(57)【要約】レチノイン酸またはそのアナログは、改善された免疫アジュバントを提供するために、水中油型エマルジョン内に送達される。本願は、水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを記載し、このプロセスは、マイクロフルイダイゼーション工程を包含し得、さらに（ｉ）レチノイン酸もしくはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを、フィルタを使用して濾過する工程；または（ｉｉ）レチノイン酸もしくはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを滅菌濾過する工程を包含し得る。
2019503354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫アジュバントとしての使用のための、レチノイン酸またはそのアナログを含む水中油型エマルジョン。
【請求項２】
レチノイン酸またはそのアナログを含む注射用水中油型エマルジョン。
【請求項３】
（ｉ）レチノイン酸またはそのアナログを含む水中油型エマルジョン、および（ｉｉ）少なくとも１種の免疫原を含む、免疫原性組成物。
【請求項４】
（ｉ）レチノイン酸またはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを含む第１の容器、および（ｉｉ）少なくとも１種の免疫原を含む第２の容器、を含む免疫原性組成物を調製するためのキット。
【請求項５】
必要に応じて取り付けられた針を有するシリンジであって、ここで該シリンジは、レチノイン酸またはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを含む、シリンジ。
【請求項６】
（ｉ）スクアレンおよびレチノイン酸もしくはそのアナログを含むか；または（ｉｉ）トコフェロールおよびレチノイン酸もしくはそのアナログを含むか；または（ｉｉｉ）レチノイン酸もしくはそのアナログを含む水中油型エマルジョンであって、ここで該エマルジョンは、＜２０容積％の油および／もしくは＜７容積％の界面活性剤を含むか；または（ｉｖ）レチノイン酸もしくはそのアナログを含むが、オレイン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、中鎖トリグリセリド、ダイズ油および／もしくはパルミチン酸セチルのうちの１種もしくはこれより多くを含まない、水中油型エマルジョン。
【請求項７】
レチノイン酸またはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、マイクロフルイダイゼーション工程を包含するプロセス。
【請求項８】
水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）レチノイン酸もしくはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを、０．２２μｍもしくはこれより小さい孔サイズを有するフィルタを使用して濾過する工程；または（ｉｉ）レチノイン酸もしくはそのアナログを含む水中油型エマルジョンを滅菌濾過する工程、を包含するプロセス。
【請求項９】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ｉ）レチノイン酸またはそのアナログを含む水中油型エマルジョンと、（ｉｉ）免疫原の溶液または懸濁物とを混合する工程を包含するプロセス。
【請求項１０】
（ｉ）スクアレンおよび／またはトコフェロール、ならびに（ｉｉ）レチノイン酸またはそのアナログを含む、油／界面活性剤混合物。
【請求項１１】
前記レチノイン酸またはそのアナログは、オールトランスレチノイン酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のエマルジョン、組成物、キット、シリンジ、プロセス、または混合物。
【請求項１２】
前記水中油型エマルジョンは、２〜２０容積％の油および／または０．０１〜５容積％の界面活性剤と、重量過剰の油とを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のエマルジョン、組成物、キット、シリンジ、プロセス、または混合物。
【請求項１３】
前記水中油型エマルジョンは、２μｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬのレチノイン酸またはそのアナログを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエマルジョン、組成物、キット、シリンジ、プロセス、または混合物。
【請求項１４】
前記水中油型エマルジョンは、２２０ｎｍ未満の平均液滴サイズを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のエマルジョン、組成物、キット、シリンジ、プロセス、または混合物。
【請求項１５】
前記水中油型エマルジョンは、スクアレンおよびポリソルベートを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のエマルジョン、組成物、キット、シリンジ、プロセス、または混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ワクチンアジュバントとして、レチノイン酸およびそのアナログを送達するという分野にある。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
レチノイン酸は、免疫調節に関与するビタミンＡ代謝産物である。それは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞ならびにＢ細胞に粘膜ホーミング能力をすり込むと考えられており、ＩｇＡ生成細胞の分化を促進する。抗原提示細胞は、それらにこの粘膜ホーミング能力を与え、それによって、粘膜および全身免疫を誘起することを可能にするレチノイン酸を生成し得る。従って、レチノイン酸は、動物およびヒトにおいてワクチンアジュバントとして試験されており、経口的に、腹腔内に、または皮下移植によって与えられてきた（例えば、参考文献１〜５を参照のこと）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の開示
本発明の目的は、その免疫アジュバント活性を活用するために、レチノイン酸またはそのアナログ（本明細書中以降、まとめて「ＲＡ」）を送達するためのさらなる改善された方法を提供することである。この目的は、水中油型エマルジョン内でＲＡを送達することによって達成された。ＲＡ含有水中油型エマルジョンは、以前に開示されている［６］が、スキンケア組成物（例えば、クリーム剤またはローション剤）としての使用に関するものである。注射用の水中油型エマルジョンは、ワクチンアジュバントとしての使用に関して既に公知であり（例えば、ＭＦ５９およびＡＳ０３製品）、これらは、ＲＡをそれらに添加することによって増強され、おそらく、それらの免疫学的活性を再指向して、改善された粘膜免疫応答を提供するが、特定の粘膜アジュバントも粘膜送達も必要としない。
【０００４】
従って、本発明は、免疫アジュバントとしての使用のための、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを提供する。同様に、本発明は、被験体にＲＡを含む水中油型エマルジョンを投与する工程を包含する、被験体において免疫応答を補助するための方法を提供する。
【０００５】
本発明は、粘膜免疫アジュバントとしての使用のための、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを提供する。同様に、本発明は、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを被験体に投与する工程を包含する、被験体において粘膜免疫応答を提供するための方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、ＲＡを含む注射用水中油型エマルジョンを提供する。
【０００７】
本発明はまた、（ｉ）ＲＡを含む水中油型エマルジョンおよび（ｉｉ）少なくとも１種の免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。
【０００８】
本発明はまた、（ｉ）ＲＡを含む水中油型エマルジョンを含む第１の容器および（ｉｉ）少なくとも１種の免疫原を含む第２の容器を含む、免疫原性組成物を調製するためのキットを提供する。
【０００９】
本発明はまた、必要に応じて取り付けられた針を有するシリンジを提供し、ここで上記シリンジは、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを含む。上記シリンジの内容物はまた、ワクチンが被験体へと注射され得るように、少なくとも１種の免疫原を含み得る。
【００１０】
本発明はまた、スクアレンおよびＲＡを含む、水中油型エマルジョンを提供する。このエマルジョンはまた、代表的には、以下で詳述されるように、少なくとも１種の界面活性剤を含む。
【００１１】
本発明はまた、トコフェロールおよびＲＡを含む水中油型エマルジョンを提供する。このエマルジョンはまた、代表的には、以下で詳述されるように、少なくとも１種の界面活性剤を含む。
【００１２】
本発明はまた、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを提供し、ここで上記エマルジョンは、≦２０容積％の油および／または≦７容積％の界面活性剤を含む。
【００１３】
本発明はまた、ＲＡを含むが、（ｉ）オレイン酸；（ｉｉ）ブチル化ヒドロキシトルエン；（ｉｉｉ）レシチン；（ｉｖ）中鎖トリグリセリド；（ｖ）ダイズ油および／または（ｖｉ）パルミチン酸セチルのうちの１もしくはこれより多くを含まない、水中油型エマルジョン提供する。
【００１４】
本発明はまた、マイクロフルイダイゼーション工程を包含する、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを提供する。
【００１５】
本発明はまた、水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを、０．２２μｍまたはこれより小さい孔サイズを有するフィルタを使用して濾過する工程を包含する。このプロセスは、（ｉ）ＲＡを含む水中油型エマルジョンを調製する工程、次いで、（ｉｉ）上記エマルジョンを、０．２２μｍまたはこれより小さい孔サイズを有するフィルタを使用して濾過する工程を包含し得る。
【００１６】
本発明はまた、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを滅菌濾過する工程を包含する、水中油型エマルジョンを調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、（ｉ）ＲＡを含む水中油型エマルジョンを調製する工程、次いで、（ｉｉ）上記エマルジョンを滅菌濾過する工程を包含し得る。
【００１７】
本発明はまた、免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、（ｉ）ＲＡを含む水中油型エマルジョンと、（ｉｉ）免疫原の溶液または懸濁物とを混合する工程を包含する。上記混合された組成物は、被験体を免疫するために適している。
【００１８】
本発明はまた、（ｉ）スクアレンおよび／またはトコフェロール、ならびに（ｉｉ）ＲＡを含む油／界面活性剤混合物を提供する。この油／界面活性剤混合物は、ＲＡを含む水中油型エマルジョンアジュバントを提供するために水性物質と混合され得る。
【００１９】
本発明のエマルジョンおよび免疫原性組成物は、以下で説明されるように免疫応答を惹起するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、（ｉ）培地単独、（ｉｉ）レチノイン酸、（ｉｉｉ）ＭＦ５９または（ｉｖ）レチノイン酸およびＭＦ５９の投与後の、（ａ）ＣＤ４＋および（ｂ）ＣＤ８＋  抗原特異的Ｔ細胞の集団を示す。ｙ軸は、ＣＣＲ９＋細胞の％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
レチノイン酸およびそのアナログ
本発明は、レチノイン酸またはそのアナログ（まとめて「ＲＡ」）を含む水中油型エマルジョンに関する。レチノイン酸は、ビタミンＡ代謝産物であり、それは、種々の異性体を有し、これらとしては、オールトランス（「ＡＴＲＡ」）、７−シス、９−シス、１１−シス、１３−シス、７，９−ジシス、７，１１−ジシス、９，１１−ジシス、９，１３−ジシス、および１１，１３−ジシスが挙げられる。上記異性形態のうちの３つが、承認された医薬の中で使用されている（すなわち、アリトレチノイン（９−シス）、イソトレチノイン（１３−シス）、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ））。レチノイン酸の公知のアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タザロテン、アダパレン、タミバロテン、５−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−アントラセニル）−３−チオフェンカルボン酸、４−（６−ヒドロキシ−７−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカ−１−イル−２−ナフタレニル）安息香酸、４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸、４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸、６−（４−ヒドロキシ−３−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカ−１−イルフェニル）−２−ナフタレンカルボン酸、４−［（１Ｅ）−３−［３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）フェニル］−３−オキソ−１−プロペニル］安息香酸、３−フルオロ−４−［［２−ヒドロキシ−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８，−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）アセチル］アミノ］−安息香酸、４−［４−（２−ブトキシエトキシ−）−５−メチル−２−チアゾリル］−２−フルオロ安息香酸、４’−オクチル−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボン酸、４−［［（２，３−ジヒドロ−１，１，３，３−テトラメチル−２−オキソ−１Ｈ−インデン−５−イル）カルボニル］アミノ］安息香酸、複素環式アロチノイド（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｔｉｎｏｉｄ）［７］、かさ高い疎水性の環を有するレチノイド［８］、シクロヘキセン上の２’位および３’位に種々のアルキル置換基を有する８−（２’−シクロヘキセン−１’−イリデン）−３，７−ジメチル−２，４，６−オクタトリエン酸［９］、およびレチノ安息香酸［１０］（例えば、Ａｍ８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチル）カルバモイル］安息香酸）。従って、広い範囲のレチノイン酸アナログが、当該分野で利用可能である。
【００２２】
本発明は、任意のレチノイン酸または任意のレチノイン酸アナログとともに使用され得、これらは、抗原特異的Ｔリンパ球におけるＣＣＲ９発現をアップレギュレートする。最も都合の良いことには、本発明は、ＡＴＲＡ（および本明細書での「ＲＡ」への任意の言及）を使用し、好ましくは、ＡＴＲＡを利用する。しかし、実際には、光によって引き起こされる異性化に起因して、または種々のチオール含有化合物の存在下で、純粋ＡＴＲＡを保持することは困難である。従って、組成物は、ＡＴＲＡを使用して調製される得るが、貯蔵後には、さらなるレチノイン酸異性体を含み得る。逆に言えば、組成物は、非ＡＴＲＡ異性体を使用して調製され得るが、ＡＴＲＡが貯蔵の間に生じ得る。
【００２３】
レチノイン酸は、室温で固体であり、一般に結晶形態で供給される。これは、水には溶けにくいが、油には溶けるので、水中油型エマルジョンでは、レチノイン酸は、ほとんど専ら油滴内に位置する（いくらかは、油／水界面に存在する）。従って、ＲＡとともに水中油型エマルジョンを調製するために、一般的手順は、油相（油、ＲＡ、および必要に応じて低ＨＬＢを有する界面活性剤）および水相（必要に応じて、高ＨＬＢを有する界面活性剤を含む）を調製し、次いで、これら相を混合して、エマルジョンを調製することである。その油相は、ＲＡの可溶化を補助するために、有機溶媒（特に、揮発性有機溶媒（例えば、ジクロロメタン））を必要に応じて含み得る。この溶媒は、その油相とその水相とを混合する前に、（例えば、エバポレーションによって）除去され得る。
【００２４】
ＲＡは、特に水の存在下では、劣化し得るので、エマルジョンが必要とされるまで、その油相および水相を互いから分離しておくこと、例えば、エマルジョンが使用される前２４時間未満でエマルジョンを調製することは、有用であり得る。従って、本発明は、（ｉ）スクアレンおよび／またはトコフェロール、ならびに（ｉｉ）ＲＡを含む油／界面活性剤混合物を提供する。望ましい場合、この油／界面活性剤混合物は、ＲＡを含む水中油型エマルジョンを提供するために、水性物質と混合され得る。代表的には、この油／界面活性剤混合物中の界面活性剤は、低ＨＬＢ（例えば、１０未満、および通常は、５未満）を有する。その水性物質は、水であり得るが、通常は、緩衝液を含み、界面活性剤（例えば、１０を上回るＨＬＢを有する界面活性剤）をも含み得る。
【００２５】
ＲＡ投与、ならびにＡＴＲＡおよび１３−シスレチノイン酸の静脈内投与後の薬物動態は、ラットにおいて１０ｍｇ／ｋｇ［１１］、およびサルにおいて０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１２５ｍｇ／ｋｇ［１２］の両方で、研究が行われた。およそ３ｎｇ／ｍｌの血漿Ｃｍａｘ［１］に関しては、約２０μｇ／注射のヒト用量が目的である。従って、本発明のエマルジョンは、代表的な０．５ｍｌ用量を考慮して、２〜２００μｇ／ｍＬの間の濃度のＲＡを含み得る。より一般には、本発明のエマルジョンは、２μｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの間の濃度のＲＡを含み得る。より高い濃度は、ＡＴＲＡより効力の低いアナログについては使用され得る；より効力の高いアナログについては、より低い濃度が使用され得る。
【００２６】
水中油型エマルジョン
本発明は、免疫アジュバント活性（すなわち、共投与される免疫原に対してインビボで誘起される免疫応答を増強する能力）を有する水中油型エマルジョンに関する。このようなアジュバント活性エマルジョンとしては、スクアレン含有エマルジョン（例えば、ＭＦ５９（［１３］）、ＡＳ０３［１４］、およびＡＦ０３）が挙げられる。本発明によれば、そのエマルジョンはさらに、例えば、粘膜免疫に関連して、それらの性能を増強するためにＲＡ構成成分を含む。
【００２７】
種々の水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、理想的には、インビボでの使用を促進するために生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【００２８】
上記エマルジョンは、１もしくはこれより多くの油を含む。適切な油としては、例えば、動物（例えば、魚類）または植物供給源に由来するものが挙げられる。その油は、理想的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物性油の供給源としては、堅果、種子および穀物が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ココナツ油、およびオリーブ油が、最も一般的に利用可能であり、堅果油が例示される。ホホバ油が使用され得、例えば、ホホバのマメから得られ得る。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ひまわり種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀物群では、コーン油が最も容易に入手可能であるが、他の穀物（例えば、小麦、オート麦、ライ麦、コメ、テフ、ライコムギなど）の油もまた、使用され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であるので、使用され得る。分離、精製、鹸化および動物供給源から純粋な油を得るために必要な他の手段のための手順は、当該分野で周知である。
【００２９】
大部分の魚類は、容易に回復され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨蝋）は、本明細書で使用され得る魚油のうちのいくつかを例示する。多くの分枝鎖の油が、５炭素のイソプレンユニットで生化学的に合成され、一般にテルペノイドといわれる。好ましいエマルジョンは、スクアレンを含む。スクアランは、スクアレンの飽和アナログであり、これもまた使用され得る。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。スクアレンは、分枝状の不飽和テルペノイドである。スクアレンは動物供給源（例えば、サメ（例えば、Ｓｑｕａｌｕｓ  ａｃａｎｔｈｉａｓ））から代表的には精製されるが、非動物供給源由来の、例えば、遺伝子操作した酵母［１５］および植物性油（例えば、オリーブ油）［１６，１７］に由来するスクアレンを使用することも、可能である。さらに可能な供給源としては、小麦胚芽油、パーム油、アマランス種子（例えば、［１８］を参照のこと）、および米糠油が挙げられる。スクアレンは、例えば、［１９］で開示されるように、蒸留によって精製され得る。［２０］で考察されるように、サメ由来のスクアレンを使用する場合、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）が、６６１ｐｇ  ＰＣＢ／ｇ  スクアレン（ＴＥＱ）未満のレベルで存在することが好ましい。この閾値内のＰＣＢレベルをどのようにして達成するかの完全な詳細は、参考文献２０に見出される。６６１ｐｇ／ｇより遙かに低い、さらには約２ｐｇ／ｇ程度の低さのレベルが達成され得る。低ＰＣＢ含有量を有することと同様に、スクアレン１ｇあたり１ｎｇ未満、および好ましくは、＜１ｐｇ／ｇ（ＴＥＱ）のジオキシン含有量を有することは、有用である。同様に、スクアレン１ｇあたり１ｎｇ未満、好ましくは＜１ｐｇ／ｇ（ＴＥＱ）のフラン含有量を有することは、有用である。
【００３０】
他の有用な油は、トコフェロール、特に、スクアレンとの組み合わせでのトコフェロールである。エマルジョンの油相が、トコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのうちのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールが両方とも使用され得る。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。
【００３１】
エマルジョン中の油は、油、例えば、スクアレンおよび少なくとも１種の他の油の組み合わせを含み得る。スクアレンおよびトコフェロール（例えば、ＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせは、使用され得る。しかし、いくつかの実施形態において、エマルジョンとしては、単一の油構成成分を含み得る。
【００３２】
上記エマルジョンの水性構成成分は、通常の水（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、またはさらなる構成成分、例えば、溶質を含み得る。例えば、それは、緩衝液を形成するために塩（例えば、クエン酸塩またはリン酸塩、例えば、ナトリウム塩）を含んでもよい。代表的な緩衝液としては、以下が挙げられる：ホスフェート緩衝液；トリス緩衝液；ボレート緩衝液；スクシネート緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはシトレート緩衝液、緩衝化された水相が好ましく、緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【００３３】
上記油性構成成分および水性構成成分に加えて、エマルジョンは、一般に、界面活性剤（例えば、非イオン性および／または双性イオン性の界面活性剤）を含む。このような界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にはＴｗｅｅｎといわれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名の下で販売される）（例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は、特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；およびソルビタンエステル（一般にＳｐａｎとして公知）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）。エマルジョンの中に含めるために好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）、レシチンおよび／またはオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）である。ポリソルベート８０を含むエマルジョンは、特に好ましい。
【００３４】
界面活性剤の混合物が使用され得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０））およびオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））の組み合わせもまた、適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス−９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００３５】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。ここで１〜１０の範囲のＨＬＢは、一般に、その界面活性剤が、水中より油中の方が、溶解度が高く、１０〜２０の範囲のＨＬＢは、油中より水中の方が、より溶解度が高いことを意味する。複数の界面活性剤が使用される場合、少なくとも５異なるＨＬＢ値を有する界面活性剤を含めることは、通常である。
【００３６】
有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＬＢは１５．０）および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、ソルビタントリオレエート、ＨＬＢは１．８）を含み得る。１：１重量比のポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートの混合物は、有用である。
【００３７】
最終エマルジョン中の全油の好ましい量（容積％）は、２〜２０％の間、例えば、５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％、４〜５％である。４〜６％のスクアレン含有量が、特に有用である。
【００３８】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（容積％）は、０．００１％〜８％の間、および理想的には、７％以下、例えば、０．０１〜５容積％である。例えば：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリソルベート８０）  ０．２〜４％、特に、０．４〜０．６％の間、０．４２〜０．５％の間、約０．５％または１．５〜２％の間、１．８〜２．２％の間、１．９〜２．１％の間、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％、または約１．８％；ソルビタンエステル（例えば、ソルビタントリオレエート）  ０．０２〜２％、特に、約０．５％または約１％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）  ０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス−９）  ０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％および特に、０．１〜１％または約０．５％。０．９〜１．０容積％の間または１．７〜１．９容積％の間の全界面活性剤含有量は、有用である。
【００３９】
油および界面活性剤の絶対量、ならびにそれらの比は、エマルジョンをなお形成すると同時に、広い範囲内で変動され得る。当業者は、上記構成成分の相対的割合を容易に変動させて、望ましいエマルジョンを得ることができるが、油および界面活性剤に関しては、４：１〜５：１の間の重量比が代表的である（油が重量過剰）。
【００４０】
特に、大動物において、エマルジョンの免疫刺激活性を担保するための重要なパラメーターは、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、ミクロン未満の範囲の液滴サイズを有する。適切なことには、その液滴サイズは、５０〜７５０ｎｍの範囲にある。最も有用なことには、その平均液滴サイズは、２２０ｎｍ未満（例えば、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満）である。なぜならそれらは、濾過滅菌に供され得るからである。いくつかの実施形態において、本発明のエマルジョンは、０．２２μｍまたはこれより小さい孔サイズ（これは、濾過滅菌には代表的である）を有するフィルタを使用して濾過される。
【００４１】
その平均液滴サイズは、有用なことには、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、そのエマルジョンの油滴のうちの少なくとも８０％（数で）は、直径が２２０ｎｍ未満であり、好ましくは、少なくとも９０％がそうである。これらの液滴サイズは、都合の良いことには、マイクロフルイダイゼーション（これは、高圧かつ高速で幾何学的に固定されたチャネルを通じて構成成分の流れを推進させ、それによって、混合を、そしてエマルジョンに関しては、小さな液滴の形成を達成する）のような技術によって達成され得る。エマルジョンにおける平均液滴サイズ、およびサイズ分布を決定するための装置は、市販されている。これらは、代表的には、動的光散乱および／または単一粒子光学検知の技術、例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，  ＵＳＡ）から入手可能なＡｃｃｕｓｉｚｅｒＴＭおよびＮｉｃｏｍｐＴＭシリーズの機器、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）のＺｅｔａｓｉｚｅｒＴＭ機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）のＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。［２１］もまた参照のこと。動的光散乱（ＤＬＳ）は、油の粒径が決定される好ましい方法である。平均油粒径を規定するための好ましい方法は、Ｚ−平均、すなわち、ＤＬＳによって測定される液滴のアンサンブル集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の強度加重平均流体力学的サイズである。Ｚ−平均は、その測定された相関曲線のキュムラント分析から得られ、ここでは単一粒度（液滴の直径）が想定され、単一の指数関数的フィットが自己相関機能に適用される。従って、本明細書中での平均直径への言及は、強度加重平均、および理想的には、Ｚ−平均として理解されるべきである。
【００４２】
理想的には、液滴サイズの分布（数で）は、唯一の最大、すなわち、複数の最大を有するのではなく、平均（モード）の周りに分布する液滴の単一集団が存在する。好ましいエマルジョンは、＜０．３５（ＰｄＩ）の多分散性を有する。多分散性は、粒子のサイズ分布の幅の尺度であり、従来から、多分散性指数（ＰｄＩ）として表される。０．７より大きい多分散性指数は、そのサンプルが非常に広いサイズ分布を有することを示し、０という報告された値は、サイズ変化が存在しないことを意味するが、０．０５より小さな値は、まれにしか見られない。本発明のエマルジョン内の油滴が比較的均一なサイズのものであることは、好ましい。従って、エマルジョン中の油滴は、好ましくは、０．３５未満、例えば、０．３未満、０．２７５、０．２５、０．２２５、０．２、０．１７５、０．１５、０．１２５、またはさらに０．１未満のＰｄＩを有する。ＰｄＩ値は、液滴直径を測定する同じ機器によって容易に提供される（上記を参照のこと）。
【００４３】
有用なことには、本発明の水中油型エマルジョンにおいて、＞１．２μｍという直径を有する油滴の数は、５×１０８／ｍＬもしくはこれより小さいか、例えば、５×１０８／ｍＬもしくはこれより小さいか、５×１０７／ｍＬもしくはこれより小さいか、５×１０６／ｍＬもしくはこれより小さいか、または５×１０５／ｍＬもしくはこれより小さい。
【００４４】
これらのサイズ特徴を有する油滴内のエマルジョンは、都合の良いことには、少なくとも１種の油、水性構成成分（例えば、水）、および少なくとも１種の界面活性剤をマイクロフルイダイゼーションすることによって形成され得る。マイクロフルイダイゼーション工程は、有用なことには、ホモジナイザーを使用することによって、構成成分を先ず混合する工程が先行する。構成成分が、１より多くの化合物（例えば、その油構成成分の中に２種の異なる油、その界面活性剤構成成分の中に２種の異なる界面活性剤など）を含む場合、これらは、乳化する前に種々の順序で合わせられ得る。例えば、第１の界面活性剤および油が、予め混合されて、第２の界面活性剤および水性構成成分の混合物と合わせられ得る。
【００４５】
本発明のエマルジョンは、［２２］〜［２４］で種々に開示される技術に従って調製され得る（これらの各々の完全な内容は、本明細書に参考として援用される）。
【００４６】
従って、乳化は、均質化による第１のエマルジョンの形成、続いて、第２のエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイゼーションを包含し得る。構成成分は、「タイプＩＩ」循環［２３］、または「タイプＩ」および「タイプＩＩ」循環の組み合わせを使用して、ホモジナイザーおよび／またはマイクロフルイダイザーを通じて再循環され得る。不活性雰囲気は、混合の間に使用され得る。温度は、およそ４０℃、例えば、約３５℃〜４５℃の間、例えば、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３８℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、および約４５℃で制御され得る。上記エマルジョンは、滅菌非対称親水性ＰＥＳ膜（ｓｔｅｒｉｌｅ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ＰＥＳ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用して濾過され得る。いくつかの実施形態において、上記エマルジョンは、滅菌二層（二重層）  ０．４５μｍ／０．２２μｍ非対称親水性ＰＥＳ膜フィルタを使用して濾過され得る。
【００４７】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されず、これらの中から、スクアレン含有エマルジョンが好ましい：
・スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートのミクロン未満のエマルジョン。このエマルジョンは、水相（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液）中のシトレートイオンを含み得る。このエマルジョンの容積による組成は、約４．５％  スクアレン、約０．５％  ポリソルベート８０および約０．５％  ソルビタントリオレエートであり得る。このアジュバントは、［２８］の第１０章および［２９］の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［２５〜２７］。約３９ｍｇ／ｍＬ  スクアレン、約４．７ｍｇ／ｍＬ  ポリソルベート８０、および約４．７ｍｇ／ｍＬ  ソルビタントリオレエートの濃度が代表的である。１５５〜１８５ｎｍの間のＺ−平均液滴サイズが好ましい（多分散性は＜０．２）。
・スクアレン、トコフェロール（特に、ＤＬ−α−トコフェロール）、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。これらのエマルジョンは、容積で、２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは＜１（例えば、０．９０）である。なぜならこれは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比または約１１：５の重量比を示し得る。従って、その３種の構成成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおよそ５５：６１：２５の重量比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」［１４］）は、４．３重量％  スクアレン、４．８重量％  トコフェロール、および２重量％  ポリソルベート８０を含む。約４２．７ｍｇ／ｍＬ  スクアレン、約４７．４ｍｇ／ｍＬ  ＤＬ−α−トコフェロール、および約１９．４ｍｇ／ｍＬ  ポリソルベート８０の濃度は代表的である。１４０〜１７０ｎｍの間のＺ−平均液滴サイズが好ましい。このエマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ  ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒト用量につき、０．５〜１０ｍｇ  スクアレン、０．５〜１１ｍｇ  トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ  ポリソルベート８０［３０］を、例えば、上記で考察された比で含み得る。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ  ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは、熱可逆性（ｔｈｅｒｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）であり、そして／または２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴のうちの少なくとも９０％（容積で）を有する［３１］。このエマルジョンはまた、以下のうちの１種もしくはこれより多くを含み得る：アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシド。このエマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［３２］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。好ましいエマルジョンは、スクアレン、ソルビタンオレエート、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテルおよびマンニトール（例えば、３２．５％  スクアレン、４．８２％  ソルビタントリオレエート、６．１８％  ポリオキシエチレンセトステアリルエーテルおよび６％  マンニトール；重量％）を含み、１５０ｎｍ未満の平均液滴サイズを有する。約４９．６ｍｇ／ｍＬ  スクアレン、約７．６ｍｇ／ｍＬ  ソルビタンオレエート、および約９．６ｍｇ／ｍＬ  ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、および９．２ｍｇ／ｍＬ  マンニトールの濃度が代表的である。
・スクアレン、ホスファチジルコリン（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン；（別名レシチン））、ポロキサマー１８８（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ６８）、グリセロールおよびリン酸アンモニウム緩衝液［３３］を含み、必要に応じてα−トコフェロール（「ＳＥ」）もまた含むエマルジョン。
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性物質（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照のこと）を含み得る。このエマルジョンは、ホスフェート緩衝液を含み得る。
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性物質（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら３種の構成成分を、約７５：１１：１０の質量比で含み得（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）、これらの濃度は、抗原からのこれらの構成成分の任意の寄与を含むはずである。このエマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。その水相は、ホスフェート緩衝液を含み得る。
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ  Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中に製剤化され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［３４］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアラン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）においてスレオニル−ＭＤＰとともに使用されている。それはまた、「ＡＦ」アジュバント［３５］（５％  スクアラン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）におけるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用され得る。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ［３６］のエマルジョン。アジュバント添加ワクチン中のこれら構成成分の最終濃度（重量）は、５％  スクアレン、４％  ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％  Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
・０．５〜５０％  油、０．１〜１０％  リン脂質、および０．０５〜５％  非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。［３７］に記載されるように、好ましいリン脂質構成成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。ミクロン未満の液滴サイズは、有利である。
・代謝可能でない油（例えば、ライトミネラルオイル）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＳｐａｎ  ８０）のミクロン未満の水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、［３８］に記載されるように、グルクロン酸のカルボキシル基を介して脂肪族アミンをデスアシルサポニンに付加することによって生成されるサポニン−親油性結合体（例えば、ＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がヘリカルミセル（ｈｅｌｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ）［３９］として会合されるエマルジョン。
・ミネラルオイル、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［４０］を含むエマルジョン。
【００４８】
従って、これらのエマルジョンのうちのいずれも、レチノイン酸を添加することによって改変され得るが、そのリストの中の最初の３つが特に好ましい。
【００４９】
注射用のワクチンを作製するために、これらエマルジョンは一般に、水性の免疫原調製物と混合される。この混合は、代表的には、水性形態にあるエマルジョンと、水性形態にある免疫原とを１：１  容積比で含み、この場合、エマルジョンの構成成分の割合は、最終ワクチンにおいて半分にされる。例えば、５容積％  スクアレンを有するエマルジョンは、抗原用液と１：１比で混合されて、最終濃度２．５容積％を有するワクチンを与え得る。他の混合比は、当然のことながら、例えば、５：１〜１：５の間で混合するために、上記２種の脂質の容積比を使用して可能である。従って、ワクチン組成物において、上記で示されるエマルジョンの構成成分の濃度は、それらの比が同じままである希釈によって（例えば、２または３のような整数で）改変され得る。
【００５０】
本発明のエマルジョンは、理想的には２℃〜８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、直射光を避けるべきである。特に、本発明のスクアレン含有エマルジョンおよび免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、スクアレンの光化学的分解を回避するために保護されるべきである。エマルジョンが貯蔵される場合、これは、不活性雰囲気（例えば、Ｎ２またはアルゴン）中にあることが好ましい。
【００５１】
免疫原性組成物
水中油型エマルジョンアジュバントをそれだけで患者に投与することは可能であるが（例えば、患者に別個に投与された抗原のためにアジュバント効果を提供するために）、投与前に、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を形成するために、アジュバントと免疫原性組成物（例えば、抗原）とを混合することは、より通常のことである。エマルジョンおよび抗原の混合は、即座に、使用時に起こり得るか、またはワクチン製造の間に、濾過前に起こり得る。本発明の方法は、両方の状況で適用され得る。
【００５２】
従って、本発明のプロセスは、本発明のエマルジョンと免疫原構成成分とを混合する工程を包含し得る。代わりに、本発明のプロセスは、エマルジョンを、キットの構成成分として免疫原構成成分と一緒にキットの中にパッケージする工程を包含し得る。
【００５３】
従って、全体として、本発明は、混合されたワクチンを調製する場合に、または免疫原および混合する準備のできたアジュバントを含むキットを調製する場合に、使用され得る。混合が製造の間に起こる場合、バルク抗原および混合されるエマルジョンの容積は、代表的には、１リットルより大きく、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどである。混合が使用時に起こる場合、混合される容積は、代表的には、１ミリリットルより小さく、例えば、≦０．６ｍｌ、≦０．５ｍｌ、≦０．４ｍｌ、≦０．３ｍｌ、≦０．２ｍｌなどである。どちらの場合でも、実質的に等容積のエマルジョンおよび免疫原溶液／懸濁物が混合される（すなわち、実質的に１：１（例えば、１．１：１〜１：１．１の間、好ましくは、１．０５：１〜１：１．０５の間、およびより好ましくは１．０２５：１〜１：１．０２５の間））のは、通常である。しかし、いくつかの実施形態において、過剰のエマルジョンまたは過剰の抗原が使用されてもよい［４１］。過剰容積の１種の構成成分が使用される場合、その過剰は、一般に、少なくとも１．５：１（例えば、≧２：１、≧２．５：１、≧３：１、≧４：１、≧５：１など）である。
【００５４】
抗原およびアジュバントがキット内で別個の構成成分として存在する場合、それらは、キット内で互いから物理的に分離しており、この分離は、種々の方法で達成される。例えば、それらの構成成分は、別個の容器（例えば、バイアル）の中にあり得る。２本のバイアルの内容物は、必要な場合に、例えば、一方のバイアルの内容物を別個に取り出し、それを他方のバイアルへと添加するか、または両方のバイアルの内容物を取り出して、それらを第３の容器の中で混合することによって、混合され得る。
【００５５】
別の取り合わせでは、上記キットの構成成分のうちの一方は、シリンジの中にあり、他方は、容器（例えば、バイアル）の中にある。上記シリンジは、その内容物を混合するためにバイアルの中へと挿入するために、（例えば、針とともに）使用され得、次いで、その混合物は、シリンジの中へと引き抜かれ得る。そのシリンジの混合された内容物は、次いで、代表的には、新しい滅菌した針を通じて患者へと投与され得る。シリンジの中に一方の構成成分を詰めることは、患者への投与のために別個のシリンジを使用する必要性を排除する。
【００５６】
別の好ましい取り合わせにおいて、上記２種のキットの構成成分は、一緒に保持されるが、同じシリンジの中に別個に保持される（例えば、デュアルチャンバシリンジ）。そのシリンジが作動される場合（例えば、患者への投与の間に）、その２つのチャンバの内容物が混合される。この取り合わせは、使用時に別個の混合工程の必要性を回避する。
【００５７】
種々のキットの構成成分の内容物は、一般に、全て液体形態にある。いくつかの取り合わせにおいて、構成成分（代表的には、エマルジョン構成成分ではなく抗原構成成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）にあり、他方の構成成分は、液体形態にある。その２種の構成成分は、乾燥構成成分を再活性化しかつ患者への投与のための液体組成物を与えるために、混合され得る。凍結乾燥された構成成分は、代表的には、シリンジではなくバイアル内に位置される。乾燥された構成成分は、安定化剤（例えば、ラクトース、スクロースまたはマンニトール、ならびにその混合物（例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など）を含み得る。１つの考えられる取り合わせは、予め充填されたシリンジ中の液体エマルジョン構成成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原構成成分を使用する。
【００５８】
ワクチンが、エマルジョンおよび抗原に加えて構成成分を含む場合、これらのさらなる構成成分は、これら２種のキット構成成分のうちの一方に含められ得るか、または第３のキット構成成分の一部であり得る。
【００５９】
本発明の混合されたワクチンのための、または個々のキット構成成分のための適切な容器は、バイアルおよび使い捨てシリンジを含む。これら容器は、無菌であるべきである。
【００６０】
組成物／構成成分がバイアルの中に位置する場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。そのバイアルは、好ましくは、組成物がそこに添加される前に滅菌されている。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料の中にラッテクスが存在しないことが好ましい。一実施形態において、バイアルは、ブチルゴムストッパーを有する。そのバイアルは、ワクチン／構成成分の単一用量を含み得るか、または１より多くの用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含み得る。一実施形態において、バイアルは、１０×０．２５ｍｌ用量のエマルジョンを含む。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【００６１】
バイアルは、予め充填されたシリンジがキャップの中に挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、そのシリンジの内容物は、バイアルの中に（例えば、凍結乾燥された物質をその中で再構成するために）排出され得、そのバイアルの内容物は、シリンジ中へと戻され得る。バイアルからシリンジを外した後に、針が取り付けられ得、上記組成物が患者へと投与され得る。キャップは、好ましくは、キャップにアクセスし得る前にシールまたはカバーが外されなければならないように、シールまたはカバーの内側に位置する。
【００６２】
組成物／構成成分がシリンジの中にパッケージされる場合、そのシリンジは、これに取り付けられる針を通常は有しないが、別個の針がアセンブリおよび使用のためにそのシリンジと共に供給され得る。セーフティーニードルが好ましい。シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、プランジャーが吸引の間に偶然に外れることを防止するためにストッパーを有する。そのシリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは一般に、針を取り付ける前に先端をシールするために先端キャップを有し、その先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。シリンジおよび針が別個にパッケージされる場合、その針は、好ましくはブチルゴムシールドに納められる。５ｍｌまでの内容積を有するシリンジは、本発明での使用に代表的である。
【００６３】
筋肉内注射に有用な針は一般に、１６〜３８ｍｍ（５／８インチ〜１．５インチ）の長さ、１９〜２７ゲージ（外径０．４〜１ｍｍ）である。本発明の注射用組成物は、シリンジからこのような針を通じて手で投与するために適しているべきである。これらの範囲内で、より短い針およびより高いゲージが、一般には、小児用途に使用される。
【００６４】
上記エマルジョンは、バイアルまたはシリンジにパッケージする前に、緩衝液で希釈され得る。代表的な緩衝液としては、ホスフェート緩衝液；トリス緩衝液；ボレート緩衝液；スクシネート緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはシトレート緩衝液が挙げられる。希釈は、上記アジュバントの相対的割合を保持すると同時に、例えば、「半強度」のアジュバントを提供するために、上記アジュバントの構成成分の濃度を低下させ得る。
【００６５】
容器は、半用量容積を示すために、例えば、小児への送達を容易にするために、マークが付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ容積を示すマークを有し得る。
【００６６】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダライムガラスからよりホウケイ酸ガラスから作製される容器を使用することが好ましい。
【００６７】
種々の抗原が、水中油型エマルジョンとともに使用され得、ウイルス抗原（例えば、ウイルス表面タンパク質）；細菌抗原（例えば、タンパク質および／またはサッカリド抗原）；真菌抗原；寄生生物抗原；および腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、種々の供給源に由来し得る免疫原にアジュバント添加するために使用され得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物に由来し得る。従って、ワクチンは、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生生物によって引き起こされる疾患から防御し得る。
【００６８】
本発明とともに使用するための代表的な細菌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）。
・Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉおよびＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）。
・Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）。
・Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）。
・Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｓｉ、Ｍ．ｂｏｖｉｓおよび弱毒化Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）。
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）。
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）。
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎双球菌）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）。
【００６９】
本発明とともに使用するための代表的なウイルスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルス）。インフルエンザＡまたはＢウイルスは、インターパンデミック（その年に流行する（ａｎｎｕａｌ）／季節性）株であり得るか、またはパンデミック大発生を引き起こす可能性を有する株（すなわち、現在広まっている株におけるヘマグルチニンと比較して新たなヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、もしくは鳥類被験体において病原性がありかつヒト集団において水平伝播する可能性を有するインフルエンザ株、もしくはヒトに対して病原性のインフルエンザ株）に由来し得る。特定の季節および株の性質に依存して、インフルエンザＡウイルスは、以下のヘマグルチニンサブタイプのうちの１またはこれより多くに由来し得る：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６。ワクチンは、１またはこれより多くの（例えば、１、２、３、４またはこれより多くの）インフルエンザウイルス株（インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む）に由来するヘマグルチニンを含み得る（例えば、一価Ａ／Ｈ５Ｎ１またはＡ／Ｈ１Ｎ１ワクチン、または三価Ａ／Ｈ１Ｎ１＋Ａ／Ｈ３Ｎ２＋Ｂワクチン、または四価Ａ／Ｈ１Ｎ１＋Ａ／Ｈ３Ｎ２＋Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ＋Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａワクチン）。インフルエンザワクチンの単位用量は、代表的には、ヘマグルチニン（ＨＡ）含有量（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）への言及によって標準化される。既存のワクチンは、代表的には、約１５μｇのＨＡ／株を含むが、より低い用量が使用され得る。より高い用量（例えば、３×または９×用量［４４，４５］）を有するように、部分用量（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｓｅｓ）（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ  ＨＡ／株）、１／４および１／８が使用され得る［４２，４３］。従ってワクチンは、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは０．１〜５０μｇの間、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含み得る。特定の用量は、１株あたり、例えば、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などを含む。
・パラミクソウイルス科ウイルス（例えば、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）およびモルビリウイルス（麻疹）。
・ニューモウイルスまたはメタニューモウイルス（例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウス肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス）。好ましくは、ニューモウイルスは、ＲＳＶまたはヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）である。
・パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）タイプ１、２、３または４、流行性耳下腺炎、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルスおよびニューカッスル病ウイルス。好ましくは、パラミクソウイルスは、ＰＩＶまたは流行性耳下腺炎である。
・ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）。エンテロウイルスは、ポリオウイルスタイプ１、２または３、コクサッキーＡウイルスタイプ１〜２２および２４、コクサッキーＢウイルスタイプ１〜６、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルスタイプ１〜９、１１〜２７および２９〜３４、ならびにエンテロウイルス６８〜７１を含む。好ましくは、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、タイプ１株（例えば、ＭａｈｏｎｅｙまたはＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ）、タイプ２株（例えば、ＭＥＦ−Ｉ）、またはタイプ３株（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ）である。ヘパドナウイルス（ヘパトウイルスとも称される）の例は、Ａ型肝炎ウイルスである。
・トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルス。ルビウイルス（例えば、風疹ウイルス））が好ましい。不活性化に有用なアルファウイルスとしては、水生動物のアルファウイルス（例えば、サケ膵臓病ウイルスおよび睡眠病ウイルス）が挙げられる。
・フラビウイルス（例えば、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）、デング（タイプ１、２、３または４）、黄熱、日本脳炎、ウエストナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎）。
・Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）。
・ペスチウイルス（例えば、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（ＢＤＶ））。
・ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原は、好ましくは、組換えＤＮＡ法によって得られる（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母での発現後に）。天然ウイルスＨＢｓＡｇとは異なり、組換え酵母が発現した抗原は、グリコシル化されていない。それは、リン脂質を含む脂質マトリクスを含む、実質的に球状の粒子の形態にあり得る（平均直径は約２０ｎｍ）。天然のＨＢｓＡｇ粒子とは異なり、その酵母が発現した粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得る。上記ＨＢｓＡｇは、サブタイプａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−およびａｄｒｑ＋のうちのいずれかに由来し得る。
・ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））。
・カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルス（Ｈａｗａｉｉ  Ｖｉｒｕｓ）およびスノーマウンテンウイルス（Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｒｕｓ）、およびベシウイルス（Ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）（例えば、ブタ水疱疹ウイルス）。
・コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ））。
・レトロウイルス（例えば、オンコウイルス、レンチウイルスまたはスプーマウイルス）。オンコウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２またはＨＴＬＶ−３であり得る。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり得る。
・レオウイルス（例えば、オルソレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルス）。
・パルボウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９、またはボカウイルス）。
・ヒトヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））。
・パポバウイルス（例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス）。パピローマウイルスとしては、ＨＰＶ血清タイプ１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３および６５が挙げられる。
・アデノウイルス科（ヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのうちのいずれかが挙げられる）。
【００７０】
本発明は、ウイルス、および特に、ワクチン抗原がウイルス表面糖タンパク質であるウイルスのワクチンへのアジュバント添加にとって理想的である。
【００７１】
上述のように、免疫原の溶液または懸濁物は通常、エマルジョンと、例えば、１：１容積比で混合される。この混合は、充填する前にワクチン製造業者によって行われ得るか、またはヘルスケア作業者によって使用時に行われ得るかのいずれかである。
【００７２】
本発明の免疫原性組成物は、エマルジョンおよび選択肢的な抗原に加えて、構成成分を含み得る。
【００７３】
上記組成物は、チメロサールまたは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンが水銀物質を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チメロサール非含有［４６，４７］であるべきであることは、好ましい。水銀を含まないワクチンおよび構成成分は、より好ましい。保存剤非含有のワクチンもまた、有用である。
【００７４】
いくつかの実施形態において（［４８］を参照のこと）、エマルジョン、または免疫原性組成物（例えば、エマルジョン含有ワクチン）は、以下のうちの１種もしくはこれより多くを含まない：（ｉ）オレイン酸、（ｉｉ）ブチル化ヒドロキシトルエン；（ｉｉｉ）レシチン、および特に、ダイズレシチン；（ｉｖ）中鎖トリグリセリド；ならびに／または（ｖ）ダイズ油。中鎖トリグリセリドは、飽和脂肪酸（主にカプリル酸およびカプリン酸の）のトリグリセリドの混合物であり、最低９５重量％のＣ８およびＣ１０飽和脂肪酸を含み得る。それらは通常、ココナツ油またはパーム核油から得られる。
【００７５】
いくつかの実施形態において（［４９］を参照のこと）、エマルジョン、または免疫原性組成物（例えば、エマルジョン含有ワクチン）は、以下のうちの１種またはこれより多くを含まない：（ｉ）オレイン酸；（ｉｉ）ブチル化ヒドロキシトルエン；（ｉｉｉ）レシチン、および特に、ダイズレシチン；（ｉｖ）中鎖トリグリセリド；（ｖ）ダイズ油ならびに／または（ｖｉ）パルミチン酸セチル。
【００７６】
組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間であり、より代表的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間である。本発明のプロセスは、従って、パッケージする前に、ワクチンのｐＨを調節する工程を包含し得る。上記組成物は、緩衝液を含み得る。
【００７７】
上記組成物は、好ましくは、滅菌されている。上記組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、＜１  ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）／用量、および好ましくは＜０．１  ＥＵ／用量を含む。上記組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。
【００７８】
上記組成物は、１回の免疫化のための物質を含み得るか、または複数回の免疫化のための物質を含み得る（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の取り合わせでは好ましい
【００７９】
ワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）は、小児に投与され得る。
【００８０】
処置方法、およびワクチンの投与
本発明のエマルジョンおよび免疫原性組成物は、注射を介して被験体に送達され得る。従って、本発明は、被験体において免疫応答を惹起するための方法を提供し、この方法は、本発明のエマルジョンまたは免疫原性組成物を、例えば、筋肉内注射によって被験体に投与する工程を包含する。
【００８１】
本発明はまた、被験体にワクチン接種するための方法における使用のための本発明のエマルジョンまたは免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、被験体において免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のエマルジョンの使用を提供する。同様に、本発明は、被験体において免疫応答を惹起するための医薬の製造における油、界面活性剤、水性構成成分、およびＲＡの使用を提供する。
【００８２】
本発明のキット、エマルジョンおよび組成物はまた、医薬としての使用のために提供される。
【００８３】
これらの方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答（例えば、血清ＩｇＧを介する）を含む。有利なことには、ＲＡを含めることは、その免疫応答が粘膜免疫応答（例えば、粘膜ＩｇＡ）を含み得、それによって、粘膜チャレンジに対する防御を増強し得ることを意味する。その免疫応答は、免疫原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を提供し得る。
【００８４】
本発明は、ヒトまたは非ヒト動物被験体にワクチンを投与するために適している。本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。しかし、ＲＡは、ときおり胎児毒性であり得るので、本発明は妊婦には、いくつかの実施形態において、妊娠可能年齢の女性には、使用されないのは好ましい。
【００８５】
筋肉内注射（例えば、腕または脚への）または皮下注射の代わりとして、本発明の組成物は、鼻内［５０〜５２］、経口［５３］、皮内［５４，５５］、経皮［５６］などが挙げられるが、これらに限定されない任意の他の適切な方法で投与され得る。
【００８６】
本発明のワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、その同じ医療相談の間にまたはヘルスケア専門家に訪れている間に）患者に投与され得る。
【００８７】
処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによるものであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／またはブースター免疫スケジュールにおいて、使用され得る。複数用量は、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与され得る。
【００８８】
一般
特許請求の範囲を含め、本明細書全体を通じて、状況が許せば、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変形（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、いかなる他の要素（例えば、整数）をも必然的に排除することなく、その述べられた要素（例えば、整数）または複数の要素（例えば、複数の整数）を含むと解釈されるべきである。従って、Ｘを「含む」組成物は、Ｘからもっぱらなり得るか、またはさらなる何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含み得る。
【００８９】
文言「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」とは、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ）」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、文言「実質的に」とは、本発明の定義から省かれ得る。いくつかの実施形態において、「ある構成成分を実質的に含まない組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」とは、このような組成物とその構成成分の残余の量とを含み得る。ここでその残余の量は、（ｉ）適切なまたは当該分野で認識された測定手段による信頼性のある検出レベル未満である；および／または（ｉｉ）その残余の量は、上記組成物の意図された目的に有害に影響を及ぼさない。
【００９０】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、数値ｘに関連して、選択肢的であり、そして例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００９１】
別段具体的に示されなければ、２またはこれより多くの構成成分を混合物する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合順序も要しない。従って、構成成分は、任意の順序で混合され得る。３種の構成成分が存在する場合、２種の構成成分が、互いと合わされ得、次いで、その組み合わせが、その第３の構成成分と合わされ得るなど。
【００９２】
動物（および特に、ウシ）材料が細胞培養において使用される場合、それらは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、および特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来材料が完全に存在しない状態で細胞を培養することが、好ましい。
【００９３】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置き換えられ得る。
【実施例】
【００９４】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、当該実施例は限定と解釈されるべきではない。
【００９５】
抗原特異的Ｔ細胞上のＣＣＲ９をアップレギュレートするための水中油型エマルジョン
ＣＣＲ９は、腸粘膜へのエフェクターＴ細胞移動の調節に関与する鍵となるホーミングレセプターである。ＭＦ５９および／またはレチノイン酸を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＣＲ９の発現に対するそれらの効果について試験した。陰性コントロールもまた、試験した。
【００９６】
骨髄から単離した抗原提示細胞を、オボアルブミンおよびアジュバントの存在下で、オボアルブミン特異的Ｔ細胞を有するトランスジェニックマウス（ＤＯ−１１．１０またはＯＴ−Ｉマウス）に由来するＣＤ４＋またはＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞とともに培養した。図１は、ＣＣＲ９陽性である（ａ）ＣＤ４＋および（ｂ）ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞の割合を示し、ＭＦ５９およびレチノイン酸を両方投与した場合（すなわち、図中の群（ｉｖ））に、最高の割合が認められる。
【００９７】
養子Ｔ細胞移入
参考文献［５７］は、レチノイン酸を受容するマウスにおけるＴ細胞のホーミングを研究するための実験プロトコルを記載する。簡潔には、試験抗原（この場合には、オボアルブミン）に特異的なＴ細胞を、マウスへと養子として移入し、特定の処置に応じたそれらの挙動を研究する。この一般的な実験手順を使用して、Ｔ細胞におけるＣＣＲ９発現に対する、ならびにそれらのインビボ移動に対するＭＦ５９およびレチノイン酸の効果を評価した。
【００９８】
マウスに、オボアルブミンペプチドと反応する２×１０６個のＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＤＯ−１１．１０細胞）を静脈内注射した。これらの細胞を、投与される前にＣＦＳＥで標識した。ほぼ同時に、マウスに、レチノイン酸または通常のビヒクルのいずれかを与えた。翌日、マウスに、ＭＦ５９アジュバント添加したオボアルブミンを与え、翌日、マウスに再びＲＡまたは通常のビヒクルに加えて、フィンゴリモド（これは、リンパ節からリンパ球が出て行くことをブロックする）を与えた。数日後に、マウスの排出リンパ節から排出し、ＤＯ−１１．１０  Ｔ細胞レセプターを発現するＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＦＡＣＳによってＣＣＲ９発現に関して試験した。そのＣＦＳＥ標識を使用して、細胞増殖を追跡した。
【００９９】
ＣＦＳＥ標識から、Ｔ細胞がＭＦ５９を受けたマウスにおいて増殖することが確認され、ＲＡまたはビヒクルを受けたマウスの間で実際の差異はなかった。しかし、ＣＣＲ９発現に関連しては大きな差異が認められた：ＭＦ５９および通常のビヒクルを受けたマウスでは、ＣＣＲ９発現は、ナイーブマウスにおいて認められるものと本質的に同じであったが、レチノイン酸を受けたマウスでは、ＣＣＲ９陽性細胞の数は、約５倍高かった。
【０１００】
別個の実験において、類似のプロトコルを使用したが、フィンゴリモド投与はなく、抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｔ細胞を注射して７日後に、排出リンパ節および肺の両方において評価した。ＭＦ５９処置群の両方において、排出リンパ節中のオボアルブミン特異的Ｔ細胞の割合は、本質的に同じであったが、肺では、そのレベルは、レチノイン酸を受けた動物に関して約２倍程度の高さであった。従って、レチノイン酸は、Ｔ細胞応答において一般的な変化を引き起こさなかったが、粘膜組織に向かうそれらの移動を増大させた。
【０１０１】
粘膜抗体応答
抗体応答を評価するために、マウスに、オボアルブミンまたはＨ５６（マラリア抗原）のいずれかの３用量を、ＭＦ５９でアジュバント添加して、０日目、２１日目、および４２日目に注射した。各免疫の前後の日に、マウスの１群に、レチノイン酸を与えたのに対して、コントロールマウスには、代わりに通常のビヒクルを与えた。血清ＩｇＧおよび膣洗浄物ＩｇＡ抗体応答を、５６日目に評価した。ＩｇＡ分泌細胞をまた、骨髄中で測定した。
【０１０２】
オボアルブミンまたはＨ５６に対する血清ＩｇＧ力価は、レチノイン酸または通常のビヒクルを受けたマウスにおいて本質的に同じであった。対照的に、腟洗浄物中の抗原特異的ＩｇＡ力価は、通常のビヒクルを受けたマウスでは本質的にゼロであったが、レチノイン酸を受けたマウスでは、約１２５０であった。さらに、ＩｇＡ分泌細胞の割合は、レチノイン酸を受けたマウスにおいて遙かに高かった：オボアルブミンに関しては、約７倍高く、Ｈ５６に関してはおよそ１２倍高かった。
【０１０３】
レチノイン酸を含むエマルジョンの形成
３種の水中油型エマルジョン（Ａ、Ｂ、Ｃ）を、油相中のオールトランスレチノイン酸ありまたはなしで作製した。エマルジョンＡは、「ＭＦ５９」［１３］に類似である；エマルジョンＢは、「ＡＳ０３」［１４］に類似である；そしてエマルジョンＣは、「ＳＥ」［別名、免疫デザインの安定なエマルジョン−上記を参照のこと］に類似である。
【０１０４】
各エマルジョンの試験バッチの構成成分は、以下のとおりであった。６０ｍｇ  レチノイン酸（ＲＡ）はまた、適切な場合に油相の中に含まれる：
（Ａ）油相：１００ｍｇ  Ｓｐａｎ  ８５、８６０ｍｇ  スクアレン；水相：１００ｍｇ  Ｔｗｅｅｎ  ８０、１９．５ｍｌ  １０ｍＭ  シトレート緩衝液。
（Ｂ）油相：８５５．２ｍｇ  スクアレン、９４８．８ｍｇ  ±−α−トコフェロール；水相：３８８．８ｍｇ  Ｔｗｅｅｎ  ８０、１９．５ｍｌ  １×リン酸緩衝化生理食塩水。
（Ｃ）油相：３８０ｍｇ  レシチン、２．０２ｍＬ  スクアレン、１２ｍｇ  ±−α−トコフェロール；水相：４５４ｍｇ  グリセロール、１８ｍｇ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、２ｍＬ  ２５０ｍＭ  リン酸アンモニウム（ｐＨ５．１）、１５．６４ｍｌ  超純水。
【０１０５】
レチノイン酸を油相の中で溶解しなかった場合、レチノイン酸をジクロロメタン（ＤＣＭ）中に５ｍｇ／ｍＬで先ず溶解し、次いで、油に添加した。次いで、ＤＣＭを室温でエバポレートさせた。
【０１０６】
エマルジョンを形成するために、油相および水相を約２分間ホモジナイズし、次いで、マイクロフルイダイザーを介して３２回までのかき混ぜを使用した。３０，０００ｐｓｉでの１２回の通過が、一般に十分であった。
【０１０７】
レチノイン酸なしのエマルジョンは、容易に形成され、予測された乳状の外観を有した。それらは、容易に濾過された。レチノイン酸ありのエマルジョンは、色が黄色であり、濾過するのはより困難であった。エマルジョンＢ＋ＲＡの色は、濾過後に黄色から灰白色に変化した。エマルジョンＡ＋ＲＡには、沈殿物が観察された。エマルジョンＣ＋ＲＡは、濾過するのが非常に困難であった。
【０１０８】
結論
レチノイン酸（ＲＡ）との組み合わせでのＭＦ５９は、抗原特異的Ｔリンパ球上での粘膜ホーミングレセプターの発現をインビトロで誘導し、そして排出リンパ節においてインビボでも誘導する。
【０１０９】
抗原特異的Ｔリンパ球は、レチノイン酸の存在下での免疫後に、粘膜区画に達し得る。
【０１１０】
全身および粘膜の抗原特異的抗体応答は、レチノイン酸の存在下で水中油型エマルジョンアジュバントでの全身免疫後に誘導される。
【０１１１】
従って、水中油型エマルジョンアジュバントによって誘導される粘膜ホーミング能力および粘膜抗原特異的応答は、レチノイン酸を含めることによって改善され得る。このようなエマルジョンは、本明細書で開示される方法を使用して作製され得る。
【０１１２】
本発明は、例示によってのみ記載されており、本発明の範囲および趣旨内にとどまりながら改変が行われ得ることは、理解される。
参考文献
【表１】
2019503354.tif 000003
【表２】
2019503354.tif 000004
【図１（ａ）】
2019503354.tif 000005
【図１（ｂ）】
2019503354.tif 000006
【国際調査報告】
2019503354.tif 000007
2019503354.tif 000008