(57)【要約】  本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１内のエピトープに高い特異性および再現性で結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、患者の層別化を助けるために組織試料中のＰＤ−Ｌ１発現の評価に使用され得る。本発明はさらに、本発明の抗体を生成する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体の軽鎖またはその抗原結合断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８の少なくとも３つのアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４の少なくとも３つのアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗原結合断片がＦａｂである、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２である、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ’である、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗原結合断片が、ジｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、ＩｇＧ型モノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体の軽鎖またはその抗原結合断片が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のすべてを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体の重鎖またはその抗原結合断片が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４のすべてを含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体の重鎖またはその抗原結合断片が、配列番号１１０のアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖またはその抗原結合断片が、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体の軽鎖が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体の軽鎖が、配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖が、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、ウサギ抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、ウサギ由来の抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な標識にさらに結合されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記検出可能な標識が、酵素である、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記検出可能な標識が、放射性同位体である、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
試料中の配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現の検出に使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記試料が、生物学的試料である、請求項２０に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
前記生物学的試料が、組織試料である、請求項２１に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記試料が、固定された組織試料である、請求項２１に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記試料が、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である、請求項２１に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
前記組織試料が、腫瘍組織に由来する、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
前記検出が、フローサイトメトリーによって行われる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
前記検出が、ＥＬＩＳＡによって行われる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
前記検出が、ウェスタンブロッティングによって行われる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
前記検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって行われる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
試料中のヒトＰＤ−Ｌ１または配列番号１のアミノ酸配列を含むその任意の断片の存在または発現を検出する方法であって、前記試料を請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップ、および結合した抗体またはその抗原結合断片の存在を検出するステップを含む方法。
【請求項３１】
前記試料が、生物学的試料である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的試料が、組織試料である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的試料が、固定された組織試料である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記固定された組織試料が、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記固定された組織試料が、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が、がんを有するまたはがんのリスクがある対象に由来する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、Ｔ細胞機能不全を有する対象に由来する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料が、急性または慢性感染症を有する対象に由来する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、腫瘍免疫のリスクがあるかまたはそれを示す対象に由来する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法における請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項４１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４３】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の抗体の製造における請求項４２に記載の発現ベクターの使用であって、前記抗体が、配列番号１５および配列番号１６のアミノ酸配列を含む、発現ベクターの使用。
【請求項４４】
請求項４１に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１２に記載の抗体の製造における請求項４３に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４６】
患者におけるがんを治療する方法であって、
（ｉ）試料中の請求項３０〜３５のいずれか一項に記載のヒトＰＤ−Ｌ１の存在または発現を検出するステップ、および
（ｉｉ）（ｉ）からの前記ＰＤ−Ｌ１発現の結果を参照試料と比較するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で検出された試料中の前記ＰＤ−Ｌ１発現が前記参照試料と比較して増加している場合、免疫チェックポイント阻害剤を前記患者に投与するステップ
を含む方法。
【請求項４７】
前記参照試料が、がんに罹患していない健康な対象に由来するまたはそれから得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者に投与される工程（ｉｉｉ）の前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−１抗体である、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、約５ｍｇ／ｋｇ体重から約３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、毎週５００〜８００ｍｇ、または２週間毎に９００〜１６００ｍｇ、または３週間毎に１２５０〜２４００ｍｇの固定投薬レジメンで投与される、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん診断の分野、特にインビトロ診断のための腫瘍試料中のＰＤ−Ｌ１エピトープの存在を検出するための診断用抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分化抗原群（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られるプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされ、ＰＤ−１のリガンド（ＣＤ２７９）の１つであるＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３）の隣にある。ＰＤ−Ｌ１は、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞および骨髄由来肥満細胞を含む多数の造血細胞上に発現される４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、インターフェロンの作用を介して上皮細胞および内皮細胞上に誘導的に発現されることが見出されている。胎盤および網膜における合胞体栄養芽細胞などの免疫特権の部位は、恒常的にＰＤ−Ｌ１を発現することが見出された。
【０００３】
胎盤におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、妊娠中期の初めに増加し、酸素の増加によって上方制御され、低酸素濃度で急速に喪失する。実験は、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ経路が、それぞれ微生物に対する有効な免疫応答および自己寛容の維持に必要とされる刺激シグナルと阻害シグナルのバランスを調節することを示している。慢性感染症を引き起こす多数の微生物は、宿主の免疫エフェクター機構を回避するためにＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１経路を利用する。肝臓感染症のマウスモデルに基づいて、ＰＤ−１ヌルマウスは、野生型マウスと比較して、非常に活発であって、攻撃的なＴ細胞によって引き起こされると考えられている、アデノウイルスのクリアランスの際に肝臓損傷の増加を示すため、ＰＤ−ＰＤ−Ｌ１経路はウイルス感染中の免疫媒介性組織損傷を調節するとも考えられる。
【０００４】
ＩＦＮγ放出を介した免疫攻撃は、粘膜によるＰＤ−Ｌ１の誘導性上方制御をもたらし、慢性炎症または感染の設定における自己免疫攻撃に対して保護するための「免疫シールド」を作り出す。これらの細胞上の上方制御されたＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＰＤ−１に結合して、Ｔ細胞枯渇の発生に寄与する。
【０００５】
腫瘍細胞は、このＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１調節機構を取り込んでいて、これは、通常の生理学的設定の下で、自己免疫攻撃から粘膜を保護し、代わりにＰＤ−Ｌ１を過剰発現して免疫学的監視を回避し、それによりがん増殖を促進する。
【０００６】
この免疫抑制機構は、免疫系による排除から腫瘍の回避を最終的にもたらすＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞によって乗っ取られる場合がある。モノクローナル抗体によってＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害することは、ＰＤ−Ｌ１発現を有する腫瘍の治療のための有望な概念を提供する。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体をブロックする臨床試験が、現在、様々な悪性腫瘍に罹患している患者に対して進行中である。
【０００７】
ＰＤ−Ｌ１陽性患者またはＰＤ−Ｌ１陰性患者の臨床反応率を比較した、公表されている抗ＰＤ−Ｌ１臨床試験データの統計分析は、ＰＤ−Ｌ１発現が特定のがんタイプに関して臨床反応の予測マーカーであり、他のものに関して相関バイオマーカーであることを示している（Gandini et al., Crit Rev Oncol Hematol. 2016 Apr;100:88-98）。例えば、転移性黒色腫では、抗ＰＤ−Ｌ１療法を受けているＰＤ−Ｌ１陽性患者は５３％の死亡率の減少を示すため、腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ１発現は有意に良好な予後と関連している。
【０００８】
研究はまた、特にＰＤ−Ｌ１が腫瘍浸潤性免疫細胞上で発現された場合に、複数のがんタイプにわたって、抗ＰＤ−Ｌ１療法に対する反応が高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍を有する患者において観察されたことを示している（例えば、Herbst et al., Nature. 2014 Nov 27;515(7528):563-7; Ilie et al., Annals of Oncology 27: 147-153, 2016を参照されたい）。乳頭状甲状腺がんにおいて、ＰＤ−Ｌ１発現は、再発、および予後マーカーとしてのこの腫瘍タイプにおけるＰＤ−Ｌ１発現の使用を支持する無病生存期間の短縮と相関することが見出された（Chowdhury et al., Oncotarget. 2016 Apr 12）。
【０００９】
腫瘍組織試料におけるＰＤ−Ｌ１発現の検出およびスコアリングは、通常、凍結またはホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織切片上の免疫組織化学によって行われる。ＰＤ−Ｌ１発現のスコアリングは、異なる方法論を用いて行うことができる：例えば、１つのアプローチは、ＰＤ−Ｌ１発現について陽性または陰性である標本の二元エンドポイントスコアリングを採用し、陽性結果は細胞表面膜染色の組織学的証拠を示した腫瘍細胞の割合に関して定義された。全腫瘍細胞の１％および５％の２つの異なるカットオフ値が用いられている。その値で、腫瘍標本をＰＤ−Ｌ１陽性と評価した（Cancer. 2011 May 15; 117(10):2192-201; N Engl J Med 2012;366:2443-54）。腫瘍標本におけるＰＤ−Ｌ１発現はまた、膜性染色と顕著な細胞質染色の両方を示す腫瘍細胞と比較して、膜性染色を示す腫瘍細胞および腫瘍浸潤性免疫細胞の両方をスコアリングすることによって定量されている。その後、ＰＤ−Ｌ１発現に基づく標本スコアリングが行われ、０、１、２、または３のＩＨＣスコアが与えられた。１％未満の細胞がＰＤ−Ｌ１陽性である場合、標本を「０」とスコア付けし、１％を超えるが５％未満の場合は「１」とスコアし、５％を超えるが１０％未満の場合は「２」とスコアし、または１０％を超える細胞がＰＤ−Ｌ１陽性である場合は「３」とスコアした（Herbst et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):563-7）。腫瘍浸潤性単核細胞（ＴＩＭＣ）におけるＰＤ−Ｌ１発現は、標本中のＴＩＭＣの数に応じて０、１、または２のそれぞれのスコアを有する３つのカテゴリーによる半定量的アプローチを用いて評価された：０％＝０、＜５％＝１、≧５％＝２。
【００１０】
ほとんどの市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の特異性および再現性は十分に評価されておらず、一部の広く使用されている抗体の限界が報告されている（例えば、Cancer 2011;117: 2192-201; Carvajal-Hausorf et al., Laboratory Investigation (2015) 95, 385-396を参照されたい）。例えば、国際公開第２０１４／１６５４２２号パンフレット、国際公開第２０１６／００７２３５号パンフレットは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、およびＰＤ−Ｌ１発現を評価するためにそれぞれの抗体との使用に関するスコアリングガイドラインを開示している。
【００１１】
したがって、ＰＤ−Ｌ１に非常に特異的であり、抗ＰＤ−Ｌ１ベースの治療に適した腫瘍患者の層別化に役立つ再現可能な結果をもたらす、入手可能な抗ＰＤ−Ｌ１抗体のレパートリーを拡大する継続的な必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、驚くべきことに、配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープに対して指向される抗体またはその抗原結合断片が、高い特異性および再現性でヒトＰＤ−Ｌ１に結合することを見出した。
【００１３】
第１の実施形態では、本発明は、高い特異性で配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合し、再現性のある結果をもたらす抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、その軽鎖配列に配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８の少なくとも３つのアミノ酸配列、およびそれらの重鎖配列に配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４の少なくとも３つのアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、一実施形態によれば、Ｆａｂ断片であり得る。
【００１５】
一実施形態によれば、本発明の抗原結合断片はＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１６】
一実施形態によれば、本発明の抗原結合断片はＦａｂ’断片である。
【００１７】
一実施形態では、本発明の抗体はｓｃＦｖである。
【００１８】
一実施形態によれば、本発明の抗体はジｓｃＦｖである。
【００１９】
一実施形態によれば、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
【００２０】
一実施形態によれば、本発明の抗体はＩｇＧ型抗体である。
【００２１】
一実施形態によれば、本発明の抗体の軽鎖またはその抗原結合断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のすべてを含む。
【００２２】
一実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４のすべてを含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖またはその抗原結合断片、および配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖またはその抗原結合断片を含む。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体の軽鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体の軽鎖は配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、抗体の重鎖は配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ウサギ抗体、またはウサギ由来抗体である。
【００２７】
一実施形態によれば、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片は検出可能な標識にさらに結合される。
【００２８】
一実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の検出可能な標識は、酵素、またはフルオロフォア、または酵素基質のうちの１つである。
【００２９】
一実施形態によれば、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片は、一実施形態によれば、生物学的試料、好ましくは、組織試料、固定された組織試料、またはホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、より好ましくは腫瘍由来のホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である、試料中の配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現の検出に使用するためのものである。
【００３０】
一実施形態では、上述した配列番号１に含まれるエピトープの存在または不存在の検出は、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いたフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロッティングによって行われる。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いた、配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現の検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって行われる。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、試料においてヒトＰＤ−Ｌ１または配列番号１のアミノ酸配列を含むその任意の断片の存在または発現を検出する方法を提供し、本発明の方法は、試料を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップ、および結合抗体またはその抗原結合断片の存在を検出するステップを含む。
【００３３】
一実施形態では、上述した本発明のインビトロ方法は、生物学的試料、組織試料、固定された組織試料、好ましくはホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料、より好ましくはホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料に対して使用される。
【００３４】
一実施形態によれば、上述した本発明のインビトロ方法において使用される試料は、がん、Ｔ細胞機能不全、急性もしくは慢性感染症または腫瘍免疫を有する対象、またはそのリスクがある対象に由来する。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、試料中の配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現における、上述した本発明の抗体または抗原結合断片の使用に関する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
一実施形態によれば、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体を生成するのに使用するための、上述した発現ベクターを提供する。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、本発明による少なくとも１つの発現ベクターを含む少なくとも１つの宿主細胞を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体の製造に使用するための本発明による少なくとも１つの宿主細胞を提供する。
【００４１】
一実施形態によれば、本発明は、患者におけるがんを治療する方法を提供し、上述した本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて、前記患者からの試料中のヒトＰＤ−Ｌ１の存在または発現を検出するステップ、患者試料におけるＰＤ−Ｌ１発現を参照試料と比較するステップ、患者試料におけるＰＤ−Ｌ１発現が参照試料と比較して増加している場合、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−１抗体）を患者に投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＥＬＩＳＡプレートのウェルのコーティングのために１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウェルの免疫原を用いた本発明の抗体クローンＭＫＰ１Ａ０７３１０のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図２】１：１００００および１：２５０００の希釈率で本発明の抗体クローンＭＫＰ１Ａ０７３１０、および指示された細胞溶解物を用いた対照抗体（抗ＣＤ２４７、希釈率１：２５０）を使用するウェスタンブロットを示す図である。ＰＤ−Ｌ１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３、ＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ  ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１のｓｉＲＮＡ  ＰＤＬ１ノックダウン、およびＰＤ−Ｌ１低細胞株Ａ５４９の細胞溶解物を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【図３】本発明の抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０）、およびＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞上のｓｉＲＮＡノックダウンにおいてヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対して指向される他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた免疫組織化学染色を示す図である。ＰＤ−Ｌ１染色は、ｓｉＲＮＡノックダウン細胞において減少した。
【図４】本発明の抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０）ならびにヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対して指向される１つの抗体（ＭＫＰ１Ｂ１９６１０）は、それぞれの結合特性を評価および比較し、さらなる研究のための最適作業濃度を決定するために、７０個の細胞株のうちのがん細胞株アレイ上で、１μｇ／ｍｌの濃度のＭＫＰ１Ａ７３１０、および３つの異なる濃度（２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）のＭＫＰ１Ｂ１９６１０を用いて特徴付けられた図である。がん細胞株アレイ（Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ  ＧｍｂＨおよびＺｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨにより製造されたＣＡＸ０９＿７０＿ＭＢ）をＩＨＣにおける抗体特性の評価に使用した。カスタムがん細胞株アレイの製造に使用されたがん細胞株を、リン酸緩衝化された４％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７で室温で１６〜４８時間かけて固定し、続いてパラフィン中に包埋した。
【図５】組織アレイＣＡＸ０８＿６０上の本発明の抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０）の実験間変動を示す図である。異なるスライド間での相関係数はｒ＝０．９９である。
【図６】がん細胞株アレイＣＡＸ０９＿７０上の本発明の抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０、「＃」で印を付けた）およびヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対する１つの抗体（ＭＫＰ１Ｂ１９６１０）の特徴付けは、１μｇ／ｍｌの濃度のＭＫＰ１Ａ７３１０、および１０μｇ／ｍｌの濃度のＭＫＰ１Ｂ１９６１０で試験された図である。
【図７】（Ａ）色素原としてＤＡＢを有する本発明の抗体を用いたＰＤ−Ｌ１陽性細胞のＩＨＣ検出（右の画像）。コンピュータソフトウェアによる色素原の検出（中央の画像）。核および細胞質の青色染色の検出（右の画像）。矢印は陽性細胞を示す。（Ｂ）１μｇ／ｍｌの濃度で本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０を用いた陽性および陰性対照組織におけるＩＨＣ染色。
【図８】（Ａ）異種移植片組織マイクロアレイＴＭＡ＿Ｘｅｎｏｓ＿１２のＦＦＰＥ組織上の本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０を２μｇ／ｍｌの濃度で用いた免疫組織化学。（Ｂ）異種移植片組織マイクロアレイＴＭＡ＿Ｘｅｎｏｓ＿１２のＦＦＰＥ組織上の１０μｇ／ｍｌの濃度のヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対して指向される抗体（ＭＫＰ１Ｂ１９６１０）を用いた免疫組織化学染色。例示的なＰＤ−Ｌ１陽性細胞は矢印で示される。
【図９】（Ａ）がん細胞株アレイＣＡＸ０８＿６０のＦＦＰＥ組織上に１μｇ／ｍｌの濃度で本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０を用いた免疫組織化学染色。（Ｂ）がん細胞株アレイＣＡＸ０８＿６０のＦＦＰＥ組織上に１０μｇ／ｍｌの濃度のヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対する抗体（ＭＫＰ１Ｂ１９６１０）を用いた免疫組織化学染色。矢印は例示的なＰＤ−Ｌ１陽性細胞を示す。
【図１０】ＦＦＰＥ固定された細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９００、ＬｏｘおよびＡ２７８０（ＮＣＩ−Ｈ２００９、Ｌｏｘがん細胞株は高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現し、がん細胞株Ａ２７８０はごく少量のＰＤ−Ｌ１のみを発現する）上で、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ染色装置で、１μｇ／ｍｌの濃度の本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０、および１０μｇ／ｍｌの濃度のＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対して指向される抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０を用いた免疫組織化学染色を示す図である。
【図１１】ＦＦＰＥ固定された細胞ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＬｏｘおよびＡ２７８０上でＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ染色装置における、０．５μｇ／ｍｌの濃度の本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０、および１μｇ／ｍｌの濃度のＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対して指向される抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０を用いた免疫組織化学染色を示す図である。
【図１２】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ（登録商標）システム（Ｖｅｎｔａｎａ）およびＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ  システム（ＤＡＫＯ）を用いて染色されたＦＦＰＥがん細胞株におけるＭＫＰ１Ｂ１９６１０を用いたＩＨＣ結果の相関を示す図である。（Ａ）互いに対してプロットされる異なるＩＨＣプラットフォームおよび濃度を用いて、低ｐＨおよび高ｐＨでＭＫＰ１Ｂ１９６１０を用いてＩＨＣを実行した結果。（Ｂ）ダイアグラムの統計分析。ピアソン相関係数は０．６１８６（２μｇ／ｍｌ、高ｐＨ）、０．６９６９（１μｇ／ｍｌ、高ｐＨ）、および低ｐＨ０．４３０９（５μｇ／ｍｌ）、０．６６３１（２μｇ／ｍｌ）。
【図１３】（Ａ）指示された抗体濃度を用いて高ｐＨでＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ（登録商標）システム（Ｖｅｎｔａｎａ）またはＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ（ＤＡＫＯ）で染色されたＦＦＰＥがん細胞株に本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０を用いたＩＨＣの結果の相関を示す図である。（Ｂ）ＩＨＣ結果の相関の統計分析。相関係数は、ｒ＝０．９４７４（１μｇ／ｍｌ）およびｒ＝０．９６９５（２μｇ／ｍｌ）であることを示す図である。
【図１４】（Ａ）指示された濃度（菱形：１μｇ／ｍｌ；丸：２μｇ／ｍｌ）でＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ（ＤＡＫＯ）で染色されたＦＦＰＥがん細胞株における抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０と本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０の間のＩＨＣ相関；指示されるように、本発明の抗体を０．５μｇ／ｍｌの濃度で使用したことを示す図である。（Ｂ）ＩＨＣ結果の相関の統計分析を示す図である。相関係数はｒ＝０．６５０３（２μｇ／ｍｌのＭＫＰ１Ｂ１９６１０）およびｒ＝０．７０８８（１μｇ／ｍｌのＭＫＰ１Ｂ１９６１０）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
【表１−１】
2019532633.tif 000002
【００４４】
【表１−２】
2019532633.tif 000003
【００４５】
【表１−３】
2019532633.tif 000004
【００４６】
【表１−４】
2019532633.tif 000005
【００４７】
【表１−５】
2019532633.tif 000006
【００４８】
【表１−６】
2019532633.tif 000007
【００４９】
【表１−７】
2019532633.tif 000008
【００５０】
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明は、以下のものは変更され得るため、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５１】
以下、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されているが、しかしながら、それらは任意の方法および任意の数で組み合わせて、追加の実施形態を作り出すことができることを理解されたい。様々に説明された例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施形態を任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持および包含するものとして理解されるべきである。さらに、本出願において記載されたすべての要素の任意の置換および組み合わせは、文脈がそうでないことを示さない限り、本出願の説明によって開示されると見なされるべきである。
【００５２】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈が他を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変形は、記述されたメンバー、整数またはステップの包含を暗示するが、記述されていない他のメンバー、整数、またはステップの除外を暗示しないことが理解される。「からなる」という用語は、「含む」という用語の特定の実施形態であり、いずれもの他の記述されていないメンバー、整数またはステップは除外される。本発明の文脈において、用語「含む」は用語「からなる」を包含する。
【００５３】
本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」および同様の参照は、本明細書で別段の指定がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に含まれる各々の別個の値を個々に指す簡潔な方法として役立つことを意図している。本明細書で別段の指定がない限り、各々の個々の値は、あたかも本明細書で個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須であるいずれもの請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００５４】
本明細書の本文中にいくつかの文献が引用されている。本明細書で引用される文献（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む）の各々は、上記または下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明のためにこのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
【００５５】
記載された目的は、本発明によって、好ましくは添付の特許請求の範囲の主題によって解決される。
【００５６】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、ＰＤ−Ｌ１に対して非常に特異的であり、免疫組織化学によるＰＤ−Ｌ１検出において再現性のある結果をもたらし、抗ＰＤ−Ｌ１ベースの治療に適した腫瘍患者の層別化を助けることを見出している。
【００５７】
記載された目的は、第１の実施形態に従って、配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合する本発明の抗体またはその抗原結合断片によって解決され、抗体の軽鎖またはその抗原結合断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含み、抗体の重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、その軽鎖において、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のうちの少なくとも１つを、または例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはすべてを含む。例えば、軽鎖は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５；配列番号４、配列番号５、配列番号６；配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号６、配列番号７、配列番号８、または例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１６を含み、抗体の重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４の少なくとも１つを含み、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、例えば配列番号９、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１１、配列番号１２；配列番号１２、配列番号１３；配列番号１３、配列番号１４、または例えば配列番号９、配列番号１０、配列番号１１；配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２；配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３；配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または例えば配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２；配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３；配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；または例えば配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または例えば配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１１７のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはすべてを含む。上述した軽鎖および重鎖アミノ酸配列要素は、例えば、列挙された配列番号の数字の昇順で存在し得、重鎖および軽鎖配列要素のすべてが本発明の抗体またはその抗原結合断片に存在する場合、軽鎖配列要素は、順に配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１６に含まれ、および重鎖配列要素は、順に配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１１７に含まれることが好ましい。本発明の抗体について使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはその断片を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびに免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体の軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。抗体の重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要である。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する（例えば、J Allergy Clin Immunol. 2010 February ; 125(2 0 2): S41-S52を参照されたい）。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００５８】
一実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、またはジｓｃＦｖである。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、またはペプシンもしくはパパインなどのペプチダーゼによる消化によって生成される、十分に特徴付けられた抗原結合断片として存在する：ペプシンは、ジスルフィド連結の下方でタンパク質分解的切断をもたらし、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片を生じさせる。一方、パパインによるタンパク質分解的切断は、ジスルフィド連結の上方で切断し、２つのＦａｂ断片を生じさせる。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に接続した軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ’）２は穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換し得る。前述の抗体断片は、ペプシンおよびパパインによる無傷な抗体の消化に関して規定されるが、このような断片は、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を使用することによってデノボで合成することができる。
【００５９】
本発明による「その抗原結合断片」という用語は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（例えば、Ward et al (1989) Nature 341 544-46を参照されたい）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。本発明で使用される「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって連結された抗体の重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体の軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含み、定常ドメインを欠く分子を指す。例えば、本発明によるｓｃＦｖ断片には、例えば、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその一部、および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）またはその一部からなる結合分子が含まれ得、各可変ドメイン（またはその一部）は同じまたは異なる抗体に由来する。好ましくは、ｓｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入されたリンカーを含み、これは、例えば、アミノ酸グリシンおよびセリンで構成されるペプチド配列を含み得る。例えば、ペプチド配列は、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み得、ｎは１〜６の整数であり、例えばｎは１、２、３、４、５、または６であり得、好ましくはｎ＝４である。ｓｃＦｖ分子およびそれらを得る方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書、Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837に記載されている。本発明の抗原結合断片に使用される「ジｓｃＦｖ」という用語は、リンカーを介して互いに結合している２つのｓｃＦｖ断片を指し、例えば、Cancer Research 54:6176-618,. December 1, 1994またはChem Commun (Camb). 2007 Feb 21; (7): 695-7に開示されているものなどが挙げられる。
【００６０】
一実施形態によれば、本発明による抗体または抗原結合断片はモノクローナル抗体である。本発明の抗体に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、少量で存在する可能性がある天然に存在する可能性のある突然変異体、またはそれらのグリコシル化パターンにおけるわずかな違いを除いて同一である。モノクローナル抗体、例えば、本発明のモノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に指向され、抗原内の単一のエピトープに特異的に結合する。これは、典型的には、異なるエピトープに対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なる。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler et al., (1975) Nature, 256:495に記載されるハイブリドーマ培養により得ることができ、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。
【００６１】
一実施形態によれば、本発明の抗体は、ＩｇＧ型のモノクローナル抗体であり、例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４型のモノクローナル抗体、または例えば、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、または例えば、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃであり得る。例えば、本発明のＩｇＧ型のモノクローナル抗体は、任意の起源のものであり得、例えば、マウス、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ラット、またはウサギ起源のものであり得る。
【００６２】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８の軽鎖アミノ酸配列のすべてを含む。
【００６３】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４の重鎖アミノ酸配列のすべてを含む。
【００６４】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域由来の３つのＣＤＲ、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域由来の３つのＣＤＲを含む。
【００６５】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域由来の３つのＣＤＲ、および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域由来の３つのＣＤＲを含み、軽鎖のＣＤＲは、配列番号４、配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれらに含まれ、重鎖のＣＤＲは、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４のアミノ酸配列を含むまたはそれに含まれる。
【００６６】
好ましい一実施形態では、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片は、上記で定義したＣＤＲを含む軽鎖および重鎖を含み、配列番号１１１の軽鎖可変領域はさらに４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、配列番号１１０の重鎖可変領域はさらに４つのフレームワーク領域を含み、軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１６のアミノ酸配列を含むまたはそれに含まれ、および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むまたはそれに含まれる。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体の重鎖（または例えば、その抗原結合断片）は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む可変領域を含み、本発明の抗体の軽鎖（または例えば、その抗原結合断片）は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む可変領域を含む。
【００６８】
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えばタンパク質分解的切断により、シグナル配列が除去されている配列番号１１４のアミノ酸配列、例えば配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および例えばタンパク質分解的切断により、シグナル配列が除去されている配列番号１１５のアミノ酸配列、例えば配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００６９】
一実施形態では、本発明の抗体の可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）、例えば、配列番号１１０および配列番号１１１のアミノ酸配列を含むものは、ｓｃＦｖに含まれてもよく、または例えば、さらにＧＡ−ＳＥＥＤもしくはＡＧ−ＳＥＥＤに連結され得るＦａｂに含まれてもよい。「ＳＥＥＤ」という用語は、国際公開第２００７／１１０２０５Ａ２号パンフレット、Protein Engineering, Design & Selection vol. 23 no. 4 pp. 195-202, 2010に開示される鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３二量体を指す。これらのヘテロ二量体分子は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの誘導体であり、ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントからなる相補的ヒトＳＥＥＤ  ＣＨ３ヘテロ二量体を作製する。得られた一対のＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインは、哺乳動物細胞中で発現された場合に、優先的に会合して１：１の比でヘテロ二量体を形成して「ＳＥＥＤ体」（Ｓｂ）を形成する。「ＧＡ−ＳＥＥＤ」という用語は、ＳＥＥＤ分子がＩｇＧ配列から開始し、それにＩｇＡ配列が続くことを意味し、一方、「ＡＧ−ＳＥＥＤ」は、ＳＥＥＤ分子がＩｇＡ由来配列から開始し、それにＩｇＧ由来配列が続くことを指す。配列番号１１０および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖは、例えば、ペプチドリンカーを介して、例えば、上述したアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのグリシン−セリンリンカーを介して、ＧＡ−またはＡＧ−ＳＥＥＤに連結され得る。
【００７０】
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体の軽鎖またはその抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、本発明の抗体の重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、その軽鎖に配列番号１５のアミノ酸配列、およびその重鎖に配列番号１６のアミノ酸配列を含み得る。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の重鎖配列と軽鎖配列の両方は、軽鎖について配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号１１１、および重鎖について配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、もしくは配列番号１１０のいずれにも含まれないアミノ酸配列におけるアミノ酸置換、例えば、軽鎖もしくは重鎖の可変領域の部分、または例えば、本発明の抗体の軽鎖の配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは例えば配列番号１１１、または重鎖の配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、もしくは配列番号１１０に対してアミノ末端またはカルボキシ末端に、いずれもの軽鎖もしくは重鎖ＣＤＲまたはフレークワーク配列を形成しないアミノ酸におけるアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、例えば、非保存的アミノ酸置換、または保存的アミノ酸置換であり得る。本発明で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、置換されたアミノ酸残基が、置き換わる残基と類似した電荷を有し、置き換わる残基と類似したまたはより小さいサイズのものであるアミノ酸置換を指す。アミノ酸の保存的置換には、例えば、以下のグループ内のアミノ酸の中でなされる置換を含む：
【００７１】
【表２】
2019532633.tif 000009
【００７２】
好ましい実施形態によれば、本発明のモノクローナルＩｇＧ抗体は、ウサギ抗体、または例えばウサギ由来の抗体である。本発明のウサギＩｇＧモノクローナル抗体は、例えばAntibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Chapter 7, Edited by Edward A. Greenfield, CSH Press, ISBN 978-1-936113-81-1に開示される方法に従って、または例えば、Proc. Natl Acad. Sci. USA, Vol, 92, pp. 9348-9352, September 1995、もしくは例えば米国特許第７，７３２，１６８号Ｂ２明細書に開示される方法などの当該技術分野における任意の適切な方法に従って生成し得る。本発明の抗体について使用される「ウサギ由来」という用語は、例えば、本発明の抗体などの、それぞれの抗体を産生するウサギハイブリドーマから得られるポリヌクレオチド配列を用いて異種発現系（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞）において産生される抗体を指す。例えば、本発明のウサギ由来抗体は、ウサギハイブリドーマ細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列（例えば、配列番号１５および／または配列番号１６による）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯまたはＨＥＫ細胞中で産生され得る抗体を含む。例えば、本発明による組換えモノクローナル抗体は、PLoS One. 2016 Mar 29; 11(3):e0152282に開示される方法によって、本発明の抗体を産生するウサギハイブリドーマ細胞から生成され得る。例えば、単一のＢ細胞からのｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）でプライムされたＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製され得る。次に、抗体可変領域遺伝子は、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のいずれかを用いた２ラウンドのＰＣＲによって回収することができる。一次ＰＣＲは、例えば、抗体可変領域の５’末端と３’末端の両方に遺伝子特異的プライマーを利用し得る。５’オリゴヌクレオチドセットは、例えば、リーダー配列の５’末端で結合することができ、３’リバースプライマーセットは、それぞれＣＨ１またはＣκ領域にアニーリングすることができる。二次ＰＣＲでは、一次ＰＣＲ産物の５’末端にコードされる「テール」にアニーリングする単一の５’フォワードオリゴヌクレオチドは、Ｊ領域にアニーリングする３’プライマーセットとともに使用され得る。二次オリゴヌクレオチドを用いて、例えば、下流のクローニングを容易にするために制限部位を導入し得る。次に、重鎖および軽鎖ＰＣＲ断片は、例えば、製造者の指示に従って、適切な発現ベクター（例えば、ｐＣＭＶ）にサブクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３フェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にトランスフェクトされ得る。トランスフェクションされた細胞は、例えば、本発明の抗体の産生を可能にする増殖培地を用いて５％ＣＯ２環境下、３７℃で７日間増殖され得る。得られた上清は、例えば５〜７日後に回収され得る。
【００７３】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識にさらに結合される。本発明の抗体またはその抗原結合断片について使用される場合、用語「検出可能な標識」は、検出することができる分子を意味し、例えば、放射性同位元素、蛍光プローブ、化学発光、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、またはビオチンが含まれ得る。本発明の抗体またはその抗原結合断片について使用される「結合」という用語は、色素、放射性同位元素が、例えばイオン性もしくは疎水性相互作用を介して、例えば非共有結合的である、または本発明の抗体もしくはその抗原結合断片に共有結合され得るという事実を指す。上述した検出可能な標識の結合、例えば、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片への蛍光プローブ、色素、または酵素の結合は、例えば、Methods Cell Biol. 2001;63:185-204; Methods Mol Biol. 2010;588:43-8; Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 11:Unit 11.1に開示されたものなど、当該技術分野において公知である方法に従って行うことができる。
【００７４】
一実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片に結合した検出可能な標識は、酵素、またはフルオロフォア、または酵素基質のうちの１つである。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片に結合された検出可能な標識は、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、タバコエッチウイルス核内包物−エンドペプチダーゼ（「ＴＥＶプロテアーゼ」）であり得る。例えば、上述した本発明の抗体に結合し得るフルオロフォアは、１，８−ＡＮＳ、４−メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、アクリジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５（商標）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、パシフィックブルー、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ４９２／５１５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５、Ｃｙ２、ｃｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、ｍハニーデュー、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５１４、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｄＴｏｍａｔｏ、Ｃｙ３．５、フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミンレッド、ｍタンジェリン、ｍストローベリー、ｍオレンジ、ｍバナナ、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン、ＲＯＸ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、カルシウムクリムソン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０（商標）、テキサスレッド、ｍチェリー、ｍケイト、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商標）、アロフィコシアニン、ＤＲＡＱ−５、カルボキシナフトフルオレセイン、Ｃ７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０、Ｃｅｌｌｖｕｅ  ＮＩＲ７８０、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲＤｙｅ（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）、ＪＯＥ、リッサミンローダミンＢ、マリナブルー、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＰｙＭＰＯ、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、ダンシルクロリド、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンゼン−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、��レシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメシン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユウロピウムトリスビピリジンジアミン、ユウロピウムクリプテートまたはキレート、ジアミン、ジシアニン、またはラホイヤブルー色素のうちの１つであり得る。本発明の抗体または抗原結合断片に結合され得るフルオロフォアにまた、例えば量子ドットを含み得る。本発明で使用される量子ドットという用語は、半導体物質の単一球状ナノ結晶を指し、この場合、ナノ結晶の半径は半導体物質の励起子ボーア半径のサイズより小さいまたはそれに等しい（励起子ボーア半径の値は、半導体の特性に関する情報を含むハンドブック（例えば、CRC Handbook of Chemistry and Physics, 83rd ed., Lide, David R. (Editor), CRC Press, Boca Raton, Fla. (2002)において見出されるデータから計算することができる）。量子ドットは当該技術分野において公知であり、例えば、下記文献に記載されている：Weller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 41-53 (1993), Alivisatos, J. Phys. Chem. 100: 13226-13239 (1996)、およびAlivisatos, Science 271: 933-937 (1996)。量子ドットは、直径が約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、または５００ｎｍ、好ましくは少なくとも約２ｎｍ〜約５０ｎｍであり、より好ましくは、ＱＤは直径が少なくとも約２ｎｍ〜約２０ｎｍである（例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｎｍ）。ＱＤは、それらの実質的に均質なナノメートルサイズ、しばしば約１０〜１５％の多分散または範囲を示すサイズによって特徴付けられる。ＱＤは、励起に際して電磁放射を放出することができ（すなわち、ＱＤはフォトルミネッセンス性である）、１つ以上の第１の半導体物質の「コア」を含み、第２の半導体物質の「シェル」によって取り囲まれ得る。半導体のシェルによって取り囲まれたＱＤコアは、「コア／シェル」ＱＤと称される。周囲の「シェル」の材料は、好ましくはコア物質のバンドギャップエネルギーより大きいバンドギャップエネルギーを有し、「コア」基質の原子間隔に近い原子間隔を有するように選択され得る。コアおよび／またはシェルは、限定されないが、以下を含む半導体物質であり得る：グループＩＩ〜ＶＩのもの（ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＵＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅなど）、およびグループＩＩＩ〜Ｖ（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂなど）、およびグループＩＶ（Ｇｅ、Ｓｉなど）の物質、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ならびにそれらの合金または混合物。好ましいシェルの材料には、ＺｎＳが含まれる。量子ドットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片に、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、Nanotechnology. 2011 Dec 9;22(49):494006; Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 84 (2011) 360-368に開示される方法などによって結合され得る。
【００７５】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、４７Ｃａ、１４Ｃ、１３７Ｃｓ、１５７Ｃｒ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、７５Ｓｅ、８５Ｓｒ、３５Ｓ、２０１Ｔｈ、３Ｈなどの放射性同位体に結合され得る。好ましくは、放射性同位体は、例えば、キレート剤などのさらなる分子に組み込まれる。本発明に従って使用され得る典型的なキレート剤は、例えば、ＤＰＴＡ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＨＥＤＴＡ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸）、ＤＴＰＡ（２−［ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチル］アミノ］酢酸）、またはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）である。
【００７６】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、試料における配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現の検出に使用するものである。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープの発現の検出に使用されるものであり、配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ６９３８１のアミノ酸残基２６０〜２９０にわたるヒトＰＤ−Ｌ１の細胞内部分に対応する。配列番号１のアミノ酸配列（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞内ドメイン内）に含まれるエピトープは、例えば、ＦＦＰＥ組織試料、または腫瘍組織試料における免疫組織化学的方法により、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用を通じて確実に再現性よく検出することができる。配列番号１（ＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ）に含まれる本発明に使用される「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはウサギにおいて抗原性または免疫原性活性を有する配列番号１の一部を指す。本発明による配列番号１に含まれるエピトープは、例えば、直鎖状エピトープ、または立体配座エピトープであり得る。立体配座エピトープは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列の不連続部分で構成されてもよく、例えば、本発明の抗体のパラトープ、または配列番号１のその３次元表面特徴および形状もしくは三次構造に基づいて上述した抗原結合断片と相互作用し得る。本発明による配列番号１に含まれるエピトープはまた、例えば、配列番号１の一次アミノ酸配列（ＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫ  ＱＳＤＴＨＬＥＥＴ）に基づく、本発明の抗体またはその抗原結合断片のパラトープと相互作用する配列番号１のアミノ酸の連続配列によって形成される直鎖状エピトープであり得る。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片のパラトープは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に含まれる直鎖状エピトープに結合し得、例えば、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個から、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のアミノ酸、または約２個から、約３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸、または例えば、約８個のアミノ酸から約１１個のアミノ酸であり得る。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片のパラトープと相互作用する直鎖状エピトープは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、���列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８のアミノ酸配列を含み得るまたはそれに含まれ得る。例えば、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、体液または血液試料などの生物学的試料であり得る試料における、上述したエピトープの存在または発現を検出するために使用され得る。例えば、体液または血液試料などの生物学的試料は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて、フローサイトメトリー、または例えば、ＦＡＣＳに供され、配列番号１に含まれるエピトープ、または例えば、本発明の配列番号１９から配列番号１０８のアミノ酸のいずれかに含まれるエピトープの非存在もしくは存在を検出し得る。例えば、針生検により得られた細胞は、１：１０００希釈のＦｃＲブロッカー（例えば、ＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；または例えば、Ｈｕｍａｎ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて室温で１０分間ブロッキングし、次に、本発明の抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートされ得、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ＰＢＳ＋２％血清中、約１：５０から約１：５００、例えば、約１：７５、１：１００、１：１２５、１：１５０、１：１７５、１：２００から、約１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、または例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００希釈の蛍光プローブ、例えばフィコエリトリン［ＰＥ］に１５分間、暗所にて室温で結合させ得る。次に、細胞は、例えば、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で分析され、その結果は、ＦｌｏｗＪｏ  １０．０ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて評価され得る。例えば、細胞はさらに、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、５μＭの最終濃度で１０分間、３７℃にて暗所中で対比染色され、続いてＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄され得る。
【００７７】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、組織試料、固定された組織試料、またはホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織において、配列番号１に含まれるエピトープ、例えば、配列番号１９から配列番号１０８のアミノ酸配列のいずれかの直鎖状エピトープに含まれるエピトープの存在または発現を検出するために使用され得る。本発明による「組織試料」という用語は、例えば、腫瘍、もしくは腫瘍であると疑われる組織に由来する単一の細胞、または例えば、Trends Biotechnol. 2013 June; 31(6): 347-354; Cancer Cell Culture: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine); S.P. Langdon (Ed.), Humana Press, ISBN: 978-1588290793に記載される、培養腫瘍細胞も含み得る腫瘍組織もしくは腫瘍であると疑われる組織に由来する少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６個またはそれより多くの細胞を指すことができる。
【００７８】
細胞または組織は、例えば、細針吸引および針生検を含むがこれらに限定されない非侵襲的手段によって、または代替的には、例えば、外科的生検を含むがこれに限定されない侵襲的方法によって得ることができる。組織試料を採取する方法は、本発明の一部を構成しない。本発明による「固定された組織試料」という用語は、化学的組織固定に供された組織試料を指す。例えば、化学的固定は、メタノール、エタノール、アセトン、メタノール−アセトン混合物、緩衝化されたホルマリン溶液、グルタルアルデヒド、または緩衝化されたパラホルムアルデヒドによる固定を含み得る。例えば、固定は、１００ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ６．８〜７．２に緩衝化された１０％飽和ホルムアルデヒド水溶液、または１０％中性緩衝化されたホルマリン（ＮＢＦ）を用いて、様々な時間で、４〜４５℃の範囲の温度、例えば、室温（２０〜２５℃）、または例えば、約５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃から、約１５℃、１７．５℃、２０℃、もしくは約１２℃、１５℃、１７．５℃、２０℃から、約２５℃、２７℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃で様々な時間量で、上述した組織試料の処理（固定化）を含み得る。例えば、上述した組織試料は、約５分から約２４時間、または約１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１８０分から、約１５分、３０分、４５分、１時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間、４８時間、固定され得る。例えば、固定された組織試料は、１０％ＮＢＦを用いた浸漬固定によって約１８から２４時間固定された組織試料を含み得る。例えば、本発明による固定された組織試料は、当該技術分野において利用可能な標準的なプロトコールに従って、例えば、Hopwood D. Fixatives and fixation: a review. Histochem J. 1969;1(4):323-60に記載され、または例えば、ＤＡＫＯ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．により出版された「Immunohistochemical Staining Methods」, 5thedition (2009)に記載される、ウェブサイトｗｗｗ．ｉｈｃｗｏｒｌｄ．ｃｏｍで提供されるものなどに従って固定されているまたは処理されている、上述した組織試料を含み得る。例えば、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は、以下の手順によって得ることができる。
【００７９】
上述した腫瘍組織は、例えば、少なくとも１０容積の緩衝化ホルマリン（３．７％ホルムアルデヒド：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐｈ７．４）または緩衝化パラホルムアルデヒド（３．７％パラホルムアルデヒド：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐｈ７．４）に入れ、続いて、緩衝化ホルマリンまたはＮＢＦ中で、上述した組織試料の厚さに応じて様々な時間量でインキュベートし得、例えば、１〜２ｍｍの組織試料の場合は室温で２〜３時間、５〜１０ｍｍ厚の組織試料の場合は室温で５時間、または例えば、＞１０ｍｍ厚の組織試料の場合は室温で２〜３時間、もしくは例えば、４℃で一晩である。続いて、組織は、例えば、ＰＢＳで１〜２回洗浄し、Ｈ２Ｏ中の７０％エタノールで４℃にて保存し、次に、組織処理組織学カセットに入れ、後で識別するためにラベルを貼り得る。次に、組織学カセットは、例えば、市販の組織プロセッサーを用いてパラフィン包埋に供され得、７０％エタノールで１時間；９５％エタノール（９５％エタノール／５％メタノール）で１時間；１回目の無水エタノールで１時間；２回目の無水エタノールで１時間３０分；３回目の無水エタノールで１時間３０分；４回目の無水エタノールで２時間；１回目の洗浄剤（キシレンまたは代替物）で１時間；２回目の最初の専用剤（キシレンまたは代替物）で１時間；１回目のワックス（Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ）を５８℃で１時間；２回目のワックス（Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ）を５８℃で１時間で供され得る。次に、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織は、さらなる処理のために型に入れることができる。
【００８０】
一実施形態では、上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片は、組織試料、固定された組織試料、または腫瘍由来のＦＦＰＥ組織試料、例えば、上述した生検によって腫瘍から得られた組織において、配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープ、例えば、上述した配列番号１９から配列番号１０８のアミノ酸配列のいずれかに含まれるエピトープの検出に使用される。本発明による「腫瘍に由来する」という用語はまた、例えば、針吸引によって得られた腫瘍細胞、または例えば、培養された、針吸引によって得られた腫瘍細胞を含み得る。
【００８１】
一実施形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープの検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロッティングによって行われる。例えば、本発明による組織試料、または腫瘍組織試料は、Current Protocols in Molecular Biology 10.8.1-10.8.28, July 2008に記載される、本発明による抗体またはその抗原結合断片を用いて配列番号１に含まれるエピトープを検出するために免疫ブロッティングに供することができる。
【００８２】
例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて、配列番号１に含まれるエピトープを検出するためにＥＬＩＳＡが使用される場合、ＥＬＩＳＡは標準的なプロトコール、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (1991) 11.2.1-11.2.22に記載されるプロトコールに従って実施することができる。好ましくは、配列番号１に含まれるエピトープは、本発明の抗体またはその抗原結合断片（例えば一次抗体）を用いて、ＦＦＰＥ組織試料上の免疫組織化学（ＩＨＣ）により検出される：例えば、ＦＦＰＥ腫瘍組織試料は、乾燥させたパラフィン切片をスライド上に６０℃のオーブンで１時間置くことにより脱パラフィン処理され得る。続いて、スライドをＳａｋｕｒａ染色ラックに入れ、以下の溶液を含有するＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）染色ディッシュにおいて浸す：５分間、キシレン中に３回、少なくとも１分間、１００％エタノール中に各２回、少なくとも１分間、９５％エタノール中に各２回、少なくとも１分間、７０％エタノール中に各１回。次に、スライドを水道水で約５分間、穏やかに濯ぎ得る。試料が由来する腫瘍組織に応じて、スライドを３％過酸化水素溶液中に室温で１０分間入れ、続いて水で濯ぐことによって内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断することが要求され得る。その後の抗原賦活化は、例えば、以下の手順に従って水浴中で行うことができる：スライドは、抗原賦活化溶液、例えば、標的賦活化溶液、増強クエン酸緩衝液（Ｄａｋｏ、Ｓ１６９９またはＳ１７００）、および標的賦活化溶液、高ｐＨ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０８）、または０．０５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６、または例えば、Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８を含むコプリンジャーに入れることができる。次に、スライドは、例えば、水浴中で７５〜９５℃に平衡化させ、約４０分間インキュベートされ得る。その後、スライドは、例えば、室温で２０分間冷却した後、溶液をデカントし得、スライドをＴＢＳ／０．６％Ｔｗｅｅｎ２０を含む染色ディッシュに最低５分間入れ得る。抗原賦活化はまた、例えば、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液  ｐＨ９を用いたＰＴリンク前処理モジュール（ＤＡＫＯ）を用いて、９７℃で２０分間行われる。抗原賦活化後、次に、スライドは、製造業者の指示に従って、自動化装置（例えば、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ（登録商標）、またはＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ４８）を用いて染色手順に供することができる。例えば、スライドはまた、Current Protocols in Molecular Biology 14.6.1-14.6.23, January 2008に記載されるように手動で処理され得る。例えば、スライドは、例えば、市販の抗体希釈剤（例えば、ＤＡＫＯ製）中に、約０．２μｇ／ｍｌから、約５μｇ／ｍｌの濃度、例えば、約０．２μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌから、約３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、６．０μｇ／ｍｌ、７．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、９．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈された本発明による抗体の４００〜５００μｌで覆わ��、湿ったチャンバー中で約３０分間、室温でインキュベートされ得る。次に、一次抗体をＴＢＳ／０．６％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で洗い流すことができる。続いて、スライドは、例えば、ゆっくり排水し、いずれもの残っている洗浄液を取り除き得る。その直後に、本発明の抗体を検出するための二次抗体を添加し、室温で約３０分間インキュベートし得る。二次抗体希釈液は、例えば、約１：１００から、約１：１０，０００、例えば、約１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００、１：７５０、１：１０００から、約１：１５００、１：２０００、１：２５００、１：３０００、１：３５００、１：４０００、１：５０００、１：５５００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、または例えば、約１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：４００、１：５００、１：７５０から、約１：１，０００、１：２０００であり得る。例えば、本発明による結合抗体を検出するために使用することができる二次抗体は、約１：５０、１：１７５から約１：２００希釈のポリクローナルヤギ抗ウサギＨＲＰ結合された免疫グロブリン、または例えば、約１：２０、１：５０、１：１００から、約１：１００、１：２００、１：２５０希釈のヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合された免疫グロブリンを含み得て、これらは、使用される検出方法および基質の選択に依存し、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合された二次抗体を使用する場合、例えば、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）が発色検出に使用され得、または例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）もしくは例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用され得、または例えば、ＡＰ結合された二次抗体を使用する場合、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）の基質の組み合わせが使用され得る。発色性免疫組織化学に関する一般原則および指針は、例えば、Current Protocols in Immunology 21.4.21-21.4.26, November 2013に見出すことができる。
【００８３】
次に、スライドは、スライドを洗浄液で約５分間オーバーレイすることにより、ＴＢＳ／０．６％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）で２回洗浄され、その後、色素原溶液を製造業者の推奨するプロトコールに従って添加し、約４〜５分間インキュベートし得る。対比染色は、例えば、ハリスのヘマトキシリンを使用して約５分間作製され得、その後、スライドを水道水を流しながら濯ぎ、続いて、さらに例えば、ＴＢＳ／０．６％Ｔｗｅｅｎ２０で約１分間、追加して濯ぎ得る。その後、切片は、例えば、次の溶液に移す前に、各溶液：７０％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール、キシレンに２回、に数秒間、スライドをゆっくりと上下にして浸すことによって脱水され得る。切片は、例えば、封入剤とカバーガラスを使用して載せられ得る。
【００８４】
一態様では、本発明は、試料中の配列番号１に含まれるエピトープ、例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８のいずれかに含まれるエピトープの存在または発現を検出する方法を提供し、本方法は、試料を本発明による抗体または抗原結合断片と接触させるステップ、および本発明による結合した抗体または抗原結合断片の存在を検出するステップを含む。例えば、試料中の配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現を検出する本発明の方法は、免疫組織化学による、または、対応する製造業者の指示および／またはプロトコールに従って、市販のＩＨＣプラットフォーム、例えば、ｉｎｔｅｌｌｉＰａｔｈ  ＦＬＸ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＷＡＶＥ  ＲＰＤ（Ｃｅｌｅｒｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｏｍｎｉｓ（ＤＡＫＯ）、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８（ＤＡＫＯ）、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ）、もしくはＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｕｌｔｒａ（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いた自動免疫組織化学による検出を含み得る。したがって、本発明の方法は、本発明による試料中のヒトＰＤ−Ｌ１の発現を検出するために使用され得る。
【００８５】
一実施形態では、本発明の方法は、試料中のヒトＰＤ−Ｌ１または配列番号１のアミノ酸配列を含むその任意の断片の存在を検出するために使用され得、本方法は、前記試料を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップ、および例えば、免疫組織化学によりまたは自動免疫組織化学により、上述した結合した抗体またはその抗原結合断片の存在を検出するステップを含む。例えば、本発明によるヒトＰＤ−Ｌ１の断片は、タンパク質分解的に切断されているヒトＰＤ−Ｌ１を含み得、切断されたＰＤ−Ｌ１断片は配列番号１のアミノ酸配列を含む。例えば、本発明によるヒトＰＤ−Ｌ１の断片は、細胞外ドメインを欠くヒトＰＤ−Ｌ１を含み得、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ６９３８１のアミノ酸２３９〜２９０）のみを含む、または例えば、本発明の抗体を用いて検出され得るＰＤ−Ｌ１断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞内ドメイン（例えば、アミノ酸２６０〜２９０）のみを含み得る。
【００８６】
一態様では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、上述した試料中の配列番号１に含まれるエピトープ、例えば、上述した配列番号１９から配列番号１０８のいずれかに含まれるエピトープの存在または発現を検出するために使用される。例えば、試料は、生物学的試料、例えば、体液、または血液試料であり得る。例えば、血液試料中の配列番号１に含まれるエピトープの存在または発現は、上述した本発明の抗体または抗原結合断片を使用して行うことができる。使用される血液試料は、例えば、哺乳動物起源のもの、好ましくはヒト血液試料、好ましくはがん患者由来またはがんを有するリスクのある個体由来の血液試料であり得る。一態様では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、循環腫瘍細胞、または例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球または単球などの白血球上のＰＤ−Ｌ１発現の存在または発現を検出する。
【００８７】
例えば、フローサイトメトリーを使用して、末梢血液試料（例えば腫瘍患者由来、ここで用語「腫瘍」は新生物、すなわち塊を形成することもあり得る組織の異常な増殖を指す）は、フィコエリトリン−テキサスレッド（ＥＣＤ）結合させた抗ＣＤ３、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＣ５）結合させた抗ＣＤ１５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合させた抗ＣＤ８０（ＭＩＨクローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合された本発明の抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて用いて分析し、配列番号１に含まれるエピトープを発現する細胞タイプを同定し得る。例えば、好中球は、ＣＤ１５＋ＣＤ３−細胞として同定され得る。その標識化は、例えば、５０μＬの新鮮なヘパリン処理全血を５μＬのＥＣＤ結合させた抗ＣＤ３、５μＬのＰＣ５結合させた抗ＣＤ１５とともに氷上で暗所中、３０分間インキュベートすることによって行うことができる。ＰＥ−およびＦＩＴＣ−結合させたマウスＩｇＧとともにインキュベートされた細胞は、例えば、アイソタイプ対照として使用され得る。次に、試料をセルソーター、例えば、製造者の指示に従って、ＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ  ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）および関連するソフトウェアプログラム（ＣＸＰ）を用いて分析され得る。
【００８８】
上述した本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用して、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）上の配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープ、または例えば、配列番号１９から配列番号１０８のアミノ酸配列のいずれかに含まれるエピトープの存在または発現は、例えば、上述した本発明の抗体と組み合わせて、以下のマーカーＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、またはＭＵＣ−１のうちの１つ以上を使用することによって上述したフローサイトメトリーにより分析され得、ＣＴＣを標識するために使用される１つ以上の抗体は、上述した本発明の抗体とは異なる蛍光標識を有する。ＣＴＣは、例えば、血液試料、例えば、上述したヒト血液試料から、市販の単離方法、例えば、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ、または例えば、ＣｌｅａｒＣｅｌｌ（登録商標）ＦＸ  ＣＴＣベースの濃縮を用いたＣＴＣチップにより、例えば、製造業者の指示に従って単離され得る。上記の方法において、上述した蛍光プローブまたは検出可能な標識に結合された本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、約０．０１μｇ／ｍｌから、約５０μｇ／ｍｌ、例えば、約０．０２５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０７５μｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５０μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌから、約１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１７．５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、３７．５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または例えば、約０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５０μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌから、約６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、または約０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌから、約１μｇ／ｍｌ、１．５０μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度で、または例えば、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５０μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
【００８９】
例えば、本発明の一態様では、血液試料などの試料における本発明の抗体または抗原結合断片を使用して、配列番号１のアミノ酸配列、または例えば、配列番号１９から配列番号１０８のいずれかのアミノ酸配列に含まれるエピトープの存在または発現は、ＥＬＩＳＡによって行うことができる。例えば、本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングするために、約０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５０μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、または対照抗体（例えば、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ２ａ）が使用され、その後、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳでブロッキングされ得る。血液試料（例えば、がん患者からのもの、および／または対照もしくは参照試料としての健康な個人からのもの）は、例えば、プレートに添加する前に３重にして１：１．０００でＰＢＳ中に希釈され得る。続いて、ウェルは、例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで６回洗浄され得る。結合した本発明の抗体は、室温で１．５時間インキュベートされた１：２．０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合させた二次抗ウサギＩｇＧＡｂによって検出し、次に、テトラメチルベンジジンと反応させて、４５０ｎｍの波長でプレートリーダーを使用して吸光度を測定され得る。対照Ｉｇでコーティングされたプレートへの血清の非特異的結合は、例えば、バックグラウンド補正のために各試料の測定値から差し引くことができる。
【００９０】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、上述した組織試料、固定された組織試料、またはホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中の配列番号１に含まれるエピトープ、または例えば、配列番号１９から配列番号１０８のアミノ酸配列のいずれかの存在または発現を検出するために使用され得る。好ましくは、一実施形態によれば、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は、腫瘍組織試料、または腫瘍組織由来試料、例えば、腫瘍細胞、培養腫瘍細胞株、または上述した培養された腫瘍組織である。本発明の方法はまた、例えば、一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を発現しないまたはごく少量しか発現しない対照組織を本発明の方法に供し、好ましくは上述した組織試料と並行して処理される対象組織を含む。例えば、対照組織は、甲状腺組織もしくは骨格筋組織、または培養されたＰＤ−Ｌ１陰性がん細胞、例えばＡ２７８０、Ｃｏｌｏ２０５、またはＩＧＲＯＶ−１を含み得る。上記で用いられる少量という用語は、例えば、Journal of Immunological Methods 345 (2009) 40-48; Journal of Immunological Methods 353 (2010) 148-150; Hematology. 2016 Mar 31:1-6に記載される半定量的免疫ブロット法またはｑＰＣＲと比較した場合、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織または腫瘍細胞（例えば、Ｈｓ７４６Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１、ＮＣＩ−Ｈ  ２００９、ヒト脾臓）よりも少なくとも５、１０、２０、２５、４０、５０、または１００倍少ない腫瘍細胞または腫瘍組織によるＰＤ−Ｌ１の発現を指す。例えば、上記で定義した組織試料または腫瘍組織試料は、ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成に供され得、次に、例えば、ｑＰＣＲに使用して、ＰＤ−Ｌ１の相対的な発現レベルを決定し得る。
【００９１】
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ガラススライド上に載せられた組織試料上で使用されて、異なる腫瘍組織試料が互いに隣接して配置され得る組織アレイを形成し得る。例えば、組織アレイは、（例えば検出アーティファクトを回避するために）ガラススライド上の異なる位置に載せられた各組織試料の少なくとも１、２、３または４つの切片を含む。例えば、組織アレイは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０から、約２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５５もしくは６０、または約２２、２４、２８、３０、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０から、約６４、６８、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９０、１００の異なる組織試料を含み得る。例えば、一実施形態では、組織アレイは、上述した腫瘍組織試料に加えて、がん細胞株ＺＲ−７５−１、ＷＭ１６４、Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−１１８ＭＧ、Ｔ４７Ｄ、ＳＷ７０７、ＳＷ６２０、ＳＮＢ−７８、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ５６９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ｍｘ−１、ＭｅＷｏ、ＰＣ−３、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ｓｕｉｔ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７、Ｍ２４ｍｅｔ、Ｌｏｘ、ＬｏＶｏ、Ｋｙｓｅ  ３０、Ｊｕｒｋａｔ、ＩＧＲＯＶ−１、ＨＴ２９、Ｈｓ７４６Ｔ、Ｈｓ６８、ＨＬ６０、ＦａＤｕ、ＥＢＣ−１、ＤＵ  １４５、ＤＬＤ−１、ＣＯＬＯ  ２０５、Ｃａｌｕ  ６、Ｃａｌｕ  ３、ＢＴ４７４、ＡＧＳ、Ａ５４９、Ａ−４３１、Ａ２７８０、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＭｉａＰａＣａ−２、ＭＥ−ＳＡのうちの少なくとも１つ以上、例えば５、１０、２０、３０、４０、５０個以上、または、例えばすべてを含み得る。上述したがん細胞株は、例えば、ＡＴＣＣ、または例えば、ＤＳＭＺ（Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ）から入手し得て、それぞれの細胞株の各々について確立された方法に従って培養され得る。上述した少なくとも１つのホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料またはＦＦＰＥ腫瘍組織試料を含む組織アレイまたは腫瘍組織アレイは、例えば、Nat Med. 1998 Jul;4(7):844-7に記載されるプロトコールに従って製造され得る。
【００９２】
一実施形態によれば、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料、またはホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋腫瘍組織試料は、がん、Ｔ細胞機能不全、急性もしくは慢性感染のリスクがあるまたはそれらに罹患している対象、または腫瘍免疫を示している対象に由来する。本発明の方法に使用されるがんという用語は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける生理学的状態を指しまたはそれを記述し、これは典型的には、生体の他の部分に侵入または拡散する可能性を伴う無秩序な細胞成長／増殖によって特徴付けられる。がんの例としては、限定されないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、切除不能な中皮腫、乳がん、胃の腺癌またはＧＥＪ、胃、胸腺腫、卵巣がん、腺様嚢胞癌、転移性腺様嚢胞癌、膀胱がん、明細胞腎臓がん、頭頸部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）またはトリプルネガティブ乳がん、リンパ球増殖性障害、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄性白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、または扁平上皮頭頸部がん（ＳＨＮＣ）が挙げられる。上記のがんのタイプは、例えば悪性腫瘍とも呼ばれ得る。上述した本発明の方法に使用される「Ｔ細胞機能不全」という用語は、ＣＤ８Ｔ細胞の病理学的状態を指し、それは、例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の厳密に制御された分化プロセスの変化が起こると生じ得、例えば、抗原遭遇の性質、状況および持続時間の変化は、Ｔ細胞の枯渇、寛容、アネルギーまたは老化とも呼ばれ得るＴ細胞活性化および分化プロセスにおける実質的な変化をもたらし得る。本発明の方法に使用される急性感染症という用語は、細菌、ウイルスまたは寄生虫によって引き起こされる急性感染症を指し、例えば、診断の約１、２、３、または４週間前に発症している。本発明の方法に使用される「慢性感染症」という用語は、病原体が迅速に排除されるのではなく、むしろ長期間、例えば３、４、５、６、７、８、９、または１０週間以上、持続するような状況を指す。持続的な病原体曝露は、慢性的な抗原刺激および持続的な炎症をもたらし得、それは病原体特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇および／またはクローン喪失をもたらす場合がある。慢性感染症は、例えば、ウイルス感染、例えばＡ型肝炎、Ｃ型肝炎もしくはＤ型肝炎、ＨＩＶ感染、または例えば未治療の場合は、髄膜炎菌、淋菌、バルトネラ・ヘンセラ、ボレリア・ブルグドルフェリ、サルモネラ種、ブルセラ種、カンピロバクター種、マイコバクテリア種、梅毒トレポネーマ、またはコクシエラ・ブルネチイによる感染であり得る。一実施形態では、ＦＦＰＥ組織試料、またはＦＦＰＥ腫瘍組織試料は、���瘍免疫によって特徴付けられるまたはそれを有する対象、例えばヒトに由来する。本発明の方法に使用される「腫瘍免疫」という用語は、腫瘍が免疫認識および排除を回避するプロセスを指す。腫瘍由来または腫瘍関連因子は、樹状細胞分化に影響を及ぼし、最終的に腫瘍免疫をもたらす抗原提示機能を有する細胞の発生を妨げると考えられている。内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）、特に腫瘍特異的内因性レトロウイルス（ＴＥＲＶ）の発現はまた、例えば腫瘍免疫に関与している。腫瘍免疫に寄与する可能性がある他の因子は、例えば遺伝子増幅ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）およびＡＬＯＸ１２Ｂ／１５Ｂであり、または抗原提示（例えば腫瘍関連新生抗原）の喪失をもたらすもしくは外因性アポトーシスの遮断をもたらす、遺伝子Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、またはＣＡＳＰ８のいずれかにおける突然変異である。
【００９３】
一態様では、本発明は、悪性腫瘍に罹患している哺乳動物、好ましくはヒトが、哺乳動物、例えば、それを必要とする個体、例えば、がん、Ｔ細胞機能不全、急性もしくは慢性の感染症または腫瘍免疫を有するまたはそのリスクがあるヒト、あるいは例えば、悪性腫瘍を患っているがん患者由来の試料における、配列番号１に含まれるエピトープ、または、例えば、配列番号１９〜配列番号１０８、例えば配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７のいずれかに含まれるエピトープの存在または非存在の検出を含む、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体を用いた治療のための有望な候補であることを予測する方法を提供し、本方法は、例えばフローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、または好ましくは本発明の抗体を用いた免疫組織化学を含み、ここで、試料中の、例えば、約０．２５％、０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、もしくは１０．０％より多くの、または約０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％から、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％未満の、または例えば、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％から、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％未満の、または約０．２５％、０．５％、０．７５％、１％から、約１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９％、９．５％もしくは１０％未満の、または約０．２５％から、約０．５％、０．７５％、１％未満の細胞において、配列番号１に含まれるエピトープ、または例えば、配列番号１９から配列番号１０８のいずれかに含まれるエピトープの検出は、患者が、免疫チェックポイント阻害剤による治療、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による治療、または抗ＰＤ−１抗体による治療に応答する可能性があることを示す。本明細書で使用される「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、当該技術分野においてその一般的な意味を有し、シグナル（刺激チェックポイント分子）を上昇させるまたはシグナル（阻害チェックポイント分子）を低下させるという点でＴ細胞によって発現される分子を指し、例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８シグナル伝達経路はともに、当該技術分野において免疫チェックポイント経路を構成するものとして認識されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264を参照されたい）。例えば、上述した本発明の方法を用いて免疫チェックポイント阻害剤による治療の可能性がある候補として同定されている、患者に投与され得る抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アヴェルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブが挙げられ、または例えば、抗ＰＤ−１抗体としてはペンブロリズマブ、ニボルマブ、もしくはＰｆ−０６８０１５９１などが挙げられる。
【００９４】
本発明による試料中のＰＤ−Ｌ１陽性細胞は、例えば、腫瘍細胞、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの免疫細胞（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、もしくはＢ細胞）が含まれ得る。例えば、上述したＦＦＰＥ腫瘍組織試料を得たまたはそれに由来した腫瘍タイプに応じて、試料中のＰＤ−Ｌ１陽性細胞の相対存在量を決定するための異なる方法（スコアリング方法）を使用することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞を検出するために本発明の抗体を使用する上述したような免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、ＰＤ−Ｌ１スコアリングは、試料中のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の相対存在量、もしくはＰＤ−Ｌ１陽性ＴＩＬの相対存在量を決定し、または例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞およびＴＩＬの組み合わせた相対存在量を決定することを含み得る。試料中の細胞の総数、またはＰＤ−Ｌ１陽性細胞の数を決定するために使用されるその任意のサブ画分は、例えば、細胞核および細胞質を可視化するためにヘマトキシリンを使用して試料を対比染色することによって、または例えば、蛍光検出法を使用する場合は、細胞核を可視化するために４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を使用することによって得ることができる。本発明の方法に使用される「ＰＤ−Ｌ１陽性細胞」という用語は、本発明の抗体が特異的に結合し、次に、本発明の抗体に特異的に結合し、対応する基質（例えば、上述される）と反応させた場合に発色または蛍光検出を可能にする、例えば、ＨＲＰ−またはＡＰ−結合した二次抗体で検出され得る、配列番号１のアミノ酸配列に含まれるエピトープを検出可能に発現する細胞を指す。例えば、ＨＲＰ結合した二次抗体を使用して、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞を標識するための基質としてＤＡＢとともにインキュベートされ得る。ＰＤ−Ｌ１陽性細胞のスコアリングは、例えば、分析されるＦＦＰＥ腫瘍組織試料（または例えばその任意のサブ切片）中のＰＤ−Ｌ１陽性細胞の数および細胞総数を決定するために、個々の細胞または核を計数することを含み得る。あるいは、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞およびヘマトキシリン染色細胞の表面積は、例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞の相対存在量を決定するために使用され得る。
【００９５】
一態様では、上述した本発明による方法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による治療のための可能性がある候補を同定するために使用され得る。本発明による悪性腫瘍は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、切除不能な中皮腫、乳がん、胃の腺癌またはＧＥＪ、胃、胸腺腫、卵巣がん、腺様嚢胞癌、転移性腺様嚢胞癌、膀胱がん、明細胞腎臓がん、頭頸部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）またはトリプルネガティブ乳がん、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄性白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、または扁平上皮頭頸部がん（ＳＨＮＣ）のうちの１つであり得る。
【００９６】
本発明の一態様によれば、本発明の方法を使用して、以下の抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるアヴェルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＬＹ３０００５４、ＢＭＳ−９３６５５９、または抗ＰＤ−１抗体であるペンブロリズマブ、ニボルマブ、もしくはＰｆ−０６８０１５９１のうちの１つにより、可能性がある候補（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤による治療に反応するがん患者）を同定または予測し得る。例えば、それを必要とする個体、例えば、ヒトがん患者、または例えば、上述した悪性腫瘍に罹患しているヒト患者、またはがんを有するリスクがあるヒトは、上記の本発明の方法を適用することによって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えばアヴェルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＬＹ３０００５４、ＢＭＳ−９３６５５９のうちの１つ、または抗ＰＤ−１抗体、例えばペンブロリズマブ、ニボルマブ、もしくはＰｆ−０６８０１５９１のうちの１つによる治療について可能性がある候補であることが見出され、約０．１ｍｇ／ｋｇから、約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２７．５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４２．５ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、または例えば１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇの投薬量で、単独でまたは他の抗がん剤と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるアヴェルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、または例えば抗ＰＤ−１抗体、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、またはＰｆ−０６８０１５９１は、例えば、固定（flat）投薬レジメンで上述した本発明の方法を適用することによって同定されている可能性がある候補に投与され得る。例えば、アヴェルマブは、毎週５００〜８００ｍｇ、例えば、毎週約６００ｍｇ〜７５０ｍｇ、または例えば、毎週約６５０〜８５０ｍｇ、または例えば、毎週約７００〜９００ｍｇ、または例えば、毎週５２５ｍｇ、毎週５５０ｍｇ、毎週６００ｍｇ、毎週６２５ｍｇ、毎週６５０ｍｇ、毎週７００ｍｇ、毎週７２５ｍｇ、毎週７５０ｍｇ、または例えば２週間毎に約９００〜約１６００ｍｇ、例えば、２週間毎に約１０００ｍｇ〜約１５００ｍｇ（ｑ２ｗ）、または約１２５０ｍｇ〜約１４００ｍｇ  ｑ２ｗ、または約１０００ｍｇ  ｑ２ｗ〜約１２５０ｍｇ  ｑ２ｗ、例えば、９２５ｍｇ  ｑ２ｗ、９５０ｍｇ  ｑ２ｗ、１０００ｍｇ  ｑ２ｗ、１１２５ｍｇ  ｑ２ｗ、１２００ｍｇ  ｑ２ｗ、１２５０ｍｇ  ｑ２ｗ、１３００ｍｇ  ｑ２ｗ、１３５０ｍｇ  ｑ２ｗ、１４００ｍｇ  ｑ２ｗ、１４５０ｍｇ  ｑ２ｗ、１５００ｍｇ  ｑ２ｗ、１５５０ｍｇ  ｑ２ｗ、または例えば、３週間毎に約１２５０〜２４００ｍｇ（ｑ３ｗ）、または約１５００ｍｇ��約２２５０ｍｇ  ｑ３ｗ、または約１７５０ｍｇ〜約２０００ｍｇ  ｑ３ｗ、または約１８００ｍｇ〜約２３００ｍｇ  ｑ３ｗ、または約１２５０ｍｇ〜約１７５０ｍｇ  ｑ３ｗ、または約１３００ｍｇ〜約１５００ｍｇ  ｑ３ｗ、または例えば１５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１３５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１４５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１５５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１６５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１７５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１８００ｍｇ  ｑ３ｗ、１８５０ｍｇ  ｑ３ｗ、１９００ｍｇ  ｑ３ｗ、１９５０ｍｇ  ｑ３ｗ、２０００ｍｇ  ｑ３ｗ、２１２５ｍｇ  ｑ３ｗ、２２５０ｍｇ  ｑ３ｗ、２３５０ｍｇ  ｑ３ｗの固定投薬レジメンで投与され得る。上記で使用される「ｍｇ／ｋｇ」という用語は、それぞれの抗体による治療を受けることになる患者の体重１ｋｇあたりの抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体のミリグラム数を指す。本明細書で使用される「ｑ２ｗ」および「ｑ３ｗ」という用語は、２週間毎または３週間毎の投与を示すものである。上記で使用される「ｍｇ／ｋｇ」という用語は、体重１キログラムあたりの抗ＰＤ−Ｌ１（または例えば抗ＰＤ−１）抗体のミリグラム数を指す。
【００９７】
一態様によれば、本発明は、悪性腫瘍に罹患している患者が抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体による治療に対して可能性がある候補であると予測するための本発明の方法における本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。例えば、本発明の抗体または抗原結合断片を免疫組織化学に使用して、ＦＦＰＥ腫瘍組織試料中のＰＤ−Ｌ１発現を検出し、続いて試料をＰＤ−Ｌ１発現の目視評価（スコアリング）に付してＰＤ−Ｌ１陽性細胞、例えば腫瘍細胞、または上述したＴＩＬの数を決定することができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片はまた、例えば、ＴＩＬを標識するための二色免疫蛍光法に使用され得る。例えば、二色蛍光は、本発明の抗体、および抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ６８抗体、抗グランザイムＢ抗体または抗ＦｏｘＰ３抗体のうちの１つを含み得、本抗体は、本発明の抗体とＴＩＬ特異的抗体の両方の検出を可能にするために、異なる種に由来する。二重免疫蛍光法は、例えば、市販のキットを用いて、例えば、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰ  ＩＨＣ検出システム、およびその後のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ）キットを用いて、製造業者の指示に従って実施され得る。ＰＤ−Ｌ１陽性細胞のスコアリングは、例えば、上述したように行われ得、または例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞（例えば、ＴＩＬ、マクロファージ）に基づくＩＨＣスコア、またはＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍と免疫細胞の合計スコアを割りあてることを含み得、例えば、０、１、２、または３のＩＨＣスコアは＜１％のＰＤ−Ｌ１陽性細胞（ＩＨＣスコアは０である）に対応し、＞１％であるが＜５％（ＩＨＣスコアは１である）、＞５％であるが＜１０％（ＩＨＣスコアは２である）、または＞１０％（ＩＨＣスコアは３である）に対応する。例えば、所与の患者の１を超える試料が上述した本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて上述した本発明のインビトロの方法に供される場合、ＩＨＣスコアは、分析された試料の平均スコアであり得、または例えば、ＩＨＣスコアは、最も高いＩＨＣスコアを有する試料のＩＨＣスコアに対応し得る。ＩＨＣスコアはまた、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いてＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞を総腫瘍細胞のパーセンテージとして、およびＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍浸潤性免疫細胞の両方を腫瘍面積のパーセンテージとしてスコアリングすることによって決定され得る。試料は、例えば、５０％以上の腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１陽性である場合には３であるとスコアリングされ得、５％以上であるが５０％未満の腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１陽性である場合、スコアは２であり；１％以上であるが５％未満の腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１陽性である場合、スコアは１であり；１％未満の腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を発現した場合、スコアは０である。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療に応答する可能性がある候補として同定された患者におけるがんを治療する方法を提供し、これは、上述した本発明の方法を前記患者から得られたまたはそれに由来する試料に適用し、その試料におけるＰＤ−Ｌ１発現を決定することにより、第２のステップでは、その試料におけるＰＤ−Ｌ１の発現と参照試料におけるＰＤ−Ｌ１発現とを比較し、第３のステップでは、前記患者の試料におけるＰＤ−Ｌ１発現が増加しまたは特定の閾値を上回ることが見出された場合に免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体を前記患者に投与することによる方法を提供する。本発明の治療方法において使用される「閾値」という用語は、例えば、上述した本発明の方法によって決定される参照試料と比較した、患者由来の試料におけるＰＤ−Ｌ１発現の相対存在量を指す。例えば、閾値は、参照試料と比較した患者試料中のＰＤ−Ｌ１陽性細胞の相対的増加として定義され得、または例えば、前記試料中のＰＤ−Ｌ１陽性細胞の絶対数もしくは相対数として定義され得、例えば、試料中の細胞の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、７５％、８０％、＞１％、＞５％、＞１０％、＞２０％、＞５０％、＞７５％、＞８０％であり得、または例えば、閾値は、上述したＩＨＣスコアもしくはスコアリング法に基づくことができる。本発明の治療方法において使用される参照試料は、例えば、がんに罹患しておらず、上述した本発明の抗体または抗原結合断片を用いたＰＤ−Ｌ１発現を検出する同方法に供される健康なドナーに由来し得、例えば、ＦＦＰＥ組織試料のＩＨＣである。例えば、参照試料は、患者から得られた試料として対応する組織および位置から得ることができ、好ましくは前記患者からの試料と並行して処理される。参照試料はまた、例えば、それが罹患していない領域または位置から得られる場合、腫瘍組織試料と同じ組織または臓器に由来し得、または例えば、参照試料は反対側の健康な臓器に由来し得る。例えば、本発明の治療方法に従って患者に投与され得る抗ＰＤ−Ｌ１には、アヴェルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブが含まれ、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えばペンブロリズマブ、ニボルマブ、またはＰｆ−０６８０１５９１である。本発明の治療方法では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体、例えばアヴェルマブは、上述したように投与され、例えば、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、または例えば５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２７．５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、抗体は週１回（ｑ１ｗ）投与される。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アヴェルマブ）はまた、上述した毎週または２週間毎または３週間毎に固定用量として、例えば、毎週５００〜８００ｍｇ、または２週間毎に９００〜１６００ｍｇ、または３週間毎に１２５０〜２４００ｍｇの固定用量で投与され得る。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明に使用される「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純粋であり、汚染物質がない、例えばタンパク質および／または脂質がないポリヌクレオチドを指す。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本発明の抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つの単離されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、本発明の抗体の軽鎖をコードする配列番号１７の１つのポリヌクレオチド配列、および本発明の抗体の重鎖をコードする配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。使用される発現系に応じて、配列番号１７および配列番号１８のポリヌクレオチド配列は、本発明のポリヌクレオチドのより良好な発現を可能にするようにコドン最適化され、それぞれの発現系において本発明の抗体のより高い収率をもたらし得る。コドン最適化は、例えば、Nucleic Acids Res. 1988 Mar 11;16(5):1715-28、Nucleic Acids Res. 1988 Sep 12;16(17):8207-11、Methods Cell Biol. 1991;36:675-7において公開されている利用可能なコドン使用表を用いて、または例えば、Bioinformatics. 2014 Aug 1;30(15):2210-2に公開されているものなどの利用可能なコンピュータに埋め込まれたコドン最適化ツールを用いて行うことができる。少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドのコドン最適化は、使用されるそれぞれの発現系、例えば、マウスもしくはヒトの細胞株、酵母または昆虫の細胞株を考慮して行われ得る。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本発明による用語「発現ベクター」は、遺伝子発現制御配列、例えば、少なくとも１つのポリペプチド、例えば、配列番号１７および／または配列番号１８をコードするヌクレオチド配列に対して５’から３’方向に作動可能に連結されたプロモーターまたはプロモーター成分を含む核酸ベクターを指す。例えば、本発明による発現ベクターは、配列番号１７もしくは配列番号１８のポリヌクレオチドを含み得、または配列番号１７と配列番号１８の両方のポリヌクレオチドを含み得る。原核生物における発現に必要な核酸配列には、プロモーター、リボソーム結合部位、場合によりオペレーター配列および可能であれば他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１ａ、またはＣＡＧプロモーター、ならびにしばしばエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用する。例示的な哺乳動物発現ベクターは、ｐＣＭＶ、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ、ｐｃＤＮＡ、または例えばNat Commun. 2010 Nov 16;1:120に記載されるプラスミドベースの多重遺伝子発現系、または、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片のウイルス発現が意図される場合、ｐＬＫＯ．１−ｈｙｇｒｏ、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ、ｐＢＡＢＥ−ｚｅｏ、ｐＬｅｎｔｉ  ＣＭＶ／ＴＯ  ｚｅｏ  ＤＥＳＴ、ｐＣＷ５７．１である。場合により、真核生物の発現ベクターは、バイシストロン性発現構築物を提供する本発明のポリヌクレオチド配列間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み、１つの発現ベクターから配列番号１７および配列番号１８の両ポリヌクレオチドの発現を可能にし得る。例えば、使用され得るＩＲＥＳ配列は、PLoS One. 2013 Dec 9;8(12):e82100に公開されているもの、例えば、５’ＡＵＧＡＵＡＡＵＡＵＧＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＵＧを含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドの発現に使用され得る適切な発現ベクターは、ｐＣＭＶベースの発現ベクター、またはｐＤ９１２ベースのベクターおよびその変異体、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）発現ベクター、ｐｃＤＮＡベースの発現ベクター、またはｐＪΩベクター（例えば、Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 4を参照されたい）、またはレトロウイルスもしくはレンチウイルス生成用に使用され得るベクター（例えば、Front Biosci. 1999 Jun 1;4:D481-96を参照されたい）を含み得る。適切な酵母発現ベクターは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのＧＡＬ４、ＰＧＫ、ＡＤＨ１、ＡＤＥ２またはＴＲＰ１プロモーター、例えば、発現ベクターｐＲＳ４２０、ｐＬＥＸ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＴＥＦ１／ｚｅｏ、ｐＡＧ４２５ＧＤＰ−ｃｃｄｂ、ｐＢＥＶＹ−Ｔ、ｐＡＧ３００、ｐＧＢＫ  Ｔ７、ｐＥＺＹ２０２、ｐＣＥＴＴ、ｐＲＧ２０１、ｐＸＰ１２０、ｐＸＰ３２０、ｐ２ＧＬｅｘ、またはｐ４２６ＧＡＬを利用し得る。例えば、上述した本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、本発明のポリヌクレオチドのバキュロウイルス発現に使用するためのポリヘドリンプロモーターを含む発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤＵＡＬ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、またはＡ���ＮＰＶを用いて、昆虫細胞中で発現させ得る。好ましい態様では、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
【０１０１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１５および配列番号１６のアミノ酸配列を含む本発明の抗体の生成における本発明による発現ベクターの使用に関する。例えば、配列番号１５および配列番号１６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む本発明による少なくとも１つのベクターは、一過性発現系を用いて、本発明の抗体を発現させ得る。例えば、Methods. 2014 Jan 1;65(1):5-10に開示されている一過性発現系を使用し得る。本発明による本発明の発現ベクターまたは少なくとも１つの発現ベクターはまた、例えば、本発明の抗体を発現する安定な細胞株の生成に使用され得る。例えば、安定な細胞株を開発するためのプロセスは、例えば、本発明の発現ベクター、または少なくとも１つの本発明の発現ベクター、例えば、２つの発現ベクターを用いた適切な宿主細胞のトランスフェクションから開始することができ、この２つの発現ベクターのうちの第１のベクターは、配列番号１７のポリヌクレオチドを含み、第２の発現ベクターは、配列番号１８のポリヌクレオチドを含む。抗体の軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む発現ベクターによるトランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞を本発明の抗体の発現を可能にする２４時間〜７２時間の適切な増殖条件でインキュベートし、増殖回復、無血清懸濁液への適応、ならびに増幅およびクローン選択の後に本発明の抗体の高い生産性を有する細胞をスクリーニングし得る。
【０１０２】
例えば、本発明の発現ベクター、または配列番号１７および／もしくは配列番号１８のポリヌクレオチドを含む本発明の少なくとも１つの発現ベクターは、上述した本発明の抗体を生成または製造するために使用され得る。例えば、配列番号１７および／または配列番号１８の配列を含む本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、上述した本発明の抗体の発現のための少なくとも１つの適切な宿主細胞をトランスフェクトするために使用され得る。例えば、配列番号１７および配列番号１８の本発明のポリヌクレオチドは、１つの発現ベクターに含まれていてもよく、または例えば、本発明の抗体の生成においてともに使用される２つの別個の発現ベクターに含まれ得る。
【０１０３】
配列番号１７および配列番号１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを発現させるための少なくとも１つの適切な宿主細胞に形質導入するために、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターにおいて使用され得る。
【０１０４】
例えば、本発明の抗体の製造または生成のために、配列番号１５の軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、および配列番号１６の重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、２つの別個の発現ベクターに含まれ得、そのため、両方の発現ベクターは、本発明の抗体の製造または生成のために、適切な宿主細胞にトランスフェクトされなければならない。使用されるトランスフェクション方法は、例えば、利用する宿主細胞株に依存し得る。哺乳動物細胞にベクターＤＮＡを安定的に導入するための様々なトランスフェクション方法が開発されていて、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、カチオン性脂質ベースのリポフェクション、およびポリマーまたはデンドリマーベースの方法が挙げられる。一例では、本発明の発現ベクター、または本発明による少なくとも１つの発現ベクターは、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞を使用するリコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）に使用され、例えば、Biotechnol Prog. 2015 Nov-Dec;31(6):1645-56に記載される方法に従って、本発明の抗体を製造するための安定な細胞株を生成し得る。
【０１０５】
一実施形態によれば、本発明は、上述した少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。例えば、本発明による宿主細胞は、配列番号１７および配列番号１８のアミノ酸配列を含む本発明の抗体をコードする、上述した少なくとも１つの発現ベクターを含み得る。例えば、宿主細胞は、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする上述した１つの発現ベクター、および配列番号１８のアミノ酸配列をコードする上述した第２の発現ベクターを含み得る。発現ベクターは、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えばＧ４１８、ゼオシン、ブラスチシジン、ハイグロマイシンＢ、ミコフェノール酸、またはピューロマイシンを含み得る。本発明の抗体はまた、例えば、本発明の１を超える発現ベクターによってコードされ得、その各々は、各発現ベクターの少なくとも１つでトランスフェクトされている宿主細胞の選択を可能にするために、異なる選択マーカーを含み得る。例えば、本発明が配列番号１７のポリヌクレオチドを含む場合の第１の発現ベクターはｎｅｏＲ遺伝子を含み得、第２の本発明の発現ベクターは、ブラスチシジンに対する耐性を付与するｂｓｄ遺伝子を含み得る。したがって、本発明の両方の発現ベクターを含む宿主細胞は、Ｇ４１８およびブラスチシジンに対する耐性を付与し、両方の抗生物質を含有する増殖培地中で選択され得る。一態様では、本発明による宿主細胞は、例えば、少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの選択マーカーを含む、配列番号１５および配列番号１６のポリヌクレオチドのウイルス形質導入によって、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた、上述した本発明のポリヌクレオチドを含み得る。例えば、一態様では、本発明による宿主細胞は、例えば、少なくとも１つ、２つの異なる選択マーカーとともに、エピソームとして配列番号１５および配列番号１６の本発明のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１０６】
例えば、本発明による宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞であり得る。例えば、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドまたは上述した本発明による発現ベクターを含む本発明による宿主細胞は、本発明によるベクターを含み得る任意のタイプの細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば植物、動物、真菌、もしくは藻類（例えば、海洋性珪藻（Phaeodactylum tricornutum）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii））であり得、または原核細胞、例えば細菌もしくは原虫であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち生物、例えばヒトから直接単離されたものであり得る。宿主細胞は、例えば、接着細胞または懸濁細胞、すなわち懸濁状態で増殖する細胞であり得る。本発明による宿主細胞としては、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌラ・ピリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュバニオマイセス・ オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、クルベロマイセス・ ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）、または例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、Ｈｉ５、もしくはＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞、または例えば、ＤＨ５α大腸菌（E. coli）が挙げられる。好ましくは、本発明による宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＮＳ０、ｐｅｒ．Ｃ６、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ−１、Ｃｏｓ−７、ＰＣ−１２、３Ｔ３、Ｖｅｒｏ、ｖｅｒｏ−７６、ＰＣ３、Ｕ８７、ＳＡＯＳ−２、ＬＮＣＡＰ、ＤＵ１４５、Ａ４３１、Ａ５４９、Ｂ３５、Ｈ１２９９、ＨＵＶＥＣ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｃａｃｏ−２、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＢＨＫ、ＡＧＥ１．ＨＮ、Ｎａｍａｌｗａ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、ＨｅｐＧ２、Ｌ−９２９、ＲＡＢ−９、ＳＩＲＣ、ＲＫ１３、１１Ｂ１１、１Ｄ３、２．４Ｇ２、Ａ−１０、Ｂ−３５、Ｃ−６、Ｆ４／８０、ＩＥＣ−１８、Ｌ２、ＭＨ１Ｃ１、ＮＲＫ、ＮＲＫ−４９Ｆ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＲＭＣ、ＣＶ−１、ＢＴ、ＭＤＢＫ、ＣＰＡＥ、ＭＤＣＫ．１、またはＭＤＣＫ．２、Ｄ−１７のうちの１つである。
【０１０７】
一実施形態によれば、本発明は、本発明の抗体、例えば、配列番号１５（軽鎖）および配列番号１６（重鎖）のアミノ酸配列を含む本発明の抗体、の製造における、上述した本発明の宿主細胞の使用を提供する。例えば、本発明の抗体の製造における本発明による宿主細胞の使用は、本発明の抗体の発現を可能にする適切な条件下で、配列番号１５および／または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの発現ベクターまたはポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの宿主細胞を培養することを含み得る。一例では、本発明の少なくとも１つの宿主細胞は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれた、ポリヌクレオチドの発現に必要とされる調節配列を含む配列番号１７および配列番号１８のポリヌクレオチドを含む。
【０１０８】
例えば、本発明の少なくとも１つの宿主細胞、例えば、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個の細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃にて、１０％ＣＯ２雰囲気において、または例えば、その後の単離および精製を補助するために無血清培地中で、例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地もしくはＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地中で増殖させることができる。例えば、本発明の少なくとも１つの宿主細胞が上述した昆虫細胞である場合、Ｇｒａｃｅの昆虫培地、ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ（登録商標）ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、もしくはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することができ、または本発明の少なくとも１つの宿主細胞が酵母細胞である場合、ＹＮＭ培地、ＹＰＤブロス、もしくは例えば、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することができる。例えば、適切な増殖条件は、本発明の少なくとも１つの宿主細胞を１２〜４０８時間、例えば、約１２〜約４００時間、例えば、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間から、約１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間、２８８時間、３１２時間、３３６時間、３６０時間、３８４時間、４０８時間の間、増殖させることを含み得る。続いて、上述した本発明の抗体または抗原結合断片は、単離および精製され得る。例えば、本発明の抗体または抗原結合断片は、クロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、限外濾過、またはプロテインＡセファロースを用いた精製、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (1997) 11.11.1-11.11.5に記載されているものによって精製および単離され得る。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものである。それらは、本発明の主題または範囲をそれに限定することを意図しない。
【０１１０】
[実施例１]
抗体生成
ＰＤ−Ｌ１のＫＬＨ結合カルボキシ末端ペプチド（配列番号１、ＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ）に対して指向される本発明のモノクローナルウサギ抗体は、マウスモノクローナル抗体と同じモノクローナル抗体を作製するための同じ基本原理を用いて生成された。簡単には、本発明のウサギモノクローナル抗体の生成は、４段階の手順に従った：
１）ウサギの免疫化およびポリクローナル血清のスクリーニング。
２）ハイブリドーマ細胞を生成するための融合およびマルチクローンの上清のスクリーニング。
３）Ｃ．サブクローニングおよびサブクローンの上清のスクリーニング。
４）ＨＥＫ−２９３細胞における組換え抗体のクローニングおよび産生。
【０１１１】
マルチクローン、サブクローンおよび組換え抗体の上清は、酵素結合免疫吸着検定法によって、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１抗原への結合についてスクリーニングされた（図１）。最初のスクリーニングは、１つの抗体クローンＭＫＰ１Ａ０７３１０の同定をもたらし、次に、ＦＦＰＥ組織切片上のウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によりさらに特徴付けた。
【０１１２】
[実施例２]
ウェスタンブロッティングによる抗体の特徴付け
抗体クローンＭＫＰ１Ａ０７３１０は、細胞株Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＰＤ−Ｌ１ノックダウンＭＤＡ−ＭＢ２３１、およびヒトＰＤ−Ｌ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３（＝ＨＥＫ２９３＿ＰＤＬ１）細胞株の溶解物についてウェスタンブロッティングにより分析して、その特異性を評価した。Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄの細胞バンクからのＡ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞株を賦活化した。ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞におけるヒトＰＤ−Ｌ１のノックダウンは、ＰＤ−Ｌ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａで行われた。ポリクローナル抗体である抗ＣＤ２７４（Ａｂｃａｍ、カタログ番号５８８１０）をＰＤ−Ｌ１（＝ＣＤ２７４）の検出のための陽性対照抗体として用いた。一次ウサギ抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合したヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１０７６）を用いて検出した。ウェスタンブロットは、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ、ＵＳＡ）を用いてスキャンされた。
【０１１３】
ウェスタンブロッティングは、ＰＤ−Ｌ１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３、ＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１のｓｉＲＮＡ  ＰＤＬ１ノックダウン、およびＰＤ−Ｌ１低細胞株Ａ５４９の細胞溶解物について行われた。ウェスタンブロットは、ＰＤ−Ｌ１の特異的標識を示し、それはｓｉＲＮＡ  ＰＤ−Ｌ１ノックダウンＭＤＡ−ＭＢ２３１において減少した（図２参照）。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＭＷが約４０ｋＤａである。高程度のグリコシル化のために、グリコシル化されたＰＤ−Ｌ１のＭＷは約５２ｋＤａである。ポリクローナル陽性対照抗体（抗ＣＤ２７４、１：２５０に希釈）は、特異的な５２ｋＤａバンドに加えていくつかのバンドを示し、この抗体がＰＤ−Ｌ１に対して低い選択性を有することを示している。ポリクローナル抗体と比較して、モノクローナル組換え抗体は非常に選択的である。
【０１１４】
[実施例３]
抗体クローニング
本発明のクローンＭＫＰ１Ａ０７３１０のハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡは、製造業者の推奨に従ってＴｕｒｂｏＣａｐｔｕｒｅキット（Ｑｉａｇｅｎ：カタログ番号７２２３２）を用いて単離し、オリゴ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写された。重鎖の可変領域（ＶＨ）は、独自のＥｐｉｔｏｍｉｃｓプライマーＯＹＺ６４−２およびＯＹＺｖｈ３を用いてＰＣＲ増幅された。全軽鎖（ＬＣ）は、独自のプライマーＯＹＺ６２およびＯＹＺ７１を用いてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ断片のＶＨ領域は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用いて消化された。ＬＣ  ＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。制限消化後、得られた断片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（カタログ番号２８０１６）を用いて精製され、得られた精製されたＶＨおよびＬＣ断片は、対応する重鎖または軽鎖に独自のｐＴＴ発現ベクターに連結され、コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（ＭＣ  Ｌａｂ、カタログ番号ＤＡ−１００）に形質転換された。得られた細菌コロニーを選び出し、対応する制限酵素を用いて挿入物を確認した（予想サイズ：ＶＨについては約４４０ｂｐ、ＬＣについては７４０ｂｐ）。予想サイズの挿入物を有するプラスミドは、ＴＴ５特異的な配列決定プライマーを用いて配列決定された。配列確認後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて対応するベクターから全軽鎖および重鎖断片を切り出し、続いてＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製した。
【０１１５】
[実施例４]
抗体特異性の評価
本発明の抗体であるＭＫＰ１Ａ０７３１０および抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０がヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することを証明するために、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を用いたｓｉＲＮＡ実験を行った。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞について、この細胞株が高いベースラインＰＤ−Ｌ１発現を有することが示されている（例えば、Cancer Immunol Res. 2014 April;2(4): 361-370を参照されたい）。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の免疫組織化学的染色は、試験された両方の抗体がＰＤ−Ｌ１を特異的に認識し、それに結合することを示した（図３参照）：ｓｉＲＮＡ１またはｓｉＲＮＡ２のトランスフェクションでは、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体染色は強く減少した（図３参照、「ＰＤＬ１＿ＳＰ＋」、「ＰＤＬ１＿ＳＰ」）。両抗体の結合特異性のこの最初の決定は、本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０（例えば、０．２μｇ／ｍｌの濃度で）について観察される同等の染色強度をもたらすためにはより高い抗体濃度（５μｇ／ｍｌ以上）が必要とされるため、ＭＫＰ１Ｂ１９６１０はそれほど感受性ではないことをすでに示した。
【０１１６】
免疫組織化学による本発明の抗体クローンＭＫＰ１Ａ０７３１０の特異性の評価について、公知のＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を有する陽性および陰性対照組織から作製された組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用した。組織マイクロアレイの構築について、異なるＰＤ−Ｌ１発現レベルを有するヒト正常組織および腫瘍組織を選択した。ＰＤ−Ｌ１の発現は、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて、ヒト臓器の凍結組織マイクロアレイ（ＢｉｏＣｈｉｐ、Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ  ＧｍｂＨ）および凍結ヒト腫瘍上で以前に分析された。ＰＤ−Ｌ１陽性および陰性の正常ヒト組織のパラフィンブロックをＰｒｏｖｉｔｒｏ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。高いまたは低いＰＤ−Ｌ１発現を有する選択された患者から、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍の対応するパラフィンブロックをＩｎｄｉｖｕｍｅｄ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。各パラフィンブロックから直径１．５ｍｍの２つのパンチを取り出し、接着テープ上に直立にして載せ、流動パラフィン中に組み込んだ（例えば、図７参照）。
【０１１７】
ＦＦＰＥ組織における免疫組織化学または組織／細胞株アレイ
３μｍのＦＦＰＥ組織の切片または組織／細胞マイクロアレイは、正に帯電したＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に載せられた。免疫組織化学的染色手順は、切片の脱パラフィン処理から始まり、染色装置Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）、またはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＵＳＡ；下記の図を参照）を用いて行われた。脱パラフィン処理後、切片をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８中でエピトープ賦活化のために加熱した。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素（ＯｍｎｉＭａｐ（商標）キットの一部、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中のインキュベーションによりブロックした。切片をＰＢＳで希釈した抗体とともにインキュベートし、次に、二次抗体、ＯｍｎｉＭａｐキットのＨＲＰ結合ポリマーとともに、１６分間、３７℃でインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２反応を触媒して、可視化することができる不溶性の暗褐色の沈殿物を生成する。モノクローナルウサギＩｇＧ抗体を陰性対照として使用した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。スライドを水道水で洗浄し、脱水し、恒久的な封入剤Ｅｎｔｅｌｌａｎ（登録商標）Ｎｅｕ（ＶＷＲ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にガラス製のカバーガラスを付けて載せた。
【０１１８】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）装置における免疫組織化学的染色手順
ＦＦＰＥ組織の免疫組織化学的染色のために、以下のステップに従って、以下のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）プラットフォーム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用した：カタログ番号７５０−２００、７５０−８００、カタログ番号Ｆ−ＤＩＳＸＴ−７５０−０００。
【０１１９】
組織／プローブ：ヒト組織、インビトロでのがん細胞株、
保存：ＦＦＰＥ（４％パラホルムアルデヒドｐＨ７、パラフィン包埋）
切片厚：ＦＦＰＥ組織の場合は３μｍ
１．切片の焼成および脱パラフィン処理
７５℃で８分間のスライドの焼成
７５℃で８分間のスライドの脱パラフィン処理
２．ブロッキング
内因性ペルオキシダーゼのブロッキングはプロテイナーゼ抗原賦活化前であって、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ染色装置における熱抗原賦活化後に行われる
３７℃で３％Ｈ２Ｏ２による内因性ペルオキシダーゼのブロッキング
３．抗原賦活化用の切片の前処理
９６℃で４８分間、標準ＣＣ１（Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８）
４．一次抗体とのインキュベーション
一次抗体：ＰＤＬ１（本発明の抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０）
会社：Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ
カタログ番号：ＭＫＰ−１Ａ−７３−１０
アイソタイプ：ウサギモノクローナル組換え
クローン：ＭＫＰ１Ａ０７３１０
希釈または濃度：１〜２μｇ／ｍｌ
３７℃で３２分間のインキュベーション
一次抗体の陰性対照：ウサギｍＡｂ  ＩｇＧアイソタイプ対照、クローンＤＡ１Ｅ（ＮＥＢ、＃３９００）
５．二次抗体とのインキュベーション
二次抗体：ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰの抗ウサギＩｇＧ
会社：Ｖｅｎｔａｎａ
カタログ番号：７６０−４３１１
希釈：ＶＭＳＩディスペンサー（不明）
３７℃で１６分間のインキュベート
６．使用した三次抗体または検出キットとのインキュベーション
抗体／キット：
ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰ（＃７６０−４３１１、ＶＭＳＩ）、ＣｈｒｏｍｏＭａｐ（＃７６０−１５９、ＶＭＳＩ）
インキュベーション中、温度、およびＣｈｒｏｍｏＭａｐ（ＤＡＢ、赤銅色）の洗浄ステップは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ装置によって設定される。
７．対比染色
３７℃で８分間、ヘマトキシリンＩＩ（＃７９０−２２０８、ＶＭＳＩ）
装置によるブルーイング
【０１２０】
洗浄ステップは図に含まれていない。脱パラフィン処理、抗原賦活化、スライドの洗浄のための試薬は、ＶＭＳＩ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）からのものである。抗体をＰＢＳで希釈する。
【０１２１】
画像分析
免疫組織化学的染色は、ＭｉｒａｘＳＣＡＮ（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスキャンされ、解像度ｘ／ｙは１ピクセル＝０．２３×０．２３μｍ２であった。ＭｉｒａｘＳｃａｎ装置は、スキャンの前に各スライドの明るさを調整する。画像は、ＭｉｒａｘＶｉｅｗｅｒソフトウェアを用いて撮影された。スキャニングは、画像分析ソフトウェアＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＳ）を用いて分析された。生存組織領域は、明らかな壊死領域および結合組織を避けて輪郭が描かれた。
【０１２２】
存在する抗原の量を決定するために、陽性の褐色に染色された面積を生存組織面積の面積％として計算した。抗体染色（任意単位）は、
抗体染色（ＡＵ）＝陽性面積（％）×（２５５−強度）／１００の褐色面積
として算出され、これにより、陽性面積は、陽性面積（％）＝１００×［褐色面積／（褐色面積＋青色面積）］として算出された。強度は、褐色面積の平均グレイ値として設定された（図７Ａ参照、最も右側の画像中の矢印は褐色細胞を示し、中央の画像中の矢印は褐色色素原のソフトウェアベースの検出を示し、右側画像は核および細胞質の青色染色の検出を示す）。
【０１２３】
[実施例５]
ＭＫＰ１Ａ０７３１０およびＭＫＰ１Ｂ１９６１０の実験内および実験間変動
本発明の抗体であるＭＫＰ１Ａ０７３１０および抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０は、それらの結合特性を比較し、さらなる研究のための最適濃度を決定するために、７０個の細胞株からがん細胞株アレイ上のそれぞれ２つの濃度において特徴付けられた。がん細胞株アレイＣＡＸ０９＿７０は、抗体の連続的な結合範囲を示した。細胞株の約５０％において、シグナルはゼロまたは非常に低かった。抗体の最も高い結合はＨｓ７４６Ｔ細胞（Ｍｅｔ増幅細胞株）を示した。抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０は、その濃度を１〜２μｇ／ｍｌに増加させてもわずかにシグナル強度の増加を示しただけであり、これは１μｇ／ｍｌが既に飽和濃度に近いことを示している。抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０は５〜１０μｇ／ｍｌのシグナルの実質的な増加を示した。抗体は１０μｇ／ｍｌを超える濃度で組織およびガラスに非特異的に結合する傾向があるため、より高い濃度で試験しなかった。７０個の細胞株における抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０およびＭＫＰ１Ｂ１９６１０の結合は相関し、ピアソン係数ｒ＝０．９５である。
【０１２４】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ染色装置上の２つの抗体を用いる免疫組織化学的染色の実験内および実験間変動は、６０個の細胞株ＣＡＸ０８＿６０からの細胞株アレイ上で実施された（図６）。抗体ＭＫＰ１Ａ０７３１０を１μｇ／ｍｌの濃度で試験し、抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０を１０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。ＣＡＸ０８＿６０の細胞株では、ＭＫＰ１Ａ０７３１０の染色はＭＫＰ１９６１０と相関し、ピアソン係数はｒ＝０．９７であった。Ａ５４９、ＰＣ−３またはＵ−８７  ＭＧのような中程度から低い全体的染色シグナルを示す細胞株では、高い染色を示す細胞が陰性細胞間に分散していた（図９Ａ：ＭＫＰ１Ａ０７３１０；図９Ｂ：ＭＫＰ１Ｂ１９６１０）。
【０１２５】
本発明の抗体であるＭＫＰ１Ａ０７３１０の実験間変動は低く、異なるスライド間で相関係数はｒ＝０．９９であった（図５）。ＭＫＰ１Ｂ１９６１０はわずかに高い実験間変動を示し、相関係数は異なるスライド間で０．９３〜０．９９の範囲であった。３つの異なる実験での実験間の変動は低く、ＭＫＰ１Ａ０７３１０ではｒ＝０．９９、およびＭＫＰ１Ｂ１９６１０ではｒ≧０．９８であった。
【０１２６】
組換え抗体は、４８の異なる異種移植片から組織マイクロアレイ上でさらに試験された（ＴＭＡ＿Ｘｅｎｏｓ＿１２、図８）。ＭＫＰ１Ａ０７３１０による染色は、ＭＫＰ１Ｂ１９６１０と相関し、相関係数ｒ＝０．９０であった。高発現異種移植片は、Ｈｓ７４６Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１、ＮＣＩ−Ｈ２００９、およびＨ１９７５であった。陰性負の例はＡ２７８０およびＣｏｌｏ２０５であった。
【０１２７】
[実施例６]
様々なＩＨＣプラットフォームを用いたＭＫＰ１Ａ０７３１０およびＭＫＰ１Ｂ１９６１０の比較
本研究の目的は、Ｄａｋｏ（Ｄａｋｏ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの抗原検索のためにＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ４８をＰＴ  Ｌｉｎｋモジュールとともに用いて抗体の結合特性をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ装置を使用した染色と比較することであった。パラフィン除去、抗原回収、スライド上での抗体の希釈、洗浄緩衝液、および検出システムのためにＤａｋｏまたはＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）が使用する試薬は様々であり、抗体の「エピトープワールド」に影響を及ぼす可能性があった。
【０１２８】
基質
ＰＤ−Ｌ１の陽性および陰性対照組織からの組織マイクロアレイ、ＴＭＡ＿ＰＤＬ１＿１１、ならびに５９個のヒトがん細胞株および１個の昆虫細胞株からの細胞株マイクロアレイ、ＣＡＸ０８＿６０を試験マトリックスとして使用した。生成した抗体の選択にはＴＭＡ＿ＰＤＬ１＿１１を使用した。３μｍのホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片または組織／細胞マイクロアレイを、正に帯電したＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に載せた。
【０１２９】
使用した抗体：
一次抗体：本発明の抗体であるＭＫＰ１Ａ０７３１０（「’７３１０ｍＡｂ」）およびＭＫＰ１Ｂ１９６１０をＰＢＳに希釈して使用した。ＭＫＰ１Ａ０７３１０を１、２および５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０を２、５、および１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
二次抗体
【０１３０】
【表３】
2019532633.tif 000010
【０１３１】
染色手順
抗原賦活化
抗原賦活化は、以下のようにして行った：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴについては、抗原賦活化は、「高ｐＨ」抗原賦活化条件（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｐＨ８）を用いて行われ、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋについては、「高ｐＨ」（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ９）抗原賦活化を用いて試験を開始した。抗体ＰＤ−Ｌ１（ＭＫＰ１Ｂ１９６１０）については、さらに「低ｐＨ」（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．１）抗原賦活化を使用した。
【０１３２】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ染色装置のための染色手順
切片の脱パラフィン処理から開始する免疫組織化学的染色手順は、染色装置Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（「ＶＭＳＩ」）Ｔｕｃｓｏｎ、ＵＳＡ）を用いて行われた。脱パラフィン処理後、切片をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８中、９６℃で４８分間エピトープ賦活化のために加熱した。内因性ペルオキシダーゼは、３％過酸化水素（ＯｍｎｉＭａｐ（商標）キットの一部、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中でのインキュベーションによりブロックした。切片をＰＢＳ希釈した抗体、次に、二次抗体、ＯｍｎｉＭａｐキットのＨＲＰ結合ポリマー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）とともに３７℃で１６分間インキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２反応を触媒して、可視化することができる不溶性の暗褐色の沈殿物を生成する。切片をヘマトキシリンで対比染色した。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を１、２および５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０を２、５、および１０μｇ／ｍｌで使用した。両方の抗体について、ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰ（＃７６０−４３１１、ＶＭＳＩ）およびＣｈｒｏｍｏＭａｐ（＃７６０−１５９）を用いて検出を行った。
【０１３３】
ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ４８のための染色手順
切片の脱パラフィン処理および抗原賦活化は、ＰＴリンク前処理モジュール（Ｄａｋｏ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行われた。スライドは、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ９（高ｐＨ）またはクエン酸緩衝液ｐＨ６．１（低ｐＨ）中、９７℃で２０分間のエピトープ賦活化のための加熱の間に脱パラフィン処理された。熱抗原賦活化後、スライドをＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ４８装置に移した。内因性ペルオキシダーゼは、３％過酸化水素中でのインキュベーションによってブロックされた。切片をＰＢＳ希釈した抗体とともに、次に、二次抗体、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸのＨＲＰ結合ポリマー（ＳＭ８０２、Ｄａｋｏ）とともに３０分間、室温でインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２反応を触媒して、可視化することができる不溶性の暗褐色の沈殿物を生成する。切片をヘマトキシリンで対比染色した。続いて、スライドを水道水で洗浄し、脱水し、恒久的な封入媒体Ｅｎｔｅｌｌａｎ（登録商標）Ｎｅｕ（ＶＷＲ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にガラス製のカバーガラスを付けて載せた。ＭＫＰ１Ａ０７３１０を０．５、１および２μｇ／ｍｌの濃度で、ＭＫＰ１Ｂ１９６１０を０．２、０．５、１、２および５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【０１３４】
様々な染色プラットフォームにおけるＭＫＰ１Ａ０７３１０およびＭＫＰ１Ｂ１９６１０の比較
ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋを用いると、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるＭＫＰ１Ｂ１９６１０および本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるＭＫＰ１Ａ０７３１０で得られたＩＨＣ結果の相関は低く、ｒ＜０．７１であった（図１１および１４）。例えば、ＮＣＩ−Ｈ２００９およびＬｏｘのように、特定の細胞株では染色強度の相関は依然として存在したが（図１１参照）、ＰＤ−Ｌ１発現について陰性対照としての役割を果たすＡ２７８０細胞では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるＭＫＰ１Ｂ１９６１０はＰＤ−Ｌ１発現を示し、一方、同じ細胞株は、本発明の抗体を用いると、ＰＤ−Ｌ１発現について陰性である（図１１参照）。
【０１３５】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴシステム上の本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０）の染色特性とＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋを用いたその特性の比較は、使用されたがん細胞株におけるＩＨＣ染色強度の高い相関が示され、相関係数は０．５μｇ／ｍｌでｒ＝０．９６であった（図１３）。本データに基づいて、脱パラフィン処理、抗原賦活化および染色のためのＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋとともに用いるためにＤａｋｏによるガイドラインに従って使用された試薬は、例えば、ＩＨＣ染色シグナルの増加を除いて、ＶｅｎｔａｎａのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴプラットフォームおよびＶｅｎｔａｎａ試薬を用いたＩＨＣ染色の結果と比較した場合、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０）について異常な結合部位をマスクを外すことによって、ＩＨＣ染色パターンを変化させなかった。
【０１３６】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴシステム上のヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外エピトープに対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０の染色特性を、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ（Ｄａｋｏ）を用いたその特性と比較すると、がん細胞株において、ＩＨＣ染色強度の相関がはるかに低いことが明らかになった。相関係数はｒ＜０．６７であった（図１２）。「低ｐＨ」抗原賦活化を使用すると、相関は、ＩＨＣ染色条件「高ｐＨ」よりもさらに低かった（例えば、図１２Ｂ、「低ｐＨ」、５μｇ／ｍｌのＭＫＰ１Ｂ１９６１０の抗体濃度でｒ＝０．４３、および１μｇ／ｍｌのＭＫＰ１Ｂ１９６１０の抗体濃度でｒ＝０．６６である）。評価された多数の細胞株におけるＩＨＣ染色強度の相関は依然として存在したが、評価されたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴシステムで陰性である細胞群は、Ａ２７８０に示されているようにＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋを用いると、ＰＤ−Ｌ１発現について陽性であった（例えば、図１１参照）。
【０１３７】
結論として、Ｄａｋｏからの試薬とともにＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋプラットフォームを用いると、ＰＤ−Ｌ１の細胞質ドメインに対する本発明の抗体（ＭＫＰ１Ａ０７３１０）は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ染色プラットフォームと同じである、５５ＦＦＰＥがん細胞株における結合特性を示した。対照的に、細胞外ドメインに対して生成された抗体ＭＫＰ１Ｂ１９６１０のさらなる結合部位は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴの代わりにＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋを用いてマスクを外された。したがって、本発明の抗体は、驚くべきことに、広く使用されている市販のＩＨＣプラットフォーム、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋプラットフォーム（ＤＡＫＯ）、ならびにＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ染色プラットフォームの両方で使用することができる。
【０１３８】
さらに、図５に示されるように、本発明の抗体を用いて得られた染色結果の実験間変動は、ｒ＝０．９９の相関効率によって示されるように驚くほど低く、そのため、ＩＨＣ染色、および本明細書に開示されるＦＦＰＥ腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ１発現の得られたスコアリングは、異なる染色実験間で同等である。したがって、本発明の抗体は、一般的に使用される２つのＩＨＣプラットフォーム（例えば、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、ＶｅｎｔａｎａおよびＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ、Ｄａｋｏ）上で、病理学において日常的に使用されるＦＦＰＥ腫瘍組織試料（例えば、生検由来）におけるＰＤ−Ｌ１発現を確実に検出することができる抗ＰＤ−Ｌ１抗体の満たされていない必要性を満たす。
【図１】
2019532633.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019532633.tif 000023
【図１４】
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【配列表】
2019532633000001.app
【国際調査報告】
2019532633.tif 000025
2019532633.tif 000026
2019532633.tif 000027