(57)【要約】血中コレステロール、低密度リポタンパク質(LDL)のレベルを低減させるための、および/または、高コレステロール、高脂血症、脂質異常症、もしくは高レベルの低密度リポタンパク質(LDL)に関連する疾患の処置のための方法であって、それを必要とする対象にDRP1阻害剤を投与する工程を含む方法を、本明細書において提供する。ある特定の態様において、対象が従来のスタチン療法に対して不耐性を示す場合に、この対象を本明細書に記載の処置のために選択する。また、がんおよび炎症性疾患の処置におけるDRP1阻害剤の使用も、本明細書において想定する。2019532049.tif 000015
2019532049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中コレステロールレベルを低減させるための方法であって、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与する工程、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含み、それによって対象における血中コレステロールレベルが低減される、方法。
【請求項２】
DRP1の阻害剤が、DRP1発現を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
DRP1発現の阻害剤が、低分子または核酸から選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
核酸が、DRP1特異的RNA干渉物質、またはDRP1特異的RNA干渉物質をコードするベクターである、請求項1、2、または3記載の方法。
【請求項５】
DRP1特異的RNA干渉物質を、肝臓への送達のためにターゲティングさせる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
DRP1の阻害剤が、DRP1活性を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
DRP1活性の阻害剤が、DRP1に対する抗体またはその抗原結合断片、低分子、および核酸からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
核酸が、DRP1特異的RNA干渉物質、RNA干渉物質をコードするベクター、またはDRP1に結合するアプタマーである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
DRP1阻害剤が、薬学的に許容される担体と共に投与される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
DRP1阻害剤が、少なくとも1つの追加のコレステロール低下物質と共に投与される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つの追加のコレステロール低下物質が、スタチン、7-アルファヒドロキシラーゼ、肝臓X受容体アゴニスト、胆汁酸結合樹脂、コレステロール吸収阻害剤、フィブラート、ナイアシン、オメガ-3脂肪酸、およびプテロスチルベンからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
DRP1阻害剤が、対象における低密度リポタンパク質の低減を引き起こす、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
DRP1阻害剤が、対象における血清前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の低減を引き起こす、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
DRP1阻害剤が、対象の細胞におけるPCSK9 mRNAの低減を引き起こす、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
対象が、高レベルのコレステロールまたは高レベルの低密度リポタンパク質を有する、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
対象が、従来のスタチン療法に対して不耐性を示している、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
細胞における前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の分泌および発現を低減させるための方法であって、細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、該細胞において、PCSK9発現および/または分泌のレベルが、DRP1阻害剤と接触させる前の細胞におけるPCSK9発現および/または分泌のレベルと比べて減少する、方法。
【請求項１９】
それを必要とする哺乳動物における前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)血清レベルを減少させるための方法であって、哺乳動物中の細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、該哺乳動物において、PCSK9発現および/または分泌のレベルが、接触させる前のPCSK9発現および/または分泌のレベルと比べて減少する、方法。
【請求項２０】
細胞の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)の発現を増加させるための方法であって、細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、該細胞において、LDLR発現のレベルが、DRP1阻害剤と接触させる前の細胞におけるLDLR発現のレベルと比べて増加する、方法。
【請求項２１】
がんまたは炎症性疾患もしくは障害を処置するための方法であって、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与する工程、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含み、それによって、対象におけるがんまたは炎症性疾患/障害を処置する、方法。
【請求項２２】
DRP1阻害剤が、少なくとも1つの抗炎症剤および/または抗がん剤と組み合わせて投与される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
対象における上昇したコレステロールの処置において使用するための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤。
【請求項２４】
対象における上昇したコレステロールの処置のための医薬の製造において使用するための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤。
【請求項２５】
対象における上昇したコレステロールの処置のための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用。
【請求項２６】
対象における上昇したコレステロールの処置のための医薬の製造における、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用。
【請求項２７】
がんの処置のための医薬の製造における、ダイナミン関連タンパク質(DRP1)阻害剤の使用。
【請求項２８】
炎症性疾患または障害の処置のための医薬の製造における、ダイナミン関連タンパク質(DRP1)阻害剤の使用。
【請求項２９】
対象におけるがんまたは炎症性疾患/障害の処置において使用するための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年9月15日に出願された米国仮出願第62/394,799号の35 U.S.C. § 119(e)の下での恩典を主張するものであり、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、高コレステロール、高脂血症、または高レベルの低密度リポタンパク質(LDL)を含む疾患および/または障害の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アテローム性冠動脈心疾患(CHD)は、西欧諸国における死亡および心血管罹患率の主要原因である。アテローム性冠動脈心疾患のリスク因子は、高血圧、真性糖尿病、家族歴、男性である性別、煙草の煙、高い血清コレステロール、高い低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールレベル、および低い高密度リポタンパク質(HDL)コレステロールレベルを含むが、これらに限定されない。臨床研究は、上昇した総コレステロールまたはLDLコレステロールレベルが、ヒトのアテローム性動脈硬化症の発症機序において役割を果たし得ること、したがって、脂質低下物質がアテローム性動脈硬化症の治療および/または予防のための重要な治療法であることを示している。
【０００４】
LDLコレステロールレベルは、HMG-CoA還元酵素阻害剤の投与によって低下させることができる。このクラスの薬物は、肝臓によるコレステロール合成において律速である、HMG-CoA還元酵素という酵素を阻害する。加えて、これらの作用物質は、細胞表面上の肝LDL受容体の数を増加させて、LDLの取り込みおよび異化を増強する。HMG-CoA還元酵素阻害剤の1つの潜在的な欠点は、例えば肝臓毒性を含む、副作用プロファイルである。
【０００５】
PCSK9(前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型)は、細胞の表面上のLDL受容体に結合してその発現を調節するセリンプロテアーゼファミリーメンバーである。LDL受容体-PCSK9相互作用の阻害は、コレステロール障害の処置の魅力的な代替アプローチである。PCSK9を標的とする作用物質を見いだすために多大な努力が注がれてきたが、低分子PCSK9阻害剤の開発は、今までのところ成功していない。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明は、一部には、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害が、細胞から分泌されるPCSK9タンパク質の量の有意な減少を引き起こし、さらに低密度リポタンパク質受容体(LDLR)の発現の増加を引き起こすという観察によって発見された。したがって、血中コレステロール、低密度リポタンパク質(LDL)のレベルを低減させるための、および/または、高コレステロール、高脂血症、脂質異常症、もしくは高レベルの低密度リポタンパク質(LDL)に関連する疾患の処置のための方法であって、それを必要とする対象にDRP1阻害剤を投与することを含む方法を、本明細書に提供する。ある特定の態様において、対象が従来のスタチン療法に対して不耐性を示す場合に、この対象を本明細書に記載の処置のために選択する。
【０００７】
さらに、DRP1の阻害は、炎症性障害および/またはがんの処置にも想定される。
【０００８】
したがって、本明細書に記載の一局面は、血中コレステロールレベルを低減させるための方法であって、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与すること、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与することを含む方法に関する。
【０００９】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の一態様において、対象は、従来のスタチン処置に対して不耐性を示す。
【００１０】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、既存の療法プロトコル(例えば、従来のスタチン療法)への補助処置として加えられる。
【００１１】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1の阻害剤は、DRP1発現を阻害する。
【００１２】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1発現の阻害剤は、低分子および核酸から選択される。
【００１３】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、低分子は、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、またはこれら化合物の塩もしくはエステルもしくは他の薬学的に許容される形態、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、核酸、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体である。この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、低分子は、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物である。
【００１４】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、低分子阻害剤は、Mdivi-1(当技術分野において、3-(2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-4(1H)-キナゾリノン、3-(2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)-2-スルファニル-4(3H)-キナゾリノンとしても公知)である。Mdivi-1は、式Iで示される化学構造を有する。
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【００１５】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、核酸は、DRP1特異的RNA干渉物質、またはDRP1特異的RNA干渉物質をコードするベクターである。
【００１６】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、RNA干渉物質は、siRNA、miRNA、shRNAなどを含む。
【００１７】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、siRNAは、
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からなる群より選択される配列を含む。
【００１８】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1特異的RNA干渉物質は、送達のために肝臓を標的とする。
【００１９】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1の阻害剤は、DRP1活性を阻害する。
【００２０】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1活性の阻害剤は、DRP1に対する抗体またはその抗原結合断片、低分子、および核酸からなる群より選択される。
【００２１】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、低分子は、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、またはこれら化合物の塩もしくはエステルもしくは他の薬学的に許容される形態、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、核酸、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体である。この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、低分子は、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物である。
【００２２】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、低分子阻害剤は、Mdivi-1(当技術分野において、3-(2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-4(1H)-キナゾリノン、3-(2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)-2-スルファニル-4(3H)-キナゾリノンとしても公知)である。Mdivi-1は、式Iで示される化学構造を有する。
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【００２３】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、核酸は、DRP1特異的RNA干渉物質、RNA干渉物質をコードするベクター、またはDRP1に結合するアプタマーである。
【００２４】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、siRNAは、
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からなる群より選択される配列を含む。
【００２５】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、薬学的に許容される担体と共に投与される。
【００２６】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、少なくとも1つの追加のコレステロール低下物質と共に投与される。
【００２７】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、少なくとも1つの追加のコレステロール低下物質は、スタチン、7-アルファヒドロキシラーゼ、肝臓X受容体アゴニスト、胆汁酸結合樹脂、コレステロール吸収阻害剤、フィブラート、ナイアシン、オメガ-3脂肪酸、およびプテロスチルベンからなる群より選択される。
【００２８】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、対象における低密度リポタンパク質の低減を引き起こす。
【００２９】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、対象における血清前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の低減を引き起こす。
【００３０】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、対象の細胞におけるPCSK9 mRNAの低減を引き起こす。
【００３１】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、細胞(例えば、肝臓細胞、ヒト肝臓細胞など)上の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)発現の増加を引き起こす。
【００３２】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、対象は、高レベルのコレステロールまたは高レベルの低密度リポタンパク質を有する。
【００３３】
本明細書に提供される別の局面は、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。
【００３４】
また、別の局面において、細胞における前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の分泌および発現を低減させるための方法であって、細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、DRP1阻害剤と接触させる前の細胞におけるPCSK9発現および/または分泌のレベルと比べて、PCSK9発現および/または分泌のレベルが細胞において減少する方法が、本明細書に提供される。
【００３５】
この局面および本明細書に提供される全ての他の局面の別の態様において、DRP1阻害剤は、細胞(例えば、肝臓細胞、ヒト肝臓細胞など)上の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)発現の増加を引き起こす。
【００３６】
本明細書に提供される別の局面は、それを必要とする哺乳動物における、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)血清レベルを減少させるための方法であって、哺乳動物中の細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、接触させる前のPCSK9発現および/または分泌のレベルと比べて、PCSK9発現および/または分泌のレベルが哺乳動物において減少する、方法に関する。
【００３７】
本明細書に提供される別の局面は、それを必要とする哺乳動物中の細胞の表面上の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)発現を増加させるための方法であって、哺乳動物中の細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、接触させる前のLDLR発現のレベルと比べて、細胞上のLDLR発現のレベルが哺乳動物において増加する、方法に関する。
【００３８】
一態様において、細胞は、肝臓細胞(例えば、ヒト肝臓細胞または肝細胞)である。
【００３９】
また、別の局面において、対象における上昇したコレステロールの処置において使用するためのダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤が、本明細書に提供される。
【００４０】
本明細書に提供されるさらなる局面は、対象における上昇したコレステロールの処置のための医薬の製造において使用するためのダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤に関する。
【００４１】
本明細書に提供される別の局面は、対象における上昇したコレステロールの処置のためのダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用に関する。本明細書に提供される別の局面は、対象における上昇したコレステロールの処置のための医薬の製造におけるダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用に関する。
【００４２】
また、がんまたは炎症性疾患もしくは障害を処置するための方法であって、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与すること、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与することを含み、それによって、対象におけるがんまたは炎症性疾患/障害を処置する方法も、本明細書に提供される。
【００４３】
本明細書に提供される別の局面は、対象におけるがんの処置のための医薬の製造におけるダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用に関する。
【００４４】
本明細書に提供される別の局面は、炎症性疾患または障害の処置のための医薬の製造におけるダイナミン関連タンパク質(DRP1)阻害剤の使用に関する。
【００４５】
また、対象におけるがんまたは炎症性疾患/障害の処置において使用するためのダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤が、本明細書に提供される。
【００４６】
定義
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」、「生理学的に耐容される」、およびそれらの文法上の変形は、これらが組成物、担体、希釈剤、および試薬を指す場合、互換的に使用され、かつ、その材料を、例えば吐き気、目眩、急性の胃の不調などの望ましくない生理学的効果の発生なしに、哺乳動物へまたはそれに対して投与できることを表す。薬学的に許容される担体は、そのように望まれない限り、それと混合される作用物質に対する免疫応答の上昇を促進しないであろう。薬理学的組成物（その中に溶解または分散された活性成分を含有する）の調製は、当技術分野においてよく理解されており、製剤に基づいて制限される必要はない。典型的には、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なように調製されるが、使用前に液体状態の溶液または懸濁液とするのに適した固体形態を調製することもできる。また、その調製物を乳化することも、リポソーム組成物として提供することもできる。活性成分を、薬学的に許容されかつ活性成分と適合可能な賦形剤と、本明細書に記載の治療法における使用に適した量で混合することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、所望であれば、組成物は、活性成分の有効性を増強する少量の補助物質、例えば湿潤または乳化剤、pH緩衝化剤などを含有することができる。本明細書に記載の治療用組成物は、その中に構成成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩は、無機酸(例えば、塩酸またはリン酸など)、または有機酸(酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような)と形成される酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される)を含む。また、遊離カルボキシル基と形成される塩を、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄)、および有機塩基(イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような)から誘導することもできる。生理学的に耐容される担体は、当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、滅菌水溶液であって、活性成分および水の他に材料を含有しないか、または、緩衝剤（例えば、生理学的pH値のリン酸ナトリウム）、生理食塩水、または両方（例えばリン酸緩衝食塩水）を含有する。なおさらに、水性担体は、2種以上の緩衝塩、ならびに、塩化ナトリウムおよびカリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有することができる。液体組成物はまた、水に加えて、またそれなしで液相を含有することもできる。例示的なそのような追加の液相は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油乳剤である。特定の障害または病態の処置において有効であろう、本明細書に記載の方法において使用される活性作用物質の量は、障害または病態の性質に依存し、標準的な臨床技術によってこれを決定することができる。一態様において、「薬学的に許容される」担体は、インビトロ細胞培養培地を含まない。
【００４７】
一態様において、用語「薬学的に許容される」は、動物、より特定するとヒトにおいて使用するための、連邦規制機関もしくは州政府によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙されている成分を指す。具体的には、それは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益/リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適した、それらの化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。
【００４８】
用語「担体」は、治療薬が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌の液体、例えば、水および油（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源の油を含む）であることができる。薬学的組成物が静脈内に投与される場合、担体として水を使用することができる。また、食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体担体（特に注射液剤用の）として用いることもできる。好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜（chalk）、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望であれば、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはpH緩衝化剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物を、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体と共に坐剤として製剤化することができる。経口用製剤は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)に記載されている。製剤は、投与の様式に合わせられるべきである。
【００４９】
「対象」は、本明細書において使用される場合、中でも、ヒト、実験動物(マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど)、家畜、競技用動物、および家庭内動物またはペット(ネコまたはイヌなど)を含むことができる。本明細書に記載の処置のために、ヒト以外の霊長類、および、好ましくは、ヒト患者が具体的に想定される。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「高脂血症」または「脂質異常症」は、低密度リポタンパク質(LDL)、遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、およびトリグリセリドなどの脂質の、異常に上昇した血中レベルに関連する病態を指す。高脂血症は、それ自体で特異的な症状を示さないが、血中の過度の脂質が、血管壁に付着して血管サイズを低減させ、炎症反応によってアテローム性動脈硬化症を引き起こす。この理由から、冠動脈心疾患、脳血管疾患、末梢血管の梗塞などが高脂血症を有する対象において生じ得る。したがって、本明細書に記載のDRP1阻害剤を、高脂血症、脂肪肝疾患、またはアテローム性動脈硬化症だけでなく、冠動脈心疾患、脳血管疾患、または末梢血管の梗塞の処置にも使用することができる。
【００５１】
一態様において、本明細書において使用される場合、「処置(treatment)」または「処置すること(treating)」は、疾患または病的状態の症状または病変に対するあらゆる有益なまたは望ましい効果を含み、かつ、処置されている疾患または病態の1または複数の測定可能なマーカーの最小限の低減さえ含み得る。別の態様において、処置は、場合により、疾患もしくは病態の症状の低減もしくは改善、または疾患もしくは病態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。「処置」は、必ずしも、疾患もしくは病態、またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【００５２】
一態様において、本明細書において使用される場合、「予防する(prevent)」および類似語、例えば「予防される(prevented)」、「予防すること(preventing)」などは、疾患または病態を予防する、阻害する、またはその発生もしくは再発の可能性を低減させるためのアプローチを示す。別の態様において、この用語は、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることを指す。別の態様において、本明細書において使用される場合、「予防(prevention)」および類似語は、疾患または病態の発症または再発前に、疾患または病態の強さ、影響、症状、および/または負担を低減させることを含む。
【００５３】
作用物質の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および重量、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用物質の効力(例えば、血清LDLレベルを少なくとも10%低減させる)などの要因に応じて変動し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が、DRP1阻害剤のあらゆる毒性または有害な効果を上回るような量でもある。用語「治療有効量」は、対象(例えば、患者)を「処置する」のに有効な量を含む。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「ヒト化」抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片(抗体のFv、Fab、Fab'、F(ab')2、または他の抗原結合サブ配列など)である、ヒト以外(例えば、マウス)の抗体の形態であって、最小限の、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する配列を含有するものを指す。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するヒト以外の種（マウス、ラット、またはウサギなど）のCDR(ドナー抗体)由来の残基で置換されているものである。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応するヒト以外の残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見いだされないが、抗体性能をさらに改良および最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト以外の免疫グロブリンのものに対応し、かつFR領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン(Fc)（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部も含む。好ましいものは、WO 99/58572に記載の通りに修飾されたFc領域を有する抗体である。他の形態のヒト化抗体は、元の抗体に対して変更された1または複数のCDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2、および/またはCDR H3)を有し、これらは、元の抗体由来の1または複数のCDRに「由来する」1または複数のCDRとも呼ばれる。
【００５５】
語句「併用療法」は、治療用物質の共作用から有益な効果を提供することを意図した特定の処置レジメンの一部としての、第二の作用物質(例えば、スタチン)の投与と組み合わされたDRP1阻害剤の投与を包含する。「併用療法」は一般に、別々の単剤療法レジメンの一部としての、これらの治療用物質の2以上の投与（偶発的および恣意的に、本発明の組み合わせをもたらすもの）を包含することを意図していない。「併用療法」は、これらの治療用物質の実質的に同時または逐次的な投与、すなわち、各治療用物質が同じまたは異なる時点に投与される投与を包含することを意図する。実質的に同時の投与は、例えば、対象に、各治療用物質の比が固定されている単一の組成物を投与するか、または、各治療用物質についての単一の組成物を複数種投与することによって、達成することができる。各治療用物質の逐次的または実質的に同時の投与を、肝内経路、静脈内経路、および非経口経路を非限定的に含む任意の適切な経路によって達成することができる。治療用物質を、同じ経路によって投与しても、異なる経路によって投与してもよい。例えば、選択された組み合わせの第一の治療用物質を、静脈内注射によって投与することができ、一方で、組み合わせの他の治療用物質を、肝内注射によって投与することができる。代替的に、例えば、全ての治療用物質を直接注射によって肝臓へ投与することができ、または、全ての治療用物質を静脈内注射によって投与してもよい。いくつかの態様において、治療用物質が投与される順序は、それほど重要ではない。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分(例えば、限定されないが、高脂血症または心血管疾患処置のための第二および異なる作用物質)および非薬物療法(例えば、限定されないが、外科手術および生活習慣介入)とさらに組み合わされたDRP1阻害剤の投与を包含することもできる。組み合わせの作用物質は、例えば心血管疾患のリスク因子を低減または排除する（例えば、スタチン剤との共処置によって高コレステロール血症を低減させる）、または、メトホルミンの投与によって糖尿病症状を低減させるために使用される薬物を含むことができる。
【００５６】
用語「減少させる(decrease)」、「低減される(reduced)」、「低減(reduction)」、または「阻害する(inhibit)」は全て、統計学的に有意な量の減少を意味するために本明細書において使用される。いくつかの態様において、「低減する」、「低減」または「減少させる」または「阻害する」は、典型的には、基準レベル(例えば、所与の処置がない)と比較して少なくとも10%の減少を意味し、かつ、例えば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはより多い減少を含むことができる。本明細書において使用される場合、「低減」または「阻害」は、基準レベルと比較して完全な阻害または低減を包含するものではない。「完全な阻害」は、基準レベルと比較して100%の阻害である。
【００５７】
用語「増加される(increased)」、「増加させる(increase)」または「増強する(enhance)」または「活性化する(activate)」は全て、統計学的に有意な量の増加を一般的に意味するために本明細書において使用される; あらゆる疑念を避けるために、用語「増加される」、「増加させる」または「増強する」または「活性化する」は、基準レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%の増加、または100%以下の増加、または10〜100%の間の任意の増加、または基準レベルと比較して少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、少なくとも約1000倍の増加、またはより多い増加を意味する。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「含む(comprising)」は、提示された既定の要素に加えて他の要素も存在できることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【００５９】
用語「からなる」は、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成成分であって、その態様の記載に列挙されていない要素を全く含まないものを指す。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の態様に必要な要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基礎的かつ新規または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を容認する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図1A〜1F  DRP1阻害はヒト肝臓細胞においてPCSK9分泌を低減させる。(図1A)SILAC質量分析によって同定された、Mdivi-1処置(50μmol/L)の24時間後の、HepG2分泌タンパク質変化のボルケーノプロット(Volcano plot)統計解析。(図1B)ビヒクル(0.01% DMSO)、Mdivi-1(50μmol/L)、ピタバスタチン(1μmol/L)、T0901317(1μmol/L)、クロロキン(50μmol/L)、MG132(0.3μmol/L)を加えた24時間後に収集されたHepG2培地を使用した、分泌されたPCSK9のELISA;および(図1C)HepG2細胞内PCSK9タンパク質。(図1D)HepG2 CRISPR/Cas9 DRP1ウェスタンブロットおよび分泌されたPCSK9のELISA。(図1E)24時間処置された初代ヒト肝細胞由来の分泌されたPCSK9のELISA、ならびにPCSK9およびLDLRのmRNA;および(図1F)初代ヒト肝細胞の細胞内PCSK9タンパク質。n=少なくとも3回の実験または3人のドナーからのプールデータ。エラーバー、標準偏差; ns=有意でない、*P<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001。
【図２】図2A〜2D  DRP1阻害はc-Junを介してHepG2 LDLRを増加させる。(図2A)ビヒクル(0.01% DMSO)またはMdivi-1(50μmol/L)での24時間処置後の、HepG2のSREBP-2、SREBP-1a、SREBP-1c、HNF1αのmRNA。(図2B)ビヒクル、Mdivi-1、ピタバスタチン(1μmol/L)、および/またはT0901317(1μmol/L)での24時間処置後の、HepG2のLDLRタンパク質およびmRNA;ならびに(図2C)HepG2のHMGCRタンパク質。(図2D)HepG2および初代ヒト肝細胞からのJUNのmRNAおよび代表的なc-Junウェスタンブロット。n=少なくとも3回の実験または3人のドナーからのプールデータ。エラーバー、標準偏差; ns=有意でない、*P<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001。
【図３】図3A〜3D  DRP1阻害はヒト肝臓細胞の細胞骨格またはERの形態を変化させず、DRP1はHepG2においてERに部分的に局在する。(図3A)ビヒクル(0.01% DMSO)またはMdivi-1(50μmol/L)で24時間処置されたHepG2および初代ヒト肝細胞由来の、有意差を示さない細胞骨格関連mRNAパネル。(図3B)24時間のMdivi-1処置後の、代表的なHepG2 α-チューブリンおよびファロイジン共焦点免疫蛍光;バー、10μm。(図3C)HepG2 CRISPR/Cas9電子顕微鏡検査の代表的なER形態画像;バー、500nm。(図3D)DRP1免疫金標識の代表的なHepG2電子顕微鏡検査画像;矢印は、ER出口部位におけるDRP1の例を示し、矢尻は、細胞質ベシクルにおけるDRP1の例を示す;バー、100nm。エラーバー、標準偏差; n=3回の実験または3人のドナー。
【図４】図4A〜4C  Mdivi-1はHepG2におけるオートファジーフラックスを減じる。(図4A)ビヒクル(0.01% DMSO)、Mdivi-1(50μmol/L)、クロロキン(50μmol/L)、および/またはMG132(0.3μmol/L)で24時間処置されたHepG2由来の、p (S349) p62、p62、LC3、BECLIN1、およびBCL-XLのウェスタンブロット。(図4B)ビヒクル、Mdivi-1、クロロキン、および/またはMG132を加えて24時間後の、LC3およびp62の共焦点免疫蛍光。白色の矢印は、核周囲p62凝集体の例を示す。(図4C)Mdivi-1と共にMG132を加えて24時間後の、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)およびp62の共焦点免疫蛍光。白色の矢尻は、p62/LAMP1陽性核周囲凝集体の例を示す。エラーバー、標準偏差; ns=有意でない、*P<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001;n=3回の実験。
【図５】図5A〜5C  肝臓のDrp1欠損はマウスにおいてPCSK9分泌を低減させる。1ヶ月齢の非絶食給餌飼育の雄マウス由来の(図5A)重量、血清濃度、および(図5B)血漿リポタンパク質プロファイル。(図5C)肝臓LDLR、PCSK9、HMGCRタンパク質およびmRNA。n=5匹のマウス/群。エラーバー、標準偏差; ns=有意でない、*P<0.05、**<0.01。
【図６】図6A〜6C  肝臓のDrp1欠損はマウス肝臓SREBPを変化させない。1ヶ月齢の非絶食給餌飼育の雄マウス由来の(図6A)肝臓SREBP2、(図6B)SREBP1、および(図6C)HNF1αタンパク質ならびにmRNA。n=5匹のマウス/群。エラーバー、SEM。ns=有意でない。n=5匹のマウス/群。エラーバー、標準偏差; ns=有意でない。
【図７】図7A〜7B  肝臓のDrp1欠損はマウスにおいてp62を増加させる。(図7A)1ヶ月齢の非絶食給餌飼育の雄マウス由来の肝臓p62およびLC3タンパク質。n=5匹のマウス/群。エラーバー、標準偏差; ns=有意でない、***P<0.001。(図7B)提案されたワーキングモデル:Mdivi-1は、HepG2におけるPCSK9を、SREBP-1c媒介性転写調節の低減を介して部分的に阻害し得る。DRP1阻害は、ヒト肝臓細胞およびマウスにおけるPCSK9分泌を、減じたオートファジーフラックスが関与するタンパク質恒常性の調節を介してより広範に低減させ、プロテアソームを介したPCSK9のER保持および分解を導き得る。
【図８】図8A〜8B  PCSK9およびLDLR抗体の確認。(図8A)ネイティブでヒトPCSK9を過剰発現するHEK293細胞、CRISPR/Cas9の仲介でPCSK9がノックアウトされたHeLa細胞(KO)、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性過剰発現を介してマウスPCSK9を過剰発現するマウス由来の肝臓溶解物を使用した、抗ヒトPCSK9抗体(抗体1;R&D systems)のヒトPCSK9検出確認。(図8B)C57BL/6およびLDLR欠損(Ldlr-/-)肝臓溶解物のウェスタンブロットを使用した、抗マウス/ラットPCSK9抗体(抗体2;R&D systems)のヒトおよびマウスPCSK9検出確認、およびLDLR抗体(BioVision Inc.)の確認。
【図９】図9A〜9D  DRP1阻害はヒト肝臓細胞のDRP1存在量を変更しない。(図9A)ビヒクル(0.01% DMSO)、Mdivi-1(50μmol/L)、ピタバスタチン(1μmol/L)、および/またはT0901317(1μmol/L)での24時間処置後の、HepG2の総DRP1タンパク質およびリン酸化(S637、S616)DRP1タンパク質。(図9B)24時間のMdivi-1処置後のHepG2の生存率。(図9C)初代ヒト肝細胞DRP1、アポリポタンパク質E(APOE)、ABC結合カセット輸送体1(ABCA1)、および(図9D)SREBP-2、SREBP-1a、SREBP-1c、およびHNF1AのmRNA。エラーバー、標準偏差。ns=有意でない、*P<0.05、**<0.01、***<0.001、****<0.0001;n=少なくとも3回の実験または3人のドナー。
【図１０】図10A〜10B  Mdivi-1は、HepG2細胞において、ミトコンドリアまたはERの分布およびミトコンドリア膜電位を変化させたようには見えなかった。(図10A)ビヒクル(0.01% DMSO)またはMdivi-1(50μmol/L)で24時間処置されたHepG2における、ミトコンドリア(抗ミトコンドリア抗体)およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI;ERマーカー)共焦点免疫蛍光、ならびに(図10B)ミトコンドリア膜電位。
【図１１】図11A〜11D  HepG2のBCL2タンパク質は検出以下であり、ヒト肝臓S9画分はDRP1およびBCL-XLを含有した。(図11A)HepG2および初代ヒト肝細胞の、BECLIN1およびBCL2のmRNA。(図11B)使用された実験条件においてBCL2タンパク質が検出以下であったことを示す代表的なウェスタンブロット:ビヒクル(0.01% DMSO)、Mdivi-1(50μmol/L)、クロロキン(50μmol/L)、および/またはMG132(0.3μmol/L)で24時間処置されたHepG2。THP1(ヒト単球細胞株)溶解物を、BCL2ウェスタンブロット陽性対照として使用した。(図11C)ヒト肝臓S9画分(細胞質ゾルおよびERを含有する)のDRP1およびBCL-XLウェスタンブロット。(図11D)24時間処置後の、HepG2のBCL2L1のmRNA。エラーバー、標準偏差。ns=有意でない、**P<0.01、****<0.0001;n= HepG2については3回の実験、ヒト肝臓S9画分の分析については、50人のドナー由来のプール溶解物。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
血中コレステロールレベルを低減させるための方法および組成物が本明細書に提供され、この方法は、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与する工程、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含む。本発明は、DRP1の阻害剤を投与することによる、高LDLコレステロールを含む疾患および/または障害の処置に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法および組成物は、従来のスタチン療法に対して不耐性を示す対象の処置に有用である。本明細書に提供される方法および組成物は、そのような対象のスタチン療法に対する感受性を回復させる。したがって、本明細書において、DRP1の阻害剤またはその組成物を、従来のスタチン療法に対する補助療法として使用できることがさらに想定される。
【００６３】
高脂血症/脂質異常症
高脂血症または脂質異常症は、遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、およびトリグリセリドなどの脂質の上昇した血中レベルに関連する病態を指す。高脂血症は、3種の形態で出現しうる:(1)高コレステロール血症、(2)高トリグリセリド血症、および(3)複合型高脂血症(高コレステロール血症および高トリグリセリド血症)。高脂血症は一般に、原発性高脂血症および二次性高脂血症に分類される。原発性高脂血症は一般に、遺伝的欠陥によって引き起こされるが、二次性高脂血症は、種々の疾患状態、薬物、および食習慣によって引き起こされる。加えて、高脂血症はまた、高脂血症の一次および二次的原因の組み合わせによっても引き起こされる。高脂血症の診断の基準として、総コレステロールレベル220mg/dl以上およびトリグリセリドレベル150mg/dl以上が一般に使用される。
【００６４】
哺乳動物に天然に存在するコレステロールには種々の形態がある。低密度(LDL)コレステロールは、健康に有害であると知られており、LDLコレステロールの増加が心疾患のリスクを増加させることが知られている(Assman et al., Am. J. Card, 1996)。加えて、高密度(HDL)コレステロールは、アテローム性動脈硬化症などを防止するので、善玉コレステロールと見なされ、健康に不可欠である。LDLコレステロールの低減は、現在のところ、脂質異常症管理の第一目標である。
【００６５】
高脂血症は、それ自体で特異的な症状を示さないが、血中の過度の脂質が、血管壁に付着して血管サイズを減少させ、炎症反応によってアテローム性動脈硬化症を引き起こす。この理由から、冠動脈心疾患、脳血管疾患、末梢血管の梗塞などが生じ得る(E. Falk et al., Circulation, 1995)。加えて、過度の血中脂質は、肝臓組織に蓄積され、ひいては脂肪肝疾患を引き起こし得る。脂肪肝は、肝臓の重量における脂肪の比率が5%を超える病態を指す。脂肪肝は、過度の脂肪の摂取だけでなく、アルコールの摂取によっても引き起こされ得る。
【００６６】
血中脂質レベルを低減させるために使用される現行の方法は、食事療法、運動療法、および薬物療法を含む。しかし、食事療法または運動療法は、厳密に制御および実施することが難しく、そして、その治療効果も限定される。
【００６７】
これまでに開発された、脂質レベル、特定すると低密度リポタンパク質を低減させるための薬物は、胆汁酸結合樹脂、コレステロール低下薬（例えば、コレステロール生合成において重要なHMG-CoA還元酵素阻害剤）、トリグリセリド低下薬、例えばフィブリン酸誘導体およびニコチン酸などを含む。しかし、これらの薬物は、肝毒性、消化器疾患、および発がんなどの副作用を有すると報告された。したがって、有意な副作用が少ない、高脂血症および関連疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症および脂肪肝疾患)を処置するために使用することができる薬物の開発の緊急の必要性がある。
【００６８】
脂質低下処置を開始する決定は、典型的には、症例毎になされる。高脂血症はそれ自体、無症状性であり、したがって、1または複数の臨床検査、例えば総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質(LDL)レベル、高密度リポタンパク質(HDL)レベル、LDL:HDL比などで診断される必要があることに留意することが重要である。当業者は、現在の脂質レベル、心血管疾患(CVD)の有無、およびCVDの他のリスク因子を考慮して、処置を特徴づける（inform）ことができる。例えば米国心臓協会(The American Heart Association)によって提供されるガイドラインを使用して、高脂血症を有する個体の処置を、リスク因子、現在の健康状態などに基づき指導することができる。特に、米国心臓協会は、以下のカテゴリーの1または複数に分類される対象はスタチンなどの脂質低下療法で処置されるべきであると勧告している。当業者は、これらの対象が、高脂血症に関連する有害効果のリスクが高く、よって、DRP1阻害剤での本明細書に記載の処置が有益である可能性が高いことを認識するであろう。
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【００６９】
一態様において、対象は、上昇した血中低密度リポタンパク質の診断、または上昇した血中LDLを含む疾患または障害の診断の結果、DRP1阻害剤での処置のために選択される。
【００７０】
一態様において、対象は、従来のスタチン療法への不耐性の結果、DRP1阻害剤での処置のために選択される。別の態様において、対象は、DRP1および第二の脂質低下物質、例えばスタチンを含む併用療法で処置される。
【００７１】
がん
DRP1阻害は、ヒト細胞および動物モデルにおける肺がんの処置において有益である。したがって、DRP1阻害剤を含有する組成物の投与を含む、がんを処置するための方法が、本明細書に提供される。本質的に全てのがんまたはがん細胞集団またはがん細胞を、本明細書に記載の方法に従って処置することができる。例示的ながんは、膀胱がん;乳がん;脳転移;膠芽腫および髄芽腫を含む脳がん;子宮頸がん;絨毛がん;結腸直腸がんを含む結腸がん;子宮内膜がん;食道がん;胃がん;頭頚部がん;急性リンパ性および骨髄性白血病、多発性骨髄腫、AIDS関連白血病および成人T細胞白血病、リンパ腫を含む血液学的新生物; ボーエン病およびページェット病、肝臓がんを含む上皮内新生物;小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん;ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫;神経芽腫;扁平上皮がんを含む口腔がん;骨肉腫;上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫および骨肉腫を含む肉腫;黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞がん、および扁平上皮がんを含む皮膚がん;胚性腫瘍（精上皮腫など）、非精上皮腫(奇形腫、絨毛がん)、間質性腫瘍、および胚細胞腫瘍を含む精巣がん;甲状腺腺がんおよび髄様がん(medullar carcinoma)を含む甲状腺がん;移行性がん、ならびに腺がんおよびウィルムス腫瘍を含む腎臓がんを含むが、これらに限定されない。
【００７２】
炎症性障害
PCSK9の阻害は、炎症誘発機能を有すると示唆されている。したがって、DRP1阻害を通じたPCSK9の阻害が炎症を低減させることができ、それによって、炎症性疾患または障害を処置できることが本明細書において想定される。本質的に全ての免疫疾患または障害を、本明細書に記載の方法および組成物を使用して処置することができる。用語「免疫疾患または障害」は、急性炎症と慢性炎症の両方を包含することを意図する。
【００７３】
いくつかの態様において、用語「免疫疾患または障害」は、炎症に関連する疾患および病態を指し、これらは、(1)炎症性またはアレルギー性疾患、例えば全身性アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー、昆虫刺傷アレルギー;炎症性腸疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、および腸炎;膣炎;乾癬、および炎症性皮膚疾患、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹;血管炎;脊椎関節症;強皮症;呼吸アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患など、(2)自己免疫性疾患、例えば関節炎(リウマチ性および乾癬性)、骨関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、糸球体腎炎など、(3)移植片拒絶(同種移植片拒絶および移植片対宿主病を含む)、ならびに(4)望まれない炎症応答が阻害されるべきである他の疾患(例えば、筋炎、炎症性CNS障害、例えば卒中および閉鎖性頭部外傷、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、およびベーチェット症候群)を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
他の態様において、用語「免疫疾患または障害」は、急性または慢性炎症の状態を指す。急性炎症応答は、有害な作用物質に対する免疫系による即時の応答である。応答は、血管拡張、内皮活性化、および好中球活性化を含む。急性炎症応答は、消失するか、または慢性炎症に進展するかのいずれかとなる。
【００７５】
慢性炎症は、長期間、すなわち数週間、数ヶ月間、またはさらに無制限の期間にわたる炎症応答であり、その長びいた時間経過は、組織内の炎症または自己免疫障害の発生の原因となる刺激の持続によって誘発される。この炎症プロセスは、不可避的に組織損傷を引き起こす。慢性炎症の正確な性質、程度、および時間経過は様々であり、原因となる作用物質とそれを除去しようとする身体の試みの間の均衡に依存する。慢性炎症を生じる作用物質は、宿主の防御を回避するか、またはそれに抵抗して、組織中に長期間存続することができる、感染性生物;元来は抵抗性ではないが、宿主の防御から保護されている損傷領域において存続する、感染性生物;酵素分解または食作用によって排除できない、刺激性で非生物の異物;または、刺激物質が、自己免疫疾患を引き起こす「正常」または「自己」組織成分である場合を含むが、これらに限定されない。慢性炎症の要素を示す数多くの疾患がある。これらは、炎症性関節疾患(例えば、関節リウマチ、骨関節炎、多発性関節炎、および痛風)、慢性炎症性結合組織疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、および皮膚筋炎、血管炎、混合性結合組織疾患(MCTD)、腱炎、滑膜炎、細菌性心内膜炎、骨髄炎、および乾癬);慢性炎症性肺疾患(例えば、慢性呼吸器疾患、肺炎、線維化性肺胞炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、肺気腫、珪肺および他の塵肺、および結核);慢性炎症性腸疾患および消化管炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病);慢性神経炎症性疾患(例えば、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、多発性硬化症、ギラン-バレー症候群、および重症筋無力症);他の炎症性疾患(例えば、乳腺炎、蹄葉炎、喉頭炎、慢性胆嚢炎、橋本甲状腺炎、炎症性乳房疾患);創傷における埋め込まれた異物によって引き起こされる慢性炎症;ならびに、半月形糸球体腎炎、ループス腎炎、ANCA関連糸球体腎炎、巣状分節性壊死性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、および尿細管間質性腎炎を含む慢性炎症性腎臓疾患を含むが、これらに限定されない。糖尿病性腎症は、慢性炎症性の要素をも有することがあり、慢性炎症応答は、移植された臓器の拒絶反応に関与する。慢性炎症の症状を有する疾患の他の非限定例は、肥満、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、乾癬、サルコイドーシス、プラーク破綻を含むアテローム性動脈硬化症、シェーグレン病、酒土性座瘡、梅毒、化学的熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、ベーチェット症候群、スティーブンス・ジョンソン病、マイコバクテリア感染、単純ヘルペスウイルス感染、帯状ヘルペス感染、原虫感染、モーレン潰瘍、ハンセン病、ウェゲナーサルコイドーシス、類天疱瘡、ループス、全身性エリテマトーデス、多発動脈炎、ライム病、バルトネラ症(Bartonelosis)、結核、ヒストプラズマ症、ならびにトキソプラズマ症を含む。
【００７６】
炎症によって特徴付けられる、炎症によって引き起こされる、炎症から生じる、または炎症によって影響を受ける本質的に全ての疾患または障害を、本明細書に記載の方法および組成物で処置することができる。本明細書に記載の方法での処置について想定される他の疾患または障害は、中でも、座瘡、アンギーナ、関節炎、誤嚥性肺炎、蓄膿症、胃腸炎、壊死性腸炎、骨盤内炎症性疾患、咽頭炎、胸膜炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
PCSK9
NARC-1としても知られるPCSK9は、ある種の家族性高コレステロール血症における遺伝子突然変異を有するタンパク質として最初に同定された。PCSK9は、小胞体においてモチーフLVFAQで自己触媒的なプロセッシングを受けるチモーゲンとして合成される。集団研究は、一部のPCSK9突然変異が「機能獲得型」であり、常染色体優性高コレステロール血症を有する個体で見いだされる一方で、他の「機能喪失型」(LOF)突然変異が低減された血漿コレステロールに関連していることを示している。この群での罹患率および死亡率研究は、PCSK9機能を低減させることで心血管疾患のリスクが有意に減退したことを明確に実証した。
【００７８】
心血管疾患の処置において顕著に重要なことに、機能喪失型突然変異は、ヒトをスタチン感受性にさせ得るので、これによって、より低い用量で有効性を可能にし（よって、安全性および寛容に関連するリスクを改善させる）、現行の治療によるものよりも低い血漿コレステロールレベルを達成する可能性がある。
【００７９】
PCSK9は、主に肝細胞によって血漿内に分泌される。マウスにおけるPCSK9の遺伝子モジュレーションは、PCSK9が血中脂質を調節できることを確認し、肝LDLRタンパク質レベルをダウンレギュレーションするように作用することを示唆した。
【００８０】
理論に束縛されるものではないが、過剰発現された場合、PCSK9は、肝細胞内でも作用し、LDLRの分泌されたリガンドとしても作用し得る。細胞外PCSK9が細胞表面LDLRに結合して、細胞内部位でのLDLR分解を促進するという強力な証拠が存在する。しかし、PCSK9とLDLRの2つのタンパク質が小胞体(ER)内で翻訳され、エンドソーム区画を通って細胞膜に向かって輸送される場合に、PCSK9がLDLRと相互作用できる可能性もある。
【００８１】
PCSK9の治療的阻害に関して、PCSK9に対する抗体は、有効な脂質低下物質であることが示されている。しかし、PCSK9抗体の使用は、抗体の作製コストが高いこと、保存が困難であること、および注射による投与を必要とすることを含め、患者コンプライアンスを低減させ得る特定の欠点を有する。しかし、PCSK9抗体を使用する代わりに上流のタンパク質DRP1を阻害することによってPCSK9活性を標的とすることは、はるかに少ない臨床上の欠点をもたらし得る。
【００８２】
加えて、PCSK9は、炎症誘発機能を有することが示されており、したがって、（例えば、本明細書に記載のDRP1阻害剤を使用した）PCSK9の阻害は、炎症性障害および/または自己免疫疾患の処置のための重要な治療戦略である。さらに、不適切で炎症誘発性の伝達物質ががんの発生および進行において役割を果たしているという理解が進んでおり、したがって、DRP1/PCSK9軸の阻害が抗がん効果を媒介すると予想される。
【００８３】
実施例における本明細書に記載の研究は、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害が、部分的には、肝細胞からのPCSK9の分泌を低減させることによって、PCSK9活性を低減させることを示す。加えて、DRP1阻害剤はまた、肝臓細胞の表面上のLDLR発現の増加も引き起こす。したがって、DRP1阻害剤は、DRP1を阻害し、これがPCSK9分泌を防止して、低密度リポタンパク質(LDL)の血中レベルを、例えば増強されたLDLR発現によりLDL取り込みを増加させることによって低減させると想定される。
【００８４】
DRP1阻害剤
DRP1阻害剤は、抗体または抗体断片、RNA干渉物質、および低分子を含むことができるが、これらに限定されない。当業者は、候補物質がDRP1阻害活性を含むかを、例えば、Qi et al. (2013) J. Cell Sci 126:789-802およびLeonard et al. (2005) Methods Enzymol 404:490-503に記載されているものなどのインビトロアッセイでDRP1活性を測定することによって、容易に決定することができる。高脂血症の処置のために具体的に想定されるDRP1阻害剤および/または本明細書に記載の薬学的組成物としての製剤が、以下本明細書に提供される。
【００８５】
DRP1に対する抗体：一態様において、例えばDRP1に結合する治療用抗体が、本明細書において、高脂血症(例えば、上昇した低密度リポタンパク質(LDL))を含む疾患または障害の処置に使用される。
【００８６】
本明細書に記載の方法に従って使用することができる「抗体」は、完全な免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合断片、ならびに免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む。免疫グロブリンの抗原結合断片は、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、およびdAbを含む。結合特異性を保持するが望ましくあり得る他の特徴(例えば、二重特異性、多価(3以上の結合部位)、および小型(例えば、結合ドメイン単独)を含む)を有する、修飾された抗体フォーマットが開発されている。単鎖抗体は、これらが由来する全抗体の定常ドメインの一部または全部を欠いている。それ故、これらは、全抗体の使用に関連する問題の一部を克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子との間のある特定の望まれない相互作用がない傾向がある。追加的に、単鎖抗体は、全抗体よりもはるかに小さく、全抗体よりも大きい透過性を有することができ、これによって、単鎖抗体は、標的抗原結合部位により効率的に局在および結合することが可能となる。さらに、単鎖抗体の比較的小さいサイズによって、これらがレシピエントにおいて不要な免疫応答を誘発する可能性が、全抗体よりも低くなる。複数の単鎖抗体（各単鎖が、第一のペプチドリンカーによって共有連結された1つのVHおよび1つのVLドメインを有する）が、少なくとも1または複数のペプチドリンカーによって共有連結されて、多価単鎖抗体（単一特異性または多重特異性でありうる）を形成することができる。多価単鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片および可変重鎖断片を含み、ペプチドリンカーによって少なくとも1つの他の鎖に連結される。ペプチドリンカーは、少なくとも15個のアミノ酸残基から構成される。リンカーアミノ酸残基の最大数は、およそ100個である。2つの単鎖抗体を組み合わせて、二価二量体としても知られるダイアボディを形成することができる。ダイアボディは、2本の鎖および2つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であることができる。ダイアボディの各鎖は、VLドメインに接続されたVHドメインを含む。ドメインは、同じ鎖上のドメイン間の対合を防止するのに十分に短いリンカーと接続され、したがって、異なる鎖上の相補性ドメイン間の対合を推進して、2つの抗原結合部位を再構築する。3つの単鎖抗体を組み合わせて、三価三量体としても知られるトリアボディを形成することができる。トリアボディは、VLまたはVHドメインのアミノ酸末端が、VLまたはVHドメインのカルボキシル末端に直接、すなわちリンカー配列なしで融合されて構成される。トリアボディは、ポリペプチドがヘッド−トゥ−テールの様式で環状に整列された、3つのFv頭部を有する。トリアボディの可能な立体配座は平面的であり、3つの結合部位が平面内に互いに120度の角度で位置する。トリアボディは、単一特異性、二重特異性、または三重特異性でありうる。したがって、本明細書に記載の方法において有用な抗体は、抗原(例えば、DRP1)と特異的に結合する、天然に存在する抗体、(Fab')2などの二価断片、Fabなどの一価断片、単鎖抗体、単鎖Fv(scFv)、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディなどを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
抗体は、当業者に公知の方法によって、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部に対して惹起することもできる。抗体は、ウサギまたはマウスなどの動物を遺伝子産物またはその断片で免疫することによって容易に惹起される。免疫マウスは、ハイブリドーマの製造用のB細胞源を提供するために特に有用であり、そのハイブリドーマが培養されて大量のモノクローナル抗体が産生される。抗体の製造方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に詳述していない。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を本明細書に記載の方法において使用することができるが、特定のタンパク質に対して増加した特異性を必要とする条件では、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。
【００８８】
有用なモノクローナル抗体および断片を、任意の種(ヒトを含む)から誘導してもよく、2以上の種由来の配列を用いるキメラタンパク質として形成してもよい。また、ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」マウス抗体を、本明細書に記載の方法およびアッセイに従って使用することもできる。例えば、マウスFv領域(すなわち、抗原結合部位を含有する)またはその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメイン領域およびFc領域をコードするヌクレオチド配列で遺伝子組換えすることによって、マウスモノクローナル抗体を「ヒト化」することができる。ヒト化されたターゲティング部分は、宿主レシピエントにおいて抗体またはポリペプチドの免疫反応性を減少させると認識され、これによって、半減期の増加および有害な免疫反応の可能性の低減が可能になる。マウスモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒト化形態で用いられるべきである。抗原結合活性は、抗体の可変部分(Fv)の軽鎖および重鎖(各3つ)に位置する、6つの相補性決定領域(CDR)のアミノ酸の配列および立体配座によって決定される。25 kDaの単鎖Fv(scFv)分子は、短いペプチドスペーサー配列を介して連結されている軽鎖の可変領域(VL)および重鎖の可変領域(VH)から構成される。scFvの遺伝子を含有する繊維状ファージの表面上にscFv分子を表示する技術が開発されている。広範な抗原特異性を有するscFv分子がscFvファージライブラリーの1つの大きいプールに存在することができる。
【００８９】
キメラ抗体は、異なる動物種に由来する2以上のセグメントまたは部分によって特徴付けられる免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ抗体の可変領域は、ヒト以外の哺乳動物抗体、例えばマウスモノクローナル抗体に由来し、免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。いくつかの態様において、両領域および組み合わせは、ルーチンで決定される低い免疫原性を有する。
【００９０】
DRP1発現の核酸阻害剤：選択された標的ポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチは、RNA干渉物質の使用を通じたものである。RNA干渉(RNAi)は、選択的分解のために、標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的とする低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖を使用する。遺伝子発現のsiRNA依存的な転写後サイレンシングは、siRNAによって導かれた部位で標的メッセンジャーRNA分子を切断することを伴う。「RNA干渉(RNAi)」は、進化的に保存されたプロセスであって、標的遺伝子と同一または非常に類似する配列のRNAの発現または導入が、その標的遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)をもたらし(Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225を参照のこと)、それによって標的遺伝子の発現を阻害するプロセスである。一態様において、RNAは、二本鎖RNA(dsRNA)である。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記述されている。自然界では、RNAiは、長いdsRNAからsiRNAと呼ばれる二本鎖断片への前進的切断を促進するdsRNA特異的エンドヌクレアーゼであるダイサーによって開始される。siRNAは、標的mRNAを認識して切断するタンパク質複合体(「RNA誘導サイレンシング複合体」または「RISC」と呼ばれる)に組み込まれる。また、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするために、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉物質を導入することによって、RNAiを開始させることもできる。本明細書において使用される場合、「標的遺伝子発現の阻害」は、RNA干渉が誘導されていない状況と比較した、標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルの任意の減少を含む。減少は、RNA干渉物質にターゲティングされなかった標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%、またはそれ以上の減少であろう。
【００９１】
用語「RNA干渉物質」および「RNA干渉」は、これらが本明細書において使用される場合、RNA干渉物質がsiRNA、miRNA、shRNA、または他の二本鎖RNA分子を含むか否かにかかわらず、二本鎖RNAによって媒介される遺伝子サイレンシングの形態を包含することを意図する。本明細書において「低分子干渉RNA」とも呼ばれる「短鎖干渉RNA」(siRNA)は、例えばRNAiによって、標的遺伝子の発現を阻害するように機能するRNA作用物質として定義される。siRNAは、化学的に合成しても、インビトロ転写によって生産させても、宿主細胞内で産生させてもよい。一態様において、siRNAは、約15〜約40ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは約19〜約25ヌクレオチド長、より好ましくは約19、20、21、22、または23ヌクレオチド長の二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、かつ、約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチドの長さを有する3’および/または5' オーバーハングを各鎖に含有することができる。オーバーハングの長さは、2本の鎖間で独立しており、すなわち、一方の鎖のオーバーハングの長さは、第二の鎖のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、siRNAは、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を通じて、RNA干渉を促進することができる。
【００９２】
siRNAはまた、低分子ヘアピン(ステムループとも呼ばれる) RNA(shRNA)も含む。一態様において、これらのshRNAは、短い(例えば、約19〜約25個のヌクレオチド)アンチセンス鎖と、これに続く約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。代替的に、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行してもよく、アンチセンス鎖が後に続いてもよい。これらのshRNAを、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含有させ、例えば、pol III U6プロモーターまたは別のプロモーターから発現させることができる(例えば、Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501を参照のこと、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる)。RNA干渉物質の標的遺伝子または配列は、細胞遺伝子またはゲノム配列、例えばDRP1配列であることができる。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片と実質的に相同であることができる。これに関連して使用される場合、用語「相同」は、標的のRNA干渉をもたらすために、標的mRNAまたはその断片と実質的に同一である、十分に相補的である、または類似していることと定義される。ネイティブなRNA分子に加えて、標的配列の発現を阻害するかまたは発現に干渉するのに適したRNAは、RNA誘導体および類似体も含む。好ましくは、siRNAは、その標的と同一である。siRNAは、好ましくは、ただ1つの配列を標的とする。siRNAなどのRNA干渉物質の各々を、例えば発現プロファイリングによって、潜在的なオフターゲット効果についてスクリーニングすることができる。そのような方法は当業者に公知であり、例えば、Jackson et al. Nature Biotechnology 6:635-637, 2003に記載されている。発現プロファイリングに加えて、オフターゲット効果を有しうる潜在的な配列を同定するために、その潜在的な標的配列を、配列データベース中の類似配列に対してスクリーニングすることもできる。例えば、Jackson et al. (Id.)によれば、15個（恐らくは、11個と少なくても）の連続するヌクレオチドという配列同一性は、標的としていない転写産物のサイレンシングを指示するのに十分である。それ故、潜在的なオフターゲットサイレンシングを避けるために、BLASTなどの任意の公知の配列比較法による配列同一性分析を使用して、提案されたsiRNAを最初にスクリーニングすることができる。siRNA配列は、siRNAのアンチセンス(ガイド)鎖のRISCへの取り込みを最大にし、それによって、分解のためにヒトGGT mRNAを標的とするRISCの能力を最大にするように選択される。これは、アンチセンス鎖の5'末端における結合の自由エネルギーが最小である配列をスキャニングすることによって達成することができる。より低い自由エネルギーは、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖の5'端の巻き戻し促進を導き、それによって、アンチセンス鎖がRISCに取り込まれてmRNAの配列特異的切断を指示することを確実にする。siRNA分子は、RNAのみを含有する分子に限定される必要はなく、例えば、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し、また、リボース糖分子が別の糖分子または同様の機能を果たす分子に置換されている分子も含む。さらに、ヌクレオチド残基間の非天然の連結、例えば、ホスホロチオエート連結を使用することもできる。RNA鎖を、フルオロフォアなどのレポーター基の反応性官能基で誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の一端または両端において、典型的にはセンス鎖の3'末端において修飾されている。例えば、3'末端の2'-ヒドロキシルを、様々な基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'-O-メチルリボシル誘導体および2'-O-フルオロリボシル誘導体などの、修飾された糖質部分を有するヌクレオチドを組み込む。また、RNA塩基を修飾することもできる。標的配列の発現を阻害するかまたは発現に干渉するために有用なあらゆる修飾塩基を使用することができる。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルなどのハロゲン化塩基を組み込むことができる。また、塩基をアルキル化することもでき、例えば、7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み込むことができる。また、阻害の成功をもたらす非天然塩基を組み込むこともできる。最も好ましいsiRNA修飾は、2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンまたはロックド核酸(LAN)ヌクレオチド、およびホスホジエステルまたは様々な数のホスホロチオエート連結のいずれかを含有するRNA二重鎖を含む。そのような修飾は、当業者に公知であり、例えば、Braasch et al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003に記載されている。siRNA分子への有用な修飾のほとんどは、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術のために確立された化学を使用して導入することができる。好ましくは、修飾は、2'-O-メチル修飾を最小限にしか含まず、好ましくはそのような修飾は除外される。また、修飾は、好ましくは、siRNAの遊離5’-ヒドロキシル基の修飾を除外する。
【００９３】
好ましい態様において、RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中で送達または投与される。リポソームなどの追加の担体物質を、薬学的に許容される担体に加えることができる。別の態様において、RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中の低分子ヘアピンRNA(shRNA)をコードするベクターによって、個体の臓器中の細胞に送達される。shRNAは、転写後に細胞によって、例えばDRP1を標的とすることができるsiRNAへと変換される。
【００９４】
一態様において、ベクターは、テトラサイクリン誘導性ベクターなどの調節可能なベクターである。例えば、Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106に記載されている、pTet-Onベクター(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を使用した方法を使用することができる。一態様において、本明細書に記載の方法において使用されるRNA干渉物質は、ベクターの使用なしに、静脈内注入、例えば水力学的注入の後にインビボで細胞によって能動的に取り込まれ、これはRNA干渉物質の効率的なインビボ送達の例証となる。siRNAを送達するための1つの方法は、適切な薬学的に許容される担体中での局所投与によるものである。また、本発明の方法において使用されるRNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAの送達のための他の戦略、例えば、ベクター、例えばプラスミド、またはウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)による送達を用いることもできる。そのようなベクターは、例えば、Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188に記載されている通り使用することができる。他の送達方法は、塩基性ペプチドを使用して、RNA干渉物質を塩基性ペプチド、例えばTATペプチドの断片とコンジュゲートさせるかもしくは混合するか、カチオン性脂質と混合するか、または粒子に製剤化することによって、本発明のRNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAを送達することを含む。DRP1のmRNAを標的とするRNA干渉物質、例えばsiRNAを、単独で送達しても、他のRNA干渉物質、例えばsiRNA(例えば、他の細胞遺伝子を対象とするsiRNAなど)と組み合わせて送達してもよい。siRNAはまた、皮膚の炎症を含む疾患または障害を治療または予防するために使用される他の薬学的作用物質と組み合わせて投与することもできる。shRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に公知の多数の技術を使用して得ることができる。例えば、siRNA分子は、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび慣用のDNA/RNA合成装置を使用して、化学合成しても、組換生産してもよい(例えば、Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200; Harborth, J. et al . (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017;およびTuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197を参照のこと)。代替的に、Proligo(商標)(Hamburg, Germany)、Dharmacon(商標)Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(商標)(Perbio Science(商標)の一部、Rockford, IL, USA)、Glen Research(商標)(Sterling, VA, USA)、ChemGenes(商標)(Ashland, MA, USA)、およびCruachem(商標)(Glasgow, UK)を非限定的に含む、いくつかの商業的なRNA合成の供給元を利用することもできる。よって、siRNA分子は、合成することがさほど困難ではなく、RNAiに適した品質で容易に提供される。加えて、dsRNAを、プラスミドベクター、レトロウイルス、およびレンチウイルスによってコードされたステムループ構造として発現させることもできる(Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850; Paul, C.P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508; Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243; Lee, N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell 9:1327-1333; Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501)。これらのベクターは、一般に、dsRNAの上流にpol IIIプロモーターを有し、センスおよびアンチセンスRNA鎖を別々におよび／またはヘアピン構造として発現させることができる。細胞内で、ダイサーが短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を有効なsiRNAにプロセシングする。本発明のsiRNA分子のターゲティング領域は、所与の標的遺伝子配列から選択することができ、例えば、開始コドンの約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチド下流から始まる、DRP1コーディング配列である。ヌクレオチド配列は、5’または3’UTRおよび開始コドン近傍の領域を含有することができる。本明細書に記載のsiRNA分子を設計する1つの方法は、23ヌクレオチドの配列モチーフAA(N19)TT(SEQ. ID. NO. 1)(ここで、Nは任意のヌクレオチドでありうる)を同定して、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、または75%のG／C含量を有するヒットを選択することを伴う。配列の「TT」部分は、随意である。代替的に、そのような配列が見いだされない場合には、モチーフNA(N21)を使用して検索を拡張することができ、ここで、Nは任意のヌクレオチドでありうる。この状況では、センスsiRNAの3’端を、センスおよびアンチセンス3’オーバーハングの配列組成に関して対称的な二重鎖の生成を可能にするために、TTへ変換することができる。次いで、アンチセンスsiRNA分子を、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド位置1〜21に対する相補鎖として合成することができる。対称的な3’TTオーバーハングの使用は、低分子干渉リボ核タンパク質粒子(siRNP)を、ほぼ等しい比のセンスおよびアンチセンス標的RNA切断siRNPで、確実に形成させるのに好都合であり得る(上記のElbashir et al., (2001)および上記のElbashir et al., 2001)。また、NCBI、BLAST、Derwent、およびGenSeqを非限定的に含む配列データベースの分析、ならびにOligoengine(登録商標)などの商業的に利用可能なオリゴ合成会社を使用して、ただ1つの遺伝子のみが確実に標的とされるように、ESTライブラリーに対してsiRNA配列を選択することもできる。
【００９５】
DRP1を標的とするsiRNA配列はまた、例えば、特にINVITROGEN、THERMO SCIENTIFIC、ORIGENEなどから商業的に得ることもできる。別の態様において、DRP1に対するsiRNAは、
2019532049.tif 000008
からなる群より選択される配列を含む。
【００９６】
RNA干渉物質の送達：RNA干渉物質、例えばsiRNA、またはRNA干渉物質を含有するベクターを、取り込みのために、標的細胞、例えば肝細胞、または他の所望の標的細胞へ送達する方法は、RNA干渉物質、例えばsiRNAを含有する組成物の局所投与もしくは注射、または、細胞、例えば肝細胞を、RNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物と直接接触させることを含む。別の態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAを、静脈、動脈、細静脈、または細動脈などの任意の血管に、例えば水力学的注入またはカテーテル挿入を介して直接注入することができる。投与は、1回の注入によっても、2回以上の注入によってもよい。RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中で送達される。1または複数のRNA干渉物質を同時に使用することができる。一態様において、ヒトDRP1を標的とする単一のsiRNAが使用される。一態様において、RNA干渉で特定の細胞を標的とし、RNA干渉の非特異的なターゲティングによって引き起こされるRNA干渉の潜在的な副作用を制限する。この方法は、例えば、RNA干渉を細胞に効果的に送達するために使用される、細胞ターゲティング部分とRNA干渉結合部分とを含む複合体または融合分子を使用することができる。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質は、siRNAと混合されると、siRNAと結合して、その抗体によって認識される抗原を発現する細胞内にsiRNAを選択的に送達し、その結果、その抗原を発現する細胞においてのみ遺伝子発現のサイレンシングをもたらす。一例では、RNA干渉分子は、肝臓細胞ターゲティング部分に融合されるが、肝細胞への送達は、ターゲティング部分の使用を必ずしも必要とするとは限らないことに留意すべきである。なぜなら、作用物質はある特定の投与様式では初回通過効果を受け、よって、これらが他の臓器の前に肝臓に侵入して、肝細胞に容易に取り込まれるからである。siRNAまたはRNA干渉誘導分子結合部分は、タンパク質、またはタンパク質の核酸結合ドメインもしくは断片であり、そして、結合部分は、ターゲティング部分の一部に融合される。ターゲティング部分の場所は、構築物のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中央にあることができる。また、Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1006)に記載されている通り、インビトロおよびインビボで細胞にsiRNAを送達するためにウイルス媒介性送達機構を用いることもできる。また、Rubinson, D.A., et al. ((2003) Nat. Genet. 33:401-406)およびStewart, S.A., et al. ((2003) RNA 9:493-501)に記載されている通り、インビトロおよびインビボで細胞にshRNAを送達するためにshRNAのプラスミド媒介性またはウイルス媒介性送達機構を用いることもできる。RNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAを、以下の動作の1または複数を行う構成要素と共に導入することができる:細胞、例えばリンパ球もしくは他の細胞による、RNA干渉物質、例えばsiRNAの取り込みを強化する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化する、または他の方法で標的細胞への送達を容易にして、標的遺伝子、例えばDRP1の阻害を増加させる。特定のRNA干渉物質の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば、翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)をもたらし、それによって、標的遺伝子発現の阻害、または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻���を導くために必要な量である。
【００９７】
DRP1活性または発現の低分子阻害：本明細書において使用される場合、用語「低分子」は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物(すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む)、1モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、1モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、1モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を非限定的に含む、化学(例えば、有機または無機)作用物質を指す。
【００９８】
本質的に全ての、DRP1発現および/または活性の低分子阻害剤を、本明細書に記載の方法を使用した高脂血症(例えば、上昇したLDL)を含む疾患の処置において使用することができる。DRP1発現および/または活性を阻害する候補低分子作用物質を同定するためのスクリーニングアッセイが、本明細書に提供される。
【００９９】
一態様において、DRP1阻害剤は、低分子である。一態様において、DRP1阻害剤は、Mdivi-1(当技術分野において、3-(2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-4(1H)-キナゾリノンとしても公知)を含む。別の態様において、DRP1阻害剤は、ペプチド阻害剤P110(例えば、Qi et al. (2013) J Cell Sci 126:789-802を参照のこと)である。他の態様において、DRP1阻害剤は、3-ヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸-(3,4-ジヒドロキシベンジリデン)-ヒドラジド、または3-ヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸 (3,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジドを含む。
【０１００】
薬学的組成物
DRP1阻害剤を、いくつかの方法で製剤化することができ、所望の投与様式、用量、または他の薬物動態もしくは薬力学的特性に適合させることができる。
【０１０１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体と共に製剤化される。代替的な態様において、本発明の薬学的組成物および製剤を、非経口的に、局所に、経口的に、もしくは局部投与によって、例えばエアロゾルによって、鼻腔内に、または経皮的に投与することができる。薬学的組成物を、任意の所望の様式で製剤化することができ、病態または疾患(例えば、脂質異常症)、病気の程度、各患者の総体的な医学的状態、それらの結果である好ましい投与方法などに応じて、様々な単位剤形で投与することができる。薬学的物質の製剤化および投与のための技術の詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA(「Remington's」)の最新版を参照されたい。
【０１０２】
本明細書に記載の組成物を単独で、または薬学的製剤の構成成分として投与することができる。化合物を、投与のために、任意の簡便な方法でヒトまたは獣医学において使用するために製剤化してよい。また、湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、保存料および酸化防止剤が、組成物中に存在することもできる。
【０１０３】
本明細書に記載の組成物は、皮内、吸入、経口/鼻腔、局所、非経口、直腸、および/または膣内投与に適したものを含む。製剤を、単位剤形で提供することができ、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製することができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分(例えば、DRP1阻害剤)の量は、処置されている宿主、特定の投与様式（例えば、経口、注射、静脈内、または吸入）に応じて変動するであろう。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば血中LDLコレステロール低下効果を生み出す化合物の量であろう。
【０１０４】
本明細書に記載の組成の薬学的製剤を、医薬製造のための当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができる。そのような薬物は、甘味料、香味料、着色剤、および保存料を含有することができる。製剤を、製造に適した無毒の薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。製剤は、1または複数の希釈剤、乳化剤、保存料、緩衝剤、賦形剤などを含んでよく、液剤、粉剤、乳剤、凍結乾燥粉剤、スプレー剤、クリーム剤、ローション剤、制御放出製剤、錠剤、丸剤、ゲル剤として、パッチ上、インプラント内などのような形態で提供してよい。
【０１０５】
経口投与用の薬学的製剤を、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体を使用して、適切かつ好適な投与量で製剤化することができる。そのような担体によって、薬学的物質を、患者による摂取に適した、錠剤、丸剤、粉剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、トローチ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとしての単位剤形で製剤化することが可能となる。経口使用のための薬学的調製物を、所望であれば好適な追加の化合物を加えた後に、場合により、得られた混合物を顆粒化し、顆粒の混合物を加工し、錠剤または糖衣錠核を得ることによって、固体賦形剤として製剤化することができる。好適な固体賦形剤は、糖質またはタンパク質充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース;ならびにアラビアおよびトラガカントを含むゴム;ならびにタンパク質、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンを含む。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩(アルギン酸ナトリウムなど)などの崩壊剤または可溶化剤を加えることができる。押し込み型カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および場合により安定剤と混合された、活性剤を含有することができる。軟カプセル剤では、活性剤を、安定剤ありまたはなしで、好適な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁することができる。
【０１０６】
水性懸濁剤は、例えば水性皮内注射剤用に、活性剤(例えば、DRP1阻害剤)を、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物中に含有することができる。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、ならびに、分散剤または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド(例えば、レシチン)、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物(例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン)、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物(例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール)、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物(例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール)、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物(例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)を含む。水性懸濁剤はまた、1または複数種の保存料、例えばp-ヒドロキシ安息香酸エチルまたはn-プロピル、1または複数種の着色剤、1または複数種の香味料、および1または複数種の甘味料、例えばスクロース、アスパルテーム、またはサッカリンを含有することもできる。製剤をモル浸透圧濃度について調整することができる。
【０１０７】
一態様において、投与のために油系の薬学的物質が使用される。活性剤(例えば、DRP1阻害剤)を、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油;またはこれらの混合物に懸濁することによって、油系の懸濁剤を製剤化することができる。そのような油性懸濁剤は、増粘剤、例えばミツロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有することができる。グリセロール、ソルビトール、またはスクロースなどの甘味料を加えて、口当たりの良い経口調製物を提供することができる。アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって、これらの製剤を保存することができる。
【０１０８】
本発明の薬学的製剤はまた、水中油型乳剤の形態であることもできる。油相は、上記の植物油もしくは鉱油、またはこれらの混合物であることができる。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム(例えば、アラビアゴムおよびトラガカントゴム)、天然に存在するホスファチド(例えば、ダイズレシチン)、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル(例えば、モノオレイン酸ソルビタン)、およびこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物(例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)を含む。乳剤はまた、シロップ剤およびエリキシル剤の製剤と同様に、甘味料および香味料を含有することもできる。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存料、または着色剤を含有することもできる。代替的な態様において、本発明のこれらの注射用水中油型乳剤は、パラフィン油、モノオレイン酸ソルビタン、エトキシル化モノオレイン酸ソルビタン、および/またはエトキシル化トリオレイン酸ソルビタンを含む。
【０１０９】
本明細書に記載の薬学的製剤はまた、坐剤、吹送法、粉剤、およびエアロゾル製剤を含む、鼻腔内、眼内、および膣内経路によって投与することもできる。薬物を、常温では固体であるが体温では液体であるために、体内で融解して薬物を放出する、好適な非刺激性の賦形剤と混合することによって、坐剤製剤を調製することができる。そのような材料は、ココアバターおよびポリエチレングリコールでありうる。有害な炎症応答または自己免疫疾患などの慢性病態を処置するとき、治療レジメンの適正な患者コンプライアンスを確保するために、経口投与が好ましい場合がある。
【０１１０】
DRP1阻害剤を含む薬学的化合物を、アプリケータースティック、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、ペースト剤、ゼリー剤、塗布剤、粉剤、およびエアロゾルとして製剤化して、経皮的に、局所経路によって送達することができる。
【０１１１】
本明細書に記載の薬学的製剤を、体内での緩徐放出のためにミクロスフェアとして送達することもできる。例えば、ミクロスフェアを、皮下で緩徐放出する薬物の皮内注射を介して (Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645を参照のこと);生分解性で注射可能なゲル製剤として(例えば、Gao (1995) Pharm. Res. 12:857-863 (1995)を参照のこと);または、経口投与用のミクロスフェアとして(例えば、Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674を参照のこと)、投与することができる。
【０１１２】
薬学的製剤を、非経口的に、例えば静脈内(IV)投与または体腔もしくは臓器の内腔への投与によって投与することができる。これらの製剤は、薬学的に許容される担体に溶解された活性剤の溶液を含むことができる。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムである。加えて、無菌の不揮発性油を溶媒または懸濁媒体として用いることもできる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も同様に、注射剤の調製に使用することができる。これらの液剤は、無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの製剤を、慣用の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。製剤は、生理学的条件を近似するのに必要な、薬学的に許容される補助物質、例えばpH調整剤および緩衝化剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。これらの製剤中の活性剤の濃度は、広範に変動することができ、主に、液量、粘度、体重などに基づいて、選択される特定の投与様式および患者の要求に従って選択される。IV投与のために、製剤は、無菌の注射用調製物、例えば無菌の注射用水性または油性懸濁剤であることができる。この懸濁剤を、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して製剤化することができる。無菌の注射用調製物はまた、1,3-ブタンジオールの溶液などの無毒の非経口用として許容される希釈剤または溶媒中の懸濁剤であることもできる。投与は、ボーラスまたは持続注入(例えば、特定の期間の、血管への実質的に中断のない導入)による投与であることができる。
【０１１３】
本明細書に記載の薬学的化合物および製剤を凍結乾燥することができる。したがって、本発明の薬学的物質と増量剤(例えば、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびスクロースまたはそれらの混合物)とを含む溶液を凍結乾燥することによって作製できる、本明細書に記載の組成物を含む安定な凍結乾燥製剤が本明細書に提供される。
【０１１４】
DRP1阻害剤を含む組成物および製剤を、リポソームの使用によって送達することができる。リポソームを使用することによって、特に、リポソーム表面が、標的細胞(例えば、肝細胞)に特異的なリガンドを保持しているか、そうでなければ特定の臓器に優先的に向かうようにされている場合、活性剤の標的細胞へのインビボ送達に焦点を合わせることができる。例えば、米国特許第6,063,400号;第6,007,839号;Al-Muhammed (1996) J. Microencapsul. 13:293-306; Chonn (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708; Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-1587を参照されたい。
【０１１５】
また、DRP1阻害剤が腫瘍の部位に直接、例えば腫瘍内注射によって投与されることも、本明細書において想定される。代替的に、がんの処置のために、DRP1阻害剤を全身投与してもよく、本明細書に記載の、またはがんの処置のための当技術分野において公知の任意の他の経路によって投与してもよい。
【０１１６】
また、本明細書に記載の化合物および薬学的組成物を製剤化して、併用療法に用いることができる、すなわち、化合物および薬学的組成物を、1または複数の他の所望の治療薬、生活習慣介入(例えば、減量、運動など)、または医学手順と共に処方するか、またはそれと同時に、その前に、もしくはその後に適用することができることが認識されるであろう。併用レジメンに用いるための治療(治療薬または手順)の特定の組み合わせは、所望の治療薬および/または手順の適合性ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮する。また、用いられる治療は、同じ障害に対して所望の効果を達成してもよく(例えば、DRP1阻害剤を含む化合物を、別のコレステロール低下薬または心血管薬と同時に投与してよい)、異なる効果(例えば、DRP1阻害剤のあらゆる有害効果の制御)を達成してもよいことも認識されるであろう。
【０１１７】
本明細書に記載の方法は、DRP1阻害剤を含む組成物と、他の薬物または薬学的物質、例えば、上昇した低密度リポタンパク質を含む疾患または障害を処置するための組成物との共投与をさらに含むことができる。例えば、本発明の方法ならびに/または組成物および製剤を、スタチン、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸結合樹脂、抗高血圧剤、スタチン、肝臓X受容体アンタゴニスト、7-アルファヒドロキシラーゼ、プテロスチルベン、フィブラート、ナイアシン、オメガ-3脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせと共適用することができる。
【０１１８】
有用な併用療法は、当業者によって理解および認識されよう。そのような併用療法の潜在的な利点は、個々の活性成分の各々の使用量を少なくして毒性副作用を最小限にできること、有効性の相乗的な改善、投与もしくは使用の容易さの改善、および/または化合物の調製もしくは製剤化の総費用の削減を含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、本明細書におけるDRP1阻害剤と少なくとも1つの追加の作用物質との組み合わせを使用して、投与される組成物の効果を相加的または相乗的に最大限にすることができる。本明細書に記載の組成物の有効量を、選択されたヒト対象に、単回1日用量として、または代替的に1日当たり2以上の分割用量で、任意の好適な投与経路、例えば経口投与を介して投与することができる。
【０１２０】
投与量および投与
治療用組成物または薬学的組成物を、任意の所望の慣用的投与経路用に製剤化することができる。本明細書において、所望の作用物質での処置にとって有利であると知られている経路が想定される。いくつかの態様において、投与経路は、血液脳関門の通過、または内皮との直接接触を伴うものでありうる。いくつかの態様において、組成物を全身送達用に製剤化することができる。いくつかの態様において、組成物を、特定の臓器、例えば、肝臓、脾臓、骨髄、および皮膚への送達用に製剤化することができる。治療用組成物または薬学的組成物を、肺への送達のためまたは肺を介した全身吸収のため、吸入によるエアロゾル適用用に製剤化することができる。代替的に、治療用組成物または薬学的組成物を、経皮送達、例えば皮膚パッチ用に製剤化することもできる。治療用組成物または薬学的組成物を腸溶コーティングして、経口送達用に製剤化することができる。治療用組成物または薬学的組成物をリポソームまたはナノ粒子に封入して、インビボでの緩徐持続送達用に製剤化することができる。代替的に、治療用組成物または薬学的組成物を、標的送達用に製剤化する、例えば、リポソームまたはナノ粒子上に少なくとも1つのターゲティング部分が設計され、それを特徴とするリポソームまたはナノ粒子に封入することができる。
【０１２１】
本明細書に記載のDRP1阻害剤および/または組成物を、任意の公知の経路または所望の経路によって投与することができる。例として、本明細書に記載のDRP1阻害剤を、中でも、粘膜、経肺、局所、経口、静脈内、腫瘍内、または他の局部もしくは全身経路(例えば、経腸および非経口)によって投与することができる。DRP1阻害剤を、任意の所望の経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜層(例えば、口腔粘膜、直腸、および腸粘膜など)を通じた吸収によって投与することができ、また他の生物学的に活性な物質と一緒に投与してもよい。
【０１２２】
投与の経路は、エアロゾル、直接注射、皮内、経皮(例えば、緩徐放出ポリマー中)、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、局所、経口、経粘膜、頬側、直腸、膣内、経皮、鼻腔内、および非経口経路を含むが、これらに限定されない。「非経口」は、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心内、皮内、肝内、臓器内、筋肉内、腹腔内、肺内、髄腔内、胸骨内、鞘内、子宮内、静脈内、腫瘍内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を非限定的に含む、一般に注射に関連する投与経路を指す。任意の他の治療上効果的な投与経路を使用することができ、それは例えば、注入もしくはボーラス注射、上皮もしくは皮膚粘膜層を通じた吸収、または、治療用タンパク質もしくはペプチドをコードするDNA分子が、例えばベクターを介して患者に投与される遺伝子療法（当該タンパク質もしくはペプチドを治療レベルでインビボ発現および分泌させる）によるものである。種々の態様において、投与物（administration）を、エアロゾル投与を介して、例えば、吸入投与で肺へ吸入させることができる。投与はまた、全身であっても局部であってもよい。
【０１２３】
いくつかの態様において、DRP1阻害剤(またはその組成物)を、特定の臓器、例えば肝臓への送達に適応した製剤として投与することができる。加えて、本明細書に記載のDRP1阻害剤を、他の構成成分または生物学的に活性な物質、例えば薬学的に許容される界面活性剤(例えば、グリセリド)、賦形剤(例えば、ラクトース)、担体、希釈剤、およびビヒクルと一緒に投与することもできる。
【０１２４】
本明細書に記載のDRP1阻害剤を含む組成物を、例えば少なくとも1つの脂質低下療法、コレステロール合成阻害剤、ビタミン、高密度リポタンパク質(HDL)増強剤、抗アテローム性動脈硬化剤、降圧剤、抗凝血剤、または他の心血管剤の適用の前に、それと同時に(同じまたは異なる組成物で)、または逐次的に、対象に治療的に投与することができる。例えば、追加の作用物質は、HMG-CoA還元酵素阻害剤、スタチン、7-アルファヒドロキシラーゼ、肝臓X受容体アゴニスト、プテロスチルベン、胆汁酸結合樹脂、コレステロール吸収阻害剤、フィブラート、ナイアシン、またはオメガ-3脂肪酸でありうる。本明細書に記載のDRP1阻害剤を含む組成物を、脂質低下または心血管療法の補助的および/または付随的療法として投与することができる。
【０１２５】
他の態様において、DRP1阻害剤を含む組成物を、抗がん療法、例えば放射線、化学療法、がん免疫療法、または外科手技の適用の前に、それと同時に(同じまたは異なる組成物で)、または逐次的に、対象に治療的に投与することができる。そのような治療法は、腫瘍を直接的に標的とすることもでき(例えば、腫瘍細胞タンパク質の阻害または盛んに有糸分裂する（highly mitotic）細胞の殺傷による)、間接的に作用して、例えば、抗腫瘍免疫応答を誘発または強化することもできる。がんまたは炎症性障害の処置のためにDRP1阻害剤と組み合わせて使用することができる例示的な抗がん剤は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびCYTOXAN(商標);シクロホスファミド;スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ(meturedopa)、およびウレドパ(uredopa);エチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamines）(アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミンを含む);アセトゲニン(とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン);カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特定するとクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む);エリュテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチイン;スポンジスタチン;ナイトロジェンマスタード類、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン(novembichin)、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン(ranimnustine);抗生物質、例えばエンジイン抗生物質(例えば、カリケアミシン、とりわけカリケアミシンガンマおよびカリケアミシンオメガ);ダイネミシンAを含むダイネミシン;クロドロネートなどのビスホスホネート;エスペラミシン;ならびに、ネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン(caminomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビジン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、アドリアマイシン(商標)、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類（例えばマイトマイシンC）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ス���レプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート;プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン;アンドロゲン類、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えばフロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート(edatrexate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エフロルニチン（elformithine）;酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン（lonidainine）;メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン（nitraerine）;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;多糖複合体(JHS Natural Products(商標), Eugene, Oreg.);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフラン(sizofuran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン類(とりわけ、T-2トキシン、ベラクリン(verracurin)A、ロリジンA、およびアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド類、例えば、タキソール(商標)、パクリタキセル(Bristol-Meyers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、アブラキサン(商標)、パクリタキセルのクレモホール不含アルブミン改変ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.)、およびタキソテール(商標)、ドキセタキセル(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲムザール(商標)、ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金類似体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ナベルビン(商標)、ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン(カンプトサール(商標)、CPT-11)(イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンの処置レジメンを含む);トポイソメラーゼ阻害物質RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸などのレチノイド;カペシタビン;コンブレタスタチン;ロイコボリン(LV);オキサリプラチン(オキサリプラチン処置レジメン(フォルフォックス(商標)を含む);ラパチニブ(タイカーブ(商標)); PKC-アルファ、Raf、H-Ras、EGFR(例えば、エルロチニブ(タルセバ(商標)))、およびVEGF-Aの阻害剤（細胞増殖を低減させる）、ならびに上記のいずれかの��学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むが、これらに限定されない。加えて、処置の方法は、放射線の使用をさらに含むことができる。
【０１２６】
他の態様において、DRP1阻害剤を他の抗炎症性剤、とりわけ非ステロイド性抗炎症性薬(NSAID)鎮痛剤(例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、およびナプロキセン);コルチコステロイド(例えば、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、およびデキサメタゾン)、およびスルファサラジンなどと組み合わせて投与することが、本明細書において想定される。
【０１２７】
非経口(例えば、静脈内、皮下、筋肉内)投与のために、本明細書に記載のDRP1阻害剤組成物を、薬学的に許容される非経口ビヒクルと組み合わせた液剤、懸濁剤、乳剤、または凍結乾燥粉剤として製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および5%ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビヒクルを使用することもできる。また、ビヒクルまたは凍結乾燥粉剤は、等張性を維持する添加物(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)および化学安定性を維持する添加物(例えば、緩衝剤および保存料)を含有することができる。製剤は、通常使用される技術によって滅菌される。
【０１２８】
対象に投与される投与量は、特定の作用物質の薬力学的特徴、ならびにその投与様式および経路;レシピエントのサイズ、年齢、性別、健康、体重、および食事;処置されている疾患の症状の性質および程度、並行処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果を含む様々な要因によって変動するであろう。
【０１２９】
通常、活性成分の1日投与量は、体重1キログラム当たり約0.01〜500ミリグラムでありうる。通常は、1日1〜6回の分割用量で、または持続放出形態で与えられる1〜40ミリグラム/キログラム/日が、所望の結果を得るために有効である。活性成分は、通常、組成物の総重量に基づいて約0.5〜95重量%の量で存在する。第二または後続の投与を、個体に投与された初回または以前の用量と同じ、それより少ない、またはそれより多い投与量で投与することができる。
【０１３０】
疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の総体的な健康および/または年齢、ならびに存在する他の疾患を非限定的に含む特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを、当業者は認識するであろう。
【０１３１】
作用物質の投与量範囲は、効力に依存し、所望の効果、例えば、少なくとも1つの症状（例えば、高LDL、高い総コレステロール、またはアテローム性動脈硬化症の）の低減をもたらすのに十分に多い量を含む。投与量は、許容されない有害な副作用を引き起こすほど大量であるべきでない。一般に、投与量は、阻害剤の種類(例えば、抗体または断片、低分子、siRNAなど)によって、ならびに、患者の年齢、病態、および性別によって変動するであろう。投与量は、当業者が決定することができ、また合併症がある場合には、個々の医師が調整することもできる。典型的には、投与量は、0.1mg/kg(体重)〜1g/kg(体重)の範囲である。いくつかの態様において、投与量範囲は、0.1mg/kg(体重)〜1g/kg(体重)、0.1mg/kg(体重)〜500mg/kg(体重)、0.1mg/kg(体重)〜250mg/kg(体重)、0.1mg/kg(体重)〜100mg/kg(体重)、0.1mg/kg(体重)〜50mg/kg(体重)、0.1mg/kg(体重)〜10mg/kg(体重)、10mg/kg〜100mg/kg、15mg/kg〜100mg/kg、20mg/kg〜100mg/kg、25mg/kg〜100mg/kg、30mg/kg〜100mg/kg、40mg/kg〜100mg/kg、50mg/kg〜100mg/kg、60mg/kg〜100mg/kg、70mg/kg〜100mg/kg、75mg/kg〜100mg/kg、25mg/kg〜50mg/kg、50mg/kg〜200mg/kg、75mg/kg〜250mg/kg、100mg/kg〜300mg/kg、100mg/kg〜200mg/kg、100mg/kg〜400mg/kg、100mg/kg〜500mg/kg、100mg/kg〜750mg/kg 200mg/kg〜1000mg/kg、300mg/kg〜1000mg/kg、400mg/kg〜1000mg/kg、500mg/kg〜1000mg/kg、600mg/kg〜1000mg/kg、700mg/kg〜1000mg/kg、800mg/kg〜1000mg/kg、900mg/kg〜1000mg/kg、250mg/kg〜750mg/kg、300mg/kg〜600mg/kg、またはそれらの間の任意の範囲である。
【０１３２】
上記の用量の投与を、限定された期間のあいだ反復することができる。いくつかの態様において、その用量は、1日に1回、または1日に複数回、例えば限定されないが1日に3回与えられる。別の態様において、上記の用量は、数週間または数ヶ月にわたって毎日投与される。処置の期間は、対象の臨床経過および治療に対する応答性に依存する。初回のより高い治療用量の後に、持続的な比較的低い維持用量が想定される。
【０１３３】
治療有効量は、高LDLレベルを含む疾患または障害の少なくとも1つの症状の、統計学的に有意な測定可能な変化をもたらすのに十分な作用物質の量である(以下の「有効性測定」を参照のこと)。そのような有効量は、所与の作用物質についての臨床試験ならびに動物研究において正確に測定することができる。一態様において、従来のスタチン療法に対する対象の感受性を評価することによって、有効性を測定することができる。
【０１３４】
少なくとも1つの作用物質を含有する治療用組成物を、単位用量で慣用的に投与することができる。用語「単位用量」は、治療用組成物に関して使用されるとき、対象にとって単一投与量として好適な、物理的に不連続な単位を指し、各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性材料を、必要な生理学的に許容される希釈剤、すなわち担体、またはビヒクルと組み合わせて含有する。
【０１３５】
組成物は、投与製剤と適合した様式で、かつ治療有効量で投与される。投与されるべき量およびタイミングは、処置される対象、活性成分を利用する対象の全身の許容量、および望まれる治療効果の程度に依存する。ターゲティング部分(例えば抗体など)またはターゲティングリポソーム技術によって、作用物質をターゲティングさせることができる。いくつかの態様において、二重特異性抗体、例えば抗リガンド抗体(Ab)および特定の標的に対するAbの化学連結によって生産される二重特異性抗体を使用することによって、作用物質を、組織を標的としたものにすることができる。化学コンジュゲートの限界を回避するために、抗体の分子コンジュゲートを、リガンドおよび/またはキメラ阻害剤を細胞表面分子へと向かわせる組換え二重特異性単鎖Abの生産に使用することができる。作用物質に抗体を付加することによって、作用物質を所望の標的部位(例えば、肝臓)に相加的に蓄積させることが可能になる。抗体に基づくターゲティング部分または抗体に基づかないターゲティング部分を用いて、リガンドまたは阻害物質を標的部位に送達することができる。好ましくは、調節不全のまたは疾患に関連した抗原に対する天然の結合物質が、この目的のために使用される。
【０１３６】
投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に対して特有である。しかし、全身適用のための好適な投与量範囲は、本明細書に開示されており、投与経路に依存する。投与のための好適なレジメンも様々であるが、初回投与に続いて、1または複数の間隔で、後続注射または他の投与による反復投与を行うことが典型的である。代替的に、血中または骨格筋組織中濃度をインビボ治療に関して指定された範囲に維持するのに十分な持続的静脈内注入も想定される。
【０１３７】
有効性測定
処置の経過の間、本明細書に記載の方法を使用して有効性試験を実施することができる。特定の病気に関連する多数の症状の重症度の測定は、処置の開始の前に、次いで、処置の開始後の第二の特定の時期に記録される。
【０１３８】
本明細書に記載の、上昇した低密度リポタンパク質レベルを含む障害に対する所与の処置の有効性は、熟練の臨床医が決定することができる。しかし、処置は、本明細書において使用される場合、例えば、DRP1阻害剤を含む薬剤での処置後に、少なくとも10%、疾患または障害の兆候または症状のいずれか1つまたは全てが有益な様式で変更される(例えば、低減された血中LDLレベル、低減された血中総コレステロール、スタチン療法への回復した感受性、低減された血管中のコレステロール沈着、および/または低減されたアテローム斑サイズなど)か、疾患の臨床的に認められている他の症状またはマーカーが向上するか、またはさらには寛解すれば、「有効な処置」であると見なされる。また、疾患または障害の安定化、入院、または医学的介入の必要性(すなわち、疾患の進行が停止するか、または少なくとも緩徐化する)によって評価したときに、個体の悪化がないことによって、有効性を測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。処置は、個体または動物(いくつかの非限定的な例は、ヒト、または哺乳動物を含む)における疾患の任意の処置を含み、(1)疾患を阻害すること、例えば、異常な骨成長の進行を停止させるかもしくは緩徐化すること;または(2)疾患を和らげること、例えば、症状の退行を引き起こすこと;および(3)疾患の発生(例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、または卒中の発生)の可能性を抑制もしくは低減させることを含む。
【０１３９】
ある疾患の処置のための有効量は、それを必要とする哺乳動物に投与されたときに、その疾患に関して、有効な処置（本明細書においてこの用語を定義したとおり）をもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、低密度リポタンパク質または総コレステロールの血中レベルを評価することによって決定することができる。
【０１４０】
本発明は、以下の番号を付したパラグラフのいずれか1つに定義される通りであり得る。
【０１４１】
1．血中コレステロールレベルを低減させるための方法であって、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与する工程、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含み、それによって対象における血中コレステロールレベルが低減される、方法。
【０１４２】
2．DRP1の阻害剤が、DRP1発現を阻害する、パラグラフ1の方法。
【０１４３】
3．DRP1発現の阻害剤が、低分子または核酸から選択される、パラグラフ1または2の方法。
【０１４４】
4．核酸が、DRP1特異的RNA干渉物質、またはDRP1特異的RNA干渉物質をコードするベクターである、パラグラフ1、2、または3の方法。
【０１４５】
5．DRP1特異的RNA干渉物質を、肝臓への送達のためにターゲティングさせる、パラグラフ1〜4のいずれかの方法。
【０１４６】
6．DRP1の阻害剤が、DRP1活性を阻害する、パラグラフ1〜5のいずれかの方法。
【０１４７】
7．DRP1活性の阻害剤が、DRP1に対する抗体またはその抗原結合断片、低分子、および核酸からなる群より選択される、パラグラフ6の方法。
【０１４８】
8．核酸が、DRP1特異的RNA干渉物質、RNA干渉物質をコードするベクター、またはDRP1に結合するアプタマーである、パラグラフ7の方法。
【０１４９】
9．DRP1阻害剤が、薬学的に許容される担体と共に投与される、パラグラフ1〜8のいずれかの方法。
【０１５０】
10．DRP1阻害剤が、少なくとも1つの追加のコレステロール低下物質と共に投与される、パラグラフ1〜9のいずれかの方法。
【０１５１】
11．少なくとも1つの追加のコレステロール低下物質が、スタチン、7-アルファヒドロキシラーゼ、肝臓X受容体アゴニスト、胆汁酸結合樹脂、コレステロール吸収阻害剤、フィブラート、ナイアシン、オメガ-3脂肪酸、およびプテロスチルベンからなる群より選択される、パラグラフ1〜10のいずれかの方法。
【０１５２】
12．DRP1阻害剤が、対象における低密度リポタンパク質の低減を引き起こす、パラグラフ1〜11のいずれかの方法。
【０１５３】
13．DRP1阻害剤が、対象における血清前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の低減を引き起こす、パラグラフ1〜12のいずれかの方法。
【０１５４】
14．DRP1阻害剤が、対象の細胞におけるPCSK9 mRNAの低減を引き起こす、パラグラフ1〜13のいずれかの方法。
【０１５５】
15．対象が、高レベルのコレステロールまたは高レベルの低密度リポタンパク質を有する、パラグラフ1〜14のいずれかの方法。
【０１５６】
16．対象が、従来のスタチン療法に対して不耐性を示している、パラグラフ1〜15のいずれかの方法。
【０１５７】
17．ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【０１５８】
18．細胞における前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の分泌および発現を低減させるための方法であって、細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、該細胞において、PCSK9発現および/または分泌のレベルが、DRP1阻害剤と接触させる前の細胞におけるPCSK9発現および/または分泌のレベルと比べて減少する、方法。
【０１５９】
19．それを必要とする哺乳動物における前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)血清レベルを減少させるための方法であって、哺乳動物中の細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、該哺乳動物において、PCSK9発現および/または分泌のレベルが、接触させる前のPCSK9発現および/または分泌のレベルと比べて減少する、方法。
【０１６０】
20．細胞の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)の発現を増加させるための方法であって、細胞を、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤を含む組成物の有効量、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる工程を含み、それによって、該細胞において、LDLR発現のレベルが、DRP1阻害剤と接触させる前の細胞におけるLDLR発現のレベルと比べて増加する、方法。
【０１６１】
21．がんまたは炎症性疾患もしくは障害を処置するための方法であって、それを必要とするヒトまたはヒト以外の対象に、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)の阻害剤の有効量を投与する工程、またはDRP1の阻害剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含み、それによって、対象におけるがんまたは炎症性疾患/障害を処置する、方法。
【０１６２】
22．DRP1阻害剤が、少なくとも1つの抗炎症剤および/または抗がん剤と組み合わせて投与される、パラグラフ21の方法。
【０１６３】
23．対象における上昇したコレステロールの処置において使用するための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤。
【０１６４】
24．対象における上昇したコレステロールの処置のための医薬の製造において使用するための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤。
【０１６５】
25．対象における上昇したコレステロールの処置のための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用。
【０１６６】
26．対象における上昇したコレステロールの処置のための医薬の製造における、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤の使用。
【０１６７】
27．がんの処置のための医薬の製造における、ダイナミン関連タンパク質(DRP1)阻害剤の使用。
【０１６８】
28．炎症性疾患または障害の処置のための医薬の製造における、ダイナミン関連タンパク質(DRP1)阻害剤の使用。
【０１６９】
29．対象におけるがんまたは炎症性疾患/障害の処置において使用するための、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)阻害剤。
【０１７０】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、この実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献の内容、ならびに図面および表は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１７１】
当業者は、本明細書に記載の発明の具体的な態様に対する多くの等価物を、日常的なものを超える実験を使用することなく、認識するか、またはこれを確かめることができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１７２】
単数形の用語(a, an, the)は、文脈が明確に他のことを指示していない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明確に他のことを指示していない限り、「および」を含むことを意図する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられる、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値近似値であり、説明のために提供されていることが、理解されるべきである。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価な方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。略号「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来するものであり、本明細書において非限定的な例を示すために使用される。したがって、略号「e.g.」は、用語「例えば」と同義である。
【０１７３】
他の説明がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示が、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されないこと、よって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とするもので、本発明の範囲（特許請求の範囲によってのみ定義される）を限定することを意図するものではない。
【０１７４】
細胞生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3), (Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); および Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; および Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見いだすことができ、これらの内容は全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【０１７５】
特に指定のない限り、本発明は、例えば、Michael R. Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998), Methods in Molecular biology, Vol.180, Transgenesis Techniques by Alan R. Clark editor, second edition, 2002, Humana Press、および Methods in Molecular Biology, Vo. 203, 2003, Transgenic Mouse, edited by Marten H. Hofker and Jan van Deursenにおける、当業者に公知の標準的な手順を使用して実施された(これらは全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる)。
【０１７６】
本発明が、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されないこと、よって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とするもので、本発明の範囲（特許請求の範囲によってのみ定義される）を限定することを意図するものではない。
【０１７７】
作業実施例または別様に指定する場合を除き、本明細書において使用される成分の数量または反応条件を表す数字は全て、いかなる場合も用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。用語「約」は、百分率と共に使用されるときには、平均±1%を意味する。
【０１７８】
特定されている特許および刊行物は全て、例えば、本発明に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的で、参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、それらの開示が本出願の出願日の前というだけの理由で提供される。これに関して、本発明者らが、先行発明によってまたは何らかの他の理由で、係る開示に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきものはない。これらの文書の、日付に関する声明または内容に関する表示は全て、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関し何らの承認となるものでもない。
【０１７９】
本明細書に記載の開示は、好ましい態様において、ヒトをクローニングするためのプロセス、ヒトの生殖系列の遺伝子同一性を改変するためのプロセス、工業的もしくは商業的な目的のためのヒト胚の使用、または、ヒトもしくは動物にいかなる実質的な医学的恩恵ももたらさない可能性の高い、動物の遺伝子同一性を改変するためのプロセスには関係せず、かつ、そのようなプロセスから生じる動物にも関係しない。
【０１８０】
また、本明細書に記載の方法を予防法として使用できることも想定される。
【実施例】
【０１８１】
実施例1:背景
細胞がタンパク質の恒常性を調節するタンパク質恒常性は、生合成、フォールディングおよび成熟、輸送、ユビキチン-プロテアソーム系、ならびにオートファジー/リソソーム媒介性タンパク質分解機序を通じて達成される。タンパク質恒常性機能不全は、真性糖尿病、がん、神経変性疾患、および心血管疾患を含む種々の障害に関連している1。心血管疾患におけるタンパク質調節に関しては、低密度リポタンパク質代謝の重大な調節因子である前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)が、オートファジー媒介性アポリポタンパク質B代謝2、血管炎症3に関与しており、かつ、増加した心血管リスクに関連している4〜6。PCSK9低分子阻害剤の開発は、困難であると証明されているが、もし達成されれば、PCSK9阻害について、高コストが原因で制限された患者集団にしか利用できない抗体療法を超える、幅広い役割を果たし得る7,8。
【０１８２】
新生PCSK9は、コートタンパク質複合体II(COPII)ベシクルを介して小胞体(ER)からゴルジへ輸送され、それは次いで、分泌されて低密度リポタンパク質受容体(LDLR)に結合し、LDLRを内在化させてリソソームへ送り、その分解を導く。COPIIカーゴアダプタータンパク質であるSEC24Aの欠損は、マウスにおいてPCSK9分泌を低減させる9。ERからゴルジへのトラフィッキングにおけるその役割とは別に、SEC24は、オートファジーの初期工程であるオートファゴソーム形成に関与する10。PCSK9はまた、分泌経路の初期において、分子シャペロンであるグルコース調節タンパク質94と相互作用し、その非存在下では、LDLRは、PCSK9媒介性分解に対してより感受性である11。グルコース調節タンパク質94は、ミスフォールドしたタンパク質を、プロテアソームを介してERから消去する一方で、グルコース調節タンパク質94の欠損は、ミスフォールドしたタンパク質の消去をプロテアソームからオートファジー/リソソーム経路へ切り替える12。まとめると、これらの研究は、PCSK9を、初期分泌経路ならびにオートファジーおよびプロテアソーム媒介性タンパク質分解のER局在性調節因子と関連付けている。
【０１８３】
ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)は、ミトコンドリア膜分裂に関与し13,14、真性糖尿病15、がん16、神経変性17、および心血管疾患18〜21を含む、タンパク質恒常性の変化に関連する疾患における治療標的として示唆されている。心血管疾患モデルでは、DRP1阻害は、ラットバルーン18およびマウスワイヤ19傷害モデルにおいて血管新生内膜形成を防止し、糖尿病アポリポタンパク質E欠損マウスにおいて損傷形成を抑制する20。最近、DRP1阻害が、骨形成性の分化に誘発されるコラーゲン分泌、ならびに血管平滑筋および弁間質細胞の石灰化を抑制することが報告されている21。肝臓のDrp1がノックアウトされたマウス(Drp1LiKO)は、食餌性肥満に耐性であり、耐糖能障害が少なく、超低密度リポタンパク質分泌が低減され、高脂肪食下でも血清総コレステロールおよびトリグリセリドがより低く、肝臓脂質およびATP含量にも、ミトコンドリア呼吸活性にも変化がない22。
【０１８４】
DRP1がタンパク質分泌およびタンパク質恒常性に関与しているか否かは明らかになっていない。細胞質DRP1は、膜に局在し、分泌タンパク質を含有する画分に濃縮され、ラット肝臓においては部分的にERに局在する23。ドミナントネガティブなDRP1は、共トランスフェクトされたルシフェラーゼタンパク質の分泌を減少させ、そして、野生型DRP1の過剰発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞においてその分泌を増加させた24。COS-7細胞にドミナントネガティブなDRP1およびGFPタグ化水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(エキソサイトーシスされるタンパク質)を共トランスフェクトすることによって分析したところ、DRP1は、分泌経路への作用を媒介しなかった25。心筋細胞Drp1欠損マウスの心臓において、ユビキチン化されたタンパク質のオートファジー媒介性タンパク質消去およびプロテアソーム分解の構成要素であるユビキチン結合タンパク質p62が増加される26。心臓Drp1欠損マウスは、オートファジーフラックスが抑制されている27が、Drp1欠損は、マウス胚線維芽細胞においてオートファジーの効力に有意に影響を及ぼすことはない28。哺乳動物細胞は、複数のDRP1アイソフォームを、細胞および組織特異性を伴って発現する29。それ故、肝臓におけるDRP1と分泌タンパク質の関連性23、ならびに高脂肪食下でのリポタンパク質分泌および血清脂質の調節へのDRP1の関与22を前提として、本発明者らは、PCSK9調節を含む、肝臓のタンパク質恒常性およびタンパク質分泌におけるDRP1の役割を調べることにした。
【０１８５】
実施例2
上昇したLDLコレステロールレベルが心血管リスクを増加させ、PCSK9がLDL代謝の重要な調節因子であるという臨床的証拠が確立されている(1〜3)。分泌されたPCSK9は、LDL受容体(LDLR)に結合し、LDLRを内在化させ、次いでリソソームへ送り、原形質膜へリサイクルされる代わりにその分解を導く。PCSK9を標的とすることに多大な努力が注がれてきたことに対して、低分子阻害剤の開発は困難であると証明されているが、もし達成されれば、PCSK9療法について幅広い役割を果たし得る(4、5)。本明細書に提供されるデータは、DRP1がおそらくは特定の小胞体(ER)ベシクルの分裂を通じてPCSK9分泌を調節することを示す。ヒト肝臓細胞におけるDRP1低分子阻害またはCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト、およびマウスにおける肝臓特異的欠失が、PCSK9分泌を実質的に低減させることが見いだされた。
【０１８６】
DRP1は、ミトコンドリア分裂の十分に確立された調節因子であるが(6、7)、DRP1がER膜分裂を通じてタンパク質トラフィッキングを調節するか否かは確立されていない。DRP1は、分泌タンパク質を含有する画分に濃縮され、ラット肝臓においてERに局在する(8)。CHO細胞におけるドミナントネガティブなDRP1は、共トランスフェクトされたルシフェラーゼタンパク質の分泌を減少させた一方で、野生型DRP1の過剰発現は分泌を増加させた(9)。肝臓特異的Drp1ノックアウトマウス(Drp1LiKO)は、高脂肪食下で、超低密度リポタンパク質(VLDL)分泌が低減されるが、肝臓脂質およびATP含量にもミトコンドリア呼吸活性にも変化がない(10)。新生VLDL粒子は、新たに合成されたタンパク質のものとは異なるコートタンパク質複合体(COP)II依存性ベシクルで、ERの外へ流出する(11)。標準的なCOPIIベシクルは、典型的には直径60〜80nmとして記述されるが、ERベシクルは、100nmを優に超えることができるリポタンパク質およびコラーゲンを含む、より大きなカーゴをも収容しなければならない。この輸送プロセスの根本的な重要性にもかかわらず、それがどのように生じるかの分子詳細は、依然としてほとんど理解されていない。このことから、DRP1が、エンドサイトーシスベシクルの切断に関与するGTPaseである原形質膜ダイナミンの、ERにおける等価体であり得るという仮説が浮上する。よって、DRP1は、特定のER分泌ベシクル、とりわけ嵩高いカーゴを輸送するものに対して、補助的な収縮/分裂の役割で機能し得る。しかし、COS-7細胞にドミナントネガティブなDRP1およびGFPタグ化VSV-Gを共トランスフェクトすることによって分析したところ、分泌経路に対するDRP1媒介作用は観察されなかった(12)。これらの結果を前提として、この研究は、DRP1が特定のERカーゴの分泌を調節するか否かを明確にしようとする。
【０１８７】
DRP1はヒト肝臓細胞からの特定のタンパク質の分泌を容易にした
タンパク質分泌におけるDRP1の関与を評価するために、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識(SILAC)を使用して、セクレトーム変化を定量した。HepG2ヒト肝細胞様細胞を、選択的DRP1阻害剤Mdivi-1ありまたはなしで24時間処置した30。Mdivi-1は、一般的なGTPase阻害剤としても、他のダイナミン関連タンパク質ファミリーメンバーの阻害剤としても作用することなく、DRP1自己集合によって刺激されたGTPase活性を遮断することによって、DRP1媒介性膜分裂を阻害し、アクチン細胞骨格またはERネットワークを変化させない30,31。Mdivi-1を、DRP1を十分に阻害する濃度で加え30、タンパク質分泌の変化について分析した。6反復のSILAC実験を実施し、それらのデータを組み合わせ、2以上の固有のペプチドによって支持されるタンパク質についてフィルタリングした32。2以上の固有のペプチドによる217種の分泌タンパク質を同定し、そのうち36種が、Mdivi-1処置後に2倍を超える倍率変化および0.05未満のP値を有した(データ示さず)。有意に変化したHepG2タンパク質SILACデータセットと、その疾患モジュールとの近接性の比較は、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症の両方との関連を示した(図XX)。有意に変化したタンパク質の経路ネットワーク分析は、血小板脱顆粒を含む数種の心血管関係経路を含み(図XX)、これは、血小板顆粒エキソサイトーシスのMdivi-1障害に関する過去の報告と合致した33。臨床的に重要な標的であるPCSK9で最も強い分泌低減が観察されたので(-74%;図XX 図IA)、研究は次に、PCSK9分泌のDRP1調節を検証することに焦点を合わせた。
【０１８８】
DRP1阻害はヒト肝臓細胞においてPCSK9分泌を低減させた
ELISAによって、Mdivi-1がHepG2細胞においてPCSK9分泌を低減させた(-76.1%)ことを確認した(図1B)。また、DRP1タンパク質含量も細胞生存率も変化させることなく(図9Aおよび9B)、HepG2において、細胞内PCSK9 mRNAおよびタンパク質存在量が、Mdivi-1によって低減された(図1BおよびC;PCSK9抗体確認 図8)。オートファゴソーム-リソソーム融合および分解の阻害剤であるクロロキンでの処置は、PCSK9分泌を増加させた(図1B)。Mdivi-1をプロテアソーム阻害剤MG132と組み合わせると、低減されたPCSK9分泌を維持しながら(図1B)、ERでのプロPCSK9蓄積をもたらした(図1C)。リポフェクタミンsiRNA試薬は、未処置HepG2と比較してPCSK9発現を低減させた。それ故、阻害剤の特異性を実証するために、CRISPR/Cas9を使用して、HepG2細胞においてDRP1をノックアウトしたところ、それは、Mdivi-1データと一致して、PCSK9分泌を低減させた(-66.8%)(図1D)。
【０１８９】
PCSK9発現の調節因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質(SREBP)は、COPII34によってERからゴルジへ輸送され、その結果、その開裂および活性化をもたらす。SEC24A欠損を介した低減されたPCSK9分泌は、SREBP9を阻害しないが、このことは、ERからのPCSK9およびSREBPの別個の輸送を示している。DRP1阻害がSREBPトラフィッキングをモジュレートするかを調べるために、2つの異なるアプローチを利用して、SREBP活性化によるHepG2 PCSK9発現を誘導したところ、両方とも、DRP1阻害と組み合わせたときに、低減されたPCSK9分泌を維持した:Mdivi-1とピタバスタチン35(-75%)およびMdivi-1と肝臓X受容体アゴニストT090131736(-65.2%)(図1B)。Mdivi-1は、細胞内PCSK9タンパク質(図1F)も、DRP1および肝臓X受容体標的遺伝子(APOEおよびABCA1)の発現(図9C)も変化させることなく、PCSK9およびLDLRのスタチン媒介性SREBP転写誘導を維持しながら、初代ヒト肝細胞においてPCSK9分泌を低減させた(図1E)。この結果は、全体的なERからゴルジへのトラフィッキングの崩壊ではなく、DRP1阻害による選択的なPCSK9輸送のモジュレーションを裏付けており、併せて、DRP1阻害剤とスタチンおよび肝臓X受容体アゴニストとの組み合わせの治療的潜在性を示している。PCSK9調節転写因子である肝核因子1-アルファ(HNF1A)、SREBP-2、およびSREBP-1aの発現は、Mdivi-1によって変化しなかった一方で、Mdivi-1は、HepG2においてPCSK9およびSREBP-1cのmRNAを強く低減させたが、初代ヒト肝細胞においては、SREBP-1cはより小さい程度で低減され、PCSK9は低減されなかった(図2A、図9D)。これらのデータは、HepG2のPCSK9発現が初代肝細胞よりもSREBP-1cでの調節に対しより感受性であり得ることを示唆している一方でまた、SREBP1cによって調節されたPCSK9発現と組み合わせても、それとは無関係にもMdivi-1がPCSK9分泌を低減させることができることを裏付けている。
【０１９０】
Mdivi-1は、HepG2のLDLRタンパク質を、単独処置(5.8倍)で、またはピタバスタチンとの組み合わせ処置(3倍)もしくはT0901317との組み合わせ処置(9倍)で増加させた(図2B)。LDLRタンパク質の増加は、PCSK9を通じて説明できないほど大きかったので、LDLR転写調節を調べた。Mdivi-1は、HepG2のLDLRを増加させたが、SREBP標的である3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素(HMGCR)の存在量を増加させず(図2C)、このことにより、LDLR誘導はSREBP媒介性のものであることから除外された。HepG2におけるDRP1阻害（これは初代肝細胞では著しく低いが）は、細胞周期調節因子およびLDLR転写活性化因子であるc-Jun37のリン酸化および総レベルを増加させた。これらの変化は、HepG2のLDLR存在量を反映し、c-Jun発現を低減させるスタチン処置によって抑制された38。理論に束縛されるものではないが、HepG2と初代肝細胞とにおけるSREBP応答遺伝子の違いは、細胞密度/周期に起因し得る。初代肝細胞は100%コンフルエントの単層として得られたが、HepG2細胞は細胞集塊を避けるために60〜70%前後のコンフルエンシーで処置された。この場合も同じく理論に束縛されるものではないが、DRP1阻害が細胞周期停止を誘導するので39、増加されたc-Junは、高増殖性のコンフルエント未満のHepG2細胞において細胞周期を誘導するものとなり、増加されたLDLR発現をもたらし得る。
【０１９１】
DRP1はヒト肝臓細胞において部分的にERに局在した
Mdivi-1処置は、一連の細胞骨格関連遺伝子の発現を評価することによって(図3A)、ならびにアクチンおよび微小管共焦点免疫蛍光によって(図3B)観察された通り、肝細胞の細胞骨格を変化させなかった。Drp1LiKOマウスにおける肝臓小胞体(ER)は、高脂肪食下では膨張および分散されたように見えるが、通常食下では対照に近いように見える22。ヒト肝臓細胞におけるER形態を調べるために、DRP1が欠失されたHepG2細胞を使用して電子顕微鏡検査を実施した。HepG2 CRISPR/Cas9 DRP1ノックアウト細胞は、対照と比較してもERの明らかな形態学的相違を有さず、ミトコンドリアに沿った管状ネットワークとして見えた(図3C)。ミトコンドリア膜電位、ならびに免疫蛍光によって観察されたミトコンドリアおよびERの局在によって評価されたミトコンドリア機能は、Mdivi-1で処置されたHepG2細胞で著しく異なることはなかった(図10)。免疫金電子顕微鏡検査を使用して細胞内DRP1局在化を評価したところ、ミトコンドリア、細胞質ゾル/細胞質ベシクル、およびER(ER出口部位を含む)においてDRP1が検出されたが、HepG2細胞のゴルジにはほとんど存在しなかった(図3D)。
【０１９２】
Mdivi-1はHepG2においてオートファジーフラックスを減じた
COPIIベシクル生成のための部位であることに加え、オートファゴソーム生成において物理的かつ機能的な役割を果たすER出口部位に、DRP1が部分的に局在したので40、オートファジーに対するDRP1阻害の効果を評価した。Mdivi-1は、p62存在量を強く増加させ、クロロキン処置下と同じく、Mdivi-1は、p62リン酸化を増加させた(図4A)。オートファジーフラックスを評価するために、HepG2細胞を、クロロキンと組み合わせたMdivi-1で処置した。組み合わせ処置は、軽鎖3(LC3)を増加させたが、クロロキン単独よりも程度は低かった(図4A)。Mdivi-1を低濃度のプロテアソーム阻害剤MG132と組み合わせると、Mdivi-1またはMG132の単独処置と比較して、LC3に加え、リン酸化および総p62のさらなる増加が導かれる(図4A)。まとめると、これらのデータは、Mdivi-1誘導性のオートファジーフラックスの減少が、プロテアソームを通じて増加されたタンパク質消去を導くことを実証している。Mdivi-1は、ヒト肝細胞におけるオートファゴソーム形成の開始因子であるBECLIN1 mRNAも、HepG2 BECLIN1タンパク質存在量も、変化させなかった(図4Aおよび図11A)。同様に、BECLIN1阻害剤であるB細胞リンパ腫2のmRNAも、肝細胞において変化せず、そのタンパク質レベルは、HepG2細胞溶解物において、ウェスタンブロットによる検出以下であった(図11A〜11B)。50人のドナー由来の、細胞質ゾルおよびERを含有するプールされたヒト肝臓S9画分は、DRP1およびB細胞リンパ腫-特大(BCL-XL)(プレオートファゴソーム構造体のBECLIN1アセンブリを阻害するようにも作用する)を含有した(図11C)。Mdivi-1は、HepG2細胞においてBCL-XLの発現および存在量を増加させた(図11Dおよび図4A)。免疫蛍光によって、LC3およびp62のウェスタンブロット分析(図4B)を確認し、併せて、Mdivi-1を低レベルのMG132と組み合わせたときに核周囲リソソーム関連膜タンパク質1およびp62陽性凝集体が形成されたことも明らかにした。これらのデータは、HepG2におけるMdivi-1によるオートファジー減少がプロテアソーム分解を導き、これが更に減じたときに、タンパク質恒常性を維持するためにタンパク質クリアランス機序をさらに変化させることを実証している。
【０１９３】
肝臓Drp1欠損はマウスにおいてPCSK9分泌を低減させた
インビボにおける肝臓のPCSK9分泌に対するDRP1の役割を試験するために、肝臓DRP1が欠損したDrp1LiKOマウスを使用した。通常食下の1ヶ月齢の雄のDrp1LiKOマウスは、Flox/Flox対照と比較して血清PCSK9が低減しており(-78.5%)(図5A)、このことにより、DRP1の阻害がPCSK9分泌を低減させることが、インビボで確認された。体重、グルコース、およびトリグリセリドは、これらの実験条件で変化しなかった(図5A)。血清の完全なリポタンパク質プロファイリングによって観察された総コレステロール(-21%)およびLDL画分は、食餌下のDrp1LiKOマウスにおいて、わずかであるが有意に減少した(図5AおよびB)。Drp1LiKOにおける肝臓HMGCRおよびPCSK9タンパク質ならびにmRNAレベルに有意差はなかったが、肝臓LDLRタンパク質は増加し、mRNAは増加しなかった(図5C)。総および核肝臓SREBP(図6AおよびB)およびHNF1A(図6C)タンパク質ならびにmRNAは、Drp1LiKOにおいて変化しなかった(図6AおよびB)。
【０１９４】
肝臓Drp1欠損はマウス肝臓においてp62を増加させた
ヒト肝臓細胞のMdivi-1処置後に観察されたタンパク質恒常性の変化がインビボでも生じるか否かを評価するために、p62存在量を、食餌下の非絶食Drp1LiKOマウスの肝臓において測定した。Drp1LiKOは、LC3存在量を有意に変化させることなしに肝臓p62を増加させたが(図7A)、このことは、タンパク質恒常性における類似の変更を裏付けている。
【０１９５】
この研究は、以下の新規知見を報告する:(1)ヒト肝臓細胞におけるMdivi-1またはCRISPR/Cas9遺伝子ノックアウト、およびマウス肝臓におけるDrp1ノックアウトを介したDRP1阻害は、PCSK9分泌を低減させる;そして、(2)肝臓のDRP1阻害は、オートファジーフラックスを減じることおよびプロテアソームを通じたタンパク質消去を誘導することによって、タンパク質恒常性を変化させる。理論に束縛されるものではないが、本研究の知見を説明するために、転写機序とトラフィッキング機序の両方を含むワーキングモデルを本明細書に提示する(図7B)。転写調節は、転写因子SREBP-1cをダウンレギュレーションすることによってMdivi-1がPCSK9発現を低減させる特定の条件で起こり得る。Mdivi-1はHepG2と初代ヒト肝細胞の両方でSREBP-1cを低減させたが、PCSK9 mRNAはHepG2においてのみ低減されたことから、PCSK9のSREBP-1c調節は特定の代謝関連条件下で起こる可能性がある36。本研究において、Drp1LiKO給餌マウスは、肝臓SREBP-1c発現が低減されなかった一方で、これらのマウスは、高脂肪食下では低減されたSREBP-1cを有することが、代謝調節をさらに裏付けている22。DRP1阻害は、本研究の実験条件ではSREBP-1aもSREBP-2も変化させなかった（これらは、低減されたSREBP-1cがPCSK9を抑制しなかった場合には、PCSK9のドミナントなSREBP転写調節因子として作用し得る）。PCSK9分泌がHepG2、初代肝細胞、およびマウスにおいてDRP1阻害によって低減されたので、これらの知見の完全な説明を、転写調節を通じて行うことはできなかった。DRP1阻害は、トラフィッキングおよび細胞タンパク質恒常性の調節を通じて、PCSK9分泌をより広範に低減し得る。
【０１９６】
少量のプロテアソーム阻害剤MG132と組み合わせたMdivi-1処置は、HepG2細胞において、Mdivi-1またはMG132の単独処置と比較して、細胞内プロPCSK9の蓄積を導いた。ERでの前駆体プロPCSK9形態の蓄積は、DRP1阻害がPCSK9分泌の低減に応答する（おそらくは、プロテアソームを介したPCSK9分解を増加させることによる、ER関連プロセス（オートファジーのような）の変化によって媒介されて）ことを示している。PCSK9分泌は、ERからゴルジへのトラフィッキングを必要とする9。ヒト肝臓細胞およびマウスにおけるDRP1阻害が、ゴルジで起こるLDLR成熟も、SREBPプロセシングおよびCOPIIによるERからゴルジへのトラフィッキングに依存する核への局在も抑制せず34、Mdivi-1が、SILACによって同定されたHepG2タンパク質の大部分の分泌を有意に変化させなかったので、DRP1阻害は、従来のERからゴルジへのトラフィッキングを遮断することによって、PCSK9分泌を阻害するのではなかった可能性が高い。DRP1は、ヒト肝臓細胞において、ミトコンドリア、細胞質ゾル/細胞質ベシクル、およびER/ER出口部位へ局在した。ER出口部位はまた、COPIIトラフィッキングだけでなく、オートファジー核形成においても機能的役割を果たす40。ER-ミトコンドリア会合膜における細胞質DRP1は、ERが会合したミトコンドリア分裂において機能することができる13。ミトコンドリア分裂に加えての、ERでのDRP1の役割は明らかになっていないが、DRP1は、特定の組織のER維持において機能的役割を有し得る。マウスβ細胞では、DRP1は小胞体タンパク質(ER resident protein)である41。β細胞におけるドミナントネガティブなDRP1の過剰発現は、対照条件下でER形態を変化させないが、DRP1阻害は、遊離脂肪酸処置によって誘導されるERの拡大を減弱させる41。細胞質DRP1は、部分的にERに局在し、DRP1阻害は、オートファジーフラックスを減じたので、PCSK9が分泌初期およびタンパク質分解経路に関連していることと併せて、DRP1阻害は、ERを通じたPCSK9トラフィッキングおよびタンパク質恒常性調節を変化させ得る。DRP1阻害は、ヒト肝臓細胞とマウス肝臓の両方で、オートファジーを減じたが完全には阻害しなかったように見受けられた。Mdivi-1は、HepG2においてBCL-XLを増加させたので、理論に束縛されるものではないが、BECLIN1保持によるBECLIN1依存性オートファジーを減じ、したがって、プレオートファゴソーム形成のBECLIN1による開始を妨害することができる。DRP1は、BCL-XLと結合することができ、BCL-XLは、DRP1活性を刺激するが42、このことは、これらのタンパク質との機能的相互作用を裏付け、阻害に対する代償性応答の可能性を高めている。DRP1の膜収縮活性に加えて、DRP1は、膜を係留するように機能することもでき43、このことは、これらの機能が、タンパク質恒常性のDRP1による調節にも関与し得る可能性を高めている。ミトコンドリアは、細胞のタンパク質恒常性にも作用する活性酸素種の供給源である1。Mdivi-1で処置されたHepG2細胞において、ミトコンドリア膜電位または細胞生存率の変化は観察されなかったが、ミトコンドリアの更なる変化、カルシウムのような関連するシグナル伝達分子、またはカルパインおよびカスパーゼを含むアポトーシス関連経路が、タンパク質恒常性におけるDRP1阻害媒介性の変化に関与しているか否かについては、さらなる調査が必要である。
【０１９７】
通常食下のマウスにおいて、循環コレステロールは大部分が高密度リポタンパク質の形態であり、よって、観察されたような総コレステロールのわずかな低減だけが、Drp1LiKOマウスにおいて見られた低減されたPCSK9分泌と共に予想される。通常食下のDrp1LiKOマウスは、循環PCSK9の78.5%低減に反して、わずかであるが有意な増加された肝臓LDLRおよび低減された血清LDLを有していた。同様に、PCSK9欠損がヘテロ接合であるマウスは、循環PCSK9のおよそ70%の低減を有し、ホモ接合性PCSK9欠損マウスでの約3.4倍のLDLRの増加と比較してLDLRは約1.3倍の増加である44;それ故、通常食下のマウスにおけるほんの少しの循環PCSK9の残留分でも、PCSK9媒介性LDLR分解にかなりの影響を及ぼすことができる。高脂肪食下、Drp1LiKOマウスは、低減されたVLDL分泌と併せて、低減された血清トリグリセリドおよび総血清コレステロールの低減を、通常食下で観察されたものの約2倍有する12。PCSK9が、LDL調節とは別に、炎症を含む追加の心血管疾患リスク因子に関与しているという新たに出現した証拠がある3。Mdivi-1は、糖尿病アポリポタンパク質E欠損マウスにおいて、酸化ストレスおよび炎症を低減させるが20、DRP1媒介性炎症調節の完全な機序は、未だ十分に解明されていない。
【０１９８】
DRP1欠損がヘテロ接合のヒトは、ヘテロ接合欠失マウスと同様に、生存能力があり健康であるが、ホモ接合性の全身DRP1欠損マウスは、神経発達に欠陥があり、胚性致死である28。野生型DRP1の全くないヒトが少数、DRP1タンパク質をコードするダイナミン1様遺伝子の突然変異（タンパク質突然変異（正常な初期発生から明らかな神経発生の問題に至る、多数の病変をもたらす）のドミナントネガティブおよび完全な喪失を含む）によって、出生後も生存していることが報告されている45,46。マウスにおいて、心臓のDRP1遺伝子欠損は、心不全をもたらすが26,27、Mdivi-1を介した薬理学的DRP1阻害は、虚血/再灌流傷害誘導性心筋梗塞を低減させる47。野生型DRP1を欠くヒトでは、正常な心電図および心エコー図の検査結果が報告されている46。言及すべきは、全身および肝臓特異的48HMGCR(スタチンの標的)欠損マウスにおいて致死性が観察されていることであり、このことは、薬理学的阻害と遺伝子欠失との間で、心血管療法の開発にとって重要な相違があることを実証している。
【０１９９】
現在のところ、Mdivi-1は、唯一同定されている選択的低分子DRP1阻害剤である。最近の報告49は、哺乳動物のDRP1の阻害におけるMdivi-1の効力について疑問を提起したが、組換えDRP1を使用した独立した報告31は、Mdivi-1による哺乳動物のDRP1活性阻害の元の知見を確認した30。ナイーブな野生型齧歯動物において、Mdivi-1注射によるか、DRP1阻害剤ペプチドによるか、局在化遺伝子療法によるかにかかわらず、DRP1阻害剤処置の10週間後まで、異常な表現型または細胞毒性は検出されなかった17。加えて、Drp1LiKOマウスは生存能力があるため、治療戦略として肝臓のDRP1を標的とすることの懸念を解消はしないが低減させている。それ故、肝臓のDRP1を標的とすることは、追加の手段18〜21を通じて心血管代謝に関する治療的恩恵を提供することに加えて、PCSK9阻害への妥当なアプローチであり得る。
【０２００】
実施例1および2に関する参考文献
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【０２０１】
方法と材料
試薬：ピタバスタチンおよびT0901317は、Kowa Company, Ltd.(Tokyo, Japan)によって合成および提供され、全ての実験で1μMの用量で扱われた。DMSO(ビヒクル;終濃度0.01%)およびMdivi-1(純度>99.85%)は、Sigma(St. Louis, MO)から購入した。DMSOビヒクル中のMdivi-1を、全ての実験で50μMの濃度で加えた。DMSOビヒクル中のMdivi-1を、50mLチューブ中の細胞培養培地に加え、数分間激しくボルテックスし、次いで、細胞に加える前に37℃でインキュベートして、化合物を完全に可溶化させた。
【０２０２】
ヒト細胞：HepG2細胞を、ATCC(Manassas, VA)から得て、12ウェルプレート(Corning, Durham, NC)において、10% FBS(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)ありまたはなしの、1% pen/strep、L-グルタミン含有EMEM(ATCC)培地中で培養した。HepG2細胞を60〜70%の密度でプレーティングしたのち、集塊を避けるための処置を行った。12ウェルプレートに100%のコンフルエンシーでプレーティングされた、新たに分離した初代ヒト肝細胞を、Thermo Fisher Scientificから得た。3人のドナーを使用して実験データを得た:43歳の白人女性、23歳の白人女性、および43歳の白人男性。初代肝細胞を到着後すぐに処理し、肝臓維持サプリメントパック(Thermo Fisher Scientific)、1% pen/strep(VWR; Radnor, PA)、および10% FBS(Thermo Fisher Scientific)を含有するウィリアムE培地中で培養した。細胞生存率を、Countess(商標)II LT自動細胞計数器(Thermo Fisher Scientific)での生/死細胞計数を使用したトリパンブルー色素排除によって評価した。
【０２０３】
マウス組織：Drp1LiKOおよびFlox/Flox対照マウスの作製は、過去に記載されている22。マウスに、通常食(5.4%脂肪、CRF-1; Orient Yeast, Tokyo, Japan)を自由に供給し、実験動物の管理と使用に関する指針に従って、12時間の明暗サイクル下で飼育した。全ての手順は、実験動物に関する倫理委員会(Kyushu University, Graduate School of Medicine)によって承認された。肝臓組織および血液を1ヶ月齢の雄のDrp1LiKO (n=5)およびFlox/Flox対照(n=5)マウスから単離した。全ての組織を、非絶食条件下で、日周調節の差を避けるために朝9時に単離した。血中グルコースを過去に記載されている通り測定した22。肝臓および血清試料をドライアイス上で日本から米国へ輸送し、処理前に-80℃で保存した。Wako(商標)総コレステロールEキット(Wako Chemicals, Japan)を使用して血清総コレステロールを、LabAssay(商標)トリグリセリドキット(Wako)によって血清トリグリセリドを、共に製造業者の説明書に従って測定した。リポタンパク質分布を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって決定した。リポタンパク質を、個々のマウスの血清(50μl)からSuperose 6カラム(HR 10/30)によってEDTA/NaCl/NaN3(1mmol/L;0.154mol/L;0.02%)を用いて0.5mL/minの流速で溶離させ、続いてWakoキットを使用した分画コレステロール分析によって、分割した。
【０２０４】
ヒト肝臓組織および免疫蛍光顕微鏡検査：剖検(n=4)からの肝臓を、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院(Brigham and Women’s Hospital)からIRBプロトコル# 2013P002517/BWHに従って、死後経過8〜18時間以内に収集した。凍結保存した肝臓試料を7μmの薄切片にカットし、アセトン中で固定した。4%血清中でブロッキングした後、切片を、一次抗体(ヒトSEC31A, 1:20; ab86600, Abcam, Cambridge, MA)、続いて抗ウサギAlexa Fluor 488抗体(1:200; Thermo Fisher Scientific)とインキュベートした。アビジン/ビオチン(Vector Laboratories, Burlingame, CA)でブロッキングした後、第二の一次抗体(DRP1, 1:20; ab56788, Abcam, Cambridge, MA)を4℃で一晩アプライし、続いて抗マウスAlexa Fluor 594抗体(Thermo Fisher Scientific)をアプライした。切片をPBS中で洗浄し、DAPIを含有する封入剤(Vector Laboratories)で包埋した。
【０２０５】
HepG2細胞および免疫蛍光顕微鏡検査：HepG2細胞を、0.1%ゼラチンコートLab-Tek IIチャンバーカバーガラス#1.5ホウケイ酸スライド(Lab-Tek, Rochester, NY)上で増殖させ、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、続いて0.3% Triton X-100を使用して5分間透過処理し、洗浄し、次いで、PBS中1% BSAで30分間ブロッキングした。線維状アクチンを、CytoPainter Phallodin iFluor 555 Reagent(1% BSA含有PBS 2000μl中ファロイジン2μl; Abcam)を使用して、室温で60分間のインキュベーションによって染色した。スライドを、抗アルファチューブリン(1:200, Abcam, ab15246)、PDI(1:100; 3501, Cell Signaling Technology)、および抗ミトコンドリア(ab92824, Abcam)と室温で2時間または4℃で一晩インキュベートし、続いて、Alexa Fluor 488標識二次抗体(1:200, Thermo Fisher Scientific)とインキュベートした。核染色をDAPI(Thermo Fisher Scientific)で実施した。可視化の前に、PBS 200μLを各ウェルに加えた。肝臓組織および細胞を、共焦点顕微鏡A1(Nikon Instruments Inc., Melville, NY)を使用して調べ、全ての画像をElements 3.20ソフトウェア(Nikon Instruments Inc.)で処理した。
【０２０６】
ミトコンドリア膜電位：ミトコンドリア膜電位を、過去に記載されている通り21TMRE試薬(Abcam)によって評価した。
【０２０７】
SILACおよび質量分析：HepG2細胞を、100mmのディッシュ上、約60〜70%のコンフルエンシーで培養した。細胞を、軽い標識リジンまたは重い標識リジンのいずれかを含有するSILAC培地中で、質量分析によって重いリジンが>99%組み込まれたことが判明するまで、約2週間培養した。DMEM(リジン不含、アルギニン不含; A14431-01, Thermo Fisher Scientific)に、L-グルタミン(2mM, Lonza, Walkersville, MD)、L-アルギニンHCl(0.17mM; Sigma)、軽いL-リジンHCl(0.339mM; Sigma)、または重いL-リジン2HCl(0.339mM; Cambridge Isotopes, Tewksbury, MA)のいずれか、10%透析済みFBS(Thermo Fisher Scientific)、1% pen/strepを加えて培地を調製した。培地を2日毎に交換し、必要に応じて細胞を分割した。実験時に、培地を、FBS不含であるがMdivi-1(50μM)またはビヒクル(0.01% DMSO)のいずれかを添加したSILAC DMEMに切り替えた。24時間のインキュベーション後、ビヒクルを含む重い標識の培地9mLを収集し、Mdivi-1を含む軽い培地9mLと共にプールした。同様に、Mdivi-1を含む重い標識の培地9mLを、ビヒクルを含む軽い培地9mLと共にプールした。培地をVivaspin(商標)20 Concentrator 5,000 MWCOカラム(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)中で製造業者の説明書に従って濃縮した。試料100μgを溶解し、溶存尿素+RapiGest(商標)(Waters)を使用してタンパク分解した(トリプシン1μg/タンパク質100μg; Promega, Madison, WIまたはLys-C 0.5μg/タンパク質100μg)。ペプチドを、Oasis Hlb 1cc(10mg)カラム(Waters, Milford, MA)を使用して脱塩し、次いで、卓上高速バキューム(Thermo Fisher Scientific)を使用して乾燥させ、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)による後続の分析のために、5%アセトニトリル(Thermo Fisher Scientific), 5%ギ酸(Sigma) 40μLに再懸濁した。
【０２０８】
ペプチド試料を希釈[1/10倍]し、Nanospray(商標)FLEXイオン源を前に置いた、Easy-nLC1000 HPLCポンプ(Thermo Fisher Scientific)に接続した高分解/精度Q Exactive(商標)質量分析計で分析した。ペプチドを二重カラム設定に供した:Acclaim PepMap(商標)RSLC C18トラップカラム75mm×20mm;およびAcclaim PepMap(商標)RSLC C18分析カラム75mm×250mm(Thermo Fisher Scientific)。分析勾配を、300 nl/minで、溶媒B(アセトニトリル/0.1%ギ酸)を130分間で5〜18%、連続的に、35分間で18〜28%、10分間で28〜65%、続いて、95%溶媒Bを5分間流した。溶媒Aは0.1%ギ酸とした。全ての試薬をHPLC等級とした。装置を分解能140Kに設定し、上位10種の前駆イオン(380〜2000m/zの走査範囲内)を、高エネルギー衝突誘起解離(HCD、衝突エネルギー25%(+/-10%)、選択幅1.6 m/z、可能なダイナミックエクスクルージョン(20s)、および17.5Kに設定した分解能)に供した。HT-SEQUEST(商標)検索アルゴリズムを使用し、Proteome Discoverer(商標)Package(version 1.4, Thermo Scientific)を介し、MS1検索空間中の10ppmの許容枠、およびHCDについて0.02Daの断片許容枠を使用して、MS/MSデータをヒトUniProt(商標)データベース(2014年8月1日にダウンロード)に対して照会した。メチオニン酸化を可変修飾として設定し、システイン残基のカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。ペプチドの偽発見率(FDR)を、Proteome Discovererによって提供されるPercolator(商標)を使用して計算した。ペプチドを1% FDRに基づきフィルタリングした。また、SILACピークペアの数量化も、Proteome Discoverer(商標)で、上位3種の最も豊富なペプチドを使用して行った。適正な同定および再現性を確保するために、Mdivi-1処置後に分泌が低減したタンパク質を、2以上の固有のペプチドを有することによって同定し、Mdivi-1で処置された軽い標識の細胞と重い標識の細胞でのものの両方を少なくとも1回含む、少なくとも3回の実験において観察した。有意な変化とは、平均値(Mdivi-1処置/ビヒクル処置のピーク強度比)に標準偏差の2倍を加えたものが対照値(ビヒクル処置/ビヒクル処置のピーク強度=1)未満であるタンパク質とした。
【０２０９】
PCSK9 ELISA：マウス前駆タンパク質転換酵素9/PCSK9 quantikine ELISA kit(MPC900, R&D Systems, Minneapolis, MN)を使用してマウス血清PCSK9を、ヒト前駆タンパク質転換酵素9/PCSK9 DuoSet ELISA(DY3888, R&D Systems)を使用してヒト肝臓細胞分泌PCSK9を、共に製造業者のプロトコルに従って測定した。
【０２１０】
CRISPR/Cas9遺伝子編集：HepG2細胞を、150mmプレート(Corning)に、pen/strepなしの10% FBS含有EMEM中、60〜70%のコンフルエンシーでプレーティングした。翌日、細胞を0.25%トリプシン-EDTA溶液(ATCC)で剥がし、懸濁状態にある間に、リポフェクタミン(商標)3000試薬(Thermo Fisher Scientific)を製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクトした。細胞に、ヒトDRP1 CRISPR/Cas9 KOプラスミド(sc-400459, Santa Cruz, Dallas, TX)およびヒトDRP1 HDRプラスミド(sc-400459-HDR, Santa Cruz)を共トランスフェクトした。対照細胞には、対照CRISPR/Cas9プラスミド(sc-41-8922, Santa Cruz)をトランスフェクトした。細胞を、37℃で72時間にわたり、48時間後に培地を交換してインキュベートした。GFPおよびRFP蛍光を共焦点顕微鏡検査によって調べた。次いで、BDFACS Aria(商標)IIセルソーター(BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ)を使用したFACSによって、細胞をソーティングしてGFP陽性細胞を単離した。GFP陽性細胞をプレーティングし、KOプラスミド細胞をピューロマイシン選択によってさらに選択した(2μg/mL EMEM(10% FBS含有)中で5日間、2日毎に培地を交換しながら)。次いで、細胞をプレーティングしてコロニーを得て、これをウェスタンブロット分析によって、DRP1遺伝子編集について評価した。
【０２１１】
RNA抽出およびリアルタイムPCR：ヒト細胞およびマウス肝臓を、TriZol(商標)(Life Technologies, Grand Island, NY)と共にホモジナイズして、RNAを単離した。QuantiTect(商標)Reverse Transcription Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を、全RNAについての逆転写に使用した。Quanta qScript(商標)cDNA Synthesis Kit(Bioscience Inc., Gaithersburg, MD)を使用して、cDNAを作製した。7900HTリアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher Scientific)にて、TaqMan(商標)リアルタイムPCRを以下のプローブと共に使用して、mRNAレベルを定量した:Hs02758991_g1(ヒトGAPDH); Mm99999915_g1(マウスGapdh); Hs00236329_m1(ヒトBCL2L1); Hs00247147_m1(ヒトDRP1); Hs00545399_m1(ヒトPCSK9); Mm01263610_m1(マウスPcsk9); Hs00168352_m1(ヒトHMGCR); Mm01282499_m1(マウスHmgcr); Hs00181192_m1(ヒトLDLR); Mm00440169_m1(マウスLdlr); Hs01088691_m1(ヒトSREBP1); Mm00550338_m1(マウスSrebp1); Hs00231674_m1(ヒトSREBP1a);カスタムプライマー(ヒトSREBP1c); Hs01081784_m1(ヒトSREBP2); Mm01306292_m1(マウスSrebp2); Hs01005622_m1(ヒトFASN); Mm00662319_m1(マウスFasn); Hs00167041_m1(ヒトHNF1A); Mm00493434_m1(マウスHnf1a); Hs00171168 (ヒトAPOE); Hs01059118_m1(ヒトABCA1); Hs01103582_s1(ヒトJUN)。以下のプライマーを用いたSYBER(商標)green PCRによって、マウスSREBP-1cを分析した。
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全ての発現レベルを、ΔΔCT法を使用してGAPDHに対して正規化した。
【０２１２】
タンパク質抽出およびウェスタンブロッティング：ヒト肝臓(n=50のプールしたドナー)由来のS9画分をThermo Fisherから得た。ネイティブPCSK9過剰発現溶解物および対照HEK293溶解物をNovusから得た。HeLa PCSK9 CRISPRノックアウトおよび対照溶解物をOrigeneから得た。ATCCから得られた細胞からTHP1溶解物を単離した。LDLR欠損(#002207)および対照(#000664)マウスをJackson labから得て、ウェスタンブロット抗体対照のために肝臓組織を収集した。過去に記載されている通り21、過剰発現したマウスPCSK9肝臓組織溶解物を、PCSK9機能獲得型アデノ随伴ウイルスを注射したマウスから得た。全細胞/組織溶解物用の1×Halt混合プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Fisher Scientific)を含有する氷冷RIPA緩衝液(Thermo Fisher Scientific)中で、ヒト細胞およびマウス肝臓をホモジナイズした。NE-PER核単離キット(Thermo Fisher Scientific)を製造業者のプロトコルに従って使用して、マウス肝臓組織から核タンパク質溶解物を単離した。タンパク質濃度を、Pierce BCAアッセイ(商標)(Thermo Fisher Scientific)によって決定した。タンパク質溶解物を、SDSローディング緩衝液(Boston BioProducts, Ashland, MA)中4〜15%のゲル(Bio-Rad, Hercules, CA)にロードした。ゲルをiBlot(商標)ニトロセルロース膜(Thermo Fisher Scientific)に転写し、一次および二次抗体とインキュベートし、ImageQuant(商標)LA54000(GE Healthcare)で撮像した。ウェスタンブロット分析に使用した一次抗体は以下を含んだ:β-アクチン(1:5,000, NB600-501, Novus, Littleton, CO);α-チューブリン(1:1000, ab15246, Abcam); DRP1(1:1,000, ab56788, Abcam);ヒト細胞に使用したPCSK9(BAF3888, R&D Systems)およびマウス肝臓に使用したPCSK9(AF3985, R&D Systems);ヒト細胞にのみ使用したPCSK9(1:1000, ab28770, Abcam); LDLR(1:1000, 3839-100, BioVision Inc, Milpitas, CA); SREBP2(1:1000, ab30682, Abcam); SREBP1(1:500, ab3259, Abcam); ラミンA/C(1:1000, 39288, Activ Motif, Carlsbad, CA); FASN(1:200, sc-55580, Santa Cruz); HMGCR(1:1000, ab174830, Abcam); c-Jun(1:1000, 9165S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); p(S73)c-Jun(1:1000, 3270s, Cell Signaling Technology); p(S616)DRP1(1:1000, 3455s, Cell Signaling); p(S637)DRP1(1:1000, 4867s, Cell Signaling); BIP(1:1000, 3177P, Cell Signaling Technology); CHOP(1:1000, 2895P, Cell Signaling Technology(商標)); HNF1a(1:200, sc-6547, Santa Cruz); BCL-2(1:200, sc-7382, Santa Cruz; 1:1000, 4223S, Cell Signaling Technology); BCL-XL(1:1000, 2764S, Cell Signaling Technology); p62(1:1000, 5114S, Cell Signaling Technology); p(S349)p62(1:1000, 95697S, Cell Signaling Technology); LC3(1:1000, NB100-222, Novus)。数量化のために、NIH ImageJソフトウェアを使用して、タンパク質レベルをβ-アクチン、α-チューブリン、またはラミンA/Cに対して正規化した。
【０２１３】
Endo Hアッセイ：一部小さな改変を加えて、(14)に記載の通りEndo Hアッセイを実施した。簡潔に述べると、RIPA緩衝液中の全マウス肝臓溶解物20μgを、10ミリユニットのEndo H酵素(New England Biolabs(商標), Ipswich, MA)と共に、またはそれなしで、37℃で一晩インキュベートし、続いて、試料を70℃で20分間加熱し、ウェスタンブロット分析を実施した。NIH ImageJソフトウェアを使用して、総PCSK9(Endo耐性+感受性PCSK9)に対するEndo H耐性PCSK9の比としてEndo H耐性を数量化した。
【０２１４】
電子顕微鏡検査：HepG2細胞を、150mmプレート上、約60〜70%の密度で増殖させた。培地をデカントし、室温固定剤をプレートに直接加えて細胞を被覆した。ER形態学用には、細胞を0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中2%グルタルアルデヒドで固定し、免疫EM用には、細胞を0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中4.0%パラホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒド中で固定した(固定剤およびEM洗浄緩衝液は、Mass General PMB microscopy coreによって新たに調製および提供された)。細胞を室温で2時間固定した。固定剤をデカントし、細胞を0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回すすいだ。ポリエチレンセルリフター(Corning)で細胞を擦り取り、15mLの遠心チューブ(Corning)に移した。ディッシュを0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液2mLですすぎ、その洗浄液を15mLチューブに加えた。4℃の遠心分離機にて、2,000rpmで10分間細胞懸濁液を遠心沈降させた。上清を除去し、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液2mLをチューブに、ペレットを破壊しないようにして加えた。ペレット試料を4℃で保存し、超低温切片としてEM処理するためにMass General PMB microscopy coreに提示した。DRP1抗体(1:100, ab56788, Abcam)を使用してDRP1免疫金標識を実施した。
【０２１５】
ネットワーク分析：SILACデータセットから、パスウェイエンリッチメントのネットワーク表示を作成した。ノードサイズを、-log(q値)の単位で測定されるエンリッチメントの有意性に比例するように設定し、ここで、q値は、超幾何分布検定によって過剰提示を試験し、偽発見率(FDR)を制御するためのBenjamini-Hochberg法を使用して多重比較を調整することによって計算した。エッジの太さを、接続された2つの経路間で重複するタンパク質の数に比例するように、Jaccard係数の単位で設定した。Jaccard係数は、以下の通り定義される。
2019532049.tif 000014
式中、sAおよびsBはそれぞれ、経路Aおよび経路Bに属するタンパク質のうち、プロテオミクスにおいて検出されたもののセットである。明瞭にするため、視覚化に際して、Jaccard係数<0.1のエッジを切り捨てた。パスウェイエンリッチメント分析のために、KEGG、BiocartaおよびReactomeからのカノニカル経路を考慮した。
【０２１６】
統計解析：PRISMソフトウェア(GraphPad, San Diego, CA)を使用し、t検定またはANOVA（事後検定を伴う）を適宜用いてデータを解析した。1試料t検定を使用してSILAC質量分析のデータ解析を実施し、有意な各タンパク質比率が1(Mdivi-1処置の効果がない場合の理想比率)からどれだけ離れていたかを評価し、次いで、Benjamini and Hochberg法(FDR)を使用してp値を調整して、ボルケーノプロットを使用して結果を視覚化した。
【０２１７】
本明細書およびその全体を通して引用される参考文献は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月17日(2019.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019532049000001.app
【国際調査報告】
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2019532049.tif 000059
2019532049.tif 000060