(57)【要約】本発明は、鎌状赤血球貧血（SCA）患者における脳卒中を治療するための組成物および方法を包含する。特定の態様では、該患者には、特定のENPP1含有ポリペプチドもしくはENNP3含有ポリペプチド、それらの変異体、または変異体断片が投与される。2019532915.tif 000063
2019532915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要がある鎌状赤血球貧血（SCA）患者における脳卒中を治療または予防する方法であって、該患者に、治療有効量の下記式（I）の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物を投与する段階を含む、前記方法：
PROTEIN-Z-DOMAIN-X-Y    (I)
式（I）中、
PROTEINは、ENPP1 (SEQ ID NO:1)、ENPP121 (SEQ ID NO:15)、ENPP71 (SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71 (SEQ ID NO:19)、ENPP51 (SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり；
Aは、タンパク質輸送配列であり；
Bは、存在しないか、またはSEQ ID NO:33中の残基Xaap-Xaa17に対応する配列であり、ここでpは1〜17の範囲の整数であり；
DOMAINは、存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、およびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1つであり；
XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり；かつ
Yは、存在しないか、または
2019532915.tif 000060
からなる「骨ターゲティング」配列の群より選択される配列であり、ここでmは1〜15の範囲の整数であり、かつnは1〜10の範囲の整数である。
【請求項２】
脳卒中を発症するリスクまたは脳卒中の重症度が、前記患者において最小限に抑えられる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
Yが存在せず、かつ前記化合物が負に荷電した骨ターゲティング配列を欠く、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、皮下、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、皮下、鼻腔内、口腔内、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼内、肺内、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路で前記患者に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が前記患者に静脈内投与または皮下投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記患者を前記化合物で治療することが、該患者の細胞外ピロリン酸濃度を増加させるか、または該濃度のさらなる低下を防止する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
PROTEINが、エクトヌクレオチドピロホスフェート/ホスホジエステラーゼ-2（ENPP2）膜貫通ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
ENPP2膜貫通ドメインが、SEQ ID NO:23に対応する、SEQ ID NO:2の12〜30位の残基を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
DOMAINがALBを含み、かつ式（I）の化合物がポリアスパラギン酸ドメインを欠く、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
PROTEINがENPP1膜貫通ドメインを欠く、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
DOMAINがIgG Fcドメインを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
AがSEQ ID NO:34〜39からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として前記患者に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者に少なくとも1つの追加の抗脳卒中治療がさらに施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
追加の抗脳卒中治療が、抗凝固薬、ヒドロキシウレア、抗血小板薬、抗高血圧薬、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、外科的介入、および血管内手術からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物および少なくとも1つの追加の抗脳卒中治療が前記患者に同時に施される、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物および少なくとも1つの追加の抗脳卒中治療薬が一緒に製剤化される、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、前記患者に投与される唯一の抗脳卒中治療薬である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、前記患者における脳卒中を治療または予防するのに十分な量で該患者に投与される唯一の抗脳卒中治療薬である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、鎌状赤血球貧血（SCA）患者に脳卒中のリスクがあるかどうかを検出する方法：
SCA患者由来のサンプル中のピロリン酸（PPi）の量を測定する段階；および
SCA患者由来のサンプル中のPPiの量を、参照サンプル中のPPiの量と比較する段階であって、PPiの量が参照サンプル中よりもSCA患者由来のサンプル中で少ない場合、該患者は脳卒中のリスクがある、段階。
【請求項２３】
前記患者が哺乳動物である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記SCA患者に抗脳卒中治療を施す段階をさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
SCA患者由来のサンプル中のピロリン酸（PPi）の量を測定する段階；
SCA患者由来のサンプル中のPPiの量を、参照サンプル中のPPiの量と比較する段階であって、PPiの量が参照サンプル中よりもSCA患者由来のサンプル中で少ない場合、該患者は脳卒中のリスクがあると判定される、段階；および
脳卒中のリスクがある該患者に、治療有効量の下記式（I）の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物をさらに投与する段階
を含む、その必要があるSCA患者における脳卒中を治療または予防する方法：
PROTEIN-Z-DOMAIN-X-Y    (I)
式（I）中、
PROTEINは、ENPP1 (SEQ ID NO:1)、ENPP121 (SEQ ID NO:15)、ENPP71 (SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71 (SEQ ID NO:19)、ENPP51 (SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり；
Aは、タンパク質輸送配列であり；
Bは、存在しないか、またはSEQ ID NO:33中の残基Xaap-Xaa17に対応する配列であり、ここでpは1〜17の範囲の整数であり；
DOMAINは、存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)(例えばIgG1、IgG2、IgG3および/またはIgG4を含むが、これらに限定されない)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、およびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1つであり；
XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり；かつ
Yは、存在しないか、または
2019532915.tif 000061
からなる「骨ターゲティング」配列の群より選択される配列であり、ここでmは1〜15の範囲の整数であり、かつnは1〜10の範囲の整数である。
【請求項２７】
少なくとも1つの抗脳卒中治療薬と、下記式（I）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物とを含む、組成物：
PROTEIN-Z-DOMAIN-X-Y    (I)
式（I）中、
PROTEINは、ENPP1 (SEQ ID NO:1)、ENPP121 (SEQ ID NO:15)、ENPP71 (SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71 (SEQ ID NO:19)、ENPP51 (SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり；
Aは、タンパク質輸送配列であり；
Bは、存在しないか、またはSEQ ID NO:33中の残基Xaap-Xaa17に対応する配列であり、ここでpは1〜17の範囲の整数であり；
DOMAINは、存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)(例えばIgG1、IgG2、IgG3および/またはIgG4を含むが、これらに限定されない)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、およびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1つであり；
XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり；かつ
Yは、存在しないか、または
2019532915.tif 000062
からなる「骨ターゲティング」配列の群より選択される配列であり、ここでmは1〜15の範囲の整数であり、かつnは1〜10の範囲の整数である。
【請求項２８】
少なくとも1つの抗脳卒中治療薬および前記化合物が一緒に製剤化されている、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
鎌状赤血球貧血患者における脳卒中を治療または予防するための前記化合物および前記抗脳卒中治療薬の使用説明書をさらに含むキット中に存在する、請求項27に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の下で、2016年8月5日に出願された米国仮特許出願第62/371,269号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脳血管発作（CVA）または脳血管損傷（CVI）としても知られる脳卒中（stroke）は、脳への最適未満の血流量が脳細胞の死をもたらすときに起こる。脳卒中の徴候と症状には、とりわけ、半身運動麻痺および感覚麻痺、理解もしくは会話の障害、平衡の喪失、または片側の視力喪失などが含まれる。症状が1〜2時間未満続く場合、それは一過性脳虚血発作（TIA）として知られている。脳卒中の主なリスク因子は高血圧である。他のリスク因子としては、喫煙、肥満、高血中コレステロール、真性糖尿病、以前のTIAの発症、鎌状赤血球貧血、および心房細動が挙げられる。
【０００３】
脳卒中には2つの主なタイプがある：血流の欠如による虚血性と、出血による出血性である。虚血性脳卒中は一般に、血管の閉塞によって引き起こされる。出血性脳卒中は、脳内に直接出血するか、または脳周辺の空間に出血することによって引き起こされる。脳卒中の予防には、リスク因子を減らすだけでなく、場合によってはアスピリン、スタチン類、問題となる狭窄がある人には脳への動脈を広げる手術、心房細動のある人にはワルファリンが含まれる。
【０００４】
特に、脳卒中は、鎌状赤血球貧血（sickle cell anemia：SCA）がある子供にとって深刻な合併症である。SCAにおける脳卒中の原因はよくわかっておらず、このことがその発症を減らす効果を妨げている。虚血性脳卒中の発症のピークは小児期にあるが、成人のSCA患者でも虚血性脳卒中がかなりの比率で発生する。SCA患者の初発性または再発性脳卒中を予防するための唯一の確立された治療法は、慢性的な輸血療法である。しかしながら、SCA患者は、この介入にもかかわらず、依然として脳血管障害を受けることがある。輸血の中止は、鎌状ヘモグロビンの濃度を低下させる防御効果を急速に失わせて、脳血管障害と脳卒中の高いリスクへと逆戻りさせる。
【０００５】
したがって、当技術分野では鎌状赤血球貧血患者における脳卒中を治療するための新規な組成物および方法が必要とされている。本発明はこの必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、鎌状赤血球貧血（SCA）患者における脳卒中を治療または予防する方法を提供する。本発明はさらに、SCA患者に脳卒中のリスクがあるかどうかを検出する方法を提供する。本発明はさらに、その必要があるSCA患者における脳卒中を治療または予防する方法を提供する。本発明はさらに、少なくとも1つの抗脳卒中治療薬と本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物とを含む組成物を提供する。
【０００７】
特定の態様では、前記方法は、治療有効量の本発明の化合物を患者に投与することを含んでなる。他の態様では、本発明の化合物は、式（I）の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物である：
PROTEIN-Z-DOMAIN-X-Y    (I)
式（I）中、PROTEINは、ENPP1 (SEQ ID NO:1)、ENPP121 (SEQ ID NO:15)、ENPP71 (SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71 (SEQ ID NO:19)、ENPP51 (SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり；Aはタンパク質輸送配列であり；Bは存在しないか、またはSEQ ID NO:33中の残基Xaap-Xaa17に対応する配列であり、ここでpは1〜17の範囲の整数であり；DOMAINは存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、およびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1つであり；XおよびZは独立して存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり；かつYは存在しないか、または
2019532915.tif 000003
からなる「骨ターゲティング」配列の群より選択される配列であり、ここでmは1〜15の範囲の整数であり、かつnは1〜10の範囲の整数である。
【０００８】
特定の態様では、脳卒中を発症するリスクまたは脳卒中の重症度は、前記患者において最小限に抑えられる。他の態様では、Yは存在しない。さらに他の態様では、前記化合物は負に荷電した骨ターゲティング配列を欠く。
【０００９】
特定の態様では、前記患者は、皮下、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、皮下、鼻腔内、口腔内、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼内、肺内、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって前記化合物を投与される。他の態様では、該化合物は該患者に静脈内投与または皮下投与される。
【００１０】
特定の態様では、前記患者を該化合物で治療することは、該患者の細胞外ピロリン酸濃度を増加させるか、または該濃度のさらなる低下を防止する。
【００１１】
特定の態様では、PROTEINは、エクトヌクレオチドピロホスフェート/ホスホジエステラーゼ-2（ecto-nucleotide pyrophosphate/phosphodiesterase-2：ENPP2）膜貫通ドメインを含む。他の態様では、ENPP2膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:23に対応する、SEQ ID NO:2の12〜30位の残基を含む。さらに他の態様では、DOMAINはALBを含む。さらに他の態様では、式（I）の化合物はポリアスパラギン酸ドメインを欠く。さらに他の態様では、PROTEINはENPP1膜貫通ドメインを欠く。さらに他の態様では、DOMAINはIgG Fcドメインを含む。さらに他の態様では、AはSEQ ID NO:34〜39からなる群より選択される。
【００１２】
特定の態様では、前記化合物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として患者に投与される。他の態様では、該患者はさらに、少なくとも1つの追加の抗脳卒中治療を施される。さらに他の態様では、追加の抗脳卒中治療は、抗凝固薬、ヒドロキシウレア、抗血小板薬、抗高血圧薬、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、外科的介入、および血管内手術からなる群より選択される。さらに他の態様では、該化合物および少なくとも1つの追加の抗脳卒中治療は患者に同時に施される。さらに他の態様では、該化合物および少なくとも1つの追加の抗脳卒中治療薬は一緒に製剤化される。さらに他の態様では、該化合物は、患者に投与される唯一の抗脳卒中治療薬である。さらに他の態様では、該化合物は、患者における脳卒中を治療または予防するのに十分な量で患者に投与される唯一の抗脳卒中治療薬である。さらに他の態様では、患者は哺乳動物である。さらに他の態様では、哺乳動物はヒトである。
【００１３】
特定の態様では、前記方法は、SCA患者由来のサンプル中のピロリン酸（PPi）の量を測定する段階を含む。他の態様では、該方法は、SCA患者由来のサンプル中のPPiの量を、参照サンプル中のPPiの量と比較する段階を含む。さらに他の態様では、PPiの量が参照サンプル中よりもSCA患者由来のサンプル中で少ない場合、その患者は脳卒中のリスクがある。
【００１４】
特定の態様では、前記方法は、SCA患者由来のサンプル中のピロリン酸（PPi）の量を測定する段階を含む。他の態様では、該方法は、SCA患者由来のサンプル中のPPiの量を、参照サンプル中のPPiの量と比較する段階を含む。さらに他の態様では、PPiの量が参照サンプル中よりもSCA患者由来のサンプル中で少ない場合、その患者は脳卒中のリスクがあると判定される。さらに他の態様では、該方法は、脳卒中のリスクがある患者に、治療有効量の本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を投与する段階をさらに含む。
【００１５】
特定の態様において、前記組成物は、鎌状赤血球貧血患者における脳卒中を治療または予防するための前記化合物および抗脳卒中治療薬の使用説明書をさらに含むキット中に存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の例示的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことで、よりよく理解されよう。本発明を説明する目的で、図面に例示的な態様が示される。しかしながら、本発明は、図面に示された態様の正確な配置および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図１】脳卒中防止を予測するENPP1多型（ヘテロアレルK/Q）と比較した、脳卒中リスクを予測するENPP1遺伝型（ホモアレルQ/Q）を有する鎌状赤血球貧血患者の血漿ピロリン酸（PPi）レベルを示すグラフである。リスクのある集団における平均PPiレベルは約0.8nMであり、これは脳卒中防止に関連したENPP1遺伝型を有する患者よりも有意に低い（pは0.005にほぼ等しい、スチューデントの両側T検定）。
【図２】ENPP1 K121（丸）およびENPP1 Q121（四角）アイソフォームの初期定常状態速度のATP依存性を示すグラフである。両タンパク質についての1μM ATPでの初期速度がVmax値に達するので、基質ATPを用いた両タンパク質についてのKMは1μM未満である。ENPP1 K121のkcat＝0.92±0.11 sec-1酵素-1およびENPP1 Q121のkcat＝0.98±0.11 sec-1酵素-1であり、これはENPP1のこれら2つのアイソフォームの触媒活性の間に統計的な差がないことを示している（Studentのt検定p＝0.779）。
【図３】ENPP3ポリペプチドの非限定的な発現および精製を示すタンパク質ゲルを示す。
【図４】本発明の範囲内で企図される非限定的なENPP3-Fc構築物のプラスミドマップを示す。
【図５】本発明の範囲内で企図される非限定的なENPP3-アルブミン構築物のプラスミドマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、一局面において、脳卒中の高リスクと関連した遺伝型を有する鎌状赤血球貧血（SCA）患者ではピロリン酸（PPi）レベルが低い、という予想外の発見に関する。別の局面において、本発明は、鎌状赤血球貧血患者における脳卒中を治療または予防するために、特定のENPP1含有ポリペプチドもしくはENPP3含有ポリペプチド、それらの変異体、または変異体断片を使用することができる、という知見に関する。特定のENPP1由来ポリペプチドもしくはENPP3由来ポリペプチド、それらの変異体、または変異体断片は、PCT公開番号WO 2014/126965、WO 2016/187408、およびWO 2017/087936に開示されており、これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１８】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料はどれも本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および材料を記載することにする。
【００１９】
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションにおいて、それと関連している意味を有する。
【００２０】
冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本明細書では、その冠詞の文法上の物体の1つまたは2つ以上（すなわち、少なくとも1つ）を指すために使用される。例として、「1つの要素（an element）」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２１】
明確にするために、本開示には以下の表記法が適用される。どのような場合でも、この表記法に従わない本明細書中の教示は、依然として本開示の一部であり、その教示が開示されている文脈を考慮すれば十分に理解することができる。タンパク質の記号は斜体ではない大文字で記載される。非限定的な例として、「ENPP1」または「ENPP7」は対応するタンパク質を指す。特定の態様では、タンパク質がヒトのタンパク質である場合、そのタンパク質記号の前に「h」が使用される。他の態様では、タンパク質がマウスのタンパク質である場合、該記号の前に「m」が使用される。したがって、ヒトENPP1は「hENPP1」と表記され、マウスENPP1は「mENPP1」と表記される。ヒト遺伝子記号は斜体の大文字で記載される。非限定的な例として、タンパク質hENPP1に対応するヒト遺伝子はENPP1（斜体）である。マウス遺伝子記号は、最初の文字が大文字で、残りの文字が小文字で記載される；さらに、マウス遺伝子記号は斜体で表記される。非限定的な例として、タンパク質mEnpp1を作るマウス遺伝子はEnpp1（斜体）である。
【００２２】
量、持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用する「約」は、特定の値からの±20％または±10％の変動、特定の態様では、±5％、±1％、±0.1％の変動を包含することを意味するが、そのような変動は開示された方法を実施するのに適切であるからである。
【００２３】
生物、組織、細胞またはそれらの構成要素との関連で使用するときの用語「異常」とは、少なくとも1つの観察可能または検出可能な特性（例えば、年齢、治療、時間など）が、「正常な」（予想される）それぞれの特性を示す生物、組織、細胞またはそれらの構成要素と異なっている生物、組織、細胞またはそれらの構成要素を指す。ある細胞型または組織型に対して正常であるまたは予想される特性は、異なった細胞型または組織型に対しては異常である可能性がある。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ALB」は、ヒト血清アルブミンタンパク質を指す。
【００２５】
疾患または障害の症状の重症度、そのような症状を患者が経験する頻度、またはその両方が低減される場合に、その疾患または障害は「軽減」されている。
【００２６】
本明細書で使用する用語「改変」、「欠陥」、「変化」または「変異」は、コードされるポリペプチドの機能、活性、発現（転写または翻訳）または立体構造に影響を及ぼす細胞中の遺伝子の変異、例えば、ミスセンスおよびナンセンス変異、挿入、欠失、フレームシフト、早期終結などを指す。
【００２７】
用語「アミノ酸配列バリアント」は、天然配列ポリペプチドとはある程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列バリアントは、天然ポリペプチドに対して少なくとも約70％の相同性、少なくとも約80％の相同性、少なくとも約90％の相同性、または少なくとも約95％の相同性を有する。
【００２８】
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する完全型（intact）免疫グロブリン、および完全型免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。
【００２９】
本明細書で使用する用語「Ap3P」は、アデノシン-5'-トリホスホ-5'-アデノシンまたはその塩を指す。
【００３０】
本明細書で使用する用語「コード配列」は、mRNAおよび/またはポリペプチドもしくはその断片を生成するために転写および/または翻訳され得る、核酸もしくはその相補体、またはその一部の配列を意味する。コード配列はゲノムDNAまたは未成熟の一次RNA転写産物中にエクソンを含み、エクソン同士が細胞の生化学的機構によってつなぎ合わされて成熟mRNAを与える。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補鎖であり、コード配列はその鎖から推定され得る。対照的に、本明細書で使用する用語「非コード配列」は、インビボでアミノ酸に翻訳されないか、またはtRNAがアミノ酸を配置するように相互作用しない、もしくはアミノ酸を配置しようとしない、核酸もしくはその相補体、またはその一部の配列を意味する。非コード配列は、ゲノムDNAまたは未成熟の一次RNA転写産物中のイントロン配列と、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子関連配列との両方を含む。
【００３１】
本明細書で使用する用語「保存的変化」または「保存的置換」は、あるアミノ酸残基を別の生物学的に類似する残基で置き換えることを指す。保存的変化または置換がペプチド鎖の形状を変える可能性は低い。保存的変化または置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの、ある疎水性残基の別の疎水性残基への置換、またはリシンをアルギニンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、アスパラギンをグルタミンに置換するなど、ある極性残基の別の極性残基への置換が含まれる。
【００３２】
用語「容器」は、薬学的組成物を保持するための任意の入れ物（receptacle）を含む。例えば、特定の態様では、その容器は薬学的組成物を含むパッケージである。他の態様では、その容器は薬学的組成物を含むパッケージではなく、すなわち、その容器は、パッケージ化した薬学的組成物またはパッケージ化してない薬学的組成物と、その薬学的組成物のための使用説明書とを含む、箱またはバイアルなどの入れ物である。さらに、パッケージング技術は当技術分野において周知である。薬学的組成物の使用説明書は薬学的組成物を含むパッケージの上に存在することができ、そのため、その使用説明書はパッケージ化した製品との増大した機能的関係を形成することが理解されよう。しかしながら、使用説明書は、意図された機能を果たす該化合物の能力、例えば、患者における疾患もしくは障害を治療、予防または軽減する能力、に関する情報を含み得ることが理解されよう。
【００３３】
「疾患」とは、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されなければ動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことである。
【００３４】
動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態が障害のない場合よりも好ましくない、健康状態のことである。未治療のままにしておいても、障害は動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【００３５】
本明細書で使用する用語「有効量」、「薬学的有効量」および「治療有効量」とは、所望の生物学的結果をもたらすのに十分であるが無毒な薬剤量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状もしくは原因の低減および/または緩和、あるいは生体系の他の何らかの望ましい改変であり得る。個々のケースにおける適切な治療量は、慣例的な実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００３６】
「コードする」とは、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の性質を指し、該配列は、規定されたヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）または規定されたアミノ酸配列のいずれかと、それに起因する生物学的特性とを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子を合成するためのテンプレートとして役立つ。したがって、ある遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生体系においてタンパク質をもたらす場合、その遺伝子は該タンパク質をコードしている。コード鎖（そのヌクレオチド配列はmRNA配列と同一であり、通常は配列表に記載される）と非コード鎖（遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして使用される）の両方は、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードしている、ということができる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「Fc」は、ヒトIgG（免疫グロブリン）のFcドメインを指す。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのIgGのサブタイプは、Fcドメインとしての利用が企図される。
【００３８】
本明細書で使用する用語「断片」は、核酸に適用する場合、より大きな核酸の部分配列を指す。核酸の「断片」は、少なくとも約15、50〜100、100〜500、500〜1000、1000〜1500、1500〜2500、または2500ヌクレオチド（およびその間の任意の整数値）であり得る。本明細書で使用する用語「断片」は、タンパク質またはペプチドに適用する場合、より大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を指し、少なくとも約20、50、100、200、300または400アミノ酸長（およびその間の任意の整数値）であり得る。
【００３９】
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン」または「Ig」は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、時にBCR（B細胞受容体）または抗原受容体と呼ばれることがある。このクラスのタンパク質に含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。
【００４０】
「説明資料」は、その用語を本明細書で使用する場合、本明細書に列挙された様々な疾患または障害を同定、軽減または治療するためのキット中の本発明の核酸、ペプチドおよび/または化合物の有用性を伝達するために使用され得る、刊行物、記録、図表、または他のいずれかの表現手段を含む。
【００４１】
「単離された」とは、天然の状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物内に天然で存在する核酸またはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはポリペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または、例えば宿主細胞のような、非天然環境に存在し得る。
【００４２】
「単離された核酸」とは、天然の状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸セグメントまたは断片を指し、例えば、該断片に通常隣接する配列、例えば該断片が天然に存在するゲノム中でそれに隣接する配列、から取り出されたDNA断片、および/または該核酸に天然で付随する他の成分、例えば細胞内でそれに天然で付随するRNA、DNAもしくはタンパク質、から実質的に精製されたDNA断片を指す。この用語は、例えば、ベクターに、自律複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA、あるいは他の配列とは無関係である別個の分子として（例えば、PCRまたは制限酵素消化によって産生されるcDNA、またはゲノムDNAもしくはcDNA断片として）存在する組換えDNAを含む。この用語はまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAをも含む。
【００４３】
本明細書で使用する用語「NPP」または「ENPP」とは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼを指す。
【００４４】
「核酸」とは、ポリヌクレオチドを指し、ピリミジン塩基とプリン塩基、好ましくは、それぞれシトシンとチミンとウラシル、およびアデニンとグアニン、の任意のポリマーまたはオリゴマーである、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを含む。Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, 793-800 (Worth Pub. 1982)を参照されたい；これは全ての目的のためにその全体が本明細書に組み入れられる。
【００４５】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも2ヌクレオチドから、特定の態様では少なくとも8、15または25ヌクレオチドの範囲の核酸であるが、50、100、1000もしくは5000ヌクレオチド長まで、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物であり得る。
【００４６】
本明細書で使用する用語「PPi」は、血漿ピロリン酸を指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「患者」、「個体」または「対象者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を指す。非ヒト哺乳動物は、例えば、家畜およびペットを含み、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスなどの哺乳動物である。特定の態様では、患者、個体または対象者はヒトである。
【００４８】
本明細書で使用する用語「予防する」または「予防」は、何も発症していなかったならば、障害または疾患の発症が起こらないことを、障害または疾患の発症が既に起こっていたならば、さらなる障害または疾患の発症が起こらないことを意味する。障害または疾患に伴う症状の一部または全部を予防する能力も予防と見なされる。
【００４９】
本明細書で使用する用語「薬学的組成物」または「組成物」は、本発明の範囲内で有用な少なくとも1つの化合物と薬学的に許容される担体との混合物を指す。薬学的組成物は患者への該化合物の投与を容易にする。当技術分野には、静脈内、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、鼻腔内、口腔内、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼内、肺内、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与するための多数の技術が存在する。
【００５０】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」は、化合物の生物学的活性または特性を無効にせず、比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指す；すなわち、その材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、個体に投与することができる。
【００５１】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、本発明の範囲内で有用な化合物を、その意図された機能を果たすことができるように、患者の体内外に運搬または輸送することに関与している、液体または固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、カプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、組成物または担体を意味する。典型的には、そのような構築物は、ある器官または生体の一部から別の器官または生体の一部に運搬または輸送される。各担体は、本発明の範囲内で有用な化合物を含めて、製剤の他の成分と適合し、かつ患者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。本発明の実施で使用される薬学的組成物に含めることができる成分類は当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている。
【００５２】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容される無毒性の酸および塩基、例えば、無機酸、無機塩基、有機酸、有機塩基、それらの溶媒和物、水和物、およびクラスレートから調製される投与化合物の塩を指す。適切な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製することができる。塩は、適切な酸または塩基を該化合物と反応させることによって、対応する化合物から調製され得る。
【００５３】
本明細書で使用する用語「血漿ピロリン酸（PPi）レベル」とは、動物の血漿中に存在するピロリン酸の量を指す。特定の態様では、動物にはラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、ウシおよびウマが含まれる。血小板からの放出のため、血清ではなく血漿中のPPiを測定する必要がある。PPiを測定するいくつかの方法があり、そのうちの1つは、ウリジン-ジホスホグルコース(UDPG)ピロホスホリラーゼ（Lust & Seegmiller, 1976, Clin. Chim. Acta 66:241-249; Cheung & Suhadolnik, 1977, Anal. Biochem. 83:61-63）を使用する酵素アッセイに改良を加えた方法である。
【００５４】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、cDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、アンチセンスRNA、リボザイム、ゲノムDNA、合成形態、および混合ポリマー、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み、非天然のまたは誘導体化された、合成または半合成のヌクレオチド塩基を含むように化学的または生化学的に修飾することができる。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」とは、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基、関連する天然の構造変異体、およびその天然に存在しない合成類似体から構成されたポリマーを指す。本明細書では、ポリペプチド配列を表すために従来の表記法が使用される：ポリペプチド配列の左端はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。
【００５６】
本明細書で使用する「サンプル」または「生物学的サンプル」は、対象者から分離された生物学的材料を意味する。生物学的サンプルは、対象者における生理学的または病理学的過程のmRNA、ポリペプチドまたは他のマーカーを検出するのに適したどのような生物学的材料を含んでいてもよく、個体から得られる体液、組織、細胞および/または非細胞材料を含むことができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「SCA」は、鎌状赤血球貧血を指す。
【００５８】
抗体に関して本明細書で使用する用語「特異的に結合する」とは、特定の抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識しない、または他の分子に結合しない抗体を意味する。場合によっては、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関して使用され、その相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；例えば、抗体は、タンパク質を全体的に認識するというよりもむしろ、特定のタンパク質構造を認識して、それに結合する。
【００５９】
本明細書で使用する「実質的に精製された」とは、他の成分を本質的に含まないことを指す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、それがその天然に存在する状態で通常会合している他の成分から分離されたポリペプチドである。非限定的な実施態様は、95％純度、99％純度、99.5％純度、99.9％純度、および100％純度を含む。
【００６０】
本明細書で使用する用語「治療」または「治療する」は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を治療、治癒、軽減、緩和、改変、修復、改善、向上させるか、またはそれに影響を及ぼすことを目的として、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を有する患者に、治療薬、すなわち本発明の範囲内で有用な化合物（単独または他の薬剤との組み合わせ）を適用または投与すること、あるいは（例えば、診断または生体外適用のために）該患者から分離された組織または細胞株に治療薬を適用または投与すること、と定義される。そのような治療は、薬理ゲノム学の分野から得られた知識に基づいて、特別にオーダーメイドまたは修正することができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も高い頻度で観察され、そのため、その遺伝子の「正常」または「野生型」形態を恣意的に設定されている。対照的に、用語「改変型」または「（突然）変異型」とは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したとき、配列および/または機能特性の改変（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は単離することができる；これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したとき、それらが変化した特徴（変化した核酸配列など）を有するという事実によって同定される。
【００６２】
範囲：  本開示を通して、本発明の様々な局面を範囲形式で提示することが可能である。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことが理解されよう。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、全ての可能な部分範囲をも具体的に開示していると見なすべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、その範囲内の個々の数、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3および6だけでなく、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲を具体的に開示していると見なすべきである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
【００６３】
説明
脳卒中は鎌状赤血球貧血（SCA）のある子供にとって深刻な合併症である。SCAにおける脳卒中の原因はよくわかっておらず、医療専門家が脳卒中を回避するかまたはその生理学的影響を最小限に抑えるための治療アプローチを設計することができるように、脳卒中を引き起こすメカニズムを明確にする必要性に迫られている。ENPP1のコード領域における多型は、SCA患者における脳卒中の全体的なリスクと関連している：小児SCAにおける脳卒中リスクおよび脳卒中防止に関連するこれらの多型は、それぞれ、Q173（またはQ121）およびK173（またはK121）である。それぞれのアミノ酸残基のナンバリングは、N末端シグナル配列を含む未成熟ENPP1酵素（173位）、または成熟ENPP1酵素中のまったく同じ残基（121位）を指す。本発明の時点では、ENPP1の多型がSCA患者における脳卒中リスクを調節しているメカニズムは、不明であった。
【００６４】
本明細書で実証された予想外の知見では、ENPP1ホモアレルQQ遺伝型を有する、脳卒中のリスクがある小児患者は、ヘテロアレルKQ多型を有する個体よりも有意に低い血漿ピロリン酸（PPi）レベルを有していた（図1）。実際、脳卒中のリスクがあるSCA患者におけるPPiのレベルは、動脈壁血管石灰化のリスクがあり得るほどに低く、特定の態様では、こうした血管石灰化がこれらの患者における脳卒中リスクの生理学的メカニズムを提示している可能性がある。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、このことは、脳卒中の病因についての合理的な説明を提供する。
【００６５】
本発明の知見は、小児鎌状赤血球患者における脳卒中と、ENPP1活性と、血漿PPiとの間の直接的な関連性を確立するものである。これにより、小児鎌状赤血球患者において、彼らの血漿PPiレベルを上昇させ、かつ彼らの脳卒中のリスクを減少させる方法として、ENPP1またはENPP3由来のポリペプチド、変異体、または変異体断片を使用するための驚くべき基礎が提供される。
【００６６】
組成物
特定の態様において、本発明の組成物は、少なくとも1つの式（I）の化合物、またはその溶媒和物もしくは塩（例えば、薬学的に許容される塩）を含む：
PROTEIN-Z-DOMAIN-X-Y    (I)
式中、PROTEINは、ENPP1 (SEQ ID NO:1)、ENPP121 (SEQ ID NO:15)、ENPP71 (SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71 (SEQ ID NO:19)、ENPP51 (SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり；Aはタンパク質輸送配列であり；Bは存在しないか、またはSEQ ID NO:33中の残基Xaap-Xaa17に対応する配列であり、ここでpは1〜17の範囲の整数であり；DOMAINは存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)(例えばIgG1、IgG2、IgG3および/またはIgG4を含むが、これらに限定されない)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、およびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1つであり；XおよびZは独立して存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり；かつYは存在しないか、または
2019532915.tif 000004
からなる「骨ターゲティング」配列の群より選択される配列であり、ここでmは1〜15の範囲の整数であり、かつnは1〜10の範囲の整数である。
【００６７】
特定の態様では、AはSEQ ID NO:34〜39からなる群より選択される。他の態様では、Bは存在しないか、またはSEQ ID NO:40〜55からなる群より選択される。
【００６８】
特定の態様では、DOMAINはヒトIgG Fcドメインまたはその断片を含む。他の態様では、DOMAINは本質的にヒトIgG Fcドメインまたはその断片からなる。さらに他の態様では、DOMAINはヒトIgG Fcドメインまたはその断片からなる。
【００６９】
特定の態様では、DOMAINはヒト血清アルブミンタンパク質またはその断片を含む。他の態様では、DOMAINは本質的にヒト血清アルブミンタンパク質またはその断片からなる。さらに他の態様では、DOMAINはヒト血清アルブミンタンパク質またはその断片からなる。さらに他の態様では、DOMAINは存在しない。
【００７０】
特定の態様では、Yは負に荷電した骨ターゲティング配列である。特定の態様では、Yは存在しない。特定の態様では、Yは存在せず、かつ式（I）の化合物は負に荷電した骨ターゲティング配列を欠く。さらに他の態様では、ポリアスパラギン酸ドメインおよびSEQ ID NO:3〜14は、負に荷電した骨ターゲティング配列の非限定的な例である。
【００７１】
特定の態様では、PROTEINまたはその変異体は、ヌクレアーゼドメインを除去するようにトランケートされている。さらに他の態様では、PROTEINまたはその変異体は、SEQ ID NO:1に対して約524位の残基から約885位の残基までのヌクレアーゼドメインを除去するようにトランケートされて、SEQ ID NO:1に対して約186位の残基から約586位の残基までの触媒ドメインのみが残っており、該触媒ドメインは該タンパク質の触媒活性を維持するのに役立つ。
【００７２】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:15)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはL I Nである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINはSEQ ID NO:16を含む。
【００７３】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:17)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはL I Nである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINはSEQ ID NO:18を含む。
【００７４】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:19)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはL I Nである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINはSEQ ID NO:20を含む。
【００７５】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:24)-Z-(Fcまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはL I Nである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26)を含む。
【００７６】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:15)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはSEQ ID NO:28〜30からなる群より選択される1つである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINはSEQ ID NO:21を含む。
【００７７】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:17)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはSEQ ID NO:28〜30からなる群より選択される1つである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:17)-Z-(SEQ ID NO:27)を含み、ここでZはSEQ ID NO:28〜30からなる群より選択される1つである。
【００７８】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:19)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはSEQ ID NO:28〜30からなる群より選択される1つである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINはSEQ ID NO:22を含む。
【００７９】
特定の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINは、(SEQ ID NO:24)-Z-(ALBまたはその断片)を含む。他の態様では、Zはトリペプチドである。さらに他の態様では、ZはSEQ ID NO:28〜30からなる群より選択される1つである。さらに他の態様では、（I）において、PROTEIN-Z-DOMAINはSEQ ID NO:25を含む。
【００８０】
特定の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜18個のアミノ酸を含むポリペプチドである。他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜16個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜14個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜12個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜10個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜8個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜6個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜5個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜4個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜3個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜2個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または単一のアミノ酸である。
【００８１】
特定の態様では、mは1である。他の態様では、mは2である。さらに他の態様では、mは3である。さらに他の態様では、mは4である。さらに他の態様では、mは5である。さらに他の態様では、mは6である。さらに他の態様では、mは7である。さらに他の態様では、mは8である。さらに他の態様では、mは9である。さらに他の態様では、mは10である。さらに他の態様では、mは11である。さらに他の態様では、mは12である。さらに他の態様では、mは13である。さらに他の態様では、mは14である。さらに他の態様では、mは15である。さらに他の態様では、mの各存在は、独立して、1〜15、2〜15、3〜15、4〜15、5〜15、6〜15、7〜15、8〜15、9〜15、10〜15、11〜15、12〜15、13〜15、14〜15、1〜14、2〜14、3〜14、4〜14、5〜14、6〜14、7〜14、8〜14、9〜14、10〜14、11〜14、12〜14、13〜14、1〜13、2〜13、3〜13、4〜13、5〜13、6〜13、7〜13、8〜13、9〜13、10〜13、11〜13、12〜13、1〜12、2〜12、3〜12、4〜12、5〜12、6〜12、7〜12、8〜12、9〜12、10〜12、11〜12、1〜11、2〜11、3〜11、4〜11、5〜11、6〜11、7〜11、8〜11、9〜11、10〜11、1〜10、2〜10、3〜10、4〜10、5〜10、6〜10、7〜10、8〜10、9〜10、1〜9、2〜9、3〜9、4〜9、5〜9、6〜9、7〜9、8〜9、1〜8、2〜8、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、7〜8、1〜7、2〜7、3〜7、4〜7、5〜7、6〜7、1〜6、2〜6、3〜6、4〜6、5〜6、1〜5、2〜5、3〜5、4〜5、1〜4、2〜4、3〜4、1〜3、2〜3、および1〜2の範囲の整数からなる群より選択される。
【００８２】
特定の態様では、nは1である。他の態様では、nは2である。さらに他の態様では、nは3である。さらに他の態様では、nは4である。さらに他の態様では、nは5である。さらに他の態様では、nは6である。さらに他の態様では、nは7である。さらに他の態様では、nは8である。さらに他の態様では、nは9である。さらに他の態様では、nは10である。さらに他の態様では、nの各存在は、独立して、1〜10、2〜10、3〜10、4〜10、5〜10、6〜10、7〜10、8〜10、9〜10、1〜9、2〜9、3〜9、4〜9、5〜9、6〜9、7〜9、8〜9、1〜8、2〜8、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、7〜8、1〜7、2〜7、3〜7、4〜7、5〜7、6〜7、1〜6、2〜6、3〜6、4〜6、5〜6、1〜5、2〜5、3〜5、4〜5、1〜4、2〜4、3〜4、1〜3、2〜3、および1〜2の範囲の整数からなる群より選択される。
【００８３】
特定の態様では、PROTEINまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較して、膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間にフーリン（furin）切断部位を含むENPP1またはENPP3の細胞外領域のセグメントにより修飾される。他の態様では、PROTEINまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較して、膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間にフーリン切断部位を含むENPP1またはENPP3の細胞外領域のセグメントにより修飾されない。
【００８４】
特定の態様では、PROTEINまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較して、シグナルペプチダーゼ切断部位を含むENPP2の細胞外領域のセグメントにより修飾される。他の態様では、PROTEINまたはその変異体は、SEQ ID NO:1と比較して、シグナルペプチダーゼ切断部位を含むENPP2の細胞外領域のセグメントにより修飾されない。
【００８５】
特定の態様では、本発明の化合物は可溶性である。他の態様では、本発明の化合物は組換えポリペプチドである。さらに他の態様では、本発明の化合物は、ENPP1もしくはENPP3の膜貫通ドメインを欠くENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体を含む。さらに他の態様では、本発明の化合物は、ENPP1もしくはENPP3の膜貫通ドメインまたはその変異体が除去されており（および/またはトランケートされており）、非限定的な例としてENPP2などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインと置き換えられている、ENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００８６】
特定の態様では、本発明の化合物は、2つ以上の膜貫通ドメインをさらに含むENPP1もしくはENPP3ポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００８７】
特定の態様では、ENPP1またはENNP3は、ヒト免疫グロブリン1（IgG1）、ヒト免疫グロブリン2（IgG2）、ヒト免疫グロブリン3（IgG3）、および/またはヒト免疫グロブリン4（IgG4）のFcドメインにC末端で融合される。
【００８８】
特定の態様では、ENPP1またはENNP3は、ヒト血清アルブミンにC末端で融合される。
【００８９】
特定の態様では、ENPP1またはENNP3の断片および/もしくは変異体は、ヒト血清アルブミンまたはその変異体および/もしくは断片と融合される。ヒト血清アルブミンは、天然または人工のジスルフィド結合を含むがこれらに限定されない化学リンカーを介して、あるいはENPP1またはENNP3、またはその断片および/もしくは変異体への遺伝子融合によって、ENPP1またはENNP3タンパク質にコンジュゲートされ得る。
【００９０】
特定の態様では、本発明の化合物は、ENPP1またはENNP3の膜貫通ドメインと、非限定的な例としてENPP2などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインとを含む、ENPP1またはENNP3ポリペプチドまたはその変異体を含む。他の態様では、ENPP1またはENNP3ポリペプチドは、ENPP2膜貫通ドメインを含む前駆体ENPP1またはENNP3ポリペプチドの切断産物を含む。さらに他の態様では、ENPP2膜貫通ドメインは、NCBIアクセッション番号NP_001124335（SEQ ID NO:2）の12〜30位の残基を含み、これは以下の配列に対応する。
2019532915.tif 000005
【００９１】
特定の態様では、本発明の化合物は、SEQ ID NO:21、22および25からなる群より選択される配列を有する。
【００９２】
特定の態様では、本発明の化合物は、SEQ ID NO:21、22、25および(SEQ ID NO:17)-Z-(SEQ ID NO:27)からなる群より選択される配列を有する。
【００９３】
特定の態様では、本発明の化合物は、SEQ ID NO:16、18、20および(SEQ ID NO:24)-Z-(SEQ ID NO:26)からなる群より選択される配列を有する。
【００９４】
特定の態様では、本発明の化合物は2つ以上の膜貫通ドメインを有する。他の態様では、本発明の化合物はさらにペグ化される。さらに他の態様では、本発明の化合物は2つ以上の膜貫通ドメインを有し、さらにペグ化される。
【００９５】
特定の態様では、本発明の化合物は、約3.4(±0.4)s-1酵素-1以上のkcat値を有し、ここで、kcatは該化合物についてのATPの加水分解速度を測定することによって決定される。
【００９６】
特定の態様では、本発明の化合物は、約2μM以下のKM値を有し、ここで、KMは該化合物についてのATPの加水分解速度を測定することによって決定される。
【００９７】
特定の態様では、本発明の化合物は液体製剤として製剤化される。
【００９８】
特定の態様では、本発明の化合物は液体製剤として製剤化される。他の態様では、本発明は、治療量の本発明の化合物を含む薬学的組成物の乾燥製品形態を提供し、その場合、該乾燥製品は液体形態の該化合物の溶液へと再構成することが可能である。
【００９９】
本発明は、少なくとも1つの本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物と、本発明の方法の範囲内で該化合物を使用するための使用説明書とを含むキットを提供する。本発明はさらに、少なくとも1つの抗脳卒中治療薬と本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物とを含む組成物を提供する。
【０１００】
ENPP1のクローニング、発現および精製
特定の態様では、ENPP1ポリペプチドは可溶性である。他の態様では、ENPP1ポリペプチドは組換えENPP1ポリペプチドである。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP1膜貫通ドメインを欠くENPP1ポリペプチドを含む。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP1の膜貫通ドメインが除去されて、非限定的な例としてENPP2、ENPP5またはENPP7などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインと置き換えられている、ENPP1ポリペプチドを含む。
【０１０１】
特定の態様では、本発明のポリペプチドはIgG Fcドメインを含む。他の態様では、本発明のポリペプチドは、約2〜約20個またはそれ以上連続するアスパラギン酸残基のポリアスパラギン酸ドメインを含むまたは欠く。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、IgG Fcドメインおよび約2〜約20個またはそれ以上連続するアスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインを含む。さらに他の態様では、ENPP1ポリペプチドはトランケートされて、ヌクレアーゼドメインを欠く。さらに他の態様では、ENPP1ポリペプチドはトランケートされて、SEQ ID NO:1に対して約524位の残基から約885位の残基までのヌクレアーゼドメインを欠き、該タンパク質の触媒活性を維持する、SEQ ID NO:1に対して約186位の残基から約586位の残基までの触媒ドメインのみが残っている。
【０１０２】
特定の態様では、本発明のポリペプチドは、アルブミンまたはその一部（アルブミンドメイン）を含む。他の態様では、アルブミンドメインはENPP1ポリペプチドのC末端領域に位置する。他の態様では、IgG FcドメインがENPP1ポリペプチドのC末端領域に位置する。さらに他の態様では、IgFcドメインまたはアルブミンドメインの存在は、ENPP1ポリペプチドの半減期、溶解性を改善し、免疫原性を低下させ、かつENPP1ポリペプチドの活性を増大させる。
【０１０３】
特定の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP1ポリペプチドの前駆体の分泌をもたらすシグナルペプチドを含み、該前駆体はタンパク質分解プロセシングを受けてENPP1ポリペプチドを生成する。他の態様では、シグナルペプチドはENPP2、ENPP5およびENPP7のシグナルペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様では、シグナルペプチドはSEQ ID NO:37〜39からなる群より選択される。
【０１０４】
特定の態様では、IgG Fcドメインまたはアルブミンドメインは、リンカー領域によってENPP1ポリペプチドのC末端領域に連結される。他の態様では、リンカーはSEQ ID NO:3〜14から選択され、ここでnは1〜20の範囲の整数である。
【０１０５】
ENPP1、つまりENPP1ポリペプチドは、US 2015/0359858 A1に記載されるように調製することができる；これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ENPP1は、異なる膜内ドメインを有する、細胞表面に局在する膜貫通タンパク質である。ENPP1を可溶性の細胞外タンパク質として発現させるために、ENPP1の膜貫通ドメインをENPP2の膜貫通ドメインと交換することができる；これは、バキュロウイルス培養物の細胞外液への可溶性組換えENPP1の蓄積をもたらすか、またはHEK細胞から分泌されて、PCT公開番号WO 2014/126965、WO 2016/187408およびWO 2017/087936に記載されるように精製される；これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
ENPP3のクローニングおよび発現
特定の態様では、ENPP3ポリペプチドは可溶性である。他の態様では、ENPP3ポリペプチドは組換えENPP3ポリペプチドである。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP3の膜貫通ドメインを欠くENPP3ポリペプチドを含む。別の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP3の膜貫通ドメインが除去されて、非限定的な例としてENPP2、ENPP5またはENPP7などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインと置き換えられている、ENPP3ポリペプチドを含む。
【０１０７】
ある態様では、本発明のポリペプチドはIgG Fcドメインを含む。他の態様では、本発明のポリペプチドは、約2〜約20個もしくはそれ以上連続するアスパラギン酸残基のポリアスパラギン酸ドメイン、または2〜約20個連続するグルタミン酸残基を含むか、または欠く。さらに他の態様では、本発明のポリペプチドは、IgG Fcドメインおよび約2〜約20個またはそれ以上連続するアスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインを含む。
【０１０８】
特定の態様では、本発明のポリペプチドはアルブミンドメインを含む。他の態様では、アルブミンドメインはENPP3ポリペプチドのC末端領域に位置する。さらに他の態様では、IgG FcドメインがENPP3ポリペプチドのC末端領域に位置する。さらに他の態様では、IgG Fcドメインまたはアルブミンドメインの存在は、ENPP3ポリペプチドの半減期、溶解性を改善し、免疫原性を低下させ、かつENPP3ポリペプチドの活性を増大させる。
【０１０９】
特定の態様では、本発明のポリペプチドは、ENPP3ポリペプチドの前駆体の分泌をもたらすシグナルペプチドを含み、該前駆体はタンパク質分解プロセシングを受けてENPP3ポリペプチドを生成する。他の態様では、シグナルペプチドはENPP2、ENPP5およびENPP7のシグナルペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様では、シグナルペプチドはSEQ ID NO:37〜39からなる群より選択される。
【０１１０】
特定の態様では、IgG Fcドメインまたはアルブミンドメインは、リンカー領域によってENPP3ポリペプチドのC末端領域に連結される。他の態様では、リンカーはSEQ ID NO:3〜14から選択され、ここでnは1〜20の範囲の整数である。
【０１１１】
ENPP3は細胞表面への輸送が不十分である。可溶性のENPP3タンパク質は、ENPP3のシグナル配列を他のENPPの天然のシグナル配列と置き換えることによって構築される。可溶性ENPP3構築物は、ENPP7および/またはENPP5を含むがこれらに限定されない他のENPP酵素のシグナル輸送シグナル配列を使用することによって作製される。可溶性ENPP3構築物は、ENPP1とENPP2のシグナル配列の組み合わせ（以後「ENPP1-2-1」または「ENPP121」という）からなるシグナル配列を用いて作製される。他の公知のタンパク質のシグナル配列、例えば、限定するものではないが免疫グロブリンカッパおよびラムダ軽鎖タンパク質のシグナル配列もまた、ENPP3の細胞外ドメインを分泌の標的とするために使用することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の構築物に限定されると解釈されるべきではなく、ENPP3細胞外ドメインの酵素的に活性なトランケーションを含む構築物をも包含する。
【０１１２】
ENPP3およびENPP3融合タンパク質の産生と精製
ENPP3は、CHOまたはHEK293哺乳動物細胞において安定なトランスフェクションを確立することによって産生される。このタンパク質は付着細胞または浮遊細胞のどちらにおいても産生させることができる。安定な細胞株を樹立するために、ENPP3融合タンパク質をコードする核酸配列（本明細書の他の箇所に開示される配列など）が大規模なタンパク質産生に適したベクター中に挿入される。商業的供給源から入手可能なこれらのベクターは多様であり、それらのいずれを使用してもよい。
【０１１３】
例えば、図4は、適切なエンドヌクレアーゼ制限部位を含むpcDNA3プラスミドにクローン化されたENPP121-exNPP3-Fcのプラスミドマップを示す。タンパク質サブドメインは、融合タンパク質のシグナル配列、ENPP3の細胞外ドメイン、およびFcドメインを示すために色分けされている。クローン化されたタンパク質のアミノ酸配列もまた、該プラスミドマップの下に表示されて、融合タンパク質の各ドメインを示すために色分けされている。所望のタンパク質構築物を含むpcDNA3プラスミドは、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミンのような確立された技術を用いて、発現プラスミドに安定にトランスフェクトすることができ、また、安定にトランスフェクトされた細胞を増やすために抗生物質選択下で該細胞を増殖させることができる。
【０１１４】
その後、単一の安定にトランスフェクトされた細胞のクローンが樹立されて、所望の融合タンパク質の高発現クローンについてスクリーニングされる。ENPP3タンパク質発現についての単一細胞クローンのスクリーニングは、ENPP1について以前に記載されたように(Saunders, et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7(10):3352-62; Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006)、合成酵素基質pNP-TMPを用いて96ウェルプレートでハイスループットの方法により達成することができる。
【０１１５】
スクリーニングを通して高発現クローンが同定されたら、タンパク質の産生を、ENPP1について以前に記載されたように(Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006)、振盪フラスコまたはバイオリアクター内で行うことができる。
【０１１６】
ENPP3の精製は、当技術分野で公知の標準的な精製技術の組み合わせを用いて達成され得る。こうした技術は当技術分野において周知であり、カラムクロマトグラフィー、超遠心分離、ろ過および沈殿などの技術から選択される。カラムクロマトグラフィーによる精製は、プロテインAおよびプロテインG樹脂、ニッケルまたは銅などの金属アフィニティー樹脂などのアフィニティークロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー、ならびにC8〜C14樹脂を用いる逆相高圧クロマトグラフィー（HPLC）を用いて達成される。イオン交換も使用することができ、例えば、Q-セファロース（アニオン交換）およびSP-セファロース（カチオン交換）、ブルーセファロース樹脂およびブルーセファデックス樹脂、ヒドロキシアパタイト樹脂などの市販の樹脂を用いるアニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーが使用される。市販のS-75およびS200 Superdex樹脂を用いたサイズ排除クロマトグラフィーもまた、当技術分野で公知であるように、使用することができる。タンパク質を可溶化し、かつ上記のクロマトグラフィー工程のための選択媒体を提供するために使用される緩衝液は、タンパク質化学分野の当業者に知られている標準的な生物学的緩衝液である。
【０１１７】
調製に使用される緩衝液のいくつかの例としては、クエン酸、リン酸、酢酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、食塩水緩衝液、グリシン-HCL緩衝液、カコジル酸緩衝液、およびバルビタールナトリウム緩衝液が挙げられ、これらは当技術分野で周知である。単一の技術または一連の技術の組み合わせ、および適切なpHに調整された適切な緩衝液系を使用することにより、図1に示されるように、記載した融合タンパク質を粗製の物質から99％を超える純度にまで精製することができる。この図では、1回の精製工程の後に、部分精製ENPP3と粗出発物質がクマシー染色ポリアクリルアミドゲル上で隣り合わせで比較される。
【０１１８】
図3に示されるように、ENPP3の適切な分子量に対応する105kDよりわずかに大きい分子量のタンパク質は、1回の精製工程の後に右側のレーンに表示された粗出発物質から富化されている。その後、この物質は、純度約99％などの、かなり高い純度に達するように、上記のような追加の技術および/またはクロマトグラフィー工程を用いてさらに精製することができる。
【０１１９】
配列
ENPP1アミノ酸配列 (NCBIアクセッションNP_006199) (SEQ ID NO:1)
2019532915.tif 000006
【０１２０】
ENPP2アミノ酸配列 (NCBIアクセッションNP_001124335) (SEQ ID NO:2)
2019532915.tif 000007
【０１２１】
Dm (ここでmは1〜15の範囲の整数である) (SEQ ID NO:3)
(DSS)n (ここでnは1〜10の範囲の整数である) (SEQ ID NO:4)
(ESS)n (ここでnは1〜10の範囲の整数である) (SEQ ID NO:5)
(RQQ)n (ここでnは1〜10の範囲の整数である) (SEQ ID NO:6)
(KR)n (ここでnは1〜10の範囲の整数である) (SEQ ID NO:7)
Rm (ここでmは1〜15の範囲の整数である) (SEQ ID NO:8)
2019532915.tif 000008
Em (ここでmは1〜15の範囲の整数である) (SEQ ID NO:14)
【０１２２】
ENPP121アミノ酸配列(SEQ ID NO:15)
2019532915.tif 000009
一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2の1〜27位の残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1タンパク質（開始および終止）。
【０１２３】
ENPP121-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)
2019532915.tif 000010
2019532915.tif 000011
一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2の1〜27位の残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1タンパク質（開始および終止）； 太字：hIgG1 (Fc)。
【０１２４】
ENPP71アミノ酸配列(SEQ ID NO:17)
2019532915.tif 000012
一重下線：ENPP7； 二重下線：ENPP1タンパク質（開始および終止）。
【０１２５】
ENPP71-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:18)
2019532915.tif 000013
一重下線：ENPP7； 二重下線：ENPP1タンパク質（開始および終止）； 太字：hIgG1 (Fc)。
【０１２６】
(ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71)アミノ酸配列(SEQ ID NO:19)
2019532915.tif 000014
一重下線：ENPP7； 二重下線：ENPP1タンパク質（開始および終止）（ENPP1のN末端の最初の3アミノ酸、GLKが除かれる）。
【０１２７】
(ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71)-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:20)
2019532915.tif 000015
一重下線：ENPP7； 二重下線：ENPP1タンパク質（開始および終止）（ENPP1のN末端の最初の3アミノ酸が除かれる）； 太字：hIgG1 (Fc)。
【０１２８】
ENPP121-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:21)
2019532915.tif 000016
太字の斜体：ENPP1細胞質および膜貫通； 一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2の1〜27位の残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1膜貫通； プレーン：ENPP1細胞外ドメイン； 太字の下線：リンカー； 太字：アルブミン。
【０１２９】
(ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71)-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:22)
2019532915.tif 000017
二重下線：ENPP7； プレーンテキスト：ENPP1； 太字：スペーサー配列； 一重下線：アルブミン。
【０１３０】
IISLFTFAVGVNICLGFTA (SEQ ID NO:23)
【０１３１】
ENPP51アミノ酸配列(SEQ ID NO:24)
2019532915.tif 000018
下線：ENPP5； プレーン：ENPP1。
【０１３２】
ENPP51-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:25)
2019532915.tif 000019
二重下線：ENPP5； プレーン：ENPP1； 太字：スペーサー； 一重下線：アルブミン。
【０１３３】
ヒトIgG Fcドメイン, Fc (SEQ ID NO:26)
2019532915.tif 000020
【０１３４】
ALB (SEQ ID NO:27)
2019532915.tif 000021
【０１３５】
LIN (SEQ ID NO:28)
GGSGGS (SEQ ID NO:29)
RSGSGGS (SEQ ID NO:30)
【０１３６】
ENPP3アミノ酸配列(NCBIアクセッションNP_O14638-1) (SEQ ID NO:31)
2019532915.tif 000022
【０１３７】
ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:32)
2019532915.tif 000023
【０１３８】
exENPP3配列(SEQ ID NO:33)
2019532915.tif 000024
【０１３９】
ENPP7タンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:34)
2019532915.tif 000025
【０１４０】
ENPP121GLKタンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:35)
2019532915.tif 000026
太字の斜体：ENPP1細胞質および膜貫通； 一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2の1〜27位の残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1膜貫通。
【０１４１】
ENPP121タンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:36)
2019532915.tif 000027
太字の斜体：ENPP1細胞質および膜貫通； 一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2の1〜27位の残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1膜貫通。
【０１４２】
ENPP5タンパク質輸送シグナル配列(SEQ ID NO:37) 
2019532915.tif 000028
(ここで、Xaa23は存在しないか、LまたはLQである)
【０１４３】
ENPP7シグナル配列(SEQ ID NO:38)
2019532915.tif 000029
【０１４４】
ENPP7シグナル配列(SEQ ID NO:39)
2019532915.tif 000030
【０１４５】
ENPP121-NPP3-Fc配列(SEQ ID NO:56)
2019532915.tif 000031
太字の残基：ENPP1由来の配列。一重下線の残基：ENPP2由来のシグナルペプチド配列。二重下線の残基：サブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のいずれかに由来し得るIgG Fcドメインの配列。あるいは、Fcドメインの代わりに、アルブミンドメインを使用することができる。特定の態様では、ENPP3のC末端領域とFcドメインは可動性リンカーによって連結される。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーは、PEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
【０１４６】
ENPP7-ENPP3-Fc配列(SEQ ID NO:57)
2019532915.tif 000032
一重下線：ENPP7由来のシグナルペプチド配列。二重下線：サブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のいずれかに由来し得るIgG Fcドメインの配列。あるいは、Fcドメインの代わりに、アルブミンドメインを使用することができる。特定の態様では、ENPP3のC末端領域とFcドメインは可動性リンカーによって連結される。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーは、PEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
【０１４７】
ENPP5-ENPP3-Fc配列(SEQ ID NO:58)
2019532915.tif 000033
一重下線：ENPP5由来のシグナルペプチド配列。二重下線：サブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のいずれかに由来し得るIgG Fcドメインの配列。あるいは、Fcドメインの代わりに、アルブミンドメインを使用することができる。特定の態様では、ENPP3のC末端領域とFcドメインは可動性リンカーによって連結される。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーは、PEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
【０１４８】
アルブミン配列(SEQ ID NO:59)
2019532915.tif 000034
【０１４９】
ENPP121-ENPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:60)
2019532915.tif 000035
太字の残基：ENPP1由来の配列。一重下線：ENPP2由来のシグナルペプチド配列。二重下線：アルブミンドメインの配列。特定の態様では、ENPP3のC末端領域とFcドメインは可動性リンカーによって連結される。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーは、PEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
【０１５０】
ENPP7-ENPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:61)
2019532915.tif 000036
一重下線：ENPP7由来のシグナルペプチド配列。二重下線：アルブミンドメインの配列。特定の態様では、ENPP3のC末端領域とFcドメインは可動性リンカーによって連結される。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーは、PEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
【０１５１】
ENPP5-ENPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:62)
2019532915.tif 000037
一重下線：ENPP5由来のシグナルペプチド配列。二重下線：アルブミンドメインの配列。特定の態様では、ENPP3のC末端領域とFcドメインは可動性リンカーによって連結される。他の態様では、可動性リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーは、PEG鎖または多炭素鎖などの合成リンカーを含む。
【０１５２】
ENPP121-ENPP3-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:63)
2019532915.tif 000038
【０１５３】
ENPP121-ENPP3-アルブミンのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:64)
2019532915.tif 000039
2019532915.tif 000040
【０１５４】
hNPP3-hFc-pcDNA3のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:65)
2019532915.tif 000041
2019532915.tif 000042
2019532915.tif 000043
2019532915.tif 000044
【０１５５】
ENPP121-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:66)
2019532915.tif 000045
一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1残基の開始および終止を示す。太字の残基はIgG Fcドメインの残基を示す。
【０１５６】
ENPP71-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:67)
2019532915.tif 000046
一重下線：ENPP7残基。二重下線：ENPP1残基の開始および終止。太字：IgG Fcドメインの残基。
【０１５７】
ENPP51-Fcアミノ酸配列(SEQ ID NO:68)
2019532915.tif 000047
一重下線：ENPP5残基。二重下線：ENPP1残基の開始および終止。太字：IgG Fcドメインの残基。
【０１５８】
ENPP121-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:69)
2019532915.tif 000048
一重下線：転移位置(**)での切断を与えるためにENPP2残基と交換した残基； 二重下線：ENPP1残基の開始および終止を示す。太字：アルブミンの残基。太字の下線：リンカー領域。
【０１５９】
NPP71-ALBアミノ酸配列(SEQ ID NO:70)
2019532915.tif 000049
一重下線：ENPP7残基。二重下線：ENPP1残基の開始および終止。太字：アルブミンの残基。太字の下線：リンカー領域。
【０１６０】
ENPP121-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:71) 
2019532915.tif 000050
【０１６１】
ENPP121-アルブミンのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:72)
2019532915.tif 000051
2019532915.tif 000052
【０１６２】
ENPP7-1-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:73)
2019532915.tif 000053
【０１６３】
ENPP7-NPP1-アルブミンのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:74)
2019532915.tif 000054
2019532915.tif 000055
【０１６４】
ENPP3のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:75)
2019532915.tif 000056
【０１６５】
ENPP1のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:76)
2019532915.tif 000057
【０１６６】
方法
本発明は、鎌状赤血球貧血（SCA）患者における脳卒中を治療または予防する方法を提供する。特定の態様では、治療有効量の少なくとも1つの本発明の化合物を対象者に投与する。他の態様では、治療有効量の式（I）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を対象者に投与する：
PROTEIN-Z-DOMAIN-X-Y    (I)
式（I）中、
PROTEINは、ENPP1 (SEQ ID NO:1)、ENPP121 (SEQ ID NO:15)、ENPP71 (SEQ ID NO:17)、ENPP1 N末端GLKを欠くENPP71 (SEQ ID NO:19)、ENPP51 (SEQ ID NO:24)、およびA-B-SEQ ID NO:32からなる群より選択される少なくとも1つであり；
Aは、タンパク質輸送配列であり；
Bは、存在しないか、またはSEQ ID NO:33中の残基Xaap-Xaa17に対応する配列であり、ここでpは1〜17の範囲の整数であり；
DOMAINは、存在しないか、またはヒトIgG Fcドメイン(Fc)(例えばIgG1、IgG2、IgG3および/またはIgG4を含むが、これらに限定されない)、ヒト血清アルブミンタンパク質(ALB)、およびそれらの断片からなる群より選択される少なくとも1つであり；
XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり；かつ
Yは、存在しないか、または
2019532915.tif 000058
からなる「骨ターゲティング」配列の群より選択される配列であり、ここでmは1〜15の範囲の整数であり、かつnは1〜10の範囲の整数である。
【０１６７】
本発明は、少なくとも1つの抗脳卒中治療薬および本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物と、鎌状赤血球貧血患者における脳卒中を治療または予防するための本化合物および抗脳卒中治療薬の使用説明書とを含むキットを提供する。
【０１６８】
本発明はさらに、SCA患者に脳卒中のリスクがあるかどうかを検出する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、SCA患者由来のサンプル中のピロリン酸（PPi）の量を測定する段階、およびSCA患者由来のサンプル中のPPiの量を参照サンプル中のPPiの量と比較する段階を含んでなる。他の態様では、PPiの量が参照サンプル中よりもSCA患者由来のサンプル中で少ない場合、その患者は脳卒中のリスクがある。さらに他の態様では、この方法は、脳卒中のリスクがある患者に、治療有効量の本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を投与する段階をさらに含む。
【０１６９】
本発明はさらに、脳卒中のリスクが高いSCA患者における脳卒中を治療または予防する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、該患者に、治療有効量の本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を投与することを含む。
【０１７０】
式（I）またはその塩もしくは溶媒和物の特定の態様では、Yは存在せず、該化合物は負に荷電した骨ターゲティング配列を欠く。他の態様では、PROTEINはエクトヌクレオチドピロホスフェート/ホスホジエステラーゼ-2（ENPP2）膜貫通ドメインを含む。さらに他の態様では、PROTEINはENPP1膜貫通ドメインを欠く。さらに他の態様では、ENPP2膜貫通ドメインは、NCBIアクセッション番号NP_001124335（SEQ ID NO:2）の12〜30位の残基を含み、これは以下の配列：
2019532915.tif 000059
に対応する。さらに他の態様では、DOMAINはALBを含み、式（I）の化合物はポリアスパラギン酸ドメインを欠く。さらに他の態様では、DOMAINはIgG Fcドメインを含む。
【０１７１】
特定の態様では、前記化合物は、皮下、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、皮下、鼻腔内、口腔内、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼内、肺内、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路で投与される。他の態様では、該化合物を患者に静脈内投与する。さらに他の態様では、該化合物を患者に急性的または慢性的に投与する。さらに他の態様では、該化合物を患者に局所的に、局部的に、または全身的に投与する。さらに他の態様では、該化合物を、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として患者に投与する。
【０１７２】
特定の態様では、前記患者は少なくとも1つの抗脳卒中治療をさらに施される。抗脳卒中治療の例としては、限定するものではないが、抗凝固薬（すなわちワルファリン/クマジン）、抗血小板薬（すなわちアスピリン、クロピドグレル）、抗高血圧薬、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、外科的介入（すなわち頸動脈内膜切除術、血管形成術/ステント）、血管内手術（機械的血栓除去術）、およびヒドロキシウレアなどのSCAに特異的な治療薬が挙げられる。
【０１７３】
特定の態様では、本発明の化合物および少なくとも1つの抗脳卒中治療は、前記患者に同時に施される。他の態様では、本発明の化合物および少なくとも1つの抗脳卒中治療薬は、一緒に製剤化される。さらに他の態様では、本発明の化合物は、患者に投与される唯一の抗脳卒中治療薬である。さらに他の態様では、本発明の化合物は、患者における脳卒中を治療または予防するのに十分な量で患者に投与される唯一の抗脳卒中治療薬である。
【０１７４】
特定の態様では、前記対象者は哺乳動物である。さらに他の態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１７５】
特定の態様では、脳卒中を発症するリスクまたは脳卒中の重症度は、前記患者において最小限に抑えられる。他の態様では、脳卒中を発症するリスクのある人は、治療を受けるよう勧められる。さらに他の態様では、抗脳卒中治療がSCA患者に施される。さらに他の態様では、本発明の方法に従って患者を治療することは、患者の細胞外ピロリン酸濃度を増加させる。
【０１７６】
当業者であれば、本明細書に詳述される方法を含む本開示を身につけると、本発明は、罹患してしまった後の疾患または障害の治療に限定されないことが理解されよう。特に、疾患または障害の症状が対象者に有害と言ってよいほどに現れている必要はない；実際、疾患または障害は、治療が施される前に対象者において検出される必要はない。すなわち、本発明が利益を提供しうる前に、疾患または障害からの重大な病変が発生する必要はない。したがって、本発明は、本明細書で詳述するように、本明細書の他の箇所で説明した本発明の化合物またはその変異体を、疾患または障害の発症前に対象者に投与することができ、それによって疾患または障害が発症するのを予防するという点で、対象者における疾患および障害を予防するための方法を包含する。
【０１７７】
当業者であれば、本明細書の開示を身につけると、対象者における疾患または障害の予防は、本発明の化合物またはその変異体を、疾患または障害の予防対策として対象者に投与することを含む、ことが理解されよう。
【０１７８】
本発明は、本発明の方法を実施するために本発明の化合物またはその変異体を投与することを包含する；当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、本発明の化合物またはその変異体を製剤化する方法および対象者に投与する方法を理解するであろう。しかしながら、本発明は、いかなる特定の投与方法または治療レジメンにも限定されない。このことは特に、当技術分野で認められている脳卒中のモデルを用いた発明の実施化（reduction to practice）を含めて、本明細書に提供される開示を身につけた当業者が、本発明の化合物を投与する方法は薬理学分野の当業者によって決定され得ると認識する場合に、当てはまる。
【０１７９】
薬学的組成物および製剤
本発明は、本発明の方法の範囲内で、本発明の化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１８０】
そのような薬学的組成物は対象者への投与に適した形態をしており、つまり薬学的組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体、1つ以上の追加の成分、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。薬学的組成物の様々な成分は、当技術分野で周知のように、生理学的に許容される塩の形態で、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンとの組み合わせで、存在し得る。
【０１８１】
一態様では、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、1ng/kg/日〜100mg/kg/日の用量を送達するように投与され得る。他の態様では、本発明を実施するのに有用な薬学的組成物は、1ng/kg/日〜500mg/kg/日の用量を送達するように投与することができる。
【０１８２】
本発明の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加成分の相対量は、治療を受ける対象者の正体、体格および健康状態に応じて、さらに該組成物が投与される経路に応じて、変わるであろう。例として、該組成物は、約0.1％〜約100％（w/w）の活性成分を含み得る。
【０１８３】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺内、鼻腔内、口腔内、眼内、髄腔内、静脈内投与または他の投与経路用に適切に開発され得る。他の企図される製剤には、発射ナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再密封赤血球（resealed erythrocyte）、および免疫学的製剤が含まれる。投与経路は当業者には容易に明らかであり、治療される疾患の種類および重症度、治療される動物またはヒト患者のタイプおよび年齢などを含むいくつもの要因に左右される。
【０１８４】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を担体または1つ以上の他の補助成分と混合し、その後、必要ならばまたは望ましいならば、その製品を所望の単回または複数回投与単位に成形またはパッケージ化する工程を含む。
【０１８５】
本明細書で使用する「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量のことである。活性成分の量は、一般に、対象者に投与されるであろう活性成分の投与量に等しいか、あるいはそのような投与量の便利な分割量、例えばそのような投与量の2分の1または3分の1に等しい。単位剤形は、1日1回の服用のためであるか、または1日複数回の服用（例えば、1日に約1〜4回またはそれ以上）のうちの1回の服用のためであり得る。1日複数回の服用が採用される場合、単位剤形は各服用ごとに同じであっても異なっていてもよい。
【０１８６】
特定の態様では、前記組成物は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化される。特定の態様では、薬学的組成物は治療有効量の活性成分および薬学的に許容される担体を含む。有用である薬学的に許容される担体には、限定するものではないが、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、およびリン酸塩、有機酸の塩などの他の薬学的に許容される塩の溶液が挙げられる。これらおよび他の薬学的に許容される担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1991, Mack Publication Co., New Jerseyに記載されている。
【０１８７】
本発明の組成物は、組成物の全重量に対して約0.005％〜2.0％の防腐剤を含み得る。該組成物は、化合物の分解を抑制する酸化防止剤およびキレート剤を含むことができる。いくつかの化合物のための例示的な酸化防止剤は、組成物の全重量基準で、約0.01重量％〜0.3重量％の例示的範囲のBHT、BHA、α-トコフェロールおよびアスコルビン酸、例えば、0.03重量％〜0.1重量％の範囲のBHTである。
【０１８８】
投与/服用
投与のレジメンは、有効量を構成しているものに影響を及ぼし得る。例えば、いくつかの分割投与量、ならびに時差投与量（staggered dosage）は毎日または連続的に投与され、あるいは、その用量は持続注入されるか、またはボーラス注射であり得る。さらに、治療用製剤の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性によって示されるように、比例的に増加または減少させることができる。特定の態様では、対象者への本発明の化合物の投与は、対象者の血漿PPiを約2.5μMのレベルにまで上昇させる。
【０１８９】
患者、例えばヒトなどの哺乳動物、への本発明の組成物の投与は、公知の手順を用いて、患者の疾患または障害を治療するのに有効な投与量で、有効な期間にわたり行うことができる。治療効果を達成するのに必要な治療用化合物の有効量は、使用する特定の化合物の活性；投与時間；該化合物の排出率；治療期間；該化合物と併用される他の薬物、化合物または物質；治療される患者の疾患または障害の状態、年齢、性別、体重、体調、全体的な健康状態、過去の病歴；医学分野で周知の同様の要因などの、諸要因によって変わり得る。投薬レジメンは、最適な治療応答が得られるように調整することができる。例えば、数回に分割した用量を毎日投与するか、または治療状況の緊急性で示されるようにその用量を比例的に減らすことが可能である。本発明の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、約0.01〜50mg/kg体重/日である。当業者であれば、過度の実験をすることなく、関連する要因を検討して、治療用化合物の有効量に関する決定を下すことができよう。
【０１９０】
前記化合物は、1日に数回程度の頻度で患者に投与することができ、あるいは、より少ない頻度で、例えば1日1回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回、またはさらに少ない頻度で、例えば数ヶ月に1回、年に1回以下でさえも、投与することができる。当然のことながら、1日あたりに服用される化合物の量は、非限定的な例として、毎日、1日おき、2日おき、3日おき、4日おき、または5日おきに投与することができる。例えば、1日おきの投与では、1日5mgの服用を月曜日に開始し、次に1日5mgを水曜日に服用し、続いて1日5mgを金曜日に服用するなどである。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、治療される疾患の種類および重症度、患者のタイプおよび年齢などを含むがこれらに限定されない、いくつもの要因に左右される。
【０１９１】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性を示すことなく、特定の患者、組成物および投与方法に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変えることができる。
【０１９２】
当業者である医師、例えば臨床医または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、臨床医または獣医師は、薬学的組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされる量よりも少ないレベルで開始し、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させることができる。
【０１９３】
特定の態様では、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、本化合物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、治療される患者に単一の投与量として適している物理的に個別の単位を指す；各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の治療用化合物を、必要な医薬用ビヒクルと混合して含む。本発明の単位剤形は、（a）治療用化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（b）患者の疾患または障害の治療のためにそのような治療用化合物を調合/製剤化する技術に内在している制限、によって決まり、かつそれらに直接左右される。
【０１９４】
特定の態様では、本発明の組成物は、1日に1〜5回またはそれ以上の範囲の投薬で患者に投与される。他の態様では、本発明の組成物は、1日に1回、2日に1回、3日に1回、1週間に1回、および2週間に1回を含むがこれらに限定されない投薬の範囲で患者に投与される。当業者には容易に明らかなように、本発明の様々な組み合わせの組成物の投与頻度は、年齢、治療すべき疾患または障害、性別、全体的な健康状態、その他の要因を含むがこれらに限定されない多くの要因に応じて、対象者ごとに異なる。したがって、本発明は特定の投薬レジメンに限定されると解釈されるべきではなく、患者に投与される正確な投与量および組成は、その患者に関する他の全ての要因を考慮に入れて主治医によって決定されるであろう。
【０１９５】
投与のための本発明の化合物は、約1μg〜約7,500mg、約20μg〜約7,000mg、約40μg〜約6,500mg、約80μg〜約6,000mg、約100μg〜約5,500mg、約200μg〜約5,000mg、約400μg〜約4,000mg、約800μg〜約3,000mg、約1mg〜約2,500mg、約2mg〜約2,000mg、約5mg〜約1,000mg、約10mg〜約750mg、約20mg〜約600mg、約30mg〜約500mg、約40mg〜約400mg、約50mg〜約300mg、約60mg〜約250mg、約70mg〜約200mg、約80mg〜約150mgの範囲、およびそれらの間のありとあらゆる全部または一部の増加量であり得る。
【０１９６】
いくつかの態様では、本発明の化合物の用量は約0.5μg〜約5,000mgである。いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物に使用される本発明の化合物の用量は、約5,000mg未満、約4,000mg未満、約3,000mg未満、約2,000mg未満、約1,000mg未満、約800mg未満、約600mg未満、約500mg未満、約200mg未満、または約50mg未満である。同様に、いくつかの態様では、本明細書に記載の第2の化合物の用量は、約1,000mg未満、約800mg未満、約600mg未満、約500mg未満、約400mg未満、約300mg未満、約200mg未満、約100mg未満、約50mg未満、約40mg未満、約30mg未満、約25mg未満、約20mg未満、約15mg未満、約10mg未満、約5mg未満、約2mg未満、約1mg未満、または約0.5mg未満、およびそれらのありとあらゆる全部または一部の増加量である。
【０１９７】
特定の態様では、本発明は、治療有効量の本発明の化合物を、単独でまたは第2の薬剤と組み合わせて、保持する容器；および患者の疾患または障害の1つ以上の症状を治療、予防または軽減するために該化合物を使用するための説明書；を含むパッケージ化された薬学的組成物に関する。
【０１９８】
投与経路
本発明の組成物の投与経路には、吸入、経口、経鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬、（経）尿道、膣（例えば、経膣および膣周囲）、（経）鼻、（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、髄腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、および局所投与が含まれる。
【０１９９】
適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ジェルキャップ、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、粉末、ペレット、マグマ、ロゼンジ、クリーム、ペースト、プラスター、ローション、ディスク、坐剤、鼻腔内または経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥粉末またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用であり得る製剤および組成物は、本明細書に記載される特定の製剤および組成物に限定されないことを理解されたい。
【０２００】
経口投与
経口適用には、錠剤、糖衣錠、液剤、滴剤、坐剤、またはカプセル剤、カプレット剤およびジェルキャップ剤が特に適している。経口投与に適した他の製剤には、粉末または顆粒製剤、水性または油性懸濁液剤、水性または油性溶液剤、ペースト剤、ゲル剤、練り歯磨き、マウスウォッシュ、コーティング剤、経口リンス剤、または乳濁液剤が含まれるが、これらに限定されない。経口使用を意図した組成物は、当技術分野において公知の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適している不活性の非毒性の医薬用添加剤からなる群より選択される1つ以上の添加剤を含み得る。そのような添加剤には、例えば、ラクトースなどの不活性希釈剤；コーンスターチなどの造粒剤および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ならびにステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が含まれる。
【０２０１】
非経口投与
本明細書で使用するとき、薬学的組成物の「非経口投与」には、対象者の組織の物理的破損を特徴とする投与経路、および組織の裂け目からの薬学的組成物の投与経路が含まれる。したがって、非経口投与には、限定するものではないが、薬学的組成物の注射、外科的切開部を通しての該組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通しての該組成物の適用などによる、薬学的組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与は、限定するものではないが、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技術を含むことが意図される。
【０２０２】
非経口投与に適した薬学的組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張食塩水などの、薬学的に許容される担体と組み合わされた、活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、パッケージ化、または販売され得る。注射用製剤は、アンプルまたは防腐剤を含む複数回投与用の容器などの単位剤形で調製、パッケージ化、または販売され得る。非経口投与用の製剤には、懸濁液剤、溶液剤、油性もしくは水性ビヒクル中の乳濁液剤、ペースト剤、および埋め込み可能な持続放出製剤または生分解性製剤が含まれるが、これらに限定されない。そのような製剤は、懸濁化剤、安定化剤、または分散化剤を含むがこれらに限定されない1つ以上の追加の成分をさらに含むことができる。非経口投与用の製剤の一態様では、活性成分は、再調製された組成物の非経口投与に先立って適切なビヒクル（例えば、発熱物質除去蒸留水）を加えて再調製するための、乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。
【０２０３】
追加の投与形態
本発明のさらなる剤形には、米国特許第6,340,475号、第6,488,962号、第6,451,808号、第5,972,389号、第5,582,837号、および第5,007,790号に記載の剤形が含まれる。本発明のさらなる剤形には、米国特許出願第20030147952号、第20030104062号、第20030104053号、第20030044466号、第20030039688号、および第20020051820号に記載の剤形も含まれる。本発明のさらなる剤形には、PCT出願番号WO 03/35041、WO 03/35040、WO 03/35029、WO 03/35177、WO 03/35039、WO 02/96404、WO 02/32416、WO 01/97783、WO 01/56544、WO 01/32217、WO 98/55107、WO 98/11879、WO 97/47285、WO 93/18755、およびWO 90/11757に記載の剤形も含まれる。
【０２０４】
制御放出製剤および薬物送達システム
本発明の薬学的組成物の制御放出または持続放出製剤は、従来の技術を用いて製造することができる。いくつかの場合には、使用される剤形は、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性の膜、浸透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはミクロスフェア、または様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するそれらの組み合わせを使用して、その剤形中の1つ以上の活性成分の徐放または制御放出として提供することができる。制御放出に適している経口投与用の単一の単位剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ジェルキャップ剤、およびカプレット剤は、本発明に包含される。
【０２０５】
特定の態様では、本発明の製剤は、短期放出製剤、急速オフセット（rapid-offset）放出製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、持続放出、遅延放出およびパルス放出製剤であり得るが、これらに限定されない。
【０２０６】
持続放出という用語は、その従来の意味で使用され、長期間にわたって薬物を徐々に放出し、かつ、必ずではないが、長期間にわたって実質的に一定の血中薬物濃度をもたらすことができる薬物製剤を指す。その期間は1ヶ月以上もの長さであり得、同量の薬剤がボーラス形態で投与されたときよりも長い放出であるべきである。持続放出のために、本化合物は、その化合物に徐放性を与える適切なポリマーまたは疎水性材料を用いて製剤化することができる。こうして、本発明の方法で使用するための化合物は、微粒子の形態で、例えば注射によって、またはウエハーもしくはディスクの形態で埋め込みによって、投与することができる。本発明の特定の態様では、本発明の化合物は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、持続放出製剤を用いて患者に投与される。
【０２０７】
遅延放出という用語は、本明細書ではその従来の意味で使用され、薬物の投与後に若干遅れて薬物の初期放出をもたらし、かつ、必ずではないが、約10分から最大約12時間の遅延を含むことができる薬物製剤を指す。パルス放出という用語は、本明細書ではその従来の意味で使用され、薬物の投与後に薬物のパルス血漿プロファイルを生じるような方法で薬物の放出をもたらす薬物製剤を指す。即時放出という用語は、その従来の意味で使用され、薬物投与の直後に薬物の放出をもたらす薬物製剤を指す。
【０２０８】
本明細書で使用するとき、短期は、薬物投与後の約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分までの任意の期間、およびそのありとあらゆる全部または一部の増分を指す。
【０２０９】
本明細書で使用するとき、急速オフセットは、薬物投与後の約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分までの任意の期間、およびそのありとあらゆる全部または一部の増分を指す。
【０２１０】
当業者は、本明細書に記載される特定の手順、態様、請求項および実施例に対する多数の均等物を認識するか、または慣例的な実験だけを用いて確かめることができるであろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあるとみなされ、添付の特許請求の範囲によって包含される。例えば、反応時間、反応サイズ/体積、実験の試薬、例えば溶媒、触媒、圧力、大気条件、例えば窒素雰囲気、還元剤/酸化剤を含むがこれらに限定されない反応条件を、当技術分野で承認されている代替条件に、慣例的な実験だけを用いて変更することは、本出願の範囲内であることが理解されよう。
【０２１１】
値および範囲が本明細書に提供される場合は常に、これらの値および範囲によって包含される全ての値および範囲が本発明の範囲内に包含されるものである、ことを理解すべきである。さらに、これらの範囲内に入る全ての値、ならびに値の範囲の上限または下限もまた、本出願によって企図される。
【０２１２】
以下の実施例は、本発明の局面をさらに説明するものである。しかしながら、それらは、本明細書に記載される本発明の教示または開示を決して限定するものではない。
【実施例】
【０２１３】
本発明について、以下の実施例を参照しながら説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明はこれらの実施例に限定されるのではなく、むしろここに提供される教示の結果として明白なあらゆる変形例を包含する。
【０２１４】
実施例1：
ENPP1酵素の多型は、小児鎌状赤血球貧血（SCA）患者における脳卒中リスクまたは脳卒中防止と関連している：具体的には、成熟ENPP1酵素の121位のグルタミンまたはリシンの存在。ホモアレルQQ遺伝型を有する患者は、ヘテロアレルKQ遺伝型を有する患者、またはホモアレルKK遺伝型を有する患者と比較して、脳卒中を起こす可能性が高い。
【０２１５】
ホモアレルQQ遺伝型、ヘテロアレルKQ遺伝型、またはホモアレルKK遺伝型を有する鎌状赤血球貧血患者において血漿無機ピロリン酸（PPi）レベルを測定した。血漿PPiレベルはホモアレルQQ遺伝型を有するSCA患者において極端に低く、平均レベルは0.89±0.30μMであった（図1）。これは、脳卒中のリスクのないホモアレルKK遺伝型の個体において報告された約3.3±0.20μMの血漿レベルと比較される。実際、ホモアレルQQ遺伝型のSCA患者（脳卒中のリスクがある）の血漿PPiレベルは、血管、組織および網膜の石灰化を誘発する単因子遺伝性疾患（monogenic disease）である弾性線維性仮性黄色腫（Pseudoxanthoma Elasticum：PxE）の患者と同じ範囲内であった。PxE患者は約0.5μMの血漿PPiレベルを示す。PxE患者も血管石灰化のリスクがある。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ENPP1の酵素活性の低下は、血漿PPiレベルを低下させて、増加した血管石灰化の生理学的メカニズムを通じて小児鎌状赤血球貧血患者が脳卒中を発症する原因となり得る。ホモアレルQQ遺伝型を有する鎌状赤血球貧血患者（脳卒中のリスクがある）に、本明細書に記載されるような、外因性ENPP1またはENPP3などの、本発明の化合物を補給することは、これらの子供に特有の血栓性脳卒中を予防するのに役立ち得る。
【０２１６】
ENPP1のKQ多型がENPP1酵素の触媒活性の増加をもたらすかどうかを調べるために、一連の実験を計画した。K121およびQ121 ENPP1アイソフォームのATP加水分解速度を直接比較したところ、これら2つの酵素は同一の触媒活性を有することが明らかになった（図2）；それゆえに、この多型は該酵素の触媒反応速度の変化を誘発しなかった。
【０２１７】
酵素の多型は、触媒反応速度とは無関係に、例えば、タンパク質の安定性の低下、タンパク質の発現の低下、または未知のメカニズムなどによって、触媒活性に影響を及ぼす可能性がある。成熟酵素の121位の多型が全体的な触媒活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、121位のQについてホモアレルの患者の血漿PPiを、同じ位置のQまたはKについてヘテロアレルの患者のものと比較した。Q多型は血漿PPiの統計的に有意な減少を示すことが観察され、それによって、脳卒中リスクを高めるための生理学的メカニズムが確立された。
【０２１８】
本発明の知見は、小児鎌状赤血球症患者における脳卒中とENPP1活性と血漿PPiの間の直接的な関連性を確立し、本明細書に記載の化合物および方法を用いて血漿PPiを上昇させるように設計された酵素補給により治療するための驚くべき基礎を提供する。
【０２１９】
本発明の知見はまた、小児鎌状赤血球集団における脳卒中の遺伝型リスク評価（ENPP1 121 Q多型）およびバイオマーカーリスク評価（血漿PPi濃度）に基づいた、脳卒中の予防的処置方法を可能にする。この方法は、鎌状赤血球貧血患者における脳卒中リスクの新規かつこれまで未知の発症メカニズム - ENPP1活性の低下 - に真正面から取り組むものである。
【０２２０】
本明細書に引用されたありとあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２１】
本発明は特定の実施態様に関して開示されているが、本発明の他の実施態様および変形態様を、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者が考案し得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施態様および等価の変形態様を包含すると解釈されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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