(57)【要約】  肺癌の治療のためのパルボウイルスの使用が記載される。該パルボウイルスは、パルボウイルスH1 (H-1PV)またはLuIII、マウスマイニュートウイルス(MMV)、マウスパルボウイルス(MPV)、ラットマイニュートウイルス(RMV)、ラットパルボウイルスまたはラットウイルス(RV)からなる群より選択される関連のあるげっ歯類パルボウイルスに基づく。
2019508058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌の治療における使用のためのパルボウイルスH1 (H-1PV)、またはLuIII、マウスマイニュートウイルス(MMV)、マウスパルボウイルス(MPV)、ラットマイニュートウイルス(RMV)、ラットパルボウイルスもしくはラットウイルス(RV)からなる群より選択される関連のあるげっ歯類パルボウイルス。
【請求項２】
該使用が非小細胞肺癌の治療のためのものであることを特徴とする、請求項１記載の使用のためのパルボウイルスH1 (H-1PV)、またはLuIII、マウスマイニュートウイルス(MMV)、マウスパルボウイルス(MPV)、ラットマイニュートウイルス(RMV)、ラットパルボウイルスもしくはラットウイルス(RV)からなる群より選択される関連のあるげっ歯類パルボウイルス。
【請求項３】
パルボウイルスが化学療法剤と組み合されることを特徴とする、請求項１または２記載の使用のためのパルボウイルスH1 (H-1PV)、またはLuIII、マウスマイニュートウイルス(MMV)、マウスパルボウイルス(MPV)、ラットマイニュートウイルス(RMV)、ラットパルボウイルスもしくはラットウイルス(RV)からなる群より選択される関連のあるげっ歯類パルボウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌の治療のためのパルボウイルスH1または関連のあるげっ歯類パルボウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺の癌腫または肺性癌腫としても知られる肺癌は、肺の組織における制御されない細胞増殖を特徴とする悪性肺腫瘍である。処置されないままにされる場合、この増殖は、体の近位の組織または他の部分への転移のプロセスにより、肺を越えて拡散し得る。原発性肺癌として知られる肺において開始されるほとんどの癌は、上皮細胞由来の癌腫である。主要な原発性の型は、小細胞肺癌(SCLC)および非小細胞肺癌(NSCLC)である。最も一般的な症状は、咳(coughing)(例えば、咳をして血を吐く)、体重減少、息切れ、および胸部の疼痛である。肺癌は、胸部X線写真およびコンピューター連動断層撮影(CT)スキャンにより見られ得る。診断は、気管支鏡検査またはCT-ガイダンス(guidance)により通常実施される生検により確認される。
【０００３】
治療および長期間の結果は、癌の種類、病期(拡散の程度)およびパフォーマンスステータスにより測定されるヒトの全体的な健康に依存する。一般的な治療としては、手術、化学療法および放射線療法が挙げられる。NSCLCは、しばしば手術により治療されるが、SCLCは通常、化学療法および放射線療法により良好に応答する。全体で、米国において肺癌であると診断された人のわずか16.8%が、診断後5年生存するが、開発途上世界において平均の結果はより悪い。世界中で、肺癌は男性および女性における最も一般的な癌関連死の原因であり、2012年現在1年間で156万件の死亡の原因となった。
【０００４】
NSCLCの3つの主要なサブタイプは、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌である。肺癌のほぼ40%が腺癌であり、これは通常末梢肺組織で生じる。腺癌のほとんどの症例は喫煙に関連するが、腺癌はまた、生涯で100本未満の煙草を吸った人(「喫煙をしない人(never-smoker)」)の間でも最も一般的な肺癌の形態である。腺癌のサブタイプである細気管支肺胞上皮癌は、喫煙をしない女性においてより一般的であり、より良い長期生存を有し得る。
【０００５】
扁平上皮癌は、肺癌の約30%を占める。それらは典型的に大気道(large airways)の近位で生じる。中空空洞(hollow cavity)および関連のある細胞死は一般的に、腫瘍の中心に見られる。肺癌の約9%は大細胞癌である。これらは、癌細胞が大きく、過剰な細胞質、大きな核および顕著な核小体を有するのでそう名付けられる。
【０００６】
小細胞肺癌(SCLC)において、細胞は、この腫瘍に内分泌/新生物随伴性症候群関連物をもたらす密な神経分泌顆粒(神経内分泌ホルモンを含む小胞)を含む。ほとんどの症例はより大きな気道(主気管支および二次気管支)で生じる。これらの癌は早く成長し、疾患の経過の初期に拡散する。現在では(at presentation)60〜70%が転移性の疾患を有する。この種類の肺癌は、喫煙に強く関連する。
【発明の概要】
【０００７】
肺癌の治療に関して現在までに達成された満足のいかない結果のために、例えば診断後の寿命の延長に関して、治療を向上させる必要がある。
【０００８】
そのため、肺癌の向上された治療のための手段を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
本発明によると、これは特許請求の範囲に規定される主題により達成される。
【００１０】
本発明は、肺癌由来の細胞株のいくつかは、他の腫瘍実体(例えば、結腸癌)に由来する細胞株と比較して、パルボウイルス腫瘍傷害性(oncotoxicity)に対してより高い感受性を示すという出願人の発見に基づく。したがって、パルボウイルスは、肺癌を治療するためのすばらしい治療潜在能力を有する。
【００１１】
新生物形質転換細胞を特異的に殺傷する(腫瘍崩壊)ウイルスまたは外装ベクター(armed vector)誘導体は、従来の治療が効果のない恐ろしい癌の種類(例えば、膵臓癌、神経膠腫、肝細胞癌)の治療に有望なアプローチを提示する(Russell et al, 2012)。いくつかの自律性パルボウイルスは、いわゆる腫瘍崩壊性ウイルスのカテゴリーに属する(Rommelaere et al, 2010)。パルボウイルスは、2つの非構造(nonstructural)(NS1、NS2)タンパク質および2つのカプシド(VP1、VP2)タンパク質を発現する5.1kbの一本鎖DNAゲノムを含む、小さな(25〜30nm)非エンベロープ粒子である(Cotmore & Tattersall, 2007)。パルボウイルスH-1PVは、アポトーシス、壊死およびカテプシンb依存型細胞死経路を含む複数の細胞死プロセスを誘発し得る(Nuesch et al, 2012)。天然の宿主がげっ歯類であるパルボウイルス属のいくつかのメンバー(H-1PV、MVM、LuIII)は、それらが宿主細胞の形質転換を失敗すること、ヒトの無症候性感染のための能力、ならびに新形成形質転換細胞において優先的に伝播する(腫瘍親和性)および該細胞を優先的に殺傷する(腫瘍崩壊)能力のために、癌遺伝子療法適用について、目下検討中である(Marchini et al, 2015)。MVMpおよびH-1PVウイルスは、インビボにおいて腫瘍抑制性活性を発揮することが示されており、すなわち該ウイルスは、実験動物において、自発的、化学的またはウイルス的に誘導された腫瘍の形成を阻害し得る(Marchini et al. 2015において概説される)。パルボウイルス発現カセットに基づくベクターも、抗癌剤として使用されている。また、パルボウイルスベクターは、腫瘍抑制性核酸、すなわち腫瘍サプレッサー遺伝子を癌に苦しむ患者に導入するためのビヒクルとして使用され得ることが公知である(US 2001/04420 A1)。
【００１２】
要するに、H-1PV腫瘍崩壊性潜在能力は脳癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫および子宮頸癌を含む種々の腫瘍に対してインビトロおよびインビボ試験において実証されている(近年、Marchini et al. 2015に概説される)。しかしながら、他の腫瘍型に対してH-1PVを抗癌剤として使用する可能性は、いまだ実証されていない。そのため、本発明をもたらす実験において、肺癌、卵巣癌、腎臓癌および/または前立腺癌のH-1PV腫瘍傷害性に対する感受性(susceptibility)についての最初のインビトロの証拠を獲得するために、NCI-60癌細胞株パネルをH-1PV感受性(sensitivity)についてスクリーニングした。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1. NCI-60細胞株パネルにおけるH-1PV腫瘍崩壊。癌細胞を96ウェルEプレートに播種し、未処理のままにしたかまたは異なるMOI(pfu/細胞)のH-1PVに感染させるかのいずれかをした。細胞成長および増殖を、1ウェル当たりの接着した細胞の量を30分ごとに測定するxCELLigenceシステムによりリアルタイムでモニタリングした。これらの値を標準化された細胞指数(CI)として表し、細胞成長曲線の表示として時間に対してプロットする。それぞれの実験条件は少なくとも三重で試験し、標準偏差バーを有する平均値を示す。垂直の灰色の線は、感染の時点を示す。腫瘍型毎の、名称がグラフの左上の部分に示される2個の細胞株を例として示す。NCI-60パネルスクリーニングの完全な結果を図3〜10に報告する。図1A〜Hにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図２】図2. NCI-60パネルに属する肺癌および黒色腫由来細胞株におけるLDHおよびMTTアッセイ。細胞を96ウェルプレートに播種し、翌日漸増ウイルスMOIを用いて感染させた。感染の48時間後、細胞をLDH(細胞溶解を測定するため)およびMTT(細胞生存能力を決定するため)について処理した。平均値は代表的な実験からの複数の複製(replicates)および結果から計算し、標準偏差バーを示す。
【図３】図3：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた肺癌由来細胞株の成長曲線。全ての細胞株はH-1PV感染に対して高い感受性を示し、低いMOI(≦10)でウイルスにより効率的に殺傷された。感染後48〜72時間で細胞傷害性効果を誘導するために50pfu/細胞のMOIが必要であったので、A549細胞株は唯一の例外を示す。図3A〜Eにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図４】図4：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた黒色腫由来細胞株の成長曲線。細胞増殖抑制性効果は、H-1PV感染の際にほとんどの細胞株で観察され：M14、MALME-3M、UACC-62、SK-MEL-28およびUACC-257細胞株において、5pfu/細胞のMOIでウイルスを使用した場合に低減された細胞成長が観察され、一方でより高いMOIのH-1PVは細胞殺傷を誘導した。SK-MEL-2およびSK-MEL-5において細胞成長遅延は0.5〜1pfu/細胞で変化するより低いMOIで検出され、MOI 5または10を用いて感染させた細胞において細胞傷害性が観察された。LOX IMVI細胞のみがH-1PV細胞傷害性に対して抵抗性を示した。図4A〜Eにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図５】図5：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた乳癌細胞株の成長曲線。5個の細胞株のうち3個が5pfu/細胞のウイルスMOIで感受性を示し、1個の細胞株(MDA-MB-231)において低いMOI(0.05〜0.5pfu/細胞)を用いた感染は、細胞増殖抑制性の効果に関連したので、乳癌は、H-1PV腫瘍崩壊の可能性のある標的であると考えられ得る。1個の細胞株MCF7のみがH-1PV誘導性細胞傷害性に抵抗性であった。図5A〜Cにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図６】図6：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた中枢神経系(CNS)由来細胞株の成長曲線。3個の細胞株(SF-539、SF-295、SNB-19)は5pfu/細胞のウイルスMOIで感受性であり、一方で他の3個はより低いウイルス量で効率的に殺傷された。これらの結果により、この腫瘍型に対してH-1PV腫瘍崩壊潜在能力を示した以前に公開されたデータが確認される。図6A〜Cにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図７】図7：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた卵巣癌細胞株の成長曲線。スクリーニングにより、OVCAR-3およびOVCAR-5はH-1PV細胞傷害性に抵抗性であり(OVCAR-5においてわずかな細胞増殖抑制性効果が検出された)、IGR-OV1は、50pfu/細胞のMOIでウイルスを使用した際に効率的に殺傷され、一方で残り4個の細胞株において5pfu/細胞またはそれ以下のMOIは細胞傷害性効果を誘導するのに十分であったことが明らかにされた。図7A〜Dにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図８】図8：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた腎臓癌由来細胞株の成長曲線。≧5pfu/細胞のMOIで使用した場合、H-1PVは4個の細胞株(786-O、A498、RFX 393およびSN12C)を殺傷し得、一方でACHN、CAKI-1、UO-31およびTK-10細胞を効率的に殺傷するために、実験において使用した最高のMOIが必要であった。これらの結果に基づいて、本発明者らは、腎臓起源の腫瘍はH-1PV腫瘍崩壊に対して中程度に感受性であると結論付けた。図8A〜Dにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図９】図9：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた結腸癌由来細胞株の成長曲線。スクリーニングにより、4個の細胞株で使用した最高のMOI(50pfu/細胞)で細胞傷害性が観察され(SW-620およびHT-29細胞においてMOI 10で細胞増殖抑制性効果が観察された)、一方で他の3個の細胞株において細胞増殖は、試験した実験条件においてウイルス感染により影響されなかったので、H-1PV感染に対する結腸癌細胞株の低い許容性が明らかになった。図9A〜Dにおいて右側の文字a〜fは、a：未処理、b：MOI 0.05、c：MOI 0.5、d：MOI 1、e：MOI 5、f：MOI 10、g：MOI 50を意味する。
【図１０】図10：未処理または漸増ウイルスMOIを用いて感染させた前立腺癌細胞株の成長曲線。DU-145細胞は、MOI 5でウイルスを使用した場合、H-1PV感染に対して感受性を示し、一方でPC-3細胞は、ウイルス誘導性の効果に対してより抵抗性であると思われる。NCI-60パネルにおいて前立腺癌は、2個の細胞株のみで示されるので、この腫瘍型においてはH-1PV腫瘍崩壊潜在能力についてしっかりした結論を出すことができなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、肺癌を治療する方法における使用のためのパルボウイルスH1 (H-1PV)または関連のあるげっ歯類パルボウイルスを提供する。
【００１５】
用語「パルボウイルス」(または「パルボ治療剤(parvotherapeutic agent)」)は、本明細書で使用する場合、野生型またはその改変された複製コンピテント(replication-competent)誘導体を含む。パルボウイルスを活発に産生するために使用され得、かつ治療に有用な適切なパルボウイルスは、過度な経験的努力なく、本明細書中の開示に基づいて当該分野の技術内で容易に決定可能である。
【００１６】
本発明によると、組成物のパルボウイルスとしては、パルボウイルスH1 (H-1PV)、またはLuIII、マウスマイニュートウイルス(minute virus)(MMV)、マウスパルボウイルス(MPV)、ラットマイニュートウイルス(RMV)、ラットパルボウイルス(RPV)もしくはラットウイルス(RV)などの関連のあるパルボウイルスが挙げられる。
【００１７】
本発明によると、パルボウイルス(またはパルボ治療剤)は、有効用量で、薬学的に許容され得る担体と組み合されて存在する。「薬学的に許容され得る」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、投与された患者に対して毒性でない任意の担体を包含することを意味する。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝化食塩水溶液、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。かかる担体は、従来の方法により調製され得、有効用量で被験体に投与され得る。
【００１８】
「有効用量」は、疾患の経過および重症度に影響し、かかる病状の低減または寛解をもたらすのに充分な活性成分の量をいう。これらの疾患または障害の治療および/または予防に有用な「有効用量」は、当業者に公知の方法を使用して決定され得る。
【００１９】
さらなる薬学的に適合性の担体としては、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、治療剤を含む植え込み因子(implantation element)、または任意の他の適切なビヒクル、送達もしくは分配の手段もしくは材料(1つまたは複数)が挙げられ得る。
【００２０】
好ましい態様において、パルボウイルスは、化学療法剤と併用される。
【００２１】
投与は、種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内の投与により実施され得る。当然ながら、投与経路は、治療の種類および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。好ましい投与経路は静脈内投与である。パルボ治療剤(および化学療法剤)の投与計画(dosage regimen)は、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される具体的なパルボウイルス、細胞、化学療法剤等、投与の時間および経路、肺癌の型および特徴、患者の一般的な健康状態、ならびに患者が供されている他の薬物療法を含む患者データ、観察および他の臨床的な要因に基づいて、主治医により、当該分野の技術内で容易に決定可能である。
【００２２】
本発明によるパルボ治療剤(1つまたは複数)が、血液脳関門を通過する能力を有する感染性ウイルス粒子を含む場合は、治療は、パルボ治療剤、例えばH1ウイルスの静脈注射により行なわれ得るかまたは少なくとも開始され得る。好ましい投与経路は腫瘍内投与である。
【００２３】
長期間の静脈内治療は、パルボ治療剤に対する中和抗体の形成の結果、無効果になりやすいので、最初の静脈内ウイルス投与計画の後、異なる投与様式が適用され得るか、またはパルボウイルス治療の経過全体を通じて、かかる異なる投与技術、例えば腫瘍内ウイルス投与が代替的に使用され得る。
【００２４】
別の具体的な投与技術として、パルボ治療剤(ウイルス、ベクターおよび/または細胞剤)は、患者に植え込まれた供給源から患者へと投与され得る。例えばシリコーン製または他の生体適合性材料製のカテーテルを、例えば腫瘍除去中にまたは別の手順により患者に設置された小さな皮下レザバー(Rickhamレザバー)に連結し得、さらなる外科的介入なく、パルボ治療組成物を、種々の時点で局所的に注入させ得る。
【００２５】
パルボ治療剤または組成物の投与は、適切なポンプシステム、例えば蠕動輸液ポンプまたは対流増強送達(convection enhanced delivery)(CED)ポンプを使用して、植え込まれたカテーテルを介して低流速で、ウイルス粒子またはウイルス粒子を含む液体の連続輸液によっても実施され得る。
【００２６】
パルボ治療組成物のさらに別の投与方法は、パルボ治療剤を所望の癌組織に分配するように構築および配列された植え込まれた物品によるものである。例えば、パルボ治療組成物、例えばパルボウイルスH1を充填した(impregnated)オブラート(wafer)を使用することができ、ここで該オブラートは、外科的腫瘍除去の終わりに切除腔の端に取り付けられる。かかる治療介入には、多数のオブラートを使用し得る。パルボ治療剤、例えばパルボウイルスH1またはH1ベクターを活発に産生する細胞を、腫瘍または腫瘍除去後の腫瘍腔に注入し得る。
【００２７】
本発明によるパルボウイルスにより治療可能な患者としてはヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。後者の例としては、限定されることなく、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコなどの動物が挙げられる。
【００２８】
本発明の目的のためのパルボウイルスとの併用に有用な化学療法剤としては、腫瘍成長の阻害に有効な全ての化合物が挙げられる。化学療法剤の投与は、非経口および腸内経路による全身性(systemically)のものを含む種々の方法(上述参照)において達成され得る。好ましくは、パルボウイルスおよび化学療法剤は、別々の化合物として投与される。
【００２９】
さらに好ましい態様において、パルボウイルスは、化学療法剤の後に投与される。化学療法剤とパルボウイルスの投与の間の好ましい時間は、14〜35日である。
【００３０】
適切な化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレン-イミン化合物およびスルホン酸アルキル；代謝拮抗物質、例えば葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト、有糸分裂阻害剤、例えビンカアルカロイドおよびポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害性抗生物質；DNA発現を損傷または干渉する化合物；ならびに成長因子受容体アンタゴニストが挙げられる。併用療法に適した化学療法剤の具体的な例としては、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルおよびそれらの組合せが挙げられる。特に好ましい化学療法剤はゲムシタビンおよびテモゾロジン(Temozolodine)である。
【００３１】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００３２】
実施例1
材料および方法
(A) 細胞培養
NCI 60細胞株収集物に属する細胞株を、10% FCSおよび2mM L-グルタミンを補充したRPMI中、37℃の温度、5% CO2の雰囲気および90%の湿度で付着単層培養(adherent monolayer cultures)として培養した。
【００３３】
(B) ウイルス産生および滴定
血清および抗生物質非含有培地中に播種した細胞(10cmディッシュ中1×106細胞)にH-1PVを0.003pfu/細胞の感染多重度(multiplicity of infection)(MOI)で感染させて、野生型H-1PVをヒトNBK324K細胞で産生させた。10% FCSを補充した培地中37℃で細胞をさらに4時間培養した。その後、細胞を15cmディッシュに移し、細胞溶解が明白になるまで培養した。次いで、細胞を培地中に回収して、10mlのVTEバッファ(50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、pH8.7)中に溶解した。凍結融解サイクルを3回行い、細胞完全性を破壊し、-20℃での一晩のインキュベーション後、ウイルス懸濁物に15%/25%/40%/60%イオジキサノール溶液を重ねることにより精製勾配を生成した。その後、4℃で2時間、50,000 Kでの真空遠心分離を行い、シリンジを用いてイオジキサノール40%画分からウイルスを抽出した。
【００３４】
NBK324K細胞上のプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。細胞を、1ディッシュ当たり5x105細胞の密度で6cmディッシュに播種した。翌日、血清または抗生物質を有さずにH-1PVストックの連続希釈を含むMEM培地中、37℃で1時間、均等なウイルスの分布を確実にするように10分ごとに緩やかに振盪しながら細胞を感染させた。その後、ウイルス懸濁物を吸引して、5% FCSおよび0.65% BactoTMAgarを補充した5ml MEM中で5〜6日間細胞を培養した。0.18% Neutral Redおよび0.8% BactoTMAgarを含む3mlのPBS 1x溶液の添加後にプラーク形成を測定した。翌日、寒天層を除去し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定して、2回の測定からプラーク数を計数した。それによりH-1PV力価を1ml当たりのプラーク形成単位として表した。
【００３５】
(C) 細胞増殖/生存能力のリアルタイム検出
96ウェルE-プレート(Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germany)上に、4,000〜16,000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した(細胞倍加速度に従った)。24h〜72h後、0.05〜50pfu/細胞の感染多重度(MOI=pfu/細胞)の範囲(0、0.05、0.25、0.5、1、5、10および50)の漸増量のH-1PV野生型に細胞を感染させた。未処理およびH-1PV感染細胞の成長を、5〜7日間リアルタイムでモニタリングして、標準化した細胞指数(CI)、1ウェル当たりの付着した細胞数に比例するパラメータで表し、そのためにxCELLigence System (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germany)を使用した細胞増殖速度と厳密に相関した。細胞増殖を30分ごとにリアルタイムでモニタリングした。示された成長曲線は、相対的標準偏差と共に少なくとも3回の繰り返し(replicate)の平均を表す。懸濁増殖している白血病細胞株中の6個は、付着細胞株の成長のみをモニタリングし得るxCELLigenceシステムに適合性ではないので、スクリーニングから除外した。
【００３６】
(D) 乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイ
ウイルス感染の際の細胞溶解を決定するために、細胞を、10%熱不活性化FCSを補充した50μlの培養培地中、1,500〜6,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。翌日、血清または抗生物質を有さず、所望の濃度でH-1PVを含む50μlの培地を細胞の上部に添加した。処理後72〜96時間に、製造業者の指示に従ってCytoTox96(登録商標)非放射性細胞傷害アッセイ(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay) (Promega)を使用して、酵素標識イムノソルベント検定法(ELISA)プレートリーダーを492nmで使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を測定した。それぞれの実験条件について、7つ繰り返しを調製し、そのうちの3つを、洗剤の存在下で総細胞溶解を計算するために使用した。ウイルス処理の際の溶解した細胞のパーセンテージを、対応する培養物の全溶解後のLDH活性に対する試料中のLDH活性の割合として計算した。
【００３７】
(E) MTTアッセイ
LDH活性を測定した同じ細胞培養物(上述参照)を使用して、比色定量反応により、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム(MTT)の不溶性の紫色のホルマザン生成物への変換を測定することにより、細胞生存能力を評価した。この変換は活性ミトコンドリアデヒドロゲナーゼのみにより行われるので、このパラメータは、細胞増殖/生存能力の測定として使用され得る。10μlの5mg/ml MTTを50μlの培養試料に添加した。37℃で3時間のインキュベーション後、上清を吸引して、プレートを37℃で一晩乾燥させた。次いで、ホルマザン生成物を可溶化するために、細胞を、100μlのイソプロパノールを用いて20分間、緩やかに浸透しながらインキュベートし、ELISAプレートリーダーを595nmで使用して吸光度を測定した。処理した細胞の生存能力は、未処理の細胞の対応する吸光度(100%と規定)に対する測定された吸光度(1条件当たり4回の繰り返しの平均)の比として表した。
【００３８】
(F) NCI-60細胞株スクリーニングにおけるH-1PV感染に対するEC50値の測定
2工程データ分析アプローチ(Kinsner-Ovaskainen et al, 2013)を適用して、それぞれのNCI-60細胞株について、4個の感染後の時点24、48、72および96時間についてEC50値を導いた。該アプローチの工程1において、一元配置ANOVA後に対照「MOI 0 対 MOI 50」のpost hocダネット対照検定(Dunnett contrast testing) (Dunnett 1955)を行って、H-1PV量が標準化された細胞指数に対して一貫した効果を有するかどうかを評価した。(a) ANOVAにより、標準化された細胞指数に対してH-1PV量の全体的な効果が示されなかった場合(p>0.05)または(b) ANOVA (p≦0.05)後のpost hocダネット対照検定により全体的ではあるが一貫していない効果が明らかになった場合(p>0.05)、一貫した効果がないと結論付けられた。ケース(a)についてダネット対照検定は必要でなかったので行わなかった。工程1において一貫した効果がないことが見られた場合、NCI-60癌細胞株および感染後の時点のそれぞれの組合せについてEC50値は報告されなかった。そうではない場合、該アプローチの工程2において、4パラメータ対数-ロジスティックモデルを、NCI-60癌細胞株と感染後の時点のそれぞれの組合せについて得られた濃度-応答データ(濃度：H-1PV量、応答：標準化された細胞指数)に適合させることにより、EC50値をコンピューター計算した。標準化された細胞指数についての負の値は生物学的に意味を持たないので、4パラメータ対数-ロジスティックモデル関数のより低い漸近線は≧0に限定された。4つの状況：(1)推定されるEC50値が試験された最大H-1PV量(例えばMOI 50)を超えた場合、得られるEC50推定値は信頼性のないものとみなされたので報告されず；(2)適合された濃度-応答曲線のより低い漸近線cとより高い漸近線dの間の距離が小さすぎた場合(例えば、c > 0.7*dの場合)、標準化された細胞指数に対するH-1PV量の観察された効果は無関係であるとみなされたのでEC50推定値は報告されず；(3)生物学的観点から解釈できるものではない増加する濃度-応答曲線が対数-ロジスティックモデル適合から得られた場合；および(4)4パラメータ対数-ロジスティックモデル関数が濃度-応答データと適合できなかった場合、においてEC50値は報告されなかった。EC50コンピューター計算は、オープンソース統計学的ソフトウェア環境R、バージョン2.14.2(http://www.R-project.org)を用いて実行された(統計分析はSven Stanzel, Department of Statistics, DKFZ, Heidelbergによりなされた)。
【００３９】
実施例2
H-1PV細胞傷害性についてのNCI-60癌細胞株のスクリーニング
H-1PV細胞傷害性について感受性であることが推定される腫瘍を同定するために、異なる起源(黒色腫、肺癌、結腸癌、中枢神経系の癌、卵巣癌、腎臓癌、乳癌、白血病および前立腺癌)の腫瘍細胞株を含むNCI-60癌細胞株収集物をスクリーニングした。細胞を96ウェルEプレートに播種し、0.05〜50pfu/細胞の感染多重度[MOI=pfu/細胞]の範囲の漸増量のH-1PV野生型に感染させた。ウイルス媒介性の細胞変性および細胞増殖抑制性効果を反映する細胞の増殖(標準化された細胞指数、CIとして表される)を、合計で5〜7日間、xCELLigence System (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germany)を使用して30分ごとにリアルタイムでモニタリングした。
【００４０】
xCELLigence分析により得られたCI値を使用して、感染後の4つの時点(24、48、72および96時間)でEC50値(細胞集団の50%を殺傷するウイルスMOI)を測定した。この分析からの結果を表1に報告する。
【００４１】
表1
一元配置ANOVA後のpost hocダネット対照検定により、感染後の4つの時点でH-1PV EC50値を統計学的に算出した。H-1PVが標準化された細胞指数に対して一貫した効果を誘導できなかった場合または推定EC50値が試験された最大H-1PV量(MOI 50)を超えた場合は、値は測定されなかった(ND)。ウイルス誘導細胞傷害性に抵抗性の細胞株を明るい灰色で強調する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【００４２】
図1は、腫瘍型当たり2つの細胞株で得られた結果を示す(全パネルの結果を図3〜10に報告する)。種々の起源の37個の細胞株は、H-1PV感染性に対して高度に感受性であることが見出され(細胞増殖抑制性および細胞傷害性の効果はMOI≦10で観察された)、9個の細胞株は、感受性が低く(ウイルスをMOI 50で使用した場合にのみ殺傷された)、一方で7個の細胞株は、H-1PV感染に対して完全に無反応性であった(3個の結腸癌細胞株を含む)。興味深いことに、肺癌(腺癌、大細胞癌、扁平上皮および非小細胞肺癌)を有する患者由来の9個の細胞株のうちの8個(EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H460、NCI-H322M、NCI-H522)は、H-1PV感染に対して特に感受性であり、感染から48〜72時間後に既に低MOI(≦10)でウイルスにより効率的に殺傷され、一方で肺癌A549細胞は、50のウイルスMOIで殺傷された(図3)。一般的に、分析された全ての細胞株中、肺癌由来のものは、パルボウイルス治療に対して最も感受性であった。
【００４３】
黒色腫および乳癌を有する患者由来の細胞株はまた、H-1PV細胞傷害性に対して高度に感受性であり、腫瘍型当たりわずか1細胞株が完全に無反応性であった(LOX IMVI黒色腫細胞および乳癌細胞株MCF7)(図4および5)。これらの結果により以前に公開された結果が確認され(Moehler et al, 2005; Muharram et al, 2010)、乳癌および黒色腫は、H-1PV腫瘍崩壊の可能性のある標的であり得ることが示唆された。肺癌、黒色腫および乳癌由来細胞株において観察されるウイルス誘導性細胞傷害性の効果は、感染の24時間後にこれらの細胞に高いかまたは中位の有効性で形質導入するウイルスの能力と相関した(データは示さず)。以前の結果(Geletneky et al, 2005; Herrero et al, 2004)と一致して、CNS起源の腫瘍(グリア芽腫、神経膠肉腫)、星状細胞腫由来の細胞株は、H-1PV感染に対して高度に感受性であった(全ての細胞株は、48〜72時間後に低MOIでウイルスにより殺傷された)(図6)。卵巣癌細胞株は、H-1PV腫瘍傷害性に対して中位〜低い感受性を示し、7個のうち4個の細胞株(OVCAR-8、SK-OV-3、OVCAR-4、NCI/ADR-RES)はMOI≦10で感受性であり、1個の細胞株(IGR-OV1)は、24時間後にMOI 50で感受性であり、一方で、2個の細胞株は抵抗性であった(OVCAR-3およびOVCAR-5)(図7)。腎臓癌由来細胞において同様の大略(profile)が観察され、その中でACHN、CAKI-1、UO-31およびTK-10細胞株は、50pfu/細胞のMOIを使用して24時間後に効率的に殺傷され得たが、一方で他の4個の細胞株(786-O、A498、RFX 393、SN12C)は、MOI≦10で感受性であった(図8)。一方、結腸癌由来の細胞株は、パルボウイルス細胞傷害性に対して特に抵抗性であり、3個の細胞株は完全に無反応性であり(HCT-15、HCC-2998、COLO 205)、2個の細胞株(HCT-116およびHT-29)は、24〜48時間後にMOI 50でウイルスにより殺傷され、一方で他の2個の細胞株(KM12およびSW-620)においては、細胞増殖抑制性/細胞傷害性の効果は、MOI≦10でウイルスを使用した場合に観察され得た(図9)。H-1PV腫瘍崩壊に対する許容性腫瘍実体または抵抗性腫瘍実体としての前立腺癌の分類は、パネルにこの起源の2個の細胞株しか含まれず、1つ(DU-145)はMOI 5で感受性を示し、もう1つ(PC-3)においては細胞傷害性効果を誘導するために50pfu/細胞のMOIを必要としたので可能ではなかった(図10)。
【００４４】
実施例3
LDHおよびMTTアッセイにより肺癌および黒色腫に由来する細胞株のH-1PV感染に対する感受性を確認する
xCELLigenceシステムを用いて得られた結果を確認するために、LDHおよびMTTアッセイ(細胞溶解および細胞生存能力のそれぞれを測定する)を、H-1PV腫瘍崩壊に対する感受性が高いために選択された肺癌および黒色腫の細胞株において実施した。細胞を96ウェルプレート中で培養(plated)し、漸増濃度のH-1PV(0、1、5および50pfu/細胞のMOI)に感染させ、次いで感染の48時間後にLDHおよびMTTについて処理した。図2に示すように、肺癌および黒色腫由来の両方の細胞株はH-1PV細胞傷害性に対して高い感受性を示した。
【００４５】
要するに、NCI-60パネルのスクリーニングにより、乳癌、黒色腫およびCNS由来の癌細胞株のH-1PV腫瘍傷害性に対する感受性が確認され、肺腫瘍がH-1PV腫瘍崩壊の新規の可能性のある標的を示し得、一方で結腸癌細胞株は、この細胞株パネルにおいてウイルス細胞傷害性に対して最も抵抗性であることが初めて示された。
【００４６】
参照文献の一覧
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2019508058.tif 000009
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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