(57)【要約】  本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去する方法に関する。本発明はまた、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製する方法に関する。本発明はさらに、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定する方法に関する。さらに、本発明は、個体における疾患を診断する方法に関する。さらに、本発明は、本発明の方法の実施に有用なキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去する方法であって、
（ｉ）該全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）該吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの該流体を回収して、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製する方法であって、
（ｉ）該全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）該吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの該流体を回収し、それにより長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するステップと、を含む、方法。
【請求項３】
前記親水性ポリマー材料が、６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下の密度を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記親水性ポリマー材料が綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択され、好ましくは、
（ｉ）該多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）該ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレンおよびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または、
（ｉｉｉ）該ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉｖ）１つまたは複数の分離技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を単離するステップをさらに含み、
好ましくは、該１つまたは複数の分離技術が、遠心分離、蒸発／再構成、濃縮、沈殿、液体／液体抽出、および固相抽出からなる群から選択される、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定する方法であって、
（ｉ）請求項２から５のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項７】
前記適切な技術が、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）前記全血サンプルが個体由来である、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップと、
（ｉｉｉ）該レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｖ）該個体が該比較に基づいて該疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
【請求項９】
前記適切な技術が、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）前記全血サンプルが個体由来である、請求項６または７に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）前記レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）該個体が該比較に基づいて該疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の参照レベルが、
１または複数の健康な被験者、
疾患に罹患している１または複数の被験者、および／または、
別の疾患に罹患している１または複数の被験者のうちの１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するための親水性ポリマー材料の使用。
【請求項１３】
全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するための親水性ポリマー材料の使用。
【請求項１４】
前記親水性ポリマー材料が６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下の密度を有する、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記親水性ポリマー材料が、綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択され、好ましくは、
（ｉ）前記多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレンおよびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
疾患を診断または鑑別診断するための、請求項６または７に記載の方法の使用。
【請求項１７】
（ｉ）親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを含むキット。
【請求項１８】
全血サンプルを採取するのに有用である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
（ｉ）親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブに吸収された全血を再構成するための流体を含むキット。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法の実施に有用である、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去する方法に関する。本発明はまた、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製する方法に関する。本発明はさらに、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定する方法に関する。さらに、本発明は、個体における疾患を診断する方法に関する。さらに、本発明は、本発明の方法の実施に有用なキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
全血サンプルは、例えば、患者が特異的疾患に罹患しているか否かを判定するために分子生物学的分析で使用されている。これらのサンプルは、多くの場合、凍結するための全血をサンプリングし、次いで、その後凍結血液を処理することにより回収される。凍結血液は、少なくともサンプルサイズとして２００μｌを要する。全血の凍結輸送および処理には高コストが伴う。
【０００３】
したがって、血液スポット技術を使用する全血サンプルの回収が好ましい。血液スポット技術では、より少量のサンプル量のみを要し、典型的にはヒトにおいて４５〜６０μｌであるが、進化している分析技術では、１０〜１５μｌのヒト血液、およびより少量のヒト血液を使用するサンプルを使用する。サンプリングが完了すると、血液スポットは空気中で乾燥された後、処理のため、研究所に移送または郵送される。血液は乾燥されているので、危険性があるとは考えられない。したがって、取扱いまたは出荷において特別な使用上の注意を払う必要はない。分析場所に入ると、所望の成分、例えばタンパク質または代謝産物が乾燥血液スポットから上澄みに抽出され、次いで上澄みが、例えば液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析によってさらに分析される。
【０００４】
今日、全血に含まれているバイオマーカーは、疾患の早期診断、リスク層別化および治療管理に重要な役割を担っている。特に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、全血で確認されているバイオマーカーである。ｍｉＲＮＡは、広範囲の生物学的プロセス、例えば、増殖、分化、アポトーシス、ストレス応答および腫瘍形成などにおいて、細胞が複雑な遺伝子発現カスケードを微調整することができるようにする調節エレメントの群を表す。ｍｉＲＮＡは血液中に遊離循環核酸として、また血液細胞中に存在する。これは、ｍｉＲＮＡが血液細胞中で、またはｍｉＲＮＡを循環血液中に放出する種々の組織中で発現されるという事実による。
【０００５】
現在、血液は、ｍｉＲＮＡなどの血液中に含まれるＲＮＡバイオマーカーを決定するために、ＰａｘＧｅｎｅ血液ＲＮＡチューブを使用して回収されている。血液中に含まれているｍｉＲＮＡなどのＲＮＡバイオマーカーを精製および単離するためには、機器に基づく大きな分析努力が必要である。さらに、この技術は非常に時間がかかり、高価である。
【０００６】
したがって、上記の欠陥および困難性の１つまたは複数を低減または排除する血液調製の改良方法が必要とされている。
【０００７】
本発明の発明者らは、全血サンプルに由来するＲＮＡ画分の複雑性の低減のためには、血液スポット技術が有用であることを初めて評価した。特に、本発明の発明者らは、全血サンプル由来の長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分の除去、または全血サンプル由来の長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分（ｍｉＲＮＡを含む）の精製に血液スポット技術が有益であることを見出した。精製および／または単離されたＲＮＡ画分はＲＮＡ分子を含む。本発明の発明者らはさらに、こうした精製および／または単離されたＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ分子の発現プロファイルが決定され得ること、また、前記発現プロファイルが高品質のものであることを見出した。さらに、本発明の発明者らは、血液スポット技術が異なる環境条件（例えば、温度および／または湿度）下でサンプル安定性を提供し、技術的安定性を提供し、疾患に罹患している個体の診断または鑑別診断ができることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０６７５２０  Ａ１号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３１１６５９７  Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：  （ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，  Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｈ．Ｇ．Ｗ，  Ｎａｇｅｌ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｋｏｌｂｌ，  Ｈ．  ｅｄｓ．  （１９９５），  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去する方法であって、
（ｉ）全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）（前記全血を再構成させるために）吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの流体を回収して、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するステップと、を含む、方法に関する。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製する方法であって、
（ｉ）全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）（全血を再構成させるために）吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの流体を回収し、それにより長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するステップと、を含む、方法に関する。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定する方法であって、
（ｉ）第２の態様の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）全血サンプルが個体由来である、第２の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｖ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法に関する。
【００１４】
あるいは、前記第４の態様は、以下の方法のようにして明確化することができる：個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）全血サンプルが個体由来である、第３の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）前記レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
【００１５】
第５の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するための親水性ポリマー材料の使用に関する。
【００１６】
第６の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するための親水性ポリマー材料の使用に関する。
【００１７】
第７の態様において、本発明は、疾患を診断または鑑別診断するための、第３の態様に記載の方法の使用に関する。
【００１８】
第８の態様において、本発明は、
（ｉ）親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを含むキットに関する。
【００１９】
第９の態様において、本発明は、
（ｉ）親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブに吸収された全血を再構成するための流体を含むキットに関する。
【００２０】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明のすべての特徴について記載しているものではない。他の実施形態は、次の詳細な説明の概要から明らかになるであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
定義
本発明を以下において詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されるものではなく、変更することができることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。特段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２２】
本明細書に使用される用語は、好ましくは、非特許文献１に記載されているように定義される。
【００２３】
いくつかの文献が本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書に引用されている各文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号配列提出物等を含む）は、上記または下記にかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明が先行発明によるそのような開示よりも先行する権利が付与されないことを認めるものと解釈されるものではない。そのように組み込まれた参考文献の定義または教示と、本明細書に挙げた定義または教示の間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先される。
【００２４】
本発明による用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載された要素または要素の群の包含を意味するが、他の要素または要素の群を排除することを意味するものではない。本明細書に記載の「〜から本質的になる」という用語は、記載した要素または要素の群を包含するが、記載した要素に実質的に影響を及ぼすか変更する改変または他の要素を排除することを意味する。本発明に記載の「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」などの変化形は、記載した要素または要素の群を包含し、他の任意の要素または要素の群を排除することを意味する。
【００２５】
本発明を説明している文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに類似の言及は、本明細書で特段の指示のない限り、または文脈によって明白に否定されない限り、単数および複数の両方を網羅すると解釈するものとする。
【００２６】
用語「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）などの核酸のモノマーまたはサブユニットとして機能する有機分子を意味する。核酸のビルディングブロックのヌクレオチドは、窒素塩基、５炭素糖（リボースまたはデオキシリボース）、および少なくとも１つのリン酸基から構成されている。したがって、ヌクレオシドとリン酸基はヌクレオチドを生じる。
【００２７】
用語「長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分」は、本明細書で使用する場合、大きなＲＮＡ分子、すなわち長さが２００ヌクレオチド以上の１つまたは複数のＲＮＡ分子を含むＲＮＡ部分を意味する。１つまたは複数のＲＮＡ分子は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子を包含する。ｒＲＮＡは、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡおよびリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡからなる群から選択される。
【００２８】
本発明の文脈において、用語「リボソームリボ核酸（略称ｒＲＮＡ）」は、リボソームのＲＮＡ成分を意味し、すべての生物におけるタンパク質合成に必須である。これはリボソーム内の主要物質を構成し、約６０重量％のｒＲＮＡおよび４０重量％のタンパク質である。リボソームは、２つの主要なｒＲＮＡおよび５０以上のタンパク質を含む。リボソームＲＮＡは、２つのサブユニット、大サブユニット（ＬＳＵ）および小サブユニット（ＳＳＵ）を形成する。大サブユニットはリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡを包含し、小サブユニットはリボソーム１８Ｓ  ＲＮＡを包含する。
【００２９】
用語「長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分」は、本明細書で使用される場合、短鎖ＲＮＡ分子、すなわち長さが２００ヌクレオチド未満の長さを有する１つまたは複数のＲＮＡ分子を含むＲＮＡ部分を意味する。この１つまたは複数のＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択することができる。
【００３０】
用語「マイクロＲＮＡ（略称ｍｉＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであって４０ヌクレオチド以下の長さを有する一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。このヌクレオチドは互いに共有結合されている。例えば、一本鎖ＲＮＡ分子は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドの長さを有する。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を制御し、また転写されるそれらのＤＮＡの遺伝子によりコードされているが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されない（すなわち、ｍｉＲＮＡは非コードＲＮＡである）。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡ分子よりも長い。ｍｉＲＮＡは、まず、ｃａｐおよびｐｏｌｙ−Ａテールを有する一次転写物またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして転写され、細胞核内のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる短い７０ヌクレオチドステム・ループ構造にプロセシングされる。このプロセシングは、ヌクレアーゼＤｒｏｓｈａおよび二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質Ｐａｓｈａからなるマイクロプロセッサ複合体として知られるタンパク質複合体によって動物において実施されている。次いで、これらのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒとの相互作用によって細胞質内の成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、またＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成も開始する。Ｄｉｃｅｒがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム・ループを切断した場合、２つの相補的なショートＲＮＡ分子が形成されるが、１つだけがＲＩＳＣに組み込まれる。この鎖はガイド鎖として知られており、５’末端の安定性に基づき、ＲＩＳＣ中の触媒的に活性なＲＮａｓｅであるアルゴノートタンパク質によって選択される。ｍｉＲＮＡ＊、アンチガイド（アンチ鎖）、またはパッセンジャー鎖として知られている残りの鎖は、ＲＩＳＣ基質として分解される。したがって、ｍｉＲＮＡ＊は、「正常な」ｍｉＲＮＡのような同じヘアピン構造に由来する。そのため、「正常」ｍｉＲＮＡが後で「成熟ｍｉＲＮＡ」または「ガイド鎖」と呼ばれる場合、ｍｉＲＮＡ＊は「アンチガイド鎖」または「パッセンジャー鎖」である。
【００３１】
用語「トランスファーＲＮＡ（略称ｔＲＮＡ）」は、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡとタンパク質のアミノ酸配列との間の物理的結合として機能する、典型的には長さが７６〜９０ヌクレオチドのＲＮＡからなるアダプター分子を意味する。これは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中の３ヌクレオチド配列（コドン）によって指示されたとおり、細胞のタンパク質合成機構（リボソーム）にアミノ酸を運ぶことによって行われる。このように、ｔＲＮＡは、遺伝子コードによる新しいタンパク質の生物学的合成である翻訳の必須成分である。
【００３２】
用語「低分子干渉ＲＮＡ（略称ｓｉＲＮＡ）」は、本明細書で使用される場合、長さが２０〜２５塩基対である二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを意味する。ｓｉＲＮＡは多くの役割を果たすが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路において最も顕著であり、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨げる。ｓｉＲＮＡは、転写後にｍＲＮＡが分解するように機能し、その結果、翻訳は起こらない。
【００３３】
用語「ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）（略称ｐｉＲＮＡ）」は、本明細書で使用される場合、動物細胞において発現される非コードＲＮＡ小分子の最も大きなクラスを意味する。ｐｉＲＮＡは、ｐｉｗｉタンパク質との相互作用を介して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。これらのｐｉＲＮＡ複合体は、生殖細胞系、特に精子形成系のレトロトランスポゾンおよび他の遺伝子エレメントのエピジェネティックおよび転写後遺伝子サイレンシングの両方に関連している。ｐｉＲＮＡ複合体は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、サイズ（２１〜２４ｎｔではなく２６〜３１ｎｔ）、配列保存の欠如、および複雑性の増加の点で異なる。
【００３４】
用語「核小体低分子ＲＮＡ（略称ｓｎｏＲＮＡ）」は、本明細書で使用される場合、主として、他のＲＮＡ、主にリボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡおよび核小体低分子ＲＮＡの化学修飾を誘導するＲＮＡ低分子のクラスを意味する。ｓｎｏＲＮＡの２つの主たるクラスには、メチル化に関連するＣ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、およびシュードウリジル化に関連するＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡがある。ｓｎｏＲＮＡは、一般にガイドＲＮＡと呼ばれているが、トリパノソーマにおけるＲＮＡ編集を指示するガイドＲＮＡと混同すべきではない。
【００３５】
用語「全血」は、本明細書で使用される場合、非分画血液を意味する。したがって、全血はすべての血液成分を含む。全血は、無細胞液（血漿または血清）および複数の血液細胞型の混合物からなる。主要な３つの血液細胞型は、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、および血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ、ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）である。それぞれの型は、血液中の全ＲＮＡに対し異なる量のＲＮＡを付与する。
【００３６】
用語「赤血球（ＲＢＣ）」および「赤血球」は、本明細書で使用される場合、血液量の４４％を構成する、全血中で最も多量な細胞を意味する。成熟ＲＢＣは、成熟中に核およびオルガネラを喪失するため、全血液ＲＮＡプールにいかなるＲＮＡも提供しない。しかし、網状赤血球としても知られている未成熟ＲＢＣは、いくらかの残存核酸を保持している可能性がある。網状赤血球はＲＢＣ集団の約１％を構成するので、網状赤血球由来の残存ＲＮＡは全血液ＲＮＡプール中の７０％以下のＲＮＡを提供する。
【００３７】
用語「白血球（ＷＢＣ）」および「白血球」は、本明細書で使用される場合、身体の免疫機能を果たす有核血液細胞を意味する。白血球は、血液中で最も転写的に活性な細胞である。白血球は、顆粒球、リンパ球および単球からなる。顆粒球はさらに、好中球、好塩基球および好酸球に分けることができる。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に分けることができる。各白血球サブタイプの細胞数は、炎症および白血病などの疾患状態の間に有意に変化する。
【００３８】
用語「血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）」および「血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）」は、本明細書で使用される場合、血液凝固において主要な役割を果たす血液細胞を意味する。血小板は、巨核球と呼ばれる骨髄大型細胞が細分化することによって血液循環に入る。赤血球と同様に、血小板には核およびオルガネラが存在しない。網状血小板と呼ばれる未成熟血小板は、巨核球由来の残存ＲＮＡを含む。血小板数の４．５％以下は網状血小板であり得る。したがって、血小板ＲＮＡもまた全ＲＮＡ血液プールに寄与する。
【００３９】
用語「血漿」は、本明細書で使用される場合、懸濁液の全血中の血球を通常保持する血液の淡黄色液体成分を意味する。血漿は血液細胞の細胞間マトリックスになっている。血漿は、約９２％の水、７％の生体タンパク質、例えばアルブミン、ガンマグロブリン、抗血友病因子、および他の凝固因子と、１％の無機塩、糖、脂質、ホルモンおよびビタミンから構成される流体である。
【００４０】
用語「血清」は、本明細書で使用される場合、血液細胞でもなく（血清は白血球または赤血球を含まない）、凝固因子でもない血液成分を意味する。血清はフィブリノーゲンを含まない血漿である。血清は、血液凝固（凝血）に使用されないすべてのタンパク質、ならびにすべての電解質、抗体、抗原、ホルモンおよび任意の外因性物質（例えば、薬物および微生物）を含む。
【００４１】
用語「全血サンプル」は、本明細書で使用する場合、もはや個体の身体の一部ではない血液物質を意味する。個体から血液を採取することによって全血サンプルを提供することができるが、以前に単離された血液物質を用いて提供することもできる。全血サンプルは、従来の採血技術を使用して個体から採取することができる。例えば、全血は、針を使用して個体の腕の静脈から、または指先穿刺によって採取することができる。したがって、全血サンプルは、血液滴の形態を有する。前記血液滴は、個体上にあってもよく、例えば個体の指先上にあってもよい。また全血サンプルは、採血管に、例えば毛細管、またはピペットチップ中に含まれていてもよい。
【００４２】
用語「血液スポット」は、１つまたは複数の血液滴を含む濾紙を意味する。通常、１つまたは複数の血液滴を含む濾紙は、サンプリング後に乾燥される。本発明者らは、親水性ポリマー材料を使用して血液滴を吸収させた。
【００４３】
用語「血液スポット技術」という用語は、血液サンプルが濾紙上に吸い取られるバイオサンプリングの形態を意味する。生体サンプル採取後、血液を含む濾紙を好ましくは乾燥させる。乾燥させたサンプルは、分析実験室に容易に輸送され、ＲＮＡ発現分析などの様々な方法を用いて分析される。特に、血液スポット標本は、指、踵またはつま先からランセットによって抜き取られた数滴の血液を吸収性濾紙上に適用することによって回収される。血液を濾紙に十分に染み込ませ、好ましくは風乾させる。標本は、乾燥剤を入れた低ガス透過性プラスチックバッグに保管して湿気を低減させることができ、熱帯地方でも周囲温度に保つことができる。実験室に入ると、技術者は、さらなる分析のため、自動型または手動型の穴あけパンチを使用して、染み込ませた濾紙の小さなディスクをシートから離すことができる。ペーパーディスクをパンチングする代わりに、最近の自動化ソリューションでは、パンチングすることなく、フィルターを通して溶離液をフラッシングすることによってサンプルを抽出することができる。本発明者らは、その上に血液を染み込ませ／適用させる親水性ポリマー材料を使用した。
【００４４】
用語「個体」は、本明細書中で使用される場合、全血サンプルを採取、取得、または単離することができる任意の対象（被験者）を意味する。
【００４５】
さらに、「個体」という用語は、本明細書で使用される場合、女性または男性が疾患に罹患しているか否かを知ることが望まれる任意の対象を意味する。特に、用語「個体」は、本明細書で使用される場合、疾患に罹患していることが疑われる対象を意味する。個体は、疾患に罹患している、すなわち病気にかかっていると診断されるか、または疾患に罹患していない、すなわち健康であると診断される。用語「個体」はまた、本明細書で使用される場合、疾患に罹患している対象、すなわち病気にかかっている対象も意味する。患者は、疾患に関して再検査されてもよく、疾患に依然として罹患している、すなわち病気にかかっていると診断することができ、または、今は疾患に罹患していない、すなわち、例えば治療的介入後に健康であると診断することができる。健康であると診断された患者、すなわち疾患に罹患していない患者は、試験されていない／未知の別の疾患に罹患している可能性があることに留意されたい。疾患は、肺がんであり得る。女性または男性が疾患に罹患しているか否かを知ることが望まれる個体はまた、患者と呼ぶこともできる。
【００４６】
個体は、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を含めた哺乳動物であってもよく、例えばげっ歯動物、ウサギまたはサルなどの動物である。げっ歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはチンチラであってもよい。
【００４７】
用語「（コントロール）対象」という用語は、本明細書で使用する場合、疾患に罹患している、すなわち病気にかかっていることが知られている対象（陽性コントロール）を意味する。用語「（コントロール）対象」はまた、本明細書で使用される場合、疾患に罹患していないことが判明している対象（陰性コントロール）、すなわち健康である対象も意味する。したがって、用語「健康な対象」は、本明細書で使用される場合、疾患に罹患していないことが判明している対象を意味する。健康であることが判明している、すなわち試験された／既知の疾患に罹患していない（コントロール）対象は、試験されていない／未知の別の疾患に罹患している可能性があることに留意されたい。疾患は肺がんであり得る。
【００４８】
（コントロール）対象は、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を含めた哺乳動物であってもよく、例えばげっ歯動物、ウサギまたはサルなどの動物である。げっ歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはチンチラであってもよい。
【００４９】
用語「疾患を診断する」は、本明細書で使用される場合、個体がその疾患の兆候を示すか、または罹患しているか否かを判定することを意味する。好ましくは、疾患は肺がんである。
【００５０】
用語「疾患を鑑別診断する」は、本明細書で使用される場合、個体が疾患の徴候を示すか、疾患に罹患しているか、または別の疾患の徴候を示すか、もしくは罹患しているか否かを判定することを意味する。好ましくは、疾患は肺がんである。他の疾患は、肺がん以外の疾患である。「疾患を鑑別診断する」はまた、本発明の文脈において使用される場合、別々に治療された疾患を互いに区別することを可能にする。例えば、疾患は、アジュバント処置された疾患、例えば、アジュバント処置された肺がんであり、他の疾患は、緩和処置された疾患、例えば、緩和処置された肺がんであってもよいし、あるいは、疾患は緩和処置された疾患、例えば、緩和処置された肺がんであってもよく、他の疾患は、アジュバント処置された疾患、例えばアジュバント処置された肺がんであってもよい。
【００５１】
用語「処置」、特に「治療的処置」は、本明細書で使用される場合、個体の健康状態を改善し、および／または個体の寿命を延長する（増加させる）任意の療法を意味する。前記治療は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止または遅延させ、個体における疾患の発症を阻害または遅延させ、個体における症状の頻度または重症度を低減し、および／または現在疾患に罹患しているか以前に疾患に罹患していた個体における再発を低減する。治療的処置は、肺がんの治療であり得る。肺がんの治療的処置は、化学療法、手術、放射線療法、アジュバント療法、および緩和療法からなる群から選択される。
【００５２】
用語「吸収性プローブ」は、本明細書で使用される場合、全血サンプル中に含まれる全血を吸収することができる任意のプローブを意味する。本明細書で使用される吸収性プローブは、親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００５３】
用語「親水性ポリマー材料」は、本明細書で使用される場合、全血サンプル中に含まれる全血を吸収することができる任意の材料を意味する。用語「親水性ポリマー材料」は、本明細書で使用される場合、極性官能基または荷電官能基を含み、材料を水中で可溶性にするポリマー材料をさらに意味する。親水性ポリマー材料は、親水性ポリマーを含む。親水性ポリマーは、２種以上の親水性モノマーから生産される。用語「親水性ポリマー材料」は、本明細書で使用される場合、例えばポリエチレンなどの本来親水性ではないが、親水性が付与されたポリマー材料も包含する。ポリマー材料が当初親水性でない場合、材料を親水性状態に変換する多くの方法が存在する。親水性表面を生成する方法としては、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−４０またはＴｗｅｅｎ−８０による吸着処理が挙げられ、親水性表面が生成される。また処理は、親水性エレメントおよび疎水性エレメントの両方を含有する他の分子によっても生じる。疎水性エレメントは疎水性ポリマー材料と強く相互作用し、親水性エレメントを露出させて親水性表面を生成する。さらに、プラズマによる処理（コロナ、空気、火炎、または化学薬品）は、酸素プラズマ処理を含めた、そのような材料の表面に極性基を加える別の周知の方法である。同様に、表面への親水性ポリマーのグラフト化、および極性または親水性分子、例えば糖などによる表面上の活性基の化学的官能化を使用し、高分子材料上に親水性表面を達成することができる。また共有結合修飾を使用して、ポリマー材料の表面に極性官能基または親水性官能基を付加することができる。
【００５４】
親水性ポリマー材料は、セルロース含有材料、例えば、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステル、またはそれらの改変物からなる群から選択することができる。多糖類はセルロースであってよく、ポリオレフィンは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレンおよびポリメチルペンテンからなる群から選択することができ、ポリエステルは、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタラートからなる群から選択することができる。親水性ポリマー材料としての綿、セルロースおよびポリエチレンが特に好ましい。
【００５５】
親水性ポリマー材料を含むデバイス／プローブの例としては、限定するものではないが、Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ（ｎｅｏｔｅｒｙｘ社製、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、米国）、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＨＦ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＳＥ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＴＮＦ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）、およびＴＮＦ−Ｄｉ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）が挙げられる。
【００５６】
用語「レベル」は、本明細書で使用される場合、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子の量（例えば、グラム、モル、またはイオン数で測定した場合）または濃度（例えば、絶対濃度または相対濃度）を意味する。用語「レベル」は、本明細書で使用される場合、スケール化された、正規化された、またはスケール化され正規化された量または値も含む。一実施形態において、レベルは、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子の発現レベルである。前記発現レベルは、（相対）ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）濃度、（相対）ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）量、または（相対）ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）消光単位、例えば相対蛍光単位などとして示すことができる。
【００５７】
本発明の文脈において、用語「パーツのキット（略称キット）」は、本明細書で特定した少なくともいくつかの構成材料の任意の組合せであり、それらの構成材料が空間的に共存して機能的ユニットに組み合わされており、またさらなる構成材料を含むことができるものと理解されたい。
【００５８】
発明の実施形態
本発明をここでさらに説明する。以下の節において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様は、明らかに反対の指示のない限り、他の任意の態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい、または有利であると示した任意の特徴は、明らかに反対の指示のない限り、好ましい、または有利であると示した任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
【００５９】
本発明者らは、血液スポット技術が全血サンプルの複雑性を低減するために有用であることを初めて評価した。特に、本発明の発明者らは、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するため、または全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分（ｍｉＲＮＡを含める）を精製するために、血液スポット技術が有用であることを見出した。精製および／または単離されたＲＮＡ画分は、ＲＮＡ分子を含む。さらに本発明の発明者らは、そのような精製および／または単離されたＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ分子の発現プロファイルを決定することができること、また前記発現プロファイルが高品質であることを見出した。さらに、本発明者らは、血液スポット技術が、異なる環境条件（例えば、温度および／または湿度）下においてサンプルの安定性を提供し、技術的安定性を提供し、疾患に罹患している個体の診断または鑑別診断を可能にすることを見出した。
【００６０】
したがって、第１の態様において、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去する方法であって、
（ｉ）全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）（全血を再構成させるために）吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの流体を回収し、それにより長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するステップと、を含む、方法に関する。
【００６１】
ステップ（ｉ）において、全血サンプル中の全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、吸収性プローブが提供される。それにより、全血に含まれている長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子が親水性ポリマー材料に吸収される。
【００６２】
ステップ（ｉ）において提供される吸収性プローブは、全血サンプルと（物理的に）接触させる、親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブを配置し、それにより親水性ポリマー材料に全血を吸収させることによって得ることができる。
【００６３】
吸収性プローブと全血サンプルとの（物理的な）接触は、吸収性プローブを全血サンプルに液浸または浸漬することによって達成することができる。全血サンプルは、血液滴の形態を取ることができる。全血も血液採取チューブに含まれていてもよい。あるいは、全血サンプルの１滴または複数の液滴は、例えばピペットを介して吸収性プローブに適用することができる。（物理的な）接触によって、全血は、全血中に含まれている長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子と共に、親水性ポリマー材料中に／親水性ポリマー材料に浸漬される。
【００６４】
通常、プローブと全血サンプルとの（物理的）接触は、１〜２０秒、好ましくは１〜１０秒、より好ましくは１〜５秒、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０秒維持することで十分である。接触時間は、できるだけ短いことが望ましい。プローブは、その時間中に所定量の血液を吸収し、飽和されると、それ以上の血液は吸収しない。プローブのサイズおよび形状は、吸収された血液の体積および吸収速度を調節するために変更することができる。１〜５０μＬ、好ましくは５〜２５μＬ、さらにより好ましくは１０〜２０μＬの血液容量、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０μｌの容量が適切であると考えられる。
【００６５】
ステップ（ｉｉ）において、吸収性プローブは流体と接触させる。流体は、液体であっても気体であってもよい。好ましくは、流体は、カオトロピック流体、例えばカオトロピック液体または気体である。より好ましくは、カオトロピック流体は、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、アルカリチオシアネート、アルカリイソチオシアネート、アルカリヨウ化物およびアルカリ過塩素酸塩からなる群から選択される。さらに好ましくは、カオトロピック流体はチオシアン酸グアニジニウムである。あるいは、カオトロピック流体、例えばカオトロピック液体または気体は、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、アルカリチオシアネート、アルカリイソチオシアネート、アルカリヨウ化物およびアルカリ過塩素酸塩を含み得る。好ましくは、カオトロピック流体は、グアニジニウムチオシアネートを含む。
【００６６】
吸収性プローブと流体との接触は、吸収性プローブを流体に液浸または浸漬することによって達成することができる。これは手動により、または流体取扱いロボットにより行うことができる。ステップ（ｉｉ）によって全血を再構成させることができる。物理的撹拌技術、例えば、流体および／または吸収性プローブの超音波処理、混合、またはボルテックスなどは、再構成プロセスを加速することができる。特に、ステップ（ｉｉ）は、全血中に含まれる分子を相互に分離させることができる。いくつかの分子は親水性ポリマー材料から除去することができ、他の分子は除去することができない。これらの分子は、親水性ポリマー材料に吸収されたままである。本発明の発明者らは、驚いたことに、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子は親水性ポリマー材料に吸収されたままで、流体に入り込まないが、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子は、ステップ（ｉｉ）の流体によって親水性ポリマー材料から抽出されることを見出した。
【００６７】
ステップ（ｉｉｉ）において、流体はステップ（ｉｉ）から回収される。このプロセスにより、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分は除去される。この点に関し、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分の除去は、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分が完全に除去されることを必ずしも意味するものではないことに留意されたい。また本発明は、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子の少なくとも一部が除去される実施形態を網羅している。例えば、いくつかの実施形態において、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が除去される。長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子の少なくとも９０％が除去されることが好ましい。長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子の少なくとも９５％が除去されることがより好ましい。長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子の少なくとも９８％または９９％が除去されることがさらにより好ましい。２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子の１００％、すなわち、２００ヌクレオチド以上のすべてのＲＮＡ分子が除去されることが最も好ましい。
【００６８】
ステップ（ｉｉ）からの流体の回収は、吸収性プローブを流体から除去することによって達成することができる。
【００６９】
好ましくは、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分は、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡおよびリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む。
【００７０】
第２の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製する方法であって、
（ｉ）全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）（前記全血を再構成させるために）吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの流体を回収し、それにより長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するステップと、を含む、方法に関する。
【００７１】
ステップ（ｉ）において、全血サンプル中の全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、吸収性プローブが提供される。それにより、全血に含まれている長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子が親水性ポリマー材料に吸収される。
【００７２】
ステップ（ｉ）において提供される吸収性プローブは、全血サンプルとの（物理的な）接触に、親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブを配置し、それにより親水性ポリマー材料に全血を吸収させることによって得ることができる。
【００７３】
吸収性プローブと全血サンプルとの（物理的な）接触は、吸収性プローブを全血サンプルに液浸または浸漬することによって達成することができる。全血サンプルは、血液滴の形態を取ることができる。全血も血液採取チューブに含まれていてもよい。あるいは、全血サンプルの１滴または複数の液滴は、例えばピペットを介して吸収性プローブに適用することができる。（物理的な）接触によって、全血は、全血中に含まれている長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子と共に、親水性ポリマー材料中に／親水性ポリマー材料に浸漬される。
【００７４】
通常、プローブと全血サンプルとの（物理的）接触は、１〜２０秒、好ましくは１〜１０秒、より好ましくは１〜５秒、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０秒維持することで十分である。接触時間は、できるだけ短いことが望ましい。プローブは、その時間中に所定量の血液を吸収し、飽和されると、それ以上の血液は吸収しない。プローブのサイズおよび形状は、吸収された血液の体積および吸収速度を調節するために変更することができる。１〜５０μＬ、好ましくは５〜２５μＬ、さらにより好ましくは１０〜２０μＬの血液容量、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０μｌの容量が適切であると考えられる。
【００７５】
ステップ（ｉｉ）において、吸収性プローブは流体と接触させる。流体は、液体であっても気体であってもよい。好ましくは、流体は、カオトロピック流体、例えばカオトロピック液体または気体である。より好ましくは、カオトロピック流体は、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、アルカリチオシアネート、アルカリイソチオシアネート、アルカリヨウ化物およびアルカリ過塩素酸塩からなる群から選択される。さらに好ましくは、カオトロピック流体はチオシアン酸グアニジニウムである。あるいは、カオトロピック流体、例えばカオトロピック液体または気体は、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、アルカリチオシアネート、アルカリイソチオシアネート、アルカリヨウ化物およびアルカリ過塩素酸塩を含み得る。好ましくは、カオトロピック流体は、グアニジニウムチオシアネートを含む。
【００７６】
吸収性プローブと流体との接触は、吸収性プローブを流体に液浸または浸漬することによって達成することができる。これは手動により、または流体取扱いロボットにより行うことができる。ステップ（ｉｉ）によって全血を再構成させることができる。物理的撹拌技術、例えば、流体および／または吸収性プローブの超音波処理、またはボルテックスなどは、再構成プロセスを加速することができる。特に、ステップ（ｉｉ）は、全血中に含まれる分子を相互に分離させることができる。いくつかの分子は親水性ポリマー材料から除去することができ、他の分子は除去することができない。これらの分子は、親水性ポリマー材料に吸収されたままである。本発明の発明者ら、驚いたことに、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子は親水性ポリマー材料に吸収されたままでで、流体には入り込まないが、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子はステップ（ｉｉ）において流体により親水性ポリマー材料から抽出されることを見出した。
【００７７】
ステップ（ｉｉｉ）において、流体はステップ（ｉｉ）から回収される。このプロセスにより、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分が精製される。それは特に再構成された血液サンプルの水性相から精製される。好ましくは、長さが２００ヌクレオチド未満の精製ＲＮＡ画分は、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは、少なくとも９０％、例えば少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９％、または１００％の純度を有する。
【００７８】
ステップ（ｉｉ）からの流体の回収は、吸収性プローブを流体から除去することによって達成することができる。
【００７９】
好ましくは、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む。
【００８０】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、２０時間以下、好ましくは５時間以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９分、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間以下、流体と接触させる。より好ましくは、吸収性プローブは１分〜２０時間、さらに好ましくは、１分〜５時間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９分、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間、流体と接触させる。
【００８１】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３、例えば０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５または６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、０．５〜６ｇ／ｃｍ３、さらにより好ましくは１〜４ｇ／ｃｍ３、例えば０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５または６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
【００８２】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は多孔質である。
【００８３】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、材料の全体積の２０〜７０％、好ましくは３０〜５０％、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０％の細孔容積を有する。
【００８４】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、直径または最大断面寸法で１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍ以下の細孔を含む。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、直径または最大断面寸法で１０〜１００μｍ、さらにより好ましくは２０〜５０μｍ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍの細孔を含む。
【００８５】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、セルロース含有材料、例えば綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択される。好ましくは、
（ｉ）多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される。
【００８６】
より好ましくは、親水性ポリマー材料は、綿、セルロースまたはポリエチレンである。
【００８７】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、１〜５０μｌ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μｌの全血の所定の最大容量を吸収した。
【００８８】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、１０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下、例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｍ以下の長さを有し、また、４０ｍｍ２以下、好ましくは２０ｍｍ２以下、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｍｍ２以下の断面積を有する。
【００８９】
このようなサイズは、全血サンプルが、例えば指先穿刺からの血液滴である場合、適切であると考えられる。
【００９０】
本発明の第１および第２の態様の別の実施形態において、吸収性プローブは、２５０ｍｍ３以下、好ましくは２００ｍｍ３以下、例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｍｍ３以下の体積を有する。このような体積は、全血サンプルが、例えば指先穿刺からの血液滴である場合、適切であると考えられる。
【００９１】
より好ましくは、吸収性プローブは、２〜１０ｍｍ、好ましくは２〜５ｍｍ、例えば２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｍの長さを有し、また、５〜４０ｍｍ２、好ましくは５〜２０ｍｍ２、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｍｍ２の断面積を有する。
【００９２】
本発明の第１および第２の態様の別の実施形態では、吸収性プローブは、１ｍｍ３〜２５０ｍｍ３、好ましくは２．５ｍｍ３〜２００ｍｍ３、例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｍｍ３の体積を有する。
【００９３】
円筒形プローブ上の平坦端部の円筒または半円形端部が望ましいと考えられるが、様々な構造を使用することができる。
【００９４】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料に吸収された全血は乾燥されている。乾燥は、外気中で、例えば室温（２０℃）で、または高温（例えば、３０℃）で実施することができる。あるいは、吸収性プローブは、吸収性プローブと乾燥容器の壁または他の潜在的な汚染物質表面との接触を最小にしながら乾燥を助けるように構成された特別な乾燥容器に移すことができる。乾燥容器は、乾燥を容易にする乾燥剤を含んでいてもよい。乾燥は、０．５〜５時間、または０．５〜３時間の間、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５時間、実施することができる。これに関して、乾燥時間は、湿度、温度、乾燥される体積、および吸収性プローブの形状および構造に依存するので、乾燥時間は変化することに留意されたい。さらに、血液を迅速に乾燥させることで、血液サンプルの分解を遅らせることができる。少量サンプルの乾燥は、多量サンプルの乾燥よりも速い。乾燥時間を短縮するため、親水性材料は、空気が吸収性プローブに入り、より速く乾燥されるように、空気透過性または気体透過性であるように選択されるのが好ましい。
【００９５】
流体は、さらなる処理（例えば、濃縮）または分析（例えば、マイクロアレイ分析）のために吸収性プローブから分離することができるが、吸収性プローブは廃棄することもできる。
【００９６】
したがって、本発明の第２の態様の一実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）１つまたは複数の分離技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を単離するステップをさらに含む。
【００９７】
１つまたは複数の分離技術は、遠心分離、蒸発／再構成、濃縮、沈殿、液体／液体抽出、および固相抽出からなる群から選択されることが好ましい。
【００９８】
この単離ステップによって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分の純度をさらに改善することができる。長さが２００ヌクレオチド未満の単離されたＲＮＡ画分は、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％、例えば、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９％、または１００％の純度を有することが特に好ましい。
【００９９】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、参照標準、抗凝固剤および安定化剤からなる群から選択される物質をさらに含む。
【０１００】
抗凝固剤の使用は、血液の均一性を維持し、望ましくない分解を防止するのに有用である。抗凝固剤は、乾燥して吸収性プローブに適用することができるが、好ましくは、湿潤状態または液体状態で適用し、使用前に乾燥させる。最も一般的な抗凝固剤は、ポリアニオン（例えば、ヘパリン）または金属キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸）の２つのカテゴリーに入る。適切な抗凝固剤は、クエン酸デキストロース、クエン酸リン酸デキストロース、クエン酸リン酸デキストロースアデニン、クエン酸ナトリウム、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡナトリウム、ヘパリンリチウム、ヘパリンナトリウム、カリウムおよびシュウ酸塩が挙げられると考えられる。吸収性プローブに適用される抗凝固剤は、分析の精度に悪影響を及ぼさないように、使用される流体および下流の分析と適切に適合させるべきである。
【０１０１】
分析の際の参照標準、例えば、内部標準および外部標準の使用は、一般的な実施である。したがって、（乾燥した）血液が吸収性プローブから抽出される場合、参照標準（湿潤または乾燥）を流体の製造またはサンプリング中に吸収性プローブに適用してもよく、または再構成流体に添加してもよい。血液の分析に影響を及ぼさない多くの不揮発性物質を参照標準として使用することができる。放射性標識、蛍光標識および重水素標識を使用することができる。
【０１０２】
安定剤の使用もまた一般的な手段である。安定剤は、血液を安定化させるのに有用である。安定剤は、吸収性プローブに乾燥して適用することができるが、好ましくは、湿潤状態または液体状態で適用し、使用前に乾燥させる。安定剤の例としては、限定するものではないが、ＲＮＡ−ｌａｔｅｒ、ＲＮＡｓｔａｂｌｅ、ＰＡＸｇｅｎｅ−ｒｅｇｅｎｔ、ＲＮＡｓｉｎ、およびｃａｔｒｉｍｏｘ−１４が挙げられる。
【０１０３】
本発明の第１および第２の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、特許文献１、または特許文献２に記載のプローブである。特に、吸収性プローブは、特許文献１または特許文献２に記載されているような生物学的流体サンプリングデバイスの一部である。これに関しては、特許文献１の第１０頁第２８行〜第３４頁第２７行、図２、図３および図８、ならびに請求項１〜１９と、特許文献２の段落［００６８］〜［０１２９］、図２、図３および図８、および請求項１〜１９を参照されたい。
【０１０４】
第３の態様において、本発明は、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定する方法であって、
（ｉ）第２の態様の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
【０１０５】
本発明の発明者らは、驚いたことに、ＲＮＡ分子、例えば、本発明の第２の態様に従って精製／単離されたｍｉＲＮＡのレベルを決定することができることを見出した。このような場合、サンプル処理時間を短縮することが可能であり、サンプル分析（例えば、発現プロファイリングによる）を簡略化することができ、コストを節約することができる。
【０１０６】
好ましくは、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される。
【０１０７】
本発明の第３の態様の一実施形態において、ステップ（ｉｉ）で決定されたレベルは発現レベルである。
【０１０８】
ステップ（ｉｉ）における決定は、ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのレベル、特にＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための任意の簡便な手段を実施することができる。例えば、定性的、半定量的および／または定量的検出方法を使用することができる。様々な技術が当業者に周知である。ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのレベル、特にＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡの発現レベルは、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、質量分析またはそれらの任意の組合せによって決定されることが好ましい。核酸増幅は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えばリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）などを使用して実施することができる。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、単一ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、または少数のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡの分析において好ましい。これは、低含量のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡを検出するのに特に好適である。しかし、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）は、単一のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、および多数のＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡを分析することができる。
【０１０９】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えばリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）によるｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための様々なキットおよびプロトコールを利用することができる。例えば、ｍｉＲＮＡの逆転写は、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して製造者の推奨に従って行うことができる。簡単に説明すると、ｍｉＲＮＡは、ｄＮＴＰ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素および標的ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーと合わせることができる。得られたｃＤＮＡを希釈し、ＰＣＲ反応に使用することができる。ＰＣＲは、製造業者の推奨（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って行うことができる。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを標的ｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎアッセイと合わせ、ＡＢＩ７３００を用いてＰＣＲ反応を行うことができる。
【０１１０】
核酸ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ／バイオチップまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行うことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、単一のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、および少数のＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡを分析するのに好ましい。しかし、マイクロアレイ／バイオチップは、単一のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、および多数のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡを分析することができる。（ｉ）核酸ハイブリダイゼーションが、マイクロアレイ／バイオチップもしくはビーズを使用して、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して実施されること、ならびに／あるいは（ｉｉ）核酸増幅がリアルタイムＰＣＲを使用して実施されることがより好ましい。
【０１１１】
ステップ（ｉｉ）における適切な技術は、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択されることが好ましい。（ｉ）マイクロアレイ／バイオチップ、ビーズ、もしくはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して核酸ハイブリダイゼーションを実施すること、および／または（ｉｉ）リアルタイムＰＣＲを使用して核酸増幅を行うことがより好ましい。
【０１１２】
第４の態様において、本発明は、個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）前記全血サンプルが個体から由来した（採取された、得られた、単離された）、第２の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子の前記レベルを決定するステップと、
（ｉｉｉ）レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｖ）個体が前記比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法に関する。
【０１１３】
ステップ（ｉｉ）における決定は、ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのレベル、特にＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための任意の簡便な手段によって実施することができる。例えば、定性的、半定量的および／または定量的検出方法を使用することができる。様々な技術が当業者に周知である。ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのレベル、特にＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡの発現レベルは、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、質量分析またはそれらの任意の組合せによって決定されることが好ましい。核酸増幅は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えばリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）などを使用して実施することができる。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、単一ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、または少数のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡの分析において好ましい。これは、低含量のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡを検出するのに特に好適である。しかし、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）は、単一のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、および多数のＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡを分析することができる。
【０１１４】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えばリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ｑＰＣＲ）によるｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための様々なキットおよびプロトコールを利用することができる。例えば、ｍｉＲＮＡの逆転写は、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して製造者の推奨に従って行うことができる。簡単に説明すると、ｍｉＲＮＡは、ｄＮＴＰ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素および標的ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーと合わせることができる。得られたｃＤＮＡを希釈し、ＰＣＲ反応に使用することができる。ＰＣＲは、製造業者の推奨（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って行うことができる。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを標的ｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎアッセイと合わせ、ＡＢＩ７３００を用いてＰＣＲ反応を行うことができる。
【０１１５】
核酸ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ／バイオチップまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行うことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、単一のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、および少数のＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡを分析するのに好ましい。しかし、マイクロアレイ／バイオチップは、単一のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、および多数のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡを分析することができる。（ｉ）核酸ハイブリダイゼーションが、マイクロアレイ／バイオチップもしくはビーズを使用して、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して実施されること、ならびに／あるいは（ｉｉ）核酸増幅がリアルタイムＰＣＲを使用して実施されることがより好ましい。
【０１１６】
ステップ（ｉｉ）における適切な技術は、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択されることが好ましい。（ｉ）マイクロアレイ／バイオチップ、ビーズ、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して核酸ハイブリダイゼーションを実施すること、および／または（ｉｉ）リアルタイムＰＣＲを用いて核酸増幅を行うことがより好ましい。
【０１１７】
前記第４の態様は、あるいは、以下のように明確化することができる：個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）前記全血サンプルが個体から由来した（採取された、得られた、単離された）、第３の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）前記レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
【０１１８】
参照レベルは、個体が疾患に罹患しているか否かを決定することができる任意のレベルであってよい。好ましくは、１つまたは複数の参照レベルは、１名または複数の健康な対象、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００名の健康な対象、１名または複数の疾患に罹患している対象、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００名の疾患に罹患している対象、ならびに／あるいは１名または複数の他の疾患に罹患している対象、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００名の他の疾患に罹患している対象からの１つまたは複数の参照全血サンプル、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００の参照全血サンプルを測定することによって決定される。
【０１１９】
特に、１つまたは複数の参照レベルは、１名または複数の肺がん対象、好ましくは肺がん治療を受けている肺がん対象、より好ましくは緩和肺がん治療またはアジュバント肺がん治療を受けている肺がん対象、ならびに／あるいは１名または複数の健康である対象、好ましくは肺がん治療を受けていない対象、より好ましくは、緩和肺がん治療またはアジュバント肺がん治療を受けていない対象からの１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される。分析において１名の対象あたり１つの参照全血サンプルを採取することが実際的である。追加の参照全血サンプルが必要な場合、同一対象を（再）試験することができる。
【０１２０】
前記参照レベルは、平均参照レベルであってもよい。参照レベルを測定し、その「平均」値（例えば、平均、中央値またはモード値）を計算することによって決定することができる。参照レベルは、試験または診断される患者と同じ性別（例えば、女性もしくは男性）および／または同様の年齢／世代（例えば、成人もしくは高齢者）の対象由来であることが好ましい。
【０１２１】
疾患は、任意の疾患、例えば、肺がんであり得る。他の疾患は、肺がん以外の疾患であってもよい。
【０１２２】
一実施形態において、個体における疾患の診断方法は、
（ｉ）前記全血サンプルが個体から由来した（採取された、得られた、単離された）、第３の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）前記レベルを、１名または複数の健康な対象由来の１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む。好ましくは、疾患は肺がんである。
【０１２３】
別の一実施形態において、個体における疾患の診断方法は、
（ｉ）前記全血サンプルが個体から由来した（採取された、得られた、単離された）、第３の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）前記レベルを、１名または複数の疾患に罹患している対象由来の１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む。好ましくは、疾患は肺がんである。
【０１２４】
別の一実施形態において、個体における疾患の診断方法は、
（ｉ）前記全血サンプルが個体から由来した（採取された、得られた、単離された）、第３の態様に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）前記レベルを、１名または複数の疾患に罹患している対象由来の１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベル、および１名または複数の別の疾患に罹患している対象由来の１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む。好ましくは、疾患は肺がんであり、他の疾患は肺がん以外の疾患である。また本方法は、異なる治療された疾患を互いに区別することも可能にする。例えば、疾患は、アジュバント処置された疾患、例えば、アジュバント処置肺がんであり、他の疾患は、緩和処置された疾患、例えば、例えば緩和処置された肺がんであってもよく、または、疾患は緩和処置された疾患、例えば緩和処置された肺がんであり、他の疾患はアジュバント処置疾患、例えばアジュバント処置肺がんであってもよい。
【０１２５】
第５の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するための親水性ポリマー材料の使用に関する。好ましくは、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分は、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡおよびリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のＲＮＡ分子を含む。
【０１２６】
第６の態様において、本発明は、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するための親水性ポリマー材料の使用に関する。好ましくは、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のＲＮＡ分子を含む。
【０１２７】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は吸着プローブ中に含まれる（本発明の第１および第２の態様を参照されたい）。
【０１２８】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下、例えば０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５または６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、０．５〜６ｇ／ｃｍ３、さらにより好ましくは１〜４ｇ／ｃｍ３、例えば０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５または６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
【０１２９】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は多孔質である。
【０１３０】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、材料の全体積の２０〜７０％、好ましくは３０〜５０％、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０％の細孔容積を有する。
【０１３１】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、直径または最大断面寸法において、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍ以下の細孔を含む。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、直径または最大断面寸法において、１０〜１００μｍ、さらにより好ましくは２０〜５０μｍ、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍの細孔を含む。
【０１３２】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、セルロース含有材料、例えば、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステルからなる群から選択」される。好ましくは、
（ｉ）多糖類は、セルロースであり、
（ｉｉ）ポリオレフィンは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）ポリエステルは、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される。
【０１３３】
より好ましくは、親水性ポリマー材料は、綿、セルロースまたはポリエチレンである。
【０１３４】
本発明の第５および第６の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、特許文献１または特許文献２に記載されている材料である。特に、親水性ポリマー材料は、特許文献１またはと特許文献２に記載されている、生物学的流体サンプリングデバイスに含まれる吸収性プローブの一部である。これに関し、特許文献１の第１０ページ第２８行〜第３４ページ第２７行、図２、３および８、および請求項１〜１９と、特許文献２の明細書の段落［００６８］〜［０１２９］、図２、３および８、ならびに請求項１〜１９を参照されたい。
【０１３５】
吸収性プローブおよび／または親水性ポリマー材料の他の実施形態に関しては、本発明の第１または第２の態様に言及されている。
【０１３６】
第７の態様において、本発明は、疾患を診断または鑑別診断するための第３の態様に記載の方法の使用に関する。疾患は肺がんであり得る。疾患の診断または鑑別診断に関しては、本発明の第４の態様に言及されている。
【０１３７】
第８の態様において、本発明は、
（ｉ）親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブ、を含むキットに関する。
【０１３８】
キットは、全血サンプルを採取するのに有用である。
【０１３９】
本発明の第８の態様の一実施形態において、キットは、
（ｉｉ）個体から血液を取り出す手段、
（ｉｉｉ）容器、および／または
（ｉｖ）吸収された全血サンプルからの全血を有する吸収性プローブが、本発明の第１〜第４の態様の方法において使用可能であるという情報を含むデータ媒体をさらに含む。
【０１４０】
本発明の第８の態様の別の一実施形態において、キットは、
（ｉｉ）個体から血液を取り出す手段、
（ｉｉｉ）長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するための手段、
（ｉｖ）容器、および／または
（ｖ）吸収された全血サンプルからの全血を有する吸収性プローブが、本発明の第１〜第４の態様の方法において使用可能であるという情報を含むデータ媒体、をさらに含む。
【０１４１】
個体から血液を取り出す手段は、注射器（針付き）、針、およびランセットからなる群から選択することができる。注射器（針付き）は、個体の腕の静脈から血液を採取するために使用することができる。針またはランセットは、上部皮膚層を破壊し、個体から（例えば、指先穿刺を介して）血液滴を取り出すために使用することができる。次いで、親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブは、全血液サンプルと（物理的に）接触するように配置され、それにより全血が親水性ポリマー材料に吸収される。その後、吸収性プローブは乾燥、例えば風乾させることができる。これは、室温（２０℃）または高温（例えば３０℃）で行うことができる。
【０１４２】
次いで、全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを、さらなる分析のために実験室に送ることができる。
【０１４３】
長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するための手段は、
（ｉ）長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子を検出するためのポリヌクレオチド、および／または
（ｉｉ）バイオチップ、ＲＴ−ＰＣＴシステム、ＰＣＲシステム、フローサイトメーターまたは次世代シークエンシングシステム、を含んでいてもよい。
【０１４４】
好ましくは、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡ分子である。
【０１４５】
前記ポリヌクレオチドは、バイオチップに結合させることができる。前記ポリヌクレオチドはまた、ＲＴ−ＰＣＴシステム、ＰＣＲシステム、または次世代配列決定システムにおけるプライマーとして使用することもできる。
【０１４６】
データ媒体は、非電子的データ媒体、例えばグラフ式データ媒体、例えば情報リーフレット（例えば、本発明の第１〜第４の態様に記載の前記キットを使用する方法の詳細を含む）、情報シート、バーコードもしくはアクセスコード、または電子データ媒体、例えばフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップまたは他の半導体ベースの電子データ媒体であってもよい。アクセスコードは、データベース、例えばインターネットデータベース、集中データベースまたは分散データベースへのアクセスを可能にする。またアクセスコードは、コンピュータにコンピュータユーザのためのタスクを実行させるアプリケーションソフトウェア、またはスマートフォンおよび他のモバイルデバイス上で動作するように設計されたソフトウェアであるモバイルアプリケーションへのアクセスを可能にする。前記データ媒体は、本明細書で決定されたＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのレベルの１つまたは複数の参照レベルをさらに含んでいてもよい。データ媒体がデータベースにアクセスすることができるアクセスコードを含む場合、前記１つまたは複数の参照レベルはこのデータベースに格納されていてもよい。
【０１４７】
キットは、全血サンプルを採取する際に有用な緩衝液、試薬および／または希釈剤を含めた、商業上および使用者の観点から望ましい材料を任意選択で含んでいてもよい。
【０１４８】
第９の態様において、本発明は、
（ｉ）親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブに吸収される（全血サンプル由来の）全血を再構成するための流体、を含むキットに関する。
【０１４９】
流体は、液体または気体であってもよい。好ましくは、流体は、カオトロピック流体、例えばカオトロピック液体または気体である。より好ましくは、カオトロピック流体は、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、アルカリチオシアネート、アルカリイソチオシアネート、アルカリヨウ化物およびアルカリ過塩素酸塩からなる群から選択される。さらに好ましくは、カオトロピック流体はチオシアン酸グアニジニウムである。あるいは、カオトロピック流体、例えば、カオトロピック流体および気体は、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、アルカリチオシアネート、アルカリイソチオシアネート、アルカリヨウ化物およびアルカリ過塩素酸塩を含み得る。好ましくは、カオトロピック流体は、グアニジニウムチオシアネートを含む。
【０１５０】
このキットは、本発明の第１〜第４の態様の方法を実施するために、すなわち、全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するため、全血液サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するため、また、全血液サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製し、（続いて）前記ＲＮＡ分子のレベルを決定するために有用である。
【０１５１】
上記のＲＮＡ画分は、１つまたは複数のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ分子を含む。長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分は、好ましくは、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡおよびリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含み、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分は、好ましくは、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む。
【０１５２】
キットが全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製し、（続いて）前記ＲＮＡ分子のレベルを決定するためのものである場合、ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ分子）のレベル、特に発現レベルを決定する手段をさらに含む。好ましくは、前記手段は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えばｍｉＲＮＡ分子）の（発現）レベルを決定するための１つまたは複数のポリヌクレオチド、および／またはマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴシステム、ＰＣＲシステム、フローサイトメーター、ビーズベースのマルチプレックスシステムまたは次世代シークエンシングシステムを含む。
【０１５３】
本発明の第９の態様の一実施形態において、キットは、
（ｉｉ）容器、および／または
（ｉｉｉ）本発明の第１〜第４の態様の方法をどのように実施するかに関する指示が入力されたデータ媒体をさらに含む。
【０１５４】
本発明の第９の態様の別の実施形態において、キットは、
（ｉｉ）長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するための手段、
（ｉｉｉ）容器、ならびに／あるいは
（ｉｖ）本発明の第１〜第４の態様の方法をどのように実施するかに関する指示が入力されたデータ媒体、をさらに含む。
【０１５５】
長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するための手段は、
（ｉ）長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子を検出するためのポリヌクレオチド、ならびに／あるいは
（ｉｉ）バイオチップ、ＲＴ−ＰＣＴシステム、ＰＣＲシステム、フローサイトメーターまたは次世代シークエンシングシステム、を含み得る。
【０１５６】
好ましくは、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡ分子である。
【０１５７】
前記ポリヌクレオチドは、バイオチップに結合させることができる。また前記ポリヌクレオチドは、ＲＴ−ＰＣＴシステム、ＰＣＲシステム、または次世代配列決定システムにおけるプライマーとして使用することもできる。
【０１５８】
キットは、１つまたは複数の容器を含む。例えば、流体は、容器内に、例えばボトル内に、特にスプレーボトル内に入れることができる。さらに、前記ＲＮＡ分子のレベルを決定するための手段は容器に含まれていてもよい。
【０１５９】
データ媒体は、非電子的データ媒体、例えばグラフ式データ媒体、例えば情報リーフレット、情報シート、バーコードもしくはアクセスコード、または電子データ媒体、例えばフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップまたは他の半導体ベースの電子データ媒体であってもよい。アクセスコードは、データベース、例えばインターネットデータベース、集中データベースまたは分散データベースへのアクセスを可能にする。またアクセスコードは、コンピュータにコンピュータユーザのためのタスクを実行させるアプリケーションソフトウェア、またはスマートフォンおよび他のモバイルデバイス上で動作するように設計されたソフトウェアであるモバイルアプリケーションへのアクセスを可能にする。前記データ媒体は、本明細書で決定されたＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡのレベルの１つまたは複数の参照レベルをさらに含んでいてもよい。データ媒体がデータベースにアクセスすることができるアクセスコードを含む場合、前記１つまたは複数の参照レベルはこのデータベースに格納されていてもよい。
【０１６０】
キットは、本発明の第１〜第４の態様の方法を実施するための緩衝液（複数可）、試薬（複数可）および／または希釈剤（複数可）を含めた、商業上および使用者の観点から望ましい材料を任意選択で含んでいてもよい。
【０１６１】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下、例えば０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５または６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、０．５〜６ｇ／ｃｍ３、さらにより好ましくは１〜４ｇ／ｃｍ３、例えば０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５または６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
【０１６２】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は多孔質である。
【０１６３】
本発明の第８および第９の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、材料の全体積の２０〜７０％、好ましくは３０〜５０％、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０％の細孔容積を有する。
【０１６４】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、直径または最大断面寸法で１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍ以下の細孔を含む。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、直径または最大断面寸法で１０〜１００μｍ、さらにより好ましくは２０〜５０μｍ、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍの細孔を含む。
【０１６５】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、親水性ポリマー材料は、セルロース含有材料、例えば、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステルからなる群から選択される。好ましくは、
（ｉ）多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、綿、セルロースまたはポリエチレンである。
【０１６６】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、１〜５０μｌ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μｌの全血の所定の最大容量を吸収した。
【０１６７】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、１０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下、例えば２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｍ以下の長さを有し、また４０ｍｍ２以下、好ましくは２０ｍｍ２以下、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｍｍ２以下の断面積を有する。このようなサイズは、全血サンプルが、例えば指先穿刺からの血液滴である場合、適切であると考えられる。
【０１６８】
本発明の第８または第９の態様の別の実施形態において、吸収性プローブは、２５０ｍｍ３以下、好ましくは２００ｍｍ３以下、例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｍｍ３以下の体積を有する。このような体積は、全血サンプルが、例えば指先穿刺からの血液滴である場合、適切であると考えられる。
【０１６９】
より好ましくは、吸収性プローブは、２〜１０ｍｍ、好ましくは２〜５ｍｍ、例えば２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｍの長さを有し、また５〜４０ｍｍ２、好ましくは５〜２０ｍｍ２、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｍｍ２の断面積を有する。
【０１７０】
本発明の第８または第９の態様の別の実施形態において、吸収性プローブは、１ｍｍ３〜２５０ｍｍ３、好ましくは２．５ｍｍ３〜２００ｍｍ３、例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｍｍ３の体積を有する。
【０１７１】
本発明の第８または第９の態様の一実施形態において、吸収性プローブは、１〜５０μｌ、好ましくは５〜２５μｌ、さらにより好ましくは１０〜２０μｌ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μｌの全血の所定の最大容量を吸収するように構成される。
【０１７２】
吸収性プローブおよび／または親水性ポリマー材料の他の実施形態に関しては、本発明の第１または第２の態様に言及されている。
【０１７３】
本発明は以下のように要約される：
１．  全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去する方法であって、
（ｉ）全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）（全血を再構成させるために）吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの流体を回収して、長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するステップと、を含む、方法。
２．  長さが２００ヌクレオチド以上の前記ＲＮＡ画分がリボソーム１８Ｓ  ＲＮＡおよびリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む、第１項の方法。
３．  全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製する方法であって、
（ｉ）全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
（ｉｉ）（全血を再構成するために）吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの流体を回収して、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するステップと、を含む、方法。
４．  長さが２００ヌクレオチド未満の前記ＲＮＡ画分が、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む、第３項の方法。
５．  前記親水性ポリマー材料が６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下の密度を有する、第１項から第４項のいずれか一項の方法。
６．  前記親水性ポリマー材料が０．５〜６ｇ／ｃｍ３、好ましくは１〜４ｇ／ｃｍ３の密度を有する、第５項の方法。
７．  前記親水性ポリマー材料が多孔質である、第１項から第６項のいずれか一項の方法。
８．  前記親水性ポリマー材料が、前記材料の全体積の２０〜７０％、好ましくは３０〜５０％の細孔容積を有する、第１項から第７項のいずれか一項の方法。
９．  前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下の細孔を含む、第７項または第８項の方法。
１０．  前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜５０μｍの細孔を含む、第９項の方法。
１１．  前記水性ポリマー材料が、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステルからなる群から選択される、第１項から第１０項のいずれか一項の方法。
１２．  （ｉ）前記多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）前記ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、第１１項の方法。
１３．  前記吸収性プローブが１〜５０μｌの全血の所定の最大容量を吸収した、第１項から第１２項のいずれか一項の方法。
１４．  前記吸収性プローブが１０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下の長さを有し、また４０ｍｍ２以下、好ましくは２０ｍｍ２以下の断面積を有するか、または前記吸収性プローブが２５０ｍｍ３以下、好ましくは２００ｍｍ３以下の体積を有する、第１項から第１３項のいずれか一項の方法。
１５．  前記吸収性プローブが２〜１０ｍｍ、好ましくは２〜５ｍｍの長さを有し、また５〜４０ｍｍ２、好ましくは５〜２０ｍｍ２の断面積を有するか、前記吸収性プローブが、１ｍｍ３〜２５０ｍｍ３、好ましくは２．５ｍｍ３〜２００ｍｍ３の体積を有する、第１４項の方法。
１６．  前記親水性ポリマー材料に吸収された全血が乾燥されている、第１項から第１５項のいずれか一項の方法。
１７．  前記方法が、
（ｉｖ）１つまたは複数の分離技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を単離するステップをさらに含む、第３項から第１６項のいずれか一項の方法。
１８．  １つまたは複数の分離技術が、遠心分離、蒸発／再構成、濃縮、沈殿、液体／液体抽出、および固相抽出からなる群から選択される、第１７項の方法。
１９．  長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定する方法であって、
（ｉ）第３項から第１８項のいずれか一項の方法を実施するステップ、および
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップを含む、方法。
２０．  長さが２００ヌクレオチド未満の前記ＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される、第１９項の方法。
２１．  ステップ（ｉｉ）で決定された前記レベルが発現レベルである、第１９項または第２０項の方法。
２２．  前記適切な技術が核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、第１９項から第２１項のいずれか一項の方法。
２３．  （ｉ）前記核酸ハイブリダイゼーションがマイクロアレイ／バイオチップ、ビーズ、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して実施され、および／または
（ｉｉ）前記核酸増幅がリアルタイムＰＣＲを使用して行われる、第２２項の方法。
２４．  個体における疾患の診断方法であって、
（ｉ）第３項または第１８項の方法を実施するステップであって、前記全血サンプルが個体由来である、ステップと、
（ｉｉ）適切な技術によって、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子のレベルを決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｖ）該個体が該比較に基づいて該疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
２５．  前記適切な技術が核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、第２４項の方法。
２６．  個体における疾患を診断する方法であって、
（ｉ）第１９項または第２３項の方法を実施するステップであって、前記全血サンプルが個体由来である、ステップと、
（ｉｉ）前記レベルを１つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
（ｉｉｉ）個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
２７．  前記１つまたは複数の参照レベルが、
１もしくは複数の健康な被験者、
疾患に罹患している１もしくは複数の被験者、および／または
他の疾患に罹患している１もしくは複数の被験者、の１つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される、第２４項から第２６項のいずれか一項の方法。
２８．  全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分を除去するための親水性ポリマー材料の使用。
２９．  長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ画分が、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡおよびリボソーム２８Ｓ  ＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む、第２８項の使用。
３０．  全血サンプルから長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分を精製するための親水性ポリマー材料の使用。
３１．  前記長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ画分がｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｎｏｒＲＮＡからなる群から選択される１つまたは複数のＲＮＡ分子を含む、第３０項の使用。
３２．  前記親水性ポリマー材料が６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下の密度を有する、第２８項から第３１項のいずれか一項の使用。
３３．  前記親水性ポリマー材料が０．５〜６ｇ／ｃｍ３、好ましくは１〜４ｇ／ｃｍ３の密度を有する、第３２項の使用。
３４．  前記親水性ポリマー材料が多孔質である、第２８項から第３３項のいずれか一項の使用。
３５．  前記親水性ポリマー材料が材料の全体積の２０〜７０％、好ましくは３０〜５０％の細孔体積を有する、第２８項から第３４項のいずれか一項の使用。
３６．  前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下の細孔を含む、第３４項または第３５項の使用。
３７．  前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜５０μｍの細孔を含む、第３６項の使用。
３８．  前記水性ポリマー材料が、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステルからなる群から選択される、第２８項から第３７項のいずれか一項の使用。
３９．  （ｉ）前記多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）前記ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、第３８項の使用。
４０．  疾患を診断または鑑別診断するための、第１９項から第２３項のいずれか一項の方法の使用。
４１．  （ｉ）親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを含むキット。
４２．  前記キットが全血サンプルを採取するのに有用である、第４１項のキット。
４３．  前記キットが、
（ｉｉ）個体から血液を取り出す手段、
（ｉｉｉ）長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子の前記レベルを決定するための手段、
（ｉｖ）容器、および／または
（ｖ）吸収された全血サンプルの全血サンプルを有する吸収性プローブが、第１項から第２７項のいずれか一項の方法において使用できるという情報を含むデータ媒体をさらに含む、第４１項または第４２項のキット。
４４．  （ｉ）親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブに吸収された全血を再構成するための流体
を含むキット。
４５．  前記キットが第１項〜第２７項のいずれか一項の方法の実施に有用である、第４４項のキット。
４６．  前記キットが、
（ｉｉ）長さが２００ヌクレオチド以上のＲＮＡ分子および／または長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子の前記レベルを決定するための手段、
（ｉｉｉ）容器、および／または
（ｉｖ）第１項〜第２３項のいずれか一項の方法をどのように実施するかに関する指示が入力されデータ媒体
をさらに含む、第４４項または第４５項のキット。
４７．  前記親水性ポリマー材料が６ｇ／ｃｍ３以下、好ましくは４ｇ／ｃｍ３以下の密度を有する、第４１項〜第４６項のいずれか一項のキット。
４８．  前記親水性ポリマー材料が０．５〜６ｇ／ｃｍ３、好ましくは１〜４ｇ／ｃｍ３の密度を有する、第４７項のキット。
４９．  前記親水性ポリマー材料が多孔質である、第４１項〜第４８項のいずれか一項のキット。
５０．  前記親水性ポリマー材料が、材料の全体積の２０〜７０％、好ましくは３０〜５０％の細孔容積を有する、第４１項〜第４９項のいずれか一項のキット。
５１．  前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下の細孔を含む、第４９項または第５０項のキット。
５２．  前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜５０μｍの細孔を含む、第５１項のキット。
５３．  前記水性ポリマー材料が綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択される、第４１項〜第５２項のいずれか一項のキット。
５４．  （ｉ）前記多糖類が、セルロースであり、
（ｉｉ）前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
（ｉｉｉ）前記ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、第５３項のキット。
５５．  前記吸収性プローブが１〜５０μｌの全血の所定の最大容量を吸収するように構成された、第４１項〜第５４項のいずれか一項のキット。
５６．  前記吸収性プローブが１０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下の長さを有し、また、４０ｍｍ２以下、好ましくは２０ｍｍ２以下の断面積を有するか、または前記吸収性プローブが２５０ｍｍ３以下、好ましくは２００ｍｍ３以下の体積を有する、第４１項〜第５５項のいずれか一項のキット。
５７．  前記吸収性プローブが２〜１０ｍｍ、好ましくは２〜５ｍｍの長さを有し、また、５〜４０ｍｍ２、好ましくは５〜２０ｍｍ２の断面積を有するか、または前記吸収性プローブが１ｍｍ３〜２５０ｍｍ３、好ましくは２．５ｍｍ３〜２００ｍｍ３の体積を有する、第５６項のキット。
【０１７４】
本発明の範囲から逸脱することのない本発明の様々な改変および変更は、当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関して説明したが、特許請求されている本発明がそのような特定の実施形態に不適当に限定されるべきではないことは理解されたい。実際、関連分野の当業者には明らかである本発明を実施するための記載された様式の各種改変は、本発明によって網羅されるものとする。
【０１７５】
次の図は、本発明の単なる例示であり、添付の特許請求の範囲によって示されている本発明の範囲を制限するように解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】ｉ）吸収性プローブを使用して２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ画分を除去した全血サンプル（Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ、下の曲線）、またｉｉ）ヒト個体由来の２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ画分を除去していない全血サンプル（全血はＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅに回収、上の曲線）から単離したＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｎａｎｏの結果の比較を示す図である。上の曲線は、ｍａｙｏｒＲＮＡピーク（１８Ｓ、２８ＳリボソームＲＮＡ）がまだ存在していることを明確に示しているが、下の曲線では、前記１８Ｓおよび２８Ｓ  ＲＮＡおよび２００ｎｔを超える長さの他のＲＮＡ種が、全血サンプルを親水性ポリマー材料の吸収性プローブに吸収させることによって効果的に除去された。
【図２】親水性ポリマー材料の吸収性プローブ（Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ画分を除去した、ヒト個体から採取した全血サンプルから単離したＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏ  ＲＮＡ  ｋｉｔ）の結果を示す図である。限定するものではないが、最も顕著なリボソームＲＮＡピーク（約２０００ｎｔの１８Ｓフラグメントおよび約４，０００ｎｔの２８Ｓフラグメント）を含めた２００ｎｔを超えるＲＮＡ画分は、親水性ポリマー材料の吸収性プローブ（Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用することにより、全血サンプルから得たＲＮＡから除去される。
【図３】２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ画分からの、全血サンプル由来の長さが２００ｎｔ未満の短鎖ＲＮＡ画分のクローズ・アップは、親水性ポリマー吸収性プローブの使用によって除去されたことを示す図である。ここで、前記短鎖ＲＮＡ画分は、ｍｉＲＮＡ（約１５〜３５ｎｔ）、ｔＲＮＡ（約６０〜８０ｎｔ）、ｓｉＲＮＡ（約２０〜２５ｎｔ）、ｐｉＲＮＡ（約２６〜３１ｎｔ）またはｓｎｏｒＲＮＡのような種々の短鎖ＲＮＡ種を含む。
【図４】親水性ポリマー吸収性プローブの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す図である：（Ａ）親水性セルロース含有ポリマー吸収性プローブ材料；例えば、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＨＦ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＳＥ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＴＮＦ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）、およびＴＮＦ−Ｄｉ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）；（Ｂ）親水性有機ポリマー吸収性プローブ材料；例えば、Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ。
【図５】ｍｉＲＮＡ発現データを示す図である：親水性ポリマー吸収性プローブの使用によって処理された全血サンプルから２００ｎｔを超える画分を除去した後に得られた短鎖ＲＮＡ画分（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｄｎａマイクロアレイ上で、詳細は実施例８を参照されたい）において発現されることが見出されたｍｉＲＮＡを示した。ここでは、例として、ポリマー性吸収性プローブ、例えば、Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅまたは親水性セルロース含有吸収性プローブ（例えば、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＨＦ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＳＥ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＴＮＦ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）、ＴＮＦ−Ｄｉ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ））を、前記親水性ポリマー吸収性プローブを含むデバイスとして使用し、全血サンプルから２００ｎｔを超えるＲＮＡ画分を除去した。以下を使用する：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ＝配列識別番号；ｍｉＲＮＡ＝ｍｉＲＢａｓｅによるマイクロＲＮＡ  ｉｄｅｎｆｉｅｒ；ｇＴｏｔａｌＧｅｎｅＳｉｇｎａｌ（Ａ）＝２００ｎｔを超えるＲＮＡを除去する親水性セルロース含有吸収材料を使用した場合に検出される対応するｍｉＲＮＡの相対発現レベル；ｇＴｏｔａｌＧｅｎｅＳｉｇｎａｌ（Ｂ）＝２００ｎｔを超えるＲＮＡを除去する親水性ポリマー吸収材料（Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用した場合に検出される対応するｍｉＲＮＡの相対発現レベル。
【図６】Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ：親水性吸収性プローブが前記デバイスの頂部先端に含まれていることを示す図である。
【図７】全血サンプルから単離されたＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｎａｎｏの結果の比較を示した図である。（ｉ）吸収性プローブ（親水性セルロース含有吸収性デバイス、例えば、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＨＦ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＳＥ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＴＮＦ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）、ＴＮＦ−Ｄｉ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）、下部曲線）を使用して２００ｎｔを超える長さのＲＮＡ画分を除去したもの、ならびに（ｉｉ）ヒト個体からの２００ｎｔを超える長さを有するＲＮＡ画分を除去しなかったもの（ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅに回収された全血、上部曲線）。上部曲線は、ｍａｙｏｒ  ＲＮＡピーク（１８Ｓ、２８ＳリボソームＲＮＡ）は依然として存在するが、下部曲線では、前記１８Ｓおよび２８Ｓ  ＲＮＡならびに２００ｎｔを超える長さを有する他のＲＮＡ種は、全血サンプルが親水性ポリマー材料の吸収性プローブに吸収されることによって効果的に除去された。
【図８】乾燥血液スポットからのｍｉＲＮｏｍｅの安定性を示す図である。Ａ．各環境要因に対する異なる条件の散布図および相関。Ｂ．環境要因に影響を及ぼすＰＶＣＡプロット。
【図９】アジュバント処置患者と緩和処置患者との比較に関する制御解除ｍｉＲＮＡのＶｏｌｃａｎｏプロットを示す図である。
【図１０】肺がん治療による生物学的変化を示す図である。発現強度、変化倍率、ｐ値、および制御解除されたｍｉＲＮＡの受信者動作特性曲線（ＡＵＣ値）の下部面積。
【実施例】
【０１７７】
以下に記載した実施例は単に例示を目的とするものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【０１７８】
Ｉ部：
実施例１：親水性ポリマー吸収デバイス（Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用する血液サンプル回収
血液は、無菌の安全性ランセット（Ｓａｆｅｔｙ−Ｌａｎｃｅｔ  Ｅｘｔｒａ  １８Ｇ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）と各個体当たり４つのＭｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ（ｎｅｏｔｅｒｙｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、米国、Ｏｒｄｅｒｉｎｇ  Ｎｏ．１０００５）を使用して、左手中指を穿刺することにより、異なる個体（ｎ＝３）から回収した。Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ（図６）の血液を周囲温度で２時間乾燥させた。Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅのサンプラー本体から各個体あたり４個の血液充填サンプラーチップを取り出し、２ｍｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）に移した。
【０１７９】
実施例２：Ｍｉｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅからの短鎖ＲＮＡの抽出
長さが２００ｎｔ未満の短鎖ＲＮＡ抽出（マイクロＲＮＡ画分を含む）は、フェノール−クロロホルム抽出技術を使用して行った。短鎖ＲＮＡの精製は、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して行った。ここでは、１ｍＬのＱｉａｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ、カオトロピック試薬としてのチオシアン酸グアニジンおよびフェノールを含む）を、４つのＭｉｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅｒ  Ｔｉｐ（実施例１、血液サンプル回収を参照）を含む２ｍＬチューブにピペッティングした。次いで、チューブを４℃、振盪機上で１０００ｒｐｍにて１６時間インキュベートした。その後、全上澄みを、新しい２ｍＬエッペンドルフチューブに移した。２００μｌのクロロホルムを添加した後、混合物を１５秒間十分にボルテックスし、室温で２分間インキュベートした後、１２，０００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離した。その後、上部の水性相を他の２つの相に触れることなく新しい１ｍＬのチューブに移した。１．５容量の１００％エタノールを水性相に添加し、ピペッティングにより十分に混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、７００μｌのサンプルをＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移し、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。最後の２つのステップを、全サンプル体積がカラムに適用されるまで繰り返した。その後、７００μｌの緩衝液ＲＷＴを各カラムに添加し、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で再度遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、５００μｌの緩衝液ＲＰＥをカラムに加え、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、５００μＬの８０％エタノールをカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍにて２分間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、カラムを新しい２ｍｌ採取管に入れ、開放蓋を用いて１３，０００ｒｐｍにて５分間、室温で遠心分離して乾燥させた。カラムを新しい１．５ｍｌ収集チューブに移した。総ＲＮＡ含有量の溶出については、マイクロＲＮＡ１４μｌのＲＮａｓｅフリー水をカラムにピペッティングし、１分間インキュベートし、室温で１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。別のＲＮａｓｅフリー水１４μｌをカラムにピペッティングし、室温で１分間インキュベートし、室温で１３，０００ｒｐｍにて１分間、遠心分離した。長さが２００ｎｔ未満の溶出された短鎖ＲＮＡ画分（マイクロＲＮＡ画分を含む）を、品質管理および定量化まで氷上で保存した。
【０１８０】
実施例３：親水性セルロース含有吸収性デバイスを使用する血液サンプル回収
血液は、無菌の安全性ランセット（Ｓａｆｅｔｙ−Ｌａｎｃｅｔ  Ｅｘｔｒａ  １８Ｇ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）を使用し、左手薬指を穿刺することにより異なる個体（ｎ＝３）から回収した。約０．５〜４．０平方センチメートルの面積をカバーしている親水性セルロース含有吸収性デバイス（Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、Ｎｏｎ−Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｒｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＨＦ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＨｅｍａＳｐｏｔ  ＳＥ（Ｓｐｏｔ  Ｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、米国）、ＴＮＦ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）、ＴＮＦ−Ｄｉ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）を含めた様々な製造業者製のセルロース含有濾紙）に、各個体当たり血液２滴を加えた。様々な親水性セルロース含有吸収性プローブを２時間乾燥し、次いで周囲温度で１週間保存した。親水性セルロース含有吸収性プローブの血液吸収領域を切り出し、２ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）に移した。
【０１８１】
実施例４：親水性セルロース含有吸収性デバイスからの短鎖ＲＮＡの抽出
長さが２００ｎｔ未満の短鎖ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ画分を含む）の抽出は、フェノール−クロロホルム抽出技術を使用して行った。短鎖ＲＮＡの精製は、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて行った。１ｍＬのＱｉａｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を、乾燥により全血サンプルが吸収された親水性セルロース含有吸収性デバイスを含む２ｍＬチューブにピペッティングした（血液サンプル回収、実施例３を参照されたい）。次いで、チューブを４℃、振盪機上で１０００ｒｐｍにて１６時間インキュベートした。その後、全上澄みを新しい２ｍＬエッペンドルフチューブに移した。２００μｌのクロロホルムを添加した後、混合物を１５秒間十分にボルテックスし、室温で２分間インキュベートし、次いで１２，０００×ｇにて４℃で１５分間、遠心分離した。その後、上部の水性相を他の２つの相に触れることなく新しい２ｍＬチューブに移した。１．５容量の１００％エタノールを水性相に添加し、ピペッティングにより十分に混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、７００μｌのサンプルをＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移し、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。最後の２つのステップを、全サンプル体積がカラムに適用されるまで繰り返した。その後、７００μｌの緩衝液ＲＷＴを各カラムに添加し、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で再度遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、５００μｌの緩衝液ＲＰＥをカラムに加え、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、５００μＬの８０％エタノールをカラムに添加し、３，０００ｒｐｍにて２分間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、カラムを新しい２ｍｌ採取管に入れ、開放蓋を用いて１３，０００ｒｐｍにて５分間、室温で遠心分離して乾燥させた。カラムを新しい１．５ｍｌ収集チューブに移した。短鎖ＲＮＡ含有物の溶出については、マイクロＲＮＡ１４μｌのＲＮａｓｅフリー水をカラムにピペッティングし、１分間インキュベートし、室温で１３，０００ｒｐｍにて１分間、遠心分離した。別のＲＮａｓｅフリー水１４μｌをカラムにピペッティングし、室温で１分間インキュベートし、室温で１３，０００ｒｐｍにて１分間、遠心分離した。長さが２００ｎｔ未満の溶出された短鎖ＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）を、品質管理および定量化まで氷上で保存した。
【０１８２】
実施例５：ＰａｘＧｅｎｅ血液ＲＮＡチューブを使用する血液サンプル回収
血液は、異なる個体から採取した（ｎ＝３）。ここでは、各献血者について、２．５ｍｌの全血をＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｃｏｎ、スイス）への静脈穿刺により回収した。血液細胞は、遠心分離によって全血サンプルを処理することから得られた／取得した。ここで、前記採血管に回収した全血からの血球は、５０００×ｇ、１０分間の遠心分離により遠心分離した。上澄み（細胞外血液画分を含む）は廃棄したが、血球ペレット（赤血球、白血球および血小板を含む細胞血液画分）はさらなる処理のために回収した。短鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ画分を含み、２００ｎｔ未満）を含むが、２００ｎｔを超えるＲＮＡ画分も含む全ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用し、回収した血液細胞から抽出した。詳細については、実施例６を参照されたい。
【０１８３】
実施例６：全ＲＮＡ（２００ｎｔを超えるＲＮＡ画分を含む）のＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブからの抽出
短鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ画分を含み、２００ｎｔ未満）および２００ｎｔを超えるＲＮＡ画分を含めた全ＲＮＡの単離は、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して行った。ここでは、血球ペレット（実施例５で概説したようにして得られた）を、上下にピペッティングすることで７００μｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬に十分に再懸濁し、直ちに懸濁液を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。次に１４０μｌのクロロホルムを添加し、十分にボルテックスし、室温で２〜３分間インキュベートした後、１２，０００ｇにて１５分間、４℃で遠心分離した。その後、上部の水性相を、他の２つの相に触れることなく、細心の注意を払い新しい２ｍｌチューブに移した。次いで、１．５容量の１００％エタノールを移した水性相に添加し、ピペッティングにより十分に混合した。次いで、７００μｌのサンプルをカラムに移し、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、７００μｌの緩衝液ＲＷＴを各カラムに添加し、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で再度遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、５００μｌの緩衝液ＲＰＥをカラムに加え、１３，０００ｒｐｍにて１５秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、別の５００μｌの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍにて２分間、室温で遠心分離し、流出液を廃棄した。次いで、カラムを新しい２ｍｌ採取管に入れ、１３，０００ｒｐｍにて１分間、室温で遠心分離して乾燥させた。カラムを新しい１．５ｍｌ回収チューブに移した。総ＲＮＡ含有量の溶出については、マイクロＲＮＡ４０μｌのＲＮａｓｅフリー水をカラムにピペッティングし、１分間インキュベートし、室温で１３，０００ｒｐｍにて１分間、遠心分離した。次いで、溶出液を同じカラムに戻し、室温で１分間インキュベートし、再び１分間遠心分離した。低分子ＲＮＡ（２００ｎｔ未満、ｍｉＲＮＡ画分を含む）および２００ｎｔを超えるＲＮＡ画分を含む溶出全ＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００を用いて定量し、発現プロファイリング実験に使用するまで−２０℃で保存した。
【０１８４】
実施例７：短鎖ＲＮＡ画分の品質管理
抽出したＲＮＡの品質管理および定量は、ＡｇｉｌｅｎｔのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）を、製造業者のプロトコールおよびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＳｍａｌｌおよびＮａｎｏ  Ａｓｓａｙに従って使用して行った。ＲＮＡを７０℃で２分間変性させた後、Ｓｍａｌｌ  ａｎｄ  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙの両方のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップに１μＬを適用した。チップを２，４００ｒｐｍでボルテックスし、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで５分以内に泳動させた。
【０１８５】
実施例８：マイクロＲＮＡ発現プロファイルのマイクロアレイベースの決定
マイクロＲＮＡ画分を含む全ＲＮＡサンプルを、ＡｇｉｌｅｎｔのヒトｍｉＲＮＡ  ８ｘ６０ｋマイクロアレイ（リリースｖ２１）で、製造業者のプロトコールに従って分析した。マイクロＲＮＡのＣｙ３酵素標識および回転ハイブリダイゼーションオーブン中での５５℃、２０時間のアレイハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイスライドを２回洗浄し（非ストリンジェントおよびストリンジェント）、その後、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｃａｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンした。得られた画像データをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１１）を用いて評価した。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアによって生成された生データファイル（Ｇｅｎｅ  Ｖｉｅｗ）は、本コール解析のためにＥｘｃｅｌにインポートした。
【０１８６】
ＩＩ部：
乾燥血液スポット（ＤＢＳ）が安定したｍｉＲＮＡ測定を容易にするか否か、また生物学的変動に対する技術的安定性の比較をさらに系統的に調査した。第１に、異なる環境条件（例えば、温度および湿度）に暴露された同一個体由来のサンプルの全ゲノムワイドｍｉＲＮＡプロファイルを生成することによりＤＢＳサンプルの安定性を試験した。第２に、同一個体から採取したサンプルを７回繰り返すことによる技術的再現性を調べた。第３に、異なる治療を受けている５３名の肺がん患者からのサンプルを調査した。３段階の間に、１０８のゲノムワイドｍｉＲＮＡプロファイルが生成され、生物統計学的手段によって評価した。
【０１８７】
材料と方法
サンプル回収：試験のため、乾燥血液スポット上に合計７８サンプルを回収した。ＴＮＦ紙（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ、Ｂａｒｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）（Ａｈｌｓｔｒｏｍ）を使用した。到着後、ＲＮＡ抽出まで、乾燥血液スポットは−８０℃で保存した。安定分析については、１つの個体が含まれており、異なる環境条件に暴露された。温度は摂氏２６〜３５℃、湿度は３８．５〜６０％の間で変化させた。ワークフロー全体、すなわち異なる抽出と異なるマイクロアレイとの間で再現性を獲得するため、本発明者らは別の個体の技術的な７回の複製を実施した。それぞれのサンプルは、肺がん試験と共にプロセスコントロールとして測定した。また同一個体も、乾燥血液スポット上のｍｉＲＮＡレパートリーを比較するためのＰＡＸＧｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｕｂｅｓ（ＢＤ）を使用し、血液チューブを用いて調べた。臨床事例として、異なる治療法に曝露された５３名の肺がんサンプルを調査した。詳細には、治癒（アジュバント）治療を受けている患者に属する１７サンプルと、緩和ケアを受けている患者の３６サンプルであった。アジュバント治療は、治癒の機会を改善するための一次外科的治療に追加的に適用され、一方、緩和ケアは進行がんの症例である生活の質の改善のために使用された。試験は、地元倫理委員会により承認されており、参加者から書面による同意を得た。血液サンプルは乾燥血液スポット上に回収した。すべてのサンプルを、ｍｉＲＢａｓｅ  Ｖ２１マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で測定した。異なるマイクロアレイを比較するため、２６サンプルのサブセットもｍｉＲＢａｓｅ  Ｖ１９マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で測定した。合計で、３０種の全ｍｉＲＮｏｍｅがＶ１９でプロファイリングされ、７８種の全ｍｉＲＮｏｍｅがＶ２１マイクロアレイでプロファイリングされた。
【０１８８】
ｍｉＲＮＡ抽出：ＲＮＡ抽出前に、ＤＢＳサンプルを室温で１時間解凍した。全血液滴を切り出し、２ｍＬエッペンドルフチューブに移した。ＤＢＳペーパーをシェーカー上で、１，０００ｒｐｍおよび４℃で、１ｍＬのＱｉａｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、１６時間インキュベートした。上澄みは、さらなる処理のため、新しい２ｍＬチューブに移した。ＲＮＡ抽出および精製は、ＱｉａｇｅｎのｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて行った。製造業者の説明書（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、米国）に従って、短鎖ＲＮＡ  Ｋｉｔを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＮＡ含量およびｍｉＲＮＡ品質をチェックした（品質管理およびＲＮＡ溶出液の定量化を行った）。
【０１８９】
ｍｉＲＮＡの測定：マイクロＲＮＡ発現プロファイリングのために、最新のｍｉＲＢａｓｅ  ｖ２１含有量のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅｐｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ（８ｘ６０ｋ）マイクロアレイスライドでサンプルを分析した。各アレイは、プローブあたり２０の複製を含めて、２，５４９個のマイクロＲＮＡを標的とする。さらに、テクニカル評価のために、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅｐｒｉｎｔ  ｍｉＲＮＡ  Ｓｌｉｄｅｓの以前のバージョン１９でサンプルの一部を測定した。抽出したマイクロＲＮＡを標識し、製造者のプロトコールに従って、ＡｇｉｌｅｎｔのｍｉＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＬａｂｅｌｉｎｇおよびＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてハイブリダイズさせた。５５℃で２０時間、ハイブリダイゼーションをローテーションした後、スライドを２回洗浄し、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｃａｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンした。スキャナからの画像ファイルは、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてテキスト生データに変換した。
【０１９０】
データ前処理：プロファイリングされたサンプルの前処理のために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイデータの前処理および分析用に設計されたＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＡｇｉＭｉｃｒｏＲｎａを適用した。処理した発現値は、ロバストなマルチアレイ平均（ＲＭＡ）アルゴリズムによって、以下の３つのステップで得られた。プローブ（ｍｉＲＮＡの２０のプローブ複製のうちの１つ）の測定シグナルが最初にバックグラウンド補正され、次いでアレイが量子化によって正規化され、最後に、ｍｉＲＮＡの最終シグナルが、対応するプローブシグナルを要約することによって推定された。追加のフィルタリングを適用することにより、いかなる実験群でも検出されなかったコントロールの特徴およびｍｉＲＮＡがデータセットから除去され、バイオインフォマティクス分析用の発現された特徴のみが得られる。
【０１９１】
バイオインフォマティクス解析：技術的再現性を評価するため、ピアソンの相関をプロセスコントロールに対して計算した。これによって、１つのｍｉＲＢａｓｅバージョンに属するチップと、異なるｍｉＲＢａｓｅバージョン（ｖ１９およびｖ２１）に属するチップとの比較がなされた。同時に、変動係数（ＣＶ）を、技術的複製の相対ｍｉＲＮＡ発現値について推定した。またこれらのｍｉＲＮＡは、それらのＧＣ含量およびｍｉＲＢａｓｅへの最初の導入に関して分析した。さらに、階層クラスタリング手法を適用し、湿度および気温などの環境条件の異なる実験群とカテゴリーを評価した。対の観察の間の距離測定は、ユークリッド距離に基づいた。３つの群（アジュバント、緩和およびプロセスコントロール）を区別する候補を確認するための生物統計学的評価のために、ｔ−検定を使用し、ペアワイズ比較を実施した。偽発見率を制御するために、すべてのｐ値をＢｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整を用いて調整した。有意値に加えて、レシーバー動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。
【０１９２】
結果
この試験の目的は、乾燥血液スポットからのゲノムワイドｍｉＲＮＡプロファイルを確実に測定し、疾患診断における適用を促進するか否かを検討することであった。３段階のアプローチを実施した。第１に、異なる環境条件下での複製をプロファイリングした。第２に、プロセスコントロールとしての技術的複製が確立され、一連のマイクロアレイ上で測定された。第３に、臨床的実現可能性を、肺がん患者サンプルを使用して試験した。３段階において測定されたｍｉＲＮｏｍｅの数値の概要を以下の表１に示す。
【０１９３】
【表１】
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【０１９４】
乾燥血液スポットからのｍｉＲＮｏｍｅの安定性
異なる環境条件に暴露された一連の乾燥血液スポットサンプルからｍｉＲＮＡを抽出した。３つの温度と３つの湿度レベルの組合せを調べ、各組合せを３回測定した。したがって、３つの形態の６つの組合せを有することにより、合計１８のｍｉＲＮｏｍｅがマイクロアレイ上にプロファイリングされた。クラスターヒートマップを確立した（データは示さず）。異なる条件を相互に比較した。結果を図８Ａに示す。０．９９７の最低相関が温度に関して計算された。最も低い影響に対応する最も高い相関−湿度（相関０．９９９）について計算した。これらの結果は、主要な様々な構成要素分析によっても確認されている（図８Ｂ参照）。これらの結果は、乾燥血液スポットから測定されたｍｉＲＮＡが固有の安定性を有し、例えば、サンプルの中央実験室への輸送によって引き起こされる、様々な条件にそれらが暴露されたとしても、診断情報のキャリアとして技術的に適していることを示している。
【０１９５】
時間経過によるｍｉＲＮＡの再現性
次に、乾燥血液スポットから再現性のあるｍｉＲＮｏｍｅがマイクロアレイ上でどのようにプロファイリングされるかについて調べた。１名の個体から、７つの異なるＡｇｉｌｅｎｔスライドでの７つの技術的複製（Ａｇｉｌｅｎｔ技術では、１つのスライド上で物理的に８つに分離されたアレイ上での８つのサンプルの並列処理が可能）で実行した。これに関して、処理しようとするサンプルはまた、プロセスコントロール（＝健常コントロール）と考えることもできる。これらのプロセスコントロールの平均相関は０．９９３と高かった。同じ測定を、バージョン２１の代わりにｍｉＲＢＡｓｅバージョン１９のＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイの旧バージョンで繰り返した。ここでは、４つのプロセスコントロールが含まれており、同等の相関が得られた（データは示さず）。以前の分析における結果として、ある個体から複製されたプロセスコントロールは乾燥血液スポットからのｍｉＲＮＡｓが技術的観点から診断ツールとして適していることが強調されている。
【０１９６】
肺がん治療に基づく生物学的差異
最後に、肺がん患者サンプルとプロセスコントロールのサンプルとの間の生物学的差異を調べた。これは２つのステップで実現した。第１に、Ｖ１９およびＶ２１の両バージョンのＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ上の３０個のサンプル（２６個の肺がん、４個のプロセスコントロール）をプロファイリングした。階層的クラスタリングを適用することにより、各バージョンについて、類似のサンプル分布を有する２つのクラスターを得た（データは示さず）。治療形態が同じのサンプルは一緒にクラスター化される傾向があっただけでなく、プロセスコントロールもまた１つのクラスターに分類された。第２のステップでは、６０個のサンプル（５３個の肺がんおよび上述の７個のプロセスコントロール）をｍｉＲＢａｓｅ  Ｖ２１のＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ上にプロファイリングした。この分析ステップの平均相関は０．９７４であった。プロセスコントロールサンプル（０．９９３）と肺がんサンプル（０．９７６）に関する平均相関はこの値を超えていたが、プロセスコントロールサンプルと肺がんサンプルの間で最も低い平均相関（０．９６７）が計算された。興味深いことに、２つの異なる肺がん治療コホート間に差異があった。したがって、次に「アジュバント」処置患者グループと「緩和」処置患者グループとの間の統計的対比較を、両側ｔ検定を使用して実施した。研究の探索的性質により、生のｐ値が０．０５未満のｍｉＲＮＡは、有意に制御解除されたと考えられた。前述の比較（アジュバント対緩和）については、５１の有意に制御解除されたｍｉＲＮＡ（全５９１発現ｍｉＲＮＡの８．６％）が両側ｔ検定および選択したアルファレベル０．０５に基づいて確認された。これらの５１のｍｉＲＮＡのうち、１１はアジュバント群（２０％）において高い発現を示した。ｐ値が０．０１９の最もアップレギュレートされたｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐであり、ｐ値が０．０１４の最もダウンレギュレートされたマーカーはｈｓａ−ｍｉＲ−６４２ａ−３ｐであった。すべてのｍｉＲＮＡは図９のボルケーノプロットに示されており、ここでは、アップレギュレートおよびダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡをそれぞれダークグレー（上方右側）で、またライトグレー（下方左側）で強調している。発現強度、倍率変化、ｐ値および受信者動作特性曲線下の面積（ＡＵＣ値）に関する詳細情報を図１０に示す。
【０１９７】
考察
様々なヒト疾患に対し、非侵襲性バイオマーカーとしてｍｉＲＮＡｓを用いる研究の数が増えている。多くの場合、これらのｍｉＲＮＡは、血清、血漿または全血由来であった。ＰＡＸｇｅｎｅおよびＥＤＴＡなどの保存チューブが一般に使用されているが、ＤＢＳからのｍｉＲＮＡの研究はまだ新しい領域である。
【０１９８】
本研究においては、ＤＢＳからのｍｉＲＮＡの測定の信頼性を以下の３つの態様：（１）異なる環境条件下でのサンプル安定性、（２）チップバージョン間の技術的安定性および再現性、ならびに（３）肺がん患者の例を使用した臨床サンプルの比較、を追求することにより分析した。
【０１９９】
第１の態様に関して、ＤＢＳから測定されたｍｉＲＮＡは、１つのカテゴリー内の異なる環境条件（湿度および温度）の比較を考慮することにより高い安定性を有することが明らかにされた。
【０２００】
この研究の第２部において、一方のプロセスコントロールでは、等しく高い相関が、異なるチップバージョンＶ１９およびＶ２１にわたって技術的安定性の証拠を示すことが明らかとなった。もう一方では、Ｖ２１からの臨床のサンプルおよびプロセスコントロールのクラスタリングパターンもまた、ｖ１９と同様の構造で検索することができた。これらの同様の結果は、チップ上の異なるｍｉＲＢａｓｅバージョンにもかかわらず、ＤＢＳで測定されたｍｉＲＮＡの高い再現性を示唆している。
【０２０１】
この研究の第３部は、３つの異なる群：プロセスコントロール、アジュバントを受けている患者、緩和療法を受けている患者間での臨床比較に関するものであった。制御解除されたｍｉＲＮＡの統計的有意性の場合、肺がん患者とプロセスコントロールとの間に非常に多くの有意なｍｉＲＮＡ（調整されたｐ値＜０．０５）が存在した。この高い数値は、肺がん疾患自体と治療法の適用によって生じ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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