(57)【要約】  癌にかかった犬において、犬ＥＣＰＫＡ蛋白質が高い水準で分泌され、犬ＥＣＰＫＡ蛋白質に対する自家抗体が形成されるということが明かされた。人間ＥＣＰＫＡが犬ＥＣＰＫＡ自家抗体に選択的に結合せず、バイオマーカーとして作用できないということも明かされた。また、犬ＥＣＰＫＡ自家抗体の検出は、このような抗体の定量的測定が採択される場合にのみ犬の癌に対する意味のある診断道具として使われ得る。犬ＥＣＰＫＡ自家抗体の測定が確実でない場合、ＣＲＰを測定することは以下に追加説明する犬ＥＣＰＫＡ自家抗体測定の予測可能性を向上させるために使われ得る補充データを提供することができる。【選択図】図１１
2019536056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
犬の血中で犬ＥＣＰＫＡ抗体を定量的に検出するためのラテラルフローキットであって、
配列番号５を含むアミノ酸配列を有する固定され精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を有する第１固体相、
第１結合蛋白質と接合されている光学密度を有する接合された着色剤を含む接合体パッドおよび
第２結合蛋白質を含む第２固体相を含み、
前記接合された着色剤が前記第１固体相では第１色相強度を提供し、前記第２固体相では第２色相強度を提供するように構成されており、
前記第１色相強度が犬の血中抗体濃度に定量的に依存し、前記第２色相強度が抗体濃度と無関係な、ラテラルフローキット。
【請求項２】
前記接合された着色剤の光学密度が５〜３０である、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項３】
前記接合された着色剤の光学密度が１０〜２０である、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項４】
前記ラテラルフローキットが少なくとも約８０％の特異性と少なくとも約８０％の感度で犬において癌を検出する、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項５】
前記第１色相強度が、前記第１色相強度を前記第１色相強度と抗体濃度間の相関データセットと比較することによって抗体濃度を提供する、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項６】
前記相関データセットの一部分が線形方程式によって近似的に表現され得、これは前記第１色相強度が前記相関データセットのうちいずれとも正確に一致しない場合に濃度を決定できるようにする、請求項５記載のラテラルフローキット。
【請求項７】
前記第１結合蛋白質が、ストレプタビディン、バイオティーン、蛋白質Ａ、抗−犬ＩｇＧラット、抗−犬ＩｇＧウサギ、抗−犬ＩｇＧヤギ、抗−犬ＩｇＧ羊および抗体に結合できる蛋白質からなる群から選択される、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項８】
前記第２結合蛋白質が、ストレプタビディン、バイオティーン、蛋白質Ａ、抗−ラットＩｇＧ、抗−ウサギＩｇＧ、抗−ヤギＩｇＧ、抗−さんＩｇＧおよびＩｇＧに結合できる蛋白質からなる群から選択される、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項９】
前記着色剤が、金、ラテックス、ｇｆｐ、ｆｉｔｃおよびＵＶ活性接合剤からなる群から選択される、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項１０】
血球を濾過するフィルタ位相をさらに含む、請求項１記載のラテラルフローキット。
【請求項１１】
犬の血中で犬ＥＣＰＫＡ抗体の濃度を決定する方法であって、
（ａ）ラテラルフローキットのために犬の血液から検査サンプルを用意するステップ
（ｂ）前記検査サンプルを前記ラテラルフローキットに適用するステップ
（ｃ）前記ラテラルフローキットが発色するようにするステップ
（ｄ）検査線を含む発色した前記ラテラルフローキットのデジタル写真を撮影してデジタル情報を得るステップおよび
（ｅ）抗体の濃度を得るステップであって、前記濃度がデジタル値を抗体濃度と関連させるデータセットとデジタル情報を比較することによって決定されるステップを含み、
前記ラテラルフローキットが
配列番号５を含むアミノ酸配列を有する固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を有する第１固体相、
第１結合蛋白質と接合されている光学密度を有する接合された着色剤を含む接合体パッドおよび
第２結合蛋白質を含む第２固体相を含み、
前記接合された着色剤が前記第１固体相では第１色相強度を提供し、前記第２固体相では第２色相強度を提供するように構成され、
前記第１色相強度が犬の血中抗体濃度に定量的に依存し、前記第２色相強度が抗体濃度と無関係な、方法。
【請求項１２】
犬が癌を患っている可能性を決定するステップをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
デジタル情報を無線通信を通じて外部サーバーに伝送するステップをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記デジタル情報を得るステップが、無線通信モジュール、カメラモジュール、光源および前記ラテラルフローキットを収容するように設計されたスロットを含むリーダーボックスを使って実施される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記無線通信モジュールが短距離無線通信プロトコルに基づいて作動する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
光学密度が５より高い、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
光学密度が１０より高い、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が少なくとも約８０％の特異性と少なくとも約８０％の感度で犬において癌を検出する、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体濃度が０．９より大きいＲ２値を有する線形方程式を使って推定される、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の血中で犬ＥＣＰＫＡ抗体の濃度を測定する方法であって、
（ａ）ラテラルフローキットのために哺乳動物の血液から検査サンプルを用意するステップ
（ｂ）前記検査サンプルを前記ラテラルフローキットに適用するステップ
（ｃ）前記ラテラルフローキットが発色するようにするステップ
（ｄ）発色した前記ラテラルフローキットのデジタル写真を撮影してデジタル情報を得るステップおよび
（ｅ）抗体の濃度を得るステップであって、前記濃度がデジタル写真で得たデジタル値を抗体濃度と関連させるデータセットと検査線のデジタル情報を比較することによって測定されるステップを含み、
前記ラテラルフローキットが
アミノ酸配列を有する固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を有する第１固体相、
第１結合蛋白質と接合されている５以上の光学密度を有する接合された着色剤を含む接合体パッドおよび
第２結合蛋白質を含む第２固体相を含み、
前記接合された着色剤が前記第１固体相では第１色相強度を提供し、前記第２固体相では第２色相強度を提供するように構成され、
前記第１色相強度が犬の血中抗体濃度に定量的に依存し、前記第２色相強度が抗体濃度と無関係な、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、犬（ｃａｎｉｎｅ）ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を抗原として使って犬の癌を検出するための装置および方法に関する。検出方法および装置は、治療的に意味のある選択性と特異性で犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質またはそのサブユニットに結合できる抗体の定量的検出を利用する。
【背景技術】
【０００２】
人間と犬は遺伝的におよび免疫学的に多くの類似点を共有しているものの、同時に多くの異なる免疫反応および生物学的反応も示す。例えば、人間はエイズウイルスに感染され易いが、犬は前記ウイルスに耐性がある。また、犬は犬ジステンパーに感染され易いが人間はそうではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
潜在的なバイオマーカーが人間には有用であるが、犬には有用でない多くの異なる例がある。例えば、Ｓ期−特異的蛋白質チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）は、文献［Ｈ．  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、Ｖｅｔ  Ｃｏｍｐ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１１  Ｍａｒ、９（１）：１−１５．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．  ｌ４７６−５８２９．２０１０．００２３８．ｘ．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｕｇ  １９］に記載されたように、人間の癌に有用なバイオマーカーであるものと公知とされている。ＴＫ１の発現はＳ期細胞の比率および増殖水準と密接な関連がある。正常細胞において、ＴＫ１活性は後期Ｇ１期および初期Ｓ期の間にのみ存在するが、多くの腫瘍細胞でＴＫ１活性はより高く、Ｓ期およびＧ２期の間ずっと維持される。過度な制御されていない細胞の増殖は癌の特徴の一つである。したがって、ＴＫ１活性の水準は癌とその相関関係を判定するために調査されたのであり、乳癌を含む固形腫瘍のような腫瘍の診断およびモニタリングに有用なものと立証された。また、ＴＫ１の主な長所は、いくつかのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体がＴＫ１に結合され得るということである。最も特異的で敏感性のＴＫ１抗体は、ＴＫ１のＣ−末端を示す３１−アミノ酸ペプチドに対して生産される。ＴＫ１の蛋白質配列相同性は人間と犬と間に高い［Ｈ．  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ］。犬ＴＫ１と人間ＴＫ１の１次アミノ酸配列は、Ｎ−末端から約２００個のアミノ酸で非常に相同性を有するが、Ｃ−末端領域は異なる。
【０００４】
人間と犬と間の蛋白質配列の高い相同性にもかかわらず、乳癌を含む４種の異なる固形腫瘍を有する犬で、ＴＫ１値は正常範囲内であると明かされた［Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｎ、Ｍｏｍｏｉ  Ｙ、Ｗａｔａｒｉ  Ｔ、Ｙｏｓｈｉｎｏ  Ｔ、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  Ｈ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ａ．、Ｐｌａｓｍａ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７；５９：９５７−９６０］。また、固形癌を有する検査された５０匹の犬のうち３匹のみがＴＫ１活性の増加を見せた［Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｕｍ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ、ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００８；３４：５０５−５１０］。犬ＴＫ１は人間ＴＫ１とは異なり、犬の癌の検出に有用なバイオマーカーではない。また、人間ＴＫ１に対して誘導された最も敏感で選択的な抗体は、犬ＴＫ１を認識できない［Ｈ．  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ］。同様に、類似する領域の犬ＴＫ１に対して誘導された抗体は、人間ＴＫ１蛋白質によって認識されない可能性が高い。
【０００５】
哺乳動物細胞でｃＡＭＰ作用を媒介するセリン／スレオニン蛋白質キナーゼであるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存性蛋白質キナーゼＡ（ＰＫＡ）は、細胞の増殖、分化、代謝作用およびアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）のような多様な生物学的過程の制御に関与する。ＰＫＡの調節解除は癌の発生および進行と関連しており、実際にその過発現はたびたび異なる種類の人間の癌で観察される。
【０００６】
したがって、ＰＫＡは人間の癌の診断バイオマーカーに対する潜在的な分子標的として提案された。不活性ＰＫＡホロ酵素（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）は、２個の触媒サブユニットと２個の調節サブユニットで構成された四量体である。調節サブユニット上のｃＡＭＰと結合すると、不活性ＰＫＡ四量体は調節サブユニットの１個の２量体と活性的触媒サブユニットの２個の単量体に解離し、引き続き核と細胞質の両方で多様な標的蛋白質を燐酸化する。生化学的研究を通じて調節サブユニットの４つのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）のＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩαおよびＲＩＩβが同定され、ＰＫＡ信号伝達活性化の結果は細胞内調節サブユニットイソ型の種類に依存するものと示された。ＲＩＩイソ型の発現は、正常組織で優先的に観察され、細胞の成長を抑制する反面、ＲＩイソ型（ＲＩα／ＰＫＡ−１）の発現は細胞の増殖を刺激する。
【０００７】
特に、ＲＩα／ＰＫＡ−Ｉの過発現は、癌の進行、多剤耐性および予後が不良な多様な種類の癌患者と高い相関関係がある。興味深いことに、最近の研究はＰＫＡが正常細胞ではほとんど細胞内で発現する反面、ＰＫＡの細胞外形態（ＥＣＰＫＡ）は前立腺、膀胱、乳房、大腸癌腫および肺腺癌を含む数多くの種類の癌細胞株から分泌されるということを示している。また、ＥＣＰＫＡは、多様な種類の癌にかかった人間の患者由来の血清で高度に検出されたが、健康な志願者由来の血清では検出されなかった。また、人間の黒色腫患者で腫瘍を外科的に切除した後にＥＣＰＫＡの血清水準が減少するとも示された。人間ＥＣＰＫＡを抗原として使って抗−ＥＣＰＫＡ自家抗体を検出するための組成物および方法を報告する米国特許第７，８３８，３０５Ｂ２号を参照する。このような観察結果は血清衆中の人間ＥＣＰＫＡおよび自家抗体が人間の癌に対する価値のある診断剤となり得るという可能性を提起する。
【０００８】
犬ＥＣＰＫＡは人間ＥＣＰＫＡと異なるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列は図１に示す。異なる配列はＣ−末端を含む鎖全体に広がっている。犬ＥＣＰＫＡが癌にかかった犬に存在するかの有無および特に犬に存在する犬ＥＣＰＫＡの水準が癌の存在と相関関係にあるかの有無は知られていない。その上、犬か自家抗体を生産する犬ＥＣＰＫＡに対する免疫反応を有するかどうかまたはそうであるとしても、このような免疫反応が犬の癌を検出するためのバイオマーカーに有用な程度に十分に強力であるかどうかは知られていない。犬の癌を検出するための診断目的上、抗原として人間ＥＣＰＫＡを使うことができるかどうかも知られていない。典型的に、血漿のうちＥＣＰＫＡのような抗原の水準は時間の経過につれて減衰し得、診断測定のために抗原の定量分析を採択するのは困難であり得る。抗原水準の検出は、サンプルを検査する前のサンプルの保有時間が結果に影響を及ぼし得るため、特定の確率で診断または検出するのに有用でない可能性もある。しかし、自家抗体の水準はこのような減衰がまるでなく、特に定量的制御が必要な場合、バイオマーカーとして有用であり得る。
【０００９】
さまざまな種類の癌である、異なる品種および年齢の犬に対する広範囲な調査と研究を通じて、犬は、犬の体内における癌の存在の検出に使用され得る、独特の犬ＥＣＰＫＡおよび自家抗体活性を示し、人間ＥＣＰＫＡと犬の癌の検出の間には相関関係が全くないか殆どないということが明かされた。固有な特殊性により、単純な定性的検出よりは犬ＥＣＰＫＡに対する抗体の定量的検出が好ましく、このような定量的検出を可能にする装置が開発されている。特に、デジタル化データ処理で使われる定量的検出が開発されており、このようなデジタル化処理を支援する装置も開発されている。定量的検出装置は本願に記載された他の蛋白質またはウイルス剤を検出するために使われ得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
一実施形態は、犬由来の血清サンプルを用意して精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を抗原として使って、血清サンプル中の抗体の量を検出することによって、犬において癌の存在を決定する方法を提供し、ここで犬において癌の存在は犬ＰＫＡ  Ｃα抗体の量が所定の水準を超過する時に決定される。犬ＰＫＡ  Ｃα抗体の検出された量により、癌が存在する可能性を判定することができる。精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質は、配列番号１（ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  Ｇ）および配列番号２（ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ｃ）の配列を有するプライマーを使って合成される。精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質は犬ＰＫＡ  Ｃαの増幅されたｃＤＮＡ断片、およびそれぞれ配列番号３（ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧ）および配列番号４（ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ）の配列を有するＴ７プロモーターおよびターミネータープライマーとともに細菌発現ベクターを使って用意される。生成された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質は配列番号５を含むアミノ酸配列および配列番号６を含むヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
所定の水準は肝臓疾患または炎症性状態のような他の医学的状態の存在のような多様な要因を考慮して決定することができる。例えば、肝臓疾患を有する犬はさらに高い水準の犬ＥＣＰＫＡ自家抗体を示し得る。したがって、前記方法は肝臓疾患のない犬に対して事前に設定された指示を有し得る。所定の水準は３．５μｇ／ｍｌ、好ましくは４μｇ／ｍｌ、より好ましくは４．５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５μｇ／ｍｌであり得る。
【００１２】
癌を患った犬において高い水準のＣＲＰ量が測定されることも明かされた。したがって、ＣＲＰ量を決定することは、犬において癌の存在を決定するためにＥＣＫＰＡまたはＥＣＰＣＫＡ自家抗体の検出と共に使うことができる。ＣＲＰはＥＣＰＫＡまたはＥＣＰＫＡ自家抗体よりはるかに優勢に血清中に存在し得るため、高い水準のＣＲＰ量を臨界水準となるように設定することができる。また、緩衝液を利用して血清サンプルを追加希釈させた後にＣＲＰ量を測定することができる。希釈比率は１００倍であり得る。所定のＣＲＰ水準は約８０μｇ、好ましくは１００μｇまたはさらに好ましくは１２０μｇであり得る。
【００１３】
他の実施形態は、犬由来の血清サンプルを用意して、精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を抗原として使って、血清サンプル中の犬ＰＫＡ  Ｃα抗体の量を検出して血清サンプル中のＣＲＰ量を決定することによって、犬において癌の存在を決定する方法を提供し、ここで前記犬における癌の存在は犬ＰＫＡ  Ｃα抗体およびＣＲＰの量がそれぞれ所定の抗体水準および所定のＣＲＰ水準を超過する時に決定され、ＣＲＰ量は希釈緩衝液の助けで測定される。希釈緩衝液は血清サンプルを約５０倍〜１５０倍だけ希釈させる。
【００１４】
他の実施形態は、固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を有する固体相で犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質に対する抗体を定量的に検出するための装置を提供し、ここで前記組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質は配列番号５を含むアミノ酸配列を有し、前記装置は前記組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を利用して犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質に対する抗体の量を検出することができる。検出された量が所定の水準を超過する場合、癌は高い確率で存在することができる。犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質に対する抗体を定量的に検出するための装置は、犬ＩｇＧに結合できるリガンドを含むことができ、ここで前記リガンドはＵＶまたは可視光線に対して活性である一部分を含む。装置はサンプル収容部を有するハウジングおよび検出窓を含み、固体相はハウジング内に配置され検出窓によって露出した固体相の一部分を通じてサンプル収容部から収容されたサンプルを移動させることができる。
【００１５】
犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質に対する抗体を定量的に検出するための装置は、検出された抗体量の少なくとも二つの水準を決定することができる。装置は基準定量線として使われ得る基準線を有することができる。基準線はサンプルにかかわらず類似する色相の結果を示し、検出された抗体の量を定量的に決定できるようにする。装置は好ましくは、検出された抗体の量の多数の水準を決定することができ、多数の水準のうち隣接した二つの水準間の間隔は約５μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３μｇ／ｍｌ以下またはより好ましくは１μｇ／ｍｌ以下である。
【００１６】
犬ＥＣＰＫＡ自家抗体を定量的に検出するための装置は、装置の結果が取られる間、患者データの同時収集を可能にする一つ以上のデータ入力スロットを含むことができる。例えば、装置の写真を撮影することによって、リーダーを使って装置の結果を読むことができ、検査結果を読んでデジタルデータに変換させることができる。変換過程は検索窓に示された固体相のイメージを変換させることができ、また、同時にデータ入力スロットに示されたデータを処理用デジタルデータに変換させることができる。このような変換されたデータは、検査リーダーに内蔵され得る通信装置またはモジュールを通じて遠隔サーバーに伝送され得る。伝送されたデータは分析のために編集および整理され得る。分析されたデータは検査リーダーまたはＥメール、メッセージなどのような他の電子的手段を通じて検査修行者に再び伝送され得る。検査リーダーはスマートフォンを使って写真を撮影してその写真を遠隔サーバーに伝送することができる。
【００１７】
他の実施形態は外表面および内部空間を有するハウジング、外表面上の制御パネル、内部空間で蛋白質またはウイルス検出サンプルの写真を撮影できる方式で位置されたカメラ、内部空間に形成されたサンプルホルダー（ここでサンプルはサンプルホルダーに配置され得る）、内部空間を照明できる光源（前記光源からの光を発散してサンプルに間接照明することを許容するように構成された光発散装置）、通信モジュールを有することができる、哺乳動物で蛋白質またはウイルス剤を検出するための装置を提供し、ここで前記光源および光発散装置は光源からの光をサンプルホルダーに間接照明するように構成され、通信モジュールはカメラによって撮影された写真を遠隔サーバーに伝送するように構成される。
【００１８】
サンプルホルダーは、ラテラルフローキットまたは他のバイオ分析キットを保有するように構成される。サンプルホルダーは、カメラがサンプルの写真を撮影することができるように、カメラの範囲内にサンプルが位置できるようにする。カメラおよび通信モジュールは、ハウジング内に統合され得る。代案として、カメラおよび通信モジュールはスマートフォンの一部分であり、スマートフォンはハウジングに配置されてサンプルの写真を撮影し、その写真を遠隔サーバーに伝送する。スマートフォンの閃光（ｆｌａｓｈ  ｌｉｇｈｔ）を光源として使うことができる。光発散装置は半透明板であり得、スマートフォンの光源の直下に位置するように移動され得る。
【００１９】
哺乳動物で蛋白質またはウイルス剤を検出する装置は、カメラ開口部を有する分離型スマートフォンアダプターを含むことができ、ここで光発散装置はスマートフォンの光源を覆うようにスマートフォンアダプターに統合されており、カメラ開口部はスマートフォンのカメラに整列されており、分離型スマートフォンアダプターのための収容領域をさらに含むハウジングが配置されており、前記収容領域はカメラと光源のための一つ以上の開口部を有する。スマートフォンアダプターはハウジングに統合され得る。
【００２０】
光源はＵＶ光または短波長光のような所定の波長を有する光を照射することができる。通信モジュールはＷｉ−Ｆｉ（ＷｉＦｉ）、ワイマックス（ＷｉＭｘ）、ブルートゥース（登録商標）（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））、ジグビー（ＺｉｇＢｅｅ）、ゼットウェーブ（Ｚ−Ｗａｖｅ）のような近距離通信プロトコルまたはその他の近距離通信プロトコルを使うことができる。
【００２１】
他の実施形態は、ウイルス検出剤を有するキットを使って哺乳動物で感染性疾患を検査するステップ、カメラおよび通信機能を有するキットリーダーを使って検査結果を判定するステップ、キットリーダーによって収得された検査結果を遠隔サーバーに伝送するステップおよび電気的通信方法によって所定の実体を知らせるステップを含む、哺乳動物で感染性疾患を検出およびモニタリングする方法を提供する。前記方法はＵＶ活性結果を提供するキットを利用することができるし、カメラはＵＳ活性結果を検出することができる。
【００２２】
キットリーダーは、外表面および内部空間を有するハウジング、外表面上の制御パネル、サンプルが配置され得る、内部空間に形成されたサンプルホルダー、内部空間を照明できる光源および前記光源からの光を発散するように構成された光発散装置を含むことができ、ここでカメラは内部空間で蛋白質またはウイルス検出サンプルの写真を撮影できる方式で位置され、前記光源および光発散装置は光源からの光をサンプルホルダーに間接照明するように構成され、通信モジュールはカメラによって撮影された写真を遠隔サーバーに伝送するように構成される。
【００２３】
検査リーダーまたはキットリーダーはＧＰＳ機能を有することができ、検査場所を識別することができる。
【００２４】
他の実施形態は犬の血中で犬ＥＣＰＫＡ抗体を定量的に検出するためのラテラルフローキットであって、配列番号５を含むアミノ酸配列を有する固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を有する第１固体相、第１結合蛋白質と接合されている光学密度を有する接合された着色剤を含む接合体パッド、および第２結合蛋白質を含む第２固体相を有し、前記接合された着色剤が第１固体相では第１色相強度を提供し、第２固体相では第２色相強度を提供するように構成されており、第１色相強度が犬の血中抗体濃度に定量的に依存し、第２色相強度は抗体濃度と無関係な、ラテラルフローキットを提供する。
【００２５】
抗体の濃度は簡単なラテラルフローキットを利用して定量的に測定されるため、着色剤は加圧装置を利用して適用され得、着色剤の光学密度は好ましくは高い水準で使われ得る。接合された着色剤の光学密度は５〜３０、好ましくは８〜２５、より好ましくは１０〜２０であり得る。
【００２６】
第１色相強度は、第１色相強度を第１色相強度と抗体の濃度間の相関データセットと比較することによって抗体の濃度を提供する。このような濃度は、データセットを利用して推定することができ、それは相関方程式、好ましくは線形方程式で表現され得る。
【００２７】
第１結合蛋白質はストレプタビディン、バイオティーン、蛋白質Ａ、抗−犬ＩｇＧラット、抗−犬ＩｇＧウサギ、抗−犬ＩｇＧヤギ、抗−犬ＩｇＧ羊および抗体に結合できる蛋白質からなる群から選択され得る。第２結合蛋白質はストレプタビディン、バイオティーン、蛋白質Ａ、抗−ラットＩｇＧ、抗−ウサギＩｇＧ、抗−ヤギＩｇＧ、抗−羊ＩｇＧおよびＩｇＧに結合できる蛋白質からなる群から選択される。第１結合蛋白質と第２結合蛋白質の選択は相互補完的である必要がある。
【００２８】
着色剤は、金、ラテックス、ｇｆｐ、ｆｉｔｃおよびＵＶ活性接合剤からなる群から選択され得る。異なる大きさの金ナノ粒子を使うことができる。
【００２９】
ラテラルフローキットは血球を濾過するフィルタ位相（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｈａｓｅ）をさらに有することができ、それは血清ではなく血液サンプルを直接適用できるようにする。
【００３０】
さらに他の実施形態は、犬の血中で犬ＥＣＰＫＡ抗体の濃度を決定する方法を提供し、前記方法は（ａ）検査線を含むラテラルフローラテラルフローキットのために犬の血液から検査サンプルを用意するステップ（ｂ）検査サンプルをラテラルフローキットに適用するステップ（ｃ）ラテラルフローキットが発色するようにするステップ（ｄ）検査線を含む発色したラテラルフローキットのデジタル写真を撮影してデジタル情報を得るステップおよび（ｅ）抗体の濃度を得るステップであって、前記濃度がデジタル写真で得たデジタル値を抗体の濃度と関連させるデータセットと検査線のデジタル情報を比較することによって決定されるステップを含む。
【００３１】
このような実施形態で使われるラテラルフローラテラルフローキットは、本願に記載されたラテラルフローキットであり得る。前記方法はまた、推定データセットを使って犬が癌を有している可能性を決定するステップを含むことができる。推定データは０．９より大きいＲ２値を有する線形方程式を使って表現することができる
【００３２】
前記方法は、デジタル情報を無線通信を通じて外部サーバーに伝送することを含むことができる。デジタル情報は、無線通信モジュール、カメラモジュール、光源およびラテラルフローキットを収容するように設計されたスロットを含むリーダーボックスを使って得ることができる。無線通信モジュールは、モバイルネットワークの代わりに短距離無線通信プロトコルに基づいて作動して、前記方法がいかなる携帯電話なしにも実行され得るが、Ｗｉ−Ｆｉのような短距離通信だけで実行できるようにする。
【００３３】
抗体の濃度は約５μｇ以下より少ない水準で前記方法によって測定され得る。
【００３４】
他の実施形態は、哺乳動物の血中でＥＣＰＫＡ抗体の濃度を決定する方法であって、（ａ）検査線を含むラテラルフローキットのために哺乳動物の血液から検査サンプルを用意するステップ（ｂ）検査サンプルをラテラルフローキットに適用するステップ（ｃ）ラテラルフローキットが発色するようにするステップ（ｄ）検査線を含む発色したラテラルフローキットのデジタル写真を撮影してデジタル情報を得るステップおよび（ｅ）抗体の濃度を得るステップであって、前記濃度がデジタル写真で得たデジタル値を抗体の濃度と関連させるデータセットと検査線のデジタル情報を比較することによって決定されるステップを含み、前記ラテラルフローキットがアミノ酸配列を有する固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を有する第１固体相、第１結合蛋白質と接合されている５以上の光学密度を有する接合された着色剤を含む接合体パッド、および第２結合蛋白質を含む第２固体相を含む、方法を提供する。前記接合された着色剤は、第１固体相では第１色相強度を提供し、第２固体相では第２色相強度を提供するように構成される。第１色相強度は犬の血中抗体濃度に定量的に依存し、第２色相強度は抗体濃度とは無関係である。
【００３５】
本願で開示される多様な実施形態は全体的にまたは選択的に組合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】人間ＥＣＰＫＡのサブユニットと犬ＥＣＰＫＡサブユニットのアミノ酸配列間の比較を図示した図面。
【図２】人間ＥＣＰＫＡのサブユニットと犬ＥＣＰＫＡサブユニットのｍＲＮＡ配列間の比較を図示した図面。
【図３】正常な犬、良性腫瘍を有する犬、腫瘍を有する犬および癌に対して外科的に治療された犬の犬ＥＣＰＫＡ自家抗体測定を例示した図面。
【図４】例示的な受信者操作特性グラフを図示し他図面であって、前記図面でＡはＲＯＣ曲線下の面積である。
【図５】本発明の一実施形態に係る癌検出方法のＲＯＣ曲線を例示した図面。
【図６】血漿中のＣＲＰ水準と多様な検査対象体間の関係を示した図面。
【図７】血漿中のＣＲＰ水準と多様な検査対象体間の関係を図示した図面。
【図８】ＣＲＰ測定値と犬ＥＣＰＫＡ自家抗体水準間の相関関係を例示した図面。
【図９】犬の癌の検出において人間ＥＣＰＫＡと犬ＥＣＰＫＡ間の相関関係を例示した図面。
【図１０】一実施形態のラテラルフローキットを使って得た色相強度とサンプル中の抗体濃度間の相関関係を例示し他図面であって、ここで相関関係は０．９より高いＲ２値とほぼ線形である。
【図１１】一実施形態に係るリーダーの平面図を例示した図面。
【図１２】一実施形態に係るリーダーの内部底板を示す図面。
【図１３】一実施形態に係るリーダーの側面図を例示した図面。
【図１４】一実施形態に係るリーダーの側面図を例示した図面。
【図１５】一実施形態に係るリーダーの透視図を例示した図面。
【図１６】一実施形態に係るリーダーの透視図を例示した図面。
【図１７】一実施形態に係るキットの検査結果を例示した図面。
【図１８】一実施形態に係るキットの検査結果のＲＯＣ曲線を例示した図面。
【図１９】一実施形態に係るキットの検査結果を要約したもの。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
広範囲な研究を通じて、癌を有する犬において、犬ＥＣＰＫＡ蛋白質が高い水準で分泌され、犬ＥＣＰＫＡ蛋白質に対する自家抗体が形成されることが明かされた。人間ＥＣＰＫＡは犬ＥＣＰＫＡ自家抗体に選択的に結合せず、バイオマーカーとして作用できないということも明かされた。また、犬ＥＣＰＫＡ自家抗体検出はこのような抗体の定量的測定が採択される場合にのみ、犬の癌に対する意味のある診断道具として使われ得る。犬ＥＣＰＫＡ自家抗体の測定が確実でない場合、ＣＲＰを測定することは、以下に追加説明するように、犬ＥＣＰＫＡ自家抗体測定の予測可能性を向上させるために使われ得る補充データを提供することができる。
【００３８】
図１は、人間（ＮＰ＿００２７２１．１）、犬（ＮＰ＿００１００３０３２．１）およびねこ（ＸＰ＿００６９２８５５２．１）由来のＰＫＡ  Ｃαのアミノ酸配列の整列である。ドットボックスは人間と犬と間の差を示すアミノ酸残基を示す。人間と犬アミノ酸配列は高い類似性を共有するものの、４つの異なる配列がＣ−末端を含んだ全体の配列に亘って広がっている。
【００３９】
図２は、人間（ＮＰ＿００２７２１．１）、犬（ＮＰ＿００１００３０３２．１）およびねこ（ＸＰ＿００６９２８５５２．１）由来のＰＫＡ  ＣαをコーディングするｍＲＮＡ配列を比較する。人間と犬のｍＲＮＡ配列の間には多くの差がある。
【００４０】
図３は、多様な検査対象体でのＥＣＰＫＡ自家抗体測定の検査結果を示す：癌にかかったと診断された犬（「複数の癌」または「癌」）、良性腫瘍にかかった犬（「良性腫瘍」）、腫瘍疾患がない犬（「対照群」または「腫瘍疾患なし」）および犬（「Ｔｘ」または「治療」）。図３に図示された通り、癌にかかった検査対象体は、他の検査対象体に比べてはるかに高い水準のＥＣＰＫＡ自家抗体測定値を示す。腫瘍疾患にかかっているが手術を通じて治療された犬は低い水準のＥＣＰＫＡ自家抗体測定値を示す。表１は検査対象体の総数と検査結果を要約したものである。検査結果を分類するために、ＥＣＰＫＡ自家抗体が４１単位以上検出された場合に陽性結果と計算し、ＥＣＰＫＡ自家抗体検出水準が４１単位未満の場合には陰性結果と決定した。
【００４１】
【表１】
2019536056.tif 000003
【００４２】
表２は癌診断方法として犬ＥＣＰＫＡ自家抗体検出に対する感度、特異性、陽性予測度および陰性予測度を要約したものである。
【００４３】
【表２】
2019536056.tif 000004
【００４４】
特定検査方法の正確度を検証または評価するための多くの方法がある。そのうち感度と特異性が一般的に使われている。一般的に、感度と特異性は、方法が標的とする結果と標的としない結果を区別するにおいて、どれほど優秀であるかを意味する。例えば、本発明の場合、感度は犬ＥＣＰＫＡの自家抗体の検出を使って犬の癌をどれほどよく発見できるかを意味する。一方、特異性は本方法が癌にかかった犬と癌にかかっていない犬をどれほどよく区別できるかと関連する。感度と特異性の他にも、方法の有用性およびカットオフ値を決定するために、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線がしばしば使われる。ＲＯＣ曲線はｘ軸値の偽陽性率およびｙ軸値の真陽性率を使って作図される。特定検査方法が正確であるかどうかは、ＲＯＣ曲線を利用して測定され得る。判定基準の多様な可能な設定について、陽性比率が偽陽性率についてプロットされている下記の例示的なＲＯＣ曲線で、１のＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は検査方法が完ぺきで正確であることを意味するが、ＡＵＣが０．５であれば検査方法が役に立たず、不正確であることを意味する。曲線が左側上端の角に近いほど検査方法はより正確でより有用である。典型的に、検査方法は、ＡＵＣが０．５である場合には有益でなく、ＡＵＣが０．５〜０．７である場合にはそれほど正確でなく、ＡＵＣが０．７〜０．９である場合には正確であり、ＡＵＣが０．９および１の場合には非常に正確なものと見なされる。したがって、ＲＯＣ曲線およびそのＡＵＣ値は、新しい検査方法を決定して評価するための立派な道具である。文献［Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｉｖｅ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）Ｃｕｒｖｅ  ｔｏ  Ｍｅａｓｕｒｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．  Ｆａｍ．  Ｍｅｄ．  Ｖｏｌ．  ３０、Ｎｏ．  １１、Ｎｏｖ  ２００９、３０：８４１−８４２］を参照する。
【００４５】
図５は、犬の癌を検出するための犬ＥＣＫＰＡ自家抗体測定のＲＯＣ曲線を図示する。ＡＵＣ値は０．９０６１であり、これは本発明の一実施形態の犬ＥＣＫＰＡ自家抗体測定が非常に効果的で正確な診断道具であることを示す。
【００４６】
図６は、多様な検査対象体でＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）の測定値を図示する：癌にかかった犬、良性腫瘍を有する犬、腫瘍疾患がない犬、非−癌疾患を有する犬。図７は、癌を患っている犬（「犬」）、犬ＥＣＫＰＡ自家抗体測定で偽陰性結果を有する犬（「ＦＮ」）、良性腫瘍を有する犬（「ＢＴ」）、癌を患っていない犬（「陰性」）および犬ＥＣＫＰＡ自家抗体測定で偽陽性結果を有する犬（「ＦＰ」）の測定値を図示する。
【００４７】
図８は、多様な検査対象体グループの犬ＥＣＫＰＡ自家抗体測定結果について、ＣＲＰ測定結果をプロットしたものである。表３はＣＲＰおよびＥＣＫＰＡ自家抗体測定が共に使われた場合の陰性予測度および陽性予測度を表す。陽性予測度はＣ面積およびＥ面積で総陽性予測度７３．６％から９１％および１００％に増加し、陰性予測度はＣ面積で総陰性予測度９３．４％から９７．６％に向上する。したがって、ＣＲＰの測定は犬ＥＣＫＰＡ自家抗体測定を利用した癌診断の正確度を向上させることができる。
【００４８】
【表３】
2019536056.tif 000005
【００４９】
図９は、人間ＥＣＰＫＡに基づいた犬の検査結果を犬ＥＣＰＫＡに基づいた犬の検査結果についてプロットしたチャートである。ｒ２値が１である場合、検査結果は互いに密接に相関関係があり、人間ＥＣＰＫＡまたはその自家抗体は犬において癌を検出するのに使われ得る。しかし、図ｘに図示された通り、ｒ２値は０．１５であり、これは人間ＥＣＰＫＡと犬ＥＣＰＫＡの間に多くの相関関係がなく、人間ＥＣＰＫＡまたはその自家抗体が犬の癌を検出する優秀なバイオマーカーではないということを示唆する。
【００５０】
表４は検査対象体で検出された多様な癌を要約したものである。本発明の一実施形態の癌検出方法は癌の種類にかかわらず使われ得、したがって、本検出方法が固有で非常に有用であるということが明かされた。
【００５１】
【表４】
2019536056.tif 000006
【００５２】
ラテラルフローキット構造は典型的なラテラルフローキット構造に従うことができる。しかし、使われる着色剤および蛋白質は、犬ＥＣＰＫＡ抗体を定量的に検出するように特殊に設計される。キットは検査サンプルが適用される適切な場所を有する。検査サンプルは典型的に検査対象体の血液から用意される。血液から得た血清は適用場所に適用される。血清サンプルは検査ストリップに沿って流れて接合された着色剤が配置されている接合体パッドを通過する。着色剤を加圧しながら適用し、オーブンでベーキングする。ラテラルフローキットで使われる典型的な光学密度は約２〜３である。しかし、表現のデジタル化された検査結果と濃度データ間にさらに優秀な相関関係を得るために、はるかに高い光学濃度が使われる。多様な着色剤が使われ得る。金およびラテックスが典型的な着色剤である。ＵＶ活性着色剤には、ｇｆｐ、ｆｉｔｃおよびＵＶ活性接合剤が含まれる。着色剤は異なる色相強度を示す。固有強度はデジタル化に影響を与える。図１０は、一実施形態に係るラテラルフローキットを利用した検査後に受信された色相強度と抗体の濃度間の例示的な相関関係を図示する。
【００５３】
サンプル中の犬ＥＣＰＫＡ抗体および他の抗体は、接合された第１結合蛋白質に結合して抗体を着色剤で効果的にコーティングするであろう。第１結合蛋白質は、ストレプタビディン、バイオティーン、蛋白質Ａ、抗−犬ＩｇＧラット、抗−犬ＩｇＧウサギ、抗−犬ＩｇＧヤギ、抗−犬ＩｇＧ羊および抗体に結合できるその他の蛋白質からなる群から選択され得る。サンプルが、固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を含有するキットの第１固体相を通過する場合、犬ＥＣＰＫＡ抗体は固定された精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質に結合する。キットの完全な発色後、犬ＥＣＰＫＡ抗体のみが第１固体相に留まって色相強度を示し、これを使って該当抗体濃度を捜し出すことができる。表現された検査結果をデジタルカメラを撮影してデジタル化し、デジタル化された情報を相関データと比較して実際の濃度を決定する。デジタル化された情報は、デジタル表現値を得るために色濃度を使う。図１０に図示された実施形態は、デジタル化された表現値と濃度間の線形関係を提供する。したがって、それは一致するデータがデータセットに存在しない濃度を推定することができるようにする。さらに容易な推定のために、線形関係を提供する多様な濃度の抗体に対する着色剤の色相強度が好ましい。
【００５４】
カメラの種類、色温度設定、サンプルとカメラ間の距離、光源および露出設定は、色相強度のデジタル化された値に影響を及ぼすであろう。したがって、表現された色相強度のデジタル化が、好ましくは一定の条件で行われるのが好ましい。
【００５５】
図１１〜図１６は、ハウジング２００を有するリーダーボックス１００を示す。ハウジングの上面には、カメラモジュール３００、モニタリングおよび制御ユニット４００およびバーコードスキャナ５００が提供されている。リーダーの内部には、キットが開口部９００を通じて配置されるスロット６００がある。ＬＥＤのような内部照明システム１０００を利用して、リーダー内部の照明をデジタル化のための一定の条件を提供するのに最適化されるように制御する。デジタルカメラモジュールがスロットでキットの写真を撮影すると、デジタルイメージは無線通信モジュール１００を通じてサーバーに伝送される。無線通信モジュールは、近距離通信プロトコルを使ってリーダーがＷｉ−Ｆｉホットスポットのような地域インターネットポータルに連結されるようにする。光源の波長はＵＶ活性着色剤のような多様な着色剤により調整され得る。リーダーは自ら通信モジュールを有するため、モバイルネットワークと独立的に作動することができる。
【００５６】
図１７〜１９は、キットが８４．７％の感度と８４．４％の特異性を示す一実施形態に係るキットの検査結果を図示する。
【００５７】
（実施例）
犬サイクリックＡＭＰ−依存性蛋白質キナーゼ触媒サブユニットＣα（ＰＫＡ  Ｃα）のクローニング
【００５８】
ＲＮｅａｓｙコラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使って、全体のＲＮＡをトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で均質化された犬の脂肪組織から単離した。引き続き、Ｉｍｐｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示にしたがって使って１μｇの全体ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーでｃＤＮＡに逆転写した。犬ＰＫＡ  ＣαｃＤＮＡをｅｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）および制限酵素認識部位、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを含有する犬ＰＫＡ  Ｃαプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。プライマーの配列は次の通りである：前方向、ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  Ｇおよび、逆方向、ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  Ｃ。
【００５９】
引き続き、犬ＰＫＡ  Ｃαの増幅されたｃＤＮＡ断片を制限酵素、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ）を利用して分解させて細菌発現ベクターであるｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、Ｔ７プロモーターおよびターミネータープライマー（Ｔ７プロモータープライマー、ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧおよびＴ７ターミネータープライマー、ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ）を利用してシークエンシングした。
【００６０】
（組み換え犬ＰＫＡ  Ｃαの精製）
Ｃ−末端で６個のヒスチジン残基（６ｘ−Ｈｉｓエピトープ）でタグされた犬ＰＫＡ  ＣαをコーディングするｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入させ、室温で一晩の間１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を利用して犬ＰＫＡ  Ｃαの発現を誘導した。細胞を回収して０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）に再懸濁させて超音波処理した。引き続き、組み換え犬ＰＫＡ  ＣαをＩＤＡエクセルローズ（Ｅｘｃｅｌｌｏｓｅ）樹脂（Ｂｉｏｐｒｏｇｅｎ）を利用して、２個の連続固定された金属親和性クロマトグラフィーで精製した後、ＳＰセファロース樹脂（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してイオン交換クロマトグラフィーで精製した。溶出された組み換え蛋白質を透析し、追加使用するまで０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１％スクロースが補充された５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度で−８０℃で保存した。
【００６１】
（ウェスタンブロッティング）
５０ｎｇの精製された組み換え犬ＰＫＡ  Ｃαおよび陽性対照群蛋白質である人間ＰＫＡ  Ｃαを１０％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルから分離し、ＰＶＤＦ膜に移転させ、ウサギポリクローナル抗−ＰＫＡ  Ｃα抗体（Ａｂｅａｍ）およびホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と接合されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体で連続的にプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）した後、強化された化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）で免疫検出した。
【００６２】
（酵素−結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）分析）
犬の血清中細胞外ＰＫＡ  Ｃαの存在と水準を製造業者の指示にしたがって抗−犬ＰＫＡ  ＣαＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｏｒｉｓｅ）を利用して評価した。簡略に言及すると、試薬希釈液中に４倍希釈された犬の血清サンプル１００μｌを抗−犬ＰＫＡ  Ｃα抗体で事前にコーティングされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加して室温で１時間の間恒温培養した。プレートを室温でさらに１時間の間犬ＰＫＡ  Ｃα検出抗体とともに恒温培養した後、室温で２０分の間ＨＲＰ接合体とともに恒温培養した。引き続き、プレートを室温で１０分の間基質溶液を利用して発色させ、５０μｌの停止溶液を利用して反応を停止させた。スキャニング多重ウェル分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６３】
犬の血清中の細胞外ＰＫＡ  Ｃα対する自家抗体を固体相ＥＬＩＳＡ方法を利用して測定した。簡略に言及すると、９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡストリップ  プレート（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を室温で一晩の間炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ  ９．６）（Ｓｉｇｍａ）中に１μｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの組み換え犬ＰＫＡ  Ｃαでコーティングし、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ  ７．４）を含有するＰＢＳで１回洗浄して室温で２時間の間ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で遮断し、洗浄緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０が補充された５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ５．２））で２回洗浄した。引き続き、プレートを室温で１時間の間サンプル希釈緩衝液（０．２５％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ  ７．４））に１：５００に希釈された１００μｌの犬の血清サンプルと共に恒温培養して洗浄緩衝液で４回洗浄し、室温で１時間の間サンプル希釈緩衝液に１：２０，０００に希釈されたＨＲＰと接合された１００μｌのヤギ抗−犬ＩｇＧ抗体（Ａｂｅａｍ）とともに追加恒温培養し、洗浄緩衝液で５回洗浄して室温で１５分の間１００μｌの３’，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で発色させた。引き続き、５０μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液で反応を停止させてスキャニング多重ウェル分光光度計を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６４】
（悪性腫瘍を患った犬由来の血清中で細胞外ＰＫＡ  Ｃα検出）
癌細胞によって生成された細胞外ＰＫＡは癌患者の血清で顕著に増加し、その患者においてこれに対する自家抗体の生成を誘発することが明かされた。また、血清中のＰＫＡに対する自家抗体の力価は多様な細胞類型の癌の存在と有意的に相関関係があると報告された。したがって、ＰＫＡに対する自家抗体は人間の癌診断のための新しい潜在的なバイオマーカーと見なされる。しかし、ＰＫＡ自家抗体の存在およびその癌との相関関係は人間以外の哺乳動物で明かされたことはない。
【００６５】
（悪性腫瘍を患った犬由来の血清中で細胞外ＰＫＡ  Ｃαに対する自家抗体の検出）
ＰＫＡ  Ｃα自家抗体の力価が人間に示された犬の多様な細胞類型の癌と正の相関関係があるかどうかを決定するために、本発明者らはまず、犬の脂肪組織由来の犬ＰＫＡ  Ｃα遺伝子をクローニングして細菌で発現させ、６ｘ−Ｈｉｓエピトープでタグされた組み換え蛋白質を精製した（図）。引き続き、精製された犬ＰＫＡ  Ｃα蛋白質を抗原として使うＥＬＩＳＡ分析でＰＫＡ  Ｃα自家抗体の存在および力価を評価した。
【００６６】
（ラテラルフローキットの用意）
ＥＣＰＫＡ（０．５〜４ｍｇ／ｍｌ）および制御蛋白質（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を蛋白質緩衝液で希釈させ、Ｂｉｏｄｏｔ低容積精密分配装備によってニトロセルロース膜に分配した。ニトロセルロース膜は１０％湿度下で一晩中乾燥させる。サンプルパッドをサンプルパッドバターに浸漬させて１５％湿度下３７℃で一晩中乾燥させる。犬ＩｇＧを検出するための蛋白質と接合された高密度金粒子の懸濁液を室温で加圧しながらスライスされた接合体パッドに噴霧して高い光学密度を得る。引き続き、接合体パッドを２５℃、１０％湿度下で一晩中乾燥させた。裏面パッド（ｂａｃｋｉｎｇ  ｐａｄ）上にニトロセルロース膜を置き、金粒子で充填されたスライスされた接合体パッドを前方面でニトロセルロース膜と重なるように裏面パッド上に置き、サンプルパッドを接合体パッド上に置き、吸着パッドを尾端部でニトロセルロース膜と重なるように置き、組み立てられた裏面パッドを４ｍｍ幅で切断し、切断された組み立てられた裏面パッドをハウジングに入れてキットを組み立てた。
【００６７】
前記実施形態は単に例示として説明したため、本発明は前記実施形態に限定されず、したがって、多様な変形または変更が本発明の範囲から逸脱することなく当業者によって容易に実施され得る。
【００６８】
配列目録
配列番号１
2019536056.tif 000007
【００６９】
配列番号２
2019536056.tif 000008
【００７０】
配列番号３
2019536056.tif 000009
【００７１】
配列番号４
2019536056.tif 000010
【００７２】
配列番号５
2019536056.tif 000011
【００７３】
配列番号６
2019536056.tif 000012
【図１】
2019536056.tif 000013
【図２】
2019536056.tif 000014
【図３】
2019536056.tif 000015
【図４】
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【図５】
2019536056.tif 000017
【図６】
2019536056.tif 000018
【図７】
2019536056.tif 000019
【図８】
2019536056.tif 000020
【図９】
2019536056.tif 000021
【図１０】
2019536056.tif 000022
【図１１】
2019536056.tif 000023
【図１２】
2019536056.tif 000024
【図１３】
2019536056.tif 000025
【図１４】
2019536056.tif 000026
【図１５】
2019536056.tif 000027
【図１６】
2019536056.tif 000028
【図１７】
2019536056.tif 000029
【図１８】
2019536056.tif 000030
【図１９】
2019536056.tif 000031
【国際調査報告】
2019536056.tif 000032
2019536056.tif 000033