(57)【要約】  ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1及びその使用を提供する。上記ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1は、配列がmPEG-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspであり、mPEGがmPEG-SC、mPEG2-NHS、mPEG-ALD又はmPEG-bALDであり、分子量の範囲が500〜40000であり、血管内皮細胞遊走の阻害能力、インテグリンとの親和性及び結合能力を有し、腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の予防及び治療に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列がmPEG-Arg-Gly -Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspであることを特徴とするポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1。
【請求項２】
前記mPEGはmPEG-SC、mPEG2-NHS、mPEG-ALD又はmPEG-bALDであり、分子量の範囲は500〜40000であることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1。
【請求項３】
配列が、
mPEG-SC5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-SC10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-SC20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-SC40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-bALD5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-bALD10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-bALD20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、又は
mPEG-bALD40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp
であることを特徴とする請求項2に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか1項に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1の腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬の製造における使用。
【請求項５】
前記腫瘍は、ヒトの頭頸部、脳部、甲状腺、食道、膵臓、肺、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸若しくは直腸、卵巣、子宮頸、子宮、前立腺、膀胱又は精巣に由来する一次又は二次癌、黒色腫、血管腫及び肉腫である、ことを特徴とする請求項4に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1の腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬の製造における使用。
【請求項６】
前記炎症は、関節リウマチ、痛風性関節炎、反応性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、伝染性関節炎、外傷性関節炎及び強直性脊椎炎を含む、ことを特徴とする請求項4に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1の腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬の製造における使用。
【請求項７】
前記新生血管性眼疾患は、虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患又は角膜新生血管性眼疾患を含む、ことを特徴とする請求項4に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1の腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬の製造における使用。
【請求項８】
請求項1〜3の何れか1項に記載のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1を含み、投与方式は注射投与である、ことを特徴とする腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬。
【請求項９】
薬物の投与方式は、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射、眼硝子体注射及び静脈点滴を含む請求項8に記載の腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド薬分野に属し、具体的には、ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（angiogenesis）とは、既存の毛細血管及び/又は細静脈をもとに、血管内皮細胞の増殖及び遊走により、既存の血管から出芽又は非出芽の形式で新たな毛細血管を形成することをいう。血管新生は、胎盤の形成、胚の成長及び創傷治癒の過程において重要な役割を果たしている。また、血管新生は、多くの疾患、例えば、腫瘍、様々な炎症及び眼科疾患（例えば、AMD）に対しても非常に重要な役割を果たしている。
【０００３】
悪性腫瘍は、人間の健康への最大の脅威と考えられている。近年、わが国の腫瘍の発生率及び死亡率は高くなっている。無限の増殖、侵襲及び移転は、腫瘍の悪性徴候であり、治療ミス及び死亡を引き起こす主要な原因でもある。そのため、腫瘍の増殖、侵襲及び移転の制御は、予後改善、生存率向上のための主な措置となっている。前世紀の70年代、Folkmanは、「ニュー・イングランド医学雑誌」に腫瘍の増殖が新血管形成に依存する理論を初めて提案している。腫瘍血管新生は、腫瘍の増殖及び移転の形態学的基礎であり、腫瘍に栄養及び酸素を提供するだけでなく、宿主にも大量の腫瘍細胞を伝達することにより、腫瘍の増殖及び移転が発生する。殆どの悪性固形腫瘍、例えば、卵巣がん、肝がん、子宮頸がん及び乳がん等は、全て血管依存性腫瘍であるため、腫瘍血管形成の阻害は重要な抗がん対策と考えられている。
【０００４】
関節炎のような炎症性疾患は、人間の健康を害する最も一般的な疾患の1つであり、人体の関節及びその周囲組織に発生する炎症性疾患である。わが国では、このような疾患に罹患している患者が多く、年々増加している。このような疾患には、主に関節リウマチ、痛風性関節炎、反応性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、伝染性関節炎、外傷性関節炎及び強直性脊椎炎が含まれる。そのうち、関節リウマチ（rheumatoid arthritis，RA）は、病因が未だに確認されていない慢性進行性関節炎であり、通常、生体防御システムの自己攻撃による自己免疫疾患と考えられている。また、遺伝、感染、寒さ及び湿気等も関節リウマチの発症に至る原因である。RAの病理学的過程において、血管新生は象徴的な組織学的変化であり、新生血管の形成は滑膜過形成及び炎症性細胞浸潤を伴い、RAにおけるパンヌス形成及び関節破壊の基礎である。従って、新生血管形成の阻害はこのような疾患を治療するための鍵であり、血管形成を阻害することにより、滑膜への酸素及び養分の供給を阻止するとともに、血管退化を直接引き起こすことができることで、RAによる滑膜過形成が抑制される。
【０００５】
眼科疾患における虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患及び角膜新生血管性眼疾患等は、いずれの発症メカニズムも新生血管の過形成に繋がっている。新生血管は、血管の正常生理構造を有さず、透過性が高いため、破裂しやすいことで血液が硝子体腔内に入ることにより、眼底出血を引き起こし、患者の視力が低下するか、又は視力を完全に失うので、患者の生活の質に大きな影響を与える。そのため、血管新生の阻害はこのような疾患を治療する鍵であり、内皮細胞の増殖及び遊走は、新生血管形成の主要なステップである。
【０００６】
エンドスタチン（ES又はEndostatin）は、高分子コラーゲンタンパク質XVIIIのカルボキシ末端の非コラーゲン領域断片であり、183個のアミノ酸残基からなり、相対分子量が20 kDである。エンドスタチンは、腫瘍新生血管形成を阻害することにより、栄養供給を遮断する血管新生阻害剤であり、内皮細胞に特異的に作用することができるため、正常組織内の血管に顕著な影響を与えず、副作用がなく、薬剤耐性が発生しないという利点を有する。動物体内試験により明らかなように、エンドスタチンは、一定の抗腫瘍効果を有するが、臨床試験では、その抗腫瘍効果が顕著ではないため、最終的にはFDAによって拒否された。エンドスタチンの6-49個目のアミノ酸及び134-178個目のアミノ酸は、いずれもヒト臍静脈内皮細胞の増殖及び遊走を阻害することができ、且つ活性がエンドスタチンそれ自体よりも高いことが報道された関連文献がある。そのため、エンドスタチンを短く切り、活性断片を選択して研究を行うことは、高分子全体のメカニズムの研究に有利であるだけではなく、開発コストを低減し、このようなポリペプチドの開発の参考になり得る。
【０００７】
インテグリンは、多種の細胞外マトリックスの成分を識別できる受容体ファミリーであり、細胞表面に広く分布しており、細胞と細胞外マトリックスとの間、及び細胞間の付着を媒介するとともに、細胞内の細胞骨格タンパク質と細胞外マトリックス分子とを連結する相互作用により血管形成に関与することができる。このような受容体は、αとβの2本の鎖からなり、現在、15種のα鎖及び9種のβ鎖が発見されており、異なるα鎖とβ鎖との組合せによってリガンドの特異性を決定し、インテグリンα1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α6β4、α5β1、αvβ3、αvβ5は、血管形成及び細胞遊走に関与し、そのうち、αvβ3は、癌化におけるいくつかの重要な過程に影響を与える。αvβ3は、多くの細胞型に発現し、リガンド分子におけるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列（Arg-Gly-Asp，RGD）を識別することができ、腫瘍の血管形成、侵襲、移転、炎症、創傷治癒及び凝血等の生理学的及び病理学的過程に関与する。従って、RGD配列は、担体として新生血管内皮細胞に標的輸送することができ、新生血管性疾患をより効率的に治療することができる。特許文献ZL201410324568.9（多機能融合ポリペプチド、その製造方法及び使用）には、いくつかの血管新生阻害剤ポリペプチドが開示され、そのうちHM-1は、配列がArg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspであり、該配列にインテグリンリガンド配列（Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp）及び新生血管阻害配列（Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala）が含まれる。反復のインビトロ及びインビボ活性評価により、該ポリペプチドは、良好な腫瘍阻害効果を有し、内皮細胞の遊走、腫瘍新生血管の形成を顕著に阻害することで腫瘍の増殖を阻害できることを実証した。しかし、上記ポリペプチドは、半減期が短いため、頻繁な投与を必要するため、患者に一定の苦痛をもたらすことがある。
【０００８】
文献報告では、分子構造を修飾したり、改変したりすることは、半減期が短く、連続的な投与が必要である問題を解決するための常用の方法である。化学修飾は、幅広く応用されており、常用の化学修飾剤には、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol，PEG）、グルカン、ポリアミノ酸、ポリ酸無水物等が含まれる。PEGは、非毒性、非免疫原性及び優れた水溶性等の利点を有し、アメリカ食品医薬品局（FDA）によって薬品の補助材料と修飾剤として承認されている。タンパク質ポリペプチド系薬物は、PEGにより修飾された後、分子量が増加し、糸球体濾過率が低下し、PEGのバリア作用によりタンパク質及びポリペプチドがタンパク質分解酵素の加水分解から保護されると共に、中和抗体の発生が減少することにより、タンパク質ポリペプチド系薬物の、生体内でのクリアランスが高く、免疫原性が高く、有効血中濃度の持続時間が短く、頻繁な投与が必要である等の欠点が大幅に改善される。現在、多種のPEG修飾タンパク質系薬物が市販されている。しかし、PEG修飾によりタンパク質及びポリペプチドの生物学的活性に影響を与えることもあり、影響の大きさは、修飾剤、修飾条件及びタンパク質とポリペプチドそれ自体の性質に関係があり、一連のインビトロ及びインビボでの薬力学試験により修飾生成物の生物活性を確定する必要がある。
【０００９】
血管新生阻害剤は、近年、新生血管性疾患の治療において非常に重要視されている薬物であり、これらの血管新生阻害剤の中では、特にアンギオスタチン及びエンドスタチンが注目されている。これらの血管阻害剤は、非常に魅力的な見通しを示しているが、その欠陥も明らかである。具体的には、従来の血管新生阻害剤系薬物は、作用ターゲットが明確ではなく、血管に対する特異性及び選択性が十分ではなく、効果に制限があり、試験中の投与量が大きい。そのため、良好な抗血管新生剤は、新生血管の標識分子に選択性を有することにより、新生血管に対するガイド作用を達成し、全体として薬物の血管形成に対する阻害作用を向上させるものであって、低用量であっても効率的な血管形成阻害効果を奏することができるものであるべきである。アバスチンは、現在、眼疾患の治療に成功裏に適用されているが、わが国では、この薬物の自主開発が不足している。本発明のインテグリンによる血管新生の標的阻害は、このような眼疾患を治療するための新しい選択肢となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の血管新生阻害剤ポリペプチドHM-1の短半減期、高血漿クリアランス、頻繁な投与等の欠点を解決するために、本発明は、ポリエチレングリコールにより修飾された血管新生阻害剤HM-1及びその使用を提供する。HM-1をPEGで修飾するが、PEG修飾過程において、反応条件は、修飾生成物の収率、生成物の種類及びPEGの安定性に影響を与えることがある。PEGの種類及び分子量も修飾生成物の生物活性にある程度影響を与える。また、異なるPEGの種類、反応条件の変化のいずれも、反応副生成物の生成を招き、修飾生成物の純度に影響し、分離精製に一定の困難をもたらす可能性がある。そのため、分子量の異なる多種のPEG及びそれによるHM-1修飾の反応条件について何度も検討したところ、PEGが安定し、単一修飾物収率が高い反応条件を見出した。また、得られた修飾生成物に対して様々なインビトロ及びインビボの有効性試験を行ったところ、インビボでの半減期が長く、その生物活性が良好に保持され得る生成物が得られることにより、腫瘍、様々な炎症及び新生血管性眼疾患の予防及び治療により良好に適用できる。
しかし、溶液状態の修飾生成物は安定性が悪い。その安定性を向上させるために、修飾生成物の溶液を回転蒸発により濃縮した後、真空凍結乾燥し、-70℃で保存する。溶液状態の修飾生成物は、それ自体の安定性が悪く、温度に対して敏感であるため、回転蒸発の温度が高過ぎ、時間が長過ぎると、修飾生成物の分解が速くなることがある一方、温度が低過ぎ、濃縮が遅くて時間が長いと、生成物の安定性に影響を与える場合もある。そこで、生成物の安定性に影響を与えずに濃縮の効果をできるだけ速く達成させるために、発明者は回転蒸発の温度及び時間を研究・検討した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記問題を解決するために、本発明の技術的解決策は以下の通りである。
配列がmPEG-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspであるポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1。
好ましくは、上記mPEGは、mPEG-SC（モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミドカーボネート）、mPEG2-NHS（分岐型モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミドエステル）、mPEG-ALD（モノメトキシポリエチレングリコール-プロピオンアルデヒド）又はmPEG-bALD（モノメトキシポリエチレングリコール-ブチラール）であり、分子量範囲は500〜40000である。
【００１２】
好ましくは、その配列は、
mPEG-SC5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-SC10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-SC20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-SC40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG2-NHS40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-ALD40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-bALD5k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-bALD10k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、
mPEG-bALD20k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、又は
mPEG-bALD40k-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspである。
【００１３】
上記ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1の腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬の製造における使用。
【００１４】
好ましくは、上記腫瘍は、ヒトの頭頸部、脳部、甲状腺、食道、膵臓、肺、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸若しくは直腸、卵巣、子宮頸、子宮、前立腺、膀胱又は精巣に由来する一次又は二次癌、黒色腫、血管腫及び肉腫である。
【００１５】
好ましくは、上記炎症には、関節リウマチ、痛風性関節炎、反応性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、伝染性関節炎、外傷性関節炎及び強直性脊椎炎が含まれる。
【００１６】
好ましくは、上記新生血管性眼疾患には、虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患又は角膜新生血管性眼疾患が含まれる。
【００１７】
上記のいずれかのポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1を含み、投与方式が、注射投与である腫瘍、炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬。
【００１８】
好ましくは、薬物の投与方式には、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射、眼硝子体注射及び静脈点滴が含まれる。
【００１９】
上記ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1の製造方法は、
配列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspを合成するステップ（1）と、
mPEGでArg-Gly-Ala-Asp -Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspを修飾するステップ（2）と、
分離精製して溶液状態にあるポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤HM-1を得るステップ（3）と、
分離精製により得られた修飾生成物の溶液を回転蒸発により濃縮した後、真空凍結乾燥することで修飾生成物の粉末を得、-70℃で保存するステップ（4）と、
を含む。
【００２０】
mPEGによりHM-1を修飾する過程において、修飾反応に影響する可能性がある各条件、例えば、反応温度、反応時間、mPEGとHM-1とのモル比、緩衝液の種類、緩衝液のpH、緩衝液の濃度（表2）、ポリペプチド濃度及び還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）の濃度等の条件に対し予備検討、再最適化を行う。高速液体クロマトグラフを用いて、面積正規化法により単一修飾生成物の修飾率を分析することにより、mPEG修飾HM-1単一修飾物の収率が高い反応条件を選別する。具体的な条件は以下の通りである。
分析カラム:COSMOSIL、250mm×4.6mm（5μm フィラー）
移動相:A相は水（0.1%TFA添加）、B相はアセトニトリル（0.1%TFA添加）である
サンプリング量:20μL;
流速:1mL/min;
測定波長:220nm;
溶出勾配:表1を参照
【００２１】
2019513713.tif 000002
【００２２】
2019513713.tif 000003
【００２３】
様々なPEG修飾条件に対する予備検討過程
反応温度を4℃、mPEGとHM-1とのモル比を1.5:1、ポリペプチドの濃度を1mg/mLに設定した上で、反応緩衝液の種類及び濃度の選択を行う。
（1）mPEG-SCによるHM-1修飾に用いられる緩衝液濃度の選択
反応時間が6時間であり、濃度が0.05mol/L、0.1mol/L、 0.2mol/Lであるときに、それぞれpH7.5、8.0、8.5のNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液を調製し、濃度、pHの異なる緩衝液中で修飾反応を行い、単一修飾生成物の修飾率を測定する。その結果、分子量の異なるmPEG-SCは、いずれも濃度0.1mol/L、pH8.5のNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液での単一修飾物の収率が最も高く、90.0%に達し、且つpHの上昇に伴って修飾率が増加する。従って、0.1mol/LのNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液を選択してmPEG-SC修飾条件の最適化を行う。
（2）mPEG2-NHSによるHM-1修飾に用いられる緩衝液濃度の選択
還元剤NaCNBH3の濃度が0.05mol/L、反応時間が10時間であり、濃度が0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/Lであるときに、それぞれpHが8.0、8.5、9.0のH3BO3-Na2B4O7緩衝液を調製し、濃度、pHの異なる緩衝液中で修飾反応を行い、単一修飾生成物の修飾率を測定する。その結果、分子量の異なるmPEG2-NHSは、いずれも濃度0.05mol/L、pH8.5のH3BO3-Na2B4O7緩衝液での単一修飾物の収率が最も高く、58.8%に達するが、pHの上昇に伴って副生成物の収率が増加する。従って、0.05mol/LのH3BO3-Na2B4O7緩衝液を選択してmPEG2-NHS修飾条件の最適化を行う。
（3）mPEG-ALD及びmPEG-bALDによるHM-1修飾に用いられる緩衝液の種類及び濃度の選択
反応時間が10時間であり、濃度が0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/Lであるときに、それぞれpHが5.0、5.5、6.0のNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液及びCH3COOH-NaCH2COOH緩衝液を調製し、濃度、pHの異なる緩衝液中で修飾反応を行い、単一修飾生成物の修飾率を測定する。その結果、分子量の異なるmPEG-ALD及びmPEG-bALDは、いずれも濃度0.1mol/L、pH5.5のCH3COOH-NaCH2COOH緩衝液中での単一修飾物収率が最も高く、それぞれ85.6%及び96.2%に達する。従って、0.1mol/LのCH3COOH-NaCH2COOH緩衝液を選択してmPEG-ALD及びmPEG-bALD修飾条件の最適化を行う。
【００２４】
様々なPEG修飾条件の最適化
予備検討の結果に基づいて、各PEGに選択される緩衝液の濃度及び種類の下で、他の重要な因子に対して試験を行うことにより、様々なPEGの修飾条件を最適化する。
（1）mPEG-SCによるHM-1修飾の条件の最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mLに設定した上で、0.1mol/LのNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液中でmPEGとHM-1とのモル比、緩衝液のpH及び反応時間に対して3要因3水準直交実験を行う（表3）。直交実験の結果をレンジ分析した結果、緩衝液のpH変化は該反応の主要な影響要因であり、pHが7.5、8.0、8.5であるときの平均修飾率は、それぞれ50.88%、74.55%、81.68%であり、修飾率に対する影響は顕著であり、緩衝液のpHを再最適化することができる。
（2）mPEG2-NHSによるHM-1修飾の条件の最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mLに設定した上で、0.05mol/LのH3BO3-Na2B4O7緩衝液中でmPEGとHM-1とのモル比、緩衝液のpH及び反応時間に対して3要因3水準直交実験を行う（表4）。直交実験の結果をレンジ分析した結果、緩衝液のpH変化は該反応の主要な影響要因であり、pHが8.0、8.5、9.0であるときの平均修飾率は、それぞれ37.40%、50.72%、25.63%であり、修飾率に対する影響は顕著であり、且つpHの上昇に伴って副生成物の含量が増加し、修飾生成物の分離精製に不利であるため、緩衝液のpHを再最適化することができる。
（3）mPEG-ALD及びmPEG-bALDによるHM-1修飾の条件の最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mLに設定した上で、0.05mol/LのH3BO3-Na2B4O7緩衝液中でmPEG与HM-1とのモル比、緩衝液のpH、反応時間及び還元剤NaCNBH3の濃度に対して4要因3水準直交実験を行う（表5）。直交実験の結果をレンジ分析した結果、緩衝液のpHはmPEG-ALDによるHM-1修飾の主要な影響要因であり、pHが5.0、5.5、6.0であるときの平均修飾率はそれぞれ66.40%、75.00%、85.32%であり、修飾率に対する影響は顕著であり、PEGとポリペプチドとのモル比の変化はmPEG-ALDによるHM-1修飾の主要な影響要因であり、モル比が1.1:1、1.3:1、1.5:1であるときの平均修飾率はそれぞれ86.18%、87.63%、95.23%であり、修飾率に対する影響は比較的顕著であり、また、還元剤NaCNBH3は一定の細胞毒性を有するため、その使用をできるだけを減少すべきであり、緩衝液のpH及びNaCNBH3の濃度に対して、mPEG-ALDによるHM-1修飾の反応条件の再最適化を行うことができ、PEGとポリペプチドとのモル比の変化及びNaCNBH3の濃度に対してmPEG-bALDによるHM-1修飾の反応条件の再最適化を行うことができる。
【００２５】
様々なPEG修飾条件の再最適化
修飾条件の最適化の結果に基づいて、異なるPEG修飾の主要な要因を再最適化する。
（1）mPEG-SCによるHM-1修飾の条件の再最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mL、mPEGとHM-1とのモル比を1.5:1、反応時間を3時間に設定した上で、pHがそれぞれ8.2，8.3，8.4，8.5，8.6及び8.7である0.1mol/LのNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液中で緩衝液のpHを再最適化する。その結果、pH8.2-8.5の場合に、pHの上昇に伴って単一修飾物の収率が高くなり、pHが8.5を超えた場合に、反応副生成物を生成し、pHの上昇に伴って副生成物の収率が増加し、修飾生成物の分離精製に不利であるため、pHを8.5に厳格に制御すべきである。
（2）mPEG2-NHSによるHM-1修飾の条件の再最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mL、mPEGとHM-1とのモル比を1.5:1、反応時間を10時間に設定した上で、pHがそれぞれ8.3，8.4，8.5，8.6及び8.7である0.05mol/LのH3BO3-Na2B4O7緩衝液中で緩衝液のpHを再最適化する。その結果、pH 8.2-8.5の場合に、pHの上昇に伴って単一修飾物の収率が高くなり、pHが8.5を超えた場合に、pHの上昇に伴って副生成物の収率が増加し、且つ目的生成物のショルダーピークとなり、修飾生成物の分離精製に不利であるため、pHを8.5に厳格に制御すべきである。
（3）mPEG-ALDによるHM-1修飾の条件の再最適化
1）緩衝液pHの再最適化
固定反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mL、mPEGとHM-1とのモル比を1.5:1、NaCNBH3濃度を0.05mol/L、反応時間を10時間に設定した上で、pHがそれぞれ5.8，5.9，6.0，6.1及び6.2である0.1mol/LのCH3COOH-NaCH2COOH緩衝液中で緩衝液のpHを再最適化する。その結果、pH5.8-6.0の場合に、pHの上昇に伴って単一修飾物の収率がやや増加し、pHが6.0を超えた場合に、副生成物を生成し、修飾生成物の分離精製に不利であるため、pHを5.8-6.0に制御することができる。
2）NaCNBH3濃度の再最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mL、mPEGとHM-1とのモル比を1.5:1、CH3COOH-NaCH2COOH緩衝液のpHを6.0、反応時間を10に設定した上で、NaCNBH3濃度がそれぞれ0.02mol/L，0.03mol/L，0.04mol/L及び0.05mol/LであるときにNaCNBH3の濃度を再最適化する。その結果、NaCNBH3の濃度が0.03mol/Lに低下したときに、濃度が0.05mol/Lであるときの修飾率に相当し、0.02mol/Lに低下したときに修飾率が顕著に低下するため、NaCNBH3の濃度を0.03mol/Lに低下させることができる。
（4）mPEG-bALDによるHM-1修飾の条件の再最適化
1）mPEGとHM-1とのモル比の再最適化
反応温度を4℃、ポリペプチドの濃度を1mg/mL、NaCNBH3濃度を0.05mol/L、CH3COOH-NaCH2COOH緩衝液のpHを6.0に設定した上で、mPEGとHM-1とのモル比が1.3:1，1.4:1及び1.5:1であるときにmPEGとHM-1とのモル比を再最適化する。その結果、生成物修飾率はmPEGとHM-1とのモル比の増加に伴って高くなるが、モル比が1.4:1と1.5:1であるときの修飾率には有意差がないため、コストを節約するために、1.4:1のモル比を選択することができる。
2）NaCNBH3濃度の再最適化
再最適化の過程及び結果は、mPEG-ALDによるHM-1修飾と同様である。
【００２６】
2019513713.tif 000004
【００２７】
2019513713.tif 000005
【００２８】
2019513713.tif 000006
【００２９】
回転蒸発条件の検討
回転蒸発の主目的は、溶液中の有機溶媒を除去し、溶液を濃縮することにある。回転蒸発速度及びサンプルの安定性に影響する2つの主要な要因は、温度及び時間である。また、時間の長さも温度の影響を受けるため、この2つの要因を検討することにより、サンプルの安定性を確保する条件下でで濃縮効率を向上させる。溶液状態の修飾生成物は、温度に対して比較的敏感であり、温度が40℃を超えると顕著な分解が発生するため、温度を30-38℃に設定する。また、異なる温度で溶液を総量の1/3に濃縮するのに必要な時間及びサンプルの安定性を測定する。結果を表6に示す。結果として、37℃では、濃縮に係る時間が比較的短く（40 min）、且つサンプルの安定性が比較的高いため、37℃で回転蒸発により濃縮する。
【００３０】
2019513713.tif 000007
【００３１】
研究により、配列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Alaは腫瘍血管形成の阻害作用を有することを発見した。アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）配列は、インテグリンの重要なリガンドであるため、 RGD 配列を含むポリペプチドGly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspもインテグリンを特異的に識別することができる。本発明の血管新生阻害剤ポリペプチドは、血管形成阻害作用を有する配列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-AlaのC端にインテグリンファミリーに親和性及び結合能力を有する、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）を含むGly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 配列に接続することにより、インテグリンに親和性及び結合能力を有するポリペプチドを構築する。同時に、該インテグリンターゲットの血管新生阻害剤ポリペプチドのN端に対してポリエチレングリコール修飾を行って最適化する。最適化した配列はmPEG-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspであり、その中にPEG及び13個のアミノ酸のポリペプチドを含み、分子におけるRGD配列の作用ターゲットはインテグリンαvβ3及びα5β1であるが、主要な結合ターゲットはインテグリンαvβ3であり、該配列における新生血管阻害配列に結合することにより、腫瘍新生血管形成を効果的に阻害することができ、腫瘍増殖及び移転の効果を達成することができる。ポリエチレングリコール（PEG）は、独特な物理的及び化学的特性を有する高分子ポリマーであり、良好な生体適合性を有し、非毒性、非抗原性である。タンパク質又はポリペプチド薬をPEGで修飾した後、その主要な生物学的機能を保持することができ、また、PEGによる修飾によりタンパク質及びポリペプチド系薬物に多種の優れた性能を与えることができる。即ち、（1）安定性を向上させ、血漿半減期を延長すること;（2）免疫原性及び抗原性を低減させること;（3）副作用を減らすこと;（4）加水分解酵素によって分解される可能性を減少させ、腎臓で浄化される速度を低減させること;（5）薬物の体内での分布及び動力学的挙動を改善することである。
【００３２】
ポリペプチドHM-1は、ポリエチレングリコールにより修飾された後、ターゲットが変化せず、ポリペプチド分子の体内での半減期が延長され、クリアランスが低く、免疫原性及び抗原性が低下し、抗腫瘍活性が保持され、投与頻度が減少し、ポリエチレングリコールにより修飾されたHM-1は、元の1日1回の投与から2〜3日に1回の投与になる。
【００３３】
発明者は、多くの実験を行うことにより、該ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤は、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）の増殖、遊走を顕著に阻害することができ、ヒト子宮頸がんHeLa細胞、ヒト結腸がんHCT 116細胞、ヒト神経膠腫U87細胞、ヒト乳がんMDA-MB-231等の腫瘍細胞の増殖に対して顕著な阻害作用を有することを発見した。
【００３４】
発明者は、多くの実験を行うことにより、該ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤は、血管新生系炎症を効果的に治療することができることを発見した。実験により、本発明は、RAにおけるパンヌス形成過程での新生血管内皮をターゲットとして、新生血管の形成を阻害することができ、関節リウマチの予防・治療効果を達成することを証明した。さらに、アジュバントラット関節リウマチ及びDBA/1マウスコラーゲン型関節リウマチモデルにより、本発明は、顕著な関節リウマチの治療効果を有し、且つ副作用が少なく、用量が少なくコストが低いことを証明した。
【００３５】
発明者は、多くの実験を行うことにより、該ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤は、ヒト網膜血管内皮細胞（HRCEC）の増殖を阻害することができ、一定の範囲内で用量依存関係を示すことを発見した。血管新生阻害剤ポリペプチドのマウス角膜新生血管及びウサギ虹彩新生血管に対する作用により、本発明のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤は、いずれも角膜及び虹彩新生血管の増植を阻害することができ、角膜新生血管性眼疾患及び虹彩新生血管性眼疾患の治療薬に開発されるポテンシャルがあり、潜在的な新生血管性眼疾患の治療作用を有する。
【００３６】
脈絡膜は、眼球の後部に位置する。実験により血管新生阻害剤は脈絡膜の血流を改善できることが証明されているが、これは、投薬後に全身循環又は強膜-ブドウ膜-視神経経路によりできるだけ速く脈絡膜に到達することができることを示しており、加齢黄斑変性症（AMD）の脈絡膜新生血管形成に対して阻害作用を有し、早期AMD及び他の脈絡膜新生血管性疾患の予防又は治療への使用が期待され得る。また、ラット脈絡膜新生血管の形成を阻害することにより、加齢黄斑変性症を含む脈絡膜新生血管性眼疾患に対して一定の治療作用を有する。
【００３７】
本発明で設計されたポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤は、科学的で合理的であり、実行可能で効果的であり、ヒト腫瘍、様々な炎症及び新生血管性眼疾患の治療薬の製造に使用されることができ、この血管新生阻害剤の治療範囲を大幅に広げ、将来の薬物開発に新しいアイデアや見込みを提供する。
【００３８】
修飾前のポリペプチド HM-1の半減期は0.34時間であり、ポリエチレングリコールで修飾されたmPEG-HM-1の半減期は表7に示す。
【００３９】
2019513713.tif 000008
【発明の効果】
【００４０】
従来技術に比べて、本発明は以下の有益な効果を有する。
（1）タンパク質ポリペプチド系分子は、アミノ酸が変化する度に、新しい分子になる。これは生体高分子の特徴である。従って、ポリペプチド系分子を含む生体高分子にとっては、如何なる技術も通用できず、検討及び実験によりこの新しい分子に適合するか否かを確認する必要がある。本発明のポリペプチドは、本発明者によって設計されて発見された新しい分子であって、初めてポリエチレングリコールで修飾されたものであり、その効果は多くの試験を行ってようやく得られたものであって、推測されたものではない。本発明のポリエチレングリコール（PEG）で修飾された生成物も新しい分子に該当し、修飾前の分子とは活性の面で異なる効果を奏する。
（2）ポリペプチド分子は、分子量が小さいため、高分子PEGで修飾すると、その活性サイトがカバーされることで、活性が低下するか又は完全に失われる場合が多い。また、ポリペプチドは、PEGで修飾される時に、修飾率が低く、副生成物を生成する問題が生じることがあるが、これは予測できないものであり、異なるPEG分子の選択、異なる修飾条件の検討、最適化及び選別を行って初めて、活性に影響せず半減期を延長できるような理想的な分子を得ることができる。そのため、本発明では、分子量がそれぞれ5000、10000、20000及び40000のPEGを用いてポリペプチドを修飾する際に、修飾に影響する様々な条件（反応温度、反応時間、mPEGとHM-1とのモル比、緩衝液の種類、緩衝液のpH、緩衝液の濃度等）を連続最適化することにより、修飾率が高く、副生成物が少ない修飾反応条件を見つけた。
（3）本発明では、ポリペプチドHM-1を修飾するためのPEGの種類は、アミノ基を修飾するアシル化PEGの中のmPEG-SC及びmPEG2-NHS、並びに、アミノ基を修飾するアルキル化PEGの中のmPEG-ALD及びmPEG-bALDである。研究により、一般に、ポリペプチドは、PEGで修飾された後の生物活性が顕著に低下し、且つ半減期は必ずしも延長せず、種類や分子量の異なるPEGのHM-1の半減期及び生物活性に対する影響が異なることが分かった。それに対し、本発明では、ポリペプチドHM-1をPEGで修飾した生成物を多くのインビトロ及びインビボでの薬力学試験により選別して半減期が大幅に延長した修飾生成物が得られ、且つ修飾されたポリペプチドHM-1は、元の生物学的活性を依然として保持できる。
（4）本発明は、ポリペプチドHM-1をPEGで修飾した新しい分子mPEG-HM-1に関する。上記の4種類のポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤mPEG-HM-1に対して多くのインビトロ及びインビボでの活性研究を行うことにより、その多種の症状に対する治療作用を研究したところ、投与の頻度が減少した場合に、各修飾生成物はHM-1と同等又はそれ以上に良好な活性を保持できることが発見された。それにより、HM-1の社会的価値と経済的価値が拡大される。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。
【００４２】
実施例1
血管新生阻害剤であるポリペプチドHM-1の製造及び検査
ポリペプチドHM-1は、固相合成法により合成し、分取HPLCにより分離精製し、分析RP-HPLCにより純度を測定する。
ポリペプチドHM-1の固相合成法は、Fmoc-wang-resin又はFmoc-CTC-resinを出発原料とし、保護アミノ酸を用いてトリデカペプチドとなるようにジペプチドを順次接続し、ペプチド接続工程が完了した後、十分に洗浄し、ペプチド切断し、後処理することで血管新生阻害剤の粗生成物を得る。粗生成物を溶解し、分取高速液体クロマトグラフィーにより2回精製し、濃縮し凍結乾燥することで精製物を得、最後に3次精製によりポリペプチドの精製物を得る。合成効率を保証できると共に、生成物の純度を向上できる。
【００４３】
1. ペプチド接続のステップは、以下の通りである。
適量のFmoc-wang-resin又はFmoc-CTC-resinを秤量し、ガラス砂コア反応カラムに入れ、適量のCH2Cl2を加えて樹脂を十分に膨脹させる。
a. 脱保護:適量のヘキサヒドロピリジン/DMFの脱保護液を加え、一定時間反応させた後、脱保護液を吸引濾過により除去し、途中で、DMFで1回洗浄し、次いで適量の脱保護液を加えて反応させることでFmoc保護基を外す。
b. 洗浄:脱保護液を吸引濾過により除去し、DMFで樹脂を数回洗浄し、副生成物を十分に取り除く。
c. 縮合:ペプチド接続に用いられる保護アミノ酸及び活性化剤をDMF及び縮合剤に溶解し、均一に混合した後、温度を34℃前後に制御し、反応釜で十分に反応させる。
d. 洗浄:反応液を吸引濾過により除去し、DMFで樹脂を十分に洗浄することで副生成物を取り除く。
2. ペプチド切断ステップは以下の通りである。
吸引濾過により液を除去した樹脂を丸底フラスコに入れ、分解液を加え、合成したトリデカペプチド中間体を十分に分解し、砂コア濾過装置により樹脂とポリペプチドとを分離する。上記分解液の体積組成は、トリフルオロ酢酸:フェノール:水:ベンゾイルスルフィド:EDT=90:3:3:2:2である。
3. 後処理ステップは以下の通りである。
無水ジエチルエーテルを切断液に加えてポリペプチドを析出させた後、遠心分離し、上澄みを捨て、その後、無水ジエチルエーテルでポリペプチドを洗浄し、溶媒を吸引濾過により除去することでポリペプチド粗生成物を得る。
4. 精製のステップは以下の通りである。
a. 溶解:HM-1の粗生成物を精密計量し、精製水を適宜加えて 5-20g/Lを調製し、粒子がない透明溶液となるまで超音波撹拌する。
b. 濾過:HM-1の粗生成物溶液を砂コア濾過装置の 0.45μmの混合濾過膜で濾過する。
c. 調製:セミ分取高速液体クロマトグラフィーにより1次精製、2次精製及び3次精製することで、ポリペプチドの精製合格品を得る。移動相は、A相がアセトニトリル、B相が0.1%のTFA水溶液である。
【００４４】
（1）1次精製:10%のアセトニトリル及び90%の水（0.1%TFA添加）の溶液を用いて、流速60mL/minで10min洗い流すことで分取カラムを平衡化させる。輸液ポンプによりサンプリングする。溶出勾配を表8に示す。
【００４５】
2019513713.tif 000009
【００４６】
紫外線波長220nmにおける吸収値が200mvを超えた溶液を収集し、純度を測定し、純度が95%を超えた溶液をピーク成分として合わせ、2次分離精製に供する。
【００４７】
（2）2次精製:1次精製で得られたピーク成分を回転蒸発して有機溶媒を除去し、5%のアセトニトリル及び95%の水（0.1%TFA添加）の溶液を用いて流速60mL/minで10 min洗い流すことで分取カラムを平衡化させる。輸液ポンプによりサンプリングする。溶出勾配を表9に示す。
【００４８】
2019513713.tif 000010
【００４９】
紫外線波長220nmにおける吸収が200mvを超えた溶液を収集し、純度を測定し、純度が98%を超えた場合を合格とする。
【００５０】
d. 濃縮、濾過、凍結乾燥:合格溶液をロータリーエバポレーターにより37℃で減圧濃縮することで、残留溶媒及び一部の水分を除去する。最後に0.22μmの濾過膜で濾過し、濾液を凍結乾燥皿に入れ、凍結乾燥器で凍結乾燥することで精製物を得る。
【００５１】
実施例2
ポリエチレングリコールによるHM-1の修飾ステップ
一、mPEG-SCによるHM-1の修飾ステップ
1. mPEG-SC5kとHM-1の反応
0.25gのmPEG-SC5k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.0-8.5のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。
2. mPEG-SC10kとHM-1の反応
0.5gのmPEG-SC10k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.0-8.5のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。
3. mPEG-SC20kとHM-1の反応
1gのmPEG-SC20k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.0-8.5のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。
4. mPEG-SC40kとHM-1の反応
2gのmPEG-SC40k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.0-8.5のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。分子量範囲が500-40000のmPEG-SCであれば、本実施例の接続反応により修飾ポリペプチドを合成することができる。
【００５２】
二、mPEG2-NHSによるHM-1の修飾ステップ
1. mPEG2-NHS5kとHM-1の反応
0.25gのmPEG2-NHS5k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.5-9.5のホウ酸緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。
2. mPEG2-NHS10kとHM-1の反応
0.5gのmPEG2-NHS10k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.5-9.5のホウ酸緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。
3. mPEG2-NHS20kとHM-1の反応
1gのmPEG2-NHS20k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.5-9.5のホウ酸緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。
4. mPEG2-NHS40kとHM-1の反応
2gのmPEG2-NHS40k及び40mgのHM-1（モル比1.5：1）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 8.5-9.5のホウ酸緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩反応させる。分子量範囲が500-40000のmPEG2-NHSであれば、本実施例の接続反応により修飾ポリペプチドを合成することができる。
【００５３】
三、mPEG-ALD によるHM-1の修飾ステップ
1. mPEG-ALD5kとHM-1の反応
0.25gのmPEG-ALD5k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。
2. mPEG-ALD10kとHM-1の反応
0.5gのmPEG-ALD10k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのNaCNBH3をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。
3. mPEG-ALD20kとHM-1の反応
1gのmPEG-ALD20k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。
4. mPEG-ALD40kとHM-1の反応
2gのmPEG-ALD40k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。分子量範囲が500-40000のmPEG-ALDであれば、本実施例の接続反応により修飾ポリペプチドを合成することができる。
【００５４】
四、mPEG-bALD によるHM-1の修飾ステップ
1. mPEG-bALD5kとHM-1の反応
0.25gのmPEG-bALD5k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。
2. mPEG-bALD10kとHM-1の反応
0.5gのmPEG-bALD10k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。
3. mPEG-bALD20kとHM-1の反応
1gのmPEG-bALD20k、40mgのHM-1（モル比1.5：1 0）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。
4. mPEG-bALD40kとHM-1の反応
2gのmPEG-bALD40k、40mgのHM-1（モル比1.5：1）及び126.2mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）をそれぞれ秤量し、40mL-100mLの調製したpH 5.0-6.0のPBS緩衝液に入れ、4℃の条件下で、一晩十分に反応させる。分子量範囲が500-40000のmPEG-bALDであれば、本実施例の接続反応により修飾ポリペプチドを合成することができる。
【００５５】
実施例3
ポリエチレングリコール修飾HM-1の分離精製ステップ
一、分離
反応後のサンプルをセミ分取高速液体クロマトグラフィー（HPLC、北京創新通恒）により精製する。精製の条件は以下の通りである。
セミ分取カラム:YMC、250mm×20mm（5μmフィラー）;
移動相:A相はアセトニトリル、B相は水である。
サンプリング量:5mL;
流速:15mL/min;
測定波長:220nm;
溶出勾配:mPEG-SC5k-HM-1、mPEG2-NHS5k-HM-1、mPEG-ALD5k-HM-1及びmPEG-bALD5k-HM-1の溶出勾配を溶出勾配1（表10）に示す。mPEG-SC10k-HM-1、mPEG2-NHS10k-HM-1、mPEG-ALD10k-HM-1及びmPEG-bALD10k-HM-1の溶出勾配を溶出勾配2（表11）に示す。mPEG-SC20k-HM-1、mPEG2-NHS20k-HM-1、mPEG-ALD20k-HM-1及びmPEG-bALD20k-HM-1の溶出勾配を溶出勾配3（表12）に示す。mPEG-SC40k-HM-1、mPEG2-NHS40k-HM-1、mPEG-ALD40k-HM-1及びmPEG-bALD40k-HM-1の溶出勾配を溶出勾配4（表13）に示す。
【００５６】
2019513713.tif 000011
【００５７】
2019513713.tif 000012
【００５８】
2019513713.tif 000013
【００５９】
2019513713.tif 000014
【００６０】
目的ピーク溶液が流出するときに、遠心分離管で精製物を収集する。
【００６１】
二、精製
セミ分取HPLCにより収集した生成物をまず-70℃の低温冷蔵庫に置き一晩仮凍結した後、事前に冷却した凍結乾燥機にて、すべてが白色粉末として目視で確認するまで（30 h前後）凍結乾燥する。凍結乾燥生成物を回収し、生成物の重量を量ってから-20℃の冷蔵庫で保存し、同定する。
【００６２】
1. 生成物の純度分析
凍結乾燥後の生成物を分析高速液体クロマトグラフィーにより純度を分析する。分析条件は以下の通りである。
分析カラム:COSMOSIL、250mm×4.6mm（5μm フィラー）
移動相:A相は水（0.1%TFA添加）、B相はアセトニトリル（0.1%TFA添加）である。
サンプリング量:20μL
流速:1mL/min
測定波長:220nm
溶出勾配:表14に示す。
【００６３】
2019513713.tif 000015
【００６４】
2. 修飾生成物のSDS-PAGE 分析
基本操作は、《分子クローニング( 第二版 )》を参照されたい。濃縮ゲルの濃度は 5%、分離ゲルの濃度は15%、濃縮電圧は80 V、分離電圧は120 Vである。電気泳動の終了後、サンプルバンドについて、クマシーブリリアントブルーR250でタンパク質部分を染色し、染色後に脱色液に入れ、バックグラウンドが透明になった後、走査分析を行い、その後、BaI2でPEGを含有する部分を染色し、染色後に水に入れ、バックグラウンドが透明になった後、走査分析を行う。
【００６５】
実施例4
ポリエチレングリコール修飾血管新生阻害剤であるポリペプチド（mPEG-HM-1）の多種の腫瘍細胞に対する増殖阻害の試験
MTT法により多種の腫瘍細胞増殖に対するmPEG-HM-1の阻害活性を測定する。腫瘍細胞を37℃の5%CO2インキュベータ内で90%以上のコンフルエンスまで培養し、トリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を2×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃の5%CO2インキュベータ内で一晩培養する。mPEG-HM-1を培養液で各所定濃度に希釈する。ドセタキセルを培養液で最終濃度に希釈する。細胞が完全にプレートに接着した後、各希釈液をそれぞれ96ウェルプレート（100μL/ウェル）に加える。mPEG-HM-1希釈液を加えたものを投与群、ドセタキセルを加えたものを陽性対照群、いずれの薬物も加えなかった培養液を陰性対照群とする。37℃の5%CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに5mg/mLのMTTを20μL加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに150μLのDMSOを加えて溶解し、シェーカーで10 min軽く揺動して均一に混合する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、以下の算式により増殖阻害率（proliferation inhibition，PI）を算出する。
PI（%）=1-投与群/陰性群
【００６６】
実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、mean±SDによって表される。実験結果を表15〜18に示す。
【００６７】
2019513713.tif 000016
【００６８】
結果:陰性対照と比べて、mPEG -SC-HM-1は、多種の腫瘍細胞の増殖に対して比較的顕著な阻害作用を有する。そのうち、mPEG-SC20k-HM-1は、効果が最も高く、一部の腫瘍細胞に対する増殖阻害の効果が陽性薬に近く、本発明の有効な抗腫瘍薬の開発に一定の基礎を提供する。
【００６９】
2019513713.tif 000017
【００７０】
結果:陰性対照に比べて、mPEG2-NHS-HM-1は、多種の腫瘍細胞の増殖に対して比較的顕著な阻害作用を有する。そのうち、mPEG2-NHS20k-HM-1は、効果が最も高いが、大部分の腫瘍細胞に対する増殖阻害効果について、mPEG-SC20k-HM-1ほど高くなく、本発明の有効な抗腫瘍薬の開発の参考となる。
【００７１】
2019513713.tif 000018
【００７２】
結果:陰性対照に比べて、mPEG-ALD-HM-1は、多種の腫瘍細胞の増殖に対して顕著な阻害作用を有する。そのうち、mPEG-ALD10k-HM-1は、効果が最も高く、mPEG-SC-HM-1及びmPEG2-NHS-HM-1よりも優れており、一部の腫瘍細胞に対する増殖阻害効果は陽性薬を超え、本発明の有効な抗腫瘍薬の開発に良い見通しを提供する。
【００７３】
2019513713.tif 000019
【００７４】
結果:陰性対照に比べて、mPEG-bALD-HM-1は、多種の腫瘍細胞の増殖に対して顕著な阻害作用を有する。そのうち、mPEG-bALD10k-HM-1は、効果が最も高く、mPEG-ALD10k-HM-1に近く、本発明の有効な抗腫瘍薬の開発に良い見通しを提供する。
【００７５】
実施例5
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）に対するmPEG-HM-1の遊走阻害作用
10mg/mLのMatrigelをHUVEC専用培地により1：2で希釈した後、transwellチャンバー膜に塗布し、室温で空気乾燥させる。対数増殖期に培養したHUVEC細胞をトリプシン消化液で消化して収集し、PBSで2回洗浄した後、ブランクのHUVECs専用培地で再懸濁させる。顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を1×105/mLに調整し、各群の試験用液を調製した後、ブランクのHUVECs専用培地で100μLに希釈する。細胞を100μL/ウェルでtranswellチャンバーに接種し、各群の試験用液をチャンバーに加える。24ウェルプレートに5%ウシ胎児血清及び1%ECGSを含有する内皮細胞培養液0.6mLを加え、細胞を遊走するように刺激し、5% CO2、37℃で24時間培養する。ウェルにおける培養液を捨て、90%アルコールにより常温で30 min固定し、0.1%クリスタルバイオレットにより常温で10 min染色した後、清水でリンスし、綿棒を用いて上層にある遊走していない細胞をやさしく拭き取り、顕微鏡で観察し、4つの視野を選択し、撮影してカウントする。以下の算式により遊走阻害率（migration inhibition，MI）を算出する。
2019513713.tif 000020
ここで、Ntestは試験群の細胞遊走数、Ncontrolはブランク対照群の細胞遊走数である。
【００７６】
実験を3回独立して繰り返し、実験結果からmean±SDを算出し、統計T検定を行い、*P<0.05の場合に有意差があり、**P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。実験結果を表19〜表22に示す。
【００７７】
2019513713.tif 000021
【００７８】
結果:mPEG-SC-HM-1の作用により、遊走した内皮細胞数が顕著に減少する。ブランク対照群に比べて、5%ウシ胎児血清及び1%ECGSによって誘導されるHUVECの遊走を阻害することができる。mPEG-SC5k-HM-1は、40μg/mL及び50μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ51.22%及び55.73%に達する。mPEG-SC10k-HM-1は、60μg/mL及び70μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.31%及び58.53%に達する。mPEG-SC20k-HM-1は、80μg/mL及び90μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ52.93%及び60.87%に達する。mPEG-SC40k-HM-1は、100μg/mL及び110μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ52.69%及び56.21%に達する。
【００７９】
2019513713.tif 000022
【００８０】
結果:mPEG2-NHS-HM-1の作用により、遊走した内皮細胞数が顕著に減少する。ブランク対照群に比べて、5%ウシ胎児血清及び1%ECGSによって誘導されるHUVECの遊走を阻害することができる。mPEG2-NHS5k-HM-1は、40μg/mL及び50μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.21%及び54.18%に達する。mPEG2-NHS10k-HM-1は、60μg/mL及び70μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ51.11%及び60.40%に達する。mPEG2-NHS20k-HM-1は、80μg/mL及び90μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.53%及び58.07%に達する。mPEG2-NHS40k-HM-1は、100μg/mL及び110μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.13%及び55.20%に達する。
【００８１】
2019513713.tif 000023
【００８２】
結果:mPEG-ALD-HM-1の作用により、遊走した内皮細胞数が顕著に減少する。ブランク対照群に比べて、5%ウシ胎児血清及び1%ECGSによって誘導されるHUVECの遊走を阻害することができる。mPEG-ALD5k-HM-1は、40μg/mL及び50μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ51.94%及び59.63%に達する。mPEG-ALD10k-HM-1は、60μg/mL及び70μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.01%及び59.38%に達する。mPEG-ALD20k-HM-1は、80μg/mL及び90μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.72%及び60.82%に達する。mPEG-ALD40k-HM-1は、100μg/mL及び110μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.39%及び54.14%に達する。
【００８３】
2019513713.tif 000024
【００８４】
結果: mPEG-bALD-HM-1の作用により、遊走した内皮細胞数が顕著に減少する。ブランク対照群に比べて、5%ウシ胎児血清及び1%ECGSによって誘導されるHUVECの遊走を阻害することができる。mPEG-bALD5k-HM-1は、40μg/mL及び50μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ50.01%及び55.20%に達する。mPEG-bALD10k-HM-1は、60μg/mL及び70μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ55.76%及び60.38%に達する。mPEG-bALD20k-HM-1は、80μg/mL及び90μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ55.68%及び53.82%に達する。mPEG-bALD40k-HM-1は、100μg/mL及び110μg/mLの2つの用量下で、細胞遊走に対する阻害作用がブランク対照に比べて極めて顕著な有意差があり（**P<0.01）、阻害率は、それぞれ52.11%及び50.04%に達する。
【００８５】
実施例6
マウス脾臓リンパ球の増殖に対するmPEG-HM-1の影響
無菌条件下ででマウス脾臓を取り出し、ブランク1640培地で3回洗浄し、5mLシリンジのピストンを用いて脾臓を押しつぶし、その後200メッシュの篩で濾過し、単細胞懸濁液を調製し、遠心分離（1000 rpm×5 min）した後、上澄みを捨て、Tris-NH4Clで赤血球を破砕し、氷水浴で4 min静置し、遠心分離（1000 rpm×5 min）した後、上澄みを捨て、無菌PBSで細胞を2回洗浄する。最後に10%子牛血清のRPMI 1640培養液（5mL）を加えて細胞を懸濁させ、細胞をカウントし、細胞濃度を5×106個/mLに調整した後、96ウェル培養プレートで培養する。
【００８６】
試験では、ブランク対照群、コンカナバリンA（ConA）群、デキサメタゾン（Dex）群（0.02mg/mL）、mPEG-HM-1群を試験群とする。各群にそれぞれ100μL/ウェルで脾臓リンパ球懸濁液を加えた後、ブランク対照群にブランク1640培養液100μL、ConA群にConA（最終濃度:5μg/mL）、Dex群にDex、試験群に濃度の異なるmPEG-HM-1を加えた上でConA（最終濃度:5μg/mL）を加える。37℃の細胞インキュベータで48時間静置培養し、培養終了後に各ウェルに20μLのMTTを加え、引き続き4時間培養し、最後に各ウェルにおけるすべての溶液を捨て、各ウェルに100μLのDMSOを加え、振とうし、マイクロプレートリーダーにより570nmでのOD値を測定し、各ウェルに対し上記操作を5回繰り返す。結果を表23〜表26に示す。
【００８７】
2019513713.tif 000025
【００８８】
結果:分子量の異なるmPEG-SC-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖をある程度阻害することができる。そのうち、mPEG-SC10k-HM-1は、投与量が40μg/mLである場合に阻害率は30.57%に達する。mPEG-SC20k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は31.25%に達する。mPEG-SC40k-HM-1は、投与量が160μg/mLである場合に阻害率は30.48%に達する。また、各投与群の阻害作用には、一定の用量依存関係がある。
【００８９】
2019513713.tif 000026
【００９０】
結果:分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖をある程度阻害することができる。そのうち、mPEG2-NHS10k-HM-1は、投与量が40μg/mLである場合に阻害率は31.44%に達する。mPEG2-NHS20k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は36.82%に達する。mPEG2-NHS40k-HM-1は、投与量が160μg/mLである場合に阻害率は30.28%に達する。また、各投与群の阻害作用には、一定の用量依存関係がある。
【００９１】
2019513713.tif 000027
【００９２】
結果:分子量の異なるmPEG-ALD-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖をある程度阻害することができる。そのうち、mPEG-ALD5k-HM-1は、投与量が20μg/mLである場合に阻害率は30.42%に達する。mPEG-ALD10k-HM-1は、投与量が40μg/mLである場合に阻害率は32.29%に達する。mPEG-ALD20k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は35.85%に達する。mPEG-ALD40k-HM-1は、投与量が160μg/mLである場合に阻害率は30.56%に達する。また、各投与群の阻害作用には、一定の用量依存関係がある。
【００９３】
2019513713.tif 000028
【００９４】
結果:分子量の異なるmPEG-bALD-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖をある程度阻害することができる。そのうち、mPEG-bALD10k-HM-1は、投与量が40μg/mLである場合に阻害率は32.75%に達する。mPEG-bALD20k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は35.82%に達する。mPEG-bALD40k-HM-1は、投与量が160μg/mLである場合に阻害率は30.12%に達する。また、各投与群の阻害作用には、一定の用量依存関係がある。
【００９５】
実施例7
マウス腹腔マクロファージのIL-1β産生に対するmPEG-HM-1の影響
（1）IL-1βの産生:マウスに1mLのブロス培地（6 %）澱粉を腹腔内注射し、3日後、無菌条件下ででマウス腹腔マクロファージを取り、1640培地で2回洗浄し、細胞濃度を2×106個/mLに調整した後、1mL/ウェルで24ウェル培養プレートに注入し、細胞インキュベータに置き3時間インキュベートし、30 min毎に振とうすることで細胞を完全にプレートに接着させる。次いで、培養液で2回洗浄することでプレートに接着していない細胞を除去する。ブランク群はPBSを加え、陽性群は陽性薬デキサメタゾン（Dex）を加え、モデル群は投与せず、試験群は、濃度が低、中、高の3種類のmPEG-HM-1であり、投与後、48時間継続的に培養した後、1000 r/minで15 min遠心分離する。上澄みをIL-1β活性測定サンプルとして回収する。
（2）IL-1βの含有量測定:R&D公司のマウスIL-1β酵素結合免疫吸着測定（ELISA）キットを用いて測定し、キットの説明書に従って以下の通り操作する。即ち、測定サンプル及び濃度の異なる標準品を、それぞれプレートシールで反応ウェルをカバーし、37℃で90 minインキュベートし、プレートを4回洗浄し、ビオチン化抗体作動流体（100μL/ウェル）を加え、プレートシールで反応ウェルをカバーし、37℃で60 minインキュベートし、プレートを4回洗浄し、酵素コンジュゲート作動流体（100μL/ウェル）を加え、プレートシールで反応ウェルをカバーし、37℃で30 minインキュベートし、プレートを4回洗浄し、顕色剤（100μL/ウェル）を加え、暗所で37℃で10-20 minインキュベートし、停止液（100μL/ウェル）加え、均一に混合した後、OD450値を測定する。結果を表27〜表30に示す。
【００９６】
2019513713.tif 000029
【００９７】
結果:分子量の異なるmPEG-SC-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖に対して比較的顕著な阻害作用を有し、陰性群に比べて、顕著な有意差がある。そのうち、mPEG-SC20k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は45.33%に達し、一定の用量依存関係がある。
【００９８】
2019513713.tif 000030
【００９９】
結果:分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖に対して比較的顕著な阻害作用を有し、陰性群に比べて、顕著な有意差がある。そのうち、mPEG-SC20k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は45.33%に達し、一定の用量依存関係がある。
【０１００】
2019513713.tif 000031
【０１０１】
2019513713.tif 000032
【０１０２】
結果: 種類や分子量の異なるmPEG-HM-1は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖に対して比較的顕著な阻害作用を有する。そのうち、mPEG-ALD10k-HM-1及びmPEG-bALD10k-HM-1は、投与量が40μg/mLである場合に阻害率は50%以上に達する。
【０１０３】
実施例8
キシレンによるマウスの耳腫脹に対するmPEG-HM-1の影響
昆明マウスを準備し、生理食塩水群をブランク対照群、アスピリン群（200mg/kg）を陽性対照群、mPEG-HM-1投与群を試験群とする。マウスに対して１日1回、5日間連続して注射投与する。ブランク対照群に対して等体積の生理食塩水を投与する。最終投与の1時間後、マウスの右耳の両面にキシレン0.05mLを塗布して炎症を誘発し、左耳には塗布せずに正常耳とする。2時間後に頸椎脱臼でマウスを死亡させ、耳介に沿って両耳を切り、イヤーパンチで耳ピースを取り、重さを測り、以下の算式で腫脹度及び腫脹率を算出する。
腫脹度=右耳ピースの重さ-左耳ピースの重さ
腫脹率=（腫脹度／左耳ピースの重さ）×100%
試験結果に対して統計t検定を行い、*P<0.05の場合に有意差があり、**P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。結果を表31〜34に示す。
【０１０４】
2019513713.tif 000033
【０１０５】
結果:分子量の異なるmPEG-SC-HM-1は、いずれもキシレンによるマウスの耳腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有する。mPEG-SC5k-HM-1は、投与量が20mg/kgである場合に阻害率は32.10%に達する。mPEG-SC10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に阻害率は35.20%に達する。mPEG-SC20k-HM-1は、投与量が80mg/kgである場合に阻害率は38.58%に達する。mPEG-SC40k-HM-1は、投与量が160mg/kgである場合に阻害率は37.01%に達する。また、これらの阻害作用には、用量依存関係がある。
2019513713.tif 000034
【０１０６】
結果:分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1は、いずれもキシレンによるマウスの耳腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有する。mPEG2-NHS5k-HM-1は、投与量が20mg/kgである場合に阻害率は30.23%に達する。mPEG2-NHS10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に阻害率は33.19%に達する。mPEG2-NHS20k-HM-1は、投与量が80mg/kgである場合に阻害率は35.92%に達する。mPEG2-NHS40k-HM-1は、投与量が160mg/kgである場合に阻害率は32.26%に達する。また、これらの阻害作用には、用量依存関係がある。
【０１０７】
2019513713.tif 000035
【０１０８】
結果:分子量の異なるmPEG-ALD-HM-1は、いずれもキシレンによるマウスの耳腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有する。mPEG- ALD 5k-HM-1は、投与量が20mg/kgである場合に阻害率は32.10%に達する。mPEG- ALD 10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に阻害率は41.58%に達する。mPEG- ALD 20k-HM-1は、投与量が80mg/kgである場合に阻害率は39.47%に達する。mPEG- ALD 40k-HM-1は、投与量が160mg/kgである場合に阻害率は32.09%に達する。また、これらの阻害作用には、用量依存関係がある。
【０１０９】
2019513713.tif 000036
【０１１０】
結果:分子量の異なるmPEG-bALD-HM-1は、いずれもキシレンによるマウスの耳腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有する。mPEG-bALD 5k-HM-1は、投与量が20mg/kgである場合に阻害率は31.08%に達する。mPEG-bALD 10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に阻害率は40.88%に達する。mPEG- ALD 20k-HM-1は、投与量が80mg/kgである場合に阻害率は37.76%に達する。mPEG-bALD 40k-HM-1は、投与量が160mg/kgである場合に阻害率は33.09%に達する。また、これらの阻害作用には、用量依存関係がある。
【０１１１】
実施例9
コラーゲン誘導マウス関節炎動物モデルに対するmPEG-HM-1の体内免疫保護作用
コラーゲン型マウス関節炎動物モデルを構築し、マウスのコラーゲン誘導性関節炎（collagen induced arthritis，CIA）に対するmPEG-HM-1の治療作用を研究する。マウスを試験動物として使用する。具体的には、SPFレベルのDBA/1マウス（雄性;7-8週齢;体重18-22g）をそれぞれ正常対照群、モデル対照群、mPEG-HM-1群、陽性薬対照群（メトトレキセート1mg/kg）にランダムに分ける。正常群以外の各試験群に対して、0日目に以下の方法により、マウスCIAモデルを構築する。即ち、鶏の軟骨に由来するIII型コラーゲン（cIII）を0.1mol/Lの酢酸で溶解して4mg/mLの溶液を調製し、4℃の冷蔵庫に一晩置く。試験当日に、III型コラーゲンと、4mg/mLのMyeobaeterium tuberculosis strain H37Rvを含有する完全フロイントアジュバント（CFA）とを等体積で十分に乳化させ、DBA/1マウスを麻酔した後、各匹の尾部に乳化剤50μLを皮下注射することで感作し、21日間後に4mg/mLのIII型コラーゲン（cIII）と不完全フロイントアジュバント（IFA）とを等体積で十分に乳化させた後、同用量の乳化剤で尾部に再免疫化を行う。モデル構築後の30日目から各群に以下のように皮下注射で投与する。即ち、
mPEG-HM-1群:3日に1回
陽性薬対照群（メトトレキセート1mg/kg）:5日に1回;3回連続
正常対照群及びモデル対照群（生理食塩水）:10日連続
モデル構築後の21日目から70日目まで3日毎に体重を測り、関節に対してスコアリングを行い、左右の後足の足首直径をそれぞれ測定することにより薬物のマウスコラーゲン型関節炎に対する影響を観察する。70日目に、頸椎脱臼でマウスを死亡させる。
【０１１２】
以下の基準で関節炎を評価する。
（1）関節スコアリング: 0〜4の5段階で四肢に対してスコアリングを行う。
0=紅斑又は赤い腫れ無し
1=僅かな紅斑又は腫脹;1つの前/後趾関節に紅斑又は腫脹が発生する
2=2以上の趾に紅斑又は腫脹が発生する
3=足首又は手首関節以下の足に腫脹が発生する
4=足首関節を含む足全体に腫脹が発生する
マウスの四足のそれぞれに対してスコアリングを行い、最高スコアは16である。モデル構築後の21日目〜70日目の間に、3日毎に関節スコアリングを行い、結果を記録する。
（2）足首直径の測定
モデル構築前及びモデル構築後の21日目〜70日目の間に3日毎にノギスでマウスの左右足首の内側から外側までの直径及び足首厚さを測定し、結果を記録する。
【０１１３】
試験を3回独立して繰り返し、試験結果はmean±SDによって表される。統計T検定を行い、*P<0.05の場合に有意差があり、**P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。
【０１１４】
2019513713.tif 000037
【０１１５】
結果:モデル構築後のマウスと正常マウスとを比較する。マウス尾部に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射し、21日後、尾部に不完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射すると、免疫後27日目に、CIAマウス足に赤い腫れが発生し、関節炎の指数スコアが増加する。モデル群は、45-60日目に腫脹はピークであり、35日目から体重が殆ど増加しなくなり、後期にはやや低下する。分子量の異なるmPEG-SC-HM-1であっても、コラーゲン誘導マウス関節炎動物モデルにおいて体内免疫保護作用を発揮する。陽性対照群、mPEG-SC-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれも極めて顕著な有意差を示している（p**<0.01）。mPEG-SC20k-HM-1群は、四肢のスコアがモデル対照群よりも明らかに低く、保護作用が最も顕著である。
【０１１６】
2019513713.tif 000038
【０１１７】
結果:モデル構築後のマウスと正常マウスとを比較する。マウス尾部に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射し、21日後、尾部に不完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射すると、免疫後27日目に、CIAマウス足に赤い腫れが発生し、関節炎の指数スコアが増加する。モデル群は、45-60日目に腫脹はピークであり、35日目から体重が殆ど増加しなくなり、後期にはやや低下する。分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1であっても、コラーゲン誘導マウス関節炎動物モデルにおいて体内免疫保護作用を発揮する。陽性対照群、mPEG2-NHS-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれも極めて顕著な有意差を示している（p**<0.01）。mPEG2-NHS20k-HM-1群は、四肢のスコアがモデル対照群よりも明らかに低く、保護作用が最も顕著である。
【０１１８】
2019513713.tif 000039
【０１１９】
結果:モデル構築後のマウスと正常マウスとを比較する。マウス尾部に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射し、21日後、尾部に不完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射すると、免疫後27日目に、CIAマウス足に赤い腫れが発生し、関節炎の指数スコアが増加する。モデル群は、45-60日目に腫脹はピークであり、35日目から体重が殆ど増加しなくなり、後期にはやや低下する。分子量の異なるmPEG-ALD-HM-1であっても、コラーゲン誘導マウス関節炎動物モデルにおいて体内免疫保護作用を発揮する。陽性対照群、mPEG-ALD-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれも極めて顕著な有意差を示している（p**<0.01）。mPEG-ALD10k-HM-1群は、四肢のスコアがモデル対照群よりも明らかに低く、保護作用が最も顕著である。
【０１２０】
2019513713.tif 000040
【０１２１】
結果:モデル構築後のマウスと正常マウスとを比較する。マウス尾部に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射し、21日後、尾部に不完全フロイントアジュバントとコラーゲンとを等体積で混合した乳化剤を皮下注射すると、免疫後27日目に、CIAマウス足に赤い腫れが発生し、関節炎の指数スコアが増加する。モデル群は、45-60日目に腫脹はピークであり、35日目から体重が殆ど増加しなくなり、後期にはやや低下する。分子量の異なるmPEG-bALD-HM-1であっても、コラーゲン誘導マウス関節炎動物モデルにおいて体内免疫保護作用を発揮する。陽性対照群、mPEG-bALD-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれも極めて顕著な有意差を示している（p**<0.01）。mPEG-bALD10k-HM-1群は、四肢のスコアがモデル対照群よりも明らかに低く、保護作用が最も顕著である。
【０１２２】
実施例10
アジュバントラット関節炎動物モデルに対するmPEG-HM-1の体内免疫保護作用
アジュバントラット関節炎動物モデルを構築し、mPEG-HM-1のアジュバント関節炎（Adjuvantarthritis，AA）ラットに対する治療作用を研究する。ラットを試験動物として使用する。具体的には、SPFレベルのSDラット（雄性;体重140-160g）をそれぞれ正常対照群、モデル対照群、mPEG-HM-1群及び陽性薬対照群（メトトレキセート1mg/kg）にランダムに分ける。正常群以外の各試験群に対して、0日目に以下の方法によりラットAAモデルを構築する。即ち、ラットの左側の後足のつま先に不活性化されたヒト型結核菌（H37RA，10mg/mL）を含む完全フロイントアジュバント0.08mLを注射してラットアジュバント関節炎モデルを構築する。モデル構築後の10日目から各群に以下のように皮下注射で投与する。即ち、
mPEG-HM-1:3日に1回
陽性薬対照群（メトトレキセート1mg/kg）:5日に1回;3回連続
正常対照群及びモデル対照群（生理食塩水）:10日連続
モデル構築後の8，11，14，17，20，23及び26日目にそれぞれ関節に対してスコアリングを行い、左右の後足の足首直径をそれぞれ測定することにより薬物のラットアジュバント関節炎に対する影響観察する。
【０１２３】
以下の基準で関節炎を評価する。
（1）関節スコアリング: 0〜4の5段階で四肢に対してスコアリングを行う。
0=紅斑又は赤い腫れ無し
1=僅かな紅斑又は腫脹;1つの前/後趾関節に紅斑又は腫脹が発生する
2=2以上の趾に紅斑又は腫脹が発生する
3=足首又は手首関節以下の足に腫脹が発生する
4=足首関節を含む足全体に腫脹が発生する
ラットの四足のそれぞれに対してスコアリングを行い、最高スコアは16である。モデル構築後の8，11，14，17，20，23及び26日目にそれぞれ関節スコアリングを行い、結果を記録する。
（2）足首直径の測定
モデル構築前及びモデル構築後の8，11，14，17，20，23及び26日目にそれぞれノギスでラットの左右足首の内側から外側までの直径及び足首厚さを測定し、結果を記録する。試験を3回独立して繰り返し、試験結果はmean±SDによって表される。統計T検定を行い、*P<0.05の場合に有意差があり、**P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。
【０１２４】
2019513713.tif 000041
【０１２５】
結果:モデル構築後のラットと正常ラットとを比較する。ラットの左後のつま先に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントを注射した後、左後足に原発性関節炎が迅速に生じ、顕著な腫脹が発生し、爛れを伴う。約10日後に、右後足に続発性関節炎が発生し始め、スコアが徐々に高くなる。耳部血管過形成が顕著であると同時に、赤い腫れが顕著であり、尾部関節に腫脹が発生する。分子量の異なるmPEG-SC-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれもアジュバントラット関節炎動物モデルに対して一定の体内免疫保護作用を発揮することができ、そのうち、mPEG-SC10k-HM-1の効果が最も顕著である。
【０１２６】
2019513713.tif 000042
【０１２７】
結果:モデル構築後のラットと正常ラットとを比較する。ラットの左後つま先に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントを注射した後、左後足に原発性関節炎が迅速に生じ、顕著な腫脹が発生し、爛れを伴う。約10日後に、右後足に続発性関節炎が発生し始め、スコアが徐々に高くなる。耳部血管過形成が顕著であると同時に、赤い腫れが顕著であり、尾部関節に腫脹が発生する。分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれもアジュバントラット関節炎動物モデルに対して一定の体内免疫保護作用を発揮することができ、そのうち、mPEG2-NHS10k-HM-1の効果が最も顕著である。
【０１２８】
2019513713.tif 000043
【０１２９】
結果:モデル構築後のラットと正常ラットとを比較する。ラットの左後つま先に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントを注射した後、左後足に原発性関節炎が迅速に生じ、顕著な腫脹が発生し、爛れを伴う。約10日後に、右後足に続発性関節炎が発生し始め、スコアが徐々に高くなる。耳部血管過形成が顕著であると同時に、赤い腫れが顕著であり、尾部関節に腫脹が発生する。分子量の異なるmPEG-ALD-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれもアジュバントラット関節炎動物モデルに対して一定の体内免疫保護作用を発揮することができ、そのうち、mPEG-ALD10k-HM-1の効果が最も顕著である。
【０１３０】
2019513713.tif 000044
【０１３１】
結果:モデル構築後のラットと正常ラットとを比較する。ラットの左後つま先に不活性化されたヒト型結核菌を含む完全フロイントアジュバントを注射した後、左後足に原発性関節炎が迅速に生じ、顕著な腫脹が発生し、爛れを伴う。約10日後に、右後足に続発性関節炎が発生し始め、スコアが徐々に高くなる。耳部血管過形成が顕著であると同時に、赤い腫れが顕著であり、尾部関節に腫脹が発生する。分子量の異なるmPEG-bALD-HM-1群は、モデル群に比べて、いずれもアジュバントラット関節炎動物モデルに対して一定の体内免疫保護作用を発揮することができ、そのうち、mPEG-bALD10k-HM-1の効果が最も顕著である。
【０１３２】
実施例11
カラギーナン誘導ラット足趾腫脹急性炎症に対するmPEG-HM-1の影響
SDラットを取り、ブランクモデル群、デキサメタゾン陽性群（5mg/ kg）及びmPEG-HM-1試験群に分ける。毎日1回注射投与し、モデル群に等体積の生理食塩水を3日連続して投与し、正常に給餌する。最終投与後の1時間目に、右後足の足裏に1%カラギーナン0.1mLを皮下注射することで炎症を誘導し、炎症誘導後の1時間、3時間、5時間、7時間にそれぞれ足体積を測定する。以下の算式により足腫脹度を算出する。
足腫脹度（mL）=炎症誘導後の足体積−炎症誘導前の足体積
こぼれた液体のミリリットル数を記録する（方法:右関節の突起箇所に対しボールペンで測定マークとして円を描き、後肢が装置外に露出し且つ円が描かれた箇所が液面と重なり合うように、各ラットの右後足を体積測定装置内に順次入れる。足が液体に入ると、液面が高くなり、こぼれた液体の体積をラットの右後足の体積として各ラットの右後足の正常体積を測定する）。
【０１３３】
2019513713.tif 000045
【０１３４】
結果:モデル構築後、各群のラットの足趾部は迅速に腫脹し、約3〜5時間目に腫脹はピークに達し、7時間目から消失し始める。分子量の異なるmPEG-SC-HM-1群は、いずれもカラギーナン誘導ラット足趾腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有し、且つ高用量群の効果が低用量群よりもよく、そのうち、mPEG-SC20k-HM-1は、投与量が80mg/kgである場合に効果が最も顕著である。
【０１３５】
2019513713.tif 000046
【０１３６】
結果:モデル構築後、各群のラットの足趾部は迅速に腫脹し、約3〜5時間目に腫脹はピークに達し、7時間目から消失し始める。分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1群は、いずれもカラギーナン誘導ラット足趾腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有し、且つ高用量群の効果が低用量群よりもよく、そのうち、mPEG2-NHS10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に効果が最も顕著である。
【０１３７】
2019513713.tif 000047
【０１３８】
結果:モデル構築後、各群のラットの足趾部は迅速に腫脹し、約3〜5時間目に腫脹はピークに達し、7時間目から消失し始める。分子量の異なるmPEG-ALD-HM-1群は、いずれもカラギーナン誘導ラット足趾腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有し、且つ高用量群の効果が低用量群よりもよく、そのうち、mPEG2-ALD10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に効果が最も顕著である。
【０１３９】
2019513713.tif 000048
【０１４０】
結果:モデル構築後、各群のラットの足趾部は迅速に腫脹し、約3〜5時間目に腫脹はピークに達し、7時間目から消失し始める。分子量の異なるmPEG-bALD-HM-1群は、いずれもカラギーナン誘導ラット足趾腫脹に対して比較的顕著な阻害作用を有し、且つ高用量群の効果が低用量群よりもよく、そのうち、mPEG2-bALD10k-HM-1は、投与量が40mg/kgである場合に効果が最も顕著である。
【０１４１】
実施例12
ヒト網膜血管内皮細胞（HRCEC）に対するmPEG-HM-1の増殖阻害作用
MTT法により、血管新生阻害剤であるポリペプチドの、ヒト網膜血管内皮細胞に対する増殖阻害活性を測定する。HRCEC細胞を37℃の5%CO2インキュベータ内で密度90%以上まで培養し、トリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を3.0×104個/mLに調整した後、細胞懸濁液を100μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃の5%CO2インキュベータ内で一晩培養する。細胞が完全にプレートに接着した後、血管新生阻害剤であるポリペプチドを加えたものを投与群、Avastiを加えたものを陽性対照群、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、培養液でそれぞれの所定濃度に希釈する。各希釈液をそれぞれ96ウェルプレート（100μL/ウェル）に加え、37℃の5%CO2インキュベータで48時間インキュベートする。96ウェルプレートの各ウェルに5mg/mLのMTTを20μL加え、引き続き4時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに100μLのDMSOを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長570nm、参照波長630nmで吸光度値を測定し、以下の算式により増殖阻害率（proliferation inhibition，PI）を算出する。
PI（%）=1-投与群/陰性群
【０１４２】
実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、mean±SDによって表される。統計T検定を行い、*P<0.05の場合に有意差があり、**P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。結果を表47に示す。
【０１４３】
2019513713.tif 000049
【０１４４】
結果:分子量の異なるmPEG-SC-HM-1は、いずれもHRCECの増殖に対して顕著な阻害作用を有し、且つ用量依存関係を示し、高用量群の阻害率は陽性薬に近い。そのうち、mPEG-SC10k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は68.84%に達し、陽性薬よりもやや高い。
【０１４５】
2019513713.tif 000050
【０１４６】
結果:分子量の異なるmPEG2-NHS-HM-1は、いずれもHRCECの増殖に対して顕著な阻害作用を有し、用量依存関係を示し、高用量群の阻害率は陽性薬に近い。そのうち、mPEG2-NHS10k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は65.13%に達し、陽性薬よりもやや高い。
【０１４７】
2019513713.tif 000051
【０１４８】
結果:分子量の異なるmPEG-ALD-HM-1は、いずれもHRCECの増殖に対して顕著な阻害作用を有し、用量依存関係を示し、高用量群の阻害率は陽性薬に近い。そのうち、mPEG-ALD10k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は73.89%に達し、mPEG-ALD20k-HM-1は、投与量が100μg/mLである場合に阻害率は68.15%に達し、陽性薬よりもやや高い。
【０１４９】
2019513713.tif 000052
【０１５０】
結果:分子量の異なるmPEG-bALD-HM-1は、いずれもHRCECの増殖に対して顕著な阻害作用を有し、用量依存関係を示し、高用量群の阻害率は陽性薬に近い。そのうち、mPEG-bALD10k-HM-1は、投与量が80μg/mLである場合に阻害率は75.19%に達し、mPEG-ALD20k-HM-1は、投与量が100μg/mLである場合に阻害率は69.12%に達し、陽性薬よりもやや高い。
【０１５１】
実施例13
BALB/cマウス角膜新生血管に対するmPEG-HM-1作用
（1）BALB/cマウスアルカリ火傷誘導角膜新生血管モデルの構築
マウスを5匹/群でmPEG-HM-1実験群及び対照群にランダムに分ける。アルカリ火傷を加えた後、それぞれmPEG-HM-1及び生理食塩水を硝子体注射により投与（1日1回、1週間）する。アルカリ火傷を加えた後の1、7、14日目に細隙灯顕微鏡下で各群角膜の炎症反応及び新生血管の状況を観察する。アルカリ火傷を加えた後の14日目に前眼部撮影付きの細隙灯顕微鏡下で撮影し各群角膜の新生血管形成状況を記録した後、頸椎脱臼で全てのマウスを死亡させ、眼球を摘出し、生理食塩水で洗い流して血痕を除去し、4%パラホルムアルデヒドで1.5時間固定し、30%スクロースを含むPBSに入れて一晩脱水した後、OCT凍結組織切片作製用包埋剤で包埋し、-80℃の冷蔵庫中に保存し、8μmの凍結切片を作製し、免疫組織化学法によりCD31の発現を検出する。
（2）角膜組織微小血管密度の定量測定
微小血管密度（Microvessel density，MVD）は、血管形成を評価する指標である。抗CD31抗体免疫組織化学法により血管内皮細胞を標識し、単位面積当たりの微小血管数をカウントすることにより、新生血管形成の程度を評価する。微小血管の統計は、以下のように行われる。顕微鏡下で角膜組織における隣接する組織の境界が明確で、琥珀色若しくは褐色に染色された内皮細胞又は細胞集団を観察し新生血管としてカウントする。10×20の顕微鏡下で切片全体における新生血管の数をカウントし、角膜組織切片を撮影した後、画像処理ソフトウェアImage Jにより角膜組織切片全体の面積を算出し、切片全体における新生血管の密度を求める。
【０１５２】
実験を3回独立して繰り返し、実験結果は、mean±SDによって表される。統計T検定を行い、*P<0.05の場合に有意差があり、**P<0.01の場合に極めて顕著な有意差がある。結果を表51に示す。
【０１５３】
2019513713.tif 000053
【０１５４】
試験の結果から明らかなように、種類や分子量の異なるmPEG-HM-1は、いずれも角膜新生血管の成長を顕著に阻害することができる。そのうち、mPEG-SC10k-HM-1の阻害率は52.17%に達し、mPEG2-NHS10k-HM-1の阻害率は50.07%に達し、mPEG-ALD10k-HM-1の阻害率は53.83%に達し、mPEG-bALD10k-HM-1の阻害率は52.03%に達する。
【０１５５】
実施例14
イエウサギの虹彩新生血管に対するmPEG-HM-1の作用
577nmのアルゴンイオンレーザーによりイエウサギの網膜の主分枝静脈を凝固・閉塞させ、蛍光眼底血管造影(FFA)により静脈が成功裏に閉塞されたことを確認する。5-12日後に、蛍光虹彩血管造影(IFA)により、虹彩血管は、正常対照群に比べてフルオレセイン漏出が顕著であるが、これは虹彩新生血管化動物モデル(NVI)の形成を実証している。
【０１５６】
モデル構築後に51眼を取り、3眼/群で陰性対照群、mPEG-SC-HM-1治療群、mPEG2-NHS-HM-1治療群、mPEG-ALD-HM-1治療群、mPEG-bALD-HM-1治療群にランダムに分ける。各群に対して、それぞれ生理食塩水、mPEG-HM-1（投与量は表52を参照）を硝子体注射により1日1回で2週間投与する。3週目に光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察する。
【０１５７】
2019513713.tif 000054
【０１５８】
結果:光学顕微鏡から分かるように、虹彩前表面は、主に線維組織からなる線維血管膜残留物であり、僅かな開放血管腔がある。虹彩基質内に壊死細胞及び細胞破片である血管残留物が認められる。光学顕微鏡から分かるように、対照眼の虹彩表面は、分枝及び潜在管腔のある線維血管膜繊維血管膜であり、治療群虹彩の超微細構造に一連の退行性変化があり、虹彩基質中央部の大血管の内皮細胞に正常な細胞核、細胞質及び細胞間結合があり、虹彩基質及び虹彩前表面に毛細血管の残留物があり、周囲に細胞破片及び浸潤してきたマクロファージがあり、潜在管腔の毛細血管及び退化した壁細胞がなく、これは新生血管の消失を示している。
【０１５９】
試験の結果から明らかなように、いずれのmPEG-HM-1もイエウサギ虹彩新生血管の形成を阻害すると共に、形成した血管を退化させることができる。
【０１６０】
実施例15
ラット脈絡膜新生血管に対するmPEG-HM-1の作用
846複合麻酔薬0.5mL/kgを腹腔内注射することで6-8週齢の雄性BNラットを十分に麻酔させ、レーザー光凝固の5 min前に複合トロピカミド点眼薬を1回点眼し、両眼の瞳孔を十分に拡張させる。動物を固定し、-53.00D角膜コンタクトレンズの補助下で、視神経乳頭の周りであって視神経乳頭から2PDの位置に等距離でクリプトンイオンレーザー光凝固を行う（光凝固スポット:合計8個;レーザー波長:647.1nm;パワー:350 mW;光凝固スポット直径及び時間:50μm及び0.05 s）。光凝固の直後に眼底撮影を行う。光凝固後の3、7、14、21、28日にそれぞれFFA、組織の病理学的検査及び透過型電子顕微鏡検査を行う。
【０１６１】
眼底撮影及びFFA検査により、光凝固後の21日目に光凝固スポットのフルオレセイン漏出がピークに達することが明らかになる。組織病理学的検査を行う。光凝固後の21日目に、光学顕微鏡下でCNVは顕著な線維血管増殖を示しており、大量の新生血管が認められ、管腔内に赤血球が見られる。また、顕微鏡下で脈絡膜メラニン色素細胞間に毛細血管が凝集性変化し、内皮細胞が凝集することが観察される。これは、21日後にラット脈絡膜新生血管モデルが形成されたことを示している。
【０１６２】
モデル構築後のラットを5匹/群で陰性対照群、mPEG-SC-HM-1治療群、mPEG2-NHS-HM-1治療群、mPEG-ALD-HM-1治療群、mPEG-bALD-HM-1治療群にランダムに分け、それぞれ生理食塩水、mPEG-HM-1（投与量は表53を参照）を硝子体注射により1日1回で1週間投与する。投与後の3、7、14及び28日目にFFA検査を行う。試験結果を表54〜57に示す。
【０１６３】
2019513713.tif 000055
【０１６４】
2019513713.tif 000056
【０１６５】
結果:FFA検査した結果、投与の3日後、mPEG-SC-HM-1治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて比較的顕著な変化を示し、投与の7、14日後、治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて徐々に減少し、投与の28日後、フルオレセイン漏出は投与の14日後よりも少ない。これは、mPEG- SC-HM-1は、ラット脈絡膜新生血管を治療できることを示している。そのうち、mPEG-SC10k-HM-1は、効果が最も顕著であり、投与の28日後、CNVの発生率は38.81%で最も低い。
【０１６６】
2019513713.tif 000057
【０１６７】
結果:FFA検査した結果、投与の3日後、mPEG2-NHS-HM-1治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて比較的顕著な変化を示し、投与の7、14日後、治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて徐々に減少し、投与の28日後、フルオレセイン漏出は投与の14日後よりも少ない。これは、mPEG2-NHS-HM-1は、ラット脈絡膜新生血管を治療できることを示している。そのうち、mPEG2-NHS10k-HM-1は、効果が最も顕著であり、投与の28日後、CNVの発生率は39.71%で最も低い。 
【０１６８】
2019513713.tif 000058
【０１６９】
結果:FFA検査した結果、投与の3日後、mPEG-ALD-HM-1治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて比較的顕著な変化を示し、投与の7、14日後、治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて徐々に減少し、投与の28日後、フルオレセイン漏出は投与の14日後よりも少ない。これは、mPEG-ALD-HM-1は、ラット脈絡膜新生血管を治療できることを示している。そのうち、mPEG-ALD10k-HM-1は、効果が最も顕著であり、投与の28日後、CNVの発生率は39.44%で最も低い。
【０１７０】
2019513713.tif 000059
【０１７１】
結果:FFA検査した結果、投与の3日後、mPEG-bALD-HM-1治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて比較的顕著な変化を示し、投与の7、14日後、治療群のフルオレセイン漏出は投与前に比べて徐々に減少し、投与の28日後、フルオレセイン漏出は投与の14日後よりも少ない。これは、mPEG-bALD-HM-1は、ラット脈絡膜新生血管を治療できることを示している。そのうち、mPEG-bALD10k-HM-1は、効果が最も顕著であり、投与の28日後、CNVの発生率は39.13%で最も低い。
【０１７２】
実施例16
OIRマウスにおける網膜血管に対するmPEG-HM-1の影響
OIRモデルの構築
C57/B16マウス出生後の7〜12日目に、マウス幼畜とその親マウスを75%の高酸素雰囲気に暴露させることにより、その中央網膜における毛細血管をすぐに消失させることができる。12日目に室内空気に戻したところ、高酸素雰囲気に暴露された網膜血管がすぐに消失し、広範な異常な血管新生の形成を引き起こし、網膜の中央部分は、長時間かなりの程度無血管状態のままである。血管が完全に消失した後、13日目にそれぞれ生理食塩水（陰性群）、mPEG-SC-HM-1、 mPEG2-NHS-HM-1、mPEG-ALD10k-HM-1、mPEG-bALD-HM-1を硝子体注射により投与し、17日目に網膜血管を評価する(閉合していない血管に標識を付けるために、テキサスレッドで標識したトマトレクチン50mLを左心室に注射し5 min循環させる)。試験結果を表58に示す。
【０１７３】
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【０１７４】
陰性対照に比べて、mPEG-SC-HM-1、 mPEG2-NHS-HM-1、mPEG-ALD10k-HM-1、mPEG-bALD-HM-1で処理したOIRマウス網膜における新生血管叢が顕著に減少する。mPEG-SC-HM-1投与群に効果が最もよいのはmPEG-SC10k-HM-1であり、投与量が50μgである場合に阻害率は56.56%に達する。mPEG2-NHS-HM-1投与群に効果が最もよいのはmPEG2-NHS10k-HM-1であり、投与量が50μgである場合に阻害率は54.63%に達する。mPEG-ALD-HM-1投与群に効果が最もよいのはmPEG-ALD10k-HM-1であり、投与量が50μgである場合に阻害率は61.75%に達する。mPEG-bALD10k-HM-1投与群に効果が最もよいのはmPEG-bALD10k-HM-1であり、投与量が50μgである場合に阻害率は62.35%に達する。
【０１７５】
実施例17
早産網膜病変ラットモデルの新生血管に対するmPEG-HM-1の作用
変動酸素誘導動物モデルを取り、同じ日に自然分娩された新生ラット（12時間内）を酸素供給モデル群、酸素供給治療群、正常対照群の3群にランダムに分ける。酸素供給モデルをさらに3つのサブモデル群に分け、治療群と共にアクリルガラス製の半閉鎖酸素室に置き、室内に医療用酸素を導入し、酸素計により濃度を80％±2％に調整し、24時間後に酸素室内に窒素を導入することで酸素濃度を10％±2％に迅速に調整して24時間維持する。これを繰り返して、酸素室内の酸素濃度が24時間毎に80％と10％との間を交互するように保持し、7日後に、空気雰囲気で飼育する。毎日酸素濃度を8回モニタリングし、酸素室内の温度を23℃±2℃に制御し、パット交換、食料追加、水交換、親マウス交換を1回行う。正常対照群を動物飼育環境に置く。モデル群は、対照群に比べて、網膜切片をADP酵素で染色したところ血管変化が顕著であり、網膜内膜を通過して硝子体に入った血管内皮細胞核の数が多くなり、差が統計的に有意である場合に、モデル構築が成功する。
【０１７６】
酸素供給治療群を4つのサブ群に分け、モデル構築の7日目にそれぞれmPEG-SC-HM-1、 mPEG2-NHS-HM-1、mPEG-ALD10k-HM-1、mPEG-bALD-HM-1を硝子体注射により投与し、酸素供給モデル群及び対照群に生理食塩水のみを投与し、1週間連続投与する。14日目に、エーテル麻酔で死亡させた後、眼球を摘出し、40 g/Lパラホルムアルデヒド溶液中で24時間固定する。グラジエントアルコールで脱水し、キシレンで透明にする。ワックスを浸漬した後、視神経乳頭の周囲をできるだけ避けるように連続的に厚さ4μmの切片を作製する。切片は、角膜から視神経乳頭の矢状面に平行である。各眼球は、10枚の切片を取り、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った後、網膜内膜を通過した血管内皮細胞核（内膜に密接に関連している血管内皮細胞核のみ）の数をカウントし、各眼球の各切片における細胞数を統計する。
【０１７７】
結果:対照群では、切片に網膜内膜を通過して硝子体に入った血管内皮細胞核が僅かに認められているか、又は認められない。モデル群では、網膜内膜に通過した血管内皮細胞核が多く認められ、いくつかは単独で現れ、いくつかはクラスタで現れ、また、いくかの切片には、これらの血管内皮細胞核が深部網膜血管に隣接することも認められており、これは、硝子体又は眼部の他の組織ではなく網膜に由来することを示している。治療群切片では、網膜内膜を通過した少数の血管内皮細胞核のみが認められている。実験結果を表59に示す。
【０１７８】
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【０１７９】
結果から明らかなように、mPEG-HM-1治療群の網膜血管内皮細胞核の数は、酸素供給モデル群の26.397±2.104に比べて顕著に減少しているが、これは、酸素誘導新生マウス網膜病変モデルの新生血管の形成をある程度阻害できることを示している。そのうち、効果が最もよいのはmPEG-ALD20k-HM-1であり、投与量が100μgである場合に、細胞核数は7.036±1.315である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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