(57)【要約】  本開示は、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システム、及び角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療するためのそれらの使用方法に関する。【選択図】図１
2019524149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためにデザインされた一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
【請求項２】
（ｉ）配列番号（１０＋４ｎ）又は配列番号（１１＋４ｎ）（ｎは、０から２２１までの整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と、（ｉｉ）トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含み、前記ｃｒＲＮＡ配列及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号２又は配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためにデザインされたｓｇＲＮＡ対であって、
（ｉ）（ａ）病因性突然変異又はＳＮＰの３’末端側にシスにある第１のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を生成する突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）のための第１のｃｒＲＮＡ配列と、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含み、該第１のｃｒＲＮＡ配列及び該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、第１のｓｇＲＮＡと、
（ｉｉ）（ａ）病因性突然変異又はＳＮＰの５’末端側にシスにある第２のＰＡＭを生成する突然変異又はＳＮＰのための第２のｃｒＲＮＡガイド配列と、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含み、該第２のｃｒＲＮＡ配列及び該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、第２のｓｇＲＮＡと、
を含む、ｓｇＲＮＡ対。
【請求項５】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療のためのシステムである、請求項４に記載のｓｇＲＮＡ対。
【請求項６】
前記ＰＡＭを生成する突然変異又は前記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子中に存在する、請求項４又は５に記載のｓｇＲＮＡ対。
【請求項７】
前記ＰＡＭを生成する突然変異又は前記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン中に存在する、請求項４〜６のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ対。
【請求項８】
前記第１のｃｒＲＮＡ配列及び前記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、図１９〜図３５に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記第１のｃｒＲＮＡ配列及び前記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、表２に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ対。
【請求項９】
（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡとを含む少なくとも１つのベクター、又は（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と請求項４〜８のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ対とを含む少なくとも１つのベクターを含み、前記ベクター中の前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び前記ｓｇＲＮＡ対は、天然には一緒に存在しないものである、操作されたクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システム。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、又はそれらの変異体由来のヌクレアーゼである、請求項９に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号４又は配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９又は１０に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項１２】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子は、配列番号３又は配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項１３】
修復ヌクレオチド分子を更に含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項１４】
１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項１５】
前記ｓｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、同じベクター上に含まれている、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【請求項１６】
遺伝子産物の発現を変化させる方法であって、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、標的配列を有すると共に前記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み発現する細胞中に導入することを含む、方法。
【請求項１７】
前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、
（ａ）前記標的配列とハイブリダイズするｓｇＲＮＡに作動的に連結された第１の調節エレメントと、
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子に作動的に連結された第２の調節エレメントと、
を含み、前記ｓｇＲＮＡは、前記標的配列を標的とし、かつ前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を開裂する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、真核細胞である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、哺乳動物細胞又はヒト細胞である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
被験体における突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）と関連する疾患を予防、改善、又は治療する方法であって、前記被験体の遺伝子産物の発現を請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法により変化させることを含み、前記ＤＮＡ分子は、突然変異配列を含む、方法。
【請求項２１】
被験体における遺伝子突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）と関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法であって、
前記被験体に、
（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と、
（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’末端に隣接する標的配列に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と、
を含む少なくとも１つのベクターを含む操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み、前記標的配列又は前記ＰＡＭは、角膜ジストロフィーを引き起こす突然変異又はＳＮＰを含み、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子及び前記ｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、方法。
【請求項２２】
前記ＰＡＭは、前記突然変異又は前記ＳＮＰを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｃｒＲＮＡ配列は、前記標的配列を含み、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、１７ヌクレオチド長〜２４ヌクレオチド長である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号（１０＋４ｎ）（ｎは、０から２２１までの整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＡＭ及び前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス由来のヌクレアーゼである、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＡＭは、ＮＧＧ又はＮＮＧＲＲＴ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣのいずれかであり、かつＲは、Ａ又はＧである）からなる、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与は、前記被験体の角膜中への前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの導入を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与は、前記被験体の角膜中への前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの注射を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与は、前記標的配列を有するＤＮＡ分子を含み発現する細胞中への前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの導入を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記角膜ジストロフィーは、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、メースマン角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ）、ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー（ＴＢＣＤ）、格子状角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、顆粒状角膜ジストロフィー（ＧＣＤ）、及びシュナイダー角膜ジストロフィー（ＳＣＤ）からなる群から選択される、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ、及びＵＢＩＡＤ１からなる群から選択される遺伝子中に位置している、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子突然変異又は前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、
（ｉ）Ｌｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質、
（ｉｉ）Ｇｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓを有する突然変異ＫＲＴ３タンパク質、
（ｉｉｉ）Ｍｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａｌ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／又はＬｅｕ４３３Ａｒｇを有する突然変異ＫＲＴ１２タンパク質、
（ｉｖ）Ａｓｐ２１４Ｔｙｒを有する突然変異ＧＳＮタンパク質、並びに、
（ｖ）Ａｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎを有する突然変異ＵＢＩＡＤ１タンパク質、
からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
（ｉ）前記遺伝子突然変異若しくは前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号５８、配列番号５４、配列番号５０、若しくは配列番号４２を含み、
（ｉｉ）前記遺伝子突然変異若しくは前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号９４、配列番号９０、配列番号８６、配列番号８２、配列番号７８、配列番号７４、若しくは配列番号７０を含み、
（ｉｉｉ）前記遺伝子突然変異若しくは前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１１４、配列番号１１０、配列番号１０６、若しくは配列番号９８を含み、
（ｉｖ）前記遺伝子突然変異若しくは前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１７８、配列番号１７４、配列番号１７０、配列番号１６６、配列番号１６２、若しくは配列番号１５８を含み、
（ｖ）前記遺伝子突然変異若しくは前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１４６、配列番号１４２、配列番号１３８、配列番号１３４、配列番号１３０、若しくは配列番号１２６を含み、及び／又は、
（ｖｉ）前記遺伝子突然変異若しくは前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号４７４、配列番号４７８、配列番号４８２、若しくは配列番号４８６を含む、
請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子突然変異又は前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ前記ｃｒＲＮＡは、配列番号８６又は配列番号９４を含む、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記角膜ジストロフィーは、前記ＳＮＰと関連しており、かつ前記標的配列又は前記ＰＡＭは、角膜ジストロフィーを引き起こすＳＮＰ部位を含む、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的配列又は前記ＰＡＭは、複数のＳＮＰ部位を含む、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体は、ヒトである、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
被験体における遺伝子突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）と関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法であって、
前記被験体に、
（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と、
（ｉｉ）病因性突然変異又はＳＮＰの３’末端側にシスにある第１のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’末端に隣接する第１の標的配列に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列であって、前記第１の標的配列又は前記第１のＰＡＭが、第１の祖先型突然変異部位又はＳＮＰ部位を含む、第１のｃｒＲＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）病因性突然変異又はＳＮＰの５’末端側にシスにある第２のＰＡＭの５’末端に隣接する第２の標的配列に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第２のｃｒＲＮＡ配列であって、前記第２の標的配列又は前記第２のＰＡＭが、第２の祖先型突然変異部位又はＳＮＰ部位を含む、第２のｃｒＲＮＡ配列と、
を含む少なくとも１つのベクターを含む操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み、前記少なくとも１つのベクターは、天然に一緒に存在するｃｒＲＮＡ配列及びＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子を有しない、方法。
【請求項３９】
前記ＰＡＭを生成する突然変異又は前記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子中に存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＡＭを生成する突然変異又は前記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン中に存在する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のｃｒＲＮＡ配列及び前記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、図１９〜図３５に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記第１のｃｒＲＮＡ配列及び前記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、表２に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のＰＡＭは、前記第１の突然変異部位若しくは前記ＳＮＰ部位を含み、及び／又は前記第２のＰＡＭは、前記第２の突然変異部位若しくは前記ＳＮＰ部位を含む、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のｃｒＲＮＡ配列は、前記第１の標的配列を含み、
前記第２のｃｒＲＮＡ配列は、前記第２の標的配列を含み、
前記第１のｃｒＲＮＡ配列は、１７ヌクレオチド長〜２４ヌクレオチド長であり、及び／又は、
前記第２のｃｒＲＮＡ配列は、１７ヌクレオチド長〜２４ヌクレオチド長である、
請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のＰＡＭ及び／又は前記第２のＰＡＭ並びに前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス由来である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のＰＡＭ及び前記第２のＰＡＭの両方は、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス由来である、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＡＭは、ＮＧＧ又はＮＮＧＲＲＴ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣのいずれかであり、かつＲは、Ａ又はＧである）からなる、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記投与は、前記被験体の角膜中への前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの導入を含む、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与は、前記被験体の角膜中への前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの注射を含む、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与は、前記標的配列を有するＤＮＡ分子を含み発現する細胞中への前記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの導入を含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記角膜ジストロフィーは、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、メースマン角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ）、ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー（ＴＢＣＤ）、格子状角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、顆粒状角膜ジストロフィー（ＧＣＤ）、及びシュナイダー角膜ジストロフィー（ＳＣＤ）からなる群から選択される、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記病因性突然変異又は前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする、請求項３８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記角膜ジストロフィーは、前記ＳＮＰと関連しており、
前記第１の標的配列若しくは前記第１のＰＡＭは、前記第１の祖先型ＳＮＰ部位を含み、及び／又は、
前記第２の標的配列若しくは前記第２のＰＡＭは、前記第２の祖先型ＳＮＰ部位を含む、
請求項３８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記病因性突然変異又は前記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードする、請求項３８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的配列又は前記ＰＡＭは、複数の突然変異部位又はＳＮＰ部位を含む、請求項３８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体は、ヒトである、請求項３８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
角膜ジストロフィーの治療を必要とする被験体における角膜ジストロフィーを治療する方法であって、
（ａ）前記被験体から角膜ジストロフィー標的核酸中に核酸突然変異を含む複数の幹細胞を取得することと、
（ｂ）前記複数の幹細胞の１つ以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作することで前記核酸突然変異を修正し、それにより１つ以上の操作された幹細胞を形成させることと、
（ｃ）前記１つ以上の操作された幹細胞を単離することと、
（ｄ）前記１つ以上の操作された幹細胞を前記被験体中に移植することと、
を含み、
前記複数の幹細胞の１つ以上の幹細胞における核酸突然変異を操作することは、請求項１６〜５５に記載の方法のいずれかを実施することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats；ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システム、及び角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療するためのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の角膜ジストロフィーは、ドミナントネガティブな病理機序により常染色体優性的に遺伝する。幾つかの遺伝子、例えばＴＧＦＢＩ及びＫＲＴ１２に関しては、それらの遺伝子がハプロ不全でないことが分かっている。つまり、正常な機能を維持するために上記遺伝子の１つの機能的コピーで十分である。突然変異アレルを特異的に標的とするｓｉＲＮＡを使用することにより、突然変異タンパク質のドミナントネガティブ効果に打ち勝ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に正常な機能を回復させることが可能である。ｓｉＲＮＡの効果は一過性であり、ｓｉＲＮＡが細胞中に十分に高い濃度で存在する間に限ってのみ継続するにすぎないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集は、突然変異アレルを永続的に改変する機会を与える。
【０００３】
二本鎖ＤＮＡを触媒的に開裂するための単純な内因性細菌システムの発見は、治療的遺伝子編集の分野に革命を起こした。ＩＩ型のクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）は、プログラム可能なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼであり、それは最近では、哺乳動物細胞における遺伝子編集で効果的であることが分かっている（非特許文献１）。この特異性が高くかつ効果的なＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、広範囲の遺伝性疾患において治療的に重要である場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、単独の触媒性タンパク質、つまり２つのＲＮＡ分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ）により特異的なＤＮＡ配列にガイドされるＣａｓ９に基づくものである（非特許文献１）。ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡを組み合わせて一本鎖ガイドＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）にすることで（非特許文献２、非特許文献３）、ゲノム内の任意の標的に潜在的に特異的な遺伝子編集ツールの迅速な開発がもたらされた。ｓｇＲＮＡ内のヌクレオチド配列を選択された標的に相補性の配列に置き換えることにより、特異性が高いシステムをほんの数日で作製することができる。このシステムの１つの注意事項は、該エンドヌクレアーゼがｓｇＲＮＡ結合部位の３’末端のすぐそばに位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とすることである。このＰＡＭ配列は、ＤＮＡ標的の不変の部分であるが、ｓｇＲＮＡ中には存在せず、その一方で、それがゲノム標的配列の３’末端に存在しないと、Ｃａｓ９が該ＤＮＡ標的を開裂することができなくなる（非特許文献４）。
【０００４】
１つの態様において、本開示は、アレル特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの、角膜ジストロフィーのための、例えばメースマン角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ；ＯＭＩＭ：１２２１００）を引き起こすＫＲＴ１２（ケラチン１２をコードする、Ｋ１２）中のドミナントネガティブ突然変異Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ（ｃ．３９５Ｔ＞Ｃ）に対する潜在能力を記載している（非特許文献５）。興味深いことに、本明細書に示されるように、この突然変異は、野生型アレルには存在しないストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）の新規ＰＡＭの出現をもたらす。幾つかの実施の形態において、本開示は、この新規ＰＡＭの５’末端にあるヌクレオチドをｓｇＲＮＡ中に導入することにより、突然変異アレルのアレル特異的開裂が誘導され得ることを示している。ヘテロ接合細胞において、この二本鎖破断は、フレームシフト及び未成熟終止コドンの出現をもたらし得る非相同末端結合（ＮＨＥＪ）か、又は野生型アレルとの再結合により突然変異配列の修復が導かれる相同配列指向性修復のいずれかをもたらし得る。例えばＫＲＴ１２の場合には、両結果とも治療的成功とみなすことができる。ドミナントネガティブ突然変異Ｋ１２タンパク質の発現は、ＮＨＥＪにより破壊されるが、それはＫＲＴ１２がハプロ不全性を示さないことが分かっているため許容され（非特許文献６）、又は上記突然変異アレルは、相同配列指向性修復により修復されることで、Ｋ１２−Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏアレルの修復がもたらされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 2014; 157: 1262-1278
【非特許文献２】Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen TS et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014; 343: 84-87
【非特許文献３】Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science 2014; 343: 80-84
【非特許文献４】Westra ER, Semenova E, Datsenko KA, Jackson RN, Wiedenheft B, Severinov K et al. Type I-E CRISPR-cas systems discriminate target from non-target DNA through base pairing-independent PAM recognition. PLoS Genet 2013; 9: e1003742
【非特許文献５】Liao H, Irvine AD, Macewen CJ, Weed KH, Porter L, Corden LD et al. Development of allele-specific therapeutic siRNA in Meesmann epithelial corneal dystrophy. PLoS One 2011; 6: e28582
【非特許文献６】Kao WW, Liu CY, Converse RL, Shiraishi A, Kao CW, Ishizaki M et al. Keratin 12-deficient mice have fragile corneal epithelia. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 2572-2584
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様において、本開示は、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に関する。幾つかの実施の形態において、上記ｓｇＲＮＡは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と、（ｉｉ）トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含む。幾つかの実施形態において、上記ｃｒＲＮＡ配列及び上記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである。幾つかの実施の形態において、上記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号（１０＋４ｎ）（ｎは、０から２２１までの整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。更なる実施の形態において、上記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００７】
別の態様において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためにデザインされたｓｇＲＮＡ対であって、（ｉ）（ａ）病因性突然変異又はＳＮＰの３’末端側にシスにある第１のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を生成する突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）のための第１のｃｒＲＮＡ配列と、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含み、該第１のｃｒＲＮＡ配列及び該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、第１のｓｇＲＮＡと、（ｉｉ）（ａ）病因性突然変異又はＳＮＰの５’末端側にシスにある第２のＰＡＭを生成する突然変異又はＳＮＰのための第２のｃｒＲＮＡガイド配列と、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含み、該第２のｃｒＲＮＡ配列及び該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、第２のｓｇＲＮＡとを含む、ｓｇＲＮＡ対に関する。幾つかの実施の形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療のためのシステムである。幾つかの実施の形態において、上記ＰＡＭを生成する突然変異又は上記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子中に位置する。更なる実施の形態において、上記ＰＡＭを生成する突然変異又は上記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン中に存在する。例えば、図１６に示されるように、上記ＰＡＭを生成する突然変異又は上記ＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子の隣り合ったイントロン中にあり、上記病因性突然変異又は上記ＳＮＰは、隣り合ったイントロンの間のエキソン中にあり得る。なおも更なる実施の形態においては、上記第１のｃｒＲＮＡ配列及び上記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、図１９〜図３５に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、及び／又は上記第１のｃｒＲＮＡ配列及び上記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、表２に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子とｓｇＲＮＡとを含む少なくとも１つ若しくは２つのベクター、又は本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子とｓｇＲＮＡ対とを含む少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの異なるベクターを含む、操作されたクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムに関する。幾つかの実施の形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び上記ｓｇＲＮＡは、天然には一緒に存在しないものである。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、Slaymaker et al., 2016 Science, 351(6268), 84-88に記載される強化型Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。更なる実施の形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスに由来する。なおも更なる実施の形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（Ｓｐｙ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・イニアエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・フォカエ（Streptococcus phocae）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Streptococcus pseudoporcinus）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Streptococcus pseudoporcinus）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Streptococcus infantarius）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・カバリ（Streptococcus caballi）、ストレプトコッカス・エクイヌス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス属種ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ（Streptococcus sp. oral taxon）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ガロリティクス（Streptococcus gallolyticus）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・パスツーリアヌス（Streptococcus pasteurianus）、又はそれらの変異体に由来する。更なる実施の形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、スタフィロコッカスに由来する。なおも更なる実施の形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、Ｓ．シミアエ（S. simiae）、Ｓ．アウリクラリス（S. auricularis）、Ｓ．カルノサス（S. carnosus）、Ｓ．コンディメンティ（S. condimenti）、Ｓ．マッシリエンシス（S. massiliensis）、Ｓ．ピスシフェルメンタンス（S. piscifermentans）、Ｓ．シムランス（S. simulans）、Ｓ．カピティス（S. capitis）、Ｓ．カプラエ（S. caprae）、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis）、Ｓ．サッカロリティクス（S. saccharolyticus）、Ｓ．デブリエセイ（S. devriesei）、Ｓ．ヘモリティクス（S. haemolyticus）、Ｓ．ホミニス（S. hominis）、Ｓ．アグネティス（S. agnetis）、Ｓ．クロモゲネス（S. chromogenes）、Ｓ．フェリス（S. felis）、Ｓ．デルフィニ（S. delphini）、Ｓ．ハイカス（S. hyicus）、Ｓ．インテルメディウス（S. intermedius）、Ｓ．��トラエ（S. lutrae）、Ｓ．ミクロティ（S. microti）、Ｓ．ムスカエ（S. muscae）、Ｓ．シュードインターメディウス（S. pseudintermedius）、Ｓ．ロストリ（S. rostri）、Ｓ．シュライフェリ（S. schleiferi）、Ｓ．ルグドゥネンシス（S. lugdunensis）、Ｓ．アーレッタエ（S. arlettae）、Ｓ．コーニイ（S. cohnii）、Ｓ．エクオルム（S. equorum）、Ｓ．ガリナルム（S. gallinarum）、Ｓ．クローシイ（S. kloosii）、Ｓ．レエイ（S. leei）、Ｓ．ネパレンシス（S. nepalensis）、Ｓ．サプロフィティクス（S. saprophyticus）、Ｓ．スクシヌス（S. succinus）、Ｓ．キシロサス（S. xylosus）、Ｓ．フレウレティイ（S. fleurettii）、Ｓ．レンツス（S. lentus）、Ｓ．シウリ（S. sciuri）、Ｓ．ステパノヴィチイ（S. stepanovicii）、Ｓ．ヴィツリヌス（S. vitulinus）、Ｓ．シムランス（S. simulans）、Ｓ．パスツーリ（S. pasteuri）、Ｓ．ワルネリ（S. warneri）、又はそれらの変異体に由来する。更なる実施の形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号４又は配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施の形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする上記ヌクレオチド分子は、配列番号３又は配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム又はベクターは、修復ヌクレオチド分子及び／又は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を除く、又は更に含む。更なる実施の形態において、上記ｓｇＲＮＡ及び上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、同じベクター上、又は異なるベクター上に含まれる。
【０００９】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を変化させる方法であって、本明細書に記載される操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、標的配列を有すると共に上記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み発現する細胞中に導入することを含む、方法に関する。幾つかの実施の形態において、上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、（ａ）上記標的配列とハイブリダイズするｓｇＲＮＡに作動的に連結された第１の調節エレメントと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子に作動的に連結された第２の調節エレメントとを含み、その際、構成要素（ａ）及び構成要素（ｂ）は、該システムの同じベクター又は異なるベクター上に位置しており、該ｓｇＲＮＡは、上記標的配列を標的とし、かつ上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、上記ＤＮＡ分子を開裂する。上記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’末端に隣接するヌクレオチド配列に相補性のヌクレオチド配列であり得る。更なる実施の形態において、上記細胞は、真核細胞、又は哺乳動物細胞若しくはヒト細胞である。幾つかの実施の形態において、上記ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより認識されるＰＡＭの５’末端に隣接するヌクレオチド配列を含む。更なる実施の形態において、上記ｓｇＲＮＡは、１６ヌクレオチド配列から２５ヌクレオチド配列までの長さを有し、又は１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、若しくは２５個のヌクレオチドを有する。
【００１０】
別の態様において、本開示は、被験体における一塩基多型（ＳＮＰ）と関連する疾患を予防、改善、又は治療する方法であって、本明細書に記載される上記被験体の遺伝子産物の発現を変化させることを含み、上記ＤＮＡ分子が、突然変異配列を含む、方法に関する。幾つかの実施の形態において、上記ＤＮＡ分子は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれより多くのＳＮＰ部位又は突然変異部位を含み得て、かつ本明細書に記載される方法は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれより多くの上記ＳＮＰ部位又は上記突然変異部位に関連する遺伝子産物の発現を変化させる。
【００１１】
別の態様において、本開示は、被験体における遺伝子突然変異又はＳＮＰと関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法であって、上記被験体に（ｉ）本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と、（ｉｉ）本明細書に記載されるｓｇＲＮＡとを含む少なくとも１つ、又は２つのベクターを含む操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み、上記ｓｇＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の５’末端に隣接する標的配列に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズするか、又は該標的配列を含み、かつ上記標的配列又は上記ＰＡＭは、突然変異部位又はＳＮＰ部位を含む、方法に関する。幾つかの実施の形態において、上記ｓｇＲＮＡは、上記標的配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び上記ｓｇＲＮＡは、天然には一緒に存在しないものである。更なる実施の形態において、上記ＰＡＭは、上記突然変異部位又は上記ＳＮＰ部位を含む。
【００１２】
幾つかの実施の形態において、上記病因性遺伝子突然変異又は上記ＳＮＰを含む突然変異配列は、（ｉ）Ｌｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質、（ｉｉ）Ｇｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓを有する突然変異ＫＲＴ３タンパク質、（ｉｉｉ）Ｍｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａｌ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／又はＬｅｕ４３３Ａｒｇを有する突然変異ＫＲＴ１２タンパク質、（ｉｖ）Ａｓｐ２１４Ｔｙｒを有する突然変異ＧＳＮタンパク質、並びに（ｖ）Ａｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎを有する突然変異ＵＢＩＡＤ１タンパク質からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする。なおも更なる実施の形態において、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法であって、上記被験体が、ヒト、動物、又は哺乳動物である、方法。
【００１３】
幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＧＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＣＡＴＧＣＴＡＡＡ（配列番号８９７）を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＧＡＧＡＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＴＧ（配列番号８９８）を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５０９Ａｒｇを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号１８６を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号４７４を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号５８、配列番号５４、配列番号５０、及び配列番号４２のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号９４、配列番号９０、配列番号８６、配列番号８２、配列番号７８、配列番号７４、及び配列番号７０のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号８６又は配列番号９４を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号１１４、配列番号１１０、配列番号１０６、及び配列番号９８のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号１７８、配列番号１７４、配列番号１７０、配列番号１６６、配列番号１６２、及び配列番号１５８のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号１４６、配列番号１４２、配列番号１３８、配列番号１３４、配列番号１３０、及び配列番号１２６のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。幾つかの実施の形態において、上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質をコードし、かつ上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号１４６、配列番号１４２、配列番号１３８、配列番号１３４、配列番号１３０、及び配列番号１２６のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。
【００１４】
別の態様において、本開示は、被験体における遺伝子突然変異又はＳＮＰと関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法であって、上記被験体に（ｉ）本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と、（ｉｉ）本明細書に記載されるｓｇＲＮＡとを含む少なくとも１つ、又は２つのベクターを含む操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み、上記ｓｇＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の５’末端に隣接する第２の標的配列に相補性の第１の標的配列にハイブリダイズし、かつ上記第１の標的配列又は上記ＰＡＭは、上記突然変異部位又は上記ＳＮＰ部位を含む、方法に関する。別の態様において、本開示は、被験体における遺伝子突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）と関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法であって、上記被験体に（ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と、（ｉｉ）病因性突然変異又はＳＮＰの３’末端側にシスにある第１のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’末端に隣接する第１の標的配列に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列であって、上記第１の標的配列又は上記第１のＰＡＭが、第１の祖先型突然変異部位又はＳＮＰ部位を含む、第１のｃｒＲＮＡ配列と、（ｉｉｉ）病因性突然変異又はＳＮＰの５’末端側にシスにある第２のＰＡＭの５’末端に隣接する第２の標的配列に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第２のｃｒＲＮＡ配列であって、上記第２の標的配列又は上記第２のＰＡＭが、第２の祖先型突然変異部位又はＳＮＰ部位を含む、第２のｃｒＲＮＡ配列とを含む少なくとも１つのベクターを含む操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み、上記少なくとも１つのベクターは、天然に一緒に存在するｃｒＲＮＡ配列及びＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子を有しない、方法に関する。幾つかの実施の形態において、ＰＡＭを生成する突然変異又はＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子中に、例えば、ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン中に存在する。別の実施の形態において、上記第１のｃｒＲＮＡ配列及び上記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、図１９〜図３５に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、及び／又は上記第１のｃｒＲＮＡ配列及び上記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、表２に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。なおも更なる実施の形態において、上記第１のＰＡＭは、上記第１の突然変異部位若しくは上記ＳＮＰ部位を含み、及び／又は上記第２のＰＡＭは、上記第２の突然変異部位若しくは上記ＳＮＰ部位を含む。更なる実施の形態において、上記第１のｃｒＲＮＡ配列は、上記第１の標的配列を含み、及び／又は上記第２のｃｒＲＮＡ配列は、上記第２の標的配列を含む。なおも更なる実施の形態において、上記ｃｒＲＮＡは、１７ヌクレオチド長〜２４ヌクレオチド長である。幾つかの実施の形態において、上記第１のＰＡＭ及び／又は上記第２のＰＡＭの両方は、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス由来である。更なる実施の形態において、上記病因性突然変異又は上記ＳＮＰを含む突然変異配列は、Ｌｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌを含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする。
【００１５】
なおも更なる実施の形態において、上記ＰＡＭは、ＮＧＧ及びＮＮＧＲＲＴ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣのいずれかであり、かつＲは、Ａ又はＧである）からなる群から選択されるＰＡＭからなる。更なる実施の形態において、上記投与は、上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記被験体の角膜（例えば、角膜実質）中に注射することにより、及び／又は上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、上記標的配列を有するＤＮＡ分子を含み発現する細胞中に導入することにより、上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記被験体の角膜（例えば、角膜実質）中に導入することを含む。
【００１６】
幾つかの実施の形態において、上記角膜ジストロフィーは、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、メースマン角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ）、ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー（ＴＢＣＤ）、格子状角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、顆粒状角膜ジストロフィー（ＧＣＤ）、及びシュナイダー角膜ジストロフィー（ＳＣＤ）からなる群から選択される。更なる実施の形態において、上記ＳＮＰ部位は、ＴＧＦＢＩ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ、及びＵｂｉＡプレニルトランスフェラーゼドメイン含有タンパク質１（ＵＢＩＡＤ１）からなる群から選択される遺伝子中に位置している。
【００１７】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び該システムを使用する方法は、複数のＳＮＰ部位又は祖先型ＳＮＰでの突然変異配列を変化させ得る。
【００１８】
別の態様において、本開示は、角膜ジストロフィーの治療を必要とする被験体における角膜ジストロフィーを治療する方法であって、（ａ）上記被験体から角膜ジストロフィー標的核酸中に核酸突然変異を含む複数の幹細胞を取得することと、（ｂ）上記複数の幹細胞の１つ以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作することで上記核酸突然変異を修正し、それにより１つ以上の操作された幹細胞を形成させることと、（ｃ）上記１つ以上の操作された幹細胞を単離することと、（ｄ）上記１つ以上の操作された幹細胞を上記被験体中に移植することとを含み、上記複数の幹細胞の１つ以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作することが、本明細書に記載される遺伝子産物の発現を変化させる方法、又は被験体における突然変異若しくはＳＮＰと関連する疾患を予防、改善、若しくは治療する方法のいずれかを実施することを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】野生型及び突然変異のケラチン１２（Ｋ１２）アレルを標的とするためのｓｇＲＮＡの例示的デザインを示す図である。Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐアレルに見られるＳＮＰに誘導されたＰＡＭを使用するｓｇＲＮＡをデザインした（赤色）。このＰＡＭは、野生型アレルには存在しない。野生型及び突然変異のＫ１２アレルの両方を標的とする第２のｓｇＲＮＡ（緑色）もデザインし、ポジティブコントロールとして使用した。
【図２】外因性発現構築物を使用したｓｇＫ１２ＬＰのアレル特異性及び有効性の評価を示す図である。野生型及び突然変異のＫ１２のための外因性発現構築物を使用して、ｓｇＫ１２ＬＰのアレル特異性及び有効性を試験した。（Ａ）デュアルルシフェラーゼアッセイにより、ｓｇＫ１２ＬＰプラスミドのアレル特異性が裏付けられ、その一方で、有効性はｓｇＫ１２構築物の有効性に匹敵することが示された（Ｎ＝８）。（Ｂ）ウェスタンブロッティングにより、これらはｓｇＫ１２ＬＰで処理された細胞中のＫ１２−Ｌ１３２Ｐタンパク質が、処理されたがＫ１２野生型タンパク質を発現する細胞と比較して著しく減少することに起因すると裏付けられた。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。（Ｃ）野生型アレル及び突然変異アレルの両方を発現する細胞における全Ｋ１２に関する定量的逆転写酵素ＰＣＲにより、ｍＲＮＡ発現のノックダウンが裏付けられた（Ｎ＝４）。（Ｄ）このｍＲＮＡノックダウンのアレル割合を、次いでパイロシーケンシングにより定量することで、両方のＫＲＴ１２アレルを同時発現するとともに、ｓｇＫ１２ＬＰで処理された細胞における突然変異アレルのアレルノックダウンが確認された（Ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図３】ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｇＫ１２ＬＰに誘導されるＮＨＥＪを示す図である。ＧＦＰ発現が、実質内注射後２４時間の時点でマウスの角膜上皮に観察されることから、角膜上皮のトランスフェクションのための実質内プラスミド注射の効力が裏付けられた（Ａ、Ｎ＝２）。ＧＦＰ発現は、注射後４８時間の時点では観察されなかった。ｓｇＫ１２ＬＰ構築物が注射されたヒトＫ１２−Ｌ１３２Ｐヘテロ接合マウス由来のｇＤＮＡのシーケンシングにより、大きな欠失と、ＫＲＴ１２−Ｌ１３２Ｐアレルの開裂によるＮＨＥＪの誘導とが裏付けられた。シーケンシングされた１３個のクローンのうち、５個がＮＨＥＪを経たことが判明した（Ｂ）。
【図４】ＴＧＦＢＩ突然変異Ｒ５１４Ｐ（Ａ）、Ｌ５１８Ｒ（Ｂ）、Ｌ５０９Ｒ（Ｃ）、Ｌ５２７Ｒ（Ｄ）のためにデザインされたＳＮＰに誘導されるＰＡＭのガイドＲＮＡを使用した結果を示す図である。ルシフェラーゼ発現を使用して、野生型アレル及び突然変異アレルの発現を評価した。ポジティブコントロール（ｓｇＷＴ）のガイドは、野生型（ＷＴ、青色の棒）アレル及び突然変異型（ＭＵＴ、赤色の棒）アレルの両方を切断するようにデザインされ、上記に示されるように予想通りに両方のアレルを切断した。Ｌ５１８Ｒのために使用されるガイド（ｓｇＭｕｔ）は、最大のアレル特異性と共にＷＴアレルの最小の切断を示す（青色の棒）。ネガティブコントロールのガイド（ｓｇＮＳＣ）は、予想通りにＷＴのＤＮＡもＭＵＴのＤＮＡもどちらも切断しなかった。
【図５】項目Ａ〜項目Ｅは、Ｒ１２４及びＲ５５５のＴＧＦＢＩ突然変異のためにデザインされた突然変異アレル特異的なガイドＲＮＡを使用した結果を示す図である。ルシフェラーゼ発現を使用して、野生型アレル及び突然変異アレルの発現を評価した。該アッセイは、１６マーから２２マーまでの範囲の種々の長さのガイドを用いて実施した。ガイドの長さに加えて、特異性の改善を補助するためのガイドの５’末端への二重のグアニンの付加も評価した。青色の棒は、ＷＴのＴＧＦＢＩ配列を表し、橙色の棒は、突然変異のＴＧＦＢＩ配列を示す。上記突然変異のガイドは、該ガイドの長さに基づいて様々な効率で切断した（図５、項目Ａ〜項目Ｅ）。Ｒ１２４（図５、項目Ａ、項目Ｂ、及び項目Ｃ）に関しては、アッセイにより、アレル特異性の傾向と共に上記突然変異のガイドが突然変異配列を優先的に標的とすることが示される（橙色の棒は青色の棒と比較して更に減少した）。項目Ｆは、Ｒ１２４Ｈ突然変異の２０マーのガイドが、非標的化結合を減らすように操作された強化型Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いて試験された場合の特異性の改善を示している。項目Ｇは、ＤＮＡが開裂されたことを確認するためのＣａｓ９によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂からの断片分析を示す。６種の共通のＴＧＦＢＩ突然変異（例えば、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｑ、Ｒ５５５Ｗ、及びＬ５２７Ｒ）のそれぞれについて、野生型配列及び突然変異配列に関して開裂テンプレートを調製した。野生型配列及び突然変異配列を含むガイドＲＮＡ分子（２０ヌクレオチド及び１８ヌクレオチド）をデザインし合成した。次いで、開裂テンプレートを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体により消化し、断片分析をアガロースゲル上で実施した（図５、項目Ｇ、（ａ）〜（ｆ））。Ｒ１２４Ｃ開裂反応の断片分析（図５、項目Ｇ、（ａ））は、デュアルルシフェラーゼアッセイの結果（図５、項目Ａ）に匹敵する結果を示す。Ｒ１２４Ｈ及びＲ１２４Ｌの両方についての開裂反応の分析（図５、項目Ｇ、（ｂ）及び（ｃ））も、デュアルルシフェラーゼアッセイの結果（図５、項目Ｂ及びＣ）と同様の結果を示し、それらの結果は、２つの大きく異なるアッセイの間で一致している。Ｒ５５５Ｑ及びＲ５５５Ｗの開裂反応の試験（図５、項目Ｇ、（ｄ）及び（ｅ））も、デュアルルシフェラーゼアッセイ（項目５、項目Ｄ及び項目Ｅ）との同等性を示す。Ｌ５２７Ｒについての開裂反応の分析（図５、項目Ｇ、（ｆ））は、該ガイドの長さに基づいて様々な切断効率を示している。
【図６】（Ａ）は、Ｌｕｃ２に特異的であり、かつＬｕｃ２遺伝子の５’領域を標的とするようにデザインされた例示的な一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列（紫色にハイライトして示される）を示す図である。該ガイドをＬｕｃ２遺伝子の５’領域において結合するようにデザインすることで、フレームシフトを起こす欠失を誘導する可能性が高まり、標的ＤＮＡ中に未成熟終止コドンを生成することによりルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）活性がノックアウトされる。（Ｂ）は、このＬｕｃ２を標的とするガイドを、ルシフェラーゼを発現する細胞に添加し、ルシフェラーゼ発現に基づいて遺伝子編集を測定した後に得られた結果を示す図である。幾つかの細胞は処理されておらず（ｕｎＴ）、その他の細胞は、細胞中のＤＮＡに結合しない非特異的なネガティブコントロールのガイドＲＮＡ（ｓｇＮＳＣ）で処理され、そしてまたｓｇＬｕｃ２ＰであるＬｕｃ２に対する試験ガイドで処理された。
【図７】ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスの角膜上皮において、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９遺伝子編集が、標的遺伝子を切断し、その発現を低下させることができ、その結果、該遺伝子から発現されるタンパク質がより少なくなることを裏付ける図である。ルシフェラーゼのヒートマップは、タンパク質発現のレベルを表しており、そこではＬｕｃ２タンパク質に関して、黒色は発現なしを表し、青色は低い発現を表し、そして赤色は高い発現を表す。
【図８】F. Ran et al., Nat. Protoc. 2013, 8(11) 2281-2308に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを示す図である。Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）は、２０ヌクレオチドのガイド配列（青色）及びスキャフォールド（赤色）からなるｓｇＲＮＡによりゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトＥＭＸ１座位が示される）に標的化される。上記ガイド配列は、必須の５’−ＮＧＧ隣接モチーフ（ＰＡＭ、ピンク色）のすぐ上流でＤＮＡ標的（上側の鎖上の青色の棒）と対をなす。Ｃａｓ９は、ＰＡＭの約３塩基対上流（赤色の三角形）でＤＳＢをもたらす。
【図９】８種の細菌種からのＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位及びｓｇＲＮＡの図式を含む、F. Ran et al., Nature 2015, 520(7546):186-91に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを示す図である。スペーサー又は「ガイド」配列は青色で示され、その後にダイレクトリピート（灰色）が続く。予測されるｔｒａｃｒＲＮＡは赤色で示され、制約生成ＲＮＡフォールディングモデルに基づいて折り畳まれている。
【図１０】F. Ran et al., Nature 2015, 520(7546):186-91に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを示す更なる図である。この図は、哺乳動物細胞におけるＳａＣａｓ９のｓｇＲＮＡスキャフォールドの最適化を示している。（Ａ）スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウスのＣＲＩＳＰＲ座位の図。（Ｂ）２１ヌクレオチドのガイド、ｃｒＲＮＡリピート（灰色）、テトラループ（黒色）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（赤色）を有するＳａＣａｓ９のｓｇＲＮＡの図。ｃｒＲＮＡリピートとｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピートとの塩基対形成の番号は、灰色のボックスの上に示されている。ＳａＣａｓ９は、（Ｃ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系統及び（Ｄ）Ｈｅｐａ１−６細胞系統において、様々なリピート：アンチリピート長さで有する標的を開裂する（ｎ＝３、エラーバーは、平均値の標準誤差を示す）。
【図１１】ストレプトコッカス・ピオゲネスのＣａｓ９ヌクレアーゼを使用するｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのための例示的なベクターを示す図である。
【図１２】スタフィロコッカス・アウレウスを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのための例示的なベクターｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：Ｂｓａｌ−ｓｇＲＮＡを示す図である。
【図１３】ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｐｙ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓａｕ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼの例示的なｓｇＲＮＡ配列、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】Ｃａｓ９開裂を導く１対のｓｇＲＮＡと密集しているメースマン角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ）関連ＫＲＴ１２突然変異のＨＤＲ媒介型修復のための例示的デザインを示す図である。図１４に示される修復オリゴ（ｓｓＯＤＮ）は、Ｌ１３２Ｐのためのものであるが、該クラスター中のその他の突然変異のためにも働くこととなる。突然変異及び修復の部位は、アスタリスクで示されている。２つの矢じりは、修復されたアレル中に同義置換を導入するが、ＰＡＭ部位を再コード化するためＣａｓ９による更なる切断は阻止されることとなる修復オリゴ中のヌクレオチド変化を示す。
【図１５】新規ＰＡＭを生成する１０％より大きなＭＡＦを有するＴＧＦＢＩにおける全てのＳＮＰを示す図である。番号付けされたボックスは、ＴＧＦＢＩ内のエキソンを示す。多数の病因性突然変異が見られるＴＧＦＢＩ中のホットスポットは、赤色のボックスにより示される。青色の矢印は、新規ＰＡＭを生成するＳＮＰの位置を示す。新規ＰＡＭはそれぞれの矢印の方向に示されており、その際、必要な変異体は赤色でハイライトされている。
【図１６】隣接ＳＮＰによる新規ＰＡＭを利用するｓｇＲＮＡが第１のイントロン中にデザインされている例示的な実施形態を示す図である。さらに、野生型アレル及び突然変異アレルの両方に共通のｓｇＲＮＡは、第２のイントロン中にデザインされている。野生型アレルにおいて、一本鎖ｓｇＲＮＡは、第２のイントロン中にＮＨＥＪを引き起こし、それは機能的効果を有しない。しかしながら、突然変異アレルにおいて、隣接ＳＮＰに誘導されるＰＡＭを利用するｓｇＲＮＡ及び共通のｓｇＲＮＡは、突然変異アレルのノックアウトをもたらす大きな欠失をもたらす。
【図１７】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でヌクレオフェクションされたＲ１２４Ｈのアベリノ角膜ジストロフィー突然変異を有する患者から得られた例示的なリンパ球細胞系統を使用することによる実験結果を示す図である。そのガイドは、ｒｓ３８０５７００  ＳＮＰにより生成される新規ＰＡＭを利用した。このＰＡＭは、その患者のＲ１２４Ｈ突然変異と同じ染色体上に存在するが、野生型染色体上には存在しない。セルソーティング後に、単クローンを単離して、インデルが生じたかどうかを調べた。６個の単クローンは、未編集の野生型染色体を有することから、このガイドの厳密なアレル特異性が指摘される。上記単離されたクローンのうち４個は突然変異染色体を有し、これらのうちの３個が編集を示すことから、突然変異染色体の７５％の編集効率が指摘される。３個のクローンのうち２個がフレームシフトを起こすインデルを示した。したがって、編集の少なくとも６６．６６％が遺伝子破壊を誘導した。
【図１８】例示的な標的部位、ガイド配列、及びそれらの相補性の配列を示す図である。
【図１９】角膜ジストロフィーと関連するＳＮＰ部位を含む例示的な標的配列を示す図である。
【図２０】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２１】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２２】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２３】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２４】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２５】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２６】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２７】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２８】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図２９】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図３０】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図３１】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図３２】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図３３】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図３４】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【図３５】ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域中の例示的な共通のガイドを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
全体を通して使用されるように、範囲は、その範囲内にあるあらゆる値を記載するための簡略記載として使用される。範囲内の任意の値を、その範囲の端点として選択することができる。さらに、本明細書で引用された全ての参考文献は、全ての目的について引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。本開示における定義と引用文献の定義とが対立する場合には、本開示を優先する。
【００２１】
１つの態様において、本開示は、角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療するための、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためにデザインされたｓｇＲＮＡを含む一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に関する。上記ｓｇＲＮＡは、人工的なｓｇＲＮＡ、人造のｓｇＲＮＡ、合成のｓｇＲＮＡ、及び／又は天然に存在しないｓｇＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態において、上記ｓｇＲＮＡは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と、（ｉｉ）「ｓｇＲＮＡスキャフォールド」とも呼ばれ得るトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含む。幾つかの実施形態において、上記ｃｒＲＮＡ配列及び上記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである。本明細書で使用される場合に「ｓｇＲＮＡ」という用語は、（ｉ）ガイド配列（ｃｒＲＮＡ配列）と、（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ動員配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む一本鎖ガイドＲＮＡを指し得る。例示的なガイド配列には、図１８〜図１９に開示される配列が含まれる。上記ｃｒＲＮＡ配列は、関心が持たれた遺伝子中の領域に対して相同であり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を導き得る配列であり得る。上記ｃｒＲＮＡ配列及び上記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである。上記ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、又はプロモーター下でｓｇＲＮＡをコードする配列（ｓｇＲＮＡ遺伝子）を有するプラスミドによる形質転換により送達され得る。
【００２２】
幾つかの実施形態において、上記ｓｇＲＮＡ又は上記ｃｒＲＮＡは、標的配列（例えば、標的ゲノム配列）の少なくとも一部分にハイブリダイズし、該ｃｒＲＮＡは、該標的配列に相補性の配列を有し得る。幾つかの実施形態において、本明細書における標的配列は、本明細書に記載されるＰＡＭ部位に隣接する第２の標的配列にハイブリダイズする第１の標的配列である。幾つかの実施形態において、上記ｓｇＲＮＡ又は上記ｃｒＲＮＡは、上記第１の標的配列又は上記第２の標的配列を含み得る。「相補性」は、１つの核酸がもう１つの核酸配列と慣例的なワトソン−クリック型又はその他の慣例的でない型のいずれかにより１つ以上の水素結合を形成する能力を指す。相補性のパーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る１つの核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、５０％相補性、６０％相補性、７０％相補性、８０％相補性、９０％相補性、及び１００％相補性である）。「完全に相補性」とは、１つの核酸配列の連続した残基の全てが、第２の核酸配列中の同じ数の連続的な残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「本質的に相補性」は、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％である相補性の度合いを指すか、又は２個の核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを指す。本明細書で使用される場合に、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に相補性を有する核酸が、該標的配列と優先的にハイブリダイズし、非標的配列には本質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般的に配列に依存しており、数多くの要因に応じて変動する。一般的に、配列が長くなるほど、該配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.に詳細に記載されている。「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基の間の水素結合を介して安定化されている複合体を形成する反応を指す。上記水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、又は任意のその他の配列特異的な様式において生じ得る。上記複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、一本鎖の自己ハイブリダイズする鎖、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範な過程、例えばＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの開裂における１つの工程を構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることが可能な配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。幾つかの実施形態において、上記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号（１０＋４ｎ）（ｎは、０から２２１までの整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。本明細書で使用される場合に「約」という用語は、示された参照値と類似した値の範囲を指し得る。或る特定の実施形態においては「約」という用語は、示された参照値の１５パーセント、１０パーセント、９パーセント、８パーセント、７パーセント、６パーセント、５パーセント、４パーセント、３パーセント、２パーセント、１パーセント以下の範囲内に含まれる値の範囲を指す。幾つかの実施形態において、上記ｃｒＲＮＡ配列は、配列番号（１０＋４ｎ）（ｎは、０から２２１までの整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列から１個、２個、３個、４個、又は５個のヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は置換を有するヌクレオチド配列を有する。そのような付加、欠失、及び／又は置換は、上記ヌクレオチド配列の３’末端又は５’末端に存在し得る。更なる実施形態において、上記ｃｒＲＮＡ又は上記ガイド配列は、約１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、又は２４ヌクレオチド長である。更なる実施形態において、上記ｃｒＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するｃｒＲＮＡ配列を除く。なおも更なる実施形態において、上記ｃｒＲＮＡは、ケラチン１２タンパク質中にＬ１３２Ｐ突然変異をもたらすＳＮＰを含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするｃｒＲＮＡ配列を除く。なおも更なる実施形態において、上記ｃｒＲＮＡは、ケラチン１２タンパク質中に１つの突然変異をもたらすＳＮＰを含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするｃｒＲＮＡ配列を除く。
【００２３】
幾つかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を活性化して、ｃｒＲＮＡ配列の結合のためにｄｓＤＮＡを開放するヘアピン構造を提供する。上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、パリンドロームリピートに相補性の配列を有し得る。該ｔｒａｃｒＲＮＡが短いパリンドロームリピートにハイブリダイズする場合に、それは、細菌の二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅ  ＩＩＩによるプロセシングを惹起し得る。更なる実施形態において、上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（SPacer Interspersed Direct Repeats））を有し、特定の細菌種に通常特異的であるＤＮＡ座位のファミリーを構成し得る。ＣＲＩＳＰＲ座位は、Ｅ．コリにおいて認識された異なるクラスの散在型の短配列リピート（interspersed short sequence repeats）（ＳＳＲ）（Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]、及びNakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]）、及び関連遺伝子を含む。同様の散在型のＳＳＲは、ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferax mediterranei）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、アナバエナ（Anabaena）、及びマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）において同定された（Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]、Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]、Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]、及びMojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ座位は、リピートの構造の点でその他のＳＳＲとは異なり得て、それらは、短い規則正しい間隔を持つリピート（short regularly spaced repeats）（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]、及びMojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]）。或る特定の実施形態において、上記リピートは、本質的に一定の長さを有する固有の介在配列により規則正しい間隔を持つクラスターで存在する短いエレメントである（上記のMojica et al., [2000]）。上記リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型のリピートの数及びスペーサー領域の配列は一般的に株ごとに異なる（van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]）。上記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためのｔｒａｃｒＲＮＡに関する任意の配列であり得る。更なる実施形態において、上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号２及び配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。上記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためのｔｒａｃｒＲＮＡのための任意の配列であり得る。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、並びにそれらの製造方法及び使用は、米国特許第８６９７３５９号、米国特許出願公開第２０１５０２３２８８２号、同第２０１５０２０３８７２号、同第２０１５０１８４１３９号、同第２０１５００７９６８１号、同第２０１５００７３０４１号、同第２０１５００５６７０５号、同第２０１５００３１１３４号、同第２０１５００２０２２３号、同第２０１４０３５７５３０号、同第２０１４０３３５６２０号、同第２０１４０３１０８３０号��同第２０１４０２７３２３４号、同第２０１４０２７３２３２号、同第２０１４０２７３２３１号、同第２０１４０２５６０４６号、同第２０１４０２４８７０２号、同第２０１４０２４２７００号、同第２０１４０２４２６９９号、同第２０１４０２４２６６４号、同第２０１４０２３４９７２号、同第２０１４０２２７７８７号、同第２０１４０１８９８９６号、同第２０１４０１８６９５８号、同第２０１４０１８６９１９号、同第２０１４０１８６８４３号、同第２０１４０１７９７７０号、同第２０１４０１７９００６号、同第２０１４０１７０７５３号、同第２０１４００９３９１３号、同第２０１４００８０２１６号、及び国際公開第２０１６０４９０２４号に開示されており、それら全ては、引用することによりその全体が本出願の一部をなす。
【００２４】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるｃｒＲＮＡ配列を含むプライマーを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためのベクター中に挿入されるべきオリゴヌクレオチド対に関する。該プライマーは、ｃｒＲＮＡ配列に隣接する２個、３個、４個、５個、又は６個のヌクレオチドのロケーター配列を更に含み得て、上記ロケーター配列は、天然にはｃｒＲＮＡ配列に隣接して存在しない。幾つかの実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためのｃｒＲＮＡをコードするためのベクター、例えばｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）及びｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：Ｂｓａｌ−ｓｇＲＮＡ中に導入されるべき、配列番号（１０＋４ｎ）（ｎは、０から２２１までの整数である）のヌクレオチド配列を含むプライマーを含むオリゴヌクレオチド対に関する。更なる実施形態において、上記オリゴヌクレオチド対は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列を有する第１のプライマーと、配列番号Ｙのヌクレオチド配列を有する第２のプライマーとを含み、その際、Ｘは、１１＋４ｎであり、Ｙは、１２＋４ｎであり、かつｎは、１から２２１までの整数である。幾つかの実施形態において、上記ｃｒＲＮＡは、配列番号５８、配列番号５４、配列番号５０、配列番号４２、配列番号９４、配列番号９０、配列番号８６、配列番号８２、配列番号７８、配列番号７４、配列番号７０、配列番号１１４、配列番号１００、配列番号１０６、配列番号９８、配列番号１７８、配列番号１７４、配列番号１７０、配列番号１６６、配列番号１６２、配列番号１５８、配列番号１４６、配列番号１４２、配列番号１３８、配列番号１３４、配列番号１３０、及び配列番号１２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子及びｓｇＲＮＡを含む少なくとも１つのベクターを含む、操作されたクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムに関する。「天然に存在しない」又は「操作された」という用語は、区別なく使用され、人の手の介入を示す。該用語は、核酸分子又はポリペプチドに適用する場合には、該核酸分子又は該ポリペプチドが、天然では本来関連があり、自然界に見られる少なくとも１種のその他の成分を少なくとも本質的に含まないことを意味する。幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び上記ｓｇＲＮＡは、天然には一緒に存在しないものである。
【００２６】
一般的に「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性の部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（「ダイレクトリピート」及び内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｔｒａｃｒＲＮＡのプロセシングされた部分的ダイレクトリピート）、ガイド配列（本明細書では「ｃｒＲＮＡ」とも、又は内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおける「スペーサー」とも呼ばれる）、及び／又はその他の配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関連する又は該活性を導く転写物及びその他のエレメント並びにＣＲＩＳＰＲ座位からの転写物をひとまとめにして指す。上記のように、ｓｇＲＮＡは、少なくともｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの組み合わせである。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムから誘導される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス又はスタフィロコッカス・アウレウスから誘導される。一般的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおいてプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成において「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列であって、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列を指し得るか、又は図８に示されるように「標的配列」は、ガイド配列が有するＰＡＭ部位に隣接する、配列を指し得る。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在するものとする。本開示においては「標的部位」は、標的配列及びその相補性配列の両方を、例えば二本鎖ヌクレオチドで含む標的配列の部位を指す。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｓｇＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡにハイブリダイズする第１の標的配列、及び／又はＰＡＭの５’末端に隣接する第２の標的配列を意味し得る。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。幾つかの実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質中に位置している。幾つかの実施形態において、上記標的配列は、真核細胞の細胞小器官、例えばミトコンドリア又は葉緑体内に存在し得る。
【００２７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼは既知である。例えば、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のホモログ又はオルソログであり得る。改善された特異性を示す突然変異Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用することもできる（例えば、Ann Ran et al. Cell 154(6) 1380-89 (2013)を参照のこと、これは全ての目的について、特に標的核酸に関する改善された特異性を有する突然変異Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）。核酸操作試薬は、失活されたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）も含み得る。核酸エレメントに結合する失活されたＣａｓ９は単独で、立体障害性ＲＮＡポリメラーゼ機構により転写を抑制し得る。さらに、失活されたＣａｓは、標的核酸に不可逆的な突然変異を導入することなく標的部位での遺伝子発現に影響を及ぼすその他のタンパク質（例えば、転写リプレッサー、アクチベーター、及び動員ドメイン）のためのホーミング装置として使用され得る。例えば、ｄＣａｓ９は、ＫＲＡＢ又はＳＩＤエフェクター等の転写リプレッサードメインに融合されて、標的部位でのエピジェネティックサイレンシングを促進することができる。Ｃａｓ９はまた、ＶＰ１６／ＶＰ６４又はｐ６４活性化ドメインへの融合により合成的転写アクチベーターへと変換さえ得る。幾つかの場合には、強化型Ｃａｓ９（ｅＣａ９）ヌクレアーゼと呼ばれる突然変異のＩＩ型ヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼの代わりに使用される。強化型Ｃａｓ９は、非標的結合を弱めることにより特異性を改善させるように適切に操作されている。これは、非標的鎖の溝内の正に荷電した残基を中和することにより実現されている（Slaymaker et al., 2016）。
【００２８】
幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列の位置で、例えば標的配列内で、及び／又は標的配列の相補体内で一方の鎖又は両方の鎖の開裂を導く。幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列の最初のヌクレオチド又は最後のヌクレオチドから約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個以上の塩基対内で一方の鎖又は両方の鎖の開裂を導く。
【００２９】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより導かれたＤＮＡ開裂の後に、２つの方式のＤＮＡ修復、つまり相同配列指向性修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が細胞に利用可能である。突然変異部位の近くでのＣａｓ９開裂の後のＨＤＲによる突然変異の継ぎ目のない修正は魅力的であるが、この方法の効率は、該方法が幹細胞又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ改変のためだけに使用することができるにすぎず、修復が行われた細胞を選択し、これらの改変された細胞のみを純化する追加の工程を伴うことを意味する。ＨＤＲは、細胞中で高い頻度では生じない。幸いなことに、ＮＨＥＪは、はるかに高い効率で生じ、角膜ジストロフィーの多くに記載されるドミナントネガティブ変異のために適切であり得る。更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスに由来する。なおも更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（Ｓｐｙ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・イニアエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・フォカエ（Streptococcus phocae）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Streptococcus pseudoporcinus）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Streptococcus pseudoporcinus）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Streptococcus infantarius）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・カバリ（Streptococcus caballi）、ストレプトコッカス・エクイヌス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス属種ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ（Streptococcus sp. oral taxon）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ガロリティクス（Streptococcus gallolyticus）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・パスツーリアヌス（Streptococcus pasteurianus）、又はそれらの変異体に由来する。そのような変異体には、Ｄ１０Ａニッカーゼ、Kleinstiver et al, 2016 Nature, 529,490-495に記載されるＳｐｙ  Ｃａｓ９−ＨＦ１、又はSlaymaker et al., 2016 Science, 351 (6268), 84-88に記載されるＳｐｙ  ｅＣａｓ９が含まれ得る。更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、スタフィロコッカスに由来する。なおも更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、Ｓ．シミアエ（S. simiae）、Ｓ．アウリクラリス（S. auricularis）、Ｓ．カルノサス（S. carnosus）、Ｓ．コンディメンティ（S. condimenti）、Ｓ．マッシリエンシス（S. massiliensis）、Ｓ．ピスシフェルメンタンス（S. piscifermentans）、Ｓ．シムランス（S. simulans）、Ｓ．カピティス（S. capitis）、Ｓ．カプラエ（S. caprae）、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis）、Ｓ．サッカロリティクス（S. saccharolyticus）、Ｓ．デブリエセイ（S. devriesei）、Ｓ．ヘモリティクス（S. haemolyticus）、Ｓ．ホミニス（S. hominis）、Ｓ．アグネティス（S. agnetis）、Ｓ．クロモゲネス（S. chromogenes）、Ｓ．フェリス（S. felis）、Ｓ．デルフィニ（S. delphini）、Ｓ．ハイカス（S. hyicus）、Ｓ．インテルメディウス（S. intermedius）、Ｓ．ルトラエ（S. lutrae）、Ｓ．ミクロティ（S. microti）、Ｓ．ムスカエ（S. muscae）、Ｓ．シュードインターメディウス（S. pseudintermedius）、Ｓ．ロストリ（S. rostri）、Ｓ．シュライフェリ（S. schleiferi）、Ｓ．ルグドゥネンシス（S. lugdunensis）、Ｓ．アーレッタエ（S. arlettae）、Ｓ．コーニイ（S. cohnii）、Ｓ．エクオルム（S. equorum）、Ｓ．ガリナルム（S. gallinarum）、Ｓ．クローシイ（S. kloosii）、Ｓ．レエイ（S. leei）、Ｓ．ネパレンシス（S. nepalensis）、Ｓ．サプロフィティクス（S. saprophyticus）、Ｓ．スクシヌス（S. succinus）、Ｓ．キシロサス（S. xylosus）、Ｓ．フレウレティイ（S. fleurettii）、Ｓ．レンツス（S. lentus）、Ｓ．シウリ（S. sciuri）、Ｓ．ステパノヴィチイ（S. stepanovicii）、Ｓ．ヴィツリヌス（S. vitulinus）、Ｓ．シムランス（S. simulans）、Ｓ．パスツーリ（S. pasteuri）、Ｓ．ワルネリ（S. warneri）、又はそれらの変異体に由来する。
【００３０】
更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを除く。
【００３１】
更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号４又は配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子は、配列番号３又は配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼの特異性を改善する１つ以上の突然変異を有する強化型Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。更なる実施形態において、上記強化型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼ中のＨＮＨ、ＲｕｖＣ、及びＰＡＭ相互作用ドメインの間に位置する正に荷電した溝を中和する１つ以上の突然変異を有するストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９ヌクレアーゼに由来するものである。なおも更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、（ｉ）Ｋ８５５Ａ、（ｉｉ）Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａ、並びに（ｉｉｉ）Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有するストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９ヌクレアーゼの突然変異アミノ酸配列（例えば、配列番号４）と少なくとも約６０％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なおも更なる実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子は、上記突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する方法は、ＮＨＥＪによりＤＮＡ配列を変化させる。更なる実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム又はベクターは、修復ヌクレオチド分子を含まない。
【００３４】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、例えば図１４に示されるようにＨＤＲによりＤＮＡ配列を変化させる。更なる実施形態において、このＨＤＲアプローチは、ＭＥＣＤにおける遺伝子治療のためのｅｘ  ｖｉｖｏアプローチにおいて使用され得る。更なる実施形態において、このアプローチは、アレル特異的でなくてもよく、ＫＲＴ１２コドン１２９、１３０、１３２、１３３、及び１３５における突然変異を修復するために使用され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム又はベクターは、修復ヌクレオチド分子を更に含み得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより開裂される標的ポリヌクレオチドは、外因性のテンプレートポリヌクレオチドである修復ヌクレオチド分子との相同組み換えにより修復され得る。この修復は、上記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらし得る。上記修復ヌクレオチド分子は、ＨＤＲ経路によるＩＩ型のヌクレアーゼ誘導型ＤＳＢの修復に際して、特異的アレル（例えば、野生型アレル）を、複数の幹細胞の１つ以上の細胞のゲノム中に導入する。幾つかの実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。その他の実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、プラスミドベクターとして細胞中に導入される。幾つかの実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、２５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド〜３５ヌクレオチド、３５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド〜４５ヌクレオチド、４５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド〜５５ヌクレオチド、５５ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド〜６５ヌクレオチド、６５ヌクレオチド〜７０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド〜７５ヌクレオチド、７５ヌクレオチド〜８０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド〜８５ヌクレオチド、８５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド〜９５ヌクレオチド、９５ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜１０５ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド〜１１０ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド〜１１５ヌクレオチド、１１５ヌクレオチド〜１２０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド〜１２５ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド〜１３０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド〜１３５ヌクレオチド、１３５ヌクレオチド〜１４０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド〜１４５ヌクレオチド、１４５ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド〜１５５ヌクレオチド、１５５ヌクレオチド〜１６０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド〜１６５ヌクレオチド、１６５ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド〜１７５ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド〜１８０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド〜１８５ヌクレオチド、１８５ヌクレオチド〜１９０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド〜１９５ヌクレオチド、又は１９５ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドの長さである。幾つかの実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、２００ヌクレオチド〜３００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド〜４００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド〜６００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド〜７００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド〜８００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド〜９００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さである。その他の実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、１０００ヌクレオチド〜２０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド〜３０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド〜４０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド〜５０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド〜６０００ヌクレオチド、６０００ヌクレオチド〜７０００ヌクレオチド、７０００ヌクレオチド〜８０００ヌクレオチド、８０００ヌクレオチド〜９０００ヌクレオチド、又は９０００ヌクレオチド〜１００００ヌクレオチドの長さである。幾つかの実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、本明細書に記載される角膜ジストロフィーと関連する突然変異を含む幹細胞ゲノム（すなわち「角膜ジストロフィー標的核酸」）の領域でＨＤＲ経路により相同組み換えを受けることができる。或る特定の実施形態において、上記修復核酸は、ＴＧＦＢＩ遺伝子、ＫＲＴ３遺伝子、ＫＲＴ１２遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、及びＵＢＩＡＤ１遺伝子内の標的核酸と相同組み換えすることが可能である。特定の実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、本明細書に記載される突然変異アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ）をコードするＫＲＴ１２遺伝子中の核酸と相同組み換えすることが可能である。幾つかの実施形態において、上記ベクターは、多数の修復ヌクレオチド分子を含む。
【００３６】
上記修復ヌクレオチド分子は、特定の突然変異を含む本明細書に記載される細胞の同定及びソーティングのための標識を更に含み得る。上記修復ヌクレオチド分子と共に含まれ得る例示的な標識には、蛍光標識及び長さ又は配列により特定可能な核酸バーコードが含まれる。
【００３７】
更なる実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム又はベクターは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。更なる実施形態において、上記ｓｇＲＮＡ及び上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、同じベクター上、又は異なるベクター上に含まれる。
【００３８】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を変化させる方法であって、本明細書に記載される操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、標的配列を有すると共に上記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み発現する細胞中に導入することを含む、方法に関する。上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、任意の適切な方法を使用して細胞中に導入され得る。幾つかの実施形態において、上記導入は、培養物中の細胞に又は宿主生物中に本明細書に記載される操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み得る。
【００３９】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入するための例示的な方法には、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベースの方法が含まれる。幾つかの場合には、１種以上の細胞内取り込み試薬は、トランスフェクション試薬である。トランスフェクション試薬には、例えばポリマーベース（例えば、ＤＥＡＥデキストラン）のトランスフェクション試薬、及びカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション試薬が含まれる。エレクトロポレーション法はまた、核酸操作試薬の取り込みを促進するために使用され得る。外部場を印加することにより、細胞において膜内外電位差の変化が引き起こされ、膜内外電位差の正味の値（印加された電位差と静止電位差との合計）が閾値よりも大きい場合に、膜内に一過的な透過構造が生成されて、エレクトロポレーションが達成される（例えば、Gehl et al., Acta Physiol. Scand. 177:437-447 (2003)を参照のこと）。上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはまた、ウイルス形質導入を通じて細胞中に送達される。適切なウイルス送達システムには、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達システム、レトロウイルス送達システム、及びレンチウイルス送達システムが含まれる。そのようなウイルス送達システムは、細胞がトランスフェクションされにくい場合に有益である。ウイルス媒介性送達システムを使用する方法は、核酸操作試薬をコードするウイルスベクターを準備する工程と、該ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする工程とを更に含み得る。核酸試薬のその他の送達方法には、限定されるものではないが、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、パーティクルガン（biolistics）、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工的ビリオン、及び作用物質により向上された核酸の取り込みが含まれる（Neiwoehner et al., Nucleic Acids Res. 42:1341-1353 (2014)、並びに米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号も参照のこと、これらは全ての目的について、特に試薬送達システムに関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）。幾つかの実施形態において、上記導入は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写物）、裸の核酸、及びリポソーム等の送達運搬体と複合体化された核酸を含む非ウイルスベクター送達システムにより行われる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与又はｅｘ  ｖｉｖｏ投与）、又は標的組織（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）に対するものであり得る。
【００４０】
核酸変化イベントを経た細胞（すなわち「変化された」細胞）は、任意の適切な方法を使用して単離され得る。幾つかの実施形態において、上記修復ヌクレオチド分子は、選択マーカーをコードする核酸を更に含む。これらの実施形態において、修復ヌクレオチド分子と宿主幹細胞ゲノムとの好結果の相同組み換えは、選択マーカーの組み込みも伴う。したがって、そのような実施形態において、変化された細胞の選択のためにポジティブマーカーが使用される。幾つかの実施形態において、上記選択マーカーは、ともすれば細胞を死滅させることとなる薬物の存在下で、該変化された細胞が生存することを可能にする。そのような選択マーカーには、限定されるものではないが、ネオマイシン、ピューロマイシン、又はハイグロマイシンＢへの耐性を授けるポジティブ選択マーカーが含まれる。さらに、選択マーカーは、同型の細胞の集団であって、その幾つかが該選択マーカーを含まない集団の中から変化された細胞を視覚的に同定することを可能にする製品であり得る。そのような選択マーカーの例には、限定されるものではないが、蛍光により可視化され得る緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、基質であるルシフェリンに曝されたときに発光により可視化され得るルシフェラーゼ遺伝子、及び基質と接触されたときに特徴的な色を生ずるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）が含まれる。そのような選択マーカーは、当該技術分野でよく知られており、これらのマーカーをコードする核酸配列は市販されている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1989を参照のこと）。蛍光により可視化され得る選択マーカーを使用する方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術を使用して更にソーティングされ得る。単離された操作された細胞を使用して、移植のための細胞系統を樹立することができる。単離された変化された細胞を任意の適切な方法を使用して培養することで、安定な細胞系統を生成することができる。
【００４１】
幾つかの実施形態において、上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、（ａ）本明細書に記載される標的配列とハイブリダイズするｓｇＲＮＡに作動的に連結された第１の調節エレメントと、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子に作動的に連結された第２の調節エレメントとを含み、その際、構成要素（ａ）及び構成要素（ｂ）は、該システムの同じベクター又は異なるベクター上に位置しており、該ｓｇＲＮＡは、上記標的配列を標的とし、かつ上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、上記ＤＮＡ分子を開裂する。上記標的配列は、ＰＡＭの５’末端に隣接する１６個〜２５個のヌクレオチドに相補性のヌクレオチド配列であり得る。本明細書における「隣接」しているとは、参照部位の２ヌクレオチド又は３ヌクレオチドの範囲内であることを意味し、それは、直接隣接したヌクレオチド配列の間に介在ヌクレオチドが存在しないことを意味する「直接隣接」を含み、それらの直接隣接したヌクレオチド配列は互いに１ヌクレオチドの範囲内である。更なる実施形態において、上記細胞は、真核細胞、又は哺乳動物細胞若しくはヒト細胞であり、かつ上記調節エレメントは、真核性レギュレーターである。更なる実施形態において、上記細胞は、本明細書に記載される幹細胞である。幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００４２】
幾つかの実施形態において、上記第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。幾つかの実施形態において、上記第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びその他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えばポリアデニル化シグナル、及びポリＵ配列）を含むと解釈される。そのような調節エレメントは、例えばGoeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を導く調節エレメント、及び或る特定の宿主細胞だけでヌクレオチド配列の発現を導く調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の対象組織、例えば筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現に向けることができる。調節エレメントはまた、時間依存的な様式で、例えば細胞周期依存的又は発生段階依存的な様式で発現を導くこともでき、上記様式は、組織特異的又は細胞型特異的であってもそうでなくてもよい。幾つかの実施形態において、ベクターは、１個以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１個、２個、３個、４個、５個以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、１個以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１個、２個、３個、４個、５個以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１個以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１個、２個、３個、４個、５個以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はそれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例には、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが含まれる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例には、限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意に、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意に、ＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照のこと）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが含まれる。また「調節エレメント」という用語に含まれるのは、エンハンサーエレメント、例えばＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988）、ＳＶ４０エンハンサー、及びウサギβ−グロブリンのエキソン２とエキソン３との間のイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981）である。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本明細書に示されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、時間依存的又は細胞型依存的な様式で発現に最適化されたＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導可能であり得る。第１の調節エレメントは、限定されるものではないが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メチオニン誘導性プロモーター（例えば、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター）、及びガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、及びＧＡＬ１０プロモーター）を含むＣａｓ９ヌクレアーゼに結合され得る誘導性プロモーターであり得る。その他の適切なプロモーターには、ＡＤＨ１及びＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（グルコース中で抑制され、グルコースが排出されてエタノールが作られたときに誘導される）、ＣＵＰ１メタロチオネインプロモーター（Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋の存在下で誘導される）、ＰＨＯ５プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、及びＡＯＸ１プロモーターが含まれる。
【００４４】
当業者によれば、発現ベクターのデザインは、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望の発現のレベル等のような要因に依存し得ると理解されるであろう。ベクターを宿主細胞中に導入することにより、本明細書に記載される核酸によりコードされる転写物、融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチド（例えば、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、その突然変異体形、その融合タンパク質等）が産生され得る。
【００４５】
「ベクター」という用語は、結合された別の核酸を輸送することを可能にする核酸分子を指す。ベクターには、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖である核酸分子、１つ以上の開放端を有する、開放端を有しない（例えば、環状）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子、及び当該技術分野で既知のその他の多様なポリヌクレオチドが含まれる。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、それは、更なるＤＮＡセグメントが、例えば標準的な分子クローニング技術により挿入され得る環状の二本鎖ＤＮＡ環を指す。ベクターのもう１つの種類はウイルスベクターであり、その際、ウイルス由来のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列はウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞中へのトランスフェクションのためにウイルスにより保有されるポリヌクレオチドを含む。或る特定のベクターは、導入される宿主細胞中で自己複製が可能である（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、或る特定のベクターは、作動的に連結される遺伝子の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組み換えＤＮＡ技術において利用される通常の発現ベクターは、しばしばプラスミドの形で存在する。組み換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞中での該核酸の発現のために適した形で含み得る、つまり、該組み換え発現ベクターは、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択され得る、すなわち発現されるべき核酸配列に作動的に連結されている１つ以上の調節エレメントを含む。組み換え発現ベクターの範囲内で「作動的に連結される」は、対象ヌクレオチド配列が１つ以上の調節エレメントへと（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおける、又は該ベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞における）、該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で連結されていることを意味すると解釈される。有利なベクターには、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのようなベクターの種類は、特定の種類の細胞を標的とするように選択することもできる。
【００４６】
別の態様において、本開示は、被験体における遺伝子突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）と関連する疾患を予防、改善、又は治療する方法であって、上記被験体の遺伝子産物の発現を上記の方法により変化させることを含み、上記ＤＮＡ分子が、突然変異配列又はＳＮＰ突然変異配列を含む、方法に関する。
【００４７】
別の態様において、本開示は、被験体における遺伝子突然変異又はＳＮＰと関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法に関する。該方法で治療され得る被験体には、限定されるものではないが、哺乳動物被験体、例えばマウス、ラット、イヌ、ヒヒ、ブタ、又はヒトが含まれる。幾つかの実施形態において、該被験体はヒトである。該方法は、少なくとも１年、２年、３年、５年、１０年、１５年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、又は１００年の年齢の被験体を治療するために使用され得る。幾つかの実施形態において、該被験体は、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの角膜ジストロフィーのために処置される。例えば、単独又は多重のｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡが、単一又は多重の角膜ジストロフィーと関連する複数の突然変異部位若しくはＳＮＰ部位で、又は祖先型の突然変異部位若しくはＳＮＰ部位でヌクレオチドを変化させるようにデザインされ得る。
【００４８】
本明細書で使用される場合に「角膜ジストロフィー」は、眼の外層（角膜）中の遺伝病の群のいずれか１つを指す。例えば、角膜ジストロフィーは、角膜中での物質の両眼の異常沈着により特徴付けられ得る。角膜ジストロフィーには、限定されるものではないが、角膜ジストロフィーの以下の４つのＩＣ３Ｄカテゴリー（例えば、Weiss et al., Cornea 34(2): 117-59 (2015)を参照のこと）：上皮及び上皮下ジストロフィー、上皮−実質ＴＧＦβＩジストロフィー、実質ジストロフィー、並びに内皮ジストロフィーが含まれる。幾つかの実施形態において、上記角膜ジストロフィーは、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、メースマン角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ）、ティール−ベーンケ角膜ジストロフィー（ＴＢＣＤ）、格子状角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、顆粒状角膜ジストロフィー（ＧＣＤ）、及びシュナイダー角膜ジストロフィー（ＳＣＤ）からなる群から選択される。更なる実施形態において、本明細書における角膜ジストロフィーは、ＭＥＣＤを除く。
【００４９】
更なる実施形態において、上記角膜ジストロフィーは、ＳＮＰを含む１つ以上の突然変異により引き起こされ、上記ＳＮＰは、トランスフォーミング成長因子β誘導（ＴＧＦＢＩ）、ケラチン３（ＫＲＴ３）、ケラチン１２（ＫＲＴ１２）、ＧＳＮ、及びＵｂｉＡプレニルトランスフェラーゼドメイン含有タンパク質１（ＵＢＩＡＤ１）からなる群から選択される遺伝子中に位置している。更なる実施形態において、上記突然変異部位又は上記ＳＮＰ部位は、本明細書に示される突然変異タンパク質中の突然変異アミノ酸のコード化をもたらす。更なる実施形態において、上記突然変異部位又は上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、（ｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のＴＧＦＢＩにおけるＬｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌに相当する突然変異を含む突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質、（ｉｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｐ１２０３５又はＮＰ＿４７６４２９．２のケラチン３タンパク質におけるＧｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓに相当する突然変異を含む突然変異ＫＲＴ３タンパク質、（ｉｉｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９９４５６．１又はＮＰ＿０００２１４．１のＫＲＴ１２におけるＭｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａｌ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／���はＬｅｕ４３３Ａｒｇを有する突然変異ＫＲＴ１２タンパク質、（ｉｖ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｐ０６３９６のＧＳＮにおけるＡｓｐ２１４Ｔｙｒを有する突然変異ＧＳＮタンパク質、並びに（ｖ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｚ９のＵＢＩＡＤ１におけるＡｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎに相当する突然変異を含む突然変異ＵＢＩＡＤ１タンパク質からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする。例えば、上記突然変異部位又は上記ＳＮＰ部位を含む突然変異配列は、タンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のアミノ酸位置５０９に相当するアミノ酸位置でＬｅｕをＡｒｇで置き換えることにより突然変異された突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質の少なくとも一部分をコードする。この場合に、上記突然変異部位又は上記ＳＮＰ部位での突然変異は、タンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のアミノ酸位置５０９に相当するアミノ酸位置での突然変異アミノ酸のコード化の原因であり得る。本明細書で使用される場合に、ヒトタンパク質における特定の突然変異「に相当する」突然変異は、ヒトタンパク質の特定の突然変異の相応の部位に存在する異なる種における突然変異を含み得る。また本明細書で使用される場合に、突然変異タンパク質が、例えばＬｅｕ５０９Ａｒｇの特定の突然変異を含むと記載される場合に、そのような突然変異タンパク質は、関連のヒトタンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のＴＧＦＢＩタンパク質における特定の突然変異に相当する突然変異部位に存在する任意の突然変異を含み得る。
【００５０】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される突然変異は、ＫＲＴ１２タンパク質におけるあらゆる突然変異を除く。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される突然変異は、例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９９４５６．１のＫＲＴ１２におけるＬｅｕ１３２Ｐｒｏに相当する突然変異を除く。更なる実施形態において、本明細書に記載される突然変異又はＳＮＰは、ＫＲＴ１２遺伝子中に存在するあらゆるＳＮＰを除く。なおも更なる実施形態において、本明細書に記載される突然変異又はＳＮＰは、ＫＲＴ１２タンパク質におけるＬｅｕ１３２Ｐｒｏ突然変異をもたらすあらゆるＳＮＰを除く。上記突然変異又は上記ＳＮＰは、ＫＲＴ１２タンパク質におけるＬｅｕ１３２Ｐｒｏ突然変異をもたらすＰＡＭ部位でのＳＮＰ（ＡＡＧ＞ＡＧＧ）を更に除き得る。
【００５１】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び該システムを使用する方法は、複数のＳＮＰ部位又は祖先型ＳＮＰでの突然変異配列を変化させ得る。そのような方法は、図１５〜図１６に示されるように隣接ＰＡＭを利用することとなる。更なる実施形態において、本明細書に記載される突然変異配列は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれより多くのＳＮＰ部位を含み得て、かつ本明細書に記載される方法は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれより多くの上記ＳＮＰ部位に関連する遺伝子産物の発現を変化させる。例えば、本明細書に記載される方法は、突然変異ＴＧＦＢＩタンパク質の発現をＲ５１４Ｐ及びＬ５１８Ｒの両方で変化させ得るか、又はＫＲＴ１２タンパク質の発現をＲ１３５Ｔ及びＬ１３２Ｐの両方で変化させ得る。幾つかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、突然変異アレルに特異的なＰＡＭ部位に隣接するｓｇＲＮＡと並行して、野生型アレル及び突然変異アレルの両方に共通の隣接イントロン中に位置するＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含み得る。
【００５２】
ヒトゲノムは本来、二倍体であり、男性のＸ染色体及びＹ染色体を除く全ての染色体は、一方が男性から、そして一方は女性から対として遺伝される。数千塩基対より大きな連続的なＤＮＡ配列の範囲を調べる場合に、遺伝形質の決定はこれらのＤＮＡの区画がどちらの親に由来するかを理解するために非常に重要である。さらに、殆どのＳＮＰは、ヒトゲノム内でヘテロ接合体として、すなわち男性又は女性のいずれか一方から遺伝されて存在する。より長い配列を読むシーケンシング技術は、ハプロタイプ判定済みゲノム配列を生成する試み、すなわちハプロタイプフェージングにおいて利用されている。したがって、５０ｋｂより長いＤＮＡの特定の範囲のゲノム配列を調査する場合に、ハプロタイプフェージングによる配列分析は、対合染色体のどちらが対象配列を有するかを決定するために利用され得る。より長いフェージングシーケンスのリードは、対象ＳＮＰが本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムのための標的として適切であるかどうかを決定するために使用され得る。
【００５３】
１つの態様において、本明細書に記載される方法は、病因性突然変異又はＳＮＰのどちらか一方の側での標的可能な突然変異又はＳＮＰを特定して、病因性突然変異又はＳＮＰをサイレンシングさせることを含む。幾つかの実施形態において、フェージングシーケンス実験においてＤＮＡの区画が特定される。幾つかの実施形態において、対象の突然変異又はＳＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのための適切な基質ではなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９開裂のために適した病因性突然変異又はＳＮＰの両方の側での突然変異又はＳＮＰの特定は、該病因性突然変異又は該ＳＮＰを含むＤＮＡの区画の除去を可能にする。幾つかの実施形態において、リードの長さを増やすことで、より長い連続的なリードを得ることができ、Weisenfeld NI, Kumar V, Shah P, Church DM, Jaffe DB. Direct determination of diploid genome sequences. Genome research. 2017; 27(5):757-767（これは引用することによりその全体が本出願の一部をなす）に記載の技術を使用することによりハプロタイプフェージングされたゲノムを得ることができる。
【００５４】
本明細書に示される方法の幾つかの実施形態において、疾患又は状態（例えば、角膜ジストロフィー）に関して肯定的な治療応答をもたらすために治療が用いられる。「肯定的な治療応答」とは、疾患若しくは状態における改善、及び／又は該疾患若しくは状態と関連する症状における改善と解釈される。主題の治療方法の治療効果は、任意の適切な方法を使用して評価され得る。幾つかの実施形態において、角膜でのタンパク質沈着を伴う角膜ジストロフィーの場合には、治療は、治療後の被験体の角膜におけるタンパク質沈着の、コントロール（例えば、治療前のタンパク質沈着の量）と比較した低下により評価される。或る特定の実施形態において、主題の方法は、被験体における角膜タンパク質沈着の量を、治療を受ける前の角膜と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％だけ減少させる。角膜混濁も、主題の方法を使用した治療効果を評価するために使用することができる。さらに、幾つかの実施形態において、治療は視覚機能により評価される。被験体における視覚機能の評価は、限定されるものではないが、裸眼視力（ＵＣＶＡ）、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）、及び輝度視力試験（ＢＡＴ）の評価を含む当該技術分野で既知の任意の適切な試験を使用して実施することができる（例えば、Awaad et al., Am J Ophthalmol. 145(4): 656-661 (2008)、及びSharhan et al., Br J Ophthalmol 84:837-841 (2000)を参照のこと、これらは全ての目的について、特に視力評価のための標準に関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）。或る特定の実施形態において、被験体の視力は、治療を受ける前と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％だけ改善する。
【００５５】
幾つかの実施形態において、被験体におけるＳＮＰと関連する角膜ジストロフィーを予防、改善、又は治療する方法は、該被験体に、有効量の本明細書に記載される操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含み得る。「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、有益な効果又は所望の効果をもたらすのに十分な作用物質の量を指す。治療的有効量は、治療される被験体及び疾患状態、被験体の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方式等の１つ以上に依存して変動し得て、その量は当業者により容易に決定され得る。その用語は、本明細書に記載されるイメージング法のいずれか１つによる検出のためのイメージをもたらす用量にも該当する。具体的な用量は、選択される特定の作用物質、従うべき投薬計画、その他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、イメージングされるべき組織、及び特定の作用物質を運搬する物理的送達システムの１つ以上に依存して変動し得る。
【００５６】
本明細書に記載される操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、（ｉ）本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子と、（ｉｉ）本明細書に記載されるｓｇＲＮＡとを含む少なくとも１つのベクターを含み得る。上記ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’末端に隣接する標的配列を含み得る、及び／又はＰＡＭの５’末端に隣接する第２の標的配列に相補性の第１の標的配列にハイブリダイズし得る。幾つかの実施形態において、上記標的配列又は上記ＰＡＭは、ＳＮＰ部位を含む。幾つかの実施形態において、上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び上記ｓｇＲＮＡは、天然には一緒に存在しないものである。幾つかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるＤＮＡ開裂は、ガイドＲＮＡ分子と標的ＤＮＡとの間の配列特異的アニーリングに加えて、ガイドＲＮＡ結合部位の３’のすぐそばにあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とする。このＰＡＭ部位の配列は、使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼに特異的である。更なる実施形態において、上記ＰＡＭは、上記ＳＮＰ部位を含む。なおも更なる実施形態において、上記ＰＡＭは、ＮＧＧ及びＮＮＧＲＲＴ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣのいずれかであり、かつＲは、Ａ又はＧである）からなる群から選択されるＰＡＭからなる。更なる実施形態において、上記投与は、上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記被験体の角膜（例えば、角膜実質）中に注射することにより、及び／又は上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、上記標的配列を有するＤＮＡ分子を含み発現する細胞中に導入することにより、上記操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記被験体の角膜（例えば、角膜実質）中に導入することを含む。
【００５７】
別の態様において、本開示は、角膜ジストロフィーの治療を必要とする被験体における角膜ジストロフィーを治療する方法であって、（ａ）上記被験体から角膜ジストロフィー標的核酸中に核酸突然変異を含む複数の幹細胞を取得することと、（ｂ）上記複数の幹細胞の１つ以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作することで上記核酸突然変異を修正し、それにより１つ以上の操作された幹細胞を形成させることと、（ｃ）上記１つ以上の操作された幹細胞を単離することと、（ｄ）上記１つ以上の操作された幹細胞を上記被験体中に移植することとを含み、上記複数の幹細胞の１つ以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作することが、本明細書に記載される遺伝子産物の発現を変化させる方法、又は被験体におけるＳＮＰと関連する疾患を予防、改善、若しくは治療する方法のいずれかを実施することを含む、方法に関する。
【００５８】
主題の方法は、複数の幹細胞を取得することを含み得る。任意の適切な幹細胞は、治療されるべき角膜ジストロフィーの種類に応じて、主題の方法のために使用され得る。或る特定の実施形態において、上記幹細胞は、異種ドナーから取得される。そのような実施形態において、異種ドナーの幹細胞及び治療される被験体は、ドナー−レシピエント組織適合性である。或る特定の実施形態において、自己幹細胞は、角膜ジストロフィーのための治療の必要がある患者から取得される。取得された幹細胞は、治療されるべき特定の角膜ジストロフィーと関連する遺伝子中に突然変異を有する（例えば、上述のように上皮−実質ジストロフィーを伴う被験体のＴＧＦＢＩ中に突然変異を有する幹細胞）。適切な幹細胞には、限定されるものではないが、歯髄幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯内膜幹細胞、胚性幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、及び縁上皮幹細胞が含まれる。
【００５９】
幾つかの実施形態において、複数の幹細胞は、縁上皮幹細胞を含む。縁上皮幹細胞（ＬＥＳＣ）は、角膜の輪部領域に位置しており、角膜表面の保全及び修復の役割を果たす。何らかの特定の動作原理に縛られるものではないが、ＬＥＳＣは、幹細胞プールを再生するための幹細胞ニッチに残る幹細胞と早期に一過的に増幅する娘細胞（ｅＴＡＣ）とを生成する非対称細胞分裂を経ると考えられる。このより分化されたｅＴＡＣは、幹細胞ニッチから除去され分裂することで、更に一過的に増幅する細胞（ＴＡＣ）が生成され得て、こうして最後には最終分化細胞（ＤＣ）がもたされる。ＬＥＳＣは、例えば被験体の眼から生検試料を採取することにより取得することができる（例えば、Pellegrini et al., Lancet 349: 990-993 (1997)を参照のこと）。輪部生検試料から取得されたＬＥＳＣは、主題の方法において使用するために、限定されるものではないが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）及び遠心分離技術を含む任意の適切な技術を使用して単離及びソーティングすることができる。ＬＥＳＣは、幹細胞関連マーカーの陽性発現及び分化マーカーのネガティブな発現を使用して生検試料からソーティングされ得る。ポジティブな幹細胞マーカーには、限定されるものではないが、転写因子ｐ６３、ＡＢＣＧ２、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＢｍｉ−１が含まれる。ネガティブな角膜特異的マーカーには、限定されるものではないが、サイトケラチン３（ＣＫ３）、サイトケラチン１２（ＣＫ１２）、コネキシン４３、及びインボルクリンが含まれる。幾つかの実施形態において、複数の幹細胞は、ｐ６３、ＡＢＣＧ２、又はそれらの組み合わせの発現についてポジティブである。或る特定の実施形態において、複数の幹細胞中の細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、ｐ６３、ＡＢＣＧ２、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＢｍｉ−１、又はそれらの組み合わせを発現する。幾つかの実施形態において、複数の幹細胞は、ＣＫ３、ＣＫ１２、コネキシン４３、インボルクリン、又はそれらの組み合わせの発現についてネガティブである。或る特定の実施形態において、複数の幹細胞中の細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、ＣＫ１２、コネキシン４３、インボルクリン、又はそれらの組み合わせを発現しない。ＬＥＳＣのために有用なその他のマーカーは、例えばTakacs et al., Cytometry A 75: 54-66 (2009)（これは全ての目的について、特にＬＥＳＣマーカーに関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）に記載されている。細胞サイズ及び高い核対細胞質比率等の幹細胞の特徴は、ＬＥＳＣの同定における補助のために使用することもできる。
【００６０】
ＬＥＳＣの他に、被験体の角膜から単離されたその他の幹細胞を、主題の方法で使用することもできる。例示的な角膜幹細胞には、限定されるものではないが、実質幹細胞、実質線維芽様細胞、実質間葉系細胞、神経堤由来の角膜幹細胞、及び推定内皮幹細胞が含まれる。
【００６１】
幾つかの実施形態において、主題の方法で使用される細胞は、被験体の角膜から単離される実質幹細胞である。実質幹細胞は、限定されるものではないが、Funderburgh et al., FASEB J 19: 1371-1373 (2005)、Yoshida et al., Invest Ophtalmol Vis Sci 46: 1653-1658 (2005)、Du et al. Stem Cells 1266-1275 (2005)、Dravida et al., Brain Res Dev Brain Res 160:239-251 (2005)、及びPolisetty et al. Mol Vis 14: 431-442 (2008)（これらは全ての目的について、特に様々な実質幹細胞の単離及び培養に関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）に記載される方法を含む任意の適切な方法を使用して単離され得る。
【００６２】
これらの実質幹細胞に特徴的なマーカーには、限定されるものではないが、Ｂｍｉ−１、Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｓｉｘ２、Ｐａｘ６、ＡＢＣＧ２、Ｓｐａｇ１０、及びｐ６２／ＯＳＩＬが含まれる。幾つかの実施形態において、複数の幹細胞中の細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、Ｂｍｉ−１、Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｓｉｘ２、Ｐａｘ６、ＡＢＣＧ２、Ｓｐａｇ１０、若しくはｐ６２／ＯＳＩＬ、又はそれらの組み合わせを発現する。或る特定の実施形態において、上記実質幹細胞は、ＣＤ３１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５について陽性であり、かつＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、及びＨＬＡ−ＤＲについて陰性である。或る特定の実施形態において、複数の幹細胞中の細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、ＣＤ３１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５について陽性であり、かつＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、及びＨＬＡ−ＤＲについて陰性である。なおも他の実施形態において、上記実質幹細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ５４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７１、Ｐａｘ６について陽性であり、かつＳＳＥＡ−１、Ｔｒａ１−８１、Ｔｒａ１−６１、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１３８、Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ１、及びＶＥ−カドヘリンについて陰性である。或る特定の実施形態において、複数の幹細胞中の細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ５４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７１、Ｐａｘ６について陽性であり、かつＳＳＥＡ−１、Ｔｒａ１−８１、Ｔｒａ１−６１、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１３８、Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ１、及びＶＥ−カドヘリンについて陰性である。
【００６３】
或る特定の実施形態において、主題の方法で使用される細胞は、被験体の角膜から単離される内皮幹細胞である。そのような幹細胞の単離方法は、例えばEngelmann et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 29: 1656-1662 (1988)（これは全ての目的について、特に角膜内皮幹細胞の単離及び培養に関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）に記載されている。
【００６４】
単離後に、複数の幹細胞（例えば、ＬＥＳＣ）を任意の適切な方法を使用して培養することで、安定な細胞系統を作製することができる。例えば、培養は、フィーダー細胞としての線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）の存在又は不存在下で維持することができる。その他の場合には、ヒト羊膜上皮細胞又はヒト胚性線維芽細胞が、培養のためのフィーダー層として使用される。ＬＥＳＣの培養のために適切な技術はさらに、Takacs et al. Cytometry A 75: 54-66 (2009), Shortt et al., Surv Opthalmol Vis Sci 52: 483-502 (2007)、及びCauchi et al. Am J Ophthalmol 146: 251-259 (2008)（これらは全ての目的について、特にＬＥＳＣの培養に関連する全ての教示について引用することによりその全体が本出願の一部をなす）に記載されている。
【００６５】
複数の幹細胞の単離後に、複数の幹細胞における１つ以上の幹細胞中の核酸突然変異を、本明細書に記載される方法により操作する又は変化させることで、角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異が修正される。本明細書で使用される場合に「角膜ジストロフィー標的核酸」は、本明細書に記載される角膜ジストロフィーの１つ以上と関連する突然変異を含む核酸を指す。
【００６６】
操作されるべき幹細胞には、個々の単離された幹細胞、又は該単離された幹細胞から樹立された幹細胞系統からの幹細胞が含まれる。任意の適切な遺伝子操作法は、幹細胞における核酸突然変異を修正するために使用され得る。
【００６７】
別の態様において、角膜ジストロフィーの治療のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含むキットが、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、上記キットは、本明細書に記載される１つ以上のｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び本明細書に記載されるように修復されるべき突然変異の野生型アレルを含む修復ヌクレオチド分子を含む。幾つかの実施形態において、上記キットはまた、細胞による核酸操作(nucleic acid manipulation)の取り込みを促進する作用物質、例えばトランスフェクション剤、又はエレクトロポレーションバッファーを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で提供される主題のキットは、幹細胞の検出又は単離のための１種以上の試薬、例えばＦＡＣＳと一緒に使用され得る１種以上のポジティブな幹細胞マーカーのための標識された抗体を含む。
【００６８】
別の態様において、本開示は、病因性突然変異又はＳＮＰをサイレンシングするための、例えば角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療のための、ｓｇＲＮＡ対、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのための少なくとも２種のｓｇＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ対を含むキットに関する。幾つかの実施形態において、上記ｓｇＲＮＡ対は、ＴＧＦＢＩ遺伝子における病因性突然変異又はＳＮＰをサイレンシングするためのｓｇＲＮＡ対である。該ｓｇＲＮＡ対は、ＴＧＦＢＩ遺伝子における、例えばイントロン中の病因性突然変異又はＳＮＰとシスにある祖先型突然変異又はＳＮＰを生成するＰＡＭのためのガイド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。更なる実施形態において、上記ｓｇＲＮＡ対は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン領域に祖先型ＳＮＰを生成するＰＡＭのための共通のガイド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。
【００６９】
幾つかの実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのためにデザインされたｓｇＲＮＡ対であって、（ｉ）（ａ）病因性突然変異又はＳＮＰの３’末端側にシスにある第１のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を生成する突然変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）のための第１のｃｒＲＮＡ配列と、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含み、該第１のｃｒＲＮＡ配列及び該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、第１のｓｇＲＮＡと、（ｉｉ）（ａ）病因性突然変異又はＳＮＰの５’末端側にシスにある第２のＰＡＭを生成する突然変異又はＳＮＰのための第２のｃｒＲＮＡガイド配列と、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含み、該第２のｃｒＲＮＡ配列及び該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然には一緒に存在しないものである、第２のｓｇＲＮＡとを含む、ｓｇＲＮＡ対に関する。
【００７０】
更なる実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療のためのシステムである。上記ＰＡＭを生成する突然変異又はＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子中に存在することができる。更なる実施形態において、上記ＰＡＭを生成する突然変異又はＳＮＰは、ＴＧＦＢＩ遺伝子のイントロン中に存在する。なおも更なる実施形態において、上記第１のｃｒＲＮＡ配列及び上記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、図１９〜図３５に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、及び／又は上記第１のｃｒＲＮＡ配列及び上記第２のｃｒＲＮＡ配列の少なくとも１つは、表２に列挙される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するために表される。そのような実施例は、排他的な実施形態を表さず、かつ排他的な実施形態を表すと解釈されないものと理解され、そのような実施例は、本発明の実施を単に説明する目的を果たすものである。
【００７２】
突然変異解析：様々な角膜ジストロフィーと関連する突然変異を解析して、どれが単独でミスセンス突然変異又はインフレームインデルであるかを決定した。この解析は、Ｋ１２及びＴＧＦＢＩ疾患の大部分について、ナンセンス突然変異又はフレームシフトを起こすインデル突然変異が疾患と関連しないことを指摘している。さらに、エクソーム変異体データベースの解析により、これらの遺伝子中に見られるあらゆる天然に存在するナンセンス突然変異、フレームシフトを起こすインデル突然変異、又はスプライス部位突然変異が、これらの個体における疾患と関連すると報告されないことが確認された。
【００７３】
突然変異解析により、以下の角膜ジストロフィー遺伝子が、標的ヌクレアーゼ遺伝子治療のために適していることが明らかになった（表１）。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
適切な角膜ジストロフィー遺伝子の調査をこの報告のために実施して、ＰＡＭ特異的アプローチ又はガイドアレル特異的アプローチのいずれかにより標的化可能な突然変異の数を調べた。ＰＡＭ特異的アプローチは、新規ＰＡＭの生成のために病因性ＳＮＰを必要とするが、アレル特異的アプローチは、病因性ＳＮＰを含むガイドのデザインを要する。１０％より大きいマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する新規ＰＡＭを生成するＴＧＦＢＩ中の全ての非病因性ＳＮＰを特定し、Benchlingのオンラインゲノム編集デザインツールにより解析した。１０％より大きいＭＡＦを有するＳＮＰの選択は、新規ＰＡＭを生ずるＳＮＰが、病因性突然変異とシスに見られる十分な機会を提供し得る。病因性突然変異と「シスにある」とは、病因性突然変異と同じＤＮＡ又は染色体の分子上にあることを指す。新規ＰＡＭを生ずるＳＮＰは、例えばＴＧＦＢＩ遺伝子中のイントロン又はエキソン中に、病因性突然変異とシスに存在し得る。ＴＧＦＢＩ内の全ての変異体を解析して、新規ＰＡＭが作製されたかどうかを調べた（表２）。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
図１５に示されるように、ＴＧＦＢＩ内の変異体の位置は、殆どのＳＮＰではイントロン中にクラスターが形成されている。このように、エキソン１１、エキソン１２、及びエキソン１４中のホットスポットに位置する多数のＴＧＦＢＩ突然変異は、このアプローチを使用して同時に標的化され得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、突然変異を有する２人以上の患者又は１つの家系を標的化することができる。このようにデザインされた１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、種々のＴＧＦＢＩ突然変異を治療するために使用することができる。上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、突然変異アレルに特異的なＰＡＭ部位に隣接するｓｇＲＮＡと並行して、野生型アレル及び突然変異アレルの両方に共通の隣接イントロン中に位置するＰＡＭ部位に隣接するｓｇＲＮＡを使用することができる（図１６）。これにより、機能的効果を有しないとされる野生型アレルのイントロン中でのＮＨＥＪがもたらされることとなり、突然変異アレルにおいて、２つの切断部位間にＤＮＡを含む欠失がもたらされることとなる。この技術は、適切なＳＮＰプロファイルを有する患者から単離された白血球において裏付けられる。
【００７８】
構築物：Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現する３種のプラスミドを使用した。使用される非標的化プラスミドは、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）（ブロード研究所、ＭＩＴ、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４８１３９、図７）であった。発表されたプロトコル（Ran FA, et al., Nat Protoc 2013; 8: 2281-2308）に従って、Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐアレルに特異的なｓｇＲＮＡを含むプラスミドを、アニーリング並びに以下の２つのプライマー（Life Technologies社、英国、ペイズリー）：５’−ＣＡＣＣＧＴＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＡＴＴ−３’及び５’−ＡＡＡＣＡＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＡＣ−３’をｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ中にクローニングすることによりデザインした。このｓｇＲＮＡは、Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐアレルに見られるアレル特異的ＰＡＭの３’に隣接する２０個のヌクレオチドに相当し（図１、赤色）、以下でｓｇＫ１２ＬＰと呼ぶ。野生型及び突然変異のＫ１２配列の両方を標的とするＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを構築し（Sigma社、英国、ジリンガム）、ポジティブコントロールとして使用した（図１、緑色）。
【００７９】
以前に記載された更なるＫ１２発現構築物を使用して、アレルの特異性及び有効性を評価した。Ｋ１２−ＷＴ又はＫ１２−Ｌ１３２Ｐのいずれかについての完全ｍＲＮＡ配列が終止コドンの３’に挿入されたホタルルシフェラーゼプラスミド（以下でそれぞれＫ１２ＷＴ−Ｌｕｃ及びＫ１２ＬＰ−Ｌｕｃと呼ばれる）（Liao H, et al. PLoS One 2011; 6: e28582.）、並びに成熟ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付きのＫ１２−ＷＴ及びＫ１２−Ｌ１３２Ｐタンパク質のための発現プラスミド（Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 3352-3360.）（以下で、それぞれＫ１２ＷＴ−ＨＡ及びＫ１２ＬＰ−ＨＡとして知られる）を使用した。ウミシイタケルシフェラーゼのための発現構築物（ｐＲＬ−ＣＭＶ、Promega社、英国、サウサンプトン）を、デュアルルシフェラーゼアッセイのために使用して、トランスフェクション効率を正規化した。
【００８０】
デュアルルシフェラーゼアッセイ：デュアルルシフェラーゼアッセイを使用して、外因性構築物中の３種の試験ｓｇＲＮＡの有効性及びアレル特異性を、以前に記載された（Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985、Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502、Atkinson SD, et al. J Invest Dermatol 2011; 131: 2079-2086）ように適合された方法を使用して定量した。手短に言えば、ＨＥＫ  ＡＤ２９３細胞（Life Technologies社）を、リポフェクタミン２０００（Life Technologies社）を使用して、Ｋ１２ＷＴ−Ｌｕｃ発現構築物又はＫ１２ＬＰ−Ｌｕｃ発現構築物とｓｇＮＳＣ構築物、ｓｇＫ１２構築物、又はｓｇＫ１２ＬＰ構築物との両方で１：４の比率でトランスフェクションさせた。細胞を溶解前に７２時間にわたりインキュベートし、ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの両方の活性を定量した。全体で８回の反復実験を、各々のトランスフェクション条件につき実施した。
【００８１】
ウェスタンブロッティング：ＨＡタグ付けされた野生型（Ｋ１２ＷＴ−ＨＡ）発現構築物及び突然変異（Ｋ１２ＬＰ−ＨＡ）発現構築物（Liao H, et al. PLoS One 2011; 6: e28582.）を、上記ｓｇＲＮＡのそれぞれと１：４の比率でＨＥＫ  ＡＤ２９３細胞中に２連でリポフェクタミン２０００（Invitrogen社）を使用して、以前に記載された（Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985、Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502）のと同様の方法を使用して一過的に同時トランスフェクションさせた。トランスフェクションされた細胞を７２時間にわたりインキュベートした。ＨＡタグ付けされたＫ１２及びβ−アクチンの発現を、ＨＡに対するウサギポリクローナル抗体（Abcam社、米国、ケンブリッジ、ａｂ９１１０、１：２０００）及びヒトβ−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Sigma社、１：１５０００）を使用して標準的方法（Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985、Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502）を用いて分析した。膜を、それぞれセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたポリクローナルブタ抗ウサギ二次抗体（DakoCytomation社、英国、イーリー）又はセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗マウス抗体（DakoCytomation社）と一緒にインキュベートした。タンパク質結合は、標準的な化学発光（Life Technologies社）により検出した。デンシトメトリーをＩｍａｇｅＪ（Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. Nat Methods 2012; 9: 671-675）を使用して行うことで、ＨＡタグ付けされたＫ１２のバンド強度を定量した（ｎ＝４）。これを、β−アクチンのバンド強度に正規化した。
【００８２】
定量的リアルタイムＰＣＲ：トランスフェクションを、ウェスタンブロッティングについて記載したのと同様にして実施したが、Ｋ１２ＷＴ−ＨＡ及びＫ１２ＬＰ−ＨＡの両方を、細胞中に同時にトランスフェクションさせた。全てのトランスフェクションは、３連で実施した。トランスフェクション後に、細胞を４８時間にわたりインキュベートし、ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット（Qiagen社、オランダ、ヴェンロー）を使用して抽出した。５００ｎｇのＲＮＡ（Life Technologies社）のｃＤＮＡ変換後に、定量的リアルタイムＰＣＲを実施して、ＫＲＴ１２のｍＲＮＡのレベルを定量した。ＫＲＴ１２アッセイ（アッセイＩｄ  １４０６７９、Roche社、英国、ウェスト・サセックス）を、ＨＰＲＴアッセイ（アッセイＩＤ  １０２０７９、Roche社）及びＧＡＰＤＨアッセイ（アッセイＩＤ  １４１１３９、Roche社）と並行して使用した。各試料を各アッセイについて３連で試験し、相対遺伝子発現を、ΔΔＣＴ法（Livak KJ, Schmittgen TD. Methods 2001; 25: 402-408）を使用して計算した。ＫＲＴ１２発現レベルを、ＨＰＲＴ及びＧＡＰＤＨ（両方の参照遺伝子の発現は、処置群の間で「安定」であると考えられる）に対して、ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒソフトウェアツール（Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Biotechnol Lett 2004; 26: 509-515）を使用して正規化した。
【００８３】
パイロシーケンシング：定量的逆転写酵素ＰＣＲにより評価された同じｃＤＮＡ試料を使用して、パイロシーケンシングを実施することで、正確に以前に記載された（Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 3352-3360）通りに、残りのＫ１２−Ｌ１３２ＰのｍＲＮＡ対Ｋ１２−ＷＴのｍＲＮＡの比率を測定した。
【００８４】
ＫＲＴ１２遺伝子導入マウス：Ｃ５７マウスモデルを取得し、内因性のマウスＫｒｔ１２コーディング配列を置き換えるためにヒトＫ１２−Ｌ１３２Ｐアレルでノックインした。これにより、アレル特異的なｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９によるＫＲＴ１２−Ｌ１３２Ｐのｉｎ  ｖｉｖｏ標的化が可能となった。１コピーのヒトＫ１２−Ｌ１３２Ｐアレル及び１コピーのマウスＫｒｔ１２が存在する２４週齢の雌のヘテロ接合マウスを使用した。標準的なＰＣＲ及びサンガー式のジデオキシヌクレオチドシーケンシングを使用して、該マウスをジェノタイピングし、Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐアレルのヘテロ接合性を確認した。この研究は１つの角膜における治療効果を調査するので、動物の無作為化は必要ないが、同じ動物のもう一方の角膜をネガティブコントロールとして使用した。研究者は、この研究において盲目化されなかった。全ての実験は、倫理規制を遵守し、地元の倫理委員会によって承認された。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの実質内の眼内注射：アレル特異的ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９の一過性発現を達成するために、上記ｓｇＫ１２ＬＰプラスミドを、以前に記載された（Moore JE, McMullen CBT, Mahon G, Adamis AP. DNA Cell Biol 21: 443-451）プロトコルに従って、ヘテロ接合ノックインマウスの角膜実質中に実質内眼内注射により導入した。この送達法を評価するために、野生型マウスに、最初に４μｇのＣａｓ９−ＧＦＰプラスミド（ｐＣａｓ９Ｄ１０Ａ＿ＧＦＰ）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４４７２０）を注射した。マウスを２４時間、４８時間、及び７２時間の時点で淘汰し、角膜を４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、標準的な組織学的手法を使用して処理した。５マイクロメートル厚の切片を切り出し、再水和し、蛍光顕微鏡法によりイメージングした。マウスに全身麻酔薬を投与し、角膜に局所麻酔薬を投与した。資格のある眼科医が、全体で３μｌのリン酸緩衝生理食塩水中に希釈された４μｇのｓｇＫ１２ＬＰプラスミド又はｓｇＮＳＣプラスミドを４匹のマウスの右眼と左眼のそれぞれの角膜中に注射した。マウスを、処置４８時間後に淘汰した。
【００８６】
ＮＨＥＪのシーケンシング及び測定：マウスを淘汰したら、眼を摘出し、角膜を解剖した。ｇＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キット（Qiagen社）を使用して抽出し、試料を２つの処置群：ｓｇＫ１２ＬＰ及びｓｇＮＳＣへとプールした。この試料に、以下の２種のプライマー：５’−ＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴ−３’及び５’−ＡＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＣ−３’を使用してＰＣＲ増幅を行うことで、Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐ突然変異の周辺の領域を増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＣｌｏｎｅＪｅｔクローニングベクター（Life Technologies社）中にライゲーションし、それらを使用することで、ＤＨ５αコンピテント細胞（Life Technologies社）を形質転換した。全体で１３個のクローンを選択し、プラスミドＤＮＡを、ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Qiagen社）を使用して製造業者の手順に従って調製した。１３個のクローンからのＤＮＡを、次いでＣｌｏｎｅＪｅｔベクターと一緒に提供されるシーケンシングプライマーを使用してシーケンシングした（オックスフォード大学動物学科）。Zhang研究室のオンラインツール（crispr.mit.edu）により予測されたマウスゲノム中のｓｇＫ１２ＬＰについての２つの最も可能性の高いエキソン内オフターゲット部位を、同様に評価した。ここで、１０個のコロニーを、それぞれの予測されたオフターゲットの分析のために選択した。予測されたオフターゲット部位は、５’−ＴＡＡＧＴＡＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＧ−３’（Ｇｏｎ４ｌ）及び５’−ＴＧＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧ−３’（Ａｓｐｈｄ１）であった。これらの２つの部位だけが選択されたのは、計算されたオフターゲットスコアが０．１を超えるのがそれら２つだけであったからである。
【００８７】
統計学：全てのエラーバーは、特段の記載がない限り、平均値の標準誤差を表す。有意性は、全ての試料が同じ分布を示したので、対応のないｔ検定を使用して計算した。統計学的有意性は、０．０５％に定めた。分散を群の間で計算することで、それらは同様であるとみなされた。
【００８８】
ＫＲＴ１２特異的ｓｇＲＮＡの構築：ＭＥＣＤを引き起こすＫＲＴ１２ミスセンス突然変異から得られた配列変化の分析により、ＭＥＣＤの重症形態を引き起こすＬ１３２Ｐ突然変異が、新規ＰＡＭ部位の生成（ＡＡＧ＞ＡＧＧ）を同時に起こすことが明らかになった。ＫＲＴ１２のＬ１３２Ｐ突然変異により生成された新規ＰＡＭ部位の５’末端に隣接する２０ヌクレオチド配列に相補性のｓｇＲＮＡ（ｓｇＫ１２ＬＰ）をデザインし、Zhang研究室（ＭＩＴ  ２０１３）によりオンラインで提供される「最適化ＣＲＩＳＰＲデザインツール（Optimized CRISPR Design Tool）」を使用して潜在的なオフターゲットについて評価した（図１、赤色）。ｓｇＲＮＡは、このシステムを使用して６６％のスコアを有すると計算された。ここで、５０％を超えるスコアは、限られた数の予測される考えられるオフターゲットでは質が高いと考えられる。
【００８９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｓｇＫ１２ＬＰのアレル特異性及び有効性の評価：ｓｇＫ１２ＬＰのアレル特異性及び有効性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥＫ  ＡＤ２９３細胞において、野生型及び突然変異のＫ１２のための外因性発現構築物を使用して評価した。アレル特異性は、最初にデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して測定した（図２Ａ）。ホタルルシフェラーゼ活性は、Ｋ１２ＷＴ−Ｌｕｃ又はＫ１２ＬＰ−Ｌｕｃのいずれかを発現する、ｓｇＫ１２で処理された細胞中で大幅に減少することが判明した。ホタルルシフェラーゼ活性の有効なアレル特異的な減少は、ｓｇＫ１２ＬＰで処理された細胞において観察された。Ｋ１２ＬＰ−Ｌｕｃを発現する細胞において、７３．４±２．７％の減少（Ｐ＜０．００１）が観察された（図２Ａ）。このアレル特異的な有効なノックダウンはまた、ウェスタンブロッティングにより、Ｋ１２ＷＴ−ＨＡ又はＫ１２ＬＰ−ＨＡのいずれかを発現する細胞においても観察され（図２Ｂ、４つのブロットを表すイメージ）、デンシトメトリーによる定量により、Ｋ１２ＬＰ−ＨＡタンパク質においてｓｇＫ１２ＬＰによりＫ１２ＷＴ−ＨＡタンパク質と比較して３２％の有意な減少が明らかとなった（Ｐ＜０．０５）。ｓｇＫ１２で処理された細胞において、野生型及び突然変異Ｋ１２タンパク質の両方が減少したことが分かり、その一方で、ｓｇＫ１２ＬＰで処理された細胞において、野生型タンパク質の発現に効果は見られないが、突然変異Ｋ１２タンパク質の大幅なノックアウトが見られた（図２Ｂ）。
【００９０】
タンパク質レベルで観察されたこのデータを裏付けるために、定量的逆転写酵素ＰＣＲ及びパイロシーケンシングを実施して、アレル特異性及び有効性をｍＲＮＡレベルで測定した。野生型及び突然変異Ｋ１２の両方を同時に（１：１の発現比率で）発現する、３種の試験Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現構築物（ＮＳＣ、Ｋ１２、及びＫ１２ＬＰ）のそれぞれで処理された細胞において、定量的逆転写酵素ＰＣＲを使用して、Ｋ１２の全ｍＲＮＡのノックダウンを測定した（図２Ｃ）。Ｋ１２の全ｍＲＮＡの７３．１±４．２％（Ｐ＜０．００１）の有効な減少がｓｇＫ１２処理された細胞において観察され、ｓｇＫ１２ＬＰ処理された細胞においては５２．６±７．０％（Ｐ＜０．０１）のより少ない減少が測定された（図２Ｃ）。パイロシーケンシングを使用して、これらのｓｇＲＮＡでの処理後の残存している成熟ｍＲＮＡ種の細胞内割合を測定した（図２Ｄ）。ｍＲＮＡの割合は「Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐ’のパーセント／Ｋ１２−ＷＴのパーセント」として計算された。突然変異及び野生型のＫ１２のｍＲＮＡの間の比率が１：１であると想定して、ｓｇＮＳＣで処理された細胞を１に正規化した。ｓｇＫ１２で試験された細胞において、０．８９±０．０３のＫ１２の突然変異ｍＲＮＡの割合が観察されたが、ＮＳＣコントロールとの差は有意ではなかった（Ｐ＜０．１４）。ｓｇＫ１２ＬＰで処理されたこれらの細胞において、０．２８±０．０２のＫ１２の突然変異ｍＲＮＡの割合が検出され、ｓｇＮＳＣ処理された細胞と比較して有意に変化した（Ｐ＜０．００１）（図２Ｄ）。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｇＲＮＡ−Ｋ１２ＬＰの効力の測定：Ｃａｓ９−ＧＦＰ構築物の実質内注射は、注射２４時間後に角膜上皮中に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のタンパク質の存在をもたらした（図３Ａ）。ＧＦＰの一過性発現は、注射後４８時間まで見られた。ｓｇＫ１２ＬＰ発現構築物又はｓｇＮＳＣ発現構築物のいずれかを、Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐヒト化ヘテロ接合マウス中に実質内注射し、４８時間の期間インキュベートした後に、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を角膜から調製した。４匹のｓｇＫ１２ＬＰ処理された動物又はｓｇＮＳＣ処理された動物の角膜からのｇＤＮＡをプールし、ヒト化されたＫ１２−Ｌ１３２Ｐ遺伝子のエキソン１のＰＣＲ増幅、クローニング、及びシーケンシングを実施した。ｓｇＮＳＣで処理された眼のｇＤＮＡから確立された１０個のクローンのうち、Ｋ１２−Ｌ１３２Ｐ配列は全てにおいてインタクトなままであった。ｓｇＫ１２ＬＰ処理された眼からの１３個の個々のクローンをシーケンシングした。８個は、変化されていないＫＲＴ１２のＬ１３２Ｐヒト配列を含むことが判明し、一方で５個のクローンは、Ｃａｓ９／ｓｇＫ１２ＬＰ複合体の予測された開裂部位の周辺でのＮＨＥＪを裏付けた（図３Ｂ）。１個のクローン（１）において、１個のヌクレオチドの挿入と共に、３２個のヌクレオチドの欠失が見出された。５３個までのヌクレオチドの大きな欠失がｉｎ  ｖｉｖｏで観察された（クローン５）。これらの５個のクローンのうち、４個は、早発の終止コドンの発生をもたらすこととなるフレームシフトを起こすと予測される欠失（クローン１及びクローン３〜クローン５）を含んでいた。マウスにおけるｓｇＫ１２ＬＰの上位２つの予測されたエキソン内オフターゲット部位も、この方法を使用して評価した。１０個のクローンを、それぞれの標的についてシーケンシングしても、非特異的開裂を経たものは見られなかった。
【００９２】
Ｒ５１４Ｐ、Ｌ５１８Ｒ、Ｌ５０９Ｒ、及びＬ５２７Ｒにおける突然変異により作製されたＰＡＭ部位と関連するＴＧＦＢＩ突然変異：一本鎖ガイドＲＮＡを、これらの突然変異のそれぞれを標的とするようにデザインし、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現プラスミド中にクローニングした。さらに、天然に存在する近接ＰＡＭを利用するポジティブコントロールのガイドＲＮＡを、それぞれの突然変異のためにデザインした。野生型及び突然変異の標的配列を、ルシフェラーゼレポータープラスミド中にクローニングすることで、野生型の発現及び突然変異発現に対する遺伝子編集の効果を確認することが可能となった。両方のプラスミドを使用してＡＤ２９３細胞をトランスフェクションさせ、ルシフェラーゼ発現をＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９処理の７２時間後に本発明者らの高スループットレポーター遺伝子アッセイを使用して測定することで、細胞中に存在する突然変異及び野生型のＤＮＡの量を測定した。
【００９３】
以下の図４は、ＳＮＰ誘導型ＰＡＭアプローチを使用して評価されたこれらの２個のＴＧＦＢＩ突然変異のそれぞれ（Ｒ５１４Ｐ、Ｌ５１８Ｒ、Ｌ５０９Ｒ、及びＬ５２７Ｒ）について、かなりのアレル特異性が達成され、その際、突然変異アレルは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムにより切断され、野生型のＤＮＡは、上記ガイドの幾つかについて或る程度まで切断されたことを示している。
【００９４】
ＰＡＭ部位に隣接する標的領域内にあるＳＮＰ突然変異と関連するＴＧＦＢＩ突然変異：一本鎖ガイドＲＮＡを、これらの突然変異を標的とするようにデザインし、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現プラスミド中にクローニングした。野生型及び突然変異の標的配列を、ルシフェラーゼレポータープラスミド中にクローニングし、本発明者らの高スループットレポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。両方のプラスミドを使用して、ＡＤ２９３細胞をトランスフェクションさせ、ルシフェラーゼ発現を３日後に測定した。
【００９５】
１６マーから２２マーまでの長さの範囲のガイドを評価することで、どの長さが、特異性の改善のために最大アレル特異性を達成するかを決定した。ガイドの長さに加えて、ガイドの５’末端への二重のグアニンの付加が特異性の改善を補助するか否かも評価した。上記ガイド配列は、ガイド長さに応じて異なる切断効率を示し、二重のグアニンの付加は、一般的に切断効率を改善しなかった（図５、項目Ａ〜項目Ｅ）。
【００９６】
アレル特異性を改善するために、Ｒ１２４Ｈを標的とする２０マーのガイドを、強化型Ｃａｓ９プラスミド中にクローニングした。強化型Ｃａｓ９は、非標的切断を抑えるように適切に操作されている。野生型配列の開裂における注目すべき減少、及びアレル特異性における増加（例えば、野生型配列についての切断効率と突然変異配列についての切断効率との間の差）が、デュアルルシフェラーゼアッセイを介して観察された（図５、項目Ｆ）。
【００９７】
ＤＮＡ開裂を確認するために、野生型ＴＧＦＢＩ配列又は突然変異ＴＧＦＢＩ配列のいずれかを含む二本鎖ＤＮＡテンプレートを調製した。テンプレートは、合成ガイド及びＣａｓ９タンパク質と一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏで３７℃において１時間にわたりインキュベートした。断片分析をアガロースゲル上で行うことで、切断能力を測定した（図５、項目Ｇ）。
【００９８】
追加のｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ライブ動物イメージング：ライブイメージングのために使用される全てのマウスは、１２週齢から２５週齢の間であった。イメージングのために、マウスを、約１．５ｌ／分の酸素流中の１．５％〜２％のイソフルラン（Abbott Laboratories Ltd.社、英国、バークシャー）を使用して麻酔した。ルシフェリン基質（３０ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリンカリウム塩、Gold Biotechnology社、米国、セントルイス）とＶｉｓｃｏｔｅａｒｓゲル（Novartis社、英国、キャンバリー）とを１：１で混合した混合物を、イメージングの直前にヘテロ接合Ｋｒｔ１２＋／ｌｕｃ２トランスジェニックマウスの眼に滴下した。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ（Perkin Elmer社、英国、ケンブリッジ）を使用して、発光を定量した。マウスの眼を取り囲む対象領域を選択して、以前に記載されたプロトコルを使用して定量し、そのサイズ及び形状は全体を通じて一定に保たれた。蛍光をまた、Ｃｙ３標識されたｓｉＲＮＡが注射されたマウスにおいてＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａを使用して可視化した。
【００９９】
実質内注射：Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ構築物を、実質内注射によりマウス角膜に送達した。これは、訓練を積んだ眼科医（Ｊ．Ｅ．Ｍ．）により上記のように行われた。角膜内の核酸の分布を評価するために、２μｌの１５０ｐｍｏｌ／μｌのＣｙ３標識されたＡｃｃｅｌｌ修飾ｓｉＲＮＡを、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右眼中に実質内注射した。Ｃｙ３標識されたｓｉＲＮＡの残存を評価するために、動物に、注射後の０時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の時点でＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステムにおいてライブイメージングを行った（ｎ＝３）。さらに、マウスを注射後の０時間、６時間、及び１２時間の時点で屠殺し（ｎ＝３）、眼組織を取り出し、−８０℃で凍結させた。組織をＯＣＴ中で固定化し、蛍光顕微鏡法のために凍結切開した。
【０１００】
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現構築物の作製：Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡの両方を発現するプラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）は、Feng Zhang教授からの寄贈として得られた（ブロード研究所、ＭＩＴ、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４８１３９）。ｌｕｃ２を標的とするｓｇＲＮＡを、Zhang研究室のＣＲＩＳＰＲデザインツール（www.crispr.mit.edu）を用いて開始コドンの６１塩基対以内でデザインした。ｌｕｃ２特異的なｓｇＲＮＡを、最初にオリゴヌクレオチド５’  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  Ｇ  ３’及び５’  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  Ｃ  ３’をアニーリングし、それに続いてＢｂｓＩで消化されたｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）中にライゲーションすることにより構築した。このプラスミドをｓｇＬｕｃ２と呼ぶ。元のｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏプラスミドを、非標的化ネガティブコントロールとして使用した。これをｓｇＮＳＣと呼ぶ。ｓｇＬｕｃ２プラスミドの活性を、上記の方法と同様のデュアルルシフェラーゼ法を使用して評価することで、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ効力を調べた。簡潔には、ｌｕｃ２構築物（ｐＧＬ４．１７、Promega社）を、ｓｇＬｕｃ２又はｓｇＮＳＣ（両者ともＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現構築物）のいずれかと共に１：４のモル比でウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物と一緒に同時トランスフェクションさせた。細胞を、トランスフェクション後４８時間にわたりインキュベートしてから、上記のようにルシフェラーゼ定量を行った。
【０１０１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｉｎ  ｖｉｖｏ評価：Ｃａｓ９／ｓｇＬｕｃ２プラスミドの有効性を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＫ１２−ｌｕｃ２遺伝子導入マウスにおいて、ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングの評価のために使用される改良されたプロトコルを使用して評価した。ｓｇＬｕｃ２（右眼）及びｓｇＮＳＣ（左眼）の両方に、４μｌのＰＢＳの全容量で５００ｎｇ／μｌの濃度で実質内注射した。マウス（ｎ＝４）のライブイメージを、２４時間毎に７日間にわたり、次いでその後は週１回、全体で６週間（４２日間）にわたり撮影した。ルシフェラーゼ阻害の定量は、右／左比を計算することにより測定し、値を０日目の値（１００％）に正規化した。
【０１０２】
角膜上皮細胞中でのみＬｕｃ２を発現するこの実験の遺伝子導入マウスモデルにおいて、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９ガイドは、Ｌｕｃ２遺伝子を以下に示されるように（ｓｇＲＮＡ）ｌｕｃ２発現を観察することにより角膜上皮中での遺伝子編集の成功を視覚的に示すことができる方法で標的化するようにできていた。こうして本質的にこれは、Ｋｒｔ１２発現によく似ている。それというのも、それは角膜上皮においてのみ発現されるからである。このｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデュアルルシフェラーゼアッセイにより、未処理の細胞に正規化した場合（未処理のコントロール＝１００％に対して正規化されたデータ）にルシフェラーゼ活性における有意な減少（示される＊はｐ＜０．０５を表す）により示されるように（図６）、ｓｇＬｕｃ２Ｐ構築物によるＬｕｃ２の標的化の成功が裏付けられた。ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９のｓｇＬｕｃ２ガイドを、角膜中でＬｕｃ２を発現する本発明者らの遺伝子導入マウス中で試験した。遺伝子導入マウスはＫ１２発現に似るようにできており、そのため明るい緑色がある場合には多くのＫｒｔ１２発現があり、図７において、青色はより少ないＫｒｔ１２発現を示し、黒色はＫｒｔ１２発現が全くないことを意味する。右側の眼に、試験用ｓｇＬｕｃ２を注射し、左側の眼に、非標的化非特異的なコントロールガイド及びＣＲＩＳＰＲを注射した。
【０１０３】
図７のグラフに示されるように、Ｌｕｃ２発現の量が測定された。処置後に、それぞれのマウスの角膜ルシフェラーゼ活性を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳライブ動物イメージャーを使用して毎日７日間にわたり、その後に７日毎に全部で６週間にわたり定量した。それぞれの処置群についてのルシフェラーゼ活性は、コントロールのパーセンテージとして表現した（Ｒ／Ｌ比の％）。
【０１０４】
アレル特異的インデルの確認
リンパ球のＥＢＶ形質転換：５ｍｌの全血の試料を採取し、滅菌５０ｍｌ容ファルコンチューブ中に入れた。２０％のウシ胎児血清を含む等容量のＲＰＭＩ培地をその全血に添加し、そのチューブを優しく転倒混和させた。６．２５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（GE Healthcare社のカタログ番号１７−１４４０−０２）を、別個の滅菌５０ｍｌ容ファルコンチューブ中に入れた。そのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅへと１０ｍｌの血液／培地混合物を添加した。そのチューブを、室温で２０００ｒｐｍにて２０分間にわたり遠心させた。赤血球が該チューブの底部に形成され、その上にＦｉｃｏｌｌ層があった。リンパ球は、Ｆｉｃｏｌｌ層上の層を形成し、一方で最上層は培地であった。清浄な滅菌パステットを挿入してリンパ球を抜き出し、それを滅菌１５ｍｌ容ファルコンチューブ中に入れた。該リンパ球を遠心分離し、洗浄した。ＥＢＶのアリコートを融解させ、再懸濁されたリンパ球に添加し、その混合物を３７℃で１時間にわたりインキュベートした（感染期間）。ＲＰＭＩの２０％ＦＣＳ培地及び１ｍｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンを、ＥＢＶで処理されたリンパ球に添加し、そのリンパ球を２４ウェルプレートに入れた。
【０１０５】
ＥＢＶ形質転換されたリンパ球（ＬＣＬ）のエレクトロポレーション：ＣＲＩＳＰＲ構築物（ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙのいずれかと同時発現される）を、懸濁されたＥＢＶ形質転換されたリンパ球細胞に添加し、その混合物をエレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを実施し、１０％のＦＢＳを含有する５００μｌの事前に温めたＲＰＭＩ  １６４０培地をそのキュベットに添加した。キュベットの内容物を、事前に温めた培地の残りを含む１２ウェルプレートへと移し、ヌクレオフェクションの６時間後に１ｍｌの培地を除去し、新たな培地と交換した。
【０１０６】
ＧＦＰ陽性生細胞及び／又はｍＣｈｅｒｒｙ陽性生細胞のセルソーティング：ヌクレオフェクションの２４時間後に、１ｍｌの培地を除去し、細胞を含む残りの培地を、１．５ｍｌ容のエッペンドルフ中に回収した。該細胞を遠心分離し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、５０μｌのｅＦｌｕｏｒ  ７８０生死判別色素を１：１０００希釈で添加した。もう１回遠心分離した後に、その細胞を１×ＨＢＳＳ（Ｃａ／Ｍｇ＋＋不含）、５ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５％のＦＣＳ／ＦＢＳ（熱失活されている）、及び１０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ  ＩＩを含有する濾過滅菌ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。細胞をソーティングして、ＧＦＰ陽性生細胞及び／又はｍＣｈｅｒｒｙ陽性生細胞を単離し、ＲＰＭＩ＋２０％のＦＢＳ中に回収した。細胞を増殖させ、ＤＮＡを該細胞から抽出した。
【０１０７】
シーケンシングのための単一アレルの単離：ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen社）を使用してＤＮＡを単離し、ＰＣＲをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により標的化される領域にわたり使用した。特異的増幅をゲル電気泳動により確認し、ＰＣＲ産物を精製した。該ＰＣＲ産物を平滑末端化し、Ｃｌｏｎｅｊｅｔ  Ｋｉｔ（Thermo Scientific社）からのｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔプラスミド中にライゲーションした。そのライゲーション混合物を、コンピテントなＤＨ５α細胞中に形質転換させた。単コロニーをピックし、サンガー式シーケンシングを実施して、編集を確認した。得られたデータは、図１７に示されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
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【図２１−１０】
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【図２１−１１】
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【図２１−１２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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