(57)【要約】  本発明は、再生肝臓ホスファターゼ−３（ＰＲＬ３）に結合するヒト化抗体、および癌治療のための前記抗体の使用に関する。やはり請求するのは、細胞におけるＰＲＬ３の細胞局在を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、細胞表面でのＰＲＬ３の発現が、細胞が癌性であることを示す、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。
2019531254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＬ３に結合するヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項２】
抗体または抗体結合性断片がＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含有する、請求項１のヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項３】
アミノ酸配列ＫＡＫＦＹＮおよび／またはＨＴＨＫＴＲを含むエピトープに結合する、請求項１記載のヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項４】
アミノ酸配列ｉ）〜ｉｉｉ）、またはアミノ酸配列ｉｖ）〜ｖｉ）、あるいは好ましくはアミノ酸配列ｉ）〜ｖｉ）；
【化１】
2019531254.tif 000027
あるいは、配列ｉ）〜ｖｉ）の１もしくはそれより多くの１、２もしくは３アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、その変異体を有する、先行する請求項のいずれか一項記載のヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項５】
以下のＣＤＲ：
【化２】
2019531254.tif 000028
を取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、先行する請求項のいずれか一項のヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項６】
以下のＣＤＲ：
【化３】
2019531254.tif 000029
を取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、先行する請求項のいずれか一項のヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項７】
ＰＲＬ３に結合する先行する請求項のいずれか一項記載の抗体または抗原結合性断片を含む、任意に単離されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体。
【請求項８】
図７に示すような重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗体および抗原結合性断片。
【請求項９】
癌治療のための薬剤製造における、先行する請求項のいずれか一項記載のヒト化抗体、抗原結合性断片の使用。
【請求項１０】
癌を治療する方法において使用するための、先行する請求項のいずれか一項記載のヒト化抗体または抗体結合性断片。
【請求項１１】
癌を治療するための、患者に対する請求項１記載のヒト化抗体または抗体結合性断片を投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
癌が胃癌または胃癌の転移である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ヒト化抗体または抗体結合性断片を静脈内投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ヒト化抗体を、治療しようとする癌とは離れた位置で投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ヒト化抗ＰＲＬ３抗体を胃癌患者に投与する工程を含み、ここで患者が以前、胃癌に関する代謝拮抗剤療法を受けていなかったか、または以前、代謝拮抗剤療法を受けていなかった、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
代謝拮抗剤療法が５−ＦＵである、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
患者が損なわれた免疫系を持たないことが決定されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
細胞においてＰＲＬ３の細胞局在を決定する工程を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、細胞表面でのＰＲＬ３発現が、細胞が癌性であることを示す、前記方法。
【請求項１９】
細胞表面でのＰＲＬ３発現が、対照細胞と比較して、２倍増加している、請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＰＲＬ３が細胞表面で発現されている場合、個体が癌を有することが決定されるか、または個体が抗癌療法のために選択される、請求項１８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＲＬ３に結合するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、根本的に、転移に向かう多段階の進行につながる、無秩序な遺伝子発現の疾患であり（１）、転移は癌関連死の主な原因である（２）。証拠の集積によって、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）が転移進行を駆動する際に重要な役割を果たすことが示されている（３）。本発明者らは、１９９８年、３つのメンバー：ＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２、およびＰＲＬ−３からなる二重特異性ＰＴＰのＰＲＬファミリーのメンバーとして、肝臓再生ホスファターゼ−３（ＰＲＬ−３；ＰＴＰ４Ａ３としても知られる）を同定した（４）。２００１年、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎのグループは、ＰＲＬ−３を、転移性結腸直腸癌試料において特異的にそして非常に上方制御されるが、原発性癌および正常結腸直腸上皮においては上方制御が見られない、転移関連ホスファターゼとして特徴付けた（５）。ＰＲＬ−３はまた、近年の独立包括的遺伝子発現研究において、ブドウ膜黒色腫患者における転移性再発の最も重要な予測因子として同定された（６）。臨床的には、ＰＲＬ−３  ｍＲＮＡ発現レベルの上昇は、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、および肺癌を含む、多数の癌タイプのより高い転移潜在能およびより劣った予後と相関することが示されてきている（７）。
【０００３】
ＰＲＬは、そのプレニル化Ｃ末端を通じて、原形質膜およびエンドソームの細胞質側に局在する（８）。積み上げられつつある証拠によって、ＰＲＬ−３が、細胞増殖、上皮間葉相互作用（ＥＭＴ）、侵襲、運動性、血管形成、および生存を含む、悪性形質転換の多数の段階を促進することが示唆される（９）。分子的には、ＰＲＬ−３は、ＰＴＥＮの下方制御を通じて間接的にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化し（１０）、そして多数の上流受容体チロシンキナーゼの恒常的な活性化を通じて、発癌性ＥＲＫおよびＳＲＣシグナル伝達を活性化することが示されてきている（１１〜１３）。
【０００４】
ＰＲＬ−３は、２００４年、ＰＲＬ−３のより高いレベルが、ＧＣ侵襲性および転移の増加と相関することが見いだされた際に、最初にＧＣ進行と関連付けられた（１４）。それ以来、ＰＲＬ−３は、原発性胃癌の最大７０％で過剰発現されていると報告され、より高いＰＲＬ−３発現は、ＧＣ患者におけるすべての腫瘍病期で、より短い術後生存と相関した（１５、１６）。主に、ＧＣの検出が遅れ、そして初期段階ではＧＣが無症候性の性質を持つことと併せて、治療後の再発が高率であるため（１７）、ＧＣが、年間７０万を超える胃癌関連死亡を伴う、世界で３番目に高い癌死亡率と位置付けられている（２）ことから、ＰＲＬ−３のこの予後診断潜在能は特に重要である。失敗率が非常に高いにも関わらず、根治手術は、ＧＣに関する療法の標準的な型のままであり、そしてアジュバント化学療法はしばしば、切除前および／または切除後に考慮される（１８、１９）。にもかかわらず、化学療法を用いた際の全生存は劣ったままであり、そして他の活発に分裂している非癌性細胞の非特異的ターゲティングのため、望ましくない副作用が伴う（１７）。この目的に向け、腫瘍特異的生物学的剤を用いたターゲティング療法は、癌細胞の増殖および生存に関与する特異的な分子を選択的に阻害する一方、正常細胞を温存するその潜在能力のため、抗癌薬剤開発の焦点として注目されてきている。現在の抗体療法は、抗体が一般的に、細胞に進入するには大きすぎると考えられているため、細胞外（細胞表面または分泌）タンパク質のみをターゲットとし、ホスファターゼ、キナーゼ、および転写因子などの細胞内療法ターゲットの大きな集団は、抗体療法によっては利用されないままである。ＧＣにおいて、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体アンタゴニスト、トラスツズマブ（ハーセプチン）は、細胞表面ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現しているＧＣの１３〜２０％、特に転移性胃または胃食道接合部腺癌をターゲティングすると認可されてきている（２０、２１）。しかし、反応が中程度であるにもかかわらず、患者はしばしばトラスツズマブに対する耐性を発展させ（２２）、その効能は妨害されている。したがって、ＧＣに対する別のターゲティング療法が切に必要とされており、そして活発に追求されている。
【０００５】
２００８年、本発明者らは、細胞内ＰＲＬ−１およびＰＲＬ−３癌抗原をターゲティングする抗体療法の新規アプローチを報告した（２３）。この報告において、本発明者らは、抗ＰＲＬ−３抗体がＰＲＬ−３を発現している（がＰＲＬ−１を発現していない）癌細胞の実験的転移を阻害する一方、抗ＰＲＬ−１抗体がＰＲＬ−１を発現している（がＰＲＬ−３を発現していない）癌細胞を阻害することを示し、したがって、こうした細胞内癌タンパク質をターゲティングした際の療法的有効性に関する特異的抗体−抗原認識の厳密な必要性を確立した。その後、２０１１年、本発明者らは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびトランスジェニック自発的乳房腫瘍ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスにおいて、さらなる内因性および外因性細胞内「腫瘍特異的抗原」を抗体療法またはワクチン接種でターゲティングして、この新規概念の実現可能性および有効性を検証した（２４）。本発明者らおよびＦｅｒｒｏｎｅは、細胞内への抗体浸透、外在化抗原に対する抗体結合および／またはＭＨＣ結合性抗原由来ペプチドの抗体認識を含む、細胞内腫瘍抗原（ＴＡ）特異的抗体の抗腫瘍活性の３つのありうる機構を提唱した（２５、２６）。
【０００６】
ＰＲＬ−３発現腫瘍をターゲティングする際の、ネズミ、そしてより最近、キメラ（２７）抗ＰＲＬ−３抗体の成功後、本発明者らは、本発明者らのアプローチを、４つの重要な側面に関して、より臨床的に適切なセッティングに変換した：１）マウスまたはキメラ抗体の代わりに、ＰＲＬ−３ヒト化抗体（ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ）の使用；２）マウス癌細胞株の代わりに、ヒト癌細胞株のターゲティング；３）マウス尾静脈転移モデルの代わりに、より臨床的に適切な同所性胃腫瘍モデルの開発；および４）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法的有効性の監視のための潜在的代理バイオマーカーの同定。本発明者らは、胃腫瘍生成を遮断するヒト化抗体の新規クラスの最初の例を示す。本発明者らの知見によって、抗体療法での細胞内癌タンパク質ターゲティングの潜在能力が明らかになり、癌療法の新たな時代の先導となる。
【発明の概要】
【０００７】
オフターゲット効果は、癌療法に関する主な臨床的懸念である。本発明者らは、多数のヒト癌において上方制御される発癌性ホスファターゼである、腫瘍特異的細胞内ＰＲＬ−３に対して、こうした種類では最初のヒト化抗体（ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ）を生成した。本発明者らは、胃癌（ＧＣ）に重点を置き、ＰＲＬ−３  ｍＲＮＡレベルの上昇が、ＧＣ患者の全生存の短縮と有意に相関する独立の証拠を提供した。ＰＲＬ−３タンパク質は、新鮮凍結ＧＣ腫瘍の８５％で過剰発現されたが、調べた患者マッチ正常胃組織では過剰発現されなかった。ヒトＧＣ細胞株を用いて、本発明者らは、臨床的に適切な同所性胃腫瘍モデルを確立し、そしてＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、ＰＲＬ−３陽性（ＰＲＬ−３＋）腫瘍の増殖を特異的に遮断するが、ＰＲＬ−３陰性（ＰＲＬ−３−）腫瘍の増殖は遮断しないことを示した。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）との併用、または５−ＦＵ単独よりも、単剤療法としてより優れた療法有効性を有した。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３＋腫瘍組織において特に濃縮され、そしてＰＲＬ−３＋腫瘍微小環境への免疫細胞補充を促進した。予期せぬことに、本発明者らは、多数のタイプのヒト癌尿の６２％、およびＰＲＬ−３＋腫瘍所持マウス由来の癌尿の１００％で、分泌ＰＲＬ−３癌タンパク質が見られるが、ＰＲＬ−３−腫瘍所持マウスにおいては見られないことを見出した。さらに、尿ＰＲＬ−３レベルは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂでの有効な治療後、有意に減少した。尿ＰＲＬ−３は、将来的に、多数の癌タイプにおいて、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法の療法的反応監視のための、潜在的に診断性でそして代理のバイオマーカーとして見なされうる。
【０００８】
本発明者らはまた作用機構（ＭＯＡ）を調べて、ＰＲＬ−３抗体がどのようにその細胞内ＰＲＬ−３抗原に結合可能であるかに取り組み、そして実際に、「細胞内癌タンパク質」が、癌において「細胞外癌タンパク質」として細胞表面に再局在化することが可能であり、したがって、細胞外癌ターゲットに対する抗体の慣用的な経路を通じて、腫瘍排除のための合理的な基礎にしたがうと結論付ける。
【０００９】
これと一致して、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体相互作用、完全抗体活性、および宿主免疫を増進させるための増加したＭ１（しかしＭ２増加は必要としない）マクロファージ、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞を必要として、ＰＲＬ−３「細胞内」抗原を発現している腫瘍を遮断することを見出した。これらの結果は、「細胞内癌タンパク質」をターゲティングする抗体のＭＯＡが、実際、腫瘍を排除するための古典的抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または食作用（ＡＤＣＰ）経路を通じた、「細胞外癌タンパク質」をターゲティングする類似の原理にしたがうことを示唆する。
【００１０】
最後に、１１０の貴重な新鮮凍結ヒト腫瘍またはそのマッチした正常組織を用いて、本発明者らは、ＰＲＬ−３が９つの異なるヒト癌タイプ：肝臓、肺、結腸、乳房、胃、膀胱、前立腺、ＡＭＬ、および腎臓患者腫瘍試料由来の平均≧７８％で広く過剰発現されているが、マッチした正常組織では過剰発現されない、優れた腫瘍特異的癌ターゲットであることをさらに示した。したがって、ＰＲＬ−３は癌の有用なバイオマーカーであり、そして癌療法のためのほぼ普遍的なターゲットでありうる。したがって、ＰＲＬ−３は、固形腫瘍の有用なバイオマーカーを提供しうる。
【００１１】
本発明は、ＰＲＬ３に結合する抗体または抗原結合性断片に関する。重鎖および軽鎖ポリペプチドもまた開示する。抗体、抗原結合性断片およびポリペプチドは、単離および／または精製型で提供されてもよく、そして研究、療法および診断で使用するために適した組成物に配合されてもよい。特に、本発明は、ＰＲＬ３に結合するヒト化抗体、および特に、ＰＲＬ３アンタゴニスト抗体に関する。
【００１２】
いくつかの場合、本発明の抗体は、ＰＲＬ３の機能を阻害する。いくつかの場合、抗体は、ＰＲＬ３のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）機能を阻害する。いくつかの場合、抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを誘導する。いくつかの場合、抗体はＦｃ受容体、例えばＦｃＲＩＩおよび／またはＦｃＲＩＩＩに結合可能である。いくつかの場合、細胞への抗体の結合は、細胞への免疫細胞、例えばＢ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの補充を導く。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の原理を例示する態様および実験は、ここで、付随する図を参照して論じられるであろう。
【図１】ＰＲＬ−３は、胃腫瘍で高発現される新規癌ターゲットである。（Ａ）ＦＶＢ／野生型マウスの多様な正常組織（レーン１〜１５）およびＦＶＢ／ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス由来の自発的乳房および転移性肺腫瘍（レーン１６および１７）におけるＰＲＬ−３のウェスタンブロット。ブロットをＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ抗体で探査した。ＨＳＰ７０、装填対照。（Ｂ）ＳＧＳｅｔ１  ＧＣ患者コホートにおけるＰＲＬ−３  ｍＲＮＡ発現のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析。ｎ＝１８３；ｐ＝０．００２、ログランク検定。（Ｃ）ＧＣ患者由来のヒト原発性胃腫瘍（Ｔ）対患者マッチ正常組織（ｎ）の２０対におけるＰＲＬ−３の完全ウェスタンブロット分析。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。
【図２−１】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３＋同所性胃腫瘍を特異的に遮断する。（Ａ）２２のヒトＧＣ細胞株における内因性ＰＲＬ−３に関するウェスタンブロット。続く動物モデルのために選択した腫瘍原性ＰＲＬ−３＋およびＰＲＬ−３−細胞株をアステリスク（＊）とともに赤で示す。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。（Ｂ）Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける実験同所性ＧＣモデルの概略。（Ｃ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４同所性胃腫瘍増殖を阻害する。パネルａ〜ｂ、実験終了時（第２８日）のマウス外観。矢印は、未治療マウスにおける異常な腹部膨満を強調する。パネルｃ〜ｄ、黒線で囲んだ腫瘍領域を含む切除胃。バー、１０ｍｍ。（Ｄ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群における第２８日の平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝８；ｐ＝０．０１、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｅ）マウスの未治療（赤線）およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．００６、ログランク検定。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意と見なされた。
【図２−２】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３＋同所性胃腫瘍を特異的に遮断する。（Ａ）２２のヒトＧＣ細胞株における内因性ＰＲＬ−３に関するウェスタンブロット。続く動物モデルのために選択した腫瘍原性ＰＲＬ−３＋およびＰＲＬ−３−細胞株をアステリスク（＊）とともに赤で示す。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。（Ｂ）Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける実験同所性ＧＣモデルの概略。（Ｃ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４同所性胃腫瘍増殖を阻害する。パネルａ〜ｂ、実験終了時（第２８日）のマウス外観。矢印は、未治療マウスにおける異常な腹部膨満を強調する。パネルｃ〜ｄ、黒線で囲んだ腫瘍領域を含む切除胃。バー、１０ｍｍ。（Ｄ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群における第２８日の平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝８；ｐ＝０．０１、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｅ）マウスの未治療（赤線）およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．００６、ログランク検定。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意と見なされた。
【図２−３】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３＋同所性胃腫瘍を特異的に遮断する。（Ａ）２２のヒトＧＣ細胞株における内因性ＰＲＬ−３に関するウェスタンブロット。続く動物モデルのために選択した腫瘍原性ＰＲＬ−３＋およびＰＲＬ−３−細胞株をアステリスク（＊）とともに赤で示す。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。（Ｂ）Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける実験同所性ＧＣモデルの概略。（Ｃ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４同所性胃腫瘍増殖を阻害する。パネルａ〜ｂ、実験終了時（第２８日）のマウス外観。矢印は、未治療マウスにおける異常な腹部膨満を強調する。パネルｃ〜ｄ、黒線で囲んだ腫瘍領域を含む切除胃。バー、１０ｍｍ。（Ｄ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群における第２８日の平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝８；ｐ＝０．０１、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｅ）マウスの未治療（赤線）およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．００６、ログランク検定。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意と見なされた。
【図３−１】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３−同所性胃腫瘍に療法的効果を持たない。（Ａ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、ＰＲＬ−３−ＭＫＮ４５同所性胃腫瘍増殖を遮断不能であった。パネルａ〜ｂ、実験終了時（第５６日）のマウス外観。パネルｃ〜ｄ、黒線で囲んだ腫瘍領域を含む切除胃。バー、１０ｍｍ。（Ｂ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群における第５６日の平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝５；ｐ＝０．４、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｃ）マウスの未治療（赤線）およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．３、ログランク検定。（Ｄ）４つのヒトＧＣ細胞株の同所性モデルにおけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療転帰の要約。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされた。（Ｅ）ＭＫＮ４５−ＰＲＬ３同所性胃腫瘍増殖からの第２８日の平均胃腫瘍体積。Ｎ＝４（未治療）または５（治療）、「ｐ＝０．００００２、ｔ検定」データは平均±ＳＥＭに相当する。
【図３−２】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３−同所性胃腫瘍に療法的効果を持たない。（Ａ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、ＰＲＬ−３−ＭＫＮ４５同所性胃腫瘍増殖を遮断不能であった。パネルａ〜ｂ、実験終了時（第５６日）のマウス外観。パネルｃ〜ｄ、黒線で囲んだ腫瘍領域を含む切除胃。バー、１０ｍｍ。（Ｂ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群における第５６日の平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝５；ｐ＝０．４、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｃ）マウスの未治療（赤線）およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．３、ログランク検定。（Ｄ）４つのヒトＧＣ細胞株の同所性モデルにおけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療転帰の要約。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされた。（Ｅ）ＭＫＮ４５−ＰＲＬ３同所性胃腫瘍増殖からの第２８日の平均胃腫瘍体積。Ｎ＝４（未治療）または５（治療）、「ｐ＝０．００００２、ｔ検定」データは平均±ＳＥＭに相当する。
【図４−１】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）との併用療法、または５−ＦＵ単独よりも、単剤療法としてより有効である。４つの治療群を用いて、ＰＲＬ−３＋ＳＮＵ−４８４同所性腫瘍を治療した：ＰＢＳ対照（群１）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単剤療法（群２）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ＋５−ＦＵ併用療法（群３）、または５−ＦＵ単剤療法（群４）。（Ａ）第２８日の各治療群由来の切除マウス胃、同所性腫瘍領域を黒線で囲む。バー、１０ｍｍ。右パネル、第２８日の各群における平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝５；群１と比較した際の各群のｐ値を示す、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｂ）療法開始前（第０日）および実験終了時（第２８日）の治療マウス群由来のギムザ染色血液スメアの代表的な画像。白血球（ＷＢＣ）は青に染まる。バー、４０μｍ。右パネル、第２８日の各マウス由来の血液スメアからの平均ＷＢＣカウント。群あたり、ｎ＝５；群１と比較した際の各群のｐ値を示す、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされた。（Ｃ）多様な治療措置終了時（第２８日）のマウス群の血液学的プロファイル。赤で強調された値は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに関する正常参照範囲からの外れ値を示す（３５）。
【図４−２】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）との併用療法、または５−ＦＵ単独よりも、単剤療法としてより有効である。４つの治療群を用いて、ＰＲＬ−３＋ＳＮＵ−４８４同所性腫瘍を治療した：ＰＢＳ対照（群１）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単剤療法（群２）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ＋５−ＦＵ併用療法（群３）、または５−ＦＵ単剤療法（群４）。（Ａ）第２８日の各治療群由来の切除マウス胃、同所性腫瘍領域を黒線で囲む。バー、１０ｍｍ。右パネル、第２８日の各群における平均胃腫瘍体積。群あたり、ｎ＝５；群１と比較した際の各群のｐ値を示す、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。（Ｂ）療法開始前（第０日）および実験終了時（第２８日）の治療マウス群由来のギムザ染色血液スメアの代表的な画像。白血球（ＷＢＣ）は青に染まる。バー、４０μｍ。右パネル、第２８日の各マウス由来の血液スメアからの平均ＷＢＣカウント。群あたり、ｎ＝５；群１と比較した際の各群のｐ値を示す、ｔ検定；データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされた。（Ｃ）多様な治療措置終了時（第２８日）のマウス群の血液学的プロファイル。赤で強調された値は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに関する正常参照範囲からの外れ値を示す（３５）。
【図５−１】細胞内ＰＲＬ−３癌タンパク質は、細胞培地内に分泌されることも可能であり、そして癌尿の６２％に存在するが、正常尿には存在しない。（Ａ）示すＧＣ細胞株のマッチした溶解物および馴化培地中のＰＲＬ−３のウェスタンブロッティング。ＣＡＮＸ、カルネキシン。（Ｂ）研究したすべての癌患者および正常個体由来の尿試料における％ＰＲＬ−３陽性の要約。（Ｃ〜Ｆ）（Ｃ）正常個体およびＧＣ患者、（Ｄ）鼻咽頭癌患者、（Ｅ）膀胱癌患者、および（Ｆ）肺癌患者の尿におけるＰＲＬ−３の代表的なウェスタンブロット。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。
【図５−２】細胞内ＰＲＬ−３癌タンパク質は、細胞培地内に分泌されることも可能であり、そして癌尿の６２％に存在するが、正常尿には存在しない。（Ａ）示すＧＣ細胞株のマッチした溶解物および馴化培地中のＰＲＬ−３のウェスタンブロッティング。ＣＡＮＸ、カルネキシン。（Ｂ）研究したすべての癌患者および正常個体由来の尿試料における％ＰＲＬ−３陽性の要約。（Ｃ〜Ｆ）（Ｃ）正常個体およびＧＣ患者、（Ｄ）鼻咽頭癌患者、（Ｅ）膀胱癌患者、および（Ｆ）肺癌患者の尿におけるＰＲＬ−３の代表的なウェスタンブロット。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。
【図５−３】細胞内ＰＲＬ−３癌タンパク質は、細胞培地内に分泌されることも可能であり、そして癌尿の６２％に存在するが、正常尿には存在しない。（Ａ）示すＧＣ細胞株のマッチした溶解物および馴化培地中のＰＲＬ−３のウェスタンブロッティング。ＣＡＮＸ、カルネキシン。（Ｂ）研究したすべての癌患者および正常個体由来の尿試料における％ＰＲＬ−３陽性の要約。（Ｃ〜Ｆ）（Ｃ）正常個体およびＧＣ患者、（Ｄ）鼻咽頭癌患者、（Ｅ）膀胱癌患者、および（Ｆ）肺癌患者の尿におけるＰＲＬ−３の代表的なウェスタンブロット。Ｍｒ、相対分子量（ｋＤａ）。
【図６−１】有効なＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、尿ＰＲＬ−３を喪失させ、そして免疫エフェクターの腫瘍内集積および補充に機構的に関与する。（Ａ）ＰＲＬ−３＋ＳＮＵ４８４またはＰＲＬ−３−ＭＫＮ４５同所性胃腫瘍を宿する未治療またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウス由来のマッチした尿および腫瘍試料におけるＰＲＬ−３タンパク質のウェスタンブロッティング。上部パネル、第２８日（ＳＮＵ−４８４）または第５６日（ＭＫＮ４５）の切除胃。（Ｂ）多様な治療に供したマウス由来の同所性ＳＮＵ−４８４およびＭＫＮ４５腫瘍細胞凍結切片を、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関する免疫組織化学（パネルａ〜ｆ；バー、２０μｍ）、またはＢ細胞（パネルｅ〜ｌ）およびＮＫ細胞マーカー（パネルｍ〜ｒ；バー、５０μｍ）に関する免疫蛍光によって分析した。緑、それぞれ、Ｂ細胞およびＮＫ細胞マーカーのＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０およびＣＤ３３５／Ｎｋｐ４６染色；青、ＤＡＰＩ核染色。（Ｃ）ＰＲＬ−３＋癌細胞に対するＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの提唱される作用機構を示すモデル：１）非慣用的な分泌（エクソソームＰＲＬ−３）、または壊死性ＰＲＬ−３＋腫瘍細胞からの自発的な漏洩（遊離ＰＲＬ−３）を通じて外在化したＰＲＬ−３抗原が、２）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ結合および腫瘍微小環境内での免疫複合体集積のベイト（ｂａｉｔ）として作用し、続いて、３）抗腫瘍効果のためのエフェクターＮＫおよびＢ細胞の補充および活性化を生じる。
【図６−２】有効なＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、尿ＰＲＬ−３を喪失させ、そして免疫エフェクターの腫瘍内集積および補充に機構的に関与する。（Ａ）ＰＲＬ−３＋ＳＮＵ４８４またはＰＲＬ−３−ＭＫＮ４５同所性胃腫瘍を宿する未治療またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウス由来のマッチした尿および腫瘍試料におけるＰＲＬ−３タンパク質のウェスタンブロッティング。上部パネル、第２８日（ＳＮＵ−４８４）または第５６日（ＭＫＮ４５）の切除胃。（Ｂ）多様な治療に供したマウス由来の同所性ＳＮＵ−４８４およびＭＫＮ４５腫瘍細胞凍結切片を、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関する免疫組織化学（パネルａ〜ｆ；バー、２０μｍ）、またはＢ細胞（パネルｅ〜ｌ）およびＮＫ細胞マーカー（パネルｍ〜ｒ；バー、５０μｍ）に関する免疫蛍光によって分析した。緑、それぞれ、Ｂ細胞およびＮＫ細胞マーカーのＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０およびＣＤ３３５／Ｎｋｐ４６染色；青、ＤＡＰＩ核染色。（Ｃ）ＰＲＬ−３＋癌細胞に対するＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの提唱される作用機構を示すモデル：１）非慣用的な分泌（エクソソームＰＲＬ−３）、または壊死性ＰＲＬ−３＋腫瘍細胞からの自発的な漏洩（遊離ＰＲＬ−３）を通じて外在化したＰＲＬ−３抗原が、２）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ結合および腫瘍微小環境内での免疫複合体集積のベイト（ｂａｉｔ）として作用し、続いて、３）抗腫瘍効果のためのエフェクターＮＫおよびＢ細胞の補充および活性化を生じる。
【図６−３】有効なＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、尿ＰＲＬ−３を喪失させ、そして免疫エフェクターの腫瘍内集積および補充に機構的に関与する。（Ａ）ＰＲＬ−３＋ＳＮＵ４８４またはＰＲＬ−３−ＭＫＮ４５同所性胃腫瘍を宿する未治療またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウス由来のマッチした尿および腫瘍試料におけるＰＲＬ−３タンパク質のウェスタンブロッティング。上部パネル、第２８日（ＳＮＵ−４８４）または第５６日（ＭＫＮ４５）の切除胃。（Ｂ）多様な治療に供したマウス由来の同所性ＳＮＵ−４８４およびＭＫＮ４５腫瘍細胞凍結切片を、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関する免疫組織化学（パネルａ〜ｆ；バー、２０μｍ）、またはＢ細胞（パネルｅ〜ｌ）およびＮＫ細胞マーカー（パネルｍ〜ｒ；バー、５０μｍ）に関する免疫蛍光によって分析した。緑、それぞれ、Ｂ細胞およびＮＫ細胞マーカーのＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０およびＣＤ３３５／Ｎｋｐ４６染色；青、ＤＡＰＩ核染色。（Ｃ）ＰＲＬ−３＋癌細胞に対するＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの提唱される作用機構を示すモデル：１）非慣用的な分泌（エクソソームＰＲＬ−３）、または壊死性ＰＲＬ−３＋腫瘍細胞からの自発的な漏洩（遊離ＰＲＬ−３）を通じて外在化したＰＲＬ−３抗原が、２）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ結合および腫瘍微小環境内での免疫複合体集積のベイト（ｂａｉｔ）として作用し、続いて、３）抗腫瘍効果のためのエフェクターＮＫおよびＢ細胞の補充および活性化を生じる。
【図７−１】ＣＤＲの位置を示す、ヒト化抗体配列。（Ａ）重鎖配列、（Ｂ）軽鎖配列。
【図７−２】ＣＤＲの位置を示す、ヒト化抗体配列。（Ａ）重鎖配列、（Ｂ）軽鎖配列。
【図８】ネズミ抗体クローンの配列（Ａ）クローン＃２２３および（Ｂ）クローン＃３１８。
【図９】ヒトＰＲＬ３配列
【図１０−１】ＰＲＬ−３ｚｕｍａｂ配列分析。（Ａ）ＣＤＲ領域を同定し（グレーのボックス）、そして重要なドメイン配列（透明なボックス）を同定する、ヒト化配列の軽鎖配列整列。（Ｂ）ＣＤＲ領域を同定し（グレーのボックス）、そして重要なドメイン配列（透明なボックス）を同定する、ヒト化配列の重鎖配列整列。
【図１０−２】ＰＲＬ−３ｚｕｍａｂ配列分析。（Ａ）ＣＤＲ領域を同定し（グレーのボックス）、そして重要なドメイン配列（透明なボックス）を同定する、ヒト化配列の軽鎖配列整列。（Ｂ）ＣＤＲ領域を同定し（グレーのボックス）、そして重要なドメイン配列（透明なボックス）を同定する、ヒト化配列の重鎖配列整列。
【図１１】ＰＲＬ−３は、正常成人組織では発現されないが、ヒト胃腫瘍において強く発現される。（Ａ）（ａ）多様な臓器由来の多数の正常ヒト組織、ならびに（Ｂ）ＧＣ患者由来のマッチした胃腫瘍および正常胃組織の、ＰＲＬ−３発現に関する免疫組織化学。バー、５０μｍ。
【図１２】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３に特異的に結合するが、近縁のＰＲＬ−１またはＰＲＬ−２には結合しない。（Ａ〜Ｃ）ＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３タンパク質のヒトアイソフォームを、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ特異性の分析に用いた。（ａ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂまたは抗ＧＳＴ抗体で探査した組換えＧＳＴ−ＰＲＬ１、ＧＳＴ−ＰＲＬ２、およびＧＳＴ−ＰＲＬ３のウェスタンブロッティング。（ｂ）組換えＧＳＴ−ＰＲＬ１、ＧＳＴ−ＰＲＬ２、およびＧＳＴ−ＰＲＬ３タンパク質を用いた、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関するＥＬＩＳＡ。（ｃ）ＰＲＬ３−ｚｕｍｂａを用いた、ＧＦＰ−ＰＲＬ１、ＧＦＰ−ＰＲＬ２、およびＧＦＰ−ＰＲＬ３を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の免疫蛍光染色。バー、４０μｍ。
【図１３】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、マウスにおいて、ＰＲＬ−３＋同所性胃腫瘍の腫瘍増殖を阻害する。８週齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに、ＰＲＬ−３陽性ＮＵＧＣ−４またはＩＭ−９５細胞株を移植して、同所性胃腫瘍を誘導した。実験終了時、可視性の腫瘍（黒で囲む）を測定し、そして体積を比較した。（ａ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウス由来のＩＭ−９５腫瘍を含む胃。最も右側のパネル、未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスにおけるＩＭ−９５腫瘍の平均腫瘍体積を示すチャート。ｐ＝０．００８、ｔ検定；ｎ＝６、データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。バー、１０ｍｍ。（ｂ）未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウス由来のＮＵＧＣ−４腫瘍を含む胃。最も右側のパネル、未治療およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスにおけるＮＵＧＣ−４腫瘍の平均腫瘍体積。ｐ＝０．００３、ｔ検定；ｎ＝４、データは平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。バー、１０ｍｍ。（Ｃ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＲＬ３陽性胃腫瘍を抑制するが、ヒトＩｇＧアイソタイプ対照はこれを抑制しない。未治療、ヒトＩｇＧ治療（ｈＩｇＧ）、およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスにおいて、８週齢雄ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに、ＰＲＬ３陽性ＳＮＵ−４８４腫瘍を移植した。Ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ；群あたり、ｎ＝４、データは平均±ＳＥＭに相当する。＊＊＊ｐ＜０．００１、ターキーの事後検定（未治療対治療群）。
【図１４】術後ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法は、ＰＲＬ−３＋腫瘍の再発を抑制する。（Ａ）ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４細胞によって形成された異種移植片腫瘍を、腫瘍切除前に３週間増殖させた。続いて、マウスをプラセボ（未治療）またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（治療）群に分け、そして週２回７週間治療して、腫瘍再増殖を監視した。パネルａ、３週終了時の腫瘍所持マウス外観。パネルｂ、腫瘍外科切除後のマウス外観、切除した腫瘍を下部パネルに示す。パネルｃ〜ｄ、切除および治療７週後のマウス外観。パネルｅ、切除部位で再発した切除腫瘍。パネルｆ、治療マウスにおいては腫瘍再発なし。バー、１０ｍｍ。（Ｂ）マウスの未治療（ｎ＝１０）および治療（ｎ＝８）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ無再発生存分析。Ｐ＜０．００１、ログランク検定。
【図１５−１】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、胃内に移植されたＰＲＬ−３＋  ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞によって形成された局所および転移性腹部腫瘍を阻害する。ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２細胞を、マウス胃の胃漿膜下層内に移植して、胃微小環境への続発性結腸直腸癌転移を模倣した。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、胃微小環境におけるＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２腫瘍の増殖を減少させた。（Ａ）接種後３週間に渡る全体的ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖のＩＶＩＳ画像化。（Ｂ）（Ａ）由来のマウスを、経時的に全動物ＩＶＩＳ強度変化に関して分析した。群あたり、ｎ＝４；ｐ＜０．００１、二方向ＡＮＯＶＡ。（Ｃ）３週終了時の切除胃における腫瘍負荷。（Ｄ）（Ｃ）由来の胃を、ＩＶＩＳ強度の相違に関して分析した。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．０１、ｔ検定；データは平均±ＳＥＭに相当する。（Ｅ）３週終了時の腹壁内の転移性腫瘍負荷。（Ｆ）（Ｅ）由来の胃を、ＩＶＩＳ強度の相違に関して分析した。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．０００３、ｔ検定；データは平均±ＳＥＭに相当する。
【図１５−２】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、胃内に移植されたＰＲＬ−３＋  ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞によって形成された局所および転移性腹部腫瘍を阻害する。ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２細胞を、マウス胃の胃漿膜下層内に移植して、胃微小環境への続発性結腸直腸癌転移を模倣した。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、胃微小環境におけるＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２腫瘍の増殖を減少させた。（Ａ）接種後３週間に渡る全体的ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖のＩＶＩＳ画像化。（Ｂ）（Ａ）由来のマウスを、経時的に全動物ＩＶＩＳ強度変化に関して分析した。群あたり、ｎ＝４；ｐ＜０．００１、二方向ＡＮＯＶＡ。（Ｃ）３週終了時の切除胃における腫瘍負荷。（Ｄ）（Ｃ）由来の胃を、ＩＶＩＳ強度の相違に関して分析した。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．０１、ｔ検定；データは平均±ＳＥＭに相当する。（Ｅ）３週終了時の腹壁内の転移性腫瘍負荷。（Ｆ）（Ｅ）由来の胃を、ＩＶＩＳ強度の相違に関して分析した。群あたり、ｎ＝４；ｐ＝０．０００３、ｔ検定；データは平均±ＳＥＭに相当する。
【図１６】エクソソーム会合ＰＲＬ−３が、膀胱癌患者の尿に存在する。膀胱癌患者尿試料から精製したエクソソーム分画を、ＰＲＬ３  ＣＤ６３エクソソームマーカーに対する抗体で分析した。
【図１７】ＳＧＳｅｔ１患者コホートの臨床特性。
【図１８】ＳＧＳｅｔ１患者コホートにおけるＰＲＬ−３発現の単変数および多変数Ｃｏｘ回帰分析。
【図１９】ＰＲＬ３癌タンパク質は、癌細胞外に分泌される可能性もあり、そしてＰＲＬ３−ｚｕｍａｂのベイトとして作用しうる。（Ａ）血清不含培地中で４８時間、胃癌（ＧＣ）細胞を培養した後の、細胞内タンパク質プール（細胞溶解物）および細胞外タンパク質プール（濃縮馴化培地）におけるＰＲＬ３タンパク質発現の分析。細胞外タンパク質分析のため、ＧＣ細胞の５つのプレート由来の馴化培地（５０ｍＬ）から、まず、死亡細胞および細胞破片を除き、その後、遠心分離濃縮した（最終体積〜０．２ｍＬ）。（Ｂ）多様な治療に供したマウス由来の同所性ＳＮＵ−４８４およびＭＫＮ４５腫瘍組織凍結切片を、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関する免疫組織化学によって分析した。バー、２０μ＜μＭ。
【図２０】ＰＲＬ−３は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞表面上で非常に上方制御されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養癌細胞上では上方制御されない。（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞およびｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞の細胞表面プロファイルのサイトメトリー分析の実験概略。（ｂ）対照（透明）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（ピンク）、またはセツキシマブ（ＣＴＸ；グレー）抗体での細胞表面染色の代表的ヒストグラム。対照染色から与えられるバックグラウンドシグナルを減じた後、陽性ゲート（％ｐｏｓ）を決定した。（ｃ）（ｂ）におけるように試験した異なる抗体に関する％細胞表面陽性集団。データは平均±ＳＥＭに相当する。（ｄ）培養細胞対腫瘍における、タンパク質の改変されたレベルを示す、ＥＧＦＲおよびＰＲＬ−３に関するウェスタンブロット。ＧＡＰＤＨ、装填対照。
【図２１−１】同所性肝臓腫瘍のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ抑制は、宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体関与を必要とする。（ａ）同所性肝臓腫瘍モデルの概略。（ｂ）６つのヒト癌細胞株におけるＰＲＬ−３発現のウェスタンブロット。ＧＡＰＤＨ、装填対照。（ｃ）同所性ＰＲＬ−３＋  ＭＨＣＣ−ＬＭ３肝臓腫瘍を所持するマウスは、プラセボ（未治療）に比較して、週２回５週間、１００μｇ／用量のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ投与後（治療）、減少した腫瘍負荷を有した。バー、１０ｍｍ。（ｄ）第３５日での未治療および治療群における平均肝臓腫瘍体積。ｐ＝０．０００１、ｔ検定；データは平均±ＳＥＭに相当する。（ｅ）マウスの未治療（赤線）および治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。ｐ＝０．００２、ログランク検定。（ｆ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ対ＰＲＬ３−ミニボディのドメイン構築、および宿主免疫細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と関与するこれらの能力を示す模式図。２．４２Ｇ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＦｃＲブロッカーとして機能し、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ＩｇＧがＦｃＲに結合するのを妨げる。
【図２１−２】同所性肝臓腫瘍のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ抑制は、宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体関与を必要とする。（ａ）同所性肝臓腫瘍モデルの概略。（ｂ）６つのヒト癌細胞株におけるＰＲＬ−３発現のウェスタンブロット。ＧＡＰＤＨ、装填対照。（ｃ）同所性ＰＲＬ−３＋  ＭＨＣＣ−ＬＭ３肝臓腫瘍を所持するマウスは、プラセボ（未治療）に比較して、週２回５週間、１００μｇ／用量のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ投与後（治療）、減少した腫瘍負荷を有した。バー、１０ｍｍ。（ｄ）第３５日での未治療および治療群における平均肝臓腫瘍体積。ｐ＝０．０００１、ｔ検定；データは平均±ＳＥＭに相当する。（ｅ）マウスの未治療（赤線）および治療（黒線）群のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析。ｐ＝０．００２、ログランク検定。（ｆ）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ対ＰＲＬ３−ミニボディのドメイン構築、および宿主免疫細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と関与するこれらの能力を示す模式図。２．４２Ｇ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＦｃＲブロッカーとして機能し、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ＩｇＧがＦｃＲに結合するのを妨げる。
【図２２−１】宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体との相互作用は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびＭ１マクロファージの腫瘍微小環境へのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ誘導性補充に必須である。多様な治療に供したマウス由来の同所性ＭＨＣＣ−ＬＭ３肝臓腫瘍組織凍結切片を、（ａ）Ｆ４／８０（汎マクロファージ）、（ｂ）ＣＤ２０６（Ｍ２マクロファージ）、（ｃ）ＣＤ８６（Ｍ１マクロファージ）、（ｄ）ＣＤ４５／Ｂ２２０（Ｂ細胞）、または（ｅ）ＣＤ３３５（ＮＫ細胞）に対する抗体を用いた免疫蛍光によって分析した。材料および方法に記載するように、腫瘍侵襲スコアを計算した。＊ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ；データは平均±ＳＥＭに相当する。（ｇ）第３５日でのプラセボ（未治療）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単独、２．４Ｇ２  ｍＡｂ、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ＋２．４Ｇ２  ｍＡｂ併用療法、ヒトＩｇＧ、またはＰＲＬ３−ミニボディで治療したマウス由来の切除肝臓の写真を撮影し、そして腫瘍体積を測定した。同所性腫瘍領域を黒線で囲む。バー、１０ｍｍ。第３５日での各群の平均肝臓腫瘍体積。ｐ＝０．００３、一方向ＡＮＯＶＡ；データは平均±ＳＥＭに相当する。
【図２２−２】宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体との相互作用は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびＭ１マクロファージの腫瘍微小環境へのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ誘導性補充に必須である。多様な治療に供したマウス由来の同所性ＭＨＣＣ−ＬＭ３肝臓腫瘍組織凍結切片を、（ａ）Ｆ４／８０（汎マクロファージ）、（ｂ）ＣＤ２０６（Ｍ２マクロファージ）、（ｃ）ＣＤ８６（Ｍ１マクロファージ）、（ｄ）ＣＤ４５／Ｂ２２０（Ｂ細胞）、または（ｅ）ＣＤ３３５（ＮＫ細胞）に対する抗体を用いた免疫蛍光によって分析した。材料および方法に記載するように、腫瘍侵襲スコアを計算した。＊ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ；データは平均±ＳＥＭに相当する。（ｇ）第３５日でのプラセボ（未治療）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単独、２．４Ｇ２  ｍＡｂ、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ＋２．４Ｇ２  ｍＡｂ併用療法、ヒトＩｇＧ、またはＰＲＬ３−ミニボディで治療したマウス由来の切除肝臓の写真を撮影し、そして腫瘍体積を測定した。同所性腫瘍領域を黒線で囲む。バー、１０ｍｍ。第３５日での各群の平均肝臓腫瘍体積。ｐ＝０．００３、一方向ＡＮＯＶＡ；データは平均±ＳＥＭに相当する。
【図２３−１】ＰＲＬ−３は、多数のヒト腫瘍において頻繁に過剰発現される、一般的な癌ターゲットである。（ａ〜ｅ）（ａ）肝臓腫瘍、（ｂ）肺腫瘍、（ｃ）結腸腫瘍、（ｄ）乳房腫瘍、および（ｅ）腎臓腫瘍の腫瘍（Ｔ）対患者マッチ正常組織（ｎ）対におけるＰＲＬ−３の完全ウェスタンブロット分析。（ｆ〜ｊ）マッチ正常組織を伴わない、さらなる患者試料における（ｆ）腎臓腫瘍、（ｇ）膀胱腫瘍、（ｈ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、（ｉ）胃腫瘍、および（ｊ）前立腺腫瘍の完全ウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。各結果セットの右側に、相対分子量（ｋＤａ）を示す。
【図２３−２】ＰＲＬ−３は、多数のヒト腫瘍において頻繁に過剰発現される、一般的な癌ターゲットである。（ａ〜ｅ）（ａ）肝臓腫瘍、（ｂ）肺腫瘍、（ｃ）結腸腫瘍、（ｄ）乳房腫瘍、および（ｅ）腎臓腫瘍の腫瘍（Ｔ）対患者マッチ正常組織（ｎ）対におけるＰＲＬ−３の完全ウェスタンブロット分析。（ｆ〜ｊ）マッチ正常組織を伴わない、さらなる患者試料における（ｆ）腎臓腫瘍、（ｇ）膀胱腫瘍、（ｈ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、（ｉ）胃腫瘍、および（ｊ）前立腺腫瘍の完全ウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。各結果セットの右側に、相対分子量（ｋＤａ）を示す。
【図２３−３】ＰＲＬ−３は、多数のヒト腫瘍において頻繁に過剰発現される、一般的な癌ターゲットである。（ａ〜ｅ）（ａ）肝臓腫瘍、（ｂ）肺腫瘍、（ｃ）結腸腫瘍、（ｄ）乳房腫瘍、および（ｅ）腎臓腫瘍の腫瘍（Ｔ）対患者マッチ正常組織（ｎ）対におけるＰＲＬ−３の完全ウェスタンブロット分析。（ｆ〜ｊ）マッチ正常組織を伴わない、さらなる患者試料における（ｆ）腎臓腫瘍、（ｇ）膀胱腫瘍、（ｈ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、（ｉ）胃腫瘍、および（ｊ）前立腺腫瘍の完全ウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。各結果セットの右側に、相対分子量（ｋＤａ）を示す。
【図２４】ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂがＰＲＬ−３＋癌細胞を直接阻害可能であるかどうかを分析するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ。
【図２５】同所性ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４胃腫瘍に対する（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２  ＰＲＬ３−ミニボディの有効性。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の１つの側面において、抗体または抗原結合性断片を提供し、該抗体のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ｉ）〜ｉｉｉ）、またはアミノ酸配列ｉｖ）〜ｖｉ）、あるいは好ましくはアミノ酸配列ｉ）〜ｖｉ）；
【００１５】
【化１】
2019531254.tif 000003
【００１６】
あるいは、配列（ｉ）〜（ｖｉ）の１もしくはそれより多くの配列の１もしくは２もしくは３アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、その変異体を含んでもよい。
抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
【００１７】
【化２】
2019531254.tif 000004
【００１８】
を取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含んでもよい。
抗体または抗原結合性断片は、以下のＣＤＲ：
【００１９】
【化３】
2019531254.tif 000005
【００２０】
を取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を含んでもよい。
抗体は、図７に示すＣＤＲを取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は、図７に示すＣＤＲを取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を含んでもよい。
【００２１】
抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つ、あるいは図７に示すＶＬ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでもよい。抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するＶＬ鎖アミノ酸配列を有し、そして以下のＣＤＲ配列：
【００２２】
【化４】
2019531254.tif 000006
【００２３】
を含んでもよい。
抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つ、あるいは図７に示すＶＨ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよい。抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するＶＨ鎖アミノ酸配列を有し、そして以下のＣＤＲ配列：
【００２４】
【化５】
2019531254.tif 000007
【００２５】
を含んでもよい。
抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つ（あるいは図７に示すＶＬ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列）を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域、および図７に示すアミノ酸配列の１つ（あるいは図７に示すＶＨ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含んでもよい。
【００２６】
抗体はＰＲＬ３に結合してもよい。抗体は、任意に、上述のようなアミノ酸配列構成要素を有してもよい。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＭであってもよく、好ましくはＩｇＧである。１つの態様において、ＰＲＬ３に結合する、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片を含む、任意に単離された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体を提供する。
【００２７】
本発明の１つの側面において、以下のＣＤＲ：
【００２８】
【化６】
2019531254.tif 000008
【００２９】
を含む、単離重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。
本発明の１つの側面において：
重鎖が、ＨＣ−ＣＤＲ１配列（配列番号１）、ＨＣ−ＣＤＲ２配列（配列番号２）、ＨＣ−ＣＤＲ３配列（配列番号３）に、それぞれ、少なくとも８５％の全体の配列同一性を有するＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３を含み、そして軽鎖が、ＬＣ−ＣＤＲ１配列（配列番号４）、ＬＣ−ＣＤＲ２配列（配列番号５）、ＬＣ−ＣＤＲ３配列（配列番号６）に、それぞれ、少なくとも８５％の全体の配列同一性を有するＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３を含む
重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗体または抗原結合性断片を提供する。
【００３０】
いくつかの態様において、配列同一性の度合いは、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つであってもよい。
【００３１】
本発明の別の側面において、任意に単離され、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体または抗原結合性断片であって：
重鎖配列が、図７に示す重鎖配列に少なくとも８５％の配列同一性を有し、そして；
軽鎖配列が、図７に示す軽鎖配列に少なくとも８５％の配列同一性を有する
前記抗体または抗原結合性断片を提供する。
【００３２】
いくつかの態様において、配列同一性の度合いは、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つであってもよい。
【００３３】
いくつかの態様において、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは、配置ＨＣＦＲ１：ＨＣ−ＣＤＲ１：ＨＣＦＲ２：ＨＣ−ＣＤＲ２：ＨＣＦＲ３：ＨＣ−ＣＤＲ３：ＨＣＦＲ４にしたがって、ＣＤＲ間に可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む。フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列由来であってもよい。
【００３４】
いくつかの場合、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは：
【００３５】
【化７】
2019531254.tif 000009
【００３６】
より選択される重鎖配列を有する。
本発明の１つの側面において、任意に、本明細書に記載するような重鎖可変領域ポリペプチドと組み合わされた、単離軽鎖可変領域ポリペプチドであって、以下のＣＤＲ：
【００３７】
【化８】
2019531254.tif 000010
【００３８】
を含む、前記軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。
いくつかの態様において、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは、配置ＬＣＦＲ１：ＬＣ−ＣＤＲ１：ＬＣＦＲ２：ＬＣ−ＣＤＲ２：ＬＣＦＲ３：ＬＣ−ＣＤＲ３：ＬＣＦＲ４にしたがって、ＣＤＲ間に可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列由来であってもよい。
【００３９】
いくつかの場合、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは：
【００４０】
【化９】
2019531254.tif 000011
【００４１】
より選択される軽鎖配列を含む。
いくつかの場合、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは：
【００４２】
【化１０】
2019531254.tif 000012
【００４３】
より選択されるアミノ酸配列の２、３、４、５、６、またはすべてを含む。
抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つ、あるいは図７に示すアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）および／または重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、そして以下のＣＤＲ配列：
【００４４】
【化１１】
2019531254.tif 000013
【００４５】
を含み、そして以下の配列：
【００４６】
【化１２】
2019531254.tif 000014
【００４７】
の少なくとも１つを含有してもよい。
抗体は、図７に示すアミノ酸配列の１つ、あるいは図７に示すアミノ酸配列の１つに、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）および／または重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよい。
【００４８】
抗体は：配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５、あるいはアミノ酸配列配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列より選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよい。
【００４９】
好ましくは、抗体は：配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２、あるいはアミノ酸配列配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列より選択される軽鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００５０】
抗体は：配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５、あるいはアミノ酸配列配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列より選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでもよい。
【００５１】
好ましくは、抗体は：配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２、あるいはアミノ酸配列配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列より選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００５２】
抗体は、以下のＣＤＲ配列：
【００５３】
【化１３】
2019531254.tif 000015
【００５４】
を含み、そして以下の配列：
【００５５】
【化１４】
2019531254.tif 000016
【００５６】
を含有し；そしてＰＲＬ３に結合可能であり、そしてＰＲＬ３の生物学的機能をアンタゴナイズ可能であってもよい。
いくつかの態様において、抗体または抗体結合性断片は、ヒト定常領域をさらに含んでもよい。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の１つより選択されるものである。
【００５７】
いくつかの態様において、抗体または抗体結合性断片は、ネズミ定常領域をさらに含んでもよい。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２ＢおよびＩｇＧ３の１つより選択されるものである。
【００５８】
抗体は好ましくは、全抗体、あるいはＦｃドメインを含む抗体または抗体断片である。抗体または抗体断片には、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの一方または両方が含まれてもよい。好ましくは、抗体にはＣＨ２ドメインが含まれる。抗体は、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの両方を含有してもよい。好ましくは、抗体はＦａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２断片ではなく、そして／またはｓｃＦｖではなく、そして／またはミニボディではない。好ましくは、抗体はＩｇＧ免疫グロブリンである。
【００５９】
いくつかの側面において、治療しようとする個体は、免疫適格性である。個体は、免疫適格性であることが決定されていてもよい。個体は、ＮＫ細胞および／またはＢ細胞を産生することが決定されていてもよい。個体は、ＮＫ細胞、および／またはＢ細胞を、例えばサイトカインの投与を通じて、あるいはＮＫ細胞および／またはＢ細胞の産生および／または活性化を減少させることが知られる剤の投与を停止することによって、ＮＫ細胞および／またはＢ細胞の産生および／または活性化を刺激するよう治療されていてもよい。
【００６０】
本発明の別の側面において、組成物、例えば薬学的組成物または薬剤を提供する。組成物は、本明細書に記載するような抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチド、および少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤を含んでもよい。
【００６１】
本発明の別の側面において、本明細書に記載するような抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。核酸は、図７に示す配列、または遺伝暗号の結果として縮重しているコーディング配列をコードするか、あるいは該配列と少なくとも７０％、任意に、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの同一性を有するヌクレオチド配列を有してもよい。
【００６２】
抗体はＰＲＬ３に結合してもよい。抗体は、アミノ酸配列ＫＡＫＦＹＮおよび／またはＨＴＨＫＴＲを含むエピトープに結合してもよい。抗体は、両方の配列に結合可能であってもよい。
【００６３】
本発明の１つの側面において、本明細書記載の核酸を含むベクターを提供する。本発明の別の側面において、ベクターを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、真核細胞、または哺乳動物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくはヒトであってもよく、あるいは原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）であってもよい。本発明の１つの側面において、本明細書に記載するような抗体、または抗原結合性断片またはポリペプチドを作製するための方法であって、抗体、または抗原結合性断片またはポリペプチドをコードするベクターの発現に適した条件下で、本明細書に記載するような宿主細胞を培養し、そして抗体、または抗原結合性断片またはポリペプチドを回収する工程を含む、前記方法を提供する。
【００６４】
本発明の別の側面において、療法において、または医学的治療法において使用するための、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを提供する。本発明の別の側面において、Ｔ細胞機能不全障害の治療において使用するための、本明細書に記載するような抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを提供する。本発明の別の側面において、Ｔ細胞機能不全障害の治療において使用するための薬剤または薬学的組成物の製造における、本明細書に記載するような抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドの使用を提供する。
【００６５】
本発明の別の側面において、ＰＲＬ３を含有するかまたは含有すると推測される試料を、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片と接触させ、そして抗体または抗原結合性断片およびＰＲＬ３の複合体の形成を検出する工程を含む方法を提供する。
【００６６】
本発明の別の側面において、被験体において、疾患または状態を診断する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、被験体由来の試料を、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片と接触させ、そして抗体または抗原結合性断片およびＰＲＬ３の複合体の形成を検出する工程を含む、前記方法を提供する。
【００６７】
本発明のさらなる側面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＲＬ３を検出するための、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片の使用を提供する。本発明の別の側面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断剤としての、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片の使用を提供する。
【００６８】
本発明の方法において、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを、本明細書に記載するような組成物として提供してもよい。
本発明の任意の側面において、抗体は、好ましくは、他のＰＲＬホスファターゼ、例えばＰＲＬ１またはＰＲＬ２よりも、ＰＲＬ３に特異的に結合する。
【００６９】
抗体はＩｇＧであってもよい。抗体は、約１４０〜１６０ｋＤａ、好ましくは約１５０ｋＤａの分子量を有してもよい。
いくつかの態様において、抗体はＰＲＬ３−ＺＵＭＡＢであってもよい。
【００７０】
本明細書にやはり開示するのは、癌の治療のための薬剤製造のための、本明細書に開示するようなヒト化抗体または抗原結合性断片の使用である。
他の側面において、癌を治療する方法において使用するためのヒト化抗体または抗体結合性断片を提供する。抗体は、腫瘍形成を阻害し、そして／または腫瘍転移を阻害するために有用であってもよい。抗体は、腫瘍サイズを減少させるために有用であってもよい。治療される個体は、治療されていない個体に比較して、または治療前の同じ個体に比較して、例えば、特定の腫瘍の腫瘍サイズにおける１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより多い減少、または腫瘍数の減少、あるいはその両方を示してもよい。
【００７１】
やはり提供するのは、本明細書に開示するような、ヒト化抗体または抗体結合性断片を投与する工程を含む、癌を治療する方法である。
癌は、ＰＲＬ３発現または過剰発現癌であってもよい。癌は胃癌であってもよい。
【００７２】
ヒト化抗体または抗体結合性断片を、静脈内投与してもよい。該抗体を、治療しようとする癌と離れた位置で投与してもよい。
いくつかの方法において、患者は、以前、化学療法、特に代謝拮抗剤療法、例えば５−ＦＵを投与されていない。いくつかの場合、患者は以前、こうした療法を受けておらず、または癌のために、例えば胃癌のためにこうした治療を受けていない。いくつかの場合、抗体は別の剤と同時投与されない（すなわち抗体単剤療法）。いくつかの場合、抗体は５−ＦＵと同時投与されない。
【００７３】
いくつかの方法において、患者は、損なわれた免疫系を持たないことが決定されている。特に、患者は、正常範囲内の白血球カウントを有することが決定されていてもよい。特に、患者は、白血球減少症を持たないことが決定されていてもよい。患者は、正常範囲内の好中球、リンパ球、単球、赤血球または血小板カウントを有することが決定されていてもよい。患者は、対照、例えば損なわれた免疫系を持たないことが知られている個体由来のカウント、または確立された正常値と有意には異ならない白血球、好中球、リンパ球、単球、赤血球または血小板カウントを有してもよい。例えば、患者は、血液マイクロリットル当たり、約４，５００〜約１０，０００の間の白血球を有すると決定されてもよい。
【００７４】
いくつかの側面において、本発明は、ヒト化抗ＰＲＬ３抗体または抗体断片での治療のための患者を選択するための方法であって、患者由来の尿試料において、ＰＲＬ３の存在を決定する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの場合、方法は、患者由来の尿試料において、ＰＲＬ３のレベルを決定する工程を含む。いくつかの場合、患者は、胃癌、鼻咽頭癌、膀胱癌、肺癌、乳癌または前立腺癌を有してもよい。
【００７５】
いくつかの場合、個体は、ＰＲＬ３過剰発現癌の家族歴を有するか、またはＰＲＬ３過剰発現癌を発展させる可能性を有すると同定されている。いくつかの場合、個体は、ＰＲＬ３過剰発現癌を有し、そしてその癌の転移のリスクがあると見なされる。
【００７６】
別の側面において、本明細書において、ＰＲＬ３の細胞局在を決定する工程を伴う方法を提供する。細胞表面上の細胞ＰＲＬ３の比率の増加は、個体が癌を有することを示しうる。本明細書において、細胞におけるＰＲＬ３の細胞局在を決定する工程を含む方法であって、細胞表面でのＰＲＬ３の発現が細胞が癌性であることを示す、前記方法を提供する。
【００７７】
方法には、細胞表面上のＰＲＬ３の存在または増加が、個体が癌を有することを示しうる、癌の診断法が含まれる。いくつかの場合、細胞におけるＰＲＬ３の量は、非癌性対照試料と同じであるが、ＰＲＬ３の局在が、非癌性対照と比較した際に変化していてもよい。
【００７８】
他の方法には、細胞が癌性であるかどうかを決定するための方法であって、細胞表面でのＰＲＬ３の存在を決定する工程を含む、前記方法が含まれる。対照細胞に比較した際のＰＲＬ３のレベルまたは比率の増加は、個体が、癌性であるかまたは癌性になるであろうことを示しうる。
【００７９】
方法は、試料におけるＰＲＬ３の細胞局在に基づいて、抗癌療法のための個体の選択を伴ってもよい。いくつかの場合、方法は、こうして選択された個体への抗癌療法の投与を含む。
【００８０】
いくつかの場合、方法は、２またはそれより多い時点に採取された、患者由来の２またはそれより多い試料におけるＰＲＬ３の細胞局在を決定する工程を含んでもよい。細胞表面上のＰＲＬ３量の変化は、個体における癌の増加または減少を示しうる。経時的な細胞表面ＰＲＬ３の増加は、個体が癌を発展させているか、または癌が悪化していることを示しうる。経時的な細胞表面ＰＲＬ３の減少は、癌が減少しているか、または療法が癌の治療を生じたことを示しうる。細胞表面でのＰＲＬ３レベルの増加または不変は、さらなるまたは代替の抗癌療法が必要であることを示しうる。したがって、細胞表面でのＰＲＬ３レベルを、さらなるまたは代替の抗癌療法のために個体を選択するために使用してもよい。
【００８１】
細胞表面での２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍多いＰＲＬ３の増加は、個体が癌を有し、そして／または細胞が癌性であるか、あるいは個体を治療のために選択すべきであることを示しうる。細胞表面でのＰＲＬ３のレベルを対照に比較してもよい。
【００８２】
試料は血液試料または血清試料であってもよい。試料は尿試料であってもよい。癌は腫瘍試料または腫瘍周囲の組織の試料であってもよい。方法は、試料を得る工程を含んでもよいし、または個体から以前得た試料に対して、方法を行ってもよい。
【００８３】
診断および検出の方法を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行ってもよく、そしていくつかの場合、方法は、個体から試料を得る工程を含まない。
説明
抗体
本発明記載の抗体は、好ましくは、任意に、５ｐＭ〜８ｐＭ、好ましくは６〜７ｐｍの範囲、好ましくは約６．３ｐＭのＫｄで、ＰＲＬ３（抗原）に結合する。いくつかの場合、抗体は、およそ７ｘ１０−５ｓ−１のオフ速度を有する。例えば、約１ｘ１０−５ｓ−１および１ｘ１０−６ｓ−１の間である。
【００８４】
いくつかの態様において、本発明記載の抗体は、ＰＲＬ３に結合するが、ＰＲＬ１またはＰＲＬ２に結合しない。
本発明記載の抗体は、単離型で提供されてもよい。
【００８５】
「抗体」によって、本発明者らは、断片またはその誘導体、あるいは合成抗体または合成抗体断片も含める。
モノクローナル抗体技術に関連した今日の技術を考慮すると、抗体は、大部分の抗原に対して調製可能である。抗原結合部分は、抗体の部分（例えばＦａｂ断片）または合成抗体断片（例えば一本鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）であってもよい。選択した抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）に、そして“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８２）に開示されるものによって調製可能である。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８，  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐａｒｔ  ２，  ７９２−７９９）によって論じられる。
【００８６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本発明の方法において有用であり、そして抗原上の単一のエピトープを特異的にターゲティングする抗体の均質な集団である。したがって、ＰＲＬ３に結合するｍＡｂは、癌の治療に有用でありうる。
【００８７】
ＦａｂおよびＦａｂ２断片などの、抗体の抗原結合性断片もまた提供してもよく、遺伝子操作した抗体および抗体断片もまた提供してもよい。抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与し、この事実は、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された。さらなる確認は、齧歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。齧歯類起源の可変ドメインを、ヒト起源の定常ドメインに融合させて、生じる抗体が、齧歯類親抗体の抗原特異性を保持するようにしてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１，  ６８５１−６８５５）。
【００８８】
本発明記載の抗体および抗体結合性断片は、ヒト化されている。ヒト化抗体は、そのタンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体変異体に対する類似性を増加させるように修飾されている、非ヒト種由来の抗体である。「ヒト化」プロセスは、通常、ヒトに対する投与のために開発されたモノクローナル抗体に適用される。「ヒト化」プロセスは、特異的抗体を開発するプロセスが、非ヒト免疫系、例えばマウスにおける生成を伴う際に必要である可能性があり、これはこうした抗体が、ヒト患者に投与した際に免疫原性でありうるためである。ヒト化は、分子のＦａｂ部分における選択的アミノ酸の置換を伴いうる。あるいは、ヒト化は、ヒト抗体足場への、適切なＣＤＲコードセグメントの挿入を伴ってもよい。
【００８９】
抗原特異性は可変ドメインによって与えられ、そして定常ドメインからは独立であることは、すべて１またはそれより多くの可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られる。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １０４１）；  Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １０３８）；  ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを通じて連結される、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，  ４２３；  Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５，  ５８７９）；ならびに単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４）が含まれる。特異的結合部位を保持する抗体断片合成に関与する技術の一般的な概説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ２９３−２９９中に見出されるはずである。
【００９０】
「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、例えば柔軟なオリゴペプチドによって共有結合されている分子を意味する。
Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、すべて大腸菌において発現可能であり、そして大腸菌から分泌可能であり、したがって、多量の前記断片の容易な産生が可能になる。
【００９１】
全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は一価であり、１つの抗原結合部位しか持たない。また、当該技術分野に周知であるようなファージディスプレイ技術を用いて、ＰＲＬ３に結合する合成抗体を作製してもよい。
【００９２】
非修飾親抗体に比較して、抗原に対する抗体のアフィニティが改善されている修飾抗体を生成する、アフィニティ成熟プロセスによって抗体を産生してもよい。当該技術分野に知られる方法、例えばＭａｒｋｓら，  Ｒｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；  Ｂａｒｂａｓら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；  Ｓｃｈｉｅｒら  Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；  Ｙｅｌｔｏｎら  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１９９４−２００４（１９９５）；  Ｊａｃｋｓｏｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４（７）：３３１  ０−１５  ９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６（１９９２）によって、アフィニティ成熟抗体を産生してもよい。
【００９３】
本発明記載の抗体は、好ましくはＰＲＬ３に対する特異的結合を示す。ターゲット分子に特異的に結合する抗体は、好ましくは、他のターゲットに結合するよりもより高いアフィニティで、および／またはより長い期間、ターゲットに結合する。１つの態様において、非関連ターゲットに対する抗体の結合の度合いは、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されるような、ターゲットに対する抗体の結合の約１０％未満である。
【００９４】
本発明記載の抗体は、好ましくは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭまたは≦１００ｐＭの１つの解離定数（Ｋｄ）を有する。抗体のそのターゲットに対する結合アフィニティは、しばしば、解離定数（Ｋｄ）の観点で記載される。結合アフィニティは、当該技術分野に知られる方法によって、例えば抗体のＦａｂ型および抗原分子で行う放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって、測定してもよい。
【００９５】
本発明記載の抗体は、該抗体が結合する抗原の生物学的活性を阻害するかまたは減少させる「アンタゴニスト」抗体であってもよい。ＰＲＬ３の遮断は、ＰＲＬ３のホスファターゼ活性を阻害するかまたは減少させてもよい。いくつかの場合、抗体は、ＰＲＬ３に結合するが、必ずしもその活性に影響を及ぼさない。
【００９６】
特定の方法において、抗体はＰＲＬ３−ＺＵＭＡＢ、またはＰＲＬ３−ＺＵＭＡＢの変異体である。ＰＲＬ３−ＺＵＭＡＢは、以下のＣＤＲ配列を含む：
【００９７】
【化１５】
2019531254.tif 000017
【００９８】
ＣＤＲ配列はＫａｂａｔ定義によって決定される。
本明細書に記載するようなＣＤＲを有する抗体分子の構造は、一般的に、ＣＤＲが、再編成免疫グロブリン遺伝子によってコードされる、天然存在ＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲに対応する位置に位置する、抗体分子またはそのかなりの部分の重鎖または軽鎖配列のものであろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  第４版  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．  １９８７、およびその改訂版を参照することによって決定可能である。いくつかの学術的および商業的オンライン供給源が、このデータベースを検索するために利用可能である。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，  Ａ．Ｃ．Ｒ．  Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｂｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２５（１９９６），  １３０−１３３、および関連するオンライン供給源、現在は、ワールドワイドウェブアドレス、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００９９】
本発明記載の抗体は、ＰＲＬ３−ＺＵＭＡＢまたは配列番号１〜６の１つのＣＤＲを含んでもよい。本発明記載の抗体において、６つのＣＤＲ配列の１または２または３または４は多様であってもよい。変異体は、６つのＣＤＲ配列の１または２において、１または２のアミノ酸置換を有してもよい。
【０１００】
抗ＰＲＬ３−ＺＵＭＡＢクローンのＶＨおよびＶＬ鎖のアミノ酸配列を図７に示す。
軽鎖および重鎖ＣＤＲはまた、いくつかの異なるフレームワーク領域と組み合わせて特に有用でありうる。したがって、ＬＣ−ＣＤＲ１〜３またはＨＣ−ＣＤＲ１〜３を有する軽鎖および／または重鎖は、代替フレームワーク領域を所持しうる。適切なフレームワーク領域が当該技術分野に周知であり、そして例えば、本明細書に援用されるＭ．  Ｌｅｆｒａｎｃ  ＆  Ｇ．  Ｌｅ：ｆｒａｎｃ  （２００１）  ”Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載される。
【０１０１】
本明細書において、抗体は、図７のＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列の１またはそれより多くに、高い割合の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨおよび／またはＶＬ鎖を有してもよい。
【０１０２】
例えば、本発明記載の抗体には、ＰＲＬ３に結合し、そして図７に示すアミノ酸配列の１つのＶＨ鎖アミノ酸配列に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ鎖を有する抗体が含まれる。
【０１０３】
本発明記載の抗体は、検出可能に標識されるか、または少なくとも検出可能であってもよい。例えば、抗体を、放射性原子または着色分子または蛍光分子または任意の他の方法で容易に検出可能な分子で標識してもよい。適切な検出可能分子には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、および放射標識が含まれる。結合部分を検出可能標識で直接標識してもよいし、または間接的に標識してもよい。例えば、結合部分は、それ自体標識されている別の抗体によって検出可能な、非標識抗体であってもよい。あるいは、第二の抗体が該抗体に結合したビオチンを有してもよく、そしてビオチンに対する標識ストレプトアビジンの結合を用いて、第一の抗体を間接的に標識する。
【０１０４】
多様な抗体断片を本明細書に記載するが、抗体は、好ましくは、抗体結合性断片（Ｆａｂ）、および結晶化可能断片（Ｆｃ）を含有する、全抗体である。抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなってもよい。抗体は、可変断片（Ｆｖ）を含み、これは、抗体の抗原特異性、および定常ドメインを提供する。
【０１０５】
本発明記載の抗体断片には、好ましくはＣＨ２ドメインが含まれる。抗体のＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を仲介し、そして抗体安定性を保持する際に重要な役割を果たす。したがって、本発明の抗体断片は、好ましくは、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖまたはミニボディではない。
【０１０６】
本発明記載の抗体および断片は、好ましくは、Ｆｃγ（Ｆｃ−ガンマ）受容体、好ましくはＦｃγＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体と相互作用可能である。
【０１０７】
検出法
本明細書記載の抗体または抗原結合性断片を、ＰＲＬ３に対する抗体または抗原結合性断片の結合を伴う方法で用いてもよい。こうした方法は、抗体または抗原結合性断片およびＰＲＬ３の結合した複合体の検出を伴ってもよい。こうしたものとして、１つの態様において、ＰＲＬ３を含有するかまたは含有すると推測される試料を、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片と接触させ、そして抗体または抗原結合性断片およびＰＲＬ３の複合体の形成を検出する工程を含む方法を提供する。
【０１０８】
サンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを含む適切な方法形式は、当該技術分野に周知である。該方法は、抗体もしくは抗原結合性断片、またはＰＲＬ３、あるいは両方を、検出可能標識、例えば蛍光、発光または放射標識で標識することを伴ってもよい。
【０１０９】
この種の方法は、ＰＲＬ３の検出およびまたは定量化を必要とする疾患または状態の診断法の基礎を提供しうる。こうした方法を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、患者試料に対して、または患者試料のプロセシング後に行ってもよい。試料をひとたび収集したら、診断のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が実行されるために、患者が居合わせる必要はなく、そしてしたがって、方法は、ヒトまたは動物の身体に対して行わないものであってもよい。
【０１１０】
こうした方法は、患者試料に存在するＰＲＬ３の量を決定することを伴ってもよい。該方法は、診断に到達するプロセスの一部として、標準または参照値に対して、決定した量を比較する工程をさらに含んでもよい。他の診断試験を、本明細書に記載するものと組み合わせて用いて、診断または予後診断の正確さを増進するか、あるいは本明細書に記載する試験を用いることによって得られる結果を確認してもよい。
【０１１１】
ＰＲＬ３の試料における検出を、患者における癌性状態の診断、癌性状態に対する素因の診断の目的のために、あるいは癌性状態の予後を提供する（予言する）ために、用いてもよい。診断または予後は、存在する（以前診断された）良性または悪性であってもよい癌性状態に関連してもよく、推測される癌性状態に関連してもよく、あるいは患者における癌性状態（以前未診断であってもよい）に関してスクリーニングすることに関連してもよい。
【０１１２】
任意の組織または体液から試料を採取してもよい。試料は：ある量の血液；フィブリン塊および血球を除去した後に得られる、血液の液体部分を含んでもよい、個体の血液由来のある量の血清；組織試料または生検；あるいは前記個体から単離された細胞を含んでもよいし、またはこれらに由来してもよい。
【０１１３】
本発明記載の方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた実験を含むよう意図され、一方、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、損なわれていない多細胞生物を用いた実験を含むよう意図される。
【０１１４】
療法適用
本発明記載の抗体、抗原結合性断片およびポリペプチド、ならびにこうした剤を含む組成物を、医学的治療の方法において使用するために提供してもよい。治療を、治療を必要とする疾患または状態を有する被験体に提供してもよい。疾患または状態は、転移性癌を含む癌であってもよい。
【０１１５】
抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドの投与は、好ましくは、「療法的有効量」であり、これは、個体に利益を示すために十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、治療する疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法、および医師に知られる他の要因が考慮されるであろう。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第２０版，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【０１１６】
本明細書記載の方法および組成物は、治療を受けていない個体に比較して、治療が適用された個体において、測定可能な判断基準での改善を適切に可能にする。
この目的に向けて、癌の進行または患者の健康を反映する、いくつかの判断基準を設計してもよい。有用な判断基準には、腫瘍サイズ、腫瘍寸法、腫瘍の最大寸法、腫瘍数、腫瘍マーカー（例えばアルファ−フェトタンパク質）の存在、転移の度合いまたは数等が含まれてもよい。
【０１１７】
したがって、例えば、治療される個体は、適切なアッセイまたは試験によって測定した際、腫瘍サイズまたは数の減少を示しうる。治療された個体は、治療されていない個体に比較して、例えば、特定の腫瘍の腫瘍サイズにおける１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより多い減少、または腫瘍数の減少、あるいはその両方を示してもよい。
【０１１８】
用語、増殖性障害は、本明細書において、細胞周期の制御を必要とする、いかなる障害も含むよう、最も広い意味で用いられる。特に、増殖性障害には、悪性および前新生物障害が含まれる。本明細書記載の方法および組成物は、腺癌、例えば：小細胞肺癌、ならびに腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸および乳房の癌の治療または診断に関して特に有用である。例えば、治療可能でありうる悪性疾患には、急性および慢性白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝腫瘍、胆管癌、セミノーマ、胚性癌、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴覚神経腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽細胞腫が含まれる。
【０１１９】
本文書の目的のため、用語「癌」は、以下の任意の１またはそれより多くを含んでもよい：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、女性生殖器系癌、男性生殖器系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児横紋筋肉腫、小児肉腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸および直腸癌、結腸癌、子宮内膜癌、子宮内膜肉腫、食道癌、眼の癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸管癌、毛様細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、白血病、白血病、肝臓癌、肺癌、悪性線維性組織球腫、悪性胸腺腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経系癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、呼吸器、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、胃癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿器系癌、子宮肉腫、膣癌、血管系、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍。
【０１２０】
治療は、癌の症状の軽減を生じてもよいし、または癌の完全な治療を生じてもよい。治療は癌の進行を遅延させてもよいし、または癌の症状の悪化を防止してもよい。
薬学的に有用な組成物および薬剤の配合
本発明記載の抗体、抗原結合性断片およびポリペプチドは、臨床的使用のための薬学的組成物として配合されてもよく、そして薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含んでもよい。
【０１２１】
本発明にしたがって、薬学的に有用な組成物の産生のためにも方法を提供し、こうした産生法は：本明細書に記載するような抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを単離し；そして／または本明細書に記載するような単離抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合する工程より選択される１またはそれより多い工程を含んでもよい。
【０１２２】
例えば、本発明のさらなる側面は、Ｔ細胞機能不全障害の治療において使用するための薬剤または薬学的組成物を配合するかまたは産生する方法であって、本明細書に記載するような抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合することによって、薬学的組成物または薬剤を配合する工程を含む、前記方法に関する。
【０１２３】
癌
癌は、任意の望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖によって現れる任意の疾患）、新生物または腫瘍、あるいは望ましくない細胞増殖、新生物または腫瘍に対するリスクまたは素因の増加であってもよい。癌は、良性または悪性であってもよく、そして原発性または続発性（転移性）であってもよい。新生物または腫瘍は、細胞の任意の異常な成長または増殖であってもよく、そして任意の組織に位置していてもよい。組織の例には、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含むまたは除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋、鼻咽頭、網（ｏｍｅｎｔｕｍｅ）、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、柔組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、外陰部、白血球が含まれる。
【０１２４】
治療されうる腫瘍は、神経系または非神経系腫瘍であってもよい。神経系腫瘍は、中枢または末梢神経系のいずれから生じてもよく、例えば神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、シュワン腫、神経線維肉腫、星状細胞腫および乏突起神経膠腫であってもよい。非神経系癌／腫瘍は、任意の他の非神経組織で生じてもよく、例には、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、肝細胞腫、類表皮癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液学的癌および肉腫が含まれる。
【０１２５】
特に好ましい側面において、癌はＰＲＬ３を発現している癌である。いくつかの場合、癌はＰＲＬ３を過剰発現している癌である。すなわち、癌は、ＰＲＬ３の過剰発現と関連付けられるか、または過剰発現によって引き起こされる。ＰＲＬ３は、癌において機能性である必要はないが、その代わり癌細胞の標識またはアーチファクトでありうる。特に好ましい側面において、癌は、胃癌、鼻咽頭癌、膀胱癌、肺癌、乳癌または前立腺癌である。癌は、急性骨髄性白血病、結腸癌または卵巣癌であってもよい。いくつかの場合、癌は転移性癌である。
【０１２６】
同時または連続投与
治療しようとする状態に応じて、組成物を単独で、あるいは他の治療と組み合わせて、同時にまたは連続してのいずれかで投与してもよい。
【０１２７】
本明細書において、本発明の抗体、抗原結合性断片またはポリペプチド、および抗感染剤または化学療法剤（療法剤）を同時にまたは連続して投与してもよい。
いくつかの態様において、本発明の抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドでの治療には、化学療法が付随してもよい。
【０１２８】
同時投与は、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドおよび療法剤の一緒の投与、例えば両方の剤を含有する薬学的組成物（組み合わせ調製物）、あるいは互いの直後の、そして任意に同じ投与経路を通じた、例えば同じ動脈、静脈または他の血管への投与を指す。
【０１２９】
連続投与は、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドあるいは療法剤の１つの投与に続く、所定の時間間隔後の他の剤の別個の投与を指す。２つの剤が同じ経路で投与される必要はないが、いくつかの態様ではこれに当てはまる。時間間隔は、任意の時間間隔であってもよい。
【０１３０】
化学療法
化学療法は、薬剤または電離放射線（例えばＸ線またはγ線を用いた放射療法）での癌の治療を指す。好ましい態様において、化学療法は、薬剤での治療を指す。薬剤は、化学実体、例えば小分子薬剤、抗生物質、ＤＮＡ挿入剤、タンパク質阻害剤（例えばキナーゼ阻害剤）、あるいは生物学的剤、例えば抗体、抗体断片、核酸またはペプチドアプタマー、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であってもよい。薬剤を、薬学的組成物または薬剤として配合してもよい。配合物は、１またはそれより多い薬剤（例えば１またはそれより多い活性剤）を、１またはそれより多い薬学的に許容されうる希釈剤、賦形剤またはキャリアーと一緒に含んでもよい。
【０１３１】
治療は、１より多い薬剤の投与を伴ってもよい。治療しようとする状態に応じて、薬剤は、単独で、あるいは他の治療と組み合わせて、同時にまたは連続してのいずれかで投与されてもよい。例えば、化学療法は、２つの薬剤の投与を伴う併用療法であってもよく、これらの１つまたはそれより多くが、癌を治療するよう意図されてもよい。
【０１３２】
化学療法は、１またはそれより多い投与経路、例えば非経口、静脈内注射、経口、または腫瘍内経路によって投与されてもよい。
化学療法は治療措置にしたがって投与されてもよい。治療措置は、医者または医師によって準備されてもよく、そして治療を必要とする患者に合わせてあつらえてもよい、化学療法投与のあらかじめ決定されたタイムテーブル、計画、スキームまたはスケジュールであってもよい。
【０１３３】
治療措置は：患者に投与する化学療法のタイプ；各薬剤または放射線の用量；投与間の時間間隔；各治療の長さ；あるとすれば任意の治療休止日の数および性質等の１またはそれより多くを指してもよい。併用療法に関して、各薬剤をどのように投与するかを示す単一の治療措置を提供してもよい。
【０１３４】
化学療法薬剤および生物製剤は以下から選択してもよい：
・アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；
・プリンまたはピリミジン代謝拮抗剤、例えばアザチオプリンまたはメルカプトプリン；
・アルカロイドおよびテルペノイド、例えばビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン）、ポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、タキサン、例えばパクリタキセル（タキソールＴＭ）、ドセタキセル；
・トポイソメラーゼ阻害剤、例えばＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、カンプトテシン、イリノテカンおよびトポテカン、またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド；
・抗腫瘍抗生物質（例えばアントラサイクリン抗生物質）、例えばダクチノマイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシンＴＭ）、エピルビシン、ブレオマイシン、ラパマイシン；
・抗体に基づく剤、例えば抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＴＮＦα、抗ＩＬ−２、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＣＤ−５２、抗ＣＤ２０、抗ＲＳＶ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）、抗ＴＮＦ受容体、抗ＥＧＦＲ抗体、モノクローナル抗体または抗体断片、例には：セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ（マブテラ（登録商標））、パリビズマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ニモツズマブが含まれる；
・ＥＧＦＲ阻害剤、例えばエルロチニブ、セツキシマブおよびゲフィチニブ；
・抗血管新生剤、例えばベバシズマブ（アバスチン（登録商標））。
【０１３５】
さらなる化学療法薬剤は:１３−シス−レチノイン酸、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アブラキサン、アキュタン（登録商標）、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン（登録商標）、アドルシル（登録商標）、アフィニトール（登録商標）、アグリリン（登録商標）、Ａｌａ−コート（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＡＬＩＭＴＡ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ（登録商標）、アルケラン（登録商標）、オールトランスレチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、アラネスプ（登録商標）、アレジア（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、アロマシン（登録商標）、アラノン（登録商標）、亜ヒ酸、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ  アバスチン（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベンダムスチン、ベバシズマス、ベキサロテン、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェックス（登録商標）、カルシウムロイコボリン、カンパス（登録商標）、カンプトサル（登録商標）、カンプトテシン−１１、カペシタビン、カラックＴＭ、カルボプラチン、カルムスチン、カソデックス（登録商標）、ＣＣ−５０１３、ＣＣＩ−７７９、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボルム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン（登録商標）、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン（登録商標）、シタラビン  シトサール−Ｕ（登録商標）、シトキサン（登録商標）、ダコゲン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸、ダウノルビシン・リポソーマル、ダウノキソーム（登録商標）、デカドロン、デシタビン、デルタ−コルテフ（登録商標）、デルタゾン（登録商標）、デニロイキン、ディフチトックス、デポシトＴＭ、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デキサゾン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ジオデックス、ドセタキセル、ドキシル（登録商標）、ドキソルビシン、ドキソルビシン・リポソーマル、ドロキシアＴＭ、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）、デュラロン（登録商標）、エリガードＴＭ、エレンスＴＭ、エロキサチンＴＭ、エルスパー（登録商標）、エンシット（登録商標）、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルビタックス、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチヨルエトポフォス（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン（登録商標）、エベロリムス、エビスタ（登録商標）、エキセメスタン、ファスロデックス（登録商標）、フェマラ（登録商標）、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラ（登録商標）、フルダラビン、フルオロプレックス（登録商標）、フルオロウラシル、フロキシメステロン、フルタミド���フォリン酸、ＦＵＤＲ（登録商標）、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツヅマブ・オゾガマイシン、グリーベックＴＭ、グリアデル（登録商標）ウェハー、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハーセプチン（登録商標）、ヘキサドロール、ヘキサレン（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ヒカムチン（登録商標）、ヒドレア（登録商標）、酢酸ヒドロコルト（登録商標）、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルトン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イダマイシン（登録商標）、イダルビシン、イフェックス（登録商標）、ＩＦＮ−アルファ、イホスファミド、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（登録商標）（インターフェロンアルファ−２ｂ）、イレッサ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、イキセンプラＴＭ、キドロラーゼ、ラナコート（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、ロイカインＴＭ、リュープロリド、リューロクリスチン、リュースタチンＴＭ、リポソーマルＡｒａ−Ｃ、液体プレド（登録商標）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、リュプロン（登録商標）、リュプロンデポ（登録商標）、マツラン（登録商標）、マキシデックス、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸、メドラロン（登録商標）、メドロール（登録商標）、メゲース（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックスＴＭ、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスターゲン（登録商標）、ムスチン、ムタマイシン（登録商標）、ミレラン（登録商標）、ミロセルＴＭ、ミロターグ（登録商標）、ナベルビン（登録商標）、ネララビン、ネオサール（登録商標）、ニューラスタＴＭ、ニューメガ（登録商標）、ニューポゲン（登録商標）、ネキサバール（登録商標）、ニランドロン（登録商標）、ニルタミド、ニペント（登録商標）、ナイトロジェンマスタード、ノバルデックス（登録商標）、ノバントロン（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー（登録商標）、オンコビン（登録商標）、オンタック（登録商標）、オンキサルＴＭ、オプレベルキン、オラプレッド（登録商標）、オラゾン（登録商標）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合型、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（登録商標）、パラプラチン（登録商標）、ペディアプレド（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスティム、ＰＥＧ−イントロンＴＭ、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ、���ントスタチン、フェニルアラニンマスタード、プラチノール（登録商標）、プラチノール−ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（登録商標）、プロカルバジン、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）、プロロイキン（登録商標）、カルムスチンインプラントプリネトール（登録商標）を含むプロリフプロスパン２０、ラロキシフェン、レブリミド（登録商標）、リューマトレックス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ−２ａ）、リューベックス（登録商標）、ルビドマイシン塩酸、サンドスタチン（登録商標）、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチン、ソリュ−コルテフ（登録商標）、ソリュ−メドロール（登録商標）、ソラフェニブ、ＳＰＲＹＣＥＬＴＭ、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、スーテント（登録商標）、タモキシフェン、タルセバ（登録商標）、タルグレチン（登録商標）、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）、テモダール（登録商標）、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、タロミド（登録商標）、テラシス（登録商標）、チオグアニン、チオグアニンタブロイド（登録商標）、チオホスホアミド、チオプレックス（登録商標）、チオテパ、ＴＩＣＥ（登録商標）、トポサール（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トリセル（登録商標）、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレアンダ（登録商標）、トレチノイン、トレキサールＴＭ、トリセノックス（登録商標）、ＴＳＰＡ、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＶＣＲ、ベシチビックスＴＭ、ベルバン（登録商標）、ベルケード（登録商標）、ベペシド（登録商標）、ベサノイド（登録商標）、ビアデュルＴＭ、ビダザ（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンカサールＰｆｓ（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット、ＶＰ−１６、ヴモン（登録商標）、キセロダ（登録商標）、ザノサール（登録商標）、ゼバリンＴＭ、ジネカード（登録商標）、ゾラデックス（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、ゾメタ（登録商標）より選択されてもよい。
【０１３６】
投与経路
本発明の側面にしたがった抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドおよび他の療法剤、薬剤および薬学的組成物を、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内および経口を含む、いくつかの経路による投与のために配合してもよい。抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドおよび他の療法剤を、液体または固体型で配合してもよい。ヒトまたは動物の体の選択した領域への注射による投与のため、液体配合物を配合してもよい。
【０１３７】
好ましい側面において、抗体を全身投与する。静脈内投与が特に意図される。
いくつかの場合、抗体を癌性細胞から離れた、または癌性細胞の既知の位置からは離れた位置で適用する。こうした場合、抗体は、体内を癌性細胞まで移動してもよく、例えば腫瘍まで移動してもよい。
【０１３８】
いくつかの側面において、抗体を癌性細胞の位置で投与し、例えば腫瘍に直接適用するか、または腫瘍切除部位に適用する。投与は切除術中に行ってもよいし、または切除術後に行ってもよい。腫瘍は原発性癌または転移性癌であってもよい。
【０１３９】
投与を、腫瘍切除部位で腫瘍再増殖を防止する意図で行ってもよいし、または切除した腫瘍以外の位置で、癌性細胞が形成されるのを防止する意図で行ってもよい。
投薬措置
抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドの多数回の用量を提供してもよい。用量の１つまたはそれより多くまたは各々には、別の療法剤の同時または連続投与が付随していてもよい。
【０１４０】
多数回用量は、あらかじめ決定した時間間隔によって分かれていてもよく、これは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日、あるいは１、２、３、４、５または６ヶ月の１つであるように選択されてもよい。例えば、用量を、７、１４、２１または２８日ごとに１回投与してもよい（プラスまたはマイナス３、２、または１日）。
【０１４１】
キット
本発明のいくつかの側面において、部分のキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、あらかじめ決定された量の抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを有する少なくとも１つの容器を有してもよい。キットは、薬剤または薬学的組成物の形で、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを提供してもよく、そして明記する疾患または状態を治療するため、患者に投与するための使用説明書とともに提供されてもよい。抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを、腫瘍へのまたは血液への注射または注入に適切であるように配合してもよい。
【０１４２】
いくつかの態様において、キットはさらに、あらかじめ決定した量の別の療法剤（例えば抗感染剤または化学療法剤）を有する少なくとも１つの容器を含んでもよい。こうした態様において、キットはまた、２つの薬剤または薬学的組成物が特定の疾患または状態に対する組み合わせ治療を提供するように、これらを同時にまたは別個に投与可能であるように、第二の薬剤または薬学的組成物も含んでもよい。療法剤はまた、腫瘍または血液への注射または注入に適切であるように配合されてもよい。
【０１４３】
被験体
治療しようとする被験体は、任意の動物またはヒトであってもよい。被験体は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被験体は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。被験体は男性または女性であってもよい。被験体は患者であってもよい。被験体は治療が必要な疾患または状態を有すると診断されていてもよいし、あるいはこうした疾患または状態を有すると推測されていてもよい。
【０１４４】
被験体または患者選択
いくつかの側面において、患者は、ヒト化抗ＰＲＬ３抗体または抗体断片での治療に関して選択されている。いくつかの場合、患者は、ＰＲＬ３を発現している癌を有すると決定されている。いくつかの場合、癌はＰＲＬ３を過剰発現している癌である。いくつかの場合、患者は、例えば患者が正常白血球カウントを有することによって示されるように、機能するかまたは活性である免疫系を有すると決定されている。いくつかの方法において、患者は損なわれた免疫系を持たないことが決定されている。特に、患者は、正常範囲内の白血球カウントを有すると決定されていてもよい。特に、患者は、白血球減少症を持たないことが決定されていてもよい。患者は、正常範囲内の好中球、リンパ球、単球、赤血球または血小板カウントを有すると決定されていてもよい。患者は、対照、例えば損なわれた免疫系を持たないことが知られている個体由来のカウント、または確立された正常値と有意には異ならない白血球、好中球、リンパ球、単球、赤血球または血小板カウントを有してもよい。例えば、患者は、血液マイクロリットル当たり、約４，５００〜約１０，０００の間の白血球を有すると決定されてもよい。
【０１４５】
いくつかの化学療法剤は、白血球カウントの減少と関連しており、したがって、いくつかの場合、患者は、化学療法を受けていない場合、または特に過去に化学療法剤を投与されていない場合にのみ、治療のために選択される。いくつかの場合、患者は過去に、その癌のための化学療法治療を受けていない。いくつかの場合、患者は、代謝拮抗剤化学療法を受けていない。いくつかの場合、患者は、チミジル酸シンターゼ阻害剤療法を受けていない。いくつかの場合、患者は５−ＦＵ療法を受けていない。
【０１４６】
本明細書に提供するデータは、腫瘍または癌細胞内で見られるＰＲＬ３が、患者の尿内で、検出を可能にするために適したレベルで存在しうることを示す。さらに、本発明者らは、癌発展の非常に初期の段階で、ＰＲＬ３が尿中で検出可能であることを見出した。したがって、いくつかの場合、患者は、患者から得られる体液試料、例えば尿、唾液、血液または血漿、あるいは母乳を含む任意の他の体液試料中のＰＲＬ３の検出または定量化に基づいて、治療のために選択される。好ましくは、体液は尿である。癌タンパク質の存在または非存在は、イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットに基づく方法を伴ってもよい。いくつかの場合、ＰＲＬ３は、試料中のエクソソームにおいて検出される。
【０１４７】
本明細書に開示する方法によって検出可能な癌には、胃癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、胃癌、鼻咽頭癌、前立腺癌（例えば前立腺腺癌または前立腺肥大、特に前立腺肥大）が含まれる。癌は、試料供給源から離れていてもよい。癌は、例えば、試料または生検にアクセスするのが困難であり、そして／またはアクセスが侵襲性であるものであってもよい。したがって、本明細書に開示する１つの側面において、患者は、患者から得られる体液試料中のＰＲＬ３の検出を通じて、癌を有すると診断され、そして次いでヒト化抗ＰＲＬ３抗体での治療のために選択されてもよい。癌は固形癌であってもよい。本明細書に示すように、ＰＲＬ３は、広範囲の癌と関連する。
【０１４８】
本明細書に説明するように、検出は、ＰＲＬ３の細胞位置を決定する工程を含んでもよく、ここで、細胞表面ＰＲＬ３の増加は、個体が癌を有するか、または細胞が癌性であることを示してもよい。
【０１４９】
ＰＲＬ３の細胞位置の決定のための方法は、当業者によって容易に認識されるであろう。いくつかの場合、イムノアッセイを用いて、個体由来の試料においてターゲット（例えばＰＲＬ３）を検出する。イムノアッセイは、検出可能な分子と組み合わせて、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを持つ抗体を用いる。いくつかの場合、抗体を検出可能分子にコンジュゲート化する。検出可能分子は、標識と称されてもよい。検出可能分子は、抗体がターゲット分子に結合した際に、検出可能シグナルを生じる。検出可能シグナルは、定量化可能シグナルであってもよい。いくつかの場合、アプタマーを抗体の代わりにまたは抗体とともに用いる。適切な方法には、免疫組織化学、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーが含まれる。方法は、結合剤、例えばＰＲＬ３に結合する抗体またはアプタマー、例えばＰＲＬ３ｚｕｍａｂを利用してもよい。方法は、細胞表面ＰＲＬ３が結合剤によって結合され、結合剤の検出が可能になるように、試料を結合剤に曝露する工程を含んでもよい。
【０１５０】
タンパク質発現
細胞において本発明記載のポリペプチドを産生するために適した分子生物学技術は、当該技術分野に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９に示されるものがある。
【０１５１】
ポリペプチドはヌクレオチド配列から発現されてもよい。ヌクレオチド配列は、細胞中に存在するベクターに含有されてもよいし、または細胞のゲノム内に取り込まれていてもよい。
【０１５２】
「ベクター」は、本明細書において、細胞内に外因性遺伝物質をトランスファーするためのビヒクルとして用いられるオリゴヌクレオチド分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ベクターは、細胞において、遺伝物質を発現させるための発現ベクターであってもよい。こうしたベクターには、発現しようとする遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されたプロモーター配列が含まれてもよい。ベクターにはまた、終結コドンおよび発現エンハンサーも含まれてもよい。当該技術分野に知られる任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび終結コドンを用いて、本発明記載のベクターからポリペプチドを発現させてもよい。適切なベクターには、プラスミド、バイナリーベクター、ウイルスベクターおよび人工染色体（例えば酵母人工染色体）が含まれる。
【０１５３】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結される」には、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー）が、制御配列の影響または調節下で、ヌクレオチド配列の発現を達成するような方式で、共有連結される（それによって発現カセットを形成する）状況が含まれうる。したがって、制御配列がヌクレオチド配列の転写を達成可能であるならば、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に、機能可能であるように連結されている。適切な場合、生じた転写物は、次いで、望ましいタンパク質またはポリペプチドに翻訳されてもよい。
【０１５４】
本発明記載のペプチドを産生するため、ポリペプチドの発現に適した任意の細胞を使用してもよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。適切な原核細胞には大腸菌が含まれる。真核細胞の例には、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が含まれる。いくつかの場合、いくつかの原核細胞は、真核細胞と同じ翻訳後修飾を可能にしないため、細胞は原核細胞ではない。さらに、真核細胞では非常に高い発現レベルが可能であり、そして適切なタグを用いると、真核細胞からタンパク質を精製することがより容易でありうる。培地へのタンパク質の分泌を増進させる特定のプラスミドもまた、利用してもよい。
【０１５５】
関心対象のポリペプチドを産生する方法は、ポリペプチドを発現するように修飾された細胞の培養または発酵を伴ってもよい。培養または発酵は、栄養素、空気／酸素および／または増殖因子の適切な供給を提供され、バイオリアクター中で実行されてもよい。細胞から、培地／発酵ブロスを分配し、タンパク質内容物を抽出し、そして個々のタンパク質を分離して、分泌されたポリペプチドを単離することによって、分泌されたタンパク質を収集してもよい。培養、発酵および分離技術は、当業者に周知である。
【０１５６】
バイオリアクターには、その中で細胞を培養可能である１またはそれより多い容器が含まれる。バイオリアクター中の培養は、連続して生じてもよく、リアクター内への反応物の連続流動、およびリアクターからの培養細胞の連続流動が伴う。あるいは、培養はバッチで生じてもよい。バイオリアクターは、培養中の細胞のために最適な条件が提供されるように、ｐＨ、酸素、容器内へのおよび容器外への流速、ならびに容器内の攪拌などの環境条件を監視し、そして調節する。
【０１５７】
関心対象のポリペプチドを発現する細胞の培養後、好ましくはそのポリペプチドを単離する。当該技術分野に知られる、細胞培養からポリペプチド／タンパク質を分離するための任意の適切な方法を使用してもよい。培養から関心対象のポリペプチド／タンパク質を単離するため、まず、関心対象のポリペプチド／タンパク質を含有する培地から、培養された細胞を分離する必要がある可能性もある。関心対象のポリペプチド／タンパク質が細胞から分泌される場合、分泌されたポリペプチド／タンパク質を含有する培地から、遠心分離によって細胞を分離してもよい。関心対象のポリペプチド／タンパク質が細胞内に集積する場合、遠心分離前に、例えば超音波、迅速凍結融解または浸透圧溶解を用いて、細胞を破壊する必要があるであろう。遠心分離は、培養細胞を含有するペレット、または培養細胞の細胞破片、ならびに培地および関心対象のポリペプチド／タンパク質を含有する上清を生じるであろう。
【０１５８】
次いで、他のタンパク質および非タンパク質構成要素も含有しうる上清または培地から、関心対象のポリペプチド／タンパク質を単離することが望ましい可能性もある。上清または培地からポリペプチド／タンパク質構成要素を分離するための一般的なアプローチは、沈殿による。異なる溶解度のポリペプチド／タンパク質は、硫酸アンモニウムなどの沈殿剤の異なる濃度で沈殿する。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性タンパク質が抽出される。したがって、増加する濃度の沈殿剤を添加することによって、異なる溶解度のタンパク質が区別可能である。続いて、透析を用いて、分離されたタンパク質から硫酸アンモニウムを除去してもよい。
【０１５９】
異なるポリペプチド／タンパク質を区別するための他の方法が当該技術分野に知られ、例えばイオン交換クロマトグラフィおよびサイズクロマトグラフィがある。これらを沈殿の代替法として用いてもよいし、または沈殿に続いて行ってもよい。
【０１６０】
関心対象のポリペプチド／タンパク質が、ひとたび培養から単離されたら、タンパク質を濃縮する必要がある可能性もある。関心対象のタンパク質を濃縮するためのいくつかの方法が当該技術分野に知られ、例えば限外濾過または凍結乾燥がある。
【０１６１】
本発明の側面にしたがった薬剤および薬学的組成物を、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内、経口および鼻を含む、いくつかの経路による投与のために配合してもよい。薬剤および組成物を注射用に配合してもよい。
【０１６２】
投与は、好ましくは「療法的有効量」であり、これは、個体に対して利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、治療中の疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮に入れる。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第２０版，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【０１６３】
配列同一性
アミノ酸またはヌクレオチド配列同一性パーセントを決定する目的のための整列を、当業者に知られる多様な方式で達成してもよく、例えば公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２．  Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いてもよい。こうしたソフトウェアを用いる場合、好ましくは、デフォルトパラメータ、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関するものを用いる。ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２のデフォルトパラメータは：タンパク質ギャップ・オープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
【０１６４】
本発明には、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれるが、こうした組み合わせが明らかに許容されえないかまたは明らかに回避される場合を除く。
本明細書に用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは意図されないものとする。
【０１６５】
本発明の側面および態様はここで、例として、付随する図を参照しながら例示されるであろう。さらなる側面および態様は、当業者には明らかであろう。本文書に言及するすべての文書が本明細書に援用される。
【０１６６】
本明細書全体に渡って、続く請求項を含めて、背景が別であることを必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及する整数または工程、あるいは整数または工程群の包含を意味するが、いかなる他の整数または工程、あるいは整数または工程群も排除しないことが理解されるであろう。
【０１６７】
本明細書および付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、背景が明らかに別であると示さない限り、複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までとして表されてもよい。こうした範囲を示した場合、別の態様には、１つの特定の値から、そして／または他の特定の値までが含まれる。同様に、値を近似値で表した場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。
【０１６８】
対照
いくつかの場合、方法は、１またはそれより多い対照試料に対して、個体由来の試料における癌タンパク質の細胞位置を比較する工程を伴う。
【０１６９】
比較は、対照試料の分析が、個体由来の試料の分析と同時にまたは連続して行われることを必要としない可能性もある。その代わり、比較は、対照試料から以前得られた結果、例えばデータベースに保存されている結果と行うことも可能である。
【０１７０】
対照試料は、癌の開始前、または癌に関連する症状の観察前に、または抗癌療法の投与前に、個体から得られた試料であることも可能である。
対照試料は、別の個体、例えば癌を持たない個体から得た試料であってもよい。該個体は、１またはそれより多い特性、例えば性別、年齢、病歴、民族、体重または特定のマーカーの発現にしたがって、個体にマッチしていてもよい。対照試料は、身体の位置から得られていてもよいし、あるいは個体から得た試料と同じ組織または試料タイプのものであってもよい。
【０１７１】
対照試料は、いくつかの異なる個体または組織に渡る代表値を提供する、試料のコレクションであってもよい。
いくつかの場合、対照は、参照試料または参照データセットであってもよい。参照は、特定の治療のための既知の度合いの適切性を持つ被験体から以前得られた試料であってもよい。参照は、参照試料の分析から得たデータセットであってもよい。
【０１７２】
対照は、ターゲット分子が存在するかまたは高レベルで発現されていることが知られる陽性対照、あるいはターゲット分子が存在しないかまたは低レベルで発現されていることが知られる陰性対照であってもよい。
【０１７３】
対照は、治療から利益を得ることが知られる被験体由来の組織試料であってもよい。組織は、試験している試料と同じタイプのものであってもよい。例えば、被験体由来の腫瘍組織の試料を、治療に適していることが知られる被験体、例えば治療に以前反応した被験体由来の腫瘍組織の対照試料に比較してもよい。
【０１７４】
いくつかの場合、対照は、試験試料と同じ個体から得られたが、被験体が健康であることが知られていた時点、例えば被験体が癌に罹患していないことが知られた時点に得られた試料であってもよい。したがって、被験体由来の癌性組織の試料を、非癌性組織の試料に比較してもよい。
【０１７５】
いくつかの場合、対照は細胞培養試料である。
【実施例】
【０１７６】
実施例１  ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの生成
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ構築物を、以前特徴付けられたネズミ抗ＰＲＬ−３抗体クローンから操作した。本発明者らは、米国の２つの独立の開発業務受託機関（ＣＲＯ）を手配し、Ｑｕｅｅｎら（６０）に記載される方法の占有修飾法を用いて、ヒト化またはクローニングした。
【０１７７】
簡潔には、マウス抗体の重鎖（ＩｇＧ１）および軽鎖（カッパ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、「アクセプター」ヒト配列フレームワーク上に移植し、ここでフレームワークは、ＣＤＲを除く可変領域のセグメントと定義される。ヒトアクセプターフレームワークの選択は、各鎖に関する最も近いヒト相同体を発見するため（典型的には６５〜７０％配列同一性）、ヒトフレームワーク配列のデータベースに対して、マウスフレームワーク配列を整列させることによって行った。
【０１７８】
マウス配列由来のＣＤＲを移植することに加えて、マウス配列由来の約３アミノ酸位（ＣＤＲに加えて）もまた、ヒトアクセプター配列内に移植した。これは、元来のネズミ抗ＰＲＬ−３抗体のＣＤＲを保持し、該ＣＤＲは、マウスおよびヒトＰＲＬ−３両方の間で保存されているが、ＰＲＬ−１またはＰＲＬ−２には保存されない、Ｃ末端領域内のエピトープを特異的に認識する。
【０１７９】
本発明者らは、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（７００  Ｗ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｓｔ  Ｂｏｉｓｅ，  Ｉｄａｈｏ  ８３７０５）に依頼し、ＰＲＬ−３抗原へのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂアフィニティ結合を試験した。動力学排除アッセイ（Ｄｒａｋｅら、２００４）を用いた結合アフィニティ分析によって、精製ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが精製ヒトＰＲＬ−３への、６．２９ｐＭのＫｄでの緊密な結合剤であると特徴付けられ、オン速度（Ｋｏｎ）およびオフ速度（Ｋｏｆｆ）は、それぞれ、１ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１および７ｘ１０−５ｓ−１であった（表１）。
【０１８０】
【表１】
2019531254.tif 000018
【０１８１】
表１：ＫｉｎＥｘＡ  ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ結合アフィニティ分析の要約。
実施例２：胃癌を治療するためのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの使用
材料および方法
組織および細胞溶解物の調製
多数の正常マウス臓器をＦＶＢ／野生型マウスから採取する一方、乳房腫瘍および転移性肺腫瘍を、乳腺特異的ポリオーマウイルス・ミドルＴ癌遺伝子のトランスジェニック過剰発現によって駆動される、転移性乳癌のよく確立された自発的モデルであるアイソジェニックＦＶＢ／ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス系統（２８）から切除した。組織に関しては、切除試料（５ｍｍ３）を、プロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ）中に懸濁し、そして組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）で完全に破壊した。１３，０００ｘｇ、４℃で４０分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。細胞株に関しては、５ｘ１０６細胞を、プロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝剤中に懸濁し、そして上述のように清澄化した。ビシンコニン酸アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、タンパク質濃度を概算した。２ｘＬａｍｅｌｌｉ緩衝剤を添加した後、試料を煮沸して、そしてウェスタンブロッティングのために直ちに用いるか、または使用するまで−２０℃で保存した。
【０１８２】
ウェスタンブロッティング
２００μｇの溶解物を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの別個のウェル中で分離し、そしてニトロセルロース膜にトランスファーした後、ブロッキングし、そして１：１，０００希釈の示す一次抗体で４℃で一晩探査した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で徹底的に洗浄した後、膜を、１：５，０００希釈のそれぞれのセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化二次抗体と、１時間インキュベーションし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、そして化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて視覚化した。
【０１８３】
細胞培養
２２の研究したヒトＧＣ細胞株は、以下の供給源から得られた：ＭＫＮ７、ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ−３、ＯＣＵＭ−１（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ）；  ＹＣＣ−１、ＹＣＣ−３、ＹＣＣ−７、ＹＣＣ−１７細胞（Ｙｏｎｓｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）；  ＡＧＳ、ＣＲＬ−５８２２、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ）；  ＨＧＣ２７、ＮＵＧＣ−４、ＯＥ１９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；  ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５（理化学研究所バイオリソース研究センター）；  ＩＭ−９５、ＳＣＨ（ＪＣＲＢ細胞バンク）；  ＳＮＵ−４８４、ＳＮＵ−７１９（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）。ＣＨＯ細胞をＡＴＣＣから購入した。ＧＦＰタグ化ＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２またはＰＲＬ−３融合タンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞の生成は、以前記載されている（２３）。ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下のルシフェラーゼ２遺伝子（ｐＧＬ４  ｌｕｃ２）を含有するランチウイルス（ｌａｎｔｉｖｉｒｕｓ）を、親ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ）に安定形質導入することによって、ルシフェラーゼ発現ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２ヒト線癌細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を確立した。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で細胞株を培養し、そして５％ＣＯ２を補充した３７℃インキュベーター中で維持した。
【０１８４】
ＰＲＬ−３  ｍＲＮＡ発現の分析
本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ｇｅｎｅｃｈｉｐアレイ上にプロファイリングされた２００の初代胃癌標本からなる、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベース由来の公的に入手可能なＧＣマイクロアレイデータセット（ＧＳＥ  １５４５９）を分析した。「ａｆｆｙＰＬＭ」Ｒパッケージ（ｖ２．１５）を用いて、データ前処理を行った。外れ値を排除し、下流分析のために利用可能な総数１８５の腫瘍試料を生じた（ＳＧｓｅｔ１；患者特性を図１７に提供する）。転帰測定として全生存を含む、生存分析を行って、それぞれの遺伝子の「低い」、「中程度の」および「高い」発現を有する腫瘍（ｎ＝１８３；２試料は生存データを欠く）を比較し、すなわち「低い」および「高い」発現群は、それぞれ、３３．３パーセンタイルより低く、そして６６．７パーセンタイル発現レベルより高い試料に対応し、一方、中央のパーセンタイルは、「中程度」と分類された。
【０１８５】
組換えＧＳＴ−タグ化タンパク質の調製
組換えＧＳＴ−ＰＲＬ−１、ＧＳＴ−ＰＲＬ−２、およびＧＳＴ−ＰＲＬ−３融合タンパク質の調製は、以前記載される通りであった（５３）。
【０１８６】
ＥＬＩＳＡ
以前記載されるようにＥＬＩＳＡアッセイを行った（５３）。簡潔には、ＧＳＴ−ＰＲＬ−１（２０ｎｇ）、ＧＳＴ−ＰＲＬ−２（２０ｎｇ）またはＧＳＴ−ＰＲＬ−３（１ｎｇ、２０ｎｇ）で一晩コーティングされた９６ウェルプレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中の３％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、２００ｎｇ  ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂと３７℃で２時間インキュベーションした。徹底的に洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲート化抗マウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を３７℃で１時間添加した。Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、比色現像を行い、そして２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４での酸性化によって停止した。プレート読み取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１８７】
動物モデルおよび治療
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ａ＊ＳＴＡＲ、シンガポール）から得た８週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスを、この研究におけるすべての動物モデルに用いた。マウスを２．５％アバーチン（１００μｌ／１０ｇ体重）でｉ．ｐ．麻酔した。同所性胃癌モデル：麻酔したマウスの腹部を、剣状胸骨（ｘｉｐｈｏｉｄ  ｓｔｅｒｎｕｍ）の０．５ｃｍ下から始まり１ｃｍの正中線切開によって、層状に開いた。外科用ピンセットによって腹部切開から胃を取り出し、そして漿膜下層内に癌細胞を注入した。続いて、胃を戻し、そして腹部を層状に縫合した。各細胞株に関して、同所性胃腫瘍を誘導するために必要な細胞数、および実験期間を、予備的実験後に確認した：ＳＮＵ−４８４腫瘍に関しては３ｘ１０６細胞、またはＩＭ−９５、ＮＵＧＣ−４およびＭＫＮ−４５腫瘍に関しては５ｘ１０６細胞。治療措置を、胃漿膜下層中に癌細胞を接種した２日後に開始した。マウスに、１００μＬ  ＰＢＳ中の１００μｇのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（Ｗｕｘｉ  Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ）を、総数８回（ＳＮＵ−４８４およびＮＵＧＣ−４腫瘍）または１０回（ＩＭ−９５およびＭＫＮ４５腫瘍）、静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＰＢＳを「未治療」マウスにおける対照として用いた。個々の腫瘍の増殖速度は異なるため、実験期間は以下の通りであった：ＳＮＵ−４８４およびＮＵＧＣ−４腫瘍に関しては４週間、ＭＫＮ−４５腫瘍に関しては８週間、そしてＩＭ−９５腫瘍に関しては１２週間。公式：体積＝０．４ｘ腫瘍の長さｘ腫瘍の幅ｘ腫瘍の幅を用いて腫瘍体積を計算した。異種移植片腫瘍モデル：１５０μｌのＰＢＳ中の３ｘ１０６  ＳＮＵ−４８４細胞を、麻酔したマウスの両脇腹に注入した。３週間後、生じた腫瘍（５〜１０ｍｍ）を麻酔下で外科切除し、そしてマウスを２群に分けて、腫瘍除去後、週２回、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（１００μＬ  ＰＢＳ中、１００μｇ、ｉ．ｖ．）またはＰＢＳ（１００μＬ）のいずれかを投与した。腫瘍再発を、未治療および治療群両方において、切除後７週まで、毎週分析した。腫瘍増殖を両群で注意深く監視した。続発性胃転移モデル：３ｘ１０６  ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２細胞を、記載するように、麻酔したマウスの胃漿膜内に直接移植した。マウスを治療（ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ、１００μＬ  ＰＢＳ中、１００μｇ）または未治療（１００μＬ  ＰＢＳ）群に分け、そして移植後１、２および３週でのｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖を、１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の腹腔内注射後１５分間、２％イソフルオラン麻酔下で、ＩＶＩＳ画像化によって監視した。
【０１８８】
マウス血液試料の分析
マウス血液スメアのＷＢＣ染色：ガラススライド上の新鮮なマウス血液滴から薄層のスメアを作製した後、スライドを３７℃で１時間ベイクしてから、修飾ライト・ギムザ染色液（Ｓｉｇｍａ）に１分間浸し、その後、脱イオン水で３分間洗浄した。乾燥後、ＷＢＣが青く染まった染色スライドを顕微鏡下で観察した。各スライド中、１０の視野をカウントし、そして等式ＷＢＣ／μｌ＝（カウントしたＷＢＣの総数／視野の数）ｘ２０００を用いて計算することによって、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で、総ＷＢＣの概算を行った。全血カウント：Ｑｕｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（シンガポール）によって、マウス試料の血液学的分析を行った。
【０１８９】
抗体
ＨＳＰ７０（カタログ番号ＥＸＯＡＢ−Ｈｓｐ７０Ａ）抗体を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃより購入した。カルネキシン（カタログ番号２６７９）抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより購入した。ＣＤ６３（カタログ番号ｓｃ−１５３６３）抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。ＧＡＰＤＨ（クローンＭＡＢ３７４）抗体をＭｉｌｌｉｐｏｒｅより購入した。Ｂ細胞マーカー（ＣＤ４５／ＣＤ２２０、クローンＲＡ３−６Ｂ２）およびＮＫ細胞マーカー（ＣＤ３３５／Ｎｋｐ４６、クローン２９Ａ１．４）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより購入した。
【０１９０】
免疫蛍光画像化
細胞スライドの調製：細胞をガラスカバースリップ上に直接植え付け、そして４８時間増殖させた。ＰＢＳＣＭ（ＰＢＳ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で２回洗浄した後、細胞を３％パラホルムアルデヒド中、室温（ＲＴ）で２０分間固定し、洗浄し、そしてＰＢＳ−０．１％サポニン（Ｓｉｇｍａ）で１５分間透過処理した。組織切片スライドの調製：ＳＮＵ−４８４およびＭＫＮ４５同所性胃腫瘍の新鮮凍結標本から、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて、−１８℃で、１０μｍスライドを切片作製した。スライドを４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そしてＰＢＳ−ＦＤＢ（ＰＢＳ  ｐＨ７．０、２％ＢＳＡ、５％ヤギ血清、５％ウシ胎児血清）中、ＲＴで１時間ブロッキングした。続いて、スライドを、１：２００希釈の示す一次抗体とＲＴで４時間インキュベーションし、洗浄し、そして対応する蛍光色素コンジュゲート化二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と２時間インキュベーションした。洗浄したスライドに、ＤＡＰＩ含有退色防止マウント試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をマウントし、そしてマニキュア液を用いて密封した。ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）を用いて、共焦点画像化を行った。
【０１９１】
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関する免疫組織化学
１０μｍ厚の凍結切片スライドを、４％ホルマリンで２０分間固定し、そして１％Ｈ２Ｏ２−ＰＢＳと暗所で５分間インキュベーションした。次いで、洗浄したスライドを、１０％ヤギ血清および１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中、ＲＴで１時間ブロッキングした。続いて、穏やかに振盪しながら、スライドをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で４回洗浄し、そしてヤギ抗ヒト標識ポリマー−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）と２時間インキュベーションした後、徹底的に洗浄して、そして基質−色素原溶液（Ｄａｋｏ）と暗所で１０〜２０分間インキュベーションした。明視野顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、マウントしたスライドを調べ、そして代表的な画像を捕捉した。
【０１９２】
統計分析
ヒト研究に関して、ログランク検定を用いて、ＰＲＬ−３  ｍＲＮＡ発現群に基づいて、全体のＧＣ患者の生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析の有意性を評価した。ＣＯＸ比例ハザード回帰を用いて、単変数および多変数分析を行った。マウス研究に関して、ログランク検定を用いて、「未治療」および「治療」マウス群間の全生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析の有意な相違を評価した。スチューデントのｔ検定を用いて、同所性腫瘍体積の統計的に有意な相違を計算した。ＳＰＳＳソフトウェアｖ１９．０（ＩＢＭ）を統計計算に用いた。すべての例において、ｐ値＜０．０５は有意と見なされた。
【０１９３】
結果
ＰＲＬ−３は腫瘍特異的ターゲットである
抗癌ターゲティング療法の開発に関連する困難は、望ましくないオフターゲット効果を回避するように、腫瘍において独占的に発現されるが、正常組織においては発現されない「腫瘍特異的抗原」の同定である。本発明者らはまず、内因性ＰＲＬ−３のウェスタンブロッティングによって、すべての主な臓器由来の正常ネズミ組織をスクリーニングした。これらの完全ブロットにおいて、ＰＲＬ−３の予測される分子量に対応する単一の〜２０ｋＤａ内因性タンパク質が検出された（図１Ａ）。本発明者らは、いかなる非特異的バンドも観察せず、ＰＲＬ−３抗体が他の分子と交差反応しないことが確認された（２７）。ＰＲＬ−３タンパク質は、正常結腸において弱く検出された（図１Ａ、レーン２）が、乳房および肺組織（図１Ａ、レーン１４〜１５）を含めて、調べた他の１４の主な正常ネズミ組織においては検出不能であった（図１Ａ、レーン１、３〜１５）。対照的に、ＰＲＬ−３は、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス（２８）由来の自発的発展乳房および肺腫瘍においては豊富に発現された（図１Ａ、レーン１６〜１７）。重要なことに、ＰＲＬ−３タンパク質はまた、免疫組織化学によって調べた１５の主な正常ヒト臓器においてもまた、検出不能であった（図Ｓ１Ａ）。さらに、患者マッチ組織試料において、ＰＲＬ−３は、非癌性胃組織において検出不能であった（図１１Ｂ、パネルａ）が、胃腫瘍切片においては高発現され（図１１Ｂ、パネルｂ）、やはり腫瘍特異的上方制御を示した。癌における高頻度のＰＲＬ−３過剰発現に関する公開された文献（２９）、およびＰＲＬ−３条件的ノックアウトマウスが全般的に正常であるという近年の観察（３０）と併せて、癌性組織における、しかし正常組織にはない、ＰＲＬ−３の特異的発現は、ＰＲＬ−３が適切な腫瘍特異的ターゲットであることを実証する。
【０１９４】
ＰＲＬ−３癌タンパク質は、調べた胃腫瘍の８５％で過剰発現される
過去１０年に渡って、いくつかの研究によって、上昇したＰＲＬ−３発現が、胃癌の負の予後因子であることが立証されてきた（１４、３１、３２）。本発明者らはさらに、１８５のＧＣ患者の独立コホート（臨床特性を図１７に提供する）において、上昇したＰＲＬ−３  ｍＲＮＡレベルの臨床的有意性を研究した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析によって、腫瘍における上昇したＰＲＬ−３  ｍＲＮＡレベルは、より短い全生存と関連することが明らかになった（ｐ＝０．００２；図１Ｂ）。多変数Ｃｏｘ分析において、高ＰＲＬ−３  ｍＲＮＡ発現はまた、より高い腫瘍悪性度と有意に関連した（図１８）。次に、本発明者らは、シンガポール国立大学病院に入院しているＧＣ患者由来の２０のマッチした新鮮凍結生検組織試料対（腫瘍対隣接正常組織）を用いて、ＰＲＬ−３タンパク質のレベルを調べた。ウェスタンブロットは、明らかに、１７／２０（８５％）の胃腫瘍（Ｔ；図１Ｃ）における内因性ＰＲＬ−３過剰発現を示したが、マッチした正常胃組織（ｎ；図１Ｃ）のいずれでも過剰発現を示さず、ＰＲＬ−３の腫瘍特異的発現が実証された。特に、ＰＲＬ−３タンパク質は、これらのブロットにおいて、２０〜２５ｋＤａの間の広いバンドとして出現し、ヒト腫瘍試料におけるＰＲＬ−３が潜在的に翻訳後修飾される（〜２０ｋＤａ）ことが示唆されるが、これはまだ定義されていない。総合すると、本発明者らの臨床データは、ヒトＧＣにおける一般的な現象として、ＰＲＬ−３癌タンパク質過剰発現を特徴付け、これは、疾患重症度と相関し、ターゲティング療法のための候補としての適切性を再確認する。
【０１９５】
新規ＰＲＬ−３ターゲティングヒト化抗体、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの生成
本発明者らは、以前、ヌードおよび野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両方において、細胞内ＰＲＬ−３を発現している腫瘍に対する、ネズミおよびキメラＰＲＬ−３抗体の高い有効性を示した（２４、２７）。これらの研究において、ＰＲＬ−３モノクローナル抗体を投与されたマウスは、連続して体重が増加し、そして正常な活動を示し、オフターゲット副作用が最小限であることが示唆された。これらの初期の知見を、ヒトにおける臨床的適用に変換するため、本発明者らは、「ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ」と称するヒト化モノクローナル抗ＰＲＬ−３抗体を生成した。ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および免疫蛍光分析によって、その前身と同様、操作されたＰＲＬ−３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３を特異的に認識し、そしてＰＲＬ−３相同体、ＰＲＬ−１またはＰＲＬ−２とは交差反応しなかった（図１２Ａ〜Ｃ）。続いて、本発明者らは、本報告に記載するすべてのさらなる実験のために、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを用いた。
【０１９６】
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３陽性（ＰＲＬ−３＋）同所性胃腫瘍の増殖を特異的に遮断するが、ＰＲＬ陰性（ＰＲＬ−３−）同所性胃腫瘍の増殖を遮断しない
マウス腫瘍モデルにおいて、天然（同所性）位置で増殖しているヒト癌細胞は、高い忠実性でヒト疾患を複製する。より重要なことに、療法に対する腫瘍反応は、癌細胞が皮下対同所性位置に移植されているかに応じて、劇的に変化することが示されてきており（３３）、抗腫瘍剤の療法的有効性をアッセイするための、正しいモデルを選択する必要性が強調される。胃腫瘍に対してＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの有効性を調べるために適切な前臨床同所性マウスモデルを確立するため、本発明者らはまず、ＰＲＬ−３タンパク質発現状態に関して２２のヒトＧＣ細胞株パネルをスクリーニングし、そして続いて、マウスの胃の漿膜下層内でのその腫瘍形成能を試験した。ＰＲＬ−３タンパク質は、分析した２２のヒトＧＣ細胞株のうち、１３（５９％）で検出された（図２Ａ）。しかし、培養中でよく増殖し、そして管理可能な時間枠（＜２ヶ月）内に同所性腫瘍を形成するＧＣ細胞株は一部のみであった。これらの判断基準に基づいて、３つのＰＲＬ−３＋細胞株（ＳＮＵ−４８４、ＮＵＧＣ−４およびＩＭ−９５）および１つのＰＲＬ−３−細胞株（ＭＫＮ４５）を、同所性ＧＣモデルを開発するために選択して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍有効性を評価した。これらの株由来の細胞を胃の漿膜下層内に接種し、そして続いて、図２Ｂに概略するプロトコルにしたがって治療した。実験終了時、マウスから胃を採取し、そして胃腫瘍負荷に関して分析した。
【０１９７】
本発明者らはまず、ＳＮＵ−４８４  ＧＣ細胞株に対するＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療の効果を研究し、該細胞株は、ＰＲＬ−３タンパク質を高発現し（図２Ａ、レーン１）、培養中で迅速に増殖し、そして３〜４週間以内に再現可能に胃腫瘍を形成することから、優れたＰＲＬ−３＋同所性胃腫瘍モデルとして働いた。実験経過に渡って、未治療マウスは、顕著な腹部膨満（図２Ｃ、パネルａ、矢印）を発展させ、そして身体活動および食物摂取の減少を示す一方、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスは、全般的に正常に見え（図２Ｃ、パネルｂ）、そして通常の食物摂取パターンで正常な身体活動を維持した。切除に際して、同所性腫瘍形成は、未治療群に比較して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群で可視性に減少していた（図２Ｃ、パネルｃ〜ｄ）。腫瘍体積を測定すると、未治療群（４．０８±１．５２ｃｍ３；ｐ＝０．０１；図２Ｄ）に比較して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群（０．２３±０．２５ｃｍ３）の腫瘍負荷の有意な２０倍の減少が明らかであった。腫瘍負荷の減少と一致して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスにおいて、未治療マウスに比較して、有意により長い生存期間を明らかにし、生存期間中央値は、それぞれ、７対４．５週であり（ｐ＝０．００６；図２Ｅ）、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４胃腫瘍を所持するマウスが、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ抗腫瘍療法に有効に反応することが確認された。この知見を検証するため、２つのさらなるＰＲＬ−３＋  ＧＣ細胞株、ＩＭ−９５およびＮＵＧＣ−４を用いて、同所性ＧＣマウスモデルを生成した（図２Ａ、それぞれレーン２および２２）。ＳＮＵ−４８４同所性腫瘍と同様、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、ＰＲＬ−３＋  ＩＭ−９５細胞（ｐ＝０．００８；図Ｓ１３Ａ）またはＰＲＬ−３＋  ＮＵＧＣ−４細胞（ｐ＝０．０３；図Ｓ１３Ｂ）のいずれによって形成される胃腫瘍の増殖も有意に抑制した。
【０１９８】
顕著に対照的に、ＰＲＬ−３−  ＧＣ細胞株であるＭＫＮ４５（図２Ａ、レーン４）によって形成される胃腫瘍は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療に反応を支援さず、顕著な腹部膨満（図３Ａ、パネルａ〜ｂ）および同所性腫瘍形成（図３Ａ、パネルｃ〜ｄ）が、治療群および未治療群の両方由来のマウスに存在した。治療群（０．１７±０．２０ｃｍ３）および未治療群（０．１３±０．１９ｃｍ３）の間には、平均同所性腫瘍体積の相違は見られなかった（ｐ＝０．４；図３Ｂ）。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析は、未治療群および治療群の間で、全生存に有意な相違を明らかにせず、未治療群の生存中央値９．２５週に対して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群では１０週であった（ｐ＝０．３；図３Ｃ）。これらの４つの細胞株から得られる同所性腫瘍のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療の結果（図３Ｄに要約）は、本発明者らが以前、ＰＲＬ−３抗体療法に関して提唱した基本的な原理（２４）を補強し、ＰＲＬ−３＋腫瘍のみがＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法に反応する一方、ＰＲＬ−３癌タンパク質発現を欠く腫瘍は反応しなかった。
【０１９９】
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）との併用療法または５−ＦＵ単独よりも、単剤療法としてより有効である。
５−ＦＵは、胃癌の一次治療として用いられる化学療法薬剤である（１７）ため、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、同所性腫瘍増殖を阻害する際に、５−ＦＵと併用して、より有効でありうるかどうかを研究した。本発明者らは、４つの治療プロトコルを試験した：ＰＢＳ対照（群１）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単剤療法（群２）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ＋５−ＦＵ併用療法（群３）、または５−ＦＵ単剤療法（群４）。治療プロトコルにしたがって、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（１００μｇ／用量）または５−ＦＵ（３０ｍｇ／ｋｇ／用量）の週２回の用量を、個々に、または併用して、同所性ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４胃腫瘍を所持するヌードマウス群に静脈内投与した。実験経過中、本発明者らは、５−ＦＵ治療マウス（群３および４）において、全体の動物活動の減少を観察した。腫瘍体積の分析は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単剤療法（群２）が、最高の療法効率を有し、平均腫瘍体積は０．６７±０．５９ｃｍ３で最低であり、次にＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ＋５−ＦＵ併用治療（群３；  １．４９±０．２７ｃｍ３）、５−ＦＵ単剤療法（群４；  １．７６±０．５２ｃｍ３）、そして最後にＰＢＳ対照（群１；  ３．９８±０．６０ｃｍ３；図４Ａ）が続くことを示した。これらの結果は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを、化学療法剤、５−ＦＵを伴わずに用いた場合、胃腫瘍を減少させる際により有効であることを示唆する。
【０２００】
以前、本発明者らは、ＰＲＬ−３抗体療法の有効性において、宿主免疫系が重要な役割を果たすことを強調した（２４）。白血球（ＷＢＣ）数の非特異的な減少を引き起こす、５−ＦＵ治療の既知の副作用（３４）を考慮して、本発明者らは、観察される療法的有効性の減少が、この現象のためでありうるかどうかを調べた。全血スメアにおいて、本発明者らは、対照（群１）またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ単剤療法（群２；図４Ｂ）に比較して、５−ＦＵ治療（群３および４）後の末梢ＷＢＣカウントが５倍減少していることを見出した。これらの結果を検証するため、本発明者らは、実験終了時（第２８日）、マウス試料の完全血液カウントを行って、異なる治療措置の血液学的影響を分析した。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを投与されているマウスは、ＢＡＬＢ／ｃヌード系統に関して正常範囲内の全般的な血液学的プロファイルを有した（３５）が、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂと併用して５−ＦＵを、または５−ＦＵを単独で投与されているマウスは、赤血球および血小板カウントの顕著な減少とともに、減少した好中球、リンパ球、および単球カウントを示した（図４Ｃ）。総合すると、本発明者らの結果は、５−ＦＵ治療の結果としての免疫機能の減少が、５−ＦＵと併用して用いた際のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ有効性の減少の原因となる可能性があることを示唆し、そしてＰＲＬ−３抗体療法が、より強い免疫系を必要とするという、本発明者らの以前の知見を裏付ける。
【０２０１】
術後ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法は、ＰＲＬ−３＋腫瘍の再発を抑制する。
手術は、ＧＣ治療の基礎であるが、患者の８０％近くが、大部分は局所領域の再発のため、そして／またはより低い度合いで、遠位転移のため、短い期間内に死亡する（３６）。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂがＰＲＬ−３＋  ＧＣ増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する能力を考慮して、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、腫瘍再発を抑制するための術後アジュバント治療としてもまた有効性を有するかどうかを調べた。ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４  ＧＣ細胞を用いて、本発明者らはまず、３週間の経過に渡って、ヌードマウスの両脇腹に、異種移植片腫瘍（幅５〜１０ｍｍの間）を確立した（図１９、パネルａ）。次いで、生じた固形腫瘍を、注意深い手術を通じて完全に除去し（図１９、パネルｂ）、そして対照抗体（未治療）、またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（治療）の週２回注射のため、マウスを２群に分けた。次いで、局所腫瘍再発を毎週監視した。術後７週までに、未治療群は、切除部位に巨大な局所腫瘍を発展させた（図１９、パネルｃ）。対照的に、同じ期間に渡って、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法を受けているマウスの切除部位には、可視性の腫瘍増殖は観察されなかった（図１９、パネルｄ）。これは解剖に際して確認され、未治療群からは巨大固形腫瘍が採取可能であった（図１９、パネルｅ）が、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療群では、切除部位に固形腫瘍はまったく見られなかった（図１９、パネルｆ）。総合すると、これらの結果は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが術後局所腫瘍再発を抑制する際に有効性を有することを示し、アジュバント療法としてのこの薬剤の臨床的変換のためのありうる手段が示唆される。
【０２０２】
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、胃における続発性ＰＲＬ−３＋腫瘍転移の増殖を抑制する
胃における転移の存在は、まれな状態であり（３７〜３９）、ほぼ常に劣った予後と関連する（４０、４１）。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが転移性腫瘍形成を遮断可能であるかどうかに取り組むため、本発明者らは、ＰＲＬ−３＋  ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２結腸直腸癌細胞を用いて、マウスの胃漿膜下層内に外科的に注入する、胃への結腸直腸癌転移の実験モデルを開発した。本発明者らは、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２細胞を、主に２つの理由で用いた：１）結腸癌からの胃転移がヒトにおいて記載されており（３８、３９、４２）、そして２）ＨＣＴ１１６−Ｌｕｃ２は、恒常的にホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼを発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化系（ＩＶＩＳ）を用いた腫瘍増殖の監視が可能になる。２つの別個の実験的複製において、ＰＲＬ−３＋  ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２腫瘍は、未治療マウスにおいて、迅速に増殖したが、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスは、同じ期間に渡り、はるかに減少したＰＲＬ−３＋  ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２腫瘍増殖を有した（図１４Ａ）。切除に際して、未治療マウスの胃に、重い腫瘍負荷が観察された（図１４Ｂ、パネルａ、ａ’）。対照的に、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスは、はるかにより低い胃腫瘍負荷を有した（図１４Ｂ、パネルｂ、ｂ’）。さらに、未治療マウスにおいて、腹壁への広範囲の転移性播種が見られた（図１４Ｂ、パネルｃ、ｃ’）が、これもまた、治療マウスでは非常に減少した（図１４Ｂ、パネルｄ、ｄ’）。総合すると、これらの結果は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、胃微小環境中およびその周囲のＰＲＬ−３＋  ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ２結腸直腸癌腫瘍の増殖および転移を減少させうることを示唆した。
【０２０３】
細胞内ＰＲＬ−３癌タンパク質は、癌の尿の６２％から分泌されることが可能であり、尿中に存在するが、正常尿には存在しない
多様な癌モデルにおいて、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍有効性が立証されており、本発明者らは次に、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法のためにＰＲＬ−３＋癌患者を同定する単純な方法を探した。以前、本発明者らは、抗ＰＲＬ−３抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＲＬ−３＋腫瘍細胞によって内在化されうることを報告した（２３）。しかし、「細胞内」ＰＲＬ−３抗原の抗体認識がどのように、そしてどこで起こるかは不明であった。本明細書において、本発明者らは、ＰＲＬ−３タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、対応するＰＲＬ−３＋癌細胞株から分泌されそして濃縮培地中で検出されることが可能であるが、ＰＲＬ−３−癌細胞株からは検出されないという、以前は認識されていなかった天然の現象を報告する（図５Ａ、レーン１〜４）。死んだ細胞または細胞破片による非特異的混入を排除するため、本発明者らは、もっぱら溶解物中にあり（図５Ａ、レーン５〜８）、馴化培地中にはない（図５Ａ、レーン１〜４）ＥＲ局在タンパク質、カルネキシン（ＣＡＮＸ）を対照として検出した。
【０２０４】
ＰＲＬ−３は、マイクロアレイおよび組織学的研究に基づいて、有望な癌バイオマーカーとしての潜在能力を有する（７）ため、本発明者らは一歩進んで、健康な個体および癌患者の両方からの尿試料を分析することによって、「分泌される」ＰＲＬ−３がバイオマーカーとして臨床的に適切でありうるかどうかを調べた。健康な個体由来の総数１５の尿試料、および癌患者由来の１９９の尿試料をウェスタンブロットによって分析して、ＰＲＬ−３タンパク質を検出した。有望なことに、ＰＲＬ−３は異なるタイプの癌を持つ患者由来の尿試料の平均６２％（１９９のうち１２３）で容易に検出され（図５Ｂ）、それでも正常尿試料においては完全に存在しなかった（図５Ｃ、レーン１〜７）。特に、尿ＰＲＬ−３タンパク質は、胃癌患者の最大１４／１６（８８％）（図５Ｃ、レーン８〜２３）、鼻咽頭癌患者の１２／１７（７０％）（図５Ｄ）、膀胱癌患者の３０／６７（４５％）（図５Ｅ）、肺癌患者の５６／８５（６６％）（図５Ｆ）、乳癌患者の８／１０（８０％）、そして前立腺癌患者の３／４（７５％）（データ未提示）で検出された。これらの２１４の尿試料からの本発明者らの結果は、ＰＲＬ−３を一般的な癌特異的尿タンパク質と同定する。
【０２０５】
ＰＲＬ−３タンパク質は、ＥＲ／ゴルジ経路を通じた古典的な分泌のための配列ペプチドを持たないため、本発明者らは、該タンパク質が、非古典的なエクソソーム分泌を通じて分泌されうるかどうかを考慮した。エクソソームは、細胞膜および／エンドソーム由来小胞であり、５０〜１５０ｎｍで、多くの生物学的液体および細胞培地に存在する（４３）。本発明者らは、対照エクソソームマーカーとしてテトラスパニンＣＤ６３を用いて、異なるタイプの癌を持つ患者由来の尿試料のエクソソーム分画を行った（４４）。驚くべきことに、本発明者らは、膀胱癌患者由来の尿において、もっぱらエクソソームＰＲＬ−３を検出した（図１６）が、他のタイプの癌からは検出しなかった（データ未提示）。したがって、尿ＰＲＬ−３は、少なくとも２つの型、可溶性「遊離」型（多数の癌患者由来の尿）およびエクソソーム関連型（膀胱癌患者由来の尿のみ）を含む、癌特異的マーカーとして存在する。
【０２０６】
尿ＰＲＬ−３は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法の療法反応監視のための潜在的な代理バイオマーカーでありうる
ＰＲＬ−３は、癌患者由来の尿試料において頻繁に検出可能であるため、本発明者らは、尿ＰＲＬ−３がｉｎ  ｖｉｖｏの本物のＰＲＬ−３＋腫瘍の存在を反映するかどうか疑問を持った。この関係を実証するために、臨床的にマッチした腫瘍−尿試料を得ることが困難であるため、本発明者らは、その代わり、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４およびＰＲＬ−３−  ＭＫＮ４５同所性胃マウスモデルを用いて、マッチした腫瘍−尿対でのＰＲＬ−３の発現を比較した。さらに、各同所性モデルを未治療、またはＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（治療）の２群に分け、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法および尿ＰＲＬ−３発現の間の関連を解明した。未治療ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４腫瘍所持マウスにおいて、ＰＲＬ−３タンパク質は、尿試料中、非常に豊富であった（図６Ａ、奇数レーン１〜９）。しかし、尿ＰＲＬ−３はＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療後、すべてのマウスでもはや検出不能であり、これはＰＲＬ−３の腫瘍内発現の減少と一致した（図６Ａ、偶数レーン２〜１０）。重要なことに、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスからの尿ＰＲＬ−３シグナルの喪失は、各場合で、胃腫瘍縮小と対応し（図６Ａ、上部パネル）、尿ＰＲＬ−３がＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法有効性の代理バイオマーカーとして有用でありうることを示唆した。対照的に、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法を行うか行わないかに関わらず、ＰＲＬ−３−  ＭＫＮ４５同所性腫瘍を所持するマウスにおいて、尿ＰＲＬ−３を検出しなかった（図６Ａ、レーン１１〜１２）。したがって、尿ＰＲＬ−３は、ＰＲＬ−３＋癌を所持するマウスでは特異的に検出されたが、ＰＲＬ−３−癌のマウスでは検出されず、そして腫瘍負荷の減少と並行して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂでの治療に際して減少する。
【０２０７】
ＰＲＬ−３＋腫瘍における、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療後のＢおよびＮＫ細胞浸潤増加
臨床的抗体発展において考慮する重要な点は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍および正常（または非抗原発現）組織の間の抗体の生体分布である（４６）。これを考慮して、本発明者らは、本発明者らの同所性モデルにおいて、腫瘍部位でのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの分布を調べた。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療後、本発明者らは、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４腫瘍内でＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの濃縮を検出した（図６Ｂ、パネルｂ〜ｃ）が、ＰＲＬ−３−  ＭＫＮ４５腫瘍では検出しなかった（図６Ｂ、パネルｆ）。対照として、未治療マウス（図６Ｂ、パネルａ）または５−ＦＵ単独（図６Ｂ、パネルｄ）ではシグナルは見られなかった。これらの結果は、ＰＲＬ−３発現腫瘍の微小環境におけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの特異的集積を示した。免疫エフェクター細胞による抗体の認識は、免疫グロブリン受容体（ＦｃＲ）を通じて起こり、該受容体が抗体のＦｃ部分に結合し、これらのエフェクター細胞の補充および活性化を生じる（４７）。腫瘍組織におけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの集積が、免疫細胞の浸潤を生じるかどうかを決定するため、細胞内抗体療法の有効性に関して非常に重要であると示唆される２つのＦｃＲ所持免疫細胞タイプであるＢ細胞およびＮＫ細胞に対する特異的抗体を用いて、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４胃腫瘍切片に対して免疫蛍光を行った（２６）。ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４同所性腫瘍切片において、未治療腫瘍切片（図６Ｂ、パネルｇおよびｍ）と比較して、浸潤Ｂ細胞およびＮＫ細胞の数は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療腫瘍において、可視的により多かった（図６Ｂ、パネルｈおよびｎ）。驚くべきことに、本発明者らは、一貫して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂおよび５−ＦＵでの併用療法に供したマウス（図６Ｂ、パネルｉおよびо）、ならびに５−ＦＵ治療マウス（図６Ｂ、パネルｊおよびｐ）において、ＢまたはＮＫ細胞浸潤が欠けていることを観察し、これはおそらく、５−ＦＵ投与に際して、リンパ球集団が減少するためであった（図４Ｃ）。ＰＲＬ−３−  ＭＫＮ４５腫瘍切片においては、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療にもかかわらず、Ｂ細胞またはＮＫ細胞浸潤の相違は観察されなかった（図６Ｂ、パネルｋ〜ｌおよびｑ〜ｒ）。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂおよびＰＲＬ−３抗原が相互作用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで療法的効果を誘発する新規機構を提唱する（図６Ｃ）：１）ＰＲＬ−３抗原は、非慣用的な分泌を通じて（エクソソームＰＲＬ−３）外在化するか、あるいは壊死性またはアポトーシス性ＰＲＬ−３＋腫瘍細胞から自発的に漏洩（遊離ＰＲＬ−３）し、ベイトとして作用し、２）これにＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが結合し、そして免疫複合体が腫瘍微小環境内に集積し、続いて、３）抗腫瘍効果のため、エフェクターＮＫおよびＢ細胞が補充され、そして活性化される。
【０２０８】
ＰＲＬ−３＋腫瘍のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ抑制に関するありうる作用機構
自己免疫病理に関する研究によって、自己抗体が特異的細胞内抗原に結合し、そして抗原提示細胞の細胞質および核区画内に集積可能であることが示されてきている（４７）。同様に、本発明者らは、抗ＰＲＬ−３抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＲＬ−３＋腫瘍細胞によって内在化可能であることを観察している（４）。しかし、抗体取り込み様式は、ほとんど定義されないままである。ここで、本発明者らは、細胞内ＰＲＬ−３抗原が特異的結合および腫瘍抑制のために抗体と関与しうる２つの新規知見を明らかにする：１）細胞内ＰＲＬ−３癌タンパク質は分泌されうる。腫瘍細胞において、いくつかの古典的「細胞内」タンパク質が、分泌および／または細胞表面再局在を通じて外在化され、それによって抗体を用いた療法介入に対してアクセス可能となることが報告されてきている（４８、４９）。本発明者らは、３つのＰＲＬ−３＋細胞株：ＳＮＵ−４８４、ＮＵＧＣ−４、ＩＭ−９５、および１つのＰＲＬ−３−細胞株、ＭＫＮ４５において、ＰＲＬ−３細胞内および細胞外ＰＲＬ−３発現を比較することによって、ＰＲＬ−３がＰＲＬ３−ｚｕｍａｂのターゲット抗原として、同様に外在化可能であるかどうかを調べた。ＰＲＬ−３発現を、対照としての非分泌ＥＲ係留タンパク質、カルネキシンと比較した。ＰＲＬ−３タンパク質は、ＰＲＬ−３＋  ＧＣ細胞の細胞内タンパク質分画（細胞溶解物）（図６Ａ、レーン１〜３）、ならびにＰＲＬ−３＋  ＧＣ細胞の細胞外タンパク質プール（濃縮馴化培地）（図６Ａ、レーン５〜７）の両方で検出されたが、ＰＲＬ−３−  ＧＣ細胞株では検出されなかった（図６Ａ、レーン４、８）。対照的に、カルネキシンは、ＰＲＬ−３＋およびＰＲＬ−３−  ＰＲＬ  ＧＣ細胞両方で、もっぱら細胞内プールに存在した（図６Ａ、レーン１〜４）が、細胞外プールには存在しなかった（図６Ａ、レーン５〜８）。この観察は、死んだ細胞または細胞破片による非特異的混入を排除し、そしてＰＲＬ−３を新規分泌タンパク質として特徴付ける。２）外在化ＰＲＬ−３は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ結合のベイトとして働きうる。本発明者らは次に、治療した同所性ＧＣマウス由来の腫瘍切片を調べ、そして腫瘍微小環境内のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ分布を分析した。対照として、未治療マウス（図６Ｂ、一番左のパネル）にはシグナルはまったく見られなかった。治療後、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４腫瘍の微小環境内で濃縮されたが、５−ＦＵ単剤療法を受けているもの、またはＰＲＬ−３−  ＭＫＮ４５腫瘍では濃縮されなかった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＰＲＬ−３＋腫瘍の微小環境においてＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが特異的に集積するが、ＰＲＬ−３−腫瘍には集積しないことを示した。
【０２０９】
考察
本研究は、最小限の副作用で、癌ターゲティング免疫療法のための利用可能な分子ターゲットとしての、腫瘍特異的細胞内癌タンパク質の以前は認識されていなかった潜在的可能性をさらに示す。本発明者らの結果は、ＰＲＬ−３を優れた腫瘍特異的癌ターゲットと特徴付け、そしてヒト胃癌細胞株を用いて同所性腫瘍モデルを生成して、臨床的に適切なセッティングで、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの特異的抗腫瘍有効性を立証した。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、同所性ＰＲＬ−３＋胃腫瘍の増殖を特異的に阻害し（しかしＰＲＬ−３−腫瘍の増殖は阻害せず）、ＰＲＬ−３＋胃癌の治療のためのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの適切性を確立した。さらに、分泌尿ＰＲＬ−３を、診断および治療反応監視のためのバイオマーカーとして使用してもよい。
【０２１０】
ヒトＧＣ細胞株を用いて、臨床的に適切な同所性ＧＣモデルを生成するため、本発明者らは、免疫不全ヌードマウスを使用し、重度免疫無防備マウス系統、例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＢＡＬＢ／ｃ−ＲＡＢ２ｎｕｌｌまたはその派生系統（４８）は使用しなかった。これらの後者の系統は、損なわれていない内因性免疫系をほとんどまたはまったく持たず、研究知見を免疫適格性ヒト患者に当てはめるにはギャップが生じるためである。より臨床的に適切なマウスモデルを使用することで、また、体内での複雑な相互作用を再現不能であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の予測が劣っている培養プレート中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬剤スクリーニング（４９）の限界も克服する。実際、抗ＰＲＬ−３抗体は、免疫無防備ＳＣＩＤマウスにおいて（２４）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＲＬ−３＋癌細胞に直接添加した際に（２７）、抗癌有効性を欠くことが示されてきており、治療成功のためには、免疫エフェクターと療法剤の相互作用が重要であることを示す。ここで、本発明者らは、原発性および転移性胃腫瘍増殖におけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの療法的有効性、ならびに癌再発を防止するための術後アジュバント療法のための価値を立証した。さらに、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療に際して、ＰＲＬ−３＋腫瘍微小環境において、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが集積し、そしてＢおよびＮＫ細胞の浸潤が増加することを示すことによって、これらの知見を拡張し、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍活性におけるこれらの重要な免疫エフェクターの関与を強化した。ＰＲＬ−３は、近年、ＮＫＧ２ＤリガンドであるＵＬＢＰ２の分泌を促進し、ＮＫ細胞による腫瘍認識および細胞溶解の減少を生じることが示された（５０）。この知見は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスで観察される、ＮＫ細胞のＰＲＬ−３＋腫瘍微小環境への浸潤増加に、ＮＫ細胞溶解活性増加が相乗的に付随し、ＰＲＬ−３＋腫瘍のより効率的な免疫ターゲティングを生じうることを示唆する。
【０２１１】
分泌型のＰＲＬ−３の発見は、ＰＲＬ−３＋腫瘍部位への免疫細胞補充およびＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍有効性に必要な特異的抗体−抗原相互作用に説得力を与える。興味深いことに、可溶性ＰＲＬ−３が多数の癌患者由来の尿で検出されているが、本発明者らは、膀胱癌患者の尿においてのみ、エクソソーム関連ＰＲＬ−３を検出し、他の悪性腫瘍患者の尿においては検出しなかった。これに関するありうる説明は、腎糸球体濾過によって課される物理的排除限界であり、これによって、尿排出のため、ボウマン嚢内には、血漿から７０ｋＤａより小さいタンパク質の通過しか可能ではない（４５）。本発明者らの結果は間接的に、ＰＲＬ−３がｉｎ  ｖｉｖｏで、少なくとも２つの型で、腫瘍細胞から分泌可能であることを示す：１）まず、多数のタイプの癌の尿に存在する可溶性の濾過可能な型として。こうした「遊離ＰＲＬ−３」は、腫瘍壊死、アポトーシス、または腫瘍細胞溶解中に体液内に漏洩し、そして２０〜２５ｋＤａの小さい分子量であるため、糸球体を通過し、そして尿中に排出される可能性がある。２）次に、もっぱら膀胱癌患者の尿に見られる「エクソソームＰＲＬ−３」として。これは、膀胱尿系に妨害されずにアクセスする膀胱癌細胞が、こうしたＰＲＬ−３含有エクソソームを尿プール内に直接脱落させることが可能であるためである。しかし、他の癌組織（例えば胃、肝臓、肺）からの循環エクソソームは、糸球体濾過を通過不能であり、なお、ＰＲＬ−３＋癌細胞由来の出芽エクソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ認識のため、腫瘍領域内の係留ポイントとして働きうる（図６Ｃ）。
【０２１２】
近年、多数のＦＤＡ認可癌薬剤が、劣ったターゲット選択性を有することが示された（５１）。本発明者らの研究において、４００を超える臨床癌試料を、腫瘍組織および／または癌尿におけるｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでのＰＲＬ−３発現に関して研究した。平均して、ＰＲＬ−３癌タンパク質は、調べた多数のタイプの癌（胃、肝臓、肺、鼻咽頭、腎臓、乳房、結腸、膀胱）の６２％で過剰発現された。こうした高いＰＲＬ−３腫瘍陽性を伴い、腫瘍特異的ＰＲＬ−３に対するＰＲＬ３−ｚｕｍａｂターゲティング療法は、個別化医療に向かう刺激的な段階である。オフターゲット副作用を最小限にしながら（ＰＲＬ−３は、大部分の正常成人組織において検出可能なレベルでは発現されない）、療法的利点を最大化することによって、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、正確な抗癌薬剤として、臨床的検証および開発が正当であると示される。
【０２１３】
本発明者らは、本明細書において、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ癌療法に関する５つの重要な知見を要約する：１）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３腫瘍特異的抗原を特異的に認識する。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは非常に特異的であり、＞７５％のアミノ酸配列同一性を共有する２つの相同体（ＰＲＬ−１またはＰＲＬ−２）と交差反応しない。さらに、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、腫瘍組織中のＰＲＬ−３抗原を特異的に認識するが、正常組織中のものは認識せず、毒性が低くそしてオフターゲット副作用が最小限であることが示唆される。２）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ＰＲＬ−３＋同所性胃腫瘍の増殖を特異的に阻害し、そして術後ＰＲＬ−３＋腫瘍再発を防止する。腫瘍内でのＰＲＬ−３タンパク質発現は、療法反応に絶対に必要であり、このことは、腫瘍阻害のために、特異的抗原−抗体認識が必要であることを示す。３）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、化学療法との併用療法よりも、単剤療法としてより有効である。総合すると、化学療法誘導性免疫抑制（３４）によって、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの療法的有効性が減少するため、本発明者らの結果は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療転帰が宿主免疫系に依存することを示す。４）ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、多数のＰＲＬ−３陽性癌において、広い有用性を有するはずである。本発明者らの結果は、ここで、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ有効性の症例研究として、多数のＧＣモデルに重点を置くが、ＰＲＬ−３はまた、腫瘍転移および劣った予後の多数の癌タイプとも広範囲に関連付けられており、より高いＰＲＬ−３発現は、より短い全生存と関連する（７）。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、その効果を、ＰＲＬ−３抗原の認識に際してのみ発揮するという原理に基づいて、免疫学的に無防備ではない患者において、すべてではなくても大部分のＰＲＬ−３陽性癌をターゲティングする際に、有用性を有することが想定され、癌療法全体において、新規療法手段が開かれる。５）尿ＰＲＬ−３は、癌診断および療法反応監視のための、潜在的な新規バイオマーカーでありうる。本発明者らは、多数のヒト癌患者の平均６２％で、尿ＰＲＬ−３を検出した。マウスモデルで観察される腫瘍および尿ＰＲＬ−３発現の間の緊密な相関は、尿ＰＲＬ−３発現が、多様なヒト悪性腫瘍において、ＰＲＬ−３ターゲティング癌療法（ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを含む）の前向き診断バイオマーカーとして有用性を有しうることを示した。さらに、本発明者らのデータは、尿ＰＲＬ−３が代理バイオマーカーとしておそらく機能可能であり、臨床家がＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ療法的有効性を判断するための迅速でそして単純な定性的方法を提供することを示唆する。尿ＰＲＬ−３のバイオマーカーとしての価値は、さらなる実証を必要とするであろうが、こうしたＰＲＬ３−ｚｕｍａｂに関する「コンパニオン診断」の開発に関する潜在能力は、初期臨床試験におけるロバストな仮説試験を可能にすることによって、薬剤開発プロセスを加速するであろう（５２）。
【０２１４】
本明細書において、本発明者らは、ＰＲＬ−３＋ヒト癌を遮断する細胞内癌ターゲットに対する最初のヒト化抗体として、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを示す。総合的に、本発明者らの結果は、本明細書において、そして別の箇所において（２３、２４、２７）、細胞内癌抗原が、抗癌効果のための療法的抗体に対してアクセス不能であるという定説に挑戦する。本発明者らは、他の細胞内癌タンパク質もまた、ターゲティング免疫療法として働く巨大な潜在能力を有しうることを示唆する。無数の候補腫瘍特異的細胞内癌抗原が、ここで、将来の臨床試験のための利用可能な分子ターゲットとしての潜在能力に関して考慮されるはずである。
【０２１５】
参考文献
【０２１６】
【化１６−１】
2019531254.tif 000019
【０２１７】
【化１６−２】
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【０２１８】
【化１６−３】
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【０２１９】
【化１６−４】
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【０２２０】
実施例３：ＰＲＬ３ｚｕｍａｂ作用機構の研究
この研究において、本発明者らは主に、「シード・アンド・ソイル（ｓｅｅｄ  ａｎｄ  ｓｏｉｌ）」肝臓同所性腫瘍モデルを用いて、ＰＲＬ−３抗体が、その細胞内ＰＲＬ−３抗原とどのように結合可能でありうるかに取り組む、分子作用機構（ＭＯＡ）に重点を置いた。本発明者らは、異なる側面から研究して、実際に「細胞内癌タンパク質」が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏよりもｉｎ  ｖｉｖｏでより高い率で、「細胞外癌タンパク質」として細胞表面に再局在化し、したがって、細胞外癌ターゲットに対する抗体慣用的経路を通じて、腫瘍排除のための合理的基礎にしたがうという重要な結論に到達する。それと一致して、本発明者らは、機構的に、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、ＰＲＬ−３「細胞内」抗原を発現している腫瘍を遮断するには以下が必要であることを見出した：１．ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ遮断剤の両方が治療有効性を無効にするため、宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体相互作用。２．完全抗体活性、Ｆｃ断片（ＣＨ１およびＣｈ２ドメイン）を欠くミニボディは、治療有効性を退ける。３．Ｍ１（しかしＭ２はそうではない）マクロファージ、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞を増加させて、宿主免疫を増進させる。これらの結果は、「細胞内癌タンパク質」をターゲティングする抗体のＭＯＡが、実際に、腫瘍を除去するための古典的な抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または食作用（ＡＤＣＰ）経路を通じて、「細胞外癌タンパク質」をターゲティングするのと類似の原理にしたがうことを示唆する。最後に、１１０の貴重な新鮮凍結ヒト腫瘍またはそのマッチした正常組織を用いて、本発明者らはさらに、ＰＲＬ−３が、９つの異なるヒト癌タイプ：肝臓、肺、結腸、乳房、胃、膀胱、前立腺、ＡＭＬ、および腎臓患者腫瘍試料の平均≧７８％で広く過剰発現されるが、マッチした正常組織では発現されないことを示した。これらの知見は、大部分の「治療が困難な」癌に対するターゲティング免疫療法の次のフロンティアとして、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ臨床試験を正当化する。
【０２２１】
材料および方法
細胞株。ヒトＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３Ｂ２．１、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７、ＰＬＣ、ＳＮＵ４４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（米国バージニア州マナサス）から購入した。ネズミＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ５３．４をＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ（ドイツ・エッペルハイム）より購入した。すべての細胞株を、組換え培地中で培養した。ＭＨＣＣ−ＬＭ３ヒトＨＣＣ癌細胞株を、ルーチンにＫａｍ−Ｍａｎ  Ｈｕｉ博士の研究室（シンガポール国立癌センター）で維持した。
【０２２２】
ウェスタンブロッティング。患者組織に関して、５ｍｍ３片を、プロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ）中に懸濁し、そして組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）で完全に破壊した。１３，０００ｘｇ、４℃で４０分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。細胞株に関しては、５ｘ１０６細胞を、プロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝剤中に溶解し、そして上述のように清澄化した。組織溶解物（４０μｇ）または細胞溶解物（２００μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離し、そしてニトロセルロース膜にトランスファーした後、ブロッキングし、そしてネズミ抗ＰＲＬ−３  ３４または抗ＧＡＰＤＨ抗体（クローンＭＡＢ３７４、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で４℃で一晩探査した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で徹底的に洗浄した後、膜を、１：５，０００希釈のそれぞれのセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化二次抗体と、１時間インキュベーションし、ＴＢＳ−Ｔ緩衝剤で洗浄し、そして化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて視覚化した。
【０２２３】
動物モデルおよび治療。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ａ＊ＳＴＡＲ、シンガポール）から得た８週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスを、この研究におけるすべての動物モデルに用いた。マウスを２．５％アバーチン（１００μｌ／１０ｇ体重）で麻酔した。麻酔したマウスの腹部を、剣状胸骨のすぐ下から始まり１ｃｍの正中線切開によって、層状に開いた。肝臓の左葉を腹部切開から取り出し、そして３ｘ１０６  ＭＨＣＣ−ＬＭ３肝臓癌細胞を漿膜下層に接種した。肝臓を腹腔に戻し、そして腹壁を層状に縫合した。治療措置を癌細胞接種後５日目に開始した。腫瘍増殖／体積実験に関しては、治療したマウスに、各１００μｇのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ、ヒトＩｇＧアイソタイプ対照（カタログＢＥ００９２；Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）、またはＰＲＬ３−ミニボディを週２回５週間、ｉ．ｖ．投与した。示す場合、１００μｇの抗ＣＤ１６／３２抗体（クローン２．４Ｇ２；Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）の同時投与によって、同時治療を行った。すべての抗体を、注射のため、１００μＬ（最終）のＰＢＳに希釈した。式：体積＝０．４ｘ腫瘍の長さｘ腫瘍の幅ｘ腫瘍の幅を用いて最終腫瘍体積を計算した。生存研究に関しては、治療マウスに、１００μｌ  ＰＢＳ中で希釈した１００μｇのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを週２回、全部で１０回、ｉ．ｖ．投与した。未治療マウスに、等体積のプラセボ（緩衝剤のみ）を対照としてｉ．ｖ．投与した。マウスが、身体活動の減少を示し、そして具合が悪そうであった場合、安楽死させ、そして生存分析において、「死亡」事象と記録した。
【０２２４】
細胞単離。腫瘍細胞。同所性ＭＨＣＣ−ＬＭ３肝臓腫瘍を採取し、そして製造者の指示にしたがって、ＭＡＣＳ組織解離キット（１３０−０９５−９２９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて穏やかに解離させた。該キットは、重要な細胞表面エピトープを保持しながら、高収量の腫瘍細胞を得るために最適化されている。単離された腫瘍細胞を続いてカウントし、ＲＰＭＩ中に再懸濁し、そして氷上で分析まで維持した。培養細胞。Ｔ−７５フラスコ中の完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質を補充したＲＰＭＩ）中で、８０％集密で指数関数的に増殖している、ＭＨＣＣ−ＬＭ３  ＰＲＬ−３＋肝臓癌細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、そして非酵素細胞解離緩衝剤（Ｃ５９１４；Ｓｉｇｍａ）で５分間インキュベーションして、接着細胞を取り外して懸濁状態にした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、カウントし、完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、そして分析まで氷上で維持した。
【０２２５】
細胞表面標識およびフローサイトメトリー分析。４ｘ１０５細胞を、総体積１００μｌ中、２μｇのセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ、キメラＡｂ）、ハーセプチン（抗ＨＥＲ２、ヒト化Ａｂ）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ（抗ＰＲＬ−３、ヒト化Ａｂ）のいずれかと、４℃で３０分間インキュベーションした。いかなる一次抗体も添加されていない別個のチューブが、陰性対照として働いた。インキュベーション後、１ｍＬ  ＰＢＳを各試料に添加し、遠心分離し、そして細胞ペレットを、１．５μＬの抗ヒトＦＩＴＣ抗体を含有する１００μＬ  ＰＢＳ中に再懸濁した。４℃で１５分インキュベーションした後、細胞を以前のようにＰＢＳで洗浄し、そして最後に、２００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。細胞を細胞ストレーナーに通過させて、単細胞懸濁物を得て、そして直ちに、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用いて、２レーザー（４８８ｎｍおよび６３３ｎｍ）を備えたＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター上で捉えた。データをＦＣＳ３ファイルとして保存し、そしてＦｌｏｗｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．５．１を用いて分析した。ＦＳＣおよびＳＳＣに基づいて、生存細胞をゲート処理した。ＦＳＣおよびＳＳＣ幅を用いて、単細胞をゲート処理した。単一抗体染色細胞（二次のみ）および未染色対照細胞を補償のために用いた。
【０２２６】
組換えＧＳＴタグ化タンパク質の調製およびＥＬＩＳＡ。組換えＧＳＴ−ＰＲＬ−１、ＧＳＴ−ＰＲＬ−２およびＧＳＴ−ＰＲＬ−３融合タンパク質の調製およびＥＬＩＳＡアッセイは、以前記載されている（５９）。簡潔には、示す抗原量でコーティングされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、３％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、０．５ｎｇまたは１ｎｇのＰＲＬ−３ミニボディと、３７℃で２時間インキュベーションした。徹底的に洗浄し、そして二次抗体とインキュベーションした後、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて比色現像を行い、そして２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４での酸性化によって停止した。プレート読み取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２２７】
免疫蛍光画像化。ＭＨＣＣ同所性肝臓腫瘍の新鮮凍結標本から、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて、１６℃で１０μｍスライドを切片作製した。スライドを４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そしてＰＢＳ−ＦＤＢ（ＰＢＳ  ｐＨ７．０、２％ＢＳＡ、５％ヤギ血清、５％ウシ胎児血清）中、ＲＴで１時間ブロッキングした。続いて、スライドを、１：２００希釈の示す一次抗体と４℃で一晩インキュベーションし、洗浄し、そして対応する蛍光色素コンジュゲート化二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と２時間インキュベーションした。洗浄したスライドに、ＤＡＰＩ含有退色防止マウント試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をマウントし、そしてマニキュア液を用いて密封した。ＬＳＭ  ８００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）を用いて、共焦点画像化を行った。腫瘍カプセル（正常および腫瘍組織のつなぎ目）に隣接した腫瘍領域における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の代表的な画像（ｎ＝３）を得た。免疫細胞（緑）およびＤＡＰＩ陽性細胞（青）の総数をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって分析し、そして免疫細胞対ＤＡＰＩの比を取ることによって、ＴＩＬの割合を決定した。３つの画像の結果の平均が、１試料のデータに相当する。
【０２２８】
結果
ＰＲＬ−３「細胞内癌タンパク質」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、「細胞外癌タンパク質」と同定されうる
ＰＲＬ−３抗体は、ＰＲＬ−３発現異種移植片腫瘍、転移性肺腫瘍、および同所性胃腫瘍に対して、有効性を示した。細胞内癌タンパク質に対するこれらの非慣用的抗体療法を理解するため、ＰＲＬ３抗体は、免疫細胞上のＦｃγＲと、細胞内ＰＲＬ−３をどのように架橋可能であるのかを考える必要がある。ありうる仮説は、ＰＲＬ−３自体の何らかの部分が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、さっとひっくり返って、細胞表面で暴露されて、サイクリング効果を誘発し、それによって、他の細胞表面（細胞外）抗原と同様、直接ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが結合することを可能にしうるというものである。これを試験するため、本発明者らは、穏やかな酵素的解離を用いて、固形肝臓腫瘍から単細胞懸濁物を調製し、そしてフローサイトメトリーアプローチを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞に対して、これらのｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞の細胞表面発現を比較した（図２０ａ）。これらの非透過処理細胞プールのサイトメトリー分析によって、これらの間の主な抗原特異的相違が明らかになった。抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）キメラ抗体であるセツキシマブは、多量の増殖因子を人工的に添加した培養細胞に比較して、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍でＥＧＦＲ表面発現の劇的な低下を示し、一方、ＰＲＬ−３に関しては逆が当てはまった（図２０ｂの代表的なフローヒストグラム）。定量化によって、培養細胞（ＣＣ；図２０ｃ、カラム３対４）に比較して、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞（Ｔ）において、表面ＥＧＦＲ染色の３倍の減少が明らかになった。対照的に、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ染色で分析した際のＰＲＬ−３発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞ではおよそ７倍増加しており、ここで、ｉｎ  ｖｉｖｏの癌細胞は、低酸素ストレスおよび血清枯渇下にあり、こうした条件は、培養細胞条件（ＣＣ；図２０ｃ、カラム５対６）に比較して、癌細胞が細胞内ＰＲＬ−３タンパク質を外在化させる能力を増進させうる。フローサイトメトリーで見られるこれらの変化が、これらの抗原の総細胞レベルの変化のためでありうるかどうかを検証するため、本発明者らは、平行して、溶解物のウェスタンブロッティングを行った。以前のサイトメトリー観察と一致して、培養細胞と比較して、ＥＧＦＲの総レベルは、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞において、顕著に下方制御されていた（図２０ｄ）。対照的に、ＰＲＬ−３発現は、元来の細胞に比較して、腫瘍で明らかに増加していた（図２０ｄ）。しかし、総ＰＲＬ−３レベルの増加は、ＰＲＬ−３表面レベルの増加に比較してはるかに小さいため、本発明者らは、後者の観察は、主に、細胞内ＰＲＬ−３の再局在化に起因しうると結論付ける。これを実証するため、培養ＭＨＣＣ細胞およびＭＨＣＣ腫瘍の透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を行い、ここで、ＭＨＣＣ細胞に比較して、ＭＨＣＣ腫瘍の細胞膜の細胞外小葉上に、細胞膜の細胞内小葉に対する有意な相違を伴わず、抗ＰＲＬ−３免疫金染色の顕著な増加が観察された。
【０２２９】
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、マウスにおいて、「シード・アンド・ソイル」同所性肝臓腫瘍モデルのＦｃ依存方式で、療法的有効性を示す
次いで、ｉｎ  ｖｉｖоでのこれらのより高いレベルの「細胞外」ＰＲＬ−３抗原は、ＰＲＬ−３抗体によって認識されて、免疫細胞を補充し、そして伝統的な細胞外癌タンパク質に対する抗体療法の古典的なＡＤＣＣおよびＡＤＣＰにしたがうことも可能であった。ヒト癌細胞（「シード」）が、天然の位置（「ソイル」）中で増殖を可能にされる同所性腫瘍モデルは、高い忠実性でヒト疾患を複製する。本発明者らは、近年、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、ヒト胃癌細胞によって形成されたＰＲＬ−３を発現している同所性胃腫瘍を抑制可能であることを報告した（８）。さらに、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂがまた、切除後、ＰＲＬ−３を発現する腫瘍の再発も遮断可能であることを示した。
【０２３０】
本研究において、臨床的に適切な療法ＨＣＣ療法反応１６をよりよく再現するため、本発明者らは同所性ＨＣＣモデルを確立して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが天然微小環境内の肝臓腫瘍を抑制する能力を試験した（図２１ａ）。ＰＲＬ−３タンパク質発現状態に関してスクリーニングした、一団の６つのヒト（１つはマウス？）肝臓癌細胞株において（図２１ｂ）、ＰＲＬ−３＋  ＭＨＣＣ−ＬＭ３細胞のみが、妥当な時間枠内（６週間）に、ロバストに肝臓腫瘍を形成し、そして続く治療実験のために選択された。同所性胃腫瘍６と同様、同所性肝臓腫瘍形成は、未治療マウスに比較して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療マウスにおいて、可視性に減少した（図２１ｃ）。腫瘍体積の測定は、未治療マウスに比較して、治療マウスにおいて、平均腫瘍負荷の有意な７倍の減少を明らかにした（図２１ｄ；  ０．３０±０．３６ｖｓ２．４１±１．２０ｃｍ３、Ｐ＝０．０００１）。治療がマウス生存に対してより長い期間の効果を有するかどうかを研究するため、本発明者らは、マウスをＰＲＬ３−ｚｕｍａｂで４週間治療し、治療を停止し、そして病的な特性（「死亡」事象）が現れるまでにかかった時間を監視した。この治療スケジュールにしたがって、治療マウスは未治療マウスに比較して、有意により長い全生存を有し、中央値生存期間は、それぞれ１２週対８週であった（図２１ｅ；  Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析、Ｐ＝０．００２）。総合すると、本発明者らの知見は、この臨床的に適切なＨＣＣモデルにおいて、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、臨床的有効性を保持し、有意な腫瘍負荷減少およびより長い生存が伴うことを確立した。
【０２３１】
関与する分子機構（単数または複数）を理解するため、本発明者らはまず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行って、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂがＰＲＬ−３＋癌細胞を直接阻害可能であるかどうかを分析した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＲＬ−３＋腫瘍の顕著な抑制にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、５０ｍｇ／ｍＬの高用量であってさえ、ＰＲＬ−３＋もＰＲＬ−３−癌細胞増殖も阻害しなかった（図２４）。対照的に、シスプラチン治療は、ＰＲＬ−３＋およびＰＲＬ−３−細胞両方の用量依存性の非特異的細胞殺傷を生じた（図２４）。この知見は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、他の療法抗体と同様に、抗腫瘍効果のために特定の宿主因子を必要とする１５ことを再確認した。慣用的な抗体療法において、免疫細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗原−抗体複合体の定常（Ｆｃ）領域に結合し、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または食作用（ＡＤＣＰ）を通じて、ターゲット抗原／細胞クリアランスのためのエフェクター経路の補充および活性化を生じる１７。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの作用機構における宿主ＦｃＲの関与を調べるため、本発明者らは２つの相補的実験を設計し（図２０ｆ）、すなわち１）ＰＲＬ−３＋同所性肝臓腫瘍を接種したマウスの、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ、ならびにＦｃγＩＩおよびＦｃγＩＩＩ受容体の結合部位を遮断することによる、ＩｇＧ  ＦｃＲ仲介免疫クリアランスの強力な阻害剤である抗ＣＤ１６／３２抗体（２．４Ｇ２  ｍＡｂ）１８での同時治療、ならびに２）Ｆｃ受容体への結合に必須であることが示されたＣＨ１およびＣＨ２ドメインを欠く操作（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２  ＰＲＬ３−ミニボディでの損なわれていないＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの置換１９、２０。２．４Ｇ２  ｍＡｂを用いて、ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体を遮断すると、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療有効性の完全な喪失が起こり、未治療、２．４Ｇ２  ｍＡｂ、またはアイソタイプマッチ対照（ＩｇＧ）治療マウス（図２０ｇ）から有意に異ならない平均腫瘍体積を生じた（図２０ｇ）。同様に、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２  ＰＲＬ３−ミニボディで治療した肝臓腫瘍もまた、療法反応を欠いた（図２０ｇ）。顕著なことに、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２  ＰＲＬ３−ミニボディの療法的有効性の類似の欠如はまた、同所性ＰＲＬ−３＋  ＳＮＵ−４８４胃腫瘍に対しても明らかであり（図２５）、これが組織特異的欠点ではないことを例示した。さらに、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂのＣＨ１およびＣＨ２ドメインの欠失は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および免疫蛍光によって明らかであるように（データ未提示）、結果として、ＰＲＬ−３へのミニボディの結合に影響を及ぼさず、療法的効果の喪失は、抗体ミニチュア化による潜在的な抗原結合欠陥のためではないことが示された。総合すると、本発明者らの結果は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂのＦｃドメインおよび宿主ＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体の間の相互作用が、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍効果に必須であることを確立した。
【０２３２】
ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、癌細胞を殺傷するため、ＰＲＬ−３発現腫瘍微小環境へ、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、およびＭ１マクロファージを補充する。
【０２３３】
Ｆｃ−ＦｃＲ相互作用はＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを通じた腫瘍細胞クリアランスにおいて重要である。ＮＫ細胞はＡＤＣＣの主なエフェクターである一方、マクロファージはＡＤＣＰのエフェクターであり、後者は癌を治療するために認可された大部分の抗体の根底にある主な作用機構として、ますます認識されてきている２１。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍形成中にダイナミックな相対する役割を果たす可能性もあり、免疫刺激および殺腫瘍活性（Ｍ１マクロファージ）から免疫抑制および転移促進活性（Ｍ２マクロファージ）まで多様である２２。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが腫瘍微小環境内にマクロファージおよび他の免疫細胞の浸潤および集積を促進するかどうかを決定するため、異なるマクロファージサブタイプに特異的な多様な抗体を用いて、ＰＲＬ−３＋  ＭＨＣＣ肝臓腫瘍切片に対して、免疫蛍光を行った：Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８６）、汎マクロファージ（Ｆ４／８０）；Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６）、Ｂ細胞（ＣＤ４５／Ｂ２２０）、およびＮＫ細胞（ＣＤ３３５）。興味深いことに、ＣＤ８６＋Ｍ１マクロファージにおける有意な増加が明らかであり（図２１ｃ；Ｆ（５，１２）＝７．１２７、ｐ＜０．００５３）、一方、Ｆ４／８０＋マクロファージおよびＣＤ２０６＋  Ｍ２マクロファージの集積に関しては、群平均間で有意な相違は観察されなかった（図２ａ、ｂ）。同様に、すべての治療群に渡って、Ｂ細胞（図２１ｄ；Ｆ（５，１２）＝４０．１４、Ｐ＜０．００１）およびＮＫ細胞（図２１ｅ；Ｆ（５，１２）＝７．３８６、Ｐ＜０．００４６）における有意な集積もまた、観察された。顕著なことに、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂおよび２．４Ｇ２  ｍＡｂでの併用療法は、このＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ誘導性集積において、逆転が生じ（図２ｃ〜ｅ）、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂが、ＦｃＲ依存性方式で、これらの細胞の特異的集積を促進することを確立した。総合すると、本発明者らの結果は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂおよびＦｃγＩＩ／ＩＩＩ受容体の間の相互作用が、殺腫瘍Ｍ１マクロファージ、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の補充に必須であり、そしてこれらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性と緊密に相関したことを示した。
【０２３４】
新規癌ターゲットであるＰＲＬ−３は、多数のヒト癌において頻繁に過剰発現され；ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、これらの多数のＰＲＬ−３陽性ヒト癌を治療する喫緊の満たされていない必要性を満たすであろう。
【０２３５】
本発明者らは以前、新規胃癌ターゲットとしてのＰＲＬ−３の価値を立証し、ここでＰＲＬ３発現が新鮮凍結胃腫瘍組織の８５％で検出されたが、患者マッチ正常胃組織では検出されなかった６。上昇したＰＲＬ−３転写物発現は、多くの他の腫瘍タイプ２において記載されているため、本発明者らは、特に侵襲性悪性腫瘍で、満たされていない医学的必要性がある９つの異なる癌タイプ由来の得がたい１１０の新鮮凍結患者腫瘍試料におけるＰＲＬ−３タンパク質発現を、広く特徴付けようと試みた。本発明者らの臨床協力者による、ランダムに割り当てられたこれらの新鮮凍結試料において、本発明者らは、１６／２０の肝臓腫瘍（８０％；図２３ａ）、９／１０の肺腫瘍（９０％：図２３ｂ）、７／１０の結腸腫瘍（７０％；図２３ｃ）、９／１０の乳房腫瘍（９０％；図２３ｄ）、１３／１８の腎臓腫瘍（７２％；図２３ｅ、ｆ）、１９／２８の膀胱腫瘍（６８％；図２３ｇ）、６／１２のＡＭＬ試料（５０％；図２３ｈ）、５／６の胃腫瘍（８３％；図２３ｉ）、および４／４の前立腺腫瘍（１００％；図２３ｉ）において、ロバストなＰＲＬ−３発現を検出した。肝臓、肺、結腸、乳房および腎臓腫瘍に関しては、本発明者らは、新鮮凍結、患者マッチ非癌性組織を同じ臓器から何とか得て、これによって、ＰＲＬ−３発現の特異性に関する貴重な洞察が可能になった。顕著なことに、ＰＲＬ−３は、対応するマッチした腫瘍において高発現されているにもかかわらず、マッチした正常組織のいずれでも検出されなかった（図４ａ〜ｅ）。要約すると、これらの結果は、ＰＲＬ−３が、多様な９つの腫瘍タイプ（表１）において、平均≧７８％で発現されており、そして多数の癌タイプ、特に喫緊の満たされていない医学的必要性があるものにおいて、優れた癌ターゲットとしてのＰＲＬ−３を強調する。ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、新規癌療法の喫緊の必要性に役立つであろう。
【０２３６】
【表２】
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【０２３７】
表１：異なる腫瘍タイプに渡るＰＲＬ３発現の概要
考察
本研究は、本発明者らの以前の研究に基づき、ありうる抗体が、どのように「細胞内癌タンパク質」をターゲティングしうるか、そして多数のＰＲＬ−３陽性ヒト癌タイプに対して、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの将来の療法的価値をさらに詳しく分析するための分子作用に関する決定的な証拠を提供する。ＰＲＬ−３の本発明者らの知見は、１１０のランダムに分析した新鮮凍結ヒト癌試料において、＞７８％の頻度で存在し、そして同所性胃腫瘍モデル（参照）に関する本研究および以前の研究において、同所性肝臓および肺腫瘍におけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの有意な療法的利益を示す腫瘍関連癌タンパク質であるというものであり、本発明者らは再び、他の癌一般に加えて、喫緊の満たされていない医学的必要性を伴う、これらの急性悪性腫瘍に関するブレイクスルー免疫療法候補としてのＰＲＬ３−ｚｕｍａｂを立証する。
【０２３８】
根底にある機能的肝不全を含むＨＣＣの病理生理学的複雑性は、ＨＣＣの医学的治療を困難なものにしてきた。移植後のＨＣＣの再発もまた、臨床的に関連する問題のままであり続けている。ＨＣＣ進行に関与する特異的分子変化を同定する以前の努力は、現実的なヒットをほとんど生じず、これは特に、ＨＣＣの病因が多様であるためであり：９０％を超えるＨＣＣが肝硬変から生じ、これはさらに、アルコール依存症、Ｂ型またはＣ型肝炎、あるいは肝臓における脂肪の集積を含む多様な要因によって引き起こされる。ＨＣＣの不均一性に関する証として、過去６年の間に、進行した肝癌に対する新規の分子ターゲティング剤の少なくとも５つの主な第ＩＩＩ相試験が失敗している３２。ソラフェニブは、進行したＨＣＣの死亡率の改善を示した元来の療法であり、２．８か月の延長された生存中央値を持つ１２。しかし、進行したＨＣＣおよび肝臓機能不全患者（Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ  Ｂ患者）におけるソラフェニブの治療は、より劣った生存転帰を生じた３３。したがって、ＨＣＣ患者に対して、高い療法的有効性および低い毒性の両方を持つ新規分子ターゲティング薬剤を発見する差し迫った必要性がある。ここで、ＰＲＬ−３過剰発現が、ランダムに分析した肝臓癌患者試料の８０％で検出されており、ＰＲＬ−３タンパク質がこの病的疾患の共通のマーカーでありうるという最初の臨床的証拠を提供した。注目すべきことに、大部分の主なヒト臓器はＰＲＬ−３発現を欠く６ため、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂは、非ヒト霊長類毒性研究においてよく許容されることが示され、３６ｍｇ／ｋｇの高い副作用非観察レベル（ＮＯＡＥＬ）用量を伴った（未公表の観察）。本明細書で報告する同所性マウスモデルにおけるＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍有効性は、ＰＲＬ−３＋  ＨＣＣ患者において、安全で有効な治療様式として、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの初期試験を始めるための強い裏付けを与える。
【０２３９】
抗体が細胞内癌タンパク質をどのように認識可能であるかに取り組むため、本発明者らは以前、癌細胞によって抗体が取り込み可能であるとするものを含む、作用機構（ＭＯＡ）の３つのありうるモデルを提供した（ＣＢＴ、２００８）。本研究において、本発明者らは、どのように「細胞内癌タンパク質」が外在化されて「細胞外癌タンパク質」になり、したがって癌細胞殺傷効果の古典的経路にしたがうかに関する証拠を提供することによって、ＭＯＡを強固にし、これは、腫瘍においてＰＲＬ−３が特異的にそして一貫して上方制御されるが、正常組織においては上方制御されないことによって支持された、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの安全でそして効率的な抗腫瘍効果に関する機構的説明となる。実際、腫瘍関連細胞内抗原の細胞表面再局在は、療法的介入の新規機会を提供する。炎症、腫瘍壊死、腫瘍細胞殺傷溶解物、アポトーシスもまた、細胞内タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍微小環境に漏洩し、そして免疫反応を誘発することに寄与している可能性もある。ＰＲＬ−３に加えて、実際、他の細胞内タンパク質の腫瘍関連細胞表面再局在もまた記載されてきており、これには熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、グルコース制御タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、アクチン、サイトケラチン、ビメンチン、ヌクレオリン、ヌクレオソーム、エストロゲン受容体アルファ変異体（ＥＲ−α３６）、および胎児房状膵臓タンパク質（ＦＡＰＰ）が含まれる（５）。癌における抗体に基づく療法に適した新規抗原ターゲットを同定する際に、かなりの努力が行われてきているため、本発明者らの結果は、ここで、悪性進行中に、古典的な「細胞内」細胞質および核タンパク質の細胞表面再局在が、より注意を払うに値する一般的な腫瘍特異的現象であり、そして癌罹患率および死亡率を減少させる、ますます革新的でそして合理的な薬剤設計の基礎を形成することを再確認する。
【０２４０】
本発明者らは、人工的条件が細胞タイプを限定し、１０％ＦＢＳ培地ではｉｎ  ｖｉｖｏの複雑さを模倣不可能である細胞培養系において、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞殺傷事象を反映する困難さを理解する。本発明者らは、薬剤は、おそらく薬剤自体の毒性のため、プレート中の癌細胞を殺すと理解する。にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＲＬ−３＋癌細胞のＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療が細胞増殖のいかなる抑制も生じないにもかかわらず、これらの細胞から得られる腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂによって潜在的に抑制されうることを示す。
【０２４１】
本発明者らの知見は、本明細書において、この現象に関する２つの説明を提供する。まず、「細胞外ＰＲＬ−３」の量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＤＣＣを実行するには培養系中でわずかであるが、腫瘍細胞上ではＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ仲介性癌細胞殺傷効果を誘発するために十分なレベルまで非常に上方制御される。次に、ｉｎ  ｖｉｖｏ系とは異なり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂによる免疫仲介性腫瘍細胞殺傷の誘導に必須の複雑な宿主因子を再現するのに失敗する。
【０２４２】
これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境は、ターゲットタンパク質の薬剤としての可能性およびその療法反応に影響を及ぼす重要な役割を果たす確かな証拠を提供し、これは、単純化された培養条件に基づくアッセイにおいて、見過ごされがちな現象である。このようにして、本発明者らは、Ｆｃ−宿主ＦｃγＲ相互作用がＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの抗腫瘍効果に必須であり、宿主細胞におけるＦｃγＲの遮断がＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ抗腫瘍効果の完全な喪失を生じ、これは、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰに関与することが重要であるＢ細胞、ＮＫ細胞およびＭ１マクロファージの浸潤減少と一致することを見出した。マクロファージは、腫瘍浸潤免疫細胞の主な集団の１つであり、そして一般的に、腫瘍増殖および転移に好適である。これは主に、進行した癌で観察されるように、Ｍ１からＭ２表現型への分化を誘導することによって、腫瘍進行中のマクロファージ極性化事象が腫瘍エスケープを促進するためである。Ｍ１細胞は、高い微生物殺傷活性、免疫刺激機能および腫瘍細胞傷害性を有する。近年のメタ分析研究は、増加した腫瘍殺傷性Ｍ１浸潤ならびに肺２３および胃２４癌患者における好ましい生存の間に、有意な相関を同定している。重要なことに、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂ治療は、Ｍ１マクロファージ集積に特異的な増加を生じたが、Ｍ２増加は生じなかった。これが、抗腫瘍表現型に向かうＭ１／Ｍ２極性化、またはＭ１マクロファージ補充の特異的促進を反映するかどうかに関しては、さらなる研究が必要である。興味深いことに、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂによるＭ１腫瘍殺傷活性のこの増進は、他の最先端ＴＡＭターゲティング抗腫瘍戦略、例えばＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴ１経路のターゲティング、ならびにＭ１  ＴＡＭ極性を促進するサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２）での治療２５とならんでランキングされる。Ｍ１マクロファージに加えて、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂはまた、ＦｃγＲ依存性方式で、ＮＫ細胞およびＢ細胞の浸潤ならびに抗腫瘍効果も促進した。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣの主なエフェクターとしてよく知られているが、抗腫瘍反応におけるＢ細胞の機能的役割に関してはほとんど知られていない。以前、本発明者らは、抗ＰＲＬ−３  ｍＡｂが、Ｂ細胞成熟および活性化が不全である遺伝子操作マウス系統（ｍｕＭＴマウス）において、ＰＲＬ−３＋腫瘍を抑制するのに失敗したのを見出した際、Ｂ細胞に関する抗腫瘍役割を暗示した。研究によって、腫瘍関連Ｂ細胞は、癌免疫監視に寄与し、そして転移を抑制しうることが示されている。原発性ヒト乳房および卵巣腫瘍内へのより多いＢ細胞浸潤は、より優れた予後と相関することが見出されている。化学療法は、抗腫瘍Ｂ細胞活性化および腫瘍内集積を、より優れた抗腫瘍反応と相関する方式で、促進することが示されてきている。逆に、Ｂ細胞枯渇は、Ｔ細胞依存性抗腫瘍細胞傷害性反応を損ない、そして腫瘍増殖を促進する。興味深いことに、高用量の化学療法を受け、続いて自己移植を受けたリンパ腫患者の後ろ向き分析において、高用量化学療法措置中のＢ細胞の枯渇は、固形腫瘍の有意により高い発生を生じることが注目された。総合すると、本発明者らは、Ｂ細胞が、一般的な抗腫瘍療法の機構的有効性にお���て、重要であるがしかし過小認識されている役割を有すると仮定する。
【０２４３】
本研究における、重要な免疫細胞補充とともに、抗体およびＦｃ受容体のＦｃ機能の重要な証拠から、本発明者らは、ＰＲＬ３−ｚｕｍａｂの作用機構が、主に、細胞表面ＰＲＬ−３の結合に関与し、その後、トラスツズマブおよびリツキシマブなどの他の受容体ターゲティング抗体と同様の、古典的ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを通じた抗腫瘍クリアランスが続くことを提唱する。本発明者らの「細胞内癌タンパク質」をターゲティングする非慣用的な抗体は、「細胞内および細胞外癌タンパク質」がどちらも、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを通じた免疫仲介性腫瘍細胞殺傷にしたがうため、抗体療法とともに利用される潜在的な癌特異的療法ターゲットの多数の細胞内の財宝に関するさらなる研究を保証する。パイオニアとなる本発明者らの新規癌治療は、癌患者にまもなく利益を与える、癌免疫療法の新たな時代を待ち望むであろう。
【０２４４】
実施例２に対する参考文献
【０２４５】
【化１７−１】
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【０２４６】
【化１７−２】
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【０２４７】
【化１７−３】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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