(57)【要約】  本発明は、ヒスタミンに対するＨ４アゴニスト分子である７−アミノ−４，５，６−トリエトキシ−３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−４−メトキシ−６−メチル−１，３−ジオキソロ［４，５−ｇ］イソキノリン−５−イル）フタリドまたはトリトクアリンの鏡像異性体の、特発性肺線維症の治療のための使用に関する。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−アミノ−４，５，６−トリエトキシ−３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−４−メトキシ−６−メチル−１，３−ジオキソロ［４，５−ｇ］イソキノリン−５−イル）フタリドまたはトリトクアリンの異性体または異性体の混合物を含むことを特徴とする、特発性肺線維症の治療の使用のための、ヒスタミンＨ４受容体に対するアゴニスト活性を有する物質。
【請求項２】
ＴＧＦβを抑制することを特徴とする、請求項１に記載の使用のための物質。
【請求項３】
軟質カプセル、錠剤、カプセル、シロップまたはゲル状の剤型に包装されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のための物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質、１−（７−アミノ−４，５，６−トリエトキシ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−３−イソベンゾフラニル）８−メトキシ−２−メチル−６，７−メチレンジオキシ−，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、すなわちトリトクアリンの左旋性及び右旋性鏡像異性体を特発性肺線維症の治療に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、間質性肺疾患の家系における２００の肺疾患の1つであり、肺胞間に位置する組織である肺間質を冒すものである。
【０００３】
特発性肺線維症は、特発性間質性肺疾患であり、びまん性実質性肺疾患としても知られている間質性肺疾患である。
【０００４】
特発性肺線維症は、慢性的な増悪を伴う特発性びまん性間質性肺疾患群に属するまれな疾患（人口１０万人当たり約１３〜２０人の罹患率）であり、そのうち最も多い形態（症例の約６０％）であり最も重篤である。
【０００５】
特発性びまん性間質性肺疾患は、特定の原因または状況が不明のものであり、その医学的原因が既知であるびまん性間質性肺疾患（例えば、薬物または塵肺により誘発される間質性肺疾患）に対するものである。
【０００６】
特発性肺線維症は、最近、国際コンセンサス分類において定義された。特発性肺線維症という用語は、以前は、非常に異なるいくつかの独立した事象、特に、特発性びまん性間質性肺疾患群において解剖学的独自性として認識されてきた非特異的間質性肺疾患を包含していた。
【０００７】
特発性肺線維症の定義は、現在、肺生検において間質性肺疾患群(通常、間質性肺炎)の病理組織学的所見を示す特発性びまん性間質性肺疾患の症例に限定されている。
【０００８】
また、特発性肺線維症の診断の維持には、特徴的なコンピュータ断層撮影の異常および呼吸機能効果が求められる。当該診断は、解剖放射線臨床要約に基づく。
【０００９】
特発性肺線維症は、６０代から７０代に発生し、やや男性に多い。５０代前ではまれである。
【００１０】
該疾患は、次第に慢性呼吸不全、死へと進展し、その生存期間の中央値は約３年であり、１０年生存率はわずか約１０％である。
【００１１】
該疾患は、進行性の労作性呼吸困難、乾性咳およびよりまれな全身性兆候により明らかになる。診察では、両側肺底部に捻髪音（「ベルクロ(登録商標)（面ファスナー）」の音に類似）が常に聴取される。
【００１２】
症例の約半数に太鼓撥指形成がみられる。チアノーゼや右室不全の兆候は、この疾患の進行した段階にのみ観察される。
【００１３】
診断は、遅くなることが多く、機能的およびコンピュータ断層撮影の異常がすでに発現している段階である。胸部Ｘ線写真では、肺底部の周辺に顕著な網状影がはっきりとみられ、肺容量の低減がみられる。
【００１４】
ミリメーター刻みの胸部コンピュータ断層撮影は、診断の必須試験である。特徴的な所見として、わずかなすりガラス陰影と共に、仮性嚢胞胸膜下蜂巣所見、牽引性気管支拡張および肺柔組織のゆがみの兆候を生じる肺底部の網状影がみられ、肺機能検査では、拘束性換気障害（肺活量および全肺気量の低下）がみられる。一酸化炭素（ＣＯ）輸送能および係数の低下により表される、肺胞−キャピラリ膜の機能障害も存在する。低酸素血症は、安静時にはほとんど認められないが、運動時にみられ、運動時低酸素血症は、最初のうちは、単なる呼吸機能障害であることもある。
【００１５】
特発性肺線維症を有する患者では、気管支癌のリスクも高くなる。
【００１６】
該疾患の全体的な予後が悪い場合には、実質的な個人差が存在する。いくつかの最近の研究により、予後診断因子が同定されている。すなわち、
・診断後数ヵ月にわたる呼吸機能低下は、悪化因子である。そのようなものとして、６カ月における１０％以上の努力性肺活量または１２カ月における１５％以上のＣＯ拡散能の低下は、高い死亡リスクの独立した予測因子となる。
・６分トレッドミル検査における８８％未満の飽和度は、予後不良の予測因子となる。
・進展の過程における肺高血圧症の発症もまた予後不良である。
・ＣＯ輸送因子の実質的な変化。
・胸部コンピュータ断層撮影における蜂巣病変の広がりおよび肺生検における発生線維芽細胞の数。
【００１７】
特発性肺線維症の治療は、平均余命、呼吸機能, 生活の質の向上および疾患の急性悪化のリスクを避けることを目的とする。
【００１８】
現在まで、本疾患の生存率の改善に有効な治療法は示されていない。現在まで、根治的治療はない。本疾患が悪化し、重篤な段階に達している患者においては、フランス厚生省（ＨＡＳ）によれば、酸素治療および肺移植が推奨される治療である。
【００１９】
しかし、２種の医薬品が販売承認を得ている。
【００２０】
上記医薬品の一方は、ピルフェニドン（Ｅｓｂｒｉｅｔ：エスブリート）であり、生存率に対する結果は、ほとんどまたは全く有意性を有しない。ピルフェニドンの作用の形態は未知である。ピルフェニドンは、軽度から中程度のＩＰＦの治療に適応される。この製品は、１日当たり約２．４ｇという非常に高用量で使用される。
【００２１】
ＨＡＳ（フランス厚生省）によれば、ピルフェニドンの有効性は、肺機能を評価する中間判定基準及び該疾患の進行のマーカーによって評価された。この判定基準において観察される差異は、プラセボと比較してピルフェニドンに有利であるが、この差異は小さく、臨床的有意性は不明確であり、研究間にばらつきがある。
【００２２】
正確な機能の判定基準（ＦＶＣ≧５０％およびＤＬＣｏ≧３５％）による、患者の肺機能の低下に対して観察されるエスブリートの効果は低い。特発性肺線維症の患者に対する臨床的効果を、探索的かつ非ロバスト性解析による臨床的な判定基準（生活の質、全生存率など）として評価することは難しい。しかし、患者の集約的研究により、特定の患者分析により生存率の顕著な改善が明らかになった。
【００２３】
観察されたピルフェニドンの主な副作用は、胃腸障害（吐き気、下痢、消化不良）、皮膚障害（光感受性および発疹）および栄養障害（拒食症および食欲不振）である。
【００２４】
上記医薬品の他方は、特発性肺線維症の治療用として、最近米国で承認された、ＯＦＥＶの商品名で知られるニンテダニブである。本品は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）のＣＨＭＰからも好意的な意見を得ており、欧州では販売承認待ちの状態である。ニンテダニブの作用の形態は、チロシンキナーゼ阻害である。この製品は、１日当たり２００〜４００ｍｇの用量で使用される。多数の副作用、特に胃腸の副作用が観察される。
【００２５】
フランス厚生省は、以下のことを推奨しないとしている（許容できる試験方法の欠如および機能的判断の基準に関する証明の欠如）、すなわち、単剤治療としてのコルチコイド類、コルチシン、シクロスポリンＡ、インターフェロンγ１ｂ、ボセタン、エタネルセプト、コルチコイド／免疫調節物質会合体、およびアセチルシステイン／プレドニゾン／アザチオプリン三剤治療。
【００２６】
酸化／抗酸化不均衡が特発性肺線維症において明らかになった。Ｎ−アセチルシステイン（肺の主たる抗酸化物質である、グルタチオンの前駆体）を特発性肺線維症の治療薬として評価した。
【００２７】
（コルチコイド類およびアザチオプリンによる治療に加えて）、Ｎ−アセチルシステイン（１，８００ｍｇ／日、１年間）の無作為比較対象試験を最近行ったところ、努力性肺活量の低下の平均が０．１８Ｌ（０．０３−０．３２）であり、相対差として９％であり、ＣＯ拡散の低下の平均が２４％であり、呼吸機能に適度な利点が示されたが、死亡率では、２つのグループ間に差は存在しなかった。
【００２８】
フランス厚生省は、証拠のレベルは低いが、肺活量の低下を抑えることが示されたアセチルシステインを、一定の患者に投与することを検討している。この製品は、現在まで販売承認を得ていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】仏国特許発明第１，２９５，３０９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／１４４，７１８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００８／００６，９７４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
現在、多くの製品が特発性肺線維症の治療のために研究されている。
【００３１】
モノクローナル抗体（II相試験にあるレブリキズマブおよび第III相試験にあるトラロキヌマブ）の２０１５年における状態は不明である。
【００３２】
ブリストルマイヤーズスクイブによって開発されたＢＭＳ−９８６２０２（リゾホスファチジン酸受容体アンタゴニスト）は、現在、II相試験中である。
【００３３】
１５４以上の研究が進行しているが、結果が特に劣っているため、現在のところ、少数の製品が第II相試験を終了しているに過ぎない。
【００３４】
このような特発性肺線維症は現在、真に効果的な市販の治療薬がほとんどない病態である（現在まで、ピルフェニドンのみが、軽度から中程度のＩＰＦに適応される）。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
トリトクアリンは、長年知られている化学物質であり、抗ヒスタミン薬として使用されている。その製造は、仏国特許発明第１，２９５，３０９号明細書に記載されている。
【００３６】
トリトクアリンは、７−アミノ−４，５，６−トリエトキシ−３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−４−メトキシ−６−メチル−１，３−ジオキソロ［４，５−ｇ］イソキノリン−５−イル）フタリドである。その市販されている剤型は、鏡像異性体の混合物の形である。
【００３７】
トリトクアリンは、ヒスチジンデカルボキシラーゼに対する抑制作用による抗アレルギー活性により知られている。しかし、この活性は非常に弱く、様々な臨床症状、鼻炎、蕁麻疹、湿疹、肥満細胞症に対する多くの性質を説明できない。
【００３８】
本発明者の一人は、他の発明者とともに、トリトクアリンが新規の受容体であるヒスタミンＨ４受容体に対して非常に実質的な作用を有することを示した。
【００３９】
Ｈ４受容体に対するトリトクアリンのこの活性は、米国特許出願公開第２０１０／１４４，７１８号明細書「Ｈ４受容体アゴニストにより調節される疾患の治療」Ｇａeｔａｎ  Ｔｅｒｒａｓｓｅおよびｃｏｌｌに記載されている。
【００４０】
しかし、この特許は、特発性肺線維症に対するトリトクアリンの作用について記載していない。
【００４１】
Ｈ４アゴニスト類に関する他の国際公開第２００８／００６，９７４号には、化学療法の枠組みにおける造血前駆体の保護においてこれらの製品を使用することが記載されている。
【００４２】
後者の特許および他の学術論文も、特発性肺線維症におけるヒスタミンに対するＨ４アゴニストの作用について明らかにしていない。
【００４３】
市販のトリトクアリンは、白い粉体状であり、光に非常に敏感でコタルニンおよびフタル酸に分解される。
【００４４】
市販のトリトクアリン（ハイポスタミン（Ｈｙｐｏｓｔａｍｉｎｅ）と称される）は、１錠当たり１００ｍｇの濃度の錠剤である。
【００４５】
トリトクアリンは、２つの不斉炭素を有するが、市販の剤型は、２つの鏡像異性体（Ｒ−ＲおよびＳ−Ｓ）の混合物である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】ＴＧＦβの分泌に対するトリトクアリンの治療的効果を、組織１ｇ当たりの発現量ｎｇで表す。
【図２Ａ】コントロールとしてピルフェニドンを用いたコラーゲンの分泌に対するトリトクアリンの効果を示す。
【図２Ｂ】コントロールとしてピルフェニドンを用いた解剖学的スコアに対するトリトクアリンの治療的効果を示す。
【図３Ｂ】肺組織に対するブレオマイシンの効果を示す。
【図４Ａ】ＡおよびＢとして不斉炭素の存在を示す。
【図４Ｂ】異性体Ｄ１の形状を示す。
【図４Ｃ】異性体Ｄ２の形状を示す。
【図５】トリトクアリンと参照用Ｈ４アゴニストであるクロベンプロピットとの比較である。この図は、トリトクアリンがＨ４受容体に富むＣＦＵの増殖を阻害できることを明らかにしている。抗Ｈ４を使用すると、トリトクアリンの活性は、クロベンプロピットの活性と実質的に同等に低減される。このことは、トリトクアリンがＨ４アゴニスト分子であることをよく示している。  本発明者らは、特発性肺線維症の従来の動物モデル、ブレオマイシンマウスモデル、におけるトリトクアリンの驚くべき性質を明らかにした。
【図３Ａ】使用したプロトコールを説明する。ブレオマイシンを５日間吸引し、肺線維症を引き起こした。１４日目にトリトクアリンの投与を開始し、２８日目まで毎日投与した。このモデルに使用された用量は２０〜４０ｍｇ／ｋｇであり、７０ｋｇの成人男子の１日当たりの用量約１．４ｋｇ〜２．８ｋｇに相当する。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４７】
プロトコール
ブレオマイシンマウスプロトコール（ＢＬＭ）を各グループ１０匹のマウス（種：Ｃ５７／Ｂ１６Ｊ、ＢＬ６とも称される）に対して行った。これらのマウスは８週齢の雌マウスである。
【００４８】
各グループの全ての動物についてそれぞれ線維症の分析を行った。線維症の程度を、種々の定量的および半定量的方法を用いて、生化学的、組織学的および細胞学的に分析した。
【００４９】
ＢＬ６マウスの全てを以下のプロトコールに従って治療する。
【００５０】
５グループのマウスを評価した。
【００５１】
ブレオマイシン（ＢＬＭ）による治療を以下のプロトコールに従って行う。
【００５２】
全グループ（グループ１を除く）の全マウスにブレオマイシン（ＢＬＭ）を連続して５日間、鼻腔内投与（３ｍｇ／ｋｇ、鼻腔内滴下）し、毎日モニターし、ＢＬＭ滴下後２９日目にマウスを屠殺し、慢性肺炎症および線維症を調べる。ブレオマイシンの５回の投与は、８週齢で行う（図３Ａ参照）。
【００５３】
トリトクアリンでの治療は２種の用量、２０および４０ｍｇ／ｋｇ／日でマウスが生きている間行う。トリトクアリンでの治療は、ブレオマイシンの吸入による最初の処置後１４日目に開始する。治療は経口的に行う。試験したグループは以下の通りである。
１．ＢＬ６マウス  ＮａＣｌ
２．ＢＬ６マウス  ＢＬＭ＋媒体
３．ＢＬ６マウス  ＢＬＭ＋ピルフェニドン（１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与）
４．ＢＬ６マウス  ＢＬＭ＋トリトクアリン（２０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）
５．ＢＬ６マウス  ＢＬＭ＋トリトクアリン（４０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）
【００５４】
組織学
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）および肺の還流後、大葉を標準的な顕微鏡（ライカ顕微鏡）分析用に４％緩衝化ホルムアルデヒド中に固定した。３ｍｍ切片を、コラーゲンの線維を青色に着色して線維症（ＴＭ）の評価および炎症の広がりの観察が可能である標準法によりマッソントリクロ−ム（ＴＭ）で染色した。
【００５５】
線維症は、二人の独立した観察者により重症度の増加を半定量的スコア（０−５）（アシュクロフトスコア）により評価した。
【００５６】
肺胞壁および気管支周囲領域に位置するコラーゲンの沈着および炎症細胞の浸潤を伴う線維症を、重症度の増加による０−５の半定量的スコアを使って二人の独立した観察者により評価した。
【００５７】
コラーゲン（ヒドロキシプロリン）の滴定
コラーゲン含有量は、肺を均質化した後に求める。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）後、肺全体を心臓の右心室を通して生理食塩水で還流し、血管内を空にした。
【００５８】
肺は、使用時まで−７０℃で冷凍保存した。次いで、肺をＰＢＳ中で均質化し、遠心分離した。
【００５９】
上清を捨て、下部部分を０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）および５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＰＢＳの１ｍＬ中に懸濁させた。
【００６０】
遠心分離後、コラーゲン含有量をＳｉｒｃｏｌアッセイ（フランス生化学部、仏）により、製造業者の説明に従って求めた。
【００６１】
サイトカインの測定
肺ホモジネート内のインターフェロンγおよびＴＧＦβ濃度を測定した。すなわち、これらの異なるサイトカインの濃度は、ＭＡＧＰＩＸ（バイオラド、仏）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、ルミネックスアッセイにより求めた。
【００６２】
結果
半定量的スコア（０−５）（アシュクロフトスコア）による評価方法に従った組織学的測定は、以下の結果を与える。
組織学のためのブレオマイシン対１００ｍｇ／ｋｇピルフェニドン試験
・対応のあるｔ検定（スチューデント検定）
・Ｐ値０．０４４９
・Ｐ値の要約：Ｐ＜０．０５、検定は有意か？はい。
検定は高度に有意か？いいえ、差異は少なく（Ｐ＝０．０４５）、有意性の限界にある。
平均±標準偏差（ブレオマイシン）：４．２±０．１４、ｎ＝１０
平均±標準偏差（ピルフェニドン）：３．８±０．１２、ｎ＝１０
２つの平均値間の差異：−０．４０±０．１８
結論：ピルフェニドンの有効性は、有意性の限界にある。
組織学のためのブレオマイシン対２０ｍｇ／ｋｇトリトクアリ試験
・対応のあるｔ検定（スチューデント検定）
・Ｐ値＜０．０００２
・Ｐ値の要約：Ｐ＜０．０００２、検定は有意か？はい。
検定は高度に有意か？はい、差異は非常に大きく（Ｐ＝０．０００２）有意性は非常に高い。図２Ａ参照。
結論：高い有意性でトリトクアリンは非常に高い有効性を有する。
【００６３】
トリトクアリンは、２０または４０ｍｇ／ｋｇの用量で組織学的スコアを実質的に低下させるが、これは有意性が高い。ピルフェニドンは、有意性の限界（Ｐ０．０４５）にあり、トリトクアリンとの差異は高い有意性（２０ｍｇ／ｋｇの用量でＰ＝０．０００１）を有する。図２Ｂ参照。
【００６４】
コラーゲンの滴定（ヒドロキシプロリンの適用量による方法）は、タンパク質ｍｇ当たりのμｇで表す。
コラーゲン（ヒドロキシプロリン）に対するブレオマイシン対１００ｍｇ／ｋｇピルフェニドン試験
・対応のないｔ検定（スチューデント検定）
・Ｐ値０．０４５０
・Ｐ値の要約：Ｐ＜０．０５、検定は有意か？はい。
検定は高度に有意か？いいえ、差異は少なく（Ｐ＝０．０４５）、有意性の限界にある。
平均±標準偏差（ブレオマイシン）：３４０．０±４．８８８、ｎ＝１０
平均±標準偏差（ピルフェニドン）：３１６．５±９．７４８、ｎ＝１０
２つの平均値間の差異：−２３．５０±１０．９０
結論：ピルフェニドンの有効性は、有意性の限界にある（Ｐ０４５）。
コラーゲン（ヒドロキシプロリン）に対するブレオマイシン対２０ｍｇ／ｋｇトリトクアリ試験
・対応のないｔ検定（スチューデント検定）
・Ｐ値＜０．０００１
・Ｐ値の要約：Ｐ＜０．０００１、検定は有意か？はい。
検定は高度に有意か？はい、差異は非常に大きく（Ｐ＝０．０００１）有意性は非常に高い。
平均±標準偏差（ブレオマイシン）：３４０．０±４．８８８、ｎ＝１０
平均±標準偏差（トリト２０ｍｇ／ｋｇ）：２８０．０±７．５２８、ｎ＝１０
２つの平均値間の差異：−６０．００±８．９７５
結論：高い有意性でトリトクアリンは非常に高い有効性を有する。
【００６５】
トリトクアリンは、コラーゲンの形成の阻害に対して強い作用を有し、その作用はピルフェニドンに比較して非常に強い。有意性も実質的である（Ｐ＝０．０００１）。図２Ａ参照。
【００６６】
サイトカインの適用量：トリトクアリンは、ピルフェニドン（Ｐ＝０．００１）と同様にＴＧＦβも強く阻害する（Ｐ＝０．００１）。図１Ａ参照。
【００６７】
トリトクアリンは、その有効性を変更することなく、「錠剤」型以外の他の剤型で、例えば、軟質カプセル、シロップ、経口ゲル、プログラム崩壊性カプセルまたは錠剤といった剤型で使用することができた。
【００６８】
トリトクアリンは既にヒトにおいて３ｍｇ／ｋｇの用量で使用されているが、特発性肺線維症に使用されたことはない。しかし、この病理においてはこの用量がヒトにおいては活性であるべきである。
【００６９】
実際に動物に使用される用量は、一般的に、ヒトに使用される用量の１０倍以上である。例えば、マウスに対するエスブリートの用量は１００ｍｇ／ｋｇであるが、ヒトでの用量は１５ｍｇ／ｋｇに過ぎない。
【００７０】
この用量比は、トリトクアリンにおいても間違いなく同じであるので、有効となり得る用量は、３〜４０ｍｇ／ｋｇであろう。
【図１Ａ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2019508446.tif 000014
2019508446.tif 000015
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