(57)【要約】【課題】プロリン水酸化酵素及びその応用を提供する。【解決手段】該プロリン水酸化酵素は、(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が突然変異し、且つプロリン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、または(ｃ)(ｂ)中の一つまたは複数のアミノ酸の突然変異を保留し、プロリン水酸化酵素活性を有し、且つ(ｂ)中のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７８％の相同性を有するタンパク質とを含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列のタンパク質及び遺伝子工学手段でそれを改善して得た突然変異体によって、既存のプロリン水酸化酵素より高い触媒特異度または顕著に向上された触媒活性を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が突然変異され、且つプロリン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、または(ｃ)前記(ｂ)中の一つまたは複数のアミノ酸の突然変異を保留し、プロリン水酸化酵素活性を有し、且つ前記(ｂ)中のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７８％の相同性を有するタンパク質と、を含むことを特徴とするプロリン水酸化酵素。
【請求項２】
前記突然変異のアミノ酸部位が、Ｈ１４、Ｓ１６、Ｔ２５、Ｆ２６、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｄ５４、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｋ８６、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１６２、Ｌ１６６、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｓ１５４、Ｎ１６５、Ｄ１７３、Ｋ２０９、Ｉ２２３、Ｓ２２５から選ばれる一つまたは複数であることを特徴とする請求項１に記載のプロリン水酸化酵素。
【請求項３】
前記突然変異が、Ｈ１４Ｒ、Ｓ１６Ｎ、Ｔ２５Ｇ、Ｔ２５Ｒ、Ｆ２６Ｌ、Ｅ２７Ｋ、Ｄ３０Ｓ、Ｓ３３Ｎ、Ｅ３４Ｎ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｌ、Ｅ３４Ｓ、Ｅ３４Ｄ、Ｙ３５Ｗ、Ｙ３５Ｋ、Ｓ３７Ｗ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｅ、Ｓ３７Ｎ、Ｓ３７Ｔ、Ｓ３７Ｃ、Ｉ３９Ｋ、Ｉ３９Ｒ、Ｗ４０Ｆ、Ｋ４１Ｅ、Ｄ５４Ｇ、Ｈ５５Ｑ、Ｓ５７Ｌ、Ｉ５８Ｔ、Ｉ５８Ｙ、Ｉ５８Ａ、Ｉ５８Ｒ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ５８Ｓ、Ｉ５８Ｃ、Ｋ８６Ｐ、Ｔ９１Ａ、Ｆ９５Ｙ、Ｃ９７Ｙ、Ｉ９８Ｖ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｔ、Ｋ１０６Ｑ、Ｆ１１１Ｓ、Ｋ１１２Ｅ、Ｋ１１２Ｒ、Ｓ１５４Ａ、Ｋ１６２Ｅ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１１８Ｆ、Ｉ１１８Ｖ、Ｉ１１８Ｒ、Ｈ１１９Ｒ、Ｈ１１９Ｆ、Ｉ１２０Ｖ、Ｋ１２３Ｄ、Ｋ１２３Ｎ、Ｋ１２３Ｑ、Ｋ１２３Ｓ、Ｋ１２３Ｉ、Ｋ１２３Ｔ、Ｔ１３０Ｎ、Ｄ１３４Ｇ、Ｖ１３５Ｋ、Ｎ１６５Ｈ、Ｄ１７３Ｇ、Ｋ２０９Ｒ、Ｉ２２３Ｖ、Ｓ２２５Ａのうちのいずれか一つまたは複数を含むことを特徴とする請求項２に記載のプロリン水酸化酵素。
【請求項４】
前記突然変異が、Ｅ２７Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ（「／」は「または」を表す）、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｋ１２３Ｄ＋Ｗ４０Ｆ、Ｋ１２３Ｄ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｄ３０Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ１１８  Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｗ４０Ｆ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ９８Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｆ２６Ｌ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｉ２２３Ｖ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｉ２２３Ｖ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｎ１６５Ｈ、  Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ３４Ｇ＋Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｔ２５Ｇ／Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ８６Ｐ、Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ１２０Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｄ３０Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ１１２Ｅ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９��／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｄ３０Ｓ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｔ２５Ｇ／Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ及びＨ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖという組み合わせのいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のプロリン水酸化酵素。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のプロリン水酸化酵素をコーディングすることを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡ分子が接続されたことを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項７】
ｐＥＴ-２１ｂ(＋)、ｐＥＴ-２２ｂ(＋)、ｐＥＴ-３ａ(＋)、ｐＥＴ-３d(＋)、ｐＥＴ-１１ａ(＋)、ｐＥＴ-１２ａ(＋)、ｐＥＴ-１４ｂ(＋)、ｐＥＴ-１５ｂ(＋)、ｐＥＴ-１６ｂ(＋)、ｐＥＴ-１７ｂ(＋)、ｐＥＴ-１９ｂ(＋)、ｐＥＴ-２０ｂ(＋)、ｐＥＴ-２１ａ(＋)、ｐＥＴ-２３ａ(＋)、ｐＥＴ-２３ｂ(＋)、ｐＥＴ-２４ａ(＋)、ｐＥＴ-２５ｂ(＋)、ｐＥＴ-２６ｂ(＋)、ｐＥＴ-２７ｂ(＋)、ｐＥＴ-２８ａ(＋)、ｐＥＴ-２９ａ(＋)、ｐＥＴ-３０ａ(＋)、ｐＥＴ-３１ｂ(＋)、ｐＥＴ-３２ａ(＋)、ｐＥＴ-３５ｂ(＋)、ｐＥＴ-３８ｂ(＋)、ｐＥＴ-３９ｂ(＋)、ｐＥＴ-４０ｂ(＋)、ｐＥＴ-４１ａ(＋)、ｐＥＴ-４１ｂ(＋)、ｐＥＴ-４２ａ(＋)、ｐＥＴ-４３ａ(＋)、ｐＥＴ-４３ｂ(＋)、ｐＥＴ-４４ａ(＋)、ｐＥＴ-４９ｂ(＋)、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ-Ａ、ｐＲＳＥＴ-Ｂ、ｐＲＳＥＴ-Ｃ、ｐＧＥＸ-５Ｘ-１、ｐＧＥＸ-６ｐ-１、ｐＧＥＸ-６ｐ-２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴrｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２-１８、ｐＵＣ-１８、ｐＵＣ-１９から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
請求項６または７に記載の組換えプラスミドを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞であって、好ましくは前記真核細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が受容性細胞であって、好ましくは前記受容性細胞が大腸菌ＢＬ２１細胞または大腸菌Ｗ３１１０であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
Ｌ-プロリン誘導体を基質とし、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のプロリン水酸化酵素で前記基質のヒドロキシ化を触媒して、式(Ｉ)に示すＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることを特徴とするＬ-ヒドロキシプロリン誘導体の生産方法。
【化１】
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（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ５のアルキリデン基またはＣ２〜Ｃ５のアルケニレン基から選ばれ、Ｒ２はＣ０〜Ｃ４のアルキリデン基またはＣ２〜Ｃ４のアルケニレン基から選ばれ、Ｒ３はヒドロキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、アリールオキシ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオ基またはＣ１〜Ｃ６のアリールチオ基から選ばれ、Ｒ４は水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基から選ばれる。）
【請求項１２】
α-ケトグルタル酸とＯ２を共同の基質とし、鉄イオンを補助因子として、プロリン水酸化酵素で前記基質のヒドロキシ化を触媒して、前記Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることが含むことを特徴とする請求項１１に記載のＬ-ヒドロキシプロリン誘導体の生産方法。
【請求項１３】
前記Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体がシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンまたは(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸であることを特徴とする請求項１１または１２に記載のＬ-ヒドロキシプロリン誘導体の生産方法。
【請求項１４】
前記プロリン水酸化酵素が、５〜４５℃の反応温度、好ましくは５〜１５℃の反応温度で前記基質のヒドロキシ化を触媒して、前記式(Ｉ)に示すＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることを特徴とする請求項１１または１２に記載のＬ-ヒドロキシプロリン誘導体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学と酵素工学に関し、特に、プロリン水酸化酵素及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロリンの誘導体は薬物合成における重要な構成ユニットで、特に、ヒドロキシプロリンは自然においてまれなアミノ酸であって、多くの重要な薬物の合成における開始原料である。プロリンの水酸化部位及び空間的構造の違いにより、ヒドロキシプロリンは合計で８種類の異性体があり、その中において、３-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンと４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンは、抗生物質、酵素阻害剤、抗腫瘍、抗高血圧及び新規の胃薬等の様々な薬物の重要な原料であって、今、生物合成の研究の注目点になった。その他、ヒドロキシプロリンは天然産物から得られるものまたは化学合成されるものであることもでき、例えば植物材料とコラーゲンの加水分解物、または臭化アリルとジエチルアセチルアミノマロン酸、Ｄ-グルタミン酸とβ-アラニンを開始原料として化学合成される。
【０００３】
同様に、ヒドロキシプロリンの誘導体であるＬ-ヒドロキシピペリジン酸も薬物の合成における重要な構造ユニットで、β-ラクタム酵素阻害剤とＴＮＦ-α変換酵素阻害剤の合成における重要な中間体である。Ｌ-ヒドロキシピペリジン酸も植物または他の自然材料の分離または化学合成の方法で調製できる。しかし、複雑な分離純化方法または複雑な合成工程が必要で、大量の産業化生産の実現は難しい。水酸化酵素でピペリジン酸をヒドロキシ化する方法はヒドロキシピペリジン酸を得る望ましい方法である。現在、最も応用されている酵素はプロリン水酸化酵素で、それはケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼであって、α-ケトグルタル酸とＯ２を共同の基質とし、鉄イオンを補助因子とする。
【０００４】
多くの微生物にはいずれもプロリン水酸化酵素が含まれていて、例えばシノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium  ｍeliloti)、ストレプトマイセス菌ＴＨ１(Streptomyces  sp.strａiｎ  TH１)及び糸状真菌Ｇｌａｒｅａ  ｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ等がある。常用のものとして、シス-プロリン-３-水酸化酵素、シス-プロリン-４-水酸化酵素、トランス-プロリン-４-水酸化酵素の３種類が挙げられ、それぞれ、シス-３-ヒドロキシ-Ｌ-プロリン、シス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリン、トランス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンを発生するようにＬ-プロリンを触媒できる。しかし、プロリン水酸化酵素によるプロリン及びプロリン誘導体の触媒反応において、例えば変換率が低く、位置異性体の発生を触媒する等の無視できない問題が存在するため、大規模な産業生産を実現できない。シノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium  meliloti)からのシス-プロリン-４-水酸化酵素は遺伝子改変によって、Ｌ-ピペリジン酸に対するヒドロキシ化作用の変換率と酵素触媒の特異度がいずれも大幅に向上されたが、依然として１０％の位置異性体である(２Ｓ,３Ｒ)-３-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸が発生される(ＷＯ２０１３１６９７２５Ａ２)。よって、プロリン及びプロリン誘導体のヒドロキシ化作用を特異的で高速に触媒できる酵素を探し出すことは、ヒドロキシプロリン及びその誘導体の産業合成に重要な意味を持つことになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、既存技術においてプロリン水酸化酵素が触媒の選択性が低い問題を解決できるプロリン水酸化酵素及びその応用を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を実現するため、本発明の一態様によると、(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が突然変異され、且つプロリン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、または(ｃ)(ｂ)中の一つまたは複数のアミノ酸の突然変異を保留し、プロリン水酸化酵素活性を有し、且つ(ｂ)中のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７８％の相同性を有するタンパク質と、を含むプロリン水酸化酵素を提供する。
【０００７】
さらに、突然変異したアミノ酸部位が、Ｈ１４、Ｓ１６、Ｔ２５、Ｆ２６、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｄ５４、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｋ８６、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１６２、Ｌ１６６、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｓ１５４、Ｎ１６５、Ｄ１７３、Ｋ２０９、Ｉ２２３、Ｓ２２５から選ばれる一つまたは複数である。
【０００８】
さらに、突然変異は、Ｈ１４Ｒ、Ｓ１６Ｎ、Ｔ２５Ｇ、Ｔ２５Ｒ、Ｆ２６Ｌ、Ｅ２７Ｋ、Ｄ３０Ｓ、Ｓ３３Ｎ、Ｅ３４Ｎ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｌ、Ｅ３４Ｓ、Ｅ３４Ｄ、Ｙ３５Ｗ、Ｙ３５Ｋ、Ｓ３７Ｗ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｅ、Ｓ３７Ｎ、Ｓ３７Ｔ、Ｓ３７Ｃ、Ｉ３９Ｋ、Ｉ３９Ｒ、Ｗ４０Ｆ、Ｋ４１Ｅ、Ｄ５４Ｇ、Ｈ５５Ｑ、Ｓ５７Ｌ、Ｉ５８Ｔ、Ｉ５８Ｙ、Ｉ５８Ａ、Ｉ５８Ｒ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ５８Ｓ、Ｉ５８Ｃ、Ｋ８６Ｐ、Ｔ９１Ａ、Ｆ９５Ｙ、Ｃ９７Ｙ、Ｉ９８Ｖ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｔ、Ｋ１０６Ｑ、Ｆ１１１Ｓ、Ｋ１１２Ｅ、Ｋ１１２Ｒ、Ｓ１５４Ａ、Ｋ１６２Ｅ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１１８Ｆ、Ｉ１１８Ｖ、Ｉ１１８Ｒ、Ｈ１１９Ｒ、Ｈ１１９Ｆ、Ｉ１２０Ｖ、Ｋ１２３Ｄ、Ｋ１２３Ｎ、Ｋ１２３Ｑ、Ｋ１２３Ｓ、Ｋ１２３Ｉ、Ｋ１２３Ｔ、Ｔ１３０Ｎ、Ｄ１３４Ｇ、Ｖ１３５Ｋ、Ｎ１６５Ｈ、Ｄ１７３Ｇ、Ｋ２０９Ｒ、Ｉ２２３Ｖ、Ｓ２２５Ａのうちのいずれか一つまたは複数を含む。
【０００９】
さらに、突然変異は、Ｅ２７Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｋ１２３Ｄ＋Ｗ４０Ｆ、Ｋ１２３Ｄ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｄ３０Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｗ４０Ｆ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ９８Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｆ２６Ｌ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｉ２２３Ｖ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｉ２２３Ｖ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ３４Ｇ＋Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｔ２５Ｇ／Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ８６Ｐ、Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ１２０Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｄ３０Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ１１２Ｅ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｄ３０Ｓ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、  Ｔ２５Ｇ／Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ及びＨ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖという組み合わせのいずれか一つを含み、ここで、「／」は「または」を示す。
【００１０】
上述した目的を実現するため、本発明の一態様によると、上述したいずれかのプロリン水酸化酵素をコーディングするＤＮＡ分子を提供する。
【００１１】
上述した目的を実現するため、本発明の他の一態様によると、上記ＤＮＡ分子が接続された組換えプラスミドを提供する。
【００１２】
さらに、組換えプラスミドは、ｐＥＴ-２１ｂ(＋)、ｐＥＴ-２２ｂ(＋)、ｐＥＴ-３ａ(＋)、ｐＥＴ-３d(＋)、ｐＥＴ-１１ａ(＋)、ｐＥＴ-１２ａ(＋)、ｐＥＴ-１４ｂ(＋)、ｐＥＴ-１５ｂ(＋)、ｐＥＴ-１６ｂ(＋)、ｐＥＴ-１７ｂ(＋)、ｐＥＴ-１９ｂ(＋)、ｐＥＴ-２０ｂ(＋)、ｐＥＴ-２１ａ(＋)、ｐＥＴ-２３ａ(＋)、ｐＥＴ-２３ｂ(＋)、ｐＥＴ-２４ａ(＋)、ｐＥＴ-２５ｂ(＋)、ｐＥＴ-２６ｂ(＋)、ｐＥＴ-２７ｂ(＋)、ｐＥＴ-２８ａ(＋)、ｐＥＴ-２９ａ(＋)、ｐＥＴ-３０ａ(＋)、ｐＥＴ-３１ｂ(＋)、ｐＥＴ-３２ａ(＋)、ｐＥＴ-３５ｂ(＋)、ｐＥＴ-３８ｂ(＋)、ｐＥＴ-３９ｂ(＋)、ｐＥＴ-４０ｂ(＋)、ｐＥＴ-４１ａ(＋)、ｐＥＴ-４１ｂ(＋)、ｐＥＴ-４２ａ(＋)、ｐＥＴ-４３ａ(＋)、ｐＥＴ-４３ｂ(＋)、ｐＥＴ-４４ａ(＋)、ｐＥＴ-４９ｂ(＋)、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ-Ａ、ｐＲＳＥＴ-Ｂ、ｐＲＳＥＴ-Ｃ、ｐＧＥＸ-５Ｘ-１、ｐＧＥＸ-６ｐ-１、ｐＧＥＸ-６ｐ-２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴrｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２-１８、ｐＵＣ-１８、ｐＵＣ-１９から選ばれる。
【００１３】
本発明の他の一態様によると、上述したいずれかの組換えプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
【００１４】
さらに、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であって、真核細胞が酵母細胞であることが好ましい。
【００１５】
さらに、宿主細胞は、受容性細胞であって、受容性細胞が大腸菌ＢＬ２１細胞または大腸菌Ｗ３１１０であることが好ましい。
【００１６】
本発明の他の一態様によると、Ｌ-プロリン誘導体を基質とし、上記のうちのいずれかに記載のプロリン水酸化酵素で基質のヒドロキシ化を触媒して、一般式(Ｉ)に示すＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得るＬ-ヒドロキシプロリン誘導体の生産方法を提供する。
【００１７】
【化１】
2019533481.tif 000003
【００１８】
ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ５のアルキリデン基またはＣ２〜Ｃ５のアルケニレン基から選ばれ、Ｒ２はＣ０〜Ｃ４のアルキリデン基またはＣ２〜Ｃ４のアルケニレン基から選ばれ、Ｒ３はヒドロキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、アリールオキシ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオ基またはＣ１〜Ｃ６のアリールチオ基から選ばれ、Ｒ４は水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基から選ばれる。
【００１９】
さらに、該方法は、α-ケトグルタル酸とＯ２を共同の基質とし、鉄イオンを補助因子として、プロリン水酸化酵素で基質のヒドロキシ化を触媒して、Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることが含む。
【００２０】
さらに、Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体は、シス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンまたは(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸である。
【００２１】
さらに、プロリン水酸化酵素は、５〜４５℃の反応温度で、好ましくは５〜１５℃の反応温度で、基質のヒドロキシ化を触媒して、一般式(Ｉ)に示すＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得る。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の技術案によると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を基礎配列として、さらに遺伝子工学手段によって改善された後の一つまたは複数のアミノ酸残基の変化を含む突然変異体またはこれらの突然変異を保留した前提で他のアミノ酸部位を変化させることで変化後のアミノ酸配列が(ｂ)中のアミノ酸配列と少なくとも７８％の相同性を有するタンパク質を選択することによって、既存のプロリン水酸化酵素より高い触媒特異度(即ち、選択性)を有し、または本発明で見つかった野生型水酸化酵素(即ち、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であるプロリン水酸化酵素)より明確に向上された触媒活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に係るプロリン水酸化酵素で触媒して合成した(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸(シス-５-ヒドロキシピペリジン酸とも呼ばれる)の化学反応過程を示す。
【図２】本発明に係るプロリン水酸化酵素で触媒して合成したシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンの化学反応方程式である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の一部を構成する図面は本発明を一層理解させるためのもので、本発明の示意的実施例及びその説明は本発明を解釈するもので、本発明を限定するものではない。
【００２５】
なお、矛盾しない限り、本願の実施例及び実施例中の特徴は互いに組み合わせられることができる。以下、図面を参照しつつ実施例を結合して本発明を説明する。
【００２６】
名称解釈
酵素の選択性は、酵素の特異度ともよばれ、酵素が生化学反応を触媒する際に基質に対する選択性を指す。本発明において、プロリン水酸化酵素の選択性とは、プロリン水酸化酵素がＬ-プロリン誘導体のヒドロキシ化を触媒して、特定の分子構造のＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得る程度を指す。この説明に係る反応において、反応するジアステレオマー過剰率で当該水酸化酵素の触媒選択性の程度を表すことができる。
【００２７】
変換率とは、ある反応物が変換されるパーセンテージまたは割合を指す。変換率は、反応物の反応程度を表す指標である。本発明において、Ｌ-ピペリジン酸ヒドロキシ化の作用における変換率とは、水酸化酵素またはプロリン水酸化酵素がＬ-ピペリジン酸反応を触媒するにおいて、生産される製品である(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸が体系におけるＬ-ピペリジン酸に占めるパーセンテージを指す。
【００２８】
触媒活性とは、単位あたりの容積(または質量)の触媒が単位時間内に原料反応物を変換させる数を指す。本発明において、プロリン水酸化酵素の触媒活性のレベルは本発明に記載の反応の変換率と正の相関関係を持つ。
【００２９】
進化とは、突然変異または組換え等の手段で分子の多様性を構成し、その後、これらの多様性を選別して、新規の機能を有する遺伝子またはＤＮＡを得ることを指す。本発明において、突然変異または組換え等の手段で水酸化酵素またはプロリン水酸化酵素を改善して、性能が高められた水酸化酵素またはプロリン水酸化酵素を得る。
【００３０】
ジアステレオマーとは、分子が２つまたは複数のキラル中心を有し、分子間が非鏡像体の関係である立体異性体を指す。
【００３１】
ジアステレオマー過剰率(diastereomeric  excess、de％と略称)とは、２つのキラル中心である場合、一つのジアステレオマーが他のエナンチオマーに対して過剰であることを指す。即ち、ｄｅ％＝(Ｒ,Ｒ＋Ｓ,Ｓ)-(Ｓ,Ｒ＋Ｒ,Ｓ)／(Ｒ,Ｒ＋Ｓ,Ｓ＋Ｓ,Ｒ＋Ｒ,Ｓ)である。
【００３２】
野生型とは、自然から取得した、人為的な変異誘発または改善がないことを指す。本発明において、野生型プロリン水酸化酵素とは、Ｇｅｎｅｂａｎｋから選別して得た天然の人為的に改善されていない遺伝子配列をコーディングして得たプロリン水酸化酵素を指す。
【００３３】
相同配列とは、同種物質の異なる個体間または異なる種類の物質間の同一または類似するＤＮＡ配列を指す。
【００３４】
本発明において、係る１ｗｔはいずれも、１ｇの主原料の変換に１ｇのプロリン水酸化酵素変異体組換えウェット細胞が必要であることを指す。
【００３５】
背景技術部分に記載のように、既存技術におけるプロリン水酸化酵素には触媒選択性が高くない問題があって、後続の目標産物の分離が難しくなる。既存技術においてプロリン水酸化酵素の選択性が高くない問題を解決するため、発明者は遺伝子工学の手段で、触媒特異度の高いプロリン水酸化酵素を得た。同時に、発明者は既存の野生型プロリン水酸化酵素に各種の突然変異による改善を行って、選択性が高く、且つ触媒活性が向上されたプロリン水酸化酵素を得ようとした。
【００３６】
発明者は、Ｇｅｎｅｂａｎｋから無数の既存のプロリン水酸化酵素のアミノ酸配列の相同配列を選別し、相同性の高い順で、選別された各種の相同配列に異なる部位の遺伝子突然変異を行い、各種の突然変異体の水酸化酵素の活性を選別した。その結果、相同性配列の高い配列に突然変異を行って得た突然変異体のプロリン水酸化酵素の活性はいずれも、既存のプロリン水酸化酵素と明確な差異を表していない。最後に、既存のプロリン水酸化酵素のアミノ酸配列との相同性が最も低い(３０％程度しかない)Ｋordiａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓからの一つの配列のみが残っており、該配列はＧｅｎｅｂａｎｋにおいて明確な遺伝子機能注釈がなく、仮説タンパク質と注釈された。発明者は、遺伝子工学技術で該配列に組換え発現を行った結果、該配列でコーディングされたタンパク質が、プロリン水酸化酵素活性を有し、また既存技術におけるプロリン水酸化酵素より高い選択性を有することを見つかった。発明者は、該タンパク質を野生型プロリン水酸化酵素と命名した。発明者は、該野生型水酸化酵素のアミノ酸配列に突然変異試験を行った結果、該Ｋordiａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓからの配列を突然変異した後に取得した突然変異体はプロリン水酸化酵素活性を有するとともに、触媒活性も野生型プロリン水酸化酵素より明確に向上されることを見つかった。
【００３７】
さらに、発明者は、該配列を基礎配列として各種の突然変異選別を行って、最終的に複数の突然変異部位がプロリン水酸化酵素の活性と関連することを見つかった。これらの突然変異部位を保留した前提で、任意の他の部位の突然変異を変化してもプロリン水酸化酵素の活性に明確な影響は与えないことを見つかった。
【００３８】
上記を基に、発明者は一層研究したところ、突然変異されたら、プロリン水酸化酵素の可溶性発現を明確に低下させ、またはプロリン水酸化酵素の触媒活性を失わせる幾つかの重要な基酸残基部位を見つかった。Ｓ３、Ｌ９４、Ｈ１０５、Ｄ１０７、Ｓ１３１、Ｅ１３２、Ｙ１３７、Ｍ１３９、Ｗ１４５、Ｈ１５３、Ｎ１５７、Ｖ１６７、Ｄ１６９アミノ酸残基部位が他の大部分のアミノ酸に突然変異した後、プロリン水酸化酵素の可溶性発現は明確に低下し、一部はゼロになった。これらのアミノ酸の突然変異は、プロリン水酸化酵素の折りたたみに影響を及ぼし、Ｅ.Ｃｏｌｉ宿主細胞中の可溶性発現量を明確に減少させ、ひいては可溶性発現がゼロまで減少し、その突然変異のアミノ酸は、Ｙ３５Ａ、Ｙ３５Ｆ、Ｙ３５Ｓ、Ｗ４０Ｙ、Ｌ９４Ａ、Ｌ９４Ｇ、Ｌ９４Ｓ、Ｆ９５Ａ、Ｆ９５Ｗ、Ｈ１０５Ｒ、Ｈ１０５Ｑ、Ｈ１０５Ｅ、Ｈ１０５Ｇ、Ｒ１１７Ａ、Ｒ１１７Ｐ、Ｒ１１７Ｋ、Ｐ１２１Ｖ、Ｖ１３５Ａ、Ｓ１３１Ｔ、Ｈ１５３Ｙ、Ｈ１５３Ａ、Ｈ１５３Ｒ、Ｈ１５３Ｋから選ばれることができる。同時に、Ｙ３２、Ｒ９３、Ｒ１１７、Ｙ１０８アミノ酸残基部位が他の大部分のアミノ酸に突然変異した後、プロリン水酸化酵素触媒活性を失ってしまうことを見つかった。このようなプロリン水酸化酵素の触媒活性を明確に低減し、ひいては活性を喪失してしまう突然変異アミノ酸は、Ｙ３２Ｎ、Ｙ３２Ｖ、Ｙ３２Ｖ、Ｙ３２Ｑ、Ｙ３２Ｅ、Ｙ３２Ｓ、Ｙ３２Ｒ、Ｙ３２Ｄ、Ｙ３２Ｒ、Ｙ３２Ｉ、Ｙ３２Ｐ、Ｙ３５Ｈ、Ｙ３５Ｆ、Ｙ３５Ａ、Ｗ４０Ｙ、Ｒ９３Ｋ、Ｒ９３Ｈ、Ｒ９３Ｅ、Ｒ９３Ａ、Ｌ９４Ａ、Ｆ９５Ｗ、Ｆ９５Ａ、Ｈ１０５Ｅ、Ｈ１０５Ｑ、Ｈ１０５Ｒ、Ｈ１０５Ｋ、Ｈ１０５Ａ、Ｋ１０６Ｈ、Ｄ１０７Ａ、Ｙ１０８Ｗ、Ｙ１０８Ａ、Ｙ１０８Ｌ、Ｙ１０８Ｓ、Ｙ１０８Ｐ、Ｒ１１７Ｄ、Ｒ１１７Ｐ、Ｒ１１７Ｎ、Ｒ１１７Ｈ、Ｒ１１７Ｋ、Ｒ１１７Ａ、Ｐ１２１Ｖ、Ｈ１５３Ｗ、Ｈ１５３Ｆ、Ｈ１５３Ｋ、Ｈ１５３Ｒ、Ｈ１５３Ａから選ばれる。
【００３９】
プロリン水酸化酵素の三次元構造をコンピュータで模擬して三次元構造図を得た。該構造図を分析した後、上述した部位のほとんどがプロリン水酸化酵素と基質の結合またはプロリン水酸化酵素と補助因子の結合に参与した重要なアミノ酸残基であると推定し、例えばＨ１０５、Ｄ１０７、Ｈ１５３は補助因子とプロリン水酸化酵素の結合に参与し、Ｙ３２、Ｒ９３、Ｒ１１７は基質とプロリン水酸化酵素の結合に参与した可能性があり、ここで、Ｒ９３、Ｒ１１７アミノ酸残基は基質と塩橋を形成する可能性がある。そして、第２３０〜２７６位間のアミノ酸残基が酵素の活性関連領域外に位置するので、該区間に一部のアミノ酸を変化または除去すると、プロリン水酸化酵素の活性に対する影響をあんまり大きくない。
【００４０】
本発明の突然変異体は、上述したプロリン水酸化酵素の活性に対する影響があんまり大きくないアミノ酸部位を不変に保持して、残りのアミノ酸を変化して得たもので、触媒活性または選択性が向上された突然変異体である。
【００４１】
上記研究結果に基づいて、発明者が本発明の技術案を提示した。典型的な実施形態においてプロリン水酸化酵素を提供し、該プロリン水酸化酵素は、(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、または(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に示すアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が突然変異され、且つプロリン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、または(ｃ)前記(ｂ)中の一つまたは複数のアミノ酸の突然変異を保留し、プロリン水酸化酵素活性を有し、且つ(ｂ)中のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７８％の相同性を有するタンパク質を含む。
【００４２】
上記プロリン水酸化酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２を基礎配列として、さらに遺伝子工学手段によって改善された後の一つまたは複数のアミノ酸残基の変化を含む突然変異体またはこれらの突然変異を保留した前提で他のアミノ酸部位を変化させることで変化後のアミノ酸配列が(ｂ)中のアミノ酸配列と少なくとも７８％の相同性を有するタンパク質を選択することによって、既存の水酸化酵素より高い触媒特異度(即ち、選択性)を有し、または本発明で見つかった野生型水酸化酵素(即ち、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２である水酸化酵素)より明確に向上された触媒活性を有する。
【００４３】
上記プロリン水酸化酵素の触媒活性は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２でコーディングされた原始野生型水酸化酵素より少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはさらに向上された。そして、上記プロリン水酸化酵素の選択性も、既存技術より明確に向上され、その触媒によって発生された(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率(ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ)は９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えているまたはさらに高い。
【００４４】
一部の実施形態において、上記プロリン水酸化酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２のアミノ酸配列がＨ１４、Ｓ１６、Ｔ２５、Ｆ２６、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｄ５４、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｋ８６、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１６２、Ｌ１６６、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｓ１５４、Ｎ１６５、Ｄ１７３、Ｋ２０９、Ｉ２２３及びＳ２２５のうちの一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異がなされ、且つプロリン水酸化酵素活性を有するタンパク質である。ここで、水酸化酵素触媒活性に関連するアミノ酸部位は、Ｈ１４、Ｓ１６、Ｆ２６、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｎ１６５、Ｋ２０９及びＩ２２３がある。そして、Ｙ３５とＳ５７アミノ酸部位は水酸化酵素の選択性に係っている。上記一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異は、野生型プロリン水酸化酵素の活性または選択性に顕著な影響を与え、突然変異体のプロリン水酸化酵素触媒活性及び／または選択性を顕著に向上させることができる。
【００４５】
上記プロリン水酸化酵素の三次元構造シミュレーション図をさらに分析し、本発明におけるプロリン水酸化酵素の活性部位がβ折りたたみに関連する領域に位置すると推定し、該領域はＮ-末端とＣ-末端のαヘリックス構造によって固定される。基質結合部位はβ折りたたみ領域の中心に位置し、補助因子結合領域に隣接する。これらの部位を分析した結果、本発明に係っているプロリン水酸化酵素の上記突然変異アミノ酸残基がプロリン水酸化酵素の三次元構造シミュレーション図において主に基質結合部位または補助因子の結合に関する領域内に位置することを見つかり、例えば、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０アミノ酸はいずれも基質結合部位付近に位置する可能性があり、これらのアミノ酸の変化によって、基質結合の特異性を向上させて、酵素の活性または触媒の選択性が向上される。例えば、Ｋ１０６、Ｌ１６６、Ｋ１２３、Ｄ１３４、Ｓ１５４、Ｎ１６５アミノ酸はいずれも補助因子結合部位付近に位置する可能性があり、これらのアミノ酸の変化によって、補助因子の結合を向上させ、酸素の利用と伝達との釣り合いを保つ作用を果たして、酵素の活性を向上させる。
【００４６】
上記部位が突然変異した状況で、発明者はこれらの部位を異なるアミノ酸に突然変異させて、そのプロリン水酸化酵素活性の変化を検出した結果、これらのアミノ酸部位が、以下のいずれか１種類または複種類の組み合わせに突然変異した後、水酸化酵素の活性及び／または選択性が一層向上されることを見つかった。突然変異は、Ｈ１４Ｒ、Ｓ１６Ｎ、Ｔ２５Ｇ、Ｔ２５Ｒ、Ｆ２６Ｌ、Ｅ２７Ｋ、Ｄ３０Ｓ、Ｓ３３Ｎ、Ｅ３４Ｎ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｌ、Ｅ３４Ｓ、Ｅ３４Ｄ、Ｙ３５Ｗ、Ｙ３５Ｋ、Ｓ３７Ｗ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｅ、Ｓ３７Ｎ、Ｓ３７Ｔ、Ｓ３７Ｃ、Ｉ３９Ｋ、Ｉ３９Ｒ、Ｗ４０Ｆ、Ｋ４１Ｅ、Ｄ５４Ｇ、Ｈ５５Ｑ、Ｓ５７Ｌ、Ｉ５８Ｔ、Ｉ５８Ｙ、Ｉ５８Ａ、Ｉ５８Ｒ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ５８Ｓ、Ｉ５８Ｃ、Ｋ８６Ｐ、Ｔ９１Ａ、Ｆ９５Ｙ、Ｃ９７Ｙ、Ｉ９８Ｖ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｔ、Ｋ１０６Ｑ、Ｆ１１１Ｓ、Ｋ１１２Ｅ、Ｋ１１２Ｒ、Ｓ１５４Ａ、Ｋ１６２Ｅ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１１８Ｆ、Ｉ１１８Ｖ、Ｉ１１８Ｒ、Ｈ１１９Ｒ、Ｈ１１９Ｆ、Ｉ１２０Ｖ、Ｋ１２３Ｄ、Ｋ１２３Ｎ、Ｋ１２３Ｑ、Ｋ１２３Ｓ、Ｋ１２３Ｉ、Ｋ１２３Ｔ、Ｔ１３０Ｎ、Ｄ１３４Ｇ、Ｖ１３５Ｋ、Ｎ１６５Ｈ、Ｄ１７３Ｇ、Ｋ２０９Ｒ、Ｉ２２３Ｖ及びＳ２２５Ａのうちのいずれか一つまたは複数を含む。突然変異が、Ｈ１４Ｒ、Ｅ２７Ｋ、Ｅ３４Ｎ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｌ、Ｅ３４Ｄ、Ｙ３５Ｗ、Ｙ３５Ｋ、Ｓ３７Ｗ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｅ、Ｓ３７Ｎ、Ｓ３７Ｔ、Ｓ３７Ｃ、Ｉ３９Ｋ、Ｉ３９Ｒ、Ｉ５８Ｔ、Ｉ５８Ｙ、Ｉ５８Ａ、Ｉ５８Ｒ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ５８Ｓ、Ｉ５８Ｃ、Ｋ１２３Ｄ、Ｋ１２３Ｎ、Ｋ１２３Ｑ、Ｋ１２３Ｓ、Ｋ１２３Ｉ及びＫ１２３Ｔのうちのいずれか一つまたは複数を含むことがさらに好ましい。ここで、プロリン水酸化酵素の選択性に関連するアミノ酸の突然変異は、Ｙ３５Ｗ、Ｓ５７Ｌ、Ｓ５７Ｖがある。
【００４７】
一部のアミノ酸の突然変異は、プロリン水酸化酵素の細菌細胞中の可溶性発現量を増加でき、特に、Ｅ.Ｃｏｌｉ宿主細胞中の可溶性発現を増加させることができ、このような突然変異アミノ酸は、Ｅ２７Ｋ、Ｄ３０Ｓ、Ｙ３５Ｗ、Ｙ３５Ｋ、Ｓ３７Ｗ、Ｓ３７Ｆ、Ｓ３７Ｅ、Ｓ３７Ｎ、Ｓ３７Ｔ、Ｓ３７Ｃ、Ｉ３９Ｋ、Ｉ３９Ｒ、Ｗ４０Ｆ、Ｉ５８Ｔ、Ｉ５８Ｙ、Ｉ５８Ａ、Ｉ５８Ｒ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ５８Ｓ、Ｉ５８Ｃ、Ｉ９８Ｖ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｔ、Ｋ１０６Ｑ、Ｈ１１９Ｒ、Ｈ１１９Ｆ、Ｋ１２３Ｄ、Ｋ１２３Ｎ、Ｋ１２３Ｑ、Ｋ１２３Ｓ、Ｋ１２３Ｉ、Ｋ１２３Ｔ、Ｎ１６５Ｈ、Ｉ２２３Ｖから選ばれる。通常、外来遺伝子を原核発現システムで見つかった場合、正確に折りたたんで形成された可溶性タンパク質のみが活性を有し、形成された封入体は活性を有しない。可溶性タンパク質の発現量が増加されて、酵素活性も総体的に増加される。
【００４８】
さらに好ましい実施例において、上記突然変異は、Ｅ２７Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｋ１２３Ｄ＋Ｗ４０Ｆ、Ｋ１２３Ｄ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｄ３０Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｗ４０Ｆ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ９８Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｆ２６Ｌ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｉ２２３Ｖ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ、Ｉ２２３Ｖ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｎ１６５Ｈ、  Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ３４Ｇ＋Ｋ１０６Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｔ２５Ｇ／Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ８６Ｐ、Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ１２０Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｄ３０Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｋ１１２Ｅ、Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９���／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ、Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｄ３０Ｓ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｔ２５Ｇ／Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｄ１７３Ｇ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ＋Ｎ１６５Ｈ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｓ３７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｗ／Ｔ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｙ３５Ｗ／Ｋ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｋ１２３Ｄ／Ｉ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２２３Ｖ、Ｈ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ５８Ａ／Ｃ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖ及びＨ１４Ｒ＋Ｅ２７Ｋ＋Ｅ３４Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｓ＋Ｉ３９Ｋ／Ｒ＋Ｉ９８Ｖ＋Ｋ１０６Ｖ／Ｔ／Ｑ＋Ｋ１１２Ｅ／Ｒ＋Ｉ１１８Ｆ／Ｖ／Ｒ＋Ｉ２２３Ｖという組み合わせの何れか１つを含む。上記突然変異組み合わせにおいて、「／」はまたはのことを表す。上記突然変異の組み合わせにおいて、Ｙ３５Ｗに係っている突然変異の組み合わせは、プロリン水酸化酵素の選択性に関連するものであって、その他の組み合わせはプロリン水酸化酵素の触媒活性に関連するものである。
【００４９】
上記好適な実施例において、プロリン水酸化酵素の触媒活性の情報は該酵素によるＬ-ピペリジン酸に対する触媒活性に基づいて選別され、このような一層好適な実施例におけるプロリン水酸化酵素の触媒活性の結果は表１と表２に示す通りであって、ＤＮＡ配列の配列番号が奇数で、アミノ酸配列の配列番号が偶数である。本発明に記載の突然変異アミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を基礎として突然変異され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はＫｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓからの仮説タンパク質の配列である。本発明において、野生型プロリン水酸化酵素の活性を「１」で表し、突然変異体のプロリン水酸化酵素の活性を「＋」で表し、「＋」は活性が野生型ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の１〜２倍であることを、「＋＋」は活性が野生型ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の２〜３倍であることを、「＋＋＋」は活性が野生型ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の３〜４倍であることを、「＋＋＋＋」は活性が野生型ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の４〜５倍であることを表す。
【００５０】
【表１】
2019533481.tif 000004
2019533481.tif 000005
【００５１】
表１にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に基づく配列に異なる部位のアミノ酸変化を行うことによる、突然変異したプロリン水酸化酵素触媒活性についての影響を示す。ここで、突然変異したプロリン水酸化酵素はＥ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞から発現され、触媒活性は該酵素によるＬ-ピペリジン酸に対する変換効率に基づくものである。触媒反応は１０ｍＬの反応体系で行われ、該反応体系はＬ-ピペリジン酸３０ｇ／Ｌ、５〜１０ｗｔの組換え酵素(１ｗｔは、１ｇの主原料の変換に１ｇのプロリン水酸化酵素変異体組換えウェット細胞が必要であることを指す。)、３７.３ｇ／Ｌ  α-ケトグルタル酸、６.１ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨ６.５、反応温度１０℃、反応時間４０ｈである。
【００５２】
【表２】
2019533481.tif 000006
2019533481.tif 000007
2019533481.tif 000008
【００５３】
表２は、複数の部位のアミノ酸の変化によるプロリン水酸化酵素触媒活性に対する影響を示す。該プロリン水酸化酵素はＥ.Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞から発現され、触媒活性は該酵素によるＬ-ピペリジン酸に対する変換効率に基づくものである。該触媒過程は２０ｍＬの反応体系で行われ、その中にＬ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、２〜５ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ  α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨ６.５、反応温度１０℃、反応時間４０ｈである。
【００５４】
一部の実施形態において、プロリン水酸化酵素活性に関連する一つまたは複数のアミノ酸残基を核心として選別して不変に保持し、他のアミノ酸残基位置には新しい突然変異を導入すると、改善された性質を有するプロリン水酸化酵素を得ることができる。よって、上記好適な実施例におけるいずれか一つのプロリン水酸化酵素をいずれも、遺伝子工学手段で他のプロリン水酸化酵素突然変異体を合成する母体アミノ酸配列とすることができる。例えば、幾つかの進化を経て得たアミノ酸残基は、表１と表２に示すアミノ酸配列と相違点のある新規の突然変異体である。
【００５５】
上述したいずれか一つのプロリン水酸化酵素または上述したアミノ酸水酸化酵素及びその変異体を基礎に他のアミノ酸残基位置で一つまたは複数のアミノ酸残基の突然変異を行って得られる新規のプロリン水酸化酵素活性を有する突然変異体はいずれも本発明の保護範囲に含まれる。ここで例として、Ｅ２７アミノ酸残基突然変異を含むプロリン水酸化酵素突然変異体は、さらに一つまたは複数の他のアミノ酸、例えばＨ１４、Ｓ１６、Ｔ２５、Ｆ２６、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｄ５４、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｋ８６、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１６２、Ｌ１６６、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｓ１５４、Ｎ１６５、Ｄ１７３、Ｋ２０９、Ｉ２２３、Ｓ２２５の突然変異をさらに行うことができるが、これに限定されることはない。他の例として、Ｉ３９アミノ酸残基突然変異を含むプロリン水酸化酵素突然変異体は、一つまたは複数の他のアミノ酸、例えばＨ１４、Ｓ１６、Ｔ２５、Ｆ２６、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｄ５４、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｋ８６、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１６２、Ｌ１６６、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｓ１５４、Ｎ１６５、Ｄ１７３、Ｋ２０９、Ｉ２２３、Ｓ２２５の突然変異をさらに行うことができる。さらに、例として、Ｉ５８アミノ酸残基突然変異を含むプロリン水酸化酵素突然変異体は、一つまたは複数の他のアミノ酸、例えばＨ１４、Ｓ１６、Ｔ２５、Ｆ２６、Ｅ２７、Ｄ３０、Ｓ３３、Ｅ３４、Ｙ３５、Ｓ３７、Ｉ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｄ５４、Ｈ５５、Ｓ５７、Ｉ５８、Ｋ８６、Ｔ９１、Ｆ９５、Ｃ９７、Ｉ９８、Ｋ１０６、Ｆ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１６２、Ｌ１６６、Ｉ１１８、Ｈ１１９、Ｉ１２０、Ｋ１２３、Ｔ１３０、Ｄ１３４、Ｖ１３５、Ｓ１５４、Ｎ１６５、Ｄ１７３、Ｋ２０９、Ｉ２２３、Ｓ２２５の突然変異をさらに行うことができる。
【００５６】
上記水酸化酵素はプロリン水酸化酵素活性を有し、同時に、(２Ｓ)-ピペリジン-２-カルボキシル酸の(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸への変換を触媒し、遺伝子工学方法で酵素の触媒活性を改善でき、一部の実施形態において突然変異体の水酸化酵素活性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２自体でコーディングした水酸化酵素の活性より１倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはさらに向上される。
【００５７】
本発明の他の典型的な実施形態においてＤＮＡ分子をさらに提供し、該ＤＮＡ分子は上述したいずれかの水酸化酵素のコーディングを行う。コーディングした上記水酸化酵素は特異度が高く、触媒活性が顕著に向上されたメリットを有する。
【００５８】
本発明のさらなる他の典型的な実施形態において、組換えプラスミドをさらに提供し、該組換えプラスミドには上記ＤＮＡ分子が接続される。該ＤＮＡ分子は上述したいずれかの選択性が高く及び／または触媒活性が顕著に向上されたプロリン水酸化酵素のコーディングを行う。具体的な配列は、表１と表２における番号が奇数である配列またはこれらの配列の上記アミノ酸部位の変化を保つ前提で、他の部位のアミノ酸配列に置換、追加または欠失突然変異が発生したヌクレオチド配列から選ばれる。
【００５９】
上記組換えプラスミドにおいて、上記水酸化酵素のＤＮＡ分子を表現できる組換えプラスミドはすべて本発明に応用できる。本発明の好適な実施例において、組換えプラスミドは、ｐＥＴ-２２ｂ(＋)、ｐＥＴ-２１ｂ(＋)、ｐＥＴ-３ａ(＋)、ｐＥＴ-３d(＋)、ｐＥＴ-１１ａ(＋)、ｐＥＴ-１２ａ(＋)、ｐＥＴ-１４ｂ(＋)、ｐＥＴ-１５ｂ(＋)、ｐＥＴ-１６ｂ(＋)、ｐＥＴ-１７ｂ(＋)、ｐＥＴ-１９ｂ(＋)、ｐＥＴ-２０ｂ(＋)、ｐＥＴ-２１ａ(＋)、ｐＥＴ-２３ａ(＋)、ｐＥＴ-２３ｂ(＋)、ｐＥＴ-２４ａ(＋)、ｐＥＴ-２５ｂ(＋)、ｐＥＴ-２６ｂ(＋)、ｐＥＴ-２７ｂ(＋)、ｐＥＴ-２８ａ(＋)、ｐＥＴ-２９ａ(＋)、ｐＥＴ-３０ａ(＋)、ｐＥＴ-３１ｂ(＋)、ｐＥＴ-３２ａ(＋)、ｐＥＴ-３５ｂ(＋)、ｐＥＴ-３８ｂ(＋)、ｐＥＴ-３９ｂ(＋)、ｐＥＴ-４０ｂ(＋)、ｐＥＴ-４１ａ(＋)、ｐＥＴ-４１ｂ(＋)、ｐＥＴ-４２ａ(＋)、ｐＥＴ-４３ａ(＋)、ｐＥＴ-４３ｂ(＋)、ｐＥＴ-４４ａ(＋)、ｐＥＴ-４９ｂ(＋)、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ-Ａ、ｐＲＳＥＴ-Ｂ、ｐＲＳＥＴ-Ｃ、ｐＧＥＸ-５Ｘ-１、ｐＧＥＸ-６ｐ-１、ｐＧＥＸ-６ｐ-２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴrｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２-１８、ｐＵＣ-１８、ｐＵＣ-１９から選ばれる一つである。
【００６０】
本発明の他の典型的な実施形態において、宿主細胞をさらに提供し、該宿主細胞は上述したいずれかの組換えプラスミドを含む。具体的な宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であることができ、ここで真核細胞が酵母細胞であることが好ましい。上記宿主細胞が受容性細胞であることがさらに好ましく、受容性細胞が大腸菌ＢＬ２１細胞または大腸菌Ｗ３１１０であることが最も好ましい。
【００６１】
本発明の他の典型的な実施形態において、Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体を生産する方法をさらに提供し、該方法は、Ｌ-プロリン誘導体を基質として、上述したいずれかの水酸化酵素で基質のヒドロキシ化を触媒して、一般式(Ｉ)に示すＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることを含む。
【００６２】
【化１】
2019533481.tif 000009
【００６３】
ここで、Ｒ１は(Ｃ１〜Ｃ５)のアルキリデン基または(Ｃ２〜Ｃ５)のアルケニレン基から選ばれ、Ｒ２は(Ｃ０〜Ｃ４)のアルキリデン基または(Ｃ２〜Ｃ４)のアルケニレン基から選ばれ、Ｒ３はヒドロキシ、アミノ、(Ｃ１〜Ｃ６)のアルコキシ基、アリールオキシ基、(Ｃ１〜Ｃ６)のアルキルチオ基、アリールチオ基から選ばれ、Ｒ４は水素、(Ｃ１〜Ｃ６)のアルキル基、(Ｃ２〜Ｃ６)のアルケニル基、(Ｃ２〜Ｃ６)のアルキニル基から選ばれる。
【００６４】
本発明の上記プロリン水酸化酵素を利用して、Ｌ-プロリン誘導体をヒドロキシ化物に触媒すると、触媒効率を向上させるとともに、Ｌ-プロリン誘導体の変換率を向上させ、さらに触媒の特異度を向上させて、得られるＬ-ヒドロキシプロリン誘導体の目標産物の純度が向上され、後続の分離ステップを減少できる。
【００６５】
上記プロリン水酸化酵素で触媒してＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を合成する化学反応方程式は図２に示すとおりである。ここで、
【００６６】
【化２】
2019533481.tif 000010
はα-ケトグルタル酸で、プロリン水酸化酵素の触媒反応において、α-ケトグルタル酸とＯ２を共同の基質とする。鉄イオンを補助因子とした共同作用で、基質のヒドロキシ化を触媒して、Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体を得る。
【００６７】
【化３】
2019533481.tif 000011
はビタミンＣで、アスコルビン酸とも呼ばれ、プロリン水酸化酵素の触媒反応において、主に鉄イオンを循環させる作用を果たす。
【００６８】
上記プロリン水酸化酵素は、典型的なジオキシゲナーゼで、触媒反応は既存のプロリン水酸化酵素と同様で、いずれもα-ケトグルタル酸とＯ２の存在を必要とし、且つ鉄イオンを補助因子とする必要がある。したがって、上記方法は、α-ケトグルタル酸とＯ２を共同の基質とし、鉄イオンを補助因子として、プロリン水酸化酵素の触媒で、基質のヒドロキシ化を触媒して、Ｌ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることを含む。
【００６９】
具体的な反応条件は、既存のプロリン水酸化酵素反応体系を基に適切な調整を経て得られる。例えば、還元剤(例えばアスコルビン酸)の濃度、洗剤濃度、ｐＨ、温度、緩衝液、溶剤システム、ベースの投入、ポリペプチドの添加、圧力と反応時間等を適切に調整できる。一部の実施形態において、具体的な反応条件は下記のとおりである：基質１５〜１２０ｇ／Ｌ、１.５ｇ〜４８ｇ／Ｌの水酸化酵素、１〜２.５ｅｑ(ｅｑ：使用される物料の質量と主原料の質量との比例を指す。)α-ケトグルタル酸、０.１〜０.３ｅｑ  Ｌ-アスコルビン酸、１ｍＭ〜１０ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウム、反応ｐＨ６〜８、反応温度５〜３０℃、反応時間６〜９６ｈ。一部の実施形態において、適切な反応条件は反応液に２〜５Ｌ／ｈの酸素と０.５〜２％の消泡剤を通過させることを含む。
【００７０】
本発明の好適な実施例において、上記プロリン水酸化酵素は、５〜４５℃の反応温度で、基質のヒドロキシ化を触媒して、一般式(Ｉ)に示すＬ-ヒドロキシプロリン誘導体を得ることができる。５〜１５℃の反応温度で上記触媒反応を行うことがさらに好ましい。本発明で提供するプロリン水酸化酵素は、低い温度で基質をヒドロキシ化物に触媒するだけではなく、さらに触媒特異度(即ち選択性)を向上させ、産物の純度を向上させることができる。
【００７１】
上記酵素は、複種類のＬ-プロリン誘導体のヒドロキシ化を触媒できる。本発明の好適な実施例において、Ｌ-プロリンまたはＬ-ピペリジン酸にヒドロキシ化を行って、シス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンまたは(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を得る。上記２種類の基質にはヒドロキシ化を行う特異度が最も高く、基質の１００％をシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンまたは(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸に変換させることができる。
【００７２】
以下、具体的な実施例を結合して本発明の有益な効果を説明する。以下の実験方法は、特別な説明がない限り、いずれも通常の方法であって、使用される実験材料は特別な説明がない限りいずれも商業会社から簡単に入手できるものである。
【００７３】
実施例１：プロリン水酸化酵素の組換え発現
Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓからの仮説タンパク質と注釈されたＤＮＡコーディング配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１にコドン最適化(大腸菌コドン嗜好性（Ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ）及び縮退性（Ｃｏｄｏｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に応じてコドン改善を行い、蘇州金唯智生物科学技術有限会社によりデザインした。)を行って、最適化後のＤＮＡ配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３を得て、コーディングしたプロリン水酸化酵素のポリペプチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３のコーディング配列をｐＥＴ２２ｂ(＋)発現ベクター(Ｎｏｖａｇｅｎから購入、製品番号６９７４４)に接続し、その後、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に変換させ、５０μｇ／ｍlアンピシリンを含むＬＢ培養皿に塗布し、３７℃で一晩培養した。上記培養皿上のモノクローンを選別して試験管で活性化した後、５０μｇ／ｍlアンピシリンを含有する５００ｍlのＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０.６になるまで振動培養し、濃度が１ｍＭまでＩＰＴＧを添加し、２５℃で誘導発現を行った。１６ｈ誘導した後、６０００ｇ遠心１０ｍｉｎして菌体を収集する。菌体を超音波ブレーカ(ＪＹ９２-２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社)で細胞を粉砕し、４℃、１００００ｇで２０ｍｉｎ遠心して上澄み液を得て、野生型プロリン水酸化酵素活性の検出に利用し、突然変異体の活性を選別する対照とした。
【００７４】
実施例２：プロリン水酸化酵素変異体の調製
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３配列を含むｐＥＴ２２ｂ(＋)発現ベクターをテンプレートとして、突然変異部位付きのプライマーで、全プラスミドのＰＣＲによって完璧な線形セグメントを得て、上記ＰＣＲ産物をＤＰｎＩ消化によって母体テンプレートを除去し、その後、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に変換させ、５０μｇ／ｍlアンピシリンを含有するＬＢ培養皿に塗布し、３７℃で一晩培養した。プロリン水酸化酵素変異体アミノ酸配列を含むモノクローンを得て、さらに誘導試験と遺伝子順番測定を介して、突然変異部位を確定した。最終的に単一突然変異部位を有する突然変異体を得て、その後、単一突然変異部位の突然変異を突然変異母体として、さらに他の部位での突然変異のあるプライマーで全プラスミドのＰＣＲを再度行って、突然変異部位を再び確定する。
【００７５】
突然変異体の細菌を活性化した後、５０μｇ／ｍlのアンピシリンを含有する５００ｍlのＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０.６になるまで振動培養し、ＩＰＴＧを濃度が１ｍＭになるまで添加し、２５℃で誘導発現を行った。１６ｈ誘導した後、６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心して菌体を収集した。菌体を超音波ブレーカ(ＪＹ９２-２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社)で細胞を粉砕し、４℃、１００００ｇで２０ｍｉｎ遠心して上澄み液を取得し、プロリン水酸化酵素変異体活性の検出に利用した。
【００７６】
実施例３：プロリン水酸化酵素変異体の活性選別
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に比べ一つのアミノ酸残基の差異のあるプロリン水酸化酵素変異体の活性選別に以下のような１０ｍＬの反応液を利用して選別した。１０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸３０ｇ／Ｌ、５〜１０ｗｔ(１ｗｔは、１ｇの主原料の変換に１ｇのプロリン水酸化酵素変異体組換えウェット細胞が必要であることを指す。)の組換え粗酵素、３７.３ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、６.１ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、２００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加して、均一に混合して、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集してＨＰＬＣによる変換率の検出に利用し、活性選別結果は、表１に示す(表１は、すべての変換率データを比較して得た活性選別結果である)。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に比べ複数のアミノ酸残基の差異のあるプロリン水酸化酵素変異体の活性選別に以下のような２０ｍＬの反応液を利用して選別した。２０ｍＬの反応液に、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、２〜５ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加して、均一に混合して、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集してＨＰＬＣによる変換率の検出に利用し、活性選別結果は表２に示す(表２は、すべての変換率データを比較して得た活性選別結果である)。
【００７８】
実施例４：プロリン水酸化酵素突然変異体のクローンと発現
水酸化酵素突然変異体の発現及び鑑定の便宜を図るため、その遺伝子の５’と３’末端に互換性のある制限酵素切断部位を設置した。ＮｄｅＩとＸｈoＩでそれぞれ、目標遺伝子とｐＥＴ-２２ｂ(＋)(他の大腸菌でタンパク質を発現できる発現プラスミドも使用可能である)に同時に酵素切断を行うことができ、酵素切断後の目標遺伝子とプラスミドの大きいフラグメントについてはＴ４ＤＮＡ接続酵素で接続反応を行わせ、接続産物を大腸菌ＤＨ５α菌株の受容性細胞に変換し、その後、変換後の受容性細胞を５０μｇ／ｍlのアンピシリンを含有するＬＢ培養板に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００７９】
上記培養皿に成長された単一のコロニーを選んで５０μｇ／ｍlのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振動培養し、菌体を収集してプラスミド抽出を行い、ＰＣＲ鑑定と二重酵素切断鑑定後、正確なクローンベクターをｐＥＴ２２ｂ(＋)-Ｒ-Ｍと命名して、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に変換させ、変換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を５０μｇ／ｍlのアンピシリンを含有するＬＢ培養板に塗布し、３７℃で一晩培養した。上記培養板に成長された単一のコロニーを選んで５０μｇ／ｍlのアンピシリンを含有する５ｍlのＬＢ液体培地に接種し、コロニーＰＣＲで鑑定し、正確な発現ベクターを含む大腸菌に後続の誘導発現を行った。上記菌液を５０μｇ／ｍlのアンピシリンを含有する５００ｍlのＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０.５〜０.６になるまで振動培養して、ＩＰＴＧを最終濃度がそれぞれ０.２〜１.０ｍＭになるまで添加し、１８〜２５℃で１０〜１６ｈ誘導発現した後、菌液を取って、６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心して菌体を収集して、-２０℃に冷凍しておいた。菌体を超音波ブレーカ(ＪＹ９２-２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社)で細胞を粉砕し、４℃、１００００ｇで２０ｍｉｎ遠心して上澄み液と堆積物を得て、上澄み液を垂直型電気泳動装置でＳＤＳ-ＰＡＧＥ検出を行った。発現された水酸化酵素突然変異体はＳＤＳ-ＰＡＧＥで現す分子量は約３０ＫＤであった。
【００８０】
実施例５：表１と表２における水酸化酵素と野生型プロリン水酸化酵素の性能比較
図１に示す、水酸化酵素で触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸(シス-５-ヒドロキシピペリジン酸とも呼ばれる)を合成する化学反応過程に従って以下の実験を行う。
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２でコーディングさらた野生型プロリン水酸化酵素でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、１０ｗｔの水酸化酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。４０ｈの際、変換率は９８.４７％で、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.３６％であった。
【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１６でコーディングされたＥ２７Ｋアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、１０ｗｔ／８ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ１０ｗｔと８ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ１００％、９４.５３％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.３２％であった。
【００８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２２でコーディングされたＮ１６５Ｈアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、１０ｗｔと６.６７ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ１０ｗｔと６.６７ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ１００％、９０.４１％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９９.８９％であった。
【００８４】
さらなる好適な単点突然変異体として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０４でコーディングされたＫ１２３Ｄアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、８ｗｔ／５ｗｔ／４ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収取して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ８ｗｔ、５ｗｔ、４ｗｔである反応体系において、４０ｈの場合、変換率はそれぞれ１００％、９７.８３％、８９.０９％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.６８％であった。
【００８５】
多点突然変異体として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１８０でコーディングされたＳ３７Ｃ＋Ｉ２２３Ｖアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、８ｗｔ／５ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ８ｗｔ、５ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ１００％、９３.９９％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.２５％であった。
【００８６】
多点突然変異体として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１７８でコーディングされたＩ３９Ｒ＋Ｙ３５Ｗアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、５ｗｔ／３ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ５ｗｔ、３ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ１００％、９４.４５％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は７５.０２％であった。該突然変異体の選択性がやや低いが、その触媒活性は野生型プロリン水酸化酵素より明確に向上された。
【００８７】
さらに好適な組み合わせ突然変異体として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１４０でコーディングされたＩ３９Ｒ＋Ｋ１２３Ｄアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、４ｗｔ／３ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ４ｗｔ、３ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ９７.３５％、９２.０８％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９９.２６％であった。
【００８８】
さらなる好適な組み合わせ突然変異体として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１６０でコーディングされたＳ３７Ｃ＋Ｉ３９Ｋ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、３ｗｔ／２ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ３ｗｔ、２ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ９５.２３％、８８.４１％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９９.９０％であった。
【００８９】
実施例６：
発明者が自己設計して構成したアミノ酸配列ＰＨ１(配列表中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２８９を参照)は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２と７８％の相同性を有し、該タンパク質はＬ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに使用される。以下の２０ｍＬの反応液を使用する。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、９ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。４０ｈの際、変換率は９８.５６％で、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.４５％であった。
【００９０】
実施例７：
１)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２アミノ酸配列においてＩ３９Ｋ＋Ｓ３３Ｎアミノ酸残基が突然変異した後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２と９９％の相同性を有し、それのアミノ酸配列は配列表中の２９０号を参照できる。該配列でコーディングした突然変異酵素は、Ｌ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに使用される。以下の２０ｍＬの反応液を使用する。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、８ｗｔ／６ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。組換え酵素使用量がそれぞれ８ｗｔ、６ｗｔである反応体系において、４０ｈの際、変換率はそれぞれ１００％、９１.６２％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.８９％であった。
【００９１】
２)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２アミノ酸配列においてＥ２７Ｋ＋Ｉ３９Ｋ＋Ｆ２８Ｌ＋Ｓ３１Ａアミノ酸残基が突然変異した後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２と９８.６％の相同性を有し、それのアミノ酸配列は配列表中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２９１号を参照できる。該配列でコーディングした突然変異酵素は、Ｌ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに使用される。以下の２０ｍＬの反応液を使用する。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、５ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。４０ｈの際、変換率は９８.７５％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.３０％であった。
【００９２】
３)実施例６にて構成されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２との相同性が７８％であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２８９配列を基礎として突然変異し、該配列のＥ２７Ｋアミノ酸残基を突然変異させた後、配列表中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２９２に示すアミノ酸配列を得て、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２と９７.８％の相同性を有する。該配列でコーディングした突然変異プロリン水酸化酵素は、Ｌ-ピペリジン酸を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製するに使用される。以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-ピペリジン酸５０ｇ／Ｌ、７ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。４０ｈの際、変換率は９７.２５％であって、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸のジアステレオマー過剰率は９８.４０％であった。
【００９３】
比較例１：
既存技術において、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ菌からの組換えプロリン水酸化酵素で(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸を調製する過程において、(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸の最高ジアステレオマー過剰率は９０.７％で、位置変異体である(２Ｓ,３Ｒ)-３-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸が９.３％発生した(ＷＯ２０１３１６９７２５Ａ２)。
【００９４】
実施例５に比べ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の水酸化酵素のジアステレオマー過剰率は９８.３６％であるに対し、比較例１のジアステレオマー過剰率は９０.７％である。このように、本発明におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の水酸化酵素の選択性が既存技術より優れている。
【００９５】
実施例８：
表１と表２における水酸化酵素のシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリン調製中の応用、その反応過程を図２に示す。
【００９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０４でコーディングされたＫ１２３Ｄアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体でＬ-プロリンを触媒してシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンを調製し、以下の２０ｍＬの反応液を使用して調製した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-プロリン５０ｇ／Ｌ、５ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。４０ｈの際、変換率は９２.３６％で、ジアステレオマー過剰率は９９.３０％であった。
【００９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１６０でコーディングされたＳ３７Ｃ＋Ｉ３９Ｋ＋Ｉ２２３Ｖ＋Ｋ１２３Ｄアミノ酸残基が突然変異したプロリン水酸化酵素突然変異体であるＬ-プロリンでシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンを調製する際に以下の２０ｍＬの反応液を使用した。２０ｍＬの反応液は、Ｌ-プロリン５０ｇ／Ｌ、４ｗｔの組換え酵素、６２.２ｇ／Ｌ α-ケトグルタル酸、１０.２ｇ／ＬのＬ-アスコルビン酸、５ｍＭ硫酸第一鉄アンモニウムを含み、反応ｐＨが６.５で、反応温度が１０℃で、反応時間が４０ｈである。反応が終了した後、１００μＬの反応体系を取り、２００μＬのアセトニトリルを添加し、均一に混合した後、３０００μＬ精製水を添加し、１００００rｐｍで５ｍｉｎ遠心して上澄み液を収集して、ＨＰＬＣによる変換率の検出に使用した。４０ｈの際、変換率は９９.４７％で、ジアステレオマー過剰率は９９.５６％であった。
【００９８】
このように、表１と表２における多くの突然変異体である水酸化酵素はシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンの調製にも応用でき、高純度と高選択性のシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンを得ることもできる。
【００９９】
上述のように、本発明の上記実施例によると以下のような技術効果を生じ得る：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２を突然変異したプロリン水酸化酵素を選別する基礎配列とし、遺伝子工学手段によって、複数のプロリン水酸化酵素触媒活性及び選択性が顕著に向上された水酸化酵素を得ることができる。このような水酸化酵素は基質の変換率を高め、触媒専用位置異性体が少なく、特異性を有するプロリン誘導体のヒドロキシ化を触媒できる作用を実現させる。特に、Ｌ-ピペリジン酸のヒドロキシ化を触媒して(２Ｓ,５Ｓ)-５-ヒドロキシピペリジン-２-カルボキシル酸(シス-５-ヒドロキシピペリジン酸とも呼ばれる)を発生し、Ｌ-プロリンのヒドロキシ化によってシス-４-ヒドロキシ-Ｌ-プロリンを発生する。
【０１００】
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。当業者であれば本発明に様々な修正や変形が可能である。本発明の精神や原則内での全ての修正、均等置換、改良などは本発明の保護範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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