(57)【要約】【課題】  神経系の疾患または障害を治療するための組成物を提供する。【解決手段】  リーリンレベルおよびリーリンシグナル伝達の変化は、認知機能を変化させる。これは、治療上有効な量のリーリンのリピート断片またはリーリンの断片リピートから形成されたコンストラクトを、患者または対象に投与することによって、実施することができる。リーリンレベルの変化は、脆弱Ｘ症候群、ウィリアム症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、虚血、低酸素症、アルツハイマー病および統合失調症のような、様々な神経変性疾患、神経傷害または卒中の治療に使用することができる。リーリンはまた、樹状突起スパイン密度、長期増強の減少、シナプス可塑性の減少および連合学習の欠陥を変化させるためにも使用できる。全長リーリンのリピート領域３および全長リーリンのリピート領域５、または、全長リーリンのリピート領域３および全長リーリンのリピート領域６から形成されたコンストラクトは、特に有用であることが分かった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経系の疾患または障害を治療する方法であって、
治療上有効な量の組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を、必要とする患者に投与すること含み、
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ４、リーリン断片リピートＲ５、リーリン断片リピートＲ６、リーリン断片リピートＲ３からＲ４、リーリン断片リピートＲ３からＲ５、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域R６、リーリン断片リピートＲ４からＲ５、リーリン断片リピートＲ５からＲ６、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３、リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートリピートＲ４、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択され、
Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６であり、
前記神経系の疾患または障害は、神経変性疾患、神経傷害、神経障害または卒中であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記神経障害が、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病および統合失調症からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経系の疾患または障害は、神経傷害であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リーリンが、患者の体重３０〜３６ｇごとに５ｎMの組成物を１〜２μｌで、投与されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リーリンベクターが、動脈内、静脈内、脳内または脳室内に注射されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リーリンが、前記患者に両側注射されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片から形成されたコンストラクトを対象にウイルスベクターに挿入してリーリンベクターを形成することと、
該リーリンベクターを対象に注射することとを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−１からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片が、ＣＭＶプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項７に記載の方法。  
【請求項１０】
神経系の疾患または障害の症状を治療する方法であって、
治療上有効な量の組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を、必要とする患者に投与すること含み、
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ４、リーリン断片リピートＲ５、リーリン断片リピートＲ６、リーリン断片リピートＲ３からＲ４、リーリン断片リピートＲ３からＲ５、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域Ｒ６、リーリン断片リピートＲ４からＲ５、リーリン断片リピートＲ５からＲ６、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３、リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートリピートＲ４、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択され、
Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６であり、
前記神経系の疾患または障害は、神経変性疾患、神経傷害、神経障害または卒中であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記神経障害が、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病および統合失調症からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経系の疾患または障害の症状が、樹状突起スパイン密度の欠陥、長期増強の減少、シナプス可塑性の減少および連合学習の欠陥からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リーリンが、患者の体重３０〜３６ｇごとに５ｎMの組成物を１〜２μｌで、投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記リーリンベクターが、動脈内、静脈内、脳内または脳室内に注射されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記リーリンが、前記患者に両側注射されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片から形成されたコンストラクトを対象にウイルスベクターに挿入してリーリンベクターを形成することと、
該リーリンベクターを対象に注射することとを更に含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−１からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片が、ＣＭＶプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
対象における樹状突起スパイン密度を増加させる方法であって、
治療上有効な量の組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を、必要とする患者に投与すること含み、
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ４、リーリン断片リピートＲ５、リーリン断片リピートＲ６、リーリン断片リピートＲ３からＲ４、リーリン断片リピートＲ３からＲ５、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域Ｒ６、リーリン断片リピートＲ４からＲ５、リーリン断片リピートＲ５からＲ６、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３、リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートリピートＲ４、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択され、
Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記リーリンが、患者の体重３０〜３６ｇごとに５ｎMの組成物を１〜２μｌで、投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リーリンベクターが、動脈内、静脈内、脳内または脳室内に注射されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記リーリンが、前記患者に両側注射されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片から形成されたコンストラクトを対象にウイルスベクターに挿入してリーリンベクターを形成することと、
該リーリンベクターを対象に注射することとを更に含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−１からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片が、ＣＭＶプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
シナプス可塑性、学習を増加させるか、または認知機能を向上させる方法であって、
治療上有効な量の組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を、必要とする患者に投与すること含み、
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ４、リーリン断片リピートＲ５、リーリン断片リピートＲ６、リーリン断片リピートＲ３からＲ４、リーリン断片リピートＲ３からＲ５、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域Ｒ６、リーリン断片リピートＲ４からＲ５、リーリン断片リピートＲ５からＲ６、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３、リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートリピートＲ４、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択され、
Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片が、患者の体重３０〜３６ｇごとに５ｎMの組成物を１〜２μｌで、投与されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記リーリンベクターが、動脈内、静脈内、脳内または脳室内に注射されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記リーリンが、前記患者に両側注射されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片から形成されたコンストラクトを対象にウイルスベクターに挿入してリーリンベクターを形成することと、
該リーリンベクターを対象に注射することとを更に含むことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−１からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片が、ＣＭＶプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
リーリンの断片を含む組成物であって、前記断片が更に組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を含み、
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ４、リーリン断片リピートＲ５、リーリン断片リピートＲ６、リーリン断片リピートＲ３からＲ４、リーリン断片リピートＲ３からＲ５、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域Ｒ６、リーリン断片リピートＲ４からＲ５、リーリン断片リピートＲ５からＲ６、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３、リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートリピートＲ４、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択され、
Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
リーリンの前記断片が、リピート領域Ｒ６と結合したリピート領域Ｒ３、またはリピート領域Ｒ５と結合したリピート領域Ｒ３であることを特徴とする、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
リーリンの前記断片が、リピート領域Ｒ３であり、該リピート領域Ｒ３が、ＡＡＶ−９ベクターまたはＡＡＶ−５ウイルスベクター内にあることを特徴とする、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
リーリンの前記断片が、ＣＭＶプロモーターの発現制御下にあることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項３３ないし３６のいずれかに記載のリーリンの前記断片を使用する方法。
【請求項３８】
請求項３３ないし３６のいずれかから形成され、神経系の疾患または障害の治療用に用いられ、
前記神経系の疾患または障害が、神経変性疾患、神経傷害、神経障害または卒中であることを特徴とする医薬。
【請求項３９】
前記神経障害が、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病および統合失調症からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記神経系の疾患または障害は、神経傷害であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３３ないし３６のいずれかから形成され、神経系の疾患または障害の症状の治療用に用いられ、
前記神経系の疾患または障害が、神経変性疾患、神経傷害、神経障害または卒中であることを特徴とする医薬。
【請求項４２】
前記神経障害が、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病および統合失調症からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記神経系の疾患または障害は、神経傷害であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３３ないし３６のいずれかから形成され、シナプス可塑性、学習を増加させるか、または認知機能を向上させるために用いられる医薬。
【請求項４５】
請求項３３ないし３６のいずれかから形成され、樹状突起スパイン密度を増加させるために用いられる医薬。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、「神経障害治療用のリーリン組成物」と題されて２０１６年８月３日に出願された米国仮出願第６２／３７０，５１９号および「神経障害治療用のリーリン組成物」と題されて２０１７年４月１８日に出願された米国仮出第６２／４８６，７２９号の非仮出願であり、それらの内容は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
リポタンパク受容体シグナル伝達システムは、様々なシグナル伝達経路の活性化により、コレステロール恒常性、細胞外タンパク質のクリアランス、および、シナプス伝達、シナプス可塑性、シナプス成熟、記憶形成の調節など、成体の中枢神経系（ＣＮＳ）において、重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００３】
細胞外基質タンパク質であるリーリンは、統合失調症（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、双極性障害（非特許文献４、非特許文献５）、鬱病（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）、自閉症（非特許文献３）およびアルツハイマー病（ＡＤ）（非特許文献１２、非特許文献１３）を含む、多くの神経障害に関与している。現在知られているリーリンシグナル伝達には、図１に示されるような細胞内カスケード事象の誘発が含まれている。
【０００４】
リーリンシグナル伝達は、介在ニューロンからのリーリンの単純な産生と放出ではなく、神経ペプチドまたは小分子伝達物質と同様に、隔離された全長の細胞外リーリンの選択的タンパク質分解によって行われると考えられる。リーリンは、図２に示すように、EFG様リピート２−３（Ｒ２−３）の間と、リピート６−７（Ｒ６−７）の間に、２箇所の主要な切断部位を有することが示されている（非特許文献１４）。これらの切断部位により、図３に示されるような、成体および発育期の脳に見られる５つの主要な断片が生じる（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。中間のＲ３−６断片は、ＶＬＤＬＲ およびＡｐｏＥＲ２と相互作用し、リーリンカスケードの下流のシグナル伝達の開始に関与する断片であると考えられている（非特許文献１４）。
【０００５】
セリンプロテアーゼ組織プラスミノーゲン活性因子（ｔＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トロンボスポンジン・モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）などのリーリン切断酵素の特定と、このタンパク質プロセシングの機能的役割の特定のために、多くの試みがなされてきた（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。細胞外リーリンの内在的プロセシング経路の一つは、脳内のセリンプロテアーゼ組織プラスミノーゲン活性因子（ｔＰＡ）を介するもので、野生型リーリンのＲ６とＲ７の間で起こる（非特許文献１７）。タンパク質分解は、ｔＰＡノックアウトマウスでは見られず（このことは、リーリンのＮＭＤＡＲ非依存性ＬＴＰ誘発切断における、このプロテアーゼの役割を裏付けている（非特許文献１７））、また、セルピンＥ１阻害剤によってブロックされる（非特許文献１６）。更なる裏付けとして、ｔＰＡをリーリンとともに４５分間、生体外でインキュベートするとN-R６断片（３７０ｋＤａ）が生成するが、これは、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１；セルピンＥ１）とジイソプロピルフルオロリン酸（セリンプロテアーゼ阻害剤の一つ）によってブロックされたが、アプロチニンまたはＣＲ−５０ (リーリンのＮ末端領域に結合する抗体；非特許文献１７、非特許文献２２)によってはブロックされなかった。研究によれば、Ｒ６、Ｒ７リピート間でのリーリン切断におけるメタロプロテアーゼ・メプリンαおよびβの関与も示唆されている（非特許文献２３）。しかし、ｔＰＡノックアウトマウスも（非特許文献１７）メプリンβノックアウトマウスも（非特許文献２３）、全長リーリンまたはリーリン断片の基底レベルに関して差異を示しておらず、プロテアーゼの組み合わせが、構成的リーリンレベルとタンパク質分解に関与していることを示唆している。
【０００６】
成体の海馬においては、糖たんぱく質リーリンは、主に歯状回の門部に存在する介在ニューロンおよび固有海馬の網状分子層によって発現される。リーリン発現細胞は、ＣＡ１、ＣＡ３領域の多形細胞層および放射状層にも見られ、海馬の錯体細胞と関連付けられている。シナプス効力の持続的増加を起こすシナプス可塑性の一形態である、長期増強（ＬＴＰ）の誘導には、ＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）の活性化と、それに続く、ＡＭＰＡ受容体の発現と機能の増加が必要である。ＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡＲ）の変化は、サブユニットのリン酸化の増加、または、サブユニットの合成と特定のシナプス部位への輸送の増加によって得られる。これとは対照的に、ＮＭＤＡＲは、一致検出器として働き、シナプス可塑性の誘導において大きな役割を果たす。ＮＭＤＡＲイオンチャネルを開くには、グルタミン酸結合とシナプス後膜の脱分極の両方が必要である。ＮＭＤＡＲサブユニットの中には、ＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂのように、セリン／スレオニンまたはチロシン残基においてリン酸化修飾を受けるものがある。ＮＭＤＡＲサブユニットのリン酸化は、チャネル動力学とシナプス部位への輸送の両方を調節する。つまり、リーリンがシナプス可塑性の調節にとって重要であるのなら、シナプス可塑性の誘導と発現におけるＮＭＤＡＲとＡＭＰＡＲの重要性を考慮すれば、論理的なターゲットはＮＭＤＡＲとＡＭＰＡＲということになるであろう。
【０００７】
リーリン分子は、最近の研究で、生体外および生体内において、Ｆｃ−ＲＡＰのような、より高次の複合体を形成することが発見された。更に研究を進めることにより、リーリンが、生体内において、ジスルフィド結合したホモ二量体として分泌されることが示された。分子のＮ末端に位置するＣＲ−５０エピトープと呼ばれる短い領域の削除により、オリゴマー形成が阻止される。この変異型リーリンは、一次マウスニューロンにおいて、Ｄａｂ１リン酸化の誘導を効率良く行うことができない。
【０００８】
リーリンは、シナプス可塑性と学習の過程において積極的役割を果たしている。本発明は、また、認知機能を向上および／または修復するための、リーリンタンパク質プロセシングのメカニズムの特定と使用を含む。例えば、本明細書においては、文脈的恐怖学習とθバースト刺激（ｔｂ−ｓｔｉｍ）が、リーリンプロセシングを変化させることが開示されている。メタロプロテイナーゼ、ｔＰＡおよびＭＭＰ−９は、シナプス可塑性と学習の過程でリーリンプロセシングに別個に関与する。リーリン断片コンプリメントの補給により、連合および空間学習と記憶を向上させることができる。リーリン断片は、Ａβプラークと関連し、その発現とプロセシングはＡＤ関連変異によって変化させられ、リーリンの補給により、Ｔｇ２５７６ ＡＤマウスモデルに見られるＬＴＰ欠陥を克服することができる。
【０００９】
リーリンが、一旦、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンによって細胞外間隙に分泌されると、リーリンは、リポタンパク質受容体である超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）およびアポリポタンパク質受容体２（ＡｐｏＥＲ２）と結合し、二量体化が起こる（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。二量体化された受容体が細胞内アダプタータンパク質Ｄｉｓａｂｌｅｄ−１ （Ｄａｂ１） をチロシンリン酸化し、引き続いて、ＦｙｎのようなＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）のリン酸化とＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）のリン酸化が起こる（非特許文献２２、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３）。
【００１０】
ＮＭＤＡＲリン酸化に起因するカルシウム流入の増加によって、シナプス後膜の脱分極、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２ＢからＮＲ２Ａ受容体サブタイプへの成熟、および、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）の挿入が起こる（非特許文献２５、非特許文献３０、非特許文献３１）。Ｃａ２＋流入の増加と細胞の脱分極によってＣＲＥＢリン酸化とタンパク質合成が増加し、最終的には、長期増強（ＬＴＰ）の誘導と高まり、および、シナプス可塑性と学習と記憶の増加が生じる（非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６）。同時に、Ｄａｂ１リン酸化によって、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）の活性化とグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の修飾が起こり、これによって、タウのリン酸化が妨げられ（非特許文献３７）、また、タウのリン酸化へのもう一つの経路であるＣＤＫ５活性化の原因となるｐ３５からｐ２５への変換の制御が妨げられる（非特許文献３８）。
【００１１】
このように、リーリンシグナル伝達は、様々な条件において、シナプスおよびニューロンの喪失に対する治療のための有用なターゲットである。例えば、リーリンは、リポタンパク質受容体とアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の両方に結合することが示されており、また、多くのＡＤマウスモデルにおいて、Ａβプラークと関連することが知られている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献３９、非特許文献４０）。
【００１２】
更に、リーリンのシグナル伝達経路は、アルツハイマー病（ＡＤ）においては特に脆弱と思われ、その病態形成に潜在的に寄与している可能性がある（非特許文献１２、非特許文献１３）。
【００１３】
同様に、リーリンは、成体のシナプス可塑性にも影響し得る。リーリン、ＡｐｏＥＲ２および ＶＬＤＬＲ、または Ｄｉｓａｂｌｅｄ−１ （Ｄａｂ１）をノックアウトしたマウスは、シナプス可塑性に欠陥を示す（非特許文献２５、Ｑｕｉ, ｅｔ ａｌ., ２００６、非特許文献２８）。リーリンの両側脳室内注射（ＩＶＩ）のような治療的介入は、治療法として用いることができ、野生型マウスにおいて学習および記憶およびシナプス可塑性を向上させている（非特許文献３５）。リーリンのＩＶＩは、ヘテロ接合型リーラマウス（非特許文献３６、図４参照）およびアンジェルマン症候群のマウスモデル（Ｈｅｔｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ., ２０１６）に見られる学習および記憶およびＬＴＰの欠陥を回復させることも示されている。このように、タンパク質投与またはリーリン遺伝子ＲＥＬＮに関する遺伝子治療による、リーリンレベルの補給は、一定範囲の疾患における治療的介入となり得る可能性がある。
【００１４】
リーリンは、一旦、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンによって細胞外間隙に分泌されると、図１に示すように、リポタンパク質受容体である超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ)およびアポリポタンパク質受容体２（ＡｐｏＥＲ２）と結合する（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献３０）。リガンド相互作用により、受容体の二量体化と、下流における細胞内のアダプタータンパク質Ｄａｂ１ のチロシンリン酸化が起こる（非特許文献１７、非特許文献２４、非特許文献２６、非特許文献３０、非特許文献３３、非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４４）。Ｄａｂ１のリン酸化が、ＦｙｎのようなＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）を活性化し、これにより、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体がリン酸化され、Ｃａ２＋流入の増加が可能となる（非特許文献２９）。Ｃａ２＋流入の増加により、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２ＢからＮＲ２Ａ受容体サブタイプへの成熟、膜へのα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体の挿入の増加が可能となり、長期増強（ＬＴＰ）の誘導と高まりへの寄与が可能となる（非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１）。更に、Ｄａｂ１誘導のリン酸化によって、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）の活性化が可能となり、これにより、続いて、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害が起こり（非特許文献３７）、さらに、タウの過剰リン酸化の抑制が起こる（非特許文献４５）。
【００１５】
リーリン陽性細胞が、ＣＡ１網状層および門部において最も多く見られるということは、それぞれ、学習及び記憶と、ニューロン新生とに影響を及ぼす、最も重要な位置に存在していることになる。実際、リーリンはシナプス可塑性および学習および記憶を向上させること（非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献３０、非特許文献４６）、成体の新生ニューロンの移動に変化を及ぼすことが示されている（非特許文献４７、非特許文献４８、非特許文献４９）。海馬においては、細胞外リーリンは網状層に蓄積し（非特許文献７、非特許文献５０）、このため、網状層は、ＣＡ１におけるシナプス活動に影響を及ぼす最重要の場所となっている（非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献３０、非特許文献４６）。これら領域におけるリーリンの内因性切断は、これらの過程に対するリーリンの影響を制御するために用いられる可能性がある。
【００１６】
さらに、リポタンパク受容体シグナル伝達システムは、様々なシグナル伝達経路の活性化により、コレステロール恒常性、細胞外タンパク質のクリアランス、記憶形成の調節、シナプス伝達、シナプス可塑性、シナプス成熟など、成体のＣＮＳにおいて、重要な役割を果たしていることが知られている。重要なことに、リポタンパク質受容体リガンドのアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、遅発性孤発性のアルツハイマー病（ＡＤ）の最も確からしい危険因子である（非特許文献５１、非特許文献５２、非特許文献５３）。同様に、細胞外基質タンパク質リーリンは、リポタンパク質受容体とアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の両方に結合することができ、多くのＡＤマウスモデルにおいて、Ａβプラークと関連していることが知られている（非特許文献５４、非特許文献５５、非特許文献５６、非特許文献５７）。Ａβ蓄積は、リーリンシグナル伝達とリポタンパク質受容体の機能に影響を及ぼし、これにより、ＡＤ発病を促進し、シナプス機能および認知機能に影響を及ぼす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
以上より、必要とされているのは、リポタンパク質受容体システムに対してリーリンと同様に作用し、認知機能の向上のための治療、および、ＡＤや他の加齢性神経変性障害、神経障害のような神経疾患の治療用に使用するための、特定のアゴニストである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本明細書中で開示される組成物および方法は、概ね、リーリンレベルを増加させること、および／またはリーリンレベルとの干渉を防止することによって、また、リーリンまたはリーリンシグナル伝達によって開始または維持される細胞のシグナル伝達を増加させること、および／またはリーリンまたはリーリンシグナル伝達によって開始または維持される細胞のシグナル伝達との干渉を防止することによって、認知機能に影響を及ぼし向上させる方法に関する。
【００２０】
本発明は、治療上有効な量の組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を、必要とする患者に投与することによって、神経系の疾患または障害を治療または修正する方法を提供する。変更形態において、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リピートＲ３からＲ５によって形成されるリーリン断片（Ｒ３−Ｒ５）、リーリン断片リピートＲ５に結合したリーリン断片リピートＲ３（Ｒ３＋Ｒ５）、リーリン断片リピートＲ３、リピートＲ３からＲ６によって形成されるリーリン断片（Ｒ３−Ｒ６）、リーリン断片リピートＲ６に結合したリーリン断片リピートＲ３（Ｒ３＋Ｒ６）であり、ここで、Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６である。オプションとして、リーリンスプライス断片がR３＋R５である場合、二つのリピート領域、即ちＲ３とＲ５は、リピート領域３ループ、リピート領域５ループ、またはそれらの組み合わせによって結合される。または、リーリンスプライス断片がR３＋R６である場合、二つのリピート領域、即ちＲ３とＲ６は、リピート領域３ループ、リピート領域６ループ、またはそれらの組み合わせによって結合される。具体例として、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートR３、リーリン断片リピートR４、リーリン断片リピートR５、リーリン断片リピートR６、リーリン断片リピートR３からR４、リーリン断片リピートR３からR５、リーリン断片リピートR３からリピート領域R６、リーリン断片リピートR４からR５、リーリン断片リピートR５からR６、リーリン断片リピートR５に結合したリーリン断片リピートR３、リーリン断片リピートR６に結合したリーリン断片リピートR３、リピートR６に結合したリーリン断片リピートリピートR４、または、前記リーリン断片若しくはリーリンスプライス断片の組み合わせである。本発明の変更形態において、神経系の疾患または障害は、神経変性疾患、神経傷害（neuronal insult）、神経障害または卒中である。具体例として、神経障害は、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病、統合失調症からなるグループから選択される。または、神経系の疾患または障害は、神経傷害またはアルツハイマー病である。
【００２１】
オプションとして、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、非経口注射によって投与される。具体例として、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、動脈内、静脈内、脳内または脳室内に注射される。本発明の具体例として、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、患者の脳室内に両側注射される。変更形態において、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、約１０μＭ から約５ｎＭのＣＮＳ液内リーリン濃度を得るように投与される。オプションとしての濃度には、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２２５μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２７０μＭ、２７５μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３２５μＭ、３４０μＭ、３５０μＭ、３７０μＭ、３７５μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４２５μＭ、４４０μＭ、４５０μＭ、４７０μＭ、４７５μＭ、４８０μＭ、５００μＭ、５２０μＭ、５２５μＭ、５４０μＭ、５５０μＭ、５７０μＭ、５７５μＭ、５８０μＭ、６００μＭ、６２０μＭ、６２５μＭ、６４０μＭ、６５０μＭ、６７０μＭ、６７５μＭ、６８０μＭ、７００μＭ、７２０μＭ、７２５μＭ、７４０μＭ、７５０μＭ、７７０μＭ、７７５μＭ、７８０μＭ、８００μＭ、８２０μＭ、８２５μＭ、８４０μＭ、８５０μＭ、８７０μＭ、８７５μＭ、８８０μＭ、９００μＭ、９２０μＭ、９２５μＭ、９４０μＭ、９５０μＭ、９７０μＭ、９７５μＭ、９８０μＭ、１ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｎＭ、１．５ｎＭ、１.６ｎＭ、１．７ｎＭ、１．８ｎＭ、１．９ｎＭ、２．０ｎＭ、２．１ｎＭ、２．２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．４ｎＭ、２．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．７ｎＭ、２．８ｎＭ、２．９ｎＭ、３．０ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、４．０ｎＭ、４.１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭおよび ５．０ｎＭを含む。例えば、治療濃度は、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満または約５ｎＭである。用量は、動物体内のタンパク質分布と血液脳関門を通じたアクセスに基づいて計算することができる。非限定的例として、リーリンは、患者の体重３０〜３６ｇごとに、５ｎＭの組成物を、１μｌで投与される。更に、治療は継続的でもよく、または、治療計画が、１年未満、６か月未満、３か月未満、１か月未満、１週間未満または約１日の間、継続してもよい。
【００２２】
本発明の変更形態においては、リーリンベクターを形成するために、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片から形成されたコンストラクトが、ウイルスベクターに挿入され、リーリンベクターが対象に注射される。オプションとして、ベクターは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１およびＡＡＶ４を含む。ただし、他のベクター、特に、当技術分野で知られている全ての適するＡＡＶも、本発明において使用可能であり、このような使用方法を考えられる。具体例として、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【００２３】
本発明はまた、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を含む組成物を含み、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リピートＲ３からＲ５によって形成されるリーリン断片（Ｒ３−Ｒ５）、リーリン断片リピートＲ５に結合したリーリン断片リピートＲ３（Ｒ３＋Ｒ５）、リーリン断片リピートＲ３、リピートＲ３からＲ６によって形成されるリーリン断片（Ｒ３−Ｒ６）、リーリン断片リピートＲ６に結合したリーリン断片リピートＲ３（Ｒ３＋Ｒ６）であり、ここで、Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６である。オプションとして、リーリンスプライス断片がR３＋R５である場合、二つのリピート領域、即ちＲ３とＲ５は、リピート領域３ループ、リピート領域５ループ、またはそれらの組み合わせによって結合される。または、リーリンスプライス断片がR３＋R６である場合、二つのリピート領域、即ちＲ３とＲ６は、リピート領域３ループ、リピート領域６ループ、またはそれらの組み合わせによって結合される。
【００２４】
組成物の変更形態において、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリンベクターを形成するためにウイルスベクターに挿入される組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片から形成されるコンストラクトに組み込まれ、リーリンベクターが対象に注入される。オプションとして、ベクターは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１およびＡＡＶ４を含む。ただし、他のベクター、特に、当技術分野で知られている全ての適するＡＡＶも、本発明において使用可能であり、このような使用方法を考えられる。具体例として、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【００２５】
前記組成物は、神経変性疾患、神経傷害および卒中を含む、神経系の疾患または障害の症状の治療にも使用することができる。非限定例として、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、虚血、低酸素症、アルツハイマー病、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病、統合失調症および卒中を含む。神経系の疾患または障害の症状の具体的例として、樹状突起スパイン密度の欠陥、長期増強の減少、シナプス可塑性の減少および連合学習の欠陥を含む。有用な治療用組成物とその量は、前述の通りである。
【００２６】
前記組成物は、対象の樹状突起スパイン密度を増加させるためにも使用することができる。有用な治療用組成物とその量は、前述の通りである。
【００２７】
前記組成物は、シナプス可塑性、学習の増加、または、認知機能の向上においても有用である。シナプス可塑性、学習の増加、または、認知機能の向上に使用可能な組成物とその量は上記と同じである。
【００２８】
本発明のより完全な理解のためには、添付図面とともに以下の詳細な説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】成体のシナプス可塑性におけるリーリン経路の説明図である。
【図２】成体の脳におけるリーリンタンパク質分解を示す説明図である。成体の脳においては、全長リーリンは、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンによって、細胞外間隙に放出される。この全長リーリンが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）リピート２−３（Ｒ２−Ｒ３）および６−７（Ｒ６−Ｒ７）の間（点線で示されている）で、様々な酵素により、酵素的に切断される。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、メプリンαおよびβは、リーリンをＲ６とＲ７の間で切断することが示されており（Kohno, et al., Mechanism and significance of specific proteolytic cleavage of Reelin. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2009;380: 93-97、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献２３）、一方、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−９は、リーリンをＲ２とＲ３の間で切断する（非特許文献１６）。ＡＤＡＭＴＳ ４および５は、リーリンを両方の部位で切断することが示されている（非特許文献１６、非特許文献２１）。他の、未特定のプロテアーゼも、リーリンプロセシングに関与している可能性がある。
【図３】全長リーリン（４５０ｋＤａ）と、様々な酵素による切断で形成されて３７０〜８０ｋＤａの範囲の５種類の断片を生成したリーリン断片を示す、説明図である。Ｒ３−Ｒ６断片（全長リーリン（４５０ｋＤａ）、３７０ｋＤａ、１９０ｋＤＡおよび２７０ｋＤＡの断片に含まれている）は、リポタンパク質受容体であるＡｐｏＥＲ２およびＶＬＤＬＲに結合することが示されている（非特許文献１４）。Ｎ−Ｒ２断片（１８０ｋＤａ）は、α３β１−インテグリンに結合することが示されており（Dulabon, et al., Reelin binds alpha3beta1 integrin and inhibits neuronal migration. Neuron. 2000;27:33-44）、ニューロンの移動は、生体内で、ＣＲ−５０抗体によって妨げられることが示されている（Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1997;94:8196-8201）。Ｃ末端領域（Ｒ７−Ｃ；８０ｋＤａ）は、リーリンの分泌と、その固有のフォールディング（de Bergeyck, et al., A truncated Reelin protein is produced but not secreted in the ’Orleans’ reeler mutation (Reln[rl-Orl]). Brain Res. Mol. Brain Res. 1997;50:85-90、非特許文献１４）、および下流のシグナル伝達の有効性（非特許文献２０）に関与していることが示されている。
【図４】θバースト刺激に対するＬＴＰを示すグラフである。
【図５】全長リーリンの配列である。エンドヌクレアーゼの認識部位が、それぞれの配列の上に示されている。リピート配列は左側にラベルが付され、リピート領域がハイライトされている。各リピート領域の間には、ハイライトされていない融合ループがある。
【図６】リーリン依存ＡｐｏＥＲ２受容体の説明図であり、活性化されていない受容体と、活性化されて蛍光を発する、二量体化された受容体を示している。このシステムは、受容体活性化ルシフェラーゼアッセイで用いられる。
【図７】様々な酵素によって切断されて形成され、様々な断片を形成する、リーリン断片を示す説明図である。Ｒ３−Ｒ６断片が、第３スプライス領域のみを含むリーリン断片Ｒ３、スプライス領域Ｒ３およびＲ４をスプライシングされて共に含むＲ３−４、リピート領域Ｒ３、Ｒ４およびＲ５をスプライシングされて共に含むＲ３−Ｒ５、領域Ｒ６にスプライシングされた領域Ｒ５を含むＲ５−Ｒ６断片と比較されている。さらに、それぞれＲ５領域またはＲ６領域にスプライシングされたＲ３領域を含む、断片Ｒ３＋Ｒ５、および、Ｒ３＋Ｒ６が示されている。
【図８】３＋６リーリン断片の配列である。この断片は、３−４ループを５−６ループに結合させ、これによってリピート３をリピート６に連結させることにより形成された。シグナルペプチド領域が、濃い灰色でハイライトされ、薄い灰色でハイライトされたリピート領域３が、これに続いている。３−４のための結合ループ領域が中間の灰色でハイライトされ、これに続いて、５−６のための結合ループ領域とリピート領域６が濃い灰色でハイライトされている。
【図９】３＋５リーリン断片の配列である。この断片は、３−４ループを４−５ループに結合させ、これによってリピート３をリピート５に連結させることにより形成された。シグナルペプチド領域は、濃い灰色でハイライトされ、薄い灰色でハイライトされたリピート領域３が、これに続いている。３−４のための結合ループ領域が中間の灰色でハイライトされ、これに続いて、４−５のための結合ループ領域とリピート領域５が濃い灰色でハイライトされている。
【図１０】マウスのリーリン断片を用いた、ＡｐｏＥＲ２ルシフェラーゼアッセイを示すグラフである。
【図１１】ヒトのリーリン断片を用いた、ＡｐｏＥＲ２ルシフェラーゼアッセイを示すグラフである。
【図１２】マウスのリーリン断片とヒトのリーリン断片のＡｐｏＥＲ２ルシフェラーゼアッセイを比較するグラフである。
【図１３（Ａ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すブロットである。ＡｐｏＥＲ２と、ＡＫＴおよびＥＲＫの活性とリン酸化状態を示す、代表的なウェスタンブロットである。ＥＲＫのリン酸化は、ＥＲＫの活性を直接的に検出するものであり、上流のシグナル伝達経路の活性化を示している。
【図１３（Ｂ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。ＡｐｏＥＲ２の活性を、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.（平均値の標準誤差）を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｃ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。ＡＫＴのリン酸化レベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｄ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。全ＡＫＴレベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｅ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化レベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｆ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）レベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｇ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）に対するリン酸化された細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の比率を決定し、無処理（時間０）で規格化した。ＥＲＫのリン酸化状態は、ＥＲＫの活性を直接的に検出するものであり、上流のシグナル伝達経路の活性化を示している。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１４（Ａ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列Ｒ３およびＲ５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３からＲ６（ｈＲ３−６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からＲ２（ＮＲ２）および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））で処理された、一次ニューロン培養物を示すブロットである。対照（ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなる。６０分間、細胞上でリーリンをインキュベートした後、細胞を溶解した。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびリン酸化された細胞外調節キナーゼに対して、代表的なウェスタンブロットが実施された。
【図１４（Ｂ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列Ｒ３およびＲ５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３からＲ６（ｈＲ３−６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からＲ２（ＮＲ２）および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））で処理された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。対照（ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなる。６０分間、細胞上でリーリンをインキュベートした後、細胞を溶解した。リン酸化された細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のレベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは４である。
【図１４（Ｃ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列Ｒ３およびＲ５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３からＲ６（ｈＲ３−６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からＲ２（ＮＲ２）および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））で処理された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。対照（ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなる。６０分間、細胞上でリーリンをインキュベートした後、細胞を溶解した。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のレベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは４である。
【図１５】全長リーリンを用いたＤａｂ−１リン酸化アッセイを示すグラフである。
【図１６】全長リーリンに曝露された後のＤａｂ−１リン酸化の経時変化を示す折れ線グラフである。
【図１７】Ｒ３−６リーリン断片を用いたＤａｂ−１リン酸化アッセイを示すグラフである。
【図１８】Ｒ３−６リーリン断片に曝露された後のＤａｂ−１リン酸化の経時変化を示す折れ線グラフである。
【図１９】Ｆｃ−ＲＡＰで灌流することにより、海馬のＬＴＰ誘導が高められる。海馬のスライスをＦｃ−ＲＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）、Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）または対照媒質で灌流した。ベースラインのシナプス応答（†）と、ＨＦＳ直後（‡）からＨＦＳ後６０分（*）までにわたる増強を記録した。矢印の頭は、２０秒間隔で２回行われた、１００Ｈｚ、１秒間の刺激によって誘導されたＬＴＰを示している。水平な線は、Ｆｃ−ＲＡＰ、Ｆｃまたは対照媒質の適用を示している。結果は、平均値±平均値の標準誤差で示されている。ｆＥＰＳＰは、興奮性シナプス後場電位、Ｓｔｒａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ ２００４。
【図２０（Ａ）】リーリンがシナプス後メカニズムを通じてＮＭＤＡＲ電流を高めることを示す電位図である。ＥＰＳＣＮＭＤＡの測定値が示されている。三本のラインは、無処理、モック（擬似試料）処理およびリーリン処理のものであり、リーリン処理は、カルシウム伝導により、ＮＭＤＡ受容体の機能を高めることを示している。
【図２０（Ｂ）】リーリンがシナプス後メカニズムを通じてＮＭＤＡＲ電流を高めることを示す電位図である。ＡＰ５を加えた場合のＥＰＳＣＮＭＤＡの測定値が示されている。三本のラインは、無処理、モック処理およびリーリン処理のものであり、リーリン処理は、カルシウム伝導により、ＮＭＤＡ受容体の機能を高めることを示している。
【図２１（Ａ）】ＥＰＳＣＮＭＤＡの測定値を示すグラフである。濃い灰色の軌跡が、ｍＥＰＳＣＮＭＤＡである。
【図２１（Ｂ）】リーリン処理がｍＥＰＳＣＮＭＤＡ振幅を有意に増加させたことを示すグラフである（黒丸はリーリン処理前、白丸はリーリン処理後、**＊ｐ ＜ ０．００１、ｎ＝１８、対応ｔ検定）。モック処理は効果がなかった（黒丸はモック処理前、白丸はモック処理後、有意差なし（ｎｓ）、ｐ ＞０．０５、ｎ＝１３、対応ｔ検定）。
【図２１（Ｃ）】リーリン処理なし、リーリン処理、および、両者を比較する合成グラフ、の３つの時点でのシナプス伝達を示すグラフである。
【図２１（Ｄ）】９つの細胞の記録に基づいて明らかにされた、１／ＣＶ２率と平均ＥＰＳＣＮＭＤＡ率（リーリン処理の前後）との相関がないことを示すグラフである（ｒ ＝ ０．３１、ｐ ＝ ０．４、スピアマン検定）。
【図２２（Ａ）】リーリンシグナル伝達が、グルタミン酸受容体サブユニットの表面発現と全レベルを変化させることを示すウェスタンブロットである。代表的ブロットにより、ＧｌｕＲ１、ＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂの表面レベルと全レベルの両方が示されている。
【図２２（Ｂ）】ウェスタンブロットの４つの実験から収集された、表面グルタミン酸受容体サブユニットの定量結果である。持続的なリーリン処理後は、モック処理グループと比べて、表面ＧｌｕＲ１およびＮＲ２Ａはいずれも有意に増加し（ＧｌｕＲ１：Ｆ（２，１１） ＝ １５．５６、＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１；ＮＲ２Ａ： Ｆ（２，１１） ＝ ４４．９、 ＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１）、表面ＮＲ２Ｂレベルは有意に減少した（Ｆ（２，１１） ＝ ２２．６、 ＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１）。
【図２２（Ｃ）】ウェスタンブロットの４つの実験から収集された、全タンパク質レベルの定量結果である。リーリン処理は、全ＧｌｕＲ１（Ｆ（２，１１） ＝ １１．２、＊＊Ｐ ＜ ０．０１）、 全ＮＲ２Ａ（Ｆ（２，１４） ＝ ９．７５、＊＊Ｐ ＜ ０．０１）のレベルを有意に増加させ、全ＮＲ２Ｂレベル（Ｆ（２，１１） ＝ ４．１、＊Ｐ ＜ ０．０５）を有意に減少させた。これとは対照的に、ＮＲ１の全レベルも（Ｂにおける）表面レベルも観察されなかった。
【図２３（Ａ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示すグラフである。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。ＷＴ（野生型）ニューロン上の樹状突起スパインが、代表的な一次樹状突起の拡大写真に示されている。
【図２３（Ｂ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ＨＲＭでは、ＷＴマウスに比べて減少していたが、リーリン処理後は、スパイン密度が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｃ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ＨＲＭでは、ＷＴマウスに比べて減少していたが、リーリン処理後は、スパイン密度が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｄ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ノックアウトリーリンマウスでは、非常にまばらであったが、リーリン処理後は、スパイン密度の欠陥が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｅ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ノックアウトリーリンマウスでは、非常にまばらであったが、リーリン処理後は、スパイン密度の欠陥が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｆ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、共焦点顕微鏡を用いて定量化された。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２４（Ａ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９（活性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ＰＦ１４０）の影響能力を、リーリン（５０ｎＭ）と様々な濃度のＭＭＰ−９（１〜４ｕｇ/ｍｌ）とをＰＢＳ内で３７℃で３時間反応させることにより、決定した。ＥＤＴＡはＭＭＰ９の活性をブロックするため、陰性対照として、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を入れた。ウェスタンブロットは、反応の１：１０に実施され、抗リーリン抗体（Ｇ１０）でプローブされた。
【図２４（Ｂ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９（２５０ｎＭ）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。細胞タンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２４（Ｃ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９（２５０ｎＭ）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。上澄みタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２４（Ｄ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９阻害剤（２５ｎＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、４４４２７８）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。細胞タンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２４（Ｅ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９阻害剤（２５ｎＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、４４４２７８）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。上澄みタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２５】リーリンが樹状突起スパイン密度に影響を及ぼすことを示すブロットである。樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、リーリンを、持続的に、一次海馬ニューロン培養物に適用した。培養物内におけるリーリンのレベルをウェスタンブロットで決定した。生体外におけるリーリンの劣化のレベルを決定するため、０、６、１２、２４、４８、７２、９６時間の時点で、培養物からサンプルを採取した。最後の列のリーリンは、培養物に投与された濃度の未劣化のものを表している。リーリンは、培養物への導入後９６時間まで存在し、また、７２時間までは劣化が始まらなかった。
【図２６（Ａ）】リーリンの補給が、連合学習と空間学習を向上させることを示すグラフである。野生型のマウスに対し、恐怖条件付けを行う３時間前に、５ｎＭのＲＡＰまたは５ｎＭのリーリンを、脳室内に、両側注射した。訓練の２４時間後に、マウスを文脈内に置き、すくみを測定した。リーリンが向上を生じさせたのに対し、ＲＡＰは学習と記憶を阻害するのが見られた（ＲＡＰ  ｎ＝９、ショックなし  ｎ＝５、処理なし  ｎ＝７、リーリン  ｎ＝５、ｐ＞０．０５）。
【図２６（Ｂ）】リーリンの補給が、連合学習と空間学習を向上させることを示すグラフである。モーリス水迷路により、野生型のマウスに、隠れたプラットホームを見つける訓練を行った。マウスには、５ｎＭのリーリン（赤丸、ｎ＝４）または溶媒（白丸、ｎ＝６）を単一注射した。５日目に、プローブ試験を行い、その後、６日目に、マウスに対して、新たなプラットホームの位置を見つける訓練を行った。マウスには、５ｎＭのリーリン（ｎ＝４）または溶媒（ｎ＝６）を単一注射した。
【図２６（Ｃ）】リーリンの補給が、連合学習と空間学習を向上させることを示すグラフである。モーリス水迷路により、野生型のマウスに、隠れたプラットホームを見つける訓練を行った。マウスには、５ｎＭのリーリン（赤丸、ｎ＝４）または溶媒（白丸、ｎ＝６）を単一注射した。１日目における個々の試行の潜時の試験である。（＊＝ｐ＞０．０５）。マウスには、５ｎＭのリーリン（ｎ＝４）または溶媒（ｎ＝６）を単一注射した。
【図２７（Ａ）】文脈的恐怖条件付けが、リーリンレベルを変化させることを示すブロットである。野生型マウスを、３ショックの文脈的恐怖条件付けプロトコル（ＣＦＣ）で訓練した。ショックを与えられていないマウス（ＣＳ）を陰性対照として用いた。ショックを与えられて文脈に晒されたマウス（ＣＳ／ＵＳ）の海馬を、訓練後、１分、５分、１５分、３０分、１８０分および１８時間で取り出した（ｎ＝４、時点ごと）。リーリンを、海馬のホモジネートにおいて、抗リーリン抗体（Ｇ１０）を用いて検出した。
【図２７（Ｂ）】文脈的恐怖条件付けが、リーリンレベルを変化させることを示すグラフである。野生型マウスを、３ショックの文脈的恐怖条件付けプロトコル（ＣＦＣ）で訓練した。ショックを与えられていないマウス（ＣＳ）を陰性対照として用いた。ショックを与えられて文脈に晒されたマウス（ＣＳ／ＵＳ）の海馬を、訓練後、１分、５分、１５分、３０分、１８０分および１８時間で取り出した（ｎ＝４、時点ごと）。全長リーリンのリーリンレベルを定量化した。アスタリスクは、両側t検定に基づく統計的有意性を示す（p ＜ ０．５）。
【図２８（Ａ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示すブロットである。月齢１４か月の野生型、Ｔｇ２５７６ （ＳｗｅＡＰＰ）、ＰＳ１−ＦＡＤ （Ｍ１４６Ｌ）および ２Ｘ （ＳｗｅＡＰＰ ｘ Ｍ１４６Ｌ）から取り出された皮質のウェスタンブロットの分析を行った（ｎ＝４）。Ｔｇ２５７６対野生型では、リーリンの４５０、１９０および１８０ｋＤａの生成物に、有意な差は検出されなかったが、Ｔｇ２５７６および２Ｘマウスにおいては、Ｇ１０によって認識される未特定のＮ末端種が、有意に増加していた。これとは対照的に、リーリンの４５０および１８０ｋＤａ生成物は、ＰＳ１−ＦＡＤおよび２Ｘマウスにおいて、有意に増加していた（ｐ ＜ ０．０５）。
【図２８（Ｂ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示すブロットである。月齢１４か月の野生型、ＰＳ１−ＦＡＤ （Ｍ１４６Ｌ）および ２Ｘ （ＳｗｅＡＰＰ ｘ Ｍ１４６Ｌ）から取り出された皮質のウェスタンブロットの分析を行った（ｎ＝４）。Ｔｇ２５７６マウスにおけるＤａｂ１−ｐＴｙｒ２２０の有意な減少と、ＰＳ１−ＦＡＤ および ２Ｘマウスの両方における有意な増加があった。
【図２８（Ｃ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示すグラフである。刺激前のリーリン（５ｎＭ）適用により、Ｔｇ２５７６マウスのＣＡ１領域におけるＨＦＳ刺激によるＬＴＰの欠陥を回復させることができた。
【図２９（Ａ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面に対し、生体内におけるリーリンプロセシングをマッピングするための３−エピトープ法を用いた。リーリン−ＣＴ（Ｇ２０）は、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された、Ｒ７−８を含むリーリン断片を検出した。
【図２９（Ｂ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面に対し、生体内におけるリーリンプロセシングをマッピングするための３−エピトープ法を用いた。リーリン−ＮＴは、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された、Ｎ−Ｒ２を含むリーリン断片を検出した。
【図２９（Ｃ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面に対し、生体内におけるリーリンプロセシングをマッピングするための３−エピトープ法を用いた。リーリン−ＭＴ（AF３８２０）は、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された、Ｒ３−６を含むリーリン断片を検出した。
【図２９（Ｄ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面の、リーリン−ＣＴ （Ｇ２０） およびリーリン-ＭＴの（ＡＦ３８２０）の免疫蛍光画像を、組み合わせた。６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された。
【図２９（Ｅ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。拡大された月齢１４か月のＴｇ２５７６の免疫蛍光画像は、リーリン−ＮＴ断片（Ｎ−Ｒ２）が、ｔｇ２５７６マウスモデル内のプラークの芯を取り囲んでいたことを示している。スケールバー＝１５μｍ。
【図３０】標準的な、２連の、１００ＨｚのＨＦＳを用いたＬＴＰ誘導を、月齢１２か月のＴｇ２５７６マウスから採取した海馬スライスに与えた。１組のスライスを５ｎＭのリーリンで灌流した。リーリン処理されたスライスは、野生型のレベルまで、ＬＴＰ誘導が上昇した。
【図３１】リーリン処理が慢性的ＴＢＩにおいて機能回復効果を発揮することを示すグラフである。皮質衝撃装置による外傷性脳損傷後、持ち上げボディスイング試験で、ベースラインに対するスイング偏向を示したが、リーリンで緩和された。
【図３２】リーリン処理が慢性的ＴＢＩにおいて機能回復効果を発揮することを示すグラフである。皮質衝撃装置による外傷性脳損傷後、肢無動試験で、ベースラインに対する肢の自発性の喪失を示したが、リーリンで緩和された。
【図３３】リーリン処理が慢性的ＴＢＩにおいて機能回復効果を発揮することを示すグラフである。皮質衝撃装置による外傷性脳損傷後、肢握力試験で、ベースラインに対する肢の強さの喪失を示した。
【図３４】ＳＡ２、ＳＡ３およびリーリン切断部位に使用されるいくつかのコンストラクトの説明図である。ＭＭＰ−９は、領域２と領域３の間で切断することができるが、生体外での反応の間にだけ、領域７で切断することが示されている。ｔＰＡは、領域６と７の間で切断することができる。提案されたコンストラクトは、生体外におけるＭＭＰ−９結合部位がなく、ＣおよびＮ末端の両方にタグがあるように作られる。Ｒｌｎ−Ｒｅｓ＝リーリン切断抵抗性、Ｒｌｎ−Ｌａｂ＝リーリン不安定。
【図３５（Ａ）】ｔＰＡがリーリンプロセシングを調節することを示すブロットである。リーリンプロセシングに対するｔＰＡ／プラスミノーゲンの影響能力を、リーリン（５０ｎＭ）をｔＰＡ（６０ｕｇ／ｍｌ）、不活性プラスミノーゲン（１８ｕｇ／ｍｌ）、ｔＰＡおよびプラスミノーゲン、プラスミノーゲン（活性、０．５Ｕ／ｍｌ）とともに、ＰＢＳ中で、４５分間、３７℃で反応させることによって、決定した。反応は、抗リーリン抗体（Ｎ−Ｒ２認識抗体であるＧ１０）および抗リーリン抗体（Ｒ７−８認識抗体である、Ａｂ１４）をプローブとして、ウェスタンブロット（１：１０）にかけた。
【図３５（Ｂ）】ｔＰＡがリーリンプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおけるリーリン代謝に対するｔＰＡの影響能力を、細胞を新鮮な上澄み内で７０ｎＭのｔＰＡとともに２４時間インキュベートすることにより、決定した。細胞のタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図３５（Ｃ）】ｔＰＡがリーリンプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおけるリーリン代謝に対するｔＰＡの影響能力を、細胞を新鮮な上澄み内で７０ｎＭのｔＰＡとともに２４時間インキュベートすることにより、決定した。上澄みのタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図３６（Ａ）】３−エピトープマッピングの説明図である。リーリンは、Ｎ末端領域と、それに続くＣＲ−５０静電領域（明るい灰色）、Ｆ−スポンジン領域（Ｈ）、および８つの連続するＥＦＧ様リピートからなる。様々な抗体と、それぞれの抗体のための、リーリン構造のエピトープ領域を示している。
【図３６（Ｂ）】３−エピトープマッピングの説明図である。全長リーリンおよびその主要な断片の分布を決定するために、リーリンのＮ−Ｒ２、Ｒ３−Ｒ６およびＲ７−Ｒ８領域を区別して認識する抗体を使用することができる。
【図３７】リーリンおよびＡｐｏＥＲ２発現に対するＲＡＰの影響を示すグラフである。ＡｐｏＥＲ２発現の減少が、海馬、前頭前皮質および頭頂葉皮質内へのＧＳＴ−ＲＡＰ（全てのリポタンパク質受容体に結合する、受容体関連タンパク質）の適用と関連付けられている。
【図３８（Ａ）】ｈＲ３−６の適用が、一次ニューロン培養物におけるＡｐｏＥｒ２発現を増加させることを示すブロットである。ニューロン（Ｅ１７、ＤＩＶ８）は、ｈＲ３−６で１時間処理され、ＡｐｏＥｒ２を認識する抗体３３２６でプローブされた。Ｎ＝３〜４。
【図３８（Ｂ）】ｈＲ３−６の適用が、一次ニューロン培養物におけるＡｐｏＥｒ２発現を増加させることを示すグラフである。ＡｐｏＥｒ２レベルはアクチンで規格化され、ウェスタンブロットから定量された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書において、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、単数形（英語原文において“a”、 “an”、 “the”の付されたもの）は、複数の指示対象を含むものとする。従って、例えば、「ポリペプチド（a polypeptide）」)は、2つ以上のポリペプチドの混合物等を含む。
【００３１】
本明細書で使用される「約（about）」は、近似的であることや近いことを意味し、数値または数値範囲の記載である場合には、数値の±15％を意味する。
【００３２】
「投与（administrationまたはadministering）」は、本発明の化合物が単独でまたは他の化合物との組み合わせで患者に送達されるプロセスを記述するために使用される。組成物は、特に、経口、非経口（静脈内および動脈内および他の適切な非経口経路をいう）、髄腔内、筋肉内、皮下、結腸、直腸、経鼻投与を含む、様々な経路で投与されてもよい。これら状態はそれぞれ、疾患または状態を治療するための本発明の化合物の他の投与ルートを使用して容易に治療してもよい。治療的または予防的効果を得るための本発明の化合物および組成物の用量は、当技術分野で周知のように、患者の状況によって決定される。本発明における患者の用量決定は、本発明の化合物若しくは組成物の個々の若しくは単位用量を通して、または、化合物若しくは組成物の組み合わされた若しくは予めパッケージされた若しくは予め調合された用量によって実施されることができる。平均的な40gのマウスは、0.416gの重さの脳を持ち、160gのマウスは、1.02gの重さの脳を持ち、250gのマウスは、1.802gの重さの脳を持っている。平均的なヒトの脳は1508gの重さがあり、これを、本明細書に記載する治療を実施するのに必要なまたは有用な治療量を指示するために、使用可能である。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法によって調合可能である。さらに、本明細書で使用される「薬学的に受容可能な担体」という言葉は、任意の標準的な、薬学的に受容可能な担体を意味する。薬学的に受容可能な担体は、希釈剤、アジュバント、媒体、さらに、インプラント担体、および、不活性な無害の固体または液体の賦形剤、希釈剤、または、本発明の有効成分と反応しないカプセル化材料を含むことができる。例として、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、水、油／水乳濁液のような乳濁液を含むが、これらに限定されない。担体は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物および植物油を含有する、溶媒または分散媒質であってもよい。調合方法は、周知かつ当業者にとって容易に入手可能な多くの情報源に記載がある。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.)には、本発明と組み合わせて使用可能な製剤方法が記載されている。
【００３４】
本明細書で使用される「動物」は、動物界または後生動物に分類される多細胞の真核生物を意味する。この用語は、哺乳動物を含むが、これに限定されない。非限定的例示として、齧歯動物、水生哺乳動物、犬および猫のような飼育動物、羊、豚、牛、馬のような家畜、および人間を含む。ここで、「動物」（英語で“animal”）または「哺乳動物」（英語で“mammal”）またはそれらの複数形の用語が使用される場合、当該用語は任意の動物にも適用されることが意図されている。
【００３５】
本明細書において使用される「保存的置換」とは、アミノ酸を類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正または負の帯電、極性または無極性）を有する他のアミノ酸で置換することを言う。以下に示す表１は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
【００３６】
表１は、保存的置換を示す官能基分類に基づいて、アミノ酸を示したものである。参考のために、各アミノ酸をコードする、重複するトリプレットコードが示されている。
【００３７】
【表１】
2019524775.tif 000003
【００３８】
本明細書において使用される「保存的変異」とは、アミノ酸をコードする際に何ら変更を生じさせない、ヌクレオチドの置換、つまり、縮合コドンの間での重複する配列への変化、または、保存的置換を生じさせる置換のことを言う。コドンの重複性の例を表２に示す。
【００３９】
表２は、重複するトリプレットコードと、対応してコードされるアミノ酸を示している。
【００４０】
【表２】
2019524775.tif 000004
つまり、コドンUUAへの保存的変異は、UUG、CUU、CUC、CUAおよびCUGを含む。
【００４１】
本明細書において、「リーリンの断片リピートから形成されたコンストラクト」とは、リーリンのリピート領域を組み合わせて得られた断片から作り出された人工タンパク質のことを言う。明細書に記載のように、全長リーリンは、図３および段落［００６１］のアミノ酸配列に示されたように、領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のようなリピートと呼ばれるＤＮＡまたは（タンパク質のための）アミノ酸の領域で構成される。ループ領域は、これらのリピート領域の間に位置し、２つのリピート領域を結合させるのに用いられる。
【００４２】
本明細書において、「ループ領域」とは、ＲＮＡのループ構造に対応する、リーリンの核酸配列の部分を意味し、「ループ領域」は、２つのリピート領域の間に配置され、２つのリピート領域を結合している。「リピート領域」の用語は、リーリンの核酸配列の１部で、基本的繰り返し単位を構成する部分を意味する。具体的な「リピート領域」については、明細書のいたるところに開示されている。具体的実施形態においては、「ループ領域」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補的領域を有する核酸の一本鎖によって形成される構造であり、相補的領域の間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二重鎖形成またはワトソン・クリック塩基対形成から除外されることによりハイブリダイズする。  
【００４３】
本明細書においては、「患者」の用語は、治療を受けているかまたは受けることを意図されている動物、好ましくは哺乳類、更に好ましくは人間を含むと理解される。
【００４４】
本明細書で使用される「治療上有効な量」の用語は、組織、システム、動物または人間において、研究者、獣医師、医師または他の臨床家によって求められる生物学的または医薬的な反応を誘発する、有効な化合物または薬剤の量を意味する。神経変性疾患または神経傷害に関しては、有効な量は、更なるニューロンの変性または損傷を防ぐか、神経変性疾患または神経傷害の症状を減少させるか、または、樹状突起の密度を向上させるのに十分な量を含む。実施形態のいくつかにおいては、有効な量は、神経変性疾患の進行を遅らせるために十分な量である。実施形態のいくつかにおいては、有効な量は、神経変性疾患の発生および／または再発を防止または遅延させるために十分な量である。有効な量は、必要に応じて、または個々のリーリン代謝率に応じて、１回で、または、２週間以上の間隔をあけて２回以上に分けて投与することができる。
【００４５】
本明細書で使用される「修正する（correcting）」は、基礎となる神経変性疾患または損傷を消散させることを言う。例えば、アルツハイマー病を修正するとは、ニューロン死を停止させることを言う。
【００４６】
本明細書で使用される「治療」または「治療する」は、有益な、または所望の臨床結果を得ることを言う。有益な、または所望の臨床結果は、一つ以上の症状の緩和、神経変性疾患または神経傷害による損傷の範囲の縮小、神経変性疾患または神経傷害の状態の安定化（つまり、悪化させないこと）、神経変性疾患または神経傷害の発生または再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または緩徐化および病状の改善のうちのいずれか一つ以上を含むが、それらに限定されない。本発明の方法は、これらの治療態様のいずれか１つ以上を考慮している。
【００４７】
本明細書で使用される「神経傷害（neuronal insult）」は、何らかの外的条件に起因する突発的な肉体的けがによって生じた神経組織の損傷を意味する。そのような外的条件の非限定的例示としては、暴力または事故、骨折、攻撃または外科手技が含まれる。
【００４８】
「薬学的に受容可能な」成分とは、過度の有害な副作用（毒性、刺激、アレルギー反応等）がなく、人間および／または動物への使用に適し、合理的なベネフィット／リスク率に釣り合うものを言う。
【００４９】
本明細書において使用される「安全かつ有効な量」とは、本発明の方法で使用された場合に、所望の治療上の反応を生じさせるのに十分で、かつ、過度の有害な副作用（毒性、刺激、アレルギー反応等）がなく、合理的なベネフィット／リスク率に釣り合う、成分の量を言う。
【００５０】
「薬学的に受容可能な担体」とは、溶媒、懸濁化剤または媒体等の、問題の化合物を動物または人間に送達するための担体を言う。担体は、液体または固体でもよく、計画された投与方法を考慮して選択される。本明細書で使用される「薬学的に受容可能な担体」は、任意の全ての溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。そのような薬学的活性物質のための媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において、よく知られている。有効成分と不適合でない限り、任意の従来の媒体または薬剤についても、治療用組成物における使用が考えられる。
【００５１】
本発明の化合物は、医薬用組成物として調合され、選択された投与ルート（例えば、経口、腹腔内、静脈内、動脈内、または脳内ルート）に合わせた様々な形態で、人間等の患者に投与されることができる。
【００５２】
有効な化合物は、また、脳内、腹腔内、静脈内、または動脈内に、注入または注射によって投与されてもよい。有効な化合物またはその塩の溶液は、水または他の適切な溶媒で作成することができ、オプションとして、無害の界面活性剤を混合してもよい。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物、および、油中への分散物を作成することもできる。一般的な保管および使用条件の下では、これらの作成物は、微生物の繁殖を予防するための保存料を含む。
【００５３】
注射または注入に適する薬の剤形は、無菌の水溶液または水分散液、または、無菌の注射可能または注入可能な溶液または分散液を即座に作成できるようにされた、有効成分を含む無菌の粉末を含むことができる。いずれの場合も、最終的な剤形は、製造および保管条件の下で、無菌で、流動性を有し、安定でなければならない。液体の担体または媒体は、溶媒または液体分散媒体であってよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒のグリセリルエステル、およびそれらの適する混合物を含むことができる。界面活性剤の使用によって、または、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、例えば、砂糖、緩衝剤または塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましいと考えられる。注射可能組成物の長期間に亘る吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって、もたらされ得る。
【００５４】
無菌の注射可能溶液は、所要量の有効な化合物を、必要に応じて上記で列挙した他のいくつかの成分を混ぜた適切な溶媒に取り込んだ後、ろ過滅菌することによって作成される。無菌の注射可能溶液を作成するための無菌の粉末の場合には、好ましい作成方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、予めろ過滅菌された溶液中に溶かすための、有効成分と任意の所望の追加成分とを合わせた粉末を作成する。
【００５５】
有用な固体担体には、タルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等の、微粉化された固体を含む。有用な液体担体には、本発明の化合物が、（オプションとして無毒の界面活性剤の助けにより、）有効なレベルにまで溶解または分散できる、水、アルコール、グリコール、または水−アルコール／グリコール混合物を含む。
【００５６】
本発明の化合物の有用な用量は、生体外でのそれらの活性、および、動物モデルにおける生体内での活性を比較することにより、決定できる。マウスおよび他の動物での有効量を人間に外挿するための方法は、当該技術分野において知られている（米国特許第４９３８９４９号（Borch et al.））。
【００５７】
従って、本発明は、上記した本発明の化合物を含む医薬用組成物を、薬学的に受容可能な担体とともにまたはそのような担体なしに、含む。脳室内、脳内または非経口投与に適合し、神経変性疾患または神経傷害の治療に有効な１つ以上の化合物を一定量含む医薬用組成物は、本発明の好適な実施形態である。
【実施例１】
【００５８】
組換えリーリン断片は、特定のリピート領域を決定するために、全長のヒトリーリン配列（Gene ID: 5649, Nat’l Center for Biotechnology Information, U.S. Nat’l Library of Medicine, Bethesda, MD; Human Gene Nomenclature Committee, Cambridgeshire, UK, HGNC:HGNC:9957）を用いて形成された。当該断片は、商業的に生産され、到着時、コンストラクトの構築およびタンパク質生成に先立って、配列決定された。
【００５９】
全長のヒトリーリン（配列番号１）
【００６０】
2019524775.tif 000005
2019524775.tif 000006
2019524775.tif 000007
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【００６１】
リーリンのリピート領域といくつかの酵素切断部位を含む配列マップが、図５に示されている。
【００６２】
組換えリーリン形成のための断片を生成するために、ＨＥＫ２９３細胞は、ｐＣｒｌベクター内の全長リーリン遺伝子で、安定的に遺伝子導入された。全長リーリンは、前述のようにして、ＨＥＫ２９３細胞に、挿入された（非特許文献２５、Sinagra, et al., Reelin, very-low-density lipoprotein receptor, and apolipoprotein E receptor 2 control somatic NMDA receptor composition during hippocampal maturation in vitro. J. Neurosci. 2005;25:6127-6136）。一旦、コンフルエントになった後で、細胞を、０．２％のウシ血清アルブミンを含む低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地で、２日間培養し、その後、培地の回収、滅菌ろ過と、セントリコンプラス８０遠心式フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）による濃縮を行った。リーリンは、細胞外で、２部位で切断され、その結果、３つの主要な断片である、Ｎ末端からリピート２（約１８０ｋＤａ）、リピート３−６の中央部断片（約１９０ｋＤａ）およびリピート７と８からなるＣ末端断片（約８０ｋＤａ）が生じた（Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997;94: 8196-820、de Rouvroit, et al., (1999) Reelin, the extracellular matrix protein deficient in reeler mutant mice, is processed by a metalloproteinase. Exp. Neurol. 1999;156:214-217、Utsunomiya-Tate, et al., Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inhibited by the function-blocking CR-50 antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97: 9729-9734、非特許文献１４、非特許文献１５、Koie, et al., Cleavage within Reelin repeat 3 regulates the duration and range of the signaling activity of Reelin protein. J. Biol. Chem. 2014;289:12922-12930、非特許文献１６、非特許文献１７）。更に、２つの中間的な断片も生成された。一つはＮ末端からリピート６（約３７０ｋＤａ）からなり、もう一つはリピート６−８（約２７０ｋＤａ）からなる（非特許文献１４）。
【００６３】
全長リーリンの切断は、上記の通り、付着末端が形成されるように行われた。組換えリーリンに関しては、特定のリーリンリピート示すDNA配列を連結することにより、２つ以上のリーリン断片が作成された。結果として得られたリーリンのリピート領域も、コード領域が維持され、読み枠が正しい方向にあることを確認するために、配列決定された。リーリン組換えタンパク質は、標準的技術を用いて生成され、ブルースクリプト保有ベクター内で増幅された。組換えDNAは、発現ベクターの中にクローニングされ、ＨＥＫ２９３細胞培養中で発現された。
【００６４】
リーリンリピート３（配列番号２）
【００６５】
2019524775.tif 000011
【００６６】
リーリンリピート４（配列番号３）
【００６７】
2019524775.tif 000012
【００６８】
リーリンリピート５（配列番号４）
【００６９】
2019524775.tif 000013
2019524775.tif 000014
【００７０】
リーリンリピート６（配列番号５）
【００７１】
2019524775.tif 000015
【００７２】
リーリンリピートループ領域３−４（配列番号６）
【００７３】
2019524775.tif 000016
【００７４】
リーリンリピートループ領域４−５（配列番号７）
【００７５】
2019524775.tif 000017
2019524775.tif 000018
【００７６】
リーリンリピートループ領域５−６（配列番号８）
【００７７】
2019524775.tif 000019
【００７８】
組換えの、ヒトリーリン遺伝子コンストラクト、Ｒ６断片に結合されたＲ３断片、即ち、リーリン断片Ｒ３＋Ｒ６（配列番号９）
【００７９】
2019524775.tif 000020
2019524775.tif 000021
【００８０】
組換えの、ヒトリーリンタンパク質、Ｒ６断片に結合されたＲ３断片、即ち、リーリンタンパク質断片Ｒ３＋Ｒ６（配列番号１０）
【００８１】
2019524775.tif 000022
【００８２】
*上記において、コード領域は、ＤＮＡ配列内で、色付けされており、何も印されていない白い領域（下線、イタリック体のようなフォント修飾のない領域）は、タンパク質に翻訳されない。
【００８３】
組換えの、ヒトリーリン遺伝子コンストラクト、Ｒ５断片に結合されたＲ３断片、即ち、リーリン断片Ｒ３＋Ｒ５（配列番号１１）
【００８４】
2019524775.tif 000023
2019524775.tif 000024
【００８５】
組換えの、ヒトリーリンタンパク質、Ｒ５断片に結合されたＲ３断片、即ち、リーリンタンパク質断片Ｒ３＋Ｒ５（配列番号１２）
【００８６】
2019524775.tif 000025
2019524775.tif 000026
【００８７】
*上記において、コード領域は、ＤＮＡ配列内で、色付けされており、何も印されていない白い領域（下線、イタリック体のようなフォント修飾のない領域）は、タンパク質に翻訳されない。
【実施例２】
【００８８】
リーリンのリピート領域は、実施例１に記載のように単離された。Ｒ３領域は、ＤＮＡの付着末端を与えるように切除された。リーリン遺伝子は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｔＸＩとともにインキュベートされ、その結果、約６３００ｂｐのセグメントの切除が行われた。切除されたＲ３断片は、その後、ＡＡＶ−９またはＡＡＶ−５ウイルスベクターに挿入された。ウイルスベクターがｐＭＤＬｇ／ｐＰＲＥまたはｐＡＤ３０００のようなＣＭＶプロモーターを有する場合、ウイルスベクターはＣＭＶプロモーターの後で切断された。しかし、ｐＡｄＥａｓｙ−１の場合のように遺伝子導入時点で、ベクターにＣＭＶプロモーターが含まれていない場合には、リーリン断片にプロモーターが加えられた。ＥｃｏＲＩおよびＢａｔＸＩに対する相補的末端を有し、リーリン断片およびＣＭＶプロモーターを含むコンストラクトが形成された。コンストラクトは、ベクターとともに、リガーゼのような酵素の中でインキュベートされ、リーリン断片とＣＭＶプロモーターを含む新たなベクターが形成された。リーリン断片を含むウイルスを作るために、このベクターが細胞に挿入された。
【００８９】
上記実施例は、リーリンＲ３について述べたが、この方法は、実施例１に記載された断片Ｒ３−５、断片Ｒ３＋５および断片Ｒ３＋６を含む他のリーリン変異型に関しても使用された。
【実施例３】
【００９０】
リーリン断片は、実施例１に記載するように形成された。断片Ｒ３−Ｒ６、Ｒ３＋Ｒ５およびＲ３＋Ｒ６を含む様々なリーリンの変異型が、リポーターとしてＡｐｏＥＲ２を使用し、ルシフェラーゼアッセイで試験された。ただし、Ｒ２（ＮＲ２）、Ｒ６（ＮＲ６）、Ｒ３−ＣおよびＲ７−Ｃのような他のスプライシング変異型も、本発明の有用な態様であると考えられる。
【００９１】
受容体がクラスタ化する際の光放出増加によってＡｐｏＥＲ２受容体のクラスタ化を決定するために、図６に示すルシフェラーゼアッセイが行われた。ルシフェラーゼ基質をルシフェラーゼ緩衝液（１：１）に溶解し、Ｎ末端ルシフェラーゼを第１セットのＡｐｏＥＲ２受容体タンパク質に結合させ、Ｃ末端ルシフェラーゼを第２セットのＡｐｏＥＲ２受容体タンパク質に結合させた。
【００９２】
ルシフェラーゼが結合したＡｐｏＥＲ２を、各アッセイプレートに１：１の割合（即ち、５０μＬのＮ末端ルシフェラーゼに対し５０μＬのＣ末端ルシフェラーゼ）で加えた。図３、７〜９に示された様々なヒトリーリンの変異型を、ＡｐｏＥＲ２をレポーターとして使用して試験した。５ｎＭの試験リーリンを加えた後、混合物を１０分間振とうし、発生した光を検出した。
【００９３】
図１０に示すように、全てのマウスリーリン断片は、R５−６を除き、光の放出が２倍から４倍に増加した。ヒトリーリン断片の使用は、図１１に示すように、シグナル放出を増加させ、殆どが、対照に対して２．５倍から３倍の増加を示した。更に、殆どのヒトリーリン断片の活性は、図１０の最も効果的なリーリンと同程度であり、ヒトR３−５、ヒトR３−４ およびヒトR３＋６は、R３−６とほぼ同じか、より高いルシフェラーゼ活性を示した。ヒトR３＋R５は、図１０に示すR３-６の約５０％、または、R３＋R６、R３＋R５およびR４＋R６と同程度の活性を示した。図１２に示すように、マウスとヒトの断片はいずれも、受容体クラスタ化誘導において有効であることが、ルシフェラーゼシグナルの増加によって証明された。
【実施例４】
【００９４】
ＡｐｏＥＲ受容体の活性化を試験することにより、リーリンの細胞シグナル伝達とプロセシングの効果を分析した。最近の研究では、正常な学習と記憶におけるリーリンシグナル伝達の重要性（非特許文献２５）が、このシグナル伝達が乱れた場合の病理学的な実例とともに、注目されている。例えば、例えば、リポタンパク質受容体は、認知プロセスに関与しており、この受容体ファミリーは、アルツハイマー病（ＡＤ）進行の基礎をなす病理的プロセスと関連付けられている。これら受容体の２つの主要なリガンドであるａｐｏＥとリーリンは、シナプス機能に大きな影響を及ぼすことのできるシグナル伝達能力を有するように見える。ＡＰＣは、構造上にＡｐｏＥＲ２と結合する部分を有し、下流のエフェクターを活性化させると考えられるため、現在、リーリンシグナル伝達の修飾因子の候補となっている。リーリンシグナル伝達のＡＰＣ修飾に関する試験は、新しい治療手段を生み出す可能性を秘めているため、科学的、臨床的に、大きな関心事となっている。
【００９５】
ＡｐｏＥＲ受容体の活性化およびシグナル伝達経路のリーリンの効果を分析した。胎生１７日のマウスから一次ニューロン培養物を作成し、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）とＬ−グルタミンを加えた無血清のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地 （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２で、培養した。細胞は、培養物中で、８日間、成熟させられた。培養物を、２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理した。リーリン処理後所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で、細胞を溶解した。全ＡｐｏＥＲ２発現、ＡＫＴ、ＡＫＴのリン酸化、リン酸化された細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）および全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のウェスタンを決定し、無処理（時間０）で規格化した。ＥＲＫのリン酸化状態は、ＥＲＫの活性を直接的に検出するものであり、上流のシグナル伝達経路の活性化を示している。
【００９６】
図１３（Ａ）に示された代表的なウェスタンブロットは、比較的安定なＡｐｏＥＲ２発現を示している。アクチンで規格化すると、図１３（Ｂ）に示されるように、ＡｐｏＥＲ２発現は、リーリン曝露後、最初の３０分間降下し、その後、発現レベルが安定するのが分かった。図１３（Ａ）に示されるように、ＡＫＴレベルは、リーリン曝露後６０分にわたって降下し、一方  、リン酸化されたＡＫＴでは増加した。アクチンで規格化したAKTとｐAKTは、ブロットの傾向が対照的であった。AKTレベルは、図１３（Ｄ）に示されるように、リーリン曝露後６０分間にわたって降下した後に上昇し、曝露前のレベルに戻った。リン酸化されたAKTは、図１３（Ｃ）に示されるように、曝露後６０分間にわたって劇的に上昇した後、曝露前のレベルまで急降下した。全ＥＲＫは、実験を通じて一定であるように見える一方で、リン酸化されたＥＲＫ１および２は、リーリン曝露後１０分および２４０分に、図１３（A）に示されたように、示された。図１３（Ｅ）および（Ｆ）に示されるように、アクチンで規格したＥＲＫおよびｐＥＲＫ１／２は、ブロットの傾向と合致し、リーリン曝露後１０分における強いリン酸化と、リーリン後２４０分における僅かな２度目の上昇を示した。図１３（Ｇ）に示されるように、全ＥＲＫに対するｐＥＲＫの比率は、リーリン後１０分でピークに達するのが見られ、その後、リーリン後１２０分まで徐々に降下し、その後、若干上昇した。
【００９７】
この結果が、使用されたリーリン断片（R３-６）に特異のものではないことを確認するために、図１４（Ａ）に示されるように、一次ニューロン培養物の実験を、他のリーリン断片でも繰り返した。一次ニューロン培養物を、２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列R３およびR５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３およびＲ６（ｈＲ３＋６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からリピートＲ２（ＮＲ２）、および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））、で処理した。対照（Ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなった。６０分間、リーリンを細胞上に置いてインキュベートした。全ＥＲＫおよびリン酸化されたＥＲＫに対して、上記したように、細胞を溶解してウェスタンブロットを実施した。
【００９８】
図１４（Ａ）に示された代表的ウェスタンブロットでは、リーリン処理は、全ＥＲＫレベルに対して識別可能な影響を及ぼさなかった。実際、図１４（C）に示されるように、結果をアクチンで規格化すると、ヒトリーリン組換え断片（ｈＲ３＋５およびｈＲ３＋６）では、全長リーリン同様、全ＥＲＫレベルが僅かに低下する結果となり、一方、マウス断片（Ｒ３−６およびＮＲ２）では、全ＥＲＫが僅かに上昇していた。しかし、図１４（Ｂ）に示すように、ヒトリーリン組換え断片（ｈＲ３＋５およびｈＲ３＋６）では、全長リーリン処理同様、リン酸化されたＥＲＫ１／２が大きく上昇する結果となった。リピート３−６から形成されたマウスのリーリン断片（Ｒ３−６）では、リン酸化されたＥＲＫの僅かな上昇を示し、対照と重なった。それとは対照的に、マウスのＮ末端断片（ＮＲ２）では、リン酸化されたＥＲＫの低下を示した。全ＥＲＫのレベルに対するリン酸化されたＥＲＫのレベルを比較することにより、マウスの断片Ｒ３−６では、リン酸化は全ＥＲＫとほぼ同等（Ｒ３−６に関しては１．１５）であることが示された。これは、図１３（Ｇ）に示された結果と適合している。モック処理を行った対照培養物では、１．０９の比率である。マウスのＮ末端断片では、レベルが対照の約５０％（０．５３）であり、ＥＲＫのリン酸化を誘発しなかった。ヒトのリーリン断片（Ｒ３＋５およびＲ３＋６）ではＥＲＫのリン酸化が生じ（それぞれ２．２２および２）、全長リーリン（２．５）と同程度であった。これらの結果は、ヒトのリーリン断片が、マウスの断片よりもＡｐｏＥＲ２シグナル伝達に対して強く影響することを示し、治療において、より効果的らしいと考えられる。
【実施例５】
【００９９】
リーリン経路のタンパク質変化の試験を行うことによって、細胞経路に対するリーリンの効果を分析した。リーリン断片のコンプリメントの変化は、主要な下流の成分Ｄａｂ−１のリン酸化によって示されるように、下流のリーリンシグナル伝達の変化と相関があるように思われる。
【０１００】
ＶＬＤＬＲおよびＡｐｏＥｒに結合させられたＤＡＢ−１レポーターを用いて、ＤＡＢ−１のリン酸化の分析を行った。一次ニューロン培養物を、上記と同じように、胎生１７日のマウスから作成した。細胞は、培養物中で、８日間、成熟させられた。プレート（９６ウェル、２４ウェル）の各ウェルに、５０μＬまたは１００μＬの、（１ｍｇ／ｍＬから希釈した）０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０１％）のポリエルリジンを加え、ポリエルリジンでプレートを覆った。ウェルを３７℃で少なくとも１時間インキュベートし、溶液を、真空吸引または他の方法で除去した。ウェルを１５０μＬの水で洗浄した。細胞を１：１０で高グルコース培地内に浮遊させ、８０〜９０％コンフルエンスになるまで（２０〜２４時間）プレートに加えた。
【０１０１】
Ｏｐｔｉ Ｍ（無血清、不完全培地として知られている）と高グルコール完全培地を３７℃まで温めた。Ｏｐｔｉ−Ｍ（５００μＬ）を、２本のエッペンドルフチューブにそれぞれ加えた。２本のエッペンドルフチューブのうち１本目に、ＤＮＡ（２０μＬ）を加え、２本目のエッペンドルフチューブに、リポフェクタミン（２０μＬ）を加えた。各チューブの内容物を混合し、２つの溶液を、室温で５分間インキュベートした。２つのＡｐｏＥＲ２融合タンパク質のためのＤＮＡとリポフェクタミンを一緒に混合し、室温で２０分間インキュベートした。この遺伝子導入混合物を、細胞の入った９６ウェルプレートの各ウェルに１０μＬ加え、混合物をインキュベートした。
【０１０２】
４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。リーリンＲ３−６断片は、対照として使用するため、１００℃で１０分間煮沸した。ルシフェラーゼ基質をルシフェラーゼ緩衝液に溶解し（１：１）、遺伝導入された各プレートに、ルシフェラーゼを１：１の割合で加えた（即ち、遺伝子導入溶液５０ｕＬに対し、ルシフェラーゼ５０ｕＬ）。混合物を１０分間振とうし、発光を検出した。
【０１０３】
リーリンの結合に関して、全長リーリンでの処理は、Ｄａｂ−１に対して再現性のある効果をもたらす結果となり、図１５および１６に示されるように、リン酸化状態が殆ど変わらなかった。対照的に、海馬のスライスをＲ３−６断片と接触させると、図１７および１８に示されるように、Ｄａｂ−１リン酸化に対する時間依存性のある効果が示された。ＡＰＣ処理された単球は、活性Ｄａｂ１（Ｔｙｒ２２０−ｐ）、Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３−ｐ、およびＧＳＫ３β Ｓｅｒ９−ｐレベルの増加を示した。ＲＡＰによる前処理またはＡｐｏＥＲ２の除去は、これらの効果を弱めることが見られた一方、ＥＰＣＲおよびＰＡＲ１の阻害剤は全く効果がなかった。興味深いことに、ＡＰＣは、３０ｎＭの親和性でＡｐｏＥＲ２に結合するが、可溶性のＶＬＤＬＲには結合しないことが分かった。受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）が、ＡＰＣによって媒介される、Ｕ９３７細胞のエンドドキシン誘導組織因子凝固促進活性の阻害をブロックすることが示され、ＡＰＣの効果とＡｐｏＥＲ２のシグナル伝達が関係づけられた。
【０１０４】
リーリン分子は、最近の研究で、生体外および生体内において、Ｆｃ−ＲＡＰのように、より高次の複合体を形成することが発見された。更に研究を進めることにより、リーリンが、生体内において、ジスルフィド結合したホモ二量体として分泌されることが示された。分子のＮ末端に位置するＣＲ−５０エピトープと呼ばれる短い領域の削除により、オリゴマー形成が阻止される。この変異型リーリンは、一次マウスニューロンにおいて、Ｄａｂ１リン酸化の誘導を効率良く行うことができない。同様に、ＣＲ−５０エピトープに対する抗体は、生体外および生体内におけるリーリン機能を弱める。
【０１０５】
ＲＡＰは非常に高い親和性でリポタンパク質受容体のファミリーと結合することのできる、細胞内タンパク質である。Ｆｃ−ＲＡＰ融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域を用いて、概ね「ダンベル」形になるように連結された、２つのＲＡＰ分子からなる改変タンパク質である。Ｆｃ−ＲＡＰは、ＡｐｏＥＲ２およびＶＬＤＬＲに対しては、結合して阻害する代わりに、受容体のクラスタ化とＡｐｏＥＲ２の活性化を引き起こすことができる。図１９に示されるように、Ｆｃ−ＲＡＰの付加は、ＬＴＰ誘導の増加によって、リーリン適用と同じ効果をもたらす。主な違いは、Ｆｃ−ＲＡＰは、全てのリポタンパク質受容体に結合する傾向があるが、ＡｐｏＥＲ２およびＶＬＤＬＲに対してはクラスタ化するだけであることである。
【０１０６】
ＡｐｏＥＲ２および／またはＶＬＤＬＲのクラスタ化により、Ｄａｂ１のリン酸化が誘導され、ＳＦＫの活性化およびＰＫＢ／Ａｋｔの修飾を含む下流の事象が誘導される。さらに、リーリンの生物学的効果の１つである、長期増強（ＬＴＰ）の調節もまた、リーリン非依存性の受容体クラスタ化によって、再現される。これらの発見は、Ｄａｂ１チロシンリン酸化と下流のシグナル伝達事象のためには、チロシンキナーゼ活性を与える追加の共受容体は必要なく、受容体誘導の二量体化またはオリゴマー化で十分であることを強く示唆している。何等の特定の理論と結び付けられるまでもなく、このことは、リーリン断片の治療上の可能性が、適切な受容体二量体化と下流のシグナル伝達を介するものであることを示唆している。
【実施例６】
【０１０７】
リーリンは、ＣＡ１グルタミン酸作動性反応を増強する能力がある。培養された海馬ニューロンにおいては、リーリンのシグナル伝達は、樹状突起構造の正常な発達のために必要とされる。リーリンまたは細胞内アダプタータンパク質Ｄａｂ１が欠如すると、ニューロンは、樹状突起の発達阻害および樹状突起の枝の減少という、リーリン受容体ａｐｏＥＲ２およびＶＬＤＬＲが欠如したニューロンに見られるのと類似の表現型を呈する（非特許文献２７）。ＨＲＭは、海馬のＣＡ１領域における、海馬依存的な文脈的恐怖条件付け学習とシナプス可塑性の欠陥を呈する。ＨＲＭのこれら行動学的および生理学的表現型は、シナプス接続の減少または阻害が原因の一部であると考えられている。これは、ＨＲＭで見られるスパイン密度の減少によって裏付けられる。
【０１０８】
海馬および皮質ニューロンの混合培養物を、胎生（Ｅ）１８〜１９日のマウス胎仔から得た。細胞を高密度（〜７５０細胞ｍｍ−２）で蒔き、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地 （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）中で培養した。細胞は、８０％コンフルエンス時点で、継代培養した。
【０１０９】
ＡｐｏＥＲ２は、シナプス後性に存在し、ＣＡ１内のＮＭＤＡＲと機能複合体を形成する。図２０（Ａ）〜（Ｂ）および図２１（Ａ）〜（Ｄ）に、ｍＥＰＳＣ−ＮＭＤＡの誘導が示されている。モックで処理された細胞は、ＮＭＤＡ受容体による興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣＮＭＤＡ）が小さく、モック処理前と比べて有意な変化がなかった（ｐ＞０．０５）。リーリンによる処理では、ｍＥＰＳＣＮＭＤＡ振幅を有意に増加させるのが見られた（ｐ＜０．００１）。
【０１１０】
リーリンのシナプス後効果の結果としてシナプスのＮＭＤＡＲ反応が増加したことを更に確かめるために、シナプス誘起ＮＭＤＡＲ全細胞電流の変動係数（ＣＶ）の分析を行った。３０分間のリーリン適用の前後で行われた９つの実験に関し、１／ＣＶ２率を平均ＥＰＳＣＮＭＤＡ率に対してプロットすると、図２１（Ｃ）および（Ｄ）に見られるように、相関は得られなかった。しかし、１／ＣＶ２率は、様々な平均ＥＰＳＣＮＭＤＡ率に対して比較的変化がなく、リーリンの活性化が、ＣＡ１におけるシナプス後メカニズムを通じてＮＭＤＡＲ活性を向上させることが確認された。
【０１１１】
持続的なリーリン処理は、シナプス反応のＡＭＰＡ成分を増加させることができ、ＥＰＳＣＮＭＤＡ動態とイフェンプロジル感受性を変化させる。ＡＭＰＡＲおよびＮＭＤＡＲサブユニットの発現レベルに対するＣＡ１内のリーリンの影響について試験を行った。ＧｌｕＲ１、ＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂの全レベルおよび表面レベルの両方を、ウェスタンブロットで調べた。ＣＡ１細胞表面において、発生的成熟の期間に発現が増加し、シナプス可塑性の期間に輸送調節を受けるＡＭＰＡＲサブユニットである、ＧｌｕＲ１の分析を行った。
【０１１２】
図２２（Ａ）〜（Ｃ）は、リーリン処理によって、モック処理グループと比較して表面ＧｌｕＲ１レベルが有意に増加したことを表しており、持続的なリーリン処理後のｍＥＰＳＣＡＭＰＡとＡＭＰＡ／ＮＭＤＡ電流比率の増加によって、発現と表面挿入が調節されたことを示している。表面または全ＮＲ１レベルのどちらにも、変化は見られなかった。これと比べて、ＮＲ２Ａの発現レベルは、全レベルおよび表面レベルの両方とも、リーリン処理後、モック処理に対して有意に上昇した。さらに、全および表面ＮＲ２Ｂタンパク質レベルのいずれも、リーリン処理後、有意に低下した。モック処理は、無処理の対照グループと比較して、様々なグルタミン酸受容体サブユニットのレベルに対して何の効果も生じさせなかった。
【０１１３】
海馬の樹状突起に対するリーリンの効果を分析した。海馬細胞は、ＨＲＭ胎仔から培養され、日齢６〜７日の野生型、ＨＲＭおよびリーリン欠損マウスから作られ、５ｎｍのリーリンで、２１日間、処理された。器官型培養物の処理は、２１日間にわたる３日ごとの５ｎＭのリーリン適用の繰り返し、または、非遺伝子導入ＨＥＫ細胞培地であった。細胞を、上記のように培養し、ホールセルパッチクランプ電流を流すことによって蛍光色素をニューロン細胞内に注入し、固定後、共焦点顕微鏡下で可視化した。
【０１１４】
樹状突起スパインは、樹状突起の表面を覆う小さな突起であり、興奮性シナプスを形成するシナプス後構造を担っている。様々な認知疾患において、樹状突起スパインの形状の異常または数の減少が見つかっている。樹状突起スパインの数の減少は、ニューロンによる集中的情報処理にとって必須の樹状突起構造の発達には、構成的レベルのリーリン／リポタンパク質受容体によって媒介されるシグナル伝達が必要であることを示唆している。このことは、ヘテロ接合体リーラ―マウス（ＨＲＭ）が、樹状突起スパイン密度の減少と、一定の学習および記憶行動におけるパフォーマンス低下を示すという、研究結果と合致している。
【０１１５】
培養された海馬ニューロンは、樹状突起スパインが有意に少なく、外来性の組換えリーリンを培養物に加えることにより回復することのできる表現型であった。リーリン処理したＨＲＭ細胞は、２１日後、図２３（Ｂ）に示されるように、日齢の合う野生型培養物のニューロンと比べて、樹状突起スパイン密度が増加した。これとは対照的に、モック処理（非安定遺伝子導入細胞の条件培地）では、図２３（Ｃ）に示されるように、スパイン密度に何の変化も見られなかった。図２３（Ｃ）および（Ｆ）に示されるように、リーリンノックアウトマウスでの同じ試験も、リーリンの適用が、やはり、モック処理の対照と比較して、樹状突起スパイン密度を回復させることを示した。リーリン処理された細胞は、両方とも、図２３（Ｄ）に示されたＷＴ細胞に見られる樹状突起スパインと形態が似ており、定量化すると、リーリン処理されたＨＲＭ培養物では、モック処理された対照と比較して樹状突起スパインが有意に増加し、図２４（Ａ）に示された野生型培養物で観察されたスパイン密度レベルと同等であった。
【０１１６】
この適用プロトコルがリーリンの持続的適用を表していることと、リーリンが劣化したり能動的に培地から除去されたりしていないこととを確認するために、発明者は、リーリン適用後、０、６、１２、２４、４８、７２および９６時間後に、培養プレートから１５μｌの培地を取り出した。これら一定分量の試料のウェスタン分析では、図２５に示されるように、リーリンの劣化や減少は見られなかった。よって、スパイン密度の増加は、生理的に意味のあるレベルで全２１日の適用期間中存在した、リーリンによるものである。
【実施例７】
【０１１７】
リポタンパク質受容体は、認知プロセスに関与しており、この受容体ファミリーを病理的プロセスと関連付けている。これら受容体の２つの主要なリガンドであるａｐｏＥとリーリンは、シナプス機能に有意な影響を及ぼすことのできるシグナル伝達能力を有するように見える。リーリンヘテロ接合型は、シナプス可塑性と認知機能の両方において欠陥を示す。リーリンの発現が約５０％減少すると、シナプス可塑性と認知機能の両方に欠陥が生じる（Qiu, et al., Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem. 2006; 85:228-242）。最近の研究では、正常な学習と記憶におけるリーリンシグナル伝達の重要性（非特許文献２５）が、このシグナル伝達が乱された場合の病理学的例とともに注目されている。ＡＰＣは、構造上にＡｐｏＥＲ２と結合する部分を有し、下流のエフェクターを活性化させると考えられるため、現在、リーリンシグナル伝達の修飾因子の候補となっている。
【０１１８】
リーリンの学習および認識効果を確認するため、リーリンの受容体への結合を効果的にブロックする、リポタンパク質アンタゴニストＲＡＰ（受容体関連タンパク質）をマウスに両側注入した。
【０１１９】
週齢１０週のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５５、雄）を、通常の条件（２０℃、相対湿度５０％、および１２時間の明暗サイクル）で飼育し、水と餌を自由に与えた。この環境に標準化した後、マウスを、偽手術（注射なし）を行いショックを与えないグループと、ＲＡＰ注射を行いショックを与えるグループ、偽手術（注射なし）を行いショックを与えるグループと、リーリン処理を行いショックを与えるグループ、に分けた。リーリン処理された動物は、全長の組換え精製リーリンタンパク質を５ｎＭの濃度で２μｌ注射された。処理後３時間で、文脈的恐怖条件付けを行った。実験の間、動物の痛みと苦痛を減少させるために必要な予防措置をとった。全ての実験は、処理条件を知らない人員によって、盲検として行われた。処理時、マウスの重量は、１２〜４５ｇであった。
【０１２０】
両側注射のために、マウスをイソフルランで麻酔し、定位手術装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社）に置いた。頭蓋中央で矢状切開し、開口を広げるために皮膚をそっと押し戻した。脳を通って脳室内までハミルトン針を通すことができるよう、頭蓋骨にドリルで２つの穴を開けた（ブレグマからＡＰ−０．３５ｍｍ、Ｌ±０．７５ｍｍ、Ｖ−２．５ｍｍ）。マウスに対し、既に確立された方法で、リーリンの全半球濃度が５ｎｍとなるように、０．５μＬのモック対照またはリーリンを１μＬ／分で両側に注射した（非特許文献２５、非特許文献３６）。その後、針を取り除き、穴を歯科用セメントでシールし、切開部を縫合した。手術後２時間、マウスは、温かい温熱パッド上においた個別のケージ内で観察された。毎日、直腸温を測って炎症または感染の反応を監視し、３８．１℃（１００．５°Ｆ）以上のマウスは、ＣＯ２吸入によって安楽死させた。動物は、５日間、回復させた。脳室内注射後の行動試験には、この時間経過が最適であることが、先の研究で示されている（非特許文献３５、非特許文献３６）。
【０１２１】
恐怖条件付け訓練を、底がワイヤ格子でできた四角形の防音チャンバー（２５×２５ｃｍ）内で行った。訓練においては、マウスを、ホワイトノイズのバックグランドのあるチャンバー内に置き、３分間、チャンバー内を探索させた後、３０秒間の条件刺激（９０ｄＢの音）を与えた。２８秒時点で、全部で２秒間の無条件刺激（軽度（０．５ｍＡ）の足ショック）を与えた。９０秒後、２度目の、条件刺激／無条件刺激のペアリングを行い、更に９０秒後、全部で７分間。この訓練から２４時間後、同じチャンバー内で、音なしで、３分間、文脈的恐怖条件付けを行い、すくみ行動の評価を行った。文脈的試験に続いて、手がかり恐怖条件付けを行った。この試験では、チャンバーを、臭い、照明および足の感触で変化させた。マウスを、変化させられたチャンバー内に置き、３分間の馴化期間（音なし）後、試験のラスト３分間、９０ｄＢの条件刺激（音）を与えた。ＡＮＹ−Ｍａｚｅソフトウェア（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社）によって行動をモニタリングした。すくみ行動を、少なくとも２秒間の不動として評価した。
【０１２２】
偽手術されて、訓練のショックを受けなかったマウスでは、音を聞いてすくんだマウスは約１５％だけであり、非常に僅かしか、すくみを呈さなかった。注射なしで、ショック訓練を受けたマウスでは、約７０％が、音を聞いてすくんだ。これを超えたのは、リーリン処理を受けたマウスだけであり、図２６（Ａ）に示すように、９０％のすくみ率を示した。これと比較して、リーリンの受容体結合を阻害するＲＡＰを投与すると、マウスはショック訓練を受けていたにも関わらず、音に対する反応が、４５％にまで減少した。分析の結果、処理を受けていないがショック訓練を受けたマウスと、ＲＡＰ処理を受けたマウスとの間で、反応に有意な差があることが示された。
【０１２３】
マウスには、また、水迷路試験も行った。空間学習および記憶を評価するために、プラットホームの隠された水迷路を使用した。マウスが底に触れられない十分な深さの不透明な水で満たした直径１．２ｍのプールの水面のすぐ下に、直径１０ｃｍのプラットホームを沈めた。部屋の周りに大きな視覚的手がかりを配置した。マウスをプール内に置き、プラットホームを見つけるために、最長で６０秒間泳がせた。訓練は、５日間、１日に４回の試行を、試行間に１５分のインターバルをあけて行った。６日目と８日目に、プラットホームを取り除き、ＡＮＹ−Ｍａｚｅビデオ追跡ソフトウェア（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社）を使用して、各マウスの泳ぎパターンを６０秒間追跡した（プローブ試験）。
【０１２４】
図２６（Ｂ）に示すように、脳室内へのリーリンの単一の注射で、プラットホームの隠された水迷路における空間学習が向上した。６日目に、異なるプラットホーム位置（反対側）を見つけるように再訓練されたマウスは、生理食塩水を注射されたマウスと比較して、継続して学習能力の向上を示した。訓練の５日前に単一のリーリン注射を受けたマウスは、１日目にプラットホームを見つけるまでの潜時も、より短かった。図２６（Ｃ）に示されるように、プラットホームを見つけるまでの潜時は、１回の訓練パラダイムを経た後で、有意に短縮された。異なるプラットホーム位置を見つけるように再訓練されたマウスは、継続して、リーリン注射と生理食塩水注射の違いを示した。泳ぎの速さおよび全ての他の活動性の測定値は、処理された動物と処理されていない動物との間で、同じままであった。これらのデータは、生体における学習と記憶形成を調節するリーリンの能力を劇的に示しており、また、リーリンタンパク質プロセシングを制御するメカニズムや、更に、断片がどのようにして認知機能を調節するのかを特定するための研究の重要性を示している。
【０１２５】
機能テストによって、リーリンレベルが低いと連合学習が低下することが示された。リーリン濃度を上昇させると、シナプス機能に対するリーリン欠乏の影響が補償される。図２６（Ａ）〜（Ｃ）に示されるように、月齢３〜４か月の野生型マウスにおいて、連合的恐怖条件付け訓練の３時間前に、組換えリーリン断片コンプリメントを直接両側脳室注入すると、訓練の２４時間後の試験で、記憶形成が向上していた。これらの結果は、正常な記憶形成のためのリーリンの必要性を示しており、また、リーリンシグナル伝達を増加させることによって記憶を向上させ得るのかという興味深い問題を提起している。
【０１２６】
次に、リーリンレベルに対する文脈的恐怖条件付けの影響について分析した。野生型マウスを、上記のように、３ショックの文脈的恐怖条件付けプロトコル（ＣＦＣ）で訓練した。ショックを与えられていないマウス（ＣＳ）を陰性対照として用いた。ショックを与えられて文脈に晒されたマウス（ＣＳ／ＵＳ）の海馬を、訓練後、１分、５分、１５分、３０分および１８０分および１８時間で取り出し（ｎ＝４、時点ごと）、海馬のホモジネートを、抗リーリン抗体（Ｇ１０）を用いて分析した。
【０１２７】
図２７（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、恐怖条件付け学習は、文脈的恐怖条件付け後の１８時間にわたって、リーリンの発現と断片のコンプリメント、特に４５０および１８０ｋＤａの断片に、劇的な変化を生じさせる。さらに、図２７（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、シェファー側枝経路へθバースト刺激を与えることにより、刺激後１５分時点でのリーリン発現と断片切断が有意に増加した。これらの結果は、シナプス可塑性の変化および学習および記憶の調節の原因となるリーリンシグナル伝達の統合と制御が、機能的に識別可能な断片へのリーリンのプロセシングを含んでいることを示している。
【実施例８】
【０１２８】
リーリンのシグナル伝達は、哺乳類の正常な認知機能の他にも、興奮性シナプスに対する様々な生理的変化に関与している。最近の研究は、正常な学習と記憶におけるリーリンシグナル伝達の重要性（非特許文献２５）とともに、このシグナル伝達が乱れた場合の病理学的例に注目している。ＡＰＣは、構造上にＡｐｏＥＲ２と結合する部分を有し、下流のエフェクターを活性化させると考えられるため、現在、リーリンシグナル伝達の修飾因子の候補となっている。
【０１２９】
リポタンパク質受容体は、認知プロセスに関与しており、この受容体ファミリーは、アルツハイマー病（ＡＤ）進行の基礎をなす病理的プロセスと関連付けられている。これら受容体の２つの主要なリガンドであるａｐｏＥとリーリンは、シナプス機能に有意な影響を及ぼすことのできるシグナル伝達能力を有すると考えられ、ＡＰＰと直接に相互作用してその代謝を調節し、また、Ａβの蓄積に感受性がある。Ａβの蓄積はリポタンパク質受容体のシグナル伝達を妨げ、付随する認知機能の障害を引き起こす。さらに、リーリンおよび／またはリポタンパク質受容体のシグナル伝達の干渉は、異常なＡＰＰ代謝とＡβクリアランスを引き起こし、続いて、Ａβ蓄積とプラーク沈着を悪化させる。従って、直接的なリーリンタンパク質の適用を通じた、または、ＤＮＡ遺伝子治療またはＲＮＡコンストラクトによるリーリンシグナル伝達の増加、または、他のリポタンパク質受容体アゴニストの使用は、Ａβ依存性の認知障害とプラーク病態の進行を緩和するために、使用可能である。
【０１３０】
ヒトの疾患におけるリーリンタンパク質分解の役割を裏付ける事実は、精神神経障害および神経変性障害の両方で見つかっている。例えば、ＡＤおよび前頭側頭型認知症患者においては、非認知症の患者と比べて、Ｎ−Ｒ２断片が増加している（Saez-Valero, et al., Altered levels of cerebrospinal fluid reelin in frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 2003;72:132-136、Botella-Lopez, et al. Reelin expression and glycosylation patterns arealtered in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103:5573-5578）。鬱病および双極性障害と確定診断された患者においては、血液サンプル内のＮ−Ｒ２断片の減少が見られ、一方、統合失調症患者に関しては、Ｎ−Ｒ６断片が増加している（Fatemi, et al., Altered levels of Reelin and its isoforms in schizophrenia and mood disorders. Neuroreport. 2001;12:3209-3215）。リーリンは、また、発作のコントロールにおいても役割を果たしている可能性があり、てんかんモデルは、ＭＭＰ依存性であるかもしれないリーリンのプロセシングを変化させた（Tinnes, et al., Epileptiform activity interferes with proteolytic processing of Reelin required for dentate granule cell positioning. FASEBJ. 2011;25:1002-1013、Tinnes, et al., TIMP-1 inhibits the proteolytic processing of Reelin in experimental epilepsy. FASEBJ. 2013;27:2542-2552、Kaneko, et al., Kainic acid-induced golgi complex fragmentation/dispersal shifts the proteolysis of reelin in primary rat neuronal cells: an in vitro model of early stage epilepsy. Mol. Neurobiol. 2016;53:1874-1883）。リーリン断片レベルに関するこれらの差異は、病気の状態におけるリーリンレベルとタンパク質分解の機能不全の重要性を示している。
【０１３１】
リーリンの試験を行うことにより、３つのＡＤマウスモデル（ＰＳ１−ＦＡＤ、ＳｗｅＡＰＰｘＰＳ１および Ｔｇ２５７６）において、リーリン代謝が変化していることが示された。月齢１４か月の野生型（変異させられていない同腹の仔）、Ｔｇ２５７６（ＳｗｅＡＰＰ）、ＰＳ１−ＦＡＤ（Ｍ１４６Ｌ）および２Ｘ（ＳｗｅＡＰＰｘＭ１４６Ｌ）を、通常の条件（２０℃、相対湿度５０％、１２時間の明暗サイクル）の下で飼育し、水と餌を自由に与えた。この環境に標準化した後、マウスの皮質を取り出し、溶解物に対し、様々なリーリン断片に関するウェスタンブロットを行った。図２８（Ａ）に示されるように、リーリン代謝は、３つのＡＤマウスモデル（ＰＳ１−ＦＡＤ、ＳｗｅＡＰＰｘＰＳ１および Ｔｇ２５７６）で変化していた。Ｔｇ２５７６対野生型では、リーリンの４５０、１９０および１８０ｋＤａ生成物に有意な差は検知されなかったが、Ｇ１０によって認識された未特定のＮ末端種は、Ｔｇ２５７６および２Ｘマウスで有意に上昇していた。これとは対照的に、リーリンの４５０および１８０ｋＤａ生成物は、ＰＳ１−ＦＡＤおよび２Ｘマウスで有意に上昇していた。リーリン断片のコンプリメントのこれら変化は、下流のリーリンシグナル伝達の変化と相関があると思われる。主要な下流の成分であるＤａｂ−１のリン酸化に関して皮質の試験を行うと、図２８（Ｂ）に示されるように、ＳｗｅＡＰＰＸＰＳ１とＰＳ１−ＦＡＤではＤＡＢ−１リン酸化の増加が示され、１匹のＳｗｅＡＰＰ （Ｔｇ２５７６）マウスでは、有意に減少していた。これらのデータは、リーリン代謝が、ＡＰＰプロセシングの変化および／またはＡβ蓄積に対して特に感受性を有することを示唆している。
【０１３２】
Ｔｇ２５７６マウスにおけるリーリン断片の組成とＤａｂ−１リン酸化の変化は、リーリンのシグナル伝達系統が損なわれていることを意味しているかもしれず、事実であれば、この現象が、これらマウスで報告されているシナプス可塑性の欠陥の原因である可能性がある（Mitchell, et al., X11beta rescues memory and long-term potentiation deficits in Alzheimer's disease APPswe Tg2576 mice. Hum Mol Genet. 2009; 18:4492-4500、Kotilinek, et al., Cyclooxygenase-2 inhibition improves amyloid-beta-mediated suppression of memory and synaptic plasticity. Brain. 2008; 131:651-664、Jacobsen, et al., Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103:5161-5166）。
【０１３３】
外来性リーリンの効果を決定するために、月齢８か月のＴｇ２５７６マウスから採取した海馬の急性スライスを、５ｎＭの組換えリーリン断片コンプリメントＲ３−６で灌流した。図２８（Ｃ）に示されるように、リーリン断片の適用により、高齢のＴｇ２５７６マウスのＬＴＰ欠陥が回復した。このことは、リーリンタンパク質プロセシングの下流のリーリンシグナル伝達に関与する生化学的および構造的な仕組みが、これらマウスにおいて損なわれていないことを示している。更に、このマウスモデルにおいては、正常なレベルのシナプス可塑性が得られることに注目するべきである。図２９（Ａ）〜（Ｄ）に示されるように、リーリン断片は、高齢の（月齢１５か月）のＴｇ２５７６マウスにおける有芯プラークとも関連している。更に、リーリンおよび関連するリポタンパク質受容体アゴニストは、Ａβの蓄積および／またはプラーク病態に起因するシナプス可塑性および認知機能の欠陥を回復させることができる。リーリンは、図３０に示されるように、月齢１２か月のＡＤモデルのマウス（Ｔｇ２５７６）のＬＴＰ欠陥を回復させた。
【０１３４】
これらのデータは、Ａβを含むプラークと関連付けられたリーリンが高齢の野生型マウスの海馬で検出された事実によって裏付けられている（Madhusudan, et al., Accumulation of reelin-positive plaques is accompanied by a decline in basal forebrain projection neurons during normal aging. Eur J Neurosci. 2009; 30:1064-1076、Knuesel, et al., Age-related accumulation of Reelin in amyloidlike deposits. Neurobiol Aging. 2009; 30:697-716）。シナプス機能におけるリーリンの確立された役割を考えると、リーリンの代謝とシグナル伝達の完全性の変化は、既にＡＤマウスモデルで確立された学習および記憶の変化において深い役割を果たしている。
【０１３５】
驚くべきことに、成体の野生型マウスにおいて、単一の外来性リーリンの適用により、少なくとも１１日間、学習と記憶が向上する。Ａβクリアランスにおけるリポタンパク質受容体の役割と、ＡＤマウスモデルにおけるＡβプラークへのリーリンの関連性の特定は、Ａβの除去および認知機能の向上を目的とするＡＤへの治療的介入としての、ＡＤの病因および病態形成における治療上のターゲットとして、リーリンに焦点を合わせることの価値を証明している。
【０１３６】
以上の通り、直接的なリーリンタンパク質の適用を通じた、または、ＤＮＡ遺伝子治療またはＲＮＡコンストラクトによるリーリンシグナル伝達の増加、または他のリポタンパク質受容体アゴニストの使用は、Ａβ依存性の認知障害およびプラーク病態の進行を緩和させるために、使用可能である。
【実施例９】
【０１３７】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、てんかん、頭部外傷、てんかん重積（ＳＥ）および虚血など、様々な原因で生じ得る（Shetty & Hattiangady, Prospects of Stem Cell therapy for Temporal Lobe Epilepsy. Stem Cells. 2007;25:2396-2407、Ogawa, et al., Ischemia-induced neuronal cell death and stress response. 2007;9:573-587、Acharya, et al., Progress in neuroprotective strategies for preventing epilepsy. Prog Neurobiol. 2008:363-404、Pitkanen, et al., From traumatic brain injury to posttraumatic epilepsy: what animal models tell us about the process and treatment options. Epilepsia. 2009;50 (Suppl 2):21-9）。損傷の急性期には、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）に位置する神経幹細胞（ＮＳＣ）が、損傷を癒そうとしてニューロン新生を増加させる（Parent, et al., Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 1997;17:3727-3738、Hattiangady, et al., Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiol Dis. 2004;17:473-490、Shetty, et al., Hippocampal neurotrophin levels in a kainate model of temporal lobe epilepsy: a lack of correlation between brain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentate mossy fiber sprouting. J Neurochem. 2003;87:147-159、Hattiangady, et al., Brain-derived neurotrophic factor, phosphorylated cyclic AMP response element binding protein and neuropeptide Y decline as early as middle age in the dentate gyrus and CA1 and CA3 subfields of the hippocampus. Exp Neurol. 2005;195:353-371）。しかし、これら損傷に対する生理的反応は、機能回復を向上させることができず、その結果、学習の欠陥と、記憶および気分障害が生じる（Jorge RE, Acion L, Starkstein SE, Magnotta V. Hippocampal volume and mood disorders after traumatic brain injury. Biol Psychiatry. 2007;62:332-338、Potvin, et al., Performance on spatial working memory tasks after dorsal or ventral hippocampal lesions and adjacent damage to the subiculum. Behav Neurosci. 2006;120:413-422）。ＴＢＩによる慢性的問題の多くは、ＮＳＣの不十分なニューロン分化、ＮＳＣからのニューロン細胞の不適切な移動または分化、および、ニューロン細胞から突き出した基底樹状突起上の不十分または不適切なシナプス形成によって引き起こされる（Sanchez, et al., Synaptic connections of hilar basal dendrites of dentate granule cells in a neonatal hypoxia model of epilepsy. Epilepsia. 2012;53 (Suppl 1):98-108）。
【０１３８】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に関するリーリン投与の効果を試験するために、一連の運動行動試験、ＥＢＳＴ、前肢無動試験、肢握力試験を行った。
【０１３９】
週齢１０週のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５５、雄）を、通常の条件（２０℃、相対湿度５０％、１２時間の明暗サイクル）の下で飼育し、水と餌を自由に与えた。この環境に標準化した後、制御式皮質衝撃装置（ＣＣＩ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）を使用して、マウスにＴＢＩを被らせた。実験手順は、実験動物委員会の承認を受けた。マウスを、偽手術（ＴＢＩなし）をして注射なしのグループ、ＴＢＩありで注射なしのグループ、ＴＢＩありで生理食塩水のモック処理を行っグループ、ＴＢＩありでリーリン処理したグループに分けた。リーリン処理された動物は、全長の組換え精製リーリンタンパク質を５ｎＭの濃度で２ｕｌ注射された。偽手術された動物は、麻酔されて外科手術を受けたが、皮質衝撃は受けなかった。全ての行動試験は、いずれの試験日も、明サイクルの間の同じ時間に行った。実験の間、動物の痛みと苦痛を減少させるために必要な予防措置をとった。全ての実験は、処理条件を知らない人員によって、盲検として行われた。処理時、マウスの重量は、１２〜４５ｇであった。
【０１４０】
亜酸化窒素／酸素（６９／３０％）に１〜２％のイソフルランを混ぜたものを用いて、鼻マスクで、深く麻酔をかけた。全ての動物は、定位固定フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国カリフォルニア州タハンガ）に固定された。ＴＢＩ損傷手術では、動物に、頭蓋骨を露出させるための頭皮切開と、頭蓋骨切除を行った。電気ドリルを使用し、ブレグマから＋０．２前方かつ−０．２ｍｍ右側方から計算された座標で、半径約２．５ｍｍの頭蓋骨切除を行った（Paxinos & Watson, (2005) The mouse brain in stereotaxic coordinates. 5th ed. San Diego, CA: Academic Press）。開頭手術後、脳の前頭頭頂皮質に、６．０ｍ／ｓの速さで、硬膜層下１．０ｍｍの深さに届き、１５０ミリ秒（ｍｓ）間脳に残存する、衝撃を与えた。衝撃装置のロッドは、衝撃面における脳の曲面の接平面に対する垂直位置が維持されるよう、垂直から１５°の角度にされた。
【０１４１】
線形可変変位変換器（Ｍａｃｒｏｓｅｎｓｏｒｓ社、ニュージャージー州ペンソーケン）を衝撃装置に接続し、速さと持続時間を測定して、一貫性を確認した。鎮痛用ケトプロフェン（５ｍｇ  ｋｇ−１）を手術後投与した。マウスを、綿密な管理下に置いた。
【０１４２】
持ち上げボディスイング試験（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｂｏｄｙ  ｓｗｉｎｇ ｔｅｓｔ；ＥＢＳＴ）は、動物を尻尾でつかみ、スイング方向を記録するものであった（Borlongan & Sanberg, (1995) Elevated body swing test: a new behavioral parameter for mice with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism. The Journal of neuroscience 15: 5372-5378）。試験装置は、透明なプレクシグラスの箱（４０×４０×３５．５ｃｍ）である。動物の尻尾の付け根をそっとつまみ、動物の鼻が表面から上に２インチ（５ｃｍ）の高さになるまで尻尾で持ち上げた。動物の頭が、身体の中央線位置から約１０度横向きに動くたびに、左か右か、スイングの方向をカウントした。一回のスイングの後、動物はプレクシグラスの箱に置き戻され、再試験に先立ち、３０秒間、自由に行動させた。これらのステップを、各動物に対して２０回繰り返した。通常、損傷のないマウスは、５０％のスイング偏向、つまり、左および右に同じ回数のスイングを示す。ＴＢＩ運動障害の基準として、１方向への７５％のスイング偏向を用いた。
【０１４３】
偽手術対照、ＴＢＩ−注射なし、ＴＢＩ−モック注射あり、または、ＴＢＩ−リーリンありのグループの若いマウスと高齢のマウスに対して、ＴＢＩ手術の前後に、前肢無動の試験を行った（Borlongan CV, Hida H, Nishino H (1998) Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport 9:3615-3621）。同側性および対側性の前肢の強度と運動性を、実験について知らされていない２人の評価者によって（盲検で）、以下に述べる前肢無動尺度を用いてスコア化した。無処理のマウス、偽損傷のマウスまたは半身パーキンソン病様のマウスを、一匹ずつ、立てたプレクシグラスの円筒（直径２０ｃｍ、高さ３０ｃｍ）内に置き、マウスが探索し前肢でガラスに触れる間、５〜１５分間、ビデオを録画した。前肢での接触を、実験について知らされていない２人の評価者が記録し、後で、「右接触数／全接触数」として計算した。５０％の値は、正常と見なされ、１とスコアされた。右（同側）前肢で８０％接触した動物は、障害があると見なされ、２とスコアされた。また、右（同側）前肢で９０％以上接触した動物は、重度の障害があると見なされ、３とスコアされた。個々の動物についてスコアを集計し、その後、処理グループの平均スコアを用いて分析を行った。
【０１４４】
肢握力試験は、ＴＢＩ手術の前後で、握力の強さを試験したものである。握力の異常は、神経筋機能障害を示す。この試験においては、マウスは、ポールに対して体を支持させられた（Ibrahim AG, Raisman G, Li Y (2009) Permanent loss of fore-paw grasping requires complete deprivation of afferent input from a minimum of four dorsal roots of the rmouse brachial plexus. Exp Neurol 215:142-145）。同側性および対側性の両方の肢握力の強さを、実験について知らされていない２人の評価者によって、以下の握力強度尺度を用いてスコア化した。１〜３のスコアのうち、１は正常、２は障害、３は重度の障害である。個々の動物についてスコアを集計し、その後、処理グループの平均スコアを用いて分析を行った。
【０１４５】
処理グループ間の統計的有意差を評価するために、各時点に対する分散分析（ANOVA）および事後ボンフェローニt検定を繰り返し行った。ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。全ての値は、平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）で表されている。
【０１４６】
ＴＢＩ動物において、リーリン処理は、行動回復の向上を示した。図３１に示されるように、リーリン処理されたマウスは、１日目には僅かなスイング偏向を示したが、２日目までには偏向が解消された。比較して、ＴＢＩ処理して担体を注射したかまたは注射しなかったマウスは、試験を通じて、より高いスイング偏向を示した。このように、処理は２日目で回復に違いが出る結果となり、リーリン処理されたマウスでは改善が見られたが、担体注射および注射なしのマウスでは僅かな改善しか見られなかった。リーリン処理はまた、図３２に示されたように、３日目までには、肢無動も改善させる結果となった。５日目には、リーリン処理されたマウスは、偽手術の動物と同様の肢無動を示したのに対し、ＴＢＩ処理されて担体を投与されたかまたは注射されなかったマウスは、継続して無動を示した。図３３に示されたように、肢握力は、リーリン処理されたマウスにおいて、安定した改善を示した。
【０１４７】
外傷性脳損傷おける慢性的なライフスタイルの喪失は、一部には、治癒中の不適切なニューロン細胞置換によるものである。リーリンは、ＤＧにおいて、細胞外糖タンパク質リーリンを発現するニューロンである、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブクラスを保護することが発見されている（Shetty, Hippocampal Injury Induced Cognitive and Mood Dysfunction, Altered Neurogenesis and Epilepsy: Can Early Neural Stem Cell Grafting Intervention Provide Protection? Epilepsy Behav. 2014 Sep;38:117-24）。これらのＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、ＮＣＳから形成されたニューロン細胞の顆粒細胞層への移動を支える（Gong, et al., Reelin regulates neuronal progenitor migration in intact and epileptic hippocampus. J Neurosci. 2007;27:1803-1811）。何等特定の理論と結び付けられることなく、リーリンまたはリーリン断片の投与は、樹状突起形成を通じて、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの保持または経路の組み合わせを起こし得る。
【実施例１０】
【０１４８】
樹状突起スパインは、樹状突起の表面を覆い、興奮性シナプスを形成するシナプス後構造を担う、小さな突起である。脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症等、多くの認知疾患において、樹状突起スパインの形状の異常や数の減少が見つかっている。樹状突起スパインの数の減少は、ニューロンによる集中的情報処理にとって必須の樹状突起構造の発達には、構成的レベルのリーリン／リポタンパク質受容体によって媒介されるシグナル伝達が必要であることを示唆している。このことは、ヘテロ接合型リーラ―マウス（ＨＲＭ）が、樹状突起スパイン密度の減少と、一定の学習および記憶行動におけるパフォーマンス低下を示すという、研究結果と合致している。また、リーリンの補給は、スパイン密度の欠陥と、関連する認知障害を回復させる。更に、リーリンシグナル伝達は、初期記憶遺伝子転写に必須のＣＲＥＢ活性化に関与する経路を開始させる。これは、上記したヒトの認知障害において共通して損なわれている経路である。
【実施例１１】
【０１４９】
原因となる特定の酵素はまだ解明されていないものの、最近になって、メタロプロテイナーゼによるリーリンのプロセシングが、正常な皮質板の形成に必須であることが示された（Jossin, et al., Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol Cell Biol. 2007; 27:7113-7124）。この発見は、メタロプロテイナーゼの媒介するリーリンプロセシングが、成体の脳における選択的なリーリンシグナル伝達にも重要である可能性を示唆している。ｔＰＡとＭＭＰ−９は、シナプス可塑性と認知機能の調節における役割を明らかに示しており、どちらも候補となるメタロプロテイナーゼである（Bozdagi, et al., In vivo roles for matrix metalloproteinase-9 in mature hippocampal synaptic physiology and plasticity. J Neurophysiol. 2007; 98:334-344、非特許文献１８、Huang, et al., Mice lacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selective interference with late-phase longterm potentiation in both Schaffer collateral and mossy fiber pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93:8699-8704、Pang, P. T., and B. Lu. 2004. Regulation of late-phase LTP and long-term memory in normal and aging hippocampus: role of secreted proteins tPA and BDNF. Ageing Res Rev 3:407-430、Zhuo, M., D. M. Holtzman, Y. Li, H. Osaka, J. DeMaro, M. Jacquin, and G. Bu. 2000. Role of tissue plasminogen activator receptor LRP in hippocampal long- term potentiation. J Neurosci 20:542-549、Baranes, et al., Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron. 1998; 21:813-825）。
【０１５０】
リーリン切断酵素の候補であるｔＰＡに一部依存する３７０ｋＤａの生成物を生成させることの有効性。この潜在的調節メカニズムは、このシグナル伝達システムがどのようにニューロンの調節の既知のメカニズムに統合され、学習や記憶といった生理的プロセスに加わるようにコーディネートされるのかに、深く関わっている。しかし、リーリンは、特定の部位で切断されて、ウェスタンブロット分析で容易に定量可能な、リーリン断片の安定なパターンを生じさせる。これらの断片は、全長リーリンとは異なる特有の性質を有するシグナル伝達分子である可能性がある。安定的に遺伝子導入されたＨＥＫ２９３細胞から精製された組換えリーリンは、海馬で見られる主要な断片と同じサイズの断片を含む。
【０１５１】
さらに、成体の脳におけるリーリンの局在性に関して知られている全てのことは、Ｎ−Ｒ２領域を認識する抗体を使用して得られた。Ｎ−Ｒ２領域は、リーリンの全長（Ｎ−Ｒ８）、Ｎ−Ｒ２およびＮ−Ｒ６断片の中に存在するが、他の主要な断片の中には存在しない。このため、表３に示されるような、３−エピトープマッピング法により、リーリン生成物の生成と局在性の変化をモニタリングするための、これまでにない空間分解能が得られた。表３は、３−エピトープ法で使用される抗体を示す（特性、供給源の特定、エピトープ認識部位を共に示す）。
【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
正常なシナプス機能と記憶形成という文脈における、ｔＰＡおよびＭＭＰ−９依存性のリーリンプロセシングによって生成される特定の断片の特性を明らかにするために、図３４に示されるように、部位特異的変異誘発によって、切断抵抗性のリーリン変異体コンストラクトを作成した。リーリン変異体は、Ｒ２−３におけるｔＰＡによる、Ｒ６−７におけるＭＭＰ−９による、および、Ｒ２−３とＲ６−７における両方の酵素による切断に対して抵抗性（Ｒｌｎ−Ｒｅｓ）のコンストラクトを含む。切断抵抗性部位を有するかまたは有さない、ｔＰＡまたはＭＭＰ−９による切断を模した断片についても考慮した。１つの相補的リーリンコンストラクトは、Ｒｌｎ−Ｒｅｓタンパク質と同じ方法で、タグを付けられたが、２つの変化させられた切断部位を含まない（リーリン切断不安定；図３４）。両方の変位部位を含むタグ付き断片（陰性対照コンストラクト）と、ＡｐｏＥＲ２およびＶＬＤＬＲに結合することの示されたタグつきのＲ３−６断片（潜在的陽性対照）が含まれる。リーリンコンストラクトは、後で、外来性のリーリンを認識できるように、Ｎ末端ポリヒスチジンタグおよび／またはＣ末端Ｍｙｃタグを含む哺乳類の発現ベクターにサブクローニングする。正確な切断部位は、ｔＰＡまたはＭＭＰ−９と反応させられた精製された全長リーリンを使用して特定することができ、このため、結果として生じる断片を単離可能である。
【０１５４】
リーリンは、ｔＰＡおよびＭＭＰ−９の両方でプロセシングされることにより、図３５（Ａ）〜（Ｃ）に示されるように、生体内で見られる主要なリーリン断片生成物を生じる。図２４（Ａ）に示されるように、ｔＰＡは３７０ｋＤａ（Ｎ−Ｒ６）と８０ｋＤａ（Ｒ７−８）の断片をセルフリー条件下で増加させており、図２７に示されるように、ｔＰＡがリーリンをＲ６−Ｒ７の間で切断することを示している。プラスミンによるリーリンの切断により、従来未特定の様々な生成物と、特有の保有率の１８０ｋＤａ断片が生じる。組換えｔＰＡを一次ニューロンに適用することにより、全長から３７０および１８０ｋＤａの形への細胞外リーリンの完全な転換と、細胞内の１８０ｋＤａリーリンの減少が生じた。更に、ＭＭＰ−９は、図２４（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように、３７０ｋＤａ（Ｎ−Ｒ６）および１８０ｋＤａ（Ｎ−Ｒ２）断片、さらに、よく知られた１８０ｋＤａ断片のすぐ下に見られる断片を増加させ、また、これらは、図２４（Ｄ）および（Ｅ）に示されるように、ＭＭＰ−９の阻害によって確認された。セルフリー条件下でのこれらの結果は、ＭＭＰ−９がリーリンをＲ２−３およびＲ６−７の両方の切断部位で切断可能であることを裏付けているが、一方で、一次ニューロンへのＭＭＰ−９の適用は、細胞内における１８０ｋＤａ断片の特有の蓄積を生じさせ、２４時間のＭＭＰ−９阻害は、劇的な全長リーリンの増加と細胞の１８０ｋＤａリーリンの減少を生じさせた。これらの結果は、正常な状態においては、ＭＭＰ−９は、図３４の断片マップに示されたように、リーリンをＲ２−Ｒ３の間で切断する原因となることを示唆している。これらの予備データをまとめて考慮すると、ＭＭＰ−９とｔＰＡが、生体内で見られる主要なリーリン断片を生成するために、十分であることを示唆している。図３６（Ａ）および（Ｂ）に示されたように、構造の分析により、リーリンの様々な断片を検出することのできる抗体が特定された。
【０１５５】
海馬におけるリーリンのプロセシングは、生体内においても生体外においても、シナプス活動の影響を受ける。また、ＭＭＰ−９とｔＰＡは、リーリン代謝のプロセスにも関与していると考えられる。
【実施例１２】
【０１５６】
リーリンは、特定の部位で切断され、ウェスタンブロット分析によって容易に定量化される、リーリン断片の安定なパターンを生じる。これらの断片は、全長リーリンとは異なる特有の性質を有するシグナル伝達分子である可能性がある。安定的に遺伝子導入されたＨＥＫ２９３細胞から精製された組換えリーリンは、海馬で見られる主要な断片と同じサイズの断片を含む。組換えリーリン断片コンプリメントの適用は、（１）ＡＭＰＡ受容体の挿入を容易にし、ＮＭＤＡ受容体機能を増加させることによって、シナプス伝達を増加させ、（２）サイレントシナプスを減少させ、（３）シナプスの形態を修正し、（４）ＬＴＰを向上させることができる。（非特許文献３１、Qiu, S., K. M. Korwek, A. R. Pratt-Davis, M. Peters, M. Y. Bergman, and E. J. Weeber. 2006. Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem 85:228-242）。
【０１５７】
リーリンに曝露された際のＡｐｏＥＲの受容体発現について分析を行った。海馬と皮質の混合ニューロン培養物を、胎生（Ｅ）１８〜１９日のマウスの胎仔から得た。細胞を高密度（〜７５０細胞ｍｍ−２）で蒔き、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地 （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）中で培養した。細胞は、８０％コンフルエンス時点で、継代培養した。細胞が８回目に継代培養されたときに、５ｎＭの濃度のリーリン断片ｈＲ３−６を培地に加え、細胞を、リーリン断片とともに、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理によって集め、培地で洗浄し、ＳＤＳ−β−メルカプトエタノールをベースとする溶解緩衝液を用いて溶解した。各細胞培養物からタンパク質を集め、２５ｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。電気泳動後、タンパク質をナイロン膜に移し、抗ＡｐｏＥＲ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＬＲＰ８、ウサギ抗ｈＡｐｏＥＲ２抗体）を用いてプローブした。
【０１５８】
細胞をＧＳＴ−ＲＡＰ（受容体関連タンパク質）で処理することにより、図３７に示されるように、受容体発現の大幅な低下が見られた。このように、ＡｐｏＥＲ２に結合するリーリンの能力のブロックは、ＡｐｏＥＲ２発現の低下を生じさせる。しかし、細胞を外来のリーリンに曝露すると、ＡｐｏＥＲ２受容体発現が増加した。さらに、ニューロン細胞をリーリン断片で処理すると、図３８（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、用量依存的にＡｐｏＥｒ２の発現が増加する。
【０１５９】
以上の明細書において、開示された全ての文書、行為または情報は、その文書、行為、情報またはその任意の組み合わせが、優先日において、公に入手可能であったか、公知であったか、当該分野における一般的知識の一部であったか、または何らかの問題解決に関連することが知られていたことを認めるものではない。
【０１６０】
以上で引用された全ての公開物の開示は、各公開物が個々に参照により組み込まれたのと同程度に、個々に、完全に、参照により明示的に本明細書中に組み込まれる。
【０１６１】
神経障害の治療法の具体的実施形態について記載、例示を行ってきたが、本発明の広範な精神と原理から逸脱することなしに、変形および改変を行い得ることは、当業者にとって明らかである。以下の請求項が、ここに記載された本発明の一般的および具体的特徴の全て、および、言語上、範囲に含まれる可能性のある、本発明の範囲の記述を全て、網羅することを意図することも、理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３（Ａ）】
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【図１３（Ｂ）】
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【図１３（Ｃ）】
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【図１３（Ｄ）】
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【図１３（Ｅ）】
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【図１３（Ｆ）】
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【図１３（Ｇ）】
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【図１４（Ａ）】
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【図１４（Ｂ）】
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【図１４（Ｃ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０（Ａ）】
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【図２０（Ｂ）】
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【図２１（Ａ）】
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【図２１（Ｂ）】
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【図２１（Ｃ）】
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【図２１（Ｄ）】
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【図２２（Ａ）】
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【図２２（Ｂ）】
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【図２２（Ｃ）】
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【図２３（Ａ）】
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【図２３（Ｂ）】
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【図２３（Ｃ）】
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【図２３（Ｄ）】
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【図２３（Ｅ）】
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【図２３（Ｆ）】
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【図２４（Ａ）】
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【図２４（Ｂ）】
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【図２４（Ｃ）】
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【図２４（Ｄ）】
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【図２４（Ｅ）】
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【図２５】
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【図２６（Ａ）】
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【図２６（Ｂ）】
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【図２６（Ｃ）】
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【図２７（Ａ）】
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【図２７（Ｂ）】
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【図２８（Ａ）】
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【図２８（Ｂ）】
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【図２８（Ｃ）】
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【図２９（Ａ）】
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【図２９（Ｂ）】
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【図２９（Ｃ）】
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【図２９（Ｄ）】
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【図２９（Ｅ）】
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【図３０】
2019524775.tif 000092
【図３１】
2019524775.tif 000093
【図３２】
2019524775.tif 000094
【図３３】
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【図３４】
2019524775.tif 000096
【図３５（Ａ）】
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【図３５（Ｂ）】
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【図３５（Ｃ）】
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【図３６（Ａ）】
2019524775.tif 000100
【図３６（Ｂ）】
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【図３７】
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【図３８（Ａ）】
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【図３８（Ｂ）】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月2日(2019.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターに挿入された組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片およびＣＭＶプロモーターを含む、リーリンベクターを含む、組成物。
【請求項２】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３（配列番号２）、リーリン断片リピートＲ４（配列番号３）、リーリン断片リピートＲ５（配列番号４）、リーリン断片リピートＲ６（配列番号５）、リーリン断片リピートＲ３からＲ４（配列番号６）、リーリン断片リピートＲ３からＲ５（配列番号１１）、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域R６（配列番号１０）、リーリン断片リピートＲ４からＲ５（配列番号７）、リーリン断片リピートＲ５からＲ６（配列番号８）、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３（配列番号１２）、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３（配列番号９）、およびリピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ４、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３（配列番号２）、リーリン断片リピートＲ４（配列番号３）、リーリン断片リピートＲ５（配列番号４）、およびリーリン断片リピートＲ６（配列番号５）、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートＲ３からＲ４（配列番号６）、リーリン断片リピートＲ３からＲ５（配列番号１１）、リーリン断片リピートＲ３からリピート領域R６（配列番号１０）、リーリン断片リピートＲ４からＲ５（配列番号７）、リーリン断片リピートＲ５からＲ６（配列番号８）、リーリン断片リピートＲ５と結合したリーリン断片リピートＲ３（配列番号１２）、リーリン断片リピートＲ６と結合したリーリン断片リピートＲ３（配列番号９）、またはこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リピート領域R６に結合したリーリン断片リピート領域Ｒ３（配列番号１０）、またはリピート領域Ｒ５と結合したリピート領域Ｒ３（配列番号１２）からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ−９ベクターまたはＡＡＶ−５ベクターからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
神経傷害または神経障害の症状を治療するための医薬を製造するための、請求項１ないし６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記神経障害が、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱および統合失調症からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記神経傷害が、外傷性脳損傷であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記神経傷害または神経障害の症状が、樹状突起スパイン密度の欠陥、長期増強の減少、シナプス可塑性の減少および連合学習の欠陥からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【国際調査報告】
2019524775.tif 000105
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2019524775.tif 000107
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