(57)【要約】  試料（１０９）を撮像するための装置であって、前記試料（１０９）を、線焦点又は焦点の配列で同時に照明するための照明手段（１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８）と、試料（１０９）から放出され又は散乱された光子を、視野の配列の中で同時に検出するための検出手段（１０８、１０７、１０６ｂ、１１１、１１２、１１３）とを備え、撮像中の光子が放出されるか又は散乱される試料中のサブ観察体積の配列は、前記照明手段（１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８）の線焦点又は焦点の配列が前記検出手段（１０８、１０７、１０６ｂ、１１１、１１２、１１３）の対応する視野の配列と重なる空間における体積によって規定され、前記装置は、前記試料（１０９）をその面に保持するように構成された試料ホルダ（１１０、１１０ａ）、好ましくは円筒形の試料ホルダ（１１０、１１０ａ）を備え、前記試料ホルダ（１１０、１１０ａ）は、前記試料ホルダ（１１０、１１０ａ）を回転させることによって、前記試料（１０９）の少なくとも一部が前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送されるように回転可能に配置されていることを特徴とする装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を撮像するための装置であって、前記装置は、
前記試料を、線焦点又は焦点の配列で同時に照明するための照明手段と、
試料から放出され又は散乱された光子を、視野の配列の中で同時に検出するための検出手段とを備え、
ここで撮像中の光子が放出されるか又は散乱される試料中のサブ観察体積（sub-observation volumes）の配列は、照明手段からの線焦点又は焦点の配列が前記検出手段の対応する視野の配列と重なる空間における体積によって規定され、
前記装置は、前記試料をその面に保持するように構成された試料ホルダを備え、前記試料ホルダは、前記試料ホルダを回転させることによって、前記試料の少なくとも一部が前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送されるように回転可能に配置されていることを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記検出手段は、前記試料内の点がサブ観察体積を通過するのにかかる時間と同じ程度、又はより短い検出システム上昇時間を有する請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記装置は、前記試料をその側面に保持するように構成された円筒状試料ホルダを含み、前記円筒状試料ホルダは、前記円筒状試料ホルダを回転させることによって、前記試料の少なくとも一部が前記サブ観察体積の少なくとも１つを通して搬送されるように回転可能に配置されることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の少なくとも１つの行に配置される請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記サブ観察体積の少なくとも１つの行に沿って描かれた仮想線と、前記行の前記サブ観察の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとの間の角度は、０より大きい請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の平面格子に配置される請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記サブ観察体積の格子の仮想平面の法線ベクトルと、前記行の前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の前記運動ベクトルとは、非直交である請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記照明手段は、マイクロレンズ配列を備える請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記検出手段がピンホール配列を含む請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記検出手段はガイガーモードでのアバランシェフォトダイオード検出器、好ましくはガイガーモード（Geiger mode）で動作するゲートアバランシェフォトダイオード検出器を含む請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記試料が、回転中に前記試料ホルダの回転軸からほぼ一定の半径方向距離に配置される請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記試料ホルダが空気軸受によって懸架される請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記試料と、前記サブ観察体積の配列との間の相対的、接線的、及び／又は半径方向の位置を、前記試料ホルダの回転ラップごとに少なくとも１回測定して、検出された信号を前記試料内の対応する絶対位置と相関させる手段をさらに備える請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記円筒状試料ホルダは、回転中に前記試料ホルダの回転軸に沿って搬送されるように、前記回転軸に沿って移動可能に配置される請求項３から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記円筒状試料ホルダは、試料容器ホルダと、前記試料容器ホルダに巻き付けられて取り付けられるように構成された取り外し可能な板状試料容器とを備える請求項３〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記円筒状試料ホルダは、前記試料を保持するための溝、ウェル等を含む請求項３から１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記円筒状試料ホルダは、前記試料を含有するために、前記溝、ウェル等を覆う薄いプレート又はフィルムの形態の蓋をさらに含み、前記蓋は、好ましくは、水の屈折率に近い屈折率を有する請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
さらに、回転中に液体層を面に広げるための、前記円筒状試料ホルダの外向き面の近傍に配置されたコーティングデバイスを含む請求項３から１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記コーティングデバイスは、顕微鏡対物レンズに取り付けられた顕微鏡スライドによって形成され、ここで前記顕微鏡スライドは、前記円筒状試料ホルダの前記外向き面の近傍に配置される請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
試料を撮像する方法であって、
ａ）回転可能に配置された試料ホルダの面に撮像される試料を提供すること；
ｂ）撮像中に光子が放出又は散乱される前記試料内のサブ観察体積の配列が、照明手段からの線焦点又は焦点の配列が検出手段の視野の対応する配列と重なる空間における前記体積によって規定されるよう、前記試料を線焦点又は焦点の配列で同時に照明し、視野の配列内で同時に前記試料から放出又は散乱した光子を検出すること；及び、
ｃ）撮像中に前記試料ホルダを回転させることによって、前記サブ観察体積の少なくとも１つを通して前記試料の少なくとも一部を搬送すること、
を含む方法。
【請求項２１】
前記検出は、前記試料内の点がサブ観察体積を通過するのにかかる時間と同じ程度、又はより短い検出システム上昇時間を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料ホルダは円筒状であり、撮像される前記試料は、前記円筒状試料ホルダの側面に配置される請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の少なくとも１つの行に配置される請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記サブ観察体積の少なくとも１つの行に沿って描かれた仮想線と、前記行の前記サブ観察の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとの間の角度は、０より大きい、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の平面格子に配置される請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記サブ観察体積の格子の仮想平面の前記法線ベクトルと、前記行の前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の前記運動ベクトルとは、非直交である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
検出はガイガーモードでのアバランシェフォトダイオード検出器、好ましくはガイガーモードで作動するゲートアバランシェフォトダイオード検出器を使用して行う請求項２０から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が、回転中に前記試料ホルダの回転軸からほぼ一定の半径方向距離に配置される前記請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は、１〜１００ｍ／ｓ、好ましくは５〜５０ｍ／ｓ、より好ましくは１０〜３０ｍ／ｓの範囲内の速度で前記サブ観察体積に対して回転させる、請求項２０から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料と、前記サブ観察体積の配列との間の相対的、接線的、及び／又は半径方向の位置を、前記試料ホルダの回転ラップごとに少なくとも１回測定して、検出された信号を前記試料内の前記対応する絶対位置と相関させる手段をさらに備える請求項２０から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料は、回転中、前記円筒状試料ホルダの前記回転軸に沿って搬送される請求項２２から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
回転中に、前記円筒状試料ホルダの前記外向き面に液体層を広げることをさらに含む請求項２２から３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に無機物を排除しない有機物から、及びこの物質における化学的、生化学的若しくは生物学的反応、相互作用、経路又は配列からのデータを検出、監視、画像化、及び読み出す方法及び装置を提供する。特に本発明は、例えば、生存細胞を含む細胞、生体組織、及び有機物を含有する溶液中において、高スループットかつ低い試料単位コストで三次元の高空間分解能で前記物質を研究するための方法及びデバイスを提供する。具体的に目的とするさらなるアプリケーションは、生存細胞を含む細胞中、又は溶液中のＤＮＡとＲＮＡ関連の活動を監視する可能性である。
【背景技術】
【０００２】
生物学的試料を画像化するための方法及びデバイスは過剰と言えるほど存在する。これらは主に、１９５７年マービン・ミンスキーによって特許を取得された共焦点顕微鏡法の変形である。共焦点顕微鏡法の普及は、従来の広視野顕微鏡法で達成可能なものと同程度の三次元の高分解能と、よりよいコントラストを可能にする切り出し能力を有することによるものである。共焦点顕微鏡法は、特定の粒子、例えば、タンパク質類が蛍光でマークされ、したがって背景から識別可能とする蛍光分光法と組み合わせられることが多い。
【０００３】
ほとんどの共焦点顕微鏡では、同じ光学系（少なくとも同じ対物レンズ）は、研究中の試料からの光を照射／励起するためと、観察／検出するための両方に使用される。この構成の利点は、古典的な広視野顕微鏡の設計を模倣することであり、したがって、より多くの場合には同一の光学部品を使用することができることである。別の利点は、照明と検出が自動的に整列されることである。さらなる利点は、試料面に対して垂直な視野軸線を用いて照明及び観察することによって、Ｎ．Ａは、全反射のような問題を引き起こさずに大きくできることである。
【０００４】
しかし、従来の共焦点顕微鏡のこの幾何学的形状は、対処可能な応用のスペクトルが制限されるという弱点と妥協を有する。
【０００５】
共焦点顕微鏡では、出射光が検出器に到達するのを許容する体積（観察体積）を制限することによって、分解能、すなわち２つの識別可能な照射点間の距離が得られる。観察体積の制限は、２つの方法を組み合わせることによって達成される。すなわち、顕微鏡の照射（又は視野に相当する）軸線に直交する次元では、観察体積の範囲は対物レンズの焦点面内の焦点距離によって決定される。対物レンズの照明軸（視野軸）線に沿った寸法では、検出器の正面にある光学共役面に配置されたピンホールの幅によって観察体積を決定する。このピンホールは、照明軸線の方向に沿って焦点面から特定の距離だけ外側にある点から放出される光をブロックできるだけの大きさに形成される。このように、焦点幅が非常に小さく、正確に位置決めされた小さなピンホールを有する対物レンズを選択することによって、３つの寸法すべてで非常に高分解能を得ることができる。ピンホールを使用することによる更なる利点は、観察体積の外側にある試料の照射された部分から放出される散乱光又は蛍光光が検出器に到達しないため、コントラストが高まることである。
【０００６】
しかし、実際には、これは重大なトレードオフを示唆する。つまり、焦点面の外部から放出される光をフィルタで除去するために使用されるピンホールは、その時点では、焦点面内の１点以上の像を結像する目標に限定する。したがって、画像を得るためには、試料と観察体積を互いに移動（走査）する必要がある。ドットとドット及び１０２４×１０２４フレームによって合成された画像は、達成するために１秒以上かかる可能性がある。このことは、撮像を並列化して高スループットを達成できる可能性を複雑化することになる。
【０００７】
上述のように、従来の共焦点顕微鏡での観察体積は、ピンホール法と小さな焦点幅とを組み合わせることによって決定される。三次元空間に観察体積を作成するもう１つの方法は、いわゆる、Stelzer, EHK等による、Opt.Commun.111、536〜547（１９９４年）「Fundamental reduction in the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy（照明軸線と直交する検出による遠視野光顕微鏡における観察体積の基本的な減少：共焦点シータ顕微鏡）」の共焦点シータ顕微鏡を使用することである。この技術では、代わりに、観察体積は、その視野の軸線が直交するように配置され、それらの焦点面が交差するように配置された２つの対物レンズを使用することによって決定される。したがって、観察体積は、１つの方向における１つの検出器の焦点幅及び直交する第２の方向における第２の検出器の焦点幅によって制限される。この場合の照明は、関心のある観察体積を照射する限り、任意とすることができる。
【０００８】
観察体積の観点から、シータ共焦点顕微鏡によりピンホールの必要性が排除される。しかし、コントラストの観点からすると、検出器のいずれかに到達する観察体積の外部から放出される光を抑制するために、ピンホールは必要である。
【０００９】
共焦点顕微鏡は本質的に点毎の測定デバイスであるため、試料の像は、研究中のどの試料を含むものであれ、試料体積を顕微鏡の対物レンズと検出器の前のピンホールとによって規定された観察体積に対して移動させて、各点の強度の値を測定することによって形成される。この動作は、二次元（ｘ−ｙ）像全体が収集されるまで継続され、時間の経過とともに一連の像を生成するプロセスが繰り返される。さらに、観察体積は、光学セクションの三次元（ｘ，ｙ及びｚ）像積層体を取得するために、顕微鏡軸線に沿って段階を付けることもできる。この値のベクトルを用いると、三次元の画像を合成することができ、通常はスクリーン上にトモグラフィ的に表示される。
【００１０】
共焦点顕微鏡の初期バージョンでは、試料は、画像ベクトルが生成されるまで、試料を系統的に三次元で動かす高精度の移動ステージ上に配置される。高いフレームレートを達成するには、試料は、サブマイクロメートル精度を維持しつつ、高速で予めプログラムされた経路に沿って移動されなければならない。試料ホルダ及びステージをまとまりとして急加速するため、困難で高価なタスクである。
【００１１】
高いフレームレートを達成するためのもう１つのアプローチは、レーザ走査共焦点顕微鏡である。試料を移動させる代わりに、励起光ビームを拡張し、試料体積を横切って集束ビームをラスタ走査する一対の振動ガルバノメータ走査ミラーへと向ける。試料からの光は、同じミラーセットを通してデスキャンされ、検出器に到達する前に共役（共焦点）ピンホールを通過する。走査速度は、通常は画像点当たり約４〜５マイクロ秒の速度で走査する最速ミラーの機械的仕様によって制限される（画素又は三次元空間ではボクセルと称することもある）。したがって、一秒で収集された５１２×５１２ピクセルの場合、走査スポットは、約４マイクロ秒の間、各ピクセル上に存在する。ここでも、ミラーを迅速に加速し、フィールドを横切らせながら一定速度を保持し、その後、走査中に一定速度で保持し、急減速及び逆走行させ、各走査ラインに対してのサイクルを繰り返すことから、より高いレートを得ることは不可能ではないにせよ、非常に困難である。
【００１２】
試料を高速スキャンするためのもう１つの方法は、（Ｎｉｐｋｏｗ）スピニングディスク法である。この共焦点顕微鏡は、ディスクの１回転中に試料体積を覆うように設計された螺旋状パターンに配列された１つ以上のピンホール配列を有する円形の回転ディスクに基づいている。ディスクを回転させるための加速度は必要ないので、この構成は定常状態では機械的に非常に安定している。この方法のもう１つの利点は、スピニングディスクのピンホールにも関わらず、いくつかの点（画素）を平行に見ることができる点である。高速と非常に高いフレームレートとを並列化する能力との組み合わせは、毎秒１０００フレームを超えるこの技法を使用して達成する。しかし、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、そのアーチファクトがないわけではない。１つの制限は、焦点面の外側から光、散乱又は放出された光が、隣接するピンホールを通って移動することによって検出器に到達することができるという、いわゆるピンホールクロストークである。第２の制限は、ディスクのピンホールを通過する光の割合が低い（しばしば１０％未満である）ことである。光の残りは反射され、検出器内のバックグラウンドノイズとして現れることがある。これらの副作用は共に、信号対ノイズ比を制限する。スピニングディスク法による第３の制限は、通常、画像を収集するために使用される検出器が、電荷結合デバイス又はＣＭＯＳセンサのいずれかであることである。そのようなデバイスの積分時間はミリ秒程度であるので、この種のデバイスに固有の暗電流は、前記積分時間ビルドアップノイズレベルを超えて、単一光子を検出することは実質的に不可能である。
【００１３】
Ｇｒａｔｔｏｎら（米国特許第７９７３２９４号明細書）は、観察体積を通して試料体積を移動させることを提案している。試料体積を中心にｘ−ｙ−ｚ変換ステージを移動させるのではなく、試料は回転する容器内に配置される。したがって、非常に大きな試料体積は、必要とされる最小限の加速度で共焦点顕微鏡の観察体積を通過することができる。定常状態では、回転ステージの摩擦のみを克服しなければならず、また、容器は試料体積のすべての部分にアクセスするために他の方向にゆっくりと移動させることもできる。しかし、Ｇｒａｔｔｏｎらは、液体中で分解された粒子を含有するキュベットを使用した。したがって、粒子は移動しており、この場合、サブマイクロメートル精度を維持することは不可能である。
【００１４】
広い領域にわたって高いフレームレート（高スループット）、三次元の高空間分解能、高感度を有し、許容可能なコストレベルである、主に微生物学的に関連する物質の研究、試験などを可能にする技術が依然として必要とされている。これらの要件を同時に満たすことができる技術的方法はいずれも存在しない。
【発明の概要】
【００１５】
本開示の目的は、先行技術の撮像技術に関連する欠点の少なくともいくつかを軽減することである。
【００１６】
本開示の目的は、本発明に基づく方法及び装置が、充分に資金を得た研究室から、例えば、ポイントオブケア用途において、より一般的な用途に移行することを可能にするコストレベルで、三次元における高いフレームレート及び高空間分解能を有する、主として微生物学的に関連する物質の研究、試験などを可能にすることである。
【００１７】
本開示によると、上記の目的及び目標は、試料体積が観察体積を通して搬送される方法、前記観察体積をどのように規定するか、及び試料からの散乱又は蛍光光をどのように収集し検出するかという新しい組合せによって満たされる。
【００１８】
本明細書に例示される態様によれば、試料を撮像するための装置が提供され、前記装置は、
前記試料を、線焦点又は焦点の配列で同時に照明するための照明手段と、
試料から放出され又は散乱された光子を、視野の配列の中で同時に検出するための検出手段と、を備え、
ここで撮像中の光子が放出されるか又は散乱される試料中のサブ観察体積(sub-observation volumes)の配列は、照明手段からの線焦点又は焦点の配列が検出手段の対応する視野の配列と重なる空間における体積によって規定され、
前記装置は、前記試料をその面に保持するように構成された試料ホルダを備え、前記試料ホルダを回転させることによって、前記試料の少なくとも一部が前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送されるように、前記試料ホルダは回転可能に配置されることを特徴とする。
【００１９】
多くの適用では、高スループットやフレームレートが非常に望ましい。例えば、スクリーニング用途や生化学反応の動力学が研究されている場合などである。本発明の１つの目標とされる適用は、生存細胞を含む細胞の生化学を研究することができることである。生存細胞は非常に複雑なシステムであるため、特定のタンパク質−タンパク質相互作用のような特定の事象を識別することは非常に困難な課題である。このような事象を可視化するために、注目されるタンパク質は、別の波長で光によって励起されるときに特定の波長で光を放出するフルオロフォアでマークされる。特定の波長又は波長だけを検出器に到達させるためのフィルタを使用することによって、顕微鏡によって生成された画像は、元の励起光の代わりに蛍光光から構成される。このようにして、マークされたタンパク質だけが画像中に現れる。
【００２０】
理想的には、フルオロフォアは、励起することができ、無限数の蛍光を発することができるべきである。残念なことに、フルオロフォアの励起は必ずしも所望の蛍光の発現に終わるわけではない。ある程度の可能性はあるが、代わりに励起分子は暗状態（例えば、いわゆる三重項状態）に終わる。これは、分子の基底状態への還元（いわゆる光退色）を無効にするか、あるいは著しく遅らせることができる。三重項状態へ移行すると、分子はその環境に毒性を示す。光退色及び毒性を回避するために、フルオロフォアの励起を最小限に保持することが非常に好ましい。同時に、実際の応用における蛍光光の量は、通常非常に低い。これは、光学系、検出器、及び検出手段の信号処理に対して非常に高い要求を課す。この点から重要なパラメータはいわゆる滞留時間である。滞留時間は、試料（標本）の同じ部分が照明されたボクセル内で「滞留する」時間と規定される。高い信号対ノイズ比を得るためには、機器の滞留時間は、少なくとも一桁のフルオロフォアの寿命を超えることが望ましい。このようにして、フルオロフォアは、検出手段の積分時間の間、励起されることができ、何度も蛍光を発することができる。
【００２１】
本発明の装置は、好ましくは光源、ビームスプリッタ及び対物レンズを含むレンズ配置を含む照明手段を有する共焦点顕微鏡配置と、１つ以上のピンホールを含む検出手段とを備えることが好ましい。
【００２２】
本発明の観察体積は、従来の共焦点顕微鏡と類似した方法で規定されるが、観察体積の配列が、照明手段の線焦点又は焦点の配列が検出手段の対応する視野の配列と重なる空間の体積によって規定されるという非常に重要な差を有する。各サブ観察体積は、ピンホール配列の別々のピンホールを介して検出器で別々に観察され、前記ピンホールは、照明／視野軸線と平行な寸法のサブ観察体積を規定する。以下では、サブ観察体積を体積ピクセル又はボクセルとして参照することがある。
【００２３】
調査中の試料又は標本は、試料ホルダ内又は上に配置され、次に試料ホルダが回転生成器官に結合されて、試料が回転し、きちんと定められた軌道に沿ってサブ観察体積を通過できるようにする。観察体積を通して試料を移動させる手段として回転を選択する理由は、試料は、その後、回転による完全にバランスがとれた力、すなわち遠心力と、試料ホルダからの付着又は試料ホルダからの正常力のいずれかによる向心力とに供されることがある。このことにより、非常に滑らかで、きちんと定められた軌道、サブ観察体積と比較して試料の非常に速い速度を維持する能力、及び非常に大きな試料領域／体積を画像化する能力が可能となる。回転生成器官は、好ましくは、サブ観察体積に対して、１〜１００ｍ／ｓ、好ましくは５〜５０ｍ／ｓ、より好ましくは１０〜３０ｍ／ｓの範囲内の速度で試料を回転させるように構成される。
【００２４】
実施形態によれば、検出手段は、各サブ観察体積からの光を空間的にフィルタリングするためのピンホール又は任意の光ファイバの配列を含む検出システムと、光を検出器に送るファイバ束、例えばガイガーモードで動作するアバランシェフォトダイオードの配列と、検出器からの信号を処理するための信号処理ユニットとを含むことが好ましい。
【００２５】
検出手段は、試料中の点がサブ観察体積を通過するのにかかる時間と等しい又はそれより短い検出システム上昇時間を用いて時間分解されてもよい。好ましくは、検出手段は、試料内の点がサブ観察を通過するのにかかる時間と同じ程度、又はより短い検出システム上昇時間を有する。
【００２６】
「上昇時間」は、検出器又は検出システムの応答速度の広く使用されている測定値である。「上昇時間」とは、概して、検出器出力パルス又は信号が、パルス又は信号の振幅の特定値から別の値まで、しばしばパルス又は信号の振幅の１０％から９０％まで増加するために必要とされる時間を意味する。本明細書で使用される場合、「上昇時間」という用語は、表示された負の(negative)ステップが場合によっては「降下時間」と呼ばれる場合もあるが、正の（positive）又は負の(negative)ステップ応答の両方に適用される。したがって、ここでの「上昇時間」は、「上昇時間又は降下時間」と置換えてもよい。
【００２７】
本開示の検出手段又は検出システムの上昇時間は、検出器への入射強度の急激な上昇に応答して、信号が初期値の１０％から最終値の９０％に達するまでに要する時間と規定される。検出速度のもう１つの測定は検出システムの帯域幅であり、これは検出システム上昇時間０．３５の逆数に相当する。
【００２８】
試料は、サブ観察体積の配列を通して動くため、試料が滞留できる時間は限られた時間であり、サブ観察体積内に限られた滞留時間だけ滞留する。試料の一部が照明される前記サブ観察体積では、前記照明は散乱、蛍光又は等価現象を引き起こす。その光の一部は、後に検出手段によって捕捉され、特定のサブ観察体積からの光が検出された時間は試料中の特定の位置に対応する。したがって、充分に迅速に時間分解検出を有することによって、また、興味のある試料の全ての部分を、少なくとも１回はサブ観察体積を通すことによって、試料の興味深い部分の完全な画像を、回折限界分解能に近いところで得ることができる。
【００２９】
検出手段の検出システム上昇時間は、好ましくは、試料の一部がサブ観察体積を通過する時間、即ち滞留時間、又はより短い時間と同様に短い時間として選択される。
【００３０】
通常、検出手段は、１００ｎｓ以下、例えば５０ｎｓ以下、又は３０ｎｓ以下の検出システム上昇時間を有する。好ましくは、検出手段は１０ｎｓ以下の検出システム上昇時間を有する。
【００３１】
最大上昇時間は、好ましくは、回折限界空間分解能を得ることを可能にする。
【００３２】
しかし、特定の位置におけるフルオロフォアの有無のみが測定される用途では、少ない光子をカウントすることは、シグナル処理の観点から見ると、上昇時間がさらに短く、通常、一桁短い時間であるという点で好ましい。その理由は、電子回路の計数は側面が急であるほど簡単であるからである。よって、いくつかの実施形態では、検出手段は、５ｎｓ以下、例えば１ｎｓ以下、又は０．５ｎｓ以下の検出システム上昇時間を有する。
【００３３】
通常、１つ又は数個の光子が、サブ観察体積から検出器に到達することになる。これは、検出手段が高速である必要があるだけでなく、高感度であることを意味する。このことは、ガイガーモードでアバランシェフォトダイオードを使用することによって達成されることが好ましい。このような検出器は、非常に高い増幅を有し、高い帯域幅を有するように設計することができる。通常は、帯域幅は１０ＭＨｚから１００ＭＨｚの間である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、検出手段はガイガーモードでのアバランシェフォトダイオード検出器、好ましくはガイガーモードでのゲートアバランシェフォトダイオード検出器を含む。
【００３５】
また、運動の回転モードを実際に利用し、同時に試料の広い領域を撮像することができるようにするために、試料は、試料ホルダの回転軸線から一定半径で規定された面の近くに配置される。したがって、試料ホルダは円筒状であることが好ましい。
【００３６】
したがって、いくつかの実施形態では、装置は、試料をその側面に保持するように構成された円筒状試料ホルダを含み、前記円筒状試料ホルダは、撮像中に円筒状試料ホルダを回転させることによって、前記試料の少なくとも一部が前記サブ観察体積の少なくとも１つを通して搬送されるように回転可能に配置される。通常、円筒状試料ホルダは、５〜３０ｃｍの範囲内、例えば約１０ｃｍの円周を有していてもよい。円筒状試料ホルダは、概して、１〜５０ｃｍの範囲内の高さ（すなわち、側面の幅）を有していてもよいが、より小さい、ならびに大きい円筒も考えられる。いくつかの好ましい実施形態では、円筒状試料ホルダは、５〜２０ｃｍの範囲内の高さ（例えば、５〜１５ｃｍの範囲）を有する。
【００３７】
本発明の実施形態では、サブ観察体積は顕微鏡対物に対して固定され、その運動は、これらの固定されたサブ観察体積に対して試料を回転させることによって達成される。例えば、３０ＭＨｚの帯域幅を有する高速検出器を有し、約１０ｎｓの検出器上昇時間に対応して、２０ｍ／ｓの速度で回転によって試料を変換することにより、従来技術の現状と比較して、１０００倍の数の画像点が可能となり、ガイガーモードにおける単一のアバランチ写真検出器（ＡＰＤ）で達成することができる。Ｍ個の検出器を用いて、毎秒Ｍ個の画像点のさらなるファクタが可能である。したがって、運動の手段としての回転を含む本発明は、デバイスのスループットを劇的に増加させることができる。
【００３８】
より広い面積／体積に対応するために、複数の焦点は、好ましくは、線形配列、又は好ましくは二次元配列のいずれかの等距離焦点の配列として配置される。２つの後続の焦点間の距離は、好ましくは、個々の焦点の幅よりもはるかに大きい。次いで、試料の運動の軌跡（運動ベクトル）を選択して、調査中の試料の関連する各部分が、少なくとも１回は、サブ観察体積を通過するようにすることが好ましい。これは、配列内のサブ観察体積の１つのそのような行に沿って描かれた仮想線と試料の運動ベクトルとの間に、適切な角度を選択することによって達成される二次元である。第３の次元では、これは、好ましくは、サブ観察体積の配列を通して描画される仮想平面の法線ベクトルに対して垂直でない観察体積を通して搬送されつつ試料の運動ベクトルを選択することによって達成できる。行と列間の距離は必ずしも同じである必要はないことを付け加えておこう。
【００３９】
いくつかの実施形態において、前記サブ観察体積の配列は、好ましくは、等距離の観察体積の少なくとも１つの行に配置される。サブ観察体積の前記少なくとも１行に沿って描かれた仮想線と、行のサブ観察の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとの間の角度は、好ましくは０より大きい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記サブ観察体積の配列は、好ましくは、等距離の観察体積の平面格子に配置される。好ましくは、前記サブ観察体積の格子の仮想平面の法線ベクトルと、行の前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとは、非直交であることが好ましい。
【００４１】
照明手段は、１つ以上の光源、好ましくは１つ以上のレーザダイオードを含んでいてもよい。照明手段は、例えば、焦点の配列内で前記試料を同時に照明するためのマイクロレンズ配列を備えていてもよい。
【００４２】
最適な撮像性能を得るためには、試料軌道の精度が重要なパラメータであり、その回転がどのように生成され維持されるかには特に注意が必要である。最先端のボール軸受は、例えば充分でないことがある。その代わりに、空気軸受が好ましい解決法である。いくつかの実施形態において、試料は、回転中に試料ホルダの回転軸からほぼ一定の半径方向距離に配置される。いくつかの実施形態において、試料ホルダは、空気軸受によって吊り下げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、装置は、試料と、サブ観察体積の配列との間の相対的、接線的、及び／又は半径方向の位置を試料ホルダの回転ラップごとに少なくとも１回測定して検出された信号を試料内の対応する絶対位置と相関させる手段をさらに備える。時間の関数として、サブ観察体積の配列に対する試料の正確な位置を知ることは、興味深いこともある。連続したラップだけでなく、単一のラップにも適用できる。精度は、好ましくは０．１μｍ程度であることが望ましい。回転運動は、サブ観察体積を全体に亘り、試料の軌道を非常に滑らかにできるという明確な利点を有する。しかし、精密空気軸受であっても、上記の位置精度を満たすのに充分な滑らかな動きを得ることができないことがある。まさにその理由のため、試料とサブ観察体積の配列との相対位置を測定する手段を導入し、このデータを用いて、検出手段で生成された信号をマッピングして、空間及び時間の関数として試料中の正しい位置に相関させるのが有用である。これは、精度を徐々に増加させていくつかの段階で達成されることが好ましい。第一のステップは、回転試料ホルダと固定照明システムとの相対的な角度位置を測定することである。このデータを双方とも使用して、検出手段信号を正しい角度位置にマッピングするために必要な補正信号を生成し、試料ホルダの角速度を調整することができる。第２のステップは、理想的な位置から試料ホルダの回転軸の位置における半径方向の偏差を測定し、そのデータを使用して、検出信号を半径方向寸法内の正しい位置にマッピングするために必要な補正信号を生成することである。そして、ラップ間の画像を比較することによって、マッピングをさらに改善するために第３の補正信号を生成することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、円筒状試料ホルダは、その試料ホルダの回転軸に沿って移動可能に配置され、回転中に試料ホルダと試料が試料ホルダの回転軸に沿って搬送される。サブ観察体積配列を、顕微鏡の視野全体にわたって均一に分布させ、上述のように運動により配置することにより、ラップごとに２５０μｍ幅のストリップを撮像することが可能となる。試料ホルダを回転軸に沿って徐々に平行移動させ、５０Ｈｚの回転周波数を使用することにより、１０平方センチメートルほどの範囲の面積を毎秒画像化することができる。これにより、例えば病理学用途のための大きな組織試料の、前例のない撮像及び分析が可能になる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、円筒状試料ホルダは、試料容器ホルダと、試料容器ホルダに巻き付けられて取り付けられるように構成された取り外し可能な板状試料容器とを備える。いくつかの実施形態において、円筒状試料ホルダは、試料を保持するための溝、ウェル等を含む。いくつかの実施形態において、円筒状試料ホルダは、試料を含有するために、前記溝、ウェル等を覆う薄いプレート又はフィルムの形態の蓋をさらに含み、前記蓋は、好ましくは、水の屈折率に近い屈折率を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、装置は、回転中に液体層を面に広げるために、円筒状試料ホルダの外向き面の近傍に配置されたコーティングデバイスをさらに含む。いくつかの実施形態において、コーティングデバイスは、顕微鏡対物レンズに取り付けられた顕微鏡スライドによって形成され、ここで、顕微鏡スライドは、円筒状試料ホルダの外向き面の近傍に配置される。
【００４７】
本明細書に例示される他の態様によれば、試料を撮像するための方法が提供され、前記方法は、
ａ）回転可能に配置された試料ホルダの面に撮像される試料を提供することと
ｂ）撮像中に光子が放出又は散乱される前記試料内のサブ観察体積の配列が照明手段からの線焦点又は焦点の配列が前記検出手段の視野の対応する配列と重なる空間の前記体積によって規定されるように前記試料を線焦点又は焦点の配列で同時に照明し、視野の配列内で同時に前記試料から放出又は散乱した光子を検出することと、
ｃ）撮像中に試料ホルダを回転させることによって、前記サブ観察体積の少なくとも１つを通して前記試料の少なくとも一部を搬送すること、を含んでいる。
【００４８】
本方法は、有利なことに、上述の装置で実施することができ、装置に関して記載された特徴及び利点は、本方法にも同様に適用可能である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、前記検出は、試料内の点がサブ観察を通過するのにかかる時間と同じ程度、又はより短い検出システム上昇時間を有する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前記試料ホルダは円筒状であり、撮像される試料は、円筒状試料ホルダの側面に配置される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、試料は、サブ観察体積に対して、１〜１００ｍ／ｓ、好ましくは５〜５０ｍ／ｓ、より好ましくは１０〜３０ｍ／ｓの範囲内の速度でサブ観察体積に対して回転させる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記サブ観察体積の配列は、好ましくは、等距離の観察体積の少なくとも１つの行に配置される。前記サブ観察体積の少なくとも１行に沿って描かれた仮想線と、行のサブ観察の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとの間の角度は、好ましくは０より大きい。
【００５３】
いくつかの実施形態において、前記サブ観察体積の配列は、好ましくは、等距離の観察体積の平面格子に配置される。前記サブ観察体積の格子の仮想平面の法線ベクトルと、行のサブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとは、非直交であることが好ましい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、検出はガイガーモードでのアバランシェフォトダイオード検出器、好ましくはガイガーモードで作動するゲートアバランシェフォトダイオード検出器を使用して行う。
【００５５】
いくつかの実施形態において、試料は、回転中に試料ホルダの回転軸からほぼ一定の半径方向距離に配置される。いくつかの実施形態において、試料ホルダは、空気軸受によって吊り下げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、方法は、試料と、サブ観察体積の配列との間の相対的、接線的、及び／又は半径方向の位置を試料ホルダの回転ラップごとに少なくとも１回測定して検出された信号を試料内の対応する絶対位置と相関させることをさらに備える。
【００５７】
いくつかの実施形態では、試料は、回転中、円筒状試料ホルダの回転軸に沿って搬送される。
【００５８】
試料ホルダ上に配置される試料の厚さは、概ね約２５０μｍであってよく、より典型的には約１５０μｍまで、例えば約１００μｍ又は約５０μｍまでであってもよい。試料ホルダ上に配置された試料の厚さは、概ね１μｍ以上であり、通常５μｍ以上である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、試料は、有機材料を含む。いくつかの実施形態において、試料は、生物学的材料を含む。いくつかの実施形態において、試料は、１つ以上の細胞、例えば生存細胞を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本方法は、回転中に、円筒状試料ホルダの外向き面に液体層を広げることをさらに含む。
【００６１】
本発明の他の態様及び好ましい実施形態は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
以下の詳細な説明では、添付図面を参照することにする。
【図１】図１は本発明の実施形態による装置の一般的なセットアップを概略的に示す。
【図２】図２ａ及び図２ｂは、本発明の実施形態による照明及び検出が、サブ観察体積の配列を協働的に規定する方法を概略的に例示する。
【図３】図３ａ及び図３ｂは、試料をプロービングするための発明的配置の拡大図を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明の一実施形態は、図１に概略的に示されている。
【００６４】
１つ以上の光源１０１、好ましくはレーザダイオードからのコリメートされた（collimated）光ビームは、同じ光ビーム内にダイクロイックビームスプリッタ１０２を介して一体化される。次いで、前記コリメートされたビームは、任意でミラー１０３を介して入射され、マイクロレンズ配列１０４上に、前記マイクロレンズ配列の他方の側の焦点面１０５上に焦点の配列を生成する。焦点距離ｆｔを有する管レンズ１０６は、その焦点面がマイクロレンズ配列１０４の焦点面と一致するように配置される。このようにして、前記管レンズは、異なる角度でコリメートされたビームの対応する配列を生成する。次いで、このコリメートされたビームの配列は、４５度の角度を有する第２のダイクロイックミラー１０７に対して反射され、その後、対物レンズ１０８に入射される。前記対物レンズは、前記対物レンズの開口が管レンズ１０６の焦点面に配置されるように配置されることが好ましい。このようにして、最大光は対物レンズ１０８の開口内に入る。対物レンズを通過する光の通路は、調査中の回転試料１０９が通過する体積内でサブ観察体積を規定する焦点の配列を生成する。サブ観察体積の数は、容易に１００又は１０００に達してもよく、したがって共焦点顕微鏡の大規模な並列化を可能にする。
【００６５】
任意で、試料容器１１０ａと試料容器ホルダ１１０ｂとからなる試料ホルダ１１０上に配置された被照明試料１０９のサブ観察体積からの散乱又は蛍光光は、同じ対物レンズ１０８によって回収され、第２のダイクロイックミラー１０７を介して再びコリメートされて通過する。次に、第２の管レンズ１０６ｂは、各サブ観察体積から検出器１１３に入射する前に光を空間的にフィルタリングしながらピンホール１１１の配列（又は任意で光ファイバ）上に光ファイバ束１１２を介してサブ観察体積の像を生成する。好ましくはアバランシェフォトダイオードの配列はガイガーモードで動作する。検出器１１３からの信号は、信号処理ユニット１１４内で処理される。
【００６６】
照明光を生成するために使用されるレーザダイオードは、用途に応じて連続波モード、又はパルスモードのいずれかで動作させることができる。照明光が蛍光を励起するために使用される場合、パルス光は、時として有利である。さらに、高パワーダイオードレーザを選択することは有益である。しかしながら、このようなレーザは、通常、一方向にマルチモード動作を示す。前記マルチモード動作が画質を劣化させることを回避するために、レーザビームを大径ビームにコリメートすることは、有利である。レーザダイオードのコリメーションは、好ましくは対物レンズによって達成される。大きな直径のビームにコリメートする理由は、レーザの像が前記マイクロレンズ配列の焦点面内のマイクロレンズの回折限界内にあることであり、したがって管レンズによる点源とみなされる。換言すれば、マイクロレンズは空間フィルタとしても機能する。
【００６７】
いわゆるマイクロレンズ配列の機能は、本質的に、後続の管レンズの焦点面内の仮想点源の配列を達成することである。前記機能は、多くの方法で実現できる。１つはマイクロレンズ配列で、基本的には小さなレンズの配列が集積されたプレートを使用することである。別の方法は、共通の焦点面を共有する連続的に配向された円柱レンズの２組のセットを使用することである。このようにして、観察体積内の焦点間の距離を調整することが可能である。
【００６８】
したがって、光学的セットアップは、図２ａ及び２ｂに概略的に示されるように、サブ観察体積（ボクセル）の線形又は二次元配列を作成する。図２ａにおいて、好ましくは等距離観察体積の少なくとも１つの行２０２ａには、サブ観察体積２０１ａの線形配列が配置される。前記サブ観察体積の少なくとも１行に沿って描かれた仮想線２０３ａと、行のサブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトル“ｖｓａｍｐｌｅ”との間の角度”α”は、０より大きい。図２Ｂにおいて、サブ観察体積２０１ｂの二次元配列は、好ましくは等距離の観察体積の平面格子２０２ｂ内に配置される。前記サブ観察体積の格子の仮想平面２０３ｂの法線ベクトル“ｎ”と、行のサブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトル“ｖｓａｍｐｌｅ”とは、非直交である。
【００６９】
試料は、ボクセルの配列を通って移動するので、試料の異なる部分は、異なる時間に観察されるであろう。各ボクセルは、ボクセル（サブ観察体積）自体が対応するよりも、多くの桁数の大きい体積をパンする。したがって、高い帯域幅の時間分解検出器と、調査中の試料の一致した高い移動速度とを組み合わせることによって、試料中の非常に多数の点を画像化又は分析することができる。
【００７０】
上で概説したように、試料は回転によって観察体積を通過させる。この配置は、いくつかの有利な特性を達成するのに役立つ。試料ホルダが所望の回転速度に持ち上げられ、この速度が一定に保たれると、試料に作用する唯一の力は遠心力と、試料が試料ホルダの内側に配置される場合は、ホルダの内壁によって試料に作用する法線力である。試料が試料ホルダの外側に配置される場合、唯一の力は試料と試料ホルダとの間の遠心力及び付着力である。そのような付着力は驚くほど大きく、試料層が薄い限り、３０００ｒｐｍ以上の回転速度は依然として可能である。したがって、試料は、制御された位置で機械的平衡状態に保たれる。さらに、運動の手段としての回転は、精度に関して有利である。技術的な軸受技術の状態を使用し、試料ホルダを注意深くバランスさせることによって、試料の非常に制御された軌道を達成することができる。定常状態では、すなわち一定回転速度では、観察体積を通過する際の試料容器ホルダの位置は、単一ボクセルの大きさ、すなわち検出光の半分の波長の順で良好に制御することができる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、試料ホルダの回転は、以下の配置によって達成される。すなわち通常電気ブラシレスＤＣモータである回転生成器官は、そのロータ軸の角運動量を、好ましくは誘導力又は磁力を介して試料ホルダに伝達して、前記試料ホルダを同じ速度で回転させる。試料ホルダは、好ましくは金属又はガラスで作られており、理想的には中空又は固体の円筒、すなわち管又は棒である。滑らかで正確な回転を可能にするために、前記試料ホルダは、その長さに沿って軸の周りで対称的となるように設計され、製造されることが好ましく、その質量は、軸から全ての半径方向に均一に分布されることが好ましい。
【００７２】
また、軸を中心とした滑らかで反復可能な回転を確保するために、回転する試料ホルダは、好ましくは空気軸受又は電気力学的軸受によって、非接触懸架装置を実現するために位置決めされたまま、前記軸受は、前記回転試料ホルダと内側又は外側固定継ぎ手との間に組み立てられる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、円筒状試料ホルダは、試料を保持するための溝、ウェル等を含む。いくつかの実施形態において、円筒状試料ホルダは、試料を含有するために、前記溝、ウェル等を覆う薄いプレート又はフィルムの形態の蓋をさらに含み、前記蓋は、好ましくは、水の屈折率に近い屈折率を有する。いくつかの実施形態において、試料ホルダは、試料容器ホルダと、取り外し可能な試料容器とから構成される。試料容器は、通常板状であり、試料容器ホルダに巻き付けられて取り付けられるように構成されていてもよい。
【００７４】
試料ホルダの一部は、継ぎ手の外側に伸びて、試料容器の手動又は自動取り付けに直接アクセスするか、又は試料に直接アクセスすることができる。
【００７５】
試料ホルダは、多くの方法で設計することができる。しかし、試料容器は、理想的には、試料容器ホルダに容易に取り付けられ、試料ホルダの重心をオフセットしないように成形され、化学的に不活性であり、試料又は標本の保護を提供し、そして業界の分析の標準的な手順と適合する。
【００７６】
本発明の一実施形態では、試料容器は、板状器官を含む。前記器官の厚さは、故障の危険を冒すことのない器官が、試料容器ホルダの少なくとも一部の外面と同じ半径に曲げられるように選択される。板状器官の片側は、ウェル、溝、隆起又は同様のパターンを備え、そこに試料又は標本を適合させことができる、及び／又は試料を液体で洗浄して分析を行うことができる。
【００７７】
一実施形態では、試料は、回転軸から外側に向かって配置され、試料と試料容器との間の付着力によって所定の位置に保持される。
【００７８】
さらに別の実施形態では、前記板状器官上に、好ましくは不活性ポリマーの光学的に透明な薄いプレート又はフィルムが、板状器官のパターン化された側に蓋として取り付けられ、同じ場所に置かれている試料又は標本を包囲して保護する。蓋のもう１つの機能は、試料が回転のため遠心力によって押し出されるときに試料上に法線力を与える最外層として機能することである。ポリマー蓋の第３の機能は、試料又は標本と試料容器との間の反射を最小限にすることである。一実施形態では、蓋は、水の屈折率（ｅ、ｇ）に近い屈折率を有する材料の中で選択される。別の実施形態では、蓋は、顕微鏡スライド３０２の屈折率と同じ屈折率に近くなるように選択される。
【００７９】
以上より、高分解能撮像を得るためには、照明手段と検出手段の両方の開口数（Ｎ．Ａ．）が大きい方が好ましいことが明らかである。大きいＮ．Ａ．のさらなる利点は、調査中の試料から散乱又は放出された光を捕捉する検出手段の能力を増大させることである。検出する必要がある光のレベルが低いことを考慮すると、特に蛍光分光法の適用方法においては、このことは重要である。しかし、Ｎ．Ａが高いと、照明手段から試料体積へ入射する光と、試料体積から散乱又は放出された光は、回転試料ホルダ面の法線ベクトルに対して大きな角度でそれを可能にすることができなければならないことを意味するため、このことは、問題を引き起こす。これは、結合が何らかの方法で緩和されない限り、反射によって光が失われることを意味する。大きな角度で試料容器と試料容器との結合を容易にする手段を導入するのが好ましい。
【００８０】
光結合手段の一実施形態を図３ａに示す。対物レンズ３０１を離れる光は、前記対物レンズの出口面に屈折率変化を受けることになる。対物レンズは、この屈折率変化による反射及び収差を最小にするように設計することができ、好ましい実施形態では、対物レンズは、ほぼ水の屈折率となるように設計されている。対物レンズの作動距離の範囲内で、顕微鏡スライド３０２、即ちガラスの平坦な部分、石英又は他の透明な材料が対物レンズ３０１に固定される。対物レンズ３０１の出射面とスライド３０２との間の空間には、水の屈折率に近い屈折率を有する液浸油３０３が充填されている。次いで、試料ホルダ３０４の試料容器３０４ａに配置された試料３０５が、スライド３０２に近接して、上述のようにサブ観察体積を通過するように、回転試料ホルダ３０４が配置される。その後、試料の回転中に前記顕微鏡スライドが前記液体層上で摺動可能とするために、水又は水に近い屈折率の液体である液体層３０６で試料を覆う。前記液体層３０６は、試料上に適切な量の前記液体を堆積させることによって達成される。試料の回転により、液滴は分散して、円筒状試料ホルダ３０４を囲むようなストリップ状の層を形成する。前記液体層ストリップがさらに狭くなり、徐々に回転試料から落ちることを避けるために、液体層片を、さらに、コーティングデバイスによって分散し、試料ホルダを囲むようにより幅広で薄い液体片を形成する。前記液体コーティングデバイスは、目的物に取り付けられてもよいし、或いは、前記回転試料の外向き面に近接して配置されていてもよい。好ましい実施形態（図３ａに示されるように）では、液体コーティングデバイスは、対物３０１上に取り付けられた固定スライド３０２から構成される。別の実施形態では、液体コーティングデバイスは、微細ブラシで構成される。
【００８１】
結果として得られる均一な液体層は、対物と試料との間の屈折率整合の役割を果たし、そうでなければ、画像を著しく不鮮明にするような照射光又は検出される所望の光信号のいずれか一方のスプリアス散乱を減少させる。さらに、前記液体層は、試料を乾燥させないようにする。
【００８２】
対物レンズ３０１に取り付けられた固定スライド３０２と試料上の回転液体層３０６との間の摩擦を最小限にするために、水に面するスライド面を、好ましくは、薄い疎水性層３０７、例えば、Ｃｙｔｏｐの層で覆う。顕微鏡スライドはビームのわずかな視差を生ずるが、前記顕微鏡スライドの厚さにマッチした右顕微鏡対物レンズを選択することによって、この顕微鏡スライドを補正することもできる。
【００８３】
別の実施形態では、図３ｂに示されるように、液体層３０６に対向する代わりに、試料３０５は蓋３０８で覆われて、試料を所定の位置に保持する。蓋３０８は、水の屈折率に近い屈折率を有する板で形成され、試料ホルダ３０４の周囲で容易に曲げられるような厚さを有するように形成されることが好ましい。その他の点では、セットアップは図３ａに示したものと同じである。液体層は上述と同様に堆積されるが、ここでは蓋３０８の外面に堆積する。
【００８４】
上述のように、配列中のそのようなサブ観察体積の１つのそのような行に沿って描かれた仮想線と試料の運動ベクトルとの間が適切な角度となるように、サブ観察体積の配列に対する試料の運動軌跡を選択するのが好ましい。したがって、所望であれば、第３の寸法、即ち試料の深さ寸法によると、これは、サブ観察体積の配列を通して描画される仮想平面の法線ベクトルに対して非垂直の適した角度の観察体積を通して搬送されつつ試料の運動ベクトルを選択することによって達成できる。これには、回転試料ホルダの回転軸をサブ観察体積の配列の軸線に対して相対的に回転させることができ、対物レンズの軸線は試料ホルダの法線ベクトルに対して傾斜させることができることが必要である。好ましくは、装置は、これらの角度を調整する手段を含む。
【００８５】
さらに別の実施形態では、深さ寸法は、対物レンズと試料との間の距離を変化させることによってカバーされてもよい。しかし、深さは１つの通路ではカバーできないが、回転の連続したラップで覆われていなければならない。
【００８６】
前述したように、好ましい実施形態では、検出器は、ガイガーモードで動作するアバランシェフォトダイオード検出器（ＡＰＤ）である。ＡＰＤは、ＳＰＡＤ（単一光子アバランシェダイオード）と呼ばれる場合もある。これは、特異性を得るために蛍光マーカーを使用する場合、特に重要である。そのような用途の場合、ボクセル内のフルオロフォアからの光子が検出される化合物の尤度は、むしろ小さい。この可能性を増加させる方法は、滞留時間を増加させること、即ち、フルオロフォアが照射されたボクセル内に存在する時間を増加させることである。こうして、フルオロフォアは励起され、増加された回数の蛍光を発することができ、したがって光子を検出する可能性が高くなる。しかし、上述のように、滞留時間を増加させることによりスループットが減少し、これは、並列化の程度を増加させることによって補償することはできるが、この方法には限界がある。滞留時間を増加させることは、検出手段の積分時間を増加させることを意味しており、これは、増幅段を含む検出器のダークカウントを増加させていることを意味する。実際には、ノイズレベルは積分時間に比例して直線的に増加する。ガイガーモードのＡＰＤは非常に大きな内部増幅（しばしば１０６以上程度となる）を有しており、これは単一光子でさえも強い信号を生成することを意味する。いくつかの実施形態において、滞留時間は約１００ｎｓを選択する。この時間の間に１光子が検出される可能性は約１である。光子が１００ｎｓ以内に到達するのは分かっているため、積分時間はその程度前後であればよい。したがって、積分ノイズは比較的低くなる。１ｋＨｚのフレームレートのスピンディスクの場合、より低い増幅、ピンホールのクロストーク等により、積分時間は、１００００倍の長さである必要がある。したがって、本発明のアプローチは、低い光レベルを有する用途において優れている。
【００８７】
ガイガーモードでＡＰＤを使用することの潜在的な欠点は、検出器に到達する光の量に対して応答が線形でないことである。これは、画像にグレースケールが存在しないことを意味する。各ボクセルは黒又は白である。しかし、これを対象とした適用方法では問題はない。本発明の装置は、分子、フルオロフォアなどがボクセル内に存在するか否かを決定する。
【００８８】
ガイガーモードで実行すると、ＡＰＤはＡＰＤの降伏電圧より高い逆電圧で動作する。結果として、増幅は、６のパワーに対して１０であってもよい。しかし、逆電圧を降伏電圧より数ボルト低くすることによって、増幅の増幅は１未満に低下する。実際、ＡＰＤを動作するガイガーモードでは、信号電流が制限され、素早く減衰する必要がある。その理由は、一度トリガされると、アバランシェの最終電流は流れ続けるため、その後の検出にデバイスを使用できなくするためである。したがって、アバランシェプロセスを停止し、その後、デバイスを静止状態に戻す必要がある。能動電流消光技術及び受動電流消光技術の両方が、この目的のために使用される好ましい実施形態である。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態において、検出される信号は、単一のレーザパルスから生成される。これらの場合、信号はレーザパルス後の明確な間隔でのみ存在するので、この時間間隔でのみ検出器を作動させるのが便利である。さらに、レーザ誘起蛍光の場合、レーザパルスは、信号を完全に消すことができるほど強くなる。ここでも、ダイオードは、レーザパルスの存在下で非アクティブ状態に維持され、その後すぐに再活性化される。この動作モードはゲートモードと呼ばれ、バイアス電圧をブレークダウンの下に維持し、予想される信号到着と一致する明確な期間にわたって所望のレベルに増加させる。
【００９０】
本発明のもう１つの目的は、方法又はデバイスを使用する際にワークフローを単純に維持することである。試料の撮像は、分析において多くの場合、通常一工程で行われる。ほとんどの分析において、画像形成の前に、試料は、増幅、沈殿、洗浄等のような多数の調製手順を経る。工業的用途において、そのような分析は、工程のプロセスの一部を通して試料を効果的に拘束して搬送するための、プレート、ディッシュ、マイクロアレイ、或いはその他のタイプの試料容器を使用する自動化された手順である。前記試料容器は、多くの場合、多数の標的（分析物）及び試薬を多数の組み合わせで試験することができるように、系統的に配置された多数のウェルを含む。多くの研究所では、分析の自動化を考慮した装置の大規模な設置ベースが存在しており、本発明で使用される試料容器がこれらの標準的な手順に固執する場合には、有利である。そのために、本発明の実施形態においては、試料は平面又は板状の試料容器上に配置される。前記試料容器は、好ましくは、試料容器ホルダの曲率又は形状に追従するように、試料容器ホルダに取り付けられるのに充分な可撓性を有する材料又は材料の組み合わせ及び適切な寸法で作られる。このようにして、試料容器が平面形状である場合には、試料容器に標準的な調製手順との互換性を持たせることができ、次に、試料容器ホルダの形状を、本発明の意図に適合するように仮定することができる。
【００９１】
本発明のもう１つの重要な利点は、観察体積内のボクセル又はボクセルのセットからの強度のスナップショット、スポット記録を取ることである。現在の技術とは異なり、試料が観察体積内にある間、強度の時間的プロフィールを記録する必要はない。これは、試料が観察体積を通過する速度が、これまで可能であったものよりも数桁高いことを意味する。（通常回転速度は１００回転／秒、試料の回転速度は数メートルから数１０メートルの数メートルの観察体積を通過する）である。通常、１０ｍ／ｓの高速で観察体積を通して試料・体積を移動させることによって、本発明は、従来の共焦点顕微鏡法などの従来技術の状態と比較して、大きな試料体積のスクリーニングを可能にする。
【００９２】
本発明によって提供される付加的な利点は、検出された信号を受信又は分析するためのパターン認識アルゴリズムを必要としないことである。各ボクセルの位置は時間の関数として知られ、各ボクセルからの光の強度は一時的に検出されるので、生成されるデータは、観察体積を通過した全体積の高解像度三次元マップを表す。
【００９３】
ラップ毎に同じ体積が観察されるような回転の高精度により、セル内の粒子、又は溶液中の粒子の運動を連続的に観察することを可能にする。運動は、ランダム歩行によるもの、向心力によるもの、又は印加された電場によるものであってもよい。試料又は標本に関する非常に重要な情報は、運動データから、特に運動の欠如から推論することができる。
【００９４】
ＣＣＤセンサ又はＣＭＯＳセンサを用いる従来技術の方法と比較して本発明によるさらなる明確な利点は、改良された光パワーバジェットである。低濃度用途で重要なフルオロフォアからの蛍光光子の最大数を得るためには、励起光（照明光）でフルオロフォアを飽和させることが必要であることが多い。これは、励起されたフルオロフォアが光子を放出するとすぐに、再び励起される可能性が高いことを意味している。こうして、フルオロフォアは最大数の光子を放出する。本発明では、検出手段は、その時点で、化合物のサブ観察体積の限定された体積のみを見ることになる。また、これと同じ時間では、照明されるのは前記化合物サブ観察体積のみである。したがって、照明に使用される光源の要求される総パワーは、フルオロフォアを単一のサブ観察体積で飽和させるのに必要な電力であり、これは、使用されるサブ観察体積の数を掛けたものである。１００のサブ観察体積と、サブ観察体積あたり約０．５ｍＷの飽和電力とを有する場合、照明源の電力は、５０％の損失を含む約１ワットである必要がある。撮像の状態では、おそらく１，０００，０００画素ＣＭＯＳ又はＣＣＤセンサを用いて飽和を達成するためには、１ｋＷの電力を必要とするであろう。これは、より高価な光源と複雑な冷却装置を必要とする。
【００９５】
当業者であれば、本発明は本明細書に記載された好ましい実施形態に限定されるわけではないことを認識するであろう。逆に、添付の特許請求の範囲内では、多くの修正及び変形が可能である。さらに、開示された実施形態の変更が、特許請求の範囲に記載した本発明を実施する当業者によって図面、開示及び添付の特許請求の範囲の研究から理解され、実施できよう。クレームでは、「を備える（comprising）」という語は他の要素やステップを排除するものではなく、要素名は複数形を除外しない。ある措置が相互に異なる従属クレームに記載されていても、これらの措置の組み合わせが有利に利用されることができないことを示すものではない。
【図１】
2019508691.tif 000003
【図２】
2019508691.tif 000004
【図３ａ】
2019508691.tif 000005
【図３ｂ】
2019508691.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月23日(2018.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を撮像するための装置であって、前記装置は、
前記試料を、線焦点又は焦点の配列で同時に照明するための照明手段と、
試料から放出され又は散乱された光子を、視野の配列の中で同時に検出するための検出手段とを備え、
ここで撮像中の光子が放出されるか又は散乱される試料中のサブ観察体積（sub-observation volumes）の配列は、照明手段からの線焦点又は焦点の配列が前記検出手段の対応する視野の配列と重なる空間における体積によって規定され、
前記装置は、前記試料をその側面に保持するように構成された円筒状試料ホルダを含み、前記円筒状試料ホルダは、前記円筒状試料ホルダを回転させることによって、前記試料の少なくとも一部が前記サブ観察体積の少なくとも１つを通して搬送されるように回転可能に配置されることを特徴とし、
前記照明手段からの前記線焦点又は焦点の配列の中心軸と、前記検出手段の視野の対応する配列が、実質的に平行であることを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記検出手段は、前記試料内の点がサブ観察体積を通過するのにかかる時間と同じ程度、又はより短い検出システム上昇時間を有する請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の少なくとも１つの行に配置される請求項１から２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４】
前記サブ観察体積の少なくとも１つの行に沿って描かれた仮想線と、前記行の前記サブ観察の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとの間の角度は、０より大きい請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の平面格子に配置される請求項１から２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記サブ観察体積の格子の仮想平面の法線ベクトルと、前記行の前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の前記運動ベクトルとは、非直交である請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記照明手段は、マイクロレンズ配列を備える請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記検出手段がピンホール配列又は光ファイバの配列を含む請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
各サブ観察体積は、前記ピンホール配列又は光ファイバの配列の別々のピンホール又は光ファイバを介して前記検出手段によって観察されるものであり、前記ピンホール又は光ファイバは、前記照明手段の前記線焦点または焦点の配列と平行な寸法の各サブ観察体積を規定する、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記検出手段はガイガーモードでのアバランシェフォトダイオード検出器、好ましくはガイガーモード（Geiger mode）で動作するゲートアバランシェフォトダイオード検出器を含む請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記試料が、回転中に前記試料ホルダの回転軸からほぼ一定の半径方向距離に配置される請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記試料ホルダが空気軸受によって懸架される請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記試料と、前記サブ観察体積の配列との間の相対的、接線的、及び／又は半径方向の位置を、前記試料ホルダの回転ラップごとに少なくとも１回測定して、検出された信号を前記試料内の対応する絶対位置と相関させる手段をさらに備える請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記円筒状試料ホルダは、回転中に前記試料ホルダの回転軸に沿って搬送されるように、前記回転軸に沿って移動可能に配置される請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記円筒状試料ホルダは、試料容器ホルダと、前記試料容器ホルダに巻き付けられて取り付けられるように構成された取り外し可能な板状試料容器とを備える請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記円筒状試料ホルダは、前記試料を保持するための溝、ウェル等を含む請求項１から１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記円筒状試料ホルダは、前記試料を含有するために、前記溝、ウェル等を覆う薄いプレート又はフィルムの形態の蓋をさらに含み、前記蓋は、好ましくは、水の屈折率に近い屈折率を有する請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
さらに、回転中に液体層を面に広げるための、前記円筒状試料ホルダの外向き面の近傍に配置されたコーティングデバイスを含む請求項１から１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記コーティングデバイスは、顕微鏡対物レンズに取り付けられた顕微鏡スライドによって形成され、ここで前記顕微鏡スライドは、前記円筒状試料ホルダの前記外向き面の近傍に配置される請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
試料を撮像する方法であって、
ａ）回転可能に配置された試料ホルダの面に撮像される試料を提供することであって、ここで前記試料ホルダが円筒状であり、撮像される前記試料は、前記円筒状試料ホルダの側面に配置される；
ｂ）撮像中に光子が放出又は散乱される前記試料内のサブ観察体積の配列が、照明手段からの線焦点又は焦点の配列が検出手段の視野の対応する配列と重なる空間における前記体積によって規定されるよう、前記試料を線焦点又は焦点の配列で同時に照明し、視野の配列内で同時に前記試料から放出又は散乱した光子を検出することであって、ここで前記照明手段からの前記線焦点又は焦点の配列の中心軸と、前記検出手段の視野の対応する配列が、実質的に平行である；及び、
ｃ）撮像中に前記試料ホルダを回転させることによって、前記サブ観察体積の少なくとも１つを通して前記試料の少なくとも一部を搬送すること、
を含む方法。
【請求項２１】
前記検出は、前記試料内の点がサブ観察体積を通過するのにかかる時間と同じ程度、又はより短い検出システム上昇時間を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の少なくとも１つの行に配置される請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サブ観察体積の少なくとも１つの行に沿って描かれた仮想線と、前記行の前記サブ観察の少なくとも１つを通って搬送される試料の運動ベクトルとの間の角度は、０より大きい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サブ観察体積の配列は、好ましくは等距離の、観察体積の平面格子に配置される請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記サブ観察体積の格子の仮想平面の前記法線ベクトルと、前記行の前記サブ観察体積の少なくとも１つを通って搬送される試料の前記運動ベクトルとは、非直交である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
検出はガイガーモードでのアバランシェフォトダイオード検出器、好ましくはガイガーモードで作動するゲートアバランシェフォトダイオード検出器を使用して行う請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料が、回転中に前記試料ホルダの回転軸からほぼ一定の半径方向距離に配置される前記請求項２０から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料は、１〜１００ｍ／ｓ、好ましくは５〜５０ｍ／ｓ、より好ましくは１０〜３０ｍ／ｓの範囲内の速度で前記サブ観察体積に対して回転させる、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料と、前記サブ観察体積の配列との間の相対的、接線的、及び／又は半径方向の位置を、前記試料ホルダの回転ラップごとに少なくとも１回測定して、検出された信号を前記試料内の前記対応する絶対位置と相関させる手段をさらに備える請求項２０から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料は、回転中、前記円筒状試料ホルダの前記回転軸に沿って搬送される請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
回転中に、前記円筒状試料ホルダの前記外向き面に液体層を広げることをさらに含む請求項２２から３０のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2019508691.tif 000007
2019508691.tif 000008
2019508691.tif 000009