(57)【要約】本発明は、抗酸化物質の酸化防止方法、その物質及びその用途に関し、より詳細には、抗酸化物質にアプタマーを処理して抗酸化物質の酸化を防止する方法、そのような活性を有するアプタマー、及び該アプタマーを用いた医薬品、化粧品及び食品などの様々な分野への応用に関する。本発明のアプタマーは、ビタミンＣのような抗酸化物質の酸化防止効果を有するので、本発明のアプタマーは、抗酸化物質の酸化防止が必要な医薬品、化粧品、及び食品などの様々な分野で応用することができる。
2019536436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸化物質にアプタマーを処理して抗酸化物質の酸化を防止する方法。
【請求項２】
前記抗酸化物質は、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチノール、ビタミンＥ、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムＱ１０、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アプタマーは、配列番号１又は２に記載された塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗酸化物質がビタミンＣである場合に、前記アプタマーは、ビタミンＣのラクトン環の２番目及び３番目のＯＨ基の酸化を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗酸化物質の酸化を防止するアプタマー。
【請求項６】
前記抗酸化物質は、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチノール、ビタミンＥ、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムＱ１０、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることを特徴とする、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記アプタマーは、配列番号１又は２に記載された塩基配列からなることを特徴とする、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項８】
ａ）請求項５乃至７のいずれかに記載のアプタマーにアミノ基を結合させるステップと、
ｂ）ヒドロゲルモノマーのヒドロキシ基を、エポキシ基を有している３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（３−ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、３−ＧＰＴＭＳ）でシリル化（ｓｉｌａｎｉｚｉｎｇ）した後、該エポキシ基に、前記アプタマーに結合しているアミノ基を結合させるステップと、
ｃ）前記ヒドロゲルモノマーを重合させるステップと、を含む、アプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法。
【請求項９】
前記方法は、前記ａ）ステップのアプタマーに結合しているアミノ基にビオチンを結合させた後、ストレプトアビジンを有している粒子と反応させた後に、ヒドロゲル重合反応時に、前記アプタマーを有する粒子をヒドロゲルモノマーと混合させるステップを含むことを特徴とする、請求項８に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法。
【請求項１０】
前記方法は、ヒドロゲルのヒドロキシ基に、化学的方法により、アプタマーに付着しているアミノ基又はカルボキシ基を結合させることを特徴とする、請求項８に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法。
【請求項１１】
請求項８乃至１０のいずれかに記載の方法によって製造されたアプタマーがトラップされたヒドロゲル。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルは、ヒドロゲルの表面にアプタマーが付着し、前記アプタマーの末端には特定の成分が付着していることを特徴とする、請求項１１に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲル。
【請求項１３】
前記特定の成分は、皮膚老化防止、しわ除去、美白、または保湿効果を有する成分であることを特徴とする、請求項１２に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲル。
【請求項１４】
請求項１１に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルを含む化粧料組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルを皮膚に塗布して、前記ヒドロゲルから成分が結合したアプタマーが皮膚内に浸透するようにした後、前記成分が結合したアプタマーがターゲット物質と結合した後、成分を放出するステップを含む、皮膚から分泌されるターゲット物質の量に応じて皮膚活性物質の放出を調節する方法。
【請求項１６】
前記ターゲット物質はＡＴＰであることを特徴とする、請求項１５に記載の皮膚から分泌されるターゲット物質の量に応じて皮膚活性物質の放出を調節する方法。
【請求項１７】
請求項５に記載の抗酸化物質の酸化を防止するアプタマーを有効成分として含む食品組成物。
【請求項１８】
前記抗酸化物質は、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチノール、ビタミンＥ、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムＱ１０、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることを特徴とする、請求項１７に記載の食品組成物。
【請求項１９】
前記アプタマーは、配列番号１又は２に記載された塩基配列からなることを特徴とする、請求項１７に記載の食品組成物。
【請求項２０】
前記食品は、飲料、菓子類、キャンデー類、乳製品、ガム類、醤類、パン類、及びアイスクリームからなる群から選択された食品であることを特徴とする、請求項１７に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アプタマーを用いた抗酸化物質の酸化防止方法、物質、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸化物質のうちの代表的な成分の一つであるＡｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（ビタミンＣ）は、その遊離基の中性化を通じた抗酸化活性により、医薬、化粧品及び食品と飲料産業で広く使用されている。食品補助剤及び／又は医薬的活性成分として使用されるときのＡＡの利点は、産業災害（タイヤ及びゴム工場、化粧品製造工場）で発生し得るＺｎＯ  ＮＰｓの吸入により生じる急性肺細胞酸化過程を、ＡＡを添加した飲用水を供給することで抑制することが報告されている。数十兆ウォン規模に達するこれらの産業では、主要な解決策として、ビタミンＣが共通に使用されることが知られている。
【０００３】
ＡＡは、その抗酸化能力により、本質的に酸化によって容易に分解され得る。ＡＡの酸化に影響を与える主要因子は、温度、ｐＨ、酸素、金属イオン、光及び酵素などである。ＡＡを主成分として使用する産業では、このような酸化分解される特性により、生産品の保存期間及び効果の両方に影響を与えるため、当面の問題として長い間認識されてきた。したがって、これらの産業において、ＡＡの酸化的分解に対する理解だけでなく、新しくかつより優れた方法を開発し、発見することに多くの研究と費用が投じられている。
【０００４】
一方、老化を促進する原因は様々であるが、その中でも活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）が非常に主要な原因の一つとして受け入れられている。このような活性酸素は、エネルギー代謝過程、免疫反応などで必然的に生成され、外部の有害環境によっても誘発される、避けられない刺激である。活性酸素は、反応性が非常に高いため、体内でＤＮＡの変性、過度な信号伝達の誘発及びタンパク質の変性などをもたらし、健康に有害な影響を累積する一連の反応を引き起こす。しかし、このような有害な反応は、生体内に存在する抗酸化物質（尿酸、ビタミンＣ、ビタミンＥなど）又は抗酸化酵素（グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼなど）によって精巧にその恒常性を維持するようになっている。しかし、内因性老化による抗酸化システムの老衰及び持続的な有害な刺激による活性酸素の蓄積は、このような均衡を破って健康を害することになり、老化を促進させ、皮膚疾患、皮膚癌、動脈硬化及び血栓のような各種疾病を誘発することもある（Ｌａｕｒｅ  Ｒｉｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１，７０５−７２０，２００２；Ｃｕｔｌｅｒ  ＲＧ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５５，９３−１３５，２００５）。
【０００５】
したがって、活性酸素種の形成を抑制するか、または形成された活性酸素種を除去する抗酸化物質への関心が益々増加している。抗酸化物質は、人体内に自然に存在するものと、外部から投与されるものとに分類されるが、人体内に自然に存在する抗酸化物質としては、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、ＳＯＤ）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）及びカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）などの酵素があり、外部から投与されるものとしては、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）及びゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）などのフィトケミカル（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；ビタミンＥ、ビタミンＣ及びベータカロチン；及びセレニウムなどのミネラルがある。
【０００６】
太陽光から照射される紫外線Ａ（ＵＶＡ）及び紫外線Ｂ（ＵＶＢ）、公害物質、ストレス、喫煙、飲酒、脂肪性食物などにより発生する遊離基（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）と活性酸素（ｏｘｙｇｅｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）などによって細胞が攻撃を受けるが、このような物質から適切な保護が行われない場合、細胞は老化または死滅することになる。皮膚の場合、このような物質によりコラーゲンやエラスチンなどの物質の生産が減少又は変性して、皮膚が弾力を失い、しわが生じる。これを防止するために、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅなどの抗酸化物質を含む製剤を皮膚に塗布し、皮膚内に吸収させることによってこのような有害活性物質による酸化を防ぐことが、皮膚の老化を防止するのに重要であることが公知されている。しかし、合成ビタミンＣは、空気中で容易に酸化してしまい、その抗酸化作用がなくなるという問題があるため、保存期間の長い様々な剤形を製造するのに問題がある。
【０００７】
また、還元力が非常に大きいビタミンＣは、酸化電位の高い物質に非常に敏感に反応して、ビタミンＣが急速に酸化される。ビタミンＣは、酸化されることによってその効能が損なわれることは、公知の事実である。水は、酸化電位が高いため、ビタミンＣは非常に敏感に反応して急速に酸化される。
【０００８】
したがって、ビタミンＣを含む抗酸化物質の酸化を抑制する新しい方法ないしは物質に対する必要性は、長い間存在してきている。
【０００９】
また、アプタマーを用いて抗酸化物質の酸化を防止することは、既存の方法と比べて、安全でかつ革新的な新しい概念のアプローチであって、これを各種産業に適用して効果を極大化できるように製造可能である。特に、既存のケミカル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ベースの化粧品、栄養補助剤、食品市場を、画期的にＤＮＡ（ＢＩＯ）ベースの市場に変化させる起曝剤になるはずである。また、各種産業分野で多様に利用することができる。今後、ＤＮＡ市場の爆発的な増加と革新的なソリューションを提供すると予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】大韓民国特許公告第１０−１１９７６７７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、抗酸化物質の酸化防止方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、抗酸化物質の酸化防止作用をする物質を提供することである。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、抗酸化成分と結合した抗酸化成分の酸化防止作用をする物質で機能化させたヒドロゲルを提供することである。その化合物は、皮膚活性成分の放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）速度を調節し、皮膚から分泌される特定物質の量に応じて皮膚活性物質の放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）成分を調節する機能を有する。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、抗酸化成分の酸化防止作用をする物質を用いて、化粧品、毛髪栄養剤、毛髪染色剤及び局所用皮膚治療剤を提供すること、また、栄養補助剤としての用途を提供することである。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、ビタミンＣの還元状態を維持することで、その抗酸化機能を長期間維持するようにする物質を提供することである。
【００１６】
本発明の更に他の目的は、ビタミンＣの還元状態を水などの液体において長期間維持させる方法により飲食品及び食品を製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的を達成するために、本発明は、抗酸化物質にアプタマーを処理して抗酸化物質の酸化速度を減少させることで、その還元力を維持させる方法を提供する。
【００１８】
本発明の一具現例において、前記抗酸化物質は、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチノール、ビタミンＥ、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムＱ１０、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の一具現例において、前記アプタマーの一例として、配列番号１又は２に記載された塩基配列からなるものが好ましいが、前記アプタマー以外にも、本発明の実施例などを通じて立証されたように、他の配列を有し、本発明の目的とする効果を達成する全てのアプタマーは、本発明の保護範囲に含まれる。
【００２０】
本発明の他の実施例において、前記抗酸化物質がビタミンＣである場合に、アプタマーは、ビタミンＣのラクトン環の２番目及び３番目のＯＨ基の酸化を抑制することが好ましいが、これに限定されない。
【００２１】
本発明において、アプタミンは、抗酸化物質とアプタマーとの複合体と定義する。例えば、アプタミンＣは、ビタミンＣとアプタマーとの複合体を意味する。
【００２２】
１．アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）ベースのヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を用いた化粧品応用例
本発明は、抗酸化物質の酸化速度を減少させるアプタマーを提供する。
【００２３】
本発明は、ａ）前記本発明のアプタマーにアミノ基を結合させるステップ；ｂ）ヒドロゲルモノマーのヒドロキシ基を、エポキシ基を有している３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（３−ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、３−ＧＰＴＭＳ）でシリル化（ｓｉｌａｎｉｚｉｎｇ）した後、該エポキシ基に、前記アプタマーに結合しているアミノ基を結合させるステップ；及びｃ）前記ヒドロゲルモノマーを重合させるステップを含むアプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法を提供する。
【００２４】
本発明の一具現例において、前記方法は、前記ａ）ステップのアプタマーに結合しているアミノ基にビオチンを結合させた後、ストレプトアビジンを有している粒子と反応させた後に、ヒドロゲル重合反応時に、前記アプタマーを有する粒子をヒドロゲルモノマーと混合させるステップを含む。
【００２５】
本発明の他の具現例において、前記方法は、ヒドロゲルのヒドロキシ基に、化学的方法により、アプタマーに付着しているアミノ基又はカルボキシ基を結合させることが好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
また、本発明は、前記本発明の方法によって製造されたアプタマーがトラップされたヒドロゲルを提供する。
【００２７】
本発明の一具現例において、前記ヒドロゲルは、ヒドロゲルの表面にアプタマーが付着し、前記アプタマーの末端には特定の成分が付着しており、前記特定の成分は、皮膚老化防止、しわ除去、美白、保湿効果を有する成分であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
また、本発明の特定の成分は、いずれの種類の抽出物、活性物質も関係なく、化粧品において使用される全ての原料を使用することができる。その例として、美白に良い緑茶抽出物、甘草抽出物、コウゾ抽出物、桑白皮抽出物、黄ゴン抽出物、葛根抽出物、紅参抽出物、老化予防に良いアンズ抽出物、オイル抽出物、オレンジ抽出物、レモン抽出物、竹抽出物、グアバ抽出物、ローズマリー抽出物、サンシュユ抽出物、レイシ抽出物、銀杏抽出物、西施玉容散抽出物、シャクヤク抽出物、保湿に良いカリン抽出物、百年草抽出物、パプリカ抽出物、アロエ抽出物、ヘチマ抽出物、海草抽出物、抗酸化効果があるニンジン抽出物、大豆抽出物、グレープフルーツ種子抽出物、ブドウ種子抽出物、スベリヒユ抽出物、しわの改善に役に立つキャビア、ザクロ、人参抽出物、皮膚の再生に役に立つモモ抽出物、センキュウ抽出物、アトピーに良いツボクサ抽出物、カモミール抽出物、紫根抽出物、苦参抽出物、トウキ抽出物、にきびに良いペパーミント抽出物、三白草抽出物、ドクダミ抽出物、シャクヤク抽出物、抗炎及び抗菌に良い木酢液、タンポポ抽出物、キンセンカ抽出物、キハダ抽出物、カラタチ抽出物、黄ゴン抽出物、ウイキョウ抽出物、コンフリー抽出物、毛穴収縮に役に立つ栗皮抽出物、緑茶抽出物、保湿機能を果たすグリセリン、パンテノール、ヒアルロン酸、セラミド、ベータグルカン、美白効果があるアルブチン、ビタミンＣ、ホワイテンス、レチノール、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、弾力に良いエラスチン、コラーゲン、コエンザイムＱ１０、エフェクチン、ＥＧＦ、抗炎症抗菌剤であるプロポリス、アラントイン、フィトスタン、インフラ酸、抗酸化剤ビタミンＥ（天然トコフェロール）、ＲＯＥ（ローズマリー油抽出物）、グレープフルーツ種子抽出物などの様々な抽出物が適用される。
【００２９】
また、本発明は、前記本発明のアプタマーがトラップされたヒドロゲルを含む化粧料組成物を提供する。
【００３０】
また、本発明は、前記本発明のアプタマーがトラップされたヒドロゲルを皮膚に塗布して、前記ヒドロゲルから成分が結合したアプタマーが皮膚内に浸透するようにした後、前記成分が結合したアプタマーがターゲット物質と結合した後、皮膚から分泌されるターゲット物質の量に応じて皮膚活性物質の放出を調節する方法を提供する。
【００３１】
本発明の一具現例において、前記ターゲット物質はＡＴＰであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３２】
本発明のアプタマーで機能化させた抗酸化物質をヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）にトラップさせることで、ビタミンＣ、ペプチド、レチノールなどの皮膚美白、しわ改善、老化防止などに優れた効能が証明された物質の酸化を抑制し、ゲルから徐々に放出するので、より向上した効果を期待することができる。
【００３３】
本発明のアプタマー−ヒドロゲルを用いた化粧品原料／材料の用途をまとめると、次の通りである。
【００３４】
広く知られているように、ビタミンＣ、ペプチド、レチノールなどの機能性化粧品の主要材料として使用される物質の場合、非常に不安定な物質であって、空気中に曝す場合に容易に酸素と結合して（酸化）、その機能を急速に失ってしまう。アプタマーを介してこれらの物質をキャプチャーするようにして、それらの物質と酸素との結合（酸化作用）を抑制させることで、物質を最大限安定的に持続（機能の持続）させる役割を付与する。
【００３５】
アプタマーを介して皮膚活性成分の放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）速度を調節することである。ほとんどのヒドロゲルの場合、構造が緻密でないため、様々な種類の物質に対する透過率が高く、これによって、含有する物質を容易に放出するようになる。特定の皮膚活性物質と反応するアプタマーをヒドロゲルに含有させる場合、アプタマーの物質に対する結合力を調節することによって、この物質の分泌速度を調節できることが実験的に証明されている。
【００３６】
皮膚から分泌される特定物質の量に応じて皮膚活性物質の放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）成分を調節する機能である。アプタセンシング（Ａｐｔａｓｅｎｓｉｎｇ）と呼ばれるこの技術は、皮膚の様々な状態をより先に感知し、その状態に合わせて皮膚に必要な物質を放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）させる方法であって、美容及び治療などの種々の方面において利用可能な方法である。皮膚の温度に応じて異なる濃度で分泌されるＡＴＰを感知するか、または皮膚の状態に応じて分泌されるサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）などをアプタマーが感知した後、これに合わせて皮膚活性成分を分泌するシステムを具現することができる。これによって、適当量の抗老化物質を分泌するようにすることによって、持続時間を調節したり、皮膚に不必要な過負荷を低減させたりすることができるようにデザインできる。
【００３７】
アプタマーとは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）やＲＮＡの３次元構造を用いて特定物質を検出する方法であって、抗原抗体反応と類似しているが、物質のサイズが遥かに小さく、様々な方法によりその活性を調節することができ、抗体に比べて生産と保存が容易であるという利点がある。また、抗体とは異なり、サイズが非常に小さい化学物質（ビタミン）などに結合するアプタマーを合成することもでき、化学的合成によって製造されるので、その効能を一定に維持することが容易である。
【００３８】
ビタミンＣは、水溶性の６個の炭素化合物であって、フラン環の３−位、４−位の炭素がジヒドロキシの形態で存在する還元型と、これらの部位がそれぞれ酸化されたセミデヒドロアスコルビン酸（ｓｅｍｉｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びデヒドロアスコルビン酸（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）がある。
【００３９】
本発明のアプタマー（ＲＮＡやＤＮＡ）を構成する塩基とビタミンＣのヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）との水素結合により、ビタミンＣの還元状態を維持するようになる（図１）。
【００４０】
本発明のアプタマーと結合して還元状態を維持しているビタミンＣを、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、ペプチドなどを含むクリームタイプあるいはヒドロゲルタイプの様々な剤形の皮膚美容組成物と栄養補助剤に使用することができる。
【００４１】
本発明はまた、皮膚の状態や外部刺激に応じて（例えば、紫外線や皮膚の温度又は酸度）異なって反応するアプタマーを介して（Ａｐｔａｓｅｎｓｉｎｇ）、皮膚の様々なコンディションに応じてビタミンＣを徐々に放出するようにする方法を含む。例えば、皮膚への紫外線照射によってアプタマーの構造が変わると、結合したビタミンＣが放出されるようにしたり、皮膚の温度や酸度の変化によってＡＴＰの量が変わるときに、これに結合するアプタマーの構造が変わることによってビタミンＣを放出するようにする方法などを含む。
【００４２】
また、本発明は、前記本発明のアプタマーと抗酸化物質との複合体を有効成分として含む様々な剤形（美容液、ゲル、ローション、クリーム、化粧液、マスクパックなど）の化粧品、毛髪栄養剤及び染色剤に使用することを含む。
【００４３】
本発明の一具現例において、前記化粧料組成物は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、及びペプチドのうちの１つ以上をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４４】
２．アプタマー、またはアプタマー−抗酸化成分の複合体を用いた栄養補助剤
本発明は、前記本発明のアプタマーと抗酸化物質との複合体、またはアプタマーを単独で有効成分として含む栄養補助剤組成物を提供する。
【００４５】
本発明の栄養補助剤に適したビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、チアミン、リボフラビン、ビオチン、葉酸、ナイアシン、パントテン酸、これらの混合物などである。栄養補助剤組成物に含まれる好ましいミネラル栄養素の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、硫黄、塩素、鉄、銅、ヨウ素、亜鉛、セレニウム、マンガン、クロム、モリブデン、フッ素、コバルト、及びこれらの化合物から選択される１つ以上の元素を含有するものである。
【００４６】
様々なハーブも栄養補助剤として使用することができる。一般に、ハーブは、様々な医薬や食品補助剤の特性を有するものから選択される。一般に、ハーブは、医薬用又は風味用に使用できる芳香族植物や植物の一部分である。
【００４７】
また、本発明は、抗酸化物質にアプタマーを結合させて抗酸化物質の還元状態を維持することで、酸化速度を遅延させる方法を提供する。
【００４８】
以下、本発明を説明する。
本発明は、ビタミンＣと同様に、ビタミンＡ（Ｒｅｔｉｎｏｌ）、ビタミンＥ、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムＱ１０、ペプチド、オイルなどの、酸化に非常に不安定な抗酸化物質をアプタマーと結合して栄養補助剤として製造して使用することができる。これを通じて物質の酸化（腐敗）を防止することによって、それらの物質が求める効果を奏するようにすることによって、その効果を最大限増加させることができる。
【００４９】
また、本発明は、その抗酸化成分に合わせて開発されたアプタマーと抗酸化成分との複合体として提供するか、または活性状態のアプタマーと抗酸化成分を個別に提供する。
【００５０】
本発明の一具現例において、前記抗酸化物質は、ビタミンＣ、ビタミンＡ、レチノール、ビタミンＥ、アスタキサンチン、レスベラトロール、４’−アセトキシレスベラトロール（Ａｃｅｔｏｘｙ  Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、カテキン、各種ポリフェノール類、エピガロカテキンガレート、コエンザイムＱ１０、ユビキノール、ユビキノン、及びオメガ３オイルからなる群から選択された物質であることが好ましいが、これらに限定されない。
【００５１】
３．アプタマー及び／又は抗酸化物質の複合体を用いた飲食品及び食品組成物
本発明は、前記本発明のアプタマーと抗酸化物質との複合体を有効成分として含むか、または飲料にアプタマーを単独で含む飲料組成物を提供する。
【００５２】
本発明の一具現例において、前記組成物は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、及びペプチドのうちの１つ以上をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
また、本発明は、前記本発明のアプタマー及び／又は抗酸化物質を有効成分として含む食品組成物を提供する。
【００５４】
本発明の一具現例において、前記食品組成物は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、及びペプチドのうちの１つ以上をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００５５】
本発明の一具現例において、前記食品組成物は、菓子類、キャンデー類、乳製品、ガム類、醤類、パン類、またはアイスクリームであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５６】
また、本発明は、前記本発明のアプタマーを食品に添加して食品を製造する方法を提供する。
【００５７】
本発明の他の具現例において、前記食品及び飲料組成物は、体内に吸収されてアプタマーの構造が変わると、結合したビタミンＣが放出されるようにするか、または体内の環境変化によってＡＴＰの量が変わるときに、これに結合するアプタマーの構造が変わることによってビタミンＣを放出することが好ましいが、これに限定されない。
【発明の効果】
【００５８】
本発明から分かるように、本発明のアプタマーは、ビタミンＣのような抗酸化物質の酸化防止効果を有し、本発明のアプタマーがトラップされたヒドロゲルは、アプタマーを介して皮膚活性成分の放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）速度を調節し、皮膚から分泌される特定物質の量に応じて抗酸化物質の放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）成分を調節する機能を有すると予想される。
【００５９】
本発明のアプタマーは、ビタミンＣのような抗酸化物質の酸化防止効果を有し、本発明のアプタマー単独、またはアプタマーと抗酸化物質との複合体は、例えば、ビタミンＣ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に選択的に結合するアプタマーを用いてビタミンＣの還元状態を維持することで、その抗酸化機能を長期間維持するようにして、様々な剤形の機能性化粧品及び経口用栄養補助剤（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）などに用いることができる。ビタミンＣに選択的に結合するアプタマーを用いることで、少量のビタミンＣでも持続的でかつ極大化された抗酸化効果を期待することができる。
【００６０】
また、本発明から分かるように、本発明は、ビタミンＣ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に選択的に結合するアプタマーを用いてビタミンＣなどの生理活性成分の還元状態を維持することで、その抗酸化機能を長期間維持するようにして、様々な健康飲料、抗酸化飲料及び抗酸化食品などに用いることができる。
【００６１】
また、アプタマーを用いて抗酸化物質の酸化を防止することは、既存の方法と比べて、安全でかつ革新的な新しい概念のアプローチであって、これを各種産業に適用して効果を得ることができるように製造可能である。特に、既存のケミカル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ベースの化粧品、栄養補助剤、食品市場を、画期的にＤＮＡ（ＢＩＯ）ベースの市場に変化させる起曝剤になるはずである。今後、ＤＮＡ市場の爆発的な増加と革新的なソリューションを提供すると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】アプタマー（ＲＮＡやＤＮＡ）を構成する塩基とビタミンＣのヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）との水素結合を通じて、ビタミンＣの還元状態を維持することを示す図である。
【図２】アプタマーＡ、Ｂ、Ｃ関連の実験データであって、ＤＨＡ検出妨害分析を示す図であり、各アプタマーの存在下でのＤＨＡ検出（ＯＰＤＡ蛍光）の時間経過グラフである。アプタマーＢ及びＣに対するグラフは、対照群と多少差があり、アプタマーＡは、対照群から外れないので、２２番が検出分析を妨げないことを示す。
【図３】酸化剤に対するアプタマーによるＡＡの酸化的保護を示す図である。１０．３μＭ  ＣｕＳＯ４、１０３．３μＭ  ＮａＩＯ４、１０．３μＭ  Ｈ２Ｏ２、及び１０３．３μＭ  ＴＥＭＰＯＬにおいて、対照群とアプタマーＡのオーバーレイを示す。
【図４】ＡＡに対するアプタマーの滴定を示す図であり、滴定データは、ＡＡの酸化的保護が、アプタマーの濃度が増加するに伴って増加することを示す。
【図５】ｖｉｔａｍｉｎｗａｔｅｒRにおいて、時間の経過によるＡＡの保護を示す図であって、ｖｉｔａｍｉｎｗａｔｅｒ（登録商標）において１６８ｈの間、アプタマーＡの存在及び不存在下でＡＡの分解を比較したグラフである。
【図６】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明の３つのアプタマーが、過酸化水素水によるビタミンＣの酸化を防止することを示す図である。
【図７】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明の３つのアプタマーが、過酸化水素水によるビタミンＣの酸化を防止することを示す図である。
【図８】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明の３つのアプタマーが、過酸化水素水によるビタミンＣの酸化を防止することを示す図である。
【図９】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明のアプタマーのＡＡ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＤＨＡ（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する解離定数（ＫＤ）を示すグラフである。
【図１０】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明のアプタマーのＡＡ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＤＨＡ（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する解離定数（ＫＤ）を示すグラフである。
【図１１】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明のアプタマーのＡＡ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＤＨＡ（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する解離定数（ＫＤ）を示すグラフである。
【図１２】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明のアプタマーのＡＡ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＤＨＡ（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する解離定数（ＫＤ）を示すグラフである。
【図１３】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明のアプタマーのＡＡ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＤＨＡ（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する解離定数（ＫＤ）を示すグラフである。
【図１４】アプタマー＃１、２、３関連試験データであって、本発明のアプタマーのＡＡ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＤＨＡ（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する解離定数（ＫＤ）を示すグラフである。
【図１５】本発明のアプタマーを用いた機能性スマートヒドロゲルの製造方法を示す図である。
【図１６】本発明のアプタマーを用いた機能性スマートヒドロゲルの製造方法を示す図である。
【図１７】本発明のアプタマーがトラップされたヒドロゲルのアプタセンシング過程を示す図である。
【図１８】本発明のアプタマーがトラップされたヒドロゲルのアプタセンシング過程を示す図である。
【図１９】本発明のアプタマーがトラップされたヒドロゲルのアプタセンシング過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
以下、本発明を非限定的な実施例を通じて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されるものと解釈されてはならない。
【００６４】
本発明では、ターゲット（ＡＡ）が急速に酸化されないように、全てのバッファーと溶液をＣｈｅｌｅｘ（登録商標）１００  ｒｅｓｉｎ（ＢｉｏＲａｄ）で１時間撹拌し、０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を介して濾過し、Ｎ２  ｇａｓ（Ｐｒａｘａｉｒ）で１０分間パージして偶発的な金属を除去した分子生物学用ウォーター（Ｐｈｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して製造した。
【００６５】
実施例１：ＤＮＡアプタマーの選択及び配列分析
Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ＳＥＬＥＸ：
アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に対する９ラウンドのＳＥＬＥＸを、〜１０１５の独特なオリゴヌクレオチドで構成されたＤＮＡライブラリー（ＢａｓｅＰａｉｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。使用したバッファーの組成は、次の通りである：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ）  ｐＨ５．５（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び１ｍＭグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）。［Ｔｈｅ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＥＬＥＸ］のストリンジェンシーを、ターゲットに対するアプタマーの結合時間を減少させ、バッファーの組成を変更し、自由分子溶出においてターゲットの濃度を減少させて変更した。ＤＨＡに対する陰性選択を、豊富な（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）ライブラリーから酸化形態のアスコルビン酸に結合するアプタマーを除去するために行った。
【００６６】
実施例２：アスコルビン酸の酸化物に対する蛍光分析
アスコルビン酸の酸化をＶｉｓｌｉｓｅｌなど（Ｖｉｓｌｉｓｅｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｆ．Ｑ．  ａｎｄ  Ｂｕｅｔｔｎｅｒ，Ｇ．Ｒ．（２００７）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６５，３１−３９）に記載された方法を変形して、酸化物デヒドロアスコルビン酸（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ；ＤＨＡ）を検出して逆に測定した。
【００６７】
要約すると、アプタマー（４１．３μＭ）を、酸化剤（１０．３μＭ  ｆｏｒ  ＣｕＳＯ４（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）、１０３．３μＭ  ｆｏｒ  ＴＥＭＰＯＬ（Ｓｉｇｍａ）及びＮａＩＯ４（Ｓｉｇｍａ））の添加前に常温で３０分間、４Ｘ濃度でＡＡ（１０．３μＭ）で培養した。ＯＰＤＡ  ｄｙｅ（Ｓｉｇｍａ）を添加する前に、酸化剤サンプルの添加後、常温で１０分間培養した。染料（９５４．６μＭ）サンプルの添加直後、対照群が収斂されるまで６０秒間隔で４５分間ＳｐｅｃｔｒａＭａｘR  ｉ３Ｘ  ｐｌａｔｅリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で励起３４５ｎｍ；放出：４２５ｎｍの条件で読み取った。スクリーニングデータがＡＡ保護を示し、酸化物（ＤＨＡ）又は分析染料（ＯＰＤＡ）の干渉がないことを確認するために、蛍光分析をＤＨＡ（１０．３μＭ）（Ｓｉｇｍａ）をＡＡの部位で培養されかつ選択されたアプタマーで繰り返した。全ての分析を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）  ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｔｏ  ｐＨを５．５に調整して行った。全ての蛍光分析は、ブラック３８４−ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）で行った。各サンプルを３回繰り返して行った。
【００６８】
実施例３：ＡＡに対するアプタマーの滴定
最適のアプタマー（Ａ）の有効濃度を決定するために、それをＡＡ（１０．３μＭ）に対して滴定した。ＡＡに対するアプタマーの相対的な濃度は、１０ｘ、５ｘ、２ｘ、１ｘ、０．５ｘ、０．２５ｘ及び０．１ｘ（１０３μＭで１．０３μＭアプタマー）であった。全てのアプタマー／ＡＡ混合物を、１０．３μＭＣｕＳＯ４の添加前に３０分間常温で培養し、サンプルを９５４．６μＭ  ＯＰＤＡの添加前に１０分間さらに常温で培養した。プレートをｅｘ：３４５ｎｍ；ｅｍ：４２５ｎｍで４５分間読み取り、６０ｓ毎にデータを集めた。各サンプルを３回繰り返して行った。
【００６９】
実施例４：アプタマー親和度の測定
アスコルビン酸及びデヒドロアスコルビン酸のような物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＡＡ及びＤＨＡに対するアプタマーの親和度の測定は、ＭＳＴ（ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用して行った（Ｊｅｒａｂｅｋ−ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．２０１１；９（４）：３４２−５３）。要約すると、Ｃｙ５−共役アプタマー（５ｎＭ）を、５０ｕＭから１．５３ｎＭまでターゲット（ＡＡ又はＤＨＡ）の１６回連続して希釈と培養を行った。スキャニング毛細管チューブ（４ｕＬ／チューブ）にローディングする前に１５分間混合物を培養した。各サンプルの蛍光を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５  ＭＳＴ装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して熱勾配に露出させる間に測定して、結合曲線を作った。各分析は３回繰り返して行った。
【００７０】
実施例５；質量分光法
サンプルの製造：
アプタマーＡ（５０ｕＭ）をｖｉｔａｍｉｎｗａｔｅｒR（ｋｉｗｉ−ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ）（Ｇｌａｃｅａｕ，Ｃｏｃａ−ｃｏｌａ）中で培養した。サンプルを常温で培養し、１０ｕＬを０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及び１６８ｈで収集した。アスコルビン酸（Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｃａｔ＃  Ｖ−０３８）及びデヒドロアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃２６１５５６）対照群を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間、ＡＡ及びＤＨＡの安定性をモニタリングするために、各時点の前後に注射した。各サンプル及び対照群を、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）内部標準物質Ｃ１３（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃａｔ＃Ａ７８６９９２）で２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度でスパイクした。ＡＡストック溶液（Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ  １ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：Ｈ２Ｏ、５０：５０）を１０ｕｇ／ｍＬ及びＡＡ−Ｃ１３で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した。１０ｕＬのＡＡ（２ｕｇ／ｍＬ）を９０ｕＬのＡＡ−Ｃ１３で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈して、それぞれ、ＡＡ及びＡＡ−Ｃ１３から最終濃度１０００ｎｇ／ｍｌ及び９００ｎｇ／ｍｌを得た。ＤＨＡ対照群を９００ｎｇ／ｍｌのＡＡ−Ｃ１３で１ｕｇ／ｍｌの最終濃度で製造した。１０ｕＬの各時点のサンプルを、同じ内部標準物質溶液中で１：２００に希釈して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００７１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータ（ＭＲＭ）：
認識（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）を、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  μＵＨＰＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）にカップリングされ、５０μｍ  ｉＤキャピラリを有する電子噴霧インターフェースを備えたＡＢＳｃｉｅｘ  ＱＴＲＡＰ  ６５００（ＡＢＳｃｉｅｘ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．３ソフトウェアを“Ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｈａｒｄｗａｒｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ”でその装置を調節し、データの加工及び認識のために使用した。最適化されたＭＲＭパラメータを、アスコルビン酸、アスコルビン酸−Ｃ１３及びＤＨＡをモニタリングするために使用した。サンプルを、２μＬループでループオーバーフィリングして注射し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。分離は、４５℃に維持されたＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８  ｆｒｏｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ５０ｍｍ×０．５ｍｍ上で行った。３．５ｍｉｎ  ＬＣ勾配の間、移動相は溶媒Ａ（１０ｍＭ  ＴＢＡ及び１５ｍＭ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ）及び溶媒Ｂ（１０ｍＭ  ＴＢＡ及び１５ｍＭ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｍｅｔｈａｎｏｌ）で構成され、流速は３０μＬ／ｍｉｎであった。勾配は、１００：０  Ａ：Ｂから開始した。ＴＢＡをイオンペアリング試薬として使用し、各サンプルを３回繰り返して分析した。
【００７２】
前記実施例の結果は、以下の通りである。
【００７３】
ＤＮＡアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸ方法によって生産された豊富なライブラリーのバイオ情報分析は、候補アプタマーを得、これらの上位２０個から、酸化からＡＡを保護する能力をスクリーニングした。
【００７４】
候補アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）によるＡＡの酸化的保護
アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）プールのスクリーニング
この分析において、ＤＨＡの蓄積／検出はＡＡの酸化を示す。したがって、もし、アプタマーが酸化からＡＡを保護する場合、生成された信号は陽性（ｎｏ  ａｐｔａｍｅｒ）対照群よりも低いはずである。ＡＡ及び酸化剤、陽性対照群（ＡＡ  ｐｌｕｓ  ｏｘｉｄｉｚｅｒ）及び陰性対照群（ＡＡ  ｍｉｎｕｓ  ｏｘｉｄｉｚｅｒ）に混合された各候補アプタマーのオーバーレイグラフを図２に示し、各タイルは、複数のアプタマー候補物質を示す。２０個のアプタマーのうち、陽性対照群未満の明確な差を有することで、ＡＡの保護効果が確実な３個をスクリーニングし（アプタマーＡ、Ｂ及びＣ）、これらは、それぞれ、２２番、２７番及び４４番に対して３０分間、ＡＡの酸化が３５±１３％、４３±９％及び２５±８％減少した（ｎ＝３）。
【００７５】
検出分析を妨げるアプタマーを決定
スクリーニングから得た上位３個のアプタマー（Ａ、Ｂ及びＣ）を、アプタマーが自ら検出分析を妨げるか否かを決定するために、酸化されたＡＡ産物であるＤＨＡに対して分析した。アプタマーＡは、ＤＨＡ対照群グラフから外れず、それは、検出方法を妨げないことを示唆する。しかし、アプタマーＢ及びＣは、対照群グラフと僅かな差を示し、これは、これらのアプタマーに対するスクリーニングから生成されたデータが信頼できないことを示唆する（図２）。信頼できるデータを作るために、全ての追加実験は、アプタマーＡのみを使用して行った。
【００７６】
酸化剤に対するアプタマースクリーニング
アプタマーＡの４種の酸化剤（ＣｕＳＯ４（１０．３μＭ）、ＮａＩＯ４（１０３．３μＭ）、Ｈ２Ｏ２（１０．３μＭ）及びＴＥＭＰＯＬ（１０３．３μＭ））に対するＡＡを保護する能力を評価した。各酸化剤の滴定を、陽性対照群と陰性対照群との間に適切なテストウィンドウを作る最低濃度を決定するために、ＡＡ（１０．３μＭ）に対して行った（データは図示せず）。アプタマー２２番は、ＮａＩＯ４の存在において酸化に対する保護に失敗（図３、ｔｏｐ  ｒｉｇｈｔ）したが、それぞれ１９±６％及び５１±７％のＡＡの相対的な酸化の減少をＨ２Ｏ２及びＴＥＭＰＯＬに対して示した（図４、ｂｏｔｔｏｍ  ｐａｎｅｌｓ）。また、ＣｕＳＯ４に対する再分析（増加した装置セッティングを有する）は、初期のスクリーニングよりも１９％以上である５４±５％の酸化の減少を示した（図３、ｔｏｐ  ｌｅｆｔ）（ｎ＝３）。
【００７７】
ＡＡに対するアプタマーＡの滴定
アプタマーＡを、アスコルビン酸と１０ｘ、５ｘ、２ｘ、１ｘ、０．５ｘ、０．２５ｘ及び０．１ｘの相対的な濃度で培養した。滴定データは、陽性及び陰性対照群に対してオーバーレイで作図した（図４）。滴定は用量依存的に作用した。最も低い２つの濃度（０．１ｘ及び０．２５ｘ）では酸化保護効果が観察されず、酸化保護効果は、ＡＡに対するアプタマーの割合が増加するに伴い増加した。酸化保護の程度は、テストした範囲で安定状態を示さなかった。したがって、アプタマーＡによるＡＡの最大保護効果は、ＡＡの１０ｘ以上の濃度で起こった。
【００７８】
アプタマーの親和度の測定
ＡＡ及びＤＨＡに対するアプタマーＡの結合親和度をＭＳＴで測定した。検出されたＫＤ値は、それぞれ、ＡＡ及びＤＨＡに対して９８７．９ｎＭ及び１８９．７ｎＭであった（ｎ＝３）。
【００７９】
ｖｉｔａｍｉｎｗａｔｅｒRにおけるＡＡの酸化の保護
データの統合と定量化は、曲線の下の面積（ＡＵＣ）を使用してＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＢＳｃｉｅｘ）で行った。ＡＡベースの定量化は、１６８ｈの経過に対して測定した（図５）。時間経過の終わりで、対照群及びアプタマーＡ処理されたサンプルにおいて、それぞれ、初期ＡＡの２１．９±６．６％及び４７．５±０．５％が残った（ｎ＝３）。ＡＡの半減期は、対照群及びアプタマーＡ処理されたサンプルにおいて、それぞれ８４±１０ｈ及び１４１±１４ｈであった。これは、アプタマーＡの添加が、ｖｉｔａｍｉｎｗａｔｅｒRにおいてＡＡの半減期を１６８％増加させることを意味する。
【００８０】
また、前記Ｖｉｔａｍｉｎｗａｔｅｒ飲料がｐＨ２．５であるため、このｐＨ濃度でもアプタミンが作用することを意味する。
【００８１】
実施例６：還元状態のビタミンＣに結合するアプタマー群の構築
ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）過程を通じて、１０１３個で構成されたＤＮＡアプタマーライブラリーから還元状態のアスコルビン酸に対して選択的に結合するアプタマーを見つける実験を、次の条件で行った。アスコルビン酸の還元状態を維持した状態でＳＥＬＥＸを行うために、〜ｐＨ５．５程度に維持し、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を投入した。
【００８２】
この条件下で、ビタミンＣの９９％以上が、酸化されたデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）ではなく、還元されたＬ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）状態に維持された。前記の反応条件でＳＥＬＥＸを行って選択されたアプタマー全体を、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った後、分析した結果、３０００個以上の２次構造群からなるアプタマーを得ることができた。
【００８３】
実施例７：アプタマーを介したビタミンＣの酸化防止の定量分析
二次構造の種類によって２０個の個別アプタマーを選択して、ビタミンＣの酸化防止実験を行った。アニーリングバッファー（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶かしたアプタマーを、９５℃に加熱した後、徐々に温度を常温に低下させながらアプタマーの二次構造を作った後、還元されたＬ−アスコルビン酸と混合して、アプタマーがＬ−アスコルビン酸と結合できるように約３０分間反応させた。その後、過酸化水素水を添加して酸化条件を作った後、Ｌ−アスコルビン酸の酸化を、蛍光染料であるＯＰＤＡ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）を添加して測定した。Ｌ−アスコルビン酸の酸化物であるＤＨＡがＯＰＤＡと反応して生成されたＤＨＡ−ＯＰＤＡからの蛍光量を測定して、ＤＨＡの生成の程度を定量分析することができる。前記の条件で、ＤＨＡ−ＯＰＤＡの蛍光量を３４秒毎に２５分間測定した。
【００８４】
このうちの３つの全てのアプタマーは、過酸化水素水によるビタミンＣの酸化を防止した。１２番のアプタマーは、約４０％の酸化を防止し、８番は約２０％、１０番は約４０％の酸化防止効果を示した。このような実験及び他の経験に基づいて、３つのアプタマーがビタミンＣに直接反応して、ビタミンＣの酸化を防止するという結論を下すことができる（図６乃至図８参照）。
【００８５】
実施例８：本発明のアプタマーのアスコルビン酸（ＡＡ）及びデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）に対する定常状態（ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ）溶液の解離定数（ＫＤ）の決定
解離定数は、ＭＳＴ（ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用して決定した。
【００８６】
本実施例は、両ターゲットに対するアッセイバッファーにおいて３つのアプタマーに対するＭＳＴデータ及び計算されたＫＤを含む。アスコルビン酸及びデヒドロアスコルビン酸を含む全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、バッファーの製造前に、脱イオン水をＣｈｅｌｅｘ−１００レジンで１時間処理して偶発的な金属を除去した。Ｃｈｅｌｅｘ処理後、その水を、酸素を最小化するために窒素ガスで１０分間パージした後、密封して保存した。この水を全ての水溶液に使用した。最終バッファーは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０であり、ＡＡ及びＤＨＡはいずれも、バッファーでｅ５ｕＭから１５３ｐＭ（最終）（アプタマー＃１０＆＃１２に対して）または５０ｕＭから１．５３ｎＭ（最終）（ｆｏｒ  アプタマー＃８）で１：１継代希釈で分析した。各Ｃｙ５−共役アプタマーの最終濃度は２０ｎＭである。
【００８７】
技術的な二次希釈物のそれぞれを、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社のＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５  ＭＳＴ装置で２回測定した。
【００８８】
その結果を、図９乃至図１４に示した。各データポイントは、平均及び近似曲線（ｆｉｔｔｅｄ  ｃｕｒｖｅ；黒い線）と共に図で示す。各グラフの垂直波線はＫＤを示す。
【００８９】
前記結果を通じて、下記のような結論を推論した。
【００９０】
１）アプタマー＃２＆１は、ＡＡ  ｖｓ  ＤＨＡに対してさらに優れた選択性を有する反面、＃８は、ＤＨＡに対してＡＡよりも僅かにより優れた選択性を有する。
【００９１】
２）アプタマー＃３は、３つのアプタマーのうち、ＡＡ  ｖｓ  ＤＨＡに対する最も優れた選択性を有する。
【００９２】
３）アプタマー＃１は、酸化からＡＡの保護には最高であったが、ＡＡ  ｖｓ  ＤＨＡの最小選択性を有した。
【００９３】
実施例９：アプタマーとヒドロゲルのトラップ
本発明のアプタマーをヒドロゲルにトラップさせる方法は、まず、アプタマーに付着させておいたアミノ基にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）を付着させた後に、これと結合するストレプトアビジンを有しているパーティクルで機能化した後、ヒドロゲルを焼成するときに２０％の割合で混合して、ヒドロゲルにアプタマーパーティクルをトラップさせる方法がある。この方法は、アプタマーとヒドロゲルとの間の化学的結合が起こらず、比較的簡単に具現できる方法であるといえる。
【００９４】
他の方法としては、ヒドロゲルのヒドロキシ基に、化学的方法により、アプタマーに付着しているアミノ基やカルボキシ基を付着する方法であって、これは、アプタマーを化学的にヒドロゲルに結合させる方法である。
【００９５】
その他に、ヒドロゲルの化学的成分を調節することによって、またはアプタマーに結合させる作用基を変えることによって、様々な形態の結合を形成することができる。
【００９６】
具体的なトラップ方法としては、ａ）アプタマーにアミノ基を結合させるステップ；ｂ）ヒドロゲルモノマーのヒドロキシ基を、エポキシ基を有している３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（３−ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、３−ＧＰＴＭＳ）でシリル化（ｓｉｌａｎｉｚｉｎｇ）した後、該エポキシ基に、前記アプタマーに結合しているアミノ基を結合させるステップ；及びｃ）前記ヒドロゲルモノマーを重合させるステップを含む、アプタマーがトラップされたヒドロゲルを製造する方法がある。
【００９７】
一方、現在、保湿効果によって多く使用されているコラーゲンヒドロゲルを、前記のような方法でアプタマー−コラーゲンヒドロゲルとして作製して、センシング（感知）後に成分をさらにゆっくり放出（Ｒｅｌｅａｓｅ）する機能を追加することができる。一例として、皮膚老化防止のために使用されるテプレノン（Ｔｅｐｒｅｎｏｎｅ）やカプリル酸（Ｃａｐｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ）などをアプタマー−コラーゲンヒドロゲルとして徐々に皮膚に供給するか、または細胞から分泌される皮膚老化関連サイトカインの量に応じて分泌するようにすることによって、スマートセンシング（感知）機能を追加することができる。
【００９８】
実施例１０：本発明のアプタマーベースのビタミンＣ含有飲料の製造
滅菌精製水１０００ｇに、本発明のアプタマービタミンＣ複合体１ｇ、オリゴ糖５００ｇ、グリシン２ｇ、タウリン２ｇ、クエン酸ナトリウム０．２ｇを添加して混合した後、精製水を再度添加して、総重量が２０００ｇとなるようにした。
【００９９】
その後、前記の成分が添加された溶液を、８０ｒｐｍで１時間撹拌した後、真空状態で容器に充填して、アプタマーと結合したビタミンＣが含有されたビタミン飲料を製造した。
【０１００】
比較例として、前記実施例１０と全ての工程は同一であり、本発明のアプタマービタミンＣ複合体の代わりに、ビタミンＣ（英国ＤＳＭ）１ｇを使用して飲料を製造した。
【０１０１】
実験例１：官能検査
前記実施例１０で製造した本発明のビタミン飲料及び比較例の飲料に対して、味、香り、全体的な嗜好度のような官能検査を行い、その結果を下記の表１に示す。
【０１０２】
前記において、官能検査は、食品関連分野で３年以上従事した官能検査要員２０人（男女それぞれ１０人）が５点採点法により測定したものであって、それぞれの項目に対する数値は、官能検査要員が付けた点数の総和を官能検査人数で割った後、これを小数第二位で四捨五入して示した。
【０１０３】
【表１】
2019536436.tif 000003
【０１０４】
表１は、実施例の飲料及び比較例の飲料の官能検査の結果である。
【０１０５】
官能検査は、数値が高いほど、官能性に優れることを意味する。
【０１０６】
上記の表１からわかるように、既存のビタミン飲料と本発明のビタミン飲料は、官能検査において大きな差はないが、本発明の飲料が若干さらに高いという検査結果を示した。
【０１０７】
実験例２：本発明の飲料の疲労改善効果
慢性疲労症状がある５０人（男性２０人、女性３０人）に、前記実施例４で製造した本発明のビタミン飲料と比較例の飲料を、２週間、毎日１５０ｍｌずつ摂取させた後、疲労改善効果に対する設問を行い、その結果を下記の表２に示す。
【０１０８】
【表２】
2019536436.tif 000004
【０１０９】
表２は、実施例４及び比較例の疲労改善効果（単位：人）に関する表であり、表において、Ａ：疲労改善効果がある、Ｂ：疲労改善効果がない、Ｃ：よく分からない、である。
【０１１０】
前記表２に示されたように、実施例１０で製造したビタミン飲料及び従来の方法により製造した比較例の飲料はいずれも、疲労改善効果があるが、比較例の飲料に比べて、本発明の実施例４で製造したビタミン飲料の疲労改善効果がさらに良かった。これは、ビタミンＣの抗酸化活性の維持を通じて、本発明の飲料が疲労改善にさらに効果があることを示唆する。
【０１１１】
上述したように、本発明の好ましい実施例を参照して説明したが、当該技術分野における熟練した当業者であれば、下記の特許請求の範囲に記載された本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で、本発明を様々に修正及び変更できることが理解できる。
【図１】
2019536436.tif 000005
【図２】
2019536436.tif 000006
【図３】
2019536436.tif 000007
【図４】
2019536436.tif 000008
【図５】
2019536436.tif 000009
【図６】
2019536436.tif 000010
【図７】
2019536436.tif 000011
【図８】
2019536436.tif 000012
【図９】
2019536436.tif 000013
【図１０】
2019536436.tif 000014
【図１１】
2019536436.tif 000015
【図１２】
2019536436.tif 000016
【図１３】
2019536436.tif 000017
【図１４】
2019536436.tif 000018
【図１５】
2019536436.tif 000019
【図１６】
2019536436.tif 000020
【図１７】
2019536436.tif 000021
【図１８】
2019536436.tif 000022
【図１９】
2019536436.tif 000023
【配列表】
2019536436000001.app
【国際調査報告】
2019536436.tif 000024
2019536436.tif 000025
2019536436.tif 000026
2019536436.tif 000027
2019536436.tif 000028
2019536436.tif 000029
2019536436.tif 000030
2019536436.tif 000031