(57)【要約】カッパ軽鎖ポリペプチドと、１つのラムダ軽鎖ポリペプチドとを含む多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子、ならびに、多重特異性抗体分子を作製及び使用する方法を開示する。本出願は、少なくとも一部分は、多重特異性抗体分子、例えば、二重特異性ＩｇＧ分子との関連で、軽鎖シャッフルが、あるカッパ軽鎖ポリペプチドと、あるラムダ軽鎖ポリペプチドとを使用することで、防止することができる、という予想外の知見に基づいている。このことは、一部では、カッパ軽鎖が、ラムダ抗体由来の重鎖と対を形成しないという観察に基づくものであり、その逆も、また同様である。したがって、本明細書では、カッパ軽鎖ポリペプチドと、ラムダ軽鎖ポリペプチドとを含む、新規の多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子、ならびに、多重特異性抗体分子を、作製及び使用する方法を記載している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重特異性抗体分子であって、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、前記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含む前記第１の抗原結合ドメイン、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、前記第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含む前記第２の抗原結合ドメインを含み、
１）前記第１のＨＣＶＲＳは、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有しており、
２）前記ＬＬＣＶＲＳは、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有しており、
３）前記第２のＨＣＶＲＳは、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有しており、または
４）前記ＫＬＣＶＲＳが、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、前記多重特異性抗体分子。
【請求項２】
１）前記第１のＨＣＶＲＳが、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３】
２）前記ＬＬＣＶＲＳが、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４】
３）前記第２のＨＣＶＲＳが、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２または３に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５】
４）前記ＫＬＣＶＲＳが、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２〜７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０】
以下の前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、前記第２の重鎖生殖細胞系、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１】
２）前記ＬＬＣＶＲＳが、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１２】
１）前記第１のＨＣＶＲＳが、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１３】
３）前記第２のＨＣＶＲＳが、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１１または１２に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１４】
４）前記ＫＬＣＶＲＳが、表６の第４欄、表８ｂの６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１５】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１６】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１７】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１８】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１９】
以下の前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、前記第２の重鎖生殖細胞系、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２０】
３）前記第２のＨＣＶＲＳが、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２１】
１）前記第１のＨＣＶＲＳが、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２０に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２２】
２）前記ＬＬＣＶＲＳが、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２０または２１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２３】
４）前記ＫＬＣＶＲＳが、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２４】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２５】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２６】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２７】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２８】
以下の前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、前記第２の重鎖生殖細胞系、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２９】
４）前記ＫＬＣＶＲＳが、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３０】
１）前記第１のＨＣＶＲＳが、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２９に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３１】
２）前記ＬＬＣＶＲＳが、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２９または３０に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３２】
３）前記第２のＨＣＶＲＳが、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３３】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３４】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３５】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３６】
前記第２の重鎖生殖細胞系配列、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列を、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３７】
以下の前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、前記第２の重鎖生殖細胞系、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３８】
前記第１の重鎖生殖細胞系配列、前記ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、前記第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、前記カッパ軽鎖生殖細胞系配列を、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３９】
多重特異性抗体分子であって、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、前記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含む前記第１の抗原結合ドメイン、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、前記第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含む、前記第２の抗原結合ドメインを含み、
前記多重特異性抗体分子が、アクセサリー部分をさらに含み、前記アクセサリー部分は、
１）前記アクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する、
２）前記アクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、
３）前記アクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む、または、
４）前記アクセサリー部分を、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する、
から選択した特性を有する、前記多重特異性抗体分子。
【請求項４０】
前記多重特異性抗体分子が、アクセサリー部分をさらに含み、前記アクセサリー部分は、
１）前記アクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する、
２）前記アクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、
３）前記アクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む、または、
４）前記アクセサリー部分を、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する、
から選択した特性を有する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４１】
前記アクセサリー部分が、前記多重特異性抗体分子のａ、ｂ、ｃ、または、ｄのポリペプチドと融合している、請求項３９または４０に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４２】
前記アクセサリー部分が、以下のいずれか、例えば、前記多重特異性抗体分子の前記ＨＣＰ１、第１のＨＣＶＲＳ、ＬＬＣＰ、ＬＬＣＶＲＳ、ＨＣＰ２、第２のＨＣＶＲＳ、ＫＬＣＰ、または、ＫＬＣＶＲＳ、例えば、前記多重特異性抗体分子のＨＣＰ１、第１のＨＣＶＲＳ、ＬＬＣＰ、ＬＬＣＶＲＳ、ＨＣＰ２、第２のＨＣＶＲＳ、ＫＬＣＰ、または、ＫＬＣＶＲＳのＣ末端またはＮ末端と融合している、請求項３９から４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４３】
前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、前記アクセサリー部分が、前記第１のＨＣＣＲＳ、例えば、前記第１のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合している、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４４】
前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、前記アクセサリー部分が、前記第２のＨＣＣＲＳ、例えば、前記第２のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合している、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４５】
前記ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、前記アクセサリー部分が、前記ＬＬＣＣＲＳ、例えば、前記ＬＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４６】
前記ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、前記アクセサリー部分が、前記ＫＬＣＣＲＳ、例えば、前記ＫＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４７】
第１のアクセサリー部分と、第２のアクセサリー部分とを含み、前記第１または第２のアクセサリー部分は、
１）前記第１または第２のアクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する、
２）前記第１または第２のアクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、
３）前記第１または第２のアクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む、または、
４）前記第１または第２のアクセサリー部分が、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する、
から選択した特性を有する、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４８】
前記第１及び第２のアクセサリー部分が同じである、請求項４７記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４９】
前記第１及び第２のアクセサリー部分が相違している、請求項４７記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５０】
ｉ）前記第１のアクセサリー部分が、前記ＨＣＰ１または前記ＨＣＰ２、例えば、前記ＨＣＰ１または前記ＨＣＰ２のＣ末端と融合しており、及び
ｉｉ）前記第２のアクセサリー部分が、前記ＬＬＣＰまたは前記ＫＬＣＰ、例えば、前記ＬＬＣＰまたは前記ＫＬＣＰの前記Ｃ末端と融合している、
請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５１】
ｉ）前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、前記第１のアクセサリー部分が、前記第１のＨＣＣＲＳ、例えば、前記第１のＨＣＣＲＳの前記Ｃ末端と融合しており、及び
ｉｉ）前記ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、前記第２のアクセサリー部分が、前記ＬＬＣＣＲＳ、例えば、前記ＬＬＣＣＲＳの前記Ｃ末端と融合している、
請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５２】
ｉ）前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、前記アクセサリー部分が、前記第２のＨＣＣＲＳ、例えば、前記第２のＨＣＣＲＳの前記Ｃ末端と融合しており、及び
ｉｉ）前記ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、前記アクセサリー部分が、前記ＫＬＣＣＲＳ、例えば、前記ＫＬＣＣＲＳの前記Ｃ末端と融合している、
請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５３】
多重特異性抗体分子であって、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、前記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）、及び、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含み、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、前記第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）、及び、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含み、
１）前記多重特異性抗体分子が、前記第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでいない、及び
２）前記多重特異性抗体分子が、前記第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでいない、前記多重特異性抗体分子。
【請求項５４】
ｉ）ａ）前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）前記ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）前記ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）前記多重特異性抗体分子が、前記第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでいない、及び
２）前記多重特異性抗体分子が、前記第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの優先的対合を促進する前記変異を含んでいない、
請求項１〜５２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５５】
前記多重特異性抗体分子が、前記第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍に促進する前記変異を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍に促進する前記変異を含んでいない、請求項５３または５４に記載の多特異的抗体分子。
【請求項５６】
前記多重特異性抗体分子が、前記第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍に促進する前記変異を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、前記変異を伴わない前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの対合と比較して、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍に促進する前記変異を含んでいない、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５７】
多重特異性抗体分子であって、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、前記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）、及び、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含み、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、前記第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）、及び、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含み、
１）前記多重特異性抗体分子が、前記第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び
２）前記多重特異性抗体分子が、前記第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、前記多重特異性抗体分子。
【請求項５８】
ｉ）ａ）前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）前記ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）前記ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）前記多重特異性抗体分子が、前記第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び
２）前記多重特異性抗体分子が、前記第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、前記多重特異性抗体分子が、前記ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、
請求項１〜５６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５９】
前記多重特異性抗体分子が、前記第１のＨＣＣＲＳ、前記ＬＬＣＣＲＳ、前記第２のＨＣＣＲＳ、及び、前記ＫＬＣＣＲＳのいずれにおいても変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列、または、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列）を含んでいない、請求項５７または５８に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６０】
多重特異性抗体分子であって、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、前記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、前記第１の抗原結合ドメインを、前記第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）、及び、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含み、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、前記第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、前記第２の抗原結合ドメインを、前記第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）、及び、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含み、
１）前記第１のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、前記ＬＬＣＣＲＳが、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、及び
２）前記第２のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、前記ＫＬＣＣＲＳが、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む、前記多重特異性抗体分子。
【請求項６１】
ｉ）ａ）前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）前記ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）前記ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）前記第１のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、前記ＬＬＣＣＲＳが、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、及び
２）前記第２のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、前記ＫＬＣＣＲＳが、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む、
請求項１〜５９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６２】
ｉ）前記第１のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、
ｉｉ）前記ＬＬＣＣＲＳが、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、
ｉｉｉ）前記第２のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、及び
ｉｖ）前記ＫＬＣＣＲＳが、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む、
請求項６０または６１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６３】
前記ＨＣＰ１が、前記ＫＬＣＰよりも優先的に前記ＬＬＣＰに結合する、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６４】
前記ＬＬＣＰが、前記ＨＣＰ２よりも前記ＨＣＰ１に優先的に結合する、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６５】
前記ＨＣＰ２が、前記ＬＬＣＰよりも前記ＫＬＣＰに優先的に結合する、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６６】
前記ＫＬＣＰが、前記ＨＣＰ１よりも前記ＨＣＰ２に優先的に結合する、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６７】
前記ＨＣＰ１が、前記ＫＬＣＰよりも前記ＬＬＣＰに対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの間の結合でのＫＤは、前記ＨＣＰ１と前記ＫＬＣＰとの間の結合でのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）請求項１〜６６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６８】
前記ＬＬＣＰが、前記ＨＣＰ２よりも前記ＨＣＰ１に対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、前記ＬＬＣＰと前記ＨＣＰ１との間の結合でのＫＤは、前記ＬＬＣＰと前記第１のＨＣＰ２との間の結合でのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）請求項１〜６７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６９】
前記ＨＣＰ２が、前記ＬＬＣＰよりも前記ＫＬＣＰに対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの間の結合でのＫＤは、前記ＨＣＰ２と前記ＬＬＣＰとの間の結合でのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）請求項１〜６８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７０】
前記ＫＬＣＰが、前記ＨＣＰ１よりも前記ＨＣＰ２に対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、前記ＫＬＣＰと前記ＨＣＰ２との間の結合でのＫＤは、前記ＫＬＣＰと前記第ＨＣＰ１との間の結合でのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）請求項１〜６９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７１】
前記ＫＬＣＰの存在下での前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの間の前記結合率が、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７２】
前記ＨＣＰ２の存在下での前記ＨＣＰ１と前記ＬＬＣＰとの間の前記結合率が、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７３】
前記ＬＬＣＰの存在下での前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの間の前記結合率が、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７４】
前記ＨＣＰ１の存在下での前記ＨＣＰ２と前記ＫＬＣＰとの間の前記結合率が、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７５】
前記ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰが、予め選択した条件下、例えば、水性緩衝液にて、例えば、ｐＨ７で、生理食塩水にて、例えば、ｐＨ７で存在し、または、生理学的条件下で、
ｉ）前記ＨＣＰ１の少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、前記ＬＬＣＰと複合体を形成し、または、相互作用し、
ｉｉ）前記ＬＬＣＰの少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、前記ＨＣＰ１と複合体を形成し、または、相互作用し、
ｉｉｉ）前記ＨＣＰ２の少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、前記ＫＬＣＰと複合体を形成し、または、相互作用し、または、
ｉｖ）前記ＫＬＣＰの少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、前記ＨＣＰ２と複合体を形成し、または、相互作用する、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７６】
前記ＨＣＰ１が、前記ＨＣＰ２と複合体を形成し、または、相互作用する、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７７】
前記ＨＣＰ１が、前記ＨＣＰ１の第２の分子よりも、ＨＣＰ２に対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７８】
前記ＨＣＰ２が、前記ＨＣＰ２の第２の分子よりも、ＨＣＰ１に対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７９】
前記ＨＣＰ１が、ＨＣＰ１−ＨＣＰ２：ＨＣＰ１−ＨＣＰ１の対合の比率を増加させる配列要素であって、前記配列要素が存在しない、例えば、天然に存在する配列が前記配列要素を置き換える場合に認められる比率と比較して同比率を増加させる配列要素を含む、請求項１〜７８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８０】
前記ＨＣＰ２が、ＨＣＰ１−ＨＣＰ２：ＨＣＰ２−ＨＣＰ２の対合の比率を増加させる配列要素であって、前記配列要素が存在しない、例えば、天然に存在する配列が前記配列要素を置き換える場合に認められる比率と比較して同比率を増加させる配列要素を含む、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８１】
前記配列要素が、天然の定常領域配列ではない、請求項７９または８０に記載の多重特異性抗体。
【請求項８２】
前記配列要素が、ＣＨ３に配置されている、請求項７９または８０に記載の多重特異性抗体。
【請求項８３】
ＨＣＰ１及びＨＣＰ２の一方または双方を選択して、ヘテロ二量体化（例えば、ＨＣＰ２−ＨＣＰ２）とは対照的に、自己二量体化（例えば、ＨＣＰ１−ＨＣＰ１）を最小にする、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項８４】
ＨＣＰ１及びＨＣＰ２が、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールとの対のメンバーである、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８５】
ＨＣＰ１−ＨＣＰ２の対合を、静電相互作用で促進する、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８６】
ＨＣＰ１−ＨＣＰ２の対合を、鎖交換で促進する、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８７】
ＨＣＰ１及びＨＣＰ２が、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールの対のメンバーではない、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８８】
前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、前記第１のＨＣＣＲＳが、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８９】
前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、前記第２のＨＣＣＲＳが、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９０】
ｉ）前記ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、前記第１のＨＣＣＲＳが、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び
ｉｉ）前記ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、前記第２のＨＣＣＲＳが、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９１】
前記ＨＣＰ１が、第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、第１のＣＨ３ドメイン配列を含み、前記第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、前記第１のＣＨ３ドメイン配列が、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９２】
前記ＨＣＰ２が、第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、第２のＣＨ３ドメイン配列を含み、前記第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、前記第２のＣＨ３ドメイン配列が、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９３】
ｉ）前記ＨＣＰ１が、第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、第１のＣＨ３ドメイン配列を含み、前記第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、前記第１のＣＨ３ドメイン配列が、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない、及び
ｉｉ）前記ＨＣＰ２が、第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、第２のＣＨ３ドメイン配列を含み、前記第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、前記第２のＣＨ３ドメイン配列が、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない、
請求項１〜７６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９４】
前記ＨＣＰ１が、インビボ、または、インビトロのいずれかで、ラムダ抗体として生じる抗体に由来する、請求項１〜９３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９５】
前記ＨＣＰ２が、インビボ、または、インビトロのいずれかで、カッパ抗体として生じる抗体に由来する、請求項１〜９４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９６】
前記ＨＣＰ１及びＬＬＣＰが、表１８（例えば、表１８にて対合した）、または、表５ａ（例えば、表５ａにて対合した）から選択したアミノ酸配列、または、それらの機能的変異体、または、断片を含む、請求項１〜９５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９７】
前記ＨＣＰ２及びＫＬＣＰが、表１８（例えば、表１８にて対合した）、または、表５ａ（例えば、表５ａにて対合した）から選択したアミノ酸配列、または、それらの機能的変異体、または、断片を含む、請求項１〜９６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９８】
前記ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰが、表１８（例えば、表１８での単一の区画）、または、表５ａ（例えば、表５ａでの単一の列）から選択したアミノ酸配列、または、それらの機能的変異体、または、断片を含む、請求項１〜９７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９９】
前記第１または第２の抗原が、腫瘍抗原、例えば、膵臓、肺、または、大腸腫瘍抗原である、請求項１〜９８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１００】
前記第１または第２の抗原を、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、メソテリン、ＩＧＦ−１Ｒ、または、ＣＡ１９−９から選択する、請求項１〜９９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０１】
前記第１または第２の抗原を、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＤＬＬ４、または、ＨＧＦから選択する、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０２】
前記第１または第２の抗原を、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ｇｐＡ３３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＡＮＧ２、ＲＳＰＯ３、ＨＥＲ２、ＣＥＡＣＡＭ５、または、ＣＥＡから選択する、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０３】
前記第１または第２の抗原が、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または、骨髄性細胞の抗原である、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０４】
前記第１または第２の抗原を、ＣＤ３、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ  −４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、または、ＩＣＯＳから選択する、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０５】
前記第１の抗原が、腫瘍抗原、例えば、メソテリンであり、かつ、前記第２の抗原が、ＮＫＰ３０、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４７、４−１ＢＢ、または、ＮＫＰ４６から選択した抗原であり、または、前記第２の抗原が、腫瘍抗原、例えば、メソテリンであり、かつ、前記第１の抗原が、ＮＫＰ３０、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４７、４−１ＢＢ、または、ＮＫＰ４６から選択した抗原である、請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０６】
前記第１の抗原が、ＩＧＦ１Ｒであり、かつ、前記第２の抗原が、ＨＥＲ３であり、または、前記第２の抗原が、ＩＧＦ１Ｒであり、かつ、前記第１の抗原が、ＨＥＲ３である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０７】
前記第１の抗原が、メソテリンであり、かつ、前記第２の抗原が、ＰＤ−Ｌ１であり、または、前記第２の抗原が、メソテリンであり、かつ、前記第１の抗原が、ＰＤ−Ｌ１である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０８】
前記第１の抗原が、ＣＴＬＡ４であり、かつ、前記第２の抗原が、ＩＬ１２βであり、または、前記第２の抗原が、ＣＴＬＡ４であり、かつ、前記第１の抗原が、ＩＬ１２βである、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０９】
前記第１の抗原が、ＣＴＬＡ４であり、かつ、前記第２の抗原が、ＴＲＡＩＬＲ２であり、または、前記第２の抗原が、ＣＴＬＡ４であり、かつ、前記第１の抗原が、ＴＲＡＩＬＲ２である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１０】
前記第１の抗原が、ＣＴＬＡ４であり、かつ、前記第２の抗原が、ＣＤ２２１であり、または、前記第２の抗原が、ＣＴＬＡ４であり、かつ、前記第１の抗原が、ＣＤ２２１である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１１】
前記第１の抗原が、ＰＤ１であり、かつ、前記第２の抗原が、ＴＲＡＩＬＲ２であり、または、前記第２の抗原が、ＰＤ１であり、かつ、前記第１の抗原が、ＴＲＡＩＬＲ２である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１２】
前記第１の抗原が、ＰＤ１であり、かつ、前記第２の抗原が、ＰＤＬ１であり、または、前記第２の抗原が、ＰＤ１であり、かつ、前記第１の抗原が、ＰＤＬ１である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１３】
前記第１の抗原が、ＰＤ１であり、かつ、前記第２の抗原が、ＰＤＬ１であり、または、前記第２の抗原が、ＰＤ１であり、かつ、前記第１の抗原が、ＰＤＬ１である、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１４】
ＩＬ−２分子、または、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体分子をさらに含む、請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１５】
請求項１〜１１４のいずれか１項に記載のＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、または、ＫＬＣＰの１つ、２つ、３つ、または、すべてをコードする核酸。
【請求項１１６】
請求項１１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１７】
請求項１１４に記載の核酸、または、請求項１１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１８】
請求項１１７に記載の細胞を培養し、それにより、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、または、ＫＬＣＰの１つ、２つ、３つ、または、すべてを製造することを含む、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、または、ＫＬＣＰの１つ、２つ、３つ、または、すべてを作製する方法。
【請求項１１９】
ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰを含む多特異性抗体分子、例えば、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の多特異性抗体分子を作製する方法であって、
ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰの会合に適した条件下で、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰを組み合わせ、
それにより、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰを含む多重特異性抗体分子を作製する、ことを含む、前記方法。
【請求項１２０】
前記方法が、適切に対を形成したカッパ／ラムダ多重特異性抗体分子を高収率で製造する、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
請求項１〜８８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子を含む製剤。
【請求項１２２】
多重特異性抗体分子の製剤であって、前記多重特異性抗体分子の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．９％が、
第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）と複合体を形成し、または、相互作用するラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）、及び
第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）と複合体を形成し、または、相互作用するカッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含み、
前記ＨＣＰ１が、前記ＨＣＰ２と複合体を形成し、または、相互作用する、前記製剤。
【請求項１２３】
前記多特異性抗体分子が、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子を含む、請求項１２２に記載の製剤。
【請求項１２４】
前記製剤が、医薬として許容される製剤であり、例えば、医薬として許容される希釈剤または賦形剤を含む、請求項１２１から１２３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２５】
請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子、及び、医薬として許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２６】
対象に多重特異性抗体分子を提供する方法であって、
請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子を含む医薬製剤を前記対象に提供する、ことを含む前記方法。
【請求項１２７】
処置を必要とする対象を処置する方法であって、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体分子の有効量、または、請求項１２５に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与する、ことを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月２３日に出願された米国出願第６２／３９９，３１９号、及び、２０１７年３月２１日に出願された米国出願第６２／４７４，５６９号の優先権を主張するものであり、それら出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【背景技術】
【０００２】
ラムダ鎖ポリペプチド、及び、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子、ならびに、それらを作製及び使用する方法を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
二重特異性抗体、及び、その他の多重特異性抗体の作製に際して、不適切な重鎖に対する軽鎖の誤対合、別名、軽鎖シャッフリングは、頻繁に認められている問題である。この問題は、不適切な抗体対合を形成し、結果として、作製収率の低下をもたらす。したがって、軽鎖シャッフリングを減らす方法、及び、組成物の開発が待望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本出願は、少なくとも一部分は、多重特異性抗体分子、例えば、二重特異性ＩｇＧ分子との関連で、軽鎖シャッフルが、あるカッパ軽鎖ポリペプチドと、あるラムダ軽鎖ポリペプチドとを使用することで、防止することができる、という予想外の知見に基づいている。このことは、一部では、カッパ軽鎖が、ラムダ抗体由来の重鎖と対を形成しないという観察に基づくものであり、その逆も、また同様である。したがって、本明細書では、カッパ軽鎖ポリペプチドと、ラムダ軽鎖ポリペプチドとを含む、新規の多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子、ならびに、多重特異性抗体分子を、作製及び使用する方法を記載している。
【０００５】
したがって、ある態様では、本明細書では、多重特異性抗体分子、例えば、２つの結合特異性を含む抗体分子、例えば、二重特異性抗体分子を開示している。
【０００６】
多重特異性抗体分子は、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含む、第１の抗原結合ドメイン、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。
【０００７】
ある実施形態では、第１のＨＣＶＲＳは、フレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列の１つ、２つ、または、すべてを含む。ある実施形態では、第１のＨＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列において対応する領域と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、第１のＨＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列において対応する領域と比較して、１、２、３、４、５、６、７、または、８個未満のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入、または、欠失、例えば、保存的置換）を含む。ある実施形態では、第１のＨＣＶＲＳは、表１６から選択したフレームワーク配列を含む。
【０００８】
ある実施形態では、ＬＬＣＶＲＳは、フレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列の１つ、２つ、または、すべてを含む。ある実施形態では、ＬＬＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列において対応する領域と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、ＬＬＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列において対応する領域と比較して、１、２、３、４、５、６、７、または、８個未満のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入、または、欠失、例えば、保存的置換）を含む。ある実施形態では、ＬＬＣＶＲＳは、表１６から選択したフレームワーク配列を含む。
【０００９】
ある実施形態では、第２のＨＣＶＲＳは、フレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列の１つ、２つ、または、すべてを含む。ある実施形態では、第１のＨＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列において対応する領域と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、第２のＨＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列において対応する領域と比較して、１、２、３、４、５、６、７、または、８個未満のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入、または、欠失、例えば、保存的置換）を含む。ある実施形態では、第２のＨＣＶＲＳは、表１６から選択したフレームワーク配列を含む。
【００１０】
ある実施形態では、ＫＬＣＶＲＳは、フレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列の１つ、２つ、または、すべてを含む。ある実施形態では、ＬＬＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列において対応する領域と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、ＫＬＣＶＲＳのフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、または、フレームワーク３配列は、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列において対応する領域と比較して、１、２、３、４、５、６、７、または、８個未満のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入、または、欠失、例えば、保存的置換）を含む。ある実施形態では、ＫＬＣＶＲＳは、表１６から選択したフレームワーク配列を含む。
【００１１】
ある実施形態では、１）第１のＨＣＶＲＳは、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有しており、２）ＬＬＣＶＲＳは、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有しており、３）第２のＨＣＶＲＳは、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有しており、または、４）ＫＬＣＶＲＳが、表６の第４欄、表８ｂの６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または１００％の配列同一性を有する。
【００１２】
ある実施形態では、第１のＨＣＶＲＳは、表７の第３欄、表８ｂの第２欄、または、表５ｂの第２欄から選択した第１の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、以下の第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。
【００１３】
ある実施形態では、ＬＬＣＶＲＳは、表７の第４欄、表８ｂの第３欄、または、表５ｂの第３欄から選択したラムダ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、以下の第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。
【００１４】
ある実施形態では、第２のＨＣＶＲＳは、表６の第３欄、表８ｂの第５欄、または、表５ｂの第４欄から選択した第２の重鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、以下の第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。
【００１５】
ある実施形態では、ＫＬＣＶＲＳは、表６の第４欄、表８ｂの第６欄、または、表５ｂの第５欄から選択したカッパ軽鎖生殖細胞系配列と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、または、１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表７、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、カッパ軽鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表６、表８ｂ、または、表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、以下の第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または、すべて）を、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。
【００１６】
ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、第２の重鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、第２の重鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、第２の重鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。ある実施形態では、第１の重鎖生殖細胞系配列、ラムダ軽鎖生殖細胞系配列、第２の重鎖生殖細胞系配列、及び、カッパ軽鎖生殖細胞系配列は、表８ｂまたは表５ｂの単一の列から選択する。
【００１７】
前述した態様の特定の実施形態では、多重特異性抗体分子は、アクセサリー部分をさらに含み、アクセサリー部分は、以下の特性、
１）アクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する、
２）アクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、
３）アクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む、または、
４）アクセサリー部分を、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する、から選択した特性を有する。
【００１８】
ある態様では、本明細書では、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含む前記第１の抗原結合ドメイン、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含む第２の抗原結合ドメイン、を含む多重特異性抗体分子を開示しており、
多重特異性抗体分子が、アクセサリー部分をさらに含み、アクセサリー部分は、
１）アクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する、
２）アクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、
３）アクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む、または、
４）アクセサリー部分を、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する、から選択した特性を有する。
【００１９】
１つ以上のアクセサリー部分を有する例示的な多重特異性抗体分子を、図６〜１０に示しており、また、実施例に記載している（例えば、例９に記載の多重特異性分子８、例１０に記載の多重特異性分子９、例１１に記載の多重特異性分子１０、例１２に記載の多重特異性分子１１、例１３に記載の多重特異性分子１２）。
【００２０】
ある実施形態では、アクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する。ある実施形態では、アクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。ある実施形態では、アクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む。ある実施形態では、アクセサリー部分を、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する。
【００２１】
ある実施形態において、アクセサリー部分は、多重特異性抗体分子のａ、ｂ、ｃ、または、ｄのポリペプチドと融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、多重特異性抗体分子のＨＣＰ１、第１のＨＣＶＲＳ、ＬＬＣＰ、ＬＬＣＶＲＳ、ＨＣＰ２、第２のＨＣＶＲＳ、ＫＬＣＰ、または、ＫＬＣＶＲＳ、例えば、ＨＣＰ１、第１のＨＣＶＲＳ、ＬＬＣＰ、ＬＬＣＶＲＳ、ＨＣＰ２、第２のＨＣＶＲＳ、ＫＬＣＰ、または、ＫＬＣＶＲＳのＣ末端またはＮ末端のいずれかと融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、ＨＣＰ１と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、第１のＨＣＶＲＳ（例えば、第１のＨＣＶＲＳのＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、ＬＬＣＰ（例えば、ＬＬＣＰのＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、ＬＬＣＶＲＳ（例えば、ＬＬＣＶＲＳのＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、ＨＣＰ２（例えば、ＨＣＰ２のＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、第２のＨＣＶＲＳ（例えば、第２のＨＣＶＲＳのＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、ＫＬＣＰ（例えば、ＫＬＣＰのＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、アクセサリー部分は、ＫＬＣＶＲＳ（例えば、ＫＬＣＶＲＳのＣ末端またはＮ末端）と融合している。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、アクセサリー部分は、第１のＨＣＣＲＳ、例えば、第１のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ＨＣＰ２は、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、アクセサリー部分は、第２のＨＣＣＲＳ、例えば、第２のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合している。ある実施形態では、当該ＬＬＣＰは、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、当該アクセサリー部分は、ＬＬＣＣＲＳ、例えば、ＬＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している。ある実施形態では、当該ＫＬＣＰは、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、当該アクセサリー部分は、ＫＬＣＣＲＳ、例えば、ＫＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している。
【００２２】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、または、それ以上）のアクセサリー分子を含む。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、第１のアクセサリー部分と、第２のアクセサリー部分とを含み、第１または第２のアクセサリー部分は、
１）第１または第２のアクセサリー部分が、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｋＤａの分子量を有する、
２）第１または第２のアクセサリー部分が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、
３）第１または第２のアクセサリー部分が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または、ＮＫ細胞の活性を調節する能力を有するポリペプチドを含む、または、
４）第１または第２のアクセサリー部分を、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子、または、ＰＤ−１結合部分、例えば、ＰＤＬ−１、または、抗ＰＤ−１抗体分子のＰＤ−１結合配列）、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２分子）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ＴＧＦ−βアンタゴニスト）、酵素、毒素、または、標識薬剤の１つ以上から選択する、から選択した特性を有する。
【００２３】
ある実施形態では、第１及び第２のアクセサリー部分は、同じである。ある実施形態では、第１及び第２のアクセサリー部分は、相違する。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分は、ＨＣＰ１またはＨＣＰ２、例えば、ＨＣＰ１またはＨＣＰ２のＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＬＬＣＰまたはＫＬＣＰ、例えば、ＬＬＣＰまたはＫＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分は、ＨＣＰ１、例えば、ＨＣＰ１のＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＬＬＣＰ、例えば、ＬＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分は、ＨＣＰ１、例えば、ＨＣＰ１のＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＫＬＣＰ、例えば、ＫＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分は、ＨＣＰ２、例えば、ＨＣＰ２のＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＬＬＣＰ、例えば、ＬＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分は、ＨＣＰ２、例えば、ＨＣＰ２のＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＫＬＣＰ、例えば、ＫＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分が、ＫＬＣＰ、例えば、ＫＬＣＰのＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＬＬＣＰ、例えば、ＬＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）第１のアクセサリー部分は、ＬＬＣＰ、例えば、ＬＬＣＰのＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）第２のアクセサリー部分は、ＫＬＣＰ、例えば、ＫＬＣＰのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）ＨＣＰ１は、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、第１のアクセサリー部分は、第１のＨＣＣＲＳ、例えば、第１のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）ＬＬＣＰは、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、第２のアクセサリー部分は、ＬＬＣＣＲＳ、例えば、ＬＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）ＨＣＰ２は、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、アクセサリー部分は、第２のＨＣＣＲＳ、例えば、第２のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）ＫＬＣＰは、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、アクセサリー部分は、ＫＬＣＣＲＳ、例えば、ＫＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）ＨＣＰ１は、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、第１のアクセサリー部分は、第１のＨＣＣＲＳ、例えば、第１のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）ＫＬＣＰは、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、アクセサリー部分は、ＫＬＣＣＲＳ、例えば、ＫＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している。ある実施形態では、ｉ）ＨＣＰ２は、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３配列）を含み、アクセサリー部分は、第２のＨＣＣＲＳ、例えば、第２のＨＣＣＲＳのＣ末端と融合しており、かつ、ｉｉ）ＬＬＣＰは、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、第２のアクセサリー部分は、ＬＬＣＣＲＳ、例えば、ＬＬＣＣＲＳのＣ末端と融合している。
【００２４】
前述した態様の特定の実施形態では、多重特異性抗体分子は、
ｉ）ａ）ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００２５】
ある態様では、本明細書では、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）、及び、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含み、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）、及び、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含み、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない、多重特異性抗体を開示する。
【００２６】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００２７】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ
２）多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００２８】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００２９】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ
２）多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００３０】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００３１】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００３２】
ある実施形態では、１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を促進する変異を含んでいない。
【００３３】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍にまで増加させる変異を含んでいない。ある実施形態では、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ１とＬＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍にまで増加させる変異を含んでいない。
【００３４】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍にまで増加させる変異を含んでいない。ある実施形態では、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）であって、この変異を伴わないＨＣＰ２とＫＬＣＰとの対合と比較して、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの優先的対合を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または、５０倍にまで増加させる変異を含んでいない。
【００３５】
前述した態様の特定の実施形態では、多重特異性抗体分子は、
ｉ）ａ）ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００３６】
ある態様では、本明細書では、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）、及び、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含み、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）、及び、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含む、多重特異性抗体であって、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、
多重特異性抗体を開示している。
【００３７】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００３８】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００３９】
ある実施形態では、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００４０】
ある実施形態では、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００４１】
ある実施形態では、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び、
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００４２】
ある実施形態では、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、または、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び、
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００４３】
ある実施形態では、
１）多重特異性抗体分子が、第１のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＬＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない、及び、
２）多重特異性抗体分子が、第２のＨＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、多重特異性抗体分子が、ＫＬＣＣＲＳにおける変異（例えば、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。
【００４４】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、以下の第１のＨＣＣＲＳ、ＬＬＣＣＲＳ、第２のＨＣＣＲＳ、及び、ＫＬＣＣＲＳ（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列、または、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列）のいずれの変異も含んでいない。
【００４５】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、ＷＯ２０１７０５９５５１に開示されている変異を含んでいない。
【００４６】
前述した態様の特定の実施形態では、多重特異性抗体分子は、
ｉ）ａ）ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）第１のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、ＬＬＣＣＲＳが、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、及び
２）第２のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、ＫＬＣＣＲＳが、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む。
【００４７】
ある態様では、本明細書では、
ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉ）ｂ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分な第１の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含む、第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）、及び
ｂ）ｉ）ａ）と対になると、第１の抗原結合ドメインを、第１の抗原に結合できるようにするに十分なラムダ軽鎖可変領域配列（ＬＬＣＶＲＳ）、及び、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含む、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）を含む、第１の抗原結合ドメイン、及び
ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインが、
ａ）ｉｉ）ｂ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分な第２の重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）、及び、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含む、第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）、及び
ｂ）ｉｉ）ａ）と対になると、第２の抗原結合ドメインを、第２の抗原に結合できるようにするに十分なカッパ軽鎖可変領域配列（ＫＬＣＶＲＳ）、及び、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含む、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）を含む、第２の抗原結合ドメイン、を含む、多重特異性抗体分子であって、
１）第１のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、ＬＬＣＣＲＳが、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、及び
２）第２のＨＣＣＲＳが、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、ＫＬＣＣＲＳが、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む、
多重特異性抗体分子を開示している。
【００４８】
ある実施形態では、１）第１のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、かつ、２）第２のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含む。ある実施形態では、１）第１のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、かつ、２）ＫＬＣＣＲＳは、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む。ある実施形態では、１）ＬＬＣＣＲＳは、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、かつ、２）第２のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含む。ある実施形態では、１）ＬＬＣＣＲＳは、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、かつ、２）ＫＬＣＣＲＳは、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む。ある実施形態では、１）第１のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、かつ、ＬＬＣＣＲＳは、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、及び、２）第２のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、ＫＬＣＣＲＳは、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む。ある実施形態では、１）第１のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、または、ＬＬＣＣＲＳは、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、及び、２）第２のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、かつ、ＫＬＣＣＲＳは、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む。
【００４９】
ある実施形態では、ｉ）第１のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、ｉｉ）ＬＬＣＣＲＳは、天然に存在するラムダ軽鎖定常領域配列を含み、ｉｉｉ）第２のＨＣＣＲＳは、天然に存在する重鎖定常領域配列を含み、及び、ｉｖ）ＫＬＣＣＲＳは、天然に存在するカッパ軽鎖定常領域配列を含む。
【００５０】
前述した態様の特定の実施形態では、ＨＣＰ１は、ＫＬＣＰよりも優先的にＬＬＣＰに結合する。前述した態様の特定の実施形態では、ＬＬＣＰは、ＨＣＰ２よりも優先的にＨＣＰ１に結合する。前述した態様の特定の実施形態では、ＨＣＰ２は、ＬＬＣＰよりも優先的にＫＬＣＰに結合する。前述した態様の特定の実施形態では、ＫＬＣＰは、ＨＣＰ１よりも優先的にＨＣＰ２に結合する。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、ＫＬＣＰよりもＬＬＣＰに対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合についてのＫＤは、ＨＣＰ１とＫＬＣＰとの間の結合についてのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）。ある実施形態では、ＬＬＣＰは、ＨＣＰ２よりもＨＣＰ１に対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、ＬＬＣＰとＨＣＰ１との間の結合についてのＫＤは、ＬＬＣＰと第１のＨＣＰ２との間の結合についてのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）。ある実施形態では、ＨＣＰ２は、ＬＬＣＰよりもＫＬＣＰに対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合についてのＫＤは、ＨＣＰ２とＬＬＣＰとの間の結合についてのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）。ある実施形態では、ＫＬＣＰは、ＨＣＰ１よりもＨＣＰ２に対して大きな親和性、例えば、実質的に大きな親和性を有する（例えば、ＫＬＣＰとＨＣＰ２との間の結合についてのＫＤは、ＫＬＣＰとＨＣＰ１との間の結合についてのＫＤの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、または、０．０１％未満である）。
【００５１】
ある実施形態では、ＫＬＣＰの存在下で、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である。ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、及び、ＫＬＣＰが、１：１：１で存在する場合、ＫＬＣＰの存在下で、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である（競合ペプチドの非存在下でのＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合を１００％とし、かつ、ＬＬＣＰの存在下でのＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合を５０％とする）。ある実施形態では、結合率は、本明細書に記載したアッセイ、例えば、ＮａｎｏＢｉＴアッセイで測定した。
【００５２】
ある実施形態では、ＨＣＰ２の存在下で、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である。ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、及び、ＨＣＰ２が、１：１：１で存在する場合、ＨＣＰ２の存在下で、ＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である（競合ペプチドの非存在下でのＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合を１００％とし、かつ、ＨＣＰ１の存在下でのＨＣＰ１とＬＬＣＰとの間の結合を５０％とする）。ある実施形態では、結合率は、本明細書に記載したアッセイ、例えば、ＮａｎｏＢｉＴアッセイで測定した。
【００５３】
ある実施形態では、ＬＬＣＰの存在下で、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である。ある実施形態では、ＨＣＰ２、ＫＬＣＰ、及び、ＬＬＣＰが、１：１：１で存在する場合、ＬＬＣＰの存在下で、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である（競合ペプチドの非存在下でのＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合を１００％とし、かつ、ＫＬＣＰの存在下でのＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合を５０％とする）。ある実施形態では、結合率は、本明細書に記載したアッセイ、例えば、ＮａｎｏＢｉＴアッセイで測定した。
【００５４】
ある実施形態では、ＨＣＰ１の存在下で、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である。ある実施形態では、ＨＣＰ２、ＫＬＣＰ、及び、ＨＣＰ１が、１：１：１で存在する場合、ＨＣＰ１の存在下で、ＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合率は、少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、９９、または、９９．５％である（競合ペプチドの非存在下でのＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合を１００％とし、かつ、ＨＣＰ２の存在下でのＨＣＰ２とＫＬＣＰとの間の結合を５０％とする）。ある実施形態では、結合率は、本明細書に記載したアッセイ、例えば、ＮａｎｏＢｉＴアッセイで測定した。
【００５５】
ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰを予め選択した条件下で、例えば、水性緩衝液で、例えば、ｐＨ７で、生理食塩水で、例えば、ｐＨ７で、または、生理学的条件下で存在する場合、ＨＣＰ１の少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、ＬＬＣＰと複合体を形成し、または、相互作用する。ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰが予め選択した条件下で、例えば、水性緩衝液で、例えば、ｐＨ７で、生理食塩水で、例えば、ｐＨ７で、または、生理学的条件下で存在する場合、ＬＬＣＰの少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、ＨＣＰ１と複合体を形成し、または、相互作用する。ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰを予め選択した条件下で、例えば、水性緩衝液で、例えば、ｐＨ７で、生理食塩水で、例えば、ｐＨ７で、または、生理学的条件下で存在する場合、ＨＣＰ２の少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、ＫＬＣＰと複合体を形成し、または、相互作用する。ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰが予め選択した条件下で、例えば、水性緩衝液で、例えば、ｐＨ７で、生理食塩水で、例えば、ｐＨ７で、または、生理学的条件下で存在する場合、ＫＬＣＰの少なくとも７０、７５、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％が、ＨＣＰ２と複合体を形成し、または、相互作用する。
【００５６】
前述した態様の特定の実施形態では、多重特異性抗体分子は、
ｉ）ａ）ＨＣＰ１が、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第１のＣＨ１配列）を含み、
ｉ）ｂ）ＬＬＣＰが、ラムダ軽鎖定常領域配列（ＬＬＣＣＲＳ）を含み、
ｉｉ）ａ）ＨＣＰ２が、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）（例えば、第２のＣＨ１配列）を含み、及び
ｉｉ）ｂ）ＫＬＣＰが、カッパ軽鎖定常領域配列（ＫＬＣＣＲＳ）を含み、
１）第１のＨＣＣＲＳが、ＬＬＣＣＲＳと複合体を形成し、または、相互作用し、及び
２）第２のＨＣＣＲＳが、ＫＬＣＣＲＳと複合体を形成し、または、相互作用する、ことを含む。
【００５７】
前述した態様の特定の実施形態では、ＨＣＰ１は、ＨＣＰ２と複合体を形成し、または、相互作用する。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、ＨＣＰ１の第２の分子よりも、ＨＣＰ２に対して大きい親和性、例えば、実質的に大きい親和性を有する。ある実施形態では、ＨＣＰ２は、ＨＣＰ２の第２の分子よりも、ＨＣＰ１に対して大きい親和性、例えば、実質的に大きい親和性を有する。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、配列要素を含んでおり、配列要素は、配列要素の非存在下で、例えば、天然に存在する配列が配列要素を置換する条件下で認められる比率と比較して、ＨＣＰ１−ＨＣＰ２：ＨＣＰ１−ＨＣＰ１の対合の比率を増加させる。ある実施形態では、ＨＣＰ２は、配列要素を含んでおり、配列要素は、配列要素の非存在下で、例えば、天然に存在する配列が配列要素を置換する条件下で認められる比率と比較して、ＨＣＰ１−ＨＣＰ２：ＨＣＰ２−ＨＣＰ２の対合の比率を増加させる。ある実施形態では、配列要素は、天然の定常領域配列ではない。ある実施形態では、配列要素を、ＣＨ３に配置する。ある実施形態では、ヘテロ二量体化（例えば、ＨＣＰ２−ＨＣＰ２）とは対照的に、ＨＣＰ１及びＨＣＰ２の一方または双方を選択して、自己二量体化（例えば、ＨＣＰ１−ＨＣＰ１）を最小限にした。ある実施形態では、ＨＣＰ１及びＨＣＰ２は、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールとの対のメンバーである。ある実施形態では、ＨＣＰ１−ＨＣＰ２の対合を、静電相互作用で促進する。ある実施形態では、ＨＣＰ１−ＨＣＰ２の対合を、鎖交換で促進する。ある実施形態では、ＨＣＰ１及びＨＣＰ２は、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールとの対のメンバーではない。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、第１のＨＣＣＲＳは、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。ある実施形態では、ＨＣＰ２は、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、第２のＨＣＣＲＳは、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。ある実施形態では、ｉ）ＨＣＰ１は、第１の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、第１のＨＣＣＲＳは、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、ｉｉ）ＨＣＰ２は、第２の重鎖定常領域配列（ＨＣＣＲＳ）を含み、第２のＨＣＣＲＳは、変異（例えば、天然に存在する重鎖定常領域配列に対する変異）を含んでいない。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、第１のＣＨ３ドメイン配列を含み、第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、第１のＣＨ３ドメイン配列は、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない。ある実施形態では、ＨＣＰ２は、第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、第２のＣＨ３ドメイン配列を含み、第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、第２のＣＨ３ドメイン配列は、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない。ある実施形態では、ｉ）ＨＣＰ１は、第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、第１のＣＨ３ドメイン配列を含み、第１のＣＨ２ドメイン配列、及び、第１のＣＨ３ドメイン配列は変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでおらず、かつ、ｉｉ）ＨＣＰ２は、第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、第２のＣＨ３ドメイン配列を含み、第２のＣＨ２ドメイン配列、及び、第２のＣＨ３ドメイン配列は、変異（例えば、天然に存在するＣＨ２ドメイン配列、または、天然に存在するＣＨ３ドメイン配列に対する変異）を含んでいない。
【００５８】
前述した態様の特定の実施形態では、ＨＣＰ１は、インビボまたはインビトロのいずれかで、ラムダ抗体として生じる抗体に由来する。前述した態様の特定の実施形態では、ＨＣＰ２は、インビボまたはインビトロのいずれかで、カッパ抗体として生じる抗体に由来する。
【００５９】
ある実施形態では、ＨＣＰ１、及び、ＬＬＣＰは、表１８（例えば、表１８にて対合した）、または、表５ａ（例えば、表５ａにて対合した）から選択したアミノ酸配列、または、それらの機能的変異体、または、断片を含む。ある実施形態では、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰは、表１８（例えば、表１８にて対合した）、または、表５ａ（例えば、表５ａにて対合した）から選択したアミノ酸配列、または、それらの機能的変異体、または、断片を含む。ある実施形態では、ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、ＨＣＰ２、及び、ＫＬＣＰは、表１８（例えば、表１８にて対合した）、または、表５ａ（例えば、表５ａにて対合した）から選択したアミノ酸配列、または、それらの機能的変異体、または、断片を含む。
【００６０】
ある実施形態では、第１または第２の抗原は、腫瘍抗原、例えば、膵臓、肺、または、大腸の腫瘍抗原である。ある実施形態では、第１または第２の抗原は、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、メソテリン、ＩＧＦ−１Ｒ、または、ＣＡ１９−９から選択する。ある実施形態では、第１または第２の抗原は、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＤＬＬ４、または、ＨＧＦから選択する。ある実施形態では、第１または第２の抗原は、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ｇｐＡ３３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＡＮＧ２、ＲＳＰＯ３、ＨＥＲ２、ＣＥＡＣＡＭ５、または、ＣＥＡから選択する。ある実施形態では、第１または第２の抗原は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または、骨髄性細胞の抗原である。ある実施形態では、第１または第２の抗原は、ＣＤ３、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、または、ＩＣＯＳから選択する。ある実施形態では、第１の抗原は、腫瘍抗原、例えば、メソテリンであり、かつ、第２の抗原は、ＮＫＰ３０、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４７、４−１ＢＢ、または、ＮＫＰ４６から選択する抗原であり、または、第２の抗原は、腫瘍抗原、例えば、メソテリンであり、かつ、第１の抗原は、ＮＫＰ３０、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４７、４−１ＢＢ、または、ＮＫＰ４６から選択した抗原である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＩＧＦ１Ｒであり、かつ、第２の抗原は、ＨＥＲ３であり、または、第２の抗原は、ＩＧＦ１Ｒであり、かつ、第１の抗原は、ＨＥＲ３である。ある実施形態では、第１の抗原は、メソテリンであり、かつ、第２の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、または、第２の抗原は、メソテリンであり、かつ、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＴＬＡ４であり、かつ、第２の抗原は、ＩＬ１２βであり、または、第２の抗原は、ＣＴＬＡ４であり、かつ、第１の抗原は、ＩＬ１２βである。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＴＬＡ４であり、かつ、第２の抗原は、ＴＲＡＩＬＲ２であり、または、第２の抗原は、ＣＴＬＡ４であり、かつ、第１の抗原は、ＴＲＡＩＬＲ２である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＴＬＡ４であり、かつ、第２の抗原は、ＣＤ２２１であり、または、第２の抗原は、ＣＴＬＡ４であり、かつ、第１の抗原は、ＣＤ２２１である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ１であり、かつ、第２の抗原は、ＴＲＡＩＬＲ２であり、または、第２の抗原はＰＤ１であり、かつ、第１の抗原は、ＴＲＡＩＬＲ２である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ１であり、かつ、第２の抗原は、ＰＤＬ１であり、または、第２の抗原は、ＰＤ１であり、かつ、第１の抗原は、ＰＤＬ１である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ１であり、かつ、第２の抗原は、ＰＤＬ１であり、または、第２の抗原は、ＰＤ１であり、かつ、第１の抗原は、ＰＤＬ１である。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、ＩＬ−２分子をさらに含む。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、ＣＤ４０ア��ニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子をさらに含む。
【００６１】
ある態様では、本明細書では、多重特異性抗体分子、例えば、２つの結合特異性を含む抗体分子、例えば、二重特異性抗体分子を開示している。多重特異性抗体分子は、
第１のエピトープに特異的なラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）、
第１のエピトープに特異的な重鎖ポリペプチド１（ＨＣＰ１）、
第２のエピトープに特異的なカッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）、及び
第２のエピトープに特異的な重鎖ポリペプチド２（ＨＣＰ２）、を含む。
【００６２】
別の態様では、本明細書では、多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子を開示しており、同抗体分子は、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、または、その双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべてを含む重鎖ポリペプチド）であって、例えば、ＨＣＰ１は、第１のエピトープに結合する、第１の重鎖ポリペプチド、
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、または、その双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべてを含む重鎖ポリペプチド）であって、例えば、ＨＣＰ２は、第２のエピトープに結合する、第２の重鎖ポリペプチド、
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１のＶＨ）と優先的に会合するラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬλ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、または、その双方）であって、例えば、ＬＬＣＰは、第１のエピトープに結合するラムダ軽鎖ポリペプチド、及び
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２のＶＨ）と優先的に会合するカッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬκ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬκ）、または、その双方）であって、例えば、ＫＬＣＰは、第２のエピトープに結合するカッパ軽鎖ポリペプチド、を含む。実施形態では、第１及び第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を増強するＦｃ界面を形成する。
【００６３】
本明細書で開示した多重特異性抗体分子の幾つかの実施形態では、
ＬＬＣＰは、ＨＣＰ２よりもＨＣＰ１に対して大きな親和性を有し、及び／または
ＫＬＣＰは、ＨＣＰ１よりもＨＣＰ２に対して大きな親和性を有する。
【００６４】
実施形態では、ＨＣＰ１に対するＬＬＣＰの親和性は、ＨＣＰ２に対するその親和性よりも十分に大きいので、予め選択された条件下、例えば、水性緩衝液で、例えば、ｐＨ７、生理食塩水で、例えば、ｐＨ７、または、生理学的条件下で、多重特異性抗体分子分子の少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％は、ＨＣＰ１と複合体を形成し、または、相互作用したＬＬＣＰを有する。
【００６５】
本明細書に開示した多重特異性抗体分子の幾つかの実施形態では、
ＨＣＰ１は、ＨＣＰ１の第２の分子よりも、ＨＣＰ２に対して大きな親和性を有しており、及び／または、
ＨＣＰ２は、ＨＣＰ２の第２の分子よりも、ＨＣＰ１に対して大きな親和性を有する。
【００６６】
実施形態では、ＨＣＰ２に対するＨＣＰ１の親和性は、ＨＣＰ１の第２の分子に対するその親和性よりも十分に大きいので、予め選択された条件下、例えば、水性緩衝液で、例えば、ｐＨ７、生理食塩水で、例えば、ｐＨ７、または、生理学的条件下で、多重特異性抗体分子分子の少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％は、ＨＣＰ２と複合体を形成し、または、相互作用したＨＣＰ１を有する。
【００６７】
別の態様では、本明細書では、多重特異性抗体分子を作製または製造する方法を開示している。方法は、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、または、その双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべて）を提供すること、
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、または、その双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべて）を提供すること、
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１のＶＨ）と優先的に会合するラムダ鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬλ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、または、その双方）を提供すること、及び
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２のＶＨ）と優先的に会合するカッパ鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬκ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬκ）、または、その双方）を提供することを、
（ｉ）〜（ｉｖ）が関連する条件下で含む。
【００６８】
実施形態では、第１及び第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を増強するＦｃ界面を形成する。
【００６９】
別の態様では、本明細書では、多重特異性抗体分子を作製または製造する方法を開示している。方法は、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、または、その双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべて）を提供すること、
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、または、その双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべて）を提供すること、
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１のＶＨ）と優先的に会合するラムダ鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬλ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、または、その双方）を提供し、かつ、エフェクター部分（例えば、ＩＬ２）をさらに含むこと、及び
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２のＶＨ）と優先的に会合するカッパ鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬκ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、または、その双方）を提供し、かつ、任意に、抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）をさらに含むことを、
（ｉ）〜（ｉｖ）が関連する条件下で含む。実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）（例えば、（ｉ）〜（ｉｖ）をコードする核酸）を、単一の細胞、例えば、単一の哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に導入する。実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）を、細胞内で発現する。
【００７０】
実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）（例えば、（ｉ）〜（ｉｖ）をコードする核酸）を異なる細胞、例えば、異なる哺乳動物細胞、例えば、２つ以上のＣＨＯ細胞に導入する。実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）を、細胞内で発現する。
【００７１】
ある実施形態では、方法は、例えば、ラムダ−、及び／または、カッパ−特異的精製、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、細胞で発現した抗体分子を精製する、ことをさらに含む。
【００７２】
実施形態では、方法は、細胞で発現した多特異性抗体分子を評価する、ことをさらに含む。例えば、細胞で発現し、精製をした多特異性抗体分子を、質量分析など、技術分野で公知の技術で分析することができる。ある実施形態では、細胞で発現し、精製をした多特異性抗体分子を開裂して、例えば、パパインで消化してＦａｂ部分を生じ、そして、質量分析を用いて評価する。
【００７３】
実施形態では、方法は、適切に対にしたカッパ／ラムダ多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子を、例えば、少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または、９９．９％という高収率で生成する。
【００７４】
前述した多重特異性分子をコードする核酸分子、ベクター、及び、宿主細胞も開示している。
【００７５】
前述した多重特異性分子、及び、医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物も開示している。
【００７６】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示した多重特異性抗体分子を使用して、障害、例えば、がんを有する対象を処置する方法を特徴としている。
【００７７】
本明細書に開示した多重特異性抗体分子、及び、方法のさらなる特徴及び実施形態は、以下のうちの１つ以上を含む。
【００７８】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、単離または精製されている。
【００７９】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子の第１及び第２の重鎖ポリペプチド、例えば、第１及び第２の重鎖定常領域（例えば、第１の及び第２のＦｃ領域）の界面を、例えば、改変されていない界面、例えば、天然に存在する界面と比較して、ヘテロ二量体化を増強するように改変、例えば、変異させる。ある実施形態では、第１及び第２の重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化は、第１及び第２のＦｃ領域のＦｃ界面に、対になった突起−空洞（「ノブ−イン−ア−ホール」）、静電相互作用、または、鎖交換の１つ以上を提供することで増強され、例えば、改変していない界面と比較して、ホモ多量体に対するヘテロ多量体の大きな比率を形成する。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または、４０９の１つ以上から選択した位置に、対になったアミノ酸置換を含む。例えば、第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、（例えば、空洞またはホールに対応する）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、または、Ｙ４０７Ｖから選択した対になったアミノ酸置換を含むことができ、そして、第２の免疫グロブリン鎖定常領域は、（例えば、突起またはノブに対応する）Ｔ３６６Ｗを含む。
【００８０】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子の第１及び第２の重鎖ポリペプチド、例えば、第１及び第２の重鎖定常領域（例えば、第１の及び第２のＦｃ領域）の界面を改変せずに、例えば、変異させないで、例えば、改変していない界面、例えば、天然に存在する界面と比較して、ヘテロ二量体化を増やす。ある実施形態では、第１及び第２の重鎖ポリペプチドのヘテロ二量体化は、第１及び第２のＦｃ領域のＦｃ界面に、対になった突起−空洞（「ノブ−イン−ア−ホール」）を提供しても増強されない。
【００８１】
幾つかの実施形態では、ＣＨ１鎖、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、及び、カッパ軽鎖定常部（ＶＬκ）の１つ以上（例えば、全部）は改変させずに、例えば、変異させないで、例えば、改変していない界面、例えば、天然に存在する界面と比較して、ヘテロ二量体化を増やす。幾つかの実施形態では、ＣＨ１鎖、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、及び、カッパ軽鎖定常部（ＶＬκ）の１つ以上（例えば、全部）は、天然に存在する。
【００８２】
幾つかの実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、任意に、ＣＤＲ１〜２）は、ＩＭＧＴ（登録商標）に記載の生殖細胞系列ファミリー、ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，”ＩＭＧＴ、ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ”  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９，２０７−２０９（２００１）、及び、Ｓｃａｖｉｎｅｒ，Ｄ．，Ｂａｒｂｉｅ，Ｖ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ，ｋａｐｐａ  ａｎｄ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ”，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１６，２３４−２４０（１９９９））、または、それらと実質的に同一のアミノ酸配列に由来する。
【００８３】
幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬカッパまたはラムダ、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、任意に、ＣＤＲ１〜２）は、ＩＭＧＴに記載の生殖細胞系列ファミリー、または、それらと実質的に同一のアミノ酸配列に由来する。
【００８４】
実施形態では、多重特異性抗体分子は、複数（例えば、２、３、または、それ以上）の結合特異性（または、機能性）を含む。
【００８５】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性（または、二機能性）分子、三重特異性（または、三機能性）分子、または、四重特異性（または、四機能性）分子である。
【００８６】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する第１の結合特異性、及び、第２のエピトープに対する第２の結合特異性を含む。幾つかの実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じポリペプチドにある。他の実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるポリペプチドにある。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の抗原、例えば、第１のポリペプチドにあり、かつ、第２のエピトープは、第２の抗原、例えば、第２のポリペプチドにある。幾つかの実施形態では、抗原、または、ポリペプチドは、表２、４、５ａ、１７、及び、１８の抗体が認識する抗原、例えば、表２、４、５ａ、１７、及び、１８に開示したラムダ及びカッパ抗体が認識する第１の及び第２の抗原から選択する。ラムダ及びカッパ抗体の例示的な対を、表５ａ及び１８に示す。
【００８７】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する第１の結合特異性を含み、第１のエピトープは、腫瘍抗原、例えば、膵臓、肺、または、大腸の腫瘍抗原にある。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、メソテリン、ＩＧＦ−１Ｒ、または、ＣＡ１９−９から選択した抗原にある。他の実施形態では、第１のエピトープは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＤＬＬ４、または、ＨＧＦから選択した抗原にある。さらに他の実施形態では、第１のエピトープは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ３、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ｇｐＡ３３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＡＮＧ２、ＲＳＰＯ３、ＨＥＲ２、ＣＥＡＣＡＭ５、または、ＣＥＡから選択した抗原にある。
【００８８】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、第２のエピトープに対する第２の結合特異性を含み、第２のエピトープは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または、骨髄性細胞の抗原にある。幾つかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＤ３、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、または、ＩＣＯＳから選択する。
【００８９】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、腫瘍抗原、例えば、メソテリンの第１のエピトープと、ＮＫＰ３０、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４７、４−１ＢＢ、または、ＮＫＰ４６から選択した抗原の第２のエピトープとに結合する。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、メソテリンとＰＤ−Ｌ１に結合する。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、メソテリンとＰＤＬ１に結合し、かつ、サイトカイン（例えば、ＩＬ２）をさらに含む。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、メソテリン、ＰＤＬ１、及び、ＮＫｐ３０に結合し、かつ、サイトカイン（例えば、ＩＬ２）をさらに含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、複数（例えば、２つ以上）の結合特異性（または、機能性）を含む。幾つかの実施形態では、第１の結合特異性は、がん細胞に選択的に局在しており、例えば、それは腫瘍標的化部分を含み、そして、第２（または、第３または第４）の結合特異性は、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、または、マクロファージ細胞エンゲージャーの１つ、２つ、３つ、または、すべてから選択した）、及び／または、サイトカイン分子の一方または双方を含む。例示的な腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャー、及び、サイトカイン分子を、詳細な説明に記載している。
【００９１】
特に定義がされていない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等の方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を、以下に記載する。本願で引用したすべての刊行物、特許出願、特許、及び、その他の参考文献は、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。何らかの矛盾が生じた場合は、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び、実施例は、例示的なものにすぎず、限定を意図するものではない。
【００９２】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Ａ〜Ｄは、軽鎖シャッフリングの概略図である。
【図２】パパインで開裂した二重特異性抗体の概略図であり、ヒンジ領域における開裂位置を点線で示している。実施形態では、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ホール修飾を有する）であるＦｃ定常部に連結した第１の重鎖可変領域−ＣＨ１に、ヘテロ二量体化したハイブリッドＶＬλ−ＣＬλを含む第１の結合特異性と、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ノブ修飾を有する）であるＦｃ定常部に連結した第２の重鎖可変領域−ＣＨ１にヘテロ二量体化したハイブリッドＶＬκ−ＣＬκを含む第２の結合特異性とを有する多重特異性抗体分子。２つのＦａｂ断片を、パパイン処理した後に放出する。
【図３】Ａ〜Ｃは、ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）タンパク質：タンパク質相互作用システム（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｆｅｂ  １９；１１（２）：４００−８）を利用して、１：１：１のモル比で混合した、重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）に対する、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）と、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）との競合を示す。ＨＣＰ２は、Ｃ末端融合として、ＬｇＢｉＴを有しており、ＫＬＣＰは、Ｃ末端融合として、ＳｍＢｉＴを有しており、そして、ＬＬＣＰは、天然軽鎖である。ＨＣＰ２及びＫＬＣＰが、Ｆａｂ領域を形成すると、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴは、完全に機能的なＮａｎｏＬｕｃドメインを作り出す（図３Ａ）。ＨＣＰ２及びＬＬＣＰが、Ｆａｂ領域を形成すると、ＮａｎｏＬｕｃは、完全でなくなり、かつ、不活性である（図３Ｂ）。ＣＨ１親和性で精製したＨＣＰ２についてのＬＬＣＰとＫＬＣＰの１：１：１の競合は、ＨＣＰ２／ＫＬＣＰ機能性ＮａｎｏＬｕｃ、及び、ＨＣＰ２／ＬＬＣＰ非機能性ＮａｎｏＬｕｃ  Ｆａｂ領域をもたらす（図３Ｃ）。
【図４】Ａ〜Ｃは、ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）タンパク質：タンパク質相互作用システムを利用して、１：１：１のモル比で混合した、重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）に対する、ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）と、カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）との競合を示す。ＨＣＰ１は、Ｃ末端融合として、ＬｇＢｉＴを有しており、ＬＬＣＰは、Ｃ末端融合として、ＳｍＢｉＴを有しており、そして、ＫＬＣＰは、天然軽鎖である。ＨＣＰ１及びＬＬＣＰが、Ｆａｂ領域を形成すると、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴは、完全に機能的なＮａｎｏＬｕｃドメインを作り出す（図４Ａ）。ＨＣＰ１及びＫＬＣＰが、Ｆａｂ領域を形成すると、ＮａｎｏＬｕｃは完全でなくなり、かつ、不活性である（図４Ｂ）。ＣＨ１親和性で精製したＨＣＰ１についてのＬＬＣＰとＫＬＣＰの１：１：１の競合は、ＨＣＰ１／ＬＬＣＰ機能性ＮａｎｏＬｕｃ、及び、ＨＣＰ１／ＫＬＣＰ非機能性ＮａｎｏＬｕｃ  Ｆａｂ領域をもたらす（図４Ｃ）。
【図５】本発明の例示的な多重特異性抗体分子の概略図である。多重特異性抗体分子は、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む第１のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドを含む第２のＦａｂ、及び、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールの対を含む。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＩＧＦ１Ｒに結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＨＥＲ３に結合する（例えば、例２に記載の多重特異性分子１）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、メソテリンに結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＰＤ−Ｌ１に結合する（例えば、例３に記載の多重特異性分子２）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ−４に結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＩＬ１２βに結合する（例えば、例４に記載の多重特異性分子３）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ−４に結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＴＲＡＩＬＲ２に結合する（例えば、例５に記載の多重特異性分子４）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ−４に結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＣＤ２２１に結合する（例えば、例６に記載の多重特異性分子５）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＰＤ−１に結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＴＲＡＩＬＲ２に結合する（例えば、例７に記載の多重特異性分子６）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＰＤ−１に結合し、かつ、第２のＦａｂは、ＰＤＬ１に結合する（例えば、例８に記載の多重特異性分子７）。
【図６】本発明の例示的な多重特異性抗体分子の概略図である。多重特異性抗体分子は、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む第１のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドを含む第２のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合したポリペプチド、及び、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールの対を含む。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ４に結合し、第２のＦａｂは、ＩＬ１２βに結合しており、そして、ラムダ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合したポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体（例えば、例１０に記載の多重特異性分子９）を含む。
【図７】本発明の例示的な多重特異性抗体分子の概略図である。多重特異性抗体分子は、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む第１のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドを含む第２のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合したポリペプチド、及び、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、例えば、ノブとホールの対のような対の突起／空洞を含んでいない（例えば、Ｆｃドメインは、天然に存在するＦｃドメインである）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ４に結合し、第２のＦａｂは、ＩＬ１２βに結合しており、そして、ラムダ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合したポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体を含む（例えば、例９に記載の多重特異性分子８）。
【図８】本発明の例示的な多重特異性抗体分子の概略図である。多重特異性抗体分子は、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む第１のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドを含む第２のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合した第１のポリペプチド、ラムダ軽鎖ポリペプチドに会合する重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合した第２のポリペプチド、及び、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールの対を含む。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ４に結合し、第２のＦａｂは、ＩＬ１２βに結合しており、第１のポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体を含み、そして、第２のポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体を含む（例えば、例１２に記載の多重特異性分子１１）。
【図９】本発明の例示的な多重特異性抗体分子の概略図である。多重特異性抗体分子は、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む第１のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドを含む第２のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合した第１のポリペプチド、ラムダ軽鎖ポリペプチドに会合する重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合した第２のポリペプチド、及び、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールの対を含んでいない（例えば、Ｆｃドメインは、天然に存在するＦｃドメインである）。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ４に結合し、第２のＦａｂは、ＩＬ１２βに結合しており、第１のポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体を含み、そして、第２のポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体を含む（例えば、例１１に記載の多重特異性分子１０）。
【図１０】本発明の例示的な多重特異性抗体分子の概略図である。多重特異性抗体分子は、カッパ軽鎖ポリペプチドを含む第１のＦａｂ、ラムダ軽鎖ポリペプチドを含む第２のＦａｂ、カッパ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合した第１のポリペプチド、カッパ軽鎖ポリペプチドに会合する重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合した第２のポリペプチド、及び、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、対になった突起／空洞、例えば、ノブとホールの対を含む。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ＣＴＬＡ４に結合し、第２のＦａｂは、ＴＲＡＩＬＲ２に結合しており、第１のポリペプチドは、インターロイキン２、または、それらの断片、または、変異体を含み、そして、第２のポリペプチドは、ｓｃＦｖを含む（例えば、例１３に記載の多重特異性分子１２）。
【図１１】多重特異性分子１のゲル。
【図１２】多重特異性分子３のゲル。
【図１３】多重特異性分子４のゲル。
【図１４】多重特異性分子５のゲル。
【図１５】多重特異性分子６のゲル。
【図１６】多重特異性分子７のゲル。
【図１７】多重特異性分子８のゲル。
【図１８】多重特異性分子９のゲル。
【図１９】多重特異性分子１のサイズ排除クロマトグラム。
【図２０】多重特異性分子３のサイズ排除クロマトグラム。
【図２１】多重特異性分子８のサイズ排除クロマトグラム。
【図２２】多重特異性分子９のサイズ排除クロマトグラム。
【図２３】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子２の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図２４】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子１の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図２５】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子３の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図２６】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子８の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図２７】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子９の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図２８】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子１１の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図２９】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子１０の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。
【図３０】カッパ／ラムダ選択分析を終えた後の多重特異性分子１２の還元試料のゲル。レーン１は、ロードであり、レーン２は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、レーン３は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムの溶出であり、レーン４は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーであり、そして、レーン５は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムの溶出である。これらの比率は、ノブとホールが３：１〜１：３であるトランスフェクションにおいて使用したＤＮＡ比率を示す。
【図３１】パパインで開裂した多特異性分子３のインタクト質量分析。
【図３２】パパインで開裂した多特異性分子４のインタクト質量分析。
【図３３】パパインで開裂した多特異性分子５のインタクト質量分析。
【図３４】パパインで開裂した多特異性分子６のインタクト質量分析。
【図３５】パパインで開裂した多特異性分子７のインタクト質量分析。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本明細書では、多重特異性抗体分子（本明細書では、「多重機能性抗体分子」とも称する）を開示しており、多重特異性抗体分子は、ラムダ軽鎖ポリペプチドと、カッパ軽鎖ポリペプチドとを含む。実施形態では、多重特異性抗体分子は、複数（例えば、２つ以上）の結合特異性（または、機能性）を含む。幾つかの実施形態では、第１の結合特異性は、がん細胞に選択的に局在しており、例えば、それは腫瘍標的化部分を含み、そして、第２（または、第３または第４）の結合特異性は、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、または、マクロファージ細胞エンゲージャーの１つ、２つ、３つ、または、すべてから選択した）、及び／または、サイトカイン分子の一方または双方を含む。ある実施形態では、多重特異性分子は、二重特異性（または、二機能性）分子、三重特異性（または、三機能性）分子、または、四重特異性（または、四機能性）分子である。したがって、本明細書では、とりわけ、ラムダ軽鎖ポリペプチドと、カッパ軽鎖ポリペプチドとを含む多重特異的分子（例えば、多重特異性抗体分子）、それらをコードする核酸、前述した分子の製造方法、及び、前述した分子を使用する、障害、例えば、がんを処置する方法を提供する。
【００９５】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１の重鎖可変領域（第１の結合特異性を有する第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、または、双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべてを含む重鎖ポリペプチド）、
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、または、双方）の１つ、２つ、３つ、または、すべてを含む重鎖ポリペプチド）、
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１のＶＨ）と優先的に会合するラムダ軽鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬλ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬλ）、または、双方）、及び
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２のＶＨ）と優先的に会合するカッパ軽鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽鎖可変領域（ＶＬκ）、ラムダ軽鎖定常部（ＶＬκ）、または、双方）、を含む。
【００９６】
実施形態では、第１及び第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を増強するＦｃ界面を形成する。その例を図１Ａに示しており、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ノブ修飾を有する）であるＦｃ定常部に連結した第１の重鎖可変領域にヘテロ二量体化したハイブリッドＶＬλ−ＣＬλを含む第１の結合特異性と、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ホール修飾を有する）であるＦｃ定常部に連結した第２の重鎖可変領域にヘテロ二量体化したハイブリッドＶＬκ−ＣＬκを含む第２の結合特異性とを有する多重特異性抗体分子を記載している。
【００９７】
幾つかの実施形態では、本明細書では、多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子を生成するための新規な方法を開示している。本明細書に開示した二重特異性分子を生成する方法は、文献でよく報告されている軽鎖交換を回避しながら、安定な抗体を産生する。軽鎖交換またはシャッフリングは、単一のカッパ、及び、単一のラムダ軽鎖を有する抗体を産生するときに遭遇する一般的な問題である。軽鎖シャッフリングの概略図を、図１Ａ〜１Ｄに示している。図１Ａ〜図１Ｄに示すように、産物のわずか２５％だけが、所望の立体配置であり（図１Ａ）、そして、その他の７５％の産物では、軽鎖に誤対合がある（図１Ｂ−１Ｄ）。本明細書に開示した多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子を製造する方法は、カッパ及びラムダ軽鎖を有する抗体、例えば、ヒト抗体を使用して、安定な多重特異性、例えば、二重特異性抗体分子を製造する。
【００９８】
特定の用語を、以下に定義する。
【００９９】
本明細書で使用する、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ以上、例えば、少なくとも１つを指す。本明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用する場合の用語「ａ」及び「ａｎ」の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」、及び「１つ、または、１を超える（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味とも符合する。
【０１００】
本明細書で使用する、「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般的には、測定の本質または精度を考慮して、測定された量について許容可能な程度の誤差のことを意味する。例示的な誤差の程度は、所与の値の範囲の２０パーセント（％）以内、一般的には、１０％以内、より一般的には、５％以内である。
【０１０１】
本明細書で使用する「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖、または、それらの断片のこと指す。抗体分子は、抗体（例えば、全長抗体）、及び、抗体断片を含む。ある実施形態では、抗体分子は、全長抗体の抗原結合あるいは機能的断片、または、全長免疫グロブリン鎖を含む。例えば、全長抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）であり、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、天然に存在するものであるか、または、通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される）。実施形態では、抗体分子とは、抗体断片などの免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分のことを指す。抗体断片、例えば、機能的断片は、抗体の一部、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、または、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。機能的抗体断片は、インタクト（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。用語「抗体断片」または「機能的断片」は、可変領域からなる単離した断片、例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、または、軽鎖及び重鎖がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）に連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子も含む。幾つかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合活性を持たない抗体の部分、例えば、Ｆｃ断片、または、単一のアミノ酸残基を含んでいない。抗体分子の例として、全長抗体、及び、抗体断片、例えば、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片、及び、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）がある。
【０１０２】
本明細書で使用する、例えば、抗体分子、サイトカイン分子、受容体分子で使用する用語「分子」は、修飾されていない（例えば、天然に存在する）分子の機能、及び／または、活性の少なくとも１つが残存している限りは、全長の天然に存在する分子、ならびに、変異体、例えば、機能的変異体（例えば、切断型、断片、変異（例えば、実質的に類似の配列）、または、それらの誘導体化形態）を含む。
【０１０３】
用語「機能的変異体」は、天然に存在する配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、あるいは、実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされており、そして天然に存在する配列の１つ以上の活性を有することができる、ポリペプチドのことを指す。
【０１０４】
本明細書において第１の配列と第２の配列（例えば、核酸配列、または、タンパク質配列に関して）との関係に関連して用いられる「由来」とは、プロセスに制限を課すものではなく、構造的類似性のみを指す。実施形態では、誘導配列は、本明細書の他の場所に記載した相同性または配列同一性のレベルによって、参照配列と異なる。
【０１０５】
本明細書で使用する「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列のことを指す。例えば、この配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含み得る。例えば、この配列は、１つ、２つ、または、それ以上の個数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでいても、含んでいなくともよく、あるいは、タンパク質構造の形成と適合可能な他の変更を含み得る。
【０１０６】
本明細書で使用する「ラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）」は、同族重鎖可変領域と組み合わせた場合に、そのエピトープへの特異的結合を媒介して、ＨＣＰ１と複合体を形成するのに十分な軽鎖（ＬＣ）配列を含むポリペプチドのことを指す。ある実施形態では、それは、ＣＨ１領域の全部または断片を含む。ある実施形態では、ＬＬＣＰは、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、及び、ＣＨ１、または、そのエピトープの特異的結合を媒介し、かつ、ＨＣＰ１と複合体を形成するのに十分な、それらに由来する配列を含む。ＬＬＣＰは、そのＨＣＰ１と共に、第１のエピトープに対する特異性を提供する（一方で、ＫＬＣＰは、そのＨＣＰ２と共に、第２のエピトープに対する特異性を提供する）。本明細書の他の箇所に記載したように、ＬＬＣＰは、ＨＣＰ２に対するよりも、ＨＣＰ１に対して大きな親和性を有する。
【０１０７】
本明細書で使用する「カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）」は、同族重鎖可変領域と組み合わせた場合に、そのエピトープへの特異的結合を媒介して、ＨＣＰ２と複合体を形成するのに十分な軽鎖（ＬＣ）配列を含むポリペプチドのことを指す。ある実施形態では、それは、ＣＨ１領域の全部または断片を含む。ある実施形態では、ＫＬＣＰは、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、及びＣＨ１、または、そのエピトープの特異的結合を媒介し、かつ、ＨＣＰ２と複合体を形成するのに十分なそれらに由来する配列を含む。ＫＬＣＰは、そのＨＣＰ２と共に、第２のエピトープに対する特異性を提供する（一方で、ＬＬＣＰは、そのＨＣＰ１と共に、第１のエピトープに対する特異性を提供する）。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「重鎖ポリペプチド１（ＨＣＰ１）」は、同族のＬＬＣＰと組み合わせた場合に、そのエピトープへの特異的結合を媒介して、ＨＣＰ１と複合体を形成するのに十分な重鎖（ＨＣ）配列、例えば、ＨＣ可変領域配列を含むポリペプチドのことを指す。ある実施形態では、それは、ＣＨ１領域の全部または断片を含む。ある実施形態では、それは、ＣＨ２、及び／または、ＣＨ３領域の全部または断片を含む。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３、または、それらに由来する十分な配列を含み、（ｉ）そのエピトープの特異的結合を媒介し、かつ、ＬＬＣＰと複合体を形成し、（ｉｉ）本明細書に記載したようにして、ＫＬＣＰとは対照的に、優先的にＬＬＣＰと複合体を形成し、及び、（ｉｉｉ）本明細書に記載したようにして、ＨＣＰ１の別の分子とは対照的に、優先的にＨＣＰ２と複合体を形成する。ＨＣＰ１は、そのＬＬＣＰと共に、第１のエピトープに対する特異性を提供する（一方で、ＫＬＣＰは、そのＨＣＰ２と共に、第２のエピトープに対する特異性を提供する）。
【０１０９】
本明細書で使用する用語「重鎖ポリペプチド２（ＨＣＰ２）」は、同族のＬＬＣＰと組み合わせた場合に、そのエピトープへの特異的結合を媒介して、ＨＣＰ１と複合体を形成するのに十分な重鎖（ＨＣ）配列、例えば、ＨＣ可変領域配列を含むポリペプチドのことを指す。ある実施形態では、それは、ＣＨ１領域の全部または断片を含む。ある実施形態では、それは、ＣＨ２、及び／または、ＣＨ３領域の全部または断片を含む。ある実施形態では、ＨＣＰ１は、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３、または、それらに由来する十分な配列を含み、（ｉ）そのエピトープの特異的結合を媒介し、かつ、ＫＬＣＰと複合体を形成し、（ｉｉ）本明細書に記載したようにして、ＬＬＣＰとは対照的に、優先的にＫＬＣＰと複合体を形成し、及び、（ｉｉｉ）本明細書に記載したようにして、ＨＣＰ２の別の分子とは対照的に、優先的にＨＣＰ１と複合体を形成する。ＨＣＰ２は、そのＫＬＣＰと共に、第２のエピトープに対する特異性を提供する（一方で、ＬＬＣＰは、そのＨＣＰ１と共に、第１のエピトープに対する特異性を提供する）。
【０１１０】
実施形態では、抗体分子は、単一特異性であり、例えば、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。幾つかの実施形態では、抗体分子は、多重特異性であり、例えば、それは複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、そして、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。幾つかの実施形態では、抗体分子は、二重特異性抗体分子である。本明細書で使用する「二重特異性抗体分子」は、１つを超える個数（例えば、２つ、３つ、４つ、または、それ以上）のエピトープ、及び／または、抗原に対して特異性を有する抗体分子のことを指す。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「多重特異性抗体分子」は、同一でない２つのエピトープに対して特異性を有する抗体分子、例えば、第１のエピトープに特異的な第１の可変領域、及び、第２のエピトープに特異的な第２の可変領域を有し、第１及び第２のエピトープが同一ではない抗体分子のことを指す。多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子を含む。
【０１１２】
本明細書で使用する「抗原」（Ａｇ）は、例えば、特定の免疫細胞、及び／または、抗体産生の活性化に関与する免疫応答を誘発することができる分子のことを指す。ほとんどすべてのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子を、抗原とすることができる。また、抗原は、ゲノム組換え体、または、ＤＮＡに由来することができる。例えば、免疫応答を惹起することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、抗原をコードする。実施形態では、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけでコードされる必要はなく、また、抗原が、遺伝子によってコードされる必要も全くない。実施形態では、抗原は、合成することができ、または、生物学的試料、例えば、組織試料、腫瘍試料、細胞、または、その他の生物学的成分を含む流体から誘導することができる。本明細書で使用する「腫瘍抗原」、または、互換的に「がん抗原」とは、がん、例えば、がん細胞、または、免疫応答を誘発することができる腫瘍微小環境に存在しているか、あるいは、それらと関連しているあらゆる分子を含む。本明細書で使用する「免疫細胞抗原」は、免疫応答を誘発することができる免疫細胞に存在しているか、あるいは、それらと関連するあらゆる分子を含む。
【０１１３】
抗体分子の「抗原結合部位」または「結合部分」とは、抗原結合に関与する抗体分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の一部のことを指す。実施形態では、抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖、及び、軽（Ｌ）鎖の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基で形成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域内にある３つの非常に多様なストレッチ、別名、超可変領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれている、よく保存がされた隣接ストレッチの間に配置されている。ＦＲは、免疫グロブリンの超可変領域の間、及び、それに隣接して天然に認められるアミノ酸配列である。実施形態では、抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域、及び、重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに関連して配置されており、結合した抗原の三次元表面に相補的な抗原結合表面を形成する。重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれている。フレームワーク領域、及び、ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、及び、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔａｌ．，（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７で定義されており、また、記載がされている。各可変鎖（例えば、可変重鎖、及び、可変軽鎖）は、一般的には、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲが、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及び、ＦＲ４のアミノ酸の並びで構成されている。
【０１１４】
本明細書で使用する重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの優先的対合は、無関係の重鎖ポリペプチド、または、無関係の軽鎖ポリペプチドよりも、重鎖ポリペプチド、及び、軽鎖ポリペプチドが、互いに優先的に結合する条件のことを指す。ある実施形態では、重鎖ポリペプチドは、重鎖ポリペプチドが無関係の軽鎖ポリペプチドに結合する場合よりも、大きな親和性で軽鎖ポリペプチドに結合する。ある実施形態では、軽鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドが無関係の重鎖ポリペプチドに結合する場合よりも、大きな親和性で重鎖ポリペプチドに結合する。
【０１１５】
本明細書で使用する競合ポリペプチド（例えば、第２の重鎖ポリペプチド、または、第２の軽鎖ポリペプチド）の存在下での第１の重鎖ポリペプチドと第１の軽鎖ポリペプチドとの間の結合率とは、あらゆる競合ポリペプチドが不存在の下での第１の重鎖ポリペプチドと第１の軽鎖ポリペプチドとの間の結合量に対する、競合ポリペプチドの存在下での第１の重鎖ポリペプチドと第１の軽鎖ポリペプチドとの間の結合量のことを指す。（後者を１００％とした）。ある実施形態では、第１の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、及び、競合ポリペプチドが、１：１：１で存在するときに結合率を測定した。ある実施形態では、第１の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、及び、競合ポリペプチドが、１：１：１で存在するときに結合率を測定し、競合ポリペプチドは、第２の軽鎖ポリペプチドである。ある実施形態では、結合率は、本明細書に記載したアッセイ、例えば、ＮａｎｏＢｉＴアッセイで測定した。
【０１１６】
本明細書で使用する「がん」は、あらゆる種類の発がん過程、及び／または、がん性増殖を含むことができる。実施形態では、がんは、原発腫瘍、ならびに、転移性組織、または、悪性形質転換細胞、組織、もしくは、臓器を含む。実施形態では、がんは、がんのすべての病理組織学的病期、及び、がんの病期、例えば、侵襲性／重症度の病期を含む。実施形態では、がんは、再発がん、及び／または、抵抗性がんを含む。用語「がん」及び「腫瘍」は、互換的に使用することができる。例えば、双方の用語は、固形腫瘍、及び、液体腫瘍を含む。本明細書で使用する用語「がん」または「腫瘍」は、前悪性、ならびに、悪性のがん、及び、腫瘍を含む。
【０１１７】
本明細書で使用する「免疫細胞」とは、例えば、感染症及び外来物質から保護するために、免疫系において機能するあらゆる様々な細胞のことを指す。実施形態では、この用語は、白血球、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、及び、単球を含む。先天的白血球として、食細胞（例えば、マクロファージ、好中球、及び、樹状細胞）、肥満細胞、好酸球、好塩基球、及び、ナチュラルキラー細胞がある。先天的白血球は、より大きな病原体に接触をして攻撃し、または、微生物を飲み込んで死滅させることで、病原体を同定及び排除し、そして、適応的免疫応答の活性化における媒介物質となる。適応的免疫系の細胞は、特殊なタイプの白血球、別名、リンパ球である。Ｂ細胞及びＴ細胞は、重要な種類のリンパ球であり、そして、骨髄の造血幹細胞に由来する。Ｂ細胞は、体液性免疫応答に関与しているのに対して、Ｔ細胞は、細胞性免疫応答に関与している。用語「免疫細胞」は、免疫エフェクター細胞を含む。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞のことを指す。免疫エフェクター細胞の例として、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞、及び、ガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ  Ｔ）細胞、及び、肥満細胞があるが、これらに限定されない。
【０１１９】
用語「エフェクター機能」または「エフェクター応答」とは、細胞の特殊化した機能のことを指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、または、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性とし得る。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、腫瘍標的化部分を含む。本明細書で使用する「腫瘍標的化部分」とは、がん細胞での標的を認識し、または、それと会合をする、例えば、標的に結合する結合剤のことを指す。腫瘍標的化部分を、抗体分子、受容体分子（例えば、全長受容体、受容体断片、または、それらの融合物（例えば、受容体−Ｆｃ融合物））、または、がん抗原（例えば、腫瘍、及び／または、間質抗原）に結合するリガンド分子（例えば、全長リガンド、リガンド断片、または、それらの融合物（例えば、リガンド−Ｆｃ融合物）とすることができる。実施形態では、腫瘍標的化部分は、標的腫瘍に特異的に結合し、例えば、標的腫瘍に優先的に結合する。例えば、腫瘍標的化部分が、抗体分子である場合、それは、約１０ｎＭ未満の解離定数で、がん抗原（例えば、腫瘍抗原、及び／または、間質抗原）に結合する。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、免疫細胞エンゲージャーを含む。「免疫細胞エンゲージャー」とは、免疫細胞、例えば、免疫応答に関与する細胞を、結合、及び／または、活性化する１つ以上の結合特異性のことを指す。実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び／または、マクロファージ細胞から選択する。免疫細胞エンゲージャーを、抗体分子、受容体分子（例えば、全長受容体、受容体断片、または、それらの融合物（例えば、受容体−Ｆｃ融合物））、または、免疫細胞抗原（例えば、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹状細胞抗原、及び／または、マクロファージ細胞抗原）に結合するリガンド分子（例えば、全長リガンド、リガンド断片、または、それらの融合物（例えば、リガンド−Ｆｃ融合物）とすることができる。実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、標的免疫細胞に特異的に結合し、例えば、標的免疫細胞に優先的に結合する。例えば、免疫細胞エンゲージャーが抗体分子である場合、それは、約１０ｎＭ未満の解離定数で、免疫細胞抗原（例えば、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹状細胞抗原、及び／または、マクロファージ細胞抗原）に結合する。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、サイトカイン分子を含む。本明細書で使用する「サイトカイン分子」とは、サイトカインの全長、断片、または、変異体、受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含むサイトカイン、または、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えば、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を惹起するサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）のことを指す。幾つかの実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、または、インターフェロンガンマ、または、それらの断片もしくは変異体、または、前述したサイトカインのあらゆる組み合わせから選択する。このサイトカイン分子は、単量体、または、二量体とすることができる。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含むことができる。他の実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５Ｒａ、または、ＩＬ−２１Ｒから選択したサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）のアゴニストである。
【０１２３】
本発明の組成物及び方法は、特定の配列、または、それと実質的に同一もしくは類似の配列、例えば、特定の配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％が同一、または、それ以上である配列を有するポリペプチド及び核酸を含む。アミノ酸配列に関連する用語「実質的に同一」とは、本明細書では、ｉ）同一である、または、ｉｉ）第２のアミノ酸配列で整列したアミノ酸残基の保存的置換である、十分または最小数のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸のことを指すために使用しており、第１及び第２のアミノ酸配列は、共通の構造ドメイン、及び／または、共通の機能的活性を持つことができるようになる。例えば、参照配列、例えば、本明細書で提供した配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列。
【０１２４】
ヌクレオチド配列に関連する用語「実質的に同一」とは、本明細書では、第２の核酸配列で整列したヌクレオチドと同一である、十分または最小数のヌクレオチドを含む第１の核酸のことを指すために使用しており、第１及び第２のヌクレオチド配列は、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードし、または、共通の構造ポリペプチドドメイン、または、共通の機能的ポリペプチド活性をコードする。例えば、参照配列、例えば、本明細書で提供した配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【０１２５】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語を、本明細書では、互換的に用いる）の計算を、以下のように行う。
【０１２６】
２つのアミノ酸配列、または、２つの核酸配列の一致率を決定するために、これらの配列を、最適な比較目的のために、整列させる（例えば、最適なアラインメントのために、第１及び第２のアミノ酸の一方または双方または核酸配列にギャップを導入でき、非相同配列を、比較目的のために、無視することができる）。好ましい実施形態では、比較目的で整列した参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列でのある位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、第２の配列での対応する位置にあるものと同じである場合、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用するアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。
【０１２７】
それら２つの配列間の一致率は、それら２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数と各ギャップの長さとを考慮した、配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【０１２８】
２つの配列の間での配列の比較、及び、一致率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列の間での一致率は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズム、すなわち、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス、または、ＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、または、４のギャップ重量と、１、２、３、４、５、または、６の長さ重量と、を使用する同アルゴリズムを用いて決定する。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間での一致率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラム、すなわち、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスと、４０、５０、６０、７０、または、８０のギャップ重量、及び、１、２、３、４、５、または、６の長さ重量と、を使用する同プログラムを用いて決定する。特に好ましいパラメータのセット（及び、特に断りの無い限りは、使用すべきもの）は、ギャップペナルティが１２であり、ギャップ拡張ペナルティが４であり、及び、フレームシフトギャップペナルティが５である、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【０１２９】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間の一致率は、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７）のアルゴリズム、すなわち、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、ギャップ長ペナルティが１２であり、そして、ギャップペナルティが４である同アルゴリズムを用いて決定することができる。
【０１３０】
本明細書に記載した核酸配列、及び、タンパク質配列は、公共のデータベースに対して検索を行って、例えば、その他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するための「クエリー配列」として使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０．のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行をして、本発明の核酸（例えば、配列番号１）分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行をして、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きのアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２．に記載されているようにして、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ、及び、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【０１３１】
本発明の分子は、追加の保存的、または、非必須アミノ酸置換を有し得るものであり、同置換が、それらの機能に実質的な影響を及ぼすことがないことは理解される。
【０１３２】
用語「アミノ酸」は、アミノ官能基と酸官能基の双方を含み、かつ、天然に存在するアミノ酸のポリマーに含まれることが可能である、天然または合成に関係なく、すべての分子を含むことを意図している。アミノ酸の例として、天然に存在するアミノ酸、それらの類似体、誘導体、及び、同族体、変種側鎖を有するアミノ酸類似体、及び、上記したいずれかのすべての立体異性体がある。本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、Ｄ−またはＬ−光学異性体、及び、ペプチド模倣物の双方を含む。
【０１３３】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸がある。
【０１３４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び、「タンパク質」（一本鎖の場合）は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書では互換的に使用する。ポリマーは、直鎖または分岐鎖とし得るものであり、それらは、修飾アミノ酸を含み得るものであり、そして、それらは、非アミノ酸によって妨げられ得る。また、これらの用語は、修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識成分との結合などのあらゆる他の操作も含む。ポリペプチドは、天然の供給源から単離することができ、真核生物もしくは原核生物の宿主から組換え技術で産生することができ、または、合成手順の産物とすることができる。
【０１３５】
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または、「ポリヌクレオチド配列」、及び、「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用する。それらは、デオキシリボヌクレオチド、または、リボヌクレオチドのいずれか、または、それらの類似体のいずれかである、あらゆる長さのポリマー形態のヌクレオチドのことを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかとし得るものであり、そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖とし得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド、及び、ヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって妨げられ得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾し得る。核酸は、組換えポリヌクレオチド、または、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または、合成起源のポリヌクレオチドであり得るものであり、それらのいずれもが、天然には存在しないか、あるいは、非天然の配置で別のポリヌクレオチドに連結している。
【０１３６】
本明細書で使用する用語「単離した」は、その当初の、または、天然の環境（例えば、それが天然に存在する場合は、自然の環境）から取り出された物質のことを指す。例えば、生きている動物に存在している天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の一部または全部から、人間の介入によって分離をした、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドを単離する。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部とし得る、及び／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部とし得る、そして、さらに、そのようなベクターまたは組成物を単離するものであり、それは、自然界に見出される環境の一部ではない。
【０１３７】
本発明の様々な態様を、以下にさらに詳細に説明する。本明細書を通して、さらなる定義を示す。
【０１３８】
抗体分子
ある実施形態では、抗体分子は、抗原、例えば、免疫エフェクター細胞、腫瘍抗原、または、間質抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原は、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトの抗原である。その他の実施形態では、抗体分子は、免疫細胞抗原、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト免疫細胞抗原に結合する。例えば、抗体分子は、がん抗原、または、免疫細胞抗原のエピトープ、例えば、直鎖状または立体配座エピトープに特異的に結合する。
【０１３９】
ある実施形態では、抗体分子は、単一特異性抗体分子であり、そして、単一のエピトープに結合する。例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を有する単一特異性抗体分子は、その各々が同じエピトープに結合する。
【０１４０】
ある実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、それは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、かつ、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または、多量体タンパク質のサブユニット）にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しない。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または、多量体タンパク質の異なるサブユニット）にある。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、第３、第４、または、第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または、四重特異性抗体分子である。
【０１４１】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴とする。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または、多量体タンパク質のサブユニット）にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しない。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または、多量体タンパク質の異なるサブユニット）にある。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ、または、Ｆａｂ、または、それらの断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはは、Ｆａｂ、または、それらの断片とを含む。
【０１４２】
ある実施形態では、抗体分子は、ダイアボディ、及び、一本鎖分子、ならびに、抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及び、Ｆｖ）を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＨと略記する）と、軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＬと略記する）とを含むことができる。ある実施形態では、抗体分子は、重鎖及び軽鎖を含み、または、それらからなる（本明細書では半抗体と称する）。別の例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列と、２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列とを含み、それにより、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価及び二重特異性）、及び、キメラ（例えば、ヒト化）抗体などの２つの抗原結合部位を形成し、それらは、全抗体、または、組換えＤＮＡ技術を用いてデノボ合成した抗体の修飾によって生成し得る。これらの機能的抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持している。抗体及び抗体断片は、あらゆるクラスの抗体に由来することができ、同クラスとして、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥがあるが、これらに限定されず、また、あらゆるサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４）の抗体に由来することができる。抗体分子の調製物は、モノクローナルまたはポリクローナルとすることができる。また、抗体分子は、ヒト、ヒト化、ＣＤＲグラフト、または、インビトロで生成した抗体とすることができる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または、ＩｇＧ４から選択した重鎖定常領域を有することができる。また、抗体は、例えば、カッパまたはラムダから選択した軽鎖を有することができる。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では、用語「抗体」と互換的に使用する。
【０１４３】
抗体分子の抗原結合断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及び、ＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片、（ｖｉ）ラクダ科動物またはラクダ化した可変ドメイン、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及び、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照されたい、（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体がある。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得られるものであり、そして、これらの断片は、インタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングする。
【０１４４】
抗体分子は、インタクトな分子、ならびに、その機能的断片を含む。抗体分子の定常領域を改変して、例えば、変異して、抗体の特性を変更する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または、補体機能の１つ以上を加える、または、減らす）ことができる。
【０１４５】
抗体分子を、単一ドメイン抗体とすることができる。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例として、重鎖抗体、軽鎖を当初から含んでいない抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、改変した抗体、及び、抗体に由来するもの以外の単一ドメインスカフォールドがあるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、技術分野にあるいずれのものでもよく、または、今後のあらゆる単一ドメイン抗体とし得る。単一ドメイン抗体は、あらゆる種に由来し得るものであり、その種として、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及び、ウシがあるが、これらに限定されない。本発明の別の態様では、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いた重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ  ９４０４６７８に開示されている。明確にするために、当初より軽鎖を欠いている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、本明細書では、それを、四本鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、ＶＨＨ、または、ナノボディとしている。そのようなＶＨＨ分子は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及び、グアナコで産生した抗体から誘導することができる。Ｃａｍｅｌｉｄａｅ以外のその他の種は、当初より軽鎖を欠いている重鎖抗体を産生し得るものであり、そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０１４６】
ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲまたはＦＷ）と命名した保存が進んだ領域が点在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と命名した超可変の領域に細分することができる。
【０１４７】
フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、幾つかの方法によって正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；及び、ｔｈｅ  ＡｂＭ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．一般的には、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：  Ｄｕｅｂｅｌ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい）。
【０１４８】
本明細書で使用する用語「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、抗原特異性、及び、結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列のことを指す。一般的に、各重鎖可変領域には、３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が、また、各軽鎖可変領域には、３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。
【０１４９】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム），  Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）に記載のものを含めて、幾つかの公知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。本明細書では、「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバースキームに従って定義したＣＤＲを、「超可変ループ」と呼ぶことがある。
【０１５０】
例えば、Ｋａｂａｔでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）でのＣＤＲアミノ酸残基には、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び、９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付与されており、また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）でのＣＤＲアミノ酸残基には、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び、８９〜９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付与されている。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶＨでのＣＤＲアミノ酸には、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、及び、９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付与されており、また、ＶＬでのアミノ酸残基には、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び、９１〜９６（ＬＣＤＲ３）の番号が付与されている。
【０１５１】
各ＶＨ及びＶＬは、一般的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置した３つのＣＤＲ、及び、４つのＦＲを含む。
【０１５２】
抗体分子を、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とすることができる。
【０１５３】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の調製物のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性とを示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって、または、ハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、組換え法）で作製することができる。
【０１５４】
抗体は、組換え的に生成させることができ、例えば、ファージディスプレイ、または、組み合わせ的方法で生成させることができる。
【０１５５】
抗体を作製するためのファージディスプレイ、及び、組み合わせ的方法は、技術分野において公知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ  ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；及び、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２、に記載の通りであり、これら文献の全内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する）。
【０１５６】
ある実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を産生するように遺伝子操作したマウスで作製した抗体）、または、非ヒト抗体、例えば、齧歯類（マウス、または、ラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は、齧歯類（マウス、または、ラット抗体）である。齧歯類抗体を産生する方法は、技術分野で公知である。
【０１５７】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろ、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。目的の抗原で免疫処置したこれらのトランスジェニックマウスの脾細胞を使用して、ヒトタンパク質由来のエピトープに対して特異的親和性を有するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生産する（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＷＯ  ９１／００９０６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９１／１０７４１号；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＷＯ  ９２／０３９１８号；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第９２／０３９１７号；Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６を参照されたい）。
【０１５８】
抗体分子を、可変領域、または、その一部、例えば、ＣＤＲが、非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生成することができる。キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、及び、ヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生成され、次いで、例えば、可変フレームワーク、または、定常領域において修飾を施して、ヒトにおける抗原性を減少させる抗体分子は、本発明の範囲内である。
【０１５９】
「実質的にヒト」タンパク質は、中和抗体応答、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を実質的に惹起しないタンパク質である。ＨＡＭＡは、例えば、抗体分子を繰り返し投与する場合に、例えば、慢性または再発性の疾患病態の処置において、幾つかの状況において問題を招く。ＨＡＭＡ応答は、血清からの抗体クリアランスを増大するものであり（例えば、Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３２：１８０−１９０（１９９０）を参照されたい）、また、潜在的なアレルギー反応（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５：５１１７−５１２３（１９８６）を参照されたい）が故に、反復抗体投与を潜在的に無効にしかねない。
【０１６０】
キメラ抗体は、技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術で作製することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願第ＷＯ  ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；及び、Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｊ．  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１５５３−１５５９を参照されたい）。
【０１６１】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、ドナーＣＤＲで置換した（重、及び／または、軽免疫グロブリン鎖の）少なくとも１つ、または、２つ、しかし、一般的には、３つすべてのレシピエントＣＤＲを有する。抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と置換し得る、あるいは、一部のＣＤＲだけを、非ヒトＣＤＲと置換し得る。必要なことは、抗原への結合に必要とする個数のＣＤＲを交換することである。好ましくは、ドナーは、齧歯類抗体、例えば、ラットまたはマウス抗体であり、そして、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。一般的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンを「ドナー」と称し、そして、フレームワークを提供する免疫グロブリンを「アクセプター」と称する。ある実施形態では、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば、齧歯類）である。アクセプターフレームワークは、天然に存在する（例えば、ヒトの）フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、あるいは、それらと、約８５％以上、好ましくは、９０％、９５％、９９％以上が同一の配列である。
【０１６２】
本明細書で使用する用語「コンセンサス配列」とは、関連配列のファミリーにおいて最も頻繁に存在するアミノ酸（または、ヌクレオチド）から形成した配列のことを指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７）を参照されたい）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列での各位置は、ファミリーにおいて、その位置に最も頻繁に存在するアミノ酸が占有している。２つのアミノ酸が同じ頻度で出現する場合は、どちらのものでも、コンセンサス配列に含めることができる。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列でのフレームワーク領域のことを指す。
【０１６３】
抗体分子は、技術分野で公知の方法でヒト化することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７，  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，による、１９８６，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４，及び、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による、ＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１、及び、ＵＳ５，６９３，７６２を参照されたく、また、これら全文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する）。
【０１６４】
ヒト化またはＣＤＲグラフト抗体分子は、ＣＤＲグラフティングまたはＣＤＲ置換で生産することができ、免疫グロブリン鎖の１つ、２つ、または、すべてのＣＤＲを置換することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１：４０５３−４０６０；Ｗｉｎｔｅｒ  ＵＳ５，２２５，５３９を参照されたく、また、これら全文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得るＣＤＲグラフティング方法（１９８７年３月２６日に出願した英国特許出願第ＧＢ  ２１８８６３８Ａ号；Ｗｉｎｔｅｒ  ＵＳ５，２２５，５３９）を記載しており、それらの内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１６５】
特定のアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されているヒト化抗体分子も、本発明の範囲内である。ドナーからアミノ酸を選択するための基準は、ＵＳ５，５８５，０８９、例えば、ＵＳ５，５８５，０８９の第１２〜１６欄、例えば、５，５８５，０８９の第１２〜１６列に記載されており、その内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。抗体をヒト化するための他の技術は、１９９２年１２月２３日に公開されたＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＰ５１９５９６  Ａ１に記載されている。
【０１６６】
抗体分子を、一本鎖抗体とすることができる。一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）を遺伝子操作することができる（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ、Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８８０：２６３−８０；及び、Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：２４５−５２を参照されたい）。一本鎖抗体を、二量体化または多量体化して、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を作製することができる。
【０１６７】
さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥの重鎖定常領域、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４の（例えば、ヒトの）重鎖定常領域から選択した重鎖定常領域を有する。その他の実施形態では、抗体分子は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒトの）軽鎖定常領域から選択した軽鎖定常領域を有する。定常領域を、改変して、例えば、変異させて、抗体の特性に修飾を施す（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の個数、エフェクター細胞機能、及び／または、補体機能の１つ以上を加える、または、減らす）ことができる。ある実施形態では、抗体は、エフェクター機能を有しており、そして、補体を定着させることができる。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低下しているか、または、それを全く有していない。例えば、それは、アイソタイプまたはサブタイプ、断片またはその他の変異体であり、Ｆｃ受容体への結合を支持しておらず、例えば、それは、変異誘発、または、欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。
【０１６８】
抗体定常領域を改変する方法は、技術分野で公知である。改変した機能を有する抗体、例えば、細胞のＦｃＲ、または、補体のＣ１成分などのエフェクターリガンドに対する改変した親和性は、抗体の定常部分の少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なる残基で置換することによって、生成することができる（例えば、ＥＰ  ３８８，１５１  Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号、及び、米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたく、また、これらの文献の全内容を本明細書の一部を構成するものとして援用する）。マウスまたは他の種の免疫グロブリンに適用して、これらの機能を低下させる、あるいは、排除するような場合にも、同様のタイプの改変を説明することができる。
【０１６９】
抗体分子は、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化、あるいは、連結することができる。本明細書で使用する「誘導体化」抗体分子とは、修飾が施されたものである。誘導体化の方法として、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、毒素、酵素、または、ビオチンなどの親和性リガンドの添加があるが、これらに限定されない。したがって、本発明の抗体分子は、免疫接着分子を含む、本明細書に記載した抗体の誘導体化形態、及び、その他の修飾形態を含むことを意図している。例えば、抗体分子は、別の抗体（例えば、二重特異性抗体、または、ダイアボディ）、検出可能な作用物質、細胞傷害性作用物質、医薬品、及び／または、抗体または抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域、または、ポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができるタンパク質またはペプチドの１つ以上の他の分子実体に対して、（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合、または、その他で）機能的に連結することができる。
【０１７０】
あるタイプの誘導体化抗体分子を、（例えば、二重特異性抗体を作製するために、タイプが同じの、または、タイプが異なる）２つ以上の抗体を架橋して生成させる。適切な架橋剤として、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、または、ホモ二官能性（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）で分離した２つの別個の反応性の基を有するヘテロ二官能性のものがある。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手可能である。
【０１７１】
多重特異性抗体分子
実施形態では、多重特異性抗体分子は、２つ以上の抗原結合部位を含むことができ、そこでは、異なる部位が、異なる抗原に対して特異的である。実施形態では、多重特異性抗体分子は、同じ抗原の２つ以上（例えば、２つ、または、それ以上）のエピトープに結合することができる。実施形態では、多重特異性抗体分子は、標的細胞（例えば、がん細胞）に対して特異的な抗原結合部位と、免疫エフェクター細胞に対して特異的な異なる抗原結合部位とを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体分子は、５つの異なる構造群、（ｉ）二重特異性免疫グロブリンＧ（ＢｓＩｇＧ）、（ｉｉ）追加の抗原結合部分を付加したＩｇＧ、（ｉｉｉ）二重特異性抗体断片、（ｉｖ）二重特異性融合タンパク質、及び、（ｖ）二重特異性抗体コンジュゲート、に分類することができる。
【０１７２】
ＢｓＩｇＧは、各抗原に対して一価であるフォーマットである。ＢｓＩｇＧフォーマットの例として、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツー−イン−ワン）、ＤＡＦ（フォー−イン−ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ、ノブ−イン−ホール、共通ＬＣ、ノブ−イン−ホールアセンブリ、チャージペア、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、トリオマブ、ＬＵＺ−Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ−ボディ、直交Ｆａｂがあるが、これらに限定されない。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＢｓＩｇＧの例として、抗ＣＤ３アームと、抗ＥｐＣＡＭアームとを含む、カツマキソマブ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ、Ｎｅｏｐｈａｒｍ）、及び、ＣＤ３及びＨＥＲ２を標的とするエルツマキソマブ（Ｎｅｏｖｉｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）がある。幾つかの実施形態では、ＢｓＩｇＧは、ヘテロ二量体化のために遺伝子操作した重鎖を含む。例えば、「ノブ−イン−ホール」手法、ＳＥＥＤプラットフォーム、一般的な重鎖（例えば、κλ−ボディでの）、及び、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の使用を介し、重鎖をヘテロ二量体化のために遺伝子操作することができる。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＢｓＩｇＧでのホモ二量体の重鎖の対形成を回避するために用いた手法は、ノブ−イン−ホール、デュオボディ、ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、電荷対、ＨＡ−ＴＦ、ＳＥＥＤボディ、及び、異なるプロテインＡ親和性を含む。同文献を参照されたい。
【０１７３】
ＢｓＩｇＧは、異なる宿主細胞における成分抗体の別々の発現と、その後のＢｓＩｇＧへの精製／組み立てとによって、産生することができる。また、ＢｓＩｇＧは、単一の宿主細胞における成分抗体の発現でも産生することができる。ＢｓＩｇＧは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、例えば、プロテインＡ、及び、連続的ｐＨ溶出を使用して、精製することができる。
【０１７４】
追加の抗原結合部分を付加したＩｇＧは、二重特異性抗体分子のその他のフォーマットである。例えば、単一特異性ＩｇＧは、例えば、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端で、追加の抗原結合単位を単一特異性ＩｇＧに付加することで、二重特異性を有するように遺伝子操作することができる。追加の抗原結合単位の例として、単一ドメイン抗体（例えば、可変重鎖、または、可変軽鎖）、遺伝子操作したタンパク質スカフォールド、及び、対になった抗体可変ドメイン（例えば、一本鎖可変断片、または、可変断片）がある。同文献を参照されたい。付加したＩｇＧフォーマットの例として、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ−Ｉｇ）、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ、Ｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＫＩＨ  ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、ｚｙｂｏｄｙ、及び、ＤＶＩ−ＩｇＧ（フォー−イン−ワン）がある。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＩｇＧ−ｓｃＦｖの例として、ＭＭ−１４１（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）があり、このものは、ＩＧＦ−１Ｒ及びＨＥＲ３に結合する。ＤＶＤ−Ｉｇの例として、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに結合するＡＢＴ−９８１（ＡｂｂＶｉｅ）、及び、ＴＮＦ及びＩＬ−１７Ａに結合するＡＢＴ−１２２（ＡｂｂＶｉｅ）がある。
【０１７５】
二重特異性抗体断片（ＢｓＡｂ）は、抗体定常ドメインの一部または全部を欠いた二重特異性抗体分子のフォーマットである。例えば、幾つかのＢｓＡｂは、Ｆｃ領域を欠いている。実施形態では、二重特異性抗体断片は、単一の宿主細胞でのＢｓＡｂの効率的な発現を可能にするペプチドリンカーで連結した重鎖領域と軽鎖領域とを含む。二重特異性抗体断片の例として、ナノボディ、ナノボディ−ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３  ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、４価ＨＣＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、Ｄｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、及び、イントラボディがあるが、これらに限定されない。同文献を参照されたい。例えば、ＢｉＴＥフォーマットは、タンデムｓｃＦｖを含み、成分ｓｃＦｖは、Ｔ細胞のＣＤ３と、がん細胞の表面抗原とに結合する。
【０１７６】
二重特異性融合タンパク質は、その他のタンパク質に連結した抗体断片を含むことで、例えば、さらなる特異性、及び／または、機能性を付加する。二重特異性融合タンパク質の例は、ｉｍｍＴＡＣであり、このものは、ＨＬＡ提示ペプチドを認識する親和性成熟Ｔ細胞受容体に連結した抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む。実施形態では、ドック−アンド−ロック（ＤＮＬ）法は、高い原子価を有する二重特異性抗体分子を生成するために使用することができる。また、アルブミン結合タンパク質、または、ヒト血清アルブミンへの融合は、抗体断片の血清半減期を延ばすことができる。同文献を参照されたい。
【０１７７】
ＣＤＲグラフトしたスカフォールド
実施形態では、抗体分子は、ＣＤＲグラフトしたスカフォールドドメインである。実施形態では、スカフォールドドメインは、フィブロネクチンドメイン、例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいている。フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインの全体的な折り畳みは、最小の機能的抗体断片、すなわち、抗体重鎖の可変ドメインの折り畳みに密接に関連している。Ｆｎ３の端部には３つのループがあり、ＢＣ、ＤＥ、及び、ＦＧループの位置は、抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１、２、及び、３の位置にほぼ対応している。Ｆｎ３は、ジスルフィド結合を持たないので、Ｆｎ３は、抗体、及び、それらの断片とは異なり、還元条件下で安定である（例えば、ＷＯ  ９８／５６９１５、ＷＯ  ０１／６４９４２、ＷＯ  ００／３４７８４を参照されたい）。Ｆｎ３ドメインに、（例えば、本明細書に記載したＣＤＲまたは超可変ループを使用して）修飾を施したり、あるいは、改変を加えたりして、例えば、本明細書に記載した抗原／マーカー／細胞に結合するドメインを選択することができる。
【０１７８】
実施形態では、スカフォールドドメイン、例えば、折り畳みドメインは、抗体、例えば、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインに由来する３つのベータ鎖を欠失させて作製した「ミニボディ」スカフォールドに基づく（例えば、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：９、及び、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５３０３−５３０９を参照されたい）。この「ミニボディ」を使用して、２つの超可変ループを提示することができる。実施形態では、スカフォールドドメインは、Ｖ様ドメインであり（例えば、Ｃｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９９／４５１１０を参照されたい）、あるいは、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された７４残基の６本鎖ベータシートサンドイッチである（例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｅｓｓ，１９９５，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０を参照されたい）。例えば、テンダミスタチンのループに、（例えば、ＣＤＲまたは超可変ループを使用して）修飾を施したり、あるいは、改変を加えたりして、例えば、本明細書に記載したマーカー／抗原／細胞に結合するドメインを選択することができる。別のスカフォールドドメインの例として、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに由来するベータ−サンドイッチ構造がある（例えば、ＷＯ  ００／６００７０を参照されたい）。
【０１７９】
その他のスカフォールドドメインの例として、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ＥＧＦリピート）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、クニッツドメイン、エコチン、ＢＰＴＩなど）、ＴＰＲリピート、トリフォイル構造、ジンクフィンガードメイン、ＤＮＡ結合タンパク質、特に、単量体ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、酵素、例えば、プロテアーゼ（特に、不活性化したプロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ、シャペロン、例えば、チオレドキシン、及び、熱ショックタンパク質、及び、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＨ２、及び、ＳＨ３ドメインなど）があるが、これらに限定されない。例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、ＵＳ  ２００４０００９５３０、及び、ＵＳ  ７，５０１，１２１を参照されたい。
【０１８０】
実施形態では、スカフォールドドメインは、例えば、以下の基準、（１）アミノ酸配列、（２）幾つかの相同ドメインの配列、（３）三次元構造、及び／または、４）ｐＨの範囲、温度、塩分、有機溶媒、酸化剤濃度にわたる安定性データ、の１つ以上によって評価、及び、選択をする。実施形態では、スカフォールドドメインは、小さく安定なタンパク質ドメイン、例えば、１００、７０、５０、４０、または、３０個未満のアミノ酸のタンパク質である。ドメインは、１つ以上のジスルフィド結合を含み得るものであり、あるいは、金属、例えば、亜鉛をキレート化し得る。
【０１８１】
本明細書で定義する多重機能性分子の構造の例を、以下に記載する。Ｗｅｉｄｌｅ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１−１８（２０１３）；及び、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７：９５−１０６に、例示的な構造がさらに記載されており、これら各々の文献の全内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する）。
【０１８２】
ヘテロ二量体化抗体分子
ヘテロ二量体化二重特異性抗体は、天然のＩｇＧ構造に基づいており、２つの結合アームは、異なる抗原を認識する。定義された一価（及び、同時）抗原結合を可能にするＩｇＧ由来フォーマットは、軽鎖の誤対合（例えば、一般的な軽鎖）を最小限に抑える技術と組み合わせて、強制重鎖ヘテロ二量体化で生成する。強制重鎖ヘテロ二量体化は、例えば、ノブ−イン−ホール、または、鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）を使用して得ることができる。
【０１８３】
ノブ−イン−ホール
ＵＳ５，７３１，１１６、ＵＳ７，４７６，７２４、及び、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７−６２１に記載されたノブ−イン−ホールは、（１）一方または双方の抗体のＣＨ３ドメインを変異させてヘテロ二量体化を促進すること、及び、（２）ヘテロ二量体化を促進する条件下で変異抗体を組み合わせること、と広く関連している。「ノブ」または「突起」は、一般的には、親抗体での小さなアミノ酸を、より大きなアミノ酸で置換して作り出される（例えば、Ｔ３６６ＹまたはＴ３６６Ｗ）ものであり、「ホール」または「空洞」は、親抗体での大きい残基を、より小さいアミノ酸で置換して作り出される（例えば、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／または、Ｙ４０７Ｖ）ものである。ある実施形態では、ノブを含む重鎖ポリペプチドは、Ｅｕ付番方式に従って番号を付与したＴ３６６Ｗ、及び、Ｓ３５４Ｃの置換を含む。ある実施形態では、ホールを含む重鎖ポリペプチドは、Ｅｕ番号付けシステムに従って番号を付与したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及び、Ｙ３４９Ｃの置換を含む。ある実施形態では、本明細書に開示した多重特異性抗体分子は、第１の重鎖ポリペプチドと、第２の重鎖ポリペプチドとを含み、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｅｕ番号付けシステムに従って番号を付与したＴ３６６Ｗ、及び、Ｓ３５４Ｃの置換を含み、かつ、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｅｕ番号付けシステムに従って番号を付与したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及び、Ｙ３４９Ｃの置換を含む。
【０１８４】
鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）
ＳＥＥＤは、優先的にヘテロ二量体化する非同一鎖を作製するためのＩｇＧ１とＩｇＡとの間の配列交換に基づく。ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインにおけるヒトＩｇＡ及びＩｇＧに由来する交互配列は、ＡＧ及びＧＡと称する、非対称であるが、相補的な２つのドメインを生成する。このＳＥＥＤ設計は、ＡＧとＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインとのホモ二量体化を嫌う一方で、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする。
【０１８５】
一般的な軽鎖及びＣｒｏｓｓＭａｂ
二重特異性ＩｇＧの均質な調製物を作製するためには、軽鎖の誤対合を避けなければならない。これを達成するための１つの方法として、共通の軽鎖原理、すなわち、１本の軽鎖を共有するが、依然として別々の特異性を有する、２つのバインダーを組み合わせることがある。別の選択肢は、二重特異性抗体の半分のＦａｂでのＣＨ１及びＣＬドメインを交換することで、非特異的なＬ鎖の誤対合を回避するＣｒｏｓｓＭａｂ技術である。そのようなクロスオーバー変異体は、結合特異性と親和性とを保持するが、２つのアームを、非常に異なるものにして、Ｌ鎖の誤対合を防止する。
【０１８６】
抗体をベースにした融合物
抗体のＮまたはＣ末端に結合した追加の結合実体を含む、様々なフォーマットを生成することができる。一本鎖、または、ジスルフィド安定化ＦｖまたはＦａｂを有するこれらの融合物は、各抗原に対して二価の結合特異性を有する四価の分子の生成をもたらす。ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂとＩｇＧとの組み合わせは、３つ以上の異なる抗原を認識することができる分子の生成を可能にする。
【０１８７】
抗体−Ｆａｂ融合物
抗体−Ｆａｂ融合物は、第１の標的に対する従来の抗体と、抗体重鎖のＣ末端と融合した第２の標的に対するＦａｂとを含む二重特異性抗体である。通常、抗体とＦａｂは、共通の軽鎖を有する。抗体融合物は、（１）標的融合物のＤＮＡ配列を遺伝子操作すること、及び、（２）標的ＤＮＡを適切な宿主細胞にトランスフェクトして、融合タンパク質を発現すること、で産生することができる。Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１５９に記載されているように、抗体−ｓｃＦｖ融合物は、ＣＨ３ドメインのＣ末端と、ｓｃＦｖのＮ末端との間を、（Ｇｌｙ）−Ｓｅｒリンカーで連結し得る。
【０１８８】
抗体−ｓｃＦｖ融合物
抗体−ｓｃＦｖ融合体は、従来の抗体と、抗体重鎖のＣ末端と融合した独特の特異性のｓｃＦｖとを含む二重特異性抗体である。このｓｃＦｖは、ｓｃＦｖの重鎖を介して、直接に、または、リンカーペプチドを介してＣ末端と融合することができる。抗体融合物は、（１）標的融合物のＤＮＡ配列を遺伝子操作すること、及び、（２）標的ＤＮＡを適切な宿主細胞にトランスフェクトして、融合タンパク質を発現すること、で産生することができる。Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１５９に記載されているように、抗体−ｓｃＦｖ融合物は、ＣＨ３ドメインのＣ末端と、ｓｃＦｖのＮ末端との間を、（Ｇｌｙ）−Ｓｅｒリンカーで連結し得る。
【０１８９】
可変ドメイン免疫グロブリンＤＶＤ
関連フォーマットは、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）であり、このものは、さらに短いリンカー配列の近傍のＶドメインのＮ末端にある第２の特異性箇所のＶＨ及びＶＬドメインから構成されている。
【０１９０】
Ｆｃ含有実体（ミニ抗体）
Ｆｃ含有実体、別名、ミニ抗体は、ｓｃＦｖを、定常重領域ドメイン３のＣ末端（ＣＨ３−ｓｃＦｖ）、及び／または、異なる特異性を有する抗体のヒンジ領域（ｓｃＦｖ−ヒンジ−Ｆｃ）を融合することで生成することができる。三価の実体も生成することができ、これは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端と融合したジスルフィド安定化可変ドメイン（ペプチドリンカーは無い）を有する。
【０１９１】
Ｆｃ含有多重特異性分子
幾つかの実施形態では、本明細書で開示した多重特異性分子は、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を含む。例示的なＦｃ領域を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または、ＩｇＧ４の重鎖定常領域、より具体的には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または、ＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択することができる。
【０１９２】
幾つかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を、改変して、例えば、変異させて、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の個数、エフェクター細胞機能、または、補体機能の１つ以上を加える、または、減らす。
【０１９３】
他の実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１及び第２のＦｃ領域）の界面を、改変して、例えば、変異させて、例えば、遺伝子操作をしていない界面、例えば、天然に存在する界面と比較して、二量体化を加減する。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）の二量体化は、第１及び第２のＦｃ領域のＦｃ界面に、例えば、遺伝子操作していない界面と比較して、ホモ多量体に対するヘテロ多量体の比率を大きくするように、対になった突出−空洞（「ノブ−イン−ホール」）、静電相互作用、または、鎖交換の１つ以上を提供することで増強することができる。
【０１９４】
幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または、４０９の１つ以上から選択した位置に対になったアミノ酸置換を含む。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、（例えば、空洞またはホールに対応する）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、または、Ｙ４０７Ｖ、及び、（例えば、突起またはノブに対応する）Ｔ３６６Ｗから選択した対になったアミノ酸置換を含むことができる。
【０１９５】
幾つかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を改変しないで、例えば、変異しないで、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または、補体機能の１つ以上を加える、または、減らす。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または、４０９の１つ以上から選択した位置に対になったアミノ酸置換を含まない。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、（例えば、空洞またはホールに対応する）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、または、Ｙ４０７Ｖ、及び、（例えば、突起またはノブに対応する）Ｔ３６６Ｗから選択した対になったアミノ酸置換を含まない。
【０１９６】
その他の実施形態では、多重特異性分子は、半減期延長剤、例えば、ヒト血清アルブミン、または、ヒト血清アルブミンに対する抗体分子を含む。
【０１９７】
非隣接ポリペプチドを含む多重特異性分子
ある実施形態では、多重特異性分子は、単一のポリペプチド鎖ではない。
【０１９８】
ある実施形態では、抗体分子は、２つの完全重鎖と、２つの完全軽鎖とを含む。ある実施形態では、少なくとも２つ、または、少なくとも３つの非隣接ポリペプチド鎖を有する多重特異性分子は、例えば、本明細書に記載したような、少なくとも２つの非隣接ポリペプチド鎖に第１及び第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１及び第２のＦｃ領域）を含む。
【０１９９】
実施形態では、多重特異性分子は、二重特異性または二重機能性分子であり、第１及び第２のポリペプチド（ｉ）及び（ｉｉ）は、不連続であり、例えば、２本の別々のポリペプチド鎖である。幾つかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチド（ｉ）及び（ｉｉ）は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または、４０９の１つ以上から選択した位置での対になったアミノ酸置換を含む。例えば、第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１のＦｃ領域）は、（例えば、空洞またはホールに対応する）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、または、Ｙ４０７Ｖから選択したアミノ酸置換を、また、第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第２のＦｃ領域）は、（例えば、突起またはノブに対応する）Ｔ３６６Ｗを含むことができる。幾つかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、ヘテロ二量体での第１及び第２のＦｃ領域の第１及び第２のメンバーである。
【０２００】
実施形態では、多重特異性分子は、二重特異性または二重機能性分子であり、第１及び第２のポリペプチド（ｉ）及び（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２本の別々のポリペプチド鎖である。幾つかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチド（ｉ）及び（ｉｉ）は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９の１つ以上から選択した位置での対になったアミノ酸置換を含まない。
【０２０１】
幾つかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｎ−ツゥ−Ｃ（Ｎ−ｔｏ−Ｃ）に由来する以下の立体配置、
（ａ）第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば、Ｆａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１であって、任意にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結したＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結した第１の抗原、例えば、がん抗原、例えば、固形腫瘍、間質抗原、または、血液学的抗原に結合する、第１の抗原ドメインの第１の部分、
（ｂ）第２の抗原ドメインの第１の部分、例えば、Ｆａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１であって、任意にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結したＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結した第２の抗原、例えば、がん抗原、例えば、固形腫瘍、間質抗原、または、血液学的抗原に結合する、第２の抗原ドメインの第１の部分、
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−ツゥ−Ｃ（Ｎ−ｔｏ−Ｃ）に由来する以下の立体配置、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば、Ｆａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有しており、ＶＬは、カッパサブタイプであり、かつ、第１の抗原、例えば、がん抗原、例えば、固形腫瘍、間質抗原、または、血液学的抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合した同じがん抗原）に結合している、第３のポリペプチド、
（ｄ）第４のポリペプチドは、Ｎ−ツゥ−Ｃ（Ｎ−ｔｏ−Ｃ）に由来する以下の立体配置、第２の抗原ドメインの第２の部分、例えば、Ｆａｂの第２のＶＬ−ＣＬを有しており、ＶＬは、ラムダサブタイプであり、かつ、第２の抗原、例えば、がん抗原、例えば、固形腫瘍、間質抗原、または、血液学的抗原（例えば、第２のＶＨ−ＣＨ１によって結合した同じがん抗原）（例えば、この立体配置の例を図１Ａに示している）に結合している、第４のポリペプチドを有する。
【０２０２】
実施形態では、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載したように、突起またはノブを含む。実施形態では、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、本明細書に記載したように、突起またはノブを含んでいない。
【０２０３】
実施形態では、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促す。実施形態では、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含んでいない。実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促さない。
【０２０４】
腫瘍特異的標的化部分
特定の実施形態では、本明細書で開示した多重特異性抗体分子は、腫瘍標的化部分を含む。腫瘍標的化部分は、抗体分子（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）、受容体もしくは受容体断片、または、リガンドもしくはリガンド断片、または、それらの組み合わせから選択することができる。幾つかの実施形態では、腫瘍標的化部分は、腫瘍細胞（例えば、腫瘍細胞の表面に存在する分子、例えば、抗原）と会合する、例えば、それに結合する。特定の実施形態では、腫瘍標的化部分は、例えば、本明細書で開示した多重特異性分子を、がん（例えば、がん、または、腫瘍細胞）に向かわせる。幾つかの実施形態では、がんは、血液癌、固形癌、転移癌、または、それらの組み合わせから選択する。
【０２０５】
幾つかの実施形態では、多重特異性分子、例えば、腫瘍標的化部分は、固形腫瘍抗原または間質抗原に結合する。固形腫瘍抗原または間質抗原は、固形腫瘍、または、その転移性病変に存在することができる。幾つかの実施形態では、固形腫瘍は、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞、または、非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌、または、肝臓癌のうちの１つ以上から選択する。ある実施形態では、固形腫瘍は、線維性、または、線維形成性の固形腫瘍である。例えば、固形腫瘍抗原または間質抗原は、腫瘍、例えば、限定的腫瘍灌流、圧迫血管、または、線維性腫瘍間質のうちの１つ以上を有することを特徴とするクラスの腫瘍に存在することができる。
【０２０６】
特定の実施形態では、固形腫瘍抗原を、メソテリン、ガングロシド２（ＧＤ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ロンキナーゼ、ｃ−Ｍｅｔ、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャンネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−Ｂ受容体、ＡＦＰ、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、αアクチニン−４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ＮＡ８８−１、ＮＰＭ、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＲＣＣ、ＲＵＩ１、ＲＵＩ２、ＳＡＧＥ、ＴＲＧ、ＴＲＰ１、または、ＴＳＴＡの１つ以上から選択する。幾つかの実施形態では、固形腫瘍抗原を、メソテリン、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＰＳＣＡ、ＣＥＡ、ロンキナーゼ、または、ｃ−Ｍｅｔから選択する。幾つかの実施形態では、固形腫瘍抗原は、メソテリンである。
【０２０７】
サイトカイン分子
特定の実施形態では、本明細書で開示した多重特異性抗体分子は、サイトカイン分子をさらに含むことができる。
【０２０８】
サイトカインは、免疫応答の媒介物質であるタンパク質性シグナル伝達化合物である。それらは、増殖、分化、及び、細胞生存／アポトーシスを含む多くの異なる細胞機能を制御し、また、サイトカインは、ウイルス感染症、及び、自己免疫疾患を含む幾つかの病態生理学的プロセスにも関与している。サイトカインは、先天的（単球、マクロファージ、樹状細胞）免疫系と、適応的（Ｔ細胞、及び、Ｂ細胞）免疫系との双方の様々な細胞によって、様々な刺激を受けながら、合成される。サイトカインは、炎症誘発性性と抗炎症性の２つのグループに分類される。ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、及び、ＴＮＦ−アルファを含む炎症誘発性サイトカインは、主に、先天的免疫細胞、及び、Ｔｈ１細胞に由来する。ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−５を含む抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ２免疫細胞から合成する。
【０２０９】
本開示は、とりわけ、例えば、免疫調節性（例えば、前炎症性）サイトカイン、及び、その変異体、例えば、その機能的変異体などの１つ以上のサイトカイン分子を含むように遺伝子操作したものを含む、多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、幾つかの実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン、または、その変異体、例えば、その機能的変異体である。幾つかの実施形態では、インターロイキンは、炎症誘発性インターロイキンである。幾つかの実施形態では、インターロイキンは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、または、インターフェロンガンマから選択する。幾つかの実施形態では、インターロイキンは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）である。幾つかの実施形態では、サイトカイン分子は、炎症誘発性サイトカインである。
【０２１０】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示した多重特異性分子は、サイトカイン分子を含む。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインの全長、断片、または、変異体、サイトカイン受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体二量体化ドメイン、または、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えば、サイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）を含む。
【０２１１】
幾つかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、または、インターフェロンガンマ、または、それらの断片もしくは変異体、または、前述したサイトカインのいずれかの組み合わせから選択する。サイトカイン分子は、単量体または二量体とすることができる。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含むことができる。
【０２１２】
他の実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えば、ＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択したサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）である。
【０２１３】
免疫細胞エンゲージャー
特定の実施形態では、本明細書で開示した多重特異性抗体分子は、免疫細胞エンゲージャーを含むことができる。
【０２１４】
本明細書で開示した多重特異性分子の免疫細胞エンゲージャーは、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞への結合、及び／または、その活性化を媒介することができる。幾つかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、または、マクロファージ細胞エンゲージャー、または、それらの組み合わせから選択する。幾つかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、または、マクロファージ細胞エンゲージャー、または、それらの組み合わせのうちの１つ、２つ、３つ、または、すべてから選択する。免疫細胞エンゲージャーは、免疫系のアゴニストとすることができる。幾つかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、抗体分子、リガンド分子（例えば、免疫グロブリン定常領域、例えば、Ｆｃ領域をさらに含むリガンド）、小分子、ヌクレオチド分子を含むことができる。
【０２１５】
ナチュラルキラー細胞エンゲージャー
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、抗体非依存的に腫瘍及びウイルス感染細胞を認識して破壊する。ＮＫ細胞の調節は、ＮＫ細胞表面の受容体を活性化及び阻害することによって媒介される。活性化受容体の１つのファミリーは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及び、ＮＫｐ４６を含む天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）である。これらＮＣＲは、がん細胞をヘパラン硫酸が認識して腫瘍標的化を開始する。ＮＫＧ２Ｄは、活性化キラー（ＮＫ）細胞に対して刺激性及び共刺激性の先天的免疫応答の双方を提供し、細胞傷害活性をもたらす受容体である。ＤＮＡＭ１は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び、ＮＫ細胞によって媒介される細胞間接着、リンパ球シグナル伝達、細胞傷害性、及び、リンホカイン分泌に関与する受容体である。ＤＡＰ１０（別名、ＨＣＳＴ）は、ＫＬＲＫ１と会合して、リンパ系細胞及び骨髄系細胞において活性化受容体ＫＬＲＫ１−ＨＣＳＴを形成する膜貫通アダプタータンパク質であり、この受容体は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連ＭＩＣＡ、及び、ＭＩＣＢ、及び、Ｕ（任意に、Ｌ１）６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）などの細胞表面リガンドを発現する標的細胞に対する細胞傷害性の誘発において主要な役割を果たしており、ＫＬＲＫ１−ＨＣＳＴ受容体は、腫瘍に対する免疫監視において役割を果たし、そして、腫瘍細胞の細胞溶解に必要とされており、実際、ＫＬＲＫ１リガンドを発現しない黒色腫細胞は、ＮＫ細胞によって媒介される免疫監視から逃れる。ＣＤ１６は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する受容体であり、このものは、複合体化した、または、凝集したＩｇＧ、さらには、単量体ＩｇＧと結合し、それによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び、食作用などのその他の抗体依存性応答を媒介する。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ウイルス性赤血球凝集素（ＨＡ）であり、ＨＡとは、インフルエンザウイルスの表面に認められる糖タンパク質のことである。このものは、上気道や赤血球の細胞など、細胞膜にシアル酸が存在する細胞にウイルスを結合させる。ＨＡは、少なくとも１８種類の抗原を持っている。これらのサブタイプには、Ｈ１からＨ１８までの名称が付けられている。ＮＣＲは、ウイルスタンパク質を認識することができる。ＮＫｐ４６は、センダイウイルス及びニューカッスル病ウイルスを含む、インフルエンザのＨＡ、及び、パラミクソウイルスのＨＡ−ＮＡと相互作用できる、ことが示されている。ＮＫｐ４６の他に、ＮＫｐ４４も、異なるインフルエンザサブタイプのＨＡと機能的に相互作用することができる。
【０２１７】
本開示は、とりわけ、ＮＫ細胞への結合、及び／または、ＮＫ細胞の活性化を媒介する１つ以上のＮＫ細胞結合剤を含むように遺伝子操作している多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、または、双方）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、または、ＣＤ２４４（別名、ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４）に結合する（例えば、活性化する）抗原結合ドメイン、または、リガンドから選択する。幾つかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＮＫｐ３０またはＮＫｐ４６に結合する（例えば、活性化する）抗原結合ドメイン、または、リガンドから選択する。
【０２１８】
その他の実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ウイルスＨＡであるＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６のリガンドである。ウイルス血球凝集素（ＨＡ）は、ウイルスの表面にある糖タンパク質である。ＨＡタンパク質は、ウイルス膜と細胞膜との融合に寄与するシアル酸糖部分を介して、ウイルスの細胞膜への結合を可能にする（例えば、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１  Ｓｅｐ；３１（９）：２６８０−９  ”Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｂｙ  ＮＫｐ４４  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｙ  ＮＫｐ３０”；及び、Ｎａｔｕｒｅ．２００１  Ｆｅｂ  ２２；４０９（６８２３）：１０５５−６０”Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｎ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＮＫｐ４６  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ”を参照されたい。各文献の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。）。
【０２１９】
その他の実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、または、ＵＬＢＰ１から選択するＮＫＧ２Ｄのリガンドである。
【０２２０】
その他の実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＮＥＣＴＩＮ２またはＮＥＣＬ５から選択したＤＮＡＭ１のリガンドである。
【０２２１】
さらにその他の実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＮＫＧ２ＤのアダプターであるＤＡＰ１０のリガンドである（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  Ａ  ２００５  Ｍａｙ  ２４；１０２（２１）：７６４１−７６４６；及び、Ｂｌｏｏｄ、１５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１  Ｖｏｌｕｍｅ  １１８，  Ｎｏ．１１を参照されたい。各文献の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。）。
【０２２２】
その他の実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＣＤ１６のリガンドであり、このものは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンド、例えば、抗体Ｆｃ領域をさらに含むＣＤ１６ａ／ｂリガンドである（例えば、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：７６は、ＣＤ１６を介して、抗体がどのようにして、Ｆｃを用いてＮＫ細胞を誘発するかを論じており、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。）。
【０２２３】
Ｂ細胞、マクロファージ、及び、樹状細胞エンゲージャー
概して、Ｂ細胞、別名、Ｂリンパ球は、リンパ球サブタイプの白血球の一種である。それらは、抗体を分泌することによって、適応的免疫系の体液性免疫成分において機能する。加えて、Ｂ細胞は、抗原を提示し（それらは、プロ抗原提示細胞（ＡＰＣ）としても分類されている）、そして、サイトカインを分泌する。マクロファージは、食作用を介して、細胞片、外来物質、微生物、がん細胞を貪食して消化する白血球の一種である。食作用以外に、それらは、非特異的防御（先天的免疫）において重要な役割を果たし、そして、リンパ球のようなその他の免疫細胞を動員することで特異的防御機構（適応的免疫）を開始するのを補助する。例えば、それらは、Ｔ細胞に対する抗原提示体として重要である。炎症を増大させ、そして、免疫系を刺激すること以外に、マクロファージは、重要な抗炎症的役割を果たし、そして、サイトカインの放出を通して、免疫反応を減少させることもできる。樹状細胞（ＤＣ）は、抗原物質の処理において機能し、そして、それを免疫系のＴ細胞に対して、細胞表面に提示する抗原提示細胞である。
【０２２４】
本開示は、とりわけ、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／または、樹状細胞への結合、及び／または、それらの活性化を媒介するＢ細胞、マクロファージ、及び／または、樹状細胞エンゲージャーの１つ以上を含むように遺伝子操作をした多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。
【０２２５】
したがって、幾つかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子、ＯＸ４０に対する抗体分子、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニスト（例えば、本明細書に記載した、例えば、ＴＬＲ４、例えば、構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）、または、ＴＬＲ９アゴニスト）、４１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４７、または、ＳＴＩＮＧアゴニスト、または、それらの組み合わせの１つ以上から選択するＢ細胞、マクロファージ、及び／または、樹状細胞エンゲージャーを含む。
【０２２６】
幾つかの実施形態では、Ｂ細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、または、ＣＤ７０リガンド、または、ＯＸ４０、ＣＤ４０、もしくは、ＣＤ７０に結合する抗体分子である。
【０２２７】
幾つかの実施形態では、マクロファージエンゲージャーは、ＣＤ２アゴニストである。幾つかの実施形態では、マクロファージエンゲージャーとは、ＣＤ４０Ｌ、または、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインもしくはリガンド、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、本明細書に記載のもの）、例えば、ＴＬＲ９またはＴＬＲ４（例えば、ｃａＴＬＲ４（構成的に活性なＴＬＲ４）、ＣＤ４７、または、ＳＴＩＮＧアゴニストに結合する抗原結合ドメインである。幾つかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、または、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）である。幾つかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを、ビオチン化する。
【０２２８】
幾つかの実施形態では、樹状細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニストである。幾つかの実施形態では、樹状細胞エンゲージャーは、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢ、ＴＬＲアゴニスト（例えば、本明細書に記載のもの）（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ４（例えば、ｃａＴＬＲ４（構成的に活性なＴＬＲ４））、ＣＤ４７、または、ＳＴＩＮＧアゴニストの１つ以上に結合する、リガンド、受容体アゴニスト、または、抗体分子である。幾つかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、または、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）である。幾つかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを、ビオチン化する。
【０２２９】
その他の実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／または、樹状細胞の１つ以上への結合、または、それらの活性化を媒介する。例示的なＢ細胞、マクロファージ、及び／または、樹状細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣＤ７０リガンド、ＣＤ４０またはＣＤ７０に結合する抗体分子、ＯＸ４０に対する抗体分子、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば、構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）、または、ＴＬＲ９アゴニスト）、４１ＢＢアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ４７、または、ＳＴＩＮＧアゴニスト、または、それらの組み合わせの１つ以上から選択することができる。
【０２３０】
幾つかの実施形態では、Ｂ細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、または、ＣＤ７０リガンド、または、ＯＸ４０、ＣＤ４０、もしくは、ＣＤ７０に結合する抗体分子の１つ以上から選択する。
【０２３１】
その他の実施形態では、マクロファージ細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、抗体分子、ＯＸ４０、ＣＤ４０、もしくは、ＣＤ７０に結合する同抗体分子、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、もしくは、その断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば、構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニスト、または、ＳＴＩＮＧアゴニストの１つ以上から選択する。
【０２３２】
その他の実施形態では、樹状細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、もしくは、その断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニスト、または、ＳＴＩＮＧアゴニストの１つ以上から選択する。
【０２３３】
さらに他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）、または、それらの組み合わせを含み、任意に、２’、５’、または、３’、５’リン酸結合を含む。
【０２３４】
Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、Ｄｒｏｓｏｒｐｈｉｌａ  Ｔｏｌｌタンパク質と同種である進化的に保存された受容体であり、かつ、高度に保存された構造モチーフ、別名、専ら、微生物病原体によって発現する、病原体関連微生物パターン（ＰＡＭＰ）、または、壊死細胞もしくは死滅細胞から放出される内因性分子である危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識する。ＰＡＭＰは、リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、及び、リポペプチド、ならびに、フラジェリン、細菌ＤＮＡ、及び、ウイルス二本鎖ＲＮＡなどの様々な細菌細胞壁成分を含む。ＤＡＭＰは、熱ショックタンパク質のような細胞内タンパク質、ならびに、細胞外マトリックス由来のタンパク質断片を含む。対応するＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによるＴＬＲの刺激は、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ、及び、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）などの転写因子の活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。ＴＬＲによるシグナル伝達は、適応的免疫応答を指示するインターフェロン（ＩＦＮ）、炎症誘発性サイトカイン、及び、エフェクターサイトカインの産生を含む、様々な細胞応答をもたらす。ＴＬＲは、数多くの炎症性、及び、免疫性障害に関係しており、そして、がんにおいて役割を果たす（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  Ｓ．＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．，２００９．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：５７−６３．）。
【０２３５】
ＴＬＲは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む細胞外ドメインと、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと称する保存領域を含む細胞質テールとを特徴とするＩ型膜貫通タンパク質である。１０個のヒト、及び、１２個のマウスＴＬＲ、すなわち、ヒトにおいてＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０、そして、マウスにおいてＴＬＲ１〜ＴＬＲ９、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、及び、ＴＬＲ１３が特徴付けられており、ＴＬＲ１０の相同体は偽遺伝子である。ＴＬＲ２は、細菌性リポタンパク質、リポマンナン、及び、リポテイコ酸などのグラム陽性細菌由来の種々のＰＡＭＰの認識に必須である。ＴＬＲ３は、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡに関与している。ＴＬＲ４は、主に、リポ多糖によって活性化される。ＴＬＲ５は、細菌性フラジェリンを検出し、また、ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡに対する応答に必要である。最後に、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、小さな合成抗ウイルス分子を認識し、そして、一本鎖ＲＮＡが、それらの天然リガンドであると報告されている。ＴＬＲ１１は、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉと、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ由来のプロフィリン様タンパク質とを認識する、ことが報告されている。ＴＬＲの特異性のレパートリーは、ＴＬＲが互いにヘテロ二量体化する能力によって明らかに広がっている。例えば、ＴＬＲ２とＴＬＲ６との二量体は、ジアシル化リポタンパク質に対する応答に必要とされており、一方で、ＴＬＲ２とＴＬＲ１とは、トリアシル化リポタンパク質を認識するために相互作用する。また、ＴＬＲの特異性は、ＬＰＳに応答してＴＬＲ４と複合体を形成するＭＤ−２とＣＤ１４のような様々なアダプター分子及びアクセサリー分子による影響も受ける。
【０２３６】
ＴＬＲシグナル伝達は、少なくとも２つの異なる経路、炎症性サイトカインの産生をもたらすＭｙＤ８８依存性経路、及び、ＩＦＮ−βの刺激及び樹状細胞の成熟に関連するＭｙＤ８８非依存性経路からなる。このＭｙＤ８８依存性経路は、ＴＬＲ３以外のすべてのＴＬＲに共通している（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ.、１９９８．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＩＬ−１−  ａｎｄ  ＩＬ−１８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．９（１）：１４３−５０）。ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによる活性化の際に、ＴＬＲはヘテロまたはホモ二量体化して、細胞質ＴＩＲドメインを介して、アダプタータンパク質の動員を誘導する。個々のＴＬＲは、異なるアダプター分子の使用によって、異なるシグナル伝達応答を誘導する。ＴＬＲ４及びＴＬＲ２シグナル伝達は、ＭｙＤ８８依存性経路に関与しているアダプターＴＩＲＡＰ／Ｍａｌを必要とする。ＴＬＲ３は、アダプターＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１を介して、ＭｙＤ８８とは無関係に、二本鎖ＲＮＡに応答してＩＦＮ−βの産生を誘発する。ＴＲＡＭ／ＴＩＣＡＭ−２は、機能がＴＬＲ４経路に限定されるＭｙＤ８８非依存性経路に関与する別のアダプター分子である。
【０２３７】
ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び、ＴＬＲ９は、ウイルス核酸を認識し、そして、Ｉ型ＩＦＮを誘導する。Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらすシグナル伝達メカニズムは、活性化したＴＬＲに応じて異なる。それらは、抗ウイルス防御、細胞増殖、及び、免疫調節において重要な役割を果たすことが知られている転写因子のファミリーであるインターフェロン調節因子、ＩＲＦと関係している。３つのＩＲＦ（ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、及び、ＩＲＦ７）は、ウイルス媒介ＴＬＲシグナル伝達の直接的トランスデューサーとして機能する。ＴＬＲ３及びＴＬＲ４は、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７を活性化し、一方で、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、ＩＲＦ５及びＩＲＦ７を活性化する（Ｄｏｙｌｅ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２００２．ＩＲＦ３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ＴＬＲ３／ＴＬＲ４−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１７（３）：２５１−６３）。さらに、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧ−Ａで刺激したＩ型ＩＦＮ産生は、ＰＩ（３）Ｋ及びｍＴＯＲによって媒介される、ことが示されている（Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ  Ｍ．＆  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ．２００８．ＲＡＰｐｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅＩ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｐＤＣｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍＴＯＲ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０９７−１０９９）。
【０２３８】
ＴＬＲ−９
ＴＬＲ９は、ＤＮＡ分子での非メチル化ＣｐＧ配列を認識する。ＣｐＧ部位は、細菌ゲノムまたはウイルスＤＮＡと比較して、脊椎動物ゲノムでは比較的に稀である（約１％）。ＴＬＲ９は、Ｂリンパ球、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び、形質細胞様樹状細胞などの免疫系の数多くの細胞によって発現される。ＴＬＲ９は、エンドソーム区画で細胞内発現を受け、そして、ＣｐＧモチーフに富むＤＮＡに結合することで、ウイルス及び細菌感染の免疫系を警告するように機能する。ＴＬＲ９シグナルは、炎症促進反応を開始させる細胞の活性化をもたらし、その結果、Ｉ型インターフェロン及びＩＬ−１２などのサイトカインを産生する。
【０２３９】
ＴＬＲアゴニスト
ＴＬＲアゴニストは、１つ以上のＴＬＲ、例えば、ヒトＴＬＲ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、または、１０の１つ以上をアゴナイズする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載した補助剤は、ＴＬＲアゴニストである。幾つかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ヒトＴＬＲ−９を特異的にアゴナイズする。幾つかの実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニストは、ＣｐＧ部分である。本明細書で使用するＣｐＧ部分とは、配列：５’−Ｃ−ホスフェート−Ｇ−３’、すなわち、唯一のホスフェートによって分離されているシトシンとグアニンとを有する直鎖状ジヌクレオチドである。
【０２４０】
幾つかの実施形態では、ＣｐＧ部分は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または、それ以上の個数のＣｐＧジヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ＣｐＧ部分は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、３０個のＣｐＧジヌクレオチドからなる。幾つかの実施形態では、ＣｐＧ部分は、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、５〜１０、５〜２０、５〜３０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、または、１０〜５０個のＣｐＧジヌクレオチドを有する。
【０２４１】
幾つかの実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニストは、合成ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）である。ＣｐＧ  ＯＤＮは、特定の配列（ＣｐＧモチーフ）に関連して、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する短い合成一本鎖ＤＮＡ分子である。ゲノム細菌ＤＮＡに認められる天然ホスホジエステル（ＰＯ）骨格とは対照的に、ＣｐＧ  ＯＤＮは、部分的または完全に、ホスホロチオエート化（ＰＳ）骨格を有する。ＣｐＧ  ＯＤＮには３つの主要なクラス、すなわち、クラスＡ、Ｂ、及び、Ｃがあり、それらは、それらの免疫刺激活性において異なる。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮは、ＰＯ中心ＣｐＧ含有パリンドロームモチーフ、及び、ＰＳ修飾３’ポリＧストリングを特徴とする。それらは、ｐＤＣから大量のＩＦＮ−αの産生を誘導するが、ＴＬＲ９依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達、及び、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６）産生の弱い刺激物質である。ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを有する完全なＰＳ骨格を含む。それらは、Ｂ細胞及びＴＬＲ９依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達を強く活性化するが、ＩＦＮ−α分泌は弱く刺激する。ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、クラスＡとＢの双方の機能を兼ね備えている。それらは、完全なＰＳ骨格と、ＣｐＧ含有パリンドロームモチーフとを含む。ＣクラスＣｐＧ  ＯＤＮは、ｐＤＣから強力なＩＦＮ−α産生と、Ｂ細胞刺激とを誘導する。
【０２４２】
多重特異性抗体分子の例
カッパ及びラムダ多重特異性抗体分子の例を、表１７及び１８に提供する。
【表１７−１】
2019531725.tif 000002
【表１７−２】
2019531725.tif 000003
【表１７−３】
2019531725.tif 000004
【表１８−１】
2019531725.tif 000005
【表１８−２】
2019531725.tif 000006
【０２４３】
核酸
また、本発明は、本明細書に記載したように、抗体分子の重鎖及び軽鎖可変領域ならびにＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。例えば、本発明は、本明細書に開示した抗体分子の１つ以上から選択した抗体分子の重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれをコードする第１及び第２の核酸を特徴とする。核酸は、本明細書の表に記載したヌクレオチド配列、または、それらと実質的に同一の（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一である）配列、または、本明細書の表に記載した配列と、３、６、１５、３０、または、４５個未満のヌクレオチドが異なる配列を含むことができる。
【０２４４】
特定の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載したアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に由来するＣＤＲまたは超可変ループの少なくとも１つ、２つ、または、３つをコードするヌクレオチド配列、または、それらと実質的に相同な配列（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一であり、及び／または、１つ以上の置換、例えば、保存的置換を有する配列）を含むことができる。その他の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に由来するＣＤＲまたは超可変ループの少なくとも１つ、２つ、または、３つをコードするヌクレオチド配列、または、それらと実質的に相同な配列（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一であり、及び／または、１つ以上の置換、例えば、保存的置換を有する配列）を含むことができる。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載したアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変領域に由来するＣＤＲまたは超可変ループの少なくとも１つ、２つ、４つ、５つ、または、６つをコードするヌクレオチド配列、または、それらと実質的に相同な配列（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一であり、及び／または、１つ以上の置換、例えば、保存的置換を有する配列）を含むことができる。
【０２４５】
特定の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載したヌクレオチド配列を有する重鎖可変領域に由来するＣＤＲまたは超可変ループの少なくとも１つ、２つ、または、３つをコードするヌクレオチド配列、それらと実質的に相同な配列（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一であり、及び／または、本明細書に記載したストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列）を含むことができる。別の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載したヌクレオチド配列を有する軽鎖可変領域に由来するＣＤＲまたは超可変ループの少なくとも１つ、２つ、または、３つをコードするヌクレオチド配列、または、それらと実質的に相同な配列（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一であり、及び／または、本明細書に記載したストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列）を含むことができる。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載したヌクレオチド配列を有する重鎖及び軽鎖可変領域に由来するＣＤＲまたは超可変ループの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または、６つをコードするヌクレオチド配列、または、それらと実質的に相同な配列（例えば、それらと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、または、それ以上が同一であり、及び／または、本明細書に記載したストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列）を含むことができる。
【０２４６】
別の態様では、本願は、本明細書に記載した核酸を含む宿主細胞、及び、ベクターを特徴としている。核酸は、同じ宿主細胞または別個の宿主細胞に存在する単一のベクターまたは別個のベクターに存在し得るものであり、その詳細は後述する。
【０２４７】
ベクター
本明細書に記載した抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、本明細書では、さらに提供する。ある実施形態では、ベクターは、本明細書に記載した抗体分子をコードするヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ベクターは、本明細書に記載したヌクレオチド配列を含む。それらベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、または、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。
【０２４８】
数多くのベクター系を、使用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、ＤＮＡ要素、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶ、または、ＭＯＭＬＶ）、または、ＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。別のクラスのベクターは、セムリキ森林熱ウイルス、東部馬脳炎ウイルス、及び、フラビウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡ要素を利用する。
【０２４９】
加えて、それらの染色体にＤＮＡを安定に組み込んだ細胞は、トランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することで選択し得る。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または、銅などの重金属に対する耐性などを提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接に連結するか、あるいは、同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡの最適合成のために、追加の要素も必要とし得る。これらの要素として、スプライスシグナル、ならびに、転写プロモーター、エンハンサー、及び、終結シグナルがある。
【０２５０】
構築物を含む発現ベクターまたはＤＮＡ配列を、発現のために調製すると、発現ベクターを、トランスフェクトするか、あるいは、適切な宿主細胞に導入し得る。このことを達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション、または、その他の従来技術などの様々な技術を使用し得る。プロトプラスト融合の場合、細胞を培地で増殖させ、そして、適切な活性についてスクリーニングをする。
【０２５１】
得られたトランスフェクト細胞を培養し、そして、産生した抗体分子を回収するための方法及び条件は、当業者に公知であり、そして、使用する特定の発現ベクター、及び、哺乳動物宿主細胞に応じて、本明細書に基づいて、変更または最適化し得る。
【０２５２】
細胞
別の態様では、本願は、本明細書に記載した核酸を含む宿主細胞及びベクターを特徴とする。核酸は、同じ宿主細胞または別個の宿主細胞に存在する単一のベクターまたは別個のベクターに存在し得る。宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または、原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉとすることができる。例えば、哺乳動物細胞を、培養した細胞または細胞株とすることができる。哺乳動物細胞の例として、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞、及び、トランスジェニック動物由来の細胞、例えば、乳腺上皮細胞がある。
【０２５３】
また、本発明は、本明細書に記載した抗体分子をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０２５４】
ある実施形態では、宿主細胞を、抗体分子をコードする核酸を含むように遺伝子操作している。
【０２５５】
ある実施形態では、宿主細胞を、発現カセットを使用することで遺伝子操作している。語句「発現カセット」は、そのような配列と適合性のある宿主において、遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列のことを指す。そのようなカセットとして、プロモーター、イントロンを有する、または、持たないオープンリーディングフレーム、及び、終結シグナルがある。発現を実現ならしめるために必要で、または、役立つ、さらなる因子も、例えば、誘導性プロモーターなどのために使用し得る。
【０２５６】
また、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０２５７】
細胞は、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または、ヒト細胞とし得るが、これらに限定されない。適切な真核細胞として、ベロ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、及び、ＭＤＣＫＩＩ細胞があるが、これらに限定されない。適切な昆虫細胞として、Ｓｆ９細胞があるが、これに限定されない。
【０２５８】
多重特異性分子を生成する方法
多重特異性抗体分子は、宿主系において、例えば、少なくとも１つ以上の成分の組換え発現によって産生することができる。宿主系の例として、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、または、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９もしくはＳ２細胞）、及び、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）がある。ある実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、安定な哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。二重特異性抗体分子は、異なる宿主細胞における成分の別々の発現、及び、その後の精製／組み立てによって産生することができる。あるいは、抗体分子は、単一の宿主細胞における成分の発現によって産生することができる。二重特異性抗体分子の精製は、例えば、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、及び、連続的ｐＨ溶出などの種々の方法により行うことができる。その他の実施形態では、親和性タグ、例えば、ヒスチジン含有タグ、ｍｙｃタグ、または、ストレプトアビジンタグを、精製に使用することができる。
【０２５９】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示した二重特異性抗体を生成するための方法は、ラムダサブタイプの軽鎖を有するヒト抗体を生成すること、カッパサブタイプの軽鎖を有するヒト抗体を生成すること、双方の抗体アームのＤＮＡで細胞をトランスフェクトすること、プロテインＡ樹脂で抗体を精製すること、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用して、ラムダ及びカッパ軽鎖の双方の存在を確認すること、パパインを用いてＦａｂアームを開裂して正確なラムダ及びカッパ重鎖及び軽鎖対合を分析すること、及び、質量分析を実行すること、を含む。多重特異性分子を作製及び試験するための実験条件を、以下の実施例に提供する。
【０２６０】
使用及び併用療法
本明細書に記載した方法は、本明細書に記載した多重特異性分子、例えば、本明細書に記載した医薬組成物を使用することで、対象におけるがんを処置することを含む。また、対象におけるがんの症状を軽減または改善するための方法、ならびに、がんの増殖を阻害するための方法、及び／または、１つ以上のがん細胞を死滅させるための方法も提供する。実施形態では、本明細書に記載した方法は、本明細書に記載した医薬組成物を投与した対象において、腫瘍の大きさを縮小し、及び／または、がん細胞の数を減らす。
【０２６１】
実施形態では、がんは、血液癌である。実施形態では、血液癌は、白血病またはリンパ腫である。本明細書で使用する「血液癌」とは、造血組織またはリンパ組織の腫瘍、例えば、血液、骨髄、または、リンパ節に影響を及ぼす腫瘍のことを指す。血液悪性腫瘍の例としては、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または、大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫、または、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ））、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前立腺Ｂリンパ芽球性リンパ腫、または、マントル細胞性リンパ腫）、または、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、または、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、または、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍があるが、これらに限定されない。
【０２６２】
実施形態では、がんは、固形癌である。固形癌の例として、卵巣癌、直腸癌、胃癌、精巣癌、肛門部のがん、子宮癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮癌、子宮頸部扁平上皮癌のがん、卵管のがん、子宮内膜のがん、膣のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、外陰部のがん、陰茎のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂のがん、脊髄軸腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の原形質、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、上記したがんの転移性病変、または、それらの組み合わせ、があるが、これらに限定されない。
【０２６３】
実施形態では、多重特異性分子（または、医薬組成物）を、処置または予防する疾患に適した方法で投与する。投与の量及び頻度は、患者の病態、及び、患者の疾患の種類及び重症度などの要因で決定する。適切な投与量を、臨床試験で決定し得る。例えば、「有効量」または「治療量」を示す場合、投与する医薬組成物（または、多重特異性分子）の正確な量は、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、年齢、体重、及び、対象の病態の個人差を考慮して、医師が決定することができる。実施形態では、本明細書に記載した医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／体重ｋｇ、例えば、１０５〜１０６細胞／体重ｋｇにおいて、これらの範囲内にあるすべての整数の用量で投与することができる。実施形態では、本明細書に記載した医薬組成物は、これらの用量で、複数回投与することができる。実施形態では、本明細書に記載した医薬組成物は、免疫療法に記載されている注入技術を用いて投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０２６４】
実施形態では、多重特異性分子、または、医薬組成物を、対象に非経口投与する。実施形態では、細胞を、対象に対して、静脈内、皮下、腫瘍内、結節内、筋肉内、皮内、または、腹腔内に投与する。実施形態では、細胞を、腫瘍またはリンパ節に、直接に投与、例えば、注射する。実施形態では、細胞を、注入して投与し（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）、または、静脈内プッシュで投与する。実施形態では、細胞を、注射可能なデポー製剤として投与する。実施形態では、対象は、哺乳動物である。実施形態では、対象は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、または、マウスである。実施形態では、対象は、ヒトである。実施形態では、対象は、小児の対象、例えば、１８歳未満、例えば、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳、または、それ未満の年齢の小児である。実施形態では、対象は、成人、例えば、少なくとも１８歳、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、または、８０〜９０歳の年齢の成人である。
【０２６５】
併用療法
本明細書で開示した多重特異性分子は、第２の治療剤または手順と組み合わせて使用することができる。
【０２６６】
実施形態では、多重特異性分子、及び、第２の治療剤または手順を、対象ががんと診断された後、例えば、がんが対象から排除される前に、投与／実施する。実施形態では、多重特異性分子、及び、第２の治療剤または手順を、一斉に、または、同時に、投与／実施する。例えば、第１の処置の送達は、第２の処置の開始時に依然として続いており、例えば、それら投与処置に重複がある。他の実施形態では、多重特異性分子、及び、第２の治療剤または手順を、順次に、投与／実施する。例えば、第１の処置の送達は、第２の処置の送達が始まる前に終了する。
【０２６７】
実施形態では、併用療法は、いずれかの薬剤単独を用いた単独療法よりも効果的な処置をもたらすことができる。実施形態では、第１の処置と第２の処置との組み合わせは、（例えば、症状、及び／または、がん細胞において、顕著に軽減するなど）第１の処置または第２の処置単独よりも効果的である。実施形態では、併用療法は、単独療法として投与された場合に同様の効果を得るために通常必要とされる第１または第２の処置の用量と比較して、低用量の第１または第２の処置の使用を可能にする。実施形態では、併用療法は、部分的相加効果、全体的相加効果、または、相加効果よりもさらに大きな効果を有する。
【０２６８】
ある実施形態では、多重特異性分子を、治療法、例えば、がん療法（例えば、抗癌剤、免疫療法、光線力学療法（ＰＤＴ）、外科手術、及び／または、放射線の１つ以上）と組み合わせて投与する。用語「化学療法」、「化学療法剤」、及び、「抗癌剤」は、本明細書では互換的に使用する。多重特異性分子の投与、及び、治療、例えば、がん治療は、連続的（重複の有無にかかわらず）、または、一斉にすることができる。多重特異性分子の投与は、治療（例えば、がん治療）の過程において、連続的または断続的とすることができる。本明細書に記載した特定の治療法は、がん性、及び、非がん性疾患を処置するために使用することができる。例えば、ＰＤＴの有効性は、本明細書に記載した方法及び組成物を用いて、がん性及び非がん性病態（例えば、結核）において増強することができる（例えば、Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６１：２５０−２８１で概説されている）。
【０２６９】
抗がん療法
その他の実施形態では、多重特異性分子を、低分子量または小分子量の化学療法剤と組み合わせて投与する。低分子量または小分子量の化学療法剤の例として、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標））、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（商標））、５−アザシチジン（アザシチジン、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、メルカプトプリン、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、６−ＴＧ（６−チオグアニン、チオグアニン、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ（登録商標））、アブラキサン（パクリタキセルタンパク質−結合型）、アクチノマイシン−Ｄ（ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アメトプテリン（メトトレキサート、メトトレキセートナトリウム、ＭＴＸ、ＴＲＥＸＡＬＬ（商標）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標））、アミホスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アラビノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ、シタラビン、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））三酸化ヒ素（ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）、ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標））、ＢＣＮＵ（カルムスチン、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、カルシウムロイコボリン（シトロボラム因子、フォリン酸、ロイコボリン）、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１、イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチンウエハ（カルムスチンインプラントを有するプロリフェプロスパン２０、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウエハ）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＣＣＮＵ（ロムスチン、ＣｅｅＮＵ）、ＣＤＤＰ（シスプラチン、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＩＣ、ＤＴＩＣ、イミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダウノマイシン（ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ルビドマイシン、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、デクスラゾキサン（ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録��標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））、エストラムスチン（ＥＭＣＹＴ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６、エトポシドホスフェート、ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、フロクスリジン（ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、フルオロウラシル（クリーム）（ＣＡＲＡＣ（商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ヒドロキシウレ（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）、ＤＲＯＸＩＡ（商標）、ＭＹＬＯＣＥＬ（商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（商標））、ＬＣＲ（ロイロクリスチン、ビンクリスチン、ＶＣＲ、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）、ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標））、Ｌ−ＰＡＭ（Ｌ−サルコリシン、メルファラン、フェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、メクロレタミン（塩酸メクロレタミン、マスタチン、ナイトロジェンマスタード、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、メスナ（ＭＥＳＮＥＸ（商標））、マイトマイシン（マイトマイシン−Ｃ、ＭＴＣ、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＯＮＸＡＬ（商標））、ペガスパルガーゼ（ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標））、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、テモゾロマイド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド（ＶＭ−２６、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、ＴＥＳＰＡ（チオホスファミド、チオテパ、ＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン、ＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビノレルビン（酒石酸ビノレルビン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、及び、ボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標））があるが、これらに限定されない。
【０２７０】
別の実施形態では、多重特異性分子を、生物製剤と共に投与する。がんの処置に有用な生物製剤は、技術分野において公知であり、そして、本発明の分子は、例えば、そのような既知の生物製剤と組み合わせて投与し得る。例えば、ＦＤＡは、乳癌の処置のために、以下の生物製剤、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラツヅマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃａｌｉｆ．，、ＨＥＲ２陽性乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  ＬＰ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｄｅｌ．、乳癌の処置のため使用するエストロゲン受容体拮抗薬）、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  ＬＰ、エストロゲンを作る上で必要な酵素であるアロマターゼをブロックする非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．、乳癌の処置に用いる不可逆的なステロイド性アロマターゼ不活性化剤）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，  Ｎ．Ｊ．、乳癌の処置についてＦＤＡの承認を受けた非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）、及び、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  ＬＰ、乳癌の処置についてＦＤＡの承認を受けた非ステロイド性抗エストロゲン薬）を承認している。本発明の結合分子を組み合わせ得るその他の生物製剤として、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、血管新生を阻害するように設計した最初のＦＤＡ承認療法）、及び、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．、Ｂ細胞リンパ腫の処置について現在承認されている放射性標識モノクローナル抗体）がある。
【０２７１】
加えて、ＦＤＡは、大腸癌の治療薬として以下の生物製剤、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；及び、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクローナル抗体である）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブメシレート、プロテインキナーゼ阻害剤）、及び、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（登録商標）（塩酸レバミゾール、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．、ＤｕｋｅｓステージＣの大腸癌患者での外科的切除後の５−フルオロウラシルとの併用するアジュバント処置として、１９９０年にＦＤＡから承認を受けた免疫調節剤）を承認している。
【０２７２】
肺癌の処置のための生物製剤の例として、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的とするように設計した小分子）がある。
【０２７３】
多発性骨髄腫の処置のための生物製剤の例として、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）ベルケイド（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．、プロテアソーム阻害剤）がある。追加の生物製剤として、ＴＨＡＬＩＤＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｒｒｅｎ，Ｎ．Ｊ．、免疫調節剤であり、かつ、骨髄腫細胞の増殖及び生存、ならびに、抗血管新生を阻害する能力を含む複数の作用が認められる）がある。
【０２７４】
追加の癌治療用抗体の例として、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭＡＢＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、アルツモマブペンテテート（ＨＹＢＲＩ−ＣＥＡＫＥＲ（登録商標））、アナツモマブマフェナトックス、アンルキンヅマブ（ＩＭＡ−６３８）、アポリズマブ、アルシツモマブ（ＣＥＡ−ＳＣＡＮ（登録商標））、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標））、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標））、ベシレソマブ（ＳＣＩＮＴＩＭＵＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツヅマブメルタンシン、カプロマブペンデチド（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、ＣＣ４９、セツキシマブ（Ｃ２２５、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、シタツズマブボガトックス、シクツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、デセツズマブ、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標））、デツモマブ、エクロメキシマブ、エデコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、エロツズマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標））、エタラシズマブ、ファレツズマブ、フィギツムマブ、フレゾリムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、イブリツモマブ（イブリツモマブチウキセタン、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イゴボマブ（ＩＮＤＩＭＡＣＩＳ−１２５（登録商標））、インテツムマブ、イノツズマブオゾガミシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ（ＣＥＡ−ＣＩＤＥ（登録商標））、レクサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ネシツムマブ、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ（登録商標）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、オララツムマブ、オポルツズマブモナトックス、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペムツモマブ（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標））、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラムシルムマブ、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、リロツムマブ、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、ロバツムマブ、サツモマブペンデチド、シブロツズマブ、シルツキシマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン（ＡＦＰ−ＣＩＤＥ（登録商標））、タプリツモマブパプトックス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））、ザルツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＥＧＦＲ（登録商標））、及び、ザノリムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標））があるが、これらに限定されない。
【０２７５】
その他の実施形態では、多重特異性分子を、ウイルス性がん治療剤薬と組み合わせて投与する。ウイルス性がん治療剤として、ワクシニアウイルス（ｖｖＤＤ−ＣＤＳＲ）、癌胎児性抗原発現麻疹ウイルス、組換えワクシニアウイルス（ＴＫ欠失プラスＧＭ−ＣＳＦ）、セネカバレイウイルス−００１、ニューカッスルウイルス、コクサッキーウイルスＡ２１、ＧＬ−ＯＮＣ１、ＥＢＮＡ１  Ｃ末端／ＬＭＰ２キメラタンパク質発現組換え改変ワクシニアアンカラワクチン、癌胎児性抗原発現麻疹ウイルス、Ｇ２０７腫瘍溶解ウイルス、ｐ５３を発現する改変ワクシニアウイルスアンカラワクチン、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＭ−ＣＳＦ改変単純ヘルペス１ウイルス、鶏痘ウイルスワクチンベクター、組換えワクシニア前立腺特異抗原ワクチン、ヒトパピローマウイルス１６／１８  Ｌ１ウイルス様粒子／ＡＳ０４ワクチン、ＭＶＡ−ＥＢＮＡ１／ＬＭＰ２  Ｉｎｊ．ワクチン、四価ＨＰＶワクチン、四価ヒトパピローマウイルス（タイプ６、１１、１６、１８）組換えワクチン（ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標））、組換え鶏痘−ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭワクチン、組換えワクシニア−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭワクチン、組換え改変ワクシニアアンカラ−５Ｔ４ワクチン、組換え鶏痘−ＴＲＩＣＯＭワクチン、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスＮＶ１０２０、ＨＰＶ  ＬＩ  ＶＬＰワクチンＶ５０４、ヒトパピローマウイルス二価（タイプ１６及び１８）ワクチン（ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標））、単純ヘルペスウイルスＨＦ１０、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３遺伝子、組換えワクシニアＤＦ３／ＭＵＣ１ワクチン、組換えワクシニア−ＭＵＣ−１ワクチン、組換えワクシニア−ＴＲＩＣＯＭワクチン、ＡＬＶＡＣ  ＭＡＲＴ−１ワクチン、ヒトプレプロエンケファリン（ＮＰ２）を発現する複製欠損型単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクター、野生型レオウイルス、３型レオウイルスＤｅａｒｉｎｇ（ＲＥＯＬＹＳＩＮ（登録商標））、腫瘍溶解性ウイルスＨＳＶ１７１６、エプスタイン−バーウイルス標的抗原をコードする組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベースのワクチン、組換え鶏痘−前立腺特異的抗原ワクチン、組換えワクシニア前立腺特異的抗原ワクチン、組換えワクシニア−Ｂ７．１ワクチン、ｒＡｄ−ｐ５３遺伝子、Ａｄ５−デルタ２４ＲＧＤ、ＨＰＶワクチン５８０２９９、ＪＸ−５９４（チミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルスとＧＭ−ＣＳＦ）、ＨＰＶ−１６／１８  Ｌ１／ＡＳ０４、鶏痘ウイルスワクチンベクター、ワクシニアチロシナーゼワクチン、ＭＥＤＩ−５１７  ＨＰＶ−１６／１８  ＶＬＰ  ＡＳ０４ワクチン、単純ヘルペスウイルスＴＫ９９ＵＮのチミジンキナーゼを含むアデノウイルスベクター、ＨｓｐＥ７、ＦＰ２５３／フルダラビン、ＡＬＶＡＣ（２）メラノーママルチ−抗原治療用ワクチン、ＡＬＶＡＣ−ｈＢ７．１、カナリアポックス−ｈＩＬ−１２メラノーマワクチン、Ａｄ−ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３、ｒＡｄ−ＩＦＮ  ＳＣＨ  ７２１０１５、ＴＩＬ−Ａｄ−ＩＮＦｇ、Ａｄ−ＩＳＦ３５、及び、コクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１、ＣＡＶＡＴＡＫ（登録商標））があるが、これらに限定されない。
【０２７６】
その他の実施形態では、多重特異性分子を、ナノ医薬品と組み合わせて投与する。がんナノ医薬品の例として、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（パクリタキセル結合アルブミンナノ粒子）、ＣＲＬＸ１０１（直鎖状シクロデキストリン系ポリマーに結合したＣＰＴ）、ＣＲＬＸ２８８（生分解性ポリマーポリ（乳酸−コ−グリコール酸）に結合したドセタキセル）、シタラビンリポソーム（リポソームＡｒａ−Ｃ、ＤＥＰＯＣＹＴ（商標））、ダウノルビシンリポソーム（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、ドキソルビシンリポソーム（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、カプセル封入ダウノルビシンクエン酸リポソーム（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、及び、ＰＥＧ抗ＶＥＧＦアプタマー（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））があるが、これらに限定されない。
【０２７７】
幾つかの実施形態では、多重特異性分子を、パクリタキセル、または、パクリタキセル製剤、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、タンパク質結合パクリタキセル（例えば、
ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））と組み合わせて投与する。パクリタキセル製剤の例として、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが販売している）、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル（ＤＨＡ−パクリタキセル、タキソプレキシン、Ｐｒｏｔａｒｇａが販売している）、ポリグルタミン酸結合パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックス、ＣＴ−２１０３、ＸＹＯＴＡＸ、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃが販売している）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）、ＡＮＧ１０５（３分子のパクリタキセルに結合したＡｎｇｉｏｐｅｐ−２、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎが販売している）、パクリタキセル−ＥＣ−１（ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ−１に結合したパクリタキセル、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００７）８７：２２５−２３０を参照されたい）、及び、グルコース結合パクリタキセル（例えば、２’−パクリタキセルメチル２−グルコピラノシルスクシネート、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００７）１７：６１７−６２０を参照されたい）があるが、これらに限定されない。
【０２７８】
がんを処置するためのＲＮＡｉ剤、及び、アンチセンスＲＮＡ剤の例として、ＣＡＬＡＡ−０１、ｓｉＧ１２Ｄ  ＬＯＤＥＲ（Ｌｏｃａｌ  Ｄｒｕｇ  ＥｌｕｔｅＲ）、及び、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２があるが、これらに限定されない。
【０２７９】
その他のがん治療薬として、サイトカイン類（例えば、アルデスロイキン（ＩＬ−２、インターロイキン−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））、アルファインターフェロン（ＩＦＮ−アルファ、インターフェロンアルファ、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ−２ａ））、エポエチンアルファ（ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標））、フィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球−コロニー刺激因子、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、サルグラモスティム、ＬＥＵＫＩＮＥ（商標））、ＩＬ−１１（インターロイキン−１１、オプレベルキン、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））、インターフェロンアルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）（ＰＥＧインターフェロン、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（商標））、及び、ペグフィルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標）））、ホルモン療法剤（例えば、アミノグルテチミド（ＣＹＴＡＤＲＥＮ（登録商標））、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フルオキシメステロン（ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標））、フルタミド（ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標））、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、ゴセレリン（ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、ロイプロリド（ＥＬＩＧＡＲＤ（商標）、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）、ＶＩＡＤＵＲ（商標））、メゲストロール（酢酸メゲストロール、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標））、ニルタミド（ＡＮＡＮＤＲＯＮ（登録商標）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標））、オクトレオチド（酢酸オクトレオチド、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ  ＬＡＲ（登録商標））、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ（登録商標））、タモキシフェン（ＮＯＶＡＬＤＥＸ（登録商標））、及び、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、ホスホリパーゼＡ２阻害剤（例えば、アナグレリド（ＡＧＲＹＬＩＮ（登録商標）））、生物学的応答調節剤（例えば、ＢＣＧ（ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）、ＴＩＣＥ（登録商標））、及び、ダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））、標的治療薬（例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（商標））、デニロイキンジフティトックス（ＯＮＴＡＫ（登録商標））、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、メシル酸イマチニブ（ＳＴＩ−５７１、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、及び、ＳＵ１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）））、免疫調節剤及び抗血管新生剤（例えば、ＣＣ−５０１３（レナリドマイド、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、及び、サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）））、��ルココルチコステロイド（例えば、コルチゾン（ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、ＡＬＡ−ＣＯＲＴ（登録商標）、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ  ＡＣＥＴＡＴＥ（登録商標）、ヒドロコルトンリン酸塩ＬＡＮＡＣＯＲＴ（登録商標）、ＳＯＬＵ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標））、デカドロン（デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、ＤＥＸＡＳＯＮＥ（登録商標）、ＤＩＯＤＥＸ（登録商標）、ＨＥＸＡＤＲＯＬ（登録商標）、ＭＡＸＩＤＥＸ（登録商標））、メチルプレドニゾロン（６−メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、ＤＵＲＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＭＥＤＲＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）、Ｍ−ＰＲＥＤＮＩＳＯＬ（登録商標）、ＳＯＬ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標））、プレドニゾロン（ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標）、ＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）、ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）、ＰＲＥＬＯＮＥ（登録商標））、及び、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＤ  ＰＲＥＤ（登録商標）、ＭＥＴＩＣＯＲＴＥＮ（登録商標）、ＯＲＡＳＯＮＥ（登録商標））、及び、ビスホスホネート類（例えば、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、及び、ゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）））があるが、これらに限定されない。
【０２８０】
幾つかの実施形態では、多重特異性分子を、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤）と組み合わせて使用する。チロシンキナーゼ阻害剤の例として、上皮成長因子（ＥＧＦ）経路阻害剤（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤（例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦトラップ、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＶＥＧＦＲ−１阻害剤、ＶＥＧＦＲ−２阻害剤、ＶＥＧＦＲ−３阻害剤）に対する抗体）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）経路阻害剤（例えば、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤））、ＲＡＦ−１阻害剤、ＫＩＴ阻害剤、及び、ＲＥＴ阻害剤があるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、ＡＨＣＭ剤と組み合わせて使用する抗癌剤を、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ−３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ−５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマキシニブ（セマキシニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ＥＮＭＤ−２０７６、ＰＣＩ−３２７６５、ＡＣ２２０、ドビチニブ乳酸塩（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ−２５８）、ＢＩＢＷ  ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−２９９８０４、ＢＭＳ−７７７６０７、ＡＢＴ−８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ  １１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標））、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ−２０３６、ＢＭＳ−６９０１５４、ＣＥＰ−１１９８１、チボザニブ（ＡＶ−９５１）、ＯＳＩ−９３０、ＭＭ−１２１、ＸＬ−１８４、ＸＬ−６４７、ＸＬ２２８、ＡＥＥ７８８、ＡＧ−４９０、ＡＳＴ−６、ＢＭＳ−５９９６２６、ＣＵＤＣ−１０１、ＰＤ１５３０３５、ペリチニブ（ＥＫＢ−５６９）、バンデタニブ（ザクティマ）、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ＡＢＴ−８６９（リニファニブ）、ＡＥＥ７８８、ＡＰ２４５３４（ポナチニブ）、ＡＶ−９５１（チボザニブ）、アキシボタニブ、ＢＡＹ  ７３−４５０６（レゴラフェニブ）、アラニン酸ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ブリバニブ（ＢＭＳ−５４０２１５）、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）、ＣＨＩＲ−２５８（ドビチニブ）、ＣＰ  ６７３４５１、ＣＹＣ１１６、Ｅ７０８０、Ｋｉ８７５１、マシチニブ（ＡＢ１０１０）、ＭＧＣＤ−２６５、モテサニブ二リン酸（ＡＭＧ−７０６）、ＭＰ−４７０、ＯＳＩ−９３０、塩酸パゾパニブ、ＰＤ１７３０７４、トシル酸ｎソラフェニブ  （Ｂａｙ  ４３−９００６）、ＳＵ  ５４０２、ＴＳＵ−６８（ＳＵ６６６８）、バタラニブ、ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９、ＥＸＥＬ−２８８０）からなる群から選択する。選択したチロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、または、ソラフェニブから選ぶ。ある実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブである。
【０２８１】
ある実施形態では、多重特異性分子を、抗血管新生剤、または、血管標的化剤、もしくは、血管破壊剤の１つ以上と組み合わせて投与する。抗血管新生剤の例として、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体阻害剤（例えば、イトラコナゾール）、細胞増殖抑制剤、及び／または、内皮細胞の遊走阻害剤（例えば、とりわけ、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、血管新生刺激剤（例えば、スラミン）があるが、これらに限定されない。血管標的剤（ＶＴＡ）または血管破壊剤（ＶＤＡ）を、中枢壊死を引き起こすがん腫瘍の血管系（血管）を損傷するように設計する（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（２００４）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．  １０：４１５−４２７で検討されている）。ＶＴＡを、小分子とすることができる。小分子ＶＴＡの例として、微小管不安定化薬（例えば、コンブレタスタチンＡ−４リン酸二ナトリウム（ＣＡ４Ｐ）、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２、Ｏｘｉ４５０３）及び、バジメザン（ＡＳＡ４０４）があるが、これらに限定されない。
【０２８２】
免疫チェックポイント阻害剤
その他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、多重特異性分子と組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤の使用を含む。この方法は、インビボでの治療プロトコルにおいて使用することができる。
【０２８３】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子を阻害する。チェックポイント分子の例として、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、または、ＣＤ２７０）、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、及び、Ａ２ａＲがあるが、これらに限定されない。例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｐａｒｄｏｌｌ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２．４（２０１２）：２５２−６４を参照されたい。
【０２８４】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、または、ピジリズマブなどの抗ＰＤ−１抗体である。ニボルマブ（別名、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、または、ＢＭＳ−９３６５５８）は、ＰＤ１を特異的に阻害する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、ＵＳ８，００８，４４９、及び、ＷＯ２００６／１２１１６８を参照されたい。ペムブロリズマブ（別名、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５、または、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９（２）：１３４−４４、ＵＳ８，３５４，５０９、及び、ＷＯ２００９／１１４３３５を参照されたい。ピジリズマブ（別名、ＣＴ−０１１、または、Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。例えば、ＷＯ２００９／１０１６１１を参照されたい。ある実施態様では、ＰＤ−１の阻害剤は、それらと実質的に同一又は類似の配列、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、又は、ピジリズマブの配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、または、それ以上が同一である配列を有する抗体分子である。さらなる抗ＰＤ１抗体、例えば、ＡＭＰ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）は、例えば、ＵＳ  ８，６０９，０８９、ＵＳ  ２０１００２８３３０、及び／または、ＵＳ  ２０１２０１１４６４９に記載されている。
【０２８５】
幾つかの態様では、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン、例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）と融合したＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）の細胞外／ＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（例えば、ＷＯ２０１１／０６６３４２、及び、ＷＯ２０１０／０２７８２７に記載されたＢ７−ＤＣＩｇ）、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０２８６】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、抗体分子である。幾つかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、または、ＭＤＸ−１１０５である。幾つかの実施態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（別名、Ａ０９−２４６−２、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）であり、このものは、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例は、例えば、ＷＯ２０１３／０７９１７４に記載されている。ある実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。このＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０７７６３４に記載されている。ある実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＸ−１１０５（別名、ＢＭＳ−９３６５５９）であり、このものは、例えば、ＷＯ２００７／００５８７４に記載されている。ある実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）であり、このものは、ＰＤ−Ｌ１に対するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、米国特許第７，９４３，７４３号、及び、米国特許公開第２０１２００３９９０６号を参照されたい。ある実施態様では、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、それらと実質的に同一又は類似の配列、例えば、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、または、ＭＤＸ−１１０５の配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、または、それ以上が同一である配列を有する抗体分子である。
【０２８７】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ２阻害剤、例えば、ＡＭＰ−２２４（このものは、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体であり、例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７、及び、ＷＯ２０１１／０６６３４２を参照されたい）である。
【０２８８】
ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体分子である。実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６（別名、ＢＭＳ９８６０１６、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）である。ＢＭＳ−９８６０１６、及び、その他のヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、ＵＳ２０１１／０１５０８９２、ＷＯ２０１０／０１９５７０、及び、ＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている。
【０２８９】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、米国特許第８，５５２，１５６号、ＷＯ２０１１／１５５６０７、ＥＰ２５８１１１３、及び、米国公開第２０１４／０４４７２８号に記載されているＴＩＭ−３阻害剤、例えば、抗ＴＩＭ３抗体分子である。
【０２９０】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体分子である。抗ＣＴＬＡ４抗体の例として、トレメリムマブ（ＰｆｉｚｅｒのＩｇＧ２モノクローナル抗体、かつては、チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６として知られている）、及び、イピリムマブ（別名、ＭＤＸ−０１０、ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９）がある。抗ＣＴＬＡ−４抗体のその他の例は、例えば、米国特許第５，８１１，０９７号に記載されている。
【実施例】
【０２９１】
以下の実施例は、例示目的のものであり、また、決して限定を意図するものではない。
【０２９２】
方法
１．ＮａｎｏＢｉＴ構築物のプラスミドの構築
タンパク質配列をコードするＤＮＡを、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓでの発現のために最適化し、合成を行い、そして、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いて、ｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６９７）にクローニングをした。使用した核酸配列を、表１に示す。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【表１−４７】
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【表１−４８】
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【表１−４９】
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【表１−５０】
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【表１−５１】
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【表１−５２】
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【表１−５３】
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【表１−５４】
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【表１−５５】
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【表１−５６】
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【表１−５７】
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【表１−５８】
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【表１−５９】
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【表１−６０】
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【表１−６１】
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【表１−６２】
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【表１−６３】
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【表１−６４】
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【表１−６５】
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【０２９３】
２．ＮａｎｏＢｉＴ構築物の発現と精製
これらのプラスミドを、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ２９１２７）に同時トランスフェクトした。トランスフェクションは、重鎖と軽鎖と競合軽鎖を１：１：１の比率で有する多重特異性構築物について、１リットル当たり１ｍｇの総ＤＮＡを用いて行った。ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションを、製造業者の指示に従って行った。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、トランスフェクションをした後に、５％ＣＯ２を用いて、３２℃で、７日間、増殖させた。これらの細胞を、３０００×ｇで遠心分離してペレット化した。その上清に、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣＨ１−ＸＬアフィニティー樹脂（ＧＥ  ２９４３４５２０１０）を添加し、そして、室温で、１〜３時間、インキュベートした。その樹脂を、フリットフィルタープレート（Ｎｕｎｃフリットディープウェルフィルタープレート２７８０１１）に充填し、３×１ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０−１４４）で洗浄した。結合したタンパク質を、２０ｍＭ  クエン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．９で、カラムから溶出した。溶出画分を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０を用いて中和した。表２は、すべてのＮａｎｏＢｉＴ構築物についてのアミノ酸配列を示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【０２９４】
３．ＮａｎｏＢｉＴ競合アッセイ
まず、競合するラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）の存在下で、ＮａｎｏＢｉＴアッセイを実施して、重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）と、その同種カッパ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）との間の結合を試験した。図３Ａ〜３Ｃに示したように、ＬｇＢｉＴは、ＨＣＰ２のＣ末端と融合し、かつ、ＳｍＢｉＴは、ＫＬＣＰのＣ末端と融合した。競合するＬＬＣＰは、未修飾の鎖として示した。ＨＣＰ２及びＫＬＣＰが、Ｆａｂを形成すると、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴは、ルシフェラーゼ活性を有する完全に機能的なＮａｎｏＬｕｃドメインを生成する（図３Ａ）。ＨＣＰ２及びＬＬＣＰが、Ｆａｂを形成すると、ＮａｎｏＬｕｃは完全ではなく、そして、不活性である（図３Ｂ）。ＨＣＰ２に対するＬＬＣＰとＫＬＣＰの１：１：１の競合は、機能的ＮａｎｏＬｕｃを有するＨＣＰ２／ＫＬＣＰ  Ｆａｂと、非機能的ＮａｎｏＬｕｃを有するＨＣＰ２／ＬＬＣＰ  Ｆａｂとをもたらす（図３Ｃ）。各試験では、競合する軽鎖が存在しないポジティブコントロールと、競合する軽鎖がＳｍＢｉＴ融合を持たない同じＫＬＣＰであるネガティブコントロールとを用いた。ポジティブコントロールは、１００％の対合を示したのに対して、ネガティブコントロールは、５０％の対合を示した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールについての発光示度数（それぞれ、１００％及び５０％）と、競合する軽鎖の存在下での各試験対についての発光示度数とを比較して、各試験対についての対合率を定量化した。
【０２９５】
競合するカッパ鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ）の存在下で、同様のＮａｎｏＢｉＴアッセイを用いて、重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）とラムダ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ）との間の結合を試験した（図４Ａ〜４Ｃ）。このアッセイでは、ＬｇＢｉＴを、ＨＣＰ１のＣ末端に融合させ、かつ、ＳｍＢｉＴを、ＬＬＣＰのＣ末端に融合させた。競合するＫＬＣＰは、未修飾軽鎖として発現した。ＨＣＰ１、ＬＬＣＰ、及び、ＫＬＣＰを、１：１：１で発現させると、機能的ＮａｎｏＬｕｃを有するＨＣＰ１／ＬＬＣＰ  Ｆａｂと、非機能的ＮａｎｏＬｕｃを有するＨＣＰ１／ＫＬＣＰ  Ｆａｂとを形成する（図４Ｃ）。同様に、競合する軽鎖の存在下における各試験対についての発光示度数を、ポジティブコントロール（競合する軽鎖は存在せず、１００％の対合）と、ネガティブコントロール（競合する軽鎖は、ＳｍＢｉＴ融合を持たない同じＬＬＣＰであり、５０％の対合）と比較して、各試験対についての対合率を決定した。
【０２９６】
ＮａｎｏＢｉＴ競合アッセイを、９６ウェルプレートで、１μｇ／ｍＬのタンパク質の１００μＬを用いて行った。製造業者の指示に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（Ｎ１１１０）アッセイシステムで、５×ストック溶液を調製した。各ウェルに、２０μｌの５×ＮａｎｏＬｕｃストック溶液を入れ、そして、プレートの発光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーを用いて直ちに読み取った。
【０２９７】
４．多重特異性分子の発現と精製
これらのプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ  １４５２７）、または、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ  ２９１２７）のいずれかに同時トランスフェクトした。ノブとホール重鎖とを１：１の比率で有し、かつ、軽鎖と重鎖とを３：２の比率で有する多重特異性構築物について、１ｍｇの総ＤＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。これら鎖の発現において起こり得る不均衡を確認するために、ノブとホール重鎖ＤＮＡとを３：１〜１：３の範囲の様々な比率を用いて、軽鎖と重鎖とを３：２という同じ比率として、トランスフェクションを行った。Ｅｘｐｉ２９３細胞におけるトランスフェクションは、総ＤＮＡに対して３：１の比率で、直鎖状２５，０００Ｄａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ  ２３３９６６）を用いて行った。ＤＮＡ及びＰＥＩを、それぞれ、５０ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３１９８５０８８）培地に添加し、そして、滅菌濾過した。ＤＮＡ及びＰＥＩを、１０分間混合し、そして、１．８〜２．８×１０６細胞／ｍＬの細胞密度と、少なくとも９５％の生存率を示すＥｘｐｉ２９３細胞に添加した。ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションは、製造業者の指示に従って行った。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、トランスフェクションの後に５〜７日間、３７℃、８％ＣＯ２の加湿インキュベーターで増殖させ、そして、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、５％ＣＯ２、３２℃で、１４日間増殖させた。これらの細胞を、１８，０００×ｇで遠心分離してペレット化し、そして、上清を、０．２μｍのメンブランに通して濾過した。プロテインＡ樹脂（ＧＥ  １７−１２７９−０３）を、濾過した上清に添加し、そして、室温で、１〜３時間、インキュベートした。この樹脂を、カラムに充填し、３×１０カラム容量のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０−１４４）で洗浄した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．９で、カラムから溶出した。必要に応じて、ＤＰＢＳのランニング緩衝液を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムで、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、タンパク質をさらに精製した。
【０２９８】
表４は、多重特異的構築物に特有の配列を含む。また、表２に記載した軽鎖配列の幾つかを用いて、多重特異性構築物を発現した。合計で１２個の多重特異性分子が、上記のように発現した。これらの分子のアミノ酸配列を、表５ａに示す。表５ｂは、多重特異性分子についての対応する生殖細胞系配列を示す。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表５−１】
2019531725.tif 000118
【表５−２】
2019531725.tif 000119
【表５−３】
2019531725.tif 000120
【表５−４】
2019531725.tif 000121
【０２９９】
５．カッパ／ラムダは、鎖対合の樹脂分析を選択する。
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  １７−５４５８−０１）、または、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  １７−５４８２−０１）樹脂のいずれかの１００μＬと、１ｍｇのタンパク質とをインキュベートして、二重特異性構築物のカッパ及びラムダ軽鎖対合を分析した。１〜３時間インキュベートした後、この樹脂を、カラムに充填し、３×１０カラム容量のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０−１４４）で洗浄した。結合したタンパク質を、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ２．４６で、カラムから溶出した。２００ｍＭ  Ｂｏｎｄ−Ｂｒｅａｋｅｒ  ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ７７７２０）で還元した試料のゲルを使用して、ロード画分、フロースルー画分、溶出画分の内容物を分析して、様々な鎖の同定を可能にした。鎖対合の定量的評価のために、ロード画分とフロースルー画分でのタンパク質の量を、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて、２８０ｎｍでの吸光度で評価した。
【０３００】
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂は、カッパ抗体の定常軽鎖に結合する親和性樹脂である。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔからの溶出物は、ラムダ及びカッパ軽鎖の双方を有する分子を含み、３つの可能性がある（図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｄ）。このＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂は、ラムダ抗体の定常軽鎖に結合する親和性樹脂である。ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔからの溶出物は、ラムダ及びカッパ軽鎖の双方を有する分子を含み、３つの可能性がある（図１Ａ、１Ｃ、及び１Ｄ）。
【０３０１】
６．鎖対合の分析のための質量分析
多重特異性分子における鎖対合の特徴付けを行うために、精製した試料を、製造業者の指示に従って、固定化パパイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２０３４１）で消化した。パパインは、ヒンジ領域の後で開裂して（図２）、２つのＦａｂアームが生じる。消化した分子を質量分析計にかけ、測定したインタクトな質量に基づいて、２つのＦａｂアームの同定を可能にした。このＭＳ分析は、異なる立体配置の識別（図１Ａと図１Ｄ）と、軽鎖交換の程度の特徴付けとを可能にする。
【０３０２】
結果
例１
重鎖、軽鎖、競合軽鎖が１：１：１の比率において、ＤＮＡを用いて、細胞を同時トランスフェクトすることで、ＮａｎｏＢｉＴベースの構築物を発現した。表３は、重鎖（第２欄）、軽鎖（第３欄）、及び、競合軽鎖（第４欄）の個々の組み合わせを示している。表３の第１欄は、各配列の組み合わせについての識別子を記載している。それらの分子を精製し、そして、Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ試薬を用いて発光アッセイを行った。ポジティブコントロール、及び、ネガティブコントロールを記載している。ポジティブコントロールは、１００％の完全対合を示しており、また、ネガティブコントロールは、５０％の完全対合を示している。これらの数値を用いて、試験構築物の対合を定量した。
【０３０３】
表６は、競合するラムダ軽鎖の存在下での重鎖及びカッパ軽鎖についての対合率を示す（７５％以上の対合率を有する配列の組合せのみを記載した）。表７は、競合するカッパ軽鎖の存在下での重鎖及びラムダ軽鎖についての対合率を示す（７５％以上の対合率を有する配列の組合せのみを記載した）。表６及び表７の第１欄に記載の識別子は、表３の第１欄に記載の識別子に対応している。加えて、表６及び７は、それぞれの配列の組み合わせにおいて用いた重鎖（第３欄）、軽鎖（第４欄）、及び、競合軽鎖（第５欄）に対応する生殖細胞系列配列をも提供している。
【０３０４】
表８ａは、表６及び表７を編集したものであり、そこには、双方向において成功した試料が記載してある。表８ａの各列は、重鎖／カッパ軽鎖の対、及び、重鎖／ラムダ軽鎖の対（ＩＤ番号で表示してある）を示しており、ＮａｎｏＢｉＴアッセイでは、これらの２つの対の間での軽鎖の交換は少ない。表８ｂは、表８ａに記載の重鎖／軽鎖の対に対応する生殖細胞系列配列を示している。表８ａ及び８ｂに記載の識別子は、表３の第１欄の識別子に対応している。
【表３−１】
2019531725.tif 000122
【表３−２】
2019531725.tif 000123
【表３−３】
2019531725.tif 000124
【表３−４】
2019531725.tif 000125
【表３−５】
2019531725.tif 000126
【表３−６】
2019531725.tif 000127
【表３−７】
2019531725.tif 000128
【表３−８】
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【表３−９】
2019531725.tif 000130
【表３−１０】
2019531725.tif 000131
【表６−１】
2019531725.tif 000132
【表６−２】
2019531725.tif 000133
【表６−３】
2019531725.tif 000134
【表６−４】
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【表７−１】
2019531725.tif 000136
【表７−２】
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【表７−３】
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【表８−１】
2019531725.tif 000139
【表８−２】
2019531725.tif 000140
【表８−３】
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【表８−４】
2019531725.tif 000142
【表８−５】
2019531725.tif 000143
【表８−６】
2019531725.tif 000144
【０３０５】
例２
多重特異性分子１は、α−ＩＧＦ１Ｒアームと、α−ＨＥＲ３アームとを含む。このα−ＩＧＦ１Ｒアームは、配列番号１７９のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１１８のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＨＥＲ３アームは、配列番号１７８のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１４５のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子１の構成を、図５に示す。
【０３０６】
配列番号８６、配列番号５４、配列番号８７、及び、配列番号２７のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子１を発現させた。多重特異性分子１を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１１に示す。図１９は、多重特異性分子１のサイズ排除クロマトグラムを示す。多重特異性分子１を用いたＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を行い、図２４に示した。ゲルは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂカラムからのフロースルーにおいて少量のタンパク質を示している。この分析の定量結果を表９に示しており、カッパ鎖について８５％の忠実度と、ラムダ鎖についての８５％の忠実度とを与えている。これらの結果は、同じＦａｂアームを有するＩＤ２８４及びＩＤ４０９のＮａｎｏＢｉＴデータと相関しており、それぞれ、８４％と９０％の忠実度を示している。
【表９】
2019531725.tif 000145
【０３０７】
例３
多重特異性分子２は、α−メソテリンアームと、α−ＰＤＬ１アームとを含む。このα−メソテリンアームは、配列番号１６４のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１６５のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＰＤＬ１アームは、配列番号１６６のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１６７のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子２の構成を、図５に示す。
【０３０８】
配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、及び、配列番号８５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子２を発現させた。多重特異性分子２を用いたＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を行い、図２３に示した。ゲルは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂカラムからのフロースルーにおいて少量のタンパク質を示している。この分析の定量結果を表９に示している。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔについて忠実度は８８％であり、また、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムについての忠実度は８６％である。
【０３０９】
例４
多重特異性分子３は、α−ＣＴＬ４アームと、α−ＩＬ１２βアームとを含む。このα−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１６８のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＩＬ１２βアームは、配列番号１７０のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１６３のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子３の構成を、図５に示す。
【０３１０】
配列番号７８、配列番号１５、配列番号９１、及び、配列番号７２のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子３を発現させた。多重特異性分子３を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１２に示す。図２０は、多重特異性分子３のサイズ排除クロマトグラムを示す。多重特異性分子３を用いたＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を行い、図２５に示した。ゲルは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔまたはＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムにおいてタンパク質を示しておらず、このことは適切な軽鎖の対合を示唆している。多重特異性分子３のパパイン開裂の質量分析データを、図３１に示しており、また、表１０にまとめている。このデータは、適切に対合したＦａｂのみを示しており、これらのカッパ及びラムダ鎖について誤対合がないことをさらに説明している。これらの結果は、同じＦａｂアームを有するＩＤ２４２及びＩＤ５０１のＮａｎｏＢｉＴデータとも相関しており、いずれも、１００％の鎖忠実度を示している。
【表１０】
2019531725.tif 000146
【０３１１】
例５
多重特異性分子４は、α−ＣＴＬ４アームと、α−ＴＲＡＩＬＲ２アームとを含む。このα−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１６８のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＴＲＡＩＬＲ２アームは、配列番号１７７のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１４８のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子４の構成を、図５に示す。
【０３１２】
配列番号７８、配列番号１５、配列番号８１、及び、配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子４を発現させた。多重特異性分子４を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１３に示す。多重特異性分子４のパパイン開裂の質量分析データを、図３１に示しており、また、表１１にまとめている。このデータは、１つの不適切なＦａｂ対合を示すものであり、カッパ重鎖とラムダ軽鎖とが対になっている。このことは、多重特異性分子４と同じＦａｂアームを有するＩＤ２３７及びＩＤ４２１のＮａｎｏＢｉＴデータとも相関しており、競合するカッパ軽鎖を有するラムダ重鎖の一方向において鎖忠実度が認められる。
【表１１】
2019531725.tif 000147
【０３１３】
例６
多重特異性分子５は、α−ＣＴＬ４アームと、α−ＣＤ２２１アームとを含む。このα−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１６８のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＴＲＡＩＬＲ２アームは、配列番号１８０のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１３６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子５の構成を、図５に示す。
【０３１４】
配列番号７８、配列番号１５、配列番号８８、及び、配列番号４５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子５を発現させた。多重特異性分子５を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１４に示す。多重特異性分子５のパパイン開裂の質量分析データを、図３３に示しており、また、表１２にまとめており、そこには、カッパ軽鎖と対になったラムダ重鎖で対合している１つの不適切なＦａｂが存在する。
【表１２】
2019531725.tif 000148
【０３１５】
例７
多重特異性分子６は、α−ＰＤ１アームと、α−ＴＲＡＩＬＲ２アームとを含む。このα−ＰＤ１アームは、配列番号１８１のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１８２のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＴＲＡＩＬＲ２アームは、配列番号１７７のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１４８のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子６の構成を、図５に示す。
【０３１６】
配列番号８９、配列番号９０、配列番号８１、及び、配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子６を発現させた。多重特異性分子６を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１５に示す。多重特異性分子６のパパイン開裂の質量分析データを、図３４に示しており、また、表１３にまとめており、そこには、カッパ軽鎖と対になったラムダ重鎖で対合している１つの不適切なＦａｂが存在する。
【表１３】
2019531725.tif 000149
【０３１７】
例８
多重特異性分子７は、α−ＰＤ１アームと、α−ＰＤＬ１アームとを含む。このα−ＰＤ１アームは、配列番号１８１のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１８２のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＰＤＬ１アームは、配列番号１６６のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１６７のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子７の構成を、図５に示す。
【０３１８】
配列番号８９、配列番号９０、配列番号８４、及び、配列番号８５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子７を発現させた。多重特異性分子７を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１６に示す。多重特異性分子７のパパイン開裂の質量分析データを、図３５に示しており、また、表１４にまとめており、そこには、カッパ軽鎖と対になったラムダ重鎖で対合している１つの不適切なＦａｂが存在する。
【表１４】
2019531725.tif 000150
【０３１９】
例９
多重特異性分子８は、α−ＣＴＬＡ４アーム、α−ＩＬ１２βアーム、及び、ＩＬ−２ポリペプチドを含む。このＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＩＬ１２βアームのラムダ軽鎖のＣ末端に融合する。α−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１７１のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＩＬ１２βアームは、融合したＩＬ−２ポリペプチドと一緒に、配列番号１７２のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１７３のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子８の２本の重鎖は、ノブ−イン−ホール変異を含んでいない。多重特異性分子８の構成を、図７に示す。
【０３２０】
配列番号７３、配列番号１５、配列番号７４、及び、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子８を発現させた。多重特異性分子８を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１７に示す。図２１は、多重特異性分子８のサイズ排除クロマトグラムを示す。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を、多特異性分子８を用いて行い、図２６に示した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔのフロースルー画分は、いずれも、タンパク質を含んでおらず、このことは、良好な鎖忠実度を示唆している。
【０３２１】
例１０
多重特異性分子９は、α−ＣＴＬＡ４アーム、α−ＩＬ１２βアーム、及び、ＩＬ−２ポリペプチドを含む。このＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＩＬ１２βアームのラムダ軽鎖のＣ末端に融合する。α−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１６８のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＩＬ１２βアームは、融合したＩＬ−２ポリペプチドと一緒に、配列番号１７０のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１７３のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子８とは違って、多重特異性分子９の２本の重鎖は、ノブ−イン−ホール変異を含む。多重特異性分子９の構成を、図６に示す。
【０３２２】
配列番号７８、配列番号１５、配列番号９１、及び、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子９を発現させた。多重特異性分子９を精製し、そして、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１８に示す。図２２は、多重特異性分子９のサイズ排除クロマトグラムを示す。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を、多特異性分子９を用いて行い、図２７に示した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔのフロースルー画分は、いずれも、タンパク質を含んでおらず、このことは、良好な鎖忠実度を示唆している。
【０３２３】
例１１
多重特異性分子１０は、α−ＣＴＬＡ４アーム、α−ＩＬ１２βアーム、及び、２つのＩＬ−２ポリペプチドを含む。第１のＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＩＬ１２βアームのラムダ軽鎖のＣ末端に融合する。第２のＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＩＬ１２βアームの重鎖のＣ末端に融合する。α−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１７１のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＩＬ１２βアームは、融合した２つのＩＬ−２ポリペプチドと一緒に、配列番号１７５のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１７３のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子１０の２本の重鎖は、ノブ−イン−ホール変異を含んでいない。多重特異性分子１０の構成を、図９に示す。
【０３２４】
配列番号７３、配列番号１５、配列番号７７、及び、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子１０を発現させた。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を、多特異性分子１０を用いて行い、図２９に示した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのフロースルー画分は、タンパク質を含んでいなかったが、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔのフロースルー画分は、主に、カッパ重鎖（ノブ）と、カッパ軽鎖とからなるタンパク質を含んでいた。このことは、鎖忠実度の問題としてよりも、カッパ片の発現が、ラムダ鎖の発現よりも大きいものであった、ことを示唆している。
【０３２５】
例１２
多重特異性分子１１は、α−ＣＴＬＡ４アーム、α−ＩＬ１２βアーム、及び、２つのＩＬ−２ポリペプチドを含む。第１のＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＩＬ１２βアームのラムダ軽鎖のＣ末端に融合する。第２のＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＩＬ１２βアームの重鎖のＣ末端に融合する。α−ＣＴＬＡ４アームは、配列番号１６８のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＩＬ１２βアームは、融合した２つのＩＬ−２ポリペプチドと一緒に、配列番号１７４のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１７３のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子１０とは違って、多重特異性分子１１の２本の重鎖は、ノブ−イン−ホール変異を含む。多重特異性分子１１の構成を、図８に示す。
【０３２６】
配列番号７８、配列番号１５、配列番号７６、及び、配列番号７５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子１１を発現させた。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を、多特異性分子１１を用いて行い、図２８に示した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのフロースルー画分は、タンパク質を含んでいなかったが、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔのフロースルー画分は、主に、カッパ重鎖（ノブ）と、カッパ軽鎖とからなるタンパク質を含んでいた。このことは、鎖忠実度の問題としてよりも、カッパ片の発現が、ラムダ鎖の発現よりも大きいものであった、ことを示唆している。このことは、多重特異性分子１０で認められたことと符合しており、同分子１０は、ノブ−イン−ホール変異が無いこと以外は同じである。
【０３２７】
例１３
多重特異性分子１２は、α−ＣＴＬＡ４アーム、α−ＴＲＡＩＬＲ２アーム、ｓｃＦｖ標的アーム、及び、ＩＬ−２ポリペプチドを含む。このＩＬ−２ポリペプチドは、α−ＣＴＬＡ４アームのカッパ軽鎖のＣ末端に融合する。ｓｃＦｖは、α−ＣＴＬＡ４アームの重鎖のＣ末端に融合する。α−ＣＴＬＡ４アームは、融合したＩＬ−２ポリペプチド、及び、ｓｃＦｖと一緒に、配列番号１６９のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。α−ＴＲＡＩＬＲ２アームは、配列番号１７７のアミノ酸配列の第１の鎖と、配列番号１４８のアミノ酸配列の第２の鎖とを含む。多重特異性分子１２の２本の重鎖は、ノブ−イン−ホール変異を含む。多重特異性分子１２の構成を、図１０に示す。
【０３２８】
配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、及び、配列番号５７のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることで、多重特異性分子１２を発現させた。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ分析を、多特異性分子１２を用いて行い、図３０に示した。それらの比率は、トランスフェクションの際に使用したＤＮＡの比率を示しており、カッパ：ラムダは、３：１〜１：３で変化する。すべての事例において、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔカラムのフロースルーのいずれにも、タンパク質が認められる。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔフロースルーでのタンパク質は、カッパ重鎖、ラムダ重鎖、及び、ラムダ軽鎖から構成されている。ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔフロースルーでのタンパク質は、カッパ重鎖と軽鎖から構成されており、ラムダ鎖の比率が増加するにつれて減少する。これらのデータは、多重特異性分子４のデータと符合しており、同分子４は、同じＦａｂ成分を有しており、そして、カッパ重鎖と対になるラムダ軽鎖のみを示し、かつ、その逆を示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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