(57)【要約】  本発明は、ウイルスベクターベースの組成物を調製する方法であって、組成物に存在するウイルスベクターベースの粒子が、０．５未満の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する粒度分布を有し、方法が（ａ）複製欠損型ウイルスベクターを提供するステップ、（ｂ）少なくとも１つの糖と、親水性および両親媒性賦形剤から選択される少なくとも３つの異なった賦形剤とを含む溶液を提供するステップであって、賦形剤が、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を特徴とし、溶液が、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）の賦形剤と糖との比をさらに特徴とするステップ、ならびに（ｃ）ステップ（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターを、ステップ（ｂ）の溶液と混合するステップを含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができるウイルスベクターベースの組成物、ならびにプライム・ブーストワクチンとして使用するための本発明のウイルスベクターベースの組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターベースの組成物を調製する方法であって、該組成物に存在するウイルスベクターベースの粒子が、０．５未満の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する粒度分布を有し、該方法が、
（ａ）複製欠損型ウイルスベクターを提供するステップ、
（ｂ）少なくとも１つの糖、ならびに親水性および両親媒性賦形剤から選択される少なくとも３つの異なった賦形剤を含む溶液を提供するステップであって、該賦形剤が、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を特徴とし、該溶液が、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）の賦形剤と糖との比を有することをさらに特徴とする、前記ステップ、ならびに、
（ｃ）ステップ（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターを、ステップ（ｂ）の溶液と混合するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ウイルスベクターベースの組成物が、液体として保存するために調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）で得られた組成物を乾燥させるステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項３で得られた組成物を再構成するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、フリーズドライ、スプレー乾燥、スプレーフリーズドライ、または超臨界乾燥によって乾燥される、請求項１、３、および４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、ＭＶＡ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複製欠損型ウイルスベクターがウイルス様粒子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗原性ポリペプチドを添加するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのアジュバントを添加するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）の前記複製欠損型ウイルスベクターが、細胞培養からの収穫および精製直後に再構成された複製欠損型ウイルスベクターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる、または得ることができるウイルスベクターベースの組成物。
【請求項１２】
プライム・ブーストワクチンとして使用するための請求項１１に記載のウイルスベクターベースの組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターベースの組成物が、筋肉内、皮下、皮内、経皮、口腔、経口、鼻腔内、および／または吸入適用のためのものである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のウイルスベクターベースの組成物。
【請求項１４】
エンベロープウイルスベクターに関して、０．５より小さい、好ましくは＜０．３、より好ましくは＜０．２、最も好ましくは＜０．１のＰＤＩ値が、処理および保存の間に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
非エンベロープウイルスベクターに関して、０．３より小さい、好ましくは＜０．２、より好ましくは＜０．１、最も好ましくは＜０．０５のＰＤＩ値が、処理および保存の間に維持される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスベクターベースの組成物を調製する方法であって、組成物に存在するウイルスベクターベースの粒子が、０．５未満の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する粒度分布を有し、方法が、（ａ）複製欠損型ウイルスベクターを提供するステップ、（ｂ）少なくとも１つの糖と、親水性および両親媒性賦形剤から選択される少なくとも３つの異なった賦形剤とを含む溶液を提供するステップであって、賦形剤が、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を特徴とし、溶液が、少なくとも１：２の賦形剤と糖との比を有することをさらに特徴とする、ステップ、および（ｃ）ステップ（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターを、ステップ（ｂ）の溶液と混合するステップを含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができるウイルスベクターベースの組成物、ならびにプライム・ブーストワクチンとして使用するための本発明のウイルスベクターベースの組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造元のマニュアルを含む多くの文献を引用する。これらの文献の開示は本発明の特許性に関連があるとは考えられないが、参照により全体として本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参照した文献は、それぞれの個別の文献が具体的かつ個別に参照によって組み込まれると指示されているかのように同程度に参照により組み込まれる。
【０００３】
複製欠損型組み換えウイルスベクターは、ワクチン開発および遺伝子治療の急速に拡大しつつある分野を表す。ワクチン接種での使用が意図される場合、ウイルスベクターおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、従来のワクチンと比較して一連の利点を与える。例外的な抗体応答の誘導に加えて、それらはまた、細胞内病原体および癌の制御にとって肝要である細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も誘発するが、この特徴はタンパク質ベースのワクチンでは観察されない［Ｒｏｌｌｉｅｒ  ＣＳら、２０１１］。レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス（例えば、修飾ワクシニアアンカラウイルス；ＭＶＡ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む多くのウイルス種がワクチンのための組み換えベクターとして評価されている。しかし、今日まで最も広く評価されているベクターは、５型アデノウイルスおよびポックスウイルス科のメンバーである［Ｒｏｌｌｉｅｒ  ＣＳら、２０１１、Ｕｒａ  Ｔら、２０１４］。
【０００４】
ウイルスベクターに関連する欠点、特に製造、保存、および流通時の欠点は、それらが種々の化学的および物理的分解経路に曝されやすい高分子の複雑な超分子集合体であるという点である［Ｖｒｄｏｌｊａｋ  Ａら、２０１２］。このため、この分野における主な課題は、産生、保存および適用の異なった段階での様々な機構によって広範囲の濃度に対して典型的に引き起こされる、隣り合うウイルス粒子の架橋およびベクター粒子相互作用の低減（回避）である。ウイルスベクターが組成物内の異なった形状およびサイズの粒子を凝集する固有の傾向により、ウイルス粒子の不均一なサイズ分布および関連する多分散度の増加がもたらされる。最終的に、これらの作用は、治療有効性の有意な損失をもたらし、最もおそらくは前記粒子凝集の結果として観察される粘度の増加により、注射部位での副作用さえ引き起こし得る。さらに、ウイルスベクターの凝集はまた、投与後の生体内分布にも影響を及ぼすと考えられ、タンパク質製剤と同様に、ウイルスベクターの凝集は、ベクターを抗原提示細胞の標的とすることによって、望ましくない免疫原性を増加させ、それによって表面タンパク質またはタンパク質カプシドおよびトランスジェニック産物に対する望ましくない免疫応答を誘導または増強し得る。高い多分散度は、高い粘度に関連することから、そのような認められない多分散度を示さない組成物は、良好な注射針通過性および注射可能性が得られると期待される。このため、低い多分散度を有し、ベクター粒子分布と機能的有効性の間のより適した比を有する改善されたウイルスベクターベースのワクチンがあれば非常に望ましいであろう。
【０００５】
ウイルスベクターが、遺伝子導入治療剤としての使用が意図される場合にも、類似の検討が当てはまる。ウイルスベクターは、一連の臨床試験において示されているように、特に単一遺伝子劣性疾患のみならず、一部の特発性疾患に関する臨床での遺伝子治療のための安全かつ有効な送達媒体であることが明らかとなっている（例えば、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ  ＭＡら、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｌｏｏｋ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．  ２０１５  Ｄｅｃ  ７；１７：６３−８９を参照されたい）。これらの臨床試験は、低い遺伝子毒性および免疫原性を高い効率的な送達と組み合わせるベクターに基づいて実施され、臨床での成功の可能性を増大させるアデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスに基づく媒体を含んだ。ウイルスベクターに基づく臨床での治療戦略の重要な例には、例えば幹細胞治療、膵嚢胞性線維症、血友病、遺伝性網膜症、または嚢胞性線維症が挙げられる（Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ，ＴｈｒａｓｈｅｒＡ，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２０１５；２８２）。典型的には、そのような遺伝子導入治療に使用されるウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０００６】
遺伝子導入治療に関して同様に、遺伝子導入ベクターのベクター粒子分布と機能的有効性との間のより適切な比を得るために、認められない多分散度を回避することは、効率的な宿主細胞の感染および後続の遺伝子発現にとって必須である。特に、ある特定の部位、例えば中枢神経系への遺伝子治療ウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、高濃度のウイルスベクターの少量が必要であると予想され、この特徴のために、低いベクター溶解性という固有の特性によって最大の達成可能な用量が制限され得る。このため、現時点で、これまでに得られた成功を広く多様な疾患に拡大するためには、克服しなければならない実質的な送達の課題がなおも存在し、これらの課題は、既存の免疫を回避するため、治療に関連する細胞タイプのより効率的な形質導入を確実にするため、送達を標的化するため、およびゲノムの維持を確実にするための開発中の技術を含む。
【０００７】
ワクチンまたは遺伝子導入治療剤のためのウイルスベースのウイルスベクター組成物の製剤開発は、主にその複雑な分子構造によりかなり難しい。このため、ウイルスベクターベースの医薬組成物の製剤開発は、比較的最近の研究領域であり、ウイルスベクター製剤および安定性を最適化する系統的な努力を記載するごく少数の研究および特許出願が報告されているに過ぎない。ベクターの安定性という重要な態様は、ベクターの精製、調製、および保存の際の溶解性である。
【０００８】
米国特許出願第７７０４７２１号は、意図される標的組織とそれにもかかわらず等張であるビリオンの調製物を産生するために、多価イオンの１つまたは複数の塩を高濃度で添加することによって、超遠心および／またはクロマトグラフィーを使用して精製される組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンの凝集を防止するための組成物および方法を記載する。高いイオン強度と中等度の浸透圧とのこの組合せは、高い価数の塩、例えばクエン酸ナトリウムを使用して達成される。１ｍｌあたり最大６．５×１０１３個のウイルス粒子を有する遺伝子治療のための高濃度ＡＡＶストック製剤を調製して、このようにして凝集することなく保存することができる。１０回の凍結／解凍サイクル後でも動的光散乱（ＤＳＬ）によって凝集は観察されなかった。取り扱いの際の表面へのビリオンの喪失を防止するために、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８が０．００１％で添加され得る。ビリオン調製物はまた、凝集を悪化させるビリオン表面上の小さい核酸鎖を除去するためにヌクレアーゼによって処置することができる。米国特許第７７０４７２１号に記載のＡＡＶ組成物のこれらの非常に特異的な製剤は、ＡＡＶビリオンの特定の固有の構造状態から意図的に誘導され、多価イオンおよび界面活性剤が大量に存在する必要があり、ならびに追加のヌクレアーゼ処置を必要とする。このように、これらの製剤は、広範囲の異なった特性を有する他のウイルスベクターベースの組成物に単純に遺伝的に移動させることができない。その代わりに、各々の新規ウイルスベクターベースの組成物に関してそれぞれの個々の特性に応じた個々の調節が必要である。
【０００９】
国際公開第２００９０２２１７４号は、ウイルス、好ましくはアデノウイルス、ポリオール、好ましくはグリセロール、および両イオン性化合物、好ましくはＨＥＰＥＳを含む非凝集性のウイルス製剤を記載する。さらに、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用するウイルス凝集アッセイが記載されており、このアッセイは、試料中のウイルス粒子のサイズを分析するステップであって、粒子がポリオールとの混合物中に存在するステップ、および組成物の繰り返し凍結解凍サイクル後および室温で組成物を保存後に、試料が実質的に許容可能な非凝集粒子のみを含むか否かをサイズから決定するステップを含む。この文書では、組成物を広範囲のウイルス、好ましくはアデノウイルスについて利用できると結論されている。国際公開第２００９０２２１７４号は、非凝集ウイルス製剤を記載し、前記製剤は、グリセロールおよび開示された両イオン性緩衝物質ＨＥＰＥＳのような緩衝液を必然的に含む。しかし、グリセロールなどのポリオールを使用することは、認められない粘度の増加に関連するという欠点を有し、これによってワクチンの好ましくない注射針通過性および注射可能性がもたらされる。緩衝物質ＨＥＰＥＳの使用は、周囲光への曝露および後続の過酸化水素の形成の結果として光毒性効果が現れる可能性があるというさらなる欠点を有する。
【００１０】
米国特許第７８８８０９６号は、感染性に関する４℃での長期保存安定性が改善された液体および凍結乾燥アデノウイルス製剤を記載する。液体および凍結乾燥製剤は、一般的にレトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルスを使用する遺伝子治療に使用するために調製される。米国特許第７８８８０９６号の著者らは、粒子が感染性であるためにはその生物学的完全性を維持しなければならないことを強調している。著者らはさらに、乾燥製剤に関して、凍結乾燥のための充填剤（マンニトール）、凍結保護剤（スクロース）、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（ヒト血清アルブミン）、いくつかの緩衝剤、および塩の使用を記載する。米国特許第７８８８０９６号に記載の液体製剤は、緩衝液およびポリオールを含み、凝集を防止するために精製の際に追加のヌクレアーゼ処置を必要とする。上記のように、ポリオールはワクチン製品において認められない粘度を増加させ得る。しかし、ヌクレアーゼは、それらがｉｎ  ｖｉｖｏで認められない効果を発揮し得るという欠点を有する。
【００１１】
国際公開第２０１５０４０２３４号は、遺伝子治療ならびにワクチン、特にアデノウイルス、ヒスチジン緩衝溶液、トレハロース、塩、および非イオン性洗浄剤を含む液体医薬製剤として使用するためのアデノウイルス医薬製剤であって、ｐＨが６〜７の範囲である製剤を記載する。得られた製剤は、含有するアデノウイルスの量、効力（感染性）、および品質を保存することが示されており、それによって、当技術分野で公知の他の製剤と比較して全体的なアデノウイルスの安定性を改善する。国際公開第２０１５０４０２３４号によるアデノウイルス製剤は、１ミリリットルあたり１×１０７〜１×１０１３個のウイルス粒子の範囲のタイターでアデノウイルスを含み、２〜８℃で６カ月より長い持続的な保存に耐える。しかし、アデノウイルス製剤について列挙された保存安定性の分析は、ｑＰＣＲ分析と細胞培養ベースの感染性アッセイの組合せのみに基づいている。動的光散乱（ＤＬＳ）分析を使用する熱融解アッセイを使用して、温度を増加させてアデノウイルスカプシドの融解温度を分析した。しかし、それに伴う多分散度指数の変化はモニターされなかった。さらに、精製および保存時の多分散度指数の変化も同様に決定されなかった。しかし、アデノウイルスベクターのいくつかの物理および化学的不安定性（例えば、凝集、脱アミド、酸化、分解等）が要約され、得られた課題、特にアデノウイルスベクターの安定化および製剤の開発における課題が考察されているものの、国際公開第２０１５０４０２３４号において引用された不安定性は、むしろタンパク質にとって典型である。このように、記載の安定化製剤は、より複雑なＶＬＰおよび／またはウイルスベクターに取り組んでおらず、懸濁液中のより高い多分散度の結果によるその凝集傾向に取り組んでいない。
【００１２】
米国特許出願公開第２０１００１２４５５７号は、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスまたはその誘導体と、組成物の唯一の安定化剤としてのマンニトールとを含む液体または液体凍結組成物を記載する。マンニトールは、液体状態では０℃〜１０℃の間の温度、および液体凍結状態では−１０〜−３０℃の間の温度で安定化効果を発揮することが示されている。マンニトール製剤中のＭＶＡウイルスの保存安定性は、細胞培養ベースの感染性アッセイにおいてのみ分析された。しかし、感染性に関して機能喪失をもたらす調製および保存時の粒度分布プロファイルおよび対応する多分散度指数の変化は分析されなかった。
【００１３】
国際公開第２０１３００１０３４号は、ウイルスまたは細菌抗原の生成のためのウイルスの利用を記載する。ウイルス表面分子の安定化が記載され、それによって複製コンピテントウイルスの長期間の保存および感染性が可能となる。さらに、タンパク質の抗原性は、組成物がアミノ酸を含む場合は、放射線照射後であっても維持されると記載されている。しかし、懸濁液中の非複製ＶＬＰまたはウイルスベクターの多分散度が増加する問題には、取り組んでいない。
【００１４】
これらのアプローチは全て、共通してウイルスまたはウイルスタンパク質の安定性に取り組んでいる。例えば、細胞標的分子のリガンドなどの、複製コンピテントウイルスにおけるウイルスタンパク質の分子完全性の維持は、細胞の感染にとって重要である。その上、関連するウイルスタンパク質の完全性は、ワクチン開発において重要である。しかし、これらの生物機能はさておき、懸濁液中の粒子の物理的特徴は、ＶＬＰおよび／またはウイルスベクターに基づくワクチン産生において重要な態様を表す。ＶＬＰおよび／またはウイルスベクターを含む組成物の多分散度の増加を回避する問題、およびこれによるワクチン接種または遺伝子導入有効性の減少は、これまでのところ解決されていない。
【００１５】
このため、新規ワクチンまたは遺伝子導入治療剤の開発に膨大な努力が現在費やされているという事実にもかかわらず、低いおよび中等度の多分散度指数を特徴とし、このため組成物内での感染粒子と非感染性の大きい粒子または粒子凝集体との間の比がより高い改善された組成物を提供することがなおも必要である。多分散度を低減させた結果、ワクチンまたは遺伝子導入アプローチの有効性を増加させることができ、このようにしてコストの低減、ならびに注射部位および体における副作用の低減がもたらされ得る。
【発明の概要】
【００１６】
この必要性は、特許請求の範囲を特徴とする実施形態の提供によって取り組まれる。
【００１７】
したがって、本発明は、ウイルスベクターベースの組成物を調製する方法であって、組成物に存在するウイルスベクターベースの粒子が、０．５未満の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する粒度分布を有し、方法が、（ａ）複製欠損型ウイルスベクターを提供するステップ、（ｂ）少なくとも１つの糖と、親水性および両親媒性賦形剤から選択される少なくとも３つの異なった賦形剤とを含む溶液を提供するステップであって、賦形剤が、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を特徴とし、溶液が、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）の賦形剤と糖との比を有することをさらに特徴とする、ステップ、ならびに（ｃ）ステップ（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターを、ステップ（ｂ）の溶液と混合するステップを含む方法に関する。
【００１８】
ウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子材料を細胞に送達するために一般的に使用される。ウイルスは、宿主細胞の内部にそのゲノムを効率よく輸送し得る。ウイルス様粒子はウイルスに類似し、非感染性であり、ウイルスゲノム材料を含まない。エンベロープまたはカプシドなどのウイルス構造タンパク質が発現されると、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己アセンブリをもたらし得る。Ｂ型肝炎ウイルスに由来するＶＬＰは、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（Ｈｙａｋｕｍｕｒａ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：１１３１２−２２、２０１５）またはＨＢＶコア（Ｓｏｍｉｎｓｋａｙａ  Ｉ．ら、ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ８：ｅ７５９３８）で構成されうる。ＶＬＰは、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）およびバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含む様々なウイルス科の構成要素から産生されている。ＶＬＰは、細菌、哺乳動物、昆虫、酵母、および植物細胞株を含む様々な細胞培養系において産生することができる。本明細書において使用される用語「ウイルスベクターベースの組成物」は、少なくともウイルスベクターを含む組成物に関する。本発明による用語「ウイルスベクター」はキャリア、すなわちウイルスから誘導される「ベクター」に関する。本発明による「ウイルスベクター」は、天然産生の、または改質されたウイルス、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）から誘導されたベクターを含む。
【００１９】
一般的に、ウイルスベクターを開発するための出発材料は、生きたウイルスである。したがって、ウイルスがベクターの開発のための出発材料である場合、動物またはヒト患者での使用に適することを保証するため、安全性および特異性等のある種の要求を満たす必要がある。ウイルスベクターの制御されない複製を避けることは、１つの重要な視点である。これは通常、ウイルスの複製に重要なウイルスゲノムの一部を欠失させることによって達成される。そのようなウイルスは、続いて新規なビリオンを産生することなしに標的細胞に感染することができる。さらに、ウイルスベクターは標的細胞の生理機能に影響しないか最小の影響しかしない必要があり、ウイルスベクターゲノムの再配列は起こるべきでない。天然産生のまたは修飾されたウイルスに由来するそのようなウイルスベクターは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｌｕｋａｓｈｅｖ  ＡＮおよびＺａｍｙａｔｎｉｎ  ＡＡの論評における「Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」に記載されている。
【００２０】
Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；９：５６ならびに  Ｓｔｏｉｃａ  ＬおよびＳｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ  Ｍの論評における「Ａｄｅｎｏ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ＲＮＡｉ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＳＯＤ１  Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６年８月２日；９：５６。
【００２１】
ウイルス様粒子から誘導されたベクターも当技術分野で周知であり、たとえばＴｅｇｅｒｓｔｅｄｔら（Ｔｅｇｅｒｓｔｅｄｔら（２００５）、「Ｍｕｒｉｎｅ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＶＬＰｓ）ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２５（４）：２６０１−８）に記載されている。ＶＬＰの１つの主な利点は、弱毒化した生ウイルスをウイルスベクターとして用いた場合に起こり得る再アセンブリーのリスクを全く伴わないということである。したがって、これらは本発明による「複製欠損性ウイルスベクター」に相当する。ＶＬＰを用いる産生には、目的の特定のウイルス株の遺伝子配列が入手できれば、従来のワクチンの産生よりも早く開始できるというさらなる利点がある。ＶＬＰは、Ｔ細胞およびＢ細胞の強力な免疫応答を引き起こすことができる立体配座的ウイルスエピトープを提示するウイルス表面タンパク質の繰り返し高密度ディスプレイを含む。ＶＬＰは、ＦＤＡの承認を受けたＢ型肝炎およびヒトパピローマウイルス用のワクチンを開発するために既に用いられてきた。さらに、ＶＬＰはチクングンヤウイルスに対する前臨床ワクチンを開発するために用いられてきた。インフルエンザウイルスに対するＶＬＰワクチンがインフルエンザウイルスに対する保護において他のワクチンより優れているということが、証拠によってさらに示唆されている。初期の臨床試験において、インフルエンザのＶＬＰワクチンは、Ｑｕａｎ  ＦＳら、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１６年５月５日：１−１３によって論評されているように、インフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１亜型ウイルスおよび１９１８インフルエンザの両方に対して完全な保護を提供するように思われた。
【００２２】
高度に精製されて均一なＶＬＰは、目的のコンフォメーション上無傷な膜タンパク質の高濃度を含む、いわゆる「脂質粒子」として製剤化することができる。膜貫通タンパク質は多様な生物機能に関係しており、既存の治療薬のほぼ５０％の標的となっている。しかし、その疎水性ドメインのために、膜タンパク質は、生きている細胞外で操作することが難しい。脂質粒子は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル、およびウイルスエンベロープを含む、多様な構造的に無傷の膜タンパク質を組み入れることができる。脂質粒子は、抗体のスクリーニング、免疫原の産生およびリガンド結合アッセイを含む多数の応用のプラットフォームとして使用され得る。
【００２３】
ウイルス様粒子はまた薬物送達ベクターとしても使用することができる（Ｚｄａｎｏｗｉｃｚ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ  Ｊ，２０１６）。
【００２４】
ウイルス構造タンパク質、例えばエンベロープまたはカプシドにおける構造タンパク質の存在は、ＶＬＰの自己アセンブリをもたらし得る。一般的にＶＬＰは、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母、および植物細胞を含む多様な細胞培養系において産生することができ、ＶＬＰは、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、およびフラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）を含む異なったウイルス科から産生されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスに由来し、小さいＨＢＶ由来表面抗原（ＨＢｓＡｇ）で構成されるＶＬＰは、Ｓｏｍｉｎｓｋａｙａ  Ｉ．ら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）ｃｏｒｅ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ＨＢＶ  ａｎｄ  ＨＣＶ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０  Ｊｕｎ；１７：１０２７−３３によって記載されている。
【００２５】
本発明に従って、用語「ウイルスベクター」は、（ｉ）ウイルスベクターの１つの特定のタイプによって表されるウイルスベクター、または（ｉｉ）異なった分子タイプのウイルスベクターのウイルスベクター混合物を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
組成物は、任意選択でウイルスベクターの特徴を変更することができるさらなる分子を含む。例えば、そのようなさらなる分子は、ウイルスベクターを安定化、その機能を調節および／または増強するために役立ち得る。本発明の方法によって調製されるウイルスベクターベースの組成物は、固体または液体形態であってもよく、中でも散剤（複数可）、錠剤（複数可）、または液剤（複数可）の形態であり得る。
【００２７】
本発明に従って調製されるウイルスベクターベースの組成物は、組成物に含まれる粒子が０．５未満の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する粒度分布を有することをさらに特徴とする。
【００２８】
本明細書において使用される用語「粒子」は、本発明に従って調製される組成物の主要な活性成分を表すウイルスベクターに関連する。本発明による用語「粒度分布」は、存在する粒子のサイズ毎の相対量を指す。典型的に、相対量は、質量によって決定される。
【００２９】
本発明に従って、粒度分布は、多分散度指数（ＰＤＩ）に関して表記される。多分散度および多分散度指数は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるパラメータであり、典型的に決定される主なパラメータ、すなわち粒度および粒子の流体力学的直径に加えて分散液または溶液を特徴付ける。ＤＬＳは、例えばランダムなブラウン運動（拡散）を受けるウイルス粒子またはタンパク質などの粒子から生じる散乱強度の時間依存的変動を測定する。レーザービームなどの単色光ビームは、光が運動している粒子に当たると、ブラウン運動を行っている粒子によって溶液においてドップラーシフトを引き起こし、それによって入射光の波長（典型的に６３３ｎｍでの赤色光または８３０ｎｍでの近赤外光）を変化させ、この変化は粒子のサイズに関連する。液体中の粒子は、ランダムに運動し、この運動を使用して、粒子のサイズを決定し、小さい粒子はより速く運動し、それによってより急速な強度の変動をもたらすが、大きい粒子はより遅く移動し、それによってより遅い強度の変動をもたらす。
【００３０】
測定された強度の変動から時間依存的自己相関関数を作成し、この相関曲線を指数関数に当てはめることにより、ブラウン分子運動の拡散係数の計算によって培地中の粒子の運動の説明が与えられる。次に、ストークス・アインスタインの式を使用することによって、粒子の流体力学的直径を計算することができる。多分散試料の場合、この曲線は、指数関数的減衰の合計である。多分散度指数（ＰＤＩ）は、Ｄ．Ｅ．Ｋｏｐｐｅｌ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ５７（１１）；１９７２；ｐｐ：４８１４−２０によって最初に導入されたＤＬＳ測定強度自己相関関数のキュムラント解析に由来するパラメータである。キュムラント解析において、単一指数関数の当てはめを、ガウス分布による単一サイズの集団を仮定して、適用したＤＬＳソフトウェアによって得られた自己相関関数に適用する。多分散度指数は、以下のように仮定の粒度集団周囲の仮説上のガウス分布の標準偏差（σ）に関連する：
ＰＤＩ  ＝  σ２／ＺＤ２、
式中、ＺＤは、Ｚ平均サイズまたはキュムラント平均値であり、多分散試料の場合ではいくつかの種の平均値を表す、粒子のアンサンブルコレクションの強度加重平均流体力学的直径である（Ｓｔｅｐｔｏ，ＲＦＴら（２００９）．「Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．８１（２）：３５１−３５３）。
【００３１】
計算された多分散度指数は、溶液中の粒度分布の幅を表す無次元パラメータである。０．１〜０．２の間のＰＤＩ値は、単分散の粒度分布をおおよそ表す狭い粒度分布に対応する。０．３付近のＰＤＩ値は、異なった粒子集団の増加数を含む粒度分布の幅の増加を示唆する。０．５〜０．７の範囲の値は、非常に大きい粒子または凝集体を含む非常に広い粒度分布を表す。０．７より大きいＰＤＩ値は、試料が非常に広い粒度分布を有し、大きい粒子または凝集体を含み得ることを示している。言い換えれば、ＰＤＩ値が低ければ、より多数の感染性ウイルス粒子種が存在し、すなわち粒度が狭く、凝集体を有しないかごく少量有するウイルス粒子種が存在し、したがってウイルスベクター組成物のより高い有効性が達成され得る。
【００３２】
本発明に従って、ＰＤＩは０．５未満である。上記のように、このＰＤＩは、ほぼ単分散から中等度の多分散の範囲の粒度分布を示し、感染性粒子が多数種であり、大きい粒子または凝集体をごく少量含むか、またはいかなる大きい粒子もしくは凝集体も含まない。好ましくは、ＰＤＩは０．３未満であり、より好ましくは０．２未満、および最も好ましくは０．１未満である。
【００３３】
本発明および適用した実施例５に従って、好ましいＰＤＩ値は、エンベロープウイルス、例えばＭＶＡに関して０．５未満であり、非エンベロープウイルス、例えばアデノウイルスに関して０．３未満である。さらに、ウイルスベクターの処理、製造、および流通相の際に上記のＰＤＩ値を維持することが好ましい。
【００３４】
本発明の方法は、第一のステップ（ａ）において複製欠損型ウイルスベクターを提供するステップを含む。
【００３５】
複製欠損型ウイルスベクターは、宿主細胞において複製して新規ウイルス粒子を産生することができないウイルスベクターである。例えば、ウイルスベクターは、経験的および合理的弱毒化プロセスによってその複製コンピテンスを失い、それによって（ｉ）いくつかの細胞タイプに感染する能力の保持、および（ｉｉ）その免疫原性の保持を伴うそのゲノムの重要な部分の喪失をもたらす。ＶＬＰもまた、本発明に従って、用語「複製欠損型ウイルスベクター」に含まれる。
【００３６】
複製コンピテンスの欠如により、複製欠損型ウイルスベクターは、エフェクター細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導するための安全かつ強力な機構を表す。その結果、これらのベクターによるプライミングは、同時に安全性の増加を提供しながら、そのような応答の大きさ、品質、および持続を改善することができる。
【００３７】
ワクチン調製物に関して適した複製欠損型ウイルスベクターは、当技術分野で周知である。例えば、Ｖｅｒｈｅｕｓｔ  Ｃ．ら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０，２０１２）は、修飾ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）ベースのベクターに関する論評を提供し、Ｒｏｓｅｗｅｌｌ  Ａら（Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｓｙｎｄｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１１）は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターに関する論評を提供し、およびＭｕｌｄｅｒ  ＡＭら（ＰｌｏｓＯｎｅ  ７，２０１２）は、組み換えＶＬＰベースのワクチンに関する論評を提供する。当技術分野で一般的に適用されるワクチン産生のための適したウイルスベクターを選択するための検討が、本発明によるワクチン産生のための適したウイルスベクターの選択に関して、準用される。したがって、当技術分野で既に利用可能なウイルスベクター、ならびに新規ウイルスベクターを、特許請求される方法において使用してもよい。好ましくは、複製欠損型ウイルスベクターは、ＭＶＡ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、または麻疹ウイルスからなる群から選択される。最も好ましくは、複製欠損型ウイルスベクターは、修飾ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）またはアデノウイルスである。
【００３８】
複製欠損型ウイルスベクターは、新たに調製することができ、例えば細胞培養から収穫後に再構成するか、または例えば販売元から予め調製した組成物として提供され得る。
【００３９】
第二のステップ（ｂ）において、方法は、少なくとも１つの糖と、親水性および両親媒性賦形剤から選択される少なくとも３つの異なった賦形剤とを含む溶液の提供であって、賦形剤が、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を特徴とする溶液の提供を含む。
【００４０】
本発明による溶液は、水溶液または非水溶液であり得る。本発明の文脈において、用語「水溶液」は、一方では水を指すが、他方では緩衝溶液、および水と混和性であり、このため均一な相を形成することができる親水性溶媒にも拡大される。水溶液の例には、水、メタノール、エタノール、または高級アルコール、ならびにその混合物が挙げられるがこれらに限定されない。非水性溶媒の非制限的な例には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチルベンゼン、および他の極性溶媒が挙げられる。
【００４１】
本発明に従って使用される用語「含む」は、具体的に列挙されたステップおよび／または構成要素に加えて、さらなるステップおよび／または構成要素を含めることができることを指す。しかし、この用語はまた、特許請求される主題が、正確に列挙されたステップおよび／または構成要素からなることも包含する。
【００４２】
本発明の方法のステップ（ｂ）による溶液に含めることができるさらなる構成要素の非制限的な例には、例えば水、アミノ酸、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、アルギニン緩衝液、および他の有機酸またはその塩の緩衝液などの緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、トリプトファン、システイン、グルタチオンなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、ナトリウムなどの対イオン、および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤、または他の溶媒が挙げられる。好ましくは、溶液は、ウイルスベクターの一部である（ウイルス）タンパク質および薬学的担体の形態で上記に含まれる構成要素以外のいかなるタンパク質も含まない。
【００４３】
本発明の方法のステップ（ｂ）による溶液は、少なくとも１つの糖をさらに含む。
【００４４】
本明細書において使用する用語「糖」は、任意のタイプの糖、すなわち炭水化物の単糖、二糖、またはオリゴ糖形態、ならびに糖アルコールを指す。適した糖の例には、トレハロース、サッカロース、スクロース、グルコース、ラクトース、マンニトール、およびソルビトール、またはアミノ糖などの糖誘導体、例えばグルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本明細書で用いる用語「少なくとも」は、具体的に言及された量または数を意味するが、具体的に言及された量または数を超える量または数も意味する。たとえば、「少なくとも１つ」という用語は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０等、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０なども包含する。さらに、この用語は正確に１、正確に２、正確に３、正確に４、正確に５、正確に６、正確に７、正確に８、正確に９、正確に１０、正確に２０、正確に３０、正確に４０、正確に５０なども包含する。
【００４６】
用語「１つの糖」は、１つのタイプの糖を意味し、糖のこの特定のタイプの分子の数を１つに限定するものではないとさらに認識される。さらに、１つより多くの糖、例えば２つの糖が含まれるそれらの例では、２つの異なったタイプの糖が想像される。好ましくは、溶液は、正確に１つのタイプの糖、好ましくはトレハロースを含む。
【００４７】
本発明による溶液中に含まれる糖の好ましい量は０．１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの糖、より好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜１８０ｍｇ／ｍｌの糖、さらにより好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌの糖であり、最も好ましくはその量は約８０ｍｇ／ｍｌの糖である。異なった種類の糖の混合物を用いる場合は、これらの好ましい量は溶液中の全ての糖の合計を意味する。
【００４８】
本明細書で用いる用語「約」は、明示的に言及された値ならびにそれからの小さな偏差を包含する。換言すれば、「約８０ｍｇ／ｍｌ」の糖の量は、正確でなくてもよいが言及された８０ｍｇ／ｍｌの量を含むが、数ｍｇ／ｍｌの相違があってもよく、したがってたとえば９２ｍｇ／ｍｌ、８４ｍｇ／ｍｌ、８８ｍｇ／ｍｌ、７６ｍｇ／ｍｌ、７２ｍｇ／ｍｌ、または６８ｍｇ／ｍｌを含む。当業者であればそのような値は相対的な値で、その値が言及された値にほぼ対応している限り、完全な正確性を要求していないことを熟知している。したがって、言及された値からのたとえば１５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは５％の偏差は「約」という用語に包含される。１５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは５％のこれらの偏差は、「約」という用語を用いる本発明に関連する全ての実施形態に当てはまる。
【００４９】
好ましくは、糖の量は正確に８０ｍｇ／ｍｌである。
【００５０】
本発明に従って、本発明の方法のステップ（ｂ）による溶液は、親水性および両親媒性賦形剤から選択される少なくとも３つの異なった賦形剤をさらに含み、賦形剤は、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を特徴とする。
【００５１】
賦形剤は、当技術分野で周知である。賦形剤は、活性剤と共に組成物、例えば医薬組成物に含まれる成分として定義される。それらは、典型的に、いくつかの理由で製剤に添加され、このため一部の賦形剤は、製剤の一部であるために１つより多くの効果または目的を有し得る。その主な機能の１つは、安定化剤の機能である。医薬組成物におけるそのような安定化剤の主な機能は、単離、精製、乾燥時に、例えば凍結乾燥、スプレー乾燥、スプレーフリーズドライ、またはフォーム乾燥による乾燥、溶液中または乾燥後の保存、ならびに乾燥後の再構成の際に、前記生物活性剤、例えばタンパク質またはウイルスベクターに加えられる異なったタイプのストレスから生物活性剤を保護することである。生物活性剤の安定化に関して、製剤中の賦形剤に特異的に関連する特定の機構が存在する。安定化は例えば、安定化力を強化することによって、変性状態を脱安定化させることによって、または生物活性剤に賦形剤を直接結合させることによって達成される。生物活性剤の安定化剤としてしばしば使用される賦形剤には、各々が異なった安定化効果を発揮し得る、糖、ポリオール、アミノ酸、アミン、塩、ポリマー、および界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
親水性および両親媒性賦形剤から選択される賦形剤であって、ウイルスベクターベースの組成物において使用するための安全な賦形剤として国際薬局方に従って分類される、極性官能基、脂肪族官能基、芳香族官能基、負に荷電した官能基、および／または正に荷電した官能基を有することをさらに特徴とする賦形剤の非制限的な例を以下の表１に表す。
【００５３】
【表１−１】
2019531288.tif 000002
【００５４】
【表１−２】
2019531288.tif 000003
【００５５】
【表１−３】
2019531288.tif 000004
【００５６】
【表１−４】
2019531288.tif 000005
【００５７】
【表１−５】
2019531288.tif 000006
【００５８】
【表１−６】
2019531288.tif 000007
【００５９】
【表１−７】
2019531288.tif 000008
【００６０】
【表１−８】
2019531288.tif 000009
【００６１】
本発明による溶液中に含まれる賦形剤の合計の好ましい量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌの間であり、好ましくは１〜８０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは５〜６０ｍｇ／ｍｌの間、さらにより好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの間、および最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００６２】
好ましくは、溶液は、糖としてトレハロースまたはスクロース、および糖アルコールとしてマンニトール、および少なくとも３つの賦形剤としてアミノ酸を含む。さらにより好ましくは、溶液は、糖としてトレハロース、および少なくとも３つの賦形剤として少なくとも３つの異なったアミノ酸を含む。
【００６３】
さらに、溶液は、少なくとも１：２の賦形剤と糖との比を有することを特徴とする。より好ましくは、溶液は、少なくとも１：１．５（ｗ／ｗ）、例えば、少なくとも１：１（ｗ／ｗ）および最も好ましくは少なくとも１：０．１（ｗ／ｗ）の賦形剤と糖との比を有することを特徴とする。
【００６４】
好ましくは、ステップ（ｂ）に従って得られた組成物のｐＨ値は、ステップ（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターと混合する前に、４．０〜９．０の間のｐＨ値に調節される。選択されるｐＨ値は、例えばサイズ、エンベロープ（脂質膜）を有する、またはエンベロープを有しないなどの生物特徴によって決定される、特定のウイルスベクターの必要条件に依存する。
【００６５】
第３のステップ（ｃ）において、本発明の方法は、ステップ（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターを、ステップ（ｂ）の溶液と混合するステップを含む。
【００６６】
本明細書において使用される用語「混合する」は、特に限定されず、ウイルスベクターを（ｂ）による溶液と混合する全ての手段を含む。例えば、ステップ（ａ）および（ｂ）の構成要素を単に同じ容器に移すことができ、そこで、それらを拡散によって混合することができ、それらを、例えば容器を旋回させることによってまたは適したツールによって攪拌することによってさらに攪拌することができる。攪拌は、例えば１回または２回などの限定された回数行うことができ、または連続的に行うことができる。
【００６７】
好ましくは、ステップ（ａ）および（ｂ）の構成要素を、クロマトグラフィー操作ならびに透析、限外濾過、および透析濾過操作を使用して、列挙されたステップ（ｂ）の組成物中で列挙されたステップ（ａ）の組成物を再緩衝化することによって共に混合することができる。
【００６８】
ステップ（ａ）と（ｂ）の順序は特に限定されず、すなわちステップ（ａ）を最初に実施した後にステップ（ｂ）を実施することができ、またはその逆も同様である。その上、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実施することができる。ステップ（ａ）および（ｂ）が実施された後に、次にステップ（ｃ）を実施する。
【００６９】
一実施形態において、本発明の方法は、列挙されたステップ（ａ）〜（ｃ）からなる。しかし、本発明の方法が、言及したステップ（ａ）〜（ｃ）を含む（からなるのではなく）場合、さらなる方法のステップを方法に含めてもよいことが認識されよう。例えば、追加の洗浄および／または乾燥ステップを含めてもよい。好ましくは、本発明の方法は、任意選択で以下に記載の追加の方法のステップ（ｄ）および（ｅ）と組み合わせた、ならびに任意選択で追加の洗浄ステップと組み合わせた、言及したステップ（ａ）〜（ｃ）からなる。さらにより好ましくは、本発明の方法は、以下に記載される追加のステップ（ｄ）乾燥および（ｅ）得られた乾燥組成物の再構成、と組み合わせた、列挙されたステップ（ａ）〜（ｃ）からなる。
【００７０】
本発明に従って、方法は、改善されたウイルスベクターベースのワクチンおよび遺伝子導入治療剤の調製物を提供される。本発明の方法を使用してベクターベースの組成物を調製することによって、認められない多分散度を回避することができ、このようにしてベクター粒子分布と機能的有効性の間のより適した比がもたらされ得る。その上、本明細書において上記で考察するように、低い多分散度は、低い粘度に関連し、より良好な感染性を提供するのみならず、より良好な注射針通過性および注射可能性が得られる。
【００７１】
添付の実施例１に示すように、本発明による、少なくとも１つの糖と少なくとも３つの異なった賦形剤とを含む溶液によって高度濃縮アデノウイルスストック溶液を希釈することによりアデノウイルスベクターを混合するステップであって、溶液が、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）の賦形剤と糖との比を有することをさらに特徴とする、ステップは、動的光散乱（ＤＬＳ）分析によってモニターした場合に、もとの供給元の製剤および一般的に使用されるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での類似の希釈と比較して、含まれるアデノウイルス粒子の流体力学的半径の完全な保持をもたらすことが意外にも観察された。
【００７２】
フリーズドライ前のアデノウイルスベクター製剤に関してそれぞれのＤＬＳ実験において記録された、得られた相関関数の評価により、本発明による溶液中、特に組成物１および組成物２中でアデノウイルスベクターを予め混合するステップが、未処理のストック溶液と比較して約７０ｎｍの対応する分析された流体力学的半径の保持をもたらすことが示唆された（実施例１；図１Ａ〜Ｃ）。これに対し、フリーズドライ前の試料の調製プロセスの際に、アデノウイルスストック溶液をＰＢＳまたはもとの供給元の製剤と同様に混合するステップは、未処理アデノウイルスベクターと比較して、アデノウイルスベクターの測定された流体力学的半径の顕著な増加をもたらした（実施例１；図１Ａおよび図２）。
【００７３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、少なくとも３つの異なった賦形剤はアミノ酸を含む。本発明の方法のさらにより好ましい実施形態において、少なくとも３つの異なった賦形剤は、少なくとも３つの異なったアミノ酸を含む。
【００７４】
本明細書で用いる用語「アミノ酸」は当技術分野で周知である。アミノ酸はタンパク質の本質的な構成要素である。本発明によれば、「アミノ酸」という用語は、相互に結合してジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド等のオリゴマーもしくはポリマーまたはタンパク質（本明細書ではポリペプチドとも称される）を形成しない遊離アミノ酸を意味する。用語「アミノ酸」は、天然産生アミノ酸を含むが、同様に人工アミノ酸などの他のアミノ酸も含む。これらは、非極性、脂肪族、極性、非荷電、正および／または負荷電、および／または芳香族Ｒ基を有する賦形剤の特徴的な群に分類することができる（Ｎｅｌｓｏｎ  Ｄ．Ｌ．、Ｃｏｘ  Ｍ．Ｍ．、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ（２００５）、１２２〜１２７頁）。本発明の溶液（ｂ）に含まれるアミノ酸は、天然産生アミノ酸ならびに人工アミノ酸またはこれらの天然産生もしくは人工アミノ酸の誘導体から選択することができる。
【００７５】
天然産生アミノ酸には、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸（すなわち、いわゆるタンパク質を構成するアミノ酸）、すなわちグリシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、システイン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、バリン、チロシン、トレオニン、およびトリプトファンが挙げられる。その他の天然産生アミノ酸は、たとえばカルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジン、またはβ−アラニンである。人工アミノ酸は、異なった側鎖長および／もしくは側鎖構造を有し、ならびに／またはα炭素原子と異なった部位にアミン基を有するアミノ酸である。アミノ酸の誘導体は、限定しないがＮ−アセチルトリプトファン、ホスホノセリン、ホスホノスレオニン、ホスホノチロシン、メラニン、アルギニノコハク酸およびそれらの塩ならびにＤＯＰＡである。本発明に関して、これら全ての用語はそれぞれのアミノ酸の塩も含む。
【００７６】
本発明の方法の一実施形態において、少なくとも３つの異なった賦形剤は、「少なくとも１つのジペプチドおよび／またはトリペプチド」を含む。１つより多くのジペプチドまたはトリペプチドが溶液に含まれる場合、ジペプチドとトリペプチドの混合物が本明細書において明白に想像される。ジペプチドおよびトリペプチドの数は、互いに独立して選択することができ、例えば溶液は２つのジペプチドと３つのトリペプチドとを含み得る。本明細書においてある特定の数のジペプチドおよびトリペプチドに言及する場合、前記数は、異なったタイプのジペプチドおよびトリペプチドの量を制限すると意図されるが、１つのタイプのジペプチドまたはトリペプチドの分子の数は制限されないと意図されることは、当業者に容易に理解されるであろう。このため、例えば、用語「４つのジペプチドまたはトリペプチド」は、ジペプチドおよび／またはトリペプチドの４つの異なったタイプを指し、各々の個々のジペプチドおよび／またはトリペプチドの量は特に限定されない。好ましくは、（異なった）ジペプチドまたはトリペプチドの数は、９個のジまたはトリペプチドを超えない。
【００７７】
本明細書において使用される用語「ジペプチドまたはトリペプチド」はそれぞれ、２つまたは３つのアミノ酸からなるペプチドに関する。例示的なジペプチドは、グリシルグルタミン（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）、グリシルチロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）、アラニルグルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）、およびグリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である。天然産生ジペプチドのさらなる非制限的な例は、カルノシン（ベータ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）、Ｎ−アセチル−カルノシン（Ｎ−アセチル−（ベータ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）、アンセリン（ベータ−アラニル−Ｎ−メチルヒスチジン）、ホモアンセリン（Ｎ−（４−アミノブチリル）−Ｌ−ヒスチジン）、キョートルフィン（Ｌ−チロシル−Ｌ−アルギニン）、バレニン（またはオフィジン）（ベータ−アラニル−Ｎタウ−メチルヒスチジン）、グロリン（Ｎ−プロピオニル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−オルニチン−δ−ｌａｃエチルエステル）およびバレチン（シクロ−［（６−ブロモ−８−エン−トリプトファン）−アルギニン］）である。人工ジペプチドの例には、アスパルテーム（Ｎ−Ｌ−ａ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル）およびシュードプロリンが挙げられるがこれらに限定されない
【００７８】
例示的なトリペプチドは、グルタチオン（γ−グルタミル−システイニル−グリシン）およびそのアナログであるオフタルミン酸（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−α−アミノブチリル−グリシン）、ならびにノルオフタルミン酸（γ−グルタミル−アラニル−グリシン）である。トリペプチドのさらに非制限的な例には、イソロイシン−プロリン−プロリン（ＩＰＰ）、グリプロメート（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ、サイロリベリンまたはプロチレリン：Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−ヒスチジニル−Ｌ−プロリンアミド）、メラノスタチン（プロリル−ロイシル−グリシンアミド）、ロイペプチン（Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギナル）およびエイセニン（ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−ＯＨ）が挙げられる。
【００７９】
同様に、（ｂ）の溶液は、アミノ酸（複数可）ならびに少なくとも１つのジペプチドおよび／またはトリペプチドを含む少なくとも３つの賦形剤を含むことが本明細書において想像される。
【００８０】
好ましくは、使用される全てのアミノ酸、ジペプチド、および／またはトリペプチドの全量（溶液中のこれらの構成要素の全ての合計である）は、０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１〜８０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは５〜６０ｍｇ／ｍｌの間、さらにより好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの間、および最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００８１】
医学的応用に関連して使用する場合のアミノ酸、ならびに／またはジペプチドおよび／もしくはトリペプチドは、いかなる薬理学的特性も発揮しないことが好ましい。
【００８２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、ウイルスベクターベースの組成物は、液体として保存するために調製される。本発明の方法の別の好ましい実施形態では、ウイルスベクターベースの組成物は、乾燥調製物として保存するために調製される。そのようなウイルスベクターベースの組成物（液体または乾燥調製物）は、その後ワクチンまたは遺伝子導入治療剤の調製のために使用されてもよい。
【００８３】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、その実施形態がステップ（ｃ）で得た組成物を乾燥させるさらなるステップ（ｄ）を含み、組成物は、フリーズドライ、スプレー乾燥、スプレーフリーズドライ、または超臨界乾燥によって乾燥される。
【００８４】
本明細書において使用される用語「乾燥する」は、組成物に存在する液体含有量を低減または除去することを指す。液体含有量は、液体が２０％未満、例えば１０％未満、例えば８％未満、より好ましくは７％未満、例えば５％未満、または１％未満まで低減される場合、低減されていると考えられる。さらにより好ましくは、液体は０．５％またはそれ未満に低減される。
【００８５】
乾燥のための好適な方法には、限定しないが凍結乾燥（フリーズドライ）、スプレー乾燥、凍結スプレー乾燥、対流乾燥、伝導乾燥、ガス流乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥、誘電乾燥（たとえば高周波またはマイクロウェーブによる）、表面乾燥、空気乾燥または気泡乾燥が含まれる。
【００８６】
フリーズドライも当技術分野で周知であり、凍結乾燥とも称されるが、試料を凍結し、引き続いて十分な熱を加えながら周囲の圧力を低下させ、材料中の凍結した水を固相から気相へ直接昇華させ、続いて二次の乾燥相を行うステップを含む。好ましくは、次に凍結乾燥調製物を、水分の再吸収を防止するために密封する。
【００８７】
スプレー乾燥も当技術分野で周知であり、溶液、懸濁液またはエマルジョンを単一のプロセスステップで固体粉末に変換する方法である。一般的に、液体産物の濃縮物を、微粒化装置にポンプで送り、そこで小さい液滴にする。これらの液滴は熱気流に曝されて、乾燥空気中に懸濁したままで極めて急速にその湿気を失う。乾燥粉末はサイクロン中で遠心作用によって湿った空気から分離される。すなわち、高密度の粉末粒子はサイクロンの壁の方に押しやられ、軽い湿った空気は排気管を通して追い出される。
【００８８】
スプレー乾燥は凍結ステップを必要とせず、凍結乾燥に比べて必要なエネルギーコストが低いので、しばしば選択される方法である。スプレー乾燥も、高温との短い接触時間と特別なプロセス制御のために、生物分子に適した特に有利な乾燥手順であることが示されている。このように、スプレー乾燥は、単に１ステップで分散性の乾燥粉末をもたらすことから、生体分子の乾燥技術を行う場合には、フリーズドライすることがしばしば好ましい。
【００８９】
スプレーフリーズドライも当技術分野で周知であり、フリーズドライとスプレー乾燥に共通の処理ステップを組み合わせた方法である。提供される試料を、極低温媒体（例えば、液体窒素など）中に噴霧し、これによってショック凍結液滴の分散液を生じる。次に、この分散液をフリーズドライ装置で乾燥させる。
【００９０】
超臨界乾燥は、当技術分野で周知の別の技術である。この方法は、液体を気体に変化させるために、相境界が交叉しないがその代わりに液体から気体への移行が気相と液相の間の区別がなくなる超臨界領域の中を通過する、臨界温度（Ｔｃ）および臨界圧（ｐｃ）より上の高温および高圧に依存する。液相と蒸気相の密度は、乾燥の臨界点で等しくなる。
【００９１】
好ましくは、ステップ（ｃ）で得られた組成物を乾燥するステップ（ｄ）は、凍結乾燥による。
【００９２】
以下の実施例１にさらに示すように、本発明の方法によってアデノウイルスベクターを、列挙された少なくとも３つの賦形剤および糖と少なくとも１：２の比で混合するステップは、乾燥アデノウイルスベクター製剤に優れた安定性を提供することが意外にも見出された。実施例１において、アデノウイルスベクター調製物と組成物、特に初期の規模縮小ステップおよび後続のフリーズドライの際に既に本発明による組成物１および２と組合せると、感染タイター（実施例１；図３）およびウイルス粒子の流体力学半径（実施例１；図４ＡおよびＢ）の完全な保持をもたらした。これに対し、もとの供給元の製剤における対応するアデノウイルスベクター調製物のフリーズドライは、感染性の有意な喪失（実施例１；図３）および粒度の増加（実施例１；図４Ｃ）をもたらした。一般的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と組み合わせた類似の試料調製手順は、フリーズドライ後で既に、感染性の完全な喪失（実施例１；図３）および粒度の大きい増加（実施例１；図４Ｄ）、および有意な量の高次凝集体の形成をもたらした。最も重要なことに、生物医薬製品または薬物産物のそのような乾燥製剤は、分注、分配、輸送、保存等などの多様なさらなる取り扱いステップにとって適している。
【００９３】
本発明の方法のこの好ましい実施形態に従って、乾燥組成物が得られる。組成物は粉末組成物であることが特に好ましい。フリーズドライまたはスプレーフリーズドライの場合、得られた乾燥組成物は、粉末の形態で自動的に得られる。乾燥組成物が粉末では得られないが、その代わりに乾燥ケークの形態で得られる場合、当業者は、粉末を得るために組成物をさらに修飾する方法を承知している。
【００９４】
そのような追加の乾燥ステップは、組成物中の分子間相互作用が、例えば粒子の完全性および機能の喪失をもたらすウイルスベクターの修飾された静電気的相互作用をもたらしい得ることから、有利であり得る。この好ましい実施形態に従った組成物中の水の含有量の低減は、生成物中での分子の可動性を低減させ、したがって粒子の完全性と機能の維持を助ける。
【００９５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、方法は、次にウイルスベクターベースの組成物を約−９０℃〜約５０℃から選択される温度で保存するステップをさらに含む。より好ましくはウイルスベクターベースの組成物は、その後約−９０℃〜約−７０℃、約−３０℃〜約−１０℃、約１℃〜約１０℃、約１５℃〜約２５℃、および約３０℃〜約５０℃からなる群から選択される温度範囲で保存される。さらにより好ましくはウイルスベクターベースの組成物はその後、約−８５℃〜約−７５℃、約−２５℃〜約−１５℃、約２℃〜約８℃、および約２０℃〜約４５℃からなる群から選択される温度範囲で保存される。最も好ましくは、ウイルスベクターベースの組成物は、その後約−８０℃、約−２０℃、室温、約４℃、約２５℃、および約４０℃から選択される温度で保存される。
【００９６】
以下の実施例１にさらに示すように、フリーズドライの直後で既に観察された、本発明による組成物（組成物１および２）ならびにもとの供給元の製剤およびＰＢＳにおいてフリーズドライされたアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性の差はそれぞれ、上昇した温度でフリーズドライ調製物の保存後ではさらにより顕著であった。もとの供給元の製剤ではフリーズドライしたウイルスベクターの機能の完全な喪失が観察され、これはＰＢＳで得られた結果（実施例１；図５ＡおよびＢ）と類似であった。これに対し、２５℃または４０℃で保存後であっても、生産プロセスの際の初期に安定化組成物１および２において製剤化したフリーズドライアデノウイルスベクター組成物は、陽性対照、すなわちフリーズドライされる前のアデノウイルスベクター（図５のダイアグラムにおいて破線で示す）とほぼ同じウイルス活性を保持した。
【００９７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性実験のこれらの結果は、同時に実施したＤＬＳ実験と良好に相関する。例として、４０℃で１４日間保存後の本発明による組成物１および２のいずれか、またはもとの供給元の製剤およびＰＢＳにおける乾燥アデノウイルスベクター組成物の保存後に記録されたＤＬＳ相関関数の評価をそれぞれ、図６に示した。安定化組成物１および２中で乾燥アデノウイルスベクター調製物を保存すると、もとの供給元の製剤およびＰＢＳ中の保存されたアデノウイルス粒子（実施例１；図７Ａおよび７Ｂ）と比較して、アデノウイルス粒子について決定された流体力学的半径が保持された（実施例１；図６ＡおよびＢ）。
【００９８】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、方法は乾燥後に得られた組成物を再構成するステップ（ｅ）をさらに含む。
【００９９】
組成物の再構成は、適した溶液中で乾燥組成物を溶解することなどの、当技術分野で公知の任意の手段によって行うことができる。適した溶液の非制限的な例には、ウイルスベクターと混合するために使用されるステップ（ｂ）の溶液、ならびにウイルスベクターベースの組成物に適していることが知られている他の任意の溶液、例えば注射用水、緩衝溶液、アミノ酸を含む溶液、糖、緩衝液、界面活性剤、またはその混合物が挙げられる。
【０１００】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、ＭＶＡ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはヘルペスウイルスからなる群から選択される。
【０１０１】
修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、１９７０年代に天然痘の撲滅運動の終息に向けて開発されたワクシニアウイルスの高度弱毒化株である。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において５７０回を超える継代によってワクシニア株アンカラから誘導された。これによって、ワクシニアゲノムの約１０％の喪失に対応する６つの主要な欠失がもたらされた。完全なゲノム配列が公知であり、１７７個の遺伝子に対応する１７８ｋｐの長さを有する。多数の変異は、ＭＶＡの弱毒化表現型および哺乳動物細胞において複製できないことを説明する。ＭＶＡは、その高い安全性プロファイルにより、臨床研究のために選択されるワクシニアウイルス株であると広く考えられている。ＭＶＡは、サル、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびゾウを含む多数の動物種に投与されており、局所または全身性の副作用は認められていない。１２０，０００人を超えるヒトが、ＭＶＡの皮内、皮下、または筋肉内注射によって天然痘に対して安全かつ首尾よくワクチン接種されている。マウスおよび非ヒト霊長類における研究から、免疫抑制状態でのＭＶＡの安全性がさらに証明された。複製するワクシニアウイルスと比較すると、ＭＶＡは、非許容細胞においても類似または高レベルの組み換え遺伝子発現を提供する。動物モデルにおいて、組み換えＭＶＡワクチンは、免疫原性であり、インフルエンザ、パラインフルエンザ、麻疹ウイルス、フラビウイルス、およびマラリア原虫を含む様々な感染剤に対して保護することが見出されている。非常に良好な安全性プロファイルと高い免疫原性様式での抗原の送達能の組合せにより、ＭＶＡはワクチンベクターとして適している。
【０１０２】
アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖線形ＤＮＡゲノムで構成される中等度のサイズ（９０〜１００ｎｍ）の非エンベロープ（裸の）正二十面体ウイルスである。ヒトにおいて５１を超える異なった血清型が存在し、これらは、小児における上気道感染症の５〜１０％および同様に成人の多くの感染症の原因である。これらのウイルスが宿主細胞に感染すると、それらは、そのＤＮＡ分子を宿主に導入する。アデノウイルスの遺伝子材料は、宿主細胞の遺伝子材料に組み込まれない（一過性である）。ＤＮＡ分子は、宿主細胞の核に遊離の状態で留まり、この余分なＤＮＡ分子における指令は、他の任意の遺伝子と同様に転写される。唯一の差は、これらの余分な遺伝子が、細胞が正確に分裂しようとしている場合には複製されず、その細胞の子孫が余分な遺伝子を有しない点である。その結果、アデノウイルスによる治療は、増殖しつつある細胞集団では再投与を必要とするが、宿主細胞ゲノムに組み込まれないことにより、ＳＣＩＤ試験において認められるがんのタイプを予防するはずである。このベクター系は、がんの処置において真に有望であることが示されており、実際に承認された最初の遺伝子治療産物（Ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ）は、がんを処置するためのアデノウイルスである。
【０１０３】
アデノウイルス科のウイルスは、ヒトを含む様々な種の動物に感染する。アデノウイルスは、それらがエンドソームを通して輸送され得る（すなわち、エンベロープの融合は不要である）最大の大きさであることから、最大の非エンベロープウイルスを表す。ビリオンもまた、宿主細胞の表面上のコクサッキー−アデノウイルス受容体を介して宿主細胞への接着を助けるカプシドの各々のペントンベースに会合する独自の「棘」または線維を有する。
【０１０４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さいウイルスである。ＡＡＶは現在、疾患を引き起こさないことが知られており、そのためウイルスが引き起こす免疫応答は非常に軽度である。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み入れることができる。その上、エピソームＡＡＶは、長く安定した発現を誘発し、このためＡＡＶは遺伝子治療のためのウイルスベクターを作製するために適している。遺伝子治療ベクターとしてのその潜在的使用のために、ＡＡＶは、これまで修飾されてきた（自己相補性アデノ随伴ウイルス；ｓｃＡＡＶ）。ＡＡＶはＤＮＡの一本鎖をパッケージングし、二本鎖合成プロセスを必要とするが、ｓｃＡＡＶは、共にアニールする両方の鎖をパッケージングして、二本鎖ＤＮＡを形成する。このアプローチによって、標的細胞において急速な発現が可能となる。
【０１０５】
レトロウイルスの亜綱であるレンチウイルスは、非分裂細胞のゲノムへのその独自の組み込み能のために遺伝子送達のためのウイルスベクターとして最近、改変されている。ＲＮＡの形態でのウイルスゲノムは、ウイルスが細胞内に入ると逆転写されてＤＮＡを産生し、次に、これがウイルスインテグラーゼ酵素によってゲノムに挿入される。この時点でプロウイルスと呼ばれるベクターは、ゲノムに留まり、細胞が分裂すると細胞の子孫に受け継がれる。
【０１０６】
水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）（しばしば、なおもＶＳＶと呼ばれる）は、ラブドウイルス科のウイルスであり、周知の狂犬病ウイルスはこの科に属する。ＶＳＩＶは、昆虫、ウシ、ウマ、およびブタに感染することができる。世界のある特定の地域では、このウイルスがウシに感染して口蹄疫ウイルスと類似の疾患を引き起こし得ることから、農業者にとって特に重要である。
【０１０７】
ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルス科に属し、これは動物およびヒトにおいて疾患を引き起こす最大のＤＮＡウイルスファミリーである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（口唇ヘルペスおよび性器ヘルペス）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ；鶏痘および帯状疱疹）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ；単核球症）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヒトにおいて広範に存在する。９０％を超える成人がこれらのうちの少なくとも１つに感染しており、ウイルスの潜伏型がほとんどのヒトに留まっている。ヘルペスウイルスは、現在、長い配列の外来ＤＮＡを運ぶことができるウイルス粒子のその高い遺伝子導入能、腫瘍溶解活性を保持する多くの異なったタイプの弱毒化ベクターを生成することができるウイルスゲノムの遺伝子複雑度、およびＨＳＶベクターがトランスジーンを強く長期間発現することができる知覚神経節のニューロンに浸潤して一生持続する非毒性の潜伏感染症を確立する能力により、遺伝子導入ベクターとして使用されている。３つの異なったクラスのベクター、すなわち複製欠損型弱毒化ベクター、複製インコンピテント組み換えベクター、およびアンプリコンとしても公知の欠損ヘルパー依存性ベクターを、ＨＳＶから誘導することができる。複製欠損型ＨＳＶベクターは、１つまたは複数の前初期遺伝子、例えばＩＣＰ４を欠失させ、次に補完する細胞株によってトランスで提供することによって作製される。腫瘍溶解性ＨＳＶベクターは、がんの有望な治療剤である。そのようなＨＳＶベースのベクターは、神経膠腫、黒色腫、および卵巣がん患者において試験されている。
【０１０８】
ウイルスベクターはＭＶＡであることが特に好ましい。
【０１０９】
上記の好ましいウイルスベクターは、動物および／またはヒトにおけるその安全性プロファイルに関して評価されており、前臨床および臨床データがそれぞれ入手可能である。
【０１１０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、複製欠損ウイルスベクターはウイルス様粒子である。
【０１１１】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、それらが感染性ではなく、ウイルス遺伝子材料を含まないことから利点を提供する。したがって、それらは生きた弱毒化ウイルスをウイルスベクターとして使用する場合に起こり得る再アセンブリのいかなるリスクにも関連しない。
【０１１２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、方法は、抗原性ポリペプチドを添加するステップをさらに含む。
【０１１３】
本発明による「抗原性ポリペプチド」は、それが免疫応答を誘発する限り、特に限定されない。抗原性ポリペプチドは、例えば、ウイルス、細菌、または腫瘍細胞から選択され得る。例えば、抗原性ポリペプチドは、本発明の方法に使用されるウイルスベクター以外のウイルスのウイルス表面タンパク質もしくはその一部、または主要な免疫原性ウイルスタンパク質もしくはその一部であり得る。これらの追加の抗原性ポリペプチドは、例えば、プライム・ブーストワクチン接種において免疫系をプライミングするために使用することができる。その場合、ブースト反応は、本発明の方法によってウイルスベクターベースの組成物を調製するために依存するそれぞれのウイルスベクターまたはＶＬＰによって誘発される。本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と互換的に使用され、一本鎖タンパク質またはその断片を含むアミノ酸の直線状の分子鎖を記載する。
【０１１４】
抗原性ポリペプチドを追加するステップは、異なった時点で行うことができる。例えば、抗原性ポリペプチドを、ステップ（ａ）で提供される複製欠損型ウイルスベクターに添加することができる。あるいは、抗原性ポリペプチドをステップ（ｃ）においてさらに混合することができ、またはステップ（ｃ）での混合後に得られた組成物に添加することができる。さらに、追加の代替として、抗原性ポリペプチドを、ステップ（ｅ）での再構成後にウイルスベクターベースの組成物に添加することができる。
【０１１５】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、方法は、少なくとも１つのアジュバントを添加するステップをさらに含む。
【０１１６】
アジュバントならびにその作用様式は、当技術分野で周知である。ミョウバンおよびエマルジョン（例えば、ＭＦ５９（登録商標））などの一部のアジュバントは、注射部位で抗原性物質を捕捉する貯留槽を生成し、免疫系の持続的な刺激を提供するために遅延放出を提供することによって送達システムとして機能する。これらのアジュバントは、注射部位での抗原の持続を増強し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の動員および活性化を増加させる。微粒子アジュバント（例えば、ミョウバン）は、抗原性物質に結合してＡＰＣによる取り込みを促進する多分子凝集体を形成する能力を有する。一部のアジュバントはまた、腫瘍組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）による抗原提示を指示することができる。他のアジュバントは、本質的にパターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンドであり、生得の免疫を誘導し、主にＡＰＣを標的とし、その結果適応免疫応答に影響を及ぼすことによって作用する。ほぼ全てのＰＲＲファミリーのメンバーがアジュバントの潜在的標的である。これらには、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ−ｌｉｋｅ受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ受容体（ＲＬＲ）およびＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）が挙げられる。それらは異なった転写因子の活性化を引き起こす異なったアダプター分子を伴う経路を通してシグナルを伝達する。これらの転写因子（ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３）は、サイトカインおよびケモカインおよびＩＬ−１８の産生を誘導する。
【０１１７】
好ましくは、少なくとも１つのアジュバントは、アラム、ＭＦ５９（登録商標）、ＡＳ０３、ＡＦ０３、ＡＳ０４、ＲＣ−５２９、Ｖｉｒｏｓｏｍｅｎ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、ＣｐＧ  １０１８、ＣｐＧ  ７９０９、ＶａｘＩｍｍｕｎｅ、ＰｒｏＭｕｎｅ（登録商標）、ＩＣ−３１（登録商標）、ＣＴＡ１−ＤＤ、または環状ジ−ＡＭＰから選択される。これらのアジュバント、そのクラス、適応、および提供元ならびに製品名を以下の表２に要約する。
【０１１８】
【表２−１】
2019531288.tif 000010
【０１１９】
【表２−２】
2019531288.tif 000011
【０１２０】
アジュバントを添加するステップは、異なった時点で行うことができる。例えば、ステップ（ａ）で提供される複製欠損型ウイルスベクターにアジュバントを添加することができる。あるいはまたはさらに、アジュバントは、ステップ（ｃ）において混合することができるか、または得られた組成物に添加して、その後ステップ（ｃ）において混合することができる。さらなる代替または追加の選択肢として、アジュバントは、ステップ（ｅ）での再構成後にウイルスベクターベースの組成物に添加することができる。
【０１２１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、アジュバントの少なくとも１つはサポニンである。あるいは、アジュバントは、サポニンを含む物質の混合物である。
【０１２２】
サポニンは、天然起源で見出される、天然起源に由来する、または化学合成することができる二次代謝物を形成する化学化合物のクラスである。サポニンは、様々な植物種において特に豊富に見出されている。サポニンは、水溶液中で振とうさせるとそれらが産生する石けん様の泡によって現象学的に分類され、親油性のステロイドアグリコンまたはトリテルペノイドアグリコンと組み合わせた１つまたは複数の親水性グリコシド部分のその組成によって構造的に分類される両親媒性グリコシドである。その構造多様性は、その物理化学および生物特性に反映される。サポニンの非制限的な例は、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、グルクロン酸、エスシン、ヘデラコシド、およびジギトニンである。
【０１２３】
好ましくは、サポニンは、周知のアジュバント組成物から選択され、例えば限定されないが表２に記載されるキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）から抽出したサポニンである。
【０１２４】
別の実施形態では、サポニンは、グリチルリチン酸またはその誘導体である。グリチルリチン酸は、グリチルリシン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｃｉｃ  ａｃｉｄ）、グリチルリチン、またはグリチルリジン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）としても知られる。グリチルリチン酸は、水溶性であり、潜在的リガンドであり得る陰イオンとして存在し、活性成分の陽イオン分子と静電気的に会合した複合体を形成する。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、陰イオン性のグリチルリチン酸が、静電気的相互作用、水素結合、またはその両方を通して、本発明の溶液中に存在するアミノ酸（すなわち、アルギニンまたはリジン）と複合体を形成するという仮説を立てている。
【０１２５】
グリチルリチン酸の誘導体は当技術分野で周知であり、これには、カルボキシルおよびヒドロキシル基でのグリチルリチン酸の変換、アミノ酸残基の炭水化物部分へのコンジュゲーション、または２−アセトアミド−β−ｄ−グルコピラノシルアミンのグリチルリチン酸のグリコシド鎖への導入によって産生される誘導体が挙げられる。他の誘導体は、グリチルリチン酸のアミド、グリチルリチン酸と２つのアミノ酸残基および遊離の３０−ＣＯＯＨ官能基とのコンジュゲーション、ならびにグリチルリチン酸分子の炭水化物部分におけるアミノ酸アルキルエステルの少なくとも１つの残基のコンジュゲートが挙げられる。特定の誘導体の例は、例えば、Ｋｏｎｄｒａｔｅｎｋｏら（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０巻（２），（２００４），ｐｐ．１４８−１５３）において見出されうる。
【０１２６】
使用されるグリチルリチン酸（またはその誘導体）の好ましい量は、０．０１〜１５ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌの間、さらにより好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌの間、および最も好ましくは、量は２ｍｇ／ｍｌである。
【０１２７】
当技術分野で公知であるように、サポニン、特にグリチルリチン酸は、ウイルスベクターベースの組成物の免疫原性作用を増強することから、アジュバントの機能に存在することは有利であることが見出されている。
【０１２８】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、（ａ）の複製欠損型ウイルスベクターは、細胞培養から収穫して精製した直後に再構成された複製欠損型ウイルスベクターである。
【０１２９】
複製欠損型ウイルスベクターを再構成する手段および方法は、当技術分野で周知である。例えば、適切な細胞培養モデルにおける複製欠損型ウイルスベクター、例えばＭＶＡの増幅後、ＭＶＡの粗製ストック調製物を、スクロースクッションの中での超遠心によって細胞デブリおよび組み換えタンパク質から半精製することができる。上清（細胞デブリおよびスクロース）を廃棄した後、沈降したウイルスベクター材料を、（ｂ）に従って溶液と混合することができる。あるいは、より高度に精製されたウイルスを得るために、半精製材料を、２５〜４０％スクロース勾配を通して遠心分離することができる。チューブの下半分に現れるウイルスベクターのバンドを濃縮して、残りのスクロースは、（ｂ）による溶液を超遠心チューブに充填するステップ、超遠心によってウイルスベクター材料を沈降させるステップ、および（ｂ）による溶液中でペレットを懸濁させるステップによって同時に除去される。
【０１３０】
非感染性粒子と比較して、組成物に存在する感染性粒子の量の多分散度の増加による減少は、細胞培養からのウイルス粒子の収穫直後に始まる。このため、複製欠損型ベクターをウイルスベクターの初回収穫後に可能な限り早期に（ｂ）の溶液と混合することが、本発明に従って特に好ましい。
【０１３１】
例えば以下の実施例２に示すように、安定化組成物、特に組成物１および２を初期に添加することは、その調製手順全体においてアデノウイルスベクター調製物の安定性に強い影響を及ぼし得る。ＣｓＣｌ密度超遠心（プロセスステップ１）による精製ステップの直後または調製プロセス（プロセスステップ２）の後期のいずれかでの、組成物１および２での透析による再緩衝化後のアデノウイルス調製物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性の分析により、適用された２つの安定化組成物の間に差が明らかとなった。プロセスステップ１および２の調製による組成物１における再緩衝化によって、破線で表す陽性対照と比較して、透析直後（実施例２；図９）ならびに５回および１０回の凍結解凍サイクルの適用後（実施例２；図１１ＡおよびＢ）に感染性が完全に保持された。調製プロセス（プロセスステップ１）の初期ステップの際の組成物２での再緩衝化によっても、透析直後に感染性が完全に保持され、繰り返し凍結解凍サイクルの適用後でも感染タイターの喪失は軽微であった（実施例２；図９および図１１Ａ）。これに対し、プロセスステップ２における調製の際の組成物２での再緩衝化によって、透析直後で既に感染タイターは顕著に減少した（実施例２；図９）。繰り返し凍結解凍サイクルのさらなる適用は、感染タイターのさらに有意な減少をもたらした（実施例２；図１１Ｂ）。
【０１３２】
したがって、本発明の安定化組成物の早期の適用は、全体の生産プロセスの間の特定の生物分子に対する顕著な安定化効果を有することが見出された。
【０１３３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性実験のこれらの結果は、同時に実施したＤＬＳ実験と良好に相関した。図１０ＡおよびＢにおいて、プロセスステップ１の際の組成物１および２での調製後のアデノウイルス粒子の流体力学的半径の決定結果は、超遠心を使用した精製ステップ直後に製剤の調製後のアデノウイルス粒度が完全に保持されることを示し、これは図９の感染性結果と一致する。組成物１の場合、プロセスステップ２によるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化後、流体力学的粒子半径の僅かな増加が観察されたが（図１０Ｃ）、これは図９に示す感染性結果と一致する。これに対し、プロセスステップ２に対応する組成物２でのアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化は、高次凝集体の形成を伴うアデノウイルス粒子の流体力学的半径の顕著な増加をもたらし（図１０Ｄ）、このことはｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性試験（図９）における機能喪失を説明し得る。
【０１３４】
５回および１０回の繰り返し凍結解凍サイクルの後、特に組成物２でのウイルス粒子の流体力学的半径の変化をＤＬＳによって測定した。プロセスステップ１および２によって調製した場合、組成物１では５回および１０回凍結解凍サイクル後であっても、顕著な増加は観察されなかった（実施例２；図１２ＡおよびＢならびに１３ＡおよびＢ）。プロセスステップ１において組成物２を使用した場合、５回の凍結解凍サイクル後で既に流体力学的半径は、高次凝集体の形成に関連して顕著に増加し（実施例２；１３ＣおよびＤ）、１０回の凍結解凍サイクル後、およびプロセスステップ２において使用した場合には、ＤＳＬ測定限界の外側であるさらに増加した半径および高次凝集体により測定不能であった。
【０１３５】
本発明は、本発明の方法によって得られたまたは得ることができるウイルスベクターベースの組成物にさらに関連する。
【０１３６】
これらのウイルスベクターベースの組成物は、遺伝的背景を有する疾患の治療のために抗菌、抗ウイルス、抗がん、抗アレルギーワクチン接種および／または遺伝子導入治療のために使用することができる。
【０１３７】
好ましい実施形態では、組成物は医薬組成物である。
【０１３８】
本発明に従って、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。
【０１３９】
医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投与レジメンは、主治医および臨床要因によって決定される。医学の技術分野において周知であるように、任意の１人の患者の投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。所定の状況の治療有効量は、ルーチンの実験によって容易に決定され、当業者の臨床医または医師の熟練および判断の範囲内である。医薬組成物は、１回投与され得るか、または長期間にわたって定期的に投与され得る。一般的に、医薬組成物の投与は、例えば、単回用量に関して１μｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でなければならない。しかしより好ましい投与量は、単回用量に関して、１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、さらにより好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０１４０】
治療的投与のために使用される医薬組成物の構成要素は無菌的でなければならない。無菌性は、例えば濾過滅菌メンブレン（例えば、０．２μｍメンブレン）を通しての濾過によって容易に達成される。
【０１４１】
組成物の様々な構成要素を、使用説明書と共にキットとして包装してもよい。
【０１４２】
したがって、本発明はさらに、本発明の方法によって得られたまたは得ることができるウイルスベクターベースの組成物、および任意選択でキットを使用する説明書を含むキットに関する。
【０１４３】
その最も広い意味での用語「キット」は、列挙された構成要素以外の他の任意の化合物、バイアル、容器等の存在を必要としないが、本発明のキットの文脈における用語「含む」は、さらなる構成要素がキットに存在し得ることを指す。そのようなさらなる構成要素の非制限的な例には、上記のような抗原性ポリペプチドまたはアジュバント、ならびに保存剤、保存のための緩衝液、酵素等が挙げられる。
【０１４４】
いくつかの構成要素がキットに含まれる場合、キットの様々な構成要素を１つまたは複数のバイアルなどの１つまたは複数の容器に包装してもよい。その結果、キットの様々な構成要素は、個別にまたは組み合わせて存在してもよい。容器またはバイアルは、構成要素に加えて、保存のための保存剤または緩衝剤を含み得る。加えて、キットは使用説明書を含み得る。
【０１４５】
本発明のキットの好ましい実施形態では、キットは、本発明の方法によって得られたまたは得ることができるウイルスベクターベースの組成物と、同じまたは異なった容器中に抗原性ポリペプチドとを含む。ｉ）ウイルスベクターベースの組成物およびｉｉ）抗原性ポリペプチドを有するこれらの個別の容器を、例えばプライム・ブースト免疫アプローチのために、個別のワクチン接種ステップ（同時または互いにその後）において使用することができる。
【０１４６】
本発明のキットの代替のまたは追加の好ましい実施形態では、キットは、本発明の方法によって得られたまたは得ることができるウイルスベクターベースの組成物と、同じまたは異なった容器中に１つまたは複数のアジュバントとを含む。
【０１４７】
同様に、（ｉ）本発明の方法によって得られるまたは得ることができるウイルスベクターベースの組成物；（ｉｉ）抗原性ポリペプチド、および（ｉｉｉ）１つまたは複数のアジュバントを、同じまたは異なった容器中に含むキットも想像される。
【０１４８】
本発明はまた、プライム・ブーストワクチンとして使用するための本発明のウイルスベクターベースの組成物にも関する。
【０１４９】
「プライム・ブーストワクチン戦略」は、当技術分野で周知であり、免疫応答を「プライミングする」第一のステップの後に、予めプライミングされた免疫応答を「ブーストする」第二のステップを包含する。このアプローチは、ヒトにおいても、高レベルの抗原特異的Ｔ細胞メモリならびに病原体に対する保護的細胞性免疫を可能にし、このため、ワクチン接種における有望なアプローチである（Ｗｏｏｄｌａｎｄ  ＤＬ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００４；Ｎｏｌｚ  ＪＣ，  Ｈａｒｔｙ  ＪＴ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０１１；７８０：６９−８３．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−４４１９−５６３２−３＿７．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）。
【０１５０】
ウイルスベクターベースの組成物は、治療的なプライム・ブーストワクチンアプローチにとって非常に魅力的である。例えば、ＨＢＶ感染症の予防のための予防的ワクチン接種は十分に確立されている。これに対し、ＨＢＶ感染症による慢性肝炎およびその続発症の有効な治療は現在利用できないが、特異的抗原プライミング、および抗原特異的抗体産生と共に抗原特異的Ｔ細胞反応を誘導する後続の特異的ウイルスベクターベースのブーストによるプライム・ブーストワクチン接種戦略による取り組みが成功しており、いずれも非常に効率的なワクチン接種アウトカムをもたらす。本明細書において上記で考察されるように、添付の実施例に提供するデータは、本発明の方法によって調製されるウイルスベクターベースの組成物の生物学的免疫原性活性が、他の方法によって調製されたウイルスベクターベースの組成物と比較して改善されることを示している。言い換えれば、本発明のウイルスベクターベースの組成物が対象の免疫系を刺激する能力、例えばそれに対してワクチンが開発されている疾患に対して対象を保護するために免疫系の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘発する能力が改善する。
【０１５１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルスベクターベースの組成物は、筋肉内、皮下、皮内、経皮、口腔、経口、鼻腔内、および／または吸入応用のためである。
【０１５２】
他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じた場合は、定義を含めて特許明細書が優越する。
【０１５３】
本明細書、特に特許請求の範囲で特徴付けた実施形態に関しては、従属請求項で述べたそれぞれの実施形態が、前記従属請求項が従属するそれぞれの（独立または従属）請求項のそれぞれの実施形態と組み合わせられることが意図されている。たとえば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣに言及する独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦに言及する従属請求項２、ならびに請求項１および２に従属し、３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩに言及する請求項３の場合には、具体的にそうではないことが述べられない限り、明細書は明らかに組合せＡ，Ｄ，Ｇ；Ａ，Ｄ，Ｈ；Ａ，Ｄ，Ｉ；Ａ，Ｅ，Ｇ；Ａ，Ｅ，Ｈ；Ａ，Ｅ，Ｉ；Ａ，Ｆ，Ｇ；Ａ，Ｆ，Ｈ；Ａ，Ｆ，Ｉ；Ｂ，Ｄ，Ｇ；Ｂ，Ｄ，Ｈ；Ｂ，Ｄ，Ｉ；Ｂ，Ｅ，Ｇ；Ｂ，Ｅ，Ｈ；Ｂ，Ｅ，Ｉ；Ｂ，Ｆ，Ｇ；Ｂ，Ｆ，Ｈ；Ｂ，Ｆ，Ｉ；Ｃ，Ｄ，Ｇ；Ｃ，Ｄ，Ｈ；Ｃ，Ｄ，Ｉ；Ｃ，Ｅ，Ｇ；Ｃ，Ｅ，Ｈ；Ｃ，Ｅ，Ｉ；Ｃ，Ｆ，Ｇ；Ｃ，Ｆ，Ｈ；Ｃ，Ｆ，Ｉに対応する実施形態を開示していることを理解されたい。
【０１５４】
同様に、また独立および／または従属請求項が選択肢に言及していない場合でも、従属請求項が先行する複数の請求項に遡って引用するならば、それに包含される主題の任意の組合せが明示的に開示されているとみなされることが理解される。たとえば、独立請求項１、遡って請求項１を引用する従属請求項２、および遡って請求項２および１を引用する従属請求項３の場合には、請求項３と１の主題の組合せは、請求項３、２および１の主題の組合せと同様に、はっきりとかつ明白に開示されているということになる。請求項１から３のいずれか一項を引用するさらなる従属請求項４が存在する場合には、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せは、はっきりとかつ明白に開示されているということになる。
【０１５５】
上記の考慮は添付した全ての請求項に準用される。非限定的な例を挙げれば、請求項１２、８、４、３および１の組合せは、請求項の構造に鑑みて、はっきりとかつ明白に予想される。たとえば、請求項１２、８および１の組合せ等についても同じことが適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
本発明を、以下に示す図面によって説明する：
【０１５７】
【図１−１】懸濁液中の凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライ前のアデノウイルスベクター組成物の流体力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）対照としてのアデノウイルスストック溶液のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）希釈により組成物１と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。（Ｃ）希釈により組成物２と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図１−２】懸濁液中の凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライ前のアデノウイルスベクター組成物の流体力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）対照としてのアデノウイルスストック溶液のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）希釈により組成物１と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。（Ｃ）希釈により組成物２と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図２】懸濁液中の凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライ前のアデノウイルスベクター組成物の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）もとの供給元の製剤と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）ＰＢＳと混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。前の図とは対照的に、もとの供給元の製剤およびＰＢＳと混合した後のアデノウイルス粒子の水力学的半径は、未処理のストック溶液と比較して増大している。
【図３】フリーズドライのストレス条件下での機能性のモデルとしての異なった製剤におけるフリーズドライ後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：アデノウイルスベクター調製物を希釈によって製剤化し、続いて組成物１および２の中でフリーズドライした。フリーズドライしたベクターを再構成した後、アデノウイルスのＨｅｘｏｎタンパク質の抗体に基づく比色検出によって、ＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロ感染性アッセイを行い、感染細胞中でアデノウイルスが増幅に成功していることを示した。組成物１および２で製剤化したアデノウイルスベクター調製物の感染タイターが完全に保持されていることが観察された（破線で示す陽性対照と比較したｍｌあたりの感染ユニット）。対照的に、もとの供給元の製剤で希釈したアデノウイルスベクターのフリーズドライによって感染タイターの顕著な損失が生じ、ＰＢＳで希釈したアデノウイルスベクターのフリーズドライによって対応する感染タイターは完全に失われた。
【図４】フリーズドライのストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライ後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）組成物１の中でフリーズドライした後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）組成物２の中でフリーズドライした後のアデノウイルスベクター調製物の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液（図１Ａ）中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図５】フリーズドライのストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライ後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）もとの供給元の製剤中でフリーズドライした直後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）ＰＢＳ中でフリーズドライした直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。前の図とは対照的に、もとの供給元の製剤中およびＰＢＳ中でフリーズドライした後のアデノウイルス粒子の水力学的半径は、未処理のストック溶液（図１Ａ）と比較して高次の凝集物の形成を伴って増大する。
【図６】熱ストレス条件下での機能性のモデルとしての上昇した温度での異なった製剤におけるフリーズドライおよび乾燥製剤の後続の保存後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：ｔ＝０ｄ（左の黒いバー）は、フリーズドライおよび保存前の再構成直後のインビトロ感染性を示す。破線は未処理陽性対照の対応する感染タイターを示す。（Ａ）もとの供給元緩衝液およびＰＢＳと比較した、組成物１および２における希釈によって再緩衝化し、フリーズドライした製剤を引き続いて２５℃および６０％の残存湿度で２１日（中央のバーの組）および４２日（右側のバーの組）保存した後のアデノウイルスベクター組成物のインビトロ感染性。（Ｂ）もとの供給元緩衝液およびＰＢＳと比較した、組成物１および２における希釈によって再緩衝化し、フリーズドライした製剤を引き続いて４０℃および７５％の残存湿度で７日（中央のバーの組）および２８日（右側のバーの組）保存した後のアデノウイルスベクター組成物のインビトロ感染性。組成物１および２の中で調製した試料ではアデノウイルスの感染性の完全な保持が観察された。一方、もとの供給元緩衝液中またはＰＢＳ中の保存では、アデノウイルスの感染性は完全に失われた。
【図７】熱ストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）組成物１の中における乾燥製剤の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）組成物２の中における乾燥製剤の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液（図１Ａ）中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図８】熱ストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしてのフリーズドライ後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）もとの供給元の製剤中におけるフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）ＰＢＳ中におけるフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。前の図とは対照的に、もとの供給元の製剤中およびＰＢＳ中でフリーズドライし、引き続いて高温で保存した後のアデノウイルス粒子の水力学的半径は、未処理のストック溶液と比較して高次の凝集物の形成を伴って増大する。
【図９】熱ストレス条件下での機能性のモデルとしてのプロセスステップ１またはプロセスステップ２で調製された安定化組成物１および２の中での製剤化の後のアデノウイルスベクター調製物のインビトロ感染性：アデノウイルス調製物を、それぞれＣｓＣｌ密度超遠心による精製ステップ（プロセスステップ１）の直後、または後の調製プロセス（プロセスステップ２）中で、それぞれ組成物１または２の中での透析によって再緩衝化した。プロセスステップ１では、両方の組成物中で陽性対照（破線で示す）と比較して透析後の感染タイターの完全な保持が観察された。対照的に、調製プロセス２での透析では、組成物２の中で行った場合には感染タイターのほぼ２ログレベルの顕著な損失が生じた一方、組成物１の中での透析ではプロセスステップ１で得られた結果と同様に感染タイターの完全な保持が得られた。
【図１０−１】凝集および多分散度のモデルとしてのプロセスステップ１またはプロセスステップ２のいずれかによる安定化組成物１および２における製剤化後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の流体力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ１または２における透析を用いる組成物１中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化によって、粒子（Ａ）および（Ｃ）の水力学的半径の保持が得られた。プロセスステップ１における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化によって、アデノウイルスベクター（Ｂ）の水力学的半径の完全な保持が得られた。対照的に、プロセスステップ２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う大きな凝集物の形成が生じた（Ｄ）。
【図１０−２】凝集および多分散度のモデルとしてのプロセスステップ１またはプロセスステップ２のいずれかによる安定化組成物１および２における製剤化後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の流体力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ１または２における透析を用いる組成物１中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化によって、粒子（Ａ）および（Ｃ）の水力学的半径の保持が得られた。プロセスステップ１における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化によって、アデノウイルスベクター（Ｂ）の水力学的半径の完全な保持が得られた。対照的に、プロセスステップ２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う大きな凝集物の形成が生じた（Ｄ）。
【図１１】ストレス条件下での機能性のモデルとしての繰り返し適用した凍結解凍サイクルの後のアデノウイルスベクター調製物のインビトロ感染性：（Ａ）プロセスステップ１における調製の間の透析によるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化。（Ｂ）プロセスステップ２における調製の間の透析によるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化。両方の調製手順（プロセスステップ１および２）において、組成物１の中の再緩衝化により、破線で示す陽性対照と比較して、透析後（初期タイター）ならびに５回および１０回の凍結解凍サイクルの適用の後、感染性の完全な保持が得られた（（Ａ）および（Ｂ））。調製プロセスの早期のステップ（プロセスステップ１）の間の組成物２の中における再緩衝化でも、透析直後の感染性の完全な保持が得られ（初期タイター、Ａ、左のバーの組）、繰り返し凍結解凍サイクルの適用の後に、感染タイターの僅かな損失が生じた（Ａ）。対照的に、プロセスステップ２における調製の間の組成物２における再緩衝化では、透析直後で既に感染タイターの顕著な低減が生じた（Ｂ；左のバーの組）。繰り返し凍結解凍サイクルをさらに適用すると、感染タイターのさらに顕著な低減が生じた（Ｂ；中央および右のバーの組）。
【図１２】ストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしての５回または１０回の凍結解凍サイクルの適用の後の安定化組成物１中におけるアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ２における透析を用いた組成物１の中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化により、（Ａ）５回の凍結解凍サイクルの適用の後、および（Ｂ）１０回の凍結解凍サイクルの適用の後の、粒子の水力学的半径の保持が得られた。
【図１３−１】ストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしての５回の凍結解凍サイクルの適用の後のプロセスステップ１またはプロセスステップ２の間の安定化組成物１および２の中におけるアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ１または２における透析を用いた組成物１の中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化により、５回の凍結解凍サイクル（Ａ）および（Ｂ）の適用後の粒子の水力学的半径の保持が得られた。対照的に、プロセスステップ１または２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、５回の凍結解凍サイクル（Ｃ）および（Ｄ）の適用後、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う高次の凝集物の形成が生じた。
【図１３−２】ストレス条件下での凝集および多分散度のモデルとしての５回の凍結解凍サイクルの適用の後のプロセスステップ１またはプロセスステップ２の間の安定化組成物１および２の中におけるアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ１または２における透析を用いた組成物１の中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化により、５回の凍結解凍サイクル（Ａ）および（Ｂ）の適用後の粒子の水力学的半径の保持が得られた。対照的に、プロセスステップ１または２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、５回の凍結解凍サイクル（Ｃ）および（Ｄ）の適用後、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う高次の凝集物の形成が生じた。
【図１４】組成物１におけるフリーズドライおよび再構成後のアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）超高倍率での特別な観察。アデノウイルス粒子は、正二十面体形状の明るい無傷の粒子（黒色の矢印）として見えた。少数のより濃く染色されたあまり明白でない正二十面体形状の粒子（白色の矢印）が観察され、おそらく部分的に脱安定化されたビリオンを表した。小さい明るく染色された構造（白色の矢印の先端）が、グリッドの背景に存在するが、デブリまたはアデノウイルスサブユニットの有意な存在は観察されなかった。アデノウイルス粒子は、単一の正二十面体形状の明るい無傷の実体として優先的に見え、アデノウイルス粒子の凝集体またはデブリは観察されなかった。
【図１５】組成物２におけるフリーズドライおよび再構成後のアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）超高倍率での特別な観察。アデノウイルス粒子は、正二十面体形状の明るい無傷の粒子（黒色の矢印）として見えた。背景は非常に滑らかに見え、デブリまたはアデノウイルスサブユニットの有意な存在は認められなかった。アデノウイルス粒子は、単一の正二十面体形状の明るい無傷の実体として優先的に見え、アデノウイルス粒子の凝集体またはデブリは観察されなかった。
【図１６】ＰＢＳにおけるフリーズドライおよび再構成後のアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）超高倍率での特別な観察。無傷のアデノウイルス粒子は、観察されなかった。おそらくヘキソン構造を表す小さいリング状構造（黒色の矢印の先）が時折グリッド（黒色の矢印の先）上に観察された。ヘキソン構造は、遊離の実体としておよびデブリの小さいクラスタ（黒色の矢印または球状の明るく染色された構造（Ｄ））に結合した状態の両方で観察された。デブリを含む少数のより大きい凝集体が観察された（Ｂ）。
【図１７】もとの供給元の製剤におけるフリーズドライおよび再構成後のアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）超高倍率での特別な観察。無傷のアデノウイルス粒子は、観察されなかった。おそらくヘキソン構造を表す小さいリング状構造（黒色の矢印の先）が時折グリッド（黒色の矢印の先）上に観察された。ヘキソン構造は、遊離の実体としておよびデブリの小さいクラスタ（黒色の矢印または球状の明るく染色された構造（Ｄ））に結合した状態の両方で観察された。
【図１８】陽性対照としての標準緩衝液中、−８０℃で保存したアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）低倍率での特別な観察の概要画像。アデノウイルス粒子は、正二十面体形状の明るい無傷の粒子（Ａ：黒色の矢印）として、およびおそらく部分的に分解した粒子を表すより濃く染色されたあまり明白でない正二十面体形状の粒子（Ａ、Ｂ、およびＣ：白色の矢印）の両方として観察された。アデノウイルス粒子の直径は、およそ１００ｎｍ（頂点から頂点まで）であると測定された。背景は、デブリ（Ｂ；黒色の破線の矢印）、線維構造（Ｃ；白色の破線の矢印）、および小さいリング状構造（Ｃ；黒色の矢印の先）が主に単一の実体として、およびごくまれに集団で存在することを示しており、おそらくヘキソン構造（Ｃ；挿入図）を表す。アデノウイルス粒子は、単一の実体としておよび小さいクラスタの両方で認められた。アデノウイルスを含む１つのより大きい凝集体およびデブリが観察された（Ｄ）。
【図１９−１】液体ストレス条件下での機能性のモデルとしての異なった製剤において５℃、２５℃、および３７℃で液体保存後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：アデノウイルスベクター調製物を、異なった製剤において１×１０８ＩＦＵ／ｍｌに希釈することによって調製し、次に１００μｌを滅菌ＰＣＲチューブにおいて液体保存した。異なった温度で保存後、ＨＥＫ  ２９３細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性アッセイを、アデノウイルスヘキソンタンパク質の抗体に基づく比色検出を使用して実施し、感染細胞におけるアデノウイルスの増幅が成功していることを示した。（Ａ）５℃で３カ月後、組成物３〜９において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の感染タイターの完全な保持が観察された（陽性対照と比較した１ｍｌあたりの感染単位；破線として表す）。これに対し、もとの供給元の製剤１では、感染タイターのほぼ２対数タイターの大きい喪失が起こった。（Ｂ）２５℃で３カ月間液体保存後、組成物３〜９において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の感染タイターは１対数タイター減少し、それによってもとの供給元の製剤１では、感染タイターの完全な喪失が起こった（陽性対照と比較した１ｍｌあたりの感染単位；破線として表す）。（Ｃ）３７℃で３５日後、組成物８はなおも１×１０５ＩＦＵ／ｍｌのタイターで検出可能であり、一方もとの供給元の製剤１では、アデノウイルスベクターは３７℃で１４日後には既に感染単位を有していない。（Ｄ）液体保存ストレス条件下でＰＤＩ値として表記した粒度分布増加のモデルとしての３７℃で液体保存後の対応するアデノウイルスベクター調製物におけるアデノウイルス粒子のＰＤＩ値の動的光散乱（ＤＬＳ）測定。
【図１９−２】液体ストレス条件下での機能性のモデルとしての異なった製剤において５℃、２５℃、および３７℃で液体保存後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：アデノウイルスベクター調製物を、異なった製剤において１×１０８ＩＦＵ／ｍｌに希釈することによって調製し、次に１００μｌを滅菌ＰＣＲチューブにおいて液体保存した。異なった温度で保存後、ＨＥＫ  ２９３細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性アッセイを、アデノウイルスヘキソンタンパク質の抗体に基づく比色検出を使用して実施し、感染細胞におけるアデノウイルスの増幅が成功していることを示した。（Ａ）５℃で３カ月後、組成物３〜９において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の感染タイターの完全な保持が観察された（陽性対照と比較した１ｍｌあたりの感染単位；破線として表す）。これに対し、もとの供給元の製剤１では、感染タイターのほぼ２対数タイターの大きい喪失が起こった。（Ｂ）２５℃で３カ月間液体保存後、組成物３〜９において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の感染タイターは１対数タイター減少し、それによってもとの供給元の製剤１では、感染タイターの完全な喪失が起こった（陽性対照と比較した１ｍｌあたりの感染単位；破線として表す）。（Ｃ）３７℃で３５日後、組成物８はなおも１×１０５ＩＦＵ／ｍｌのタイターで検出可能であり、一方もとの供給元の製剤１では、アデノウイルスベクターは３７℃で１４日後には既に感染単位を有していない。（Ｄ）液体保存ストレス条件下でＰＤＩ値として表記した粒度分布増加のモデルとしての３７℃で液体保存後の対応するアデノウイルスベクター調製物におけるアデノウイルス粒子のＰＤＩ値の動的光散乱（ＤＬＳ）測定。
【図２０】２５℃で２８日間液体保存後の組成物８において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）低倍率での特別な観察の概要画像。アデノウイルス粒子は、正二十面体形状の明るい無傷の粒子（Ａ：黒色の矢印）、およびおそらく部分的に分解した粒子を表すより濃く染色されたあまり明白でない正二十面体形状の粒子の両方として観察された。アデノウイルス粒子の直径は、およそ１００ｎｍ（頂点から頂点まで）であると測定された。背景は、デブリ、線維構造、および小さいリング状構造が主に単一の実体として、およびごくまれに集団で存在することを示しており、おそらくヘキソン構造を表す。
【図２１】２５℃で２８日間液体保存後の組成物６において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：（Ａ）低倍率；（Ｂ）中間倍率；（Ｃ）高倍率；（Ｄ）低倍率での特別な観察の概要。アデノウイルス粒子は、正二十面体形状の明るい無傷の粒子として、およびおそらく部分的に分解した粒子を表すより濃く染色されたあまり明白でない正二十面体形状の粒子の両方として観察された。アデノウイルス粒子の直径は、およそ１００ｎｍ（頂点から頂点まで）であると測定された。背景は、デブリ、線維構造、および小さいリング状構造が主に単一の実体として、およびごくまれに集団で存在することを示しており、おそらくヘキソン構造を表す。
【図２２】液体ストレス条件下で機能性のモデルとしての組成物１０において３７℃で液体保存後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：組成物１０におけるアデノウイルスベクター調製物は、１４日間の液体保存後に感染タイターの良好な保持を示し、もとの供給元の製剤２における対応する調製物より３７℃で２１日間明白であった。
【図２３】異なったプロセスステップによる機能性のモデルとしての、プロセスステップ１および２（ＰＳ１およびＰＳ２）によって調製した組成物１１および１２またはもとの供給元の製剤１および２における３７℃で液体保存後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：組成物１１および１２（Ａ）におけるアデノウイルスベクター調製物は、もとの供給元の製剤１および２における対応する調製物より、３７℃で２８日間の液体保存後に感染タイターの良好な保持を示した。調製ステップ２を使用して組成物１１において製剤化したアデノウイルスベクター調製物は、ＰＢＳ（Ｂ；既に１４日後で感染性を喪失した）と比較して３７℃で２８日間の保存時に顕著な安定化を示した。
【図２４】もとの供給元の製剤１および２、ならびにＰＢＳと比較してＰＳ１およびＰＳ２に従って製剤化後の組成物１１および１２における異なった凍結解凍サイクルの適用後のアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性：組成物１１および１２（Ａ）におけるアデノウイルスベクター調製物は、もとの供給元の製剤１および２、ならびにＰＢＳと比較して５回の凍結解凍サイクルの適用後に感染タイターの良好な保持を示し、１５回の凍結解凍サイクル後ではより明白であった。調製ステップ２（ＰＳ２）を使用して組成物１１において製剤化したアデノウイルスベクター調製物は、ＰＢＳと比較して１０回凍結解凍サイクルの適用後に感染性の良好な保持を示した。
【図２５】異なった処理条件下でのＰＤＩ値として表記した、粒度分布増加のモデルとしての数回の凍結解凍サイクルの適用後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子のＰＤＩ値の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：ＰＳ１による組成物１１および１２において製剤化したアデノウイルスベクター組成物のＰＤＩ値は、２０回の凍結解凍サイクル後でも０．３より低かった（Ａ）。ＰＳ２による組成物１１および１２におけるアデノウイルスベクター試料の製剤は、０．３より小さいＰＤＩ値を保持した（Ｂ）。
【図２６】組成物１３におけるＭＶＡ粒子のＰＤＩ値の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：２０回の凍結解凍サイクルの適用後、組成物１３におけるＭＶＡのＰＤＩ値は、もとの供給元の製剤１および２、ならびにＰＢＳと比較して０．５より小さかった。
【発明を実施するための形態】
【０１５８】
実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
凍結乾燥し、その後保存したアデノウイルスベクターの機能的および構造的完全性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、アミノ酸および糖を含む組成物がフリーズドライの際にウイルスベクターを安定化させることを示した。
【０１６０】
１．１  材料および方法
組成物１および２は、アミノ酸の合計４０ｇ／ｌに対応する濃度で７つのアミノ酸、アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン、ヒスチジンおよびトリプトファンを含んでいた。しかし組成物１では、組成物２と比較して、トリプトファン濃度を５倍に増加し、ヒスチジンおよびグルタミン酸濃度を１．６６７倍に増加し、他のアミノ酸、アルギニン、グリシン、リジンの濃度を低減し、アラニン濃度を変更しなかった結果、アミノ酸全量を４０ｇ／ｌの同じ濃度とした。さらに、組成物２とは対照的に、組成物１に追加の界面活性剤ポリソーベート８０を０．０５ｇ／ｌの濃度で添加した。両方の組成物は対応する糖としてトレハロースを、アミノ酸／トレハロース比１：２で含んでいた。全ての組成物でｐＨ値を７に調整した。
【０１６１】
もとの供給元の製剤（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の７．５×１０１０ＩＦＵ／ｍｌの濃度で、−８０℃で保存したアデノウイルスのストック溶液を用いた。
【０１６２】
１．１．１  試料調製およびフリーズドライ
組成物１または組成物２を用いてストック溶液を１×１０８ＩＦＵ／ｍｌの濃度に希釈することによって、アデノウイルスベクターストック溶液を再緩衝化した。比較のため、もとの供給元の製剤またはＰＢＳを用いて、ストック溶液を同じ濃度に希釈した。
【０１６３】
フリーズドライ用の試料を調製するため、種々のアデノウイルス製剤を２Ｒフリーズドライバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ  ＡＧ、Ｍａｉｎｔｚ、Ｇｅｒａｍａｎｙ）中で体積５００μｌに分注し、続いて以下の乾燥パラメータによってフリーズドライした。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
フリーズドライの後、試料を目視で検査し、時点ｔ＝０における初期感染タイターの解析まで、試料の一部を２〜８℃で短期間保存した。試料の他の部分を医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインに従って、残存湿度６０％の環境条件下、２５℃で２１日もしくは４２日、または残存湿度７５％の環境条件下、４０℃で７日もしくは２８日、保存した。
【０１６６】
１．１．２  細胞培養中のアデノウイルスベクターの感染タイターの測定
アデノウイルスベクター製剤の感染タイターを解析するため、感染細胞中のアデノウイルスの増幅に成功した後、アデノウイルスのヘキソンタンパク質の検出によって、ＨＥＫ２９３細胞培養における抗体に基づくウイルス滴定実験を適用した。２４ウェルのマイクロタイタープレートのウェルあたり２．５×１０５個のＨＥＫ２９３（ＣＣＳ）細胞（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を体積５００μｌで播種した。アデノウイルスベクター製剤を、フリーズドライの直後、または２５℃および４０℃で保存した後の指示された時点で再構成した。陽性対照として、もとの供給元の製剤（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の濃度７．５×１０１０ＩＦＵ／ｍｌで、−８０℃で保存したアデノウイルスストック溶液のアリコートを用いた。続いて、アデノウイルス試料の連続希釈を調製し、得られた希釈物のウェルあたり５０μｌを細胞の感染に用いた。プレートを３７℃で４２時間インキュベートした。感染の後、細胞をメタノールで固定し、一次抗ヘキソンタンパク質抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）とインキュベートし、続いて一次抗体に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗マウス抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）とインキュベートし、ジアミノベンジジン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＫＧ、Ｇｒａｆｒａｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とのＨＲＰ酵素反応を行った。褐色の着色は感染細胞を示す。顕微鏡下で褐色に着色した細胞を計数することによって、感染細胞の数を定量した。それぞれの感染細胞は１個の感染性ウイルス粒子として計数される。
【０１６７】
１．１．３  動的光散乱（ＤＬＳ）測定
−８０℃で保存したアデノウイルスストック溶液のアリコートに対応する未処理の陽性対照と比較した、再緩衝化直後でフリーズドライ前に採取した試料、ならびにアデノウイルスベクター製剤の再構成の後の試料について、ＤＬＳを行った。後者の場合、ＤＬＳはフリーズドライの直後（ｔ＝０）または２５℃（２１日、４２日）および４０℃（７日、２８日）での保存の関連する時点で行った。
【０１６８】
この目的のため、試料５μｌを特別のＤＬＳキュベットにピペットで入れ、ＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ  ＤＬＳ装置（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｄｅｒｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。それぞれの実験製剤について、同じ条件でブランク測定を行った。ＤＬＳ測定は１０または２０サイクルで、２０〜４０秒の取得時間で行った。得られた相関曲線を、ＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアで解析した。
【０１６９】
１．１．４  透過型電子顕微鏡法
アデノウイルスベクター調製物を希釈した後、組成物１および２ならびにもとの供給元の製剤およびＰＢＳ中でフリーズドライすることによって製剤化した。ＥＭ画像はＶｉｒｏｎｏｖａ（Ｓｗｅｄｅｎ）によって獲得した。フリーズドライしたベクターの再構成後、試料３μｌを、適した親水化ＥＭグリッド（例えば、連続炭素）上に適用して、水で洗浄し、２％酢酸ウラニルを使用して陰性染色した。グリッドを、１００ｋＶの加速電圧で作動させるＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  Ｂｉｏｔｗｉｎ電子顕微鏡を使用して撮像した。低倍率および高倍率画像はいずれも代表的な領域で獲得した。陽性対照の場合、もとの供給元の製剤緩衝液中の非希釈凍結保存試料（−８０℃）３μｌをグリッドに適用した。
【０１７０】
１．２  結果
興味あることに、アデノウイルスベクター調製物を本発明の溶液（組成物１または組成物２）と混合した直後のＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価によって、もとのストック溶液中の未処理のアデノウイルス粒子の水力学的半径（図１Ａ）と比較して、アデノウイルスベクターの水力学的半径の完全な保持（図１Ｂおよび図１Ｃ）が示唆された。フリーズドライの前の試料の調製プロセスの間の、もとの供給元の製剤またはＰＢＳによる希釈によるアデノウイルスストック溶液の同様の混合によって既に、未処理のアデノウイルスベクター（図１Ａ）と比較して、アデノウイルスベクターの測定された水力学的半径の顕著な増大が生じた（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０１７１】
フリーズドライ後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性アッセイにより、フリーズドライ生物医薬製品の産生プロセスにおける初期の安定化組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の製剤化が、図１において破線として表す陽性対照の感染タイターに対応する感染タイターをもたらすことが明らかとなった。したがって、フリーズドライ後の感染タイターの完全な保持が観察された。対照的に、もとの供給元の製剤中で再緩衝化したアデノウイルスベクターをフリーズドライした場合には、感染タイターの顕著な喪失が観察され、ＰＢＳ中でのフリーズドライでは対応する感染タイターは完全に喪失された（図３）。
【０１７２】
乾燥された製品を再構成した後のアデノウイルス調製物のインビトロ感染性の結果は、動的光散乱実験による水力学的半径の並行した測定の結果とよく一致した。早期相ダウンスケールステップと後続のフリーズドライの間で既に、アデノウイルスベクター調製物と本発明の組成物１および２との組合せにより、ウイルス粒子の水力学的半径の完全な保持が得られた（実施例１、図４Ａおよび４Ｂ）。対照的に、もとの供給元の製剤中での対応するアデノウイルスベクター調製物のフリーズドライでは、粒径の増大が生じた（実施例１、図５Ａ）。一般的なリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）と組み合わせた同様の試料調製手順では、フリーズドライ後で既に、粒径の大きな増大（実施例１、図５Ｂ）および顕著な量の高次凝集物の形成が生じた。
【０１７３】
これらの相違はフリーズドライ調製物の保存後で、より顕著であった。もとの供給元の製剤中でフリーズドライしたウイルスベクターの完全な機能の喪失（図６）が観察され、ＰＢＳ中で得られた結果と同様であった。対照的に、２５℃または４０℃での保存後でも、製造プロセスの早期に安定化組成物１および２の中で製剤化したフリーズドライアデノウイルスベクター組成物は、陽性対照、すなわちフリーズドライ前のアデノウイルスベクター（図６のダイアグラムに破線で示す）とほぼ同じウイルス活性を保持していた。
【０１７４】
インビトロ感染性実験のこれらの結果は、並行して行ったＤＬＳ実験とよく対応している。例として、本発明の組成物１および２の中での、またはもとの供給元の製剤およびＰＢＳの中での、乾燥されたアデノウイルスベクター組成物の保存後の記録されたＤＬＳ相関関数の評価を、それぞれ４０℃、１４日の保存後、図７および図８に示した。安定化組成物１および２の中での乾燥されたアデノウイルスベクター調製物の保存によって、もとの供給元の製剤中およびＰＢＳ中で保存されたアデノウイルス粒子（実施例１、図８Ａおよび図８Ｂ）とは対照的に、アデノウイルス粒子の測定された水力学的半径の保持が得られた（実施例１、図７Ａおよび図７Ｂ）。
【０１７５】
フリーズドライしたアデノウイルス調製物を再構成し、電子顕微鏡分析を使用してさらに特徴を調べた。この分析は、本発明に従って、アデノウイルスベクターを、少なくとも１：２の列挙された少なくとも３つの賦形剤と糖との比で組み合わせると、乾燥したアデノウイルスベクター製剤の優れた安定性を提供することをさらに実証し、同様に先に詳述した感染性およびＤＬＳ結果を確認した。
【０１７６】
組成物１および２における対応するアデノウイルス調製物の電子顕微鏡画像（図１４および１５）は、比較的均一に分布したアデノウイルス粒子を示し、アデノウイルス粒子の大部分は、直径およそ１００ｎｍの正二十面体形状の明るい無傷の粒子（黒色の矢印）として見える。少数のより濃く染色されたあまり明白でない正二十面体形状の粒子が観察され（白色の矢印）、これはおそらく部分的に脱安定化されたビリオンを表す。小さい明るく染色された構造（白い矢印の先）が、グリッドの背景に存在するが、組成物１ではデブリまたはアデノウイルスサブユニットの有意な存在は観察されなかった（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。組成物２では、背景は非常に滑らかに見え、デブリはまたはアデノウイルスサブユニットの有意な存在は認められなかった（図１５）。組成物１および２において製剤化したアデノウイルス調製物では、アデノウイルス粒子は、単一の正二十面体形状の明るい無傷の実体として主に見え、アデノウイルス粒子の凝集体またはデブリは観察されなかった。これに対し、もとの供給元の製剤（図１７）またはＰＢＳ（図１６）でのフリーズドライ後のアデノウイルスベクターの分析では、無傷のアデノウイルス粒子が観察されないことが示された。おそらくヘキソン構造を表す小さいリング状構造（黒色の矢印の先）が、時にグリッド（黒色の矢印の先；図１６Ｃおよび１７Ｄ）上に、いずれも遊離の実体としておよびデブリの小さいクラスタ（黒色の矢印；図１６Ａおよび１７ＡおよびＢ）または球状の明るく染色された構造（図１６Ｄおよび１７Ｄ）に結合した状態の両方として観察された。ＰＢＳにおける対応するアデノウイルス調製物では、デブリを含む少数のより大きい凝集体が観察された（図１６Ｂ）。
【０１７７】
比較のために、図１８は、標準的な緩衝液において−８０℃で保存した顕著に高濃度の陽性対照の電子顕微鏡解析を示す。アデノウイルス粒子は、正二十面体形状の明るい無傷の粒子（図１８Ａ；黒色の矢印）として、およびおそらく部分的に分解した粒子を表す少数のより濃く染色されたあまり明白でない正二十面体形状の粒子（図１８Ａ、ＢおよびＣ；白色の矢印）の両方として観察された。アデノウイルス粒子の直径は、およそ１００ｎｍ（頂点から頂点）であると測定された。背景は、デブリ（Ｂ；黒色の破線の矢印）、線維構造（図１８Ｃ；白色の破線の矢印）、および小さいリング状構造（Ｃ；黒色の矢印の先）が主に単一の実体として、およびごくまれにクラスタとして存在することを示しており、おそらくヘキソン構造（図１８Ｃ；挿入図）を表す。アデノウイルス粒子は、単一の実体としておよび小さいクラスタの両方で認められた。アデノウイルスおよびデブリを含む１つのより大きい凝集体が観察された（図１８Ｄ）。陽性対照は、２×１０１１ＩＵ／ｍｌの感染タイターを含む−８０℃で保存した標準的な緩衝液中のアデノウイルス組成物について測定したことに注意すべきである。これに対し、図１４〜１７のＥＭ画像によるフリーズドライおよび再構成したアデノウイルス調製物の感染タイターは、およそ１×１０８ＩＵ／ｍｌであった。
【０１７８】
実施例２
凍結解凍ストレス後の異なったアデノウイルスベクター調製物の機能的および構造的完全性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、アミノ酸および糖を含む組成物が、凍結解凍サイクルの際にウイルスベクターを安定化させることを示した。
【０１７９】
２．１  材料および方法
２．１．１  試料調製およびさらなる処理
ｅＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡを含むアデノウイルスタイプ５ベクターの高タイターのアデノウイルスベクターストック。５×１０８個のＨＥＫ２９３細胞にアデノウイルス粒子を導入した。導入の４８時間後に細胞を収穫し、Ｎａ−ＤｅｏｘｙｃｈｏｌａｔおよびＤＮａｓｅ  Ｉ処理によってウイルス粒子の放出を行った。ＣｓＣｌ勾配超遠心および通常それに続くＰＤ１０カラム上のもとの供給元の製剤による緩衝液交換によってウイルス粒子を精製し、続いて感染タイターを測定した。得られた高タイターのアデノウイルスストックを続いて分注し、−８０℃で保存した。
【０１８０】
試料調製−プロセスステップ１：ＣｓＣｌ勾配超遠心の直後にアデノウイルスベクター調製物を再緩衝化することによって、アデノウイルスベクター製剤を調製した。得られたアデノウイルスベクターバンドを収穫し、組成物１または２のいずれかで（１．１に記載したように）２〜８℃で透析した。得られた製剤を分注し、−８０℃で保存した。
【０１８１】
試料調製−プロセスステップ２：凍結された（−８０℃）アデノウイルスストック溶液（７．５×１０１０ＩＦＵ／ｍｌ、Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をもとの供給元緩衝液中で解凍し（室温、ＲＴ）、続いて組成物１および２の中で、２〜８℃で透析した。
【０１８２】
２．１．２  プロセスステップ１およびステップ２の調製物からのアデノウイルス試料の繰り返し凍結解凍サイクル
後続のストレス条件の間のアデノウイルスベクター調製物の安定性を解析するため、組成物１または２の中で製剤化したアデノウイルスベクター５０μｌを繰り返し凍結（−８０℃）解凍（ＲＴ）サイクルに供した。ＨＥＫ２９３細胞培養（１．１．２に記載）におけるウイルス滴定により、初期時点ｔ＝０ならびに５回および１０回の凍結解凍サイクルの後で、インビトロ感染性（１．１．２に記載）を測定した。並行して、アデノウイルス粒子の水力学的半径をＤＬＳ（１．１．３に記載）によって測定した。
【０１８３】
２．２  結果
インビトロ感染性アッセイにより、陽性対照（図９の破線）と比較して、組成物１はプロセスステップ１とステップ２の両方のアデノウイルスベクター調製物の感染タイターを完全に保持していることが明らかになった（図９）。超遠心ステップの直後（プロセスステップ１）の組成物２の中におけるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化も、アデノウイルスベクター調製物の感染性を完全に保持していた。興味あることに、プロセスステップ２の後で用いた組成物２は、初期タイターのほぼ２ログレベルの喪失を生じた（図９）。
【０１８４】
さらなる凍結解凍サイクル（５回および１０回）に際して、生産プロセスステップおよび再緩衝化の時点に関わらず、組成物１は完全な感染タイターを保持していた（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。対照的に、２つの異なったプロセスステップ１および２で調製した場合、組成物２は全く異なった効果を生じた。プロセスステップ２によって得られた組成物２の試料の感染タイターは、５回の凍結解凍サイクルの後で顕著に低減し、１０回のサイクルの後ではさらに大きく低減した（図１１Ｂ）。アデノウイルスベクターを早期のプロセスステップ１で組成物２の中で製剤化した場合には、５回の凍結解凍サイクルの後で僅かなタイターの喪失が観察された。１０回の凍結解凍サイクルではより大きな低減が生じたが、プロセスステップ２における調製と比較して僅かな程度であった（図１１Ａ）。
【０１８５】
繰り返し凍結解凍サイクルの前後の感染タイターの測定と並行して、対応するアデノウイルス粒子の水力学的半径を動的光散乱（ＤＬＳ）によって解析した（図１０、図１２および図１３）。超遠心による精製ステップの直後のアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化（調製ステップ１）によって、両方の組成物においてウイルス粒子の水力学的半径の完全な保持が得られ（図１０Ａおよび図１０Ｂ）、対応するインビトロ感染性の完全な保持が確認された（図９）。組成物１の場合には、プロセスステップ２によってアデノウイルスベクター調製物を再緩衝化した後に水力学的粒子半径の僅かな増大が観察され（図１０Ｃ）、これは図９に示す感染性の結果と一致している。対照的に、処理ステップ２に対応する組成物２の中のアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化によって、高次凝集物の形成を伴うアデノウイルス粒子の水力学的半径の顕著な増大が生じ（図１０Ｄ）、これはインビトロ感染性試験における機能の喪失（図９）を説明するものであろう。
【０１８６】
５回および１０回の繰り返し凍結解凍サイクルの後、特に組成物２におけるウイルス粒子の水力学的半径の変化をＤＬＳによって測定した。プロセスステップ１および２で調製した場合、組成物１では顕著な増大は観察されなかった。例として、５回および１０回の凍結解凍サイクルの適用後の組成物１の中におけるアデノウイルス粒子のサイズについてのＤＬＳの結果を図１２に示す。プロセスステップ１で組成物２を用いた場合、５回の凍結解凍サイクルの後で既に高次凝集物の形成を伴って水力学的半径が顕著に増大し、１０回の凍結解凍サイクルの後、およびプロセスステップ２で用いた場合には、半径のさらなる増大とＤＳＬ測定限界外の高次凝集物のために測定できなかった（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。５回の凍結解凍サイクルの適用の後の、プロセスステップ１および２のいずれかで調製した組成物１および２におけるアデノウイルス粒子サイズの挙動を図１３Ａ〜図１３Ｄに示す。
【０１８７】
要旨および結論として、組成物１は一般に、適用された両方の早期生産ステップにおいてアデノウイルスベクター粒子に対して優れた安定化効果を示した。対照的に、組成物２は超遠心直後に用いた場合には安定化効果を示したが、生産プロセスの後の方で用いた場合には組成物１と比較して低減した安定化効果が観察された。
【０１８８】
ＤＬＳデータは、実施例１で示されたインビトロ感染性データと相関している。これにより、ウイルスベクター組成物の生産プロセスの早期にアミノ酸に基づいて特に調整された安定化組成物を用いることが、生物医薬製造のさらなる処理ステップの間の安定性に重要であることが結論される。さらに、溶液の多分散性の低減の観点からのウイルスベクター系組成物の安定化により、高いインビトロ感染性を有する溶液が得られる。
【０１８９】
実施例３
２５℃および３７℃で液体保存後のアデノウイルスベクターの機能的および構造的完全性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、少なくとも３つ、４つ、および／または５つの賦形剤、好ましくはアミノ酸を糖、例えばスクロースと組み合わせて少なくとも１：２のアミノ酸と糖との比で含むアミノ酸ベースの組成物が、細胞培養においてウイルスベクターの感染性を顕著に保持できること、および０．３未満の多分散度指数値で粒度分布を保持できることが示された。
【０１９０】
３．１  材料および方法
組成物３、４、５、および６はそれぞれ、以下の３つのアミノ酸を含んだ：
・ヒスチジン、グルタミン酸、メチオニン（組成物３）、
・ヒスチジン、リジン、メチオニン（組成物４）、
・ヒスチジン、グリシン、メチオニン（組成物５）、および
・ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸（組成物６）。
組成物７および８はそれぞれ、以下の４つのアミノ酸を含んだ：
・ヒスチジン、リジン、グリシン、アルギニン（組成物７）、および
・ヒスチジン、リジン、アラニン、メチオニン（組成物８）。
組成物９は、５つのアミノ酸、ヒスチジン、グリシン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンを含んだ。
【０１９１】
組成物は全て、さらに４０ｇ／ｌサッカロースおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を固定濃度で含み、組成物３、４、５、および６の場合についてそれぞれ、１：３；１：１．３；１：１．６および１：１．５の異なったアミノ酸と糖との比をもたらした。組成物７および８の場合、アミノ酸と糖との比は両方の組成物において１．１：１であった。組成物９では、アミノ酸と糖との比を１：１．５に調節した。ｐＨ値は、全ての組成物において７．４に調節した。
【０１９２】
もとの供給元の製剤において１×１０１１ＩＦＵ／ｍｌの濃度で、−８０℃で保存したアデノウイルスストック溶液（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ；Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。もとの供給元の製剤は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、４ｇ／ｌサッカロースおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。
３．１．１  試料の調製および液体保存
【０１９３】
ＨＥＫ２９３細胞に、ｅＧＦＰタンパク質のコードＤＮＡを含む高タイターのアデノウイルス５型ベクターを形質導入した。形質導入の４８時間後、細胞を収穫して、ウイルス粒子の放出を行い、デオキシコール酸ナトリウムおよびＤＮアーゼＩ処置を介して放出した。ウイルス粒子を精製し、ＣｓＣｌ勾配超遠心によって濃縮した後、ＰＤ１０カラムにおいてもとの供給元の製剤に緩衝液交換を行い、その後感染タイターを決定した。得られた高タイターアデノウイルスストックを次に分注し、−８０℃で保存した。もとの供給元の製剤におけるアデノウイルスストック溶液の初回タイターは、２×１０１１ＩＦＵ／ｍｌであると決定された。アデノウイルスベクターストック溶液を、上記の段落３．１節に従って組成物の塩基構成要素を含む保存液において５×１０８ＩＦＵ／ｍｌの濃度に希釈することによって再緩衝化し、次に上記の段落３．１節による組成物の１．２５×濃縮物を使用して１×１０８ＩＦＵ／ｍｌの最終試料濃度にさらに希釈し、後続の液体保存のためのアデノウイルスベクター製剤を得た。アデノウイルスベクター製剤５０μｌを、滅菌１００μｌのＰＣＲバイアルに分注した後、それぞれ、５℃ならびに２５℃で最大３カ月、および３７℃で最大３５日間保存した。液体保存の際の表記の時点ならびに最初の時点ｔ＝０で、感染タイターを、上記の段落１．１．２節に詳述される方法に従ってＨＥＫ２９３細胞培養におけるウイルスタイター決定によって決定した。同時に、アデノウイルス粒子の流体力学的半径および対応する多分散度指数を、以下のように僅かに異なったプロトコールを使用して上記の段落１．１．３節に記載の方法に従ってＤＬＳによって測定した。ＤＬＳ測定は、濾過滅菌水（０．０２ｎｍ）によって、アデノウイルスベクターの適した濃度に希釈したアデノウイルスベクター調製物１０μｌについて実施し、獲得時間はそれぞれ８０および４０サイクルで１〜３秒間であった。得られた自己相関関数を、ＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアを使用して解析し、流体力学的半径（ｎｍ）ならびに多分散度指数（ＰＤＩ）に関する粒度分布の評価を得た。本発明による組成物の特別な成分は、分析したアデノウイルス粒子について得られた自己相関関数に寄与した。このため、得られた自己相関関数とウイルスベクターを有しない組成物との差によって、ＤＬＳ測定の計算結果が得られた。
電子顕微鏡分析を、上記の段落１．１．４に記載のように実施した。
【０１９４】
３．２結果
液体保存
３つ、４つ、および／または５つのアミノ酸を含む、本発明による組成物３〜９において５℃で３カ月間の液体保存（上記の段落３．１節を参照）により、陽性対照と比較して約１×１０８ＩＦＵ／ｍｌの感染タイターの完全な保持が明らかとなった（図１９Ａ）。これに対し、もとの供給元の製剤におけるアデノウイルス粒子の感染タイターは、５℃で３カ月間の液体保存後におよそ１×１０６ＩＦＵ／ｍｌへと顕著に低減した（図１９Ａ）。その上、２５℃でもとの供給元の製剤におけるアデノウイルスベクター粒子の液体保存では、２１日間の液体保存後で既に感染タイターの約１×１０６ＩＦＵ／ｍｌへの低減をもたらし、１カ月間の液体保存後では、感染タイターはさらに低減し、１カ月間の液体保存後では約１×１０５ＩＦＵ／ｍｌへとさらに低減した。もとの供給元の製剤における２５℃で３カ月間のさらなる液体保存は、アデノウイルス粒子の感染タイターの完全な喪失をもたらした（図１９Ｂ）。他方で、３つ、４つ、および／または５つのアミノ酸をそれぞれ含む組成物３〜９におけるアデノウイルス粒子の製剤は、２５℃で３カ月間の液体保存後であっても、アデノウイルスベクター調製物の感染タイターのほぼ完全な保持をもたらした（およそ１×１０７ＩＦＵ／ｍｌ；図１９Ｂ）。３７℃で２１日間の液体保存後であっても、３つおよび／または４つのアミノ酸を含む組成物４および８において製剤化したアデノウイルスベクター粒子の感染タイターは顕著に保持され、３７℃で２１日間の液体保存の際のもとの供給元の製剤における感染タイターの完全な喪失と比較して、残留タイターは約１×１０６ＩＦＵ／ｍｌであった。３７℃で３５日間のさらなる液体保存により、組成物４において感染タイターの喪失が起こったが、４つのアミノ酸を含む組成物８では、アデノウイルスベクターの対応するタイターは約１×１０５ＩＦＵ／ｍｌに保持された（図１９Ｃ）。
【０１９５】
ＤＬＳ測定
３７℃で１４日〜約３５日間の液体保存の際のアデノウイルスベクター組成物の分子完全性を、ＤＬＳ測定を使用して分析した。アデノウイルス粒子の流体力学的半径の評価に加えて、多分散度指数（ＰＤＩ）ならびにアデノウイルス粒子組成物中の粒度分布のパラメータとしてＤ１０、Ｄ５０、およびＤ９０の値を決定した。図１５では、３５℃で１４日間および３５日間の液体保存後のもとの供給元の製剤における対応するＰＤＩ値と比較した、組成物６、８、および９において製剤化したアデノウイルスベクターのＰＤＩ値を示す。もとの供給元の製剤において製剤化したアデノウイルスベクター組成物の時点ｔ＝０での最初のＰＤＩ値は、組成物６、８、および９における対応するＰＤＩ値と比較して強い標準偏差に関連して既に顕著に増加した（ＰＤＩおよそ０．２５）。これらの知見は、時点ｔ＝０で狭い粒度分布（ＰＤＩおよそ０．１）を有する組成物６、８および９中のアデノウイルス粒子と比較して、もとの供給元の製剤にサイズの変動を有する大きい粒子が出現したことを示唆している。３５℃で１４日間保存後、粒度分布は、組成物６、８、および９では僅かに異なった程度に増加したが、もとの供給元の製剤では０．１および０．２の値の間に留まった。もとの供給元の製剤において、粒度分布は、３７℃で１４日間の液体保存後に僅かに減少した。３７℃で３５日間の液体保存後、ＰＤＩ値は、全ての製剤においてさらに増加し、特にもとの供給元の製剤では、大きい標準偏差に関連しておよそ０．２６のＰＤＩ値に増加し、このことは多様なサイズを有する大きい粒子の出現を示唆した。組成物６および８では、ＰＤＩ値に対応する粒度分布もまた増加したが、もとの供給元の製剤と比較して軽微な程度であり、すなわち組成物６の場合、ＰＤＩは０．２３４であり、組成物８の場合、ＰＤＩは０．１７１であった。もとの供給元の製剤における大きい標準偏差およびＰＤＩの顕著な増加は、粒度が変わりやすい大きい粒子が出現した結果として、３７℃で３５日間の液体保存後のこの製剤における感染性の喪失を説明し得る。これに対し、４つのアミノ酸を含む組成物８におけるアデノウイルスベクターの液体保存は、標準偏差が小さいＰＤＩ値０．１７１の保持をもたらし、測定された粒子の大部分の出現が、狭い粒度分布に関連する感染性粒子を表すことを示唆している（図１９Ｄ）。
【０１９６】
透過型電子顕微鏡法
加えて、２５℃で２カ月間液体保存後の組成物５および８において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の分子完全性を、上記の段落１．１．４節に記載する透過型電子顕微鏡法を使用してさらに分析した。獲得した電子顕微鏡画像において、アデノウイルス粒子の大部分は、無傷の正二十面体形状の明るい粒子として観察された（図２０および２１；黒色の矢印）。アデノウイルス粒子の直径は、頂点から頂点までおよそ１００ｎｍであると測定された。アデノウイルス粒子は、単一の実体として優先的に見えた。それにもかかわらず、背景は、大きい多型構造および小さい顆粒構造などのアデノウイルスベクターデブリの存在を示し、これはおそらく、ヘキソンおよび線維などのアデノウイルスの下位構成要素を表す。時に、アデノウイルス粒子の凝集体およびデブリを観察することができた（図２０および２１）。
【０１９７】
実施例４
３７℃で液体保存の際の表記の時点でのアデノウイルスベクター組成物の感染タイターの解析により、もとの供給元の製剤と比較して本発明による４つのアミノ酸を含む組成物のより良好な安定化有効性が明らかとなった。
【０１９８】
４．１  材料および方法
本実施例に使用した組成物１１は、４つのアミノ酸、ヒスチジン、リジン、アラニン、メチオニンを４０ｇ／ｌサッカロースと組み合わせて、アミノ酸と糖との比が１．１：１となるように含んだ。製剤のｐＨ値を７．４に調節した。比較のために、１．５２２ｇ／ｌヒスチジン、５０ｇ／ｌサッカロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，、１．２１１ｇ／ｌ  Ｔｒｉｓ、４．３８３ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．０２９ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）エタノールおよび０．２％ポリソルベート８０を含むｐＨ７．４の標準的なもとの供給元の製剤２を適用した。
【０１９９】
もとの供給元の製剤において−８０℃で保存した２×１０１１ＩＦＵ／ｍｌの濃度のアデノウイルス血清５型（Ａｄ５）ストック溶液（Ｓｉｒｉｏｎ；Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。もとの供給元の製剤は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、４ｇ／ｌサッカロース、および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。
４．１．１試料の調製および液体保存
【０２００】
ＨＥＫ２９３細胞に、ｅＧＦＰタンパク質のコードＤＮＡを含む高タイターのアデノウイルス５型ベクターを形質導入した。形質導入の４８時間後、細胞を収穫して、ウイルス粒子を、デオキシコール酸ナトリウムおよびＤＮアーゼＩ処置を介して放出した。ウイルス粒子を精製し、ＣｓＣｌ勾配超遠心によって濃縮した後、ＰＤ１０カラムにおいてもとの供給元の製剤に緩衝液交換を行い、その後感染タイターを決定した。得られた高タイターアデノウイルスストックを次に分注し、−８０℃で保存した。もとの供給元の製剤におけるアデノウイルス保存溶液の初回タイターは、２×１０１１ＩＦＵ／ｍｌであると決定された。第１のステップにおいて、初回感染度２×１０１１ＩＦＵ／ｍｌを有するアデノウイルスストック溶液を、もとの供給元の製剤によって１：２に希釈し、開始濃度１×１０１１ＩＦＵ／ｍｌを得た。アデノウイルスベクターストック溶液を、上記の４．１節による組成物の塩基構成要素を含むストック溶液中で５×１０８ＩＦＵ／ｍｌの濃度に１／２００希釈することによって再緩衝化し、次に上記の４．１節による組成物の１．２５×濃縮物によってさらに１：５希釈し、後続の液体保存のための最終試料濃度１×１０８ＩＦＵ／ｍｌを得た。アデノウイルスベクター製剤５０μｌを、滅菌１００μｌ  ＰＣＲバイアルに分注した後、３７℃で最大２１日間保存した。上記の１．１．２節による感染タイターを、液体保存の際の表記の時点ならびに最初の時点ｔ＝０でＨＥＫ２９３細胞培養におけるウイルスタイター決定によって決定した。
【０２０１】
４．２  結果
液体保存
４つのアミノ酸を含む組成物１１において製剤化したアデノウイルスベクターの液体保存は、３７℃で１４日間の液体保存後の感染タイターの良好な保持をもたらし、標準的なもとの供給元の製剤２と比較すると３７℃で２１日間の液体保存後ではより明白であった（図２２）。このデータは、最も有効な安定化組成物が同様に４つのアミノ酸ヒスチジン、リジン、アラニン、メチオニンを、４０ｇ／ｌサッカロースと組み合わせて１．１：１のアミノ酸と糖との比で含む（組成物８）という上記の実施例３の結果をさらに確認した。したがって、４０ｇ／ｌサッカロースと組み合わせた４つのアミノ酸ヒスチジン、リジン、アラニン、メチオニンの組合せと、１．１：１のアミノ酸と糖との比により、熱ストレスおよび液体保存の際に、４．１節に記載したように標準的な製剤に対してアデノウイルスベクター粒子の優れた安定化が示された。
【０２０２】
実施例５
異なったプロセスステップおよび後続の数回の凍結解凍サイクルの適用後、ならびに３７℃での液体保存の際のアデノウイルスベクターの機能的および構造的完全性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験から、少なくとも３つ、４つ、および５つの賦形剤、好ましくはアミノ酸を、糖、例えばスクロースと組み合わせて少なくとも１：２のアミノ酸と糖との比で含むアミノ酸ベースの組成物が、細胞培養においてウイルスベクターの感染性を顕著に保持し、０．３未満の多分散度指数値で粒度分布を保持することが示された。
【０２０３】
５．１  材料および方法
組成物１１は、３つのアミノ酸、アラニン、ヒスチジン、グルタミン酸を４０ｇ／ｌサッカロースと組み合わせて１：１．５のアミノ酸と糖との比で含んだ。本実施例に使用した組成物１２は、４つのアミノ酸、ヒスチジン、リジン、アラニン、メチオニンを４０ｇ／ｌサッカロースと組み合わせて１．１：１のアミノ酸と糖との比で含んだ。製剤のｐＨ値を７．４に調節した。比較のために、１．５２２ｇ／ｌヒスチジン、５０ｇ／ｌサッカロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２１１ｇ／ｌ  Ｔｒｉｓ、４．３８３ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．０２９ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）エタノールおよび０．２％ポリソルベート８０を含むｐＨ  ７．４の標準的なもとの供給元の製剤２、ならびに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、４ｇ／ｌサッカロース、および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む別の標準的なもとの供給元の製剤１、ならびに標準的な緩衝液ＰＢＳを適用した。
【０２０４】
もとの供給元の製剤において−８０℃で保存した２×１０１１ＩＦＵ／ｍｌの濃度のアデノウイルス血清５型（Ａｄ５）ストック溶液（Ｓｉｒｉｏｎ；Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。もとの供給元の製剤は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、４ｇ／ｌサッカロース、および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ９）中の修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターを、凍結解凍実験および後続のＤＬＳ解析のために使用した。
【０２０５】
５．１．１  試料の調製および液体保存
ＨＥＫ２９３細胞に、ｅＧＦＰタンパク質のコードＤＮＡを含む高タイターのアデノウイルス５ベクターを形質導入した。形質導入の４８時間後、細胞を収穫して、ウイルス粒子の放出を、デオキシコール酸ナトリウムおよびＤＮアーゼＩ処置を介して実施した。ウイルス粒子を精製し、ＣｓＣｌ勾配超遠心によって濃縮した。アデノウイルスベクター粒子のさらなる製剤化を、以下の２つの異なったプロセスステップで実施した。
プロセスステップ１：アデノウイルスベクター製剤を、ＣｓＣｌ勾配超遠心の直後にアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化によって調製した。第１のステップにおいて、得られた濃縮および収穫されたアデノウイルスベクターバンドを標準的なもとの供給元の製剤１中で１：１に希釈し、本発明による組成物１１および１２（５．１に記載する）ならびに標準的なもとの供給元の製剤１および２、ならびに標準的な緩衝液ＰＢＳ中での２〜８℃での透析を使用して再緩衝化した。
プロセスステップ２：超遠心後、得られた濃縮および収穫されたアデノウイルスベクターバンドを標準的なもとの供給元の製剤１中で１：１に希釈し、標準的なもとの供給元の製剤１中での２〜８℃での透析を使用して再緩衝化した。得られた高タイターのアデノウイルスストックを次に分注して、−８０℃で保存した。解凍後、標準的なもとの供給元の製剤１中のアデノウイルスベクターを、本発明による組成物１１（段落５．１に記載）および標準的な緩衝液ＰＢＳ中での２〜８℃での２回目の透析を使用して再緩衝化した。
【０２０６】
標準的なもとの供給元の製剤３および１ならびに両方のプロセスステップ後の本発明による組成物におけるアデノウイルスストック溶液の初回タイターは、約１×１０１１ＩＦＵ／ｍｌであると決定された。数回の凍結解凍サイクルをその後に適用するために、高タイターアデノウイルスベクター製剤５０μｌを滅菌１００μｌのＰＣＲバイアルにおいて分注し、繰り返し凍結（−８０℃で１時間）および解凍（室温で１時間）サイクルに供した。時点ｔ＝０、ならびに５、１０、１５、および２０回の凍結解凍サイクルの適用後、感染タイターを、段落１．１．２によるＨＥＫ２９３細胞培養におけるウイルス滴定によって決定した。同時に、アデノウイルス粒子の流体力学的半径および対応する多分散度指数を、段落３．１．１による僅かに異なったプロトコールを使用して段落１．１．３に従ってＤＬＳによって測定した。
【０２０７】
後続の３７℃での液体保存に関して、異なった製剤中の高タイターアデノウイルスストック溶液を、感染タイターがおよそ１×１０８ＩＦＵ／ｍｌとなるようにさらに希釈した。希釈したアデノウイルスベクター製剤５０μｌを、滅菌１００μｌのＰＣＲバイアルにおいて分注し、その後３７℃で最大２８日間保存した。最初の時点ｔ＝０ならびに３７℃で１４日間および２８日間液体保存後、段落１．１．２によるＨＥＫ２９３細胞培養におけるウイルス滴定によって感染タイターを決定した。同時に、アデノウイルス粒子の流体力学的半径および対応する多分散度指数を、段落３．１．１による僅かに異なったプロトコールを使用して段落１．１．３に従ってＤＬＳによって測定した。
【０２０８】
ＭＶＡ製剤に関して、３つのアミノ酸ヒスチジン、メチオニン、アラニンを含む組成物１３を使用した。次に凍結解凍サイクルを適用して、試料をＤＬＳによって分析した。
【０２０９】
５．２  結果
液体保存
図２３において、２つの異なったプロセスステップ（ＰＳ）後のアデノウイルス調製物の、３７℃で最大２８日間の液体保存の際のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性を表す。組成物１２および１１中のアデノウイルスベクターの製剤は、プロセスステップ１（ＰＳ１）によって調製した場合、標準的な緩衝液ＰＢＳと比較して３７℃で液体保存の際の感染タイターの顕著に高い保持を示し、これは２つの標準的なもとの供給元の製剤２および１と同等に維持された。プロセスステップ２（ＰＳ２）によるアデノウイルスベクター製剤の調製物は、標準的な緩衝液ＰＢＳ中の製剤と比較して、およびプロセスステップ（ＰＳ１）によって調製したもとの供給元の製剤中のアデノウイルスベクター調製物と比較しても、３７℃で２８日間の液体保存の際の組成物１１中で製剤化したアデノウイルスベクターの感染タイターのより高い安定化を示した。
【０２１０】
数回の凍結解凍サイクルの適用後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性
プロセスステップ１（ＰＳ１）に従って組成物１１および１２中で調製したアデノウイルスベクター調製物の製剤は、もとの供給元の製剤２および１と比較して、特に１５回の凍結解凍サイクルの適用後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性の顕著な維持を示した（図２４Ａ）。これに対し、標準的な緩衝液ＰＢＳ中でのアデノウイルスベクター調製物の製剤は、プロセスステップ１（ＰＳ１）後で既に感染タイターの完全な喪失をもたらした（図２４Ａ）。その上、プロセスステップ２による組成物１１中のアデノウイルスベクター調製物の製剤は、最大１０回の凍結解凍サイクルの適用後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性のほぼ完全な保持を示した（図２０Ｂ）。これに対し、プロセスステップ２による標準的な緩衝液ＰＢＳ中のアデノウイルスベクター調製物の製剤は、５回の凍結解凍サイクルの適用後で既に感染性の完全な喪失をもたらした（図２４Ｂ）。
【０２１１】
ＤＬＳ測定
類似の観察を、同時に実施したＤＬＳ測定においても行った。プロセスステップ１（ＰＳ１）による試料調製は、組成物１１および１２ならびにもとの供給元の製剤１において、０．３より小さい多分散度指数の計算値で表される試料調製直後（０）のアデノウイルスベクター調製物中の粒度分布のほぼ完全な保持をもたらした。これに対し、プロセスステップ１（ＰＳ１）による標準的な緩衝液ＰＢＳ中のアデノウイルスベクター調製物の製剤は、調製後で既に＞０．３の多分散度指数を有する高い粒度分布を示し、これは僅か５回の凍結解凍サイクルの適用後で明白であった。１０回および２０回の凍結解凍サイクルのさらなる適用後では、製剤化されたＰＢＳ中のウイルス粒子の完全な分解をもたらした。本発明による組成物１１および１２中で製剤化したアデノウイルスベクター調製物に５、１０、および２０回の凍結解凍サイクルをさらに適用しても、初回粒度分布は＜０．３であり、ほぼ完全に保持された。これに対し、もとの供給元の製剤１中のアデノウイルスベクター調製物の製剤は、１０回ならびに２０回の凍結解凍サイクルの適用後に増加した標準偏差に関連するＰＤＩ＞０．３の顕著な増加をもたらし、主なアデノウイルスベクター粒子に加えて多様なサイズを有するより大きい粒子の出現を示唆した（図２５）。
【０２１２】
プロセスステップ２による試料調製（ＰＳ２）は、本発明による組成物１１および１２において製剤化したアデノウイルスベクター調製物の場合、５、１０、１５、および２０回の凍結解凍サイクルの適用後に粒度分布（ＰＤＩ＜０．３）が保持されることを明らかにした。これに対し、プロセスステップ２（ＰＳ２）による標準的な緩衝液ＰＢＳ中のアデノウイルスベクターの製剤は、１０、１５、および２０回の凍結解凍サイクルの適用後に無傷のアデノウイルス粒子の完全な喪失をもたらした。
【０２１３】
類似の実験を、もとの供給元の製剤２および１ならびにＰＢＳと比較して組成物１３中のＭＶＡについて実施した（図２６）。ＭＶＡを組成物１３中で製剤化すると、ＰＤＩは０．５より小さかった。これに対し、もとの供給元の製剤１および２では、試料調製後で既におよび２０回の凍結解凍サイクル後で０．５より高いＰＤＩ値を示した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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