(57)【要約】  本発明は、複数種のアミロイド単量体と凝集体を結合するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、（ａ）及び／又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。（ａ）一般式がＳｅｒ−Ｘ1−Ｐｈｅ−Ｘ2−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ただし、Ｘ1とＸ2が独立した、２０種のアミノ酸のいずれか１種である）であるアミノ酸配列。（ｂ）前記ポリペプチドの機能を有する、（ａ）一般式で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は修飾の付加を行った変異体。前記ポリペプチドは分子量が小さく、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームのオリゴマー、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎの単量体及び繊維を特異的に結合することができ、Ａβ４２とリゾチームの凝集を阻害し、且つＡβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームの細胞毒性を阻害し、神経細胞をＡβ４２毒性による影響から保護し、ＡＤ、ＰＤ、ＨＤ及びＴ２ＤＭ等のアミロイド疾患の予防と治療の面で広い応用の見通しを有している。
2019503705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種のアミロイド単量体と凝集体とを結合するポリペプチドであって、（ａ）及び／又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とするポリペプチド。
（ａ）一般式がＳｅｒ−Ｘ1−Ｐｈｅ−Ｘ2−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ただし、Ｘ1とＸ2が独立して、２０種のアミノ酸のいずれか１種である）であるアミノ酸配列
（ｂ）前記ポリペプチドの機能を有する、（ａ）の一般式で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は修飾の付加を行った変異体
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すアミノ酸配列、又は、前記ポリペプチドの機能を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すアミノ酸配列に対して１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは修飾の付加を行った変異体である、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記変異体の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６である、ことを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項５】
少なくとも１つのコピーされた請求項４に記載のＤＮＡ断片を含む、ことを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む、ことを特徴とする組換え細胞。
【請求項７】
アミロイド細胞毒性阻害剤であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載のＤＮＡ断片、請求項５に記載の組換えベクター、又は請求項６に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含み、
好ましくは、前記阻害剤の、Ａβ、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームの細胞毒性の阻害における使用であり、
好ましくは、前記細胞がＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫である、ことを特徴とするアミロイド細胞毒性阻害剤。
【請求項８】
アミロイド凝集阻害剤であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載のＤＮＡ断片、請求項５に記載の組換えベクター、又は請求項６に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含み、
好ましくは、前記阻害剤の、Ａβとリゾチームの凝集の阻害における使用である、ことを特徴とするアミロイド凝集阻害剤。
【請求項９】
細胞によるＡβ除去促進剤であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載のＤＮＡ断片、請求項５に記載の組換えベクター、又は請求項６に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含み、
前記細胞が、好ましくはミクログリア細胞であり、より好ましくはＢＶ−２細胞であり、
好ましくは、前記ＡβがＡβ４２である、ことを特徴とする細胞によるＡβ除去促進剤。
【請求項１０】
医薬組成物であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載のＤＮＡ断片、請求項５に記載の組換えベクター、又は請求項６に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含み、
好ましくは、前記医薬組成物が薬学的に許容する補助材料を更に含み、
好ましくは、前記補助材料が賦形剤、希釈剤、ベクター、調味料、バインダー及び充填剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせである、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物の、アミロイドに関する疾患を検出、診断及び／又は治療する医薬の調製における使用であり、
好ましくは、前記疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、又はＩＩ型糖尿病のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物技術分野に関し、具体的には、ポリペプチドに関し、特に、複数種のアミロイド単量体と凝集体を結合するポリペプチド及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド疾患は、アミロイドの凝集によって引き起こされる２０種以上の疾患の総称であり、アルツハイマー病（通称：老人性認知症）（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、舞踏病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）等を含む。異なるアミロイド疾患の病変の発症する部位は異なり、主に神経系、心臓、肝臓、腎臓等に関する。一部の蛋白質単量体自体は毒性がなく又は毒性が小さいが、毒性機能を有するオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）又は繊維状物（ｆｉｂｒｉｌ）に凝集可能で一連の疾患を引き起こし、例えば、β−ａｍｙｌｏｉｄ（Ａβ）はＡＤを引き起こすことが可能で、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎはＰＤを引き起こすことが可能で、プリオン蛋白質（Ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｒＰ）は狂牛病を含む人と動物の少なくとも１０種以上の脳症を引き起こすことが可能で、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）を含むポリペプチドはＨＤを含む少なくとも９種の遺伝性神経変性疾患を引き起こすことが可能で、膵島アミロイドポリペプチド（ｉｓｌｅｔ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ＩＡＰＰ、ａｍｙｌｉｎ）はＩＩ型糖尿病及び長時間の透析によるリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の凝集堆積によって引き起こされる疾患等を引き起こすことが可能である。そのうち、人の健康への危害が最も大きいものはＡＤ、ＰＤ及びＩＩ型糖尿病である。医学的統計によれば、中国と欧米諸国では６５歳以上の高齢者のうち、５〜６％がＡＤに罹っており、且つ発病度が年々上昇していることが分かった。当該病気は既に心臓病、癌及び脳卒中に次ぐ死亡に至る第４の疾患として挙げられている。また、約１％の６５歳以上の高齢者がＰＤに罹っている。ＩＩ型糖尿病に罹っている人数は全人口の５％以上に達している。これらの疾患は人類の健康に対して大きな危害をもたらし、その発病の根本的な原因（又は一部の原因）は一部の蛋白質自体の凝集にある。
【０００３】
研究から、異なる蛋白質の凝集は、最初は間違った折り畳み又は変性された蛋白質単量体から始まり、単量体ポリペプチド鎖間の水素結合の形成によって蛋白質分子の重合をもたらすことが分かった。まず、電子又は原子間力顕微鏡によって観察可能な大きさが約３〜１０ｎｍの可溶性球状オリゴマーを形成し、一部のオリゴマーは更に可撓性を有ししなやかな糸状物（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）に凝集することができ、更に、直径が６〜１０ｎｍの表面が滑らかな又は螺旋状をなす繊維を形成する。非相同性の蛋白質は最終的に類似の構造を有する蛋白質重合体を形成することができる。Ａβ、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＰｒＰ、ＩＡＰＰ、インスリン及びリゾチーム等の様々な蛋白質の凝集により形成される繊維は全て「ｃｒｏｓｓ−Ｂｅｔａ」構造を含み、そのうち、βシートで構成される骨格は繊維の縦軸と垂直であり、骨格中の水素結合ネットワークは縦軸に平行する。ポリペプチドがβシートで平行するβ鎖となるように配列され、βシートにおいて、アミノ酸は全て正確な位置を有する。異なるソースのオリゴマーも類似の構造特徴を有し、オリゴマー特異性認識抗体は異なるソースの蛋白質単量体で形成されるオリゴマーと結合することができるが、それらの単量体と繊維とは結合しない。これは、アミロイドポリペプチド骨格がそのアミノ酸の一次構造とは別の共通のオリゴマー特有の抗原エピトープを形成することができることを表す。Ｇｌａｂｅ実験室はＡβ４０が連結された金コロイド粒子を用いてＡβ４０オリゴマーを再現し、Ａβ４０及びＡβ４２オリゴマーと結合できるだけでなく、更にα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＩＡＰＰ、ＰｏｌｙＱ、ＰｒＰ、インスリン、リゾチーム等で形成されたオリゴマーと結合できるポリクローナル抗体（Ａ１１）を調製し、当該抗体はこれらのオリゴマーの細胞毒性を全て効果的に阻害することもできる。
【０００４】
従来、アミロイド疾患の発生は蛋白質が凝集した不溶性の繊維状物質によって引き起こされると考えられていた。近年、多くの研究において、病原となる重要な要因は体積が小さい水溶性のオリゴマーであることが明らかになっている。蛋白オリゴマーによる変性疾患には、細胞膜損傷、酸化ストレス、ミトコンドリア機能の障害、信号伝達の異常、細胞死等の類似のメカニズムが存在している。オリゴマーの形成メカニズム及びどのようにしてその細胞毒性を効果的に阻害することができるか等は研究と解決が強く望まれる問題である。Ａβは、異なるオリゴマー形態を形成することができ、例えば、フィブリルオリゴマー（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ、ＦＯ）、プロフィブリルオリゴマー（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ、ＰＦＯ）である。前者は更に凝集して繊維を形成することができるが、後者はできない。ＦＯとＰＦＯはそれぞれコンフォメーション依存性抗体ＯＣとＡ１１によって認識されることができる。Ａβは別のオリゴマー形態を更に形成することができ、例えば単鎖抗体Ｗ２０によって認識されることができるが、ＯＣとＡ１１によっては認識されることができないオリゴマーである。研究により、この３種の抗体はＡβと結合するだけでなく、更にα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ａｍｙｌｉｎ、インスリン、リゾチーム等のアミロイドのオリゴマーと結合することができることが見出され、複数種のアミロイドオリゴマーは蛋白質及び配列とは別の同じ構造を形成できることが分かった。同様に、各アミロイドが形成した繊維も共通の空間構造を形成し、且つ同一の抗体と結合することができる。しかし、各アミロイド単量体、オリゴマー及び繊維の間に蛋白質の一次構造と関わらない同じ構造が存在するか否かについては、まだ報告されていない。
【０００５】
ＡＤは、Ａβの凝集により高齢者の記憶力が徐々に喪失し、脳内に老人斑が形成されることを特徴とする神経変性疾患である。Ａβオリゴマーはシナプスに集中し、シナプスの劣化、インスリン抵抗及びｔａｕ蛋白の過度燐酸化を引き起こす。Ａβ及び他のアミロイドによる疾患のメカニズムに基づき、アミロイド疾患に対する治療の戦略は、一般的に、アミロイドの生成、凝集又は細胞毒性を阻害し、アミロイドの除去を加速させることである。アミロイドによる疾患の発生と拡大は、更にそれによって引き起こされる酸化ストレス、一酸化窒素生成、炎症因子の形成と関係している。
【０００６】
従って、成功したアミロイド疾患の治療医薬は多機能でなければならない。この１０数年、ポリペプチド類の医薬は医薬業界で広く注目されており、免疫原性が低く、毒性が低く、且つバイオマトリックス技術方法でその特異性、安定性及び透過性等を容易に向上させることができる特点を有する。ＣＮ１０４２７７１０５Ａはβアミロイドの凝集と毒性を阻害するポリペプチド又はその前記ポリペプチドの機能を有する変異体を開示している。当該発明のポリペプチドはＡβ蛋白質と強い結合力が存在し、Ａβが凝集の平衡状態に達した場合のβ折り畳み構造の有效な含有量を大幅に低減し、Ａβの溶液環境における２級構造を変更し、βの折り畳み構造の含有量を大幅に低減して更に無くすことができ、且つ極めて低い濃度でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＡβの毒性を著しく低減することができ、且つＡβにより誘導された活性酸素の生成を大きく抑制することができ、それにより、βアミロイドによるアルツハイマー病の治療に実行可能な方法を提供する。当該発明におけるポリペプチドはＡβ蛋白質を特異的に認識して結合できるだけであり、アミロイド単量体と結合し、アミロイドの凝集、細胞毒性、酸化ストレス及び神経炎症等を阻害するが、複数種のアミロイド単量体、オリゴマー及び繊維を同時に認識することができない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ポリペプチド及びその使用、特に複数種のアミロイド単量体と凝集体を結合するポリペプチド及びその使用を提供することを目的とし、当該ポリペプチドはＡβ蛋白質と結合することができるだけでなく、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチーム等を含む他のアミロイドと結合することができる。
【０００８】
この発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術案を採用する。
【０００９】
第１態様において、本発明は複数種のアミロイド単量体と凝集体を結合するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは（ａ）及び／又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
（ａ）一般式がＳｅｒ−Ｘ1−Ｐｈｅ−Ｘ2−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ただし、Ｘ1とＸ2は独立して、２０種のアミノ酸のいずれか１種である）であるアミノ酸配列。
【００１１】
（ｂ）前記ポリペプチドの機能を有する、（ａ）一般式で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は修飾の付加を行った変異体。
【００１２】
本発明において、前記ポリペプチドの分子量は小さく、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームのオリゴマー、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎの単量体及び繊維を特異的に結合することができ、Ａβ４２とリゾチームの凝集を阻害し、且つＡβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームの細胞毒性を阻害し、神経細胞をＡβ４２毒性の影響から保護する。
【００１３】
好ましくは、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜２に示すアミノ酸配列、又は前記ポリペプチドの機能を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜２に示すアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は修飾の付加を行った変異体である。
【００１４】
好ましくは、前記変異体の配列は重点として挙げられたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３〜６から選ばれるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
アミノ酸配列は以下のとおりである。
【００１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１：Ｓｅｒ−Ｘ1−Ｐｈｅ−Ｘ2−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、（ＺＲポリペプチド）
【００１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４：Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ。
【００２２】
第２態様において、本発明は第１態様に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を提供する。
【００２３】
第３態様において、本発明は少なくとも１つのコピーされた第２態様に記載のＤＮＡ断片を含む組換えベクターを提供する。
【００２４】
第４態様において、本発明は第３態様に記載の組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００２５】
第５態様において、本発明は、第１態様に記載のポリペプチド、第２態様に記載のＤＮＡ断片、第３態様に記載の組換えベクター、又は第４態様に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含むアミロイド細胞毒性阻害剤を提供する。
【００２６】
好ましくは、前記阻害剤の、Ａβ、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームの細胞毒性の阻害における使用である。
【００２７】
好ましくは、前記細胞はＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫である。
【００２８】
第６態様において、本発明は、第１態様に記載のポリペプチド、第２態様に記載のＤＮＡ断片、第３態様に記載の組換えベクター、又は第４態様に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含むアミロイド凝集阻害剤を提供する。
【００２９】
好ましくは、前記阻害剤のＡβとリゾチームの凝集の阻害における使用である。
【００３０】
第７態様において、本発明は、第１態様に記載のポリペプチド、第２態様に記載のＤＮＡ断片、第３態様に記載の組換えベクター、又は第４態様に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む細胞によるＡβ除去促進剤を提供する。
【００３１】
好ましくは、前記細胞はミクログリア細胞であり、ＢＶ−２細胞であることが好ましい。
【００３２】
好ましくは、前記ＡβはＡβ４２である。
【００３３】
本発明において、前記Ａβ促進剤はＡβに対するミクログリアの貪食作用を増加させることができる。
【００３４】
第８態様において、本発明は、第１態様に記載のポリペプチド、第２態様に記載のＤＮＡ断片、第３態様に記載の組換えベクター、又は第４態様に記載の組換え細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む医薬組成物を提供する。
【００３５】
好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容する補助材料を更に含む。
【００３６】
好ましくは、前記補助材料は賦形剤、希釈剤、ベクター、調味料、バインダー及び充填剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせである。
【００３７】
好ましくは、前記医薬組成物の、アミロイドに関する疾患を検出、診断及び／又は治療する医薬の調製における使用である。
【００３８】
好ましくは、前記疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）又はＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む。
【００３９】
本発明において、前記ポリペプチドはＡＤトランスジェニックマウスの空間記憶能力を向上させ、マウスの脳内の老人斑の数を減少し、及び／又はマウスの脳内のＡβ４０とＡβ４２のレベル及び脳内の炎症反応を低減することができ、前記ポリペプチドはＰＤトランスジェニックマウスの動作協調能力を改善し、ＰＤトランスジェニックマウスの脳内のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白レベルを低減することができ、更に、前記ポリペプチドはＨＤトランスジェニックマウスの動作協調能力を改善し、ＨＤトランスジェニックマウスの脳内のＨＴＴ蛋白レベルを低減することができる。
【００４０】
従来の技術と比べ、本発明は以下の有益な効果を有する。
【００４１】
（１）本発明のポリペプチドは分子量が小さく、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームのオリゴマー、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎの単量体及び繊維を特異的に結合することができ、Ａβ４２とリゾチームの凝集を阻害し、且つＡβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン及びリゾチームの細胞毒性を阻害し、神経細胞をＡβ４２毒性の影響から保護する。
【００４２】
（２）本発明のポリペプチドはＡＤ、ＰＤ、ＨＤ及びＴ２ＤＭ等のアミロイド疾患の予防と治療の面で広い応用の見通しを有し、ＡＤ、ＰＤ、ＨＤ及びＴ２ＤＭ等のアミロイド疾患の治療と診断に基礎を定める。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）により検出されたＺＲポリペプチドと複数種のアミロイドとの結合の図である。
【図２】本発明のＤｏｔ−ｂｌｏｔにより検出されたＺＲポリペプチドと複数種のアミロイドとの結合の図であり、そのうち、（Ａ）はＺＲポリペプチドと各時点のＡβ４２との結合の図であり、（Ｂ）はＺＲポリペプチドと各時点のＡβ４２とが結合した形態図であり、（Ｃ）はＺＲポリペプチドと各時点のＡｍｙｌｉｎとの結合の図であり、（Ｄ）はＺＲポリペプチドと各時点のＡｍｙｌｉｎとが結合した形態図であり、（Ｅ）はＺＲポリペプチドと各時点のリゾチームとの結合の図であり、（Ｆ）はＺＲポリペプチドと各時点のリゾチームとが結合した形態図であり、（Ｇ）はＺＲポリペプチドと各時点のインスリンとの結合の図であり、（Ｈ）はＺＲポリペプチドと各時点のインスリンとが結合した形態図である。
【図３】本発明のＥＬＩＳＡにより検出されたＺＲポリペプチド誘導体とＡβ４２オリゴマーとの結合であり、そのうち、（Ａ）は配列１〜８とＡβ４２オリゴマーとが結合した検出結果であり、（Ｂ）は配列１、９〜１２とＡβ４２オリゴマーとが結合した検出結果である。
【図４】（Ａ）は本発明のＺＲポリペプチドがＡβ４２の凝集を阻害する蛍光密度図であり、（Ｂ）は本発明のＺＲポリペプチドがａｍｙｌｉｎの凝集を阻害する蛍光密度図であり、（Ｃ）は本発明のＺＲポリペプチドがリゾチームの凝集を阻害する蛍光密度図であり、（Ｄ）は本発明のＺＲポリペプチドがインスリンの凝集を阻害する蛍光密度図であり、（Ｅ）は本発明のＺＲポリペプチドがＡβ４２の凝集を阻害する走査電子顕微鏡の形態図であり、（Ｆ）は本発明のＺＲポリペプチドがａｍｙｌｉｎの凝集を阻害する走査電子顕微鏡の形態図であり、（Ｇ）は本発明のＺＲポリペプチドがリゾチームの凝集を阻害する走査電子顕微鏡の形態図であり、（Ｈ）は本発明のＺＲポリペプチドがインスリンの凝集を阻害する走査電子顕微鏡の形態図である。
【図５】（Ａ）はポリペプチドＺＲがＡβ４２の細胞毒性をインビトロ阻害する図であり、（Ｂ）はポリペプチドＺＲがａｍｙｌｉｎの細胞毒性をインビトロ阻害する図であり、（Ｃ）はポリペプチドＺＲがリゾチームの細胞毒性をインビトロ阻害する図であり、（Ｄ）はポリペプチドＺＲがインスリンの細胞毒性をインビトロ阻害する図である。
【図６】本発明のポリペプチドがＡＤトランスジェニックマウスの記憶能力を改善する図であり、そのうち、（Ａ）はＡＤトランスジェニックマウスがプラットホームに到着するまでの潜伏期であり、（Ｂ）は探索実験におけるＡＤトランスジェニックマウスがプラットホームに到着するまでの潜伏期であり、（Ｃ）はＡＤトランスジェニックマウスがプラットホームを通る回数であり、（Ｄ）はＡＤトランスジェニックマウスがターゲット象限に滞在する時間である。
【図７】本発明のポリペプチドがＡＤトランスジェニックマウスの脳内の老人斑の数を低減する図であり、そのうち、（Ａ）はマウスの老人斑ＴｈＳの染色状況であり、（Ｂ）はマウスの老人斑が占有するスライス面積の割合であり、（Ｃ）はマウスの老人斑が占有するスライス面積の数であり、（Ｄ）はマウスの老人斑６Ｅ１０の染色状況であり、（Ｅ）はマウスの海馬内の老人斑の面積であり、（Ｆ）はマウスの皮質内の老人斑の面積であり、（Ｇ）はマウスの海馬内の老人斑の数であり、（Ｈ）はマウスの皮質内の老人斑の数である。
【図８】本発明のポリペプチドがＡＤトランスジェニックマウスの脳内のＡβ４０とＡβ４２レベルを低減する図であり、そのうち、（Ａ）はＡＤトランスジェニックマウスの脳内の不溶性Ａβ４０レベルであり、（Ｂ）はＡＤトランスジェニックマウスの脳内の不溶性Ａβ４２レベルであり、（Ｃ）はＡＤトランスジェニックマウスの脳内の可溶性Ａβ４０レベルであり、（Ｄ）はＡＤトランスジェニックマウスの脳内の可溶性Ａβ４２レベルである。
【図９】本発明のポリペプチドがＡＤトランスジェニックマウスの脳内の炎症反応を低減する図であり、そのうち、（Ａ）はＡＤマウスの脳内のミクログリアの染色状況であり、（Ｂ）はＡＤマウスの脳内の星状細胞の染色状況であり、（Ｃ）はＡＤマウスの脳内のミクログリアが占有する脳スライス面積であり、（Ｄ）はＡＤマウスの脳内の星状細胞が占有する脳スライス面積である。
【図１０】本発明のポリペプチドがＡβに対するミクログリアの貪食を促進する図である。
【図１１】本発明のポリペプチドがＰＤトランスジェニックマウスの動作協調能力を改善する図であり、そのうち、（Ａ）はＰＤマウスの回頭時間であり、（Ｂ）はＰＤマウスが籠内に至るまでの時間であり、（Ｃ）はＰＤマウスの後肢抱き程度である。
【図１２】本発明のポリペプチドがＰＤトランスジェニックマウスの脳内のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎレベルを低減する図である。
【図１３】本発明のポリペプチドがＨＤトランスジェニックマウスの動作協調能力を改善する図であり、そのうち、（Ａ）はＨＤマウスがロータロッド上にある持続時間であり、（Ｂ）は９回の試験におけるＨＤマウスがロータロッド上にある持続時間の平均値である。
【図１４】本発明のポリペプチドがＨＤトランスジェニックマウスの脳内のＨＴＴレベルを低減する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、具体的な実施形態により、本発明の技術案を更に説明する。当業者であれば、前記実施例は本発明を理解するためのものに過ぎず、本発明を具体的に限定するものとして見なすべきではないことを理解すべきである。
【００４５】
下記実施例において使用される実験方法は断りのない限り、全て通常の方法である。
【００４６】
下記実施例において使用される材料、試薬等は断りのない限り、全て市販から取得することができる。
【００４７】
下記実施例におけるＰＢＳ緩衝液はＰＨが７．２の緩衝液であり、その処方は、５．８４ｇのＮａＣｌ、４．７２ｇのＮａ2ＨＰＯ4、２．６４ｇのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、水で１リットルに配合し、ｐＨを７．２に調整することである。
【００４８】
下記実施例におけるポリペプチド及びその誘導体は、上海ＧＬ生化学有限公司で合成・調製され、実験に用いられるポリペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２（ＺＲポリペプチド）及びその誘導体の純度が９５％以上であり、ＺＲポリペプチド及びその誘導体が−２０℃に保存され、繰り返しの凍結・溶融を回避する。
【００４９】
下記実施例における全ての実験データは、水迷路記憶実験のほか、いずれも３回の独立した実験により取得され、実験データは平均数±標準偏差として表現され、データの統計分析はＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡソフトウェアを用いて行われるが、複数グループの繰り返しの記憶力測定データの比較分析に対しては繰り返しデータのＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いる。
【００５０】
下記実施例において、マウスはポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループ、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ  ｃｏｎ）、野生型（ＷＴ）グループに分けられる。
【００５１】
実施例１  ＺＲポリペプチド及びその誘導体の調製
【００５２】
アミロイド疾患の発病原理から、当該類疾患を治療する根本的な方法はアミロイドの生成を減少し、その凝集と細胞毒性を阻害し、又はアミロイドの除去を加速することであるはずである。ファージディスプレイ技術を用い、ａｍｙｌｉｎオリゴマーをスクリーニング基質とし、１×１０8種のヘプタペプチドに対して４回の選別を行い、フェージＥＬＩＳＡを用いて複数本のａｍｙｌｉｎオリゴマーと著しく結合できるポリペプチドをスクリーニングし、複数本のペプチド鎖とａｍｙｌｉｎ、Ａβ４２、ＰｒＰ、インスリン、リゾチームとの結合特性及びアミロイドの凝集と細胞毒性への影響を比較することにより、最終的にポリペプチドＺＲをスクリーニングした。
【００５３】
ＺＲポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）の配列はＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇである。
【００５４】
ＺＲの誘導体は、ＺＲのアミノ酸を置換、欠失し、又は他のアミノ酸を挿入して得たポリペプチドであり、配列２〜８は配列１におけるアミノ酸を順にアラニンに置換するために行われるアラニン走査であり、配列９〜１２はＺＲのアミノ酸を置換、欠失して又は他のアミノ酸を挿入して得たポリペプチドであり、具体的には以下のとおりである。
【００５５】
配列１：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００５６】
配列２：Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、（対照グループ１）
【００５７】
配列３：Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００５８】
配列４：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、（対照グループ２）
【００５９】
配列５：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００６０】
配列６：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、（対照グループ３）
【００６１】
配列７：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ、（対照グループ４）
【００６２】
配列８：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、（対照グループ５）
【００６３】
配列９（ＺＲ４−△Ｎ）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００６４】
配列１０（ＺＲ４−ＦＮ／ＡＱ）：Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００６５】
配列１１（ＺＲ＋Ｎ）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
【００６６】
配列１２（ＺＲ＋Ｋ）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ。
【００６７】
実験例２  ＺＲと複数種のアミロイドとの特異的な結合
【００６８】
１００μＬのＡβ４２、ＰｒＰ、ａｍｙｌｉｎ、インスリン、リゾチーム単量体、オリゴマー及び繊維をそれぞれ９６穴の酵素免疫マイクロウェルプレート（１μｇ／穴）で被覆し、ＢＳＡがネガティブコントロールであり、３７℃で２ｈ配置し、３％のＢＳＡによって３７℃で２ｈ封止し、２００μＬ／穴とした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ヒスチジンラベル付きのＺＲポリペプチド溶液を１００μＬ添加し、室温で１ｈインキュベートした後に、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬのＨＲＰ（ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ：西洋ワサビペルオキシダーゼ）が接続されたヒスチジンラベルを認識する抗体９Ｅ１０を穴ごとに投入し、室温で１ｈインキュベートした後に、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。穴ごとに基質溶液ＴＭＢを１００μＬ入れ、３７℃で２０ｍｉｎ置き、その後、５０μＬの１ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸を穴ごとに入れて反応を終了させ、酵素免疫検出器でＯＤ４５０値を測定した。同じ条件で３回繰り返し、結果を図１に示す。
【００６９】
ＺＲとネガティブコントロールＢＳＡとが結合したＯＤ４５０は０．０６であり、ＺＲとＡβ４２単量体、オリゴマー及び繊維とが結合した後のＯＤ４５０はそれぞれ０．３４、０．３８、０．３５であり、ＺＲとａｍｙｌｉｎ単量体、オリゴマー及び繊維とが結合した後のＯＤ４５０はそれぞれ０．４１、０．５０、０．１８であり、ＺＲとリゾチーム単量体、オリゴマー及び繊維とが結合した後のＯＤ４５０はそれぞれ０．１１、０．１８、０．０８であり、ＺＲとインスリン単量体、オリゴマー及び繊維が結合した後のＯＤ４５０はそれぞれ０．０７、０．１４、０．０６であった。
【００７０】
図１において、ＺＲポリペプチドはＡβ４２、ａｍｙｌｉｎ、ＰｒＰ、リゾチーム等の複数種のアミロイドのオリゴマーと結合することができ、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎの単量体及び繊維と結合することもできるが、ＰｒＰ、リゾチームの単量体及び繊維との結合は著しくないことが分かった。これらのアミロイドアミノ酸の一次構造にはいずれの相同性もないため、ＺＲポリペプチドの種々の形態と同時に結合することができるアミロイドは類似の構造特徴を有しなければならない。
【００７１】
ＺＲポリペプチドと各アミロイドとの結合の状況を更に検証するために、Ａβ４２、ＰｒＰ、ａｍｙｌｉｎ、インスリン、リゾチームを一定の時間インキュベートした後にそれぞれアセテート繊維膜に滴下した（１．８μｇ／滴）。室温で乾燥した後に、８％のｍｉｌｋによって３７℃で２ｈ封止し、ヒスチジンラベル付きのＺＲポリペプチド溶液を添加し、室温で１ｈインキュベートした後に、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。マウス抗ヒスチジンラベル付きの抗体（１：３０００）を添加し、３７℃で２ｈインキュベートし、膜を０．１％のＰＢＳＴで３回洗浄し、毎回を５ｍｉｎとし、ＨＲＰに連結されるヒツジ抗マウスの第２抗体１：５０００を添加し、３７℃で１ｈインキュベートし、０．１％のＰＢＳＴで膜を３回洗浄し、毎回を１０ｍｉｎとした。続いて、ＥＣＬ発光試薬キットを用いて膜上の発光スポットを検出し、３ｍｉｎ露光し、３０ｓ現像した。各アミロイドの複数種の形態と結合可能な抗体及びアミロイドオリゴマーのみと結合する抗体Ｗ２０を対照とし、走査透過型電子顕微鏡によって各時点におけるアミロイドの形態を検出し、結果を図２（Ａ）〜（Ｈ）に示す。
【００７２】
図２（Ａ）と図２（Ｂ）において、ＺＲポリペプチドは各時点のＡβ４２と結合でき、即ち、Ａβ４２単量体、オリゴマー及び繊維と結合できることがわかった。同様に、図２（Ｃ）と図２（Ｄ）において、ＺＲポリペプチドは各時点のＡｍｙｌｉｎと結合でき、即ち、ａｍｙｌｉｎ単量体、オリゴマー及び繊維と結合できることが見て取れた。しかし、図２（Ｅ）と図２（Ｆ）において、ＺＲは２４と３６時間インキュベートして形成したリゾチームオリゴマーのみと結合し、その単量体及び繊維とは結合しない。これと類似するように、図２（Ｇ）と図２（Ｈ）において、ＺＲは９時間インキュベートして形成したインスリンオリゴマーのみと結合し、その単量体及び繊維とは結合しない。
【００７３】
実験例３  ＺＲの誘導体とＡβ４２オリゴマーとの結合
【００７４】
実施例１で得た配列１〜１２をそれぞれヒスチジンラベルに接続し、且つ実施例２におけるＥＬＩＳＡ実験方法により、Ａβ４２オリゴマーとの結合特性を検出し、各ポリペプチドを穴ごとに１μｇ／穴で入れ、ＥＬＩＳＡ方法でＯＤ４５０値を測定し、結果を図３（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
【００７５】
図３（Ａ）では、ＺＲポリペプチド配列における第２位のフェニルアラニン及び第４位のアスパラギン酸をアラニンに置換することで、それぞれポリペプチド配列３及び５となり、この２種のポリペプチドとＡβ４２オリゴマーとの結合はＺＲとＡβ４２オリゴマーとの結合に類似し、アラニンの置換のその結合特性への影響は著しくなく、ＯＤ４５０はそれぞれ０．４８及び０．５７であることが見られ、第２位のフェニルアラニン及び第４位のアスパラギン酸はＺＲポリペプチドの結合活性に対して小さい作用を果たすことが分かった。ＺＲにおける他の位置のアミノ酸がアラニンに置換されると、それとＡβ４２オリゴマーとの結合活性は著しく喪失した。第１、３、５、６と７位のアミノ酸がそれぞれアラニンに置換されると、それらのＯＤ４５０はそれぞれ０．２２、０．１５、０．１８、０．１４、０．１４及び０．１３であり、ＺＲにおける第１位のセリン、第３位のフェニルアラニン、第５位のアスパラギン、第６位のリジン及び第７位のアルギニンはＺＲの結合活性に対して重要な作用を果たし、Ｓｅｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ構造はＺＲの活性を保持するために必要な基本的な枠構造であることが分かった。
【００７６】
図３（Ｂ）はＺＲの誘導体配列ＺＲ４−△Ｎ、ＺＲ４−ＦＮ／ＡＱ、ＺＲ＋Ｎ及びＺＲ＋ＫとＡβ４２オリゴマーとが結合した検出結果であり、それらがＡβ４２オリゴマーと結合した後のＯＤ４５０はそれぞれ０．４９、０．４７、０．５４及び０．５６である。ＺＲのあるアミノ酸が置換、欠失されて又はポリペプチドでアミノ酸を増加した後にも、Ａβ４２と結合する能力を依然として保留することが分かった。
【００７７】
実験例４  ＺＲポリペプチドはＡβ４２とリゾチームの凝集をインビトロ阻害する
【００７８】
１）Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎをヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）で１ｍｇ／ｍＬに溶解し、室温で超音波処理を１０ｍｉｎ行い、エッペンドルフチューブ内に分注し、真空でＨＦＩＰを揮発し、その後、−２０℃で保存した。使用する前に、ＨＦＩＰで処理した各蛋白質を室温で２０ｍｉｎ配置し、続いてＤＭＳＯを添加し、各蛋白質の濃度を５ｍｇ／ｍＬとし、その後、０．０２ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で所望の濃度に希釈した。ＰｒＰ、リゾチームについては、０．０２ＭのｐＨ７．４のＰＢＳを直接用いて所望の濃度に調製した。
【００７９】
２）ＺＲポリペプチドを０．０２ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液に溶解し、その後、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリン、リゾチーム溶液（リゾチームがｐＨ２．５の酢酸緩衝液であり、残りがｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液である）に入れ、各蛋白質の終濃度をそれぞれ１０、２０、１００、１０００μＭとした。各蛋白質とＺＲポリペプチドとのモル比はそれぞれ１：１及び１：１０である。Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎ、インスリンを３７℃、リゾチームを６５℃の環境でそれぞれ１日間、５日間、５時間及び６日間配置した。
【００８０】
３）チオフラビン（ＴｈＴ）をｐＨ６．５、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解し、その濃度を５ｍＭとした。インキュベートした後の２０μＬのサンプルを１８０μＬのＴｈＴ溶液を含む黒色の酵素標板に投入した。均一に混合した後に、マイクロプレートリーダー上にて４５０ｎｍの励起波長と４８２ｎｍの発光波長でＴｈＴの蛍光強度を測定した。各サンプルの蛍光強度からＴｈＴ自体の背景蛍光を減らした。
【００８１】
図４（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、ＺＲポリペプチドが投入されていないＡβ４２及びＺＲポリペプチドが投入されたＡβ４２とＺＲとのモル比それぞれ１：１及び１：１０である場合、その蛍光値はそれぞれ２６５００、２２０００、１７０００であり、ＺＲポリペプチドが投入されていないリゾチーム及びＺＲポリペプチドが投入されたリゾチームとＺＲとのモル比がそれぞれ１：１及び１：１０である場合、その蛍光値はそれぞれ３１００００、２２００００、１７００００であり、ＺＲポリペプチドが投入されていないａｍｙｌｉｎ及びＺＲポリペプチドが投入されたａｍｙｌｉｎとＺＲとのモル比がそれぞれ１：１及び１：１０である場合、その蛍光値はそれぞれ３８０００、４１０００、４３０００であり、ＺＲポリペプチドが投入されていないインスリン及びＺＲポリペプチドが投入されたインスリンとＺＲとのモル比がそれぞれ１：１及び１：１０である場合、その蛍光値はそれぞれ３０５０００、３０５０００、３１００００であった。
【００８２】
結果から、ＺＲが投入されたＡβ４２とリゾチームの蛍光強度はその蛋白質自体の対照よりも著しく低いことが分かった。ＴｈＴはアミロイドの凝集後の凝集体におけるβ−シートと結合した後に蛍光を励起することができるため、蛍光が強ければ強いほど、アミロイドの凝集が多いことを表す。そのため、ＺＲはＡβ４２とリゾチームの凝集を著しく阻害することができるが、ＺＲはａｍｙｌｉｎとインスリンの凝集に対して顕著な影響がなかった。上記結果を更に検証するために、図４（Ｅ）〜（Ｈ）のように、走査透過型電子顕微鏡を用いてＴｈＴ試験の終了時の各アミロイドの形態特徴を検出した。結果は、ＺＲポリペプチドが投入されたＡβ４２とリゾチームが凝集して形成した繊維は明らかに減少したが、ＺＲの投入はａｍｙｌｉｎとインスリンの凝集に対しては明らかな影響はなかった。
【００８３】
実験例５  ＺＲポリペプチドはアミロイドの細胞毒性をインビトロ阻害する
【００８４】
１０％のウシ胎児血清を含む培地（ＤＭＥＭ）を用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を単一の細胞懸濁液に配合し、細胞を１００００個／穴で９６穴の細胞培養プレートに接種し、各穴の体積は１００μＬである。細胞を３７℃で２４時間培養し、インキュベータのＣＯ2濃度は５％である。
【００８５】
以下のサンプルを穴ごとに投入した。
【００８６】
Ａβ４２：Ａβ４２蛋白の終濃度が４μＭであるもの、Ａβ４２とＺＲの混合物（Ａβ：ＺＲ＝１：０．５）：Ａβ４２蛋白の終濃度が４μＭであり、ＺＲの終濃度が２μＭであるもの、Ａβ４２とＺＲの混合物（Ａβ：ＺＲ＝１：１）：Ａβ４２蛋白の終濃度が４μＭであり、ＺＲの終濃度が４μＭであるもの。
【００８７】
Ａｍｙｌｉｎ：ａｍｙｌｉｎ蛋白の終濃度が４μＭであるもの、ＡｍｙｌｉｎとＺＲの混合物（Ａｍｙｌｉｎ：ＺＲ＝１：１）：Ａｍｙｌｉｎ蛋白の終濃度が４μＭであり、ＺＲの終濃度が４μＭであるもの、ＡｍｙｌｉｎとＺＲの混合物（Ａｍｙｌｉｎ：ＺＲ＝１：１０）：Ａｍｙｌｉｎ蛋白の終濃度が４μＭであり、ＺＲの終濃度が４０μＭであるもの。
【００８８】
リゾチーム：リゾチーム蛋白の終濃度が２０μＭであるもの、リゾチームとＺＲの混合物（リゾチーム：ＺＲ＝１：１）：リゾチーム蛋白の終濃度が２０μＭであり、ＺＲの終濃度が２０μＭであるもの、リゾチームとＺＲの混合物（リゾチーム：ＺＲ＝１：１０）：リゾチーム蛋白の終濃度が２０μＭであり、ＺＲの終濃度が２００μＭであるもの。
【００８９】
インスリン：インスリン蛋白の終濃度が６０μＭであるもの、インスリンとＺＲの混合物（インスリン：ＺＲ＝１：１）：インスリン蛋白の終濃度が６０μＭであり、ＺＲの終濃度が６０μＭであるもの、インスリンとＺＲの混合物（インスリン：ＺＲ＝１：５）：インスリン蛋白の終濃度が６０μＭであり、ＺＲの終濃度が３００μＭであるもの、ＰＢＳを対照とするもの。
【００９０】
細胞を４８時間培養し続けた後、ＭＴＴ溶液を穴ごとに１０μＬ添加し、３７℃で３時間インキュベートし、培養を終了させ、１００μＬの結晶溶解液（１０％のＳＤＳと５％のイソブタノールを０．０１ＭｈＣＬに溶解したもの）を穴ごとに投入し、３７℃で一晩インキュベートし、結晶物を十分に溶解させた。多機能酵素免疫検出器において５７０ｎｍの波長で各穴の光吸収値を測定した。バックグラウンドを減らした後、サンプルの吸光度をサンプルが投入されていない細胞の吸光度で割るものを細胞の活性指標とし、且つ、サンプル間の違いが著しい場合を分析し、結果を図５（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００９１】
Ａβ４２グループの細胞活性は７１％であり、Ａβ：ＺＲ＝１：０．５グループの細胞活性は８０％であり、Ａβ：ＺＲ＝１：１グループの細胞活性は８２％であり、Ａｍｙｌｉｎグループの細胞活性は６１％であり、Ａｍｙｌｉｎ：ＺＲ＝１：１グループの細胞活性は７０％であり、Ａｍｙｌｉｎ：ＺＲ＝１：１０グループの細胞活性は７５％であり、リゾチームグループの細胞活性は５５％であり、リゾチーム：ＺＲ＝１：１グループの細胞活性は８５％であり、リゾチーム：ＺＲ＝１：１０グループの細胞活性は９３％であり、インスリングループの細胞活性は７７％であり、インスリン：ＺＲ＝１：１グループの細胞活性は９２％であり、インスリン：ＺＲ＝１：５グループの細胞活性は１０２％であった。
【００９２】
結果から、各アミロイドは一定の濃度においていずれもＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して細胞毒性を有することがわかった。ＺＲの投入により、各アミロイドの細胞毒性を著しく低減することができ、且つ数量依存性もなしている。ＺＲとＡβ４２、ａｍｙｌｉｎ、リゾチーム、インスリンとのモル比がそれぞれ１：１、１：１０、１：１０、１：５である場合、Ａβ４２、ａｍｙｌｉｎ、リゾチーム、インスリンによる細胞毒性の３７．８％、４５．４％、１１７．６％及び８９．８％をそれぞれ阻害することができる。そのため、ＺＲポリペプチドの各アミロイドの凝集時への影響がどのように異なっても、ＺＲはいずれもＡβ４２、ａｍｙｌｉｎ、リゾチーム、インスリンの細胞毒性を著しく阻害することができる。
【００９３】
実験例６  ＺＲポリペプチドはＡＤトランスジェニックマウスの記憶能力を改善する
【００９４】
１）側脳室の注射：８月齢のＡＰＰとＰＳ１遺伝子を組み換えたＡＤ雌性マウスをポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループとＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ  ｃｏｎ）にランダムに分け、１グループは８匹である。それと同時に、８匹の年齢が同じである同腹（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ）野生型マウスを対照グループ（ＷＴ）とし、上記３グループのマウスに対して以下の処理を行った。
【００９５】
脳内に注射する前の１２ｈからマウスを絶食させるが、絶水させない。まず、マウスに麻醉をした。麻醉剤の量は、２５ｇのマウスの腹腔に濃度が１０％の抱水クロラールを０．１ｍＬ注射する。マウスを定位固定装置に固定し、標準アトラスを参照し脳定位固定を行い側脳室に注射し医薬を投与した。マウスの脳室注射の定位パラメータは、ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）の後ろ１．８ｍｍ、中間線の近傍±１．８ｍｍ、硬膜の下の２．５ｍｍである。無菌水を用いてＺＲを１ｍｇ／ｍＬに溶解し、注射速度は０．２μＬ／ｍｉｎであり、注射用量は５μＬである。注射後に針を入れたまま５ｍｉｎ保持した。７日間おきに１回注射し、合計４回注射した。最後の注射から５日目に、マウスに対して水迷路記憶能力テストを行った。
【００９６】
２）記憶力のトレーニング：水迷路のトレーニングの前にマウスを室温２５℃で湿度４６％の環境に配置して３日間適応させた。全ての行動学検出試験において、いずれもランダム化二重盲検の形態を採用する。トレーニングする前に、プラットホームを撤去し、マウスを水タンクの中央に軽く入れ、６０ｓ自由に泳がせた。各グループのマウスの泳ぐ象限の嗜好を測定し、対向する水タンクの壁を選択して当該マウスの最初の放出位置とした。一回目のトレーニングの前に、マウスをプラットホーム（プラットホームの直径が１０センチメートル）上で１５ｓ立たせ、プールの（直径が１．１メートル）中のプラットホームの空間位置を記憶させた。プラットホームを第２象限の中部に配置し、且つ、プラットホームの上面は水面より１．５センチメートルとする。動物の視覚的コントラストを増加させ、画像を記録しやすいように、プール水に粉乳を投入した。マウスをプールの壁に向けて水に軽く入れ、水タンクの中で泳がせた。マウスがプラットホーム上で２ｓ立つと計時を停止し、プラットホームに登ったと認め、トレーニングの時間は毎回最長で６０ｓであった。その間に、ソフトウェアを用いてその軌跡、及び水に入ってからプラットホームに登るまでの時間、即ち潜伏期を記録した。マウスが６０ｓ内にプラットホームを見つけると、それをプラットホーム上で１０ｓ滞在させた。マウスが６０ｓ内にプラットホームを見つけないと、６０ｓ後に操作者によってマウスをガイドしてプラットホームに登らせ、且つプラットホーム上で１０ｓ滞在させた。５日間トレーニングし続け、１日に２回トレーニングし、２回のトレーニング間の間隔は３〜４ｈであった。その後、２４ｈ空け、プラットホームを撤去し、マウスに水中でプラットホームを６０ｓ探させる。録画とソフトウェアシステムで５日間のトレーニングと探索試験の結果を記録し、且つ、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析し、試験結果を処理した。
【００９７】
試験結果は図６（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、トレーニング時間の増加に伴い、各グループのマウスがプラットホームを見つける潜伏期は徐々に短縮した。具体的には以下のとおりである。
【００９８】
ＺＲを注射したＡＤマウスが、トレーニング３，４，５日目にプラットホームを見つける潜伏期は、ＰＢＳを注射した対照的なＡＤマウスと比べて著しい違いがある。図６（Ａ）において、ＺＲを注射したＡＤマウスの空間記憶能力はＰＢＳを注射した対照グループよりも著しく優れている。図６（Ｂ）において、プラットホームを撤去した後、ＺＲを注射したＡＤマウスがプラットホームを見つける潜伏期もＡＤ対照グループより小さく、野生型（ＷＴ）マウス、ＡＤ対照マウス及びＺＲで治療したＡＤマウスの潜伏期はそれぞれ１６ｓ、２４ｓ及び１７ｓである。図６（Ｃ）において、ＺＲを注射したＡＤマウスがプラットホームの所在位置を通った回数はＡＤ対照グループよりも著しく高く、野生型（ＷＴ）マウス、ＡＤ対照マウス及びＺＲで治療したＡＤマウスがプラットホームを通る回数はそれぞれ４．２、１．８及び３．７である。図６（Ｄ）において、ＺＲを注射したＡＤマウスがターゲット象限に所在する時間はＡＤ対照マウスよりも著しく高く、野生型（ＷＴ）マウス、ＡＤ対照マウス及びＺＲで治療したＡＤマウスがターゲット象限に所在する時間はそれぞれ２０ｓ、１１ｓ及び１９ｓである。これらの結果から、ＺＲを注射したＡＤマウスの空間記憶能力はＺＲが注射されていないＡＤ対照グループよりも著しく優れていることが分かった。
【００９９】
実験例７  ＺＲポリペプチドはＡＤトランスジェニックマウスの脳内の老人斑の数量を低減する
【０１００】
１）上記ポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループ、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ  ｃｏｎ）、野生型（ＷＴ）グループのマウスに対して心臓潅流を行い、脳組織を取って組織用冷蔵保存液及び液体窒素を用いて凍結処理を行い、且つ−８０℃に保存した。使用時に凍結ミクロトームでスライスし、スライスの厚さを１６μｍとし、９枚のスライスおきに１枚を取り出し染色観察を行った。
【０１０１】
２）１ｍｇ／ｍＬのＴｈＳを用いてスライスを１０ｍｉｎ浸染し、続いて７０％のエタノールで３回洗浄した。
【０１０２】
３）蛍光顕微鏡を用いて励起波長４８８ｎｍの画像を採取し、４×対物レンズで観察し、結果を図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【０１０３】
図７（Ａ）は野生型マウスであり、ポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループ（ｎ＝８）、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ  ｃｏｎ）（ｎ＝８）の脳スライス（１匹の動物につき部位ごとに１０〜１２枚のスライスを検出する）における老人斑の面積である。ＺＲを注射したＡＤマウスの脳内の老人斑の数は著しく減少している。図７（Ｂ）と図（Ｃ）では、ポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループの脳スライスにおける老人斑の面積が占有するスライス面積の割合及び老人斑の数はそれぞれ０．３％と４個／ｍｍ2であり、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ  ｃｏｎ）の脳スライスにおける老人斑の面積が占有するスライス面積の割合及び数はそれぞれ１．７％と１７個／ｍｍ2であることが分かった。統計学的解析により、ＺＲを注射したＡＤマウスの脳内の老人斑の数と占有面積はいずれも著しく低下することが分かった。
【０１０４】
上記凍結スライスを０．３％の過酸化水素内に配置し、且つ１０％のヒツジ血清を用いてスライスを封止する。１：３０００で希釈したＡｂ抗体６Ｅ１０を投入して３７℃で１ｈ機能させ、ビオチン化したヒツジ抗マウスの第２抗体を投入して３７℃で１ｈ機能させ、最後にＨＲＰと接続するストレプトアビジンを投入し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として発色させ、顕微鏡を用いて画像を採取する。
【０１０５】
図７（Ｄ）により、ＰＢＳを注射したＡＤマウスの脳海馬と皮質における老人斑の数はポリペプチドＺＲを注射したＡＤマウスにおける老人斑の数よりも著しく多いことが見られる。システムｖｉｓｉｏｐｈａｒｍを用いてポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループ（ｎ＝８）、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ＋ｃｏｎ又はｃｏｎｔｒｏｌ）（ｎ＝８）の脳スライス（１匹の動物につき部位ごとに１０〜１２枚のスライスを検出する）における老人斑の面積を測定し、結果を図７（Ｅ）〜（Ｈ）を示す。
【０１０６】
ポリペプチドＺＲを注射したマウスの海馬における老人斑の面積は０．７％で、ＰＢＳを注射したマウスの海馬における老人斑の面積は２．４％であり、ポリペプチドＺＲを注射したマウスの皮質における老人斑の面積は１．３％で、ＰＢＳを注射したマウスの皮質における老人斑の面積は２．９％であり、ポリペプチドＺＲを注射したマウスの海馬における老人斑の数は７個／ｍｍ2で、ＰＢＳを注射したマウスの海馬における老人斑の数は１８個／ｍｍ2であり、ポリペプチドＺＲを注射したマウスの皮質における老人斑の数は９個／ｍｍ2であり、ＰＢＳを注射したマウスの皮質における老人斑の数は３０個／ｍｍ2であった。統計学的解析により、ＺＲを注射したＡＤマウスの脳の海馬と皮質における老人斑の数と占有面積はいずれも著しく低下することが分かった。
【０１０７】
実験例８  ＺＲポリペプチドはＡＤトランスジェニックマウスの脳内のＡｂ４０とＡβ４２レベルを低減する
【０１０８】
上記ポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループ、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ対照）の試験用マウスの脳組織をプロテアーゼインヒビターを含むｐＨ７．２のＰＢＳにおいて均質化した。続いて、１５０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心し、上澄み液を回収した。沈殿物に５Ｍの塩酸グアニジン（ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で調製され、ｐＨ８．０）を投入し、且つ遠心処理を行い、上澄み液を回収し、可溶性と不溶性Ａｂ４０及びＡβ４２レベルはキットによってＥＬＩＳＡ方法でＯＤ値とＡｂ検量線を測定し、結果を図８（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【０１０９】
図８（Ａ）において、ＺＲポリペプチドを注射した脳内のＡβ４０レベルは１７ｐｇ／μｇで、ＰＢＳを注射した脳内のＡβ４０レベルは５６ｐｇ／μｇであり、図８（Ｂ）において、ＺＲポリペプチドを注射した脳内のＡβ４２レベルは２３ｐｇ／μｇで、ＰＢＳを注射した脳内のＡβ４２レベルは９７ｐｇ／μｇであり、図８（Ｃ）において、ＺＲポリペプチドを注射した脳内のＡβ４０レベルは４ｐｇ／μｇで、ＰＢＳを注射した脳内のＡβ４０レベルは７．４ｐｇ／μｇであり、図８（Ｄ）において、ＺＲポリペプチドを注射した脳内のＡβ４２レベルは２．４ｐｇ／μｇで、ＰＢＳを注射した脳内のＡβ４２レベルは５．１ｐｇ／μｇである。
【０１１０】
統計分析の結果により、ＡＤマウスにＺＲを注射した後、脳内の可溶性Ａｂ４０とＡβ４２レベル及び不溶性Ａｂ４０とＡβ４２レベルは、いずれもＰＢＳを注射したマウスよりも著しく低いことが分かった。
【０１１１】
実験例９  ＺＲポリペプチドはＡＤトランスジェニックマウスの脳内炎症レベルを低減する
【０１１２】
凍結した脳スライスを０．３％の過酸化水素内に配置して処理を行い、且つ１０％のヒツジ血清を用いてスライスを封止した。１：２００で希釈した抗Ｉｂａ−１抗体と１：１００で希釈した抗ＧＦＡＰ抗体をそれぞれ投入して３７℃で１ｈ機能させ、ビオチン化したヒツジ抗マウスの第２抗体を投入して３７℃で１ｈ機能させ、最後にＨＲＰと接続するストレプトアビジンを投入し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として発色させ、顕微鏡を用いて画像を採取した。システムｖｉｓｉｏｐｈａｒｍを用いてポリペプチドＺＲ（ＡＤ＋ＺＲ）を注射したグループ（ｎ＝８）、ＰＢＳを注射したグループ（ＡＤ  ｃｏｎ）（ｎ＝８）の脳スライス（１匹の動物につき部位ごとに１０〜１２枚のスライスを検出する）におけるミクログリアと星状細胞の面積を測定した。
【０１１３】
図９（Ａ）と（Ｂ）はそれぞれ、ＺＲを注射したＡＤマウスの脳内のミクログリアと星状膠細胞の数が著しく減少することを示している。図９（Ｃ）と（Ｄ）は、ＺＲポリペプチドを注射したＡＤマウスの脳内のミクログリアが占有する脳スライス面積は１．２％で、ＰＢＳを注射したＡＤマウスの脳内ミクログリアが占有する脳スライス面積は５．７％であり、ＺＲポリペプチドを注射した脳内の星状膠細胞が占有する脳スライス面積は１．８％で、ＰＢＳを注射した脳内の星状膠細胞が占有する脳スライス面積は４．９％であることを表している。
【０１１４】
統計学的解析の結果により、ＺＲを注射したＡＤマウスの脳内のミクログリアと星状膠細胞の数はいずれも著しく減少することが分かった。
【０１１５】
実験例１０  ＺＲポリペプチドは細胞のＡβに対する貪食を促進する
【０１１６】
１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いてＢＶ−２細胞を単一の細胞懸濁液に配合し、細胞を１００００個／穴で９６穴の細胞培養プレートに接種し、各穴の体積は１００μＬである。細胞を３７℃で２４時間培養し、インキュベータのＣＯ2濃度は５％であり、その後、以下のものをそれぞれ投入した。
【０１１７】
Ａβ４２：Ａβ４２蛋白の終濃度が０．１μＭであり、Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：５０であるもの：Ａβ４２蛋白の終濃度が０．１μＭであり、ＺＲの終濃度が５μＭであり、Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：１００であるもの：Ａβ４２蛋白の終濃度が０．１μＭであり、ＺＲの終濃度が１０μＭであり、Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：２００であるもの：Ａβ４２蛋白の終濃度が０．１μＭであり、ＺＲの終濃度が２０μＭであるもの。
【０１１８】
細胞を続けて４時間培養した後、細胞を回収した。プロテアーゼインヒビターを含む細胞溶解液を用いて細胞を処理し、細胞抽出液を回収した。Ａβ試験キットを用いて細胞内のＡβ４２レベルを測定し、結果を図１０に示す。
【０１１９】
Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：０であるもの：Ａβ４２蛋白の濃度が２６ｎｇ／ｇであり、Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：５０であるもの：Ａβ４２蛋白の濃度が２８ｎｇ／ｇであり、Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：１００であるもの：Ａβ４２蛋白の濃度が３３ｎｇ／ｇであり、Ａβ４２：ＺＲのモル比が＝１：２００であるもの：Ａβ４２蛋白の濃度が３８ｎｇ／ｇであるもの。
【０１２０】
投入されたＺＲの濃度の増加に伴い、ＢＶ−２細胞内のＡβ４２レベルが徐々に高まり、これにより、ＺＲはミクログリアのＡｂに対する貪食を促進する機能を有することが分かった。
【０１２１】
実験例１１  ＺＲポリペプチドがＰＤトランスジェニックマウスの動作協調能力を改善すること
【０１２２】
１）側脳室の注射：９月齢のＰＤトランスジェニックマウスをポリペプチドＺＲ（ＰＤ＋ＺＲ）を注射したグループ及びＰＢＳを注射したグループ（ＰＤｃｏｎｔｒｏｌ）にランダムに分け、１グループは８匹である。それと同時に、８匹の年齢が同じである同腹（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ）野生型マウスを対照グループ（ＷＴ）とし、上記３グループのマウスに対して以下の処理を行った。
【０１２３】
脳内に注射する前の１２ｈからマウスを絶食させるが絶水させない。マウスの注射形態は実施例６と同じであり、マウスに対してポールテストと後肢抱き程度テストの検出を行った。
【０１２４】
２）ポールテスト（Ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｐｏｌｅ  ｔｅｓｔ）：使用されるポールは１つの表面が粗い、台座付きの木質ポールであり、直径が１センチメートルで、長さが５０センチメートルである。ポールをマウスの籠内に穏やかに配置し、マウスをヘッドが上方へ向くようにポールの頂部に配置し、それにより、自動的に回頭してからヘッドが下方へ向くようにポールに沿って籠内に行かせた。マウスの回頭及び籠内に至るまでに使用する時間をそれぞれ記録した。マウスが落下、滑落するか、又はタスクを完成することができないと、回頭時間を３０秒と記録し、籠内に至るまでの時間を６０秒と記録した。１日に５回連続して行い、前の２日間をトレーニング期間とし、３日目をテスト期間とした。各グループのマウスのテスト期間における回頭及び籠内に至るまで使用する時間を統計分析し、結果を図１１（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
【０１２５】
野生型（ＷＴ）マウス、ＰＤ対照マウス及びＺＲで治療したＰＤマウスの回頭時間はそれぞれ１．３８秒、２１．８７秒及び１３．９秒であり、籠内に至るまで使用する時間はそれぞれ６．０２秒、４５．４８秒及び１９．７４秒であった。統計学的解析により、ＺＲを注射したＰＤマウスの回頭及び籠内に至るまで使用する時間はＰＤ対照グループのマウスよりも著しく低いことが分かった。
【０１２６】
３）後肢抱き程度テスト：マウスをヘッドが下方に向くように空中に吊り下げ、マウスの後肢抱き程度の分級を判断するように１５秒観察した。分級の基準は次のとおりである。０級＝２つの後肢を外へ伸ばして腹部から離れた、１級＝少なくとも半数の観察期間において、１本の後肢が腹部へ収縮した、２級＝少なくとも半数の観察期間において、２本の後肢が不完全に腹部へ収縮した、３級＝少なくとも半数の観察期間において、２本の後肢が完全に腹部へ収縮した。適切な状況において、０．５スコアの分級を使用してもよい。３日間連続して観察し、後肢抱き程度の評点は３回の実験のランク評点の合計とし、結果を図１１（Ｃ）に示す。
【０１２７】
野生型（ＷＴ）マウス、ＰＤ対照マウス及びＺＲで治療したＰＤマウスの後肢抱き程度のランキングスコアはそれぞれ０、１．７８及び１．０８であった。統計学的解析により、ＺＲを注射したＰＤマウスの後肢抱き程度のランキングスコアはＰＤ対照グループのマウスよりも著しく低いことが分かった。
【０１２８】
実験例１２  ＺＲポリペプチドはＰＤトランスジェニックマウスの脳内のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎレベルを低減する
【０１２９】
ポリペプチドＺＲ（ＰＤ＋ＺＲ）を注射したグループ、ＰＢＳを注射したグループ（ＰＤｃｏｎｔｒｏｌ）、野生型（ＷＴ）グループのマウスに対して心臓潅流を行い、脳幹と小脳を秤量した。脳組織を１：５（Ｖ／Ｗ）の割合で１×蛋白質加水分解酵素阻害剤と０．５％のＮＰ４０を含むＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に投入し、氷上に配置して５ｍｉｎ研磨し、２０ｍｉｎ静置した後に４℃にて１００,０００ｇの遠心力で５ｍｉｎ遠心し、上澄み液を回収した。
【０１３０】
反応系全体が１０μＬのＬＤＳ緩衝液、還元剤及び一定量の可溶性成分を十分に均一に混合し、７０℃の金属浴に１０ｍｉｎ配置し、その後１２０００ｒｐｍで室温において５ｍｉｎ遠心してサンプルを得た。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルを用い、サンプルを穴ごとに１０μＬ配置し、１５０Ｖで電気泳動を８０ｍｉｎ行った。続いて、３００ｍＡで湿式フィルム転写を２時間行った。ターゲット蛋白の分子量の大きさによってターゲット蛋白を含むＮＣ膜を切り出した。５％のスキムミルクを含むＰＢＳを室温で２ｈ封止し、抗α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ抗体を１：１０００で投入し、室温で２ｈインキュベートし、０．１％のＰＢＳＴ膜を３回洗浄し、毎回を５ｍｉｎとし、ＩＲで染色したヒツジ抗マウス／ウサギの第２抗体を１：１５０００で投入し、室温で遮光して１ｈインキュベートし、０．１％のＰＢＳＴ膜を３回洗浄し、毎回を１０ｍｉｎとした。その後、赤外レーザ撮像システムを用いて膜上の発光バンドの光学濃度値を検出し、結果を図１２に示す。
【０１３１】
ＷＴマウスの脳内の可溶性α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ／α−ｔｕｂｕｌｉｎの比は０．１９であり、ポリペプチドＺＲを注射したＰＤトランスジェニックマウスの脳内の可溶性α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ／α−ｔｕｂｕｌｉｎの比は１．４４であり、ＰＢＳを注射したＰＤトランスジェニックマウスの脳内の可溶性α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ／α−ｔｕｂｕｌｉｎの比は１．８４であることがわかった。統計分析の結果から、ＰＤトランスジェニックマウスのＺＲを注射した後の脳内の可溶性α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎレベルはＰＤ対照グループのマウスよりも著しく低いことが分かった。
【０１３２】
実験例１３  ＺＲポリペプチドはＨＤトランスジェニックマウスの動作協調能力を改善する
【０１３３】
側脳室の注射：１２月齢のＨＤトランスジェニックマウスをポリペプチドＺＲ（ＨＤ＋ＺＲ）を注射したグループとＰＢＳを注射したグループにランダムに分け、１グループは８匹であり、それと同時に、８匹の年齢が同じである同腹（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ）野生型マウスを対照グループとする。
【０１３４】
上記３グループのマウスに対して以下の処理を行った。
【０１３５】
脳内に注射する前の１２ｈからマウスを絶食させるが絶水させず、マウスの注射形態は実施例６と同じであり、マウスに対してロータロッド試験の検出を行った。
【０１３６】
ロータロッド試験：ロータロッド試験は３日間連続して行い、１日はトレーニング段階とテスト段階という２つの段階から構成される。トレーニング段階：ロータロッドの回転数を４ｒ／ｍｉｎとし、マウスをロータロッド上で５分間トレーニングした後に籠内に戻し、１時間後にテスト段階に移行した。テスト段階：ロータロッドの回転数を５分以内に静止から４０ｒ／ｍｉｎまで均一に加速させ、マウスがロータロッド上に所在する持続時間を記録し、落下しない場合は３００秒と記録した。１日にテストを３回行い、３０分間おきに１回行った。各グループのマウスが３日の中で毎回ロータロッド装置上に所在する持続時間を統計分析した（合計９回のテスト）。結果は図１３（Ａ）〜（Ｂ）に示すように、野生型（ＷＴ）マウス、ＨＤ対照マウス及びＺＲで治療したＨＤマウスがロータロッド上に所在する持続時間はそれぞれ２９５秒、１７６．７２秒及び２３３．６４秒であった。
【０１３７】
統計学的解析により、ＺＲを注射したＨＤマウスがロータロッド上に所在する持続時間はＨＤ対照グループのマウスよりも著しく高いことが分かった。
【０１３８】
実験例１４  ＺＲポリペプチドはＨＤトランスジェニックマウスの脳内のＨＴＴレベルを低減する
【０１３９】
ｗｅｓｔｅｒｎ方法を用いてＺＲがＨＤトランスジェニックマウスの脳内のＨＴＴに対する影響を検出する。
【０１４０】
上記ポリペプチドＺＲ（ＨＤ＋ＺＲ）を注射したグループ、ＰＢＳを注射したグループ、野生型（ＷＴ）グループのマウスに対して心臓潅流を行い、大脳を秤量した。脳組織を１：５（Ｖ／Ｗ）の割合で１×蛋白質加水分解酵素阻害剤を含むＲＩＰＡ溶解液に投入し、氷上に配置して５ｍｉｎ研磨し、２０ｍｉｎ静置した後に４℃にて１２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄み液を回収した。
【０１４１】
反応系全体が１０μＬのＬＤＳ緩衝液、還元剤及び一定量の可溶性成分を十分に均一に混合し、７０℃の金属浴に１０ｍｉｎ配置し、その後１２０００ｒｐｍで室温において５ｍｉｎ遠心すればサンプルを得た。３〜８％のＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ＮｕＰＡＧＥゲルを用い、穴ごとにサンプルを１０μＬ配置し、１５０Ｖで電気泳動を８０ｍｉｎ行った。続いて、３００ｍＡで湿式フィルム転写を２時間行った。ターゲット蛋白の分子量の大きさによってターゲット蛋白を含むＮＣ膜を切り出した。５％のスキムミルクを含むＰＢＳを室温で２ｈ封止し、抗ＨＴＴ抗体２１６６（１：１０００）、又はα−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（１：１０００）を投入し、室温で２ｈインキュベートし、０．１％のＰＢＳＴ膜を３回洗浄し、毎回を５ｍｉｎとし、ＩＲで染色したヒツジ抗マウス／ウサギの第２抗体を１：１５０００で投入し、室温で遮光して１時間インキュベートし、０．１％のＰＢＳＴ膜を３回洗浄し、毎回を１０ｍｉｎとした。その後、赤外レーザ撮像システムを用いて膜上の発光バンドの光学濃度値を検出し、結果を図１４に示す。
【０１４２】
図１４から、ＷＴマウスの脳内の可溶性ＨＴＴ／α−ｔｕｂｕｌｉｎの比は０．９５５であり、ポリペプチドＺＲを注射したＨＤトランスジェニックマウスの脳内の可溶性ＨＴＴ／α−ｔｕｂｕｌｉｎの比は２．１７であり、ＰＢＳを注射したＨＤトランスジェニックマウスの脳内の可溶性ＨＴＴ／α−ｔｕｂｕｌｉｎの比は２．７９であることがわかった。統計分析の結果から、ＨＤトランスジェニックマウスのＺＲを注射した後の脳内の可溶性ＨＴＴレベルは、対照マウスよりも著しく低いことが分かった。
【０１４３】
本発明は上記実施例によって本発明のプロセスを説明したが、本発明は上記プロセスに限定されるものではなく、即ち、本発明は必ずしも上記プロセスによってしか実施できないわけではないことを出願人より声明する。当業者であれば、本発明に対するいずれかの改善、本発明が使用する原料に対する均等置換及び補助成分の添加、具体的な形態の選択等は、全て本発明の保護範囲と公開範囲内に含まれることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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