(57)【要約】  対象において神経疾患（自閉症など）を処置する方法が開示される。本方法は、対象に治療的有効量の間葉系幹細胞由来の微粒子を投与することを含む。【選択図】図６Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において神経疾患を処置する方法であって、前記対象に治療的有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の粒子を投与することを含み、前記神経疾患がアルツハイマー病またはパーキンソン病ではなく、それによって前記対象において前記神経疾患を処置する、方法。
【請求項２】
対象において自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置する方法であって、前記対象に治療的有効量の間葉系幹細胞由来の微粒子を投与することを含み、それによって前記自閉症スペクトラム障害を処置する、方法。
【請求項３】
脳卒中の処置を必要とする対象において脳卒中を処置する方法であって、前記対象に治療的有効量の間葉系幹細胞由来の粒子を鼻腔内投与することを含み、それによって前記対象における脳卒中を処置する、方法。
【請求項４】
前記神経疾患が統合失調症である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記投与が鼻腔内投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子が、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソームおよびエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）からなる群から選択される、請求項１、２または３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子がエキソソームである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子が微粒子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が歯髄由来である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記間葉系幹細胞が骨髄由来である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＳＣがヒトＭＳＣである、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、神経障害の処置および、より具体的には自閉症であるが限定されないものの処置のための間葉系幹細胞由来の粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、３つのコアとなる症状：社会的相互作用およびコミュニケーションスキルの重度障害、反復行動増加および認知の不変性を特徴とする神経発生障害である（Ｂｌｅｎｎｅｒ，ＲｅｄｄｙおよびＡｕｇｕｓｔｙｎ，２０１１）。ＡＳＤの基礎となる病態生理学は依然として不明であるが、近年の証拠から、様々な分子的機能不全、例えば神経発生における欠陥（Ｗｅｇｉｅｌら、２０１０）、神経免疫学的過程（Ａｓｈｗｏｏｄら、２０１１；Ｌｉら、２００９）および神経栄養因子の利用可能性（Ｎｉｃｋｌ−ＪｏｃｋｓｃｈａｔおよびＭｉｃｈｅｌ，２０１１）などが関与することが示唆される。ＢＴＢＲマウスは、コミュニケーションおよび社会的相互作用の欠陥ならびに認知不変性および反復行動増加（Ｂｏｌｉｖａｒら、２００７）を示す近交ストランド（ｉｎｂｒｅｄ  ｓｔｒａｎｄ）である。神経学的に、ＢＴＢＲでは海馬の神経発生が減少しており、これは自閉症のヒトと相関する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎら、２０１１）。脳室下ゾーンに隣接するＢＴＢＲマウスの脳の側脳室へのＭＳＣの移植は、見慣れない雄マウスへの関心の向上、反復行動および認知の不変性の軽減など、それらの自閉症様行動に有益となる能力を有することが示されている（Ｓｅｇａｌ−Ｇａｖｉｓｈら、２０１５）。
【０００３】
統合失調症（ＳＣＺ）は、世界的におよそ１％の生涯リスクがあり、陽性症状（例えば妄想および幻覚）、陰性症状（例えば情動の平板化、感情鈍麻および引きこもり）および認知機能不全を特徴とする重度の神経発生障害である。ＳＣＺは、遺伝的要素および、出生前感染、周産期合併症および大麻使用を含む、環境的障害の組み合わせにより引き起こされる。ＳＣＺの長期経過の根本にある病態機構は、まだ完全には明らかになっていない。結果的に、ＳＣＺに対する最新の抗精神病薬処置は、この壊滅的な疾病の基本的な特性であると考えられる、陰性症状および認知欠陥における効果が不十分となっている。
【０００４】
エキソソームは、最初、網状赤血球からの不要な膜タンパク質を除去するための機序であると考えられたが、最新の研究から、ある細胞から別の細胞への遺伝情報の輸送による細胞と細胞とのコミュニケーションのためにそれらが使用されることが示されている。一部の研究では、ＭＳＣ由来エキソソームが、組織損傷の修復、炎症反応の抑制および免疫系の調整など、ＭＳＣと同様の機能を有することが報告されている（Ｙｕら、２０１４）。エキソソームは、容易に追跡可能であり、特異的な領域に標的化され得、これにより、細胞と比較してそれらの作用機序を追跡することが容易となる（Ｖａｌａｄｉら、２００７）。さらに、エキソソームは、それらが鼻腔内投与される場合、炎症の軽減など、脳において著しい生物学的効果を有することが示されている（Ｚｈｕａｎｇら、２０１１）。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１５０１９０４３０号明細書は、アルツハイマー病およびパーキンソン病を処置するためのＭＳＣのエキソソームを教示する。
【０００６】
国際公開第２０１３１５０３０３号パンフレットは、ＮＤ障害を処置するための神経幹細胞のエキソソームを教示する。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１４  Ｍａｒ；１５（３）：４１４２−４１５７は、アルツハイマー病を処置するためのＭＳＣのエキソソームを教示する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様によれば、対象において神経疾患を処置する方法であって、対象に治療的有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の粒子を投与することを含み、神経疾患がアルツハイマー病またはパーキンソン病ではなく、それによって対象において神経疾患を処置する、方法が提供される。
【０００８】
本発明の態様によれば、対象において自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置する方法であって、対象に治療的有効量の間葉系幹細胞由来の微粒子を投与することを含み、それによって自閉症スペクトラム障害を処置する、方法が提供される。
【０００９】
本発明の態様によれば、脳卒中の処置を必要とする対象において脳卒中を処置する方法であって、対象に治療的有効量の間葉系幹細胞由来の粒子を鼻腔内投与することを含み、それによって前記対象における脳卒中を処置する、方法が提供される。
【００１０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、神経疾患は統合失調症である。
【００１１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、投与は鼻腔内投与を含む。
【００１２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、粒子は、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソームおよびエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）からなる群から選択される。
【００１３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、粒子はエキソソームである。
【００１４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、粒子は微粒子である。
【００１５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、間葉系幹細胞は歯髄由来である。
【００１６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、間葉系幹細胞は骨髄由来である。
【００１７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特性によれば、ＭＳＣはヒトＭＳＣである。
【００１８】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により一般的に理解される意味と同じである。本明細書中に記載のものと同様または同等の方法および材料が本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、代表的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾がある場合、定義を含む本特許明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【００１９】
添付の図面を参照して、単なる例として本発明のいくつかの実施形態を本明細書中で記載する。ここで詳細に図面を具体的に参照して、示される項目は例であり、本発明の実施形態の例示的な考察の目的のためであることが強調される。この点において、図面とともにとられる説明により、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者にとって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】静脈内、鼻腔内および定位投与される場合にＰＫＨ２６で染色されたＭＳＣ−エキソソーム。投与１時間後に脳を分析した。収率は定位投与により１００％、鼻腔内により６８．５％および静脈内により１１．２％となった。
【図２】図２Ａ−図２Ｂ。鼻腔内ＭＳＣ−エキソソームがニューロンで見られた。ＤＡＰＩ−ＮＥＵＮ−ＰＫＨ２６．Ｘ６０。
【図３】図３Ａ−図３Ｃ。ＭＳＣ−エキソソームの鼻腔内投与後の超音波発声の特異的な改善。Ａ．ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、食塩水ＢＴＢＲと比較して、超音波発声の音節がより多かった。Ｂ．社会的接触（鼻と鼻および鼻と生殖器）において群間で有意差はなく、このことから、超音波発声での特異的効果が示唆される。Ｃ．各群の典型的な音節の可視化。ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、音節継続時間および複雑性の特性においてＣ５７ｂｌとより近くなった。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＳＥＭ。
【図４】図４Ａ−図４Ｂ。ＭＳＣ−エキソソームにより、雄と雄との社会的相互作用が増加し（Ａ）、社会的相互作用中の反復行動が減少する（Ｂ）。基本的行動（灰色）について各群を試験し、処置（食塩水またはＭＳＣ−ｅｘｏ、黒）から３週間後に再び試験した。ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、社会的相互作用および社会的相互作用中の反復行動に費やす時間において、処置前後で有意差があった唯一の群であった（対応のあるＴ検定、ＳＥＭ）。ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、処置前にＣ５７ｂｌ食塩水群とは有意に異なり、ＢＴＢＲ食塩水群と有意に異なった（ＡＮＯＶＡ１、ＳＥＭ）。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】ＭＳＣ−エキソソームによって、セルフグルーミングの反復行動が減少した。基本的行動（灰色）について各群を試験し、処置（食塩水またはＭＳＣ−ｅｘｏ、黒）から３週間後に再び試験した。ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、セルフグルーミングに費やす時間において処置前後で有意差があった唯一の群であった（対応のあるＴ検定、ＳＥＭ）。ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、処置前にＣ５７ｂｌ食塩水群とは有意に異なり、ＢＴＢＲ  食塩水群と有意に異なった（ＡＮＯＶＡ１、ＳＥＭ）。＊ｐ＜０．０５。
【図６】図６Ａ−図６Ｂ。ＭＳＣ−エキソソームによって認知の硬さが低下する。ＢＴＢＲ−ｅｘｏマウスは、Ｔ型水迷路アッセイの逆転を学習する可能性がより高く、第１日および第２日に学習したパターンに立ち戻る可能性がより低かった（Ａ）。ＢＴＢＲ−ｅｘｏマウスはそれらの学習においてより速く、４匹のマウスは６回目の試行までに逆転した経路を着実に進むことを学習した。ＢＴＢＲ−食塩水マウスは、学習により長い時間を要し、一貫して正しい道を曲がる可能性がより少なかった。１０回の試行後、６匹のＢＴＢＲ−食塩水マウスのうち３匹が新しい経路を学習したが、確実にそれを追跡し得たのはそのうち２匹のみであった。各１回の試行での群間の比較は有意ではないが、正確に曲がる総数は食塩水群と比較してＭＳＣ−ｅｘｏ群で有意に高く、群の合計成功数の間の差は有意である（Ｂ）、（ｔ＝０．０２６）。
【図７】ＭＳＣ−エキソソームは母性行動の学習を改善する。Ｃ５７ｂｌ母マウスは平均９．９秒で全ての仔マウスをシェルターに回収し（Ｃ５７ｂｌ、白色）、ナイーブバージンマウスは、１８０秒後において仔マウスを全く回収せず（ｃ５７ｂｌ、薄灰色）、Ｃ５７ＢＬ母マウスとともに３日間過ごしたバージンマウスは、平均３７秒で、全ての仔マウスを回収することを学習した（Ｃ５ｂｌ、濃灰色）。食塩水投与されたＢＴＢＲ母マウスは１８０秒後に仔マウスの殆どを回収せず、ＢＴＢＲナイーブバージンは１８０秒後に仔マウスを全く回収しなかった。ＢＴＢＲ食塩水母マウスとともに２日間過ごした後、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、平均５５秒で全ての仔マウスを回収した（ＳＥＭ）。
【図８】図８Ａ−図８Ｂ。図８Ａ−Ｂは、対照と比較して、ＰＣＰ注射後にＭＳＣ−エキソソーム処置マウスの活動性が低下したことを例示するグラフである。
【図９】図９は、中枢情報処理過程におけるＰＣＰ亜慢性処置の効果を例示するグラフである。バーのプロットは、潜在的抑制タスクの条件づけ期の間、音ＣＳ中に、前曝露なし（ＮＰＥ）および前曝露あり（ＰＥ）対象においてすくみが起こっているパーセント時間を示す。印（＊）および（＊＊）は、それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１の統計学的有意性を指す。値は全て平均＋ＳＥＭである。
【図１０】図１０は、全身性アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に対する感受性におけるＰＣＰ亜慢性処置の効果を例示するグラフである。ＰＣＰ処置によって、オープンフィールドでのマウスの移動距離（ｃｍ）により測定した場合、全身性アンフェタミンに対する自発運動反応が増加した。統計学的有意性は、活動性の４０分のピークの後のみ示した。
【図１１】図１１は、スリーチャンバー社会的アプローチテストの結果を例示するグラフである。ソーシャルケージおよび非ソーシャルケージに近接近して過ごした時間を測定した。選好指標が与えられるが、これは、社会的および非社会的刺激の両方の近くで過ごした時間に対する、社会的刺激に近接近して過ごした時間の量を示す。印（＊）および（＊＊）はそれぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１の統計学的有意性を指す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＮＳＣ由来エキソソームではなくＭＳＣ由来エキソソームが、ＢＴＢＲマウスにおいて、雄と雄との社会的相互作用を改善し、社会的相互作用中の反復行動を減少させることを例示するグラフである。食塩水処置およびＮＳＣ−ｅｘｏ処置マウスと比較して、ＭＳＣ−ｅｘｏ処置マウスのみが社会的相互作用において費やす時間の有意な増加を示し、反復行動を有意に減少させた（対応のないＴ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均＋ＳＥＭとして与える。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＭＳＣ−ｅｘｏの鼻腔内投与後に超音波発声の有意な改善があることを例示するグラフである。ＮＳＣ−ｅｘｏは効果がなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、神経障害の処置、より具体的には自閉症であるが限定されないものの処置のための間葉系幹細胞由来の粒子に関する。
【００２２】
少なくとも１つの本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、続く記載または実施例により示される記載において示される詳細に必ずしもその出願において限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施もしくは行うことが可能である。
【００２３】
エキソソームは、最初、網状赤血球からの不要な膜タンパク質を除去するための機序であると考えられた。しかし、最新の研究から、ある細胞から別の細胞への遺伝情報の輸送を通じた細胞と細胞とのコミュニケーションのためにもそれらが使用されることが示されている。エキソソームは主にタンパク質、ならびにＲＮＡおよび多数のマイクロＲＮＡを含有する。これらのタンパク質およびＲＮＡのおよそ２５パーセントが細胞増殖および維持に寄与する。
【００２４】
本発明者らは、間葉系幹細胞由来エキソソームが神経疾患に対する薬効を有するか否かを調べた。
【００２５】
第１の場合において、発明者らは、社会的相互作用およびコミュニケーションスキルの重度障害、反復行動および認知の不変性の増加という、自閉症の３つの診断症状に関連する複数の行動表現型を組み込む近交系マウス系列ＢＴＢＲ  Ｔｌｔｆ／Ｊ（ＢＴＢＲ）を使用して、自閉症における間葉系幹細胞由来エキソソームの効果を調べた。ＢＴＢＲマウスは、Ｃ５７ＢＬ対照と比較して、社会的アプローチの選択的低下、低いレシプロカル社会的相互作用および幼若動物の遊び（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｐｌａｙ）の障害を示す。
【００２６】
本発明者らは、間葉系幹細胞由来エキソソーム（本明細書中でＭＳＣ−ｅｘｏとも呼ぶ。）を鼻腔内投与されたマウスが社会的相互作用ドメインにおける有意な改善を示すことを示した。ＭＳＣ由来エキソソームで処置した雄ＢＴＢＲマウスは、処置前のそれら自身のベースライン行動と比較して、および他の食塩水処置雄と比較して、他の見慣れない雄への社会的関心の向上を示した（図４Ａ−Ｂ）。社会的相互作用において費やされるそれらの時間は、ｃ５７ｂｌ群と同等であった。雄と雌との超音波発声（ＵＳＶ）コミュニケーションにおいて、ＭＳＣ−ｅｘｏで処置したマウスは、雌に対して食塩水処置群と比較して、ＵＳＶ数が有意に高くなった（図３Ａ−Ｃ）。ＢＴＢＲマウスの自閉症様行動の第２のコア症状は、穴掘り様動作およびグルーミングの反復行動において費やす時間の延長である。ここで、本発明者らは、ＭＳＣ由来エキソソームで処置したマウスが、それらのベースラインと比較して、社会的相互作用中および単離されている間に反復行動に費やす時間が短縮したことを示す（図５）。ＢＴＢＲマウスの自閉症様行動の第３のコア症状は認知の硬さである。本発明者らは、ＭＳＣ由来エキソソーム処置マウスが、Ｔ型水迷路アッセイ中に、食塩水処置群と比較して、レスキュープラットフォーム（ｒｅｓｃｕｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）の逆転状態中に誤りが有意に少なかったことを示す（図６Ａ−Ｂ）。
【００２７】
本発明者らは、仔マウス回収行動におけるＭＳＣ由来エキソソームの効果も調べた。出産後、母マウスは新生仔マウスのために巣作りをし、仔マウスが引き離されると、母マウスはすぐにそれを取り返し、巣に戻すことが知られている。ナイーブバージン雌マウスは引き離された仔を取り返さないが、バージンマウスが母マウスと数日過ごすと、バージンマウスは仔マウス回収行動を学習し得、したがって経験を積んだバージンマウスとなる（Ｍａｒｌｉｎ，Ｍｉｔｒｅ，Ｄ’ａｍｏｕｒ，ＣｈａｏおよびＦｒｏｅｍｋｅ，２０１５）。ここで、本発明者らは、ＢＴＢＲ母マウスもＢＴＢＲ経験バージンマウスも、ｃ５７ｂｌ母マウスが行うような仔マウス回収のベースライン行動を示さないことを示す。しかし、ＭＳＣ由来エキソソームで処置した場合、ＢＴＢＲ経験バージンマウスは、ｃ５７ｂｌ経験バージンマウスと同じ仔マウス回収行動をとる（図７）。
【００２８】
第２の場合において、発明者らは、ＮＭＤＡグルタメート受容体アンタゴニストとして作用するフェンシクリジン（ＰＣＰ）に基づく薬理学げっ歯類モデルを使用して、統合失調症における間葉系幹細胞由来エキソソームの効果を調べた。
【００２９】
図８Ａ−Ｂおよび１０は、間葉系幹細胞由来エキソソームで処置したマウスが、ＰＣＰとともに投与した場合、全身性アンフェタミン投与に対して自発運動反応の低下を示したことを示す。図９は、ＰＣＰ処置マウスでの中枢情報処理過程におけるＭＳＣ由来エキソソームの好ましい効果を示し、聴覚性驚愕反射を評価することにより分析した。さらに、エキソソーム処置マウスは、このモデルにおいて社会的刺激に対する最大の選好性を示した（図１１）。
【００３０】
まとめると、本発明者らは、非常に異なる病因を有する２つの神経障害における間葉系幹細胞由来エキソソームの好ましい効果を明らかにした。したがって、本発明者らは、間葉系幹細胞由来エキソソームが一般に神経疾患に対する有用な治療薬となろうことを提案する。
【００３１】
したがって、本発明の第１の態様によれば、対象において神経疾患を処置する方法であって、対象に治療的有効量の間葉系幹細胞由来の粒子を投与することを含み、神経疾患がアルツハイマー病またはパーキンソン病ではなく、それによって対象において神経疾患を処置する、方法が提供される。
【００３２】
「間葉系幹細胞」という用語は、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨の細胞）、筋細胞（筋肉の細胞）および脂肪細胞（脂肪の細胞）を含む、様々な細胞型に分化し得る多能性間質細胞を指す。
【００３３】
それらの多能性状態において、間葉系幹細胞は、一般的に、次のマーカー：ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０およびＣＤ７３を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現しない。
【００３４】
間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄、口腔粘膜、末梢血および羊水を含むが限定されない様々な組織から単離され得る。
【００３５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、精製し、増殖させる方法は当技術分野で公知であり、例えばＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ、米国特許第５，４８６，３５９号明細書およびＪｏｎｅｓ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４６（１２）：３３４９−６０により開示されるものが含まれる。
【００３６】
好ましくは、間葉系幹細胞培養物は、ＢＭ吸引液（通常２０ｍｌ）を等体積のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で希釈し、約１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌカラム（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）上に希釈細胞を層状に載せることによって作り出される。２，５００ｘｇでの３０分間の遠心分離後、単核細胞層を界面から除去し、ＨＢＳＳ中で懸濁する。次に、細胞を１，５００ｘｇで１５分間遠心分離し、完全培地（ＭＥＭ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド不含の培地；ＧＩＢＣＯ）；ＭＳＣの急速増殖のために選択されたロット由来の２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）；１００単位／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）；および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）中で再懸濁する。再懸濁した細胞を１０ｃｍ培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において約２５ｍｌの培地中でプレーティングし、５％加湿ＣＯ２で３７℃にて温置する。培養２４時間後、未接着細胞を廃棄し、接着細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回徹底的に洗浄する。約１４日間にわたり３または４日ごとに培地を新鮮な完全培地に交換する。次に、３７℃にて５分間、０．２５％トリプシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ）を用いて接着細胞を回収し、６ｃｍプレートに再プレーティングし、さらに１４日間培養する。次に、細胞をトリプシン処理し、例えば血球計算盤（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）などの細胞計数器具を使用して細胞数を数える。培養細胞を遠心分離により回収し、５％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＣＳとともに細胞１〜２Ｘ１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁する。約１ｍｌのアリコートそれぞれをゆっくりと凍結し、液体窒素中で保存する。
【００３７】
間葉系幹細胞の一部を増殖させるために、凍結細胞を３７℃で凍結融解し、完全培地で希釈し、遠心分離により回収してＤＭＳＯを除去する。細胞を完全培地中で再懸濁し、細胞約５，０００個／ｃｍ２の濃度でプレーティングする。培養２４時間後、未接着細胞を除去し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して接着細胞を回収し、狭くなったパスツールピペットに通過させることにより解離させ、好ましくは細胞約１．５〜約３．０個／ｃｍ２の密度で再プレーティングする。これらの条件下で、約５０世代にわたり倍加してＭＳＣ培養物が増殖し得、約２０００倍増殖させ得る［Ｃｏｌｔｅｒ  ＤＣ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｃ−ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７：３２１３−３２１８，２０００］。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態により利用されるＭＳＣ培養物は、好ましくは、それらの形態学的特徴により定められる３つの群の細胞を含む：小型および無顆粒細胞（本明細書中で以下、ＲＳ−１と呼ぶ）、小型および顆粒細胞（本明細書中で以下、ＲＳ−２と呼ぶ）および大型のやや顆粒のある細胞（本明細書中で以下、成熟ＭＳＣと呼ぶ）。培養物中でのこのような細胞の存在および濃度は、様々な細胞表面マーカーの有無を同定することにより、例えば免疫蛍光、原位置ハイブリッド形成および活性アッセイを使用することにより、アッセイされ得る。
【００３９】
言及されるように、本発明は、神経疾患を処置するための間葉系幹細胞由来の粒子の使用を企図する。
【００４０】
「粒子」という用語は、本明細書中で使用される場合、タンパク質および／またはＲＮＡなどの生物学的物質を組み込む個別の実体を指す。本発明のこの態様の粒子が生物学的な細胞ではないことが理解されよう。
【００４１】
粒子は、いくつかの手段のうちの何れかにより、例えば、ＭＳＣからの、分泌、出芽または分散により、ＭＳＣから導き出され得る。例えば、本粒子は、ＭＳＣから、生成、浸出、放出または脱落させられ得る。ＭＳＣが細胞培養中にある場合、粒子は細胞培養培地に分泌され得る。
【００４２】
本粒子は特に小胞を含み得る。本粒子はエキソソームを含み得る。本明細書中に記載の粒子は、本明細書中に記載のエキソソームの特性の何れか１つ以上を含み得る。
【００４３】
本粒子は、脂質二重層により限定される小胞または平板化された球体を含み得る。本粒子は４０〜１００ｎｍの直径を含み得る。本粒子は、エンドソーム膜の内向きの出芽により形成され得る。本粒子は、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し得、スクロース勾配上で浮遊し得る。本粒子は、コレステロールおよびスフィンゴミエリンおよび脂質ラフトマーカー、例えばＧＭ１、ＧＭ３、フロチリンおよびｓｒｃタンパク質キナーゼＬｙｎなどに富み得る。本粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭに特徴的または特異的なタンパク質など、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中に存在する１つ以上のタンパク質を含み得る。これらは、ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡを含み得る。
【００４４】
特定の実施形態によれば、本粒子はエキソソームである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「エキソソーム」という用語は、原形質膜との多胞体（ＭＶＢ）の融合時に細胞から放出される細胞外小胞を指す。
【００４６】
エキソソームは、（ａ）電子顕微鏡により決定した場合に５０ｎｍ〜１００ｎｍのサイズを有し得；（ｂ）＜１００ｋＤａのタンパク質を含む分子量＞１００ｋＤａの複合体を含み；（ｃ）＜３００ｋＤａのタンパク質を含む分子量＞３００ｋＤａの複合体を含み；（ｄ）分子量＞１０００ｋＤａの複合体を含み；（ｅ）０．２ｐＭフィルターに対するろ過および１０ｋＤａの分子量カットオフの膜に対する濃縮により決定した場合に２ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有するか；または（ｆ）レーザー回折または動的光散乱により決定される場合に１００ｎｍを下回る流体力学半径を有する。
【００４７】
本粒子は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離可能である何かであり得る。本粒子は、少なくとも、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの活性に関与し得る。本粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの機能の実質的に殆どまたは全てに関与し、それを行い得る。例えば、本粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭに対する代用物（または生物学的代用物）であり得る。
【００４８】
本粒子は、好ましくは間葉系幹細胞の少なくとも１つの特性を有する。本粒子は生物学的特性、例えば生物学的活性などを有し得る。本粒子は、ＭＳＣの生物学的活性の何れかを有し得る。本粒子は、例えばＭＳＣの治療的または回復性活性を有し得る。
【００４９】
本粒子は、多くの方法で作製または単離され得る。このような方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から粒子を単離することを含み得る。このような方法は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から粒子を単離することを含み得る。
【００５０】
本粒子は、例えば粒子の何れかの特性に基づいて非会合成分から分離されることにより単離され得る。例えば、本粒子は、分子量、サイズ、形態、組成または生物学的活性に基づいて単離され得る。
【００５１】
馴化培地に対して、分離中、分離前または分離に続いて、ろ過または濃縮またはその両方が行われ得る。例えば膜、例えばサイズまたは分子量カットオフであるもの、を通じてこれをろ過し得る。これは接線ろ過または限外ろ過に対する対象であり得る。
【００５２】
例えば、この文書の他の部分の分子量に対するアッセイにおいて記載されるように、適切な分子量またはサイズカットオフの膜でのろ過を使用し得る。
【００５３】
場合によってはろ過または濃縮されるか、またはその両方が行われる馴化培地は、カラムクロマトグラフィーなど、さらなる分離手段に対する対象であり得る。例えば様々なカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し得る。カラムは、サイズ排除カラムまたは結合カラムであり得る。
【００５４】
間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の分画中でその活性を追跡するために本粒子の１つ以上の特性または生物学的活性を使用し得る。例として、粒子を追うために、光散乱、屈折率、動的光散乱またはＵＶ−可視光検出器を使用し得る。例えば、分画中の活性を追跡するために、心保護的活性などの治療活性を使用し得る。
【００５５】
次の段落は、エキソソームなどの間葉系幹細胞粒子がどのように得られ得るかの具体例を提供する。
【００５６】
間葉系幹細胞を馴化させるための培地中で間葉系幹細胞を培養することによって、間葉系幹細胞粒子が作製され得る。培地はＤＭＥＭを含み得る。ＤＭＥＭはフェノールレッドを含まないようなものであり得る。培地にはインスリン、トランスフェリンまたはセレノプロテイン（ＩＴＳ）または何らかのそれらの組み合わせが補給され得る。これはＦＧＦ２を含み得る。これは、ＰＤＧＦ  ＡＢを含み得る。ＦＧＦ２の濃度は約５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２であり得る。ＰＤＧＦ  ＡＢの濃度は約５ｎｇ／ｍｌであり得る。培地は、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンまたは−メルカプトエタノールまたは何らかのそれらの組み合わせを含み得る。
【００５７】
細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間またはそれ以上、例えば３日間培養し得る。馴化培地は培地から細胞を分離することにより得られ得る。馴化培地を例えば５００ｇで遠心分離し得る。膜を通じたろ過によってこれを濃縮し得る。膜は＞１０００ｋＤａ膜を含み得る。馴化培地は約５０倍以上濃縮し得る。
【００５８】
馴化培地は、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーの対象であり得る。馴化培地をサイズ排除により分離し得る。セファロースなどの何らかのサイズ排除マトリクスを使用し得る。例として、ＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６ｘ４０ｍｍまたはＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷＸＬ、７．８ｘ３００ｍｍを使用し得る。溶出緩衝液は、食塩水などの何らかの生理的溶液を含み得る。これは、ｐＨ７．２の１５０ｍＭのＮａＣｌ入りの２０ｍＭリン酸緩衝液を含み得る。クロマトグラフィー系は０．５ｍｌ／分の流速で平衡化し得る。溶出方式は均一濃度であり得る。２２０ｎｍでのＵＶ吸収を使用して、溶出の進行を追跡し得る。準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）について分画を調べ得る。
【００５９】
動的光散乱を呈することが見られる分画を保持し得る。例えば、上記のような一般的方法により生成される、および１１〜１３分間、例えば１２分間の保持時間で溶出される分画は、動的光散乱を呈することが分かる。このピークでの粒子のｒ．ｓｕｂ．ｈは約４５〜５５ｎｍである。このような分画は、エキソソームなどの間葉系幹細胞粒子を含む。
【００６０】
本粒子は２ｎｍより大きいサイズを有し得る。本粒子は５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍまたは５０ｎｍより大きいサイズを有し得る。本粒子は、１００ｎｍより大きい、例えば１５０ｎｍより大きいサイズを有し得る。本粒子は、実質的に２００ｎｍ以上のサイズを有し得る。
【００６１】
本粒子は、２ｎｍ〜２０ｎｍ、２ｎｍ〜５０ｎｍ、２ｎｍ〜１００ｎｍ、２ｎｍ〜１５０ｎｍまたは２ｎｍ〜２００ｎｍなどのサイズ範囲を有し得る。本粒子は、２０ｎｍ〜５０ｎｍ、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５０ｎｍまたは２０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。本粒子は、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍまたは５０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。本粒子は、１００ｎｍ〜１５０ｎｍまたは１００ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。本粒子は、１５０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。
【００６２】
サイズは様々な手段により決定され得る。原則としては、サイズは、適切なサイズカットオフの膜を通じたサイズ分画およびろ過により決定され得る。次に、粒子サイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の分離を追跡することによって、または生物学的アッセイによって決定され得る。
【００６３】
サイズは流体力学半径を含み得る。粒子の流体力学半径は、１００ｎｍを下回り得る。これは約３０ｎｍ〜約７０ｎｍであり得る。流体力学半径は、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、例えば約４５ｎｍ〜約５５ｎｍなどであり得る。流体力学半径は、約５０ｎｍであり得る。
【００６４】
粒子の流体力学半径は、何らかの適切な手段、例えばレーザー回折または動的光散乱により決定され得る。
【００６５】
本粒子は、間葉系幹細胞により分泌される１つ以上のタンパク質またはポリヌクレオチドを含み得る。本粒子は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中に存在する１つ以上のタンパク質またはポリヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、本粒子は、ＭＳＣに由来するｍｉＲＮＡを含み得る。
【００６６】
例えば、本粒子は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または７０％以上のこれらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含み得る。本粒子は、実質的に約７５％のこれらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含み得る。タンパク質は、遺伝子のリストのタンパク質または遺伝子産物のリストを参照することにより定められ得る。
【００６７】
既に述べたように、本発明のこの態様の粒子は、神経疾患の処置に有用である。
【００６８】
処置され得る対象としては、哺乳動物対象、例えばヒト、マウス、ラット、サル、イヌおよびネコが挙げられる。
【００６９】
「神経疾患」という用語は、脳、脊椎および／またはそれらを連結する神経の疾患を指す。
【００７０】
一実施形態によれば、疾患は記憶疾患である。
【００７１】
好ましい実施形態において、疾患は神経発生障害、例えば自閉症または統合失調症などである。
【００７２】
別の実施形態によれば、疾患は、統合失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、トゥーレット症候群、強迫性障害ならびに神経系の変性の神経行動関連症状、例えばパーキンソン病、本態性振戦、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症および器質精神病などの行動疾患である。
【００７３】
ある実施形態において、神経疾患はパーキンソン病またはアルツハイマー病（ＡＤ）ではない。
【００７４】
別の実施形態において、神経疾患は脳卒中ではない。
【００７５】
特定の実施形態によれば、神経疾患は自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）である。
【００７６】
既に述べたように、薬剤（互いに交換可能に医薬組成物と呼ばれる）を調製するために、本発明の実施形態の粒子を使用し得、それによりこのような薬剤が神経疾患を処置するために処方される。
【００７７】
本発明の粒子は、様々な移植アプローチを使用して処置される個体に投与され得、その性質は移植部位に依存する。
【００７８】
「移植」、「細胞補充」または「グラフト」注入という用語または句は、本明細書中で互いに交換可能に使用され、脳、灰白質などの標的組織への本発明の粒子の導入を指す。粒子が得られる間葉系幹細胞は、レシピエント（同種）由来または非同種もしくは異種ドナー由来であり得る。
【００７９】
本粒子は、脊髄に（髄腔内に）直接、静脈内に、脳に直接、またはそれが脳に到達するようなものの組み合わせで移植され得る。ある実施形態において、本粒子は非侵襲性に、例えば鼻腔内送達される。他の投与方式は全身投与なども企図される。
【００８０】
処置のために（例えば鼻腔内）投与され得る粒子（例えばエキソソーム）の代表的な用量は、７０ｋｇヒトに対して、１ｘ１０６〜１ｘ１０２０個、より好ましくは１ｘ１０９〜１ｘ１０１５個であり得る。
【００８１】
本明細書中に記載の方法の何れかにおいて、本粒子は、それ自体、または好ましくは薬学的に許容可能な担体をさらに含む医薬組成物の一部としての何れかで投与され得る。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」は、薬学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を伴う、本明細書中に記載の粒子の調製物を指す。医薬組成物の目的は、対象への粒子の投与を促進することである。
【００８３】
本明細書中で以後、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、対象に対して顕著な刺激性を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しない担体または希釈剤を指す。担体の非限定例は、プロピレングリコール；食塩水；エマルション；緩衝液；培地、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど；フリーラジカルを除去する成分を含有する低温保存培地であり、ｐＨ緩衝、膨張／浸透圧的サポート、低温での細胞内の状態のバランスをとるエネルギー基質およびイオン濃度および水との有機溶媒の混合物が提供される。
【００８４】
一般的には、薬学的担体は、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間またはさらに少なくとも９６時間にわたり、組成物中で粒子数を保つ（例えば９０％超減少しない）。
【００８５】
本明細書中で「賦形剤」という用語は、化合物の投与をさらに促進し、移植／注射前に適切な時間にわたり予め決定された温度で細胞生存能を維持するために、医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の非限定例としては、アルブミン、血漿、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）、抗酸化剤、例えばＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはレスベラトロールなど、が挙げられる。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的担体は、緩衝液の水溶液またはＤＭＥＭなどの培養液である。
【００８７】
本発明の方法で使用される何らかの調製物に対して、治療的有効量または用量は、最初にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定され得る。好ましくは、用量は、所望の濃度または力価を達成するために、動物モデルにおいて処方される。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定し得る。
【００８８】
本明細書中に記載の活性成分の毒性および治療効果は、インビトロでの標準的な薬学的手順により、細胞培養物または実験動物において決定され得る。
【００８９】
これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を処方することにおいて使用され得る。さらなる情報は、臨床試験から得られ得る−例えばＳａｌｅｍ  ＨＫ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２０１０；２８：５８５−９６；およびＵｃｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１；１０：６４９−５６を参照）。
【００９０】
投与量は、使用される剤型および利用される投与経路に依存して変動し得る。的確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個別の医師により選択され得る（例えばＦｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５，”Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１  ｐ．１参照）。
【００９１】
注射に対して、本医薬組成物の活性成分は、水溶液中で、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液および本明細書中で上記に記載のようなさらなる薬剤中で処方され得る。
【００９２】
神経障害を有効に処置するのに十分である活性成分のレベルに対して個々に投与量および間隔が調整され得る。所望の効果を達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に依存する。
【００９３】
処置しようとする状態の重症度および反応性に依存して、粒子の投与は、数日〜数週間または数か月続く一連の処置で、疾患状態の減少がいつ達成されるかに依存して、単回または複数回投与であり得る。
【００９４】
投与しようとする粒子の量は、当然ではあるが、処置されている個体、苦痛の重症度、投与方式、処方医師の判断などに依存する。投与量および投与のタイミングは、個体の変化の状態の慎重で継続的な監視に対応する。
【００９５】
投与後、それらが標的部位に到達したことを確認するために、粒子を追跡し得る。これは金ナノ粒子を使用して行われ得、例えば国際公開第２０１３１８６７３５Ａ３号パンフレットを参照のこと。
【００９６】
少なくともいくつかの実施形態において、本発明の粒子は、即時使用型シリンジ中に単位剤型で予め包装され得る。シリンジに、粒子の名称およびそれらの起源付きのラベルを付し得る。ラベルは、粒子の機能に関する情報も含み得る。シリンジは、粒子に関する情報を伴うラベルも付されるパッケージ中で包装され得る。
【００９７】
少なくともいくつかの実施形態において、本発明の粒子は、神経障害を処置するのに有用な治療剤、ガングリオシドなど；抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子；および代謝拮抗低分子剤およびＬ−ＤＯＰＡなどの神経伝達物質分子の前駆体と同時投与し得る。さらに、またはあるいは、少なくともいくつかの実施形態において、本発明の粒子は、神経疾患のうち少なくとも１つの症状を軽減可能な他の細胞と同時投与され得る。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、「約」という用語は±１０％を指す。
【００９９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの同根語は「含むが限定されない」を意味する。
【０１００】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）という用語は、「含み、限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇおよびｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０１０１】
「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、組成物、方法または構造が、さらなる成分、段階および／または部分を含み得るが、さらなる成分、段階および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的および新規特徴を実質的に変更しない場合のみであることを意味する。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から別段明らかに示されない限り、複数の参照物を含む。例えば「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含め、複数の化合物を含み得る。
【０１０３】
本願を通じて、本発明の様々な実施形態は範囲方式で表され得る。範囲方式の記載は単に利便性および簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する変更できない限定として解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能なサブ範囲ならびにその範囲内の個々の数値全てが具体的に開示されていると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６など、具体的に開示されるサブ範囲を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅に関わりなく適用される。
【０１０４】
本明細書中で数値が示される場合はいつでも、示される範囲内のあらゆる引用される数字（分数または整数）を含むものとする。第１の指定数と第２の指定数との「間の範囲である（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲である（ｒａｎｇｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ）」および第１の指定数から第２の指定数「まで」の「範囲である（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲である（ｒａｎｇｅｓ  ｆｒｏｍ）」という句は、本明細書中で交換可能に使用され、第１および第２の指定数およびその間の分数および整数全てを含むものとする。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実務家にとって公知であるか、またはそれらにより公知の方式、手段、技術および手順から容易に開発されるかの何れかの、方式、手段、技術および手順を含むが限定されない、ある種の課題を完遂するための、方式、手段、技術および手順を指す。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、状態の進行を抑止する、実質的に阻害する、減速させる、または逆転させる、状態の臨床もしくは審美的症状を実質的に寛解させる、または状態の臨床もしくは審美的症状の出現を実質的に防ぐことを含む。
【０１０７】
明確にするために、個々の実施形態の文脈で記載される本発明のある一定の特性はまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡略化のために、単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特性はまた、個別に、または何らかの適切なサブコンビネーションで、または本発明の何らかの他の記載される実施形態において適切なように、提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載されるある種の特性は、実施形態がこれらの要素がない場合に無効とならない限り、これらの実施形態の必須の特性であるものとはみなされない。
【０１０８】
本明細書上記で説明されるような、および下記の特許請求の範囲のセクションで主張されるような本発明の様々な実施形態および態様は、次の実施例において実験的支援を見出す。
【０１０９】
実施例
ここで、上の記載と一緒に非限定的に本発明のいくつかの実施形態を例示する次の実施例を参照する。
【０１１０】
一般に、本明細書中で使用される命名法および本発明で利用される実験室での手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組み換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献で徹底的に説明される。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８０１，５３１号明細書；同第５，１９２，６５９号明細書および同第５，２７２，０５７号明細書で示される方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で徹底的に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８３９，１５３号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，８５０，５７８号明細書；同第３，８５３，９８７号明細書；同第３，８６７，５１７号明細書；同第３，８７９，２６２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；同第３，９３５，０７４号明細書；同第３，９８４，５３３号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，０３４，０７４号明細書；同第４，０９８���８７６号明細書；同第４，８７９，２１９号明細書；同第５，０１１，７７１号明細書および同第５，２８１，５２１号明細書；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照；これらは全て、本明細書中で完全に示されるようかのように参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、この文書全体で提供される。その中での手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の利便性のために提供される。その中に含有される情報は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１１１】
実施例１
自閉症を処置するためのＭＳＣ由来エキソソーム
材料および方法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）調製：ヒトＭＳＣはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。既に記載のように細胞を培養し、増殖させた（Ｓａｄａｎら、２０１２）。
【０１１２】
精製プロトコール：
培養液を採取し、それを３００ｇで１０分間遠心分離することによりエキソソームを精製した。上清を回収し、２０００ｇで１０分間遠心分離した。もう一度、上清を回収し、１００００ｇで３０分間遠心分離した。上清を採取し、０．２２μｍフィルターに通し、１０００００ｇで７０分間遠心分離した。エキソソームおよびタンパク質を含有するペレットをＰＢＳ中で洗浄し、次いで１０００００ｇで７０分間遠心分離した。精製エキソソームを含有するペレットを２００μｌの滅菌ＰＢＳ中で再懸濁した。各遠心分離は４℃で行った。
投与粒子数／マウス＝８．５ｘ１０９ｐａｒｔｉｃｉｅｓ／ｕｉ
【０１１３】
染色プロトコール：５００μｌ希釈剤中で２μｌのｐＫＨ  ２６を混合することによって、保存溶液を作製した。保存液から、ＰＢＳ中５０μｌのエキソソームに１００μｌを添加した。５分後、１００μｌのエキソソーム不含血小板を前の混合物に添加し、４℃にて１００ｇで９０分間遠心分離した。２００μｌのＰＢＳ中でペレットを再懸濁した。Ｍａｅｓｔｒｏ  ＣＲｉ、励起フィルター５２３および発光フィルター５６０を用いて、全脳蛍光イメージングを撮影した。
【０１１４】
動物：元来Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した成獣ペアからＢＴＢＲ  Ｔｌｔｆ／Ｊマウスを繁殖させた。５週齢で、同腹仔雄マウスの第１のコホートを食塩水鼻腔内投与（食塩水、ｎ＝７）またはＭＳＣ−ｅｘｏ鼻腔内投与（ＭＳＣ−ｅｘｏ、ｎ＝７）の何れかに無作為に割り当てた。５週齢で、同腹仔雌マウスの第１のコホートを食塩水鼻腔内投与（食塩水、ｎ＝９）またはＭＳＣ−ｅｘｏ鼻腔内投与（ＭＳＣ−ｅｘｏ、ｎ＝６）に無作為に割り当てた。
【０１１５】
元来Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した成獣ペアからＣ５７ｂｌ／６マウスを繁殖させた。５週齢で、同腹仔雄マウスの第１のコホートに鼻腔内投与により食塩水を与えた（食塩水、ｎ＝７）。５週齢で、同腹仔雌マウスの第１のコホートを食塩水鼻腔内投与（食塩水、ｎ＝７）および食塩水なし（なし、ｎ＝１１）に無作為に割り当てた。
【０１１６】
ケージあたり３〜５匹の同腹仔の群でマウスを飼育した。第７〜９週で行ったエキソソームの投与前に５〜７週でベースライン行動についてマウスを最初に試験した（１４日間にわたり１日おきに、全部で３５μｌ、５μｌのエキソソームまたは食塩水を投与した）。
【０１１７】
エキソソームの投与から３週間後、母性学習行動のために、６匹のＢＴＢＲ−ＭＳＣ−ｅｘｏバージン雌マウスを１匹のＢＴＢＲ−食塩水妊娠雌マウスと一緒に置いた。母性学習行動のために、５匹のＢＴＢＲ−食塩水バージン雌マウスを１匹のＣ５７−食塩水妊娠雌マウスと一緒に置いた。
【０１１８】
行動試験：
オープンフィールド：マウスを全部で２０分間、４５Ｘ４５Ｘ４５ｃｍに置いた。Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  ｖ１０．１１を使用して、移動した総距離および中心部で費やした時間量を測定した。
【０１１９】
超音波発声：Ａｖｉｓｏｆｔ−ＲＥＣＯＲＤＥＲ  ｖ．４．２．２１録音プログラムを使用して、雄から雌への超音波発声を試験した。この設定には、２５０ｋＨｚのサンプリングレートおよび１６ビット方式が含まれた。スペクトログラム生成のために、録音をＡｖｉｓｏｆｔ−ＳＡＳＬａｂ  Ｐｒｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．２．０７に移し、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を行った。２５６ポイントのＦＦＴ長および５０％の時間窓重複を用いてスペクトログラムを生成させた（１００％フレーム、フラットトップ窓）。ＢＴＢＲ  Ｔｌｔｆ／ＪおよびＣ５７ｂｌ／６雄マウスの両方をＣ５７ｂｌ／６雌マウスと会わせた。各雄を１時間にわたり個別ケージに入れ、次いで雌をそのケージに入れた。出会いの最初の５分間にわたり超音波発声を録音し、雄−雌社会的相互作用分析のために撮影した。
【０１２０】
レシプロカル・ダイアディック社会的相互作用（Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｙａｄｉｃ  ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）試験：社会的刺激として５週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６ストレンジャーマウスを使用して、レシプロカル・ダイアディック社会的相互作用（Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｙａｄｉｃ  ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）試験（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２０１２）を行った。試験マウスとともにストレンジャーマウスを４０Ｘ４０Ｘ２０ｃｍケージに入れた。両マウスを２０分間記録し；処置について盲検となる観察者によって最後の１０分間を定量した。試験前に両マウスを１時間引き離した。Ｃｏｗｌｏｇ  Ｖ３ソフトウェアを使用して、試験マウスによって開始される社会的接触のスコア化を行った（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）。社会的行動においてマウスがストレンジャーマウスに関与する持続時間により、スコアを判定した。次の社会的行動を定量した：鼻と鼻とのスニッフィング（すなわちストレンジャーに向き合うように接近）、鼻と生殖器とのスニッフィング（すなわちストレンジャーの背後へ接近）、攻撃（すなわち試験マウスがストレンジャーマウスとの戦いを開始）および回避（すなわちストレンジャーマウスがそれを開始するときに試験マウスが故意に相互作用を回避する場合）。社会的相互作用中、反復行動、すなわちグルーミングおよび穴掘り様動作に費やした時間も観察し、定量した。
【０１２１】
社会的相互作用中ではない反復行動：マウスを単独で２０分間にわたり寸法４０Ｘ４０Ｘ２０ｃｍの領域に置き；グルーミングおよび穴掘り様動作について最後の１０分間を定量した。グルーミング行動を観察する一方で、穴掘り様動作を防ぐために、木片チップを含有しない清潔なケージにマウスを入れた。穴掘り様動作行動を観察している間、セルフグルーミングは測定しなかった。
【０１２２】
母性行動学習：４匹のｃ５７ｂｌ母マウスおよび３匹のＢＴＢＲ母マウスに対して、仔マウスを回収し、その仔を巣に戻すまでのそれらの待ち時間について試験した。３匹の仔マウスを使用して各母マウスを試験した。仔マウスが巣の外に置かれた後１８０秒で母マウスが仔マウスを巣に戻さなかった場合、失敗とみなした。数日間にわたり、各母マウスを３匹のバージン雌マウス（学習バージンマウス）と同じケージに入れた。ＢＴＢＲ食塩水およびＣ５７食塩水バージンマウスはＣ５７ｂｌ母マウスおよびその仔マウスと過ごし、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏ雌マウスはＢＴＢＲ雌マウスおよびその仔マウスと過ごした。前に仔マウスと過ごしたことがなかったナイーブバージンマウスの群も試験した（ＢＴＢＲナイーブバージンマウス、ｃ５７ｂｌナイーブバージンマウス）。試験中、全ての雌をケージから取り出し、各試験終了時にマウスをホームケージに戻し、１５分間の再順化時間を与えた。各仔マウスは試験時点で２〜４日齢であった。ＳＡＭＳＵＮＧリンプカメラ（ｌｉｍｐ  ｃａｍｅｒａ）を使用して試験を撮影した。
【０１２３】
Ｔ型水迷路アッセイ：Ｔ型水迷路（ＧｕａｒｉｇｌｉａおよびＣｈａｄｍａｎ，２０１３；ＫａｒｖａｔおよびＫｉｍｃｈｉ，２０１３）は、２２Ｘ３Ｘ１１ｃｍのサイズの３本のアームおよび１１Ｘ３Ｘ１１ｃｍのサイズのセンターゾーンがあるＴ型プレキシガラスチャンバーであった。迷路に１５ｃｍの水深になるように水を満たし、２５＋１℃に維持した。スライド長３ｃｍのプラットフォームを沈めて、最上部が液面の下０．５ｃｍになるようにした。各動物に対して、３日の実験日の各日に１０回試行し、合計３０回試行した。センターゾーンに面する開始アームに動物を置き、プラットフォームを見つけるために９０秒を与えた。動物をプラットフォームに置いたとき、それを５秒間その上に滞在させた。マウスが９０秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合、マウスを穏やかにプラットフォームに導き、マウスをその上に１５秒間滞在させた。試行間の間隔は＞５分であった。第１日および第２日に、プラットフォームを右側のアームに配置し、一方で第３日にそれを逆側の左側のアームに配置し；開始アームは各日同一とした。マウスが１０回のうち８回の試行で成功するまで、反対側の試行を開始させず、その結果、一部のマウスにおいては、学習日を追加し、全部で最大４０回の試行を行った。マウスがプラットフォーム上に立つまで、マウスが水に入る時間からプラットフォームに到達するまでに要する時間量、エラー回数および正しいかまたは正しくない道で曲がる傾向を測定した。
【０１２４】
結果
ＭＳＣ−エキソソームの鼻腔内投与の高効率：ＰＫＨ２６染色エキソソームの静脈内、鼻腔内および定位投与間の比較を行った。補正された総細胞蛍光（ＣＴＣＦ）計算を使用して、異なる投与ストラテジーの効率を推定した（ＭｃＣｌｏｙら、２０１４）。定位注射に対する蛍光定量から、鼻腔内投与エキソソームの６８．５％が脳内で見出され、一方で静脈内エキソソームの１１．２％が脳内で見出されたことが示された（図１）。免疫染色ＤＡＰＩおよびＮｅｕＮから、エキソソームが細胞およびそれらの膜上で見出されたことが示された（図２Ａ−Ｂ）。
【０１２５】
ＭＳＣ−エキソソームは雄から雌への超音波発声を改善した：超音波発声は、雄マウスと雌マウスとの間の交尾コミュニケーション形態であるとみなされる。コミュニケーション欠陥は、自閉症におけるコア症状であり、したがってこのタイプの行動における処置の効果を評価した。雌との相互作用の最初の５分間においてＢＴＢＲ食塩水マウスは３１７音節を発し（ＳＥＭ＝３９．４）、一方でＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、同じ時間中に５７１音節を発し、これは１８０％の増加であり（ＳＥＭ＝７４）、一方でＣ５７ｂｌマウス（対照）は最初の５分間あたり８５４．５音節を発した（ＳＥＭ＝６５．２）。（図３Ａ、ＡＮＯＶＡ１、Ｆ＝１９．２  Ｐ＜０．００１）。雌の生殖器または顔面をスニッフィングするのに費やす時間の有意差はなく、これは、この効果が、超音波発声に特異的に影響を及ぼし、雌のフェロモンへの関心には影響がないと思われることを意味する（図３Ｂ）。質的に、これは、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏ発声がより複雑になり、ＢＴＢＲ食塩水群と比較して長くなるスペクトログラムから見られ得、これによりＣ５７ｂｌとより同等になる（図３Ｃ）。
【０１２６】
ＭＳＣ−エキソソームは、雄と雄との社会的相互作用および社会的相互作用中の反復行動を改善する：ＭＳＣ−ｅｘｏまたは食塩水投与前後に雄と雄との相互作用についてマウスを試験した。対象内分析から、処置後にＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏ群が顕著に改善し、雄ストレンジャーマウスとの社会的接触に費やす時間がより長くなり、一方でＢＴＢＲ食塩水およびＣ５７ｂｌ食塩水群では影響がなかったことが示される（図４Ａ、対応のあるＴ検定。ｔ＜０．０００１）。群の比較分析から、処置前にＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏとＢＴＢＲ食塩水の基本行動との間で差がなく、それらの両方がｃ５７ｂｌ食塩水の基本行動とは有意に異なることが示される（ＡＮＯＶＡ１、Ｆ＝１４．４、ｐ＜０．０１）。処置後、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、ＢＴＢＲ食塩水群とは有意に異なる（ＡＮＯＶＡ１、Ｆ＝９．４４、ｐ＜０．０１）。
【０１２７】
社会的相互作用中の反復行動も測定した。対象内分析から、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏ群が処置後に顕著に改善し、反復行動に費やす時間が短縮し、一方でＢＴＢＲ食塩水およびＣ５７ｂｌ食塩水群は影響がなかったことが示される（図４Ｂ、対応のあるＴ検定。ｔ＜０．００１）。群の比較分析から、処置前にＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏとＢＴＢＲ食塩水の基本行動との間で差がなく、それらの両方がｃ５７ｂｌ食塩水の基本行動とは有意に異なることが示される（ＡＮＯＶＡ１、Ｆ＝１３．７１、ｐ＜０．００１）。処置後、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、ＢＴＢＲ食塩水群およびＣ５７ｂｌ群とは有意に異ならないが、処置前後でＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏからの有意な変化がある。
【０１２８】
ＭＳＣ−エキソソームはセルフグルーミングおよび穴掘り様動作を減少させる：社会的相互作用なしでセルフグルーミングおよび穴掘り様動作も測定した。ＭＳＣ−ｅｘｏまたは食塩水投与前後で雄と雄との相互作用についてマウスを試験した。グルーミング試験において、対象内分析から、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏ群が処置後に有意に改善し、セルフグルーミングに費やす時間が短縮し、一方でＢＴＢＲ食塩水およびＣ５７ｂｌ食塩水群は変化しなかったことが示された（図４Ａ、対応のあるＴ検定。ｔ＜０．０５）。群の比較分析から、処置前にＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏとＢＴＢＲ食塩水の基本行動との間で差がなく、それらの両方がｃ５７ｂｌ食塩水の基本行動とは有意に異なることが示される（ＡＮＯＶＡ１、Ｆ＝１２．４、ｐ＜０．０５）。処置後、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、ＢＴＢＲ食塩水群とは有意に異なる（ＡＮＯＶＡ１、Ｆ＝１３．８３、ｐ＜０．０１）。
【０１２９】
ＭＳＣ−エキソソームは、Ｔ型水迷路において認知の硬さを改善する：Ｔ型水迷路アッセイを使用して、学習行動および認知の硬さを分析した。ｃ５７ｂｌとＢＴＢＲマウスとの間の水泳能力が異なるので、試験におけるそれらの行動は同等ではなく、したがってｃ５７ｂｌマウスを排除した。まとめると、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏ処置マウスは、全部で１０回の試行において逆転学習で誤りが顕著に減少するようになった（図６Ａ）。逆転条件の各試行での成功率を分析することにより、実験用の４匹のＭＳＣ−ｅｘｏ処置マウスが正しく角を曲がることにおいて食塩水群よりも成功率が高かったことが示される（図６Ｂ）。
【０１３０】
ＭＳＣ−ｅｘｏは母性行動学習を改善する：全てのＣ５７ｂｌ母マウスは全ての仔マウス（１２／１２）を平均時間９．９秒で回収して巣に戻した（ＳＥＭ＝１．０８）。Ｃ５７ｂｌナイーブバージンマウスのうち、１８０秒以内に仔マウスを回収して戻したものはなかった。Ｃ５７ｂｌ学習バージンマウス群は、平均時間３８．３秒（ＳＥＭ＝１１．９）で全ての仔マウスを回収して戻した。３匹の試験ＢＴＢＲ母マウスのうち１匹のみが仔マウスを回収したが、１５０秒後、この母マウスは、仔マウスを巣に戻さず、むしろ無作為な場所にそれらを置き；この母マウスの行動は、Ｃ５７ｂｌ母マウスおよび学習バージンマウスと比較して混乱していた。ＢＴＢＲナイーブバージンマウスのうち、１８０秒以内に何れの仔マウスも回収したものはなかった。ＢＴＢＲ学習バージンマウスのうち、Ｃ５７ｂｌ母マウスと数日過ごした後でさえも、仔マウスを回収したものはなかった。ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ＥＸＯは、平均時間５５．７秒（ＳＥＭ＝１２．８）で全ての仔マウスを回収し、興味深いことに、ＢＴＢＲ  ＭＳＣ−ｅｘｏは、仔マウスをそれ自身で回収可能ではなかったＢＴＢＲ母マウスと数日過ごした。
【０１３１】
実施例２
統合失調症を処置するためのＭＳＣ由来エキソソーム
材料および方法
アンフェタミン誘導性の自発運動亢進活動に対する感受性：いくつかの相で実験を行った。第１相において、３０匹のＣ５４／ｂｌマウスを無作為に３つの群に割り当てた；食塩水処置群、ＰＣＰ処置群およびＰＣＰ＋エキソソーム処置群（処置群）。ＰＣＰ群には、１０ｍｇ／ｋｇのＰＣＰの皮下注射を１４日間にわたり毎日行った。同時に、食塩水群には等体積の食塩水注射を行い、エキソソーム群には、ＰＣＰ注射ならびに鼻腔内投与により２μｌのエキソソームを投与した。他の群には、同じ技術を使用して２μｌの食塩水を投与した。注射終了から１週間後、マウスに対して行動試験を行った。
【０１３２】
全群に対して全身性アンフェタミン注射を行い、１２０分間にわたりオープンフィールド試験で監視し、活動性指数について平均５分ごとに測定した。
【０１３３】
潜在抑制。聴覚性驚愕反射を評価することによって、ＰＣＰ処置マウスにおける中枢情報処理過程に対するエキソソームの効果を分析した。各群からの３匹のマウスを前曝露なし（ＮＰＥ）群に割り当て、７匹のマウスを前曝露（ＰＥ）群に割り当てた。ＰＥマウスに３０−ｓの音刺激を５０回提示し（条件刺激−ＣＳ）、一方で、前曝露なし（ＮＰＥ）対象は、刺激提示せずに、同等の時間にわたってチャンバーに閉じ込めた。その後すぐに、ＰＥおよびＮＰＥの両群に対して条件付けを行い、これは、ＣＳと非条件刺激（ＵＳ）との間での３回の対形成（ｔｈｒｅｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）から構成され：音刺激とその直後に０．３ｍＡで設定される１ｓ足刺激を送達する。２４時間後、試験段階を行った。最初の３６０秒の順化後、音ＣＳを送達し、９０秒間継続し、音刺激に対する条件付けすくみの時間を評価した。
【０１３４】
３−チャンバー社会的相互作用における社会的相互作用：３群のマウスを次のように処置した：
１．食塩水群（ｎ＝１９）、
２．ＰＣＰ群（ｎ＝１７）、
３．ＰＣＰ＋エキソソーム（ｎ＝１８）
【０１３５】
結果
アンフェタミン誘導性自発運動亢進活動に対する感受性：アンフェタミン注射後、全てのアンフェタミン処置マウスの自発運動活性が向上し、注射から約４０分後にピークとなった。測定時間全体を通じて、全身性アンフェタミンの効果促進は、ＰＣＰ処置対象において有意により顕著であった。
【０１３６】
図８Ａ〜Ｂおよび１０で例示されるように、ＰＣＰ処置マウス（エキソソーム処置なし）は、食塩水処置陰性対照群よりも活動性が高く、より長い距離を移動し、またエキソソーム処置群よりも活動性が高かった。これは、アンフェタミンにより触発された活動性のピーク後、４０分後に最も明らかであった。
【０１３７】
潜在抑制：試験段階の間に対象間で差は見られなかった（結果は示さない）。条件付け中、食塩水処置群およびエキソソーム処置群の両方が、ＰＥおよびＮＰＥ群におけるそれらのすくみ反応間で有意差を示し、一方で、ＰＣＰ処置群は、ＮＰＥのすくみの有意な増加を示さず（図９）、これにより、ＰＣＰ処置マウスにおけるＬＩ効果の低下およびエキソソーム処置の好ましい効果が示された。
【０１３８】
アンフェタミン誘導性自発運動亢進活動性に対する感受性：全てのアンフェタミン処置マウスの自発運動活性が向上し、注射から４０分後にピークとなった。測定時間の殆どを通じて、全身性アンフェタミンの促進効果は、ＰＣＰ処置対象において有意により顕著であった。図１０で例示されるように、エキソソームの鼻腔内投与を受けた食塩水処置群（群４）は影響を受けなかった（食塩水群（１）とは有意差がなかった。ＰＣＰ処置マウス（群２）は、食塩水処置対照群（群１）よりも、活動性が高く、より長い距離を移動し、またエキソソーム処置群（群３）よりも活動性が高かった。これは、アンフェタミンにより触発された活動性のピーク後、４０分後に最も明らかである。
【０１３９】
３−チャンバー社会的相互作用における社会的相互作用：３−チャンバーの枠組みにおいて、ＰＣＰ処置マウス（ｎ＝１７）は、選好指標により明らかになるように、ストレンジャー馴らしケージ（社会的刺激）よりも、空のケージ（すなわち非社会的刺激）に対する選好性の向上を示した。食塩水処置群（ｎ＝１９）は、マウス馴らしケージに対する選好性を示し、一方でエキソソーム処置マウス（ｎ＝１８）は、社会的刺激に対して最大の選好性を示した（図１１）。
【０１４０】
実施例３
自閉症ＢＴＢＲモデルにおける、骨髄由来ＭＳＣからのエキソソーム対神経幹細胞からのエキソソームの比較
材料および方法
ＮＳＣ由来エキソソーム：神経幹細胞株（ＣＴＸ０Ｅ０３）（ＲｅＮｅｕｒｏｎ）を使用した。
処置群：マウスに対して、１日おきに１日５μｌ（２．５μｌｘ２）で１２日間にわたりＭＳＣ−ｅｘｏ（Ｎ＝５）、ＮＳＣ−ｅｘｏ（Ｎ＝５）または食塩水（Ｎ＝７）の鼻腔内投与（全部でマウスあたり３０μｌ）を行った。
【０１４１】
結果
図１２Ａ〜Ｂで例示されるように、ＭＳＣ由来エキソソームの投与によって、食塩水処置群と比較して、社会的相互作用が向上し、反復行動が減少し、コミュニケーションが増加し、一方で神経幹細胞由来エキソソーム（ＮＳＣ−ｅｘｏ）処置マウスは、食塩水処置群と比較して、同じ行動の相違を示さなかった（ＡＮＯＶＡ１、Ｆ２，ｉ４＝４．２８、ｐ＜０．０５、ボンフェローニ）。
【０１４２】
具体的なその実施形態と組み合わせて本発明を記載してきたが、多くの代替物、改変および変形が当業者にとって明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に入る全てのこのような代替物、改変および変形を包含することが意図される。
【０１４３】
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が本明細書中に具体的および個々に参照により本明細書中に組み込まれることが示される場合と同程度に、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み込まれる。さらに、本願における何らかの参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを受け入れるものと解釈すべきではない。セクションの表題が使用される範囲まで、それらが必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月17日(2019.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経発達障害の処置での使用のための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の粒子を含む、医薬組成物。
【請求項２】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の処置での使用のための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の粒子を含む、医薬組成物。
【請求項３】
鼻腔内投与を介した脳卒中の処置での使用のための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の粒子を含む、医薬組成物。
【請求項４】
前記神経発達障害が統合失調症である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記神経発達障害が注意欠陥多動性障害である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記神経発達障害が強迫性障害である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
鼻腔内投与を介した使用のための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記粒子が、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソームおよびエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）からなる群から選択され；好ましくは前記粒子がエキソソームである、請求項１、２または３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記粒子が微粒子である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記間葉系幹細胞が歯髄由来である、請求項１〜９の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞が骨髄由来である、請求項１〜９の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記間葉系幹細胞が脂肪組織由来である、請求項１〜９の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＭＳＣがヒトＭＳＣである、請求項１〜１２の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＭＳＣが同種である、請求項１〜１３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＭＳＣが非同種である、請求項１〜１３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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