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または１００％の膜成分が官能化され得る。
【０１６５】
１つ以上のアンカーがタンパク質を含むとき、それらは、例えば、膜と適合可能である外部疎水性領域を既に有する場合、さらなる官能化なしで膜中に直接アンカリングすることができることがある。かかるタンパク質の例としては、膜貫通タンパク質、膜内タンパク質、および膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、タンパク質は、膜に適合する遺伝的に融合された疎水性領域によって発現され得る。かかる疎水性タンパク質領域は、当該技術分野で既知である。
【０１６６】
１つ以上のアンカーは、好ましくは、膜への送達前にポリヌクレオチドと混合されるが、１つ以上のアンカーは、膜と接触させ、その後ポリヌクレオチドと接触させることができる。
【０１６７】
別の態様では、ポリヌクレオチドは、それが特異的結合基によって認識され得るように、上記の方法を使用して官能化されてもよい。具体的には、ポリヌクレオチドは、（ストレプトアビジンへの結合のための）ビオチン、（マルトース結合タンパク質または融合タンパク質への結合のための）アミロース、（ポリ−ヒスチジンまたはポリ−ヒスチジンタグ付きタンパク質への結合のための）Ｎｉ−ＮＴＡ、または（抗原などの）ペプチドなどのリガンドで官能化され得る。
【０１６８】
好ましい実施形態に従い、１つ以上のアンカーを使用して、ポア内に優先的に入るリーダー配列にポリヌクレオチドが付着しているときに、ポリヌクレオチドを膜に連結させることができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポア内に優先的に入るリーダー配列に付着（例えばライゲーション）している。かかるリーダー配列は、ホモポリマーポリヌクレオチドまたは脱塩基領域を含み得る。リーダー配列は、典型的には、直接、または１つ以上の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）を介して、１つ以上のアンカーにハイブリダイズするように設計される。かかる実例において、１つ以上のアンカーは、典型的には、リーダー配列中の配列または１つ以上の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）中の配列に対して相補的ポリヌクレオチド配列を含む。かかる実例において、１つ以上のスプリントは、典型的には、リーダー配列中の配列に対して相補的ポリヌクレオチド配列を含む。
【０１６９】
ポリヌクレオチドを両親媒性層などの膜に連結するための以上に論じられる方法のいずれも、もちろん他のポリヌクレオチドおよび膜の組み合わせに適用することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、トリブロックコポリマー層または脂質二分子層などの両親媒性層に連結している。かかるポリヌクレオチドの化学的結合のための様々な方法論が利用可能である。化学的結合に使用される分子の例は、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド）である。反応性基は、市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、部品番号２２９８０）を使用してポリヌクレオチドの５’に付加することもできる。好適な方法には、ヒスチジン残基およびＮｉ−ＮＴＡを使用する一時的親和性結合、ならびに反応性システイン、リジン、または非天然型アミノ酸によるより強固な共有結合が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
リーダー配列
リーダー配列は、典型的には、ポリマーを含むポリマーは、好ましくは、負に荷電されている。ポリマーは、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、修飾ポリヌクレオチド（例えば、脱塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを含む一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ＤＮＡの一本鎖、例えばポリｄＴセクションを含む。リーダー配列は、好ましくは、１つ以上のスペーサーを含む。
【０１７１】
リーダー配列は、任意の長さであり得るが、典型的には、１０〜１５０ヌクレオチド長、例えば２０〜１５０ヌクレオチド長である。リーダーの長さは、典型的には、本方法に使用される膜貫通ポアに依拠する。
【０１７２】
リーダー配列は、膜貫通ポア中に優先的に進み、それによってポアを通るポリヌクレオチドの移動を促進する。リーダー配列は、本明細書で論じられるようにポリヌクレオチドを１つ以上のアンカーに連結させるのに使用することもできる。
【０１７３】
配列決定アダプター−Ｙアダプター
ナノポア配列決定に使用するためのＹ−プアダプターは、当該技術分野において既知である。Ｙアダプターは、典型的には、（ａ）二本鎖領域と、（ｂ）一本鎖領域または他方の末端において相補的ではない領域とを含む。Ｙアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハングを有するとして記載され得る。Ｙアダプター中の非相補領域の存在は、二本鎖部分とは異なり２本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないため、アダプターにＹ形状を与える。Ｙアダプターは、１つ以上のアンカーを含み得る。
【０１７４】
Ｙアダプターは、好ましくは、ポア内に優先的に入るリーダー配列を含む。
【０１７５】
Ｙアダプターおよび／またはヘアピンループは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。アダプターの一方または両方は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼ、および９ｏＮ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用してライゲーションされ得る。あるいは、アダプターは、以下に論じられる方法を使用してポリヌクレオチドに付加され得る。
【０１７６】
好ましい実施形態では、方法は、一方の末端にＹアダプター、および他方の末端にヘアピンループを含むように、試料中の二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することを含む。任意の修飾方法を使用することができる。方法は、好ましくは、二本鎖標的ポリヌクレオチドを修飾することを含む。
【０１７７】
二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをＭｕＡトランスポザーゼおよび二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させることによって、Ｙアダプターおよびヘアピンループなどのアダプター、またはアンカーを備えてもよい。トランスポザーゼは、二本鎖ポリヌクレオチドを断片化し、ＭｕＡ基質を断片の一方または両方の末端にライゲーションさせる。これは、アダプターまたはアンカーを含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、次いで、本発明の方法を使用して調査され得る。
【０１７８】
これらのＭｕＡに基づく方法は、ＷＯ２０１５／０２２５４４およびＷＯ２０１６／０５９３６３に開示されている。それらは、ＷＯ２０１５／１５０７８６にも詳細に議論されている。
【０１７９】
二本鎖ポリヌクレオチドは、一方の末端にＹアダプター、および他方の末端にヘアピンループを備えてもよい。例えば、集団中のある割合のＭｕＡ基質は、リーダー配列を含むＹアダプターであり得、集団中のある割合の基質は、ヘアピンループであり得る。
【０１８０】
Ｙアダプターは、アダプターが付着している二本鎖領域が巻き戻されるときに明らかになる捕捉配列、親和性タグ、またはポアテザーを含み得る。捕捉配列またはタグは、二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖がポアを通過するときに二本鎖ポリヌクレオチドが巻き戻される場合に二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖がナノポアから拡散するのを防止するように機能し、ポアは、テザーに結合するか、またはＹアダプター中の捕捉配列に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチド、Ｙアダプター上のタグの親和性パートナーでタグ付けされている。
【０１８１】
ヘアピンループ
ナノポア配列決定に使用するためのヘアピンループアダプターは、当該技術分野において既知である。ヘアピンループは、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に提供することができ、方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドの一端にヘアピンループを有するポリヌクレオチドを提供することをさらに含む。ポリヌクレオチドの２つの鎖は、一端でヘアピンループと連結され得る。
【０１８２】
好適なヘアピンループは、当該技術分で既知の方法を使用して設計することができる。ヘアピンループは、任意の長さであり得る。ヘアピンループは、典型的には、１１０ヌクレオチド長以下、例えば１００ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、２０ヌクレオチド長以下、または１０ヌクレオチド長以下である。ヘアピンループは、好ましくは、約１〜１１０、２〜１００、５〜８０、または６〜５０ヌクレオチド長である。ループがアダプターの分別選択性に関与する場合、ヘアピンループのより長い長さ、例えば５０〜１１０ヌクレオチドが好ましい。同様に、ループが下記の選択的結合に関与していない場合、ヘアピンループのより短い長さ、例えば１〜５ヌクレオチドが好ましい。
【０１８３】
ヘアピンループは、ポリヌクレオチドのいずれかの末端、例えば５’末端または３’末端に提供され得る。ヘアピンループは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。ヘアピンループは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼ、および９ｏＮ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用してライゲーションされ得る。
【０１８４】
配列決定によってポリヌクレオチドを特徴付ける方法において、ヘアピンループによって連結された二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して分離され得る。ポリヌクレオチドの２つの鎖は、次いで、一度に１つずつポアを通して移動させる。この方法で二本鎖構造体上の両方の鎖を結合し、調べることは、特徴付けの効率および精度を増加させる。
【０１８５】
ヘアピンループは、好ましくは、選択的結合部分を含む。これは、ポリヌクレオチドが精製または単離されることを可能にする。選択的結合部分は、その結合特性に基づいて選択され得る部分である。したがって、選択的結合部分は、好ましくは、表面に特異的に結合する部分である。それが、本発明に使用される任意の他の部分よりもはるかに大きい程度で表面に結合する場合、選択的結合部分は表面に特異的に結合する。好ましい実施形態では、部分は、本発明に使用される他の部分が結合しない表面に結合する。
【０１８６】
好適な選択的結合部分は、当該技術分野で既知である。好ましい選択的結合部分には、ビオチン、ポリヌクレオチド配列、抗体、抗体断片、例えばＦａｂおよびＳｃＳｖ、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテール、ならびにＧＳＴタグが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい選択的結合部分は、ビオチンおよび選択的ポリヌクレオチド配列である。ビオチンは、アビジンでコーティングされた表面に特異的に結合する。選択的ポリヌクレオチド配列は、相同配列でコーティングされた表面に特異的に結合する（例えば、ハイブリダイズする）。代替的には、選択的ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド結合タンパク質でコーティングされた表面に特異的に結合する。
【０１８７】
ヘアピンループおよび／または選択的結合部分は、切断、ニック、開裂、または加水分解され得る領域を含み得る。かかる領域は、ポリヌクレオチドを精製または単離後に結合している表面から除去することを可能にするように設計することができる。好適な領域は、当該技術分野で既知である。好適な領域には、ＲＮＡ領域、デスチオビオチンおよびストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合、ならびに光開裂可能な領域が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８８】
ビーズ
ビーズ、典型的にはマイクロ粒子を使用して、複合体を膜貫通ポアに送達することができる。これは、ＷＯ２０１６／０５９３７５に記載されている。本発明の方法では、任意の数のマイクロ粒子を使用することができる。例えば、方法は、単一のマイクロ粒子、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、１，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００、５００，０００、もしくは１，０００，０００個以上のマイクロ粒子を使用し得る。２つ以上のマイクロ粒子が使用される場合、マイクロ粒子は同じであり得る。あるいは、異なるマイクロ粒子の混合物が使用され得る。
【０１８９】
各マイクロ粒子は、付着している１つの複合体を有し得る。あるいは、各マイクロ粒子は、２つ以上の複合体、例えば付着している３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上、１０００，０００個以上、または５０００，０００個以上のポリヌクレオチドを有し得る。マイクロ粒子は、複合体で実質的にまたは完全にコーティングまたは被覆され得る。マイクロ粒子は、その表面の実質的に全部または全部にわたって付着している複合体を有し得る。マイクロ粒子は、アダプターを介して複合体に付着させることができる。アダプターは、Ｙアダプターまたはヘアピンアダプターであり得る。
【０１９０】
複合体は、その成分のうちの任意の１つ以上を介してマイクロ粒子に付着させることができる。ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および／または標的ポリヌクレオチドは、マイクロ粒子に付着させることができる。例えば、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、ガイドポリヌクレオチド、および／または標的ポリヌクレオチドは、マイクロ粒子の表面に結合するであろう付着している結合部分を有し得る。
【０１９１】
適切な結合部分の例には、タンパク質結合タグ（ストレプトタグ、フラッグタグなど）、共役結合体（ポリヌクレオチド、ポリマー、ビオチン、ペプチド）、およびアミノ酸（システイン、Ｆａｚなど）が含まれる。
【０１９２】
複合体は、２つ以上のマイクロ粒子に付着させることができる。
【０１９３】
微粒子は、そのサイズが典型的にはマイクロメートル（μｍ）で測定される微細粒子である。微粒子は、マイクロスフェアまたはマイクロビーズとしても知られている場合がある。微粒子は、ナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、そのサイズが典型的にはナノメートル（ｎｍ）で測定される微細粒子である。
【０１９４】
マイクロ粒子は、典型的には、約０．００１μｍ〜約５００μｍの粒径を有する。例えば、ナノ粒子は、約０．０１μｍ〜約２００μｍまたは約０．１μｍ〜約１００μｍの粒径を有し得る。より多くの場合、マイクロ粒子は、約０．５μｍ〜約１００μｍ、または例えば約１μｍ〜約５０μｍの粒径を有する。マイクロ粒子は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの粒径を有し得る。
【０１９５】
マイクロ粒子は、球状または非球状であり得る。球状マイクロ粒子は、マイクロスフェアと呼ばれ得る。非球状粒子は、例えば板状、針状、不規則、または管状であり得る。本明細書で使用される「粒径」という用語は、粒子が球状である場合は粒子の直径を意味し、粒子が非球状である場合は体積基準の粒径を意味する。体積基準の粒径は、問題の非球状粒子と同じ体積を有する球の直径である。
【０１９６】
方法において２つ以上のマイクロ粒子が使用される場合、マイクロ粒子の平均粒径は、約０．５μｍ〜約５００μｍなどの、上記に論じられるサイズのうちのいずれかであり得る。２つ以上のマイクロ粒子の集団は、好ましくは、５％以下または２％以下などの１０％以下の変動係数（平均に対する標準偏差の比）を有する。
【０１９７】
マイクロ粒子のサイズを決定するために任意の方法が使用され得る。適切な方法としては、フローサイトメトリーが挙げられるが、これに限定されない（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１１  Ｊｕｎ；９（６）：１２１６−２４参照）。
【０１９８】
マイクロ粒子は、任意の材料から形成され得る。マイクロ粒子は、好ましくは、セラミック、ガラス、シリカ、ポリマー、または金属から形成され得る。ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、ポリラクチド、アガロース、セルロース、デンプン、もしくはキトサンなどの天然ポリマー、またはポリウレタン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、シラン、もしくはメタクリレートなどの合成ポリマーであり得る。適切なマイクロ粒子は、当該技術分野において知られ、市販されている。セラミックおよびガラスマイクロスフェアは、３Ｍ（登録商標）から市販されている。シリカおよびポリマーマイクロ粒子は、ＥＰＲＵＩ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ＆Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄから市販されている。マイクロ粒子は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも市販されている。
【０１９９】
マイクロ粒子は、固体であり得る。マイクロ粒子は、中空であり得る。マイクロ粒子は、ポリマー繊維から形成され得る。
【０２００】
マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドを抽出および単離するために使用されるキットから誘導され得る。
【０２０１】
マイクロ粒子の表面は、分析物と相互作用し、これを付着することができる。表面は、官能化なしに、ポリヌクレオチドなどの分析物と自然に相互作用し得る。マイクロ粒子の表面は、典型的には、分析物の付着を容易にするために官能化される。適切な官能化は、当該技術分野において知られている。例えば、マイクロ粒子の表面は、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジンタグ、６×Ｈｉｓタグ、Ｈｉｓ６タグ、またはＨｉｓ−ｔａｇ（登録商標））、Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡなど）、カルボキシル基、第４級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧオクタペプチド、ポリヌクレオチド結合タンパク質（以下に論じられるもののいずれかを含む）、ペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片で官能化され得る。マイクロ粒子はまた、本明細書で論じられるリンカーまたは基のいずれかで官能化され得る。
【０２０２】
マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドに特異的に結合する分子または基で官能化され得る。この例では、マイクロ粒子に付着され、膜貫通ポアに送達されるであろうポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと呼ばれ得る。これは、マイクロ粒子が他のポリヌクレオチドを含有する試料から標的ポリヌクレオチドを選択または捕捉することを可能にする。分子または基は、標的ポリヌクレオチドには優先的なまたは高い親和性で結合するが、他のもしくは異なるポリヌクレオチドには結合しないか、または低い親和性でのみ結合する場合、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する。分子または基は、１×１０−６Ｍ以下、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、またはより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合する場合、優先的なまたは高い親和性で結合する。分子または基は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合する場合、低い親和性で結合する。
【０２０３】
好ましくは、分子または基は、標的ポリヌクレオチドに、他のポリヌクレオチドについてのその親和性よりも大きい、少なくとも１０倍、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００倍である親和性で結合する。親和性は、蛍光および放射性同位体を利用するものなどの既知の結合アッセイを用いて測定することができる。競合結合アッセイも当該技術分野において知られている。ペプチドまたはタンパク質とポリヌクレオチドとの間の結合強度は、Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．４：３１５−３１７．（２００７）に記載されているようにナノポア力分光法を用いて測定することができる。
【０２０４】
マイクロ粒子は、標的ポリヌクレオチドもしくはガイドポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするか、または標的ポリヌクレオチドもしくはガイドポリヌクレオチドの一部分もしくは領域に相補的である一部分もしくは領域を含む、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドで官能化され得る。これは、マイクロ粒子が他のポリヌクレオチドを含有する試料から標的ポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチドを選択または捕捉することを可能にする。
【０２０５】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対して優先的なまたは高い親和性でハイブリダイズするが、他のポリヌクレオチドに実質的にハイブリダイズしない、ハイブリダイズしない、または低い親和性でハイブリダイズするとき、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに、他の配列についてのそのＴｍよりも高い、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、または少なくとも１０℃である、融解温度（Ｔｍ）でハイブリダイズする場合、特異的にハイブリダイズする。より好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに、他の核酸についてのそのＴｍよりも高い、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃、または少なくとも４０℃である、Ｔｍでハイブリダイズする。好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに、１つ以上のヌクレオチド、例えば１、２、３、４、または５つ以上のヌクレオチドだけ標的ポリヌクレオチドとは異なる配列についてのそのＴｍよりも高い、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃、または少なくとも４０℃である、Ｔｍでハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチドに、少なくとも９０℃、例えば少なくとも９２℃または少なくとも９５℃のＴｍでハイブリダイズする。Ｔｍは、ＤＮＡマイクロアレイの使用を含む、既知の技法を用いて実験的に測定することができ、またはインターネット上で入手可能なものなどの公的に入手可能なＴｍ計算機を用いて計算することができる。
【０２０６】
ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェントな条件下、例えば３７℃の３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、および１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液の存在下で実施し、続いて５０℃の１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）〜２×（０．３３Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）で２０回洗浄することができる。ハイブリダイゼーションは、中等度ストリンジェントな条件下、例えば３７℃の４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、および１％ＳＤＳのバッファー溶液の存在下で実施し、続いて５５℃の０．５×（０．０８２５Ｍ  Ｎａ＋）〜１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣで洗浄することができる。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェントな条件下、例えば３７℃の５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液の存在下で実施し、続いて６０℃の０．１×（０．０１６５Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣで洗浄することができる。
【０２０７】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチドの一部分または領域に実質的に相補的である一部分または領域を含み得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域または部分は、したがって、標的ポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド中の部分または領域と比較して５、１０、１５、２０、２１、２２、３０、４０、または５０ヌクレオチドの領域にわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の不一致を有し得る。
【０２０８】
領域の一部分は、典型的には、５０ヌクレオチド以下、例えば４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、または５ヌクレオチド以下である。
【０２０９】
マイクロ粒子は、好ましくは、常磁性または磁性である。マイクロ粒子は、好ましくは、常磁性もしくは超常磁性材料、または鉄などの常磁性もしくは超常磁性金属を含む。任意の適切な磁性マイクロ粒子が使用され得る。例えば、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、およびＮＥＢから市販されている磁性ビーズが使用され得る。いくつかの実施形態では、マイクロ粒子は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレート基などの有機基が付着している磁性粒子を含む。有機成分は、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｉ、−Ｓ（＝Ｏ）２−、および−Ｓ−から選択される基を含み得る。有機成分は、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）などの金属キレート基を含み得る。通常、金、鉄、ニッケル、またはコバルトなどの金属も、金属キレート基に付着している。この種の磁性ビーズは、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を捕捉するために一般的に使用されているが、本発明における使用にも適している。
【０２１０】
マイクロ粒子は、最も好ましくは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＨｉｓ−Ｔａｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）、ＩＢＡからのＭａｇ  Ｓｔｒｅｐビーズ、ＮＥＢからのストレプトアビジン磁性ビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒからの固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ、またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
【０２１１】
膜
本発明に従い、任意の膜を使用することができる。好適な膜は、当該技術分野で周知である。膜は、好ましくは、両親媒性層または固体層である。
【０２１２】
両親媒性層は、親水および親油特性の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成された層である。両親媒性分子は、合成または天然であり得る。非天然型両親媒性物質および単分子層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で既知であり、例えば、ブロックコポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７−１０４５０）が含まれる。ブロックコポリマーは、２つ以上のモノマーサブユニットが共に重合されて単一のポリマー鎖を作成する、ポリマー材料である。ブロックコポリマーは、典型的には、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない固有の特性を有し得る。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットのうちの１つが疎水性（例えば、親油性）である一方、他のサブユニット（複数可）が水性媒体中で親水性であるように操作することができる。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を保有し得、生体膜を模倣する構造を形成し得る。ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）であり得るが、３つ以上のモノマーサブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置でもあり得る。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、またはペンタブロックコポリマーであってもよい。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
【０２１３】
古細菌二極性テトラエーテル脂質は、脂質が単分子層膜を形成するように構築される天然型脂質である。これらの脂質は、一般に、厳しい生物環境で生き残る好極限性細菌、好熱菌、好塩菌、および好酸球において見出される。それらの安定性は、最終二分子層の融合性質から得られると考えられている。一般モチーフ親水性−疎水性−親水性を有するトリブロックポリマーを作製することによってこれらの生物学的存在を模倣するブロックコポリマーを構築することは簡単である。この材料は、脂質二分子層と同様に挙動するモノマー膜を形成し、ベシクルから層状膜に至るまで幅広い相挙動を包含し得る。これらのトリブロックコポリマーから形成された膜は、生体脂質膜に対していくつかの利点を有する。トリブロックコポリマーは合成されているため、その性格な構造を慎重に制御して、膜を形成し、ポアおよび他のタンパク質と相互作用するために必要とされる正しい鎖長および特性を提供することができる。
【０２１４】
ブロックコポリマーはまた、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構築されてもよく、例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作製され得る。ブロックコポリマーの親水性サブセクションはまた、低いタンパク質結合特性を保有し得、これは、生の生体試料に曝露されたときに高度に耐性である膜の作製を可能にする。このヘッドグループ単位はまた、非分類脂質ヘッド基に由来してもよい。
【０２１５】
トリブロックコポリマー膜はまた、生体脂質膜と比較して増加した機械的および環境的安定性、例えば、はるかに高い動作温度またはｐＨ範囲を有する。ブロックコポリマーの合成性質は、ポリマー系膜を幅広い用途のためにカスタマイズする基盤を提供する。
【０２１６】
膜は、最も好ましくは、ＷＯ２０１４／０６４４４３またはＷＯ２０１４／０６４４４４に開示されている膜のうちの１つである。
【０２１７】
両親媒性分子は、複合体への連結を促進するように化学修飾または官能化され得る。
【０２１８】
両親媒性層は、一分子層または二分子層であり得る。両親媒性層は、典型的には、平面である。両親媒性層は、湾曲してもよい。両親媒性層は、支持されてもよい。両親媒性層は、凹面であってもよい。両親媒性層は、（ピラーに付着している）両親媒性層の周辺領域が両親媒性層領域よりも高くなるように隆起ピラーから吊り下げられてもよい。これは、マイクロ粒子が上記のような膜に沿って移動、移動、摺動、または転動することを可能にし得る。
【０２１９】
両親媒性膜は、典型的には、天然に移動性であり、約１０−８ｃｍ  ｓ−１の脂質拡散速度を有する２次元流体として本質的に作用する。これは、ポアおよび連結した複合体が、典型的には、両親媒性膜内で移動することができることを意味する。
【０２２０】
膜は、脂質二分子層膜であり得る。脂質二分子層は、細胞膜のモデルであり、幅広い実験研究のための優秀な基盤として働く。例えば、脂質二分子層は、シングルチャネルレコーディングによる膜タンパク質のインビトロ調査のために使用することができる。代替的には、脂質二分子層は、幅広い物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使用することができる。脂質に二分子層は、任意の脂質二分子層であり得る。好適な脂質二分子層には、平面脂質二分子層、支持二分子層、またはリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。脂質二分子層は、好ましくは、平面脂質二分子層である。適切な脂質二分子層は、ＷＯ２００８／１０２１２１、ＷＯ２００９／０７７７３４、およびＷＯ２００６／１００４８４に開示されている。
【０２２１】
脂質二分子層を形成するための方法は、当該技術分野で既知である。脂質二分子層は、Ｍｏｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２；６９：３５６１−３５６６）の方法によって一般に形成され、この方法において、脂質一分子層は、水溶液／空気界面上で、その界面に対して直角な孔の両側を通り過ぎて担持される。脂質は、通常、最初にそれを有機溶媒中に溶解し、次いで少量の溶媒を孔の両側で水溶液の界面上で蒸発させることによって、電解質水溶液の界面に添加される。いったん有機溶媒が蒸発すると、孔の両側の溶液／空気界面は、二分子層が形成されるまで、孔を通り過ぎて物理的に上下に動かされる。平面脂質二分子層は、膜内の孔にわたって、または陥凹部内への開口部にわたって形成され得る。
【０２２２】
Ｍｏｎｔａｌ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒの方法は、費用効果があり、かつタンパク質ポア挿入のために好適である高品質の脂質二分子層を形成する比較的簡単な形成方法であるため、普及している。二分子層形成の他の一般的な方法には、先端浸漬（ｔｉｐ−ｄｉｐｐｉｎｇ）、二分子層の塗装（ｐａｉｎｔｉｎｇ  ｂｉｌａｙｅｒｓ）、およびリポソーム二分子層のパッチクランプが含まれる。
【０２２３】
先端浸漬二分子層形成は、孔表面（例えば、ピペット先端）を、脂質の一分子層を担持する試験溶液の界面上に接触させることを伴う。ここでまた、脂質一分子層は、有機溶媒中に溶解した少量の脂質を溶液界面において蒸発させることによって、溶液／空気界面において最初に生成される。次いで、二分子層は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｓｃｈａｅｆｅｒプロセスによって形成され、孔を溶液界面に対して移動させるために機械的自動化を必要とする。
【０２２４】
二分子層の塗装について、有機溶媒中に溶解した少量の脂質が孔に直接塗布され、これが、試験水溶液中に沈められる。脂質溶液は、塗装用刷毛などを使用して孔にわたって薄く広げられる。溶媒を薄くすることは、脂質二分子層の形成をもたらす。しかしながら、二分子層からの溶媒の完全な除去は困難であり、したがって、この方法によって形成された二分子層は安定性が低く、電気化学的測定中にノイズを生じやすい。
【０２２５】
パッチクランプは、生体細胞膜の研究において一般的に使用される。細胞膜は吸引によりピペットの端部に留められ、孔にわたって膜のパッチが付着する。この方法は、リポソームを留め、それが次いで破裂してピペットの孔にわたる脂質二分子層シールを残すことにより、脂質二分子層を生成するために適合されてきた。この方法は、安定した、巨大かつ単層のリポソームと、ガラス表面を有する材料における微小孔を作ることとを必要とする。
【０２２６】
リポソームは、超音波処理、押出、またはＭｏｚａｆａｒｉ法によって形成することができる（Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｉｃｒｏｎ  ３８：８４１−８４７）。
【０２２７】
好ましい実施形態では、脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４に記載されるように形成される。有利には、本方法において、脂質二分子層は、乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態では、脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４に記載されるように、開口部にわたって形成される。
【０２２８】
脂質二分子層は、脂質の２つの対向する層から形成される。２つの脂質層は、それらの疎水性テール基が互いに向き合って疎水性の内部を形成するように配置される。脂質の親水性ヘッド基は、二分子層の両側で水性環境に向かって外側に向いている。二分子層は、液体不規則相（流体層状）、液体規則相、固体規則相（層状ゲル相、交互ゲル相）、および平面二分子層結晶（層状サブゲル相、層状結晶相）を含むがこれらに限定されないいくつかの脂質相中に存在し得る。
【０２２９】
脂質二分子層を形成する任意の脂質組成物を使用することができる。脂質組成物は、必要とされる特性、例えば表面荷電、膜タンパク質を支持する能力、充填密度、または機械的特性を有する脂質二分子層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１つ以上の異なる脂質を含んでもよい。例えば、脂質組成物は、最大で１００種の脂質を含有し得る。脂質組成物は、好ましくは、１〜１０種の脂質を含有する。脂質組成物は、天然型脂質および／または人工脂質を含んでもよい。
【０２３０】
脂質は、典型的には、ヘッド基、界面部分、および同じであるかまたは異なり得る２つの疎水性テール基を含む。好適なヘッド基には、中性ヘッド基、例えばジアシルグリセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）；双イオン性ヘッド基、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）；負に荷電したヘッド基、例えばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）、および  カルジオリピン（ＣＡ）；ならびに正に荷電したヘッド基、例えばトリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。好適な界面部分には、天然型界面部分、例えばグリセロール系またはセラミド系部分が含まれるが、これらに限定されない。好適な疎水性テール基には、飽和炭化水素鎖、例えばラウリン酸（ｎ−ドデカノール酸（ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ミリスチン酸（ｎ−テトラデコノニン酸（ｎ−Ｔｅｔｒａｄｅｃｏｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）、およびアラキジン酸（ｎ−エイコサン酸）、不飽和炭化水素鎖、例えばオレイン酸（シス−９−オクタデカン酸）、ならびに分岐炭化水素鎖、例えばフィタノイルが含まれるが、これらに限定されない。鎖の長さ、ならびに不飽和炭化水素鎖中の二重結合の位置および数は変化し得る。鎖の長さ、ならびに分岐炭化水素鎖中のメチル基などの分岐の位置および数は変化し得る。疎水性テール基は、エーテルまたはエステルとして界面部分に結合し得る。脂質は、ミコール酸であり得る。
【０２３１】
脂質はまた、化学修飾されてもよい。脂質のヘッド基またはテール基は、化学修飾され得る。そのヘッド基が化学修飾されている好適な脂質には、ＰＥＧ修飾脂質、例えば１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ  −［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］；官能化ＰＥＧ脂質、例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３  ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］；ならびにコンジュゲーションのために修飾された脂質、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）が含まれるが、これらに限定されない。そのテール基が化学修飾されている好適な脂質には、重合性脂質、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル（ｔｒｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｙｌ））−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；フッ化脂質、例えば１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；重水素化脂質、例えば１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；およびエーテル結合脂質、例えば１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが含まれるが、これらに限定されない。脂質は、複合体への連結を促進するように化学修飾または官能化され得る。
【０２３２】
両親媒性層、例えば、脂質組成物は、典型的には、層の特性に影響を与える１つ以上の添加剤を含む。好適な添加剤には、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸；脂肪アルコール、例えばパルミチン酸アルコール、ミリスチン酸アルコール、およびオレイン酸アルコール；ステロール、例えばコレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロール、およびスチグマステロール；リゾリン脂質、例えば１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ならびにセラミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３３】
固体層は、微細電子材料、絶縁材料、例えばＳｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３、およびＳｉＯ、有機および無機ポリマー、例えばポリアミド、プラスチック、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）またはエラストマー、例えば二成分付加硬化シリコンゴム、およびガラスを含むがこれらに限定されない有機および無機材料の両方から形成することができる。固体層は、グラフェンから形成され得る。適切なグラフェン層は、ＷＯ２００９／０３５６４７に開示されている。Ｙｕｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１；６：２５３−２６０および米国特許出願第２０１３／００４８４９９号は、マイクロ粒子の使用なしでの固体層中の膜貫通ポアへのタンパク質の送達を記載している。本発明の方法は、これらの文献に開示されている方法における送達を改善するために使用され得る。
【０２３４】
本方法は、典型的には、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然型脂質二分子層、または（ｉｉｉ）ポアが内部に挿入された細胞を使用して実施される。本方法は、典型的には、人工両親媒性層、例えば人工トリブロックコポリマー層を使用して実施される。層は、ポアに加えて、他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質、ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、以下に論じられる。本発明の方法は、典型的には、インビトロで実施される。
【０２３５】
複合体が送達される膜は、典型的には、液体中に含まれる。液体は、膜を「濡れた」状態に保ち、それが乾燥するのを止める。液体は、典型的には、水溶液である。水溶液は、典型的には、水と同じ密度を有する。水溶液の密度は、典型的には、約１ｇ／ｃｍ３である。溶液の密度は、溶液の温度および正確な組成に応じて変動し得る。水溶液は、典型的には、約０．９７〜約１．０３ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
【０２３６】
膜は、典型的には、２つの体積の水溶液を分離する。膜は、体積間の電流の流れに抵抗する。膜中に挿入された膜貫通ポアは、膜にわたるイオンの通過を選択的に可能にし、これは２つの体積の水溶液中の電極によって検出された電気信号として記録することができる。標的ポリヌクレオチドを含む複合体の存在は、イオンの流れを調節し、結果として生じる電気信号の変動を観察することによって検出される。
【０２３７】
アレイ
膜は、典型的には、各膜が好ましくは膜貫通ポアを含む、膜のアレイの一部である。したがって、本発明は、膜のアレイを使用して標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
【０２３８】
膜は、アレイが試験試料から並行して測定する多くの個別のセンサーと等価であるように、各々その独自の電極を使用して個別にアドレス指定される、電気的に絶縁した膜のアレイを有する装置に含まれ得る。膜は、比較的高密度に充填され、所与の体積の試験試料に多数の膜を使用することを可能にし得る。膜および装置の適切なアレイは、当該技術分野、例えばＷＯ２００９／０７７７３４およびＷＯ２０１２／０４２２２６に記載されている。ＷＯ２００９／０７７７３４は、例えば、マイクロウェル孔のアレイにわたって形成された複数の個々にアドレス可能な脂質二分子層を開示し、各マイクロウェルは、脂質二分子層と接触する電極および水性媒体を含有する。
【０２３９】
装置は、典型的には、膜および膜貫通ポアが予め挿入されている「使用準備完了」状態でエンドユーザーに提供される。「使用準備完了」状態で提供される典型的な装置は、各膜が膜貫通ポアを含み、液体を含有するウェルにわたって提供される、両親媒性膜のアレイを含む。かかる装置およびその作製方法は、ＷＯ２０１４／０６４４４３に開示されている。分析対象の試験液は、両親媒性膜の上面に塗布される。
【０２４０】
装置を「使用準備完了」状態で提供することは、しかしながら、性能の低下をもたらし、またはセンサーを損傷し得るため、センサーが乾燥しないように、すなわち両親媒性膜を通過することによって液体がウェルから失われないように注意を払う必要があるという追加の考慮点を有する。センサーの乾燥の問題に対処するための１つの解決策は、膜の表面を通るいかなる蒸発も最小限に抑え、膜のいずれかの側に提供される液体がいかなる浸透効果も低減するために同じイオン強度を有し得るように、デバイスに両親媒性膜の表面にわたって緩衝液を提供することである。使用時には、緩衝液は両親媒性膜の表面から除去することができ、分析対象の試験液が表面に接触するように導入される。
【０２４１】
いくつかの用途は、膜にわたる電気的特性、例えばイオン電流の測定を使用し得る。かかる測定を提供するために、装置は、極性媒体を含む体積と電気的に接触する各区画中のそれぞれの電極をさらに含み得る。他の種類の測定は、例えば蛍光測定およびＦＥＴ測定などの光学的測定について実施され得る。光学的測定および電気的測定は、同時に実施され得る（Ｈｅｒｏｎ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９；１３１（５）：１６５２−３）。
【０２４２】
装置は、共通電極をさらに含み得る。装置は、共通電極と各区画中のそれぞれの電極との間で接続された電気回路をさらに含むことができ、電気回路は電気的測定を行うように構成されている。かかる電気的測定は、膜でまたは膜を通って起こるプロセスに依存し得る。
【０２４３】
装置は、ナノポアアレイの測定を行うためのＦＥＴアレイを含み得る。
【０２４４】
ポア
ナノポアは、ナノメートルスケールの少なくとも１つの寸法を有する孔である。ナノポアは、ポア形成タンパク質によって、またはシリコンもしくはグラフェンなどの合成材料中の穴として作成され得る。あるいは、ナノポアは、これらのハイブリッド、例えば合成膜中に設定されたタンパク質チャネルであり得る。ナノポアはまた、ＤＮＡ折り紙ポアまたはガラスキャピラリーであり得る。ナノポアは、典型的には約２０ｎｍ未満の直径であるが、最大約１００ｎｍの直径であり得る。
【０２４５】
膜貫通ポアは、膜をある程度横切る構造である。それは、印加電位によって駆動される水和イオンが膜を横切ってまたは膜内で流れることを可能にする。膜貫通ポアは、典型的には、水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れ得るように膜全体を横切る。しかしながら、膜貫通ポアは、膜を横切る必要はない。一方の末端が閉じている場合がある。例えば、ポアは、それに沿ってまたはその中に水和イオンが流れ得る、膜中のウェル、ギャップ、チャネル、トレンチ、またはスリットであり得る。
【０２４６】
任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工的であり得る。適切なポアは、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポア、および固体ポアを含むが、これらに限定されない。ポアは、ＤＮＡ折り紙ポアであり得る（Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３８：９３２−９３６）。膜貫通ポアは、好ましくは、膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、ポリヌクレオチドなどの水和イオンが膜の一方の側から他方の側へ流れることを可能にするポリペプチドまたはポリペプチドの集合体である。本発明では、膜貫通タンパク質ポアは、印加電位によって駆動される水和イオンが膜の一方の側から他方の側へ流れることを可能にするポアを形成することができる。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくは、ポリヌクレオチドがトリブロックコポリマー膜などの膜の一方の側から他方の側へ流れることを可能にする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドをポアを通して移動させることを可能にする。
【０２４７】
膜貫通タンパク質ポアは、モノマーまたはオリゴマーであり得る。ポアは、好ましくは、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のサブユニットなどのいくつかの繰り返しサブユニットで構成される。ポアは、好ましくは、６量体、７量体、８量体、または９量体ポアである。ポアは、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであり得る。
【０２４８】
膜貫通タンパク質ポアは、典型的には、それを通ってイオンが流れ得るバレルまたはチャネルを含む。ポアのサブユニットは、典型的には、中心軸を取り囲み、鎖を膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通α−ヘリックスバンドルもしくはチャネルに寄与する。
【０２４９】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、典型的には、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸などの、ｓとの相互作用を促進するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に位置する。膜貫通タンパク質ポアは、典型的には、アルギニン、リジン、もしくはヒスチジンなどの１つ以上の正電荷アミノ酸、またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸との間の相互作用を促進する。
【０２５０】
本発明に従った使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックスバンドルポアに由来し得る。β−バレルポアは、β鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なβ−バレルポアとしては、α−溶血毒、炭疽毒素、およびロイコシジンなどのβ−毒素、ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、またはＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン、ならびにリセニンなどの他のポアが挙げられるが、これらに限定されない。α−ヘリックスバンドルポアは、α−ヘリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。適切なα−ヘリックスバンドルポアは、内膜タンパク質およびα外膜タンパク質、例えばＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素を含むが、これらに限定されない。
【０２５１】
膜貫通ポアは、Ｍｓｐ、α溶血毒（α−ＨＬ）、リセニン、ＣｓｇＧ、ＣｌｙＡ、Ｓｐ１、および溶血性タンパク質フラガセトキシンＣ（ＦｒａＣ）に由来するか、またはそれらに基づき得る。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＣｓｇＧ、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＣ４１００からのＣｓｇＧに由来する。ＣｓｇＧに由来する適切なポアは、ＷＯ２０１６／０３４５９１に開示されている。膜貫通ポアは、リセニンに由来し得る。リセニンに由来する適切なポアは、ＷＯ２０１３／１５３３５９に開示されている。
【０２５２】
野生型α溶血毒ポアは、７つの同一のモノマーまたはサブユニットから形成される（すなわち、それは７量体である）。α溶血毒−ＮＮの１つのモノマーまたはサブユニットの配列は、例えば、ＷＯ２０１６／０５９３７５に開示されている。
【０２５３】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐ、より好ましくはＭｓｐＡに由来する。ＭｓｐＡ由来の適切なポアは、ＷＯ２０１２／１０７７７８に開示されている。
【０２５４】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載されるタンパク質のいずれも、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ、もしくはＭＢＰタグの付加によって、またはポリペプチドがかかる配列を天然に含有しない細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によって、修飾してそれらの同定または精製を補助することができる。遺伝的タグを導入することの代替は、ポアまたは構造体上の天然のまたは操作された位置上にタグを化学反応させることである。これの例は、ゲルシフト試薬を、ポアの外側に操作されたシステインに反応させることであろう。これは、溶血毒ヘテロオリゴマーを分離するための方法として示されている（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ｊｕｌ；４（７）：４９７−５０５）。
【０２５５】
ポアは、顕示標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）で標識され得る。顕示標識は、ポアが検出されることを可能にする任意の好適な標識であり得る。適切な標識としては、蛍光分子、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、およびビオチンなどのリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載のタンパク質のいずれも、合成的にまたは組み換え手段によって作製され得る。例えば、ポアは、インビトロ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアのアミノ酸配列は、非自然発生アミノ酸を含むように、またはタンパク質の安定性を増加させるように修飾され得る。タンパク質が合成手段によって生成される場合、かかるアミノ酸は、生成中に導入され得る。ポアはまた、合成または組み換え生成のいずれかに続いて改変され得る。
【０２５７】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載のタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られている標準的な方法を使用して生成することができる。ポアまたは構造体をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して誘導および複製され得る。ポアまたは構造体をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して細菌宿主細胞において発現され得る。ポアは、組み換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイツ発現によって細胞において生成され得る。発現ベクターは、任意に、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを担持する。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【０２５８】
ポアは、タンパク質生成有機体からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製に続いて、または組み換え発現後に大規模に生成され得る。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステム、およびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが含まれる。
【０２５９】
診断
本発明の方法は、疾患または状態を診断または予後診断するために使用することができる。疾患または状態は、好ましくは、癌、冠状動脈性心疾患、心血管疾患、結核、または敗血症である。
【０２６０】
疾患または状態の例には、腹部大動脈瘤、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性心筋梗塞、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、腺腫、副腎皮質癌、アルコール性肝疾患、アルツハイマー病、未分化甲状腺癌（ＡＴＣ）、不安障害、喘息、星細胞腫、アトピー性皮膚炎、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞性リンパ腫、ベッカー性筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、心肥大、心筋症、心血管疾患、小脳神経変性、子宮頸癌、胆管癌、真珠腫、絨毛癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性膵炎、大腸癌、結腸直腸癌、先天性心疾患、冠動脈疾患、皮膚筋炎（ＤＭ）、糖尿病性腎症、下痢型過敏性腸症候群、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、拡張型心筋症、ダウン症候群（ＤＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、子宮内膜癌、子宮内膜類内膜腺腫、子宮内膜症、上皮性卵巣癌、食道癌、食道扁平上皮癌、本態性血小板血症（ＥＴ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）、前頭側頭型認知症、胃癌（胃癌）、神経膠芽腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、神経膠腫、糸球体疾患、糸球体硬化症、過誤腫、ＨＢＶ関連肝硬変、ＨＣＶ感染、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、難聴、心疾患、心不全、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝門部胆管癌、ホジキンリンパ腫、ホモ接合型鎌状赤血球疾患（ＨｂＳＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、高血圧、下咽頭癌、封入体筋炎（ＩＢＭ）、インスリノーマ、肝内胆管癌（ＩＣＣ）、腎臓癌、腎臓疾患、喉頭癌、晩期不眠症（睡眠疾患）、肺平滑筋腫、白血病、肢帯型筋ジストロフィー２Ａ型（ＬＧＭＤ２Ａ）、脂肪腫、肺腺癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫（ＭＭ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、代謝性疾患、三好型ミオパチー（ＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、多発性硬化症、ＭＹＣ再編成リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、心筋梗塞、心筋損傷、筋腫、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、ネマリンミオパチー（ＮＭ）、腎炎、神経芽細胞腫（ＮＢ）、好中球増加症、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肥満、口腔癌骨肉腫卵巣癌（ＯＣ）、膵臓癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、膵臓腫瘍、パニック病、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、パーキンソン病、ＰＦＶ−１感染症、咽頭疾患、下垂体腺腫、多発性嚢胞腎、多発性肝嚢胞、真性多血症（ＰＶ）、多発性筋炎（ＰＭ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性骨髄線維症、プリオン病、前立腺癌、乾癬性関節炎、乾癬、肺高血圧症、再発性卵巣癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、リウマチ性心疾患および心房細動、関節リウマチ、肉腫、統合失調症、敗血症、重篤卵巣癌、セザリー症候群、皮膚疾患、小細胞肺癌、脊髄小脳失調症、扁平上皮癌、Ｔ細胞白血病、奇形癌、精巣胚細胞腫瘍、サラセミア、甲状腺癌、舌扁平上皮癌、トゥレット症候群、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、子宮平滑筋腫（ＵＬＭ）、ブドウ膜黒色腫、血管疾患、水疱性口内炎、またはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれる。
【０２６１】
多重方法を使用する実施形態では、２個以上の標的ポリヌクレオチド（例えば、少なくとも５個以上、１０個以上、２０個以上、または３０個以上）の存在または不在が決定され得るので、上記の疾患のうちのいずれかの２つ以上（例えば、３、４、５、６つ以上）を予後診断または診断することが可能である。したがって、複数（例えば、少なくとも２個以上、少なくとも３個以上、少なくとも１０個以上、少なくとも２０個以上、または少なくとも３０個以上）の標的ポリヌクレオチドを検出および／または分析するための多重方法が提供される。
【０２６２】
方法は、微生物または微生物の群に由来するポリヌクレオチドを検出するためにも使用され得る。これは、疾患診断および監視に有用であるが、他の用途も有する。例えば、方法は、腸内または膣内フローラ、皮膚上または他の場所に存在する微生物を分析するために使用され得る。微生物は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、またはマイコバクテリウムであり得る。方法は、どの感染因子が疾患を引き起こしているのかを決定するために、よって治療の最良コースを決定するために使用され得る。例えば、尿路感染症および他の感染症は、ますます抗細菌薬耐性を発現させている。方法は、感染症の原因である細菌を決定するために、よって感染症を首尾よく治療するであろう抗生物質または他の治療を同定するために使用され得る。
【０２６３】
方法は、ゲノムＤＮＡを特徴付けるために使用され得る。１つの特定の例示的な実施形態では、方法は、ＳＮＰなどの多型を同定するために使用され得る。別の実施形態では、本発明の方法は、例えばＶ（Ｄ）Ｊ領域のレパトア解析に使用され得る。かかる方法は、解析のために血液細胞、またはＴ細胞由来の試料を使用し得る。
【０２６４】
方法は、未知の配列を特徴付けるためにも使用され得る。
【０２６５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを通るその移動を制御することができる任意のタンパク質であり得る。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを判定することは、当該技術分野において簡単である。タンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用するか、またはそれを修飾する。タンパク質は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。部分は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させる、例えばその移動を制御することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。
【０２６６】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用しかつそれを修飾することができるポリペプチドである。酵素は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。酵素は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させることによってポリヌクレオチドを修飾し得る。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、それが、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るその移動を制御することができる限り、酵素活性を提示する必要がない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されてもよく、または酵素として作用することを防ぐ条件下で使用されてもよい。そのような条件は、以下により詳細に論じられる。
【０２６７】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の構造体に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０、および３．１．３１のうちのいずれかのメンバーに由来する。酵素は、ＷＯ２０１０／０８６６０３に開示されているもののいずれかであり得る。
【０２６８】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、トランスロカーゼ、およびトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。適切な酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＲｅｃＪおよびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼ、ならびにそれらのバリアントを含むが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、またはそれらのバリアントであり得る。酵素は、好ましくは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼまたはそのバリアントである。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーである。
【０２６９】
酵素は、最も好ましくは、ヘリカーゼに由来する。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えばＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、またはＤｄａヘリカーゼであり得るか、またはそれらに由来する。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙ  Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ、ＴｒａＩ  Ｅｃｏ、ＸＰＤ  Ｍｂｕ、もしくはそれらのバリアントであり得るか、またはそれらに由来し得る。
【０２７０】
ヘリカーゼは、ＷＯ２０１３／０５７４９５、ＷＯ２０１３／０９８５６２、ＷＯ２０１３／０９８５６１、ＷＯ２０１４／０１３２６０、ＷＯ２０１４／０１３２５９、ＷＯ２０１４／０１３２６２、およびＷＯ／２０１５／０５５９８１に開示されているヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼ、またはヘリカーゼ構造体のいずれかであり得る。
【０２７１】
Ｄｄａヘリカーゼは、好ましくは、ＷＯ／２０１５／０５５９８１およびＷＯ２０１６／０５５７７７に開示されている修飾のいずれかを含む。
【０２７２】
本発明に従い、任意の数のヘリカーゼを使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のヘリカーゼが使用され得る。いくつかの実施形態では、異なる数のヘリカーゼが使用され得る。上記ヘリカーゼのうちの２つ以上の任意の組み合わせが使用され得る。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、１つ以上のＤｄａヘリカーゼおよび１つ以上のＴｒｗＣヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントであり得る。
【０２７３】
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに付着している。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有付着している。ヘリカーゼは、任意の順序で、かつ任意の方法を使用して付着し得る。本発明における使用のための好ましいヘリカーゼ構造体は、ＷＯ２０１４／０１３２６０、ＷＯ２０１４／０１３２５９、ＷＯ２０１４／０１３２６２、およびＷＯ２０１５／０５５９８１に記載されている。
【０２７４】
ポリヌクレオチド結合能力は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して測定することができる。例えば、タンパク質をポリヌクレオチドと接触させることができ、ポリヌクレオチドに結合し、それに沿って移動するその能力を測定することができる。タンパク質は、ポリヌクレオチドの結合を促進ならびに／またはその活性を高い塩濃度および／もしくは室温で促進する修飾を含み得る。タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合する（例えば、ポリヌクレオチド結合能力を保持する）が、ヘリカーゼとして機能しない（例えば、移動を促進するための全ての必要な成分、例えば、ＡＴＰおよびＭｇ２＋を備えるとき、ポリペプチドに沿って移動しない）ように修飾され得る。かかる修飾は、当該技術分野で既知である。例えば、ヘリカーゼにおけるＭｇ２＋結合ドメインの修飾は、典型的には、ヘリカーゼとして機能しないバリアントをもたらす。これらの種類のバリアントは、分子ブレーキとして作用し得る。
【０２７５】
酵素は、ポアと共有結合していてもよい。任意の方法を使用して、酵素をポアと共有結合させることができる。
【０２７６】
鎖配列決定において、ポリヌクレオチドは、印加された電位と共にまたはそれに対して、ポアを通して転座される。二本鎖ポリヌクレオチドに対して進行的または前進的に作用するエキソヌクレアーゼをポアのシス側に使用して、残りの一本鎖を印加電位下で、またはトランス側に逆電位下で供給することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを解くヘリカーゼも、類似の様式で使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。印加された電位に対する鎖転座を必要とする配列決定アプリケーションの可能性もあるが、ＤＮＡはまず、逆電位下または電位のない状態下で酵素によって「捕まら」なければならない。その後、結合に続いて電位が戻されると、鎖は、ポアをシスからトランスへと通り、電流によって拡張された立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは分子モーターとして作用して、印加された電位に対して、新たに転座された一本鎖を、制御された様式でポアを通ってトランスからシスへと引き戻すことができる。
【０２７７】
本発明において、任意のヘリカーゼを使用することができる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで働き得る。第１に、本方法は、好ましくは、それが、印加された電位から生じる電界と共にポアを通してポリヌクレオチドを移動させるように、ヘリカーゼを使用して実施される。このモードでは、ポリヌクレオチドの５’末端がまずポア中に捕捉され、ヘリカーゼは、最終的に膜のトランス側に転座するまで電界を有するポアを通過するように、ポリヌクレオチドをポア中へと移動させる。代替的には、本方法は、好ましくは、ヘリカーゼが、印加された電位から生じる電界に対して、ポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるように実施される。このモードでは、ポリヌクレオチドの３’末端がまずポア中に捕捉され、ヘリカーゼは、最終的に膜のシス側に押し出されるまで印加電界に対してポアの外に引き出されるように、ポリヌクレオチドをポアを通って移動させる。
【０２７８】
本方法はまた、逆方向で実施されてもよい。ポリヌクレオチドの３’末端は、まずポア中に捕捉され得、ヘリカーゼは、最終的に膜のトランス側に転座するまで電界を有するポアを通過するように、ポリヌクレオチドをポア中へと移動させ得る。
【０２７９】
ヘリカーゼが、移動を促進するために必要な構成要素を含まないか、またはその移動を妨げるかもしくは防ぐように修飾されている場合、それはポリヌクレオチドに結合し、印加された電界によってポア内に引き込まれたときにポリヌクレオチドの移動を遅らせるブレーキとして作用する。不活性モードにおいて、ポリヌクレオチドが３’または５’を下にして捕捉されているかにかかわらず、トランス側に向かってポア内にポリヌクレオチドを引くのは、印加された電界であり、酵素がブレーキとして作用する。不活性モードにあるとき、ヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動の制御は、ラチェッティング、スライディング、およびグレーキングを含むいくつかの方法で説明することができる。ヘリカーゼ活性を欠くヘリカーゼバリアントも、この方法において使用することができる。
【０２８０】
ポリヌクレオチドは、任意の順序でポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアと接触させることができる。ポリヌクレオチドが、ヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアと接触される場合、ポリヌクレオチドはまず、タンパク質と複合体を形成することが好ましい。ポアにわたって電圧が印加されると、ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は次いで、ポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０２８１】
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法における任意のステップは、典型的には、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体、およびポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を促進する酵素補因子の存在下で実施される。遊離ヌクレオチドは、上記の個々のヌクレオチドのうちの１つ以上であり得る。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構造体が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【０２８２】
分子ブレーキは、ポリヌクレオチドに結合し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を遅らせる任意の化合物または分子であり得る。分子ブレーキは、上記に論じられるもののいずれかであり得る。分子ブレーキは、好ましくは、ポリヌクレオチドに結合する化合物を含む。化合物は、好ましくは、大環状体である。好適な大環状分子には、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウンエーテル、ククルビツリル、ピララレン（ｐｉｌｌａｒａｒｅｎｅ）、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６０８１−６０８８に開示されるもののいずれかであり得る。シクロデキストリンは、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
【０２８３】
ポリヌクレオチド特徴付け
方法は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることを伴い得る。標的ポリヌクレオチドがポアと接触するとき、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す１つ以上の測定は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動する際に行われる。
【０２８４】
方法は、各ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つ、または５つ以上の特徴を測定することを伴い得る。１つ以上の特徴は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝などの（ｉ）〜（ｖ）の任意の組み合わせが本発明に従って測定され得る。
【０２８５】
（ｉ）について、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数またはポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を判定することによって測定され得る。
【０２８６】
（ｉｉ）について、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列の測定と併せて、またはポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は簡単であり、ポリヌクレオチドが配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド中の特定のモチーフの存在が測定され得る（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定することなく）。代替的には、本方法における特定の電気的および／または光学的シグナルの測定は、特定の供給源から得られるものとしてポリヌクレオチドを同定することができる。
【０２８７】
（ｉｉｉ）について、ポリヌクレオチドの配列は、前述のように判定することができる。適切な配列決定方法、特に電気的測定を使用するものは、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０２８８】
（ｉｖ）について、二次構造は、様々な方法で測定され得る。例えば、方法が電気的測定を伴う場合、二次構造は、滞留時間の変化またはポアを通過する電流の変化を使用して測定され得る。これは、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの領域を識別することを可能にする。
【０２８９】
（ｖ）について、任意の修飾の存在または不在が測定され得る。本方法は、好ましくは、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つ以上のタンパク質によって、または１つ以上の標識、タグ、もしくはスペーサーによってポリヌクレオチドが修飾されているか否かを判定することを含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、これは下記の方法を使用して測定することができる。例えば、メチルシオチン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｏｔｓｉｎｅ）は、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを通過する電流に基づき、シトシンと区別され得る。
【０２９０】
方法は、ポアが膜中に存在する膜／ポアシステムを調査するのに適した任意の装置を使用して実施され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングのために好適な任意の装置を使用して実施され得る。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの区画に分ける障壁とを備える。障壁は、典型的には、ポアを含有する膜が形成される孔を有する。代替的には、障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０２９１】
方法は、ＷＯ２００８／１０２１２０に記載される装置を使用して実施され得る。
【０２９２】
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これは、電気的測定および光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光の測定を含む適切な光学的方法は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。考えられる電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｊａｎ  １２；１１（１）：２７９−８５）、およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）が挙げられる。光学的測定は、電気的測定と組み合わされ得る（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通過するイオン電流の測定であり得る。
【０２９３】
電気的測定は、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されるような標準的な単一チャネル記録装置を使用して行われ得る。あるいは、電気的測定は、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載されるような、マルチチャネルシステムを使用して行われ得る。
【０２９４】
本方法は、好ましくは、膜にわたって電位が印加された状態で実施される。印加される電位は、電圧電位であり得る。代替的には、印加される電位は、化学的電位であり得る。この例は、両親媒性層などの膜にわたって塩勾配を使用することである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７  Ｊｕｌ  １１；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。いくつかの実例において、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定するために、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する間の、ポアを通過する電流が使用される。これは、鎖配列決定である。
【０２９５】
方法は、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する際のポアを通過する電流の測定を伴い得る。したがって、装置はまた、電位を印加し、膜およびポアにわたる電気シグナルを測定することができる電気回路を含み得る。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施され得る。方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を伴う。
【０２９６】
方法は、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する際のポアを通過する電流の測定を伴い得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するために好適な条件は、当該技術分野で既知であり、実施例において開示される。方法は、典型的には、膜およびポアにわたって電圧が印加された状態で実施される。使用される電圧は、典型的には、＋５Ｖ〜−５Ｖ、例えば＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。使用される電圧は、典型的には、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶまたは−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、および０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、および＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲内である。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲内、最も好ましくは、１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲内である。増加した印加電位を使用することによって、ポアによる異なるヌクレオチド間の識別を増加させることが可能である。
【０２９７】
方法は、典型的には、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの任意のチャージキャリアの存在下で実施される。チャージキャリアには、イオン性液体または有機塩、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウム、または１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドが含まれ得る。上記の例示的な装置において、塩は、チャンバ内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的に使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が好ましい。チャージキャリアは、膜にわたって不斉であり得る。例えば、チャージキャリアの種類および／または濃度は、膜の各側で異なり得る。
【０２９８】
塩濃度は、飽和であり得る。塩濃度は、３Ｍ以下であってもよく、典型的には、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を用いて行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流が、正常電流変動のバックグラウンドに対して同定されることを可能にする。
【０２９９】
方法は、典型的には、バッファーの存在下で実施される。上記に論じられる例示的な装置において、バッファーは、チャンバ内の水溶液中に存在する。本発明の方法において、任意のバッファーを使用することができる。典型的には、バッファーは、リン酸バッファーである。他の好適なバッファーは、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーである。本方法は、典型的には、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで実施される。使用されるｐＨは、好ましくは、約７．５である。
【０３００】
方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０°Ｃ、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０°Ｃで実施され得る。方法は、典型的には、室温で実施される。方法は、任意に、酵素機能を支持する温度、例えば約３７℃で実施される。
【０３０１】
遊離ヌクレオチドおよび補因子
方法は、遊離ヌクレオチドもしくは遊離ヌクレオチド類似体、および／またはポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を容易にする酵素補因子の存在下で実施され得る。方法はまた、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体の不在下および酵素補因子の不在下で実施され得る。遊離ヌクレオチドは、上記に論じられる個々のヌクレオチドのいずれかの１つ以上であり得る。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【０３０２】
測定種類
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これは、電気的測定および光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光の測定を含む適切な光学的方法は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。考えられる電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｊａｎ  １２；１１（１）：２７９−８５）、およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）が挙げられる。光学的測定は、電気的測定と組み合わされ得る（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通過するイオン電流の測定であり得る。
【０３０３】
電気的測定は、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されるような標準的な単一チャネル記録装置を使用して行われ得る。あるいは、電気的測定は、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載されるような、マルチチャネルシステムを使用して行われ得る。
【０３０４】
本方法は、好ましくは、膜にわたって電位が印加された状態で実施される。印加される電位は、電圧電位であり得る。代替的には、印加される電位は、化学的電位であり得る。この例は、両親媒性層などの膜にわたって塩勾配を使用することである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７  Ｊｕｌ  １１；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。いくつかの実例において、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定するために、ポアに対してポリヌクレオチドが移動する間の、ポアを通過する電流が使用される。これは、鎖配列決定である。
【０３０５】
キット
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットを提供する。キットは、典型的には、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および膜に連結することができるアンカーを含む。キットは、ガイドポリヌクレオチド、アダプター配列、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質、および／またはリーダー配列のうちの１つ以上をさらに含み得る。キットは、マイクロ粒子をさらに含み得る。
【０３０６】
ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、アンカー、アダプター、ポリヌクレオチド結合タンパク質、リーダー配列、および／またはマイクロ粒子は、本明細書に定義されるもののいずれかであり得る。キットは、ガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体のパネルを含み得る。パネルは、典型的には、特定の微生物、疾患に関連するマーカー、特定の多型などを検出するなどの特定の目的のために設計されている。
【０３０７】
キットは、上に開示される膜、例えば両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜のいずれかの構成要素を含み得る。キットは、膜貫通ポアをさらに含み得る。方法を参照して上記に論じられる実施形態のいずれも、キットに等しく適用される。
【０３０８】
キットは、上記の実施形態のいずれかを実施することを可能にする１つ以上の他の試薬または器具をさらに含み得る。かかる試薬または器具には、以下、好適なバッファー（複数可）（水溶液）、対象から試料を得るための手段（容器または針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現させるための手段、上記に定義されるような膜、または電圧もしくはパッチクランプ装置のうちの１つ以上が含まれる。試薬は、流体試料が試薬を再懸濁するために使用されるように、乾燥状態でキット中に存在し得る。キットはまた、任意に、キットを本明細書に記載の方法で使用することを可能にする指示、または方法が使用され得る有機体に関する詳細を含み得る。キットは、磁石または電磁石を含み得る。キットは、任意に、ヌクレオチドを含み得る。
【０３０９】
キットは、末端伸長部、または本明細書に記載の第１および第２の末端伸長部を有するガイドポリヌクレオチドと、捕捉オリゴヌクレオチド、または本明細書に記載の第１および第２の捕捉オリゴヌクレオチドとを含み得る。キットは、本明細書に記載の競合オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。キットは、親和性分子対の半分（例えばストレプトアビジン）を含むビーズと、親和性分子対の他の半分（例えばビオチン）を含む第１および第２の捕捉オリゴヌクレオチドとをさらに含み得る。第１および第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、各々、別々の表面、例えば別々のビーズの集団に結合されてもよい。第１の捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、「精製」ビーズまたは「精製」カラムに結合されてもよい。第２の捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、「送達」ビーズに結合されてもよい。「精製」ビーズおよび／または「送達」ビーズは、磁性であり得る。
【０３１０】
ナノポアと、ガイドポリヌクレオチド結合ドメインを含むポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、標的ポリヌクレオチドの一部分およびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質のガイドポリヌクレオチド結合ドメインに結合するように適合された構造における配列に相補的である第１の部分を含むガイドポリヌクレオチドとを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するためのシステムも提供される。一実施形態では、システムは、ナノポアが膜中に存在する膜をさらに含む。一実施形態では、システムは、標的ポリヌクレオチドをさらに含む。システムの一実施形態では、標的ポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、複合体を形成する。システムの一実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、膜に連結している。
【０３１１】
下記の非限定的な実施例は、本発明を説明する。
【０３１２】
実施例１：
この実施例は、ナノポアによる混合物中の特定の標的ポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡは、標的ポリヌクレオチドに結合する２種類のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブを用いて同定される。第１のものは、コレステロールタグ付きＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブを介して標的ポリヌクレオチドを膜にアンカリングする伸長部を含有する。第２のもの（「分析物」）は、結合ポリヌクレオチド結合タンパク質（ヘリカーゼ）を保有する伸長部を担持し、ナノポアを通る分析物上のバーコード配列のポリヌクレオチド結合タンパク質制御移動を介して間接的に標的ポリヌクレオチドを明確に同定する。
【０３１３】
材料および方法
オリゴヌクレオチドＡＲ１３１およびＡＲ１３２を、各々４０μＭで、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分０．６℃でアニールした。ハイブリダイズさせたＤＮＡは、「コレステロールｈｙｂ」（ＯＮＬＡ１７３５１）として知られていた。
【０３１４】
オリゴヌクレオチドＡＲ１３０およびＯＮＬＡ１１３２６を、各々４０μＭで、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分０．６℃でアニールした。ハイブリダイズさせたＤＮＡは、ＯＮＬＡ１７３５０として知られていた。ポリヌクレオチド結合タンパク質を、以下のようにＯＮＬＡ１７３５０のストール含有鎖に装填し、閉鎖した：ヘリカーゼを５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡに、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてバッファー交換し、ヘリカーゼをＯＮＬＡ１７３５０に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭの酢酸カリウム中の３．５μＭのバッファー交換ヘリカーゼとの室温で５分間の５００ｎＭ（分子）のＯＮＬＡ１７３５０のインキュベーション（２００μｌ）によって装填した。ヘリカーゼを、次いで、１００μＭのＴＭＡＤとの室温で１時間の混合物のインキュベーションによってＤＮＡの周囲で閉鎖した（最終体積、２２０μｌ）。非特異的結合未閉鎖ヘリカーゼを、５ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）（最終体積、２７５μｌ）を含む０．２５体積当量の塩−ＡＴＰストレスバッファー（５５μＬ）を用いて、２５分間室温でアダプターから流出させた。２５ｍＭのトリス−Ｃｌ（２１℃でｐＨ７．５）、２８％（重量／体積）のＰＥＧ−８０００、２．５ＭのＮａＣｌ中の３．７体積当量のＳＰＲＩビーズの５分間室温での添加によって、複合体をＳＰＲＩ精製に供した。ビーズを磁性ラック上でペレット化し、上清を除去した。まだ磁性ラック上にある間に、ビーズを５００ｕｌの５０ｍＭのトリス（２１℃でｐＨ７．５）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％ＰＥＧ（重量／体積）８，０００で洗浄し、３６０°回転させてラック上でペレットを浸漬した。洗浄バッファーを除去し、ペレットを遠心分離機で短時間パルス標識した後、磁性ラックに戻して溶液の最後の残留物を除去した。ペレットを次いで３０ｕｌの２５ｍＭのトリス−Ｃｌ（２１℃でｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌに５分間室温で再懸濁した後、磁性ラック上に配置して「ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂ」として知られていた精製アダプターを回収した。
【０３１５】
３．６キロベースの試験分析物を、λファージゲノムＤＮＡに対する特異的プライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、平滑末端を担持する二本鎖ＤＮＡ分析物を得た。この分析物は、「平滑λ３．６ｋｂ」として知られていた。「コレステロールｈｙｂ」または「ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂ」のいずれかへのハイブリダイゼーションを可能にする３’伸長部を担持するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）を、４０μＭの「Ａｌｔ−Ｒ（商標）」ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴから購入）を別々に１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中の各ｃｒＲＮＡで、６５℃から２５℃まで毎分１．０℃でアニールすることによって、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせ、「ガイドＲＮＡ」として知られる複合体を得た。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を、１００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」をＣａｓ９結合バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ６．５）中の１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１１８３６）と１０分間２１℃でインキュベートすることによって形成し、１００ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を得た。結合ｄＣａｓ９を有する、これらの複合体は、「コレステロールｈｙｂ」または「ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂ」がそれぞれｃｒＲＮＡ３’伸長部にアニールすることができるかによって、「アンカープローブ」または「ヘリカーゼプローブ」として知られていた。
【０３１６】
この実施例では、「アンカープローブ」は、各指定種の１００ｎＭの分子濃度で、結合ｄＣａｓ９と、ｔｒａｃｒＲＮＡに別々にハイブリダイズされた、オリゴヌクレオチドＡＲ１４５またはＡＲ１３８またはＡＲ１４１またはＡＲ１４２を含んだ。
【０３１７】
この実施例では、「ヘリカーゼプローブ」は、各指定種の１００ｎＭの分子濃度で、結合ｄＣａｓ９と、ｔｒａｃｒＲＮＡに別々にハイブリダイズされた、１００ｎＭのオリゴヌクレオチドＡＲ１３３またはＡＲ１３４またはＡＲ１３５を含んだ。
【０３１８】
「アンカープローブ」および「ヘリカーゼプローブ」は、以下の表に従って、合計２０μｌまで、以下の組み合わせで共にプール化された。
【表２】
2019532642.tif 000003
【０３１９】
これらの混合物は、「プローブ組み合わせ」として知られていた。
【０３２０】
２０μｌの「プローブ組み合わせ」（１００ｎＭ分子）に、１．１μｌの標的ＤＮＡ（「平滑３．６ｋｂ、ＯＮＬＡ１７５１０」）を１０ｎＭ分子のＯＮＬＡ１７５１０の最終濃度まで添加し、「プローブ−標的複合体」として知られる複合体を得た。２１．１μＬの「プローブ−標的複合体」を、「ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂ」、「コレステロールｈｙｂ」、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびｒＡＴＰの混合物中で１００μＬの最終体積まで希釈し、最終濃度の「ＭｉｎＩＯＮ反応ミックス」として知られる、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、５００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのｒＡＴＰ、３０ｎＭの「ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂ」、１００ｎＭの「コレステロールｈｙｂ」、１０ｎＭの「ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体」、ｐＨ８．０を得た。「ＭｉｎＩＯＮ反応ミックス」を１０分間周囲温度でインキュベートした後、以下のように、混合物をナノポア分析に供した：電気的測定を３７℃のバッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一ＣｓｇＧナノポアから得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後、バッファー（２ｍＬ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の過剰なＣｓｇＧナノポアを除去した。全てのその後のステップを３４℃で行った。シス区画を、（「洗浄バッファー」として知られる）５００μｌの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのｒＡＴＰで、各洗浄間１０分で平衡化した。１０分間２１℃でプレインキュベートした７５μｌの「ＭｉｎＩＯＮ反応ミックス」を、フローセルに適用し、１０分間インキュベートして、標的ＤＮＡと接触する任意のプローブ−ｄＣａｓ９複合体をブロックコポリマーに付着させた。さらに１０分後、さらに２ｍＬの「洗浄バッファー」を、フローセルに通して灌流して、標的と接触しない任意のｄＣａｓ９結合ＣＲＩＳＰＲプローブおよび「ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂ」を含む、任意の非特異的標的ＤＮＡを除去した。実験は１８０ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を監視した。ＤＮＡ鎖の転座から生じる電気信号を、その特有の電流信号によって同定された、ヘリカーゼ−Ｙ−アダプターｈｙｂのナノポアの頻度を計数することによって分析した。
【０３２１】
結果
ヘリカーゼを使用して、ＣｓｇＧナノポアを通した、「コレステロールｈｙｂ」を介してトリブロックコポリマーにテザリングされた、Ｃａｓ接触型プレ配列決定ミックスの移動を制御した。図８は、標的ＤＮＡ中のそれらの同族部位に結合している２つのＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９プローブを担持する標的ＤＮＡ分子を示す。図２３は、ナノポアを通る分析物のヘリカーゼ制御転座から生じる電気信号を示す。例となる信号は、「アンカープローブ」および「ヘリカーゼプローブ」の両方が標的ＤＮＡと接触したことを示す。データは、テザリングされたＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を介した標的ポリヌクレオチドの固定化が標的ＤＮＡポリヌクレオチドを首尾よく同定したことを実証する。
【０３２２】
実施例２
この実施例は、ナノポア配列決定による混合物からの特定の２０ｎｔ標的ＤＮＡポリヌクレオチド配列（「標的」）を含有する断片の直接富化および配列決定方法を記載し、標的ＤＮＡは、コレステロールタグ付きＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブと接触し、ナノポアを通るＤＮＡの移動は、ＤＮＡモータータンパク質によって制御される。この例では、「標的」は、その配列によって直接的に明確に同定されている。結合ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブは、ヘリカーゼの転座を一時的にストールさせ得、よってまた、試料をさらに明確に同定するために使用され得る。
【０３２３】
材料および方法
オリゴヌクレオチドＡＲ１３１およびＡＲ１３２は、各々４０μＭで、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分０．６℃でアニールされた。ハイブリダイズされたＤＮＡは、「コレステロールｈｙｂ」（ＯＮＬＡ１７３５１）として知られていた。
【０３２４】
「コレステロールｈｙｂ」へのハイブリダイゼーションを可能にする３’伸長部を担持するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）を、４０μＭの「Ａｌｔ−Ｒ（商標）」ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴから購入）を１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中のオリゴヌクレオチドＡＲ１３９で、６５℃から２５℃まで毎分１．０℃でアニールすることによって、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせ、「ガイドＲＮＡ」として知られる複合体を得た。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を、１００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」をＣａｓ９結合バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ６．５）中の１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１１８３６）と１０分間２１℃でインキュベートすることによって形成し、１００ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を得た。結合ｄＣａｓ９を有する、これらの複合体は、「コレステロールｈｙｂ」がｃｒＲＮＡ３’伸長部にアニールすることができるので、「アンカープローブ」として知られていた。腸内細菌ラムダファージゲノムＤＮＡを、ｇＴｕｂｅ（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．）を用いて約１ｋｂの平均サイズに断片化した。断片化ＤＮＡを、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｅｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ−ｔａｉｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を用いて末端修復およびｄＡテール化した。標準ＳＫ００７アダプターを、ＳＰＲＩビーズを用いて精製された末端修復断片化ラムダファージＤＮＡにライゲーションした。得られたライブラリー（２５μｌ、１μｇの全ＤＮＡ）に、２７５ｎＭ（分子）のＯＮＬＡ１６９４１を室温で＞５分間添加して、リーダーを「コレステロールｈｙｂ」の非特異的ハイブリダイゼーションに対してブロックした。両方のＤＮＡ末端上に末端ライゲーションされ、装填されたヘリカーゼを担持する、得られたＤＮＡライブラリーは、「プレ配列決定ミックス」として知られていた。
【０３２５】
１２μｌのプレ配列決定ミックスに、３３μｌの「アンカープローブ」を添加し、７３ｎＭの「アンカープローブ」および約０．３２ｎＭの標的部位を含有する混合物を得た。結合を１０分間２１℃で進行させ、その後混合物を、以下のように、ＳＰＲＩ磁性ビーズを用いた精製ステップに供した：０．４体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、得られた混合物を５分間２１℃で撹拌した。磁性ビーズを磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、１００μｌの５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％ＰＥＧ８，０００（２５℃でｐＨ７．５）をビーズにまだラック上にある間に添加し、ペレットを３６０°回転させてラック上でペレットを洗浄した。ビーズをもう一回直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブをラックから取り出し、２５ｍＭのトリス−Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）を含有する４５μｌのバッファーをビーズに添加して、５分間２１℃でのインキュベーションによってＤＮＡを溶出した。ビーズを磁性分離機を用いてペレット化し、（「プローブ−標的複合体」として知られる）溶出液を保持した。
【０３２６】
４５μＬの「プローブ−標的複合体」を、ＯＮＬＡ１７３５１、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびｒＡＴＰの混合物中で３３０μＬの最終体積まで希釈し、最終濃度の「ＭｉｎＩＯＮ反応ミックス」として知られる、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、５００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのｒＡＴＰ、１０ｎＭのＯＮＬＡ１７３５１、１０ｎＭの「ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体」、および約４４ｐＭの標的部位、ｐＨ８．０を得た。
【０３２７】
電気的測定を３７℃のバッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一ＣｓｇＧナノポアから得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後、バッファー（２ｍＬ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の過剰なＣｓｇＧナノポアを除去した。全てのその後のステップを３４℃で行った。シス区画を、（「洗浄バッファー」として知られる）５００μｌの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのｒＡＴＰで、各洗浄間１０分で平衡化した。１０分間２１℃でプレインキュベートした１５０μｌの「ＭｉｎＩＯＮ反応ミックス」を、フローセルに適用し、１０分間インキュベートして、標的ＤＮＡと接触する任意のコレステロール：ＣＲＩＳＰＲプローブ：ｄＣａｓ９複合体をブロックコポリマーに付着させた。さらに１０分後、さらに２ｍＬの「洗浄バッファー」を、フローセルを通して灌流して、任意の非特異的標的ＤＮＡを除去した。実験は１８０ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を監視した。ＤＮＡ鎖の転座から生じる電気信号を分析し、それらのヌクレオチド配列を決定した。
【０３２８】
結果
ヘリカーゼを使用して、ＣｓｇＧナノポアを通した、「コレステロールｈｙｂ」を介してトリブロックコポリマーにテザリングされた、Ｃａｓ接触型プレ配列決定混合物の移動を制御した。図９は、その同族部位およびコレステロールテザーに結合している末端装填ヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９を担持する標的ＤＮＡ分子を示す。図１５は、ヘリカーゼの経路、およびその転座が結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体の遭遇時どのように一時的にストールされ得るかを示す。図２２は、ナノポアを通る標的ＤＮＡ（この場合、λＤＮＡの３．６キロベース断片）のヘリカーゼ制御転座および転座事象の途中の１つのかかる一時的ストール事象から生じる電気信号を示す。例となる信号は、ｄＣａｓ９が標的ＤＮＡと接触したこと、およびヘリカーゼがｄＣａｓ９と接触したことを示す。データは、テザリングされたＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を介する標的ポリヌクレオチドの固定化が首尾よく富化し（図２１参照）、他の非特異的断片よりも優先して標的ＤＮＡポリヌクレオチドを配列決定したことを実証する。
【０３２９】
実施例３
この実施例は、ナノポア配列決定によるＤＮＡポリヌクレオチド（「ＤＮＡ」）の混合物からの特定の２０ｎｔ標的ＤＮＡポリヌクレオチド配列（「標的」）を含有する断片の直接富化および配列決定方法を記載し、標的ＤＮＡは、コレステロールタグ付きＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブと接触する。この実施例では、オリゴヌクレオチドの混合物は、ＤＮＡの混合物の各末端でＹ−アダプター上に装填されたポリヌクレオチド結合タンパク質を担持する。この例では、Ｙ−アダプターは、ストール部位を含有しないが、Ｙ−アダプターにハイブリダイズされたコレステロール部分を含有するテザーオリゴヌクレオチドを介して膜表面にアンカリングされる。モータータンパク質は、結合ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含有しない混合物中の任意のＤＮＡを完全に巻き戻し、それによって膜から非標的ＤＮＡを放出する。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩなどのエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡモーター転座と同時に標的の非転座鎖、および完全に巻き戻される試料中の任意の非標的ＤＮＡを分解するために使用され得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、結合ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含有する任意のＤＮＡを部分的に巻き戻すが、ナノポアとは無関係なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の遭遇時にストールする。ナノポアによる標的の捕捉時、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、印加電位によって標的から除去され、それによって標的上のポリヌクレオチド結合タンパク質の転座を再開する。分析物の配列およびストールの位置は、試料を明確に同定するために使用され得る。
【０３３０】
方法
オリゴヌクレオチドＡＲ１３１およびＡＲ１３２は、各々４０μＭで、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、９５℃〜２５℃、毎分０．６℃でアニールされた。ハイブリダイズＤＮＡは、「コレステロールｈｙｂ」（ＯＮＬＡ１７３５１）として知られていた。
【０３３１】
「コレステロールｈｙｂ」へのハイブリダイゼーションを可能にする３’伸長部を担持するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）を、４０μＭの「Ａｌｔ−Ｒ（商標）」ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴから購入）を１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中のオリゴヌクレオチドＡＲ１４５で６５℃から２５℃まで毎分１．０℃でアニールすることによって、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせ、「ガイドＲＮＡ」として知られる複合体を得た。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を、１００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」をＣａｓ９結合バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ６．５）中の１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１１８３６）と１０分間２１℃でインキュベートすることによって形成し、１００ｎＭのＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を得た。結合ｄＣａｓ９を有する、これらの複合体は、「コレステロールｈｙｂ」がｃｒＲＮＡ３’伸長部にアニールすることができるので、「アンカープローブ」として知られていた。
【０３３２】
ヘリカーゼを担持する約２０ｎＭのＹ−アダプターＯＮＬＡ１７９１７を、６６ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰγＳ、１００μｌの体積中４．５％（重量／体積）のＰＥＧ−８０００中の２０，０００単位のＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１μｇの末端修復ｄＡテール化３．６ｋｂ  ＤＮＡ  ＣＳ（ＯＮＬＡ１７５１０）に、周囲温度で１０分間ライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを、ＤＮＡを２４μｌの２０ｍＭのＣＡＰＳ、４０ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ１０）中で溶出したことを除いて、実施例２に詳述されるようにＳＰＲＩ精製によって精製した。このＤＮＡに、１０ｎＭ（分子）の「アンカープローブ」を添加し、試料を１０分間周囲温度でインキュベートして、アンカープローブを標的に接触させた。このＤＮＡに、１０ｎＭ（分子）のＳＫ４３、Ｙ−アダプターにハイブリダイズすることができるコレステロール部分を担持するオリゴヌクレオチドを添加した。これは、「ＭｉｎＩＯＮ配列決定ミックス」として知られる、各末端上にポリヌクレオチド結合タンパク質装填Ｙ−アダプターを担持する３．６キロベース標的二本鎖ＤＮＡをもたらした。
【０３３３】
プレ配列決定ミックスを、分析のために１５０μｌの体積まで希釈し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＫＣｌ、１０ｎＭのコレステロールｈｙｂ（ＯＮＬＡ１７３５１）、および約２５０ｎｇのＭｉｎＩＯＮ配列決定ミックスを含有する混合物をもたらした。
【０３３４】
電気的測定を３７℃のバッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一ＣｓｇＧナノポアから得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後、バッファー（２ｍＬ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の過剰なＣｓｇＧナノポアを除去した。全てのその後のステップを３４℃で行った。シス区画を、（「燃料レス洗浄バッファー」として知られる）５００μｌの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＫＣｌで、各洗浄間１０分で２回平衡化した。１０分間２１℃でプレインキュベートした１５０μｌの「ＭｉｎＩＯＮ反応ミックス」を、フローセルに適用し、１０分間インキュベートして、標的ＤＮＡと接触する任意のコレステロール：ＣＲＩＳＰＲプローブ：ｄＣａｓ９複合体をブロックコポリマーに付着させた。さらに１０分後、さらに２ｍＬの「燃料レス洗浄バッファー」を、フローセルを通して灌流して、任意の非結合標的ＤＮＡを除去した。実験を１８０ｍＶで行い、ナノポア電流を約８００秒間監視し、その後フローセルを２ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２で灌流した。ＤＮＡ鎖の転座から生じる電気信号を分析し、それらのヌクレオチド配列を決定した。
【０３３５】
結果
ヘリカーゼを、非加水分解性ＡＴＰ類似体ＡＴＰγＳの存在下で標的の両方の末端にライゲーションし、結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９を含有しないか、またはナノポアとは無関係なＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９ストールに先行する、任意の標的ＤＮＡを巻き戻すために使用した。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９およびライゲーションされたＹ−アダプターを、「コレステロールｈｙｂ」を介して、および標的の両方の末端にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを介して、トリブロックコポリマーにテザリングした。図２８は、膜表面への標的の固定化を示す。標的は結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９プローブを担持し、ＭｇＡＴＰの不在下で、ヘリカーゼは標的ＤＮＡの末端に位置する。図２９は、ＭｇＡＴＰの添加時の結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体への両方のヘリカーゼの転座およびストーリングを示す。ストーリングは、一方または両方のヘリカーゼによって達成され得る。図３０は、電位の印加時のナノポアによる標的分析物の捕捉を示す。図３１は、ナノポアによる標的の捕捉時のヘリカーゼによる結合ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体の除去を示す。図３２は、初期のプレｄＣａｓ９転座事象（Ｂ）、ストーリング（Ｃ）、および転座の再開（Ｄ）を含む、ＭｇＡＴＰの添加の約２３５０秒後のトレース例を示す。ストールからの再開は、強調および拡大される（Ｅ）。
【０３３６】
配列
オリゴヌクレオチド
ｔｒａｃｒＲＮＡ
全体を通して使用されるｔｒａｃｒＲＮＡは、ＩＤＴから購入された６７量体であった（「Ａｌｔ−Ｒ（商標）」ｔｒａｃｒＲＮＡ、カタログ番号１０７２５３４）
【表３】
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【表４】
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バクテリオファージラムダＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ  Ｊ０２４５９．１、ＮＥＢから入手）を、ＳｎａＢＩおよびＢａｍＨＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ−Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を用いて末端修復およびｄＡテール化した。ヘリカーゼ装填アダプターを、ＮＥＢ  Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用してｄＡテール化ＤＮＡにライゲーションした。
【表５】
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【０３３７】
実施例４
この実施例は、標的／プローブ複合体の直接検出による混合物からの特定の２０ｎｔ標的ＤＮＡポリヌクレオチド配列（「標的」）を含有する断片の検出方法を記載し、標的ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブと接触する。この実施例では、「標的」は、ナノポアと相互作用する標的／プローブ複合体によって与えられる固有の信号によって明確に同定される。この場合、ポアはＤＮＡの一本鎖を収容するのにだけ十分に大きい（図１４）。
【０３３８】
材料および方法
両方の末端で末端修復およびｄＡテール化された３．６ｋｂ長のラムダＤＮＡを、ヘリカーゼを有さないＳＫ００７アダプター（ＯＮＬＡ１６３８９、上＋ＯＮＬＡ１９９３６、下＋ＯＮＬＡ１９７５０、ブロッカー）にライゲーションした。これを次いで、以下のように、ＳＰＲＩビーズを用いて精製した：０．４体積当量のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を混合物に添加し、得られた混合物を５分間２１℃で撹拌した。磁性ビーズを磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、１００μｌの５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％ＰＥＧ８，０００（２５℃でｐＨ７．５）をビーズにまだラック上にある間に添加し、ペレットを３６０°回転させてラック上でペレットを洗浄した。ビーズをもう一回直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブをラックから取り出し、２５ｍＭのトリス−Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）を含有する４５μｌのバッファーをビーズに添加して、５分間２１℃でのインキュベーションによってＤＮＡを溶出した。ビーズを磁性分離機を用いてペレット化し、溶出液を保持した。これは、「二重−Ｙ３．６ｋｂ」である。
【０３３９】
以前使用された領域３．６ｋｂラムダを標的とする配列を有するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）ＡＲ１４８を、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中の４０μＭの「Ａｌｔ−Ｒ（商標）」ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴから購入）に６５℃から２５℃まで毎分１．０℃でアニールすることによって、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせ、「ガイドＲＮＡ」として知られる複合体を得た。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を、１００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」をＣａｓ９結合バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ６．５）中の１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１１８３６）と１０分間２１℃でインキュベートすることによって形成し、１００ｎＭの「ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体」を得た。
【０３４０】
０．５μｇの二重−Ｙ３．６ｋｂを、５０μＬのＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体と、少なくとも１０分間２０℃でインキュベートした。これに次いで、６５μＬの２×ｃ１７バッファー（１ＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８）、１２．５μＬのＥＬＢ、および脱イオン水を添加して、最終体積を最大１５０μＬとした。これは、「チップ試料」である。
【０３４１】
電気的測定を３７℃のバッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一ＣｓｇＧナノポアから得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後、バッファー（２ｍＬ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１５０ｍＭのフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭのフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の過剰なＣｓｇＧナノポアを除去した。全てのその後のステップを３４℃で行った。シス区画を、（「ｃ１７」として知られる）５００μｌの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＫＣｌで、各洗浄間１０分で平衡化した。１５０μｌのチップ試料を次いで、チップに添加し、データを１００ｍＶで３４℃で記録した。
【０３４２】
結果
ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が存在しない場合、またはＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が二重−Ｙ３．６ｋｂ中に存在するｃｒＲＮＡ配列を有さない場合、得られる信号は、典型的には＜０．５秒持続する６０〜８０ｐＡでの事象に特徴的である。図３３および３４は、それに結合しているＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体がポアを通って転座しない二重−Ｙ３．６ｋｂを示す。
【０３４３】
ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が存在するが二重−Ｙ３．６ｋｂが存在しない場合、事象は観察されない。
【０３４４】
二重−Ｙ３．６ｋｂが、上記のように二重−Ｙ３．６ｋｂ中に見られるｃｒＲＮＡ配列を有するＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体に結合している場合、信号は、約６０ｐＡで長いブロックによって支配される。これらのブロックは、典型的には＞＞１０秒持続する。これらの事象は、自発的にオープンポア電流に戻ることもある。これらの事象は、上記のものと同じ特徴プロファイルを有するが、２つのＹ−アダプター間に新たな長い静電レベルを有する。図１４、図３５、および図３６は、ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体がポアに到達するまでポアを通って転座するＤＮＡを示し、その時点で二重−Ｙ３．６ｋｂは、ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体がそれに作用するポアの力によって置き換えられるまで停止し、その時点で二重−Ｙ３．６ｋｂは、転座し続ける。
【０３４５】
実施例５
この実施例は、標的／プローブ複合体の直接検出による混合物からの特定の２０ヌクレオチド標的ＤＮＡポリヌクレオチド配列（「標的」）を含有する断片の検出方法を記載し、標的ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプローブと接触する。この例では、「標的」は、ナノポアと相互作用する標的／プローブ複合体によって与えられる固有の信号によって明確に同定される。この場合、ポアは、プローブが付着している二本鎖ＤＮＡを収容するのに十分に大きい（図１２参照）。
【０３４６】
材料および方法
３．６ｋｂ長のラムダＤＮＡを調製および精製した。これは３．６ｋｂである。
【０３４７】
領域３．６ｋｂラムダを標的とする配列を有するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）ＡＲ１４８を、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ中の４０μＭの「Ａｌｔ−Ｒ（商標）」ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴから購入）に６５℃から２５℃まで毎分１．０℃でアニールすることによって、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせ、「ガイドＲＮＡ」として知られる複合体を得た。ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を、２００ｎＭの「ガイドＲＮＡ」をＣａｓ９結合バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ６．５）中の２００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１１８３６）と１０分間２１℃でインキュベートすることによって形成し、２００ｎＭの「ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体」を得た。
【０３４８】
０．５μｇの３．６ｋｂを、２５μＬのＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体と、少なくとも１０分間２０℃でインキュベートした。これに次いで、２５μＬの２×１Ｍバッファー（２ＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８）を添加した。これはチップ試料である。
【０３４９】
電気的測定は、絶縁破壊によって形成された単一１５ｎｍ直径ＳｉＮ  ＡＬＤポアから得た（しかし、＞１０ｎＭの直径を有する任意のポア、例えば、固体、タンパク質、ＤＮＡ折り紙、または任意の他の材料を使用することができた）。シスおよびトランスは１ＭのＫＣｌであり、電圧は変動した。試料を用いないポア特徴付けの期間後、シス区画の体積をチップ試料で置き換え、測定を異なる電圧で２０℃で実施した。
【０３５０】
結果
ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が存在しない場合、またはＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が３．６ｋｂ中のＤＮＡ配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を有さない場合、得られる信号は、３．６ｋｂがポアを通過するときに短命電流偏向のものである（図３７）。３．６ｋｂが、上記のように３．６ｋｂ中に見られるＤＮＡ配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を有するＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体に結合している場合、信号は、ポアを通過するＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を表す追加のサブレベルを有する（図３８）。複数のＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体がＤＮＡに結合している場合、各複合体は、電流に対して別々の偏向を引き起こす（図３９）。ｄＣａｓが修飾または装飾される場合、信号は、各複合体が細孔を通過するときに変化する（図４０）。複合体によって引き起こされる電流偏向の信号位置の変化は、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）についての情報を提供するために使用することができる。
【表６】
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【０３５１】
実施例６
この実施例は、標的分子の富化後のナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡ分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、ｄＣａｓ９分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。ｄＣａｓ９は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのリボソーム１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子に対するｃｒＲＮＡによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、捕捉ビーズ表面上でのその後の精製前に過剰な未結合ｄＣａｓ９を除去するためのＳＰＲＩ精製ステップと組み合わせて、結合ｄＣａｓ９タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。標的ＤＮＡ分子は、ナノポア配列決定に適合され、ｄＣａｓ９は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
【０３５２】
ｄＣａｓ９は、この伸長部に相補的なＤＮＡ配列（図４１のａ’）を担持するビーズ捕捉オリゴヌクレオチドコンジュゲート上の標的分子の捕捉を可能にする５’ＤＮＡ伸長部（図４１の配列ａ）を担持するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を保有する。この実施例では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ビオチン部分を介してビーズに連結される。この実施例では、非標的ＤＮＡは洗い流され、標的分子はビーズに結合したままである。標的分子は次いで、その遊離ｄＡテール化末端の一方または両方へのライゲーションによってナノポア配列決定に適合させ、ｄＣａｓ９標的分子は、ビーズに結合させる。ビーズ−標的−ＲＮＰアセンブリ全体は次いで、配列決定のためにフローセルに送達される。アセンブリは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってフローセルのウェルに提供されるか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、ビーズ上に、ビーズを膜にテザリングする、アダプター末端にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドコレステロールテザーを流すことによって開始される。あるいは、コレステロールテザーは、ビーズ−標的コンジュゲートがフローセルに添加される前の、「洗い流し」ステップ中に膜に導入することができる。
【０３５３】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００９１３．３）を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５．９ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化した。末端修復およびｄＡテーリング後、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４×ＳＰＲＩ精製に供し、０．１×ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出した。
【０３５４】
２００ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、（ｄＣａｓ９結合バッファーとして知られる）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファーに添加した。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。２５０ｎＭのｃｒＲＮＡ（ＡＲ４００）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。最終体積は５０μＬであった。この混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られていた。
【０３５５】
ｄＣａｓ９−標的複合体を形成するために、５００ｎｇ（約１．２μＬ）の上記からのゲノムＤＮＡ（ＯＮＬＡ１８８１６）をＲＮＰに添加し、２０分間室温でインキュベートした。混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないｄＣａｓ９を除去した。混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供した：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートした。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出した。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持した。
【０３５６】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の２．５μＬのＡＲ３６４捕捉オリゴと約１時間撹拌しながらインキュベートした。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「捕捉ビーズ」として知られていた。
【０３５７】
ｄＣａｓ９−結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を１０μｇの捕捉ビーズ（１μＬ）および６５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）と２０分間撹拌しながらインキュベートすることによって、捕捉ビーズに結合させた。ビーズをその後、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄した。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去した。この試料は、「ビーズ−標的複合体」として知られていた。
【０３５８】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（チューブ「ＡＭＸ  １Ｄ」）を、上記からペレット化ビーズを１２．５μＬの２×ＬＡＱＡ１バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からの寄贈品）、７μＬのヌクレアーゼフリー水、５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）、および０．５μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｃａｔ．＃Ｍ０２０２）を含むライゲーションミックスで再懸濁することによって、ビーズ−標的複合体にライゲーションした。ビーズをライゲーションミックス中で１０分間撹拌しながらインキュベートし、ペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する約１２５μＬのバッファーで１回洗浄して、遊離未ライゲーションアダプターを除去した。洗浄後、ビーズをもう１回ペレット化し、製造業者の指示に従って１倍に希釈した、５０μＬのＲＢＦ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の成分）に再懸濁した。この混合物は、装填試料として知られていた。
【０３５９】
図４１は、ここで装填試料としても知られる、ｄＣａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−標的−ビーズコンジュゲートの予想される外観を示す。
【０３６０】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移した。装填試料の５０μＬ全体をＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませた。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データを標準カスタマープロトコルに従って収集および分析した。
【０３６１】
結果
図４２は、ＭｉｎＫＮＯＷ  １．７．１４ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを使用して上記プロトコルを用いる６時間の配列決定ランにわたって収集されたデータを示す。このプルダウンに使用される単一のｃｒＲＮＡプローブ、ＡＲ４００は、ｄＣａｓ９を図４２Ｄに列挙される７つの１６Ｓリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想され、１つの位置は、位置ｖｉｉとして同定され、ＰＡＭ部位に対して−２位に単一の不一致を担持し、別の位置は、ピークｉとして同定され、ＰＡＭ部位に対して−６位に単一の不一致を担持する。約４．６Ｍｂのゲノムのうち、約３５ｋｂ（約０．７６％）のインプットＤＮＡ（７×中央リード長、５．９ｋｂ）が標的と考えられ得る。９２，９４２配列決定リードがこのランから得られ、標準的なベースコールおよびアラインメント解析ワークフローを通して配置された。８５，１２６リードをＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５ゲノム（ＮＣ＿０００９１３．３）にマッピングすることができ、そのうち６２，９４３（７３．９％）が各予想プローブハイブリダイゼーション位置の３つの中央リード長内にマッピングされた。配列決定リードのパイルアップは、位置ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉの各々について９，０００〜１０，０００倍のカバレッジ深度をもたらした。
【０３６２】
材料
【表７】
2019532642.tif 000024
【表８】
2019532642.tif 000025
【０３６３】
実施例７
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡ分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、ｄＣａｓ９分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。ｄＣａｓ９は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのリボソーム１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子に対するｃｒＲＮＡによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、ｄＣａｓ９タンパク質に熱および塩ストレスを加えること、続いてｔｒａｃｒＲＮＡに特異的な捕捉表面上のｄＣａｓ９−標的複合体の精製および溶出、ならびにｄＣａｓ９−標的複合体のｃｒＲＮＡに特異的な第２の特異的捕捉表面への転移によって最小化される。第１の「精製」ビーズからの標的の放出は、トーホールド変位として知られる現象によってもたらされる。標的ＤＮＡ分子は、ナノポア配列決定に適合され、ｄＣａｓ９は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
【０３６４】
ｃｒＲＮＡは、ビーズ、カラム、または表面上の標的分子の捕捉に使用される３’ＤＮＡ伸長部（図４４の配列ｄ）も担持する。ｄＣａｓ９は、「精製」ビーズ、カラム、または表面上の標的分子の捕捉を可能にする５’ＤＮＡ伸長部（図４４の配列ａ・ｃ）を担持するｔｒａｃｒＲＮＡ分子も保有する。標的ポは、まず、ｔｒａｃｒＲＮＡのＤＮＡ伸長部に相補的なオリゴヌクレオチドを担持するビーズ上での捕捉によって非標的ＤＮＡから分離される。非標的ＤＮＡは、このステップ中に洗い流される。標的分子は、ＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ分子とビーズへの結合について競合するオリゴヌクレオチドの添加を介した、トーホールド変位によってビーズから溶出される。標的分子の溶出後、標的は、ｃｒＲＮＡ上のＤＮＡ伸長部を介して第２の「送達」ビーズに結合させる。標的分子は次いで、その遊離ｄＡテール化末端の一方または両方へのライゲーションによってナノポア配列決定に適合させ、ｄＣａｓ９標的分子は、ビーズに結合したままである。ビーズ−標的−ＲＮＰアセンブリ全体は次いで、配列決定のためにフローセルに送達される。アセンブリは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってフローセルのウェルに提供されるか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、ビーズ上に、ビーズを膜にテザリングする、アダプター末端にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドコレステロールテザーを流すことによって開始される。あるいは、コレステロールテザーは、ビーズ−標的コンジュゲートがフローセルに添加される前の、「洗い流し」ステップ中に膜に導入することができる。
【０３６５】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約７ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化した。末端修復、ｄＡテール化、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４倍ＳＰＲＩ精製に供し、０．１倍ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出した。
【０３６６】
２００ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、（ｄＣａｓ９結合バッファー、ＢＢとして知られる）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファーに添加した。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。２５０ｎＭの３’ＤＮＡ伸長部を担持するｃｒＲＮＡ（ＡＲ１９１）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。最終体積は５０μＬであった。この混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られていた。
【０３６７】
ｄＣａｓ９−標的複合体を形成するために、５００ｎｇ（約１．２μＬ）の上記からのゲノムＤＮＡ（ＯＮＬＡ１８８１６）をＲＮＰに添加し、２０分間室温でインキュベートした。混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないｄＣａｓ９を除去した。混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供した：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートした。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出した。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持した。
【０３６８】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むバッファー中の２．５μＬのＡＲ６６７捕捉オリゴ（配列ａ’−ｂ’、および３’ビオチン部分を含む）と約１時間撹拌しながらインキュベートした。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「精製ビーズ」として知られていた。
【０３６９】
オリゴヌクレオチドＡＲ１３２およびＡＲ１９６を、標準ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）＋２００ｍＭのＮａＣｌ中の４０μＭの各オリゴヌクレオチドをインキュベートし、９５℃で２分間加熱し、２５℃まで約２時間かけてゆっくり冷却することによって、ＰＣＲサーモサイクラーを用いてハイブリダイズした。ｃｒＲＮＡ配列のＤＮＡ伸長部に相補的なオーバーハングを担持する、１２．５μＬのこの二重螺旋ＤＮＡを、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）と、約１時間撹拌しながらインキュベートした。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、各洗浄ステップで磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「送達ビーズ」として知られていた。
【０３７０】
ｄＣａｓ９−結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を５０μｇの精製ビーズおよび６７．５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）と２０分間室温で撹拌しながらインキュベートすることによって、精製ビーズに結合させた。ビーズを、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄した。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去した。この試料は、「精製ビーズ−標的複合体」として知られていた。
【０３７１】
標的ＤＮＡ−ＲＮＰ複合体の固定化後、標的ＤＮＡを精製ビーズから、図４４からの配列ａ・ｂを担持する２５μＭのオリゴヌクレオチドＡＲ６６８、２０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する２０μＬのバッファーの添加によって、室温で１０分間、穏やかに撹拌しながら溶出した。溶出液を「精製ビーズ溶出液」として保持した。
【０３７２】
精製ビーズ溶出液を次いで、２０μＬの精製ビーズ溶出液を１μＬの送達ビーズ、および１０５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）との２０分間撹拌しながらのインキュベーションによって、送達ビーズ上に固定化した。ビーズをその後、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄した。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去した。この試料は、「送達ビーズ−標的複合体」として知られていた。
【０３７３】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（チューブ「ＡＭＸ  １Ｄ」）を、上記からペレット化ビーズを１２．５μＬの２×ＬＡＱＡ１バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からの寄贈品）、７μＬのヌクレアーゼフリー水、５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）、および０．５μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｃａｔ．＃Ｍ０２０２）を含むライゲーションミックスで再懸濁することによって、ビーズ−標的複合体にライゲーションした。ビーズをライゲーションミックス中で１０分間撹拌しながらインキュベートし、ペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する約１２５μＬのバッファーで１回洗浄した。洗浄後、ビーズをもう１回ペレット化し、製造業者の指示に従って１倍に希釈した、５０μＬのＲＢＦ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の成分）に再懸濁した。この混合物は、装填試料として知られていた。
【０３７４】
図４４は、トーホールド変位オリゴヌクレオチドを用いて精製ビーズから標的結合ｄＣａｓ９分子を溶出し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセル上に装填するために第２の送達ビーズに移すために必要とされる、この実施例に記載される連続的な一連のステップを示す。
【０３７５】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移した。装填試料の５０μＬ全体をＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませた。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データを標準カスタマープロトコルに従って収集および分析した。
【０３７６】
結果
図４５は、非標的Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡからのＥ．ｃｏｌｉ１６Ｓ遺伝子標的の富化に対する、熱ストレス、ＳＰＲＩ精製、精製ビーズ結合、トーホールド変位、および捕捉ビーズ結合のコンビナトリアル効果を示す。結果を、オンターゲットのリード％を示す、以下の表に要約する。
【表９】
2019532642.tif 000026
【０３７７】
具体的には、図４５、Ｈは、３つ全ての富化方法の相加効果を実証する。図４５、Ｈのデータは、ＭｉｎＫＮＯＷ  １．７．１４ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを使用して上記プロトコルを用いる６時間の配列決定ランにわたって収集された。このプルダウンに使用される単一のｃｒＲＮＡプローブ、ＡＲ１９１は、ｄＣａｓ９を図４２Ｄに列挙される７つの１６Ｓリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想され、１つの位置は、位置ｖｉｉとして同定され、ＰＡＭ部位に対して−２位に単一の不一致を担持し、別の位置は、ピークｉとして同定され、ＰＡＭ部位に対して−６位に単一の不一致を担持する。約４．６Ｍｂのゲノムのうち、約３６ｋｂ（約０．７８％）のインプットＤＮＡ（７×中央リード長、５．１ｋｂ）が標的と考えられ得る。
【０３７８】
１０，４８２配列決定リードがこのランから得られ、標準的なベースコールおよびアラインメント解析ワークフローを通して配置された。９，２４５リードをＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５ゲノム（ＮＣ＿０００９１３．３）にマッピングすることができ、そのうち７，９７５（７６．１％）が各予想プローブハイブリダイゼーション位置の３つの中央リード長内にマッピングされた。配列決定リードのパイルアップは、位置ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉの各々について＞１，０００倍のカバレッジ深度をもたらした。
【０３７９】
材料
【表１０】
2019532642.tif 000027
タンパク質
ＯＮＬＰ１２３２６：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
【０３８０】
実施例８
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡ分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、ｄＣａｓ９分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。ｄＣａｓ９は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのリボソーム１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子に対するｃｒＲＮＡによって標的分子に結合する。オフターゲット、すなわち不一致領域の結合は、ｄＣａｓ９を「特異性強化型ｄＣａｓ９」として知られるｄＣａｓ９酵素の突然変異誘導体のそうでなければ野生型のバックグラウンドで置換すること、ならびに捕捉ビーズ表面上でのその後の精製の前に過剰な未結合ｄＣａｓ９を除去するためのＳＰＲＩ精製ステップと組み合わせて、結合ｄＣａｓ９タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。標的ＤＮＡ分子は、ナノポア配列決定に適合され、ｄＣａｓ９は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
【０３８１】
ｄＣａｓ９は、この伸長部に相補的なＤＮＡ配列（図４１のａ’）を担持するビーズ捕捉オリゴヌクレオチドコンジュゲート上の標的分子の捕捉を可能にする５’ＤＮＡ伸長部（図４１の配列ａ）を担持するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を保有する。この実施例では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ビオチン部分を介してビーズに連結される。この実施例では、非標的ＤＮＡは洗い流され、標的分子はビーズに結合したままである。標的分子は次いで、その遊離ｄＡテール化末端の一方または両方へのライゲーションによってナノポア配列決定に適合させ、ｄＣａｓ９標的分子は、ビーズに結合させる。ビーズ−標的−ＲＮＰアセンブリ全体は次いで、配列決定のためにフローセルに送達される。アセンブリは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってフローセルのウェルに提供されるか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、ビーズ上に、ビーズを膜にテザリングする、アダプター末端にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドコレステロールテザーを流すことによって開始される。あるいは、コレステロールテザーは、ビーズ−標的コンジュゲートがフローセルに添加される前の、「洗い流し」ステップ中に膜に導入することができる。
【０３８２】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５．９ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化した。末端修復およびｄＡテーリング後、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４×ＳＰＲＩ精製に供し、０．１×ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出した。
【０３８３】
２００ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、（ｄＣａｓ９結合バッファーとして知られる）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファーに添加した。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭの野生型を有するｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）または「特異性強化型」ｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２２９６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。２５０ｎＭの３’伸長部を担持するｃｒＲＮＡ（ここでは使用されない伸長部、ＡＲ１９１）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。最終体積は５０μＬであった。この混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られていた。
【０３８４】
ｄＣａｓ９−標的複合体を形成するために、５００ｎｇ（約１．２μＬ）の上記からのゲノムＤＮＡ（ＯＮＬＡ１８８１６）をＲＮＰに添加し、２０分間室温でインキュベートした。混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないｄＣａｓ９を除去した。混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供した：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートした。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出した。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持した。
【０３８５】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の２．５μＬのＡＲ３６４捕捉オリゴと約１時間撹拌しながらインキュベートした。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「捕捉ビーズ」として知られていた。
【０３８６】
ｄＣａｓ９−結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を１０μｇの捕捉ビーズ（１μＬ）および６５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）と２０分間撹拌しながらインキュベートすることによって、捕捉ビーズに結合させた。ビーズをその後、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄した。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去した。この試料は、「ビーズ−標的複合体」として知られていた。
【０３８７】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（チューブ「ＡＭＸ  １Ｄ」）を、上記からペレット化ビーズを１２．５μＬの２×ＬＡＱＡ１バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からの寄贈品）、７μＬのヌクレアーゼフリー水、５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）、および０．５μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｃａｔ．＃Ｍ０２０２）を含むライゲーションミックスで再懸濁することによって、ビーズ−標的複合体にライゲーションした。ビーズをライゲーションミックス中で１０分間撹拌しながらインキュベートし、ペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する約１２５μＬのバッファーで１回洗浄して、遊離未ライゲーションアダプターを除去した。洗浄後、ビーズをもう１回ペレット化し、製造業者の指示に従って１倍に希釈した、５０μＬのＲＢＦ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の成分）に再懸濁した。この混合物は、装填試料として知られていた。
【０３８８】
図４１は、ここで装填試料としても知られる、ｄＣａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−標的−ビーズコンジュゲートの予想される外観を示す。
【０３８９】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移した。装填試料の５０μＬ全体をＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませた。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データを標準カスタマープロトコルに従って収集および分析した。
【０３９０】
結果
図４６は、ＭｉｎＫＮＯＷ  １．７．１４ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを使用して上記プロトコルを用いる６時間の配列決定ランにわたって収集されたデータを示す。このプルダウンに使用される単一のｃｒＲＮＡプローブ、ＡＲ１９１は、ｄＣａｓ９を図４２、Ｄに列挙される７つの１６Ｓリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想され、１つの位置は、文字ＣおよびＤとして同定され、ＰＡＭ部位に対して−２位に単一の不一致を担持する。この位置は、図４２、Ｄにおいて同定されるピークｖｉｉに対応する。ＣまたはＤとして同定される不一致ピークに対する最大ピークの高さの比は、野生型ｄＣａｓ９および「特異性強化型」ｄＣａｓ９バリアントについてそれぞれ３．３３：１および９．４５：１であった。
【０３９１】
材料
【表１１】
2019532642.tif 000028
タンパク質
ＯＮＬＰ１２２９６：「特異性強化型ｄＣａｓ９」として知られる、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ：ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
ＯＮＬＰ１２３２６：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
【０３９２】
実施例９
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡ分子を主にその配列によって同定し、リード方向性バイアスに対する触媒活性（「生きた」、野生型）および死んだ（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ）Ｃａｓ９の効果を調査した。方向性バイアスは、特定のリード方向について富化するために使用され得る。標的分子は、Ｃａｓ９分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。Ｃａｓ９は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのリボソーム１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子に対するｃｒＲＮＡによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、捕捉ビーズ表面上でのその後の精製前に過剰な未結合Ｃａｓ９を除去するためのＳＰＲＩ精製ステップと組み合わせて、結合Ｃａｓ９タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。標的ＤＮＡ分子は、ナノポア配列決定に適合され、Ｃａｓ９は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
【０３９３】
Ｃａｓ９は、この伸長部に相補的なＤＮＡ配列（図４１のａ’）を担持するビーズ捕捉オリゴヌクレオチドコンジュゲート上の標的分子の捕捉を可能にする５’ＤＮＡ伸長部（図４１の配列ａ）を担持するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を保有する。この実施例では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ビオチン部分を介してビーズに連結される。この実施例では、非標的ＤＮＡは洗い流され、標的分子はビーズに結合したままである。標的分子は次いで、その遊離ｄＡテール化末端の一方または両方へのライゲーションによってナノポア配列決定に適合させ、Ｃａｓ９−標的分子は、ビーズに結合させる。ビーズ−標的−ＲＮＰアセンブリ全体は次いで、配列決定のためにフローセルに送達される。アセンブリは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってフローセルのウェルに提供されるか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、ビーズ上に、ビーズを膜にテザリングする、アダプター末端にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドコレステロールテザーを流すことによって開始される。あるいは、コレステロールテザーは、ビーズ−標的コンジュゲートがフローセルに添加される前の、「洗い流し」ステップ中に膜に導入することができる。
【０３９４】
触媒活性Ｃａｓ９は、標的部位の各々で二本鎖切断を行うと予想される。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０７，６２−６７（２０１４）によって実証されるように、生きたＣａｓ９が切断物の一方の側のみに結合したままであるとした場合、有意な方向性バイアスが予想される。
【０３９５】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５．９ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化した。末端修復およびｄＡテーリング後、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４×ＳＰＲＩ精製に供し、０．１×ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出した。
【０３９６】
死んだＣａｓ９を有するリボヌクレオチド−タンパク質複合体を形成するために、２００ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、（ｄＣａｓ９結合バッファーとして知られる）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファーに添加した。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。２５０ｎＭのｃｒＲＮＡ（ＡＲ４００）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。最終体積は５０μＬであった。この混合物は、死んだＲＮＰとして知られていた。
【０３９７】
生きたＣａｓ９を有するリボヌクレオチド−タンパク質複合体を形成するために、２００ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、Ｃａｓ９開裂バッファーとして知られる、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する２５℃のバッファー、ｐＨ６．５に添加した。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭの野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ＃Ｍ０３８６Ｔ）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。２５０ｎＭのｃｒＲＮＡ（ＡＲ４００）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。最終体積は５０μＬであった。この混合物は、生きたＲＮＰとして知られていた。
【０３９８】
Ｃａｓ９−標的複合体を形成するために、５００ｎｇ（約１．２μＬ）の上記からのゲノムＤＮＡ（ＯＮＬＡ１８８１６）をＲＮＰに添加し、（死んだＲＮＰについて）３０分間３０℃または（生きたＲＮＰについて）３０分間３７℃でインキュベートした。混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないＣａｓ９を除去した。混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供した：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートした。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出した。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持した。
【０３９９】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の２．５μＬのＡＲ３６４捕捉オリゴと約１時間撹拌しながらインキュベートした。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「捕捉ビーズ」として知られていた。
【０４００】
Ｃａｓ９−結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を１０μｇの捕捉ビーズ（１μＬ）および６５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）と２０分間撹拌しながらインキュベートすることによって、捕捉ビーズに結合させた。ビーズをその後、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄した。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去した。この試料は、「ビーズ−標的複合体」として知られていた。
【０４０１】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（チューブ「ＡＭＸ  １Ｄ」）を、上記からペレット化ビーズを１２．５μＬの２×ＬＡＱＡ１バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からの寄贈品）、７μＬのヌクレアーゼフリー水、５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）、および０．５μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｃａｔ．＃Ｍ０２０２）を含むライゲーションミックスで再懸濁することによって、ビーズ−標的複合体にライゲーションした。ビーズをライゲーションミックス中で１０分間撹拌しながらインキュベートし、ペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する約１２５μＬのバッファーで１回洗浄して、遊離未ライゲーションアダプターを除去した。洗浄後、ビーズをもう１回ペレット化し、製造業者の指示に従って１倍に希釈した、５０μＬのＲＢＦ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の成分）に再懸濁した。この混合物は、装填試料として知られていた。
【０４０２】
図４１は、ここで装填試料としても知られる、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−標的−ビーズコンジュゲートの予想される外観を示す。
【０４０３】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移した。装填試料の５０μＬ全体をＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませた。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データを標準カスタマープロトコルに従って収集および分析した。
【０４０４】
結果
図４７は、プルダウンに触媒不活性Ｃａｓ９（「死んだ」、Ａ）または活性Ｃａｓ９（「生きた」、Ｂ）のいずれかを用いて、ＭｉｎＫＮＯＷ  １．７．１４ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを使用して上記プロトコルを用いる６時間の配列決定ランにわたって収集されたデータを示す。このプルダウンに使用される単一のｃｒＲＮＡプローブ、ＡＲ４００は、Ｃａｓ９を図４２、Ｄに列挙される７つの１６Ｓリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想される。この例において上昇したインキュベーション温度に起因する、追加のピーク、＊も見られる。それぞれＣおよびＤとして同定される、「死んだ」および「生きた」Ｃａｓ９のカバレッジ方向性プロットは、生きたＣａｓ９によって課されるわずかな追加の方向性バイアスを実証する。
【０４０５】
材料
【表１２】
2019532642.tif 000029
タンパク質
ＯＮＬＰ１２３２６：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
【０４０６】
実施例１０
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの混合物の検出を多重化するための方法を記載する。この例では、同じＥ．ｃｏｌｉ全ゲノム試料を、ｃｒＲＮＡプローブの異なる組み合わせを含む複数の別々の富化ｄＣａｓ９「プルダウン」に供した。各試料を特定のＤＮＡバーコードアダプター配列とライゲーションし、全ての試料を同じフローセルを用いて同時に配列決定し、それらのバーコードアダプターを用いて同定することを可能にした。
【０４０７】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５．９ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化した。末端修復およびｄＡテーリング後、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４×ＳＰＲＩ精製に供し、０．１×ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出した。５００ｎｇのこのライブラリーを次に、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮａｔｉｖｅ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  １Ｄ（Ｃａｔ＃ＥＸＰ−ＮＢＤ１０３）からの７つのネイティブバーコード（ＮＢ）アダプター、ＮＢ０１、ＮＢ０２、ＮＢ０３、ＮＢ０４、ＮＢ０５、ＮＢ０６、およびＮＢ０７の各々に、製造業者の指示に従ってライゲーションした。
【０４０８】
７つの試料を個別に、各々ｃｒＲＮＡプローブの異なる組み合わせで、以下のように調製した：２２０ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、（ｄＣａｓ９−ＥＤＴＡバッファーとして知られる）５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーに添加した。１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。２００ｎＭのｃｒＲＮＡ（トータル）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートした。最終体積は５０μＬであった。ｃｒＲＮＡの組み合わせは以下の通りであった：（ＮＢ０１）ＡＲ３９８、（ＮＢ０２）ＡＲ３９９、（ＮＢ０３）ＡＲ４００、（ＮＢ０４）ＡＲ３９８およびＡＲ３９９、（ＮＢ０５）ＡＲ３９８およびＡＲ４００、（ＮＢ０６）ＡＲ３９９およびＡＲ４００、（ＮＢ０７）ＡＲ３９８、ＡＲ３９９およびＡＲ４００。これらの７つの混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られていた。
【０４０９】
この例で使用される３つのｃｒＲＮＡプローブの各々は、以下の表に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体の固有の領域を標的とする。
【表１３】
2019532642.tif 000030
【０４１０】
ＲＮＰ−標的複合体を形成するために、５００ｎｇの上記からの各バーコードを保有するゲノムＤＮＡ（ＯＮＬＡ１８８１６）を、別々に、ＲＮＰの各混合物（ＮＢ０１〜ＮＢ０７、合計７つ）に添加し、２０分間室温でインキュベートした。各混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないｄＣａｓ９を除去した。混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供した：約５０μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートした。この時点で、７つの試料全てを単一のチューブに組み合わせた。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約１ｍＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出した。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持した。
【０４１１】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の２．５μＬのＡＲ３６４捕捉オリゴと約１時間撹拌しながらインキュベートした。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「捕捉ビーズ」として知られていた。
【０４１２】
ｄＣａｓ９結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を３０μｇの捕捉ビーズ（１μＬ）および５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ−２０を含む約６５μＬのバッファーと２０分間撹拌しながらインキュベートすることによって、捕捉ビーズに結合させた。ビーズをその後、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回洗浄した。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去した。この試料は、「バーコード付きビーズ−標的複合体」として知られていた。
【０４１３】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮａｔｉｖｅ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  １Ｄ（ＥＸＰ−ＮＢＤ１０３）からの酵素装填アダプターミックス（チューブ「ＢＡＭ」）を、上記からのペレット化ビーズを１２．５μＬの２倍Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃Ｍ０３６７）、５μＬのＢＡＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ．、キットＥＸＰ−ＮＢＤ１０３）、および７．５μＬのヌクレアーゼフリー水を含むライゲーションミックスで室温で１０分間再懸濁することによって、バーコード付きビーズ−標的複合体にライゲーションし、ペレット化し、遊離未ライゲーションアダプターを除去するために５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する約１２５μＬのバッファーで１回洗浄した。洗浄後、ビーズをもう１回ペレット化し、製造業者の指示に従って１倍に希釈した、５０μＬのＲＢＦ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の成分）に再懸濁した。この混合物は、バーコード付き装填試料として知られていた。
【０４１４】
図４８は、ここでバーコード付き装填試料としても知られる、ライゲーションされたバーコードアダプターを有する、ｄＣａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−標的−ビーズコンジュゲートの予想される外観を示す。試料は、（標的配列以外で）試料を同定する、標的と酵素装填アダプターとの間のバーコードアダプター配列の存在を除いて、図４１に示されるものと同様である。
【０４１５】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移した。バーコード付き装填試料の５０μＬ全体をＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませた。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データをＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮａｔｉｖｅ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔｓの標準カスタマーワークフローに従って収集および分析した。
【０４１６】
結果
図４８、Ｄは、上記の多重化プロトコルを用いる６時間の配列決定ランにわたって収集された、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに対して整列させたリードからのカバレッジプロットを示す。試料を、ＭｉｎＫＮＯＷ  １．７．１４ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行する単一のＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎＩＯＮフローセルにかけ、使用されるＮａｔｉｖｅ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｋｉｔに適したＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓワークフローを用いて分析した。
【０４１７】
各バーコード、ＮＢ０１〜ＮＢ０７は、以下の表に従ってＥ．ｃｏｌｉ配列の特定領域のプルダウンに関連付けられる。図４８、Ｄのカバレッジプロットは、各特定の標的領域についてのバーコード配列のデコンボリューションの成功を示す。
【表１４】
2019532642.tif 000031
材料
【表１５】
2019532642.tif 000032
タンパク質
ＯＮＬＰ１２３２６：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
【０４１８】
実施例１１
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡ分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、ｄＣａｓ９分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。ｄＣａｓ９は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのリボソーム１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子に対するｃｒＲＮＡによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、ビーズ表面上でのその後の捕捉前に過剰な未結合ｄＣａｓ９を除去するためのＳＰＲＩ精製ステップと組み合わせて、結合ｄＣａｓ９タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。
【０４１９】
この実施例では、ＤＮＡ分析物は、捕捉ビーズに結合しながら、以下のいずれかの異なる方法で適合され得る：（１）高分子量ゲノムＤＮＡは、せん断、末端修復、ｄＡテール化、および適切な末端を用いてアダプターにライゲーションしてもよく、または（２）高分子量ＤＮＡは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｒａｐｉｄ  １Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＱＫ−ＲＡＤ００３）によって使用されるものなどのトランスポザーゼシステムを用いて同時に切断および適合されてもよい。アダプターは、ビーズ上にある間に捕捉された分析物に対して他の化学反応が行われることを可能にし得るが、遊離アダプターなどの過剰な成分は洗い流される。例として、分析物は、酵素アダプターをライゲーションする前に適切なアダプター化学をライゲーションすることによって、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ２技術に適合され得る。あるいは、ＰＣＲによる捕捉標的の増幅、およびビーズからの捕捉分析物の放出を可能にするアダプターがライゲーションされ得る。
【０４２０】
捕捉標的がＰＣＲによって放出される例を除いて、ビーズ−標的−ＲＮＰアセンブリ全体を配列決定のためにフローセルに送達する。アセンブリは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってフローセルのウェルに提供されるか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、ビーズ上に、ビーズを膜にテザリングする、アダプター末端にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドコレステロールテザーを流すことによって開始される。あるいは、コレステロールテザーは、ビーズ−標的コンジュゲートがフローセルに添加される前の、「洗い流し」ステップ中に膜に導入することができる。
【０４２１】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５．９ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。このライブラリーを、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化する。末端修復およびｄＡテーリング後、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４×ＳＰＲＩ精製に供し、０．１×ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出する。この試料は、「ｄＡ−テール化ｌゲノムＤＮＡ」として知られている。
【０４２２】
５００ｎｇのｄＡテール化ゲノムＤＮＡを、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（「ＡＭＸ  １Ｄ」）に、１２．５μＬの２倍Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃Ｍ０３６７）、７．５μＬのヌクレアーゼフリー水、および５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）中、１０分間室温でライゲーションする。ライゲーション後、未ライゲーションアダプターを０．４倍ＳＰＲＩ精製によって精製し、適合されたライブラリーを１０ｍＭのトリスＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０中でＳＰＲＩビーズから溶出する。この試料は、「プレライゲーションゲノムＤＮＡ」として知られている。
【０４２３】
１μｇのＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡ試料をせん断し、粘着末端を、約１μｇのＤＮＡの２．５μＬの（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ．のＳＱＫ−ＲＡＤ００３からの）ＦＲＡとの、１０μＬの合計体積、３０℃で２０分間、続いて８０℃で１分間のインキュベーションによって、単一のステップで導入する。５００μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズをヌクレアーゼフリー水で５回洗浄し、続いて５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）のＰＥＧ−８０００を含む元の体積のバッファーに再懸濁し、「洗浄済みＳＰＲＩビーズ」を得る。ゲノムＤＮＡ試料を、０．４倍「洗浄済みＳＰＲＩビーズ」を用いる精製に供し、ＳＰＲＩビーズを０．１倍ＴＥを含む１２．５μＬのバッファーと室温で５分間インキュベートすることによって溶出する。ビーズをもう１回ペレット化し、「トランスポザーゼ断片化ゲノムＤＮＡ」として知られる上清を保持する。
【０４２４】
２００ｎＭのＤＮＡ伸長型ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＲ３６３）を、（ｄＣａｓ９結合バッファーとして知られる）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファーに添加する。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートする。２５０ｎＭのｃｒＲＮＡ（ＡＲ４００）を次いで反応物に添加し、さらに１０分間室温（約２１℃）でインキュベートする。最終体積は反応毎に５０μＬであった。この混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られている。
【０４２５】
ｄＣａｓ９−標的複合体を形成するために、５００ｎｇ（約１．２μＬ）のトランスポザーゼ断片化ゲノムＤＮＡ、ｄＡテール化ゲノムＤＮＡ、またはプレライゲーションゲノムＤＮＡのいずれかを反応毎にＲＮＰに添加し、２０分間室温でインキュベートする。混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないｄＣａｓ９を除去する。各混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供する：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートする。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出する。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持した。
【０４２６】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の２．５μＬのＡＲ３６４捕捉オリゴと約１時間撹拌しながらインキュベートする。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去した。このコンジュゲートは、「捕捉ビーズ」として知られていた。
【０４２７】
（トランスポザーゼ断片化ゲノムＤＮＡ、ｄＡテール化ゲノムＤＮＡ、またはプレ適合ゲノムＤＮＡに結合している）ｄＣａｓ９結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を１０μｇの捕捉ビーズ（１μＬ）および６５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）と２０分間撹拌しながらインキュベートすることによって、捕捉ビーズに結合させる。ビーズを、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄する。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去する。この試料は、「ビーズ−標的複合体」として知られている。
【０４２８】
１つの反応では、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（チューブ「ＡＭＸ  １Ｄ」）を、上記からペレット化ビーズを１２．５μＬの２×Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃Ｍ０３６７）、７．５μＬのヌクレアーゼフリー水、および５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）を含むライゲーションミックスで１０分間室温で再懸濁することによって、ビーズ上で捕捉されたｄＡテール化ゲノムＤＮＡにライゲーションする。この試料は、「ビーズライゲーション１Ｄ」試料として知られている。
【０４２９】
第２の反応では、標的がビーズに結合している間に２つの連続的ライゲーションを行うことによって、分析物を「１Ｄ２」配列決定のために調製する。第１のライゲーション反応では、ビーズを、２．５μｌの１Ｄ２アダプター、２５μｌのＢｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、および２２．５μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、１０分間室温でインキュベートする。１０分のインキュベーション後、さらに１０μＬのＢＡＭおよび１０μＬのＢｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘをビーズに添加し、さらに１０分間室温でインキュベートする。この試料は、「１Ｄ２」試料として知られている。
【０４３０】
第３の反応では、ビーズに結合しているトランスポザーゼ断片化ゲノムＤＮＡを、ビーズを１倍ＲＢＦ、および１μＬの（ＳＱＫ  −  ＲＡＤ００３からの）ＲＰＤを含有するバッファーに１０分間再懸濁することによって、配列決定に適合させる。この試料は、「Ｒａｐｉｄ  １Ｄ」試料として知られている。
【０４３１】
上記ライゲーションの各々の後、ビーズをライゲーション後にペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１２５μＬのバッファー中で１回洗浄し、５０μＬの（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８からの）ＲＢＦに再懸濁し、製造業者の指示に従って１倍に希釈する。この混合物は、装填試料として知られている。
【０４３２】
ビーズに結合しているプレ適合ゲノムＤＮＡを含有する試料について、ビーズを５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１２５μＬのバッファー中でもう１回洗浄し、５０μＬのＲＢＦ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の成分）に再懸濁し、製造業者の指示に従って１倍に希釈する。この混合物は、「プレライゲーション試料」として知られている。
【０４３３】
さらなる反応では、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬｏｗ−Ｉｎｐｕｔ  Ｂｙ  ＰＣＲキット（ＳＱＫ−ＬＷＰ００１）からのＰＣＲ−アダプター（チューブ「ＰＣＡ」）を、上記からペレット化ビーズを５０μＬの２倍Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃Ｍ０３６７）、３０μＬのヌクレアーゼフリー水、および２０μＬのＰＣＡを含むライゲーションミックスで１０分間室温で再懸濁することによって、ビーズ上で捕捉されたｄＡテール化ゲノムＤＮＡにライゲーションする。ライゲーション後、ビーズをさらに１２５μＬの１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、５０μＬのＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑ  ２×Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ  Ｃａｔ＃Ｍ０２８７）、２μＬのＷＧＰプライマー、および４８μＬのヌクレアーゼフリー水を含有する混合物に再懸濁する。混合物を、９４℃での３０秒の変性、ならびに９４℃での３０秒の変性、６２℃で３０秒のアニーリング、および６５℃での５００秒の伸長の１０サイクルを含む、ＰＣＲ増幅に供する。この試料を、上記のように予め洗浄したＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて０．４倍ＳＰＲＩ精製に供する。試料を、ＳＰＲＩビーズから１０μＬの１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌ中、５分間室温で溶出する。ＳＰＲＩビーズからの溶出後、１μＬのＲＰＤ（ＳＱＫ−ＬＷＰ００１）を添加し、混合物を１０分間室温でインキュベートして、クリックケミストリーによって配列決定アダプターをライゲーションする。さらに３５μＬのＲＢＦ、２５μＬのＬＬＢ、および５μＬのヌクレアーゼフリー水も添加する。この試料は、「ＰＣＲ」試料として知られている。
【０４３４】
５つのＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移す。各試料：１Ｄ２、ＰＣＲ、Ｒａｐｉｄ  １Ｄ、ビーズライゲーション、およびプレライゲーションを、５つのフローセルの各々のＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませる。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データを標準カスタマープロトコルに従って収集および分析する。
【０４３５】
図４９は、（１）ビーズに結合している捕捉標的分析物の末端への酵素フリーアダプターのライゲーションを介したｄＣａｓ９の酵素フリー検出、（２）ビーズから標的を放出するための、上記のような、ＰＣＲアダプターのライゲーションによる標的の富化、続いて標的のＰＣＲ増幅、（３）ｄＣａｓ９が標的に結合し、標的がビーズに結合している間の、高精度ナノポア配列決定のための、１Ｄ２バーコードアダプター、続いて配列決定アダプターの連続的なライゲーションのための３つの例となるワークフローを示す。
【０４３６】
図５０は、アダプターライゲーションのために粘着末端を同時に付加しながら、ＤＮＡのトランスポザーゼ媒介せん断による、高分子量ＤＮＡからの標的の迅速な富化のための、実施例１１に記載されるワークフローの例を示す。ｄＣａｓ９は、次いで、実施例１１に記載されるように、せん断ＤＮＡに結合しており、オフターゲット効果は、ストレスステップによって最小化され、配列決定アダプターは、クリックケミストリーを介してライゲーションされる。このワークフローは、実施例１０に記載されるように、トランスポザーゼ断片化ステップとアダプター付着ステップとの間にＣａｓ９結合およびビーズ捕捉ステップの挿入を有する、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＱＫ−ＲＡＤ００３キットを利用する。
【０４３７】
結果
上記のワークフローの各々からの結果は、図４２に描写されるもの、すなわち、全ゲノム試料からのＥ．ｃｏｌｉ  ｒｒｓ遺伝子の標的化富化と非常に類似した結果をもたらす。この例における唯一の相違は、配列決定アダプターを付着するための末端調製の方法である。バーコードの連続的なライゲーションを介して、１Ｄ２アダプター、続いて酵素装填配列決定アダプターを付着する能力は、ナノポア配列決定の単一分子精度を高める。トランスポザーゼを介したアダプターの結合、続いてクリックケミストリーを介した酵素フリーライゲーションを行う能力は、エンドユーザーにより大きな利便性を与え、より速い試料調製時間を可能にし得る。ＰＣＲアダプターを付着する能力は、エンドユーザーにかなり改善された感度を与え、はるかに少ない投入量の出発材料から富化標的の検出を可能にし得る。
【０４３８】
標的分析物がビーズに結合している間の配列決定アダプターのライゲーションは、ポアを汚すことまたはヌクレオチド濃度を枯渇させることによってナノポア配列決定反応を害し得る過剰なアダプターをライゲーションステップ後に便利に洗い流すことを可能にする
【０４３９】
材料
【表１６】
2019532642.tif 000033
タンパク質
ＯＮＬＰ１２３２６：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
【０４４０】
実施例１２
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この例では、標的ＤＮＡ分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、触媒活性（「生きた」、野生型）Ｃｐｆ１（ＯＮＬＰ１２３５０）または不活性（Ｅ９９３ＡまたはＤ９０８Ａ）ｄＣｐｆ１（ＯＮＬＺ１１８８２またはＯＮＬＺ１１８８３）上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。Ｃｐｆ１またはｄＣｐｆ１は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのリボソーム１６Ｓ（ｒｒｓ）遺伝子に対するｃｒＲＮＡによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、ビーズ表面上でのその後の捕捉前に過剰な未結合Ｃｐｆ１またはｄＣｐｆ１を除去するためのＳＰＲＩ精製ステップと組み合わせて、結合Ｃｐｆ１またはｄＣｐｆ１タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。
【０４４１】
Ｃｐｆ１またはｄＣｐｆ１は、図ＲＢ１２に描写されるように、この伸長部（ＡＲ３６４）に相補的なＤＮＡ配列を担持するビーズ捕捉オリゴヌクレオチドコンジュゲート上の標的分子の捕捉を可能にする５’ＤＮＡ伸長部（ＡＲ７６６）を担持するｃｒＲＮＡ分子を保有する。この実施例では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ビオチン部分を介してビーズに連結される。この実施例では、非標的ＤＮＡは洗い流され、標的分子はビーズに結合したままである。標的分子を次いで、その遊離ｄＡテール化末端の一方または両方へのライゲーションによってナノポア配列決定に適合させ、Ｃｐｆ１標的分子をビーズに結合させる。ビーズ−標的−ＲＮＰアセンブリ全体を次いで、配列決定のためにフローセルに送達する。アセンブリは、フローセルの下に配置された磁界の印加によってフローセルのウェルに提供されるか、または重力によって沈降させることができる。配列決定は、ビーズ上に、ビーズを膜にテザリングする、アダプター末端にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドコレステロールテザーを流すことによって開始する。あるいは、コレステロールテザーは、ビーズ−標的コンジュゲートがフローセルに添加される前の、「洗い流し」ステップ中に膜に導入することができる。
【０４４２】
方法
Ｅ．ｃｏｌｉ全ゲノムライブラリー、ＯＮＬＡ１８８１６を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５．９ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。このライブラリーを、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキットを使用して末端修復およびｄＡテール化する。末端修復およびｄＡテーリング後、断片化ゲノムＤＮＡを、０．４×ＳＰＲＩ精製に供し、０．１×ＴＥ中でＳＰＲＩビーズから溶出する。この試料は、「ｄＡ−テール化ｌゲノムＤＮＡ」として知られている。
【０４４３】
２５０ｎＭのＤＮＡ伸長型ｃｒＲＮＡ（ＡＲ７６６）を、（Ｃｐｆ１結合バッファーとして知られる）５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＤＴＴを含有するバッファーに添加する。ｃｒＲＮＡを９５℃まで２分間加熱し、室温まで冷却させ、その後５００ｎＭのＣｐｆ１（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を２０分間室温（約２１℃）でインキュベートする。この混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られている。
【０４４４】
Ｃｐｆ１−標的複合体を形成するために、５００ｎｇ（約１．２μＬ）の上記からのゲノムＤＮＡ（ＯＮＬＡ１８８１６）をＲＮＰに添加し、６０分間室温でインキュベートする。混合物を次に５５℃で５分間インキュベートして、その意図する標的に結合していないＣｐｆ１を除去する。混合物を以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供する：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートする。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを４０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）、４０ｍＭのＫＣｌを含む１２．５μＬのバッファーと５分間インキュベートすることによって溶出する。ビーズをもう１回ペレット化し、「ＳＰＲＩ溶出液」として知られる上清を保持する。
【０４４５】
５０μｇのＳｏｌｕｌｉｎｋ「Ｎａｎｏｌｉｎｋ」ストレプトアビジン磁性ビーズ（５μＬ）を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む約１２０μＬのバッファー中の２．５μＬのＡＲ３６４捕捉オリゴと約１時間撹拌しながらインキュベートする。未結合オリゴヌクレオチドを、ビーズを同じバッファーで２回洗浄し、磁性分離機を使用してビーズをペレット化することによって除去する。このコンジュゲートは、「捕捉ビーズ」として知られていた。
【０４４６】
Ｃｐｆ１またはｄＣｐｆ１結合標的分子を、１２．５μＬのＳＰＲＩ溶出液を１０μｇの捕捉ビーズ（１μＬ）および６５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓキロベースＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．＃６０１０１）と２０分間撹拌しながらインキュベートすることによって、捕捉ビーズに結合させる。ビーズを、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するバッファーで３回、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーで１回洗浄する。このステップ後、ビーズをペレット化し、上清を除去する。この試料は、「ビーズ−標的複合体」として知られている。
【０４４７】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からの酵素装填アダプター（チューブ「ＡＭＸ  １Ｄ」）を、上記からペレット化ビーズを１２．５μＬの２×Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃Ｍ０３６７）、７．５μＬのヌクレアーゼフリー水、および５μＬのＡＭＸ  １Ｄ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８の一部）を含むライゲーションミックスで１０分間室温で再懸濁することによって、ビーズ上で捕捉されたｄＡテール化ゲノムＤＮＡにライゲーションする。この試料は、「ビーズライゲーション１Ｄ」試料として知られている。
【０４４８】
ビーズをライゲーション後にペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１２５μＬのバッファー中で１回洗浄し、５０μＬの（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８からの）ＲＢＦに再懸濁し、製造業者の指示に従って１倍に希釈する。この混合物は、装填試料として知られている。
【０４４９】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した５０ｎＭのテザーオリゴを含有する８００μＬの１×ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移す。装填試料をフローセルのＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませる。ＭｉｎＩＯＮのデータ収集を直ちに開始し、データを標準カスタマープロトコルに従って収集および分析する。
【０４５０】
結果
上記のワークフローからの結果は、図４２に描写されるものおよび図４７に描写されるもの、すなわち、全ゲノム試料からのＥ．ｃｏｌｉ  ｒｒｓ遺伝子の標的化富化と非常に類似した結果をもたらす。生きたＣｐｆ１は、方向性バイアスを課し得る。この実施例における相違は、ＲＮＰを形成するために使用されるＣＲＩＳＰＲタンパク質（すなわち、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９ではなく、Ｃｐｆ１またはｄＣｐｆ１）、およびＲＮＰを形成するための単一ＤＮＡ伸長型ｃｒＲＮＡの使用である。
【０４５１】
標的分析物がビーズに結合している間の配列決定アダプターのライゲーションは、ポアを汚すことまたはヌクレオチド濃度を枯渇させることによってナノポア配列決定反応を害し得る過剰なアダプターをライゲーションステップ後に便利に洗い流すことを可能にする。
【０４５２】
材料
【表１７】
2019532642.tif 000034
タンパク質
ＯＮＬＰ１２３５０：Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｃｐｆ１、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＮ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶによって開裂された部分を示す：
【表１８】
2019532642.tif 000035
ＯＮＬＺ１１８８２：Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｃｐｆ１  Ｄ９０８Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＮ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶによって開裂された部分を示す：
【表１９】
2019532642.tif 000036
ＯＮＬＺ１１８８３：Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｃｐｆ１  Ｅ９９３Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＮ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶによって開裂された部分を示す：
【表２０】
2019532642.tif 000037
【０４５３】
実施例１３
この実施例は、ナノポア検出によるヒトバックグラウンドにおける特定のバクテリオファージラムダポリヌクレオチドの迅速な検出および定量化のための方法を記載する。この実施例では、標的ＤＮＡを、表面上への標的分子の固定化に使用され得る親和性タグを保有する１つ以上のｄＣａｓ９−ＲＮＰ複合体（複数可）（「固定化ｄＣａｓ９複合体（複数可）」）に接触させ、１つ以上のさらなるｄＣａｓ９−ＲＮＰ複合体（「バーコードＣａｓ９複合体（複数可）」）は、第２の領域において標的ＤＮＡ分子と接触する。「バーコードｄＣａｓ９複合体」は、その電流シグネチャーがｄＣａｓ９がその標的に結合していることを確認するために使用される、酵素装填アダプター分子を保有する。標的領域の存在は、バーコードによって同定され、一方で非標的ＤＮＡに対する標的の検出の感度は、膜表面上への固定化によって向上する。よって、ｄＣａｓ９複合体の両方の種類は、バーコード配列の検出を成功させるために、同じ標的分子に結合している必要がある。この例では、非標的ＤＮＡを洗い流す必要はない。
【０４５４】
方法
バクテリオファージラムダ全ゲノムライブラリー（ＮＥＢ  Ｃａｔ＃Ｎ３０１３）を、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いるＥ．ｃｏｌｉ高分子量ゲノムＤＮＡの約５ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。ヒト全ゲノムライブラリーも、製造業者の指示に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ  ｇＴｕｂｅを用いる高分子量ゲノムＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃０００００００１１６９１１１２００１）の約５ｋｂの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。
【０４５５】
「酵素装填ｃｒＲＮＡ」を、オリゴヌクレオチドＯＬＩＧＯ＿１、３’ＤＮＡ伸長部を担持するｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド、およびＯＬＩＧＯ＿２、ＤＮＡアダプターオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ装置で、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ中、４０μＭの各オリゴヌクレオチドで、９５℃まで２分間加熱し、２０℃まで約２時間かけてゆっくり冷却することによって、ハイブリダイズすることによって調製する。このアニーリング反応は、ｃｒＲＮＡ部分、および「ｃｒＲＮＡアダプター」として知られる、二重螺旋であり、３’ｄＡ−オーバーハングを担持する、ＤＮＡ伸長部分を有するハイブリッド分子をもたらす。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１Ｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）からのＡＭＸ  １Ｄ酵素アダプターを、５μＬの（ｄＴ−オーバーハングを保有する）ＡＭＸ  １Ｄを１μＬの「ｃｒＲＮＡアダプター」（１．２５μＬ）、５０μＬの２倍ＮＥＢ  Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、および４３．８μＬのヌクレアーゼフリー水と、約１００μＬの合計体積で、１０分間室温でインキュベートすることによって、「ｃｒＲＮＡアダプター」にライゲーションする。過剰な未ライゲーション材料を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２８％（重量／体積）のＰＥＧ−８０００中で平衡化した３．８倍体積のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズの添加によって精製し、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー中で「酵素装填ｃｒＲＮＡ」を溶出する。
【０４５６】
「コレステロールテザー」を、オリゴヌクレオチドＡＲ１３１およびＡＲ１３２をＰＣＲ装置で、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ中、４０μＭの各オリゴヌクレオチドで、９５℃まで２分間加熱し、２０℃まで約２時間かけてゆっくり冷却することによって、ハイブリダイズすることによって調製した。このアニーリング反応は、以下のｃｒＲＮＡ  ＡＲ１４０に対する相補性を担持する３’オーバーハングを有するハイブリッド分子をもたらす。
【０４５７】
２００ｎＭの「Ａｌｔ−Ｒ」ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃１０７２５３２）を、（ｄＣａｓ９結合バッファーとして知られる）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するバッファーに添加する。ｔｒａｃｒＲＮＡを９０℃まで２分間加熱し、湿った氷上で急冷し、その後１００ｎＭのｄＣａｓ９（ＯＮＬＰ１２３２６）を添加し、反応物を１０分間室温（約２１℃）でインキュベートする。２つのｃｒＲＮＡ、１つの３’ＤＮＡ伸長配列を担持する、１２５ｎＭのＡＲ１４０、および配列決定アダプターを担持する、上記からの１２５ｎＭの「酵素装填ｃｒＲＮＡ」の等モルミックスを添加する。インキュベーションを室温（約２１℃）で１０分間継続する。最終体積は、約５０μＬである。この混合物は、リボヌクレオチド−タンパク質複合体（ＲＮＰ）として知られている。
【０４５８】
ｄＣａｓ９−標的複合体を形成するために、変動する量の０〜１００ｎｇの上記からのバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡを、一定の１μｇ（合計５μＬ中）の上記からのヒトＤＮＡと混合し、ＲＮＰに添加し、２０分間室温でインキュベートする。混合物を、過剰な未結合ｄＣａｓ９、ｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを除去するために、以下のように１×ＳＰＲＩ精製に供する：５１μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを混合物に添加し、穏やかな再懸濁によって混合し、１０分間室温でインキュベートする。ビーズを磁性分離機を使用してペレット化し、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（４℃でｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（重量／体積）ＰＥＧ−８０００を含む約２５０μＬのバッファーで２回洗浄し、ＳＰＲＩビーズを１２．５μｌの１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＮａＣｌとインキュベートすることによって溶出する。１２．５μＬの溶出液に、３５μＬのＲＢＦ、２５μＬのＬＬＢ（ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの両成分）、および２．５μＬのヌクレアーゼフリー水を添加する。この試料は、「装填試料」として知られている。
【０４５９】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮフローセルを、その入口ポートを介してピペットで移した、ＡＲ１３４Ａおよびコレステロール部分への相補性を担持する、５０ｎＭの「コレステロールテザー」を含有する８００μＬの１倍ＲＢＦでプライミングし、続いて１０分の停止後、ＳｐｏｔＯＮポートを開いたその入口ポートを介して２００μＬの同じ混合物をピペットで移す。装填試料の７５μＬ全体をＳｐｏｔＯＮポートにピペットで滴下し、流体をフローセルに吸い込ませた。フローセルは洗い流されず、膜テザリング分析物はナノポアによって優先的に捕捉されるので、バックグラウンドにわたる標的分析物の定量化が可能である。ＭｉｎＩＯＮデータ収集を直ちに開始し、データをアダプター事象の数を計測することによって収集および分析する。
【０４６０】
結果
図５２は、上記の例を漫画形態で示す。ナノポア配列決定リードアウトは、酵素装填アダプターＣに依存する（バーコード配列ｂをもたらすようにベースコールされ得る）特徴的な事象Ｌ１によって中断され、その頻度は、標的分析物（膜テザリング種Ｇ、および溶液種Ｈ）の濃度に依存し、膜テザリング種Ｇは、ナノポアへのその近接のため、ナノポアＪによって優先的に捕捉される。一定量のヒト非標的ＤＮＡに対する標的分析物（バクテリオファージラムダ）の滴定は、標的分析物濃度に対する事象Ｌ１の頻度のプロットＭをもたらす。ゼロ標的分析物濃度（Ｎ）での事象Ｌ１の頻度は、溶液から捕捉される（すなわち、表面にテザリングされていない）種Ｈの検出の「偽陽性」またはバックグラウンド率を示す。
【０４６１】
材料
【表２１】
2019532642.tif 000038
タンパク質
ＯＮＬＰ１２３２６：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、ＴＥＶ開裂可能なリンカーを有するＣ末端Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、括弧内太字はＴＥＶ（上記配列）によって開裂された部分を示す。
【図１】
2019532642.tif 000039
【図２】
2019532642.tif 000040
【図３】
2019532642.tif 000041
【図４】
2019532642.tif 000042
【図５】
2019532642.tif 000043
【図６】
2019532642.tif 000044
【図７】
2019532642.tif 000045
【図８】
2019532642.tif 000046
【図９】
2019532642.tif 000047
【図１０】
2019532642.tif 000048
【図１１】
2019532642.tif 000049
【図１２】
2019532642.tif 000050
【図１３】
2019532642.tif 000051
【図１４】
2019532642.tif 000052
【図１５】
2019532642.tif 000053
【図１６】
2019532642.tif 000054
【図１７】
2019532642.tif 000055
【図１８】
2019532642.tif 000056
【図１９】
2019532642.tif 000057
【図２０】
2019532642.tif 000058
【図２１】
2019532642.tif 000059
【図２２】
2019532642.tif 000060
【図２３】
2019532642.tif 000061
【図２４】
2019532642.tif 000062
【図２５】
2019532642.tif 000063
【図２６】
2019532642.tif 000064
【図２７】
2019532642.tif 000065
【図２８−１】
2019532642.tif 000066
【図２８−２】
2019532642.tif 000067
【図２８−３】
2019532642.tif 000068
【図２９】
2019532642.tif 000069
【図３０】
2019532642.tif 000070
【図３１】
2019532642.tif 000071
【図３２】
2019532642.tif 000072
【図３３】
2019532642.tif 000073
【図３４】
2019532642.tif 000074
【図３５】
2019532642.tif 000075
【図３６】
2019532642.tif 000076
【図３７】
2019532642.tif 000077
【図３８】
2019532642.tif 000078
【図３９】
2019532642.tif 000079
【図４０】
2019532642.tif 000080
【図４１】
2019532642.tif 000081
【図４２】
2019532642.tif 000082
【図４３−１】
2019532642.tif 000083
【図４３−２】
2019532642.tif 000084
【図４３−３】
2019532642.tif 000085
【図４４】
2019532642.tif 000086
【図４５−１】
2019532642.tif 000087
【図４５−２】
2019532642.tif 000088
【図４５−３】
2019532642.tif 000089
【図４５−４】
2019532642.tif 000090
【図４６】
2019532642.tif 000091
【図４７】
2019532642.tif 000092
【図４８】
2019532642.tif 000093
【図４９】
2019532642.tif 000094
【図５０】
2019532642.tif 000095
【図５１】
2019532642.tif 000096
【図５２】
2019532642.tif 000097
【配列表】
2019532642000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月26日(2019.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５０】
結果
ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が存在しない場合、またはＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体が３．６ｋｂ中のＤＮＡ配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を有さない場合、得られる信号は、３．６ｋｂがポアを通過するときに短命電流偏向のものである（図３７）。３．６ｋｂが、上記のように３．６ｋｂ中に見られるＤＮＡ配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を有するＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体に結合している場合、信号は、ポアを通過するＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体を表す追加のサブレベルを有する（図３８）。複数のＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９複合体がＤＮＡに結合している場合、各複合体は、電流に対して別々の偏向を引き起こす（図３９）。ｄＣａｓが修飾または装飾される場合、信号は、各複合体がポアを通過するときに変化する（図４０）。複合体によって引き起こされる電流偏向の信号位置の変化は、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）についての情報を提供するために使用することができる。
【表６】
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【国際調査報告】
2019532642.tif 000100
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2019532642.tif 000102