(57)【要約】  本発明は、ＭＳなどの脱髄症状を治療する髄鞘再生剤の投与を含む。髄鞘再生、乏突起膠細胞分化、およびＭＳなどの脱髄症状の治療を促進する様々な髄鞘再生組成物が開示される。一つの態様では、髄鞘再生組成物は髄鞘再生特性を有する選択的エストロゲン受容体調節剤である。一つの態様では、髄鞘再生組成物は、髄鞘再生のエフェクターとして過去に特定されていないＧタンパク質結合受容体である、ＧＰＲ５６の作用剤である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱髄症状の治療のための医薬組成物であって、髄鞘再生ＳＥＲＭおよび／またはＧＰＲ５６作用剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物が髄鞘再生ＳＥＲＭである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物がＧＰＲ５６作用剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物がバゼドキシフェン、ラロキシフェン、クロミフェン、オスペミフェン、ラソフォキシフェン、ジアリールプロピオニトリル、トレミフェン、およびタモキシフェンからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物がバゼドキシフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物がラロキシフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物がクロミフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物がオスペミフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物がラソフォキシフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物がジアリールプロピオニトリルである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物がトレミフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物がタモキシフェンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
エストロゲン性薬剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記エストロゲン性薬剤がエストロゲン、エストラジオール、共役体化エストロゲン、エストリオール、エストロゲン模倣物質、エストロン、エチニルエストロゲン、およびエストロゲン作用剤からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
被験体における脱髄疾患を治療する方法であって、請求項１〜１４のいずれかの医薬組成物の医薬的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記脱髄症状がＭＳである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
脱髄症状の治療のための請求項１〜１４のいずれかの医薬組成物の使用。
【請求項１８】
前記脱髄症状がＭＳである、請求項１７に記載の方法。
被験体における脱髄化中枢神経系組織における髄鞘再生を促進する方法であって、請求項１〜１４のいずれかの医薬組成物の医薬的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記被験体が脱髄症状を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記脱髄症状がＭＳである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体における乏突起膠細胞前駆体細胞をミエリン産生乏突起膠細胞に分化するように促進する方法であって、請求項１〜１４のいずれかの医薬組成物の医薬的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記被験体が脱髄症状を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記脱髄症状がＭＳである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
脱髄症状の治療における使用のための医薬品の製造における請求項１〜１４のいずれかの医薬組成物の使用。
【請求項２５】
前記脱髄症状がＭＳである、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１６年８月１２日出願された「Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ（髄鞘再生療法）」を名称とする米国特許仮出願第６２／３７４，２７０号、および２０１６年１２月６日出願された「Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ（髄鞘再生療法）」を名称とする米国特許仮出願第６２／４３０，３５７号の優先権を主張し、それぞれの内容が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多発性硬化症（ＭＳ）などの様々な脱髄疾患では、神経線維を囲むミエリン被覆が免疫系または他の因子によって攻撃され損傷される。ミエリン修復、または髄鞘再生はミエリン産生性乏突起膠細胞によって行われる。健常な動物では、脱髄過程後に、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）が活性化されミエリン産生性乏突起膠細胞に成熟し、これが軸索を覆い損傷された領域にミエリンを再適用する。
【０００３】
しかし、ＭＳなどの様々な脱髄疾患では、髄鞘再生過程が欠如し、ミエリン損傷が時間経過にともない蓄積し、重度な変性をもたらす。髄鞘再生不全は脱髄した組織への損傷したＯＰＣ動員および／または移動の結果ではないことが一般的に受け入れられている。それに代わり、不十分なＯＰＣ分化および膜被覆が脱髄症状においてミエリン修復を妨げる重大な障壁であると考えられる。
【０００４】
最新のＭＳ治療は、本疾患の根底にある炎症性成分に向けられるが、現在、軸索修復または髄鞘再生のための承認された療法はない。従って、効果的な髄鞘再生療法のための技術が現在非常に必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の発明者らは髄鞘再生を促進する新規療法を有利に開発した。第一態様では、本開示の発明者らは髄鞘再生を促進する特定の選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）を同定した。別の態様では、本開示の発明者らは、特定の細胞で活性なＧ結合タンパク質受容体であるＧＰＲ５６が髄鞘再生過程の仲介物質であること、およびこの受容体の作用剤が脱髄組織における髄鞘再生および関連過程を促進することを決定した。
【０００６】
さらに、本開示の発明者らは、エストロゲン性物質との併用での髄鞘再生ＳＥＲＭまたはＧＰＲ５６作用剤の投与が髄鞘再生をさらに促進することを決定した。
【０００７】
一つの態様では、本発明の範囲は髄鞘再生ＳＥＲＭを含む新規治療用組成物を包含する。一つの態様では、本発明の範囲はＧＰＲ５６作用剤を含む新規治療用組成物を包含する。一つの態様では、本発明の範囲はＧＰＲ５６作用剤としても作用する髄鞘再生ＳＥＲＭを含む新規治療組成物を包含する。
【０００８】
別の態様では、本発明の範囲は、脱髄症状の治療のために髄鞘再生ＳＥＲＭおよび／またはＣＰＲ５６作用剤を用いる新規方法を包含し、髄鞘再生を促進し、かつ乏突起膠細胞前駆体の分化を促進する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】様々な薬剤による処置に応答するＰＤＧＦＲα（ＯＰＣの指標）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（髄鞘形成乏突起膠細胞）について陽性染色された環の割合を表すＢＩＭＡマイクロピラーアッセイ結果である。
【図２】エストラジオールの存在または不在で、種々の投与量のＢＺＡで処置された細胞においてＭＢＰについて陽性染色された環の割合を表すＢＩＭＡマイクロピラーアッセイの結果である。
【図３】リゾレシチン誘発性脱髄およびそれに続くＢＺＡによる処置後のラット脳梁における大腸腺腫症（ＡＰＣ−成熟乏突起膠細胞のマーカー）陽性細胞密度およびＯｌｉｇ２（乏突起膠細胞結合のマーカー）細胞密度である。
【図４Ａ−４Ｄ】培養で増殖された単離ＯＰＣのＢＺＡ処置後のＭＢＰ陽性細胞の割合を示す。図４Ａは野生型細胞におけるＢＺＡ応答を示し、図４ＢはＥＲαノックアウト細胞におけるＢＺＡ応答を示し、図４ＣはＥＲβノックアウト細胞におけるＢＺＡ応答を示し、図４ＤはＥＲα／ＥＲβ二重ノックアウト細胞におけるＢＺＡ応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の詳細説明
脱髄疾患。一つの態様では、本発明の様々な実施形態は脱髄症状の治療に関する。本明細書において使用されるとき、脱髄症状は、脱髄、すなわち神経線維を囲む保護的髄鞘に対する損傷、が生じているあらゆる疾患状態、自己免疫障害、または過程を指す。一般的に、このような損傷は未知の原因の自己免疫過程によって生じる。
【００１１】
一つの実施形態では、脱髄症状は中枢神経系の症状である。一つの実施形態では、脱髄疾患は髄鞘破壊障害である。一つの実施形態では、脱髄症状はＭＳである。他の実施形態では、脱髄疾患はデビック病、炎症性脱髄病、または急性散在性脳脊髄炎であり得る。脱髄症状は白質萎縮性障害を含み得る。脱髄症状は、中枢神経系神経障害、橋中心髄鞘崩壊症、または進行性多巣性白質脳症を含み得る。本発明の組成物および方法はまた、末梢神経系の脱髄症状における髄鞘再生を促進するために適用され得る。
【００１２】
髄鞘再生組成物。本開示の発明者らは、髄鞘再生剤として作用し得る物質の特定の組成物を同定した。本発明の範囲は、本明細書において「髄鞘再生組成物」と呼ばれるものの投与を包含する。髄鞘再生組成物は１種類以上の髄鞘再生剤を含む。
【００１３】
第一態様では、髄鞘再生組成物は髄鞘再生活性を有するＳＥＲＭを含む。このような組成物は本明細書において「髄鞘再生ＳＥＲＭ」と呼ばれる。ＳＥＲＭはエストロゲン受容体に作用することが知られており、組織特異的効果を有し、例えば、いくつかの組織ではエストロゲン性薬剤として作用し、他の組織では抗エストロゲン性である。
【００１４】
第二態様では、髄鞘再生組成物はＧＰＲ５６作用剤を含む。ＧＰＰＲ５６は、従来技術で知られているように、様々な組織において活性であるＧ結合タンパク質受容体である。ＧＰＲ５６タンパク質配列は登録番号Ｑ９Ｙ６５３、ならびにＧＣ１６Ｐ０５７６１０のＧｅｎｅＣａｒｄ  ＩＤおよびＮＧ＿０１１６４３．１のＮＣＢＩ参照配列を有する。ＧＲＰ５６は接着Ｇタンパク質結合受容体Ｇ１、およびＴＭ７ＸＮ１としても知られている。
【００１５】
ＧＰＲ５６は以前に、発達の際の大脳皮質パターン化、卵巣発達、細胞接着、細胞−細胞相互作用、および骨髄ニッチにおける造血幹細胞および／または白血病幹細胞に関与すると示唆されている。髄鞘形成におけるＧＰＲ５６に関する役割は過去に報告されていない。
【００１６】
本開示の発明者らはＧＰＲ５６が髄鞘再生と関連することを有利に決定した。具体的には、特定の髄鞘再生組成物が確認されており、それらはＳＥＲＭを含み、またＧＰＲ５６作用剤として作用する。この発見は、髄鞘再生を促進するために適用され得る様々な治療方法、既知化合物の二次的な使用、および他の価値ある発明を当技術分野に提供する。
【００１７】
本発明の様々な実施形態は、ＧＰＲ５６作用剤によるＧＰＲ５６の活性化に関する。作用剤は、本明細書で使用されるとき、ＧＰＲ５６に結合し乏突起膠細胞または他の細胞における１種類以上のＧＰＲ５６関連髄鞘形成過程を誘発する物質の任意の組成物を指す。ＧＰＲ５６作用剤は、小分子、成長因子、ポリペプチド、核酸、または物質の任意の他の化学的もしくは生物学的組成物であり得る。
【００１８】
ＧＰＲ５６作用剤は、本明細書で使用されるとき、ＧＰＲ５６の下流エフェクターの作用剤、活性化剤、および増強剤、すなわち、ＧＰＲ５６活性化によって調節され、かつＧＰＲ５６活性化によって誘発される髄鞘再生応答に寄与する、活性剤の種類をさらに指す。
【００１９】
本開示の発明者らは、いくつかの髄鞘再生組成物を有利に同定した。髄鞘再生組成物は髄鞘再生ＳＥＲＭを含みおよび推定的なＧＰＲ５６作用剤も含む。
【００２０】
第一の髄鞘再生組成物はバゼドキシフェンである。バゼドキシフェン（ＢＺＡ）は選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）であり、共役体化されたエストロゲンとの併用で、閉経後骨粗しょう症および閉経期顔面潮紅の治療のために承認されている。共役体化エストロゲンとの併用でＢＺＡは十分耐容性であり、例えばタモキシフェンよりも低い副作用を有する。
【００２１】
第二の髄鞘再生組成物はラロキシフェンである。ラロキシフェンはＦＤＡ承認薬であり、閉経後女性における骨粗しょう症の予防でおよび乳癌予防として使用される。
【００２２】
第三の髄鞘再生組成物はクロミフェンである。クロミフェンはＦＤＡ承認薬であり、女性の不妊治療に使用される。
【００２３】
第四の髄鞘再生組成物はトレミフェンである。トレミフェンはＦＤＡ承認薬であり、乳癌の治療に使用される。
【００２４】
第五の髄鞘再生組成物はラソフォキシフェンである。ラソフォキシフェンはＥＵ承認薬であり、骨粗しょう症、乳癌予防、および膣萎縮を治療する効能を示している。
【００２５】
第六の髄鞘再生組成物はオスペミフェンである。オスペミフェンは性交疼痛症の治療のためのＦＤＡ承認薬である。
【００２６】
第七の髄鞘再生組成物はジアリールプロピオニトリルである。ジアリールプロピオニトリルはエストロゲン受容体作用剤であり、内因性オキシトシン系の活性剤である。
【００２７】
第八の髄鞘再生組成物作用剤はタモキシフェンである。タモキシフェンは特定の乳癌の治療に幅広く使用される。
【００２８】
興味深いことに、前述の化合物のそれぞれはＳＥＲＭである。しかし、本開示の発明者らは、これらのＳＥＲＭの髄鞘再生効果はαまたはβエストロゲン受容体のいずれとも関係なく仲介されると決定した。後述の例で説明されるように、髄鞘再生は、ＥＲの両型がノックアウトされている細胞でさえ、乏突起膠細胞においてこれらの化合物によって誘発される。従って、これらの化合物によって誘発される髄鞘再生効果はＥＲ活性とは大きく独立しており、ほとんどまたはすべてＧＰＲ５６活性化の作用によるものと考えられる。
【００２９】
本発明の範囲は様々な髄鞘再生組成物を包含する。一つの実施形態では、本発明の範囲は、脱髄症状の治療のための髄鞘再生組成物を含む医薬組成物を包含する。一つの実施形態では、脱髄再生組成物は脱髄再生ＳＥＲＭである。一つの実施形態では、髄鞘再生組成物はＧＰＲ５６作用剤である。一つの実施形態では、髄鞘再生組成物はバゼドキシフェン、ラロキシフェン、クロミフェン、オスペミフェン、ラソフォキシフェン、ジアリールプロピオニトリル、トレミフェン、およびタモキシフェンからなる群から選択され、これらは髄鞘再生ＳＥＲＭでありＧＰＲ５６作用剤として作用する。
【００３０】
エストロゲンとの共投与。本開示の発明者らは、髄鞘再生組成物の髄鞘再生効果がエストロゲン性物質と共投与されるときに増強されることを決定した。ＭＳは、男性に対して女性におけるＭＳ発生率の増加および閉経後女性におけるＭＳ発生率の低下などの様々な関係に基づいて、エストロゲン成分を有することが従来技術で知られている。しかし、ＭＳにおけるエストロゲン性ホルモンの役割は明確ではなく、エストロゲン性ホルモン単独の投与が脱髄症状を効果的に治療することは示されていない。従って、髄鞘再生組成物との併用でのエストロゲン性ホルモンによる髄鞘再生の驚くべき増強は、能力増加された髄鞘再生療法を当技術分野にもたらす。
【００３１】
共投与されるエストロゲン性薬剤は、任意のエストロゲンホルモンまたはエストロゲン性物質を含み得、例えば、エストロゲン、エストラジオール、共役体化エストロゲン、エストリオール、エストロゲン模倣物質、エストロン、エチニルエストロゲン、およびエストロゲン作用剤などが挙げられる。
【００３２】
発明の方法。本発明の範囲は、髄鞘再生過程を促進するために髄鞘再生組成物を使用する様々な方法を包含する。本明細書で開示される方法は、被験体への髄鞘再生組成物の投与を包含する。
【００３３】
このような投与は、髄鞘再生組成物の医薬的に効果的な量、すなわち、１つ以上の髄鞘再生過程に対し測定可能な効果を有するのに十分な量の投与を包含する。例えば、１ｎＭ〜１ｍＭの生理学的濃度をもたらす髄鞘再生組成物投与量は、例えば、５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲で使用され得る。髄鞘再生組成物と組み合わされるエストロゲン性薬剤では、例示的な投与量は１〜１００μＭの範囲の生理学的濃度をもたらす量を含む。
【００３４】
投与の被験体は任意の動物、例えば、ヒト、獣医学被験体、または試験動物などであり得る。一つの実施形態では、被験体は脱髄症状を有する、または脱髄症状を有するリスクがあり、そのための治療を必要とするヒトである。本発明の範囲はまた、細胞、細胞培養、および外植組織への髄鞘再生組成物の投与にも及ぶ。一つの実施形態では、本発明の範囲は、従来技術で知られているマイクロピラーアッセイにおける乏突起膠細胞への髄鞘再生組成物の投与を包含する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、髄鞘再生組成物の投与は、髄鞘形成関連過程の程度を増加する、増強する、さもなければ変化させることとして言及される。このような変化は、未治療コントロールでまたは治療前の被験体で認められる髄鞘形成関連過程の程度に対して定められ得る。
【００３６】
一つの態様では、本発明の範囲は、髄鞘再生組成物の投与によって被験体における脱髄症状を治療する方法を包含し、ここで髄鞘再生組成物は髄鞘再生ＳＥＲＭ、ＧＰＲ５６作用剤であり、または髄鞘再生ＳＥＲＭおよびＧＰＲ５６作用剤の両方である。あるいは、本発明の範囲は、被験体における脱髄症状の治療のための髄鞘再生組成物の使用を包含し得、ここで髄鞘再生組成物は髄鞘再生ＳＥＲＭ、ＧＰＲ５６作用剤、または髄鞘再生ＳＥＲＭおよびＧＰＲ５６作用剤の両方である。治療は、本明細書で使用される場合、例えば、脱髄症状を治癒すること、脱髄（例えば、神経シグナル破壊、軸索損傷、および神経変性）と関連する徴候を改善すること、脱髄症状の進行を遅らせること、リスクのある被験体における脱髄症状の発症を防止または遅延すること、ミエリンのさらなる欠如を防止すること、または治療前に失われたミエリンを回復することを含む。このような治療または使用は、１種類以上のエストロゲン性薬剤の投与との組み合わせであってよい。
【００３７】
一つの態様では、本発明の範囲は、脱髄症状を有する被験体における軸索の髄鞘再生を、被験体への髄鞘再生組成物の投与によって増強する方法を包含する。増強は、本明細書で使用されるとき、髄鞘再生度を高めること、例えば、軸索の髄鞘の厚みを増加すること、軸索被覆の割合または保有を増加すること、髄鞘再生の速度を増加すること、または治療領域において髄鞘再生された軸索の数を増加することを指す。このような投与は、１種類以上のエストロゲン性薬剤の投与との組み合わせであってよい。
【００３８】
一つの態様では、本発明の範囲は、被験体における髄鞘形成乏突起膠細胞へのＯＰＣの分化を、被験体への髄鞘形成組成物の投与によって増強する方法を包含する。増強された分化は、本明細書で使用されるとき、ミエリン産生乏突起膠細胞へのＯＰＣ分化の任意の測定における増加を指し得、例えば、ＯＰＣに対する分化した乏突起膠細胞の比率を増加すること、例えば、ＭＢＰ発現細胞の増加またはＰＤＧＦＲα発現細胞の比率の低下を含む。このような投与は、１種類以上のエストロゲン性薬剤の投与との組み合わせであってよい。
【００３９】
別の態様では、本発明の範囲は、脱髄症状の治療での使用のための医薬品の製造のために髄鞘再生組成物を用いる方法を包含する。例えば、脱髄症状の治療のための医薬組成物は、１種類以上の医薬品として許容可能な追加成分と組み合わせて製剤化または混合される１種類以上の髄鞘再生組成物を含み得る。例えば、髄鞘再生組成物は、担体、賦形剤、希釈剤、緩衝剤、塩、または放出調節剤などの組成物、ならびにエストロゲン性組成物と組み合わされ得る。
【００４０】
例。
例１。髄鞘再生ＳＥＲＭの同定。様々なＳＥＲＭおよび他の化合物を、その周りで乏突起膠細胞により被覆する膜のミエリン「環」が断面で視覚化できる圧縮シリカのフリースタンディングマイクロピラーアレイを用いる機能的高性能スクリーニングである、ＢＩＭＡ（マイクロピラーアッセイを用いた髄鞘形成に関する２成分指標）アッセイを用いて、それらの髄鞘再生効果について試験した。ＢＩＭＡはニューロンおよび他の因子からの間接的な影響を受けずに、乏突起膠細胞における化合物の直接的な効果を試験できる。
【００４１】
マイクロピラーをＯＰＣとともに培養し、１００個のマイクロピラーの各視野におけるＭＢＰ陽性またはＰＤＧＦＲα陽性環の数を測定した。結果を図１に示す。誤差バーは±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊Ｐ＜０．０５は各陽性とのスチューデントｔ検定に基づく有意性を示す。７種の追加ＳＥＲＭまたはエストロゲン誘導体を５００ｎＭ〜１μｍの濃度でスクリーニングし、乏突起膠細胞分化または膜被覆に対するいずれの有意な効果はなかった。
【００４２】
例２。ＢＺＡは乏突起膠細胞分化を促進する。精製したＯＰＣを培養し種々の濃度のＢＺＡ単独でまたはエストラジオールとともに４８時間処理し、ＭＢＰ、ＰＤＧＦＲα、およびＤＡＰＩについて免疫染色した。処理後のＭＢＰ陽性細胞の割合の定量を図２に示す。誤差バーは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は各陽性とのスチューデントｔ検定に基づく有意性を示す。
【００４３】
例３。ＯＰＣ分化。髄鞘形成に対する選択されたＳＥＲＭの効果を評価するため、ＯＰＣを、既に検証されている方法論を用いてＷＴ  Ｐ７仔ラットから得、単離して培養し、５００ｎＭの予備的濃度でＳＥＲＭの選択群によって４８時間処理した。細胞を次いで透過処理しＭＢＰ（乏突起膠細胞）、ＰＤＧＦＲα（ＯＰＣ）、およびＤＡＰＩ（細胞体）について免疫染色した。試験した各ＳＥＲＭ（（２，３−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオニトリル、ＢＺＡ、およびタモキシフェン）は、この濃度でＯＰＣ分化を有意に増強した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。さらに、ＯＰＣを後根神経節ニューロン（ＤＲＧ）と共培養し、続いて３日毎に５００ｎＭのＢＺＡで処理した。共培養を固定し、透過処理し染色した。ＢＺＡは共培養系においてＯＰＣ分化、および続く髄鞘形成を有意に（ｐ＜０．００１）増強し、ＯＰＣ分化および髄鞘形成に対し強い効果を示した。
【００４４】
例４。ヒトＥＳＣ由来ＯＰＣにおけるＢＺＡ処理。ヒトＯＰＣをヒトＥＳＣから産生し、ＢＺＡ（５００ｎＭ）の存在または不在下で１０日間培養した。細胞を次いでＯ４およびＭＢＰについて染色した。ＢＺＡによる治療でＭＢＰ陽性乏突起膠細胞の数が有意に増加した。
【００４５】
例５。ＯＰＣ分化に対するＢＺＡの効果。リゾレシチンをマウスの脳梁に注射し、注射後６日目に分析し、脱髄病変領域を示した。マウスをＢＺＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルコントロールのどちらかでリゾレシチンの注射後７日間処理した。マウスを注射後１０日目に安楽死させ、脳を切片化し、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質ペプチド（ＭＯＧ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ−成熟乏突起膠細胞のマーカー）、およびＯｌｉｇ２について免疫染色した。ＡＰＣ陽性細胞の定量は、図３に示すように、ＢＺＡでの処理後に脳梁における髄鞘再生の２倍増加を示した。
【００４６】
例６。髄鞘再生動態に対するＢＺＡ効果。毒性で限局性の脱髄傷害を８週齢雄マウスの脳梁に誘発させ、髄鞘再生の速度および範囲を前述の方法論によって評価した。脱髄を１％リゾレシチン溶液の１μＬ注射によって誘発した。この脱髄モデルには修復のための時系列が非常に重要であり、活性脱髄化［１〜３日の病変後日数（ｄｐｌ）］、ＯＰＣ動員（３〜７ｄｐｌ、５ｄｐｌでピーク）、乏突起膠細胞分化（７〜１０ｄｐｌ）、および活性髄鞘再生（１４〜２１ｄｐｌ）を含む。１０ｄｐｌで乏突起膠細胞分化および髄鞘再生を分析し、ミエリン修復の動態に対するＢＺＡ効果の評価ができた。ＢＺＡを、リゾレシチン注射後に１０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で成熟マウスに経口胃管によって７日間投与した。マウスを１０ｄｐｌで屠殺して灌流した。ＭＯＧおよびＣＣ１／ＡＰＣ免疫染色は、同腹仔ビヒクル処理コントロールと比べて、１０ｄｐｌでＢＺＡ処理マウスの病変における増加した分化および有意に多い乏突起膠細胞を示した。これらの結果はさらに、ＢＺＡが脱髄化損傷後に分化を大きく促進し髄鞘再生の動態を加速することを示す。
【００４７】
例７。髄鞘再生効果はエストロゲン受容体活性と無関係である。
ＯＰＣをエストロゲン受容体α（ＥＲα）またはβ（ＥＲβ）欠損Ｐ７マウスから、ならびに二重ノックアウトマウスから分離した。ノックアウトマウスは、Ｅｓｒ１またはＥｓｒ２遺伝子（それぞれＥＲαおよびＥＲβをコードする遺伝子）のどちらかに挿入されたカセットについてのジェノタイピングによって確認した。ＯＰＣを単離して培養し、５００ｎＭのＢＺＡで４８時間処理した。細胞を次いで透過処理しＭＢＰ（乏突起膠細胞）、ＰＧＦＲα（ＯＰＣ）、およびＤＡＰＩ（細胞体）について染色し、ＭＢＰ／ＤＡＰＩ＋細胞／全細胞を２０倍拡大下で定量した。有意性は両側スチューデントｔ検定を用いて決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＢＺＡはコントロールと比較して、野生型（図４Ａ）、ＥＲα欠損（図４Ｂ）、ＥＲβ欠損（図４Ｃ）、およびＥＲα／ＥＲβ欠損マウス（図４Ｄ）でＯＰＣ分化を有意に高めた。これらの結果は、ＥＲはＳＥＲＭ髄鞘再生剤が髄鞘再生効果を誘発するために必要ではないことを示す。
【００４８】
例８。髄鞘再生ＳＥＲＭはＧＰＲ５６を活性化する。前結果はＳＥＲＭがエストロゲン受容体を通して作用しないことを示したので、髄鞘再生を促進する髄鞘再生ＳＥＲＭの分子標的を同定するためにバイオインフォマティックススクリーニングを実施し、化学プロファイルおよび分子プロファイルを統合するバイオインフォマティックス方法を使用した。具体的には、分析はエストロゲン誘導体（髄鞘形成に単独では効果を有しない）と髄鞘再生ＳＥＲＭの間で重ならない標的を同定するように設計された。同定された最有力候補はＧＰＲ５６であり、これは乏突起膠細胞発達における役割を演じると以前に示唆されている接着GＰＣＲである。予備データは、ＧＰＲ５６が髄鞘再生効果の促進のための髄鞘再生ＳＥＲＭの分子標的であることを示唆する。
【００４９】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および公開は、同一範囲まで参考によって本明細書に援用され、各独立した特許出願、または公開は、参考によって援用されることが具体的および個別的に示される。開示される実施形態は、説明の目的のために提示され、限定されるものではない。本発明はこれらの説明される実施形態を参考にして説明されているが、本発明の構造および構成要素に全体として本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変更がなされ得ることが従来技術の当業者に認識されるであろう。
【図１】
2019524805.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【国際調査報告】
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