(57)【要約】  本明細書では、がん治療のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、より特定すると、ＣＤ３３モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを含有するＣＡＲが提示される。このようなＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞と、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および再発性または難治性ＡＭＬなどの増殖性障害を処置する方法とが提示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、
（ｂ）ストークドメイン、
（ｃ）膜貫通ドメイン、
（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
【請求項２】
前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号９および１０のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１１および１２のアミノ酸配列（ＤＲＢ２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、ならびに
（ｄ）配列番号１４および１５のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項３】
前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項４】
前記ストークドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列（ＣＤ８アルファヒンジ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項５】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢを含む、請求項１から４のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項６】
４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項５に記載の単離核酸。
【請求項７】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８を含む、請求項１から５のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項８】
ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項７に記載の単離核酸。
【請求項９】
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１から８のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項１０】
切断型表皮増殖因子受容体をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項１１】
前記切断型表皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔであり、配列番号３２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１０に記載の単離核酸。
【請求項１２】
前記切断型表皮増殖因子受容体が、ＨＥＲ１ｔ−１であり、配列番号５４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１０に記載の単離核酸。
【請求項１３】
前記ＣＡＲが、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、または５５に示されるアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項１４】
骨格と、
（１）ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、またはこれらの機能的な変異体のうちの少なくとも１つを含む切断型表皮増殖因子受容体、ならびに
（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、
（ｂ）ストークドメイン、
（ｃ）膜貫通ドメイン、
（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
をコードする核酸配列とを含むベクター。
【請求項１５】
骨格と、
（１）全長ＣＤ２０、切断型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ−１）、またはこれらの機能的な変異体、ならびに
（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、
（ｂ）ストークドメイン、
（ｃ）膜貫通ドメイン、
（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
をコードする核酸配列とを含むベクター。
【請求項１６】
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項１４または１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記切断型表皮増殖因子受容体が、配列番号３２または配列番号５４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１８】
切断型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ−１）、またはこの機能的な変異体をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＣＤ２０ｔ−１が、配列番号５６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】
前記全長ＣＤ２０が、配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２０】
自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１４から１９のいずれかに記載のベクター。
【請求項２１】
前記骨格が、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンのＤＮＡプラスミドまたはｐＦＵＧＷである、請求項１４から２０のいずれかに記載のベクター。
【請求項２２】
プロモーターをさらに含む、請求項１４から２１のいずれかに記載のベクター。
【請求項２３】
前記プロモーターが、ｈＥＦ１ａ１である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号９および１０のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１１および１２のアミノ酸配列（ＤＲＢ２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、ならびに
（ｄ）配列番号１４および１５のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４から２３のいずれかに記載のベクター。
【請求項２５】
前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１４から２４のいずれかに記載のベクター。
【請求項２６】
前記ストークドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列（ＣＤ８アルファヒンジ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１４から２５のいずれかに記載のベクター。
【請求項２７】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢを含む、請求項１４から２６のいずれかに記載のベクター。
【請求項２８】
４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８を含む、請求項１４から２６のいずれかに記載のベクター。
【請求項３０】
ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１４から３０のいずれかに記載のベクター。
【請求項３２】
プラスミドを含む、請求項１４から３１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３３】
各前記ベクターが、発現プラスミドを含む、請求項１４から３１に記載のベクター。
【請求項３４】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項３５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含む免疫エフェクター細胞。
【請求項３６】
骨格と、（１）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターを含む免疫エフェクター細胞。
【請求項３７】
（１）キルスイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せとしての使用のための細胞タグ、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞。
【請求項３８】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０を含む、請求項３７に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項３９】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔを含み、前記ＨＥＲ１ｔが、配列番号３２のポリペプチド配列を含む、請求項３８に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項４０】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１ｔ−１を含み、前記ＨＥＲ１ｔ−１が、配列番号５４のポリペプチド配列を含む、請求項３８に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項４１】
請求項１４から３４のいずれかに記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
【請求項４２】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調節性Ｔ細胞である、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項４３】
前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合すると、抗腫瘍免疫を呈する、請求項４２に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項４４】
それを必要とするヒト対象における、標的細胞集団または標的組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、前記ヒト対象に、有効量の、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を投与するステップを含み、前記ＣＡＲが、
（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、
（ｂ）ストークドメイン、
（ｃ）膜貫通ドメイン、
（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、
（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、および
（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）
を含む、方法。
【請求項４５】
前記ヒトが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記急性骨髄性白血病が、再発性または難治性ＡＭＬである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を伴うＣＤ３３抗原結合性ドメイン、
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を伴うストークドメイン、
（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を伴うＣＤ２８を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号５４のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ；
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
【請求項４８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、前記ＣＡＲが、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を伴うＣＤ３３抗原結合性ドメイン、
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を伴うストークドメイン、
（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を伴う４−１ＢＢを含む共刺激シグナル伝達ドメイン、
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号５４のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ、
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含む、単離核酸。
【請求項４９】
請求項４７および４８に記載のポリヌクレオチドのうちの任意の１または複数を含むベクター。
【請求項５０】
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
複数のベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５３】
免疫エフェクター細胞内でＣＡＲを発現させるための系であって、請求項１から１３および４７から４８のいずれか一項に記載の単離核酸をコードする、１または複数のベクターを含む系。
【請求項５４】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項５３に記載の系。
【請求項５５】
少なくとも１つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む、請求項５３から５４のいずれか一項に記載の系。
【請求項５６】
前記さらなる遺伝子が、サイトカインを含む、請求項５５に記載の系。
【請求項５７】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項５６に記載の系。
【請求項５８】
前記サイトカインが、分泌型にある、請求項５６に記載の系。
【請求項５９】
前記サイトカインが、膜結合型にある、請求項５６に記載の系。
【請求項６０】
１つのベクターを含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の系。
【請求項６１】
前記１または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項５３から６０のいずれか一項に記載の系。
【請求項６２】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項６１に記載の系。
【請求項６３】
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項６２に記載の系。
【請求項６４】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼが、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０である、請求項６３に記載の系。
【請求項６５】
前記免疫エフェクター細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５３から６４のいずれか一項に記載の系。
【請求項６６】
免疫エフェクター細胞内でＣＡＲを発現させる方法であって、前記免疫エフェクター細胞を、請求項５３から６５のいずれか一項に記載の系と接触させるステップを含む方法。
【請求項６７】
改変Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、
（ａ）細胞の試料を対象から得るステップであって、前記試料が、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞を含むステップと、
（ｂ）前記細胞に、請求項１から１３および４７から４８のいずれか一項に記載の単離核酸をコードする、１または複数のベクター、ならびにトランスポザーゼをコードするベクターをトランスフェクトして、改変ＣＤ３３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団をもたらすステップと、
（ｃ）任意選択で、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の前記集団を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、２日間またはこれ未満にわたり培養するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
前記細胞に、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む融合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記１または複数のベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼが、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０である、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月８日に出願された、米国特許仮出願第６２／３４７，５０３号の利益を主張する。
【０００２】
配列表への参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１７年６月６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「５０４７１＿７０９＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔ」と名付けられ、１０３，１２０バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
本明細書では、ヒトにおけるがんを処置するための組成物および方法が提示される。本発明はさらに、骨髄性悪性腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病を処置するための、特異的キメラ抗原受容体およびベクターにも関する。
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）とは、骨髄が、異常な骨髄芽球を作り出す種類のがんである。ＡＭＬは、成人における急性白血病の、最も一般的な形態である（Siegel, R., et al., Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 64(1):9-29 (2014)）。ＡＭＬは、発症時の年齢中央値を６５〜７０歳とする、急速な進行性疾患である。ＡＭＬは、急性骨髄性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）、急性顆粒球性白血病、および急性非リンパ球性白血病を含む、多くの名称で知られている。「急性」とは、急速に進行する可能性があり、処置されなければ、診断から数カ月以内に致死性となりうる、この疾患の侵襲性の性質を表す。がんは、骨髄内に発するが、血液を介して、他の解剖学的部位へと急速に拡散する。疾患は、小児および成人のいずれにおいても観察されるが、老齢者において、より一般的である。ＡＭＬに罹患する可能性は、年齢と共に増加するが、年齢にかかわらずＡＭＬに罹患しうる。急性白血病を伴う成人１０人中約８人が、ＡＭＬを有し、白血病を伴う小児６人中約１人が、ＡＭＬを有すると予想される。米国では、現在のところ、年平均１２，０００例の新たなＡＭＬ症例が予測され、約３０，０００例の患者が、寛解の下で生存しているか、または寛解を経験している。
【０００５】
老齢のＡＭＬ患者（≧６５歳）では、生存期間中央値は、短い（６５〜７４歳の患者の３．９カ月間〜≧８５歳の患者の１．４カ月間）。ＡＭＬ患者のための処置選択肢は、限定されており、転帰は通例、不良であり、平均５年生存率は、２０％であり、６５歳を超える患者の５年生存率は、５％未満である（Thein, M. et al., Outcome of older patients with acute myeloid leukemia: an analysis of SEER data over 3 decades, Cancer, 119(15):2720-7 (2013)）。ＡＭＬのある特定の亜群は、第７染色体内の異常、複合核型、既往の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）から生じる、再発性および／または難治性ＡＭＬおよびＡＭＬを伴う患者など、特に、より不良な転帰を有する。ＡＭＬを伴う、６５歳以上の患者は、若齢の患者より、好ましくない危険性の細胞遺伝学を示す可能性が大きい。これらの細胞遺伝学因子は、化学療法に対する耐性と関連し、治療に対して、大幅に低い奏効率を示す。奏効率に加えて、ＡＭＬを伴う老齢患者は、忍容性および処置転帰の不良のために、標準的な導入化学療法の候補者として検討されないか、またはこれを施されるように選択されないことが多い。導入化学療法は、この患者サブセットでは、高率の処置関連死亡率および完全奏効（ＣＲ）率の低さと関連する。現在のところ、標準的な導入化学療法を施されないＡＭＬ患者のために承認された療法は存在しない。治療の欠乏と、奏効率の不良と関連する細胞遺伝学により、ＡＭＬは、好適な安全性プロファイルを伴う臨床的利益を裏付ける、新たな薬剤に対する医学的必要を満たされていない。
【０００６】
造血は、多能性幹細胞から、より成熟した分化細胞の表現型への、組織特異的な階層的分化を特徴とする。恒常性造血と同様に、ＡＭＬは、この休眠幹細胞集団内で蓄積される、白血病性幹細胞（ＬＳＣ）をもたらす突然変異から生じると考えられる。このＡＭＬ  ＬＳＣ集団を消失させることができないため、再発および治療の失敗が結果としてもたらされる。
【０００７】
ＡＭＬを伴う大半の患者は、導入化学療法により、寛解を達成するが、多くは、寛解後強化療法の投与にもかかわらず、再発する。再発は、数週間〜何年もの後にも発生しうる。患者のうちの最大１０％が、導入化学療法に対して抵抗性となる。これらの群の患者（再発性／難治性）のいずれも、特に不良な危険性の群を構成する。同種幹細胞移植は、これらの患者の大半のために推奨される手法と考えられるが、実行可能なのは、少数の患者に限られ、著明な罹患率および死亡率と関連する（Hamadani, M., Awan, F. & Copelan, E., Hematopoietic stem cell transplantation in adults with acute myeloid leukemia, Biol Blood Marrow Transplant, 5:556-67 (2008)）。加えて、難治性疾患を伴う、移植された患者の転帰も、不良であり（Duval, M. et al., Hematopoietic stem-cell transplantation for acute leukemia in relapse or primary induction failure, J Clin Oncol, 28(23):3730-8 (2010)）、再発性疾患を伴う患者のうちのほぼ半数が、化学療法抵抗性であり、したがって、移植にも適さない（Hamadani, M., Awan, F. & Copelan, E., Hematopoietic stem cell transplantation in adults with acute myeloid leukemia Biol Blood Marrow Transplant, 5:556-67 (2008)、Estey, E., 2013. Acute myeloid leukemia: 2013 update on risk-stratification and management. Am J Hematol, 88(4), pp. 318-27）。多くの新規の薬物および手法が、この群の患者のために探索されている。しかし、ＣＲ率は、一般に、３０％未満である（Litzow, M. et al., Failure of three novel regimens to improve outcome for patients with relapsed or refractory acute myeloid leukaemia: a report from the Eastern Cooperative Oncology Group, Br J Haemotol, 148:217-25 (2010)、Cortes, J. et al., Phase 2 randomized study of p53 antisense oligonucleotide (cenersen) plus idarubicin with or without cytarabine in refractory and relapsed acute myeloid leukemia, Cancer, 118(2):418-27 (2012)、Kirschbaum, M. et al., A phase 1 trial dose-escalation study of tipifarnib on a week-on, week-off schedule in relapsed, refractory or high-risk myeloid leukemia, Leukemia, 25(10):1543-7 (2011)）。
【０００８】
ＡＭＬ患者では、細胞遺伝学は、処置に対する応答の予測において、重要な予後因子である（Grimwade, D. et al., The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Children’s Leukaemia Working Parties, Blood, 92(7):2322-33 (1998)）。ＡＭＬを伴い、その白血病性細胞が、ｔ（８；２１）、ｔ（１５；１７）、ｔ（１６；１６）、またはｉｎｖ（１６）の転座を有する患者は、導入化学療法および集中的な寛解後強化化学療法による転帰が良好である。しかし、第５染色体もしくは第７染色体の異常、１１ｑ２３、または複合核型は、現在利用可能な導入化学療法および寛解後化学療法によっても、転帰が極めて不良である。正常核型または第８トリソミーを伴う患者は、中程度の予後を有する。ＡＭＬを伴う成人中、ｔ（９；２２）またはｔ（４；１１）は、極めて不良な予後をもたらす。ｔ（９；２２）によるＡＭＬを伴う患者は、化学療法単独では、治癒は、起きるとしても稀である。白血病性芽球上で発現する表面抗原の、免疫表現型の決定は、診断の一助となる場合があり、骨髄性白血病、Ｔ細胞系の白血病、およびＢ細胞系の白血病お処置および予後について、重要な示唆を与える。従来の療法を使用する場合にＡＭＬの長期生存の延長を達成しにくいことを踏まえると、新規の処置戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示の一態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢおよびＣＤ２８のうちの少なくとも１つ、またはこれらの断片を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ならびに任意選択で、（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）を含む、単離核酸に関する。
【００１０】
本明細書では、骨格と、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。ある特定の実施形態では、切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）、または全長ＣＤ２０もしくは切断型ＣＤ２０をコードする核酸をさらに含むベクターが提示される。
【００１１】
本明細書では、骨格と、（１）切断型表皮増殖因子受容体またはこれらの機能的な変異体、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、骨格と、（１）全長ＣＤ２０およびこの機能的な変異体、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。
【００１３】
ある特定の実施形態では、骨格と、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、ならびに（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）、全長ＣＤ２０、および切断型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ−１）のうちの少なくとも１つを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターを含む改変細胞（engineered cell）、例えば、免疫エフェクター細胞が提示される。
【００１４】
ある特定の実施形態では、（１）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変細胞、例えば、免疫エフェクター細胞が提示される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、（１）キルスイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せとしての使用のための細胞タグ、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変細胞、例えば、免疫エフェクター細胞が提示される。ある特定の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ２８のうちの少なくとも１つを含む。複数の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０、またはＣＤ２０ｔ−１である。
【００１６】
本明細書では、ヒトにおける、標的細胞集団または標的組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、ヒトに、有効量の、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を投与するステップを含み、ＣＡＲが、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、および（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）を含む、方法が提示される。
【００１７】
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸が提示される。
【００１８】
一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号９および１０のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号１１および１２のアミノ酸配列（ＤＲＢ２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、ならびに（ｄ）配列番号１４および１５のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
【００１９】
場合によって、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである。場合によって、ストークドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列（ＣＤ８アルファヒンジ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである。
【００２０】
一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢを含む。場合によって、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２１】
場合によって、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、単離核酸は、切断型表皮増殖因子受容体をさらに含む。場合によって、切断型表皮増殖因子受容体は、ＨＥＲ１ｔであり、配列番号３２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、切断型表皮増殖因子受容体は、ＨＥＲ１ｔ−１であり、配列番号５４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、または５５を含むアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２３】
本明細書では、骨格と、（１）ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、またはこれらの機能的な変異体のうちの少なくとも１つを含む切断型表皮増殖因子受容体、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。
【００２４】
本明細書では、骨格と、（１）全長ＣＤ２０、切断型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ−１）、またはこれらの機能的な変異体、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。
【００２５】
一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。場合によって、切断型表皮増殖因子受容体は、配列番号３２または配列番号５４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、ベクターは、切断型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ−１）、またはこの機能的な変異体をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＣＤ２０ｔ−１は、配列番号５６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、全長ＣＤ２０は、配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、ベクターは、自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。場合によって、ベクターの骨格は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンのＤＮＡプラスミドまたはｐＦＵＧＷである。
【００２７】
場合によって、ベクターは、プロモーターをさらに含む。場合によって、プロモーターは、ｈＥＦ１ａ１である。場合によって、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号９および１０のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号１１および１２のアミノ酸配列（ＤＲＢ２）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド、ならびに（ｄ）配列番号１４および１５のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドである。場合によって、ストークドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列（ＣＤ８アルファヒンジ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によって、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢを含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００２９】
場合によって、ベクターの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８を含む。場合によって、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。場合によって、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、前記ベクターは、プラスミドを含む。場合によって、各前記ベクターは、発現プラスミドを含む。場合によって、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書で開示されるヌクレオチドを含みうる。
【００３１】
本明細書では、骨格と、（１）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターを含む免疫エフェクター細胞が提示される。
【００３２】
本明細書ではさらに、（１）キルスイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せとしての使用のための細胞タグ、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞も提示される。
【００３３】
一部の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０を含む。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔを含み、前記ＨＥＲ１ｔは、配列番号３２のポリペプチド配列を含む。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ−１を含み、前記ＨＥＲ１ｔ−１は、配列番号５４のポリペプチド配列を含む。場合によって、免疫エフェクター細胞は、本明細書で開示されるベクターを含む。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、または調節性Ｔ細胞である。場合によって、細胞は、ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合すると、抗腫瘍免疫を呈する。
【００３４】
本明細書では、それを必要とするヒト対象における、標的細胞集団または標的組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、前記ヒト対象に、有効量の、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を投与するステップを含み、ＣＡＲが、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、および（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）を含む、方法が提示される。
【００３５】
一部の実施形態では、ヒトは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断されている。場合によって、急性骨髄性白血病は、再発性または難治性ＡＭＬである。
【００３６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を伴うＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を伴うストークドメイン、（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を伴うＣＤ２８を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号５４のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ、（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸が提示される。
【００３７】
本明細書ではさらに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を伴うＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を伴うストークドメイン、（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を伴う４−１ＢＢを含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｄ）配列番号３２のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔおよび配列番号５４のアミノ酸配列を伴うＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つを含むＨＥＲ１タグ、（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を伴うＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、単離核酸も提示される。
【００３８】
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書で開示されるポリヌクレオチドのうちの１または複数を含む。場合によって、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。場合によって、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施形態では、前記ベクターは、複数のベクターである。
【００３９】
免疫エフェクター細胞内でＣＡＲを発現させるための系であって、本明細書で開示される単離核酸をコードする、１または複数のベクターを含む系が提示される。一部の実施形態では、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。場合によって、前記系は、少なくとも１つのさらなる遺伝子をコードする核酸をさらに含む。場合によって、前記さらなる遺伝子は、サイトカインを含む。一部の実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、前記サイトカインは、分泌型にある。一部の実施形態では、前記サイトカインは、膜結合型にある。
【００４０】
場合によって、前記系は、１つのベクターを含む。場合によって、前記１または複数のベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。場合によって、前記系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む。場合によって、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０である。場合によって、前記免疫エフェクター細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞内でＣＡＲを発現させる方法は、前記免疫エフェクター細胞を、本明細書で開示される系と接触させるステップを含む。
【００４１】
本明細書では、改変Ｔ細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、（ａ）細胞の試料を対象から得るステップであって、試料が、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞を含むステップと、（ｂ）細胞に、請求項１から１３および４４から４５のいずれか一項に記載の単離核酸をコードする、１または複数のベクター、およびトランスポザーゼをコードするベクターをトランスフェクトして、改変ＣＤ３３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団をもたらすステップと、（ｃ）任意選択で、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、２日間またはこれ未満にわたり培養するステップとを含む方法が提示される。
【００４２】
一部の実施形態では、方法は、細胞に、サイトカインをコードするベクターをトランスフェクトするステップをさらに含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む融合タンパク質である。場合によって、前記１または複数のベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。場合によって、方法は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む。場合によって、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０である。
【００４３】
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＣＤ３３アイソフォームの構造について描示する概略図である。
【図２】ＣＤ３３  ＣＡＲレンチウイルスベクターマップを描示する図である。
【図３】Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系についての例示的な概略図である。
【図４】ＣＡＲ−Ｔ細胞を作出するための、レンチウイルスによる形質導入についての例示的な概略図である。
【図５】養子導入Ｔ細胞上の、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔの発現を描示する図である。
【図６】レンチウイルスにより形質導入された細胞からの、ＣＤ３３  ＣＡＲの発現の、ウェスタンブロットによる確認を裏付ける図である。
【図７】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養されたＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の絶対数の増加、ならびにＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激の後における、非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）およびＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３３  ＣＡＲＬＶ）からの、全Ｔ細胞集団の倍数の増加の動態を示す図である。
【図８】レンチウイルスによる形質導入後におけるＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞のコピー数についての評価を提示する図である。
【図９−１】図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃ：ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の、標的特異的な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用を裏付ける図である。ＣＤ３３特異的細胞傷害作用は、ユーロピウム標識化標的細胞（ＥＬ４、ＥＬ４／ＣＤ３３およびＭＯＬＭ−１３）により測定した（図９Ａ）。被験細胞株における、ＣＤ３３の表面発現レベルは、フローサイトメトリーにより測定した。太字の影付き直線は、アイソタイプ対照抗体による染色を示し、明色の影付き直線は、抗ヒトＣＤ３３抗体による染色を示す（図９Ｂおよび図９Ｃ）。
【図９−２】図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃ：ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の、標的特異的な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用を裏付ける図である。ＣＤ３３特異的細胞傷害作用は、ユーロピウム標識化標的細胞（ＥＬ４、ＥＬ４／ＣＤ３３およびＭＯＬＭ−１３）により測定した（図９Ａ）。被験細胞株における、ＣＤ３３の表面発現レベルは、フローサイトメトリーにより測定した。太字の影付き直線は、アイソタイプ対照抗体による染色を示し、明色の影付き直線は、抗ヒトＣＤ３３抗体による染色を示す（図９Ｂおよび図９Ｃ）。
【図１０Ａ】ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させたＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞からの、サイトカイン（ＩＦＮγ（図１０Ａ）、ＩＬ−２（図１０Ｂ）、およびＴＮＦ（図１０Ｃ））の産生を裏付ける図である。
【図１０Ｂ】ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させたＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞からの、サイトカイン（ＩＦＮγ（図１０Ａ）、ＩＬ−２（図１０Ｂ）、およびＴＮＦ（図１０Ｃ））の産生を裏付ける図である。
【図１０Ｃ】ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させたＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞からの、サイトカイン（ＩＦＮγ（図１０Ａ）、ＩＬ−２（図１０Ｂ）、およびＴＮＦ（図１０Ｃ））の産生を裏付ける図である。
【図１１】ＨＥＲ１ｔを発現するＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞のセツキシマブにより誘導される抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を示す図である。
【図１２】ＡＭＬ腫瘍モデルにおける、処置群ごとのＮＳＧマウスの生存曲線を裏付ける図である。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ：ｆＬＵＣ生体発光により測定される腫瘍負荷についての定量的解析を提示する図である。図１３Ａ：腹側から見た図であり、図１３Ｂ：背側から見た図である。
【図１４Ａ】ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたＮＳＧマウスに由来する血液試料、骨髄試料、および脾臓試料についてのフローサイトメトリー解析を提示する図である。
【図１４Ｂ】ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたＮＳＧマウスに由来する血液試料、骨髄試料、および脾臓試料についてのフローサイトメトリー解析を提示する図である。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂ：ＬＶにより形質導入された多様なヒトＴ細胞上における、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔの発現を裏付ける図である。
【図１６Ａ】多様なＡＭＬ細胞株上における、ＣＤ３３発現についてのフローサイトメトリー結果について描示するグラフを示す図である（図１６Ａ）。多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株における、多様なＬＶ  ＣＤ３３  ＣＡＲについての、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイの結果について描示するグラフである（図１６Ｂ）。ＬＶ  ＣＤ３３  ＣＡＲによる、多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株の認識時において、Ｔ細胞により放出されるサイトカインの発現結果について描示するグラフである（図１６Ｃ）。
【図１６Ｂ】多様なＡＭＬ細胞株上における、ＣＤ３３発現についてのフローサイトメトリー結果について描示するグラフを示す図である（図１６Ａ）。多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株における、多様なＬＶ  ＣＤ３３  ＣＡＲについての、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイの結果について描示するグラフである（図１６Ｂ）。ＬＶ  ＣＤ３３  ＣＡＲによる、多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株の認識時において、Ｔ細胞により放出されるサイトカインの発現結果について描示するグラフである（図１６Ｃ）。
【図１６Ｃ】多様なＡＭＬ細胞株上における、ＣＤ３３発現についてのフローサイトメトリー結果について描示するグラフを示す図である（図１６Ａ）。多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株における、多様なＬＶ  ＣＤ３３  ＣＡＲについての、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイの結果について描示するグラフである（図１６Ｂ）。ＬＶ  ＣＤ３３  ＣＡＲによる、多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株の認識時において、Ｔ細胞により放出されるサイトカインの発現結果について描示するグラフである（図１６Ｃ）。
【図１７】ＣＡＲ３３−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｍ−Ｚ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）Ｔ細胞による、ＣＤ３３発現白血病細胞株での溶解について描示するグラフを提示する図である。
【図１８】ＣＤ３３発現標的細胞の存在下における、ＣＡＲ３３−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｍ−Ｚ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）Ｔ細胞の、ＣＤ１０７ａの脱顆粒化およびＩＦＮγの産生に対する効果を裏付けるフローサイトメトリー結果について描示するグラフを提示する図である。
【図１９】ＣＤ３３  ＣＡＲ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）およびＨＥＲ１ｔの、遺伝子改変Ｔ細胞上の発現を裏付けるフローサイトメトリー結果について描示するグラフを提示する図である。
【図２０Ａ】ＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞内の、本明細書で記載されるＣＡＲの効果を描示する図である。図２０Ａは、多様なＡＭＬ細胞株上における、ＣＤ３３発現についてのフローサイトメトリー結果について描示するグラフを提示する。図２０Ｂは、多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株における、ＣＡＲ３３−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｍ−Ｚ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）についての、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイの結果について描示するグラフを提示する。
【図２０Ｂ】ＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞内の、本明細書で記載されるＣＡＲの効果を描示する図である。図２０Ａは、多様なＡＭＬ細胞株上における、ＣＤ３３発現についてのフローサイトメトリー結果について描示するグラフを提示する。図２０Ｂは、多様なＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株における、ＣＡＲ３３−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｍ−Ｚ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）についての、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイの結果について描示するグラフを提示する。
【図２１−１】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−２】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−３】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−４】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−５】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−６】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−７】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−８】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−９】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−１０】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−１１】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−１２】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−１３】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−１４】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２１−１５】本明細書で記載される方法および組成物についての核酸配列およびポリペプチド配列を例示する配列表を提示する図である。
【図２２Ａ−１】本明細書で記載される組成物の、腫瘍細胞と接触させたときの効果であって、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの結果を含む効果を提示する図である。図２２Ａは、研究の１１日目（ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の３日後）における、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスの血漿によるサイトカイン解析について描示するグラフを提示する図である。マウスに由来する血漿を回収し、ヒトサイトカインを、マルチプレックス解析物プラットフォームにより評価した。測定されたいくつかの解析物（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、およびＩＰ−１０）についての平均値±ＳＥＭが示される。群１つ当たりのマウスのＮ＝１１〜１５であり、これは、規定された時点における組織回収のためのサテライト群の一部であるマウスを含んだ。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；それぞれの処置群に対する、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞についての、チューキーによる多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）である。図２２Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後における、ＡＭＬ腫瘍保有マウスから採取された血液試料の、代表的なサンプリングについて描示するグラフを提示する図である。ＡＭＬ保有腫瘍マウスを、８日目に、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回投与、またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した。投与２回と注記された群には、研究の１５日目に、等用量のＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞だけによる２回目を施した。血液試料を、マウスから得て、ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在および存続、ならびにＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞（ＣＤ１２３の発現に基づく）の存在について査定した。（Ａ）マウスが瀕死となった１６日目に、血液試料を、生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスから採取した。（Ｂ）１８日目に、血液試料を、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された、残りのマウスから採取した。示されるデータに、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ヒトＣＤ４５＋細胞について、ゲートをかけた。図２２Ｃ：ＡＬＭ腫瘍細胞株（ＴＨＰ１およびＨＬ６０）に対する細胞傷害活性について描示するグラフである。
【図２２Ａ−２】本明細書で記載される組成物の、腫瘍細胞と接触させたときの効果であって、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの結果を含む効果を提示する図である。図２２Ａは、研究の１１日目（ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の３日後）における、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスの血漿によるサイトカイン解析について描示するグラフを提示する図である。マウスに由来する血漿を回収し、ヒトサイトカインを、マルチプレックス解析物プラットフォームにより評価した。測定されたいくつかの解析物（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、およびＩＰ−１０）についての平均値±ＳＥＭが示される。群１つ当たりのマウスのＮ＝１１〜１５であり、これは、規定された時点における組織回収のためのサテライト群の一部であるマウスを含んだ。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；それぞれの処置群に対する、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞についての、チューキーによる多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）である。図２２Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後における、ＡＭＬ腫瘍保有マウスから採取された血液試料の、代表的なサンプリングについて描示するグラフを提示する図である。ＡＭＬ保有腫瘍マウスを、８日目に、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回投与、またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した。投与２回と注記された群には、研究の１５日目に、等用量のＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞だけによる２回目を施した。血液試料を、マウスから得て、ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在および存続、ならびにＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞（ＣＤ１２３の発現に基づく）の存在について査定した。（Ａ）マウスが瀕死となった１６日目に、血液試料を、生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスから採取した。（Ｂ）１８日目に、血液試料を、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された、残りのマウスから採取した。示されるデータに、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ヒトＣＤ４５＋細胞について、ゲートをかけた。図２２Ｃ：ＡＬＭ腫瘍細胞株（ＴＨＰ１およびＨＬ６０）に対する細胞傷害活性について描示するグラフである。
【図２２Ｂ−１】本明細書で記載される組成物の、腫瘍細胞と接触させたときの効果であって、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの結果を含む効果を提示する図である。図２２Ａは、研究の１１日目（ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の３日後）における、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスの血漿によるサイトカイン解析について描示するグラフを提示する図である。マウスに由来する血漿を回収し、ヒトサイトカインを、マルチプレックス解析物プラットフォームにより評価した。測定されたいくつかの解析物（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、およびＩＰ−１０）についての平均値±ＳＥＭが示される。群１つ当たりのマウスのＮ＝１１〜１５であり、これは、規定された時点における組織回収のためのサテライト群の一部であるマウスを含んだ。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；それぞれの処置群に対する、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞についての、チューキーによる多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）である。図２２Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後における、ＡＭＬ腫瘍保有マウスから採取された血液試料の、代表的なサンプリングについて描示するグラフを提示する図である。ＡＭＬ保有腫瘍マウスを、８日目に、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回投与、またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した。投与２回と注記された群には、研究の１５日目に、等用量のＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞だけによる２回目を施した。血液試料を、マウスから得て、ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在および存続、ならびにＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞（ＣＤ１２３の発現に基づく）の存在について査定した。（Ａ）マウスが瀕死となった１６日目に、血液試料を、生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスから採取した。（Ｂ）１８日目に、血液試料を、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された、残りのマウスから採取した。示されるデータに、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ヒトＣＤ４５＋細胞について、ゲートをかけた。図２２Ｃ：ＡＬＭ腫瘍細胞株（ＴＨＰ１およびＨＬ６０）に対する細胞傷害活性について描示するグラフである。
【図２２Ｂ−２】本明細書で記載される組成物の、腫瘍細胞と接触させたときの効果であって、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの結果を含む効果を提示する図である。図２２Ａは、研究の１１日目（ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の３日後）における、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスの血漿によるサイトカイン解析について描示するグラフを提示する図である。マウスに由来する血漿を回収し、ヒトサイトカインを、マルチプレックス解析物プラットフォームにより評価した。測定されたいくつかの解析物（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、およびＩＰ−１０）についての平均値±ＳＥＭが示される。群１つ当たりのマウスのＮ＝１１〜１５であり、これは、規定された時点における組織回収のためのサテライト群の一部であるマウスを含んだ。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；それぞれの処置群に対する、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞についての、チューキーによる多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）である。図２２Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後における、ＡＭＬ腫瘍保有マウスから採取された血液試料の、代表的なサンプリングについて描示するグラフを提示する図である。ＡＭＬ保有腫瘍マウスを、８日目に、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回投与、またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した。投与２回と注記された群には、研究の１５日目に、等用量のＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞だけによる２回目を施した。血液試料を、マウスから得て、ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在および存続、ならびにＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞（ＣＤ１２３の発現に基づく）の存在について査定した。（Ａ）マウスが瀕死となった１６日目に、血液試料を、生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスから採取した。（Ｂ）１８日目に、血液試料を、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された、残りのマウスから採取した。示されるデータに、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ヒトＣＤ４５＋細胞について、ゲートをかけた。図２２Ｃ：ＡＬＭ腫瘍細胞株（ＴＨＰ１およびＨＬ６０）に対する細胞傷害活性について描示するグラフである。
【図２２Ｃ】本明細書で記載される組成物の、腫瘍細胞と接触させたときの効果であって、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの結果を含む効果を提示する図である。図２２Ａは、研究の１１日目（ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の３日後）における、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスの血漿によるサイトカイン解析について描示するグラフを提示する図である。マウスに由来する血漿を回収し、ヒトサイトカインを、マルチプレックス解析物プラットフォームにより評価した。測定されたいくつかの解析物（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、およびＩＰ−１０）についての平均値±ＳＥＭが示される。群１つ当たりのマウスのＮ＝１１〜１５であり、これは、規定された時点における組織回収のためのサテライト群の一部であるマウスを含んだ。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；それぞれの処置群に対する、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞についての、チューキーによる多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）である。図２２Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置後における、ＡＭＬ腫瘍保有マウスから採取された血液試料の、代表的なサンプリングについて描示するグラフを提示する図である。ＡＭＬ保有腫瘍マウスを、８日目に、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回投与、またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した。投与２回と注記された群には、研究の１５日目に、等用量のＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞だけによる２回目を施した。血液試料を、マウスから得て、ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在および存続、ならびにＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞（ＣＤ１２３の発現に基づく）の存在について査定した。（Ａ）マウスが瀕死となった１６日目に、血液試料を、生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスから採取した。（Ｂ）１８日目に、血液試料を、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された、残りのマウスから採取した。示されるデータに、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ヒトＣＤ４５＋細胞について、ゲートをかけた。図２２Ｃ：ＡＬＭ腫瘍細胞株（ＴＨＰ１およびＨＬ６０）に対する細胞傷害活性について描示するグラフである。
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｅ：ＡＭＬ患者のＴ細胞からの、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の作出について記載し、ＡＭＬ腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を裏付ける図である。図２３Ａ：ＡＭＬドナーに由来するＰＢＭＣを得、ＣＤ３３およびＣＤ３の発現について、表現型を特徴づけした。図２３Ｂ：ビーズベースの方法を使用して、Ｔ細胞を、ＰＢＭＣ画分から単離し、非標識化画分を、ＣＤ３３＋腫瘍細胞について特徴づけた。図２３Ｃ：Ｔ細胞に、ＬＶ−ＣＤ３３−ＣＡＲ構築物により形質導入し、培養の１４日目におけるＣＡＲの発現を示す。図２３Ｄ：０日目（アッセイの準備がなされた時点）および３日目における、ＡＭＬドナーによるＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞またはＡＭＬドナー腫瘍細胞との共培養物を示す。全ての細胞に、ＦＳＣ／ＳＳＣ／生細胞について、ゲートをかけた。図２３Ｅ：ＡＭＬ患者に由来するＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＣＤ３３発現腫瘍細胞との共培養後におけるサイトカイン発現である。細胞内サイトカイン染色は、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＡＭＬドナーＥ２６１に由来する）の、表示の腫瘍細胞との共培養の１８時間後において実施した。Ｔ細胞は、細胞表面染色し、次いで、固定／透過化に続き、サイトカインであるＩＦＮγおよびＩＬ−２について染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣ／生／ＣＤ３  Ｔ細胞に基づき、細胞にゲートをかけた。ＡＭＬ  Ｅ２６１細胞とは、試料中に存在する、患者の自家ＣＤ３３腫瘍細胞を指す。
【図２３−２】図２３Ａ〜２３Ｅ：ＡＭＬ患者のＴ細胞からの、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の作出について記載し、ＡＭＬ腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を裏付ける図である。図２３Ａ：ＡＭＬドナーに由来するＰＢＭＣを得、ＣＤ３３およびＣＤ３の発現について、表現型を特徴づけした。図２３Ｂ：ビーズベースの方法を使用して、Ｔ細胞を、ＰＢＭＣ画分から単離し、非標識化画分を、ＣＤ３３＋腫瘍細胞について特徴づけた。図２３Ｃ：Ｔ細胞に、ＬＶ−ＣＤ３３−ＣＡＲ構築物により形質導入し、培養の１４日目におけるＣＡＲの発現を示す。図２３Ｄ：０日目（アッセイの準備がなされた時点）および３日目における、ＡＭＬドナーによるＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞またはＡＭＬドナー腫瘍細胞との共培養物を示す。全ての細胞に、ＦＳＣ／ＳＳＣ／生細胞について、ゲートをかけた。図２３Ｅ：ＡＭＬ患者に由来するＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＣＤ３３発現腫瘍細胞との共培養後におけるサイトカイン発現である。細胞内サイトカイン染色は、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＡＭＬドナーＥ２６１に由来する）の、表示の腫瘍細胞との共培養の１８時間後において実施した。Ｔ細胞は、細胞表面染色し、次いで、固定／透過化に続き、サイトカインであるＩＦＮγおよびＩＬ−２について染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣ／生／ＣＤ３  Ｔ細胞に基づき、細胞にゲートをかけた。ＡＭＬ  Ｅ２６１細胞とは、試料中に存在する、患者の自家ＣＤ３３腫瘍細胞を指す。
【図２３−３】図２３Ａ〜２３Ｅ：ＡＭＬ患者のＴ細胞からの、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の作出について記載し、ＡＭＬ腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を裏付ける図である。図２３Ａ：ＡＭＬドナーに由来するＰＢＭＣを得、ＣＤ３３およびＣＤ３の発現について、表現型を特徴づけした。図２３Ｂ：ビーズベースの方法を使用して、Ｔ細胞を、ＰＢＭＣ画分から単離し、非標識化画分を、ＣＤ３３＋腫瘍細胞について特徴づけた。図２３Ｃ：Ｔ細胞に、ＬＶ−ＣＤ３３−ＣＡＲ構築物により形質導入し、培養の１４日目におけるＣＡＲの発現を示す。図２３Ｄ：０日目（アッセイの準備がなされた時点）および３日目における、ＡＭＬドナーによるＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞またはＡＭＬドナー腫瘍細胞との共培養物を示す。全ての細胞に、ＦＳＣ／ＳＳＣ／生細胞について、ゲートをかけた。図２３Ｅ：ＡＭＬ患者に由来するＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＣＤ３３発現腫瘍細胞との共培養後におけるサイトカイン発現である。細胞内サイトカイン染色は、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＡＭＬドナーＥ２６１に由来する）の、表示の腫瘍細胞との共培養の１８時間後において実施した。Ｔ細胞は、細胞表面染色し、次いで、固定／透過化に続き、サイトカインであるＩＦＮγおよびＩＬ−２について染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣ／生／ＣＤ３  Ｔ細胞に基づき、細胞にゲートをかけた。ＡＭＬ  Ｅ２６１細胞とは、試料中に存在する、患者の自家ＣＤ３３腫瘍細胞を指す。
【図２４】ＮＫ細胞上における、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔの発現について記載する図である。
【図２５】ＣＤ３３  ＣＡＲ  ＮＫ細胞上における、ＨＥＲ１ｔおよびＨＥＲ１ｔ−１タグの発現について記載する図である。
【図２６】ＣＤ３３  ＣＡＲ  ＮＫ細胞上における、ＣＤ２０ｔ−１タグの発現について開示する図である。
【図２７】ＣＤ３３−ＣＡＲ  ＮＫ細胞が、ＮＫ抵抗性ＣＤ３３＋  ＡＭＬ細胞（ＭＬ−２、ＫＧ−１）を効率的に溶解させることを裏付ける図である。
【図２８】ＣＤ３３−ＣＡＲ  ＮＫ細胞が、ＮＫ抵抗性ＡＭＬ細胞株（ＫＧ−１）を、低Ｅ：Ｔ比で、効率的に溶解させることを裏付ける図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の記載および主張では、以下の用語法を使用する。
【００４６】
定義
特許請求の範囲および／または本明細書において、「〜を含むこと」という用語と共に使用される場合の、「ある（a）」または「ある（an）」という語の使用は、「１つの」を意味しうるが、また、「１または複数の」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは１つを超える」という意味とも合致する。
【００４７】
本出願を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するのに利用されるデバイス、方法についての誤差の固有の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを指し示すように使用される。典型的に、用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％、またはこれら未満のばらつきを包含することを意図する。
【００４８】
特許請求の範囲における「または」という用語は、代替物だけを指すか、または、代替物が相互に排他的であることが明示的に指し示されない限りにおいて、「および／または」を意味するように使用するが、本開示は、代替物だけを指す定義、および「および／または」を指す定義を支持する。
【００４９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと（comprising）」（「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など、「〜を含むこと（comprising）」の任意の形態）、「〜を有すること」（「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など、「〜を有すること」の任意の形態）、「〜を含むこと（including）」（「〜を含む（include）」および「〜を含む（includes）」など、「〜を含むこと（including）」の任意の形態）、または「〜を含有すること」（「〜を含有する（contain）」および「〜を含有する（contains）」など、「〜を含有すること」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
【００５０】
本明細書で使用される「合成」または「改変」とは、天然由来の化合物と対比して、化学的過程および／または人為を介して形成するか、または発現させた化合物を指す。
【００５１】
「単離」とは、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。「精製」とは、所与の核酸が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、かつ／または検査室条件下で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。
【００５２】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。
【００５３】
「ポリペプチド」は、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語と互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。
【００５４】
核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾することができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２つまたはこれを超える核酸またはタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。本明細書では、配列同一性百分率を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）について記載するが、これらは、一般に利用可能である。
【００５５】
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における、「同一」または「配列同一性」という用語は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。本明細書で使用される「比較域」とは、少なくとも約２０、通例、約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０の連続する位置によるセグメントであって、その中の配列を、２つの配列を、最適にアライメントした後で、同じ数の、連続する位置による基準配列と比較しうるセグメントを指す。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)のアライメントアルゴリズム；Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム内のＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない）により行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988)およびHiggins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)、Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988)、Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992)、ならびにPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)により十分に記載されている。アライメントはまた、目視および手作業のアライメントにより実施されることも多い。
【００５６】
実施形態の１つのクラスでは、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはこの断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。
【００５７】
核酸配列またはアミノ酸配列に対して適用される「実質的に同一な」という用語は、核酸配列またはアミノ酸配列が、上記で記載したプログラム、例えば、標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用する基準配列と比較して、少なくとも９０％の配列同一性、またはこれを超える配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい）。配列同一性百分率は、２つの最適にアライメントされた配列を、比較域にわたり比較することにより決定し、比較域内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数を求め、マッチさせた位置の数を、比較域内の位置の総数で除し、結果に、１００を乗じて、配列同一性百分率を求めることにより計算する。複数の実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基の長さの配列の領域にわたり、少なくとも約１００残基の領域にわたり存在し、複数の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり、実質的に同一である。複数の実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたり、実質的に同一である。
【００５８】
本明細書で開示されるタンパク質の「機能的変異体」は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０カ所の保存的アミノ酸置換、またはほぼこれらの数の保存的アミノ酸置換を伴う基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」という語句は、１つのアミノ酸の、共通の特性を伴う、別のアミノ酸による置き換えを指す。個別のアミノ酸の間の共通の特性を規定する、機能的な方式は、相同な生物の、対応するタンパク質の間の、アミノ酸変化の標準化頻度を解析することである（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)）。このような解析に従い、群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において、最も互いと相似する、アミノ酸群を規定することができる（上述のSchulz, G. E. and Schirmer, R. H.）。保存的突然変異の例は、上記の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、陽性電荷を維持しうるような、リシンによる、アルギニンの置換、およびこの逆の置換；陰性電荷を維持しうるような、グルタミン酸による、アスパラギン酸の置換、およびこの逆の置換；遊離−ＯＨを維持しうるような、セリンによる、トレオニンの置換；ならびに遊離−ＮＨ2を維持しうるような、グルタミンによる、アスパラギンの置換を含む。
【００５９】
代替的に、または加えて、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を伴う、基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。「非保存的突然変異」は、異なる群の間のアミノ酸置換、例えば、リシンのトリプトファンへの置換、またはフェニルアラニンのセリンへの置換などを伴う。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉したり、これを阻害したりしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が、親ＣＡＲと比較して増加するように、機能的変異体の生物学的活性を増強しうる。
【００６０】
本明細書で開示されるタンパク質（これらの機能的部分および機能的変異体を含む）は、１または複数の、天然アミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。
【００６１】
「ＣＤ３３」とは、６７ｋＤａの１回膜貫通糖タンパク質であり、シアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ３３は、シアル酸への結合の一因となる、ＶセットのＩｇ様ドメインと、その細胞外ドメイン内の、Ｃ２セットのＩｇ様ドメインとを特徴とする。ＣＤ３３  ｍＲＮＡの代替的スプライシングは、図１に示される通り、ＶセットのＩｇ様ドメインのほか、ＶセットのＩｇ様ドメインと、Ｃ２セットのＩｇ様ドメインとを連結するジスルフィド結合も欠く、短鎖アイソフォーム（ＣＤ３３ｍ）をもたらす。健常対象では、ＣＤ３３は主に、通常の複能性骨髄性前駆細胞上、単能性コロニー形成細胞上、単球上、および成熟顆粒球上に見出される、骨髄性分化抗原として発現する。ＣＤ３３は、８０％を超える骨髄性白血病細胞上で発現するが、通常の造血幹細胞上または成熟顆粒球上では発現しない（Andrews, R. et al., The L4F3 antigen is expressed by unipotent and multipotent colony-forming cells but not by their precursors, Blood, 68(5):1030-5 (1986)）。ＣＤ３３は、悪性骨髄細胞上、活性化Ｔ細胞上、および活性化ＮＫ細胞上で発現することが報告されており、ＡＭＬ患者の大多数における芽球の、少なくともサブセット上で見出される（Pollard, J. et al., Correlation of CD33 expression level with disease characteristics and response to gemtuzumab ozogamicin containing chemotherapy in childhood AML, Blood, 119(16):3705-11 (2012)）。ＡＭＬ芽球上の広範な発現に加えて、ＣＤ３３は、ＡＭＬの基底をなす幹細胞上でも発現しうる。
【００６２】
「実質的に精製された」という用語は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、または他の化合物が、天然では会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％を超えて含まない、約７０％を超えて含まない、約９０％を超えて含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「コード配列」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。
【００６４】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮＡセグメントへの、物理的および／または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされている場合、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮＡ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。
【００６５】
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
【００６６】
「誘導」という用語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上昇を指す。
【００６７】
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。
【００６８】
「プロモーター活性」という用語は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【００６９】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。
【００７０】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡのメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照されたい）。
【００７１】
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、または宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメントの発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
【００７２】
ベクターはまた、「選択用マーカー遺伝子」も含みうる。本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現する細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載されている。
【００７３】
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的な例を表す。
【００７４】
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」（ＴＥ）とは、ゲノム内のその位置を変化させ、場合によって、突然変異を創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する、ベクターＤＮＡ配列である。転移は、ＴＥの重複を結果としてもたらすことが多い。クラスＩのＴＥは、２段階でコピーされる：まず、クラスＩのＴＥは、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され、次いで、産生されたＲＮＡは、ＤＮＡへと逆転写される。次いで、この、コピーされたＤＮＡは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、ＴＥ自身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、ＨＩＶなどのレトロウイルスと同様である。クラスＩＩのＴＥによるカットアンドペースト転移機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素により触媒される。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的ＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位において、互い違いの（staggered）切断をもたらす結果として、５’側または３’側における、一本鎖のＤＮＡ突出（粘着（sticky）末端）をもたらす。このステップは、ＤＮＡトランスポゾンを切り出し、次いで、ＤＮＡトランスポゾンは、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを充填するＤＮＡポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせる（close）ＤＮＡリガーゼの活性とを伴う。これは、標的部位の重複を結果としてもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡ内の互い違いの切断、およびＤＮＡポリメラーゼによる充填により創出されうる短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるＴＥの切出しに重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のＳ期において、ドナー部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカットアンドペーストＴＥは重複される。転移は、クラスＩ  ＴＥおよびクラスＩＩ  ＴＥのいずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型ＴＥが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型ＴＥは、移動するのに、別のＴＥの存在を必要とする。これは、非自律型ＴＥが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）または逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くためであることが多い。
【００７５】
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。
【００７６】
「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」とは、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体へと導入するための合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す。系についての、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、同第９，２２８，１８０号明細書および国際公開第２０１６／１４５１４６号パンフレットにおいて記載されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、またはＳＢ１１０トランスポゾン系を含みうる。
【００７７】
本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」により導入することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ−デキストラン法；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); and strontium phosphate DNA co-precipitation (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
【００７８】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
【００７９】
「ヘルパーＴ細胞」（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球を支援する。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋  Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
【００８０】
「細胞傷害性Ｔ細胞」（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
【００８１】
「メモリーＴ細胞」とは、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、３つの亜型：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣM細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴEM細胞およびＴEMRA細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、典型的に、細胞表面タンパク質である、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現する。
【００８２】
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【００８３】
「ナチュラルキラーＴ細胞」（ＮＫＴ細胞：自然免疫系のナチュラルキラー細胞と混同しないものとする）は、獲得免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔｈ細胞およびＴｃ細胞の両方に帰せられた機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果たしうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、これらを消失させることも可能である。
【００８４】
本明細書で使用される「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞内で産生されるかまたは過剰発現する、任意の抗原性物質を指す。腫瘍抗原は、例えば、宿主における免疫応答を誘発しうる。代替的に、本開示の目的では、腫瘍抗原は、健常細胞および腫瘍細胞のいずれもが発現するが、ある特定の腫瘍型を同定するため、適切な治療標的であるタンパク質でありうる。一実施形態では、腫瘍抗原は、骨髄性悪性腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するためのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の標的である、ＣＤ３３である。
【００８５】
本明細書で使用される「ＡＭＬ」とは、急性骨髄性白血病、急性顆粒球性白血病、および急性非リンパ球性白血病としてもまた公知の、急性骨髄性白血病を指す。ＡＭＬは、白血病が発症する細胞型に基づく、８つの異なる亜型を有するため、白血病の他の主要な形態と区別される。したがって、「ＡＭＬ」という用語は、特殊な解析による、骨髄芽球性（Ｍ０）、成熟を伴わない骨髄芽球性（Ｍ１）、成熟を伴う骨髄芽球性（Ｍ２）、前骨髄球性（Ｍ３）、骨髄単球性（Ｍ４）、単球性（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、および巨核球性（Ｍ７）を含む、全ての亜型を指す。本明細書で使用される「ＡＭＬ」はまた、骨髄が、異常な骨髄芽球を作り出すがんである、急性骨髄性白血病も指す。ＡＭＬは、成人における急性白血病の、最も一般的な形態である（Siegel, R., Ma, J., Zou, Z. & Jemal, A., Cancer statistics, 2014, CA Cancer J Clin, 64(1):9-29 (2014)）。「再発性ＡＭＬ」とは、ＡＭＬの寛解期を経験した対象を指す。「難治性ＡＭＬ」とは、その疾患が、初期の標準的な導入療法（例えば、アントラサイクリンおよび／またはシタラビンベースの治療）の第１サイクルに応答しない患者を指す。複数の実施形態では、「難治性ＡＭＬ」とは、その疾患が、標準的な導入療法の、１つもしくは２つまたはこれを超えるサイクルに応答しない患者を指す。
【００８６】
「養子Ｔ細胞移入」とは、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖であって、ワクチン接種単独または患者の天然の腫瘍応答により得られうる数の細胞より大きな数のＴ細胞を達成する拡大増殖を指す。次いで、それらの免疫系に、がんに攻撃し、これらを死滅させうるＴ細胞を介して、残りの腫瘍を圧倒する能力をもたらそうとする試みにおいて、がんを伴う患者へと、腫瘍特異的Ｔ細胞を輸注する。がん処置のために、Ｔ細胞療法の多くの形態であって、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬを培養する形態と、１つの特定のＴ細胞またはクローンを単離および拡大増殖させる形態とが使用されており、なお、腫瘍を強力に認識し、これらに攻撃するように改変されたＴ細胞を使用する形態も使用されている。
【００８７】
「抗原認識部分または抗原認識ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する分子または分子の部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれらの断片であり、抗原は、腫瘍抗原である。
【００８８】
本明細書で使用される「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞の単一のクローンにより産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。これに対し、「ポリクローナル抗体」とは、異なるＢ細胞により産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する抗体の集団を指す。全抗体は、典型的に、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピー、および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピーからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端の可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端の定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）領域とを含有し、各軽鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＬ）領域と、１つのＣ末端の定常（ＣＬ）領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合性部位を形成する。ＶＨ領域と、ＶＬ領域とは、各領域が、それらの配列が比較的保存されている、４つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として公知である、３つのＣＤＲは、抗原への結合の一因となる、抗体の「超可変領域」を形成する。
【００８９】
「抗体様分子」は、例えば、パートナーに選択的に結合することが可能な、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。ＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体は、このような分子である。一実施形態では、抗体様分子は、ＴＣＲである。一実施形態では、ＴＣＲは、そのＭＨＣへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。
【００９０】
本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、および「抗原結合性部分」という用語を、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の、１または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する（一般に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい）。抗体断片は、例えば、１もしくは複数のＣＤＲ、可変領域（またはこの部分）、定常領域（またはこの部分）、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｉｖ）２つのドメインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接合された、Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）からなる一価分子である、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい）；ならびに（ｖ）各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上のＶＨとＶＬとの間の対合を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより、ＶＬへと接続されたＶＨを含み、これにより、２つの機能的な抗原結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディーを含むがこれらに限定されない。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００９／００９３０２４Ａ１号明細書において、より詳細に記載されている。
【００９１】
「キメラ抗原受容体」はまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体としても公知である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、任意の特異性を、免疫エフェクター細胞へとグラフトする、改変受容体である。ＣＡＲは、典型的に、抗原結合性ドメインおよびストーク領域を含む細胞外ドメイン（エクトドメイン）と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメイン（エンドドメイン）とを有する。
【００９２】
「スペーサー」領域または「ヒンジ」領域という用語を包含する「ストーク」領域を、抗原結合性ドメインを、膜貫通ドメインと連関させるのに使用する。本明細書で使用される「ストークドメイン」という用語は、一般に、ポリペプチド鎖内で、膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインと連結するように機能する、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。複数の実施形態では、ストークドメインは、抗原結合性ドメインが、異なる方向を向いて、抗原認識を容易とすることを可能とするのに十分な程度に可撓性である。一実施形態では、ストークドメインは、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域である。代替物は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域と、ＣＤ３の一部とを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、ストーク領域は、ＣＤ８アルファヒンジ（配列番号２２）である。ＣＡＲに関して使用される場合の「機能的部分」という用語は、本明細書で記載されるＣＡＲの、任意の部分または断片であって、機能的部分がその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する部分または断片を指す。親ＣＡＲをコードする核酸配列に関して、ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は、親ＣＡＲのうちの、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える親ＣＡＲを含むタンパク質をコードしうる。
【００９３】
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、基準ポリペプチドに対する、実質的または著明な配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指し、それがその変異体である、基準ポリペプチドの生物学的活性を保持する。機能的変異体は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体であって、標的細胞を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保持する変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に照らして、ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列は、親ＣＡＲをコードする核酸配列と、例えば、約１０％同一、約２５％同一、約３０％同一、約５０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、または約９９％同一でありうる。
【００９４】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部でありうる。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンドの誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、限定せずに述べると、それらの各々が、参照によりそれらの全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）、米国特許第７，０９１，０３８号明細書、同第７，７７６，５８７号明細書、同第７，８０７，４１７号明細書、同第８，２０２，７１８号明細書、ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）、米国特許第８，１０５，８２５号明細書、同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／１Ｊ５２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）、米国出願第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）、米国特許第７，５３１，３２６号明細書、同第８，２３６，５５６号明細書、同第８，５９８，４０９号明細書、ＰＣＴ／Ｕ５２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）、米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）、米国特許第７，６０１，５０８号明細書、同第７，８２９，６７６号明細書、同第７，９１９，２６９号明細書、同第８，０３０，０６７号明細書、ＰＣＴ／Ｕ５２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）、米国出願第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）、米国特許第７，５６３，８７９号明細書、同第８，０２１，８７８号明細書、同第８，４９７，０９３号明細書、ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）、米国特許第７，９３５，５１０号明細書、同第８，０７６，４５４号明細書、ＰＣＴ／Ｕ５２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）、米国出願第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）、米国出願第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）、米国出願第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）、米国出願第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号パンフレット）、ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）、および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかを含む、エクジソンベースの受容体の構成要素から選択することができる。
【００９５】
本明細書で言及される「増殖性疾患」とは、細胞の過剰な増殖および細胞内マトリックスの過剰な代謝回転が、がんを含むいくつかの疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一的概念が提示されていることを意味する。
【００９６】
本明細書で使用される「患者」とは、がんなどの増殖性障害を伴うか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われると診断された哺乳動物対象を指す。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんなどの増殖性障害を発症する可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および／または女性でありうる。
【００９７】
本明細書では、「〜を投与すること」とは、本明細書で記載される、１または複数の組成物を、患者または対象に施すことを指す。例を目的として、限定せずに述べると、組成物の投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋内（ｉ．ｍ．）注射により実施することができる。１または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もある。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設置による場合もある。
【００９８】
本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」とは、がんなどの増殖性障害を伴うか、またはこれを有することが疑われると診断された患者を指す。一実施形態では、患者は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などであるがこれらに限定されない白血病を有するか、またはこれらを発症する可能性がある。
【００９９】
ある実施形態では、本明細書で記載される組成物は、本明細書で記載される核酸配列を発現する改変細胞もしくは宿主細胞、または本明細書で記載される、少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みうる。本明細書で使用される「処置」、「〜を処置すること」などの用語は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。複数の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および／または疾患に帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。この目的で、本発明の方法は、本発明の核酸配列、または本発明の核酸配列を含むベクターを発現する宿主細胞を含む、「治療有効量」の組成物を投与するステップを含む。
【０１００】
「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに１または複数の対象において所望の応答を誘発する、本明細書で記載される組成物の能力などの因子に従い変動しうる。
【０１０１】
代替的に、薬理学的効果および／または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する。
【０１０２】
「予防有効量」とは、所望の予防結果（例えば、疾患の発症の防止）を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
【０１０３】
キメラ抗原受容体
本明細書で記載される複数の実施形態では、ＣＡＲは、標的認識のために、抗体由来の細胞外単鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）を含むことが可能であり、ｓｃＦｖは、可撓性リンカーにより、膜貫通ドメインおよび／またはＴ細胞活性化のための、例えば、ＣＤ３ζを含む、細胞内シグナル伝達ドメインへと接続されうる。通常、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞を活性化させうる場合、Ｔ細胞は、抗原誘導性の一次ＴＣＲシグナルを、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−２およびＩＬ−２１）の産生を誘導する、ＣＤ２８に由来する二次共刺激シグナル伝達と共に受け取り、次いで、これらを、自己分泌／傍分泌の形で、シグナル伝達ループへとフィードバックする。これを念頭に置くと、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメイン、または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインなど、他の共刺激分子によるシグナル伝達ドメインを含みうる。キメラＣＤ２８による共刺激は、抗アポトーシス分子の上方調節およびＩＬ−２の産生のほか、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞を拡大増殖させることにより、Ｔ細胞の存続を改善する。
【０１０４】
一実施形態では、ＣＡＲは、例えば、膜貫通ドメインおよびＣＤ３ゼータのエンドドメインへと融合させた、腫瘍関連抗原であるＣＤ３３に特異的なモノクローナル抗体に由来する、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。このような分子は、ｓｃＦｖによる、その標的の認識に応答した、ゼータシグナルの伝達を結果としてもたらす。
【０１０５】
ある実施形態では、ＣＡＲは、エクトドメイン（細胞外）、膜貫通ドメイン、およびエンドドメイン（細胞内）を有しうる。ＣＡＲエクトドメインについての一実施形態では、シグナルペプチドは、新生タンパク質を、小胞体へと方向付ける。これは、例えば、受容体がグリコシル化され、細胞膜内にアンカリングされた場合である。任意の真核シグナルペプチド配列は、機能的であることが想定されている。一般に、天然において、アミノ最末端の構成要素へと接合しているシグナルペプチドを使用する（例えば、軽鎖−リンカー−重鎖の方向を伴うｓｃＦｖでは、軽鎖の天然シグナルを使用する）。複数の実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦＲａ（配列番号１６）またはＩｇＫ（配列番号３４）である。使用されうる、他のシグナルペプチドは、ＣＤ８アルファおよびＣＤ２８に由来するシグナルペプチドを含む。
【０１０６】
抗原認識ドメインは、ｓｃＦｖでありうる。しかし、代替物も存在しうる。天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータの単鎖に由来する抗原認識ドメインは、単純なエクトドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識する、ＣＤ４エクトドメイン）のほか、連結された、例えば、サイトカイン（サイトカイン受容体を保有する細胞の認識をもたらす）など、他の認識構成要素を有するので、想定される。例えば、腫瘍関連抗原など、所与の標的に、高アフィニティーで結合する、ほぼ任意のものを、抗原認識領域として使用することができる。
【０１０７】
一般に、ＣＡＲは、二量体化形態で存在し、細胞外ｓｃＦｖ（ＶＬへと連結されたＶＨ）領域、ストークドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達モチーフを連結する融合タンパク質として発現する。第１世代のＣＡＲのエンドドメインは、Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ３ζによるシグナル伝達だけを介して誘導する。第２世代のＣＡＲは、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８、または４−１ＢＢもしくはＯＸ４０など、他のエンドドメインを介する活性化シグナル伝達をもたらす。第３世代のＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＯＸ４０など、３つのシグナル伝達モチーフの、ＣＤ３ζを含有する組合せを介して、Ｔ細胞活性化させる。
【０１０８】
複数の実施形態では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。複数の実施形態では、細胞外ドメインは、そうでなければ、抗原結合性部分またはｓｃＦｖと称する、標的特異的結合エレメントと、ストークドメインとを含む。複数の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン、または、そうでなければ、細胞質シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。
【０１０９】
共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であって、リンパ球の、抗原に対する、効率的な応答に必要とされる表面分子である。
【０１１０】
複数の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間に、ストークドメインが組み込まれる。本明細書で使用される「ストークドメイン」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを、ｓｃＦｖ、またはポリペプチド鎖内の細胞質ドメインへと連結するように機能する、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。ストークドメインは、Ｆｃヒンジなどの可撓性ヒンジと、任意選択で、Ｆｃの、１つまたは２つの定常ドメインとを含みうる。場合によって、ストーク領域は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域と、任意選択で、ＣＤ３の一部とを含む。場合によって、ストーク領域は、国際公開第２０１６／０７３７５５号パンフレットにおいて記載されている、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ４−Ｆｃの１２アミノ酸のヒンジ領域（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ）（配列番号６２）、またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
【０１１１】
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、組換え供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
【０１１２】
細胞内ドメインは、１または複数の共刺激ドメインを含みうる。例示的な共刺激ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ゼータ、またはこれらの断片もしくは組合せを含むがこれらに限定されない。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８およびＣＤ２８、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインであるＤＡＰ１０、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインであるＤＡＰ１２、またはこの断片を含む。
【０１１３】
本開示のＣＡＲの、細胞質ドメインとしてもまた公知の、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを入れた免疫細胞の、通常のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、特化された細胞の機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含む、ヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化された機能を果たすように細胞を方向付ける、タンパク質の部分を指す。通例、細胞内シグナル伝達ドメインの全体を利用しうるが、多くの場合、鎖の全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用し、それが、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このような切断部分を、完全鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意の切断部分を含むことを意図する。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインをさらに含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するドメインを含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するドメインを含む。
【０１１４】
本明細書の複数の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸であって、ＣＡＲが、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、任意選択で、（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）を含む、単離核酸が提示される。
【０１１５】
本発明の範囲には、本明細書で記載されるＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列が含まれる。機能的部分は、例えば、標的細胞を認識するか、または疾患を検出、処置、もしくは予防する能力を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に保持するＣＡＲの部分を包含する。
【０１１６】
複数の実施形態では、ＣＡＲは、部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または両方の末端におけるさらなるアミノ酸であって、親ＣＡＲのアミノ酸配列内では見出されない、さらなるアミノ酸を含有する。さらなるアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能であって、例えば、標的細胞を認識するか、がんを検出するか、がんを処置または防止するなどの生物学的機能に干渉しないことが所望される。さらなるアミノ酸が、ＣＡＲの生物学的活性を、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して増強することが、より所望される。
【０１１７】
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、本発明の核酸配列によりコードされるＣＡＲに対する、実質的または著明な配列同一性または配列類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、この機能的変異体は、それがその変異体である、ＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的変異体は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体であって、標的細胞を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保持する変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に照らして、ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列は、親ＣＡＲをコードする核酸配列と、例えば、約１０％同一、約２５％同一、約３０％同一、約５０％同一、約６５％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、または約９９％同一でありうる。
【０１１８】
本明細書で記載されるＣＡＲ（機能的部分、およびこれらの機能的変異体を含む）は、例えば、ジスルフィド架橋を介して、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化されたＣＡＲ、あるいは酸添加塩へと転換されたＣＡＲ、および／または、任意選択で、二量体化もしくは重合化されたＣＡＲ、またはコンジュゲートさせたＣＡＲを含む。
【０１１９】
抗原結合性部分
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、そうでなければ、抗原結合性部分と称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する、所望の抗原結合性部分を改変することにより、目的の腫瘍抗原をターゲティングするように、本明細書で記載されるＣＡＲを改変する。本発明の文脈では、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」とは、がんなど、特異的な過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。
【０１２０】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ３３に特異的（ＣＤ３３  ＣＡＲ）である。ＣＤ３３特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＣＤ３３へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより接続された、ＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｍ１９５、ｍ２Ｈ１２、ＤＲＢ２、および／またはＭｙ９−６である。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖ、例えば、ｈＭ１９５である。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、指向的に連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０１２１】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２２】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２３】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（配列番号６）またはリンカーの機能的な変異体を伴う、ヒト化抗ＣＤ３３  ｍＡｂのクローンであるｈＭ１９５の抗原結合性部分のＶＬ（配列番号１）およびＶＨ（配列番号３）を含む。
【０１２４】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＨ、ＶＬ、およびリンカー）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２５】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号９のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２  ＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２６】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２  ＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２７】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１１のアミノ酸配列（ＤＲＢ２  ＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２８】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１２のアミノ酸配列（ＤＲＢ２  ＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１２９】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１３のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６  ＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１３０】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号１４のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６  ＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０１３１】
複数の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有する。
【０１３２】
ストークドメイン
複数の実施形態では、本発明のＣＤ３３  ＣＡＲは、抗原結合性部分と、Ｔ細胞膜との分離をもたらすストークドメインを含む。複数の実施形態では、ストークドメインは、エフェクター−標的間の最適な膜間距離を確立する。複数の実施形態では、ストークドメインは、抗原結合性ドメインが、その標的に到達するための可撓性をもたらす。一実施形態では、ストークドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインである。
【０１３３】
複数の実施形態では、ＣＤ８アルファヒンジドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
膜貫通ドメイン
複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲストークドメインの細胞外ドメインへと融合させた膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、天然において、ＣＡＲ内のドメインのうちの１つと会合する膜貫通ドメインを使用する。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜を貫通する、疎水性のアルファヘリックスである。
【０１３５】
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本発明で特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来しうる（すなわち、これらの、少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、この場合、膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むであろう。複数の実施形態では、合成膜貫通ドメインの各末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出されるであろう。任意選択で、複数の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。複数の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。
【０１３６】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ内の膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインである。複数の実施形態では、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３７】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ内の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。複数の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３８】
細胞質ドメイン（共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメイン）
本明細書で記載されるＣＡＲの、細胞内シグナル伝達ドメインとしてもまた公知の、細胞質ドメインは、ＣＡＲを入れた免疫細胞の、通常のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、特化された細胞の機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含む、ヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化された機能を果たすように細胞を方向付ける、タンパク質の部分を指す。通例、細胞内シグナル伝達ドメインの全体を利用しうるが、多くの場合、鎖の全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用し、それが、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このような切断部分を、完全鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意の切断部分を含むことを意図する。
【０１３９】
本明細書で記載されるＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の結合の後において、協同して、シグナル伝達を誘発するように作用する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列および共受容体のほか、これらの配列の、任意の誘導体または変異体、および同じ機能的な能力を有する、任意の合成配列を含みうる。
【０１４０】
ＴＣＲ単独を介して発生したシグナルは一般に、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルもまた、必要とされる。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を誘発する、細胞質シグナル伝達配列（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原非依存的な形で、二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように作用する、細胞質シグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達配列）とにより媒介されると言うことができる。
【０１４１】
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を、刺激的または阻害的に調節する。刺激的に作用する、一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。
【０１４２】
本発明において特に使用される、ＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列の例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来する初代細胞質シグナル伝達配列を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ内の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
【０１４３】
複数の実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体で、または本明細書で記載されるＣＡＲの文脈において有用な、他の任意の所望される細胞質ドメインと組み合わせて、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むようにデザインすることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分と、共刺激シグナル伝達領域とを含みうる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの部分を指す。共刺激分子とは、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であって、リンパ球の、抗原に対する、効率的な応答に必要とされる細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどを含む。複数の実施形態では、共刺激分子を、例えば、ＣＤ２８と４−１ＢＢとを併せて使用することもでき、ＣＤ２８とＯＸ４０とを併せて使用することもできる。したがって、本発明を、共刺激シグナル伝達エレメントとしての４−１ＢＢおよびＣＤ２８と共に例示するが、他の共刺激エレメントも、本発明の範囲内にある。
【０１４４】
本明細書で記載されるＣＡＲの、細胞質シグナル伝達部分内の、細胞質シグナル伝達配列は、互いと、ランダムな順序で連結することもでき、指定された順序で連結することもできる。任意選択で、複数の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、連結を形成しうる。グリシン−セリンのダブレットは、特に、適切なリンカーをもたらす。
【０１４５】
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。
【０１４６】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ内の細胞質ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、この場合、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２６の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【０１４７】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ内の細胞質ドメインを、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むようにデザインするが、この場合、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号２８のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２６のポリペプチド配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【０１４８】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ内の細胞質ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４に明示されたアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２６に明示されたアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
さらなる遺伝子エレメント
細胞療法は、ヒト疾患の処置に向けて、大きな将来性を有するが、細胞自体またはそれらのトランス遺伝子産物に由来する著明な毒性は、臨床的探索を妨げてきた。本明細書で記載される複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞であって、哺乳動物対象、例えば、ヒトへと輸注された免疫エフェクター細胞は、それらの使用から傷害作用が生じた場合、このような免疫エフェクター細胞の作用を調節するために、除去することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される治療剤である、ＣＤ３３特異的キメラ抗原受容体に加えてまた、第２の遺伝子も、本明細書で記載される改変免疫エフェクター細胞へと導入することができる。第２の遺伝子は、事実上、ＣＤ３３  ＣＡＲ含有細胞の枯渇を可能とする「キルスイッチ」である。ある特定の実施形態では、「キルスイッチ」とは、少なくともＨＥＲ１もしくはＣＤ２０の抗体結合エピトープ、またはこれらの機能的断片を含み、任意選択で、シグナルポリペプチド配列またはこの断片を含むＨＥＲ１ポリペプチドまたはＣＤ２０ポリペプチドを含むＨＥＲ１タグまたはＣＤ２０タグである。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、第２の遺伝子は、表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１）またはこれらの断片もしくは変異体である、ＨＥＲ１タグである。複数の実施形態では、第２の遺伝子は、切断型ヒト表皮増殖因子受容体１（例えば、ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）である、ＨＥＲ１タグである。場合によって、第２の遺伝子は、切断型ヒト表皮増殖因子受容体１の変異体である。複数の実施形態では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ、およびＨＥＲ１ｔ−１のうちの少なくとも１つは、ＦＤＡで承認されているセツキシマブ、またはＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ、および／もしくはＨＥＲ１ｔ−１を認識する任意の抗体を投与することを介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号３２の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ−１遺伝子は、配列番号５４の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。切断型ＨＥＲ１配列、例えば、ＨＥＲ１ｔおよびＨＥＲ１ｔ−１は、セツキシマブの、受容体への結合を無傷に保ちながら、ＥＧＦリガンドへの結合、ＥＧＦＲのホモ二量体化およびヘテロ二量体化、ならびにＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達の潜在的可能性を消失させる（Ferguson, K., 2008. A structure-based view of Epidermal Growth Factor Receptor regulation. Annu Rev Biophys, Volume 37, pp. 353-373）。
【０１５１】
本発明の、さらなる実施形態では、治療用のＣＤ３３特異的キメラ抗原受容体に加えて、導入される第２の遺伝子は、ＣＤ２０タグである。場合によって、ＣＤ２０タグは、全長ＣＤ２０ポリペプチド、または切断型ＣＤ２０ポリペプチド（ＣＤ２０ｔ−１）である。場合によって、ＣＤ２０タグ、例えば、ＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１はまた、ＦＤＡで承認されているリツキシマブ療法を投与することを介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構ももたらす。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号３６の配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０タグは、ＣＤ２０ｔ−１タグであり、配列番号５６の配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号３５の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＤ２０遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、ＣＤ２０タグは、配列番号５７の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＤ２０ｔ−１遺伝子によりコードされる。
【０１５２】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含むＣＡＲベクターは、配列番号３６の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む全長ＣＤ２０タグをさらに含む。
【０１５３】
複数の実施形態では、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔタグ、ＨＥＲ１ｔ−１タグ、ＣＤ２０タグ、またはＣＤ２０ｔ−１タグをコードする遺伝子を、ＣＤ３３  ＣＡＲへと、３’末端において、インフレームの、例えば、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドであるがこれらに限定されない、自己切断型ペプチドを介して遺伝子融合させる。複数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１５４】
複数の実施形態では、キルタグ遺伝子を、ｐＦＵＧＷレンチウイルスプラスミド骨格へと、ＣＤ３３  ＣＡＲ遺伝子とインフレームでクローニングする。他の実施形態では、両方の遺伝子を、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターへとクローニングする。他の実施形態では、キルタグを、別個のレンチウイルスベクターへとクローニングする。さらに他の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０、またはＣＤ２０ｔ−１などのキルタグを、別個のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターへとクローニングする。ある特定の実施形態では、キルタグは、シグナルペプチド、例えば、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有し、この場合、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３４の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を有するＩｇＫである。場合によって、シグナルペプチドは、ＩｇＥおよびＣＤ８α、これらの変異体および断片から選択することができる。
【０１５５】
本明細書で記載されるＣＡＲおよびキルタグをコードする、例示的なベクターを、図２に示す。
【０１５６】
例示的なＣＡＲのオープンリーディングフレーム
本明細書で記載される方法および組成物により包含される、例示的なＣＡＲおよびヒトＣＤ３３受容体オープンリーディングフレームは、表１にある。
【０１５７】
【表１】
2019517267.tif 000002
【０１５８】
本明細書の複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする単離核酸であって、ＣＡＲが、配列番号配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１または配列番号５３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、単離核酸が提示される。
【０１５９】
表１に列挙された実施形態であって、「ｈＭ１９５ｓｃＦｖ」を伴う実施形態の各々では、ＣＡＲの抗原結合性部分は、配列番号８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むｈＭ１９５ｓｃＦＶである。複数の実施形態では、ｈＭ１９５ｓｃＦｖは、配列番号１６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチドを有する。
【０１６０】
表１における実施形態であって、「ＣＤ８ａ」を伴う実施形態の各々では、ＣＡＲの膜貫通領域は、配列番号１８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ８アルファ膜貫通ドメインを含み、ストークドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むＣＤ８ａである。
【０１６１】
表１における実施形態であって、「ＣＤ２８ｍ」を伴う実施形態の各々では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を伴うＣＤ２８を含む。
【０１６２】
表１における実施形態であって、「Ｔ２Ａ」を伴う実施形態の各々では、ＣＡＲのＯＲＦは、単一のベクターからの、複数の遺伝子産物の産生を可能とする、自己切断型トセア・アシグナ（Thoseaasigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドを含む。複数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１６３】
表１における実施形態であって、「ＨＥＲ１ｔ」を伴う実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、ＦＤＡで承認されているリツキシマブ療法を投与することを介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす切断型ヒト表皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ１ｔ）を含む。本明細書で記載されるＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号３１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含みうる。表１において、そうでないことが言及されない限りにおいて、ＨＥＲ１ｔタグは、ＧＭ−ＣＳＦＲａシグナルペプチド（「ＧＭ−ＣＳＦＲｓｐ」）（配列番号１６）を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１ｔは、別のタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ−１またはＣＤ２０ｔ−１で置換することができる。表１における実施形態であって、「ＩｇＫｓｐ」を伴う実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＫである。
【０１６４】
表１における、複数の実施形態であって、「４−１ＢＢ」を伴う、複数の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、配列番号２４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する共刺激分子を含む。
【０１６５】
表１における、複数の実施形態であって、「ＦＬ  ＣＤ２０」を伴う、複数の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、配列番号３６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む全長ＣＤ２０タグを含む。ＣＤ２０は、ＦＤＡで承認されているリツキシマブ療法を投与することを介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。表１における、ある特定の実施形態では、ＣＡＲのＯＲＦは、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンドの誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０１６６】
サイトカイン
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを、対象へと、サイトカインを含むがこれらに限定されない、１または複数のさらなる治療剤と共に投与する。場合によって、サイトカインは、少なくとも１つのケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体もしくは組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、およびこれらの機能的な変異体および断片のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。複数の実施形態では、サイトカインは、可溶性ＩＬ−１５、可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３）である。ある特定の場合には、インターロイキンは、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、またはＩＬ−１５と、ＩＬ−１５Ｒαとの融合体を含みうる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される改変免疫エフェクター細胞と共に共発現させることができる、膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた、全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαへと、リンカーを介して、間接的に連結する。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。場合によって、サイトカインを、ＣＡＲと同じ免疫エフェクター細胞内で発現させる。一部の実施形態では、上記で記載したサイトカインは、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンドの誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０１６７】
さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、膜結合型ＩＬ−１５（「ｍＩＬ−１５またはｍｂＩＬ−１５」）を発現する。本発明の複数の態様では、ｍｂＩＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合タンパク質を含む。さらなる実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号３７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５を、本明細書で記載される、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ−１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０などの細胞タグと共に発現させる。ｍｂＩＬ−１５は、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ−１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０とインフレームで発現させることができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、遺伝子転写のための誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンドの誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０１７０】
ウイルスベースの送達系
本発明はまた、本発明の核酸を挿入したウイルスベースの系などの送達系も提供する。代表的なウイルス発現ベクターは、アデノウイルスベースのベクター（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている、アデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系）、レンチウイルスベースのベクター（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製の、レンチウイルスベースのｐＬＰＩ）、およびレトロウイルスベクター（例えば、ｐＣＦＢ−ＥＧＳＨを付加したｐＦＢ−ＥＲＶ）、ヘルペスウイルスを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１または複数の選択用マーカー（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット、国際公開第０１／２９０５８号パンフレット、および米国特許第６，３２６，１９３号明細書）を含有する。
【０１７１】
複数の実施形態では、骨格と、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むレンチウイルスベクターが提示される。任意選択で、ベクターは、切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）、ＣＤ２０ｔ−１、または全長ＣＤ２０をコードする核酸をさらに含む。
【０１７２】
場合によって、骨格と、（１）切断型表皮増殖因子受容体、例えば、ＨＥＲ１ｔもしくはＨＥＲｔ−１、またはこれらの機能的な変異体、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。
【０１７３】
場合によって、骨格と、（１）全長ＣＤ２０、切断型ＣＤ２０、またはこれらの変異体、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターが提示される。
【０１７４】
複数の実施形態では、ＣＤ３３特異的ＣＡＲをコードする核酸を、レンチウイルスへと、骨格構成要素を含むベクタークローニングする。例示的な骨格構成要素は、ｐＦＵＧＷおよびｐＳＭＰＵＷを含むがこれらに限定されない。ｐＦＵＧＷレンチウイルスベクター骨格は、自己不活化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター骨格であり、不要なＨＩＶ−１ウイルス配列を除去する結果として、新生物の発生、有害な突然変異、および感染性粒子の再生の潜在的可能性の低減もたらす。複数の実施形態では、ＣＤ３３  ＣＡＲをコードするベクターはまた、単一の構築物内で、ｍｂＩＬ−１５もコードする。複数の実施形態では、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５は、２つの個別のレンチウイルスベクター上でコードされる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５を、切断型表皮増殖因子受容体タグと共に発現させる。複数の実施形態では、ＣＤ３３  ＣＡＲは、ｍｂＩＬ−１５および細胞タグと共に、単一のレンチウイルスベクターから共発現させることができる。さらなる実施形態では、ＣＤ３３  ＣＡＲは、誘導性プロモーターの制御下にありうる。別の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチリガンドの誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０１７５】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ３３  ＣＡＲは、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジ、および膜貫通ドメイン、ならびにヒト４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のＣＤ３３  ＣＡＲは、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジ、および膜貫通ドメイン、ヒト４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと、任意選択で、切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）タグとを含む。他の適切なベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）製のｆｌｐ−ｉｎ系、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見出されうるｃｒｅ−ｌｏｘ系などのｃｒｅ−ｌｏｘ系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入される場合）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製のｐＣＩまたはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
【０１７６】
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。
【０１７７】
適切なプロモーターの別の例は、ヒト伸長成長因子１アルファ１（ｈＥＦ１ａ１）である。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含むベクター構築物は、ｈＥＦ１ａ１の機能的変異体を含む。
【０１７８】
しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０１７９】
本明細書で記載されるＣＡＲまたはこの部分の発現を評価するために、細胞へと導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させることが求められる細胞集団からの、発現細胞の同定および選択を容易とする、選択用マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはこれらの両方も含有しうる。他の態様では、選択用マーカーは、別個のＤＮＡ片上に保有され、共トランスフェクション手順で使用さる場合もある。選択用マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞内の発現を可能とするように、適切な調節配列で挟むことができる。有用な選択用マーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびアンピシリン耐性遺伝子などの抗生剤耐性遺伝子を含む。一部の実施形態では、切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）タグを、選択用マーカー遺伝子として使用することができる。
【０１８０】
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含む。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の５’側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子へと連結することができ、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
【０１８１】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるベクターは、トランス遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１ａ１プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンポリＡ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のほか、ｐＦＵＧＷプラスミドに由来するＬＴＲ配列を含みうる。
【０１８２】
遺伝子を、細胞へと導入し、発現させる方法は、周知である。発現ベクターの文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
【０１８３】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。
【０１８４】
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞、例えば、免疫エフェクター細胞へと導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０１８５】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイド状系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０１８６】
ウイルス送達系を用いる場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。脂質製剤を、核酸の、宿主細胞への導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける）のために使用することができる。別の態様では、核酸は、脂質と会合させることができる。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させることもでき、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成しうる。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
【０１８７】
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から購入することができ、ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から購入することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから購入することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から購入することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む（Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)）。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
【０１８８】
非ウイルスベースの送達系
本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸はまた、免疫エフェクター細胞へと、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体へと導入するための合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使用して導入することもできる。例示的なＳＢトランスポゾン系については、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書および同第８，２２７，４３２号明細書において記載されており、図３に例示されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンから構成される。
【０１８９】
ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から、別のＤＮＡ部位へと、単純なカットアンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたＤＮＡセグメントを、１つのＤＮＡ分子から切り出し、同じＤＮＡ分子内もしくはゲノム内、または異なるＤＮＡ分子内もしくはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼと同様、ＳＢトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエントＤＮＡ配列内の、ＴＡジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内の別の部位の場合もあり、別のＤＮＡ分子（または染色体）内の場合もある。ヒトゲノムを含む哺乳動物ゲノムには、約２億カ所のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組込みの過程において、重複される。このＴＡ配列の重複は、転移の顕著な特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源により供給される場合もあり、この場合、トランスポゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。略述すると、Ｔ細胞を遺伝子改変するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）系（Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)）を適合させた（Cooper et al., Blood 105:1622-31, (2005)）。これは、２つのステップ：（ｉ）Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするためのＳＢトランスポゾン［すなわち、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）］およびＳＢトランスポザーゼを発現するＤＮＡプラスミドのエレクトロトランスファー（Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)、Kebriaei et al., Hum Gene Ther 23:444-50, (2012)）、ならびに（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株に由来するデザイナー人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）（ＡａＰＣ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ）としてもまた公知である）に接する形での、組込み配列を安定的に発現するＴ細胞の繁殖および拡大増殖を伴った。一実施形態では、ＳＢトランスポゾン系は、ｔｄＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはキメラ抗原受容体をコードするコード配列を含む。このような系については、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). April 15, 2008およびMaiti et al., J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)において記載されている。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ３３  ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５は、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、別個のベクター内でコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ３３  ＣＡＲは、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ｍｂ−ＩＬ１５は、第２のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、第３のＤＮＡプラスミドベクター内でコードされる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＲｔ−１、ＣＤ２０、またはＣＤ２０ｔ−１によりコードされる。
【０１９１】
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または細胞を、本発明の阻害剤へと、他の形で曝露するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなど、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）、または薬剤を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本発明の範囲内に収まるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的」アッセイを含む。
【０１９２】
複数の実施形態では、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい）、および／またはｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン系（例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい）を使用して、ＣＤ３３  ＣＡＲおよび他の遺伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１４８，２０３号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号明細書、Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 およびIvics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)において提示されている。
【０１９３】
他の実施形態では、リコンビナーゼおよび発現ベクターの組込みを介して、ＣＤ３３  ＣＡＲならびにサイトカイン、ｍｂＩＬ−１５、および／またはＨＥＲ１ｔ／ＨＥＲ１ｔ−１／ＣＤ２０／ＣＤ２０ｔ−１タグなど、他の遺伝子エレメントを、免疫エフェクター細胞のＤＮＡへと組み込むことができる。このようなベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在によりにより、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書で記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方によりにより、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および／または断片を含む。
【０１９４】
リコンビナーゼは、標的細胞へと、ターゲティングベクターの導入の前に導入することもでき、これと共時的に導入することもでき、この後で導入することもできる。リコンビナーゼは、例えば、リポソーム、粒子のコーティング、またはマイクロインジェクションを使用して、細胞へと、タンパク質として直接導入することもできる。代替的に、適切な発現ベクターを使用して、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡである、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することもできる。上記で記載したターゲティングベクターの構成要素は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現カセットの構築において有用である。しかし、リコンビナーゼの発現は、他の方式で、例えば、リコンビナーゼの発現を、調節可能なプロモーター（すなわち、その発現を選択的に誘導または抑制しうるプロモーター）の制御下に置くことにより調節することもできる。
【０１９５】
リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーに由来しうる。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、１００を超えるメンバーを有し、例えば、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、およびラムダインテグラーゼを含む。インテグラーゼファミリーはまた、チロシンファミリーまたはラムダインテグラーゼファミリーとも称し、ＤＮＡのホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために、チロシンの触媒性ヒドロキシル基を使用する。典型的に、チロシンファミリーのメンバーはまず、ＤＮＡにニックを入れ、これにより、その後、二重鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例は、Ｃｒｅインテグラーゼ、ＦＬＰインテグラーゼ、ＳＳＶ１インテグラーゼ、およびラムダ（λ）インテグラーゼを含む。セリンリコンビナーゼファミリーとしてもまた公知の、リゾルバーゼファミリーでは、保存性セリン残基が、ＤＮＡ標的部位への共有結合性連結を形成する（Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16）。
【０１９６】
一実施形態では、リコンビナーゼは、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ、Ａ１１８リコンビナーゼ、およびΦＲｖ１リコンビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０３４，６５２号明細書において詳細に記載されている。
【０１９７】
本発明の実施における使用のためのリコンビナーゼは、組換えにより作製することもでき、既に記載された通りに精製することもできる。所望のリコンビナーゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野で公知の方法であって、タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿の方法、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998）を含むがこれらに限定されないタンパク質精製の方法により、所望の純度まで精製することができる。
【０１９８】
一実施形態では、リコンビナーゼを、任意の適切な方法による組換えが所望される組換え接合部位を含有する真核細胞へと導入することができる。当技術分野では、例えば、マイクロインジェクションまたは他の方法により、機能的タンパク質を、細胞へと導入する方法が周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、タンパク質の一過性の存在、およびその機能を確認するが、これは、好ましい実施形態であることが多い。代替的に、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクターであって、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結した、発現ベクター内に含まれうる。リコンビナーゼポリペプチドはまた、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡによっても、真核細胞へと導入することができる。リコンビナーゼは、核酸断片の、改変されるゲノムへの挿入に必要であるような場合に限り存在することが一般に好ましい。したがって、大半の発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害ではないと予測される。リコンビナーゼ遺伝子を、目的の外因性ポリヌクレオチドの導入の前に導入することもでき、これと同時に導入することもでき、この後で導入することもできる。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるポリヌクレオチドを保有するベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子はなお、ポリヌクレオチド内にも、組み入れることができる。
【０１９９】
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第１の組換え部位および第２の組換え部位を用意するステップと、第１の組換え部位および第２の組換え部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え部位と、第２の組換え部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢであり、第２の組換え部位は、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される。
【０２００】
さらなる実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの、ゲノムが改変される細胞への導入を提供する。一実施形態は、真核細胞内の部位特異的組換えを得るための方法であって、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第１の組換え接合部位と、第２の組換え接合部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え接合部位が、ファージゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＰ）、または細菌ゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＢ）であり、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される、方法に関する。ある実施形態では、リコンビナーゼは、Ａ１１８リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ΦＲｖ１リコンビナーゼ、およびＢｘｂ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一実施形態では、組換えは、組込みを結果としてもたらす。
【０２０１】
ＣＤ３３  ＣＡＲおよびベクターを含む細胞
本明細書では、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する改変細胞が提示される。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される改変細胞は、免疫エフェクター細胞である。本明細書の複数の実施形態では、骨格と、（１）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含むベクターを含む免疫エフェクター細胞が提示される。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、および（ｆ）切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞が提示される。
【０２０３】
本明細書の複数の実施形態では、（１）キルスイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せとしての使用のための細胞タグ、ならびに（２）（ａ）ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、（ｂ）ストークドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢもしくはＣＤ２８、またはこれらの両方を含む共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞が提示される。複数の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０である。
【０２０４】
複数の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および調節性Ｔ細胞である。複数の実施形態では、細胞は、ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合すると、抗腫瘍免疫を呈する。
【０２０５】
改変免疫エフェクター細胞
本明細書で記載される、１または複数の異種遺伝子または異種ポリペプチドを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞が提示される。本明細書で記載されるＣＤ３３  ＣＡＲ、ならびにＨＥＲ１ｔタグ、ＨＥＲ１ｔ−１タグ、ＣＤ２０タグ、およびＣＤ２０ｔ−１タグのうちの少なくとも１つを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞が提示される。場合によって、本明細書で開示されるＣＤ３３  ＣＡＲ、ｍｂＩＬ−１５、ならびにＨＥＲ１ｔタグ、ＨＥＲ１ｔ−１タグ、ＣＤ２０タグ、およびＣＤ２０ｔ−１タグのうちの少なくとも１つを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞が提示される。
【０２０６】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
【０２０７】
一部の実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を含む改変免疫細胞である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する白血球の亜型である。例示的なＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１７細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞を含む。
【０２０８】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球を支援する。場合によって、ＴＨ細胞は、細胞表面上のＣＤ４糖タンパク質の発現のために、ＣＤ４＋  Ｔ細胞として公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
【０２０９】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
【０２１０】
メモリーＴ細胞は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、亜型：ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質である、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現しうる。
【０２１１】
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２１２】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、獲得免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔｈ細胞およびＴｃ細胞の両方に帰せられた機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果たしうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、これらを消失させることも可能である。
【０２１３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とは、自然免疫系の、細胞傷害性リンパ球の種類である。場合によって、ＮＫ細胞は、ウイルス感染および／または腫瘍形成に対する、最前線の防御をもたらす。ＮＫ細胞は、感染細胞上またはがん性細胞上に提示されたＭＨＣを検出することが可能であり、サイトカイン放出を誘発し、その後、溶解およびアポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞はさらに、抗体および／またはＭＨＣの非存在下で、ストレス細胞を検出することが可能であり、これにより、迅速な免疫応答を可能とする。
【０２１４】
改変免疫エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変免疫エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投与するが、量は、サイトカインと関連する傷害作用を誘導する有効性および潜在的可能性に基づき決定する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０5〜約１０9個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０5〜約１０8個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０5〜約１０7個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０6〜約１０9個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０6〜約１０8個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０7〜約１０9個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０5〜約１０6個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０6〜約１０7個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０7〜約１０8個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０8〜約１０9個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０9個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０8個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０7個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０6個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０5個を含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞であるＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０5〜約１０9個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０5〜約１０8個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０5〜約１０7個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０6〜約１０9個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０6〜約１０8個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０7〜約１０9個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０5〜約１０6個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０6〜約１０7個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０7〜約１０8個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０8〜約１０9個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０9個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０8個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０7個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０6個を含む。場合によって、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０5個を含む。
【０２１６】
免疫エフェクター細胞の供給源
ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、リダイレクトされた、抗原特異的免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ  Ｔ細胞）を作り出し、かつ／またはこれを拡大増殖させる方法であって、細胞に、ＣＡＲをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターによりトランスフェクトし、次いで、任意選択で、細胞を、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップを含む方法を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲを発現するように改変された細胞（または細胞集団）は、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫エフェクター細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞である。
【０２１７】
免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。場合によって、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させることもできる。したがって、実施形態に従い改変するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離することができる。例えば、同種Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（そして、任意選択で、機能的なＴＣＲを欠くように）改変することができる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血から回収することもでき、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による刺激の後で、骨髄または臍帯血から回収することもできる。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲの発現構築物による）の後、細胞は、速やかに輸注するか、または凍結保存することができる。ある特定の態様では、トランスフェクションの後、細胞は、細胞への遺伝子導入後、約１、２、３、４、５日間またはこれを超える日数以内に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、バルク集団として、数日間、数週間、または数カ月間にわたり繁殖させることができる。さらなる態様では、トランスフェクションの後、トランスフェクト細胞を、クローニングし、組み込まれるか、またはエピソーム内に維持された、単一の発現カセットまたはプラスミドの存在、およびキメラ抗原受容体の発現を裏付けるクローンを、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させる。拡大増殖のために選択されたクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識し、溶解させる能力を裏付ける。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および他のサイトカイン）を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞に接する形で拡大増殖させることもでき、Ｔ細胞表面上のＣＤ３を架橋する、ＯＫＴ３などの抗体により拡大増殖させることもできる。組換えＴ細胞のサブセットは、磁気ビーズベースの単離法および／または蛍光活性化細胞分取技術の使用により、さらに選択することができ、ＡａＰＣと共にさらに培養することができる。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
【０２１８】
Ｔ細胞はまた、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることもできる。本発明の、ある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能な、任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本発明の、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して、対象から回収された血液単位から得ることができる。複数の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス生成物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その語における加工ステップのために、適切な緩衝液中または培地中に入れる。本発明の一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないが、多くの二価カチオンを欠く場合もある。カルシウムの非存在下における初期活性化ステップは、活性化の強化をもたらす。当業者がたやすく理解する通り、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することなど、当業者に公知の方法により達することができる。洗浄の後、細胞を、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩液溶液など、様々な生体適合性の緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望されない構成要素を除去し、細胞を、培養培地中に、直接再懸濁させることもできる。
【０２１９】
別の実施形態では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介する遠心分離、または対向流遠心溶出により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３+、ＣＤ２８+、ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ４５ＲＡ+、およびＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的亜集団も、陽性選択法または陰性選択法により、さらに単離することができる。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズを伴う、所望のＴ細胞陽性選択に十分な時間にわたるインキュベーションにより単離する。一実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、時間は、３０分間〜３６時間、またはこれより長い時間、およびこれらの間の任意の整数値の時間の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、時間は、１０〜２４時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を伴う患者からのＴ細胞の単離ための、２４時間など、長いインキュベーション時間の使用は、細胞収率を増大させうる。腫瘍組織または免疫障害個体から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する状況など、Ｔ細胞が、他の細胞型と比較して少数である、任意の状況においては、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離することができる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率も増加させうる。したがって、単に、時間を短くするかまたは長くすることにより、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能となり、かつ／またはビーズの、Ｔ細胞に対する比（本明細書で、さらに記載される通り）を増加もしくは減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、もしくは工程中の他の時点において、優先的に、陽性もしくは陰性に選択することができる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、または他の所望の時点において、優先的に、陽性または陰性に選択することができる。当業者は、本発明の文脈では、複数ラウンドにわたる選択もまた、使用しうることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、選択手順を実施し、「選択されなかった」細胞を、活性化工程および拡大増殖工程において使用することも所望でありうる。「選択されなかった」細胞はまた、さらなるラウンドにわたる選択にかけることもできる。
【０２２０】
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する、細胞分取および／または陰性の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーを介する選択である。例えば、ＣＤ４+細胞を、陰性選択により濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的に、ＣＤ４+、ＣＤ２５+、ＣＤ６２Ｌhi、ＧＩＴＲ+、およびＦｏｘＰ３+を発現する調節性Ｔ細胞を、濃縮または陽性選択することが所望でありうる。代替的に、ある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択法により枯渇させることができる。
【０２２１】
陽性選択または陰性選択により、所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変動させることができる。ある特定の実施形態では、ビーズと細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞とビーズとの最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超える濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、または多くの腫瘍細胞（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）が存在する試料に由来する細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８+Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０２２２】
関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが所望でありうる。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を、著明に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用を最小化する。これは、粒子に結合する、高量の所望の抗原を発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度のＣＤ８+Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、１ｍｌ当たりの細胞５×１０6個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌ当たりの細胞約１×１０5個〜１ｍｌ当たりの細胞１×１０6個、およびこれらの間の任意の整数値でありうる。
【０２２３】
他の実施形態では、細胞は、速度を変動させて、２〜１０℃または室温で、長さを変動させる時間にわたり、ロテーター上でインキュベートすることができる。
【０２２４】
刺激されるＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で、凍結させることもできる。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結用溶液中に懸濁させることができる。当技術分野では、多くの凍結用溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈でも有用であろうが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、もしくは１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを含有する、他の適切な細胞凍結用培地の使用を伴い、次いで、細胞を、１分間当たり１℃の速度で、−８０℃へと凍結させ、液体窒素保管タンクの蒸気相中で保存する。制御型凍結の他の方法を使用しうるほか、−２０℃または液体窒素中における速やかな非制御型凍結も使用しうる。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を、本明細書で記載される通りに、融解させ、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に、室温で、１時間にわたり休眠させる。
【０２２６】
ある特定の実施形態ではまた、本明細書で記載される拡大増殖細胞が必要とされうる時点の前の期間における、対象からの血液試料またはアフェレーシス生成物のコレクションも提供される。したがって、拡大増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点において回収することができ、Ｔ細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載されるＴ細胞療法などのＴ細胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法におけるその後の使用のために、単離し、凍結させることができる。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、健常対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、疾患を発症する危険性があるが、疾患をいまだ発症していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離し、凍結させる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、その後の時点において、拡大増殖させ、凍結させ、使用することができる。ある特定の実施形態では、試料を、患者から、本明細書で記載される特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前において回収する。さらなる実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射など、他の免疫除去剤などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されない、任意の数の妥当な処置モダリティーの前に、対象に由来する血液試料またはアフェレーシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼである、カルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または、増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)、Henderson et al., Immun 73:316-321, (1991)、Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)）。さらなる実施形態では、細胞を、患者のために単離し、骨髄移植または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法を伴う（例えば、この前に、これと同時に、またはこの後で）その後の使用のために凍結させる。別の実施形態では、細胞を、あらかじめ単離し、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、ＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後における処置のためのその後の使用のために凍結させることができる。
【０２２７】
本発明の、さらなる実施形態では、Ｔ細胞を、処置後における患者から直接得る。この点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置の後であって、患者が通常、処置から回復する期間中の、処置の直後である、処置の後において、得られるＴ細胞お品質は、最適でありうるか、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖するそれらの能力について改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使用する、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける改変の後、これらの細胞は、生着の延長、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖に好ましい状態でありうる。したがって、本発明の文脈内では、この回復期において、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系列の細胞を含む血液細胞を回収することが想定される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、対象において、とりわけ、治療後における規定された時間窓において、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／またはぞうが好適となる条件を創出することができる。例示的な細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
【０２２８】
Ｔ細胞の活性化および拡大増殖
本明細書で記載されるＣＡＲを発現するように、Ｔ細胞を改変する前であれ、この後であれ、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書、同第６，５３４，０５５号明細書、同第６，９０５，６８０号明細書、同第６，６９２，９６４号明細書、同第５，８５８，３５８号明細書、同第６，８８７，４６６号明細書、同第６，９０５，６８１号明細書、同第７，１４４，５７５号明細書、同第７，０６７，３１８号明細書、同第７，１７２，８６９号明細書、同第７，２３２，５６６号明細書、同第７，１７５，８４３号明細書、同第５，８８３，２２３号明細書、同第６，９０５，８７４号明細書、同第６，７９７，５１４号明細書、同第６，８６７，０４１号明細書、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書において記載されている方法を一般に使用して、活性化させ、拡大増殖させることができる。
【０２２９】
一般に、本明細書で記載されるＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドをそれへと接合させた表面との接触により拡大増殖する。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書で記載される通り、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体、もしくはこの抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアを伴う、タンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などにより刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, (1999)、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, (1999)）。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールによりもたらされる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中とする場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。表面へとカップリングさせる場合、薬剤は、同じ表面へとカップリングさせることもでき（すなわち、「シス」構成）、別個の表面へとカップリングさせることもできる（すなわち、「トランス」構成）。代替的に、１つの薬剤を、表面へとカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中とすることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液とするか、または表面へとカップリングさせる。ある特定の実施形態では、いずれの薬剤も、溶液中とする。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤に結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋される。この点で、本発明における、Ｔ細胞の活性化および拡大増殖における使用のために想定される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０２３１】
一実施形態では、２つの薬剤を、同じビーズ上に、すなわち、「シス」であるか、または別個のビーズへと、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目的として述べると、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはこの抗原結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはこの抗原結合性断片であり、両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズへと、共固定化させる。一実施形態では、ＣＤ４+Ｔ細胞の拡大増殖およびＴ細胞の増殖のために、ビーズへと結合させた各抗体の、１：１の比を使用する。本発明のある特定の態様では、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、Ｔ細胞の拡大増殖の増大が観察されるように使用する。特定の一実施形態では、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、約１〜約３倍の増大が観察される。一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００、およびこれらの間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子へと結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は、１未満である。本発明のある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体の、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３に対する比は、２：１を超える。特定の一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１００の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：７５の比を使用する。さらなる実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：５０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３０の比を使用する。複数の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３の比を使用する。さらに別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、３：１の比を使用する。
【０２３２】
１：５００〜５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である、粒子の、細胞に対する比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやすく理解しうる通り、粒子の、細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しうる。例えば、小型サイズのビーズが、少数の細胞だけに結合しうるのに対し、大型のビーズは、多くの細胞に結合しうるであろう。ある特定の実施形態では、細胞の、粒子に対する比は、１：１００〜１００：１、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さらなる実施形態では、比は、１：９〜９：１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用しうる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８カップリング粒子の、Ｔ細胞に対する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及した通り、変動しうるが、ある特定の値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含み、１つの比は、少なくとも１：１の粒子のＴ細胞に対する比である。一実施形態では、１：１またはこれ未満の、粒子の、細胞に対する比を使用する。特定の一実施形態では、粒子：細胞比は、１：５である。さらなる実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、刺激日に応じて変動しうる。例えば、一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、１日目には、１：１〜１０：１であり、さらなる粒子を、細胞へと、その後、最長１０日間にわたり、毎日または隔日で追加し、最終的な比を１：１〜１：１０とする（追加日における細胞カウントに基づく）。特定の一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、１：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：５へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：５へと、毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、２：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：１０へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：１０へと、毎日または隔日で追加する。当業者は、様々な他の比も、本発明における使用に適しうることを理解するであろう。特に、比は、粒子のサイズ、ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するであろう。
【０２３３】
本明細書で記載される、さらなる実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を、薬剤コーティングビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと、細胞とを分離せず、併せて培養する。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力などの力を適用することにより濃縮する結果として、細胞表面マーカーのライゲーションの増加もたらし、これにより、細胞の刺激を誘導する
【０２３４】
例を目的として述べると、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーションさせることができる。一実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０4〜１０9個）と、ビーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は、任意の細胞濃度を使用しうることをたやすく理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料のうちの０．０１％だけを含む場合もあり、全試料（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数が、本発明の文脈内にある。ある特定の実施形態では、粒子と細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増大させて）、細胞と粒子との最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、約１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超える濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８+Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０２３５】
本明細書で記載される一実施形態では、混合物を、数時間（約３時間）〜約１４日間またはこれらの間の任意の整数値時間にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物を、２１日間にわたり培養することができる。本発明の一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、約８日間にわたり培養する。別の実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、２〜３日間にわたり培養する。Ｔ細胞の培養期間が、６０日間またはこれを超えるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望でありうる。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−アルファ、または当業者に公知である、細胞の増殖のための、他の任意の添加剤を含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための、他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、アミノ酸の添加、ピルビン酸ナトリウム、ならびにビタミン、無血清もしくは適量の血清（または血漿）の補充、または規定されたセットのホルモン、ならびに／あるいはＴ細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイトカインを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物に限り組み入れ、対象へと輸注される細胞培養物には組み入れない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ2）下で維持する。
【０２３６】
変動させる刺激時間へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈しうる。例えば、典型的な血液生成物またはアファレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴC、ＣＤ８+）より多くのヘルパーＴ細胞集団（ＴH、ＣＤ４+）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大増殖は、約８〜９日目の前には、主にＴH細胞からなるが、約８〜９日目の後では、ますます多くのＴC細胞の集団を含むＴ細胞の集団をもたらす。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴH細胞を含むＴ細胞集団を輸注することも、有利でありうる。同様に、ＴC細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合、このサブセットを、より大きな程度で拡大増殖させることが有益でありうる。
【０２３７】
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、著明に変動するが、大部分は、細胞拡大増殖工程の経過中において、再現可能な形で変動する。したがって、このような再現性は、特殊な目的のためのＴ細胞生成物の活性化を調整する能力を可能とする。
【０２３８】
場合によって、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＡａＰＣ  （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）と共に共培養して、細胞の拡大増殖を支援する。ＡａＰＣはまた、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と称することもできる。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物および細胞療法用生成物の調製において有用である。一態様では、ＡａＰＣは、トランスジェニックＫ５６２細胞でありうる。抗原提示系の調製および使用に関する、一般的な指針については、例えば、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、同第６，３６２，００１号明細書、および同第６，７９０，６６２号明細書、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号明細書および同第２００９／０００４１４２号明細書、ならびに国際公開第２００７／１０３００９号パンフレットを参照されたい。実施形態についてのなおさらなる態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の培養は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激する、樹状細胞またはＡａＰＣ  （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の存在下で、トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む。なおさらなる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合性抗体またはこの断片を含む。ＡａＰＣは、場合によって、Ｔ細胞を活性化させるかまたは共刺激する、さらなる分子を含みうる。さらなる分子は、場合によって、膜結合型Ｃγサイトカインを含みうる。なおまださらなる態様では、ＡａＰＣは、不活化させているかもしくは照射されているか、または感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている。なおさらなる態様では、ＡａＰＣの存在下におけるトランスジェニックＣＡＲ細胞の培養は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはＩＬ−２などの可溶性サイトカインを含む培地中で、トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。
【０２３９】
一態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現しうる。他の態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、またはｍＩＬ１５をさらに発現しうる。ある特定の態様では、ＡａＰＣは、例えば、ＯＫＴ３および／またはＵＣＨＴ１など、少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローンを発現しうる。一態様では、ＡａＰＣは、不活化させる（例えば、照射する）ことができる。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている場合がある。当技術分野では、このようなＡａＰＣを作製するための方法が公知である。一態様では、ＡａＰＣを伴うＣＡＲ改変Ｔ細胞集団の培養は、細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することを含みうる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。一態様では、培養するステップは、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）と共に培養することをさらに含みうる。
【０２４０】
さらなる態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団を、７、１４、２１、２８、３５、４２日間、４９、５６、６３、または７０日間を超えない日数にわたり培養および／または刺激する。ある実施形態では、刺激は、トランスジェニックＣＡＲ  Ｔ細胞の、ＡａＰＣとの共培養であって、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖を促進する共培養を含む。別の態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団を、刺激１回、刺激２回、刺激３回、刺激４回、刺激５回、刺激５回、刺激６回、刺激７回、刺激８回、刺激９回、または刺激１０回を超えない回数にわたり刺激する。場合によって、トランスジェニック細胞を、ＡａＰＣの存在下にあるｅｘ  ｖｉｖｏでは培養しない。一部の特殊な場合には、実施形態の方法は、トランスフェクションステップおよび／または培養するステップの後で、細胞集団を、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）について濃縮するステップをさらに含む。濃縮するステップは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）と、ＣＡＲを発現する細胞について分取することとを含みうる。さらなる態様では、ＣＡＲを発現する細胞について分取することは、ＣＡＲ結合性抗体の使用を含む。濃縮するステップはまた、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含みうる。実施形態についての、なおまださらなる態様では、方法は、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団についての凍結保存試料をさらに含む。
【０２４１】
場合によって、ＡａＰＣを、さらなるプロセシングを伴わずに、ペプチドの、ＭＨＣ分子との直接的な結合を可能とする、最適な長さのペプチドと共にインキュベートする。代替的に、細胞は、目的の抗原（すなわち、ＭＨＣ非依存型の抗原認識の場合）を発現しうる。さらに、場合によって、ＡＰＣは、特異的なＣＡＲポリペプチドまたは一般的なＣＡＲポリペプチド（例えば、ｕＡａＰＣ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に結合する抗体を発現しうる。このような方法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットにおいて開示されている。ペプチド−ＭＨＣ分子または目的の抗原に加えて、ＡａＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性支援分子も含みうる。任意の適切な数および組合せの支援分子を利用することができる。支援分子は、共刺激分子および接着分子などの支援分子から選択することができる。例示的な共刺激分子は、ＣＤ７０およびＢ７．１（Ｂ７．１は、かつては、Ｂ７として公知であり、また、ＣＤ８０としても公知であった）を含み、これらは、とりわけ、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子および／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞の拡大増殖、Ｔｈ１の分化、短期的なＴ細胞の生存、およびインターロイキン（ＩＬ）２など、サイトカインの分泌に影響を及ぼす。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合生糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例えば、細胞間または細胞−マトリックス間の接触を促進する、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの、１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含みうる。例示的な接着分子は、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭ、を含む。共刺激分子および接着分子を含む、例示的な支援分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技法、方法、および試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において例示されている。
【０２４２】
ＡａＰＣとなるように選択される細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、および／またはＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子の細胞内ペプチドローディングを欠損させているか、あるいは。変温性（すなわち、哺乳動物細胞株より、温度刺激に対する感受性が小さい）であるか、あるいは欠損および変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣとなるように選択される細胞はまた、細胞へと導入される、外因性のＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子、および支援分子の構成要素に対する、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性のＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子、および／または上記で記載した内因性支援分子）を発現する能力も欠く。さらに、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを作出するための、それらの改変の前に、細胞が保有していた欠損および変温特性を保持することが好ましい。例示的なＡａＰＣは、昆虫細胞株など、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株を構成するか、またはこれに由来する。例示的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞株などのショウジョウバエ（Drosophila）属細胞株（例えば、Schneider 1972を参照されたい）である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において提示されている。
【０２４３】
一実施形態ではまた、ＡａＰＣを、凍結融解サイクルにもかける。例示的な凍結融解サイクルでは、凍結が、迅速に生じるように、ＡａＰＣを含有する、適切なレセプタクルを、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）、または同様の低温材料と接触させることにより、ＡａＰＣを凍結させることができる。次いで、凍結させたＡＰＣを、ＡａＰＣの、低温材料からの摘出、および周囲の室温条件への曝露により、または微温水浴もしくは手の温熱を利用して、融解時間の短縮を促進する、促進融解工程により融解させる。加えて、融解の前に、ＡａＰＣを、凍結させ、長ｆ時間にわたり保存することができる。凍結させたＡａＰＣはまた、融解させ、次いで、さらなる使用の前に、凍結乾燥させることもできる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および他の保存剤など、凍結融解手順に有害な影響を及ぼしうる保存剤は、凍結融解サイクルを経るＡａＰＣを含有する培地には非含有とするか、またはこのような保存剤を本質的に欠く培地へのＡａＰＣの導入などにより、本質的に除去する。
【０２４４】
さらなる実施形態では、不活化の後で、細胞の増殖、複製、または核酸の発現が本質的に生じないように、異種核酸およびＡａＰＣに内因性の核酸を、架橋により不活化させることができる。一実施形態では、ＡａＰＣを、外因性ＭＨＣおよび支援分子の発現、このような分子の、ＡａＰＣ表面上の提示、ならびに提示されたＭＨＣ分子への、選択された、１または複数のペプチドのローディングの後の時点において不活化させる。したがって、このような、選択されたペプチドをロードした不活化ＡａＰＣは、増殖または複製が本質的に不可能とされているが、選択されたペプチドの提示機能は保持する。好ましくは、架橋はまた、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を、実質的に低下させずに、細菌およびウイルスなどの汚染微生物を本質的に含まない、ＡａＰＣももたらす。したがって、架橋は、ＡａＰＣを使用して開発される細胞療法製品の安全性に関する懸念を軽減する一助となる一方、重要なＡａＰＣ機能を維持する。架橋およびＡａＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００１７０００号明細書を参照されたい。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、改変抗原提示細胞（ＡＰＣ）がさらに提供される。ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、免疫エフェクター細胞を繁殖させるのに、このような細胞を、例えば、上記で記載した通りに使用することができる。さらなる態様では、改変ＡＰＣ自体を、患者へと投与し、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激することができる。実施形態の改変ＡＰＣ自体を、治療剤として使用することができる。他の実施形態では、改変ＡＰＣを、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激し、かつ／または標的抗原に特異的な、養子導入された免疫エフェクター細胞の活性を増加させるか、もしくは存続を延長しうる治療剤として使用することができる。
【０２４６】
本明細書で使用される「改変ＡＰＣ」という用語は、少なくとも第１のトランス遺伝子を含み、第１のトランス遺伝子が、ＨＬＡをコードする細胞を指す。このような改変ＡＰＣは、抗原が、ＨＬＡと複合したＡＰＣの表面上に提示されるように、抗原の発現のための第２のトランス遺伝子をさらに含みうる。一部の態様では、改変ＡＰＣは、抗原を提示した細胞型（例えば、樹状細胞）でありうる。さらなる態様では、改変ＡＰＣは、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞など、通常、抗原を提示しない細胞型（「Ｔ−ＡＰＣ」と称する）から作製することができる。したがって、一部の態様では、実施形態の改変ＡＰＣは、ＨＬＡが、標的抗原のエピトープと複合した改変ＡＰＣの表面上で発現するように、標的抗原をコードする第１のトランス遺伝子と、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第２のトランス遺伝子とを含む。ある特定の具体的な態様では、改変ＡＰＣ内で発現するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ２である。
【０２４７】
一部の態様では、実施形態の改変ＡＰＣは、共刺激分子をコードする、少なくとも第３のトランス遺伝子をさらに含みうる。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインでありうる、共刺激サイトカインでありうる。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型ＩＬ−１５などのＩＬ−１５である。一部のさらなる態様では、改変ＡＰＣは、編集（または欠失）遺伝子を含みうる。例えば、ＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、またはＴＣＲなどの阻害性遺伝子は、遺伝子の発現を低減するかまたは消失させるように編集することができる。実施形態の改変ＡＰＣは、任意の目的の標的抗原をコードするトランス遺伝子をさらに含みうる。例えば、標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でありうる。
【０２４８】
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を、ポイントオブケア施設において改変する。場合によって、ポイントオブケア施設は、対象の近傍の病院または機関（例えば、医療機関）にある。場合によって、免疫エフェクター細胞を、キメラ受容体および／またはサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと改変／導入することにより改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。一部の実施形態では、このような免疫エフェクター細胞を、電気穿孔を介して、本明細書で記載されるベクターにより改変する。他の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターの場合もあり、ウイルスベクターの場合もある。１つの場合には、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、繁殖ステップおよび活性化ステップを経ない。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、インキュベーションステップまたは培養するステップを経ない。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、前記免疫エフェクター細胞へと改変／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、前記細胞へと改変／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、少なくとも０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間以内に、迅速に輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、細胞へと改変／導入することにより、ＮＫ細胞またはＴ細胞を改変し、次いで、対象へと、０日間、＜１日間、＜２日間、＜３日間、＜４日間、＜５日間、＜６日間、または＜７日間以内に、迅速に輸注する。場合によって、免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。１つの場合には、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でありうる。１つの場合には、キメラ受容体は、ＣＤ３３  ＣＡＲでありうる。別の場合には、サイトカインは、ｍｂＩＬ−１５でありうる。別の場合には、ＣＤ３３  ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＨＥＲ１ｔタグまたはＨＥＲ１ｔ−１タグを含みうる。別の場合には、ＨＥＲ１ｔタグは、配列番号３２もしくは５４、またはこれらの変異体もしくは断片を含みうる。１つの場合には、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号３７、またはこの変異体もしくは断片によるｍｂＩＬ−１５である。別の場合には、ｍｂＩｌ−１５はまた、ＨＥＲ１ｔタグまたはＨＥＲ１ｔ−１タグも含みうる。さらに別の場合には、ＣＤ３３  ＣＡＲおよび／またはｍｂＩＬ−１５の発現を、本明細書で記載される遺伝子スイッチ発現系によりモジュレートする。
【０２４９】
治療的適用
本明細書の複数の実施形態では、レンチウイルスベクター（ＬＶ）により形質導入された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）について記載される。例えば、ＬＶは、ＣＤ３３の抗原認識ドメインを、ＣＤ８アルファヒンジのストークドメインおよびこの変異体、ＣＤ３ゼータの細胞内ドメイン、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはこれらの任意の組合せとＣＤ３ゼータの細胞内ドメインを組み合わせるＣＡＲをコードする。したがって、場合によって、形質導入されたＴ細胞は、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答を誘発しうる。
【０２５０】
本明細書で記載される複数の実施形態では、初代Ｔ細胞の特異性を、ＣＤ３３腫瘍抗原へとリダイレクトするＣＡＲの使用が提示される。したがって、本発明はまた、哺乳動物における、標的細胞集団または標的組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、哺乳動物へと、ＣＡＲを発現するＴ細胞を投与するステップを含み、ＣＡＲが、ＣＤ３３、ストークドメイン、例えば、ヒトＣＤ３ゼータの細胞内ドメインを含むゼータ鎖部分、および共刺激シグナル伝達領域と、特異的に相互作用する結合性部分を含む、方法も提供する。
【０２５１】
一実施形態では、本開示は、本発明のＣＤ３３特異的ＣＡＲを発現するように、Ｔ細胞を、遺伝子改変し、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントへと輸注する種類の細胞療法を含む。輸注された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複製される結果として、持続的な腫瘍のコントロールをもたらしうる、長期にわたる存続をもたらすことが可能である。
【０２５２】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ロバストなＴ細胞の拡大増殖を経ることが可能であり、長期間にわたり存続しうる。別の実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、さらなる腫瘍の形成または増殖を阻害するように再活性化させうる、特異的メモリーＴ細胞へと進化する。
【０２５３】
本明細書で記載されるＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける免疫化および／または哺乳動物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療のための、ある種のワクチンとしても用いられうる。複数の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。ｅｘ  ｖｉｖｏにおける免疫化に関して述べると、ｉ）細胞の拡大増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の、細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも１つを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて行ってから、免疫エフェクター細胞を、哺乳動物へと投与する。
【０２５４】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける手順は、周知であり、下記で、より完全に論じられる。略述すると、細胞を、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本明細書で開示されるＣＡＲを発現させるベクターにより、遺伝子改変する（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形質導入またはトランスフェクトする）。ＣＡＲ改変細胞を、哺乳動物レシピエントへと投与して、治療的利益をもたらすことができる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであることが可能であり、ＣＡＲ改変細胞は、レシピエントに対して、自家でありうる。代替的に、細胞は、レシピエントに対して、同種の場合もあり、同系の場合もあり、異種の場合もある。
【０２５５】
造血幹細胞および造血前駆細胞の、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖のための手順については、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１９９，９４２号明細書において記載されており、本発明の細胞へと適用することができる。当技術分野では、他の適切な方法も公知であり、したがって、本発明は、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖の、任意の特定の方法に限定されない。略述すると、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、Ｔ細胞の培養および拡大増殖は、（１）ＣＤ３４＋の造血幹細胞および造血前駆細胞を、哺乳動物の末梢血採取物または骨髄外植物から回収することと、（２）このような細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させることとを含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書において記載されている細胞的増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、およびｃ−ｋｉｔリガンドなど、他の因子も、細胞を培養および拡大増殖させるために使用することができる。
【０２５６】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける免疫化の点で、細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者における抗原に対して方向付けられた免疫応答を誘発する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫化のための組成物および方法も提供する。
【０２５７】
一般に、本明細書で記載される通りに活性化させ、拡大増殖させた細胞は、免疫障害個体において発生する疾患の処置および防止において用いることができる。特に、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞を、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）など、骨髄性悪性腫瘍の処置において使用する。本発明の、ある特定の実施形態では細胞を、ＡＭＬを発症する危険性がある患者の処置において使用する。したがって、本発明は、ＡＭＬを、処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞を投与するステップを含む方法を提供する。複数の実施形態では、本明細書で記載される通りに活性化させ、拡大増殖させた細胞は、再発性または難治性ＡＭＬの処置において用いることができる。
【０２５８】
略述すると、本発明の医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団を、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。複数の実施形態では、本発明の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
【０２５９】
本明細書で記載される医薬組成物は、処置される（または予防される）疾患に適切な形で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することができる。
【０２６０】
「免疫有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」を指し示す場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して、医師により決定されうる。一般に、本明細書で記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、これらの範囲内の全ての整数値を含む、体重１ｋｇ当たりの細胞１０4〜１０9個、体重１ｋｇ当たりの細胞１０5〜１０6個の投与量で投与しうることが言明されうる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で、複数回にわたり投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般に公知の輸注法を使用することにより投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676 (1988)を参照されたい）。特定の患者に最適な投与量および処置レジメは、医療技術分野における当業者が、患者を、疾患の徴候についてモニタリングし、これに応じて、処置を調整することにより、たやすく決定しうる。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を、対象へと投与し、次いで、その後、再採血し（またはアフェレーシスを実施し）、本発明に従い、これに由来するＴ細胞を活性化させ、患者に、これらの活性化させ、拡大増殖させたＴ細胞を再輸注することが所望されうる。この工程は、数週間ごとに、複数回にわたり実行することができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血物から活性化させることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血物から活性化させることができる。理論に束縛されずに述べると、この複数回にわたる採血／複数回にわたる再輸注のプロトコールの使用は、ある特定のＴ細胞集団を選び出すのに用いられうる。別の実施形態では、放射線または化学療法を介する、患者のリンパ枯渇後に、対象組成物である活性化Ｔ細胞を投与することが所望されうる。
【０２６２】
本明細書で記載される組成物の投与は、エアゾール吸入、注射、内服、移入、植込み、または移植を含む、任意の好都合な形で実行することができる。本明細書で記載される組成物は、患者へと、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、リンパ節内投与、骨髄内投与、筋内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内投与することができる。一実施形態では、本発明のＴ細胞組成物を、患者へと、皮内注射または皮下注射により投与する。別の実施形態では、本発明のＴ細胞組成物を、ｉ．ｖ．注射により投与する。Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位へと、直接注射することができる。
【０２６３】
患者へと投与される、上記の処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエントの正確な性質と共に変動するであろう。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当技術分野で許容されている慣行に従い実施することができる。例えば、上記の処置用量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０4個〜１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞５×１０6個の範囲でありうる。例示的な用量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０4個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０5個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞３×１０5個、１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞１×１０6個、または１ｋｇ当たりのＣＡＲ＋細胞５×１０6個でありうる。したがって、適切な用量は、成人患者のために調整することもでき、小児患者のために調整することもできる。
【０２６４】
代替的に、哺乳動物（例えば、ヒト）へと投与される免疫エフェクター細胞の典型的な量は、例えば、細胞１００万〜１０００億個の範囲でありうるが、この例示的な範囲を下回るか、または上回る量も、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の宿主細胞の用量は、細胞約１００万〜約５００億個（例えば、細胞約５００万個、細胞約２５００万個、細胞約５億個、細胞約１０億個、細胞約５０億個、細胞約２００億個、細胞約３００億個、細胞約４００億個、または前出の値のうちのいずれか２つにより規定される範囲）、細胞約１０００万〜約１０００億個（例えば、細胞約２０００万個、細胞約３０００万個、細胞約４０００万個、細胞約６０００万個、細胞約７０００万個、細胞約８０００万個、細胞約９０００万個、細胞約１００億個、細胞約２５０億個、細胞約５００億個、細胞約７５０億個、細胞約９００億個、または前出の値のうちのいずれか２つにより規定される範囲）、細胞約１億個〜細胞約５００億個（例えば、細胞約１億２０００万個、細胞約２億５０００万個、細胞約３億５０００万個、細胞約４億５０００万個、細胞約６億５０００万個、細胞約８億個、細胞約９億個、細胞約３０億個、細胞約３００億個、細胞約４５０億個、または前出の値のうちのいずれか２つにより規定される範囲）でありうる。
【０２６５】
治療有効性または予防有効性は、処置された患者についての、定期的な評価によりモニタリングすることができる。数日間またはこれを超える反復投与のために、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、処置を反復する。しかし、他の投与量レジメンが有用な場合もあり、本発明の範囲内にある。所望の投与量は、組成物の単回のボーラス投与により送達することもでき、組成物の複数回のボーラス投与により送達することもでき、組成物の連続輸注投与により送達することもできる。
【０２６６】
開示される核酸配列、またはこれらの核酸配列を含むベクターを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物は、哺乳動物へと共投与されうる、１または複数のさらなる治療剤と共に投与することができる。「〜を共投与すること」とは、１もしくは複数のさらなる治療剤と、本発明の宿主細胞もしくは本発明のベクターを含む組成物とを、１もしくは複数のさらなる治療剤の効果を増強するのに十分に近接した時点において投与すること、またはこの逆を意味する。この点で、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞、または本明細書で記載されるベクターを含む組成物を、１または複数のさらなる治療剤と同時に投与することもでき、これを第１に投与し、１または複数のさらなる治療剤を、第２に投与することもでき、この逆にすることもできる。代替的に、開示される免疫エフェクター細胞、または本明細書で記載されるベクターを含む組成物と、１または複数のさらなる治療剤とは、同時に投与することもできる。
【０２６７】
本発明の宿主細胞および／または本発明のベクターを含む組成物中に含まれている（またはキット内に含まれている）か、またはこれらと共に共投与されるうる治療剤の例は、インターロイキン、サイトカイン、インターフェロン、アジュバント、および化学療法剤である。複数の実施形態では、さらなる治療剤は、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、増殖因子、およびｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体である、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１０のリガンドである。
【０２６８】
Ｂｃｌ−２阻害剤、ＳＴＡＴ３阻害剤、またはＳＴＡＴ５阻害剤もまた、組成物中に含まれているか、またはこれと共に共投与される（またはキット内に含まれている）。がん細胞は、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシスタンパク質を過剰発現する場合もあり、天然のアポトーシスメディエーターまたは薬理学的薬剤に対する、異常に高度な耐性を結果としてもたらす経路（すなわち、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３）の活性化を遷延させている場合もある。薬物療法の手法と、免疫療法の手法とを組み合わせて、１つを超えるアポトーシス経路を用いることは、腫瘍細胞死を増加させ、治療に対する耐性を減少させることが想定される。低分子阻害剤の使用は、腫瘍細胞内の、アポトーシス促進分子と、抗アポトーシス分子との均衡を、腫瘍細胞を、死へと感作するか、または腫瘍特異的Ｔ細胞との遭遇時における殺滅への耐性を減少させる程度に十分にシフトさせうる。Ｂｃｌ−２発現の上昇は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などの血液悪性腫瘍、および充実性腫瘍（すなわち、黒色腫、乳がん、および卵巣がん）において見出されている。ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ５の活性化の遷延は、ＡＭＬ、ＣＬＬ、慢性骨髄性白血病、大型顆粒リンパ球性白血病、および白血病細胞株において観察されている。Ｂｃｌ−２、ＳＴＡＴ３、またはＳＴＡＴ５をターゲティングする低分子阻害剤は、本発明の組成物中に含まれており、これと共に共投与され、かつ／またはこれと共に共培養されることが想定される。１つのｂｃｌ−２阻害剤は、ＡＢＴ−７３７である。この化合物は、これらのＢｃｌ−２ファミリータンパク質をターゲティングするが、Ａ１またはＭｃｌ−１はターゲティングしない、ＢＨ３模倣低分子阻害剤（ＳＭＩ）群の一部である。ＡＢＴ−７３７は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＢｃｌ−ｗに対するアフィニティーが、顕在的に大きいため、従来のＢＣＬ−２阻害剤とは異なる。いわゆるＢＨ３模倣薬物である、ＡＢＴ−１９９は、慢性リンパ球性白血病を伴う患者における、Ｂｃｌ−２タンパク質の機能を遮断するようにデザインされている。
【０２６９】
ＳＴＡＴ３阻害剤およびＳＴＡＴ５阻害剤は、Fagardet al., STAT3 inhibitors for cancer therapy, JAK-STAT, 2:1 (2013), e22882, DOI: 10.4161/jkst.22882およびFurqan, et al., Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:90 doi:10.1186/1756-8722-6-90において記載されている、ＳＴＡＴ３阻害剤およびＳＴＡＴ５阻害剤を含むがこれらに限定されない。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路エフェクターに加えて、負の調節因子の３つの主要なクラス：ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＩＡＳ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｔａｔｓ）、およびＰＴＰも存在する。チロシンホスファターゼは、ＪＡＫの活性を無効化する。これらの調節因子のうちで、最もよく特徴づけられているものは、マウスモスイートン遺伝子の産物である、ＳＨＰ−１である。ＳＨＰ−１は、２つのＳＨ２ドメインを含有し、リン酸化ＪＡＫまたはリン酸化受容体に結合して、これらの活性化シグナル伝達分子の脱リン酸化を容易としうる。ＣＤ４５など、他のチロシンホスファターゼは、受容体のサブセットを介して、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の調節において役割を果たすと考えられる。したがって、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、本開示の組成物のための薬物標的であることが想定される。
【０２７０】
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発泡剤は、シリコンエマルジョン（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）またはセスキオレイン酸（sesquoleate）ソルビタンを含む。
【０２７１】
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
【０２７２】
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０２７３】
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））などのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ商標）、ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
【０２７４】
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
【０２７５】
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリックスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしてもまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロースまたはトリエチルセルロースな��の可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である。
【０２７６】
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、本組成物中で使用することができる。
【０２７７】
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるのにも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐＨの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
【０２７８】
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース  粉末、デキストロース、デキストレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物を含む。
【０２７９】
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０２８０】
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、またはマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑化剤は、例えば、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １４５０、ＰＥＧ  ３３５０、およびＰＥＧ  ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
【０２８１】
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０２８２】
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
【０２８３】
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
【０２８４】
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔｗｅｅｎ  ６０またはＴｗｅｅｎ  ８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
【０２８５】
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組合せを含む。
【０２８６】
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０２８７】
キットおよび組成物
本開示の一態様は、本発明のＣＤ３３特異的ＣＡＲをコードするコード領域と、任意選択で、安全性の理由で組み入れられる遺伝子、例えば、ＨＥＲ１ｔまたはＨＥＲ１ｔ−１、およびこれらの機能的変異体、またはＣＤ２０またはＣＤ２０ｔ−１、およびこれらの機能的変異体とを含む第１のベクターを含む、キットおよび組成物に関する。これらのキットおよび組成物は、各々が異なるタンパク質またはタンパク質のサブセットをコードする、複数のベクターを含みうる。これらのベクターは、ウイルスベクターの場合もあり、非ウイルスベクターの場合もあり、エピソームベクターの場合もあり、組込みベクターの場合もある。一部の実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
【０２８８】
一部の実施形態では、キットおよび組成物は、ベクターだけでなく、また、細胞、およびインターロイキン、サイトカイン、インターロイキン、および化学療法剤、アジュバント、保湿剤、または乳化剤などの薬剤も含む。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一実施形態では、キットおよび組成物は、ＩＬ−２を含む。一実施形態では、キットおよび組成物は、ＩＬ−２１を含む。一実施形態では、キットおよび組成物は、Ｂｃｌ−２阻害剤、ＳＴＡＴ３阻害剤、またはＳＴＡＴ５阻害剤を含む。複数の実施形態では、キットは、ＩＬ−１５、またはｍｂＩＬ−１５を含む。
【０２８９】
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法による使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されている。
【０２９０】
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
【０２９１】
例えば、容器は、ＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、本明細書で記載されるＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）と、任意選択で、加えて、本明細書で開示されるサイトカインおよび／または化学療法剤とを含む。このようなキットは、任意選択で、本明細書で記載される方法におけるその使用に関する記載または表示または指示書の内容確認を含む。
【０２９２】
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組み入れられると予想される。
【０２９３】
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
【０２９４】
配列
表２には、本明細書で提示される実施形態に含まれる、ある特定の配列についての代表的なリストを提示する。
【０２９５】
【表２−１】
2019517267.tif 000003
【０２９６】
【表２−２】
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【０２９７】
【表２−３】
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【０２９８】
【表２−４】
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【０２９９】
【表２−５】
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【０３００】
【表２−６】
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【０３０１】
【表２−７】
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【０３０２】
【表２−８】
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【０３０３】
【表２−９】
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【０３０４】
【表２−１０】
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【０３０５】
【表２−１１】
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【０３０６】
【表２−１２】
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【０３０７】
【表２−１３】
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【０３０８】
【表２−１４】
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【０３０９】
【表２−１５】
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【０３１０】
【表２−１６】
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【０３１１】
【表２−１７】
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【実施例】
【０３１２】
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許請求の範囲を限定しようとするものではない。
【０３１３】
[実施例１]
レンチウイルスベクターを介する、ＣＤ３３  ＣＡＲの送達：ＣＤ３３  ＣＡＲレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１由来のベクター骨格に基づき構築した。ＨＥＲ１ｔ遺伝子を、ＣＤ３３  ＣＡＲへと、３’末端において、インフレームの、自己切断型トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａペプチドペプチド（Ｔ２Ａ）を介して遺伝子融合させた。いずれの遺伝子も、下記で記載されるｐＦＵＧＷレンチウイルスプラスミド骨格へとクローニングした。
【０３１４】
ＣＤ３３  ＣＡＲレンチウイルスのために、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）の糖タンパク質）を、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の代替物として使用する結果として、ベクター安定性の改善、標的細胞への指向性、および形質導入の効率をもたらした（Cronin, J., Zhang, X. & Reiser, J., Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping, Curr Gene Ther, 5(4):387-98 (2005)）。
【０３１５】
産生時に、ＣＤ３３  ＣＡＲウイルス粒子を、アセンブルし、トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面から出芽させた。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ｐＭＮＤ−ＶＳＶＧヘルパープラスミドによりもたらし、ベクターコアおよび酵素タンパク質は、ｐΔ８．９  ｓｏ  （ＧａｇＰｏｌ）ヘルパープラスミドによりもたらし、ＲＮＡゲノムの、ウイルス粒子への、効率的な輸送およびパッケージングに必要とされるＲｅｖタンパク質は、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖプラスミドによりもたらした。Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、およびＴａｔを含む、他の全てのＨＩＶ−１アクセサリータンパク質を、ＣＤ３３  ＣＡＲベクターから欠失させた。
【０３１６】
ｐＦＵＧＷレンチウイルスベクター骨格は、ＳＩＮレンチウイルスベクター骨格である。
【０３１７】
調節エレメント
ＬＶ−ＣＤ３３  ＣＡＲベクターは、トランス遺伝子の発現を駆動する、ヒト伸長因子１アルファ１（ＥＦ１Ａ１）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリＡ配列、ならびにＫｏｚａｋリボソーム開始配列を含有した。ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のほか、ｐＦＵＧＷプラスミドに由来するＬＴＲ配列も使用した。複製起点は、ｐＵＣ１９プラスミドに基づいた。図２は、ＣＤ３３  ＣＡＲのレンチウイルスベクターマップである。
【０３１８】
[実施例２]
ＣＤ３３  ＣＡＲベクターを作り出す方法
ＬＶ−ＣＤ３３  ＣＡＲベクターを、３つの供給源からアセンブルした：
（１）以下を、既に構築されたベクターから得、制限酵素であるＰａｃＩおよびＢｌｐＩで消化した：
（ａ）ｐＦＵＧＷ骨格構成要素
（ｂ）ヒト伸長因子１アルファ１プロモーター（ＥＦ１Ａ１）プロモーター、およびＧＭ−ＣＳＦＲアルファシグナルペプチドを伴う抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖを駆動するエンハンサー
（ｃ）ＣＤ８αヒンジ領域および膜貫通領域
（２）４−１ＢＢシグナル伝達ドメインモジュールは、合成遺伝子として得た；
（３）ＣＤ３ζ、Ｔ２Ａ転写リンカー、ＧＭ−ＣＳＦＲアルファシグナルペプチド、ＨＥＲ１ｔ枯渇マーカー、ウシ成長ホルモンポリＡ、およびフランキングのクローニング部位を含有する領域を、ＰＣＲにより増幅した。
【０３１９】
各カセットへと施された相同性領域を使用して、３つのＤＮＡカセットを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアセンブリー反応において、併せてアニーリングした。結果として得られるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムに対して逆方向で、目的のトランス遺伝子（ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ）を含有した。Ｓｔｂｌ４大腸菌（E. coli）株への形質転換の後、陽性コロニーを、コロニーＰＣＲにより同定し、３つのインサート片を、サンガーシーケンシングにより検証した。全プラスミド配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより検証した。
【０３２０】
４つのプラスミド、ＬＶ−ＣＤ３３  ＣＡＲベクタープラスミド、ならびに３つのヘルパープラスミド、ｐΔ８．９  ｓｏ  （ＧａｇＰｏｌ）；ｐＭＮＤ−ＶＳＶＧ；およびｐＲＳＶ−Ｒｅｖのリン酸カルシウム沈殿トランスフェクションを使用して、１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内で、ベクターを作出した。
【０３２１】
プラスミドトランスフェクションの約１８時間後、完全培地交換を、ベンゾナーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）を含有する培養培地により実行した。培地交換の約２４時間後、培養物上清を含有するベクターを採取し、これに、採取物１とラベル付けした。細胞に、未使用の培地を再フィードし、インキュベーターへと戻した。フィルターを使用して、採取物１の上清を清澄化させ、２〜８℃の間で、一晩にわたり保存した。
【０３２２】
翌日、細胞を、顕微鏡により観察し、ベクターを含有する上清を、前出と同様に濾過される採取物２として、再度採取した。採取物１の上清を、濾過された採取物２の上清と組み合わせ、プールされた上清を、０．４５μｍのフィルターを通して、さらに清澄化させた。アニオン交換膜クロマトグラフィーを使用して、清澄化させたベクター採取物を、精製し、中空糸デバイスを使用して、選択した培地へと、濃縮および透析濾過した。精製されたＬＶ−ＣＤ３３  ＣＡＲベクターを充填し、＜−８０℃で凍結させて保存した。
【０３２３】
[実施例３]
送達系の効率
健常ドナーに由来するＴ細胞への、ＬＶ−ＣＤ３３  ＣＡＲレンチウイルスベクターによる形質導入は、典型的に、形質導入の１２〜１４日後において、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔを安定的に共発現する、２５〜５０％の細胞を結果としてもたらした。図４は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の作出のための、典型的なレンチウイルスによる形質導入の概略について記載する。図５は、レンチウイルスによる形質導入の１２日後における、健常ドナーのＴ細胞１個からの、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔの発現についての代表的なデータを示す。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して、精製ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を活性化させてから、感染多重度（ＭＯＩ）を５として、ＣＤ３３  ＣＡＲレンチウイルスベクターによる形質導入を行った。細胞は、ＩＬ−２を含有する培地中で、形質導入後１２日間にわたり増殖させた。形質導入の１２日後に、フローサイトメトリー解析を実施して、それぞれ、プロテインＬおよびセツキシマブｍＡｂにより測定される、ＣＤ３３  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔの発現を評価した。
【０３２４】
図６は、ＣＤ３３  ＣＡＲの、レンチウイルスにより形質導入された細胞からの発現を、ウェスタンブロットにより確認する。拡大増殖させた、非形質導入ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞またはレンチウイルス形質導入ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を培養し、プロテアーゼ阻害剤を伴うＲＩＰＡ緩衝液を使用して、細胞溶解物を作出した。また、還元条件を伴うゲルへとロードされたタンパク質の量を標準化ように、ドナーにおいて作出された試料に対して、ＢＣＡアッセイも実施した。タンパク質の転写後、膜をブロッキングし、次いで、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ζ抗体（クローン８Ｄ３）に続き、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ検出抗体でプロービングした。バンドは、化学発光により検出し、デジタルイメージングシステムにより捕捉した。１６ｋＤａのバンドが、内因的に発現したＣＤ３ζを表すのに対し、６０ｋＤａのバンドは、ＣＤ３ζシグナル伝達部分を発現するＣＤ３３  ＣＡＲを表す。ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞だけが、内因性のＣＤ３ζバンドに加えて、６０ｋＤａのバンドを示すのに対し、非形質導入細胞およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、内因性ＣＤ３ζだけを提示する。
【０３２５】
図７は、レンチウイルスベクターによる形質導入後における培養物中の、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける増殖を示す。出発細胞集団は、２．５×１０5個であり、示されるデータは、４例の独立のＴ細胞ドナーによる平均値±ＳＥＭである。ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、効率的に形質導入され、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、臨床的に妥当な用量が達成されたことを意味するレベルへと拡大増殖された。
【０３２６】
[実施例４]
遺伝子素材の組込み
送達された遺伝子素材は、プロウイルスゲノムの形態で組み込まれた。レンチウイルスによる形質導入を使用して、Ｔ細胞内に導入されたトランス遺伝子は、研究期間にわたり安定的であった。図８は、レンチウイルスによる形質導入後における、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞についてのコピー数評価である。５のＭＯＩを使用して、ヒトＳＵＰＴ１  Ｔ細胞または健常なドナー２７０１６９（Ｄ２７０１６９）に由来するＴ細胞への、レンチウイルスによる形質導入後において、宿主ゲノムへと組み込まれた遺伝子コピーの数を決定するのに、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いた。形質導入の少なくとも１４日間後において、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を得た。ｄｄＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のｄｄＰＣＲシステム（ＱＸ２００ＴＭ  ＡｕｔｏＤＧ  ｄｄＰＣＲシステム）を、ＣＤ３３  ＣＡＲを検出するための、Ｔａｑｍａｎベースのプライマーおよびプローブセットと共に使用して準備した。あらゆる細胞は、２コピーずつのＲＮａｓｅＰ遺伝子を有するという仮定に基づき、ＲＮａｓｅＰを、コピー数変異体（ＣＮＶ）を評価するための、標準化基準遺伝子として使用した。ＳＵＰＴ１／ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞上およびＤ２７０１６９／ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞上のＣＤ３３  ＣＡＲの発現は、フローサイトメトリーにより確認され、それぞれ、約８０％および約３０％（データは示さない）であると報告された。Ｄ２７０１６９／ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞について、アッセイにおいて測定された試料（「測定」と称する）は、混合集団に由来するが、さらなる計算を実施して、ＣＡＲを発現するＴ細胞の、インサートのコピー数（「逆算」と称する）を決定した。示されるデータは、２つの実験による、細胞１個当たりの平均値コピー数±ＳＤである。
【０３２７】
[実施例５]
遺伝子導入系の有効性について評価する、動物モデルおよび培養細胞モデル
導入された遺伝子の発現により測定される、レンチウイルス媒介性遺伝子導入の効率を、形質導入細胞のフローサイトメトリーにより査定した（図５）。形質導入Ｔ細胞の拡大増殖は、妥当な用量を達成するように、形質導入後１２〜１４日間にわたり、ｅｘ  ｖｉｖｏの培養物培地中で実行した（図７）。
【０３２８】
前臨床解析において、レンチウイルスによる形質導入（図８）を伴うＴ細胞表面上で観察されるＣＤ３３  ＣＡＲのレベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、異なるＣＤ３３陽性標的腫瘍細胞株を、効率的かつ特異的に消失させる（図９）ほか、ＣＤ３３陽性腫瘍を保有するマウスの生存を、対照群に対して、統計学的に有意なレベルまで延長する（図１２）のに十分であった。また、さらなる支持データについては、図５および６も参照されたい。
【０３２９】
ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能的な能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルの両方において調べた。
【０３３０】
ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞株のほか、表面上にヒトＣＤ３３を発現するように形質導入されたマウスＥＬ４細胞株に対する細胞傷害作用、およびＣＤ３３陽性標的細胞との共培養時における、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αサイトカインの分泌を含んだ。ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、セツキシマブの投与により、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とするように、ＨＥＲ１ｔタンパク質を共発現した。ＡＤＣＣにより、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を消失させるセツキシマブの能力についてもまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて評価した。
【０３３１】
ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的細胞に対して、用量依存的に、特異的に細胞傷害性であった（図９）。エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１０：１（Ｂ）とした細胞傷害作用ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、およびＥ：Ｔ比を１：１（Ｂ）とした細胞傷害作用ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイにより測定した。標的細胞に対する、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞による用量依存的細胞傷害作用を、１０：１のＥ：Ｔ比と１：１比のＥ：Ｔ比との間で観察したが、標的細胞が、表面上で、ＣＤ３３を発現した場合に限り、有意な細胞傷害作用が観察された。非形質導入Ｔ細胞は、任意の被験標的細胞に対する、有意な細胞傷害作用を示さなかった。グラフに示されるデータは、４例の異なるドナーに由来する平均値±ＳＥＭであり、**ｐ値＜０．０１および***ｐ値＜０．００１である。
【０３３２】
ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、様々な標的細胞株との共培養時に、非形質導入Ｔ細胞と比較して、高レベルの、多様なサイトカインを、特異的に分泌した（図１０）。ＣＤ３３を発現する、多様な標的ＡＭＬ細胞株との共培養後において、非形質導入Ｔ細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞からのサイトカイン産生についての評価。マウスＥＬ４細胞株を、ヒトＣＤ３３発現についての陰性対照として使用した。Ｔ細胞を、共に、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１０：１として、一晩にわたり共培養し、培養物上清を、ＱＢｅａｄｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用する、マルチプレックスサイトカイン解析のために回収した。ヒトＩＦＮγ、ヒトＩＬ−２、およびヒトＴＮＦ分泌の、培養培地への発現についてのマルチプレックス解析をアッセイした。ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＣＤ３３を発現する標的細胞との共培養後に、同じ標的細胞を伴う、非形質導入Ｔ細胞による基本発現レベルと比較した場合に、高レベルのサイトカインである、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦが検出された。プロットされた値は、被験試料についての平均値±ＳＤを、二連で表す。
【０３３３】
セツキシマブは、表面上で、ＨＥＲ１ｔを発現するＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、用量依存的に消失させることが可能であった（図１１）。ＡＤＣＣは、Ｅ：Ｔ比を５：１とする、精製エフェクターＮＫ細胞と共に、２４時間にわたり共インキュベートされたＰＫＨ２６標識化標的細胞を使用する、７−ＡＡＤの取込みについてのフローサイトメトリー解析により決定した。セツキシマブによる、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞に対する、特異的な用量依存的ＡＤＣＣを観察した。プロットされた値は、被験試料についての平均値±ＳＤを、二連で表す。
【０３３４】
また、生物発光イメージングにより腫瘍負荷をモニタリングするのに、ｆＬＵＣを発現するように形質導入されたＡＭＬ細胞株であるＭＯＬＭ−１３（ＭＯＬＭ−１３／ｆＬＵＣ）を使用して、腫瘍負荷を特異的に低減する、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の能力を、免疫不全ＮＳＧにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏの異種移植モデル（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＮＯＤｓｃｉｄガンマ）マウスにおいても調べた。研究デザインの詳細については、表２に描示する。ＭＯＬＭ−１３／ｆＬＵＣ腫瘍を保有するＮＳＧマウスにおける、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与は、生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞と同じ健常Ｔ細胞ドナーから作出された、非特異的ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞からなる対照処置群と比較した場合に、統計学的に有意なレベル（Ｐ＜０．００１）へと、腫瘍負荷を低減し、生存平均値を延長した。ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍を保有するマウスのｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増殖した（図１４）。注射の前の、ＮＳＧマウスにおける、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞についてのフローサイトメトリー解析、および処置されたマウスの多様な組織内の、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の検出を実行して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の存続および拡大増殖を記録した（図１４Ａ）。ＣＤ３３  ＣＡＲレンチウイルスにより、健常ドナーＴ細胞に形質導入し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させた。処置のための、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の注射の前に、フローサイトメトリー解析を実施して、ＣＤ３３  ＣＡＲの発現レベルを評価した。示される集団に、ＦＳＣ／ＳＳＣ／生／ＣＤ３＋細胞について、ゲートをかけた（図１４Ｂ）。１８日目（尾静脈への全身ＩＶ注射による、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞注射の１０日後）に、フローサイトメトリー解析を、ＭＯＬＭ−１３腫瘍を保有する、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ処置マウスから回収された、血液試料、骨髄試料、および脾臓試料に対して実施して、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在を検出した。集団に、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ｈＣＤ４５／ｈＣＤ３の発現に基づきゲートをかけた、１つの代表的なマウスに由来するデータ。
【０３３５】
０日目において、免疫不全ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬＵＣ）遺伝子を発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞株（ＭＯＬＭ−１３／ｆＬＵＣ）５×１０5個を、静脈内（ＩＶ）注射した。７日目に、腫瘍を保有するマウスを、ＩＶＩＳイメージングを介する生物発光の発現により確認し、次いで、様々な処置群へと無作為化した。８日目に、マウスを、ＩＶ注射を介する生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞（マウス１匹当たりの全Ｔ細胞１０7個）、細胞タグを伴わないか、もしくはＨＥＲ１ｔ細胞タグを伴うＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（マウス１匹当たりのＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞１０7個）、またはＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（マウス１匹当たりのＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞１０7個）により処置した。加えて、１５日目に、別の群のマウスに、ＨＥＲ１ｔ細胞タグを伴うＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（マウス１匹当たりのＣＤ３３  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞１０7個）の２回目の投与を施した。全腫瘍負荷を、生物発光イメージングを使用するｆＬＵＣ発現により、研究の経過にわたり査定した。様々な処置群による生存曲線を、図１２に示す。生理食塩液、非形質導入Ｔ細胞、およびＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるマウスの生存時間中央値は、１５日間であった。細胞タグを含有しないＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスも、生存を延長したが、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（投与１または２回）で処置された全てのマウスは、最長２９日間の完全な生存を示した。
【０３３６】
腹側および背側から見た平均フラックス値を、様々な処置群について、図１３にプロットする。示される値は、光子／秒として表した全フラックス値であり、各群について、平均±ＳＥＭを示した。実線の上向き矢印は、各群についての、ＣＡＲ−Ｔの投与日を指し示し、１５日目における、点線の上向き矢印は、投与２回群についての、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔの２回目の投与を指し示す。
【０３３７】
【表３】
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【０３３８】
[実施例６]
サイトカイン解析：マウスに由来する血漿試料を、プロトコール内の特異的時点、またはマウスが瀕死となり、人道的理由で安楽死させられた時点において回収した。血漿を得るために、血液を、回収用ＥＤＴＡ試験管内に回収し、次いで、室温、５，０００×ｇで、１５分間にわたりスピンし、次いで、結果として得られる血漿を、きれいな回収用試験管へと導入した。血漿を凍結させ、アッセイまで、−８０℃で保存した。ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（登録商標）ヒトサイトカイン／ケモカイン／増殖因子パネル１キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、以下の解析物：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エオタキシン、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＲＯアルファ（ＣＸＣＬ１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン（ＩＬ）−１受容体アルファ（ＩＬ−１ＲＡ）、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０；ＣＸＣＬ１０としてもまた公知である）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１；ＣＣＬ２として公知である）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ−１アルファ；ＣＣＬ３としてもまた公知である）、ＭＩＰ−１ベータ（ＣＣＬ４としてもまた公知である）、ベータ−神経増殖因子（ＮＧＦベータ）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５としてもまた公知のＲｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、胎盤増殖因子１（ＰＩＧＦ−１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質由来因子１アルファ（ＣＸＣＬ１２アルファとしてもまた公知のＳＤＦ−１アルファ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、ＴＮＦベータ（リンホトキシンアルファとしてもまた公知である）、血管内皮増殖因子アルファ（ＶＥＧＦ−Ａ）、および血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）のマルチプレックス検出のための、４５プレックスの磁気ビーズベースのキットである。アッセイは、製造元の特殊なプロトコールに従い実施した。データは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を稼働するＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）２００測定器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で収集した。
【０３３９】
１１日目に、マウスから採取された血漿を使用して、ヒトサイトカインおよびヒト増殖因子の発現について評価した。図２２Ａを参照されたい。ＭＯＬＭ−１３およびＮＳＧマウスへと導入されるＴ細胞は、ヒト由来であるので、ヒトサイトカインの測定は、腫瘍細胞に対して作用するＣＡＲ−Ｔ細胞の作用機構への詳細について、さらに検討することを可能とした。生理食塩液による処置だけを施されたＭＯＬＭ−１３腫瘍保有マウスでは、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ１ベータ（データは示さない）のほか、他のいくつかの増殖因子など、一部のヒト全身サイトカインが検出されたが、ＩＦＮγおよびＴＮＦαなどのサイトカインのレベルは、検出範囲を下回った（図２２Ａ）。非形質導入Ｔ細胞で処置されたＭＯＬＭ−１３腫瘍保有マウスもまた、生理食塩液だけにより処置された群と比較して同様の、サイトカインおよび増殖因子の発現パターンを示し続けた。非形質導入Ｔ細胞群において見られたサイトカインおよび増殖因子のレベルは、このマウスモデル系における、ヒトＴ細胞と腫瘍細胞との混合物によるベースライン値をもたらす。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞が、細胞タグを共発現したのかどうかにかかわらず）によるサイトカイン発現データの解析は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、およびＩＰ−１０に加えて、著明なレベルのＩＦＮγおよびＴＮＦの産生を示した。これに対し、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＭＯＬＭ−１３腫瘍保有マウスへの投与は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１８などのサイトカインについて、生理食塩液だけまたは非形質導入Ｔ細胞のマウス群と比較して、わずかなレベルの上昇を示したが、これらのサイトカインの発現レベルは、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（細胞タグを伴わない）またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（細胞タグを伴う）またはＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（細胞タグを伴う；投与２回）を投与されたマウスにおいて検出される、同じサイトカインのレベルと比較した場合、それほど上昇しなかった。
【０３４０】
血液試料は、腫瘍細胞のほか、養子導入Ｔ細胞の存在について、フローサイトメトリーにより査定する研究の、指定された時点において採取した。図２２Ｂにおいて示される通り、１６日目に、マウスの末梢血中では、ＭＯＬＭ−１３／ｆＬＵＣ細胞の存在を検出することができた。ＭＯＬＭ−１３細胞内の、ＣＤ３３抗原の喪失の過小評価または潜在的可能性を回避するために、ＣＤ１２３抗体を用いて、腫瘍細胞を同定した。生理食塩液だけ、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスから得られた末梢血試料中では、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞が検出された。加えて、非形質導入Ｔ細胞またはＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞を施されたマウスからは、導入されたＴ細胞が、血液中で、１６日目および血液についての細胞解析を開始した１１日目という早期に検出された。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスに由来する血液は、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞が、ほとんど存在しない〜全く存在しない一方で、Ｔ細胞集団は、明らかに存在することを示した。
【０３４１】
図２２Ｃは、さらなるＡＭＬ腫瘍細胞株（ＴＨＰ１およびＨＬ６０）に対する細胞傷害活性を裏付ける。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、リダイレクトされた細胞傷害性機能についてのさらなる証拠は、ＣＤ３３腫瘍細胞との共培養時における、免疫エフェクター細胞によるサイトカイン発現を査定することによりもたらされた。いくつかのＣＤ３３発現腫瘍細胞株を、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞との共培養後における、ＩＦＮγ、ＴＮＦ（また、ＴＮＦαとも称する）、およびＩＬ−２の発現の誘導について評価した。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＣＤ３３発現腫瘍細胞との共培養は、同じドナーに由来する非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、およびＩＬ−２の発現の顕著な増加を引き起こした（図１０）。さらに、腫瘍標的の陰性対照として用いられた親ＥＬ４細胞株からは、サイトカインの発現が検出されなかった。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を、標的特異性についてのさらなる確認として実施した。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ３３を発現するＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞、ＴＨＰ−１腫瘍細胞、またはＨＬ−６０腫瘍細胞との、一晩にわたる共培養の後において、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の両方の発現を、細胞レベルで裏付けたのに対し、マウスＥＬ４細胞との共培養は、Ｔ細胞だけにより見られるレベルを上回る、著明なサイトカイン発現を示さなかった（図２３Ｅ）。
【０３４２】
ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、再発性ＡＭＬ疾患を伴うＡＭＬ患者（ドナーＥ２６１）から得られた細胞から作出した。略述すると、ＡＭＬドナーに由来する凍結保存ＰＢＭＣを融解させ、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して、Ｔ細胞を選択し拡大増殖させた。Ｔ細胞に、ＣＤ３３−ＣＡＲ  ＬＶ粒子により形質導入し、Ｔ細胞を、培養物中で拡大増殖させた。この融解ＰＭＢＣ試料の特徴付けから、このドナーからの場合、ＰＢＭＣ試料中に存在するＴ細胞は低頻度であり、主にＣＤ３３＋細胞からなることが明らかとなった（図２３Ａ）。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を作出する、ＬＶによる形質導入のために、Ｔ細胞を、単離し、活性化させ、拡大増殖させた。Ｔ細胞単離後における残りの細胞は、ＣＤ３３＋であり（図Ｅ−Ｂ）、サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の使用により、培養物中で維持した。このＡＭＬドナーについて、Ｔ細胞のうちの約４１％は、ＬＶによる形質導入後の、１２日間にわたる培養の後において評価される通り、細胞表面上で、ＣＤ３３−ＣＡＲを発現した（図２３Ｃ）。細胞傷害活性は、このドナーに由来するＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＭＯＬＭ−１３腫瘍細胞または患者自身のＣＤ３３発現腫瘍細胞との、フローサイトメトリーベースの共培養アッセイにおいて裏付けた。残りの細胞集団の、査定した時点（０日目および３日目）における、染色による、細胞上の、ＣＤ３（Ｔ細胞）およびＣＤ３３（腫瘍）の発現についての評価によれば、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞との共培養だけが、ＣＤ３３発現腫瘍細胞を消失させることが可能であったのに対し、非形質導入（ＵＮＴ）Ｔ細胞を伴う共培養設定では、細胞殺滅が観察されなかった（図２３Ｄ）。
【０３４３】
加えて、細胞内サイトカイン染色を使用するフローサイトメトリーにより評価される通り、ＡＭＬドナーから作出されたＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の発現も誘導した。細胞内サイトカイン染色は、ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＡＭＬドナーＥ２６１に由来する）の、表示の腫瘍細胞との共培養の、１８時間後において実施した。Ｔ細胞は、細胞表面染色し、次いで、固定／透過化に続き、サイトカインであるＩＦＮγおよびＩＬ−２について染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣ／生／ＣＤ３  Ｔ細胞に基づき、細胞にゲートをかけた。ＣＤ３３−ＣＡＲ−Ｔ細胞独またはマウスＥＬ４腫瘍細胞との共培養が、ＩＦＮγまたはＩＬ−２の発現を示さなかったのに対し、ＭＯＬＭ−１３または特定のドナー細胞に由来する腫瘍細胞との共培養後においては、いずれのサイトカインの発現の増大も観察された（図２３Ｅ）。加えて、ＣＤ３３−ＣＡＲを発現する細胞からのサイトカイン発現が、特異的に誘導されたのに対し、ＣＡＲを発現しないＴ細胞は、サイトカインの発現を示さなかった。
【０３４４】
[実施例７]
多様なシグナル伝達ドメインを伴うレンチウイルスＣＤ３３  ＣＡＲを構築し、発現について調べた。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインだけを伴うＣＤ３３  ＣＡＲ、ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ（ＣＤ２８ｚと称する）シグナル伝達ドメインを伴うＣＤ３３  ＣＡＲ、またはｗｉｔｈＨＥＲ１ｔの共発現を伴うＣＤ２８−ＣＤ３ｚドメインを伴うＣＤ３３  ＣＡＲを伴うレンチウイルス粒子を、図４に概括された概略図に従い、あらかじめ活性化させたヒトＴ細胞へと形質導入した。フローサイトメトリー解析は、形質導入の１２〜１４日後に、Ｔ細胞について実施した。ＣＤ３３  ＣＡＲの発現は、プロテインＬ染色を介して検出し、ＨＥＲ１ｔは、セツキシマブ染色を介して検出した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。
【０３４５】
その標的を認識するＣＤ３３  ＣＡＲ（異なるシグナル伝達ドメインを伴う）の特異性を裏付けるために、共培養アッセイを、多様な腫瘍細胞株に対して実施した。被験細胞株上のＣＤ３３の発現を表示した（図１６Ａ）。Ｋ５６２細胞は、ＣＤ３３を内因的に発現するので、Ｋ５６２／ＣＤ１２３において、発現を観察し、Ｋ５６２／ＣＤ３３細胞株には、ＣＤ３３を過剰発現するように形質導入したことに留意されたい。ＥＬ４は、ヒトＣＤ３３を発現しないマウス細胞株である。細胞傷害作用は、ＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害作用アッセイ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、多様な腫瘍標的細胞株を標識化し、次いで、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）を、標識化腫瘍細胞と共に、エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）を、２０：１の比として共培養することにより決定した。２時間後に、アッセイに由来する上清を採取し、ＤＥＬＦＩＡユーロピウムアッセイを添加することにより現像し、時間分解型蛍光測定器上で読み取った（図１６Ｂ）。２０：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を用いる、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の、ＣＤ３３を発現する腫瘍細胞との共培養、および１８時間にわたるインキュベーションによりロバストなＩＦＮγ産生を得、培養物上清を採取し、製造元の指示書に従い、ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮγの産生についてアッセイした。非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）は、共培養物中で、ＩＦＮγが、ほとんど検出されない〜全く検出されなかった（図１６Ｃ）。
【０３４６】
ＡＭＬを伴うと診断された患者の、凍結保存ＰＢＭＣ試料に由来するＴ細胞への、レンチウイルスによる形質導入は、健常ドナーのＴ細胞に由来するＴ細胞への形質導入のために、上記で概括された工程と同様に実施した。略述すると、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに続き、ＭＯＩを変動させる、レンチウイルスによる、ＣＤ３３  ＣＡＲ−４１ＢＢｚ−Ｔ２Ａ−ＨＥＲ１ｔの形質導入を使用して、ＰＢＭＣ試料から単離されたＴ細胞を活性化させた。形質導入されたＴ細胞培養物を、１４日間の培養期間にわたり拡大増殖させた。プロテインＬの染色により決定されるＣＡＲの発現は、培養物拡大増殖期間全体にわたり査定した。ＣＤ３３  ＣＡＲのレベルは、Ｔ細胞表面上で観察した（データは示さない）。ドナーの自家ＣＤ３３発現腫瘍細胞のほか、ＡＭＬ腫瘍細胞株を用いて、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害活性を裏付けた。１つの場合には、低Ｅ：Ｔ比を使用して、共培養物を準備した。様々な時点において、フローサイトメトリー解析を実施して、Ｔ細胞の存在および頻度を決定し、多様な時点において、共培養物中に存在するＣＤ３３発現腫瘍細胞を評価した。ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の、自家ＣＤ３３発現腫瘍細胞との共培養は、ＣＤ３３＋腫瘍細胞の減少または非存在により決定される通り、細胞傷害活性を裏付けた（データは示さない）。同様の知見は、ＭＯＬＭ−１３など、公知の被験ＡＭＬ腫瘍細胞株によっても観察された。
【０３４７】
[実施例８]
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙによるＣＤ３３  ＣＡＲ
様々なＣＤ３３  ＣＡＲ構築物を、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ−トランスポゾン系において、構築および作出した（図３）。例えば、ＣＤ３３−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ＴＭ−ＣＤ３ｚ構築物を、多様なＥＦ１ａプロモーター長（短、中、および長）で作り出した。また、ＨＥＲ１ｔ細胞タグを伴うＣＤ３３  ＣＡＲ構築物も作りだし、調べた。
【０３４８】
ゲノムへの構築物の組込みを媒介するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙベースのトランスポゾン系を使用して、ＣＡＲ構築物を、細胞へと、電気穿孔を介して導入した。０日目に、ＰＢＭＣ２０００万個を、１５μｇのトランスポゾンおよび５μｇのトランスポザーゼ（ｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１）と混合された１００μＬのＡｍａｘａ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（型番：ＶＰＡ−１００２；  Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁させ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｕ−１４を使用して、電気穿孔した。翌日（１日目）、細胞をカウントし、セツキシマブを使用する、プロテインＬ染色およびＨＥＲ１ｔ染色により、ＣＡＲの発現について表面染色した。細胞を、比を１：１とする、γ照射（１００Ｇｙ）またはマイトマイシンＣ処理されたＡａＰＣで刺激した。使用されるＡａＰＣ細胞は、ＣＤ３３の内因的発現を伴う、ＣＤ６４−ＣＤ８６−４１ＢＢＬ−ＣＤ１９−ｍｂＩＬ−１５／ＩＬ１５Ｒａ−ＲＯＲ１抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、比を１：１とするＡａＰＣで刺激した。培養物に、刺激の第１のラウンドには、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）だけを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充した。Ｔ細胞培養物は、典型的に、７日間にわたり続いた各刺激サイクルの終了時において表現型解析にかけた。プロテインＬ染色を用いて、またはマルチパラメータフローサイトメトリーにより検出される、組換えＣＤ３３／Ｆｃタンパク質染色により、培養物を、ＣＡＲ発現について、表現型解析にかけた。培養物はまた、ＮＫ細胞（ＣＤ３−  ＣＤ５６＋集団として規定される）の増殖についても、緊密にモニタリングし、百分率が、全細胞集団のうちの１０％を超えたら、製造元の指示書に従い、ＣＤ５６についての磁気ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよび／またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物から除去した。フローサイトメトリーを使用して、ＡａＰＣによる刺激後における、複数のドナーＰＢＭＣからの、ＣＤ３３  ＣＡＲの発現について査定した。
【０３４９】
その標的を認識するＣＤ３３  ＣＡＲ（様々なシグナル伝達ドメインを伴う）の特異性を裏付けるために、共培養アッセイを、多様な腫瘍細胞株に対して実施した。Ｋ５６２細胞は、ＣＤ３３を内因的に発現し、ＥＬ４は、ヒトＣＤ３３を発現しないマウス細胞株であることに留意されたい。細胞傷害作用は、ＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害作用アッセイ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、多様な腫瘍標的細胞株を標識化し、次いで、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）を、標識化腫瘍細胞と共に、エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）を、１０：１の比とし、Ｅ：Ｔ比を２：１として共培養することにより決定した。２時間後に、アッセイに由来する上清を採取し、ＤＥＬＦＩＡユーロピウムアッセイを添加することにより現像し、時間分解型蛍光測定器上で読み取った（図１７）。
【０３５０】
脱顆粒化アッセイ、およびＩＦＮγによる細胞内サイトカイン染色
リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）としてもまた公知のＣＤ１０７ａは、細胞の後期エンドソーム−リソソーム内では、構成的に発現するが、脱顆粒化細胞の細胞表面上では、一過性に発現する。ＣＤ３３の発現を伴うかまたは伴わない、異なる標的細胞を認識するＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔの能力を、細胞１個当たりの細胞内ＩＦＮγの共時的な検出により評価する、脱顆粒化アッセイを確立した。略述すると、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、９６ウェルプレート内のＥ：Ｔ比を１０：１として、標的細胞と共に共培養した。標的細胞は、Ｋ５６２／ＣＤ１９（内因性のＣＤ３３発現を有する）、ＴＨＰ−１およびＥＬ−４（マウス細胞株）を含んだ。共培養の開始時に、蛍光コンジュゲートＣＤ１０７ａ抗体または蛍光コンジュゲートアイソタイプ抗体を、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（モネンシンおよびブレフェルジンを含有する；１倍濃度；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に添加し、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を、プレート内でペレット化させ、細胞表面抗原を、ＣＡＲ発現およびＴ細胞マーカーの検出のために染色した。細胞表面染色の後、細胞はまた、製造元の指示書に従い、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によっても染色し、次いで、洗浄するのに続き、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による固定を行った。試料を固定した後で、細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で洗浄し、次いで、蛍光コンジュゲート抗ヒトＩＦＮγ抗体で細胞内染色した。試料を洗浄し、次いで、適切な染色緩衝液中に再懸濁させ、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、データを収集した。図１８に示した通り、ＣＤ１０７ａ脱顆粒化の著明な発現が、Ｋ５６２由来細胞およびＣＤ３３を発現するＴＨＰ−１細胞株だけにおいて観察されたのに対し、免疫エフェクター細胞だけおよびＥＬ−４との共培養により観察された脱顆粒化は、最小限であった。細胞内ＩＦＮγ発現についても、同様のパターンを観察した。
【０３５１】
[実施例９]
ゲノムへの構築物の組込みを媒介するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙベースのトランスポゾン系を使用して、ＣＡＲ構築物を、細胞へと、電気穿孔を介して導入した。０日目に、ＰＢＭＣ２０００万個を、１５μｇのトランスポゾン（ＣＤ３３  ＣＡＲ−ＣＤ８−ＣＤ２８ｚに対して）および５μｇのトランスポザーゼ（ｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１）と混合された１００μＬのＡｍａｘａ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（型番：ＶＰＡ−１００２；  Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁させ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｕ−１４を使用して、電気穿孔した。翌日（１日目）、細胞をカウントし、セツキシマブを使用する、プロテインＬ染色およびＨＥＲ１ｔ染色により、ＣＡＲの発現について表面染色した。細胞を、比を１：１とする、γ照射（１００Ｇｙ）またはマイトマイシンＣ処理されたＡａＰＣで刺激した。使用されるＡａＰＣ細胞は、ＣＤ６４−ＣＤ８６４１ＢＢＬ−ＣＤ１９−ｍｂＩＬ−１５／ＩＬ１５Ｒａ−ＲＯＲ１抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、比を１：１とするＡａＰＣで刺激した。培養物に、刺激の第１のラウンドには、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）だけを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏ−Ｔｅｃｈ）を補充した。Ｔ細胞培養物は、典型的に、７日間にわたり続いた各刺激サイクルの終了時において表現型解析にかけた。プロテインＬ染色を用いて、またはマルチパラメータフローサイトメトリーにより検出される、組換えＣＤ３３／Ｆｃタンパク質染色により、培養物を、ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現について、表現型解析にかけた。培養物はまた、ＮＫ細胞（ＣＤ３−  ＣＤ５６＋集団として規定される）の増殖についても、緊密にモニタリングし、百分率が、全細胞集団のうちの１０％を超えたら、製造元の指示書に従い、ＣＤ５６についての磁気ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよび／またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物から除去した。フローサイトメトリーを使用して、ＡａＰＣによる刺激後における、多様なドナーＰＢＭＣからの、ＣＤ３３  ＣＡＲの発現について査定した。代表的なドナーによるデータを、ＣＤ３３  ＣＡＲ−ＣＤ８−ＣＤ２８ｚについては、表３にまとめ、ＨＥＲ１ｔ細胞タグを伴うかまたは伴わないＣＤ３３−ＣＡＲ−ＣＤ８−４−１ＢＢｚについては、表４にまとめる。図１９は、ＨＥＲ１ｔタグを伴う、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＣＤ３３  ＣＡＲ−ＣＤ２８ｚ構築物の発現をさらに裏付ける。
【０３５２】
表４は、様々なＰＢＭＣドナーにおける、例示的なＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＣＤ３３−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｚ  ＣＡＲの発現を裏付ける。
【０３５３】
【表４】
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【０３５４】
表５は、様々なＰＢＭＣドナーにおける、例示的な、ＨＥＲ１ｔタグの発現を伴うＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＣＤ３３−ＣＤ８ａ−４１ＢＢｚ  ＣＡＲ、およびＨＥＲ１ｔタグの発現を伴わないＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＣＤ３３−ＣＤ８ａ−４１ＢＢｚ  ＣＡＲの発現を裏付ける。
【０３５５】
【表５】
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【０３５６】
[実施例１０]
レンチウイルスによる、ＮＫ細胞への形質導入はまた、多様なＨＥＲ１ｔタグ（配列番号３２および５４）およびＣ２０ｔタグへとカップリングさせたＣＤ３３  ＣＡＲによっても実施した。図２５〜２７は、ＣＤ３３  ＣＡＲ、ならびにＨＥＲ１ｔタグおよびＣＤ２０ｔ−１タグの、ＮＫ細胞上の発現を裏付ける。図２８〜２９はまた、ＣＤ３３  ＣＡＲ  ＮＫ細胞が、ＮＫ抵抗性ＣＤ３３＋  ＡＭＬ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で、効率的に溶解させることも裏付けた。異なる標的細胞と共に共培養したところ、ＣＤ３３  ＣＡＲ  ＮＫ細胞により、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＭＩＰ−１ａ、およびＭＩＰ−１ｂ）が産生された（データは示さない）。
【０３５７】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語ならびに任意の頭字語は、本発明の分野における当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。
【０３５８】
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、もしくはその中で記載される態様のうちの１または複数の組合せに対する、多様な代替物を、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
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【図２１−１０】
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【図２１−１１】
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【図２１−１２】
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【図２１−１３】
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【図２１−１４】
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【図２１−１５】
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【図２２Ａ−１】
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【図２２Ａ−２】
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【図２２Ｂ−１】
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【図２２Ｂ−２】
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【図２２Ｃ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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