(57)【要約】  対象の衛生化方法、及び対象の麻酔方法を提供する。それを必要とする対象の皮膚科学的障害を治療及び／若しくは予防し、皮膚の炎症を軽減し、疼痛を軽減し、並びに／又は痒みを軽減する方法をさらに提供する。方法は、有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を対象に投与することを含み得る。TRPA1及び／又はTRPV4阻害化合物を、局所適用に適した担体、ビヒクル、又は希釈剤と組み合わせて含む組成物をさらに提供する。【選択図】図１Ａ
2019513749.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
阻害剤及びヨウ素を含む組成物であって、前記阻害剤がTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、前記組成物。
【請求項２】
阻害剤及び麻酔剤を含む組成物であって、前記阻害剤がTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、前記組成物。
【請求項３】
前記阻害剤がTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記阻害剤が、下記式I：
【化１】
2019513749.tif 000054
(I)
（式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；
DはC1-C3アルキレンであり；
Eは結合、又はC1-C2アルキレンであり；かつ
Rは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される）
の化合物を含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記阻害剤が、下記から選択される化合物を含む、請求項４に記載の組成物。
【化２】
2019513749.tif 000055
2019513749.tif 000056
2019513749.tif 000057
【請求項６】
対象の衛生化方法であって、前記対象を、請求項１及び３〜５のいずれか1項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項７】
前記対象上の微生物の個体数の減少を引き起こすのに十分な時間、前記対象が前記組成物と接触する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が前記対象の表面に投与され、この表面は、皮膚領域、創傷、及び潰瘍から成る群より選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が前記対象を消毒する、請求項６〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が前記対象を滅菌する、請求項６〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が殺菌活性を有する、請求項６〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
対象の麻酔方法であって、請求項２〜５のいずれか1項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
対象の麻酔方法であって、麻酔剤と阻害剤を前記対象に同時投与することを含み、前記阻害剤が、TRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、前記方法。
【請求項１４】
組成物が衛生化して疼痛を軽減する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
それを必要とする対象の皮膚科学的障害の治療及び／又は予防方法であって、有効量のTRPV4及び／又はTRPA1阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記皮膚科学的障害が、膵炎、てんかん、関節炎、変形性関節症、多発性硬化症、脳卒中、CNS自己免疫状態、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳浮腫、CNS感染症、精神神経障害、骨格変性・炎症性障害、三叉神経痛、大腸炎、及び硬化症から成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記三叉神経痛が頭痛を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記TRPV4及び／又はTRPV4阻害剤が、下記I：
【化３】
2019513749.tif 000058
(I)
（式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；
DはC1-C3アルキレンであり；
Eは結合、又はC1-C2アルキレンであり；かつ
Rは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される）
の化合物を含む、請求項１５〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記TRPV4及び／又はTRPA1阻害剤が、下記から選択される化合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【化４】
2019513749.tif 000059
2019513749.tif 000060
2019513749.tif 000061
【請求項２０】
前記化合物がTRPV4及びTRPA1を阻害する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない、請求項１８又は１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔発明の詳細な説明〕
関連出願の相互参照
この出願は、2016年4月7日に提出された米国仮特許出願第62/319,684号、2016年5月4日に提出された米国仮特許出願第62/331,951号、及び2016年5月17日に提出された米国仮特許出願第62/337,701号に対する優先権を主張する。各出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)／国立歯科・頭蓋顔面研究所(National Institute of Dental and Craniofacial Research)(NIH／NIDCR)により授与された助成金番号DE018549及びDE018529S1、並びに米国国立衛生研究所／国立関節炎・骨格筋・皮膚疾患研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)(NIH／NIAMS)により授与された助成金番号AR059402、AR31737、及びAR050452の下に政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本開示は、表面を衛生化し、対象に麻酔をかけ、並びに炎症、疼痛、痒み、癌、自己免疫疾患、線維性疾患、皮膚色素沈着、及び／又は他の皮膚科学的障害を治療するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
序論
皮膚は、ヒトを含めた多くの脊椎動物の最大器官である。皮膚は、潜在的に有害な外部環境に対するバリア保護を提供する。皮膚は、生物の免疫学的に能力があり、かつ感覚力のある構造体への周囲環境の最初の相互作用部位にもなる。暖かさ、冷たさ、機械的キュー、疼痛、及び痒みの感覚伝達能力が賦与された細胞は、皮膚と直接連動するそれらの末梢軸索を有する後根及び三叉神経節内の感覚ニューロンである。しかしながら、炎症、疼痛、痒み、癌、自己免疫疾患、線維性疾患、皮膚色素沈着、及び他の皮膚科学的障害の治療のために皮膚をうまく標的にすることは依然として分かりにくい。
【０００５】
皮膚内の生化学経路としては、イオンチャネルの一過性受容器電位(TRP)スーパーファミリーに関するものがある。このファミリーの1つのイオンチャネルがTRPV4である。TRPV4は、カルシウム(すなわち、Ca++)に透過性の多様に活性化される非選択的カチオンチャネルである。TRPV4イオンチャネルは、哺乳動物皮膚の表皮ケラチノサイトにおいてロバストに発現する。しかしながら、TRPV4は皮膚神経支配感覚ニューロンにおいても発現する。Trpv4-/-マウスでは、表皮と真皮との間のバリア機能障害の表皮性表現型が示されている。疼痛シグナル伝達に関して、TRPV4は、侵害性の熱的ではなく、浸透圧的及び機械的キューへの生理学的引っ込め応答にとって重大な意味をもつことが分かっており、侵害受容の炎症又は神経損傷誘導感作に関連することも分かっている。TRPV4が表皮ケラチノサイト及び皮膚神経支配感覚ニューロンにおいて発現することは分かっているが、UVB曝露によって誘発される病理学的疼痛におけるTRPV4のインビボ役割は実証されていない。さらに、痒み伝達におけるTRPV4の直接的役割もまだ今のところ実証されていない。
【０００６】
TRPA1は、細胞膜にある別のTRPイオンチャネルである。TRPA1は、環境による刺激、痛み、冷たさ、及びストレッチのセンサーとして作用する。TRPV4及びTRPA1は皮膚内で機能するが、TRPV4及び／又はTRPA1を標的にすることが炎症、疼痛、痒み、癌、自己免疫疾患、線維性疾患、皮膚色素沈着、及び他の皮膚科学的障害の治療に役立つかどうか分からない。さらに、特異的TRPV4及びTRPA1阻害剤は、現在知られていない。皮膚科学的障害の新規かつ良好な治療、並びに衛生化及び麻酔方法が必要である。 
【発明の概要】
【０００７】
概要
一態様では、本開示は、阻害剤及びヨウ素を含む組成物であって、阻害剤がTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、組成物に関する。
一態様では、本開示は、阻害剤及び麻酔剤を含む組成物であって、阻害剤がTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、組成物に関する。
一態様では、本開示は、TRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する阻害剤に関する。
一部の実施形態では、阻害剤は、TRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない。一部の実施形態では、阻害剤は、下記式Iの化合物を含む。
【０００８】
【化１】
2019513749.tif 000003
(I)
【０００９】
式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；DはC1-C3アルキレンであり；Eは結合、又はC1-C2アルキレンであり；かつRは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される。一部の実施形態では、阻害剤は、下記化合物から選択される化合物を含む。
【００１０】
【化２】
2019513749.tif 000004
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2019513749.tif 000013
【００１１】
別の態様では、本開示は、対象の衛生化(sanitizing)方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、対象を本明細書で詳述する組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、対象は、対象上の微生物の個体数の減少を引き起こすのに十分な時間、組成物と接触する。一部の実施形態では、組成物は対象の表面に投与され、表面は、皮膚領域、創傷、及び潰瘍から成る群より選択される。一部の実施形態では、組成物は対象を消毒(disinfect)する。一部の実施形態では、組成物は対象を滅菌(sterilize)する。一部の実施形態では、組成物は抗菌(antibacterial)活性を有する。
別の態様では、本開示は、対象の麻酔方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書で詳述する組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、麻酔剤と阻害剤を同時投与することを含み、阻害剤は、TRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する。一部の実施形態では、組成物は、衛生化して疼痛を軽減する。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象の皮膚科学的障害の治療及び／又は予防方法であって、有効量のTRPV4及び／又はTRPA1阻害剤を対象に投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、膚科学的障害は、膵炎、てんかん、関節炎、変形性関節症、多発性硬化症、脳卒中、CNS自己免疫状態、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳浮腫、CNS感染症、精神神経障害、骨格変性・炎症性障害(skeletal degenerative-inflammatory disorder)、三叉神経痛、大腸炎、及び硬化症から成る群より選択される。一部の実施形態では、三叉神経痛は頭痛を含む。
一部の実施形態では、TRPV4及び／又はTRPV4阻害剤は、下記式Iの化合物を含む。
【００１２】
【化３】
2019513749.tif 000014
(I)
【００１３】
式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；DはC1-C3アルキレンであり；Eは結合、又はC1-C2アルキレンであり；かつRは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される。一部の実施形態では、TRPV4及び／又はTRPA1阻害剤は、下記化合物から選択される化合物を含む。
【００１４】
【化４】
2019513749.tif 000015
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2019513749.tif 000017
【００１５】
一部の実施形態では、化合物はTRPV4及びTRPA1を阻害する。一部の実施形態では、化合物はTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない。
本開示は、下記詳細な説明及び添付図面に照らせば明らかになる他の態様及び実施形態を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図1A〜1Gは、ケラチノサイト特異性・誘導性Trpv4ヌルマウス及びそのUVB応答を示す。ケラチノサイト特異性・誘導性Trpv4ノックアウトマウス生成の基礎をなすTrpv4の遺伝子ターゲティング及び遺伝子操作を示す。マウス胚性幹細胞において、loxP要素と隣接しているTrvp4エクソン13、及びfrt部位と隣接した選択カセットの挿入で出発するマウスTrpv4ターゲティングの逐次工程を示す。キメラマウスの生成及び遺伝子操作変異の安定伝達の後、FLPeマウスと交配することによって選択カセットを除去した。結果として生じたマウスをホモ接合及びK14-CRE-ERtamマウスと交雑させて、ケラチノサイト特異性・誘導性Trpv4ノックアウト/ノックダウンを可能にした。
【図１Ｂ】DNAジェノタイピングを示す。WTのPCR産物、ヘテロ接合体及びホモ接合性Trpv4lox/loxマウスを示す。ここで留意すべきは、PCR産物はPacIによる消化を必要とし、かつ全てのマウスは別のジェノタイピングPCRによってCRE+であると予めスクリーニングされたことである。
【図１Ｃ】ケラチン1及びケラチン14についてのマウス皮膚の共標識化を示し、ビヒクル誘導コントロールマウスについて確立したパターン(上パネル)、及びケラチノサイトにおける特異性TRPV4ノックダウンについての類似パターン(下パネル)を示している。しかしながら、これらの動物では有棘層においてK14の発現がわずかに増え、TRPV4発現の減弱、ひいてはCa++流入減少を反映していることに留意されたい。K14は、通常、基底から基底上への移行で、Ca++シグナル伝達及び末端分化誘導の増加と同時に下方制御される。
【図１Ｄ】L5 DRGニューロンにおけるTRPV4タンパク質発現は遺伝子型間で差がないことを示す。L5(＝足蹠神経支配)DRGニューロンにおけるTRPV4免疫組織化学のデンシトメトリー(上パネル顕微鏡写真)、棒グラフは、ベースラインでもUV曝露後48時間でも油処置マウス対tam処置マウスにおいてTRPV4タンパク質存在量について差がないことを示し、K14をCREドライバーとして用いたときの皮膚のTRPV4ノックダウンの特異性を確証する。DRG感覚ニューロンとしてそれらを同定する装飾細胞の特徴的形態に留意されたい。前述したように、これらのニューロンにおけるTRPV4発現の異なるレベルにも留意されたい；n＝3匹のマウス／群、≧50個のニューロン／マウス。
【図１Ｅ】足蹠表皮内のMerkel細胞にTRPV4発現がないことを示す。iKOコントロール対タモキシフェン誘導マウスの免疫標識肉球の代表的イメージを表す共焦点三重蛍光顕微鏡写真パネルを示す。この例のTRPV4の完全ノックダウンに留意されたい(赤パネル)。Merkel細胞(緑パネル)のために、抗サイトケラチン8抗体を使用した。Merkel細胞にTRPV4共標識がないことに留意されたい。青パネル＝DAPI。
【図１Ｆ】UVB行動感作に関してK14-CRE-ERtamマウスにタモキシフェン適用の効果がないことを示す。侵害性機械的(上図)及び熱的(下図)刺激に対して(K14-CRE-ERtam X Trpv4lox/+)マウス(＝タモキシフェンで誘導したときのケラチノサイト内のTrpv4ヘテロ接合体)のよく似た引っ込め閾値に留意されたい；n＝7匹のマウス／群。48時間の時点で感度ピークがある時間経過にも留意されたい。
【図１Ｇ】UVBに曝露された油処置iKOマウスにおけるpERK発現L5 DRGニューロンのサイズ分布を示す。棒グラフは、UVB曝露の48時間後にpERKを発現する小サイズ及び中サイズの感覚ニューロンのサイズの普及を示す。より大きいニューロン(＞1200μm2)が存在しないことに留意されたい。n＝22個のニューロン。
【図２Ａ】図2A〜2Gは、UVB刺激装置及びUVBケラチノサイトコントロール実験を示す。LEDによって放射されたUVスペクトルを、UVBにほぼ完全に透過性である石英のスペクトル(赤トレース)、及び超低UVB透過性を有するガラス(青トレース)と重ねて示す。
【図２Ｂ】ボールレンズの集束特性を示す。
【図２Ｃ】UV-LEDとボールレンズの組み合わせの焦点幾何学を示す。
【図２Ｄ】UV-LEDの熱的効果がないこと；経時的な焦点温度の測定を示す。
【図２Ｅ】TRPV3活性化実験を示す。10μMのIPPによって効果的に遮断できるカンファーによるCa++トランジェントの誘導は、TRPV3媒介シグナル伝達を示唆している。
【図２Ｆ】TRPV4選択的アクチベーターGSK101関連知見を示す。20μMのGSK205によって完全に遮断できる5nMのGSK101に応答しての1°MKのCa++トランジェントは、それがTRPV4によって特異的に媒介されることを示唆している。TRPV4シグナル伝達に沿って、GSK101応答も外部Ca++の非存在によって排除可能である。
【図２Ｇ】TRPV4がUVB-Ca++応答−HEK293T細胞異種トランスフェクションに十分であることを示す。HEK293T細胞におけるTRPV4の管理された発現は、UVB放射線に応答してのCa++トランジェントをもたらし、これはコントロールトランスフェクト細胞では大いに低減する。20μMのGSK205への前曝露は、TRPV4トランスフェクト細胞におけるCa++シグナルを実質的に排除し、コントロールトランスフェクト細胞の中程度のシグナルを排除する。
【図３Ａ】図3A〜3Eは、Trpv4のケラチノサイト特異的除去が、UVBに応答しての侵害防御行動の変化につながることを示す。tam誘導iKOマウスにおける表皮TRPV4発現及びTrpv4のケラチノサイト特異的除去によるその減少を示す。(i)TRPV4免疫蛍光。ビヒクル(油)処置コントロールの表皮にはTRPV4があるが、tam誘導iKOマウスにはないことに留意されたい。バー＝10μm。(ii)肉球皮膚の表皮ライセートのウエスタンブロット。誘導Trpv4除去後のTRPV4のノックダウン及びさらに完全な損失に留意されたい(正規化のためにβ-アクチンを用いた)。(iii)肉球皮膚のTrpv4 mRNAについてのqRT-PCRを示し、担体(油)処置に対してtam処置に応答しての顕著なTrpv4ノックダウンを示唆している。P＜0.0001、t検定。(iv)表皮系列マーカーについての免疫蛍光。WT皮膚では、末端分化に関与すると基底表皮マーカーケラチン14が下方制御され、基底上マーカーケラチン1が誘導される。TRPV4のノックダウンにより、このバランスが乱れるようであり、共標識を示す有棘層細胞もある。バー＝10μm。
【図３Ｂ】UVB曝露に応答しての侵害防御行動を示す。侵害性機械的刺激によって誘発された侵害防御行動(自動フォンフライヘアー(von Frey hair)アッセイ、左図)又は熱誘発侵害防御行動(ハーグリーブス(Hargreaves)アッセイ、右図)の時間経過(時間で)。Trpv4-/-及びtam処置iKOマウスにおける感作が、油処置(ビヒクル)iKOマウス及びWTマウスに比べて顕著に少ないことに留意されたい。1群当たりn≧10匹の動物；**p＜0.01 ANOVA。
【図３Ｃ】侵害防御行動とTrpv4ノックダウンレベルとの間の関係を示す。両パラメーターを利用でき、Trpv4 mRNAレベル＜0.45のn＝12匹の動物を示す。4匹のビヒクル誘導動物(緑記号)対それらのタモキシフェン誘導対応動物(赤記号)に留意されたい。
【図３Ｄ】表皮TRPV4の損失は、ホルマリン注射によって引き起こされる侵害防御行動に有意な効果を示さない。棒は、注射後最初の10分(相I)、及び10〜45分(相II)内の平均累積侵害防御行動を表す。1群当たりn＝4。
【図３Ｅ】L5 DRGニューロンにおけるリン酸化ERKを示す。L5 DRG切片のpERK免疫蛍光を油処置及びtam処置iKO動物±UVBへの曝露について示す。UVB曝露コントロールマウスだけが肉球神経支配L5 DRGにおいてpERK発現を示すことに留意されたい。右図に定量化を示す。1群当たりn＝3匹の動物、動物毎にDRG当たり6切片、**p＜0.01 ANOVA。
【図４Ａ】図4A〜4Eは、UVB媒介皮膚組織損傷がケラチノサイトTRPV4に依存することを示す構造及び超微細構造解析を示し、免疫組織学的解析は、ケラチノサイトのUVB媒介活性化並びにマクロファージ及び好中球の動員がケラチノサイトTRPV4に依存することを実証する。1μmのトルイジンブルー半薄切片を示す。顕微鏡写真は、UVB曝露48時間後にサンプリングした場合に、UVBに応答しての皮膚の代表的知見を示す。ここで留意すべきは、UVB刺激により、油処置(TRPV+)iKOマウスは表皮-真皮境界での分離及び組織損傷のロバストな兆候を示すが、tam処置(TRPV-)iKOマウスは示さないことである；顆粒球(Gr、好中球)に注意。角質層(SC)直下で、上方表皮が広範な構造損傷を示すことにも留意されたい。これは、Trpv4ノックダウンが不完全な場合のtam処置iKOマウスの皮膚にも見られることがあったが、Trpv4ノックダウンがより完全な場合の当該動物には見られなかった(図S2A参照)。バー＝20μm。Der＝真皮；Epi＝表皮。
【図４Ｂ】EMによる超微細構造知見を示す。足皮膚の1μmの半薄切片から選択した領域を透過型電子顕微鏡で調べた。(A〜A’)及び(C〜C’)は、油処置及びtam処置の両iKOマウスについて正常表皮(Epi)構造をUVB刺激の非存在下で示す。(A)及び(C)はインタクトな表皮を示す。表皮損傷の証拠がない正常組織化を表示するA’及びC’に基底(BL)及び有棘(Sp)層が拡大されている。(B、B’B”)、(D〜D’)及び(E〜E’)は、UVB曝露48時間後にサンプリングした場合の、UVBに応答しての皮膚の代表的知見を示す。(B)油処置iKOマウスにおける乱れた表皮。四角で囲った領域に相当する領域が(B’)に拡大されており、表皮の顆粒球浸潤が明らかであり(Gr)、真皮からの表皮の脱離により水疱形成している(二重矢印)。(B”)角質層(SC)と接触している表皮の上部は、広範な空胞化及び空胞内部のフィブリンの沈着を示している(アスタリスク)。(D)trvp4のノックダウンが不完全なタモキシフェン処置iKOマウスは、油処置iKOマウスと類似の皮膚表現型を示し、基底層及び有棘層への組織損傷のロバストな兆候、フィブリン沈着(アスタリスク)及び細胞間空間(D’中の矢頭)がある。(E)trvp4のノックダウンが完全なiKOマウスのインタクトな表皮を示し、(E’)に正常な基底及び有棘層を示す。Der、真皮。点線は真皮-表皮境界を示す。バー＝A、B、C及びDについては20μm；B’及びE’については10μm、他の顕微鏡写真については2μm。
【図４Ｃ】表皮活性化のマーカーとしてのケラチノサイトにおけるIL-6上方制御を示す。IL-6免疫蛍光は、UVB曝露に応答してのTRPV4欠損マウスのケラチノサイトIL-6発現を増やす能力の低下を明らかにする。顕微鏡写真の次にタンパク質についての定量化を示してある。1群当たりn≧3匹のマウスについてのデンシトメトリーであり、油処置iKOマウスについて有意な上方制御を示し、tam処置ではそれを欠く。右側の棒グラフは、Il-6 mRNA定量化及び時間経過を示す。Il-6 mRNAは、肉球表皮から総RNAの単離後にqPCRにより決定した。Trpv4-/-表皮における非常に穏やかな増加とは対照的に、WTコントロール表皮では、2時間時点で変動があるものの、早期かつロバストな増加に留意されたい。24時間での持続性のロバストな上方制御にも留意されたい。この場合もTrpv4-/-表皮では穏やかに上方制御された。n＝8〜12匹のマウス／群についての定量化である。*は、統計的有意性を表す(p＝0.011、t検定)；スケールバー＝20μm。
【図４Ｄ】UVB曝露皮膚におけるマクロファージの動員を示す。ここで留意すべきは、コントロールマウスにおけるUVB曝露によって誘導される真皮CD68+マクロファージの数が、Trpv4が表皮内で除去されると顕著に減少することである。右図に定量化を示す(n＝3匹のマウス／群；*p＜0.05、t検定)；スケールバー＝20μm。
【図４Ｅ】UVB曝露皮膚へのエラスターゼ発現好中球の動員を示す。代表的免疫蛍光顕微鏡写真及びそれぞれの定量化を示す。コントロールマウスにおけるエラスターゼ発現好中球の存在量の強力な増加、及びtam処置iKOマウスではそうでないことに留意されたい。(n＝4匹のマウス／群、*p＜0.05、t検定)；スケールバー＝40μm。
【図５Ａ】図5A〜5Eは、Trpv4-/-及びコントロールマウスにおけるUVBに応答しての病理組織学を示す。図4A〜4Eに示すサンプルのTrpv4ノックダウンレベルを示す。この棒グラフは、図4に示すUVB曝露皮膚サンプルのWTと比較したTrpv4のノックダウンの相対レベルを示す。曝露48時間後に後足皮膚の隣接サンプルをRNA抽出し、Trpv4 qRT-PCRに供し；10匹のマウスからプールしたWT mRNA値を100%として設定した。
【図５Ｂ】Trpv4-/-マウス及びWTコントロールマウスからの1μmの半薄切片の知見の光学顕微鏡写真解析を示す。非刺激状態で両遺伝子型について正常な皮膚を上列に示し、UVBに皮膚を曝露したとき、48時間でサンプリングしたWTコントロールには表皮及び真皮の炎症が存在するのに対してTrpv4-/-には存在しないことを示す。図4に示すように、油処置iKOマウスの炎症変化に類似の炎症変化に留意されたい。
【図５Ｃ】Trpv4-/-マウス及びWTコントロールマウスの超微細構造解析を示す。(A〜A’)及び(B〜B’)のWT及びTrpv4-/-マウスは、UVB刺激の非存在下でインタクトな表皮(Epi)を有する正常な皮膚形態を示す。A’及びB’は、高倍率の基底層(BL)細胞を示す。(C〜C’)は、空胞化(C中の挿入図)及び顆粒球(好中球)(顆粒球−Gr)浸潤(C’)を有する損傷した表皮を示す。(D〜D’)は、UVBに曝露したTrpv4-/-マウスにおける正常な表皮及び真皮の超微細構造を示す。Der−真皮；NT、神経終末。点線は真皮-表皮境界を表す。バー＝A、B、C、C’及びDでは10μm、他の顕微鏡写真では2μm。
【図５Ｄ】UVBに応答しての表皮ケラチノサイトにおけるIL-6上方制御はTrpv4に依存すること；Trpv4-/-及びWTコントロールマウスからの知見を示す。UVBに曝露しない場合と曝露した場合のTrpv4-/-及びWTコントロールの皮膚の蛍光顕微鏡写真を示す。UVBに曝露したWTにおける強いIL-6シグナル、及び非曝露及びUVB曝露の両状態におけるTrpv4-/-での低いシグナルに留意されたい。真皮内のIL-6発現神経支配末梢神経終末にも留意されたい。
【図５Ｅ】iKOマウスのUVB光線皮膚炎において肥満細胞の存在量に差がないことを示す。左側の顕微鏡写真は、タモキシフェンで誘導されたiKOマウスにおける、トルイジンブルーで染色された表皮下炎症組織内の肥満細胞を示し、右側の顕微鏡写真は、油処置iKOマウスにおけるその対応物を示す。白矢頭が肥満細胞を指している。バー＝20μm。右側の棒グラフは、63×視野当たりの肥満細胞数の定量化を示す(1マウス当たり5視野、1群当たり3匹のマウス)。
【図６Ａ】図6A〜6Hは、UVBに応答してのケラチノサイトへのCa++流入がTRPV4に依存することを示す。カスタムビルドUVB細胞照明装置を示す。図2をも参照されたい。
【図６Ｂ】1°MKにおけるフルオ-4 Ca++イメージングを示す。曝露の前(上図)及び曝露の後(下図)の、Ca++感受性染料フルオ-4を負荷した後の1°MKsの蛍光顕微鏡写真。バー＝10μm。
【図６Ｃ】図6C-6Hは、UVB誘発Ca++シグナル伝達プロファイルを示す。UVB曝露後に1°MKsにおいてフルオ-4イメージングを用いてCa++トランジェントを検出した。y軸は、予備刺激シグナルF0について正規化した蛍光増加ΔFを示す(ΔF／F0)。示したシグナルは、≧50個の細胞から平均したものである。）Ca++シグナル伝達はUVBに依存し、石英カバースリップを、UVB透過を阻止するガラス製カバースリップと置き換えると著しく減少することを示す(図2A参照)。ここで留意すべきは、WT 1°MKsにおけるこの特定のCa++シグナルは、時々観察されるように、UVB後に持続したことである。
【図６Ｄ】UVB誘発Ca++シグナル伝達は外部[Ca++]に依存性であることを示す。
【図６Ｅ】UVB誘発Ca++シグナル伝達はTrpv4-/- 1°MKsでは見られないことを示し、TRPV4イオンチャネルの重要性を明らかにしている。
【図６Ｆ】UVB誘発Ca++シグナル伝達は、TRPV4選択的阻害剤、GSK205(20μM)の存在下で強度に下方制御されることを示す。
【図６Ｇ】UVB誘発Ca++シグナルは、TRPV3選択的阻害剤、IPPによっては阻害されないことを示す。IPPの活性の検証のためには、図2Eを参照されたい。
【図６Ｈ】UVB誘発Ca++シグナルは、特異的PLC阻害剤、U73122で強く減少し得ることを示す。
【図７Ａ】図7A〜7Dは、UVB誘発Ca++シグナル伝達及び侵害防御行動におけるケラチノサイトTRPV4の中心的役割−ET1の効果を示す。1°MKsにおけるUVB誘発Ca++シグナル伝達へのET1の効果を示す。パネル(i)は、UVBに応答しての1°MKにおける平均Ca++トランジェント、ET1ペプチドへの同時曝露によるそれらの増大、及びTRPV4を阻害するGSK205、又はET1タンパク質分解プロセシングを遮断するET転換酵素阻害剤CGS35066によるそれらの顕著な減弱を示す。パネル(ii)は、(i)と同様に、ET増大、UVB誘発Ca++トランジェントを示すが、この場合、それらは、ET(R)-A(BQ123)及びET(R)-B(BQ788)の選択的拮抗作用によって減弱される。パネル(iii)は、ET(R)の両亜型が遮断されるときのET1増大Ca++トランジェントの完全な排除を説明する。
【図７Ｂ】1°MKsにおける4α-PDD誘発Ca++シグナル伝達−ET1関連知見を示す。左側のパネルは、選択的TRPV4アクチベーター4α-PDDに応答してのCa++トランジェント(フラ-2比率計測イメージングにより)を示す。ET1の同時適用によって応答の顕著な増加を観察することができ、これは部分的にET(R)-Aに依存性であり、ET(R)-Bに完全に依存性である。
【図７Ｃ】UVBに応答してのマウス足におけるET1の上方制御を示す。免疫組織化学は、tam処置iKOマウスよりはむしろ油ビヒクル処置(TRPV4+)マウスのUVB曝露皮膚の著しく強力なET1シグナルを明らかにする。n＝3匹のマウス／群について定量化を示す。***は、統計的に有意なことを意味する(p＜0.001、t検定)。
【図７Ｄ】ET1足蹠注射に応答しての侵害防御行動は、表皮TRPV4に依存することを示す。棒グラフは、Trpv4-/-対WT及び油処置対tam処置iKOマウスについての行動知見を要約する。WT及び油処置iKOマウスでは、ET1の足蹠注射が有意なレベルの機械的アロディニアにつながることに留意されたい。Trpv4-/-及びtam処置iKOマウスは応答できない；n≧7匹のマウス／群、**p＜0.01、ANOVA。
【図８Ａ】図8A〜8Dは、UVB誘発Ca++シグナル伝達及び侵害防御行動におけるKC TRPV4の中心的役割−ET1関連補足知見を示す。ET1によるGSK101誘発Ca++シグナル伝達の増大を示す。5nMのGSK101に応答しての平均Ca++測定値(フラ-2)を示す。ET1への同時曝露に応答してのシグナルの増加に留意されたい。
【図８Ｂ】非刺激1°MKによるET1分泌がTRPV4及びPLCに依存することを示す。非刺激1°MKの上清中の相対的ET1濃度(ELISAにより決定、pg/mL；ビヒクル処置かつWTコントロールを100に正規化)を示す。Trpv4-/- 1°MKの50%によって示されるように、TRPV4への明白な依存性に留意されたい。さらに、TRPV4の特異的阻害による顕著な下方制御があり、これは用量依存性(2用量のGSK205)であり、2つの異なる化合物(GSK205、RN1734)によって媒介され得る。PLCの特異的阻害剤(U73122)、及びET転換酵素阻害剤、CGS35066によるET1分泌の下方制御もあり、これらはコントロール化合物として役立った。さらに、PLC阻害剤は、WT及びTrpv4-/- 1°MKにおけるET1分泌にロバストに影響を与える。
【図８Ｃ】UVB曝露1°MKによるET1発現がTRPV4及びPLC−免疫細胞化学に依存することを示す。Ca++イメージングに関して、UVB-LEDを用いてUVBに曝露された1°MKにおける特異的ET1免疫標識を示す。UVB-LED装置の使用はET1 ELISAの適用を排除し、照射された細胞だけを調べることができた。TRPV4の特異的阻害(2つの異なる化合物、GSK205、RN1734)、PLC阻害(U73122)、またET転換酵素(CGS35066)によるET1免疫反応性の顕著な下方制御に留意されたい。
【図８Ｄ】UVB曝露1°MKによるET1発現がTRPV4及びPLCに依存すること−免疫細胞化学の定量化を示す。バックグラウンドを減算した、条件毎にn≧25個の細胞の濃度測定値を示し、UVBに応答してのET1の顕著な上方制御(*p＜0.05 ANOVA)、並びに選択的TRPV4拮抗剤(GSK205、RN1734)、PLC阻害剤U73122及びET転換酵素阻害剤CGS35066による処置についてのコントロール処置かつUVB曝露細胞に対する顕著な下方制御を示唆している；・p＜0.05、t検定；#p＜0.05 ANOVA。
【図９Ａ】図9A〜9Hは、ケラチノサイトにおけるUVB誘発インフラマソーム活性化がTRPV4に依存することを示す。UVBに応答しての足蹠皮膚におけるカスパーゼ1免疫標識を示す。代表的イメージは刺激前(コントロール)又はUVB曝露後48時間の皮膚の切片からものである。バー＝20μm。
【図９Ｂ】カスパーゼ1免疫標識の定量化を示す。棒グラフは、デンシトメトリー、n≧3匹の動物／群を示す。比較：UVB曝露WT対Trpv4-/-及びiKO+油対iKO+tam。**p＜0.01 ANOVA。
【図９Ｃ】1°MK±UVB曝露からのカスパーゼ1についてのウエスタンブロッティングを示す。カスパーゼ1レベル、特に切断型カスパーゼ1(下のバンド)は、UVB曝露WT細胞で上昇するが、Trpv4-/-マウス由来の1°MKではプロカスパーゼ1と切断型カスパーゼ1が両方とも完全に存在しないことに留意されたい。
【図９Ｄ】IL-1βはUVB曝露によって誘導され、TRPV4に依存性であることを示す。その他の点ではパネルAと同様の抗-IL-1β免疫蛍光。
【図９Ｅ】IL-1β免疫標識の定量化を示す。n≧3匹の動物／群。比較：UVB曝露WT対Trpv4-/-及びiKO+油対iKO+tam、**p＜0.01 ANOVA。
【図９Ｆ】UVB曝露足蹠の間質液内のIL-1β濃度を示す。灌流間質液内のIL-1βレベル(ELISA)を示す。Trpv4-/-及びtam処置iKOマウスにおける顕著な減弱と対照的に、UVB後のWT及び油処置iKOマウスにおける強い上方制御に留意されたい。n≧5匹のマウス／群、**p＜0.01 ANOVA。
【図９Ｇ】CXCL5はUVB曝露によって誘導され、TRPV4に依存性であることを示す。その他の点ではパネルAと同様の抗CXCL5免疫標識。
【図９Ｈ】CXCL5免疫標識の定量化を示す。n≧3匹の動物／群。比較：UVB曝露WT対Trpv4-/-及びiKO+油対iKO+tam、**p＜0.01 ANOVA。
【図１０Ａ】図10A〜10Bは、光線皮膚炎では健康なヒト皮膚に比べて表皮TRPV4、ET1及びIL-1βが増加することを示す。急性光線皮膚炎の表皮内におけるTRPV4、ET1及びIL-1βの分布の代表的な顕微鏡写真を健康なヒト皮膚と比較して示す。各抗原についての免疫染色は、健康皮膚に対して急性光線皮膚炎で増加する。スケールバー＝50μm(左)、100μm(中央)、50μm(右)。
【図１０Ｂ】免疫反応性TRPV4、ET1及びIL-1βについての形態計測解析を示す。知見は、健康なヒト皮膚に比べて急性光線皮膚炎では3つ全てのタンパク質について顕著に増加する免疫標識を明らかにする(n＝正常な健康皮膚について3名の被験者、急性UV光線皮膚炎について3名の患者)。
【図１１】ヒト慢性光線皮膚炎の例を示す。上パネルは、比較のため、図10Aに表示した正常な健康ヒト皮膚を示す。下パネルは、有棘層及び基底層内のTRPV4、ET1(至る所)及びIL-1β(至る所)の発現が増加した慢性光線皮膚炎の例を示す。急性光線皮膚炎に比べて、減少した間質性表皮内浮腫に留意されたい。バー＝50μm。
【図１２Ａ】図12A〜12Dは、選択的TRPV4阻害剤の外部局所適用がUVB誘発侵害防御行動及び炎症を減弱することを示す。UVB誘導侵害防御行動を示す。疼痛行動は、GSK205の局所適用によって減弱される。左図は、侵害性熱的キューに応答してのUVB曝露後の引っ込め閾値(ハーグリーブス試験)、及び2つの用量の局所適用GSK205(1mM及び5mM；60’及び10’前曝露)によるそれらの調節を示す。より高い用量は、UVB後48時間で熱的アロディニアの顕著な減弱をもたらした；n＝6匹のマウス／群；**p＜0.01 ANOVA。右図は、Trpv4-/-マウスにおける中程度の熱的アロディニアの発症、及びビヒクル処置対5mM GSK205処置マウスについて類似の感作を示し、5mMの化合物ではオフターゲット効果がないことを示唆している；n＝5匹のマウス／群。
【図１２Ｂ】GSK205処置がUVB曝露足蹠におけるIL-1βのケラチノサイト発現を減弱すること−代表的顕微鏡写真を示す。バー＝20μm。
【図１２Ｃ】GSK205処置がUVB曝露足蹠定量化においてIL-1βのケラチノサイト発現を減弱することを示す。棒グラフは、n＝3匹のマウス／群からの濃度測定結果を示す。 **p＜0.01 ANOVA。
【図１２Ｄ】GSK205処置がUVB曝露1°MKによるIL-1βの分泌を減弱することを示す。UVBに応答しての上清中のIL-1β濃度(ELISA)を示す。細胞を+/-5μMのSK205と培養した。GSK205で処置するとUVBに応答してのIL-1β分泌増加を阻止することに留意されたい。**P＜0.01 ANOVA。
【図１３Ａ】図13A〜13Bは、マウスケラチノサイトにおいて選択的TRPV4阻害剤の局所適用が、発痛促進性(pro-algesic)／発痛性媒介物質の上方制御を抑制することによってUVB誘発侵害防御行動を減弱すること−CXCL5及びIL6に関する知見を示す。GSK205処置がUVB曝露足蹠におけるCXCL5のケラチノサイト発現を減弱すること−顕微鏡写真及び定量化を示す。図12Bと同様に、UVBに応答して足蹠ケラチノサイトにおいて選択的に下方制御されるCXCL5に関する特異的免疫標識を示す。 GSK205処置による減弱に留意されたい。棒グラフは、CXCL5免疫標識の濃度測定を示し、n＝3匹の動物／群、動物1匹当たり≧3の切片を分析した。ビヒクル処置マウスについてUVB曝露と非曝露との間の有意な差異、5mMのGSK205で局所処置したマウスでは該差異がないことに留意されたい。ビヒクル処置とGSK205処置との間の比較UVB曝露、**p＜0.01 ANOVA。バー＝20μm。
【図１３Ｂ】GSK205処置がUVB曝露足蹠におけるIL-6のケラチノサイト発現を減弱すること−顕微鏡写真及び定量化を示す。図12B及び図13Aと同様に、IL-6に特異的な免疫標識は、CXCL5及びIL-1βに関してIL-6の類似の制御を実証する。ビヒクル処置とGSK205処置との間の比較UVB曝露、**p＜0.01 ANOVA。バー＝20μm。
【図１４Ａ】図14A〜14Dは、選択的TRPV4阻害剤の外部局所適用がUVB誘発侵害防御行動及び炎症を減弱することを示す。GSK205で処置したマウスにおいてUVB光線皮膚炎が減弱されることを示す。肉球皮膚の代表的H&E顕微鏡写真を示し、バー＝20μm。UVB曝露皮膚のGSK205による処置は、24時間後のビヒクル処置に比べてマウスの皮膚構造を改善した。(i)及び(iii)GSK205処置後のUVB誘発光線皮膚炎の代表的皮膚切片は、顕著に低下した炎症性浸潤を示し、海綿状変化が少なく、表皮の肥厚部を残す真皮-表皮水疱が少ない。(ii)及び(iv)UVB誘発光線皮膚炎後のビヒクル処置マウスは、重篤な急性光線皮膚炎、例えば海綿状変化、表皮角化症、真皮-表皮境界破壊(水疱)、及び血管拡張及び真皮浮腫を伴う顕著な炎症性浸潤等の兆候(矢印)を特徴とした。皮膚炎を示唆する血管内の赤血球蓄積にも留意されたい。
【図１４Ｂ】TRPV4特異的阻害剤による局所処置が発痛性ET1/Edn1の上方制御を減弱することを示す。肉球表皮からの全RNAの抽出後にqPCRによりEdn1 mRNAを判定した。ビヒクル処置皮膚では、2時間の時点での早期の上方制御によるEdn1発現の増加、及び24時間の時点まで持続的に増加することに留意されたい。この時間経過は、Trpv4-/-と比較すると(図15)、WTコントロールマウスで見られる時間経過と似ている。重要なことに、5mMのGSK205による局所処置は、この制御の完全な欠如をもたらす；n＝4匹のマウス／群、*p＜0.05 ANOVA。
【図１４Ｃ】GSK205は日焼け止めとして機能しないことを示す。模式図は実験装置を説明する。
【図１４Ｄ】GSK205は日焼け止めとして機能しないことを示す。棒グラフは、n＝7〜8匹のマウス／群からの結果を示す。日焼け止めSPF100で顕著に低下にもかかわらず、(B)に関して局所適用した5mMのGSK205では、ビヒクルコントロールに対して、UVB透過に変化がないことに留意されたい。
【図１５】UVBに応答してのマウス足におけるET1/End1の上方制御を示す。肉球表皮からの全RNAの単離後にqPCRによりEdn1 mRNAを決定した。WTコントロール表皮における2時間時点での早期増加、及びTrpv4-/-におけるその完全な欠如、並びに2時間時点に対してわずかに低減した24時間での持続性上方制御、この場合もやはりTrpv4-/-では上方制御が完全にないことに留意されたい。定量化はn＝4匹のマウス／群についてのものである。**は、統計的に有意なことを意味する(p＜0.01、t検定)。
【図１６Ａ】図16A〜16Bは、皮膚UVB透過性試験を示す。UVBへの皮膚透過性の試験用実験装置を示す。
【図１６Ｂ】図16Aからの結果を示す。UVビームの中心まで500μmの半径内で強度が70%であることに留意されたい。
【図１７】インビボでのマウスの痒み伝達におけるTRPV4の役割を示す。C57b/6コントロール(WT)又はTRPV4ノックアウトマウスの頬にヒスタミン(10%)を皮下注射した(Trpv4完全ノックアウト(pan-nockou)；n＝6／群)。30分にわたって、TRPV4ヌルマウスは、WTマウスに比べて痒み行動の顕著な減少を示した((p＜0.01) t検定))。
【図１８】痒みにおけるTRPV4の役割を示す。TRPV4ノックアウトの誘導後にケラチノサイトにTRPV4が欠失したマウスにおける起痒物質の投与後の引っ掻く行動のグラフをノックアウトを誘導しなかったマウスと比較して示す。ノックアウトを誘導しないと、マウスは野生型コントロールマウスとして機能する(Moore et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013, 110, E3225-E3234)。コントロールマウスに比べて、皮膚ケラチノサイト内でTRPV4チャネルを選択的に除去されたマウスでは引っ掻く行動が顕著に低減した。
【図１９】化合物16-19を示す。化合物16-8及び16-18のハイブリッドとして化合物16-8/18hを設計した。本明細書では化合物16-19を16-8/18hyと呼ぶこともある。
【図２０】TRPV4によるカルシウムイオン流束の阻害を示す。本発明の化合物は、TRPV4に対する阻害活性を示し、GSK205より強い拮抗剤であった。
【図２１Ａ】疼痛処置を示す。本明細書に開示の化合物はマウスの侵害防御行動を減弱した。
【図２１Ｂ】疼痛処置を示す。本明細書に開示の化合物はマウスの侵害防御行動を減弱した。
【図２１Ｃ】疼痛処置を示す。本明細書に開示の化合物はマウスの侵害防御行動を減弱した。
【図２１Ｄ】疼痛処置を示す。本明細書に開示の化合物はマウスの侵害防御行動を減弱した。
【図２２】UVB曝露後の疼痛処置を示す。本明細書に開示の化合物は、日焼けに関するマウスモデルの侵害防御行動を減弱した。
【図２３】TRPA1への効果を示す。本明細書に開示の化合物は、カルシウムのトランジェンスを測定することによって示されるように、TRPA1を阻害した。
【図２４Ａ】TRPV1への効果を示す。本明細書に開示の化合物は、カルシウムのトランジェンスを測定することによって示されるように、TRPV1を阻害しなかった。
【図２４Ｂ】TRPV2への効果を示す。本明細書に開示の化合物は、カルシウムのトランジェンスを測定することによって示されるように、TRPV2を阻害しなかった。
【図２４Ｃ】TRPV3への効果を示す。本明細書に開示の化合物は、カルシウムのトランジェンスを測定することによって示されるように、TRPV3を阻害しなかった。
【図２５】TRPV4の標的化改善のためのツール化合物GSK205の修飾を示す。合成化合物は分子の強調部分が異なり、変化した残基を矢印で示した。抗TRPV4スクリーニングアッセイで最も強力なことが分かった(図26参照)2つの化合物16-8及び16-18からの2つの修飾を組み入れるために16-19化合物を合成した。
【図２６Ａ】図26A〜26Bは、TRPV4発現が管理されたN2a細胞における化合物の評価を示す。TRPV4の発現が管理されたN2A細胞における全ての化合物のCa++イメージングスクリーニングを示す(ラット)。5μMのそれぞれ阻害剤の存在下、TRPV4選択的アクチベーター化合物GSK101(5nM)で細胞を刺激した。各棒の数値は、約100個の細胞中の平均ピークΔCa++濃度に相当する。挿入図：5nMのGSK101による活性化の前後の偽着色細胞の顕微鏡写真、さらに平均Ca++シグナルの対応する時間経過を示す(フラ-2 Ca++イメージング)。化合物16-43C以外は、ビヒクルコントロールに対する差が統計的有意性p＜0.01のレベルに達する(一元配置分散分析(one-way ANOVA))。
【図２６Ｂ】TRPV4発現N2a細胞における最強の「ウィナー(winner)」化合物の用量依存性を示す。IC50は、0.45±0.05μM(16-8)、0.59±0.12μM(16-18)、0.81±0.1μM (16-19)、4.19±0.71μM(GSK205)であった。データ点毎に≧75個の細胞の平均ピークΔCa++濃度から作成したプロット。
【図２７Ａ】図27A〜27Bは、化合物16-8及び16-19によるTRPV4チャネル阻害−パッチクランプe-physを示す。5nMのGSK101による活性化後のTRPV4媒介電流の電流-電圧関係を示す。TRPV4-GFP+N2a細胞でにおいて記録を行なった。代表的トレースは約12掃引の平均を表す。全ての実験で、細胞をそれぞれの化合物(5μM)と5分間プレインキュベートした。
【図２７Ｂ】-100mV/+100mVで平均電流密度が阻害剤により顕著に低減したことを示す(*P＜0.05；一元配置分散分析；n≧5個の細胞／群)。
【図２８Ａ】図28A〜28Bは、化合物16-8がI°細胞内でGSK205より強力にTRPV4を阻害することを示す。1°(初代)関節軟骨細胞(ブタ)；5nMの GSK101による刺激に応答しての最強化合物16-8とGSK205との間の用量依存性比較を示す。挿入図：GSK101による活性化に応答する軟骨細胞、フラ-2 Ca++イメージング；左側イメージは、GSK101適用後5秒で撮った。16-8は、GSK205より著しく強力だった(平均±SEM、n＝6依存性実験、n≧25個の細胞／実験；*p＜0.05、t検定)。縦軸は平均ピークΔCa++濃度を示す。
【図２８Ｂ】1°(初代)星状細胞(ラット)；5nMのGSK101に応答しての16-8とGSK205との間の用量依存性比較を示す。挿入図：GSK101による活性化に応答する星状細胞；右側イメージは、GSK101適用後5秒で撮った(平均±SEM、n＝5依存性実験、n≧200個の細胞／実験；*p＜0.05、t検定)。縦軸は平均ピークΔCa++濃度を示す。
【図２９Ａ】図29A〜29Bは、化合物16-8及び化合物16-19も強力にTRPA1を阻害し、TRPV1〜3を阻害しないことを示す。TRPV1〜3に対する特異性を示す。16-8及び16-19(それぞれ5μM)の両化合物は、N2a細胞及びその後のCa++イメージングにおいて過剰発現が管理されたTRPV1、TRPV2又はTRPV3チャネル(全てのマウスのイソ型)を阻害しなかった。平均±SEMを示し、条件毎に≧100個の細胞。
【図２９Ｂ】100μMのカラシ油によるGSK205、16-8及び16-19活性化によるTRPA1の用量依存性阻害を示し(マウス、N2a細胞における管理された発現)、5.56±0.4μM(GSK205)、0.41±0.37μM(16-19)、0.43±0.3μM(16-8)のIC50をもたらす。データ点毎に≧75個の細胞の平均ピークΔCa++濃度から作成したプロット。
【図３０Ａ】図30A〜30Bは化合物16-8及び16-19の細胞毒性研究を示す。N2a細胞を化合物16-8及び16-19の濃度上昇にさらし、結果としての細胞生存能を次の48時間分析した。種々の濃度の16-8の存在下での細胞生存能の時間経過を示す。40及び80μMでの明白な低下に留意されたい。
【図３０Ｂ】図30Aと同様に、化合物16-19についての同様の結果を示す。2つの依存性実験の代表的結果。
【図３１Ａ】図31A〜31Dは、16-8及び16-19がホルマリン誘発三叉神経刺激性疼痛を効率的に減弱することを示す。4%ホルマリンのウィスカーパッド注射後のWTマウスにおける侵害防御行動の時間経過を示す。マウスにGSK205、16-8又は16-19を前注射した(i.p.、10mg/kg；ホルマリンの15分前)。後の「神経性」期に化合物16-8、16-19によって侵害防御行動の効率的減少があるが、GSK205によってはないことに留意されたい。
【図３１Ｂ】3期：急性期(0〜5分)、中間期(5〜15分)、及び後の「神経性」期(15〜45分)に分けた累積的応答を示す。16-8、16-19では後期に侵害防御行動が顕著に低減するが、GSK205ではそうでないことに留意されたい(*P＜0.01対ビヒクル及びGSK205、一元配置分散分析)。
【図３１Ｃ】図31Aと同様であるが、Trpv4-/-マウスをも含めて示す。確立されたTRPA1ブロッカーA967079(25mg/kg)を除き、ホルマリン誘発の15分前に、10mg/kgで化合物をi.p.適用した。Trpv4-/-マウスで早期及び後期に、以前に確立された侵害防御行動の減弱が再現され、これはTRPA1ブロッカーA967079でさらに低減した。
【図３１Ｄ】図31Bと同様に、Trpv4-/-マウスを含めて示す。TRPA1ブロッカーA967079のロバストな効果は、早期では16-8及び16-19によって、後期では16-8によって、後期では部分的に16-19によって等しい有効性で模倣された。図31A、図31Cは、時点毎に平均行動測定基準を示し、図31B、図31Dの棒は、平均±SEMを表し；(D)では*P＜0.05；#P＜0.005、一元配置分散分析；全てパネルについてn＝5〜8匹のマウス／群。
【図３２Ａ】図32A〜32Fは、化合物16-8が急性膵炎を減弱し、疼痛行動を改善することを示す。セルレイン誘発膵炎が膵臓浮腫を引き起こし、これは化合物16-8(10mg/kg、セルレインへの最初の曝露前30分に適用)で排除されることを示す。
【図３２Ｂ】セルレイン誘発急性膵炎が血清中の細胞毒性マーカーアミラーゼを強く上昇させ、16-8処置動物において、顕著ではないが、アミラーゼが減少することを示す。
【図３２Ｃ】セルレイン誘発急性膵炎が、膵臓への炎症細胞浸潤のマーカーである血清中ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性上昇を引き起こし、16-8処置マウスにおいてMPO活性が顕著に低減することを示す。
【図３２Ｄ】セルレイン誘発急性膵炎は組織学的に容易に立証できることを実例を挙げて示す顕微鏡写真パネルである。ビヒクルコントロール誘発マウスの非炎症膵臓に対する中央パネルの膵臓炎症増加、及び化合物16-8での措置によるその減弱に留意されたい。
【図３２Ｅ】図32Dに示す炎症の組織学的パラメーターの定量化を示す棒グラフである。セルレイン急性膵炎マウスの炎症指数の顕著な増加、及び化合物16-8での処置によるその顕著な低減に留意されたい。
【図３２Ｆ】セルレイン誘発急性膵炎が疼痛行動を引き起こし、化合物16-8により顕著に低減されることを示す。セルレイン誘発急性膵炎における6時間の試験期間中の活動の大きな低下に留意されたい。この侵害防御行動は、化合物16-8の全身適用に応答して大いに改善される。結果を平均±SEMとして表す；n＝6匹のマウス／群；*P＜0.05(一元配置分散分析)。
【図３３Ａ】図33A〜33Eは、化合物16-8、16-19及びGSK205のインビボでの薬物動態／薬物毒(pharmaco-tox)を示す。i.p.注射後1時間の幾つかのマウス組織／器官内の化合物16-8、16-19及びGSK205の濃度(10mg/kg)を示す。
【図３３Ｂ】幾つかの器官内における6時間及び24時間での化合物16-19の時間経過を示す。1時間の時点での16-19の高レベルのため、かつ16-19が16-8及びGSK205より親油性であるという推定に基づいて16-19を選択した。6時間での計量は24時での計量より常に高いことに留意されたい。全ての値は、1時間での値より認識できるほど高い。
【図３３Ｃ】1時間後の脂肪及び膵臓内の16-8、16-19及びGSK205の濃度を示す。そのIC50より高いけれども、16-19及びGSK205に対して低い16-8の濃度に留意されたい。
【図３３Ｄ】1時間及び2時間の時点での膵臓内の16-8の濃度を示す。
【図３３Ｅ】4時間／37℃後の安定濃度によって示唆される血漿中の化合物16-19の構造安定性を示す。結果を平均±SEMとして表してあり、全ての実験でn＝6匹のマウス／実験群である。
【図３４Ａ】図34A〜34Cは、化合物16-8、16-19の心臓、腎臓及び肝臓毒性の非存在を示す。化合物のi.p.注射(10mg/kg)後の心拍数の時間経過を示す。ビヒクルと化合物との間に心拍数の有意な差はなかった。
【図３４Ｂ】ビヒクルコントロールに対して16-19及び16-8で処置した動物において血清クレアチニンが有意には上昇しなかったことを示す。
【図３４Ｃ】ビヒクルコントロールに対して16-19及び16-8で処置した動物において血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)レベルが有意には上昇しなかったことを示す。全ての実験についてn＝6匹のマウス／群。
【図３５】化合物16-08〜16-19の一般的合成スキームを示す。試薬及び条件：(i)K2CO3、CH3CN。(ii)Zn、MeOH、12M HCl。(iii)1,1′-チオカルボニルジイミダゾール。(iv)MeOH中7MのNH3。(v)EtOH、還流。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本開示は、対象の皮膚及び創傷を衛生化し、いずれもの汚染性かつ有害な可能性のある細菌又は他の微生物を除去するために対象の皮膚及び創傷を処置することに関する。本開示は、ヨウ素又は局所麻酔剤によって引き起こされ得る疼痛、炎症、及び／又は刺激を軽減することにも関する。本明細書では、対象を衛生化し、対象に麻酔をかけ、並びに皮膚科学的障害を治療及び／又は予防するための組成物及び方法を記載する。皮膚は、外部環境と脊椎動物生命体との間の必須バリアとして機能する。皮膚内のケラチノサイトはUV光線を吸収し、過剰曝露後には皮膚の炎症、疼痛、及び痒みにつながり、これは引き続き皮膚色素沈着をもたらす。発明者らは、皮膚、特にその表皮性上皮が実質的に感覚伝達に関与することを明らかにした。本明細書では日焼けのマウスモデルについて述べ、光のUVスペクトルに応答して限定された自己回復(self-resolving)炎症によって誘発される感覚閾値低下状態を引き起こすためにこれを使用する。感覚閾値のUV誘発低下は、このモデルの有用な特徴である病理学的疼痛の主特質を共有する。
【００１８】
1.定義
特に定義のない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に解釈するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含め、本文書が支配する。好ましい方法及び材料について後述するが、本明細書に記載する方法及び材料に類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及する全ての公表文献、特許出願、特許及び他の文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で開示する材料、方法、及び実施例は、単に例示であり、限定する意図ではない。
本明細書で使用する用語「comprise(s)」、「include(s)」「having」、「has」、「can」、「contain(s)」、及びその変形は、追加の作用又は構造の可能性を排除しない無制限の移行句、用語、又は単語であるよう意図される。単数形「a」、「an」及び「the」には、明白にそうでないと示さない限り、複数の言及が含まれる。本開示は、本明細書に提示する実施形態又は要素を「含み」、それら「から成り」及びそれら「から本質的に成る」他の実施形態をも明示的記載の有無にかかわらず企図する。
本明細書の数値範囲の記述については、それらの間の各介在数値が同程度の精度で明示的に企図される。例えば、6〜9の範囲では、6及び9に加えて数値7及び8が企図され、範囲6.0〜7.0では、数値6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、及び7.0が明示的に企図される。
【００１９】
特定の官能基及び化学用語の定義をさらに詳細に本明細書に記載する。元素周期表、CASバージョン、Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.、表紙裏に従って化学元素を特定し、本明細書に記載どおりに特定官能基を一般的に定義する。さらに、有機化学、並びに特定の官能部分及び反応性の一般的原理は、Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987に記載されており；それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２０】
用語「アシル」又は「カルボニル」は、基-C(O)Rを指し、Rは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル及びヘテロシクリルアルキルから成る群より選択され、いずれも、例えば、1つ以上の置換基で置換されていてもよい。例えば、Rがアルキルのとき、該基をアルキルカルボニル基と呼ぶことがある。用語「アシル」又は「カルボニル」には、例えば、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アリールカルボニル、又はヘテロアリールカルボニル置換基が含まれ、いずれもさらに(例えば、1つ以上の置換基で)置換されていてもよい。
用語「アルキル」は、指示数の炭素原子を含有する直線又は分岐炭化水素鎖を指す。例えば、C1-C12アルキルは、アルキル基が1〜12(1と12を含む)個の炭素原子を有し得ることを意味し、C1-C4アルキルは、アルキル基が1〜4(1と4を含む)個の炭素原子を有し得ることを意味する。アルキル基は、置換されていてもよい。C1-C4アルキルの例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル及びtert-ブチルが挙げられる。
用語「アルキレン」は、1〜6個の炭素原子を有する二価炭化水素基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、及びブチレンを指す。アルキレン基には、C1-C2アルキレン、又はC1-C3アルキレン、又はC1-C4アルキレンが含まれる。
【００２１】
用語「アルケニル」は、1つ以上の二重結合を有する直線又は分岐炭化水素鎖を指す。アルケニル基の例としては、限定するものではないが、アリル、プロペニル、2-ブテニル、3-ヘキセニル及び3-オクテニル基が挙げられる。二重結合炭素の1つは、アルケニル置換基の付着点であってよい。アルケニル基は、置換されていてもよい。
用語「アルキニル」は、1つ以上の三重結合を有する直線又は分岐炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、限定するものではないが、エチニル、プロパルギル、及び3-ヘキシニルが挙げられる。三重結合炭素の1つは、アルキニル置換基の付着点であってよい。アルキニル基は、置換されていてもよい。
用語「アリール」又は「芳香族」は、芳香族単環式、二環式、又は三環式炭化水素環系を指し、置換可能ないずれの環原子も(例えば、1つ以上の置換基で)置換されていてもよい。アリール部分の例としては、限定するものではないが、フェニル、ナフチル、及びアントラセニルがある。芳香族アミンは、1つ以上のアミノ基で置換されているアリール基である。芳香族アルコールは、1つ以上のヒドロキシル基で置換されているアリール基である。芳香族アミンも芳香族アルコールもさらに他の置換基で置換されていてもよい。
用語「アリールアルキル」は、アルキル水素原子がアリール基と置き換わっているアルキル部分を指す。アリールアルキルには、複数の水素原子がアリール基と置き換わっている基も含まれる。アリールアルキル基の例としては、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、9-フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基がある。
【００２２】
用語「カルボキシル」は、基-C(=O)ORを指し、Rは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから成る群より選択され、いずれも、例えば、1つ以上の置換基で置換されていてもよい。
用語「カルボニルアミノ」又は「アミド」は、基-C(O)NR'R''を指し、R'及びR''は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから成る群より独立に選択され、或いはR'とR''が、それらが付着している窒素と一緒に環を形成することがある。基R'及びR''は、例えば、1つ以上の置換基で置換されていてもよく、或いはR'とR''が、それらが付着している窒素と一緒に環を形成しているときには、環は、例えば、1つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００２３】
本明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、3〜12個の炭素(例えば、3、4、5、6、又は7個の炭素原子)を有する非芳香族の飽和又は一部不飽和環式、二環式、三環式、又は多環式炭化水素基を指す。いずれの環原子も(例えば、1つ以上の置換基で)置換され得る。シクロアルキル基は、縮合環を含有し得る。縮合環は、1個以上の共通炭素原子を共有する環である。シクロアルキル基の例としては、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、メチルシクロヘキシル、アダマンチル、ノルボルニル、及びノルボルネニルが挙げられる。用語「シクロアルケニル」は、単環式環及び少なくとも1つの内部不飽和点を有する4〜8個の炭素原子の環式アルケニル基を指す。いずれの環原子も(例えば、1つ以上の置換基で)置換され得る。
本明細書で使用する用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素のいずれかの基を指す。
本明細書で使用する用語「ハロアルキル」は、1個以上の水素原子がハロゲンと置き換わっているアルキルを指し、全ての水素がハロゲンと置き換わっていているアルキル部分(例えば、CF3等のペルフルオロアルキル)が含まれる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」は、芳香族5〜8員単環式、8〜12員二環式、又は11〜14員三環式環系を指し、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子を有し、二環式の場合は1〜6個のヘテロ原子を有し、三環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子は、独立にO、N、S、P、及びSiから選択される(例えば、炭素原子並びに、それぞれ単環式、二環式、又は三環式の場合、O、N、S、P、及びSiから独立に選択される1〜3、1〜6、又は1〜9個のヘテロ原子)。アリール環原子は、(例えば、1つ以上の置換基で)置換され得る。ヘテロアリール基は、1個以上の共通原子を共有する環である縮合環を含有し得る。ヘテロアリール基の例としては、限定するものではないが、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、フラン、チアゾール、イソチアゾール、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、インドール、イソインドール、インドリジン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、フタラジン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、ナフチリジン、及びプリンの基が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族の飽和又は一部不飽和3〜10員単環式、8〜12員二環式、又は11〜14員三環式環系を指し、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子を有し、二環式の場合は1〜6個のヘテロ原子を有し、三環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子は、O、N、S、Si、及びPから独立に選択される(例えば、炭素原子並びに、それぞれ単環式、二環式、又は三環式の場合、O、N、S、P、及びSiから独立に選択される1〜3、1〜6、又は1〜9個のヘテロ原子)。いずれの環原子も(例えば、1つ以上の置換基で)置換され得る。ヘテロシクリル基は、1個以上の共通原子を共有する環である縮合環を含有し得る。ヘテロシクリル基には、ヘテロシクロアルケニル基が含まれ得る。ヘテロシクリル基の例としては、限定するものではないが、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリン、ピリミジン、ピロリジン、インドリン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピラン、チアントレン、ピラン、ベンゾピラン、キサンテン、フェノキサチイン、フェノチアジン、フラザン、ラクトン、ラクタム、例えばアゼチジノン及びピロリジノン、スルタム、スルトン等の基が挙げられる。
【００２６】
用語ヘテロアルキルは、1個以上(好ましくは1、2、又は3個)の炭素原子が1つ以上のヘテロ原子と置き換わっているアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を指し、前記ヘテロ原子は、O、N、S、Si、及びPから選択される。ヘテロアルキル基には、例えば、アルキルオキシ基、例えばメトキシ若しくはエトキシ、又はメトキシメチル、ニトリル、メチルカルボキシアルキルエステル又は2,3-ジオキシエチル基が含まれる。用語ヘテロアルキルは、さらにカルボン酸又はカルボン酸から誘導される基、例えばアシル、アシルオキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルエステル、例えばメチルカルボキシアルキルエステル、カルボキシアルキルアミド、アルコキシカルボニル、又はアルコキシカルボニルオキシ等を指す。
用語「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、-OH基を指す。用語「アルコキシ」は、基-O-Rを指し、Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル又はヘテロシクリルであり、いずれも、例えば、1つ以上の置換基で置換されていてもよい。用語「アリールオキシ」は、-O-アリール基を指す。用語「ハロアルコキシ」は、-O-ハロアルキル基を指す。
【００２７】
用語「置換基」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アリールアルキル、又はヘテロアリール基上で、当該基のいずれかの原子にて「置換される」基を指す。適切な置換基には限定でなく、アシル、アシルアミド、アシルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、カルボキシ、シアノ、エステル、ハロ、ヒドロキシ、イミノ、ニトロ、オキソ(例えば、C=O)、ホスホナート、スルフィニル、スルホニル、スルホナート、スルホンアミノ、スルホンアミド、チオアミド、チオール、チオキソ(例えば、C=S)、及びウレイドが含まれる。実施形態では、基上の置換基は、独立に、いずれか1つの単一の上記置換基、又は上記置換基のいずれかの組み合わせである。実施形態では、置換基自体が、上記置換基のいずれか1つで置換されていてもよい。
本明細書では上記置換基を略記することがあり、例えば、略語Me、Et、及びPhは、それぞれメチル、エチル及びフェニルを表す。有機化学者が用いる略語のさらに包括的なリストは、Journal of Organic Chemistryの各巻の初号に現れ；このリストは典型的に表題「Standard List of Abbreviations」で提示される。前記リストに含まれる略語、及び当技術分野の通常スキルの有機化学者が用いる全ての略語は、参照によってここに組み込まれる。
【００２８】
化合物について、その基及び置換基は、原子及び置換基の許容原子価に従って選択され、その結果、その選択及び置換基は安定化合物をもたらし、例えば、それは自発的に転位、環化、脱離等の変換を受けない。
置換基が、それらの通常の左から右へ書かれる化学式で特定される場合、それらは、右から左へ構造を書くことから生じる置換基を包含することがあり、例えば-CH2O-は、-OCH2-を表すこともある。
当技術分野で用いられる慣例によれば、本明細書の構造式に下記基：
【００２９】
【化５】
2019513749.tif 000018
【００３０】
を用いて、該部分又は置換基のコア又は骨格構造への付着点である結合を表す。
興味ある1つ以上の値に適用して本明細書で使用する用語「約」は、規定参照値に類似する値を指す。特定の態様では、用語「約」は、別に規定されるか又はさもなければ文脈から明白でない限り、規定参照値のどちらかの方向の(多かれ少なかれ)20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、又はそれ未満内に入る値の範囲を指す(該数値が可能な値の100%を超えることになる場合を除いて)。
【００３１】
「投与」又は「投与すること」は、所望効果を達成するためにいずれかの適切な経路で化合物又は組成物を送達することを指す。投与は、全身／末梢又は所望作用部位でも、いずれの便利な投与経路をも含むことができ、限定するものではないが、経口(例えば摂取による)；局所(例えば経皮、鼻腔内、眼内、頬側、及び舌下を含めて)；肺；呼吸器(例えば吸入又は吹送法、例えばエアロゾルを用いて、例えば口又は鼻を介して)；直腸；腟内；非経口、例えば、注射、例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、及び胸骨内を含めて；デポーの例えば、皮下又は筋肉内移植が挙げられる。特定実施形態では、投与は局所投与であり得る。「共投与」は、同時又は逐次投与を指す。化合物又は組成物は、別の化合物又は組成物の投与の前、同時、又は後であってよい。当業者は、患者、治療する個々の疾患、障害、又は状態、治療の持続期間、現在の療法等に応じて適切な用量及び投与経路を選択することができる。特定実施形態では、用量は、疾患、障害、又は状態(例えば、皮膚の炎症、疼痛、又は痒み)を考慮して、有効性と副作用の可能性のバランスをとって選択される。
【００３２】
本明細書では、用語「コントロール」、「基準レベル」及び「基準」を互換的に使用する。基準レベルは、測定結果を評価するためにベンチマークとして利用する所定の値又は範囲であり得る。本明細書で使用する「コントロール群」は、コントロール対象又は細胞の群を指す。所定レベルは、コントロール群からのカットオフ値であり得る。所定レベルは、コントロール群からの平均であり得る。カットオフ値(又は所定カットオフ値)は、アダプティブインデックスモデル(AIM)方法論により決定し得る。カットオフ値(又は所定カットオフ値)は、患者群の生体サンプルからの受信者操作曲線(ROC)解析により決定し得る。ROC解析は、生物学分野では一般的に知られているように、ある条件を別の条件から識別するため、例えば、CRCを有する患者の特定における各マーカーの性能を決定するための試験の能力の判定である。ROC解析の記述は、P. J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)に提供されており、その開示は、参照によってその全体がここに組み込まれる。これとは別に、カットオフ値を患者群の生体サンプルの四分位解析によって決定してもよい。例えば、25〜75パーセンタイル範囲内のいずれかの値に相当する値、好ましく25パーセンタイル、50パーセンタイル又は75パーセンタイルに相当する値、さらに好ましくは75パーセンタイルに相当する値を選択することによってカットオフ値を決定することができる。該統計解析は、技術上周知のいずれの方法を用いても達成可能であり、いずれの数の市販ソフトウェアパッケージによっても実施し得る(例えば、Analyse-it Software Ltd., Leeds, UK; StataCorp LP, College Station, TX; SAS Institute Inc., Cary, NC.から)。標的又はタンパク質活性について健康又は正常レベル又は範囲は、標準的習慣に従って定義し得る。コントロールは、疾患状態が分かっている対象、又はそのサンプルであり得る。コントロールには、「コントロール細胞」と呼ばれる細胞が含まれる。対象、又はそのサンプルは健康状態、疾患状態、治療前の疾患状態、治療中の疾患状態、又は治療後の疾患状態、或いはその組み合わせであってよい。
【００３３】
「有効量」は、合理的な利益／危険比で釣り合っている、所望効果を誘発するのに有効な化合物又は組成物の用量を指す。本明細書ではこの用語を用いて、動物、好ましくは、ヒトに所望のインビボ効果、例えば皮膚炎症の減少、疼痛の軽減、又は痒みの軽減をもたらすときの有効量を指すこともある。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」は、一本鎖若しくは二本鎖であってよく、又二本鎖と一本鎖の両配列の部分を含有することがある。ポリヌクレオチドは、核酸、天然若しくは合成DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、又はハイブリッドであってよく、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、並びに例えばウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニン等の塩基の組み合わせを含有し得る。ポリヌクレオチドは、化学合成法又はその組み合わせによって得ることができる。
【００３４】
「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、ペプチド結合で連結された2つ以上のアミノ酸の連鎖配列である。ポリペプチドは、天然、合成、若しくは修飾又は天然と合成の組み合わせであり得る。ペプチド及びポリペプチドには、タンパク質、例えば結合タンパク質、受容体、及び抗体等が含まれる。本明細書では用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」を互換的に使用する。「一次構造」は、特定ペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に秩序化された三次元構造を指す。二次構造は、βシート及びαヘリックスを含み得る。これらの構造は一般的にドメインとして、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、及び細胞質側末端ドメインとして知られる。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成し、典型的に15〜350アミノ酸長である、ポリペプチドの部分である。例示ドメインとしては、酵素活性又はリガンド結合活性を有するドメインがある。典型的ドメインは、βシート及びαへリックスのストレッチ等の低組織化セクションで構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立の三次単位の非共有結合性会合によって形成された三次元構造を指す。「モチーフ」は、ポリペプチド配列の一部であり、少なくとも2つのアミノ酸を含む。モチーフは、2〜20、2〜15、又は2〜10アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、モチーフは3、4、5、6、又は7個の連続的アミノ酸を含む。
【００３５】
本明細書で使用する「対象」は、本明細書に記載の方法及び組成物が欲しい又は必要な哺乳動物を意味し得る。対象は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、霊長類又は非霊長類であり得る。哺乳動物は、ヒト等の霊長類；非霊長類、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、及びモルモット；又は例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザル等の非ヒト霊長類であり得る。対象は、いずれの年齢又は発育段階、例えば成人、青年、又は幼児であってもよい。本明細書で使用する場合、「治療が必要な対象」は、本明細書に記載の組成物及び方法が必要な対象を指す。対象は、衛生化が必要な表面を有し得る。対象は、麻酔状態が必要であり得る。対象は、皮膚の炎症、疼痛、痒み、又はその組み合わせを伴う皮膚科学的疾患又は障害と診断されたことがあり得る。実施形態では、対象にはヒト及び非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば非哺乳動物(例えばニワトリ、両生類、爬虫類)及び哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、家畜化及び／又は農業的に有用な動物(例えばヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ等)、及びげっ歯類(例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット等)が含まれる。従って、本明細書に記載の方法の実施形態は、細胞若しくは組織の処置、対象からの細胞若しくは組織の処置、又は真核生物、動物、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類(例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス)、ネズミ科の動物(例えば、マウス)、イヌ科の動物(例えば、イヌ)、ネコ科の動物(例えば、ネコ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、霊長類、類人猿(例えば、サル又はエイプ)、サル(例えば、マーモセット、ヒヒ)、エイプ(例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)、又はヒトであり得る対象の処置に関する。
【００３６】
「医薬的に許容される」は、ヒト又は他の哺乳動物に用いるのに適していることを意味する。用語「医薬的に許容される担体」及び「医薬的に許容される賦形剤」は、互換的に使用され、医薬的に許容される組成物の調製に役立つ物質を指す。特定実施形態では、医薬的に許容される担体は、通常、組成物の他の成分に適合性であり、賦形剤に有害でなく、及び／又は生物学的にも他の意味でも望ましくなくない。「医薬的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という表現は、動物に投与されたときに有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体」には、いずれの全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、殺細菌剤、殺真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等も含まれる。一部の実施形態では、担体は中性pHの溶液を含む。一部の実施形態では、担体は塩を含む。一部の実施形態では、担体は緩衝溶液を含む。
【００３７】
本明細書で使用する「サンプル」又は「試験サンプル」は、標的の存在及び／又はレベルを検出又は決定すべき任意のサンプル、或いは本明細書で詳述する対象由来の部分又は組成物の部分を意味し得る。サンプルには、液体、溶液、エマルション、又は懸濁液が含まれる。サンプルとしては医学サンプルが含まれ得る。サンプルとしては生体液又は組織、例えば血液、全血、血液の画分、例えば血漿及び血清等、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻汁、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、嘔吐物、糞便物質、肺組織、末梢血単核細胞、全白血球、リンパ節細胞、脾臓細胞、扁桃腺細胞、癌細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、又はその組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、サンプルは細胞を含む。一部の実施形態では、サンプルはアリコートを含む。他の実施形態では、サンプルは生体液を含む。サンプルは、技術上周知のいずれの手段によっても得ることができる。サンプルは、患者から得たまま直接使用可能であり、或いは例えば濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活化、試薬の添加等によって前処理して、本明細書で論じるか、そうでなくても技術上周知なようにサンプルの特性を改変することができる。
対象の疾患に言及するときの「治療」又は「治療すること」は、疾患を抑制すること、抑圧すること、軽減すること、寛解させること、又は完全に排除することを意味する。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的所見前に対象に組成物を投与することを含む。疾患の抑圧又は軽減又は寛解は、疾患の臨床的所見後に対象に組成物を投与することを含む。疾患の「予防」は、疾患の発症前に対象に組成物を投与することを含む。
【００３８】
2.  TRPV4及び／又はTRPA1の阻害
本明細書ではTRPV4及び／又はTRPA1を阻害するための組成物及び方法を提供する。本明細書ではTRPV4及び／又はTRPA1の阻害剤、並びに阻害剤を含む組成物について詳述する。阻害剤は、対象の表面を衛生化すること、対象に麻酔をかけること、並びに種々の障害及び疾患を治療することを含め、様々な方法に使用し得る。
a.  TRPチャネル
本明細書で開示する組成物及び方法は、表皮ケラチノサイトが顕著に機能して、皮膚におけるUVB媒介炎症及び末梢神経終末の感作を組織化するという発見に関する。その点で、表皮ケラチノサイトは、共感覚細胞と似た役割を有する。ケラチノサイトは大量にTRPV4を発現する。本明細書で述べるように、表皮ケラチノサイト内で発現されたTRPV4は、UV誘発炎症及び疼痛において役割を果たす。TRPV4チャネルは、UVB誘発皮膚炎症及びケラチノサイトへのCa++流入による侵害受容の主要制御因子としてその役割を発揮する。このUVBに誘発されたTRPV4媒介Ca++流入が、エンドセリン-1(ET-1)のTRPV4依存性分泌によって、ケラチノサイトを初期化して炎症促進及びアレルギー促進(疼痛促進)様式で機能し、これが痒み感覚及び皮膚色素沈着につながり得る。TRPV4は、UVB曝露と同時に活性化され、ヒト疼痛に関連性を有すると以前に実証された分泌因子によるアレルギー促進経路の活性化につながる。本明細書でさらに詳述するように、ケラチノサイトを標的とした誘導性Trpv4欠失を有するマウスを、TRPV4欠失のために誘発し、その後にUVB曝露すると、侵害性熱的及び機械的刺激に対してコントロールマウスより感受性が低いことが分かった。これらの研究に基づいて、表皮TRPV4をUVB媒介皮膚炎症の組織化に関与するタンパク質であると同定した。マウス皮膚において、UVB誘発インフラマソーム活性化並びにアレルギー促進性／発痛性メディエーター、例えばIL1-β、CXCL5、ET-1、及びIL-6の発現増加はTRPV4依存性であった。ET-1は、皮膚に注射されると、ヒトにおいて有痛感覚を誘発するのみならず、痒みをも誘発することが示されている。また、ET-1は、メラノゲンであると、すなわち、メラノサイトへのシグナル伝達によって皮膚色素沈着を増やすと同定されている。初代マウスケラチノサイトにおいては、UVBが直接的なTRPV4依存性Ca++応答を引き起こした。さらに、マウスにおいては、TRPV4選択的阻害剤の局所適用がUVB誘発表皮炎症及び疼痛行動を減少させた。さらに、急性ヒトUV光線皮膚炎においてTRPV4、ET1、及びIL1βの表皮発現が増加することが分かった。本出願では、光線皮膚炎という用語を用いて、UV放射線／光に応答しての皮膚炎症を指す。この組織応答には、疼痛、刺激、痒み、炎症性細胞及び疼痛促進細胞の流入並びに組織損傷を含め得る。本明細書で詳述する化合物はTRPV4を阻害し得る。本明細書で詳述する化合物はTRPA1を阻害し得る。本明細書で詳述する化合物はTRPV4及びTRPA1を阻害し得る。本明細書で詳述する化合物はTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害し得ない。阻害剤はTRPV4及びTRPA1に特異的であり得る。
【００３９】
b.  TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤
TRPV4はCa2+透過性の非選択的カチオンチャネルなので、一部の実施形態は、TRPA1及び／又はTRPV4の生物学的機能を抑制できるTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を提供する(例えば、カチオンチャネル活性を抑制し、Ca++輸送及び／又は利用能を抑制する)。他の実施形態は、TRPA1又はTRPV4をコードするmRNAの発現を抑制し得るTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を提供する。一部の実施形態は、TRPA1又はTRPV4をコードするmRNAのタンパク質への翻訳を抑制し得るTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を提供する。従って、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、間接的又は直接TRPA1及び／又はTRPV4に結合してTRPA1及び／又はTRPV4の活性(例えば、結合活性又は酵素活性)を抑制し、TRPA1及び／又はTRPV4の発現を減少させ、TRPA1及び／又はTRPV4の発現を阻止し、或いは細胞内でのTRPA1及び／又はTRPV4の産生を抑制する。抑制する又は抑制することは、量又は活性、例えば、本明細書で開示するものようなTRPA1及び／又はTRPV4の量又は活性のいずれの測定可能な減少又は減弱にも関する。タンパク質又は発現の「量」及び「レベル」は、本明細書では互換的に使用し得る。
本明細書で詳述する阻害剤はTRPA1を阻害し得る。本明細書で詳述する阻害剤阻害剤 はTRPV4を阻害し得る。本明細書で詳述する阻害剤はTRPV4及びTRPA1を阻害し得る。本明細書で開示する阻害剤はTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害し得ない。阻害剤はTRPV4及びTRPA1に特異的であり得る。
【００４０】
一部の実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、TRPA1及び／又はTRPV4の活性を低減させ得るタンパク質の量、又は生物学的活性を高めることができる。該タンパク質のレベルを高め得る阻害剤には、TRPV4及び／又はTRPA1を阻害するタンパク質若しくはmRNAレベルを高め得るか又は該タンパク質の発現を増やすことができるいずれの阻害剤も含まれる。一実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、タンパク質自体を含み得る。例えば、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、細胞に送達され得る外因的に発現及び単離されるタンパク質を含み得る。タンパク質は、例えばTat若しくはVP16への融合又はリポソーム等の送達ビヒクルによって等の、全てタンパク質に基づく阻害剤を細胞膜を横切って送達できる様々な方法によって細胞に送達され得る。当業者は、タンパク質の他の送達機構を使用し得ることを知っている。これとは別に、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤との接触によってコントロール細胞に比べてmRNA発現が増強し得る。例えば、TRPV4及び／又はTRPA1を阻害する自然に発現されるタンパク質のレベルを高め得る阻害剤は遺伝子発現活性化因子又は誘導因子(de-repressor)を含み得る。別の例として、自然に発現されるTRPV4及び／又はTRPA1タンパク質のレベルを低減させ得るTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、遺伝子発現抑制因子を含み得る。TRPV4及び／又はTRPA1を阻害するタンパク質のレベルを高め得る阻害剤には、直接又は間接的に結合し、例えば、タンパク質の結合性又は他の活性を増強することによって、タンパク質の有効レベルを高める阻害剤も含まれる。TRPV4及び／又はTRPA1タンパク質のレベルを低減させ得る阻害剤には、直接又は間接的に結合し、例えば、TRPV4及び／又はTRPA1タンパク質の結合性又は他の活性を抑制又は低減させることによって、TRPV4及び／又はTRPA1タンパク質の有効レベルを低減させる化合物又は組成物も含まれる。
【００４１】
細胞内の生体分子(例えば、mRNA又はタンパク質)の発現の量又はレベルは、当技術分野で知られるいずれの様々な技術によっても評価可能である。例えば、タンパク質(例えば、TRPV4及び／又はTRPA1)発現レベルの抑制は、タンパク質又はmRNAレベルにて、限定するものではないが、ウエスタンブロット、ELISA、ノーザンブロット、リアルタイムPCR、免疫蛍光、又はFACS解析といった技術を用いて評価可能である。例えば、タンパク質の発現レベルは、蛍光標識タンパク質特異性抗体で染色した細胞を可視化することによって免疫蛍光で、タンパク質発現のウエスタンブロットで、及びタンパク質転写物のRT-PCRで評価可能である。TRPA1及び／又はTRPV4の発現レベルをコントロールと比較することができる。コントロール細胞、例えば非疾患細胞又は他の正常細胞内の発現レベルに対して比較を行うことができる。これとは別にコントロールは正常細胞集団からの発現レベルの平均範囲を含み得る。或いは、療法又は薬剤への既知の応答を有する細胞集団の結果を解析することによって確定した基準値を使用し得る。当業者は、いずれの様々なコントロールをも使用し得ることを知っている。
【００４２】
TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、1種以上の化合物及び組成物を含み得る。一部の実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は化合物を含む。一部の実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は化合物である。一部の実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は小分子を含む。一部の実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は小分子である。TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、核酸分子、例えばTRPA1及び／又はTRPV4に対するRNAi活性を有するポリヌクレオチド又はその基質等を含めた生体分子を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子としては、RNA、dsRNA、miRNA、siRNA、核酸アプタマー、アンチセンス核酸分子、及びコード化核酸配列への結合を可能にし、その活性を抑制するのに十分な(すなわち、該コード化核酸配列に相補的である)配列を含む酵素的核酸分子が挙げられる。好適には、RNAi分子は、生理的条件又は人工的に規定した(例えば、反応)条件下でRNAiが標的配列にハイブリダイズできるように、標的配列の少なくとも一部に相補性である配列を含む。一部の実施形態ではRNAi分子は、周知かつ当業者は決定できる中程度又は高度のストリンジェンシー条件下で分子が標的配列にハイブリダイズできるように相補性である配列を含む。一部の実施形態ではRNAi分子は、その全長にわたって標的配列に対して完全な(100%)相補性を有する。当技術分野では様々なRNAi分子が知られており、技術上周知の糖リン酸骨格又はヌクレオベースへの修飾等の化学修飾を含むことができる。当業者は、活性、結合性、免疫応答、又は他の特性を変えるために修飾を選択することができる。一部の実施形態では、RNAiは、約18〜約24個のヌクレオチド、約5〜約50個のヌクレオチド、約5〜約30個のヌクレオチド、又は約10〜約20個のヌクレオチドの長さを有するsiRNAを含むことができる。
【００４３】
一部の実施形態では、阻害性核酸分子は、ストリンジェントな結合条件下で標的核酸配列に結合することができる。用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、ポリヌクレオチドがその標的配列に、他の配列より検出できるほど高い(例えば、バックグラウンドより少なくとも2倍高い)程度までハイブリダイズすることになる条件への言及が含まれる。ストリンジェントな条件の例としては、50%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDS中37℃でのハイブリダイゼーション、及び 60〜65℃にて0.1×SSC中での洗浄が行なわれる条件が挙げられる。アミノ酸及びポリヌクレオチドの同一性、相同性及び／又は類似性は、ClustalWアルゴリズム、MEGALIGN(商標)(Lasergene, WI)を用いて決定可能である。標的ポリヌクレオチド配列、例えば、TRPA1及び／又はTRPV4或いはその生物学的基質を所与として、技術上周知なように、モチーフを用いて阻害性核酸分子を設計し、阻害活性に有効であると予測される領域を標的にすることができる。
【００４４】
他の実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、TRPA1及び／若しくはTRPV4又はそのフラグメント等のタンパク質に特異的に結合できる抗体を含む。実施形態は、TRPA1及び／又はTRPV4基質分子への特異的結合によってTRPA1及び／又はTRPV4を阻害する抗体をも提供する。いずれの技術上周知の方法によっても、例えばTRPA1及び／若しくはTRPV4等の全長タンパク質、又はそのフラグメントによる免疫化によって、抗体を産生させることができる。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってよく、及び／又は組換え抗体であり得る。実施形態では、ヒト抗体である抗体は、例えば、ヒト抗体を産生できるトランスジェニック動物の免疫化によって調製可能である(例えば、国際特許出願公開第WO 93/12227号参照)。通常のモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler及びMilsteinの標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術、並びに他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス性又は発癌性形質転換を含めた様々な技術によってモノクローナル抗体(mAbs)を作製することができる。ハイブリドーマを調製するための動物系としてはマウスがある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立されており、融合用免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコル及び技術は技術上周知である。融合パートナー(例えば、マウスミエローマ細胞)及び融合手順も知られている。
【００４５】
いずれの適切な方法を用いてもTRPA1及び／又はTRPV4に対する阻害活性の候補活性化合物又は組成物を評価することができる。該方法としては例えば、インビトロアッセイ、インビトロ細胞ベースアッセイ、エクスビボアッセイ、及びインビボ方法が挙げられる。これらの方法は、興味ある酵素の結合活性、又は興味ある酵素の下流の活性を評価することができる。エクスビボアッセイは、本発明の阻害剤による細胞の処置後に、細胞RNAの収集、cDNAへの転換、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-QPCR)による定量化を介したTRPA1及び／又はTRPV4等の特定遺伝子の転写レベルの変化の検出を伴い得る。さらに、阻害剤による処置後に細胞生存能又は炎症を判定することができる。
【００４６】
i.  式Iの化合物
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、下記式Iの化合物である。
【００４７】
【化６】
2019513749.tif 000019
(I)
【００４８】
式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；
Dは、C1-C3アルキレンであり；
Eは、結合、又はC1-C2アルキレンであり；及び
Rは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される。一部の実施形態では、B及びCは、独立にフェニル基である。一部の実施形態では、Aはフェニル又はヘテロアリールである。一部の実施形態では、Aはピリドニルである。一部の実施形態では、RはC1-C4アルキルである。一部の実施形態では、Aはヘテロアリールであり、B及びCはフェニルであり、Dはエチレンであり、Eはメチレンであり、Rはメチルである。一部の実施形態では、Rはエチルである。
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００４９】
【化７】
2019513749.tif 000020
【００５０】
特定実施形態では、TRPA及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物を除外する。
【００５１】
【化８】
2019513749.tif 000021
【００５２】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤下記化合物である。
【００５３】
【化９】
2019513749.tif 000022
【００５４】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００５５】
【化１０】
2019513749.tif 000023
【００５６】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００５７】
【化１１】
2019513749.tif 000024
【００５８】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００５９】
【化１２】
2019513749.tif 000025
【００６０】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００６１】
【化１３】
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【００６２】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００６３】
【化１４】
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【００６４】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００６５】
【化１５】
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【００６６】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００６７】
【化１６】
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【００６８】
特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は下記化合物である。
【００６９】
【化１７】
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【００７０】
ii.  化合物の合成
式Iの化合物は、技術上周知の様々な手段で合成可能である。例示合成を実施例及び図35に詳細に示す。
4-ニトロフェネチルブロミドのSN2置換の一般手順：オーブン乾燥した粉末K2CO3(1.5当量)及びアミン(1.5当量)を無水CH3CN中の室温ブロミド溶液(0.33M)に順次添加し得る。LCMSによる反応混合物の分析がブロミドの完全な消費を示すまで(約6〜18時間)反応混合物を80℃(油浴温度)に加熱し得る。混合物を室温に冷まし、ブライン(2体積当量)で希釈してよい。結果として生じるエマルションをEtOAc(2×1体積当量)で抽出し得る。混ぜ合わせた抽出物をシリカゲル(シリカゲルの質量＝2×出発ブロミドの質量)に添加し、減圧下で混合物を濃縮乾固させ得る。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により褐色乃至琥珀色の油として生成物を確認することができる。
【００７１】
ニトロのアニリンへの還元の一般手順：ニトロ化合物の溶液(MeOH中0.5M)を氷-NaCl浴内で冷却し得る。亜鉛末(4.5当量)を一度で加えた後、12MのHCl(4.5当量)を2〜3分かけて滴加し得る。1時間後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で一晩撹拌し得る。翌朝、混合物を氷-NaCl浴内で再度冷却し、pH(万能指示pH紙)が14に達するまで30%のNaOH水溶液を滴加し得る。混合物をCH2Cl2(5体積当量)で希釈し、5分間撹拌し得る。この時間後、真空にて不溶物を除去し、フィルターケークをCH2Cl2(2×25mL)で洗浄し得る。濾液の有機相を分離し、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥(MgSO4)させ得る。
濾過で乾燥剤を除去し得る。シリカゲル(約5g)を添加し、濾液を減圧下で濃縮乾固させ得る。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により清澄な琥珀色油として生成物を確認することができる。
【００７２】
チオ尿素形成の一般手順：無水CH2Cl2中のアニリン溶液(0.22M)を無水CH2Cl2中の1,1’-チオカルボニルジイミダゾールの氷-NaCl浴冷却溶液(2当量、0.15M)に2〜5分かけて滴加し得る。15分後、冷却浴を除去し、TLC(CH2Cl2中5%のMeOH)による分析が出発アニリンの完全な消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌し得る。混合物を氷浴内で再度冷却し、MeOH中7MのNH3(10.5当量)を2〜5分かけて滴加し得る。浴を除去し、混合物を室温で一晩撹拌し得る。シリカゲル(シリカゲルの質量＝2×出発アニリンの質量)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。ラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により純粋なチオ尿素を確認することができる。
【００７３】
チアゾール形成の一般手順：EtOH中のチオ尿素(0.1M)とα-ブロモアセトフェノン誘導体(1.1当量)の混合物を、TLC(CH2Cl2中5%のMeOH)による分析がチオ尿素の完全な消費を示すまで75℃(油浴温度)に加熱し得る。シリカゲル (シリカゲルの質量＝2×出発チオ尿素の質量)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させ得る。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により純粋なチアゾール臭化水素酸塩を確認することができる。
【００７４】
c.  組成物
他の態様では、本開示は、1種以上のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を含む組成物を提供する。対象の皮膚又は創傷を衛生化し、或いは汚染性かつおそらく有害な細菌又は他の微生物を除去するか又は減らすために本組成物を用いて対象の皮膚又は創傷を処置し得る。そのようにしながら、組成物は、疼痛、炎症、刺激、又はその組み合わせを減らすこともでき、それは局所麻酔によって引き起こされるか又は局所麻酔から生じ得る。
一部の実施形態では、組成物は阻害剤とヨウ素を含む。ヨウ素は、組成物中に元素ヨウ素として、若しくはヨウ素塩として、又はその組み合わせとして存在し得る。ヨウ素塩としては、例えば、ヨウ化カリウム及びヨウ化ナトリウムが挙げられる。
一部の実施形態では、組成物は阻害剤と麻酔剤を含む。一部の実施形態では、麻酔剤は局所麻酔剤である。一部の実施形態では、麻酔剤は全身麻酔剤でない。一部の実施形態では、麻酔剤は対象の皮膚の感覚をなくす。阻害剤と麻酔剤を含む組成物を用いて、対象の皮膚を効率的に浄化することができる。阻害剤と麻酔剤を含む組成物を医学的手技、手術、又は切開術前に対象に適用することができる。阻害剤と麻酔剤を含む組成物を対象の創傷に適用して治癒を促進することができる。
【００７５】
局所麻酔剤は、疼痛線維内の触覚及び痛覚遮断伝達を減少させるか又は排除し、対象に痛みを引き起こす心配なく医療従事者が麻酔組織を操作できるようにする。全身麻酔とは異なり、局所麻酔は、手技中に対象が覚醒及び認識できるようにし、従って医学的手技中の対象の信頼及び幸福を促すことができる。さらに、局所麻酔は、全身麻酔に伴うリスク、例えば悪心、嘔吐、及び悪性高熱症等の一部を回避する。多くの化合物を局所麻酔剤としての使用に利用可能である。局所麻酔剤は、それらの化学構造に基づいて2つの広いカテゴリーに分けることができる。アミド含有麻酔剤としては、例えば、アルチカイン、ブピバカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、及びトリメカインが挙げられる。別の分類の局所麻酔剤は、エステル化学残基を含有し、これには、例えば、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、ピペロカイン、プロポキシカイン、プロカイン (ノボカイン)、プロパラカイン、及びテトラカインが含まれる。
【００７６】
組成物は、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を担体、ビヒクル、又は希釈剤と組み合わせて含み得る。実施形態は、医薬的に許容される担体を提供し、これには、限定するものではないが、局所、くも膜下腔内、眼内、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下、経鼻、及び経口投与に有用な物質が含まれる。投与は全身投与であり得る。「医薬的に許容される担体」には、注射用の水性分散系及び無菌粉末又は分散系の調製用の薬剤も含まれる。医薬的に許容される担体及び賦形剤の例は、例えば、Remington Pharmaceutical Science, 16th Edで論じられている。剤形を作るための特定の例示技術及び組成物は、下記文献に記載されている：Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10, Banker & Rhodes, eds.(1979)；Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1981)；及びAnsel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 2nd Ed., (1976)。担体、ビヒクル、又は希釈剤は、局所適用に適していてよい。一部の実施形態では、担体は水を含む。一部の実施形態では、担体はアルコール、例えばメタノール又はエタノール等を含む。
【００７７】
特定実施形態では、組成物は注射用に処方される。特定実施形態では、組成物は、局所投与用に処方される。局所投与に適した組成物のためには、組成物を1種以上の担体と組み合わせて、化粧品製剤の形態で使用することができる。製剤としては、フォーム、クリーム、ゲル、ローション、軟膏、又は溶液が挙げられる。例えば、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤は、皮膚消毒用ゲルのアルコールに又はローション、クリーム、若しくは他の製剤に適宜溶解し得る。特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を化粧品製剤に含めるか又は添加してよい。特定実施形態では、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を日焼け止め局所製剤に含めるか又は添加してよい。
経口治療投与のためには、組成物を1種以上の担体と組み合わせて、摂取可能錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、座剤、シロップ剤、ウエハー、チューインガム、食品等の形態で使用してよい。組成物及び製剤の百分率は、当然に、変動してよく、通常は所与の単位剤形の質量の約0.1〜約100%であり得る。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、下記成分を含有してもよい：結合剤、例えばトラガカントガム、アカシアガム、トウモロコシデンプン又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等；潤沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；及び甘味剤、例えばスクロース、フルクトース、ラクトース若しくはアスパルテーム等又は香味剤、例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、若しくはチェリー香等。上記リストは単に代表例であり、当業者は、他の結合剤、賦形剤、甘味剤等を想定することができる。単位剤形がカプセル剤のとき、それは、上記タイプの材料に加えて、液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールを含有し得る。種々の他の材料がコーティング剤として、そうでなくても固体単位剤形の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック又は糖等でコーティングされ得る。
【００７８】
このような治療的に有用な組成物中のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤の量は、有効な用量レベルが得られるような量である。選択用量レベルは、利用する特定化合物の活性、投与経路、投与の時間、利用される特定化合物の排泄又は代謝の速度、治療の持続期間、利用する特定化合物と併用する他の薬物、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、健康全般及び前病歴、並びに医療分野で周知の同様の因子を含め、種々の因子によって決まることになる。
一般に、1日の用量は、約0.1mg〜 約2000mgの活性成分、又は約0.5〜約60mgの活性成分を含有する。この剤形は、1又は2回の経口用量で投与すべき完全な1日の用量を可能にする。本明細書では1日1回又は1日2回より多く、例えば、1日当たり3、4、5、又は6回の投与も企図される。
一部の実施形態では、上述したように、投与することは、ヒト等の動物においてTRPA1及び／又はTRPV4の阻害等の所望のインビボ効果をもたらすのに有効な量を与えることに関する。
【００７９】
d.  マウスモデル
他の態様では、本開示は、そのゲノムが、表皮のケラチノサイトにTrpv4遺伝子の欠失を含むトランスジェニックマウスを提供する。トランスジェニックマウスは、ケラチノサイト特異的活性化及び部位特異的組換え酵素の発現後の表皮のケラチノサイトのTrpv4遺伝子のノックアウトマウスであり得る。Trpv4遺伝子のノックアウトは技術上周知のいずれの適切な手段によって行なってもよい。例えば、トランスジェニックマウスは、部位特異的組換え酵素のケラチン14プロモーター発現によって作製可能である。部位特異的組換え酵素としては、CREリコンビナーゼが挙げられる。部位特異的組換え酵素を変異エストロゲン受容体に融合させてよい。抗エストロゲン剤は、野生型エストロゲンに比べて変異エストロゲン受容体に高い親和性を有し得る。抗エストロゲン剤はタモキシフェンを含み得る。一部の実施形態では、トランスジェニックマウスへの抗エストロゲン剤の添加が部位特異的組換え酵素を核に追いやり、Trpv4遺伝子発現のノックダウンをもたらす。そのようなものとして、Trpv4遺伝子のケラチノサイト特異的欠失は、抗エストロゲン剤を適用することによって誘導可能である。一部の実施形態では、Trpv4遺伝子の欠失は、表皮のケラチノサイトに特異的かつコンディショナルに誘導可能である。一部の実施形態では、Trpv4遺伝子の欠失は、表皮のケラチノサイトにおける恒常的に活性又は誘導性の組換え酵素の発現によって達成可能である。一部の実施形態では、トランスジェニックマウスは、UVB曝露に応答して、IL6、ET1、カスパーゼ1、IL1β、及びCXCL5、又はその組み合わせの少なくとも1つのコントロールに比べて低減した発現を示し得る。
【００８０】
e.  方法
i.  対象の衛生化方法
本明細書では、対象、又は対象の表面若しくは一部を衛生化する方法を提供する。本方法は、対象を阻害剤及びヨウ素を含む組成物と接触させることを含み、阻害剤はTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する。一部の実施形態では、阻害剤はTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない。一部の実施形態では、阻害剤は、本明細書で詳述する式Iの化合物を含む。一部の実施形態では、対象は、表面上の微生物の個体数の減少を引き起こすのに十分な時間組成物と接触する。組成物と接触する対象の表面、又はその一部は、皮膚領域、創傷、痛む所、及び潰瘍から成る群より選択され得る。一部の実施形態では、組成物を医用ドレッシング材又は包帯に適用し、次にそれを対象に適用する。
一部の実施形態では、対象の皮膚又は創傷を衛生化し、いずれの汚染性かつ有害な可能性のある細菌若しくは他の微生物をも減らすか又は除去するため、組成物を対象に投与して対象の皮膚又は創傷を処置する。一部の実施形態では、組成物は対象又はその表面を消毒する。一部の実施形態では、組成物は対象又はその表面を衛生化する。一部の実施形態では、組成物は抗菌活性を有する。一部の実施形態では、組成物は皮膚、創傷、痛い所、又は潰瘍の治癒を促進する。一部の実施形態では、組成物は、ヨウ素によって引き起こされるか又はヨウ素に起因し得る疼痛、炎症、刺激、又はその組み合わせをも減少させる。一部の実施形態では、阻害剤は、ヨウ素によって誘発された疼痛を減らすか又は弱める。一部の実施形態では、組成物は、疼痛の局所抑制をもたらす。一部の実施形態では、手術又は切除術等の医学的手技前に組成物を対象に適用する。該実施形態では、組成物は、対象の領域を衛生化し、微生物感染を阻止し、微生物感染を減らし、微生物感染を治療し、又はその組み合わせを行ない得る。組成物は、手術又は他の医学的手技の前、その間、又はその後に投与可能である。
【００８１】
ii.  対象の麻酔方法
本明細書では対象の麻酔方法を提供する。本方法は、阻害剤及び麻酔剤を含む組成物を対象に投与することを含み、阻害剤はTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する。本方法は、麻酔剤と阻害剤を対象に同時投与することを含み、阻害剤はTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、TRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない。一部の実施形態では、阻害剤は、本明細書で詳述する式Iの化合物を含む。一部の実施形態では、麻酔剤は局所麻酔剤である。一部の実施形態では、組成物は、局所麻酔剤によって引き起こされるか又は局所麻酔剤に起因し得る疼痛、炎症、刺激、又はその組み合わせを減少させる。一部の実施形態では、組成物は、疼痛の局所抑制をもたらす。一部の実施形態では、阻害剤は、麻酔剤によって誘発された疼痛及び／又は灼熱を減らすか又は弱める。一部の実施形態では、対象は急性歯髄炎又は炎症「熱感」歯を有する。一部の実施形態では、対象は皮膚又は軟組織の化膿性感染症を有する。一部の実施形態では、組成物は、対象の急性歯髄炎、炎症「熱感」歯、又は皮膚若しくは軟組織の化膿性感染症に投与される。一部の実施形態では、組成物は、手術又は切除術等の医学的手技の前に対象に適用される。組成物は、手術、口腔手術、又は他の歯科的若しくは医学的手技の前、その間、又はその後に投与可能である。
【００８２】
iii.  疾患又は障害の治療方法
組成物及び方法を用いて、皮膚科学的障害を含めた種々の疾患及び治療を治療することができる。本明細書では、疾患又は障害の治療方法を提供する。本方法は、有効量の、本明細書で詳述するTRPV4及び／又はTRPA1阻害剤を対象に投与することを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示する組成物及び方法で治療可能な疾患又は障害としては、膵炎(例えば、セルレイン誘発膵炎モデルに従う)、てんかん、関節炎、変形性関節症、多発性硬化症、脳卒中、CNS自己免疫状態、外傷性脳／脊髄損傷、脳浮腫、CNS感染症、精神神経障害、骨格変性・炎症性障害、三叉神経痛、例えば頭痛等、大腸炎、及び硬化症が挙げられる。
他の態様では、本開示は、皮膚科学的疾患又は障害、例えば刺激、疼痛、痒み、そう痒症、自己免疫疾患、皮膚癌(例えば、TRPA1及び／又はTRPV4阻害剤に基づくUV保護の局所治療によるメラノーマを含めて)、自己免疫疾患、線維性障害、色素異常症、及び上述したの他のものの予防方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、色素性乾皮症、コケイン症候群、ブルーム症候群、ロスムンド・トムソン症候群、及びハートナップ(Hartnup)症候群の発症及び／又は増悪の予防方法を提供する。
【００８３】
皮膚科学的障害は、TRPA1又はTRPV4経路に関連し得る。皮膚科学的障害には、限定するものではないが、光線誘発炎症、皮膚の疼痛、痒み、癌、自己免疫疾患、線維性疾患、他のざ瘡様又は炎症性皮膚疾患を伴う疾患における疼痛、及び色素異常症が含まれる。例えば、皮膚科学的障害としては、限定するものではないが、日焼け；光アレルギー性反応；光毒性反応；植物性光線皮膚炎(ベルロック皮膚炎)；急性及び慢性光線過敏性皮膚炎；アトピー性皮膚炎増悪；酒さの全ての亜型、例えば三叉神経痛関連酒さ等；全てのエリテマトーデス亜型(全身性、円板状、亜急性)；アトピー性皮膚炎；光線痒疹；結節性痒疹；亜急性痒疹(prurigo subacuta)；色素性痒疹；単純性苔癬(神経皮膚炎とも呼ばれる)；糖尿病性そう痒症；尿毒症性そう痒症；代謝性(肝臓)疾患により誘発されるそう痒症；リンパ腫のような悪性腫瘍により誘発されるそう痒症；真性赤血球増加症により誘発されるそう痒症；疥癬により誘発されるそう痒症；水疱性類天疱瘡により誘発されるそう痒症；蕁麻疹(排他的ではないが、特に光線過敏性蕁麻疹)により誘発されるそう痒症；媒介昆虫／クモ形類動物咬傷により誘発されるそう痒症；寄生虫症により誘発されるそう痒症；メラノーマ；非メラノーマ皮膚癌(BCC、SCC)；光線過敏性角化症及び他の前悪性皮膚癌；菌状息肉症；セザリー症候群；色素性乾皮症；コケイン症候群；全てのエリテマトーデス亜型(全身性、円板状、亜急性)；皮膚筋炎；多形性紅斑；扁平苔癬；UV曝露により誘発される線維性疾患(鼻瘤、慢性光線過敏性皮膚炎、光線過敏性類細網症、光老化、皮膚-粘膜ヒアリン症；多形日光疹；夏季ざ瘡(Acne aestivalis)；光線誘発皮膚変化に影響を及ぼす全てのポルフィリン症サブフォーム(赤血球生成性ポルフィリン症、赤血球生成性プロトポルフィリン症、多型ポルフィリン症)；光線誘発単純ヘルペス感染症(口唇ヘルペス)；ダリエー病(morbus Darier)；播種性表在性光線過敏性汗孔角化症；毛孔性紅色粃糠疹；ブルーム症候群；ロスムンド・トムソン症候群；ハートナップ症候群光老化；皺；光線誘発炎症；色素沈着；及び色素異常症が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示は、対象の治療方法であって、医薬的に許容される組成物中のTRPA1及び／又はTRPV4の阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００８４】
iv.  皮膚炎症の軽減方法
一態様では、本開示は、それを必要とする対象の皮膚炎症の軽減方法を提供する。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。皮膚炎症はUVB曝露に関係があり得る。
皮膚炎症は、限定するものではないが、日焼け(急性光線皮膚炎)、光アレルギー性反応、光毒性反応、植物性光線皮膚炎(ベルロック皮膚炎)、急性及び慢性光線過敏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎増悪、及び酒さを含めた状態と関連し得る。
v.  疼痛管理
他の態様では、本開示は、疼痛管理方法を提供する。本方法は、それを必要とする対象の表面の少なくとも一部に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。疼痛はUVB曝露に関係があり得る。
疼痛は慢性又は急性であり得る。疼痛は、限定するものではないが、例えば三叉神経痛関連酒さ等の酒さの全ての亜型、反射性交感神経性ジストロフィー(RSD)、及び全てのエリテマトーデス亜型(全身性、円板状、亜急性)を含めた状態に関連するか又は起因し得る。
【００８５】
vi.  痒みの軽減方法
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象の痒みの軽減方法を提供する。ET-1は、痒みを誘発することが分かっており、かつ実施例に示すように、ET-1の発現増加はTRPV4依存性であった。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
痒みは慢性又は急性であり得る。痒みは、限定するものではないが、酒さ、アトピー性皮膚炎、光線痒疹、結節性痒疹、亜急性痒疹、色素性痒疹、単純性苔癬(神経皮膚炎とも呼ばれる)、糖尿病性そう痒症、及び尿毒症性そう痒症を含めた状態に関連するか又は起因し得る。痒み又はそう痒症は、代謝性(肝臓)疾患、リンパ腫のような悪性腫瘍、真性赤血球増加症、疥癬、水疱性類天疱瘡、蕁麻疹(排他的ではないが、特に光線過敏性蕁麻疹)、媒介昆虫／クモ形類動物咬傷、及び寄生虫症を含めた状態に関連するか又は起因し得る。
【００８６】
vii.  癌の治療方法
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象の癌の治療方法を提供する。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
癌及び関連状態としては、限定するものではないが、メラノーマ、非メラノーマ皮膚癌(BCC、SCC)、光線過敏性角化症及び他の前悪性皮膚癌、菌状息肉症、セザリー症候群、及び色素性乾皮症が挙げられる。
viii.  自己免疫疾患の治療方法
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象の自己免疫疾患の治療方法を提供する。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
自己免疫疾患としては、限定するものではないが、全てのエリテマトーデス亜型(全身性、円板状、亜急性)、皮膚筋炎、多形性紅斑、及び扁平苔癬が挙げられる。
ix.  線維性疾患の治療方法
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象の線維性疾患の治療方法を提供する。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
線維性疾患には、UV曝露により誘発される状態、例えば、鼻瘤、慢性光線過敏性皮膚炎、光線過敏性 類細網症、光老化、及び皮膚-粘膜ヒアリン症が含まれ得る。
【００８７】
x.  他のざ瘡様又は炎症性皮膚疾患の治療方法
他の態様では、 本開示は、それを必要とする対象の他のざ瘡様又は炎症性皮膚疾患の治療方法を提供する。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
ざ瘡様又は炎症性皮膚疾患としては、限定するものではないが、多形日光疹、夏季ざ瘡、光線誘発単純ヘルペス感染症(口唇ヘルペス)、ダリエー病、播種性表在性光線過敏性汗孔角化症、毛孔性紅色粃糠疹、及び光線誘発皮膚変化に影響を及ぼす全てのポルフィリン症サブフォーム、例えば、赤血球生成性ポルフィリン症、赤血球生成性プロトポルフィリン症、及び多型ポルフィリン症等が挙げられる。
xi.  皮膚色素沈着の減少方法
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象の皮膚色素沈着の減少方法を提供する。ET-1は、皮膚メラノサイトに信号を送って主要メラノゲンとして機能する(＝皮膚色素沈着を増強する)ことが分かっており、かつ実施例に示すように、ET-1の発現増加はTRPV4依存性であった。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
皮膚炎症、疼痛、痒み、及び／又は色素沈着は、限定するものではないが、コケイン症候群、3度未満の非UV皮膚熱傷、創傷治癒障害、ツタウルシへの曝露及び病的応答、並びに脛骨、指、又は頭蓋骨の骨折等の皮膚に直接隣接する骨折の疼痛を含めた障害にも関連し得る。例えば、これらの障害の1つ以上は反射性交感神経性ジストロフィー(RSD)の症候であり得る。
xii.  美容状態の治療又は予防方法
他の態様では、本開示は美容状態の治療又は予防方法を提供する。例えば、本開示は、光老化、皺、光線誘発炎症、色素沈着、及び色素異常症の治療又は予防方法を提供する。本方法は、対象に有効量のTRPA1及び／又はTRPV4阻害剤を投与することを含み得る。
【００８８】
xiii.  TRPA1及び／又はTRPV4の選択的阻害剤の同定方法
さらなる態様では、本開示は、TRPA1及び／又はTRPV4の選択的阻害剤の同定方法を提供する。本方法は、(a)マウスを試験化合物を接触させる工程；(b)試験化合物との接触後のTRPA1及び／又はTRPV4の生物学的活性を決定する工程；及び(c)試験化合物の非存在下でのTRPA1及び／又はTRPV4の生物学的活性のコントロールレベルを決定する工程；(d)工程(b)のTRPA1及び／又はTRPV4の生物学的活性をTRPV4欠失モデルのTRPA1及び／又はTRPV4の生物学的活性と比較する工程（ここで、TRPV4欠失モデルには、本明細書で開示するトランスジェニックマウス又は完全ヌル(pan-null)Trpv4-/-マウスが含まれる）；及び(e)(i)試験化合物の存在下でTRPA1及び／又はTRPV4生物学的活性が、試験化合物の非存在下でのTRPA1及び／又はTRPV4生物学的活性より低い；(ii)試験化合物の存在下でのTRPA1及び／又はTRPV4生物学的活性が、TRPV4欠失モデルのTRPA1及び／又はTRPV4生物学的活性とほぼ同じであるか、又はそれより低い；或いは(iii)(i)と(ii)の任意の組み合わせの少なくとも1つであるときに試験化合物をTRPA1及び／又はTRPV4の選択的阻害剤として同定する工程を含む。
【実施例】
【００８９】
3.  実施例
実施例1：材料及び方法
動物。TM5-6をコードするエクソン13をloxP部位が包囲するようにTrpv4ゲノム遺伝子座を操作した。K14-CRE-ERtamマウスと交配したマウス内でこの変異を増殖させ、その結果、2〜4月齢のマウスで、0.3mLのコーン油中6mg/日にて5日連続で経口胃管栄養法によるタモキシフェン投与に加えて、最後の適用2週間後に1回のブースターにより((Trpv4lox/lox)X(K14-CRE-ERtam))マウスを誘導することができた。雄性及び雌性のマウスを等しく誘導した。プライマー、センス5’-CCTGCTGGTCACCTACATCA(配列番号:1)及びアンチセンス5’-CTCAGGAACACAGGGAAGGA(配列番号:2)（配列番号:1のプライマーはエクソン13に位置している）を用いてTrpv4についてqRT-PCRによりノックダウンの効率を検証した。本明細書に記載する全ての動物実験は、NIH及びDuke大学内部ガイドラインに完全準拠して、有効なIACUCプロトコル下で行なった。
Trpv4-/-完全ヌルマウスの作製に用いた同一のゲノムクローンを使用して、Trpv4標的コンストラクトをマウスES細胞(C57BL6バックグラウンド)にエレクトロポレートし、PCR及びサザンブロットにより同所性組込みを検証した。キメラマウスとC57BL6 WTマウスの交配により遺伝子操作変異を生殖系列に導入した。FLPe欠失マウスにおけるfrt-pGK-neo-frt カセットのFLPe媒介(FLPemediated)切除によって選択マーカーを除去した。PCR及びその後のPacI消化によりジェノタイピングを達成した(図1B)。
【００９０】
実験全体を通して8〜12週齢のマウスを使用した。Trpv4-/-マウス3をWT(C57BL/6J)と異系交配し、PCRで遺伝子型を同定した3,15。気候制御室内に12／12時間の明／暗サイクルで自由に利用できる水及び標準化げっ歯類飼料を与えて動物を収容した。全ての実験は、NIH及びDuke大学の動物実験委員会(Institutional Animals’ Care and Use Committee)(IACUC)のガイドラインに準拠かつ従って、Duke大学IACUCの有効なIACUCプロトコル下で行なった。この公報に記載の全ての動物方法は、Duke大学IACUCにより承認された。
引っ込め閾値の行動評価。行動試験を行なって、後足に適用した機械的なフォンフライヘアー又は熱的刺激に応答しての引っ込め閾値の低減を評価した。試験を実施した。これらの引っ込め閾値をUV曝露前後に確認した。タモキシフェン／油の最後の適用後3〜5日にBio Rad Gel Doc 2000 UVトランスイルミネーター(302nm)を用いて5分間、マウスを600mJ/cm2の被曝量にさらした。
足間質液分析。UV曝露48時間後、各動物は安楽死直後に10μLのPBSの足底内注射を受けた。間質液を即座に収集し、ELISA(Biorad)でIL-1βの存在について分析した。
インビボ局所インターベンション。ET1注射：ベースライン引っ込め閾値の決定後、各動物は、10μLの100nM ET-1足底内注射に加えて反対側にビヒクルを受けた。注射1時間後に再び閾値を評価した。
GSK205局所処置：68%EtOH／5%グリセロールに加えて1mM又は5mMのGSK205(コントロールについては無し)の粘性溶液を20 μL中で擦ることによって後足に適用し、1時間の時点及びUV曝露10分前に再び適用した。
ホルマリン誘発侵害防御行動：4%のホルマリンを右後足に注射した。次にマウスを50分間ビデオテープに録画し、盲検観察者が行動を解析した。
【００９１】
1μmの半薄切片及びEMのためのマウス組織処理。サンプルを処理してEMに供した。
免疫組織化学のためのマウス及びヒト組織の処理。日常手順に従い、治験審査委員会承認(institutional review-board approval)(UCSF)下でヒト組織を処理した。
初代マウスケラチノサイト細胞培養。新生マウスの背部皮膚から初代マウスケラチノサイトを誘導した。
UV曝露後に培養ケラチノサイトにより分泌されたIL-1βの分析。UV照射前に、培地をPBSと交換した。次に細胞を50mJ/cm2の線量にてUVBで照射した。24時間後、IL-1β ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて上清を分析した。
培養ケラチノサイトのCa++イメージング。日常手順後に1°MKのCa++イメージングを行なった。UVB刺激のため、カスタマイズした装置を構築した。このシステムは、電気的相互接続及び機械的支持のためのプリント基板並びに紫外発光ダイオード(UV LED)を備えた。細胞端部にカスタマイズした設備は、細胞培養皿の底として石英カバースリップに加えて、Olympus BX61直立顕微鏡に適合した熱平衡ステージ(HW-101 Dagan Corporation)を含んだ。UV LEDはIII-窒化物に基づくタイプ(UVTOP-295 BL; Sensor Electronic Technology)であった。
動作波長は295nm(図2A)であり、12nmの半値全幅を有した。光パワーは500mWであった。石英カバースリップ上面の平面に焦点を合わせ、これを用いて細胞に向かう光路に沿うUV吸収を最小限にした(図2A〜2C)。焦点での光強度を150mW/mm2と推定した。
295nmのLEDを用いるケラチノサイトUV照射及び免疫細胞化学。UV光学システム(295nm LED)を用いて1°MKをUVBに曝露した。24時間後に細胞を固定し、ET1のために蛍光免疫標識した。デジタルイメージを獲得し、形態計測に供した。
【００９２】
統計解析。データを平均±SEMとして表す。数シグナル又は数値は、それらのそれぞれの群について平均し、統計平均+/-平均の標準誤差を群間で、固定効果一元配置分散分析及びポストホックシェッフェ検定、又はスチューデントt検定、又は両側t検定、又は一元配置分散分析後のチューキーポストホック検定をp＜0.05の有意水準で用いて比較した。
化学物質／生物。下記生物及び化合物を使用した：エンドセリン1；BQ123及びBQ788 (ET(R)-A及びET(R)-B用のET(R)ブロッカー；Sigma, St.Louis, MO)、U73122(PLC阻害剤；Tocris, Ellisville, MO)、4α-ホルボール12,13 ジデカノアート(4α-PDD；TRPV4アクチベーター；Tocris)、GSK205(TRPV4阻害剤(Li et al., 2011; Phan et al., 2009; Vincent and Duncton, 2011))、RN-1734(TRPV4阻害剤；Tocris)、CGS35066(エンドセリン変換酵素阻害剤、Tocris)、ピロリン酸イソペンテニル、IPP (TRPV3阻害剤；Sigma)；及びカンファー(TRPV3アクチベーター；Whole Foods)。
引っ込め閾値及び侵害防御行動の行動評価。行動試験を行なって、後足に適用した機械的又は熱的刺激に応答しての引っ込め閾値の低減を評価した。これらの引っ込め閾値は、UVB曝露の前後に確認した。25×26cmの Bio Rad Gel Doc 2000 UV トランスイルミネーター(302nm)の上面にプレキシガラスエンクロージャーでマウスを拘束し、その他の点ではこの環境をオープンに調査できるようにした。600mJ/cm2の被曝量で5分間UV曝露を持続した。この方法の開始時の慎重な観察により、この時間全体を通して後足がUVに曝露されることが実証された。
【００９３】
自動フォンフライヘアー試験。後足の機械的引っ込め閾値は、自動フォンフライヘアー法により、自動足底タッチ刺激装置の部品である0.5mm径のステンレススチールフィラメント(Ugo Basile, Modena, Italy)を用いて決定した。関連詳細は、静かな部屋内での30分間の試験前順化を含み、日の同じ時間に同じ盲検観察者で試験を行なった。刺激が後足に送達され、足が引っ込めれらると自動的に刺激が中断され、その強度が自動的に記録された。1匹の動物当たり6〜8回行い、両方の後足を等しく曝露して、平均引っ込め閾値を導いた。結果は、処置前測定値から処置後測定値を減算することにより計算し、%として又は1.0に対して表したΔ閾値として報告してある。
ハーグリーブス検定。後足の熱的(ホット)引っ込め閾値は、確立したハーグリーブス法により、後足の下から刺激を送達する赤外熱刺激装置を引っ込め時の自動シャットオフ(Ugo Basile)と併用して決定した。フォンフライヘアー試験について述べたように刺激及び測定を行なった。カットオフを20秒に設定して組織損傷を防止した。
【００９４】
ホルマリン誘発侵害防御行動。各マウスが尻込みするか又は注射した後足をなめる時間の総量について盲検観察者がビデオを解読した。
1μmの半薄切片及び電子顕微鏡検査のためのマウス組織処理。0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2%のグルタルアルデヒド、4%のPFA、及び2mMのCaCl2、pH 7.2に室温で＞1時間サンプルを固定し、脱水し、1%の四酸化オスミウム内で後固定し、エポン包埋(Epon embedding)用に処理した。半薄切片(1μm)をトルイジンブルーで染色し、Axioplan 2顕微鏡(Zeiss)で撮影した。EM解析のため、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で超薄切片(60〜70nm)を対比染色した。デジタルカメラ(モデルXR60；Advanced Microscopy Techniques, Corp.)を備えた透過型電子顕微鏡(Tecnai G2- 12; FEI)でEMイメージを撮った。
【００９５】
免疫組織化学のためのマウス組織処理。以前に記述されているように日常手順に従った(Chen et al., 2009)。マウスに経心的に30mLのPBS、次に30mLの4%パラホルムアルデヒドを流した。L5 DRG(両側)を含む組織、及び足蹠標本を解剖し、4%パラホルムアルデヒドに後固定した。組織ブロックをさらにPBS中30%のスクロースで24〜48時間凍結保護した。マウスTRPV4、ケラチン特異性抗体、ホスホ-ERK、IL-6、IL-1β、CXCL5及びカスパーゼ1のためには、組織を凍結ブロックとして調製し、その後にクリオスタット上で薄片を作った。CD68、CD15(好中球エラスターゼ)及びCD3のためには、マウス皮膚を2%のPFA灌流により調製した。足蹠及びDRG切片(両方とも6〜10μm)を解凍マウントし、5%の正常ヤギ血清(NGS; Jackson)で遮断してから一晩4℃で下記一次抗体とインキュベートした：ウサギ抗TRPV4(1:300; Abcam)、マウス抗ケラチン14(1:300；Abcam；残基850を超えるC末端ペプチドに対して)；ウサギ抗ケラチン14(1:1000; Fuchs-Lab)、ウサギ抗ホスホ-ERK1/2(1:500; Cell signaling technologies)、ヤギ抗IL-1β(1:800; Abcam)、ヤギ抗IL-6 (1:200；Santa Cruz Biotechnology Inc)；ウサギ抗カスパーゼ1(1:200; Biovision Research Products, CA)；ヤギ抗マウスLIX/CXCL5(1:200; R&D Systems Inc)、抗CD68、抗CD25、及び抗CD3(AbDSerotec)。適切な蛍光標識二次抗体(AlexaFluor595、AlexaFluor488抱合抗体1:600で；Invitrogen；ロバ由来のCD15ビオチン化二次抗体については、1:400後にローダミン-ストレプトアビジン(streptavidine) 1:250)、又はペルオキシダーゼ結合検出試薬(CD68のため)を用いて室温で2時間免疫検出を達成した。切片をすすぎ、マウントし、フルオロマウント(fluoromount)(Sigma)と共にカバースリップを乗せた。Zeiss LSM510共焦点をも備えたBX61 Olympus 直立顕微鏡を用いて（両方とも高解像度CCDカメラを備え、ISEE又はZeiss Zenソフトウェアを用いて一定曝露状況で取得した）を用いてデジタル顕微鏡写真を得た。形態計測解析は、核区画を温存する興味ある目的に合わせた領域を有するImageJフリーウェア(v1.45)を用いて行なった。ImageJは、DRG表面積の決定にも使用した。
【００９６】
ヒト組織試料の免疫標識。ヒト組織をキシレン及びエタノール系列で脱パラフィンしてから、PBS中で洗浄し、80℃で20分間抗原賦活化(Antigen Retrieval)緩衝液(Biogenex)内でインキュベートした。その後に、試料をPBSで洗浄した。内在性ペルオキシダーゼをPBS中0.3%のH2O2＋0.01%のナトリウムアジドで室温にて10分間遮断した後、PBS中の洗浄工程を行なった。遮断は、PBS中5%の正常ウマ血清＋0.3%のトリトンX-100中で室温にて1時間行なった。一次抗体(抗TRPV4、Abcam、マウスについてと同じ、1:8,000；抗ET1；抗IL-1b、マウス組織についてのように)をVentana抗体希釈緩衝液(Fisher)内で4℃にて一晩インキュベートした。PBS中での洗浄後、試料ををビオチン化抗ウサギ二次抗体(Vector, BA-1000)と共に希釈遮断緩衝液中で30分間インキュベートした。PBSでの洗浄後、アビジンビオチンブロック(Vector, PK4000)を室温で30分間適用し、ポジティブ免疫反応性をDAB(Fisher, NC 9567138)で可視化した。水中での洗浄後、ヘマトキシリンを用いて核を対比染色した。組織を洗浄し、脱水し、Permount(Fisher)中にマウントした。TRPV4、IL-1β、及びET1の形態計測定量化のため、各患者及び健康ボランティア(n＝3／群)からの切片を×20の倍率で調べて撮影した。Leicaソフトウェアを用いて切片全体をデジタル化し、ImageJを用いて解析した。定量化のため、色閾値プラグイン(Color Threshold Plugin)においてIsoData閾値処理法を用いて各イメージの3つのランダムに選択した表皮領域(3.5×1.25インチ(8.9×3.18cm))内のDAB及びHE染色を分離した。バックグラウンド補正測定値から相対シグナル強度を計算した。患者1名当たり5つの切片から決定した平均の平均値として値を表す。TRPV4、ET1、及びIL-1βについてのヒト皮膚組織の定量化は、健康皮膚(n＝3／群)と比較して急性光線皮膚炎から行なった。光線皮膚炎と健康皮膚を比較した慢性光線皮膚炎の種々のサブフォームの定量化は、現在活発な研究中である。さらに最終的な結果は、ヒト慢性光線皮膚炎の亜群毎に少なくとも3つの事例の有効性及び適切な染色を待ち構えている。
【００９７】
初代マウスケラチノサイト細胞培養。1時間のディスパーゼ(BD Biosciences)処理によって真皮から表皮を調製した。次にトリプシンを用いて表皮からケラチノサイトを分離した。ケラチノサイトをコラーゲン被覆皿又はガラス若しくは石英カバースリップ上に蒔き、ウシ下垂体抽出物及び表皮成長因子(EGF)(R&D Systems)、100pmolのコレラ毒素(Calbiochem、San Diego、CA、USA)及び1×抗生物質／抗真菌剤(Gibco)を補充したケラチノサイト血清フリー培地(Gibco)内で5%のCO2及び37℃にてインキュベーター内で成長させた。
培養ケラチノサイトのUVB刺激：カルシウムイメージング。TRPV4の化学的活性化に応答してのマウス1°MKのCa++イメージングは、2μMのフラ2-AMを負荷した後、比率計測Ca2+イメージングプロトコルに従い、二重励起用の340/380nmの青色光を用いて行なった。発光比は0.5Hzで取得した。ベースライン比を超えた所与の比の増加率として、ベースライン比で除してΔR/R0を決定した。340/380nm及び295nmの刺激に近接するためフラ2が適さないUVBによる細胞の刺激のためには、2μMのフロ4-AMを代わりに使用した。Ca++イメージングは488nmの励起、0.5Hzでの発光取得で行い、ΔF/F0として表した。カスタム構築UV光学システムにおいては、半球状レンズの形の透明光窓であるボールレンズでUV LEDの頂上を覆った(図2B)。LED出力光ビームの焦点をレンズから15〜20mmに合わせ、スポット径は約1.5〜2.0mmであった(図2C)。UV LE用の電力供給は、プリント基板上の表面マウント成分であり、外部スイッチによって制御される定常状態20mAの電流出力を有した。熱平衡ステージを生理的温度に合わせて設定した。我々は、専用の実験にカスタマイズされた295nmのLED装置を用いるUVB刺激の非熱的性質を確認し(図2D)、結果としてUVBとしての刺激の特有のモダリティーを確証した。
【００９８】
295nmのLEDを用いるケラチノサイトUV照射及び免疫細胞化学。マウスケラチノサイトをコラーゲン被覆石英カバースリップ上で培養してから前述したUV光学システムを用いて底から295nmのLEDを用いて刺激した。24時間後に細胞をPBS中4%のホルムアルデヒドに20分間固定し、PBS中0.1%のトリトンX-100で10分間透過処理し、洗浄してからPBS中10%の正常ヤギ血清内で45分間遮断した。カバースリップを一次抗体マウス抗ET1(1:200; Abcam)と一晩インキュベートし、PBSで3回洗浄し、二次抗体と2時間25℃でインキュベートした。カバースリップをPBSで3回、二重蒸留H2Oで1回洗浄した。BX61 Olympus直立顕微鏡で40×液浸レンズを用いてデジタルイメージを得た。興味ある目的に合わせた領域を有するImageJフリーウェアを用いて形態計測解析を行なった。
【００９９】
皮膚のUVB透過の決定。まず最初に、図16Aに示すように、剃刀刃光スポット閉鎖法(razor-edge optical spot occlusion method)を用いてLEDからのUV入力光ビーム(UVTOP-295 UV)のスポットサイズを推定した(結果を図16Bに示す)。UV LEDに20mAの電流で動力を供給し、直径1.5mmの円形焦点に500μWの光パワーをもたらし、0.5mmビーム半径内に総フラックスの70%があった。サンプルを通って伝達されるUV光パワーをHamamatsu S127-66BR UV検出器で検出し、Keithley 236ソース測定ユニットを用いて光検出器の出力を測定した。次に、マウスの足蹠表皮を石英カバースリップ上に置き、UVビームへの曝露によって、足蹠表皮のUV伝達について測定した。図12Aに示す実験に関してはアルコール及びグリセロール溶液中の足蹠皮膚にGSK205を投与した。ビヒクルコントロール群はアルコール及びグリセロール溶液のみで処理した。別のコントロール群は、クリーム形態の市販のSPF100日焼け止め製剤から成り、ビヒクルコントロールと同様に適用した。GSK205及び日焼け止めについてのデータをこのコントロールデータに正規化した。
ウエスタンブロッティング。サンプルをSDS-PAGEで分離し、PVDF膜(Bio-Rad)に導入した。膜をドライミルクで遮断してから一次抗体(ウサギ抗TRPV4(免疫原＝免疫標識に関してTRPV4の最終C末端エピトープ)、Alomone；抗カスパーゼ1、Biovision；マウス抗β-アクチン、(クローンAC-5) Abcam；マウス抗β-チューブリン、アイオワハイブリドーマバンク)後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体(Jackson Immunoresearch)でプローブした。Supersignal West Dura Extended Duration基質(Amersham)を用いて二次抗体を検出した。
【０１００】
急性膵炎マウスモデル。61に以前に記載されているように、1時間毎に合計6時間で過最大用量のセルレイン(50μg/kg)の腹腔内注射によって8〜10週齢のC57BL/6J雄性マウスを急性膵炎の状態にした。コントロール動物は25%のDMSO-生理食塩水を腹腔内注射により毎時6時間受けた。化合物16-8をこのビヒクルに溶かし(10mg/kg)、セルレインの最初の注射の30分前に腹腔内注射した。最後の注射の1時間後に動物を屠殺した。採血し、膵臓組織を迅速に単離し、膵臓の湿潤重量／体重比の決定のため秤量した。組織のサンプルを10%の中性緩衝ホルマリンに一晩固定し、パラフィン包埋及びH&E染色し、或いは膵臓組織を急速凍結させ、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性について評価した。以前に記載されていように61、血清アミラーゼ、MPO及び組織学的評価を行なった。
侵害防御行動の評価8：マウスを個別ケージ内に収容し、実験全体を通してビデオ録画した。一度に2匹のマウスを観察した。マウスがケージの中央平面を通るときに1事象として直線運動を測定した。最初のセルレイン／ビヒクル注射直後に分析を開始し、実験の最後まで続けた。最初の注射後の6時間に及ぶ時間の運動事象の合計として結果を表した。
【０１０１】
細胞培養。前述されているように13、TRPイオンチャネルの管理された発現についてN2a細胞を使用した。天然の非融合TRPV4と同様にGSK101及び低浸透圧性による刺激に応答することが以前に分かったラット由来のTRPV4-eGFPを使用した。全ての他のチャネルはマウス由来の天然のチャネルであり、eGFPをコトランスフェクトした。過剰発現したTRPV4の刺激はGSK101(5nM)で、TRPV1はカプサイシン(10μM)で、TRPV2は低浸透圧性(270mosmol/L)で、TRPV3はカンファー(100μM)で、TRPA1はカラシ油(100μM)で行なった。eGFPコントロールトランスフェクトN2a細胞はこれらの刺激に応答しなかった。以前に記載されているように13,14,34、Ca++イメージングを行なった。
用量依存関係を可視化するため、下記式に基づいてプロットを導き出すIgor Proソフトウェアプログラムを用いてヒルプロットを行なった。
【０１０２】
【数１】
2019513749.tif 000031
【０１０３】
、以前に記載されているように19,32,62,63、骨格が成熟したブタの大腿顆状突起由来の初代ブタ軟骨細胞を培養しCa++イメージングに供した。
確立したプロトコル64~66に従って、星状細胞培養を行なった。スプラーグドーリーラット胎仔(E18)から星状細胞を調製した。簡潔には、単離皮質を刻んでからトリプシン及びDNアーゼとインキュベートした。10%のウシ胎仔血清及びペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ100U/ml及び100μg/ml)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に解離細胞を懸濁させた。その後、ポリL-リジン(10μg/ml)で予め被覆した75cm2の組織培養フラスコ(10×106細胞／フラスコ)に細胞懸濁液を蒔いた。細胞を10%のCO2インキュベーター内で37℃にて維持した。10〜12 日後、培地を除去し、接着細胞をトリプシン処理し(0.25%)、その後のCa++イメージング34,67のためにカバースリップの上に蒔いた。＞95%の細胞が星状細胞マーカーであるグリア線維酸性タンパク質(GFAP)68を発現することが分かった。
【０１０４】
培養内の細胞生存能。N2a細胞を96ウェルプレート内で24〜48時間培養した。細胞生存能研究は、指示染料レサズリンでモニターした代謝能力に頼った。そのレゾルフィンへの還元(濃青からピンクへの色の変化で示される)を経時的にモニターした。マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いてλ＝570nmでの吸光度の変化を記録した。代謝的に活性で生存可能な細胞は、レサズリンをレゾルフィンに還元する能力を共有したが、死細胞はそうでなかった。実験時点毎に8つの同型培養を研究した。
16-…化合物で処置したマウスの肝臓、腎臓及び心臓の機能の評価。化合物16-8及び16-19(10mg/kg)でマウスを腹腔内処置した。肝臓及び腎臓の完全性は、両方とも96ウェルマイクロタイタープレート内でλ＝570nmでの吸光度の測定に頼るアラニンアミノ-トランスフェラーゼ及びクレアチニンアッセイ(Sigma)により解析した。動物1匹当たり8つの技術的同型解析を行なった。
16-8及び16-19で処置したマウスの心拍数評価のために、動物を2つの電極に、1つは耳にクリップを介して、1つは胸郭に堅固な接着剤を用いて装着した。心拍数をモニターし、アクソスコープ(axoscope)及びクランプフィット(clampfit)9.2ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて解析した。
【０１０５】
液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)。マウスを10mg/kgのそれぞれの阻害剤の腹腔内注射で処置した。安楽死後に収穫した組織を液体窒素で凍結させ、さらなる解析用に-80℃で貯蔵した。
凍結組織サンプルを部分的に解凍し、1mmの薄片にカットし、5〜15mgの組織と、2倍過剰の水(質量／体積)と、適量の内部標準、及び2.5mmのジルコニア／シリカビーズ(Biospec Products Inc.)を含有する6倍過剰のアセトニトリル(16-… 化合物)又はメタノール(GSK205)とを500μLのポリプロピレン(PP)製コニカルチューブに添加し、Fast-Prep装置(Thermo-Savant)内で速度「4」にて20秒間室温でホモジナイズし、13,600gで5分間室温で遠心分離機にかけた。測定化合物の予測濃度範囲に応じて、上清を1/4〜1/20に希釈し(移動相A内、下記参照)、LC-MS/MS分析用オートサンプラーに入れた。
Applied Biosystems API 5500QTrap、ハイブリッド三重四重線トラップMS/MS分光計とインタフェースした Agilent 1200シリーズLCシステムで16-…化合物及びGSK205についてのLC-MS/MSアッセイを展開した。
【０１０６】
質量パラメーター調整、データ取得、及び定量化のためにAnalyst(バージョン1.6.1)ソフトウェアを用いた。LCカラム：3×4mmのRP C18(Phenomenex, AJ0-4287)を35℃で操作した。移動相A：LC/MS等級の水中0.1%のギ酸、2%のアセトニトリル;移動相B：アセトニトリル：流量：1mL/分、1:1 MS/MS：消耗スプリット(waste split)。実行時間は4分であった。切換弁を用いて1.2分と2.5分の間のみにMS/MS流れを送った。溶出グラジエントは以下のとおりだった：0〜0.5分、1%B；0.5〜1.2分、1〜95%B；1.2〜1.5分、95%B；1.5〜1.6分、95〜1%B。オートサンプラーは4℃で操作し；注射容積は10〜50μLで維持した。エレクトロスプレーイオン化(ESI)ソースパラメーターは以下のとおりだった：ポジティブイオン化モード、カーテンガス流＝30、イオン化電位＝5500V、温度＝500℃、噴霧ガス1の流れ＝30、噴霧ガス2＝30、デクラスタリング電位＝20V。16-…化合物及びGSK205は、個々に50%A/50%B中100nM溶液として、10μL/分の流量並びに「親」及び衝突誘発(「娘」)MS/MSイオンについて最大イオン数をもたらすように最適化したパラメーターで注入した。親／娘量化子(quantifier)[修飾子(qualifier)]イオンを利用した：GSK205 (401.1/280[370])、16-8 (400.1/279.1[91.1]、16-16 (387.1/280[105])、16-18 (415.2/280[370]、16-19 (414.1/279.2[91.1]。標準物質(興味ある分析物)／内部標準ペアを利用した：GSK205／16-16、16-8／16-16、16-18／GSK205、16-19／16-8。
【０１０７】
特定の投与計画に必要な適切な範囲で測定化合物の純粋標準物質を組織ホモジネート(組織＋2倍過剰の水、質量／体積)に添加することによって較正サンプル(n＝6)を調製した。研究サンプルに並行して研究器官を解析した。下記は用いた典型的範囲である(80%の精度限界でLLOQにも相当するより低い値、85%の精度限界での全ての他の較正値)：0.38〜6nM(血漿)、6〜100nM(皮膚)、6〜48nM(心臓)、7.5〜120nM(脳)、19〜300又は1500〜24000nM(肝臓)、56〜900又は1500〜12000nM(腎臓)、500〜8000nM(脂肪)。ピーク積分、較正、及び定量化はAnalystソフトウェア内で行なった。名目上の濃度に対するピーク面積標準／積分標準(int.std.)の応答はr＝0.999以上で線形であった。
【０１０８】
パッチクランプ記録。異種トランスフェクトN2a細胞をパッチクランプ電気生理学的記録に供した。簡潔には、トランスフェクション24時間後に、1mMのMgCl2、10mMのグルコース、10mMのHEPES、145mMのNaCl及び2mMのCaCl2を含有する細胞外液(ECF) (pH 7.4、310mOsM)で細胞を予洗した。次に細胞をECF中でTRPV4阻害剤がある場合とない場合に5分間インキュベートした後に全細胞を記録した。蛍光フィルターを備えたLeica倒立顕微鏡のステージ上に搭載された記録チャンバーにカバースリップを移した。トランスフェクト細胞を同定した後にそれらの緑蛍光色でパッチング(patching)した。ピペットプラー(Sutter instruments)を用いてホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き伸ばした2.5〜3.0MΩのガラス電極を細胞に当てた。細胞内溶液は140mMのCsCl、10mMのHEPES、1mMのEGTA、0.3mMのNa-GTP、2mMのNa2-ATP、及び2mMのMgCl2を含有した(pH 7.4、295mOsM)。pclamp 9.2ソフトウェア及びAxopatch 200B増幅器(Molecular Devices)を用いて全細胞流を記録した。細胞をまず最初に-65mVでクランプした後に-110mVから+120mVへの1秒の電圧ランプを適用した。15〜20回の掃引に対して2秒毎に電圧ランプを適用した。実験記録全体を通して電気容量をモニターした。報告データは±3pF以内であった。
【０１０９】
実施例2：表皮特異性タモキシフェン誘導性Trpv4ヌルマウスの作製
ユビキタスな欠失のある遺伝子標的マウスに生じ得る発育問題を回避するため、我々は、UVB媒介皮膚刺激、炎症、及び感覚鋭敏化におけるTRPV4の役割を評価するための誘導可能なコンディショナルシステムを開発した。マウスES細胞を用いて、我々はまず最初に、膜貫通ドメイン5、6、及び中間にあるポアループの相当に大きいエクソンコーディングがloxP要素と隣接するようにTrpv4lox/loxマウスを構築した。FLPeマウスと交配して、frt要素と隣接している選択マーカーを除去した後、これらの動物をタモキシフェン(tam)誘導性ケラチン14(K14)-CREERトランスジェニックマウスと交配した。コンストラクト及びジェノタイピングを図1A〜1Bに要約する。
我々は、我々の分析のために成体(2カ月)腺性マウス肉球皮膚に着目した。それはヒト皮膚に非常によく似ているからである。タモキシフェン誘導は、抗TRPV4免疫標識、qRT-PCR及びウエスタンブロッティングによって判定したところ(図3A)、皮膚表皮におけるTrpv4発現の効率的なノックダウンをもたらした。しかしながら、tam処置誘導性Trpv4ノックダウン(iKO)マウスにおける皮膚／表皮の肉眼的及び微視的外観は普通だった。ケラチノサイトのCa++シグナル伝達への皮膚新生の確立した依存性を所与として、我々は、興味深いことに、Trpv4ノックダウンは、皮膚／表皮の肉眼的変化をも、基底上でのCa++流入増加によって支配されることが分かっている末端分化特異性マーカーケラチン1(K1)の誘導をももたらさないことに気付いた(図3A及び図1C)。Trpv4欠損皮膚のより厳密な分析により、K14の発現が基底上に持続することが明らかになった。このケラチンは通常、Ca++シグナル伝達の増加及び末端分化の誘導と同時に起こる基底から基底上への移行で下方制御される。
総合すると、これらのより中程度の異常にもかかわらず、8週齢でケラチノサイトにTrpv4ノックダウンを誘導しても、表皮の細胞構造及び層構造に肉眼的妨害をもたらさない。
【０１１０】
実施例3：UVB曝露により誘発される侵害防御行動は表皮発現TRPV4に依存性である。
Trpv4遺伝子ターゲティングの特異性を強調したのもかかわらず、足蹠を神経支配する末梢感覚ニューロンがTRPV4のロバストな発現を示した(図1D)。これにより、我々は、表皮TRPV4欠損がUVB媒介侵害防御行動に決定的に影響するかどうか評価することができた。このために、我々は、2つの関連する従属要素、すなわち熱的刺激と機械的刺激をアッセイし、我々のiKOマウスを完全ヌルTrpv4-/-マウス及びそれらの野生型(WT)コントロールと比較した(図3B)。UV曝露48時間後、tam処理iKOマウスとTrpv4-/-マウスは両方とも侵害性輻射熱(ハーグリーブス検定)に対して、侵害性機械的刺激(自動フォンフライヘアー試験を利用)に向けても、それらのそれぞれのコントロールよりずっと低い感受性を呈した。我々は、表皮特異的TRPV4欠損は、輻射熱及び機械的刺激へのUVB誘発行動感作の低減、すなわち、熱的及び機械的アロディニアの減弱において全般的なTrpv4除去と同等であると結論づけた。
【０１１１】
さらに侵害防御行動の制御における表皮TRPV4の重要性を強調すると、熱的刺激へのUV感受性とTrpv4遺伝子ノックダウンのレベル、特に＜0.45でのTrpv4 mRNAのWTレベルとの間に良い相関性が存在した(図3C)。これは、Trpv4ノックダウンが侵害防御行動に影響する閾値の存在を示した。我々の機械的アッセイにおいては用量応答性はあまり明白でないが(示さず)、我々は、これをこのアッセイにおいて刺激を混乱させることになる強制的後肢(足)運動の関与が原因であるとした。対照的に、ハーグリーブスアッセイは、刺激を混乱させることなく侵害性になる純粋に熱的なキューを適用する。
傷害性刺激の特異性を評価するため、我々は、確立した二相性応答を誘発するホルマリンの足蹠注射で刺激を誘発した。このアッセイにおいて、TRPV4のコンディショナル表皮ノックダウンは、直接的な末梢化学的刺激(相I)又は早期の非適応性神経応答(相II)に効果を及ぼさなかった(図3D)。総合すると、これらの結果は、表皮Trpv4ノックダウンのレベルが、UVB照射に起因する侵害防御行動の減弱の程度にとって決定的因子であることを示唆した。このことは、化学的刺激物誘発侵害防御行動は表皮Trpv4ノックダウンによって影響を受けないので特異的である。
追加のコントロール実験において、Trpv4lox/+ヘテロ接合体マウスは、タモキシフェン又はビヒクルによるCRE誘発に無関係に、UVBに応答して実際に同一の行動感作(WTと同様)を有した(図1E)。これらの知見は、CREERのそれ自体に関する機能的役割を排除し、ケラチノサイトへのTrpv4除去を標的にする祭の我々の取り組みの特異性を繰り返し表明する。また、Trpv4-/-皮膚は、そのWT対応物と等しくUVBに透過性であった。
【０１１２】
実施例4：皮膚神経支配末梢ニューロンの活性化マーカーは行動知見を支持する
WTマウスでは、足蹠はL5 DRGの感覚ニューロンによって神経支配される。我々はこれを免疫標識によって調べた。神経支配ニューロンを感作することが分かっている刺激物キューであるUVBへの足蹠の曝露でTRPV4発現は変化しなかった(図1D)。興味深いことに、感作をコントロールマウスで検証できたが、炎症及び刺激に応答しての感覚ニューロン活性化の既知マーカーであるリン酸化ERK(pERK)についての標識化によって実証されたように、tam処理iKOマウスでは感作が存在しないようだった(図3E)。さらに、L5 DRGニューロンを発現するpERKのサイズ測定により、それらは小サイズ乃至中サイズであることが明らかになり、それらが侵害性刺激の中継に関与する可能性を示唆している(図1F)。これらの結果は、我々のマウスに見られる侵害防御行動欠損によく一致しており、皮膚神経支配DRG感覚ニューロンのUVB誘発活性化の支配における表皮性発現TRPV4の重要な役割をさらに強調する。
【０１１３】
実施例5：UVB誘発皮膚炎症はTRPV4の表皮性発現に依存する
TRPV4の損失がどのようにUVB誘発皮膚に影響するかを理解するため、我々は光学顕微鏡解析及び超微細構造解析を行なった(図4A及び図5A〜5C)。UVBに応答して、顆粒球の表皮内浸潤によって明らかなように、コントロール皮膚内に炎症のロバストな兆候が現れた。表皮では、限局的水疱形成が起こり、広範な空胞化を伴った。ターゲティングが不完全なtam処理iKOマウスにおいては、まだ炎症変化が観察され、これはおそらく中程度に低い重症度であった。しかしながら、際立って対照的に、Trpv4のコンディショナルな表皮除去が完全である皮膚領域内においては、炎症又は水疱形成の兆候は見れらなかった。これらのデータは、UVB曝露に対して皮膚が炎症促進性応答を開始するのに表皮TRPV4が必要であることを確信的に実証した。さらに、炎症は免疫細胞を巻き込み、コンディショナルノックアウトは表皮に特異的だったので、データは、応答における表皮炎症性細胞のクロストークの重要性をさらに強調する。詳細には、これらのデータは、正常皮膚において、表皮ケラチノサイトはUVB応答の一部として炎症性細胞の動員を誘発し、この回路網は表皮TRPV4がノックダウンされると中断されることを暗示する。
【０１１４】
次に我々は、UVBに曝露されたWTマウス、及び応答する免疫細胞集団に生じる特異的TRPV4依存性表皮性シグナルを同定しようとした。IL-6はUV皮膚炎の間中の皮膚表皮活性化の確立したマーカーであり、さらに、IL-6はロバストに発痛性なので、IL-6は表皮シグナルに適した候補であった。実際にコントロールマウスのUVB曝露皮膚においてIL-6の免疫反応性が観察されたのみならず、さらに、このロバストなIL-6上方制御は、コンディショナルに標的にされ、かつ完全ヌルTrpv4ノックアウト皮膚では実質的に排除された(図4B及び図5D)。
マクロファージも好中球も、TNFα、IL-6、IL-8、プロテアーゼ、及びケモカイン等の発痛促進性／発痛性媒介物質の宿主のそれらの発現による疼痛閾値の低減に寄与することが分かっている。CD68(マクロファージ)及び細胞型特異的エラスターゼ(活性化好中球を示し、侵害受容を高めることも知られている)のための免疫染色によって判定されたように、これらの両細胞集団のUVB誘発浸潤は、Trvp4のコンディショナルノックアウトマウスの皮膚では顕著に減少した(図4C〜4D)。対照的に、肥満細胞浸潤物は影響を受けなかった(図5E)。これはマクロファージ及び活性化好中球の下記特異性の知見を強調する：T細胞数はどちらの遺伝子型間でも変化しなかった。総合すると、これらの知見は、ケラチノサイトによるTRPV4発現は、UVB放射線に応答してIL-6を産生し、マクロファージ及び活性化好中球を誘引するそれらの能力にとって極めて重要であることを示した。
【０１１５】
実施例6：初代マウスケラチノサイトにおけるUVBに対するUVB誘発Ca++応答は、TRPV4経由の細胞外Ca++流入に決定的に依存性である。
根底にある関与機構をさらに精査するため、我々は、インビトロで培養した初代マウス表皮ケラチノサイト(1°MK)の特異的かつ狭帯域UVB刺激にカスタマイズした装置を構築した(図6A〜6B及び図2A〜2D)。これは、Ca++感受性染料であるフルオ4を使用できるようにし、かつUVB曝露後の1°MKのCa++動態の評価を可能にした(図6B)。誘発されたCa++シグナルは、UV屈折ガラス製カバースリップによって抹消され、UVBへのカルシウム応答の厳密な依存性を強調している(図6C及び図2A)。
次に、我々は、UVB媒介Ca++応答が細胞外Ca++に依存性であるかどうかを求めて、最初にUVB、次にCa++への逐次曝露によって肯定的知見を記録した(図6D)。この知見は、我々が、UVB媒介Ca++応答におけるTRPV4の役割を直接問いただすことを促した。実際に、Trpv4-/-マウス由来の1°MKは、それらのWT対応物に比べて大いに低減した応答を示した(図6E)。さらに、選択的小分子化合物であるGSK205(Vincent and Duncton. Current Topics in Medicinal Chemistry 2011, 11, 2216-2226)を用いてTRPV4チャネル機能を遮断すると、WT 1°MKは、Trpv4-/- 1°MKの応答に非常に似た応答を示した(図6F)。
ケラチノサイト内でのTRPV3の既知のロバストな発現を考慮して(Moqrich et al., 2005; Peier et al., 2002)、我々は、UVB媒介Ca++増加におけるTRPV3の役割にも取り組んだが、TRPV3選択的阻害剤であるIPPでは効果が観察されなかった(図6G)。同用量のIPPは、カンファー誘発Ca++トランジェントの抑制には有効であり(図2E)、ネガティブな結果を検証した。
【０１１６】
合わせると、我々の実験は、表皮へのUVB曝露がTRPV3チャネルではなくTRPV4経由の細胞外Ca++の流入を誘発することを示した。両チャネルが存在したので、データはさらに、UVB光によってTRPV4チャネルが選択的に活性化されることを示唆した。我々は、WT 1°MK内のTRPV4を直接刺激できるGSK101でRPV4を化学的に活性化することによって裏付けとなる知見を得た。GSK101媒介応答は、外部Ca++に依存性であり、TRPV4阻害剤GSK205によって排除された(図2F)。これらの知見は、TRPV4の直接的な化学的チャネル活性化がUVB誘発Ca++動態の決定的特性を共有することを示した。
TRPV4がUVB誘発Ca++流入にとって十分であるかどうかを評価するため、我々は、高レベルのTRPV4をHEK293上皮細胞に導入した。TRPV4発現は、これらの細胞に、UVBに応答してロバストなCa++シグナル伝達を引き起こす能力を与えた(図2G)。さらに、それらをGSK205に前曝露すた場合、応答が遮断された。従って、異種性TRPV4発現は、UVB放射線が細胞のCa++トランジェントを引き起こすのに十分である。
【０１１７】
実施例7：エンドセリン1増加は、UVB-TRPV4-Ca++応答の重大な意味を持つ表皮性エフェクターである
UVB-TRPV4-Ca++応答は、特異的PLC阻害剤U73122によって実質的に排除されたので、ホスホリパーゼC(PLC)に依存性した(図6H)。PLCシグナル伝達に基づくTRPV4活性化の確実性は、PLCのそれぞれの脂質産物、例えばIP3が関与し得ることを示唆した。それは、Gタンパク質共役型受容体シグナル伝達の関与の可能性をも暗示した。
候補アプローチを利用して、我々は、皮膚ケラチノサイト内で発現されることが分かっているエンドセリン受容体[ET(R)]に着目した。ET(R)は、発痛促進的／発痛的に機能し、かつそれらの同族ペプチドリガンドであるエンドセリン1(ET1)は、ケラチノサイトがUVBに曝露されると増加するので特に良い候補であった。1°MKがET1に曝されると、それらは、それらのUVB誘発Ca++シグナル伝達の顕著な増加を示した(図7A(i))、この応答は、GSK205によって大いに減少したのでTRPV4に依存性であった。この結果と一致して、ET1はGSK101誘発Ca++シグナル伝達を増大させた(図8A)。
我々は次に、プロエンドセリン転換酵素阻害剤であるCGS35066を適用することによってET1分泌を遮断した。この阻害剤は、1°MKにおけるUVB誘発Ca++シグナル伝達を顕著に減少させた(図7A(i))。Ca++シグナル伝達に及ぼすET1の増強効果はTRPV4に依存性であり、UVB-Ca++応答は、インビトロでET1分泌によって著しく持続したので、我々は、ET1に係わるオートクリン／パラクリンシグナル伝達が機能してその同族受容体であるET-R(A)とET-R(B)を活性化するのではなかと仮定した。この考えによく一致して、ET-R阻害剤は、UVBとET1の同時曝露に応答してのCa++シグナルを顕著に減弱させた。興味深いことに、ET-R(A)の拮抗作用は、Ca++応答の後期を排除したが、初期増加は影響を受けないままであり；対照的に、ET-R(B)の拮抗作用は、UVB-Ca++応答をより遅延性応答に変換した(図7A(ii))。両阻害剤の同時適用は、1°MKによるUVB誘発Ca++応答を完全に排除した(図7A(iii))。
【０１１８】
総合すると、これらの知見は、UVB媒介ET1分泌がUVB-TRPV4-Ca++応答にとって有意な寄与因子であることを示す。データはさらに、UVBの他の効果から独立して、ET1-ET(R)同時シグナル伝達がTRPV4依存性Ca++応答を増幅できることを示唆する。この考えを支持して、UVB曝露を省略し、代わりに1°MKをET1と選択的TRPV4アクチベーター4α-PDDMで同時処理することによってUVB-Ca++応答を再現することができた。さらに、この応答は、ET(R)-A阻害によって著しく減弱され、かつET(R)-B阻害によって大いに減少した(図7B)。ET(R)sの選択的拮抗作用は両化合物に対して減弱をもたらしたが、UVBで観察されるパターンとのわずかな差異、すなわち、UVBに対する両ET(R)sの共依存性、及び4α-PDDに対してET(R)-Aより多いET(R)-Bの動員を示した。UVBの多面的効果を所与として、これらのわずかな差異は驚くべきことではなく、全体として、これらの結果は、応答におけるTRPV4及びET(R)のシグナル伝達の相互依存に対して説得力のある支持を提供した。
興味深いことに、未刺激1°MKは、TRPV4及びPLCに依存性の分泌行動である認識できるレベルのET1をもたらた(図8B)。我々は、UVBがTRPV4依存様式でET1の上方制御を引き起こすかどうか試験した。1°MKにおけるET1発現の絶妙な波長依存性を所与として、我々は、Ca++イメージングに関するUVB-LED装置に頼った(図6A及び図2A-D)。UVB曝露1°MKは、ET1免疫標識の増加を示したが、これは細胞をTRPV4阻害剤GSK205及びRN1734と前インキュベートすると減少した(図8C〜8D)。UVB誘発Ca++トランジェントに及ぼすその効果と一致して、PLC阻害剤U73122もET1発現を弱めた。合わせると、これらの知見は、UVBに応答してのET1発現のTRPV4依存性増加、及びET(R)sによるオートクリン／パラクリンシグナル伝達を伴う限定されたフィード・フォワード(feed-forward)機構を示唆した。これがTRPV4依存性Ca++シグナル伝達をもたらし、今度はパラクリン／オートクリン様式でET1シグナル伝達を増幅する。
【０１１９】
インビボでの我々の知見の生理学的関連性を評価するため、我々は肉球をUVBに曝露した。WTマウスの肉球皮膚におけるEdn1 mRNA発現の興味深い時間経過が明白であり、それは120分後にピークになり、24時間で弱くなったが、有意に上昇したままだった。対照的に、Trpv4-/-マウスの肉球皮膚ではEdn1の発現は制御されなかった。これらの知見は、UVBに応答してのTRPV4によるEdn1遺伝子発現のより直接的な制御を示唆している。ET1は、コントロール表皮内で容易に検出されたが、TRPV4欠失表皮内では減少した(図7C)。TRPV4は、フォンフライヘアー刺激に応答しての引っ込め閾値が、表皮下ET1注射に応答して、コントロールマウスでは顕著に低下するが、Trpv4-/-マウスでは完全ヌル及びコンディショナルヌルの両方で低下しないという知見によって判断されたように、侵害防御行動へのET1の促進効果にとっても重大な意味を持った(図7D)。この結果は、ET1の発痛促進／発痛効果が完全にケラチノサイト内のTRPV4に依存性であることを示唆した。以前の研究は、ET1は侵害防御行動を誘発するのに十分であることを示したが、我々のTrpv4コンディショナルヌルマウスにおけるET1の発痛促進／発痛効果の排除は、ET(R)sとTRPV4の両方が、我々のtam処理iKOマウスでは影響を受けなかった感覚求心路によって発現されると仮定すると予想外であった。
【０１２０】
実施例8：ケラチノサイトによるインフラマソームのUVB誘発活性化はTRPV4に依存する
ケラチノサイト内で炎症及び侵害受容へのUVB曝露に関連する別のシグナル伝達機構は、感染及び他の細胞傷害に応答して組み立てられ、かつカスパーゼ活性化並びにサイトカインIL-1及びIL-18の産生において最高に達する炎症カスケードを誘発する大型の多タンパク質複合体であるインフラマソームである。以前は、その形成はCa++シグナル伝達に依存すると示されていたので、我々はインフラマソーム活性化のTRPV4への依存性を明らかにしようと促された。実際に、カスパーゼ1はUVB処理コントロール皮膚内で上方制御されたが、これはTrpv4-/-皮膚内では大きく排除され、tam処理iKO皮膚内では大いに減弱された(図9A〜9B)。さらに、UVBに曝露されたWT 1°MKからのライセートのウエスタンブロッティングによってカスパーゼ1開裂(活性化)が容易に検出されたけれども、Trpv4ヌル対応物では、UVBがなくても、カスパーゼ1発現を欠いてた(図9C)。
同様に、コントロール皮膚表皮のUVB処理に応答して発痛促進性インフラマソーム産物IL-1βの上方制御が容易に検出あれたが、TRPV4欠損表皮ではそうでなかった。これは、免疫標識によってのみならず、肉球浮腫間質液内のIL-1βレベルを測定することによっても実証された(図9D〜9F)。合わせると、これらの結果は、プロIL-1βのカスパーゼ1媒介タンパク質分解開裂を増強して活性IL-1βを形成するインフラマソームのケラチノサイト媒介活性化におけるTRPV4の基本的重要性を確立する。
UVBに応答しての皮膚によるIL-1β分泌に関連して、我々は、Trpv4へのCXCL5依存性を明らかにしようとした。その発現がIL1β／IL1R1シグナル伝達に依存性であるCXCL5は、最近、げっ歯類及びヒトにおいてUVBに応答してケラチノサイト内で発痛促進／発痛様式で機能すると報告された。インフラマソーム機能及びTRPV4上でのIL-1β発現の確実性に一致して、我々は、同様に、UVB誘発発痛促進性／発痛性CXCL5上方制御もケラチノサイト由来TRPV4に依存性であることを見出した(図9G〜9H)。
【０１２１】
実施例9：UVB曝露への侵害受容応答の伝達における表皮由来TRPV4の臨床的関連性
興味深いことに、TRPV4は、UV光線皮膚炎を患うヒト患者の表皮内で顕著に増加した (図10A及び図11)。健康な皮膚コントロールに比べて、急性光線皮膚炎においてET1及びIL-1β免疫染色についてもロバストな増加が見られた(図10A〜10B)。これらの知見は、TRPV4が、有害なUV放射線へのヒト皮膚の種々の応答の1つであるUVB誘発光線皮膚炎にも関与する可能性があることを示唆する。
UVBに応答してのマウス侵害受容への表皮特異的TRPV4欠損の観察された影響を考慮して、またインビトロでの1°MKへの選択的TRPV4ブロッカーの明確な効果のため、我々は、我々の知見の臨床的関連性の可能性を試験した。このために、我々は、TRPV4阻害剤GSK205をWTマウス皮膚に局所適用し、その後に動物をUVBに曝した(図12A)。溶媒処置コントロールマウスは正常な熱過敏性応答を呈したが、1mMのGSK205で処置したマウスは、感受性の約24時間の遅延を示し、用量を5mMのGSK205に増やすと、熱誘発侵害防御行動の持続的減弱をもたらした。注目すべきは、この処置は、フォンフライヘアー機械的刺激へのマウスの感受性の顕著な低減をももたらした。
外部局所処置の特異性を評価するため、我々は、5mMのGSK205をTrpv4-/-マウス対ビヒクルコントロールに適用した(図12A)。侵害防御行動は、如何なる群間差異も示さないけれども、刺激前閾値とは有意に異なった。これらの結果に基づくと、5mMのGSK205によるインビボでの局所処置は、他のチャネル又はシグナル伝達経路への、引っ込め行動に測定できるほどに影響し得るオフターゲット効果を誘発しなかった。マクロファージ及び神経TRPV4のGSK205媒介拮抗作用を排除できないが、表皮は局所適用薬物の初期標的であり、我々が5mMのGSK205で測定した効果は、我々がTrpv4 tam誘発iKO皮膚で観察した効果と一致した。
GSK205局所処置皮膚の病理組織学は、ビヒクル処置足におけるUVB光線皮膚炎の特徴を示し、足が炎症の実質的排除を示した GSK205処置動物(5mM)とは著しく対照的であった(図14A)。皮膚におけるET／Edn1発現のTRPV4依存性を考慮して、我々は、GSK205処置対ビヒクル処置の肉球皮膚内のEdn1 mRNA存在量を測定した。我々は、2時間の時点でのビヒクル処置マウスにおける早期上方制御を検出した。それは24時間でもまだ曝露前動物より有意に高く、未処置WTマウスにおけるEdn1制御及び時間経過に似ている(図14B、図15と比較されたい)。著しく対照的に、かつ病理組織学と調和して、GSK205局所処置皮膚におけるEdn1 mRNA発現は不変であることが分かった。
【０１２２】
これらの知見を検証するため、我々は、GSK205処置肉球皮膚におけるUVB吸収、及びその結果GSK205が日焼け止めとして機能するかどうか試験した。GSK205処置対ビヒクル処置肉球皮膚の同等UVB透過によって実証されたように、結果はネガティブであったけれども、SPF100日焼け止めによるUVB透過の有意な低減によって実証されたように妥当である(図14CD及び図16AB)。これらの結果は、局所適用GSK205の効果が、おそらく表皮ケラチノサイト内のTRPV4に影響を与えることによるTRPV4拮抗作用によって引き起こされることを裏付ける。
我々は、インビボでのGSK205処置への下流UVBエフェクター機構の応答をも調べた。マウス皮膚では、ビヒクル処置でUVBに応答してIL-1βが上方制御されたけれでも、5mMのGSK205では上方制御できなかった(図12B〜12C)。このインビボでの知見は、IL-1β分泌のUVB誘発増加が5μMのGSK205の存在下で完全に排除された1°MKで再現された(図12D)。CXCL5及びIL-6の上方制御について比較的有意な遮断が観察された(図13A〜13B)。
従って、表皮内のUVB誘発シグナル伝達は、TRPV4が特異的小分子阻害剤の局所適用によって拮抗されたときにも、Trpv4が我々のケラチノサイト特異的かつ誘導性Trpv4コンディショナルヌルマウスにおいて遺伝子的に標的にされたときにも減少した。これは、TRPV4のイオンチャネル機能が両実験手法に共通する重大な意味を持つ要因であることを示唆する。総合すると、これらの知見は、GSK205等の選択的TRPV4ブロッカーを、ヒトにおいてUVB曝露によって引き起こされる有害な炎症応答を減らすための治療手法の優れた候補にする。
【０１２３】
実施例10：痒み応答に対するTRPV4の重要性
行動研究は、WTマウスに比べてTrpv4ヌルマウスで減少した引っ掻き行動を示す。ヒスタミン(10%)をC57b/6コントロール(WT)又はTrpv4ヌルマウス(n＝6／群)の頬に皮内注射した。30分にわたって、Trpv4ヌルマウスは、WTマウスに比べて有意な減少を示した((p＜0.01)t検定)(図17)。結果は、TRPV1及びTRPA1と同様に、TRPV4が痒みに関与し、TRPV4活性化のブロッカーは痒みの治療に有益であり得ることを実証した。
【０１２４】
実施例11：痒みにおけるTRPV4の役割についての証拠
選択的にTRPV4が欠失したマウス及び化合物48/80を用いて、TRPV4が痒みに役割を果たすかどうか調べた。化合物48/80(Sigma-Aldrich, St.Louis, MOから入手可能)は、確立した起痒物質であり、脂肪細胞を脱顆粒することによってヒスタミン依存性痒みを誘発する。実施例2で詳述したように、遺伝子ターゲティングによって皮膚ケラチノサイト内でTRPV4チャネルが選択的に欠失したマウスを使用し、タモキシフェンの摂食によって標的対立遺伝子を誘導した。野生型マウスをコントロールとして用いた。
化合物48/80(50μL中100匹の微生物)をマウスに耳介後方注射し、それに応答してのマウスの引っ掻き行動をモニターした。結果を図18に示す。コントロールマウスに比べて、TRPV4チャネルが皮膚ケラチノサイト内で選択的に欠失したマウスでは30分にわたる引っ掻き行動が顕著に減った。
結果は、痒みにおけるTRPV4の役割の追加の証拠、特に、皮膚のケラチノサイト内で発現されるTRPV4イオンチャネルへの痒みの依存性を提供した。結果は、感覚ニューロン又は免疫関連若しくはアレルギー関連細胞ではなく、皮膚上皮細胞(ケラチノサイト)内のTRPV4が、ヒスタミン依存性痒みにおけるTRPV4の発現及び機能の重大な意味を持つ部位であることを明白に示した。これらの知見は、TRPV4チャネルの局所ターゲティングが痒みとうまく闘えることをも示唆した。
【０１２５】
実施例12：化合物の全体的調製
化合物16-8、16-12c、16-13、16-14、16-16、16-18、及び16-19の調製についての一般スキームは以下おとりであり、各工程で下記試薬及び条件を用いる：(i) K2CO3、CH3CN；(ii) Zn、MeOH、12M HCl；(iii) 1,1′-チオカルボニルジイミダゾール；(iv) MeOH中7MのNH3；(v) EtOH、還流。
【０１２６】
【化１８】
2019513749.tif 000032
【０１２７】
工程(i)4-ニトロフェネチルブロミドのSN2置換のための一般手順。粉末化し、オーブン乾燥したK2CO3(1.5当量)及びアミン(1.5当量)を無水CH3CN中のブロミドの室温溶液(0.33M)に順次添加した。反応混合物のLCMSによる分析がブロミドの完全な消費を示すまで(約6〜18時間)反応混合物を80℃(油浴温度)に加熱した。混合物を室温に冷まし、ブライン(2体積当量)で希釈した。結果として生じたエマルションをEtOAc(2×1体積当量)で抽出した。混ぜ合わせた抽出物をシリカゲル(シリカゲルの質量＝2×出発ブロミドの質量)に加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により褐色乃至琥珀色の油として生成物を得た。中間体13a〜13d(工程(i)で生じた三級アミン)の収率を表1に示す。
【０１２８】
表1.  工程(i)で生じた三級アミン13a〜13dの収率
2019513749.tif 000033
【０１２９】
工程(ii) ニトロのアニリンへの還元のための一般手順。ニトロ化合物の溶液(MeOH中0.5M)を氷-NaCl浴内で冷却した。亜鉛末(4.5当量)を一度に添加した後に12M HCl (4.5当量)を2〜3分かけて滴加した。1時間後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。翌朝、混合物を氷-NaCl浴内でもう一度冷却し、pHが14(普遍的pH指示紙)に達するまで30%のNaOH水溶液を滴加した。混合物をCH2Cl2(5体積当量)で希釈し、5分間撹拌した。この時間後、真空にて不溶物を除去し、フィルターケークをCH2Cl2 (2×25mL)で洗浄した。濾液の有機相を分離し、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させた(MgSO4)。乾燥剤を濾過で除去した。シリカゲル(約5g)を加え、濾液を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により清澄な琥珀色油として生成物を得た。中間体14a〜14d(工程(ii)で生じたアニリン)の収率を表2に示す。
【０１３０】
表2.  工程(ii)で生じたアニリン14a〜14dの収率
2019513749.tif 000034
【０１３１】
工程(iii)及び(iv) チオ尿素形成のための一般手順。無水CH2Cl2中のアニリンの溶液(0.22M)を無水CH2Cl2中の1,1’-チオカルボニルジイミダゾールの氷-NaCl浴冷却溶液(2当量、0.15M)に2〜5分かけて滴加した。15分後、冷却浴を除去し、TLC(CH2Cl2中5%のMeOH)による分析が出発アニリンの完全な消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。混合物を氷浴内でもう一度冷却し、MeOH中7MのNH3(10.5当量)を2〜5分かけて滴加した。浴を除去し、混合物を室温で一晩撹拌した。シリカゲル(シリカゲルの質量＝2×出発アニリンの質量)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により純粋なチオ尿素を得た。中間体15a〜15d(工程(iii)〜(iv)で生じたチオ尿素)の収率を表3に示す。
【０１３２】
表3.  工程(iii)〜(iv)で生じたチオ尿素15a〜45dの収率
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【０１３３】
工程(v)チアゾール形成のための一般手順。EtOH中のチオ尿素(0.1M)とα-ブロモアセトフェノン誘導体(1.1当量)の混合物をTLC(CH2Cl2中5%のMeOH)による分析がチオ尿素の完全な消費を示すまで75℃(油浴温度)に加熱した。シリカゲル(シリカゲルの質量＝2×出発チオ尿素の質量)を加え、混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により純粋なチアゾール臭化水素酸塩を得た。最終生成物16-8〜16-19(工程(v)で生じたチアゾール臭化水素酸塩)の収率を表4に示す。
【０１３４】
表4.  工程(v)で生じたチアゾール臭化水素酸塩16-8〜16-19の収率
2019513749.tif 000036
【０１３５】
実施例13：化合物16-8及び16-19の調製
化合物16-8。実施例11で詳述したように化合物16-8を調製した。簡潔には、無水CH3CN(65mL)中のブロミド(5.01g、21.8mmol)、N-ベンジルメチルアミン(4.2mL、33mmol、1.5当量)及びK2CO3(4.6g、33mmol、1.5当量)の懸濁液を80℃(油浴温度)に18時間加熱した。この時間後に出発材料がほぼ完了した。混合物を室温に冷ましてブライン(120mL)で希釈した。結果として生じたエマルションをEtOAc(2×60mL)で抽出した。混ぜ合わせた抽出物をシリカゲル(約10g)に加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(120g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により清澄な濃橙色油として生成物を得た(2.91g、49%)。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30-7.22 (m, 5H), 3.55 (s, 2H), 2.91 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H)。ESIMS: m/z  271 [(M+H)+]。
【０１３６】
【化１９】
2019513749.tif 000037
270.33g/モル
【０１３７】
MeOH(20mL)中のニトロ化合物(2.8g、10.4mmol)の溶液を氷-NaCl浴内で冷却した。亜鉛末(325メッシュ、3g、4.5当量)を添加後、12MのHCl(3.8mL、4.5当量)を2〜3分かけて滴加した。1時間後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。翌朝、混合物を氷-NaCl浴内でもう一度冷却し、pHが14(普遍的pH指示紙)に達するまで30%のNaOH水溶液を滴加した。混合物をCH2Cl2(100mL)で希釈し、5分間撹拌した。この時間後に、真空にて不溶物を除去し、フィルターケークをCH2Cl2(2×25mL)で洗浄した。濾液の有機相を分離し、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させた(MgSO4)。乾燥剤を濾過で除去した。シリカゲル(約5g)を加え、濾液を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(120g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により清澄な琥珀色油として生成物を得た(2.1g、84%)。ESIMS: m/z 241 [(M+H)+]。この物質をさらに分析又は精製せずに次工程で使用した。
【０１３８】
【化２０】
2019513749.tif 000038
【０１３９】
無水CH2Cl2(40mL)中のアミン(2.1g、8.7mmol)の溶液を無水CH2Cl2(120mL)中の1,1’-チオカルボニルジイミダゾール(95%、3.1g、17.4mmol、2当量)の氷-NaCl浴冷却溶液に2〜5分かけて滴加した。15分後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。この時間後にTLC(CH2Cl2中5%のMeOH)による分析が出発アニリンの完全な消費を示した。混合物を氷浴内でもう一度冷却し、MeOH中7MのNH3(13mL、91mmol、10.5当量)を2〜5分かけて滴加した。浴を除去し、混合物を室温で一晩撹拌した。シリカゲル(約5g)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(120g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により琥珀色油としてチオ尿素を得た。これを静置すると凝固して粘着性残渣となった(2.5g、96%)。
【０１４０】
【化２１】
2019513749.tif 000039
299.44g/モル
【０１４１】
チオ尿素(2.5g、8.3mmol)と2-ブロモアセトフェノン(1.8g、9.1mmol、1.1当量)のEtOH(80mL)中の混合物を75℃(油浴温度)に20分間加熱した。この時間後にTLC(CH2Cl2中5%のMeOH)による分析がチオ尿素の完全な消費を示した。シリカゲル(約5g)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2 (120g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により麦わら色ガラスとしてチアゾール臭化水素酸塩を得た(3.73g、93%)。
【０１４２】
【化２２】
2019513749.tif 000040
化合物16-8
【０１４３】
化合物16-19。化合物16-8及び16-18に対するGSK205の活性の調査の結果、ピリジル基の窒素の除去がTRPV4アンタニストの効力を高め、窒素炭素側鎖への追加の炭素の付加がTRPV4アンタニストの効力を高めたようだった。化合物16-19が形成され、16-8及び16-18の構造に基づいていた。図19を参照されたい。
実施例11で詳述したように化合物16-19を調製した。簡潔には、ブロミド(5.01g、21.8mmol)、N-ベンジルエチルアミン(4.9mL、33mmol、1.5当量)及びK2CO3(4.6g、33mmol、1.5当量)の無水CH3CN(65mL)中の懸濁液を80℃(油浴温度)に18時間加熱した。この時間後に出発材料がほぼ完了した。混合物を室温に冷ましてブライン(120mL)で希釈した。結果として生じたエマルションをEtOAc(2×60mL)で抽出した。混ぜ合わせた抽出物をシリカゲル(約10g)に加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(120g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により橙色油として生成物を得た。これは室温で静置すると凝固した(3.3g、53%)。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30-7.22 (m, 5H), 3.55 (s, 2H), 2.91 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.87 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。ESIMS: m/z  285 [(M+H)+]。
【０１４４】
【化２３】
2019513749.tif 000041
【０１４５】
MeOH(20mL)中のニトロ化合物(3.0g、10.4 mmol)の溶液を氷-NaCl浴内で冷却した。亜鉛末(325メッシュ、3g、4.5当量)を添加後、12MのHCl(3.8mL、4.5当量)を2〜3分かけて滴加した。1時間後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。翌朝、混合物を氷-NaCl浴内でもう一度冷却し、pHが14(普遍的pH指示紙)に達するまで30%のNaOH水溶液を滴加した。混合物をCH2Cl2(100mL)で希釈し、5分間撹拌した。この時間後に、真空にて不溶物を除去し、フィルターケークをCH2Cl2(2×25mL)で洗浄した。濾液の有機相を分離し、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させた(MgSO4)。乾燥剤を濾過で除去した。シリカゲル(約5g)を加えて濾液を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(120g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中5%のMeOH)により清澄な琥珀色油として生成物を得た(2.3g、87%)。ESIMS: m/z 255 [(M+H)+]。この物質をさらに分析又は精製せずに次工程で使用した。
【０１４６】
【化２４】
2019513749.tif 000042
【０１４７】
無水CH2Cl2(2mL)中のアミン(0.110g、0.43mmol)の溶液を無水CH2Cl2(6mL)中の1,1’-チオカルボニルジイミダゾール(95%, 0.162g、0.87mmol、2当量)の氷-塩浴冷却溶液に2〜5分かけて滴加した。15分後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。この時間後にTLC(CH2Cl2中10%のMeOH)による分析は出発アニリンの完全な消費を示した。混合物を氷浴内でもう一度冷却し、MeOH中7MのNH3(620μL、4.3mmol、10当量)を2〜5分かけて滴加した。浴を除去し、混合物を室温で一晩撹拌した。シリカゲル(約1g)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(40g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により琥珀色油としてチオ尿素を得、これは静置すると凝固した(0.130g、97%)。
【０１４８】
【化２５】
2019513749.tif 000043
【０１４９】
チオ尿素(159mg、0.51mmol)と2-ブロモアセトフェノン(0.113g、0.56mmol、1.1当量)のEtOH(5mL)中の混合物を75℃(油浴温度)に1時間加熱した。この時間後にTLC (CH2Cl2中10%のMeOH)による分析はチオ尿素の完全な消費を示した。シリカゲル(約1g)を加えて混合物を減圧下で濃縮乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(RediSepRf SiO2(40g)、100%のCH2Cl2→CH2Cl2中10%のMeOH)により麦わら色ガラスとしてチアゾール臭化水素酸塩を得た(0.165g、78%)。
【０１５０】
【化２６】
2019513749.tif 000044
化合物16-19
【０１５１】
実施例14：TRPV4媒介カルシウム輸送への効果
ヒトTRPV4の標的発現を有するN2a培養細胞内でのTRPV4媒介カルシウム流入への化合物(GSK205、16-12、16-13、16-14、16-18、16-8、及び16-19)の効果について試験した。Ca2+イメージングはLiら(Environ. Health Perspect. 2011, 119, 784-93)及びMooreら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013, 110, E3225-E3234)に従って行なった。簡潔には、TRPV4の化学的活性化に応答しての初代マウス表皮ケラチノサイト(1°MK)のCa2+イメージングは、2μMのフラ2-AMを負荷した後、比率計測Ca2+イメージングプロトコルに従い、二重励起用の340/380nmの青色光を用いて行なった。発光比は0.5Hzで取得した。ベースライン比を超える所与の比の増加率として、ベースライン比で除してΔR/R0を決定した。295nmに対して340/380nmでの刺激の近接さのためフラ2が適さないUVBによる細胞の刺激のためには、2μMのフルオ4-AMを代わりに用いた。Ca2+イメージングは488nmの励起、0.5Hzでの発光取得で行い、ΔF/F0として表した。RFPトランスフェクト細胞に効果がない特異的アクチベーターである10nMのGSK101でTRPV4を活性化した。6種の各化合物を2.5μMの濃度まで加え、その効果を観察した。
結果を図20に示す。左側の棒グラフは、2.5μMのそれぞれの阻害剤(10分間プレインキュベーション)の効果を示す。縦軸は、細胞(平均n＞75個の細胞)内のピークカルシウム濃度(nM)である。6種全ての化合物がTRPV4媒介カルシウム流入の抑制に有効であり、16-18及び16-8は最も強力であった。16-19は、16-8を超える抑制増加を示さなかった(データ示さず)。標的過剰発現を有する培養細胞内ではこの濃度ではGSK205は非常に低い効力を有すると認められた。
【０１５２】
実施例15：マウスのインビボ疼痛モデル
マウスのインビボ疼痛モデルを用いて、疼痛の軽減における化合物の効果を試験した。マウスのホルマリン誘発刺激行動測定のため、マウスは栄養が行き届き、よく休息が取れており、日の同時刻に、マウスの概日リズムの同時点で試験した。試験前に少なくとも30分間マウスをプレキシグラスチャンバーに順化させ、マウスは、Luccariniら(J. Pain, 2006, 7, 908-914)にさらに詳述されているように、4%のホルマリン(市販の37%のホルムアルデヒドと生理食塩水(NS)の水溶液から希釈した)の10μLの皮下注射を30ゲージ針を介して右のウィスカーパッド(whiskerpad)に受けた。生理食塩水をコントロール注射として用いた。注射後、マウスを即座にチャンバー内に戻し、45分の観察時間にわたって個人消費者型ビデオカメラで擦る行動を記録した。記録時間を5分の9ブロックに分け、ブロック毎に動物が注射領域を主に同側前足で、まれに後足で擦ることに費やす時間を測定することによって侵害受容スコアを決定した。この前足で擦る行動は、疼痛によって誘発され、痒み行動とは異なる。行動解析は、処置が見えない観察者が行なった。
特異的化合物GSK205、16-8、及び16-19がホルマリン誘発侵害受容行動に及ぼす効果を調査するため、マウスは、ホルマリン注射の15分前にウィスカーパッド中へ化合物の単回皮下注射を受けた(10μL、4%のDMSOに溶解)。コントロール動物は同体積のNS、4%のDMSOを受けた。
【０１５３】
結果を図21に示す。図21Aは、BL6マウスへのホルマリンのウィスカーパッド注射に応答しての侵害防御行動の時間経過を示す。二相応答及び「クリーン」なコントロールに留意されたい。図21Bは、1群当たりn＝10匹の動物による図21Aの定量化を示す。ホルマリン注射に応答しての有意な増加に留意されたい。図21Cは、化合物を前もって0.5mM/10μLで局所注射したときの同様の定量化を示す。この濃度は、Trpv4-/-マウスの残存侵害防御行動に効果を及ぼさなかった。16-8及び16-19に応答して、特に中央の第2相で起こった侵害防御行動の有意な減弱にもかかわらず、この濃度ではGSK205の効果がないことに留意されたい。図21Dは、3種の化合物の時間経過を示す。GSK205は、この濃度ではコントロールと異ならなかったが、16-19及び16-8は侵害防御行動を顕著に減弱した。より低い親油性の16-8では45分時点でコントロールレベルに対して低減し、より高い親油性の16-19ではこの時点でコントロールレベルに逆転したことに留意されたい。ホルマリンが末梢ウィスカーパッド神経終末上にもたらす直接刺激によって引き起こされた第1相に影響を与えた化合物がないことにも留意されたい。
【０１５４】
実施例16：UVB曝露誘発侵害防御行動
UVB過剰曝露後の侵害防御行動(疼痛への応答)に及ぼす化合物の効果を試験した。行動試験を行なって、後足に加えられた機械的フォンフライヘアー刺激又は熱的刺激に応答しての引っ込め閾値の低減を評価した。フォンフライ装置(Ugo Basile)は、可撓性鋼線で後足下から機械的刺激を与えた。引っ込めをもたらす力を決定した。熱的刺激試験のためには、赤外線ビーム(ハーグリーブス試験装置；Ugo Basile)により加えられた下からの熱で足を刺激し、引っ込め潜時を記録した。UV曝露の前後に引っ込め閾値を確認した。tam／油の最後の適用の3〜5日後に、Bio-Rad Gel Doc 2000 UVトランスイルミネーター(302nm)を用いて600mJ/cm2の被曝量で5分間マウスをUVBに曝した。これは、日焼けを誘導し、日焼け誘発疼痛を研究するという理論的根拠に沿って、最小の紅斑誘導用量の5〜10倍に相当する。
結果を図22に示す。この図は、UVB過剰曝露誘発侵害防御行動の化合物16-8による有効な局所処置を実証する。局所適用した16-8は、UVB曝露後の疼痛への応答の低減に特に有効であるが、この濃度(40μL中0.5mM)のGSK205はビヒクと同程度の有効性である(n＝4／群)。
【０１５５】
実施例17：TRPA1への効果
TRPA1に及ぼす化合物の効果を試験した。N2a永久細胞にpcDNA3.1発現プラスミドを用いてヒトTRPA1 cDNAをトランスフェクトした。それらにeGFP発現プラスミドをコトランスフェクトするか、又は、コントロールについては、eGFPプラスミドのみをトランスフェクトした。
ビヒクル処置TRPA1発現細胞は、両方とも求電子性TRPA1アクチベーターであることが分かっている60μMのAITC及び1mMのカラシ油にも応答してロバストなCa2+トランジェンスを示した。しかしながら、eGFP発現コントロールトランスフェクト細胞(TRPA1なし)は、TRPA1アクチベーターAITCに応答しなかった。次に細胞を10分間5μMの化合物16-8及び16-19に前曝露した。
結果を図23に示す。＞75個の細胞から平均Ca2+シグナルを示してある。60μMのAITCによって誘発された結果のCa2+トランジェントは、5μMの化合物16-8又は16-19の投与により＞80%減少した。これは両化合物の明らかなTRPA1阻害効果を示している。従って、化合物16-8及び16/8-18hyは、ヒトTRPA1に対する阻害活性を示した。25μM以下の用量では、GSK205はTRPA1活性を抑制しなかった。
【０１５６】
実施例18：TRPV1、TRPV2、及びTRPV3への効果
TRPV1、TRPV2、及びTRPV3への化合物の効果を試験した。方法は、実施例15に記載の方法と同様であった。簡潔には、N2a細胞にヒトTRPV1、TRPV2、又はTRPV3をトランスフェクトした。eGFPトランスフェクションをコントロールとして用いた。TRPV1の特異的刺激のためには、5μMのカプサイシンを用いた。TRPV2の刺激のためには、TRPV2が浸透圧に応答性であるという以前の報告に基づいて、低浸透圧性(260mosmol/L)を使用した。N2a細胞は低浸透圧性に応答せず、コントロールトランスフェクト細胞にも応答しなかった。TRPV3発現細胞のためには、カンファー(市販原液の20%)を用いた。カンファー自体はeGFP発現コントロールN2a細胞又は天然N2a細胞を刺激しなかった。TRPA1発現N2a細胞に関しては、実施例15で上述したように刺激及びコントロールプロトコルを適用した。
結果を図24に示す。この図は、TRPV1、TRPV2、及びTRPV3の特異的刺激に対するCa2+シグナルを示している。コントロールトランスフェクトN2a細胞はカプサイシン(TRPV1活性化)又はカンファー(TRPV3活性化)に応答しなかった。TRPV1、TRPV2、及びTRPV3について、Ca2+トランジェンスは、16-8又は16-19の投与によって影響を受けなかった。従って、化合物16-8及び16-19は、TRPV1、TRPV2、及びTRPV3に影響を及ぼさなかった。
【０１５７】
実施例19：GSK205誘導体の化学合成及び細胞ベースアッセイにおけるそれらのTRPV4阻害効力の評価。
我々は、図25に示すように、7つの主要な修飾をもたらすことによって、化合物GSK205を修飾した。一次選別で明らかになった2つの最も強力な化合物のそれぞれの修飾を併せ持つ1つの追加化合物(16-19)をも合成した。我々は、Ca++イメージングアッセイにおいて、哺乳動物(ラット)のTRPV4の発現が管理されたニューロン2a(N2a)永久組織培養細胞内でのこれらの合成化合物のTRPV4阻害効力を評価した。選択的アクチベーター化合物GSK1016790A(GSK101)を5nMで用いてTRPV4チャネルを刺激した。第1ラウンドのアッセイのため、全てのTRPV4阻害化合物を5μMで用いた(図26A)。化合物16-43CはCa++流入を抑制せず、この効果はビヒクルコントロールと同様であった。全ての他の化合物はTRPV4媒介Ca++流入を抑制し、化合物16-8及び16-18が2つの最強化合物として浮上した。16-8と16-18の両方の修飾を組み入れた化合物16-19もTRPV4媒介流れの抑制に有効であった。しかしながら、我々は、両方とも実質的にCa++流入を排除した化合物16-19と化合物16-8の間の有意な差を見出さなかった。
【０１５８】
次に我々は、親化合物GSK205の4.19μMというIC50に対して、それぞれ、0.45、0.81及び0.59μMのIC50を示した化合物16-8、16-18及び16-19についてさらに詳細な用量依存性評価を行なった。これらの知見は、GSK205誘導化合物の効力の16-8では約10倍、16-19では8倍、16-18では5倍の上昇に相当する。驚くべきことに、化合物16-19は、16-8より有意には効力が高くなく、16-8は16-18より効力が高かった。これらの結果に基づいて、我々は、16-8及び16-19対GSK205(コントロール)をパッチクランプ研究で試験した(図27)。我々の結果は、TRPV4媒介流れの減弱において親分子GSK205に比べて化合物16-8及び16-19の有意に高い効力を示す(全て5μMで適用)。
我々は次に最強化合物16-8対親化合物GKS205の効力を、TRPV4を発現することが分かっており、かつTRPV4機能が関連生物学的状況で実証されている2つの型の初代細胞で評価することを決めた。我々は、顕著なTRPV4発現を有し、軟骨組織内ではTRPV4が生理学的機械的負荷のメカノトランスデューサーとして働いて細胞の同化応答、ひいては組織恒常性を制御する関節軟骨細胞を調査した19。さらに、我々は、星状細胞浮腫の制御、脳の血流とのニューロン活性の連関、及びCNS外傷の媒介においてTRPV4発現及び関連機能が実証されている脳星状細胞を研究した35~37。我々の主目的を満たすため、両細胞型で我々は、親分子GSK205に比べて顕著に高い化合物16-8の効力を観察した(図28)。チャネルの過剰発現を管理せずに機能的かつ生物学的に関連するTRPV4を発現するこれらの初代細胞におけるGSK205誘導体の阻害効力の評価は(図28)、異種的にTRPV4過剰発現する不死化細胞株を用いるさらに基礎的な研究の知見を直接確証し(図26)、新たに誘導された化合物の高い効力に関する我々の結論を強く指示する。総合すると、我々は、化合物16-8を異種系においてμM未満で、その親分子GSK205に比べて約10倍高い効力を有するTRPV4阻害化合物として同定した。さらに、16-8は、TRPV4発現性初代骨格及びCNS由来細胞においてさらに効果的であることが判明した。しかしながら、さらに効力を増強しようとした化合物16-19への合理的な修飾は、意図した効果をもたらさなかった。
関連インビボ動物モデルでこれらの化合物を試験する前に、我々は次に、細胞毒性並びに他の選択されたTRPイオンチャネルに対するこれらの化合物の特異性を試験した。
【０１５９】
実施例20：新規TRPV4阻害剤は、TRPA1の強力な阻害を呈するにもかかわらず、選択的で、良性毒性プロファイルを有する。
異種的にトランスフェクトした永久N2a細胞においては、我々は、TRPV1、TRPV2及びTRPV3に対する化合物16-8又は16-19の阻害効力を観察しなかった(図29A)。しかしながら、我々は、化合物16-8及び16-19についてTRPA1に対してμM未満の阻害効力、GSK205についてはμMの効力、かつ、注目すべきことに、化合物16-18については有意な活性がないことを発見した(図29B)。我々は、化合物16-8、16-19、GSK205及び16-18について、それぞれ0.41、0.43、5.56μM及び＞25μMというIC50を記録した。
細胞毒性に関して、我々は、20μMで、2日の時間経過にわたる感受性細胞の生存能アッセイを用いて毒性の第1の証拠、及び40μMでさらに明白な効果を見出した(図30)。
総合すると、我々の結果は、化合物16-8及び16-19は、μM未満の効力でTRPA1をも阻害することを示し、それらの細胞毒性対TRPV4/TRPA1に対するそれらの阻害効力は、50〜100の系数で変動する。
広範囲の受容体及びイオンチャネルに対する16-8、16-18及び16-19の特異性の評価は、これらの化合物の臨床への橋渡しに向けた献身的な将来の研究の主題となる。
我々は次に、TRPV4及びTRPA1の両方に頼ることが分かっている刺激性疼痛のインビボモデルに対してこれらの化合物を評価した。
【０１６０】
実施例21：TRPV4/TRPA1二重阻害剤は、三叉神経刺激性疼痛の抑制に有効である。
我々は以前にホルマリン用の細胞受容体としてTRPV4を記載したことがあり13、三叉神経媒介刺激性疼痛行動に焦点を合わせて、そのホルマリン刺激誘発疼痛行動の関与を実証した。この最近の研究では、我々は三叉神経ホルマリン誘発疼痛においてTRPA1と共にTRPV4の同時寄与を実証した。我々は、用量依存様式でGSK205を用いて三叉神経ホルマリン誘発疼痛行動の効率的な減弱をも示した。さらに、我々は、GSK205によって遮断された三叉神経テリトリーにおけるTRPV4の選択的活性化に応答しての刺激性疼痛行動、及びTrpv4-/-完全ヌルマウスに該効果が存在しないことを見い出した。
理論的根拠として妥当なこの背景を踏まえて、我々は、TRPV4/TRPA1二重阻害化合物16-8及び16-19を、コントロールとしてGSK205を用いて、10mg/kgの用量で全身適用した。我々は、(i)三叉神経ホルマリン疼痛モデルはTRPV4とTRPA1の両方に頼り、(ii)我々は橋渡し用途に向けて最初にTRPV4/TRPA1二重阻害分子を開発する意図だったので化合物16-18(TRPV4のみの阻害剤)の試験より二重阻害剤に優先順位をつけた。どの化合物も、急性化学的組織損傷疼痛に相当するホルマリンウィスカーパッド注射後の早期相において疼痛行動を有意に減少させるのに有効でなかった。早期の非適応性神経可塑性を意味する神経性媒介疼痛として理解されている遅延相においては、化合物16-8及び16-19に応答してホルマリン誘発疼痛行動の有意な減弱があり、化合物16-8は注目すべき＞50%で疼痛行動を減少させ13、化合物16-19もロバストな効果を示した(図31A、31B)。注目すべきは、以前は皮内注射で適用したときに用量依存様式で有効だった13、GSK205の10mg/kgの全身投与では有意な効果はなかった。従って、化合物16-8及び16-19は、全身投与により、三叉神経ホルマリン疼痛の後期の神経媒介相を効率的に減弱し、これらの化合物は、それらの親化合物GSK205よりインビボで強力である。
【０１６１】
これらのインビボ知見を考慮して、化合物16-8及び16-19のさらなるTRPA1阻害効果を示す異種細胞発現系からの結果と統合して、我々は、それらのインビボでのTRPA1阻害効力をより良く明らかにするため、Trpv4の遺伝子コード化非存在(Trpv4-/-マウス)の状況におけるこれらの化合物の有効性を評価すると決断した。我々は、我々の以前の報告と一致して13、Trpv4-/-マウスにおいてホルマリンモデルの全ての相での有意な残存刺激性疼痛行動を観察した(図31C、31D)。中間相の疼痛行動は、両方ともこの場合もやはり10mg/kg(体重)で適用した化合物16-8及び16-19で実質的に排除された。後期相の疼痛行動は、化合物16-8を適用すると著しく減少し、化合物16-19を適用すると、16-8ほどの効力ではないが、ビヒクル処置Trpv4-/-に対してさらに有意に減少した。以前の報告に基づいて38、標準TRPA1阻害化合物であるA967079を25mg/kg(体重)でポジティブコントロールとして用いてTRPA1を阻害した。Trpv4-/-マウスにおける疼痛行動の低減は、後期の神経相での50%より著しかった。我々は、両方ともホルマリン誘発三叉神経痛行動を同様にロバストな程度に低減させた25mg/kg(体重)の標準TRPA1阻害化合物A967079に対して10mg/kg(体重)の化合物16-8の等しい効力に注目した(図31C、31D)。我々は、化合物16-8は、TRPA1の三叉神経刺激性疼痛への寄与を評価するために特別に設計されたインビボ刺激性疼痛モデルにおいて強力なTRPA1阻害剤として、及び確立した標準TRPA1拮抗化合物と少なくとも同じくらい強力に機能するとも結論づけた。
【０１６２】
実施例22：強力なTRPV4/TRPA1二重阻害剤16-8は、急性膵炎における炎症及び疼痛の制御に有効である。
これらの知見は、細胞ベースの結果及び生きた動物の結果に基づいて、化合物16-8を強力なTRPV4/TRPA1二重阻害分子と定義する。従って、我々は、二重阻害剤は膵炎の疼痛及び炎症を効率的に治療できるという原理証明を確立するため、化合物16-8をTRPV4とTRPA1の両方に頼るさらに特異的な前臨床疼痛モデルで試験すると決断した。膵炎モデルは、この条件での新しい有効な治療のために未だ対処されていない臨床的必要性39、並びに膵炎の疼痛及び炎症におけるTRPV4とTRPA1の両方の既知の役割8、25、40のため、橋渡しの高い可能性を提供するので、我々は膵炎モデルを使用した。
セルレインで膵炎を誘導して、急性膵炎用によく特徴づけらたモデル41を誘導した。炎症誘導の30分前に動物を10mg/kg(bw)の16-8を腹腔内注射で処置した。我々は、炎症パラメーター、すなわち、16-8処置動物では実質的に排除された浮腫の有意な減弱を見出した。さらに、膵臓の炎症性損傷のマーカーである血清アミラーゼが16-8処置で有意に減少し、同様に膵臓の炎症性細胞浸潤のマーカーとしての膵臓のミエロペルオキシダーゼ含量が有意に減少した。膵臓の炎症に関する病理組織学スコアも有意に下がった(図32A〜32E)。注目すべきは、疼痛行動が、膵臓浮腫への16-8の効果と同様に、化合物16-8で処置すると実質的に排除された。従って、化合物16-8は、急性化学的誘発膵炎の疼痛及び炎症の減弱に非常に有効であることが分かった。
【０１６３】
実施例23：新規TPRV4/TRPA1阻害剤の良性予備的毒性及び薬物動態。
強力な16-…化合物の有望な特性に促されて我々はインビボ毒性及び薬物動態に関してそれらの初期の予備的特徴を明らかにしようと試みた。これらは将来の研究でさらに広範かつ徹底的な調査が続くことになる。このために、我々は化合物16-8を総合的な最強の二重TRPV4/TRPA1阻害剤として選択し、潜在的に高い親油性を有する化合物16-19をも選択する(表5)。我々は、いくつかの生物及び血漿中の化合物濃度を測定し、肝臓及び腎臓内ではマイクロモル／マイクロモル未満の濃度、心臓、脳、脳幹、三叉神経節及び皮膚内では100nM未満の濃度を検出した。注目すべきは、化合物は、血漿中では実質的に検出できなかった(図33A)。我々は、非神経組織、特に肝臓及び腎臓内ではより高い濃度の16-19を検出した。これはおそらく化合物16-19の高い親油性に関連するパターンである。この知見に基づいて、我々は次に6時間及び24時間の時点で調べ、1時間時点に比べて、6時間時点で10〜20倍高い16-19の濃度を検出した(図33B〜33D)。これは、固形器官への化合物のゼクエストレーション(sequestration)を意味する。24時間時点での値は、6時間時点より低かったが、1時間時点より高かった。これは進行中の持続的な化合物のクリアランスを示している。我々は次に、血漿中の低い／検出されない濃度は、化合物16-19を用いて行なった血漿中で37℃にて4時間のインキュベーション後に検出可能な化合物の損失がないことを示す図33Eに示されるように、血漿中での化合物の変性／分解によって引き起こされないことを確証した。
【０１６４】
表5.  GSK205、16-8、及び16-19の特性。
2019513749.tif 000045
MW＝分子量。PSA＝極性表面積。C-logP(oct/H2O)は計算値logP(オクタノール溶解度／H2O溶解度)を示す。
【０１６５】
我々は次に、化合物16-8及び16-19についての基本的な予備的インビボ毒性研究を両方とも10mg/kg(bw)で行なった。これはインビボ疼痛モデルで有効な濃度だった。我々は、化合物16-8及び16-19をビヒクルと比較するときに心臓、肝臓及び腎臓毒性の最初の証拠を検出しなかった(図34)。心臓評価のため、我々は、6時間時点でEKGによって行なった1時間にわたる心拍数の差及び変化を検出しなかった。腎機能のマーカーとしての血清クレアチニン及び肝細胞完全性のマーカーとしてのアラニン-アミノ-トランスフェラーゼ(ALT)は、化合物16-8又は16-19で処置した動物で有意には上昇しなかった。従って、強力な16-…化合物についての初期証拠は、それらの許容できる予備的薬物動態特性並びに肉眼的全身毒性の欠如を強調する。これらの化合物の薬物動態及び毒性のさらに詳細な評価には将来研究が必要である。
【０１６６】
特定態様の上記記述は、本発明の一般的性質を非常に完全に明らかにするので、当技術分野のスキル内の知識を適用することによって、過度の実験をせずに、本開示の一般的概念から逸脱することなく、容易に該特定態様を修正し及び／又は種々の用途に適応させることができる。従って、このような適応及び修正は、ここに提示した教示及び指針に基づいて、開示態様の等価物の意味及び範囲内であるよう意図される。本明細書の表現又は用語法は記述のためであり、限定のためではなく、従って本明細書の表現又は用語法は、教示及び指針を考慮して当業者が解釈すべきであるという共通認識がある。
本開示の幅及び範囲は、上記例示態様のいずれによっても限定されるべきでなく、下記特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。
本出願で引用した全ての公表文献、特許、特許出願、及び／又は他の文書は、あたかも各個々の公表文献、特許、特許出願、及び／又は他の文書が個々に全ての目的で参照によって組み込まれると示されたかのように、全ての目的で参照によって同程度までそれらの全体が組み込まれる。
【０１６７】
完全性の理由のため、本発明の種々の態様を下記番号付き条項で提示する。
条項1.  阻害剤及びヨウ素を含む組成物であって、阻害剤がTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、組成物。
条項2.  阻害剤及び麻酔剤を含む組成物であって、阻害剤がTRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、組成物。
条項3.  阻害剤がTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない、条項1又は2に記載の組成物。
条項4.  阻害剤が下記式I：
【０１６８】
【化２７】
2019513749.tif 000046
(I)
【０１６９】
（式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；DはC1-C3アルキレンであり；Eは結合、又はC1-C2アルキレンであり；かつRは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される）
の化合物を含む、条項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
条項5.  阻害剤が下記化合物から選択される化合物を含む、条項4に記載の組成物。
【０１７０】
【化２８】
2019513749.tif 000047
2019513749.tif 000048
2019513749.tif 000049
【０１７１】
条項6.  対象の衛生化方法であって、対象を、条項1及び3〜5のいずれか1項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
条項7.  対象上の微生物の個体数の減少を引き起こすのに十分な時間、対象が組成物と接触する、条項6に記載の方法。
条項8.  組成物が対象の表面に投与され、この表面は、皮膚領域、創傷、及び潰瘍から成る群より選択される、条項6又は7に記載の方法。
条項9.  組成物が対象を消毒する、条項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
条項10.  組成物が対象を滅菌する、条項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
条項11.  組成物が殺菌活性を有する、条項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
条項12.  対象の麻酔方法であって、条項2〜5のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
条項13.  対象の麻酔方法であって、麻酔剤と阻害剤を対象に同時投与することを含み、阻害剤が、TRPV4、TRPA1、又はその組み合わせを阻害する、方法。
条項14.  組成物が衛生化して疼痛を軽減する、条項13に記載の方法。
条項15.  それを必要とする対象の皮膚科学的障害の治療及び／又は予防方法であって、有効量のTRPV4及び／又はTRPA1阻害剤を対象に投与することを含む、方法。
条項16.  皮膚科学的障害が、膵炎、てんかん、関節炎、変形性関節症、多発性硬化症、脳卒中、CNS自己免疫状態、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳浮腫、CNS感染症、精神神経障害、骨格変性・炎症性障害、三叉神経痛、大腸炎、及び硬化症から成る群より選択される、条項15に記載の方法。
条項17.  三叉神経痛が頭痛を含む、条項16に記載の方法。
条項18.  TRPV4及び／又はTRPV4阻害剤が、下記I：
【０１７２】
【化２９】
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(I)
【０１７３】
（式中、A、B、及びCは、芳香族、ヘテロ芳香族、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基から成る群より独立に選択され；DはC1-C3アルキレンであり；Eは結合、又はC1-C2アルキレンであり；かつRは、水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、芳香環、又はヘテロ芳香環から成る群より選択される）
の化合物を含む、条項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
条項19.  TRPV4及び／又はTRPA1阻害剤が下記化合物から選択される化合物を含む、条項18に記載の方法。
【０１７４】
【化３０】
2019513749.tif 000051
2019513749.tif 000052
2019513749.tif 000053
【０１７５】
条項20.  化合物がTRPV4及びTRPA1を阻害する、条項18又は19に記載の方法。
条項21.  化合物がTRPV1、TRPV2、又はTRPV3を阻害しない、条項18又は19に記載の方法。
【０１７６】
配列
(配列番号:1)  5’-CCTGCTGGTCACCTACATCA
(配列番号:2)  5’-CTCAGGAACACAGGGAAGGA
【図１Ａ】
2019513749.tif 000062
【図１Ｂ】
2019513749.tif 000063
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2019513749.tif 000068
【図２Ａ】
2019513749.tif 000069
【図２Ｂ】
2019513749.tif 000070
【図２Ｃ】
2019513749.tif 000071
【図２Ｄ】
2019513749.tif 000072
【図２Ｅ】
2019513749.tif 000073
【図２Ｆ】
2019513749.tif 000074
【図２Ｇ】
2019513749.tif 000075
【図３Ａ】
2019513749.tif 000076
【図３Ｂ】
2019513749.tif 000077
【図３Ｃ】
2019513749.tif 000078
【図３Ｄ】
2019513749.tif 000079
【図３Ｅ】
2019513749.tif 000080
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019513749.tif 000082
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
2019513749.tif 000086
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2019513749.tif 000089
【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
2019513749.tif 000091
【図６Ｂ】
2019513749.tif 000092
【図６Ｃ】
2019513749.tif 000093
【図６Ｄ】
2019513749.tif 000094
【図６Ｅ】
2019513749.tif 000095
【図６Ｆ】
2019513749.tif 000096
【図６Ｇ】
2019513749.tif 000097
【図６Ｈ】
2019513749.tif 000098
【図７Ａ】
2019513749.tif 000099
【図７Ｂ】
2019513749.tif 000100
【図７Ｃ】
2019513749.tif 000101
【図７Ｄ】
2019513749.tif 000102
【図８Ａ】
2019513749.tif 000103
【図８Ｂ】
2019513749.tif 000104
【図８Ｃ】
2019513749.tif 000105
【図８Ｄ】
2019513749.tif 000106
【図９Ａ】
2019513749.tif 000107
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2019513749.tif 000109
【図９Ｄ】
2019513749.tif 000110
【図９Ｅ】
2019513749.tif 000111
【図９Ｆ】
2019513749.tif 000112
【図９Ｇ】
2019513749.tif 000113
【図９Ｈ】
2019513749.tif 000114
【図１０Ａ】
2019513749.tif 000115
【図１０Ｂ】
2019513749.tif 000116
【図１１】
2019513749.tif 000117
【図１２Ａ】
2019513749.tif 000118
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2019513749.tif 000120
【図１３Ａ】
2019513749.tif 000121
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2019513749.tif 000123
【図１４Ｂ】
2019513749.tif 000124
【図１４Ｃ】
2019513749.tif 000125
【図１４Ｄ】
2019513749.tif 000126
【図１５】
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【図１６Ａ】
2019513749.tif 000128
【図１６Ｂ】
2019513749.tif 000129
【図１７】
2019513749.tif 000130
【図１８】
2019513749.tif 000131
【図１９】
2019513749.tif 000132
【図２０】
2019513749.tif 000133
【図２１Ａ】
2019513749.tif 000134
【図２１Ｂ】
2019513749.tif 000135
【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
2019513749.tif 000137
【図２２】
2019513749.tif 000138
【図２３】
2019513749.tif 000139
【図２４Ａ】
2019513749.tif 000140
【図２４Ｂ】
2019513749.tif 000141
【図２４Ｃ】
2019513749.tif 000142
【図２５】
2019513749.tif 000143
【図２６Ａ】
2019513749.tif 000144
【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
2019513749.tif 000148
【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３４Ａ】
2019513749.tif 000167
【図３４Ｂ】
2019513749.tif 000168
【図３４Ｃ】
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【図３５】
2019513749.tif 000170
【配列表】
2019513749000001.app
【国際調査報告】
2019513749.tif 000171
2019513749.tif 000172
2019513749.tif 000173