(57)【要約】  本開示は、１００ｍＭを超える高い濃度の塩の中で鋳型依存的ＤＮＡ合成を触媒するポリメラーゼの処理能力を亢進する方法および組成物を提供する。０．８〜２．２マイクロモルのレベルのヌクレオチドの存在下および３５〜４５℃の高い温度、例えばポリメラーゼの融点またはその付近の温度における活性ＤＮＡ合成と適合性のあるポリメラーゼ−鋳型複合体の構築を亢進する方法および組成物も開示される。鋳型とポリメラーゼの複合体はナノポアシーケンシングに用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼを提供するステップ、および、
（ｂ）０．８μＭ〜２．２μＭの濃度のヌクレオチドを含む３５℃〜４５℃の温度の溶液中で前記ポリメラーゼをポリヌクレオチド鋳型と接触させ、それにより前記ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記溶液を、前記ポリメラーゼ−鋳型複合体の前記ポリメラーゼで飽和させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力を増大させる方法であって、
０．８μＭ〜２．２μＭの濃度のヌクレオチドを含む３５℃〜４５℃の温度の溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップを含み、
ここで、前記高温溶液中で形成された前記ポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力が、対照である室温のポリメラーゼ−鋳型複合体溶液から得られる処理能力より大きいものである、前記方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップが、前記溶液を前記ポリメラーゼ−鋳型複合体の前記ポリメラーゼで飽和させるステップを含むものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させた後、前記溶液中のヌクレオチドの濃度を上昇させるステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ−鋳型複合体の前記ポリメラーゼが配列番号１４として示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上の配列同一性を有し、またはこれと同一である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチド鋳型のナノポアに基づくシーケンシングのための方法であって、
０．８μＭ〜２．２μＭの濃度のヌクレオチドを含む溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップであって、前記溶液が高い温度を有するステップ、
前記形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアと組み合わせて、ナノポア−シーケンシング複合体を形成させるステップ、
タグ付きヌクレオチドを前記ナノポアシーケンシング複合体に提供して、３５℃〜４５℃の高い温度で前記鋳型の鋳型依存的ナノポアシーケンシングを開始するステップ、および、
前記ナノポアを利用して、前記タグ付きヌクレオチドのそれぞれが前記ポリメラーゼと会合しつつ前記タグ付きヌクレオチドのそれぞれが組み込まれている間に、前記タグ付きヌクレオチドのそれぞれと会合したタグを検出し、それにより前記ポリヌクレオチド鋳型の配列を決定するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップが、前記溶液を前記ポリメラーゼ−鋳型複合体の前記ポリメラーゼで飽和させるステップを含むものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ−鋳型複合体の前記ポリメラーゼが配列番号１４として示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上の配列同一性を有し、またはこれと同一である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列（配列番号１０）に直接または間接的に連結されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼを提供するステップ、および、
（ｂ）少なくとも１００ｍＭの濃度の塩を含みヌクレオチドを含まない溶液中で前記ポリメラーゼをポリヌクレオチド鋳型と接触させ、それにより前記ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力を増大させる方法であって、
前記方法が、少なくとも１００ｍＭの濃度の塩を含みヌクレオチドを含まない溶液中で鋳型−ポリメラーゼ複合体を形成させるステップを含み、
ここで、前記鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力が同様に高い濃度の塩を含む溶液中、ヌクレオチドの存在下で形成された場合の同じ鋳型−ポリヌクレオチド複合体の処理能力より大きいものである、前記方法。
【請求項１３】
鋳型依存的ＤＮＡ合成を行う方法であって、
（ａ）少なくとも１００ｍＭの濃度の塩を含みヌクレオチドを含まない溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップ、および、
（ｂ）ヌクレオチドを前記溶液に添加することによって前記鋳型依存的ＤＮＡ合成を開始するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
高い塩濃度におけるナノポアシーケンシングのための方法であって、
（ａ）少なくとも１００ｍＭの濃度の塩を含む溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップであって、前記溶液がヌクレオチドを実質的に含まないステップ、
（ｂ）前記ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアと組み合わせてナノポア−シーケンシング複合体を形成させるステップ、
（ｃ）タグ付きヌクレオチドを前記ナノポアシーケンシング複合体に提供して、前記高い塩濃度で前記鋳型の鋳型依存的ナノポアシーケンシングを開始するステップ、および、
（ｄ）前記ナノポアを利用して、前記ヌクレオチドのそれぞれが前記ポリメラーゼと会合しつつ前記ヌクレオチドのそれぞれが組み込まれている間に、前記タグ付きヌクレオチドのそれぞれと会合したタグを検出し、それにより前記ポリヌクレオチド鋳型の配列を決定するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
少なくとも１００ｍＭの塩の溶液中にポリメラーゼ−鋳型複合体を含む、保存または反応組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]本開示は一般にＤＮＡシーケンシングの処理能力を改善するための方法および組成物に関し、より詳細には温度、ヌクレオチド濃度、および／またはポリメラーゼ濃度を調整することによってＤＮＡシーケンシング反応におけるシーケンシング収率を亢進することに関する。
【背景技術】
【０００２】
[002]ナノポアは、核酸の配列および構造を検討するための標識不要な基盤技術として最近注目されてきた。データは典型的には印加電場が電圧固定増幅器によって制御された単一のポアにわたって印加される際にＤＮＡ配列が決定されるとともにイオン電流の時系列として報告される。数十万個の分子を大きなバンド幅および空間分解能で調べることができる。
【０００３】
[003]信頼できるＤＮＡ解析ツールとしてのナノポアの成功に対する重大な障害は、処理能力または平均読み取り長である。例えば、ポリメラーゼによる鋳型の効率的な結合が、高いシーケンシング収率のために重要である。この、およびその他の望ましい特性は、ポリメラーゼを修飾して鋳型依存的シーケンシング反応から得られる配列情報の量を増加させることによって亢進することができる。さらに、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成に有利な（またはこれを安定化させる）条件を提供することによっても、処理能力を増大させることができる。しかし、シーケンシング反応を行うことができる数多くの条件が変動するので、ナノポアに基づくシーケンシング等のある種のシーケンシング反応を最適化する特定の変数（条件）は、概して見つかりにくいままであった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[004]本明細書において、ナノポアに基づくシーケンシング等のシーケンシング反応を最適化するために用いることができる方法および組成物が提供される。ある例示態様では、高い塩濃度を用いてシーケンシング反応を亢進する方法および組成物が提供される。例えば一態様では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法が提供される。この方法は、（ａ）ポリメラーゼを提供するステップと、（ｂ）高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼをポリヌクレオチド鋳型と接触させ、それによりポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するステップとを含む。
【０００５】
[005]別の態様では、鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力を増大させる方法が提供され、この方法は、高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中で鋳型−ポリメラーゼ複合体を形成させるステップを含み、鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力は、同様に高い濃度の塩を含む溶液中、ヌクレオチドの存在下で形成された場合の同じ鋳型−ポリヌクレオチド複合体の処理能力より大きい。例えば、処理能力は鋳型とポリメラーゼの会合の速度がより速いことによって増大し、および／または処理能力はポリメラーゼからの鋳型の解離の速度がより遅いことによって増大する。
【０００６】
[006]別の態様では、鋳型依存的ＤＮＡ合成を実施する方法が提供され、この方法は、（ａ）高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップと、（ｂ）ヌクレオチドを溶液に添加することによって鋳型依存的ＤＮＡ合成を開始するステップとを含む。
【０００７】
[007]別の態様では、高い塩濃度におけるナノポアシーケンシングの方法が提供され、この方法は、（ａ）高い濃度の塩を含む溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップであって、溶液がヌクレオチドを実質的に含まないステップと、（ｂ）ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアと組み合わせてナノポアシーケンシング複合体を形成させるステップと、（ｃ）タグ付きヌクレオチドをナノポアシーケンシング複合体に提供して高い塩濃度で鋳型の鋳型依存的ナノポアシーケンシングを開始するステップと、（ｄ）ナノポアを利用して、ヌクレオチドのそれぞれがポリメラーゼと会合しつつヌクレオチドのそれぞれが組み込まれている間に、タグ付きヌクレオチドのそれぞれと会合したタグを検出し、それによりポリヌクレオチド鋳型の配列を決定するステップとを含む。
【０００８】
[008]上記の種々の態様のそれぞれにおいて、ポリメラーゼはバリアントポリメラーゼ、例えば配列番号２のポリメラーゼに少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリメラーゼであってよい。さらに、ナノポアはモノマーナノポア、例えばＯｍｐＧナノポアであってよく、またはナノポアはオリゴマーナノポア、例えばα−ヘモリシンナノポアであってよい。さらに、塩の高い濃度は例えば少なくとも１００ｍＭの塩濃度として定義される。
【０００９】
[009]別の態様では保存または反応組成物が提供され、保存または反応組成物は少なくとも１００ｍＭの塩の溶液中にポリメラーゼ−鋳型複合体を含む。いくつかの実施形態では、組成物はヌクレオチドを実質的に含まない。
【００１０】
[0010]ある他の例示態様では、低いヌクレオチド濃度および高い温度を用いてシーケンシング反応を亢進する方法および組成物が提供される。例えば一態様では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法が提供され、この方法は、例えばポリメラーゼを提供するステップと、次にポリメラーゼを溶液中でポリヌクレオチド鋳型と接触させ、それによりポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するステップとを含む。溶液は低い濃度のヌクレオチドを含み、高い温度を有している。
【００１１】
[0011]別の態様では、鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力を増大させる方法が提供される。この方法は、溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップを含み、この溶液は低い濃度のヌクレオチドを含み、高い温度を有している。このような方法では、高温溶液中で形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力は対照である室温のポリメラーゼ−鋳型複合体溶液から得られる処理能力より大きい。
【００１２】
[0012]別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型のナノポアに基づくシーケンシングの方法が提供される。この方法は溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップを含み、この溶液は高い温度で低い濃度のヌクレオチドを含む。形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体はナノポアと合わされ、ナノポア−シーケンシング複合体を形成する。タグ付きヌクレオチドがナノポアシーケンシング複合体に提供され、鋳型の鋳型依存的ナノポアシーケンシングが高い温度で開始される。ナノポアを利用して、タグ付きヌクレオチドのそれぞれがポリメラーゼと会合しつつタグ付きヌクレオチドのそれぞれが組み込まれている間に、タグ付きヌクレオチドのそれぞれと会合したタグが検出され、それによりポリヌクレオチド鋳型の配列が決定される。ナノポアはモノマーナノポア、例えばＯｍｐＧナノポアであってよく、またはマルチマーナノポア、例えばα−ヘモリシン系ナノポアであってよい。
【００１３】
[0013]低いヌクレオチド濃度と高い温度を含む上記の態様のそれぞれにおいては、この方法には、溶液をポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼで飽和させるステップがさらに含まれてよい。ポリメラーゼは例えば配列番号２として示されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有するポリメラーゼ等のポリメラーゼバリアントであってよい。ある態様では、ヌクレオチドの低い濃度は０．８μＭ〜２．２μＭであり、１．２μＭ等である。ある態様では高い温度は室温を超え、３５℃〜４５℃等である。ある態様においては、高い温度は４０℃である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0014]ＤＮＡポリメラーゼによる単一ヌクレオチド組み込みに必要な最小限の触媒ステップの説明図である。反応は遊離のＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｅ）の二重鎖プライマー／鋳型ＤＮＡ複合体（ＤＮＡｎ）への結合によって開始し、二元の酵素−ＤＮＡ複合体（Ｅ・ＤＮＡｎ）が生じる。ｋｏｎ．ＤＮＡは酵素と鋳型との会合速度を意味し、ｋｏｆｆ．ＤＮＡは酵素−ＤＮＡ複合体からの酵素の解離速度を意味する。ｋｏｎ．ＤＮＡとｋｏｆｆ．ＤＮＡの速度によって決定される平衡によって、ポリメラーゼ−鋳型複合体の静的処理能力が定義される。したがって、酵素の静的処理能力は、会合速度ｋｏｎ．ＤＮＡの増大および／または解離速度ｋｏｆｆ．ＤＮＡの減少によって増大させることができる。Ｍｇ２＋等の二価カチオンの存在下における正しいヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の会合によって、酵素−ＤＮＡ−ｄＮＴＰ三元複合体の形成が促進される（Ｅ・ＤＮＡｎ・ｄＮＴＰ・Ｍｇ２＋）。ｋｏｎ．ヌクレオチドは酵素のヌクレオチド結合の速度を意味し、ｋｏｆｆ．ヌクレオチドは酵素−鋳型複合体からのヌクレオチドの解離速度を意味する。ポリメラーゼが鋳型を延長している間のｋｏｎ．ＤＮＡとｋｏｆｆ．ＤＮＡによって決定される平衡によって、ポリメラーゼの複製処理能力が定義される。したがって、ポリメラーゼの複製処理能力は、ＤＮＡ会合の速度ｋｏｎ．ＤＮＡの増大および／またはＤＮＡ解離の速度ｋｏｆｆ．ＤＮＡの減少によって増大させることができる。ｄＮＴＰの結合によって、三元複合体中の酵素の第１のコンフォメーション変化が誘導される。進入するｄＮＴＰのα−ホスフェートと鋳型／プライマー末端の３’−ＯＨとの間にホスホジエステル結合が形成され、プライマー末端に追加のヌクレオチド塩基が産生される（Ｅ＊・ＤＮＡｎ＋１・ＰＰｉ）。反応によりピロホスフェート（ＰＰｉ）およびプロトンが発生する。第２のコンフォメーション変化によりＰＰｉの放出が可能になり、ヌクレオチド組み込みのサイクルが完了する。
【図２】[0015]ＦＲＥＴ置換アッセイで用いる例示的な鋳型を示す説明図である。
【図３】[0016]種々の塩濃度における鋳型とポリメラーゼとの会合の速度に対する、ポリホスフェートヌクレオチドの存在下においてポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させることの効果の例示的な結果を示すグラフである。実施例３を参照する。
【図４】[0017]図３に示す蛍光シグナルについての会合曲線を示す一連のグラフである。実施例３を参照する。
【図５Ａ】[0018]ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成の阻害に対する、ブロックされたヌクレオチドの効果の結果を示す一連のグラフである。ＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルを図５Ａに示す。実施例４．１を参照する。
【図５Ｂ】ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成の阻害に対する、ブロックされたヌクレオチドの効果の結果を示す一連のグラフである。解離曲線を図５Ｂに示す。実施例４．１を参照する。
【図６Ａ】[0019]Ｍｇ２＋（◆）または２０μＭのｄ６Ｐｓ（ポリホスフェートヌクレオチド；■）の存在下に形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体の形成およびポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度に対するヌクレオチドの効果の例示的な結果を示す一連のグラフである。ＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルを図６Ａに示す。実施例４．２を参照する。
【図６Ｂ】Ｍｇ２＋（◆）または２０μＭのｄ６Ｐｓ（ポリホスフェートヌクレオチド；■）の存在下に形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体の形成およびポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度に対するヌクレオチドの効果の例示的な結果を示す一連のグラフである。解離曲線を図６Ｂに示す。実施例４．２を参照する。
【図７Ａ】[0020]Ｃａ２＋の非存在下（◆）または存在下（■）に形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体の形成およびポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度に対する、ヌクレオチド（ｄ６Ｐｓ）の効果の例示的な結果を示す一連のグラフである。ＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルを図７Ａに示す。実施例４．３を参照する。
【図７Ｂ】Ｃａ２＋の非存在下（◆）または存在下（■）に形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体の形成およびポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度に対する、ヌクレオチド（ｄ６Ｐｓ）の効果の例示的な結果を示す一連のグラフである。解離曲線を図７Ｂに示す。実施例４．３を参照する。
【図８Ａ】[0021]Ｍｇ２＋（■）、２０μＭのポリホスフェートヌクレオチド（△）の存在下、またはＭｇ２＋および２０μＭのポリホスフェートヌクレオチドの両方の非存在下（◆）において複合体が形成された場合の、ポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度の例示的な結果を示す一連のグラフである。ＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルを図８Ａに示す。実施例４．４を参照する。
【図８Ｂ】Ｍｇ２＋（■）、２０μＭのポリホスフェートヌクレオチド（△）の存在下、またはＭｇ２＋および２０μＭのポリホスフェートヌクレオチドの両方の非存在下（◆）において複合体が形成された場合の、ポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度の例示的な結果を示す一連のグラフである。解離曲線を図８Ｂに示す。実施例４．４を参照する。
【図９Ａ】[0022]ｄＮＴＰｓ（■）またはｄ６Ｐｓ（◆）の存在下において複合体が形成された場合の、ポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度の例示的な結果を示す一連のグラフである。ＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルを図９Ａに示す。実施例４．５を参照する。
【図９Ｂ】ｄＮＴＰｓ（■）またはｄ６Ｐｓ（◆）の存在下において複合体が形成された場合の、ポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度の例示的な結果を示す一連のグラフである。解離曲線を図９Ｂに示す。実施例４．５を参照する。
【図１０Ａ】[0023]室温におけるポリメラーゼの鋳型への静的結合を示す未変性５％ＴＢＥゲルの画像である。ポリメラーゼ濃度はヌクレオチドの非存在下で鋳型濃度に対して増大（０、１倍、４倍、および８倍）させている。４倍および８倍のポリメラーゼ濃度で、バンドシフトは多数のポリメラーゼが鋳型上の多数の位置に非特異的結合をしていることを示している。実施例５を参照する。
【図１０Ｂ】[0024]４０℃におけるポリメラーゼの鋳型への静的結合を示す未変性５％ＴＢＥゲルの画像である。図１０Ａと同様に、ポリメラーゼ濃度は鋳型濃度に対して増大（０、１倍、４倍、および８倍）させているが、１．２μＭのヌクレオチド（ポリホスフェート）が存在している。４倍および８倍の濃度でバンドシフトを欠くことは、４０℃においてポリメラーゼが鋳型ＤＮＡの３’末端に特異的に結合していることを示している。実施例５を参照する。
【図１１Ａ】[0025]４０℃におけるポリメラーゼ−鋳型結合と鋳型の延長との相関を示す図である。より詳細には、図１１Ａは０、１倍、２倍、４倍、６倍、および８倍のポリメラーゼ濃度の鋳型への結合を示す未変性５％ＴＢＥゲルの画像である。示されるように、４０℃で１．２μＭのヌクレオチドの存在下において、ポリメラーゼの増大は鋳型結合の増大をもたらす。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａに示す結合の後の鋳型の延長を示す未変性５％ＴＢＥゲルの画像である。ポリメラーゼ濃度を増大させた際の下のバンドから上のバンドへのバンド強度のシフトによって証明されるように、ポリメラーゼの濃度を増大させると鋳型の延長が増大する（延長は１０μＭのヌクレオチドの存在下で起こる）。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは鋳型の結合（図１１Ａから）と鋳型の延長（図１１Ｂ）との相関を示すグラフである。示されるように、結合％は延長％に直接相関する（勾配＝１）。実施例６を参照する。
【図１２Ａ】[0026]４０℃で低レベル（１．２μＭ）のヌクレオチドの存在下におけるポリメラーゼ−鋳型複合体の形成の後の鋳型の延長を示す一連のグラフである。図１２Ａは、鋳型に対するポリメラーゼの濃度を増大（０、１倍、２倍、４倍、６倍、８倍、および１倍）させた際のＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルの振幅曲線を示す図である。示されるように、結合におけるポリメラーゼ濃度の増大により、（対照と比較して増大した濃度におけるシグナル振幅の増大によって証明されるように）延長が増大する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａにおけるデータについての蛍光シグナルの振幅の定量（即ちフルオロフォア単独（▲）と比較したフルオロフォア−消光剤（延長反応）（■））を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、フルオロフォア−消光剤の蛍光振幅（延長反応）をフルオロフォア単独の蛍光振幅と比較することによって決定された、ポリメラーゼ濃度を増大させることによるポリメラーゼの延長％（◆）を示す図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ゲルに基づくアッセイ（上記参照）とプレートリーダー（ＦＲＥＴ）アッセイとの間の鋳型延長比較を示す図である。示されるように、ゲルに基づくアッセイまたはプレートリーダーに基づくアッセイによって測定された鋳型延長％の間には良好な相関がある。図１２Ａ〜１２Ｄは、実施例中の実施例７を参照する。
【図１３Ａ】[0027]４０℃におけるポリメラーゼ−鋳型結合と結合条件を変化させた場合の解離を示す一連のグラフである。図１３Ａは、示された結合条件についてのＦＲＥＴアッセイで得られた蛍光シグナルの振幅曲線を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、１．２μＭ  ｄＮｐＣｐｐ（ブロッキングヌクレオチド）／３ｍＭ  Ｓｒ＋２（◆）、１．２μＭ  ｄＮｐＣｐｐのみ（■）、１．２μＭ  ポリホスフェートヌクレオチドのみ（▲）、またはヌクレオチド／Ｓｒなし（×）についての解離曲線を示す図である。示されるように、Ｓｒ＋２はポリメラーゼ−鋳型の解離に影響しない。ポリホスフェートヌクレオチド（▲）の濃度が低いと解離レベルが最小になる。実施例８を参照する。
【図１４Ａ】[0028]高いヌクレオチド濃度（３６μＭ）の存在下および非存在下における４０℃でのポリメラーゼ複合体の形成および３０℃での解離に対する塩濃度の影響を示すグラフである。図１４Ａは、ヌクレオチドの存在下（■）（最終濃度１０μＭ）およびヌクレオチドの非存在下（対照）（◆）における７５ｍＭ  ＫＧｌｕでのＦＲＥＴアッセイから得られた解離曲線を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ヌクレオチドの存在下（■）（最終濃度１０μＭ）およびヌクレオチドの非存在下（対照）（◆）における３８０ｍＭ  ＫＧｌｕでのＦＲＥＴアッセイから得られた解離曲線を示す図である。示されるように、時間ゼロで結合している鋳型の量は、ヌクレオチドの非存在下において約２倍良好である。したがって、両方の塩濃度で、高いヌクレオチド濃度（結合の間、１０μＭ＋）の存在により、ポリメラーゼ−鋳型の結合は減少する。実施例９を参照する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0029]本特許のファイルは少なくとも１つのカラー図を含んでいる。カラー図を含む本特許または本特許公開のコピーは要望により、かつ必要な手数料の支払いによって、特許庁から提供される。
【００１６】
[0030]本明細書において別段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）により、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書が当業者に与えられる。本明細書において説明する方法および材料と類似または等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。当技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３年が実施者らに特に向くものである。方法、プロトコルおよび試薬は様々であり得るので、本発明は、記載する特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解するべきである。
【００１７】
[0031]数の範囲は、範囲を定める数を含める。本明細書において約という用語は、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するよう使用する。例えば「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指す。
【００１８】
[0032]別段に示されていない限り、核酸は５’〜３’の配向でそれぞれ左から右に書き、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの配向でそれぞれ左から右に書く。
[0033]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照することによって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照することによってより充分に定義される。
【００１９】
[0034]本明細書において参照する全ての特許および刊行物は、このような特許および刊行物で開示されている全ての配列を含めて、参照によって明示的に組み入れられる。
定義
[0035]本明細書において用語「処理能力」は、鋳型に付着したままで複数の修飾反応を行うポリメラーゼの能力を指す。「修飾反応」には、それだけに限らないが、重合、およびエキソヌクレアーゼ的切断が含まれる。いくつかの実施形態では、「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖から酵素の解離に干渉することなく一連の重合ステップを行うＤＮＡポリメラーゼの能力を指す。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼの「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖からＤＮＡポリメラーゼの解離に先立ってポリメラーゼによって成長しているＤＮＡ鎖に組み込まれる、即ち重合されるヌクレオチドの数（例えば、２０ｎｔ、３００ｎｔ、０．５〜１ｋｂ、またはそれ以上）によって測定される。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の処理能力は、単一の鋳型結合事象の間にＤＮＡ鋳型から解離する前にポリメラーゼがＤＮＡの中に組み込むことができるヌクレオチドの数として定義される。ポリメラーゼの処理能力が増大すれば、ＤＮＡ合成の全体の効率が増大する。「処理能力」は、ポリメラーゼの性質、ＤＮＡ鋳型の配列、および反応条件、例えば、塩濃度、温度、または特定のタンパク質の存在に依存し得る。本明細書において用いる「高い処理能力」という用語は、鋳型との会合／解離あたり２０ｎｔ超（例えば、４０ｎｔ超、６０ｎｔ超、８０ｎｔ超、１００ｎｔ超、１２０ｎｔ超、１４０ｎｔ超、１６０ｎｔ超、１８０ｎｔ超、２００ｎｔ超、２２０ｎｔ超、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ超、２８０ｎｔ超、３００ｎｔ超、３２０ｎｔ超、３４０ｎｔ超、３６０ｎｔ超、３８０ｎｔ超、４００ｎｔ超、またはそれ以上）の処理能力を指す。ポリメラーゼの処理能力が高ければ、ポリメラーゼが鋳型から解離する前に組み込まれ得るヌクレオチドの数が増大し、したがって得られる配列（読み取り長）が長くなる。処理能力は本明細書およびＷＯ０１／９２５０１Ａ１（ＭＪ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、２００１年１２月０６日公開）において定義された方法に従って測定することができる。処理能力は静的処理能力および複製処理能力を包含する。
【００２０】
[0036]本明細書において用語「静的処理能力」は、ヌクレオチド組み込みがない場合、即ちポリヌクレオチドの合成がない場合に、ポリメラーゼと鋳型との会合の速度、ｋｏｎ．ＤＮＡおよびポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離の速度、ｋｏｆｆ．ＤＮＡによって決定される、ポリメラーゼ−鋳型複合体の永続性を指す。静的処理能力はポリヌクレオチド合成がない場合に定義される。
【００２１】
[0037]本明細書において用語「複製処理能力」は、ヌクレオチド組み込みの間、即ちポリヌクレオチドの合成がある場合に、ポリメラーゼと鋳型との会合の速度、ｋｏｎ．ヌクレオチドおよびポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離の速度、ｋｏｆｆ．ヌクレオチドによって決定される、ポリメラーゼ−鋳型複合体の永続性を指す。
【００２２】
[0038]本明細書において用いる用語「会合速度」は、所与のポリメラーゼに関して用いる場合、本明細書ではポリメラーゼが鋳型と会合する速度を指す。会合速度は、定義された反応条件の組においてポリメラーゼと核酸鋳型との会合の時定数（「ｋｏｎ．ＤＮＡ」）と解することができる。ポリメラーゼの解離の時定数を測定するためのいくつかの例示的なアッセイを以下にさらに述べる。いくつかの実施形態では、解離の時定数は時間の逆数、例えばｓｅｃ−１またはｍｉｎ−１の単位で測定することができる。
【００２３】
[0039]用語「解離速度」は、所与のポリメラーゼに関して用いる場合、本明細書ではポリメラーゼ−鋳型複合体の鋳型からポリメラーゼが解離する速度を指す。解離速度は、定義された反応条件の組において核酸鋳型からのポリメラーゼの解離の時定数（「ｋｏｆｆ．ＤＮＡ」）と解することができる。ポリメラーゼの解離の時定数を測定するためのいくつかの例示的なアッセイを以下にさらに述べる。いくつかの実施形態では、解離の時定数は時間の逆数、例えばｓｅｃ−１またはｍｉｎ−１の単位で測定することができる。
【００２４】
[0040]用語「安定性」は、ポリメラーゼ−鋳型複合体に関して用いる場合、本明細書では鋳型のポリメラーゼへの会合、およびポリメラーゼからの解離の速度によって決定される、ポリメラーゼ−鋳型複合体の永続性を指す。
【００２５】
[0041]本明細書において用語「読み取り長」は、ポリメラーゼが鋳型からの解離の前に鋳型依存的に核酸鎖の中に組み込むヌクレオチドの数を指す。
[0042]本明細書において用語「高い塩濃度」は、少なくとも１００ｍＭ、１Ｍまでの塩、即ち１価の塩の濃度を指す。
【００２６】
[0043]本明細書において用語「耐塩性」は、例えば１００ｍＭの塩より大きい高い塩濃度を含む溶液中でポリメラーゼ活性を保つポリメラーゼ酵素に関して用いられる。
[0044]本明細書において用語「ヌクレオチドを実質的に含まない」は、少なくとも９９．９％ヌクレオチドを含まない溶液を指す。
【００２７】
[0045]本明細書において用いる用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、鎖内で共有結合したヌクレオチドモノマーからなるポリマー分子を相互交換可能に指す。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓデオキシリボ核酸、ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、およびＲＮＡ（リボ核酸）はポリヌクレオチドの例である。
【００２８】
[0046]用語「アミノ酸」は、本明細書において最も広義にはポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然由来のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然由来のペプチドにおいて一般に見出される２０種の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるものであるか天然源から得られるものであるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において用いる「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、化学修飾アミノ酸には、それだけに限らないが塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換体が含まれる。ペプチドのカルボキシ末端および／またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、それらの活性に悪影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または、他の化学物質での置換によって修飾することができる。アミノ酸はジスルフィド結合に関与することができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸、および／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。その用語が遊離アミノ酸またはペプチドの残基のいずれを指すかは、その用語が使用される文脈から明らかになる。本明細書においては、全てのアミノ酸残基配列は、左右の配向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって示されていることに留意されたい。
【００２９】
[0047]本明細書において用語「ナノポアシーケンシング複合体」または「ナノポア複合体」は、例えばポリヌクレオチドまたはタンパク質等のポリマーと会合したポリメラーゼ等の酵素に連結されたナノポアを指す。ナノポアシーケンシング複合体は膜、例えば脂質二重層の中に存在し、ここでポリマー成分、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸を同定するように機能する。
【００３０】
[0048]本明細書において用語「ポリメラーゼ−鋳型複合体」は、ポリマー、例えばポリヌクレオチド鋳型と会合／カップリングしたポリメラーゼを指す。
[0049]本明細書において用語「複合化ポリメラーゼ」は、ポリメラーゼ−鋳型複合体においてポリヌクレオチド鋳型と会合したポリメラーゼを指す。
【００３１】
[0050]本明細書において用語「ヌクレオチド」は、糖部分（ペントース）、ホスフェート、および含窒素複素環塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位を指す。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３’位または５’位に結合したホスフェート基を含む場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作用的に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書において典型的には「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と呼ばれ、本明細書においては、左から右への配向が５’末端から３’末端への従来の方向である式によって表わされている。
【００３２】
[0051]本明細書において用語「ヌクレオチドアナログ」は、ヌクレオシドトリホスフェートのアナログ、例えば一般的な核酸塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミジンの（Ｓ）グリセロールヌクレオシドトリホスフェート（ｇＮＴＰｓ）を指す（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５〜５３４７（２００６））。
【００３３】
[0052]本明細書において用語「タグ」は、原子もしくは分子、または原子もしくは分子の集団であってよい検出可能な部分を指す。タグは光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば誘導的、容量的）特徴を提供し、その特徴はナノポアを利用して検出することができる。
【００３４】
[0053]本明細書において用語「タグ付きヌクレオチド」は、その末端ホスフェートにタグが付けられたヌクレオチドを指す。
[0054]本明細書において用語「ブロックされたヌクレオチド」は、プライマー延長をブロックする修飾された組み込み不能なヌクレオチドを指す。ｄＮｐＣｐｐは「ブロックされたヌクレオチド」の例である。
【００３５】
[0055]本明細書において用語「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する（即ち、ポリメラーゼ活性）酵素を指す。ポリメラーゼという用語は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を包含する。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。「ＲＮＡポリメラーゼ」はリボヌクレオチドの重合を触媒する。「逆転写酵素」はＲＮＡ鋳型に相補的なデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。本明細書において用いる用語「ポリメラーゼ」およびそのバリアントは、ヌクレオチド（そのアナログを含む）の核酸鎖への重合を触媒することができる任意の酵素を含む。必ずしもそうとは限らないが典型的には、そのようなヌクレオチドの重合は鋳型依存的な様式で起こり得る。
【００３６】
[0056]本明細書において用語「鋳型ＤＮＡ分子」および「鋳型鎖」は相互交換可能に用いられ、例えばプライマー延長反応においてＤＮＡポリメラーゼによって相補的な核酸鎖がそれから合成される核酸の鎖を指す。
【００３７】
[0057]本明細書において用語「試料ポリヌクレオチド」は、試料、例えば生物学的試料から得られたポリヌクレオチドを指す。
[0058]用語「鋳型依存的合成」は、目的の鋳型鎖に相補的な新たなＤＮＡ鎖の合成（例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含むプロセスを指す。用語「鋳型依存的合成」は、典型的には新たに合成されたポリヌクレオチドの鎖の配列が相補的な塩基対形成によって規定されるＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチドの合成を指す（例えばＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照されたい）。
【００３８】
[0059]本明細書において用語「ナノポア」は、膜に形成された、または他の方法で膜に与えられたチャネルまたは通路を指す。膜は脂質二重層等の有機膜であっても、ポリマー材料で形成された膜等の合成膜であってもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路等の検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。いくつかの例においては、ナノポアは、０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。いくつかのナノポアはタンパク質である。ＯｍｐＧおよびα−ヘモリシンはタンパク質ナノポアの例である。
【００３９】
[0060]用語「アルファ−ヘモリシン」、「α−ヘモリシン」、「ａＨＬ」、「αＨＬ」、「ａ−ＨＬ」および「α−ＨＬ」は相互交換可能に用いられ、本明細書において自己組織化して７量体の含水膜貫通ナノポアチャネルを形成するタンパク質を指す。
【００４０】
[0061]本明細書において用語「ＯｍｐＧ」は、外膜プロテインＧモノマーナノポアを指す。
[0062]本明細書において用語「ナノポアシーケンシング」は、ナノポアを利用してポリヌクレオチドの配列を決定する方法を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの配列は鋳型依存的な方式によって決定される。
【００４１】
[0063]本明細書において用語「モノマーナノポア」は、単一のサブユニットからなるナノポアタンパク質を指す。ＯｍｐＧはモノマーナノポアの例である。
[0064]本明細書において用語「オリゴマーナノポア」は、多数の同一のサブユニット、多数の異なったサブユニット、または同一のおよび異なったサブユニットの混合物からなってもよいナノポアを指す。同一のサブユニットからなるナノポアは「ホモオリゴマーナノポア」と称される。２つまたはそれ以上の異なったポリペプチドサブユニットを含むナノポアは「ヘテロオリゴマーナノポア」と称される。α−ヘモリシンはオリゴマーナノポアの例である。
【００４２】
[0065]本明細書において用語「野生型」は、天然由来の供給源から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物（例えばタンパク質）を指す。
【００４３】
[0066]本明細書において用語「親の」または「親」は、それに対して修飾、例えば置換、挿入、欠失、および／または切り詰めを行ってそのバリアントが作成されるタンパク質、例えばナノポアまたは酵素を指す。この用語は、それに対してバリアントが比較され、整列されるポリペプチドをも指す。親は天然由来（野生型）のポリペプチドであってもよく、任意の好適な手段で調製されたそれらのバリアントであってもよい。
【００４４】
[0067]本明細書において用語「変異」は、それだけに限らないが、置換、挿入、（切り詰めを含む）欠失を含む、親配列に導入された変更を指す。変異の結果には、それだけに限らないが、親配列には見出されない新しい特性、特質、機能、表現型、または形質の創造が含まれる。
【００４５】
[0068]本明細書において用語「バリアント」は、親タンパク質と比較して改変された特徴、例えば改変された処理能力を示す修飾タンパク質、例えばバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを指す。
【００４６】
[0069]本明細書において用語「精製された」は、それが含有される試料の重量に対して少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で存在するポリペプチドを意味する。
【００４７】
命名法
[0070]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字コードおよび３文字コードを使用する。
【００４８】
[0071]参照を容易にするため、本出願のポリメラーゼバリアントは、以下の命名法を用いて記載する。元のアミノ酸：位置：置換したアミノ酸。この命名法によれば、例えば、２４２位におけるセリンのアラニンによる置換は、
Ｇｌｕ５８５ＬｙｓまたはＥ５８５Ｋ
として示される。
【００４９】
[0072]複数の変異はプラス記号によって分ける。即ち、
Ｇｌｕ５８５Ｌｙｓ＋Ｌｅｕ７３１ＬｙｓまたはＥ５８５Ｋ＋Ｌ７３１Ｋ
は、それぞれ５８５位および７３１位における、グルタミン酸をリシンに、またロイシンをリシンに置換する変異を表わす。
【００５０】
[0073]１つまたは複数の代替アミノ酸残基を所与の位置に挿入する場合には、これはＥ５８５Ｋ／ＲまたはＥ５８５ＫもしくはＥ５８５Ｒとして示される。
例示実施形態
[0074]ある例示実施形態では、本開示は高い濃度の塩の存在下における鋳型依存的ポリヌクレオチド合成の間にポリメラーゼの処理能力を亢進する方法および組成物を提供する。他の例示実施形態では、本開示は低いヌクレオチド濃度および高い温度の存在下における鋳型依存的ポリヌクレオチド合成の間にポリメラーゼの処理能力を亢進する方法および組成物を提供する。提供される方法および組成物は、ＤＮＡ増幅およびシーケンシングを含む鋳型依存的ＤＮＡ合成の方法に適用可能である。シーケンシング方法には、単一ＤＮＡ分子のナノポアシーケンシング等の単一ポリヌクレオチド分子のシーケンシングバイシンセシスが含まれる。
【００５１】
[0075]図１に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼの処理能力は、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成および酵素によるｄＮＴＰの組み込みに直接関連する。これらのパラメーターの下で、ポリメラーゼの全体の処理能力は静的処理能力および複製処理能力に依存する。ポリメラーゼの静的処理能力および／または複製処理能力が増大すれば、ポリメラーゼの全体の処理能力が増大する。図１に示すように、静的処理能力はポリメラーゼの鋳型との会合速度（ｋｏｎ，ＤＮＡ）および解離速度（ｋｏｆｆ，ＤＮＡ）によって決定される。静的処理能力はポリヌクレオチド合成の非存在下で決定される。したがって、ポリメラーゼと鋳型の会合の速度が大きく（または速く）、および／またはポリメラーゼの鋳型からの解離の速度が小さく（または遅く）なれば、ポリメラーゼの静的処理能力が大きくなる。
【００５２】
[0076]複製処理能力はヌクレオチドの存在下で決定され、ヌクレオチドとポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼとの会合および解離の速度に基づく。したがって、ヌクレオチドと複合体のポリメラーゼとの会合の速度が大きく（または速く）、および／または複合体のポリメラーゼからのヌクレオチドの解離の速度が小さく（または遅く）なれば、ポリメラーゼの複製処理能力が大きくなる。複製処理能力は、ヌクレオチドおよびＭｇ２＋等の二価カチオンの存在下等の重合条件下におけるヌクレオチドのポリメラーゼ−鋳型複合体との会合速度（ｋｏｎ．ヌクレオチド）および解離速度（ｋｏｆｆ．ヌクレオチド）によって決定される。ポリメラーゼの静的処理能力は、ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成するポリメラーゼと鋳型との会合の増大によって、および／またはポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離の減少によって、増大させることができる。
【００５３】
[0077]例示的なアッセイでは、本明細書の実施例に記載したように、所与のポリメラーゼの鋳型との会合および鋳型からの解離の速度は、ポリメラーゼを蛍光標識等の標識をされたオリゴヌクレオチド（図２）と所定の条件下でインキュベートすることによって測定することができる。オリゴヌクレオチドがポリメラーゼと結合していない場合にはオリゴヌクレオチドの蛍光標識の蛍光は消光される。ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドに結合すれば、オリゴヌクレオチド標識の消光が打ち消され、蛍光が増大する。反応混合物に未標識の競合オリゴヌクレオチドを添加することによってブロッキングが開始される。ポリメラーゼが蛍光標識されたオリゴヌクレオチドから解離するとともに、競合オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ポリメラーゼがさらに結合することを阻害する。反応混合物の蛍光は競合オリゴヌクレオチドの添加の後、種々の時点で測定される。観察された蛍光（ＲＦＵ、即ち相対蛍光単位）は、時間（Ｘ軸）に対してグラフ化（Ｙ軸）される。種々の条件下においてポリメラーゼの会合速度および解離速度を比較するため、それぞれの反応混合物の蛍光が種々の時点で測定される並行した別々の反応において酵素を用いることができ、その後で任意の好適な方法によってそれぞれの酵素の解離速度を計算し、比較することができる。
【００５４】
[0078]公開された方法には、ポリメラーゼ−鋳型複合体を安定化させるためにヌクレオチドが用いられてきたことから、ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるための鋳型のポリメラーゼへの結合がヌクレオチドの存在下に行われることが記載されている。例えば、米国特許第２０１５０１６７０７２号には、ポリメラーゼ−鋳型複合体を安定化させるための精製プロセスにヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含ませる、ポリメラーゼ−鋳型複合体の精製のための方法が提供されている。同様に、米国特許第２０１５０３６８６２６号には、１つまたは複数のヌクレオチドの存在下にポリメラーゼを核酸鋳型と接触させるステップを含む、核酸シーケンシングを実施するための方法が提供されている。
【００５５】
[0079]驚くべきことに、本出願人は高い塩濃度においてヌクレオチドが鋳型のポリメラーゼへの結合を妨げることによってポリメラーゼ−鋳型複合体の形成に影響することを確定した（実施例４）。さらに本出願人は、（極めて低い濃度以外における）ヌクレオチドの存在下で鋳型のポリメラーゼへの結合によってポリメラーゼからの鋳型の解離速度が増大することを確定した（実施例５および１０）。ポリメラーゼ−鋳型複合体の静的処理能力に対するヌクレオチドの影響は、典型的にはポリメラーゼ−鋳型複合体の安定剤として含まれるＣａ２＋等の二価カチオンによって低減されない。
【００５６】
[0080]ポリメラーゼ−鋳型複合体の静的処理能力に対する高レベルのヌクレオチドの不安定化効果は、高い塩濃度で起こる合成を必要とする条件、例えばナノポアシーケンシングにおけるポリヌクレオチドの鋳型依存的合成において顕著である。ナノポアシーケンシングにおいては、高い塩濃度によってイオン電流に基づくナノポア測定のシグナル／ノイズ比が増大される。しかし、高い塩濃度によってポリメラーゼ−ＤＮＡ鋳型複合体は不安定化され、重合反応が低下している間にポリメラーゼターンオーバー速度が高くなり、配列ヌクレオチド付加の検出が低下し、即ち処理能力または配列読み取り長が低下する。
【００５７】
[0081]したがって、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼを提供するステップと、高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼをポリヌクレオチド鋳型と接触させるステップとを含む、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法が提供される。ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは野生型でもよく、高い塩濃度でポリメラーゼ活性を保持しているバリアントポリメラーゼでもよい。本明細書に記載した組成物および方法で用いられるポリメラーゼの例には、本明細書の他の箇所に記載した耐塩性ポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼである。
【００５８】
[0082]高レベルのヌクレオチドはポリメラーゼ−鋳型結合に悪影響があるものの、本出願人はまた驚くべきことに、結合の際の低レベルのヌクレオチドが高温における結合の開始とともにポリメラーゼ−鋳型結合の改善およびそれによる処理能力の改善をもたらすことを見出した。例えば、Ｐｏｌ６の融点はおよそ４０℃であり、鋳型が結合すると融点はおよそ４３℃である。ポリメラーゼを４０℃で鋳型に結合させることにより、本明細書に提供する方法および組成物によってポリメラーゼの３’末端への特異的結合および結合していないか鋳型の非特異的部位に結合したポリメラーゼの変性が促進される。本出願人は、結合の改善が鋳型の延長の改善と付随していることも確定した（実施例６〜１０）。
【００５９】
[0083]したがって、ある例示実施形態では、低レベルのヌクレオチドの存在下および高い温度においてポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するための方法が提供される。さらに、反応溶液はポリメラーゼで飽和されていてもよい。ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは野生型でもよく、低いヌクレオチド濃度および高い温度でポリメラーゼ活性を保持しているバリアントポリメラーゼでもよい。ある例示実施形態では、ポリメラーゼは耐塩性であってよい。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼである。本明細書に記載した方法および組成物において有用なポリメラーゼ、ならびに本発明のその他の特色、使用、および態様について以下に述べる。
【００６０】
ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼ
[0084]ある例示実施形態では、本明細書に記載したポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼであってよく、細菌ＤＮＡポリメラーゼ、真核ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、およびファージＤＮＡポリメラーゼを含んでよい。
【００６１】
[0085]ある例示実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、天然産生のポリメラーゼおよびその任意のサブユニットおよび切り詰め、ミュータントポリメラーゼ、バリアントポリメラーゼ、組み換え、融合もしくは他の操作されたポリメラーゼ、化学的修飾ポリメラーゼ、合成分子、ならびに鋳型依存的ポリヌクレオチド合成を行う能力を保持した任意のアナログ、ホモログ、誘導体またはそれらの断片であってよい。任意選択でポリメラーゼは、１つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸による置き換え、ポリメラーゼからの１つまたは複数のアミノ酸の挿入もしくは欠失、または２つ以上のポリメラーゼの部分の連結を含む１つまたは複数の変異を含むミュータントポリメラーゼであってよい。
【００６２】
[0086]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するために用いるポリメラーゼは、高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中で鋳型依存的ＤＮＡ合成を触媒することができる耐塩性ポリメラーゼである。ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させることができる高い塩濃度は、少なくとも１００ｍＭの塩、例えば１００ｍＭのグルタミン酸カリウム（Ｋ−ｇｌｕ）の塩濃度として定義される。
【００６３】
[0087]耐塩性ポリメラーゼは野生型であってもよく、もともと耐塩性のポリメラーゼのバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、耐塩性ポリメラーゼは、高度好塩菌に属するものを含むタイプＢ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに例えば参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０１１３２９１号「Ｓａｌｔ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」に記載されたそれらのバリアントである。
【００６４】
[0088]他の実施形態では、耐塩性ポリメラーゼは、もともと耐塩性ではないが耐塩性になるように修飾されたポリメラーゼであってよい。
[0089]ある例示実施形態では、遅いｋｏｆｆ，ＤＮＡ、速いｋｏｎ，ＤＮＡに加えて、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは高い塩濃度でＤＮＡ重合を行うことができ、またＤＮＡのシーケンシングにおいて有用な１つまたは複数の所望の特徴、例えば遅いｋｏｆｆ，ヌクレオチド、速いｋｏｎ，ヌクレオチド、高い忠実度、低いエキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡ鎖置換、ｋｃｈｅｍ、増大した安定性、増大した処理能力、耐塩性、およびナノポアへの結合との適合性を有することができる。ある例示実施形態では、ポリメラーゼは４、５、６、７または８ホスフェートを有するポリホスフェート、例えばクアドラホスフェート、ペンタホスフェート、ポリホスフェート、ヘプタホスフェートまたはオクタホスフェートヌクレオチドを組み込む能力、シーケンシング精度、ならびに長い読み取り長、即ち長い連続読み取りを有する。
【００６５】
[0090]ある例示実施形態では、ポリメラーゼは室温を超える温度で機能するポリメラーゼ、例えば約３０℃超で機能するポリメラーゼであってよい。他の例示実施形態では、ポリメラーゼは４０℃またはそれ以上の温度で機能し得る。そのようなポリメラーゼには、そのような温度で機能する本明細書に記載した任意のポリメラーゼが含まれてよい。
【００６６】
[0091]ある例示実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、増大した処理能力を有するように操作されたポリメラーゼである。そのような例示的ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）をシーケンシングするためのポリメラーゼの所望の特徴の１つまたは複数に影響を与えまたはそれを亢進する追加の修飾をさらに含んでもよい。
【００６７】
[0092]ある例示実施形態では、操作されたポリメラーゼは、それから誘導された親Ｐｏｌ６と比較して増大した処理能力を示すバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼであってよい。例えば、親ポリペプチドは野生型Ｐｏｌ６ポリペプチドである。ポリメラーゼ−鋳型複合体のバリアントＰｏｌ６ポリペプチドは野生型親クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４野生型配列（配列番号１）核酸コーディング領域プラスＨｉｓタグ、配列番号１、タンパク質コーディング領域）から誘導することができ、他から入手可能である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓまたはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  ＡＦＨ２７１１３）。野生型親Ｐｏｌ６ポリメラーゼは、増大した処理能力を有するバリアントポリメラーゼを提供するための出発点として用いられるクロストリジウムからの親Ｐｏｌ６のホモログであってもよい。
【００６８】
[0093]当業者には理解されるように、本明細書に提供する組成物および方法の範囲を無効にしない限り、クロストリジウムファージｓｐ．株ｐｈｉＣＰＶ４と高度にホモロジーを有する他のポリメラーゼを親Ｐｏｌ６として用いることができる。クロストリジウムファージからの親Ｐｏｌ６のホモログは、クロストリジウムファージからのＰｏｌ６（配列番号１）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有することができる。例えば、バリアントＰｏｌ６はクロストリジウムファージからの親Ｐｏｌ６と少なくとも７０％同一であるクロストリジウムファージのホモログから誘導することができる。
【００６９】
[0094]他の例示実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼはバリアント親Ｐｏｌ６から誘導することができるバリアントＰｏｌ６ポリペプチドである。いくつかの例示実施形態では、バリアント親Ｐｏｌ６ポリメラーゼは配列番号２のＰｏｌ６ポリメラーゼである。他の実施形態では、バリアント親Ｐｏｌ６ポリメラーゼは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を除去／減少させる修飾を含む（例えば参照により明示的に本明細書に組み込まれる２０１６年２月２９日出願の米国特許仮出願第６２／３０１，４７５号「Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」）。さらに他の実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖（例えば成長する核酸鎖）の中に組み込む速度を低減するように変異させることができる。いくつかの例では、ヌクレオチドが核酸鎖の中に組み込まれる速度は、例えば鋳型核酸鎖のメチル化等によって立体障害を生じるようにヌクレオチドおよび／または鋳型鎖を機能化することによって低減させることができる。いくつかの例では、速度はメチル化ヌクレオチドを組み込むことによって低減する。他の実施形態では、親ポリペプチドは、ナノポアシーケンシングにおいて用いるポリメラーゼの所望の特徴を改善するために追加の変異が導入されたＰｏｌ６バリアントである。ある例示実施形態では、バリアントＰｏｌ６は配列番号２の親Ｐｏｌ６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有することができる。
【００７０】
[0095]ある例示実施形態では、ＤＮＡ結合部位における１つまたは複数のアミノ酸の修飾は置換、欠失または挿入の１つまたは複数であってよく、この修飾はバリアントポリメラーゼのポリメラーゼ活性を保持し、親Ｐｏｌ６に対してＰｏｌ−ＤＮＡ複合体からのポリヌクレオチドの解離の速度が減少している。アミノ酸修飾は、配列番号２のアミノ酸残基Ｖ１７３、Ｎ１７５、Ｎ１７６、Ｎ１７７、Ｉ１７８、Ｖ１７９、Ｙ１８０、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１４、Ｙ３３８、Ｔ３３９、Ｇ３４０、Ｇ３４１、Ｔ３４３、Ｈ３４４、Ａ３４５、Ｄ４１７、Ｉ４１８、Ｆ４１９、Ｋ４２０、Ｉ４２１、Ｇ４２２、Ｇ４３４、Ａ４３６、Ｙ４４１、Ｇ５５９、Ｔ５６０、Ｑ６６２、Ｎ５６３、Ｅ５６６、Ｅ５６５、Ｄ５６８、Ｌ５６９、Ｉ５７０、Ｍ５７１、Ｄ５７２、Ｎ５７４、Ｇ５７５、Ｌ５７６、Ｌ５７７、Ｔ５７８、Ｆ５７９、Ｔ５８０、Ｇ５８１、Ｓ５８２、Ｖ５８３、Ｔ５８４、Ｙ５９６、Ｅ５８７、Ｇ５８８、Ｅ５９０、Ｆ５９１、Ｖ６６７、Ｌ６６８、Ｇ６６９、Ｑ６７０、Ｌ６８５、Ｃ６８７、Ｃ６８８、Ｇ６８９、Ｌ６９０、Ｐ６９１、Ｓ６９２、Ａ６９４、Ｌ７０８、Ｇ７０９、Ｑ７１７、Ｒ７１８、Ｖ７２１、Ｉ７３４、Ｉ７３７、Ｍ７３８、Ｆ７３９、Ｄ６９３、Ｌ７３１、Ｆ７３２、Ｔ７３３、Ｔ２８７、Ｇ２８８、Ｍ２８９、Ｒ２９０、Ｔ２９１、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｖ４３６、Ｓ４３７、Ｇ４３８、Ｑ４３９、Ｅ４４０、Ｅ５８５、Ｔ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、およびＤ６５７Ｒに対応する１つまたは複数のアミノ酸残基において行うことができる。
【００７１】
[0096]いくつかの例示実施形態では、ポリメラーゼ活性を有するバリアントＰｏｌ６酵素は配列番号２の全長親Ｐｏｌ６の配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸残基Ｖ１７３、Ｎ１７５、Ｎ１７６、Ｎ１７７、Ｉ１７８、Ｖ１７９、Ｙ１８０、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１４、Ｙ３３８、Ｔ３３９、Ｇ３４０、Ｇ３４１、Ｔ３４３、Ｈ３４４、Ａ３４５、Ｄ４１７、Ｉ４１８、Ｆ４１９、Ｋ４２０、Ｉ４２１、Ｇ４２２、Ｇ４３４、Ａ４３６、Ｙ４４１、Ｇ５５９、Ｔ５６０、Ｑ６６２、Ｎ５６３、Ｅ５６６、Ｅ５６５、Ｄ５６８、Ｌ５６９、Ｉ５７０、Ｍ５７１、Ｄ５７２、Ｎ５７４、Ｇ５７５、Ｌ５７６、Ｌ５７７、Ｔ５７８、Ｆ５７９、Ｔ５８０、Ｇ５８１、Ｓ５８２、Ｖ５８３、Ｔ５８４、Ｙ５９６、Ｅ５８７、Ｇ５８８、Ｅ５９０、Ｆ５９１、Ｖ６６７、Ｌ６６８、Ｇ６６９、Ｑ６７０、Ｌ６８５、Ｃ６８７、Ｃ６８８、Ｇ６８９、Ｌ６９０、Ｐ６９１、Ｓ６９２、Ａ６９４、Ｌ７０８、Ｇ７０９、Ｑ７１７、Ｒ７１８、Ｖ７２１、Ｉ７３４、Ｉ７３７、Ｍ７３８、Ｆ７３９、Ｄ６９３、Ｌ７３１、Ｆ７３２、Ｔ７３３、Ｔ２８７、Ｇ２８８、Ｍ２８９、Ｒ２９０、Ｔ２９１、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｖ４３６、Ｓ４３７、Ｇ４３８、Ｑ４３９、Ｅ４４０、Ｅ５８５、Ｔ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、およびＤ６５７Ｒに対応するアミノ酸の１つまたは複数において修飾を有する。
【００７２】
[0097]いくつかの例示実施形態では、ＤＮＡ結合部位の１つまたは複数のアミノ酸の変異は陽性荷電したアミノ酸への置換である。例えば、配列番号２のアミノ酸残基Ｖ１７３、Ｎ１７５、Ｎ１７６、Ｎ１７７、Ｉ１７８、Ｖ１７９、Ｙ１８０、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１４、Ｙ３３８、Ｔ３３９、Ｇ３４０、Ｇ３４１、Ｔ３４３、Ｈ３４４、Ａ３４５、Ｄ４１７、Ｉ４１８、Ｆ４１９、Ｋ４２０、Ｉ４２１、Ｇ４２２、Ｇ４３４、Ａ４３６、Ｙ４４１、Ｇ５５９、Ｔ５６０、Ｑ６６２、Ｎ５６３、Ｅ５６６、Ｅ５６５、Ｄ５６８、Ｌ５６９、Ｉ５７０、Ｍ５７１、Ｄ５７２、Ｎ５７４、Ｇ５７５、Ｌ５７６、Ｌ５７７、Ｔ５７８、Ｆ５７９、Ｔ５８０、Ｇ５８１、Ｓ５８２、Ｖ５８３、Ｔ５８４、Ｙ５９６、Ｅ５８７、Ｇ５８８、Ｅ５９０、Ｆ５９１、Ｖ６６７、Ｌ６６８、Ｇ６６９、Ｑ６７０、Ｌ６８５、Ｃ６８７、Ｃ６８８、Ｇ６８９、Ｌ６９０、Ｐ６９１、Ｓ６９２、Ａ６９４、Ｌ７０８、Ｇ７０９、Ｑ７１７、Ｒ７１８、Ｖ７２１、Ｉ７３４、Ｉ７３７、Ｍ７３８、Ｆ７３９、Ｄ６９３、Ｌ７３１、Ｆ７３２、Ｔ７３３、Ｔ２８７、Ｇ２８８、Ｍ２８９、Ｒ２９０、Ｔ２９１、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｖ４３６、Ｓ４３７、Ｇ４３８、Ｑ４３９、Ｅ４４０、およびＥ５８５に対応するアミノ酸の任意の１つまたは複数を、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗおよび／またはＴに変異させることができる。
【００７３】
[0098]いくつかの例示実施形態では、ＤＮＡ結合部位の１つまたは複数のアミノ酸の変異はＫへの置換である。例えば、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼはアミノ酸置換Ｇ４３８Ｋ、Ｅ５６５Ｋ、Ｅ５８５Ｋ、Ｌ７３１Ｋ、およびＭ７３８Ｋの１つまたは複数を含むことができる。いくつかの例示実施形態では、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼは置換Ｅ５８５Ｋを含む。他の例示実施形態では、Ｐｏｌ６ポリメラーゼは置換Ｅ５８５Ｋ＋Ｌ７３１Ｋを含む。さらに他の実施形態では、Ｐｏｌ６ポリメラーゼは置換Ｅ５８５Ｋ＋Ｍ７３８Ｋを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ結合部位の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つのアミノ酸またはそれ以上が変異される。
【００７４】
[0099]ある例示実施形態では、ＤＮＡ結合部位の１つまたは複数のアミノ酸の変異は、Ｔ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、またはＤ６５７Ｒの１つまたは複数を含む置換である。例えば、バリアントポリメラーゼには以下の置換、Ｔ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、およびＤ６５７Ｒが含まれてよい。ある例示実施形態では、バリアントポリメラーゼは配列番号１４として示されるアミノ酸配列と約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一のアミノ酸配列である一方、配列番号１４において同定される置換の１つまたは複数を保持している（例えばそこで同定される全ての置換を保持している）。
【００７５】
[00100]ある例示実施形態では、得られるバリアントＰｏｌ６酵素はポリメラーゼ活性を保持し、同じ変異を欠く親ポリメラーゼで示される解離の速度に対して低減したＰｏｌ−ＤＮＡ複合体からのポリヌクレオチドの解離の速度を示す。いくつかの例示実施形態では、親Ｐｏｌ６の修飾により、親Ｐｏｌ６の大きくとも２分の１である鋳型からの解離の速度を有するバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼが産生される。親Ｐｏｌ６の修飾により、親Ｐｏｌ６の大きくとも３分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも４分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも５分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも６分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも７分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも８分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも９分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも１０分の１である、鋳型からの解離の速度を有するバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼが産生され得る。
【００７６】
[00101]野生型親Ｐｏｌ６をコードするＤＮＡ配列は、当技術で周知の種々の方法を用いて、問題のＰｏｌ６を産生する任意の細胞または微生物から単離される。野生型クロストリジウムｐｈｉＣＰＶ４（即ち野生型Ｐｏｌ６）をコードするＤＮＡ配列の例は本明細書において配列番号３のヌクレオチド２８〜２２２０として、および配列番号５のヌクレオチド４２１〜２６１０として提供される。野生型Ｐｏｌ６に加えて、配列番号３はその５’末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６：ＨＨＨＨＨＨ、配列番号９）をコードするヌクレオチドを含む。配列番号５はその５’末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６（配列番号９））およびＳｐｙＣａｔｈｃｅｒペプチドＳＧＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＶＤＴＬＳＧＬＳＳＥＱＧＱＳＧＤＭＴＩＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＫＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＱＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＫＡＴＫＧＤＡＨＩ（配列番号１０）をコードするヌクレオチドを含む。ある例示実施形態では、バリアントポリメラーゼのいずれをも含む本明細書で同定したポリメラーゼのいずれも、ＳｐｙＣａｔｈｃｅｒペプチド（配列番号１０）に直接または間接的に連結される。
【００７７】
[00102]ＤＮＡ配列はゲノム起源、ゲノムおよび合成の混合起源、合成およびｃＤＮＡの混合起源、またはゲノムおよびｃＤＮＡの混合起源であってよく、標準的な手法に従って合成、ゲノム、またはｃＤＮＡ起源の断片（必要に応じてＤＮＡ配列全体の種々の部分に対応する断片）をライゲーションすることによって調製される。ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号またはＲ．Ｋ．Ｓａｉｋｉら（１９８８）に記載されたように特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても調製される。
【００７８】
高い塩濃度におけるポリメラーゼ−鋳型複合体の形成
[00103]ある例示実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体は少なくとも１００ｍＭで１Ｍまでの塩、例えばＫＣｌ、Ｋ−ｇｌｕまたは他の１価の塩の高い塩濃度の存在下で形成させることができる。高い塩濃度は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００ｍＭ、９００ｍＭまたはそれ以上であってよい。典型的な塩には金属元素の塩が含まれる。高い塩溶液には、カリウム塩、ナトリウム塩、セシウム塩、カルシウム塩、コバルト、ニッケル、アルミニウム、マンガン、亜鉛、およびリチウムの１つまたは複数が含まれ得る。塩には当業者には公知の金属元素の重炭酸塩、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、臭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シアン化物、酸化物またはリン酸塩も含まれ得る。いくつかの実施形態では、塩はグルタミン酸カリウム（Ｋ−ｇｌｕ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、または硝酸セシウム（ＣｓＮＯ３）である。いくつかの実施形態では、高い塩溶液にはＫ−Ｇｌｕ（グルタミン酸カリウム）または他の１価の塩が含まれる。さらに、本発明において有用な塩には塩の混合物またはブレンドが含まれ得る。本発明において用いることができるミネラル塩のブレンドには、Ｋ−ＧｌｕとＫＣｌ、Ｋ−ＧｌｕとＫ２ＳＯ４、Ｋ−ＧｌｕとＫＮＯ３、Ｋ−ＧｌｕとＣｓＣｌ、Ｋ−ＧｌｕとＣｓＮＯ３、Ｋ−ＧｌｕとＫＮＯ３、Ｋ−ＧｌｕとＣｓＣｌ、Ｋ−ＧｌｕとＣｓＮＯ３、Ｋ−ＧｌｕとＣｓＣｌ、Ｋ−ＧｌｕとＣｓＮＯ３、ＫＣｌとＫ２ＳＯ４、ＫＣｌとＫＮＯ３、ＫＣｌとＣｓＣｌ、ＫＣｌとＣｓＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４とＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４とＣｓＣｌ、Ｋ２ＳＯ４とＣｓＮＯ３、ＫＮＯ３とＣｓＣｌ、ＫＮＯ３とＣｓＮＯ３、およびＣｓＣｌとＣｓＮＯ３が含まれる。上記の塩はシーケンシング重合反応において５０〜１Ｍの範囲、１００〜８００ｍＭの範囲、２００〜７００ｍＭの範囲、３００〜６００ｍＭの範囲、４００〜５００ｍＭの範囲の濃度で用いられる。いくつかの実施形態では、高い塩濃度は少なくとも１５０ｍＭで５００ｍＭまでであってよい。いくつかの実施形態では、高い塩濃度は少なくとも５００ｍＭ塩である。
【００７９】
[00104]高い塩濃度における複合ポリメラーゼ、例えばバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼの重合の速度は少なくとも１塩基／秒、少なくとも５塩基／秒、少なくとも１０塩基／秒、少なくとも２０塩基／秒、少なくとも３０塩基／秒、少なくとも４０塩基／秒、少なくとも５０塩基／秒またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、複合ポリメラーゼ、例えばバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼの重合の速度は、１００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、２００ｍＭ塩で１塩基／秒、３００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、４００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、５００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、６００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、７００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、８００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、８００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、９００ｍＭ塩で少なくとも１塩基／秒、１Ｍ塩で少なくとも１塩基／秒である。いくつかの実施形態では、複合ポリメラーゼ、例えばバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼの重合の速度は、１００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、２００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、３００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、４００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、５００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、６００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、７００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、８００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、８００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、９００ｍＭ塩で１〜１０塩基／秒、または１Ｍ塩で１〜１０塩基／秒である。
【００８０】
[00105]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するための高い濃度の塩を含む溶液は、ポリメラーゼ−鋳型複合体安定剤をさらに含む。ポリメラーゼ−鋳型複合体安定剤の例には、限定なしにＣａ２＋が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するために提供される溶液は、例えば１００ｍＭ〜５００ｍＭのＫ−ｇｌｕの高い濃度の塩を含む。ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するための溶液は、ヌクレオチドを実質的に含まない。
【００８１】
[00106]ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は、当技術で公知の種々の方法に従ってアッセイすることができる。例えば、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は実施例３に記載した方法に従って決定することができる。
【００８２】
[00107]したがって、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼを提供するステップと、高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼをポリヌクレオチド鋳型と接触させるステップとを含む、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法が提供される。ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは野生型でもよく、高い塩濃度でポリメラーゼ活性を保持しているバリアントポリメラーゼであってもよい。本明細書に記載した組成物および方法で用いることができるポリメラーゼの例には、本明細書の別の箇所に記載した耐塩性ポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼである。
【００８３】
高い温度および低いヌクレオチド濃度におけるポリメラーゼ−鋳型複合体の形成
[00108]ある例示実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体は高い温度および低いヌクレオチド濃度の存在下で形成させることができる。例えば、ある例示実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を調製する方法が提供され、本方法は、（ａ）ポリメラーゼを提供するステップと、（ｂ）低い濃度のヌクレオチドを含み、高い温度である溶液中でポリメラーゼをポリヌクレオチド鋳型と接触させ、それによりポリメラーゼ−鋳型複合体を調製するステップとを含む。
【００８４】
[00109]温度に関しては、例えばポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるための溶液の温度は室温より高く、即ち約２０℃を超えてよい。例えば高い温度は約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃またはそれ以上であってよい。ある例示実施形態では、高い温度は３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、または４２℃である。ある例示実施形態では、高い温度はポリメラーゼまたはポリメラーゼ−鋳型複合体の融点または融点付近である。
【００８５】
[00110]本明細書に記載したある例示実施形態では、その中でポリメラーゼ−鋳型複合体が形成される反応溶液は高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まないが、他の例示実施形態では溶液は低い濃度のヌクレオチドを含む。例えば低いヌクレオチド濃度は０．５μＭ〜２．５μＭの範囲であってよい。他の例示実施形態では、ヌクレオチド濃度は０．８μＭ〜２．２μＭ、例えば約０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、２．０μＭ、２．１μＭ、または２．２μＭである。低い濃度のヌクレオチドに加えて、溶液は本明細書に記載したように高い温度であってよい。例として、その中でポリメラーゼ−鋳型が形成される反応溶液は約０．８μＭ〜２．２μＭの濃度で鋳型ヌクレオチドを含んでよく、溶液の温度は約３８℃〜４２℃である。
【００８６】
[00111]ポリメラーゼの鋳型への結合を促進するため、ある例示実施形態では、ポリメラーゼは鋳型の濃度と等しいか、鋳型の濃度よりモル過剰であってよい。例えば、ポリメラーゼは鋳型の濃度の１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上であってよい。言い換えれば、ある例示実施形態では、反応溶液はポリメラーゼで飽和されていてもよい。
【００８７】
[00112]本明細書に記載した組成物および方法に用いられるポリメラーゼ−複合体のポリメラーゼの例には、本明細書に記載した種々のポリメラーゼが含まれる。これらには、例えば、本明細書に記載したバリアントポリメラーゼに加えて本明細書に記載した高温に適したポリメラーゼのいずれかが含まれる。実施例１０〜１４に記載したようなある例示実施形態では、ポリメラーゼは配列１４として示される配列を含む。他の例示実施形態では、複合体のポリメラーゼは、配列番号２として示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％またはそれ以上の同一性を有する。ある例示実施形態では、ポリメラーゼまたはバリアントポリメラーゼは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチド（配列番号１０）に直接または間接的に連結されて融合ペプチドを形成することができる。例として、配列番号１４として示される配列またはそれに７０％またはそれ以上の同一性を有する配列は、配列１０として示される配列に直接または間接的に結合される。ポリメラーゼおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチドは、例えば当技術で公知の任意のリンカーペプチドによって結合できる。
【００８８】
[00113]ポリメラーゼ複合体を形成させるため、例えばポリメラーゼ、鋳型、およびヌクレオチドは所望の温度で反応溶液中で相互に接触させる。次いで複合体を溶液中で形成させる。例えば、シーケンシングを開始する前に反応溶液を約１０、１５、２０、２５、３０分またはそれ以上インキュベートすることができる。ポリメラーゼ−鋳型複合体が形成され、シーケンシングが開始されると、例えば追加のヌクレオチドを溶液に添加し、それにより溶液中のヌクレオチドの濃度を上昇させる。即ち、シーケンシングが開始すれば、本明細書に記載したいくつかの利点、例えばポリメラーゼ−鋳型複合体形成の増大および処理能力の亢進を達成するために低いヌクレオチド濃度を維持する必要はない。例えば、ヌクレオチドの濃度は約５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、または１５μＭに上げてよい。ある例示実施形態では、反応溶液は本明細書に記載したように高い塩濃度を含んでもよい。
【００８９】
[00114]塩を増加させたポリメラーゼ−鋳型複合体形成の評価と同様、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は当技術で公知の種々の方法に従ってアッセイすることができる。例えば、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は実施例３に記載した方法に従って（即ちＦＲＥＴアッセイを用いて）決定することができる。本明細書に記載した方法および組成物を用いれば、例えばポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は、低いヌクレオチドを欠き、かつ／または室温もしくはそれより低い温度で行った対照と比べて約１０％、１５％、２０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上増大され得る。
【００９０】
[00115]ある例示実施形態では、本明細書において鋳型−ポリメラーゼ複合体の処理能力を増大させる方法が提供され、本方法は本明細書に記載した低い濃度のヌクレオチドを含み本明細書に記載した高い温度を有する溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップを含む。溶液はポリメラーゼで飽和されていてもよい。高温溶液中および低ヌクレオチド溶液中で形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力は、対照である室温のポリメラーゼ−鋳型複合体溶液から得られる処理能力より大きい。例えば、本明細書に記載した方法および組成物を用いれば、処理能力は、低いヌクレオチドを欠き、かつ／または室温もしくはそれより低い温度で行った対照と比べて約１０％、１５％、２０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上増大され得る。
【００９１】
鋳型ポリペプチド
[00116]本明細書に提供する方法および組成物は、種々の異なった種類の、一本鎖ＤＮＡを含む核酸鋳型、発生期の鎖、および二本鎖生成物；二本鎖ＤＮＡ；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド；修飾された、欠失した、非天然の、合成の、および／または稀なヌクレオシドを含む核酸；ならびにそれらの誘導体、模倣体、および／または組合せに適用可能である。
【００９２】
[00117]本発明の鋳型核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、重合剤の結合のための認識部位を有するＲＮＡ、ならびにＲＮＡヘアピンを含む任意の好適なポリヌクレオチドを含んでよい。さらに、標的ポリヌクレオチドは、イントロン、規制領域、アレレ、バリアントもしくは変異等の細胞のゲノムの特定の部分；ゲノム全体；またはそれらの任意の部分であってよい。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉであってもよく、これらから誘導されてもよい。
【００９３】
[00118]本発明の鋳型核酸は、ＰＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド（例えば２４０−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド等の、生物学的ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的でないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）、修飾ホスフェート主鎖等の非天然核酸を含んでよい。核酸は例えば一本鎖または二本鎖であってよい。
【００９４】
[00119]本明細書の方法において鋳型核酸を産生させるために用いる核酸（標的核酸）は、本明細書に提示する方法に修正可能な実質的に任意の種類の核酸であってよい。いくつかの例では、標的核酸それ自体が鋳型核酸として直接用いることができる断片を含む。典型的には、標的核酸は断片化され、鋳型として用いるためにさらに処理される（例えばアダプターでライゲーションされ、および／または環化される。例えば、標的核酸はＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、その他）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、その他）、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、増幅核酸（例えばＰＣＲ、ＬＣＲ、または全ゲノム増幅（ＷＧＡ）による）、断片化および／またはライゲーションによる修飾に供する核酸、全ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの誘導体（例えば化学修飾、標識化、再コード化、タンパク質結合、または他の方法で改変された）であってよい。
【００９５】
[00120]鋳型核酸は直鎖状、環状（環状冗長シーケンシング（ＣＲＳ）のための鋳型を含む）、一本鎖もしくは二本鎖、および／または一本鎖領域を有する二本鎖（例えばステムループ構造）であってよい。鋳型核酸は環境試料（例えば海洋水、アイスコア、土壌試料、その他）、培養試料（例えば一次細胞培養または細胞株）、病原体（例えばウイルスまたは細菌）に感染した試料、組織もしくは生検試料、法医学試料、血液試料、または生命体、例えば動物、植物、細菌、真菌、ウイルスその他からの別の試料から精製または単離されてよい。そのような試料は、タンパク質、脂質、および非標的核酸等の種々の他の成分を含んでもよい。ある実施形態では、鋳型核酸は生命体からの完全なゲノム試料である。他の実施形態では、鋳型核酸は生物学的試料から抽出された全ＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーである。
【００９６】
[00121]高い塩の濃度でポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力を増大させることに加えて、本明細書に提供される方法および組成物を用いて、次善の濃度のコファクター、次善のｐＨレベル、および／もしくは次善の温度から生じる、またはポリヌクレオチドの合成に必要な必須のヌクレオチド以外の化学的または生物学的阻害物質の存在を含む、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成に対する悪影響を相殺できることが考えられる。例えば、ポリメラーゼ−鋳型複合体はヌクレオチドの非存在下で、次善のｐＨおよび／または温度で形成させることができる。
【００９７】
[00122]本明細書に提供される方法に従って調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体は、ＤＮＡ増幅を含む鋳型依存的ＤＮＡ合成法、および鋳型依存的ＤＮＡシーケンシングに用いることができる。
【００９８】
[00123]いくつかの実施形態では、（ａ）高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップと、（ｂ）ヌクレオチドを溶液に添加することによって鋳型依存的ＤＮＡ合成を開始するステップとを含む、鋳型依存的ＤＮＡ合成を行う方法が提供される。他の例示実施形態では、（ａ）低いヌクレオチド濃度を含む溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップであって、溶液が高い温度であるステップと、（ｂ）その後、ヌクレオチドを溶液に添加することによって鋳型依存的ＤＮＡ合成を開始するステップとを含む、鋳型依存的ＤＮＡ合成を実施する方法が提供される。
【００９９】
[00124]ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは野生型でもよく、高い塩濃度および／または高い温度でポリメラーゼ活性を保持しているバリアントポリメラーゼであってもよい。本明細書に記載した組成物および方法で用いられるポリメラーゼの例には、本明細書の他の箇所に記載した耐塩性および耐高温性ポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、塩の高い濃度は１００ｍＭ塩より大きく、例えば１００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕより大きい。
【０１００】
[00125]図１を参照して述べたように、ポリメラーゼの処理能力は、複合ポリメラーゼの静的処理能力を増大させること、および／または複合ポリメラーゼの複製処理能力を増大させることによって、増大させることができる。いくつかの実施形態では、高い塩濃度を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させることによって、ポリメラーゼ−鋳型複合体の静的処理能力を増大させる方法が提供される。高い塩濃度の存在およびヌクレオチドの非存在下において調製した場合、ポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力の増大は、同じ高い塩濃度でヌクレオチドの存在下に調製した場合のポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力より大きい。いくつかの実施形態では、処理能力はポリメラーゼと鋳型の会合の速度が速いこと、および／またはポリメラーゼの鋳型からの解離の速度が遅いことによって増大する。塩の高い濃度は１００ｍＭ塩より大きく、例えば１００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕより大きい。
【０１０１】
[00126]いくつかの実施形態では、低濃度のヌクレオチドを含む高い温度の溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させることによってポリメラーゼ−鋳型複合体の静的処理能力を増大させる方法が提供される。さらに、溶液は本明細書に記載したようにポリメラーゼで飽和されていてもよい。そのような溶液中で調製した場合、ポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力の増大は、室温で高濃度のヌクレオチドを含む溶液中で調製した場合のポリメラーゼ−鋳型複合体の処理能力より大きい。
【０１０２】
ナノポアシーケンシング複合体−ポリメラーゼのナノポアへの付着
[00127]ポリメラーゼを利用するナノポアシーケンシングは、ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアに連結することによって形成されるナノポアシーケンシング複合体によって達成される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体は引き続いてナノポアに連結されてナノポアシーケンシング複合体を形成し、続いてこれが脂質二重層に挿入される。他の実施形態では、ナノポアが最初に脂質二重層に挿入され、続いてポリメラーゼ−鋳型複合体がナノポアに付着される。ナノポアシーケンシング複合体を構築する方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１６年１月２１日出願の米国仮出願第６２／２８１，７１９号「Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」に記載されている。
【０１０３】
[00128]ナノポアを通るイオン電流の測定は、脂質膜に再構成されたナノポアを横切って行われる。いくつかの例では、ナノポアは（例えばエレクトロポレーションによって、拡散によって）膜に挿入される。ナノポアは電気刺激、圧刺激、液体流刺激、気泡刺激、超音波処理、音響、振動、またはそれらの任意の組合せ等の刺激シグナルによって挿入することができる。いくつかの例では、膜は泡を利用して形成され、ナノポアは電気刺激を利用して膜に挿入される。他の実施形態では、ナノポアはそれ自体で膜に挿入される。脂質二重層を構築し、脂質二重層中にナノポアを形成させ、核酸分子をシーケンシングする方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開ＷＯ第２０１１／０９７０２８号およびＷＯ第２０１５／０６１５１０号に見られる。
【０１０４】
[00129]ポリメラーゼ−鋳型複合体は、ナノポアが脂質膜中に挿入される前に、またはナノポアが脂質膜中に挿入された後に、ナノポアに付着させることができる。ある例示実施形態では、ポリメラーゼをナノポアに、例えばα−ヘモリシンのモノマーの１つまたは複数に付着させ、その後で鋳型を添加してポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させる。
【０１０５】
[00130]ナノポアシーケンシング複合体のナノポアには、限定はないが生物学的ナノポア、固相ナノポア、およびハイブリッド生物学的−固相ナノポアが含まれる。Ｐｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体の生物学的ナノポアには、Ｅ．ｃｏｌｉ，ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．からのＯｍｐＧ、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ｓｐ．からのα−ヘモリシン、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｓｐ．からのＭｓｐＡが含まれる。ナノポアは野生型ナノポア、バリアントナノポア、または修飾バリアントナノポアであってよい。
【０１０６】
[00131]バリアントナノポアは、親酵素の特徴に対して変更された特徴を有するように操作されてもよい。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年１０月２８日出願の米国特許出願第１４／９２４，８６１号「ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」を参照されたい。
【０１０７】
[00132]他のバリアントナノポアは、例えば参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１６年６月３０日出願の米国仮特許出願第６２／３５７，２３０号「Ｌｏｎｇ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ」に記載されている。他の例示実施形態では、α−ヘモリシンナノポアのα−ヘモリシンは、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１６年３月３１日出願の米国仮特許出願第６２／３１６，２３６号「Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」に記載されているように修飾されてよい。
【０１０８】
[00133]いくつかの例示実施形態では、野生型酵素に対して特徴が改変される。いくつかの実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体のバリアントナノポアは、それが誘導された親ナノポアのイオン電流ノイズを低減するように操作される。改変された特徴を有するバリアントナノポアの例は、狭窄部位に１つまたは複数の変異を有するＯｍｐＧナノポアであり（参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年９月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２２２，１９７号「ＯｍｐＧ  Ｖａｒｉａｎｔｓ」）、これは親ＯｍｐＧに対してイオンノイズレベルを低減する。イオン電流ノイズの低減により、これらのＯｍｐＧナノポアバリアントをポリヌクレオチドおよびタンパク質の単一分子センシングに用いることができる。他の実施形態では、バリアントＯｍｐＧポリペプチドをさらに変異させて分子アダプターを結合させることができ、この分子アダプターはポアの中に存在している間にポアを通る分析物質、例えばヌクレオチド塩基の動きを遅くしてそれにより分析物質の同定の精度を改善する（２００５年１２月３０日にオンラインで発表されたＡｓｔｉｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １０．１０２１／ｊａ０５７１２３＋）。
【０１０９】
[00134]修飾されたバリアントナノポアは、典型的にはそのサブユニットがサブユニット間相互作用に影響するように操作されたマルチマーナノポアである（参照により全体として本明細書に組み込まれる、それぞれ２０１５年９月２４日および２０１５年１０月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２３２，１７５号および第６２／２４４，８５２号「Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔｓ」）。改変されたサブユニット相互作用を利用して、それによってモノマーがオリゴマー化して脂質二重層中でマルチマーナノポアを形成する配列および順序を特定することができる。この手法により、ナノポアを形成するサブユニットの化学量論を制御することができる。オリゴマー化の間のサブユニットの相互作用のシーケンスを決定するためにそのサブユニットを修飾することができるマルチマーナノポアの例は、ａＨＬナノポアである。
【０１１０】
[00135]いくつかの例示実施形態では、単一のポリメラーゼがそれぞれのナノポアに付着される。他の実施形態では、２つ以上のポリメラーゼがモノマーナノポアに、またはオリゴマーナノポアのサブユニットに付着される。
【０１１１】
付着の手段
[00136]Ｐｏｌ６−ＤＮＡ鋳型複合体等のポリメラーゼ−鋳型複合体は、任意の好適な方法でナノポアに付着させることができる。ポリメラーゼ−ポリマー複合体のナノポアへの付着は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチドシステム（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ１０９：Ｅ６９０〜Ｅ６９７（２０１２））、未変性化学ライゲーション（Ｔｈａｐａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９：１４４６１〜１４４８３（２０１４））、ソルターゼシステム（ＷｕおよびＧｕｏ、Ｊ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｃｈｅｍ  ３１：４８〜６６（２０１２））；Ｈｅｃｋら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９７：４６１〜４７５（２０１３））、トランスグルタミナーゼシステム（Ｄｅｎｎｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２５：５６９〜５７８（２０１４））、ホルミルグリシン連結（Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４：１２７７〜１２９４（２０１３））、または当技術で公知の他の化学ライゲーション手法を用いて達成することができる。
【０１１２】
[00137]ポリメラーゼ−鋳型複合体は、複合体のポリメラーゼ部分をナノポアに連結することによって、ナノポアに付着させることができる。いくつかの例では、ポリメラーゼ、例えばバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を用いてナノポアに連結される。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）はＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４−ホルミルベンゾエート、芳香族アルデヒド）との反応であってよい。いくつかの例では、ポリメラーゼはＣｌｉｃｋ化学（例えばＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能）を用いてナノポアに連結される。
【０１１３】
[00138]いくつかの例では、亜鉛フィンガー変異をナノポア分子に導入し、次いで分子（例えばＤＮＡ中間分子）を用いてＰｏｌ６ポリメラーゼをナノポア、例えばα−ヘモリシンの亜鉛フィンガー部位に連結する。
【０１１４】
[00139]さらに、ポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ鋳型複合体は、付着部位においてナノポアに付着されるリンカー分子を用いて、ナノポア、例えばａＨＬ、ＯｍｐＧに付着させることができる。いくつかの例では、ポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ鋳型複合体は、分子ステープルを用いてナノポアに付着される。いくつかの例では、分子ステープルは３つのアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、Ｃと表わされる）を含む。リンカーＡはナノポアモノマーから延長でき、リンカーＢはポリメラーゼ単独からまたはポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体のポリメラーゼから延長でき、次いでリンカーＣは（例えばリンカーＡとリンカーＢ両方の周囲に巻きつくことによって）リンカーＡとリンカーＢを結合し、それによりポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ鋳型複合体をナノポアに連結することができる。リンカーＣはリンカーＡまたはリンカーＢの部分になるように構成してもよく、それによりリンカー分子の数が減少する。
【０１１５】
[00140]バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼをナノポアに付着させるために用いられる他のリンカーは、直接の遺伝子連結（例えば（ＧＧＧＧＳ）１−３アミノ酸リンカー（配列番号１９））、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えばＲＳＫＬＧ（配列番号２０））、ソルターゼ媒介連結、およびシステイン修飾による化学的連結である。本明細書において有用と考えられる特定のリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１−３（配列番号１９）、Ｎ末端上のＫ−ｔａｇ（ＲＳＫＬＧ（配列番号２０））、ΔＴＥＶ部位（１２〜２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２〜４９）である。
【０１１６】
[00141]膜中でポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ鋳型複合体をナノポアに付着させる例示的な方法は、リンカー分子をナノポアに付着させるステップ、または付着部位を有するようにナノポアを変異させ、次いでポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体を付着部位または付着リンカーに付着させるステップを含む。ナノポアが膜中に挿入された後でポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体が付着部位または付着リンカーに付着される。いくつかの例では、ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体は、膜中に挿入されバイオチップのウェルおよび／または電極の上に配置された複数のナノポアのそれぞれに付着される。
【０１１７】
[00142]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、リンカーペプチドを含む融合タンパク質として発現する。ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドを含む融合タンパク質として発現することができ、これはＳｐｙＴａｇペプチドを含むナノポアに共有結合することができる（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ１０９：Ｅ６９０〜Ｅ６９７（２０１２））。
【０１１８】
[00143]ポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ鋳型複合体は、例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開；Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に記載された方法を用いてナノポアに付着されてよい。
【０１１９】
バイオチップ
[00144]本明細書に記載されたように調製された１つまたは複数のポリメラーゼ−鋳型複合体をそれぞれ含むナノポアを、膜、例えば脂質二重層に挿入し、ナノポアに基づくセンサー、例えばバイオチップの集積回路等の検知回路の検知電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。ナノポアは膜中に挿入し、バイオチップのウェルおよび／または検知電極の上に配置してもよい。複数のナノポアセンサーをアレイとして提供してもよい。バイオチップおよびバイオチップを作成する方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５４（ＷＯ２０１５／０６１５１１として公開、Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている。
【０１２０】
[00145]バイオチップは、親Ｐｏｌ６に対して増大した処理能力を有するポリメラーゼをそれぞれ有するナノポアを含んでよい。バリアントＰｏｌ６には、本明細書に記載した修飾／置換のいずれかが含まれ得る。例えば、バリアントポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸残基Ｖ１７３、Ｎ１７５、Ｎ１７６、Ｎ１７７、Ｉ１７８、Ｖ１７９、Ｙ１８０、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１４、Ｙ３３８、Ｔ３３９、Ｇ３４０、Ｇ３４１、Ｔ３４３、Ｈ３４４、Ａ３４５、Ｄ４１７、Ｉ４１８、Ｆ４１９、Ｋ４２０、Ｉ４２１、Ｇ４２２、Ｇ４３４、Ａ４３６、Ｙ４４１、Ｇ５５９、Ｔ５６０、Ｑ６６２、Ｎ５６３、Ｅ５６６、Ｅ５６５、Ｄ５６８、Ｌ５６９、Ｉ５７０、Ｍ５７１、Ｄ５７２、Ｎ５７４、Ｇ５７５、Ｌ５７６、Ｌ５７７、Ｔ５７８、Ｆ５７９、Ｔ５８０、Ｇ５８１、Ｓ５８２、Ｖ５８３、Ｔ５８４、Ｙ５９６、Ｅ５８７、Ｇ５８８、Ｅ５９０、Ｆ５９１、Ｖ６６７、Ｌ６６８、Ｇ６６９、Ｑ６７０、Ｌ６８５、Ｃ６８７、Ｃ６８８、Ｇ６８９、Ｌ６９０、Ｐ６９１、Ｓ６９２、Ａ６９４、Ｌ７０８、Ｇ７０９、Ｑ７１７、Ｒ７１８、Ｖ７２１、Ｉ７３４、Ｉ７３７、Ｍ７３８、Ｆ７３９、Ｄ６９３、Ｌ７３１、Ｆ７３２、Ｔ７３３、Ｔ２８７、Ｇ２８８、Ｍ２８９、Ｒ２９０、Ｔ２９１、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｖ４３６、Ｓ４３７、Ｇ４３８、Ｑ４３９、Ｅ４４０、Ｅ５８５、Ｔ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、およびＤ６５７Ｒに対応する１つまたは複数のアミノ酸残基における修飾を含んでよい。
【０１２１】
[00146]いくつかの例示実施形態では、修飾はアミノ酸Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、および／またはＴに対する置換である。いくつかの実施形態では、置換はＫに対する置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＰｏｌ６は置換Ｅ５８５Ｋを含む。他の実施形態では、バリアントＰｏｌ６は２つのアミノ酸Ｅ５８５Ｋ＋Ｌ７３１Ｋの置換を含む。さらに他の実施形態では、バリアントＰｏｌ６は２つのアミノ酸Ｅ５８５Ｋ＋Ｌ７３１Ｋの置換を含む。他の例示実施形態では、バリアントＰｏｌ６はＴ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、および／もしくはＤ６５７Ｒまたはそれらの組合せにおいて１つまたは複数の置換を含んでよい。例えば、ポリメラーゼバリアントはＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ置換のそれぞれを含んでよい。ある例示実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈｉｓ６タグ（配列番号９）および配列番号４のポリメラーゼで与えられるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチドを含む親Ｐｏｌ６ポリメラーゼ内で行うことができる。
【０１２２】
[00147]ある例示実施形態では、得られるバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼは、それらの親Ｐｏｌ６ポリメラーゼに対して増大した処理能力を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼは高い塩濃度で増大した処理能力を有する。いくつかの実施形態では、増大した処理能力は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００ｍＭまたはそれ以上の高い塩濃度で保持される。いくつかの実施形態では、処理能力の増大は、１００ｍＭより大きい高い塩濃度で示される。処理能力の増大は、親Ｐｏｌ６の大きくとも２分の１である鋳型解離速度の減少を含む。親Ｐｏｌ６の修飾により、親Ｐｏｌ６の大きくとも３分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも４分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも５分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも６分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも７分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも８分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも９分の１である、親Ｐｏｌ６の大きくとも１０分の１である鋳型からの解離速度を有するバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを産生することができる。いくつかの実施形態では、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼは低いヌクレオチド濃度および高い温度で増大した処理能力を有する。ある例示実施形態では、ポリメラーゼは高い温度、例えば本明細書に記載したように室温を超える温度で増大した処理能力を有する。
【０１２３】
[00148]膜、例えば脂質二重層の中にナノポアのアレイを含む実施形態については、シーケンシングナノポア複合体の密度は高くてよい。高密度アレイは、１ｍｍ２あたり約５００ナノポアシーケンシング複合体以上のＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体の密度を有する膜表面を有するという点で特徴付けられる。いくつかの実施形態では、表面は１ｍｍ２あたり約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００ナノポアシーケンシング複合体の離散したナノポアシーケンシング複合体の密度を有する。いくつかの実施形態では、表面は１ｍｍ２あたり少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約２００００、少なくとも約４００００、少なくとも約６００００、少なくとも約８００００、少なくとも約１０００００、または少なくとも約５０００００ナノポアシーケンシング複合体の離散したナノポアシーケンシング複合体の密度を有する。
【０１２４】
[00149]本明細書に提供するナノポアシーケンシング方法は、ヌクレオチドとの相互作用の間にポアを通過する電流を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子をシーケンシングするステップは、（例えば、分子がナノポアを通って移動する方向が逆転しないように）直流の印加を必要とすることがある。しかし、直流を用いて長い時間にわたってナノポアセンサーを操作することは、電極の組成を変化させ、ナノポアにわたるイオン濃度の平衡を変化させ、その他の望ましくない影響を及ぼすことがある。交流（ＡＣ）波形を適用することによって、これらの望ましくない影響を避け、以下に述べるようにある利点を得ることができる。タグ付きヌクレオチドを利用する本明細書に記載した核酸シーケンシング方法は、ＡＣ印加電圧と完全な適合性があり、したがって前記の利点を達成するために用いることができる。
【０１２５】
[00150]膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は当技術で公知であり、その例を本明細書の実験の部に提供する。この方法は、膜とポアにわたって印加される電圧で行われる。用いる電圧は典型的には−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。用いる電圧は、好ましくは−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍｖ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限ならびに＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限を有する範囲である。用いる電圧は、より好ましくは１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲である。印加する電位の増大を用いることによって、本発明のポアによる異なったヌクレオチドの間の差を増大させることが可能である。ＡＣ波形およびタグ付きヌクレオチドを用いる核酸のシーケンシングは、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１３年１１月６日出願の米国特許公開第２０１４／０１３４６１６号「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」に記載されている。ＵＳ２０１４／０１３４６１６に記載されたタグ付きヌクレオチドに加えて、糖または非環式部分を欠くヌクレオチドアナログ、例えば４つの共通の核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミジンの（Ｓ）−グリセロールヌクレオシドトリホスフェート（ｇＮＴＰｓ）を用いてシーケンシングを実施することができる（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５〜５３４７（２００６））。
【０１２６】
ポリヌクレオチドをシーケンシングする方法
[00151]本明細書の他の箇所に述べたように、本明細書に記載したＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体のバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを用いて特徴付けされる分子は、荷電したまたは極性のポリマー分子等の荷電したまたは極性の分子を含む種々の型であってよい。特定の例には、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が含まれる。ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子であってよい。リボ核酸は逆転写され、次いでシーケンシングされ得る。
【０１２７】
[00152]ある例示実施形態では、本明細書に提供される方法に従って、即ち高い塩濃度およびヌクレオチドの非存在下で調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体を用いて高い塩濃度で核酸をシーケンシングする方法が提供される。ポリメラーゼ−鋳型複合体は続いてナノポアに付着されてナノポアシーケンシング複合体を形成し、これがポリヌクレオチド配列を検出する。他の例示実施形態では、本明細書に提供される方法、例えば低いヌクレオチド濃度を用い、高い温度で、過剰のポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップに従って調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体を用いて核酸をシーケンシングする方法が提供される。ポリメラーゼ−鋳型複合体は続いてナノポアに付着されてナノポアシーケンシング複合体を形成し、これがポリヌクレオチド配列を検出する。
【０１２８】
[00153]本明細書に提供される組成物および方法に従って調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体は、ポリヌクレオチドのシーケンシングに酵素を利用する当技術で公知の他のナノポアシーケンシングプラットフォームを用いて高い塩濃度で核酸の配列を決定するために用いることができる。同様に、提供される組成物および方法に従って調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体は、ポリヌクレオチドのシーケンシングに酵素を利用する当技術で公知の他のナノポアシーケンシングプラットフォームを用いて例えば高い温度で核酸の配列を決定するために用いることができる。例えば、本明細書に記載した方法に従って調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＳｔｒａｔｏｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）のナノポアシーケンシングバイエクスパンジョンのヘリカーゼおよびエキソヌクレアーゼに基づく方法に従って核酸をシーケンシングするために用いることができる。
【０１２９】
[00154]いくつかの例示実施形態では、核酸のシーケンシングは、本明細書に記載した方法に従って調製されたポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体を調製するステップと、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１３年１１月７日出願の「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」）に記載されているようにタグ付きヌクレオチドを用いて高い塩濃度でポリヌクレオチド配列を決定するステップとを含む。例えば、ヌクレオチド塩基がポリメラーゼと会合したポリヌクレオチドの鎖に相補的な鎖の中に組み込まれ、ヌクレオチドのタグがナノポアによって検出されるので、１つまたは複数の検知電極に隣接した、または検知近傍にある膜（例えば脂質二重層）の中に存在するナノポアシーケンシング複合体によって、高い塩濃度におけるポリメラーゼによるタグ付きヌクレオチドの組み込みを検出することができる。本明細書に示したように、ポリメラーゼ−鋳型複合体はナノポアと会合することができる。
【０１３０】
[00155]タグ付きヌクレオチドのタグは、ナノポアによって検出できる化学基または分子を含み得る。タグ付きヌクレオチドを提供するために用いられるタグの例は、少なくともＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７の段落［０４１４］〜［０４５２］に記載されている。ヌクレオチドは異なったヌクレオチドの混合物、例えばタグ付きｄＮＴＰｓの混合物から組み込むことができ、ここでＮはアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）である。あるいは、ヌクレオチドは個別のタグ付きｄＮＴＰｓの交互の溶液、即ちタグ付きｄＡＴＰ、タグ付きｄＣＴＰ、続いてタグ付きｄＧＴＰ等から組み込むことができる。ポリヌクレオチド配列の決定は、タグがナノポアを通して流れもしくはそれに隣接している際に、タグがナノポア中に存在する際に、および／またはタグがナノポアに提示される際に、ナノポアがタグを検出することによって起こり得る。それぞれのタグ付きヌクレオチドのタグは、これだけに限らないがヌクレオチドのホスフェート（例えばγホスフェート）、糖または含窒素塩基部分を含む任意の位置でヌクレオチド塩基に連結することができる。いくつかの場合には、ヌクレオチドタグの組み込みの間にタグがポリメラーゼと会合している際に、タグが検出される。タグは、ヌクレオチドの組み込みおよび引き続くタグの開裂および／または放出の後でナノポアを通してタグが移動するまで、検出を続けることができる。いくつかの場合には、ヌクレオチド組み込み事象によってタグ付きヌクレオチドからタグが放出され、タグはナノポアを通過して検出される。タグはポリメラーゼによって放出され、またはこれだけに限らないがポリメラーゼの付近に位置する酵素による開裂を含む任意の適当な方式で開裂され／放出され得る。それぞれの型のヌクレオチド（即ちアデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル）から固有のタグが放出されるので、組み込まれた塩基（即ちＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）をこのようにして同定することができる。いくつかの状況では、ヌクレオチド組み込み事象によってタグは放出されない。そのような場合には、組み込まれたヌクレオチドに連結されたタグはナノポアを利用して検出される。いくつかの例では、タグはナノポアを通って、またはその近傍を移動することができ、ナノポアを利用して検出することができる。
【０１３１】
[00156]したがって、一態様では、ナノポアシーケンシング複合体を利用して高い塩濃度で試料、例えば生物学的試料からのポリヌクレオチドをシーケンシングする方法が提供される。試料のポリヌクレオチドは高い塩濃度を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼと合わされて、ナノポアシーケンシング複合体のポリメラーゼ−鋳型複合体部分が提供される。一実施形態では、試料のポリヌクレオチドは試料のｓｓＤＮＡ鎖であり、これがＤＮＡポリメラーゼと合わされてポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体が提供される。
【０１３２】
[00157]いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド試料のナノポアシーケンシングは、例えば１００ｍＭを超える高い塩濃度を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−鋳型またはバリアントＰｏｌ６−鋳型複合体を提供し、ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアに付着させてナノポア−シーケンシング複合体を形成させ、ヌクレオチドを提供して鋳型依存的鎖合成を開始させることによって実施される。シーケンシング複合体のナノポア部分は、本明細書の他の箇所に記載したように、検知電極に隣接した、またはその近傍にある膜の中に存在する。得られるナノポアシーケンシング複合体は、本明細書の他の箇所に記載したように、試料ＤＮＡのヌクレオチド塩基の配列を高い塩濃度で決定することができる。他の実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体は二本鎖ＤＮＡの配列を決定する。他の実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体は一本鎖ＤＮＡの配列を決定する。さらに他の実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体は逆転写産生物をシーケンシングすることによって、ＲＮＡの配列を決定する。
【０１３３】
[00158]いくつかの実施形態では、高い塩濃度におけるナノポアシーケンシングの方法が提供される。この方法は、（ａ）例えば少なくとも１００ｍＭの高い濃度の塩を含みヌクレオチドを含まない溶液中でポリメラーゼ−鋳型複合体を提供するステップと、（ｂ）ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアと組み合わせてナノポア−シーケンシング複合体を形成させるステップと、（ｃ）タグ付きヌクレオチドをナノポアシーケンシング複合体に提供して少なくとも１００ｍＭ塩の高い塩濃度で鋳型依存的ナノポアシーケンシングを開始するステップと、（ｄ）ナノポアを利用して、ヌクレオチドのそれぞれの組み込みの間にタグ付きヌクレオチドのそれぞれと会合したタグを検出し、鋳型の配列を決定するステップとを含む。ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは野生型でもよく、高い塩濃度でポリメラーゼ活性を保持しているバリアントポリメラーゼでもよい。本明細書に記載した組成物および方法で用いられるポリメラーゼの例には、本明細書の他の箇所に記載した耐塩性ポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼである。
【０１３４】
[00159]いくつかの実施形態では、核酸試料をナノポアシーケンシングする方法が提供される。この方法は、本明細書に提供されるバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを含むナノポアシーケンシング複合体を用いるステップを含む。一実施形態では、この方法は、タグ付きヌクレオチドをＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体に提供し、高塩条件下で重合反応を実施して鋳型依存的の様式でヌクレオチドを組み込むステップと、組み込まれたヌクレオチドのそれぞれのタグを検出して鋳型ＤＮＡの配列を決定するステップとを含む。
【０１３５】
[00160]一実施形態では、タグ付きヌクレオチドが本明細書に提供されるバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを含むＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体に提供され、高塩の条件下で前記ナノポアシーケンシング複合体のバリアントＰｏｌ６酵素を利用して重合反応を実施して、核酸試料からの一本鎖核酸分子に相補的な成長する鎖の中にタグ付きヌクレオチドを組み込み、ナノポアを利用して個別のタグ付きヌクレオチドの組み込みの間に前記個別のタグ付きヌクレオチドと会合したタグを検出し、タグはヌクレオチドがバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼと会合している間に前記ナノポアを利用して検出される。
【０１３６】
[00161]一態様では、高い温度および低いヌクレオチド濃度でナノポアシーケンシング複合体を利用して試料、例えば生物学的試料からのポリヌクレオチドをシーケンシングする方法が提供される。例えば、試料ポリヌクレオチドは、高い温度および低いヌクレオチド濃度を有する溶液中でポリメラーゼと合わされる。一実施形態では、試料ポリヌクレオチドは試料ｓｓＤＮＡ鎖であり、これはＤＮＡポリメラーゼと合わされてポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体が提供される。温度は本明細書に記載したように約４０℃等、室温を超えてよい。ヌクレオチド濃度は本明細書に記載したように例えば約１．２μＭでよい。さらに、溶液は高濃度のポリメラーゼを含んでよく、ポリメラーゼで飽和されていてもよい。ポリメラーゼは本明細書に記載したようにバリアントポリメラーゼであってよい。
【０１３７】
[00162]ある例示態様では、ポリヌクレオチド鋳型のナノポアに基づくシーケンシングの方法が提供される。この方法は、低濃度のヌクレオチドを含む溶液中で本明細書に記載したようにポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップであって、溶液が室温を超える等の高い温度を有するステップを含む。例えば、温度は本明細書に記載したように約４０℃であってよい。この方法は、形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアと組み組み合わせてナノポア−シーケンシング複合体を形成させるステップを含む。次いでタグ付きヌクレオチドがナノポア−シーケンシング複合体に提供され、鋳型の鋳型依存的ナノポアシーケンシングが高い温度で開始され得る。ナノポアを利用して、タグ付きヌクレオチドのそれぞれがポリメラーゼと会合しつつタグ付きヌクレオチドのそれぞれが組み込まれている間に、タグ付きヌクレオチドのそれぞれと会合したタグが検出され、それによりポリヌクレオチド鋳型の配列が決定される。ある例では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させるステップは、溶液をポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼで飽和させるステップを含む。ヌクレオチド濃度は０．８μＭ〜２．２μＭ、例えば約１．２μＭであってよい。温度は例えば約３５℃〜４５℃、例えば約４０℃であってよい。
【０１３８】
[00163]ポリヌクレオチドをシーケンシングするための本発明のナノポアシーケンシング複合体とともにタグ付きヌクレオチドの使用を含むシーケンシング方法の他の実施形態は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７４７２７に提供されている。
【０１３９】
[00164]ＡＣ波形およびタグ付きヌクレオチドを用いる核酸のシーケンシングは、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１３年１１月６日出願の米国特許公開第２０１４／０１３４６１６号「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」に記載されている。ＵＳ２０１４／０１３４６１６に記載されたタグ付きヌクレオチドに加えて、糖または非環式部分を欠くヌクレオチドアナログ、例えば５つの共通の核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミジンの（Ｓ）−グリセロールヌクレオシドトリホスフェート（ｇＮＴＰｓ）を用いてシーケンシングを実施することができる（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５〜５３４７（２００６））。
【０１４０】
試薬、保存溶液、およびキット
[00165]ＤＮＡシーケンシングまたは増幅、例えばナノポアシーケンシングのためのシーケンシング試薬も提供され、試薬は高い濃度の塩を含みヌクレオチドを実質的に含まない溶液中にポリメラーゼ−鋳型複合体を含む。ある例示実施形態では、試薬は低レベルのヌクレオチドを含む溶液中にポリメラーゼおよび鋳型を含み、本明細書に記載したように溶液を高い温度に加温してポリメラーゼ−鋳型複合体の形成を開始および／または亢進することができる。そのような実施形態では、溶液はポリメラーゼで飽和されていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、野生型または高い塩濃度でポリメラーゼ活性を保持しているバリアントポリメラーゼ、例えば配列番号１、２、４、６、７、８および１４のいずれかのＰｏｌ６であるポリメラーゼを含む。本明細書に記載した組成物および方法で用いられるポリメラーゼの例には、本明細書の他の箇所に記載した耐塩性および／または耐高温性ポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼである。
【０１４１】
[00166]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号２の全長親ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＰｏｌ６ポリメラーゼであり、配列番号２のアミノ酸Ｖ１７３、Ｎ１７５、Ｎ１７６、Ｎ１７７、Ｉ１７８、Ｖ１７９、Ｙ１８０、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１４、Ｙ３３８、Ｔ３３９、Ｇ３４０、Ｇ３４１、Ｔ３４３、Ｈ３４４、Ａ３４５、Ｄ４１７、Ｉ４１８、Ｆ４１９、Ｋ４２０、Ｉ４２１、Ｇ４２２、Ｇ４３４、Ａ４３６、Ｙ４４１、Ｇ５５９、Ｔ５６０、Ｑ６６２、Ｎ５６３、Ｅ５６５、Ｅ５６６、Ｄ５６８、Ｌ５６９、Ｉ５７０、Ｍ５７１、Ｄ５７２、Ｎ５７４、Ｇ５７５、Ｌ５７６、Ｌ５７７、Ｔ５７８、Ｆ５７９、Ｔ５８０、Ｇ５８１、Ｓ５８２、Ｖ５８３、Ｔ５８４、Ｙ５９６、Ｅ５８７、Ｇ５８８、Ｅ５９０、Ｆ５９１、Ｖ６６７、Ｌ６６８、Ｇ６６９、Ｑ６７０、Ｌ６８５、Ｃ６８７、Ｃ６８８、Ｇ６８９、Ｌ６９０、Ｐ６９１、Ｓ６９２、Ａ６９４、Ｌ７０８、Ｇ７０９、Ｑ７１７、Ｒ７１８、Ｖ７２１、Ｉ７３４、Ｉ７３７、Ｍ７３８、Ｆ７３９、Ｄ６９３、Ｌ７３１、Ｆ７３２、Ｔ７３３、Ｔ２８７、Ｇ２８８、Ｍ２８９、Ｒ２９０、Ｔ２９１、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｖ４３６、Ｓ４３７、Ｇ４３８、Ｑ４３９、Ｅ４４０、およびＥ５８５、Ｔ５２９Ｍ、Ｓ３６６Ａ、Ａ５４７Ｆ、Ｎ５４５Ｌ、Ｙ２２５Ｌ、およびＤ６５７Ｒに対応するアミノ酸残基の１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換はＫ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、および／またはＴに対するものである。いくつかの実施形態では、シーケンシング試薬は配列番号６、配列番号７、配列番号８および／または配列番号１４のバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、シーケンシング試薬は本明細書に提供するバリアント耐塩性または耐熱性Ｐｏｌ６ポリメラーゼの任意の１つをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１４２】
[00167]別の例示実施形態では、保存溶液が提供される。保存溶液は高い濃度の塩を含む溶液中にポリメラーゼ−鋳型複合体を含む。いくつかの実施形態では、塩の高い濃度は１００ｍＭ塩より大きく、例えば１００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕより大きい。別の例示実施形態では、保存溶液は低レベルのヌクレオチドを含む溶液中にポリメラーゼおよび鋳型を含み、本明細書に記載したように該溶液を高温に加温してポリメラーゼ−鋳型複合体の形成を開始および／または亢進することができる。保存溶液は、例えばポリメラーゼで飽和されていてもよい。
【０１４３】
[00168]別の態様では、ＤＮＡシーケンシングのためのシーケンシング試薬を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは高い濃度の塩を含みヌクレオチドを含まない溶液中にポリメラーゼ−鋳型複合体を含む。いくつかの実施形態では、キットは緩衝液および／またはヌクレオチドをさらに含む。ある例示実施形態では、キットは低レベルのヌクレオチドを含む溶液中にポリメラーゼおよび鋳型を含み、本明細書に記載したように溶液を高い温度に加温してポリメラーゼ−鋳型複合体の形成を開始および／または亢進することができる。そのような実施形態では、溶液はポリメラーゼで飽和されていてもよい。キットの溶液は緩衝液を含んでもよい。キットのポリメラーゼは、例えば野生型ポリメラーゼまたは本明細書に記載したバリアントポリメラーゼのいずれかのようなバリアントポリメラーゼであってよい。
【０１４４】
[00169]以下の実験開示において、以下の略語が適用される。ｅｑ（当量）、Ｍ（モル）、μＭ（マイクロモル）、Ｎ（規定）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメーター）、ｍｍ（ミリメーター）、μｍ（マイクロメーター）、ｎｍ（ナノメーター）、℃（摂氏度）、ｈ（時間）、ｍｉｎ（分）、ｓｅｃ（秒）、ｍｓｅｃ（ミリ秒）。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：定方向変異誘発
Ｐｏｌ６  ミュータント
[00170]ＷＴ−Ｐｏｌ６（配列番号２）をコードする配列番号３のＤＮＡを、市販の供給源（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。シーケンシングによって配列を確認した。
【０１４６】
[00171]部位特異的変異誘発を行って、親バリアントＰｏｌ６−４４−Ｘ１（配列番号４）の想定されるヌクレオチド／ＤＮＡ結合部位の１つまたは複数のアミノ酸を変異させた。Ｐｏｌ６−４４−Ｘ１は以下の置換：Ｓ３６６Ａ  Ｔ５２９Ｍ  Ａ５４７Ｆ  Ｄ４４Ａ（配列番号４）を含むように野生型Ｐｏｌ６から誘導した。Ｐｏｌ６−６７−Ｘ２は以下の変異：Ｓ３６６Ａ  Ｔ５２９Ｍ  Ａ５４７Ｆ  Ｎ５４５Ｌ  Ｙ２２５Ｌ  Ｄ６５７Ｒ  Ｙ２４２Ａを含むように野生型Ｐｏｌ６から誘導した（配列番号１４を参照されたい）。
【０１４７】
[00172]４４−Ｘ１のようなＰｏｌ６バリアントは、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４における下線を施した配列を参照されたい）およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメイン（配列番号４の太字イタリック配列）を有する融合タンパク質として発現させた。
【０１４８】
変異誘発のプロトコル
[00173]ＮＥＢ塩基チェンジャープロトコルを用いてそれぞれの変異誘発反応のためのプライマーを設計し、９６ウェルプレートフォーマットでＩＤＴに発注した。
【０１４９】
[00174]ＮＥＢから購入したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いて高スループット（ＨＴＰ）のフォーマットで、フォワードおよびリバースプライマーを５’ホスホリル化した。典型的な２５μｌの反応は、１５μｌの１０μＭプライマー、５μｌの５倍反応緩衝液（ＮＥＢより）、１．２５μｌのＰＮＫ酵素、３．７５μｌの水を含んでいた。反応は３７℃で３０分行い、酵素は６５℃、２０分で熱失活させた。
【０１５０】
[00175]ＮＥＢ製のＱ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ変異誘発を行った。典型的な２５μｌの反応は、５μｌのＱ５緩衝液、５μｌのＧＣエンハンサー、０．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５μｌの１０μＭホスホリル化変異誘発フォワードおよびリバースプライマー、０．２５μｌのＱ５ポリメラーゼおよび１μｌの５ｎｇ／ｍｌ野生型Ｐｏｌ６鋳型、即ちＨｉｓ−Ｐｏｌ６、ならびに１０．７５μｌの水を含んでいた。
【０１５１】
[00176]ＰＣＲが完了すれば、２５μｌのＰＣＲ混合物に０．５μｌのＤｐｎ１を加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、Ｄｐｎ１で処理したＰＣＲ産生物２．５μｌに２．５μｌのＢｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックスを加え、反応混合物を室温で１時間インキュベートした。その後、２０μｌの９６ウェルＢＬ２１ＤＥ３細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に１μｌのライゲーション混合物を加え、氷上で５分インキュベートした。
【０１５２】
[00177]ＰＣＲサーモサイクラーを用いて４２℃で正確に３０秒、細胞に熱ショックを与え、氷上に２分放置した。その後、細胞に８０μｌのＳＯＣを加えて、次いで振盪せずに３７℃で１時間インキュベートした。細胞に１００μｌのアリコットのＳＯＣまたは超純水を加え、次いで５０〜１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む４８ウェルＬＢ−寒天プレート上に播種した。細胞を３７℃で一夜増殖させた。
【０１５３】
実施例２：発現および精製
[00178]親ポリメラーゼＰｏｌ６−４４−Ｘ１（配列番号４）およびＰｏｌ６−６７−Ｘ２（配列番号１４）のバリアントを、以下に示すように高スループット法を用いて発現させ、精製した。
【０１５４】
[00179]発現プラスミドｐＤ４４１ベクター中のバリアントをコードするＤＮＡをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、形質転換した細胞のグリセロールストックを作成した。グリセロールストックの微小な採取物から出発し、０．２％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ中でおよそ８時間、１ｍｌの開始培養物を増殖させる。２５μｌの対数期開始培養物を、９６ディープウェルプレートの発現培地（０．２％のグルコース、５０ｍＭのリン酸カリウム、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）自己誘導培地）１ｍｌの中に移す。プレートを、２５０〜３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３６〜４０時間インキュベートした。
【０１５５】
[00180]次いで細胞を４℃で３０分間、３２００×ｇにて遠心分離して収集した。デカントして培地を除き、細胞ペレットを２００μｌの予め冷却した細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、５ｍＭのＴＣＥＰ、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＰＭＳＦ、１倍のＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ、１００μｇ／ｍｌのリゾチーム、およびプロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁させ、穏やかに撹拌しながら室温で２０分インキュベートした。次いで１０倍ストックから２０μｌを最終濃度１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ｉに加え、氷上で５〜１０分インキュベートして溶解液を生成させた。溶解液に２００μｌの１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５）（最終濃度は４００μｌの溶解液中、約０．５Ｍのリン酸カリウムとなる）を添加し、４℃で１０分間、およそ１５００ｒｐｍで遠心分離することによりＰａｌｌフィルタープレート（部品番号５０５３、３ミクロンフィルター）でろ過した。次いで澄明な溶解液を平衡化した９６ウェルＨｉｓ−Ｐｕｒコバルトプレート（Ｐｉｅｒｃｅ部品番号９００９５）に添加し、１５〜３０分間結合させた。
【０１５６】
[00181]流出液（ＦＴ）を、５００×Ｇで３分間遠心分離することによって収集した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー１（０．５Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＴＣＥＰ、２０ｍＭのイミダゾール、および０．５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー２（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、２００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＴＣＥＰ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのイミダゾール）で２回洗浄した。
【０１５７】
[00182]Ｐｏｌ６を２００μｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、２００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＴＣＥＰ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、３００ｍＭのイミダゾール、２５％のグリセロール）を用いて溶出させ、１〜２分のインキュベーション後に収集した。溶離液を２〜３回、同じＨｉｓ−Ｐｕｒプレートに再び添加して、溶離液中に濃縮したＰｏｌ６を得る。精製したポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した場合に９５％超の純度である。タンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって評価した場合に約３μＭ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）であり、２６０／２８０比は０．６である。
【０１５８】
実施例３：鋳型会合実験
[00183]ポリメラーゼ−鋳型複合体の会合を、ＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（／５Ｃｙ５／ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  Ｔ／ｉＳｐＣ３／ＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＣＧＧ）（配列番号１２および２１）およびＳｈｏｒｔＢＨＱ２Ｐｒｉｍｅｒ（ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ／ＢＨＱ２／−３）（配列番号１３）を用いてアッセイした。
【０１５９】
[00184]ポリメラーゼ−鋳型複合体の会合は、以下の条件でアッセイした。（Ａ）２倍のＰｏｌ６−４４Ｘ１ポリメラーゼ（配列番号４）をＭｇ２＋のみの存在下で、５０ｎＭのＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともに３２、５５、および８５分、プレインキュベートし、その時間にポリホスフェートヌクレオチドを加えることによってポリヌクレオチド合成を開始した。（Ｂ）２倍のＰｏｌ６−４４Ｘ１ポリメラーゼ（配列番号４）をポリホスフェートヌクレオチドのみの存在下で、５０ｎＭのＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともに３２、５５、および８５分、プレインキュベートし、その時間にＭｇＣｌ２を加えることによってポリヌクレオチド合成を開始した。（Ｃ）２倍のＰｏｌ６−４４Ｘ１ポリメラーゼ（配列番号４）をＭｇＣｌ２およびポリホスフェートヌクレオチド単独の非存在下で、５０ｎＭのＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともに３２、５５、および８５分、プレインキュベートし、その時間にＭｇＣｌ２およびポリホスフェートヌクレオチドを加えることによってポリヌクレオチド合成を開始した。
【０１６０】
[00185]Ｋ−ｇｌｕの濃度を７５ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕ、１５０ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕ、および３００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕと増加させた３つのアッセイ条件のそれぞれについて、ポリメラーゼ−鋳型複合体形成のレベルを測定した。
【０１６１】
[00186]６４８ｎｍ（５９０〜５０）ｎｍにおける励起および６６８ｎｍ（６７５〜５０）における発光を用いて、反応を開始した後のそれぞれの場合における蛍光を測定し、１分間、０．１秒ごとに測定した。
【０１６２】
[00187]結果を図３（Ａ〜Ｃ）および対応する図４Ａ〜Ｃに示す。より詳細には、図３は上に述べたアッセイ条件のそれぞれについて３２分、５５分および８５分で得られた蛍光シグナルを示す。シグナルの振幅（ＲＦＵで表わす）は、ＤＮＡ−Ｐｏｌ６複合体のレベルを表わす。シグナルの振幅についての数値を計算し、対応する図４（Ａ〜Ｃ）に表わした。ここで図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、それぞれアッセイ条件Ａ、Ｂ、およびＣで得られた蛍光シグナルの振幅を示す。菱形（◆）は７５ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕで測定されたシグナル振幅を表わし、（■）は１５０ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕで測定されたシグナル振幅を表わし、三角（△）は３００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕで測定されたシグナル振幅を表わす。
【０１６３】
[00188]図３および図４に示すデータは、７５ｍＭおよび１５０ｍＭのＫ−ｇｌｕで形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルはインキュベーション条件に依存せず、即ちＭｇ２＋のみの存在下またはヌクレオチドと合わせた場合のＤＮＡのＰｏｌ６とのプレインキュベーションはＰｏｌ６への鋳型結合には影響しなかったということを示している。しかし、３００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕという高い塩濃度では、複合体がヌクレオチドのみの存在下で形成された場合にＤＮＡのＰｏｌ６への結合が減少した。５００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕの塩濃度においても同じ影響が見られた（データは示していない）。
【０１６４】
[00189]これらのデータは、高い塩濃度においてはヌクレオチドがＤＮＡ鋳型のポリメラーゼへの結合を妨げ、それによりポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルを低減させていることを示している。
【０１６５】
実施例４：鋳型解離実験
[00190]この例（４．１〜４．５）は、鋳型−ポリメラーゼ複合体からの鋳型の解離に対するヌクレオチドの影響を示す。
【０１６６】
[00191]高い塩濃度、例えば５００ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕにおけるポリメラーゼ−鋳型複合体からの鋳型の解離の速度（ｋｏｆｆ）に対する二価金属イオン、即ちＭｇ２＋、および／またはヌクレオチドの影響を、以下のようにして決定した。７５ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕの存在下にポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させた。時間＝０で塩の濃度を５００ｍＭに上昇させ、引き続く複合体の解離を、実施例３に記載したＦＲＥＴアッセイに従う以下の５つのアッセイ条件下でポリヌクレオチド合成を開始することによって、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、および２４０分で決定した。
【０１６７】
４．１．ブロックされたヌクレオチドはポリメラーゼ−鋳型複合体の形成を阻害する
[00192]２倍濃度のＰｏｌ６−４４Ｘ１（配列番号４）を、７５ｍＭ  Ｋ−ｇｌｕの塩濃度で、５ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下（Ａ（ｉ））または５ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．１μＭのｄｎｐＣｐｐ（ブロックされたヌクレオチド）の存在下（Ａ（ｉｉ））で、ＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともにプレインキュベートして、鋳型−ＤＮＡ複合体を形成させた。時間＝０で塩を加えて最終濃度を５００ｍＭ  ＫＧｌｕとした。種々の時間間隔でポリホスフェートを加えた後に、鋳型−ＤＮＡ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０１６８】
[00193]図５Ａに、Ａ（ｉ）およびＡ（ｉｉ）で与えられた条件下に検出されたポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルに対応する蛍光シグナルを示す。
[00194]図５Ｂに、Ｍｇ２＋の存在下（◆）、または５ｍＭのＭｇ２＋＋０．１μＭのｄｎｐＣｐｐの存在下（■）で複合体を形成させた場合のポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離のプロットを示す。５Ａ（ｉ）および（ｉｉ）に示す蛍光シグナルの計算された振幅を、時間の関数としてＲＦＵでプロットしている。
【０１６９】
[00195]データは、ブロックされたヌクレオチドが鋳型のポリメラーゼへの結合を阻害することを示している。
４．２．ヌクレオチドの存在下のポリメラーゼ−鋳型複合体の形成により、ポリメラーゼからの鋳型の解離の速度が時間とともに増大する
[00196]２倍濃度のＰｏｌ６−４４Ｘ１（配列番号４）を、ＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともにプレインキュベートした。５ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下に結合を進行させ、続いて２０μＭのポリホスフェートヌクレオチド（図６Ａ（ｉ））を加えて反応を開始させた。または５０μＭのポリホスフェートヌクレオチドの存在下に結合が起こり、続いてＭｇ２＋（図６Ａ（ｉｉ））を加えて反応を開始させた（両方の例においてポリホスフェートの最終濃度は２０μＭであることに注意されたい）。時間＝０分で塩を加えて最終濃度を５００ｍＭ  ＫＧｌｕとした。種々の時間間隔でポリホスフェート（６Ａ（ｉ））またはＭｇＣｌ２（６Ａ（ｉｉ））を加えた後に、鋳型−ＤＮＡ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０１７０】
[00197]データを図６Ａ（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに図６Ｂに示す。より詳細には、図６Ａは６Ａ（ｉ）および６Ａ（ｉｉ）で与えられた条件下に検出されたポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルに対応する蛍光シグナルを示す。図６Ｂは、Ｍｇ２＋のみの存在下（◆）、またはポリホスフェートヌクレオチドの存在下（■）で複合体を形成させた場合のポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離のプロットを示す。６Ａ（ｉ）および（ｉｉ）に示す蛍光シグナルの計算された振幅は、時間の関数としてプロットしている。
【０１７１】
[00198]これらのデータは、５０μＭのポリホスフェートの存在下にポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させることにより、ポリメラーゼ−鋳型複合体がＭｇ２＋の存在下およびポリホスフェートの非存在下に形成された場合よりも大きな鋳型からのポリメラーゼの解離の速度がもたらされることを示している。
【０１７２】
４．３．Ｃａ２＋はポリメラーゼ−鋳型複合体のヌクレオチド依存的不安定化、即ち解離を改善しない
[00199]２倍濃度のＰｏｌ６−４４Ｘ１（配列番号４）を、ＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともにプレインキュベートした。５０μＭのポリホスフェートの存在下に結合を進行させ、続いて５ｍＭのＭｇＣｌ２（図７Ａ（ｉ））を加えて反応を開始させた。または５０μＭのポリホスフェート＋０．５ｍＭのＣａ２＋の存在下に結合が起こり、続いて５ｍＭのＭｇ２＋（図７Ａ（ｉｉ））を加えて反応を開始させた。時間＝０分で塩を加えて最終濃度を５００ｍＭ  ＫＧｌｕとした。種々の時間間隔でＭｇＣｌ２（７Ａ）を加えた後に、鋳型−ＤＮＡ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０１７３】
[00200]データを図７Ａ（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに図７Ｂに示す。より詳細には、図７Ａは７Ａ（ｉ）および７Ａ（ｉｉ）で与えられた条件下に検出されたポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルに対応する蛍光シグナルを示す。図７Ｂは、ポリホスフェートの存在下（◆）、またはポリホスフェート＋Ｃａ２＋の存在下（■）で複合体を形成させた場合のポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離のプロットを示す。７Ａ（ｉ）および（ｉｉ）に示す蛍光シグナルの計算された振幅は、時間の関数としてプロットしている。
【０１７４】
[00201]図７Ｂに示すように、Ｃａ２＋の効果は複合体の解離に影響しない。図７Ｂはまた、ヌクレオチドの存在下の鋳型結合の後の複合体の解離の速い速度は、Ｃａ２＋の非存在下または存在下のいずれで起こっても同様であることを示している。
【０１７５】
４．４．Ｍｇ２＋はポリヌクレオチド合成の間のポリメラーゼ−鋳型複合体のヌクレオチド依存的不安定化、即ち解離を改善しない
[00202]２倍のＰｏｌ６−４４Ｘ１ポリメラーゼ（配列番号４）を、ＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともにプレインキュベートした。Ｍｇ２＋およびポリホスフェートの非存在下に結合を進行させ、続いてＭｇ２＋およびポリホスフェートを加えて反応を開始させた（図８Ａ（ｉ））。Ｍｇ２＋の存在下に続いてポリホスフェートを加えて反応を開始させた（図８Ａ（ｉｉ））。またはポリホスフェートの存在下に続いてＭｇ２＋を加えた（図８Ａ（ｉｉｉ））。時間＝０分で塩を加えて最終濃度を５００ｍＭ  ＫＧｌｕとした。種々の時間間隔でＭｇ２＋およびポリホスフェート、ポリホスフェートのみ、またはＭｇ２＋のみを加えた後に、鋳型−ポリメラーゼ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０１７６】
[00203]データを図８Ａ（ｉ）、８Ａ（ｉｉ）、８Ａ（ｉｉｉ）、および図８Ｂに示す。より詳細には、図８Ａ（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、それぞれ８．４Ａ（ｉ）、８．４Ａ（ｉｉ）および８．４Ａ（ｉｉｉ）で与えられた条件下に検出されたポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルに対応する蛍光シグナルを示す。図８Ｂは、ポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離のプロットを示す。８Ａ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）に示す蛍光シグナルの計算された振幅は、時間の関数としてプロットしている。図８Ａ（ｉ）および（ｉｉ）のデータは、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は、Ｍｇ２＋の存在下（ｉｉ）、またはＭｇ２＋とヌクレオチドの両方の非存在下で起こっても同様であることを示している。図８Ａ（ｉｉｉ）に示すデータは、ヌクレオチドが鋳型の結合を阻害していることを示している。図８Ｂは、Ｍｇ２＋の存在下（■）、またはＭｇ２＋およびヌクレオチドの非存在下（◆）で形成された場合、複合体の解離の速度は同様であることを示している。図８Ｂ（△）はまた、ポリホスフェートの存在下における複合体の形成によって複合体の解離の速度が増大すること、即ちヌクレオチドは時間とともにポリメラーゼ−鋳型複合体を不安定化することを示している。
【０１７７】
４．５．ヌクレオチドトリホスフェートはポリホスフェートと比較して鋳型−ポリメラーゼの解離の速度を増大させる
[00204]２倍濃度のＰｏｌ６−４４Ｘ１ポリメラーゼ（配列番号４）を、ＤＮＡ鋳型、即ちＳｈｏｒｔＣｙ５Ｔｅｍｐｌａｔｅ（配列番号１２および２１）とともにプレインキュベートした。ポリホスフェートの存在下に結合を進行させ、続いてＭｇ２＋を加えて反応を開始させた（図９Ａ（ｉ））。またはトリホスフェートヌクレオチドの存在下に続いてＭｇ２＋を加えてポリヌクレオチド合成を開始させた（条件９Ａ（ｉｉ））。時間＝０分で塩を加えて最終濃度を５００ｍＭ  ＫＧｌｕとした。種々の時間間隔でＭｇ２＋（９Ａ）を加えた後に、鋳型−ＤＮＡ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０１７８】
[00205]データを図９Ａ（ｉ）および９Ａ（ｉｉ）、ならびに図９Ｂに示す。より詳細には、図９Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）は、それぞれ５．５Ａ（ｉ）および５．５Ａ（ｉｉ）で与えられた条件下に検出されたポリメラーゼ−鋳型複合体のレベルに対応する蛍光シグナルを示す。図９Ｂは、ポリメラーゼ−鋳型複合体からのポリメラーゼの解離のプロットを示す。９Ａ（ｉ）および（ｉｉ）に示す蛍光シグナルの計算された振幅は、時間の関数としてプロットしている。
【０１７９】
[00206]図９Ａ（ｉ）および（ｉｉ）のデータは、ポリメラーゼ−鋳型複合体の形成は、ｄＮＴＰまたはポリホスフェートヌクレオチドのいずれの存在下で起こっても同様であることを示している。図９Ｂは、ｄＮＴＰヌクレオチドの存在下で形成された場合（■）、複合体の解離の速度はポリホスフェートヌクレオチドの存在下の場合（◆）よりも大きいことを示している。
【０１８０】
[00207]以上まとめると、データはトリホスフェートヌクレオチドの存在下の鋳型−ポリメラーゼ複合体の形成は、ポリホスフェートと比較してより大きい鋳型解離速度をもたらすことを示している。この効果は、鋳型依存的ＤＮＡ重合の間の低い処理能力および低下したシーケンシング寿命をもたらすことが予想される。
【０１８１】
実施例５：ポリメラーゼの鋳型への結合に対する温度およびヌクレオチドの影響
[00208]この例は、低濃度のヌクレオチドの存在下および非存在下における、鋳型−ポリメラーゼ複合体からの鋳型の会合に対する温度の影響を示す。
【０１８２】
[00209]Ｐｏｌ６−６７  Ｘ２（配列番号１４）の種々の希釈物（０倍、１倍、４倍、８倍）を、１．２μＭのポリホスフェートヌクレオチドの存在下に４０℃で、または１．２μＭのポリホスフェートヌクレオチドの非存在下に室温で、３０分、１００ｎＭの蛍光ヘアピンＤＮＡ鋳型（配列番号１５および２２）とともにプレインキュベートした。１２μＬの予備結合した鋳型−Ｐｏｌ複合体を５％の未変性ＴＢＥゲルに装荷し、１００Ｖ、４℃で６０分運転した。ＢｉｏｒａｄのＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋イメージングシステムを用い、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎフィルターを用いてイメージングを行った。
【０１８３】
[00210]図１０Ａに示すように、２０℃で４倍および８倍のポリメラーゼ濃度でバンドシフトが生じ、したがって多数のポリメラーゼが鋳型上の多数の場所に非特異的に結合していることが示された。対照的に、温度を４０℃に上昇させ、１．２μＭのポリホスフェートヌクレオチドを添加するとバンドシフトは生じず（図１０Ｂ参照）、したがって鋳型の３’末端へのポリメラーゼの特異的結合が示された。したがって、１．２μＭのポリホスフェートの添加および昇温は、ポリメラーゼ−鋳型結合に好ましい効果を有する。
【０１８４】
実施例６：鋳型の延長に対する温度およびヌクレオチドの影響（延長ゲルアッセイ）
[00211]この例は、（高い温度および低いヌクレオチドレベルにおける）鋳型に結合したポリメラーゼの百分率と、（高い温度および高いヌクレオチド濃度における）鋳型の延長との間の相関を示す。
【０１８５】
[00212]Ｐｏｌ６−６７  Ｘ２の種々の希釈物（０倍、１倍、２倍、４倍、８倍）を、１．２μＭのポリホスフェートヌクレオチドの存在下に４０℃で３０分、３００ｍＭの蛍光ヘアピンＤＮＡ鋳型（配列番号１５および２２）とともにプレインキュベートした。結合緩衝液は７５ｍＭのＫ−Ｇｌｕ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＴＣＥＰ、および８％のトレハロースを含むＨｅｐｅｓ緩衝液であった。
【０１８６】
[00213]結合ゲルについては、１２μＬの予備結合した鋳型−Ｐｏｌ複合体を５％の未変性ＴＢＥゲルに装荷し、１００Ｖ、４℃で６０分運転した。ＢｉｏｒａｄのＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋イメージングシステムを用い、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎフィルターを用いてイメージングを行った。
【０１８７】
[00214]延長反応については、予備結合したポリメラーゼ−鋳型複合体に１０μＭのポリホスフェートヌクレオチド、５ｍＭのＭｇＣｌ２（それぞれ最終）および２０倍のＣｈａｓｅ鋳型（配列番号１６）を加えて反応を開始させた。反応は３０℃で５分行った。５分後、ホルムアミド＋５０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて反応を停止させ、９５℃で５分加熱した。次いで１２μＬの試料を１５％  ＴＢ尿素ゲルに１８０Ｖで１８０分装荷し、ＢｉｏｒａｄのＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋イメージングシステムを用い、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎフィルターを用いてイメージングを行った。
【０１８８】
[00215]図１１Ａに示すように、低い（１．２μＭ）ポリホスフェートヌクレオチドの存在下、４０℃で、ポリメラーゼの濃度を増大させると鋳型結合が増大する。図１１Ｂでポリメラーゼの濃度の増大による下のバンドから上のバンドへのバンド強度のシフトによって証明されるように、延長反応の間、ヌクレオチドの濃度を１０μＭに調節した場合に、ポリメラーゼの濃度が増大すれば鋳型延長の増大がもたらされる。１倍のポリメラーゼで活性画分は２６％の延長を示す一方、８倍のポリメラーゼで活性画分は４０℃で６６％の延長を示す（図１１Ｂ）。結合百分率を延長百分率と比較すると、直接の相関が存在する（図１１Ｃ参照、勾配＝１）。したがって、活性画分は延長前の鋳型へのポリメラーゼの結合に大きく依存している。
【０１８９】
実施例７：鋳型の延長に対する温度およびヌクレオチドの影響（ＦＲＥＴアッセイ）
[00216]この例は、ＦＲＥＴアッセイ（実施例３に記載）を用いる４０℃におけるポリメラーゼ−鋳型複合体の形成および延長ならびに鋳型の延長を示す。
【０１９０】
[00217]ＬｏｎｇＨＰ−Ｃｙ５−ＥｘｏＲ鋳型（配列番号１７および２２）の当モル量を、クールダウンアニーリングプロトコルを用いてＱｕｅｎｃｈｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１８）とともにアニールした。ＬｏｎｇＨＰ−Ｃｙ５−ＥｘｏＲ鋳型（配列番号１７および２２）のみを（同じ最終濃度で）１倍ＴＥで希釈した対照を作成し、これもクールダウンアニーリングプロトコルに通した。
【０１９１】
[00218]Ｐｏｌ６−６７  Ｘ２の種々の希釈物（０倍、１倍、２倍、４倍、６倍、８倍）を、１．２μＭのポリホスフェートヌクレオチドの存在下に４０℃で３０分、５０ｍＭのアニールした鋳型−プライマーペアまたは鋳型対照のみとともにプレインキュベートした。結合緩衝液は７５ｍＭのＫ−Ｇｌｕ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＴＣＥＰ、および８％のトレハロースを含むＨｅｐｅｓ緩衝液であった。
【０１９２】
[00219]上記の反応は９６ウェルのハーフエリア黒色プレートで行った。７５ｍＭのＫ−Ｇｌｕ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＴＣＥＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＮｕｃｓ、２０倍のＣｈａｓｅ（最終濃度）を含む試薬Ｂをプレートリーダー（ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ）に注入して反応を開始し、蛍光を１０分間、１秒ごとに測定した。用いた励起フィルターは５９０〜５０ｎｍ、用いた発光フィルターは６７５〜５０である。
【０１９３】
[00220]図１２Ａ〜１２Ｃに、４０℃で低レベルのヌクレオチド（１．２μＭ）の存在下でのポリメラーゼ−鋳型形成の後の鋳型の延長を示す。図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、ポリメラーゼ−鋳型形成の後、ポリメラーゼ濃度の増大によって延長の増大がもたらされ、これは増大したポリメラーゼ濃度におけるフルオロポア消光剤の増大したシグナル振幅によって証明される。例えば０倍のポリメラーゼにおいては鋳型のポリメラーゼへの結合は起こらず、したがって蛍光シグナルは完全に消光される。しかし、ポリメラーゼ−鋳型形成の間のポリメラーゼの濃度を増大させると、消光されるシグナルは少なくなる（これは蛍光振幅の増大に対応している）（図１２Ａおよび１２Ｂ）。対照のフルオロポアのみでは、種々のポリメラーゼ濃度にわたって最大蛍光のままである（即ち１００％飽和）（図１２Ａおよび１２Ｂ）。図１２Ｃに示すように、（フルオロポアのみの１００％飽和の百分率として決定される）延長百分率も、複合体が高い温度で低レベルのヌクレオチドの存在下に形成される場合には、ポリメラーゼ−鋳型形成の間のポリメラーゼ濃度の増大によって延長反応の間の延長の増大がもたらされることを示している。
【０１９４】
[00221]図１２Ｄに、２つの独立の実験、即ち１つはゲルに基づくアッセイ、他はプレートリーダーアッセイ（ＦＲＥＴアッセイ）から得られた鋳型の延長の量を比較する。図は直線の勾配が１に近いことを示し、したがってゲルに基づくアッセイおよびプレートリーダーに基づくアッセイによって測定された鋳型延長百分率の間に良好な相関があることを証明している。
【０１９５】
実施例８：ポリメラーゼ−鋳型解離に対する結合条件の影響
[00222]この例は、ＦＲＥＴアッセイ（実施例３に記載）を用いるポリメラーゼ−鋳型複合体の解離に対するＳｒ＋２および／またはヌクレオチドの影響を示す。
【０１９６】
[00223]６倍濃度のＰｏｌ６−６７Ｘ２（配列番号１４）をＬｏｎｇ−ＨＰ−Ｃｙ５−ＥｘｏＲ鋳型（配列番号１７および２２）とプレインキュベートした。結合は３０分、４０℃で、（１３Ａ（ｉ））１．２μＭのｄＮｐＣｐｐ、３ｍＭのＳｒＣｌ２、もしくは（１３Ａ（ｉｉ））１．２μＭのｄＮｐＣｐｐ、もしくは（１３Ａ（ｉｉｉ））１．２μＭのポリホスフェートの存在下、または（１３Ａ（ｉｖ））ＳｒＣｌ２、ヌクレオチドの非存在下に進行させた。時間＝０分で塩を加えて最終濃度を３００ｍＭ  ＫＧｌｕとし、追加して最終濃度を２０倍とした。種々の時間間隔でポリホスフェートおよびＭｇＣｌ２を加えた後に、鋳型−ＤＮＡ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０１９７】
[00224]図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、Ｓｒ＋２は鋳型からのポリメラーゼの解離には最小の影響を有する。さらに、低濃度のポリホスフェートヌクレオチドは最良の結合条件である。他のデータ（示していない）は、Ｓｒ＋２がポリメラーゼ−鋳型結合に顕著な影響を何ら有していないことを示している。
【０１９８】
実施例９：ヌクレオチドおよび塩の添加の影響
[00225]この例は、高い塩濃度の存在下でのポリメラーゼ−鋳型結合に対する高いヌクレオチド濃度の影響を示す。
【０１９９】
[00226]６倍濃度のＰｏｌ６−６７Ｘ２（配列番号１４）をＬｏｎｇ−ＨＰ−Ｃｙ５−ＥｘｏＲ鋳型（配列番号１７および２２）とプレインキュベートした。結合は３０分、４０℃で、３６μＭのポリホスフェートの存在下または非存在下に進行させた。時間＝０分で塩を加えて、２ｍＭのビオチン、２０倍のＣｈａｓｅ鋳型、および１ｍＭのＳｒＣｌ２とともに最終濃度を７５ｍＭ（図１４Ａ）または３８０ｍＭ  ＫＧｌｕ（図１４Ｂ）とした。種々の時間間隔でそれぞれＭｇ２＋のみまたは３６μＭのポリホスフェートおよびＭｇ２＋を加えた後に、鋳型−ＤＮＡ複合体からの鋳型の解離を決定した。
【０２００】
[00227]図１４Ａおよび図１４Ｂに示すように、高いレベルのヌクレオチド（結合の間、３６μＭ）の存在下に、７５ＫＧｌｕおよび３８０ＫＧｌｕの両方の塩濃度によって、最初の鋳型結合の３３％の低減がもたらされた。Ｐｏｌ６−６７Ｘ２については、ポリホスフェートの存在または非存在における鋳型−ポリメラーゼの解離速度に顕著な差は見られない。
【０２０１】
実施例１０：ポリメラーゼのナノポアへの付着
[00228]この例は、バリアントポリメラーゼのナノポア、例えばα−ヘモリシン、ＯｍｐＧへの付着の方法を提供する。
【０２０２】
[00229]実施例２に従ってＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ  ＨｉｓＴａｇ（配列番号４）を含むＰｏｌ６バリアントを発現し、コバルトアフィニティカラムを用いて精製した。ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成させ、精製し、ナノポアに付着させて、ナノポアシーケンシング複合体を形成させた。ナノポアシーケンシング複合体を形成させる方法およびナノポアシーケンシング複合体を精製する方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１６年１月２１日出願の米国仮出願「Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」第６２／２８１，７１９号、および２０１５年１１月２５日出願の米国仮出願「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」第６２／２６０，１９４号に記載されている。ナノポアシーケンシング複合体は、バリアントポリメラーゼをナノポアに連続的に結合させて酵素−ナノポア複合体を形成し、次いで鋳型を会合させてナノポアシーケンシング複合体を形成させることによって形成することができる。あるいは、ナノポアシーケンシング複合体は、最初に鋳型をバリアントポリメラーゼと会合させることによって鋳型−酵素複合体を形成し、次いで鋳型−酵素複合体をナノポアに付着させることによって形成することができる。
【０２０３】
[00230]ポリメラーゼは任意の好適な手段でナノポアに連結することができる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開；Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を参照されたい。
【０２０４】
[00231]バリアントｐｏｌ６  ＤＮＡポリメラーゼはリンカー分子を介してタンパク質ナノポア（例えばα−ヘモリシン、ＯｍｐＧ）と連結される。特に、生理学的条件下で自発的に共有結合性のイソペプチド連結を形成するＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムが用いられる。例えばＬｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日、４２６（２）、３０９〜１７を参照されたい。
【０２０５】
実施例１１：ナノポアシーケンシング
[00232]ナノポアに結合したバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼがタグ付きヌクレオチドに結合し、それによりポリメラーゼが付着しているナノポアにおけるブロックされたチャネル電流の検出を可能にする能力を決定した。バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼの処理能力の増大を、バリアント酵素の修飾を欠く親Ｐｏｌ６のそれと比較した。
【０２０６】
[00233]バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼをＤＮＡ鋳型と接触させてバリアントＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体を形成させ、続いてこれを、バイオチップとも称される半導体センサーチップのウェルの上で脂質二重層に埋め込まれたナノポアに付着させる。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５３（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｉｐｓ」、２０１４年１０月２２日出願）に記載されているように、脂質二重層を形成させ、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体が付着したナノポア、即ちバリアントＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体を挿入する。
【０２０７】
[00234]あるいは、ナノポアを脂質二重層に埋め込み、バリアントＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体をインサイチュで付着させる。
[00235]タグが３μＭのＴ−Ｔ３０、３μＭのＣ−Ｔ３０、３μＭのＧ−Ｔ３０、および３μＭのＡ−Ｔ３０からなる３０チミンヌクレオチド（Ｔ３０）のポリマーであるタグ付きヌクレオチドの混合物を、静的条件（５００ｍＭのＫＧｌｕ、３ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）下で、０．８３４μｌ／秒の速度でナノポアに流す。
【０２０８】
[00236]ピークツーピーク２１０ｍＶの交流を２５Ｈｚで印加し、ナノポアに結合したポリメラーゼによってヌクレオチド塩基がコピーされたＤＮＡ鎖に組み込まれる際の、ヌクレオチドタグの捕捉を評価する。
【０２０９】
[00237]バリアントＰｏｌ６の処理能力を非修飾の親Ｐｏｌ６のそれと比較して、読み取り長および／もしくはポリヌクレオチドの合成速度の増大、ならびに／またはシーケンシングエラーの低減を決定する。
【０２１０】
配列
配列番号１−野生型Ｐｏｌ６（ＤＮＡポリメラーゼ（クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４）；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）
【０２１１】
【化１】
2019513007.tif 000002
【０２１２】
配列番号２−Ｐｏｌ６（Ｈｉｓタグあり）
【０２１３】
【化２】
2019513007.tif 000003
【０２１４】
配列番号３−Ｐｏｌ６  Ｈｉｓタグあり（ＤＮＡ配列）
【０２１５】
【化３−１】
2019513007.tif 000004
【０２１６】
【化３−２】
2019513007.tif 000005
【０２１７】
配列番号４−Ｐｏｌ６−４４−Ｘ１  Ｈｉｓタグ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒあり
【０２１８】
【化４】
2019513007.tif 000006
【０２１９】
配列番号５−Ｐｏｌ６−４４−Ｘ１  Ｈｉｓタグ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒあり（ＤＮＡ配列）
【０２２０】
【化５−１】
2019513007.tif 000007
【０２２１】
【化５−２】
2019513007.tif 000008
【０２２２】
【化５−３】
2019513007.tif 000009
【０２２３】
【化５−４】
2019513007.tif 000010
【０２２４】
配列番号６−Ｐｏｌ６−４４−Ｘ１  Ｈｉｓタグ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒあり＋配列番号２のＥ５８５Ｋ、これは配列番号６のＥ７１５Ｋに対応する。
【０２２５】
【化６】
2019513007.tif 000011
【０２２６】
配列番号７−Ｐｏｌ６−４４−Ｘ１  Ｈｉｓタグ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒあり＋配列番号２のＥ５８５Ｋ＋Ｌ７３１Ｋ、これは配列番号６のＥ７１５Ｋ＋Ｌ８６１Ｋに対応する。
【０２２７】
【化７】
2019513007.tif 000012
【０２２８】
配列番号８−Ｐｏｌ６−４４−Ｘ１  Ｈｉｓタグ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒあり＋配列番号２のＥ５８５Ｋ＋Ｍ７３８Ｋ、これは配列番号６のＥ７１５Ｋ＋Ｍ８６８Ｋに対応する。
【０２２９】
【化８】
2019513007.tif 000013
【０２３０】
配列番号９−Ｈｉｓ６タグ
【０２３１】
【化９】
2019513007.tif 000014
【０２３２】
配列番号１０−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
【０２３３】
【化１０】
2019513007.tif 000015
【０２３４】
配列番号１１−ＳｐｙＴａｇ
【０２３５】
【化１１】
2019513007.tif 000016
【０２３６】
配列番号１２および２１−Ｃｙ５−標識フルオロゲンＤＮＡ鋳型
【０２３７】
【化１２】
2019513007.tif 000017
【０２３８】
配列番号１３−Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）、色素標識消光剤オリゴヌクレオチド
【０２３９】
【化１３】
2019513007.tif 000018
【０２４０】
配列番号１４−Ｐｏｌ６−６７  Ｘ２（Ｈｉｓタグあり、Ｔ５２９Ｍ−Ｓ３６６Ａ−Ａ５４７Ｆ−Ｎ５４５Ｌ−Ｙ２２５Ｌ−Ｄ６５７Ｒ  Ｙ２４２Ａ）
【０２４１】
【化１４】
2019513007.tif 000019
【０２４２】
配列番号１５および２２−−蛍光ヘアピンＤＮＡ鋳型
【０２４３】
【化１５】
2019513007.tif 000020
【０２４４】
配列番号１６−−Ｃｈａｓｅ鋳型
【０２４５】
【化１６】
2019513007.tif 000021
【０２４６】
配列番号１７および２２−ＬｏｎｇＨＰ−Ｃｙ５−ＥｘｏＲ
【０２４７】
【化１７】
2019513007.tif 000022
【０２４８】
配列番号１８−Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ
【０２４９】
【化１８】
2019513007.tif 000023
【図１】
2019513007.tif 000024
【図２】
2019513007.tif 000025
【図３】
2019513007.tif 000026
【図４】
2019513007.tif 000027
【図５Ａ】
2019513007.tif 000028
【図５Ｂ】
2019513007.tif 000029
【図６Ａ】
2019513007.tif 000030
【図６Ｂ】
2019513007.tif 000031
【図７Ａ】
2019513007.tif 000032
【図７Ｂ】
2019513007.tif 000033
【図８Ａ】
2019513007.tif 000034
【図８Ｂ】
2019513007.tif 000035
【図９Ａ】
2019513007.tif 000036
【図９Ｂ】
2019513007.tif 000037
【図１０Ａ】
2019513007.tif 000038
【図１０Ｂ】
2019513007.tif 000039
【図１１Ａ】
2019513007.tif 000040
【図１１Ｂ】
2019513007.tif 000041
【図１１Ｃ】
2019513007.tif 000042
【図１２Ａ】
2019513007.tif 000043
【図１２Ｂ】
2019513007.tif 000044
【図１２Ｃ】
2019513007.tif 000045
【図１２Ｄ】
2019513007.tif 000046
【図１３Ａ】
2019513007.tif 000047
【図１３Ｂ】
2019513007.tif 000048
【図１４Ａ】
2019513007.tif 000049
【図１４Ｂ】
2019513007.tif 000050
【配列表】
2019513007000001.app
【国際調査報告】
2019513007.tif 000051
2019513007.tif 000052
2019513007.tif 000053
2019513007.tif 000054
2019513007.tif 000055