(57)【要約】  抗腫瘍薬の調製におけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスの使用が開示される。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤として適用できる。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬品キット、及び腫瘍を治療するためのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスの使用が開示される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤の使用であって、前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスである使用。
【請求項２】
前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有し、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質を分解する物質、又はＢｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質は、化合物から選択され、より好ましくは、前記化合物は、（Ｓ）−ゴシポール酢酸、アポゴシポール、Ａ−１１５５４６３、ＡＴ−１０１、ＷＥＨＩ−５３９、ＷＥＨＩ−５３９塩酸塩、ガンボギン酸、Ａ−１２１０４７７、ＡＢＴ−２６３及びＡＢＴ−７３７からなる群より選択される１つ以上であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、又は遺伝子編集若しくは遺伝子ノックアウト材料である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（ａ）少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤と、
（ｂ）少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスと、
を含むキット又は医薬組成物であって、
好ましくは、前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬを阻害する物質であり、好ましくは、前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質を分解する物質、又はＢｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
好ましくは、前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、低分子化合物であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質は、化合物から選択され、
より好ましくは、前記化合物は、（Ｓ）−ゴシポール酢酸、アポゴシポール、Ａ−１１５５４６３、ＡＴ−１０１、ＷＥＨＩ−５３９、ＷＥＨＩ−５３９塩酸塩、ガンボギン酸、Ａ−１２１０４７７、ＡＢＴ−２６３及びＡＢＴ−７３７からなる群より選択される１つ以上であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、又は遺伝子編集若しくは遺伝子ノックアウト材料であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスであり、
好ましくは、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス又はゲタウイルスであり、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有し、
好ましくは、前記組成物は、腫瘍を治療するための組成物であるキット又は医薬組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び前記少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスは、別々の成分として存在する請求項３に記載のキット。
【請求項５】
腫瘍を治療するための医薬品の調製におけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせの使用であって、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスを含み、
好ましくは、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス又はゲタウイルスであり、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有し、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質を分解する物質、又はＢｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質は、化合物から選択され、
より好ましくは、前記化合物は、（Ｓ）−ゴシポール酢酸、アポゴシポール、Ａ−１１５５４６３、ＡＴ−１０１、ＷＥＨＩ−５３９、ＷＥＨＩ−５３９塩酸塩、ガンボギン酸、Ａ−１２１０４７７、ＡＢＴ−２６３及びＡＢＴ−７３７、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される１つであり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、又は遺伝子編集若しくは遺伝子ノックアウト材料である使用。
【請求項６】
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質阻害剤は、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、又はそれらの組み合わせである請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用、組成物又はキット。
【請求項７】
前記少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍ１ウイルス、ゲタウイルス又はそれらの組み合わせであり、
好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、
より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用、組成物又はキット。
【請求項８】
前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり、
好ましくは、前記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんであり、
好ましくは、前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍であり、
より好ましくは、前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用、組成物又はキット。
【請求項９】
前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び前記腫瘍溶解性ウイルスは、０．０１〜１５ｍｇ：１０３〜１０９ＰＦＵ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０４〜１０９ＰＦＵ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０５〜１０９ＰＦＵの割合で用いられ、
より好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０３〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられ、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０４〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられ、
より好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０５〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられ、
より好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７又はそれらの組み合わせであり、
より好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７である、請求項３又は４に記載の組成物／医薬品キット。
【請求項１０】
前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み、
好ましくは、前記組成物は、凍結乾燥粉末、注射剤、調剤、カプセル剤、キット又はパッチ剤の形態である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬを阻害する物質であり、
好ましくは、前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質を分解する物質、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
好ましくは、前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、低分子化合物であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質は、化合物から選択され、
より好ましくは、前記化合物は、（Ｓ）−ゴシポール酢酸、アポゴシポール、Ａ−１１５５４６３、ＡＴ−１０１、ＷＥＨＩ−５３９、ＷＥＨＩ−５３９塩酸塩、ガンボギン酸、Ａ−１２１０４７７、ＡＢＴ−２６３及びＡＢＴ−７３７からなる群より選択される１つ以上であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、又は遺伝子編集若しくは遺伝子ノックアウト材料であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は抗体であり、
好ましくは、前記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、配列番号１−４に記載の核酸のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の核酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスを含み、
好ましくは、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス又はゲタウイルスであり、
前記Ｍ１ウイルスは、遺伝子バンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のゲノムを有し、或いは、遺伝子バンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のゲノムヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるゲノムを有し、
前記ゲタウイルスは、遺伝子バンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムを有し、或いは、遺伝子バンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるゲノムを有し、
前記Ｍ１ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有し、
前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、より好ましくは、前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり、
好ましくは、前記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんであり、
好ましくは、前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍であり、
より好ましくは、前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び前記少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスは、別々に投与される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物医学の分野に属し、抗腫瘍薬の調製におけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍溶解性ウイルスは、非腫瘍細胞に影響を及ぼさずに、標的化の方式で腫瘍細胞に感染してそれを殺す複製可能なウイルスである。腫瘍溶解性ウイルス療法は、革新的な腫瘍標的療法であり、天然の又は遺伝子組み換えウイルス（又はそれらの組み合わせ）を使用して腫瘍細胞に選択的に感染させ、これらのウイルスを腫瘍細胞中で複製させることにより、正常細胞にほとんど又は全く損傷を与えずに、腫瘍細胞を標的として溶解及び殺傷する効果を達成することができる。
【０００３】
腫瘍溶解性ウイルスの一例は、アルファウイルス属に属するＭ１ウイルス（アルファウイルスＭ１）である。Ｍ１ウイルスは、抗腫瘍薬の製造に適用され得る。例えば、中国特許出願Ｎｏ．２０１４１０４２５５１０．３には、Ｍ１ウイルスは正常細胞の生存に影響を与えることなく腫瘍細胞の死を選択的に引き起こすことができることが開示されている。しかし、異なる腫瘍はＭ１ウイルスに対する感受性が異なる。特定の腫瘍に対して、Ｍ１ウイルスは単独で投与する場合に十分な腫瘍溶解効果を発揮することができない。中国特許出願Ｎｏ．２０１４１０４２５５１０．３における、Ｍ１ウイルス及び他のウイルスによる腫瘍の治療についての説明、並びに異なる腫瘍型及び治療レベル／方法論による異なる結果についての説明は、本明細書中に参考として援用される。同出願には、異なる種類の腫瘍に対しるＭ１の治療有効性が異なることが開示されている。具体的には、Ｍ１ウイルスは、膵がん、鼻咽頭がん、前立腺がん及び黒色腫に対する治療効果がもっとも有効であり、大腸がん、肝臓がん、膀胱がん及び乳がんに対する治療効果が低くなり、神経膠腫、子宮頸がん、肺がんの場合には、治療効果がより一層低くなり、胃がんに対する治療効果が最も低いことが記載されている。
【０００４】
腫瘍に対する腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増大させる化合物のスクリーニングは、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍スペクトル及び抗腫瘍強度を増大できる化合物を同定するために進行されている。本発明者によって提出された中国特許ＣＮ２０１５１０９９０７０５．７には、クリソファノールはＭ１ウイルスの抗腫瘍相乗剤として使用され、両者の併用は腫瘍細胞の生存率を３９．６％に減少させることができることが開示されている。しかし、腫瘍溶解性ウイルスを含む治療的組み合わせの開発にはまだ改善の余地がある。本開示の目的は、より良好な抗腫瘍効果を発揮することができる、腫瘍溶解性ウイルスに対する抗腫瘍相乗剤を提供することである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤の使用を提供する。
【０００６】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスがより良い抗腫瘍効果を示すことを可能にする抗腫瘍医薬組成物をさらに提供する。
【０００７】
腫瘍溶解性ウイルスに対して感受性ではない腫瘍に向けられる、腫瘍溶解性ウイルスとの相乗的な薬の組み合わせをさらに提供する。
【０００８】
本発明は、上記の治療的組み合わせの投与を含む、固形腫瘍又は血液系（即ち、血液）腫瘍の治療方法をさらに提供する。
【０００９】
上記の目的は、以下の技術的解決策によって達成される。
【００１０】
研究により、本発明者らは、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤が腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を増強できることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＡＢＴ−２６３及びＭ１ウイルスは、ヒト肝臓細胞株の形態学的病変を顕著に増強することを示す。
【図２】ＡＢＴ−２６３／ＡＢＴ−７３７とＭ１ウイルスの併用処理は、ヒト肝臓がん細胞株の生存率を顕著に減少することを示す。
【図３】Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせの抗腫瘍メカニズムに対する研究を示す。
【図４】ＡＢＴ−２６３及びＭ１ウイルスの併用処理は、ヒト肝臓がん細胞株の移植性腫瘍の増殖を顕著に阻害することを示す。
【符号の説明】
【００１２】
ＡＢＴ−２６３：ＡＢＴ−２６３処理群；  ＡＢＴ−７３７：ＡＢＴ−７３７処理群；  Ｍ１＋ＡＢＴ−２６３：Ｍ１ウイルスとＡＢＴ−２６３の併用処理群；  Ｍ１＋ＡＢＴ−７３７；  Ｍ１ウイルスとＡＢＴ−７３７の併用処理群
【発明を実施するための形態】
【００１３】
用語
他に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単語「又は」は「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子量の値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。「概ね」、「約」、「実質的」などの用語は、説明されている文脈及びパラメータに基づいて当業者人によって理解されるように値／説明を修飾し、理解されるためにさらなるガイダンスが必要とされる場合、５％の値が挙げられ得る。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。用語「含む」は「含有する」ことを意味する。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語の例示に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は「例えば」と同義である。記載されたパーセント配列同一性は、参照配列と同一である、それぞれ所与のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質内の核酸残基又はアミノ酸残基の百分率を指す。
【００１４】
矛盾がある場合は、本明細書（用語の説明を含む）が優先するものとする。さらに、すべての材料、方法、及び実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００１５】
Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性アルファウイルスの抗腫瘍組み合わせ
【００１６】
上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する物質、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質を分解する物質、又はＢｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段である。
【００１７】
Ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子によって発現されるタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質と呼ばれる。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、ミトコンドリア膜透過性変化（ＭＯＭＰ）を制御する進化的に関連するタンパク質である。Ｂｃｌ−２ファミリーは２５の遺伝子からなり、そのうちＢａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ及びＢｏｋなどのいくつかのメンバーはアポトーシスを促進することができる一方、ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗなどのいくつかのメンバーはアポトーシスを防止することができることが知られている。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、アポトーシス経路において重要なタンパク質であり、腫瘍形成及び転移において重要な役割を果たす。ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗを含むＢｃｌ−２ファミリータンパク質ががん細胞中で高度に発現されるため、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質阻害剤は、腫瘍細胞において選択的に抗腫瘍効果を生じることができる。
【００１８】
しかし、全てのＢｃｌ−２ファミリータンパク質阻害剤が腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を相乗的に増強できることを期待することは困難である。
【００１９】
本明細書に記載されるように、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの干渉断片（ｓｉＲＮＡ）を用いてこの２つの遺伝子の発現を阻害することにより、対応するタンパク質の発現を減少させた。結果は、Ｂｃｌ−ｘＬ又はＢｃｌ−ｗ単独の干渉は、非干渉群と同様に、細胞形態の病理学的変化を引き起こさなかった。また、Ｍ１ウイルスの単独使用も細胞形態の病理学的変化を引き起こさなかった。しかし、Ｂｃｌ−ｘＬの干渉とＭ１ウイルスの使用との組み合わせは、顕著な細胞形態の病理学的変化を引き起こした。一方、Ｂｃｌ−ｗの干渉とＭ１ウイルスの使用との組み合わせは、顕著な細胞形態の病理学的変化を引き起こさなかった。さらに、本発明者らは、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ−１９９と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせを用いて腫瘍細胞を処理した結果、腫瘍細胞の生存率に有意差は見られなかった。これは、Ｂｃｌ−２の阻害がＭ１ウイルスの腫瘍溶解効果を増強できないことを示している。
【００２０】
そこで、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性効果は、Ｂｃｌ−ｘＬの阻害のみによって顕著に増強され得ると推測した。この推測を調べるために、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルス、特にＭ１ウイルスとＢｃｌ−ｘｌ阻害活性化合物ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７とを併用して腫瘍細胞を処理した結果、ＡＢＴ-２６３、ＡＢＴ７３７又はそれらの組み合わせは、腫瘍溶解性ウイルスと相乗的に作用することで腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を増強できることを見出した。
【００２１】
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質阻害剤であるＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）は、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｗの阻害剤（それぞれＫｉ≦０．５ｎＭ、≦１ｎＭ、≦１ｎＭ）であるが、Ｍｃｌ−１及びＡ１と弱く結合する。
【００２２】
ＡＢＴ-７３７は、Ｂｃｌ-ｘＬ、Ｂｃｌ-２及びＢｃｌ-ｗに作用するＢＨ３模倣阻害剤（ＥＣ５０は７８．７ｎＭ、３０．３ｎＭ及び１９７．８ｎＭ）であるが、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−Ｂ及びＢｆｌ−１に対して阻害効果を有しない。ＡＢＴ−１９９（ＧＤＣ−０１９９）は、Ｂｃｌ−２の潜在的な選択的阻害剤（Ｋｉは０．０１ｎＭ）であり、Ｂｃｌ−２に対する阻害効果は、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗに対する阻害効果の４，８００倍以上であるが、Ｍｃｌ−１に対して活性を有しない。
【００２３】
本開示は、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤が腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤として適用できることを初めて発見した。
【００２４】
本開示は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤の使用を提供する。
【００２５】
Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、物質（例えば、化合物、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列）、或いはＢｃｌ−ｘＬの遺伝子発現をノックダウン若しくはそれに影響を与えることができるか、又はＢｃｌ−ｘＬのタンパク質量若しくはタンパク質量活性をすることが低減できるツールである。当業者は、阻害化合物、配列又は遺伝的手段を改変、置換及び／又は変更することができる。得られた物質がＢｃｌ−ｘＬを阻害する効果を有すれば、このような物質は本発明のＢｃｌ−ｘＬ阻害剤に該当し、上記の物質、化合物及び手段の等価置換に属する。
【００２６】
上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、（Ｓ）−ゴシポール酢酸（式１）、アポゴシポール（式２）、Ａ−１１５５４６３（式３）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール酢酸）（式４）、ＷＥＨＩ−５３９及びＷＥＨＩ−５３９塩酸塩（式５）、ガンボギン酸（式６）、Ａ−１２１０４７７（式７）、ＡＢＴ−２６３（式８）、ＡＢＴ−７３７（式９）及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する他の化合物を含むが、これらに限定されない。これらの化合物は、化学的分離、合成、又は商業的購入を通じて入手することができるが、これらに限定されない。
【００２７】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害し、本明細書でＢｃｌ−ｘＬ阻害剤として使用可能な他の低分子化合物は、ＢＨ３Ｉ（式１０）、ＢＨ３Ｉ−１（式１１）、ＴＷ−３７（式１２）、２−メトキシ−アンチマイシンＡ３（式１３）、ＢＩ−９７Ｃ１（式１４）、ＡＢＴ−１９９（式１５）、ＢＭ−１１９７（式１６）及びＡ−１３３１８５２（式１７）を含む。さらに、本明細書で使用可能なＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、はＨｅｎｎｅｓｓｙ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２０１６，  ２６：  ２１０５-２１１４；  その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００２８】
本発明の好適な実施形態において、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７又はそれらの組み合わせであり得る。
【００２９】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【００３０】
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【００３１】
【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【００３２】
【化１３】
2019524841.tif 000015
【化１４】
2019524841.tif 000016
【化１５】
2019524841.tif 000017
【００３３】
【化１６】
2019524841.tif 000018
【化１７】
2019524841.tif 000019
【００３４】
Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を阻害するための遺伝的手段をさらに含み得る。上記遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集剤又は遺伝子ノックアウト剤を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、例えば、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を減少又は除去する小さな阻害性核酸分子（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）など）をさらに含む。
【００３６】
このような小さな阻害性核酸分子は、互いにハイブリダイズして１つ以上の二本鎖領域を形成する第１鎖及び第２鎖を含み得る。各鎖の長さは、約１８〜２８個のヌクレオチド、好ましくは約１８〜２３個のヌクレオチド、より好ましくは約１８，１９，２０，２１又は２２個のヌクレオチドである。或いは、ｓｈＲＮＡ分子のように、一本鎖には、互いにハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができる領域を含んでもよい。
【００３７】
このような小さな阻害性核酸分子は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現を減少又は除去する能力を維持しながら修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、安定性、活性及び／又は生物学的利用能などのインビトロ又はインビボの特性を改善するために含まれ得る。例えば、このような小さな阻害性核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子に存在する総ヌクレオチドに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチドを含み得る。このような修飾ヌクレオチドは、例えば、デオキシヌクレオチド、２'−Ｏ−メチルヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、及び／又は２'−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを含み得る。ｓｉＲＮＡなどの小さな阻害性核酸分子は、エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、例えば「５−及び／又は３」−キャップ構造を含んでもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、配列番号１−４に記載の核酸と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の核酸である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記小さな阻害性核酸分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸又はオーバーハングヌクレオチドを含み得る。存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対をもたらすヌクレオチドを含み得る。上記小さな阻害性核酸分子は、例えばリポソームに封入すること、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲルもしくはシクロデキストリンなどの他の担体に組み込むことによって、投与用に製剤化することができる。
【００４０】
本発明の好適な実施形態において、上記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬの干渉ＲＮＡ断片又はＢｃｌ−ｘＬに対する抗体である。いくつかの実施形態において、上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、遺伝子バンク登録番号Ｚ２３１１５（アミノ酸配列又は核酸配列）に記載のＢｃｌ−ｘＬに対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。他の実施形態において、上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、遺伝子バンク登録番号Ｚ２３１１５に記載のＢｃｌ−ｘＬの変異体に対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。変異体Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質は、例えば、遺伝子バンク登録番号Ｚ２３１１５に記載のＢｃｌ−ｘＬタンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一のアミノ酸配列を有することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は抗体である。この抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び／又はＢｃｌ−ｘＬに結合する抗体断片であり得る。上記抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はヒト抗体であってもよい。上記抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、又はＶＬ若しくはＶＨドメインであってもよい。抗体は、例えばタグ、検出可能な標識、又は細胞毒性薬に結合した結合物の形態であり得る。上記抗体は、アイソタイプＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのものであり得る。
【００４２】
上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスである。好ましくは、上記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つである。本明細書に記載の上記アルファウイルス（例えば、Ｍ１ウイルス、ゲタウイルス）は、既存の腫瘍溶解性ウイルスに加えて、自然変異、突然変異（自然、強制又は選択的）、又は遺伝的修飾（例えば、配列の一部の付加、欠失又は置換）を受けたウイルスを含んでもよい。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、上記の変更を受けたウイルスものを含む。好ましくは、上記変化は、該腫瘍溶解性ウイルスが本発明に記載の機能を発揮するのを妨げない。
【００４３】
本開示は、１つ以上のＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスを含む腫瘍を治療するための医薬組成物をさらに提供する。本開示は、１つ以上のＢｃｌ−ｘＬ  阻害剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスを含む腫瘍を治療するための医薬品キットをさらに提供する。上記医薬品キットは、医薬品キットにおいてＢｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスとが混在することではなく、別々の剤形（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤を含む丸剤、カプセル、錠剤又はアンプル、及び腫瘍溶解性ウイルスを含む丸剤、カプセル、錠剤又はアンプル）で提供される点で組成物と異なる。いくつかの実施形態において、上記剤形（腫瘍溶解性ウイルス、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、又は腫瘍溶解性ウイルスとＢｃｌ−ｘＬ阻害剤の組み合わせ）には、１つ以上のアジュバントを含んでもよい。上記アジュバントは、医薬組成物中の薬物の治療効果を促進することができる。上記医薬品キットは、別々の剤形で提供されるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスを含んでもよい。医薬品キットにおけるＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスは、同時に又は任意の順序で投与することができる。例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤を腫瘍溶解性ウイルスの前に投与する場合、腫瘍溶解性ウイルスをＢｃｌ−ｘＬ阻害剤の前に投与する場合、又はＢｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスを同時に投与する場合を含む。様々な実施形態において、患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトであってもよい。
【００４４】
上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、（Ｓ）−ゴシポール酢酸（式１）、アポゴシポール（式２）、Ａ−１１５５４６３（式３）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール酢酸（式４）、ＷＥＨＩ−５３９及びＷＥＨＩ−５３９塩酸塩（式５）、ガンボギン酸（式６）、Ａ−１２１０４７７（式７）、ＡＢＴ−２６３（式８）、ＡＢＴ−７３７（式９）及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質の活性を阻害する他の化合物を含むが、これらに限定されない。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、Ｂｃｌ−ｘＬの遺伝子発現を阻害する手段（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ及び遺伝子編集又は遺伝子ノックアウト材料を含むが、これらに限定さらない）をさらに含む。上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７又はそれらの組み合わせであることが好ましい。
【００４５】
上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスである。好ましくは、上記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される少なくとも１つである。上記組成物又は医薬品キットにおいて、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７と腫瘍溶解性ウイルスとは、０．０１〜１５ｍｇ：１０３〜１０９ＰＦＵ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０４〜１０９ＰＦＵ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ：１０５〜１０９ＰＦＵの割合で使用される。
【００４６】
好ましくは、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０３〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられる。いくつかの実施形態において、１０３〜１０４、１０４〜１０５、１０５〜１０６、１０６〜１０７、１０７〜１０８、又は１０８〜１０９ＰＦＵ／ｋｇのＭＯＩを提供する用量を用いてもよい。いくつかの実施形態において、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０４〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられる。より好ましくは、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０５〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられる。
【００４７】
好ましくは、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０３〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられる。好ましくは、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０４〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられる。より好ましくは、ＡＢＴ−２６３は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩが１０５〜１０９（ＰＦＵ／ｋｇ）の力価で用いられる。
【００４８】
一実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つのアルファウイルスである。
【００４９】
好ましくは、上記腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスからなる群より選択される。Ｍ１ウイルスは、ゲタ様ウイルスに属し、ゲタウイルスとの相同性が発見された関連ウイルスにおいて９７．８％と高いことが報告されている（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ．  ２００７；  ３５  （３）  ：  ５９７−６０３）。
【００５０】
Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスに関するさらに詳しい情報は、中国特許１０４８１４９８４Ａを参照することができる。
【００５１】
本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、既存の腫瘍溶解性ウイルスに加えて、自然変異、突然変異（自然、強制又は選択的）、又は遺伝的修飾（例えば、配列の一部の付加、欠失又は置換）を受けたウイルスを含んでもよい。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、上記の変更を受けたウイルスものを含む。好ましくは、上記変化は、該腫瘍溶解性ウイルスが本発明に記載の機能を発揮するのを妨げない。
【００５２】
上記腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、遺伝子バンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のＭ１ウイルス、又は遺伝子バンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを有するウイルスであり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、２０１４年７月１７日に中国典型培養物保蔵センターに寄託されたＭ１ウイルス（寄託番号：ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３）である。腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３の上記Ｍ１ウイルスのゲノムヌクレオチドとの同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを含んでもよい。
【００５４】
さらに、上記腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子バンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲタウイルスであってもよいか、又は遺伝子バンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを有するウイルスであってもよい。
【００５５】
場合により、単一の腫瘍溶解性ウイルス株が使用される。他の実施形態において、複数の株及び／又は種類の腫瘍溶解性ウイルスが使用される。
【００５６】
様々な実施形態において、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせは、様々な種類の腫瘍の治療に適用できる。適切な腫瘍は、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんであり、好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍であり、より好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである。より好ましい実施形態において、上記腫瘍は、Ｍ１腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍である。
【００５７】
単一のＢｃｌ−ｘＬ阻害剤を使用してもよく、或いはいくつかを組み合わせて同時に又は連続して使用してもよい。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の阻害剤、１つ以上の担体、賦形剤、希釈剤、薬学的に許容される担体、安定剤、緩衝剤、防腐剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤、及び他の添加物を含む組成物の形態であり得る。上記医薬組成物は、経口投与、経皮投与、皮下投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、局所投与などの様々な投与経路で患者に投与することができる。一般的に、上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、経口的、非経口的、静脈内的又は皮下的に患者に投与される。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスと組成物中に混在してもよく、又は別の組成物中に存在してもよい。
【００５８】
本開示は、腫瘍の治療方法にも関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＢｃｌ−ｘＬ阻害剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍を罹患している被験体に投与される。上記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり得る。好ましくは、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんである。より好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍である。より好ましいくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんである。上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、本明細書の腫瘍溶解性ウイルスと同時に投与してもよいか、腫瘍溶解性ウイルスの投与の前後に投与してもよい。さらに、上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、週に１回又は数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）投与することができる。上記Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、１週間又は数週間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、１ヶ月間又は数ヶ月間（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上）投与することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、Ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、又はそれらの組み合わせ）は、注射により投与することができるか、又は錠剤、カプセル剤、パッチ剤、キットなどの形態で投与することができる。いくつかの実施形態において、Ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤は、キットの一部であり得る。他の実施形態において、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせは、注射、好ましくは静脈内注射により投与することができる。
【００６０】
本開示は、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７などのＢｃｌ−ｘＬ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を増強することで、抗腫瘍薬として働く腫瘍溶解性ウイルスの治療有効性を向上させることができることを示す。細胞学的実験により、Ｍ１ウイルスとＢｃｌ−ｘＬ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７）の組み合わせは、腫瘍細胞の形態学的病変を引き起こすことで腫瘍細胞増殖を顕著に阻害できることが実証されている。
【００６１】
いくつかの実施形態において、Ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤（ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７）をＭ１ウイルスと併用してヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂを処理した結果、抗ウイルス化合物ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７とＭ１ウイルスの組み合わせは、腫瘍細胞の形態学的病変を顕著に増加させ、腫瘍細胞の生存率を顕著に低下させることが驚くべきことに発見された。いくつかの例では、腫瘍細胞の形態変化は、細胞の膨張、核凝縮、細胞の断片化、及びアポトーシスを含む。例えば、一実施形態において、（Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤を使用せずに）Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）単独で処理した肝臓がん細胞の生存率は８１．５％であるのに対して、１００ｎＭのＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７とＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）の組み合わせで処理した腫瘍細胞の生存率は２５．２％に急激に減少した。明らかにであるように、Ｍ１ウイルス単独処理の抗腫瘍効果に比べて、Ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３）とＭ１の併用は、腫瘍溶解効果を顕著に改善した。
【００６２】
本発明者が先に提出した中国特許ＣＮ２０１５１０９９０７０５．７には、クリソファノール及びその誘導体は、Ｍ１ウイルスの抗腫瘍相乗剤として用いられること、及び５０μＭのクリソファノールとＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）の組み合わせは、腫瘍細胞の生存率を３９．６％に低下できることが開示されている。しかし、ウイルス−相乗剤併用によるより高い抗腫瘍効果を達成すること、及び／又は、正常細胞に対する影響がより小さいか又はないことを達成することが期待できる。本開示は、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせが腫瘍細胞の生存率を顕著に低下させることを示している。例えば、１００ｎＭのＡＢＴ−２６３とＭ１ウイルスの併用は、腫瘍細胞の生存率を２５．２％に低下させた。クリソファノール及びその誘導体に比べて、本発明に記載のＭ１ウイルスの抗腫瘍相乗剤は、腫瘍細胞に対する殺傷効果を顕著に増大させることができた。さらに、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３）は、クリソファノールの２／１０００の薬学的有効量で用いても、抗腫瘍相乗剤として迅速に作用することができる。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３）処理に係る時間は、クリソファノールの２／３である（クリソファノールによる処理には７２時間が必要であるのに対して、ＡＢＴ−２６３による処理には４８時間が必要である）。
【００６３】
ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７及びＡＢＴ−１９９などのＢｃｌ−２ファミリー阻害剤は、腫瘍細胞における抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗを阻害することにより、抗腫瘍効果を有することが報道されているが、本明細書に示されるように、全てのＢｃｌ−２ファミリー阻害剤が腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を相乗的に増強できるわけではない。Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を相乗的に増強することが期待できない一方、Ｂｃｌ−２阻害剤もＢｃｌ−ｗ阻害剤も腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を相乗的に増強することができない。
【００６４】
本明細書に示されるように、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７）を腫瘍溶解性ウイルスと併用して腫瘍細胞を処理する場合において、腫瘍細胞に対する殺傷効果は、同じ濃度でＢｃｌ−ｘＬ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７）単独を使用する場合の効果よりも高い。例えば、１００ｎＭのＡＢＴ−２６３で腫瘍細胞を処理した場合、腫瘍細胞の生存率は、８８．８％と高い一方、１００ｎＭのＡＢＴ−２６３をＭ１ウイルスと併用して腫瘍細胞を処理した場合、腫瘍細胞の生存率は、２５．２％に急激に減少した。従って、大幅に増強した腫瘍溶解効果は、単なるＡＢＴ−２６３の抗腫瘍メカニズムではなく、ＡＢＴ−２６３とＭ１ウイルスの相乗作用メカニズムに基づくＡＢＴ−２６３とＭ１の併用により生じたものである。
【００６５】
実施例
【００６６】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。本発明の実施形態は、以下の実施例に限定されない。本発明の原理又は精神に従ってなされたあらゆる同等の変更又は修正は、本発明の保護範囲内にあると見なされるべきである。
【００６７】
特に明記しない限り、本発明で使用される材料及び実験方法は従来の材料及び方法である。
【００６８】
実施例１．  ＡＢＴ−２６３及びＭ１ウイルスは、ヒト肝臓がん細胞株の形態学的病変を顕著に増加させる。
【００６９】
材料：
【００７０】
ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣから購入）、Ｍ１ウイルス（ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４２３から取得）、高グルコースＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／ｌグルコース）（から購入Ｃｏｒｎｉｎｇ）、倒立位相差顕微鏡
【００７１】
方法
【００７２】
ａ）細胞培養
ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂを、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ完全培地中で増殖された。全ての細胞株を５％ＣＯ２、３７℃の恒温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）に入れて継代培養した。細胞株の増殖を倒立顕微鏡で観察した。細胞を約２〜３日毎に継代し、対数増殖期にある細胞を正式な実験のために採取した。
【００７３】
ｂ）細胞処理及び形態観察
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）に入れ、細胞懸濁液を調製した。細胞を２．５×１０４／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに接種した。ＡＢＴ−２６３（１００ｎＭ）単独処理、Ｍ１（ＭＯＩ＝０．００１）単独感染、及びＭ１（ＭＯＩ＝０．００１）とＡＢＴ−２６３（１００ｎＭ）の併用処理の４８時間後、Ｍ１ウイルス又はＡＢＴ−２６３で処理しなかった群を対照群として、倒立位相差顕微鏡により細胞の形態変化を観察した。
【００７４】
結果
【００７５】
図１に示すように、位相差顕微鏡により細胞の形態を観察した結果、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、単一層で接着増殖し、同一な表現型で緊密に並んでいた。ＡＢＴ−２６３（１００ｎＭ）及びＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）で処理してから４８時間後、細胞の形態は著しく変化した。対照群、Ｍ１単独処理群及びＡＢＴ−２６３単独処理群の細胞に比べて、併用処理群の生細胞の数は顕著に減少し、生細胞の形態は細胞体が球形に収縮するように著しく変化し、屈折率は顕著に増加した。アポトーシスの病理学的変化は、示されなかった。
【００７６】
実施例２．  ＡＢＴ−２６３又はＡＢＴ−７３７とＭ１ウイルスの併用処理は、ヒトがん細胞株の生存率を顕著に低下させる。
【００７７】
材料
【００７８】
ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト膀胱がん細胞Ｔ２４、ヒト大腸がん細胞ＬｏＶｏ、Ｍ１ウイルス、高グルコースＤＭＥＭ培地及び酵素免疫測定法のための自動マイクロプレートリーダー。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【００７９】
方法
【００８０】
ａ）細胞接種及び投与処理
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））  に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を４×１０３／ウェルの密度で９６ウェル培養プレートに接種した。１２時間後、細胞は壁に完全に付着した。ウェルを対照群、ＡＢＴ−２６３単独処理群、Ｍ１単独感染群、ＡＢＴ−２６３／Ｍ１併用処理群、及びＡＢＴ−７３７／Ｍ１併用処理群に分けた。用量については、Ｍ１ウイルスで細胞に感染し、Ｍ１ウイルスに対して異なる用量勾配を設定した。
【００８１】
ｂ）ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド又はメチルチアゾリルテトラゾリウム）と細胞内のコハク酸デヒドロゲナーゼとの反応
培養４８時間後、２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。インキュベートした後、生細胞中に形成された粒状の青紫色ホルマザン結晶を顕微鏡検査により観察した。
【００８２】
ｃ）細胞内で形成されたホルマザン粒子の溶解
上澄みを注意深く吸い取って捨てた後、１００μｌ／ウェルでＤＭＳＯを加えて形成された結晶を溶解し、マイクロ振動機で５分間振盪した。次いで、酵素結合検出器を用いて５７０ｎｍの波長で各ウェルの光学密度（ＯＤ値）を測定した。実験は各群につき３回繰り返した。細胞の生存率＝薬物処理群のＯＤ値／対照群のＯＤ値×１００％
【００８３】
結果
【００８４】
図２ａに示すように、Ｍ１ウイルス単独での処理は、腫瘍細胞Ｈｅｐ３Ｂに対する比較的低い阻害効果をもたらす（腫瘍細胞の生存率は８１．５％に達する）。１００ｎＭのＡＢＴ−２６３で処理した腫瘍細胞の生存率は、依然として８８．８％と高かった。しかし、腫瘍細胞を１００ｎＭのＡＢＴ−２６３と同じＭＯＩを有するＭ１ウイルスの組み合わせ（ＡＢＴ−２６３＋Ｍ１）で処理した場合、生存率が２５．２％に急激に減少した。同様に、Ｍ１ウイルス単独処理群及びＡＢＴ−２６３単独処理群に比べて、腫瘍細胞を様々な用量のＡＢＴ−２６３のＭ１の組み合わせで処理した場合、生存率が大幅に低下した。ＡＢＴ−７３９／Ｍ１併用処理群で処理した場合にいても、同様の結果が観察された（図２ｂ）。さらに、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤ＡＢＴ−７３７とＭ１の組み合わせも腫瘍細胞Ｔ２４（図２ｃ及びｄ）及びＬｏＶｏ（図２ｅ及び２ｆ）の生存率を顕著に低下させた。
【００８５】
しかし、Ｍ１ウイルス単独処理群及びＢｃｌ−２選択的阻害剤ＡＢＴ−１９９単独処理群に比べて、様々な用量のＡＢＴ−１９９とＭ１の組み合わせで処理した腫瘍細胞は、生存率に有意差を示さなかった。Ｂｃｌ−２の阻害は、Ｍ１ウイルスの腫瘍溶解作用の増大をもたらさないことが示されている（図２ｇ及び２ｈ）。
【００８６】
実施例３．  Ｂｃｌ−ｘＬとＭ１腫瘍溶解性ウイルスの併用による阻害は、抗腫瘍効果を達成した。
【００８７】
材料
【００８８】
実施例１に記載のＭ１ウイルス、ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ、膀胱がん細胞Ｔ２４、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗのＲＮＡ干渉断片、ＭＴＴ（メチルチアゾリルテトラゾリウム）（  ＭＰｂｉｏから購入）、位相差顕微鏡。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【００８９】
干渉断片  （ＳｉＲＮＡ）  ｏｆ  Ｂｃｌ−ｘＬ：
センス鎖（配列番号１）
2019524841.tif 000020
アンチセンス鎖（配列番号２）
2019524841.tif 000021
【００９０】
Ｂｃｌ−ｗの干渉断片  （ＳｉＲＮＡ）：
センス鎖（配列番号３）
2019524841.tif 000022
アンチセンス鎖（配列番号４）
2019524841.tif 000023
【００９１】
方法
【００９２】
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を１ｘ１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種した。２４時間後、リポソームで包まれたＳｉＲＮＡ標的遺伝子断片を加えた。２４時間時間後、細胞をＭ１ウイルスに感染させた。感染して４８時間後、試料を処理した。
【００９３】
（１）位相差顕微鏡を用いて形態変化を観察した。
【００９４】
（２）タンパク質試料を収集し、ウエスタンブロットにより干渉効率、Ｍ１ウイルスタンパク質ＮＳ３及びＥｌを検出した。
【００９５】
（３）ＭＴＴ法により細胞の生存率を計算した。
【００９６】
結果
【００９７】
Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗをそれぞれ干渉した後、ウエスタンブロット検出結果において、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗの遺伝子発現（図３ｂ）は顕著に減少したことが見出された。非干渉群（ＣＴＬ）又は文字化け干渉群（ＮＣ）の処理と比較すると、Ｂｃｌ−ｘＬ干渉又はＢｃｌ−ｗ干渉単独での処理は、細胞形態の病理学的変化を引き起こしなかった。また、Ｍ１ウイルスの単独使用は、細胞形態の病理学的変化を引き起こしなかった。しかし、Ｂｃｌ−ｘＬの干渉とＭ１ウイルスの使用との組み合わせ（ｓｉＢｃｌ−ｘＬ＋Ｍ１）は、顕著な細胞形態の病理学的変化を引き起こした。一方、Ｂｃｌ−ｗの干渉とＭ１ウイルスの使用との組み合わせ（ｓｉＢｃｌ−ｗ＋Ｍ１）は、細胞形態の病理学的変化を引き起こすことができなかった（図３ａ）。ＭＴＴアッセイ（図３ｃ）によるＡＮＯＶＡ分析結果（＊＊＊はｐ＜０．００１を示す）は、試験したＢｃｌ−２メンバーのうち、Ｂｃｌ−ｘｌの干渉とＭ１の使用との組み合わせのみがヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ及び膀胱がん細胞Ｔ２４の生存率を顕著に減少したことを示している。
【００９８】
上記結果は、Ｍ１の腫瘍溶解効果がＢｃｌ−ｘＬを阻害することにより増強されることを示している。しかし、Ｂｃｌ−ｗの阻害は、Ｍ１の腫瘍溶解効果を相乗的に増強することができない。
【００９９】
実施例４．  ＡＢＴ−２６３とＭ１ウイルスの組み合わせは、ヒト肝臓がん細胞株移植性腫瘍の増殖を顕著に阻害する。
【０１００】
材料
【０１０１】
実施例１に記載のＭ１ウイルス、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、大腸がん細胞株ＬｏＶｏ及び４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（南京大学モデル動物研究センター）。細胞及びウイルスは実施例１と同じ供給源に由来する。
【０１０２】
方法
【０１０３】
無作為化単盲検試験を実施した。５×１０６個のＨｅｐ３Ｂ又はＬｏＶｏ細胞を４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背部に皮下注射した。
【０１０４】
腫瘍の大きさが５０ｍｍ３に達した後、マウスを未処理対照群、ＡＢＴ−２６３単独処理群（ｉ．ｐ．  １０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）、Ｍ１単独感染群（Ｍ１ウイルスを２×１０６ＰＦＵ／回で尾静脈注射する）及びＡＢＴ−２６３／Ｍ１（ＡＢＴ−２６３及びＭ１ウイルスを同じ方法及び同じ用量で投与する）併用処理群に分け、及び注射を３回連続して行った（６〜８日目に３回注射した）。腫瘍の重量、長さ及び幅を２日ごとに測定し、腫瘍体積を式：（長さ×幅２）／２に従って計算した。腫瘍体積を測定した後、一元配置分散分析統計を行った。ここで、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【０１０５】
結果
【０１０６】
腫瘍体積を測定するために、２つの腫瘍細胞の移植性腫瘍を有する動物において病理解剖学を行った。結果は、対照群と比較して、ＡＢＴ−２６３単独処理群及びＭ１単独感染群が腫瘍体積のわずかな縮小を引き起こした一方、ＡＢＴ−２６３／Ｍ１併用処理群が腫瘍体積の著しい縮小を引き起こした（図４ｂ及び４ｄ）。一元配置分散分析では、統計的差があることが示された（図４ａ及び４ｃ）。この相乗効果は、特に単一の薬物に対する感受性が低い腫瘍において顕著に増強され、腫瘍体積は驚くべき程度減少した（図４ａ）。
【０１０７】
上記実施例は、本発明の例示的な実施形態にすぎない。本発明の実施形態は、上記実施例に限定されない。本発明の精神及び原理から逸脱することなく他のいかなる変更、修正、置き換え、組み合わせ、及び簡単化は、全て本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
2019524841.tif 000024
【図２ａ−ｆ】
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【図２ｇ−ｈ】
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【図３】
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【図４ａ−ｂ】
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【図４ｃ−ｄ】
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【配列表】
2019524841000001.app
【国際調査報告】
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2019524841.tif 000031
2019524841.tif 000032
2019524841.tif 000033
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