(57)【要約】本開示は、固形腫瘍を治療する方法に関し、当該方法は、ＣＤ２５に対する抗体の使用を伴う。特に、ＣＤ２５に対する抗体は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるように最適化される。本発明はまた、新規の抗ＣＤ２５抗体、及び当該抗ＣＤ２５抗体と、免疫チェックポイント阻害薬、がん抗原または抑制型Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を標的にする化合物などの他の抗がん薬との組み合わせを提供する。【選択図】図１６Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有するヒト対象を治療する方法であって、抗ＣＤ２５抗体を対象に投与するステップを含み、前記対象は、固形腫瘍を有し、前記抗ＣＤ２５抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａから選択される少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ＩｇＧ１抗体である、前記方法。
【請求項２】
前記抗ＣＤ２５抗体が、ＣＤ２５に対して、１０−８Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有し、かつ／または少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に対して、約１０−６Ｍ未満の解離定数を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＣＤ２５抗体が、
（ａ）抑制型に対する活性化型の比（Ａ／Ｉ）が１を上回る状態でＦｃγ受容体に結合し、かつ／または
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂに対する結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａのうちの少なくとも１つに結合する、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＣＤ２５抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＣＤ２５抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＣＤ２５抗体が、向上したＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰ応答、好ましくは、増大したＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰ応答、より好ましくは、増大したＡＤＣＣ応答を誘導する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＣＤ２５抗体が、定着腫瘍を有する対象に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固形腫瘍を有する対象を特定するステップを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象に免疫チェックポイント阻害薬を投与することを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫チェックポイント阻害薬がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される抗ＣＤ２５抗体。
【請求項１３】
ヒト対象のがんの治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に定義される抗ＣＤ２５抗体であって、前記対象は、固形腫瘍を有する、前記抗ＣＤ２５抗体。
【請求項１４】
ヒト対象のがんを治療するための薬剤の製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に定義される抗ＣＤ２５抗体の使用であって、前記対象は、固形腫瘍を有する、前記使用。
【請求項１５】
免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与するためのものである、請求項１３に記載の使用または請求項１３に記載の使用のための抗ＣＤ２５抗体。
【請求項１６】
前記免疫チェックポイント阻害薬がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項１５に記載の使用または請求項１４に記載の使用のための抗ＣＤ２５抗体。
【請求項１７】
ヒト対象のがんの治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に定義される抗ＣＤ２５抗体と、請求項９〜１１のいずれか一項に定義される免疫チェックポイント阻害薬との組み合わせであって、前記対象は、固形腫瘍を有し、前記抗ＣＤ２５抗体及び前記ＰＤ−１アンタゴニストは、同時に、個別に、または連続して投与される、前記組み合わせ。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される抗ＣＤ２５抗体と、請求項９〜１１のいずれか一項に定義される免疫チェックポイント阻害薬とを含む、がんの治療に使用するためのキット。
【請求項１９】
薬学的に許容される媒体中に、抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
（ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分と
を含む、二重特異性抗体であって、
前記二重特異性抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａから選択される少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ＩｇＧ１抗体である、前記二重特異性抗体。
【請求項２１】
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＬＬＴ１、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７及びＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項２０に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
前記免疫チェックポイントタンパク質が腫瘍細胞上に発現される、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
前記免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ−Ｌ１である、請求項２１または２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記第２の抗原結合部分がアテゾリズマブ中に含まれているものである、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のいずれか一項に定義される二重特異性抗体を対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法。
【請求項２６】
前記対象が固形腫瘍を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象のがんの治療に使用するための、請求項１９〜２４のいずれか一項に定義される二重特異性抗体。
【請求項２８】
前記対象が固形腫瘍を有する、請求項２７に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項２９】
対象の固形腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、前記対象に抗ＣＤ２５抗体を投与するステップを含み、前記抗体は、請求項１〜６のいずれか一項に定義されるものである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん免疫療法の分野のものであり、固形腫瘍を治療する方法を含む、がんを治療する方法に関し、当該方法は、ＣＤ２５に対する抗体の使用を伴う。
【背景技術】
【０００２】
がん免疫療法は、がんを治療または予防するために、対象自身の免疫系を使用することによって行われる。免疫療法は、多くの場合、免疫系によって検出され得るがん細胞の表面上の分子がわずかに異なるという事実を利用する。これらの分子、すなわち、がん抗原は、最も一般的にはタンパク質であるが、炭水化物などの分子を含むこともある。したがって、免疫療法は、これらの標的抗原を介して腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を誘導することを伴う。しかしながら、悪性腫瘍、特に、固形腫瘍は、腫瘍細胞に固有であり、かつ腫瘍微小環境の構成要素によって媒介される様々な機構によって、免疫監視を回避することができる。腫瘍微小環境の構成要素のなかでも、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞またはＴｒｅｇ）による腫瘍浸潤、より具体的には、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とＴｒｅｇの望ましくないバランス（すなわち、Ｔｒｅｇに対するＴｅｆｆの比率が低い）が重要な因子として提案されている（Ｓｍｙｔｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９２，４７３−４）。
【０００３】
この発見以来、Ｔｒｅｇは、免疫恒常性を左右すること、ならびに末梢性免疫寛容の確立及び維持を促進することに重要であることが判明している。しかしながら、その役割は、がんとの関係において、より複雑である。がん細胞は、自己抗原と腫瘍関連抗原の両方を発現するので、エフェクター細胞応答を弱めるようとするＴｒｅｇの存在は、腫瘍進行の一因となり得る。したがって、定着腫瘍におけるＴｒｅｇの浸潤は、効果的な抗腫瘍応答及び全般的ながん治療に対する主な障害の１つとなっている。Ｔｒｅｇが活用する抑制機構は、現行の治療法、特に、抗腫瘍応答の誘導または強化に依存している免疫療法に制限をもたらし、更には失敗させる、大きな原因であると考えられる（Ｏｎｉｓｈｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ；，２０１２  Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．３２，９９７−１００３）。
【０００４】
がんを治療するための治療アプローチとしてのＴｒｅｇの枯渇は、Ｔｒｅｇがネズミモデルにおける腫瘍の確立及び進行の一因となることを示した研究によって裏付けられているアプローチである。更に、Ｔｒｅｇによる腫瘍浸潤は、いくつかのヒトがんにおいて、予後不良とも関連している（Ｓｈａｎｇ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．５：１５１７９）。しかしながら、腫瘍におけるＴｒｅｇの枯渇は複雑であり、この分野における研究結果には矛盾が生じている。そのため、当該技術分野では、Ｔｒｅｇの枯渇を伴う、がんの治療法が必要とされている。
【０００５】
Ｔｒｅｇの枯渇を達成する可能性のある分子標的のなかでも、ＩＬ−２／ＣＤ２５相互作用は、ネズミモデルでの一部の研究の対象となっており、そのうちのいくつかは、ラット抗マウスＣＤ２５抗体であるＰＣ６１の使用を含んでいる（Ｓｅｔｉａｄｙ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：７８０−６）。この抗体のＣＤ２５結合及び機能的活性については、様々な著者によって作製されたモノクローナル抗体パネルのものと比較されている（Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ  Ｊ．Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，３９８８−３９９４；Ｍｏｒｅａｕ，Ｊ．−Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，９２９−９３５；Ｖｏｌｋ  ＨＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７６，１２１−５；Ｄａｎｔａｌ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５２：１１０−５）。
【０００６】
このような方法で、マウスＩＬ−２結合部位とは異なるまたは共通している、当該標的内の抗マウスＣＤ２５の３つのエピトープが特徴付けられた。ＰＣ６１（マウスＩｇＧ１アイソタイプを有する）は、ＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを遮断または阻害し、抗マウスＣＤ２５抗体（抗ヒトＣＤ２５抗体として開示されているもののほとんど；例えば、ＷＯ２００４／０４５５１２、ＷＯ２００６／１０８６７０、ＷＯ１９９３／０１１２３８及びＷＯ１９９０／００７８６１参照）の他の多くのハイブリドーマも同様である。更に、マウスＣＤ２５へのＰＣ６１の結合は、７Ｄ４などの他の抗マウスＣＤ２５抗体の場合と同様に、ＩＬ−２結合部位におけるＣＤ２５のＡＤＰリボース化による影響を受けない（Ｔｅｅｇｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：８９５９）。
【０００７】
一部の文献は、がんまたはＴｒｅｇ枯渇に関連して、抗ＣＤ２５を単独でまたは組み合わせて使用することに言及している（ＷＯ２００４／０７４４３７；ＷＯ２００６／１０８６７０；ＷＯ２００６／０５０１７２；ＷＯ２０１１／０７７２４５；ＷＯ２０１６／０２１７２０；ＷＯ２００４／０４５５１２；Ｇｒａｕｅｒ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１２１：９５−１０５）。しかしながら、がんのマウスモデルで試験すると、ラット抗マウスＣＤ２５  ＰＣ６１は、腫瘍確立後に送達した場合、抗腫瘍活性を示さなかった。
【０００８】
自己免疫のネズミモデルの場合では、抗ＣＤ２５  ＰＣ６１抗体を更に操作して、ＩＬ−２受容体の遮断及び末梢Ｔｒｅｇの枯渇に対する、抗ＣＤ２５抗体の大幅に異なるＦｃエフェクター機能の作用について評価された（Ｈｕｓｓ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２７６−８６）。しかしながら、ＰＣ６１（それ自体として、操作された抗体として、またはマウスＣＤ２５に対するＰＣ６１と同様のＣＤ２５結合特徴を有するように設計され、もしくは特徴付けられた抗ヒトＣＤ２５として）に関して、単独または他の抗体もしくは抗がん化合物との組み合わせで、腫瘍中のＴｒｅｇを枯渇させる能力または抗腫瘍治療活性を媒介する能力については、評価されていない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、Ｔｒｅｇを特に腫瘍内で効率的に枯渇させる構造要素を特徴とする、新規抗ＣＤ２５抗体及び抗ＣＤ２５抗体の新規使用を提供する。本目的において、単独または他の抗がん剤との組み合わせにおけるＴｒｅｇ枯渇としての使用及び腫瘍に対する有効性という点で驚くほど改善された特徴を呈する抗体を提供するために、ラットＩｇＧ１  ＰＣ−６１（マウスＣＤ２５に関して記載されているもの）の構造上及び機能上の特徴を変更した。これらの知見を使用して、ヒト対象の腫瘍に対して同等の効果を提供する新しい抗ヒトＣＤ２５を定義し、作製することができる。
【００１０】
したがって、発明者らによる重要な発見は、抗マウス抗ＣＤ２５  ＰＣ６１が、リンパ節及び循環中のＴｒｅｇは枯渇させられるのに対し、腫瘍内ではＴｒｅｇを枯渇させられないという予期しない知見である。腫瘍におけるＴｒｅｇ枯渇の欠如は、抗腫瘍活性の欠如と相関する。この新しい予期せぬデータに促され、発明者らは、腫瘍内Ｔｒｅｇの強力な枯渇及び抗腫瘍活性をもたらすＦｃ操作によって、抗マウスＣＤ２５の枯渇活性を増大させた。
【００１１】
主要な態様において、本発明は、がんを有するヒト対象を治療する方法であって、抗ＣＤ２５抗体を対象に投与するステップを含み、当該対象は、腫瘍（好ましくは、固形腫瘍）を有し、当該抗ＣＤ２５抗体は、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体（好ましくは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａから選択される）に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ＩｇＧ１抗体である、方法を提供する。
【００１２】
このような抗体は、好ましくは、ＣＤ２５に対して、１０−８Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有し、かつ／または少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に対して、約１０−６Ｍ未満の解離定数を有する。最も好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、Ｆｃγ受容体に関する他の特徴、特に、
（ａ）抑制型に対する活性化型の比（Ａ／Ｉ）が１を上回る状態でＦｃγ受容体に結合し、かつ／または
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂに対する結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａのうちの少なくとも１つに結合することを特徴とする。
治療方法において抗ＣＤ２５抗体を使用することを想定する場合、更に好ましい特徴を呈することができる。抗ＣＤ２５抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、特に、ヒト抗体またはヒト化抗体である。更に、免疫細胞及び／またはその活性を発揮するための免疫系構成要素の他の構成要素との相互作用を考慮して、抗ＣＤ２５抗体は、向上したＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰ応答、好ましくは、増大したＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰ応答、より好ましくは、増大したＡＤＣＣ応答を更に誘導し得る。
【００１３】
本発明の抗ＣＤ２５抗体（上で概ね定義され、「発明を実施するための形態」において詳述されるもの）は、ヒト対象を治療する方法において使用することができ、当該抗ＣＤ２５抗体は、定着した固形腫瘍を有する対象に投与される（好ましくは、固形腫瘍を有する対象を特定するステップを更に含む方法において）。このような方法は、当該対象に免疫チェックポイント阻害薬を、例えば、抗体結合の形態で、投与することと、免疫チェックポイントタンパク質を阻害することを更に含み得る。好ましい免疫チェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１アンタゴニストであり、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり得る。より一般的には、抗ＣＤ２５抗体は、対象の固形腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、当該抗ＣＤ２５抗体を当該対象に投与するステップを含む方法において使用することができる。
【００１４】
更なる態様において、本発明の抗ＣＤ２５抗体は、ヒト対象のがんを治療するための薬剤の製造に使用することができ、当該対象は、固形腫瘍を有する。この目的において、当該抗体は、免疫チェックポイント阻害薬、好ましくは、ＰＤ−１アンタゴニストと組み合わせて投与するためのものである。
【００１５】
更なる態様において、本発明は、ヒト対象のがんの治療に使用するための、上に定義される抗ＣＤ２５抗体と別の抗がん化合物（好ましくは、「発明を実施するための形態」に示される免疫チェックポイント阻害薬または他の化合物）との組み合わせを提供し、当該対象は、固形腫瘍を有し、抗ＣＤ２５抗体及び抗がん化合物（例えば、ＰＤ−１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害薬）は、同時に、個別に、または連続して投与される。この目的において、本発明はまた、上に定義される抗ＣＤ２５抗体と、抗がん化合物（例えば、ＰＤ−１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害薬）とを含む、がんの治療に使用するためのキットを提供する。
【００１６】
更なる態様において、本発明はまた、薬学的に許容される媒体中に、上に定義される抗ＣＤ２５抗体を含む、医薬組成物を提供する。このような組成物は、抗がん化合物（例えば、ＰＤ−１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害薬）も含み得る。
【００１７】
なお更なる態様において、本発明はまた、
（ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｂ）別の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗体であって、
二重特異性抗体は、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ＩｇＧ１抗体である、二重特異性抗体を提供する。好ましくは、かかる第２の抗原結合部分は、免疫チェックポイントタンパク質、腫瘍関連抗原から選択される抗原に結合するか、抗ヒト活性化型Ｆｃ受容体抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩｃまたは抗ＦｃγＲＩＩＩａ抗体）であるか（または当該抗体をベースにするか）、抗ヒトＦｃγＲＩＩｂアンタゴニスト抗体である（または当該抗体をベースにする）。
【００１８】
好ましくは、このような二重特異性抗体は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＬＬＴ１、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７及びＩＣＯＳからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質に結合する、第２の抗原結合部分を含む。このような免疫チェックポイントタンパク質は、好ましくは、腫瘍細胞上に発現され、最も好ましくは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４から選択される。免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分は、免疫チェックポイント阻害薬として作用する市販の抗体に含まれるものであってもよいし、それをベースにしてもよく、例えば、
（ａ）ＰＤ−１の場合、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブまたはペンブロリズマブであり得、
（ｂ）ＰＤ−Ｌ１の場合、抗ＰＤ−Ｌ１は、アテゾリズマブであり、
（ｃ）ＣＴＬＡ−４の場合、抗ＣＴＬＡ−４は、イピリムマブである。
このような二重特異性抗体は、デュオボディ、ＢｉＴＥ  ＤＡＲＴ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ノブ・イントゥ・ホール、トリオマブまたは二重特異性抗体及びその断片の他の適切な分子フォーマットを含む、任意の市販のフォーマットで提供され得る。
【００１９】
あるいは、このような二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む。この代替的実施形態において、このような抗原及び対応する抗体には、限定するものではないが、ＣＤ２２（ブリナツモマブ）、ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ）、ＣＤ５６（ロルボツズマブ）、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ（ラベツズマブ）、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）、ＣＤ２２１／ＩＧＦ１Ｒ（ＭＫ−０６４６）、ＣＤ３２６／Ｅｐｃａｍ（エドレコロマブ）、ＣＤ３４０／ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ）及びＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）が挙げられる。
【００２０】
本発明の抗ＣＤ２５抗体と別の抗がん化合物の組み合わせ、または上に定義される二重特異性抗体は、特に、対象が固形腫瘍を有するとき、かつ対象のがんの治療に使用するために、当該組み合わせまたは当該二重特異性抗体を対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法において使用することができる。
【００２１】
本発明の更なる目的は、本発明の抗ヒトＣＤ２５抗体、及びがんを治療する方法、医薬組成物、他の抗がん化合物との組み合わせ、二重特異性抗体におけるその使用に関する更なる定義を含め、「発明を実施するための形態」及び「実施例」に記載される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、対象のがん、特に固形腫瘍を治療または予防する方法であって、ＣＤ２５に結合する抗体を当該対象に投与するステップを含み、抗ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇを特に腫瘍内で効率的に枯渇させる構造要素を特徴とする、方法を提供する。本発明はまた、がん、特に固形腫瘍の治療または予防に使用するための、本発明に定義される、ＣＤ２５に結合する抗体を提供する。あるいは、本発明は、がん、特に固形腫瘍を治療または予防するための薬剤の製造のための、ＣＤ２５に結合し、Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させる抗体の使用を提供する。本発明はまた、がん、特に固形腫瘍の治療または予防における、ＣＤ２５に結合し、Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させる抗体の使用を提供する。
【００２３】
本発明は、どのようにして抗ＣＤ２５抗体のアイソタイプ（ラット抗マウスＣＤ２５抗体ＰＣ６１によって例示されるもの）を枯渇型アイソタイプ（ＰＣ６１の場合、マウスＩｇＧ２であるが、ヒトにおいてＩｇＧ１に相当する）に切り替えて、固形腫瘍の状況において制御性Ｔ細胞の枯渇を改善させるかを開示する。更に、本発明者らは、ＣＤ２５が、治療的状況、例えば、定着した固形腫瘍において、制御性Ｔ細胞を枯渇させるための標的になり得、ＣＤ２５が、制御性Ｔ細胞に優先的に発現しているということを初めて見出した。本発明者らは、活性化型Ｆｃγ受容体への結合を向上させた操作された抗ＣＤ２５抗体が、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞の効果的な枯渇をもたらし、例えば、他のがん標的化合物、例えば、免疫チェックポイントタンパク質、腫瘍関連抗原または抑制型Ｆｃγ受容体を標的にするものなどと関係付けることができる治療アプローチ（二重特異性抗体との組み合わせ、または二重特異性抗体中）になることを見出した。
【００２４】
本発明者らはまた、抑制型Ｆｃγ受容体ＩＩｂが腫瘍部位で上方制御されていることで、元の抗マウスＣＤ２５抗体ＰＣ６１による効果的な腫瘍内制御性Ｔ細胞の枯渇が阻害されているということを初めて見出した。したがって、本発明は、ＣＤ２５及びＦｃγ受容体ＩＩｂを標的にすること含む併用アプローチを伴う、治療用途を包含する。
【００２５】
ＣＤ２５は、ＩＬ−２受容体のα鎖であり、活性化Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、いくつかの胸腺細胞、骨髄前駆細胞及び希突起膠細胞上に認められる。ＣＤ２５は、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２と会合し、ＩＬ−２の高親和性受容体として作用するヘテロ三量体を形成する。ヒトＣＤ２５のコンセンサス配列を以下の配列番号１に示す（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１５８９；アミノ酸２２〜２４０に対応する成熟ヒトＣＤ２５細胞外ドメインを下線で示し、配列番号２に示す）。
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【００２６】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ２５に結合する抗体」は、ＩＬ−２受容体のＣＤ２５サブユニットに結合することができる抗体を指す。このサブユニットは、ＩＬ−２受容体のαサブユニットとしても知られている。このような抗体は、本明細書中、「抗ＣＤ２５抗体」とも呼ばれる。
【００２７】
抗ＣＤ２５抗体は、ＩＬ−２受容体のＣＤ２５サブユニット（抗原）に特異的に結合することができる抗体である。「特異的結合」、「特異的に結合」及び「特異的に結合する」は、抗体が、目的の抗原に対して、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有することを意味するものと理解される。好ましい実施形態において、解離定数は、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍの範囲である。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子、及び抗原結合部位を含むその断片の両方を指す。これらには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作された抗体及び別様に改変された形態の抗体が含まれ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート及び／または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリボディ及びテトラボディ）、ならびに抗体の抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｌｇＧ、ポリペプチド−Ｆｃ融合体、単鎖バリアント（ｓｃＦｖ断片、ＶＨＨ、トランスボディ（登録商標）、アフィボディ（登録商標）、サメ単一ドメイン抗体、単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、アンチカリン（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、二環式ペプチド及び他の代替的免疫グロブリンタンパク質足場）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体は、天然に産生される場合には有し得る共有結合修飾（例えば、グリカンの付加）を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、検出可能部分、治療部分、触媒部分、または抗体の安定性もしくは投与を改善するポリエチレングリコールなどの他の化学基の付加）を含有してもよい。「抗体」は、ラクダ抗体（重鎖のみの抗体）及びアンチカリンなどの抗体様分子も指し得る（Ｓｋｅｒｒａ（２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７５，２６７７−８３）。いくつかの実施形態において、抗体は、各々が単一の抗体配列に関連付けられ、抗原内の大なり小なり異なるエピトープ（様々な参照抗ヒトＣＤ２５抗体に結合する、ヒトＣＤ２５細胞外ドメイン内の異なるエピトープなど）に結合する、抗体パネルとして作製されたポリクローナルまたはオリゴクローナルである。ポリクローナル抗体またはオリゴクローナル抗体は、文献に記載されているように、医学的使用のための単一調製物で提供することができる（Ｋｅａｒｎｓ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１４：１６２５−３６）。
【００２９】
本発明の一態様において、抗体は、モノクローナルである。抗体は、追加的または代替的に、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。更なる態様において、抗体は、ヒト抗体であり、いずれにせよ、ヒト対象における使用及び投与が可能なフォーマット及び特徴を有する抗体である。
【００３０】
抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造上の特徴を有する糖タンパク質である。免疫グロブリンは、ｌｇＡ、ｌｇＤ、ｌｇＧ、ｌｇＥまたはｌｇＭなどの任意のクラスに由来し得る。免疫グロブリンは、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３またはｌｇＧ４などの任意のサブクラスであり得る。本発明の好ましい態様において、抗ＣＤ２５抗体は、ＩｇＧクラス、好ましくは、ｌｇＧ１サブクラスに由来する。一態様において、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトｌｇＧ１サブクラスに由来する。
【００３１】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、いくつかの細胞のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用して、下流のエフェクター機構を刺激し、制御する。５つの活性化型受容体、すなわち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）と、１つの抑制型受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）がある。ＩｇＧ抗体と免疫系との連絡は、特に生物学的製剤の場合、抗体によって感知及び収集される情報を免疫系に中継し、自然免疫系と適応免疫系との間の連係をもたらすＦｃγＲによって制御及び媒介される（Ｈａｙｅｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ  ９：２０９−２１９）。
【００３２】
ＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに結合する能力が異なり、この結合の差が一連の機能的応答を誘導する能力を決定する。例えば、ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化に関与する主な受容体であり、この受容体に対して最も高い親和性を示し、ＡＤＣＣを強力に誘導する能力をもたらすのは、ＩｇＧ３であり、そのすぐ後にＩｇＧ１が続く。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、ＦｃγＲに高親和性で結合し、好ましくは、活性化型受容体に高親和性で結合する。好ましくは、抗体は、ＦｃγＲＩ及び／またはＦｃγＲＩＩａ及び／またはＦｃγＲＩＩＩａに高親和性で結合する。具体的な実施形態において、抗体は、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満の解離定数でＦｃγＲに結合する。
【００３４】
一態様において、抗体は、少なくとも１つのＦｃ活性化型受容体に結合することができる、ＩｇＧ１抗体、好ましくは、ヒトＩｇＧ１抗体である。例えば、抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂから選択される１つ以上の受容体に結合し得る。一態様において、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合することができる。一態様において、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩａに結合することができ、任意選択によりＦｃγＲＩに結合することができる。一態様において、抗体は、これらの受容体に、高親和性、例えば、約１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満の解離定数で結合することができる。
【００３５】
一態様において、抗体は、抑制型受容体ＦｃγＲＩＩｂに低親和性で結合する。一態様において、抗体は、ＦｃγＲＩＩｂに、１０−７Ｍ超、１０−６Ｍ超または１０−５Ｍ超の解離定数で結合する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、抗ヒトＣＤ２５抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスに由来し、好ましくは、本明細書で論じられるように、特に、ヒト起源の細胞に関して、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰ活性を有する。実際に、先に記載されているように（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０：１５１０−２）、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプに相当）は、全てのＦｃγＲサブタイプに結合するが、抑制型に対する活性化型の比（Ａ／Ｉ）が高く、少なくとも１を超える。対照的に、他のアイソタイプ（ｒＩｇＧ１アイソタイプなど）は、１つの活性化型ＦｃγＲのみ（ＦｃγＲＩＩＩ）及び抑制型ＦｃγＲＩＩｂに同等の親和性で結合することから、Ａ／Ｉ比が低い（＜１）。実施例において示されるように、この低Ａ／Ｉ比は、腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇の低さ及びアイソタイプの抗腫瘍治療活性の低さに相関する。
【００３７】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５に、好ましくは、高親和性で結合する。更に好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、上に示されるように、ヒトＣＤ２５の細胞外領域に結合する。一態様において、本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体を提供する。特に、実施例は、ＰＣ−６１．５．３ハイブリドーマによって分泌され、ＰＣ６１またはＰＣ−６１のいずれかとして概ね特定された抗体を用いて生成された実験データを提供する。文献（例えば、Ｓｅｔｉａｄｙ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：７８０−６；ＭｃＮｅｉｌｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：６３−９；Ｔｅｅｇｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：８９５９）中のＰＣ−６１及びマウスＣＤ２５を含むアッセイは、実施例に開示されるもの（ＰＣ６１のＣＤ２５結合ドメインを含む組み換え抗体を含む）とともに、実施例に記載されるように適切なアイソタイプと関連付けられたときのＣＤ２５との相互作用レベル（特に、ＩＬ−２結合を遮断することによる）及びＦｃγ受容体との相互作用レベル（特に、好ましくは、ヒト活性化型Ｆｃγ受容体に結合し、Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させることによる）の両方で、ＰＣ６１と同じ機能的特徴を有するヒトＣＤ２５を認識するヒト抗体を特徴付けられるように、適合させてもよい。本明細書に記載される抗体の所望の機能的特徴を達成するのに適した方法は、当業者に知られている。
【００３８】
好ましい実施形態において、がんを有するヒト対象を治療する方法は、抗ＣＤ２５抗体を対象に投与するステップを含み、当該対象は、好ましくは、固形腫瘍を有し、当該抗ＣＤ２５抗体は、好ましくは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）から選択される少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ヒトＩｇＧ１抗体である。好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５に対して、１０−８Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。より好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５に結合し、マウスＣＤ２５と同様に、ＩＬ−２結合及びＴｒｅｇ枯渇に作用する。更なる実施形態において、抗ＣＤ２５抗体は、抑制型に対する活性化型の比（Ａ／Ｉ）が１を上回る状態でＦｃγ受容体に結合し、かつ／またはＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）に対する結合よりも高い親和性でＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に結合する。
【００３９】
ＰＣ−６１抗体のＣＤ２５結合ドメインは、クローン化され、適切な定常領域と融合された組み換えタンパク質として発現されている。任意の適切な技術（例えば、ＣＤ２５で免疫化されたげっ歯類に由来するハイブリドーマパネルを増殖させるか、組み換え抗体ライブラリーを作製した後、本明細書に記載されるような機能的特徴付けについて、ＣＤ２５断片を含むこれらの抗体レパートリーをスクリーニングすることによる）によって作製及びスクリーニングされた抗ＣＤ２５抗体候補を比較するために、ＰＣ−６１抗体のＣＤ２５結合ドメインの配列を使用することができ、ＣＤ２５細胞外ドメイン内の別個のエピトープに対する特異性及び／またはその他の機能的活性も同様である。その結果として特定される抗ＣＤ２５抗体は、本明細書に記載される組み換え抗体、特に、完全抗体または断片もしくはバリアントとして産生することもできる。
【００４０】
天然抗体及び免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽鎖（Ｌ）と２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これにいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、カルボキシ末端に定常ドメインを有する。
【００４１】
可変領域は、構造上相補的である抗原標的と相互作用することができ、異なる抗原特異性を持つ抗体とはアミノ酸配列の相違によって特徴付けられる。Ｈ鎖またはＬ鎖は、どちらの可変領域も、抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらの配列内には、特異性が異なる抗体間で極端に可変であることから、「超可変」と呼ばれる更に小さい配列がある。このような超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域とも呼ばれる。
【００４２】
これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性を担う。ＣＤＲは、可変領域内の非連続的なアミノ酸ストレッチであるが、可変重鎖及び可変軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置は、種にかかわらず、可変鎖のアミノ酸配列内で類似の位置を持つことがわかっている。全ての抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は、それぞれ３つのＣＤＲ領域を有し、その各々は、各軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）の他のもの（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれる）と連続していない。一般に認められているＣＤＲ領域は、先に記載されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５２，６６０９−６６１６）。
【００４３】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）ならびにＴｒｅｇ細胞の標的化、増殖阻害及び／または枯渇を可能にする任意の他の機構を介して機能し得る。
【００４４】
「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における、本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。
【００４５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、これにより、標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。
【００４６】
「抗体依存性細胞食作用」（ＡＤＣＰ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する食細胞（マクロファージなど）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、これにより、標的細胞の食作用をもたらす、細胞媒介性反応を指す。
【００４７】
ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、当該技術分野において知られ、かつ利用可能であるアッセイを使用して測定することができる（Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６）。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害及び食作用を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、本明細書で論じられるように、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害／食作用を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択され得る。
【００４８】
本明細書で論じられるように、本発明の実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇をもたらす抗ＣＤ２５抗体が使用される。例えば、強力なＣＤＣ応答及び／または強力なＡＤＣＣ及び／または強力なＡＤＣＰ応答を誘導する抗ＣＤ２５抗体を使用することができる。ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰを増大させる方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ＣＤＣ応答は、Ｃ１ｑ結合の親和性を高める抗体の変異により増大し得る（ｌｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ  １６６，２５７１−５）。
【００４９】
ＡＤＣＣは、ＹＢ２／０細胞株で抗体を産生することなどにより抗体グリカンからフコース部分を除去する方法によって、またはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に特異的変異（例えば、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）を導入することによって増大し得る（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３，２００５−２０１０；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，６１８１−６）。ＡＤＣＰは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に特異的変異を導入することによって増大し得る（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７，２５１７−２７）。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、ＡＤＣＣ応答を有するように最適化され、すなわち、他の抗ＣＤ２５抗体または例示的な修飾されていない抗ＣＤ２５モノクローナル抗体と比較して、ＡＤＣＣ応答が向上、増大または改善されている。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「キメラ抗体」は、ラットまたはマウス抗体などの１つの種に由来する免疫グロブリンから得られた可変配列と、ヒト抗体などの別の種から得られた免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を指し得る。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、ＡＤＣＣを誘導するように強化された定常領域を有し得る。
【００５２】
本発明による抗体は、部分的または完全に合成されてもよく、この場合、抗体のポリペプチド鎖の少なくとも一部分が合成され、場合により、その同種抗原に結合するように最適化される。このような抗体は、キメラ抗体であってもヒト化抗体であってもよく、完全に四量体の構造であっても二量体であってもよく、単一の重鎖と単一の軽鎖のみを含んでもよい。
【００５３】
本発明の抗体はまた、モノクローナル抗体であってもよい。本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ法によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、抗体が産生される方法ではなく、あらゆる真核生物、原核生物またはファージクローンを含む単一のクローンから得られる抗体を指す。
【００５４】
本発明の抗体はまた、ヒト抗体であってもよい。本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」は、フレームワークとＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまたヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列をコードしないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的変異導入またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。
【００５５】
本明細書に記載される特徴を示す抗ＣＤ２５抗体は、本発明の更なる目的である。更なる実施形態において、本発明は、本明細書に定義される抗ＣＤ２５抗体をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、提供されるこのような核酸分子は、コドン最適化された核酸配列を含有し得、かつ／または宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫、魚、ネズミ、サルまたはヒトの細胞などにおける発現のための適切な核酸ベクター内の発現カセット中に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本発明は、所望の抗体を発現する異種核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明は、上に定義される単離された抗ＣＤ２５抗体を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、かかる方法は、核酸（例えば、宿主細胞に含まれ得、かつ／またはベクターを介して宿主細胞に送達され得る異種核酸）を含む宿主細胞を培養することを含み得る。好ましくは、宿主細胞（及び／または異種核酸配列）は、抗体またはその抗原結合断片が宿主細胞から分泌され、細胞培養上清から単離されるように、準備及び構築される。
【００５７】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。「多重特異性抗体」は、１つの標的抗原またはポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、２つ以上の標的抗原またはポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含有し得る（Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，２３８−４４）。
【００５８】
本発明の一態様において、抗体は、単一特異性抗体である。以下に詳細に論じられるように、代替的態様において、抗体は、二重特異性抗体である。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「二重特異性抗体」は、１つの抗原もしくはポリペプチド上、または２つの異なる抗原もしくはポリペプチド上の２つの異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を指す。
【００６０】
本明細書で論じられる本発明の二重特異性抗体は、体細胞ハイブリダイゼーションなどの生物学的方法；もしくは細胞株もしくは生物中における所望の抗体構造をコードする非天然ＤＮＡ配列の発現などの遺伝的方法；化学的方法（例えば、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の分子実体との化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他の方法による）；またはこれらの組み合わせを介して作製することができる。
【００６１】
単一特異性または二重特異性の作製を可能にする技術及び製品は、当該技術分野において知られ、文献でも広く検討されており、代替的フォーマット、抗体−薬物コンジュゲート、抗体設計法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法、定常領域、翻訳後修飾及び化学修飾、Ｆｃ操作などのがん細胞死を誘発する改善された特徴についても同様である（Ｔｉｌｌｅｒ  Ｋ  ａｎｄ  Ｔｅｓｓｉｅｒ  Ｐ，２０１５  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．１７：１９１−２１６；Ｓｐｅｉｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７：９５−１０６；Ｗｅｉｎｅｒ  Ｇ，２０１５．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，１５：３６１−３７０；Ｆａｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ８：１３０）。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。当該技術分野においてよく知られているように、エピトープは、連続アミノ酸（線状エピトープ）またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非連続アミノ酸（高次構造エピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒に曝された場合でも維持されるが、三次フォールディングから形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的に、固有の空間構造で、少なくとも３、より一般的には少なくとも５または８〜１０アミノ酸を含む。エピトープの空間構造を決定する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｘ線結晶学及び２Ｄ核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照されたい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体は、特に、がんの治療または診断のための治療薬または診断薬などのコンジュゲートされたペイロードを更に含む薬剤中に含まれ得る。放射性核種または毒素との抗ＣＤ２５抗体コンジュゲートを使用してもよい。一般に使用される放射性核種の例は、とりわけ、例えば、９０Ｙ、１３１Ｉ及び６７Ｃｕであり、一般に使用される毒素の例は、ドキソルビシン及びカリケアミシンである。更なる実施形態において、抗ＣＤ２５抗体は、改変された半減期を有するように修飾され得る。半減期の改変を達成する方法は、当該技術分野において知られている。
【００６４】
一実施形態において、抗体は、好ましくは、ＣＤ２５発現細胞の枯渇を（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／またはＣＤＣを介して）促進することに加えて、ヒトＣＤ２５の機能を遮断することができる。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２がヒトＣＤ２５に結合するのを阻害し、最も好ましくは、ＣＤ２５発現細胞のヒトＩＬ−２シグナル伝達を遮断する。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、本明細書に記載される本発明の態様のいずれかの対象は、哺乳動物、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットであるが、最も好ましくは、対象は、ヒトである。したがって、本明細書に記載される本発明の全ての態様において、対象は、好ましくは、ヒトである。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「がん」、「がん性」または「悪性」という用語は、典型的に無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳類の生理学的状態を指すか、当該状態を記述するものである。
【００６７】
がんの例には、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫及び肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞癌（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）癌、腎癌、卵巣癌、肝癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌及び頭頸部癌が挙げられる。
【００６８】
一態様において、がんは、固形腫瘍を含む。固形腫瘍の例は、肉腫（海綿骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、造血組織または線維性結合組織などの組織における、間葉起源の形質転換細胞から生じるがんを含む）、癌腫（上皮細胞から生じる腫瘍を含む）、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などである。固形腫瘍を伴う癌には、限定するものではないが、脳癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、膀胱癌、腎臓癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、口腔癌、肉腫、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、膣癌、頸部癌、リンパ腫などが挙げられる。
【００６９】
本発明の一態様において、がんは、黒色腫、非小細胞肺癌、腎癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫及び大腸癌から選択される。本発明の好ましい態様において、がんは、黒色腫、卵巣癌、非小細胞肺癌及び腎癌から選択される。一実施形態において、がんは、黒色腫、卵巣癌または乳癌ではない。好ましい態様において、がんは、肉腫、結腸癌、黒色腫または大腸癌、より一般的にはＭＣＡ２０５、ＣＴ２６、Ｂ１６またはＭＣ３８細胞株（実施例で特定されているもの）が化合物の治療管理有用性を検証するための前臨床モデルとなり得る任意のヒトがんである。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」という用語は、がんと診断された対象またはがんの疑いがある対象に対して適用される場合、悪性または悪性と思われる任意の大きさの新生物または組織の塊を指し、原発腫瘍及び続発性新生物を含む。「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」及び「癌腫」という用語はまた、比較的異常で、無秩序であり、かつ／または自律性の増殖を示し、これにより、細胞増殖の著しい制御不能を特徴とする異常な増殖表現型を呈する、腫瘍及び腫瘍細胞を指すために本明細書において区別なく使用され得る。一般に、検出または治療の対象となる細胞には、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性及び非転移性細胞が含まれる。本開示の教示は、あらゆるがんに関連し得る。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「固形腫瘍」は、通常、嚢胞または液体部分を含まない、組織の異常な増殖または塊であり、特に、白血病または非充実性リンパ性癌以外の腫瘍及び／または転移（場所を問わない）である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。固形腫瘍の各種類は、固形腫瘍を形成する細胞の種類及び／または固形腫瘍が位置する組織または器官によって名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫（海綿骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、造血組織または線維性結合組織などの組織における、間葉起源の形質転換細胞から生じるがんを含む）、癌腫（上皮細胞から生じる腫瘍を含む）、黒色腫、リンパ腫、中皮腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫である。
【００７２】
本発明に係る特に好ましいがんには、固形腫瘍の存在、すなわち、対象が非固形腫瘍を有していないことを特徴とするものが含まれる。本明細書で論じられる本発明の全ての態様において、がんは、固形腫瘍であること、すなわち、対象が固形腫瘍を有していること（及び非固形腫瘍を有していないこと）が好ましい。
【００７３】
本明細書で使用される場合、がんを「治療する」または「治療すること」への言及は、少なくとも１つの肯定的な治療効果、例えば、がん細胞数の減少、腫瘍サイズの縮小、周辺器官へのがん細胞浸潤率の低下、または腫瘍移転率もしくは腫瘍増殖率の低下の達成を定義するものである。
【００７４】
がんにおける肯定的な治療効果は、様々な方法で測定することができる（例えば、Ｗｅｂｅｒ（２００９）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５０，１Ｓ−１０Ｓ）。例として、腫瘍増殖抑制に関しては、米国国立がん研究所（ＮＣＩ）基準によれば、４２％以下のＴ／Ｃが抗腫瘍活性の最低レベルであり、Ｔ／Ｃが１０％未満であると、抗腫瘍活性レベルが高いとみなされる（Ｔ／Ｃ（％）＝処置群の腫瘍体積の中央値／対照群の腫瘍体積の中央値×１００）。いくつかの実施形態において、治療上有効な量によって達成される治療は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）または全生存期間（ＯＳ）のいずれかである。ＰＦＳは、「腫瘍無進行期間」とも呼ばれ、治療期間中及び治療期間後のがん増殖のない期間を示し、患者が完全奏効または部分奏効を得た時間量だけでなく、患者が安定を得た時間量も示す。ＤＦＳは、治療期間中及び治療期間後に、患者が疾患のない状況を維持している期間を指す。ＯＳは、ナイーブまたは未処置の個体または患者と比較した平均寿命の延長を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「予防」（または防止）への言及は、がんの症状の発生を遅延または予防することを指す。予防は、完全なもの（疾患が生じない）であっても、一部の個体でのみ、または限られた時間内に有効であってもよい。
【００７６】
本発明の好ましい態様において、対象は、定着腫瘍を有し、すなわち、対象は、例えば、固形腫瘍に分類される腫瘍を既に有する。そのため、本明細書に記載される本発明は、対象が固形腫瘍などの腫瘍を既に有するときに使用することができる。したがって、本発明は、既存の腫瘍を治療するために使用することができる治療選択肢を提供する。本発明の一態様において、対象は、既存の固形腫瘍を有する。本発明は、固形腫瘍を既に有する対象における予防として、または好ましくは治療として使用することができる。一態様において、本発明は、予防または防止として使用されない。
【００７７】
一態様において、本明細書に記載される本発明を使用すると、例えば、他のがん治療（例えば、所与のがんのための標準治療）と比較して、腫瘍退縮が増大し得、腫瘍増殖が低下もしくは減少し得、かつ／または生存期間が延長され得る。
【００７８】
本発明の一態様において、本明細書に記載されるがんを治療または予防する方法は、がんを有する対象を特定するステップ、特に、固形腫瘍などの腫瘍を有する対象を特定するステップを更に含む。
【００７９】
がん患者の治療に効果的である本明細書に記載の治療法の投薬レジメンは、患者の病状、年齢及び体重、ならびに抗がん応答を対象において誘導する治療法の効能などの因子によって変動し得る。適切な用量の選択は、当業者の能力の範囲内である。例えば、０．０１、０．１、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇ。いくつかの実施形態において、かかる量は、関連する集団に投与されたときに所望の成果または有益な成果と相関することが判明している投与レジメン（すなわち、治療投与レジメン）に基づいた投与に適切な単位投与量（またはその分割の全量）である。
【００８０】
本明細書に記載される本発明のいずれかの態様による抗体は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を追加で含む、医薬組成物の形態であってよい。これらの組成物には、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤またはリポソームなどの液体、半固形及び固形の製剤が含まれる。いくつかの実施形態において、好ましい形態は、意図される投与方法及び／または治療用途に依存し得る。抗体を含有する医薬組成物は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法によって投与することができ、限定するものではないが、経口、粘膜、吸入、局所、頬側、鼻、直腸または非経口（例えば、静脈内、注入、腫瘍内、結節内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、経皮、または対象の組織を物理的に破壊すること及び組織の破壊を介した医薬組成物の投与を伴う他の種類の投与）が挙げられる。このような製剤は、例えば、皮内、腫瘍内もしくは皮下投与、または静脈内注入に好適である、注射可能または注入可能な溶液の形態であってよい。投与は、断続的な投与を伴い得る。あるいは、投与は、他の化合物の投与と同時か、それまでの間における、少なくとも選択された期間の連続的な投与（例えば、灌流）を伴い得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、抗体は、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化された送達系などの制御放出製剤のように、急速な放出及び／または分解を防ぐ担体とともに調製することができる。生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。
【００８２】
当業者は、例えば、送達経路（例えば、経口ｖｓ静脈内ｖｓ皮下ｖｓ腫瘍内など）が投与量に影響を及ぼすことがあり、かつ／または必要投与量が送達経路に影響を及ぼすことがあることを理解するであろう。例えば、特定の部位または位置（例えば、腫瘍内）内で薬剤を著しく高濃度にすることを目的にする場合、集中的送達（例えば、この例では腫瘍内送達）が望ましく、かつ／または有用であり得る。所与の治療レジメンのための経路及び／または投与計画を最適にする際に検討すべき他の要素は、例えば、治療対象の特定のがん（例えば、種類、病期、位置など）、対象の臨床状態（例えば、年齢、全体的な健康状態など）、併用療法の有無、及び医師に知られている他の要素を含み得る。
【００８３】
医薬組成物は、典型的に、滅菌され、製造及び保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高濃度薬物に好適な他の規則構造体として製剤化することができる。注射可能な無菌溶液は、必要量の抗体を、必要に応じて、上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、続いて、滅菌濾過することによって、調製することができる。非経口投与用製剤には、懸濁剤、液剤、油性または水性ビヒクル中の乳剤、ペースト、及び本明細書で論じられる埋め込み可能な徐放性または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。注射可能な無菌製剤は、非経口的に認められる非毒性の希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。本発明に従って使用される各医薬組成物は、採用される用量及び濃度で対象に非毒性である、薬学的に許容される分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、等張化剤、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、担体、賦形剤、塩または安定剤を含み得る。好ましくは、このような組成物は、がんの治療に使用するために、所与の投与方法及び／または投与部位、例えば、非経口（例えば、皮下、皮内または静脈内注射）、腫瘍内、または腫瘍周囲投与に適合する、薬学的に許容される担体または賦形剤を更に含み得る。
【００８４】
本発明に従って使用される治療方法または組成物の実施形態は、全ての対象において肯定的な治療効果を達成するのに功を奏さないこともあるが、一貫して正しい医療行為をもって使用される医薬組成物及び投与レジメン、ならびにスチューデントのｔ検定、χ２検定、マン−ホイットニーによるＵ検定、クラスカル−ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール−タプストラ検定及びウィルコクソン検定などの当該技術分野において知られている任意の統計的検定によって求められる統計的に有意な数の対象においては、効果的である。
【００８５】
腫瘍、腫瘍疾患、癌腫またはがんについて上記または以下に記載される場合、元の器官もしくは組織及び／または任意の他の位置における転移もまた、その腫瘍及び／または転移の位置がどこであれ、代替的または付加的に意図される。
【００８６】
本明細書で論じられるように、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇に関する。したがって、本発明の一態様において、抗ＣＤ２５抗体は、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇または減少させる。一態様において、当該枯渇は、ＡＤＣＣを介する。別の態様において、当該枯渇は、ＡＤＣＰを介する。抗ＣＤ２５抗体は、循環する制御性Ｔ細胞を枯渇または減少させ得る。一態様において、当該枯渇は、ＡＤＣＣを介する。別の態様において、当該枯渇は、ＡＤＣＰを介する。
【００８７】
したがって、本発明は、対象の腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、当該対象に抗ＣＤ２５抗体を投与することを含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇは、固形腫瘍内で枯渇する。「枯渇」とは、Ｔｒｅｇの数、比率またはパーセンテージが、抗ＣＤ２５抗体を投与しない場合と比較して減少することを意味する。本明細書に記載される本発明の特定の実施形態において、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％超が枯渇する。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「制御性Ｔ細胞」（「Ｔｒｅｇ」、「Ｔｒｅｇ細胞」または「Ｔｒｅｇｓ」）は、自己免疫、アレルギー及び感染の制御に特化したＣＤ４＋Ｔリンパ球系統を指す。典型的に、制御性Ｔ細胞は、Ｔ細胞集団の活性を制御するが、ある特定の自然免疫系細胞種にも影響し得る。Ｔｒｅｇは、通常、バイオマーカーＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３の発現によって特定される。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、通常、末梢性ＣＤ４＋Ｔリンパ球の約５〜１０％を構成する。しかしながら、腫瘍微小環境内（すなわち、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞）では、全ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団の２０〜３０％をも構成し得る。
【００８９】
活性化ヒトＴｒｅｇ細胞は、パーフォリンまたはグランザイムＢ依存性経路を介して、エフェクターＴ細胞及びＡＰＣなどの標的細胞を直接殺傷することができ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４＋）Ｔｒｅｇ細胞は、ＡＰＣによるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を誘導し、それによりトリプトファンを減少させることによってＴ細胞の活性化を阻害し、Ｔｒｅｇ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦβ）を放出することができ、これにより、Ｔ細胞活性化を直接阻害し、ＭＨＣ分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩＬ−１２の発現を阻害することによって、ＡＰＣ機能を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞はまた、抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６に結合し、エフェクターＴ細胞の適切な活性化を妨げることができるＣＴＬＡ４を高レベルで発現することによって、免疫を抑制することもできる。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態において、固形腫瘍における制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比は、増加する。いくつかの実施形態において、固形腫瘍における制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比は、５、１０、１５、２０、４０または８０超まで増加する。
【００９１】
免疫エフェクター細胞は、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞には、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞及び好塩基球が挙げられる。
【００９２】
免疫応答のエフェクター相に関与する免疫エフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を発揮する。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えば、ＡＤＣＣを誘導することができる好中球である。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球及びリンパ球は、標的細胞の特異的殺傷及び免疫系の他の構成要素への抗原提示または抗原提示細胞への結合に関与する。エフェクター細胞はまた、標的抗原、標的細胞または微生物を貪食することもできる。本明細書で論じられるように、本発明による抗体は、ＡＤＣＣを誘導する能力について最適化され得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、がんに対する異なる薬剤を当該抗体と組み合わせて、同一もしくは異なる送達経路を介して、及び／または異なる計画に従って、投与することができる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態において、第１の有効薬剤の１回または複数回の用量は、１つ以上の他の有効薬剤とともに実質的に同時に投与され、いくつかの実施形態では、共通の経路を介して、及び／または１つ以上の他の有効薬剤との単一組成物の一部として、実質的に同時に投与される。当業者であれば、本発明に従って提供される併用療法のいくつかの実施形態は、相乗効果をもたらすことを更に理解するであろう。このようないくつかの実施形態において、組み合わせて使用される１つ以上の薬剤の用量は、大きく異なり得（例えば、低い）、かつ／または当該薬剤が別の治療レジメンにおいて（例えば、単剤療法として、及び／または異なる併用療法の一部として）使用されるときには標準的である経路、好ましい経路、もしくは必要な経路とは別の経路を介して送達され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、２つ以上の有効薬剤が本発明に従って使用される場合、かかる薬剤は、同時にまたは連続して投与され得る。いくつかの実施形態において、ある薬剤の投与は、別の薬剤の投与に対して明確に時間が決められる。例えば、いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、特定の効果が観察されるように（または、例えば、所与の投与レジメンと目的の特定の効果との間の相関関係を示す集団研究に基づいて観察されることが予想されるように）投与される。いくつかの実施形態において、組み合わせて投与される薬剤の所望の相対的投与レジメンは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して評価され、または経験的に決定され得、いくつかの実施形態において、かかる評価または経験的決定は、患者集団（例えば、相関が確立されるように）、または特定の対象患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００９５】
本発明の別の態様において、本発明者らは、抗ＣＤ２５抗体が、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせたときに、治療効果の改善を示すことを明らかにした。本実施例に示されるように、抗ＣＤ２５抗体と免疫チェックポイント阻害薬の併用療法は、定着腫瘍の治療において、相乗効果を有し得る。本実施例におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に関するデータは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の妨害に関する。したがって、ＰＤ−１受容体とＰＤ−Ｌ１リガンドとの間の相互作用が遮断され得、「ＰＤ−１遮断」がもたらされる。一態様において、この組み合わせは、本明細書に記載される本発明を使用すると、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断（抗ＰＤ１抗体を使用して直接的に、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用して間接的に）のみのいずれかと比較して、腫瘍退縮の増大、腫瘍増殖の低下もしくは減少の増大をもたらし得、かつ／または生存期間が延長され得る。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「免疫チェックポイント」または「免疫チェックポイントタンパク質」は、免疫系の抑制経路に属するタンパク質、特に、Ｔ細胞応答を調節するタンパク質を指す。正常な生理学的条件下において、免疫チェックポイントは、特に、病原体に対する応答中に、自己免疫を防ぐために重要である。がん細胞は、免疫監視を回避するために、免疫チェックポイントタンパク質の発現制御を変えることができる。
【００９７】
免疫チェックポイントタンパク質の例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ及びＴＩＭ３が挙げられ、またＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ及びＨＶＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイントタンパク質はまた、免疫応答を抑制するように調節する他の免疫チェックポイントタンパク質に結合するタンパク質も指し得る。このようなタンパク質には、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＬＬＴ１及びＧＡＬ９が挙げられる。
【００９８】
「免疫チェックポイントタンパク質阻害薬」は、免疫チェックポイントタンパク質によって媒介されるシグナル伝達及び／またはタンパク質間相互作用を妨害することができる、任意のタンパク質を指す。本発明の一態様において、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１である。本明細書に記載される本発明の好ましい態様において、免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を介するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を妨害する。
【００９９】
したがって、本発明はまた、抗ＣＤ２５抗体及びチェックポイント阻害薬を対象に投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。本発明はまた、がんの治療に使用するための抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬を提供する。
【０１００】
本発明は、がんを治療するための薬剤の製造のための抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬の使用を更に提供する。抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬の投与は、同時、個別、または連続であり得る。
【０１０１】
本発明は、対象のがんの治療に使用するための、抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬の組み合わせを提供し、抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬は、同時に、個別に、または連続して投与される。このような抗ヒトＣＤ２５抗体は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１であり、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／またはＣＤＣを可能にする配列を示すか、それを欠く、免疫チェックポイントを標的にする抗体と特に組み合わせて使用することができる。
【０１０２】
代替的態様において、本発明は、がんの治療に使用するための抗ＣＤ２５抗体を提供し、当該抗体は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与するためのものである。本発明はまた、がんを治療するための薬剤の製造における抗ＣＤ２５抗体の使用を提供し、当該薬剤は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与するためのものである。
【０１０３】
本発明は、薬学的に許容される媒体中に、抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害薬を含む、医薬組成物を提供する。上で論じられるように、免疫チェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１の阻害薬、すなわち、ＰＤ−１アンタゴニストであり得る。
【０１０４】
ＣＤ２７９としても知られるＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）は、活性化したＴ細胞及びＢ細胞上に発現される細胞表面受容体である。そのリガンドとの相互作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、Ｔ細胞の応答を弱めることが示されている。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に結合する。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＰＤ−１シグナル伝達には、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されたペプチド抗原のすぐそばにあるＰＤ−１リガンドへの結合が必要である（Ｆｒｅｅｍａｎ（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，１０２７５−６）。したがって、Ｔ細胞膜上におけるＰＤ−１とＴＣＲとのコライゲーションを阻止するタンパク質、抗体または小分子は、有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
【０１０５】
一実施形態において、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片であり、ＰＤ−１に特異的に結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻止する。抗ＰＤ−１抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗ＰＤ−１抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１受容体に特異的に結合することができる抗体である。当該技術分野において知られている抗ＰＤ−１抗体には、ニボルマブ及びペンブロリズマブが挙げられる。
【０１０６】
本発明のＰＤ−１アンタゴニストはまた、ＰＤ−１のリガンドに結合し、かつ／またはこれを遮断して、リガンドがＰＤ−１受容体に結合するのを妨害または阻害するか、ＰＤ−１受容体を介した抑制シグナル伝達を誘導することなく、ＰＤ−１受容体に直接結合し、これを遮断する、化合物または薬剤を含み得る。あるいは、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、抑制シグナル伝達を誘発することなく、ＰＤ−１受容体に直接結合することができ、またＰＤ−１受容体のリガンドに結合して、リガンドがＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を誘発するのを低減または阻害する。ＰＤ−１受容体に結合し、抑制シグナルの伝達を誘発するリガンドの数及び／または量を減らすことによって、ＰＤ−１シグナル伝達によって送られる負のシグナルによって減衰する細胞が減少し、より強力な免疫応答を得ることができる。
【０１０７】
一実施形態において、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片であり、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻止する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト抗体またはアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）などのヒト化抗体であり得る。
【０１０８】
本発明はまた、抗ＣＤ２５抗体と、Ｔ細胞活性化共刺激経路のアゴニストである抗体とを対象に投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。Ｔ細胞活性化共刺激経路のアゴニスト抗体には、限定するものではないが、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＬＩＧＨＴ及び４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体が挙げられる。
【０１０９】
本発明者らは、驚くべきことに、抑制型Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）のレベルが固形腫瘍で上昇し得ることを特定した。したがって、がんを治療する更なる方法は、抗ＣＤ２５抗体と、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を減少、妨害、阻害及び／または遮断する化合物とを投与することを含む。このようなＦｃγＲＩＩｂアンタゴニストは、ＦｃγＲＩＩｂによって誘導される細胞内シグナル伝達を妨害する小分子、抑制型ＦｃγＲＩＩｂ受容体に結合しない修飾抗体、または抗ヒトＦｃγＲＩＩｂ（抗ＣＤ３２ｂ抗体であり得る。例えば、抗ヒトＦｃγＲＩＩｂアンタゴニスト抗体は、その抗腫瘍特性に関しても特徴付けられている（Ｒｏｇｈａｎｉａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２７，４７３−４８８；Ｒｏｚａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１２：１４８１−９１；ＷＯ２０１５１７３３８４；ＷＯ２００８００２９３３）。
【０１１０】
更なる態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質、腫瘍関連抗原に結合するか、抗ヒト活性化型Ｆｃ受容体抗体（例えば、抗ＦｃｇＲＩ、抗ＦｃｇＲＩＩａ、抗ＦｃｇＲＩＩＩ）であるか（または当該抗体をベースにするか）、抗ヒトＦｃγＲＩＩｂアンタゴニスト抗体である（または当該抗体をベースにする）、第２の抗原結合部分と
を含む、二重特異性抗体であって、
二重特異性抗体は、好ましくは、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ＩｇＧ１抗体である、二重特異性抗体を提供する。
【０１１１】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞上に発現され、隣接する非がん細胞との区別を可能にする抗原を指し、限定するものではないが、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶ３、ＣＥＡ、ＴＹＲＰ１及びＨＥＲ２が挙げられる。関係する腫瘍関連抗原及びそれに対応する治療的に有用な抗腫瘍抗体薬について記載する様々な総説論文が公開されている（例えば、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ＆Ｍｅｌｌｍａｎ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，１９２−８参照）。このような抗原及び対応する抗体には、限定するものではないが、ＣＤ２２（ブリナツモマブ）、ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ）、ＣＤ５６（ロルボツズマブ）、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ（ラベツズマブ）、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）、ＣＤ２２１／ＩＧＦ１Ｒ（ＭＫ−０６４６）、ＣＤ３２６／Ｅｐｃａｍ（エドレコロマブ）、ＣＤ３４０／ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ）及びＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）が挙げられる。
【０１１２】
一態様において、本明細書に記載される本発明による二重特異性抗体は、ＡＤＣＣ、または、一態様において、向上したＡＤＣＣをもたらす。
【０１１３】
二重特異性抗体は、ＣＤ２５上の特定のエピトープと、本明細書に定義される免疫チェックポイントタンパク質または腫瘍関連抗原上の特定のエピトープに結合することができる。好ましい実施形態において、第２の抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に結合する。好ましい一態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｂ）腫瘍細胞上に発現される免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分と
を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１１４】
具体的な実施形態において、腫瘍細胞上に発現される免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＧＡＬ９、Ｂ７Ｈ３またはＢ７Ｈ４である。更に好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、Ｆｃγ受容体に高親和性で結合し、かつ腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる、ＩｇＧ１抗体である。
【０１１５】
当業者であれば、既知の方法を使用して、二重特異性抗体を作製することができる。本発明による二重特異性抗体は、本明細書に記載される本発明の態様のいずれにおいても使用することができる。好ましくは、本発明による二重特異性抗体内の第２の抗原結合部分は、ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１１６】
一態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ２５と、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ上に高レベルで発現される免疫調節受容体、例えば、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢまたはＯＸ４０に結合することができる。
【０１１７】
本発明はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体と、本明細書で論じられる免疫チェックポイント阻害薬、好ましくは、ＰＤ−１アンタゴニスト（抗ＰＤ１抗体を使用して直接的に、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用して間接的に）とを含むキットを提供する。一態様において、免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＰＤ−Ｌ１である。代替的な実施形態において、キットは、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体と、Ｔ細胞活性化共刺激経路のアゴニストである抗体とを含む。キットは、使用のための説明書を含み得る。
【０１１８】
更なる態様において、キットは、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体と、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を減少、妨害、阻害及び／または遮断する化合物とを含み得るか、あるいは、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体と、抗ヒト活性化型Ｆｃ受容体抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩｃまたは抗ＦｃγＲＩＩＩａ）とを含み得る。
【０１１９】
本明細書に記載される本発明の任意の態様は、追加のがん療法と組み合わせて実施されてもよい。特に、本発明による抗ＣＤ２５抗体及び任意選択による免疫チェックポイント阻害薬（または任意の他の併用療法）は、共刺激抗体、化学療法及び／もしくは放射線治療、標的療法またはモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与することができる。
【０１２０】
本明細書で使用される化学療法薬実体は、細胞にとって有害である実体を指し、すなわち、当該実体は、細胞の生存能力を低下させる。化学療法薬実体は、細胞傷害性薬であり得る。企図される化学療法薬には、限定するものではないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソ尿素、エチレンイミン／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ピリミジンアナログ、エピポドフィロトキシン、Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；ＩＦＮα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなどの生体応答調節剤；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体、アントラセンジオン、ヒドロキシウレアなどの置換ウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及び誘導体を含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬；プレドニゾン及び同等物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモン及びアンタゴニスト；ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリドなどの抗アンドロゲン；ならびにフルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲンが挙げられる。
【０１２１】
追加のがん療法はまた、がんワクチンの投与を含み得る。本明細書で使用される「がんワクチン」は、患者自身の免疫応答を強化することによってがん細胞を根絶するように設計され、がん患者に投与される治療用がんワクチンを指す。がんワクチンには、腫瘍細胞ワクチン（自己及び同種）、樹状細胞ワクチン（ｅｘ  ｖｉｖｏ生成及びペプチド活性化によるもの）、タンパク質／ペプチドをベースにしたがんワクチン及び遺伝子ワクチン（ＤＮＡ、ＲＮＡ及びウイルスをベースにしたワクチン）が挙げられる。したがって、治療用がんワクチンは、基本的に、進行がん、ならびに／または手術、放射線療法及び化学療法などの従来の治療法に対して不応性である再発腫瘍の更なる増殖を阻害するために利用することができる。腫瘍細胞ベースのワクチン（自己及び同種）には、サイトカイン（ＩＬ２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ１２、ＧＭＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ）などの可溶性免疫刺激剤、免疫調節受容体（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）に対する単鎖Ｆｖ抗体を分泌するように、かつ／または免疫刺激性受容体に対するリガンド、特に、ＩＣＯＳ−リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＧＩＴＲ−リガンド及び／もしくはＯＸ４０リガンドなどをその膜上に発現するように遺伝子改変されたものが含まれる。
【０１２２】
追加のがん療法は、腫瘍微小環境の周辺及び腫瘍微小環境内で免疫制御を低下させる他の抗体または小分子試薬、例えば、ＴＧＦｂ経路、ＩＤＯ（インドールアミンデオキシゲナーゼ）、アルギナーゼ及び／またはＣＳＦ１Ｒを標的にする分子であり得る。
【０１２３】
「組み合わせて」は、本発明による任意の態様の実施前、それと同時、またはその後における追加療法の実施を指し得る。
【０１２４】
本発明を以下の実施例により図面を参照して更に記述する。実施例は、本発明を実施する際に当業者の助けとなることが意図され、いかなる場合であれ、本発明の範囲を限定する意図はない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】血液及びリンパ節に対するＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の発現を示す。（Ａ）異なる腫瘍モデルのリンパ節（ＬＮ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に存在するＴ細胞サブセット表面上のＣＤ２５の発現（検出抗体クローン７Ｄ４；抗マウスＣＤ２５、ＩｇＭアイソタイプ）。ヒストグラムは、各腫瘍モデルの１匹のマウスのものを示す。（Ｂ）ＭＣＡ２０５腫瘍モデルを使用した個々の実験でプールされたデータ（ｎ＝１０）から得たＰＢＭＣ及びＴ細胞サブセットにおけるＣＤ２５陽性細胞のパーセンテージ及びＣＤ２５のＭＦＩ。（Ｃ）及び（Ｄ）では、同じ評価（Ｔ細胞サブセットに限定）をＭＣ３８、Ｂ１６及びＣＴ２６腫瘍モデルで実施した。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥ）を示す。ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性細胞と、ＣＤ８陽性またはＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陰性細胞との間の統計的関連性が示されている。
【図２】ＭＣＡ２０５腫瘍モデルにおける、血液及びリンパ節に対するＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞の抗ＣＤ２５（αＣＤ２５）媒介性枯渇の制限を示す。（Ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＣＤ２５（検出抗体クローン７Ｄ４；抗マウスＣＤ２５、ＩｇＭアイソタイプ）及びＦｏｘＰ３の発現。（Ｂ）Ｔｒｅｇ（ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔ細胞でゲーティング）上のＣＤ２５の平均蛍光強度。腫瘍担持マウスに、５×１０５個のＭＣＡ２０５細胞をｓ．ｃ．接種してから５及び７日目に、２００μｇの抗ＣＤ２５−ｒ１（αＣＤ２５−ｒ１；抗ＣＤ２５ラットＩｇＧ１）、抗ＣＤ２５−ｍ２ａ（αＣＤ２５−ｍ２ａ；抗ＣＤ２５ネズミＩｇＧ２ａ）、抗ＣＴＬＡ−４（αＣＴＬＡ−４；抗ＣＴＬＡ４クローンＢ５６）を注射するか、処置なしとした（処置なし）。９日目に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節（ＬＮ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を採取し、フローサイトメトリー解析用に処理し、染色した。
【図３】図２のＭＣＡ２０５腫瘍モデルのＴ細胞サブ集団に対する抗ＣＤ２５（αＣＤ２５）媒介性作用を示す。（Ａ）総ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するＦｏｘＰ３陽性細胞のパーセンテージ。（Ｂ）ＰＢＭＣ（細胞数／ｍＬ）、ＬＮ（３つの流入領域リンパ節中の細胞総数）及びＴＩＬ（細胞数／ｇ腫瘍）におけるＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔ細胞の絶対数をＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陰性Ｔ細胞と並列して示す。（Ｃ）エフェクターＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の比。（Ｄ）エフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞の比（ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陰性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞でゲーティング）。
【図４】腫瘍移植から１０日後に無処置ＭＣＡ２０５腫瘍モデル（図２参照）でフローサイトメトリーによって評価した、Ｂ細胞（ＣＤ１９陽性）、Ｔ細胞（ＣＤ３陽性ＣＤ５陽性）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１陽性）、顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ；ＣＤ１１ｃ高ＭＨＣＩＩ陽性）及び単球／マクロファージ（Ｍｏｎｏ／Ｍφ；ＣＤ１１ｂ陽性Ｌｙ６Ｇ陰性ＮＫ１．１陰性ＣＤ１１ｃ低／陰性）上のＦｃγＲ発現に関する代表的なヒストグラムを示す。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。データは、３つの個別の実験のうちの１つに対応するが、結果は実験全体で一致した。
【図５】Ｔｒｅｇ枯渇が活性化型Ｆｃ−γ受容体の発現にどのように依存するかを示す。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（ｗｔ）及びＦｃｅｒ１ｇ−／−マウスに５×１０５個のＭＣＡ２０５細胞を０日目に皮下注射し、次いで、５及び７日目に２００μｇの抗ＣＤ２５を注射した。９日目に、腫瘍、流入領域リンパ節及び血液を採取し、フローサイトメトリー解析用に処理し、染色した。ＰＢＭＣ、ＬＮ及びＴＩＬにおける制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３発現によって特定された。総ＣＤ４＋細胞に対するＦｏｘｐ３＋のパーセンテージを（Ａ）に示す。同一のアプローチを野生型（ｗｔ）、Ｆｃｇｒ３−／−、Ｆｃｇｒ４−／−またはＦｃｇｒ２ｂ−／−に適用し、ＦｃγＲＩＩｂによる腫瘍内αＣＤ２５−ｒ１媒介性Ｔｒｅｇ枯渇の阻害を示す。プロットは、総ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）のパーセンテージの定量を示す（ＴＩＬのみ）（Ｂ）。
【図６】抗ＣＤ２５−ｍ２ａと抗ＰＤ−１の組み合わせの相乗作用により、定着腫瘍の根絶がもたらされることを示す。個々のマウスの成長曲線（Ａ）及び各処置群の経時的なＭＣＡ２０５腫瘍体積の平均（Ｂ）を示す。１００日後の無腫瘍生存数または統計的有意性を各グラフに示す。エラーバーは、平均のＳＥを示す。２つの個別の実験の累積データを用いたカプランマイヤー生存曲線も示す。ＭＣ３８（Ｃ）またはＣＴ２６（Ｄ）腫瘍細胞を注射し、ＭＣＡ２０５モデルに記載されるように処置されたマウス（条件当たりｎ＝１０）の生存曲線も示す。マウスに５×１０５個のＭＣＡ２０５、ＭＣ３８またはＣＴ２６細胞を皮下注射し、次いで、５日目に指定の抗ＣＤ２５（２００μｇ  ｉ．ｐ．）で処置し、６、９及び１２日目に抗ＰＤ−１（αＰＤ−１、抗ＰＤ１、クローンＲＭＰ１−１４；１００μｇ  ｉ．ｐ．）の投与を続けた（またはしなかった）。腫瘍サイズを週２回測定し、いずれかの直交直径が１５０ｍｍに達したら、マウスを安楽死させた。
【図７】１４日目に採取した免疫細胞を使用して、図６に記載するように確立したＭＣＡ２０５腫瘍モデルの機能解析を示す。ＭＣＡ２０５腫瘍中の腫瘍浸潤ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合（％）（Ａ）と、腫瘍中のＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陰性Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比及びＣＤ８陽性／Ｔｒｅｇ比（Ｂ）を各処置群について示す。ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激した後のＩＦＮｇ発現に関する腫瘍浸潤リンパ球の細胞内染色（Ｃ）と、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生エフェクターＴ細胞の頻度（Ｄ）もＣＤ４陽性細胞及びＣＤ８陽性細胞の同じ処置群について示す。（Ｂ）のヒストグラムは、処置群当たりの代表的なマウスに対応する。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）には、２つの個別の実験（ｎ＝１０）から得た代表的なプロット及び統計的有意性を示す。
【図８】抗ＣＤ２５−ｍ２ａ／抗ＰＤ１による腫瘍排除がＣＤ８＋Ｔ細胞依存であることを示す。個々のマウスのＭＣＡ２０５腫瘍増殖曲線であって、処置なし（処置なし、Ａ）、抗ＣＤ２５−ｍ２ａと抗ＰＤ−１の組み合わせによる処置（αＰＤ−１＋αＣＤ２５−ｍ２ａ；Ｂ）、または同一の組み合わせに抗ＣＤ８を更に含むものでの処置（αＰＤ−１＋αＣＤ２５−ｍ２ａ＋αＣＤ８；Ｃ）のＭＣＡ２０５腫瘍増殖曲線。各処置群（ｎ＝７）に関する４０日後の生存数を各グラフに示す。対応するカプランマイヤー生存曲線も生成した（Ｄ）。マウスに５×１０５個のＭＣＡ２０５細胞をｓ．ｃ．注射し、５日目に２００μｇの抗ＣＤ２５−ｍ２ａ（αＣＤ２５−ｍ２ａ、クローンＰＣ６１、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）で処置し、６、９及び１２日目に１００μｇの抗ＰＤ−１（αＰＤ−１、クローンＲＭＰ１−１４）でｉ．ｐ．処置した。マウスの指定群において、４、９、１２及び１７日目に、２００μｇの抗ＣＤ８（αＣＤ８、クローン２．４３）をｉ．ｐ．注射することによって、ＣＤ８陽性細胞を枯渇させた。腫瘍サイズを週２回測定し、いずれかの直交直径が１５０ｍｍに達したら、マウスを安楽死させた。
【図９】抗ＣＤ２５−ｍ２ａ／抗ＰＤ−１療法がＢ１６黒色腫腫瘍に対して少なくとも部分的な腫瘍制御を誘導することを示す。図６（Ａ）に定義されるように、Ｇｖａｘ単独または指定の抗体との組み合わせで処置した個々のマウスのＢ１６腫瘍増殖曲線。対応するカプランマイヤー生存曲線も生成した（Ｂ）。マウスに５×１０４個のＢ１６黒色腫細胞を皮内（ｉ．ｄ．）注射し、次いで、５日目に２００μｇの抗ＣＤ２５（αＣＤ２５−ｒ１、クローンＰＣ６１ラットＩｇＧ１アイソタイプまたはαＣＤ２５−ｍ２ａ、クローンＰＣ６１マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）で処置し、６、９及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１（αＰＤ−１、クローンＲＭＰ１−１４）でｉ．ｐ．処置し、１×１０６個の放射線照射（１５０Ｇｙ）Ｂ１６−Ｇｖａｘでｉ．ｄ．処置した。腫瘍増殖を追跡し、いずれかの直交直径が１５０ｍｍに達するか、試験８０日目のいずれか早い時点で、マウスを安楽死させた。種々の群（ｎ、マウス数）の生存日数の中央値は、Ｇｖａｘのみ（ｎ＝１４）で２１日、Ｇｖａｘ＋αＰＤ−１（ｎ＝１５）で２７日、Ｇｖａｘ＋αＣＤ２５−ｒ１（ｎ＝７）で２１日、Ｇｖａｘ＋αＣＤ２５−ｍ２ａ（ｎ＝８）で３３日、Ｇｖａｘ＋αＰＤ−１＋αＣＤ２５−ｒ１（ｎ＝１３）で２９日、Ｇｖａｘ＋αＰＤ−１＋αＣＤ２５−ｍ２ａ（ｎ＝１２）で３９日であった。
【図１０】個々のマウスのＣＴ２６腫瘍増殖曲線であって、処置なし（ＰＢＳ、ビヒクルのみ）、ＩｇＧ１（ＰＣ６１ｍ１；マウスＩｇＧ１アイソタイプ、したがって、低いＦｃ受容体媒介性殺傷活性、低いＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性）を有する抗マウスＣＤ２５またはＩｇＧ２ａ（ＰＣ６１ｍ２；マウスＩｇＧ２ａ、したがって、高いＦｃ受容体媒介性活性、高いＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性）を有する抗マウスＣＤ２５による処置、及び抗マウスＰＤ１（αＰＤ１  ＲＭＰ１−１４）を更に組み合わせた処置またはなしでのＣＴ２６腫瘍増殖曲線を示す。移植に使用したＣＴ２６細胞を対数増殖期中に回収し、冷却ＰＢＳ中に再懸濁した。試験の１日目に、各マウスに細胞懸濁液０．１ｍＬ中の３×１０５細胞を右脇腹に皮下注射した。６日目（触診可能な腫瘍が検出される時点）に、抗マウスＣＤ２５をｉ．ｐ．注射した（１０ｍｇ／ｋｇ）。７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、抗マウスＰＤ１をｉ．ｐ．注射した（１００μｇ／注射）。増殖をモニタリングするために、腫瘍を週２回、キャリパーで二次元計測した。腫瘍サイズ（ｍｍ３）を次のように算出した。腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２（式中、ｗ＝腫瘍の幅、ｌ＝腫瘍の長さ（ｍｍ））試験のエンドポイントは、腫瘍体積２０００ｍｍ３または６０日目のいずれか早い時点とした。
【図１１】個々のマウスのＣＴ２６腫瘍増殖曲線であって、処置なし（ＰＢＳ、ビヒクルのみ）、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａのいずれかを有する抗マウスＣＤ２５による処置（それぞれＰＣ６１ｍ１及びＰＣ６１ｍ２）、及び抗マウスＰＤ−Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２（ａＰＤＬ１  １０Ｆ．９Ｇ２）を更に組み合わせた処置またはなしでのＣＴ２６腫瘍増殖曲線を示す。図１０のαＰＤ１による組み合わせ実験と同様に、モデル、レジメン及び分析を実施した。
【図１２】図１０のＣＴ２６腫瘍モデルについて記載されるように、個々のマウスのＭＣ３８腫瘍増殖曲線であって、処置なし（ＰＢＳ、ビヒクルのみ）、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａのいずれかを有する抗マウスＣＤ２５による処置（それぞれＰＣ６１ｍ１及びＰＣ６１ｍ２）、及び抗マウスＰＤ１クローンＲＭＰ１−１４（ａＰＤ１  ＲＭＰ１−１４）を更に組み合わせた処置またはなしでのＭＣ３８腫瘍増殖曲線を示す。移植に使用したＭＣ３８結腸癌細胞を対数増殖期中に回収し、冷却ＰＢＳ中に再懸濁した。各マウスに細胞懸濁液０．１ｍＬ中の５×１０５腫瘍細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が１００〜１５０ｍｍ３の標的範囲に近づくように、腫瘍をモニタリングした。腫瘍移植から２２日後の試験１日目に、個々の腫瘍体積が６３〜１９６ｍｍ３の範囲である動物を、群平均腫瘍体積が１０４〜１０８ｍｍ３になるように９つの群に分けた（ｎ＝１０）。定着ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスにおいて、処置をＤ１に開始した。１日目、２日目、５日目、９日目及び１２日目にＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与されたビヒクル処置対照群と各処置の作用を比較した。抗ＰＤ１は、２日目から始めて、１００μｇ／動物で週２回、２週間、ｉ．ｐ．投与した。ＰＣ６１−ｍ１及びＰＣ６１−ｍ２ａを１日目に２００μｇ／動物で１回ｉ．ｐ．投与した。腫瘍測定を４５日目まで週２回行い、個々の動物が１０００ｍｍ３の腫瘍体積エンドポイントに達した時点で試験を終了した。
【図１３】個々のマウスのＭＣ３８腫瘍増殖曲線であって、処置なし（ＰＢＳ、ビヒクルのみ）、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａのいずれかを有する抗マウスＣＤ２５による処置（それぞれＰＣ６１ｍ１及びＰＣ６１ｍ２）、及び抗マウスＰＤ−Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２（ａＰＤＬ１  １０Ｆ．９Ｇ２）を更に組み合わせた処置またはなしでのＭＣ３８腫瘍増殖曲線を示す。図１２のαＰＤ１による組み合わせ実験と同様に、モデル、レジメン及び分析を実施した。
【図１４】異なるヒトがん種から得たサンプル中の腫瘍局在免疫細胞の外面におけるＣＤ２５発現を示す。代表的なヒストグラムは、ステージＩＶのヒト卵巣癌（腹膜転移；Ａ）及びヒト膀胱癌（Ｂ）のＴＩＬサブセットにおけるＣＤ２５発現を示す。他のがん種から単離したＰＢＭＣ及びＴＩＬ内の個々のＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陰性及びＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性のＴ細胞サブセットについても、代表的なヒストグラムを得た（Ｃ）。また、各試験患者コホート内の個々のＴ細胞サブセットに関するＣＤ２５発現のパーセンテージ（％）での定量及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、黒色腫（上のパネル）、ＮＳＣＬＣ（中央のパネル）及びＲＣＣ（下のパネル）について示す（Ｄ）。
【図１５】抗ＰＤ−１で治療した患者のＣＤ２５発現に関するデータを示す。抗ＰＤ−１療法を受ける前（「ベースライン」）と２回の注射後（「６週目」）の黒色腫皮下転移のマルチプレックス免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、患者２名のベースライン時と６週目におけるＣＤ８及びＦｏｘＰ３  ＩＨＣ染色の定量と並列して示す。６週目において、１名は治療に応答し、１名は応答しなかった（Ｂ；４０倍の高倍率視野当たりの平均計数値を示す）。ベースライン時及び治療中（６週目）におけるＣＤ８陽性ＣＤ２５陽性及びＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５陽性の二重染色細胞のパーセンテージ（％）を、抗ＰＤ１で治療した黒色腫患者及びＲＣＣ患者について示す（Ｃ）。
【図１６】いずれもヒトＩｇＧ１アイソタイプを有し、特定のアミノ酸を変異させた（ＰＣ６１−ＩｇＧ１の場合Ｋ４０９Ｒ及びＳ７０−ＩｇＧ１の場合Ｆ４０５Ｌ）、抗マウスＣＤ２５（ＰＣ６１）及び抗マウス／ヒトＰＤ−Ｌ１（クローンＳ７０）の抗原結合領域を使用して作製した二重特異性抗ＩｇＧ１抗ＰＤ−Ｌ１ベースデュオボディ（ｂｓ  ＣＤ２５／ＰＤ−Ｌ１）の構造及び結合活性を示す（Ａ）。マウスＣＤ２５（ＣＤ２５＋細胞株）またはマウスＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ１＋細胞株）のいずれかを発現するベクターをトランスフェクトした細胞株（ＳＵＰ−Ｔ１細胞、ヒトＴリンパ芽球；ＳＵＰ−Ｔ１［ＶＢ］ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９４２（登録商標））を使用して、ＣＤ２５に対するｂｓ  ＣＤ２５／ＰＤ−Ｌ１の特異性を試験した。元の細胞株及び得られた２つの他の細胞株を使用して、ｂｓ  ＣＤ２５／ＰＤ−Ｌ１の結合能力と、関連する単一特異性抗体（ａＣＤ２５、クローンＰＣ６１；ａＰＤ−Ｌ１、クローンＳ７０）の結合と比較した。ＣＤ２５＋細胞株及びＰＤ−Ｌ１＋細胞株を互いに１：１の比で（またはそれぞれ個別にトランスフェクトされていない対照細胞とともに）混合し、次いで、ｂｓＣＤ２５／ＰＤ−Ｌ１、ａＣＤ２５、ａＰＤ−Ｌ１とともに、またはいかなる抗体も含めずに（抗体なし）３０分間インキュベートした。インキュベーション後、３つの細胞サンプル群をフローサイトメトリーで解析し、種々の細胞サンプルにおける二重陽性細胞のパーセンテージを算出する（Ｂ）。ｂｓ  ＣＤ２５／ＰＤ−Ｌ１（ＢｓＡｂ）の特異性は、ＣＤ２５＋細胞株及びＰＤ−Ｌ１＋細胞株を個別に使用して確認した。各細胞株を、一次抗体としてｂｓＣＤ２５／ＰＤＬ１またはそれぞれの単一特異性Ａｂ（ＭｓＡｂ、ＣＤ２５＋細胞には抗マウスＣＤ２５ＩｇＧ１及びＰＤ−Ｌ１＋細胞には抗マウスＰＤ−Ｌ１）のいずれかで標識するか、緩衝液のみとした。次いで、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の二次抗体ａＨｕｍａｎ  ＡＦ６４７（ａＨｕｍａｎ）とともに３０分間インキュベートし、固定可能な生死判定色素も同様にした。二次抗体（ａＨｕｍａｎ  ＡＦ６４７）とのみインキュベートした細胞または一次抗体とも二次抗体ともインキュベートしていない細胞（無染色）を陰性対照として使用した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって解析し、ＢｓＡｂにより得られた陽性細胞のパーセンテージ（各パネルの右側に示される）を算出し、ＭｓＡｂと比較した（Ｃ）。
【図１７】ＭＣＡ２０５腫瘍マウスモデル（図３に記載のとおりに確立；各群４または５匹のマウス）のＬＮ及び腫瘍中のエフェクター細胞及び制御性Ｔ細胞に対する、図１６に記載される二重特異性ＩｇＧ１ベースデュオボディ（Ｂｓ  ＣＤ２５ＰＤ−Ｌ１）、抗マウスＣＤ２５（ａＣＤ２５）ＩｇＧ１及び抗マウスＰＤ−Ｌ１（ａＰＤ−Ｌ１）ＩｇＧ１単一特異性抗体のそれぞれもしくは一緒に混合したもの（ａＣＤ２５＆ａＰＤ−Ｌ１）、またはアイソタイプＩｇＧ１コントロールの影響を示す。サンプルを使用して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するか、リンパ節細胞（ＬＮ）を単離し、ＦｏｘＰ３、ＣＤ３及びＣＤ４陽性に基づいた各処置群におけるエフェクター細胞及び制御性Ｔ細胞の存在（Ａ）またはＣＤ８陽性／Ｔｒｅｇ（ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ４陽性）比（Ｂ）について解析した。また、刺激に応答する腫瘍浸潤ＣＤ４陽性Ｔ細胞の能力に対する各治療のｉｎ  ｖｉｖｏ作用についても評価した。Ｇｏｌｇｉ  ｐｌｕｇタンパク質阻害剤の存在下でＰＭＡ及びイオノマイシンを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＩＬを再刺激し、次いで、インターフェロン−γ（ＩＦＮｇ）の細胞内固定後に、ＣＤ５及びＣＤ４を細胞外染色した。ＩＦＮｇも陽性であるＣＤ５陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって解析した（Ｃ）。
【実施例】
【０１２６】
材料及び方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。Ｆｃｅｒ１ｇ−／−及びＦｃｇｒ３−／−マウスは、Ｓ．Ｂｅｅｒｓ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）の好意により提供された。Ｆｃｇｒ４−／−及びＦｃｇｒ２ｂ−／−マウスは、Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ氏（Ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）から寄贈された。動物実験は全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ及び英国内務省の倫理審査承認及び規則の下で実施された。
【０１２７】
細胞株及び組織培養
ＭＣ３８、Ｂ１６、ＣＴ２６及びＭＣＡ２０５腫瘍細胞（３−メチルコラントレンにより誘導された弱免疫原性の線維肉腫細胞；Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ氏（Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より）及びレトロウイルス産生に使用する２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭＬ−グルタミン（全てＧｉｂｃｏ製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）中で培養した。抗体産生に使用するＫ５６２細胞を、１０％ＩｇＧ枯渇ＦＣＳを添加したフェノールレッド不含イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。Ｂ１６（マウス皮膚黒色腫細胞）及びＣＴ２６（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタンにより誘導された未分化結腸癌細胞株）の各細胞及び関連培養条件は、ＡＴＣＣから入手可能である。
【０１２８】
抗体産生
抗ＣＤ２５の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列をｃＤＮＡ末端高速増幅（ＲＡＣＥ）によってＰＣ−６１．５．３ハイブリドーマから分離し、次いで、ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｍＧ２Ａ及びｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｍｋプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に由来するネズミＩｇＧ２ａ及びκ鎖の定常領域にクローニングした。次いで、各抗体鎖をネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来レトロウイルスベクター中にサブクローニングした。予備実験のために、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを形質導入したＫ５６２細胞を使用して、抗体を産生した。
再クローニングされたＰＣ−６１．５．３抗体由来の抗ＣＤ２５重鎖可変ＤＮＡ配列は、次のタンパク質配列をコードする。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＶＳＧＤＴＩＴＡＹＹＩＨＦＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＤＤＳＴＥＹＡＥＫＦＫＮＫＡＴＩＴＡＮＴＳＳＮＴＡＨＬＫＹＳＲＬＴＳＥＤＴＡＴＹＦＣＴＴＤＮＭＧＡＴＥＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１２９】
再クローニングされたＰＣ−６１．５．３抗体由来の抗ＣＤ２５軽鎖可変ＤＮＡ配列は、次のタンパク質配列をコードする。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＱＶＶＬＴＱＰＫＳＶＳＡＳＬＥＳＴＶＫＬＳＣＫＬＮＳＧＮＩＧＳＹＹＭＨＷＹＱＱＲＥＧＲＳＰＴＮＬＩＹＲＤＤＫＲＰＤＧＡＰＤＲＦＳＧＳＩＤＩＳＳＮＳＡＦＬＴＩＮＮＶＱＴＥＤＥＡＭＹＦＣＨＳＹＤＧＲＭＹＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０１３０】
プロテインＧ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して抗体を上清から精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析し、濃縮し、滅菌濾過した。更なる実験のために、抗体産生をＥｖｉｔｒｉａ  ＡＧに外注した。市販の抗ＣＤ２５クローンＰＣ−６１は、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。
公開されている抗ＰＤＬ１（ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６）の可変重鎖及び可変軽鎖のＤＮＡ配列は、組み換え抗体として再クローニング及び発現されている。
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍実験
培養した腫瘍細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ．）した（Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＣＡ２０５及びＭＣ３８モデルには５×１０５細胞；Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６モデルには２．５×１０５細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６モデルには５×１０５細胞）細胞）。抗体は、図の凡例に記載される時点で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。機能実験のために、１０日後、腫瘍、流入領域リンパ節及び組織を採取し、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０，１６９５−７１０に記載されているフローサイトメトリーによる解析用に処理した。治療実験のために、腫瘍を週２回測定し、３つの直行する直径の積として体積を算出した。いずれかの直径が１５０ｍｍに達したら、マウスを人道的に安楽死させた。腫瘍担持マウスを、５及び７日目に、２００μｇの抗ＣＤ２５−ｒ１（αＣＤ２５−ｒ１）、抗ＣＤ２５−ｍ２ａ（αＣＤ２５−ｍ２ａ）または抗ＣＴＬＡ−４（αＣＴＬＡ−４）により処置し、６、９及び１２日目に、１００μｇの抗ＰＤ−１により処置した。治療実験の場合は、マウスを５日目にのみ処置し、表現型決定及び枯渇の場合には、５日目及び７日目にのみ処置した。腫瘍サイズを週２回測定し、いずれかの腫瘍直径が１５０ｍｍに達したら、マウスを安楽死させた。９日目に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節（ＬＮ）及び腫瘍（ＴＩＬ）を採取し、フローサイトメトリー解析用に処理し、染色した。
【０１３２】
フローサイトメトリー
データ収集は、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。次の直接コンジュゲート抗体：抗ＣＤ２５（７Ｄ４）−ＦＩＴＣ、ＣＤ４（ＲＭ４−５）−ｖ５００（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；抗ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、抗ＰＤ−１（Ｊ４３）−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、抗Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）−ＰＥ、抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）−ＰＥ−Ｃｙ７、抗Ｋｉ６７（ＳｏｌＡ１５）−ｅＦｌｕｏｒ４５０、抗ＣＤ５（５３−７．３）−ｅＦｌｕｏｒ４５０、固定可能な生死判定色素−ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；抗ＣＤ８（５３−６．７）−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；及び抗グランザイムＢ（ＧＢ１１）−ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。次の抗体：抗ＣＤ２５（ＢＣ９６）−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４（ＯＫＴ４）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ８（ＳＫ１）−Ｖ５００、抗Ｋｉ６７（Ｂ５６）−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；抗ＦｏｘＰ３（ＰＣＨ１０１）−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ヒト細胞を染色した。Ｆｏｘｐ３の核内染色は、Ｆｏｘｐ３  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。サイトカインの細胞内染色のために、細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、２０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、３７℃で４時間、再刺激し、次いで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液セット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して染色した。細胞の絶対数を定量するために、データ取得の前に所定数の蛍光ビーズ（Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｓｅｔ−ｕｐ  Ｂｅａｄｓ  ｆｏｒ  ＵＶ  Ｌａｓｅｒｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を各サンプルに添加し、計数基準として使用した。
【０１３３】
ヒト組織
進行性黒色腫（ｎ＝１０、１２の病変）、早期非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ｎ＝８）及び腎細胞癌（ＲＣＣ）（ｎ＝５）の３つの異なる患者コホートにおいて、末梢血（ＰＢＭＣ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調査した。示されるヒトデータは、倫理審査承認を受けた３つの異なる並行試験（黒色腫ＲＥＣ  ｎｏ．１１／ＬＯ／０００３、ＮＳＣＬＣ−ＲＥＣ  ｎｏ．１３／ＬＯ／１５４６、ＲＣＣ−ＲＥＣ  ｎｏ．１１／ＬＯ／１９９６）から得た。全ての症例において、書面によるインフォームドコンセントを得た。
【０１３４】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離
腫瘍は、手術室から病理部門に直接持ち込まれ、腫瘍の代表領域が切り出された。続いて、サンプルを滅菌条件下で細断し、酵素分解（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ試験等級（Ｒｏｃｈｅ）及びＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ））を３７℃で３０分間行い、その後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して機械的分散を行った。得られた単一細胞懸濁液を濾過し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配に通して白血球を濃縮した。生細胞を計数し、１０％ジメチルスルホキシド含有ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）中に−８０℃で凍結させた後、液体窒素に移した。
【０１３５】
マルチパラメータフローサイトメトリーによるＴＩＬ及びＰＢＭＣの表現型分析
腫瘍サンプル及びＰＢＭＣを解凍し、完全ＲＰＭＩで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５００ｍＬ  ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、２ｎＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、丸底９６ウェルプレートに入れた。表面抗体のマスターミックスを製造元の推奨希釈：ＣＤ８−Ｖ５００、ＳＫ１クローン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤ−１−ＢＶ６０５、ＥＨ１２．２Ｈ７クローン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３−ＢＶ７８５で調製した。固定可能な生死判定色素（ｅＦｌｏｕｒ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）も表面マスターミックスに含めた。細胞内固定・透過処理緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して透過処理を２０分間行った後、製造元の推奨希釈で使用される次の抗体：グランザイムＢ−Ｖ４５０、ＧＢ１１クローン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦｏｘＰ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＣＨ１０１クローン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｋｉ６７−ＦＩＴＣ、クローンＢ５６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＴＬＡ−４−ＡＰＣ、Ｌ３Ｄ１０クローン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）からなる細胞内染色パネルを適用した。
【０１３６】
マルチプレックス免免疫組織化学
腫瘍サンプルを緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィンに包理した。２〜５μｍの組織切片を切り出し、次の免疫組織化学用抗体：抗ＣＤ８（ＳＰ２３９）、抗ＣＤ４（ＳＰ３５）（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、抗ＦｏｘＰ３（２３６Ａ／Ｅ７）（Ｇ．Ｒｏｎｃａｄｏｒ  ＣＮＩＯ博士（Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）からの寄贈）及び抗ＣＤ２５（４Ｃ９）（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した。多重染色のために、細胞コンディショニング１試薬（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）及び内因性ペルオキシダーゼ不活化用過酸化水素を使用して抗原を賦活化した後、パラフィン包理組織切片を一次抗体とともに３０分間インキュベートした。検出は、ペルオキシダーゼベースの検出試薬（ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）及びアルカリホスファターゼ検出試薬（ＵｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。免疫アルカリホスファターゼの更なるサイクルを、別の基質（先にＦａｓｔ  Ｒｅｄを使用した場合はＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ；逆もまた同様）を使用して実施した。免疫組織化学及びタンパク質反応パターンを評価した。多重免疫染色のスコアリングも実施した。本試験の承認は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ４から得た（ＲＥＣ参照番号０９／Ｈ０７１５／６４）。
【０１３７】
抗ＣＤ２５及び抗ＰＤ−Ｌ１をベースにした二重特異性デュオボディの構築及び検証
Ｂｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１デュオボディは、文献に記載されている技術に従って、ＣＨ３ドメイン中に、Ｆａｂ交換を可能にする１つの対応する点変異を含有する２つの親ＩｇＧ１から開始して、作製及び産生されている（Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１４，９：２４５０−６３）。簡潔に述べれば、抗マウスＣＤ２５（上記のＰＣ６１；マウスＩｇＧ１アイソタイプ）及び抗マウス／ヒトＰＤ−Ｌ１（クローンＳ７０（アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６またはクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０としても知られる）；ＷＯ２０１００７７６３４及びＨｅｒｂｓｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  ５１５：５６３−７参照）のそれぞれを、軽鎖は同一のままであるが、ＣＨ３ドメイン中にＫ４０９Ｒ変異（ＰＣ６１−ＩｇＧ１）及びＦ４０５Ｌ変異（Ｓ７０−ＩｇＧ１）を含めて、哺乳動物発現ベクター（５０４８６５｜ＵＣＯＥ（登録商標）発現ベクター−マウス３．２ｋｂ  Ｐｕｒｏ  Ｓｅｔ−Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、哺乳動物細胞において別々の組み換えタンパク質として産生させる。半分子の組み換えを可能にするために、これらの親ＩｇＧ１を、許容される酸化還元条件下（例えば、７５ｍＭ  ２−ＭＥＡ；インキュベーション５時間）、等モル量でｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合する。還元剤を除去して鎖間ジスルフィド結合の再酸化を可能にした後、得られたヘテロマータンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーまたは質量分析に基づく方法を使用して、交換効率について分析する。Ｂｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１の場合、質量分析により、ヘテロ二量体タンパク質の分子量は１５１Ｋｄであることが確認され、これは、クローンＳ７０の単一の重鎖及び軽鎖の分子量（７４Ｋｄ）とＰＤ６１−ＩｇＧ１の単一の重鎖及び軽鎖の分子量（７７Ｋｄ）を加算したものに対応し、各親ＩｇＧ１の半分が組み合わされて単一分子になったことを示している。
【０１３８】
Ｂｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１の特異性は、実施例５に記載されるフローサイトメトリーによって、文献及び製造元の説明書に従ってＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に希釈して使用される、対照の親抗体及びＩｇＧ１認識検出抗体（ａＨｕｍａｎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  １０９−６０５−０９８）を使用して更に確認した。更なるフローサイトメトリー及び細胞生物学の材料は、固定可能な生死判定色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６５０８６５１４）、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−３５７６）及びイオノマイシン（４００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｉ０６３４）及びＧｏｌｇｉ  ｐｌｕｇタンパク質阻害剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５１２３０１ＫＺ）である。
【０１３９】
ＭＣＡ２０５モデルにおけるＢｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１の検証は、先の実施例に示されるのと同じアプローチを使用して実施し、アイソタイプコントロール、単一特異性抗体（各１００μｇ）または二重特異性デュオボディ（各２００μｇ）をＭＣＡ２０５注射後の７日目に投与し、１０日目にマウス組織を取得及び調製した。
【０１４０】
実施例１−ＴｒｅｇのＣＤ２５高発現は、その枯渇の好適な標的となる。
インターロイキン２高親和性受容体アルファ（ＩＬ２Ｒα）であるＣＤ２５は、Ｔｒｅｇの誠実な表面マーカーとしてこれまで使用されており、したがって、抗体媒介性Ｔｒｅｇ枯渇の標的である。抗ＣＤ２５（ａＣＤ２５）が活性化エフェクターＴ細胞も排除し得るかどうかについては、議論があることから、ＣＤ２５の発現を腫瘍及び末梢リンパ器官のリンパ球サブ集団で解析した。
【０１４１】
マウスにＭＣＡ２０５（５×１０５細胞、Ｃ５７ＢＬ／６マウス）、Ｂ１６（２．５×１０５細胞、Ｃ７ＢＬ／６マウス）またはＣＴ２６（５×１０５細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス）の各細胞を脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、１０日後、腫瘍（ＴＩＬ）及び流入領域リンパ節を採取し、フローサイトメトリーによる解析のために処理した。
【０１４２】
腫瘍移植から１０日後、ＣＤ２５の相対発現を、腫瘍担持マウスの腫瘍、流入領域リンパ節及び血液中の個々のＴリンパ球サブ集団ごとに評価することにした。結果を図１に示す。移植可能な腫瘍細胞株（ＭＣＡ２０５肉腫、ＭＣ３８結腸腺癌、Ｂ１６黒色腫及びＣＴ２６大腸癌を含む）の種々のモデル間で、ＣＤ２５発現は、先に記載されているように（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で一貫して高く、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞では最小であった（図１（Ａ））。その免疫原性及びより高いＴ細胞浸潤から、ＭＣＡ２０５腫瘍モデルにおけるＴｒｅｇ枯渇への作用を更に試験した（図１（Ｂ〜Ｃ））。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験とは対照的に、エフェクター区画（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞）におけるＣＤ２５の最小発現がｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたが、腫瘍浸潤ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）におけるＣＤ２５は、わずかに上方制御された。ＣＤ２５陽性細胞のパーセンテージ（ＣＤ８＋細胞３．０８％〜８．３５％、ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陰性細胞１４．１１〜２６．８７％）及び細胞当たりの発現レベル（平均蛍光強度（ＭＦＩ）：ＣＤ８陽性細胞１６６．６、ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陰性細胞１３４）は、Ｔｒｅｇ（８３．６６〜９０．２３％、ＭＦＩ  １０５１．９；ｐ＜０．００１）よりも大幅に低かった。最後に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づく発現レベルは、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇでより高かったが、ＣＤ２５は、流入領域リンパ節及び血液中に存在するＴｒｅｇ上にも発現した。Ｔｅｆｆ細胞上のＣＤ２５発現がＴｒｅｇ細胞と比較して大幅に低いということは、Ｔｒｅｇの発現レベルが有意に高い腫瘍におけるＴｒｅｇ枯渇にとって、ＣＤ２５が好適かつ魅力的な標的であることを示している。
【０１４３】
実施例２−抗ＣＤ２５による効果的かつ安全な腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇にはアイソタイプスワッピングが必要である。
従来から、抗ＣＤ２５抗体（αＣＤ２５）クローンＰＣ−６１（ラットＩｇＧ１，κ）（αＣＤ２５−ｒ１）は、マウスモデルでのＴｒｅｇ枯渇に使用されており、マウスモデルでは、末梢リンパ器官中のＴｒｅｇが排除されることが繰り返し示されている。ＦｃγＲ結合における種間の相違を避けるために、ＰＣ−６１の定常領域をマウスＩｇＧ２ａ，κ（αＣＤ２５−ｍ２ａ）（典型的なマウス枯渇アイソタイプ）に交換し、Ｔｒｅｇ数を末梢と腫瘍の両方で定量し、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの枯渇をもたらすことが知られている抗ＣＴＬＡ４（αＣＴＬＡ４、クローン９Ｈ１０）の作用と比較した。
【０１４４】
免疫調節抗体の活性を共定義することで腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇の重要性を示している先の証拠に基づき、その免疫原性が高いことから、また抗ＣＤ２５が腫瘍内の活性化Ｔｅｆｆに対して負の影響を与える可能性を評価するために、ＭＣＡ２０５マウスモデルにおいて、血液、流入領域リンパ節（ＬＮ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＴｅｆｆ及びＴｒｅｇの頻度に対するαＣＤ２５−ｒ１の作用を比較することにした。
【０１４５】
腫瘍担持マウスに、５×１０５個のＭＣＡ２０５細胞をｓ．ｃ．接種してから５及び７日目に、２００μｇの抗ＣＤ２５−ｒ１（αＣＤ２５−ｒ１）、抗ＣＤ２５−ｍ２ａ（αＣＤ２５−ｍ２ａ）または抗ＣＴＬＡ−４（αＣＴＬＡ−４）を注射した。９日目に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節（ＬＮ）及び腫瘍（ＴＩＬ）を採取し、フローサイトメトリー解析用に処理し、染色した。結果を図２及び３に示す。
【０１４６】
αＣＤ２５のｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、抗体アイソタイプに関係なく、リンパ節、特に血液中のＣＤ２５＋細胞数を減少させた。特徴的な転写因子であるＦｏｘｐ３の発現によってＴｒｅｇ数を定量すると、両アイソタイプは、末梢においても同様に等しく有効であったが、驚くべきことに、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプだけが腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの頻度及び絶対数をαＣＴＬＡ４で観察されたレベルに匹敵するレベルまで有意に減少させた。ＣＤ２５発現は、腫瘍浸潤エフェクターＴ細胞のわずかな部分で上昇制御されるが（実施例１参照）、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−の数の有意な減少は末梢でも腫瘍でも観察されなかった。その結果、両αＣＤ２５アイソタイプは、末梢において、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比が上昇した。しかしながら、αＣＤ２５−ｍ２ａだけが、末梢ではなく腫瘍部位でＴｒｅｇを優先的に枯渇させることが知られている抗ＣＴＬＡ４と同じように、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比を上昇させた。これは、先の試験において、定着腫瘍に対して観察された有効性の欠如を潜在的に説明するものである。したがって、抗ＣＤ２５（マウスＩｇＧ２ａ）だけがリンパ節及び血液中のＴｒｅｇ数を減少させ、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる。重要なことに、循環Ｔｒｅｇ及びＬＮ在住Ｔｒｅｇの数が減少したにもかかわらず、αＣＤ２５−ｍ２ａの複数回投与後、毒性の全般的な証拠は、皮膚、肺及び肝臓において観察されなかった。このタイプの抗ＣＤ２５療法は、異なる処置群で、全身の健康状態及び総体重、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）及び肝臓酵素（ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ）の血清レベルに統計的に関連する差異が示されなかったことから、マウスにおいて、当該実験中の毒性に起因する他の重大な問題を伴わなかった。
【０１４７】
皮下にＭＣＡ２０５腫瘍を担持するマウスの血液、脾臓、ＬＮ及び腫瘍中の異なる白血球サブ集団における活性化型及び抑制型の両方のＦｃγＲの発現レベルも求めた（図４）。ＦｃγＲは、試験した他の全ての器官と比較して、腫瘍浸潤骨髄細胞（顆粒球、通常型樹状細胞及び単球／マクロファージ）上でより発現しているようであった。抗ＣＤ２５の２つのＦｃバリアントのＦｃγＲに対する結合親和性についても表面プラズモン共鳴によって決定した（表１）。
【表１】
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【０１４８】
これらのデータは、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプが全てのＦｃγＲサブタイプに結合し、抑制型に対する活性化型の比（Ａ／Ｉ）が高いことを示している。対照的に、ｒＩｇＧ１アイソタイプは、１つの活性化型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＩ）及び抑制型ＦｃγＲＩＩｂに同等の親和性で結合することから、Ａ／Ｉ比が低い（＜１）。
【０１４９】
どの特定のＦｃγＲが抗ＣＤ２５媒介性Ｔｒｅｇ枯渇に関与しているのかを判別するために、種々のＦｃγＲ発現を欠くマウスにおける腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの数を異なるマウスモデルで定めた（図５）。Ｃ５７ＢＬ／６対照マウス及びＦｃｅｒ１ｇ−／−マウスにＭＣＡ２０５細胞を皮下注射し、腫瘍、流入領域リンパ節及び血液を採取し、フローサイトメトリー解析用に処理し、染色した。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３発現によって特定された。総ＣＤ４陽性細胞に対するＦｏｘｐ３陽性のパーセンテージは、抗ＣＤ２５の作用がＦｃｅｒ１ｇ遺伝子の発現によるものであることを示す。いずれの活性化型ＦｃγＲ（Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶ）も発現しないＦｃｅｒ１ｇ−／−マウスの解析は、Ｔｒｅｇ枯渇の完全な不在を示した。したがって、末梢におけるαＣＤ２５−ｒ１によるＴｒｅｇ排除と、末梢及び腫瘍におけるαＣＤ２５−ｍ２ａによるＴｒｅｇ排除は、ＩＬ−２のＣＤ２５への結合を遮断することによるものではなく、ＦｃγＲ媒介性ＡＤＣＣに起因する。αＣＤ２５−ｍ２ａによる枯渇は、いかなる個々の活性化型ＦｃγＲに依存せず、Ｆｃｇｒ３−／−及びＦｃｇｒ４−／−マウスの両方でＴｒｅｇ排除が維持された。このように、αＣＤ２５−ｒ１による末梢Ｔｒｅｇの枯渇は、この受容体の腫瘍内発現が高いにもかかわらず、腫瘍内の枯渇をもたらさない。しかしながら、腫瘍内におけるＴｒｅｇ枯渇は、抑制型受容体ＦｃγＲＩＩｂの発現を欠くマウスにおいて効果的に回復した。この設定において、腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇は、αＣＤ２５−ｒ１とαＣＤ２５−ｍ２ａとの間で同等である。したがって、αＣＤ２５−ｒ１による腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇の欠如は、Ａ／Ｉ結合比が低く、ＦｃγＲＩＩｂの腫瘍内発現が高いことで、このアイソタイプが結合する唯一の活性化型受容体によって媒介されるＡＤＣＣが阻害されることにより、説明され得る。
【０１５０】
実施例３−抗ＣＤ２５療法は、抗ＰＤ−１と相乗作用を示し、定着腫瘍を根絶し、腫瘍担持マウスの生存を延ばす。
腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇の効率がより良いことから、αＣＤ２５−ｍ２ａは、定着腫瘍の治療において良好な治療成果を有し得ると仮定された。定着腫瘍に対するαＣＤ２５−ｍ２ａ及びαＣＤ２５−ｒ１の抗腫瘍活性を、腫瘍が定着した、ＭＣＡ２０５細胞の皮下移植から５日後に、単回用量のαＣＤ２５を投与することによって評価した。結果を図６に記載する。
【０１５１】
腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる能力の欠如が観察されたことと一致して、定着腫瘍（５日目）を有するマウスに投与した単回用量のαＣＤ２５は、αＣＤ２５−ｒ１では防御をもたらさなかった。他方、αＣＤ２５−ｍ２ａを投与したマウスでは、増殖遅延及び長期生存が観察された（１５．４％）。免疫療法標的として共抑制型受容体ＰＤ−１を標的にする薬剤の臨床的意義及び腫瘍微小環境内においてＴ細胞制御を支配するＰＤ−１の重要な役割から、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の枯渇とＰＤ−１遮断は、組み合わせると、相乗作用を有し得ると仮定された。同一モデルにおいて、αＣＤ２５と、抗ＰＤ−１を使用するＰＤ−１遮断（αＰＤ−１、クローンＲＭＰ１−１４；３日ごとに１００μｇの用量）の組み合わせを試験した。単剤療法でのαＰＤ−１は、確立されたＭＣＡ２０５腫瘍モデルの治療において有効でなく、αＣＤ２５−ｒ１との組み合わせは、その作用を改善しなかった。一方、αＣＤ２５−ｍ２ａの単回投与とそれに続くαＰＤ−１療法は、マウスの７８．５％で定着腫瘍を根絶し、これにより、１００日を超える長期生存をもたらした。同様の結果がＭＣ３８及びＣＴ２６腫瘍モデルでも観察され、これらの腫瘍において腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させなかったαＣＤ２５−ｒ１との組み合わせとは対照的に、αＣＤ２５−ｍ２ａは、αＰＤ−１療法との相乗作用を示した部分的治療効果をもたらした。したがって、この併用投与は、有効な腫瘍排除を可能にし、異なる腫瘍マウスモデルの長期生存を劇的に改善した。
【０１５２】
αＣＤ２５−ｍ２ａとαＰＤ−１の組み合わせによる相乗作用の根底にある作用機序を理解するために、αＰＤ−１の３回目の投与から２４時間後の治療プロトコル終了時に、ＭＣＡ２０５腫瘍微小環境に存在する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の表現型及び機能を評価した（図７）。αＰＤ−１による単剤療法は、Ｔｅｆｆ増殖にも腫瘍内Ｔｅｆｆ浸潤の程度にも影響を与えなかったが、治療活性の欠如に対応して、Ｔｒｅｇの持続的な高頻度（データ示さず）と低いＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比が観察された。逆に、αＣＤ２５−ｍ２ａによる腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇により、腫瘍内において、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞の増殖及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生の比率が高くなった。これは、高いＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比と抗腫瘍応答に対応している。この作用は、抗ＰＤ−１と組み合わせると更に増強され、抗ＣＤ２５−ｍ２ａによる単剤療法と比較して、更に高い増殖と、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陰性Ｔ細胞数の１．６倍の増加をもたらした。対照的に、抗ＣＤ２５−ｒ１によるＴｒｅｇ枯渇の観察された欠如は、単剤療法または抗ＰＤ−１との組み合わせで使用した場合、Ｔｅｆｆ増殖にもＩＦＮ−γ産生にも変化を与えなかった。
【０１５３】
元のマウスＩｇＧ１アイソタイプまたは有効なＴｒｅｇ枯渇を可能にするマウスＩｇＧ２ａアイソタイプのいずれかを有するＰＣ６１によって生成されたデータは、当該抗ＣＤ２５が、単独で、または抗がん抗体と組み合わせて、定着腫瘍、特に、有効な腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇を要する腫瘍を拒絶するのに有効であり得ることを示唆している。
【０１５４】
上に示されるように、単回用量のαＣＤ２５−ｍ２ａ投与とそれに続くαＰＤ−１治療は、ＭＣＡ２０５マウスモデルにおいて、腫瘍サイズとマウス生存の両方に良い効果があった。抗ＣＤ８抗体を更に投与すると、無処置動物で観察されたレベルの腫瘍サイズとマウス生存になったことから、抗ＣＤ２５−ｍ２ａ／抗ＰＤ１によるこの治療効果は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性に依存する（図８）。したがって、ＭＣＡ２０５腫瘍排除は、ＣＤ８陽性細胞集団及びＴｒｅｇ細胞集団に対するαＰＤ−１／αＣＤ２５相乗作用の効果に依存し、全体的なエフェクターＴ細胞応答は、枯渇する抗ＣＤ２５抗体による負の影響を受けない。
【０１５５】
このような相乗作用は、αＣＤ２５−ｍ２ａ及びαＰＤ−１をＧＭ−ＣＳＦ発現全腫瘍細胞ワクチンＧｖａｘと組み合わせると、免疫原性の低いＢ１６黒色腫腫瘍モデルにおいても観察された（図９）。この系において、Ｇｖａｘ療法単独及びＧｖａｘとαＰＤ−１またはαＣＤ２５−ｒ１の組み合わせはいずれも、腫瘍増殖を阻止することも、腫瘍担持マウスの生存も延長できなかった。この設定において、ＧｖａｘとαＣＤ２５−ｍ２ａの組み合わせのみ（単独またはαＰＤ−１とともに）。このような改善は、αＣＤ２５−ｒ１を投与したいずれの処置群においても、観察されなかった。
【０１５６】
ＭＣ３８腫瘍モデルでは、αＰＤ−１（図１０）またはαＰＤ−Ｌ１（図１１）を投与した場合のいずれでも、免疫チェックポイント阻害薬とαＣＤ２５−ｍ２ａの相乗作用について同様の結果が観察された。また、ＣＴ２６腫瘍モデルは、これらの組み合わせの治療効果を立証した（図１２及び１３）。したがって、αＣＤ２５−ｍ２ａは、Ｔｒｅｇ枯渇に起因する部分的治療効果を既に有するが、この有利な特性は、免疫チェックポイント阻害薬に基づく治療法に対する応答を驚くほど改善する可能性を与えるものである。
【０１５７】
実施例４−ＣＤ２５は、ヒト腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ上で高発現され、抗ＰＤ−１療法は、ヒト腫瘍において、ＣＤ２５発現Ｔｒｅｇの浸潤を誘導する。
ＣＤ２５は、マウスモデルに基づくＴｒｅｇ枯渇及び併用免疫療法アプローチの魅力的な標的であると考えられる。ヒトにおいてＴｒｅｇ枯渇を可能にする標的としてＣＤ２５を検証するために、末梢血及び腫瘍浸潤リンパ球におけるその発現レベルを、卵巣癌、膀胱癌、黒色腫、非小細胞癌（ＮＳＣＳ）及び腎細胞癌（ＲＣＣ）患者から得た生体サンプルを使用して、フローサイトメトリー及び免疫組織化学（ＩＨＣ）によって比較した。ペンブロリズマブによるαＰＤ−１療法を受ける前と後のＲＣＣ患者の腫瘍サンプルにおけるＴｒｅｇ及びＣＤ２５発現の数もまた定量した。結果を図１４及び１５に示す。
【０１５８】
解剖学的位置、腫瘍の種類または病期とは関係なく、ＴｒｅｇのＣＤ２５発現は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（１０〜１５％）及びＣＤ８＋（＜５％）の各Ｔ細胞よりも有意に高い（５０〜８５％）ことが観察された。ネズミモデルと同様に、ＣＤ２５発現のレベルは、ＭＦＩによって評価したとき、試験した全ての腫瘍サブタイプのなかで、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−及びＣＤ８＋Ｔｅｆｆに比べてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇで有意に高かった。
【０１５９】
これらの観察結果は、マルチプレックス免疫組織化学（ＩＨＣ）によって更に裏付けられた。同じ患者コホートから得た黒色腫、ＮＳＣＬＣ及びＲＣＣ腫瘍の分析では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤が高密度である領域においても、ＣＤ２５発現が依然としてＦｏｘＰ３陽性細胞に限定されることを示した。驚くべきことに、この発現プロファイルは、腫瘍サブタイプ、病期、切除部位、現在の療法または以前の療法に関係なく一貫しており、マウスモデルで得られたデータと一致している。
【０１６０】
加えて、ネズミ皮下腫瘍において観察されたＴｒｅｇの高割合とは対照的に、ＲＣＣサンプルでは、治療を受けなかった腫瘍で、Ｔｒｅｇ数が減少した。しかしながら、抗ＰＤ−１療法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３陽性細胞）の両方による有意な浸潤をもたらした。更に、黒色腫及びＲＣＣサンプルから生成されたデータにより、ＣＤ２５は、Ｆｏｘｐ３陽性細胞によって高発現されるが、その発現は、Ｆｏｘｐ３陰性ＣＤ８陽性細胞では最小であることが確認される。
【０１６１】
ＣＤ２５発現が治療的免疫調節の状況で評価される場合。進行腎癌及び進行黒色腫の患者のそれぞれにおいて、ベースライン時と、ニボルマブ４サイクルまたはペンブロリズマブ２サイクル）の後に、同じ病変のコア生検を実施した。全身性免疫調節にもかかわらず、マルチプレックスＩＨＣによって評価すると、ＣＤ２５発現は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤が高密度である領域であっても、依然としてＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇに限定された。
【０１６２】
これらの所見は、記載される前臨床データの翻訳値を裏付けるものであり、ヒトがんにおけるＣＤ２５を介したＴｒｅｇの選択的治療標的のコンセプトを更に支持するものである。更に、抗ＰＤ１治療との関連におけるヒト固形癌のＣＤ２５発現プロファイルは、ＰＤ−１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害薬と合わせた抗マウスＣＤ２５  ＰＣ６１（ＩｇＧ２ａ）に関して示されたものと同等のＣＤ２５結合及びＦｃγ受容体特異性を有する抗ヒトＣＤ２５抗体の治療的組み合わせに対する根拠を提供する。
【０１６３】
実施例５−抗ＣＤ２５及び抗ＰＤ−Ｌ１をベースにした二重特異性抗体と抗体の組み合わせは、有効なＴｒｅｇ枯渇及びサイトカイン誘導特性を示す。
これまでの実施例により、ＰＣ６１をベースにし、かつ適切なアイソタイプを有する抗体のＴｒｅｇ枯渇ＣＤ２５結合特性は、ＰＤ−１アンタゴニスト（抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）などの免疫チェックポイントタンパク質を標的にする抗体などの他の抗がん化合物と組み合わせて利用できることが示された。これらの所見は、２つの抗原結合特性及び関連するアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１）を組み合わせた二重特異性抗体の構築を示唆するものである。
【０１６４】
個別に産生された２つの別個の単一特異性抗体に由来する単一の重鎖及び軽鎖を単一のヘテロマータンパク質中で有効に結合することができるデュオボディ技術を使用して、このアプローチを検証した（Ｂｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１と命名）（図１６Ａ）。この抗体の結合特異性を、マウスＣＤ２５またはマウスＰＤ−Ｌ１のいずれかをそれぞれ発現する２つの遺伝子改変ヒト細胞株を使用して検証し、当初の単一特異性抗体の結合特異性と比較した（図１６Ｂ及びＣ）。これらの細胞株を個別にまたは等量で混合してフローサイトメトリーによって試験したところ、Ｂｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ２５とＰＤ−Ｌ１の二重特異性を維持することを示し、更に、Ｂｓ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１がＣＤ２５陽性細胞とＰＤ−Ｌ１陽性細胞の両方に同時に結合することによって形成される二重陽性細胞複合体の複合体を更に検出することも可能であった。
【０１６５】
先の実施例においてＰＣ６１を検証するために使用した細胞相互作用及び枯渇の各モデルを使用して、ＢｓＡｂ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１の機能的特性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。腫瘍及びＬＮにおけるエフェクター細胞と制御性Ｔ細胞に対するＢｓＡｂの影響を評価するために、ＭＣＡ２０５モデルを使用した。このモデルにおいて、ＢｓＡｂ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１は、抗ＣＤ２５（ＰＣ６１−ｍ２ａ）または単一特異性抗ＣＤ２５抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせと同等の有効性で、ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞を認識して枯渇させることができ、腫瘍及びＬＮにおけるＣＤ８陽性Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞の比を上げることができる（図１７ＡＢ）。更に、ＢｓＡｂ  ＣＤ２５  ＰＤ−Ｌ１は、インターフェロンγ発現ＣＤ４陽性ＣＤ５陽性細胞の数を、単一特異性抗ＣＤ２５と抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせと少なくとも同等のレベルに増加させ、場合により抗ＣＤ２５ｍ２ａ抗体単独のうちの１つよりも大きく増加させる（図１７Ｃ）。
【０１６６】
データは、がんを治療するためのＰＣ６１ベースのＴｒｅｇ枯渇抗ヒトＣＤ２５抗体の使用が、適切なアイソタイプを選択することによって改善されることに加え、他の抗がん剤、特に、異なる細胞表面抗原に結合する抗がん抗体と効果的に組み合わせることができることを示している。このアプローチは、２つの産物を、単一特異性抗体の新規混合物として、またはＴｒｅｇ枯渇、ＣＤ２５結合及び親モノクローナル抗体の他の結合特性を維持するように結合され産生された新規二重特異性抗体として、作製し、投与することによって行うことができる。
【０１６７】
本明細書で参照される文献は全て、参照される主題に特に注意し、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明の記載の方法及びシステムの様々な変更及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態との関連で記載してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるものではないことを理解されたい。実際に、分子生物学、細胞免疫学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載された形態の様々な変更は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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