(57)【要約】  本発明は、タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート、及びタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート、並びにこれらのコンジュゲートを製造するためのポリアミノ酸に関する。さらに、前記コンジュゲート及びポリアミノ酸の製造方法に関する。【選択図】図１
2019508375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式１：
【化１】
2019508375.tif 000045
（式中、
Ｐｔｎは、タンパク質を示し、
ＥＴは、ＰｔｎのＮ末端に連結される場合、
【化２】
2019508375.tif 000046
であり、ＰｔｎのＮ末端以外の部位に連結される場合、
【化３】
2019508375.tif 000047
であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１〜３００から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項２】
Ｐｔｎは、ポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、組換えワクチンを含むタンパク質であり、好ましくは、Ｐｔｎはインターフェロンα２ｂである、請求項１に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項３】
Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれ、好ましくは、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項１又は２に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項４】
Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項５】
次の一般式２：
【化４】
2019508375.tif 000048
（式中、
Ｐｔｎ、ＥＴ、Ｒ１及びＲ２は、請求項１〜４のいずれかに記載の定義と同様であり、
ｎは、１〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項６】
次の一般式３：
【化５】
2019508375.tif 000049
（式中、
Ｐｔｎは、Ｎ末端におけるシステイン残基とＣ末端におけるＬＰＸａＴ配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Ｘａは１種又は複数種のアミノ酸を示し、
ＰＡＡ（Ｇｌｙ）ｍは、次の一般式４で表される構造を有し、
【化６】
2019508375.tif 000050
式中、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１０〜３００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項７】
Ｐｔｎは、ポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、組換えワクチンを含むタンパク質であり、好ましくは、Ｐｔｎはインターフェロンα２ｂである、請求項６に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項８】
Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項６又は７に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項９】
Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す、請求項６〜８のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項１０】
次の一般式５：
【化７】
2019508375.tif 000051
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、ポリアミノ酸化合物。
【請求項１１】
Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項１０に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１２】
Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す、請求項１０又は１１に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１３】
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ１８アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ１８ヘテロアリール基を示し、その中で、Ｒ５を置換する置換基は、Ｃ１−３ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び／又はハロゲンその中で、Ｒ５を置換する置換基は、Ｃ１−３ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び／又はハロゲンからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ１８アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ１８ヘテロアリール基を示す、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１４】
Ｒ５は、以下の構造から選ばれる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物。
【化８】
2019508375.tif 000052
【請求項１５】
次の一般式６：
【化９】
2019508375.tif 000053
（式中、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５は、請求項１０〜１４のいずれかに記載の定義と同様であり、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート、請求項６〜９のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物の、タンパク質の製造における使用。
【請求項１７】
（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸を得るステップと、
（２）得られたポリアミノ酸と１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップとを含む、
部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法。
【請求項１８】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸ＰＡＡ−ＸＲ５を得る、請求項１７に記載の方法。
【化１０】
2019508375.tif 000054
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
【請求項１９】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸ＰＡＡ−ＸＲ５を得る、請求項１７に記載の方法。
【化１１】
2019508375.tif 000055
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
【請求項２０】
前記Ｒ５ＸＹは、トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップ（１）は非プロトン性溶媒中且つ室温で行われる、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸について後修飾を行い、前記後修飾は、前記得られたポリアミノ酸と、メルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である調整剤とを混合して紫外線ランプの照射下で反応させることを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（２）では、以下のように、前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る、請求項１８に記載の方法。
【化１２】
2019508375.tif 000056
（式中、Ｐｔｎはタンパク質を示す。）
【請求項２４】
前記ステップ（２）では、以下のように、前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る、請求項１９に記載の方法。
【化１３】
2019508375.tif 000057
（式中、Ｐｔｎはタンパク質を示す。）
【請求項２５】
（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、
（２）得られたブロックポリアミノ酸と、Ｎ末端にシステインを有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ配列（Ｘａはいずれかのアミノ酸である）を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む、
部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法。
【請求項２６】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得る、請求項２５に記載の方法。
【化１４】
2019508375.tif 000058
（式中、Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基をを示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【請求項２７】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物と別の１種のＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得る、請求項２５に記載の方法。
【化１５】
2019508375.tif 000059
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基をを示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【請求項２８】
前記Ｒ５ＸＹは、トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（１）は非プロトン性溶媒中且つ室温で行われる、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸について後修飾を行い、前記後修飾は、前記得られたポリアミノ酸と、メルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である調整剤とを混合して紫外線ランプの照射下で反応させることを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（２）では、以下のように、前記ステップ（１）で得られたブロックポリアミノ酸と、Ｎ末端にシステインを有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ配列を有するタンパク質とを混合して、前記ブロックポリアミノ酸と前記タンパク質のＮ末端におけるシステインとをライゲーション反応させ、次にソルターゼの存在下で環化を達成する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【化１６】
2019508375.tif 000060
（式中、ＬＰＸａＴＧ配列はソルターゼの認識部位である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬品の分野に関し、具体的には、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート、このようなコンジュゲートを製造するポリアミノ酸（以下「ＰＡＡ」と略称する場合もある）、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質薬物（例えば、抗体、インターフェロン）は、バイオ医薬品分野、例えば標的療法、臨床診断等に幅広く利用されている。他の薬物に比べて、タンパク質薬物は、特異性に優れ、効き目が速く、低毒性である。しかしながら、このような薬物の安定性が悪く、血液循環時間が短い等の欠点があるため、その薬効や応用は制限される。
【０００３】
従来、タンパク質の安定性を向上させて血液循環時間を延長させる系として、研究が多かったのは、タンパク質−高分子ハイブリッド系（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）である。タンパク質薬物は、通常、インビでボプロテアーゼにより分解されるため、血液循環時間が短くなり、したがって、水溶性に優れた高分子材料をタンパク質の表面にグラフトして、タンパク質に対して一定の保護効果を果たすことにより、タンパク質の免疫原性を低下させると共に、プロテアーゼによるタンパク質の分解を低下させて血液循環時間を延長させることができる。例えば、インターフェロン−α２ａは慢性Ｃ型肝炎を治療する薬物であり、その表面に１本の４０ｋＤａのポリエチレングリコール鎖をグラフトすることにより血液循環時間を有意に延長でき、インターフェロン−α２ａ−ポリエチレングリコールハイブリッド材料は既に臨床に適用されている。
【０００４】
しかしながら、現在、臨床に応用されているタンパク質−高分子ハイブリッド系では、主にポリエチレングリコールを高分子セグメントとして使用するのが一般的である。ポリエチレングリコールは、免疫原性が低く、水溶性に優れる等の利点を有するが、ポリエチレングリコールの化粧品、食品、製薬等の分野へ幅広く応用されるにつれて、大部のヒトのインビボでは、ポリエチレングリコール抗体がすでに生じたため、ポリエチレングリコールで修飾されたタンパク質の血液での除去を、かえって速めることになる。さらに厳しくなるのは、ポリエチレングリコールが人体内で分解できないため、長期間摂取される場合、毒性が蓄積されてしまう。したがって、分解可能で生体適合性に優れる高分子材料の開発は目睫の間に迫っている。
【０００５】
ポリアミノ酸（ＰＡＡ：Ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ））は、良好な生体適合性を有する高分子材料であり、主鎖の分解性及び側鎖の利便性のいずれからも、タンパク質の変性に幅広く利用できる。もっと重要なのは、ポリアミノ酸がポリペプチド主鎖構造を有し、生体適合性に優れ、免疫原性が低い等の特徴を有し、タンパク質薬物の修飾に適することである。
【０００６】
このため、本発明は、本分野に存在する欠点を解決するために、タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート及びタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートを提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様によれば、下記一般式１で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
【化１】
2019508375.tif 000003
（式中、
Ｐｔｎは、タンパク質を示し、ＥＴは、ＰｔｎのＮ末端に連結される場合、
【化２】
2019508375.tif 000004
であり、ＰｔｎのＮ末端以外の部位に連結される場合、
【化３】
2019508375.tif 000005
であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１〜３００から選ばれる整数である。）
【０００８】
一実施形態では、本発明の前記タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートは、下記一般式２で表される構造を有する。
【化４】
2019508375.tif 000006
（式中、
Ｐｔｎ、ＥＴ、Ｒ１及びＲ２は、本明細書で定義した通りであり、
ｎは、１〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【０００９】
本発明の別の態様によれば、下記一般式３で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートを提供する。
【化５】
2019508375.tif 000007
（式中、
Ｐｔｎは、Ｎ末端におけるシステイン残基とＣ末端におけるＬＰＸａＴ配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Ｘａは１種又は複数種のアミノ酸を示し、
ＰＡＡ（Ｇｌｙ）ｍは、下記一般式４で表される構造を有し、
【化６】
2019508375.tif 000008
式中、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１０〜３００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【００１０】
また、本発明の別の態様によれば、下記一般式５で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸（環状）コンジュゲートを製造するためのポリアミノ酸化合物を提供する。
【化７】
2019508375.tif 000009
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、本発明の前記ポリアミノ酸化合物は下記一般式６で表される構造を有する。
【化８】
2019508375.tif 000010
（式中、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５は、本明細書で定義した通りであり、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【００１２】
本発明の更なる態様によれば、（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸を得るステップと、（２）得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップとを含む、上記部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法を提供する。
本発明の一実施形態によれば、（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシン（ＰＧｌｙ）のブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、（２）得られたブロックポリアミノ酸と、Ｎ末端にシステイン残基を有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ配列（Ｘａはいずれかのアミノ酸である）を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ媒介性反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、本発明の前記タンパク質−ポリアミノ酸（環状）コンジュゲートの、タンパク質の製造における使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
以下、図面を参照しながら、本発明の例示的な実施形態について説明するが、該図面は、本発明の内容を当業者に理解させやすいようにするためのものに過ぎず、本発明の内容の範囲を限定することを意図しない。
【図１】本発明の一実施形態に係る部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸（ＰＡＡ）コンジュゲートの模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るタンパク質−ポリアミノ酸の環化反応の模式図である。
【図３】実施例１に係るポリアミノ酸Ｐ１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。
【図４】実施例１５に係る環状コンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルであり、その中で、ＯはＬ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステルセグメントを示し、Ｇはグリシンセグメントを示し、添字は対応セグメントの重合度を示す。
【図５】実施例１６に係るＥＮＬＹＦＱ−Ｃｙｓ−ｅＧＦＰタンパク質のＵＰＬＣ−ＭＳスペクトルである。
【図６】実施例１８に係るＣｙｓ−ｅＧＦＰタンパク質のＵＰＬＣ−ＭＳスペクトルである。
【図７】実施例１９に係るポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）−強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）コンジュゲートの電気泳動図であり、変性タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ａ）及び非変性タンパク質ゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ）（Ｂ）を示す。
【図８】実施例２０に係るＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリグリシン（ＰＧｌｙ）コンジュゲートの電気泳動図であり、変性タンパク質ゲル電気泳動（Ａ）及び非変性タンパク質ゲル電気泳動（Ｂ）を示す。
【図９】実施例２１に係るポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）−強化緑色蛍光タンパク質−ポリグリシン−ポリエチレングリコールのノード状コンジュゲートの電気泳動図であり、変性タンパク質ゲル電気泳動（Ａ）及び非変性タンパク質ゲル電気泳動（Ｂ）を示す。
【図１０】実施例２２に係る強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−インターフェロンαのダンベル状コンジュゲートの電気泳動図であり、変性タンパク質ゲル電気泳動（Ａ）及び非変性タンパク質ゲル電気泳動（Ｂ）を示す。
【図１１】実施例２３に係る環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートの特徴付けを示す。Ａ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｂ：変性タンパク質ゲル電気泳動、及びＣ：ウエスタンブロット分析。
【図１２】実施例２４に係るＣｙｓ−強化緑色蛍光タンパク質（Ａ）、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質（Ｂ）及び環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲート（Ｃ）の酵素安定性の特徴付けを示す。図のＡ、Ｂ及びＣ内のブロックはタンパク質又はタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート原料を示す。
【図１３】実施例２６に係るタンパク質−インターフェロンのＵＰＬＣ−ＭＳスペクトルである。
【図１４】実施例２７及び２８に係るポリアミノ酸コンジュゲートの電気泳動図である。
【図１５】実施例２９に係る環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）コンジュゲートの特徴付けを示す。Ａ：環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）コンジュゲートの変性ゲルゲル電気泳動。Ｂ：環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）コンジュゲートのウエスタンブロット分析。Ｃ：環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）コンジュゲートの変性ゲルゲル電気泳動。Ｄ：環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）コンジュゲートのウエスタンブロット分析。
【図１６】実施例３０に係る各タンパク質サンプルのＴｍ値を示す縦棒グラフである。
【図１７】実施例３１に係るトリプシン耐性テスト結果のグラフである。
【図１８】実施例３２に係る野生型インターフェロンα（ｗｔ−ＩＦＮα）、ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００、Ｌ型）−ＩＦＮαコンジュゲート及びポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００,Ｄ、Ｌ型）−ＩＦＮαコンジュゲートの円二色性スペクトルの特徴付けを示す。
【図１９】実施例３４に係るポリアミノ酸−インターフェロンコンジュゲートの血中濃度を示すグラフである。
【図２０Ａ−Ｂ】実施例３５に係るポリアミノ酸−コンジュゲート及び環状ポリアミノ酸−コンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２１】実施例３７に係るポリアミノ酸−抗体コンジュゲートの電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、具体的な実施形態に基づいて本発明の内容をさらに説明するが、挙げられた実施形態は例示的なものに過ぎず、本発明の内容を制限することを意図しない。当業者であれば、以下のいずれかの実施形態における具体的な特徴が本発明の主旨から逸脱しない限り、その他の実施形態にも適用できると理解すべきである。
【００１６】
定義
以下、特に断らない限り、本明細書に記載のすべての用語（技術用語と科学用語を含む）は、本発明の所属分野の当業者が通常理解する意味と同様である。明示的に定義されていない限り、用語、例えば一般的な辞書に定義された用語は、関連技術の文脈における意味と一致した意味を有し、且つ理想化された意味や過度に正式的な意味で解釈されない。
【００１７】
例えば、本明細書に記載の用語「Ｃ１−３０」とは、基の主鎖に１〜３０のいずれかの整数個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、３０個の炭素原子を有することを意味する。
【００１８】
本明細書に記載の用語「アルキル基」とは、直鎖又は分岐鎖を有する飽和脂肪族炭化水素基である。その非限定的な例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。例えば、本明細書に記載の用語「アルケニル基」とは、アルキル基の炭素鎖に沿って１つ又は複数の位置に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素基を意味する。その非限定的な例として、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基等が挙げられる。例えば、本明細書に記載の用語「アルキニル基」とは、アルキル基の炭素鎖に沿って１つ又は複数の位置に少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素基を意味する。その非限定的な例として、エチニル基、プロピニル基等が挙げられる。
【００１９】
例えば、本明細書に記載の用語「ヘテロアルキル基」、「ヘテロアルケニル基」、「ヘテロアルキニル基」は、それぞれＮ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ及びＳから選ばれるヘテロ原子を少なくとも１つ含むアルキル基、アルケニル基、アルキニル基である。
【００２０】
例えば、本明細書に記載の用語「シクロアルキル基」とは、単環式飽和炭化水素基である。その非限定的な例として、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基及びシクロヘプチル基が挙げられる。例えば、本明細書に記載の用語「ヘテロシクロアルキル基」とは、環化原子としてＮ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ及びＳから選ばれるヘテロ原子を少なくとも１つ含む単炭素環式基である。その非限定的な例として、テトラヒドロフラニル基及びテトラヒドロチエニル基が挙げられる。
【００２１】
例えば、本明細書に記載の用語「シクロアルケニル基」とは、その環に炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する単環式基であって、芳香族のものではない基を意味する。その非限定的な例として、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基及びシクロヘプテニル基が挙げられる。例えば、本明細書に記載の用語「ヘテロシクロアルケニル基」とは、その環に環化原子としてＮ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子、及び少なくとも１つの二重結合を有する単炭素環式基である。その非限定的な例として、４,５−ジヒドロ−１,２,３,４−オキサトリアゾリル基、２,３−ジヒドロフラニル基及び２,３−ジヒドロチエニル基が挙げられる。
【００２２】
例えば、本明細書に記載の用語「アリール基」とは、炭素環芳香族系を含む基である。その非限定的な例として、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントレニル基、ピレニル基等が挙げられる。アリール基が複数の環を含む場合、それぞれの環は互いに縮合してもよい。
【００２３】
例えば、本明細書に記載の用語「ヘテロアリール基」とは、環化原子としてＮ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ及びＳから選ばれるヘテロ原子を少なくとも１つ含む炭素環芳香族系基である。その非限定的な例として、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピラジニル基、トリアジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基等が挙げられる。ヘテロアリール基が複数の環を含む場合、それぞれの環は互いに縮合してもよい。
【００２４】
タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート
本発明の一実施形態では、一般式１で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
【化９】
2019508375.tif 000011
（式中、
Ｐｔｎは、タンパク質を示し、
ＥＴは、ＰｔｎのＮ末端に連結される場合、
【化１０】
2019508375.tif 000012
であり、ＰｔｎのＮ末端以外の部位に連結される場合、
【化１１】
2019508375.tif 000013
であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１〜３００から選ばれる整数である。）
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、Ｐｔｎは酵素、ホルモン、サイトカイン、モノクローナル抗体及び／又はタンパク質ワクチンから選ばれるタンパク質である。本発明の別の実施形態によれば、Ｐｔｎは、例えばポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、及び組換えワクチン等のタンパク質である。本発明の別の実施形態によれば、Ｐｔｎはインターフェロンα２ｂである。本発明に使用し得るタンパク質は特に制限がなく、ＥＴ結合基（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）と連結できればよい。理論的に、いずれの修飾後のタンパク質も本発明に利用できる。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得る酵素は、プロテイナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、グルタミナーゼ、アルギナーゼ、セリンデヒドラターゼ、フェニルアラニンアミノラーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、ペニシリナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルカナーゼ及び／又はデキストラナーゼが挙げられるが、それらに制限されない。
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るホルモンは、視床下部ホルモン、下垂体ホルモン、消化管ホルモン、インシュリン、カルシトニンが挙げられるが、それらに制限されない。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るサイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ケモカイン及び／又は成長因子が挙げられるが、それらに制限されない。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１及び／又はＩＬ−３２が挙げられるが、それらに制限されない。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るインターフェロンは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γα、ＩＦＮ−λ及びそのサブタイプが挙げられるが、それらに制限されない。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るコロニー刺激因子は、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、多能性コロニー刺激因子、幹細胞因子、白血病阻害因子及び／又はエリスロポエチンが挙げられるが、それらに制限されない。
【００３１】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得る成長因子は、表皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子及び／又は神経成長因子が挙げられるが、それらに制限されない。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るモノクローナル抗体は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、タネツマブ、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ、アマチュシマブ、アポリツマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン、ブレンツキシマブ・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カンツズマブレブタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、シタツズマブ・ボガトクス、シクスツムマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマクソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ギレントキシマブ、グレムバツムマブベドチン、イブリツモマブ・チウキセタン、イゴボマブ、インドタキシマブレブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミトモマブ、モガムリズマブ、ナコロマブ・タフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ネチツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オナツズマブ、オポツズマブモナトックス、オレゴボマブ、ペムトモマブ、パトリツマブ、ペルツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、オマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タプリツモマブパプトックス、テナトモマブ、テプロツムマブ、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、ツコツズマブセルモリンキン、ウレウマブ、ベルツズマブ、ボロキシマブ、ボツムマブ、及びザルツムマブ（それらの抗原結合断片を含む）が挙げられるが、それらに制限されない。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、本発明に使用し得るタンパク質ワクチンは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、炭疽菌分泌タンパク質ワクチン及び／又は血漿由来B型肝炎ワクチンが挙げられるが、それらに制限されない。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれる。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれ非天然アミノ酸の側鎖、例えば人工的に修飾された上記天然アミノ酸を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール（重合度２〜１０、例えばトリエチレングリコール、ＯＥＧ３）、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれトリエチレングリコール（ＯＥＧ３）で修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す。本発明では、Ｒ１について特に制限がなく、理論的に、天然アミノ酸であれば、本発明のコンジュゲートにそのまま利用でき、又は、安定性を改善するために、修飾された後に本発明に係るコンジュゲートに利用できる。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ２は、それぞれ水素、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ２は水素又はメチル基を示す。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、ｎは１〜２００から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１〜１５０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１〜１００から選ばれる整数を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、ｎは１〜５０から選ばれる整数を示す。理論的に、得られたコンジュゲートが安定的に存在する限り、ｎはいずれの数値であってもよく、当業者であれば、必要に応じて、具体的にｎ値を設定することができ、且つ、この選択は当業者の身に付けるべき能力である。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、下記一般式２で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
【化１２】
2019508375.tif 000014
（式中、
Ｐｔｎ、ＥＴ、Ｒ１及びＲ２は前記一般式１の定義と同様であり、
ｎは、１〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【００３８】
本発明の一実施形態によれば、ｎは１〜１５０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１〜１００から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１〜５０から選ばれる整数を示す。本発明の一実施形態によれば、ｍは１〜２０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｍは１〜１０から選ばれる整数を示す。前記の通り、得られたコンジュゲートが安定的に存在する限り、ｎ値及びｍ値はいずれの数値であってもよく、本発明に挙げられる特定の範囲に制限されない。当業者であれば、必要に応じて、具体的にｎ値及びｍ値を設定することができ、且つ、この選択は当業者の身に付けるべき能力である。
【００３９】
タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート
本発明の一実施形態によれば、下記一般式３で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートを提供する。
【化１３】
2019508375.tif 000015
（式中、
Ｐｔｎは、Ｎ末端におけるシステイン残基とＣ末端におけるＬＰＸａＴ配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Ｘａは１種又は複数種のアミノ酸を示し、
ＰＡＡ（Ｇｌｙ）ｍは、次の一般式４で表される構造を有し、
【化１４】
2019508375.tif 000016
式中、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１０〜３００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【００４０】
本発明の一実施形態によれば、Ｐｔｎは前記タンパク質であり、前記タンパク質は、Ｎ末端におけるシステイン残基とＣ末端におけるＬＰＸａＴ配列とを有し、又は修飾されることでＮ末端におけるシステイン残基とＣ末端におけるＬＰＸａＴ配列とを有する。本発明の別の実施形態によれば、ＰｔｎはＮ末端にシステイン残基を有し且つＣ末端にＬＰＸａＴ配列を有するインターフェロンα２ｂである。本発明の別の実施形態によれば、Ｐｔｎはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１を有するタンパク質である。本発明のさらなる実施形態によれば、Ｐｔｎは前記した一般式１に対する定義の通りである。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれる。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれ非天然アミノ酸の側鎖、例えば人工的に修飾された上記天然アミノ酸の側鎖を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール（重合度２〜１０、例えばトリエチレングリコール、ＯＥＧ３）、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれトリエチレングリコール（ＯＥＧ３）で修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、Ｘａはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれる１種又は複数種であってもよい。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ２は、それぞれ水素、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ２は水素を示す。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、ｎは、１０〜２００から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１０〜１５０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１０〜１００から選ばれる整数を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、ｎは１０〜５０から選ばれる整数を示す。本発明の一実施形態によれば、ｍは１〜２０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｍは１〜１０から選ばれる整数を示す。前記の通り、得られたコンジュゲートが安定的に存在する限り、ｎ値及びｍ値はいずれの数値であってもよく、本発明に挙げられた特定範囲に制限されない。当業者であれば、必要に応じて、具体的にｎ値及びｍ値を設定することができ、且つ、この選択は当業者の身に付けるべき能力である。
【００４５】
タンパク質（環化）ライゲーション用のポリアミノ酸
本発明の一実施形態によれば、下記一般式５で表される構造を有するタンパク質（環化）ライゲーション用のポリアミノ酸を提供する。
【化１５】
2019508375.tif 000017
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれる。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれ非天然アミノ酸の側鎖、例えば人工的に修飾された上記天然アミノ酸の側鎖を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール（重合度２〜１０、例えばトリエチレングリコール、ＯＥＧ３）、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、Ｒ１は、それぞれトリエチレングリコール（ＯＥＧ３）で修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ２は、それぞれ水素、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ２は水素を示す。
【００４８】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ１８アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ１８ヘテロアリール基を示す。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ１８アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ１８ヘテロアリール基を示す。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ５を置換する置換基は、Ｃ１−３ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び／又はハロゲンからなる群より選ばれる。本発明の別の実施形態によれば、Ｒ５は以下の構造式から選ばれるが、それらに制限されない。
【化１６】
2019508375.tif 000018
【００５０】
本発明の別の実施形態によれば、Ｒ５はメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、Ｒ５はフェニル基を示す。
【００５１】
本発明の一実施形態によれば、ｎは、１〜２００から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１〜１５０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１〜１００から選ばれる整数を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、ｎは１〜５０から選ばれる整数を示す。理論的に、得られたポリアミノ酸が安定的に存在する限り、ｎはいずれの数値であってもよく、当業者であれば、必要に応じて、具体的にｎ値を設定することができ、且つ、この選択は当業者の身に付けるべき能力である。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、下記一般式６で表される構造を有するタンパク質（環化）ライゲーション用のポリアミノ酸を提供する。
【化１７】
2019508375.tif 000019
（式中、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５は前記一般式５の定義と同様であり、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【００５３】
本発明の一実施形態によれば、ｎは１０〜１５０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１０〜１２０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｎは１０〜１００から選ばれる整数を示す。本発明のさらなる実施形態によれば、ｎは１０〜８０から選ばれる整数を示す。本発明の他の実施形態によれば、ｎは１０〜５０から選ばれる整数を示す。本発明の一実施形態によれば、ｍは１〜２０から選ばれる整数を示す。本発明の別の実施形態によれば、ｍは１〜１０から選ばれる整数を示す。前記の通り、得られたコンジュゲートが安定的に存在する限り、ｎ値及びｍ値はいずれの数値であってもよく、本発明に挙げられた特定範囲に制限されない。当業者であれば、必要に応じて、具体的にｎ値及びｍ値を設定することができ、且つ、この選択は当業者の身に付けるべき能力である。
【００５４】
タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法
本発明の一実施形態によれば、（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸を得るステップと、（２）得られたポリアミノ酸と１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップとを含む本発明の前記部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法を提供する。
【００５５】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（１）は、以下のように、開始剤（Ｒ５ＸＹ）を用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸（ＰＡＡ−ＸＲ５）を得るステップを含む。
【化１８】
2019508375.tif 000020
（式中、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ５及びｎは前記一般式５の定義と同様であり、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基におけるアルキル基は、好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等である。）
【００５６】
本発明の別の実施形態によれば、Ｙがトリアルキルシリル基である場合、得られたポリアミノ酸のＮ末端におけるトリアルキルシリルカルバメート構造が空気における水分と接触する際に非常に除去されやすいため、最終的に得られたポリアミノ酸は、Ｎ末端がアミノ基になる。
本発明の別の実施形態によれば、ステップ（１）は、以下のように、開始剤（Ｒ５ＸＹ）を用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸（ＰＡＡ−ＸＲ５）を得ることを含む。
【化１９】
2019508375.tif 000021
（式中、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びｎは前記一般式５の定義と同様であり、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基におけるアルキル基は、好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等である。）
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、Ｒ５ＸＹがトリメチルシリルベンゼンチオール（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ  ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｉｄｅ）又はトリメチルシリルベンゼンセレノール（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ  ｐｈｅｎｙｌｓｅｌｅｎｉｄｅ）である場合を例にして、反応式は以下の通りである。
【化２０】
2019508375.tif 000022
（式中、Ｘ、Ｒ１及びｎは前記一般式５の定義と同様である。）
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（１）では、非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等の溶媒において重合を行う。本発明の別の実施形態によれば、反応温度は、通常室温（２５℃）であり、反応時間はモノマーと所望の重合度によって、数十分間から数十時間であり、例えば２０分間、４０分間、１時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間等が挙げられる。
本発明の一実施形態によれば、ステップ（１）で得られた、炭素構造を有するポリアミノ酸について、得られたポリアミノ酸と調整剤とを混合して反応させて、後修飾されたポリアミノ酸を得ることを含む後修飾を行うことができる。本発明の別の実施形態によれば、前記調整剤はメルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である。本発明の別の実施形態によれば、前記後修飾過程は、紫外線ランプの照射下で例えば１時間、３時間、５時間、１０時間等の所定時間反応させることができ、当業者は具体的に反応プロセスに応じて決定できる。本発明の他の実施形態によれば、後修飾は、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等の非プロトン性溶媒を含む溶液中で行われ、且つ、前記溶液は、さらに反応を促進するために、例えばベンゾインジメチルエーテル（ＤＭＰＡ）等の光増感剤を含んでもよい。
【００５９】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（２）は、以下のように、ステップ（１）で得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造（例えばＮ末端にシステインを有し、又はＣ末端若しくはその他の任意の位置に１,２−メルカプトエチルアミン構造を含有する非天然アミノ酸を挿入するもの）含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション（ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップを含む。
【化２１】
2019508375.tif 000023
（式中、Ｐｔｎ、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記一般式１の定義と同様である。）
【００６０】
本発明の別の実施形態によれば、ステップ（２）は、以下のように、ステップ（１）で得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造（例えばＮ末端にシステインを有し、又はＣ末端若しくはその他の任意位置に１,２−メルカプトエチルアミン構造を含有する非天然アミノ酸を挿入するもの）含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップを含む。
【化２２】
2019508375.tif 000024
（式中、Ｐｔｎ、Ｒ１及びｎは前記一般式１の定義と同様である。）
【００６１】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（２）にでは、ｐＨ６．５〜７．０の反応溶液が使用され、通常、還元剤ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を添加するが、必ず添加することではない。
【００６２】
上記方法は、Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸ＰＡＡ−ＸＲ５を得て、ＰＡＡ−ＸＲ５と１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合し、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る。トリメチルシリルベンゼンチオールを用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させる場合を例にすれば、該過程は図１に示す通りである。
標準分子クローニング法によってタンパク質のＮ末端にシステイン−グリシン（Ｎ末端はシステイン残基であり、グリシン残基が結合手段として用いられるため、Ｎ末端の柔軟性を高める）を挿入でき、或いは、ＴＡＧとスクシニルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡの方法（文献Ｎｇｕｙｅｎ, Ｄ． Ｐ．； Ｅｌｌｉｏｔｔ, Ｔ．； Ｈｏｌｔ, Ｍ．； Ｍｕｉｒ, Ｔ． Ｗ．； Ｃｈｉｎ, Ｊ． Ｗ．, Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ １,２−ａｍｉｎｏｔｈｉｏｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｖｉａ ａ ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｙａｎｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ． ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ２０１１,１３３ （３０）, １１４１８−２１．）により、その側鎖に１,２−メルカプトエチルアミン構造を有する非天然アミノ酸を挿入して、後続の部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸のライゲーション反応を行う。
【００６３】
タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法
本発明の一実施形態によれば、（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、（２）得られたブロックポリアミノ酸と、Ｎ末端にシステインを有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ配列を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む本発明の前記部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法を提供する。
【００６４】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（１）は、以下のように、開始剤（Ｒ５ＸＹ）を用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得ることを含む。
【化２３】
2019508375.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ５、Ｘ、Ｙ、ｍ及びｎは前記一般式６の定義と同様である。）
【００６５】
本発明の別の実施形態によれば、ステップ（１）は、以下のように、開始剤（Ｒ５ＸＹ）を用いてＮ−カルボキシ無水物と別の1種のＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップを含む。
【化２４】
2019508375.tif 000026
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｎ及びｍは前記一般式６の定義と同様であり、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基におけるアルキル基は、好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等である。）
【００６６】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（２）は、以下のように、ステップ（１）で得られたブロックポリアミノ酸（Ｈ−（Ｇｌｙ）ｍＰＡＡ−ＸＲ５を例にする）をＮ末端にシステインを有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ（Ｘａはいずれかのアミノ酸である）配列を有するタンパク質と混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成することを含む。
【化２５】
2019508375.tif 000027
【００６７】
上記ＬＰＸａＴＧ配列は、ソルターゼの認識部位であり、ブロックポリアミノ酸は前記タンパク質のＮ末端におけるシステインとをライゲーション反応させ、次にソルターゼの存在下で環化を達成する。タンパク質の後続精製を容易にするために、反応前のタンパク質のＣ末端にポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を付加して、環化後にニッケルアフィニティークロマトグラフィー方法により精製することができる。
【００６８】
本発明の一実施形態によれば、プラスミド構築によりｅＧＦＰ遺伝子配列のＮ末端にタバコエッチウイルスプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ：ＴＥＶ）の酵素消化配列ＥＮＬＹＦＱを挿入して、そのＣ末端にＬＰＥＴＧ配列を挿入して、ＴＥＶで触媒されたライゲーション反応を行い、具体的なタンパク質アミノ酸配列は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１を示す。ブロックポリアミノ酸のＣ末端は、ネイティブ化学ライゲーションによって、Ｎ末端にシステインを有するタンパク質とをライゲーションし、そのＮ末端はソルターゼの存在下でタンパク質のＣ末端にあるＬＰＥＴＧとをライゲーションし、その反応は図２に示す通りである。
【００６９】
本発明のように重合して得たアミノ酸配列は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、L-アミノ酸、D-アミノ酸を含む、任意の水溶性アミノ酸から構成されてもよいため、生物学的発現の面で材料の多様性の重要な利点がある。また、該重合で得られたα−ポリアミノ酸は、制御可能な分子量及び分子量分布を有するため、必要に応じて、異なる長さのポリペプチド材料を製造できる。本発明の方法によれば、α−ポリアミノ酸のＣ末端にあるチオエステルとＮ末端にあるグリシン繰り返し配列を、その場で付与することができ、それらは高効率の反応によりタンパク質にライゲーションすることが可能であり、それによって、タンパク質修飾のコストを大幅に低下させ、広い応用見通しを持っている。
【００７０】
本発明に係るタンパク質−高分子ハイブリッド材料は、従来のタンパク質−高分子ハイブリッド材料の利点を保持し、例えば特殊な性質（例えば熱応答性、光応答性等）を有する高分子とタンパク質との連結により、タンパク質−高分子ハイブリッド材料に所定の機能性と応答性を付与する。また、タンパク質は、通常Ｃ末端又はＮ末端に分解するため、その両端を高分子鎖で連結して環化することによりタンパク質の分解速度を低下させ、その安定性を高め、血液循環時間を延長させることができる。したがって、本発明は、タンパク質薬物としての非常に広範な応用見通しが期待できる。
【００７１】
実施例
【００７２】
以下の実施例は、本発明の内容を理解しやすくするためのものであり、制限するものではない。下記実施例に使用されている実験方法は、特に断らない限り、通常の方法であり、特に断らない限り、使用される材料、試薬等はすべて市販品として入手でき、使用されるプラスミドはすべて標準分子クローニング方法により製造される。
【００７３】
実施例１：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ１の合成
【化２６】
2019508375.tif 000028
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ１、４０．０ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、２０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（１３．６μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌した後、反応液をエチルエーテル溶液４０ｍＬに注入し、白色沈殿である製品を析出させた。遠心処理して固体製品を得て、上澄み液を捨ててエチルエーテル４０ｍＬで製品を洗浄して、遠心処理して固体を得た後、上澄み液を捨てて真空オーブンにおいて乾燥させ、無色透明のゲル状固体３０ｍｇ（収率７２％）を得て、−２０℃の冷蔵庫に保存した。
上記方法と類似する方法により、平均重合度７のポリＬ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステルを合成し、Ｌ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物の投入量を１３ｍｇに変更して、反応後、酢酸無水物（１．３３ｍｇ、２．０当量）を加えてキャッピングし、上記方法のように後処理を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルの特徴付けを図３に示す。
【００７４】
実施例２：  タンパク質環化用のブロックポリアミノ酸Ｐ２の合成
【化２７】
2019508375.tif 000029
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ１、１３．０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、７当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（１３．１μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌した後、グリシン−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ２、２．０ｍｇ、０．０１９７ｍｍｏｌ、３当量）を加え、室温で２時間撹拌し続け、実施例１と同様に後処理を行った。
【００７５】
実施例３：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ４の合成
【化２８】
2019508375.tif 000030
グローブボックスにおいて、リン酸エチル−Ｌ−チロシンＮ−カルボキシ無水物（Ｎ３、１００ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ、２０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（２９．１μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。
上記ポリアミノ酸（Ｐ３、８０ｍｇ、０．０１３３ｍｍｏｌ、１．０当量）をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解して、トリエチルアミン（３００μＬ、２．１ｍｍｏｌ）及びブロモトリメチルシラン（３６０μＬ、２．７ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応液を６０℃に加熱して８時間撹拌し、ロータリーエバポレーターにおいて溶媒を回転乾燥させた後、生成物を脱イオン水（４ｍＬ）に溶解して、ＥＤＴＡ（１０ｍｇ）を加え、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）でｐＨを中性になるまで調整し、塩化ナトリウム水溶液で透析した（１０００Ｄａ  ＭＷＣＯ、３回）。溶液を凍結乾燥させて、淡黄色固体Ｐ４  ６０ｍｇ（収率８３％）を得た。
【００７６】
実施例４：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ５の合成
【化２９】
2019508375.tif 000031
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸−４−プロペニルオキシベンジルエステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ４、３００ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ、５０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（３８．０μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。最終的に無色透明のゲル状固体２００ｍｇ（収率６９％）を得た。
【００７７】
実施例５：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ６の合成
【化３０】
2019508375.tif 000032
実施例４で製造されたポリアミノ酸（Ｐ５、５０ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ、１．０当量  二重結合の物質量を基準として計算）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解して、メルカプトエチルアミン塩酸塩（１１８ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、６．０当量）を脱イオン水（２００μＬ）に溶解し、２つの溶液を混合してベンゾインジメチルエーテル（０．８９ｍｇ、３．４６×１０−３ｍｍｏｌ、０．０２当量）を加え、均一に振とうさせた後、３６５ｎｍの紫外線ランプで３時間反応させた。反応終了後、溶液をイソプロパノール（４０ｍＬ）に注入して、遠心処理して沈殿を収集した。真空オーブンで乾燥させて、無色透明の高粘度ゲル状固体３２ｍｇ（収率５３％）を得た。
【００７８】
実施例６：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ７の合成
【化３１】
2019508375.tif 000033
実施例１で製造されたポリアミノ酸（Ｐ１、５０ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ、１．０当量  二重結合の物質量を基準として計算）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解して、メルカプトプロピオン酸（１１０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、６．０当量）を脱イオン水（２００μＬ）に溶解し、２つの溶液を混合して、ベンゾインジメチルエーテル（０．８９ｍｇ、３．４６×１０−３ｍｍｏｌ、０．０２当量）を加え、均一に振とうさせた後、３６５ｎｍの紫外線ランプで３時間反応させた。実施例５と同様に後処理を行い、最終的に淡黄色透明のゲル状固体３３ｍｇ（収率５１％）を得た。
【００７９】
実施例７：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ８の合成
【化３２】
2019508375.tif 000034
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸−プロペニル（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ５、２００ｍｇ、０．５８０ｍｍｏｌ、５０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（２３．２μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行い、最終的に無色透明のゲル状固体１６０ｍｇ（収率８２％）を得た。
【００８０】
実施例８：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸の後修飾
【化３３】
2019508375.tif 000035
実施例７で製造されたポリアミノ酸（Ｐ８、５０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ、１．０当量）二重結合の物質量を基準として計算）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解して、メルカプトエチルアミン塩酸塩（１１３ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ、６．０当量）を脱イオン水（２００μＬ）に溶解し、２つの溶液を混合して、ベンゾインジメチルエーテル（０．８４ｍｇ、３．３０×１０−３ｍｍｏｌ、０．０２当量）を加え、均一に振とうさせた後、３６５ｎｍの紫外線ランプで６時間反応させた。反応終了後、溶液を脱イオン水で５ｍｌになるまで希釈し、脱塩カラムＰＤ１０で２回に分けて処理して、凍結乾燥させ、無色透明のゲル状固体２５ｍｇ（収率４６％）を得た。
【００８１】
実施例９：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ１０の合成
【化３４】
2019508375.tif 000036
グローブボックスにおいて、Ｎ−メチル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ６、１５．０ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、２０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（１３．６μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。最終的に白色固体７ｍｇ（収率７８％）を得た。
【００８２】
実施例１０：  タンパク質コンジュゲーション用のブロックポリアミノ酸Ｐ１１の合成
【化３５】
2019508375.tif 000037
グローブボックスにおいて、Ｌ−ベンジルオキシカルボニルリシン−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ７、１００．３ｍｇ、０．３２８ｍｍｏｌ、５０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのＤＭＦ溶液（１３．１μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌した後、Ｌ−グルタミン酸ベンジルエステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ８、８６．１ｍｇ、０．３２８ｍｍｏｌ、５０当量）を加え、室温で２５時間撹拌し続け、実施例１と同様に後処理を行った。
【００８３】
実施例１１：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ１２の合成
【化３６】
2019508375.tif 000038
グローブボックスにおいて、Ｌ−ベンジルオキシカルボニルリシン−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ７、１００．３ｍｇ、０．３２８ｍｍｏｌ、５０当量）を無水テトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルシリルベンゼンチオールのテトラヒドロフラン溶液（１３．１μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。テトラヒドロフランでは開始剤の開始効率が低いため、実際に得られたポリマーの重合度が比較的大きく、理論重合度は３００であった。
【００８４】
実施例１２：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ１３の合成
【化３７】
2019508375.tif 000039
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ１、１３．０ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、２０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、トリメチルスズベンゼンセレノール（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｔａｎｎｙｌ  ｂｅｎｚｅｎｅｓｅｌｅｎｏｌ）のＤＭＦ溶液（１３．６μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。
【００８５】
実施例１３：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ１４の合成
【化３８】
2019508375.tif 000040
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ１、１３．０ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、２０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、２−メルカプトエタンスルホン酸スルホン酸ナトリウムのＤＭＦ溶液（１３．６μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。
【００８６】
実施例１４：  タンパク質コンジュゲーション用のポリアミノ酸Ｐ１５の合成
【化３９】
2019508375.tif 000041
グローブボックスにおいて、Ｌ−グルタミン酸（エチレングリコール）３エステル−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｎ１、１３．０ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、２０当量）を無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解して、メルカプトプロピオン酸のＤＭＦ溶液（１３．６μＬ×０．５Ｍ、１．０当量）を加え、室温で２５時間撹拌して、実施例１と同様に後処理を行った。
上記実施例で製造されたポリマーの特徴付けパラメータは、下表１に示されており、且つ示された実測値はすべて少なくとも３回測定して得られた数値の平均値であった。具体的に、すべてのポリマーの分子量及び分子量分布係数（ＰＤＩ）はゲル排除クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と９角度レーザー光散乱装置との組み合わせにより測定されるものであり、使用される移動相は０．１Ｍ臭化リチウムを添加した無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【表１】
2019508375.tif 000042
上記表により明らかなように、すべてのポリマーは、実際分子量が理論分子量に近く、且つ分子量分布が非常に狭いことから、重合過程の制御性に優れることが示される。
【００８７】
実施例１５：  環状（ポリペプチド−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）コンジュゲートの製造
実施例２で製造されたポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）（３．８ｍｇ、１．７２μｍｏｌ、２．０当量）と、Ｎ末端にシステインを有するポリペプチド（Ｃｙｓ−ＰＥＰ、１．８ｍｇ、０．８６μｍｏｌ、１．０当量、配列ＣＧＤＡＫＧＬＰＥＴＧＨＨＨＨＨＨＫ）とを超純水に溶解して、水酸化ナトリウム水溶液（１．０Ｍ）でｐＨを７．０に調整し、室温で１２時間反応させた。ＮｉＮＴＡアフィニティー精製後、脱塩カラムＰＤ１０で処理した後、凍結乾燥させて、白色粉末である、ネイティブ化学ライゲーション生成物２．６ｍｇ（収率７４％）を得た。ネイティブ化学ライゲーション生成物を塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）及び塩化カルシウム（１０ｍＭ）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、５．０ｍＬ、ｐＨ〜７．４）に溶解し、ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａ（１５０μＬ×２２７μＭ、０．０５当量）を加え、室温で０．５時間反応させた後、環状ポリペプチド−ポリアミノ酸コンジュゲートの粗製品をＮｉＮＴＡにより精製した（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾールを含有したｐＨ〜８．０のバッファーＢで溶離した）。溶離された画分を収集して脱塩カラムＰＤ１０で処理した。凍結乾燥させて、白色粉末である環状（ポリペプチド−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲート精製品１．６ｍｇ（収率８２％）を得た。図４に示されるように、生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより特徴付けられたところ、分子量が理論値と一致した。
【００８８】
実施例１６：  ＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６（ＥＮＬＹＦＱ−Ｃｙｓ−ｅＧＦＰ−  ＬＰＥＴＧＨ６）の発現及び精製
Ｎ末端にＥＮＬＹＦＱ、Ｃ末端にＬＰＥＴＧＨＨＨＨＨＨがコーディングされたプラスミドｐＥＴ−ＴＥＶ−Ｃｙｓ−ｅＧＦＰを、化学的形質転換方法で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１に導入した。１００μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ培地１０ｍＬにおいて菌種を１０〜１２時間活性化し、次に１００μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ培地１Ｌに１：１００で接種して、２５０ｒｐｍ、３７℃の条件においてＯＤ６００＝０．８になるまで振とうさせ、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加えて細菌発現を誘導し、培養条件を２５０ｒｐｍ、３０℃に変更した。５時間後、６５００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心処理して菌体を収集した。バッファーＡ（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０）２０ｍＬで細菌を懸濁させ、氷浴条件において超音波（１３０Ｗ、２０ｋＨｚ、５０％パワー、５秒超音波処理、１０秒停止、超音波処理時間１０分間）で分解した。分解液について６５００ｒｐｍ、４０分間、及び１２０００ｇ、４０分間の２つのステップにより４℃で順次遠心処理して、上澄み液を収集し、０．２２μｍろ過膜でろ過して、ＮｉＮＴＡ親和性カラムにより精製し、ここで、平衡化バッファーは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、溶離液は３００ｍＭのイミダゾールを添加した上記平衡化液であった。最後に目的タンパク質（配列は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１に示される）４８ｍｇを得て、ＵＰＬＣ−ＭＳにより確認したところ（図５を参照）、計算値は３１３２４であり、得られた値は３１３３３である。分子量誤差（９ダルトン）が誤差許可範囲（１０ダルトン）にあるため、得られたタンパク質は目的タンパク質としてのＴＥＶ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６であることが確認された。
【００８９】
実施例１７：  １,２−メルカプトエチルアミン構造を含有する部位特異的強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現
ステップ１：  １,２−メルカプトエチルアミン非天然アミノ酸の合成
【化４０】
2019508375.tif 000043
化合物１（２３３ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解して、Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２０６ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０当量）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１１５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、室温で３時間撹拌した後、固体をろ過除去し、濾液を回転乾燥させた後、ジクロロメタン：酢酸エチル＝５：１（体積比）〜純粋な酢酸エチルを溶離剤としたカラムクロマトグラフィーにより分離した。白色固体化合物２（２６４ｍｇ、収率８０％）を得た。
化合物２（２６４ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解して、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（２４６ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）とトリエチルアミン（０．２ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した後、溶媒を回転乾燥させ、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（体積比）を溶離剤としたカラムクロマトグラフィーにより分離した。無色油状液体化合物３（２２１ｍｇ、収率６０％）を得た。
化合物３（２２１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）を塩化水素のジオキサン溶液（１０ｍＬ）に溶解して、室温で一晩撹拌した後、製品を析出させて、吸引ろ過して、製品である化合物４（１,２−メルカプトエチルアミン非天然アミノ酸）を得て、ｐＨ調整後、後続の実験に用いた。
ステップ２：  強化緑色蛍光タンパク質の発現
タンパク質遺伝子配列の特定部位をＴＡＧに突然変異したプラスミド（元のタンパク質配列について配列表ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２（Ｃ末端にＨｉｓ６タグがある）に示されるように、第１４９位のアスパラギン酸のＮに対応したコドンがＴＡＧに突然変異して、特定部位突然変異した遺伝子配列を得る）と、スクシニルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡを有するプラスミドとを、化学的形質転換方法で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１に同時に導入した。菌種を１００μｇ／ｍＬアンピシリンと３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地１０ｍＬにおいて１０〜１２時間活性化させ、次に１００μｇ／ｍＬアンピシリンと３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地１Ｌに接種して、２５０ｒｐｍ、３７℃の条件下で２時間培養後、最終濃度２ｍＭの非天然アミノ酸４を加え、ＯＤ６００＝０．８になるまで振とうさせ、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加えて細菌発現を誘導し、培養条件を２５０ｒｐｍ、３０℃に変更した。１２時間後、６５００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心処理して菌体を収集した。２０ｍＬのバッファーＡ（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で細菌を懸濁させ、氷浴条件下、超音波で分解した。分解液について６５００ｒｐｍ、４０分間、及び１２０００ｇ、４０分間の２つのステップにより４℃で順次遠心処理して、上澄み液を収集し、０．２２μｍのろ過膜でろ過し、実施例１６と同様にＮｉＮＴＡ精製を行った。
【００９０】
実施例１８  ＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６（ＥＮＬＹＦＱ−Ｃｙｓ−ｅＧＦＰ−ＬＰＥＴＧＨ６）の酵素消化
透析バッグ（ＭＷＣＯ  ３０００）に、タンパク質溶液（１２ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（０．２ｍｇ／ｍＬ）５μＬ及び１０ＸバッファーＢ（５００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ  ＤＴＴ）１０μＬを加えた。透析バッグをバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴ）１Ｌに入れて室温で透析して酵素消化を行った。３時間酵素消化した後、タンパク質Ｃｙｓ−ｅＧＦＰ−ＬＰＥＴＧＨ６（アミノ酸配列は配列表ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１からＮ末端の「ＭＥＮＬＹＦＱ」を除去した配列である）を得て、ＵＰＬＣ−ＭＳにより確認したところ（図６を参照）、計算値は３０３９８であり、得られた値は３０４０４である。分子量誤差（６ダルトン）が誤差許可範囲（１０ダルトン）にあるため、得られた酵素消化後のタンパク質は目的タンパク質Ｃｙｓ−緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６であることが確認された。
【００９１】
実施例１９：  Ｃｙｓ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６とポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）とのネイティブ化学ライゲーション反応（タンパク質Ｎ末端へのライゲーション）
１当量のＣｙｓ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６及び２当量のポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの溶液（ｐＨ〜６．５）においてネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、１０時間反応した後、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製して、部位特異的タンパク質高分子ハイブリッド材料を得、且つ、その分子量変化は変性タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）により特徴付けられ、その純度は非変性タンパク質ゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）により特徴付けられた。図７に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにおいて、ポリアミノ酸−強化緑色蛍光タンパク質コンジュゲートのバンドが原料タンパク質に対して分子量の大きい位置へシフトしていることから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、変性及び非変性ゲル電気泳動におけるポリアミノ酸−強化緑色蛍光タンパク質コンジュゲートは、均一な単一バンド（二量体は、同じモノマータンパク質から天然状態で物理的な相互作用により形成された）であることから、生成物の純度は比較的高く示され、収率は５０％〜６５％であった。
【００９２】
実施例２０：  ＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６とポリエチレングリコール−ポリグリシンとのソルターゼ媒介性ライゲーション（ｓｏｒｔａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ、タンパク質Ｃ末端へのライゲーション）
１当量のＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６（１ｍｇ／ｍＬ、３００μＬ）、５当量のポリエチレングリコール−ポリグリシン（１０Ｍｍ、５３μＬ）及び０．１当量のソルターゼ（４．９ｍｇ／ｍＬ、５２μＬ）を１５０ｍＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４バッファー２００μＬに加えた。室温で３０分間反応させ、ＮｉＮＴＡアフィニティー精製を行って、生成物ＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ポリエチレングリコール−ポリグリシンコンジュゲートを分離した。平衡化バッファーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であり、ローディングサンプルしてから流出バッファーを収集し始め、次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０で溶離して、生成物を溶解した溶離液を得て、さらに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０のバッファーで樹脂を洗浄して、未反応のタンパク質原料を溶離した。ＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ポリエチレングリコール−ポリグリシンコンジュゲートについて、その分子量は変性タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）により特徴付けられ、その純度は非変性タンパク質ゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）により特徴付けられた。図８に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにおいて、ＥＮＬＹＦＱＣ−強化緑色蛍光タンパク質−ポリグリシン−ポリエチレングリコールコンジュゲートのバンドが原料タンパク質に対して分子量の大きい位置へシフトし、このことから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、変性及び非変性ゲル電気泳動におけるポリアミノ酸−強化緑色蛍光タンパク質コンジュゲートが均一な単一バンドであることから、生成物の純度は比較的高く示され、収率は５６％であった。
【００９３】
実施例２１：  ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）−強化緑色蛍光タンパク質−ポリグリシン−ポリエチレングリコールのノード状コンジュゲートの製造
２つのステップで、順次実施例１９及び２０に記載の反応及び精製方法によって、ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）−強化緑色蛍光タンパク質−ポリグリシン−ポリエチレングリコールのノード状コンジュゲートを製造した。中間生成物であるポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）−強化緑色蛍光タンパク質とノード状コンジュゲートとのいずれについても変性及び非変性タンパク質ゲル電気泳動により特徴付けを行った（図９を参照）。生成物の分子量が徐々にタンパク質の分子量の高い位置へシフトすることから、高分子の前後のグラフトのいずれも成功したことが示され、且つ単一バンドから、生成物の純度は比較的高く示される。２つのステップの収率は、それぞれ６５％及び５０％であった。
【００９４】
実施例２２：  強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−インターフェロンαのダンベル状コンジュゲートの製造
１当量の強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６（６．５ｍｇ）、１０当量のポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）（６．６ｍｇ）及び０．１当量のソルターゼ（０．５ｍｇ）を、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの塩化カルシウムを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）１ｍＬに加え、室温で３０分間反応させた。実施例２１の精製方法と同様に精製して、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）コンジュゲートを、収率５５％で得た。その後、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）コンジュゲートとＣｙｓ−インターフェロンαについて実施例２１と同様にネイティブ化学ライゲーションを行って、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−インターフェロンαのダンベル状コンジュゲートを、収率５０％で得た。中間生成物とダンベル状コンジュゲートとのいずれについても、変性及び非変性タンパク質ゲル電気泳動によって分子量及び純度の特徴付けを行った（図１０を参照）。コンジュゲートの分子量が徐々に高分子量の大きい位置へシフトし、且つ強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸−インターフェロンαのダンベル状コンジュゲートの分子量がタンパク質分子スケールで４３ｋＤａ〜５５ｋＤａの間に分布し、予測された強化緑色蛍光タンパク質（〜３１ｋＤａ）及びインターフェロンα（〜２１ｋＤａ）のヘテロダブルタンパク質の全分子量範囲（〜５２ｋＤａ）にあるため、得られたものは強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸−インターフェロンαのヘテロダブルタンパク質のダンベル状コンジュゲートであることが確認できた。単一バンドから、生成物の純度が比較的高いと確認された。
【００９５】
実施例２３：  環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートの製造
実施例１９のように、ネイティブ化学ライゲーションによりポリアミノ酸Ｐ２  （ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６コンジュゲートを製造した。１当量のポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６コンジュゲート（０．４２ｍｇ）及び０．１当量のソルターゼを、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの塩化カルシウムを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５のバッファーにおいて混合し、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６コンジュゲートの最終濃度を５０ｍＭに制御して、室温で３０分間反応させ、反応終了後、実施例２２のように、分離精製を行い、収率は約４２％であった。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、変性タンパク質ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）によって、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートが特徴付けられた。その結果、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６コンジュゲートのＮ末端は、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートよりもアミノ酸が７個多かった（すなわち、ＧＨＨＨＨＨＨ）。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によれば、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質−ＬＰＥＴＧＨ６コンジュゲートを環化した後の分子量は、全体的に環化前（理論的に１１６０Ｄａ、実際に〜１２０６Ｄａ）より低く、このことから、強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）は環状コンジュゲートを形成することが示される。また、変性タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）では、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））は、分子量の減少及びトポロジー構造の変化により、バンド位置が低分子量の位置へシフトし、ウエスタンブロット分析から、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が消えたことが分かる、このことによっても、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートを得ることは示され、具体的な分析結果は図１１に示される。
【００９６】
実施例２４：  Ｃｙｓ−強化緑色蛍光タンパク質、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートのカルボキシペプチダーゼ安定性テスト
Ｃｙｓ−強化緑色蛍光タンパク質、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質及び環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートの、５０ｍＭ  ｐＨ７．４のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーにおける最終濃度を４．０ｍｇ／ｍＬ、カルボキシペプチダーゼの最終濃度を８０μｇ／ｍＬ、当量比をｅＧＦＰの０．０１当量に制御して、３７℃でインキュベートした。設定時点に、サンプリング（５μＬ）してローディングバッファーとを混合して、９５℃で１０分間煮ることにより酵素消化反応を終止した。最後の時点でのサンプリングが終了した後、すべてのサンプルについて同時にゲル電気泳動にかけ、タンパク質ゲル電気泳動により特徴付けられた。クーマシーブリリアントブルー染色及び脱色が終了した後、ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒでタンパク質を定量化させた。
図１２に示されるように、図Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれＣｙｓ−強化緑色蛍光タンパク質、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質及び環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））コンジュゲートがカルボキシペプチダーゼの作用下で経時的に分解する状況を示す。ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒを用いて、染色後のバンドの強度に基づいてタンパク質を定量化させ、同一のカルボキシペプチダーゼの比率では、野生型強化緑色蛍光タンパク質は１時間内で殆どすべて分解し、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）−強化緑色蛍光タンパク質は、３時間後に完全なコンジュゲートが２０％程度だけ残し、それに対して、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３）コンジュゲート）は、７時間から始めて一定の程度の分解が観察された。したがって、線状のトポロジー構造に比べて、環状（強化緑色蛍光タンパク質−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７,ｍ＝３））は、酵素耐性の面で大きな利点を示す。
【００９７】
実施例２５：  薬物タンパク質ＥＮＬＹＦＱＣＧ−インターフェロン−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６（ＴＥＶ−Ｃｙｓ−ＩＦＮα−ＬＰＥＴＧＨ６）の発現及び精製
Ｎ末端にＭＥＮＬＹＦＱＣＧ、Ｃ末端にＬＰＥＴＧＬＥＨＨＨＨＨＨがコーディングされたプラスミドｐＥＴ−ＴＥＶ−Ｃｙｓ−ＩＦＮα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６を化学的形質転換方法で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）に導入した。菌種を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬＢ培地１０ｍＬにおいて１０〜１２時間活性化させ、次に、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬＢ培地１Ｌに接種し、２５０ｒｐｍ、３７℃の条件においてＯＤ６００＝０．８になるまで振とうさせ、最終濃度１．０ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加えて細菌発現を誘導し、培養条件を２００ｒｐｍ、３０℃に変更した。一晩培養後、６５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心処理して菌体を収集した。バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０）２０ｍＬで菌体を再懸濁させ、氷浴条件下、超音波で分解した。分解液について、６５００ｒｐｍ、４０分間、及び１２０００ｇ、４０分間の２つのステップにより４℃で順次遠心処理して、上澄み液を収集して、０．２２μｍろ過膜でろ過し、ＮｉＮＴＡ親和性コラムにより精製して、目的タンパク質９８ｍｇを得て、ＵＰＬＣ−ＭＳにより確認したところ、計算した理論分子量は２１９１８であるが、得られたのは２１９１４である。分子量誤差（４ダルトン）が誤差許可範囲（１０ダルトン）にあるため、得られたタンパク質は目的タンパク質ＴＥＶ−Ｃｙｓ−ＩＦＮα−ＬＰＥＴＧＨ６であることが確認された。
【００９８】
実施例２６：  薬物タンパク質ＥＮＬＹＦＱＣＧ−インターフェロン−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６（ＴＥＶ−Ｃｙｓ−ＩＦＮα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）の酵素消化
透析バッグ（ＭＷＣＯ  ３０００）にタンパク質溶液（１２ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（０．２ｍｇ／ｍＬ）５μＬ及び１０ＸバッファーＢ（５００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ  ＤＴＴ）１０μＬを加えた。透析バッグをバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴ）１Ｌに入れて室温で透析して酵素消化を行った。３時間酵素消化した後、タンパク質Ｃｙｓ−ｅＧＦＰ−ＬＰＥＴＧＨ６を得て、ＵＰＬＣ−ＭＳにより確認したところ（図１３を参照）、計算値は２０９９１であるが、得られた値は２０９８７である。分子量誤差（６ダルトン）が誤差許可範囲（１０ダルトン）にあるため、得られた酵素消化後のタンパク質は目的タンパク質Ｃｙｓ−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＨ６であることが確認された。
【００９９】
実施例２７：  薬物タンパク質Ｃｙｓ−インターフェロン−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６と、異なる長さのポリアミノ酸とのネイティブ化学ライゲーション反応
１当量の目的タンパク質Ｃｙｓ−ＩＦＮα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６と、３当量のポリアミノ酸ＰｈＳ−Ｐ（ＯＥＧ３−Ｇｌｕ）１００（Ｌ型、Ｐ１（ｎ＝１００））とを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴの溶液（ｐＨ〜７．４）においてネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、１０時間反応後、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製して、部位特異的Ｐ（ＯＥＧ３−Ｌ−Ｇｌｕ）１００−ＩＦＮαコンジュゲートを得た。ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００）−インターフェロンαコンジュゲートについて、１５％変性タンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）により、その分子量及び純度が特徴付けられた。図１４に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌにおいて、ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００）−インターフェロンαコンジュゲートバンドは、原料タンパク質に対して分子量の大きい位置へシフトし、このことから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、且つコンジュゲートが均一な単一バンドであることから、生成物の純度は比較的高く示され、収率は７０％であった。
或いは、上記と同様な方法及び条件を用いて、薬物タンパク質Ｃｙｓ−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６と、ポリアミノ酸ＰｈＳ−Ｐ（ＯＥＧ３−Ｇｌｕ）１００（Ｄ,Ｌ−アミノ酸）及びポリアミノ酸Ｐ２（ＰｈＳ−Ｐ（ＯＥＧ３−Ｇｌｕ）ｎ−Ｇｌｙ３（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３））のネイティブ化学ライゲーション反応を行い、得られたコンジュゲートは、ＦＰＬＣで精製された後、１５％の変性タンパク質ゲル電気泳動により特徴付けられた。図１４に示されるように、ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのバンドは、原料タンパク質に対いていずれも分子量の大きい位置へシフトし、このことから、ポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かり、収率は７０％〜８０％であった。
【０１００】
実施例２８：  Ｃｙｓ−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧのＮ、Ｃ両末端のそれぞれと、異なる長さのポリアミノ酸との部位特異的ライゲーション
実施例２７における生成物ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６とポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）を用いて、ソルターゼの存在下、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２のバッファーにおいてソルターゼ媒介性のペプチド転移反応を行い、反応系をＮｉＮＴＡカラムにより分離精製して、Ｎ末端とＣ末端と共に部位特異的にポリアミノ酸がライゲーションされた生成物であるポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００）−インターフェロンα−ＬＰＥＴ−ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）を得た。生成物は、１５％の変性タンパク質ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析により特徴付けられた。ウエスタンブロット分析において、図１４に示されるように、タグＨｉｓ−ｔａｇの除去により、生成物の抗Ｈｉｓタグシグナルが消えて、インターフェロンαのＮ末端とＣ末端と共にポリアミノ酸のグラフトに成功したことが分かった。
【０１０１】
実施例２９：  ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６コンジュゲートの環化反応
ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６コンジュゲートを、ソルターゼの存在下、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２のバッファーにおいて、環化反応させて、ＮｉＮＴＡカラムにより分離精製して、環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−インターフェロンα−ＬＰＥＴＧＬＥＨ６）を得た。図１５に示されるように、インターフェロンαとポリアミノ酸との環状トポロジー構造の形成は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのバンドが環化前のコンジュゲートより低分子量位置へシフトすると共に、対応したウエスタンブロット分析におけるＡｎｔｉ−Ｈｉｓシグナルの消失により確認できる。
【０１０２】
実施例３０：  ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００）−ＩＦＮα及び環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−ＩＦＮα）の熱安定性テスト
本実施例において、使用される目的タンパク質を組換えヒトインターフェロンαに変更し、染料Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅを用いてタンパク質の融解温度（Ｔｍ値）を測定でき、この染料は昇温によるタンパク質構造変化につれて露出された疎水性領域と結合できるため、蛍光発光強度に大きな変化が示される。野生型ＩＦＮα及び各種のポリアミノ酸とのコンジュゲートのＴｍ値については、２００×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅタンパク質染料（Ｔｈｅｒｍｏ）５μＬと（５μＭ）被検タンパク質４５μＬとを１×ＰＢＳバッファー中において混合し、反応系全体を５０μＬにして、９６ウェル板に加え、３つの平行ウェルにサンプルを加えて、蛍光定量的ＰＣＲ装置において検出し３７℃から２．２℃／ｍｉｎで９８℃に加熱して、得られた曲線に基づいて各タンパク質サンプルのＴｍ値を計算した。
図１６に各タンパク質サンプルのＴｍ値が示されており、それから各種コンジュゲートの熱安定性が判断でき、Ｔｍ値が高いほど、熱安定性に優れる。ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００）−インターフェロンαコンジュゲートと環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−インターフェロンα）は非常に優れた熱安定性を示し、特に環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝７又は２０,ｍ＝３）−インターフェロンα）の熱安定性は、従来の文献や特許に開示されたものに比べて最もよいである。
【０１０３】
実施例３１：  各種ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのトリプシン耐性テスト
本実施例において、野生型組換えヒトインターフェロンαを対照にして、本発明のポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのトリプシン耐性をテストした。３７℃で、０．０１当量のトリプシン処理サンプルを加えて、異なる時点にサンプリングして、残った完全なタンパク質の比率を検出し、結果を図１７に示し、タンパク質のバンド強度に基づいて定量化させて、得られたデータを用いて曲線図（図１７を参照）を作成し、曲線図Ｂ、Ｃから分かるように、コンジュゲートに使用されるポリアミノ酸の分子量の増大につれて、得られたコンジュゲートのトリプシン耐性は高まり、且つ、図Ａに示されるように、分子量が近いコンジュゲートでは、トポロジー構造が環状のコンジュゲートは、トリプシン耐性が未環化のコンジュゲートよりも遥かに優れる。
【０１０４】
実施例３２：  野生型インターフェロンｗｔ−ＩＦＮαとポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝１００  Ｌ型又はｎ＝１００  Ｄ,Ｌ型）−ＩＦＮαコンジュゲートの円二色性スペクトルテスト
本実施例において、使用されるポリアミノ酸Ｐ（ＯＥＧ３−Ｇｌｕ）ｎ（Ｌ型）は独立にαへリックスを主にする顕著な二次構造を有するため、ＩＦＮαとライゲーションすることによりＩＦＮαの二次構造へ一定の影響を与える。０．３５ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳタンパク質溶液を調製して、円二色性スペクトルにより二次構造の変化を監視し、テストした結果、ＩＦＮα−ポリアミノ酸コンジュゲートはＩＦＮαの二次構造を著しく強化させ、結果は図１８に示される。
【０１０５】
実施例３３：  野生型インターフェロンα及び各種ポリアミノ酸−インターフェロンαのコンジュゲートのインビトロ活性テスト
本実施例において、Ｄａｕｄｉ細胞に対する成長阻害及びそのＡ５４９細胞の抗脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）活性の誘導の２つの点について、それぞれ各種ポリアミノ酸−インターフェロンαのインビトロ抗腫瘍活性及び抗ウィルス活性の維持を判断した。
ＩＦＮαに対して高感度のヒトＢリンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉを実験細胞系とし、各種ポリアミノ酸−インターフェロンαのインビトロ抗腫瘍活性を検出した。具体的な実験ステップは以下の通りである。５０００個の細胞／ウェルで９６ウェル板に播種して、タンパク質及びポリアミノ酸とのコンジュゲートを適切な勾配になるまで希釈して、細胞を播種した９６ウェル板に加え、７２時間培養後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ(R)  Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）で細胞活性を検出して、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ処理関連データから各サンプルの半数抑制量ＩＣ５０を得た。実験により確認されたとおり、異なるトポロジー構造のポリアミノ酸−ＩＦＮαコンジュゲートは、抗腫瘍活性に大きな差異があり、具体的なデータは表２に示される。表２中、二次構造を有するポリアミノ酸はインターフェロンαとライゲーションする場合は、その活性への影響が最も小さく、且つ臨床に実用されているインターフェロンα−ポリエチレングリコールコンジュゲートであるペグイントロン（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）より優れ、環状コンジュゲートはそれに次いだ。以上から分かるように、インターフェロンα−ポリアミノ酸コンジュゲートの二次構造又はトポロジー構造を調整することにより、熱安定性及び酵素耐性を高めると共に、その活性を最大限に維持できる。
本実験では、ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートで刺激されたＡ５４９細胞の抗脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）活性を測定することによって、そのインビトロでの抗ウィルス活性が判断される。具体的な測定ステップは、以下の通りである。８０００〜１００００個の細胞／ウェルの密度で、Ａ５４９細胞を黒色不透明の９６ウェル板に播種して、２４時間後、細胞が完全に付着すると、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地（１０μｇ／ｍＬ、３倍希釈し、合計１４個の濃度ポイント）に勾配希釈したポリアミノ酸−インターフェロンコンジュゲート（１００μＬ／ウェル）を加えて、細胞と共に２４時間共培養した後、タンパク質液体を吸い取り、所定濃度のＥＭＣＶウィルス液（２％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地に希釈し、ウィルスの添加量については、タンパク質未添加の細胞が４８時間後にすべて病変する必要がある）を加え、タンパク質及びウィルスを添加していないウェルを細胞生存１００％の対照とし、タンパク質を添加せずにウィルスだけを添加したウェルを細胞生存０％の対照とし、４８時間後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ(R)  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて細胞活性を検出して、各種コンジュゲートの抗ウィルス活性を判断した。
【表２】
2019508375.tif 000044
【０１０６】
実施例３４：  ｗｔ−ＩＦＮαと各ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートの血中濃度の測定
本実施例において、ＳＤ雌ラットを動物生体実験の対象として、ＳＤラットについて頸静脈挿管手術を行い、４８時間回復後、１５０μｇ／ｋｇの用量で静脈挿管を介して被検サンプルを注射し、薬物ごとの実験数を３匹にし、それぞれ１ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈの時点で採血した。氷上に３０分間保存後、４０００ｇを遠心処理して上澄み液を−８０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡ方法により血清中のＩＦＮα含有量を測定し、各タンパク質サンプルの血液中の濃度変化曲線を図１９に示し、血中濃度半減期（ｔ１／２）を表２に示す。タンパク質ポリアミノ酸コンジュゲートは、ＷＴ−ＩＦＮα２ｂより遥かに高い血中濃度半減期を有し、且つＬ型ポリアミノ酸をライゲーションしたコンジュゲートの効果は高くて（ｔ１／２＝９．６ｈ）臨床に実用されたペグイントロンとほぼ一致し（ｔ１／２＝９．８ｈ）、Ｄ,Ｌ型ポリアミノ酸をライゲーションしたコンジュゲート（ｔ１／２＝７．８ｈ）より高く、このことから、ポリアミノ酸の二次構造は、タンパク質ポリアミノ酸コンジュゲート固体の二次構造を調整することでその各種の生物学的特性や機能を調整できることが明らかになった。環状ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートの血液循環時間（ｔ１／２＝７．５ｈ）が環化前の血液循環時間（ｔ１／２＝６．５ｈ）より長いことから、ポリアミノ酸−インターフェロンαコンジュゲートのトポロジー構造は、血液循環にも大きな影響を与えることが分かった。
【０１０７】
実施例３５：  ｗｔ−ＩＦＮα、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）−ＩＦＮαコンジュゲート及び環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）−ＩＦＮα）コンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性
本実施例において、ヒト卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ−３を研究する腫瘍細胞系として、六週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性ヌードマウスの体内で腫瘍モデルを作成した。細胞を１０７／２００μＬの密度で１６４０／マトリゲル（１：１混合）に懸濁させて、２００μＬ／匹でヌードマウス右前胸に皮下注射して、三週間後、腫瘍の大きさが約３０ｍｍ３になり、マウスをランダムに４群に分けて、１群を５匹とし、それぞれＰＢＳ、ｗｔ−ＩＦＮα、ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）−ＩＦＮαコンジュゲート及び環状（ポリアミノ酸Ｐ２（ｎ＝２０,ｍ＝３）−ＩＦＮα）コンジュゲートを注射し、用量は２０μｇインターフェロンα／匹で、注射体積は１００μＬで、投与頻度は1週間に１回であり、３日間おきに腫瘍の大きさ及びヌードマウス体重を測定した。
【０１０８】
実施例３６：  Ｃｙｓ−ヒト上皮成長因子受容体２結合断片（Ｃｙｓ−Ｈｅｒ２  Ｆａｂ抗体）の発現及び精製
Ｃｙｓ−Ｈｅｒ２  Ｆａｂ（システインを軽鎖のＮ末端に挿入した）抗体を有するプラスミドを化学的形質転換によりＴＯＰ１０大腸菌コンピテント細胞に導入して、ＬＢ培地１０ｍＬにおいて３７℃、２５０ｒｐｍで一晩活性化させて、１：１００の比率でＴＢ培地１Ｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍの条件においてＯＤ６００＝０．８程度になるまで振とうさせ、最終濃度０．２％のアラビノースを加えてタンパク質発現を誘導し、３０℃、２００ｒｐｍで１６〜２０時間発現させた。発現終了後、６５００ｒｐｍで３０分間遠心処理して、菌体を収集した。分解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、２０％蔗糖）１５０ｍＬを加えて、室温で３０分間軽く撹拌して、菌体を分解液に均一に分散させ、最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、２．５Ｕ／Ｌベンゾナーゼヌクレアーゼを加え、３７℃、２５０ｒｐｍで３０分間振とうさせ、分解液について、６５００ｒｐｍと１２０００ｇで順次３０分間遠心処理して、それぞれ上澄み液を保留した。上澄み液を０．２２μｍろ過膜でろ過して、ｐｒｏｔｅｉｎＧ樹脂により精製し、ローディングサンプル後、４〜５カラム体積の酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で洗浄し、５０ｍＭ、ｐＨ２．８グリシン溶液（５〜８カラム体積）で抗体を溶離して、Ｃｙｓ−Ｈｅｒ２  Ｆａｂ抗体を得た。ジチオスレイトールで還元した後、ＵＰＬＣ−ＭＳによりタンパク質の分子量を確認した。理論値として、抗体重鎖の分子量は２４３０５で、軽鎖の分子量は２３６７４であった。装置で確認したところ、得られた抗体重鎖の分子量は２４３１０で、軽鎖の分子量は２３６８２であり、これらの分子量は理論計算値と一致した（誤差は許可範囲にある）。このため、得られた抗体はターゲット抗体であることが確認された。
【０１０９】
実施例３７：  ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）とＣｙｓ−Ｈｅｒ２  Ｆａｂ抗体とのネイティブ化学ライゲーション反応
Ｃｙｓ−Ｈｅｒ２  Ｆａｂ  （５ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ、１．０当量）とポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）（３０当量）とを混合して、室温で１０〜１２時間反応させた。混合物をＦＰＬＣにより精製して、ポリアミノ酸Ｐ１（ｎ＝７）−Ｈｅｒ２  Ｆａｂ抗体コンジュゲートを得、タンパク質ゲル電気泳動によりその純度及び分子量が特徴付けられた。ジチオスレイトールで還元すると、抗体の重鎖及び軽鎖が解かれて、図２１に示されるように、分子量が約半減するバンドは得られた。精製して得られた生成物は、反応前の抗体に対していずれも高分子量の位置へシフトし且つ還元前のバンドが均一であるから、ポリアミノ酸のグラフトに成功し、且つ生成物の純度は比較的高いことが分かり、生成物の収率は２６％であった。
【０１１０】
以上から分かるように、本発明のタンパク質−高分子ハイブリッド材料は、その製造プロセスがシンプルであり、制御性が高い等の特徴を有するため、タンパク質の修飾コストを大幅に低下させると共に、インビボ性質をより安定化させ、血液循環時間を改善し且つ生物学的効果及び薬理効果を効果的に発揮させる。
【０１１１】
特定の実施例を参照しながら、本発明に係る実施形態を説明したが、当業者にとっては、本発明の範囲や主旨を逸脱しない限り、それに基づいて様様な調整や変更を行うことができる。
【図１】
2019508375.tif 000061
【図２】
2019508375.tif 000062
【図３】
2019508375.tif 000063
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019508375.tif 000068
【図９】
2019508375.tif 000069
【図１０】
2019508375.tif 000070
【図１１】
2019508375.tif 000071
【図１２】
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【図１３】
2019508375.tif 000073
【図１４】
2019508375.tif 000074
【図１５】
2019508375.tif 000075
【図１６】
2019508375.tif 000076
【図１７】
2019508375.tif 000077
【図１８】
2019508375.tif 000078
【図１９】
2019508375.tif 000079
【図２０Ａ】
2019508375.tif 000080
【図２０Ｂ】
2019508375.tif 000081
【図２１】
2019508375.tif 000082
【配列表】
2019508375000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月30日(2018.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の一態様によれば、下記一般式１で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
【化１】
2019508375.tif 000083
（式中、
Ｐｔｎは、タンパク質を示し、ＥＴは、ＰｔｎのＮ末端に連結される場合、
【化２】
2019508375.tif 000084
であり、ＰｔｎのＮ末端以外の部位に連結される場合、
【化３】
2019508375.tif 000085
であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１〜３００から選ばれる整数である。）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート
本発明の一実施形態では、一般式１で表される構造を有するタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを提供する。
【化９】
2019508375.tif 000086
（式中、
Ｐｔｎは、タンパク質を示し、
ＥＴは、ＰｔｎのＮ末端に連結される場合、
【化１０】
2019508375.tif 000087
であり、ＰｔｎのＮ末端以外の部位に連結される場合、
【化１１】
2019508375.tif 000088
であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ1−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１〜３００から選ばれる整数である。）
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式１：
【化１】
2019508375.tif 000089
（式中、
Ｐｔｎは、タンパク質を示し、
ＥＴは、ＰｔｎのＮ末端に連結される場合、
【化２】
2019508375.tif 000090
であり、ＰｔｎのＮ末端以外の部位に連結される場合、
【化３】
2019508375.tif 000091
であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１〜３００から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項２】
Ｐｔｎは、ポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、及び組換えワクチンからなる群より選ばれるタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項３】
Ｐｔｎはインターフェロンα２ｂである、請求項１又は２に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項４】
Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから選ばれ、好ましくは、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項５】
Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項６】
次の一般式２：
【化４】
2019508375.tif 000092
（式中、
Ｐｔｎ、ＥＴ、Ｒ１及びＲ２は、請求項１〜５のいずれかに記載の定義と同様であり、
ｎは、１〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート。
【請求項７】
次の一般式３：
【化５】
2019508375.tif 000093
（式中、
Ｐｔｎは、Ｎ末端におけるシステイン残基とＣ末端におけるＬＰＸａＴ配列とを有するタンパク質を示し、その中で、Ｘａは１種又は複数種のアミノ酸を示し、
ＰＡＡ（Ｇｌｙ）ｍは、次の一般式４で表される構造を有し、
【化６】
2019508375.tif 000094
式中、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
ｎは、１０〜３００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項８】
Ｐｔｎは、ポリペプチドホルモン、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、及び組換えワクチンからなる群より選ばれるタンパク質である、請求項７に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項９】
Ｐｔｎはインターフェロンα２ｂである、請求項７又は８に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項１０】
Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項７〜９のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項１１】
Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項１２】
次の一般式５：
【化７】
2019508375.tif 000095
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、ポリアミノ酸化合物。
【請求項１３】
Ｒ１は、それぞれ天然アミノ酸の側鎖を示し、前記天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｒ１は、それぞれオリゴエチレングリコール、リン酸エステル、プロペニルオキシベンジルエステル、アリルトリエチレングリコールで修飾されたチロシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の側鎖を示す、請求項１２に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１４】
Ｒ２は、それぞれ水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を示す、請求項１２又は１３に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１５】
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ１８アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ１８ヘテロアリール基を示し、その中で、Ｒ５を置換する置換基は、Ｃ１−３ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び／又はハロゲンその中で、Ｒ５を置換する置換基は、Ｃ１−３ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボン酸塩、スルホン酸塩、エステル基、アミド及び／又はハロゲンからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ１８アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ１８ヘテロアリール基を示す、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１６】
Ｒ５は、以下の構造から選ばれる、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物。
【化８】
2019508375.tif 000096
【請求項１７】
次の一般式６：
【化９】
2019508375.tif 000097
（式中、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５は、請求項１２〜１６のいずれかに記載の定義と同様であり、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
で表される構造を有する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のポリアミノ酸化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートに含まれるものであるタンパク質で治療できる被検体における疾患の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲート、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲート。
【請求項１９】
（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸を得るステップと、
（２）得られたポリアミノ酸と１，２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得るステップとを含む、
部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートの製造方法。
【請求項２０】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸ＰＡＡ−ＸＲ５を得る、請求項１９に記載の方法。
【化１０】
2019508375.tif 000098
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
【請求項２１】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物の重合を開始させて、炭素構造を有するポリアミノ酸ＰＡＡ−ＸＲ５を得る、請求項１９に記載の方法。
【化１１】
2019508375.tif 000099
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、且つ
ｎは、１〜２００から選ばれる整数である。）
【請求項２２】
前記Ｒ５ＸＹは、トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（１）は非プロトン性溶媒中且つ室温で行われる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸について後修飾を行い、前記後修飾は、前記得られたポリアミノ酸と、メルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である調整剤とを混合して紫外線ランプの照射下で反応させることを含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（２）では、以下のように、前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る、請求項２０に記載の方法。
【化１２】
2019508375.tif 000100
（式中、Ｐｔｎはタンパク質を示す。）
【請求項２６】
前記ステップ（２）では、以下のように、前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸と、１,２−メルカプトエチルアミン構造含有タンパク質とを混合して、室温でネイティブ化学ライゲーション反応を発生させ、部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸コンジュゲートを得る、請求項２１に記載の方法。
【化１３】
2019508375.tif 000101
（式中、Ｐｔｎはタンパク質を示す。）
【請求項２７】
（１）開始剤を用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得るステップと、
（２）得られたブロックポリアミノ酸と、Ｎ末端にシステインを有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ配列（Ｘａはいずれかのアミノ酸である）を有するタンパク質とを混合して、ネイティブ化学ライゲーション反応及びソルターゼ反応を連続的に発生させて、タンパク質の環化を達成するステップとを含む、
部位特異的タンパク質−ポリアミノ酸環状コンジュゲートの製造方法。
【請求項２８】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物とグリシンのＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得る、請求項２７に記載の方法。
【化１４】
2019508375.tif 000102
（式中、Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基をを示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【請求項２９】
前記ステップ（１）では、以下のように、開始剤Ｒ５ＸＹを用いてＮ−カルボキシ無水物と別の１種のＮ−カルボキシ無水物との重合を開始させ、Ｃ末端にフェニルチオエステル構造を有し、Ｎ末端にポリグリシンブロック構造を有するブロックポリアミノ酸を得る
、請求項２７に記載の方法。
【化１５】
2019508375.tif 000103
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基をを示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ１は、それぞれ独立に天然アミノ酸の側鎖又は非天然アミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ２は、それぞれ独立に水素又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル基を示し、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示し、
ｎは、１０〜２００から選ばれる整数であり、且つ
ｍは、１〜３０から選ばれる整数である。）
【請求項３０】
前記Ｒ５ＸＹは、トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（１）は非プロトン性溶媒中且つ室温で行われる、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（１）で得られたポリアミノ酸について後修飾を行い、前記後修飾は、前記得られたポリアミノ酸と、メルカプトエチルアミン塩酸塩又はメルカプトプロピオン酸である調整剤とを混合して紫外線ランプの照射下で反応させることを含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（２）では、以下のように、前記ステップ（１）で得られたブロックポリアミノ酸と、Ｎ末端にシステインを有し、Ｃ末端にＬＰＸａＴＧ配列を有するタンパク質とを混合して、前記ブロックポリアミノ酸と前記タンパク質のＮ末端におけるシステインとをライゲーション反応させ、次にソルターゼの存在下で環化を達成する、請求項２８又は２９に記載の方法。
【化１６】
2019508375.tif 000104
（式中、ＬＰＸａＴＧ配列はソルターゼの認識部位である。）
【請求項３４】
Ｒ５ＸＹの構造を有する、ポリアミノ酸の製造するための開始剤。
（式中、
Ｘは、硫黄又はセレンを示し、
Ｙは、水素又はトリアルキルシリル基を示し、その中で、トリアルキルシリル基中のアルキル基はＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
Ｒ５は、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０アルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０アルキニル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルキル基、置換又は非置換のＣ３−Ｃ３０シクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルケニル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロアルキニル基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、置換又は非置換のＣ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルケニル基、置換又は非置換のＣ６−Ｃ３０アリール基、或いは置換又は非置換のＣ５−Ｃ３０ヘテロアリール基を示す。）
【請求項３５】
トリメチルシリルベンゼンチオール又はトリメチルシリルベンゼンセレノールである、請求項３４に記載の開始剤。
【国際調査報告】
2019508375.tif 000105
2019508375.tif 000106
2019508375.tif 000107
2019508375.tif 000108
2019508375.tif 000109
2019508375.tif 000110