(57)【要約】  本開示は、膵疾患または障害の治療および／または予防における幹細胞およびその治療的使用に関する。本明細書に提供されるのは、ｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞を含む組成物、ならびに膵疾患または障害の治療および／または予防のため、ｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞を調製および使用する方法である。
2019508503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験者における膵疾患または障害を治療または予防する方法であって、単離された膵臓幹細胞を前記被験者に投与することを含み、ここで前記膵臓幹細胞が、膵組織検体から単離され、かつｃ−ｋｉｔ陽性である、方法。
【請求項２】
前記膵臓幹細胞が成体膵臓幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膵臓幹細胞が膵臓のβ細胞を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膵臓幹細胞が、内分泌細胞および／または外分泌細胞に分化するそれらの能力によって特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記膵疾患または障害が１型糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記膵疾患または障害が２型糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単離された膵臓幹細胞が、前記被験者への投与前に培養下で拡大される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記単離された膵臓幹細胞が、前記被験者への投与前に、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記単離された膵臓幹細胞が、前記被験者への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、および／または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記膵組織検体が前記被験者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離された膵臓幹細胞が、前記被験者に、血管、膵管を通じて、または直接的に前記組織に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離された膵臓幹細胞が、前記被験者に、注射により、またはカテーテルシステムにより投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離された膵臓幹細胞が、未分化であるか、またはインスリンおよび／もしくはＣペプチドを最小レベルで発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
膵臓の損傷組織を修復および／または再生するための、治療有効量の単離された膵臓幹細胞および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、前記単離された膵臓幹細胞がｃ−ｋｉｔ陽性である、医薬組成物。
【請求項１５】
前記膵臓幹細胞が成体膵臓幹細胞である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記単離された膵臓幹細胞が、クローン原性、多能性および自己複製性である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記膵臓幹細胞が膵組織から単離される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記単離された膵臓幹細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記単離された膵臓幹細胞が自己由来である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記単離された膵臓幹細胞が、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記１つ以上の膵細胞型が外分泌細胞を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記１つ以上の膵細胞型が内分泌細胞を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記内分泌細胞がα細胞またはβ細胞である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記単離された膵臓幹細胞が、未分化であるか、またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
約１０６個の単離された膵臓幹細胞を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記単離された膵臓幹細胞が、インビトロで培養および拡大される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦをさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
カテーテル媒介または直接注射用に製剤化される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
膵臓から常在膵臓幹細胞を単離する方法であって、
（ａ）培養下の前記膵臓からの組織検体を培養し、それにより組織外植片を形成することと；
（ｂ）ｃ−ｋｉｔ陽性である前記培養外植片から細胞を選択することと、
（ｃ）前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、を含み、ここで前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が常在膵臓幹細胞である、方法。
【請求項３１】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、外分泌および／または内分泌細胞の１つ以上のマーカーを発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上のマーカーが、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の膵細胞型が外分泌細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の膵細胞型が内分泌細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記内分泌細胞がα細胞またはβ細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で拡大することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、クローン原性、多能性および自己複製性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、培養下で幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦに曝露することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法であって、膵臓幹細胞を膵臓から抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞である前記膵臓幹細胞を培養および拡大することと；前記抽出および拡大された膵臓幹細胞の１用量を、前記被験者における損傷組織の領域に投与することと、を含み、それは膵臓の前記損傷組織を修復および／または再生するのに有効である、方法。
【請求項４２】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、外分泌および／または内分泌細胞の１つ以上のマーカーを発現する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上のマーカーが、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上の膵細胞型が外分泌細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の膵細胞型が内分泌細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記内分泌細胞がα細胞またはβ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記損傷組織への投与前に、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記損傷組織への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦに曝露される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、カテーテル媒介または直接注射により投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記膵臓幹細胞が自己由来である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記膵臓幹細胞が同種である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１６年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３０５，７３６号、および２０１７年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４５７，７１０号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下での優先権の利益を主張し、それら各々の内容はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの記述
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される：配列表のコンピュータで読み込み可能な形式のコピー（ファイル名：ＡＡＬＳ＿００５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１７年３月５日、ファイルサイズ：約３キロバイト）。
【０００３】
発明の分野
本開示は、膵疾患または障害の治療および／または予防における幹細胞およびその治療的使用に関する。本明細書に提供されるのは、膵疾患または障害の治療および／または予防における、ｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞を含む組成物およびｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞を調製し、用いる方法である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
膵臓は、内分泌腺および外分泌腺の双方である。内分泌腺としてのその機能では、膵臓は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよび膵ポリペプチドを含む幾つかの重要なホルモンを産生する。インスリンおよびグルカゴンは各々、βおよびα細胞から分泌され、炭水化物、タンパク質および脂質代謝を調節する。外分泌膵臓は、食物の消化に寄与する消化酵素を合成および分泌する、導管および腺房細胞を含む。膵臓に関連した疾患および障害は、糖尿病、膵炎、膵外分泌不全および嚢胞性線維症を含む。
【０００５】
１型糖尿病は、膵臓が自己免疫応答によりインスリンをほとんどまたは全く産生しないときに生じる慢性病状である。免疫系は、膵臓においてインスリン産生β細胞を破壊する。１型糖尿病は通常、小児期または青年期に始まるが、年齢に関係なく発症し得る。米国、カナダ、および欧州では、１型糖尿病は、糖尿病の全症例の５〜１０パーセントを占める。糖尿病を発症する人々は、彼らを疾患に罹りやすくする１つ以上の遺伝子を有する。環境因子、例えば人生初期における特定のウイルスおよび食物への曝露であれば、自己免疫応答を誘導する場合がある。１型糖尿病を有する人々は、心臓発作、胸痛、脳卒中、ひいては死亡を引き起こし得る心血管疾患のリスクが増大している。
【０００６】
１型糖尿病は、規則的な血糖監視、生活様式の調整およびインスリンによる治療を必要とする。一般に、１型糖尿病を有する人々においては、血糖を厳格な管理状態で維持するため、集中的なインスリン治療が推奨される。集中的なインスリン治療に対する欠点として、１日あたり複数回のインスリン注射またはインスリンポンプの使用；血糖を頻繁に検査する必要性；日常活動を調和させる必要性；低血糖エピソードのリスク増大；初期の体重増加；およびコストが挙げられる。インスリン作用の有効性はまた、注射されるインスリンの用量、注射技法、注射の部位、皮下血流、オープンボトルからのインスリン効力、および各個体に特有の要素に依存する。
【０００７】
２型糖尿病は、身体がグルコースを使用する方法を破壊する慢性病状である。この障害では、膵臓は、十分なインスリンを作ることなく、身体は正常レベルまたはさらに高いレベルのインスリン、または双方に対して抵抗性を示すようになる。これは、高血糖レベルを引き起こし、未治療の場合、問題を引き起こし得る。米国、カナダ、および欧州では、糖尿病を有するすべての人々の約９０パーセントが２型糖尿病を有する。２型糖尿病は、遺伝因子および環境因子の組み合わせによって引き起こされると考えられる。２型糖尿病を有する多くの人々が、２型糖尿病または糖尿病に関連した他の医学的問題のいずれか、例えば、高コレステロールレベル、高血圧、または肥満を有する家族を有する。２型糖尿病を発症する可能性は、特定の民族、例えば、ラテンアメリカ系、アフリカ系、およびアジア系の人々において高めである。
【０００８】
２型糖尿病のための治療は、生活様式の変化、セルフケア処置、およびインスリンの規則的投与ならびに他の薬物療法を含む。これらの治療は、血糖レベルをほぼ正常に維持し、合併症を発症するリスクを最小化し得る。
【０００９】
膵炎は、膵臓の炎症であり、消化酵素が膵臓自体を消化し始めるときに発症する。膵炎は、急性または慢性であり得る。いずれの形態も重篤であり、合併症をもたらし得る。急性膵炎は、急激に発症し、通常、治療とともに数日以内に消失する。それは胆石によって引き起こされることが多い。一般的症状は、上腹部における激痛、悪心、および嘔吐である。治療は通常、静脈内（ＩＶ）輸液、抗生物質、および疼痛を軽減するための薬剤を意図した数日の入院である。慢性膵炎は、治癒または改善することがない。それは経時的に悪化し、永久的損傷をもたらす。最も一般的な要因は、重度のアルコール使用である。他の要因として、嚢胞性線維症および他の遺伝性障害、血中の高レベルのカルシウムまたは脂肪、幾つかの薬剤、および自己免疫状態が挙げられる。症状として、悪心、嘔吐、体重減少、および油っぽい便が挙げられる。治療はまた、静脈内輸液、疼痛を軽減するための薬剤、および栄養サポートを意図した数日の入院であってもよい。慢性膵炎は、膵がん、糖尿病および膵外分泌不全などの他の障害におけるリスク因子である。
【００１０】
膵外分泌不全（ＥＰＩ）は、膵臓によって作られる消化酵素の欠乏に起因して、食物を適切に消化することができない。ＥＰＩは、嚢胞性線維症およびシュワックマン・ダイアモンド症候群に苦悩するヒトにおいて見出される。それは、消化酵素を作る膵細胞の漸進的減少によって引き起こされる。慢性膵炎は、ヒトにおけるＥＰＩの最も一般的な要因である。消化酵素の減少は、栄養分の消化不良および吸収不良をもたらす。
【００１１】
嚢胞性線維症を患う個体では、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）における突然変異が、膵臓を含む幾つかの臓器における上皮液輸送の調節不全をもたらす。結果的に生じる膵臓の線維症および炎症は、栄養失調および糖尿病を生じ得る。
【００１２】
特定タイプの膵がんは、異常に機能する細胞を含む。例えば、膵臓の腺房細胞がんは、消化酵素の過剰産生の原因となり、皮疹および関節痛などの症状を引き起こすことがある。別の例として、神経内分泌腫瘍の機能タイプは、インスリン、ガストリンおよびグルカゴンなどのホルモンを血流中に多量に分泌し、低血糖などの重篤な症状をもたらし得る。手術は、外分泌型のがんに対する唯一の治療法であるが、該方法は、膵臓の正常部分を損傷し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、膵臓内の細胞の修復、再構成および／または再生を可能にする治療から利益を得ることになる種々の膵疾患および障害が存在する。しかし、膵臓からの膵臓幹細胞の同定、特徴づけ、および単離は理解しがたい状況のままであり、かかる幹細胞が存在するか否かについては議論の余地がある。したがって、当該技術分野では、膵疾患または障害の治療にて用いることができるような幹細胞を単離するために使用可能な膵臓幹細胞のマーカーを同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明の実施形態は、幹細胞およびそれを調製し、用いる方法に関する。
【００１５】
本発明の実施形態は、幹細胞に典型的な特徴を有する膵組織内のｃ−ｋｉｔ陽性細胞の集団の発見に基づく。その発見前に、幹細胞のあらゆる特徴を有する膵組織からの１つの細胞型の認識または単離はなされていない。幹細胞の基本的特性は、インビトロおよびインビボでの自己複製能（self-renewal）、クローン形成能および多分化能(multipotentiality)である。ｃ−ｋｉｔ陽性膵細胞は、一般に、未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【００１６】
本発明の実施形態は、膵疾患または障害、例えば限定はされないが、１型糖尿病、２型糖尿病、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんによって損傷された膵細胞を置換するという課題に対して解決策を提供する。一部の態様では、それら課題は、膵組織の修復および／または再生を促進するとともに、それを必要とする被験者における膵疾患または障害、例えば限定はされないが、１型糖尿病、２型糖尿病、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんを治療または予防するように、膵臓幹細胞を欠損および／または損傷膵組織に投与することにより解決される。一実施形態では、膵臓幹細胞は、患者に細胞を移植することによって投与される。
【００１７】
したがって、一態様では、本発明は、それを必要とする被験者における膵疾患または障害を治療または予防する方法であって、単離された膵臓幹細胞を被験者に投与することを含み、ここで膵臓幹細胞は、膵組織検体から単離され、ｃ−ｋｉｔ陽性である、方法を提供する。一実施形態では、膵組織検体は、被験者から得られる。一実施形態では、膵臓幹細胞は、膵臓のβ細胞を生成する。別の実施形態では、膵臓幹細胞は、内分泌細胞および／または外分泌細胞に分化するその能力によって特徴づけられる。さらなる実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【００１８】
一実施形態では、本明細書に記載の方法または組成物によって治療される膵疾患または障害は、１型糖尿病である。別の実施形態では、膵疾患または障害は、２型糖尿病である。別の実施形態では、膵疾患または障害は、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんである。
【００１９】
一実施形態では、前記単離された膵臓幹細胞は、被験者への投与前に培養下で拡大される。一実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者への投与前に、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、および／または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に曝露される。
【００２０】
一実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者に、血管、膵管を通じて、または直接的に組織に投与される。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、注射により、またはカテーテルシステムにより、または肝臓における注射を通じて被験者に投与される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、膵臓の損傷組織を修復および／または再生するため、治療有効量の単離された膵臓幹細胞および薬学的に許容できる担体を含み、前記単離された膵臓幹細胞がｃ−ｋｉｔ陽性である、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、膵臓幹細胞は、膵組織から単離される。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、自己由来である。
【００２２】
一実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、外分泌細胞を含む。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、内分泌細胞を含む。さらなる実施形態では、内分泌細胞は、α細胞またはβ細胞である。さらに別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【００２３】
一実施形態では、当該組成物は、約１０６個の単離された膵臓幹細胞を含む。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、インビトロで培養および拡大される。別の実施形態では、該組成物は、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子をさらに含む。さらなる実施形態では、該組成物は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦをさらに含む。
【００２４】
一実施形態では、該組成物は、カテーテル媒介または直接注射用に製剤化される。
【００２５】
別の態様では、本発明は、常在膵臓幹細胞を膵臓から単離する方法であって、（ａ）前記膵臓からの組織検体を培養下で培養し、それにより組織外植片を形成することと；（ｂ）培養外植片からｃ−ｋｉｔ陽性である細胞を選択することと、（ｃ）前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、を含み、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が常在膵臓幹細胞である、方法を提供する。
【００２６】
一実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、外分泌および／または内分泌細胞の１つ以上のマーカーを発現する。別の実施形態では、１つ以上のマーカーは、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼを含む。
【００２７】
膵臓から常在膵臓幹細胞を単離する方法の一実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、外分泌細胞を含む。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、内分泌細胞を含む。さらなる実施形態では、内分泌細胞は、α細胞またはβ細胞である。
【００２８】
一実施形態では、膵臓から常在膵臓幹細胞を単離する方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で拡大することをさらに含む。別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露することをさらに含む。さらに別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦに曝露することをさらに含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法であって、膵臓から膵臓幹細胞を抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞である前記膵臓幹細胞を培養および拡大することと；前記抽出および拡大された膵臓幹細胞の１用量を被験者における損傷組織の領域に投与することと、を含み、それは膵臓の損傷組織を修復および／または再生するのに有効である、方法を提供する。
【００３０】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、外分泌および／または内分泌細胞の１つ以上のマーカーを発現する。別の実施形態では、１つ以上のマーカーは、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼを含む。
【００３１】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、外分泌細胞を含む。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、内分泌細胞を含む。さらなる実施形態では、内分泌細胞は、α細胞またはβ細胞である。
【００３２】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷組織への投与前に、培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。さらに別の実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷組織への投与前に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦに曝露される。
【００３３】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、カテーテル媒介または直接注射により投与される。
【００３４】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、膵組織は、ヒトから得られる。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、膵組織は、成体膵組織である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離される膵臓幹細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、クローン原性、多能性および自己再生性である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、膵臓幹細胞は、自家細胞である。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、膵臓幹細胞は、同種である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、手術時に得られる代表的なヒト膵臓試料を示す。
【図２−１】図２Ａは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびインスリン（赤色）について染色された膵細胞の代表的な免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。      図２Ｂは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびＣペプチド（赤色）について染色された膵細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。
【図２−２】図２Ｃは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびグルカゴン（赤色）について染色された膵細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。トリプターゼ染色は、白色で示され、マスト細胞に対するマーカーである。      図２Ｄ：図２Ｃにおけるボックス領域の拡大を示す。図２Ｄは、ｃ−ｋｉｔ（緑色）について染色された細胞を示す。      図２Ｅ：図２Ｃにおけるボックス領域の拡大を示す。図２Ｅは、グルカゴン（赤色）について染色された同じ細胞を示す。      図２Ｆ：図２Ｃにおけるボックス領域の拡大を示す。図２Ｆは、ｃ−ｋｉｔおよびグルカゴン染色シグナルのマージを示す。
【図３】図３Ａ：ｃ−ｋｉｔ（緑色）および上皮マーカーＣＫ１９（赤色）について染色された膵管および外分泌膵臓に関連する細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。トリプターゼ染色は、白色で示され、マスト細胞に対するマーカーである。      図３Ｂ：ｃ−ｋｉｔ（緑色）および上皮マーカーＣＫ１９（赤色）について染色された膵管および外分泌膵臓に関連する細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。図３Ａにおけるボックス領域の拡大を示す。ｃ−ｋｉｔおよび上皮マーカーＣＫ１９を同時発現する一部の外分泌細胞を示す。矢印は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。トリプターゼ染色は、白色で示され、マスト細胞に対するマーカーである。      図３Ｃ：ｃ−ｋｉｔ（緑色）および上皮マーカーＣＫ１９（赤色）について染色された膵管および外分泌膵臓に関連する細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。図３Ａにおけるボックス領域の拡大を示す。ｃ−ｋｉｔおよび上皮マーカーＣＫ１９を同時発現する一部の外分泌細胞を示す。矢印は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。トリプターゼ染色は、白色で示され、マスト細胞に対するマーカーである。
【図４】図４は、ｃ−ｋｉｔ（緑色）および細胞運命決定因子αアダプチン（赤色）について染色されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。
【図５】図５は、ｃ−ｋｉｔ（緑色）について染色されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞のクローンから得られる娘細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色された。
【図６Ａ】ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびＣペプチド（赤色）について染色された未分化の（「対照」）または分化された（「Ｄｅｘａ」）ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。
【図６Ｂ】ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびグルカゴン（赤色）について染色された未分化の（「対照」）または分化された（「Ｄｅｘａ」）ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。
【図６Ｃ】ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびおよびアミラーゼ（赤色）について染色された未分化の（「対照」）または分化された（「Ｄｅｘａ」）ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の代表的なＩＨＣ画像を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、高感度ＥＬＩＳＡアッセイでの測定によると、グルコースを含有する培地中で増殖されたｈＰＳＣがヒトインスリンを合成することを示す。ＧＳＩＳ：グルコース刺激インスリン分泌。
【図７】ヒト膵臓の試料を示す。手術時に廃棄された膵臓標本が、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の組織学および単離に用いられる。
【図８−１】図８Ａ：ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト膵臓に存在する。３つのｃ−ｋｉｔ陽性細胞（緑色、矢印）が存在する；島はＣペプチド（赤色）により染色される。核はＤＡＰＩ（青色）により染色される。各蛍光チャネルは、下の挿入図にてより高い拡大率で図示される。      図８Ｂ：ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト膵臓に存在する。１つのｃ−ｋｉｔ陽性細胞（緑色、矢印）が、インスリン（赤色）によって染色された島内部に存在する。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、インスリンに対して陽性である。挿入図：各蛍光チャネル。      図８Ｃ：ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト膵臓に存在する。左および右パネルは、グルカゴン（赤色）の末梢局在により画定される島内部の２つの異なるｃ−ｋｉｔ陽性細胞（矢印）を図示する、６μｍ離れた２つの焦平面を示す。両方のｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、グルカゴンを発現する。挿入図：各蛍光チャネル。ｃ−ｋｉｔおよびトリプターゼに対して陽性である１つのマスト細胞（矢頭）が領域内に存在する。
【図８−２】図８Ｄ：ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト膵臓に存在する。サイトケラチン１９（右上パネル；ＣＫ１９、赤色）によって染色された膵管の上皮内部のｃ−ｋｉｔ陽性細胞（左上パネル；緑色）。矢印は、４つのｃ−ｋｉｔ陽性、ＣＫ１９陰性およびトリプターゼ陰性（左下パネル；白色）細胞を示す。ｃ−ｋｉｔおよびトリプターゼに対して陽性である４つのマスト細胞（矢頭）が、膵管近傍に存在する。挿入図：各蛍光チャネル。破線は、トリプターゼおよびＣＫ１９に対して陰性のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を画定する。右下パネル：マージ。
【図８−３】図８Ｅ：ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト膵臓に存在する。ヒト膵臓におけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞およびマスト細胞の割合（ｎ＝６）。各データ（青色バー）は、それらの平均±標準偏差（赤色バー）と一緒に示される。
【図９】図９：ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト膵臓に存在する。３つのｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、外分泌腺房細胞の近傍に存在する（アミラーゼ、赤色）。２つがｃ−ｋｉｔおよびトリプターゼ（白色）に対して陽性であり、マスト細胞（矢頭）を表す。第３のｃ−ｋｉｔ陽性細胞がトリプターゼおよびアミラーゼに対して陰性である（矢印）。挿入図：各蛍光チャネル；アミラーゼはｃ−ｋｉｔ陽性細胞に隣接するが、その一部ではない。
【図１０−１】図１０Ａ：推定上のｈＰＳＣが対称的および非対称的に分裂し、多細胞クローンを形成する。膵細胞におけるｃ−ｋｉｔ発現の散布図（右パネル）；四分円Ｑ２では、細胞はｃ−ｋｉｔ受容体の２つの異なるエピトープに対して陽性である。２つのｃ−ｋｉｔ抗体に対するアイソタイプ対照もまた示される（左パネル）。      図１０Ｂ：推定上のｈＰＳＣが対称的および非対称的に分裂し、多細胞クローンを形成する。定量データが、個別に（青色バー）、平均±標準偏差として（赤色バー）示される（ｎ＝１６）。
【図１０−２】図１０Ｃ：推定上のｈＰＳＣが対称的および非対称的に分裂し、多細胞クローンを形成する。ＦＡＣＳ選別されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞（緑色）の培養物が低い拡大率およびより高い拡大率で図示される。核はＤＡＰＩ（青色）によって染色される。大部分の細胞がｃ−ｋｉｔを発現する。      図１０Ｄ：推定上のｈＰＳＣが対称的および非対称的に分裂し、多細胞クローンを形成する。３つの分裂するｃ−ｋｉｔ陽性細胞（緑色）が後期／終期における染色体を有する（左上パネル）。これらのうちの２つの有糸分裂細胞（矢印）が対称的に分裂中であり；αアダプチン（赤色）が両方の娘細胞内に分布する（右上パネル）。残りのｃ−ｋｉｔ陽性細胞（矢頭）は有糸分裂のほぼ終期にあり、非対称的に分裂中であり；αアダプチンは２つの娘細胞の一方に制限される。左下パネル、マージ。データは、平均±標準偏差（ｎ＝５）で示される。＊ｐ＜０．０５は非対称細胞分裂に対する。
【図１０−３】図１０Ｅ：推定上のｈＰＳＣが対称的および非対称的に分裂し、多細胞クローンを形成する。位相差顕微鏡によって示される２つの単細胞由来クローン。      図１０Ｆ：推定上のｈＰＳＣが対称的および非対称的に分裂し、多細胞クローンを形成する。共焦点顕微鏡によって図示される、ｃ−ｋｉｔ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）によって染色された３つの単細胞由来クローン。
【図１１】図１１Ａ：膵臓ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の増殖および特徴。ＦＡＣＳ選別されたｃ−ｋｉｔ陽性およびｃ−ｋｉｔ陰性細胞が、蒔かれ、パラホルムアルデヒドに固定され、選別用に利用される場合と異なる第３のｃ−ｋｉｔ抗体で染色される；ｃ−ｋｉｔ陽性画分は左パネルに、ｃ−ｋｉｔ陰性画分は右パネルに示される。      図１１Ｂ：膵臓ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の増殖および特徴。ＦＡＣＳ選別されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が９６ウェルプレートの単一ウェル内に個別に播種された。クローンがメチレンブルーにより染色され、赤円内に含まれる。      図１１Ｃ：膵臓ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の増殖および特徴。クローン効率に関するデータが、個別に（青色バー）、また平均±標準偏差として（赤色バー）示される（ｎ＝１４）。      図１１Ｄ：膵臓ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の増殖および特徴。クローンｃ−ｋｉｔ陽性細胞は造血細胞系統の表面マーカーを発現しない：拡大された細胞の散布図がＦＡＣＳ選別されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞から得られる；ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現が示される。
【図１２−１】図１２Ａ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。クローンｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣにおける遺伝子転写物（ｎ＝４）。      図１２Ｂ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。ヒートマップは、クローンｈＰＳＣにおけるＷｎｔ／β−カテニン経路に対する分化誘導物質デキサメタゾンの効果を図示する（ｎ＝３）。
【図１２−２】図１２Ｃ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。ヒートマップは、クローンｈＰＳＣにおけるＴＧＦ−β／ＢＭＰ経路に対する分化誘導物質デキサメタゾンの効果を図示する（ｎ＝３）。      図１２Ｄ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。ヒートマップは、クローンｈＰＳＣにおけるＮｏｔｃｈ経路に対する分化誘導物質デキサメタゾンの効果を図示する（ｎ＝３）。      図１２Ｅ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。ｈＰＳＣの関与（ｎ＝４）。各々の場合、上の３つのパネルは、未分化細胞におけるｃ−ｋｉｔ（緑色）の発現を図示する。デキサメタゾンへの曝露後、プロインスリンＣペプチド（赤色）の発現は、下の３つのパネルの各々において明白である。核はＤＡＰＩ（青色）により染色される。グルコースの培地への添加により、高感度ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるヒトインスリンの合成がもたらされた。ＧＳＩＳ、グルコース刺激によるインスリン分泌。
【図１２−３】図１２Ｆ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。ｈＰＳＣの関与（ｎ＝４）。各々の場合、上の３つのパネルは、未分化細胞におけるｃ−ｋｉｔ（緑色）の発現を図示する。デキサメタゾンへの曝露後、グルカゴン（赤色）の発現は、下の３つのパネルの各々において明白である。核はＤＡＰＩ（青色）により染色される。      図１２Ｇ：ｈＰＳＣが、膵臓前駆細胞のマーカーを発現し、内分泌および外分泌細胞の表現型にコミットする。ｈＰＳＣの関与（ｎ＝４）。各々の場合、上の３つのパネルは、未分化細胞におけるｃ−ｋｉｔ（緑色）の発現を図示する。デキサメタゾンへの曝露後、アミラーゼ（赤色）の発現は、下の３つのパネルの各々において明白である。核はＤＡＰＩ（青色）により染色される。
【図１３−１】図１３ＡｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。ＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣ（赤色、矢印）がマウス膵臓内に存在し；外分泌腺房細胞がアミラーゼ（白色）により染色される。ＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣは、挿入図中により高い拡大率で図示される。核はＤＡＰＩ（青色）により染色される。      図１３Ｂ：ｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。マウス膵臓におけるＧＦＰ陽性ｈＰＳＣの集団（緑色）。
【図１３−２】図１３Ｃ：ｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。損傷されたマウス膵臓の領域内のＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣの集団（赤色、矢印）。これらのｈＰＳＣは、Ｃペプチド（緑色）およびアミラーゼ（白色）に対して陰性である。これらのｈＰＳＣの小集団は、挿入図中により高い拡大率で示される。
【図１３−３】図１３Ｄ：ｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。四角は、インタクトなマウス膵臓におけるＧＦＰ陽性ｈＰＳＣを画定する（アミラーゼ、白色）。挿入図中により高い拡大率で図示される通り、これらのｈＰＳＣは、インスリン（赤色）の細胞内局在を示す。
【図１３−４】図１３Ｅ：ｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。広範に損傷された膵組織が、ＧＦＰ陽性ｈＰＳＣの大集団により部分的に置換される。ｈＰＳＣの大部分が、インスリン（赤色）を発現する。β細胞の分化におけるＧＦＰおよびインスリンの共局在をより明確にするため、小さい四角内に含まれる領域が大きい四角内でより高い拡大率で図示される。      図１３Ｆ：ｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。広範に損傷された膵組織が、ＰＫＨ２６陽性ｈＰＳＣの大集団により部分的に置換される。ｈＰＳＣの大部分が、Ｃペプチド（緑色）を発現する。β細胞の分化におけるＰＫＨ２６およびＣペプチドの共局在をより明確にするため、小さい四角内に含まれる領域が大きい四角内でより高い拡大率で図示される。
【図１３−５】図１３Ｇ：ｈＰＳＣがマウス膵臓内に生着し、内分泌および外分泌細胞運命を獲得する。インタクトなマウス膵臓は、アミラーゼ（白色）を発現する単一のＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣ（赤色、四角）を有する。ＰＫＨ２６（赤色）、Ｃペプチド（緑色）およびアミラーゼ（白色）における各蛍光チャネルは、挿入図中により高い拡大率で図示される。
【図１４】図１４Ａ：ｈＰＳＣは、インタクトなマウス膵臓および損傷されたマウス膵臓に戻る。ＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣの小集団（赤色、矢印）が組織内に存在する。これらのｈＰＳＣは、Ｃペプチドおよびアミラーゼに対して陰性である。ＰＫＨ２６（赤色）、Ｃペプチド（緑色）およびアミラーゼ（白色）における各蛍光チャネルが、挿入図中により高い拡大率で示される。      図１４Ｂ：ｈＰＳＣは、インタクトなマウス膵臓および損傷されたマウス膵臓に戻る。極めて多数のＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣが、マウス膵臓の損傷領域内に存在する。ＰＫＨ２６標識ｈＰＳＣ（赤色）は、Ｃペプチド（緑色；赤色および緑色＝黄色）の細胞内局在を示す。四角内に含まれる領域は、挿入図中により高い拡大率で図示され、ここではＰＫＨ２６（赤色）、Ｃペプチド（緑色）およびアミラーゼ（白色）における各蛍光チャネルが、挿入図中により高い拡大率で示される。核はＤＡＰＩ（青色）により染色される。
【図１５】分化するｈＰＳＣは、インスリンを発現する。四角によって画定される２つのＧＦＰ標識ｈＰＳＣ（緑色）は、インスリン（赤色）に対して陽性である。ＧＦＰ（緑色）、インスリン（赤色）およびアミラーゼ（白色）における各蛍光チャネルは、挿入図中により高い拡大率で示される。
【図１６−１】図１６Ａ：Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスおよびＫｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスでは、外分泌腺房細胞はＧＦＰ（緑色）に対して陽性である。ＧＦＰおよびインスリン（赤色）に対して陽性であるβ細胞は、島内に存在する（白色および黄色矢頭）。２つの挿入図（右パネル）は、左パネル中に示される島内の黄色矢頭によって指される細胞集団および単細胞におけるＧＦＰおよびインスリンの各蛍光チャネルを図示する。      図１６Ｂ：Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスおよびＫｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。白色矢印は、ＧＦＰおよびインスリンに対して陽性である７つのβ細胞を示し、黄色矢頭は、ＧＦＰのみに対して陽性である２つの細胞を示す。四角１および２内に含まれる細胞は、ＧＦＰおよびインスリンにおける蛍光チャネルを別々に示す挿入図中により高い拡大率で図示される。挿入図１：１つのβ細胞がＧＦＰおよびインスリンに対して陽性である（白色破線）。挿入図２：一方のβ細胞がＧＦＰおよびインスリンに対して陽性である（白色破線）一方、もう一方はＧＦＰに対して陽性であるが、インスリンに対して陰性である（黄色破線）。
【図１６−２】図１６Ｃ：Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスおよびＫｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウス：島の末梢で、インスリン（赤色）およびＧＦＰ（緑色）に対して陽性である２つのβ細胞は、四角によって画定され、ＧＦＰ、インスリンおよびアミラーゼにおける蛍光チャネルが別々に図示される挿入図中により高い拡大率で示される。一方の細胞（最初３つの垂直挿入図）は、ＧＦＰに対して陽性であり、インスリンおよびアミラーゼに対して陰性である。もう一方（２番目の３つの垂直挿入図）は、ＧＦＰおよびインスリンに対して陽性であり、アミラーゼに対して陰性である。アミラーゼ（白色）によって標識され、ＧＦＰに対して陽性である幾つかの外分泌腺房細胞が領域内に存在する。
【図１７】ＧＦＰがＫｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウスの膵臓において発現される。ＧＦＰ（緑色）が、アミラーゼ（白色）によって標識された外分泌腺房細胞の原形質膜に局在化される。
【図１８−１】図１８Ａ：ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウス：膵細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。ＧＦＰ（緑色）に対して陽性である外分泌腺房細胞を有するマウス膵臓の切片（アミラーゼ、白色）。５つの島（インスリン、赤色）が存在し、図１８Ｂ中に詳細に示される。
【図１８−２】図１８Ｂ：ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウス：膵細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。上パネルでは、幾つかのＧＦＰ陽性細胞が島内に存在し、例示として２６が選択された。２６のＧＦＰ陽性細胞の内、２１が白色矢頭により、５つが黄色矢印により示される。これらの細胞は、中央および下パネルに示される挿入図中により高い拡大率で記述される。例示目的としては、緑色チャネルの強度は増加し；赤色チャネルの強度は変化しなかった。白色矢頭（上パネル）によって示される２１の細胞に対応する白色破線は、ＧＦＰ（中央パネル）およびインスリン（下パネル）に対して陽性であるβ細胞を画定する。黄色矢印（上パネル）によって示される５つの細胞に対応する黄色破線は、ＧＦＰ（中央パネル）に対して陽性であり、かつインスリン（下パネル）に対して陰性である細胞を画定する。
【図１９−１】図１９Ａ：ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。新しく単離された膵臓。上の３つのパネルは、天然ＧＦＰ蛍光（左、緑色）、天然ＤｓＲｅｄ蛍光（中央、赤色）およびそれらの組み合わせ（右、緑色および赤色）を記述する。下の３つのパネルは、天然ＧＦＰ蛍光を示さない（左）。天然ＤｓＲｅｄ蛍光のみが存在する（中央および右パネル）。      図１９Ｂ：ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。ドットプロットは、天然ＧＦＰによって標識された新しく単離された膵細胞の画分、および天然ＧＦＰによって標識された固定された膵細胞の画分を示す。データは、平均±標準偏差である。
【図１９−２】図１９Ｃ：ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。膵細胞が最初に天然ＧＦＰに対して、次にインスリン、Ｃペプチドおよびグルカゴンに対してゲーティングされたドットプロット。天然ＧＦＰを発現するインスリン、Ｃペプチドおよびグルカゴン陽性細胞の百分率は、平均±標準偏差として示される。左パネル：ゲーティング方法を設定するために用いられる陰性対照。      図１９Ｄ：ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウス：膵細胞はｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫である。細胞が最初にインスリン、Ｃペプチドおよびグルカゴンに対してゲーティングされたドットプロット、次に天然ＧＦＰを発現するインスリン陽性、Ｃペプチド陽性およびグルカゴン陽性細胞の百分率が平均±標準偏差として示される。左パネル：ゲーティング方法を設定するために用いられる陰性対照。
【図２０】図２０Ａ：Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウス。非タモキシフェン治療トランスジェニックマウスにおける腹部の白班。      図２０Ｂ：Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウス。同齢の対照野生型マウスにおける睾丸（上パネル）。タモキシフェン治療の不在下では、８月齢（左下パネル）および１８月齢（右下パネル）トランスジェニックマウスにおいて精巣萎縮が明白である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態は、幹細胞に典型的な特徴を有する膵組織内でのｃ−ｋｉｔ陽性細胞の集団の発見に基づく。幹細胞の基本的特性は、インビトロおよびインビボでの自己複製する（すなわち、より多くの幹細胞を作る）能力、クローン形成能および多分化能である。この発見に先立ち、幹細胞の３つすべての特徴を呈する、膵組織からの１つの細胞型の認識または単離はなされていない。
【００３７】
周知のように、幹細胞は、それらの特性のおかげで、身体のすべての細胞および組織を発生させる。したがって、幹細胞は、損傷および／または欠損膵臓を修復するかまたは修復を加速するために用いることができる。膵臓幹細胞（ＰＳＣ）が十分な量で入手できる場合、損傷および／または欠損膵臓を膵臓における新しい組織を構築することによって修復するため、ＰＳＣのこの量を用いることができる。欠損および／または損傷膵臓では、ＰＳＣがほとんど存在しないかまたは欠如し得る。ＰＳＣが自己複製することから、インプラントされるＰＳＣは、コロニー形成し、欠損および／または損傷膵臓において微小環境を形成し得る。インプラントされるＰＳＣはまた、クローン性および多能性でもあることから、分裂および分化し、すべての新しい膵細胞および組織を生成し得る。したがって、単離されたＰＳＣの集団または単離されたＰＳＣの集団を含む組成物は、被験者における膵疾患または障害の治療または予防のために用いることができる。
【００３８】
したがって、一実施形態では、本発明は、膵組織の試料からの、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを含有する単離細胞の集団を提供する。ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣのこの集団は、有意に濃縮および拡大され得る。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に提供されるのは、膵臓の損傷組織を修復および／または再生するための、治療有効量の単離および拡大された膵臓幹細胞および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、前記単離された膵臓幹細胞がｃ−ｋｉｔ陽性である、医薬組成物である。別の実施形態では、膵臓幹細胞は、成体（例えば、非胚性および／または非胎性）膵臓幹細胞である。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。一部の実施形態では、膵臓幹細胞は、膵組織から単離される。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、自己由来である。
【００４０】
一部の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある。一実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、外分泌細胞を含む。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、内分泌細胞を含む。さらなる実施形態では、内分泌細胞は、α細胞またはβ細胞である。さらに別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【００４１】
一実施形態では、該組成物は、約１０６個の単離された膵臓幹細胞を含む。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、インビトロで培養および拡大される。別の実施形態では、該組成物は、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子をさらに含む。さらなる実施形態では、該組成物は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦをさらに含む。
【００４２】
一実施形態では、組成物は、カテーテル媒介または直接注射用に製剤化される。
【００４３】
一実施形態では、本明細書に提供されるのは、被験者における膵疾患または障害の治療および／または予防のための薬剤の製造における使用を意図した組成物であり、該組成物は膵組織試料から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの濃縮された集団を含む。この組成物の別の実施形態では、該組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、膵臓から常在膵臓幹細胞を単離する方法であって、（ａ）培養下の前記膵臓からの組織検体を培養し、それにより組織外植片を形成することと；（ｂ）ｃ−ｋｉｔ陽性である細胞を培養外植片から選択することと、（ｃ）前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、を含み、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が常在膵臓幹細胞である、方法を提供する。
【００４５】
一実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、外分泌および／または内分泌細胞の１つ以上のマーカーを発現する。別の実施形態では、１つ以上のマーカーは、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼである。
【００４６】
膵臓から常在膵臓幹細胞を単離する方法の一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある。一実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、外分泌細胞を含む。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、内分泌細胞を含む。さらなる実施形態では、内分泌細胞は、α細胞またはβ細胞である。
【００４７】
一実施形態では、膵臓から常在膵臓幹細胞を単離する方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で拡大することをさらに含む。別の実施形態では、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、クローン原性、多能性および自己複製性である。別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露することをさらに含む。さらに別の実施形態では、該方法は、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養下で幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦに曝露することをさらに含む。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣに対して実質的に濃縮された単離細胞の集団を得る方法であって、被験者から得られた膵組織の検体を凍結保存することと；後日、凍結保存された検体を解凍することと；１つ以上のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を膵組織の検体から選択することと；選択されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培地で増殖させることと、を含む、方法を提供する。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣに対して実質的に濃縮された単離細胞の集団を増殖する方法であって、１つ以上のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を膵組織試料から選択することと；１つ以上のｃ−ｋｉｔ陽性である選択された細胞を培地に導入することと；選択されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培地で増殖することと、を含む、方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんなどの膵疾患または障害の修復、再生および／または治療における、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣに対して実質的に濃縮された単離細胞のこの集団の使用または単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの濃縮された集団を含む医薬組成物の使用に関する方法を提供する。理論によって拘束されることを望まないが、発明者は、膵組織内で同定されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、膵臓における特殊化した細胞、例えば、グルカゴン分泌α細胞、インスリン分泌β細胞、ソマトスタチン放出δ細胞、グレリン産生ε細胞、膵ポリペプチド分泌ＰＰ細胞、外分泌腺房細胞、外分泌腺房中心細胞、および／または外分泌導管細胞の供給源を示し得ると考える。それ故、一実施形態では、インビトロで拡大されている単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、冒された／損傷膵臓へ移植またはインプラントされ得る。次に、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、膵臓に定住し、増殖し、通常は膵臓に見出される様々なタイプの組織に分化し、外分泌および内分泌細胞を回復させ、かつ／または再構成する。目標は、冒された膵臓における疾患が原因で損傷した膵組織の少なくとも一部を置換することである。膵組織の置換は、冒された被験者における既存または残存する膵組織を、概してその被験者における膵疾患または障害を寛解、治療および／または予防するための適切な膵臓の消化および／または内分泌機能にとって十分な組織が存在するように補充するのに役立つ。
【００５１】
一実施形態では、ＰＳＣがインスリン産生β細胞に分化し、ひいてはマウスにおける糖尿病を寛解、治療および／または予防するか否かを確立するため、分化したｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）／非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの腹部脂肪体に移植され得る。
【００５２】
成体膵臓における真の多能性組織に特異的な成体幹細胞の存在および患者における膵疾患または障害を治療または予防するためのこれらＰＳＣの使用について実証する文献は存在しない。本発明の利点は、膵疾患または障害の治療または予防において用いられるＰＳＣが自家細胞であり得、治療または予防の成功率を大幅に高めることになる点である。患者の膵臓の一部は、例えば生検中に外科的に除去される。わずか１ｃｍ３で十分である。組織片は、採取された膵組織から単細胞を放出するように処理される。幹細胞マーカーｃ−ｋｉｔを幹細胞同一性の指標として用いて、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が選択される。次に、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣがインビトロで拡大され、治療または予防に要求される十分な数の細胞が得られる。十分な細胞が存在する場合、細胞は回収され、同じ患者またはＰＳＣのドナーに対して遺伝的に適合した患者に戻し注射される。各移行段階で、例えば選択と拡大の間または拡大とインプラントの間に、任意選択的にはＰＳＣは凍結保存され得る。一実施形態では、患者は、インビトロで選択され、拡大されている患者自身のＰＳＣを元に戻す。別の実施形態では、患者は、遺伝的に適合したドナーから得られるＰＳＣを得る。一部の実施形態では、この方法はまた、膵臓を有する任意の哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サルなどに拡張され得る。
【００５３】
したがって、本発明は、それを必要とする被験者における膵疾患または障害を治療または予防する方法であって、単離された膵臓幹細胞を被験者に投与することを含み、ここで膵臓幹細胞は膵組織検体から単離され、ｃ−ｋｉｔ陽性である、方法を提供する。一実施形態では、膵組織検体は、被験者から得られる。一実施形態では、膵臓幹細胞は、膵臓のβ細胞を生成する。別の実施形態では、膵臓幹細胞は、内分泌細胞および／または外分泌細胞に分化するその能力により特徴づけられる。さらなる実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、未分化であるか、またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【００５４】
一実施形態では、膵疾患または障害は、１型糖尿病である。別の実施形態では、膵疾患または障害は、２型糖尿病である。さらなる実施形態では、膵疾患または障害は、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんである。
【００５５】
一部の実施形態では、前記単離された膵臓幹細胞は、被験者への投与前、培養下で拡大される。一実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者への投与前、１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者への投与前、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、および／または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に曝露される。
【００５６】
一部の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者に、血管、膵管を通じて、または直接的に膵組織に投与される。別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、被験者に、注射により、またはカテーテルシステムにより、または肝臓における注射を通じて投与される。
【００５７】
一部の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、カプセル化デバイスで患者にインプラントされてもよい（例えば、米国特許第９，１３２，２２６号および米国特許第８，４２５，９２８号を参照、それら各々の内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。一実施形態では、患者は糖尿病を有し、カプセル化デバイスでインプラントされるＰＳＣは、患者においてインスリンを産生する。
【００５８】
一実施形態では、ここで提供されるのは、それを必要とする被験者における膵疾患または障害を治療および／または予防するための方法であって、本明細書に記載のｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を含む組成物を被験者に投与することを含む、方法である。
【００５９】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における膵疾患または障害を治療および／または予防するための方法であって、膵組織の試料を被験者から得ることと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を膵組織試料から抽出することと；選択されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣをインビトロで拡大し、かかるＰＳＣの数を増加させることと；被験者の膵臓における外分泌および／または内分泌細胞および組織を修復、再構成および／または再生するため、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの拡大された集団を被験者に投与することと、を含む、方法を提供する。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における膵疾患または障害を治療または予防するための方法であって、膵組織を第１の被験者から得ることと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を膵組織試料から抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を拡大することと；ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を第２の被験者に、ｃ−ｋｉｔ  ＰＳＣが膵臓に定住するように投与し、第２の被験者の膵臓における外分泌および／または内分泌細胞および組織を修復、再構成、および／または再生することと、を含む、方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法であって、膵臓幹細胞を膵臓から抽出することと；ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞である前記膵臓幹細胞を培養および拡大することと；前記抽出および拡大された膵臓幹細胞の１用量を被験者における損傷組織の領域に投与することと、を含み、それは膵臓の損傷組織を修復および／または再生するのに有効である、方法を提供する。
【００６２】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、外分泌および／または内分泌細胞の１つ以上のマーカーを発現する。別の実施形態では、１つ以上のマーカーは、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼである。
【００６３】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一部の実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、１つ以上の膵細胞型を生成する能力がある。一実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、外分泌細胞を含む。別の実施形態では、１つ以上の膵細胞型は、内分泌細胞を含む。さらなる実施形態では、内分泌細胞は、α細胞またはβ細胞である。
【００６４】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷組織への投与前、培養下の１つ以上のサイトカインおよび／または成長因子に曝露される。さらに別の実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷組織への投与前、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦに曝露される。
【００６５】
それを必要とする被験者における膵臓の損傷組織を修復および／または再生する方法の一実施形態では、抽出および拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、カテーテル媒介または直接注射により投与される。
【００６６】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、主に単離細胞の集団を形成するｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、自己複製能、クローン形成能および多分化能を有する。これは、単離された各ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、分裂し、より多くのｃ−ｋｉｔ陽性細胞を発生させ、培養下でコロニーを形成し得ることを意味する。特定条件下で刺激されるとき、各ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、コミットされるようになり（すなわち、分化するべき特定の細胞系統を選択し）、特定系統の細胞、例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞、腺房細胞、腺房中心細胞または導管細胞にさらに分化し得る。これらの細胞およびそれらの子孫は、特異化および分化の際、確定系統に特有の特定の細胞マーカーを発現することになる。さらに、委任細胞(committed cell)およびその子孫は、ｃ−ｋｉｔの発現を失うことになる。
【００６７】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、膵臓組織はヒトから得られる。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、ヒトは成人である。
【００６８】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、膵臓組織は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を選択する前に凍結保存される。
【００６９】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＮＳＣの選択は、ｃ−ｋｉｔに対する抗体を用いて実施される。
【００７０】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対する抗体は、モノクローナル抗体である。
【００７１】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体は、ヒトｃ−ｋｉｔの抗原エピトープに対するマウスモノクローナルＩｇＧである。
【００７２】
記載される方法のいずれかの一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対する抗体は、蛍光色素コンジュゲートされる。
【００７３】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔに対する抗体は、磁気粒子にコンジュゲートされる。
【００７４】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の選択は、フローサイトメトリーによる。
【００７５】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、該選択は、蛍光標識細胞分取または高勾配磁気選択による。
【００７６】
記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、単離された膵臓幹細胞は、未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【００７７】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、エクスビボでさらに拡大される。記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、インビトロでさらに拡大される。特定の態様では、目標は、インプラントされたＰＳＣの損傷膵臓の微小環境への十分な生着を保証するため、インプラントする上で十分に多量のｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを有することである。基本的に、膵臓の損傷部分を修復および／または置換するのに必要とされるあらゆる細胞を提供するため、損傷膵臓において成長および増殖するのに十分な細胞が存在する必要がある。
【００７８】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、拡大または増殖ステップ後に数が少なくとも倍増する。記載される方法のすべての態様の一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の増加または増殖時の数が、増殖段階の終了時に少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍またはそれ以上増加することが望ましい。培養液中の細胞の数は、当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばコールター計数器の使用により測定され得る。これらの方法は、当業者に周知である。
【００７９】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、選択されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、拡大前の貯蔵用に凍結保存される。
【００８０】
記載される方法のすべての態様の別の実施形態では、拡大されたＰＳＣは、貯蔵目的で凍結保存される。必要があるとき、凍結した細胞は、解凍され、次にそれを必要とする被験者への投与またはインプラントに用いられる。
【００８１】
記載される方法のすべての態様の一実施形態では、該方法は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を凍結保存することをさらに含む。
【００８２】
新たに膵疾患または障害と診断されている人においては、被験者の膵臓の生検試料が診断用に入手された場合、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は本明細書に記載される方法に従って調製され得、ＰＳＣは次に、疾患がその人が膵臓幹細胞治療を必要とするような進行期に進行していた事象では、将来的使用のために凍結保存され得る。
【００８３】
同様に、膵疾患または障害を発症するリスクがある人は、その人自身の膵組織からのｃ−ｋｉｔ  ＰＳＣの集団の早期調製およびＰＳＣの凍結保存から利益を得ることができる。例えば、糖尿病に対する遺伝的素因を有する人または糖尿病を有する直近親族を有する人であれば、利益を得ることになる。２型糖尿病を発症する生涯リスクは、糖尿病を有する人の第一度近親者（姉妹、兄弟、息子、娘）においては、糖尿病の家族歴を有しない人と比べて、５〜１０倍高い。膵疾患または障害を発症するリスクがある他の人々は、限定はされないが、嚢胞性線維症遺伝子を保有するかまたは嚢胞性線維症と診断された人；ならびに、膵炎、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんと診断された個体を含む。
【００８４】
治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、治療する(treating)および治療(treatment)は、それを必要とする被験者における損傷膵臓に対して「構造的および機能的完全性を回復させること」を含む。
【００８５】
記載される方法のすべての態様の他の実施形態では、治療することは、損傷を受けたまたは不適切なヒト膵臓を修復することを含む。別の実施形態では、治療する(treating)および治療(treatment)は、損傷膵臓における外分泌および／または内分泌細胞および組織の、修復、再構成および／または再生を含む。
【００８６】
その回復または修復は、健常者の膵臓の場合に対して１００％である必要はない。被験者における症状において改善が認められる限り、回復または修復は達成されている。熟練した医師であれば、治療の前および後に、また改善が認められるか否かの比較判定に基づき、症状の重症度を評価できるであろう。多くの場合、被験者は、症状において改善が認められるか否かについて述べることができる。幾らかの症状の例として、限定はされないが、頻尿、激しいのどの渇き、強い空腹感、霧視、体重減少、嗜眠、肺換気増大（糖尿病の場合）；腹痛、悪心、嘔吐（糖尿病、膵炎）が挙げられる。
【００８７】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、予防する(preventing)および予防(prevention)は、疾患、例えば、嚢胞性線維症、膵炎または糖尿病に起因する膵臓の機能的能力および完全性の低下を緩徐化することを含む。
【００８８】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、膵臓における外分泌および／または内分泌細胞および組織を修復、再構成、または生成する。
【００８９】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、膵疾患または障害を治療および／または予防する方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣに対して実質的に濃縮された細胞の集団の投与前、膵疾患または障害を患う被験者、例えば嚢胞性線維症、膵炎または糖尿病を患う被験者を選択することをさらに含む。
【００９０】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、膵疾患または障害を治療および／または予防する方法は、細胞を投与する前に、損傷膵臓の構造的および機能的完全性を回復させることを必要とする被験者、例えば、嚢胞性線維症、膵炎または糖尿病を患う被験者を選択することをさらに含む。
【００９１】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、膵疾患または障害を治療および／または予防する方法は、膵臓における外分泌および／または内分泌細胞および組織の治療、予防または修復または再構成または生成を必要とする被験者、例えば、嚢胞性線維症、膵炎または糖尿病を患う被験者を選択することをさらに含む。
【００９２】
例えば、選択された被験者は、特定の形態もしくはタイプの膵疾患もしくは障害に対して、伝統的治療に全く応答していないかまたはあまり応答していない者、および／または当該技術分野で現在公知のあらゆる治療オプションに疲れ果てている者である。
【００９３】
膵疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、投与は、注射により、カテーテルシステムにより、またはそれらを組み合わせて行われる。
【００９４】
膵疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、被験者への投与は、血管、膵管を通じて、直接的に組織に、またはそれらを組み合わせて行われる。
【００９５】
膵疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、被験者への投与は、カプセル化デバイスでの患者へのインプラントである。
【００９６】
膵疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、自家細胞である。
【００９７】
膵疾患または障害を治療または予防するための治療方法のすべての態様の一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、１つ以上のドナーから得られる同種細胞である。
【００９８】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、該方法は、少なくとも１つの治療薬を、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ、例えば、嚢胞性線維症、膵炎または糖尿病を治療するためのものとともに投与することをさらに含む。
【００９９】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、少なくとも１つの治療薬は、ＰＳＣの集団のホーミング、生着、または生存を増強する。
【０１００】
治療方法のすべての態様の一実施形態では、被験者は、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、被験者は成人である。一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、ｃ−ｋｉｔ陽性ヒトＰＳＣの集団である。
【０１０１】
膵発生
膵臓は、内胚葉に由来する内分泌区画および外分泌区画から構成される。内分泌区画は、島に組織化されたホルモン分泌細胞を有する一方で、外分泌区画は、腺房、導管および腺房中心細胞を有する。
【０１０２】
内分泌区画内には、５つの異なるホルモン分泌細胞型：グルカゴン分泌α細胞；インスリン分泌β細胞；ソマトスタチン放出δ細胞；グレリン産生ε細胞；および膵ポリペプチド分泌ＰＰ細胞が存在する。ホルモンは、栄養素代謝およびグルコース恒常性の調節に関与する。内分泌細胞は、凝集し、ランゲルハンス島を形成し、それは血管、ニューロン、および中胚葉由来の間質成分と混ざる。内分泌および血管細胞の密接な関係性により、ホルモン放出が調節され、身体における微調整されたグルコース恒常性が確立される。
【０１０３】
腺房細胞は、消化酵素を合成および分泌し、それらは管の複雑なネットワークを通って十二指腸に流れ込む炭酸水素塩リッチな体液中で濃縮される。終末管、または介在管は、平坦な扁平上皮様上皮によって裏打ちされる。腺房に干渉する終末管細胞は、腺房中心細胞と称される。介在管は、融合し、（立方状上皮により裏打ちされた）小葉内管を形成し、次いでこれらは融合し、小葉間導管を形成し、それらは最終的に融合し、（単層円柱上皮により裏打ちされた）主管を形成する。主管は、膵臓を横切って十二指腸に至り、消化性酵素を含んだ体液を送達する。
【０１０４】
膵臓の内分泌および外分泌区画は、共通の前駆細胞集団から出現する。膵発生は、初期段階中のヘッジホッグシグナル伝達、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、および間充織からの他の合図の相互作用を含む。さらに、膵発生にとって決定的である幾つかの転写因子が遺伝的試験から同定されており、ここでＰｄｘ１は、すべての膵臓系統の特異化にとって必要とされ；Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ（ＢＥＴＡ２としても公知）、Ｐａｘ４、Ｍａｆａ、Ｍａｆｂ、Ｎｋｘ６−１、Ｎｋｘ２−２、Ｎｅｕｒｏｄ、Ｍｎｘ１、Ｆｏｘａ１、Ｆｏｘａ２およびＡｒｘは、内分泌系統コミットメントに関連し；外分泌系統の特異化または分化は、プロエンドクリン転写因子の欠如と、Ｗｎｔシグナル伝達、ラミニン−１、および可溶性フォリスタチンを含む、隣接する膵臓間充織によって提供される許容シグナルの存在との双方により影響される。腺房細胞に関連する転写因子として、限定はされないが、Ｐｔｆ１ａ、Ｇａｔａ４、Ｍｉｓｔ１およびＮｒ５ａ２が挙げられる。導管細胞に関連する転写因子として、限定はされないが、Ｈｎｆ６、Ｈｎｆ１ｂ、Ｓｏｘ９およびＦｏｘａ２が挙げられる。さらに、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７、ＴＧＦ−β１、アクチビンおよびＥＧＦＲのレベルは、内分泌および外分泌分化の間の平衡を判定する際に重要である。
【０１０５】
腺房細胞の発生中の分化は、ｂＨＬＨ（塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス）転写因子Ｐｔｆ１ａ（ｐ４８としても公知）により調節されるように見える。Ｐｔｆ１ａの発現は、多能性前駆細胞における膵発生中に早期に検出されるが、分化し、成熟した腺房細胞に制限されるようになる。内分泌区画が一部の下等脊椎動物に存在する場合、マウスにおけるＰｔｆ１ａのノックアウトは、外分泌膵臓の不在および島細胞の脾臓への移動をもたらす。Ｍｉｓｔ１は、およそ二次移行期に重要になる別のｂＨＬＨ転写因子であり、Ｍｉｓｔ１が欠乏したマウスは、腺房細胞機構の欠陥を呈する。
【０１０６】
膵臓幹細胞（ＰＳＣ）
幹細胞は、有糸分裂細胞分裂を通じてそれ自身の種類を複製する能力を保持する細胞であり、その娘細胞は多様な範囲の特殊化した細胞型に分化し得る。その２つの広範な哺乳動物幹細胞型は、胚盤胞内で見出される胚性幹（ＥＳ）細胞、および成体組織内で見出される成体幹細胞である。発生する胚では、ＥＳは特殊化した胚性組織のすべてに分化し得る。成体臓器では、成体幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充するだけでなく、再生臓器、例えば血液、皮膚または腸管組織の正常な代謝回転を維持する、身体における修復系として作用する。多能性幹細胞（pluripotent stem cell）は、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化し得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、用語「幹細胞」は、本明細書で用いられるとき、増殖し、多数の母細胞を生成し、次いで分化した、または前駆細胞として公知の分化可能な娘細胞を生成することができる能力を有するより多くの前駆細胞を生成する能力がある未分化細胞を指す。娘細胞自身は、親発生能を有する１つ以上の細胞を保持しつつも、増殖し、後に１つ以上の成熟細胞型に分化する子孫を生成するように誘導され得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、用語「幹細胞」はまた、特定の環境下で、より特殊化したまたは分化した表現型に分化する能力または可能性を有する前駆体のサブセットを指し、特定の環境下で、実質的に分化することなく増殖する能力も保持する。
【０１０９】
本明細書に記載のＰＳＣは、ＥＳとは対照的に、体性幹細胞である。好ましい実施形態では、記載されるＰＳＣは、成体幹細胞である。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書で用いられるとき、用語「ｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞」または「ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ」は、幹細胞、前駆細胞(progenitor cells)および前駆細胞(precursor cells)を包含し、それらすべてがｃ−ｋｉｔ陽性である。
【０１１１】
一実施形態では、本明細書で用いられるとき、用語「ｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞」または「ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ」は、インスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼを最小レベルで発現するｃ−ｋｉｔ陽性細胞を包含する。
【０１１２】
細胞分化は、典型的には多くの細胞分裂を通じて生じる複雑なプロセスである。分化細胞は、自らが多能性細胞などに由来する多能性細胞に由来してもよい。これらの多能性細胞の各々を幹細胞とみなしてよい一方で、各多能性細胞が生成し得る細胞型の範囲は大幅に変動してもよい。一部の分化細胞は、発生能がより大きい細胞を生成する能力も有する。かかる能力は、天然であってもよく、または様々な要素による治療時、人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的事例では、幹細胞は、２つ以上の異なる細胞型の子孫を生成し得ることから「多能性」であり、この文書内で用いられるとき、それは必要とされる。自己複製は、他の古典的な幹細胞定義の一部であり、この文書内で用いられるとき、それは必須である。理論上は、自己複製は、２つの主な機構のいずれかにより生じ得る。幹細胞は非対称的に分裂することがあり、一方の娘は幹細胞状態(stem state)を保持し、他方の娘は幾つかの異なる他の特定の機能および表現型を発現する。あるいは、集団内の幹細胞の一部が対称的に２つの幹細胞に分裂し、それにより集団内での幾つかの幹細胞を全体として維持し得る一方で、集団内のその他の細胞は、分化した子孫のみを生成する。
【０１１３】
一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞に対して実質的に濃縮される単離細胞の集団は、主にＰＳＣを含む。したがって、一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞に対して実質的に濃縮される単離細胞の集団は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団と称される。それは、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団が幾つかのｃ−ｋｉｔ陽性前駆細胞(progenitor cells)および／またはｃ−ｋｉｔ前駆細胞(precursor cells)を含み得ることを意味する。
【０１１４】
本明細書で用いられるとき、一部の実施形態では、用語「単離され、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団」または「単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団」は、ＰＳＣおよび／または膵臓前駆細胞(progenitor cells)および／または膵臓前駆細胞(precursor cells)の異質または均一集団を包含する。ＰＳＣは、多能性であり、多系統の細胞型を生成する。それに対し、膵臓前駆細胞(progenitor cells)および膵臓前駆細胞(precursor cells)は、系統決定細胞である。例えば、膵臓前駆細胞(progenitor cells)がβ細胞系統について決定的である、すなわち将来的にβ細胞を生成する場合、この膵臓前駆細胞(progenitor cell)は、外分泌膵臓の細胞である腺房細胞を転換および生成することはない。一部の実施形態では、膵臓前駆細胞(progenitor cells)および膵臓前駆細胞(precursor cells)は、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞、腺房細胞、腺房中心細胞または導管細胞について決定的である。
【０１１５】
少なくとも２つの異なる細胞型を含む単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、本明細書中で「異質集団」と称される。膵臓幹細胞または膵臓前駆細胞が移植前にエクスビボで単離および拡大されることもまた、本明細書中で検討される。１つの細胞型のみ（例えばβ細胞）を含む単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、本明細書中で「細胞の均一集団」と称される。
【０１１６】
例の中で、ヒト膵組織内のこの細胞集団は、サイトカイン幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合するサイトカイン受容体である、ＫＩＴまたはＣＤ１１７とも称されるｃ−ｋｉｔを発現する。ＳＣＦは、細胞にシグナル伝達し、分裂および増殖させる。一般に、ｃ−ｋｉｔは、幹細胞ならびに有糸分裂による幹細胞からの子孫である前駆(progenitor)および前駆(precursor)細胞型の表面上で発現する。したがって、ｃ−ｋｉｔは幹細胞マーカーである。ヒト膵組織内のｃ−ｋｉｔに対する免疫染色により、発明者は、かかるｃ−ｋｉｔ陽性細胞を見出した（図２Ａ〜２Ｆ、図３Ａ〜３Ｃ）。この発見に先立ち、成体膵臓における幹細胞の存在の証拠は報告されていない。これらのｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、主に未分化であり、かつ／またはインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／もしくはアミラーゼを最小レベルで発現する。
【０１１７】
発明者は、これらのｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣがクローン原性特性を有することを示した。これらの細胞が単離され、非常に低い細胞密度で蒔かれるとき、すなわちインビトロで単細胞として蒔かれるとき、多細胞クローンがこれらの単細胞から生じたことから（図５）、幹細胞のクローン原性特性が実証された。
【０１１８】
さらに、最初に単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣから生じる多細胞クローンは、コロニーの娘細胞の細胞運命の観点で多能性である。発明者は、分化培地に曝露されたクローンｃ−ｋｉｔ陽性細胞が内分泌および外分泌系統のマーカーを得ることを示した（図６Ａ〜６Ｃ）。
【０１１９】
最終的に、これらのｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、自己複製し得る。発明者は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣが非対称的に分裂し、娘幹細胞および娘委任細胞(daughter committed cell)を生成することを示した。加えて、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、対称的に分裂し得る。分裂様式は、細胞運命決定因子αアダプチンの非均一または均一分布に基づいて規定された（図４）。
【０１２０】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、長期および短期複製能を有する細胞、ならびにコミットされた多能性、少能性、および単能性前駆細胞を有する。
【０１２１】
したがって、本明細書で用いられるとき、用語「ＰＳＣ」は、多系統膵分化能および持続的な自己複製活性を有する細胞を指す。「自己複製」は、ある細胞の、分裂し、親細胞と同一の（例えば自己複製する）特徴を有する少なくとも１個の娘細胞を生成する能力を指す。第２の娘細胞は、特定の分化経路にコミットし得る。例えば、自己複製性ＰＳＣは、分裂し、１つの娘幹細胞と膵臓の外分泌および／または内分泌細胞への分化にコミットされた別の娘細胞とを形成する。コミットされた前駆細胞は、典型的には自己複製能を失っており、細胞分裂時、より分化した（すなわち制限された）表現型を呈する２つの娘細胞を生成する。
【０１２２】
したがって、「ＰＣＳ」は、本明細書に記載の方法で用いられるとき、限定はされないが、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞、腺房細胞、腺房中心細胞、または導管細胞を含む、膵臓の幾つかの細胞型に分化する能力があるあらゆる多能性細胞を包含する。
【０１２３】
「膵臓前駆細胞」は、該用語が本明細書で用いられるとき、特定の膵細胞系統にコミットされ、一般に自己複製しないＰＳＣのサブセットを指し、例えば細胞表面マーカーまたは細胞内タンパク質により同定され得る。例えば、β細胞系統へのコミットメントを示すインスリンもしくはＣペプチド；またはα細胞系統へのコミットメントを示すグルカゴンが挙げられる。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＰＳＣは、これらの追加的な細胞表面マーカーの１つ以上を用いるために選択される。
【０１２４】
ＰＳＣの存在は、当該技術分野で公知の任意の方法により、または表現型的には当業者に公知のアッセイまたは実施例に記載されるものを用いての細胞表面マーカーの検出を通じて判定され得る。
【０１２５】
ＰＳＣの単離
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＰＳＣは、以下の供給源：新たに死亡した被験者、生存被験者からの組織生検、または膵臓幹細胞株の膵組織試料から得られるかまたは単離される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＰＳＣは、他の細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または成体多能性細胞からエクスビボで得られる。
【０１２６】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、ＰＳＣは、当業者に公知の任意の方法を用いて、または本明細書に記載の方法に従い、例えば生存被験者からの少量の膵組織試料に対する微小針吸引により単離され得る。
【０１２７】
ＰＳＣは、当該技術分野で公知の任意の方法により、膵組織試料から単離され得る。組織試料から各細胞を解離させる方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許７，５４７，６７４号、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２３９９８３号、米国特許出願公開第２００９／０１４８４２１号、および米国特許出願公開第２００９／０１８０９９８号が挙げられる。これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２８】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、単離されるＰＳＣの集団は、以下の方法により単離される。当業者であれば、異なる供給源からの膵臓組織について必要とされる方法に対して微調節を行うことができるであろう。膵臓組織の小片（最小サイズが少なくとも１ｃｍ３）がコラゲナーゼを用いて酵素的に消化され、単一細胞が得られる。少量の無傷細胞が再懸濁され、細胞の凝集体がセルストレーナーを用いて除去される。このセルストレーナーステップは、任意選択的である。次に、細胞がマウスｃ−ｋｉｔ抗体とともにインキュベートされる。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、抗マウスＩｇＧでコーティングされた免疫磁気ビーズを用いて単離および収集される。
【０１２９】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、得られる単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、以下の方法により培養される。当業者であれば、必要に応じた方法に対して微調節を行うことができるであろう。その培養方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを増殖し、その数を拡大するため、用いられる。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、５〜１０％ＦＢＳ(GIBCO)およびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物(SIGMA, St.Louis, MO)を添加したF12培地を含有する改変F12Ｋ培地(GIBCO, Grand Island, NY)に標準組織培養条件下で蒔かれる。コンフルエントに達してから、細胞は幾つかの他のプレートに継代され、細胞を取り扱う標準組織培養プロトコルを用いて培養が拡大される。
【０１３０】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、本明細書に記載の膵臓組織からのＰＳＣは、本明細書に記載の方法における使用前、当業者にとって許容可能な任意の方法を用いてエクスビボで拡大される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、さらに選別され、分画され、処理されて、任意の望まれない細胞が除去されるか、またはその他として、患者を治療するため、移植用細胞を調製する、当業者にとって許容可能な任意の方法を用いて操作される。望まれない細胞の例が悪性細胞である。
【０１３１】
典型的には、膵組織の試料中に非常に少数のＰＳＣが存在し、例えば、約４０，０００個の細胞あたり、わずか１個かまたは２個のｃ−ｋｉｔ陽性細胞が存在し得る。したがって、選択されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの拡大には、本明細書に記載の治療的使用にとって必要とされる細胞の数を増加させることが必要であることが多い。本明細書に記載の治療的使用において移植されるＰＳＣの数が増加すると、そこで用いられる治療の成功率が増加する。ＰＳＣは、被験者の膵臓での損傷組織および細胞の一部を修復、再構成および生成するために用いられる。したがって、移植されるＰＳＣの増加は、新しい膵細胞および膵組織を修復、再構成および生成するのに利用可能な細胞の増加を意味する。一部の実施形態では、移植治療の成功、例えば当該技術分野に精通した医師に理解される被験者の血糖レベルおよび一般健康状態における改善は、当該技術分野で公知の任意の方法および本明細書に記載の方法により測定され得る。
【０１３２】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＰＳＣを含む膵組織試料は、被験者から単離され、次に例えば細胞選別（例えばＦＡＣＳ）によりさらに処理され、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団が得られる。記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、拡大されたＰＳＣのインビトロまたはエクスビボ培養物を指す。
【０１３３】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、様々な供給源からの膵組織試料は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの抽出または選択前の凍結試料、例えば凍結物または凍結保存物である。膵組織試料は、被験者または本明細書に記載の他の供給源から得られ、次に凍結保護物質とともに凍結保存される。記載される組成物および方法のすべての態様の別の実施形態では、膵組織試料から単離されたｃ−ｋｉｔ  ＰＳＣの集団は、使用前に凍結保護物質とともに凍結保存される。記載される組成物および方法のすべての態様のさらに別の実施形態では、インビトロ培養下で拡大されている単離されたｃ−ｋｉｔ  ＰＳＣの集団は、使用前に凍結保護物質とともに凍結保存される。凍結保護物質を加えての組織および細胞の凍結保存方法は、当該技術分野で周知である。さらに、使用のために凍結保存された組織または細胞を解凍するための方法もまた、当該技術分野で周知である。
【０１３４】
用語「単離する」および「入手または調製する方法」は、本明細書で用いられるとき、細胞または細胞の集団、例えばＰＳＣの集団が最初に見出された被験者または膵組織試料から除去される過程を指す。用語「単離された集団」は、本明細書で用いられるとき、生体試料、またはかかる試料中に見出される細胞の混合もしくは異質集団から除去および分離されている細胞の集団を指す。かかる混合集団は、例えば膵組織試料から得られるＰＳＣの集団を含む。一部の実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮される元の異質集団と比べて実質的に純粋な細胞集団である。一部の実施形態では、単離された集団は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団である。この態様および本明細書に記載のすべての態様の他の実施形態では、単離された集団は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの実質的に濃縮された集団を含む。一部の実施形態では、単離された細胞または細胞集団、例えばｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、インビトロまたはエクスビボで、例えば成長因子またはサイトカインの存在下でさらに培養され、単離された細胞集団または実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ細胞集団における細胞の数をさらに拡大する。一実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、インビトロまたはエクスビボでＳＣＦ、ＩＧＦ−１および／またはＨＧＦとともにさらに培養される。かかる培養は、当業者に公知の任意の方法を用いて実施され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法により得られた、単離または実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ集団は、後に第２の被験者に投与されるか、または細胞集団が最初に単離された被験者に再導入される（例えば、同種移植対自家投与）。
【０１３５】
特定の細胞集団に関する用語「実質的に濃縮される」は、全細胞集団を構成する細胞に対して、少なくとも約５０％、７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％純粋である細胞の集団を指す。換言すれば、本明細書に開示される方法にて用いるために単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団に関する用語「実質的に濃縮される」または「本質的に精製される」は、本明細書中の用語により定義される通り、ＰＳＣでない細胞の約３０％未満、２５％、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または１％未満を含有するｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を指す。これら態様の一部の実施形態は、実質的に純粋なまたは濃縮されたＰＳＣの集団を拡大するための方法をさらに包含し、ここでｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの拡大された集団は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの実質的に純粋なまたは濃縮された集団でもある。
【０１３６】
細胞集団内での特定マーカーの存在に関する用語「実質的に陰性な」は、全細胞集団を構成する細胞に関して、そのマーカーについて最高で約１０％まで、最高で約８％まで、最高で約６％まで、最高で約４％まで、最高で約２％まで、最高で約１％まで陽性である細胞の集団を指す。
【０１３７】
用語「濃縮する」または「濃縮された」は、本明細書で交換可能に用いられ、１つのタイプの細胞、例えば本明細書に記載の方法にて用いるためのＰＳＣの収量（画分）が、出発生体試料、培養液、または製剤の中のそのタイプの細胞の画分よりも、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％増加することを意味する。本明細書に記載の方法にて用いる場合に得られるＣ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、最も好ましくは、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣに対して少なくとも５０％濃縮される。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＰＳＣに特異的なマーカーは、これらの細胞に対して単離または濃縮するため、用いられる。「マーカー」は、本明細書で用いられるとき、細胞の特徴および／または表現型を表す。マーカーは、意図する特徴を含む細胞の選択のために用いることができる。マーカーは、特定細胞に応じて変化するであろう。マーカーは、特徴、すなわち特定の細胞型またはその細胞型によって発現される分子の形態学的、機能的、または生化学的（酵素的）特徴である。好ましくは、かかるマーカーはタンパク質であり、またより好ましくは当該技術分野において利用可能な抗体に対するエピトープまたは他の結合分子を有する。しかし、マーカーは、限定はされないが、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸およびステロイドを含む、細胞内で見出される任意の分子からなってもよい。形態学的特徴または形質の例として、限定はされないが、形状、大きさ、外観（例えば、滑らか、半透明）、および核対細胞質比が挙げられる。機能的特徴または形質の例として、限定はされないが、特定の基質に対する接着能、特定色素の取り込み能または排除能、特定条件下での遊走能、および特定の系列に沿った分化能が挙げられる。マーカーは、当業者にとって利用可能な任意の方法によって検出されてもよい。
【０１３９】
したがって、本明細書で用いられるとき、「細胞表面マーカー」は、細胞の表面上に発現される任意の分子を指す。細胞表面での発現には、通常、分子が膜貫通ドメインを有することが必要である。通常、細胞表面上で見出されない一部の分子は、組換え技術により細胞の表面上に発現されるように改変され得る。多数の天然起源の細胞表面マーカーが、「ＣＤ」または「表面抗原分類」分子と称される。細胞表面マーカーは、抗体が結合し得る対象の抗原決定基を提供することが多い。本明細書に記載の方法に特に関連する細胞表面マーカーは、ＣＤ１１７またはｃ−ｋｉｔである。該組成物および方法に準じる有用なＰＳＣは、好ましくはｃ−ｋｉｔを発現する、または換言すればｃ−ｋｉｔ陽性である。
【０１４０】
細胞は、任意の細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して「陽性」または「陰性」と指定され得、かかる指定の双方は、本明細書に記載の方法を実施する上で有用である。ある細胞が、その細胞表面上または細胞内で、当業者に公知の方法を用いて、例えば細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合されるか否かを判定するため、かかる接触された細胞のフローサイトメトリー分析を実行することで、検出されるのに十分な量でマーカーを発現する場合、細胞は細胞表面マーカーに対して「陽性」とみなされる。ある細胞が、本明細書に記載の方法について陽性とみなされるように、細胞表面マーカーとしてメッセンジャーＲＮＡを発現し得る一方で、該細胞がその表面上でマーカーを発現する必要があることは理解されるべきである。同様に、ある細胞が、当業者に公知の方法を用いて、例えば細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合されるか否かを判定するため、かかる接触された細胞のフローサイトメトリー分析を実行することで、検出されるのに十分な量でマーカーを発現しない場合、細胞は細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して「陰性」とみなされる。
【０１４１】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは陰性選択され、その選択では細胞表面マーカーに特異的な作用剤が用いられる。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、外分泌細胞系統または内分泌細胞系統などの系統に特異的なマーカーである。
【０１４２】
陰性選択との関連で、記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、系統マーカーに特異的な作用剤が用いられる場合、すべての薬剤は、同じ標識またはタグ、例えば蛍光タグを含み得、ひいてはその標識またはタグに対して陽性のすべての細胞が排除または除去され、本明細書に記載の方法にて用いられる、系統マーカー陰性のＰＳＣ、膵臓前駆細胞(progenitor cells)および／または膵臓前駆細胞(precursor cells)が残存し得る。これは、系統マーカーに特異的な作用剤と接触しなかった細胞について選択する、陰性選択である。
【０１４３】
したがって、本明細書で定義されるとき、「細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに特異的な作用剤」は、その細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して選択的に反応または結合可能な作用剤を指し、別の細胞表面マーカー、他の細胞内マーカーまたは抗原に対してほとんど検出不能な反応性を有する。例えば、ｃ−ｋｉｔに特異的な作用剤は、ＣＤ４９ｅに対して同定または結合することがない。したがって、細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに特異的な作用剤は、マーカーの固有の構造的特徴を認識する。一部の実施形態では、マーカーに特異的な作用剤は、マーカーに結合しても、そのマーカーによって媒介される下流シグナル伝達事象の開始を引き起こさない、例えば非活性化抗体である。細胞表面分子に特異的な作用剤は、限定はされないが、抗体またはその抗原結合断片、天然または組換えリガンド、小分子、核酸配列および核酸類似体、細胞内抗体、アプタマー、ならびに他のタンパク質またはペプチドを含む。
【０１４４】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＰＳＣを単離するために用いられる細胞表面マーカーに特異的な好ましい薬剤は、細胞表面マーカーに特異的に結合し、かつポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらの抗原結合誘導体または断片を含み得る抗体薬である。周知の抗原結合断片として、例えば、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ；本質的に単一のＶＬまたはＶＨ抗体ドメインからなる）、Ｆｖ断片、例えば、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。かかる抗体分子を構成するための方法は、当該技術分野で周知である。したがって、本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、またはＦｃ（結晶化可能断片）領域もしくはＦｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合断片を指す。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製されてもよい。「抗原結合断片」は、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、およびポリペプチドに特異的な抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを含む。Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖという用語は、例えば、Klein, “Immunology”(John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W. R. (1986); in “The Experimental Foundations of Modern Immunology” (Wiley & Sons, Inc., New York);およびRoitt, I. (1991) “Essential Immunology”, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)における当業者に公知の標準の免疫学的な意味で用いられる。かかる抗体または抗原結合断片は、R&D Systems, BD Biosciences, e-BiosciencesおよびMiltenyiなどのベンダーから市販されており、または当業者に公知の方法により、これらの細胞表面マーカーまたは他の細胞内マーカーに対して産生され得る。
【０１４５】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、細胞表面分子または他の細胞内マーカーに特異的な作用剤、例えば抗体または抗原結合断片は、膵臓幹細胞の単離を容易にするため、タグで標識される。用語「標識」または「タグ」は、本明細書で用いられるとき、標的の存在、例えば生体試料中での特定の細胞表面マーカーの存在を示す検出可能なシグナルを生成する能力がある組成物を指す。好適な標識は、蛍光分子、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、化学発光部分、磁気粒子、生物発光部分などを含む。それ故、標識は、ＰＳＣ、膵臓前駆細胞(progenitor cell)および膵臓前駆細胞(precursor cells)について単離および濃縮するための方法において必要とされる分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【０１４６】
用語「標識抗体」または「タグ化抗体」は、本明細書で用いられるとき、検出可能な手段により標識され、かつ限定はされないが、蛍光的、酵素的、放射活性的、および化学発光的に標識される抗体を含む、抗体を含む。抗体はまた、検出可能なタグ、例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、またはＨＩＳで標識され得、それらは、タグに特異的な抗体、例えば抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いて検出され得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該技術分野で公知であり、用いられてもよい。発明の方法において用いられる抗体を標識するための蛍光標識またはタグの非限定例として、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、スクシンイミジルエステル、メトキシクマリン、Cascade Blue、ヒドラジド、Pacific Blue、マレイミド、Pacific Orange、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、Ｒ−フィコエリトリン(PE)、PE-Cy5コンジュゲート(Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red)、PE-Cy7コンジュゲート、Red 613、PE-Texas Red, PerCP、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed (PerCP-Cy5.5コンジュゲート)、FluorX、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-Rhodamine (XRITC)、リサミンローダミンＢ、Texas Red、アロフィコシアニン(APC)、APC-Cy7コンジュゲート、ALEXA FLUOR（登録商標）350、ALEXA FLUOR（登録商標）405、ALEXA FLUOR（登録商標）430、ALEXA FLUOR（登録商標）488、ALEXA FLUOR（登録商標）500、ALEXA FLUOR（登録商標）514、ALEXA FLUOR（登録商標）532、ALEXA FLUOR（登録商標）546、ALEXA FLUOR（登録商標）555、ALEXA FLUOR（登録商標）568、ALEXA FLUOR（登録商標）594、ALEXA FLUOR（登録商標）610、ALEXA FLUOR（登録商標）633、ALEXA FLUOR（登録商標）647、ALEXA FLUOR（登録商標）660、ALEXA FLUOR（登録商標）680、ALEXA FLUOR（登録商標）700、ALEXA FLUOR（登録商標）750、ALEXA FLUOR（登録商標）790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5またはCy7が挙げられる。
【０１４７】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、実質的に純粋なまたは濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団を単離するための種々の方法、例えば、免疫選択技術、例えばフローサイトメトリー法を用いるハイスループット細胞選別、磁気ビーズ、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズに対して標識された抗体、およびディッシュを含む表面にパニングされた抗体を用いる親和性法、ならびにかかる方法の組み合わせが当業者に利用可能である。
【０１４８】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ＰＳＣの集団に対する単離および濃縮は、磁気ビーズなどのビーズに基づく選別機構を用いて実施され得る。かかる方法では、消化された膵臓組織試料は、１つ以上の特異的な細胞表面抗原、例えばｃ−ｋｉｔに対する抗体でコーティングされた磁気ビーズと接触される。これが原因で、各抗原を発現する試料中の細胞が磁気ビーズに付着する。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞がビーズに結合できるだけの時間経過後、細胞およびビーズの混合物は、強力な磁場、例えば磁石を有するカラムまたはラックに曝露される。（細胞表面マーカーを発現する）ビーズに付着された細胞がカラムまたは試料チューブ上に留まる一方で、（細胞表面マーカーを発現しない）他の細胞はフロースルーまたは溶液中に残存する。この方法を用いて、細胞は、特定の細胞表面マーカーに対して陽性または陰性にまたはその組み合わせを用いて分離され得る。
【０１４９】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）方法が、ＰＳＣの単離および予備選択に用いられる。一部の実施形態では、ＰＳＣは、ヒト血漿またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、例えば２％ＨＳＡの存在下で単離される。
【０１５０】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の好ましい実施形態では、ＰＳＣは、細胞表面マーカーｃ−ｋｉｔに対する陽性選択を用いて単離または濃縮される。
【０１５１】
本明細書で定義されるとき、「陽性選択」は、特定の細胞表面マーカーまたは細胞内タンパク質を発現する細胞の単離または濃縮をもたらす技術を指す一方で、「陰性選択」は、特定の細胞表面マーカーまたは細胞内タンパク質を発現しない細胞の単離または濃縮をもたらす技術を指す。陰性選択は、当該技術分野で公知の任意の方法により実施され得る。例えば、典型的な陰性選択は、目的のマーカーを確実に発現する細胞を除去することにより実施される。
【０１５２】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、当該技術分野で公知の標準的技術、例えば市販のビーズコンジュゲーションキットを用いて、当業者により、ビーズが抗体でコーティングされ得る。一部の実施形態では、陰性選択ステップが、１つ以上の系統マーカーを発現する細胞を除去するために実施され、その後、１つ以上の特定の細胞表面マーカーを発現するＰＳＣを陽性選択するために蛍光標識細胞分取が行われる。
【０１５３】
幾つかの異なる細胞表面マーカーは、特定の分化細胞系統上での特異的発現を有し、本明細書に記載の方法において単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣによって発現されない。したがって、それら系統細胞マーカーに特異的な作用剤がｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣと接触されるとき、その細胞は「陰性」となる。
【０１５４】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、フローサイトメトリー法は、単独でまたは磁気ビーズに基づく方法と組み合わせて、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣについて単離または濃縮するため、用いられる。本明細書で定義されるとき、「フローサイトメトリー」は、顕微粒子、例えば細胞およびＤＮＡを、流れる液体に懸濁し、電子検出装置を通過させることによって計数および検査するための技術を指す。フローサイトメトリーは、１秒あたり最大数千個の粒子の、蛍光パラメータなど、物理的および／または化学的パラメータの同時多パラメータ分析を可能にする。現代のフローサイトメトリー装置は通常、複数のレーザーおよび蛍光検出器を有する。レーザーおよび検出器の数の増加は、複数の抗体による標識を可能にし、標的集団をそれらの表現型マーカーによって、より正確に同定することができる。特定のフローサイトメトリー装置は、各細胞のデジタル画像を撮ることができ、細胞内または細胞表面上での蛍光シグナル位置の分析を可能にする。
【０１５５】
フローサイトメトリー技術に共通のバリエーションは、「蛍光標識細胞分取」を用いて、粒子をその特性に基づいて物理的に選別し、目的の集団を精製することである。本明細書で定義されるとき、「蛍光標識細胞分取」または「フローサイトメトリーに基づく選別」方法は、単一生体試料からの細胞の異質混合物を１つ以上の容器中に一度に細胞１個を各細胞に特異的な光散乱および蛍光特性に基づいて選別するためのフローサイトメトリー法を指し、各細胞からの蛍光シグナルの迅速、客観的かつ定量的な記録とともに、特に興味深い細胞の物理的分離をもたらす。したがって、細胞表面マーカーに特異的な作用剤がフローサイトメーターによって検出可能なタグで標識された抗体である場合の実施形態では、本明細書に記載の方法の中やそれと併せて、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、ＰＳＣの集団に対して単離および濃縮することができる。
【０１５６】
ＰＳＣの拡大
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、単離され、実質的に濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、本明細書に記載の治療方法におけるその使用前、数が増加するようにさらに拡大される。
【０１５７】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および技術を用いることにより単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、培養下で拡大される、すなわちその細胞数は、必要とする被験者への投与前、当業者に公知の方法を用いて被験者の身体外部で増加される。
【０１５８】
記載される組成物および方法のすべての態様の一実施形態では、得られる単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、以下の方法に従い、培養下で拡大される。当業者であれば、必要に応じて、該方法に対してマイナーな調節を行うことができるであろう。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、標準組織培養条件下、例えば、９５％空気、５％ＣＯ２、３７℃で、５〜１０％ＦＢＳ(Gibco)およびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物(SIGMA, St. Louis, MO)が添加されたF12培地を含有する修飾F12Ｋ培地(GIBCO, Grand Island, NY)に蒔かれる。コンフルエントに到達後、１つのコンフルエントプレートからの細胞が、幾つかの他のプレートに継代され、細胞を扱う標準組織培養プロトコルを用いて培養が拡大される。
【０１５９】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、かかる拡大方法は、例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを、サイトカインおよび／または成長因子が添加された無血清培地中で、ＰＳＣ、例えば、例えば幹細胞因子、ＩＧＦ−１、および／またはＨＧＦの拡大を引き起こす条件下で培養することを含み得る。ＨＧＦは、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の発現および活性化を通じて細胞遊走に正の影響を与える。この酵素ファミリーは、細胞外マトリックスにおけるバリアーを破壊し、それにより幹細胞移動、ホーミングおよび組織回復を促進する。同様に、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、分裂促進的で抗アポトーシス的であり、神経幹細胞増殖および分化にとって必要である。同等な様式で、ＩＧＦ−１は、それらの数を増加させ、それらの生存度を保護することにより幹細胞に影響する。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、例えばデキサメタゾンおよび／または成長因子とサイトカインとの組み合わせが添加された無血清培地を用いて、ＰＳＣの外分泌および／または内分泌細胞への分化を誘導することを意図した因子とともにかつ／または条件下でさらに培養され得る。
【０１６０】
記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、Lu J et al., “A Novel Technology for Hematopoietic Stem Cell Expansion using Combination of Nanofiber and Growth Factors.” Recent Pat Nanotechnol. 2010 4(2):125-35にレビューされるようなナノテクノロジーまたはナノエンジニアリングの方法を最高で約０．５％まで適応させることにより、拡大される。例えば、一部の実施形態では、幹細胞微小環境のナノエンジニアリングが実施され得る。本明細書で用いられるとき、分泌される因子、幹細胞−隣接細胞相互作用、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および機械的特性により、集合的に「幹細胞微小環境」が形成される。幹細胞微小環境ナノエンジニアリングは、マイクロ／ナノパターン化表面、ナノ粒子による放出成長因子および生化学物質の制御、ナノファイバーによる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の模倣、整列される生体材料のナノリットル規模の合成、自己組織化ペプチド系による幹細胞のシグナル群の模倣、ナノワイヤー、レーザー加工によるナノグルーブ、およびナノフェーズ薄膜によるＰＳＣの拡大、の使用を含み得る。
【０１６１】
記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、遺伝子操作される、例えば外因性核酸が遺伝子導入される。ＰＳＣにおける遺伝子導入および遺伝子操作、例えば、インビボ遺伝子送達のためのナノ粒子、ＰＳＣへの遺伝子送達のためのナノニードル、ＰＳＣ遺伝子導入のための自己組織化ペプチド系、ＰＳＣへの遺伝子送達のためのナノワイヤー、およびＰＳＣ電気穿孔のためのマイクロ／ナノ流体デバイスにおいて、ナノエンジニアリングを用いることができる。
【０１６２】
記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、該方法における使用のために単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、バイオリアクターを用いて拡大され得る。
【０１６３】
用語「増加した」、「増加する」または「拡大する」は、ＰＳＣの増加との関連で用いられるとき、一般に、ＰＳＣの数における統計学的に有意な量の増加を意味し、あらゆる疑いを回避するため、用語「増加した」、「増加する」、「拡大する」または「拡大された」は、参照レベルと比べての少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは１００％を含むそれ以下の増加、または少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約７倍、もしくは少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または対照または参照レベルと比べての１０倍以上の任意の増加を意味する。対照／参照試料またはレベルは、例えば本明細書に記載の方法を用いて拡大されていない、例えば拡大培養の開始または拡大培養に添加される細胞の初期数での同じ生物学的供給源から得られる細胞の集団を示すように本明細書で用いられる。
【０１６４】
膵組織試料および／または膵臓幹細胞の貯蔵
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、膵組織試料は、使用前、すなわちその中のｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの抽出、単離または選択前に貯蔵される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、消化された膵組織試料は、その中のｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの抽出または選択前に貯蔵される。記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは貯蔵される。記載される組成物および方法のすべての態様の他の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、貯蔵前にまず単離および／または拡大される。一実施形態では、貯蔵は凍結保存による。ＰＳＣは、本明細書に記載の治療方法において必要であるとき、解凍される。
【０１６５】
記載される組成物および方法のすべての態様の一部の実施形態では、膵組織試料または単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ（拡大されるかまたはそれ以外）は、本明細書に記載の方法におけるそれらの使用前に凍結される。試料の凍結は、凍結−解凍プロセスの間、細胞損傷を最小化するため、１つ以上の異なる凍結保護物質の存在下で実施され得る。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トレハロース、またはスクロースを用いることができる。
【０１６６】
再生医療におけるＰＳＣの投与および使用
本明細書に記載の特定の実施形態は、ヒト膵組織における体性幹細胞の発見に基づく。場合によっては、これらのヒト膵臓幹細胞（ｈＰＳＣ）は、糖尿病マウスにおいて損傷膵組織を修復し得る。糖尿病のマウスモデルの例およびかかるマウスにおいて幹細胞をインプラントする方法は、例えば、Hua et al., PLoS One, 2014 Jul 10;9(7):e102198に記載されている。ｈＰＳＣが損傷膵臓を有するマウスに置かれるとき、投与されたｈＰＳＣの長期生着が生じ得、これらのｈＰＳＣはβ細胞に分化し得、例えば、その後のβ細胞再生および修復をもたらし得る。この実験は、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣが、例えばヒト患者における糖尿病の膵組織再生および治療のために使用可能であるか否かを示し得る。ＰＳＣはまた、マウスにおいてグルコース応答性のインスリン分泌細胞を生成し、ストレプトゾトシン誘導糖尿病に対してマウスを保護する能力について試験され得る（Kroon et al., Nature Biotechnology, 2008, Apr;26(4):443-52に記載）。したがって、本明細書に提供されるのは、それを必要とする被験者における膵疾患または障害の治療および／または予防のための方法である。本明細書で用いられるとき、用語「膵疾患または障害」、「膵疾患」、「膵臓状態」および「膵障害」は、交換可能に用いられる。これらの方法の一部は、注射により、カテーテルシステムにより、またはそれらの組み合わせで、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを治療有効量で被験者に投与することを含む。これらの方法の一部の態様では、治療有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、血管、膵管を通じて、直接的に組織に、またはそれらを組み合わせて、投与される。他の態様では、治療有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣが、カプセル化デバイスで患者にインプラントされる（例えば、米国特許第９，１３２，２２６号および米国特許第８，４２５，９２８号を参照、その各々の内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。これらの方法は、特に、膵疾患または障害を有するかまたはそれに対するリスクがあるヒト被験者、例えば膵炎または糖尿病を有する被験者の治療的および予防的処置が意図される。本明細書に記載の単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、任意の膵疾患もしくは障害を有するかまたは膵疾患もしくは障害を発症する素因になる選択された被験者に投与され得、その投与は、被験者における効果的治療をもたらす任意の適切な経路を介し得る。本明細書に記載の治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該細胞の投与前に最初に、膵疾患または障害を有する被験者が選択される。
【０１６７】
用語「被験者」、「患者」および「個体」は、本明細書で交換可能に用いられ、本明細書に記載の方法にて用いるための細胞が入手可能な動物、例えばヒト（すなわちドナー被験者）、および／または本明細書に記載のような細胞を用いる予防的治療を含む治療が提供される動物、例えばヒト、すなわちレシピエント被験者を指す。特定動物、例えばヒト被験者に特異的であるような状態または病状の治療においては、被験者という用語は、その特定動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳類」は、本明細書で交換可能に用いられるとき、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、雌ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳類を含む。用語「被験者」はまた、限定はされないが、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類を含む任意の脊椎動物を包含する。しかし、有利には、被験者は、哺乳動物、例えばヒト、または他の哺乳類、例えば、家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、または食糧生産用哺乳動物(food production mammal)、例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタなどである。
【０１６８】
したがって、本明細書に記載の治療方法の一部の実施形態では、被験者は、レシピエント被験者、すなわち単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの投与対象である被験者、またはドナー被験者、すなわちｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを含む膵臓組織試料の入手元である被験者である。レシピエントまたはドナー被験者は、任意の年齢であり得る。一部の実施形態では、被験者は、１０歳未満の被験者として本明細書で定義される「若年被験者」である。他の実施形態では、被験者は、２歳未満の被験者として本明細書で定義される「幼児被験者」である。一部の実施形態では、被験者は、２８日齢未満の被験者として本明細書で定義される「新生児被験者」である。一実施形態では、被験者は成人である。
【０１６９】
本明細書に記載の治療方法の一部の実施形態では、投与されている単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ集団は、１つ以上のドナーから得られる同種ＰＳＣを含む。本明細書で用いられるとき、「同種」は、１つ以上の遺伝子座での遺伝子が同一でない場合で、同種の１つ以上の異なるドナーから得られるＰＳＣまたはＰＳＣを含む膵組織試料を指す。例えば、被験者に投与されている単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ集団は、１つ以上の無関係のドナー被験者、または１つ以上の非同一同胞もしくは他の供給源から得られる膵組織から得ることができる。一部の実施形態では、同系の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ集団、例えば遺伝的に同一の動物、または一卵性双生児から得られるものが用いられる。本態様の他の実施形態では、単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、自家ＰＳＣである。本明細書で用いられるとき、「自家」は、被験者から入手または単離され、かつ同じ被験者に投与されている（すなわちドナーとレシピエントが同じである）ＰＳＣまたはｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを含む膵組織試料を指す。
【０１７０】
膵疾患または障害は、膵臓で発症するかまたは膵臓の不適切な作用を引き起こす任意の疾患または障害である。膵疾患または障害は、限定はされないが、１型糖尿病、２型糖尿病、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんを含み得る。
【０１７１】
本明細書に記載の方法は、症状を治療し、寛解させ、多数の膵疾患またはそれらの症状、例えば膵構造に対して病理学的損傷をもたらすものの進行を予防および／または緩徐化するために用いることができる。用語「膵疾患または障害」、「膵疾患」、「膵臓状態」および「膵障害」は、本明細書で交換可能に用いられ、内分泌細胞（α、β、δ、ε、ＰＰ）および外分泌細胞（腺房、腺房中心、導管）を含む膵臓の構造または機能に関連する任意の状態および／または障害を指す。かかる膵疾患は、限定はされないが、１型糖尿病、２型糖尿病、膵炎、嚢胞性線維症、膵外分泌不全、膵管出血、膵管癒合不全および輪状膵などの膵臓の先天性奇形、および／または膵がんを含む。
【０１７２】
これら条件の一部では、炎症が状態の病理学における役割を担う場合、ｃ−ｋｉｔ  ＰＳＣと一緒に用いられる治療薬は、炎症からの損傷を低減することにより、状態の進行を寛解または緩徐化し得る。その他の場合、ｃ−ｋｉｔ  ＰＳＣと一緒に用いられる治療薬は、病原体の複製または病原体に関連する膵組織損傷を制限するように作用し得る。
【０１７３】
本明細書で用いられるとき、用語「投与する」、「導入する」、「移植する」および「インプラントする」は、所望される効果が得られるように、所望される部位、例えば損傷または修復の部位への導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法または経路による、本発明の細胞、例えばｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの被験者への配置との関連で交換可能に用いられる。細胞、例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ、またはそれらの分化子孫（例えばβ様細胞）は、直接的に膵臓にインプラントされ得るか、またはその代わり、インプラント細胞または該細胞の成分の少なくとも一部が生存可能性を維持する場合に、被験者における所望される位置への送達をもたらす任意の適切な経路により投与され得る。細胞の被験者への投与後の生存可能期間は、数時間、例えば２４時間から数日程度の短期間から、数年程度の長期間に至る（すなわち長期生着）可能性がある。例えば、本明細書に記載の治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの単離または濃縮された集団の有効量が、糖尿病を患う個体の膵臓に、直接注射により直接的に投与される。本明細書に記載の治療方法のすべての態様の他の実施形態では、単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団は、間接的な全身投与経路、例えばカテーテル媒介性の経路を介して投与される。
【０１７４】
本発明の一実施形態は、注射を送達するためのカテーテルに基づく手法の使用を含む。カテーテルの使用により、膵臓にアクセスする、身体の外科的開口などのより浸潤的な送達方法が排除される。当業者が理解する通り、ここで概説のように、カテーテル手法を含む、浸潤性がより最小限の手法により、最適な回復時間が可能となる。予防的に提供されるとき、単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、膵疾患または障害の任意の症状に先立ち、被験者に投与され得る。したがって、単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ集団の予防的投与は、膵疾患または障害、または本明細書に開示されるような膵疾患または障害のさらなる進行を予防するのに役立つ。
【０１７５】
治療的に提供されるとき、単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、膵疾患または障害の症状または徴候の発症時（または後）、例えば糖尿病の発病時、提供される。
【０１７６】
本明細書で用いられるとき、用語「治療する(treat)」、「治療(treatment)」、「治療する(treating)」または「寛解」は、目的が、疾患または障害に関連した状態の進行または重症度を元に戻す、緩和する、寛解する、低下させる、阻害する、または緩徐化することであるような治療的処置を指す。用語「治療する(treating)」は、膵疾患、例えば限定はされないが膵炎に関連した状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害作用または症状を低減または軽減することを含む。治療は、該用語が本明細書で定義されるように、１つ以上の症状または臨床マーカーが減少する場合、一般に「有効である」。あるいは、疾患の進行が低下または停止する場合、治療は「有効である」。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の不在下で予想されることになる症状の進行または悪化の休止または少なくとも緩徐化を含む。有益なまたは所望される臨床結果は、限定はされないが、検出可能または検出不能に限らず、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の低下、安定化された（すなわち悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の寛解または緩和、および緩解（部分的または全体的のいずれか）を含む。一部の実施形態では、「治療(treatment)」および「治療する(treating)」はまた、被験者が治療を受けなかった場合の予想される生存と比べて、被験者の生存を延長させることを意味し得る。
【０１７７】
本明細書で用いられるとき、用語「予防」は、目的が、疾患もしくは障害の発病を予防するもしくは遅延させるか、または疾患もしくは障害に関連した症状の発症を遅延させることであるような予防的(prophylactic)または予防的(preventative)手段を指す。一部の実施形態では、「予防」は、状態の進行もしくは重症度または膵疾患もしくは障害に関連した膵機能の悪化を緩徐化することを指す。
【０１７８】
別の実施形態では、膵疾患または障害の「治療」はまた、（対症治療を含む）疾患の症状または副作用からの軽減を提供することを含む。例えば、どんなにわずかであっても、血糖レベル、腹痛、悪心および／または嘔吐におけるいずれかの低下があれば、症状が軽減されたとみなされることになる。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、疾患または障害の症状または測定パラメータは、単離および濃縮されたＰＳＣの集団の投与時、対照または非治療被験者と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％軽減される。
【０１７９】
測定されるまたは測定可能なパラメータは、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、上昇または抑制されたレベルの臨床的または生物学的マーカー、ならびに疾患または障害における臨床的に認められる規模の症状またはマーカーに関するパラメータを含む。しかし、本明細書に開示されるような組成物の全体的使用が、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは理解されるであろう。要求される正確な量は、治療中の膵疾患または障害のタイプ、損傷の程度、目標が治療または予防または双方のいずれであるか、被験者の年齢、利用可能な細胞の量などの要素に応じて変動することになる。したがって、当業者は、治療が病態を改善し得るが、疾患に対する完全な治癒でない場合があることを理解する。
【０１８０】
記載される治療方法のすべての態様の一実施形態では、用語「有効量」は、本明細書で用いられるとき、膵疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を緩和するのに必要な単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団の量を指し、所望される効果を提供する、例えば糖尿病を有する被験者を治療するための薬理学的組成物の十分な量に関する。したがって、用語「治療有効量」は、典型的な被験者、例えば糖尿病を有するかまたはそのリスクがある者に投与されるとき、特定の効果をもたらすのに十分である、本明細書に開示されるような治療方法を用いて単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの量を指す。
【０１８１】
記載される方法のすべての態様の別の実施形態では、本明細書で用いられるときの有効量はまた、疾患の症状の発症を予防するかまたは遅延させる、疾患症状の経過を変更する（例えば限定はされないが、疾患の症状の進行を緩徐化する）、またはさらに疾患の症状を元に戻すのに十分な量を含むことになる。特定の効果にとって必要とされるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の有効量は、各個体とともに変動することになり、さらに対処されている膵疾患または障害のタイプとともに変動することになる。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でない。しかし、ある特定の場合には、適切な「有効量」は、通常の実験を用いて当業者により決定され得る。
【０１８２】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、被験者は、本明細書に記載の方法に従い、細胞を投与する前、膵組織に影響する疾患または障害を有するとして最初に診断される。記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、被験者は、細胞を投与する前、膵疾患または障害を発症するリスクがあるとして最初に診断され、例えば糖尿病に対する遺伝的素因を有するかまたは糖尿病を有する近親者を有する個体である。
【０１８３】
本明細書に記載の治療方法のすべての態様における使用においては、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、１投与あたり、少なくとも１０２、少なくとも５×１０２、少なくとも１０３、少なくとも５×１０３、少なくとも１０４、少なくとも５×１０４、少なくとも１０５、少なくとも２×１０５、少なくとも３×１０５、少なくとも４×１０５、少なくとも５×１０５、少なくとも６×１０５、少なくとも７×１０５、少なくとも８×１０５、少なくとも９×１０５、または少なくとも１×１０６のｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣまたはその倍数を含む。一部の実施形態では、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの２回以上の投与が被験者に対して実施される。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの複数回投与は、長期にわたり行うことができる。ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、１つ以上のドナーから単離または濃縮され得るか、または自家供給源(autologous source)から入手され得る。
【０１８４】
本明細書に記載の方法にて用いられるＰＳＣおよび他の薬剤の例示的な投与様式は、限定はされないが、注射、注入、吸入（鼻腔内含む）、摂取、および直腸投与を含む。「注射」は、限定はされないが、静脈内、動脈内、管内、組織への直接注射、脳室内、心臓内、経気管注射および注入を含む。語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書で用いられるとき、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を指し、限定はされないが、静脈内、脳室内、心臓内、経気管注射および注入を含む。一部の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、静脈内、動脈内、管内、もしくは組織への直接注射により、または肝臓における注射を通じて投与され得る。
【０１８５】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、注射により被験者に投与される。他の実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、カテーテル媒介性のシステムにより被験者に投与される。他の実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、血管、膵管を通じて、組織に直接的に、またはそれらを組み合わせて、被験者に投与される。さらなる実施形態では、有効量の単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、カプセル化デバイスで患者にインプラントされる（例えば、米国特許第９，１３２，２２６号および米国特許第８，４２５，９２８号を参照、それら各々の内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１８６】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、有効量の単離および濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、全身投与、例えば静脈内投与により被験者に投与される。
【０１８７】
語句「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は、本明細書で用いられるとき、膵臓に直接的でない代わりに、被験者の循環系に侵入するようなＰＳＣの集団の投与を指す。
【０１８８】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、被験者において明らかな効果を得るように、１つ以上の投与経路が用いられる。例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの単離または濃縮された集団は、外分泌および／または内分泌組織を治療または修復するため、直接注射およびカテーテル媒介性の経路の双方により被験者に投与される。かかる実施形態では、異なる有効量の単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、各投与経路において用いることができる。
【０１８９】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該方法は、単離または濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの投与によって媒介される効果を強化または増強する、例えば、ＰＳＣのホーミングまたは生着を増強する、外分泌および／または内分泌細胞の修復を増強する、または外分泌および／または内分泌細胞の増殖および再生を増強する可能性がある１つ以上の治療薬、例えば薬物または分子の投与をさらに含む。治療薬は、タンパク質（抗体または抗原結合断片など）、ペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ウイルス、小分子、化合物、細胞、薬物などであり得る。
【０１９０】
本明細書で定義されるとき、「血管再生」は、限定はされないが膵臓疾患を含む、本明細書に記載の通り、損傷または外傷後の新しい血管の新規形成または損傷した血管（例えば毛細管）の交換を指す。「血管新生」は、かかる現象を記述するため、交換可能に用いることができる用語である。
【０１９１】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを、増殖、分化、および血管新生剤または膵臓組織内での細胞の増殖、分化、および血管新生を刺激するための当該技術分野で公知の因子と一緒に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、これら因子の任意の１つは、本明細書に記載の組成物を投与する前または後に送達され得る。生着、分化および／または血管新生を誘導および／または増強するため、これら因子の任意の１つの複数回のその後の送達もなされ得る。好適な成長因子は、限定はされないがトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む。その他の例が、Dijke et al., “Growth Factors for Wound Healing”, Bio/Technology, 7:793-798 (1989); Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF, eds. Clinicians’ Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4th ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85; Ziegler T.R., Pierce, G.F., and Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlagに記載されており、これらはそれら全体が参照によりここで援用される。
【０１９２】
一実施形態では、該組成物は、損傷膵臓組織の治癒または再生を誘導する、例えば血管形成細胞を周囲組織から動員して、新生血管における結合点を提供する１つ以上の生物活性剤を含み得る。好適な生物活性剤は、限定はされないが、医薬活性化合物、ホルモン、増殖因子、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルス、タンパク質、脂質、ポリマー、ヒアルロン酸、炎症促進性分子、抗体、抗生物質、抗炎症剤、アンチセンスヌクレオチドおよび形質転換核酸またはそれらの組み合わせを含む。他の生物活性剤は、細胞増殖および細胞分化のため、有糸分裂の増加を促進し得る。
【０１９３】
極めて多数の増殖因子および分化因子は、幹細胞および前駆細胞の細胞の増殖および分化を刺激することが当該技術分野で公知である。好適な増殖因子およびサイトカインは、前駆細胞を刺激、維持、および／または動員する能力がある任意のサイトカインまたは増殖因子を含む。それらは、限定はされないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子１、造血幹細胞因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦβ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３、コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、ｆｉｔ３−リガンド、および腫瘍壊死因子αを含む。その他の例が、Dijke et al., “Growth Factors for Wound Healing”, Bio/Technology, 7:793-798 (1989); Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF, eds. Clinicians’ Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4th ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85; Ziegler T.R., Pierce, G.F., and Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlagに記載されている。
【０１９４】
記載される治療方法のすべての態様の一実施形態では、記載される組成物は、生理食塩水などの好適な生理学的担体溶液中のＰＳＣの懸濁液である。懸濁液は、限定はされないが、医薬活性化合物、ホルモン、増殖因子、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルス、タンパク質、脂質、ポリマー、ヒアルロン酸、炎症促進性分子、抗体、抗生物質、抗炎症剤、アンチセンスヌクレオチドおよび形質転換核酸またはそれらの組み合わせを含む、追加的な生物活性剤を含有し得る。
【０１９５】
記載される治療方法のすべての態様の特定の実施形態では、生物活性剤は、「血管新生促進因子」であり、膵臓における新しい血管形成を直接的または間接的に促進する因子を指す。血管新生促進因子は、限定はされないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｅ−カドヘリン、ＶＥＧＦ、アンジオゲニン、アンジオポエチン−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘパラナーゼ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、アンジオポエチン、低酸素症誘導因子−１（ＨＩＦ−１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ、ＢＰ−３、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、血管透過性因子（ＶＰＦ）、ビトロネクチン、レプチン、トレフォイルペプチド（ＴＦＦ）、ＣＹＲ６１（ＣＣＮ１）、ＮＯＶ（ＣＣＮ３）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ｃ−Ｍｙｃ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）、散乱因子（ＳＦ）、オステオポンチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、プレイオトロフィン、プロリフェリン、フォリスタチン、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ミッドカイン、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ）、およびフラクタルカイン、ならびに血管新生および血管分布増加の誘導因子である炎症性サイトカインおよびケモカイン、例えば、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を含む。
【０１９６】
本明細書に記載の組成物における１つ以上の治療薬の至適用量は、約０．１〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約３０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０〜約５００ｎｇ／ｍｌ、または約８０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの濃度を含み得る。一部の実施形態では、１つ以上の治療薬の至適用量は、約１０、約２５、約４５、約６０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、または約５００ｎｇ／ｍｌである。他の実施形態では、１つ以上の治療薬の至適用量は、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、または約２．０μｇ／ｍｌである。
【０１９７】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、該方法は、１つ以上の界面活性剤の治療薬としての投与をさらに含むか、または１つ以上の界面活性剤治療法と併用されてもよい。界面活性剤は、本明細書で用いられるとき、任意の表面活性剤、例えば限定はされないが、浸潤剤、表面張力低下剤、洗剤、分散剤および乳化剤を指す。特に好ましいのは、肺胞表面上で単分子層を形成するもの、例えば限定はされないが、リポタンパク質、レシチン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＧ）、アポタンパク質Ａ、アポタンパク質Ｂ、アポタンパク質Ｃ、アポタンパク質Ｄ、パルミトイルオレオイル、ホスファチジルグリセロール、パルミチン酸およびスフィンゴミエリンである。例示的な界面活性剤は、限定はされないが、界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄ、ならびにそれらの混合物および組み合わせを含む。市販の界面活性剤は、限定はされないが、KL-4、SURVANTA（登録商標）、ウシ脂質抽出物界面活性剤 (BLES)、INFASURF（登録商標）(CALFACTANT（登録商標）)、CUROSURF（登録商標）、HL-10、AEROSURF（登録商標）、SUBOXONE（登録商標）、ALVEOFACT（登録商標）、SURFAXIN（登録商標）、VENTICUTE（登録商標）、PUMACTANT（登録商標）／ALEC、およびEXOSURF（登録商標）を含む。
【０１９８】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、１つ以上の他の標準治療薬の投与は、膵疾患または障害、例えば糖尿病または膵炎を治療するための濃縮されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの投与と組み合わせることができ、抗コリン剤、β２アドレナリン受容体作動薬、例えばホルモテロールまたはサルメテロール、コルチコステロイド、抗生物質、抗酸化剤、降圧薬(antihypertension agents)、一酸化窒素、カフェイン、デキサメタゾン、およびＩＬ−１０または他のサイトカインの使用を含む。一部の実施形態では、含まれる標準治療薬は、膵疾患の症状を治療するために用いられる。
【０１９９】
例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）などの症状の進行を治療、寛解または緩徐化するための本明細書に記載の方法におけるｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの使用は、任意選択的には他の好適な治療または治療薬と組み合わせられ得る。ＣＦにおいては、これは、限定はされないが、経口またはエアロゾルコルチコステロイド治療、イブプロフェン治療、デオキシリボヌクレアーゼまたはＩＬ−１０治療、食事調節、例えば、ビタミンＥ補充、病原体、例えばインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対するワクチン接種、胸部物理的治療、例えば胸部ドレナージまたは打診、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２００】
記載される治療方法のすべての態様の一部の実施形態では、標準治療薬は、詳述されているものであり、例えば、Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, 2001, E. Braunwald, et al., editors, McGraw-Hill, New York, N.Y., ISBN 0-07-007272-8, especially chapters 252-265 at pages 1456-1526; Physicians Desk Reference 54.sup.th edition, 2000, pages 303-3251, ISBN 1-56363-330-2, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J.を参照されたい。任意の膵臓疾患または障害の治療は、本明細書に記載の治療計画を用いて達成され得る。慢性状態においては、治療の頻度を低減するため、間欠投与を用いることができる。間欠投与プロトコルは、本明細書に記載の通りである。
【０２０１】
本明細書に記載の方法の臨床的使用においては、本明細書に記載の濃縮されるｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの単離または濃縮された集団は、被験者における効果的治療をもたらす任意の薬学的に許容できる化合物、材料、担体または組成物とともに投与され得る。したがって、本明細書に記載の方法にて用いるための医薬製剤は、１つ以上の薬学的に許容できる成分と組み合わせたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの単離または濃縮された集団を含有し得る。
【０２０２】
用語「担体」は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。かかる医薬担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるとき、好ましい担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液用の液体担体として用いることができる。好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。該組成物はまた、必要に応じて、湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を少量含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取り得る。該組成物は、坐剤として、伝統的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドとともに製剤化され得る。経口製剤は、標準担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。好適な医薬担体の例が、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)に記載されている。製剤は、投与様式に適合する必要がある。
【０２０３】
一実施形態では、用語「薬学的に許容できる」は、動物、およびより具体的にはヒトにおける使用として、連邦もしくは州政府の規制当局によって認可される、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方において列挙されることを意味する。詳細には、それは、合理的なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の課題もしくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に適した、健全な医学的判断の範囲内に該当する化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【０２０４】
語句「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、ＰＳＣの単離または濃縮された集団の活性の維持、その保有、または１つの臓器もしくは身体の一部から別の臓器もしくは身体の一部へのその輸送に関与する、薬学的に許容できる材料、組成物または媒体、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体（例えば幹細胞媒体）、被包材料、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒被包材料を意味する。
【０２０５】
各担体は、製剤の他の成分と適合でき、患者に対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料の幾つかの例として、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）リン酸緩衝液；（３）パイロジェンフリー水；（４）等張食塩水；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（１７）トラガカント末；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２４）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；（２５）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；および（２６）医薬製剤中に用いられる他の非毒性親和性物質、が挙げられる。浸潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容できる担体」などの用語は、本明細書で交換可能に用いられる。
【０２０６】
定義
特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されている場合と同じ意味を有する。本明細書、実施例および特許請求の範囲においてここで用いられる特定用語は、ここに集められる。
【０２０７】
本明細書で用いられるとき、インビボ（ラテン語で「生体内」）は、生体、例えばヒト被験者を全体として用いる方法を指す。本明細書で用いられるとき、「エクスビボ」（ラテン語で生体外）は、被験者の身体外で実施される方法を指し、例えば、ドナー被験者から得られる膵組織からｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣを単離し、次に単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣ試料をレシピエント被験者に投与する方法として、臓器、細胞、または組織が生存する被験者から採取される場合の方法を指す。本明細書で用いられるとき、「インビトロ」は、被験者の外部で実施される方法、例えばインビトロ細胞培養実験を指す。例えば、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣは、本明細書に記載の方法に従って用いられるかまたは投与される前に、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの数を拡大するまたは増加させるか、または特定の系統または細胞型、例えばβ細胞へのＰＳＣの分化を導くため、インビトロで培養され得る。
【０２０８】
用語「多能性」は、本明細書で用いられるとき、異なる条件下で、１つ以上の特定細胞型の系統にコミットする、またコミットされた系統の２つ以上の分化された細胞型に分化する、好ましくは全部で３つの胚細胞層に特有の細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は主に、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いての、２つ以上の細胞型、好ましくは全部で３つの胚葉に分化するその能力によって特徴づけられる。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によって証明されるが、多能性についての好ましい試験は、３つの胚葉の各々の細胞に分化する能力の実証である。かかる細胞を単純に培養することにより、それらが自然に多能性を得ることがないことは注目すべきである。再プログラム化された多能性細胞（例えば、その用語が本明細書で定義されるときはｉＰＳ細胞）は、一般には培養下でほんの限られた数の分裂についての能力を有する初代細胞親に対して、増殖能力の低下を伴わない継代延長の能力の特徴も有する。
【０２０９】
用語「前駆」細胞は、本明細書で用いられるとき、それが分化により生成し得る細胞に対してより未分化である（すなわち、完全に分化されたまたは末期に分化された細胞であるよりも早期の発生経路または進行に沿うステップである）細胞表現型を有する細胞を指す。多くは、前駆細胞はまた、顕著なまたは非常に高い増殖可能性を有する。前駆細胞は、発生経路、および細胞が発生し、分化する環境に応じて、複数の明確な分化細胞型または単一の分化細胞型を生じ得る。前駆細胞は、特定の確定系統の前駆細胞を発生させる、例えば、特定の膵臓前駆細胞は、分裂し、内分泌細胞系統前駆細胞を発生させる。これらの前駆細胞は、分裂し、多数の細胞を発生させ、それは末期に例えばβ細胞に分化する。
【０２１０】
用語「前駆体」細胞は、本明細書で用いられるとき、末期に分化される細胞よりも未分化であるが、その同じ発生経路に沿って存在する幹細胞または前駆細胞ほどに未分化でない細胞表現型を有する細胞を指す。「前駆体」細胞は、典型的には、「幹細胞」の娘の一部である「前駆体」細胞の子孫細胞である。典型的な非対称細胞分裂中の娘の１つは、幹細胞の役割が想定される。
【０２１１】
用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すように用いられる（米国特許第５８４３７８０号、米国特許第６２００８０６号を参照）。かかる細胞は、同様に体細胞核導入から得られる胚盤胞の内部細胞塊から得ることができる（例えば、米国特許第５９４５５７７号、米国特許第５９９４６１９号、米国特許第６２３５９７０号を参照）。胚性幹細胞の顕著な特徴は、胚性幹細胞表現型を明確にする。したがって、細胞が、他の細胞と区別できるように胚性幹細胞の固有の特徴の１つ以上を有する場合、それは胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な顕著な胚性幹細胞の特徴は、限定はされないが、遺伝子発現特性、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などを含む。
【０２１２】
用語「成体幹細胞」は、若年性および成体組織を含む非胚性組織から得られる任意の多能性幹細胞を指すように用いられる。一部の実施形態では、成体幹細胞は、非胎生期の起源であり得る。
【０２１３】
細胞個体発生との関連で、形容詞「分化された」または「分化する」は、比較されている細胞よりも発生経路をさらに下流に進行している細胞である「分化細胞」を意味する関連用語である。したがって、幹細胞は、系統が制限された前駆細胞（膵臓幹細胞など）に分化し得、次いで経路のさらに下流の他のタイプの前駆細胞（外分泌または内分泌前駆体など）、次いで特定の組織タイプにおける特徴的役割を担う末期分化細胞に分化し得るが、さらに増殖する能力を保持するか否かは不明である。
【０２１４】
用語「分化細胞」は、その用語が本明細書で定義される通り、その天然形態で多能性でない任意の初代細胞を意味する。別の方法で述べると、用語「分化細胞」は、細胞分化過程において大して特殊化していない細胞型の細胞（例えば膵臓幹細胞などの幹細胞）から得られるより特殊化した細胞型の細胞を指す。理論に制限されることを望むものではないが、正常な個体発生の過程における多能性幹細胞は、最初に内分泌または外分泌細胞に分化し得る。膵臓幹細胞のさらなる分化により、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞、腺房細胞、腺房中心細胞または導管細胞を含む様々な膵細胞型の形成がもたらされる。
【０２１５】
本明細書で用いられるとき、用語「体細胞」は、生殖系列細胞に対立するものとして、生物の身体を形成する任意の細胞を指す。哺乳類では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知）は、精子および卵子であり、それらは受精中に融合し、接合子と称される細胞を生成し、それから哺乳動物胚全体が発生する。哺乳動物身体におけるすべての他の細胞型（精子および卵子は別にして、それらが作られる元の細胞（生殖母細胞）および未分化幹細胞）は体細胞であり、内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織はすべてが体細胞から構成される。一部の実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、それは、胚内に存在しないかまたは胚から得られず、インビトロでのかかる細胞の増殖から得られない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、それは、胚または胎児以外の生命体に存在するかまたはそれから得られる、またはインビトロでのかかる細胞の増殖から得られる細胞を意味する。
【０２１６】
本明細書で用いられるとき、用語「成熟細胞」は、胚発生後に身体全体を通じて見出される細胞を指す。
【０２１７】
用語「表現型」は、実の遺伝子型とは無関係に、特定の環境条件および要素のセットの下での細胞または生物を規定する１つまたは幾つかの生物学的特性全体を指す。例えば、細胞内での細胞表面マーカーの発現が挙げられる。
【０２１８】
用語「細胞培地」（本明細書中で「培地(culture medium)」または「培地(medium)」とも称される）は、本明細書で言及されるとき、細胞生存度を維持し、増殖を支持する栄養分を含有する細胞を培養するための培地である。細胞培地は、以下：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、および他の成分、例えばペプチド成長因子などのいずれかを適切な組み合わせで含有してもよい。通常、特定の細胞型において用いられる細胞培地は、当業者に公知である。
【０２１９】
用語「複製能」または「自己複製能」または「増殖」は、本明細書で交換可能に用いられ、幹細胞が、長期間および／または多くの月数から年数にわたり、同じ非特殊化細胞型に分裂することにより自ら複製する能力を指すように用いられる。
【０２２０】
場合によっては、「増殖」は、単一細胞の２つの同一の娘細胞への分裂の反復による細胞の増殖を指す。
【０２２１】
用語「系統」は、本明細書で用いられるとき、共通の祖先を有する細胞または共通の発生運命を有する細胞を示す。
【０２２２】
用語「単離された細胞」は、本明細書で用いられるとき、最初に見出された生物から取り除かれている細胞またはかかる細胞の子孫を指す。任意選択的には、該細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。任意選択的には、該細胞は、後に第２の生物に導入されるか、またはそれ（またはその由来元である細胞）が単離された元の生物に再導入される。
【０２２３】
単離された細胞集団と関連する用語「単離された集団」は、本明細書で用いられるとき、細胞の混合または異質集団から除去および分離されている細胞の集団を指す。一部の実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮される元の異質集団と比べて実質的に純粋な細胞の集団である。
【０２２４】
用語「組織」は、特定の特別な機能を一緒に遂行する特殊化した細胞の群または層を指す。用語「組織特異的な」は、特定の組織からの細胞の供給源を指す。
【０２２５】
用語「低下する(decrease)」、「低下した(reduced)」、「低下(reduction)」、「低下する(decrease)」または「阻害する」はすべて、一般に統計学的に有意な量の低下を意味するように本明細書で用いられる。しかし、疑いを回避するため、「「低下した(reduced)」、「低下(reduction)」または「低下する(decrease)」または「阻害する」は、典型的には、参照レベルと比べて少なくとも約５％〜１０％の低下、例えば、参照レベルと比べて、少なくとも約２０％の低下、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の低下（すなわち、参照試料と比べて不在レベル）、または１０〜９０％の間の任意の低下を意味する。治療または予防との関連で、参照レベルは、ｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの集団の投与の不在下での被験者の症状レベルである。
【０２２６】
用語「上昇した(increased)」、「上昇する(increase)」または「増加する(enhance)」はすべて、一般に統計学的に有意な量の上昇を意味するように本明細書で用いられるが、あらゆる疑いを回避するため、用語「上昇した(increased)」、「上昇する(increase)」または「増加する(enhance)」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の上昇、例えば、参照レベルと比べて、少なくとも約２０％の上昇、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％もしくはそれ以上の上昇、もしくは１０〜９０％の間の任意の上昇、または参照レベルと比べて、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の上昇、もしくは２倍〜１０倍の間もしくはそれ以上の任意の上昇を意味する。インビトロでのｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの拡大との関連で、参照レベルは、膵組織試料から単離されるｃ−ｋｉｔ陽性ＰＳＣの初期数である。
【０２２７】
用語「最低レベルで発現する」は、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、Nanostring、質量分析または当該技術分野で公知の他の分子定量技術による測定としての、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性膵臓幹細胞内でのインスリン、Ｃペプチド、グルカゴン、ＣＫ１９および／またはアミラーゼなどの内分泌または外分泌マーカーの限られた発現を指す。内分泌および／または外分泌マーカーの最低レベルの発現は、典型的には、各マーカーが、当業者に公知の分子アッセイによる測定として、そのマーカーについて、ｃ−ｋｉｔの発現と比べて、最高で約１０％まで、最高で約８％まで、最高で約６％まで、最高で約４％まで、最高で約２％まで、最高で約１％までまたはそれ未満の陽性で発現することを意味する。
【０２２８】
用語「統計学的に有意な」または「有意に」は、統計学的有意性を指し、一般に、マーカーの正常未満、すなわち低い方の濃度の２標準偏差（２ＳＤ）を意味する。該用語は、差異があることの統計学的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真であるとき、帰無仮説を拒絶するという決定を下す確率として定義される。その決定は、Ｐ値を用いてなされることが多い。
【０２２９】
本明細書で用いられるとき用語「含む(comprising)」または「含む(comprises)」は、本発明にとって必須である場合に加え、必須であるか否かは別にして不特定要素の包含に開かれている組成物、方法、およびその各々の成分に関連して用いられる。
【０２３０】
用語「〜からなる」は、本実施形態のその記述中に列挙されない任意の要素を除く、本明細書に記載のような組成物、方法、およびその各々の成分を指す。
【０２３１】
特に説明されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されている場合と同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出してもよい。さらに、文脈によって特に要求されなければ、単数用語は複数を含むこととし、また複数用語は単数を含むこととする。
【０２３２】
特に指定のない限り、本発明は、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005)およびAnimal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)（すべてはそれら全体が参照により本明細書に援用される）における当業者に公知の標準的手順を用いて実施された。
【０２３３】
本発明が本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されることなく、それ故に変化し得ることは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、あくまで特定の実施形態を記述することを目的とし、あくまで特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０２３４】
運用事例中以外であるか、または特別に指示される場合、本明細書で用いられる成分の量または反応条件を表すすべての数は、あらゆる場合に用語「約」により変更されるものとして理解されるべきである。用語「約」は、百分率と組み合わせて用いられるとき、±１％を意味することになる。
【０２３５】
特定されるすべての特許および出版物は、例えば、本発明と関連して用いられてよいかかる出版物中に記載される方法を説明し、開示することを目的として、参照により本明細書中に明示的に援用される。これらの出版物は、あくまでそれらの本願の出願日前の開示を意図して提供される。これに関連する何であっても、先行発明の理由で、または任意の他の理由で、発明者にかかる開示に先立つ権利が与えられないことの承認として解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれら文書の内容に関する表現は、出願人に対する利用可能な情報に基づくもので、これら文書の日付または内容の訂正に関する承認では決してない。
【０２３６】
本発明は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに例示される。本願全体を通じて引用されるすべての参考文献の内容、ならびに図面は、参照により本明細書中に援用される。
【０２３７】
当業者は、せいぜい通常の実験を用いることで、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物、異なる培地および添加物が、単離された細胞を培養拡大するため、用いることができることを理解するか、または確認することができるであろう。当業者であれば、培地および添加物の選択を評価するための試験を実施することができるであろう。かかる均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０２３８】
本明細書中で、また本明細書全体を通じて引用される参考文献は、参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０２３９】
発明者は、幹細胞抗原ｃ−ｋｉｔを膵臓未分化細胞の同定および特徴づけのためのマーカーとして用いている。ｃ−ｋｉｔエピトープは、自己複製性、クローン原性および多能性である膵臓幹細胞（ＰＳＣ）のプールを解明しやすくするため、用いた。これらのＰＳＣは、インスリン、Ｃペプチドおよびグルカゴンなどの内分泌膵臓のマーカーを発現する細胞、ひいてはＣＫ１９およびアミラーゼなどの外分泌膵臓のマーカーを発現する細胞に再生することができる。
【０２４０】
材料および方法
ｈＰＳＣ
ヒト膵組織の２９の試料を手術時に得た。代表的試料を図１に示す。ヒト膵臓幹細胞（ｈＰＳＣ）の単離においては、心臓および肺を含む他の臓器におけるｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞クラスの収集および拡大のため、発明者の研究室にて開発したプロトコルを用いて、断片を酵素的に解離させた。コラゲナーゼを含有する溶液中で組織断片を酵素的に解離させ、単一細胞懸濁液を得た。細胞をｃ−ｋｉｔについて磁気イムノビーズ(Miltenyi)を用いて選別し、選別後、細胞表現型を免疫細胞化学により明らかにした。次に、推定上のｈＰＳＣを、５〜１０％ＦＢＳ(Gibco)およびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物(Sigma)を添加したF12培地(Gibco)中で培養した。免疫細胞化学においては、可能であれば、一次抗体を蛍光色素(Molecular Probes)で直接標識し、交差反応性を回避した。共焦点顕微鏡により、免疫標識を分析した。
【０２４１】
クローニングアッセイおよびクローン原性細胞の分化
ヒトｃ−ｋｉｔ陽性細胞を選別し、顕微鏡制御下で各ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を９６ウェルプレートの単一ウェル内に個別に播種した。２つ以上の細胞を有するウェルを除外した。加えて、限界希釈時、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、直径が１０ｃｍのペトリ皿内に約１００〜１５０個の細胞で播種した。クローン原性細胞の分化を、１０％ＦＢＳ、１０−８Ｍのデキサメタゾンを含有するＭＥＭにより誘導した。免疫細胞化学により細胞表現型を明らかにした。
【０２４２】
ｈＰＳＣの分裂
ｈＰＳＣの対称および非対称分裂が、αアダプチン抗体での有糸分裂細胞の免疫標識により判定された。有糸分裂染色体が、ＤＡＰＩでの染色により同定された。
【０２４３】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
ｃ−ｋｉｔ、膵内分泌細胞分化に対するマーカー（Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｉｎｓ、Ｎｇｎ３）、膵外分泌細胞分化に対するマーカー（Ａｍｙ２Ａ）および膵臓前駆細胞に対するマーカー（Ｓｏｘ９）における転写物の検出のため、TRIzolを用いてクローンｈＰＳＣから全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとともに３７℃で２時間インキュベートした全ＲＮＡ２μｇから生成した。ＲＴ−ＰＣＲを、１反応あたり１／２０のｃＤＮＡを用いて、7300 Real Time PCR Systems (Applied Biosystems)で実施した。循環条件は、次の通りであった。９５℃で１０分後、３５サイクルの増幅（９５℃で１５秒間の変性、および６０℃で１分間のアニーリング／伸長の組み合わせ）。ヒトに特異的なプライマーを、Vector NTIソフトウェア（INVITROGEN（商標））を用いて設計した。定量化値は、ハウスキーピングヒト遺伝子β２ミクログロブリンによって測定されたインプットに対して正規化した。ヒト膵臓全ＲＮＡ(Applied Biosystems)およびマウス膵臓から抽出したＲＮＡを各々、陽性および陰性対照として用いた。
【０２４４】
ＰＣＲ産物を２％アガロース／１×ＴＢＥゲル上を走らせ、予想される分子サイズを有するＤＮＡバンドが得られた。QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いてＤＮＡを抽出し、１０ｍＭトリス緩衝液３０μｌ（ｐＨ８．５）に溶出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いられる同じフォワードおよびリバースプライマーの存在下で、Platinum Blue PCR Supermixにより増幅した。Eppendorf Mastercycler内でＰＣＲ反応を実行した。循環条件は、次の通りであった。９４℃で２分後、２０サイクルの増幅（９４℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１５秒間の伸長）と、７２℃で２分間の最終インキュベーション。QIAquick PCR精製キットを用いて精製後、試料を配列決定した。転写物のヒト起源について、ＢＬＡＳＴ検索を用いることにより確認した。
【０２４５】
クローンｈＰＳＣのｍＲＮＡプロファイリング
Nanostringアッセイを用いることにより、クローンｈＰＳＣのｍＲＮＡプロファイリングが得られた。この技術は、色分けされた分子プローブおよび単分子イメージングを用いて、標的ＲＮＡ分子のデジタル定量化を可能にする。Nanostringシステムは高レベルの特異性および感度を有することから、１細胞あたり１つの転写物コピーが測定され得る。Nanostring分析により生成された生データをハウスキーピング遺伝子の発現により正規化し、試料中の遺伝子の差次的発現をヒートマップとして示す。クローンｈＰＳＣからTRIzolを用いて全ＲＮＡを抽出した。１９５の幹細胞パネルに関連するヒト遺伝子について試験した。未処理のクローンｈＰＳＣおよび分化誘導物質デキサメタゾン（Ｄｅｘａ）に曝露されたクローンｈＰＳＣにおいて、遺伝子発現を測定した。各クローンにおいて、遺伝子発現は、デキサメタゾンに曝露された対応するクローン細胞に対するパーセント差異として示し、ヒートマップとして表した。赤色は、Ｄｅｘａで処理した細胞における、未処理細胞よりも高い遺伝子発現のレベルに対応する。青色は、Ｄｅｘａで処理した細胞における、未処理細胞よりも低い遺伝子発現のレベルに対応する。
【０２４６】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウス、移植および測定
この試験では、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）／非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスを用いる。これらのマウスを用いて試験を実施するための方法は、例えば、Hua et al., PLoS One, 2014 Jul 10;9(7):e102198に準じてもよい。マウスは、湿度、照明、および温度が制御された動物施設内、特定病原体不在条件下で維持する。施設内の空気は、細菌およびウイルスを除外するように設計されたＨＥＰＡフィルターシステムを通過させる。動物は、標準的な照射された餌に自由にアクセスできるように給餌する。
【０２４７】
実験的糖尿病を誘導するため、マウス腹腔内にＳＴＺを毎日注射する。ＳＴＺ注射の４日後、グルコースメーターで尾静脈血を用いて毎日、血糖レベルを測定し始める。糖尿病マウスを規定する平均血糖レベルを決定するため、ＳＴＺ注射前およびＳＴＺ投与の１〜５日後にマウスの平均血糖を測定する。次に、糖尿病マウスに長時間作用性インスリンを移植まで毎日注射する。不成功の誘導糖尿病マウスは試験から除外する。マウスは、体重および血糖レベルについて、毎日または毎週監視する。
【０２４８】
ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣは、腹部脂肪体に移植する、膵管を通じて注入する、かつ／またはＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスの膵実質に直接注射する。各マウスは、約１０６個のｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣを受ける。ｈＰＳＣの生着および組織再生を各々判定するため、移植後の初期（２〜４日）および後期（１〜４か月）に、臓器を１０％ホルマリン溶液で固定する。毎週、移植前および後、平均血糖レベルを測定する。細胞の生存および機能は、血清ヒトインスリンレベルを測定することにより評価する。
【０２４９】
実施例１
外分泌および内分泌膵臓組織におけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の同定
ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が膵組織内に存在するか否かを判定するため、試料を組織学的に分析した。細胞を、ｃ−ｋｉｔに対する、ならびにインスリン、Ｃペプチドおよびグルカゴンに対する抗体（内分泌細胞が産生するインスリンおよびＣペプチド（β細胞）、またはグルカゴン（α細胞）に関与するマーカー）を用いて免疫組織化学により分析した。ｃ−ｋｉｔ受容体を発現する細胞は、膵臓の内分泌部（島）および外分泌部に見出された。あらゆる場合に、分析からマスト細胞を除外するため、トリプターゼについての染色を実施した。重要なことには、ｃ−ｋｉｔおよび系統マーカーを示す細胞を同定し、これはｃ−ｋｉｔ陽性細胞が膵臓における特殊化した細胞の供給源を表し得ることを示唆した。図２Ａは、島内部の一部の細胞がｃ−ｋｉｔおよびインスリンを同時発現することを示す。図２Ｂは、島内部の一部の細胞がｃ−ｋｉｔおよびＣペプチドを同時発現することを示す。図２Ｃは、島内部の一部の細胞がｃ−ｋｉｔおよびグルカゴンを同時発現することを示す。図２Ｃ中のボックス領域の拡大図を図２Ｄ〜２Ｆに示す。拡大図は、ｃ−ｋｉｔ（図２Ｄ）、グルカゴン（図２Ｅ）を発現する細胞ならびにｃ−ｋｉｔおよびグルカゴンの２つのシグナルのマージを通じた同時発現（図２Ｆ）を示す。
【０２５０】
Ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、管の上皮内層内部および外分泌膵臓におけるその近傍で同定された（図３Ａ〜３Ｃ）。時折、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、上皮マーカーＣＫ１９および酵素アミラーゼを発現した。図３Ａ中のボックス領域の拡大図を図３Ｂ〜３Ｃに示す。図３Ｂ〜３Ｃは、一部の外分泌細胞がｃ−ｋｉｔおよび上皮マーカーＣＫ１９を同時発現することを示す。図３Ｂ〜３Ｃ中の矢印は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を示す。
【０２５１】
実施例２
Ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は自己複製性、クローン原性および多能性である
膵標本を酵素的に解離させ、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離および培養し、それは幹細胞の３つの特性：自己複製能、クローン形成能および多分化能を有することが見出された。
【０２５２】
ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、非対称的に分裂し、娘幹細胞および娘委任細胞を生成した。加えて、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、対称的に分裂し得る。分裂の様式は、細胞運命決定因子αアダプチンの不均一または均一分布に基づいて規定された（図４）。
【０２５３】
９６ウェルプレートの単一ウェル内に個別に蓄積させたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、娘細胞からなるクローンを生成し、それはｃ−ｋｉｔの発現を保持した（図５）。
【０２５４】
分化培地（図６Ａ〜６Ｃ中の「Ｄｅｘａ」）に曝露したクローンｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、内分泌および外分泌系統のマーカーを得た。分化したｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、β細胞マーカーのＣペプチド（図６Ａ）、内分泌α細胞マーカーのグルカゴン（図６Ｂ）、および外分泌細胞マーカーのアミラーゼ（図６Ｃ）を発現する。加えて、ｈＰＳＣは、グルコースでの刺激後、インビトロでインスリンを分泌する（図６Ｄ）。
【０２５５】
実施例３
糖尿病ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスにおけるｈＰＳＣのインビボ試験
ヒト膵臓幹細胞（ＰＳＣ）が糖尿病ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスの膵臓に送達されるインビボ試験を実施する。目的は、ＰＳＣがインスリン産生β細胞に分化し得るかを確認することである。この場合、血糖レベルの低下および糖尿病の改善が得られることになる。
【０２５６】
実施例４
ヒト膵臓はインスリン産生幹細胞の区画を有する
β細胞の新生は、内分泌膵臓が、妊娠、肥満に伴う、または部分的膵臓切除後のインスリン分泌への高まる需要を満たすことを可能にする。一般的見解は、高度に特殊化したβ細胞が、細胞周期に再び入り、自己複製し、β細胞集団を回復させ、血糖レベルを正常化することである。逆に、β細胞増殖を部分的に制御するヒト膵臓幹細胞（ｈＰＳＣ）の認識は不明確な状況である。本開示は、ヒト膵臓が、組織特異的な成体幹細胞の決定的な識別子である、自己複製性、クローン原性および多能性であるｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣのプールを有することを示す。ｈＰＳＣは、インビトロおよびインビボで内分泌β細胞およびα細胞、および外分泌腺房細胞にコミットし、対応するホルモンおよび酵素を生成する。２つのマウスモデルにおける運命マッピングプロトコルにより、これらの観察結果が確認されており、これは膵臓生物学の新しいパラダイムを示唆する。β細胞形成の機構を理解することにより、この天然に存在するプロセスを増強するための機会が得られ、ヒト糖尿病を管理するための新規な方法が提供され得る。
【０２５７】
生物の出生後での成熟後、幾つかの臓器は、生理的な細胞代謝回転を調節し、損傷後の組織修復に寄与する幹細胞区画を保有し続ける。内分泌膵臓は、明らかに出生後間もなく失われるニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）陽性前駆細胞の一過性集団から発生する(Soyer et al., 2010)。しかし、β細胞の新生は、内分泌膵臓が妊娠および肥満に伴い、または部分的膵臓切除後に生じるインスリン分泌への高まる需要を満たすことを可能にする決定的なプロセスである(Menge et al., 2012）。したがって、基本的課題は、インスリン分泌細胞の起源に関連する。一般的見解は、高度に特殊化した高分化型β細胞が、細胞周期に再び入り、自己複製し、β細胞集団を回復させ、血糖レベルを正常化し得るということである(Dirice et al., 2014; Dor et al., 2004; Mezza and Kulkarni, 2014)。
【０２５８】
高分化細胞が細胞周期に再び入り、分裂し得るという仮定は、本質的に生物学的矛盾である。さらに、自己複製がβ細胞増殖の機構であるという考えは、固有の制限を有する、インスリンプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子を用いる系統追跡試験から得られた(Dor et al., 2004)。この手法における主なバイアスは、インスリンの存在が機能的β細胞に制限されると仮定されていることである。ホルモンは、コミットされていないインスリン陰性膵臓幹細胞（ＰＳＣ）の活性化および漸進的な系統特異化により生成される、前駆(progenitor)−前駆(precursor)細胞および増殖細胞において等しく発現され得る。インスリンは、成体マウスおよび胎児ヒト膵臓におけるＮｇｎ３陽性およびＰｄｘ１陽性前駆(progenitor)−前駆(precursor)細胞を含む、発生的に異質な細胞集団にて検出されており(Jiang and Morahan, 2012)、より多くの未分化細胞がβ細胞の増殖および分化を制御し得ることが示唆される。しかし、β細胞の代謝回転および再生を制御する単能性または多能性の常在ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）の認識は不明確な状況である。
【０２５９】
本開示は、成体ヒト膵臓が、インビトロで自己複製性、クローン原性および多能性であるｃ−ｋｉｔ陽性細胞のプールを有することを示す。重要なことには、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の関与により生成されるβ細胞は、グルコース刺激に応答してヒトインスリンを合成する。さらに、マウスにおける系統追跡試験は、膵臓の内分泌および外分泌成分がｃ−ｋｉｔ陽性細胞の複製および分化からインビボで得られるという考えを支持する。まとめると、これらの知見は、哺乳動物膵臓が臓器恒常性を調節する常在幹細胞の区画により調節されることを示唆する。
【０２６０】
ヒト膵臓はｃ−ｋｉｔ陽性細胞を有する
造血、心臓および肺幹細胞の同定および特徴づけのため、ｃ−ｋｉｔエピトープが以前に用いられており(Beltrami et al., 2003; Ellison et al., 2013; Leri et al., 2015; Liu et al., 2015; Orlic et al., 1993)、この受容体チロシンキナーゼが組織特異的な成体幹細胞の他のクラスにおいて発現され得るという可能性が高まっている。発明者は、ｃ−ｋｉｔの存在が、他の臓器における幹細胞との類似性により、自己複製性、クローン原性および多能性であるｈＰＳＣのプールを解明するか否かについて試験した。手術時に廃棄された正常に見えるヒト膵臓の２９の試料をこの試験に含めた（図７）。ｃ−ｋｉｔ受容体は、マスト細胞の原形質膜中に高度に発現されるが、ここではトリプターゼの不在および存在が推定上のｈＰＳＣおよびマスト細胞を各々識別するために利用された(Esposito et al., 2002)。
【０２６１】
試験のすべての場合に、ｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陰性の推定上のｈＰＳＣが組織学的に同定された。それらはランゲルハンスの島内部または外分泌腺房細胞の近傍に位置し（図８Ａ〜８Ｃ、および図９）；それらはまた、小膵管の上皮内層内部に見出された（図８Ｄ）。ｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陰性細胞は、Ｃペプチド（図８Ａ）、アミラーゼ（図９）およびサイトケラチン１９（図８Ｄ）を発現しなかったか、またはインスリン（図８Ｂ）およびグルカゴン（図８Ｃ）により同時標識された。
【０２６２】
組織内のｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陰性およびｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陽性細胞の数を評価するため、定量的分析を実施した（ｎ＝６）。マスト細胞は、優先的な解剖学的局在が欠如した実質全体を通じて同定された。しかし、マスト細胞は、膵管の上皮内部で検出されなかった。平均でｃ−ｋｉｔ陽性細胞６３１個／膵細胞１０６個であり；ｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陰性の推定上のｈＰＳＣは、２６個／膵細胞１０６個、すなわち膵細胞３８，５００個あたり１個の頻度で存在した。ｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陽性マスト細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の大部分、すなわち６０５個／膵細胞１０６個を構成した（図８Ｅ）。推定上のｈＰＳＣがｃ−ｋｉｔ陽性細胞プールの４％を構成した一方、マスト細胞はこの細胞区画の９６％を占めた。したがって、膵臓は、コミットされていないかまたは系統特異化を示すタンパク質を同時発現する、ｃ−ｋｉｔ陽性である推定上のｈＰＳＣの希少集団を有する。
【０２６３】
ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は自己複製性およびクローン原性である
組織試料は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の単離およびインビトロ増殖のため、利用した（ｎ＝１６）。非分画化細胞区画の酵素的消化および拡大後、ｃ−ｋｉｔ受容体の異なるエピトープを認識する２つのモノクローナル抗体を用いて細胞をＦＡＣＳ選別した。両抗体と反応する細胞のみを収集し、非特異的結合を最小化した（図１０Ａ）。これらの調製物から、平均で０．４％のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を得た（図１０Ｂ）。加えて、ＦＡＣＳ選別したｃ−ｋｉｔ陽性およびｃ−ｋｉｔ陰性画分の試料を蒔き、特異性を意図して、第３のｃ−ｋｉｔ抗体で染色した（図１１Ａ）。
【０２６４】
その後、ＦＡＣＳ選別したｃ−ｋｉｔ陽性細胞を蒔き、さらなる拡大（図１０Ｃ）および細胞分裂のパターンの記述を行った（ｎ＝５）。対称細胞分裂を図示するため、エンドサイトーシスタンパク質αアダプチンの二極局在を用いた一方、非対称細胞分裂を記述するため、αアダプチンの単極性分布を用いた(Williams et al., 2011)。定量的には、対称細胞分裂が優勢であった（図１０Ｄ）。
【０２６５】
Ｐ２〜Ｐ４時、２９中１４の組織試料からのｃ−ｋｉｔ陽性細胞をＦＡＣＳ選別し、９６ウェルプレートの単一ウェル内に個別に播種した（図１１Ｂ）。３週間にわたり、多細胞クローンを得て、クローン効率を測定した（図１０Ｅ、図１０Ｆ、および図１１Ｃ）。加えて、拡大されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、造血細胞系統ＣＤ３４およびＣＤ４５ならびに間葉系間質細胞のエピトープＣＤ９０に対して陰性であった。細胞の大半において、ＣＤ１０５が検出された（図１１Ｄ）。したがって、ヒト膵臓は、自己複製性およびクローン原性であり、対称的および非対称的に分裂するｃ−ｋｉｔ陽性細胞のプールを有する（すべては組織特異的な成体幹細胞の決定的な識別子である）。
【０２６６】
各ｈＰＳＣの分子シグネチャーは異質である
クローンｈＰＳＣが確立された膵臓前駆細胞の未分化および多能性状態に一致する転写特性を有するか否かを判定するため、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびNanoString技術を利用した。各ｃ−ｋｉｔ陽性細胞から得られた別々のクローンを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより試験した（ｎ＝４）。加えて、分化を促進するため、クローンｈＰＳＣを７日間、１０−８Ｍのデキサメタゾンで処理した。
【０２６７】
クローンｈＰＳＣは、前駆細胞運命の主な決定因子であるＰｄｘ１、Ｓｏｘ９およびＮｇｎ３と一緒に、ｃ−ｋｉｔを発現した（図１２Ａ）(Arda et al., 2013; Jennings et al., 2015)。すべての膵細胞は、Ｐｄｘ１胚性前駆細胞から得られ(Murtaugh and Melton, 2003)、外分泌腺房および導管細胞を、またランゲルハンス島の４つの内分泌細胞型を生成する(Gu et al., 2002)。転写因子Ｓｏｘ９は、胚性膵臓において、有糸分裂活性があるＰｄｘ１陽性多能性前駆細胞のサブセットを同定する(Gradwohl et al., 2000; Seymour, 2014)。デキサメタゾンにより、ｃ−ｋｉｔおよびＳｏｘ９  ｍＲＮＡが有意に減少したが、Ｎｇｎ３およびＰｄｘ１の発現は変化しなかった（図１２Ａ）。したがって、ｃ−ｋｉｔは、以前に認識された膵臓前駆細胞の他のクラスを含み得るｈＰＳＣの区画を同定する。
【０２６８】
Nanostringプロトコルを用いることにより、クローンｈＰＳＣのｍＲＮＡプロファイリングを得た(Manoranjan et al., 2013)。この技術は、色分けされた分子バーコードおよび単分子イメージングを用いて、標的ＲＮＡ分子のデジタル定量化を可能にする。Nanostringシステムは高レベルの特異性および感度を有することから、１細胞あたり１つの転写物コピーが測定され得る。Nanostring分析により得られた生データをハウスキーピング遺伝子の発現に基づいて正規化し、試料中の遺伝子の差次的発現をヒートマップとして示す。
【０２６９】
１９５の幹細胞に関連したヒト遺伝子のパネルを、ｈＰＳＣの単細胞由来クローンにおいて試験した（ｎ＝３）。遺伝子発現は、未処理のクローン細胞および分化誘導物質のデキサメタゾンに７日間曝露したクローン細胞において測定した。各クローンにおいて、遺伝子発現は、デキサメタゾンで未処理の対応するクローン細胞に対するパーセント差異として示し、ヒートマップとして表す。赤色は、デキサメタゾンの存在下で培養した細胞における、未処理細胞よりも高い遺伝子発現のレベルに対応する。青色は、デキサメタゾンに曝露した細胞における、未処理細胞よりも低い遺伝子発現のレベルに対応する。
【０２７０】
３つのクローン細胞セットは、幹細胞の維持および系統決定にとって重要である、３つのシグナル伝達経路：Ｗｎｔ／β−カテニン経路、ＴＧＦ−β／ＢＭＰ経路およびＮｏｔｃｈ経路の活性化または抑制の異なる程度を示した。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、臓器の内分泌および外分泌区画双方の発生に必要とされる(Arda et al., 2013)。Ｗｎｔ／β−カテニン経路の遺伝子は、３つのクローン細胞セットにおいて差次的に調節され（図１２Ｂ）、これはデキサメタゾンに曝露したクローン細胞の中でのある程度の分子異質性を示した。
【０２７１】
ＴＧＦ−β／ＢＭＰ経路は、β細胞形成に関与し、ＴＧＦ−βの阻害は、β細胞の複製を促進するが、生理学的に機能障害性であり得る(Brown and Schneyer, 2010)。Ｗｎｔ／β−カテニン経路において認められる場合に類似した様式では、ＴＧＦ−β／ＢＭＰシグナル伝達系の遺伝子転写物は、３つの試料において等しく調節されなかったが（図１２Ｃ）、各ｈＰＳＣの複製から得られる細胞集団がデキサメタゾンに対して異なって反応することがさらに示唆された。
【０２７２】
逆に、Ｎｏｔｃｈ経路の成分は、クローン細胞の３つの群において、同様に調節された（図１２Ｄ）。Ｎｏｔｃｈの活性化は、胚性膵臓前駆細胞の未分化状態を維持し、内分泌および外分泌細胞の特異化を阻害する(Shih et al., 2012)。Ｎｏｔｃｈの下方制御およびＮｇｎ３に対するＨｅｓ１の抑圧的機能の抑止は、β細胞分化にとって必要とされる(Qu et al., 2013)。Ｄｅｌｔａ様リガンド１、Ｊａｇｇｅｄ２リガンド、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ４受容体、転写因子ＲＢＰｊｋ、Ｚｎフィンガータンパク質ＧＬＩ２およびＧＬＩ３、転写コアクチベーターＭＡＭＬ２およびＭＡＭＬ３、ならびに細胞運命決定因子Ｎｕｍｂは、クローンｈＰＳＣの３つのセットにおいて、デキサメタゾンにより下方制御され、それらのβ細胞系統の獲得が示された。
【０２７３】
集合的に、Ｎｏｔｃｈの転写減衰は、クローンｈＰＳＣの内分泌細胞表現型への分化を支持し得るが、ベースライン時およびデキサメタゾン後の遺伝子発現におけるクローン間の変動性は、単細胞レベルでのそれらの機能的異質性を強調し、この現象は成体幹細胞のすべてのクラスに共通する(Goodell et al., 2015)。
【０２７４】
ｈＰＳＣの分化はＣペプチド、グルカゴン、アミラーゼを発現し、ヒトインスリンを合成する
上で論じた分子アッセイにより、ベースライン時およびデキサメタゾンへの曝露後、クローンｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣのｍＲＮＡ特性が明らかになった。結果として、この分析は、組織特異的な成体幹細胞のこの新規クラスの多分化能を強化するため、特定の細胞質タンパク質の検出で補完した。ＦＡＣＳ選別したｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣ（ｎ＝４）を拡大し、次にデキサメタゾンを含有する分化培地中で培養し、１週間後、免疫標識および共焦点顕微鏡により細胞を試験した。
【０２７５】
未分化対照細胞におけるｃ−ｋｉｔの発現は、すべての場合に明白であった。デキサメタゾンの存在下で、プロインスリンＣペプチドの上方制御（図１２Ｅ）は明白であり、グルコースの培地への添加に基づくグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）プロトコルは、ヒトインスリンの合成をもたらし、それは高感度ＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。さらに、ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣは、α細胞表現型を獲得し、細胞質内でグルカゴンを呈したか、またはアミラーゼを示す外分泌腺房細胞の特性を得た（図１２Ｆおよび図１２Ｇ）。しかし、デキサメタゾンプロトコルは、ｃ−ｋｉｔ発現の完全な喪失と関連しなかった。したがって、ｈＰＳＣは、その多分化能に一致して、特殊化した膵細胞に分化する能力を有する。
【０２７６】
ｈＰＳＣは免疫不全マウスの膵臓に生着および分化する
単細胞由来のクローンｈＰＳＣが膵臓でコロニーを形成する能力を有するか否かを試験するため、免疫易感染性マウスにおける損傷の簡素化された形態として凍結損傷を用いた。その直後、ＰＫＨ２６またはＧＦＰ陽性細胞を死組織の近傍に注射した（ｎ＝６）。１〜８日後、細胞治療臓器の組織学的切片を試験した。この時間間隔は、他の系において約２４時間以内に幹細胞ホーミングが生じ、数日以内に系統特異化が明白であることから選択した(Quesenberry et al., 2005; Rota et al., 2007)。標識ｈＰＳＣの幾つかの個別の小群が保存されたインタクトな組織内で検出された一方（図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１４Ａ）、タグ化ｈＰＳＣのより大規模なプールが損傷領域内で同定され（図１３Ｃ）、ｈＰＳＣが膵臓の非病理学的部分および病理学的部分へ遊走およびホーミングする能力があることが示された。
【０２７７】
レシピエントマウス臓器内に投与されたｈＰＳＣの組込みおよび潜在的機能は、注射された細胞の運命獲得により実証された。生着されたｈＰＳＣの単一の小群および大群が、β細胞表現型を獲得し、インスリンまたはＣペプチドを発現した（図１３Ｄ〜１３Ｆ、および図１４Ｂ）。加えて、Ｃペプチドまたはインスリンに対して陽性である各β細胞が、組織全体に散らばった（図１５）。アミラーゼを形成する外分泌腺房細胞の生成もまた認められた（図１３Ｇ）。元の未分化状態を保持するクローンｈＰＳＣが、試験対象の全部で６匹の動物における臓器の複数部位に分布した（図示しない）。したがって、インビトロで増殖したｈＰＳＣは、それらの可塑性を保持し、膵臓の保存された損傷部分にインビボでホーミングし得、これはヒトの１型および２型糖尿病における幹細胞治療の将来的実施と密接に関連した知見である。
【０２７８】
ｃ−ｋｉｔ陽性膵細胞の運命マッピングはその多分化能を記述する
多能性ｈＰＳＣの認識は、特殊化した膵細胞が、脱分化し、細胞周期に再び入り、分裂する既存の分裂終了細胞の自己複製に由来するという一般的解釈と対照的である(Dor et al., 2004)。常在幹細胞区画が成体臓器の内分泌および外分泌細胞の恒常性を調節するという可能性が以前から高まっている(Jiang and Morahan, 2012; Xu et al., 2008)。
【０２７９】
実験膵病理学におけるｃ−ｋｉｔに対して陽性である導管および分化島細胞の潜在的役割を指摘する情報が提起されているが、これらの試験の中で、これら委任細胞の幹細胞特性について示しているものはない(Feng et al., 2015)。ラットにおける膵管の結紮は、導管および島細胞におけるｃ−ｋｉｔの上方制御に関連し、それは細胞新生へのそれらの関与を示唆している(Peters et al., 2005)。ストレプトゾトシン誘導糖尿病後(Tiemann et al., 2007)、またラットの膵炎モデルにおいて(Gong et al., 2012)、同様の観察がなされている。ラットにおける上記データおよびこれらの知見に基づくと、ヒト膵臓における結果は、マウスにおける系統追跡試験で補完されている。このプロトコルは、前駆細胞とそれらの子孫との間の関連性を解明する可能性を有する強力なツールを表す(Kretzschmar and Watt, 2012)。
【０２８０】
膵細胞の起源は、タモキシフェン誘導性のｍｅｒ−Ｃｒｅ−ｍｅｒタンパク質がＫｉｔ遺伝子座に標的化されるようなトランスジェニックマウスモデルにおいて最初に判定された(van Berlo et al., 2014)。これらのマウスは、タモキシフェン投与時にｃ−ｋｉｔを発現する任意の細胞をＧＦＰで不可逆的に標識するため、Ｒ−ＧＦＰレポーター系統と異種交配させ、すなわちＫｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスとした。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の子孫は、細胞分化に伴うｃ−ｋｉｔ発現の低下後、細胞質内に存続する蛍光タグの存在により認識することができる。
【０２８１】
この遺伝的方法により、６〜８か月間のタモキシフェン治療後（ｎ＝５）、外分泌腺房細胞がＧＦＰに対して強く陽性であったことが見出されている（図１６Ａ）。さらに、ＧＦＰ標識β細胞は、一貫してランゲルハンス島内部に見出された（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。次に、第２のレポーターマウスｍＴ／ｍＧを導入した(Muzumdar et al., 2007)。この二色のＣｒｅレポーターマウスでは、膜標的化ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｍＴ）がＣｒｅ媒介性組換え前に発現される一方、膜に制限された緑色蛍光タンパク質（ｍＧ）が停止コドンの除去後に限り明白になる。これらｍＴ／ｍＧマウスをＫｉｔ＋／ＭＣＭ動物と異種交配させ、Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウスを作製した。タモキシフェンを毎日５日間、腹腔内注射し、１０日後に屠殺した（ｎ＝６）。このプロトコルは、Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスにおけるタモキシフェンへの有意に長期化した曝露を補完するため、導入した。膵臓の領域をＧＦＰによって標識したところ、ＧＦＰは、明白であり、アミラーゼ陽性外分泌細胞およびインスリン陽性内分泌β細胞の表面に制限された（図１６Ｃおよび図１７）。
【０２８２】
ｃ−ｋｉｔ遺伝子などの著しく調節された遺伝子座への複合構築物の挿入は、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現に影響し得る。Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスにおけるｍｅｒ−Ｃｒｅ−ｍｅｒ構築物は、これらの制御イントロン配列の１つに近接しており(Cairns et al., 2003; Nadal-Ginard et al, 2014)、これはＣｒｅリコンビナーゼに影響し得る。この潜在的な制限が理由で、第２の運命マッピングモデルは、ｃ−ｋｉｔプロモーターの異なる領域が標的化されるＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスで試験した(Goss et al., 2016; Hatzistergos et al., 2015)。Ｃｒｅ−ＥＲＴ２構築物を、近位イントロン領域に影響することなく、ｃ−ｋｉｔの第１エクソンに挿入した(Goss et al., 2016; Hatzistergos et al., 2015)。これらのマウスは、Ｃｒｅ媒介性組換えの不在下で天然赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）がすべての臓器にて発現されるように、二色ＩＲＧレポーター系統と異種交配させた。タモキシフェン投与およびＣｒｅ媒介性組換えの場合、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞およびそれらの子孫はＧＦＰで不可逆的に標識される。２〜３か月間のタモキシフェン治療後（ｎ＝４）、マウス膵臓の広範な領域が、ＧＦＰ、アミラーゼおよびインスリンに対して陽性であったが（図１８Ａおよび図１８Ｂ）、これはこれらの特殊化した細胞がｃ−ｋｉｔ陽性細胞に由来することを示した。したがって、トランスジェニックマウスにおけるこれらの結果により、ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣが多能性であり、臓器恒常性を生理学的に調節し得るという考えを強化するヒトデータが確認される。
【０２８３】
天然ＧＦＰは系統特異的な膵細胞タンパク質とともに同時発現される
異なる細胞内タンパク質についての考証は、異なる膵細胞型の同定および特殊化した内分泌および外分泌細胞がｃ−ｋｉｔ陽性細胞に由来するか否かの理解にとって必要である。この情報は、臓器の解剖、組織の酵素消化、ならびに単離細胞の固定および特異的抗体による免疫標識に続いて得ることができる。ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウスは、隔週で６週間、タモキシフェンに曝露し、新規に単離した膵臓は、複数の組織領域が天然ＧＦＰ蛍光によって標識されることを示した（図１９Ａ）。最初に、天然ＧＦＰの存在が細胞の固定および透過処理により影響を受けたか否かを判定するための実験を実施した。天然ＧＦＰに対して陽性である膵細胞のプールにおいて、未処理であるかまたは固定および透過処理されたかと無関係に差異は見出されなかった。両方の場合において、膵細胞の約８〜９％がレポーター遺伝子を発現した（図１９Ｂ）。
【０２８４】
この結果に基づき、３つの細胞内タンパク質、すなわち、インスリン（ｎ＝５）、Ｃペプチド（ｎ＝２）、およびグルカゴン（ｎ＝２）について検討した。単離された膵細胞の全区画内で、天然ＧＦＰを発現するインスリン陽性、Ｃペプチド陽性およびグルカゴン陽性細胞の百分率は各々、６％、２０％および１４％であった（図１９Ｃ）。ＧＦＰを発現する非内分泌細胞の有意な画分は主に、アミラーゼを合成する外分泌細胞の大規模プールを反映し得る。その後、これら３つの細胞カテゴリーの各々の範囲内での天然ＧＦＰによって標識されたインスリン陽性、Ｃペプチド陽性およびグルカゴン陽性細胞の頻度を測定した。二重陽性細胞の画分は、インスリン、Ｃペプチドおよびグルカゴンに対して各々、１６％、２３％、および２４％であった（図１９Ｄ）。したがって、ヒト膵臓におけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞がインビトロで自己複製性、クローン原性および多能性であり、かつマウスｃ−ｋｉｔ陽性細胞がインビボでβ細胞、α細胞および外分泌腺房細胞に分化するという理解は、哺乳動物膵臓が常在幹細胞のあるクラスにより調節されるという考えを強化する。
【０２８５】
本開示では、劇的な臨床的意義を有する膵臓生物学のパラダイムシフトについて検討する。ｃ−ｋｉｔ受容体の発現によりここで同定されたｈＰＳＣは、β細胞の増殖およびインスリンの合成、α細胞およびグルカゴンの生成、ならびに腺房細胞およびアミラーゼの形成に関与する。一連のインビトロおよびインビボアッセイを運命マッピングの方法と組み合わせて実施し、真の組織特異的な成体幹細胞としてのｃ−ｋｉｔ陽性細胞の理解および機能的役割を支持する説得力のある証拠を得た。したがって、ヒト膵臓は、常在幹細胞区画によって調節され、それは骨髄、皮膚、腸、肺および心臓に類似した自己複製性臓器として規定される。
【０２８６】
長年にわたり、β細胞の再生をもたらす生物学的過程を理解しようとする努力がなされている。生理学的および病理学的にβ細胞区画の拡大に関与する過程として、自己複製が提起されている(Dor et al., 2004)。これに関連して、３〜１２月齢のマウスにおいて、β細胞数における６倍の増加が報告されている(Dor et al., 2004)。しかし、成体ヒト膵臓におけるβ細胞の生成は、明らかに極端に限られ(Perl et al., 2010)、自己複製が実際に生じるか否かは疑問の余地があり、明確に規定された機能を有する高度に特殊化した細胞がいかにしてＤＮＡを複製し、分裂し得るかを想定することは困難である。この過程は、前駆細胞様表現型を獲得し、細胞周期に再び入り、増殖するような分裂終了β細胞の脱分化を含むことになる(Dor and Glaser, 2013; Weinberg et al., 2007)。残念ながら、インビボでの細胞の脱分化を規定することが可能な形態学的基準は存在せず(Leri et al., 2015)、新しいβ細胞のこの潜在的な供給源については難解である。同様に、インスリンを合成および分泌する能力を達成する既存の外分泌細胞の分化転換または再プログラム化については議論の余地がある(Gomez et al., 2015; Lemper et al., 2015)。本開示において特徴づけられるｈＰＳＣは、肥満、妊娠に伴う、また部分的膵臓切除後のβ細胞の増殖適応についての理解に対して妥当な生物学的基盤をもたらす。
【０２８７】
幹細胞が成体膵臓におけるβ細胞形成を制御することを立証または反証するため、単一の創始細胞のクローンアッセイが要求され；幹細胞は、自己複製および分化するという二重の能力により特徴づけられる個別の細胞実体である(Hsu and Fuchs, 2012; Leri and Anversa, 2016)。細胞集団に基づく試験は、幹細胞挙動をクローン性、自己複製能、および多分化能の観点で明確にするには至らない。この制限は、特異的なプロモーター駆動性レポーター遺伝子が事前に選択される系統追跡試験では明白であり、人為的な区画化因子(compartmentalization factor)の導入により (Leri and Anversa, 2016)；例えば、インスリンプロモーターの使用により、未分化の系統陰性幹細胞に対して遠位のβ細胞になる運命の細胞クラスのみが標的化されることになる(Dor et al., 2004; Xiao et al., 2013)。さらに、インスリン陽性細胞集団は、著しく異質性であり、高分化細胞および前駆細胞(progenitors)／前駆細胞(precursors)の中間的な未熟表現型を有する細胞を含む。これらの交絡変数を回避するため、幹細胞抗原ｃ−ｋｉｔのプロモーターが、ここで用いられたトランスジェニックマウスにおいて標的化された(Hatzistergos et al., 2015; van Berlo et al., 2014)。
【０２８８】
当初、心臓、腸およびマスト細胞におけるｃ−ｋｉｔ受容体の役割を判定するために開発されたこれら２つのトランスジェニックマウスにおいて、膵臓の外分泌および内分泌区画におけるＧＦＰ標識の異なる強度および分布が観察された(Hatzistergos et al., 2015; Heger et al., 2014; Klein et al., 2013; van Berlo et al., 2014)。しかし、Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスにおける内分泌および外分泌腺房細胞でのＧＦＰシグナルは、ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウスにおける場合よりも強力でありかつ散在性があった。さらに、ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウスでは、外分泌腺房細胞におけるＧＦＰ標識は、内分泌細胞における場合よりも明白であった。レポータータンパク質の発現におけるこの変動性は、容易に説明することができない。
【０２８９】
これらの遺伝的モデルの作製において利用されるノックイン構築物(Hatzistergos et al., 2015; van Berlo et al., 2014)は、ｃ−ｋｉｔ対立遺伝子の一方の欠失をもたらす。ＰＳＣでのｃ−ｋｉｔの発現における減少は、組織の外分泌成分よりも著しく内分泌に影響しており、腺房細胞よりも大して強力に標識されていないＧＦＰ陽性β細胞をもたらし得る。心筋細胞よりも内皮細胞において (van Berlo et al., 2014)、または血管細胞よりも心筋細胞において(Hatzistergos et al., 2015)、ＧＦＰが著明であることが見出されている心臓において、同様の現象が認められている。ノックインマウスにおけるｃ−ｋｉｔ遺伝子座の破壊により、ｃ−ｋｉｔ突然変異体マウスにおいて認められる場合と類似した表現型的改変が促進される(Geissler et al., 1988)。事実、すべてのマウスが腹部の白班を呈し、睾丸の重篤な萎縮を有したが（図２０Ａ〜２０Ｂ）、いずれもがｃ−ｋｉｔ遺伝子座でのＣｒｅノックインの結果としてのｃ−ｋｉｔ機能における改変を示した(Hatzistergos et al., 2015; Nadal-Ginard et al., 2014)。膵臓の恒常性調節におけるｃ−ｋｉｔの決定的役割は、受容体チロシンキナーゼ活性の部分的低下が、インスリン分泌欠損、β細胞集団の減少、β細胞増殖の減弱および糖尿病表現型の徴候に関連するような一部のｃ−ｋｉｔ突然変異体マウスに存在する異常と一致している(Krishnamurthy et al., 2007)。
【０２９０】
成体臓器におけるｈＰＳＣの分子同一性は、機能的内分泌および外分泌細胞への移行中の胚性膵臓前駆細胞の場合を再現する。胚性前駆細胞の遺伝子制御ネットワークは、典型的にはますます制限された発生オプションを有する前駆細胞内に見出される転写因子の逐次活性化および抑制を含む。ｃ−ｋｉｔの発現は、多能性前駆細胞を同定する２つの転写因子Ｐｄｘ１およびＳｏｘ９に関連することが見出されている(Seymour, 2014)。加えて、内分泌および外分泌運命決定因子Ｐｄｘ１、Ｓｏｘ９およびＮｇｎ３は、ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣにおける発現のために準備され、それらの可塑性および多分化能を支持する重要な証拠が提供される。
【０２９１】
ｑＲＴ−ＰＣＲおよびNanoStringによって規定されるクローンｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣの転写特性を、膵臓の特殊化した細胞に典型的なタンパク質発現の評価で補完した。分化するｈＰＳＣにおけるＣペプチド、インスリン、グルカゴンおよびアミラーゼの検出は、ｃ−ｋｉｔが膵細胞の再生を調節する常在未分化細胞の区画を認識するというある程度説得力のある証拠を提供し、損傷後の組織修復に寄与し得る。
【０２９２】
近年、β細胞の特性を有する細胞が機能的同一性を共有しないという古い考えが見直されている(Dorrell et al., 2016)。多様な遺伝子発現特性およびグルコース応答性を有する４つの抗原性が異なるβ細胞サブセットが、ヒト島内に見出されている(Bonner-Weir and Aguayo-Mazzucato, 2016; Dorrell et al., 2016)。各細胞サブセットのβ細胞の全区画への寄与は、健常ヒト島において変わらないままであるが、糖尿病に伴って著しく変動し、グルコース刺激に対する感受性がより低いβ細胞の割合における増加をもたらす(Dorrell et al., 2016)。β細胞の動力学のインビボ分析によると、制限されたβ細胞のプールが妊娠中に活発に増殖し、成熟β細胞の集団における増加をもたらすことが示されている(Bader et al., 2016)。機能的に異なる細胞が独立細胞系統に対応するかまたは独立した実体を構成するかは、明確化されるべき状況である(Bonner-Weir and Aguayo-Mazzucato, 2016)。増殖型および分裂終了細胞の共存は、膵臓が、分化する幹細胞がコミットされた状態を次第に獲得し、分裂細胞の増殖への成熟を経験し、最終的には末端分化および増殖停止に至るような階層的に構成された系であり得ることを示唆する(Smukler et al., 2011)。
【０２９３】
ヒトにおける１型糖尿病の好ましくない進化がβ細胞の漸進的減少と相関する一方で、中程度の残留インスリン分泌は、改善された血糖コントロールおよび全身性合併症における低減からなる臨床的有用性をもたらす(Oram et al., 2014; Sherr et al., 2014)。重要なことには、持続的なインスリン産生および分泌が、５０年以上の１型糖尿病の病歴を有する患者の大コホートにおいて考証されている(Keenan et al., 2010)。インタクトな非アポトーシスβ細胞が、Joslin Medalist試験において最初に登録された糖尿病被験者９名から死後に収集されたすべての膵臓試料中で組織学的に同定されている(Keenan et al., 2010)。糖尿病の長期にわたる負の効果にもかかわらず、一部のβ細胞機能は維持され、ｈＰＳＣのプールが疾患の進化中でのβ細胞の補充に関与し得ることが示唆された。
【０２９４】
β細胞の劣化と末梢脈管障害、神経学的障害、腎症および心筋症の重症度との間の類似相関が２型糖尿病において見出されている(Boudina and Abel, 2007; Wajchenberg, 2007; Yagihashi et al., 2016)。Ｃペプチドの循環レベルでの低下は、内皮依存性血管拡張における低下を伴う血管異常の程度に比例する(Hadi and Suwaidi, 2007)。逆に、より有効なインスリン分泌は、代謝調節を保ち、かつ慢性合併症を減弱させる傾向がある(Saisho, 2014)。これらの臨床知見は、β細胞集団を回復させ、２型糖尿病において機能することとの関連性を強調する。
【０２９５】
結論として、ヒト膵臓は、インビトロで、また同様に重要であるがインビボで、インスリンを合成するβ細胞に分化する常在幹細胞の区画を有する。１型および２型糖尿病の存在にもかかわらず、インタクトなｈＰＳＣのプールは臓器内で存続し得、幹細胞の単離および増幅のため、生検試料が収集され得る。インビトロで増殖されたｈＰＳＣは、患者に逆に送達され得、ここで実験的に実証される通り、生着し、β細胞表現型を獲得し、幹細胞区画およびβ細胞集団を再構成し得、幹細胞治療は、糖尿病状態を矯正し、その全身的影響に干渉し得る
【０２９６】
ヒト膵臓試料
手術時に廃棄された正常に見える組織の２９の標本を試験に含めた。試料を２つの部分に分割した。一方の部分は、免疫標識および共焦点顕微鏡のため、１０％ホルマリンに固定し、パラフィン包埋することで、厚みが４〜６μｍの切片を得た。新しい組織のもう一方の部分は、後の消化のため、ＰＢＳで洗浄し、小片に分割した。場合によっては、試料の一部を凍結させた。
【０２９７】
ヒト膵臓の免疫標識および共焦点顕微鏡
膵臓試料からの組織切片を、４℃で一晩、ウサギポリクローナル抗ヒトｃ−ｋｉｔ（１：１００；Dako）およびマウスモノクローナル抗ヒトトリプターゼ（１：１００；Abcam）、またはヤギポリクローナル抗ヒトトリプターゼ（１：１００；R&D）で標識し、推定上のヒト膵臓幹細胞（ｈＰＳＣ）をマスト細胞と区別した(Sanada et al., 2014)。核をＤＡＰＩ(Sigma)により染色した。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の数、ならびにｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陰性の推定上のｈＰＳＣおよびｃ−ｋｉｔ陽性トリプターゼ陽性であるマスト細胞の数を、６つの無作為に選択された試料中で定量的に測定した（ｎ＝６）(Anversa & Olivetti, 2002; Sanada et al., 2014)。これらのパラメータは、組織切片中での３つの細胞クラスの各々に関係する核の数をそれら以外の膵細胞集団内に存在する核の数と一緒に評価することにより集めた。推定上のｈＰＳＣの系統コミットメントは、マウスモノクローナル抗ヒトＣペプチド（１：１００；Abcam）、マウスモノクローナルまたはモルモットポリクローナル抗ヒトインスリン（１：１００；Abcam）、マウスモノクローナル抗ヒトグルカゴン（１：１００；Abcam）、マウスモノクローナルまたはウサギモノクローナル抗ヒトアミラーゼ（１：１００；Santa CruzまたはCell Signaling）、およびマウスモノクローナル抗ヒトサイトケラチン１９（１：１００；Dako）での同時標識により判定した。インキュベーション時間は、あらゆる場合、３７℃で１時間であった。蛍光タンパク質を運搬する二次抗体を利用した。Olympus FV1000共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を収集した。画像取得中、全パラメータの設定を一定に維持した。
【０２９８】
インビトロでの膵細胞の単離および増殖
組織断片を、２５μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＬ(Roche)および０．０２％DNAse I (Sigma)を含有するHam’s F12培地(Lonza)中、３７℃で酵素的に解離させた。次に、単離した未分画細胞を、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する培地で洗浄し、その後、ラミニンコーティングディッシュ(Invitrogen)上に蒔いた。細胞は、１０％ＦＢＳ(HyClone)、５ｍＵ／ｍｌの組換えヒトエリスロポエチン(Sigma)、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−Ｂ）(Peprotech)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma)および０．２ｍＭのＬ−グルタチオン(Sigma)を添加したHam’s F12培地中で培養した(Beltrami et al., 2003; Bearzi et al., 2007)。増殖培地は、２〜３日毎に変更した。約８０％コンフルエント時、Acutase (Innovative Cell Technologies)を用いて細胞を解離させ、継代した。このプロトコルを１６の試料に適用した（ｎ＝１６）。
【０２９９】
ヒト膵細胞のフローサイトメトリーおよび選別
拡大された膵細胞を免疫標識し、ｃ−ｋｉｔについて選別した。プロセスの特異性を増強し、非特異的結合を回避するため、ｃ−ｋｉｔ受容体（ＣＤ１１７）の２つの異なるエピトープを認識する２つの抗体：ＡＰＣコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ１１７（１：１００；BD-Biosciences）およびＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ１１７（１：１００；Miltenyi Biotec）を利用した。２つの抗体に対するＡＰＣコンジュゲートおよびＰＥコンジュゲートマウスＩｇＧアイソタイプ対照（１：１００）を用いた(Liu et al., 2015)。標識反応を４℃で実行した。ＤＡＰＩによる染色を追加し、分析から死細胞を除外した。２つのｃ−ｋｉｔエピトープに対して陽性である細胞のみを選別し(BD FACSAria II;BD-Biosciences)、蒔き、１〜３日後試験した。選別し、蒔いた細胞の免疫標識のため、第３のｃ−ｋｉｔ抗体を用いた（１：１００；Dako）。
【０３００】
対称および非対称細胞分裂
細胞分裂の様式は、選別し、蒔いた細胞をｃ−ｋｉｔ（上記参照）およびαアダプチンについて標識することにより判定した（ｎ＝５）。αアダプチンについては、マウスモノクローナル抗ヒト（１：１００；Santa Cruz）を利用し(Ferreira-Martins et al., 2012)；反応を３７℃で１時間実施した。核をＤＡＰＩにより染色した。対称および非対称幹細胞分裂を各々識別するため、αアダプチンの均一な局在および非均一な局在をｃ−ｋｉｔと一緒に評価した。
【０３０１】
クローナルアッセイ
患者１４名からＦＡＣＳ選別したｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、９６ウェルプレートの単一ウェル内に個別に播種した（ｎ＝１４）。２〜３週間にわたり、多細胞クローンを得た(Bearzi et al., 2007; Beltrami et al., 2003; Liu et al., 2015)。細胞集団の存在を位相差顕微鏡で同定することによりクローン効率を測定し、５％メチレンブルー(Sigma)で固定および染色後、エタノールに溶解した。クローン細胞を増幅し、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびNanostring法を含む分子アッセイに利用した。
【０３０２】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
ｃ−ｋｉｔ、Ｐｄｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｇｎ３およびＮｋｘ６．１の転写物の検出のため、クローンｈＰＳＣ製剤から全ＲＮＡをTRIzolで抽出した（ｎ＝４）。ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとともに３７℃で２時間インキュベートした全ＲＮＡ１μｇから生成し、次に１：１０に希釈した。１反応あたり１／２００のｃＤＮＡを用いて、StepOnePlus Real Time PCR Systems(Applied Biosystems)でＲＴ−ＰＣＲを実施した。循環条件は次の通り：９５℃で１０分後、３５サイクルの増幅（９５℃で１５秒間の変性、および６０℃で１分間のアニーリング／伸長の組み合わせ）であった。ヒト特異的プライマー（下記参照）は、ＮＩＨプライマーデータベースqPrimerDepotからダウンロードするか、またはVector NTIソフトウェア(Invitrogen)を用いて設計した。定量化値は、ハウスキーピングヒト遺伝子β２ミクログロブリンによって測定されたインプットに対して正規化した。ＰＣＲ産物を２％アガロース／１×ＴＢＥゲル上を走らせ、予想される分子サイズを有するＤＮＡバンドを得た。
【０３０３】
【表１】
2019508503.tif 000003
【０３０４】
Nanostringプロトコル
１９４の幹細胞関連遺伝子パネルの発現は、ｈＰＳＣクローンにおいて評価した（ｎ＝３）。１０−８Ｍのデキサメタゾン(Sigma)の不在下または存在下で１週間にわたり培養した細胞を分析した。試料調製、ハイブリダイゼーション、検出、および走査を含む、ｍＲＮＡの定量化に関連するすべての手順は、NanoString Technologiesにより推奨される通りに実施した(Geiss et al., 2008; Talhouk et al., 2016; Veldman-Jones et al., 2015)。
【０３０５】
簡潔に述べると、全ＲＮＡは、Trizol法(Invitrogen)を用い、製造業者の使用説明書に従い、ｈＰＳＣから抽出した。Nanodrop 1000装置(ThermoFisher Scientific)を用いて、ＲＮＡ濃度を測定した。nCounter Stem Cell Codeset中に含まれる各遺伝子に対するプローブセットを設計し、NanoString Technologiesで合成した。内部参照遺伝子および３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨおよびＬＤＨＡ）を、正規化を目的としてCodesetに含めた。コードセットは、１９４の転写物の各々につき、３’ビオチン化捕捉プローブ、蛍光バーコードでタグ化された５’レポータープローブおよび２配列に特異的なプローブを含んだ。プローブは、６５℃で１６時間、全ＲＮＡ１００ｎｇにハイブリダイズし、その後、余分な捕捉およびレポータープローブを除去し、転写物に特異的な三元複合体をストレプトアビジンでコーティングされたカートリッジ上に固定化した。
【０３０６】
nCounter Digital Analyzerを用いてデータ収集を実施し、各蛍光バーコードを計数し、各試料中に存在する標的ＲＮＡ分子を定量した。各実験内での各遺伝子における生のNanoString数には、陽性対照プローブに対して得られた数を用いて、テクニカルな正規化を施した。その後、パネル中に含まれる３つのハウスキーピング遺伝子を用いて、生物学的正規化を行った。正規化データは、ｌｏｇ２変換した。平均バックグラウンド±２標準偏差よりも低かったすべてのｍＲＮＡは、検出限界を下回ると考えられた。対応ｔ検定を利用し、未処理クローンｈＰＳＣおよび対応するデキサメタゾンで処理されたクローンｈＰＳＣにおいて差次的に発現された遺伝子を同定した。結果は、未処理クローンｈＰＳＣに対するパーセント差異として表し、ヒートマップとして表した。
【０３０７】
ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の分化
異なる製剤から得たｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、１０−８Ｍのデキサメタゾン(Sigma)で１週間処理し、系統コミットメントを誘導した（ｎ＝４）。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ロバ血清でブロッキングし、ｃ−ｋｉｔおよびＣペプチド、アミラーゼまたはグルカゴンについて同時染色した。以下の実験条件：１：１００の濃度、４℃で一晩のウサギポリクローナル抗ヒトｃ−ｋｉｔ(Dako)；１：１００の濃度、３７℃で１時間のマウスモノクローナル抗ヒトＣペプチド(Abcam)；１：１００の濃度、３７℃で１時間のマウスモノクローナル抗ヒトグルカゴン(Abcam)；および１：１００の濃度、３７℃で１時間のマウスモノクローナル抗ヒトアミラーゼ(Santa Cruz)で実行した。ｃ−ｋｉｔおよび系統マーカーの発現は、共焦点顕微鏡により判定した。
【０３０８】
グルコース刺激によるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）
各ウェル内で培養したクローンｃ−ｋｉｔ陽性ｈＰＳＣを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで洗浄し、次に０．１％ＢＳＡおよび２．８〜３．３ｍＭのグルコースを含有するクレブス・リンゲル緩衝液（ＫＲＢ）中、１時間３７℃で１時間飢餓させた。グルコース刺激においては、細胞を、０．１％ＢＳＡおよび１６．７ｍＭのグルコースを添加した新しいＫＲＢに３７℃で１時間で移した。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、酸エタノール５００μｌで処理した。細胞をウェルから掻き取り、エッペンドルフチューブに収集し、１分間超音波処理した。細胞を４℃で一晩維持し、溶解プロセスを完了させた。可溶化液を４℃、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、高感度ヒトインスリンに特異的なＥＬＩＳＡアッセイにより上清を分析した。ＤＮＡの収集のため、ペレットをSpeedVac (Thermo Scientifics)を用いてさらに濃縮し、再懸濁した。ＤＮＡの濃度をNanodropにより測定した。インスリン値をＤＮＡ含量について正規化した(Dirice et al., 2014)。
【０３０９】
膵臓の損傷
動物は、Institute of Laboratory Animal Research Resources, Commission on Life Sciences, National Research Councilにより記述された、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従い、ヒューマンケアを受けた。イソフルラン（１．５％）麻酔下で、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（ｎ＝６）の腹部を開腹し、膵臓において体積が約２〜３ｍｍ３の凍結損傷を、液体窒素で予備冷却したステンレス鋼プローブを用いて誘導した。損傷領域は、冒された組織の浅色により同定した。その直後、ＧＦＰを保有するレンチウイルスに感染させた(Hosoda et al., 2009)、またはＰＫＨ２６色素で標識した(Liu et al., 2015)クローンｈＰＳＣの注射を３〜４回、損傷した実質に隣接する領域に施した。注射したクローンｈＰＳＣは、多くて２００，０００個であった。動物は、イソフルランの過剰投与および１〜８日後の心臓の切開により安楽死させた。膵臓は、１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。
【０３１０】
系統追跡
２つの異なるｃ−ｋｉｔノックインマウス系統：Ｋｉｔ＋／ＭＣＭおよびＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを試験した(Hatzistergos et al., 2015; Goss et al., 2016; van Berlo et al., 2014)。Ｋｉｔ＋／ＭＣＭマウスは、タモキシフェン投与時にｃ−ｋｉｔを発現する任意の細胞をＧＦＰで不可逆的に標識するため、ＬｏｘＰ部位依存性のRosa26-CAG-loxP-STOP-loxP-eGFP (R-GFP)レポーターマウスと交配させた(van Berlo et al., 2014)。
【０３１１】
Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰマウスに、２００〜４００ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを６〜８か月間与えた（ｎ＝５）。野生型マウスおよびタモキシフェンに曝露しないマウスを対照として用いた（ｎ＝２）。加えて、第２のレポーターマウスｍＴ／ｍＧを導入した(Muzumdar et al., 2007)。この二重蛍光Ｃｒｅレポーターマウスでは、Ｃｒｅ媒介性組換えに先立ち、膜標的化タンデム２量体Ｔｏｍａｔｏ（ｍＴ）が発現される一方で、停止コドンの除去後、膜標的化緑色蛍光タンパク質（ｍＧ）が発現される（すなわち、Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧ）。Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧマウス（ｎ＝６）では、これらマウスに、タモキシフェンを２ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ．）で毎日５日間腹腔内注射し、１０日後に屠殺した。
【０３１２】
Ｋｉｔ＋／ＭＣＭマウスで得られた結果を確認するため、ｃ−ｋｉｔプロモーターの異なる領域が標的化される、別のｃ−ｋｉｔノックインマウス、すなわちＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２マウス系統を試験した。Ｃｒｅ媒介性組換えの不在下で天然赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）がすべての臓器で発現されるように、ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを二色ＩＲＧレポーター系統と異種交配させた(De Gasperis et al., 2008; Goss et al., 2016; Hatzistergos et al., 2015)。ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウスは、２〜３か月間、タモキシフェン４００ｍｇ／ｋｇで処理した（ｎ＝３）。Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×Ｒ−ＧＦＰ、Ｋｉｔ＋／ＭＣＭ×ｍＴ／ｍＧ、およびＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウスは、組織学および免疫標識および共焦点顕微鏡のために用いた。フローサイトメトリーによる膵細胞の分析においては(Liu et al., 2015; Sanada et al., 2014)、細胞の単離および特徴づけの前、ＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋×ＩＲＧマウスに、タモキシフェン２００ｍｇ／ｋｇを隔週で６週間与えた（インスリンの場合、ｎ＝５であり、またＣペプチドおよびグルカゴンの場合、ｎ＝２である）。
【０３１３】
マウス膵臓の免疫標識および共焦点顕微鏡
脱パラフィンおよび再水和後、組織切片を、ＰＢＳ中の１０％正常ロバ血清(Jackson Immuno Research)で３０分間ブロッキングし、４℃で一晩または３７℃で２時間、ヤギポリクローナル抗ＧＦＰ（１：４０；Molecular Probes）とともにインキュベートした。ＰＢＳで１：１００に希釈した、マウスモノクローナル抗インスリン(Abcam)またはモルモット抗インスリン(Abcam)、およびウサギモノクローナル抗アミラーゼ(Cell Signaling)を用いて、β細胞および腺房細胞を各々標識した。ＰＢＳで洗浄後、組織切片を、ＰＢＳで１：１００に希釈したＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣコンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)に３７℃で１時間曝露した。パラフィン包埋ホルマリン固定組織切片の自己蛍光を回避するため、スライドを７０％エタノール中の１％Sudan Blackで３０分間処理した。切片にVectashieldハードセットマウンティング媒体(Vector Labs)を乗せた。Olympus FV1000およびNikon C2plus共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、画像を取得した。画像取得の間、すべてのパラメータの設定を一定に維持した。
【０３１４】
マウス膵細胞のフローサイトメトリー
新しく解剖した膵臓を撮影し、組織を酵素的に解離させ、ヒト試料における上記のような膵細胞を得た。最初に、天然ＧＦＰ蛍光を発現する生きた固定されていない膵細胞の百分率を、免疫標識固定したＧＦＰ陽性細胞の割合とともに測定した（ＦＩＴＣコンジュゲートウサギポリクローナル抗ＧＦＰ；１：１００）。後者の場合、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間、２％ホルムアルデヒドを含有する固定緩衝液(eBioscience)で固定した。次に、細胞を透過処理緩衝液(eBioscience)で透過処理し、ロバ血清でブロッキングした。β細胞およびα細胞の特徴づけについては、細胞懸濁液は、特異抗体またはアイソタイプに適合した対照抗体による染色前、ラットＩｇＧ２ｂ抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体(BD Bioscience)とともに室温で１５分間予備インキュベートした。細胞を、一次抗体：ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ（１：１００；Invitrogen）、モルモットポリクローナル抗インスリン（１：２００；Abcam）、マウスモノクローナル抗Ｃペプチド（１：２００；Abcam）、およびマウスモノクローナル抗グルカゴン（１：２００；Abcam）とともに室温で３０分間インキュベートした。染色細胞をＰＢＳで洗浄し、Alexa Fluor 488（ＧＦＰ）またはAlexa Fluor 647（系統マーカー）とコンジュゲートした二次抗体に曝露し、BD FACS Canto IIを用いて分析した。少なくとも１０，０００の事象が収集され、FlowJoソフトウェアを用いてデータを分析した(Liu et al., 2015; Sanada et al., 2014)。
【０３１５】
統計学的分析
データは、平均±標準偏差として示す。統計学的差異は、スチューデントｔ検定により評価し；ｐ＜０．０５は有意とみなした(McDonald, 2014)。
【０３１６】
参考文献
Arda, H.E., Benitez, C.M., and Kim, S.K. (2013). Gene regulatory networks governing pancreas development. Dev. Cell 25, 5-13. 
Bader, E., Migliorini, A., Gegg, M., Moruzzi, N., Gerdes, J., Roscioni, S.S., Bakhti, M., Brandl, E., Irmler, M., Beckers, J., et al. (2016). Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature 535, 430-434.
Beltrami, A.P., Barlucchi, L., Torella, D., Baker, M., Limana, F., Chimenti, S., Kasahara, H., Rota, M., Musso, E., Urbanek, K., et al. (2003). Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 114, 763-776.
Bonner-Weir, S., and Aguayo-Mazzucato, C. (2016). Physiology: pancreatic β-cell heterogeneity revisited. Nature 535, 365-366.
Boudina, S., and Abel, E.D. (2007). Diabetic cardiomyopathy revisited. Circulation 115, 3213-3223.
Brown, M.L., and Schneyer, A.L. (2010). Emerging roles for the TGFbeta family in pancreatic beta-cell homeostasis. Trends Endocrinol. Metab. 21, 441-448. 
Cairns, L.A., Moroni, E., Levantini, E., Giorgetti, A., Klinger, F.G., Ronzoni, S., Tatangelo, L., Tiveron, C., De Felici, M., Dolci, S., et al. (2003). Kit regulatory elements required for expression in developing hematopoietic and germ cell lineages. Blood 102, 3954-3962.
Dirice, E., Kahraman, S., Jiang, W., El Ouaamari, A., De Jesus, D.F., Teo, A.K., Hu, J., Kawamori, D., Gaglia, J.L., Mathis, D., et al. (2014). Soluble factors secreted by T cells promote β-cell proliferation. Diabetes 63, 188-202.
Dor, Y, Brown, J., Martinez, O.I., and Melton, D.A. (2004). Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature 429, 1-6.
Dor, Y., and Glaser, B. (2013). β-cell dedifferentiation and type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 368, 572-573.
Dorrell, C., Schug, J., Canaday, P.S., Russ, H.A., Tarlow, B.D., Grompe, M.T., Horton, T., Hebrok, M., Streeter, P.R., and Kaestner K.H. (2016). Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat. Commun. 7, 11756. 
Ellison, G.M., Vicinanza, C., Smith, A.J., Aquila, I., Leone, A., Waring, C.D., Henning, B.J., Stirparo, G.G., Papait, R., Scarfo, M., et al. (2013). Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell 154, 827-842.
Esposito, I., Kleeff, J., Bischoff, S.C., Fischer, L., Collecchi, P., Iorio, M., Bevilacqua. G., Buechler, M.W., and Friess, H. (2002). The stem cell factor-c-kit system and mast cells in human pancreatic cancer. Lab. Invest. 82, 1481-1492.
Geissler, E.N., Ryan, M.A., and Housman D.E. (1988). The dominant-white spotting (W) locus of the mouse encodes the c-kit proto-oncogene. Cell 55, 185-192.
Gomez, D.L., O’Driscoll, M., Sheets, T.P., Hruban, R.H., Oberholzer, J., McGarrigle, J.J., and Shamblott, M.J. (2015). Neurogenin 3 expressing cells in the human exocrine pancreas have the capacity for endocrine cell fate. PLoS One 10, e0133862.
Goodell, M.A., Nguyen, H., and Shroyer, N. (2015). Somatic stem cell heterogeneity: diversity in the blood, skin and intestinal stem cell compartments. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 16, 299-309.
Goss, G.M., Chaudhari, N., Hare, J.M., Nwojo, R., Seidler, B., Saur, D., and Goldstein, B.J. (2016). Differentiation potential of individual olfactory c-Kit+ progenitors determined via multicolor lineage tracing. Dev. Neurobiol. 76, 241-251. 
Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., and Guillemot, F. (2000). Neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1607-1611.
Gu, G., Dubauskaite, J., and Melton, D.A. (2002). Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development 129, 2447-2457.
Hadi H.A., and Suwaidi JA. (2007). Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc. Health Risk Manag. 3, 853-876.
Hatzistergos, K.E., Takeuchi, L.M., Saur, D., Seidler, B., Dymecki, S.M., Mai, J.J., White, I.A., Balkan, W., Kanashiro-Takeuchi, R.M., Schally, A.V. et al. (2015). cKit+ cardiac progenitors of neural crest origin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 13051-13056.
Heger, K., Seidler, B., Vahl, J.C., Schwartz, C., Kober, M., Klein, S., Voehringer, D., Saur, D., and Schmidt-Supprian, M. (2014). CreER(T2) expression from within the c-Kit gene locus allows efficient inducible gene targeting in and ablation of mast cells. Eur. J. Immunol. 44, 296-306.
Hsu, Y.C., and Fuchs, E. (2012). A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 13, 103-114.
Jennings, R.E., Berry, A.A., Strutt, J.P., Gerrard, D.T., and Hanley, N.A. (2015). Human pancreas development. Development 142, 126-317. 
Jiang, F.X., and Morahan, G. (2012). Pancreatic stem cells: from possible to probable. Stem Cell Rev. 8, 647-657.
Keenan, H.A., Sun, J.K., Levine, J., Doria, A., Aiello, L.P., Eisenbarth, G., Bonner-Weir, S., and King, G.L. (2010). Residual insulin production and pancreatic β-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist. Diabetes 59, 2846-2853. 
Klein, S., Seidler, B., Kettenberger, A., Sibaev, A., Rohn, M., Feil, R., Allescher, H.D., Vanderwinden, J.M., Hofmann, F., Schemann, M., et al. (2013). Interstitial cells of Cajal integrate excitatory and inhibitory neurotransmission with intestinal slow-wave activity. Nat. Commun. 4, 1630.
Kretzschmar, K., and Watt, F.M. (2012). Lineage tracing. Cell 148, 33-45.
Krishnamurthy, M., Ayazi, F., Li, J., Lyttle, A.W., Woods, M., Wu, Y., Yee, S.P., and Wang, R. (2007). c-Kit in early onset of diabetes: a morphological and functional analysis of pancreatic beta-cells in c-KitW-v mutant mice. Endocrinology 148, 5520-5530.
Lemper M, Leuckx G, Heremans Y, German MS, Heimberg H, Bouwens L, and Baeyens L. (2015). Reprogramming of human pancreatic exocrine cells to β-like cells. Cell Death Differ. 22, 1117-1130. 
Leri, A., and Anversa, P. (2016). Complexity of tracking the fate of adult progenitor cells. Circ. Res. 119, 1067-1070
Leri, A., Rota, M., Pasqualini, F.S., Goichberg, P., and Anversa, P. (2015). Origin of cardiomyocytes in the adult heart. Circ. Res. 116, 150-166.
Liu, Q., Huang, X., Zhang, H., Tian, X., He, L., Yang, R., Yan, Y., Wang, Q.D., Gillich, A., and Zhou, B. (2015). c-kit(+) cells adopt vascular endothelial but not epithelial cell fates during lung maintenance and repair. Nat. Med. 21, 866-868.
Manoranjan, B., Wang, X., Hallett, R.M., Venugopal, C., Mack, S.C., McFarlane, N., Nolte, S.M., Scheinemann, K., Gunnarsson T, Hassell, J.A., et al. (2013). FoxG1 interacts with Bmi1 to regulate self-renewal and tumorigenicity of medulloblastoma stem cells. Stem Cells 31, 1266-1277.
Menge, B.A., Breuer, T.G., Ritter, P.R., Uhl, W., Schmidt, W.E., and Meier, J.J. (2012). Long-term recovery of β-cell function after partial pancreatectomy in humans. Metabolism 61, 20-24.
Mezza, T., and Kulkarni, R.N. (2014). The regulation of pre- and post-maturational plasticity of mammalian islet cell mass. Diabetologia 57, 1291-1303. 
Murtaugh, L.C., and Melton, D.A. (2003). Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 71-89.
Muzumdar, M.D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., and Luo, L. (2007). A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis 45, 593-605.
Nadal-Ginard, B., Ellison, G.M., and Torella, D. (2014). The absence of evidence is not evidence of absence: the pitfalls of Cre knock-ins in the c-kit locus. Circ. Res. 115, 415-418. 
Oram, R.A., Jones, A.G., Besser, R.E., Knight, B.A., Shields, B.M., Brown, R.J., Hattersley, A.T., and McDonald, T.J. (2014). The majority of patients with long-duration type 1 diabetes are insulin microsecretors and have functioning beta cells. Diabetologia 57, 187-191.
Orlic, D., Fischer, R., Nishikawa, S., Nienhuis, A.W., and Bodine, D.M. (1993). Purification and characterization of heterogeneous pluripotent hematopoietic stem cell populations expressing high levels of c-kit receptor. Blood 82, 762-770.
Perl, S., Kushner, J.A., Buchholz, B.A., Meeker, A.K., Stein, G.M., Hsieh, M., Kirby, M., Pechhold, S., Liu, E.H., Harlan, D.M., et al. (2010). Significant human beta-cell turnover is limited to the first three decades of life as determined by in vivo thymidine analog incorporation and radiocarbon dating. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, E234-239.
Quesenberry, P.J., Colvin, G., and Abedi, M. (2005). Perspective: Fundamental and clinical concepts on stem cell homing and engraftment: A journey to niches and beyond. Exp. Hematol. 33, 9-19.
Qu, X., Afelik, S., Jensen, J.N., Bukys, M.A., Kobberup, S., Schmerr, M., Xiao, F., Nyeng, P., Veronica Albertoni, M., Grapin-Botton, A., et al. (2013). Notch-mediated post-translational control of Ngn3 protein stability regulates pancreatic patterning and cell fate commitment. Dev. Biol. 376, 1-12.
Rota, M., Kajstura, J., Hosoda, T., Bearzi, C., Vitale, S., Esposito, G., Iaffaldano, G., Padin-Iruegas, M.E., Gonzalez, A., Rizzi, R., et al. (2007). Bone marrow cells adopt the cardiomyogenic fate in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 17783-17788.
Saisho Y. (2014). Importance of beta cell function for the treatment of type 2 diabetes. J. Clin. Med. 3, 923-43.
Seymour, P.A. (2014). Sox9: a master regulator of the pancreatic program. Rev. Diabet. Stud. 11, 51-83.
Sherr, J.L., Ghazi, T., Wurtz, A., Rink, L., and Herold, K.C. (2014). Characterization of residual β cell function in long-standing type 1 diabetes. Diabetes Metab. Res. Rev. 30, 154-162.
Shih, H.P., Kopp, J.L., Sandhu, M., Dubois, C.L., Seymour, P.A., Grapin-Botton, A., and Sander, M.A. (2012). A Notch-dependent molecular circuitry initiates pancreatic endocrine and ductal cell differentiation. Development 139, 2488-2499.
Smukler, S.R., Arntfield, M.E., Razavi, R., Bikopoulos, G., Karpowicz, P., Seaberg, R., Dai, F., Lee, S., Ahrens, R., Fraser, P.E. et al. (2011). The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell 8, 281-293. 
Soyer, J., Flasse, L., Raffelsberger, W., Beucher, A., Orvain, C, Peers B, Ravassard P, Vermot J, Voz ML, Mellitzer G., et al. (2010). Rfx6 is an Ngn3-dependent winged helix transcription factor required for pancreatic islet cell development. Development 137, 203-122.
van Berlo, J.H., Kanisicak, O., Maillet, M., Vagnozzi, R.J., Karch, J., Lin, S.C., Middleton, R.C., Marban, E., and Molkentin, J.D. (2014). c-kit+ cells minimally contribute cardiomyocytes to the heart. Nature 509, 337-341.
Wajchenberg BL. (2007). Beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment. Endocr. Rev. 28, 187-218.
Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., and Dor, Y. (2007). Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes 56, 1299-1304.
Williams, S.E., Beronja, S., Pasolli, H.A., and Fuchs, E. (2011). Asymmetric cell divisions promote Notch-dependent epidermal differentiation. Nature 470, 353-358.
Xiao, X., Chen, Z., Shiota, C., Prasadan, K., Guo, P., El-Gohary, Y., Paredes, J., Welsh, C., Wiersch, J., and Gittes, G.K. (2013). No evidence for β cell neogenesis in murine adult pancreas. J. Clin. Invest. 123, 2207-2217.
Xu, X., D’Hoker, J., Stange, G., Bonne, S., De Leu, N., Xiao, X., Van de Casteele, M., Mellitzer, G., Ling, Z., Pipeleers, D., et al. (2008). Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell 132, 197-207.
Yagihashi, S., Inaba, W., and Mizukami, H. (2016). Dynamic pathology of islet endocrine cells in type 2 diabetes: β-cell growth, death, regeneration and their clinical implications. J. Diabetes Investig. 7, 155-165.
Anversa, P., and Olivetti, G. (2002). Cellular Basis of Physiological and Pathological Myocardial Growth. In: Handbook of physiology. Section 2: The Cardiovascular System, The Heart, E Page, H.A. Fozzard, R.J. Solaro, eds. (New York Oxford University Press), pp. 75-144.
Beltrami, A.P., Barlucchi, L., Torella, D., Baker, M., Limana, F., Chimenti, S., Kasahara, H., Rota, M., Musso, E., Urbanek, K., et al. (2003). Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 114, 763-776.
Bearzi, C., Rota, M., Hosoda, T., Tillmanns, J., Nascimbene, A., De Angelis, A., Yasuzawa-Amano, S., Trofimova, I., Siggins, R.W., LeCapitaine, N., et al. (2007). Human cardiac stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 14068-14073.
De Gasperi, R., Rocher, A.B., Sosa, M.A., Wearne, S.L., Perez, G.M., Friedrich, V.L. Jr., Hof, P.R., and Elder, G.A. (2008). The IRG mouse: a two-color fluorescent reporter for assessing Cre-mediated recombination and imaging complex cellular relationships in situ. Genesis 46, 308-317. 
Dirice, E., Kahraman, S., Jiang, W., El Ouaamari, A., De Jesus, D.F., Teo, A.K., Hu, J., Kawamori, D., Gaglia, J.L., Mathis, D., et al. (2014). Soluble factors secreted by T cells promote β-cell proliferation. Diabetes 63, 188-202.
Feng, Z-C., Riopel, M., Popell, A., and Wang, R. (2015). A survival Kit for pancreatic beta cells: stem cell factor and c-Kit receptor tyrosine kinase. Diabetologia 58, 654-665.
Ferreira-Martins, J., Ogorek, B., Cappetta, D., Matsuda, A., Signore, S., D’Amario, D., Kostyla, J., Steadman, E., Ide-Iwata, N., Sanada, F., et al. (2012). Cardiomyogenesis in the developing heart is regulated by c-kit-positive cardiac stem cells. Circ. Res. 110, 701-715.
Geiss, G.K., Bumgarner, R.E., Birditt, B., Dahl, T., Dowidar, N., Dunaway, D.L., Fell, H.P., Ferree, S. George, R., Grogan, T., et al., (2008). Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat. Biotech. 26, 317-325.
Gong, J., Zhang, G., Tian, F., and Wang, Y. (2012). Islet-derived stem cells from adult rats participate in the repair of islet damage. J. Mol. Histol. 43, 745-750.
Goss, G.M., Chaudhari, N., Hare, J.M., Nwojo, R., Seidler, B., Saur, D., and Goldstein, B.J. (2016). Differentiation potential of individual olfactory c-Kit+ progenitors determined via multicolor lineage tracing. Dev. Neurobiol. 76, 241-251. 
Hatzistergos, K.E., Takeuchi, L.M., Saur, D., Seidler, B., Dymecki, S.M., Mai, J.J., White, I.A., Balkan, W., Kanashiro-Takeuchi, R.M., Schally, A.V. et al. (2015). cKit+ cardiac progenitors of neural crest origin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 13051-13056.
Hosoda T, D’Amario D, Cabral-Da-Silva MC, Zheng H, Padin-Iruegas ME, Ogorek B, Ferreira-Martins J, Yasuzawa-Amano S, Amano K, Ide-Iwata N., et al. (2009). Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 17169-17174. 
Liu, X., Hall, S.R., Wang, Z., Huang, H., Ghanta, S., Di Sante, M., Leri, A., Anversa, P., and Perrella, M.A. (2015). Rescue of neonatal cardiac dysfunction in mice by administration of cardiac progenitor cells in utero. Nat Commun 6, 8825.
McDonald, J.H. (2014). Handbook of Biological Statistics (Sparky House Publishing, Baltimore, Maryland).
Muzumdar, M.D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., and Luo, L. (2007). A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis 45, 593-605.
Peters, K., Panienka, R., Li, J., Kloeppel G., and Wang, R. (2005). Expression of stem cell markers and transcription factors during the remodeling of the rat pancreas after duct ligation. Virchows Arch. 446, 56-63.
Sanada, F., Kim, J., Czarna, A., Chan, N.Y., Signore, S., Ogorek, B., Isobe, K., Wybieralska, E., Borghetti, G., Pesapane, A., et al. (2014). c-kit-positive cardiac stem cells nested in hypoxic niches are activated by stem cell factor reversing the aging myopathy. Circ. Res. 114, 41-55.
Talhouk, A., Kommoss, S., Mackenzie, R., Cheung, M., Leung, S., Chiu, D.S., Kalloger, S.E., Huntsman, D.G., Chen, S., Intermaggio, M., et al. (2016). Single-patient molecular testing with NanoString nCounter Data using a reference-based strategy for batch effect correction. PLoS ONE 11, e0153844. 
Tiemann K., Panienka, R., and Kloeppel G. (2007). Expression of transcription factors and precursor cell markers during regeneration of beta cells in pancreas of rats treated with streptozotocin. Virchows Arch. 450, 261-266.
van Berlo, J.H., Kanisicak, O., Maillet, M., Vagnozzi, R.J., Karch, J., Lin, S.C., Middleton, R.C., Marban, E., and Molkentin, J.D. (2014). c-kit+ cells minimally contribute cardiomyocytes to the heart. Nature 509, 337-341.
Veldman-Jones, M.H., Brant, R., Rooney, C., Geh, C., Emery, H., Harbron, C.G., Wappett, M., Sharpe, A., Dymond, M., Barrett, J.C., et al. (2015). Evaluating robustness and sensitivity of the NanoString Technologies nCounter Platform to enable multiplexed gene expression analysis of clinical samples. Cancer Res. 75, 2587-2593.
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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