(57)【要約】  少なくとも二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を少なくとも部分的に低減させた突然変異体である植物体またはその一部であって、該二つのＨＭＡが、（ｉ）配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、もしくは（ｉｉｉ）ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり；そこで、（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたＨＭＡのうちの一つの発現または活性が部分的に低下するかまたは失われ、（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたＨＭＡのうちの一つの発現または活性が対照植物体に比べて失われ；該突然変異体である植物体またはその一部が、該突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示す、該突然変異体である植物体またはその一部について、本明細書で説明している。【選択図】図１
2019503187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を少なくとも部分的に低減させた突然変異体である植物体またはその一部であって、前記二つのＨＭＡが、
（ｉ）  配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｉｉ）  （ｉ）に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（ｉｉｉ）  ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、
前記突然変異体である植物体またはその一部が、前記突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示す、前記突然変異体である植物体またはその一部。
【請求項２】
（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたＨＭＡのうちの一つの発現または活性が部分的に低下するかまたは失われ、（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたＨＭＡのうちの一つの発現または活性が対照植物体に比べて失われる、請求項１に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
【請求項３】
収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じであり、好適には、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、請求項１または請求項２に記載の突然変異体である植物体またはその一部。
【請求項４】
（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたポリヌクレオチド配列の各々の制御領域において、またはコード配列において、少なくとも一つの遺伝子改変を含み、好適には、前記突然変異にはミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異が備わる、請求項１〜３のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部。
【請求項５】
以下の突然変異の群のうちの一つ以上を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部であって：
配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１〜２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１または２９３または２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３〜２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異であり、好適には、そこで、前記植物体が、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３または２３４または２３５または２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含み；
配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２〜４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異であり；前記突然変異体である植物体またはその一部が、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２または４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含み；
配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおけるアミノ酸位置２６５に対応する少なくとも一つの突然変異；
配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号３に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのＰ／Ｎドメイン第二細胞質ループの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１〜２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１または２９３または２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３〜２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異であり、好適には、そこで、前記植物体が、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３または２３４または２３５または２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含み；
配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２〜４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２または４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおけるアミノ酸位置２６５に対応する少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；
配列番号４に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；ならびに
配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのＰ／Ｎドメイン第二細胞質ループの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異  ；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、のうちの一つ以上を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部。
【請求項６】
以下の突然変異の群であって：
配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＷ２６５＊＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＬ２２３Ｆであり；
配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＧ２３５Ｅであり；
配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＬ２２３Ｆであり；
配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＤ２３４Ｎであり；
配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＧ２３５Ｅであり；
配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＬ２２３Ｆであり；
配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＤ２３４Ｎであり；
配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＧ２３５Ｅであり；
配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＷ２６５＊＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＱ４６４＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＬ２２３Ｆであり；
配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＥ２９６ＫおよびＧ２３５Ｅであり；
配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＬ２２３Ｆであり；
配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＤ２３４Ｎであり；
配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＴ４０２ＩおよびＧ２３５Ｅであり；
配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＬ２２３Ｆであり；
配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＤ２３４Ｎであり；
配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＧ２５１ＤおよびＧ２３５Ｅであり；
配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；
配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、前記突然変異はＨ４３８ＹおよびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表す、突然変異の群のうちの一つを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部。
【請求項７】
圃場栽培植物体の葉におけるカドミウムレベルの低減方法であって、前記方法が、
（ａ）  二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を低減させる工程であって、前記二つのＨＭＡが、
（ｉ）  配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｉｉ）  （ｉ）に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（ｉｉｉ）  ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、
好適には、前記ＨＭＡの発現または活性が突然変異誘発またはゲノム編集により低下する、前記低減させる工程と；
（ｂ）  前記植物体を圃場で栽培する工程と；
（ｃ）  任意選択的に、工程（ｂ）で得られた前記植物体におけるカドミウム含有量を測定する工程と；
（ｄ）  そこでの前記カドミウム含有量が、前記ＨＭＡの発現または活性が減少していない対照植物体に比べて減少する植物体を特定する工程であって、好適には、前記植物体またはその一部が、前記植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、前記対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示し；好適には、収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じであり、好適には、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない前記特定する工程と、を含む、前記方法。
【請求項８】
圃場栽培植物体における一つ以上の遺伝子改変を特定する方法であって、前記一つ以上の遺伝子改変が、前記一つ以上の遺伝子改変を含まない圃場栽培対照植物体と比べた場合の葉中のカドミウムレベルの低減と関連し、
（ａ）  圃場で栽培された場合に、前記圃場で栽培された対照植物体に比べて前記葉中のカドミウムレベルを低減させた植物体を特定する工程であって、任意選択的に、収穫時の前記植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じであり、好適には、前記植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、前記特定する工程と；
（ｂ）  工程（ａ）で特定された植物体に由来する核酸試料を提供する工程と；
（ｃ）  工程（ｂ）由来の核酸試料において、配列番号１および配列番号２に記載された非突然変異配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するＨＭＡをコードするポリヌクレオチド配列中か、または配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列中の一つ以上の遺伝子改変を特定する工程と、を含む、前記方法。
【請求項９】
好適には、前記植物材料が乾燥処理または乾燥済み植物材料であり、好適には、収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じであり、好適には、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、請求項１から請求項７のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部に由来する植物材料。
【請求項１０】
圃場で栽培した場合に、圃場栽培対照植物体と比べて葉中のカドミウムの蓄積を低減させた植物材料を生成する方法であって、
（ａ）  請求項１から請求項６のいずれかに記載の突然変異体である植物体またはその一部を提供する工程と；
（ｂ）  前記植物体を前記圃場で栽培する工程と；
（ｃ）  前記植物体から植物材料を収穫する工程であって、好適には、収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じであり、好適には、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、前記収穫する工程と、を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法によって得られるかまたは得ることが可能なものから誘導されたか、または誘導可能な突然変異体である植物体もしくはその一部または植物材料であって、好適には、収穫時の前記突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の前記対照植物体と同じであり、好適には、前記突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の前記対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、前記突然変異体である植物体もしくはその一部または植物材料。
【請求項１２】
請求項１から請求項６、もしくは請求項１１のいずれかに記載の突然変異体である植物体もしくはその一部、または請求項９に記載の植物材料のうちの少なくとも一部を含む、植物産物。
【請求項１３】
請求項１から請求項６、もしくは請求項１１のいずれかに記載の突然変異体である植物体もしくはその一部、または請求項９に記載の植物材料、または請求項１２に記載の植物産物を含む、たばこ製品もしくは喫煙物品、または消耗製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
土壌には元々数多くの重金属が含まれており、植物に様々な程度で取り込まれる。マンガンまたは亜鉛などの一部の重金属は植物体に必要不可欠であるが、これは、それらの重金属が酵素活性に必要な補因子であるからである。他の重金属は植物体に不可欠なものではなく、重金属濃度を低減させることが有益となる場合がある。カドミウム（Ｃｄ）は、植物体またはヒトの発育への有益な作用が何ら報告されていない金属の一つである。カドミウムは、既知のヒト発癌物質として分類されている。Ｃｄが植物体に過剰に蓄積されると、葉表面の減少、乾燥重量の減少、水含有量の減少、クロロフィル含有量の減少、およびカロテノイド含有量の減少などの種々の有害作用が引き起こされることがある。たばこは、Ｃｄを、根よりも苗条に４倍高いレベルで蓄積する性能によって特徴づけられる植物種である。たばこなどの植物体では、Ｃｄの蓄積を低減可能であることが望ましい。たばこなどの植物体では、特に、量産に向けて大規模に開放圃場で屋外栽培される場合に、Ｃｄの蓄積を低減可能であることが望ましい。
【０００２】
植物体におけるＣｄの蓄積程度は、遺伝子型の複雑性と生長環境とに起因した複数のパラメータに依存して変わりうる。例えば、圃場栽培されたたばこ葉におけるＣｄ濃度は、農業気候、土壌パラメータ、および栽培品種などの因子に依存して変わりうる。圃場栽培されたたばこ葉（中央脈および葉脈を含む）で測定されたＣｄ濃度は、平均して、およそ０．５〜５ｐｐｍ（百万分率、すなわちたばこ葉の乾燥重量１ｇ当たりのμｇ（μｇ／ｇ））の範囲になりうる。それより低い値も高い値も０〜６．７８ｐｐｍの範囲で観測されている（Ｌｕｇｏｎ−Ｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００３】
たばこ葉におけるＣｄ蓄積を低減させるために、様々な試みがなされてきた。一つの方法は、根液胞内にＣｄを隔離することによって、苗条におけるＣｄの蓄積を低減させるものである。これは、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＣＡＸ２およびＣＡＸ４というカルシウムおよびマンガンの液胞トランスポーターを、たばこの根に過剰発現させることによって成し遂げられていた（Ｋｏｒｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００４】
植物体の葉におけるＣｄの蓄積を、遺伝子不活性化を用いて低減させる、非遺伝子組み換え生物体（非ＧＭＯ）手法の開発が望ましい場合がある。ヨーロッパを含めた国々では遺伝子組み換え作物を栽培し市場に出すことが困難になっているため、遺伝子工学技術を用いるよりも、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）などを用いた処理で得られる一塩基多型を特徴とする突然変異体を扱うのが望ましい可能性がある。突然変異体は、突然変異が人工的に誘発された場合であってもＧＭＯとは見なされない。例えばＥＵでは、突然変異育種由来の植物体には特段の規制がないのである。
【０００５】
国際公開第２０１２／０４１９１３号には、葉中の重金属含有量を低減させたたばこ植物体について記載されている。これは、ＨＭＡ遺伝子に少なくとも一つの突然変異を含むたばこ植物体を使用することによって実現されている。突然変異により、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに少なくとも一つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入が生じ、植物体の葉による重金属の取り込み量が減少する。種々の単一突然変異は、国際公開第２０１２／０４１９１３号で特定され、本明細書の表１にまとめられている。この引用文献は、水栽培された小植物体のデータを示している。このシステムでは、非常に高濃度のＣｄとＺｎとが含まれていたが、これは開放圃場システムの条件を反映するものではない。こうしたシステムの対照植物体の葉で測定されたＣｄ濃度は、土壌条件下で見られるＣｄ濃度よりも３０倍〜３００倍高い。
【０００６】
Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）には、ＥＭＳ処理により得られた突然変異を用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＨＭＡ２およびＨＭＡ４のたばこオルソログを不活性化させた結果が報告されている。ＡｔＨＭＡ２およびＡｔＨＭＡ４は、亜鉛（Ｚｎ）とＣｄの両方を根から苗条に輸送する重金属ＡＴＰアーゼ144（ＨＭＡ）をコードする。ＡｔＨＭＡ２およびＡｔＨＭＡ４遺伝子に対する二つのオルソログは、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍゲノムで特定されており、それぞれＮｔＨＭＡαおよびＮｔＨＭＡβと命名されていた。葉中のＣｄレベルを低減させるたばこ系統を得るために、この手法を用いることができるかどうかを発現を改変して判定した。たばこにおけるこれらのＮｔＨＭＡ遺伝子の役割を検討するために、ＮｔＨＭＡ遺伝子のうちのどちらか一方に突然変異を含むたばこ系統を、ＥＭＳ突然変異誘発変異体コレクションのスクリーニングによって特定した。ミスセンス突然変異（Ｐ２４９Ｓ、Ｅ３８７Ｋ、Ｇ５１５Ｒ）およびナンセンス突然変異（Ｗ２６５＊、Ｒ５２９＊）が、ＮｔＨＭＡα（Ｐ２９４Ｓ、Ｅ３８７Ｋ、Ｗ２６５＊）またはＮｔＨＭＡβ（Ｇ５１５Ｒ、Ｒ５２０＊）のどちらかにおいて特定された。これらの突然変異により、ＨＭＡタンパク質の第二細胞質ループ（Ｐ２９４Ｓ、Ｗ２６５＊）および第三細胞質ループ（Ｅ３８７Ｋ、Ｇ５１５Ｒ、Ｒ５２０＊）において、アミノ酸が変わるかまたは未成熟終止コドンが導入された。Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）によって生成されたホモ接合単一突然変異体系統を、ムラシゲスクーグ培地を含有する寒天平板で人工的な無菌状態下において栽培した。単一突然変異体を用いて得られた結果は、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の図４ａおよび図４ｂに示されている通りであり、本明細書では表２にまとめられている。単一突然変異体により、苗条においてＣｄとＺｎの蓄積が減少したと報告されている。単一突然変異体である植物体は、野生型と同等に生長かつ発育したと報告されている。両方のＮｔＨＭＡ遺伝子にナンセンス突然変異を含む植物体は、著しい発育不全が見られ、種子を生成しなかった。図４ａおよび図４ｂに示されたデータは、無菌培養で栽培された小植物体を用いて得られており、その培養では、意図的に高いＣｄ濃度とＺｎ濃度とが用いられているのが明らかである。これらの意図的に高いＣｄ濃度とＺｎ濃度は、開放圃場条件で見られる自然状態を反映していない。図４ａの対照植物体の苗条で測定されたＣｄ濃度は約１３５ｐｐｍである。これらの濃度は、圃場条件下で栽培される植物体で見られるＣｄ濃度と比較して、約３０倍〜３００倍高い濃度である。ＥＭＳ処理で得られた一塩基多型を含む突然変異体を用いたこれらの検討結果に基づき、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）で結論付けられたのは、ＮｔＨＭＡα／βの機能は、通常の生長および発育のために少なくとも部分的に保持される必要があり、また苗条にＣｄを含まない商業的に価値のあるたばこ植物体は、二つのＮｔＨＭＡ遺伝子を不活性化するだけでは工学的に作り出すことはできないということである。ＮｔＨＭＡ遺伝子のうちの一つのみを不活性化することによって、苗条におけるＣｄ濃度を低減させた商業的に価値のある植物体が生じる可能性があることが論じられている。Ｃｄを葉中に蓄積する植物体の性能をさらに低下させるために、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）が検討しているのは、ＮｔＨＭＡ遺伝子において異なる突然変異を組み合わせることであり、例えば、一方のＮｔＨＭＡ遺伝子のナンセンス突然変異と、他方のＮｔＨＭＡ遺伝子の漏出突然変異との組み合わせなどである。Ｌｉｅｄｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．は、２０１５年１０月２５日〜２９日に行われた第１２回Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（ＳＯＬ２０１５）（フランス、ボルドー）で、ＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２（それぞれＮｔＨＭＡαおよびＮｔＨＭＡβに対応）のどちらかにおけるミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異では、圃場条件下で栽培されるたばこ植物体の葉におけるカドミウムの含有量が有意に減少しないと述べた。この研究では、ＨＭＡ４ＲＮＡｉたばこ植物体が、野生型対照に比べてＣｄ含有量を約１０倍低減させると説明している。しかしながら、表現型は、生長の抑制、肉厚の葉、および壊死性病変の影響を強く受けていた。同様の表現型が、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４で、たばこＨＭＡ４ダブルノックアウト突然変異体に関して報告されている。１９個のホモ接合ミスセンスＨＭＡ４突然変異体系統および４個のホモ接合ナンセンスＨＭＡ４突然変異体系統が、圃場においてそれらのヌル分離対照に隣接させて評価された。ＨＭＡ４の突然変異体である植物体には、いかなる表現型の差異も見られなかった。測定の不確実性レベル（２０％）を超える統計的に有意な（比率に関する対応のあるｔ検定、ｐ＜０．０５）ＣｄおよびＺｎの低減は、ＨＭＡ４遺伝子の一つにホモ接合ミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異のいずれかを含む評価した突然変異体系統のいずれにおいても観測されなかった。Ｌｉｅｄｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）がこの研究で結論付けているのは、ＨＭＡ４の完全ノックアウトでは、ＣｄおよびＺｎの大幅な低減と表現型の変化（矮性化および壊死性病変を含む）とが生じるということである。また、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）とは対照的に、ＮｔＨＭＡ４．１またはＮｔＨＭＡ４．２の有害突然変異が、圃場条件下で栽培される植物体において、Ｃｄレベルを有意には低減させないと結論付けている。Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の手法は、圃場条件には適用可能ではないと結論付けられている。
【０００７】
当該技術分野においては、植物体を量産に向けて大規模に開放圃場で屋外栽培する場合に、植物体（たばこなど）におけるＣｄの蓄積を低減させる手法（非ＧＭＯ手法など）を開発するニーズが依然として存在する。本発明は、このニーズに対処することを探究するものである。
【発明の概要】
【０００８】
国際公開第２０１２／０４１９１３号およびＨｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）には、極めて人工的な無菌条件または水栽培条件下で、苗条におけるＺｎおよびＣｄの蓄積を低減させたＥＭＳ突然変異体たばこ系統が記載されている。国際公開第２０１２／０４１９１３号およびＨｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の教示とは対照的に、本発明は、植物体を開放環境（例えば、圃場）で屋外栽培する場合に、植物体のＣｄレベルを低減させることに関連し、そこで、Ｃｄレベルは、国際公開第２０１２／０４１９１３号およびＨｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）で用いられたＣｄレベルよりも３０倍〜３００倍低くなっている。本開示に記載の植物体は、植物体を人工的な条件下で栽培するのではなく、野外の圃場条件下にて大量に栽培することを要する量産用に用いられることを意図している。植物体を人工的な条件下で商業的に栽培するのは不経済である。本発明は、開放圃場条件で栽培した場合にＣｄの蓄積レベルを低減させる突然変異体である植物体（非ＧＭＯの突然変異体である植物体など）を提供しようとするものである。
【０００９】
Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により使用された条件は、本開示の関心対象となる状態を表す、開放圃場条件での自然状態を反映していない。Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により報告された結果は、開放圃場条件で栽培された植物体におけるＣｄレベルの低減を求める当業者に対して限られた有用性しか持たないが、これは、開放圃場条件でのＣｄレベルと、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）によって用いられた人工的な条件とが、比較不可能であるからである。さらに、Ｌｉｅｄｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、ＮｔＨＭＡ４．１またはＮｔＨＭＡ４．２の有害突然変異が、圃場条件下で栽培される植物体において、測定の不確実性レベル（約２０％）を超える有意性を持ってＣｄレベルを低減させることはないと結論付けている。Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の手法は、圃場条件には適していないと判断される。
【００１０】
発明者らは、種々のＨＭＡ４ホモ接合ＥＭＳ単一突然変異体を作製したが、それにはＨｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により報告された単一Ｗ２６５＊ナンセンス突然変異が含まれており、それらを開放圃場条件で評価した。その実験結果を本明細書の表３に示している。その結果によると、評価した単一突然変異体（Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）のＷ２６５＊単一突然変異を含む）のいずれも、開放圃場条件下でＣｄの低減を示さなかった。表３の４列目に見られるように、開放圃場下で評価した単一変異体各々の対照に対するＣｄ低減率（％）は０％であった。これらの結果は、Ｌｉｅｄｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）により報告された結果と一致している。
【００１１】
本明細書の表３において評価および報告された単一突然変異体のいずれも開放圃場条件下でＣｄ低減を示さなかったという知見に基づき、発明者らは、開放圃場条件下で不活性なこれらの単一突然変異のうちの二つ以上を組み合わせたとしても、開放圃場条件下ではＣｄの低減には影響を及ぼさないか、または無視できるほど小さい影響を及ぼすことになるであろうと推測した。一方で、またこの推測とは全く対照的に、発明者らは、表３に報告された種々の単一突然変異が様々な組み合わせで合わせられて二重ホモ接合突然変異体を形成する場合、開放圃場条件で葉中のＣｄが高レベル（例えば、２０％超）で減少しうることを明らかにした。ある場合には、開放圃場条件で達成された葉中のＣｄ低減レベルは、少なくとも約２７％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、もしくは約９０％、またはそれ以上であり、これらは本明細書の表４、表５、および表６にまとめられている。高レベルのＣｄ低減は、開放圃場条件下で栽培される植物体におけるＣｄのレベルを低減させるのに極めて有利である。意外にも、本明細書に記載されるように、葉中のＣｄレベルを低減させた二重突然変異体である植物体は、有害表現型（例えば、生長／萎縮／バイオマス量の低減など）を生じさせることはない。本明細書に記載される二重突然変異体に関して報告された有利な結果は、発明者らが予期も予想もしていなかった結果である。このデータを元に、本発明は、植物体が開放圃場で栽培された場合に、ＮｔＨＭＡ４．１およびＮｔＨＭＡ４．２の発現または活性を少なくとも部分的に低減させることによって、葉中のＣｄの蓄積が減少しうるという結果に少なくとも部分的に依拠している。好適には、非ＧＭＯ植物体は、変異誘発を用いることによって調製することができ、また好適には、有害な表現型を生じさせることはない。ＮｔＨＭＡ４．１およびＮｔＨＭＡ４．２は、それぞれＮｔＨＭＡαおよびＮｔＨＭＡβに相当し、これはＨｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により報告されている通りである。有利なことには、異なる突然変異体の組み合わせがツールキットとして使用されて、カドミウムのレベルを低減させ、かつ表現型および／または収率を損なうことなく、様々な品種を繁殖させることができる。
【００１２】
発明の態様および実施形態
第一の態様では、少なくとも二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を少なくとも部分的に低減させた突然変異体である植物体またはその一部について説明されており、該二つのＨＭＡは、（ｉ）配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、もしくは（ｉｉｉ）ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、該突然変異体である植物体またはその一部は、該突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示している。
【００１３】
好適には、（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたＨＭＡのうちの一つの発現または活性が部分的に低下するかまたは失われ、（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたＨＭＡのうちの一つの発現または活性が対照植物体に比べて失われている。
【００１４】
好適には、収穫時の突然変異体である植物体またはその一部の表現型は同一収穫時の対照植物体と同じであり、好適には、該突然変異体である植物体またはその一部は、収穫時に、同一収穫時の対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない。
【００１５】
好適には、突然変異体である植物体またはその一部は、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載されたポリヌクレオチド配列の各々の制御領域において、またはコード配列において、少なくとも一つの遺伝子改変を含み、好適には、突然変異にはミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異が備わる。好適には、突然変異体である植物体またはその一部は、以下の突然変異：配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１〜２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１または２９３または２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３〜２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異であり、好適には、そこで、該植物体は、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３または２３４または２３５または２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含み；配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２〜４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異である。該突然変異体である植物体またはその一部が、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２または４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含み；配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおけるアミノ酸位置２６５での少なくとも一つの突然変異；配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号３に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのＰ／Ｎドメイン第二細胞質ループの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号３に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、
または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１〜２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２５１または２９３または２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変；異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３〜２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異であり、好適には、そこで、該植物体は、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのアミノ酸位置２２３または２３４または２３５または２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含み；配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２〜４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置４０２または４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、；および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループにおけるアミノ酸位置２６５に対応する少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；配列番号４に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；ならびに、配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループの第二細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループのＰ／Ｎドメイン第二細胞質ループの第三細胞質ループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異；好適には、配列番号４に記載された非突然変異配列のＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３に記載された非突然変異配列によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインループの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５、２２３、２３４、または２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、のうちの一つ以上を含む。
好適には、突然変異体である植物体またはその一部は、以下の突然変異のうちの一つ以上を含む：配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＷ２６５＊＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＬ２２３Ｆであり；配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；または、配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＧ２３５Ｅであり；配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＬ２２３Ｆであり；配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＤ２３４Ｎであり；配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＧ２３５Ｅであり；配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；または、配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＬ２２３Ｆであり；配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＤ２３４Ｎであり；配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＧ２３５Ｅであり；配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、
好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆ  であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＷ２６５＊＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミス���ンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＬ２２３Ｆであり；配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＧ２３５Ｅであり；配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＬ２２３Ｆであり；配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＤ２３４Ｎであり；配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＧ２３５Ｅであり；配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＬ２２３Ｆであり；配列番号２のアミノ酸位置���５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＤ２３４Ｎであり；配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＧ２３５Ｅであり；配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンである。
【００１６】
さらなる態様では、圃場栽培植物体の葉におけるカドミウムレベルの低減方法であって、該方法が、（ａ）二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を低減させる工程であって、該二つのＨＭＡが、（ｉ）配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、もしくは（ｉｉｉ）ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、好適には、該ＨＭＡの発現または活性が変異誘発またはゲノム編集により低下する、該低減させる工程と；（ｂ）該植物体を圃場で栽培する工程と；（ｃ）任意選択的に、工程（ｂ）で得られた該植物体におけるカドミウム含有量を測定する工程と；（ｄ）そこでのカドミウム含有量が、ＨＭＡの発現または活性が低下していない対照植物体に比べて減少する植物体を特定する工程であって、好適には、該植物体またはその一部が、該植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、該対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示し；好適には、収穫時の該突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の該対照植物体と同じであり、好適には、該突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の該対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、該特定する工程と、を含む該方法が開示されている。
【００１７】
さらなる態様では、一つ以上の遺伝子改変を含まない圃場栽培対照植物体と比べた場合の、葉中のカドミウムレベルの低減と関連する、圃場栽培植物体における一つ以上の遺伝子改変を特定する方法が開示されており、該方法は、（ａ）圃場で栽培された場合に、圃場で栽培された対照植物体に比べて葉中のカドミウムレベルを低減させた植物体を特定する工程であって、任意選択的に、収穫時の該植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の該対照植物体と同じであり、好適には、該植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の該対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、該特定する工程と；（ｂ）工程（ａ）で特定された植物体由来の核酸試料を提供する工程と；（ｃ）工程（ｂ）由来の核酸試料において、配列番号１および配列番号２に記載された非突然変異配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するＨＭＡをコードするポリヌクレオチド配列中か、または配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列中の一つ以上の遺伝子改変を特定する工程と、を含む。
【００１８】
さらなる態様では、本明細書に記載されるように、突然変異体である植物体またはその一部由来の植物材料が開示されており、好適には、該植物材料は乾燥処理または乾燥済み植物材料であり、好適には、収穫時の該突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の対照植物体と同じであり、好適には、該突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない。
【００１９】
さらなる態様では、圃場で栽培した場合に、圃場栽培対照植物体に比べて葉中のカドミウムの蓄積を低減させた植物材料を生成する方法が開示されており、該方法は、（ａ）本明細書に記載される突然変異体である植物体またはその一部を提供する工程と；（ｂ）該植物体を圃場で栽培する工程と；（ｃ）該植物体から植物材料を収穫する工程であって、好適には、収穫時の該突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の対照植物体と同じであり、好適には、該突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない該収穫する工程と、を含む。
【００２０】
さらなる態様では、請求項７に記載の方法によって得られるかまたは得ることが可能なものから誘導されたか、または誘導可能な突然変異体である植物体もしくはその一部または植物材料が開示されており、好適には、収穫時の該突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の対照植物体と同じであり、好適には、該突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない。
【００２１】
さらなる態様では、本明細書に記載の突然変異体である植物体もしくはその一部または植物材料のうちの少なくとも一部を含む植物産物が開示されている。
【００２２】
さらなる態様では、本明細書に記載の突然変異体である植物体もしくはその一部、または植物材料、または植物産物を含む、たばこ製品もしくは喫煙物品、または消耗製品が開示されている。
【００２３】
好適には、少なくとも一つの遺伝子改変が、（ｉ）突然変異誘発剤を用いた種子材料の非標的処理によって導入されるか；または（ｉｉ）ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または改変メガヌクレアーゼなど）によって標的とされて導入される。
【００２４】
さらなる態様では、配列番号１に記載された非突然変異配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を含み、かつ本明細書に記載の突然変異のうちの一つ以上を含む、金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）ポリペプチドをコードする単離ポリペプチドが開示されている。
【００２５】
さらなる態様では、配列番号２に記載された非突然変異配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を含み、かつ本明細書に記載の突然変異のうちの一つ以上を含む、金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）ポリペプチドをコードする単離ポリペプチドが開示されている。
【００２６】
さらなる態様では、本明細書に記載の単離ポリペプチドを含む単離ポリペプチドの組み合わせが開示されている。
【００２７】
さらなる態様では、本明細書に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列が開示されている。
【００２８】
さらなる態様では、本明細書に記載の単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターが開示されている。
【００２９】
さらなる態様では、本明細書に記載の突然変異体である植物体もしくはその一部、または植物材料由来の突然変異体である植物体の細胞が開示されている。
【００３０】
さらなる態様では、本明細書に記載の突然変異体である植物体の細胞を含む、乾燥処理または乾燥済みの植物材料が開示されている。
【００３１】
好適には、本明細書に記載の突然変異体である植物体は、突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発など）またはゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または改変メガヌクレアーゼなど）によって生成される。
【発明の効果】
【００３２】
発明の効果
本開示に記載の植物体を生成することには、数多くの利点がある。
【００３３】
本明細書に記載の植物体は非ＧＭＯ植物体とすることができ、該非ＧＭＯ植物体は、遺伝子組み換え作物を栽培かつ市場に出すことに伴う問題を克服するものである。
【００３４】
本明細書に記載の植物体は、変動するＣｄ濃度を含む土壌で栽培されうる。これらの植物体および派生種子によって、さらに広範囲な土壌環境での栽培に対してより多くの選択肢が提供され、実施者が利用できる耕作可能な土壌の総量が増加しうる。また、高レベルのＣｄを汚染要素として含みうるリン酸肥料の許容可能範囲が増加しうる。したがって、低コストのリン酸肥料を、作物生産に使用できるようになる。
【００３５】
これらの植物体由来産物を喫煙したり、本発明が適用されうる食用作物を消費したりすることは、その低いＣｄレベルのために、健康的な選択となりうる。突然変異体である植物体（葉身部分を含めた、突然変異体である植物体の気生部分など）におけるＣｄ低減率（％）は、野生型の対応する対照と比較して、およそ少なくとも約２０％、２７％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％、またはそれ以上でありうる。
【００３６】
本明細書に記載の突然変異体である植物体の表現型は、特に収穫時に、野生型の対応する対照と同様であるか、または同一でありうるが、これは、生産用に得られるバイオマスの量が商業的に許容できる量であることを意味している。詳細には、突然変異体である植物体は、特に収穫時に、生長／萎縮量の低減を生じさせることはない。
【００３７】
Ｃｄ含有量をできるだけ低くし、かつ商業的に許容できるバイオマスレベルをもたらす突然変異の組み合わせは、関心対象の植物種およびたばこ栽培品種に応じて選択されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１：８つの組織におけるＴＮ９０およびＫ３２６のＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２遺伝子発現レベル。根と葉の遺伝子発現比は、ＨＭＡ４．１とＨＭＡ４．２の両方に対して同様である。この実験に用いた植物体は、成熟した圃場栽培植物体である。バーおよび誤差表示は、３箇所の複製植物体の平均および上限信頼区間を表す。
【図２】図２：ＴＮ９０およびＫ３２６のＨＭＡ４  ＲＮＡｉ系統とその各々のＷＴ対照におけるＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２の遺伝子発現レベル。根全体は、寒天栽培植物体から収穫され、粉砕、抽出されている。バーおよび誤差表示は、４個の複製植物体の平均および標準偏差（ＳＤ）を表す。＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、およびＰ＜０．００１での、ＷＴ対照植物体と比較した場合の有意性のレベルを示している。
【図３】図３：（ａ）ＨＭＡ４ＲＮＡｉのＫ３２６たばこ植物体およびＴＮ９０たばこ植物体、ならびにその各々のバックグラウンドＷＴ植物体を、低Ｎ施肥状況下にて温室で５週間栽培している。（ｂ、ｃ）乾燥重量でのＣｄ／Ｚｎレベル、（ｄ）高さ、（ｅ）葉重量、（ｆ）葉厚、（ｇ）水含有量（生重量と乾燥重量との比較）を算出している。バーおよび誤差表示は、５個の植物体の平均±ＳＤを表す。＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、およびＰ＜０．００１での、未処理対照植物体と比較した場合の有意性のレベルを示している。点線は、Ｃｄ測定値に関してＬＯＱ＝０．０５ｐｐｍであることを示している。
【図４】図４：温室で５週間（左）および１１週間（右）栽培した後の機能的ＨＭＡ４対立遺伝子数の漸減を含む突然変異体である植物体の（ａ）表現型、（ｂ）葉の生重量、ならびに乾燥重量における（ｃ）葉中Ｃｄレベル、および（ｄ）葉中Ｚｎレベル。遺伝子型をパネルの下に示している：ＡおよびａはＨＭＡ４．１の野生型および突然変異体対立遺伝子であり、ＢおよびｂはＨＭＡ４．２の野生型および突然変異体対立遺伝子である。バーおよび誤差表示は、８つの植物体の平均±ＳＤを表す。＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、およびＰ＜０．００１での、ＷＴ対照植物体と比較した場合の有意性のレベルを示している。点線は、Ｃｄ測定値に関してＬＯＱ＝０．０５ｐｐｍであることを示している。
【図５】図５：温室において土壌で５週間および１１週間栽培した、異なる二重突然変異体である植物体およびその各々のＨＭＡ４ＷＴヌル分離対照における（ａ）葉中のＣｄおよび（ｂ）Ｚｎ、ならびに（ｃ）葉の生重量の分析結果。黒色バーはヌル分離対照を示し、灰色バーは各々のＨＭＡ４ホモ接合二重突然変異体を示す。＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、およびＰ＜０．００１での、ＷＴ対照植物体と比較した場合の有意性のレベルを示している。点線は、Ｃｄ測定値に関してＬＯＱ＝０．０５ｐｐｍであることを示している。
【図６】図６：Ｃｄ含有量が中程度である領域の圃場で栽培されたＨＭＡ４突然変異体の（ａ）葉中のＣｄおよび（ｂ）葉の生重量データ。遺伝子型を以下に示している：ＡおよびａはＨＭＡ４．１の野生型および突然変異体対立遺伝子であり、ＢおよびｂはＨＭＡ４．２の野生型および突然変異体対立遺伝子である。葉のプール試料を、６箇所の（一部は遺伝子型については３箇所）の複製区画における茎の低位置から採取した。バーおよび誤差表示は、３〜６箇所の複製区画の測定値からの平均および標準偏差を表す。＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、およびＰ＜０．００１での、ＷＴ対照植物体と比較した場合の有意性のレベルを示している。点線は、Ｃｄ測定値に関してＬＯＱ＝０．０５ｐｐｍであることを示している。
【図７】図７：Ｃｄ含有量が中程度である領域の圃場で栽培されたＨＭＡ４突然変異体の（ａ）葉中のＣｄおよび（ｂ）葉の乾燥重量データ。黒色バーはヌル分離対照を示し、灰色バーは各々のＨＭＡ４ホモ接合二重突然変異体を示す。葉のプール試料を、６箇所（Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊およびＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎについては４箇所）の複製区画における茎の低位置から採取した。バーおよび誤差表示は、平均および標準偏差を表す。
【図８】図８：Ｃｄ含有量が高い二つの領域の圃場で栽培されたＨＭＡ４突然変異体の（ａ、ｂ）葉中のＣｄおよび（ｃ、ｄ）乾燥処理した葉の重量データ。（ａ）および（ｃ）は圃場３由来のＣｄおよび乾燥処理した葉の重量データに相当し、（ｂ）および（ｄ）は圃場４由来のＣｄおよび乾燥処理した葉の重量データに相当する。黒色バーはヌル分離対照を示し、灰色バーは各々のＨＭＡ４ホモ接合二重突然変異体を示す。葉のプール試料を、５箇所の複製区画における茎の低位置から採取した。バーおよび誤差表示は、平均および標準偏差を表す。
【図９】図９：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍＨＭＡ４タンパク質の模式図。三つの機能的ドメインである、リン酸化（Ｐ）ドメイン、ヌクレオチド結合（Ｎ）ドメイン、およびアクチュエータ（Ａ）ドメインが触媒機能を果たしており、これらは、タンパク質の第二の細胞質ループおよび第三の細胞質ループに位置している。ナンセンス突然変異と組み合わせると、タンパク質機能およびＣｄの低減に影響を及ぼすことが見出されたミスセンス突然変異を、下線を引いた文字で強調している。本研究で検討した他の全てのミスセンス突然変異は、ナンセンス突然変異と組み合わせた場合に、Ｃｄの低減にいかなる影響も及ぼさなかった。ナンセンス突然変異は黒色で強調されている。（本モデルは、単に説明目的のために供するものであり、ドメインフォールディングを反映していない。）
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本明細書の範囲内で使用される技術的な用語および表現には一般に、植物体および分子生物学の関連分野でそれらに共通して適用される意味が与えられる。以下の用語の定義はどれも、本明細書の全内容に適用される。「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、それ以外の要素または工程を除外するものではなく、また不定冠詞「ａ」もしくは「ａｎ」は、複数であることを除外するものではない。ある一つの工程が、請求の範囲に列挙された複数の特徴の機能を実現することもある。所定の数値または範囲の文脈での「約」、「本質的に」および「およそ」という用語は、所定の値または範囲の２０％以内、１０％以内、または５％、４％、３％、２％または１％以内である値または範囲を意味する。
【００４０】
「単離した」という用語は、その天然の環境から取り去った任意の実体を意味するが、この用語は、いかなる精製の度合いも暗示してはいない。
【００４１】
「発現ベクター」は、核酸の発現を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む核酸媒体である。適切な発現ベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源の機能的に等価な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、上流に位置し、下記に定義する通り、核酸、核酸構築物または核酸結合体に作用できるように連結された、少なくともプロモーターを含む。
【００４２】
「構築物」という用語は、一つ以上のポリヌクレオチドを備える二本鎖の組み換え体核酸断片を意味する。構築物は、補完的「センス鎖またはコード鎖」と対になった「テンプレート鎖」塩基を含む。所定の構築物を、ベクター（発現ベクターなど）内に位置するプロモーターの向きに対して同一（またはセンス）または反対（またはアンチセンス）のいずれかの方向に、可能性のある２つの方向でベクターに挿入できる。
【００４３】
「ベクター」は、核酸、核酸構築物および核酸結合体、およびこれに類するものの運搬を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む、核酸媒体を意味する。適切なベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。
【００４４】
「プロモーター」は、一般に上流に位置し、二本鎖ＤＮＡ断片に作用できるように連結された核酸の要素／配列を意味する。プロモーターは、所定の未変性遺伝子に最も近い領域に完全に由来することも、または異なる未変性のプロモーターまたは合成ＤＮＡセグメントに由来する異なる要素から構成することもできる。
【００４５】
「相同性、同一性または類似性」という用語は、配列の整列によって比較した２個のポリペプチド間または２個の核酸分子間の配列の類似性の度合いを意味する。比較対象の２個の不連続な核酸配列間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。同一性のパーセント値は、目視検査および数学的計算によって決定しうる。別の方法として、２個の核酸配列の同一性のパーセント値は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどのコンピュータプログラムを使用して、配列情報を比較することにより決定しうる。二つの配列の同一性のパーセント値は以下に依存して異なる値をとりうる：（ｉ）例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装）または３Ｄ比較による構造的整列などの、配列を整列するのに用いる方法；ならびに（ｉｉ）整列方法（例えば、ローカルアライメント対グローバルアライメント）に用いるパラメータ、使用される対スコア行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ（例えば、関数形式および定数）。整列させた後、二つの配列間の同一性のパーセント値を計算する様々な方法がある。例えば、同一性の数を、（ｉ）最短配列長；（ｉｉ）整列長；（ｉｉｉ）配列の平均長：（ｉｖ）非ギャップ位置の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数で除してもよい。さらに、同一性のパーセント値は、長さにも大きく依存することが理解されるだろう。従って、配列の対が短いほど、偶然生じる考えられる配列同一性がより高くなる。一般的な多重整列プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）２２，４６７３−４６８０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），２４，４８７６−４８８２）は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの多重整列を作成するのに好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメータは以下の通りである：ポリヌクレオチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、行列＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。ポリペプチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質の整列について：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列の整列のためにこれらのパラメータおよび他のパラメータを変える必要がありうることに留意するであろう。続いて、好適には、同一性のパーセント計算値は、こうした整列からＮ／Ｔ（Ｎは、配列が同一残基を共有している位置の数、Ｔは、ギャップを含めるがオーバーハングを除いて比較される位置の総数である）として計算される。
【００４６】
「変異体」は、実質的に類似した配列を意味する。変異体は、野生型配列と類似した機能または実質的に類似した機能を持ちうる。本明細書に記載の変異体では、類似した機能は、野生型酵素機能の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％となる。本明細書に記載の変異体では、実質的に類似した機能は、野生型酵素機能の少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％となる。変異体は、野生型ポリペプチドと比較して活性のレベルを低減させた酵素を結果的にもたらす、一つ以上の好都合な突然変異を持つことができる。変異体は、それらの活性が結果的にノックアウトされる一つ以上の好都合な突然変異（すなわち、１００％抑制、よって非機能的ポリペプチド）を持つことができる。一つ以上の好都合な突然変異を持つ例示的な変異体が本明細書で説明されている。
【００４７】
「植物」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物もしくはその部分、およびその子孫を意味する。一つの実施形態で、植物体は「たばこ植物体」であり、これはたばこ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物体を意味する。好ましい種のたばこ植物体は、本明細書に記述される。好適には、植物体は、一つ以上遺伝子の発現または一つ以上タンパク質の活性が対照植物体に比べて調節された、突然変異体である植物体である。好適には、植物体を突然変異体である植物体に変える改変により、一つ以上遺伝子の発現か、または一つ以上ポリペプチドの活性が調節されるようになる。特定の実施形態では、改変は、遺伝子改変か、または遺伝子修飾である。
【００４８】
「植物の部分」は、植物体細胞、植物プロトプラスト、そこから再生可能な植物全体を再生可能な植物体細胞組織培養、植物カルス、植物凝集塊、ならびに植物体または植物体の部分（胚、花粉、葯、胚珠、種子、葉、花、茎、枝、果実、根、根の先端部およびこれに類するものなど）内で無傷の植物体細胞を含む。再生された植物体の子孫、変異体および突然変異体も、本明細書に記載された導入済みのポリヌクレオチドを含む場合、本開示の範囲内に含まれる。植物体の葉は、本開示における使用に特に適するものである。
【００４９】
「植物体細胞」とは、植物の構造的および生理学的な単位を指す。植物体細胞は、細胞壁のない原形質体、単離した単一の細胞、もしくは培養した細胞の形態で、または、植物組織、植物器官、または植物全体などを含むがこれらに限定されない、より高次の組織的単位の部分であってもよい。
【００５０】
「植物材料」という用語は、バイオマス、葉、茎、根、花または花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切断物、分泌物、抽出物、細胞または組織培養物、または植物体のその他任意の部分または生成物を含めた、植物体から獲得しうる任意の固体、液体またはガス状の組成、またはその組み合わせを意味する。一つの実施形態で、植物材料は、バイオマス、幹、種子または葉を含むか、またはそれらから構成される。別の実施形態で、植物材料は、葉を含むか、またはそれらから構成される。
【００５１】
「品種」という用語は、同じ種の他の植物体と区別する一定の特性を共有する植物体の母集団を意味する。一つ以上の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間で非常に些細な全体的変化によって特性付けられる。品種は、しばしば市販されていることがある。
【００５２】
「系統」または「育種系統」という用語は、本明細書で使用されるとき、植物体の育種時に使用される植物体群を意味する。系統は、他の形質について個体間でいくらかの変化がある場合もあるが、一つ以上の所定の形質について個体間での変化はわずかしか現れないため、品種と区別しうる。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「非天然（の）」という用語は、天然では形成されないかまたは天然には存在しない物質（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子突然変異、ポリペプチド、植物体、植物体細胞および植物材料）を意味する。こうした非天然の物質または人工的な物質は、本明細書で説明したか、または当業界において公知の方法によって、作成、合成、開始、修飾、介在、または操作されうる。こうした非天然の物質または人工的な物質は、人によって作成、合成、開始、修飾、干渉、または操作されうる。こうして、一例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、遺伝子操作技術（アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、メガヌクレアーゼおよびこれに類するものなど）を用いて作製されうる。さらなる例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料またはその子孫が天然では形成されないかまたは天然には存在しない遺伝的構成（例えば、ゲノム、染色体またはそのセグメント）を含むように、一つ以上の遺伝的突然変異（例えば、一つ以上の多型）を第一の植物体または植物体細胞から第二の植物体または植物体細胞（これはそれ自体が天然でありうる）に遺伝子移入するかまたは移動することで作成しうる。結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料は、こうして人工的なものであるか、または天然のものではない。従って、人工的または非天然の植物体または植物体細胞は、結果的に得られる遺伝子配列が第一の植物体または植物体細胞とは異なる遺伝的背景を備える第二の植物体または植物体細胞内で自然発生する場合であっても、第一の天然の植物体または植物体細胞内での遺伝子配列を修飾することにより作成しうる。
【００５４】
「調節する」という用語は、ポリペプチドの発現または活性を低減する、抑制する、増大をなくす、または別の方法で該発現または活性に影響を及ぼすことを意味しうる。この用語はまた、転写活性の調節を含みうるがこれに限定されない、ポリペプチドをコードする遺伝子の活性を低減する、抑制する、排除する、増大する、または別の方法で該活性に影響を及ぼすことを意味しうる。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「減少する」または「低減される」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の約１０％〜約９９％の減少、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％以上の減少を意味する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「抑制する」もしくは「抑制された」または「排除する」もしくは「排除された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写活性、および発現などの量または活性の、約９８％〜約１００％の低下、または少なくとも９８％、少なくとも９９％、特に１００％の低下を意味する。
【００５７】
細胞の形質転換は、安定的であっても過渡的であってもよい。「過渡的形質転換」もしくは「過渡的に形質転換する」という用語またはその変化形は、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムに組み込むことなく、一つ以上の外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを意味する。一方、「安定的形質転換」または「安定的に形質転換する」という用語は、一つ以上の外因性ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに導入し、組み込むことを意味する。「安定形質転換体」という用語は、一つ以上の外因性ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡまたはオルガネラＤＮＡに安定的に組み込まれた細胞を意味する。本開示の核酸、構築物、および／またはベクターで形質転換された生物体またはその細胞は、過渡的にも安定的にも形質転換されうることが理解されるべきである。特定の実施形態では、安定的形質転換が好ましい。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「増加する」または「増加された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の約５％〜約９９％の増大、または少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％以上の増大を意味する。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、および量の文脈で使用されるとき、「実質的」という用語は、その量が、比較される量の少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、少なくとも約１％、または少なくとも約０．１％であることを意味する。
【００６０】
対照植物体または対照植物体細胞の文脈での「対照」という用語およびこれに類するものは、対象の遺伝子またはタンパク質の発現または活性が調節されておらず、それゆえに酵素の発現または活性が改変された植物体または植物体細胞との比較または参照を提供できる、植物体または植物体細胞を意味する。したがって、本発明の文脈では、対照は、本明細書に記載のＨＭＡ４の発現または活性を低減させる遺伝子改変を一つも含むことはないことになる。対照植物体または植物体細胞は、空のベクターを備えうる。対照植物体または植物体細胞は、野生型植物体または野生型植物体細胞などに対応しうる。こうした全ての場合において、被験植物体および対照植物体は、比較目的のために同一条件下でおよび同一のプロトコルを使用して、栽培かつ収穫される。したがって、一例として、被験植物体および対照植物体は、二つの間の比較が可能になるように、Ｃｄなどの重金属の含有量をほぼ同一レベルで有する土壌で栽培され、該土壌から収穫されうる。これにより、圃場の同じ部分で栽培された被験植物体および対照植物体は、例えば、およそ同一の土壌Ｃｄレベルに曝露されるようになりうる。本明細書に記載された遺伝子またはポリペプチドのレベル、比率、活性、または分布の変化、または植物体の表現型の変化、特にＣｄおよび／または亜鉛の蓄積の減少は、被験植物体を対照植物体と比較することにより本明細書に記載の方法を用いて測定することができ、好適には、該被験植物体および対照植物体は、同一のプロトコルを使用して培養および／または収穫されたものである。対照植物体は、被験植物体の表現型の変化を測定するための基準点を提供することができる。表現型の変化の測定は、植物の成長中、老化時、または乾燥処理後を含めて、植物中で任意の時点で測定されうる。表現型の変化の測定は、グロースチャンバー内、温室内、または野原で成長した植物体からのものを含め、任意の条件下で成長した植物体中で測定することができる。表現型の変化は、当該技術分野で周知の方法を用いて、乾燥処理または乾燥前、および／または乾燥処理または乾燥中、および／または乾燥処理または乾燥後に、Ｃｄ含有量および／または亜鉛含有量を測定することにより求めることができる。
【００６１】
「圃場」という用語は、本明細書で使用される場合、開放地の領域、特に、作物が植え付けられうるか、または植え付けられている領域としての当該技術分野での通常の意味を想定している。圃場は、自然環境の一部であり、実験室または温室などの人工的な環境ではない。したがって、人工の建物または構造物であるのが一般的な人工的な環境とは異なり、圃場は、開放外部環境の一部である。
【００６２】
本明細書で論じる通り、ＨＭＡの発現または活性は、突然変異体である植物体において部分的に低下しうる。本明細書で使用される場合、「部分的に低減」という用語は、突然変異体である植物体におけるＨＭＡの発現または活性が、対照植物体におけるＨＭＡの発現または活性のレベルよりも約１％〜９９％低くなることを意味する。好適には、突然変異体である植物体におけるＨＭＡの発現または活性は、対照植物体におけるＨＭＡの発現または活性のレベルよりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低くなる。一例として、ＨＭＡタンパク質の大部分をトランケートするナンセンス突然変異は、いかなる酵素活性も提示せず、結果として完全に活性を失わせる（つまり、活性皆無にする）ことが予測される。さらなる例として、ミスセンス突然変異に関しては、酵素活性は、対照植物体と同じとなりうるか、部分的に低下しうるか、または検出不可能になる（例えば、完全消失されるか、または皆無になる）場合がある。
【００６３】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性と、配列番号１または配列番号２に記載された野生型配列と比較した場合に少なくとも一つのアミノ酸突然変異とを有するポリペプチド配列を含む単離ＨＭＡ４ポリペプチド変異体（突然変異体）について本明細書で説明する。配列番号１および配列番号２は、非突然変異配列である。配列番号１および配列番号２は、それぞれ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）重金属ＡＴＰアーゼ（ＮｔＨＭＡ４．１）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＣＱ７７７９８のアミノ酸配列、およびタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）重金属ＡＴＰアーゼ（ＮｔＨＭＡ４．２）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＣＷ０３２４３．１のアミノ酸配列に相当する。好適には、単離ポリペプチドは、それらに対して少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性と、少なくとも一つのアミノ酸突然変異とを有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍなどの特定の植物体は、本明細書でＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２と称されるＨＭＡ４の二つのホメオログを含む。
【００６４】
植物体、植物体細胞、または植物材料などにおいて、突然変異体ポリペプチドの機能または活性が、調節、低減、部分的に不活性化、抑制、排除、ノックアウト、または消失される。一実施形態では、一突然変異体ポリペプチドの機能または活性が、ポリペプチド活性が検出不可能になるように抑制、排除、ノックアウト、または消失されうる。一実施形態では、二つの突然変異体ポリペプチド（例えば、同一遺伝子のホメオログによりコードされるポリペプチド）の機能または活性が、ポリペプチド活性が検出不可能になるように抑制、排除、ノックアウト、または消失されうる。
【００６５】
別の実施形態では、一方の突然変異体ポリペプチド（例えば、遺伝子の一ホメオログ）の機能または活性が、ポリペプチド活性が検出不可能になるように消失、抑制、または排除され、他方の突然変異体ポリペプチド（例えば、遺伝子の他方のホメオログ）の機能または活性が、ＨＭＡポリペプチドの活性が対照ＨＭＡポリペプチドに比べて低いが未だ検出可能になるように低下または部分的に低下する。この種の例示的な突然変異の組み合わせは二重ホモ接合突然変異体Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊であり、Ｇ２５１Ｄの突然変異はＮｔＨＭＡ４．１（配列番号１）の活性を部分的に低下させ、Ｑ５６１＊の突然変異はＮｔＨＭＡ４．２（配列番号２）の活性をノックアウト、抑制、または排除する。ＨＭＡ４ポリペプチドのうちの一つの活性が部分的に低下し、かつＨＭＡのうちの一つの活性が消失される場合には、配列番号１または配列番号２の活性のどちらかが部分的に低下し、かつ配列番号１または配列番号２の活性のどちらかが消失、抑制、または排除される。ＨＭＡ４ポリペプチドのうちの一つの活性が部分的に低下し、かつＨＭＡのうちの一つの活性が消失される場合には、配列番号１または配列番号２の活性のどちらかが部分的に低下する可能性があり、かつ配列番号１または配列番号２の活性のどちらかが消失、抑制、または排除される可能性がある。
【００６６】
好適には、ＨＭＡのうちの少なくとも一つが完全にノックアウトされ、ＨＭＡのうちの少なくとも一つが、Ａドメインか、ＰドメインのＤＫＴＧＴモチーフか、またはＮドメインのＨＰ座位のいずれかにおいて、ナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。
【００６７】
植物体、植物体細胞、または植物材料などにおいて、ＮｔＨＭＡ４．１（配列番号１）およびＮｔＨＭＡ４．２（配列番号２）の活性が、対照植物体と比較して消失、抑制、または排除されうる。この種の例示的な突然変異の組み合わせは二重ホモ接合突然変異体Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊であり、Ｑ２９３＊の突然変異はＮｔＨＭＡ４．１（配列番号１）の活性をノックアウト、抑制、または排除し、Ｑ５６１＊の突然変異はＮｔＨＭＡ４．２（配列番号２）の活性をノックアウト、抑制、または排除する。他の例示的な突然変異体を表４および表５に示す。本明細書に記載の変異体（突然変異体）ＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの組み合わせまたは混合物が検討されている。
【００６８】
全ての組み合わせに関して、それぞれ他のホメオログでの同一の組み合わせが考慮される。例えば、ＨＭＡ４．１  Ｅ２９６Ｋ／ＨＭＡ４．２  Ｑ５６１＊の組み合わせ、およびＨＭＡ４．１  Ｑ５６１＊／ＨＭＡ４．２  Ｅ２９６Ｋの組み合わせが考慮される。
【００６９】
好適には、ＨＭＡ４ポリペプチド変異体は、該変異体を含む植物体に、対照と比較して少なくとも約２７％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％、またはそれ以上のＣｄの低減をもたらす。
【００７０】
配列の整列の際に、本明細書に開示された位置に相当する位置に少なくとも一つのアミノ酸突然変異を含む、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも６０％の同一性を有する他のＨＭＡも、本開示での使用に検討されている。これらの配列の例として、トマト、ジャガイモ、およびナスなどのＳｏｌａｎａｃｅａｅファミリー由来のＨＭＡ配列が挙げられる。
【００７１】
変異体ポリペプチドの断片もまた、アミノ酸突然変異のうちの一つ以上を保持するという条件付きで検討されている。変異体ポリペプチドの断片は、少なくとも約２５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸からの範囲、または最大完全長ポリペプチドまでの範囲としうる。
【００７２】
変異体は、任意のタイプの改変（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；グリコシル化状態の変化；リフォールディングもしくは異性化、三次元構造、または自己会合状態に影響を及ぼす変化）を導入することより生成することができるが、ただし、突然変異体ポリペプチドが、該突然変異体ポリペプチドを発現する植物体に、本明細書に記載されたようにＣｄの蓄積の少なくとも低減をもたらすということが前提である。
【００７３】
ポリペプチド変異体は、任意のタイプの改変（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；グリコシル化状態の変化；リフォールディングもしくは異性化、三次元構造、または自己会合状態に影響を及ぼす変化）を導入することにより生成される変異体を含み、これは故意に操作されうるか、または自然に単離されうる。物質の二次的な結合活性が保持されている限り、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および残基の両親媒性の類似性に基づき、意図的にアミノ酸を置換しうる。例えば、負の電荷を帯びたアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正電荷を帯びたアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み、ならびに類似した親水性値を持つ無電荷の極性頭基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。伝統的な置換は、例えば、下記の表に従い行いうる。２列目の同一ブロックにあるアミノ酸、および好適には３列目の同一系統にあるアミノ酸を、相互に置換することができる。
【００７４】
【表１】
2019503187.tif 000003
【００７５】
突然変異の好適な一種は、点突然変異であるミスセンス突然変異であり、そこでは、単一ヌクレオチドの変化によって、異なるアミノ酸をコードするコドンが生じることになる。ミスセンス突然変異は、ＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２などのＨＭＡ４ポリペプチドを部分的に不活性化（例えば、低減）するのに特に効果的でありうる。
【００７６】
突然変異の好適な別の種は、点突然変異であるナンセンス突然変異であり、そこでは、単一ヌクレオチドの変化によって、転写ｍＲＮＡにおける未成熟終止コドンまたはナンセンスコドンが生じ、トランケートされ不完全で非機能的なＨＭＡ４ポリペプチド（ＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２など）が生じることになる。ナンセンス突然変異は、ＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２などのＨＭＡ４ポリペプチドの活性を抑制するか、排除するか、またはノックアウトするのに特に効果的でありうる。
【００７７】
本明細書に記載されるように、特定の実施形態では、ＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２のうちの一方の発現または活性が少なくとも部分的に低下し、他方のＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２の発現または活性が、対照植物体と比較して消失、排除、または低減される。一実施形態では、ＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２のうちの一方の発現または活性が、ミスセンス点突然変異の使用により部分的に低下し、他方のＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２の発現または活性が、ナンセンス点突然変異の使用により消失、排除、または低減される。
【００７８】
好適には、本明細書に記載の突然変異はヘテロ接合突然変異であるか、またはホモ接合突然変異である。好適には、本明細書に記載の突然変異はホモ接合突然変異である。
【００７９】
突然変異は、例えば、ＨＭＡ４．１もしくはＨＭＡ４．２の制御領域に、またはＨＭＡ４．１もしくはＨＭＡ４．２のコード配列に位置しうる。特定の実施形態では、突然変異はＨＭＡ４．１またはＨＭＡ４．２のコード配列に位置する。
【００８０】
ＨＭＡ４ポリペプチドは、表７に示す種々のドメインを含む。
【００８１】
本明細書に記載の突然変異体の組み合わせについては、同一の組み合わせが、それぞれ他のホメオログに含まれうる。
【００８２】
少なくとも二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性が部分的に低下し、その結果、ＨＭＡを含む突然変異体である植物体またはその一部が、該突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下で圃場栽培する場合、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示すようになる。ＨＭＡのうちの一方の発現または活性を部分的に低減または消失することができ、他方のＨＭＡの発現または活性を対照植物体と比較して消失することができる。
【００８３】
好適には、ＨＭＡ４ポリペプチド変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含みうる。
好適には、ＨＭＡ４ポリペプチド変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含みうる。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２５１〜２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２５１〜２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２５１または２９３または２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２５１または２９３または２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、植物体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、植物体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２２３〜２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２２３〜２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドＡドメインのＮドメインのアミノ酸位置２２３、または２３４、または２３５、または２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインのアミノ酸位置２９３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドＡドメインのＮドメインのアミノ酸位置２２３、または２３４、または２３５、または２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４０２〜４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４０２〜４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４０２または４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４０２または４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインループにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおける一アミノ酸位置に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号３によってコードされるＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおけるアミノ酸位置２６５での少なくとも一つの突然変異を含む。
さらに好適には、変異体は、配列番号４によってコードされるＰ／Ｎドメインループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインにおけるアミノ酸位置２６５での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖ）配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；または、（ｘ）配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表す。
【００８４】
好適には、変異体は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号２アミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖ）配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；または、（ｘ）配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１に記載された非突然変異配列のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表す。
【００８５】
ナンセンス突然変異のうちの任意の一つを、本明細書に記載のミスセンス突然変異のうちの任意の一つと組み合わせることができると考えられる。
【００８６】
上述の変異体を含む植物体を用いて、圃場で屋外栽培された場合に得られたデータのまとめを表４、表５、および表６に記載している。二重突然変異体Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｗ２６５＊、またはＱ４６４＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅ、またはＥ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、またはＴ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊を含む植物体は、約８０〜９６％のＣｄ低減を示している。二重突然変異体Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊を含む植物体は、約３３〜７０％のＣｄ低減を示している。二重突然変異体Ｑ２９３＊／Ｌ２２３ＦまたはＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎを含む植物体は、約２７〜３７％のＣｄ低減を示している。初期段階および特定の条件下では、植物体発育の遅延が、二重突然変異体Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｗ２６５＊、またはＱ４６４＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅ、またはＥ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、またはＴ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊で観測されている。一方、収穫時には、突然変異体の各々と対照との間に、いかなる明らかな表現型の差異も観察されることはない。Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊は、通常の生長および発育を示している。Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｗ２６５＊、またはＱ４６４＊／Ｑ５６１＊、またはＥ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅは、環境条件に応じて、初期段階で葉に壊死性病変を示す場合があるが、壊死性病変の存在は、圃場における収穫時のほとんどの条件下で観察されていない。評価した他の突然変異の組み合わせ（Ｇ３８２Ｒ／Ｑ５６１＊、Ｖ３５１Ｍ／Ｑ５６１＊、Ａ１８８Ｖ／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ａ３６９Ｖ、Ｑ２９３＊／Ａ３７４Ｖ、Ｔ１８９Ｉ／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｓ２７Ｌ、Ｑ２９３＊／Ａ１８８Ｖ、Ｇ１２８Ｅ／Ｑ５６１＊）は、有意なＣｄ低減または２０％超のＣｄ低減をもたらしていない。好適には、特定の実施形態において、二重突然変異体は、Ｇ３８２Ｒ／Ｑ５６１＊でも、Ｖ３５１Ｍ／Ｑ５６１＊でも、Ａ１８８Ｖ／Ｑ５６１＊でも、Ｑ２９３＊／Ａ３６９Ｖでも、Ｑ２９３＊／Ａ３７４Ｖでも、Ｔ１８９Ｉ／Ｑ５６１＊でも、Ｑ２９３＊／Ｓ２７Ｌでも、Ｑ２９３＊／Ａ１８８Ｖでも、Ｇ１２８Ｅ／Ｑ５６１＊でもない。
【００８７】
温室で栽培された場合における、これらの二重突然変異体の一部に関するデータが表８に示されている。表４（圃場試験）と表８（温室）との比較から見られるように、種々の突然変異の組み合わせに対するＣｄ低減レベルは、概して相互に対応している。
【００８８】
さらなる二重突然変異体が温室で評価された。これらのデータの結果を表９に示している。表４および表８で示した二重突然変異体のＣｄ低減レベルが圃場データと温室データとに対して概して一致していることに鑑みて、表９に示す温室データも、圃場で得られる結果に概して相応することになることが予測される。突然変異の組み合わせＨ４３８Ｙ／Ｗ２６５＊は、約５８％のＣｄ低減をもたらした温室条件下でのみ評価され、表現型の変化が観察されなかった（表９）。
【００８９】
特定の実施形態では、二重突然変異体Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｗ２６５＊、またはＥ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、またはＴ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊、またはＱ４６４＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅが、圃場において約８０％以上のＣｄ低減を示すため、好ましいものとなる。好ましい組み合わせの一実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖ）配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表す。
【００９０】
好ましい組み合わせの一実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖ）配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表す。
【００９１】
特定の実施形態では、二重突然変異体Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊、またはＨ４３８Ｙ／Ｗ２６５＊、またはＱ２９３＊／Ｌ２２３Ｆ、またはＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎが、２７〜７０％のＣｄ低減を示し、かつ生長を妨げない可能性が高いため、（例えば、たばこ（例としてバーレーたばこ）などの植物体への導入に対して）好ましいものとなる。好ましい組み合わせの一実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表す。
【００９２】
好ましい組み合わせの一実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸位置２９３に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ２９３＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表す。
【００９３】
特定の実施形態では、二重突然変異体Ｔ４０２Ｉ／  Ｑ５６１＊は、約９０％のＣｄ低減を示し、かつ初期栽培段階でも許容できる形態を示すため、好ましいものとなる。したがって、この実施形態によると、突然変異体である植物体またはその一部は、配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異を含み、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表す。
【００９４】
本明細書に記載の突然変異の組み合わせも考慮される。詳細には、二重突然変異体における各単一突然変異の種々の組み合わせが考慮される。こうした組み合わせの例が表１１および表１２に示されており、以下に説明する。
【００９５】
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドの第三ループＰドメインのアミノ酸位置４６４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
【００９６】
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２９６に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４０２に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２６５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２５１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置５６１に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２２３に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３４に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
一実施形態では、変異体は、配列番号４によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＰ／Ｎドメインの第三細胞質ループのアミノ酸位置４３８に対応する位置での少なくとも一つの突然変異、および配列番号３によってコードされるＨＭＡポリペプチドのＡドメインの第二細胞質ループのアミノ酸位置２３５に対応する位置での少なくとも一つの突然変異を含む。
好適には、変異体は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＷ２６５＊＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；（ｖ）配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＬ２２３Ｆであり；（ｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＧ２３５Ｅであり；（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｘ）配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＬ２２３Ｆであり；（ｘｉ）配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＤ２３４Ｎであり；（ｘｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＧ２３５Ｅであり；（ｘｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｘｉｖ）配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＬ２２３Ｆであり；（ｘｖ）配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＤ２３４Ｎであり；（ｘｖｉ）配列番号１のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＧ２３５Ｅであり；（ｘｖｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｘｖｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｘｉｘ）配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；または（ｘｘ）配列番号１のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号２のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表す。
【００９７】
好適には、変異体は、以下からなる群から選択される突然変異のうちの一つ以上を含む：（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＷ２６５＊＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸位置４６４に対応する位置でのナンセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＱ４６４＊およびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表し；（ｖ）配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＬ２２３Ｆであり；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９６に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＥ２９６ＫおよびＧ２３５Ｅであり；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｘ）配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＬ２２３Ｆであり；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＤ２３４Ｎであり；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置４０２に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＴ４０２ＩおよびＧ２３５Ｅであり；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２６５に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＷ２６５＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＬ２２３Ｆであり；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＤ２３４Ｎであり；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸位置２５１に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＧ２５１ＤおよびＧ２３５Ｅであり；（ｘｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置５６１に対応する位置でのナンセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＱ５６１＊であり、＊は終止コドンを表し；（ｘｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２２３に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＬ２２３Ｆであり、＊は終止コドンを表し；（ｘｉｘ）配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３４に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＤ２３４Ｎであり、＊は終止コドンを表し；または（ｘｘ）配列番号２のアミノ酸位置４３８に対応する位置でのミスセンス突然変異、および配列番号１のアミノ酸位置２３５に対応する位置でのミスセンス突然変異、好適には、そこで、該突然変異はＨ４３８ＹおよびＧ２３５Ｅであり、＊は終止コドンを表す。
【００９８】
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、一般的にリン酸ジエステル結合を含むが、一部のケースでは、ポリヌクレオチド類似物は、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、またはＯ−メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖を含む、代わりのバックボーンを持ちうる。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。例えば、こうした分子の生理学的環境での、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増大させるためなどの様々な理由で、リボース−リン酸塩バックボーンの修飾を行いうる。天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成することができるが、別の方法として、異なるポリヌクレオチド類似物の混合物、ならびに天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成しうる。
【００９９】
配列番号３または配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性と、配列番号３または配列番号４に記載された野生型配列と比較した場合に少なくとも一つのヌクレオチド突然変異とを有するポリヌクレオチド配列を含む単離ＨＭＡ４ポリヌクレオチド変異体（突然変異体）について本明細書で説明する。配列番号３および配列番号４は、非突然変異配列である。配列番号３および配列番号４は、それぞれ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）重金属ＡＴＰアーゼ（ＮｔＨＭＡ４．１）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＨＦ６７５１８１．１、およびタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）重金属ＡＴＰアーゼ（ＮｔＨＭＡ４．２）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＨＦ９３７０５４．１のポリヌクレオチド配列に相当する。好適には、単離ポリヌクレオチドは、それらに対して少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性と、少なくとも一つのヌクレオチド突然変異とを有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
【０１００】
好適には、植物体は、配列番号３および配列番号４の各々における少なくとも一つの突然変異、ならびに／または（ｉｉ）に記載されたＨＭＡをコードするＲＮＡ転写の翻訳を妨げる遺伝子断片を含み、好適には、そこで該突然変異にはミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異が備わる。
【０１０１】
様々なポリヌクレオチド類似物、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、Ｏ−メチルホホロアミダイト連鎖およびペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖などが知られている。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。一つ以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドも含まれる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドのハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータ、および適切な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９によって説明されている。遺伝暗号の知識と本明細書で説明したアミノ酸配列との組み合わせを用いて、縮重オリゴヌクレオチドのセットを作成できる。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法鎖反応（ＰＣＲ）など、プライマーとして有用であり、そこでＤＮＡ断片が単離され増幅される。ある一定の実施形態で、縮重プライマーは、遺伝的ライブラリ用のプローブとして使用できる。こうしたライブラリは、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、またさらには電子的な発現配列タグまたはＤＮＡライブラリを含むが、これに限定されない。この方法によって識別された相同配列は次に、本明細書で特定した配列の相同体を特定するためのプローブとして使用される。
【０１０３】
また、潜在的な用途は、低い厳密度の条件下で、通常はやや厳密な条件で、また一般に高い厳密度の条件下で、本明細書で説明したポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）の用途である。ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、当該技術分野の当業者であれば、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基の組成に基づき、容易に特定できる。やや厳密な条件の達成の一つの方法は、５×標準クエン酸ナトリウム、０．５％ナトリウムドデシル硫酸塩、１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ  ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリッド形成緩衝液、６×標準クエン酸ナトリウムを含む予洗溶液をハイブリッド形成温度約５５℃で（または約５０％ホルムアミドを含むものなど、その他の類似したハイブリッド形成溶液をハイブリッド形成温度約４２℃で）使用することと、０．５×標準クエン酸ナトリウム、０．１％ナトリウムドデシル硫酸塩中での約６０℃の洗浄条件とが関与する。一般的に、高い厳密度の条件は、上記のハイブリッド形成条件として定義されるが、洗浄はおよそ６８℃で、０．２×標準クエン酸ナトリウム、０．１％ナトリウムドデシル硫酸塩である。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム塩化物、１０ｍＭリン酸ナトリウム、および１．２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．４）を、ハイブリッド形成および洗浄緩衝液中で標準クエン酸ナトリウム（１×標準クエン酸ナトリウムは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム塩化物および１５ｍＭクエン酸ナトリウム）と置換でき、洗浄はハイブリッド形成の完了後１５分間実施される。当然のことながら、洗浄温度および洗浄塩分濃度は、当業者にとって公知でありかつ下記にさらに説明のある、ハイブリッド形成反応および二重鎖の安定性を支配する基本原則を適用することにより、望ましい度合いの厳密性を達成するように必要に応じて調整されうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。ポリヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成の長さであると想定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な配列の補完性のある領域を識別することにより決定できる。長さが５０塩基対未満であると予想される混成体についてのハイブリッド形成温度は、混成体の融解温度よりも５〜１０℃低いべきだが、ここで、融解温度は以下の等式によって決定される。長さが１８塩基対未満の混成体では、融解温度（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８塩基対を超える混成体では、融解温度（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは混成体中の塩基の数、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオン濃度（１×標準クエン酸ナトリウムの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。通常、こうしたそれぞれのハイブリッド形成用ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（少なくとも５０％、６０％、または７０％であることが一般で、少なくとも８０％が最も一般的）の長さを持ち、またハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）を持つ。
【０１０４】
単離ポリヌクレオチドもまた考慮される。「単離」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物体のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドの５’端および３’端に位置する配列）に自然の状態で隣接する配列（至適には、タンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、各種の実施形態で、単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチドが自然の状態で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含みうる。
【０１０５】
組み換え構築物を用いて、植物体または植物体細胞を形質転換することができる。組み換え体ポリヌクレオチド構築物は、本明細書に記載された一つ以上の変異体ポリペプチドをコードし、変異体ポリペプチドを発現させるのに適切な制御領域に作用できるように連結された、ポリヌクレオチドを備えることができる。こうして、ポリヌクレオチドは、変異体ポリペプチドをコードするコード配列を備えることができる。植物体または植物体細胞は、組み換えＤＮＡの安定した組み込みによって改変されたゲノムを含むことができる。組み換えＤＮＡは、遺伝子組み換えされ、細胞の外に構築されたＤＮＡを含み、また天然のＤＮＡ、またはｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡを含むＤＮＡを含む。植物体は、当初の形質転換された植物体細胞から再生された植物体や、形質転換した植物体の後の世代または交雑種からの子孫植物体を含むことができる。修飾によって、本明細書に記載のＨＭＡポリヌクレオチドまたはＨＭＡポリペプチドの発現または活性が、対照植物体と比較して改変されることが適切である。特定の実施形態では、遺伝子の不活性化を用いてＣｄ蓄積を低減させるために、非ＧＭＯ手法が用いられる。したがって、例えば、一つ以上の一塩基変異多型を特徴とする突然変異体が用いられており、該一つ以上の一塩基変異多型は、遺伝物質に無作為な突然変異を生じさせる一つ以上の外因的な添加化学物質（変異誘発、催奇性、または発癌性の有機化合物、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）など）を使用することによって得られるものである。処理される植物体のＤＮＡライブラリは、二つのＨＭＡ４遺伝子の突然変異についてスクリーニングされうる。
【０１０６】
本明細書で説明したものなど、組み換え体ポリヌクレオチド構築物を含むベクターも提供されている。適切なベクターバックボーンは、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体など、当業界で日常的に使用されているものを含む。適切な発現ベクターは、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスのベクターを含むがこれらに限定はされない。多数のベクターおよび発現システムが市販されている。ベクターは、例えば、複製の起源、足場アタッチメント領域またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物体細胞に対して選択可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）、または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロンまたはフォスフィノスリシン）などの殺生物剤耐性を与えることができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するようデザインされたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑蛍光タンパク質蛍光タンパク質、グルタチオンＳ−転移酵素、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃまたは赤血球凝集素配列などのタグ配列が、一般にコードされたポリペプチドと融合したものとして表現される。こうしたタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含めた、ＨＭＡ変異体ポリペプチド内のどこにでも挿入されうる。
【０１０７】
植物体または植物体細胞は、安定して転換されるようにそのゲノムに組み入れられた組み換え体ポリヌクレオチドを持つことで転換させることができる。本明細書で説明した植物体または植物体細胞は、安定して転換させることができる。安定して転換された細胞は通常、毎回の細胞分裂でも導入されたポリヌクレオチドを保持する。植物体または植物体細胞はまた、組み換え体ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み入れられないように、過渡的に転換させることができる。過渡的に転換された細胞は通常、十分な数の細胞分裂の後で、導入された組み換え体ポリヌクレオチドが娘細胞内で検出されないように、導入された組み換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂で失う。ゲノム編集の使用も考慮されている。
【０１０８】
植物体細胞を転換するための数多くの方法が当業界で利用でき、微粒子銃、遺伝子銃テクニック、アグロバクテリウム媒介の形質転換、ウイルスベクター媒介の形質転換およびエレクトロポーレーションを含めて、これらすべてを本明細書に含む。外来性ＤＮＡを植物体染色体に組み入れるためのアグロバクテリウムシステムが、植物体遺伝子工学で広範にわたり研究、修正、および開発されてきた。センスまたはアンチセンスの方向に作用できるように制御配列に連結された、主題の精製済みタンパク質に対応するＤＮＡ配列を含む、裸の組み換えＤＮＡ分子が、従来の方法により適切なＴ−ＤＮＡ配列に結合される。これらはポリエチレングリコール技術によるか、またはエレクトロポーレーション技術によってプロトプラストに導入されるが、どちらも標準技術である。別の方法としては、主題の精製済みタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を含むこうしたベクターを生きたアグロバクテリウム細胞に導入し、次いで、その細胞によりＤＮＡを植物体細胞内に移動させる。Ｔ−ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡによる形質転換は、プロトプラストとＤＮＡ含有リポソームとの融合によるか、またはエレクトロポーレーションによって達成できる。Ｔ−ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡは、不活性の高速微粒子銃によって細胞を転換するために使用することもできる。
【０１０９】
組み換え体構築物に含める制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導性、望ましい発現レベル、および細胞優先的または組織優先的な発現を含むがこれに限定されない、いくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、ＨＭＡ変異体コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。ポリヌクレオチドの転写は、類似した方法で調節できる。一部の適切な制御領域は、転写のみで、または主にある一定の細胞型で開始される。植物体ゲノムＤＮＡ内の制御領域の識別および特性付けをするための方法は、当業界において公知である。プロモーターの例として、異なる組織または細胞型に存在するか（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）、または異なる発育段階で存在するか、または異なる環境的条件に応じて存在する、組織特異的要因によって認識される組織特異的プロモーターが挙げられる。プロモーターの例として、ほとんどの細胞型で特定の誘導物質を必要とせずに活性化できる構成的プロモーターが挙げられる。ＲＮＡｉポリペプチド生成を制御するためのプロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ／３５Ｓ）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンプロモーターもしくはファゼオリンプロモーターが挙げられる。当業者は、組み換え体プロモーターの複数の変形物を生成することができる。植物体プロモーターに加えて、適切なその他のプロモーターを、細菌性の起源（例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、およびＴｉプラスミドに由来するその他のプロモーターなど）から誘導しうるか、またはウイルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター、たばこモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）から誘導しうる。
【０１１０】
本明細書に記載のＨＭＡの発現または活性を低減または抑制することは、種々の手段によって成し遂げられると理解されるべきである。例えば、欠失、挿入、部位特異的突然変異、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含め、ＨＭＡをコードする遺伝子のうちの少なくとも一つに一つ以上の突然変異を入れることが考慮される。
【０１１１】
一態様では、少なくとも二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を少なくとも部分的に低減させた突然変異体である植物体またはその一部が提供され、該二つのＨＭＡは、（ｉ）配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、もしくは（ｉｉｉ）ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、該突然変異体である植物体またはその一部は、該突然変異体である植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場で栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示している。
【０１１２】
ＨＭＡの発現または活性を一つ以上の突然変異を使用することによって調節することができ、該突然変異によって、コードされる遺伝子またはタンパク質の発現または機能が低減する。本明細書に記載の一つ以上の突然変異は別として、突然変異体である植物体または植物体細胞は、一つ以上のその他の遺伝子またはポリペプチドにおいて一つ以上のさらなる突然変異を持つことができる。特定の実施形態では、突然変異体は、一つ以上のその他の遺伝子またはポリペプチドにおける一つ以上のさらなる突然変異を持ちうる。
【０１１３】
さらなる態様では、圃場栽培植物体の葉におけるカドミウムレベルの低減方法であって、該方法が、（ａ）二つの重金属ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ）の発現または活性を低減させる工程であって、該二つのＨＭＡが、（ｉ）配列番号１および配列番号２に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、もしくは（ｉｉｉ）ＨＭＡをコードする配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、該低減させる工程と；（ｂ）該植物体を圃場で栽培する工程と；（ｃ）任意選択的に、工程（ｂ）で得られた該植物体におけるカドミウム含有量を測定する工程と；（ｄ）そこでのカドミウム含有量が、ＨＭＡの発現または活性が低下していない対照植物体に比べて減少する植物体を特定する工程であって、好適には、該植物体またはその一部が、該植物体を天然または非天然のカドミウムの存在下にて圃場栽培する場合に、葉中のカドミウムの蓄積において、該対照植物体に比べて少なくとも２７％の低減を示し；好適には、収穫時の該突然変異体である植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の該対照植物体と同じであり、好適には、該突然変異体である植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない該特定する工程と、を含む該方法が提供されている。特定の実施形態では、二つのＨＭＡの発現または活性が、本明細書に記載の突然変異誘発手法により、または本明細書に記載の突然変異体の使用により低下する。
【０１１４】
植物体の「収穫時」は、当業者に直ちにわかるはずである。言い換えると、当業者は、植物体が収穫できる状態になっている時をわかるはずである。一例として、当業者は、たばこ植物体の葉が熟し始めることから、たばこ植物体の収穫期を認識する。たばこの特定の品種に対しては、これは、葉が黄色くなり始めることを意味し、適切な乾燥処理に向いておりかつ望ましい状態を表している。  緑色から茶色に乾燥処理するか、緑色から黄色、さらに茶色に乾燥処理をするたばこの品種もある。植物体は、一旦植物体の一部が収穫できる状態になると、全体的または部分的に収穫されうる。例えば、たばこ植物体に関しては、収穫時は各茎位置に対して定められうる。たばこの茎の下部にある葉は最初に色が変わり始め（例えば、黄色）、収穫できるようになり、上部の葉はその後に黄色くなって収穫されるようになる。一つ以上の遺伝子改変を含まない圃場栽培対照植物体と比べた場合の、葉中のカドミウムレベルの低減と関連する、圃場栽培植物体における一つ以上の遺伝子改変を特定する方法も提供されており、該方法は、（ａ）圃場で栽培された場合に、圃場で栽培された対照植物体に比べて葉中のカドミウムレベルを低減させた植物体を特定する工程であって、任意選択的に、収穫時の該植物体またはその一部の表現型が、同一収穫時の該対照植物体と同じであり、好適には、該植物体またはその一部が、収穫時に、同一収穫時の該対照植物体に比べてバイオマス（例えば、葉重量）の減少を示さない、該特定する工程と；（ｂ）工程（ａ）で特定された植物体由来の核酸試料を提供する工程と；（ｃ）工程（ｂ）由来の核酸試料において、配列番号１および配列番号２に記載された非突然変異配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するＨＭＡをコードするポリヌクレオチド配列中か、または配列番号３および配列番号４に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列中の一つ以上の遺伝子改変を特定する工程と、を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、一つ以上の好都合な突然変異は、突然変異体である植物体の母集団をスクリーニングすることによって特定される。一部の実施形態で、スクリーニング手法を用いて特定された一つ以上の好都合な突然変異を、異なる植物体または植物体細胞に導入することができ、導入された突然変異は、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、または表現型分析などの当業者にとって既知の方法を使用して特定または選択されうる。遺伝子発現に影響を与えるか、またはコードされたＨＭＡタンパク質の機能を妨げる突然変異は、当業界で周知の方法を使用して決定されうる。
【０１１６】
植物体細胞または植物材料を含めた、関心対象の任意の植物体は、突然変異を誘発することが知られている様々な方法により修飾でき、これには、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、化学的に誘発された突然変異誘発、照射誘発された突然変異誘発、修飾塩基を利用した突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを利用した突然変異誘発、二本鎖分解突然変異誘発、修復欠損宿主系統を利用した突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、ＤＮＡシャフリングおよびその他の同等の方法が含まれる。
【０１１７】
突然変異ポリペプチド変異体を用いて、一つ以上の突然変異ポリペプチド変異体を含む突然変異体である植物体または植物体細胞を作製することができる。突然変異ポリペプチド変異体のＨＭＡ活性は、未成熟のポリペプチドと比較して、高いか、低いか、またはほぼ同一でありうる。好適には、突然変異ポリペプチド変異体のＨＭＡ活性は、本明細書に記載するように、部分的に不活性化（例えば、低減）されるか、または消失（例えば、抑制または排除）される。
【０１１８】
本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人造の突然変異または合成的な突然変異または遺伝子組み換えの突然変異を含むことができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、生体外または生体内の操作手順を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人による介入を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。一例として、工程は、遺伝子材料内に無作為な突然変異を生成する、変異原性、催奇性、または発癌性の有機化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸塩（ＥＭＳ））などの外因的な添加化学物質を使用した突然変異誘発を含みうる。さらなる例として、工程は、一つ以上の遺伝子工学工程（本明細書で説明されている一つ以上の遺伝子工学工程など）またはその組み合わせを含みうる。さらなる例として、工程は一つ以上の植物体交雑工程を含みうる。
【０１１９】
植物体内における一つ以上のＨＭＡポリペプチドの活性は、本開示に従って低減または抑制されるが、これは、そのＨＭＡポリペプチド活性が、ＨＭＡポリペプチドの活性を低減または抑制するようには改変されていない、かつ同一のプロトコルを使用して栽培および収穫がなされた植物体内の同一のＨＭＡポリペプチドの活性よりも、統計的に低い場合のことである。植物体内でのＨＭＡポリペプチドの活性は、本明細書に記載のアッセイ法によって検出できない場合、排除されていると見なされる。突然変異体ＨＭＡタンパク質のＣｄ輸送活性を分析するために、酵母ベースのアッセイを用いることができる。このアッセイでは、完全長配列を酵母発現ベクターにクローニングし、Ｃｄ感受性ｙｃｆ１酵母突然変異体で発現させることができる。対数期の細胞をそれぞれＯＤ600に希釈し、Ｃｄを含む培地にスポットする。この株のＣｄ耐性は、ＨＭＡ突然変異体タンパク質の輸送活性を表している。別の方法として、突然変異ＨＭＡ配列を、ＨＭＡ輸送活性を完全に消失させる別のＨＭＡナンセンス突然変異と組み合わせて、活性を推定することができる。タンパク質の大部分をトランケートするナンセンス突然変異は、いかなる輸送活性をも示さないと予想される。ミスセンス突然変異に対しては、酵素活性は、部分的に低下しうるか、または完全に消失されうる。ナンセンス突然変異とミスセンス突然変異とを組み合わせた二重突然変異体のＣｄ値が対照と同等である場合、ミスセンス突然変異はタンパク質活性に有意な影響を及ぼすことはないと推定できる。Ｃｄ値および／または表現型が二重ナンセンス突然変異と対照の間にある場合、ミスセンス突然変異の部分的な活性が想定されうる。Ｃｄ値および表現型が二重ＨＭＡナンセンス突然変異体と同等である場合、ミスセンス突然変異は輸送活性を完全に消失していると結論付けることができる。
【０１２０】
突然変異を遺伝子配列内に無作為に導入する方法には、化学的突然変異誘発、ＥＭＳ突然変異誘発、および放射線突然変異誘発を含めることができる。一つ以上の標的突然変異を細胞に導入する方法として、以下に限定されないが、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発（Ｐｅｔｏｌｉｎｏ，２０１５に概説）、ゲノム内標的誘導局所病変（ＴＩＬＬＩＮＧ）（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に概説）、メガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発（例えば、Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照）、ＴＡＬＥＮ（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に概説）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｂｏｒｔｅｓｉ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，２０１５に概説）が挙げられる。植物体におけるゲノム／遺伝子編集方法は、例えば、Ｐｕｃｈｔａ  ａｎｄ  Ｆａｕｓｅｒ（２０１３）、Ｑｉｗｅｉ  ａｎｄ  Ｃａｉｘｉａ，（２０１５）、およびＣｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇａｏ（２０１４）に概説されている。
【０１２１】
上述した種々の方法の組み合わせもまた考慮される。言い換えると、一方のＨＭＡの活性または発現を、ある特定の手法を用いて調節することができ、他方のＨＭＡを異なった手法を用いて調節することができる。
【０１２２】
突然変異のうちのいくつかの非限定的な例としては、少なくとも一つのヌクレオチド欠失、挿入、ナンセンス突然変異およびミスセンス突然変異や、一塩基多型、ならびに単純配列反復がある。突然変異の後、早熟の終止コドンまたはそれ以外での非機能的な遺伝子を生成した突然変異を特定するためにスクリーニングを実施できる。突然変異体のスクリーニングは、配列決定により、または遺伝子またはタンパク質に対して特異的な一つ以上のプローブまたはプライマーを使用することにより実施できる。遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡの安定性の調節、またはタンパク質の安定性の調節をもたらすことができる、ポリヌクレオチド内での特定の突然変異も生成できる。こうした植物体は、本明細書では、「非天然の」または「突然変異体」植物体と呼ぶ。突然変異体または非天然の植物体には、操作される前には植物体内に存在しなかった、外来性もしくは合成または人造の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも一部が含まれるようになる。外来性の核酸は、単一のヌクレオチド、二つ以上のヌクレオチド、二つ以上の連続するヌクレオチドまたは二つ以上の非連続的なヌクレオチド、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００または１５００個またはそれ以上の連続的または非連続的なヌクレオチドなどとしうる。
【０１２３】
一つの実施形態では、植物体からの種子は突然変異誘発された後、栽培されて第一世代の突然変異体である植物体となり、続いてその座位の突然変異についてスクリーニングされる。第一世代の植物体は自家受粉がなされ、第一世代植物体からの種子が栽培されて第二世代の植物体になることができ、その座位の突然変異についてスクリーニングされうる。突然変異について、突然変異誘発性植物材料（種子を含む）をスクリーニングすることができるが、第二世代の植物体をスクリーニングすることの利点は、細胞体の全ての突然変異が生殖細胞系列変異に相当することである。当業者であれば、突然変異体である植物体を生成するために、種子、花粉、植物体組織または植物体細胞を含むがこれに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発しうることを理解することになる。ただし、突然変異誘発した植物材料のタイプは、植物体の核酸がいつ突然変異についてスクリーニングを受けるかに影響しうる。例えば、非突然変異誘発性植物体の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となるとき、その受粉の結果生じる種子は第一世代植物体に栽培される。第一世代の植物体の各細胞は、花粉内で生成された突然変異を含むことになり、こうしてこれらの第一世代の植物体はその後、第二世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングを受けうる。
【０１２４】
主に点突然変異および短い欠失、挿入、塩基転換、および／又は遷移を生成する突然変異原は、化学的突然変異原または放射線を含めて、突然変異を生成するために使用しうる。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタードカラシナ、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン、酸化エチレン酸化物、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン、およびこれに類するもの）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩およびホルムアルデヒドを含むが、これに限定されない。
【０１２５】
突然変異原が直接原因ではなかったかもしれない座での天然の突然変異も、それらが結果的に望ましい表現型をもたらす場合には意図されている。適切な変異原性物質には、例えば、イオン化放射線（Ｘ線、γ線、高速中性子照射およびＵＶ放射放射線など）も含めることができる。突然変異スクリーニングのための植物体核酸を準備するために、当業者にとって公知の植物体の核酸を準備する任意の方法を使用しうる。
【０１２６】
個体植物体、植物体細胞、または植物材料から準備した核酸は、随意に、突然変異誘発性の植物体組織、細胞または材料を起源とする植物体の母集団内で、突然変異についてのスクリーニングを促進させるためにプールすることができる。植物体、植物体細胞または植物材料のその後の一世代以上の世代をスクリーニングできる。随意にプールされる群のサイズは、使用するスクリーニング方法の感受性に依存する。
【０１２７】
核酸試料が随意にプールされた後、それらを、ポリメラーゼ連鎖反応などのポリヌクレオチド特異的増幅テクニックの対象とすることができる。遺伝子のすぐ隣にある遺伝子または配列に特異的な一つ以上の任意のプライマーまたはプローブは、随意にプールされた核酸試料内で配列を増幅するために利用しうる。オリゴヌクレオチドプライマーの例が本明細書に記載されている。一つ以上のプライマーまたはプローブは、有用な突然変異が最も発生する可能性の高い座の領域を増幅するよう設計されていることが適切である。プライマーは、ポリヌクレオチドの領域内での突然変異を検出するように設計されることが最も好適である。さらに、プライマーおよびプローブは、点突然変異についてのスクリーニングを容易にするために、既知の多型の部位を避けることが好適である。増幅生成物の検出を促進するために、一つ以上のプライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。プライマーまたはプローブは、当業界でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。
【０１２８】
増幅生成物の検出を促進するために、プライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。これらは、当業界でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。多型は、当業界において公知の手段により識別しうるが、いくつかがこれまでに文献に記載されている。
【０１２９】
さらなる態様で、突然変異体である植物体を準備する方法が提供されている。方法には、本明細書に記載の機能的ＨＭＡポリペプチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）をコードする遺伝子を含む、植物体の少なくとも一つの細胞を提供することが含まれる。次に、植物体の少なくとも一つの細胞が、本明細書に記載のＨＭＡポリペプチドの活性を調節するのに効果的な条件下で処理される。続いて、少なくとも一つの突然変異体である植物体の細胞は、突然変異体である植物体内で増殖するが、そこで突然変異体である植物体は、対照植物体と比較して調節されたレベルのＨＭＡポリペプチドを持つ。突然変異体である植物体を作成するこの方法の一つの実施形態において、処理手順には、上述の通り、および少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも一つの細胞を化学的突然変異誘発物質に晒す段階が関与する。この方法の別の実施形態で、処理手順には、少なくとも一つの細胞を少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で線源に晒す段階が関与する。「突然変異体である植物体」という用語には、対照植物体と比較して遺伝子型が修飾された、突然変異体である植物体が含まれる。
【０１３０】
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体、突然変異体である植物体細胞、または突然変異体である植物材料は、別の植物体、植物体細胞または植物材料で自然に発生し、望ましい特性を与える一つ以上の突然変異を備えうる。この突然変異は、別の植物体、植物体細胞、または植物材料（例えば、突然変異が誘導された植物体とは異なる遺伝的背景を持つ植物体、植物体細胞または植物材料）に組み込まれて（例えば、遺伝子移入されて）、その植物体に非天然である突然変異を生成し、かつその植物体に対して特性を与えることができる。こうして一例として、第一の植物体で自然に発生した突然変異が第二の植物体（第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ第二の植物体など）に導入されうる。従って当業者は、本明細書で説明した望ましい特性を与える遺伝子の一つ以上の突然変異体対立形質をそのゲノム内に自然に持つ植物体を、検索し特定することができる。自然に発生する突然変異体対立遺伝子は、本明細書で説明した遺伝子で一つ以上の突然変異を持つ系統、品種または混成体を生成するために、育種、戻し交配および遺伝子移入を含む様々な方法により、第二の植物体に移動させることができる。望ましい特性を示す植物体は、突然変異体である植物体のプールからスクリーニングして除外しうる。選択は、本明細書で説明したヌクレオチド配列の知識を利用して実施されることが適切である。従って、対照と比較した遺伝的特性についてのスクリーニングが可能である。こうしたスクリーニングのアプローチには、本明細書で説明した通り従来的な核酸増幅および／またはハイブリッド形成テクニックの適用が関与しうる。
【０１３１】
別の態様において、対照植物体と比較して、Ｃｄのレベルが減少した突然変異体である植物体を調製するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）第一の植物体に由来する試料を提供する工程と、（ｂ）該試料が、圃場で栽培された植物体のＣｄのレベルを結果的に低減させた本明細書に記載のＨＭＡ４ポリペプチドの各々において、同時突然変異を含むかどうかを判定する工程と、（ｃ）両方の突然変異を第二の植物体に移入させる工程とを含む。突然変異は、遺伝子組み換え、遺伝子操作、遺伝子移入、植物体育種、戻し交配、およびこれに類するものによるなど、当業界において公知の様々な方法を使用して、第二の植物体に移動できる。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。
【０１３２】
別の態様において、対照植物体と比較して、Ｃｄのレベルが減少した突然変異体である植物体を調製するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）第一の植物体に由来する試料を提供する工程と、（ｂ）該試料が、圃場で栽培された植物体のＣｄのレベルを結果的に低減させた本明細書に記載のＨＭＡ４ポリペプチドにおいて二重突然変異を含むかどうかを判定する工程と、（ｃ）第一の植物体由来の両方の突然変異を第二の植物体に遺伝子移入させる工程とを含む。一つの実施形態で、遺伝子移入の工程は、植物体育種を含み、随意に、戻し交配およびこれに類するものを含む。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。一つの実施形態で、第一の植物体は、栽培品種または優良栽培品種ではない。一つの実施形態で、第二の植物体は、栽培品種または優良栽培品種である。
【０１３３】
さらなる態様が、本明細書に記載した方法によって獲得されたか、または獲得可能な突然変異体である植物体（栽培品種または優良栽培品種の突然変異である植物体を含む）に関連する。ある一定の実施形態で、「突然変異体である植物体」は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの配列内など、植物体の特定の領域にのみ局所化された一つ以上の突然変異を持ちうる。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一となるかまたは実質的に同一となる。
【０１３４】
本開示は、他の植物体で再現可能であり、また変異体系統での育種に適用可能であると考えられる。
【０１３５】
関心対象の植物体は、以下に限定されないが、単子葉および双子葉の植物体および植物体細胞系を含み、以下の科のうちの一つに属する種を含む：Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ、Ａｌｌｉａｃｅａｅ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ、Ａｒｅｃａｃｅａｅ、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ、Ｂｉｘａｃｅａｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅ、Ｌａｍｉａｃｅａｅ、Ｌｉｎａｃｅａｅ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｍａｌｖａｃｅａｅ、Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ、Ｍｕｓａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｎｙｓｓａｃｅａｅ、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ、Ｐｉｎａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ、Ｒｏｓａｃｅａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ、Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、Ｔａｘａｃｅａｅ、Ｔｈｅａｃｅａｅ、またはＶｉｔａｃｅａｅ。
【０１３６】
適切な種は、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ、Ａｂｉｅｓ、Ａｃｅｒ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ａｎａｎａｓ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、Ａｒｕｎｄｏ、Ａｔｒｏｐａ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ、Ｂｅｔａ、Ｂｉｘａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｊａｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｍｅｎｔｈａ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｍｕｓａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｉｎｕｓ、Ｐｏａ、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｉｘ、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｐａｒｔｉｎａ、Ｓｐｉｎａｃｅａ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ、Ｔａｘｕｓ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｕｎｉｏｌａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｔｉｓ、およびＺｅａといった属の一つを含みうる。
【０１３７】
適切な種は、Ｐａｎｉｃｕｍ属種、Ｓｏｒｇｈｕｍ属種、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属種、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属種、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ属種、Ｐｏｐｕｌｕｓ属種、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ（ヒメアブラススキ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（オオガマ）、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（クサヨシ）、Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ（ギョウギシバ）、Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（ヒロハノウシノケグサ）、Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ（プレーリーコードグラス）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ（ダンチク）、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）、Ｓａｌｉｘ属種（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属種（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ（コムギタイムライ麦）、竹、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（ヤシ）、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓｙｃｌｉｓｅ  ａｌｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅ  ｃｌｉｓｅｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ（トウガラシおよびアマトウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｒｏｓａ属種（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ属種（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オートムギ）、ベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ属種）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（ポプラ）、Ｐｉｎｕｓ属種（マツ）、Ａｂｉｅｓ属種（モミ）、Ａｃｅｒ属種（カエデ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ属種（ドクムギ）およびＰｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ（チモシー）、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕ１８ｙｃｌｉｓｅ１８または（モロコシ、スーダングラス）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  属種（ｅｎｅｒｇｙｃａｎｅ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンビエ）を含みうる。
【０１３８】
様々な実施形態は、遺伝子発現レベルを調節するために修飾され、それによってＨＭＡポリペプチドの発現レベルが関心対象の組織内で対照に比べて調節された、植物体または植物体細胞（たばこ植物体またはたばこ植物体細胞など）を生成する、突然変異体である植物体または植物体細胞を対象とする。開示された組成物および方法は、たばこ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属するＮ．ｒｕｓｔｉｃａおよびＮ．  ｔａｂａｃｕｍを含む任意の種（例えば、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、ＴＩ  １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ  １０００−１、およびＰｅｔｉｃｏ）に適用できる。その他の種は、Ｎ．アカウリス（Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ）、Ｎ．アクミナタ（Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、Ｎ．アフリカナ（Ｎ．ａｆｒｉｃａｎａ）、Ｎ．アラタ（Ｎ．ａｌａｔａ）、Ｎ．アメギノイ（Ｎ．ａｍｅｇｈｉｎｏｉ）、Ｎ．アムプレキシカウリス（Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ）、Ｎ．アレントシイ（Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ）、Ｎ．アッテニュアタ（Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ）、Ｎ．アゼンブジェ（Ｎ．ａｚａｍｂｕｊａｅ）、Ｎ．ベナヴィデシイ（Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ）、Ｎ．ベンタミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｎ．ビゲロビイ（Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ）、Ｎ．ボラリエンシス（Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｎ．カヴィコラ（Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ）、Ｎ．クレベランヂイ（Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、Ｎ．コルジフォリア（Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．コリムボサ（Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ）、Ｎ．デブネイ（Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ）、Ｎ．エクセルシオル（Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）、Ｎ．フォルゲチアナ（Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ）、Ｎ．フラグランス（Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ）、Ｎ．グラウカ（Ｎ．ｇｌａｕｃａ）、Ｎ．グルチノサ（Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、Ｎ．グッドスピーディイ（Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ）、Ｎ．ゴッセイ（Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ）、Ｎ．ハイブリッド（Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ）、Ｎ．イングルバ（Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ）、Ｎ．カワカミイ（Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ）、Ｎ．ナイチアナ（Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ）、Ｎ．ラングスドルフィイ（Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ）、Ｎ．リネアリス（Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ）、Ｎ．ロンギフロラ（Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ）、Ｎ．マリチマ（Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｎ．メガロシフォン（Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）、Ｎ．ミエルシイ（Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ）、Ｎ．ノクチフロラ（Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ）、Ｎ．ヌヂカウリス（Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ）、Ｎ．オブツシフォリア（Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．オクシデンタリス（Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｎ．オクシデンタリス亜種ヘスペリス（Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｓ）、Ｎ．オトフォラ（Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ）、Ｎ．パニキュラタ（Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、Ｎ．パウシフロラ（Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ）、Ｎ．ペツニオイデス（Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ）、Ｎ．プルムバギニフォリア（Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．クアドリヴァルヴィス（Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ）、Ｎ．ライモンジイ（Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｎ．レパンダ（Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ）、Ｎ．ロスラタ（Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、Ｎ．ロスラタ亜種イングルバ（Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｇｕｌｂａ）、Ｎ．ロツンヂフォリア（Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．セッシェリイ（Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ）、Ｎ．シムランス（Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）、Ｎ．ソラニフォリア（Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．スペガッジニイ（Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ）、Ｎ．ストックトニイ（Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ）、Ｎ．スアヴェオレンス（Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、Ｎ．シルヴェストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、Ｎ．サイルシフロラ（Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ）、Ｎ．トメトサ（Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、Ｎ．トメトシフォルミス（Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｎ．トリゴノフィラ（Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ）、Ｎ．ウムブラチカ（Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ）、Ｎ．ウンジュラタ（Ｎ．ｕｎｄｕｌａｔａ）、Ｎ．ヴェルチナ（Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ）、Ｎ．ウィガンディオイデス（Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ）およびＮ．キサンデラエ（Ｎ．ｘ  ｓａｎｄｅｒａｅ）を含む。
【０１３９】
たばこ栽培品種および優良たばこ栽培品種の使用も、本明細書で意図されている。したがって、突然変異体である植物体は、一つ以上の導入遺伝子、もしくは一つ以上の遺伝子突然変異、またはその組み合わせを含む、たばこ品種または優良たばこ栽培品種でありうる。  遺伝子突然変異（例えば、一つ以上の多型）は、個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）内に天然には存在しない突然変異とするか、または個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）で天然に発生しないとする場合に、天然に発生する遺伝子突然変異とすることができる。
特に有用なＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ品種には、バーレータイプ、ダークタイプ、熱風送管乾燥処理タイプ、およびオリエンタルタイプのたばこが含まれる。品種または栽培品種の非限定的な例は：ＢＤ  ６４、ＣＣ  １０１、ＣＣ  ２００、ＣＣ  ２７、ＣＣ  ３０１、ＣＣ  ４００、ＣＣ  ５００、ＣＣ  ６００、ＣＣ  ７００、ＣＣ  ８００、ＣＣ  ９００、Ｃｏｋｅｒ  １７６、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ  ４８、ＣＤ  ２６３、ＤＦ９１１、ＤＴ  ５３８  ＬＣ  Ｇａｌｐａｏ  ｔｏｂａｃｃｏ、ＧＬ  ２６Ｈ、ＧＬ  ３５０、ＧＬ  ６００、ＧＬ  ７３７、ＧＬ  ９３９、ＧＬ  ９７３、ＨＢ  ０４Ｐ、ＨＢ  ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ  ４０３ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ  ４０４ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ  ５０１  ＬＣ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＤＨ  ９５９、ＫＴ  ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  １７１、ＫＹ  ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＹ１４ｘＬ８  ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ  ３７３、ＭｃＮａｉｒ  ９４４、ｍｓＫＹ  １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ  ＬＣ、ＮＢＨ  ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１ＬＣ、ＮＣ  １００、ＮＣ  １０２、ＮＣ  ２０００、ＮＣ  ２９１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ２９９、ＮＣ  ３、ＮＣ  ４、ＮＣ  ５、ＮＣ  ６、ＮＣ７、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ８１０、ＮＣ  ＢＨ  １２９、ＮＣ  ２００２、Ｎｅａｌ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ  ２０７、ＰＤ  ７３０２  ＬＣ、ＰＤ  ７３０９  ＬＣ、ＰＤ  ７３１２  ＬＣ、’Ｐｅｒｉｑｅ’  ｔｏｂａｃｃｏ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ  ６１０、Ｒ  ６３０、Ｒ  ７−１１、Ｒ  ７−１２、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ  ４、ＲＧＨ  ５１、ＲＳ  １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ−６、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ＮＦ３、ＴＩ  １４０６、ＴＩ  １２６９、ＴＮ  ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ  ９０、ＴＮ  ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ  Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ  ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ  ３７−１、Ｂ１３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｍｏｒ）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、Ｓａｍｓｕｎ  Ｈｏｌｍｅｓ  ＮＮ、ＫＴＲＤＣ  ｎｕｍｂｅｒ  ２  Ｈｙｂｒｉｄ  ４９、Ｂｕｒｌｅｙ  ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ  ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ１１、ＲＧ  ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ  Ａ１、Ｂａｓｍａ  Ｄｒａｍａ  Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ  Ｉ  Ｚｉｃｈｎａ  ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ  Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ  ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ  Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ  ８１、ＤＶＨ  ４０５、Ｇａｌｐａｏ  Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ  Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋｕｔｓａｇｅ  Ｅ１、ＬＡ  ＢＵ  ２１、ＮＣ  ２３２６、ＮＣ  ２９７、ＰＶＨ  ２１１０、Ｒｅｄ  Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ  ２８、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｐｒｉｌｅｐ  ＨＣ−７２、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ  ＰＢ  １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ１２−２／１、Ｙａｋａ  ＪＫ−４８、Ｙａｋａ  ＪＢ  １２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ  ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ  ２００２、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ  ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａである。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上記の低コンバーター亜種も意図されている。一実施形態では、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のバーレータイプが使用される。
【０１４０】
実施形態は、本明細書に記載のＨＭＡポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節するために修飾された、突然変異体である植物体を生成する組成物および方法も対象とする。有利なことに、得られる突然変異体である植物体は、全体的な外観において対照植物体と類似しているか、または実質的に同一でありうる。成熟度、植物体当たりの葉の数、茎の高さ、葉の挿入角度、葉のサイズ（幅および長さ）、節間の距離、および葉身と中央脈の比率など、様々な表現型特性を現場での観察により評価できる。
【０１４１】
一態様は、突然変異体である植物体の種子に関連する。好適には、種子はたばこ種子である。さらなる態様は、本明細書に記載された突然変異体である植物体の花粉または胚珠に関連する。さらに、雄性不稔性を与える核酸をさらに含む、本明細書に記載の突然変異体である植物体が提供されている。
【０１４２】
また、本明細書に記載の突然変異体である植物体またはその一部の再生可能な細胞の組織培養も提供されており、その培養によって、親の全ての形態学的特性および生理学的特性を発現する能力を持つ植物体が再生される。再生可能な細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、幹、茎、随およびカプセルに由来する細胞、またはカルスまたはそれに由来する原形質体が含まれるが、これに限定されない。
【０１４３】
なおさらなる態様は、突然変異体である植物体または細胞から誘導されるかまたは誘導可能な乾燥処理もしくは乾燥済み植物材料（乾燥処理もしくは乾燥済みの葉または乾燥処理もしくは乾燥済みたばこなど）であって、本明細書に記載のＨＭＡポリヌクレオチドのうちの一つ以上の発現、またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下し、これが結果的にそこでのＣｄレベルの低減をもたらす、該乾燥処理もしくは乾燥済み植物材料に関連する。
【０１４４】
実施形態は、本明細書に記載のＨＭＡポリヌクレオチドまたはＨＭＡポリペプチドのうちの一つ以上の発現または活性を調節するために修飾された突然変異体である植物体または植物体細胞を生成する組成物および方法も対象とするが、これは、本明細書で説明したようにＣｄレベルが減少した植物体、または植物体成分（例えば、葉（乾燥処理または乾燥済みの葉など））、または植物体細胞をもたらしうるものである。
【０１４５】
本明細書に記載の植物体の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であるのが好適である。バイオマスおよび葉のサイズは、対照植物体と比較して実質的に変わらないのが好適である。一実施形態では、突然変異体である植物体の葉の重量は、実質的に対照植物体と同一である。一実施形態では、突然変異体である植物体の葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一実施形態では、突然変異体である植物体の葉の重量および葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一実施形態では、突然変異体である植物体の茎の高さは、例えば、圃場に移植してから１か月、２か月または３か月以上、または最高の高さまで伸びた後１０日、２０日、３０日もしくは３６日もしくはそれ以上の日数が経過した時点で実質的に対照植物体と同一である。例えば、突然変異体である植物体の茎の高さは、対照植物体の茎の高さよりも低くはない。別の実施形態では、突然変異体である植物体のクロロフィル含有量は、実質的に対照植物体と同一である。別の実施形態では、突然変異体である植物体の茎の高さは、実質的に対照植物体と同一であり、突然変異体である植物体のクロロフィル含有量は、実質的に対照植物体と同一である。他の実施形態では、突然変異体である植物体の葉のサイズまたは形態または数または彩色は、実質的に対照植物体と同一である。
【０１４６】
対照と比較した発現の減少は、約５  ％〜約１００  ％としうるか、または少なくとも１０  ％、少なくとも２０  ％、少なくとも２５  ％、少なくとも３０  ％、少なくとも４０  ％、少なくとも５０  ％、少なくとも６０  ％、少なくとも７０  ％、少なくとも７５  ％、少なくとも８０  ％、少なくとも９０  ％、少なくとも９５  ％、少なくとも９８  ％、または１００  ％の減少であり、これには、転写性の活性またはポリヌクレオチド発現またはポリペプチド発現またはその組み合わせの減少が含まれる。
【０１４７】
対照と比較した活性の減少は、約５  ％〜約１００  ％としうるか、または少なくとも１０  ％、少なくとも２０  ％、少なくとも２５  ％、少なくとも３０  ％、少なくとも４０  ％、少なくとも５０  ％、少なくとも６０  ％、少なくとも７０  ％、少なくとも７５  ％、少なくとも８０  ％、少なくとも９０  ％、少なくとも９５  ％、少なくとも９８  ％、または１００  ％の低減である。
【０１４８】
本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび組み換え体構築物を使用して、関心対象の植物種（好適にはたばこ）において、本明細書に記載した通りＮｔＨＭＡ４の発現の調節することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび組み換え体構築物を使用して、関心対象の植物種（好適にはたばこ）において、本明細書に記載した通り突然変異体ＮｔＨＭＡ４ポリペプチドを発現することができる。
【０１４９】
特定の実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部の葉の表現型および生長速度は、対照植物体と同一である。これらの特性を付与する二重突然変異の一例は、Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊である。
【０１５０】
特定の実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部の葉の表現型は対照植物体と同一であり、突然変異体である植物体またはその一部は、初期段階で対照植物体と比較した場合に生長の遅延を示す。初期段階での生長の遅延は問題とは見なされていないが、これは、収穫時に、対照植物体と比較した場合にバイオマスの差異が観察されないためである。これらの特性を付与する二重突然変異体の一例は、Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊である。
【０１５１】
特定の実施形態では、突然変異体である植物体またはその一部の葉の表現型は、初期段階で壊死性病変があることを除いて対照植物体と同一であり、突然変異体である植物体またはその一部は、初期段階で対照植物体と比較した場合に生長の遅延を示す。壊死性病変があることは問題とはならないが、これは、壊死性病変は、ほとんどの条件下で圃場での収穫時に観察されないためである。これらの特性を付与する二重突然変異体の例は、Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｗ２６５＊、またはＥ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、またはＱ４６４＊／Ｑ５６１＊、またはＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅである。好適には、本明細書に記載の突然変異体である植物体またはその一部の生長量は、対照植物体に比べて減少していない。
【０１５２】
好適には、本明細書に記載の突然変異体である植物体またはその一部は、対照植物体に比べて矮性表現型を呈していない。好適には、本明細書に記載の突然変異体である植物体またはその一部は、対照植物体の収穫時に比べて、収穫時に矮性表現型を呈していない。
【０１５３】
好適には、本明細書に記載の突然変異体である植物体またはその一部は、対照に比べてバイオマス（葉重量）が減少していない。好適には、本明細書に記載の突然変異体である植物体またはその一部は、対照に比べて収穫時にバイオマス（葉重量）が減少していない。
【０１５４】
特定の実施形態では、突然変異体である植物体には、生長の間に亜鉛が補充されうる。
【０１５５】
様々な実施形態が、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの発現レベルを、ポリヌクレオチドの複数のコピーを植物体ゲノムに組み込むことで低減させるための方法を対象とするが、これには、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて植物体細胞宿主を形質転換させる工程が含まれる。組み換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。
【０１５６】
本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の突然変異体対立遺伝子を持つ植物体は、有用な系統、品種および混成体を生成するための植物体育種プログラムで使用できる。特に、突然変異体対立遺伝子は、上述した商業的に重要な品種に遺伝子移入される。こうして、本明細書に記載の突然変異体である植物体を異なる遺伝的同一性を備えた植物体と交雑することを含む、植物体を育種するための方法が提供されている。方法は、さらに子孫植物体と別の植物体との交雑を含めることができ、また随意に、望ましい遺伝的形質または遺伝的背景を持つ子孫が得られるまで交雑が繰り返される。こうした育種方法が果たしている一つの目的は、望ましい遺伝的特性を他の品種、育成系統、混成体または栽培品種、特に商業的利害のあるものに導入することである。別の目的は、異なる遺伝子の遺伝的修飾を単一の植物体品種、系統、混成体または栽培品種へ積み重ねることの促進である。種内および種間の交配が意図されている。こうした交雑から発生した子孫植物体は、育種系統とも言うが、本開示の非天然の植物体の例である。
【０１５７】
一つの実施形態では、非天然のまたは突然変異体である植物体を生成するための方法が提供されおり、この方法は、（ａ）突然変異体である植物体を第二の植物体と交雑して、子孫たばこ種子を得る工程と、（ｂ）該子孫種子を植物体生長条件下で栽培して、非天然の植物体を得る工程とを含む。この方法は、（ｃ）前の世代の非天然の植物体を、それ自体または別の植物体を交雑して、子孫種子を得る工程と、（ｄ）工程（ｃ）の子孫種子を、植物体栽培条件下で栽培して、追加的な非天然の植物体を得る工程と、（ｅ）（ｃ）および（ｄ）の交雑および栽培の工程を複数回繰り返して、非天然の植物体のさらなる世代を生成する工程とをさらに含みうる。この方法は、任意選択的に、工程（ａ）の前に、特性付けられた遺伝的同一性を備え、突然変異体である植物体とは同一ではない親植物体を提供する工程を含みうる。一部の実施形態で、育種プログラムにもよるが、交雑および栽培の工程は、非天然の植物体の世代を生成するために、０〜２回、０〜３回、０〜４回、０〜５回、０〜６回、０〜７回、０〜８回、０〜９回、または０〜１０回繰り返される。戻し交雑は、こうした方法の一実施例であり、ここで、親のものと近い遺伝的同一性を持つ次世代の子孫植物体を得るために、子孫はその親またはその親と遺伝的に類似した別の植物体との交雑がなされる。植物体育種、特に植物体育種の技法はよく知られており、本開示の方法で使用できる。本開示はさらに、これらの方法により生成された非天然の植物体を提供する。一定の実施形態では、植物体を選択する工程は除外される。
【０１５８】
本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、標準現場手続きを使用して、変異体遺伝子のための育種およびスクリーニングからもたらされた系統が現場で評価される。最初の変異誘発されていない親を含む対照遺伝子型が含められ、無作為化完全ブロックデザインまたはその他の適切な現場設計で、エントリーが現場で配列される。たばこについては、標準的な農業方法が使用され、例えば、たばこは、収穫され、秤量され、乾燥処理または乾燥の前およびその途中に化学的およびその他の一般的な試験用に標本化される。データの統計分析が実行され、選択した系統の親系統に対する類似性が確認される。選択した植物体の細胞遺伝子学的分析が随意に実施され、染色体補体および染色体対合関係が確認される。
【０１５９】
本明細書で説明した通り、遺伝子の突然変異体対立形質を他の植物体に移入または育種するために、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）育種プログラムで、ＤＮＡフィンガープリント法、一塩基変異多型、マイクロサテライトマーカー、または類似した技術を使用することができる。例えば、育種家は、農業経済学的に望ましい遺伝子型を備えた突然変異体対立遺伝子を含む遺伝子型をハイブリッド形成したものから、分離母集団を作成できる。Ｆ２または戻し交雑の植物体は、ゲノム配列またはその断片から発育させたマーカーを使用して、本明細書でリストした技術のどれか一つを使用して、スクリーニングすることができる。突然変異体対立遺伝子を所有しているものとして識別された植物体は、戻し交雑または自家受粉をして、スクリーニング対象の第二の母集団を形成できる。期待される継承パターンまたは使用するＭＡＳ技術に応じて、望ましい個体植物体の識別を助けるために、戻し交雑の各サイクルの前に、選択した植物体を自家受粉することが必要なこともある。戻し交雑またはその他の育種手順は、反復親の望ましい表現型が回復されるまで繰り返すことができる。
【０１６０】
育種プログラムにおいて、奏功した交配種は稔性のＦ１植物体を産する。選択したＦ１植物体は、親のうちの一つと交配でき、最初の戻し交雑世代の植物体は自家受粉されて、変異体遺伝子発現（例えば、ヌルバージョンの遺伝子）について再びスクリーニングされる母集団が形成される。戻し交雑、自家受粉、およびスクリーニングの過程が、例えば、少なくとも４回、最終的なスクリーニングによって稔性であり、かつ反復親と合理的に類似した植物体が生成されるまで反復される。希望に応じて、この植物体は自家受粉され、その後で子孫が再びスクリーニングされて、植物体が変異体遺伝子発現を示すことが確認される。一部の実施形態で、Ｆ２世代の植物体母集団は、変異体遺伝子発現についてスクリーニングを受け、例えば、植物体は、標準方法（例えば、ＰＣＲ法）に従い、本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）についてのヌクレオチド配列情報に基づき、プライマーと共に使用して、遺伝子がないためにポリペプチドを発現しないことが識別される。
【０１６１】
混成体品種は、第一の品種の雌性の親株（すなわち、種子親）の自家受粉を阻止して、第二の品種の雄性の親株からの花粉が雌性の親株と受粉できるようにし、Ｆ１混成体種子が雌性の植物体上に形成されるようにすることで生成できる。雌性の植物体の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の雄しべを除去することで防止できる。別の方法として、花粉形成は、雄性不稔の形成を使用して、雌性の親株で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）または遺伝子組み換え雄性不稔により生成でき、ここでは、導入遺伝子が小胞子生成および／または花粉生成、または自家不和合性を阻害する。ＣＭＳを含む雌性の親株は、特に有用である。雌性の親株がＣＭＳである実施形態で、花粉が雄性の稔性植物体から収穫され、手作業でＣＭＳ雌性の親株の柱頭に適用され、結果的なＦ１種子が収穫される。
【０１６２】
本明細書で説明した品種および系統は、単交雑Ｆ１混成体を形成するために使用できる。こうした実施形態で、親品種の植物体は、実質的に均質な隣接した母集団として栽培でき、雄性の親株から雌性の親株への自然な他家受粉が促進される。雌性の親株に形成されたＦ１種子は、従来的な手段によって選択的に収穫される。２つの親株品種を大量に栽培して、雌性の親に形成されたＦ１混成体種子と、自家受粉の結果として雄性の親に形成された種子の混合物とを収穫することもできる。別の方法として、三原交雑を行うことができ、ここでは単交雑Ｆ１混成体が雌性の親として使用され、異なる雄性の親と交雑される。また別の方法として、二重交雑混成体を作成でき、ここでは異なる二つの単交雑のＦ１子孫自体の間で交雑される。
【０１６３】
突然変異体である植物体の母集団は、望ましい特性または表現型を持つ母集団を構成するものについてスクリーニングまたは選抜されうる。例えば、単一の形質転換事象の子孫の母集団は、それによってコードされるポリペプチドの望ましいレベルの発現または活性を持つ植物体についてスクリーニングをすることができる。発現または活性のレベルを特定するために、物理的および生化学的な方法を使用できる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅、ＲＮＡ転写物の検出のためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素学的アッセイ、ならびにタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびポリペプチドを検出するための酵素連鎖イムノアッセイが含まれる。原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成、酵素染色、および免疫染色および酵素アッセイなど、その他のテクニックも、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在、または発現、または活性を検出するために使用できる。
【０１６４】
一つ以上の組み換え体ポリヌクレオチド、一つ以上のポリヌクレオチド構築物、一つ以上の二本鎖ＲＮＡ、一つ以上の結合体、または一つ以上のベクター／発現ベクターを含む、突然変異体である植物体細胞および植物体が本明細書で説明されている。
【０１６５】
限定はされないが、本明細書に記載の突然変異体である植物体は、発現または活性が本開示に従い調節される前または調節された後のいずれかに、他の目的で改変されうる。好適には、突然変異体である植物体は、これらのさらなる修飾にも関わらず、非ＧＭＯ植物体のままである。以下の遺伝子修飾のうちの一つ以上が、突然変異体である植物体内に存在しうる。一つの実施形態で、窒素性代謝性の中間体の変換に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、結果的に、乾燥処理時に、対照植物体よりも低いレベルの少なくとも一つのタバコ特異的ニトロソアミンが生成される植物体（葉など）となる。修飾されうる遺伝子の非限定的な例は、本明細書に記載する通り、ニコチンからノルニコチンへの変換に係わるＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、およびＣＹＰ８２Ｅ１０などのアスパラギンシンテターゼをコードする遺伝子を含み、国際公開第２００６０９１１９４号、国際公開第２００８０７０２７４号、国際公開第２００９０６４７７１号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１０８８号に記載されており、また本明細書に記載される通りである。別の実施形態では、重金属摂取または重金属輸送に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、結果的に、修飾のない対照植物体またはその部分よりも低い重金属含有量を持つ植物体または植物体の部分（葉など）となる。非限定的な例には、多剤耐性に関連するタンパク質ファミリー、陽イオン拡散ファシリテーター（ＣＤＦ）ファミリー、Ｚｒｔ−Ｉｒｔ様タンパク質（ＺＩＰ）ファミリー、陽イオン交換体（ＣＡＸ）ファミリー、銅トランスポーター（ＣＯＰＴ）ファミリー、重金属Ｐ型ＡＴＰアーゼファミリー（例えば、国際公開第２００９０７４３２５号に記載のＨＭＡ）、自然耐性に関連するマクロファージタンパク質（ＮＲＡＭＰ）の相同体ファミリー、およびＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリー（例えば、国際公開第２０１２／０２８３０９号に記載のＭＲＰであり、重金属（Ｃｄなど）の輸送に関わる）に属する遺伝子が含まれる。本明細書で使用されるとき、重金属という用語は遷移金属を含む。その他の修飾の例には除草剤耐性が含まれ、例えば、グリホサートは、広分野での数多くの除草剤の有効成分である。グリホサート耐性遺伝子組み換えの植物体は、ａｒｏＡ遺伝子（ネズミチフス菌および大腸菌に由来するグリホサートＥＰＳＰ合成酵素）の移入により開発されたものである。スルホニル尿素耐性植物体は、アラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来する突然変異体ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）遺伝子の形質転換により作成されたものである。突然変異体Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｈｙｂｒｉｄｕｓに由来する光化学系ＩＩのＯＢタンパク質が植物体に移入され、アトラジン耐性遺伝子組み換えの植物体が作成され、またブロモキシニル耐性遺伝子組み換えの植物体は、バクテリアＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するｂｘｎ遺伝子を組み入れることにより作成された。別の模範的な修飾によって、昆虫に対する耐性のある植物体がもたらされる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素は、Ｂｔ−耐性害虫の発生を遅らせる効果的な方法を提供でき、このことは、最近、ブロッコリで明らかになったが、錐体のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＣＢｔ遺伝子が、どちらかの単一のタンパク質に対する耐性を持つコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ  ｍｏｔｈ）を駆除し、かつ耐性昆虫の進化を著しく遅らせた。別の模範的な修飾も、病原体（例えば、ウイルス、バクテリア、菌類）によって生じた疾患に対して抵抗性を持つ植物体をもたらした。Ｘａ２１遺伝子（細菌性胴枯れ病に対する耐性）を発現する植物体と、Ｂｔ融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子（イッテンオオメイガへの耐性および葉鞘への耐性）の両方を発現する植物体が作り出された。別の模範的な修飾によって、生殖能力（雄性不稔など）が変更された。別の模範的な修飾によって、非生物的ストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に対する耐性のある植物体がもたらされ、また耐性の遺伝子組み換え植物体がアラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来するアシルグリセロールリン酸塩酵素を移入することにより作り出され、またマンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、乾燥への耐性を改善する。その他の模範的な修飾によって、タンパク質および油の貯蔵能力が改善された植物体、光合成効率が高められた植物体、有効期間が延長された植物体、炭水化物含有量が増えた植物体、および菌類への耐性のある植物体、アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードする植物体をもたらすことができる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）および／またはシスタチオニンγ−合成酵素（ＣＧＳ）の発現が調節された遺伝子組み換えの植物体も意図されている。
【０１６６】
一つ以上のこうした形質は、突然変異体である植物体に別の栽培品種から遺伝子移入されうるか、または直接それに形質転換されうる。突然変異体である植物体への形質の遺伝子移入は、当該技術分野において公知の任意の植物体育種方法により達成することができ、これには例えば、系統育種、戻し交雑、倍化した染色体を半数用いる育種、およびこれに類するものがある（Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ，ａｎｄ  Ｒｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ  ６６９−６９８  Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（ｅｄ．），ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ  ７６１  ｐｐ．を参照）。上記で説明した分子生物学ベースの技術、特にＲＦＬＰおよびマイクロサテライトマーカーは、反復親との最高度の遺伝的同一性を持つ子孫を識別するのに戻し交雑で使用できる。これにより、反復親との間に少なくとも９０％、好適には少なくとも９５％、より好適には少なくとも９９％の遺伝的同一性を持ち、なおさらに好適には反復親に対して遺伝的に同一であり、ドナー親から遺伝子移入された形質をさらに備えた品種の生成が加速されるようになる。こうした遺伝的同一性の決定は、当業界において公知の分子マーカーに基づいてできる。
【０１６７】
最後の戻し交雑世代は、移入されつつある核酸に純粋な育種子孫を与えるために自家受粉できる。結果的に得られる植物体は通常、移入された形質（例えば、一つ以上の単一の遺伝子形質）に加えて、突然変異体である植物体の形態学的特性および生理学的特性の本質的に全てを持つ。正確な戻し交雑プロトコルは、適切な試験プロトコルを決定するために変更されつつある特性に依存する。戻し交雑方法は、移入する特性が優性対立遺伝子であるときには簡略化されるが、劣性対立遺伝子もまた移入しうる。この例で、望ましい特性が首尾よく移入されたかどうかを判断するために、子孫の試験を導入する必要があることもある。
【０１６８】
様々な実施形態が、突然変異体である植物体ならびにバイオマスを提供し、そこで、ＮｔＨＭＡ４ポリヌクレオチドの発現レベルが減少して、そこでのＣｄ含有量を低減させている。
【０１６９】
こうした植物体、具体的にはたばこ植物体の部分は、またさらに具体的にはたばこ植物体の葉身および中央脈は、様々な消費可能製品に組み入れたり、その製造に使用したりでき、これにはエアロゾル形成材料、エアロゾル形成装置、喫煙物品、喫煙可能物品、無煙製品、およびたばこ製品が含まれるが、これに限定されない。エアロゾル形成材料の例には、たばこ組成物、たばこ、たばこ抽出物、刻みたばこ、刻み充填剤、乾燥処理または乾燥済みのたばこ、拡張したたばこ、均質化したたばこ、再構成たばこ、およびパイプたばこが含まれるが、これらに限定されない。喫煙物品および喫煙可能物品は、エアロゾル形成装置の種類である。喫煙物品または喫煙可能物品の例には、紙巻たばこ、シガリロ、および葉巻たばこが含まれるが、これに限定されない。無煙製品の例は、噛みたばこ、および嗅ぎたばこを含む。特定のエアロゾル形成装置では、燃焼（または発火）ではなく、例えば一つ以上の電気発熱体要素によって、たばこ組成物または別のエアロゾル形成材料が加熱されてエアロゾルを生成する。典型的には、こうした加熱式喫煙物品において、エアロゾルは、熱源の内部、周りまたは下流に位置しうる、物理的に離れたエアロゾル形成基体または材料への熱源からの熱伝達によって生成される。喫煙中、揮発性化合物は、熱源からの熱伝達によってエアロゾル形成基体から放出され、喫煙物品を介して引き出される空気中に一緒に運ばれる。放出された化合物が冷えるにつれて、これらは凝縮してユーザーによって吸入されるエアロゾルを形成する。こうした装置には、例えば、加熱式喫煙物品のエアロゾル発生装置のうちの一つ以上の電気発熱体からエアロゾル形成基体への熱伝達によってエアロゾルを生成する、電気加熱式エアロゾル発生装置が含まれる。
【０１７０】
別のタイプの加熱式エアロゾル形成装置では、エアロゾルは、可燃性燃料要素または熱源から、熱源の内部、周囲、または下流に位置しうる物理的に分離されたエアロゾル形成材料に熱伝達することにより生成される。無煙のたばこ製品および様々なたばこ含有エアロゾル形成材料は、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分に蒸着したか、それに混合したか、それによって囲んだか、またはそれと組み合わせた、乾燥済みの粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーを含めた任意の形態のたばこを含みうる。本明細書で使用されるとき、「煙」という用語は、紙巻たばこなどの喫煙物品によって、またはエアロゾル形成材料を燃焼することによって生成される種類のエアロゾルを描写するために使用される。
【０１７１】
一実施形態では、本明細書に記載の突然変異体であるたばこ植物体に由来する乾燥処理済み植物材料も提供されている。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、当業者にとって公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるがこれらに限定されない。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、収穫されたたばこの種類に依存する。例えば、バーレーおよびある種のダークストレインは通常空気乾燥処理され、パイプたばこ、噛みたばこ、および嗅ぎたばこは通常火力乾燥処理される。
【０１７２】
本明細書に記載された通りにたばこ植物体を組み込んだ無煙たばこ製品を、消費者の口腔に快適となるように適切な任意の方式で製造することができる。無煙たばこ製品は、任意の形式（薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど）の他の成分に蒸着したか、それに混合したか、それにより包囲したか、または別の方法と組み合わせた、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーを含めた任意の形態のたばこを含有する。無煙たばこ製品は、食用または非食用となりうる材料で包まれていてもよい。無煙たばこ製品の液体内容物は、ある形態（例えば、ビーズなど）の中に封入して、水溶性ラッパーとの相互作用を排除することができる。ラッパーは、部分的にまたは完全にたばこを組み込む組成物を閉じ込める、またはたばこの複数のタブ、ビーズ、または薄片を一緒に保持するための接着剤として機能させるための、小袋の形状であってもよい。ラッパーは、消費者の口の形に合わせた成形用のたばこ組成物を封入していてもよい。口腔内で分解可能なラッパーは、例えば、乾燥かぎたばこまたは可溶性たばこなどの無煙たばこを封入してもよく、連続熱成形装置、もしくは水平成形／充填／封止装置、または他の好適な包装装置で、食用フィルム（たばこを含有してもしなくてもよい）を用いて形成されてもよい。ラッパーを構成するための例示的な材料としては、ＨＰＭＣ、ＣＭＣ、ペクチン、アルギン酸塩、プルラン、およびその他の商業的に実現可能な食用の膜形成ポリマーを含む膜組成物が含まれる。口腔内で崩壊されないラッパーは、織物もしくは不織布で、塗工紙もしくは非塗工紙で、または有孔フィルムもしくはそれ以外の多孔性プラスチックフィルムで構成されてもよい。ラッパーは風味剤および／または着色剤を組み込んでもよい。無煙製品は、小さなパッケージを垂直成形／充填／封止包装機によって形成することができるブリスター包装およびスティック包装などの方法を含めた、当業者に公知である商業用包装の任意の方法を利用して、ラッパーと一緒に組み立てられうる。
【０１７３】
別の実施形態で、本明細書で説明した突然変異体である植物体に由来する乾燥済みの植物材料も提供されている。葉を乾燥する工程は、当業者に既知であり、空気乾燥処理と日光乾燥処理とが含まれるがこれらに限定されない。葉を乾燥する厳密な工程は、収穫した植物体のタイプによって決まる。好適には、植物材料は、収穫の後に乾燥される。従って、乾燥済みの材料および収穫後の乾燥済みの材料の使用が、本明細書で意図される。乾燥工程は、一つ以上の老化関連遺伝子を活性化しうる。本明細書で説明した遺伝子およびタンパク質の活性の発現は、乾燥処理または乾燥中にモニターされうる。
【０１７４】
別の実施形態では、たばこ含有エアロゾル形成材料を含むたばこ製品は、本明細書に記載の突然変異体であるたばこ植物体に由来する植物材料（葉、好適には乾燥処理または乾燥済みの葉など）を含むものとして描写されている。本明細書で説明したたばこ製品は、ブレンドしたたばこ製品とすることができ、未変性のたばこをさらに備えうる。
【０１７５】
本明細書に記載の圃場栽培植物体、植物体の一部、植物材料、植物産物、またはたばこ製品におけるＣｄの量は、野生型の対応する対照と比較して、少なくとも約３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％、またはそれ以上減少しうる。ＨＭＡ４は、根から苗条までのＣｄの転流に作用するため、ＨＭＡ４の活性または発現を低減または排除することにより、葉中のＣｄ蓄積が減少し、根内のＣｄ蓄積が増加しうる。
【０１７６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の植物体を肥料の存在下で栽培することが望ましいこともある。一実施形態では、肥料はＺｎを含むか、またはＺｎからなり、植物体の栽培前または栽培中のどちらかに圃場に添加される。この補充は、Ｃｄのレベルを低減させたまま、植物体におけるＺｎ含有量を補給または回復するのに役立ちうる。この補充は、Ｃｄのレベルを低減させたまま、植物体の表現型を回復するのに役立ちうる。Ｚｎの添加は、茎の高さおよび／または葉の重量を増加させることができる。
【０１７７】
本明細書に記載の植物体由来の種子を、当該技術分野において公知の手段によって調整し、包装材料内に袋詰めして、製造物品を形成することができる。紙および布などの包装材料は、当業界で周知である。種子のパッケージは、標識、例えば、包装材料に固定されたタグまたは標識、その中に入っている種子の性質を描写するパッケージに印刷された標識などを持つことができる。
【０１７８】
識別、選択、または育種のために植物体の遺伝子型判別をするための組成、方法およびキットは、ポリヌクレオチドの試料中のポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の存在を検出する手段を含むことができる。従って、組成は、増幅または検出を行うための一つ以上のポリヌクレオチド、および随意に一つ以上のプローブ、および随意に一つ以上の試薬の少なくとも一部分を特異的に増幅するための一つ以上のプライマーを含むものとして描写されている。
【０１７９】
一実施形態では、本明細書に記載の突然変異体である植物体に由来する乾燥処理または乾燥済みの植物材料も提供されている。例えば、たばこ葉を乾燥処理または乾燥する工程は、当業者にとって公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理および日光乾燥処理を含むがこれらに限定はされない。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、本明細書で説明したように、収穫されたたばこの種類に依存する。
【０１８０】
別の実施形態では、本明細書に記載の突然変異体である植物体、または本明細書に記載した方法で生成された突然変異体である植物体に由来する植物材料（葉などであって、乾燥処理または乾燥済みの葉などの乾燥処理済み植物材料であることが好適である）を備えたたばこ製品を含めた、たばこ製品が説明されている。本明細書で説明したたばこ製品は、未変性のたばこをさらに備えうる。
【０１８１】
別の実施形態では、たばこ製品は、本明細書に記載の突然変異体である植物体に由来する植物材料（乾燥処理または乾燥済みの葉などの葉であることが好適である）を備えたものとして描写されている。例えば、植物材料をたばこ製品の内部または外部に加えて、燃焼時に望ましい芳香を放出させうる。この実施形態によるたばこ製品は、さらには未変性のたばこまたは変性たばこともしうる。この実施形態によるたばこ製品は、さらには、本明細書で開示された遺伝子以外の一つ以上の遺伝子に突然変異を持つ突然変異体である植物体に由来するものである場合がある。
【０１８２】
本発明について、下記の例でさらに説明するが、これらの例では発明をさらに詳細に説明している。これらの例は、本発明を実施するために現時点で意図されている好ましい様式を規定したもので、本発明を例証するものであって、限定するものではない。
【実施例】
【０１８３】
実施例１−材料および方法
ＨＭＡ４配列
ＮｔＨＭＡ４．１（タンパク質配列：配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＱ７７７９８．１；ヌクレオチド配列：配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＨＦ６７５１８１．１）、およびＮｔＨＭＡ４．２（タンパク質配列：配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＷ０３２４３．１；ヌクレオチド配列：配列番号４、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＨＦ９３７０５４．１）
【０１８４】
植物材料
ＴＮ９０（ＰＩ  ５４３７９２、ＴＣ  ５８６、ＵＳＤＡ−ＧＲＩＮデータベース）、Ｋ３２６（ＰＩ  ５５２５０５、ＴＣ  ３１９、ＵＳＤＡ−ＧＲＩＮデータベース）。ＡＡ３７は、南米ダークたばこと米国バーレー種の生殖質との交雑種であると推定される。
【０１８５】
ＨＭＡ４  ＲＮＡｉ植物体の生成
ＨＭＡ４ＲＮＡｉ構築物を構築するために、ＨＭＡ４．１のエクソン７の配列（５’−ＴＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＧ−３’）をセンス方向およびアンチセンス方向で用い、隣接したイントロンの一部（５’−ＴＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＣＡＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡ  ＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＴＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＡＡＴ−３’）をヘアピンループとして使用する。構築物を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ、レーゲンスブルク）によって、Ｇａｔｅｗａｙサイトを用いて設計し、合成する。続いて、それをＧａｔｅｗａｙ技術を用いて発現ベクターに移入し、対応する酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールズバッド）に移入する。アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、発現ベクターと共に形質転換し、前述した方法（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を用いてたばこ葉ディスク形質転換用に使用する。Ｔ０一次形質転換体を土壌で栽培し、その根をＨＭＡ４発現に関して分析する。最良性能系統（ＨＭＡ４の発現が最小）を特定し、Ｔ１世代植物体と野生型植物体とを寒天培地で栽培し、全根をＨＭＡ４発現に関して再度分析する。
【０１８６】
ＥＭＳ突然変異体系統およびＴＩＬＬＩＮＧ
突然変異体の母集団を、突然変異誘発物質であるエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を用いてたばこＡＡ３７種子を処理することによって作製する。約９’８００Ｍ２世代ＥＭＳ処理植物体（１０５０Ｍ１世代変異体の分離子孫を表す）のＤＮＡライブラリを、二つのＨＭＡ４遺伝子における突然変異についてスクリーニングする。５個のアンプリコンを配列決定し、それぞれＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２において突然変異について分析する。以下のプライマー対を増幅に用いる：ＨＭＡ４．１−エクソン１：順方向プライマー５’−ＧＣＡＴＧＴＴＣＴＴＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＧＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡ−３’；ＨＭＡ４．１−エクソン２：順方向プライマー５’−ＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＧＴＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＧＧＡＣＡＡＡＡＧ−３’；ＨＭＡ４．１−エクソン４／５：順方向プライマー５’−ＧＴＧＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡＴＡ−３’、逆方向プライマー５’−ＴＡＧＴＧＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡ−３’；ＨＭＡ４．１−エクソン６：順方向プライマー５’−ＡＴＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＣＣＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＡＣＣＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡ−３’；ＨＭＡ４．１−エクソン７／８：順方向プライマー５’−ＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＴＣＴ−３’；ＨＭＡ４．２−エクソン１：順方向プライマー５’−ＴＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣ−３’；ＨＭＡ４．２−エクソン２：順方向プライマー５’−ＴＧＴＧＣＡＴＡＣＡＴＡＡＣＧＴＡＡＡＴＣＧ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＡＡＧＴＡＧＧＧ−３’；ＨＭＡ４．２−エクソン４／５：順方向プライマー５’−ＴＴＴＡＧＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＧＧ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＡＴ−３’；ＨＭＡ４．２−エクソン６：順方向プライマー５’−ＴＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＧＡＣＣＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＴＡＣＴＣＧＣＡＡＧ−３’；ＨＭＡ４．２−エクソン７／８：順方向プライマー５’−ＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＡＡＴＣＧ−３’、逆方向プライマー５’−ＴＡＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＴＧ−３’。増幅産物を、ＡＢＩ  ＸＬ３７３０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）でサンガー法に従って配列決定する。同様に、ＨＭＡ４．２−エクソン６を除いた増幅プライマーを用いて配列決定するが、そこではネステッド逆方向プライマー５’−ＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＡＣ−３’を用いて配列決定する。タンパク質機能に影響を及ぼす突然変異体系統を選択するために、ミスセンス突然変異だけではなく停止突然変異も選択する。
【０１８７】
植物体栽培用の温室条件
以下の溶液を肥料として用い、全ての溶液はＹａｒａ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  Ｂ．Ｖ．（オランダ、ヴラールディンゲン）から購入している：「熱風送管乾燥型」：多量要素：６６６．５ｍｇ  ＮＯ３−ｌ−１、１８ｍｇ  ＮＨ４＋ｌ−１（総計１６５．３９ｍｇ  Ｎｌ−１）、８８．７８ｍｇ  Ｐ２Ｏ５ｌ−１、３０６．２５ｍｇ  Ｋ２Ｏｌ−１、４９．９９ｍｇ  Ｍｇｌ−１、１８５．６１ｍｇ  Ｃａｌ−１、３６９．６０ｍｇ  ＳＯ４２−ｌ−１；微量要素：０．８３９ｍｇ  Ｆｅｌ−１、０．５４９ｍｇ  Ｍｎｌ−１、０．２６２ｍｇ  Ｚｎｌ−１、０．２１６ｍｇ  Ｂｌ−１、０．０４８ｍｇ  Ｃｕｌ−１、０．０４８ｍｇ  Ｍｏｌ−１。「バーレー種」：多量要素：８５０．３ｍｇ  ＮＯ３−ｌ−１、１８．５ｍｇ  ＮＨ４＋ｌ−１（総計２０７．３５ｍｇ  Ｎｌ−１）、９１．３１ｍｇ  Ｐ２Ｏ５ｌ−１、３８３．６５  ｍｇ  Ｋ２Ｏｌ−１、４９．９９ｍｇ  Ｍｇｌ−１、１８５．６１ｍｇ  Ｃａｌ−１、３６９．６０ｍｇ  ＳＯ４２−ｌ−１；微量要素：０．８３９ｍｇ  Ｆｅｌ−１、０．５４９ｍｇ  Ｍｎｌ−１、０．３２７ｍｇ  Ｚｎｌ−１、０．３２４ｍｇ  Ｂｌ−１、０．０４８ｍｇ  Ｃｕｌ−１、０．０４８  ｍｇ  Ｍｏｌ−１。ＨＭＡ４  ＲＮＡｉ系統を、「熱風送管乾燥型」または「バーレー種」の溶液のいずれかを用いて二つの並列実験で施肥する。溶液中の硝酸塩含有量は様々であるが、これがＣｄレベルまたはＨＭＡ４表現型に差次的影響を及ぼすことはない。（本研究で示すデータは「熱風送管乾燥型」溶液で施肥した植物体から得られるものである）。ＡＡ３７系統を、「バーレー種」溶液で施肥する。Ｚｎの添加に関しては、Ｚｎの０．１ｇを、ＺｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ（Ｌａｎｄｏｒ、スイス、ビルスフェルデン）の形態で１００ｍｌの水に希釈して適用する。全ての植物体を、１０Ｌの鉢にて明：暗サイクルを１６時間：８時間として栽培する。
【０１８８】
圃場試験
圃場試験をスイス（ヴォー州）の圃場で行う。全ての植物体を浮遊トレイに植え付け（農業慣行に従って）、温室で栽培してから移植する。植物体を遺伝子型分類毎に分ける。植物を圃場で６回反復される実験単位に分類する。一年目に、それぞれの突然変異の組み合わせに関して、ホモ接合状態で両方の突然変異を保有する１０個の植物体を、ＨＭＡ４．１の突然変異に対してのみホモ接合である１０個の植物体と、ＨＭＡ４．２の突然変異に対してのみホモ接合である１０個の植物体と、ＨＭＡ４遺伝子の両方に対してヌル分離植物体である１０個の植物体とに隣接して栽培する。二重ナンセンス突然変異体については、以下の二つの他の遺伝子型も（３個の複製物中に）含まれる：ＨＭＡ４．１に対してホモ接合ナンセンス突然変異体であり、かつＨＭＡ４．２に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体である１０個の植物体と、ＨＭＡ４．２に対してホモ接合ナンセンス突然変異体であり、かつＨＭＡ４．１に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体である１０個の植物体とであり、後者の群は、一つの機能的非突然変異対立遺伝子のみを含んでいる。二年目に、それぞれの突然変異の組み合わせに関して、ホモ接合状態で両方の突然変異を保有する２０個の植物体を、ＨＭＡ４遺伝子の両方に対してヌル分離植物体である２０個の植物体に隣接して栽培する。圃場を標準的慣行に従ってバーレー種栽培に対して施肥する。
【０１８９】
二つの圃場試験を、二つの圃場にてカドミウムを多く含有する二つのたばこ栽培領域において一年間で行う。それぞれの突然変異の組み合わせに関して、ホモ接合状態で両方の突然変異を保有する２０個の植物体を、ＨＭＡ４遺伝子の両方に対してヌル分離植物体である２０個の植物体に隣接して栽培する。
【０１９０】
ｑＰＣＲを用いた発現分析
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を用いて、全ＲＮＡをたばこから抽出する。ＲＮＡをＲＱ１  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて消化し、オリゴｄＴ１７プライマー、ｄＴＮＰ、ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＮａｓｅ  ＩｎｈｉｂｉｔｏｒおよびＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＲＮａｓｅ（Ｈ−）、Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｎｔ（全てＰｒｏｍｅｇａ製、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて逆転写する。ｑＲＴ−ＰＣＲをＭｘ３００５Ｐシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ、ヴァルトブロン）で実施する。ＳＹＢＲ  ２ステップｑＲＴ  Ｌｏｗ  Ｒｏｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国サリー）を使用して、ＨＭＡ４．１順方向プライマー（５’−ＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧ−３’）およびＨＭＡ４．１逆方向プライマー（５’−ＡＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＧＡＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡ−３’）、またはＨＭＡ４．２順方向プライマー（５’−ＧＴＴＡＴＧＣＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＧＴＧＣＣＴＡ−３’）およびＨＭＡ４．２逆方向プライマー（５’−ＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＧＡＧＡＧＴＣＣＡＧＡＣ−３’）を用いて増幅反応を行う。内部標準として、ａｃｔｉｎ９遺伝子を、順方向プライマー（５’−ＣＴＡＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＡ−３’）および逆方向プライマー（５’−ＡＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＡＣＧ−３’）と共に使用する。
【０１９１】
ＤＮＡ抽出物および植物体遺伝子型
葉の試料を、ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ  ９６  ＤＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）と合わせたＢｉｏＳｐｒｉｎｔ  ９６（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を用いて抽出する。植物体の遺伝子型を求めるために、ＤＮＡ試料をＴａｑＭａｎ反応に用いる。ＴａｑＭａｎを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）と、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）とを用いて行う。以下のＴａｑＭａｎプライマー（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス、バルガッハ）とプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国ウォリントン）とを用いる：ＨＭＡ４．１  Ｑ２９３＊：突然変異体プローブ５’−ＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＡＧＣＴ−３’、野生型（ＷＴ）プローブ５’−ＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴ−３’、順方向プライマー５’  ＣＴＧＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＧＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＴＧＧＴＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＧ−３’；ＨＭＡ４．１  Ｅ２９６Ｋ：突然変異体プローブ５’−ＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧ−３’、ＷＴプローブ５’−ＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧ−３’、順方向プライマー５’−ＣＴＧＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＧＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＴＧＧＴＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＧ−３’；ＨＭＡ４．１  Ｔ４０２Ｉ：突然変異体プローブ５’−ＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＴＡ−３’、ＷＴプローブ５’−ＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡ−３’、順方向プライマー５’−ＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＴＴＴＣＡ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴ−３’；ＨＭＡ４．１  Ｇ２５１Ｄ：突然変異体プローブ５’−ＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧ−３’、ＷＴプローブ５’−ＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧ−３’、順方向プライマー５’−ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＣＴＣ３’；ＨＭＡ４．１  Ｖ３５１Ｍ：突然変異体プローブ５’−ＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡ−３’、ＷＴプローブ５’−ＴＴＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴ−３’、順方向プライマー５’−ＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡ−３’；ＨＭＡ４．１  Ｇ３８２Ｒ：突然変異体プローブ５’−ＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧ−３’、ＷＴプローブ５’−ＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＡ−３’、順方向プライマー５’−ＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＴＴＴＣＡ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴ−３’；ＨＭＡ４．２  Ｗ２６５＊：突然変異体プローブ５’−ＡＴＡＧＡＴＴＣＡＡＣＧＧＴＣＴＡＧＧ−３’、ＷＴプローブ５’−ＴＴＣＡＡＣＧＧＴＣＴＧＧＧＣ−３’、順方向プライマー５’−ＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＡ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＴＡＣ−３’；ＨＭＡ４．２  Ｑ５６１＊：突然変異体プローブ５’−ＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＧＡＴ−３’、ＷＴプローブ５’−ＴＧＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧ−３’、順方向プライマー５’−ＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＧＡＧＡＧ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴ−３’。
【０１９２】
元素組成分析
収穫時に、成熟植物体の中央部より低い茎位置から収穫し、各圃場区画に対するプール試料にする（１個の植物体当たり１枚の葉）。個々の温室植物体から、中央部より低い茎位置の２枚の葉（全ての植物体に対して同じ葉位置）を収穫する。収穫された材料を、オーブンにて６０℃で完全に乾くまで乾燥する。
【０１９３】
試料の分析をＡＬＳ（チェコ共和国プラハ）によって行う。試料を均質化し、酸および過酸化水素により石灰化した後に分析する。ＺｎとＣｄとを、誘導結合プラズマを備えた質量分析計（ＩＣＰ−ＭＳ）により、ＣＺ＿ＳＯＰ＿Ｄ０６＿０２＿００２（米国環境保護局（ＵＳ  ＥＰＡ）２００．８、ＣＳＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １７２９４−２）に従って測定する。
【０１９４】
バイオインフォマティクス解析
突然変異耐性スコアを、ＵｎｉＰｒｏｔの植物体配列データベース（２０１２年１２月３０日にダウンロード）に基づいてＳＩＦＴソフトウェア（Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，２００３）を用いて算出する。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ−２５００で配列決定する。塩基呼び出し（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）および試料の逆多重化を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＣＡＳＡＶＡパイプラインソフトウェアを用いて行う。読み取りデータを、Ｔｏｐｈａｔ２ソフトウェア（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１３；ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１１）を用いてこれまでに公表されたゲノム（Ｓｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）にマッピングする。差次的遺伝子発現をＣｕｆｆｄｉｆｆ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１３、バージョン２．２．１）を用いて計算する。
【０１９５】
統計
分析値がＬＯＱを下回る場合、ＬＯＱ値が計算およびグラフ表示用に考慮される。有意性の評価には、両側ｔ検定を、分散の不均一性に対してサタースウェイトの修正を用いて行う。圃場実験については、比率に関する対応のあるｔ検定を突然変異体区画および対応する対照区画に対して行った。測定不確かさ（２０％）未満での有意なＣｄ／Ｚｎ低減を判定するために、未加工のｐ値を計算して、偶然に平均値（突然変異体）＜０．８＊平均値（対照）となる確率を求めた。
【０１９６】
実施例２−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＨＭＡ２／３／４トランスポーターのオルソログ同定およびＮｔＨＭＡ４発現分析
アラビドプシストランスポーターＨＭＡ２、ＨＭＡ３、およびＨＭＡ４は近縁である。ＨＭＡ２およびＨＭＡ４はＺｎおよびＣｄの根から苗条までの転流に関与する一方（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｂｂｅｔｔ，２００９）、ＨＭＡ３は、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｃｏ、およびＰｂの根液胞貯蔵によるＣｄ蓄積に関与している（Ｇｒａｖｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。アラビドプシスの配列に基づいて、たばこゲノムを、推定ＡｔＨＭＡ２／３／４オルソログについてスクリーニングし、ＨＭＡ４の二つのホモログであるＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２（それぞれＮ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓおよびＮ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓに由来）をＮ．ｔａｂａｃｕｍにおいて見出す。
【０１９７】
ＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２の発現パターンを主な二つのたばこ栽培品種であるＴＮ９０およびＫ３２６で調べる。熱風送管乾燥たばこタイプ（Ｋ３２６）には、バーレータイプ（ＴＮ９０）たばこに比べて窒素があまり豊富ではない施肥が必要になる（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。施肥方法におけるこれらの差異も、Ｃｄ含有量が、熱風送管乾燥たばこに比べてバーレータイプたばこで高くなった理由を部分的に説明している（Ｌｕｇｏｎ−Ｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＮｔＨＭＡ４．１およびＮｔＨＭＡ４．２の発現パターンを、圃場で栽培されたＴＮ９０たばこ植物体およびＫ３２６たばこ植物体の異なる組織で分析する。これらの二つの栽培品種において、両方の遺伝子は特に根組織および花組織で発現しているが、他の全ての組織でも、それよりも少ない量ではあるが発現していることがわかる（図１）。このパターンは、Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）により報告されたアラビドプシスに関するＧＵＳ発現データと、Ｈｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により報告されたたばこに関するＧＵＳ発現データとに一致する。
【０１９８】
実施例３−ＮｔＨＭＡ４のサイレンシングが葉のＣｄ蓄積および表現型に及ぼす影響
ＮｔＨＭＡ４たばこ遺伝子がＣｄを低減させる標的となる可能性を評価するために、ＲＮＡｉ構築物を両方のＮｔＨＭＡ４ホモログに対して設計する。ＤＮＡ断片を、構成的ＭＭＶプロモーターの制御下で二成分ベクターにクローニングし（Ｄｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｉｔｉ，１９９９）、上述の二つの栽培品種であるＴＮ９０およびＫ３２６内に形質転換する。各々のたばこタイプに対して、ＲＮＡｉ系統を、ＨＭＡ４ホメオログ両方の発現の低減に基づいて選択する（図２）。１系統当たり５個の植物体と、その各々の非形質転換対照とを、Ｚｎの補充の有り無し両方で土壌にて栽培する。
【０１９９】
各系統の代表的な植物体を図３ａに示す。その各々のＣｄおよびＺｎの含有量を図３ｂおよび図３ｃに示す。ＴＮ９０とＫ３２６両方のＨＭＡ４ＲＮＡｉ系統は、両方の栽培品種において、Ｃｄが対照植物体（＞０．５５ｐｐｍのＣｄ）に比べて極めて少ない（およそＬＯＱ＝０．０５ｐｐｍ）。これに加えて、Ｃｄの１０倍を超える低減、Ｚｎの約４倍の低減を観察した。植物体のバイオマス（茎の高さおよび葉の重量）に関しては、Ｋ３２６ＨＭＡ４ＲＮＡｉ系統が良好な結果を出し、有意に少なくはならず、対照植物体よりも極わずかに重い葉を備えている（図３ｄ、図３ｅ）。葉の形状が極わずかに異なり、遺伝子組み換えの葉は、さらに丸く、さらに厚い葉脈となる（図３ａ）。対照的に、ＴＮ９０ＨＭＡ４ＲＮＡｉ系統では、葉に発育不全と壊死部分が見られる（図３ａ、図３ｄ）。葉は、ＴＮ９０のＷＴ対照と比較して厚い（図３ｆ）。生重量および乾燥重量の測定値に基づくと、これらの植物体では水含有量が増加している（図３ｇ）。この実験は、高硝酸塩の施肥下で反復されるが、窒素供給量はＣｄレベルと表現型には影響を及ぼさない（データは示さず）。結論として、これらの結果が示すのは、両方のたばこ栽培品種における両方のＨＭＡ４ホメオログをサイレンシングすることにより、葉のＣｄが約１０倍超、Ｚｎが約４倍減少する。しかしながら、両方の品種において同様のＣｄ／Ｚｎ低減を示すにもかかわらず、表現型への作用がＫ３２６とＴＮ９０の間で極めて異なっており、Ｋ３２６の方が良好な結果であった。
【０２００】
興味深いことに、ＨＭＡ４ＲＮＡｉ植物体をＺｎと用いて処理すると、植物体のＺｎ含有量がほぼ対照レベルまで補充され、ＴＮ９０において、Ｃｄレベルを低減させたまま、正常の（バーレー種）植物体表現型が回復した（図３ａ〜３ｃ、斜線バー）。Ｚｎの添加によって、ＴＮ９０ＲＮＡｉ系統において茎の高さと葉の重量が増加し、ＴＮ９０およびＫ３２６のＨＭＡ４ＲＮＡｉ植物体の両方において水含有量と葉の厚さが減少する（図３ｄ〜３ｇ、斜線バー）。これは、Ｚｎが、９０％超のＣｄ含有量低減を保持したまま、ＨＭＡ４ＲＮＡｉを補完し、ＷＴ表現型を回復させることができることを示している。
【０２０１】
実施例４−圃場におけるＣｄ低減にはＮｔＨＭＡ４突然変異の組み合わせが必要である
たばこ育種用に、栽培品種ＡＡ３７のＥＭＳ母集団をＨＭＡ４における突然変異についてスクリーニングする。ＡＡ３７は、南米ダークたばこと米国バーレー種の生殖質の交雑由来の栽培品種であり、それ故にＫ３２６よりもＴＮ９０に近いものである（Ｆｒｉｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。比較可能な発現プロファイルによると、ＨＭＡ４ホメオログの両方（図１および図２）が根から苗条までのＺｎおよびＣｄの転流に関与していることが示唆される。このため、触媒作用的に重要なドメインをコードするエクソンを、ＨＭＡ４コピーの両方において点突然変異についてスクリーニングする。ＮｔＨＭＡ４．１およびＮｔＨＭＡ４．２において特定されるアミノ酸の置換全てを、ＳＩＦＴプログラムを用いて、タンパク質機能に及ぼしうる影響について分析する（Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，２００３）。小さいＳＩＦＴスコア（＜０．０５）は、アミノ酸残基が機能的レベルで許容されない可能性があることを意味する。ＮｔＨＭＡ４．１およびＮｔＨＭＡ４．２において、それぞれ３６個および３３個の突然変異が特定され、ホメオログの各々には２個のナンセンス突然変異、およびＳＩＦＴスコア比が０．０５未満の各ホメオログには１５個のミスセンス突然変異が含まれている（表１０）。ＳＩＦＴスコアを、突然変異の選択を容易にするツールとして用いている。
【０２０２】
ＨＭＡ４アイソフォームの両方における突然変異を交雑により組み合わせる。こうした交雑には、少なくとも一つのナンセンス突然変異と、ナンセンス突然変異か、またはＳＩＦＴから予測されるミスセンス突然変異のどちらかとなった別の突然変異とが含まれる。各温室評価および圃場評価の前に、分離子孫を浮遊トレイで栽培し、ＴａｑＭａｎを用いて遺伝子型を同定し、個々の分類毎に分けた後に、土壌移植する。
【０２０３】
温室実験では、突然変異の６組の組み合わせを評価する。その各々について、二つのホモ接合突然変異を保有する８個の植物体を、ＨＭＡ４．１におけるただ一つの突然変異に対してホモ接合型である８個の植物体、ＨＭＡ４．２におけるある突然変異に対してのみホモ接合型の８個の植物体、およびＨＭＡ４遺伝子の両方に対してヌル分離である８個の植物体と共に栽培する。二重ナンセンス突然変異体について、他の二つの遺伝子型も含まれ、それは、ＨＭＡ４．１に対してホモ接合ナンセンス突然変異体であり、かつＨＭＡ４．２に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体である８個の植物体と、ＨＭＡ４．２に対してホモ接合ナンセンス突然変異体であり、かつＨＭＡ４．１に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体である８個の植物体とであり、後者の群は、一つの機能的非突然変異対立遺伝子のみを含んでいる。土壌で５週および１１週生長させた後（ａ）、下部の茎位置の葉を収穫して生重量を算出し（ｂ）、Ｃｄ、Ｚｎについて分析する（図４ｃ、図４ｄ）。
【０２０４】
単純ナンセンス突然変異体、および一つの機能的ＨＭＡ４対立遺伝子を有するナンセンス突然変異体とは異なり、二重ナンセンス突然変異体ＨＭＡ４．１Ｑ２９３＊／ＨＭＡ４．２Ｑ５６１＊のみが、ＨＭＡ４ＲＮＡｉ植物体で観察されたＣｄの低減と同様のＣｄ低減を示している。土壌で５週生長させた後、ホモ接合二重ナンセンス突然変異体では、Ｃｄが対照植物体の０．６ｐｐｍからおよそ定量下限のレベルまで（ＬＯＱ＝０．０５ｐｐｍ）減少するが、Ｚｎ含有量は３分の１に減少するのみである（図４ｃ、図４ｄ）。１１週後のＣｄ分析結果から、さらに植物体が生長した温室植物体では、バイオマスの増加でＣｄが希釈されたことがわかる。Ｃｄの対照レベル平均値は約０．３ｐｐｍである一方、分析した二つの二重突然変異体系統は定量下限未満のＣｄレベルを示している（図４ｃ）。興味深いことに、一つの機能的ＨＭＡ４対立遺伝子を保有する、単一ナンセンス突然変異体および突然変異体である植物体は、中程度のＺｎ含有量を示すのに対し、Ｃｄは対照レベルを示している。このＺｎレベルは通常の生長には十分であり、これらの植物体では対照と比較した場合に生長におけるいかなる差異も観察されていない。一方で、ホモ接合二重ナンセンス突然変異体では、５週の生長後に葉重量が５０％減少する。しかしながら、１１週の後、突然変異体である植物体は、対照と同じサイズに達しており（図４ａ、図４ｂ）、開花がわずかに遅れるのみである。
【０２０５】
５週の生長の後に調べた他の突然変異体組み合わせのうち、他の二つの組み合わせ（Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊およびＴ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊）は、二重ナンセンス突然変異体と同様のＣｄ低減を示すのと同時に、対照のＺｎ含有量のわずか３分の１を含有している（図５ａ、図５ｂ）。これらの二つの系統は、同様の生長の遅延を示し、初期段階で、Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊では葉重量が約２５％減少し、Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊では葉重量が５０％減少した（図５ｃ）。さらに６週間生長させた後には、対照と二重突然変異体との間の葉のサイズや高さに、もはや有意な差は見られていない。しかしながら、二重突然変異体系統では、花成がわずかに遅れることになる。他の二つの突然変異の組み合わせ（Ｇ３８２Ｒ／Ｑ５６１＊およびＧ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊）は、有意なＣｄ低減を示していない。ＣｄとＺｎの全てのデータを表８にまとめている。表８の対照群については、個々の対照植物体の全ての値をまとめている。
【０２０６】
総合すると、これらの実験により、ＨＭＡ４遺伝子の両方には、Ｃｄレベルを有意に低減させるように少なくとも部分的に嵌入させることが必要であることが示されている。
【０２０７】
実施例５−Ｃｄが中程度の条件下の二つの圃場試験におけるＣｄ低減の検証
温室データを確証するために、二つの圃場実験をカドミウムが中程度の条件下で行う。第一の実験では、同一の遺伝子型群（単一突然変異体、二重突然変異体、および対照植物体）を６箇所の複製区画で栽培する。各複製単位は、それぞれ二重突然変異体、ＨＭＡ４ＷＴ対照、および二つの単純突然変異体の１０個の植物体を含む。二重ナンセンス突然変異体については、一つの機能的非突然変異対立遺伝子を含む他の二つの遺伝子型（ＨＭＡ４．１に対してホモ接合ナンセンス突然変異体／ＨＭＡ４．２に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体、およびＨＭＡ４．１に対してヘテロ接合ナンセンス突然変異体／ＨＭＡ４．２に対してホモ接合ナンセンス突然変異体）が含まれる。植物体をスイスの圃場で１４週間栽培する。植物体表現型を調べ、中間部の茎位置で葉を収穫し、乾燥して、Ｃｄ／Ｚｎ分析を行う。ｐ値を計算して、突然変異体のＣｄが対照に比べて偶然に２０％超低減するのが観測される確率を求める。
【０２０８】
全体的に、圃場データと温室データとは対応している。単一突然変異体は対照に比べていかなるＣｄの低減も示していない（表２）一方、温室でＣｄが低くなった系統と同一の二重突然変異体系統（Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊、Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊）と、さらなる二重ナンセンス突然変異体（Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊）とは、二重突然変異体の平均値が少なくとも２０％減少する確率がｐ＜０．０５（最も高いｐ値＝０．００５４）となる圃場条件下で、１０倍を超えるＣｄ含有量の低減を示している（表４）。これらの四つの系統に加えて、系統Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊は３０％のＣｄの低減を示すが、この系統では、Ｃｄ含有量は２０％を超えて有意に減少することはない（ｐ値＝０．１０２９）。Ｚｎ含有量は温室では約７０％減少する一方、圃場で栽培されたＣｄが少ない系統（Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊、Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊）は単に最大約５０％のＺｎ低減を示している（表４）。第一の圃場試験では、系統Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊で葉重量が減少するが、他の三つのＣｄが少ない系統（Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊）では、葉重量は有意には影響を受けない（図６ｂ）。植物体および葉の形態は、突然変異によって影響を受けていない。しかしながら、系統Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｑ５６１、およびＱ２９３＊／Ｗ２６５＊について、壊疽斑点が、特に初期生長段階で下部の葉に観察されている。二重突然変異体のＴ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊およびＧ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊は最良の表現型を示し、いかなる時点においても壊死性病変を呈していない。これらの二つの系統は、その対照とほとんど区別することができない。
【０２０９】
第二の圃場試験では、同一の突然変異の組み合わせを、追加の組み合わせ（総計１８組）と共に圃場で栽培する。今回、一実験単位は２０個のホモ接合ＨＭＡ４二重突然変異体である植物体と、２０個のＨＭＡ４ＷＴ対照植物体とを含む。単一突然変異体については再度の分析を行っていない。Ｃｄ／Ｚｎデータを表５に示し、Ｃｄデータと表現型データのグラフを図７に示す。第一の圃場試験でＣｄの低減を示す系統と同一系統は再び同等のＣｄの低減を示すが、例外として、系統Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊はさらに今回７０％のＣｄ低減を示している。これらの系統に加えて、もう一つの二重ナンセンス突然変異を分析し（Ｑ４６４＊／Ｑ５６１＊）、予想したように９４％という極めて大幅なＣｄの低減が見られている。同様に、新規な突然変異の組み合わせＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅも９４％のＣｄ低減を示している。突然変異の組み合わせＱ２９３＊／Ｌ２２３ＦおよびＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎは、中程度のＣｄ低減（それぞれ３７％および２７％）を示している。系統Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊、Ｑ４６４＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｇ２３５Ｅ、Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊、Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊、およびＱ２９３＊／Ｌ２２３Ｆは、２０％を超える有意なＣｄ低減を示している（ｐ＜０．０５、最大ｐ値＝０．０００７）。系統Ｑ２９３＊／Ｄ２３４Ｎは２７％のＣｄ低減を示しているが、その低減率はｐ＜０．０５では２０％より大きくはない。分析した他の全ての二重突然変異体は、２０％未満のＣｄ低減のみを示し、したがって、さらなる検討を行うに至っていない。突然変異の組み合わせＱ２９３＊／Ｑ５６１＊およびＱ２９３＊／Ｗ２６５＊、Ｑ４６４＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｇ２３５Ｅ、ならびにＥ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊では、初期段階で葉に壊疽斑点が見られ、また生長速度が減少する。しかしながら、収穫時には、これらの二重突然変異体とその対照との間に明らかな差異は見られていない。圃場におけるほとんどの突然変異体系統の葉の乾燥重量は、それらの対照植物体とほぼ同等である（図７ｂ）。葉の乾燥重量が対照とわずかに異なる場合があるが、これはＣｄの低減とは何の関連も見られない。
【０２１０】
実施例６−高Ｃｄ条件下の二つの圃場試験におけるＣｄ低減の検証
二つの小圃場試験において、５組の有望な低Ｃｄ突然変異の組み合わせ（二重ナンセンス突然変異の組み合わせＱ２９３＊／Ｑ５６１＊、ならびに組み合わせＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅ、Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊、およびＧ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊）と、それぞれの対照とを、Ｃｄ含有量が高いとわかっている二つの領域で栽培する。Ｃｄ／Ｚｎデータを表６に示し、Ｃｄデータと表現型データのグラフを図８に示す。対照植物体は約３ｐｐｍのＣｄを蓄積する一方、突然変異の組み合わせＱ２９３＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｇ２３５Ｅ、Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊、およびＴ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊に対しては、Ｃｄ含有量は、第一の領域（圃場３）および第二の領域（圃場４）において、それぞれ８０％以上および９０％以上減少している。組み合わせＧ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊に関しては、Ｃｄ低減率は、両方の圃場箇所で約４５％である。全ての系統に対して、平均値が２０％未満となる確率は有意である（ｐ＜０．０５、最大ｐ値＝０．００６８）。葉重量に及ぼすいかなる影響も観察されていない（図８ｂ）。
【０２１１】
まとめると、圃場データによれば、農業圃場条件下の異なる領域であっても、ＨＭＡ４突然変異の組み合わせはＣｄ含有量を５〜１０倍低減させる可能性を有することが示されている。植物体発育および収率は、栽培品種ＡＡ３７において後期の段階で影響を受けないと考えられる。
【０２１２】
実施例７−ＮｔＨＭＡ４は根から苗条までのＣｄ転流に対する鍵酵素である。
本明細書に記載のＨＭＡ４ＲＮＡｉ系統およびＨＭＡ４二重ナンセンス突然変異体において、葉のＣｄを１０倍超低減でき、これは、たばこにおける根から苗条までのＣｄの移動がＨＭＡ４に本質的に依存することを示している。両方のＨＭＡ４遺伝子における突然変異が、低Ｃｄのたばこ向けに繁殖することが必要になる。温室と圃場の両方の条件下で、ＨＭＡ４二重ナンセンス突然変異体は９０％のＣｄ低減を示している。評価した全てのＣｄ条件下で、ＨＭＡ４遺伝子のうちのただ一つにおけるナンセンス突然変異は、たばこ植物体のＣｄ含有量を低減させることができない。
【０２１３】
興味深いことに、非天然のＣｄが極めて多い条件下で、ＮｔＨＭＡ４遺伝子のうちの一つにおいてただ一つのナンセンス突然変異を保有する植物で、Ｃｄの５０％低減が観察されている（Ｈｅｒｍａｎｄ，２０１４）。これは、アラビドプシスで観察された、Ｃｄの多い寒天培地でＡｔＨＭＡ４のノックアウトが苗条のＣｄ含有量を５０％超低減させたという結果に対応しているが、一方で、トランスポーター遺伝子の両方を同時にノックアウトすることにより、さらに大幅な低減をもたらしている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｂｂｅｔｔ，２００９）。ＮｔＨＭＡ４．１およびＮｔＨＭＡ４．２についての発明者らの検討によると、植物体育種に対する突然変異の影響を評価するために、人工的システムから得た結果は、土壌および圃場の条件下で立証される必要があることを示している。
【０２１４】
多くの作物種と同じように、多様なたばこ栽培品種が存在する。これらには、例えば施肥の要件ならびにアミノ酸および糖の蓄積において、大きな相違点がある（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。分析した３種の栽培品種、ＴＮ９０、Ｋ３２６、およびＡＡ３７においては、ＨＭＡ４の破壊は同等の作用を示し、すなわち、これら栽培品種全てにおいてＣｄが９０％超減少している。一方、ＣｄおよびＺｎの低減に見られる同等の作用にもかかわらず、植物体の生育能力は全く異なっている。Ｋ３２６が、ＨＭＡ４が存在しないことによりわずかに影響を受けるのみであり、一定のバイオマスおよび植物体サイズを備えつつ、葉の形状はさらに丸みを帯び、葉脈が増加するに対し、ＴＮ９０は激しい発育不全および壊死性病変を呈し、ＡＡ３７（ＴＮ９０などの典型的なバーレー種植物体ではない）はわずかな影響のみを示す。このことは、Ｚｎのホメオスタシスに関するたばこ栽培品種間の代謝の違いを明らかにするものである。土壌にＺｎを供給することによって表現型が回復可能となり、これは、他のトランスポーターがＨＭＡ４の埋め合わせをし、かつ低いレベルではあるがＺｎの取り込みを媒介することができることを示している。
【０２１５】
実施例８−表現型に影響を及ぼすことなく低ＣｄとするにはＮｔＨＭＡ４ホメオログ両方の微調整が必要である
ＨＭＡ４ダブルノックアウトの表現型に及ぼす影響を最小化するために、第二の突然変異をＨＭＡ４遺伝子のうちの一つにおいて特定する。この目的は、様々な選択肢の中のかかる組み合わせを育種する場合に、それが植物体の表現型に影響を及ぼさずに、有意にＣｄを低減させるのに十分となることである。ＡＡ３７のＥＭＳ突然変異体バックグラウンドでは、特に初期栽培段階では影響が見られるが、後期段階では生長およびバイオマスへのいかなる影響も観察することができない。しかしながら、関心対象品種のＨＭＡ４ＲＮＡｉ系統のデータ（図３）によると、特にバーレー品種において、生長への悪影響が生じる場合がある。
【０２１６】
以下には、さらなる植物体育種に特に有用であると考えられる突然変異の組み合わせを説明する。二重ＨＭＡ４ノックアウト突然変異体（Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊、Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊、Ｑ４６４＊／Ｑ５６１＊）に加えて、同等にＣｄを低減させる（８０〜９０％）さらなる組み合わせを特定した：
二重突然変異体Ｅ２９６Ｋ／Ｑ５６１＊およびＱ２９３＊／Ｇ２３５Ｅは、初期段階でダブルノックアウト突然変異体と同様の表現型（壊死性病変、生長の抑制）を示す一方、Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊  突然変異体である植物体は良好な生長を示し、初期段階の葉には壊死部分が見られない。組み合わせＧ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊は、３０〜７０％のＣｄ低減と、対照とは区別できない表現型とを提示している。さらなる二つの突然変異の組み合わせ（Ｑ２９３＊／Ｌ２２３ＦおよびＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎ）のみが少ないＣｄ低減（一圃場試験でそれぞれ３７％および２７％）を示している。
【０２１７】
第二の温室実験を追加の突然変異の組み合わせを用いて行い、そこで、組み合わせＨ４３８Ｙ／Ｗ２６５＊は５８％のＣｄ低減を示し、表現型に影響を及ぼさなかった（表９）。
【０２１８】
上述の突然変異の組み合わせは、ＣｄとＺｎの含有量を含ませる可能性、および各栽培品種に対する最適な突然変異の組み合わせを見出す可能性を提供する。遺伝子組み換え系統に示すように（図３）、ＨＭＡ４が存在しないことにより影響を受けやすいバーレー種などの栽培品種については、中間解（例えば、Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊、Ｈ４３８Ｙ／Ｗ２６５＊、Ｑ２９３＊／Ｌ２２３Ｆ、またはＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎ）を使用する必要がある場合がある。
【０２１９】
以下では、突然変異の局在化を調べた（図９）。重金属ＡＴＰアーゼは、触媒機能に重要である三つのドメインである、リン酸化（Ｐ）ドメイン、ヌクレオチド結合（Ｎ）ドメイン、およびアクチュエータ（Ａ）ドメインを含む。Ｐドメインは、第三細胞質ループのＮ末端部およびＣ末端部から構成される。ループの中央部分はＮドメインである。ＤＫＴＧＴモチーフはＰドメインに見られる。このモチーフにおけるアスパラギン酸残基は、触媒反応の間に活性酵素においてリン酸化されることが予想される。Ａドメインでは、触媒作用的に活性なＴＧＥ（Ｓ）ループが構造体から突き出し、ＡＴＰ結合ドメインのリン酸化部位と相互作用する（Ｂａｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２２０】
Ｃｄ取り込みに影響を及ぼす５個の機能的突然変異を、トランスポーター（Ｌ２２３Ｆ、Ｄ２３４Ｎ、Ｇ２３５Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｅ２９６Ｋ）のＡ（アクチュエータ）ドメインで、Ｇ２５１＊がＴＧＥＳモチーフで局在化された状態で見出している。Ａドメインで生じる突然変異が、ドメインのフォールディングを不安定にするか、または酵素の他のドメインとの相互作用に影響を与えることは、他のＨＭＡトランスポーターから知られている（Ｂａｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｔ４０２Ｉ突然変異は、ＤＫＴＧＴモチーフ、すなわちタンパク質の第三細胞質ループにおけるＰ（リン酸化）ドメインで見られる。Ｈ４３８Ｙ突然変異は、タンパク質の第三細胞質ループにおけるＮ（ヌクレオチド結合）ドメインのＨＰモチーフで見られ、これは、ヌクレオチド配位を損なうことによって作用する可能性がある。
【０２２１】
結論として、二つの突然変異がＣｄの転流を抑制するのに必要であり、そのうちの一つは完全ノックアウトであり、第二の突然変異は、第二のＨＭＡ４コピーにおけるＡドメインか、ＰドメインのＤＫＴＧＴモチーフか、またはＮドメインのＨＰ座位に位置すると考えられるナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異である。
【０２２２】
まとめると、この検討は、ＨＭＡ４突然変異とそれらの組み合わせがＣｄ含有量および表現型に及ぼす影響を評価するための、好適なシステムの特定が必要であることを明らかにするものである。この検討によると、関心対象となる全ての栽培品種に対して表現型を変化させることなくＣｄの少ないたばこを得るために、ＨＭＡ４の根から苗条までの転流システムを微調整することの重要性が示されている。
【０２２３】
参考文献
Arnould, S., Delenda, C., Grizot, S., Desseaux, C., Paques, F., Silva, G.H., and Smith, J. (2011). The I-CreI meganuclease and its engineered derivatives: applications from cell modification to gene therapy. Protein Eng Des Sel.24(1-2):27-31。
Banci, L., Bertini, I., Cantini, F., Migliardi, M., Natile, G., Nushi, F., and Rosato, A. (2009). Solution structures of the actuator domain of ATP7A and ATP7B, the Menkes and Wilson disease proteins. Biochemistry 48(33):7849-7855
Bortesi, L., and Fischer, R. (2015). The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol Adv. 33(1):41-52。
Chen, K, and Gao, C. (2014). Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements. Plant Cell Rep. 33(4):575-583。
Chen, L., Hao, L., Parry, M.A., Phillips, A.L., and Hu, Y.G. (2014). Progress in TILLING as a tool for functional genomics and improvement of crops. J Integr Plant Biol. 56(5):425-443。
Dey, N., and Maiti, I.B. (1999). Structure and promoter/leader deletion analysis of mirabilis mosaic virus (MMV) full-length transcript promoter in transgenic plants. Plant Mol Biol. 40(5):771-82。
Fricano, A., Bakaher, N., Del Corvo, M., Piffanelli, P., Donini, P., Stella, A., Ivanov, N.V., and Pozzi, C. (2012). Molecular diversity, population structure, and linkage disequilibrium in a worldwide collection of tobacco (Nicotiana tabacum L.) germplasm. BMC Genet. 13:18. doi: 10.1186/1471-2156-13-18。
Gravot, A., Lieutaud, A., Verret, F., Auroy, P., Vavasseur, A., and Richaud, P. (2004). AtHMA3, a plant P1B-ATPase, functions as a Cd/Pb transporter in yeast. FEBS Lett. 561(1-3):22-28。
Hermand, V., Julio, E., Dorlhac de Borne, F., Punshon, T., Ricachenevsky, F.K., Bellec, A., Gosti, F., and Berthomieu, P. (2014) Inactivation of two newly identified tobacco heavy metal ATPases leads to reduced Zn and Cd accumulation in shoots and reduced pollen germination. Metallomics, 6(8), 1427-1440。
Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N.L., Wallroth, M., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T. (1985). A Simple and General Method for Transferring Genes into Plants. Science,  227, 1229-1231
Hussain, D., Haydon, M.J., Wang, .Y, Wong, E., Sherson, S.M., Young, J, Camakaris J, Harper JF, Cobbett CS. (2004) P-type ATPase heavy metal transporters with roles in essential zinc homeostasis in Arabidopsis. Plant Cell, 16(5), 1327-1339。
Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., and Salzberg, S.L. (2013). TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology 14:R36。
Korenkov, V., King, B., Hirschi, K., and Wagner, G.J. (2009). Root-selective expression of AtCAX4 and AtCAX2 results in reduced lamina cadmium in field-grown Nicotiana tabacum L. Plant Biotechnol J 7(3):219-226。
Lewis, R.S., Parker, R.G., Danehower, D.A., Andres, K., Jack, A.M., Whitley, D.S., and Bush, L.P. (2012) Impact of alleles at the Yellow Burley (Yb) loci and nitrogen fertilization rate on nitrogen utilization efficiency and tobacco-specific nitrosamine (TSNA) formation in air-cured tobacco. J Agric Food Chem. 60, 6454-6461。
Liedschulte, V., Laparra, H., Battey, J., Goepfert, S., and Bovet, L. Missense or nonsense mutations in either HMA4.1 or HMA4.2 do not significantly reduce cadmium content in the leaves of tobacco plants grown under field conditions. Poster session presented at: The 12th Solanaceae conference; 2015 Oct 25-29; Bordeaux, France。
Lugon-Moulin, N., Martin, F., Krauss, M.R., Ramey, P.B., and Rossi L. (2006) Cd concentration in tobacco (Nicotiana tabacum L.) from different countries and its relationship with other elements. Chemosphere 63, 1074-1086。
Morel, M., Crouzet, J., Gravot, A., Auroy, P., Leonhardt, N., Vavasseur, A., and Richaud, P. (2009). AtHMA3, a P1B-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage in Arabidopsis. Plant Physiol., 149(2),894-904。
Ng, P.C., and Henikoff, S. (2003). SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31(13):3812-4。
Petolino, J.F. (2015). Genome editing in plants via designed zinc finger nucleases. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 51(1):1-8。
Puchta, H., and Fauser, F. (2013). Gene targeting in plants: 25 years later. Int J Dev Biol. 57(6-8):629-37。
Qiwei, S., and Caixia, G. (2015). Research progress of genome editing and derivative technologies in plants. Yi Chuan. 37(10):953-973。
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y。
Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 9, 671-675, 2012。
Sierro, N., Battey, J.N.D., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M.C., and Ivanov, N.V. (2014) The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications  5, Article number: 3833 
Trapnell, C., Hendrickson, D., Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, J.L., and Pachter, L. (2013). Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq. Nature Biotechnology 31: 46-53。
Wong, C.K., and Cobbett C.S. (2009) HMA P-type ATPases are the major mechanism for root-to-shoot Cd translocation in Arabidopsis thaliana. New Phytol., 181(1), 71-78。
Wright, D.A., Li, T., Yang, B., and Spalding, M.H. (2014) TALEN-mediated genome editing: prospects and perspectives. Biochem J. 462(1):15-24。
【０２２４】
本明細書で引用または記述されたあらゆる刊行物は、本出願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。本明細書における記載は、発明者がこのような開示に先だって権利を与えられないことの承認としては解釈されない。上記の明細書で言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な修正および変形が、本発明の範囲および主旨を逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記述してきたが、当然のことながら、本発明は主張の通り、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際に、本発明を実施するための記述された方法について、細胞生物学、分子生物学および植物体生物学の分野または関連する分野の当業者にとって明らかである様々な改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内に収まるものであることが意図される。
【０２２５】
配列
配列番号1
タバコ（Nicotiana tabacum）重金属ATPアーゼ（NtHMA4.1）GenBank登録番号 CCQ77798のアミノ酸配列。
1 MVESEKMNET KKLSKSYFDV LGICCTSEVV LVEKILKNLE GVKEVSVIVT TKTVIVIHDS
61 LLISPQQIVK ALNQARLEAS IRVKGEKNYQ KKWPSPFAIG SGILLGLSFL KYFFAPFQWL
121 ALAAVAVGIP PIIFRGVAAV RNLTLDINIL VLIAVAGSIV LHDYWEAGTI VFLFAIAEWL
181 ESRASHKATA AMSSLVNIVP PTAVLAESGE VVNVDEVKVN SILAVKAGET IPIDGVVVEG
241 ECDVDEKTLT GESFPVSKQR DSTVWAGTTN LNGYISVKTT ALAEDCAVAR MAQLVEDAQN
301 KKSKTQRYID KCAKYYTPAI VAISASLAIV PTALRVHNRN EWYRLALVTL VSACPCALVL
361 STPVAMCCAL SKAATSGLLF KGAEYLETLA KIKIMAFDKT GTITKGEFMV TEFKSLIDGF
421 SLNTLLYWVS SIESKSGHPM AAALVDYAQS NSVEPKPDRV EQFQNFPGEG IFGRIDGMEI
481 YVGNRKISSR AGCTTVPEIE GDSFKGKSVG YIFLGSSPAG IFSLSDVCRI GVKEAMRELK
541 QMGIKTAMLT GDCYAAANHV QDQLGGALDE FQAELLPEDK ATIIKGFQKE APTAMIGDGL
601 NDAPALATAD IGISMGISGS ALAKETGHVI LMTNDIGRIP KAARLARRVR RKIVENMIIS
661 VVTKAAIVAL AIAGYPLVWA AVLADTGTCL LVILNSMLLL RGGTRRHGKK CWRSSTPSHA
721 PHHKDKASCC KSENAPQLCC SDIESQKKCT SQSCSSEVCV PRCQPVSSGS KSCGNNQCPD
781 SIENSGFHSH RRPQCCSSKM AAKACQSAVS ESKSCGNNQC PDSVENSGFH SHPRPECCSS
841 KMAAKACQSA VSESKSCGNN QCPDSVENSG FHSHPRPQCC SSKMAAKAGQ SALSESKSCG
901 NNNCSDSIHK SNCHSLTNSL VCSSKMSAPQ CHSATSSNKS CGSTKCSDFS DKKCCQSDKI
961 PQTCSTKKSA PGCQSAVSGS KSCGNSKCSD SKDNSSHPSH PDHQTCMSKL CAPQSQSATS
1021 SSRTCGNTKC SDTNSKNSCY SQTNSESCSS KMSGPSCKTA NSGSRSCRNK KCQDSATENS
1081 FHSPLTNPLS GEKLSEQKSL DLVRKDKESS HDLRHGCSDE EHDHTNLDKA YDSCALQECC
1141 YSVQGNKTDV SETGIQETAH CDSTNQTCQT ASSGSMTCGN DKILDSLSIH GCHSHDNPLH
1201 EENNLEQKIL DVVGEGIKSP HAVGHGCSDK EHDHSHPEKA YDSCATDDCC FSVQVHGIDD
1261 VSKSEIQETA HCDSTKQSMV ISSSCKHEPK DQVNHCGLHS KTTPTDEELA KLVRRCCKYK
1321 PCHDVRSGCR KHAAECGPTV RSTINILRDN HHHYLDCSGR KVCSLLEKRH IGGCCDSFRK
1381 ECCAKKKHLG ASFGGGLSEI VIE
【０２２６】
配列番号2
タバコ（Nicotiana tabacum）重金属ATPアーゼ（NtHMA4.2）GenBank登録番号 CCW03243.1のアミノ酸配列。
1 MVESEKMNDT KNLSKSYFDV LGICCTSEVV LVEKILKNLE GVKEVSVIVT TKTVIVIHDS
61 LLISQQQIVK ALNQARLEAS IRVKGEKNYQ KKWPSPFAIG SGILLGLSFL KYFFAPFQWL
121 ALAAVAVGIP PIIFRGVAAV RNLTLDINIL VLIAVTGSIV LHDYWEAGTI VFLFTIAEWL
181 ESRASHKATA AMSSLVNIVP PTAVLAESGE VVNVDEVKLN SILAVKAGET IPIDGVVMEG
241 ECDVDEKTLT GESFPVSKQI DSTVWAGTTN LNGYISVKTT ALAEDCAVAR MAQLVEDAQN
301 KKSKTQRYID KCAKYYTPAI VAISASLAIV PTALRVHNRN EWYRLALVTL VSACPCALVL
361 STPVAMCCAL SKAATSGLLF KGAEYLETLA KIKIMAFDKT GTITRGEFMV TEFKSLVDGL
421 GLNTLLYWVS SIESKSGHPM AAALVDYAQS NSVEPKPDRV EQFQNFPGEG IFGRIDGMEI
481 YVGNRKISSR AGCTTVPEIE GDSFQGKSVG YIFLGSSPAG IFGLSDVCRI GVKEAMRELK
541 QMGIKTAMLT GDCYAAANHV QDQLGGAMDE FQAELLPEDK ATIIKGFQKE APTAMIGDGL
601 NDAPALATAD IGISMGISGS ALAKETGHVI LMTNDIGRIP KAARLARRVR RKIVENMIIS
661 VVTKAAIVAL AIAGYPLVWA AVLADTGTCL LVILNSMLLL RVGTHRHGKK CCRSATPSHA
721 PNHKDKASCC KSENAPQLCC SDIESQKKCT SQSCSSEVCV PRCQPVSSGS KSCGNNQCPD
781 SVENSGFHSH PRPQCCSSKM ASKACQSAVS ESKSCGNNQC PDSVENSGFH SHPRPQCCSS
841 KMASKACQSA VSESKSCGNN QCPDSVENSG FHSHPRPQCC SLKMASKACQ SAVSESKSCG
901 NNQCPDSVEN SGFHSHPRPQ CCSSKMAAKA CQSAVSESKS CGNNNCSESI YKSSCHSLTS
961 SLVCSSKMSA PQCHSATSSS KSCGSTKCSN FSDKKCCQYD KIPQTCSTKK SAPGCQSAVS
1021 GSKSCGDSKC SDSKDNSSHP SHPDHQICTS KLCAPQSQSA TSSSRTCGNM KCSDTNSKNS
1081 CYSHTNSESC SSKMSGPACK TANSGSRLCG NKKCLDSANE NSFHSLTNPL CEEKLLEKES
1141 LDLARKDRES NHDLSHGCSD EEHDHLNLDK AHDSCALQEC CYSVQGNKTD VSETGIQEAA
1201 HCDSINQTCQ TAISGSMTCG NNKSLDSLSI HGCHSHDSPL HKESNLEQKS LDVAGEGIKS
1261 PHAVGQGCSD KEHNHSHPEK AYDSCATDDC CFSVQVHGID DVSRSEIQET AHCDSTKQST
1321 VIPSSCEHEP KDQVNHCGSH SKSIPTDEEL AKLVRRCCKY KPCHDVRSGC RKHAAECGPT
1381 VRSTINILRD NHHHHLDCSG RKVCSLLEKR HIGGCCDSFR KECCAKNNHL GASFGGGLSE
1441 IVIE
【０２２７】
配列番号3
タバコ（Nicotiana tabacum）重金属ATPアーゼ（NtHMA4.1）GenBank登録番号 HF675181.1のポリヌクレオチド配列。
1 agagaaggag aaaaatggtg gaaagtgaaa aaatgaatga aacaaagaag ttgagcaaga
61 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttctagtt gaaaaaattc
121 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg
181 ttattcatga ttctcttctc atttctccgc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa
241 gattagaagc aagcataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc
301 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac
361 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttagag
421 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtgg
481 ctggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcgcca
541 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac cgctgctatg tcatcactgg
601 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagcgg agaagtcgta aatgttgatg
661 aagtcaaggt gaatagcatt cttgctgtga aagctggtga aactatacct attgatggag
721 ttgtagtgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag
781 tttctaagca aagagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca
841 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggca cagcttgtcg
901 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat cgacaagtgt gctaaatatt
961 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat tgttcctact gcattaagag
1021 ttcacaatcg aaatgaatgg tatcgcttgg ctttggtcac attggtgagt gcatgtccgt
1081 gtgcacttgt tctatctaca ccagttgcca tgtgttgcgc actttcaaaa gcagcaacgt
1141 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct agctaaaatc aaaatcatgg
1201 cttttgacaa aacagggact ataactaaag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc
1261 tgattgatgg ttttagtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagcatt gagagcaagt
1321 caggtcatcc gatggcagcc gctctggtgg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa
1381 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg
1441 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtaccacag
1501 taccagaaat agagggtgat agtttcaaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat
1561 catctccagc tggaattttc agtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa
1621 tgagagaact gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag
1681 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctttgga tgaatttcaa gcagaactcc
1741 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga
1801 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg
1861 gcatctctgg gtcagctctc gctaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca
1921 tcggaagaat accgaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga
1981 atatgattat atcagtcgtt acaaaggctg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc
2041 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcagata ctgggacatg cttgctagtg attttgaaca
2101 gcatgctact tctacgagga ggcacacgca gacatgggaa aaaatgttgg agatcttcta
2161 ctccttcgca tgctccccac cacaaagaca aagcttcatg ttgcaagtcg gaaaatgctc
2221 cccagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacaagtcaa tcatgctcgt
2281 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcagg atcaaagtca tgtggaaata
2341 atcagtgccc agactccatt gaaaatagtg gttttcattc tcatcgccgt cctcaatgct
2401 gctcgtcgaa gatggctgct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgcg
2461 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctg
2521 aatgctgctc gtcgaagatg gctgctaaag cgtgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt
2581 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc
2641 gtcctcaatg ctgttcatcg aagatggctg ctaaagcagg ccaatctgca ctttcagaat
2701 caaagtcatg tggaaataac aattgctcag actccattca caagagtaat tgtcattctt
2761 taactaactc tctagtatgt tcttccaaga tgtctgctcc acaatgtcat tctgctactt
2821 caagcaacaa atcatgtgga agtaccaagt gctccgactt cagtgacaaa aaatgttgtc
2881 aatccgacaa aattcctcaa acgtgctcta ccaagaagtc tgctccagga tgtcaatctg
2941 cagtttctgg gtctaaatca tgtggaaata gcaagtgttc agactcaaaa gacaatagta
3001 gccatccttc acatcccgat catcaaacat gcatgtctaa gttgtgtgct ccacaaagcc
3061 aatctgcaac ttcaagctcc aggacatgtg gaaatacaaa gtgctcggac accaatagca
3121 agaattcttg ttattcacaa accaactctg aatcatgctc ttcaaagatg tctggtccat
3181 catgcaaaac tgctaattca ggttcaaggt catgcagaaa taagaagtgc caggactctg
3241 caaccgagaa cagttttcat tcaccactta ctaatccact cagtggggaa aagctttcgg
3301 agcagaaaag cttggattta gtccgaaaag ataaggaatc aagtcatgat cttcgtcatg
3361 gctgctctga cgaggaacat gatcatacaa atttagacaa ggcatatgac agttgtgcct
3421 tacaagaatg ttgttattcg gttcaaggca ataaaactga tgtatcagaa actggaatcc
3481 aggaaactgc tcattgtgac agcaccaatc aaacatgcca aactgcaagt tcaggatcga
3541 tgacatgcgg aaatgataag atcctggact ctctaagcat ccatggttgt cattcgcatg
3601 ataatccact ccacgaggag aacaacttgg agcagaaaat cttggatgtt gttggagaag
3661 gtataaaatc acctcatgct gtcggtcatg gctgttcgga caaggaacac gatcactcac
3721 atccagaaaa ggcatatgac agttgtgcaa cagatgattg ttgtttttca gttcaagtcc
3781 atggcattga cgacgtatca aaaagtgaaa ttcaagaaac tgctcattgt gacagcacaa
3841 agcagagcat ggtcatctcc agcagctgca aacatgaacc aaaagatcag gtaaatcact
3901 gtggacttca ctctaaaact actccaactg atgaagaact agccaagctg gttagaagat
3961 gctgcaaata caaaccatgc cacgacgtcc gttctggctg caggaagcat gctgcagaat
4021 gtggtccaac cgttcgatca accatcaata tcttacggga caaccatcat cattacctag
4081 actgcagtgg tcgtaaggtt tgttcgctgt tggagaagag acacatcggt ggatgctgtg
4141 acagcttcag aaaagaatgt tgtgccaaga aaaaacacct tggagcaagt tttggaggag
4201 gtttatcaga aattgtcata gagtagatgc aatccgaagt gtacat
【０２２８】
配列番号4
タバコ（Nicotiana tabacum）重金属ATPアーゼ（NtHMA4.2）GenBank登録番号 HF937054.1のポリヌクレオチド配列。
1 atagaaagaa gagaatggtg gaaagtgaga aaatgaatga cacaaagaat ctgagcaaga
61 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttcttgtt gaaaaaattc
121 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg
181 ttattcatga ttctctcctc atttctcagc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa
241 gattagaagc aagtataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc
301 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac
361 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttaggg
421 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtga
481 cgggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcacca
541 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac tgctgctatg tcatcactgg
601 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagtgg agaagtcgta aatgttgatg
661 aagtcaagtt gaatagcatt cttgctgtta aagctggtga aactatacct attgatggag
721 ttgtaatgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag
781 tttctaagca aatagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca
841 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggcg cagcttgtcg
901 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat tgacaagtgt gctaaatatt
961 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat agttcctact gcattaagag
1021 ttcacaatcg aaatgagtgg tatcgcttgg ctttggtcac gttggtgagt gcatgtccgt
1081 gtgcacttgt gctatctaca ccagttgcca tgtgttgtgc actttctaaa gcagcaacgt
1141 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct tgctaaaatc aaaatcatgg
1201 cttttgacaa aacagggact ataactagag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc
1261 tggttgatgg tcttggtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagtatt gagagcaagt
1321 caggtcatcc gatggcagcc gctctggttg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa
1381 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg
1441 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtactacag
1501 taccagaaat agagggtgat agtttccaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat
1561 catctcccgc tggaattttc ggtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa
1621 tgagagagct gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag
1681 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctatgga tgaatttcaa gcggaactct
1741 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga
1801 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg
1861 gcatctctgg gtcagctctc gcgaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca
1921 tcggaagaat accaaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga
1981 atatgattat atcagtcgtt acaaaggccg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc
2041 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcggata ctgggacatg cttgctagtg atcttgaaca
2101 gcatgctact tctacgagta ggcacacaca gacatgggaa aaaatgttgt agatctgcta
2161 ctccttcgca tgctcccaac cacaaagaca aagcttcttg ttgcaagtcg gaaaatgctc
2221 cgcagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacgagtcaa tcatgctcgt
2281 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcggg atcaaagtca tgtggaaata
2341 atcagtgccc agactccgtt gaaaatagtg gttttcattc tcatccccgt cctcaatgct
2401 gctcgtcgaa gatggcttct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgtg
2461 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgccctc
2521 aatgctgctc gtctaagatg gcttctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt
2581 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc
2641 gtcctcaatg ctgctcgttg aagatggctt ctaaagcatg ccaatctgca gtttcagaat
2701 caaagtcatg tggaaataat cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc
2761 atccccgtcc tcaatgctgc tcgtcgaaga tggctgctaa agcatgccaa tctgcagttt
2821 cagaatcaaa gtcatgtgga aataacaatt gctcggagtc catttacaag agtagttgtc
2881 attctttaac aagttctcta gtatgttctt ccaagatgtc tgctccacaa tgtcattctg
2941 ccacttcaag ctccaaatca tgtggaagta ccaagtgctc caacttcagt gacaaaaaat
3001 gttgccaata tgacaaaatt cctcaaacgt gctctaccaa gaagtctgct ccaggatgtc
3061 aatctgcagt ttctgggtct aaatcatgtg gagatagcaa gtgttcagac tcgaaagaca
3121 atagtagcca tccttcacat cccgatcatc aaatatgcac gtctaagttg tgtgctccac
3181 aaagccaatc tgcaacttca agctccagga catgtggaaa tatgaagtgc tcggacacca
3241 atagcaagaa ttcttgttat tcacatacca actctgaatc atgctcttca aagatgtctg
3301 gtccagcatg caaaactgct aattcaggtt caaggttatg cggaaataag aagtgcctag
3361 actctgcaaa cgagaacagt tttcattcac ttactaatcc actctgtgag gaaaagcttt
3421 tggagaagga aagcttggat ttagcccgaa aagataggga atcaaatcat gatcttagtc
3481 atggttgctc tgacgaggaa catgatcatc taaatttaga caaggcacat gacagttgtg
3541 ccttacaaga atgttgttat tctgttcaag gcaataaaac tgatgtatca gaaactggaa
3601 tccaggaagc tgctcattgt gacagcatca atcaaacatg ccaaactgca atttcaggat
3661 caatgacatg cggaaataat aagagtctgg actctctaag catccatggt tgtcattcac
3721 atgatagtcc actccacaag gagagcaact tggagcagaa aagcttggat gttgctggag
3781 aaggtataaa atcacctcat gctgtcggtc aaggctgttc ggacaaggag cacaatcact
3841 cgcatccaga aaaggcgtat gacagttgtg caacagacga ttgttgtttt tcagttcaag
3901 tccatggcat tgacgacgta tcaagaagtg aaattcaaga aactgctcat tgtgacagca
3961 caaaacagag cacggtcatc cccagcagct gcgaacatga accaaaagat caggtaaatc
4021 actgtggatc tcactctaaa agtattccaa ctgatgaaga actagccaag ctggttagaa
4081 gatgctgcaa atacaaacca tgccacgatg tccgctctgg ctgcaggaag catgctgcag
4141 aatgtggtcc aaccgttcga tcaaccatca atatcttacg ggacaaccat catcatcatc
4201 tagactgcag tggtcgtaag gtttgttcgc tgttggagaa gagacacatt ggtggatgct
4261 gtgacagctt cagaaaagaa tgttgtgcca agaacaatca ccttggagca agttttggag
4321 gaggtttatc agaaattgtc atagagtaga tgcaatctga agtgtacata tgttgt
【０２２９】
表1
【表２】
2019503187.tif 000004
【０２３０】
国際公開第２０１２／０４１９１３Ａ１号に記載された単一ＨＭＡ突然変異体におけるＣｄデータおよびＺｎデータのまとめ。国際公開第２０１２／０４１９１３Ａ１号における突然変異体の名称は、本明細書の突然変異名称およびＨｅｒｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に記載された突然変異体とは異なっている。これは、国際公開第２０１２／０４１９１３Ａ１号では不完全配列が使用されたためである。第一列では、対応する標準的な名称が用いられている。
【０２３１】
表２
【表３】
2019503187.tif 000005
Hermand et al(2014) Metallomics.6(8):1427-1440の図4ａおよび図4ｃで報告されたデータのまとめ
【０２３２】
表３
圃場試験１（Ｃｄが中程度の領域）：単一突然変異体の圃場データ
【表４】
2019503187.tif 000006
大規模圃場実験で栽培したホモ接合単一突然変異体およびそれらのヌル分離対照の区画からのプール試料のＣｄ／Ｚｎ値（平均±標準偏差）。Ｃｄ／Ｚｎ低減％を対照値と比較して算出する。ｐ値（対応のあるｔ検定）を計算して、偶然に平均値（突然変異体系統）＜０．８＊平均値（対照系統）となる確率を求める。有意な２０％超のＣｄ／Ｚｎ低減が見られる系統（ｐ＜０．０５）に関して、ｐ値は太字で強調されている。圃場試験では、７組の突然変異組み合わせに関して、それぞれの単一突然変異体、二重突然変異体、および対照の植物体を６箇所の複製区画で栽培した（Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊については５箇所、Ｅ２９６／Ｑ５６１＊については４箇所、Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊については３箇所）。各複製単位は、それぞれ二重突然変異体、ＨＭＡ４  ＷＴ対照、および二つの単純突然変異体の１０個の植物体を含む。突然変異Ｑ２９３＊およびＱ５６１＊はいくつかの組み合わせに生じるため、これらの単一突然変異のデータは、それぞれ８区画および３３区画の値に基づいている。単一突然変異体である植物体は、対照と比較してバイオマス（葉重量）の低減を示していないが、これは図６に示されている。
【０２３３】
表４
圃場試験１（Ｃｄが中程度の領域）：二重突然変異体の圃場データ
【表５】
2019503187.tif 000007
大規模圃場実験で栽培したホモ接合二重突然変異体およびそれらのヌル分離対照の区画からのプール試料のＣｄ／Ｚｎ値（平均±標準偏差）。Ｃｄ／Ｚｎ低減％を対照値と比較して算出する。ｐ値（対応のあるｔ検定）を計算して偶然に平均値（突然変異体系統）＜０．８＊平均値（対照系統）となる確率を求める。有意な２０％超のＣｄ／Ｚｎ低減が見られる系統（ｐ＜０．０５）に関して、ｐ値は太字で強調されている。圃場試験では、７組の突然変異の組み合わせのうちの分離種子ロットを植え付け、それらの遺伝子型について分析する。各々の突然変異の組み合わせについて、四つの遺伝子型群を６箇所の複製区間で栽培する（Ｑ２９３＊／Ｑ５６１＊に対しては５箇所、Ｅ２９６／Ｑ５６１＊に対しては４箇所、Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊に対しては３箇所）。各複製単位は、それぞれ二重突然変異体、ＨＭＡ４ＷＴ対照、および二つの単純突然変異体の１０個の植物体を含む。表現型のデータ（葉の生重量）を図６に示す。
【０２３４】
表５
圃場試験２（Ｃｄが中程度の領域）二重突然変異体の圃場データ
【表６】
2019503187.tif 000008
【０２３５】
大規模圃場実験で栽培したホモ接合二重突然変異体およびそれらのヌル分離対照の区画からのプール試料のＣｄ／Ｚｎ値（平均±標準偏差）。Ｃｄ／Ｚｎ低減％を対照値と比較して算出する。ｐ値（対応のあるｔ検定）を計算して偶然に平均値（突然変異体系統）＜０．８＊平均値（対照系統）となる確率を求める。有意な２０％超のＣｄ／Ｚｎ低減が見られる系統（ｐ＜０．０５）に関して、ｐ値は太字で強調されている。圃場試験では、１８組の突然変異の組み合わせに関して、二重突然変異体およびそれら対照植物体を６箇所の複製区画で栽培した（Ｑ２９３＊／Ｗ２６５＊およびＱ２９３＊／Ｄ２３４Ｎに対しては４箇所）。各複製単位には、それぞれ二重突然変異体およびＨＭＡ４  ＷＴ対照の２０個の植物体が含まれた。表現型のデータ（葉の乾燥重量）を図７に示す。
【０２３６】
表６
圃場試験３および圃場試験４の圃場データ：高Ｃｄ領域
【表７】
2019503187.tif 000009
【０２３７】
二つの圃場実験において高カドミウム領域で栽培したホモ接合二重突然変異体およびそれらのヌル分離対照の区画からのプール試料のＣｄ／Ｚｎ値（平均±標準偏差）。Ｃｄ／Ｚｎ低減％を対照値と比較して算出する。ｐ値（対応のあるｔ検定）を計算して偶然に平均値（突然変異体系統）＜０．８＊平均値（対照系統）となる確率を求める。有意な２０％超のＣｄ／Ｚｎ低減が見られる系統（ｐ＜０．０５）に関して、ｐ値は太字で強調されている。圃場試験では、５組の突然変異の組み合わせに関して、二重突然変異体およびそれら対照植物体を５箇所の複製区画で栽培した。各複製単位には、それぞれ二重突然変異体およびＨＭＡ４  ＷＴ対照の２０個の植物体が含まれた。突然変異体と対照の両方に対して許容できる生長を有する区画のみを分析した（多くの系統に対しては５区画であるが、例外として圃場３：Ｔ４０２Ｉ／Ｑ５６１＊に対して４区画、圃場４：Ｇ２５１Ｄ／Ｑ５６１＊に対して４区画、およびＱ２９３＊／Ｑ５６１＊に対して３区画である）。表現型のデータ（乾燥処理済み葉重量）を図８に示す。
【０２３８】
表７
【表８】
2019503187.tif 000010
【０２３９】
HMA4のドメイン構造は、アラビドプシスのHMA2タンパク質およびHMA4タンパク質との配列整列と、UniProtを用いたそのそれぞれのドメインアノテーション（AtHMA2：Q9SZW4、AtHMA4：O64474）とから推定した。
【０２４０】
表8
選択した二重突然変異体の温室データ 
【表９】
2019503187.tif 000011
【０２４１】
ホモ接合二重突然変異体（「ＨＭＡ４．１におけるホモ接合突然変異／ＨＭＡ４．２におけるホモ接合突然変異」として示される突然変異）である８個の植物体（Ｑ２９３＊／Ａ３７４Ｖについては６個の植物体）と、全ての二重突然変異体（総計５４個）のヌル分離対照とのＣｄ／Ｚｎ値（平均±標準偏差）。Ｃｄ／Ｚｎ低減％を対照値と比較して算出する。表をあまり複雑化しないように、上述の表では全５４個の対照植物体をあわせて分析しており、二重突然変異体区画のＣｄ／Ｚｎ値を全対照と比較している。（ｔ検定を行い、括弧内の値はＰ＜０．０５で有意な低減を示していないものである）。この実験の植物体は温室にて大型鉢で栽培されている。鉢で４週および１１週生長させた後に分析した植物体の形態および収率が示されている。
【０２４２】
表９
さらなる選択した二重突然変異体の温室データ
【表１０】
2019503187.tif 000012
【０２４３】
ホモ接合ＨＭＡ４突然変異体（「ＨＭＡ４．１におけるホモ接合突然変異／ＨＭＡ４．２におけるホモ接合突然変異」として示される突然変異）のさらなる２組の組み合わせと、各二重突然変異体の同数のヌル分離対照との葉中Ｃｄ／Ｚｎ値（Ｈ４３８Ｙ／Ｗ２６５＊に対する９個の複製植物体およびＬ３６Ｆ／Ｑ５６１＊に対する６個の複製植物体の平均±標準偏差）。Ｃｄ／Ｚｎ低減％を対照値と比較して算出する。
【０２４４】
表１０
【表１１】
2019503187.tif 000013
2019503187.tif 000014
ＨＭＡ４．１およびＨＭＡ４．２における特定および検証された突然変異の一覧表。アミノ酸変化を示し、対応するＳＩＦＴスコアを示している。興味深い突然変異（置換されたアミノ酸のＳＩＦＴスコアが元のＳＩＦＴスコアの０．０５未満となるナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異）を太字で強調している。
【０２４５】
表１１
葉中のＣｄ含有量が減少すると予測される突然変異の組み合わせの例
【表１２】
2019503187.tif 000015
【０２４６】
表１２
葉中のＣｄ含有量が減少すると予測される突然変異の組み合わせの例
【表１３】
2019503187.tif 000016
【図１】
2019503187.tif 000017
【図２】
2019503187.tif 000018
【図３】
2019503187.tif 000019
【図４】
2019503187.tif 000020
【図５】
2019503187.tif 000021
【図６】
2019503187.tif 000022
【図７】
2019503187.tif 000023
【図８】
2019503187.tif 000024
【図９】
2019503187.tif 000025
【配列表】
2019503187000001.app
【国際調査報告】
2019503187.tif 000026
2019503187.tif 000027
2019503187.tif 000028
2019503187.tif 000029
2019503187.tif 000030