(57)【要約】  内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）及び神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）が含まれる構成型一酸化窒素合成酵素（ｃＮＯＳ）を標的とすることによる、ＵＶＢ照射傷害を阻害するための組成物及び方法について記載する。
2019508411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の皮膚細胞を治療する方法であって：
構成型一酸化窒素合成酵素（ｃＮＯＳ）阻害剤組成物を、ＵＶＢ照射への曝露によって引き起こされる皮膚細胞中のＤＮＡ損傷を阻害する、及び／又は皮膚細胞をＵＶＢ誘発形質転換から保護するのに十分な量で該被験者へ投与する工程を含んでなり；
ここでｃＮＯＳ阻害剤組成物は、内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）及び／又は神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）を含む、前記方法。
【請求項２】
ｃＮＯＳ阻害剤組成物が、Ｌ−ＮＧ−ニトロ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）とＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が局所用組成物の形態である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
局所用組成物が、スプレー剤、ミスト剤、エアゾール剤、ローション剤、クリーム剤、溶液剤、油剤、ゲル剤、軟膏剤、ペースト剤、乳液剤、懸濁注射剤、及び／又は経皮適用剤の形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被験者の皮膚が正常かつ健全であって、組成物は、皮膚細胞へのＵＶ傷害の低下を引き起こすのに十分な時間と量で該皮膚へ適用される、請求項１、請求項２、請求項３、又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＵＶＢ照射への曝露によって引き起こされる皮膚細胞中のＤＮＡ損傷を阻害する、及び／又は皮膚細胞をＵＶＢ誘発形質転換から保護するのに十分な有効量の構成型一酸化窒素合成酵素（ｃＮＯＳ）阻害剤を含んでなる組成物であって；
ここでｃＮＯＳ阻害剤は、内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）及び／又は神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）；及び
１以上の許容される賦形剤、希釈剤、及び／又は担体を含んでなり、及び／又は被包化されている、前記組成物。
【請求項７】
ｃＮＯＳ阻害剤が、Ｌ−ＮＧ−ニトロ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）とＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）の少なくとも１つを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
局所用組成物の形態である、請求項６又は請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
スプレー剤、ミスト剤、エアゾール剤、液剤、ローション剤、クリーム剤、溶液剤、油剤、ゲル剤、軟膏剤、ペースト剤、乳液剤、懸濁注射剤、及び／又は経皮適用剤の形態である、請求項８に記載の局所用組成物。
【請求項１０】
治療用医薬組成物として製剤化される、請求項６、請求項７、請求項８、又は請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
化粧用組成物として製剤化される、請求項６、請求項７、請求項８、又は請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
ＵＶ照射によって引き起こされる細胞損傷に関連した病理学的状態の化学的予防の方法であって、請求項１０に記載の組成物の有効量を個体へ投与する工程を含んでなり、ここで該組成物は、該病理学的状態の影響を改善するのに有効である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Shiyong Wu, Lingying Tong
関連出願
[0001]  本出願は、その開示がその全体で参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号：６２，２９３，８６０（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１１（ｂ）の下で２０１６年２月１１日に出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦支援研究に関する陳述
[0002]  本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された認可番号：ＣＡ０８６９２８下の政府支援でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ＤＮＡ損傷修復、細胞増殖停止、及びアポトーシスの誘導を制御するＵＶ活性化経路について広範な研究がなされてきた一方で、オートファジーの役割については、さほどよく理解されていない。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]  本明細書に記載されるのは、ＵＶＢ誘発性皮膚癌の生成及び進行への化学的予防剤としてのｃＮＯＳ阻害剤の使用である。その利益の中には、ｃＮＯＳ阻害剤がＤＮＡ損傷を抑制するだけでなくて、損傷（した）細胞の生存能を抑制し得ることもある。ｃＮＯＳ阻害剤はまた、ＵＶＢ照射後の正常皮膚組織のアポトーシス／壊死を抑制する。
【０００５】
[0005]  ｃＮＯＳ阻害剤を化学的予防剤として使用することのもう１つの利益は、ｃＮＯＳ阻害剤が皮膚をＵＶＢへ感作させることなく皮膚癌生成を抑えることである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
[0006]  本特許又は出願ファイルは、カラーで処理された１以上の図面、及び／又は１以上の写真を含有する場合がある。カラー図面（複数）及び／又は写真（複数）の付いた本特許又は特許出願公報のコピーは、要望して必要代金を支払えば、米国特許商標局によって提供され得る。
【図１】[0007]  図面１：ＵＶＢ後のＣＯＳ−１細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるオートファジー。ＣＯＳ−１細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰＬＣ３Ｂプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、これらの細胞をＵＶＢ放射線（５０ｍＪ／ｃｍ２）へ曝露した。ＵＶＢ後６時間で、これらの細胞におけるＬＣ３の凝集（矢印によって示す）が蛍光顕微鏡で観察された。
【図２】[0008]  図面２：ＵＶＢ誘発ｃＮＯＳ−ＮＦ−κＢ−ＩＫＫα制御オートファジーのモデル
【図３】[0009]  図面３：ＨａＣａＴヒト角化細胞におけるＩＫＫαのｍＲＮＡ発現についての定量的リアルタイムＰＣＲ解析。この細胞は、ＤＭＳＯ又はアクチノマイシン０（Ａｃｔ．Ｄ，５μｇ／ｍＬ）で予め処理して、ＵＶＢ（５０ｍＪ／ｃｍ２）で処理した。ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰ  ＯＨ発現に対して正規化して、ＤＭＳＯ対照に対する倍率変化として図示した。
【図４】[0010]  図面４：ＩＫＫαプロモーター構築体のスキーム。
【図５】[0011]  図面５：ＵＶＢ誘発皮膚癌発生におけるｃＮＯＳ媒介性のＤＮＡ損傷及びオートファジーの役割についてのモデル。
【図６Ａ】[0012]  図面６Ａ〜図面６Ｂ：ＵＶＢ誘発性のＨａＣａＴ細胞の形質転換。この細胞は、隔日で１０日間、シャム処理するか又はＵＶＢ処理した。細胞の形質転換について、軟寒天アッセイによって解析した。図面６Ａ：矢印は、軟寒天において増殖している形質転換細胞コロニーを指し示す。図面６Ｂ：６日目に、この細胞を Cytoselect 緩衝液（Cell Biolabs 社）に可溶化して、蛍光プレートリーダーを使用して、蛍光強度によって細胞形質転換を決定した。＊：「ＵＶＢ」対「対照」のｐ値＜０．０５。
【図６Ｂ】[0012]  図面６Ａ〜図面６Ｂ：ＵＶＢ誘発性のＨａＣａＴ細胞の形質転換。この細胞は、隔日で１０日間、シャム処理するか又はＵＶＢ処理した。細胞の形質転換について、軟寒天アッセイによって解析した。図面６Ａ：矢印は、軟寒天において増殖している形質転換細胞コロニーを指し示す。図面６Ｂ：６日目に、この細胞を Cytoselect 緩衝液（Cell Biolabs 社）に可溶化して、蛍光プレートリーダーを使用して、蛍光強度によって細胞形質転換を決定した。＊：「ＵＶＢ」対「対照」のｐ値＜０．０５。
【図７】[0013]  図面７：エレクトロスピニング技術によって製造したポリマーベースの３Ｄ培養スキャフォールド（scaffold）。エレクトロスピニングによって作製したＰＣＬ／アセトンナノファイバー構造の共焦点顕微鏡造影法。スケールバーは、１０である。
【図８】[0014]  図面８Ａ〜図面８Ｃ：２Ｄ及び３Ｄ培養細胞におけるビメンチンの発現。Ｈ１２９９細胞を２Ｄプレート（図面８Ａ）又は３Ｄ培養スキャフォールド（図面８Ｂ）に播いた。この細胞をカルセイングリーンによって染色して、共焦点顕微鏡によって造影した。この細胞を播種後１日目〜１０日目に採取した。ウェスタンブロット解析を使用して、ビメンチンの発現を決定した（図面８Ｃ）。スケールバーは、１００ｔｍである。
【図９】[0015]  図面９：２層３Ｄ共培養系の図解。
【図１０】[0016]  図面１０Ａ〜図面１０Ｂ：ＨａＣａＴ細胞におけるＵＶＢ誘発ＤＮＡ損傷。画像（図面１０Ａ）は、Cytation 3 Imaging Analyzer（BioTek, バーモント州ウィノースキー）によって撮って；ＤＮＡ密度（図面１０Ｂ）は、Comet Assay Plugin（Pathology & Lab Med UNC-CH）を用いた ImageJ（バージョン１．４６ｒ．NIH）によって解析した。＊：「ＤＭＳＯ単独」に対するｐ値＜０．０５；＊＊：「ＮＡＭＥ」に対するｐ値＜０．０５。＊＊＊：「ＵＶ＋ＤＭＳＯ」に対するｐ値＜０．０５。このデータは、５個より多い細胞についてのＤＮＡ損傷解析の平均を表す。
【図１１】[0017]  図面１１：ＵＶＢ誘発ＨａＣａＴ細胞形質転換。この細胞形質転換は、形質転換アッセイキット（Cell Biolabs 社）を使用して決定した。＊：「対照」に対するｐ値＜０．０５。＊＊：「ＵＶＢ単独」に対するｐ値＜０．０５。このデータは、３セットの独立実験の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
[0018]  今回、本明細書で示されるのは、ｃＮＯＳのＵＶＢ誘発活性化が細胞損傷の程度を増加させることと損傷細胞が生き残り得る確率を増加させることの両方によって皮膚癌の発現を高めることである。
【０００８】
[0019]  今回、本明細書でまた示されるのは、ｃＮＯＳ阻害剤が皮膚癌の生成を防ぐことが可能であることである。標的としてのｃＮＯＳの望ましい特性は、それがＵＶＢ誘発ＮＦ−κＢ活性化だけに影響を及ぼす（そして、ＴＮＦα誘発ＮＦ−κＢ活性化には影響を及ぼさない）ことである。ＵＶＢ照射はまた、ｃＮＯＳ依存的なやり方でオートファジーを増加させる（図面１）。ＵＶＢ誘発ＮＦ−κＢ活性化は、ｃＮＯＳ活性化に依存している。従って、ｃＮＯＳは、ＵＶＢ誘発癌の生成及び進行の化学的予防と治療に良好な標的となる。
【０００９】
[0020]  遺伝子ノックアウトと遺伝子過剰発現の両方にレンチウイルスシステム（Addgene）を使用することができる。このｐＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（Addgene）を使用して、単一又は多数の標的遺伝子をノックアウトすることができる。ガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲダイレクトオンラインソフトウェア（CRlSPRdirect）を使用して設計することができる。それぞれの標的への高特異性ｇＲＮＡ配列を選択して、プラスミドのｐＬ  ＣＲＩＳＰＲ．ＳＥＦＶ．ＧＦＰ（ＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡについてのレンチウイルスのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９デリバリー、Addgene）へクローニングすることができる。
【００１０】
[0021]  ｇＲＮＡの有効性を証明するために、リポフェクタミン（Lipofectamin）２０００（Invitrogen）を使用して、ＣＯＳ−１細胞を先のベクターでトランスフェクトし得て、トランスフェクション後７２時間でのウェスタンブロット解析によってノックアウト効率を証明することができる。
【００１１】
[0022]  ｐＬｅｎｔｉＮ（フラッグタグで標識した標的遺伝子のクローニング及び過剰発現のためのレンチウイルス骨格）ベクターを使用して、標的遺伝子を過剰発現させることができる。このベクターの中へ標的遺伝子のｃＤＮＡを挿入することができる。標的タンパク質の発現は、ＣＯＳ−１細胞のこのベクターでの一過性トランスフェクションに続くウェスタンブロット解析によって確認することができる。
【００１２】
[0023]  ウイルス粒子をパッケージングするために、ｓｇＲＮＡが挿入された確認済みのベクターｐＬ−ＣＲＩＳＰＲ．ＳＦＦＶ．ＧＥＰ、又はｃＤＮＡが挿入されたｐＬｅｎｔｉＮをｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（レンチウイルス粒子を産生するためのエンベロープタンパク質）とｐＣＭＶ−ｄＲ８．２ｄｖｐｒ（レンチウイルス粒子を産生するためのパッキングプラスミド）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞系の中へ１：３：４の比で同時トランスフェクトすることができる。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトされた細胞由来のレンチウイルス粒子を含有する培地を採取して４℃で保存することができる。対応する空のベクターもウイルス粒子をパックするのに使用し得て、これを対照実験用に使用し得る。
【００１３】
[0024]  安定した細胞系の構築：
[0025]  Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ゲノム編集、哺乳動物の遺伝子発現、及び Addgene からのレンチウイルスシステムを使用して、以下の安定した細胞系を構築する（註：Ｃｅｌｌ９は、遺伝子ノックアウトを示し；Ｃｅｌｌ’は、遺伝子過剰発現を示し；ｃＮＯＳは、ｎＮＯＳとｅＮＯＳの両方の二重ノックアウト又は過剰発現を示す）。
【００１４】
[0026]  ＨａＣａＴ細胞系：ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｎＮＯＳ、ＨａＣａＴｅＮＯＳ、ＨａＣａＴｃＮＯＳ；ＨａＣａＴＩＫＫ−／−、ＨａＣａＴＩＫＫ、ＨａＣａＴｐ６５−／−（ＵＶＢは、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットだけを活性化する）。
【００１５】
[0027]  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系：ＨＥＫ２９ｎＮＯＳ、ＨＥＫ２９３ＴｅＮＯＳ、及びＨＥＫ２９３ＴｃＮＯＳ。
[0028]  ＳＣＣ−１３細胞系：ＳＣＣ−１３ｎＮＯＳ−／−、ＳＣＣ−１３ｅＮＯＳ−／−、ＳＣＣ−１３ｃＮＯＳ−／−、ＳＣＣ−１３ｎＮＯＳ、ＳＣＣ−１３ｅＮＯＳ、ＳＣＣ−１３ｃＮＯＳ、ＳＣＣ−１３ＩＫＫ−／−、ＳＣＣ−１３ＩＫＫ。
【００１６】
[0029]  Ａ４３１細胞系：Ａ４３１ｎＮＯＳ−／−、Ａ４３１ｅＮＯＳ−／−、及びＡ４３ｌｃＮＯＳ−／−；Ａ４３ｌｎＮＯＳ、Ａ４３１ｅＮＯＳ、及びＡ４３ｌｃＮＯＳ、Ａ４３１ＩＫＫ−／−、Ａ４３１ＩＫＫ。
【００１７】
[0030]  細胞をｐＬ  ＣＲＩＳＰＲ−標的遺伝子又はｐＬｅｎｔｉＮ−標的遺伝子のウイルス粒子にそれぞれ感染させることによって、標的遺伝子のノックアウト又は過剰発現がある細胞系を作製することができる。簡潔に言えば、８μｇ／ｍＬのポリブレンを含有する細胞培養基へレンチウイルス粒子含有培地を直接加える。安定した細胞系を確立するには、感染から２４時間後に１〜３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む新鮮培地を被感染細胞上に入れることができる。
【実施例】
【００１８】
[0031]  実施例
[0032]  下記の実施例において、本明細書に開示する組成物及び方法のいくつかの態様を明確化する。これらの実施例が、本発明の特別な態様を示す一方で、例解のためにのみ示されることを理解されたい。上記の考察とこれらの実施例より、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認し得て、その精神及び範囲より逸脱することなく、様々な変更及び修飾を施して、本明細書に記載される組成物及び方法を様々な使用法及び状況へ適応することができる。本開示の本質的な範囲より逸脱することなく、様々な変更を施してよくて、その諸要素を同等物で代用してよい。加えて、特別な状況又は材料を本開示の本質的な範囲より逸脱することなくその教示へ適応するために、多くの修飾を施してよい。
【００１９】
[0033]  実施例１
[0034]  ＵＶＢ後のＮＦ−κＢ活性化、ＩＫＫα発現、及びオートファジーの制御におけるｃＮＯＳ
[0035]  本明細書に記載するのは、ＵＶＢ誘発オートファジーの制御における、ｃＮＯＳを中心とするＮＦ−κＢ−ＩＫＫαシグナル伝達回路についてである。図面２は、ＵＶＢ誘発ｃＮＯＳ−ＮＦ−κＢ−ＩＫＫα制御オートファジーのモデルを提供する。ＵＶＢ誘発ＮＦ−κＢ活性化単独で、又はｐＬＣＲＩＳＰＲ−ｅＮＯＳと感染後２４時間の両方で、この細胞は、シャム処理又はＵＶＢ処理し得て、ＵＶＢ処理後６時間で決定することができる。
【００２０】
[0036]  １．１．
[0037]  ＵＶＢ後のＮＦ−κＢの活性化の制御における、ｎＮＯＳ及びｅＮＯＳの必要性及び十分性の決定。ｃＮＯＳには、２つのアイソフォーム（ｅＮＯＳとｎＮＯＳ）があって、多数の機能を有する。
【００２１】
[0038]  ａ．ＵＶＢ誘発ＮＦ−κＢ活性化へのそれぞれのｃＮＯＳの関与を決定するために：ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−をＵＶＢで処理して、照射後６時間でこれらの細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を決定する。
【００２２】
[0039]  ｂ．ｃＮＯＳヌルＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ活性の誘導能の回復についてのそれぞれのｃＮＯＳ発現の十分性を決定するために：ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＴｎＮＯＳ、ＨＥＫ２９３ｅＮＯＳ、ＨＥＫ２９３ＴｃＮＯＳ細胞をＵＶＢで処理して、照射後６時間でのＮＦ−κＢ活性化（ＮＦ−κＢ  ＤＮＡの結合、転座、及びリン酸化が含まれる）を決定する。
【００２３】
[0040]  ｃ．ＵＶＢ照射時のｃＮＯＳ依存性ＮＦ−κＢ活性化が細胞系特異的ではないことを確認するために：１．１ａをＨＥＫｎ一次ヒト角化細胞で繰り返す。この細胞をｐＬＣＲＩＳＰＲウイルス粒子又はｐＬＣＲＩＳＰＲ−ｎＮＯＳウイルス粒子に感染させる。感染後２４時間で、これらの細胞をピューロマイシンで１週間選択してから、シャム処理するか又はＵＶＢ照射する。ＵＶＢ処理後６時間でＮＦ−κＢ活性化について決定する。
【００２４】
[0041]  ｄ．ｃＮＯＳ媒介性ＮＦ−κＢ活性化に対するＵＶＢ線量の影響を決定するために：５ｍＪ／ｃｍ２（細胞形質転換アッセイ用の線量）、５０ｍＪ／ｃｍ２（約５０％  ＭＥＤ）、及び１８０ｍＪ／ｃｍ２（マウスモデル用の線量）で処理した後で、ＨａＣａＴ細胞とＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−細胞におけるＮＦ−κＢ活性化について解析する。
【００２５】
[0042]  ｅ．ｃＮＯＳ媒介性ＮＦ−κＢ活性化に対するＵＶＢ線量の影響を決定するために：隔日で１０日間、５ｍＪ／ｃｍ２で処理した後で、ＨａＣａＴ細胞とＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−細胞におけるＮＦ−κＢ活性化について解析する。
【００２６】
[0043]  １．２．
[0044]  ＩＫＫα  ｍＲＮＡがＵＶＢ放射線によって低下する場合にＩＫＫαタンパク質レベルを維持するための機序の決定
[0045]  ＵＶＢ照射単独では、ＩＫＫα  ｍＲＮＡレベルを有意に低下させるものの、ＩＫＫαタンパク質レベルは低下させない。しかしながら、ｃＮＯＳ阻害剤又はＮＦ−κＢ阻害剤は、それ自体では、ＩＫＫαのｍＲＮＡ又はタンパク質レベルに影響しないものの、そのいずれも、ＵＶＢ照射後は、ｍＲＮＡレベルではなく、ＩＫＫαタンパク質レベルの低下をもたらすことができる。
【００２７】
[0046]  本明細書のデータは、転写阻害剤のアクチノマイシンＤには、ＵＶＢ後のＩＫＫα  ｍＲＮＡレベルに対して統計学的に有意な効果がないことを示し、ＵＶＢがｍＲＮＡの安定性ではなくて、ＩＫＫα  ｍＲＮＡの転写を阻害することを示す（図面３）。
【００２８】
[0047]  ＵＶＢ後に一定のＩＫＫαタンパク質レベルが維持されることへのＩＫＫα  ｍＲＮＡ発現のＵＶＢ誘発下方制御の分子機序について（タンパク質安定性の増加、及び／又は翻訳効率の増加という２つの機序の関与に沿って）決定する。また、ＵＶＢ照射後のＩＫＫαのＮＦ−κＢ媒介性安定化についての機序を決定する。
【００２９】
[0048]  ａ．ＵＶＢ照射の後でＩＫＫαプロモーターを抑制することに関与する因子（複数）を同定するために：Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ２９２０，プロメガ）を使用して、全長プロモーターと欠失変異プロモーターのＵＶＢ照射に対する応答について解析する。簡潔には、全長（−９４０／＋７０）プロモーターとＩＫＫαプロモーターの欠失変異体の系列（−４３８／＋７０、−９８／＋７０、−５０／＋７０、３０／＋７０、＋１／＋７０、−９４０／＋７０  ｄｅｌ  ｅｔｓ−１、−９４０／＋７０  ｍｕｔ  ｐ５３、−９４０／＋７０  ｍｕｔ  ｅｔｓ−１）（図面４）をプロモーターの無いルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ）の中へ構築する。この欠失変異体を設計したのは、ＩＫＫαプロモーターがｐ５３とｅｓｔ−１によって負に制御されるからである。ＨａＣａＴ細胞をこのｐＧＬ３−ＩＫＫα−Ｌｕｃベクター（空、全長、又は変異させたＩＫＫαプロモーター）とウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ発現ベクターで一過的に同時トランスフェクトする。トランスフェクション後２４時間で、この細胞にＵＶＢ照射して、ルシフェラーゼ（ホタルとウミシイタケ）活性を２時間間隔で０〜６時間の間定量する。
【００３０】
[0049]  ＩＫＫα転写を制御する因子（複数）は、イン・シリコ（in silico）解析とタンパク質−ＤＮＡ結合ＥＭＳＡを使用して同定可能である。同定される因子のＵＶＢ照射後のＩＫＫα転写の制御における役割について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトとＥＭＳＡを使用してさらに確認する。
【００３１】
[0050]  ｂ．ＵＶＢ照射後のＩＫＫαタンパク質レベルの維持におけるｃＮＯＳ媒介性ＮＦ−κＢ活性化の機序を決定するために：３５Ｓ−ＭｅＶＣｙｓ代謝パルス標識とパルス・チェイス標識を使用して、翻訳効率と安定性をそれぞれ検討する。簡潔には、ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−、及びＨａＣａＴｐ６５−／−細胞をシャム処理するか又はＵＶＢ照射する。次いで、この細胞をＵＶＢ照射後１時間間隔で０〜６時間の間、３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ（１００μＣｉ／ｍＬ）で３０ミリ分パルス標識する。細胞を３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ（１００μＣｉ／ｍＬ）で並行して３０ミリ分パルス・チェイス標識して、完全培地における３０ミリ分のインキュベーションを続ける。パルス標識又はパルス・チェイス標識の後で全細胞溶解液を調製して；ＩＫＫタンパク質を免疫沈降させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くオートラジオグラフィーによって解析する。
【００３２】
[0051]  ｃ．ＩＫＫαレベルを維持することにおけるｃＮＯＳ媒介性ＮＦ−κＢ活性化の機序を解明するために：活性化されたＮＦ−κＢが、何らかの複合体を形成すること、及び／又はＩＫＫαの核内局在化を促進することによってＩＫＫαを安定化させるかどうかを決定する。簡潔には、ＨａＣａＴとＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−をシャム処理するか又はＵＶＢ照射する。ＵＶＢ後６時間で、細胞質画分と核画分を単離する。それぞれの画分中のＮＦ−κＢのｐ６５又はＩＫＫαを免疫沈降させて、共沈降したＮＦ−κＢ（ｐ６５）又はＩＫＫαをウェスタンブロット解析によって決定する。ＮＦ−κＢ（ｐ６５）とＩＫＫαの同時局在性について、共免疫染色によって決定する。
【００３３】
[0052]  １．３．
[0053]  ＵＶＢ照射後のアポトーシス及びオートファジーの制御におけるｃＮＯＳ媒介性ＮＦ−κＢ活性化の機序の決定
[0054]  先のデータは、ｃＮＯＳヌルＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではＵＶＢ照射後にＬＣ３が凝集しなかったことを示し（図面１）、ｃＮＯＳがＵＶＢ誘発オートファジーに必要とされ得ることを示す。ｃＮＯＳ媒介性ＮＦ−κＢ−ＩＫＫαシグナル伝達カスケードは、ＵＶＢ誘発性のオートファジー及び細胞死のコントローラである。
【００３４】
[0055]  ａ．ＵＶＢ照射後のアポトーシス及びオートファジーの制御におけるｅＮＯＳ及び／又はｎＮＯＳの役割を決定するために：ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−細胞にシャム処理、及びＵＶＢ照射する。ＵＶＢ後６時間と２４時間で、オートファジーマーカーのＬＣ−Ｉ、ＬＣ３−ＩＩ、及びｐ６２のウェスタンブロットによる解析によって該細胞のオートファジーを決定する。ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰＬＣ３Ｂプラスミドを上記細胞系の中へ一過的にトランスフェクトして、トランスフェクション後２４時間でこの細胞にＵＶＢ照射することによっても、オートファジーについて解析することができる。次いで、図面１に示すように、ＵＶＢ後６時間で蛍光色素共役ＬＣ３抗体と蛍光顕微鏡法を使用して、この細胞におけるオートファゴソームの生成を検出する。ウェスタンブロットとフローサイトメトリーによるアネキシンＶ／Ｐｌ染色によるアポトーシスタンパク質マーカーの解析によって、この細胞のアポトーシスを決定する。
【００３５】
[0056]  ｂ．ＵＶＢ誘発オートファジーにｃＮＯＳ維持性ＩＫＫα発現が必要とされるかどうかを決定するために：ＨａＣａＴＩＫＫ−／−細胞をシャム処理するか又はＵＶＢ処理する。１．３ａに記載のように、ＵＶＢ曝露後６時間と２４時間でオートファジーとアポトーシスについて決定する。ＩＫＫαがＵＶＢ後のオートファジーの制御に関与することを示すために、１．ｌｃに記載のように、ＨＥＫｎをｐＬＣＲＩＳＰＲ−ＩＫＫαウイルス粒子と１週間のピューロマイシン選択とともに使用して、この実験を繰り返す。
【００３６】
[0057]  ｃ．ＩＫＫαレベルの増加がＵＶＢ照射細胞におけるオートファジーを上方制御するのに十分であるかどうかを決定するために、ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−細胞をＬｅｎｔｉＮ−ＩＫＫαウイルス粒子に感染させてから、これらの細胞を１週間培養して回復させる。これらの細胞におけるＩＫＫα過剰発現をウェスタンブロット解析によって確認する。次いで、ＩＫＫα過剰発現細胞をシャム処理するか又はＵＶＢ処理する。１．３ａに記載のように、ＵＶＢ処理後６時間と２４時間でオートファジーとアポトーシスについて決定する。
【００３７】
[0058]  実施例１の結果：
[0059]  ＵＶＢ照射の初期におけるＮＦ−κＢ活性化の誘導とＩＫＫα発現レベルの維持には、ｎＮＯＳ又はｅＮＯＳのいずれかを発現することが必要にして十分である可能性がある。
【００３８】
[0060]  二重ノックアウト又はｎＮＯＳ又はｅＮＯＳの個々のノックアウトは、ＮＦ−κＢの誘導能を損ねて、ＵＶＢ照射時のＩＫＫα発現レベルを低下させる可能性がある。
[0061]  ＵＶＢ誘発オートファジーには、比較的一定レベルのＩＫＫαを維持することが必要とされる。
【００３９】
[0062]  ＩＫＫαの発現を抑えると、ＵＶＢによって誘導されるオートファジーが阻害される可能性がある。しかしながら、ＩＫＫαの過剰発現は、細胞オートファジーを誘導し得ないものの、ＵＶＢ誘発オートファジーに対して細胞を感作させることが可能である。ＩＫＫα  ｍＲＮＡ翻訳追加の同定は、ＩＫＫΑプロモーターを制御するＩＫＫα転写因子（複数）を制御する機序を示す（即ち、効率を決定することによって、そしてＵＶＢ処理後のＩＫＫαタンパク質安定性を制御する経路を同定することによって）。
【００４０】
[0063]  実施例２
[0064]  ＵＶＢ誘発性のＤＮＡ損傷、細胞死、及び皮膚癌の生成及び進行の制御におけるｃＮＯＳの役割（複数）についての評価
[0065]  先のデータは、ＵＶＢ誘発細胞オートファジーにｃＮＯＳの発現が必要とされることを示す（図面１）。
【００４１】
[0066]  また、ｃＮＯＳは、ＵＶＢ照射後のＯＮＯＯ−誘発ＤＮＡ損傷とＩＫＫα媒介性オートファジーの両方における同時増加を促進することによって、皮膚癌発生の制御にきわめて重要な役割を担う（図面５）。
【００４２】
[0067]  ＵＶＢ誘発ＤＮＡ損傷とＩＫＫα媒介性オートファジーに対するｃＮＯＳの寄与、並びにＵＶＢ後の角化細胞の形質転換と扁平細胞癌（ＳＣＣ）の進行の制御におけるそれらの役割について決定した。このデータは、皮膚細胞の形質転換と皮膚癌の進行の制御にｃＮＯＳが関与することを示す。
【００４３】
[0068]  ２．１．
[0069]  ＵＶＢ誘発ＤＮＡ損傷及び細胞死の制御におけるｃＮＯＳとｃＮＯＳ媒介性オートファジーの役割の決定。ｃＮＯＳとｃＮＯＳ−ＮＦ−κＢ−ＩＫＫαカスケードは、ＵＶＢ誘発性のＤＮＡ損傷及び細胞死の一因となる。
【００４４】
[0070]  ａ．ＵＶＢ照射細胞におけるＤＮＡ損傷への各ｃＮＯＳの寄与を決定するために：ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣＡＴｃＮＯＳ−／−細胞をシャムとＵＶＢ照射で処理する；次いで、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、（６−４）光産物（６−４ＰＰ）、及び８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（８−ｏｘｏｄＧ）の全量とそれらを除去することの反応速度論をＵＶＢ後０、６、２４、及び４８時間で、対応する抗体を使用するスロットブロット解析によって決定する。ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．４２ｋ、ＮＩＨ）を使用して、バンドの強度を半定量する。
【００４５】
[0071]  ｂ．ＵＶＢ誘発ＤＮＡ損傷修復の制御におけるｃＮＯＳ−ＮＦ−κＢ−ＩＫＫα媒介性オートファジーの役割を決定するために：ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣＡＴｃＮＯＳ−／−細胞を担体又はオートファジー阻害剤のＳｐａｕｔｉｎ１（１０ｎＭ）で６時間前処理してから、シャムとＵＶＢ照射で処理する。この細胞をＳｐａｕｔｉｎ１の有り無しで同じ培地において培養した後で、採取する。再び、２．ｌａにおいて上記に記載したように、ＣＰＤ、６−４ＰＰ、及び８−ｏｘｏｄＧの全量とそれらを除去することの反応速度論をＵＶＢ後０、６、２４、及び４８時間で決定して半定量する。
【００４６】
[0072]  ｃ．ＵＶＢ誘発細胞死の制御においてｃＮＯＳ媒介性オートファジーが主要な役割を担うかどうかを決定するために：ＨａＣａＴ、ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣＡＴｃＮＯＳ−／−細胞を担体又はオートファジー阻害剤のＳｐａｕｔｉｎ１（１０ｎＭ）で６時間前処理してから、シャムとＵＶＢ照射で処理する。この細胞をＳｐａｕｔｉｎ１の有り無しでこの培地において継続的に培養した後で、ＵＶＢ照射後６時間と２４時間で採取する。オートファジー、アポトーシス、細胞の生存能及び回復について、本明細書に記載のように決定する。
【００４７】
[0073]  ２．２．
[0074]  角化細胞のＵＶＢ誘発形質転換の制御におけるｃＮＯＳ−ＩＫＫαカスケードの役割の決定
[0075]  ｃＮＯＳ−ＩＫＫαカスケードは、ＵＶＢ誘発皮膚細胞形質転換の制御に関与する。
【００４８】
[0076]  ａ．ｃＮＯＳ阻害剤のＵＶＢ誘発細胞形質転換への化学的予防効果について決定するために：ＨａＣａＴ細胞を隔日で１０日間、ＵＶＢ（１０ｍＪ／ｃｍ２）処理の１時間前〜６時間後にシャム又は薬物（Ｌ−ＮＡＭＥ）（１ｍＭ）で処理する。同じ薬物処理した細胞とシャムＵＶＢ照射処理した細胞を対照として使用する。この薬物及びＵＶＢ処理の後で、図面６に示すような軟寒天アッセイとケラチン５及びＭＭＰ９のような発癌バイオマーカーのウェスタンブロット解析を使用して、細胞形質転換について決定する。ＨａＣａＴｎＮＯＳ−／−、ＨａＣａＴｅＮＯＳ−／−、及びＨａＣａＴｃＮＯＳ−／−が含まれるＮＯＳノックアウト細胞を使用する細胞形質転換実験を実施することによって、ＵＶＢ誘発細胞形質転換の制御におけるｃＮＯＳの役割を確認する。
【００４９】
[0077]  ｂ．それぞれのｃＮＯＳの発現増加がＵＶＢ照射後に形質転換される細胞数の増加と相関する可能性があるかどうかを決定するために：２．２ａ．に記載のように、ＨａＣａＴｎＮＯＳ、ＨａＣａＴｅＮＯＳ、及びＨａＣａＴｃＮＯＳが含まれる、安定したＮＯＳ過剰発現細胞をシャム処理するか又はＵＶＢ処理した後で細胞形質転換解析をする。
【００５０】
[0078]  ｃ．ＩＫＫα発現レベルがＵＶＢ誘発細胞形質転換に関与するかどうかを決定するために：安定したＩＫＫαノックアウトＨａＣａＴＩＫＫ−／−細胞とＩＫＫα過剰発現ＨａＣａＴＩＫＫ細胞をシャム又はＵＶＢで処理した後で、２．２ａに記載のように、細胞形質転換解析を実施する。
【００５１】
[0079]  ２．３．
[0080]  ＵＶＢ後のＳＣＣ細胞の侵襲性及びＥＭＴの制御におけるｃＮＯＳ維持性ＩＫＫα発現の役割
[0081]  一酸化窒素放出性の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＯＮＯ−ＮＳＡＩＤ）は、内皮タンパク質と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に対するメラノーマ細胞の接着親和性を抑制するとともに、ＵＶＢ誘発皮膚癌における上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーの発現を抑制する。ＳＣＣ細胞の増殖及び遊走の制御には、オートファジー制御性のｐ６２が関与する。本明細書のデータは、ＵＶＢ誘発オートファジーにｃＮＯＳ発現が必要とされることを示している（図面１）。即ち、ｃＮＯＳとＩＫＫαは、ＳＣＣ細胞の遊走挙動とＥＭＴの制御に関与する。
【００５２】
[0082]  ａ．ＵＶＢ照射後のＳＣＣ進行の制御におけるｃＮＯＳの早期活性化の必要性について決定するために：この細胞をＵＶＢ照射の１時間前〜６時間後にシャム又は薬物（Ｌ−ＮＡＭＥ）（１ｍＭ）で処理する。この細胞の侵襲性について、トランズウェ（transwell）遊走アッセイを使用して、ＵＶＢ照射後６時間と１２時間で決定する。この細胞のＥＭＴについて、免疫蛍光染色とウェスタンブロット解析を使用するＥＭＴマーカー（ビメンチン、Ｅ−カドヘリン、等）の発現の解析によって、ＵＶＢ照射後６時間と１２時間で決定する。
【００５３】
[0083]  ｂ．ｃＮＯＳ発現レベルがＳＣＣ進行と相関するかどうかを決定するために：ヒト表皮ＳＣＣ系のＳＣＣ−１３及びＡ４３１の侵襲性及びＥＭＴに対する、ＮＯＳの過剰発現及びノックアウトの影響の程度について決定する。簡潔には、ＳＣＣ−１３ｎＮＯＳ、ＳＣＣ−１３ｅＮＯＳ、ＳＣＣ−１３ｃＮＯＳ、Ａ４３１ｎＮＯＳ、Ａ４３１ｅＮＯＳ、及びＡ４３１ｃＮＯＳが含まれるＮＯＳ過剰発現細胞と、ＳＣＣ−１３ｎＮＯＳ−／−、ＳＣＣ−１３ｅＮＯＳ−／−、ＳＣＣ−１３ｃＮＯＳ−／−、Ａ４３１ｎＮＯＳ−／−、Ａ４３１ｅＮＯＳ−／−、及びＡ４３１ｃＮＯＳ−／−が含まれるＮＯＳノックアウト細胞をシャム又はＵＶＢで処理した後で、２．３ａに記載されるような細胞侵襲性及びＥＭＴの解析をする。
【００５４】
[0084]  ｃ．ＳＣＣ進行へのＩＫＫα活性の必要性について決定するために：ヒト表皮ＳＣＣ系のＳＣＣ−１３及びＡ４３１の侵襲性及びＥＭＴに対する、ＩＫＫαの過剰発現及びノックアウトの影響の程度について決定する。簡潔には、ＳＣＣ−１３ＩＫＫとＡ４３１ＩＫＫが含まれるＩＫＫα過剰発現細胞と、ＳＣＣ１３ＩＫＫ−／−とＡ４３１ＩＫＫ−／−が含まれるＩＫＫαノックアウト細胞をシャム又はＵＶＢで処理した後で、２．３ａに記載されるような細胞侵襲性及びＥＭＴの解析をする。
【００５５】
[0085]  ｃＮＯＳノックアウトは、ＤＮＡ損傷を抑制して細胞生存能を高めることができる。ＵＶＢ誘発オートファジーにはｃＮＯＳ活性化が必要とされるので、細胞をｃＮＯＳ阻害剤で処理すると、ＵＶＢ誘発ＨａＣａＴ形質転換を抑制することができる。オートファジー阻害剤のＳｐａｕｔｉｎ１は、ＵＶＢ誘発オートファジーを阻害して、野生型ＨａＣａＴ細胞の細胞生存能を低下させることができるが、ｃＮＯＳ、ｐ６５、及びＩＫＫαのノックアウトがあるＨａＣａＴ細胞に対してはさほどの効果が無い。ｃＮＯＳ阻害剤とｃＮＯＳ過剰発現は、上記に考察した機序に類似した機序によって、ＳＣＣ細胞の侵襲性とＥＭＴを抑制することが可能である。ＨＵＶＥＣ細胞と共培養されるＳＣＣ細胞は、ＵＶＢ照射後の侵襲性とＥＭＴを抑制した。ＩＫＫαノックアウトは、ＳＣＣ細胞の侵襲性とＥＭＴと同様に、ＨａＣａＴ細胞の形質転換に対して類似した効果を有する可能性がある。ＩＫＫαの過剰発現は、ＩＫＫがオートファジーを促進するだけでなくＮＦ−κＢを活性化する（これにより、細胞の生存と癌の進行が促進される）ことが可能であるという事実により、ＨａＣａＴ細胞の形質転換とＳＣＣ細胞の侵襲性及びＥＭＴを高めることができる。しかしながら、このことは、ｃＮＯＳの過剰発現がＵＶＢ照射後のＨａＣａＴの形質転換を高める可能性があることを意味するものではない。実のところ、今日では、それぞれのｃＮＯＳの過剰発現は、より高いレベルのＮＯ産生がＮＯ／ＯＮＯＯ−をより健常な均衡へシフトさせることによってＥＲストレスとオートファジーを抑制する可能性があるが故に、細胞の形質転換を抑制する可能性もあると考えられている。
【００５６】
[0086]  実施例３
[0087]  ３Ｄ共培養モデルとマウスモデルでのＵＶＢ誘発性の光発癌反応、非メラノーマ癌生成、及び腫瘍進行におけるｃＮＯＳの役割の決定
[0088]  ｃＮＯＳの阻害は、ＵＶＢ誘発非メラノーマ皮膚癌生成の発生を抑えるとともに、腫瘍進行を抑制することができる。ｃＮＯＳは、ＮＯとＯ２−を産生して、これらが速やかに互いと反応して、ＵＶＢ後にＯＮＮＯ−を生成する。ＮＯとＯＮＯＯ−は、ともに膜透過又はギャップ結合を介して隣接細胞へ拡散し得るので、隣接細胞におけるこれら両分子の産生は、標的細胞に影響を及ぼす可能性がある。ＵＶＢ誘発角化細胞形質転換とＳＣＣ進行に対する、共培養されるｅＮＯＳリッチ内皮細胞の影響については、カスタム化３Ｄ細胞共培養モデルを使用して、図面７に示す。
【００５７】
[0089]  ＳＫＨ−１無毛マウスモデルを使用する、ＵＶＢ誘発皮膚癌の生成及び進行に対する、ｃＮＯＳノックアウトと広汎なｃＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥの局所治療の効果。
【００５８】
[0090]  ３．１．
[0091]  ＵＶＢ誘発皮膚細胞形質転換とＳＣＣ進行に対する、隣接ｅＮＯＳリッチ内皮細胞の重要性の解析用にカスタム化した３Ｄ細胞共培養系。
【００５９】
[0092]  ２Ｄ培養で増殖させる細胞は、細胞−細胞コミュニケーションとＥＣＭ支持構造を欠くので、組織、臓器、及び動物のモデル中の細胞と比較して、刺激に対する応答が異なる場合が多い。この欠点を克服するために、３Ｄ細胞培養系が開発されてきた。しかしながら、市販の３Ｄ培養系は、柔軟性を欠くので、すべての細胞系に最適なわけではない。従って、本明細書に記載するのは、最適化することができる、これまでと異なる３Ｄ細胞培養系である。この３Ｄ細胞培養用のナノファイバースキャフォールド（図面７）は、ポリマー溶液のエレクトロスピニングによって製造されるが、これは、ナノ〜マイクロスケールのポリマー線維を産生して、スキャフォールドの内部に微小構造を組み立てるための技術である。生体に優しいポリマー素材の溶液を高圧電子場の中へ注入する。この強い電子場は、薄いポリマー線維を伸ばすことが可能であって、これらが集まって自動的に好適なスキャフォールドを形成する。この培養系は、変更するのにきわめて便利である。ポリマーの種類、溶媒、電圧、及び溶液の注入速度は、容易に変更し得て、このいずれもそのファイバーの特性に影響を及ぼす。
【００６０】
[0093]  このデータは、通常の培養プレート又は３Ｄ系で培養されたＨ１２９９ヒト非小細胞肺癌細胞（図面８Ａ〜図面８Ｂ）が異なるレベルのビメンチン（ＥＭＴマーカー）を発現して（図面８Ｃ）、そのことがそれらの遊走挙動と侵襲性に影響を及ぼす可能性があることを示す。
【００６１】
[0094]  ２層の３Ｄ細胞共培養系（図面９）を使用して、ＵＶＢ照射に対する標的角化細胞とＳＣＣ細胞の応答に及ぼす隣接ｅＮＯＳリッチ内皮細胞の影響について解析する。
[0095]  ａ．角化細胞のＵＶＢ誘発形質転換に対する隣接内皮細胞の影響について決定するために、ＨａＣａＴ細胞とＨＵＶＥＣ細胞を３Ｄスキャフォールド上で別々に培養してから、これらの細胞を、コラーゲンゲルスペーサーが層間にあるＨａＣａＴ／ＨａＣａＴ又はＨａＣａＴ／ＨＵＶＥＣとして積み重ねる（図面９）。これらの細胞を隔日で１０日間、シャムとＵＶＢ（１０ｍＪ／ｃｍ２）で処理する。次いで、この２層を分離して、２．２ａに記載のように、ＨａＣａＴ細胞形質転換について決定する。
【００６２】
[0096]  ｂ．ＵＶＢ後のＳＣＣ進行に対する隣接内皮細胞の影響について決定するために、ＳＣＣ−１３細胞、Ａ４３１細胞、及びＨＵＶＥＣ細胞を３Ｄスキャフォールド上で別々に培養してから、これらの細胞を、コラーゲンゲルスペーサーが層間にあるＳＣＣ−１３／ＳＣＣ−１３、ＳＣＣ−１３／ＨＵＶＥＣ、Ａ４３１／Ａ４３１、又はＡ４３ｌ／ＨＵＶＥＣとして積み重ねる。これらの細胞をシャムとＵＶＢ照射で処理する。ＵＶＢ照射後６時間と１２時間でこの２つのスキャフォールドを分離して、２．３ａに記載のように、ＳＣＣ細胞の侵襲性とＥＭＴについて解析する。
【００６３】
[0097]  ３．２．
[0098]  マウスにおけるＵＶＢ誘発光発癌反応の制御におけるｃＮＯＳの役割の決定。
[0099]  アポトーシスとオートファジーは、ＵＶＢ誘発皮膚癌発生をともに制御する。ＵＶＢ被照射細胞においてＩＫＫαレベルを維持してオートファジーを誘導するには、ｃＮＯＳ活性化が不可欠である。ｃＮＯＳは、ＮＰ−κＢ活性化、ＩＫＫα発現、アポトーシス、オートファジー、及び短期間の光発癌の制御に関与する。
【００６４】
[00100]  ａ．ＵＶＢ誘発ＮＦ−κＢ活性化、ＩＫＫα発現、及びオートファジーの制御におけるｎＮＯＳ及び／又はｅＮＯＳの役割を決定するために、ＳＫＨ−１（ＷＴ）、ＳＫＨ−１（ｎＮＯＳ−／−）、ＳＫＨ−１（ｅＮＯＳ−／−）、及びＳＫＨ−１（ｃＮＯＳ−／−）が含まれるマウスにＵＶＢ（１８０ｍＪ／ｃｍ２）照射して、皮膚切片をＵＶＢ照射後１２時間で解析用に調製する。免疫組織化学染色法によって、ＮＦ−κＢ局在化とＩＫＫαレベルを決定する。皮膚より抽出される全タンパク質におけるオートファジーマーカー（ＬＣ３−Ｉ、ＬＣ３−ＩＩ、及びｐ６２）の発現について、ウェスタンブロット解析を使用して決定する。この皮膚組織中のｐ６２のレベルについても、免疫組織化学染色法を使用して決定する。
【００６５】
[00101]  ｂ．ｃＮＯＳ阻害剤の潜在的な化学予防効果について決定するために、ＳＫＨ−１（ＷＴ）をシャム又はＵＶＢ（１８０ｍＪ／ｃｍ２）処理の１時間前にＬ−ＮＡＭＥ（２ｍＭ）で局所的に処理して、皮膚切片をＵＶＢ照射後１２時間で調製する。次いで、短期間の光発癌について、以下のように解析する：（Ｉ）マイクロメーターを使用して二つ折り皮膚厚の増加を評価することによって、皮膚浮腫について検討する。二つ折り皮膚厚の増加は、対照動物についての数値を引くことによって得られる。（ＩＩ）組織病理学的検査によって、表皮過形成について検討する。パラフィン包埋皮膚組織をＨ＆Ｅ染色して、顕微鏡によって過形成を検証する。垂直方向の表皮厚と垂直方向の表皮層の数を評価することによって、表皮過形成について決定する。（ＩＩＩ）免疫組織化学染色法によって、表皮オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）誘導について検討する。
【００６６】
[00102]  ３．３
[00103]  マウスでのＵＶＢ誘発非メラノーマ癌生成におけるｃＮＯＳの役割。
[00104]  ａ．ＵＶＢ誘発皮膚癌生成におけるｎＮＯＳ及び／又はｅＮＯＳの役割を決定するために、ＳＫＨ−１（ＷＴ）、ＳＫＨ−１（ｎＮＯＳ−／−）、ＳＫＨ−１（ｅＮＯＳ−／−）、及びＳＫＨ−１（ｃＮＯＳ−／−）が含まれるマウスに、週２回２８週間、シャム処理するか又はＵＶＢ（１８０ｍＪ／ｃｍ）照射する。次いで、皮膚切片と腫瘍切片を調製して特性決定する。簡潔には、腫瘍発生を視覚的に計数する。腫瘍サイズは、２つの垂直寸法をノギスで定量することによって測定して、その体積は、式：（ａｘｂ２）／２（ａ＝長軸寸法、ｂ＝短軸寸法）を使用して計算する。腫瘍特性について、組織病理学的分析によって評価する。ホルマリン固定してパラフィン包埋した皮膚組織の切片（４μｍ）をスライド上に載せて、ヘマトキシリンとエオジンで染色する。腫瘍特性を顕微鏡下で検証する。
【００６７】
[00105]  ｂ．ＵＶＢ誘発皮膚癌生成に対するｃＮＯＳ阻害剤の化学的予防効果を決定するために、ＳＫＨ−１（ＷＴ）をシャム処理又はＵＶＢ（１８０ｍＪ／ｃｍ２）照射の１時間前にＬ−ＮＡＭＥ（２ｍＭ）で局所的に処理する。この処理を週２回２８週間繰り返す。次いで、３．３ａに記載のように、４週間隔で２０〜２８週の期間の間、皮膚切片と腫瘍切片を調製して特性決定する。
【００６８】
[00106]  実施例４
[00107]  ＵＶＢ誘発皮膚癌発生の化学的予防にＬ−ＮＡＭＥを使用すること
[00108]  ４．１
[00109]  Ｌ−ＮＡＭＥは、角化細胞中のＤＮＡをＵＶＢ誘発傷害から保護する。
【００６９】
[00110]  角化細胞中のＵＶＢ誘発ＤＮＡ損傷に対するｃＮＯＳ阻害剤の効果について評価するために、ＨａＣａＴ細胞を、ＵＶＢ放射線（１０ｍＪ／ｃｍ２）の１時間前にＤＭＳＯ（溶媒）又はＬ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）で処理した。ＵＶＢ後３０分でこの細胞を回収して、中性コメットアッセイキットを製造業者（Trevigen, メリーランド州ゲイサーズバーグ）のプロトコルに従って使用して、ＤＮＡ損傷を決定した。
【００７０】
[00111]  Ｌ−ＮＡＭＥの処理は、ＵＶＢ誘発テイル（tail）ＤＮＡ含量の百分率を４９．２％から３２．４％へ低下させた（図面１０Ａ〜図面１０Ｂ）。ＤＭＳＯ又はＬ−ＮＡＭＥ単独におけるテイルＤＮＡ含量が２０．７％又は２５．６％であることを考慮すると、Ｌ−ＮＡＭＥの処理は、角化細胞におけるＵＶＢ誘発性のＤＮＡ切断をそれぞれ５８．９％又は７１．２％抑制した。ＤＮＡ損傷抑制の％は、以下のように計算した（対照は、ＤＭＳＯ又はＬ−ＮＡＭＥ単独であり得る）：
【００７１】
【数１】
2019508411.tif 000003
【００７２】
[00112]  ４．２
[00113]  Ｌ−ＮＡＭＥは、角化細胞をＵＶＢ誘発形質転換から保護する。
[00114]  ＵＶＢ誘発皮膚細胞形質転換へのｃＮＯＳ阻害剤の化学予防機能を決定するために、細胞を全時間のＬ−ＮＡＭＥ（培地中１ｍＭ）の存在下又は非存在下に隔日で１４日間、シャム又はＵＶＢで処理した。この細胞をプレートから剥離して、同量の細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート中の軟寒天に播いた。１０日目に、Cytoselect 緩衝液（Cell Biolabs 社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、この細胞を軟寒天とともにウェル中で可溶化して、Spectra Max M2 蛍光プレートリーダー（Molecular Devices）を使用して、形質転換細胞の量を蛍光強度によって決定した。
【００７３】
[00115]  このデータは、Ｌ−ＮＡＭＥの処理が形質転換細胞の読取りを３．２から１．３へ低下させたことを示す（図面１１）。これらの結果は、Ｌ−ＮＡＭＥの存在によって角化細胞のＵＶＢ誘発形質転換がほぼ完全に抑制されることを示す。
【００７４】
[00116]  実施例５
[00117]  医薬組成物
[00118]  本明細書に記載される医薬組成物は、どの医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とも製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、それが固体、液体、又はエアゾールの形態で投与されるかどうか、そしてそれを注射のような投与経路のために無菌にする必要があるかどうかに依拠して、様々な種類の担体を含み得る。本明細書に開示される組成物は、限定されないが、局所的（即ち、経皮）、皮下的、局所灌流標的細胞によって直接的に、洗浄によって、クリーム剤において、脂質組成物（例、リポソーム剤）において、簡便な局所投与用のエリキシル剤又は溶液剤として製剤化されて、持続放出剤形として製剤化されて、又は当業者に知られているような他の方法又は上記方法のあらゆる組合せによって、が含まれる、好適なやり方で投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる「Remington’s Pharmaceutical Sciences（レミントン製剤科学）」（2003）を参照のこと）。
【００７５】
[00119]  本発明において提供される組成物は、ヒトのような動物を治療するのに有用である。本開示に従ってヒト患者を治療する方法には、本明細書に記載されるような組成物の投与が含まれる。
【００７６】
[00120]  「医薬の」又は「薬理学的に許容される」という句は、例えば、ヒトのような動物へ投与されるときに、副作用、アレルギー反応、又は他の有害反応をもたらさない分子実体及び組成物に言及する。担体又は希釈剤は、治療活性物質の担体、賦形剤、又は媒体とて役立つ、固体、半固体、又は液体の材料であってよい。本開示の医薬組成物において利用し得る希釈剤又は担体のいくつかの例は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、プロピレングリコール、流動パラフィン、白色ワセリン、カオリン、ヒュームド二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、ケイ酸カルシウム、シリカ、ポリビニルピロリドン、セトステアリルアルコール、デンプン、加工デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、ココア脂、エトキシル化エステル、カカオ脂、落花生油、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、乳酸エチル、ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、及びオレイルアルコール、並びに、トリクロロモノフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、及びジクロロテトラフルオロエタンのような推進剤である。
【００７７】
[00121]  本明細書に開示される、遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての組成物の溶液剤は、好適にはヒドロキシプロピルメチルセルロースのような界面活性剤と混合して、水において調製され得る。分散液剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物において、そして油剤において調製され得る。保存及び使用の通常条件の下で、これらの調製品は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。使用に適した医薬形態には、無菌の水溶液剤又は分散液剤と、無菌の溶液剤又は分散液剤の即時調製用の無菌散剤が含まれる。ある事例において、この形態は、無菌であるべきあって、容易な注射可能性が存在する程に流動的であるべきである。それは、製造及び保存の条件の下で安定であるべきであって、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に抗して保存されてもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（即ち、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等）、これらの好適な混合物、及び／又は植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散液剤の場合は要求される粒径の維持によって、及び／又は界面活性剤の使用によって維持し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等）によってもたらすことができる。多くの事例において、限定されないが、糖類又は塩化ナトリウムのような等張剤を含めることが好ましい場合がある。注射用組成物の長期化吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンのような吸収遅延剤の該組成物における使用によってもたらすことができる。
【００７８】
[00122]  治療される被験者の状態に依存して、投与量の変動が余儀なく生じる可能性がある。いずれにしても、個々の被験者に適正な投与量を決定することができるのは、投与に責任がある人物である。
【００７９】
[00123]  局所投与用の医薬組成物には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、又は散剤のような、医療適用のために製剤化される組成物が含まれ得る。軟膏剤には、局所適用のための油質、吸着、乳化、及び水溶性ベースのあらゆる組成物が含まれ、一方クリーム剤とローション剤は、乳化基剤のみ含まれる組成物である。局所投与される医薬品は、有効成分の皮膚を介した吸着を促進するための浸透エンハンサーを含有し得る。好適な浸透エンハンサーには、グリセリン、アルコール類、アルキルメチルスルホキシド類、ピロリドン類、及びラウロカプラムが含まれる。局所適用のための組成物に可能な基剤には、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリン、並びに他の好適な吸収、乳化、又は水溶性軟膏基剤が含まれる。局所用調製品には、組成物を保存して均質混合物を提供するために、乳化剤、ゲル化剤、及び抗微生物保存剤も必要に応じて含まれてよい。組成物の経皮投与は、「パッチ剤」の使用を含む場合もある。例えば、パッチ剤は、１以上の組成物を一定の期間にわたって所定の速度と連続したやり方で供給し得る。
【００８０】
[00124]  本明細書に開示される組成物は、エアゾール剤を介して送達される場合があるとさらに想定される。「エアゾール剤」という用語は、微細化した固体又は液体粒子が液化又は加圧されたガス推進剤に分散したコロイド系を意味する。典型的なエアゾール剤は、液体推進剤又は液体推進剤の混合物中の有効成分の分散液と好適な溶媒から構成される。好適な推進剤には、炭化水素と炭化水素エーテルが含まれる。好適な容器は、推進剤の圧力要件に従って変動する可能性がある。エアゾール剤の投与は、被験者の年齢、体重、並びに症状の重症度及び応答性に従って変動する可能性がある。
【００８１】
[00125]  投与量
[00126]  動物又はヒト患者へ投与される、本明細書に開示される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の種類、既往又は現行の治療介入法、患者の特発症、投与の経路といった、身体的及び生理学的因子によって決定することができる。投与量と投与経路に依拠して、好ましい投与量及び／又は有効量の投与回数は、被験者の応答に従って変動してよい。一般に、医薬化合物は、広い投与量範囲にわたって有効である。いずれにしても、有効成分（複数）の組成物中の濃度と個々の被験者に適正な用量（複数）を決定することができるのは、投与の責任がある医療従事者である。
【００８２】
[00127]  ある態様では、医薬組成物が、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の態様では、活性化合物が単位重量の約２％〜約７５％の間（又は、例えば、約２５％〜約６０％の間）と、その中で派生するあらゆる範囲を含み得る。当然ながら、治療上有用な各組成物中の活性化合物（複数）の量は、該化合物の所与のどの単位用量においても好適な投与量を得ることができるようなやり方で調製され得る。そのような医薬製剤を製造する人々には、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命のような要因、並びに他の薬理学的考慮事項を熟慮することが可能であって、従って、多様な投与量及び治療計画（regimens）が望ましい場合がある。
【００８３】
[00128]  いくつかの態様において、本組成物には、１以上の追加有効成分がさらに含まれる。少なくとも１つの化合物又は追加有効成分を含有する医薬組成物の製法について、当業者は、参照により本明細書に組み込まれる「Remington’s Pharmaceutical Sciences（レミントン製剤科学）」（2003）によって例示されるように、本開示に照らして知ることができる。さらに、動物（例、ヒト）への投与については、調製品が、ＦＤＡ生物製品基準局（Office of Biological Standards）によって要求されるような、無菌性、発熱原性、一般的安全性、及び純度の基準に合致すべきであることが理解され得る。
【００８４】
[00129]  化粧用組成物
[00130]  別の他の例示態様において、本明細書に記載される組成物は、非治療用、そして特に化粧用の製品として製剤化することができる。
【００８５】
[00131]  「化粧用組成物」は、哺乳動物の角質組織上での局所適用に適した組成物を意味する。
[00132]  「角質組織」は、限定されないが、皮膚、毛髪、爪、及びキューティクルが含まれる、哺乳動物の最も外側の保護被覆として配置されたケラチン含有層を意味する。
【００８６】
[00133]  「有効量」は、本明細書に記載されるような１以上の生物学的効果を誘導するのに十分な量を意味する。
[00134]  使用の方法
[00135]  本明細書に開示される化粧用組成物は、使用者の毎日の日課又は計画の一部として、１以上の皮膚表面、及び／又は１以上の哺乳動物角質組織表面へ適用され得る。追加的又は代替的に、本発明の化粧用組成物は、「必要に応じた」ベースで使用してよい。いくつかの実施例では、有効量の化粧用組成物が角質組織又は皮膚の標的部分へ適用され得る。いくつかの実施例において、化粧用組成物は、適用計画について詳述する書面の説明書入りのパッケージにおいて提供され得る。
【００８７】
[00136]  この方法には、角質組織又は皮膚の標的部分を同定する工程が含まれ得る。この方法には、皮膚状態を改善するための化粧用組成物での処理のために皮膚表面を同定する工程も含まれ得る。その皮膚表面は、使用者によって、又は皮膚科医、美容師、又は他の個人といった第三者によって、又は様々な個人の組合せによっても同定され得る。同定は、例えば、処理の必要な皮膚表面の、サイズ及び／又は色に基づいた目視検査によってなされ得る。同定はまた、特注又は市販の撮像器具によってもなし得る。
【００８８】
[00137]  皮膚表面には、通常は衣服によって覆われていない、顔皮膚表面、手及び腕の皮膚表面、肢及び脚の皮膚表面、並びに首及び胸の皮膚表面（例、デコルタージュ）のようなものが含まれ得る。例えば、処理用に特定される領域には、額、口周囲、顎、眼窩周囲、鼻、及び／又は頬の皮膚表面のような領域が含まれ得る。別の実施例において、化粧用組成物は、化粧用組成物による処理が必要と特定される、どの顔の皮膚ケア表面にも、及び／又はどの他の皮膚表面にも適用し得る。いくつかの実施例では、これら皮膚表面の１以上が処理を必要とすると特定される場合があって、これら皮膚表面の１以上が化粧用組成物で処理され得る。
【００８９】
[00138]  本方法は、これまでに特定されたことが有っても無くてもよい皮膚表面へ本組成物を適用する工程を含み得る。化粧用組成物の適用には、多くの計画（regimens）が存在する。化粧用組成物は、処理期間の間に、必要に応じて、及び／又は１日少なくとも１回、１日２回、又はより頻繁な日常ベースで適用してよい。処理期間の非限定的な例は、約１週間と約１２週間の間、約４週間と約１２週間の間、及び／又は約４週間と約８週間の間であり得る。別の実施例において、処理期間は、数ヶ月（即ち、３〜１２ヶ月）又は数年にわたって延びる場合がある。別の実施例において、化粧用組成物は、少なくとも約４週間又は少なくとも約８週間の処理期間の間、１日少なくとも１回適用され得る。別の実施例において、化粧用組成物は、少なくとも約４週間又は８週間の処理期間の間、１日２回適用され得る。別の実施例において、化粧用組成物はまた、少なくとも１つの皮膚表面領域へ、７、１４、２１、又は２８日以上の期間の間、１日少なくとも１回、１日２回、又は１日３回適用することができる。１日２回適用される場合、第一適用と第二適用は、少なくとも１時間〜約１２時間だけ隔ててよい。化粧用組成物はまた、午前中、及び／又は就寝前の夜間に適用してよい。処理期間は、皮膚表面の改善をもたらすのに十分な時間であるべきだが、十分な時間である必要もない。角質組織、そして特に顔の皮膚表面への一般的な適用では、化粧用組成物の用量は、１回の適用につき（即ち、皮膚表面への単回適用につき）約１〜約５０マイクロリットル／ｃｍ２の間であり得る。
【００９０】
[00139]  組成物の包装
[00140]  製剤化の後で、組成物は、移送とエンドユーザーによる使用に適したやり方で包装される。１つの態様において、組成物は、適正なディスペンサーの中へ入れられて、エンドユーザーへ輸送される。最終容器の例には、ポンプ付きボトル、スクイズボトル、ジャー、チューブ、カプセル、又はバイアルが含まれ得る。
【００９１】
[00141]  本明細書に記載される組成物及び方法は、単数又は複数のキットの部品として具現化することができる。そのようなキットの非限定的な例は、組成物を調製するための成分を含み、ここで容器は、複合構成（combined configuration）で存在しても存在してなくてもよい。ある態様において、キットは、局所アプリケータ又はシリンジのような、組成物を投与するための手段をさらに含む。キットには、本方法を実施するためにキットの諸成分を使用するための説明書がさらに含まれ得る。本方法を実施するための説明書は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、添付文書としてキット中に、又はキット又はその成分の容器のラベル上に存在し得る。他の態様において、説明書は、フラッシュドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、又はディスケットのような好適なコンピュータ読取り保存媒体に存在する電子保存データファイルとして存在する。他の態様では、実際の説明書がキット中に存在しないが、インターネットを介するようにして、説明書を遠隔情報源より入手するための手段が提供される。この態様の例は、ウェブアドレスが含まれるキットであって、ここで説明書を閲覧することができる、及び／又はここから説明書をダウンロードすることができる。説明書の場合と同様に、説明書を入手するためのこの手段も、好適な基板上に記録されている。
【００９２】
[00142]  本明細書において言及される、特許及び非特許文献が含まれる、すべての刊行物が参照により本明細書に明確に組み込まれる。本明細書において列挙される文書のいずれの引用も、いずれの先述も先行技術に関連していると認めることを企図するものではない。これらの文書の日付に関する陳述又はその内容に関する説明のいずれも、出願人に利用可能な情報に基づくものであって、これらの文書の日付又は内容の正確さに関する容認を構成しない。
【００９３】
[00143]  本発明について、様々で好ましい態様を参照して記載してきたが、当業者には、本発明の本質的な範囲より逸脱することなく、様々な変更がなし得ること、そしてその要素が種々の同等物で代用し得ることが理解されるべきである。加えて、本発明の本質的な範囲より逸脱することなく、特別な状況又は材料を本発明の教示に適応するために、多くの変更を加えてよい。
【００９４】
[00144]  故に、本発明は、本発明を実施するために熟慮される、本明細書に開示される特別な態様に限定されないが、本発明には、特許請求項の範囲内に該当するすべての態様が含まれると企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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