(57)【要約】  本発明は、標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させるために、細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に保持するかまたは他に保存する方法であって、タンパク質架橋剤もしくはアミン架橋剤および／または酸の機能を有する化合物を細胞組成物に添加するステップを含む方法を提供する。本発明は、ｄｓＲＮＡを含む細胞と、タンパク質架橋剤および／または酸とを含む組成物、ならびに前記架橋剤および／または酸の本方法における使用も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に保持するかそうでなければ保存して標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させる方法であって、タンパク質架橋剤もしくはアミン架橋剤および／または酸の機能を有する化合物を、前記細胞を含む組成物に添加する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質架橋剤またはアミン架橋剤の添加前に、タンパク質またはポリアミンを前記細胞組成物に添加し、前記タンパク質またはポリアミンが前記細胞の表面に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物の場所への投与前に、前記細胞を含む前記組成物に前記架橋剤および／または酸を添加する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記場所が、土壌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤が、ポリアルデヒド、ジアルデヒド、ジエポキシド、ポリエポキシド、ピリジルジスルフィド、多官能性カルボジイミド、多官能性マレイミド、多官能性イミドエステル、多官能性ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび多官能性ハロアセタールからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤が、グルタルアルデヒドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記酸が、乳酸またはギ酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、事前に不活性化されていてもよい細菌細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
転写されたときに二本鎖ＲＮＡをもたらすＤＮＡ配列を含むように前記細菌細胞が操作されており、前記二本鎖ＲＮＡの少なくとも一部が、植物有害生物における遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物有害生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ）、線虫、ハリガネムシおよび地虫、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、細菌細胞であり、前記架橋剤が、グルタルアルデヒドであり、前記グルタルアルデヒドが、前記細胞組成物の体積に対して１〜０．０１％の量で土壌に適用され、前記生物活性が、少なくとも２１日間の期間にわたって実質的に保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、細菌細胞であり、前記酸が、乳酸またはギ酸であり、前記酸が、前記細胞組成物中１Ｍ〜０．１Ｍの量で前記組成物に適用され、前記生物活性が、少なくとも２１日間の期間にわたって実質的に保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞と、タンパク質架橋剤もしくはアミン架橋剤および／または酸とを含む物質の組成物であって、前記組成物が、土壌を含み、前記細胞が、ｄｓＲＮＡを含み、前記架橋剤が、グルタルアルデヒドであり、前記酸が、乳酸またはギ酸であることを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
細胞内で異種的に発現されたｄｓＲＮＡの生物活性を保持する目的のために添加されたタンパク質架橋剤もしくはアミン架橋剤および／または酸を含む、細胞組成物。
【請求項１５】
細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に安定化するかそうでなければ保存するための、タンパク質架橋剤もしくはアミン架橋剤および／または酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の制御に関する。特に、本発明は、外因的に（すなわち標的生物の外側にかつ比較的厳しい環境条件下で）投与された二本鎖ＲＮＡが標的生物おいて遺伝子発現を停止させる能力を増強する方法に関する。本発明は、本方法で使用するための組成物ならびに特定の既知の架橋剤および／または酸の本方法における使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉が潜在的に遺伝子発現を停止させる現象は、よく知られている。
【０００３】
ＲＮＡは、比較的不安定であり、例えば細胞の外側に遍在的に存在するリボヌクレアーゼによって急速に分解され得る。ｄｓＲＮＡを直接的に標的生物へ適用するか、または外因性投与によりこれらが存在する場所へ適用することの問題は、ＲＮＡの安定性の乏しさに関する。外因性適用とは、生物がそれを取り込むことができるような方法、または標的生物と異なる第１の生物においてｄｓＲＮＡが産生され、かつ標的生物が第１の生物またはｄｓＲＮＡを含むその一部を取り込むような方法で標的生物に適用されることを意味し、その結果、前記ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡにより含まれる配列に対応するヌクレオチド配列を含む遺伝子の転写後サイレンシングをもたらすことができる。外因性適用は、標的遺伝子を転写後に発現停止させることができる二本鎖ＲＮＡが標的生物の細胞内で産生されること（一般的に適切な異種配列からの発現による）を意味する内因性産生と区別される。
【０００４】
外因的に適用されたｄｓＲＮＡは、一般的に、適用後、短期間内、おそらく最大でも数日間にわたり関連の生物学的効果を発揮することができるが、効果は、一般的に急速に低下し、通常、ｄｓＲＮＡは、例えば、土壌中でわずか約１２〜２４時間の半減期を有し、それが投与される正確な環境条件にさらに依存する。ｄｓＲＮＡを、その安定性を増強するポリマーにカプセル化するかまたは他に結合させることによってｄｓＲＮＡを安定化し、従って作用の持続時間の増大を提供することなど、この問題に対する種々の解決法が提唱されている。効果の持続時間には２つの態様がある。遺伝子サイレンシング自体は、関連タンパク質の回転率に応じて消滅し得る。周囲条件における土壌とのインキュベーションにおいて、ｄｓＲＮＡは、約２日以内に分解される。ｄｓＲＮＡは、これよりも実質的に長い効果を有することが可能であり、本発明の利点は、環境中のｄｓＲＮＡの残留性を増大させることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、通常、圃場条件下（一般的にｄｓＲＮＡの急速な分解または不活性化につながる）で生物に外因的に適用されるｄｓＲＮＡの比較的急速な不活性化の問題の解決法に関する。
【０００６】
本発明によると、標的生物内の遺伝子の発現を転写後に停止させるために、細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に保持するかまたは他に保存する方法であって、タンパク質架橋剤もしくはアミン架橋剤および／または酸の機能を有する化合物を、細胞を含む組成物に添加するステップを含む方法が提供される。
【０００７】
本発明の一態様では、ポリアミンまたはタンパク質は、タンパク質架橋剤またはアミン架橋剤の添加前に細胞組成物に添加され、それにより、ポリアミンまたはタンパク質は、細胞表面のカルボン酸基に結合し、架橋後に外側安定化層を形成することになり、細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性のより大きい保存が得られる。
【０００８】
架橋剤および／または酸は、組成物の場所への投与前に、細胞を含む組成物に添加され得る。場所とは、架橋剤を含む細胞組成物が投与されるところを意味し、植物が生育している圃場、または栽培植物の種子が蒔かれる圃場、またはこのような種子もしくは植物が植えられる土壌、または実際に圃場、土壌、種子および／もしくは植物自体が含まれる。
【０００９】
本方法の好ましい実施形態では、場所は、土壌であり、組成物は、例えば、コーンルートワームなどの昆虫有害生物の必須遺伝子に対してｄｓＲＮＡを標的化することにより保護されることが所望される植物の近くで土壌に適用される。
【００１０】
架橋剤は、ポリアルデヒド、ジアルデヒド、ジエポキシド、ポリエポキシド、ピリジルジスルフィド、カルボジイミド、ジまたはポリイソシアナート、多官能性マレイミド、ジまたはポリイミドエステル、ビス−ジアゾニウム、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびハロアセタール、ならびにさらに少なくとも２つの官能基（同じであっても異なっていてもよい）を含む任意の他の既知の架橋剤からなる群から選択され得る。いくつかの架橋剤は、水にやや溶けにくく、この場合、これらは、適切な溶媒中または水およびこのような溶媒の混合物中の溶液において都合よく使用され得る。より好ましくは、架橋剤は、ポリアルデヒドおよびジアルデヒドから、さらにより好ましくはジアルデヒドからなる群から選択される。最も特に好ましいジアルデヒドは、グルタルアルデヒドであり、本発明の方法におけるその特定の使用は、以下に例示される。グルタルアルデヒドは、反応が都合よく速いが、取り扱いが困難である程度に速くないような反応性であるために好ましい。グルタルアルデヒドは、比較的無毒性であり、都合よく水溶性であり、容易に入手可能でありかつ安価である。
【００１１】
酸は、有機酸または無機酸であり得る。好ましくは、酸は、弱酸であり、より好ましくは有機酸であり、より好ましくは炭素数１〜５の有機酸であり、最も好ましくは乳酸またはギ酸である。作用機序の任意の特定の解釈により限定されることなく、本発明の細胞を不活性化するための酸の適用は、環境中でのより高いｄｓＲＮＡの残留性をもたらすタンパク質の変性を生じ得る。
【００１２】
特定の実施形態では、細胞は細菌細胞であるが、藻類およびさらに植物または他の真核細胞を含む他の細胞も使用することができる。
【００１３】
細胞が細菌細胞である場合、架橋剤および／または酸は、それを不活性化するために細胞に適用され得る。従って、架橋剤および酸は、２つの機能を有し得る。第１の機能は、細胞を不活性化することであり、および第２の機能は、細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を保存することである。
【００１４】
あるいは、架橋剤および／または酸は、事前に不活性化された細胞に提供され、１つの機能（細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を保存すること）を有する。熱による不活性化（かなり幅広い範囲の温度および持続時間の条件下）、過酢酸、アスコルビン酸第二銅、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、チオシアン酸グアニジニウム、ホルムアルデヒドおよび他のモノアルデヒドのようなものによる化学的不活性化、ならびに電離放射線への暴露を含む種々の不活性化プロセスが当該技術分野において知られている。
【００１５】
架橋剤は、酸を伴わずに細胞組成物に添加され得、酸は、架橋剤を伴わずに添加され得、あるいは両方が任意の順序で順次細胞組成物に添加される。
【００１６】
使用されるプロセスを問わず、得られる細胞組成物は、生物学的に生存可能な細菌を全く含有しない。
【００１７】
原核生物または真核生物であり得る細胞は、転写されたとき、二本鎖ＲＮＡであって、その少なくとも一部は、原核生物細胞または真核生物細胞（特に例えば昆虫などの植物有害生物の細胞）内の遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含む、二本鎖ＲＮＡをもたらすＤＮＡ配列を含むように操作されている。このような昆虫有害生物の典型的な例としては、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）およびディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ  ｂｅｅｔｌｅ））が挙げられる。ｄｓＲＮＡが有効であり得る有害生物には、線虫、ハリガネムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍ）および地虫、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体など、農学者によく知られている種々の有害生物も含まれる。
【００１８】
細胞組成物中に存在するか、または細胞組成物へ添加される架橋剤の濃度は、比較的重要である。存在するか、または細胞組成物が添加される場所に添加されるかもしくは他に存在する架橋剤が多すぎるかまたは少なすぎると、転写後遺伝子サイレンシング効果を示すことできるｄｓＲＮＡがそれほど有効ではない。架橋剤がグルタルアルデヒドである場合、架橋剤は、５〜０．００１％、より好ましくは２．５〜０．００５％、最も好ましくは１〜０．０１％の量で細胞組成物中に／場所に存在する（ここで、％は、細胞組成物の最終体積に対するものである）。当業者は、架橋剤の細胞不活性化およびｄｓＲＮＡ安定化の両方の効果から利益を得るために、事前に不活性化された細胞に架橋剤が添加される場合よりも高い濃度が必要とされることを認識するであろう。
【００１９】
従って、細胞を不活性化し、かつｄｓＲＮＡを安定化するために使用される場合、架橋剤（特にグルタルアルデヒド）の濃度は、少なくとも約０．１％であり、好ましくは、架橋剤は、１〜０．１％の量で細胞組成物中に／場所に存在する。あるいは、架橋剤がｄｓＲＮＡの安定化のために使用され、細胞が事前に不活性化される場合、架橋剤（特にグルタルアルデヒド）の濃度は、少なくとも約０．０１％であり、好ましくは、架橋剤は、１〜０．０１％の量で細胞組成物中に／場所に存在する。
【００２０】
本方法の好ましい実施形態では、細胞は、細菌細胞であり、架橋剤は、組成物の最終体積により１〜０．０１％の量で細胞組成物中に存在するグルタルアルデヒドである。作用機序の任意の特定の解釈により限定されることなく、過剰な架橋剤は、ｄｓＲＮＡの生物学的利用能を低減する一方、少なすぎる架橋剤は、所望される安定性の改善を付与せず、細胞を不活性化しないことが理解される。
【００２１】
本方法の好ましい実施形態では、細胞は、細菌細胞であり、および酸は、組成物中において１Ｍ〜０．１Ｍの量で細胞組成物中に存在するギ酸または乳酸である。
【００２２】
本発明の方法の使用は、細胞中に存在するｄｓＲＮＡに関連する生物活性の持続時間をかなり大幅に延長し、通常、架橋剤を使用せずに土壌に投与されたｄｓＲＮＡと比べて、２１日間までおよびそれを超える期間にわたり、約１２℃よりも高い温度の土壌環境下で活性を保持する。
【００２３】
本発明は、細胞およびタンパク質架橋剤を含む物質の組成物も含み、本組成物が土壌を含み、細胞がｄｓＲＮＡを含み、および架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする。
【００２４】
本発明は、細胞および酸を含む物質の組成物も含み、本組成物が土壌を含み、細胞がｄｓＲＮＡを含み、および酸が乳酸またはギ酸であることを特徴とする。
【００２５】
本発明はまた、細胞内で異種的に発現されるｄｓＲＮＡの生物活性を保持する目的のために添加されたタンパク質架橋剤および／または酸を含む細胞組成物と、細胞中に存在するｄｓＲＮＡの生物活性を実質的に安定化するかまたは他に保存するためのタンパク質架橋剤および／または酸の使用とを含む。
【００２６】
本発明は、以下の非限定的な実施例からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】不活性化方法の表示である。
【図２】不活性化細胞のＴＥＭ顕微鏡観察である。
【図３】熱的不活性化サンプル（黒色棒）または（Ａ）メタノールもしくは（Ｂ）イソプロパノールで処理したサンプル（縞模様の棒）により処理した土壌の寄生の７日後の幼虫の死亡率の比較である。全てのサンプルにおいて、標的遺伝子は、標的Ｄｖｓ００６．５に対応する。幼虫寄生の０日前、３日前および７日前にサンプルを土壌に適用した。
【図４】熱的不活性化サンプル（黒色棒）または（Ａ）クエン酸、（Ｂ）ギ酸もしくは（Ｃ）乳酸で処理したサンプル（縞模様の棒）により処理した土壌の寄生の７日後の幼虫の死亡率の比較である。全てのサンプルにおいて、標的遺伝子は、標的Ｄｖｓ００６．５に対応する。幼虫寄生の０日前、３日前および７日前にサンプルを土壌に適用した。
【図５】熱的不活性化サンプル（黒色棒）または（Ａ）０．１％のグルタルアルデヒドもしくは（Ｂ）０．５％のグルタルアルデヒドで処理したサンプル（縞模様の棒）により処理した土壌の寄生の７日後の幼虫の死亡率の比較である。全てのサンプルにおいて、標的遺伝子は、標的Ｄｖｓ００６．５に対応する。幼虫寄生の０日前、３日前および７日前にサンプルを土壌に適用した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
試験サンプルの作製  −  発酵
Ｔ７駆動性ｄｓＲＮＡ発現カセットを含有するプラスミドをＨＴ１１５（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に形質転換した。
【００２９】
ｄｓＲＮＡの産生のために、単一コロニーから培養物を播種し、適切な抗生物質を含有するＬＢ培地中で一晩成長させた。
【００３０】
次に、適切な抗生物質を含有するＬＢを用いて、一晩培養物をＯＤ600＝１に希釈した。ｄｓＲＮＡの転写を誘導するために、ＩＰＴＧを１．０ｍＭの最終濃度まで添加した。次に、２５０ｒｐｍで振とうさせながら、培養物を３７℃で３．５時間インキュベートした。
【００３１】
誘導後、培養物を遠心分離し、関連のＯＤ600、通常、５０〜１００単位／ｍｌ（ここで、１単位は、ＯＤ600＝１における１ｍｌの細胞に対応する）で再懸濁させ、上澄みを廃棄した。次に、さらなる実験のためにペレットを不活性化した。
【００３２】
熱的不活性化。熱処理、通常、低温殺菌法についてよく知られているようにフロースルーで細菌ブロスを加熱することからなる「高温短時間」プロセスのＨＴＳＴ処理によって細菌を死滅させた。処理したブロスのアリコートをＬＢプレート上に画線し、３７℃で一晩のインキュベーションにより、細菌の非生存性を確認した。
【００３３】
土壌安定性の増大のための製剤（図１）
１）アルコール処理：細菌ペレットを１００％のメタノールまたは１００％のイソプロパノール中に再懸濁させ、４℃で貯蔵した。バイオアッセイを開始する前にサンプルをスピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）で乾燥させ、関連のＯＤ６００で水中に再懸濁させた。
２）酸処理：細菌ペレットを、クエン酸、ギ酸または乳酸を含む０．５Ｍの最終濃度の酸（ｐＨ３．５）中に再懸濁させた。３５ｒｐｍにおいてローラー上で振とうさせながらサンプルを室温で４時間インキュベートし、その後、サンプルを遠心分離し、水で２回洗浄し、関連のＯＤ６００で再懸濁させた。バイオアッセイの開始までサンプルを４℃で貯蔵した。
３）グルタルアルデヒド処理：細菌ペレットを０．１％または０．５％の最終濃度のグルタルアルデヒド中に再懸濁させた。３５ｒｐｍにおいてローラー上で振とうさせながらサンプルを室温で２時間、４時間または７２時間インキュベートし、その後、サンプルを遠心分離し、２回洗浄し、関連のＯＤ６００で再懸濁させた。バイオアッセイの開始までサンプルを４℃で貯蔵した。
【００３４】
各不活性化方法について、処理したブロスのアリコートをＬＢプレート上に画線し、３７℃で一晩のインキュベーションにより、細菌の非生存性を確認した。
【００３５】
ＴＥＭ顕微鏡観察
不活性化ステップ後の細胞膜の完全性および細胞の一般的態様をＴＥＭ顕微鏡観察により検査した。簡単には、２％のパラホルムアルデヒドおよび２％のグルタルアルデヒドを含有するカコジル酸ナトリウム緩衝液中、室温で２時間サンプルを固定した。次に、サンプルを洗浄し、１％のＯｓＯ４水溶液により２回目に固定し、さらにすすいだ。ブロッキング染色溶液の０．５％の酢酸ウラニル水溶液と共に一晩インキュベーションした後、サンプルをさらに洗浄した。その後、エタノールにより脱水し、Ｓｐｕｒｒ樹脂に埋め込んだ後、オーブン内で１０時間のインキュベーションを行い、重合させた。サンプルをＴＥＭにより可視化した（図２）。
【００３６】
結果は、ギ酸、乳酸およびグルタルアルデヒドにより不活性化したサンプルでは細胞が無傷であるが、メタノール、イソプロパノールおよびクエン酸で処理した他のサンプルでは、細胞構造および細胞壁が破壊されたように見えることを示した。
【００３７】
土壌生物活性アッセイにおいて。同じサンプルを用いてアッセイを開始した。簡単には、ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ対照または活性Ｄｖｓ００６．５  ｄｓＲＮＡのいずれかを発現する不活性化サンプルを混合することにより、有効成分の異なるアリコートを調製した。試験サンプルは、熱処理、グルタルアルデヒド処理、酸処理またはアルコール処理により不活性化した細菌サンプルを含んだ。２．５μｇ、２５μｇまたは５０μｇに等しいｄｓＲＮＡの最終濃度に達するまで、異なる量のサンプルを４８ウェルプレート内の土壌へ適用した。プレートを２５℃で０、３および７日間インキュベートした後、幼虫を寄生させた。
【００３８】
土壌プレートにおける２４時間のインキュベーション後、１処理当たり少なくとも３０匹の幼虫を人工的なダイエットプレートに移した（１ウェル当たり１匹の幼虫）。幼虫の死亡率を７日間毎日評価した。寄生の７日後の幼虫の死亡率のデータが示される（図３、４および５）。幼虫寄生の日（０日目）に有効成分を土壌プレートに添加すると、熱処理（ＨＴＳＴ）、アルコール処理、酸処理またはグルタルアルデヒド処理による不活性化を含む全てのサンプルによって著しい死亡率が誘導された。これは、異なる不活性化方法がｄｓＲＮＡの生物学的利用能に影響を与えないことを示した。
【００３９】
土壌中で３日間または７日間のインキュベーション後、予想通りにＨＴＳＴサンプルについて活性の明らかな低下が観察された（３日目の死亡率６０％未満および７日目の死亡率２５％未満）。メタノールおよびイソプロパノールのそれぞれのアルコール処理について、ＨＴＳＴ対照と比べて改善は観察されなかった（図３）。興味深いことに、ギ酸および乳酸試験サンプルについて、ＨＴＳＴ対照と比べて明らかな改善が観察され、土壌中で３日間または７日間のインキュベーション後でも依然として約８０％の死亡率が観察された。クエン酸は、対照と比べて改善を示さなかった（図４）。
【００４０】
０．１または０．５％のグルタルアルデヒドで処理したサンプルでは、効果は、さらにより大きく、３日目および７日目に達成された死亡率は、９０％を上回ったままであり、ＨＴＳＴ対照よりも著しく高かった（図５）。
【００４１】
データは、０．５Ｍのギ酸もしくは乳酸（図４．ＢおよびＣ）または０．１もしくは０．５％の最終濃度のグルタルアルデヒド（図５．ＡおよびＢ）で処理した細菌サンプル中のｄｓＲＮＡが７日までの間、土壌中で安定であり、これらの処理が土壌中での分解に対して有効成分を保護し、従ってｄｓＲＮＡの残留性を延長する方法を提供したことを示す。
【図１】
2019531078.tif 000002
【図２】
2019531078.tif 000003
【図３】
2019531078.tif 000004
【図４】
2019531078.tif 000005
【図５】
2019531078.tif 000006
【国際調査報告】
2019531078.tif 000007
2019531078.tif 000008
2019531078.tif 000009