(57)【要約】ＩＩＩ型インターフェロンに関する組成物及び方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＦＮλシンセカインであって、ＩＦＮλ受容体の細胞外ドメイン、及び非天然組み合わせにおいて第二受容体の細胞外ドメインに結合することにより、前記受容体の多量体化、及びシグナル伝達の活性化を引き起こす、前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項２】
前記ＩＦＮλ受容体は、ＩＦＮλＲ１またはＩＬ−１０Ｒβである、請求項１に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項３】
前記ＩＦＮλ受容体は、ＩＦＮλＲ１である、請求項１に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項４】
前記第二受容体は、Ｉ型インターフェロンの受容体である、請求項１から３のいずれかに記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項５】
前記第二受容体は、ＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２である、請求項４に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項６】
前記第二受容体は、ＩＦＮＡＲ１である、請求項４に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項７】
前記シンセカインは、ポリペプチドを含む、請求項１から６のいずれかに記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項８】
前記シンセカインは、ヒトＩ型インターフェロンポリペプチドに結合されるヒトＩＦＮλポリペプチドを含む、請求項１から６のいずれかに記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項９】
前記ＩＦＮλポリペプチドは、その同族受容体への結合の前記親和性を変える、少なくとも１個のアミノ酸変化を有する、請求項８に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項１０】
ＩＦＮλＲ１またはＩＬ−１０Ｒβのうちの１個への結合は、抑止される、請求項９に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項１１】
前記ヒトＩ型インターフェロンは、その同族受容体への結合の前記親和性を変える、少なくとも１個のアミノ酸変化を有する、請求項８に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項１２】
ＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２のうちの１個への結合は、抑止される、請求項１１に記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項１３】
前記シンセカインは、ＩＦＮＡＲ２への結合を抑止する１セットのアミノ酸変化を有するＩＦＮωポリペプチドに結合されるＩＬ−１０Ｒβへの結合を抑止する１セットのアミノ酸変化を有するＩＦＮλポリペプチドを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の前記ＩＦＮλシンセカイン。
【請求項１４】
前記野生型タンパク質と比較して同族受容体への親和性を増加させる１個以上のアミノ酸置換を有する、単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項１５】
前記同族受容体は、ＩＬ−１０Ｒβである、請求項１４に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項１６】
ＩＬ１−Ｒβへの親和性は、前記野生型タンパク質と比較して少なくとも５倍増加する、請求項１５に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項１７】
ＩＬ１−Ｒβへの親和性は、前記野生型タンパク質と比較して少なくとも１０倍増加する、請求項１５に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項１８】
ＩＦＮλＲ１への親和性は、前記野生型タンパク質と比較して少なくとも５倍増加する、請求項１５に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項１９】
前記インターフェロンは、ヒトＩＦＮ−λ３である、請求項１４から１８のいずれかに記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列は、配列番号３に由来する、請求項１４から１９のいずれかに記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２１】
前記配列中には、アミノ酸残基１から１１を欠く、請求項２０に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２２】
前記１箇所以上のアミノ酸置換は、ＩＩＩ型インターフェロンとＩＬ−１０Ｒβとの間の接触に関与する少なくとも１個の残基によって行われる、請求項１４から２１のいずれかに記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換は、Ｑ２６及びＥ８４の一方または両方に行われ、番号付けは、配列番号３に関する、請求項２２に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２４】
前記アミノ酸置換は、Ｑ２６Ｒ及びＥ８４Ｄの一方または両方である、請求項２３に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２５】
前記１箇所以上のアミノ酸置換は、Ｔ１６１に行われ、番号付けは、配列番号３に関する、請求項２２に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２６】
前記１箇所以上のアミノ酸置換は、前記置換Ｔ１６１Ａを含む、請求項２２に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２７】
Ｈ１３１、Ｔ１６１及びＶ１７４に１箇所以上のアミノ酸置換をさらに有する、請求項２４または請求項２５に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２８】
前記アミノ酸置換は、Ｈ１３１Ｒ、Ｔ１６１Ａ及びＶ１７４Ｅのうちの１箇所以上である、請求項２７に記載の前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号７から２０のいずれか１箇所に記載される配列、またはそのフラグメントを含む、前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項３０】
参照配列の配列番号３に関する配列番号７から２０に記載される１箇所以上のアミノ酸置換を有する、前記単離されたＩＦＮλ変異型ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか１項に記載のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの有効量を含む、医薬品製剤。
【請求項３２】
請求項１から３０のいずれか１項に記載のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを符号化する、ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項１から３０のいずれか１項に記載のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを産生する細胞。
【請求項３４】
細胞感染またはウイルス複製が阻害されるように、請求項１から３０のいずれか１項に記載されるような前記哺乳類へＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを投与することを備える、哺乳類におけるウイルス感染を処置する、または予防する方法。
【請求項３５】
前記ウイルスは、肝炎ウイルスである、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記癌の増殖または複製が阻害されるように、請求項１から３０のいずれか１項に記載されるような前記哺乳類へＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを投与することを備える、哺乳類における癌を処置する方法。
【請求項３７】
前記癌細胞は、ＩＦＮ−λについての受容体を発現する、請求項３６に記載の前記方法。
【請求項３８】
前記第二受容体は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達のために提供される、請求項１から３のいずれかに記載の前記シンセカイン。
【請求項３９】
前記第二受容体は、βｃ、γｃ、ＩＬ−３Ｒα、βＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＣＮＴＦα、ＣＲＬＦ１、ＬＩＦＲα、ｇｐ１３０、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、ＯＳＭＲβ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１Ｒα、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ−２３Ｒ、ＥｐｏＲ、ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＦＮＡＲ１、Ｇ−ＣＳＦＲ、及びｃ−ＭＰＬＲから選択される、請求項３８に記載の前記シンセカイン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により付与された契約ＡＩ１０９６６２及びＣＡ１７５１２７の下、政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウイルス感染及び癌への自然応答を誘発する。ヒトのほぼすべての細胞は、Ｉ型ＩＦＮに応答性であるが、診療において、これらのサイトカインは、部分的に全身性細胞応答による、重篤な副作用と関連している。ＩＩＩ型インターフェロンは、標的抗ウイルス（ＡＶ）活性及び抗増殖（ＡＰ）活性を、肺及び肝臓などの上皮組織に与えるサイトカインファミリーである。この標的活性は、Ｉ型ＩＦＮと比較して、より低い毒性プロファイルを与えることができる。生体外において、ＩＩＩ型ＩＦＮは、より強力なＩ型ＩＦＮより１００倍大きなＥＣ５０を有する。これは、ＩＩＩ型ＩＦＮがＩ型ＩＦＮと同一の活性（ＥＣ５０）を達成するために、１００倍のタンパク質量を必要とすることを意味する。より低い生体外の有効性と一致して、ＩＩＩ型ＩＦＮの臨床試験は、Ｉ型ＩＦＮと比較して限られた有効性を明らかにする。
【０００３】
ＩＩＩ型ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮによって使用されるこれらの受容体と異なる一対の受容体を介して結合し、シグナル伝達する。ＩＩＩ型ＩＦＮについてのこれらの受容体は、ＩＬ−１０受容体ベータ（ＩＬ−１０Ｒβ）及びＩＦＮλ受容体１（ＩＦＮλＲ１）である。ＩＦＮλＲ１受容体についてのサイトカインの親和性は、測定され、約８５０ｎＭであった。低い親和性のＩＬ−１０Ｒβ受容体単独についての親和性は、＞１００μＭであると推定される。肺及び肝臓などの上皮細胞への制限されたＩＦＮλＲ１の発現量は、ＩＩＩ型ＩＦＮについての自然な標的指向化を提供する。ＨＣＶ、ノロウイルス、インフルエンザ、ＨＢＶ、及びＨＢＶ／ＨＤＶのようなウイルスの同時感染は、上皮組織、及びこれらのような組織に制限される癌に主に感染し、ＩＩＩ型ＩＦＮによる処置のための候補である。
【０００４】
ＩＩＩ型インターフェロンの有効性を改善するタンパク質工学、及びＨＣＶなどの改善されたウイルス感染処置は、大変興味深い。本発明は、この課題に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
ＩＦＮλとも称される、ＩＩＩ型ＩＦＮに関する組成物及び方法を提供し、そこで変異体のヒトＩＦＮλタンパク質を提供し、これらのタンパク質は、１個以上のアミノ酸変異を有し、これらのアミノ酸変異は、変異型ＩＦＮλの結合親和性をその受容体の一方または両方について変える。野生型タンパク質と比較して、変異型ＩＦＮλは、ＥＣ５０レベルにおける改善、より高い遺伝子誘導レベル、ならびに改善された抗ウイルス活性及び抗増殖活性によって、細胞内でＪａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態において、親和性成熟型ＩＦＮλは、野生型タンパク質と比較して、ＩＦＮλＲ１及びＩＬ−１０Ｒβの両方について変化した親和性を有する。
【０００６】
また、本明細書に「シンセカイン（ｓｙｎｔｈｅｋｉｎｅ）」と称される、工学的に設計された合成シグナル伝達分子に関する、組成物及び方法を提供し、これらのシンセカインは、ＩＦＮλポリペプチドを含む。シンセカインは、一般的に工学的に設計された、細胞表面受容体の二重特異性リガンドであり、そこでサイトカインは、少なくとも１個、及び頻繁に２個の異なる細胞表面受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（複数可）へ高い親和性で特異的に結合する。ＩＦＮλシンセカインは、高親和性結合ドメインを含み、この高親和性結合ドメインは、ＩＦＮλ受容体、すなわち、ＩＦＮλＲ１またはＩＬ−１０Ｒβ、及びＩ型ＩＦＮ受容体、すなわち、ＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２に結合する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＩＦＮλシンセカインは、本明細書に開示される、工学的に設計された受容体結合対に提供され、そこでシンセカインは、Ｉ型及びＩＩＩ型インターフェロンなどの結合ドメイン、デノボ設計された結合タンパク質、抗体由来結合タンパク質（たとえば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）及び１個以上の受容体ＥＣＤ配列に特異的に結合する抗体の他の部分などの結合ドメインと、ナノボディ由来結合ドメインと、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）に基づき工学的に設計されたスカフォールドと、ノルリン（ｎｏｒｒｉｎ）及びそれに由来する工学的に設計された結合フラグメントと、自然発生結合ドメインと、同様のものとから構成され、そこで受容体結合ドメインは、高親和性、たとえば、約１×１０−７Ｍを上回らない、約１×１０−８Ｍを上回らない、約１×１０−９Ｍを上回らない、または約１×１０−１０Ｍを上回らない解離定数などで所望の受容体細胞外ドメインを結合するいずれかのドメインから選択されることができる。
【０００８】
ポリペプチドＩＦＮλシンセカインは、単鎖、二量体、またはより高次の多量体であることができる。各受容体についての結合ドメイン／要素、たとえば、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＦＮλＲ１、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２などは、直接に連結されることができる、またはリンカー、たとえば、ポリペプチドリンカー、若しくは非ペプチド性リンカーなどによって分離されることができる。いくつかの実施形態において、シンセカインは、上述されるように、天然の受容体配置を活性化しない。これらのような結合ドメインは、ＩＦＮλ及びＩ型ＩＦＮのドミナントネガティブ変異体を含むが、これらに限定されない。結合ドメインは、所望の受容体への結合を強化するように選択される、及び／または所望でない受容体への結合を防ぐように変異誘発される、親和性であることができる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＩＦＮλシンセカインは、ハイブリッドタンパク質であり、このハイブリッドタンパク質は、野生型または変異型ＩＦＮλポリペプチド（たとえば、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＬ４など）、及び野生型または変異型のＩ型ＩＦＮポリペプチド（たとえば、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκ、ＩＦＮωなど）を含む。これらのようなシンセカインは、非天然受容体二量体、たとえば、ＩＦＮλＲ１及びＩＦＮＡＲ１から構成される二量体などの形成を強いる。ＩＦＮλシンセカインは、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドを含むことができ、このＩＦＮλ変異型ポリペプチドは、その受容体の一方または両方について変化した結合親和性を有する。シンセカインは、Ｉ型ＩＦＮ変異型ポリペプチドを含むことができ、このＩ型ＩＦＮ変異型ポリペプチドは、その受容体の一方または両方について変化した親和性を有する。
【００１０】
ある一定の実施形態において、ＩＦＮλシンセカインは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、ＩＦＮλＲ１に結合するが、ＩＬ−１０Ｒβに結合しないＩＦＮλ変異型ポリペプチドと、ＩＦＮＡＲ１に結合するが、ＩＦＮＡＲ２に結合しないＩＦＮω変異型ポリペプチドとを含む。これらのポリペプチドは、リンカーを介して連結されることができる。したがって、ハイブリッドシンセカインは、作製された後に、ＩＦＮλＲ１／ＩＦＮＡＲ１二量体の形成を強いる。この二量体は、それがＩＬ−１０ＲβのＴｙｋ２をＩＦＮＡＲ１のそれと置換することを除き、天然ＩＦＮλＲ１二量体によって使用されるＪＡＫ１／ＴＹＫ２対合を再現する。ＩＦＮλへのＩＬ−１０Ｒβ、及びＩＦＮωへのＩＦＮＡＲ２の結合への結合切断は、変異をそれぞれの受容体結合部位に導入することによって成し遂げられることができる。ＩＦＮλシンセカインの際立った結果は、ＩＦＮω  ＳＴＡＴ１活性化レベルの維持と、たとえば、肺組織、肝組織などの、たとえば、ウイルス感染した細胞及び上皮組織などの、ＩＦＮλＲ１発現細胞に対する強力な抗増殖活性とである。上皮癌細胞は、本明細書に記載されるようにシンセカインと接触することによる増殖の阻害について特別な興味の対象である。
【００１１】
他の実施形態において、ＩＦＮλシンセカインは、ＩＬ−１０Ｒβに結合するがＩＦＮλＲ１に結合しないＩＦＮλポリペプチド、及びＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２のうちの１個のみに結合するＩ型インターフェロンから工学的に設計され、また、このシンセカインは、新規のＴｙｋ２／Ｊａｋ１対合をもたらす。
【００１２】
シンセカインポリペプチドを薬剤と融合し、結合し、または代替に同時投与し、受容体活性化を増強することが可能である。シンセカインをサイトカイン、ケモカイン、または対象となる増殖因子と融合する、結合する、または代替に同時投与することが可能である。
【００１３】
シンセカイン結合ドメインは、１箇所の球状ドメイン内で近接する、またはたとえば、ポリペプチドリンカー若しくは非ペプチド性リンカーなどのリンカーによって分離されることができる。リンカー長、したがって、結合ドメイン間の空間を使用してシグナル強度を変調することが可能であり、シンセカインの所望の用途により選択されることが可能である。たとえば、Ｆｃドメインなどを介して、鎖状体形成、コイルドコイル、ポリペプチドジッパー、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン多量体化、及び同様のものによって、シンセカインを多量体化することが可能である。また、生体内で安定性を向上させるために当該技術分野において知られているような、ＰＥＧ、ＭＳＡ、Ｆｃなどの部分にサイトカインを連結することが可能である。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、ＩＦＮλシンセカインを含む、単離された親和性成熟型ＩＦＮλ変異型ポリペプチド及び誘導体及びそのフラグメント、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカインの１個以上を含む医薬品製剤、ならびにこれらのＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカインを産生する細胞株を含む。また、提供されるのは、これらのＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカインの結合特異性を与えるアミノ酸配列である。
【００１５】
さらに本発明は、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカインを符号化する単離された核酸と、その核酸を含み、任意選択でベクターにより形質転換される宿主細胞によって認識される配列を制御するように動作可能に結合されるベクターと、そのベクターを含む宿主細胞と、核酸を発現するために宿主細胞を培養することを備えるインターフェロンを産生し、任意選択で宿主細胞培養から（たとえば、宿主細胞培養培地から）インターフェロンを回収するプロセスとを提供する。また本発明は、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカイン、及び薬学的に許容可能な担体または希釈剤のうちの１つ以上を含む組成物を提供する。治療用途のためのこの組成物は、滅菌され、凍結乾燥されることができ、たとえば、希釈剤、及びたとえば、吸入器、注射器などの送達装置により、単位用量におけるプレパックとして提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、慢性感染症を含むが、これらに限定されない、感染症の処置方法を提供し、これらの方法は、それを必要とする患者に有効量のＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカインを投与することを備える。特定の実施形態において、これらの方法は、慢性病原体感染症の処置に使用され、これらの慢性病原体感染症は、たとえば、ウイルス感染症（たとえば、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）と、細胞内細菌感染症（たとえば、マイコバクテリウム、クラミドフィラ、エーリキア、リケッチア、ブルセラ、レジオネラ、フランシセラ、リステリア、コクシエラ、ナイセリア、サルモネラ、エルシニア菌種など）と、細胞内病原虫（たとえば、マラリア原虫菌種、トリパノソーマ菌種、ジアルジア菌種、トキソプラズマ菌種、リーシュマニア菌種など）とを含むが、これらに限定されない。肝炎ウイルスによる感染症、たとえば、癌を含む、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ及び関連肝疾患などの処置は、対象となる。また、血液単球由来マクロファージのヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染症の抑制、及びヒトアストロサイト及びニューロンの単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）感染症は、対象となる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＩＩＩ型インターフェロンへの癌応答性の処置方法を提供し、これらの方法は、それを必要とする患者に有効量のＩＦＮλ変異型ポリペプチドまたはシンセカインを投与することを備える。いくつかの実施形態において、処置を第二薬剤、たとえば、Ｉ型ＩＦＮ、チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線照射などと組み合わせる。ＩＩＩ型インターフェロンへの癌応答は、たとえば、ＩＦＮλＲ１などのＩＩＩ型インターフェロンについての受容体を一般的に発現し、これらの細胞は上皮細胞、大腸腺癌、神経膠芽腫、メラノーマ、基底細胞癌、肝細胞癌などを含むが、これらに限定されないことができる。
【００１８】
他の態様及び特徴は、本開示を読めば当業者に容易に明らかになる。
【００１９】
本発明は、添付の図面と併せて読まれるときに、以下の詳細な説明から最も良く理解される。本特許または本願の記録は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。一般的な慣例に従い、図面のさまざまな特徴が縮尺通りではないことを強調する。反対に、明確さのためにさまざまな特徴の寸法を任意に拡大させる、または縮小させる。図面に含まれるのは、以下の図である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】高親和性ＩＦＮ−λの工学的設計。（ａ）野生型ＩＦＮ−λ３２２は、酵母上に提示され、ＩＦＮ−λＲ１１３（ｙ軸、ＦＬ２）の５０ｎＭのストレプトアビジン四量体の有無にかかわらず、ＩＬ−１０Ｒβ２１（ｘ軸、ＦＬ４）の、１μＭの単量体、または４００ｎＭのストレプトアビジン四量体によって染色された。（ｂ）ＩＦＮ−λＲ１の存在下で１μＭのＩＬ−１０Ｒβ単量体によって染色した、ナイーブで進化した第一世代（エラープローン）及び第二世代（シャッフルされた）ＩＦＮ−λ３酵母提示型ライブラリーについての蛍光（ＦＬ４）の密度プロット。（ｃ）進化したＩＦＮ−λ変異体の配列及び酵母上親和性測定。（ｄ）野生型ＩＦＮ−λＲ１／ＩＦＮ−λ３またはＨ１１含有二成分複合体についてのＩＬ−１０Ｒβ親和性を表面プラズモン共鳴によって決定した。ＫＤ値を一次平衡結合モデルに適合させることによって決定した。
【図２】ＩＦＮ−λ三成分複合体の構造。（ａ）三成分複合体の構造は、ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１（青色）及びＩＦＮ−λＲ１（灰色）のＩＬ−１０Ｒβ（金色）認識の機構を明らかにする。ＩＬ−１０Ｒβは、部位２ａ、２ｂ、及びＩＦＮ−λＲ１によるステム間接触から構成される部位３において、Ｈ１１と広範で連続的な接触を行う。ＩＦＮ−λ構造へユニークな、サイトカインの大きな表面積は、表面が三成分複合体中に曝露されたままである。（ｂ）ＩＦＮ−λ３／ＩＦＮ−λＲ１二成分の観点からのＩＬ−１０Ｒβの図。三成分結合立体構造（金色リボン）へのアポリポタンパク質ＩＬ−１０Ｒβ（ピンクリボン）（ＰＤＢ  ３ＬＱＭ２１）の比較は、ほぼ同一のＳＤ１及びＳＤ２ドメイン配向と、チロシン含有ループ２、３及び５の大きな立体構造上の変化とを明らかにする。
【図３】三成分複合体の安定性のために重要な特異的相互作用。（ａ）ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１（青色）／ＩＦＮ−λＲ１（灰色）／ＩＬ−１０Ｒβ（金色）の三成分複合体の概要。（ｂ）接触表面積を強調表示するサイトカイン／受容体及び受容体／受容体の明白な観点を受けて彩色する。部位３、受容体−受容体、界面は、約１４００Å２であり、２箇所のサイトカイン−受容体接触表面積は、それぞれ約１７００Å２である。（ｃ）ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１とＩＬ−１０Ｒβチロシン５９、８２、及び１４０との間の部位２ａ及び部位２ｂの接触の詳細図。水素結合を黒色破線で示す。チロシン５９及び８２は、ヘリックス束（表面上の右側リボン）の末端を「挟む」ＩＦＮ−λ上のポケット上にドッキングする。ＩＦＮ−λ  Ｈ１１のＨｉｓ９１は、水素結合をＴｙｒ８２カルボニルＩＬ−１０Ｒβの主鎖によって形成する。（ｄ）ＩＦＮ−λＲ１とＩＬ−１０Ｒβとの間の部位３のステム接触の詳細図。水素結合を黒色破線で示す。
【図４】ＩＬ−１０スーパーファミリー中に結合するＩＬ−１０Ｒβの構造的及び化学的保存。（ａ）ＩＬ−１０（緑色）（ＰＤＢ  １Ｊ７Ｖ１４）の構造、及びＩＬ−２２（オレンジ）（ＰＤＢ  ３ＤＬＱ１５）は、三成分複合体構造中のＩＦＮ−λ３  Ｈ１１（青色リボン）にアライメントを取り、ＩＬ−１０Ｒβ（金色表面）認識の保存された特徴を強調表示する。Ｈ１１の接触距離内のＩＬ−１０Ｒβ表面残基に赤色で陰影を付ける。ＩＬ−１０Ｒβ結合に悪影響を与えるアラニン変異体を示しているＩＦＮ残基を、棒状に示す（右側パネル）。（ｂ）ＩＦＮ−λ３のＩＬ−１０Ｒβ含有ヘリックス領域のＩＬ−１０及びＩＬ−２２サイトカインとの配列アライメント。アラニン変異原性試験（図４ａの右側に、また図３ａに拡大したデータを示す）によって結合するＩＬ−１０Ｒβに関与している残基を強調表示する。（ｃ）ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１三成分複合体を使用して、ＩＬ−１０及びＩＬ−２２の表面上にモデル化されるＩＬ−１０Ｒβ結合界面の図。ＩＬ−１０Ｒβ界面におけるサイトカイン残基を化学的特性（極性／荷電について赤色、または疎水性について白色）によって着色し、ＩＬ−１０Ｒβチロシンがドッキングしそうな、保存された「疎水性」ポケットを強調表示する。
【図５】工学的に設計されたＩＦＮ−λ３変異体の機能上の特性。いくつかの機能アッセイにおいて、ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１（オレンジ）を野生型ＩＦＮ−λ３（黒色）及びＩ型、ＩＦＮ−ω（赤色）と比較した。（ａ）Ｈａｐ１細胞中のＳＴＡＴ１活性化。曲線を一次ロジスティックモデルに適合させた。（ｂ）ｑＰＣＲによって決定されるように、各インターフェロンに関して５ｐＭによって６時間処置されるＨａｐ１細胞中のＩＳＧ１５の誘導。（ｃ）ＨＣＶに感染したＨｕｈ７．５細胞中のＩＦＮの抗ウイルス活性。（ｄ）Ｈｕｈ７．５細胞中のＩＦＮの抗増殖活性。（ｅ）ＩＦＮの抗増殖活性は、ＩＦＮ−λＲ１を過剰発現させるＨｕｈ７．５細胞において増強される。（ｆ）ヒト肝臓キメラマウスは、ヒト肝芽細胞をｆａｈ−／−ｒａｇ２−／−ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ（ＦＲＧ）マウスに注入することによって作製され、遺伝子型Ｃ  ｅＡｇ陰性患者から得られたウイルスの２×１０７ＤＮＡコピーに感染した。ヒトアルブミンは、ＥＬＩＳＡ（赤丸）によって追跡され、ＨＢＶ  ＤＮＡは、ＩＦＮ処置前に２２０日を超えてｑＰＣＲ（緑丸）によって定量化された。（ｇ）媒体、ＩＦＮ−λ３、またはＩＦＮ−λ３  Ｈ１１のいずれか一方で体重の１０μｇ／ｋｇによって、毎日４週間、マウスを処置した。工学的に設計されたＩＦＮ−λ３  Ｈ１１は、野生型ＩＦＮ−λ３（ｐ＝０．０２）を上回る改善された生体内活性を有する。
【図６】サイトカインの工学的設計、及びハイスループット機能スクリーニングを介してＩ型ＩＦＮ機能の探索。（ａ）低親和性ＩＦＮ−αＲ１部位に変異誘発するように設計される部位特異的ＩＦＮ−ωライブラリーを、サイトカイン上のＩＦＮ−αＲ２界面に合理的に設計された親和性向上Ｌｙｓ１５２Ａｒｇ変異と組み合わせた。マウスＩＦＮ−αＲ１構造（ＰＤＢ  ３ＷＣＹ）を使用して、複合体（３ＳＥ４１０）へのＩＦＮ−αＲ１のＳＤ４ドメインをモデル化した。（ｂ）ハイスループット機能スクリーニングを使用して、２８８個のクローンを活性についてスクリーニングした。提示されたＩＦＮを部位特異的３Ｃプロテアーゼによって酵母から切断した。次にろ過された上澄みを使用し、ＶＰＮ５３２７細胞を処置してＡＰ活性を測定し、ＨＣＶ感染Ｈｕｈ−７．５細胞を処置してＡＶ活性を測定した。（ｃ）ホスホ（ｐｈｏｓｐｏ）−ＳＴＡＴ１シグナル伝達の機能上の特徴づけ、複合体安定性の関数としてＡＶ及びＡＰ効力。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＳＴＡＴ１のＩＦＮが介在する活性化の効力、ＨＣＶ感染Ｈｕｈ７．５細胞中のウイルス排除、及びＷＩＳＨ細胞の増殖阻害を使用して、ＥＣ５０を決定し、複合体安定性の関数としてプロットした（左側パネル）。（ｄ）複合体安定性と比較してｑＰＣＲによって測定した場合の倍率ＩＳＧ誘導。
【図７】高親和性ラムダ−インターフェロンの工学的設計。（ａ）野生型ｍｙｃタグ付きＩＦＮ−λ３（ＰＤＢ  ３ＨＨＣ）を、酵母表面上に提示し（右側パネルは抗Ｍｙｃ−６４７抗体によって染色されたのに対して、中央パネルは酵母を染色せずに残した）、（ｂ）ＩＦＮ−λＲ１（ＫＤ＝４００ｎＭ）に結合させる。（ｃ）ＰＤＢ  ３ＨＨＣ及び３ＯＧ６を使用してモデル化された、ＩＦＮ−λ３／ＩＦＮ−λＲ１の二成分複合体の状況下でのＨ１１変異の位置（赤色棒状）。（ｄ）野生型ＩＦＮ−λ３（ＫＤ＝８５０ｎＭ）またはＨ１１（ＫＤ＝１５０ｎＭ）サイトカインについてのＩＦＮ−λＲ１親和性を、表面プラズモン共鳴によって決定した。ＫＤ値を一次平衡結合モデルに適合させることによって決定した。（ｅ）ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１の三成分複合体のサイズ排除クロマトグラフ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５カラム）。
【図８】ラムダ−ＩＦＮ／ＩＦＮ−λＲ１／ＩＬ−１０Ｒβの三成分複合体の電子密度。２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップに１．０σで輪郭を描く。（ａ）ラムダ複合体について２．８５Åでの全電子密度マップ。（ｂ）ＩＬ−１０Ｒβのループ５とＩＦＮ−λＲ１との間の部位３の水素結合の拡大図。（ｃ）２個の受容体ステム間の部位３の水素結合の拡大図。（ｄ）ＩＬ−１０ＲβのＴｙｒ５９近くの部位２ａの拡大図。（ｅ）ＩＬ−１０ＲβのＴｙｒ８２近くの部位２ａの拡大図。（ｆ）ＩＬ−１０ＲβのＴｙｒ１４０及びＴｒｐ１４３近くの部位２ｂの拡大図。
【図９】ＩＬ−１０スーパーファミリーにおいて結合するＩＬ−１０Ｒβの構造的保存。（ａ）他のＩＬ−１０スーパーファミリーメンバーの構造上にマッピングされたＩＦＮ−λ３  Ｈ１１の界面に結合するＩＬ１０Ｒβの図。変異原性解析を通して識別される、ＩＬ−１０Ｒβ結合に影響する残基、及びＩＦＮ−λ三成分複合体構造中で水素結合をＩＬ−１０Ｒβと共有する残基を棒状に示す。図４ｂに示されるように、ＩＬ−１０Ｒβ接触ヘリックス領域の配列アライメントは、ファミリーにおける配列保存の欠如を強調表示する。
【図１０】Ｈ１１の機能上の特性。（ａ）５ｐＭの各インターフェロンによって６時間処置され、ｑＰＣＲによって測定されるＨａｐ１細胞中の６個のＩＳＧの誘導。（ｂ）受容体発現による局在化を後に伴う、ＩＦＮ−λＲ１受容体のレンチウイルス形質導入前後の、３個の異なる細胞株中のＩＦＮの抗増殖活性。野生型を超えるＨ１１の倍率の改善を挿入図に示す。（ｃ）ＨＢＶ  ｓＡｇレベルをＥＬＩＳＡによって定量化し、Ｈ１１還元が野生型処置（ｐ＝０．００８３）より大きかったことを実証する。（ｄ）４週間の処置の経過中にヒトアルブミンレベルは、監視され、ヒト肝細胞減少を除き、すべての群について安定した。
【図１１】配列アライメント、配列番号１から１５を示す。
【図１２】図１２Ａから１２Ｄを示す。シンセカイン２は、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ受容体を二量体化するハイブリッドインターフェロンである。Ａ）受容体二量体化時に活性化された、ＩＦＮ受容体、それらに関連したＪＡＫ、及びＳＴＡＴの表である。Ｂ）シンセカイン２は、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮλＲ１受容体、ならびにそれらのそれぞれのＪＡＫを二量体化するハイブリッドインターフェロンである。Ｃ）シンセカイン２（緑色）によるホスホ−ＳＴＡＴ１活性化のＥｍａｘは、Ｉ型ＩＦＮ（赤色）のそれに等しく、ＩＩＩ型ＩＦＮ（青色及びオレンジ）によって誘発されるシグナルの２倍に等しい。エラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。Ｄ）Ｉ型ＩＦＮ（赤色）、ＩＩＩ型ＩＦＮ（青色及びオレンジ）またはＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせ（黒色）の処置が無効であるが、シンセカイン２（緑色）は、抗増殖効果を強く誘発する。エラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。ホスホ−ＳＴＡＴ１シグナル伝達、及び抗増殖アッセイを、Ｈａｐ１細胞中で実施し、これらのＨａｐ１細胞は、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方に自然に応答性である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される専門用語が特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
【００２２】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値も具体的に開示されることを理解する。いずれかの記載値、または記載範囲内の介在値からいずれかの他の記載値またはその記載範囲内の介在値の間のそれぞれのより小さな範囲を本発明内に含む。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、この範囲内に独立して含まれてもよいし、含まれなくてもよく、またこれらのより小さい範囲内に、これら限界値のいずれか一方を含む、いかなる限界値も含まない、またはこれらの限界値の両方を含む各範囲は、この記載範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従い、本発明内に含まれる。記載範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれか一方または両方を除外する範囲も本発明に包含される。
【００２３】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様若しくは同等の任意の方法及び物質が本発明の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法及び材料は、以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物が引用されることに関連した方法及び／または物質を開示し、説明するために、参照により本明細書に援用される。矛盾がある限り、本開示が援用された刊行物のいかなる開示にも優先することを理解する。
【００２４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、たとえば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「このポリペプチド（ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つ以上のポリペプチド及び当業者に既知のそれらの均等物などへの言及を含む。
【００２５】
特許請求の範囲が任意選択であることができるいずれかの要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」などの排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として役立つことが意図される。
【００２６】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認される必要があり得る。
【００２７】
定義
ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮλ）。ＩＦＮは、多面的な抗ウイルス応答の確立に重要なサイトカインである。ＩＦＮの構造上の特徴、受容体用途及び生物学的活性に基づき、ＩＦＮの３個の別個の型を現在認識する（Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型）。ＩＦＮ及びＩＬ−１０関連のサイトカインのすべては、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリー（ＣＲＦ２）として知られている、それらの細胞外ドメイン内の共通のモチーフを共有する、受容体を介してシグナル伝達する。ヒトにおいて、異なるが、密接に関連したＩＦＮλタンパク質のファミリーは、ＩＦＮλ１、λ２、λ３、λ４（それぞれＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂとしても知られている）は、ＩＩＩ型ＩＦＮファミリーを形成する。
【００２８】
ヒト及びマウスのＩＦＮλタンパク質の配列を配列表に、また図１１に参照のために提供する。図１１に記述されるように、野生型タンパク質の参照配列をタンパク質の成熟形態として提供することができる。参照配列は、ヒトＩＦＮλ１（配列番号１）、ヒトＩＦＮλ２（配列番号２）、ヒトＩＦＮλ３（配列番号３）、及びヒトＩＦＮλ４（配列番号４）を含む。本明細書に提供されるマウスの参照配列は、マウスＩＦＮλ３（配列番号５）、マウスＩＦＮλ２（配列番号６）である。ヒトＩＦＮλ３の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＸＰ＿００５２５８８２２．１に対応する。成熟変異型タンパク質の親和性は、適切なアミノ酸置換を有する、すべての、または一部の参照配列を含むことができる。ある一定の実施形態において、タンパク質は、参照ＩＦＮλ３タンパク質の残基１から１１の欠失によって切断される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態において、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、ＩＦＮλ３に関するものを含むが、これに限定されない、野生型ＩＦＮλタンパク質と比較して１個以上のアミノ酸変化を有し、これらの変化は、ＩＬ−１０Ｒβへの結合を抑止する。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、配列番号３に関する、１箇所、２箇所または３箇所の位置、Ｑ２６、Ｑ９９、Ｈ１０２における置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、アミノ酸置換を含み、３箇所すべてのＱ２６、Ｑ９９、Ｈ１０２において行われる。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、非保存的置換、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖなどの残基への置換などである。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、Ｑ２６Ａ、Ｑ９９Ａ、Ｈ１０２Ａのうちの１箇所以上である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、ＩＦＮλＲ１への結合を増強する、ＩＦＮλ３に関するものを含むが、これに限定されない、野生型ＩＦＮλタンパク質と比較して１個以上のアミノ酸変化を有する。これらの変化を、ＩＬ−１０Ｒβへの結合を抑止するアミノ酸置換と任意選択で組み合わせる。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、配列番号３に関する、１箇所、２箇所、または３箇所の位置、Ｈ１３１、Ｔ１６１、Ｖ１７４における置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、置換を含み、３箇所すべてのＨ１３１、Ｔ１６１、Ｖ１７４において行われる。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、置換Ｈ１３１Ｒ、Ｔ１６１Ａ、Ｖ１７４Ｅである。これらのようなＩＦＮλ変異体をシンセカインのＩＦＮλＲ１結合腕として使用するが、これに限定されないことができる。
【００３１】
Ｈ１１における変異の特異的なセットは、配列番号３に関して、Ｑ２６Ｒ、Ｅ８４Ｄ、Ｈ１３１Ｒ、Ｔ１６１Ａ、Ｖ１７４Ｅである。優性陰性変異体Ｈ１１ＤＮは、ＩＬ−１０ＲβではなくＩＬＦλＲ１に結合し、変異Ｑ２６Ａ、Ｑ９９Ａ、Ｈ１０２Ａ、Ｈ１３１Ｒ、Ｔ１６１Ａ、Ｖ１７４Ｅのセットを含む。
【００３２】
ＩＦＮλタンパク質は、ＩＦＮλＲ１鎖（ＩＬ−２８ＲＡとしても知られている）、ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２６についての受容体複合体の一部でもある共有されたＩＬ−１０Ｒβ鎖から構成される受容体複合体を介して結合し、シグナル伝達する。ＩＦＮλまたはＩＦＮαのいずれか一方の受容体複合体を介するシグナル伝達は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。ＩＦＮλは、ＩＦＮλＲ１鎖へ最初に結合し、二成分複合体は、ＩＦＮλのＩＦＮλＲ１鎖との会合によって形成され、この複合体への第二受容体鎖、ＩＬ−１０Ｒβの漸増を促進する急速な立体構造変化を引き起こす。三成分複合体の会合体が完成すると、受容体関連のヤヌスチロシンキナーゼ、Ｊａｋ１及びＴｙｋ２は、受容体鎖のトランスリン酸化を媒介し、このトランスリン酸化は、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２を含む、細胞質ＳＴＡＴタンパク質について一過性のドッキング部位を提供する、ＩＦＮλＲ１鎖の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）上にリン酸化チロシン含有ペプチドモチーフをもたらす。生物学的活性は、ＩＩＩ型ＩＦＮによって誘発され、抗ウイルス活性の誘導、及び主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ抗原発現の増加を備える。
【００３３】
上皮由来の細胞は、白血球と異なり、それらが有意なＩＦＮλＲ１レベルを発現するため、ＩＦＮλについて一次標的であるようにみえる。ＩＦＮλＲ１の膜発現パターンは、ＩＬ−２２Ｒ１に非常に類似しているようにみえ、ＩＬ−２２Ｒ１鎖のように、ＩＦＮλＲ１を白血球上に発現しない。
【００３４】
ＩＦＮλは、ある一定の腫瘍の増殖を抑制する宿主抗腫瘍機構を活性化することが可能である。メラノーマ、腸上皮細胞及びヒト膠芽腫細胞株、ＬＮ３１９を含む、いくつかの標的細胞型を使用して、ＩＦＮλの抗増殖活性を実証している。標的細胞中の抗増殖活性を誘導するＩＦＮλの能力は、相対的なＩＦＮλＲ１レベルによることができる。
【００３５】
Ｉ型ＩＦＮ。ヒトＩ型ＩＦＮファミリーは、複数のＩＦＮαメンバー、単一のＩＦＮβ、イプシロン、カッパー、及びオメガ亜型からなる。これらのサイトカインは、多種多様な細胞型上に発現する、共通の受容体、ＩＦＮＡＲ１／ＩＦＮＡＲ２を結合することによって、抗ウイルス応答を誘導する。ＩＦＮαタンパク質を白血球によって産生する。それらは、ウイルス感染症に対して自然免疫応答に主に関与している。それらの合成の原因である遺伝子は、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１と称される１３亜型に入る。これらの遺伝子を９番染色体上のクラスターにまとめて見出す。ＩＦＮ−βタンパク質を線維芽細胞によって大量に産生する。それらは、自然免疫応答に主に関与している抗ウイルス活性を有する。２種類のＩＦＮ−β、ＩＦＮ−β１（ＩＦＮＢ１）及びＩＦＮ−β３（ＩＦＮＢ３）を記述している。今回、ＩＦＮε、κ、ωは、ヒトにおいて単一のイソ型に入るようにみえる。ウイルス感染部位における白血球、または腫瘍によって、ＩＦＮ−ωを遊離する。
【００３６】
他のサイトカイン受容体として、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２と名付けられた２成分の、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）受容体（ＩＦＮＡＲ）を含む。それは、同族リガンド数において、サイトカイン受容体の中でユニークである。Ｉ型ＩＦＮ受容体は、ＩＩ型ＩＦＮλ（ＩＦＮＧＲ１及びＩＦＮＧＲ２）及びＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮλＲ及びＩＬ１０Ｒβ）に必要なものと異なる。ほとんどの細胞型は、結合部位数（２００から１０，０００／細胞）及び結合親和性にかなりの差異を有する、ＩＦＮを結合する。さまざまなＩ型ＩＦＮは、ほとんどｎＭ範囲（０．１から１０００ｎＭ）中のＫｄ値を有するＩＦＮＡＲ２に結合し、ほとんどμＭ範囲（０．０５から１０μＭ）中のＫｄを有するＩＦＮＡＲ１に結合する。
【００３７】
クラスＩＩｈＣＲに特有の、Ｉ型ＩＦＮ受容体は、固有のキナーゼ活性を欠くため、会合したヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）に依存し、リガンド誘導受容体のクラスター化後に、受容体、及びＳＴＡＴタンパク質などのシグナル伝達分子をリン酸化する。ＩＦＮＡＲ１は、Ｔｙｋ２と予め会合し、またＩＦＮＡＲ１細胞表面発現レベルを安定化させる。
【００３８】
簡便さのために、成熟ヒトＩＦＮωタンパク質の参照配列を配列番号２１としてこの配列表に提供する。いくつかの実施形態において、ＩＦＮＡＲ２への結合を抑止しているＩＦＮωポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、配列番号２１に関する、１箇所、２箇所、３箇所または４箇所の位置、Ｒ１４、Ｌ３２、Ｒ３５、Ｋ１５２における置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、アミノ酸置換を含み、４箇所すべてのＲ１４、Ｌ３２、Ｒ３５、Ｋ１５２において行われる。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、非保存的置換、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖなどの残基への置換などである。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化は、４箇所すべての変化を含む、Ｒ１４Ａ、Ｌ３２Ａ、Ｒ３５Ａ、Ｋ１５２Ａのうちの１箇所以上である。
【００３９】
特異的なＩＦＮω変異型ポリペプチドは、ＩＦＮＡＲ２への結合を低下させており、配列番号２２としてこの配列表に提供され、この変異体は、ＩＦＮＷＤＮ２と称されることができる。ＩＦＮＷＤＮ２におけるアミノ酸変化のセットは、配列番号２１に関して、Ｒ１４Ａ、Ｌ３２Ａ、Ｒ３５Ａ、Ｋ１５２Ａである。
【００４０】
用語「特異的結合」、「特異的に結合する」及び同様のものは、溶液または反応混合物（たとえば、同族受容体に結合するインターフェロンなど）中の他の分子または部分に関する分子への非共有または共有の優先的結合を指す。いくつかの実施形態において、分子が特異的に結合する、一方の分子の他方の分子についての親和性は、１０−５Ｍ以下（たとえば、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、１０−１５Ｍ以下、または１０−１６Ｍ以下）のＫＤ（解離定数）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、増加した結合親和性は、より低いＫＤと相関している。
【００４１】
本明細書に使用されるような用語「特異的結合メンバー」は、特異的結合対のメンバーを指す（すなわち、２分子、通常２個の異なる分子、そこで分子のうちの１個、たとえば、第一特異的結合メンバーなどは非共有結合手段を介して他の分子、たとえば、第二特異的結合メンバーなどへ特異的に結合する）。
【００４２】
用語、結合の「切断」は、リガンドの存在下で受容体からのシグナル伝達がたとえば、同一濃度の天然リガンドの存在下でのシグナル伝達レベルと比較して少なくとも約１０分の１の低下、少なくとも約１００分の１の低下、少なくとも約１０3分の１の低下、またはそれを上回る低下などの、実質的にバックグラウンドレベルまで低下するように、受容体へのリガンドの結合における低下を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるように、用語「感染」は、感染体によって感染する、生物（すなわち、被検体）の少なくとも１個の細胞におけるいずれかの状態を指す。本明細書に使用されるように、用語「感染体」は、感染した生物の少なくとも１個の細胞内で繁殖する外来生物学的実体、すなわち、病原体を指す。たとえば、感染体は、バクテリア、ウイルス、原生動物、及び菌類を含むが、これらに限定されない。細胞内病原体は、特に興味深い。感染症は、感染体によって引き起こされる疾患である。いくつかの感染体は、ある一定の条件下で、認識できない症状または疾患を引き起こすが、変化した条件下で、症状または疾患を引き起こす可能性を有する。
【００４４】
肝炎ウイルス。肝炎ウイルスは、無関係で、多くの場合に非常に珍しいヒト病原体の範囲を含む。ヘパトウイルス属として分類される、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、ピコルナウイルス科の多くの特性を共有する、小さな、非エンベロープ型対称的ＲＮＡウイルスであり、糞口経路によって伝染する感染症または流行性肝炎の原因である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス群のメンバーであり、逆転写によって、異常に複製される二本鎖ＤＮＡウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルスは、人類に固有であり、世界の多くの地域で高侵淫性である。このウイルスの多数の変異体を記述している。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、Ｃ型肝炎が媒介節足動物によって伝染しないが、フラビウイルス属に遠位に関連する（おそらくその進化において）ようにみえるエンベロープ型一本鎖ＲＮＡウイルスである。いくつかの遺伝子型を識別している。ごく最近になって識別されたウイルスによる感染は、多くの国で一般的である。Ｃ型肝炎ウイルスは、慢性肝疾患と関連し、またいくつかの国で原発性肝癌と関連する。Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、ある一定の植物ウイルスサテライト及びウイロイドに対する多数の類似性を有する、異常な、一本鎖の環状ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、肝細胞における増殖のためにヘパドナウイルスヘルパー機能を必要とし、世界の多くの地域で急性及び重篤な慢性肝損傷の重要な原因である。腸管に伝染した非Ａ型、非Ｂ型肝炎の原因である、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、別の非エンベロープ型、一本鎖ＲＮＡウイルスであり、このウイルスは、カリシウイルスによる多くの生物物理学的特徴及び生化学的特徴を共有する。Ｅ型肝炎ウイルスは、インド、中央及び東南アジア、中東、アフリカの地域及び他の地域の亜大陸における急性肝炎の大流行の重要な原因である。
【００４５】
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」、「ＨＣＶ」、「非Ａ型、非Ｂ型肝炎」、または「ＮＡＮＢＨ」は、本明細書において互換的に使用され、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡによって符号化される、または天然アレル変異により発生する、ウイルス粒子のいずれかの「遺伝子型」若しくは「サブゲノムタイプ」（「サブタイプ」とも称される）、またはその部分（たとえば、ＨＣＶの遺伝子型ＩａのＥ２タンパク質の一部）を含む。ＨＣＶゲノムは、５’非翻訳領域を含み、その後、約３，０１０個のアミノ酸にコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を伴う。ＯＲＦは、ヌクレオチド塩基対３４２から８，９５５まで続いた後に、３’末端に別の非翻訳領域を伴う。コアタンパク質中の変異によってカテゴリー化される約６種の別個のＨＣＶ遺伝子型（たとえば、遺伝子型１、２、３、４、５及び６）があり、また各遺伝子型内でさらに変異を示す８０種超のサブゲノムタイプがあり、これらのいくつかは、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、５ａ、及び６ａを含む。
【００４６】
用語「癌」、「新生物」、及び「腫瘍」は、本明細書で互換的に使用され、それらが細胞増殖に勝る制御の有意な喪失を特徴とする異常な増殖表現型を示すような、自律的な、未制御の増殖を示す細胞を指す。本出願において検出、解析、または処置の対象となる細胞は、前癌性の（たとえば、良性の）、悪性の、転移前の、転移性の、及び非転移性の細胞を含む。実質的にすべての組織の癌は、知られている。語句「癌量」は、被検体中の癌細胞量または癌体積を指す。したがって、癌量を減少させることは、被検体中の癌細胞数または癌体積を減少させることを指す。本明細書に使用されるような、用語「癌細胞」は、癌細胞である、または癌細胞に由来する（たとえば、癌細胞のクローン）、いずれかの細胞を指す。多くの種類の癌は、当業者に知られており、細胞腫、肉腫、膠芽腫、メラノーマ、リンパ腫、骨髄腫などの固形腫瘍、及び白血病のような循環癌を含む。癌の例は、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、細胞腫、メラノーマ、頭頸部癌、及び脳癌を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「有効量」または「有効用量」は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。用語「治療上の有効量」は、疾患をすでに患う患者における疾患及びその合併症を治療する、または少なくとも部分的に静止させるのに十分な量として定義される。この用途に効果的な量は、治療される疾患の重症度、及び患者自身の免疫系の一般的な状態に依存する。
【００４８】
本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド類及びオリゴペプチド類を含むことが可能である。自然起源のタンパク質分子のアミノ酸配列を指す「ポリペプチド」を本明細書に列挙する場合に、「ポリペプチド」及び同様の用語は、必ずしも列挙されたタンパク質分子と関連する完全に、天然なアミノ酸配列へのアミノ酸配列に限定されないが、代替に、本明細書に提供されるアミノ酸配列に関して識別される、実質的な配列類似性、または配列を含むポリペプチド類を含有する、生物学的活性変異体またはフラグメントを含むことが可能である。一般に、フラグメントまたは変異体は、それらの配列が由来する、親ポリペプチドの生物学的活性を保持する。
【００４９】
本明細書に使用されるように、「ポリペプチド」は、ｉ）天然ポリペプチド、ｉｉ）ポリペプチドの生物学的活性フラグメント、またはｉｉｉ）ポリペプチドの生物学的活性変異体、のアミノ酸配列を含む、組換え、または非組換えポリペプチドのアミノ酸配列を指す。使用に適しているポリペプチド類は、いずれかの種、たとえば、天然、合成、半合成または組換えであろうといずれかの供給源からの、哺乳類、または非哺乳類（たとえば、爬虫類、両生類、鳥類（たとえば、ニワトリ））、特にヒト、齧歯類（たとえば、マウスまたはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、またはウマを含む哺乳類、特にラットまたはヒトから得られることが可能である。一般に、ヒトポリペプチドの配列を含むポリペプチド類は、特別な興味の対象である。
【００５０】
用語「に由来する」は、指示された供給源（たとえば、タンパク質が細胞から直接に精製されるときに、このタンパク質はこの細胞「に由来する」）から得られる分子を示し、または情報は、供給源、たとえば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列などから得られ、供給源からの分子は、情報供給源以外の材料から合成されることが可能である。
【００５１】
用語「単離された」は、列挙された材料（たとえば、ポリペプチド、核酸など）が自然に（たとえば、細胞内で）発生する他の材料から実質的に分離される、またはこれらの材料と比較して濃縮されることを示す。単離される材料（たとえば、ポリペプチド、核酸など）は、所与の試料中の同一の種類の総材料の少なくとも約０．１重量％、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、または少なくとも約５重量％を占める。
【００５２】
用語「被検体」及び「患者」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載される製薬方法、医薬品組成物及び薬学的処置に必要性を有する可能性がある、いずれかの哺乳類または非哺乳類の種の単数のメンバーまたは複数のメンバーを意味する。したがって、被検体及び患者は、霊長類（ヒトを含む）、イヌ、ネコ、有蹄動物（たとえば、ウマ、ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）（たとえば、ブタ（ｐｉｇ）））、鳥類、及び他の被検体を含むが、これらに限定されない。ヒト、及び商業的重要性を有する非ヒト動物（たとえば、家畜及び飼育動物）は、特別な興味の対象である。用語が使用される文脈から明らかであるように、被検体及び患者は、癌を含む、ウイルスなどによって感染した被検体または患者を指すことができる。
【００５３】
「哺乳類」は、いずれかの哺乳類の種の単数のメンバーまたは複数のメンバーを意味し、例として、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、齧歯類など、及び霊長類、特にヒトを含む。非ヒト動物モデル、特に哺乳類、たとえば、霊長類、マウス、ウサギなどを実験的調査のために使用することができる。
【００５４】
本明細書に使用されるように、用語「単位投与量形態」は、ヒト及び動物被検体についての単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体または媒体と関連する所望の効果を生じるのに十分な量で計算された化合物の所定量を含有する。新規の単位投与量形態についての仕様は、用いられる特定化合物及び達成される効果、ならびに宿主における各化合物と関連する薬力学に依存する。
【００５５】
「薬学的に許容可能な賦形剤」、「薬学的に許容可能な希釈剤」、「薬学的に許容可能な担体」、及び「薬学的に許容可能なアジュバント」は、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物を調製する際に有用である、賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを意味し、ヒトの医薬用途と同様に、獣医学的用途に許容可能である、賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるような、「薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、担体及びアジュバント」は、賦形剤、希釈剤、担体及びアジュバントなどの、１つ以上のこのようなものを包含する。
【００５６】
本明細書で使用する「医薬組成物」は、哺乳類などの被検体、特にヒトへの投与に好適な組成物を含むことを意味する。一般に、「医薬組成物」は、滅菌であり、被検体内の望ましくない反応を誘発することができる汚染物質を通常含まない（たとえば、医薬組成物中の化合物（複数可）は医薬品等級である）。医薬組成物は、経口、バッカル、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管及び同様のものを含む、複数の異なる投与経路を介してそれらを必要とする被検体または患者への投与のために設計されることが可能である。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「標識」という語は、抗体へ直接的に、または間接的にコンジュゲートされる、検出可能な化合物または組成物を指す。標識自体は、それ自体（たとえば、放射性同位体標識または蛍光標識）によって検出可能であり得る、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物若しくは組成物の化学変成を触媒し得る。
【００５８】
「固相」とは、本発明の抗体が接着することが可能である非水系マトリクスを意味する。本明細書に含まれる固相の例は、ガラス（たとえば、コントロールドポアガラス）、多糖類（たとえば、アガロース）、ポリアクリルアミド類、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンの部分に、または全体に形成された固相を含む。ある一定の実施形態において、文脈により、固相は、アッセイプレートのウェルを含むことが可能であり、他のものにおいて、それは、精製カラム（たとえば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。また、この用語は、離散粒子の不連続固相、たとえば、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されるものなどを含む。
【００５９】
変異体。またＩＦＮポリペプチド類、たとえば、ＩＦＮλシンセカイン中に結合ドメインを提供するＩＦＮ配列などは、上述されるポリペプチドの誘導体、変異体、及び生物学的活性フラグメント、たとえば、天然物リガンドの変異体などを含むことができる。「変異型」ポリペプチドは、以下に定義されるような、提供された配列に関して１００％未満の配列相同性を有する、生物学的活性ポリペプチドを意味する。これらのような変異体は、たとえば、１個以上のアミノ酸残基を自然配列の、または自然配列内のＮ−またはＣ−終端に加え、約１個から４０個までのアミノ酸残基を欠失して、任意選択で１個以上のアミノ酸残基によって置換する提供された配列と比較して、またアミノ酸残基が共有結合修飾されたため、得られた生成物が非自然発生アミノ酸を含む上記のポリペプチド類の誘導体と比較して、１個以上のアミノ酸修飾、たとえば、挿入、欠失または置換などを有するポリペプチド類を含む。通常、生物学的活性変異体は、自然配列ポリペプチドを含む少なくとも約９０％のアミノ酸配列相同性を有する、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
配列の「機能誘導体」は、初期配列と共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能誘導体」は、それらが共通に生物学的活性を有する限り、配列のフラグメント、及び配列の誘導体を含むが、これらに限定されない。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、及びその共有結合修飾の両方を包含する。
【００６１】
通常の分子生物学技術及び合成化学を使用して、本発明の組成物及び方法における使用のための結合ドメインを改変することができるので、タンパク質分解へのそれらの抵抗性を改善する、または溶解性を最適化する、またはそれらを治療薬としてより適切にすることができる。これらのようなポリペプチド類の類似体は、自然発生するＬ−アミノ酸以外の残基、たとえば、Ｄ−アミノ酸または非自然発生する合成アミノ酸などを含む類似体である。Ｄ−アミノ酸をいくつかの、またはすべてのアミノ酸残基について置換することができる。
【００６２】
ＩＦＮλシンセカインを追加のポリペプチド配列へ融合する、または結合することができる。例は、シンセカインを免疫グロブリン配列、特にＦｃ配列と結合させるイムノアドヘシン、及び「タグポリペプチド」に融合される、天然の阻害剤ポリペプチドまたはその部分を含むエピトープタグ付きポリペプチドを含む。タグポリペプチドは、それが天然ポリペプチドの生物学的活性を妨げないように十分短い。適切なタグポリペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸残基、及び通常約６から６０個の間のアミノ酸残基を一般的に含む。また、シンセカインまたはＩＦＮλを製剤中に融合する、若しくは結合する、または活性、たとえば、サイトカイン、増殖因子、化学療法剤、免疫抑制剤などを増強する薬剤と同時投与することができる。
【００６３】
リンカー。リンカー、たとえば、ポリペプチドリンカー、または非ペプチドリンカーなどによってシンセカインの結合ドメインを分離することができる。ドメインを連結するアミノ酸リンカーは、マルチドメインタンパク質の構造及び機能において重要な役割を演じることが可能である。触媒活性が適切なリンカー組成物を必要とするタンパク質の複数の例がある。一般に、ドメインを接合するリンカーの長さを変えることにより、タンパク質安定性、フォールディング率及びドメイン間配向に影響することを示している（Ｇｅｏｒｇｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒｉｎｇ（２００３）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１５：８７１−８７９参照）。シンセカイン中のリンカーの長さ、したがって結合ドメイン間のスペーシングを使用して、シンセカインのシグナル強度を改変することが可能であり、シンセカインの所望の用途により選択することが可能である。シンセカインの結合ドメイン間で実施された距離は、変わることが可能であるが、ある一定の実施形態において、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、約５０オングストローム未満、約４０オングストローム未満、約３０オングストローム未満、約２０オングストローム未満であることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、リンカーは、剛性リンカーであり、他の実施形態において、リンカーは、可撓性リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカー部分は、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、２から１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９個のアミノ酸を含むが、１００個より多いアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、５から７５、５から５０、５から２５、５から２０、５から１５、５から１０、または５から９の間のアミノ酸長である。例示的なリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなど、少なくとも２個のアミノ酸残基を含有する直鎖ペプチドを含む。適切なリンカーペプチド類は、アラニル及び／またはセリニル及び／またはプロリニル及び／またはグリシルアミノ酸残基からなる、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン及びオリゴペプチド類を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ９、Ｇｌｕ９、Ｓｅｒ９、Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ２−Ｃｙｓ、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、及びＧｌｙ９−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ、または（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、そこでｎは、１、２、３、４、５などであるが、多くのこれらのようなリンカーは、当該技術分野において知られており、使用され、この目的を果たすことができる。
【００６５】
シンセカインは、一本鎖形態で提供されることが可能であり、このことは、リンカーペプチドを介するペプチド結合によって結合ドメインを連結することを意味する。他の実施形態において、結合ドメインは、個々のペプチドであり、非ペプチドリンカーを介して連結されることが可能である。
【００６６】
結合ドメインを連結する際に用途を見出す化学基は、当該技術分野において知られているような、カルバメートと、アミド（アミンとカルボン酸）と、エステル（アルコールとカルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカンとスルフヒドリル、マレイミドとスルフヒドリル）、Ｓｃｈｉｆｆ塩基（アミンとアルデヒド）、尿素（アミンとイソシアン酸塩）、チオ尿素（アミンとイソチオシアネート）、スルホンアミド（アミンとスルホニルクロリド）、ジスルフィドと、ヒドラゾン（ｈｙｒｏｄｒａｚｏｎｅ）、脂質類、及び同様のものを含む。
【００６７】
結合ドメイン間のリンケージは、スペーサー、たとえば、アルキルスペーサーなどを含むことができ、これらのスペーサーは、直鎖または分岐鎖であり、通常直鎖であることができ、１つ以上の不飽和結合を含むことができ、通常、１から３００個までの炭素原子を含み、さらに通常、約１から２５個までの炭素原子を含み、約３から１２個までの炭素原子であることができる。またこの種類のスペーサーは、アミン類、エーテル類、リン酸ジエステル類、及び同様のものを含有する、ヘテロ原子または官能基を含むことができる。対象となる特異的構造は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎを含み、そこでｎが１から約１２であり、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎを含み、そこでｎが１から約１２であり、［（ＣＨ２）ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ］ｚを含み、そこでｎ及びｍが１から約６であり、ｚが１から約１０であり、［（ＣＨ２）ｎＯＰＯ３（ＣＨ２）ｍ］ｚを含み、そこでｎ及びｍが１から約６であり、ｚが１から約１０である。これらのようなリンカーは、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい、ポリエチレングリコールを含むことができる。
【００６８】
結合ドメインは、親水性ヘッドグループへ安定リンケージを形成することができる一端における基、及び標的部分へ安定リンケージを形成することができる対向端における基を含む、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーを介して連結されることができる。例示的な実体は、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスベラート、アジプイミド酸ジメチル、酒石酸ジスクシンイミジル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸、グルタルアルデヒド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬと、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸塩と、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）と、Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミドと、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）と、または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）と、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、及びスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸びきり鎖類似体を含む。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００６９】
この目的のために有用な他の試薬は、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ及びフェノール基と不可逆的架橋反応を形成する）と、ジメチルアジピミダート（アミノ基に特異的である）と、フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（アミノ基と主に反応する）と、ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（アミノ基と主に反応する）と、ジスジアゾベンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（チロシン及びヒスチジンと主に反応する）と、Ｏ−ベンゾトリアゾールイルオキシテトラメチルウロニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｕｌｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｄｅ）、ブロモ−トリス（ピロリジノン）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）と、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と、４−ピロリジノ（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ）ピリジンと、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールと、同様のものとを含む。ホモ二官能性架橋剤は、ビスマイレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）を含む。
【００７０】
抗体：本明細書で使用されるような、用語「抗体」は、特定の標的抗原への特異的結合を与えるのに十分な標準免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。受容体のうちの１つ以上の細胞外ドメインに結合する抗体：ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＦＮλＲ１、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２は、対象となる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＦＮλＲ１及びＩＦＮＡＲ１、またはＩＦＮλＲ１及びＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインへの二重特異性抗体結合である。
【００７１】
当該技術分野において知られているように、天然に産生されるようなインタクト抗体は、「Ｙ字型」構造と一般的に称される、互いに会合する、２個の同一の重鎖ポリペプチド（各約５０ｋＤ）、及び２個の同一の軽鎖ポリペプチド（各約２５ｋＤ）から構成される、約１５０ｋＤの四量体薬剤である。各重鎖は、少なくとも４箇所のドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸長）から構成され、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置している）と、その後、ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙのステムの塩基に位置している）の３箇所の定常ドメインを伴う。「スイッチ」として知られている、短い領域は、重鎖可変領域及び定常領域を接合させる。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残りに接合させる。このヒンジ領域中の２箇所のジスルフィド結合は、インタクト抗体中で２個の重鎖ポリペプチドを互いに接合させる。各軽鎖は、２箇所のドメインから構成され、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、その後にカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインを伴い、これらのドメインは、別の「スイッチ」によって互いから分離される。インタクト抗体四量体は、２個の重鎖−軽鎖二量体から構成され、その中で、重鎖及び軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって互いに結合され、他の２箇所のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに連結するため、二量体は、互いに連結され、四量体を形成する。また、一般的にＣＨ２ドメイン上で、自然に産生する抗体をグリコシル化する。自然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行ベータバレル中で互いに接して詰め込まれる、２枚のベータシート（たとえば、３本鎖、４本鎖、または５本鎖シートなど）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）として知られている３つの高頻度可変性ループ、及び４箇所の若干の不変「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含む。自然抗体がフォールドするときに、ＦＲ領域は、ドメインに構造フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域は、３次元空間にまとめられるため、それらは、Ｙ構造の先端に位置している単一の高頻度可変性抗原結合部位を作製する。
【００７２】
自然発生する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、またエフェクター細胞上で受容体に結合し、これらのエフェクター細胞は、たとえば、細胞毒性を媒介するエフェクター細胞を含む。当該技術分野において知られているように、Ｆｃ受容体についてのＦｃ領域の親和性及び／または他の結合属性を糖鎖付加または他の修飾を介して改変することが可能である。いくつかの実施形態において、本発明に従い産生される、及び／または利用される抗体は、グリコシル化などの改変された、または工学的に設計された、Ｆｃドメインを含む、グリコシル化されたＦｃドメインを含む。
【００７３】
自然抗体中に見出されるものとして、十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む、いずれかのポリペプチド、またはポリペプチドの複合体は、このようなポリペプチドが自然に産生される（たとえば、抗原に反応する生物によって生成される）か、遺伝子組み換え工学、化学合成、または他の人工システム若しくは方法論によって産生されるかどうかにかかわらず、「抗体」と称される、及び／または「抗体」として使用されることが可能である。いくつかの実施形態において、当該技術分野において知られているように、抗体配列要素は、ヒト化、霊長類化、キメラ化などである。
【００７４】
さらに、本明細書に使用されるように、用語「抗体」は、適切な実施形態（別段に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り）において、代替の提示において抗体の構造及び機能特徴を利用するために当該技術分野において知られている、または開発された構築物または形態のいずれかを指す。たとえば、実施形態の、本発明に従い利用される抗体は、インタクトＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、二重特異性抗体または多特異性抗体（たとえば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖｓ、Ｆａｂｓ、小モジュラー免疫医薬品（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖またはタンデム型二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択される形態にあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体は、天然に産生した場合に有する共有結合的修飾（たとえば、グリカンの付着）を欠く可能性がある。いくつかの実施形態において、抗体は、共有結合的修飾を含む可能性がある（たとえば、グリカン、ペイロード（たとえば、検出可能な部分、処置部分、触媒部分など）、または他のペンダント基（たとえば、ポリエチレングリコールなど）の付着）。
【００７５】
小分子組成物。またシンセカインは、有機分子、好ましくは、５０超から約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物を含む。有用なシンセカインは、たとえば、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＦＮλＲ１、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインの一方または両方への高親和性結合について分子をアッセイする、スクリーニングアッセイなどによって識別される。いくつかの実施形態において、ＩＦＮλＲ１及びＩＦＮＡＲ１、またはＩＦＮλＲ１及びＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインへの分子結合は、対象となる。分子は、結合部分を提供することが可能であり、この結合部分は、別の結合部分に連結される、またはポリペプチド薬について上述されるような結合ドメインに連結される。
【００７６】
候補のシンセカインは、受容体ＥＣＤとの構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、一般的に、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは、これらの化学官能基のうちの少なくとも２個を含む。候補のシンセカインは、上記の官能基のうちの１つ以上と置換される環式炭素または複素環式構造及び／または芳香族または多環芳香族構造を含むことが多い。また候補の薬剤は、ペプチド類、糖類、脂肪酸類、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体類、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む、生体分子間に見出される。
【００７７】
候補のシンセカインは、合成または天然化合物のライブラリーを含む、多種多様な供給源から得られる。たとえば、複数の手段は、ランダムに利用可能であり、ランダム化オリゴヌクレオチド類及びオリゴペプチド類の発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子の合成を対象とする。代替に、天然化合物ライブラリーは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態で利用可能である、または容易に作製される。加えて、天然で、または合成で作製されたライブラリー及び化合物を、従来の化学的手段、物理的手段及び生化学的手段を介して容易に改変し、これらを使用して、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。既知の薬理学的な薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、直接または無作為化学修飾を受け、構造類似体を産生することができる。たとえば、天然物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリーなどのライブラリーから試験剤を得ることが可能である。これらのようなライブラリーを調製するために複数の異なる種類のコンビナトリアルライブラリー及び方法は、たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９５／３５５０３、ＷＯ９４／０８０５１及びＷＯ９５／３０６４２などに、記述されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【００７８】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、分子のうちの１個以上を標識に連結することができ、この標識は、検出可能なシグナルを直接的に、または間接的に提供することが可能である。さまざまな標識は、放射性同位元素、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、磁性粒子などの粒子、及び同様のものを含む。特異的結合分子は、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシンなどのような、対を含む。特異的結合メンバーについて、相補的メンバーは、既知の手順に従い、検出用に提供する分子によって通常標識付けされる。
【００７９】
さまざまな他の試薬をスクリーニングアッセイに含むことができる。これらは、塩類、アルブミンなどの中性タンパク質、界面活性剤などのような試薬を含み、これらの試薬を使用して、最適なタンパク質間結合を促進する、及び／または非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少させる。アッセイの効率を改善する試薬、たとえば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などを使用することができる。成分の混合物を、必要な結合を提供する、いずれかの順序で加える。インキュベーションを、いずれかの適切な温度、一般的に４から４０℃の間で実施する。インキュベーション期間を最適な活性のために選択するが、またインキュベーション期間を最適化し、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にすることができる。典型的に０．１から１時間の間で十分である。
【００８０】
対象となる受容体ポリペプチド（複数可）に結合することが可能である化合物についてスクリーニングすることによって、予備的スクリーニングを行うことが可能である。結合アッセイは、受容体ＥＣＤを１個以上の試験化合物と接触させること、及びタンパク質及び試験化合物が結合複合体を形成するのに十分な時間を許容することを通常伴う。形成されるいずれかの結合複合体を、複数の確立された解析技術のいずれかを使用して検出することが可能である。タンパク質結合アッセイは、共沈殿、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の共遊走、及びウエスタンブロット上の共遊走を測定する方法を含むが、これらに限定されない（たとえば、Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．（１９８５）“Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”，ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．６１−８９．参照）。
【００８１】
ある一定のスクリーニング方法は、シグナル伝達活性を調節する化合物についてスクリーニングすることを備える。これらのような方法は、細胞ベースアッセイを行うことを備えることができ、これらのアッセイにおいて、試験化合物を１個以上の細胞と接触させ、発現した後に、応答性遺伝子の発現の増加を検出し、さまざまなアダプタータンパク質、Ｊａｋ、ＳＴＡＴ（複数可）、及び同様のものにおける変化を検出する。
【００８２】
発現または活性のレベルを基線値と比較することが可能である。上記に示されるように、基線値は、対照試料についての値、または対照集団についての発現レベルを表す統計値であることが可能である。また、受容体を発現しない細胞についての発現レベルを、陰性対照として決定することが可能である。一般的に、これらのような細胞は、他の点では実質的に試験細胞と遺伝的に同一のものである。さまざまな対照は、レポーター構築物を欠く細胞と並発反応を行うことを有する、またはレポーター構築物を内部にもつ細胞を試験化合物と接触させないことによって、観察された活性が真であることを確保するように行われることが可能である。また化合物は、下記のように、さらに妥当性確認されることが可能である。
【００８３】
前述のスクリーニング方法のいずれかによって最初に識別される化合物をさらに試験し、見かけの活性を妥当性確認することが可能である。これらのような方法の基本的な形式は、動物への最初のスクリーニング中に、またはヒトについてモデルとして機能する細胞培養モデルにおいて、識別されたリード化合物を投与することを備える。妥当性確認研究に利用される動物モデルは、一般的に哺乳類である。適した動物の特異的な例は、霊長類、マウス、及びラットを含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書に記述されるスクリーニング方法によって識別される活性試験剤は、類似体化合物の合成のためのリード化合物として機能することが可能である。一般的に、類似体化合物は、リード化合物に類似する、電子配置及び分子立体構造を有するように合成される。自己無撞着場（ＳＣＦ）解析、配置間相互作用（ＣＩ）解析、及びノーマルモードのダイナミクス解析などの技法の使用を介して、類似体化合物の識別を実施することが可能である。これらの技法を実装するコンピュータプログラムは、利用可能である。たとえば、Ｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。
【００８５】
他の用語の定義は、本明細書全体を通して現れる。
【００８６】
タンパク質組成物
それらに由来する変異型ＩＦＮλポリペプチド及びシンセカインを提供する。シンセカインは、天然リガンドに関して異なるシグナルプロファイルを活性化するという条件で、標的経路によるシグナル伝達レベルにおける測定可能な増加をもたらす。重要な特徴は、シンセカインが細胞表面受容体の２箇所以上の別個の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合することである。本明細書に使用されるような、ＩＦＮλシンセカインは、ＩＦＮλＲ１またはＩＬ−１０Ｒβのうちの１個に結合する。いくつかの実施形態において、第二ＥＣＤは、ＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２である。
【００８７】
シンセカインは、たとえば、タンパク質、または所望の結合タンパク質を含む医薬品などの、いずれかの分子であることが可能であり、変異型ＩＦＮλ及びＩ型ＩＦＮポリペプチド類を含むことができる。小分子は、約１５Ｋｄ未満であることができ、対象となり、本明細書に記載されるような化合物スクリーニングを介して発生することが可能である。またポリペプチド類は、対象となる。加えて、ある一定のサイトカインは、ポリペプチド領域またはドメインと、非ポリペプチド領域またはドメインとの両方を含むことができる。シンセカインは、ポリペプチドであることが可能であり、そこで２箇所の異なる受容体の細胞外ドメインについて結合ドメインを結合する。ポリペプチドシンセカインは、単鎖、二量体、またはより高次の多量体であることができる。結合ドメインは、直接連結されることができる、またはリンカー、たとえば、ポリペプチドリンカー若しくは非ペプチドリンカーなどによって分離されることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、１箇所の、またはすべての結合ドメイン（複数可）は、ＩＩＩ型ＩＦＮ、すなわち、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、及びＩＦＮＬ４に連結される、天然リガンド、すなわち、Ｉ型ＩＦＮ、たとえば、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκ、ＩＦＮωの結合ドメインを含み、そこで結合ドメインは、リガンドについて天然受容体を活性化させない。たとえば、結合ドメインは、天然受容体ポリペプチド類の一方への結合の欠如をもたらすが、他方への結合の欠如をもたらさない、標的アミノ酸置換を有することができる。多くのこれらのような修飾された結合ドメインは、当該技術分野において知られており、たとえば、天然受容体配置に関してドミナントネガティブ変異をもたらすことが可能である。これらのようなポリペプチド類の特異的実施形態は、本明細書に記載され、配列番号３に関する残基Ｑ２６、Ｑ９９、Ｈ１０２のうちの１個以上におけるアミノ酸変化の結果としてＩＬ−１０Ｒβへの抑止された結合を有するＩＦＮλポリペプチドと、配列番号２１に関する残基Ｒ１４、Ｌ３２、Ｒ３５、Ｋ１５２のうちの１個以上におけるアミノ酸変化の結果としてＩＦＮＡＲ２への抑止された結合を有するＩＦＮωポリペプチドとを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
さまざまな他の実施形態において、結合ドメインは、受容体の一方の鎖に特異的に結合する、抗体、またはそれに由来する結合部分であることができる。
【００９０】
ある一定の実施形態において、ＩＦＮλシンセカインは、ＩＦＮλ変異型ポリペプチドを含む融合タンパク質であり、このＩＦＮλ変異型ポリペプチドは、ＩＦＮＡＲ１に結合するがＩＦＮＡＲ２に結合しない、ＩＦＮω変異型ポリペプチドを含むが、これに限定されない、ＩＦＮλＲ１に結合するが、ＩＬ−１０Ｒβ及びＩ型ＩＦＮに結合しない。配列番号２０（Ｈ１１ＤＮ）に記載される、ＩＦＮλタンパク質を含むハイブリッドタンパク質と、短いポリペプチドリンカーを介して融合されることができる、配列番号２２（ＩＦＮＷＤＮ２）に記載されるＩＦＮω変異体とを例として提供する。したがって、シンセカインは、作製された後に、ＩＦＮλＲ１／ＩＦＮＡＲ１受容体二量体の形成を強いる。この二量体は、それがＩＬ−１０ＲβのＴｙｋ２をそのＩＦＮＡＲ１と置換させることを除き、天然ＩＦＮλＲ１二量体によって使用されるＪＡＫ１／ＴＹＫ２対合を再現する。ＩＦＮλへのＩＬ−１０Ｒβの結合、及びＩＦＮωへのＩＦＮＡＲ２の結合の切断は、変異をそれぞれの受容体結合部位に導入することによって成し遂げられることができる。他の実施形態において、ＩＦＮλへのＩＬ−１０Ｒβの結合、及びＩ型ＩＦＮ、たとえば、ＩＦＮωなどへのＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２の一方の結合を切断するように、ＩＦＮλシンセカインを工学的に設計し、また新規のＴｙｋ２／Ｊａｋ１対合をもたらす。
【００９１】
他の実施形態において、ＩＦＮλシンセカインは、ＩＦＮλＲ１またはＩＬ−１０Ｒβの１つと、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達のために提供する受容体のＥＣＤとに結合し、この受容体のＥＣＤは、βｃ、γｃ、ＩＬ−３Ｒα、βＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＣＮＴＦα、ＣＲＬＦ１、ＬＩＦＲα、ｇｐ１３０、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、ＯＳＭＲβ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１Ｒα、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ−２３Ｒ、ＥｐｏＲ、ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＦＮＡＲ１、Ｇ−ＣＳＦＲ、ｃ−ＭＰＬＲを含むが、これらに限定されない。参照により本明細書に具体的に援用される、同時係争中の出願米国仮第６２／４７９，９９３号を参照する。
【００９２】
また、親和性成熟（変異型）ＩＩＩ型インターフェロンに関する組成物及び方法を提供する。変異型インターフェロンは、野生型タンパク質に関して、たとえば、配列番号１から６に記載される参照配列などに関して、１箇所以上のアミノ酸置換を有し、これらの変化は、同族受容体について変異型インターフェロンの親和性を変える。変異型タンパク質は、本明細書に提供される野生型配列に関して、配列全長を含むことができる、またはフラグメント若しくは切断型バージョンであることができる。ある一定の実施形態において、配列番号３の残基１から１１は、タンパク質の最終形態から切断される。
【００９３】
変異型インターフェロンは、天然タンパク質と比較して、親和性における少なくとも５倍の増加、親和性における少なくとも１０倍の増加によって、増加した結合を有することができ、親和性における、若しくはＩＦＮλＲ１かＩＬ−１０Ｒβに対して、少なくとも２０倍の増加を有することができ、または親和性における少なくとも５分の１の減少、親和性における少なくとも１０分の１の減少を有することができ、親和性における、若しくはＩＦＮλＲ１かＩＬ−１０Ｒβに対して少なくとも２０分の１の減少を有することができる。最適化された結合定数を達成するように、１個以上のアミノ酸残基は、結合を修飾するように変えられ、より好都合な結合の結合速度、より好都合な結合の解離速度、若しくは両方を達成することができる。親和性成熟技術は、当該技術分野において周知であり、親和性成熟技術を使用して、結合領域（複数可）を変えた後に、結合における所望の変化について得られた結合分子のスクリーニングを伴うことが可能である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、変異型ＩＩＩ型インターフェロンは、ヒトＩＦＮ−λ３に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１０Ｒβについて親和性を増加させるアミノ酸置換を行う。ＩＬ−１０Ｒβについての変異型インターフェロンの親和性は、約５μＭ  Ｋｄ未満、約１μＭ  Ｋｄ未満、約７５０ｎＭ  Ｋｄ未満、約５００ｎＭ  Ｋｄ未満であることができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換を、残基Ｑ２６、Ｅ８４、Ｈ１３１、Ｔ１６１及びＶ１７４のうちの１個以上に行い、配列番号３に関して番号付けを行う。修飾を配列番号３以外の配列に行う場合、行われた参照を、図１１に提供された配列アライメントへ行い、配列番号１、２、４、５または６において対応するアミノ酸を決定する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、１箇所以上のアミノ酸置換は、ＩＩＩ型インターフェロンとＩＬ−１０Ｒβとの間の接触に関与する少なくとも１個の残基によって行われる。ある一定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｑ２６及びＥ８４の一方または両方にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、Ｑ２６Ｒ及び／またはＥ８４Ｄである。追加の置換は、Ｈ１３１Ｒ、Ｔ１６１Ａ及びＶ１７４Ｅを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、変異体は、配列番号１９の配列、またはそのフラグメント、たとえば、アミノ酸残基１から１１のトランケーションなどを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、１箇所以上のアミノ酸置換は、ＩＩＩ型インターフェロンとＩＦＮλＲ１受容体との間の接触に関与する少なくとも１個の残基によって行われる。ある一定の実施形態において、アミノ酸置換は、位置Ｔ１６１にある。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、Ｔ１６１Ａである。
【００９７】
修飾されたインターフェロンは、配列番号７から２０のいずれかに記載される配列を含むことができ、配列番号３の参照配列と比較して、配列番号７から２０に記載される１箇所以上のアミノ酸置換を有することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アミノ酸残基１から１１の欠失によって配列番号７から２０のいずれかに関して切断される。
【００９８】
変異型タンパク質の増強した親和性は、増加した活性において明らかにされることができる。たとえば、ウイルス負荷を低下させる生物システムにおいて、変異型インターフェロンは、約５から１０日の期間にわたり、野生型タンパク質と比較して約２分の１まで、約５分の１まで、約１０分の１以上までウイルス力価、たとえば、肝炎ウイルス力価などを減少させることができる。細胞培養系において、変異型インターフェロンは、野生型タンパク質と比較して、約２倍まで、約５倍まで、約１０倍以上まで、誘導された遺伝子発現、ｐＳＴＡＴ１シグナル伝達、及び／または減少したウイルス複製における増加を提供することが可能である。
【００９９】
本発明の実施形態は、単離されたＩＦＮλシンセカイン、変異型インターフェロンと誘導体及びそのフラグメント、ＩＦＮλシンセカインまたは親和性成熟型インターフェロンのうちの１個以上を含む医薬品製剤、ならびにこれらのＩＦＮλシンセカインまたは親和性成熟型インターフェロンを産生する細胞株を含む。
【０１００】
ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドは、１箇所以上のポリエチレングリコール部分によって化学的に修飾される、すなわち、ＰＥＧ化されることができる、または類似した修飾によって、たとえば、ＰＡＳ化されることができる。ＰＥＧ分子またはＰＡＳ分子は、インターフェロンの１本以上のアミノ酸側鎖にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化またはＰＡＳ化インターフェロンは、ＰＥＧまたはＰＡＳ部分を１個のアミノ酸上のみに含む。他の実施形態において、ＰＥＧ化またはＰＡＳ化インターフェロンは、たとえば、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、または２０個以上などの異なるアミノ酸残基に接着される、２個以上のアミノ酸上にＰＥＧまたはＰＡＳ部分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＡＳ鎖は、２０００、２０００超、５０００、５０００超、１０，０００、１０，０００超、１０，０００超、２０，０００、２０，０００超、及び３０，０００Ｄａである。ポリペプチドは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を介してＰＥＧまたはＰＡＳに直接に（すなわち、結合基を含まずに）共役されることができる。
【０１０１】
本発明のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチド製剤を使用して、さまざまな状態、たとえば、肝炎ウイルス感染、ウイルス感染と関連する肝疾患、及びＩＦＮ−λに応答性の癌を含むがそれに限定されない、ウイルス感染などを処置することができる。ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチド製剤は、たとえば、２個以上のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドのカクテルなどの本明細書に記載されるような１個以上のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチド、ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドとα−ＩＦＮ、β−ＩＦＮまたはγ−ＩＦＮのうちの１個以上との組み合わせなどを含むことができる。また、これらの組み合わせは、抗ウイルス薬、化学療法剤、免疫腫瘍剤、及び同様のものによって作製されることができる。抗ウイルス剤は、ペグ化インターフェロンα、リバビリン（ｒｉｂｉｖａｒｉｎ）などを含む。別の例において、ポリクローナルガンマグロブリン（たとえば、ヒトガンマグロブリン）と共に抗体を投与する。別の例において、ＨＣＶワクチン前、この後、またはこれと同時に抗体を投与する。これらは、概して、それまでに使用されたような投与量及び投与経路で、またはそれまでに用いられた投与量の約１〜９９％で使用される。
【０１０２】
ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチド製剤は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む、いずれかの適した手段によって投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。加えて、インターフェロン製剤は、パルス注入によって、特にインターフェロンの用量を減少させながら適切に投与されることができる。
【０１０３】
疾患の予防または治療のために、ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの適切な投与量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、予防目的でインターフェロンを投与するかどうか、以前の療法、患者の病歴及びインターフェロンへの応答、ならびに主治医の裁量に依存するだろう。ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドは、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【０１０４】
本発明の別の実施形態において、上記に説明される疾患の処置に有用な物質を含有する製品を提供する。製品は、容器及びラベルを含む。適した容器は、たとえば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。これらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。容器は、病態を治療するのに有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（たとえば、容器は、静注液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、上述されるような本発明の製剤中の１個以上のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドである。容器上の、または容器と関連するラベルは、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。製品は、薬学的に許容可能である緩衝液、たとえば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、及びブドウ糖液などを含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用に関する指示を有する添付文書を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１０５】
本発明の１個以上のタンパク質を含む治療用製剤は、所望の純度を有するインターフェロンを、凍結乾燥した製剤または水溶液の形で、任意選択的な生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって貯蔵用に調製される。インターフェロン組成物は、良好な医療行為と一致した様式で処方、投薬、及び投与される。この背景で検討する因子には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の因子が含まれる。投与されるＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの「治療上有効量」は、このような考慮によって決定され、感染者においてウイルス力価を減少させる、癌細胞の増殖を減少させる、腫瘍負荷を減少させるなどのために必要な最低量である。
【０１０６】
治療量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、及び約１００μｇ／ｋｇ体重以下であることができる。当業者は、これらのようなガイドラインがたとえば、インターフェロンフラグメントの用途において、またはＩＦＮλシンセカイン若しくはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの用途などにおいて、活性剤の分子量について調節されることを理解するであろう。また投与量は、たとえば、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．、及び同様のものなどの、局所投与のために、または全身投与のために変えることができる。
【０１０７】
例示的な治療計画は、毎日、週に２回、毎週、２週間に１回、１ヶ月に１回などの投与を伴う。別の例において、治療は、持続注入として与えられることが可能である。本発明の治療実体は、通常、複数の機会に投与される。単回投与の際の間隔は、毎週、毎月または毎年であることができる。また間隔は、患者の治療実体の血中レベルを測定することによって指定される場合、不定期でもあり得る。あるいは、本発明の治療実体は、徐放性製剤として投与されることが可能であり、その場合、あまり頻繁な投与を必要としない。用量と頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期によって変化する。
【０１０８】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエントに対し、用いられる投薬量及び濃度で無毒であり、緩衝液（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル若しくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど)、低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体(たとえば、Ｚｎ−タンパク質錯体)、及び／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含む。生体内投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通すろ過によって容易に達成される。
【０１０９】
活性成分はまた、たとえば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、あるいはマクロエマルジョン中に、封入されてもよい。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１１０】
薬学的な有効量は、疾患状態を防止する、その発生を阻害する、または治療する（少なくともある程度まで症状を緩和する）ために、たとえば、感染した個体のウイルス力価を低下させる、癌細胞の増殖を減少させるなどのために、必要とされる用量である。薬学的な有効量は、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、処置される被検体の種類、考察中の被検体依存特性、併用薬物療法、及び当業者が認識するであろう他の因子に依存する。一般的に、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の量の活性成分を投与する。
【０１１１】
製剤、及び肝臓への薬剤送達方法は、当該技術分野において知られており、たとえば、Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０：２４４−９；Ｍｕｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９：１８０８−１４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１８０−７；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４；５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４９：１６１１−７；及びＭａｔｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１０：１５５９−６６．を参照する。
【０１１２】
製剤、及び皮膚または粘膜への薬剤送達方法は、当該技術分野において知られている。これらのような送達系は、たとえば、水性及び非水性ゲル、クリーム、多重エマルション、マイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション、パッチ、座薬、及び錠剤などを含み、溶解剤、浸透促進剤（たとえば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、及び親水性ポリマー（たとえば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）などのような賦形剤を含むことが可能である。
【０１１３】
経口投与は、錠剤、トローチ剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性散剤若しくは顆粒剤、エマルション、硬若しくは軟カプセル剤、またはシロップ若しくはエリキシル剤として対象となる処方された薬剤を含む薬学的組成物を使用して達成されることが可能である。これらのような経口用組成物は、薬剤的に洗練され味の良い調製を提供するために、１つ以上の甘味剤、香味剤、着色剤または保存剤などを含むことが可能である。錠剤は、コーティングされる、またはコーティングされないことが可能であり、無毒の薬学的に許容可能な賦形剤、たとえば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤と、コーンスターチまたはアルギン酸などの造粒剤及び崩壊剤と、デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結着剤と、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石などの滑沢剤となどと混合している活性成分を含むように処方されることが可能である。コーティングを使用する場合、コーティングは、消化管中で崩壊及び吸収を遅らせることにより、長期間にわたる持続作用を与える。
【０１１４】
製剤が水性懸濁剤である場合、このような製剤は、適切な賦形剤（複数可）との混合物中に活性剤を含むことが可能である。これらのような賦形剤は、適宜、懸濁剤（たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム及びアカシアガム）、分散または湿潤剤、保存剤、着色剤、及び／または香味剤であることが可能である。
【０１１５】
たとえば、薬剤の直腸投与などのための坐薬は、これらの薬剤を、常温で個体であるが直腸温度で液体であるため直腸内で融けて薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製されることが可能である。これらのような材料は、カカオバター、及びポリエチレングリコールを含む。
【０１１６】
投薬量レベルは、当業者によって容易に決定されることが可能であり、必要に応じて、たとえば、治療への被検体の応答を修正するために必要とされるように、修正されることが可能である。一般に投薬量レベルは、１日、体重キログラムあたり約０．１ｍｇから約１４０ｍｇのオーダーである。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることが可能である活性成分の量は、治療する宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。一般的に単位剤形は、約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分を含む。
【０１１７】
使用方法
本発明は、ウイルス感染または複製を抑制するために、腫瘍細胞成長、増殖など、たとえば、感染、ウイルスまたは腫瘍媒介症状または病的状態などを抑制するために、有効な量に本明細書に記載されるような、ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを被検体へ投与することによって、被検体中の疾患を処置する方法を含む。これらのような疾患は、肝炎ウイルス感染と関連するさまざまな肝臓状態を含むことができる。肝臓または腎臓移植前、移植中、及び／または移植後の患者の治療に含まれる。治療は、単剤として、または薬物、追加の抗体、ワクチン、及び同様のものを含む、追加の抗ウイルス若しくは抗癌剤と組み合わせた薬剤として、本発明のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの使用を有することができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、感染症は、慢性感染症、すなわち、１週間、２週間などまでの期間内に宿主免疫系によって除去されない感染症である。いくつかの事例において、慢性感染症は、病原体の、たとえば、レトロウイルス、レンチウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどの宿主ゲノム中への遺伝的要素の組み込みを伴う。他の事例において、慢性感染症、たとえば、ある一定の細胞内バクテリアまたは原虫の病原体などは、宿主細胞内に存在する病原体細胞に起因する。加えて、いくつかの実施形態において、感染は、ヘルペスウイルスまたはヒト乳頭腫ウイルスに関するような、潜伏期にある。
【０１１９】
対象となるウイルス病原体は、レトロウイルス、ヘパドナ、レンチウイルスなど、病原体（たとえば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶなど）、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型）などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、感染症を罹患している患者の診断、または感染症を罹患すると以前に診断された患者の選択、変異型ＩＩＩ型インターフェロン治療、任意選択で追加の治療と組み合わせた、レジメンによって患者を治療すること、及び治療の有効性について患者を監視することを備える。監視することは、感染の臨床徴候、たとえば、発熱、白血球数などを測定する、及び／または病原体の存在について直接監視することができる。治療を他の活性剤と組み合わせることができる。またサイトカインは、たとえば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２などを含むことができる。また抗ウイルス剤、たとえば、アシクロビル、ガンシクロビルなどを治療に使用することができる。ＨＣＶ感染症を含む感染症を有すると疑われる被検体を治療する前にスクリーニングすることが可能である。さらに、治療を受ける被検体は、治療の活性及び有効性をアッセイするために試験されることができる。１つ以上のパラメータにおける有意な改善は、有効性を示す。さまざまな要因（たとえば、疾患などの重症度のような患者に依存する要因、投与される化合物、及び同様のものなど）に従い患者に最適な利益を提供するように投与計画及び投与量を調整することは、十分に普通の医療従事者（たとえば、臨床医）の技術の範囲内である。たとえば、個体内のＨＣＶ感染症は、血中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在によって、及び／またはそれらの血清中に抗ＨＣＶ抗体を含むことによって検出される、及び／または監視されることが可能である。診断、及び／または治療の監視において有用であることが可能である、他の臨床徴候及び症状は、肝機能の評価、及び肝線維症の評価（たとえば、慢性ウイルス感染症を伴う可能性がある）を含む。
【０１２０】
本明細書に記載される治療を投与することが可能である被検体は、ナイーブな個体（たとえば、感染症と診断されるが、以前に処置されていない個体）、及び以前の処置に失敗した個体（「治療の失敗した」患者）を含む。ＨＣＶ治療について、以前の治療は、たとえば、ＩＦＮ−α単剤治療（たとえば、ＩＦＮ−α及び／またはＰＥＧ化ＩＦＮ−α）、またはＩＦＮ−α併用療法などを有し、この併用療法は、ＩＦＮ−α、及びリバビリンなどの抗ウイルス剤の投与を備えることができる。治療の失敗した患者は、非レスポンダー（すなわち、臨床上有意な奏効を提供するＨＣＶについての以前の治療、たとえば、以前のＩＦＮ−α単剤治療、以前のＩＦＮ−α及びリバビリン併用療法、または以前のペグ化ＩＦＮ−α及びリバビリン併用療法などによって減少したＨＣＶ力価が有意または十分ではなかった個体）、及び再発者（すなわち、ＨＣＶについて以前に治療された（たとえば、以前のＩＦＮ−α単剤治療、以前のＩＦＮ−α及びリバビリン併用療法、または以前のペグ化ＩＦＮ−α及びリバビリン併用療法を受けた）、臨床上有意な奏効を提供するＨＣＶ力価が低下したが、低下したＨＣＶ力価がその後のＨＣＶ力価における増加により維持されなかった個体）を含む。
【０１２１】
本明細書に開示される治療が対象となる、他の被検体は、ＨＣＶ感染症の性質により「治療するのが困難」な被検体である被検体を含む。「治療するのが困難」な被検体は、１）１ミリリットルの血清あたり、少なくとも約１０5 、少なくとも約５×１０5 、または少なくとも約１０6 以上のＨＣＶゲノムコピーのＨＣＶ力価として通常定義される、高い力価のＨＣＶ感染症を有する被検体、２）治療失敗と関連していると当該分野で認識される遺伝子型（たとえば、ＨＣＶ遺伝子型１、それらのサブタイプ（たとえば、１ａ、１ｂなど）、及びそれらの疑似種）のＨＣＶに感染する被検体、または３）両方の被検体である。
【０１２２】
他の実施形態において、方法は、ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの治療上有効量または有効用量と治療を必要とする被検体を接触させることを備えるレジメンにおける原発癌または転移癌を治療する、または減少させるために提供される。癌の治療のための有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因によって変化する。通常、患者は、ヒトであるが、また非ヒトの哺乳動物、コンパニオンアニマル（たとえば、イヌ、ネコ、ウマなど）、実験用哺乳動物（たとえば、ウサギ、マウス、ラットなど）、及び同様のものを処置することができる。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために滴定されることが可能である。
【０１２３】
予防的適用において、比較的低い投薬量は、比較的低頻度の間隔で長い期間にわたって投与されることができる。一部の患者は、残りの彼らの生涯にわたって治療を受け続ける。他の治療的適用において、比較的短い間隔での比較的高い投薬量は、疾患の進行が低減するか若しくは終止するまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的な若しくは完全な寛解を示すまで、ときに必要とされる。それ以降、患者は、予防的投与計画を施与され得る。
【０１２４】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、細胞腫、血液癌、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、特にＩＦＮλＲ１及びＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２、またはＩＬ−１０Ｒβ及びＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２を発現する上皮由来の癌を含む癌の腫瘍増殖、腫瘍転移または腫瘍浸潤を治療する、減少させる、または防止することを備える。いくつかの実施形態において、シンセカインが活性化する同族受容体を癌が発現するかどうかを判定すること、たとえば、ＩＦＮλＲ１、及びＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＡＲ２の発現を判定することなどによって、ＩＦＮλシンセカインへの応答性について癌を評価する。ＩＦＮλＲ１を発現することで知られている組織は、たとえば、肺、心臓、肝臓（肝細胞）、前立腺、ケラチノサイト及びメラノサイトなどを含む。ＩＦＮλ及びＩＦＮλシンセカインに応答性の癌は、とりわけ、メラノーマ、線維肉腫、肝細胞癌、膀胱癌、バーキットリンパ腫、大腸癌、膠芽腫、非小細胞肺癌、食道癌、及び骨肉腫を含むが、これらに限定されないことができる。
【０１２５】
予防的適用について、医薬品の組成物または薬物は、疾患の生化学的、組織学的及び／または行動学的症状、その合併症及び疾患の発生中に提示する中間の病理学的表現型を含む、リスクを除去する、若しくは減少させる、重症度を減らす、または疾患の発端を遅らせるのに十分な量で、疾患になりやすい、またはその他の点で疾患のリスクのある患者へ投与される。
【０１２６】
ポリヌクレオチド類
また本発明は、本発明のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを符号化する、単離された核酸、この核酸を含むベクター及び宿主細胞、ならびにＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの産生のための組換え技術を提供する。例示的なポリヌクレオチド類は、本明細書に記載されるタンパク質配列、たとえば、配列番号７から１９、２０、２２及び２３を符号化する。
【０１２７】
対象となる核酸は、配列番号７から１９、２０、２２及び２３を符号化する配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％同一である、または同一であることができる。いくつかの実施形態において、連続したヌクレオチド配列は、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔであり、完全なコード配列まで使用されることができる。
【０１２８】
ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドの組換え産生について、それを符号化する核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために、複製可能ベクターに挿入され得る。ＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドを符号化するＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して配列決定され得る。多くのベクターは、利用可能である。ベクター成分は、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明のＩＦＮλシンセカインまたはＩＦＮλ変異型ポリペプチドは、直接のみならず、異種または相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得、この異種または相同ポリペプチドは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチド、及び同様のものを含む。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであることができる。天然タンパク質シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核宿主細胞について、シグナル配列は、選択される原核シグナル配列によって置換される。この目的のために異種ポリペプチドは、治療部分、たとえば、アポトーシス、細胞死、抗ウイルス活性、及び同様のものの誘導などの所望の生物学的活性を提供するポリペプチドなどを含む。
【０１３０】
「単離された」核酸分子は、通常、核酸の天然源中で会合する、少なくとも１つの混入核酸分子から識別され、分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然にみられる形態または状況にあるもの以外のものである。単離された核酸分子は、したがって、天然細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、たとえば、核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体位置にある場合、通常は抗体を発現する細胞中に含有される核酸分子を含む。
【０１３１】
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物における作動可能に結合されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。たとえば、原核生物に適している制御配列は、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１３２】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合に「作動可能に結合」される。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現する場合に、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に結合され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合に、コード配列に作動可能に結合され、あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合に、コード配列に作動可能に結合される。一般に、「作動可能に結合される」は、結合されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、かつリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。結合は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣例に従って使用される。
【０１３３】
本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は、同義に使用され、全てのかかる指名は、子孫を含む。このため、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、移行の数にかかわらず初代対象細胞及びそれ由来の培養物を含む。また、すべての子孫が意図的な、または想定外の変異に起因してＤＮＡ量において厳密に同一でない場合があることを理解する。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫を含む。別個の指定が意図される場合には、それは文脈から明確となるであろう。
【０１３４】
ＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、またはより高次の真核生物細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１３５】
宿主細胞は、インターフェロン産生のための上述の発現またはクローニングベクターによって形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養培地中で培養される。
【０１３６】
細胞から調製されたインターフェロン組成物は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーなどを使用して精製されることが可能であり、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技法である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１３７】
任意の予備精製ステップ（複数可）後、対象とするインターフェロン及び混入物を含む混合物は、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用して、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを受けることができ、好ましくは、低塩濃度（たとえば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われることができる。
【０１３８】
ここで十分に説明されている本発明は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、さまざまな変更及び修正を行うことができることが当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【０１３９】
実施例１
工学的に設計するサイトカインと関連するラムダ−ＩＦＮ受容体三成分複合体の構造
ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λとしても知られている）は、内皮起源の組織、及びバリア表面に制限された抗ウイルス及び抗増殖活性をもつ。高親和性ヒトＩＩＩ型ＩＦＮ三成分複合体の結晶構造は、ＩＬ−１０ＲβがＩＬ−１０スーパーファミリーについて共有された受容体である機構を明らかにする。ＩＬ−１０サイトカイン間の配列相同性の欠如にもかかわらず、ＩＬ−１０Ｒβによる受容体−リガンド認識は、すべてのＩＬ−１０サイトカイン上で疎水性「アンカーポイント」として作用する３個のチロシン残基のネットワークを介して可能になる。我々は、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方を親和性成熟させ、２つのサイトカインファミリーについてのシグナル伝達への影響を探索した。高親和性ＩＦＮ−λは、Ｂ型肝炎に感染したマウスにおける、シグナル伝達、標的遺伝子誘導、抗増殖性及び抗ウイルス活性の効力を有意に増強するが、野生型Ｉ型ＩＦＮの抗ウイルス効力は、最大であり、親和性増強によって改善されない。我々の結果は、サイトカインのＩＬ−１０スーパーファミリーへの共有されたＩＬ−１０Ｒβの結合機構上で構造的洞察を提供し、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮファミリーの抗ウイルス及び抗増殖の効力の相対的な可塑性を強調している。
【０１４０】
ＩＩＩ型ＩＦＮとしても知られている、ラムダインターフェロン（ＩＦＮ−λ）は、最近報告されたインターフェロンサイトカインのファミリーである。Ｉ型ＩＦＮと同様に、これらの分泌型サイトカインは、自然免疫応答を誘発し、ウイルス感染と戦い、また癌に対する細胞分裂停止（抗増殖）活性を示す。ＩＩＩ型ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮとの重要な差異を標的特異性及び効力の両方において示し、それらの発現において内皮及びバリア組織に限定される。ＩＦＮ−λファミリーは、脊椎動物の進化全体を通して保存され、本来であればＩ型ＩＦＮによって誘発される全身応答を誘導せずに、感染のリスクが高い内皮組織を特異的、かつ局所的に保護する。ＩＦＮ−λの局所作用は、ＩＦＮ−λの投与がＩＦＮ−αなどのＩ型ＩＦＮと関連する既知の毒性を回避することができるという点で、治療用途のために魅力的である。実際に、最近の研究は、持続的なノロウイルス感染症を治療する際の、ＩＩＩ型ＩＦＮの重要で、重複しない役割を強調しており、またＩＦＮ−λは、インフルエンザ、サイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）及びＢ型肝炎（ＨＢＶ）を含む、他のウイルス病原体数に対して有効性を実証している。ＩＦＮ−λのこの見込みのある抗ウイルス（ＡＶ）活性は、ＨＣＶ、ＨＢＶ、及びＤ型肝炎（ＨＤＶ）における使用について臨床治験にそれらの評価を導いた（たとえば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  ＮＣＴ０２７６５８０２参照）。
【０１４１】
ヒトにおけるＩＩＩ型ＩＦＮの３つのサブタイプ、ＩＦＮ−λ１から３（それぞれＩＬ−２９、ＩＬ−２８Ａ、及びＩＬ−２８Ｂとも称される）があり、これらのすべては、多面発現性ＩＬ−１０スーパーファミリーのメンバーである。Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮは、全く異なる細胞表面受容体を認識する。１６個のヒトサブタイプＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−αＲ１及びＩＦＮ−αＲ２から構成されるヘテロ二量体の受容体を結合する。Ｉ型三成分複合体の結晶構造は、「アンカーポイント」として作用する保存された残基のネットワーク、及びサブタイプ特異的親和性及び機能性を加える保存されない残基のネットワークを有する、異なるＩＦＮサブタイプによって形成される、類似した全体的な結合の幾何学的形状を明らかにする。このシステムにおいて、異なるＩＦＮサブタイプの受容体との化学的相互作用は、重複性の機能、及び非オーバーラップの機能の両方として現れる別個の複合体安定性をもたらす。
【０１４２】
ラムダＩＦＮは、ＩＬ−１０Ｒβ及びＩＦＮ−λＲ１から構成される、別個のヘテロ二量体受容体に結合する。ＩＬ−１０Ｒβは、ＩＬ−１０スーパーファミリーメンバー、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２及びＩＬ−２６について共有された受容体として機能するが、ＩＦＮ−λＲ１は、型に特異的な受容体である。不十分な配列保存（＜２５％の同一性）にもかかわらず、ＩＬ−１０スーパーファミリーサイトカインは、構造的に保存され、この構造的類似性は、共有されたＩＬ−１０Ｒβの会合を促進すると信じられている。高親和性二成分ＩＦＮ−λ１／ＩＦＮ−λＲ１複合体の結晶構造は、シグナル伝達の開始に重要なＩＦＮ−λＲ１のドメイン間の「肘部」付近での分子接触を明らかにした。ＩＦＮ−λ１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体の他のＩＬ−１０スーパーファミリーメンバーとの比較は、ＩＦＮ−λ二成分複合体とＩＬ−２２／ＩＬ−２２Ｒ１とＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒ１二成分複合体構造との間で、類似したリガンド−受容体ドッキングの幾何学的形状を示した。
【０１４３】
リガンド未結合のＩＬ−１０Ｒβの結晶構造が報告されながら、この結晶構造は、おそらく、これらの相互作用の非常に低い親和性のために、そのサイトカインリガンドのいずれかと、または完全な三成分シグナル伝達複合体内で、複合体を形成するＩＬ１０Ｒβを結晶化することが不可能であった。生化学データは、三成分複合体形成が配列プロセスであることを示唆する。この会合体における第一ステップは、ＩＦＮ−λ１とＩＦＮ−λＲ１との間の高親和性相互作用である（ＫＤ＝７３ｎＭ）。次にＩＦＮ−λ１／ＩＦＮ−λＲ１複合体は、ＩＬ−１０Ｒβをリクルートし、三成分複合体を形成し、この三成分複合体は、受容体の細胞内ドメインとすぐ近くで構成的に会合するＪａｋキナーゼに、シグナル伝達を開始させる。ＩＦＮ−λ／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体についてのＩＬ−１０Ｒβの親和性は、報告されなかったが、それぞれＩＬ−２２／ＩＬ−２２Ｒ１及びＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒ１複合体へのＳＰＲ測定に基づき１２から２３４μＭの間に入ると推定される。計算上のドッキングモデルと組み合わされる変異原性試験は、ＩＬ−１０スーパーファミリー三成分複合体のいくつかの提案されたモデルを導いたが、実験的に決定された構造は、とらえどころのないままであった。
【０１４４】
Ｉ型及びＩＩＩ型インターフェロンサイトカインは、別個の細胞表面受容体を認識するが、それらのそれぞれの受容体の細胞内ドメインは、同一のヤヌスキナーゼ、Ｊａｋ１及びＴｙｋ２と会合し、共通のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達し、インターフェロン刺激遺伝子を誘導し、類似した免疫調節活性を誘発する。しかしながら、ＩＦＮ−λは、Ｉ型ＩＦＮと比較してより低い効力及び有効性を有する、これらの応答を誘導するように示されている。より強力なＩ型応答についての１つの根拠は、ＩＩＩ型複合体と比較して、リガンド−受容体の複合体がより高い親和性、及びより大きな安定性を示すことである。原則として、より強力なＩＩＩ型ＩＦＮを作製することは、Ｉ型ＩＦＮと比較して、より低い毒性プロファイルを維持するために天然の組織特異性に影響しながら、臨床において改善された活性に翻訳することが可能である。
【０１４５】
本明細書で、我々は、より高い親和性のＩＦＮ−λを工学的に設計し、我々は、このＩＦＮ−λを使用して、ＩＦＮ−λ／ＩＬ−１０Ｒβ／ＩＦＮ−λＲ１複合体を結晶化し、生体外及び生体内で増強された機能的効力を特徴づけた。また、我々は、親和性成熟型ＩＦＮ−λと比較するために、多様な活性プロファイルを有するＩ型ＩＦＮを工学的に設計する、ハイスループット（ＨＴＰ）機能スクリーニングを開発した。ＩＦＮ変異体のこの大きなパネルは、下流側ＳＴＡＴシグナル伝達、抗ウイルス（ＡＶ）活性、抗増殖（ＡＰ）活性、及び受容体複合体安定性について特徴づけられた。これら全体の構造−機能研究を通じて、我々は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達及び抗ウイルス活性がすでに最大であり、親和性成熟が多様なＡＰ活性を提示したが、ＡＶ効力における増強がほとんどなかったことを見出す。対照的に、ＩＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達及び機能的効力は、親和性成熟によって改善されることが可能である。さらに、親和性増強されたＩＩＩ型ＩＦＮは、ＨＢＶに対して、増強された生体内抗ウイルス活性を示した。
【０１４６】
結果
例及び図面におけるアミノ酸置換の番号付けを、１１個の残基をアミノ末端で欠くインターフェロンの切断型に関して行う。明確さのために、説明及び特許請求の範囲は、完全な、成熟タンパク質を表す、配列番号３に関して番号付けされた置換を有する。したがって、番号付けにおいて、１１個のアミノ酸のオフセットがある。
【０１４７】
高親和性ＩＩＩ型インターフェロンの工学的設計。我々は、より高い親和性のＩＦＮ−λを工学的に設計するために、酵母表面ディスプレイをプラットフォームとして使用した。我々は、結晶構造が報告され、それが３個の天然のラムダの中で最高のＡＶ効力を有するので、ＩＦＮ−λ３について我々の工学的設計の試みに着目した。我々は、それがＩＦＮ−λＲ１に結合するＩＦＮ−λ３よりはるかに低い親和性であるので、親和性成熟についてＩＦＮ−λ３とＩＬ−１０Ｒβとの間の相互作用を標的とした。酵母上に提示されるＩＦＮ−λ３は、約４００ｎＭ（図７ａ、ｂ）の滴定中間点に関して、ＩＦＮ−λＲ１に結合した。酵母上に提示されたＩＦＮ−λ３に対して、我々は、単量体、及び結合活性増強四量体形態（ＩＦＮ−λＲ１の非存在下で）の両方のＩＬ−１０Ｒβに結合することについて試験したが、結合を観察しなかった（図１ａ、左側パネル）。しかしながら、ＩＦＮ−λＲ１四量体の存在下で、ＩＬ−１０Ｒβが四量体として提示された（図１ａ、右側パネル）が、ＩＬ−１０Ｒβが単量体として提示されなかった（図１ａ、中央パネル）ときに、酵母上に提示されるＩＦＮ−λ３への結合を観察した。このデータは、ＩＦＮ−λ３が適切にフォールドされ、酵母上に提示され、ＩＬ−１０Ｒβと、ＩＦＮ−λ／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体の複合体界面との間の低親和性協同相互作用であることを示す（図１ａ）。したがって、我々は、酵母上でＩＦＮ−λ３に結合した溶解性ＩＦＮ−λＲ１の存在下で親和性成熟実験を実施した。
【０１４８】
我々がＩＬ−１０Ｒβに会合するＩＦＮ−λ３中の特異的なアミノ酸上に我々を導く構造を欠いたため、我々の方針は、エラープローンＰＣＲ及び遺伝子シャッフリングを伴った後に、ＩＬ−１０Ｒβ上での選択を伴った。最初に、我々は、１×１０８クローンを含むエラープローンＩＦＮ−λ３ライブラリーを作製した。４ラウンドの選択は、ＩＬ−１０Ｒβの次第にストリンジェントな濃度に対して実施された（４００ｎＭのＩＬ−１０Ｒβ四量体によって開始し、１μＭのＩＬ−１０Ｒβ単量体で終了した）。濃縮されたライブラリーは、１μＭのＩＬ−１０Ｒβ単量体へある程度の結合を示した（図１ｂ、上の２つのヒストグラム）。９６個のクローンを１μＭのＩＬ−１０Ｒβ単量体結合についてスクリーニングし、ＩＬ−１０Ｒβ受容体を用いた酵母表面滴定によって相互作用するクローンの親和性を測定した。次に６個の最も高い親和性のクローン（これらのすべてはＩＬ−１０Ｒβについて＞１μＭの親和性を有する）をＤＮＡシャッフリング反応における親鋳型として使用した（図１ｃ）。得られた第二世代ライブラリーは、１×１０８個のクローンを含み、１μＭから１２５ｎＭに及ぶＩＬ−１０Ｒβ単量体の減少する濃度に対して３ラウンドの選択を受けた。９６個のクローンをＩＬ−１０Ｒβに結合するためにスクリーニングし、酵母表面滴定によって経過観察し、親和性を測定した。最も高い親和性のクローンは、「Ｈ１１」で表され、ＩＬ−１０Ｒβに対して２００ｎＭの「酵母上」ＫＤを含むことがわかった（図１ｃ）。Ｈ１１の配列解析は、遺伝子が野生型と比較して５箇所の変異を含み、ＤＮＡシャッフリング反応からの４個の第一世代配列の組み合わせであったことを明らかにした（図１ｃ、図７ｃ）。Ｈ１１を組換えで発現し、固定化Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体へのＩＬ−１０Ｒβの親和性を表面プラズモン共鳴によって決定した。Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１複合体は、野生型ＩＦＮ−λ３／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体と比較して、ＩＬ−１０Ｒβ親和性（ＫＤ＝５６０ｎＭ）において３０倍の増加を示した（図１ｄ）。Ｈ１１変異のうちの１箇所、Ｔｈｒ１５０Ａｌａは、ＩＦＮ−λＲ１結合部位の中央に位置し、ＩＦＮ−λＲ１（８５０ｎＭ）についての野生型ＩＦＮ−λ３親和性に対して、ＩＦＮ−λＲ１（１５０ｎＭ）についてのＨ１１の約５倍より高い親和性をもたらす（図１ｄ）。
【０１４９】
ＩＦＮ−λ３受容体三成分複合体の構造。ＩＬ−１０ファミリーサイトカインの三成分複合体の完全な構造の欠如は、ＩＬ−１０Ｒβの低親和性による可能性が高い。実際に、我々が三成分複合体を野生型ＩＦＮ−λ３、ＩＦＮ−λＲ１、及びＩＬ−１０Ｒβの間に形成したときに、我々は、安定な三成分複合体を示唆するゲルろ過についてのクロマトグラフィーシフトを観察しなかった。しかしながら、ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１は、安定した三成分複合体をＩＦＮ−λＲ１及びＩＬ−１０Ｒβと形成することができた（図７ｅ）。我々は、脱グリコシル化三成分複合体を結晶化し、２．８５Åのデータを得た（表１）。三成分複合体の構造は、ＩＦＮ−λ１／ＩＦＮ−λＲ１、ＰＤＢ  ３Ｏ６Ｇの二成分構造と、ＩＬ−１０Ｒβ、ＰＤＢ  ３ＬＱＭの非結合構造とによる分子置換を使用して解析された（図２ａ）。ＩＦＮ−λ１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体からも、アポリポタンパク質ＩＬ−１０Ｒβ構造からも、ドメイン配向における変化を観察しなかった。ＩＬ−１０Ｒβは、Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体と広範で連続的な接触を行い、部位２ａ及び２ｂを介してＨ１１と、また部位３においてＩＦＮ−λＲ１ステムと相互作用する（図２ａ、左側パネル）。興味深いことに、共有されたＩＬ−１０Ｒβ受容体は、サイトカイン／受容体結合界面に一般的であるような、ヘリックス束のさらに面心上よりもむしろ、Ｈ１１をヘリックス束の末端でユニークに結合する（図２ａ、中央及び右側パネル）。
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【０１５０】
複合体構造において、３つのＩＬ−１０Ｒβループ２、３及び５は、芳香族残基を含み、これらの芳香族残基は、ＩＦＮ−λ／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体を結合すると、大きな立体構造変化（２．４〜６．５Å）を受ける（図２）。注目すべきことに、ＩＬ−１０Ｒβのループ５中の残基は、水素結合をサイトカイン及び受容体間残基の両方と部位２ｂ及び３において共有する位置にある。ＩＬ−１０Ｒβのループ２中のＴｙｒ５９は、ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１をサイトカインのらせん体Ｃ及びＤによって形成されるポケット中で結合する（図２、３ａからｃ、拡張データ図２）。アポリポタンパク質ＩＬ−１０Ｒβ立体構造に関する４．３Å置換に加えて、Ｔｙｒ５９は、２軸周囲で約９０°回転する（図２ｂ）。注目すべきことに、Ｈ１１特異的変異Ｇｌｕ７３Ａｓｐ（ヘリックスＣ）は、水素結合をＴｙｒ５９のヒドロキシル基と形成し、Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体とＩＬ−１０Ｒβとの間の相互作用を安定化させる（図３ｃ）。ＩＬ−１０Ｒβのループ３上のＴｙｒ８２は、ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１に部位２ａで結合し、Ｎ末端と、サイトカインのらせん体Ａ及びＤとの間に形成されるポケットに位置する（図２、３ａからｃ）。この位置において、Ｔｙｒ８２は、２箇所の水素結合をサイトカインと共有する。１箇所目は、Ｔｙｒ８２のバックボーンカルボニルと、Ｈｉｓ９１（Ｈ１１）のＮεとの間であり、２箇所目は、Ｔｙｒ８２のヒドロキシル基とＳｅｒ１３（Ｈ１１）の窒素バックボーンとの間である（図３ｃ）。
【０１５１】
部位２ｂにおいて、ループ５（ＩＬ−１０Ｒβ）のＴｙｒ１４０及びＴｒｐ１４３は、ヘリックスＡのＮ末端を「挟む」ことによってＩＦＮ−λ３  Ｈ１１を結合する（図３ａからｃ）。Ｔｙｒ１４０及びＴｒｐ１４３の両方は、アポリポタンパク質ＩＬ−１０Ｒβ  構造と比較して、それぞれ６．５Å及び３．６Åに移動する残基のＣβと、ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体を結合させると、大きな移動を受ける（図２ｂ）。三成分複合体構造において、Ｔｙｒ１４０（ＩＬ−１０Ｒβ）は、２箇所の水素結合をＨ１１残基Ｇｌｎ１８及びＧｌｎ１５Ａｒｇと形成し、これらの後者は、ＩＦＮ−λ３の操作された変異である（図３ｃ）。Ｔｒｐ１４３は、ヘリックスＡの疎水性バックボーンに対してパッケージングし、Ｎ末端残基Ｓｅｒ１１（Ｈ１１）のバックボーンカルボニルによって共有される水素結合と同様に、ファンデルワールス相互作用に寄与する（図３ｃ）。
【０１５２】
部位３は、ＩＦＮ−λＲ１の受容体ステムドメインＤ２と、ＩＬ−１０ＲβのＳＤ２との間の共有された界面を表す。部位３の界面は、部位２ｂから、膜−近位受容体ドメインのＣ末端へ広がる（図２ａ、３ａ、ｂ及びｄ）。この接触領域は、表面積（１９００Å２）において、サイトカイン−受容体界面（それぞれ１７００Å２）のいずれかよりも大きい（図３ｂ）。部位３は、界面の長さ沿いにファンデルワールス相互作用から構成されるが、水素結合も複合体を安定化させる際に重要な役割を果たす。水素結合は、バックボーンカルボニルＧｌｎ１６３（ＩＦＮ−λＲ１）へのＡｒｇ１３０（ＩＬ−１０Ｒβ）の側鎖と、側鎖水素結合への側鎖との間で観察され、この側鎖水素結合への側鎖は、Ｈｉｓ１２８（ＩＬ−１０Ｒβ）とＧｌｎ１６３（ＩＦＮ−λＲ１）との間、Ｇｌｕ１４１（ＩＬ−１０Ｒβ）とＴｙｒ１８９（ＩＦＮ−λＲ１）との間、及びＴｈｒ１４２（ＩＬ−１０Ｒβ）とＴｈｒ１８３（ＩＦＮ−λＲ１）との間にある（図３ｄ）。この構造は、ＩＬ−１０ＲβのＩＦＮ−λ３  Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体への協同的結合における受容体ステム間接触の重要性を強調する。
【０１５３】
サイトカインのＩＬ−１０ファミリーへの共有されたＩＬ−１０Ｒβ結合モードのための意味。我々のＩＦＮ−λ三成分複合体の構造は、ＩＬ−１０ＲβのＩＬ−１０スーパーファミリーの他のメンバーとの相互作用への洞察を提供する。ＩＦＮ−λ三成分複合体を構造鋳型として使用して、我々は、ＩＬ−１０Ｒβ結合及び認識の分子基盤を解明するために、ＩＬ−１０Ｒβを、ＩＬ−２２／ＩＬ−２２Ｒ１（ｐｄｂ  ３ＤＬＱ）及びＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒ１（１Ｊ７Ｖ）の二成分構造上にドッキングする（図４ａ、左側）。我々のＩＦＮ−λ３  Ｈ１１／ＩＦＮ−λＲ１／ＩＬ−１０Ｒβ三成分複合体の構造に基づき、ＩＬ−１０Ｒβは、３つのサイトカインらせん体Ａ、Ｃ、及びＤと接触する。構造−機能研究は、共有されたＩＬ−１０Ｒβ受容体に結合する複数のＩＬ−１０ファミリーメンバーに重要であると信じられている識別された変異を有する。これらの変異のすべては、受容体のＩＦＮ−λ３  Ｈ１１結合領域内に入り、ＩＬ−１０ＲβのホットスポットＴｙｒ残基に接触する（図４ａ、右側、赤い表面）。３つのサイトカインの構造に基づく配列アライメントは、ＩＬ−１０Ｒβ結合部位への残基マッピングが非常に多様であることを示す（図４ｂ）。保存のこの欠如にもかかわらず、部位２の界面内のＩＦＮ−λ３、ＩＬ−１０、及びＩＬ−２２残基の構造比較は、極性残基によって囲まれる、ＩＬ−１０Ｒβチロシンドッキング（図４ｃ）の部位に疎水性パッチの保存されたパターンを３つのサイトカインが含むことを明らかにする。したがって、ＩＬ−１０ファミリーメンバーは、ＩＬ−１０Ｒβに関して化学的相補性を進化させたようにみえるが、それは、別個の対相互作用を通してである。
【０１５４】
高親和性ＩＦＮ−λの機能的挙動。ＩＦＮ−λ三成分複合体の安定化がＩＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達及び機能を増強することが可能であるかどうかを判定するために、我々は、野生型ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λ３）及びＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮω）と比較して、生体外でＨ１１の、ホスホ−ＳＴＡＴ１シグナル伝達、ＩＳＧ遺伝子誘導、ならびに抗ウイルス及び抗増殖活性を測定した。Ｈ１１は、ＩＦＮ−ωの効力と適合した、野生型ＩＦＮ−λ３と比較して、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ応答性Ｈａｐ１細胞上のホスホ−Ｓｔａｔ１についてＥＣ５０を１００倍まで改善した。ＥＣ５０におけるこの改善にもかかわらず、しかしながら、ＩＦＮ−λ３及びＨ１１の両方についてのＥｍａｘ値は、ＩＦＮ−ωのその３０％に過ぎなかった（図５ａ）。同様に、Ｈ１１は、Ｈａｐ１細胞中の野生型ＩＦＮ−λ３よりも強力にＩＳＧを誘導したが、遺伝子誘導は、Ｉ型ＩＦＮによって誘導されたレベルをかなり下回ったままであった（図５ｂ、図１０ａ）。Ｈ１１は、ＨＣＶに感染したＨｕｈ７．５細胞上のＩ型ＩＦＮより１０分の１やや効力が低いが、野生型ＩＦＮ−λ３より効力が１２倍高く、ＡＶ活性を改善した（図５ｃ）。
【０１５５】
ＩＦＮ−λ３及び工学的に設計された高親和性Ｈ１１変異の両方は、以前に生体外で観察された最小のＡＰ活性を誘発した（図５ｄ）。我々は、ＡＰ活性の欠如がＨｕｈ７．５細胞上のＩＦＮ−λＲ１の限られた発現に起因する可能性があると仮定した。実際は、ＩＦＮ−λＲ１をＨｕｈ７．５またはＷＩＳＨ細胞に形質導入したときに、ラムダＩＦＮ非応答性細胞株、ＩＩＩ型ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮの効力を超えても、ＡＰ効果を強く誘導した。期待されたように、高親和性Ｈ１１の効果は、野生型ＩＦＮ−λ３の効果より強く、この違いの大きさは、ＩＦＮ−λＲ１発現レベルの相対的レベルに依存した（図１０ｂ）。まとめると、これらの実験は、ＩＩＩ型ＩＦＮ  ＡＰ活性がＩＦＮ−λＲ１受容体発現とラムダ−ＩＦＮシグナル伝達複合体の安定性との両方によって制限されることができることを示唆し、この後者は、親和性成熟を介して対処されることが可能である（図５ｄ、ｅ、図１０）。
【０１５６】
野生型ＩＦＮ−λ３を超えるＨ１１の改善された生体外効力が増強された生体内抗ウイルス治療をもたらすかどうかを試験するために、我々は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のヒト肝臓キメラマウスモデルに我々が工学的に設計したインターフェロンを試験した。我々は、Ｇｒｏｍｐｅ及び同僚らによって開発された肝臓キメラモデルの使用を行い、このモデルにおいて、マウスは、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ欠乏性（ｆａｈ−／−）であり、肝損傷は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）の投与及びＸｕらによって制御され、この中で、ＮＯＧマウスは、チミジンキナーゼ導入遺伝子をそれらの肝臓中で発現し、肝損傷を簡単なガンシクロビル投与（ＲＥＦ）によって制御することを可能にする。ヒト胎児胚芽細胞のＦＲＧマウス中への移植後、我々は、マウス肝損傷を保護薬ＮＴＢＣの断続的な中止によって誘導した。代替に、マウス肝損傷をＴＫ−ＮＯＧマウスへのガンシクロビル投与によって誘導した後、初代成人肝細胞による移植を伴った。両方の事例において、血清中のヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）レベルを測定することによって、経時的な生着レベルを監視した（図５ｆ）３１。マウスは、ｈＡｌｂレベルが定常に達すると、ＨＢＶに曝露された後に、慢性的に感染したマウスは、ＩＦＮ−λ３に基づく抗ウイルス処置を受けた。ＩＦＮ−λ３  Ｈ１１は、ＩＦＮ−λ３野生型レジメンより効果的に、ＨＢＶウイルス量を抑制した（図５ｇ）。またＨＢＶ表面抗原（ｓＡｇ）レベルは、野生型処置と比較してＨ１１に応答してさらに深刻に低下したが、応答振幅及び基間差の両方は、ウイルス量について観察されたものより小さかった（図１０ｃ）。ヒトアルブミンレベルは、毒性の代用として機能し、処置の最中に安定したままであり、ヒト肝細胞減少の可能性を排除し、より高い親和性のＩＦＮ−λを示唆したため、野生型より毒性がなかった（図１０ｄ）。同様に、ヒト化肝臓を含むＴＫ−ＮＯＧマウスは、ＨＢＶを最初に接種された後に、ＨＤＶによる重複感染を伴った。次にマウスを野生型またはＨ１１  ＩＦＮ−λ３によって処置した。野生型処置されたマウスと比較して、Ｈ１１においてより重度であった、有意な抗ＨＤＶ効果を観察した。したがって、Ｈ１１は、明白な毒性なしで改善された治療有効性を実証し、ここで三成分複合体の結晶構造をガイドとして使用して、親和性改善が治療的に改善されたＩＦＮ−λを抗ウイルス及び抗癌治療の両方に対して産生することが可能であることを示唆する。
【０１５７】
構造がガイドされたタンパク質の工学的設計を通したＩ型インターフェロン機能の探索。ＩＩＩ型ＩＦＮ、ＩＦＮ−λ３のＡＶ及びＡＰ効力を親和性増強が改善させたことを示したため、我々がＩＦＮ−λ３に使用したときに、コンビナトリアル工学的設計手法を使用して、我々は、受容体親和性へのＩ型ＩＦＮのＡＶ及びＡＰ機能の感受性を探索したいと望んだ。エラープローン手法を行うことよりもむしろ、我々は、ＩＦＮ−αＲ１及びＩＦＮ−αＲ２の受容体を含む複合体中の、Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮ−ωの構造によってガイドされた（図６ａ）。我々は、修正された抗ウイルス及び抗増殖活性によって変異体を作製する手段として、そのＩＦＮ−αＲ１結合界面、より低い親和性部位を多様化した、ＩＦＮ−ωの部位特異的変異原性ライブラリーを作製した（図６ａ）。我々は、野生型ＩＦＮ−αＲ１親和性（ＫＤ＝１μＭ）への結合剤のためにライブラリーを濃縮した。最も興味深い変異体（多様な活性）をみつけるために、我々は、ハイスループット機能スクリーニングを開発し、ライブラリーから２８８個のランダムに選択されたクローンの特性を明らかにした（図６ｂ）。我々のスクリーニングについて、別個のＩ型ＩＦＮ変異体は、酵母細胞から切断され、上澄みに放出されたサイトカインは、ろ過によって酵母から離れて精製された。次にＩＦＮ含有上澄みを使用して、細胞を処置した（図６ｂ）。それらの多様な抗増殖及び抗ウイルス活性に基づき、４個のＩＦＮ−ω変異体を組換え発現及び特徴づけのために選択した。先に、我々は、野生型サイトカインより１００倍高いＩＦＮ−αＲ２受容体についての親和性を有する、ＩＦＮ−ω変異体（Ｌｙｓ１５２Ａｒｇ）を合理的に設計した。したがって我々は、ＨＴＰスクリーニングからの、我々の工学的に設計されたＩＦＮ−αＲ１界面変異体のそれぞれの上へＬｙｓ１５２Ａｒｇ変異を加えた。これらの変異体に加えて、我々は、野生型ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−ω（Ｌｙｓ１５２Ａｒｇ）、及びＡＶ活性に偏っていると以前に報告された、シャッフルされたＩＦＮα変異体（Ｍａｘｙｇｅｎ９×２５）を生物物理学的に、また生化学的に特徴づけた。
【０１５８】
我々は、野生型ＩＦＮ−ωと比較して工学的に設計されたインターフェロンの我々のパネルの、シグナル伝達効力（ホスホ−ＳＴＡＴ１）、遺伝子誘導、ならびに抗ウイルス及び抗増殖活性を測定した（図６ｃ）。また我々は、表面プラズモン共鳴を介して、ＩＦＮ−αＲ１及びＩＦＮ−αＲ２サブニットについての各サイトカインの親和性を決定した（表２）。受容体親和性を変異体の選択のための判断基準として使用しなかったが、我々は、複合体安定性（各受容体サブニットを結合するためのサイトカインＫＤｓの積）とサイトカイン活性との間の相関を調べることを目標とした。ＩＦＮ−αＲ１についての親和性は、２０ｎＭから３００μＭ（野生型ＩＦＮ−ω、ＫＤ＝１．２μＭ）に及んだ。ＩＦＮ−αＲ２についての親和性は、未修飾ＩＦＮ−ωについての２ｎＭから、Ｌｙｓ１５２Ａｒｇバックボーンにおける２００ｐＭの間にあった。全体で、我々のＩＦＮ変異体は、５．７ｌｏｇ範囲の複合体安定性を構成する（表２）。ＳＴＡＴシグナル伝達及び抗ウイルス活性について我々の変異体のＥＣ５０は、野生型ＥＣ５０を越える最小の改善と、広範囲の複合体安定性に対する挟範囲のＥＣ５０（それぞれ０．８５及び１．２ｌｏｇ）との両方によって図示されるように、親和性における変更へ非感受性であることがわかった（図６ｃ、左側パネル及び中央パネル、表２）。対照的に、抗増殖活性は、３．５ｌｏｇまで変化し、複合体安定性と相関した（Ｒ＝０．６７）（図６ｃ、右側）。我々は、Ｈｕｈ７．５細胞上の我々のＩＦＮ変異体のうちの７個による、代表的な１セットのインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の誘導を測定した（図６ｄ）。ＡＶ及びＡＰ活性についての複合体安定性の微分効果によって観察されるように、高親和性変異体は、遺伝子誘導（ＩＳＧ１５及びＭＸ１など）において、野生型を上回る改善をほとんど提示しなかった（図６ｄ、２つの左側パネル）が、他の遺伝子（ＡＰＯＬ３及びＳＡＭ９ＤＬのような）は、複合体安定性にさらに感受性であった（図６ｄ、２つの右側パネル）。この観察は、いくつかの以前の研究と一致する。
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【０１５９】
考察
この研究において、我々は、タンパク質工学的設計計画を実施し、ラムダ−ＩＦＮ／ＩＦＮ−λＲ／ＩＬ−１０Ｒβ三成分複合体への構造的アクセスを得て、ＩＩＩ型対Ｉ型ＩＦＮの機能的有効性を増強するために相対的な可能性を評価した。三成分複合体は、非常に低い親和性であるため、それらの有効治療用途へ障壁を提示する、ＩＬ−１０ファミリーサイトカインのＩＬ−１０Ｒβ相互作用を支配している、いくつかの重要な分子特徴を説明する。以前に、ＩＬ−１０スーパーファミリーサイトカイン内の多様な配列は、より強力なＩＬ−１０ファミリー治療を工学的に設計する我々の能力における実質的な制限を課した。手元のこの構造に関して、我々は、ＩＬ−１０Ｒβのドメイン間ループ上の芳香族残基と連動させる、３つの疎水性パッチをＩＬ−１０スーパーファミリーサイトカインがそれらの表面上に提示する方法を観察する。加えて、この構造は、三成分複合体を安定化させる際に、広範なＩＦＮ−λＲ１／ＩＬ−１０Ｒβステム間相互作用の重要性を明らかにし、ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン複合体の形成における協同性の役割についての分子論的根拠を提供する。
【０１６０】
ＩＩＩ型ＩＦＮのＡＶ活性を改善することが可能である徴候は、ＩＦＮ−λ２と３との間のＡＶ  ＥＣ５０において固有の６０倍の差を確立する研究から収集された。我々は、ＩＩＩ型ＩＦＮがＩＬ−１０Ｒβをほぼ検出不可能な親和性によって生体外で結合することを考慮に入れると、この効果が分子工学的設計手法を介してさらにきわだたせられる可能性があると期待した。定向進化を用いて、我々は、変異体を１５０倍まで増加した複合体安定性によって識別することができ、ｐＳＴＡＴ１シグナル伝達についてのＥＣ５０において１００倍の改善、及びＡＶ活性についてのＥＣ５０において１２倍の改善をもたらした。Ｂ型肝炎ウイルスに感染したヒト肝臓キメラマウスの研究は、工学的に設計されたＩＦＮ−λがさらにＩ型のようである野生型サイトカインの有効性において改善することが可能であることを実証することによって、生体内状況においてこの改善された効力を妥当性確認し、最近の臨床治験の品質は、臨床的に望ましいとして公開されている。さらに強力なＩＦＮ−λは、Ｉ型ＩＦＮと比較して低毒性プロファイルを維持し、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ならびにＢ型肝炎及びＤ型肝炎の同時感染などのような持続性ウイルス感染の処置について、また広域性抗ウイルス薬として、新規の手段を提供する。
【０１６１】
生体外で、ラムダは、鈍化したＡＰ活性を有し、その効果は、ＩＦＮ−λＲ１受容体の発現過剰によって回復されることが可能である。実際に、工学的に設計されたラムダは、野生型よりさらに強力であった。形質導入されなかった細胞株上の最小ＡＰ効果は、ＩＩＩ型ＩＦＮが抗癌剤として制限された可能性を有してもよいことを示唆するようにみえる可能性があるが、生体内研究は、異なる実体を表している。マウス癌モデルは、ＩＦＮ−λがＩ型ＩＦＮ処置と比較して毒性において著しい低下を有しながら、腫瘍増殖を有意に阻害することが可能であることを実証している。まとめると、これは、継続した癌に関連する試みについて希望を与える。
【０１６２】
また我々は、Ｉ型対ＩＩＩ型ＩＦＮの抗ウイルス及び抗増殖効力において観察された差の根底にある分子機構を探索するための、親和性の範囲を有するＩ型ＩＦＮタンパク質のパネルを開発した。生体外ＡＶ研究は、最近のＨＣＶ、ＨＢＶ臨床治験において観察されるように、臨床においてより低い有効性に翻訳する、Ｉ型ＩＦＮよりあまり強力ではないＩＩＩ型ＩＦＮを確立している。Ｉ型ＩＦＮの以前の構造−機能研究は、ＩＦＮ−α２などのより低い親和性のリガンドと比較して、最も高い親和性の天然ＩＦＮ（ＩＦＮ−β）、またはＩＦＮ−α２  ＹＮＳなどの工学的に設計されたＩＦＮの間でＡＶ効力において大きくはない２倍の差を実証している。しかしながら、１つの研究は、＞２０倍の改善されたＡＶ活性を有するが、相対的に変化しなかったＡＰ活性を有する、工学的に設計されたＩ型ＩＦＮを報告した。この研究は、ＡＰ効果へさらに感受性であり、おそらく異常なＡＰ：ＡＶ比を導く、Ｄａｕｄｉ細胞株を使用して、ＡＰ活性を測定した。本明細書で、構造に基づく工学的設計を使用して、我々は、ＳＴＡＴシグナル伝達効力、及びＡＶ活性が複合体安定性に非感受性であり、野生型レベルと比較して安定していることを実証する。対照的に、ＡＰ活性を複合体安定性と直接相関する。この観察は、野生型ＩＦＮを超えて、ＡＶ活性において２０倍の改善を有すると以前に報告されたＤＮＡシャッフリングから工学的に設計された、合成ＩＦＮ、９×２５のために保持した。この研究において、シャッフルしたＩＦＮ（ＥＣ５０＝１４０ｐＭ）のＡＶ活性は、ＩＦＮ−ω（ＥＣ５０＝１００ｐＭ）に類似し、複合体安定性において３ｌｏｇの改善と一致している野生型を超えて、ＡＰ活性において４８倍の改善を有する。まとめると、これらの実験は、主に変化した受容体親和性の結果としてリガンド間のＡＰ効力における差により、Ｉ型ＩＦＮがそれらのＡＶ：ＡＰプロファイルにおいて変わることを実証する。
【０１６３】
我々は、改善されたシグナル伝達及びＡＶ活性を有するＩＩＩ型ＩＦＮを工学的に設計することが可能であった。さらにＩＩＩ型ＩＦＮ三成分複合体は、Ｉ型ＩＦＮとＩＩＩ型ＩＦＮとの間の有効性における間隙を縮めることが可能である、さらに多くの強力なサイトカインを工学的に設計する試みをガイドすることができる。
【０１６４】
材料及び方法
ＩＦＮ−ω及びＩＦＮ−λ３の酵母ディスプレイ。Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方について、サイトカインは、以前に記載されるが、Ｎ末端に３Ｃライノウイルスプロテアーゼタグを含むように、酵母上に提示された。ストレプトアビジン−フィコエリトリン標識受容体を介して、常磁性の抗フィコエリトリンミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；ＭＡＣＳ）による受容体−酵母集団の分離によって、染色及び選択を実施した。Ａｌｅｘａ６４７（細胞シグナル伝達）にコンジュゲートされたＭｙｃタグ抗体により染色したことによって、酵母表面上の発現をアッセイした。フローサイトメトリー（ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ）により染色した受容体酵母によって、濃縮の進行を監視した。Ｉ型ＩＦＮを工学的に設計するために、部位特異的ライブラリーを使用した。第二世代のラムダ変異体のために１ラウンドのエラープローンＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリングを使用した。
【０１６５】
ＩＦＮ−ωについての機能スクリーニング。ライブラリーからの個々のクローンをＳＤ−ＣＡＡプレート上に蒔き、９６ディープウェルフォーマット中で増殖させた。３Ｃプロテアーゼを使用して、各クローンについてのタンパク質を酵母から切断し、ろ過によって酵母から分離させ（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ８００）、そしてＨｕｈ７．５細胞中のＨＣＶウイルス複製を追跡することによって抗ウイルス活性についてアッセイし、また先に記載されるように細胞密度を測定することによってＰＶＮ５３で処置した細胞における抗増殖活性についてアッセイした。組換え発現及び特徴づけのために、多様な活性を有する変異体を選択した。
【０１６６】
タンパク質発現、精製、及び構造決定。Ｈｉ５昆虫発現系において、Ｉ型ＩＦＮサイトカイン、Ｉ型ＩＦＮ受容体、ＩＩＩ型ＩＦＮ及びＩＩＩ型受容体を発現し、先に記載されるように精製し、１０％のグリセリン中に貯蔵した。結晶学について、ＩＬ−１０Ｒβ中の４個すべての糖鎖付加部位は、Ｙｏｏｎ  ｅｔ．ａｌ．に記載されるように、ＡｓｎからＧｌｎへ変異した。ＨＥＫ２９３  Ｇｎｔｉ−細胞中にＩＦＮ−λＲ１を発現し、ＥｎｄｏＦ及びＥｎｄｏＨによる処置によって脱糖鎖付加した。Ｓ７５カラム（ＧＥ）上のＳＥＣによって、メチル化された「Ｈ１１」／ＩＦＮ−λＲ１／ＩＬ−１０Ｒβ複合体を精製した。２４時間内に２０℃で、ＭＣＳＧ３スクリーニング（Ａｎａｔｒａｃｅ）から結晶を得て、添加物として、０．２ＭのＣａアセテート、０．１Ｍ、ｐＨ８．０のイミダゾール、１０％のＰＥＧ８０００、及び３％のショ糖（カタログ＃ＨＲ２−１３８，Ｈａｍｐｔｏｎ）に最適化した。凍結保護物質は、ショ糖、グルコース、及びキシリトールのそれぞれ８％を加えた母液であった。
【０１６７】
結晶学的データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）Ｂｅａｍｌｉｎｅ８．２．１．で収集した。ＸＤＳまたはＨＫＬ２０００プログラムスイートを使用して、データをインデックス付けし、統合し、スケーリングした。プログラムＰＨＡＳＥＲによる分子置換によって、ＩＦＮ−λ１／ＩＦＮ−λＲ１二成分複合体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＯＧ６）及びアポリポタンパク質ＩＬ−１０Ｒβ（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＬＱＭ）構造を検索モデルとして使用して、結晶構造を解明した。ＰＨＥＮＩＸ及びＢＵＳＴＥＲによる逆格子空間精密化、及びＣＯＯＴによる手動再構築の反復サイクルによって、最終構造を構築した。このプロジェクトに使用された結晶学ソフトウェアをＳＢＧｒｉｄによってインストールし、設定した。
【０１６８】
配列、構造、及びＦＡＣＳ解析。Ｐｒｏｍａｌｓ３Ｄを使用して、構造に基づく配列アライメントを実施した。ＪａｌＶｉｅｗ（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｎｄｅｅ）によって、配列アライメント及びパーセント同一性計算を実施した。構造アライメント、相同性モデル、表面積と距離の計算、及び図面をＰｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）に生成した。ＦＡＣＳデータの図面は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒソース（Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ）またはＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）のいずれか一方に関するＲを含む。
【０１６９】
表面プラズモン共鳴法。ＧＥ  Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を使用し、動態（Ｉ型ＩＦＮ）方法または平衡（ＩＩＩ型ＩＦＮ）方法のいずれか一方によって、ＫＤを測定した。各受容体の約１００ＲＵを、無関係のサイトカイン受容体（ＩＬ−２Ｒβ）の参照チャネルを含むＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰ−ｃｈｉｐ（ＧＥ）上で捕捉した。
【０１７０】
生体外特徴づけ。Ｉ型ＩＦＮについて、先に記載されるような、シグナル伝達、抗ウイルス及び抗増殖アッセイを実施した。遺伝子誘導を測定するために、Ｈｕｈ７．５細胞を６ウェルフォーマット中に蒔き、１ｎＭのＩ型ＩＦＮによって２４時間処置し、Ｈａｐ１細胞（Ｊａｎ  Ｃａｒｅｔｔｅからの寄贈）を５ｐＭのＩ型またはＩＩＩ型ＩＦＮによって６時間処置し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ反応（ＨＣ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってｃＤＮＡに変換され、未処置の対照と比較して、１８Ｓレベルに正規化されたＩＳＧ誘導を、製造指示書に従いＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲアッセイシステムによって測定した。ＩＩＩ型ＩＦＮについて、前述されるように固定して染色する前に、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）によって５分間インキュベートすることによるＩＦＮ処置後、Ｈａｐ１細胞を剥離したことを除き、前述されるようにｐＳＴＡＴ１シグナル伝達を実施した。
【０１７１】
ＩＩＩ型ＩＦＮの抗増殖活性。ヒトＩＦＮ−λＲ１、ＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌ、及びＶＳＶ−Ｇをそれぞれ１．１／０．７／０．２の割合で符号化するｐＬＸ３０４プロウイルスＤＮＡを発現するプラスミドと、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされた６ウェルプレート中の４×１０５Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を同時導入することによって、レンチウイルス偽粒子を生成した。各遺伝子導入について、５μｌのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２．０μｇの全ＤＮＡと１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で混合させた。遺伝子導入を６時間実行した後に、３％のＦＢＳを含むＤＭＥＭへの培地変更を伴った。上澄みを２４時間と４８時間に採集し、プールして、０．４５μｍのフィルターに通し、−８０℃で貯蔵した。３×１０５Ｈｕｈ７．５及びＷＩＳＨ細胞を、１．５ｍｌの総容量中で１０％のＦＢＳ、５００μｌのレンチウイルス、及び８μｇ／ｍｌのポリブレンを含むＤＭＥＭ中で再懸濁し、１２ウェルプレート中に１．５時間、８５０×ｇでスピノキュレーションした（ｓｐｉｎｏｃｕａｌｔｅｄ）。形質導入後４８時間、細胞を２．５μｇ／ｍｌのブラストサイジンによって選択した。Ｈｕｈ７．５及びＷＩＳＨ細胞をＰＢＳ＋５ｍＭのＥＤＴＡ中で収集し、冷たいＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡによって２回洗浄した。次に細胞を抗ＩＬ−２８ＲＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ＃  ＡＦ５２６０）によって１×１０６個の細胞あたり５μｇの抗体で０．４ｍｌ容積中に３０分間インキュベートし、３回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒツジＩｇＧ（Ａｂｃａｍ；ｃａｔ＃  ａｂ６７４３）による１：２０００希釈に３０分間インキュベートし、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメトリーを使用して、低、中、及び高ＩＦＮ−λＲ１発現集団に細胞選別する前に３回洗浄した。ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７．５及びＷＩＳＨ細胞を、１×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。翌日、培地を１００μｌ／ウェルのＩＦＮ含有培地と交換した。ＩＦＮ処置後４日目に、製造元のプロトコルに従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞密度を測定した。
【０１７２】
ＨＢＶ感染したヒト肝臓キメラマウス作製及びＩＦＮ−λ３処置。記述されるように、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＡＢＲ），Ｉｎｃ．から調達された、ヒト胎児肝臓からヒト肝芽細胞を単離した。イソフルランによる麻酔下で、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られたオスｆａｈ−／−ｒａｇ２−／−ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ（ＦＲＧ）中の脾臓内に、ヒト肝細胞懸濁液を注入した（マウス１匹あたり０．５−１×１０６個の細胞）。移植日に開始し、他の人に記載されるように、マウスに肝臓保護薬ＮＴＢＣ（Ｙｅｃｕｒｉｓ）を循環させた。ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）によって、ヒトアルブミンレベルをマウス血清中で測定した。遺伝子型ＣのｅＡｇ陰性患者由来の血漿によって最初に感染したＨＢＶの２×１０８ＤＮＡコピー／ｍｌを含有する、１００μｍのマウス血清を、ヒト肝臓キメラマウスの静脈内に注入した。ＨＢＶウイルス量測定について、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２５μＬのマウス血清からＤＮＡを単離し、前述されるように院内Ｔａｑｍａｎアッセイによって、コピー数を解析した。製造元の指示でＣＬＩＡによって、ＨＢｓＡｇ（Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）レベルをマウス血清中で決定した。溶媒（ＰＢＳ中の１５％のグリセリン）、ＩＦＮ−λ３ｗｔ、または１０ｕｇ／ｋｇ体重で「Ｈ１１」の腹腔内注入による４週間の毎日の処置のために、８匹のマウスをランダム化した（それぞれ２、３、及び３匹のマウス）。すべての時点で、基線値に正規化され、対照と比較したデータをプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰｒｉｓｍにおけるＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後検定を用いる、通常の二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して統計解析を実施した。
参考文献
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【０２０１】
Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｌｅｔｈａｌ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｔｙｒｏｓｉｎａｅｍｉａ  ｔｙｐｅ  Ｉ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０，４５３−４６０（１９９５）．
【０２０２】
Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｅｔａｌ  ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．６５，３３４−３４３（２０１６）．
【０２０３】
Ｂｉｓｓｉｇ，Ｋ．−Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０，９２４−９３０（２０１０）．
【０２０４】
Ｂｒｉｄｅａｕ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，８２６９−８２７４（２００７）．
【０２０５】
Ｋａｌｉｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｄｉｃｔａｔｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，３２９２５−３２９３６（２００８）．
【０２０６】
Ｌａｖｏｉｅ，Ｔ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｌ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５６，２８２−２８９（２０１１）．
【０２０７】
Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５０，３１７−３３４（２０１２）．
【０２０８】
Ｌｅｖｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｒｅ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．７，ｒａ５０（２０１４）．
【０２０９】
Ｊａｉｔｉｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｑｕｉｒｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ（ＩＦＮｓ）：ａｎ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ２  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ＩＦＮＡＲ１  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＩＦＮ−ｂｅｔａ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６，１８８８−１８９７（２００６）．
【０２１０】
Ｋａｌｉｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ２  ｍｕｔａｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ＩＦＮＡＲ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，１１６０２−１１６１１（２００７）．
【０２１１】
Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｌａｍｂｄａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＢｅＡｇ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ：Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ２ｂ  ｓｔｕｄｙ（ＬＩＲＡ−Ｂ）．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．６４，１０１１−１０１９（２０１６）．
【０２１２】
Ｃｉａｎｃｉｏ，Ａ．＆  Ｒｉｚｚｅｔｔｏ，Ｍ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ  ａｔ  ａ  ｓｔａｎｄｓｔｉｌｌ：ｗｈｅｒｅ  ｄｏ  ｗｅ  ｇｏ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｅ？Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１１，６８−７１（２０１４）．
【０２１３】
Ｓａｔｏ，Ａ．，Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｍ．，Ｈａｔａ，Ｍ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｅ．＆  Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＩＦＮ−λ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６，７６８６−７６９４（２００６）．
【０２１４】
Ｎｕｍａｓａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−２８  Ｅｌｉｃｉｔｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８，５０８６−５０９８（２００７）．
【０２１５】
Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ‘ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ’．Ｎａｔｕｒｅ  ４８４，５２９−５３３（２０１２）．
【０２１６】
Ｗａｌｔｅｒ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｙｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｒｅｓｃｕｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｌｏｎｄ．Ｅｎｇｌ．１９９３  １４，１６１７−１６２２（２００６）．
【０２１７】
Ｐｅｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＲＯＭＡＬＳ３Ｄ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６，２２９５−２３００（２００８）．
【０２１８】
Ａｎｄｒｕｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  Ｖ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ  ５４，１９０１−１９１２（２０１１）．
【０２１９】
Ｂｒｅｈｍ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ＩＬ２ｒｇａｍｍａ（ｎｕｌｌ）  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｏｒｌａｎｄｏ  Ｆｌａ  １３５，８４−９８（２０１０）．
【０２２０】
Ａｚｕｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−ｍｉｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，９０３−９１０（２００７）．
【０２２１】
Ｓｈｌｏｍａｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，１２１９３−１２１９８（２０１４）．
【０２２２】
実施例２
シンセカイン２は、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ受容体を二量体化するハイブリッドインターフェロンである。
【０２２３】
図１に示されるように、ＩＦＮλＲ１結合配列（Ｈ１１ＤＮ）を含むシンセカイン、及びＩＦＮＡＲ１結合配列（ＩＦＮＷＤＮ２）を生成した。完全なシンセカイン配列を配列番号２３に提供する。シンセカインをこのように生成し、シンセカイン２は、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮλＲ１受容体ならびにそれらのそれぞれのＪＡＫを二量体化する、ハイブリッドインターフェロンである。
【０２２４】
図１２Ｃに示されるように、シンセカイン２によるホスホ−ＳＴＡＴ１活性化のＥｍａｘは、Ｉ型ＩＦＮのそれに等しく、ＩＩＩ型ＩＦＮによって誘導されるシグナルの２倍に等しい。エラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【０２２５】
重要なことに、図１２Ｄに示されるように、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮまたはＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせの処置が無効であるが、シンセカイン２は、抗増殖効果を強く誘導する。エラーバーは、±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。ホスホ−ＳＴＡＴ１シグナル伝達、及び抗増殖アッセイを、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方に自然応答性であるＨａｐ１細胞中で実施した。
【０２２６】
また、シンセカイン２などのハイブリッドポリペプチド中で結合されない限り、Ｉ型及びＩＩＩ型インターフェロンの組み合わせがこの活性を提供しないことに留意することが重要である。シンセカインの活性及び特異性は、抗増殖及び抗ウイルス活性に強力な薬剤を提供し、この薬剤は、作用の選択性を提供するため、Ｉ型インターフェロンの望ましくない副作用を避ける。
【０２２７】
方法
生体外特徴づけ。実施例１に記載したように、遺伝子誘導を測定するための実験を行った。Ｉ型、ＩＩＩ型ＩＦＮ、及びシンセカイン２、ならびにＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせについて、固定して染色する前に、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）によって５分間インキュベートすることによるＩＦＮ処置後、Ｈａｐ１細胞を剥離した修正を除き、記載されるようにｐＳＴＡＴ１シグナル伝達を実施した。
【０２２８】
Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮ、シンセカイン２、ならびにＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせを比較する抗増殖活性について、Ｈａｐ１細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルフォーマット中に蒔いた修正を含む、ＩＩＩ型ＩＦＮの抗増殖活性を実施例１に記載されるように実施した。翌日、培地を１００μｌ／ウェルのＩＦＮ含有培地と交換し、細胞密度を測定する前に７２時間インキュベートした。
【０２２９】
実施例は、当業者に本発明をどのように作製し、使用するかの完全なる開示及び説明を提供するように提示され、本発明者らが彼ら自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数値（たとえば、量、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラー及び偏差が計上されるはずである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【０２３０】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、均等物が置き換えられてもよいことを理解されたい。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップを、本発明の目的、主旨、および範囲に適応させるために、多くの修正が行われてもよい。すべての係る修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内となるように意図されている。
【図１】
2019531729.tif 000004
【図２】
2019531729.tif 000005
【図３】
2019531729.tif 000006
【図４】
2019531729.tif 000007
【図５】
2019531729.tif 000008
【図６】
2019531729.tif 000009
【図７−１】
2019531729.tif 000010
【図７−２】
2019531729.tif 000011
【図８】
2019531729.tif 000012
【図９】
2019531729.tif 000013
【図１０−１】
2019531729.tif 000014
【図１０−２】
2019531729.tif 000015
【図１１−１】
2019531729.tif 000016
【図１１−２】
2019531729.tif 000017
【図１１−３】
2019531729.tif 000018
【図１２】
2019531729.tif 000019
【配列表】
2019531729000001.app
【国際調査報告】
2019531729.tif 000020
2019531729.tif 000021
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