(57)【要約】本発明は、前立腺癌を発症する患者のリスクを予測する方法、又はＰＣａを有すると疑われ、それゆえ生検が選択された患者のうち緩慢性と侵攻性の癌を区別する方法、及び／又は特に根治的前立腺摘除術、小線源療法、及び／又は体外照射療法による前立腺癌治療を受けた患者における前立腺癌の進行リスクを予測する方法に関し、前記方法は、前記患者から得られた尿試料中のインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを検出／定量することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  前立腺癌（ＰＣａ）を有する又は発症する患者のリスクを予測する、
−  前立腺生検に患者を割り当てる、
−  臨床的に関連する（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ）ＰＣａを有する患者のリスクを予測する、
−  緩慢性の（ｉｎｄｏｌｅｎｔ）ＰＣａを有する患者のリスクを予測する、
−  緩慢性の癌と侵攻性の（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）癌とを区別する、
−  前立腺癌の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）又は生化学的再発（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）の患者のリスクを予測する、及び／又は
−  緩慢性前立腺癌が臨床的に関連する前立腺癌に進行する患者のリスクを予測する、
方法であって、
前記方法は、前記患者から得られた尿試料中のインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを検出／定量することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記尿試料を採取する前に直腸指診（ＤＲＥ）が行われない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値１未満である場合、前立腺癌を有するリスクが前記患者について排除される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値２未満であるが前記所定のｍＲＮＡ閾値１を超える場合、前立腺癌を有するリスクが前記患者に割り当てられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、前記患者は前立腺生検に割り当てられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、グリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｅ）≧７の前立腺癌を有する高いリスクが前記患者に割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが前記所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、５年以内の前立腺癌の生化学的再発の高いリスクが、前立腺癌治療を受けている患者に割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、再発のリスクが前記患者に割り当てられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＩＤＯのｍＲＮＡの定量が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＤＯのタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値１未満である場合、前立腺癌を有する低いリスクが前記患者に割り当てられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＤＯのタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値２を超える場合、臨床的に関連する前立腺癌の明確なリスクが患者に割り当てられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＤＯのタンパク質の定量が酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって達成される、請求項１〜２又は１０〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記尿試料が未処理の一定容量の尿である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記尿試料が、一定容量の尿を遠心分離することによって得られるペレットである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
前立腺癌（ＰＣａ）は、男性において最も一般的な癌であり、先進国における男性の癌死亡率の主な原因である。末期前立腺癌のほとんどの症例は、成長が遅い臓器限定腫瘍から侵襲性の高い去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）への進行過程を経て生じる。
【背景技術】
【０００２】
大規模な研究（Ｓｃｈｒｏｄｅｒｅｔら、（２００９）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０、１３２０−８）によれば、現在の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に基づくスクリーニングは前立腺癌による死亡率を２０％減少させるが、高い過剰診断のリスクに関連する。Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ．２００９；１１（３）：１２７−１３３  ｄｏｉ：１０．３９０９／ｒｉｕ０４７４。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｄｅｒｅｔら、（２００９）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６０、１３２０−８
【非特許文献２】Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ．２００９；１１（３）：１２７−１３３  ｄｏｉ：１０．３９０９／ｒｉｕ０４７４
【非特許文献３】Ｅｐｓｔｅｉｎら、根治的前立腺摘除術にて有意でない癌を予測するための飽和生検の有用性（Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｉｏｐｓｙ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｔ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）、第６６巻、２００５年８月２日発行、３５６−３６０頁
【非特許文献４】Ｒａｂｂａｎｉら、偽陰性の六ヶ所前立腺生検の発生率及び臨床的意義（Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｘｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、第１５９巻、第４号７２  １９９８年４月、１２４７−１２５０頁
【非特許文献５】Ｖｌａｅｍｉｎｃｋ−Ｇｕｉｌｌｅｍら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、２０１０；７５（２）：４４７）；Ｒｏｏｂｏｌら、Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２０１０；５８（４）：４７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、前立腺生検は、患者に対する潜在的に有害な副作用、その高い費用及び明確な偽陽性率（１１．５％、Ｅｐｓｔｅｉｎら、根治的前立腺摘除術にて有意でない癌を予測するための飽和生検の有用性（Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｉｏｐｓｙ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｔ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）、第６６巻、２００５年８月２日発行、３５６−３６０頁による報告のとおり）及び偽陰性率（２３％、Ｒａｂｂａｎｉら、偽陰性の六ヶ所前立腺生検の発生率及び臨床的意義（Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｘｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、第１５９巻、第４号７２  １９９８年４月、１２４７−１２５０頁に記載）に関連するにも関わらず、前立腺癌検出のための最も標準的な手順である。
【０００５】
臨床的に限局性の前立腺癌は通常、根治的前立腺切除術、小線源治療（ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）、及び外照射療法のような十分に確立された治療法によって対処される。決定的な局所療法で多くの患者を治療することができるが、根治的前立腺摘除術による治療後に血清ＰＳＡ上昇により検出された疾患である生化学的再発（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）（ＢＲ）を有する者もいる。
【０００６】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、尿中の前立腺癌遺伝子３（ＰＣＡ３）の検出に基づく前立腺癌検査を承認しているが、その臨床的有用性はＰＳＡ検出よりごくわずかしか優れていないと報告されている（Ｖｌａｅｍｉｎｃｋ−Ｇｕｉｌｌｅｍら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、２０１０；７５（２）：４４７）；Ｒｏｏｂｏｌら、Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２０１０；５８（４）：４７５）。
【０００７】
したがって、患者をスクリーニングするための現在の方法を改善することは非常に重要である。
【０００８】
膨大な数の文献は、炎症とＰＣａとの間の直接的かつ因果的な相関関係はまだ確立されていないが、炎症がＰＣａの発症及び進行において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。考慮すべき疫学的証拠は、ＰＣａがより高い度合の炎症を有する人口統計学的集団においてより優勢であること、そして肥満に冒された患者が前立腺癌特異的な死亡のリスクの増加を示すことを指している。さらに、前立腺組織の分析は、ほとんどの場合、腺癌が慢性炎症に隣接して見出されることを明らかにしている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの遺伝子変異及び後成的変化の蓄積による形質転換の際、免疫の適応度に応じて腫瘍細胞は完全に排除されるか、明らかな癌へと進行するかどちらかである。特に、ＰＣａにおける腫瘍免疫回避は、癌の免疫編集の調整やＴＤＳＦネットワークの調節においてインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、アルギナーゼ、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）及びサイトカイン関連など免疫抑制特性を有する種々の腫瘍由来可溶性因子（ＴＤＳＦ）の分泌を通して起こる。いくつかの微小環境修飾因子の中で、我々の関心は、ＰＣａの発症及び進行の可能性のあるメディエーターとして報告されているもの（ＩＤＯ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１βなど）に集中した。癌における微小環境の役割についての論争の的となるデータは文献に報告されており、推定の腫瘍促進剤の発現は癌の侵攻性及び臨床転帰不良と一時的に相関することがある。確かに、高レベルのＩＤＯは、卵巣癌、子宮内膜癌及び結腸癌、悪性黒色腫、乳癌及び肺癌における臨床予後不良と相関していたが、腎細胞癌（ＲＣＣ）では相関していなかった。後者の場合、初発腫瘍又は転移における高レベルのＩＤＯのｍＲＮＡは、より長い全生存期間と正の相関を示した。ＩＤＯの発現は、腫瘍細胞内ではなく、腫瘍領域内の新しく形成された血管の内皮細胞において検出された。他の著者らはこれらのデータを確認し、内皮細胞によって産生されたＩＤＯが癌細胞から必須アミノ酸トリプトファンを奪い、それゆえそれらの増殖を阻害するであろうという仮説を立てた。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＩＤＯのｍＲＮＡについての閾値の定義及びＤＲＥ（前立腺マッサージ）なしでの検査の実現可能性を示す。ＧＳ≧７の患者及びＧ≦６の患者はＰＣａを有し、ＧＳは生検又は前立腺摘除後に可能な場合に評価した。ＧＳ≧７は臨床的に関連するＰＣａを意味し、ＧＳ≦６は緩慢性ＰＣａを意味する。カットオフ１（ａ≦０．００１５、生検への割り当て又は臨床的に関連するＰＣａを有するリスク：ＮＰＶ  １００％、ＰＰＶ  ４７％；ＰＣａを有するリスク：ＮＰＶ＝１００％、ＰＰＶ＝８２％）、カットオフ２（ｂ≦０．００７５、生検への割り当て又は臨床的に関連するＰＣａを有するリスク：ＮＰＶ  ８１％、ＰＰＶ  ７２％；ＰＣａを有するリスク：ＮＰＶ＝４７％、ＰＰＶ＝１００％）、カットオフ３（ｃ≧０．００９６、生検への割り当て又は臨床的に関連するＰＣａを有するリスク：ＮＰＶ  ８３％、ＰＰＶ  ８８％）及びカットオフ４（ｄ≧０．０４７９、治療又は治療抵抗性のＰＣａから５年以内にＢＲを有するリスク：ＮＰＶ  １００％、ＰＰＶ  ４０％）。ＩＤＯ相対的遺伝子発現を、ＤＲＥを実施せずに採取した患者の尿中で分析した。ＩＤＯ検査は、不要な生検の数を、カットオフ１で１４．８％、又はカットオフ２で５１．８％、又はカットオフ３で６６．６％減少させる。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＤＯタンパク質の閾値と、ＤＲＥ（前立腺マッサージ）を実施しない検査の実現可能性を示す。タンパク質カットオフ１（ａ≦４２ｐｇ／ｍＬ、生検への割り当て又は臨床的に関連するＰＣａを有するリスク：ＰＰＶ  ８３％、ＮＰＶ  ６３％、ＰＣａを有するリスク：ＰＰＶ  ９０％、ＮＰＶ  ８３％）、タンパク質カットオフ２（ｂ≦２００ｐｇ／ｍＬ、生検への割り当て又は臨床的に関連するＰＣａを有するリスク：ＰＰＶ  ６９％、ＮＰＶ  １００％；ＰＣａを有するリスクＰＰＶ  １００％、ＮＰＶ  ８５％）及びＤＲＥ（前立腺マッサージ）を実行なしの検査の実現可能性。ＩＤＯ相対的遺伝子発現を、ＤＲＥを実施せずに採取した患者の尿中で分析した。ＧＳ≧７、ＧＳ≦６及びＰＣａなしは、生検又は前立腺摘除術からの結果である。ＩＤＯ検査では、タンパク質カットオフ２により不要な生検の数を２９．４％減少させる。
【図２】図２は、遠心分離なしの尿中検査の実現可能性を示す（遊離ＲＮＡ対ペレット）。
【図３】前立腺マッサージは尿中のｍＲＮＡ  ＰＳＡの量を５０倍に増加させる；（５人の患者において行われたＤＲＥ前後の遺伝子発現を比較する試験）。通常、ＤＲＥは血清中のＰＳＡタンパク質を３倍に増加させる。ＰＳＡとは異なり、前立腺マッサージはＩＤＯの量を２〜３倍わずかに増加させた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
説明
本発明は
−  前立腺生検に患者を割り当てる、
−  前立腺癌を有する又は発症する患者のリスクを予測する、
−  臨床的に関連する（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ）前立腺癌を有する患者のリスクを予測する、
−  緩慢性（ｉｎｄｏｌｅｎｔ）の前立腺癌を有する患者のリスクを予測する、
−  緩慢性の癌と侵攻性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）の癌を区別する、
−  患者の前立腺癌の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）のリスクを予測する、
−  緩慢性前立腺癌から症候性前立腺癌へ進行する患者のリスクを予測する、
方法を提供する。
【００１２】
いずれの場合でも、該方法は、患者から得られた尿試料中のインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを検出／定量することを含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は
−  前立腺癌を発症する患者のリスクを予測する、
−  前立腺生検を受けるように指示された患者の中で緩慢性癌と侵攻性癌とを区別する、
−  前立腺癌治療を受けた患者における前立腺癌の生化学的再発の可能性を予測する、及び／又は
−  前立腺癌治療、特に根治的前立腺摘除術、小線源治療（ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）、及び／又は体外照射療法；を受けた患者における前記前立腺癌の進行のリスクを予測する、
方法を提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明は
−  前立腺癌を有する患者のリスクを予測する、
−  グリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｅ）≧７で、臨床的に関連する前立腺癌を有する患者のリスクを予測する、
−  前立腺癌及び／又は慢性の多巣性前立腺炎症を有する患者のリスクを予測する、
−  前立腺癌を発症する患者のリスクを予測する、
−  前立腺生検に患者を割り当る、
−  前立腺生検を受けるように指示された患者の中で緩慢性癌と侵攻性癌とを区別する、
−  前立腺癌の生化学的再発の患者のリスクを予測する、及び／又は
−  緩慢性前立腺癌から症候性前立腺癌へ進行する患者のリスクを予測する、
方法を提供する。
【００１５】
本発明者らは、尿試料中のインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルを定量し、患者が前立腺生検を受けることで利益を得るかどうか、及び生化学的再発及び／又は治療不能へと進行する平均リスク（関連する患者群を比較検討）より高いかどうかを予測する相対カットオフを測定した。
【００１６】
国際ガイドライン（生検前ノモグラム：人種、年齢、家族歴、ＰＳＡレベル＞４ｎｇ／ｍＬ、ＤＲＥの結果、以前の生検）に従って、医師による前立腺腫瘍を有するリスクがあるとして患者を選択することができる。医師によって前立腺腫瘍を有するリスクがあると選択された患者は、前立腺生検を受けるように指示される。本発明による検査は、これらの患者のうちのどちらが生検を受けなければならず、どちらが受ける必要がないかを選択する。
【００１７】
本発明による検査は、治療前又は治療後の任意の時点で、ＰＣａの発症を監視するために繰り返し実施することができる。陽性の生検が検出され治療の適用が決定されると、診断はこの結果に基づく。
【００１８】
生検後、患者が積極的な監視療法（ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に割り当てられている場合は、ＩＤＯ検査を使用して病変の発症の変化を監視することができる。生検の後、患者が治療に割り当てられている場合、ＩＤＯ検査を使用して前立腺内の残存腫瘍組織の存在を監視することができる。
【００１９】
特定の実施形態では、緩慢性前立腺癌が症候性又は臨床的に関連する前立腺癌に進行する患者のリスクは、前立腺の生検を実施するために選択された患者において測定される。
【００２０】
特定の実施形態では、患者の前立腺癌の進行のリスク、特に緩慢性前立腺癌の症候性又は臨床的に関連のある前立腺癌への進行のリスクは、前立腺癌治療を受けた患者において測定される。
【００２１】
特定の実施形態では、前立腺癌の生化学的再発の患者のリスクが測定される。
【００２２】
特定の実施形態において、前立腺癌の生化学的再発の患者のリスクは、前立腺癌治療を受けた患者において測定される。特定の実施形態では、前立腺癌治療は根治的前立腺摘除術、小線源治療、及び／又は体外照射療法から選択される。特定の実施形態では、前立腺癌の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）の患者のリスクが測定される。
【００２３】
特定の実施形態では、尿試料を採取する前にＤＲＥは行われない。本発明による方法は、ＤＲＥを実行せずに重要な結果をもたらす。ＤＲＥの放棄は、患者の適合性を向上させ、そして本発明による方法をより速くかつより容易にする。
【００２４】
特定の実施形態では、ＤＲＥは尿試料を採取する前に行われる。これは、コントロール及び標的遺伝子に関する技術的問題のために、本発明による最初のＩＤＯ検査が有益でない結果の場合に有益であり得る。
【００２５】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡは前記尿試料中で定量される。
【００２６】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡの定量化はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成される。
【００２７】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡの定量化は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって行われる。
【００２８】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡの定量化は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）によって行われる。デジタルＰＣＲは、核酸鎖を直接定量し、かつクローン的に増幅するために使用することができる従来のＰＣＲ法のバイオテクノロジーの改良である。デジタルＰＣＲは、反応を複数のより小さな反応に分割することによって、従来のＰＣＲ方法を改良する。試料内の個々の核酸分子が多くの別々の領域内に局在するように試料を分割する。マイクロウェルプレート、キャピラリー、オイルエマルジョン、及び核酸結合表面を有する小型化チャンバーのアレイを使用して試料を分割することができる。
【００２９】
あるいは、ＩＤＯのｍＲＮＡの定量化は、当業者に知られている他の技術によって達成することができる。
【００３０】
当業者は、ＩＤＯ及びコントロール遺伝子の発現との間の比率を計算するための適切な方法及び公式を心得ている。例示的な方法は、以下の「材料及び方法」に記載する。
【００３１】
特定の実施形態では、コントロール遺伝子は、ＩＤＯよりも高いレベルで前立腺細胞によって発現される任意の遺伝子である。当業者は、コントロール遺伝子の発現が前立腺癌の存在と無関係でなければならないことを心得ている。特定の実施形態では、コントロール遺伝子は、ＩＤＯよりも高いレベルで前立腺細胞によって発現されるハウスキーピング遺伝子である。特定の実施形態では、コントロール遺伝子はＧＡＰＤＨである。
【００３２】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値１未満である場合、前立腺癌を有するリスクは患者に対して排除される。言い換えれば、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルは、所定のｍＲＮＡ閾値１未満である場合、前立腺癌を有するリスクは０である（に近い）と測定される。
【００３３】
特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値１は、ＩＤＯのｍＲＮＡ分子の絶対コピー数が試料内において０〜１００コピーの間のである。試料は一定容量の未処理の尿、特に０．１ｍＬ〜５ｍＬ、さらに特に０．２ｍＬ〜２ｍＬ、さらに特に０．２５〜１ｍＬ、なおさらに特に約０．５ｍＬであり得る。試料は、尿の遠心分離により、特に２ｍＬ〜１００ｍＬの尿、さらに特に５ｍＬ〜７５ｍＬの尿、さらに特に１５ｍＬ〜５０ｍＬの尿、なおさらに特に約２０ｍＬの尿の遠心分離により得られるペレットであり得る。
【００３４】
特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値１は、コントロール遺伝子の発現に対するＩＤＯのｍＲＮＡのコピー数の比である。
【００３５】
このｍＲＮＡ閾値１未満のＩＤＯのｍＲＮＡレベルを有する患者は、ＰＣａを有する可能性が０％又はごくわずかであり（図１Ａ）、それゆえ前立腺生検は推奨されない。
【００３６】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが前立腺癌に罹患していない個体のコントロール集団のＩＤＯのｍＲＮＡレベルと比較して上昇している場合、前立腺癌を有する又は発症するリスクが患者に割り当てられる。これは前立腺生検の結果又は前立腺摘除術の結果（利用可能な場合）によって実証される。
【００３７】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値１を上回る場合、前立腺癌を有するという重大なリスクが患者に割り当てられる。
【００３８】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値２未満であるが所定のｍＲＮＡ閾値１を超える場合、（臨床的に関連する癌よりも緩慢性前立腺癌を有する確率が高い）前立腺癌を有するリスクが患者に割り当てられる。
【００３９】
特定の実施形態では、前記所定のｍＲＮＡ閾値２は、所定のｍＲＮＡ閾値１の１．５〜６倍である。
【００４０】
この所定のｍＲＮＡ閾値２未満であるが所定のｍＲＮＡ閾値１を超えるＩＤＯのｍＲＮＡレベルを有する患者は、生検が推奨され得る群に割り当てられる（図１Ａ）。
【００４１】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルがｍＲＮＡ閾値３を超える場合、（緩慢性前立腺癌よりも臨床的に関連のある癌を有するより高い可能性を有する）前立腺癌を有するより高いリスクを患者に割り当てる。
【００４２】
特定の実施形態では、前記所定のｍＲＮＡ閾値３は、所定のｍＲＮＡ閾値４の６〜１０倍である。
【００４３】
このｍＲＮＡ閾値３を超えるＩＤＯのｍＲＮＡレベルを有する患者は、生検が常に推奨される群に割り当てられる。
【００４４】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、臨床的に関連する前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、グリーソンスコア≧７によって特徴付けられる前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、前立腺生検後に治療を必要とする前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。これらの患者には前立腺生検が常に推奨される。
【００４５】
特定の実施形態において、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値３を超える場合、５年以内の前立腺癌の生化学的再発の高いリスクが患者に割り当てられる。
【００４６】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、臨床的に関連する前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、グリーソンスコア≧７によって特徴付けられる前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、前立腺生検後に治療を必要とする前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。これらの患者には前立腺生検が常に推奨される。
【００４７】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、より高い進行及び転移の可能性を有する前立腺癌を有する高いリスクが患者に割り当てられる。
【００４８】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、再発のリスクが患者に割り当てられる。
【００４９】
特定の実施形態では、ＩＤＯのｍＲＮＡのレベルが所定のｍＲＮＡ閾値４を超える場合、５年以内の前立腺癌の生化学的再発の高いリスクが患者に割り当てられる。
【００５０】
特定の実施形態において、第４の所定のｍＲＮＡ閾値は、ｍＲＮＡ閾値１よりも２０倍以上高い。このｍＲＮＡ閾値４を超えるＩＤＯのｍＲＮＡレベルを有する患者は、緊急治療の選択肢のために生検が常に推奨される群に割り当てられる（図１Ａ）。
【００５１】
ＧＡＰＤＨ発現に対するＩＤＯのｍＲＮＡ発現閾値
特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値１は、ＧＡＰＤＨ発現に対して０．０００１〜０．００４倍の発現である。特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値１は、ＧＡＰＤＨ発現に対して０．００１５倍のＩＤＯ発現である。
【００５２】
本発明者らのデータは、このｍＲＮＡ閾値１を下回るＩＤＯのｍＲＮＡレベルを有する患者は、ＰＣａを有する可能性が０％又は無視できる程度であることを実証する（図１Ａ）。
【００５３】
特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値２は、ＧＡＰＤＨと比較して０．００４〜０．００９０倍の発現である。特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値２は、ＧＡＰＤＨ発現に対して０．００７５倍のＩＤＯ発現である。
【００５４】
特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値３は、ＧＡＰＤＨと比較して０．００９０〜０．０３倍の発現である。特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値３は、ＧＡＰＤＨ発現に対して０．００９６倍のＩＤＯ発現である。
【００５５】
本発明者らのデータは、緩慢性ＰＣａを有する患者の８７．５％（ＧＳ≦６かつＢＲ−かつ生検後の治療なし）、ＰＣａを有しない患者の１００％及び臨床的に関連性のあるＰＣａを有する患者の２７％（ＧＳ≧７、ＢＲ−、生検後の治療）は、０．００９６未満のＩＤＯを発現したことを実証する（図１Ａ）。
【００５６】
本発明者らのデータは、臨床的に関連するＰＣａを有する患者の７２％（ＧＳ≧７、生検後の治療）が０．００９６を超えるＩＤＯを発現したことを実証する（図１Ａ）。
【００５７】
特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値４は、ＧＡＰＤＨ発現に対して０．０３〜０．０５倍発現である。特定の実施形態では、所定のｍＲＮＡ閾値４は、ＧＡＰＤＨ発現に対して０．０４７９倍のＩＤＯ発現である。
【００５８】
本発明者らのデータは、ＢＲ＋  ＰＣａ（ＧＳ≧７、生検後の治療、５年以内のＢＲ）を有するか又は放射線療法に反応しない患者の１００％が０．０４７９を超えるＩＤＯを発現したことを実証する（図１Ａ）。
【００５９】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質は前記尿試料中で定量される。特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質の定量化は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって行われる。
【００６０】
あるいは、ＩＤＯタンパク質の定量化は、当業者に知られている他の技術によって達成され得る。
【００６１】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値１未満である場合、前立腺癌を有するリスクは患者に対して排除される。特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値１未満である場合、前立腺癌を有するリスクは患者のリスクが非常に低いと測定される。特定の実施形態では、所定のタンパク質閾値１は、ＩＤＯタンパク質の絶対濃度であり、０〜１００ｐｇ／ｍＬの間である。
【００６２】
このタンパク質閾値１未満のＩＤＯタンパク質レベルを有する患者は、ＰＣａを有する可能性が低く（図１Ｂ）、したがって前立腺生検は推奨されない。
【００６３】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質のレベルが前立腺癌に罹患していない個体のコントロール集団のＩＤＯタンパク質レベルと比較して上昇している場合、前立腺癌を有する又は発症するリスクが患者に割り当てられる。これは前立腺生検の結果又は前立腺摘除術の結果（利用可能な場合）により実証される。
【００６４】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値１を超える場合、前立腺癌を有するという有意なリスクが患者に割り当てられる。
【００６５】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値２を超える場合、（臨床的に関連する癌よりも緩慢性前立腺癌が発生する可能性がより高い）前立腺癌を有するというより高いリスクが患者に割り当てられる。特定の実施形態において、前記所定のタンパク質閾値２は、所定のタンパク質閾値１の１．５から６倍の間である。特定の実施形態では、前記所定のタンパク質閾値２は１００から３００ｐｇ／ｍＬの間である。特定の実施形態では、前記所定のタンパク質閾値２は２００ｐｇ／ｍＬである。
【００６６】
特定の実施形態において、タンパク質閾値２未満であるがタンパク質閾値１を超えるＩＤＯタンパク質レベルを有する患者は、生検が推奨され得る群に割り当てられる。
【００６７】
特定の実施形態において、このタンパク質閾値２を超えるＩＤＯタンパク質レベルを有する患者は、生検が常に推奨される群に割り当てられる。
【００６８】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質のレベルが所定のタンパク質閾値３を超える場合、（緩慢性前立腺癌より臨床的に関連する癌を有する可能性がより高い）前立腺癌を有するというより高いリスクを患者に割り当てる。特定の実施形態では、前記所定のタンパク質閾値３は、３００ｐｇ／ｍＬよりも大きいか、又は所定のタンパク質閾値１の２倍よりも大きい。これらの患者に対しては、前立腺生検が常に推奨される。
【００６９】
本発明者らのデータは、ＰＣａを有さない患者の８３％が２００ｐｇ未満のＩＤＯタンパク質レベルを有することを実証する。本発明者らのデータは、臨床的に関連するＰＣａを有する患者の８７．５％（ＧＳ≧７、ＢＲ−、生検後の治療）が２００ｐｇを超えるＩＤＯタンパク質レベルを有することを実証する。本発明者らのデータは、緩慢性ＰＣａを有する又はＰＣａを有さない患者の１００％がタンパク質閾値３未満のＩＤＯタンパク質レベルを有することを実証する（図１Ｂ）。特定の実施形態において、尿試料は処理されず、そしてＲＮＡ又はタンパク質の分析を可能にする。
【００７０】
特定の実施形態では、尿試料は、ＲＮＡを保存するための試薬を添加した一定量の尿である。
【００７１】
特定の実施形態では、尿試料は尿を遠心分離することによって得られるペレットである。特定の実施形態では、尿試料は、３００ｇ超で５分間を超えて尿を超遠心分離することによって得られるペレットである。特定の実施形態では、尿試料は、２００〜２０００Ｇで５分間を超えて尿を遠心分離することによって得られるペレットである。特定の実施形態では、尿試料は、３００ｇで５分間を超えて尿を超遠心分離することによって得られるペレットである。特定の実施形態では、尿試料は、７００ｇを上回り１０分間以上尿を遠心分離することによって得られるペレットである。
【００７２】
特定の実施形態では、方法は以下の工程を含む：
ａ．尿試料を採取直後に少なくとも５分間、特に５〜３０分間、さらに特に８〜１５分間１０℃未満、特に１０℃〜４℃の間で遠心分離する。
ｂ．任意に、１つ又は複数のＲＮＡｓｅ阻害剤化合物を収集時又は遠心分離前に試料に添加する。
【００７３】
特定の実施形態では、尿試料は無細胞ＲＮＡ試料である。この発現は、ＲＮＡ単離の前に（例えば遠心分離によって）処理されていない尿試料から得られたＲＮＡ調製物に関する。ＩＤＯ遺伝子発現に関してペレットと無細胞ＲＮＡの間に違いは検出されなかった（図２）。
【００７４】
尿は、採取直後に、３℃〜２５℃、特に４℃での遠心分離（ペレットを採取するため）又は分注（無細胞ＲＮＡ又はタンパク質分析のため）のいずれかで処理する必要がある。ＲＮＡを分解から保護するための溶液の添加も可能である。採取後に試料を４℃に保ち、数時間（例えば１〜２４時間）後に遠心分離を行うことも可能である。無細胞ＲＮＡを分析するために、遠心分離せずに０．５ｍＬの尿からＲＮＡを抽出する。任意に１つ又は複数のＲＮＡｓｅ阻害剤又はＲＮＡ安定剤化合物を収集時に試料に添加する。ｍＲＮＡを逆転写することによって生成されたＩＤＯ  ｃＤＮＡは、従って、ＩＤＯ遺伝子を標的とする一組のプライマー及びプローブを使用することによってリアルタイムＰＣＲによって定量される（実施例に示されるＴａｑＭａｎアッセイはその一例である）。適切なＩＤＯ領域の一例は触媒領域である。実施例に示されるＴａｑＭａｎアッセイは、ＩＤＯの触媒領域を標的とする。逆転写は、標的特異的プライマー又は混合プライマーを用いて実施することができる。逆転写は別々の反応であり得る、もしくは標的配列の定量化に使用されるのと同じ反応で行われ得る。定量化は、リアルタイムＰＣＲ又は他の定量的方法、例えばデジタルＰＣＲもしくはＲＮＡ−ｓｅｑにより行うことができる。検査をＰＳＡ測定から独立させるために、コントロール遺伝子を用いてＩＤＯの相対的遺伝子発現を計算する。
【００７５】
特定の実施形態では、コントロール遺伝子はＧＡＰＤＨである。特定の実施形態において、１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、増幅のための遺伝物質の量を測定するための内部コントロール（技術的コントロール）として使用される。１８ｓ＞７  Ｃｔ（リアルタイムＰＣＲの閾値サイクル）の場合、検査は有益ではない可能性があるため、それゆえ新しい尿試料を採取し、適切に検査を繰り返す必要がある。特定の実施形態では、ＤＲＥは技術的コントロール遺伝子のパフォーマンスを改善すると想定され得る。
【００７６】
特定の実施形態では、この方法は、以下のプライマー及びプローブのうちの少なくとも１つ、そして特にその全てを使用する。
プライマーＦ  ５’−ＧＡＡＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号０１）
プライマーＲ  ５’−ＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号０２）
プローブ：５’−ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴ−３’（配列番号０３）。
【００７７】
特定の実施形態では、プローブは、５’末端又は３’末端を蛍光色素分子で、及び他の末端を蛍光色素分子消光剤で修飾される。蛍光色素分子消光剤は、励起時に蛍光色素分子から放出される蛍光を消光することができる。配列番号０３の特定のプローブ配列に関して、ＭＧＢは、異なる蛍光色素分子と組み合わせて使用することができる特に有用な蛍光色素分子消光剤である。非限定的な例は、ＦＡＭ／ＭＧＢ、ＶＩＣ／ＭＧＢ、ＴＷＴ／ＭＧＢ、ヤキマイエロー／ＭＧＢ、ＨＥＸ／ＭＧＢ及びＣｙ５／ＭＧＢである。蛍光色素分子と蛍光色素分子消光剤の他の有用なペアは、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）／（マイナーグローブバインダー（ＭＧＢ）、ＦＡＭ／ブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）、ＹＹＥ／ＢＨＱ１、ＲＯＸ／ＢＨＱ２、Ｃｙ５／ＢＨＱ２である。
【００７８】
特定の実施形態では、プローブは、５’側がＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、３’側がＭＧＢで修飾される。
【００７９】
特定の実施形態では、ＩＤＯタンパク質はＥＬＩＳＡによって定量化される。特定の実施形態では、定量化は、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ、Ｓｔｕｂｅｎｗａｌｄ−Ａｌｌｅｅ  ８ａ、６４６２５  ベンスハイム、ドイツよるＩＤＫ（登録商標）ＩＤＯ  ＥＬＩＳＡキットを使用して行う。
【００８０】
特定の実施形態では、尿試料は未処理の尿量である。本明細書において、このような試料は「無細胞」ＲＮＡ試料とも呼ばれる。「未処理」は、試料がＲＮＡ単離の前に遠心分離されていないということを言い、それゆえ、それは遠心分離によって一次試料から分離された画分ではなく「全」尿を含む（言い換えれば：患者から得られた試料）。未処理のＲＮＡ試料は、ＲＮＡの分解を防ぐために添加された溶液を含み得る。
【００８１】
特定の実施形態では、尿試料は、一定量の尿を遠心分離することによって得られるペレットである。
【００８２】
ＩＤＯのｍＲＮＡはＰＣａ組織において高レベルで発現される。ＩＤＯタンパク質は、染色によってＰＣａ組織に存在することが報告されているが、絶対的な方法で定量されたことはない。ＩＤＯのｍＲＮＡ及びタンパク質は前立腺癌を有すると疑われる患者の尿中に高レベルで検出され得、そしてそのレベルは腫瘍保持患者又は生検によるそれらの状態のさらなる測定を必要とする患者を識別するためのバイオマーカーとして使用され得るという所見は驚くべきことである：
【００８３】
疾患又は他の損傷を受けた組織から体液（血液、尿及び唾液など）へのｍＲＮＡ及びタンパク質の検出は、疾患の発症中に組織により受ける損傷の種類によって異なる。
【００８４】
参照として役立つ可能性がある１つの事例は、ＰＳＡの検出である。ＰＳＡは非常に特異的な前立腺分子であり、末梢循環中のその上昇したレベルは、腫瘍、良性疾患もしくは炎症（すなわち前立腺炎）の存在による前立腺損傷、又は年齢もしくは性交による過剰産生のいずれかの指標である。特にＰＳＡは腫瘍特異的ではない。ＰＳＡは現在、ＰＣａの診断に最も一般的に使用されているバイオマーカーである。ＰＳＡタンパク質は前立腺細胞によって前立腺腺の内腔に分泌され、前立腺管に運ばれる。それにより尿に到達し、そして検出することが可能である。ＰＳＡはまた、その不活性形態（遊離ＰＳＡ）において、有意ではないレベル（４ｎｇ／ｍＬ）で生理学的に血流に入るが、後者の量は年齢とともに増加する。より高い病期及び悪性度で腫瘍発症の間に、前立腺構造への損傷のために、ＰＳＡタンパク質レベルは患者の血清中で有意に増加し、そしてこれまでのところ、この検体においてのみ前立腺癌に対する予測力を有する。この分泌タンパク質は尿中に検出することができるが、尿中のそのレベルだけでは予測できない（Ｂｏｌｄｕｃら、（２００７）、Ｃａｎ．Ｕｒｏｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．１、３７７−８１）。
【００８５】
相同性において、ＩＤＯが前立腺癌組織において他の臓器の状態よりも高いレベルで検出可能であるという事実は、ＩＤＯが尿中で検出可能であることを予測せず、はるかに少なく、この検体において、他の症状を有する患者と比較してＰＣａ腫瘍を有する患者からの試料においてより上昇したレベルで検出することができる。前立腺摘除術後に採取された前立腺腫瘍試料では高いレベルのＩＤＯが検出されており、早期段階での前立腺の存在（例：前立腺生検）は今までに報告されておらず、それゆえ前立腺癌（ＰＳＡ検査で示されるとおり）を内部に持つリスクがあるが、その診断はまだ評価されていない（前立腺生検の前）患者の尿中にＩＤＯを検出することができることは、予想外のことである。さらに、前立腺内の他の細胞は免疫調節が起こる特定の領域でそれを放出する可能性があるため、ＩＤＯは前立腺特異的タンパク質ではない。したがって、内皮細胞、マクロファージなどの前立腺における他のＩＤＯ源は、患者において検出可能なバックグラウンドレベルに寄与する。非腫瘍特異的マーカーが有効な診断／予後ツールであることに関連するのは、腫瘍を有する患者における生理学的ベースラインを超えたその有意な過剰発現である。バックグラウンドレベルにもかかわらず、ＩＤＯは生理的に豊富には尿中に分泌されず、かつＰＳＡのようにそれは前立腺マッサージ後に有意に増加しない（図３）。したがって、ＰＳＡの場合のように体液中で上昇したレベルでの検出は予想されない。予備データに基づいて、本発明者らは、ＰＣａのリスクがある患者の尿中のＩＤＯ検出（ｍＲＮＡ及びタンパク質）が診断力を有することを観察した（図１）。
【００８６】
尿は、それらの生理学的機能により、剥離した細胞、細胞片、及び排出物質の存在を特徴とする検体であり、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ及びその他の分解酵素が豊富である。それゆえ、それらは、細胞がより長い期間生存することができる血液と比較して、ＲＮＡの分析（そのような条件では不安定でそして容易かつ迅速に分解されると考えられる）には困難な材料と考えられる。さらに、排出物質の存在は、ＩＤＯ（タンパク質は前立腺中のいくつかの種類の細胞に存在する）のように、１種類の細胞によって独占的に発現されない分子のバックグラウンドレベルを増加させると予想される。そのような検体中のＩＤＯのＲＮＡ及びタンパク質の検出は、それ故に予想外である。さらに驚くべきことは、予測力を持つ定量的マーカーとしてそれを使用する可能性である（図１）。
【００８７】
用語と定義
本明細書の文脈において、表現「ｍＲＮＡ」は、一次転写物（ｍＲＮＡ前駆体とも呼ばれる）及びｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡのプロセシング中に形成される任意の中間構築物を含む、所与の遺伝子の発現の定量化に使用できる任意のＲＮＡ種を含むことを意味する。
【００８８】
本明細書の文脈における「ＰＣａ」は、「前立腺癌」に関する。
【００８９】
本明細書の文脈における「ＰＳＡ」は、「前立腺特異抗原」に関する。
【００９０】
本明細書の文脈における「ＲＰ」は「根治的前立腺摘除術」に関する。
【００９１】
本明細書の文脈における「ＲＴｘ」は「放射線療法」に関する。
【００９２】
本明細書の文脈における「ＡＳ」は、手術又は化学療法などの即時治療ではなく、定期的な検査によって病状の進行を監視する方法に関する「能動的監視」に関する。
【００９３】
本明細書の文脈における「ＤＲＥ」は、「直腸指診」に関する。
【００９４】
本明細書の文脈における「ＢＲ」は「生化学的再発」に関し、そして検出可能なレベルの生化学的癌マーカーの上昇、特にＰＳＡの血中レベルの上昇を規定する。ＢＲは、例えば手術又は放射線療法によって前立腺癌が治療されている前立腺癌患者において起こり得る。罹患の患者は症状を示さないことがある。「ＢＲ−」は５年以内に前立腺癌の生化学的再発がないことを意味し、「ＢＲ＋」は５年以内に前立腺癌の生化学的再発を意味する。
【００９５】
本明細書の文脈における「ＰＣａの再発」は、ＰＣａの再発、特に生化学的再発、及び治療に対する無反応性／不応性を含むことを意味する。
【００９６】
本明細書の文脈における「ＧＳ」は「グリーソンスコア」に関する。グリーソンスコアは、病理学者によって評価された、その微視的外観に基づいてＰＣａ組織を等級付けするシステムである。ＧＳの範囲は２から１０である。ＧＳが高いほど、ＰＣａのより予後不良を伴う侵攻性になる。
【００９７】
本明細書の文脈における「ＰＰＶ」は「陽性適中率」に関する。
【００９８】
本明細書の文脈における「ＮＰＶ」は「陰性適中率」に関する。
【００９９】
本明細書の文脈における「ＧＡＰＤＨ」は「グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ」に関する。ＧＡＰＤＨはほとんどの細胞で構成的に発現しており、遺伝子発現レベルの正常化に使用することができる。
【０１００】
本明細書の文脈における「緩慢性前立腺癌」は、ＧＳ≦６の前立腺癌に関する。
【０１０１】
本明細書の文脈における「臨床的に関連する前立腺癌」は、担当医によってそのように分類されるであろう前立腺癌に関する。臨床的に関連するＰＣａの診断は、通常、外科手術、化学療法、凍結療法、ホルモン療法、及び／又は放射線療法から選択される方法により治療の推奨をもたらす。ほとんどの場合、臨床的に関連するＰＣａはＧＳ≧７で特徴付けられる。
【０１０２】
本明細書の文脈における用語「症候性前立腺癌」及び「侵攻性前立腺癌」は、「臨床的に関連する前立腺癌」と同義語として使用される。
【０１０３】
本明細書の文脈において、ＧＳ≧７の前立腺癌に関する。
【０１０４】
本明細書の文脈において、表現「（前立腺癌を有する）リスク」は「（前立腺癌を有する）可能性」と同義である。
【０１０５】
本明細書の文脈において、表現「閾値」は「カットオフ」と同義である。本明細書の文脈において、表現「閾値１」は「第１の閾値」と同義である。
【０１０６】
単一の分離可能な特徴に対する代替が、本明細書において「実施形態」として既述される場合は常に、そのような代替が自由に組み合わされて本明細書に開示される本発明の個別の実施形態を形成し得ることを理解されたい。したがって、検出可能な標識についての任意の代替の実施形態は、任意の代替の実施形態の配列と組み合わせることができ、かつこれらの組み合わせは、本明細書に記載の任意の医学的症状又は診断方法と組み合わせることができる。
【実施例】
【０１０７】
本発明は、以下の実施例及び図面によってさらに説明され、これから、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するためのものではない。
【０１０８】
材料及び方法
尿の収集
患者は、採取の前の２４時間前は性行為を避ける必要がある。朝の最初の尿を無菌容器に採取する。
【０１０９】
ペレット：２０ｍＬを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットをＲＮＡ抽出に使用する。
【０１１０】
無細胞ＲＮＡ及びタンパク質：ＲＮＡ抽出に５００μＬの尿を使用する。
【０１１１】
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出は、ＲＮＡ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｋｉｔの手順（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））に従って行う。７００μＬの溶解溶液をペレット又は５００μＬの尿のいずれかに添加する。溶出工程は、毎回５０μＬの容量で同じチューブ内で２回行う（最終容量は１００μＬである）。試料を−８０℃で保存する。
【０１１２】
逆転写
Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて調製した３０μＬの混合物に３０μＬのＲＮＡを添加する。
【０１１３】
１０μＬの混合物は、２．０μＬの１０×ＲＴ緩衝液、０．８μＬのｄＮＴＰ、２．０μＬのランダムプライマー、１．０μＬのマルチスクライブ逆転写酵素及び４．２μＬの水を含む。反応は、サーモサイクラー中にて４段階で行われる：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分及び４℃で５分。試料を−８０℃で保存する。
【０１１４】
リアルタイムＰＣＲ
ＩＤＯ１アッセイを、エクソン９と１０の間のエクソン−エクソン接合部をカバーするように設計する。プライマーを、最適な長さが２０ｂｐ、かつＣＧ含有量が３０％〜８０％の間で、５８°Ｃ〜６１°Ｃの間の融解温度を持つように設計する。プローブを、プライマーの一つよりも１０℃高い融解温度を持ち、かつＧで開始しないように設計する。プライマー及びプローブを、それぞれ最終濃度４００ｎＭ及び２００ｎＭで使用する。
【０１１５】
例示的なＴａｑＭａｎアッセイは以下の配列によって表される。
プライマーＦ  ５’−ＧＡＡＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号０１）
プライマーＲ  ５’−ＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号０２）
プローブ：５’−ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴ−３’（配列番号０３）
【０１１６】
プローブは５’側をＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で及び３’側の端部をＭＧＢ（マイナーグローブバインダー、ＦＡＭスペクトル品質に適合する非蛍光消光剤、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入）で修飾する。定量的ＰＣＲのための混合物は、ＴａｑＭａｎ  遺伝子発現マスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を使用して調製される：それは１０μＬのマスターミックス  ２×、７μＬの水、０．８μＬのプライマーＦ（１０μＭ）、０．８μＬのプライマーＲ（１０μＭ）及び０．４μＬのプローブ（１０μＭ）を（１ウェル当たり）含む。１μＬのｃＤＮＡを１ウェル当たりで試験する。試料は３回ずつ実行される。各実験について、ネガティブコントロールも３回ずつ試験する。
【０１１７】
ＰＣＲプログラムは以下の通りである：ＵＮＧインキュベーション（５０℃で２分）。ポリメラーゼ活性化（９５℃で１０分）。ＰＣＲサイクル（４０×）：変性（９５℃で１５秒）及びアニーリング（６０℃で１分）。
【０１１８】
ＩＤＯのタンパク質の定量
ＥＬＩＳＡによるＩＤＯのタンパク質の定量には、１２５μＬの尿を使用した。このアッセイは、ヒトインドールアミン２，３−デオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）に結合する２つの選択されたポリクローナル抗体を用いる２部位サンドイッチ技術を利用する（イミューンダイアグノスティック社（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ）シュトゥーベンヴァルト−アレー（Ｓｔｕｂｅｎｗａｌｄ−Ａｌｌｅｅ）８ａ、６４６２５  ベンスハイム、ドイツのＩＤＫＲ  ＩＤＯ  ＥＬＩＳＡキット  Ｋ７７２７）。尿試料を、高アフィンポリクローナル抗ヒトＩＤＯ１抗体で被覆したマイクロプレートのウェルに添加する。第１のインキュベーション工程の間に、試料中のＩＤＯ１は固定化抗体によって捕捉される。次いで、ビオチン化検出抗体、ポリクローナル抗ヒトＩＤＯ１抗体を添加する。ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応物に添加し、そしてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をペルオキシダーゼの基質として使用する。反応を停止させるために酸性停止溶液を添加する。プレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定し、標準曲線から得られた値を使用してＩＤＯ１の濃度を計算する。
【０１１９】
データ分析
遺伝子発現の正規化は、ＧＡＰＤＨ又は１８Ｓのいずれかを用いて行った。２−ΔΔＣｔ法を使用して、ＤＲＥ前後の対象遺伝子（ＰＳＡ及びＩＤＯ）の倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を計算した。２−ΔΔＣｔ法を使用して、またＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較したＩＤＯの倍率の減少を１として計算した。１０−７以下の値はすべて検出不能と見なした。
【０１２０】
特定のカットオフの選択
臨床的に関連するＰＣａ（ＧＳ≧７）、緩慢性ＰＣａ（ＧＳ≦６）及びＰＣａを含まない生検患者と診断された患者を比較することによって、特定のカットオフを選択した。
【０１２１】
図１は、Ａ）カットオフ１（０．００１５）、カットオフ２（０．００７５）、カットオフ３（０．００９６）、カットオフ４（０．０４７９）、Ｂ）カットオフ５（４２ｐｇ／ｍＬ）、カットオフ６（２００ｐｇ／ｍＬ）の定義を示す。
【０１２２】
生検を受けている患者を陰性の結果（ＮＰＶ  １００％；０％偽陽性）で識別するために、０．００１５の第１のカットオフ（カットオフ１）を生成した。
【０１２３】
低リスクＰＣａを集めるために、０．００７５の第２のカットオフ（カットオフ２）を生成した。ＰＣａがＧＳ≦６かつＢＲ−の患者又はＰＣａを有さない患者の８２％がＩＤＯ＜０．００７５を発現した。このカットオフ２未満の患者には、生検は推奨されない。
【０１２４】
中／高リスクＰＣａを集めるために、０．００９６の第３のカットオフ（カットオフ３）を生成した。ＰＣａがＧＳ≦６かつＢＲ−又はＰＣａを有さない患者の９３．７％が、ＩＤＯ＜０．００９６を発現した。このカットオフ３を超える患者には、生検が常に推奨される。
【０１２５】
進行する可能性が高い患者を診断するために、０．０４７９の第４のカットオフ（カットオフ４）を生成した。このカットオフ４より上の患者は直ちに生検を受け、かつおそらく治療を受ける必要がある。
【０１２６】
生検を受けている患者を陰性の結果（ＰＣａのリスク：ＰＰＶ＝９０％；ＮＰＶ＝８３％）で識別するために、４２ｐｇ／ｍＬの第１のタンパク質カットオフ（タンパク質カットオフ１）を生成した。
【０１２７】
中／高リスクＰＣａを集めるために、２００ｐｇ／ｍＬの第２のタンパク質カットオフ（タンパク質カットオフ２）を生成した（ＰＰＶ＝１００％、ＮＰＶ＝６９％）。このタンパク質カットオフ２を超える患者には、生検が常に推奨される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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