(57)【要約】本発明は、抗体からシステインキャップを除去し、抗体にシステイン分子を再キャップする方法を提供する。本方法は、とりわけ、少なくとも１つのキャップされた工学的に操作されたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、およびこの細胞培養物をシスチンと接触させるステップを含む。本発明により、溶存酸素レベルを細胞培養物中で操作して、除去および再キャッププロセスをさらに増強することができる。
2019532663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分子からシステインキャップを除去する方法であって、
少なくとも１つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、および
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるステップ
を含み、それによって、前記システインキャップが、前記タンパク質分子から除去される、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞の培養物を溶存酸素（ＤＯ）と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるのと同時に、またはその後に、前記宿主細胞の培養物を０％〜５０％ＤＯの設定点でＤＯの第１の操作と接触させるステップ、
前記宿主細胞の培養物をＤＯの前記第１の操作と接触させた後に、前記宿主細胞の培養物を２０％〜１００％ＤＯの設定点でＤＯの第２の操作と接触させるステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞の培養物を前記第１の操作と接触させる前記ステップが、０．５〜８時間の持続期間にわたり行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞の培養物を前記第１の操作と接触させる前記ステップが、２時間の持続期間にわたり行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞の培養物を前記第２の操作と接触させる前記ステップが、０．５〜８時間の持続期間にわたり行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞の培養物を前記第２の操作と接触させる前記ステップが、２時間の持続時間で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＯの前記第１の操作が、０％ＤＯの設定点にある、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ＤＯの前記第２の操作が、１００％ＤＯの設定点にある、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が抗体である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体を、抗体−薬物コンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、薬物−リンカー化合物と組み合わせるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、少なくとも２つの工学的に操作されたシステイン残基を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記工学的に操作されたシステイン残基が、前記抗体分子の重鎖定常領域中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記工学的に操作されたシステイン残基が、前記抗体分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
それによって、前記タンパク質分子がシステイン分子により再キャップされる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記システインキャップが工学的に操作されたシステインキャップ（ＥＣ−キャップ）である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞の培養物を、宿主細胞培養の１０日目にシスチンと接触させる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞の培養物を、宿主細胞培養持続期間の全体にわたり、毎日、シスチンと接触させる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞の培養物を、宿主細胞培養持続期間の最終日にシスチンと接触させる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記シスチンが、０．１ｍＭ〜５Ｍの間の濃度で添加される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記シスチンが４ｍＭの濃度で添加される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質分子からシステインキャップを除去し再形成する方法であって、
少なくとも１つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、および
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるステップ、
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるのと同時に、またはその後に、前記宿主細胞の培養物を０％〜５０％の設定点でＤＯの第１の操作と接触させるステップ、
前記宿主細胞の培養物を０％〜５０％の設定点でＤＯと接触させた後に、前記宿主細胞の培養物を２０％〜１００％の設定点でＤＯの第２の操作と接触させるステップ
を含み、これにより、前記システインキャップが前記タンパク質分子から除去され、タンパク質がシステイン分子により再キャップされる、方法。
【請求項２３】
タンパク質分子からシステインキャップを除去する方法であって、
少なくとも１つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、および
宿主細胞の培養物を対称ジスルフィドと接触させるステップ
を含み、それによって、前記システインキャップが、前記タンパク質分子から除去される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１１月７日に出願された米国仮出願番号第６２／４１８，５７２号の利益を主張しており、この仮出願は、すべての目的のためにその全体が本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
選択されたアミノ酸がシステインに変異されているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（すなわち、工学的に操作されたシステインｍＡｂまたはｅｃｍＡｂ）は、ｅｃｍＡｂを含むコンジュゲートが、薬物対抗体比（ＤＡＲ）の均一性、有利な薬物動態、安定性および溶解性を含む、有利な特性を有するので、コンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートまたはＡＤＣ）での使用に特に好適である。システイン変異は、鎖間または鎖内ジスルフィド結合を一般に形成しない抗体のアミノ酸配列の位置にあり、変異体ｍＡｂを生成する細胞内の発現機構は、システイン残基を不対システインととらえる。したがって、工学的に操作されたシステインは、非コードシステイン分子とジスルフィドが混ざった形態で、一般に発現される（すなわち、工学的に操作されたシステインは、キャップ剤、例えばシステイン（ｃｙｓ−キャップ）、ホモシステイン（ｈｃｙ−キャップ）、システイニルグリシン（ｃｙｓｇｌｙ−キャップ）またはグルタチオン（ｇｓｈ−キャップ）により「キャップ」されて、工学的に操作されたシステインキャップ（ＥＣ−キャップ）を形成する）。
【０００３】
工学的に操作されたシステイン抗体のいずれのバッチでも、工学的に操作されたシステインの非常に反応性の高いチオールが、幅広い範囲のＥＣ−キャップ種によって通常、保護される。ｅｃｍＡｂは、最終のｍＡｂまたはＡＤＣに影響を及ぼさないが、ｅｃｍＡｂ上のＥＣ−キャップにおける不均質性は、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）プロファイルにおいて様々なピークとして現れ得る一方、同一のＥＣ−キャップ種を有するｅｃｍＡｂのｉｃＩＥＦプロファイルは一致する。ｉｃＩＥＦは、ｍＡｂおよびＡＤＣの生成の間に、中間抗体物質に関する抗体放出アッセイに一般に使用されるので、ｉｃＩＥＦプロファイルの不一致は、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）のバッチが不合格になる場合もあり得る。不均質なＥＣ−キャップ分配は、細胞培養の持続期間の延長によって、単一のＥＣ−キャップ種（ｃｙｓ−キャップ）に変換することができるが、これには制約があり、かつコストがかかり、製品品質に影響を及ぼし得る。本発明は、この問題および他の問題に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な要旨
本発明は、とりわけ、少なくとも１つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養し、宿主細胞の培養物をシスチンと接触させ、これにより、システインキャップをタンパク質分子から除去することによる、タンパク質分子からシステインキャップを除去する方法を提供する。一実施形態では、宿主細胞の培養物を、溶存酸素（ＤＯ）とさらに接触させる。さらなる実施形態では、宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるのと同時に、またはその後に、宿主細胞の培養物を０％〜５０％ＤＯの設定点でＤＯの第１の操作と接触させ、宿主細胞の培養物をＤＯの第１の操作と接触させた後に、宿主細胞の培養物を、２０％〜１００％ＤＯの設定点でＤＯの第２の操作と接触させる。一実施形態では、宿主細胞の培養物は、０．５〜８時間、ＤＯの第１の操作と接触させる。一実施形態では、宿主細胞の培養物は、０．５〜８時間、ＤＯの第２の操作と接触させる。一実施形態では、ＤＯの第１の操作は、０％ＤＯの設定点にある。一実施形態では、ＤＯの第２の操作は、１００％ＤＯの設定点にある。
【０００５】
一実施形態では、上記のタンパク質は抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、抗体−薬物コンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、薬物−リンカー化合物と組み合わされる。さらなる実施形態では、抗体は、少なくとも２つの工学的に操作されたシステイン残基を有する。一実施形態では、工学的に操作されたシステイン残基は、抗体分子の重鎖定常領域中に存在する。別の実施形態では、工学的に操作されたシステイン残基は、抗体分子の重鎖または軽鎖可変領域中に存在する。一実施形態では、システインキャップは、工学的に操作されたシステインキャップ（ＥＣ−キャップ）である。
【０００６】
一実施形態では、宿主細胞の培養物は、宿主細胞培養の１０日目にシスチンと接触させる。別の実施形態では、宿主細胞の培養物は、全宿主細胞培養持続期間の全体にわたり、毎日、シスチンと接触させる。別の実施形態では、宿主細胞の培養物は、宿主細胞培養持続期間の最終日に、シスチンと接触させる。一実施形態では、シスチンは、０．１ｍＭ〜５Ｍの間の濃度で添加される。さらなる実施形態では、シスチンは、４ｍＭの濃度で添加される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、システイン（−ｃｙｓまたはｃｙｓ−キャップ）、ホモシステイン（−ｈｃｙまたはｈｃｙ−キャップ）、システイニルグリシン（−ｃｙｓｇｌｙまたはｃｙｓｇｌｙ−キャップ）およびグルタチオン（−ｇｓｈまたはｇｓｈ−キャップ）を含む、幅広い範囲の工学的に操作されたシステインキャップ種を有する抗体を示す図である。
【０００８】
【図２】図２は、実施形態による、２分子の場合のシスチン添加および溶存酸素操作の後のＥＣ−キャップ分配を示す図である。１０日目とは、細胞培養の１０日目を表し、＋ＣｙｓＣｙｓは、シスチン添加物を表し、０％または１００％のＤＯは、溶存酸素の設定点を表す。
【０００９】
【図３】図３は、実施形態による様々な条件下での、細胞培養物中のｅｃｍＡｂのｉｃＩＥＦプロファイルを示す図である。
【００１０】
【図４】図４は、対照（破線）、および実施形態による６日目（実線）から開始した毎日のシスチン添加の経時的なＥＣ−キャップ分配を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
Ｉ．総説
本発明は、細胞培養物中のタンパク質から、様々な種（例えば、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンおよび／またはグルタチオン）の工学的に操作されたシステインキャップ（ＥＣ−キャップ）を除去し、これによって、次に、タンパク質の工学的に操作されたシステインを、一致する所望のキャップ種（例えば、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンおよびグルタチオンのうちの１種）により再キャップする方法をとりわけ提供する。一実施形態では、本方法は、工学的に操作されたシステイン残基のキャップを解除し、ｃｙｓ−キャップによりこの残基を再キャップするのに十分な条件下で、ｅｃｍＡｂを含む細胞培養物をシスチン溶液と接触させるステップを含む。シスチン溶液を細胞培養物に添加することは、抗体を採取した後にシスチン溶液を添加するより好ましくあり得、なぜなら、これは、中間ｍＡｂ物質中のＥＣ−キャップの潜在的な不均質性に対処するものであり、ＥＣ−キャップ分配が、細胞培養プロセスのレベルで制御されることを確実にするからである。一部の実施形態では、溶存酸素（ＤＯ）レベルは、細胞培養物中で操作され、キャップ解除／再キャッププロセスをさらに増強する。本発明の方法は、とりわけ、ｉｃＩＥＦ全体の一致、ならびに他の電荷をベースとするアッセイ、プロファイルと、ｍＡｂおよびＡＤＣを調製する現在の製造実践の単純化とを実現する。
【００１２】
ＩＩ．定義
本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異的抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および所望の生物活性（すなわち、標的抗原に対する特異的結合）を示し、かつ少なくとも１つの生来の鎖間ジスルフィド結合を有する抗体フラグメントを幅広く指す。例示的な断片には、例えば、Ｆａｂ、ミニ抗体などが含まれる。無傷抗体は、典型的には、４つのポリペプチド鎖（２つの重鎖および２つの軽鎖）で構成され、各ポリペプチドは、主に２つの領域：可変領域および定常領域を有する。可変領域は、標的抗原に特異的に結合して、これと相互作用する。可変領域は、特定の抗原上の特異的結合部位を認識してこれに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。定常領域は、免疫系により認識されて、これと相互作用することができる（例えば、Janewayら、２００１年、Immuno.  Biology、第５版、Garland  Publishing、New  Yorkを参照されたい）。４つのポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合を介して、互いに共有結合により連結している。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または部分クラスのものであり得る。抗体は、任意の好適な種に由来することができる。一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはネズミ起源のものである。モノクローナル抗体は、例えば、ヒト、ヒト化またはキメラであり得る。文脈に応じて、用語「抗体」とは、単一の抗体分子、または抗体溶液中などの抗体分子の集合体を指すことができる。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語「鎖間ジスルフィド結合」とは、抗体における隣接ポリペプチド鎖上の２つのシステイン残基間の共有結合を指す。ジスルフィド結合は、式Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ２を有しており、ここで、硫黄原子は、システイン側鎖に存在しており、Ｒ１およびＲ２は、システイン残基、およびそれらが存在するポリペプチド鎖の残りを表す。鎖間ジスルフィド結合は、抗体における重鎖と軽鎖との間に、または２つの重鎖間に一般に存在する。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語「工学的に操作されたシステイン残基」とは、タンパク質（例えば、抗体）のペプチド配列中に導入されたシステイン残基を指す。工学的に操作されたシステイン残基を有するモノクローナル抗体は、「ｅｃｍＡｂ」と呼ぶことができる。工学的に操作されたシステイン残基は、タンパク質の生来（すなわち、天然に存在する）のペプチド配列には一般に存在しない。工学的に操作されたシステイン残基は、ペプチド配列における所与の位置で、天然に存在するアミノ酸の位置をとることができ、部位特異的突然変異などの組換え技法により、ペプチド配列中に導入され得る。工学的に操作されたシステイン残基は、キャップされていてもよく、またはキャップがなくてもよい。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語「キャップのないシステイン残基」とは、α側鎖が式Ｒ１−ＳＨを有する遊離チオール部分を含有する、システイン残基を指す。Ｒ１は、システイン残基の非チオール部分を表す。キャップのないシステイン残基は、キャップのない工学的に操作されたシステイン残基であり得る。
【００１６】
本明細書において使用される場合、用語「キャップされたシステイン残基」とは、α側鎖が、式Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｒ３を有するジスルフィド部分を含有する、システイン残基を指す。Ｒ１は、システイン残基の非チオール部分を表し、Ｒ３は、約５００Ｄａ未満またはこれに等しい分子量を有するキャップ部分の非チオール部分を表す。例えば、キャップは、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンまたはグルタチオン（それぞれ、Ｒ３は、遊離システイン、システイニルグリシンの非チオール部分、またはグルタチオンの非チオール部分を表す）、または任意の他の利用可能なモノチオールであり得る。キャップされたシステイン残基は、キャップされた工学的に操作されたシステイン残基であり得る。
【００１７】
本明細書で使用する場合、タンパク質からＥＣ−キャップなどの物質（または、キャップ副生物）を「除去すること」とは、タンパク質から、物質の全体を含む物質の任意の部分を除去することを指す。
【００１８】
本明細書で使用する場合、タンパク質上のＥＣ−キャップなどの物質（または、キャップ副生物）を「再キャップする」とは、タンパク質上の、物質の全体を含む物質の任意の部分を再形成することを指す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「抗体−薬物コンジュゲート」および「ＡＤＣ」とは、任意選択でリンカーを介して、治療剤（すなわち、薬物）にコンジュゲートされた抗体を指す。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「薬物−リンカー化合物」または「薬物−リンカー」とは、薬物部分とこれに付着しているリンカーとを有する分子を指し、ここで、リンカーは、抗体におけるアミノ酸残基（システイン残基など）への付着に好適な反応性部分を含有する。
【００２１】
ＩＩＩ．実施形態の説明
本発明は、とりわけ、ｅｃｍＡｂから工学的に操作されたシステインキャップ（ＥＣ−キャップ）を除去する方法、およびｅｃｍＡｂ上の所望のキャップ種を再形成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、工学的に操作されたシステイン残基のキャップを解除し、システインによりこの残基を再キャップするのに十分な条件下で、ｅｃｍＡｂを含む細胞培養物をシスチン溶液と接触させるステップを含む。
【００２２】
細胞培養条件
一部の実施形態では、ｅｃｍＡｂは、宿主細胞の培養物から生成して、採取する。図１は、抗体の工学的に操作されたシステイン残基上のＥＣ−キャップの様々な例を示している。いずれの細胞培養物でも、工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体は、図１に示されているＥＣ−キャップ種のいずれか、またはすべてによりキャップされてもよい。本発明の方法を使用して、細胞培養物中のｅｃｍＡｂのＥＣ−キャップ間の一致を生じさせることができる、例えば、ＥＣ−キャップを除去し、工学的に操作されたシステイン残基をｃｙｓ−キャップにより再キャップすることができる。一部のこのような態様では、工学的に操作されたシステイン残基は、抗体の重鎖の２３９位（Kabatら、「Sequences  of  proteins  of  immunological  interest」、第５版、出版番号９１−３２４２、U.S.  Dept.  Health  &  Human  Services、NIH、Bethesda、M.D.、１９９１年により記載されている、ＥＵインデックスに従う番号付け）に存在する。細胞培養物は、ＣＨＯ細胞を含む、哺乳動物細胞株のいずれかを含むことができる。細胞培養に使用される培地は、ＲＰＭＩを含む任意の培地であり得る。一部の実施形態では、培地は、シスチンを低濃度ですでに含有する。しかし、培地中の低量のシスチンは、ｅｃｍＡｂからＥＣ−キャップを除去して再キャップするには一般に十分ではない。
【００２３】
細胞培養物は、ｅｃｍＡｂの任意の好適な量を含むことができる。典型的には、細胞培養物中のタンパク質（抗体タンパク質または非抗体タンパク質に関わらない）の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、またはこれより高く、より典型的には、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。細胞培養物は、細胞培養物１ｍＬあたり、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または約１５０ｍｇのタンパク質（抗体タンパク質または非抗体タンパク質に関わらない）を含有することができる。当業者は、質量に基づく濃度（例えば、ｍｇ／ｍＬ）を、モル濃度（すなわち、モル／Ｌ）に変換することができるであろう。
【００２４】
ｅｃｍＡｂからＥＣ−キャップを除去しシステインにより再キャップするため、シスチン溶液を細胞培養物に加える。シスチン溶液は、酸性溶液または塩基性溶液などのいかなる種類の溶液であり得るか、またはシスチンは、細胞培養培地（例えば、フィード用培地または基本培地）中に存在することができる。シスチン溶液は、直接的な注入を含む、任意の方法によって細胞培養物に添加することができる。他の実施形態では、ホモシステインのジスルフィドまたは任意の対称ジスルフィドなどの細胞培養物に、様々な溶液を添加する。一部の実施形態では、所望のＥＣ−キャップの単量体と二量体の両方を加えると、ＥＣ−キャップの交換が容易になり、例えば、システインおよびシスチンが細胞培養物に添加される。一実施形態では、工学的に操作されたシステイン残基を再キャップするために使用されるＥＣ−キャップ種は、細胞培養物に添加される対称ジスルフィドに依存する。例えば、シスチンが添加される場合、ｅｃｍＡｂは、システインにより再キャップされることになる。ホモシステインジスルフィドが添加される場合、ｅｃｍＡｂは、ホモシステインにより再キャップされることになる。
【００２５】
シスチン溶液（または、他の対称ジスルフィド）の任意の好適な量を、本発明の方法に使用することができる。一般に、細胞培養物に添加される対称ジスルフィドの濃度は、抗体の工学的に操作されたシステイン残基をキャップ解除して、再キャップするほど十分に高い。一部の実施形態では、シスチンは、０．１ｍＭ〜５Ｍの間の濃度で添加される。さらなる実施形態では、シスチンは、０．１ｍＭ〜１Ｍ、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、１ｍＭ〜１００ｍＭ、１ｍＭ〜１０ｍＭ、または１ｍＭ〜５ｍＭの間の濃度で添加される。さらなる実施形態では、シスチンは、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００もしくは９００ｍＭ、または１、２、３、４または５Ｍの濃度で添加される。一部の実施形態では、濃度は、増大してもよく、または減少させてもよい。一部の実施形態では、シスチンの濃度は、全抗体の濃度よりも高い濃度で維持される。一部の態様では、細胞培養物中のシスチンの濃度は、細胞培養物中の全抗体の濃度よりも、約５倍〜約１０，０００倍、５倍〜約５，０００倍、５倍〜約１，０００倍、５倍〜約５００倍、５倍〜約１００倍、５倍〜約２０倍、５倍〜約１５倍または５倍〜約１０倍高い範囲となる。例えば、一部の実施形態では、細胞培養物中のシスチンの全抗体に対する濃度比は、約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、５０：１、１００：１、またはこれより高くなる。
【００２６】
一部の実施形態では、シスチン（または、他の対称ジスルフィド）は、細胞培養の持続期間にわたり、毎日、添加される。他の実施形態では、シスチンは、ある特定の日に、例えば細胞培養の１０日目にしか添加されない。一部の実施形態では、シスチンは細胞培養の以下の日：１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、または１５日目よりも後（２０日目、２５日目、３０日目、３５日目、６０日目、９０日目、または９０日目よりも後のいずれかの日など）のいずれか、またはすべての日に添加される。一実施形態では、シスチンは、細胞培養持続期間の最終日に添加される。シスチンは、細胞培養の持続期間全体にわたり、１回、２回、３回もしくは４回、またはそれより多い回数、添加することができる。一実施形態では、シスチンは、抗体が細胞培養物から採取される日に、細胞培養物に添加される。
【００２７】
任意の適切な量の溶存酸素が、本発明の方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＤＯの設定点は、シスチンの添加後に細胞培養物中で操作される。他の実施形態では、ＤＯの設定点は、シスチンの添加前、またはシスチンの添加と同時に操作される。一実施形態では、ＤＯは、還元環境を作り出すため、シスチンの添加前、添加中または添加後に、０％〜９９％の間（ここで、１００％のＤＯは、空気飽和度１００％、または約２１％の酸素である）の範囲まで低減される。例えば、ＤＯは、０％〜９０％、０％〜５０％、０％〜３０％、０％〜２０％、０％〜１０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％の間の設定点、または０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の設定点まで低減される。ＤＯは、シスチンの添加後、０．５〜１０時間、０．５〜４時間、０．５〜２時間、０．５〜８時間、０．５〜１０時間、１〜１０時間、１〜４時間、１〜２時間、５分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間もしくは１０時間、またはそれより長い時間を含む、任意の持続期間にわたり、低減され得る。ＤＯが低減された後、ＤＯは、次に、任意の持続期間にわたり、１％〜５００％の間の範囲まで増加される。例えば、ＤＯは、１０％〜５００％、２０％〜５００％、３０％〜５００％、４０％〜５００％、５０％〜５００％、６０％〜５００％、７０％〜５００％、８０％〜５００％、９０％〜５００％、１０％〜１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％の間の設定点、または１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の設定点まで増加され得る。ＤＯは、０．５〜１０時間、０．５〜４時間、０．５〜２時間、１〜１０時間、１〜４時間、１〜２時間、５分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間もしくは１０時間、またはそれより長い時間を含む、任意の持続期間にわたり、増加され得る。ＤＯは、空気および酸素を吹き付けること、ならびに／または覆い被せることを含む、任意の方法により添加され得る。
【００２８】
抗体コンジュゲート
抗体上のキャップのない工学的に操作されたシステイン残基は、イメージング剤（発色団およびフルオロフォアなど）、診断剤（ＭＲＩ造影試薬および放射性同位体など）、安定剤（ポリエチレン（polyetheylene）グリコールポリマーなど）および治療剤を含む様々な官能基を導入するための有用な手段として働く。コンジュゲートプロセス中に、ｅｃｍＡｂの様々なＥＣ−キャップが除去され、キャップのないシステイン残基をもたらす。キャップのないシステイン残基を有する抗体は、機能剤にコンジュゲートして、抗体−機能剤−コンジュゲートを形成することができる。機能剤（例えば、薬物、検出剤、安定剤）は、工学的に操作されたシステイン残基の部位において、抗体にコンジュゲートされる（共有結合による付着）。機能剤は、リンカーを介して間接的に、または機能剤上のチオール反応性基を介して直接、付着され得る。
【００２９】
キャップのないシステイン残基を有する抗体は、薬物にコンジュゲートされて、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成することができる。典型的には、ＡＤＣは、薬物と抗体との間にリンカーを含有する。リンカーは、切断可能リンカーまたは切断不能リンカーであり得る。切断可能リンカーは、通常、リンカーの切断が標的部位において抗体から薬物を放出するよう細胞内条件下で切断を受けやすい。好適な切断可能リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼにより切断可能なリンカーを含有するペプチジルを含む酵素により切断可能なリンカー、または糖リンカー、例えばグルクロニダーゼにより切断可能なグルクロニド含有リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、例えば、バリン−シトルリン（ｖａｌ-ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リシン（ｐｈｅ-ｌｙｓ）またはバリン−アラニン（ｖａｌ-ａｌａ）などのジペプチドを含むことができる。他の適切な切断可能リンカーは、例えば、ｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカーなどの５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカー）、および還元条件下で切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）を含む。切断不能リンカーは、通常、抗体のタンパク質分解により薬物を放出する。
【００３０】
抗体への付着前に、リンカーはキャップのない工学的に操作されたシステイン残基と反応性の基を有し、付着は、その反応性基を介するものとなる。チオール特異的反応性基が好ましく、例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、プロモまたはクロロ）、ベンジル型ハロゲン化物（例えば、ヨウ化物、臭化物または塩化物）、ビニルスルホン、（ピリジル）ジスルフィド、二酸化ジスルフィド誘導体、水銀誘導体（例えば、酢酸塩、塩化物または硝酸塩の対イオンを有する３，６-ビス（マーキュリメチル）ジオキサンなど）、およびポリメチレンビスメタンチオスルホネートを含む。リンカーは例えば、チオ−スクシンイミド連結基を介して、抗体に付着するマレイミドを含むことができる。
【００３１】
薬物は、任意の細胞毒性薬、細胞増殖抑制薬、または免疫抑制薬であり得る。リンカーが抗体と薬物を連結する実施形態では、薬物は、リンカーとの結合を形成することができる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーとの結合を形成することができる、アミン、カルボン酸、チオール、ヒドロキシル基またはケトンを有することができる。薬物がリンカーに直接付着している態様では、薬物は、抗体への付着前に、キャップのない工学的に操作されたシステインと反応性の基を有する。
【００３２】
薬物の有用なクラスは、例えば、抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。特に、細胞毒性剤の有用なクラスの例は、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤およびチューブリン阻害剤を含む。例示的な細胞毒性剤は、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシンおよびマイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン、またはベンゾジアゼピン含有薬物（例えば、ピロロ［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、およびビンカアルカノイドを含む。選択されるベンゾジアゼピン含有薬物は、ＷＯ２０１０／０９１１５０、ＷＯ２０１２／１１２７０８、ＷＯ２００７／０８５９３０およびＷＯ２０１１／０２３８８３に記載されている。
【００３３】
一部の典型的な実施形態では、好適な細胞毒性剤は、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エンジインおよびレキシトロプシン、ＣＢＩ化合物；米国特許第６，１３０，２３７号も参照されたい）、デュオカルマイシン（米国公開番号第２００６００２４３１７号を参照されたい）、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、ジスコデルモリド、エレウテロビンならびにミトキサントロンを含む。
【００３４】
薬物は、抗チューブリン剤であり得る。抗チューブリン剤の例には、以下に限定されないが、タキサン（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、およびビンカアルカロイド（vinca  alkyloid）（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）が含まれる。他の抗チューブリン剤には、例えば、バッカチン誘導体、タキサンアナログ（例えば、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド（colcimid）、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ジスコデルモリド、アウリスタチンならびにエレウテロビンが含まれる。
【００３５】
薬物は、マイタンシンまたはマイタンシノイド、別のグループの抗チューブリン剤であり得る（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．、Chariら、１９９２年、Cancer  Res.  ５２巻：１２７〜１３１頁、および米国特許第８，１６３，８８８号も参照されたい）。
【００３６】
薬物は、アウリスタチンであり得る。アウリスタチンは、以下に限定されないが、ＡＥ、ＡＦＰ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥを含む。アウリスタチンの合成および構造は、米国特許出願公開第２００３−００８３２６３号および同第２００９−０１１１７５６号、国際特許公開番号ＷＯ０４／０１０９５７号、国際特許公開番号ＷＯ０２／０８８１７２号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第７，６５９，２４１号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第８，３４３，９２８号および米国特許第８，６０９，１０５号に記載されており、すべての目的のため、そのそれぞれの全体が参照により組み込まれている。
【００３７】
一部の実施形態では、薬物部分は、抗チューブリン剤、ＤＮＡ結合剤およびＤＮＡアルキル化剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬物は、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド、タキサン、カリケアマイシンおよびアントラサイクリンからなる群から選択される。
【００３８】
薬物−リンカーを使用して、単一ステップでＡＤＣを形成することができる。他の実施形態では、二官能性リンカー化合物を使用して、２ステップまたは多重ステップのプロセスで、ＡＤＣを形成することができる。
【００３９】
一般に、リンカー上の官能基は、薬物部分における好適な反応性基との特異的反応のために選択される。非限定的な例として、アジドをベースとする部分を、薬物部分における反応性アルキン基との特異的反応のために使用することができる。薬物は、アジドとアルキンとの１，３−双極子付加環化により、リンカーに共有結合されている。他の有用な官能基には、例えば、ケトンおよびアルデヒド（ヒドラジドおよびアルコキシアミンとの反応に好適）、ホスフィン（アジドとの反応に好適）、イソシアネートおよびイソチオシアネート（アミンおよびアルコールとの反応に好適）、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの活性エステル（アミンおよびアルコールとの反応に好適）が含まれる。例えば、Bioconjugate  Techniques、第２版（Elsevier）に記載されている、これらのおよび他の連結戦略が、当業者に周知である。当業者は、反応性官能基の相補性ペアが、リンカーへの薬物部分の選択的反応に選択される場合、このペアの各メンバーは、リンカー上または薬物上のどちらかで用いられ得ることを理解している。
【００４０】
本発明の一部の実施形態は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに十分な条件下で、ｅｃｍＡｂを薬物−リンカー化合物と組み合わせる方法を提供する。一部の実施形態は、本方法は、抗体−リンカーコンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、ｅｃｍＡｂを二官能性リンカー化合物と組み合わせるステップを含む。このような実施形態では、本発明の方法は、リンカーを介して、薬物部分を抗体に共有結合により連結するのに十分な条件下で、抗体−リンカーコンジュゲートを薬物部分と組み合わせるステップをさらに含むことができる。
【００４１】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、以下の式：
【化１】
2019532663.tif 000003
（式中、
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付文字ｐは、１〜８の値である）
である。
【００４２】
薬物負荷
抗体あたりの薬物−リンカー分子の数平均（または平均薬物負荷）は、標的細胞に送達され得る薬物の量の主要決定因子となるので、ＡＤＣ組成物の重要な特徴である。平均薬物負荷は、工学的に操作されたシステイン残基にコンジュゲートされる薬物、ならびに意図される工学的に操作されたシステイン残基以外の部位にコンジュゲートされる薬物および組成物における未コンジュゲート抗体の量を含む。抗体あたり約２つの薬物となる平均薬物負荷を目標とする場合、２つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体（例えば、各重鎖上の１つの部位または各軽鎖上の１つの部位）を使用して、ＡＤＣ組成物を調製することができる。抗体あたり約４つの薬物となる平均薬物負荷を目標とする場合、４つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体（例えば、各重鎖上の２つの部位もしくは各軽鎖上の２つの部位、または重鎖上の１つの部位と軽鎖上の１つの部位）を使用して、ＡＤＣ組成物を調製することができる。当業者は、他のレベルの薬物負荷（例えば、２つ未満の薬物負荷レベルおよび４つより多い薬物負荷レベルを含む）が、特定の抗体または特定の薬物に応じて、治療的に有用となり得ることを理解している。薬物コンジュゲートのための部位は、重鎖中の１つより多い部位もしくは２つより多い部位において、工学的に操作されたシステインを位置付けることにより、または軽鎖中の上記部位で工学的に操作されたシステインを位置付けることにより、またはそれらの両方で抗体中に導入することができる。
【００４３】
通常、２つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体により調製されたＡＤＣ組成物は、抗体あたり約１．５〜２．５の薬物となる平均薬物負荷を有する。抗体あたりの薬物部分の数平均は、例えば、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４または２．５であり得る。一部の実施形態では、２つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体により調製されたＡＤＣ組成物に関する平均薬物負荷は、抗体あたり約１．５〜約２．２の薬物部分、または抗体あたり約１．８〜約２の薬物部分である。通常、４つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体により調製されるＡＤＣ組成物は、抗体あたり約３．４〜４．５の薬物部分の平均薬物負荷を有する。抗体あたりの薬物部分の数平均は、約３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９または４．０であり得る。一部の実施形態では、４つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体により調製されるＡＤＣ組成物の平均薬物負荷は、抗体あたり約３．６〜約４．２の薬物部分、または抗体あたり約３．８〜約４の薬物部分である。
【００４４】
様々な分析方法を使用して、コンジュゲートの収率および異性体混合物が決まり得る。抗体への薬物のコンジュゲート後、このコンジュゲートされた薬物−抗体種を分離することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートされた抗体種は、抗体、薬物および／またはコンジュゲートの特徴に基づいて分離することができる。ＡＤＣ組成物の分析に有用な他の技法には、以下に限定されないが、逆相クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動および質量分析法が含まれる。ＡＤＣ組成物は、例えば、ＡＤＣ中の薬物部分の位置を決定するために、タンパク質分解消化と連携させたＬＣ／ＭＳにより分析することができる。
【００４５】
抗体
いくつかの好適な抗体が、本発明の方法に使用することができる。本発明の方法に使用される抗体は、特徴的な抗原に関連する疾患および状態のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ診断、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングおよび治療を含む、いくつかの用途に有用である。５種のヒト抗体のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）、およびこれらのクラス内の様々な部分クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）は、単一抗体分子における免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の差異などの構造的差異に基づいて認識される。抗体のこれらのクラスおよび部分クラスは、抗体のアイソタイプと呼ばれる。
【００４６】
抗体は、無傷抗体または抗原結合性抗体断片であり得るが、但し、この抗体断片は、発現中または生成中にチオールによりキャップされた、工学的に操作されたまたは生来の少なくとも１つの不対システイン（タンパク質内の鎖間または鎖内結合を一般に形成しないシステイン）を含有することを条件とする。
【００４７】
通常、抗体は、ヒト、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。抗体は、例えば、当業者に周知の技法により生成される、ネズミ、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体であり得る。標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて作製され得る、ヒトおよび非ヒト部分の両者を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体が、有用な抗体である。キメラ抗体は、ネズミモノクローナル由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものなどの、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Cabillyら、米国特許第４，８１６，５６７号、およびBossら、米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい）。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する、非ヒト種に由来する抗体分子である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Queenの米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当分野で公知の組換えＤＮＡ技法により生成することができる。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号および同第６，１１１，１６６号に記載されている通り、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、ヒトＢ細胞から、または１つまたは複数のヒト免疫グロブリンのためのトランスジェニック動物から単離された抗体を含む。
【００４８】
抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的、またはこれより大きな多重特異的であり得る。
【００４９】
ある特定の場合、定常ドメインは、エフェクター機能を有する。抗体エフェクター機能という用語は、本明細書で使用する場合、ＩｇのＦｃドメインにより寄与される機能を指す。このような機能は、例えば、食細胞作用もしくは溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメインの結合により、または補体系の構成成分へのＦｃエフェクタードメインの結合によりもたらされ得る。エフェクター機能は、例えば、「抗体依存性細胞毒性」またはＡＤＣＣ、「抗体依存性細胞食作用」またはＡＤＣＰ、「補体依存性細胞毒性」またはＣＤＣであり得る。ある特定の場合、定常ドメインは、１つまたは複数のエフェクター機能が欠如している。エフェクター機能結合性ドメインに位置する工学的に操作されたシステイン残基への薬物−リンカー化合物のコンジュゲートにより、エフェクター機能がモジュレートされ得る。
【００５０】
抗体は、医療的および／または治療的関心がもたれるなどの、任意の目的とする抗原に対して指向され得る。例えば、抗原は、病原体（以下に限定されないが、ウィルス、細菌、真菌および原生動物など）、寄生虫、腫瘍細胞、または特定の医療的状態に関連するものであり得る。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の場合、がんは、免疫系、肺、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、頭部、頚、骨、または他の任意の解剖学的位置のものであり得る。目的の抗原には、以下に限定されないが、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ルイスＹ、ＣＤ７０、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ｄｒ１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、ルイスＸ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＩＬ−２受容体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧおよびＮｅｕ発がん遺伝子産物が含まれる。
【００５１】
いくつかの特定の有用な抗体には、以下に限定されないが、ＣＤ３３抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ２０１３／１７３４９６号に記載されているヒト化２Ｈ１２抗体）、ＣＤ７０抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ２００６／１１３９０９号に記載されているヒト化１Ｆ６抗体）、ＣＤ３０抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ２００８／０２５０２０号に記載されているヒト化ＡＣ１０抗体）、ＣＤ１９抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ２００９／０５２４３１号に記載されているヒト化ＢＵ１２抗体）、ＬＩＶ−１、ＣＤ１２３、ＮＴＢＡまたはアルファＶベータ６に対する抗体が含まれる。腫瘍特異的抗原に結合する多くの他の内在化抗体を使用することができ、概説されている（例えば、Frankeら、（２０００年）、Cancer  Biother  Radiopharm.  １５巻：４５９〜７６頁；Murray（２０００年）、Semin  Oncol.  ２７巻：６４〜７０頁；Breitlingら、Recombinant  Antibodies、John  Wiley,  and  Sons、New  York、１９９８年を参照されたい）。これらの参照文献および国際出願の開示は、すべての目的のため、参照により本明細書に組み込まれている。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも３つの鎖間ジスルフィド結合を含む抗体を調製する方法を提供する。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも４つの鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、抗体は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの鎖間ジスルフィドを含む。一部の実施形態では、工学的に操作されたシステイン残基は、抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域に存在する。
【００５３】
工学的に操作されたシステイン部位
工学的に操作されたシステインの部位は、得られたＡＤＣの特性に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質の構造中に完全に隠れた工学的に操作されたシステインは、溶媒への接近が不良となるため、コンジュゲートするのに困難となり得る一方、抗体の外表面上の工学的に操作されたシステインは、血漿中での物質への長期曝露のために、安定性の損なわれたＡＤＣをもたらすことがある。同様に、高度に表面曝露した工学的に操作されたシステインを有するｅｃｍＡｂから調製されたＡＤＣは、薬物の疎水性に対して感受性が高くなり得る一方、一層保護された位置における工学的に操作されたシステインは、溶液中の他の物質への接近が制限されるので、薬物の特性にはそれほど感受性は高くなり得ない。工学的に操作されたシステイン残基の位置を使用して、特定のＡＤＣに対して所望のエフェクター機能をモジュレートすることもできる。例えば、エフェクター機能結合性ドメインにおける工学的に操作されたシステイン残基への薬物−リンカーのコンジュゲートを使用して、エフェクター機能媒介性受容体への結合が遮断され得る。
【００５４】
一部の実施形態では、工学的に操作されたシステインは、重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、またはそれらの組合せに位置する。好ましい工学的に操作されたシステイン残基は、コンジュゲート可能な、安定した連結をもたらす部位に位置する残基である。コンジュゲート可能とは、工学的に操作されたシステイン残基が、最初に抗体を変性させることなく、機能剤（例えば、イメージング剤、診断剤、安定剤または治療剤）にコンジュゲートされ得ることを意味する。後で機能剤にコンジュゲートされ得るシステイン残基を導入するための部位を選択する方法は、当分野で公知である（例えば、Junutulaら、２００８年、Nature  Biotechnology、２６巻（８号）、９２５〜９３２頁を参照されたい）。一部の実施形態では、抗体は、１〜８つ、または２〜８つ、または２〜４つの工学的に操作されたシステイン残基を有する。
【００５５】
一部の態様では、工学的に操作されたシステイン残基は、１０％もしくはそれより高い、２０％もしくはそれより高い、３０％もしくはそれより高い、４０％もしくはそれより高い、または５０％もしくはそれより高い分画溶媒接近値（fractional  solvent  accessibility）を有するものである。一部の態様では、システイン残基は、約１０％〜約９５％、約１０％〜約８５％、約１０％〜約７５％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約８５％、約２０％〜約７５％、約２０％〜約６０％または約４０％〜約９５％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約７５％、約４０％〜約６０％の分別溶液接近性を有するものである。特定部位における残基の溶媒接近率を決定するための方法は、当分野で公知であり、例えば、FraczkiewiczおよびBraun、１９９８年、J.  Comp.  Chem.、１９巻、３１９〜３３３頁（http://curie.utmb.edu/getarea.htmlを参照されたい）に記載されている方法論を用いるオンラインサーバーｇｅｔａｒｅａを用いて決定することができる。例示的な残基には、軽鎖上の部位１５、１１４、１２１、１２７、１６８、２０５（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、または重鎖上の部位１１２、１１４または１１６（Ｋａｂａｔに従う番号付け）におけるものが含まれる。例示的な残基には、Ｆｃ領域中の部位２３９、３２６、３２７または２６９（ＥＵインデックスに従う番号付け）におけるものなどのＩｇＧ１抗体のＦｃ領域中のものが含まれる。部位２３９、３２６および３２７における残基の溶媒接近率は、それぞれ、約５０％、約９４％および約２３％である。
【００５６】
非抗体タンパク質
本明細書に記載されている方法は、抗体に関して例示されているが、発現また生成の間に、チオールによりキャップされる、工学的に操作されたまたは生来の不対システイン（タンパク質内に鎖間または鎖内結合を一般に形成しないシステイン）を有する任意のタンパク質に対して首尾よく用いられ得ることは、当業者により理解されよう。本明細書に記載されている方法はまた、タンパク質の一部として、遊離チオールを含有する任意のタンパク質に対して首尾よく用いることができる。この方法が特に有用であるタンパク質は、不対システインを含む他に、鎖間ジスルフィド結合、特に、タンパク質のアンフォールディングを直ちにもたらすことなく切断され得る結合を形成する、生来のシステインを含むタンパク質である。非抗体タンパク質に言及する場合、鎖間ジスルフィド結合という用語は、隣接するポリペプチド鎖上の２つのシステイン残基間の共有結合を指す。非抗体タンパク質の候補としては、溶媒に曝露されているジスルフィド結合であって、生来のフォールディングされた立体構造でのその安定性がキャップされているチオールの立体構造に匹敵する、ジスルフィド結合を含有するものを含むものが挙げられる。工学的に操作されたシステインタンパク質とは、本明細書で使用する場合、タンパク質における選択されたアミノ酸がシステインに変異したものである。例示的なタンパク質はまた、Ｆｃ融合タンパク質、例えば、所望の標的に対する特異性をもたらすタンパク質に共有結合により連結される抗体のＦｃ領域を含有するタンパク質を含む。
【実施例】
【００５７】
ＩＶ．実施例
（実施例１）
細胞培養物の調製
この検討では、工業的に関連するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を使用した。この細胞株は、ジヒドロ葉酸マイナス（ｄｈｆｒ−）ＣＨＯ宿主（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ、Ｃｈａｓｉｎ  ＬＡ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を欠損しているチャイニーズハムスターの細胞変異体を単離。Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ７７巻：４２１６〜４２２０頁、１９８０年）から誘導され、ＦＣ領域（すなわち、Ｓ２３９Ｃ）の各々に挿入された工学的に操作されたシステイン残基を有する組換えｍＡｂを分泌するよう遺伝子操作されたものであった。細胞は、工業的標準品である化学的に明確な基本培地を使用する、振とう用フラスコ中で培養して維持した。この振とう用フラスコでの培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、および１９ｍｍのスローで１２５ＲＰＭとした。細胞培養物の容量は、３Ｌのバイオリアクター中で生成期を開始する３〜４日前にスケールアップした。
【００５８】
流加細胞培養法をバイオリアクター実験に使用した。バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．）に、較正済みのＤＯ（溶存酸素）プローブ、ｐＨプローブおよび温度プローブを装備した。温度制御は、加熱用ブランケットにより達成した。ＤＯは、空気および酸素を散布することによりオンラインで制御し、ｐＨは、ＣＯ２または液状塩基の添加により制御した。工業的標準品の基礎培地およびフィード用培地を使用して、細胞を培養した。このプロセス条件は、ｐＨ７．００、３０％ＤＯ、および１つの傾斜ブレード翼を用いて２００ＰＲＭとした。初期温度設定点は３７℃とし、培養４日目に、３３℃に変更した。最初の作業容量は、１．２Ｌとし、この培養物に、培養１日目〜９日目まで様々なフィード容量を加えた。グルコース濃度は、培養全体にわたり維持した。
【００５９】
（実施例２）
細胞培養の１０日目に工学的に操作されたシステイン残基のキャップ解除および再キャップ
１０日目に、１００ｍＭのシスチン溶液５０ｍＬを細胞培養物に加え、最終的な添加濃度を４ｍＭにした。この細胞培養物をこの条件で２時間、インキュベートした。シスチン添加の２時間後、ＤＯを２時間、０％まで低減させて、次に、ＤＯをさらに２時間、１００％まで増加させた。ＥＣ−キャップ分配に及ぼす影響を評価するため、各操作前後で試料を採取した。
【００６０】
図２に示されている通り、−ｃｙｓ  ｅｃｍＡｂ（ｃｙｓ−キャップにより再キャップしたｅｃｍＡｂ）は、シスチン添加ステップ後、約８４％から９３％まで増加し、１００％のＤＯ操作後には、９７％までさらに増加した。通常、パーセント−ｃｙｓ  ｅｃｍＡｂは、ｉｃＩＥＦプロファイルの一致を示す。このモデル分子で行った検討により、−ｃｙｓ  ｅｃｍＡｂの増加は、ｉｃＩＥＦプロファイルの一致度の増加に対応することを示唆するものである。図３は、シスチンの添加またはＤＯ操作のない、１０日目のｉｃＩＥＦプロファイルの例を示している。このプロファイルは、１４日目における陽性対照と一致しない（この細胞培養を１４日目まで行った場合、ｉｃＩＥＦプロファイルは一般に一致する）。しかし、シスチンを添加した１０日目の、ならびにシスチンを添加して０％および１００％ＤＯでの１０日目のｉｃＩＥＦプロファイルは、この陽性対照と一致する。この方法は、このプロセスおよび生成物を損なうことなく、不均質なＥＣ−キャップ分配を制御する有効な手段であることを証明する。
【００６１】
（実施例３）
細胞培養持続期間の全体にわたる、工学的に操作されたシステイン残基のキャップ解除および再キャップ
この実施例では、１００ｍＭのシスチン溶液２５ｍＬを、培養６日目から始めて、毎日、培養物に加えた。ＥＣ−キャップ分配に及ぼすシスチンの毎日の添加の影響を評価するために、試料を培養６日目〜１０日目に採取した。培養６日目におけるシスチン添加の影響は、培養７日目に評価した。図４に例示されている通り、培養７日目〜１０日目まで毎日、シスチンを添加した条件の場合、−ｃｙｓ  ｅｃｍＡｂ（システインキャップした再キャップｅｃｍＡｂ）は９０％を超えた。この−ｃｙｓ  ｅｃｍＡｂは、対照条件の場合、培養１４日目の後だけ９０％を超えた。
【００６２】
培養１０日目に、−ｃｙｓ  ｅｃｍＡｂは、対照および毎日、シスチンを添加した条件の場合、それぞれ、約８５％および９８％であった。この方法により、このプロセスおよび生成物を損なうことなく、任意の所与の培養日数時に、不均質なＥＣ−キャップ分配を制御する有効な手段が実現される。
【００６３】
上記は、明確性および理解のために、例示および実施例によって、ある程度詳細に記載してきたが、当業者は、ある特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを理解するであろう。さらに、本明細書に提示されている各参照文献は、各参照文献が、参照によりあたかも個々に組み込まれているかのごとく同じ程度まで、その全体が参照により組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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