(57)【要約】  エピトープ特異的自己免疫細胞の検出、標的化、および／または排除による自己免疫系疾患の診断、予防および／または治療のための組成物、方法、およびキット。該組成物は、エピトープ特異的自己免疫細胞の検出、標的化、および／または排除を可能とするエピトープおよび薬物の複合体を含む。
2019524884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜性腎症（ＭＮ）患者の治療方法であって、前記方法が：
ＭＮ患者を特定すること；および
ＰＬＡ２Ｒエピトープおよび薬物を含む複合体を患者に投与することであって、前記エピトープがＰＬＡ２Ｒフラグメント内に含まれる、前記投与すること、
を含み、これにより、前記患者の抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞集団を排除または低減する、前記方法。
【請求項２】
前記ＰＬＡ２Ｒエピトープが、配列番号１３で定められた通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号１で定められた通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号２で定められた通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号２で定められた通りであり、配列番号３で定められた配列の少なくとも約５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号４で定められた通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号５で定められた通りである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号５で定められた通りであり、配列番号６で定められた配列の少なくとも約５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物が、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞集団の排除効率が、約７０％〜約１００％の範囲である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体がＴ細胞集団も排除し、前記Ｔ細胞集団が前記抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞集団にＴ細胞ヘルプを提供する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＬＡ２Ｒエピトープおよび薬物を含む複合体であって、前記エピトープが、ＰＬＡ２Ｒフラグメント内に含まれる、前記複合体。
【請求項１３】
前記ＰＬＡ２Ｒエピトープが、配列番号１３で定められた通りである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号１で定められた通りである、請求項１
２に記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号２で定められた通りである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号２で定められた通りであり、配列番号３で定められた配列の少なくとも約５％である、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号４で定められた通りである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１８】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号５で定められた通りである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１９】
前記ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列が、配列番号５で定められた通りであり、配列番号６で定められた配列の少なくとも約５％である、請求項１２に記載の複合体。
【請求項２０】
前記薬物が、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記薬物が、バリン−シトルリンリンカーによりＰＬＡ２Ｒフラグメントと結合している、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞を有する対象への薬物の送達方法であって、前記方法が：
リンカーにより前記薬物と結合されたエピトープを含むエピトープ−薬物複合体（ＥＤＣ）における前記薬物を準備することであって、前記エピトープは前記対象の前記自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞上の受容体により認識され、前記薬物は前記Ｂ細胞が他の細胞を刺激することを阻害する作用を有する、前記準備すること、および
該対象にＥＤＣを皮内または皮下投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞が、前記対象の血液中に循環している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞が、前記対象のリンパ節中にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物が、Ｂ細胞またはＴ細胞を殺す、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬物が、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ−１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、またはカペシタビン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アントラサイクリン系薬剤、オキサリプラチ
ン、またはボルテゾミブからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬物が、前記Ｂ細胞または前記Ｔ細胞からのサイトカインの放出を阻害するかまたは前記Ｂ細胞または前記Ｔ細胞内のサイトカインシグナル伝達を阻害する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬物が、ラパマイシン、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、イマチニブ、テムシロリムス、ソラフェニブ、スニチニブ、ピルフェニドン、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ダサチニブ、サラカチニブ、ボスチニブ、バフェチニブ）、ＭＥＫキナーゼ阻害剤（セルメチニブ、トラメチニブ、およびレファメチニブ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、活動性自己免疫疾患の急性期ではない、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、前記活動性自己免疫疾患の急性期でないように免疫抑制剤を用いて治療された対象である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥＤＣが、１４〜７０ｋＤａの分子量を有する、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
尋常性天疱瘡（ＰＶ）患者の治療方法であって、前記方法が：
ＰＶ患者を特定すること；および
デスモグレイン１またはデスモグレイン３エピトープおよび薬物を含む複合体を前記患者に投与することであって、前記エピトープがデスモグレイン１またはデスモグレイン３フラグメント内に含まれる、前記投与すること、
を含み、これにより、前記患者の抗デスモグレイン１または抗デスモグレイン３自己抗体産生Ｂ細胞集団を排除または低減する、前記方法。
【請求項３３】
前記デスモグレイン１エピトープが、配列番号１６で定められた通りである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記デスモグレイン１フラグメントの配列が、配列番号１６で定められた通りである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記デスモグレイン３エピトープが、配列番号１７で定められた通りである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記デスモグレイン３フラグメントの配列が、配列番号１７で定められた通りである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記薬物が、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗デスモグレイン１自己抗体産生Ｂ細胞集団の排除効率が、約７０％〜約１００％の範囲である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗デスモグレイン３自己抗体産生Ｂ細胞集団の排除効率が、約７０％〜約１００％の範囲である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記複合体がＴ細胞集団も排除し、前記Ｔ細胞集団が前記抗デスモグレイン１自己抗体産生Ｂ細胞集団にＴ細胞ヘルプを提供する、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記複合体がＴ細胞集団も排除し、前記Ｔ細胞集団が前記抗デスモグレイン３自己抗体産生Ｂ細胞集団にＴ細胞ヘルプを提供する、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
薬物およびデスモグレイン１エピトープまたはデスモグレイン３エピトープを含むエピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）であって、前記デスモグレイン１エピトープがデスモグレイン１フラグメント内に含まれ、かつ前記デスモグレイン３エピトープはデスモグレイン３フラグメント内に含まれる、前記エピトープ薬物複合体。
【請求項４３】
前記デスモグレイン１エピトープが、配列番号１６で定められた通りである、請求項４２に記載のエピトープ薬物複合体。
【請求項４４】
前記デスモグレイン１フラグメントの配列が、配列番号１６で定められた通りである、請求項４２に記載のエピトープ薬物複合体。
【請求項４５】
前記デスモグレイン３エピトープが、配列番号１７で定められた通りである、請求項４２に記載のエピトープ薬物複合体。
【請求項４６】
前記デスモグレイン３フラグメントの配列が、配列番号１７で定められた通りである、請求項４２に記載のエピトープ薬物複合体。
【請求項４７】
前記薬物が、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１６年８月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／３７４，３８２号の優先権を主張し、これは参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
電子フォーマットの配列表
本願は、ＥＦＳウェブを介してＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子的配列表と共に出願されている。電子的配列表は、７２，８１０バイトの容量を有し、２０１７年８月１１日に作成、最終保存されたＩＭＷＯ００１ＷＯＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔというファイル名で提出されている。電子的配列表の中の情報は、米国特許法第１．５２（ｅ）条に従って、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【０００３】
本開示は、概して、エピトープ特異的自己免疫細胞の検出、標的化、および／または排除による自己免疫系疾患の診断、予防および／または治療のための組成物、方法、および／またはキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
自己免疫疾患は、Ｔ細胞媒介、Ｂ細胞媒介、またはその双方媒介であり得、臓器および／または組織傷害と関連し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態では、膜性腎症（ＭＮ）患者の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＮ患者の治療方法は、ＭＮ患者を特定すること、およびＰＬＡ２Ｒエピトープおよび薬物を含む複合体を患者に投与することを含み、該エピトープはＰＬＡ２Ｒフラグメント内に含まれ、それにより患者の抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞集団を排除または低減する。
【０００６】
ＭＮ患者の治療方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒエピトープは、配列番号１３で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は、配列番号１で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は、配列番号２で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントは配列番号２で定められた通りであり、配列番号３で定められた配列の少なくとも約５％である。方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントは、配列番号４で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントは、配列番号５で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントは配列番号５で定められた通りであり、配列番号６で定められた配列の少なくとも約５％である。方法のいくつかの実施形態では、薬物は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン（bizelesin
）、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される。方法のいくつかの実施形態では、抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞集団の排除効率は、約７０％〜約１００％の範囲である。方法のいくつかの実施形態では、複合体は、Ｔ細胞集団も排除し、該Ｔ細胞集団は、抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞集団にＴ細胞ヘルプを提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒエピトープを含む複合体および薬物を提供する。複合体のいくつかの実施形態では、エピトープは、ＰＬＡ２Ｒフラグメント内に含まれる。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒエピトープは、配列番号１３で定められた通りである。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は、配列番号１で定められた通りである。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は、配列番号２で定められた通りである。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は配列番号２で定められた通りであり、配列番号３で定められた配列の少なくとも約５％である。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は、配列番号４で定められた通りである。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は、配列番号５で定められた通りである。複合体のいくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒフラグメントの配列は配列番号５で定められた通りであり、配列番号６で定められた配列の少なくとも約５％である。複合体のいくつかの実施形態では、薬物は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される。複合体のいくつかの実施形態では、薬物は、バリン−シトルリンリンカーによりＰＬＡ２Ｒフラグメントと結合している。
【０００８】
自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞を有する対象への薬物の送達方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬物の送達方法は、リンカーにより薬物と結合されたエピトープを含むエピトープ−薬物複合体（ＥＤＣ）において薬物を提供することであって、該エピトープは対象の自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞上の受容体により認識され、該薬物はＢ細胞が他の細胞を刺激することを阻害する作用を有する、前記提供をすること、および該対象にＥＤＣを皮内または皮下投与することを含む。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞は、対象の血液中に循環している。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、自己免疫Ｂ細胞またはＴ細胞は、対象のリンパ節中にある。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、薬物は、Ｂ細胞またはＴ細胞を殺す。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、薬物は、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ−１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、またはカペシタビン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アントラサイクリン系薬剤、オキサリプラチン、またはボルテゾミブからなる群から選択される。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、薬物は、Ｂ細胞またはＴ細胞からのサイトカインの放出を阻害するかまたはＢ細胞またはＴ細胞内のサイトカインシグナル伝達を阻害する。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、薬物は、ラパマイシン、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、イマチニブ、テムシロリムス、ソラフェニブ、スニチニブ、ピルフェニドン、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ダサチニブ、サラカチニブ、ボスチニブ、バフェチニブ）、ＭＥＫキナーゼ阻害剤（セルメチニブ、トラメチニブ、およびレファメチニブ）からなる群から選択される。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、対象は、活動性自己免疫疾患の急性期ではない。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、対象は、患者が活動性自己免疫疾患の急性期でないように免疫抑制剤を用いて治療された。薬物の送達方法のいくつかの実施形態では、ＥＤＣは、１４〜７０ｋＤａの分子量を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、尋常性天疱瘡（ＰＶ）患者の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＶ患者の治療方法は、ＰＶ患者を特定すること、およびデスモグレイ
ン１またはデスモグレイン３エピトープおよび薬物を含む複合体を患者に投与することを含み、該エピトープはデスモグレイン１またはデスモグレイン３フラグメント内に含まれ、それにより患者の抗デスモグレイン１または抗デスモグレイン３自己抗体産生Ｂ細胞集団を排除または低減する。
【００１０】
ＰＶ患者の治療方法のいくつかの実施形態では、デスモグレイン１エピトープは、配列番号１６で定められた通りである。ＰＶ患者の治療方法のいくつかの実施形態では、デスモグレイン１フラグメントの配列は、配列番号１６で定められた通りである。ＰＶ患者の治療方法のいくつかの実施形態では、デスモグレイン３エピトープは、配列番号１７で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、デスモグレイン３の配列は、配列番号１７で定められた通りである。方法のいくつかの実施形態では、薬物は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される。方法のいくつかの実施形態では、抗デスモグレイン１自己抗体産生Ｂ細胞集団の排除効率は、約７０％〜約１００％の範囲である。方法のいくつかの実施形態では、抗デスモグレイン３自己抗体産生Ｂ細胞集団の排除効率は、約７０％〜約１００％の範囲である。方法のいくつかの実施形態では、複合体は、Ｔ細胞集団も排除し、該Ｔ細胞集団は、抗デスモグレイン１自己抗体産生Ｂ細胞集団にＴ細胞ヘルプを提供する。方法のいくつかの実施形態では、複合体は、Ｔ細胞集団も排除し、該Ｔ細胞集団は、抗デスモグレイン３自己抗体産生Ｂ細胞集団にＴ細胞ヘルプを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、エピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）を提供する。いくつかの実施形態では、ＥＤＣは、薬物およびデスモグレイン１エピトープまたはデスモグレイン３エピトープを含み、該デスモグレイン１エピトープはデスモグレイン１フラグメント内に含まれ、該デスモグレイン３エピトープはデスモグレイン３フラグメント内に含まれる。
【００１２】
ＥＤＣのいくつかの実施形態では、デスモグレイン１エピトープは、配列番号１６で定められた通りである。ＥＤＣのいくつかの実施形態では、デスモグレイン１フラグメントは、配列番号１６で定められた通りである。ＥＤＣのいくつかの実施形態では、デスモグレイン３エピトープは、配列番号１７で定められた通りである。ＥＤＣのいくつかの実施形態では、デスモグレイン３フラグメントは、配列番号１７で定められた通りである。ＥＤＣのいくつかの実施形態では、薬物は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメント、１つ以上のデュオカルマイシン類似体、またはアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびカペシタビンなどの細胞傷害性薬物からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、対象の自己免疫疾患の診断方法を提供する。いくつかの実施形態では、診断方法は、対象からサンプルを採取することにより対象の自己免疫Ｂおよび／またはＴ細胞の集団の存在を検出すること、エピトープおよびフルオロフォアを含むＥＤＣとサンプルをインキュベートし、該エピトープは自己免疫Ｂ細胞により発現された１つ以上のＢ細胞受容体および／または自己免疫Ｔ細胞により発現された１つ以上のＴ細胞受容体に特異的である、前記インキュベートすること、ＥＤＣとＢ細胞および／またはＴ細胞との結合を検出し、それにより対象の自己免疫疾患を診断することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】細胞膜中のＰＬＡ２Ｒの形態的なフォールディング構造および構造的ドメインの実施形態を示す。
【図２】優位な立体構造エピトープを含むＰＬＡ２Ｒの形態的なフォールディング構造の実施形態を示す。
【図３】抗原プロセシングおよびＢ細胞によるＴ細胞ヘルプの補充の実施形態の模式図を示す。
【図４】エピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）設計の実施形態の分子基盤の模式図を示す。
【図５】ＥＤＣ治療の機序の実施形態の模式図を示す。
【図６】ＰＬＡ２Ｒフラグメント（配列番号１）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図７】ＰＬＡ２Ｒフラグメント（配列番号２）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図８】ＰＬＡ２Ｒフラグメント（配列番号３）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図９】ＰＬＡ２Ｒフラグメント（配列番号４）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１０】ＰＬＡ２Ｒフラグメント（配列番号５）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１１】ＰＬＡ２Ｒフラグメント（配列番号６）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１２】ＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲドメイン（配列番号７）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１３】ＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲおよびＦＮＩＩドメイン（配列番号８）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１４】ＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲ、ＦＮＩＩおよびＣＴＬＤ１ドメイン（配列番号９）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１５】ＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲ、ＦＮＩＩおよびＣＴＬＤ１、２ドメイン（配列番号１０）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１６】ＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲ、ＦＮＩＩおよびＣＴＬＤ１、２、３ドメイン（ＰＬＡ２Ｒ−１〜５ドメイン）（配列番号１１）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１７】ＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲ、ＦＮＩＩおよびＣＴＬＤ１、２、３、４ドメイン（配列番号１２）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１８】それに対する自己抗体がＭＮ患者に存在するＰＬＡ２Ｒのエピトープ（配列番号１３）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図１９】完全長ＰＬＡ２Ｒ（配列番号１４）の実施形態のアミノ酸配列を示す。影付き領域はそれに対する自己抗体がＭＮ患者に存在するＰＬＡ２Ｒのエピトープ（配列番号１３）の実施形態を示す。下線領域はＰＬＡ２ＲのＣｙｓＲ、ＦＮＩＩおよびＣＴＬＤ１ドメイン（配列番号９）の実施形態を示す。
【図２０】ＰＬＡ２Ｒ（配列番号１５）のＮ末端２７２アミノ酸における潜在的なＮ結合グリコシル化部位を示す。
【図２１】自己免疫疾患治療のための薬物開発プラットフォームの模式図を示す。上図は、エピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）の設計を示す。中央図は、ＥＤＣがＢ細胞およびＴ細胞の表面上の抗原特異的受容体と結合することを示す。下図は、標的免疫細胞に対するＥＤＣの効果（例えば、細胞死）を示す。
【図２２】末梢リンパ節に存在する記憶Ｂ細胞へのＥＤＣの送達の模式図を示す。
【図２３】ＰＬＡ２Ｒエピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）の実施形態の設計を示す。
【図２４】ＰＬＡ２Ｒ−ＡｂポジティブＰＭＮ患者血液サンプルから単離された全Ｂ細胞中のＰＬＡ２Ｒエピトープ特異的記憶Ｂ細胞の検出を示す。
【図２５】ＰＬＡ２ＲＡｂポジティブＰＭＮ患者から単離されたＢ細胞に対するＰＬＡ２Ｒ−エピトープ−ＭＭＡＥ複合体の効果を示す。
【図２６】細胞膜中のデスモグレインの形態的なフォールディング構造を示す。短い方の垂直線は、自己抗体結合（ＥＣ１〜２）に関するＤｓｇ１における免疫優性エピトープ領域を示し、長い方の垂直線は、自己抗体結合（ＥＣ１〜３）に関するＤｓｇ３における免疫優性エピトープ領域を示す。
【図２７】粘膜皮膚ＰＶ患者の治療方法のいくつかの実施形態治療のためのエピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）の実施形態の設計を示す。
【図２８】精製および薬物結合エピトープと結合する自己抗体。
【図２９】粘膜皮膚ＰＶ患者血液サンプルから単離された全Ｂ細胞中のＤｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ特異的記憶Ｂ細胞の検出を示す。
【図３０】粘膜皮膚ＰＶ患者血液サンプルから単離されたＢ細胞に対するＤｓｇ１−エピトープ−ＭＭＡＥおよびＤｓｇ３−エピトープ−ＭＭＡＥ複合体の効果を示す。
【図３１】ＥＤＣを開発するためのＤｓｇ１のエピトープ配列（配列番号１６）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【図３２】ＥＤＣを開発するためのＤｓｇ３のエピトープ配列（配列番号１７）の実施形態のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
現在、ステロイドホルモンおよび免疫抑制剤の高用量を使用すること以外に自己免疫疾患の効果的な治療はない。これらの治療は非特異的であり、顕著な副作用を有し、該疾患の進行を止めることができないことも多い。これらの治療の大きな課題は、試薬用量を減らす場合（例えば、疾病は臨床的寛解になった後）、高頻度で疾病が再発することであり、このことは、患部臓器の機能を重く傷害する。
【００１６】
自己免疫疾患診断、予防および／または治療のための新規薬物開発プラットフォーム
Ｂ細胞における抗体産生は、細胞表面Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）と結合する抗原により開始される。ＢＣＲとの抗原の初期結合は、Ｂ細胞活性をもたらす一連の細胞内シグナル伝達イベントを誘発する。ＢＣＲと結合する抗原は、ＢＣＲ−抗原複合体の迅速な内部移行を開始させる。内部移行後、ＢＣＲ−抗原複合体は初期エンドソームに仕分けられ、その後、主要組織適合性複合体分類ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）含有後期エンドソームに仕分けられる。リソソームと融合時、これらのコンパートメントは、抗原を、ヘルパーＴ細胞に提示するためにＭＨＣＩＩ上にロードされるペプチドに分解する（図３）。特異的ヘルパーＴ細胞の結合は活性化されたＢ細胞による抗体産生を刺激する（図３）。
【００１７】
自己免疫疾患は、正常な体組織および／または臓器に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞による抗体産生）によって起こる。約８０種類の自己免疫疾患がヒトにおいて公知であり、ほとんどいずれもの組織および／または臓器が影響を受け得る。
【００１８】
臨床的に、患者における頻繁な自己免疫疾患の再発は、患者の身体内での静止状態において存在する記憶Ｂ細胞の特定の群の存在のせいであり、末梢血液および末梢リンパ組織および／または器官（例えばリンパ節）間で循環している。これらが特異的である抗原と再び出会った時、これらの記憶Ｂ細胞は即時に活性化され、その後、短時間で莫大な量の病原抗体（病原性抗体）を産生するプラズマ細胞に分化する。加えて、これらの記憶Ｂ細胞は、抗原特異的ヘルパーＴ細胞に処理抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割をし、従って、Ｔ細胞媒介性臓器および／または組織傷害を引き起こすおよび／または増強する。これらの記憶Ｂ細胞および抗原特異的Ｔ細胞は、それぞれ、固有かつ抗原特異的なＢＣＲならびにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有し、これら双方は特異的に抗原と結合する。現在、病原記憶Ｂ細胞および抗原特異的Ｔ細胞（自己免疫記憶Ｂ細胞およびＴ細胞）のこの群を特異的に標的とすることができる治療はない。詳細には、末梢血液および末梢リンパ組織および／または器官（例えばリンパ節）間で循環している自己免疫記憶Ｂ細胞および自己免疫Ｔ細胞のこの群を特異的に標的とすることができる治療はない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象／患者の末梢血液および末梢リンパ器官における自己免疫細胞のこのレパートリーを特異的に標的とする新規薬物開発プラットフォー
ムに関する。いくつかの実施形態では、末梢血液および末梢リンパ器官における自己免疫細胞のこのレパートリーの標的化は、生涯にわたる治療効果をもたらすだろう。
【００２０】
自己免疫抗体結合の原因となる抗原の部分はエピトープと呼ばれる特定の領域である。本明細書で使用されるとき、「エピトープ」は、天然ペプチド、合成ペプチド、人工ペプチド、バイオシミラー、アプタマー、タンパク質ドメイン、またはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、立体配座である。いくつかの実施形態では、エピトープは、非立体配座である。いくつかの実施形態では、エピトープは、立体配座および非立体配座の両方である。ペプチド／タンパク質エピトープを、組換え技術により発現する他に、エピトープ合成および精製の技術分野において周知の１つ以上の技術を用いて大量合成で得ることができる。エピトープは、病原自己抗体の他、記憶Ｂ細胞上で発現された抗原特異的ＢＣＲ、ヘルパーＴ細胞上で発現されたＴＣＲ、またはその両方に対して高親和性を有する。いくつかの実施形態では、エピトープは、非ペプチド／タンパク質エピトープであり得る。非限定的例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、および有機化学物質が挙げられる。
【００２１】
本開示は、エピトープ薬物複合体（ＥＤＣ）、および組成物、方法および／またはＥＤＣを含むキットに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、記憶Ｂ細胞上で発現された抗原特異的ＢＣＲ、ヘルパーＴ細胞上で発現されたＴＣＲ、またはその両方を標的とするペプチドエピトープを含むＥＤＣに関する（図２１）。いくつかの実施形態では、ＥＤＣは、ＥＤＣを貪食するおよび／またはＥＤＣのエンドサイトーシスを行うＡＰＣも標的とする（図２１）。プラットフォームは免疫細胞により特異的に認識されるエピトープに基づいているので、本開示によるプラットフォームは、いずれもの自己免疫疾患に適し得る。図２１は、自己免疫疾患治療のための薬物開発プラットフォームの模式図を示す。図２１（上図）は、ＥＤＣの設計を示す。図２１（中央図）は、ＥＤＣがＢ細胞およびＴ細胞の表面上の抗原特異的受容体と結合することを示す。ＥＤＣを、ＢＣＲ媒介エンドサイトーシスにより細胞内に内部移行することができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示によるＥＤＣは、エピトープ、リンカー、および薬物を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、患者の体内および／または細胞外側の血液循環中で安定（すなわち、加水分解も分解もしない）である。いくつかの実施形態では、リンカーは開裂可能であり、エピトープと薬物の分離を可能とする。いくつかの実施形態では、リンカーは細胞の内側で開裂される。いくつかの実施形態では、リンカーは細胞の外側で開裂される。いくつかの実施形態では、リンカーは細胞の内側と外側の両方で開裂される。いくつかの実施形態では、リンカーは細胞の外側で部分的に開裂され、細胞の内側で部分的に開裂される。いくつかの実施形態では、リンカーは細胞の外側で部分的に開裂され、細胞の内側で完全に開裂される。いくつかの実施形態では、リンカーの初期開裂は細胞の内側で起こり、最終の開裂は細胞の内側で起こる。開裂可能なリンカーの非限定的例としては、ヒドラゾンリンカー、ジスルフィド系リンカーおよびペプチドリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ジスルフィド系リンカーは、細胞の内側で選択的に分解する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド系リンカーは、チオールのより高い細胞内濃度が理由で細胞の内側で選択的に分解する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、細胞内酵素により細胞の内側で選択的に分解する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂可能でない。開裂可能でないリンカーの非限定的例としては、チオエーテルリンカー、ＰＥＧ４Ｍａｌリンカー、および同様のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、エピトープ上の１つ以上のアミノ酸と結合している。いくつかの実施形態では、リンカーはエピトープ上のシステイン残基と結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、エピトープ上のシステイン以外（例えば、リジン）の残基と結合している。いくつかの実施形態では、リンカー結合のエ
ピトープ上の１つ以上の部位は、１つ以上の溶媒露出システインもしくはリジンまたは両方であり得る。
【００２４】
ＥＤＣの生成のための他の種類のリンカー、結合化学物質、およびエピトープ上の結合部位は、本開示の範囲内に含まれる。非限定的例は、米国特許第９，１５６，８５４号および米国特許第９，３８８，４０８号に開示されており、これらはその全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。リンカーの他の非限定的例としては、イミドエステル（Ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓ）、マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ）、カルボジイミド（Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ピリジルジチオール（Ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ）、イソシアネート（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）、イソペプタグ（Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ）、スパイタグ（ＳｐｙＴａｇ）、スヌープタグ（ＳｎｏｏｐＴａｇ）およびＳＮＡＰタグ（ＳＮＡＰ−ｔａｇ）が挙げられる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、エピトープおよび薬物の両方が、二成分を結合するための結合部位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは開裂可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、エピトープおよび薬物の１つまたは両方から開裂可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂可能でない。いくつかの実施形態では、リンカーは、エピトープおよび薬物の１つまたは両方から開裂可能でない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、遊離システイン残基を、エピトープのＣ末端において導入する。それから、遊離システインのチオ基を、開裂可能なリンカーと結合する。いくつかの実施形態では、開裂可能なリンカーは、バリン−シトルリンリンカーである。いくつかの実施形態では、バリン−シトルリンリンカーは、薬物（例えば、デュオカルマイシン類似体）とあらかじめ結合している。いくつかの実施形態では、遊離システイン残基を、エピトープのＣ末端に導入し、該遊離システインのチオ基を、薬物（例えば、デュオカルマイシン類似体）とあらかじめ結合された開裂可能なバリン−シトルリンリンカーと結合する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＣＸＰＸＲの短い配列を、エピトープのＣ末端に導入する。いくつかの実施形態では、システイン残基を、ホルミルグリシンアルデヒドタグに変換する。いくつかの実施形態では、システイン残基を、ホルミルグリシン生成酵素を用いてホルミルグリシンアルデヒドタグに変換する。いくつかの実施形態では、それから、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、非開裂（non-cleavable）結合により薬物−リンカーと結
合する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、オキシム化学による非開裂結合により薬物−リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、ピクテ・スペングラー反応による非開裂結合により薬物−リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、薬物−リンカー中の薬物は、細胞傷害性試薬である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、薬物を、ＢＣＲ／ＴＣＲ相互作用部位の外側の領域においてエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、薬物を、１つ以上のリジン残基とのＢＣＲ／ＴＣＲ相互作用部位の外側の領域においてエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、薬物を、薬物−リンカーに付加されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとのアミド結合による１つ以上のリジン残基とのＢＣＲ／ＴＣＲ相互作用部位の外側の領域においてエピトープと結合する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、エピトープを、実施例４および実施例７に記載されているように操作することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の化学的結合部位を、エピトープに導入する。いくつかの実施形態では、１つ以上の化学的結合部位は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、１つ以上の化学的結合部位は、１つ以上のシス
テイン残基を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、エピトープは、その天然アミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、エピトープの天然アミノ酸配列を、修飾してもよい。例えば、エピトープ中のグリコシル化部位（例えば、ＰＬＡ２Ｒの細胞外部分をグリコシル化する）は、エピトープの大きさ、体積、および立体配座の複雑さを増大させることができる。ＰＬＡ２Ｒ（配列番号１５）の最初の２７２アミノ酸における潜在的なＮ結合グリコシル化部位（下線Ａｓｎ残基）を図２０に示し、Ｄｓｇ１エピトープ（配列番号１６）の場合を図３１に示し、Ｄｓｇ３エピトープ（配列番号１７）の場合を図３２に示している。いくつかの実施形態では、エピトープの大きさ、体積、立体配座の複雑さは、潜在的なグリコシル化部位（例えば、図２０中のＡｓｎ７０およびＡｓｎ８９において）をＧｌｎまたは自己抗体認識に関してタンパク質構造および／または立体配座に影響を与えないだろう他の非グリコシル化アミノ酸で置換することにより低減することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、グリコシル化される可能性のある残基を、例えば、部位特異的変異誘発を用いて置換することができる。いくつかの実施形態では、グリコシル化される可能性のある残基を、例えば、エピトープを発現する発現ベクターを用いる場合、部位特異的変異誘発を用いて置換することができる。いくつかの実施形態では、エピトープを直接合成することができる。いくつかの実施形態では、エピトープを直接合成する場合、グリコシル化される可能性のある残基が自己抗体認識に関してタンパク質構造および／または立体配座に影響を与えないだろう非グリコシル化残基で置換されるように、ペプチドおよび／またはタンパク質合成をカスタマイズすることができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、エピトープにさらなる修飾を行って、例えば、試薬（例えば、薬物）をエピトープに結合させ、細胞表面上の受容体へのエピトープの接近性を向上、および／またはタンパク質発現および産生量を向上させてもよい。例えば、小さい（約２〜１０アミノ酸）Ｎ末端もしくはＣ末端ペプチドまたは両方を挿入すること、保存的置換および／または非保存的置換すること、および／または１つ以上の異種配列を付加して所望の目的を達成することにより、エピトープを改変してもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるエピトープの１つ以上を核酸によりコードする。いくつかの実施形態では、エピトープをコードする核酸は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、エピトープをコードする核酸は、タンパク質発現ベクター内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、哺乳類細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、昆虫細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクター内に含まれるエピトープをコードする核酸は、調節エレメントと機能可能に連結してエピトープの発現を調節する。
【００３４】
調節エレメントは、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、その他を含み得る。本明細書で使用されるとき、「機能可能に連結した」とは、核酸からのタンパク質発現を正または負に制御する調節エレメントを表す。
【００３５】
本明細書で提供されるタンパク質発現ベクターの１つ以上、ならびに当業者に公知の他のタンパク質発現ベクターを使用して、本明細書で提供された組成物、方法および／またはキットの１つ以上に組み込むために、本明細書で開示された大量の１つ以上のエピトープならびにそのフラグメントおよび変異体を得ることができる。いくつかの実施形態では、エピトープの変異体は、該エピトープと約７０％〜約９９．９９％の同一性を有し得る
。いくつかの実施形態では、エピトープの変異体は、該エピトープと約６５、７０、５７、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．２５、９９．５、９９．７５、９９．９９％の同一性を有するか、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲を有する値の同一性を有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、コードされたエピトープにタグを導入する。いくつかの実施形態では、１つ以上のタグは、エピトープの精製を可能とする。いくつかの実施形態では、タグはＮ末端にある。いくつかの実施形態では、タグはＣ末端にある。いくつかの実施形態では、タグは、Ｎ末端およびＣ末端の両方にある。タグの非限定的例としては、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−転移酵素、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧ、Ｖ５、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＮＥ、ビオチン、ビオチンカルボキシルキャリアプロテイン、ＧＦＰ、Ｈａｌｏ、Ｎｕｓ、Ｆｃ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン、ポリＧｌｕ、Ｅ、Ｓ、ＳＢＰ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＴＣ、ＶＳＶ、ＴｙおよびＸｐｒｅｓｓが挙げられる。いくつかの実施形態では、タグは、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）タグである。
【００３７】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、エピトープおよびタグ間の開裂部位を付加的に導入して、タグからエピトープの分離を可能とする。いくつかの実施形態では、開裂部位は、タンパク質分解部位である。いくつかの実施形態では、開裂部位は、非タンパク質分解部位である。タンパク質分解部位の非限定的例としては、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子またはエンテロペプチダーゼの部位が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質分解部位は、トロンビン開裂部位である。考えられる他のプロテアーゼおよび非プロテアーゼ開裂部位の非限定的例としては、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）プロテアーゼ、Ａｒｇ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンテロペプチダーゼ、ＢＮＰＳ−スカトール、カスパーゼ、高特異性キモトリプシン、低特異性キモトリプシン、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＮＴＣＢ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）、好中球エラスターゼ、ペプシン、プロリン−エンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、および当業者に公知の酵素に特異的な他の部位が挙げられる。
【００３８】
１つ以上の市販のセルラインを使用してエピトープを発現することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ポリＨｉｓタグエピトープを哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）内で発現し、Ｎｉ−アフィニティ精製およびゲルろ過カラムを用いて、細胞培養培地から精製することができる。それから、ポリＨｉｓタグをタンパク質消化（例えば、トロンビンを用いて）により除去することができ、エピトープを、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて均一になるまでさらに精製してトロンビン酵素ならびに遊離したポリＨｉｓタグを除去する。エピトープの発現および精製を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてタンパク質抽出物に対して試験することができる（図２３および図２８）。１つ以上の抗体ならびに／または患者血漿および／もしくは血清を用いて、ウェスタンブロッティング法（図２３および図２８）により、エピトープ発現も試験することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、クマシー染料染色（図２３および図２８）、銀染色、亜鉛染色、蛍光染料染色、および官能基特異的染色の１つ以上で染色することができる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、ＥＤＣ中の「薬物」を、「治療薬」（図２１；上図）または「薬剤」と呼ぶこともできる。薬物としては、１つ以上の疾病の予防および／または治療のために特異的に使用される薬剤が挙げられる。薬物は、細胞分裂阻害薬、細胞傷害性薬、免疫抑制剤、または治療目的のために使用することができるいずれもの薬剤であり得
る。例えば、ＥＤＣとＴＣＲとの結合は、薬物による免疫寛容の誘発をもたらし得、ＥＤＣのＡＰＣへの内部移行は、ＡＰＣの死をもたらし得る（図２１；下図）。いくつかの実施形態では、免疫寛容は１つ以上の公知の機序により起こる。例えば、薬物は自己免疫Ｂ細胞、Ｔ細胞または両方により１つ以上のサイトカインの放出を阻害、または自己免疫Ｂ細胞、Ｔ細胞または両方におけるサイトカインシグナル伝達を阻害する。非限定的例としては、クローン除去、レセプター編集、濾胞除去、および免疫不応答が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬物は、自己免疫Ｂ細胞によるＴ細胞への抗原提示を阻害する。いくつかの実施形態では、薬物は、１つ以上のシグナル伝達経路を阻害する。非限定的例としては、ＩＬ−６受容体シグナル伝達、ＮＦ−κＢシグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、Ｂ細胞受容体シグナル伝達、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、およびインフラマソームシグナル伝達が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシグナル伝達経路における１つ以上の標的を、薬物により標的としてもよい。非限定的例としては、ＣＯＸ、ＣＣＲ、ヒスタミン受容体、インターロイキン受容体、ｇｐ１２０／ＣＤ４、ＣＸＣＲ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＭＡＬＴ、ＬＴＲ、ＲＯＳ、ＮＯＳ、ＴＬＲ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、およびＮｒｆ２が挙げられる。
【００４０】
薬物の非限定的例としては、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ−１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン、シクロホスファミド、ラパマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、またはカペシタビン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アントラサイクリン系薬剤、オキサリプラチン、またはボルテゾミブが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣは、細胞死滅のための細菌性毒素と融合した抗体に基づいた標的ドメインである免疫毒素に基づき得る（Alewine, C., et al, The Oncologist, Vol. 20, pp. 176-185, 2015、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられる）。免疫毒素に基づいたＥＤＣはタンパク質合成の阻害により細胞を殺すことができ、分裂細胞および非分裂細胞の両方を標的にすることができる。
【００４２】
薬物は、検出試薬、例えば、フルオロフォアであり得る。非限定的例としては、ＦＩＴＣ、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、ＮＢＤ−Ｘ、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５複合体、ＰＥ−Ｃｙ７複合体、レッド６１３（ＰＥ−テキサスレッド）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ＴｒｕＲｅｄ（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５複合体）、ＦｌｕｏｒＸ、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、テキサスレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびＡＰＣ−Ｃｙ７複合体が挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳおよび／または顕微鏡に基づいたアッセイを、ＥＤＣにおける薬物として使用することができる小分子のスクリーニングおよび同定のために設計することができる。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳに基づいたアッセイ（実施例１に基づく）を使用して、小分子の１つ以上の市販ライブラリーをスクリーニングし、ＥＤＣにおける薬物として使用することができる小分子を同定することができる。いくつかの実施形態では、顕微鏡に基づいたアッセイ（実施例２に基づく）を使用して、小分子の１つ以上の市販ライブラリーをスクリーニングし、ＥＤＣにおける薬物として使用することができる小分子を同定することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、薬物は、自己免疫細胞死を誘導することができる化学物質、
試薬、タンパク質またはペプチドの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、薬物は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＢ細胞内の抗体ｍＲＮＡ安定性、ターンオーバー、および／または翻訳に干渉することができるＲＮＡｉに関するＲＮＡフラグメントの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、薬物は細胞傷害性薬物であり、細胞死をもたらすＢ細胞およびＴ細胞に対する細胞傷害効果を有する。いくつかの実施形態では、細胞死は、プログラムされた細胞死、アポトーシス、マクロオートファジー、オートファジー、ネクローシス、ネクロトーシス、分裂期細胞死、活性化誘導細胞死、アノイキス、角質化、興奮毒性、フェロトーシス、ウォーラー変性、および免疫原性アポトーシスの１つ以上により起こる。
【００４５】
一旦、ＥＤＣが記憶Ｂ細胞表面上の抗原特異的受容体と結合したならば、タンパク質複合体はエンドサイトーシスにより内部移行し、その後、細胞効果を開始させる結合された薬物が放出される。ＥＤＣがヘルパーＴ細胞表面上の抗原特異的受容体と結合する場合、細胞効果を誘導する。細胞効果の非限定的例としては、細胞増殖停止、細胞死、アポトーシス、オートファジー、免疫寛容などが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＥＤＣは、ＡＰＣにより内部移行する。いくつかの実施形態では、ＡＰＣにより内部移行されたＥＤＣは、該ＡＰＣがＴ細胞に抗原を提示するのを阻害する。
【００４６】
ＥＤＣおよびＢＣＲ／ＴＣＲ間の相互作用は、「親和性」の観点で表すことができ、その受容体に対する単一ＥＤＣの結合強度として定義することができる。親和性は平衡解離定数（ＫＤ）として表され、その受容体に対するＥＤＣの結合速度および受容体からのＥＤＣの解離速度間に平衡が存在する濃度である。より小さいＫＤ値は、より高い親和性を意味し、その逆もまた同様である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＢＣＲおよびＴＣＲに対するＥＤＣの親和性は、約１０−７〜約１０−１３の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、親和性は、約１０−４〜約１０−１０の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、親和性は、約１０−９〜約１０−１５の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、親和性は、約１０−４〜約１０−１０の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、親和性は、約１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６、１０−１７、もしくは１０−１８、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内の値である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、１つより多いＥＤＣを、組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、１つより多いＥＤＣを使用することができ、この場合、自己免疫細胞に対する増強された効果が観察される。この増強は、付加的または相乗的であり得る。相乗効果は、付加効果より大きい。増強が、異なるＥＤＣの個々の効果の合計と同じである場合、付加効果が観察される。増強が、異なるＥＤＣの個々の効果の合計より大きい場合、相乗効果が観察される。相乗効果、付加効果または両方は、ヒト患者、非ヒト患者、非患者ヒトボランティア、インビボモデル、エキソビボモデル、インビトロモデルなどで起こり得る。増強は、約＜１〜約１００倍の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、相乗効果は、約３倍〜約３０倍である。いくつかの実施形態では、増強は、＜１、１、＞１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍の範囲であり、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内である。
【００４９】
ＢＣＲおよびＴＣＲに対するエピトープの特異性のおかげで、ＥＤＣは、正常な免疫細胞の機能に影響を及ぼすことなく、病原自己免疫細胞（例えば、抗原特異的Ｂ細胞およびＴ細胞）のみを特異的に標的とする。したがって、本開示によるプラットフォームは、全く副作用なく／最小限の副作用で、または重大な副作用なく、病原自己免疫細胞の特異的
レパートリーのみを標的とする。したがって、疾病の進行および再発は軽減され、長続きする保護効果をもたらす。
【００５０】
ＥＤＣは、いずれもの分子サイズ範囲であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、大きさは、約２．５ｋＤａ〜約７５ｋＤａの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、大きさは、約５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、大きさは、約２５０ｋＤａ〜約２５００ｋＤａの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、大きさは、約２．５、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、もしくは２５００ｋＤａ、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内の値であり得る。
【００５１】
図２２は、末梢リンパ節に存在する記憶Ｂ細胞へのＥＤＣの送達の模式図を示す。患者にＥＤＣを効率的に送達し、記憶Ｂ細胞へＥＤＣを最大限に接近させるために、本開示によるＥＤＣを、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子範囲で設計する。ＥＤＣの分子の大きさが約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの範囲内である場合、皮下および／または皮内経路により投与する場合、ＥＤＣを輸入リンパ管に直接流すことができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、ＥＤＣの大きさは、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの範囲である。いくつかの好ましい実施形態では、ＥＤＣの大きさは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５ｋＤａ、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内の値である。
【００５２】
皮下および／または皮内経路により送達する場合、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの大きさの範囲のＥＤＣは、輸入リンパ管に直接流れる（図２２）。したがって、いくつかのより好ましい実施形態では、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの大きさの範囲のＥＤＣの投与経路は、皮下、皮内または両方であり、輸入リンパ管にＥＤＣを直接送達する。
【００５３】
皮下および／または皮内経路により送達する場合、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの大きさの範囲のＥＤＣは輸入リンパ管に直接流れ、抗原提示細胞の助けなしで直接リンパ節において記憶Ｂ細胞と遭遇して結合する（図２２）。したがって、いくつかのより好ましい実施形態では、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの大きさの範囲のＥＤＣの投与経路は、皮下、皮内または両方であり、輸入リンパ管にＥＤＣを直接送達し、抗原提示細胞の助けなしでリンパ節において直接記憶Ｂ細胞にＥＤＣを送達する。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態では、約１４ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量範囲内のＥＤＣを、リンパ節に迅速に流し、皮下および／または皮内経路により送達する場合、抗原特異的記憶Ｂ細胞（およびＴ細胞）を標的とする。しかしながら、ＥＤＣを、必要に応じて、全ての可能な送達経路により患者に送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、局所、非経口、関節内（intrarticular）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、
腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、小脳内（intracelebellar）、脳室内、
結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、筋肉内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、腟、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または経皮経路の１つ以上によるＥＤＣ投与が考えられる。
【００５５】
いくつかの患者では、自己抗体の循環レベルは高く、例えば、活動性自己免疫疾患患者ではそうである。活動性疾病の間、自己抗体は、患者の血液循環中に存在し、患者は疾病の影響を経験している。循環している自己抗体は、特に、静脈内投与する場合、ＥＤＣにおけるエピトープとの結合によりＥＤＣの効果を中和することができる。加えて、自己抗体は、ＥＤＣとの免疫複合体を形成し、望ましくない副作用をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態では、特に活動性病態中および／または自己抗体の高いレベルが対
象の血液循環中に存在する場合、好ましい投与経路は、皮下、皮内、または経口の１つ以上である。このような患者では、送達の皮下および／または皮内経路は、自己抗体によるＥＤＣ中和の機会を最小限にし、リンパ組織および／または器官において記憶Ｂ細胞（およびＴ細胞）にＥＤＣが達する機会を最大にする（図２２）。一旦、活動性病期が過ぎ、患者が低レベルの血液循環抗体の寛解状態でなったならば、皮内および／または皮下経路によるＥＤＣの投与に加えて、患者に静脈内経路によりＥＤＣを与えて末梢を循環している自己免疫細胞を標的にすることができる。
【００５６】
しかしながら、いくつかの実施形態では、経路の組合せによりＥＤＣを投与することは必要で有り得る（例えば、尋常性天疱瘡）。このような患者では、患者の血液循環中に自己抗体の滴定量を減らした後に、ＥＤＣを送達する。例えば、患者の血液循環中に自己抗体の滴定量を減らした後に、皮内、皮下および静脈内経路の組合せアプローチでＥＤＣを送達することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、循環自己抗体レベルが再利用、分解、または両方によって抗体の半減期に対して自然に減少し、その後、ＥＤＣを投与するまで、患者の活動性疾病を代替療法により治療する。患者の活動性疾病を代替療法により治療している状況では、皮内、皮下、経口、または静脈内経路の１つ以上によりＥＤＣを投与してもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、代替療法を投与されて寛解している患者に、ＥＤＣを送達することができる。このような状況では、ＥＤＣを投与して病原記憶Ｂ細胞およびＴ細胞の長引く集団を排除し、したがって、潜在的な将来の疾病の再発を阻止することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示による薬物開発プラットフォームを使用して、いずれものＴ細胞およびＢ細胞媒介性自己免疫疾患を診断、予防および／または効果的に治療することができる。いくつかの実施形態では、本開示による薬物開発プラットフォームを使用して、これに限定されないが、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性じん麻疹、軸索型＆神経型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、低ガンマグロブリン血症（Hypogammalglobulinemia）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼球瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（
末梢性ぶどう膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群（Parsonnage-Turner syndrome）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多発内分泌腺症候群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子＆精巣自己免疫病、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トローザ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合織疾患（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症（または多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））を含むいずれもの抗原特異的自己免疫疾患を診断、予防および／または効果的に治療することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、他の免疫疾患の診断、予防および／または治療は、１つ以上の免疫細胞の機能が歪み必ずしも自己免疫疾患でない免疫系疾患をもたらすものを含むと考えられる。したがって、本明細書における薬物開発プラットフォームを使用して、自己免疫疾患でない疾病を診断、予防および／または効果的に治療することもできる。好ましい実施形態では、ヒト自己免疫疾患をプラットフォームにより標的とする。いくつかの実施形態では、非ヒトの自己免疫疾患を標的とする。非ヒトの非限定的例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット、サル、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびシマウマが挙げられる。いくつかの実施形態では、ヒトおよび非ヒトにおける非自己免疫疾患である免疫系疾患を、本開示のプラットフォームにより標的とする。
【００６１】
いくつかの実施形態では、患者は、約１か月〜約５年間自己免疫疾患を有していた。いくつかの実施形態では、患者は、約１、２、３もしくは４週間、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内、または２，３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月間、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年間、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内、自己免疫疾患を有していた。
【００６２】
いくつかの実施形態では、患者は、以前に、自己免疫疾患に対する治療を受けていなかった。いくつかの実施形態では、患者は、以前に、自己免疫疾患に対する治療（免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれか）を受けた。いくつかの実施形態では、患者は、以前に自己免疫疾患に対する免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いた治療に成功した。いくつかの実施形態では、患者は、以前に自己免疫疾患に対する免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いた治療に成功したが、自己免疫疾患は再発した。いくつかの実施形態では、患者は、以前に自己免疫疾患に対する免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いた治療に成功しなかった。
【００６３】
患者の年齢は、約２０歳〜約９５歳の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、患者の年齢は、約５歳〜約７０歳の範囲である。いくつかの実施形態では、患者の年齢は、５歳未満である。いくつかの実施形態では、患者の年齢は、７０歳より上である。いくつかの実施形態では、患者の年齢は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５歳、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内である。いくつかの実施形態では、患者は男性である。いくつかの実施形態では、患者は女性である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣを、組成物の形態で提供する。いくつかの実施形態では、ＥＤＣ組成物を、本明細書中の１つ以上の投与経路による送達のために製剤することができる。組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および指定レシピエントの血液と等張の処方物を与える溶質を含有することができる水性および非水性で等張性滅菌注射液剤、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁剤であり得るが、これに限定されない。
【００６５】
組成物を、アンプルおよびバイアルなどの単回用量または反復用量のシール容器で提供することができる。注射液剤および懸濁剤を、滅菌散剤、顆粒剤、カプセル剤および錠剤の１つ以上から調製することができる。エアロゾルまたはネブライザーによる送達および皮膚用パッチ剤による送達などの他の非限定的組成物も考えられる。いくつかの実施形態では、組成物の有効性を、ヒト患者、非ヒト患者、または両方に投与する前に、非患者ヒトボランティア、インビボモデル、エクスビボモデル、インビトロモデルで試験してもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣを、毎日、毎週、隔週または毎月投与する。いくつかの実施形態では、ＥＤＣを、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回または１日８回投与する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣを用いた治療期間は、約２週間〜約４か月の範囲である。いくつかの実施形態では、疾病の重度に応じて、ＥＤＣを用いた治療期間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４週間、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、治療の治療有効性は、患者の循環する自己抗体レベルおよび／またはエピトープ特異的免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）数により決定したとき、約８０％〜約９５％の範囲である。いくつかの実施形態では、治療有効性は、患者の循環する自己抗体レベルおよび／またはエピトープ特異的免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）数により決定したとき、約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣ組成物の体積は、約０．１ｍｌ〜約１０ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態では、ＥＤＣ組成物の体積は、約０．０５ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態では、ＥＤＣ組成物の体積は、約０．００５、０．００７５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、１００、もしくは１５０ｍｌ、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、例えば、ＢＣＲおよびＴＣＲに対するＥＤＣの非常に高い親和性および特異性、ならびに体内の比較的近接不能な位置への接近性によって、ＥＤＣ中の薬物を単独で投与する場合と比較して、より低いＥＤＣ中の薬物用量で自己免疫疾患の効果的治療を行うことができる。加えて、いくつかの実施形態では、ＥＤＣを用いた必要な治療期間は、ＥＤＣ中の薬物を単独で投与する場合と比較してより短い。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＤＣ中の薬物が抗がん／抗腫瘍薬物である場合、ＥＤＣの開始用量は、ＥＤＣ中の薬物を固形腫瘍治療のために使用する用量の約１０分の１である。
【００７１】
ＥＤＣは末梢血液循環中のＢＣＲおよび末梢リンパ組織／器官に、よりよく到達するの
で、ＥＤＣの形態の薬物の開始用量は、薬物の用量が単独であるよりも、より低くあり得る（例えば、体内の比較的近接不能な位置における腫瘍／がんのため）。例えば、ＥＤＣの形態の薬物の開始用量は、ＥＤＣ中の薬物を疾病の治療のために使用する用量の約５分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、３５分の１、４０分の１、４５分の１、５０分の１、５５分の１、６０分の１、６５分の１、７０分の１、７５分の１、８０分の１、８５分の１、９０分の１、９５分の１、１００分の１、２００分の１、２５０分の１、５００分の１、１０００分の１、２０００分の１もしくは５０００分の１、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内であり得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つ以上のＥＤＣによる治療選択肢は、免疫抑制剤および／またはステロイド剤を用いた治療と比較して、即効性であり、より低い用量のみ必要とし、最小限の副作用しかない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣの単回用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＤＣの単回用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を標的とするためのＥＤＣの単回用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を標的とするためのＥＤＣの単回用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＤＣの単回用量は、約０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｍｇ／ｋｇ、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内の値であり得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣを単回１日の用量として投与する。いくつかの実施形態では、ＥＤＣを１日当たり１回より多い用量として投与する。いくつかの実施形態では、１日当たりの用量回数は、１回〜６回の範囲である。いくつかの実施形態では、１日当たりの用量回数は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、または８回である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書中のＥＤＣを使用して、血漿交換療法、アフェレシス療法、および白血球除去療法中において、循環自己免疫細胞を除去および／または排除することができる。
【００７６】
診断および治療後患者モニタリング
疾病診断および治療後疾病進行のモニタリングは、患者治療選択肢、治療に対する患者応答、および患者疾病管理の確認にとって欠かせない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、診断および疾病進行の治療後患者モニタリングを、痛みのある侵襲的な方法を用いて行う。例えば、膜性腎症（ＭＮ）進行の診断および治療後患者モニタリングは、侵襲的であり、重度の腎臓の出血および多くの他の副作用を引き起こし得る腎臓の生検に完全に依存している。
【００７８】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の非侵襲的および／または最小限の侵襲的な診断および治療後モニタリングのためのＥＤＣを本明細書において提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の非侵襲的および／または最小限の侵襲的な診断および治療後モニタリングのためのＥＤＣは、本明細書で提供される１つ以上のエピトープを含む。エピトープは、溶液もしくは基材上に固定化、または両方であり得る。基材は、カラム、ビーズ、マイクロスフィア、診断および治療後モニタリング用アッセイに有用であることが公知の試験ストリップまたはマルチウェルプレートなどの様々な基材のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の診断および治療後モニタ
リングは、１つ以上のアッセイによる。いくつかの実施形態では、アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＦＡＣＳ、エリスポット法（Enzyme-Linked ImmunoSpot）（ＥＬＩＳＰＯＴ）、放射免疫アッセイ、磁性免疫アッセイなどの免疫アッセイの１つ以上であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つ以上のエピトープを、標準的手順を用いて基材（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に結合することができる。患者サンプル（例えば、血液、血清および／または血漿）を、標準的な臨床的な処置によって、病院への訪問中に採取することができる。患者サンプルを、適切なコントロールサンプルと共に、異なる希釈（例えば、１０分の１、１００分の１、１０００分の１、その他）でＥＬＩＳＡプレートに添加することができる。標準的インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを、標準的プレートリーダーを用いて読むことができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、コントロールサンプルと比較して患者サンプルにおいて抗エピトープ自己抗体の検出可能な増加がある。いくつかの実施形態では、コントロールサンプルと比較した抗エピトープ自己抗体の少なくとも１０％の検出可能な増加は、患者における自己免疫疾患の存在を示す。いくつかの実施形態では、患者サンプルにおける抗エピトープ自己抗体の検出可能な増加は、コントロールサンプルと比較して１０％より大きい。いくつかの実施形態では、患者サンプルにおける抗エピトープ自己抗体の検出可能な増加は、コントロールサンプルと比較して約５％〜約１５％の範囲である。いくつかの実施形態では、患者サンプルにおける抗エピトープ自己抗体の検出可能な増加は、コントロールサンプルと比較して約１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００％、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、コントロールサンプルと比較して、患者サンプルにおける抗エピトープ自己抗体の検出可能な増加がある。患者サンプルにおける抗エピトープ自己抗体の増加は、本明細書で提供される組成物、方法および／または診断用キットの１つ以上を用いて検出可能である。本明細書で使用されるとき、「コントロールサンプル」というのは、抗エピトープ自己抗体の正常レベルの代表となるサンプル、または自己免疫疾患がないと分かっている対象から得られたサンプルのいずれかを言う。
【００８３】
いくつかの実施形態では、患者サンプルは、例えば、体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、およびリンパ液の１つ以上）、自己免疫疾患にかかった組織および／または臓器の生検サンプルであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＮ患者において腎生検を行ってもよい。いくつかの実施形態では、尋常性天疱瘡患者において粘膜皮膚病変の生検を行ってもよい。
【００８４】
自己免疫疾患の診断および治療後モニタリングのための顕微鏡によるアッセイは、患者の血液サンプルを得ることを含み得る。本明細書中の１つ以上のＥＤＣを用いて、血液サンプルをそのまま分析することができ、または細胞（例えば、全Ｂ細胞または全Ｔ細胞）の１つ以上の特定集団を、患者の自己免疫細胞の存在を診断する前に、当技術分野で公知の１つ以上の細胞精製技術（例えば、ＦＡＣＳ）を用いて単離してもよい。例えば、本明細書中の１つ以上のＥＤＣを使用して、患者サンプルにおける自己抗体産生Ｂ細胞の存在を検出することができる（実施例５：図２４および実施例８：図２９）。本明細書中の１つ以上のＥＤＣを、患者における自己抗体レベルの検出のために使用することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、アッセイを、患者における自己免疫疾患の状態および／または本明細書で提供される治療選択肢の１つ以上に対する応答性をモニタリングするようにもできる。例えば、血液、血清および／または血漿サンプルを、第一時点において患者か
ら採取することができる。第一時点は、診療所への患者の最初の訪問であり得、患者は自己免疫疾患と診断されておらず、以前に自己免疫疾患の治療をした経験がない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、第一時点は、患者が以前に他の形態の治療を経験している、本明細書で提供される１つ以上の治療選択肢の開始前であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の治療選択肢の開始後、第二時点ならびにさらにその後の時点において患者から血液、血清および／または血漿サンプルを採取することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、患者サンプルにおける抗エピトープ自己抗体産生Ｂ細胞の量を、様々な時点において比較することができる。いくつかの実施形態では、第一時点と比較して、第二および／またはその後の時点における患者サンプルの自己抗体産生Ｂ細胞量の減少は、疾病の寛解を示している。いくつかの実施形態では、第一時点と比較して、第二および／またはその後の時点における患者サンプルの自己抗体産生Ｂ細胞量の減少は、自己抗体産生Ｂ細胞の排除および疾病の１００％治療を示している。いくつかの実施形態では、自己免疫細胞の排除および疾病の寛解は、約５０％〜１００％の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、自己免疫細胞の排除および疾病の寛解は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％である。いくつかの実施形態では、自己免疫細胞の排除は、１回のみの治療後１００％である。いくつかの実施形態では、自己免疫細胞の排除は１回の治療後では低く（例えば、５０％未満）、追加の１回以上の治療を提供して自己免疫細胞を排除してもよく、および／または患者に１つ以上の追加の治療を行ってもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＥＤＣの有効性を、患者にＥＤＣを投与する前に、患者サンプルを用いてインビトロで試験をしてもよい。例えば、ＥＤＣの有効性を、患者末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの単離Ｂ細胞に対して試験する（図２５：実施例６および図３０：実施例９）。細胞傷害性薬物を含むＥＤＣへのサンプルの暴露前に、フルオロフォア（例えば、ＦＩＴＣ）を含むＥＤＣを使用して患者サンプル（図２５の左図（ＭＮ患者サンプル）および図３０（尋常性天疱瘡患者サンプル））における自己抗体産生Ｂ細胞の存在を検出する。それから、患者サンプルを、細胞傷害性薬物（例えば、ＭＭＡＥ）を含むＥＤＣで処理する。それから、フルオロフォアを含むＥＤＣを使用して、患者サンプル（図２５中の中央図（ＭＮ患者サンプル）および図３０（尋常性天疱瘡患者サンプル））の自己抗体産生Ｂ細胞の細胞傷害性薬物を含むＥＤＣの有効性を決定する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、患者自己抗体産生Ｂ細胞の排除における細胞傷害性薬物を含むＥＤＣの有効性は１００％である（図２５中の中央図（ＭＮ患者サンプル）および図３０（尋常性天疱瘡患者サンプル））。いくつかの実施形態では、有効性は、約５０％〜１００％の範囲である。いくつかの実施形態では、有効性は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％である。いくつかの実施形態では、１回目の治療後の有効性は１００％でなく、追加の１回以上の治療を行うことができ、有効性の再評価を治療の各回後に行うことができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアを含む１つ以上のＥＤＣを診断ツールとして使用し、患者のエピトープ特異的細胞数を決定する。例えば、図２４は、ＭＮ患者の末梢血液循環における自己免疫Ｂ細胞の存在を決定するための診断ツールとして、ＰＬＡ２ＲエピトープおよびＦＩＴＣによるＥＤＣの使用を示す。図２９は、ＰＶ患者の末梢血液循環における自己免疫Ｂ細胞の存在を決定するための診断ツールとして、ＤｓｇエピトープおよびＦＩＴＣによるＥＤＣの使用を示す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、フルオロフォアを含む１つ以上のＥＤＣを診断ツールとして
使用し、第一時点における患者のエピトープ特異的自己免疫細胞数を決定する。第一時点における患者のエピトープ特異的自己免疫細胞数が所定の閾値（患者が疾病のための１つ以上の治療を必要とすることを示す）より上である場合、単独または１つ以上の補助療法と併用のいずれかで薬物を含む１つ以上のＥＤＣを患者に投与する。エピトープ特異的自己免疫細胞数を、フルオロフォアを含む１つ以上のＥＤＣを用いて第二時点において再評価する。第二時点におけるエピトープ特異的自己免疫細胞数が所定の閾値未満である場合、治療を中断する。第二時点におけるエピトープ特異的自己免疫細胞数が所定の閾値より上である場合、治療を継続し、その後評価を行う。
【００９２】
患者の自己免疫細胞の存在を、血液、他の生体液、ならびに組織および臓器生検（例えば、手術中に採取する）で検出することができる。ＥＤＣを使用して、エピトープと結合することができるいずれもの細胞集団（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ中の他の細胞、および他の生体液中の細胞）を検出することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書中のプラットフォームを、いずれものペプチド、タンパク質ドメイン、小分子、および他のリガンド（例えば、特異的受容体と結合するリガンドドメインまたはペプチドドメイン）に適合することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、患者の自己抗体産生Ｂ細胞数／レベルを、標準的自動コンピュータプログラムを用いて算出することができる。いくつかの実施形態では、自己抗体産生Ｂ細胞レベルを、本明細書で提供される１つ以上の治療選択肢での治療の前後で比較することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つ以上のエピトープを大量に製造、精製することができ、標準的商用グレードのＥＬＩＳＡプレートを製造し、臨床検査室における診断および治療後患者モニタリングのためのルーチン手順として使用することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、アッセイは、非侵襲的および／または最小限の侵襲的、簡単、時間効率が良く、対費用効果が高く、臨床検査室でルーチン的に行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＮ患者に対して使用するとき、侵襲的腎生検の必要なしに、アッセイを行うことができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒエピトープ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを、ＭＮ治療のために小分子をスクリーニングおよび同定するように設計することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒ自己抗体とＰＬＡ２Ｒとの結合を特異的に阻害する小分子を同定することができる。例えば、本明細書で提供されるＥＬＩＳＡプレートの実施形態を使用して、小分子の１つ以上の市販ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、この小分子の１つ以上の市販ライブラリーは、代謝産物（例えば、アルカロイド、グリコシドおよび脂質）、ペプチド、天然フェノール類（例えば、フラボノイド類）、ポリケチド類、テルペン類、ステロイドおよびテトラピロール類を含み得るが、これに限定されない。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および／または方法のいずれかを、１つ以上のキットとして提供する。キットは、１つ以上のポリペプチド、抗体、プローブおよび／または本明細書に記載されている他のアッセイ試薬を備え得る。キットは、アッセイ試薬を結合または固定し得る固形担体を備えることができる。試薬を、必要に応じて、検出可能なマーカーで標識化することができる。キットは、ポリペプチド、抗体、プローブおよび／または本明細書に記載されている他の試薬を収容、貯蔵および／または運搬するための１つ以上の容器をさらに備えることができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、エピトープ特異的免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）を特異的に標的とし排除する組成物、方法、および／またはキットを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の患者を、本明細書で提供される組成物、方法、および／またはキットを用いて選択し治療して、患者のエピトープ認識免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）を特異的に標的とし排除する。
【０１００】
膜性腎症（ＭＮ）
膜性腎症（ＭＮ）（原発性ＭＮまたは特発性ＭＮとも呼ぶ）は、一般的糸球体疾患である。ＭＮの罹患率は４０歳を超えた患者で高い。頻繁な疾病の再発は、臨床治療の大きな課題である。高用量のステロイドホルモンおよび免疫抑制剤を使用すること以外に効果的な治療はなく、患者は現在の治療では５〜１０年で腎不全に進行する。米国では４，０００〜６，０００件の新たな症例／年があり、欧州では１０，０００件の新たな症例／年があり、世界では８０，０００件の新たな症例／年がある。
【０１０１】
ＭＮは，自己免疫糸球体疾患である。ＭＮの疾病を引き起こす機序は、自己抗体産生Ｂ細胞により生じた循環自己免疫抗体（自己抗体）の腎有足細胞表面上の膜受容体、ホスホリパーゼＡ２受容体（ＰＬＡ２Ｒ）との結合が原因であることが最近特定された。７０％を超える患者が、抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体による原因である。ＭＮはしばしば再発して、５〜１０年で腎不全をもたらす。
【０１０２】
ＭＮに対する現在の臨床治療は、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、リツキシマブ、クロラムブシル、タクロリムス、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル）またはステロイドホルモン（例えば、コルチコステロイド）のいずれかを使用する。しかしながら、これらの治療選択肢の両方とも、非特異的であり、重大な副作用を生じる。これらの治療の容量を減らした場合、しばしば疾病の再発が起こる。さらに、多くの患者では、これらの治療は効果的でない。したがって、まだ、有害な副作用のないＭＮに対する特異的治療に対する強いニーズがある。
【０１０３】
ＭＮの疾病を引き起こす機序は、腎有足細胞表面上のＰＬＡ２Ｒと結合する循環自己抗体が原因であると最近特定された。加えて、ＣＴＬＤ６およびＣＴＬＤ７間のリンカー領域中のＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）およびＧ１１０６Ｓ中における多型Ｍ２９２Ｖａｎｄ  Ｈ３００Ｄが、患者のＭＮの発生と相関があり得る（Kao, L., et al.）
。
【０１０４】
ＭＮ患者の血漿中の抗体レベルは、疾病の重度および治療に対する患者の応答と直接相関する。したがって、有害な副作用を同時に回避しながら疾病を治療するように患者から自己抗体産生Ｂ細胞を取り除くニーズがある。
【０１０５】
ＰＬＡ２Ｒは、約１８０〜１８５ｋＤａの分子量を有する大きな内在性膜タンパク質である（配列番号１４）。マンノース受容体によるＰＬＡ２Ｒの提案された形態を、図１に示す。ＰＬＡ２Ｒは、リガンド、単一膜貫通ドメインおよび短い細胞質末端鎖と相互作用する大きなグリコシル化細胞外部分を含む（図１）。この大きな細胞外部分は、さらに１０ドメイン：縦一列になった、システインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）、フィブロネクチン様ＩＩ型ドメイン（ＦｎＩＩ）、および８つの反復Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）に分割することができる（図１）。
【０１０６】
図１は、ＰＬＡ２Ｒの様々なドメイン（矢印で示している）の境界を画定するアミノ酸の位置を示す。ドメインのいくつかのアミノ酸配列を、配列番号７〜配列番号１２（図１２〜図１７）に示す。ＭＮ患者における自己抗体により認識されるＰＬＡ２Ｒエピトープ
（配列番号１３）は、受容体の細胞外部分に位置し、立体配座であり、還元されやすく、自己抗体に対する非常に高い親和性を有する。
【０１０７】
しかしながら、単独で発現された場合、ＰＬＡ２Ｒエピトープ（図１８：配列番号１３）は、正しい立体配座に適切にフォールディングしない。最初の２つのドメインを含むことで、抗原の適切な立体配座へのフォールディングを可能とする。完全長ＰＬＡ２Ｒタンパク質（図１９：配列番号１４）は、生化学的に安定でないので、大規模で発現、精製をすることができない。しかしながら、ドメイン１〜３ドメインおよびドメイン１〜６までは、大量のタンパク質を発現して得るのに適している。ドメイン１〜５は最適なタンパク質発現を与える。例えば、適切にフォールディングされた立体配座を、配列番号９で示した配列を用いることにより得ることができる。
【０１０８】
ＭＮ患者における抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体の産生は、ＰＬＡ２Ｒのエピトープを認識する特定のＢＣＲを運搬する特定のＢ細胞集団の活性化および増殖による。同じＰＬＡ２Ｒエピトープに対して特異的なＴ細胞受容体を運搬する特定のヘルパーＴ細胞集団に関与された場合に、特定のＢ細胞集団が活性化される。これらの特定のＢ細胞およびＴ細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞の全レパートリーのほんのわずかのみを提示する。
【０１０９】
Ｂ細胞およびＴ細胞の標的化によるＭＮ治療
患者からの抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体の除去は、自己抗体の病理学的影響を軽減し得る。しかしながら、患者からの自己抗体の除去は、依然として患者は疾病再発しやすいままである。これは、ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生Ｂ細胞が、患者血液から病原自己抗体を除去したにもかかわらず、自己抗体を産生し続けているからである。したがって、ＰＬＡ２Ｒエピトープ認識免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の特異的な標的化は、他の免疫細胞の正常な機能に影響を及ぼすことなく、病原性自己抗体の産生を排除することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、組成物、方法、および／またはキットは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ認識免疫細胞を特異的に標的とし排除する。いくつかの実施形態では、組成物、方法、および／またはキットは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ認識Ｂ細胞を特異的に標的とし排除する。いくつかの実施形態では、組成物、方法、および／またはキットは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ認識Ｔ細胞を特異的に標的とし排除する。いくつかの実施形態では、組成物、方法、および／またはキットは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ認識Ｂ細胞およびＴ細胞を特異的に標的とし排除する。いくつかの実施形態では、ＥＤＣは、本明細書で提供される１つ以上のＰＬＡ２Ｒフラグメント、リンカーおよび薬物を含む。
【０１１１】
ＭＮに対する現在の治療は非特異的であり、重大な副作用および頻繁な疾病再発がある。ＭＮに対する本明細書中のＥＤＣは特異的であり、最小限の副作用しかなく／全く副作用がなく、疾病再発を排除する。
【０１１２】
患者は、少なくとも１つのＭＮ臨床症状を示す。ＭＮの症状としては、ネフローゼ症候群、浮腫（身体のいずれかの領域に腫脹）、タンパク尿、尿の泡沫の出現（大量のタンパク質が原因）、排尿（夜、過剰に）、疲労、食欲不振および体重増加の１つ以上が挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、患者は、約１か月〜約５年ＭＮを有している。いくつかの実施形態では、患者は、約１、２、３もしくは４週、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年、または前述の値のいずれか２つにより規定された範囲内、ＭＮを有している。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、患者は、以前にＭＮのための治療を全く受けていない。いく
つかの実施形態では、患者は、以前に、ＭＮに対する治療（免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれか）を受けた。いくつかの実施形態では、患者は、以前に、免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いたＭＮに対する治療に成功した。いくつかの実施形態では、患者は、以前に、免疫抑制剤もしくはステロイドホルモンまたは両方のいずれかを用いたＭＮに対する治療に成功しなかった。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、患者を腎生検に付し、患者がＭＮであることを確認してもよい。いくつかの実施形態では、コントロールサンプルと比較して、患者サンプルにおいて抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体の検出可能な増加がたとえあったとしても、患者を腎生検に付す。いくつかの実施形態では、コントロールサンプルと比較して、患者サンプルにおいて抗ＰＬＡ２Ｒの検出可能な増加がある場合、患者を腎生検に付さない。
【０１１６】
完全長ＰＬＡ２Ｒ（図１９：配列番号１４）は精製するのが難しく、したがって、臨床背景での応用は限られている。したがって、いくつかの実施形態では、患者サンプルからの自己抗体産生Ｂ細胞の除去のための組成物、方法、および／またはキットは、完全長ＰＬＡ２Ｒの精製されたフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ＣｙｓＲ、ＦｎＩＩおよび１つ以上のＣＴＬＤを含む（図２）。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、フラグメントは、少なくともＰＬＡ２Ｒのドメイン１〜５を含む。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号１（約６５８アミノ酸長）において定められた通りである（図６）。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号２で定められた通りである。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号２（図７）で定められた通りであり、配列番号３（図８）に定められた配列の約５％〜約９５％である。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号２（図７）で定められた通りであり、配列番号３（図８）に定められた配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号４（約８０５アミノ酸長）において定められた通りである（図９）。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号５（図１０）で定められた通りである。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号５（図１０）で定められた通りであり、配列番号６（図１１）に定められた配列の約５％〜約９５％である。いくつかの実施形態では、フラグメントの配列は、配列番号５で定められた通りであり、配列番号６（図１１）に定められた配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、組成、方法、および／またはキットは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ認識免疫細胞を特異的に標的とし排除し、１つ以上の薬物（ＥＤＣ）のキャリアとして本明細書で提供されるＰＬＡ２Ｒの１つ以上のフラグメントを含む（図４）。ＰＬＡ２Ｒフラグメントは、特定のＢ細胞および患者の抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体産生に関与している対応するヘルパーＴ細胞に対して、薬物を特異的に標的化するだろう。ＥＤＣは、表面Ｂ細胞およびＴ細胞上の特定の受容体と結合し、エンドサイトーシスにより細胞に侵入することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、遊離システイン残基を、ＰＬＡ２ＲフラグメントのＣ末端において導入する。それから、遊離システインのチオ基を、開裂可能なリンカーと結合する。いくつかの実施形態では、開裂可能なリンカーは、バリン−シトルリンリンカーである。いくつかの実施形態では、バリン−シトルリンリンカーは、薬物とあらかじめ結合している。いくつかの実施形態では、薬物は、デュオカルマイシン類似体である。いくつかの
実施形態では、遊離システイン残基を、ＰＬＡ２ＲフラグメントのＣ末端に導入し、該遊離システインのチオ基を、デュオカルマイシン類似体とあらかじめ結合された開裂可能なバリン−シトルリンリンカーと結合する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＣＸＰＸＲの短い配列を、ＰＬＡ２ＲフラグメントのＣ末端に導入する。いくつかの実施形態では、システイン残基を、ホルミルグリシンアルデヒドタグに変換する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシン生成酵素を用いてホルミルグリシンアルデヒドタグに変換する。いくつかの実施形態では、それから、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、非開裂結合により薬物−リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、オキシム化学による非開裂結合により薬物−リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、ホルミルグリシンアルデヒドタグを、ピクテ・スペングラー反応による非開裂結合により薬物−リンカーと結合する。いくつかの実施形態では、薬物−リンカー中の薬物は、細胞傷害性試薬である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、薬物を、ＢＣＲ相互作用部位の外側の領域においてＰＬＡ２Ｒフラグメントと結合する。いくつかの実施形態では、薬物を、１つ以上のリジン残基とのＢＣＲ相互作用部位の外側の領域においてＰＬＡ２Ｒフラグメントと結合する。いくつかの実施形態では、薬物を、薬物−リンカーに付加されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとのアミド結合による１つ以上のリジン残基とのＢＣＲ相互作用部位の外側の領域においてＰＬＡ２Ｒフラグメントと結合する。
【０１２３】
例えば、いくつかの実施形態では、静脈内経路により患者血液循環中にＥＤＣを投与する。いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒ認識自己抗体産生Ｂ細胞とのＥＤＣの結合は、エンドサイトーシスによる受容体−ＥＤＣ複合体の迅速な内部移行を開始させる（図５）。いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｒ認識Ｔ細胞とのＥＤＣの結合は、エンドサイトーシスによる受容体−ＥＤＣ複合体の迅速な内部移行を開始させる。エンドソームでは、内部移行受容体−ＥＤＣ複合は、結合された薬物の放出によって消化される。いくつかの実施形態では、それから、放出された薬物は、ＰＬＡ２Ｒ認識自己抗体産生Ｂ細胞の死を引き起こす（図５）。いくつかの実施形態では、それから放出された薬物は、ＰＬＡ２Ｒ認識Ｔ細胞の死を引き起こす。いくつかの実施形態では、薬物は、アポトーシスによりＢ細胞およびＴ細胞の死を引き起こす。いくつかの実施形態では、薬物は、非アポトーシス機序によりＢ細胞およびＴ細胞の死を引き起こす。
【０１２４】
尋常性天疱瘡
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、細胞間接着喪失を原因とする上皮内水疱形成を特徴とする潜在的な重篤な自己免疫性水疱形成疾患である。ＰＶは、皮膚および粘膜の両方に影響を及ぼし、ケラチノサイト細胞表面分子デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）およびデスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に向けられた循環病原性自己抗体により媒介される。
【０１２５】
デスモグレインとの自己抗体の結合は、水疱形成を引き起こす細胞−細胞接着喪失をもたらすデスモソームの完全性を損ない、加えて、棘融解をもたらす細胞プロセスを開始させる。ＰＶの粘膜皮膚形態を有する患者は、病原性抗Ｄｓｇ１および抗Ｄｓｇ３自己抗体を有する。ＰＶの粘膜形態を有する患者は、抗Ｄｓｇ３自己抗体のみを有する。
【０１２６】
Ｄｓｇ３およびＤｓｇ１は双方共、各々が５つの細胞外カドヘリン（ＥＣ）ドメイン、１回膜貫通領域および細胞内テールを含む類似の分子構造を有する膜貫通タンパク質である（図２６）。Ｄｓｇ３における優性エピトープは、全ての抗Ｄｓｇ３病原性自己抗体と結合するＥＣ１〜３ドメイン（図２６）中に位置する。Ｄｓｇ３  ＥＣ１〜３ドメインは、３３４個のアミノ酸を含む。Ｄｓｇ１における優性エピトープは、全ての抗Ｄｓｇ１病原性自己抗体と結合するＥＣ１〜２ドメイン（図２６）に位置し、Ｄｓｇ１  ＥＣ１〜２
は、それぞれ、２２１個のアミノ酸を含む。エピトープにおけるカルシウム結合部位は、自己抗体結合にとって重要である（図２６）（Ohyama, B., et al.）。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ１におけるエピトープによるＥＤＣを提供する。図３１は、本開示によるＤｓｇ１エピトープベースＥＤＣの開発に使用されるＤｓｇ１のエピトープの実施形態のアミノ酸配列（配列番号１６：３３６アミノ酸）を示す。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ３におけるエピトープによるＥＤＣを提供する。図３２は、本開示によるＤｓｇ３エピトープベースＥＤＣの開発に使用されるＤｓｇ３のエピトープの実施形態のアミノ酸配列（配列番号１７：４５０アミノ酸）を示す。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３におけるエピトープによるＥＤＣを提供する。
【０１２８】
Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３におけるエピトープによるＥＤＣの実施形態の模式図を図２７に示す。ＰＶ治療のためのＤｓｇ１およびＤｓｇ３におけるエピトープによるＥＤＣの開発は、実施例７に記載している。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、グリコシル化される可能性のある残基を、例えば、Ｄｓｇ１フラグメントまたはＤｓｇ３フラグメントを発現する発現ベクターを用いる場合、部位特異的変異誘発を用いて置換することができる。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３タンパク質フラグメントを直接合成する場合、グリコシル化される可能性のある残基が自己抗体認識に関してタンパク質構造および／または立体配座に影響を与えないだろう非グリコシル化残基で置換されるように、ペプチドおよび／またはタンパク質合成をカスタマイズすることができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、さらなる改変をＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントに行って、例えば、試薬（例えば、薬物）をＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントと結合させてもよく、細胞表面上の受容体にＤｓｇ１またはＤｓｇ３エピトープの接近性を向上させてもよく、および／またはタンパク質発現および収量を向上させてもよい。例えば、小さい（約２〜１０アミノ酸）Ｎ末端もしくはＣ末端ペプチドまたは両方を挿入すること、保存的置換および／または非保存的置換すること、および／または１つ以上の異種配列を付加して所望の目的を達成することにより、Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントを改変してもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントの１つ以上を核酸によりコードする。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３をコードする核酸は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３をコードする核酸は、タンパク質発現ベクター内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、哺乳類細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、昆虫細胞発現ベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクター内に含まれるＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントをコードする核酸は、調節エレメントと機能可能に連結してＰＬＡ２Ｒフラグメントの発現を調節する。
【０１３２】
調節エレメントは、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、その他を含み得る。本明細書で使用されるとき、「機能可能に連結した」とは、核酸からのタンパク質発現を正または負に制御する調節エレメントを表す。
【０１３３】
本明細書で提供されるタンパク質発現ベクターおよび当業者に公知の他のもののうち１つ以上を使用して、本明細書で提供される組成物、方法、および／またはキットのうち１
つ以上に組み込むために、本明細書で提供されるＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントのうち１つ以上を大量に得ることができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、コードされたＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントにタグを導入する。いくつかの実施形態では、タグはＮ末端にある。いくつかの実施形態では、タグはＣ末端にある。いくつかの実施形態では、タグは両末端にある。タグの非限定的例としては、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−転移酵素、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧ、Ｖ５、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＮＥ、ビオチン、ビオチンカルボキシルキャリアプロテイン、ＧＦＰ、Ｈａｌｏ、Ｎｕｓ、Ｆｃ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン、ポリＧｌｕ、Ｅ、Ｓ、ＳＢＰ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＴＣ、ＶＳＶ、ＴｙおよびＸｐｒｅｓｓが挙げられる。いくつかの実施形態では、タグは、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）タグである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現ベクターは、Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントおよびタグ間の開裂可能部位を付加的に導入する。いくつかの実施形態では、開裂部位は、タンパク質分解部位である。タンパク質分解部位の非限定的例としては、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子またはエンテロペプチダーゼの部位が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質分解部位は、トロンビン開裂部位である。
【０１３６】
他の開裂可能部位
例えば、いくつかの実施形態では、ポリＨｉｓタグＤｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントを哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）内で発現し、Ｎｉ−アフィニティ精製を用いて、細胞培養培地から精製することができる。それから、ポリＨｉｓタグをタンパク質消化（例えば、トロンビンを用いて）により除去することができ、Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３フラグメントを、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてさらに精製し、トロンビン酵素ならびに遊離したポリＨｉｓタグを除去する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、自己抗体は、例えば、ＰＶ患者において、皮膚（皮膚コンパートメント中の標的細胞間結合）および／または皮下コンパートメント中に蓄積し得る。このような状況では、ＥＤＣを皮下に送達する場合、ＥＤＣはちょうど注入部位において中和され得、リンパ節に到達しない。したがって、皮膚および／または皮下コンパートメント中の自己抗体により本明細書中の１つ以上のＥＤＣの可能性ある中和のおかげで、自己抗体を低減させおよび／または排除するために、ＰＶ患者を１つ以上の免疫抑制剤（例えば、リツキサン）を用いて最初に治療する。免疫抑制剤は皮膚および／または皮下コンパートメント中の自己抗体を特異的に標的としないが、免疫抑制剤は免疫系を抑制し、したがって、自己抗体の産生を抑制する。この結果、新しい抗体の産生を阻害し、循環自己抗体を排除する（循環自己抗体は再循環されおよび／またはその半減期に基づき分解する）。それから、静脈内、皮下および／または皮内経路によりＰＶ患者に本明細書中の１つ以上のＥＤＣを投与して、リンパ節中の自己免疫記憶Ｂ細胞を標的とし疾病再発を阻止することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つ以上のＥＤＣを、１つ以上の免疫抑制剤治療と併用で使用して、疾病再発を阻止することができる。例えば、ＰＶは高い頻度の再発を有し、反復リツキサン治療は致死性感染症の原因となる。したがって、リツキサン投与後の本明細書中の１つ以上のＥＤＣの投与は、ＰＶ患者の致死性感染症を阻止することができる。加えて、リツキサンは、リンパ節中の自己免疫記憶Ｂ細胞に達することができない。対照的に、ＥＤＣは、リンパ節中の自己免疫記憶Ｂ細胞に達することができる。したがって、再発の阻止に加えて、ＥＤＣは、リンパ節中の自己免疫記憶Ｂ細胞の排除によりＰＶ患者を治癒することができる。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は非限定的であり、本発明を例証し、本発明を実施および使用する際に当業者の助けとするためにのみ提示されている。実施例はいかなる方法でも本発明の範囲を別様に限定するものではない。
【０１３９】
実施例１
ＭＮ患者から血液を採取する。血液から全Ｂ細胞を単離する。ＦＡＣＳを使用して、ＰＬＡ２Ｒエピトープに対する受容体を発現する細胞を特定し分離する。ＰＬＡ２Ｒエピトープに対する受容体を運搬する細胞にＥＤＣを添加する。ＰＬＡ２Ｒエピトープに対する受容体を発現しない細胞をコントロールとして使用する。ＥＤＣを、各細胞集団に、該ＥＤＣ中の薬物の通常の用量の１０００分の１の用量で添加する。細胞集団を、ＥＤＣと共に一夜インキュベートする。ＰＬＡ２Ｒエピトープ受容体を発現する細胞はＥＤＣによって殺されるが、受容体を発現しない細胞は影響を受けず生き残る。細胞をトリパンブルーで染色してＰＬＡ２Ｒエピトープに対する受容体を発現する細胞を殺すことにおけるＥＤＣの有効性を評価することができる。
【０１４０】
実施例２
ＭＮ患者から血液を採取する。ＰＬＡ２Ｒエピトープに対する受容体を発現する細胞に蛍光標識ＰＬＡ２Ｒエピトープで標識化する。標識化および標識化していない細胞を、顕微鏡を用いて分離する。標識化していない細胞をコントロールとして使用する。ＥＤＣを、各細胞集団に、該ＥＤＣ中の薬物の通常の用量の１０００分の１の用量で添加する。細胞集団を、ＥＤＣと共に一夜インキュベートする。ＰＬＡ２Ｒエピトープ受容体を発現する細胞をＥＤＣにより殺すが、受容体を発現しない細胞は影響を受けず生き残る。細胞をトリパンブルーで染色してＰＬＡ２Ｒエピトープに対する受容体を発現する細胞を殺すＥＤＣの有効性を評価することができる。
【０１４１】
実施例３
１つの例では、本明細書で提供される１つ以上の治療選択肢を用いた治療後、ＭＮ患者は、以前に治療レジメンを受けて約６か月と比較して、約１か月で回復した。患者の回復を、尿中タンパク質レベルにより測定した。
【０１４２】
実施例４−部位特異的化学結合に対する改変ＰＬＡ２Ｒエピトープのエンジニアリング
ＰＬＡ２Ｒエピトープは、最低でも３つのドメイン、すなわち、Ｎ末端システインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）、フィブロネクチン様ＩＩ型ドメイン（ＦｎＩＩ）、およびＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）を含む（図１、図２、および図２３）。エピトープと自己抗体および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）との相互作用の性質は、いまだに明らかでない。エピトープとの化学物質の結合は、抗体抗原相互作用と干渉しないことは重要である。
【０１４３】
これを達成するため、結合に対するＰＬＡ２Ｒエピトープの特異的部位を開発した。詳細には、遊離システインをエピトープのＣ末端鎖中に操作して化学結合のための特異的部位を開発した。ＴＥＶ開裂部位およびＨｉｓタグ（６ヒスチジン残基）もエピトープタンパク質Ｃ末端中に操作してタンパク質精製のためにシステインを導入した。図２３（上）は、タンパク質精製および薬物結合のための改変ＰＬＡ２Ｒエピトープ構築物の設計の模式図を示す。図２３（中央）は、薬物（細胞傷害性薬剤）が精製されたＰＬＡ２Ｒエピトープとどのように結合しているかの模式図を示す。
【０１４４】
タンパク質発現の評価により、改変ＰＬＡ２Ｒエピトープが充分に発現され、抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体に強力に達し、導入されたシステインがエピトープのフォールディングに影響を及ぼさないことを示すことが分かった。それから、構築物はＨＥＫ２９３細胞内で発現され、エピトープタンパク質はニッケルおよびゲルろ過カラムを用いて精製され、次い
で、ＴＥＶが開裂されＨｉｓタグを除去した。それから、タンパク質を蛍光剤（例えば、ＦＩＴＣ）または細胞傷害性試薬（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））と結合する。
【０１４５】
図２３（上）は、タンパク質精製および薬物結合のための改変ＰＬＡ２Ｒエピトープ構築物の設計を示す。ＰＬＡ２Ｒ  ＥＤＣの設計では、部位特異的結合部位をＰＬＡ２Ｒエピトープ、次いで、ＴＥＶ開裂部位およびＨｉｓタグを導入した。図２３（中央）は、薬物が精製されたＰＬＡ２Ｒエピトープとどのように結合しているかを示す。精製エピトープタンパク質を、部位特異的な方法で細胞傷害性薬剤と結合する。図２３（下）は、精製後のＰＬＡ２Ｒエピトープタンパク質の純度を示す。結合ＰＬＡ２Ｒエピトープタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。エピトープを７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、正確な分子量（約３７ｋＤａ）における単一タンパク質バンドを示した（図２３：左下）。
【０１４６】
別の実験（図２３：右下）では、等量のエピトープ、ＦＩＴＣ結合エピトープおよびＭＭＡＥ結合エピトープタンパク質を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、膜に移して、抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体を含む患者血清によりプローブした。非結合および結合ＰＬＡ２Ｒエピトープタンパク質を非還元条件下４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体を含む患者血清によりプローブした（図２３、右下）。結果は、薬物結合ＰＬＡ２Ｒエピトープは、非結合ＰＬＡ２Ｒエピトープと同様に強力に自己抗体と結合していることを示した（図２３、右下）。
【０１４７】
抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体を用いたウェスタンブロッティング法は、ＰＬＡ２Ｒエピトープが抗ＰＬＡ２Ｒ自己抗体と強力に反応し、導入されたシステインはエピトープのフォールディングに影響を及ぼさないことを示した（図２３（右下；ウェスタンブロット））。それから、構築物はＨＥＫ２９３細胞内で発現され、エピトープタンパク質はニッケルおよびゲルろ過カラムを用いて精製され、次いで、ＴＥＶが開裂されＨｉｓタグを除去した。それから、タンパク質を蛍光剤（例えば、ＦＩＴＣ）または細胞傷害性試薬（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））と結合する（図２３）。
【０１４８】
実施例５−ＰＭＮ患者から単離された記憶Ｂ細胞と結合するＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣの評価 
ＰＭＮは、Ｂ細胞媒介自己免疫疾患である。病原性自己抗体は、ＰＬＡ２Ｒエピトープと特異的に結合する固有のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を有し、記憶Ｂ細胞群由来血漿細胞から分泌される。記憶Ｂ細胞のこの群を識別し、ＰＬＡ２Ｒエピトープ薬物複合体が記憶Ｂ細胞群のこの群の表面上のＢＣＲと効果的に結合することができるか否かを評価するため、ＰＭＮ患者の血液サンプルから単離された全Ｂ細胞に対するＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣ分析を用いて結合アッセイを行った。患者末梢血液から単離された全Ｂ細胞を、ウシ胎仔血清および抗生物質を添加したＲＰＭＩ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２において一夜培養した。それから、細胞を、上下にピペッティングして分散し、集めて、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を、４℃で１時間、ＰＢＳ中ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍにおいて蛍光顕微鏡下で撮像した。図２４は、ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣで標識化されたＢ細胞集団が、ＰＭＮ患者のＰＬＡ２Ｒエピトープ結合記憶Ｂ細胞の特定集団の存在、およびこれらの記憶Ｂ細胞表面上でのＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣとＢＣＲとの強力な結合を示していることを示す。
【０１４９】
実施例６−ＰＭＮ患者から単離された記憶Ｂ細胞に対するＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＭＭＡＥの有効性評価
ＰＭＮ患者から単離されたＰＬＡ２Ｒエピトープ特異的記憶Ｂ細胞の排除に対するＰＬＡ
２Ｒエピトープ−ＭＭＡＥの有効性を評価した。ＭＭＡＥは、細胞死を引き起こすチューブリン重合を阻害する強力な細胞傷害性薬剤である。ＭＭＡＥは、リンパ腫治療用抗体−薬物複合体、ブレンツキシマブベドチン（商品名アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ））の開発のために使用され、２０１１年にＦＤＡにより認可された。患者末梢血液から単離された全Ｂ細胞を、ＲＰＭＩ培地中一夜培養してから、１２ウェル細胞培養プレート（２ｍｌ／ウェル）の２つのウェル中に等しく分割した。１つのウェルの細胞をＭＭＡＥと共にインキュベートし、他を細胞培養インキュベーター内で２４時間ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＭＭＡＥと共にインキュベートした。それから、両方のウェルからの細胞を集め、氷冷ＰＢＳで洗浄し、４℃で１時間、ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍにおいて蛍光顕微鏡下で撮像した。
【０１５０】
ＭＭＡＥ単独とのプレインキュベーションは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣにより染色されている多くのＢ細胞をもたらした（図２５）。対照的に、ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＭＭＡＥとのプレインキュベーションは、ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＭＭＡＥによるＰＬＡ２Ｒエピトープ特異的記憶Ｂ細胞の特異的標的化および排除を示すＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＦＩＴＣ染色はないことを示した（図２５）。ＰＬＡ２Ｒエピトープ−ＭＭＡＥ治療Ｂ細胞の光学顕微鏡画像は、ＥＤＣが大部分のＢ細胞に対してほとんど効果がないことも示した（図２５）。
【０１５１】
実施例７−尋常性天疱瘡に対するＥＤＣ治療の開発
自己抗体結合にとって重要であるＤｓｇ３エピトープ中にカルシウム結合部位を保存するために、Ｄｓｇ３  ＥＣ１〜４ドメイン（４５０アミノ酸；図３２；配列番号１７）を薬物結合のためのエピトープとして選択した。Ｄｓｇ３  ＥＣ１〜４における特異的結合部位を開発するために、全ての内在性システイン（図３２の下線部）を構造類似アミノ酸セリンと置き換えた。加えて、２つの内在性Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ６１およびＡｓｎ１３１；図３２の下線部）を構造類似アミノ酸グルタミンと置き換えた。薬物結合のためＤｓｇ１エピトープを設計するために同様なアプローチをして、改変Ｄｓｇ１  ＥＣ１〜３ドメイン（３３６アミノ酸）を選択した（図３１；配列番号１６）。生成されたエピトープを、Ｄｓｇ１  ＥＣ１〜３およびＤｓｇ３  ＥＣ１〜４と名付けた。Ｄｓｇ１  ＥＣ１〜３エピトープの分子量は約３５ｋＤａであり、Ｄｓｇ３  ＥＣ１〜４エピトープの分子量は約６０ｋＤａであった。
【０１５２】
それから、遊離システインを各エピトープのＣ末端鎖中に操作して、化学結合のための特異的部位を開発した。ＴＥＶ開裂部位およびＨｉｓタグ（６Ｈｉｓ）も、タンパク質精製のためのシステイン導入後にエピトープタンパク質中に操作した（図２７）。
【０１５３】
操作されたエピトープをＨＥＫ２９３細胞内で発現し、ニッケルアフィニティおよびゲルろ過カラムを用いて培養培地から精製し、次いで、ＴＥＶを開裂してＨｉｓタグを除去した（図２８、左図；クマシーブルー）。それから、エピトープを、蛍光剤（例えば、ＦＩＴＣ）または細胞傷害性試薬（例えば、ＭＭＡＥ）のいずれかと結合した。
【０１５４】
Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３に対する自己抗体は、未変性Ｄｓｇ１またはＤｓｇ３タンパク質と優先的に結合するので、ＴＥＶ処理前の２つのエピトープの精製ＦＩＴＣまたはＭＭＡＥ複合体を、ＰＢＳ緩衝液中で粘膜皮膚ＰＶ患者血清と混合して免疫複合体を生成し、それからタンパク質Ｇビーズと免疫沈降させた。Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ精製複合体の等量（ＴＥＶ開裂前）を、４℃で２時間、ＰＢＳ緩衝液中で粘膜皮膚ＰＶ患者血清と混合し、タンパク質Ｇビーズと免疫沈降させた。ビーズを広範囲に洗浄し、結合したエピトープをＳＤＳサンプル緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、膜に移して、抗Ｈｉｓタグ抗体によりプローブした（図２８、中央および右図；ウェスタンブロット）
。ウェスタンブロットの結果により、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３の操作および化学結合したエピトープは自己抗体と強力に反応し、タンパク質Ｇビーズとよく免疫沈降し、エピトープタンパク質の操作および化学結合が自己抗体−抗原相互作用と干渉しないことを示すことが分かった。
【０１５５】
実施例８−粘膜皮膚ＰＶ患者から単離された記憶Ｂ細胞と結合するＤｓｇエピトープ−ＦＩＴＣの評価
粘膜皮膚ＰＶ患者の血液サンプルから単離された記憶Ｂ細胞における特定のＢＣＲと結合するＤｓｇエピトープ−ＦＩＴＣの能力を評価した。まず、末梢血液単核細胞を、密度勾配遠心分離（ヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）−１０７７）を用いて全血から単離し、次いで、Ｂ細胞ネガティブ単離キットを用いてＢ細胞を単離した。それから、単離された全Ｂ細胞を、ウシ胎仔血清および抗生物質を添加したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２において一夜培養した。それから、細胞を処理し、ＰＢＳ中、４℃で１時間、Ｄｓｇエピトープ−ＦＩＴＣで染色し、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍにおいて蛍光顕微鏡で撮像した。図２９は、Ｄｓｇエピトープ−ＦＩＴＣはＢ細胞群を強力に染色し、これらの記憶Ｂ細胞表面上のＢＣＲとのＤｓｇエピトープ−ＦＩＴＣの強い結合を示す。
【０１５６】
実施例９−粘膜皮膚ＰＶ患者から単離された記憶Ｂ細胞上のＤｓｇエピトープ−ＭＭＡＥの有効性評価
粘膜皮膚ＰＶ患者から単離された、それぞれ、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ特異的記憶Ｂ細胞を排除するためのＭＭＡＥと結合したＤｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープの有効性を評価した。患者末梢血液から単離された全Ｂ細胞を、ＲＰＭＩ培地中で一夜培養してから、１２ウェル細胞培養プレート（２ｍｌ／ウェル）の２つのウェル中に等しく分割した。１つのウェルの細胞をＭＭＡＥと共にインキュベートし、他を細胞培養インキュベーター内で２４時間Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＭＭＡＥと共にインキュベートした。それから、両方のウェルからの細胞を集め、氷冷ＰＢＳで洗浄し、４℃で１時間、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍにおいて蛍光顕微鏡下で撮像した。
【０１５７】
ＭＭＡＥ単独とのプレインキュベーションは、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＦＩＴＣにより染色されている多くのＢ細胞をもたらした（図３０）。対照的に、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＭＭＡＥとのプレインキュベーションは、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＭＭＡＥによるＤｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ特異的記憶Ｂ細胞の特異的標的化および排除を示すＤｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＦＩＴＣ染色はないことを示した（図３０）。Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３エピトープ−ＭＭＡＥ治療Ｂ細胞の光学顕微鏡画像は、ＥＤＣが大部分のＢ細胞に対してほとんど効果がないことも示した（図３０）。
【０１５８】
本明細書で使用されるとき、節の見出しは、構成的な目的のためだけのものであり、いかなる場合も記載された主題を限定すると解釈すべきでない。これに限らないが、特許、特許出願、論文、書籍、学術論文、およびインターネットウェブページを含む本願中に引用された全ての文献および類似の材料は、いかなる目的のためでも、その全文を参照することにより明示的に組み入れられるものとする。組み入れられた参照中の用語定義が本教示中で定められた定義と異なるように思われる場合、本教示中で定められた定義が優先する。少しおよびごくわずかな偏差が本明細書中の本教示の配位内であるように、本教示中で議論される温度、濃度、時間などの前に黙示的「約」があると理解されるであろう。
【０１５９】
本願では、特に断りがない限り、単数形の使用は複数形を含む。また、「含む（ｃｏｍ
ｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は限定的でないことを意図している。
【０１６０】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、特に文脈から別の意味を明示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の意味を含む。
【０１６１】
本明細書で使用されるとき、「約」は、指示量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対して２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％の大きさで変動する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを意味する。
【０１６２】
本発明は、特定の実施形態および実施例との関連で開示されているが、当業者は、本発明が具体的に開示された実施形態の範囲外で、本発明の他の代替の実施形態および／または使用ならびにその明白な修飾および均等物まで及ぶことを理解するだろう。加えて、本発明のいろいろな変化形が詳細に示され記載されているが、本発明の範囲内である他の修飾は、本開示に基づいて当業者に容易に明らかとなるであろう。実施形態の具体的特徴および態様の様々な組合せまたはサブコンビネーションを行ってもよく、まだ本発明の範囲内となることも理解される。本開示された実施形態の様々な特徴および態様を、本開示の発明の様々な様式または実施形態を形成するために互いを組合せることも、置き換えることもできると理解されるべきである。したがって、本明細書中開示された本発明の範囲が上記特定の開示された実施形態により限定されるべきでないものとする。
【０１６３】
しかしながら、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変化および修飾が当業者に明白になるので、本詳細な説明は例証によってのみ与えられると理解されるべきである。
【０１６４】
本明細書中で提示された説明で使用された用語は、いかなる限定的にも制限的にも解釈されないものとする。むしろ、用語は、システム、方法および関連構成成分の実施形態の詳細な説明と関連して単純に利用されている。さらに、実施形態は、いくつかの新規な特徴を含んでもよく、そのうちの１つが、その所望の特質に単独で原因となることも、本明細書に記載された本発明の実践に必須であると考えられることもない。
【０１６５】
前述の説明中に開示された概念および具体的実施形態を、本発明の同じ目的を実行するために他の実施形態を修飾または設計するための基礎として容易に利用してもよいと、当業者は認識するだろう。
【０１６６】
本願で使用された全ての科学および技術用語は、特に断りがない限り、当技術分野で共通に使用される意味を有する。本願中で使用されるとき、次の語またはフレーズは指定された意味を有する。
【０１６７】
本明細書で使用されるとき、「検出可能なマーカー」または「標識」は、試薬の部分と結合、または試薬の部分として合成された分子である。この分子は、独自に検出可能であり、試薬が結果として検出されることを可能とする。これらの検出可能な部分は、放射性同位体、化学発光分子、酵素、ハプテン、または独自のオリゴヌクレオチド配列でさえあることがしばしばである。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」としては、タンパク質、タンパク質のフ
ラグメント、および天然源から単離、組換え技術により製造または化学的に合成されたかにかかわらずペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、通常、少なくとも約６アミノ酸を含む。より短いポリペプチド、例えば、約５０アミノ酸長未満のものは、通常、「ペプチド」と呼ぶ。
【０１６９】
本発明のポリペプチドは、いくつかの実施形態では、天然タンパク質の変異体を含む。本明細書で使用されるとき、ポリペプチド「変異体」は、ポリペプチドの治療有効性が実質的に小さくならないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において天然タンパク質と異なるポリペプチドである。すなわち、天然タンパク質と比較して、有効性は増強してもよく変化しなくてもよく、天然タンパク質と比較して５０％未満小さくてもよく、好ましくは２０％未満小さくてもよい。好ましい変異体としては、Ｎ末端リーダー配列などの１つ以上の部分が除去されたものが挙げられる。他の好ましい変異体としては、小さい部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が天然タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された変異体が挙げられる。ポリペプチド変異体は、好ましくは、同定されたポリペプチドと少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性（上記のように決定される）を示す。当技術分野で知られているように、変異体は、結合パートナーに対するポリペプチドの親和性を最適化するように選択することもできる。
【０１７０】
好ましくは、変異体は、保存置換を含む。「保存置換」は、ペプチド化学の当業者が置換的に変化しないポリペプチドの第二構造およびヒドロパシー性を期待するように、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸と置き換わるものである。アミノ酸置換は、概して、残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または両性の類似性を基本として行ってもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが挙げられ；ならびに類似の親水性値を有する無荷電極性頭部を有するアミノ酸としてはロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存変化を示し得るアミノ酸の他の群としては：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；および（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ。変異体は、非保存的変化も含んでもよく、または代替的に含んでもよい。好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドは、５個のアミノ酸または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により天然配列と異なる。変異体を、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシー性に対する最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加により改変してもよい（または代替的に改変してもよい）。
【０１７１】
本明細書中で提示された説明で使用された用語は、いかなる限定的にも制限的にも解釈されないものとする。むしろ、用語は、システム、方法および関連構成成分の実施形態の詳細な説明と関連して単純に利用されている。さらに、実施形態は、いくつかの新規な特徴を含んでもよく、そのうちの１つが、その所望の特質に単独で原因となることも、本明細書に記載された本発明の実践に必須であると考えられることもない。
【０１７２】
しかしながら、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修飾は当業者に明白であるので、本詳細な説明は例証によってのみ与えられると理解されるべきである。
【０１７３】
参考文献
本開示中に引用された全ての参考文献は、その全文を参照することにより本明細書に組
み入れられるものとする。
【０１７４】
米国特許第８，５０７，２１５（Ｂ２）号
【０１７５】
Beck, L.H., et al., N Engl J Med, Vol. 361, pp. 11-21, 2009.
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Roozendaal, R., et al, Immunity, Vol. 30, pp. 264-276, 2009.
【図１】
2019524884.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019524884.tif 000036
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