(57)【要約】  本発明はワンステップアッセイを用いた複数ウイルスの分別検出のための組成物および方法に関する。検出されるウイルスには、ジカ、ウエストナイル、デング（遺伝型１〜４）、およびチクングニアウイルスが含まれる。特に、本発明はウイルス間を検出および分別するように設計された特異的プライマーおよびプローブを用いたウイルスの分別検出のための方法およびアッセイに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおけるジカウイルスの存在を検出するための方法であって、
ａ．前記サンプルをジカウイルスに特異的な少なくとも１種類のプライマーと接触させ、
ｂ．前記サンプルおよび前記プライマーを増幅条件にし、
ｃ．増幅産物の存在を検出すること
を含み、ここで、ジカウイルスに特異的な前記プライマーからの前記増幅産物の存在が前記サンプルにおけるジカウイルス由来の核酸の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルをジカウイルスに特異的なプローブと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが天然起源のものであり、血漿、血清、全血、髄液、精液、羊水、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官、および組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが尿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルがヒト被験体からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ジカウイルスに特異的な前記プライマーおよびプローブが、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲ由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルにおけるジカウイルスならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも１種類の他のウイルスの存在を検出する方法であって、
ａ．前記サンプルを、ジカウイルスに特異的な少なくとも１種類のプライマー、ならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される別のウイルスに特異的な少なくとも１種類のプライマーを接触させ、
ｂ．前記サンプルおよび前記プライマーを増幅条件にし、
ｃ．増幅産物の存在を検出すること
を含み、ここで、ジカウイルスに特異的な前記プライマーからの前記増幅産物の存在が前記サンプルにおけるジカウイルス由来の核酸の存在を示し、デングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも１種類のウイルスに特異的な前記プライマーからの前記増幅産物の存在が前記サンプルにおける前記ウイルス由来の核酸の存在を示す、方法。
【請求項１１】
前記サンプルを、ジカウイルス、ならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも１種類の他のウイルスに特異的なプローブと接触させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
デングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも２種類のウイルスが、ジカウイルスと同時に検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
デングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される全３種のウイルスが、ジカウイルスと同時に検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが天然起源のものであり、血漿、血清、全血、髄液、精液、羊水、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官、および組織からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが尿または血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルがヒト被験体からのものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
ジカウイルスに特異的な前記プライマーおよびプローブが、前記ウイルスゲノムの３’ＵＴＲ由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２を含み、前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブがＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６１０の５’修飾およびＢＨＱ−２の３’修飾を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
デングウイルス（遺伝型１〜４）に特異的な前記プライマーおよびプローブが、前記ウイルスゲノムの３’ＵＴＲ由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、および９を含み、前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブがＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ５６０の５’修飾およびＢＨＱ−１Ｐｌｕｓの３’修飾を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
チクングニアウイルスに特異的な前記プライマーおよびプローブが、前記ウイルスゲノムのＮＳＰ２部分由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プライマーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２を含み、前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブがＦＡＭの５’修飾およびＢＨＱ−１Ｐｌｕｓの３’修飾を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ウエストナイルウイルスに特異的な前記プライマーおよびプローブが、前記ウイルスゲノムのＮＳ５部分由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記プライマーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５を含み、前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブがＱｕａｓａｒ６７０の５’修飾およびＢＨＱ−２の３’修飾を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
サンプルにおける、ジカウイルス、ならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される全３種のウイルスの存在を同時に検出して分別する方法であって、
ａ．前記サンプルを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、４、７、および１１を含む第一プライマーと接触させ
ｂ．前記サンプルを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、８、９、および１２を含む第二プライマーとさらに接触させ、
ｃ．前記サンプルおよび前記プライマーを増幅条件にし、
ｄ．増幅産物の存在を検出すること
を含み、ここで、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２からの前記増幅産物の存在は前記サンプルにおけるジカウイルス由来の核酸の存在を示し、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５からの前記増幅産物の存在は前記サンプルにおけるウエストナイルウイルス由来の核酸の存在を示し、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８および９からの前記増幅産物の存在は前記サンプルにおけるデングウイルス（遺伝型１〜４）由来の核酸の存在を示し、ならびにプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２からの前記増幅産物の存在は前記サンプルにおけるチクングニアウイルス由来の核酸の存在を示し、ここで前記プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２が前記サンプルにおける各ウイルスの分別検出を可能にする、方法。
【請求項３１】
前記サンプルをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、および１３を含むプローブとさらに接触させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブが検出可能に標識される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが天然起源のものであり、血漿、血清、全血、髄液、精液、羊水、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官、および組織からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルが尿または血清である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルがヒト被験体からのものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが合成起源のものであり、インビトロ細胞培養成分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４および１５を含むプライマー、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むプローブと接触させることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸がＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記プライマーおよびプローブが、ｃＤＮＡである、請求項１〜３８に記載の方法。
【請求項４０】
ジカウイルス、ならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも１種類の他のウイルスの同時検出および分別のためのキットであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２を含むプライマー、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、および１３を含むプローブを含む、キット。
【請求項４１】
コントロール配列、核酸ポリメラーゼ、および核酸抽出試薬を含む前記分別検出を実施するための試薬、ならびに使用のための取扱説明書をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
各ウイルスの前記検出のための前記プライマーおよびプローブが、単一反応混合物におけるものである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記プローブが検出可能な標識をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
ジカウイルス、ならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも１種類の他のウイルスの同時検出および分別のためのキットであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３を含むジカウイルスを検出するためのプライマーおよびプローブ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６を含むウエストナイルウイルスを検出するためのプライマーおよびプローブ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１０を含むデングウイルス（遺伝型１〜４）を検出するためのプライマーおよびプローブ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３を含むチクングニアウイルスを検出するためのプライマーおよびプローブを含む、キット。
【請求項４５】
前記プローブが検出可能な標識をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１６を含むコントロールプライマーおよびプローブをさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
前記検出を実施するために、コントロール配列、核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、安定剤、核酸抽出試薬、および使用のための取扱説明書をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４８】
前記プライマーおよびプローブが、ｃＤＮＡを含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１３のいずれか一項から選択される核酸配列を有する、合成核酸。
【請求項５０】
ジカウイルスの存在を、デングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される全３種のウイルスから同時に検出して分別するためのプライマーセットであって、ここで前記プライマーセットがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２から選択される核酸配列を有する合成核酸を含む、プライマーセット。
【請求項５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５、７、８、９、１１、および１２から選択される核酸配列を有する合成核酸をさらに含む、請求項５０に記載のプライマーセット。
【請求項５２】
ジカウイルスの存在を、デングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される全３種のウイルスから同時に検出して分別するためのプローブであって、ここで前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列を有する合成核酸を含む、プローブ。
【請求項５３】
ジカウイルスの存在を、デングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される全３種のウイルスから同時に検出して分別するためのプローブであって、ここで前記プローブがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、および１３からなる群から選択される核酸配列を有する合成核酸を含む、プローブ。
【請求項５４】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項４９に記載の合成核酸。
【請求項５５】
ジカウイルス、ならびにデングウイルス（遺伝型１〜４）、チクングニアウイルス、およびウエストナイルウイルスからなる群から選択される少なくとも１種類の他のウイルスの同時検出および分別のためのアッセイであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３を含むジカウイルスを検出するためのプライマーおよびプローブ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６を含むウエストナイルウイルスを検出するためのプライマーおよびプローブ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１０を含むデングウイルス（遺伝型１〜４）を検出するためのプライマーおよびプローブ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３を含むチクングニアウイルスを検出するためのプライマーおよびプローブを含み、ここで前記プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２がサンプルにおける各ウイルスの分別検出を可能にする、アッセイ。
【請求項５６】
前記プローブが検出可能な標識をさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ。
【請求項５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１６を含むコントロールプライマーおよびプローブをさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ。
【請求項５８】
前記検出を実施するために、コントロール配列、核酸ポリメラーゼ、核酸抽出試薬緩衝剤、安定剤、および使用のための取扱説明書を含む試薬をさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は２０１６年３月１７日に出願された米国特許出願第６２／３０９，７７０号および２０１６年１２月８日に出願された第６２／４３１，５５０号の優先権を主張し、その全体が参考によって本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明はワンステップアッセイを用いた複数ウイルスの分別検出のための組成物および方法に関する。検出されるウイルスには、ジカ、ウエストナイル、デング（遺伝型１〜４）、およびチクングニアウイルスが含まれる。特に、本発明はウイルス間を検出して分別するように設計された特異的プライマーおよびプローブを用いたウイルスの分別検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は新たな蚊媒介性ウイルスであり、アフリカ、アジア、およびアメリカを含むいくつかの主要な大陸に影響を及ぼし、世界保健機構（ＷＨＯ）によって地球規模の出現が考えられている。ＺＩＫＶ感染は小頭症、頭蓋内石灰沈着、および胎児性脳破綻シークエンスのような重度な胎児性脳異常、ならびに眼球異常に原因として関連しており、妊婦にとって高いリスクを有する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１６）。さらに、ＺＩＫＶ感染はギランバレー症候群のリスク増加を引き起こす可能性がある（Ｂｒｏｕｔｅｔら、２０１６）。
【０００４】
都市および郊外の環境において、ＺＩＫＶはヒト−蚊−ヒト感染サイクルで伝播される。蚊伝播に加え、ＺＩＫＶは妊娠期間に母親から胎児に感染され得ることが証明されている。さらにパートナーとの性行為感染も報告されている。最後に、血液伝播を通したＺＩＫＶの感染は報告されていないが、この経路を通る他の関連するフラビウイルスの伝播が示されており、生じる可能性がある。
【０００５】
ジカウイルスはフラビウイルスであり、デングウイルス（ＤＥＮＶ）と密接に関連している。ＺＩＫＶ診断はしばしば臨床症状および疫学的関連に基づいている。ジカウイルスおよびデングウイルス感染、ならびに他のウイルス、すなわちウエストナイルウイルス（フラビウイルス）およびチクングニア（アルファウイルス）からの感染が、分別診断を困難にさせる同様な臨床症状で現れる。
【０００６】
今日まで、これらの４種の関連するアルボウイルスの分別検出に関する方法またはアッセイはない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明はアッセイ（すなわち、ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイ）のために、血清および尿検体（同一患者から血清検体と同時に採取され得る）におけるウイルスＲＮＡを検出することによって、ジカウイルス感染の検出および診断のために意図される多重ワンステップ逆転写リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応試験を提供する。アッセイはまた、血清および尿サンプルにおけるデングウイルス（ＤＥＮＶ１〜４型）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、およびウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）由来のＲＮＡの分別検出のために使用することができる。ＺＩＫＶ  ＲＮＡは一般的に、感染の急性期および症状の発症後２週までの間、血清および／または尿で検出可能である。ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによる陽性結果は、急性ウイルス感染の指標である。
【０００８】
本発明は、特定のアルボウイルスの核酸の存在を検出するための組成物、方法、およびキットを提供する。具体的には、本発明は特定のアルボウイルスの分別検出を可能にする。特に、本発明はポリメラーゼ連鎖反応方式を用いたワンステップアッセイにおいて、ジカウイルスならびにデング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの分別検出を可能にする。本発明の方法およびアッセイは、迅速で費用がかからず、高感度で特異的であり、ジカウイルスならびにデング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの検出および診断を可能にする。特定の実施形態では、本発明は単一サンプルで認められる特定の１種類のウイルスまたは複数ウイルスの検出および測定を可能にする。一つの態様では、本発明は単一サンプルにおけるウイルスを検出することができるだけでなく、単一サンプルに含まれる１種類のウイルスまたは複数のウイルスを分別することができるプライマーおよびプローブである。
【０００９】
特定の態様では、本発明はジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸をワンステップアッセイ、すなわち単一サンプルで検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は検出可能な標識オリゴヌクレオチドプローブの存在中でウイルスの核酸を増幅させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法はプライマーを用いてウイルスの核酸を増幅することを含み、ここでプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、または１２を含む。いくつかの実施形態では、本方法はプライマー対または群における１種類を超えるプライマーを用いてウイルスの核酸を増幅することを含み、ここでプライマー対または群は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、または１３を含む。いくつかの実施形態では、本方法はプライマー対または群における１種類を超えるプライマーを用いてウイルスの核酸を増幅し、検出可能な標識がされたプローブによって核酸の存在を検出することを含み、ここでプライマー対または群およびプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を含む。本方法のいくつかの実施形態では、プライマー群およびプローブのすべてを使用して、１つのサンプルにおけるウイルスの核酸を同時に、すなわち一度に検出する。本方法のいくつかの実施形態では、プライマー群およびプローブのすべてを使用して、１つのサンプルにおけるウイルスの核酸を連続した時間で、すなわち連続的に検出する。いくつかの実施形態では、検出される核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、検出される核酸はｃＤＮＡである。
【００１０】
特定の実施形態では、プローブは検出可能な部分を含む。検出可能な部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意の検出可能な部分であることができる。例えば、検出可能な部分は蛍光部分であることができる。特定の実施形態では、蛍光部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素からなる群から選択することができる。
【００１１】
特定の実施形態では、プローブはクエンチャー部分を含む。クエンチャー部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意のクエンチャー部分であることができる。特定の実施形態では、クエンチャー部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、および非蛍光クエンチャー部分からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、非蛍光クエンチャー部分はＢＨＱＴ（商標）系色素、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）、またはＤａｂｃｙｌであることができる。
【００１２】
特定の実施形態では、本方法は、蛍光部分およびクエンチャー部分を含む検出可能な標識核酸プローブの存在において、ジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸を増幅することを含む。特定の実施形態では、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼによる検出可能な標識プローブの分裂は、蛍光部分をクエンチャー部分から分離する。特定の実施形態では、プローブの分裂、そしてウイルスの核酸の存在は、蛍光の放出をモニタリングすることによって検出することができる。
【００１３】
本発明はまた、ジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスをワンステップアッセイ、すなわち単一サンプルで検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法はジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群から選択される配列を含む少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドによって、オリゴヌクレオチドからヌクレオチド配列の少なくとも一部の増幅の開始を可能にする条件下で増幅させ、増幅した核酸を検出し、これによってウイルスを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はプライマー対または群における１種類を超えるプライマーを用いてウイルスの核酸を増幅することを含み、ここでプライマー対または群はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、または１３を含む。いくつかの実施形態では、本方法はプライマー対または群における１種類を超えるプライマーを用いてウイルスの核酸を増幅し、検出可能な標識プローブによって核酸の存在を検出することを含み、ここでプライマー対または群およびプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を含む。本方法のいくつかの実施形態では、プライマー群およびプローブのすべてを使用して、１つのサンプルにおけるウイルスの核酸を同時に、すなわち一度に検出する。本方法のいくつかの実施形態では、プライマー群およびプローブのすべてを使用して、１つのサンプルにおけるウイルスの核酸を連続した時間で、すなわち連続的に検出する。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸はｃＤＮＡである。
【００１４】
特定の実施形態では、プローブは検出可能な部分を含む。検出可能な部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意の検出可能な部分であることができる。例えば、検出可能な部分は蛍光部分であることができる。特定の実施形態では、蛍光部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素からなる群から選択することができる。
【００１５】
特定の実施形態では、プローブはクエンチャー部分を含む。クエンチャー部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意のクエンチャー部分であることができる。特定の実施形態では、クエンチャー部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、および非蛍光クエンチャー部分からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、非蛍光クエンチャー部分はＢＨＱＴ（商標）系色素、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）、またはＤａｂｃｙｌであることができる。
【００１６】
特定の実施形態では、本方法は、蛍光部分およびクエンチャー部分を含む検出可能な標識核酸プローブの存在において、ジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸を増幅することを含む。特定の実施形態では、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性核酸ポリメラーゼによる検出可能な標識プローブの分裂は、蛍光部分をクエンチャー部分から分離する。特定の実施形態では、プローブの分裂、そしてウイルスの核酸の存在は、蛍光の放出をモニタリングすることによって検出することができる。
【００１７】
前述の方法に加え、本発明はさらにジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸を検出するための核酸プライマーおよびプローブを提供する。特定の実施形態では、本発明はジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスを検出するための核酸プライマーを提供する。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明はジカウイルスを検出するための核酸プライマーを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む。特定の実施形態では、本発明はウエストナイルウイルスを検出するための核酸プライマーを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を含む。特定の実施形態では、本発明は、デングウイルスを検出するための核酸プライマーを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。特定の実施形態では、本発明はチクングニアウイルスを検出するための核酸プライマーを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明はジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスを検出するための核酸プローブを提供する。特定の実施形態では、本発明はジカウイルスを検出するための核酸プローブを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む。特定の実施形態では、本発明は、ウエストナイルウイルスを検出するための核酸プローブを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む。特定の実施形態では、本発明はデングウイルスを検出するための核酸プローブを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を含む。特定の実施形態では、本発明はチクングニアウイルスを検出するための核酸プローブを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は蛍光部分およびクエンチャー部分を含む核酸プローブを提供する。特定の実施形態では、プローブが完全な状態であるとき、蛍光部分はクエンチャー部分に対して、蛍光部分によって放出される光子がクエンチャー部分によって吸収されるように配置される。５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるプローブの分裂は、蛍光部分をクエンチャー部分から分離し、そのため蛍光部分によって放出される光子を検出することができる。
【００２１】
他の態様では、本発明はジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸の検出、および／またはジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの検出のためのキットを提供する。特定の実施形態では、本キットは本発明の１種類以上のプライマーおよびプローブの組み合わせを含む。特定の実施形態では、本キットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２からなる群から選択される１種類以上のプライマーを含む。特定の実施形態では、本キットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、および１３からなる群から選択される１種類以上のプローブを含む。特定の実施形態では、キットはさらに陽性コントロール配列のためのプライマーおよびプローブを含む。特定の実施形態では、本キットはさらにヒトＲＮアーゼを検出するためのプライマーおよびプローブを含む。特定の実施形態では、本キットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１６を含むプライマーおよびプローブを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明のキットは核酸プローブとして有用なオリゴヌクレオチドを含み、ここで１つ以上の検出可能な部分が核酸プローブと結合される。特定の実施形態では、１つ以上の検出可能な部分は蛍光部分である。特定の実施形態では、蛍光部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素からなる群から選択することができる。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明のキットは核酸プローブとして有用なオリゴヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つのクエンチャー部分が核酸プローブと結合される。特定の実施形態では、クエンチャー部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、および非蛍光クエンチャー部分からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、非蛍光クエンチャー部分はＢＨＱＴ（商標）系色素、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）、またはＤａｂｃｙｌであることができる。他の実施形態では、プローブは少なくとも１つの検出可能な部分、例えば蛍光部分、および少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。一つの実施形態では、プローブは二重標識ＢＨＱ（登録商標）を用いて標識される。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明のキットは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。特定の実施形態では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写活性を有する。特定の実施形態では、本発明のキットはさらに本発明の方法に従ってジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸および／またはジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスを検出するための取扱説明書を含む。特定の実施形態では、本発明のキットはコントロールを含み、限定されないが、当該ウイルスのすべておよびヒト核酸の陽性コントロール、ならびに陰性コントロールを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アッセイ結果の解釈および報告の指図を示す表を示す図である。
【図２】デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスを加えて調製した血清および尿サンプルによるＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの検証結果の表を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に従って、分子免疫学、細胞免疫学、薬理学、および微生物学で一般的に使用されるような、従来技術における多くのツールおよび技術があり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（検査室マニュアル），３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新プロトコル），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ホーボーケン、ニュージャージー州、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（細胞生物学における最新プロトコル），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ホーボーケン、ニュージャージー州、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における最新プロトコル），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ホーボーケン、ニュージャージー州、Ｃｏｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学における最新プロトコル），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ホーボーケン、ニュージャージー州、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（タンパク質科学における最新プロトコル），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ホーボーケン、ニュージャージー州、およびＥｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（薬理学における最新プロトコル），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：ホーボーケン、ニュージャージー州、を参照のこと。
【００２７】
「増幅反応」は、鋳型核酸配列のコピーの増加、または鋳型の存在を示すシグナルの増加をもたらす、いずれかの反応（例えば、化学的、酵素的、または他の反応型）を意味する。増幅反応には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＰＣＲプロトコル：方法および応用のガイド）（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０））、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  ３（１）：１−６（１９９３）），転写仲介増幅（Ｐｈｙｆｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：８３４−８４１（１９９６）；Ｖｕｏｒｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１８５６−１８５９（１９９５）），核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１））、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：７５−９９（１９９９））；Ｈａｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５（２）：３５−４０  （１９９９））、分枝化ＤＮＡシグナル増幅（ｂＤＮＡ）（Ｉｑｂａｌ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １３（４）：３１５−３２０（１９９９））、およびＱ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７（１９８８）を参照のこと）。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「サンプル」は核酸を含んでいる、または含むと推測されるいずれかの物質を意味する。サンプルは天然または合成由来であることができ、従来技術の当業者によって知られている任意の手段によって得ることができる。サンプルは個体または複数の個体から分離される組織または液体のサンプルであることができ、限定されないが例えば、皮膚、血漿、血清、全血、髄液、精液、精漿、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官、腫瘍、気管支洗浄液、およびインビトロ細胞培養成分のサンプル（限定されないが、細胞培養培地における細胞の増殖から得られる条件化培地、組換え細胞、および細胞成分を含む）も含まれる。核酸は従来技術で知られている任意の手順によって生物学的サンプルから得ることができる。好ましいサンプルは血清および尿を含む。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「被験体」はいずれかの生物を意味し、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、モルモット、フェレット、ウサギ、および霊長類のような哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、被験体はヒト、愛玩動物、または家畜動物である。
【００３０】
本出願で使用される用語「患者」はヒト被験体を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される用語「検出」、「検出する」、「検出している」などは、存在または現存を見つけることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用される用語「分別する」、「分別的」などは、異なることを特定または認めることを意味する。
【００３３】
本明細書で使用される用語「アルボウイルス」は、カ、ダニ、または他の節足動物によって伝播されるウイルスを意味し、ジカ、デング、ウエストナイルウイルス、およびチクングニアウイルス、ならびに黄熱病および脳炎を含む。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ、検出されるべきオリゴマーフラグメント、オリゴマーコントロール、および非標識ブロッキングオリゴマーを意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンまたはピリミジン塩基の他のＮ−グリコシド、あるいは修飾されたプリンまたはピリミジン塩基の直鎖ポリマーを総称する。
【００３５】
核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合または修飾結合を含むことができ、限定されないが、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、炭酸、カルボキシメチルエステル、アセトイミデート、カルバマート、チオエーテル、架橋化ホスホルアミデート、架橋化メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオアート、架橋化ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびこのような結合の組み合わせを含む。
【００３６】
核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、５種の生物学的由来の塩基（アデニン、グアニン、チミジン、シトシン、およびウラシル）および／または５種の生物学的由来の塩基以外の塩基を含むことができる。これらの塩基は多くの目的を果たし得、例えば、ハイブリダイゼーションを安定化または不安定化する、プローブ分解を促進または阻害する、あるいは検出可能な部分またはクエンチャー部分のための結合点などが挙げられる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾化、非標準的、または誘導体化された塩基部分を含むことができ、限定されないが、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−ｔ−ブチル−ベンジル−アデニン、イミダゾール、置換イミダゾール、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄマンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、および５−プロピニルピリミジンが含まれる。修飾化、非標準的、または誘導体化された塩基部分の他の例は、米国特許第６，００１，６１１号、第５，９５５，５８９号、第５，８４４，１０６号、第５，７８９，５６２号、第５，７５０，３４３号、第５，７２８，５２５号、および第５，６７９，７８５号に認められ得る。
【００３７】
さらに、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾糖部分を含むことができ、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースが含まれる。
【００３８】
本発明は核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの供給源によって制限されることは意図されない。核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、またはいずれかの他の生物由来であることができ、あるいはインビトロで合成されたいずれかの組換え源から導き出す、または化学的合成によることができる。核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ハイブリッド、またはこれらのいずれかの混合であり得、二本鎖、一本鎖、または部分的な二本鎖型で存在し得る。核酸はまた、米国特許第５，６９６，２４８号に記載される派生的核酸であり得る。本発明の核酸は、精製型または未精製型で核酸およびこのフラグメントの両方を含み、遺伝子、染色体、プラスミド、生物学的材料として例えば細菌、酵母、ウイルス、ビロイド、カビ、真菌のような微生物、植物、動物、ヒトなどのゲノムを含む。
【００３９】
用語である核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの間に長さにおける意図された区別はなく、これらの用語は交換可能で使用される。これらの用語は、二本および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本および一本鎖ＲＮＡを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーおよび／またはプローブとして使用され得る。このため、「プライマー」と本明細書でいわれるオリゴヌクレオチドは、プローブとして作用し得、「プローブ」といわれるオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態ではプライマーとして作用し得る。
【００４０】
本明細書で使用される用語「残基」は、前述で定められる核酸内のヌクレオチドまたは塩基を意味する。残基は従来技術の当業者に知られているいずれかのヌクレオチドであることができ、限定されないが、生物学的由来のヌクレオチドおよび前述の非生物学的由来のヌクレオチドのすべてを含む。
【００４１】
用語「プライマー」は、鋳型鎖と相補的であるプライマー伸長産物の合成が可能である条件下に配置されたとき、鋳型核酸鎖に沿ったポリヌクレチド合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、精製された制限フラグメントとして組換え源から得ることができ、あるいは合成によって作製することができる。プライマー伸長条件は一般的に、適切な緩衝剤（「緩衝剤」はコファクターである、またはｐＨ、イオン強度に影響する、置換成分を含むことができる）における４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合化活性を有する薬剤の存在、および適切な温度を含む。プライマーは好ましくは増幅における最大効率のために一本鎖である。本発明のプライマーは、５〜５００ヌクレオチドであり得、いくつかの実施形態では、少なくとも１０、２０、３０、２５、３０、４０、５０、７５、または１００ヌクレオチドを有し、および／または５００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、または２０ヌクレオチドより少なく有する。
【００４２】
用語「ハイブリダイゼーションする」は、一本鎖核酸または二本鎖核酸の局所的な一本鎖領域の、相補的配列を有する他の一本鎖核酸または二本鎖核酸の局所的な一本鎖領域との結合を意味する。従来技術の当業者が気付くように、２つの核酸鎖が完全に相補的であることは、互いにハイブリダイゼーションする上で必要とされない。ハイブリダイゼーション条件に応じて、核酸はその相補体と、一方または両方の鎖に僅か、いくつか、または多くのミスマッチ、欠失、または付加がある場合でさえ、ハイブリダイゼーションすることができる。特定の実施形態では、本発明のプライマーおよびプローブは、後述のように、少なくとも部分的に相補的である核酸と選択的にハイブリダイゼーションすることができる。特定の実施形態では、本発明のプライマーおよびプローブは、少なくとも部分的に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができる。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「プローブ」は核酸の領域と二重構造を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味し、プローブにおける少なくとも１つの配列の、当該領域における配列との相補性に起因する。プローブは、好ましくは、プライマーの配列と相補的である配列を含まない。後述で考察されるように、プローブは標識または非標識であることができる。プローブの３’端は、プローブのプライマー伸長産物への取り込みを防ぐために「ブロッキング」することができる。「ブロッキング」は、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに、非相補的塩基を使用することによって、あるいはビオチンまたはリン酸基のような化学的部分を加えることによって達成することができ、選択された部分に応じて、その後の検出のための標識または標識に結合する核酸の捕捉としても作用することによって、二重の目的を果たし得る。ブロッキングはまた、３’ヒドロキシルを取り除く、またはジデオキシヌクレオチドのような３’ヒドロキシルを欠如するヌクレオチドを用いることによって達成することができる。
【００４４】
本明細書で使用される用語「検出可能な部分」は、検出可能（任意に定量可能）なシグナルを得るために使用することができ、核酸またはタンパク質に結合することができる、任意の原子または分子を意味する。検出可能な部分は、蛍光、放射能、比色分析、重量分析、Ｘ線回析または吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能であるシグナルをもたらし得る。本発明に都合が良い検出可能な部分は、オリゴヌクレオチドフラグメントのサイズの検出を容易にするものを含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「蛍光部分」は、特定の部分に適した条件下で光を放出することができる化学的部分を意味する。一般的に、特定の蛍光部分は特定波長の光を、より短い波長の光の吸収によって放出することができる。特定の蛍光部分によって放出される光の波長は、その部分の特性である。このため、特定の蛍光部分は、より短い波長の光による蛍光部分の励起の後に続く適切な波長の光を検出することによって、検出することができる。本発明の方法および組成物で使用することができる蛍光部分の例には、限定されないが、フルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素が含まれる。
【００４６】
本明細書で使用される用語「クエンチャー部分」は、クエンチャー部分が蛍光部分に十分接近しているとき、例えばクエンチャーと蛍光の両部分が共通のポリヌクレオチドに結合されているとき、蛍光部分によって放出されるエネルギーを吸収することができる化学的部分を意味する。この現象は蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）として従来技術で一般的に知られている。クエンチャー部分は蛍光部分から吸収されたエネルギーをクエンチャー部分に特有なシグナルで再放出することができ、このためクエンチャー部分は「蛍光部分」であることもできる。あるいは、クエンチャー部分は蛍光部分から吸収されるエネルギーを熱として消散することができる。
【００４７】
本明細書で定められるとき、「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」または「５’ヌクレアーゼ活性」は酵素の活性を意味し、これによってヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’端から連続的手段で取り除かれる。５’ヌクレアーゼ活性は、５’から３’へのエクソヌクレアーゼ活性または５’から３’へのエンドヌクレアーゼ活性であることができる。例えば、多くの鋳型特異的核酸ポリメラーゼは、いくつかのＤＮＡポリメラーゼと伝統的に関連している５’から３’へのエクソヌクレアーセ活性を示す（すなわち、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有し、一方、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは有さない）。５’から３’へのエクソヌクレアーゼ活性も、基質の５’端から１つを超えるホスホジエステル結合（ヌクレオチド）で基質核酸を切断することができる。
【００４８】
用語「約」または「おおよそ」は、従来技術の当業者によって測定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味し、値がどのように計測または測定されるか、すなわち計測系の限界、すなわち医薬製剤のような特定の目的で要求される精度の程度に部分的に依存する。例えば、「約」は従来技術の実施において、１以内または１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、所定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらに好ましくは１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的な系またはプロセスに関して、本用語は値の一桁の大きさ以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および請求項で説明される場合、他に明示がない限り、用語「約」は推測されるべき特定の値に関する許容可能な誤差範囲内を意味する。
【００４９】
他に説明されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本開示に属する従来技術の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００５０】
アルボウイルスの検出のためのプライマーおよびプローブ
本発明は、ウイルスゲノムの特異的部分由来のプライマーおよびプローブのような分離された核酸配列を提供し、ジカおよびデングウイルスの３’ＵＴＲ、ウエストナイルウイルスゲノムのＮＳ５部分、およびチクングニアウイルスゲノムのＮＳＰ２部分を含む。これらの特異的プライマーおよびプローブは、配列アラインメントに基づいた交差反応の可能性およびアッセイ感度を考慮して設計されており、そのため、本発明のプライマーおよびプローブは、これらが単一サンプルにおいて、および／またはジカ、デング、ウエストナイル、およびチクングニアを含む４種の異なるアルボウイルスを検出および分別するための反応において使用することができることで特に有用である。
【００５１】
さらに、本発明のプライマーおよびプローブは、非天然由来組成物である。オリゴヌクレオチドが由来とするアルボウイルスは、フラビウイルス（ＺＫＶ、ＤＫＶ、およびＷＮＶ）およびアルファウイルス（ＣＨＶ）であり、これらのすべてが一本鎖ＲＮＡウイルスである。そのため、本発明のプライマーおよびプローブは自然に発生しないｃＤＮＡを含み、本発明の核酸配列は天然由来ウイルスＲＮＡ配列とは構造が著しく異なる。
【００５２】
一つの態様では、本発明はジカウイルスの核酸および／またはジカウイルスそれ自体の存在を検出するのに有用である少なくとも１種類のプライマーを提供する。特定の実施形態では、プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含むプライマーを含むプライマーセットに関する。
【００５３】
一つの態様では、本発明はウエストナイルウイルスの核酸および／またはウエストナイルウイルスそれ自体の存在を検出するのに有用である少なくとも１種類のプライマーを提供する。特定の実施形態では、プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のヌクレオチド配列を含むプライマーを含むプライマーセットに関する。
【００５４】
一つの態様では、本発明はデングウイルスの核酸および／またはデングウイルスそれ自体の存在を検出するのに有用である少なくとも１種類のプライマーを提供する。特定の実施形態では、プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のヌクレオチド配列を含むプライマーを含むプライマーセットに関する。
【００５５】
一つの態様では、本発明はチクングニアウイルスの核酸および／またはチクングニアウイルスそれ自体の存在を検出するのに有用である少なくとも１種類のプライマーを提供する。特定の実施形態では、プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列を含むプライマーを含むプライマーセットに関する。
【００５６】
従来技術の当業者は、いくつかの塩基をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２の末端から欠失、または末端に追加することができ、当該プライマーは依然として核酸を増幅することができることを理解するであろう。従って、本発明はいくつかの塩基がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２の配列から欠失、または配列に追加されるプライマーを含む。
【００５７】
特定の態様では、本発明は本明細書で説明される分離された核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するものであり、プローブは適切な条件下でジカウイルス由来の核酸とハイブリダイゼーションするのに適している。特定の実施形態では、プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸を含む。
【００５８】
特定の態様では、本発明は本明細書で説明される分離された核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するものであり、プローブは適切な条件下でウエストナイルウイルス由来の核酸とハイブリダイゼーションするのに適している。特定の実施形態では、プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸を含む。
【００５９】
特定の態様では、本発明は本明細書で説明される分離された核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するものであり、プローブは適切な条件下でデングウイルス由来の核酸とハイブリダイゼーションするのに適している。特定の実施形態では、プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の核酸を含む。
【００６０】
特定の態様では、本発明は本明細書で説明される分離された核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するものであり、プローブは適切な条件下でチクングニアウイルス由来の核酸とハイブリダイゼーションするのに適している。特定の実施形態では、プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の核酸を含む。
【００６１】
本発明の核酸プライマーおよびプローブは、限定されないが、従来技術の当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。
【００６２】
プローブヌクレオチド配列に加えて、プローブは本発明の方法を阻害しない追加ヌクレオチド配列または他の部分を含むことができる。本発明に好都合な実施形態では、プローブは本発明の方法を促進する追加ヌクレオチド配列または他の部分を含むことができる。例えば、プローブは３’端でブロックして、プローブによる望ましくない核酸重合化プライミングを防止することができる。また、プローブまたはプローブフラグメントのヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを安定化または不安定化する部分が、プローブ内に存在し得る。本発明のプローブはまた、前述で定められるように、修飾化、非標準的、または誘導体化ヌクレオチドを含むことができる。
【００６３】
本発明の特定の実施形態では、プローブは検出可能な部分を含むことができる。検出可能な部分は、限定されないが従来技術の当業者よって知られている任意の検出可能な部分であることができる。さらに、検出可能な部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意の手段によって検出可能であることができる。例えば、検出可能な部分は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能であることができる。
【００６４】
本発明のプローブを検出するために使用することができる様々な検出可能な部分、ならびにプローブとのこれらの結合のための方法は、従来技術で知られており、限定されないが、酵素（例えば、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ）および酵素基質、放射性部分、蛍光部分、発色団、化学発光標識、Ｏｒｉｇｉｎ（商標）（Ｉｇｅｎ、ロックビル、メリーランド州）のような電気化学発光標識、特異的結合パートナーを有するリガンド、あるいはシグナルを増加、変化、または減少するように互いに相互作用し得るいずれかの他の標識を含む。５’ヌクレアーゼ反応は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて高温で実施され、検出可能部分はこのような高温によって分解されてならず、そうでなくとも検出不能にされてはならない。
【００６５】
特定の実施形態では、検出可能な部分は蛍光部分であることができる。蛍光部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意の蛍光部分であることができる。一般的に、幅広いストークシフトを有する蛍光部分が好ましく、モノクロメーターよりもむしろフィルターを備える蛍光光度計の使用が可能であり、検出効率を増加させる。特定の実施形態では、蛍光部分は、フルオレセイン系色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，、コーラルビル、アイオワ州）、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）、ローダミン系色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，）、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、および６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，）からなる群から選択することができる。本発明のプローブ、方法、およびキットで使用することができる蛍光部分の他の例は、米国特許第６，４０６，２９７号、第６，２２１，６０４号、第５，９９４，０６３号、第５，８０８，０４４号、第５，８８０，２８７号、第５，５５６，９５９号、および第５，１３５，７１７号に認めることができる。
【００６６】
他の実施形態では、検出可能な部分は蛍光部分以外の検出可能な部分であることができる。放射性部分の中では、３２Ｐ標識化合物が好ましい。従来技術の当業者に知られているいずれかの方法が、限定されないが、３２Ｐをプローブに導入するために使用され得る。例えば、プローブは、キナーゼを用いた５’標識によって、またはニックトランスレーションによるランダム挿入によって、３２Ｐで標識され得る。酵素である検出可能な部分は、一般的にこれらの活性によって検出することができる。例えば、アルカリホスファターゼは、適切な基質化合物に対する酵素の作用によって生じる蛍光を測定することによって検出することができる。特異的結合パートナーの構成要素が検出可能な部分として使用される場合、プローブの存在は特異的結合パートナーの構成要素への分子の特異的結合を検出することによって検出することができる。例えば、抗原をプローブに結合することができ、この抗原に特異的なモノクローナル抗体を使用して抗原、従ってプローブの存在を検出することができる。検出可能な部分として使用することができる他の特異的結合パートナーには、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに従来技術で良く知られている多くの他の受容体−リガンド対が含まれる。検出可能な部分が蛍光部分ではないさらなる他の例は、米国特許第５，５２５，４６５号、第５，４６４，７４６号、第５，４２４，４１４号、および第４，９４８，８８２号で認めることができる。
【００６７】
検出可能な部分の上記説明は、様々な標識を異なるクラスに分類することは意味されず、同一標識がいくつかの異なる方式で作用し得る。例えば、１２５Ｉは放射性部分として、または高電子密度試薬として作用し得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼは、酵素として、またはモノクローナル抗体に対する抗原として作用し得る。さらに、様々な検出可能な部分を所望の効果のために組み合わせ得る。例えば、プローブをビオチンで標識して、１２５Ｉ標識したアビジンによって、またはホースラディッシュペルオキシダーゼによって標識された抗ビオチンモノクローナル抗体によって、その存在を検出し得る。他の交換および可能性は、従来技術の当業者に容易に明らかになり、本発明の範囲内の均等物と考えられる。
【００６８】
検出可能な部分をプローブと結合または共役体化する方法は、当然、使用される検出可能な部分のタイプ、およびプローブの検出可能な部分の位置に依存する。
【００６９】
検出可能な部分はプローブと様々な技術によって直接的または間接的に結合され得る。使用される検出可能な部分の正確なタイプに応じて、検出可能な部分は、プローブの５’または３’端に配置させる、プローブのヌクレオチド配列の内部に配置させる、または様々なサイズのスペーサーアームおよびシグナル相互作用を促進する組成物と結合させることができる。市販のホスホラミダイト試薬を用いて、適切に保護されたホスホラミダイトを介していずれかの末端に官能基（例えば、チオールまたは第一級アミン）を含むオリゴヌクレオチドを作製することができ、例えばＩｎｎｉｓらによるＰＣＲ  Ｐｒｏｏｃｏｌｓ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＰＣＲプロトコル：方法および応用のガイド），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されるプロトコルを用いてこれらに検出可能な部分を結合することができる。
【００７０】
特定の実施形態では、検出可能な部分をプローブの５’端に結合させることができる。特定の実施形態では、検出可能な部分をプローブの３’端に結合させることができる。他の実施形態では、検出可能な部分をプローブ内にある残基でプローブに結合させることができる。検出可能な部分をプローブの残基のいずれかの部分に結合させることができる。例えば、検出可能な部分をプローブにおける糖、リン酸、または塩基部分に結合させることができる。別の実施形態では、検出可能な部分をプローブの２つの残基間に結合させることができる。
【００７１】
本発明の特定の実施形態では、プローブは蛍光部分およびクエンチャー部分を含むことができる。このような実施形態では、蛍光部分は、前述のように従来技術の当業者に知られている任意の蛍光部分であることができる。さらに、クエンチャー部分は、限定されないが従来技術の当業者に知られている任意のクエンチャー部分であることができる。特定の実施形態では、クエンチャー部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、および非蛍光クエンチャー部分からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、非蛍光クエンチャー部分は、ＢＨＱＴ（商標）系色素（ＷＯ  ０１／８６００１に記載されるクエンチャーを含む）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）またはＤａｂｃｙｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であることができる。特定のクエンチャー部分の他の例には、例えば、限定されないが、ＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｙ３（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、またはＣｙ５（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれる。本発明のプローブ、方法、およびキットで使用することができるクエンチャー部分の他の例は、米国特許第６，３９９，３９２号、第６，３４８，５９６号、第６，０８０，０６８号、および第５，７０７，８１３号に認めることができる。
【００７２】
特定の実施形態では、クエンチャー部分をプローブの５’端に結合させることができる。特定の実施形態では、クエンチャー部分をプローブの３’端に結合させることができる。他の実施形態では、クエンチャー部分はプローブ内にある残基でプローブに結合させることができる。クエンチャー部分はプローブの残基のいずれかの部分に結合させることができる。例えば、クエンチャー部分はプローブにおける糖、リン酸、または塩基部分に結合させることができる。別の実施形態では、クエンチャー部分はプローブの２つの残基間に結合させることができる。
【００７３】
本発明のこの態様で使用することができる蛍光部分およびクエンチャー部分の例示的な組み合わせには、限定されないが、二重標識ＢＨＱ（登録商標）プローブが含まれる。二重標識ＢＨＱプローブは、オリゴヌクレオチドの５’端および３’端に共有結合されるフルオロフォアおよびクエンチャーを組み入れる直鎖の二重標識５’−３’エクソヌクレアーゼプローブである。蛍光シグナルはＴａｑポリメラーゼの５’エクソヌクレアーゼ活性によって発生され、標的鎖においてその相補的配列とハイブリダイゼーションされたプローブの消化の際に蛍光色素標識ヌクレオチドをプローブから切断し、これによってクエンチャーをフルオロフォアから分離する。
【００７４】
特に、ジカウイルスの検出について例示されるプローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、５’端がＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ６１０によって、３’端がＢＨＱ−２によって修飾される。
【００７５】
ウエストナイルウイルスの検出について例示されるプローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、５’端がＱｕａｓａｒ６７０によって、３’端がＢＨＱ−２によって修飾される。
【００７６】
デングウイルスの検出について例示されるプローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、５’端がＣＡＬ  Ｆｌｕｏｕｒ  Ｏｒａｎｇｅ５６によって、３’端がＢＨＱ−１ｐｌｕｓによって修飾される。
【００７７】
チクングニアウイルスの検出について例示されるプローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、５’端がＦＡＭによって、３’端がＢＨＱ−１ｐｌｕｓによって修飾される。
【００７８】
アルボウイルスの多重検出の方法
本発明は特定のアルボウイルスの核酸および／またはウイルスそれ自体を検出する核酸プライマーおよびプローブを用いるための方法を提供する。いくつかの態様では、本発明はサンプルにおける特定のアルボウイルスの核酸を定量する核酸プライマーおよびプローブを用いるための方法を提供する。従来技術の当業者に知られている、または最近開発されている核酸を検出する核酸プライマーおよびプローブを用いるためのいずれかの方法が、限定されないが、本明細書で説明されるように、検出可能なアルボウイルスの核酸を検出するために使用することができる。特定の実施形態では、本方法はプライマーおよびプローブを用いて、アルボウイルスの核酸を検出することを提供する。特定の実施形態では、本方法は２種類以上のプライマーおよびプローブを用いて、アルボウイルスの核酸を検出することを提供する。いくつかの実施形態では、１種類のアルボウイルスの核酸が単一サンプルで検出される。いくつかの実施形態では、１種類を超えるアルボウイルスの核酸が単一サンプルで検出される。
【００７９】
アルボウイルスの核酸を検出する一つの方法は一般的に、ウイルスの核酸とハイブリダイゼーションされたプライマーを、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させることを含む。そして５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素はウイルスの核酸とハイブリダイゼーションされたプローブを５’ヌクレアーゼ反応で分解する。プローブは、プローブの分裂の検出を可能にする検出可能部分で標識することができる。このような方法は、米国特許第６，２１４，９７９号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，９７２号、および第５，２１０，０１５号に記載される方法に基づく。
【００８０】
５’ヌクレアーゼ反応では、核酸、プライマー、およびプローブは限定されないが、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有することが従来技術の当業者によって知られている任意の酵素と接触させることができる。条件は好ましくは、ポリメラーゼがプローブを切断して核酸からプローブの複数のフラグメントを放出することができるように選択される。５’ヌクレアーゼ活性を有する好ましい酵素には、鋳型依存性核酸ポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼの既知の天然および組換え型には、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｉｎｃ．，ハノーバー、メリーランド州）、バシルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ、およびサーモコックス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００８１】
好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、耐熱性および熱活性核酸ポリメラーゼである。このような耐熱性ポリメラーゼには、限定されないが、真正細菌属であるサーマス、テルモトガ、およびテルモシフォの様々な種由来のポリメラーゼの天然型および組換え型が含まれる。
【００８２】
５’ヌクレアーゼ反応は、検出すべき核酸をプライマー、プローブ、および５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する酵素と、プライマーおよびプローブが当該核酸とハイブリダイゼーションする条件下で接触させることを含む。５’ヌクレアーゼ反応の成分は検出すべき核酸といずれかの順序で接触することができ、例えば、プライマーが最初に検出すべき核酸と接触し、続いてプローブおよび５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が接触する、あるいは５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が検出すべき核酸と最初に接触し、続いてプローブおよびプライマーが接触することができる。特定の実施形態では、１種類を超えるプライマーおよびプローブが５’ヌクレアーゼ反応に加えられ得る。特定の好ましい実施形態では、プライマー対は５’ヌクレアーゼ反応において核酸と接触することができる。プライマーはＤＮＡ合成反応をプライミングすることができるいずれかのプライマーであることができる。１種類のみのプライマーが使用される場合、プライマーはプローブの上流である核酸とハイブリダイゼーションするようにすべきであり、すなわち、プライマーの３’端がプローブの５’端に向けられるべきである。プライマーの３’端はプローブの５’端に隣接してハイブリダイゼーションすることができる、またはプライマーの３’端はさらにプローブの５’端の上流とハイブリダイゼーションすることができる。１種類を超えるプライマーが使用される場合、少なくとも１種類のプライマーは、前述のように、検出すべき核酸とプローブの上流でハイブリダイゼーションするようにすべきである。
【００８３】
本発明の５’ヌクレアーゼ反応の特定の実施形態は、従来技術の当業者に知られているいくつかの５’ヌクレアーゼ反応に基づいている。このような反応の例は、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号に詳細が説明されている。
【００８４】
簡単に説明すると、５’ヌクレアーゼ反応では、標的核酸はプライマーおよびプローブと、プライマーおよびプローブが当該核酸の一つの鎖とハイブリダイゼーションする条件下で接触される。核酸、プライマー、およびプローブはまた、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば核酸ポリメラーゼと接触される。５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼは、プライマーの下流である核酸とハイブリダイゼーションされたプローブを切断することができる。プライマーの３’端は、核酸ポリメラーゼによる鋳型核酸に基づいた新たな核酸の伸長のための基質をもたらす。ポリメラーゼが新たな核酸を伸張するとき、これはプローブの５’端と接近し、プローブからフラグメントを切断し始める。
【００８５】
プライマーおよびプローブは、核酸ポリメラーゼのプライマーの３’との結合がプローブの５’端との接触をもたらすように互いに近接し、これらが標的核酸とハイブリダイゼーションするように設計することができる。このプロセスでは、核酸伸長は核酸ポリメラーゼが切断を実施する位置に入ることは必要とされない。用語「ポリメリゼーション非依存性切断」はこのプロセスを意味する。
【００８６】
あるいは、プライマーおよびプローブが核酸のさらに離れた領域にアニーリングする場合、核酸伸長は核酸ポリメラーゼがプローブの５’端と接近する前に生じなければならない。ポリメリゼーションが継続するとき、ポリメラーゼはプローブの５’端からフラグメントを漸進的に切断する。この切断はプローブの残余が鋳型分子から分離し得る程度に不安定化されている限り継続する。用語「ポリメリゼーション依存性切断」はこのプロセスを意味する。
【００８７】
どちらのプロセスでも、サンプルは核酸を含んで加えられる。核酸が二本鎖である場合、これは最初に変性、例えば核酸の鎖が互いに分離される。いずれかの好ましい変性方法は、限定されないが従来技術の当業者に知られている物理的、化学的、または酵素的手段を含み、核酸鎖を分離するために使用することができる。
【００８８】
本発明のプライマー、プローブ、方法、およびキットによって検出することができるウイルスは一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであることに留意すべきである。従って、天然ウイルスゲノムの変性は、未増幅ウイルスゲノムを検出するために必要とされない。しかし、天然ウイルスゲノムが本発明の特定の実施形態に従いＤＮＡに逆転写される場合、本発明のプライマーおよびプローブによる検出前に、増幅したウイルス核酸の変性が必要である。
【００８９】
検出すべき核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡは前述の５’ヌクレアーゼ反応のためにＲＮＡ鋳型として使用され得る、またはＲＮＡはｃＤＮＡへの逆転写のための鋳型として使用され得る、のいずれか、あるいは同時的に両方であることができる。特定の実施形態では、ＲＮＡは本発明の方法を用いてｃＤＮＡへの逆転写なしで検出することができる。前述のポリメリゼーション非依存性切断方法は、このような実施形態に特に良く適している。他の実施形態では、ＲＮＡはプローブの不存在下で最初にｃＤＮＡに逆転写することができ、そしてｃＤＮＡ産物を本発明の方法に従って検出することができる。さらに他の実施形態では、ＲＮＡはプローブの存在下で逆転写することができ、続いて増幅および／または検出され得るｃＤＮＡを同時に産生して、本明細書で説明されるプローブの分裂を評価することによってＲＮＡの存在を検出する。
【００９０】
ＲＮＡがプローブの不存在下で逆転写される場合、ＲＮＡは従来技術の当業者によって知られている任意の方法によってｃＤＮＡに逆転写することができる。このような逆転写の産物は、次に本明細書で説明される方法に従っていずれかの検出可能な核酸のように検出することができる。
【００９１】
ＲＮＡがプローブの存在下で逆転写される場合、ＤＮＡ鎖合成のための鋳型としてＲＮＡを使用することができる５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡを逆転写することができる。すべての知られているＤＮＡポリメラーゼ合成活性によるとき、このような合成は本明細書で説明されるようなプライマーの存在を必要とする。ＲＮＡを鋳型として使用することができるＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは耐熱性であり、そのため、変性の複数サイクルおよびＤＮＡ合成を、ポリメラーゼを破壊することなく生じることができる。さらに、逆転写に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ鋳型を用いてＤＮＡを合成することもできる。このようなポリメラーゼは、例えば、米国特許第６，４６８，７７５号（カルボキシドサーマス・ヒドロゲンホルマンスＤＮＡポリメラーゼ）、第５，９６８，７９９号（サーモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼ）、第５，７３６，３７３号（バシルス・パリダスＤＮＡポリメラーゼ）、第５，６７４，７３８号（サームス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ）、および第５，４０７，８００（サームス・アクアチカスおよびサームス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ）に記載されている。さらに、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを逆転写するための方法および組成物は、米国特許第５，６９３，５１７号、第５，５６１，０５８号、第５，４０５，７７４号、第５，３５２，６００号、第５，３１０，６５２号、および第５，０７９，３５２号に記載されている。
【００９２】
ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらも、変性した核酸鎖が次にハイブリダイゼーション条件下でプライマーおよびプローブと接触され、プライマーおよびプローブは核酸鎖と結合することが可能である。特定の実施形態では、２種類のプライマーを使用して、核酸を増幅することができる。このような実施形態では、２種類のプライマーは、核酸に沿ったこれらの相対的な位置が、１つのプライマーから合成される伸長産物は、当該伸長産物がその鋳型（相補体）から分離された後に、他のプライマーの伸長のための鋳型として働いて所定の長さの増幅産物を生じるように選択することができる。産物の長さは、２種類のプライマーの間における配列の長さおよび２種類のプライマー自体の長さに依存する。
【００９３】
プローブが好ましくは検出すべき核酸とハイブリダイゼーションしてから、ポリメラーゼが核酸およびプライマーと結合して、検出可能な核酸の鋳型に基づいてプライマーから新たな核酸鎖を伸長することを開始する。プローブが検出可能な核酸と接触する前にポリメラーゼがプライマーおよび検出すべき核酸と結合することは可能であるが、この構成は、後述の好ましいＰＣＲをベースとした５’ヌクレアーゼ反応におけるプライマー伸長の複数サイクルが実施されない場合、プローブ分裂の低下をもたらし得る。従って、ポリメラーゼによるプライマー伸長が開始する前に、プローブが検出すべき核酸とハイブリダイゼーションすることが好ましい。
【００９４】
プローブが検出可能な核酸とハイブリダイゼーションする可能性を、プライマー伸長ポリメリゼーションがこの二本鎖領域に達する前、またはポリメラーゼがポリメリゼーション非依存性プロセスにおいて上流オリゴヌクレオチドと結合する前に高めるため、従来技術の当業者に知られている様々な技術を使用することができる。例えば、短いプライマー分子は一般的に、核酸と十分安定な融合複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。従って、プローブはプライマーより長く設計することができ、これによってプローブはプライマーアニーリングよりも高い温度で優先的に核酸とアニーリングする。
【００９５】
これらのヌクレオチド組成物に基づいて異なる熱安定性を有するプライマーおよびプローブを使用することもできる。例えば、プローブは高いＧ／Ｃ含量を有するように選択し、結果的にプライマーよりも高い熱安定性を有するように選択することができる。これに代えて、または追加として、１つ以上の修飾化、非標準的、または誘導体化されたＤＮＡ塩基がプライマーまたはプローブに組み込まれ、通常のＤＮＡ塩基のみを有するプライマーまたはプローブと比べて高いまたは低い熱安定性を生じ得る。修飾化、非標準的、または誘導体化された塩基部分の他の例は、米国特許第６，３２０，００５号、第６，１７４，９９８号、第６，００１，６１１号、および第５，９９０，３０３号に認められ得る。
【００９６】
さらに、反応温度もプローブおよびプライマーの示差的熱安定性の効果を得るために変化させることができる。例えば、前述の高温での変性後、反応はプローブが結合できるがプライマーが結合できない中間温度、さらにその後にプライマーアニーリングおよびその後の伸長を可能にする温度低下によってインキュベーションすることができる。
【００９７】
オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存性伸長は、適切な塩、金属カチオン、およびｐＨ緩衝化系からなる反応メディウム中で、前述のように４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）またはｄＵＴＰなどのアナログの十分な量の存在中で、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。適切な重合化剤は、プライマーおよび鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒して、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有することが知られている酵素である。このような酵素には、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ、バシルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ、サーモコックス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチカスＤＮＡポリメラーゼ、サーマトガ・マリチマＤＮＡポリメラーゼおよびサーマトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。さらに、これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成を実施するための反応条件は、従来技術で良く知られている。本発明の方法に有用であるために、重合化剤は、オリゴヌクレオチドを効果的に切断して標識フラグメントを放出することができ、これによって検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じさせる、５’ヌクレアーゼ活性を有するべきである。
【００９８】
合成の産物は、鋳型鎖およびプライマー伸長鎖からなる二重分子である。この合成の副産物は、モノ−、ジ−、およびオリゴ−ヌクレオチドフラグメントの混合物からなり得るプローブフラグメントである。好ましい実施形態では、変性の反復サイクル、プローブおよびプライマーのアニーリング、ならびにプライマー伸長およびプローブの切断が実施され得、プライマーによって定められる増幅領域の指数関数的蓄積、および標識フラグメントの指数関数的発生をもたらす。このような反復サーマルサイクルは、一般的にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として従来技術で知られている。検出すべき核酸が存在する陽性反応を、検出すべき核酸が存在しない陰性反応から区別するのに十分なプローブの量にフラグメントが達するのに適したサイクルが実施され得る。一般的に、陽性反応は陰性反応よりも数桁大きいシグナルを示す。
【００９９】
特定の好ましい実施形態では、ＰＣＲ反応は耐熱性酵素を使用する自動化工程として実施される。この工程では、反応混合物は変性ステップ、プローブとプライマーのアニーリングステップ、および合成ステップを通してサイクル化され、これによって切断および置換がプライマー依存性鋳型伸長と同時に生じる。本発明のこのような実施形態の特定のものでは、検出すべき核酸は検出可能な標識プローブの不存在下で増幅することができ、これに別の反応における増幅産物の検出が続く。あるいは、検出すべき核酸をプローブの存在下で増幅することができ、単一反応における増幅および検出が可能である。
【０１００】
熱安定性ポリメラーゼはこの自動化工程で好ましく、二本鎖伸長産物を変性する好ましい方法が、ＰＣＲサイクルの際に高温にこれらをさらすことによるためである。例えば、米国特許第４，８８９，８１８号は、サーマス・アクアチカスから分離される代表的な耐熱性酵素を開示する。追加となる代表的な温度に安定なポリメラーゼには、例えば、サームス・フラブス、サームス・ツベル、サームス・サーモフィルス、バシルス・ステアロサーモフィルス（リスト化される他のものより多少低い温度最適性を有する）、サームス・ラクテウス、サームス・ルベンス、サーモトガ・マルチマ、サーモコックス・リトラリス、メタノサームス・フェルビダス、およびピロコックス・フリオスス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホヤ，カリフォルニア州）から抽出されたポリメラーゼが含まれる。前述のように、これらの耐熱性ポリメラーゼの特定のものは、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することができる。ＲＮＡ分子が本発明の方法によって検出されるべきである場合、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することができる、すなわち逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが使用されるべきである。
【０１０１】
本明細書で説明されるプライマーおよびプローブは多くが市販され、自動化システムである前述のものを含む、ＰＣＲ方式を利用する方法およびシステムで使用することができる。本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１３、ならびにコントロールＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１６を利用するＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲで示されるアッセイが例示される。例１および表２を参照のこと。例示されるアッセイでは、二重標識ＢＨＱプローブが使用され、それぞれオリゴヌクレオチドの５’端および３’端に共有結合されるフルオロフォアおよびクエンチャーを組み入れる直鎖の二重標識５’−３’エクソヌクレアーゼプローブである。蛍光シグナルはＴａｑポリメラーゼの５’エクソヌクレアーゼ活性によって発生され、蛍光色素標識ヌクレオチドを標的鎖におけるその相補的配列とハイブリダイゼーションされたプローブの消化の際にプローブから切り離し、そしてクエンチャーをフルオロフォアから分離する。５種のプライマーおよびプローブセットが、ウイルス暴露と一致する各ウイルス感染および／または疫学的リスク因子の徴候および症状を示す患者から得られる、血清および尿におけるＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＷＮＶ、およびＲＮアーゼＰ由来のＲＮＡを検出するために設計された。患者検体収集および検査室による受領後、全核酸をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）自動抽出プラットフォーム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いてサンプルから分離することができる。精製した核酸を逆転写して、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でサーマルサイクリングおよび検出を備えたＲＮＡ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓｅ（商標）ワンステップ定量ＲＴ−ＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いることによって増幅することができる。この工程では、特異的プローブが特異的フォワードおよびリバースプライマーの間に配置される特定標的配列とアニーリングし、蛍光シグナルを発生し、ＰＣＲサイクルの伸長段階の最後の際に測定される。ＰＣＲの各サイクルにより、より多くのプローブが消化され、標的核酸の量に比例する蛍光の増加をもたらす。蛍光シグナル強度はＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅ（商標）ソフトウェアによってデータ収集される。例１〜４を参照のこと。アッセイの結果は例５に示されるように分析される。
【０１０２】
特に、５８検体／日まで、臨床検体抽出から結果まで、ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ（血清型１〜４）、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶについて、単一ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）およびＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出プラットホーム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ならびに本発明のアッセイを用いて評価することができる。５８サンプルを抽出するのに要する時間は約６０分を３回で約３時間であり、ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイを設定して実施するのに要する時間は約２時間であり、装置運転あたり２９検体に相当する１枚の９６ウェルプレートを試験するため必要とされる全時間は５時間となる。
【０１０３】
例示されたアッセイならびにプライマーおよびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１３を用いて、アッセイの感受性、特異性、および交差反応を評価し、アッセイが血清および尿の両方におけるＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶを含むアルボウイルスを分別して検出するために要求されるように遂行されたと判断された。例６〜９を参照のこと。さらに、特定のウイルスについて陽性または陰性であることが判明している臨床サンプル（血清および尿の両方）を用いたアッセイの性能的特性も評価し、要求されるように遂行することが認められた。例１０〜１３を参照のこと。
【０１０４】
本発明は、任意のサンプルにおけるＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶ由来の核酸の検出のための方法およびシステムを含み、本発明のプライマーおよびプローブを使用する。
【０１０５】
本発明の方法およびシステムは、研究および臨床設定においてＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶ由来の核酸を検出するために使用され得る。
【０１０６】
好ましいサンプルは生物学的サンプルである。生物学的サンプルは、被験体の組織からまたは被験体由来の体液から得ることができ、限定されないが、鼻咽頭吸引液、血液、脳脊髄液、唾液、血清、血漿、尿、喀痰、気管支洗浄液、心膜液、または腹水、あるいは糞便のような固体を含む。好ましいサンプルは血清、血漿、および尿である。被験体はいずれかの動物、特に脊椎動物、より特定的には哺乳動物であり得、限定されないが、ウシ、イヌ、ヒト、サル、マウス、ブタ、またはラットを含む。一つの実施形態では、被験体はヒトである。
【０１０７】
サンプルはまた、研究、臨床、または環境サンプルであり得る。
【０１０８】
追加的な適用は、限定されないが、血液製剤のスクリーニング（例えば、感染性病原体に関する血液製剤のスクリーニング）、生物テロ防御、食品安全性、環境汚染、科学捜査、および遺伝子適合性試験の検出が含まれる。本発明はまた、細胞、細胞培養、細胞培養培地、ならびに医薬品および治療剤の開発のために使用される他の組成物におけるウイルス核酸を検出するための方法およびシステムを提供する。
【０１０９】
そのため、本発明の一つの実施形態は、任意のサンプルにおけるＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶ由来の核酸の検出、またはウイルスそれ自体の検出のためのシステムを提供する。本システムは少なくとも１つのサブシステムを含み、ここでサブシステムはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、および９、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２を含むプライマー群、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、および１３を含むプローブを含む。システムはまた、サンプルからの核酸の抽出、サンプルからの核酸を逆転写する、反応を増幅する、および増幅産物の検出の目的のための追加サブシステムを含む。
【０１１０】
本発明は、任意のサンプルにおけるＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶ由来の核酸を検出するため、またはウイルスそれ自体の検出のための方法を提供し、サンプルを得、サンプルから核酸を抽出し、サンプルにおける核酸をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される少なくとも１種類のプライマーと接触させ、核酸およびプライマーを増幅条件にし、増幅産物の存在を検出することを含み、ここで増幅産物の存在がサンプルにおけるウイルスの核酸の存在を示す。
【０１１１】
一つの実施形態では、本方法はサンプル由来の核酸を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、および９、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２を含むプライマー群と接触させることを含む。さらなる実施形態では、本方法はサンプル由来の核酸を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、および１３を含むプローブとさらに接触させることを含む。なおさらなる実施形態では、プローブはサンプルにおける増幅産物の存在を検出するために検出可能である。
【０１１２】
キット
別の態様では、本発明はアルボウイルスの核酸またはアルボウイルスそれ自体を検出するために使用することができるキットを提供する。本キットは、ジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルス由来の核酸の検出するため、および／またはジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの検出のために使用することができる。特定の実施形態では、本キットは本発明のプローブを含む。いくつかの実施形態では、本キットは本発明のプライマーを含む。いくつかの実施形態では、本キットは本発明の１種類以上のプライマーおよびプローブの組み合わせを含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、本キットは本発明の１種類以上のプライマーおよびプローブの組み合わせを含む。特定の実施形態では、本キットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、４、５、７、８、９、１１、および１２からなる群から選択される１種類以上のプライマーを含む。特定の実施形態では、本キットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、６、１０、および１３からなる群から選択される１種類以上のプローブを含む。特定の実施形態では、本キットはさらに陽性コントロール配列用のプライマーおよびプローブを含む。特定の実施形態では、本キットはさらにヒトＲＮアーゼを検出するためのプライマーおよびプローブを含む。特定の実施形態では、本キットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１５を含むプライマーおよびプローブを含む。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明のキットは核酸プローブとして有用なオリゴヌクレオチドを含み、ここで１つ以上の検出可能な部分が核酸プローブと結合される。特定の実施形態では、１つ以上の検出可能な部分は蛍光部分である。特定の実施形態では、蛍光部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素からなる群から選択することができる。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明のキットは核酸プローブとして有用なオリゴヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つのクエンチャー部分が核酸プローブと結合される。特定の実施形態では、クエンチャー部分はフルオレセイン系色素、ポリハロフルオレセイン系色素、ヘキサクロロフルオレセイン系色素、クマリン系色素、ローダミン系色素、シアニン系色素、オキサジン系色素、チアジン系色素、スクアライン系色素、キレート化ランタニド系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、および非蛍光クエンチャー部分からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、非蛍光クエンチャー部分はＢＨＱＴ（商標）系色素、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）、またはＤａｂｃｙｌであることができる。他の実施形態では、プローブは少なくとも１つの検出可能な部分、例えば蛍光部分、および少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。
【０１１６】
特定の実施形態では、本発明のキットは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。特定の実施形態では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写活性を有する。特定の実施形態では、本発明のキットはさらに本発明の方法に従ってジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの核酸を検出するための取扱説明書を含む。
【０１１７】
他の実施形態では、本キットは本キットの成分を保持する１つ以上の容器を含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、本キットは本発明のプライマーを含む組成物を含むことができる。本キットはまた、本発明のプローブを含む組成物を含むことができる。本キットはさらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、耐熱性ＤＮＡポリラーゼは、カルボキシドサーマス・ヒドロゲンホルマンスＤＮＡポリメラーゼ、サーモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼ、バシルス・パリダスＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチカスＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ、サーマトガ・マルチマＤＮＡポリメラーゼ、サーマトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ、およびサーマスｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼの群から選択される。本発明のプライマーまたはプローブあるいは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物は、さらに追加の試薬を含むことができる。例えば、組成物は、本組成物の分解を防ぐ適切な保存剤、本組成物のｐＨを調節する適切な緩衝剤、本組成物の粘性を変える適切な希釈剤などを含むことができる。
【０１１９】
本キットは前述のように、５’ヌクレアーゼ反応を実施するための他の試薬を追加で含むことができる。さらに、本キットはＺＩＫＶ、ＷＮＶ、ＤＥＮＶ、およびＣＨＩＫＶの核酸の存在を示す分裂されたプローブの検出を促進する試薬を含むことができる。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態では、本キットは各バイアルに組み合わされた各標的用のプライマーおよびプローブを有する５バイアル、陽性コントロールとして各ウイルス病原体の抽出された核酸（測定済み）を含む４バイアル、抽出コントロールおよびｒＲＴ−ＰＣＲコントロール（ウイルス陰性、ＲＮアーゼＰ陽性）として使用されるヒト検体コントロール（ＨＳＣ）の２バイアル、および非鋳型コントロール（ＮＴＣ）として使用される無菌蒸留したＨ２Ｏの２バイアルを含み、１００回の反応に十分な試薬を提供する。
【０１２１】
本発明の一つの実施形態は、表１で示されるように、単一サンプルにおけるジカ、デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスの分別検出のための種々な成分を含む種々の容器を含むキットである。
【表１】
2019508057.tif 000003
【０１２２】
好ましい実施形態では、プローブは検出可能な部分を含む。より好ましい実施形態では、ジカウイルスの検出用プローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、５’がＣＡＬ  Ｆｌｏｕｒ  Ｒｅｄ６１０によって、３’がＢＨＱ−２によって修飾され、ウエストナイルウイルスの検出用プローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、５’がＱｕａｓａｒ６７０によって、３’がＢＨＱ−２によって修飾され、デングウイルスの検出用プローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、５’がＣＡＬ  Ｆｌｕｏｕｒ  Ｏｒａｎｇｅ５６によって、３’がＢＨＱ−１によって修飾され、チクングニアウイルスの検出用プローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、５’がＦＡＭによって、３’がＢＨＱ−１ｐｌｕｓによって修飾される。ＲＮアーゼ−Ｐの検出用プローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は５’がＱｕａｓａｒ７０５によって、３’がＢＨＱ−３によって修飾される。
【０１２３】
一つの実施形態では、本キットは陽性、陰性、およびＨＳＣ抽出コントロール、ならびに予測される結果を評価する取扱説明書を提供する。
【０１２４】
一つの実施形態では、陽性コントロール（バイアル６〜９）は感染した培養細胞から抽出された核酸を含む。ＺＩＫＶ、ＷＮＶ、ＤＥＮＶ、およびＣＨＩＫＶ用のＲＮＡ陽性コントロールは、予測されるＣｔ値範囲内（２５〜２８）で陽性であるべきである。
【０１２５】
キットのヒト検体コントロール（ＨＳＣ）（バイアル１０）は、試験サンプルと同時に抽出され、ｒＲＴ−ＰＣＲの際にサンプルとして含めるヒト抽出コントロールを提供する。ＨＳＣはＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶプライマーおよびプローブセットでは陰性の結果を生じるべきだが、ＲＮアーゼＰでは陽性の結果を生じるべきである。ＲＮアーゼＰシグナルが認められない場合、核酸抽出は失敗している可能性がある。ＲＮアーゼＰおよび１種類以上のウイルスプライマー／プローブセットで陽性となるアッセイはクロスコンタミナーションを示す。このような結果が得られる場合、検体結果はすべて無視する。
【０１２６】
キットはまた、ヒト検体コントロール（ＨＳＣ）から抽出された核酸であるｒＲＴ−ＰＣＲコントロール（ｅＨＳＣ）（バイアル１１）、およびＮＴＣ用の無菌ヌクレアーゼ無含有Ｈ２Ｏである陰性コントロール（ＮＴＣ）（バイアル１２）を提供する。ＮＴＣは陰性となるべきである。陽性となるＮＴＣはコンタミネーションを示し、検体結果はすべて無視されなければならず、各検体におけるＲＮアーゼＰはサンプル検体からの核酸の問題ない抽出を確証するために陽性となるべきである。ＲＮアーゼＰシグナルが検出されないサンプルの結果は無視しなければならない。
【０１２７】
このキットの追加の構成要素には、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、安定剤、リボヌクレアーゼ阻害剤、緩衝剤、および取扱説明書を含むことができる。
【０１２８】
例
本発明は次の非限定的な例を参考にすることによってより良く理解され得、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される。これらは本発明の広範な範囲を制限すると解釈されるべきでない。
【０１２９】
例１−アッセイにおける使用のためのプライマーおよびプローブ
次のプローブおよびプライマーが例で使用された。
【表２】
2019508057.tif 000004
【０１３０】
プライマーおよびプローブはすべてユニバーサルである。ジカプライマーおよびプローブはＺＩＫＶゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲを標的にする（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３）。ウエストナイルウイルスプライマーおよびプローブはＷＮＶゲノムＲＮＡのＮＳ５遺伝子を標的にする（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６）。デングウイルスプライマーおよびプローブはＤＥＮＶゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲを標的にする（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１０）。チクングニアウイルスプライマーおよびプローブの遺伝子標的はＣＨＩＫＶゲノムＲＮＡのＮＳＰ２遺伝子である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３）。
【０１３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１６はコントロールプライマーおよびプローブである。遺伝子標的はヒトリボヌクレアーゼＰサブユニットｐ３０ｍＲＮＡである。       
【０１３２】
例２−多重アッセイのための試薬および材料
表２に示されるプローブおよびプライマーは、各ウイルスについて凍結乾燥形態で１バイアルに調製し、１００μＬのＨ２Ｏで再構成した。ＺＩＫＶ−ＭＩＸと表示されたバイアルはプライマーおよびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３を含んだ。ＷＮＶ−ＭＩＸと表示されたバイアルはプライマーおよびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜６を含んだ。ＤＥＮＶ−ＭＩＸと表示されたバイアルはプライマーおよびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１０を含んだ。ＣＨＩＫ−ＭＩＸと表示されたバイアルはプライマーおよびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３を含んだ。ＲＰ−ＭＩＸと表示されたバイアルはプライマーおよびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１６を含んだ。表１および２を参照のこと。
【０１３３】
追加の試薬には、表１および３に示される表示バイアルでアッセイコントロールが含まれた。
【０１３４】
すべてのアッセイコントロールは、各プレートに含め、臨床サンプルと同時に試験されるべきである。これらのアッセイコントロールには、抽出コントロール試薬、各ウイルス用の陽性コントロール、および他のものを含む。
【０１３５】
抽出コントロールはヒト検体コントロール（ＨＳＣ、抽出コントロール）であり、ＲＮアーゼＰ鋳型を含むことが判明しているヒト培養細胞抽出物であるが、試験するウイルス標的について陰性である。ＨＳＣコントロールは、試験検体の各バッチとともに含め、同時に抽出する。抽出されたＨＳＣコントロール核酸は、その同時に抽出された試験サンプルとともに各ＰＣＲプレートに含めてｒＲＴ−ＰＣＲによって分析することができる。
【０１３６】
ＨＳＣコントロールはＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＷＮＶ、およびＺＩＫＶについて陰性の結果を生じるべきであるが（各プローブ／色素から蛍光シグナルがない）、陽性結果がＲＮアーゼＰについて得られるべきである（Ｑｕａｓａｒ７０５色素の蛍光シグナル）。
【０１３７】
ウイルスの陽性コントロールは、１種類のウイルスのみで陽性となるべきである。次の陽性コントロールが各ＰＣＲプレートで試験されるべきである。
【０１３８】
ＺＩＫＶ陽性コントロール：ＺＩＫＶ感染した培養細胞から抽出された核酸がＺＩＫＶプライマー／プローブセットおよびＰＣＲ試薬機能の性能のためのコントロールとして使用される。
【０１３９】
ＣＨＩＫＶ陽性コントロール：ＣＨＩＫＶ感染した培養細胞から抽出された核酸がＺＩＫＶプライマー／プローブセットおよびＰＣＲ試薬機能の性能のためのコントロールとして使用される。
【０１４０】
ＷＮＶ陽性コントロール：ＷＮＶ感染した培養細胞から抽出された核酸がＺＩＫＶプライマー／プローブセットおよびＰＣＲ試薬機能の性能のためのコントロールとして使用される。
【０１４１】
ＤＥＮＶ陽性コントロール：ＤＥＮＶ−１感染した培養細胞から抽出された核酸がＺＩＫＶプライマー／プローブセットおよびＰＣＲ試薬機能の性能のためのコントロールとして使用される。
【０１４２】
他のコントロールには鋳型を含有しないコントロール（ＮＴＣ）およびＲＴ−ＰＣＲコントロール（ｅＨＳＣ）が含まれる。鋳型のない２本のコントロール（ＮＴＣ：無菌、ヌクレアーゼ無含有水）を各ＰＣＲプレートで操作することができる。ＲＮアーゼＰを含むことが判明しているヒト培養細胞（ｅＨＳＣ）から抽出した核酸が、ＲＮＡ完全性およびｒＲＴ−ＰＣＲコントロール阻害剤の存在しないことに関するコントロールとして使用される。
【０１４３】
アッセイ用のこれらの試薬および各バイアルにおける量を表３に示す。
【表３】
2019508057.tif 000005
【０１４４】
追加の試薬および材料ならびに本方法およびアッセイで使用された装置は、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）自動化全核酸抽出法で使用されるサンプルからの核酸分離のためのものを含み、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘカタログ番号２８０１３３）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）ディスポーザブル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘカタログ番号２８０１３５）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）緩衝剤１（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘカタログ番号２８０１３０）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）緩衝剤２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘカタログ番号２８０１３１）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）緩衝剤３（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘカタログ番号２８０１３２）、およびＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘカタログ番号２８０１３４）、ならびにｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ；カタログ番号２８０１４０）を含む。
【０１４５】
本方法およびアッセイで使用された追加の試薬および材料はポリメラーゼ連鎖反応のものを含み、ヌクレアーゼ無含有の分子グレード水、およびＲＮＡ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ（商標）ワンステップ定量ＲＴ−ＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１１７３２９２７）、ならびにＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含む。
【０１４６】
核酸抽出およびポリメラーゼ連鎖反応は、製造業者の取扱説明書に従って実施された。
【０１４７】
例３−核酸抽出および保存
抽出過程および装置インターフェース操作は一般的に、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）の製造業者の取扱説明書に従う。
【０１４８】
簡単に説明すると、２５０μＬの検体使用容量および５０μＬの溶出容量を全核酸で使用した。
【０１４９】
生物学的サンプルは、既に収集されて凍結されている尿および血清を含む生物学的サンプルを氷上で解凍する。２５０μＬのサンプルをピペッティングして７５０μＬのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）溶解緩衝液と混合し、室温で１０〜１５分間インキュベーションした（標準的な比は溶解緩衝液に対してサンプルが１：３である）。
【０１５０】
５０μＬのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）磁性シリカビーズをサンプル＋溶解緩衝液混合に加え、サンプルおよび磁性シリカビーズの上下ピペッティングによって完全に混合した。サンプルをＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）サンプルカートリッジに移した。磁性シリカカートリッジをピペットカートリッジおよび処理したサンプルとともに装置に設置した。
【０１５１】
運転が終了したとき、溶出した全核酸の５０μＬをＰＣＲアッセイ設定のために清浄な反応チューブに移した。あるいは、サンプルは≦−７０℃に保存する。
【０１５２】
例４−ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイ設定
マスターミックスを次の成分を用いて調製した。１回を超える反応のため、調製を次のように変更する。
【表４】
2019508057.tif 000006
【０１５３】
マスターミックスをＰＣＲプラットホームのウェルに小分けした。各運転は例２で説明されるすべてのコントロールを含むべきであり、ＣＨＩＫＶ、ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＷＮＶ用の陽性コントロール、ヒト抽出コントロール（ＨＳＣ）、ｒＲＴ−ＰＣＲコントロール（抽出したＨＳＣコントロール；ｅＨＳＣ）、および３ウェルの陰性鋳型無含有コントロール（ＮＴＣ）を含む（表３）。サンプルは三重測定で試験する。
【０１５４】
検体は、色素チャンネルＦＡＭ、Ｃａｌ  Ｏｒａｎｇｅ５６０、Ｃａｌ  Ｒｅｄ６１０、Ｑｕａｓａｒ６７０、およびＱｕａｓａｒ７０５を選択する多重検出ならびに次のサイクルプロトコルを有するサイクルプロファイルおよび色素選択のために製造業者の取扱説明書に従ってプログラムされたＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出プラットホームで運転された。
１．５０．０℃で３０分間
２．９５．０℃で２分間
３．９５．０℃で１５秒間
４．６０．０℃で１分間
＋プレート読み取り
５．ステップ３を４４回実施
６．終了
【０１５５】
例５−結果の解釈および患者検体結果の調査
試験コントロールから得られるすべてのデータは、患者結果の解釈の前に調査すべきである。コントロールが有効でない場合、患者結果は解釈することができない。各アッセイは適切な陽性および陰性コントロールとともに実施されるべきである。ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイは、陽性、陰性、およびＨＳＣ抽出コントロールを提供する。すべてのコントロールは予測される結果を生じなければならない。
【０１５６】
ヒト検体コントロール（ＨＳＣ）−ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイキットは、試験サンプルと同時に抽出され、ｒＲＴ−ＰＣＲの際にサンプルとして含まれるヒト抽出コントロールを提供する。ＨＳＣはＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶプライマーおよびプローブセットでは陰性の結果を生じるべきだが、ＲＮアーゼＰでは陽性の結果を生じるべきである。ＲＮアーゼＰシグナルが認められない場合、核酸抽出は失敗している可能性がある（後述の「ｒＲＴ−ＰＣＲコントロール」および「ＲＮアーゼＰ」も参照のこと）。ＲＮアーゼＰおよび１種類以上のウイルスプライマー／プローブセットで陽性となるアッセイはクロスコンタミナーションを示す。このような結果が得られる場合、検体結果はすべて無視する。
【０１５７】
ｒＲＴ−ＰＣＲコントロール（ｅＨＳＣ）−ヒト検体コントロール（ＨＳＣ）から抽出された核酸。
【０１５８】
陽性コントロール−ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイキットは、予測されるＣｔ値範囲内（２５〜２８）で陽性であるべきＺＩＫＶ、ＷＮＶ、ＤＥＮＶ、およびＣＨＩＫＶ用の抽出されたＲＮＡ陽性コントロールを提供する。１つ以上の陽性コントロールが陰性の結果、または高いＣｔ値（Ｃｔ＞３１）を生じる場合、ｒＲＴ−ＰＣＲを繰り返す。
【０１５９】
ＮＴＣ−ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲキットは、ＮＴＣ用の無菌ヌクレアーゼ無含有Ｈ２Ｏを提供する。ＮＴＣは陰性となるべきである。陽性ＮＴＣはコンタミネーションを示し、検体結果はすべて無視しなければならない。
【０１６０】
ＲＮアーゼＰ−各検体における結果は、サンプル検体からの核酸の良好な抽出を確証するため陽性となるべきである。ＲＮアーゼＰシグナルが検出されないサンプルの結果は無視しなければならない。新たなサンプル小分けから抽出を繰り返す。ＲＮアーゼＰが陽性である場合、ウイルス特異的な結果を報告し、ＲＮアーゼＰが依然として陰性の場合、結果を報告することができない。
【０１６１】
臨床検体試験結果の評価は、陽性および陰性コントロールが調査されて有効であり、許容可能であることが判断された後に実施されるべきである。コントロールが有効でない場合、患者結果は解釈され得ない。ＰＣＲ増幅曲線が、プライマープローブセットにおいて増加する蛍光放出に基づいて、３８サイクル以内（≦）で閾値と交差する場合、結果は陽性であり、増幅曲線が、プライマープローブセットにおいて３８サイクル以上（≧）で閾値と交差する場合、結果は陰性である。図１は臨床検体結果の解釈を示す。
【０１６２】
使用者は、ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲ結果解釈および報告の説明書に従うことができる（図１）。すべてのコントロールは検体データのさらなる分析のために予測される結果が得られるべきである。真の陽性は、Ｃｔ値≦３８で指数関数的曲線を生じるべきである。指数関数的増幅を示さない、または３８サイクル以下で閾値と交差しないサンプルは、陰性と考えられる。試験の３ウェル中２ウェルが陽性の場合、サンプルの結果は陽性であり、試験の３ウェル中２ウェルが陰性の場合、サンプルの結果は陰性である。
【０１６３】
例６−血清におけるアッセイの分析感度評価
例１〜５に示される材料および方法、ならびに表５に示されるウイルスストックを用いて、本アッセイの分析感度を血清で試験した。
【０１６４】
ウイルスコピー数（ゲノム当量、ＧＥＱ／ｍＬ）を、各標的について校正された合成Ｔ７インビトロ転写ＲＮＡ転写物の連続希釈を用いて、各ウイルスについて評価した。
【表５】
2019508057.tif 000007
【０１６５】
検出限界（ＬｏＤ）の範囲評価を見い出すため、表５に示されるウイルスストックの連続希釈を調製してＬｏＤの最初の評価用に得た。核酸抽出のため、単一ドナー血清小分けの２２５μＬに各連続希釈したストックの２５μＬを個別に加えた。添加血清混合物（全２５０μＬ）をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）によって抽出した。全核酸を５０μＬの溶出緩衝液で溶出し、直ちに次のステップのために氷上で保存した。各サンプルを三重測定で抽出し、例１で説明されるプライマーおよびプローブならびに例２〜４で説明される材料および方法を用いて、ＣＦＸ９６（商標）ｔｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験した。試験結果は、サンプルがＲＮアーゼＰで陽性だった場合のみ有効だった（例５を参照）。すべての三重測定が陽性として試験された最も低い濃度を推定的ＬｏＤとして得た。血清ＬｏＤ（ゲノムコピー当量／ｍＬ）結果を表６に示す。
【表６】
2019508057.tif 000008
【０１６６】
範囲検出試験において測定されたＬｏＤ評価に基づき、ウイルスストックを推定的ＬｏＤの最終濃度を得るために２０本の血清サンプル小分けに希釈した。核酸をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）によって抽出した。抽出した２０本の全サンプルを、例１〜４で説明されるように、ＣＦＸ９６（商標）ｔｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験した。血清におけるすべてのウイルスに関する結果を表７に示す。
【表７】
2019508057.tif 000009
【０１６７】
例７−尿におけるアッセイの分析感度評価
例１〜５に示される材料および方法、ならびに表５に示されるウイルスストックを用いて、本アッセイの分析感度を尿で試験した。
【０１６８】
核酸抽出のため、単一ドナー尿小分けの２２５μＬに各連続希釈したストックの２５μＬを個別に加えた。添加尿混合物（全２５０μＬ）をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）  ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）によって抽出した。全核酸を５０μＬの溶出緩衝液で溶出し、直ちに氷上で保存した。各サンプルを三重測定で抽出し、例１で説明されるプライマーおよびプローブならびに例２〜４で説明される材料および方法を用いて、ＣＦＸ９６（商標）ｔｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験した。試験結果は、サンプルがＲＮアーゼＰで陽性だった場合のみ有効だった（例５を参照）。すべての三重測定が陽性として試験された最も低い濃度を推定的ＬｏＤとして得た（各ウイルスについて太字で強調）。尿ＬｏＤ（ＧＥＱ／ｍＬ）結果を表８に示す。
【表８】
2019508057.tif 000010
【０１６９】
推定的ＬｏＤに基づき、希釈したウイルスストックを試験的なＬｏＤで２０本の尿サンプル小分けに加えた。核酸をＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭａｇ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）によって抽出した。抽出した２０本の全サンプルを、例１〜４で説明されるように、ＣＦＸ９６（商標）ｔｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験した。血清におけるすべてのウイルスに関する結果を表９に示す。
【表９】
2019508057.tif 000011
【０１７０】
例８−分析特異性試験
ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲの反応性を、例１〜５の材料および方法を用いて、アフリカ分離株（ＭＲ７７６およびＡｒＤ１５８０９５）を示すジカウイルスの追加分離株の湿式試験によって評価した。
【表１０】
2019508057.tif 000012
【０１７１】
例１で説明されるプライマーおよびプローブの反応性も、例２〜５の材料および方法を用いて、ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶの他の代表株を用いて、コンピュータシミレーションによって試験した。
【０１７２】
ウエストナイルウイルスの次の株を使用した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号を添える）。ＡＲＣ１０−０６（ＪＦ９５７１６１）、ＡＲＣ１３−０６（ＪＦ９５７１６２）、ＡＲＣ−１７−０６（ＪＦ９５７１６３）、ＡＲＣ２３−０６（ＪＦ９５７１６４）、ＡＲＣ２７−０６（ＪＦ９５７１６５）、ＡＲＣ３３−０６（ＪＦ９５７１６６）、ＢＳＬ１０６−０６（ＪＦ９５７１６７）、ＡＲ１４０−０７（ＪＦ９５７１６８）、ＣＯ４−０７（ＪＦ９５７１６９）、ＣＯ５−０７（ＪＦ９５７１７０）、ＩＤ２１ｂｉｒｄ−０７（ＪＦ９５７１７１）、ＩＤ２８ｂｉｒｄ−０７（ＪＦ９５７１７２）、ＢＳＬ１７３−０８（ＪＦ９５７１７３）、ＢＳＬ１７６−０８（ＪＦ９５７１７４）、ＢＳＬ２−０９（ＪＦ９５７１７５）、ＢＳＬ５−０９（ＪＦ９５７１７６）、ＢＳＬ６−０９（ＪＦ９５７１７７）、ＢＳＬ１１−０９（ＪＦ９５７１７８）、ＢＳＬ１８−０９（ＪＦ９５７１７９）、ＢＳＬ２０−０９（ＪＦ９５７１８０）、ＢＳＬ２２−０９（ＪＦ９５７１８１）、ＢＳＬ２４−０９（ＪＦ９５７１８２）、ＢＳＬ２７−０９（ＪＦ９５７１８３）、ＣＯ７−０９（ＪＦ９５７１８４）、ＢＳＬ２−１０（ＪＦ９５７１８５）、ＢＳＬ３−１０（ＪＦ９５７１８６）、ＮＹ１０−０３（ＪＱ７００４３７）、ＢＳＬ４−１１（ＪＱ７００４３８）、ＢＳＬ６−１１（ＪＱ７００４３９）、ＢＳＬ２３−１１（ＪＱ７００４４０）、ＢＳＬ２４−１１（ＪＱ７００４４１）、およびＢＳＬ２６−１１（ＪＱ７００４４２）。
【０１７３】
ジカウイルスの次の株を使用した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号を添える）。ＰＲＶＡＢＣ５９（ＫＵ５０１２１５）、ＭＲ７６６（ＡＹ６３２５３５）、ＦＬＲ（ＫＵ８２０８９７）、Ｃ１／Ｃ２（ＫＸ０８７１０２）、ＩｂＨ＿３０６５６（ＨＱ２３４５００）、ＩｂＨ−３０６５６（ＫＵ９６３５７４）、ＳＥＮ−ＤＡＫ（ＫＵ９５５５９２）、１７２７１（ＫＵ７５８８７７）、Ｐａｒａｉｂａ＿０１（ＫＸ２８００２６）、１０３４５１（ＫＸ２６２８８７）、ＺＫＣ（ＫＸ２５３９９６）、ＣＯＬ／ＵＦ−１（ＫＸ２４７６４６）、ＭＥＸ＿Ｉ＿７（ＫＸ２４７６３２）、ＰＡＮ／ＢＥＩ−２５９６３４＿Ｖ４（ＫＸ１９８１３５）、Ｂｒａｚｉｌ／ＰＥ２４３（ＫＸ１９７１９２）、ＣＮ／ＳＺ０２（ＫＸ１８５８９１）、ＺＩＫＶＮＬ０００１３（ＫＵ９３７９３６）、ＰＡＮ／ＣＤＣ−２５９３５９（ＫＸ１５６７７６）、／ＰＡＮ／ＣＤＣ−２５９２４９（ＫＸ１５６７７５）、ＰＡＮ／ＣＤＣ−２５９３５９（ＫＸ１５６７７４）、Ｂａｈｉａ０１（ＫＸ１０１０６６）、Ｚｈｅｊｉａｎｇ０４（ＫＸ１１７０７６）、Ｈａｉｔｉ／１／２０１６（ＫＸ０５１５６３）、Ｈａｉｔｉ／１２２５／２０１４（ＫＵ５０９９９８）、ＳＺ−ＷＩＶ０１（ＫＵ９６３７９６）、Ｂｒａｚｉｌ／２０１６／ＩＮＭＩ１（ＫＵ９９１８１１）、Ｂａｈｉａ０７（ＫＵ９４０２２８）、Ｂａｈｉａ０９（ＫＵ９４０２２４）、Ｚ１６００６（ＫＵ９５５５８９）、ＦＢ−ＧＷＵＨ−２０１６（ＫＵ８７０６４５）、Ｒｉｏ−Ｓ１（ＫＵ９２６３１０）、Ｒｉｏ−Ｕ１（ＫＵ９２６３０９）、ＭＥＸ／ＩｎＤＲＥ／Ｓｍ／２０１６（ＫＵ９２２９６０）、ＭＥＸ／ＩｎＤＲＥ／Ｌｍ／２０１６（ＫＵ９２２９２３）、ＳＺ０１（ＫＵ８６６４２３）、ＧＺ０１（ＫＵ８２０８９８）、ＧＤ０１（ＫＵ７４０１８４）、ＤＲ／２０１６／ＰＤ２（ＫＵ８５３０１３）ＤＲ／２０１６／ＰＤ１（ＫＵ８５３０１２）、ＺＪ０３（ＫＵ８２０８９９）、ＢｅＨ８２３３３９（ＫＵ７２９２１７）、ＢｅＨ８２８３０５（ＫＵ７２９２１８）、ＧＤＺ１６００１（ＫＵ７６１５６４）、ＴＨＡ／２０１４（ＫＵ６８１０８１）、ＶＥ＿Ｇａｎｘｉａｎ（ＫＵ７４４６９３）、Ｂｒａｚｉｌ−ＺＫＶ２０１５（ＫＵ４９７５５５）、ＳＳＡＢＲ１，（ＫＵ７０７８２６）、ＮａｔａｌＲＧＮ（ＫＵ５２７０６８）、ＭＲＳ＿ＯＰＹ（ＫＵ６４７６７６）、８３７５（ＫＵ５０１２１７）、１０３３４４（ＫＵ５０１２１６）、ＢｅＨ８１５７４４（ＫＵ３６５７８０）、ＢｅＨ８１９９６６（ＫＵ３６５７７９）、ＢｅＨ８１９０１５（ＫＵ３６５７７８）、ＢｅＨ８１８９９５（ＫＵ３６５７７７）、Ｚ１１０６０３３（ＫＵ３１２３１２）、ＺｉｋａＳＰＨ２０１５（ＫＵ３２１６３９）、Ｈ／ＰＦ／２０１３（ＫＪ７７６７９１）、ＧＺ０２／２０１６（ＫＸ０５６８９８）、Ｚ１６０１９（ＫＵ９５５５９０）、ＫＨＭ／２０１０（ＫＵ９５５５９３）、ＰＬＣａｌ＿ＺＶ（ＫＦ９９３６７８）、ＦＳＳ１３０２５（ＪＮ８６０８８５）、ＣＰＣ−０７４０（ＫＵ６８１０８２）、Ｔａｈｉｔｉ（ＫＪ４６１６２１）、ＡｒＤ１２８０００（ＫＦ３８３１１７）、Ｐ６−７４０（ＨＱ２３４４９９）、ＳＥＮ／ＤＡＫ−ＡＲ−４１５２４（ＫＸ１９８１３４）、４１６７１−ＤＡＫ（ＫＵ９５５５９５）、４１５２５−ＤＡＫ（ＫＵ９５５５９１）、ＡｒＤ１４２６２３（ＫＦ３８３１２０）、ＡｒＤ７１１７（ＫＦ３８３１１６）、ＡｒＤ＿４１５１９（ＨＱ２３４５０１）、ＡｒＤ１５８０９５（ＫＦ３８３１２１）、ＡｒＤ１５８０８４（ＫＦ３８３１１９）、ＡｒＤ１５７９９５（ＫＦ３８３１１８）、ＡＲＢ７７０１（ＫＦ２６８９５０）、ＡＲＢ１５０７６（ＫＦ２６８９４９）、ＡＲＢ１３５６５（ＫＦ２６８９４８）、およびＡｒＢ１３６２（ＫＦ３８３１１５）。
【０１７４】
ＤＥＮＶウイルスの次の株を使用した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号を添える）。Ｂｒａｚｉｌ２０１０（ＪＸ６６９４６６）、Ｔｈａｉｌａｎｄ２０１３（ＫＦ８８７９９４）、Ｍｅｘｉｃｏ２０１２（ＫＪ１８９３６８）、Ｂｒａｚｉｌ２０１０（ＪＸ６６９４７７）、Ｐｅｒｕ２０１１（ＫＣ２９４２１０）、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ２０１０（ＫＣ７６２６７９）、ＳａｕｄｉＡｒａｂｉａ２０１４（ＫＪ８３０７５０）、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ２０１２（ＫＭ２７９５７７）、Ｔｈａｉｌａｎｄ２０１０（ＨＧ３１６４８３）、Ｂｒａｚｉｌ２００９（ＪＦ８０８１２０）、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ２０１０（ＫＣ７６２６９３）、Ｃｈｉｎａ２０１３（ＫＪ６２２１９５）、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ２００５（ＧＱ３９８２５６）、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ２００７（ＨＱ３３２１７４）、Ｃａｍｂｏｄｉａ２００８（ＪＮ６３８５７０）、Ｂｒａｚｉｌ２０１０（ＪＮ９８３８１３）、ａｎｄＰａｋｉｓｔａｎ２００９（ＫＦ０４１２６０）。
【０１７５】
ＣＨＩＫＶウイルスの次の株を使用した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号を添える）。Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ２０１３（ＡＢ８６０３０１）、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ２００８（ＦＪ４４５４６３）、ＳｒｉＬａｎｋａ２００８（ＦＪ５１３６５４）、Ｍａｌａｙｓｉａ２００８（ＦＪ８０７８９９）、Ｃｈｉｎａ２００８（ＧＵ１９９３５１）、Ｉｎｄｉａ２００８（ＪＮ５５８８３５）、Ｃｈｉｎａ２０１２（ＫＣ４８８６５０）、Ｔｈａｉｌａｎｄ２０１３（ＫＪ５７９１８６）、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ２０１３（ＫＭ６７３２９１）、ＲｅｐｏｆＣｏｎｇｏ２０１１（ＫＰ００３８１３）、Ｍｅｘｉｃｏ２０１４（ＫＰ８５１７０９）、Ｔｒｉｎｉｄａｄ＆Ｔｏｂａｇｏ２０１４（ＫＲ０４６２３１）、Ｂｒａｚｉｌ２０１４（ＫＲ２６４９５１）、ＥｌＳａｌｖａｄｏｒ２０１４（ＫＲ５５９４７１）、ＦｒｅｎｃｈＰｏｌｙｎｅｓｉａ２０１５（ＫＲ５５９４７３）、ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ２０１４（ＫＲ５５９４７４）、Ｈｏｎｄｕｒａｓ２０１４（ＫＲ５５９４８８）、Ｊａｍａｉｃａ２０１４（ＫＲ５５９４８９）、Ｇｕｙａｎａ２０１４（ＫＲ５５９４９６）、およびＩｎｄｉａ２０１３（ＫＴ３３６７８２）。
【０１７６】
ほとんどすべての試験で、各ウイルスのプライマーおよびプローブはウイルスの代表的な分離株と１００％反応性であり、ごくわずかな例でのみ１００％ではなく、反応性は少なくとも９５％だった。各ウイルスのプライマーおよびプローブの反応性は、他のウイルスの代表的な分離株と約２４％未満から約７０％未満だった。
【０１７７】
例９−プライマーおよびプローブの交差反応性
ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲの交差反応性を、追加のフラビウイルスまたは他のウイルスおよび病原性細菌による感染を原因とする他の熱病から精製した核酸を試験することによって評価した。
【０１７８】
ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの分析特異性を評価するため、サンプルは例１〜５の材料および方法を、特に表１のプライマーおよびプローブとともに用いて、ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイで標的とされない広範なヒト病原体を代表する核酸を含む。核酸は、感染症・免疫学センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）で登録保存されている細胞培養上清または臨床検体から抽出、あるいはＮＩＨ−統合研究所（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（フォートでトリック，メリーランド州）から提供された。ＣＦＸ９６（商標）ｔｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験されたサンプルは、交差反応性の証拠を示さなかった。試験結果は、サンプルがホスト転写物コントロールＲＮアーゼＰについて陽性だった場合のみ有効と考えられた。結果を表１１に示す。
【表１１】
2019508057.tif 000013
【０１７９】
コンピュータシミュレーション分析を実験室試験が利用できない他の病原体について実施した。例１および表１におけるプライマーおよびプローブの配列を、表１４に示される種に対する交差反応の証拠について評価した。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた分析を、プライマー／プローブのすべての可能な組み合わせを用いて実施した。コンピュータによるアラインメントに基づく任意の相互関係を、密接したプライマーの結合を通して、標的核酸でのプローブの互いのフランキングに対する適切な方向付けによって、ＰＣＲ産物の形成の可能性を見直した。
【０１８０】
表１４に示されるほとんどすべての種について、例１に示されるプローブおよびプライマーセットは２０％未満の交差反応性を有した。
【表１２】
2019508057.tif 000014
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【０１８１】
例１０−ジカウイルスの臨床評価
臨床評価試験のために調製したサンプルは、熱病を有するがウイルス感染の徴候はない個別患者から採取された１３例の陰性コントロール血清サンプルおよび１３例の陰性コントロール尿に１×ＬｏＤおよび３×ＬｏＤを添加することによって用意した。陽性検体はＮＹＣＤＯＨＭＨ、ＮＹＳＤＯＨ、およびＢｏｃａ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ、フロリダ州、米国を通して得た。ＺＩＫＶ陽性サンプルを特定するために使用された比較装置アッセイは、Ｂｏｃａ  ＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓでのＬｉｇｈｔＭｉｘ  Ｚｉｋａ  ｒＲＴ−ＰＣＲテスト（Ｒｏｃｈｅ）またはＡｐｔｉｍａジカウイルスアッセイ（ＨＯＬＯＧＩＣ，ＰＲＤ−０４０３７−Ｄ）、あるいはＬａｎｃｉｏｔｔｉらによって変更されたＣＤＣ公表アッセイである、ＮＹＣＤＯＨＭＨおよびＮＹＳＤＯＨでのＮＹＳ承認されたＬＤＴアッセイだった。ＣＩＩ−ＡｒｂｏＶｉｒｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによる臨床サンプル評価に関する結果を表１３〜１６に示す。対である尿と血清サンプルの結果が表１３に示され、対でない血清サンプルが表１４に示され、対でない尿サンプルが表１５に示され、調製した尿および血清サンプルが表１６に示される。
【０１８２】
全例において、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ＺＩＫＶ陽性サンプルについて陽性だった。
【０１８３】
プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによるジカウイルスに関する臨床サンプル評価のまとめ
全数  ｎ＝１１５（血清  ｎ＝６５、尿  ｎ＝５０）
全血清サンプル  ｎ＝６５  陽性サンプル
臨床  ｎ＝３９（対である血清／尿  ｎ＝７、対でない  ｎ＝３２）
調製  ｎ＝２６（１×ＬｏＤ  ｎ＝１３、これは５．１６Ｅ＋０３  ＧＥＱ／ｍＬである、３×ＬｏＤ  ｎ＝１３、これは１．５４  Ｅ＋０４  ＧＥＱ／ｍＬである）
全尿サンプル  ｎ＝５０  陽性サンプル
臨床  ｎ＝２４（対である血清／尿  ｎ＝７、対でない  ｎ＝１７）
調製  ｎ＝２６（１×ＬｏＤ  ｎ＝１３、これは５．１６Ｅ＋０３  ＧＥＱ／ｍＬである、３×ＬｏＤ  ｎ＝１３、これは１．５４  Ｅ＋０４  ＧＥＱ／ｍＬである）
【表１３】
2019508057.tif 000020
2019508057.tif 000021
【表１４】
2019508057.tif 000022
2019508057.tif 000023
2019508057.tif 000024
【表１５】
2019508057.tif 000025
2019508057.tif 000026
【表１６】
2019508057.tif 000027
【０１８４】
例１１−デングウイルスの臨床評価
臨床血清サンプルにおけるＤＥＮＶの検出のためのＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの性能特性を、例１〜５に示される材料および方法、特にプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜９およびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ならびに２９例のＤＥＮＶ陽性臨床ヒト血清サンプル（ＤＥＮＶ−１が４例、ＤＥＮＶ−２が４例、ＤＥＮＶ−３が６例、ＤＥＮＶ−４が３例、および血清型データが利用できなかったＤＥＮＶが１２例）を用いて確立した（表１７）。臨床サンプルに加え、調製したサンプル２６例も検証のために使用した（図２）。調製したサンプルを用意するため、熱病を有するがウイルス感染の徴候はない個別患者から採取された１３例の陰性コントロール血清サンプルにＤＥＮＶ３を１×ＬｏＤおよび３×ＬｏＤで添加した。陽性ＤＥＮＶ臨床血清検体をＮＹＣＤＯＨＭＨ、ＮＹＳＤＯＨ、オズワルドクルズ財団（ＦＩＯＣＲＵＺ，ブラジル）、および感染症・免疫学センター（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）（コロンビア大学）から収集した。ＤＥＮＶ陽性サンプルを特定するために使用された比較装置アッセイは、ＮＹＣＤＯＨＭＨおよびＮＹＳＤＯＨでのＣＤＣ  Ｔｒｉｏｐｌｅｘ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＣＩＩおよびＦＩＯＣＲＵＺ）およびデングウイルスリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＦＤＡ承認ＣＤＣアッセイ−ＫＫ０１２８）だった。ＣＩＩ−ＡｒｂｏＶｉｒｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによるＤＥＮＶ１〜４に関する臨床サンプル評価の結果を表１７に示す。全例において、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、および９、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ＤＥＮＶ陽性サンプルについて陽性だった。
【０１８５】
プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜９、およびプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによるデングウイルスに関する臨床サンプル評価のまとめ
全血清サンプル  ｎ＝５６  陽性血清サンプル
臨床  ｎ＝２９
調製  ｎ＝２６（１×ＬｏＤでｎ＝１３、これは４．６３Ｅ＋０３  ＧＥＱ／ｍＬである、３×ＬｏＤでｎ＝１３、これは１．３９Ｅ＋０４  ＧＥＱ／ｍＬである）
【表１７】
2019508057.tif 000028
2019508057.tif 000029
2019508057.tif 000030
【０１８６】
例１２−チクングニアウイルス臨床評価
ＣＨＩＫＶの検出のためのＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの性能特性を、例１〜５に示される材料および方法、特にプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、そして２０例のＣＨＩＫＶ陽性臨床ヒト血清サンプルを用いて確立した（表１８）。陽性ＣＨＩＫＶ検体は、ウエストインディーズ大学、トリニダードで収集された。ＣＤＣ  Ｔｒｉｏｐｌｅｘ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイがコロンビア大学でＣＨＩＫＶ陽性データを得るための比較装置アッセイとして使用された。臨床サンプルに加え、調製した血清サンプル２６例（血清サンプル１３例にＣＨＩＫＶが１×ＬｏＤおよび３×ＬｏＤで加えられた）も検証のために使用された（図２）。全例において、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ＣＨＩＫＶ陽性サンプルについて陽性だった。
【０１８７】
プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによるチクングニアウイルスに関する臨床サンプル評価のまとめ
全血清サンプル  ｎ＝４６  陽性血清サンプル
臨床  ｎ＝２０
調製  ｎ＝２６（１×ＬｏＤでｎ＝１３、これは３．６５Ｅ＋０２  ＧＥＱ／ｍＬである、３×ＬｏＤでｎ＝１３、これは１．０９Ｅ＋０４  ＧＥＱ／ｍＬである）
【表１８】
2019508057.tif 000031
2019508057.tif 000032
【０１８８】
例１３−ウエストナイルウイルス臨床評価
ＣＨＩＫＶの検出のためのＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの性能特性を、例１〜５に示される材料および方法、特にプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、そして１９例のＷＮＶ陽性臨床ヒト血清サンプルを用いて確立した（表１９）。陽性ＷＮＶ検体は、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって収集され、ＦＤＡ−承認されたＰｒｏｃｌｅｉｘ（登録商標）ＷＮＶ  ＴＭＡアッセイを用いたＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、フェニックス、アリゾナ州によってＷＮＶについて陽性が試験された。ＷＮＶ−ＮＳ３  ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＰＭＩＤ：１０８２１３６８）が、コロンビア大学でＷＮＶリアルタイムデータを得るための比較装置アッセイとして、わずかな変更を加えて使用された。臨床サンプルに加え、調製した血清サンプル２６例（血清サンプル１３例にＷＮＶが１×ＬｏＤおよび３×ＬｏＤで加えられた）も検証のために使用された（図２）。全例において、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ＷＮＶ陽性サンプルについて陽性だった。
【０１８９】
プライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および５、ならびにプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を用いたＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによるウエストナイルウイルスに関する臨床サンプル評価のまとめ
全血清サンプル  ｎ＝４５  陽性血清サンプル
臨床  ｎ＝１９
調製  ｎ＝２６（１×ＬｏＤでｎ＝１３、これは２．１２Ｅ＋０２  ＧＥＱ／ｍＬであり、３×ＬｏＤでｎ＝１３、これは６．３６Ｅ＋０２  ＧＥＱ／ｍＬである）
【表１９】
2019508057.tif 000033
2019508057.tif 000034
【０１９０】
例１４−デング、チクングニア、およびウエストナイルウイルスを加えて調製した血清および尿サンプルによるＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの検証
１３例の血清および尿サンプルは、それぞれＤＥＮＶ（血清型３）、ＣＨＩＫＶ、またはＷＮＶによって１×ＬｏＤおよび２×ＬｏＤで添加され（ＤＥＮＶ血清サンプルが２６例、ＤＥＮＶ尿サンプルが２６例、ＣＨＩＫＶ血清サンプルが２６例、ＣＨＩＫＶ尿サンプルが２６例、ＷＮＶ血清サンプルが２６例、ＷＮＶ尿サンプルが２６例）、例１〜５および１１〜１３に示される材料および方法、ならびにＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＷＮＶに特異的な表２に示すプライマーおよびプローブを用いて試験された。アッセイ特異性コントロールとして、熱性ライム病患者（２６）から得られた血清サンプル、およびＺＩＫＶ感染が疑われるがすべてのアルボウイルスがＰＣＲによって陰性である被験体からＮＹＳＤＯＨで収集された尿検体（２６）のパネルを使用した。すべての例でウイルスが１００％検出された。サンプルに関するデータを図２に示す。
【０１９１】
参考
Ｂｒｏｕｔｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１６  Ａｐｒ  ２１；３７４（１６）：１５０６−９．
Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１６  Ｍａｙ  １９；３７４（２０）：１９８１−７．
ＣＤＣ  Ｗｅｂｓｉｔｅ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｚｉｋａ／
Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｒｉａｎ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ（母親の長期ウイルス血症および胎児脳異常を伴うジカウイルス感染）．，Ｊｕｎｅ  ２，２０１６；３７４：２１４２−２１５１．
Ｍｅａｎｅｙ−Ｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｔ  Ｗｏｍｅｎ（妊婦におけるジカウイルスＲＮＡの長期検出）．，２０１６  Ｏｃｔ；  １２８（４）７２４−７３０．
Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ（流行と関連するジカウイルスの遺伝的および血清学的特性），Ｙａｐ  Ｓｔａｔｅ，Ｍｉｃｒｏｎｅｓｉａ，２００７．２００８；１４：１２３２−９．
Ｂｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ（脳脊髄液におけるウエストナイルウイルス配列の検出）．２０００  Ｍａｙ  ６；３５５（９２１５）：１６１４−５．
【図１】
2019508057.tif 000035
【図２】
2019508057.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月22日(2018.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイの分析特異性を評価するため、サンプルは例１〜５の材料および方法を、特に表１のプライマーおよびプローブとともに用いて、ＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイで標的とされない広範なヒト病原体を代表する核酸を含む。核酸は、感染症・免疫学センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）で登録保存されている細胞培養上清または臨床検体から抽出、あるいはＮＩＨ−統合研究所（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（フォートでトリック，メリーランド州）から提供された。ＣＦＸ９６（商標）ｔｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＣＩＩ−ＡｒｂｏＰｌｅｘ  ｒＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験されたサンプルは、交差反応性の証拠を示さなかった。試験結果は、サンプルがホスト転写物コントロールＲＮアーゼＰについて陽性だった場合のみ有効と考えられた。結果を表１１に示す。
【表１１】
2019508057.tif 000037
2019508057.tif 000038
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
表１２に示されるほとんどすべての種について、例１に示されるプローブおよびプライマーセットは２０％未満の交差反応性を有した。
【表１２】
2019508057.tif 000039
2019508057.tif 000040
2019508057.tif 000041
2019508057.tif 000042
2019508057.tif 000043
2019508057.tif 000044
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019508057000001.app
【国際調査報告】
2019508057.tif 000045
2019508057.tif 000046
2019508057.tif 000047
2019508057.tif 000048
2019508057.tif 000049
2019508057.tif 000050