(57)【要約】Ｃｅｎｔｙｒｉｎを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（すなわち、ＣＡＲＴｙｒｉｎ）、本開示のＣＡＲおよびＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするトランスポゾン、本開示のＣＡＲおよびＣＡＲＴｙｒｉｎを発現するように修飾された細胞、ならびに作製方法および養子細胞療法にそれを使用する方法を開示する。本開示は、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメイン(ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）であって、抗原認識領域が少なくとも１つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ)とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
2019524721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメインであって、前記抗原認識領域が、少なくとも１つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含む、エクトドメイン、
（ｂ）膜貫通ドメイン、および
（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
（ａ）の前記エクトドメインがシグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
（ａ）の前記エクトドメインが前記抗原認識領域と前記膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含む、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記シグナルペプチドが、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項２または３に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記シグナルペプチドが、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項２または３に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記シグナルペプチドが、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記シグナルペプチドが、ａｔｇｇｃａｃｔｇｃｃａｇｔｃａｃｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇｃａｇｃｔａｇａｃｃａ（配列番号４５）を含む核酸配列によりコードされている、請求項５または６に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記膜貫通ドメインが、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記膜貫通ドメインが、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記膜貫通ドメインが、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号４）を含むアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメインが、ａｔｃｔａｃａｔｔｔｇｇｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃａｃａｃｔｇｔａｃｔｇｃ（配列番号５）を含む核酸配列によりコードされている、請求項９または１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記エンドドメインが、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ヒトＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号６）
を含むアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、
cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg（配列番号７）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインが、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号８）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインが、
aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号９）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項１７に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインが、前記膜貫通ドメインと前記ＣＤ２８共刺激ドメインの間に位置する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
前記ヒンジが、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
前記ヒンジが、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
前記ヒンジが、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
前記ヒンジが、
actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac（配列番号１１）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＣｅｎｔｙｒｉｎが、タンパク質足場を含み、前記足場が、抗原に特異的に結合することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＣｅｎｔｙｒｉｎが、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むタンパク質足場を含み、前記足場が、抗原に特異的に結合することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインが、ヒトタンパク質に由来する、請求項２５に記載のＣＡＲ。
【請求項２７】
前記ヒトタンパク質が、テネイシンＣである、請求項２６に記載のＣＡＲ。
【請求項２８】
前記コンセンサス配列が、
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号１）
を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項２９】
前記コンセンサス配列が、
MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号１３）
を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項３０】
前記コンセンサス配列が、
atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca（配列番号１４）
を含む核酸配列によってコードされる、請求項２９に記載のＣＡＲ。
【請求項３１】
前記コンセンサス配列が、
（ａ）前記コンセンサス配列の１３〜１６位におけるアミノ酸残基ＴＥＤＳ（配列番号１５）を含む、もしくはそれからなるＡ−Ｂループ、
（ｂ）前記コンセンサス配列の２２〜２８位におけるアミノ酸残基ＴＡＰＤＡＡＦ（配列番号１６）を含む、もしくはそれからなるＢ−Ｃループ、
（ｃ）前記コンセンサス配列の３８〜４３位におけるアミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥ（配列番号１７）を含む、もしくはそれからなるＣ−Ｄループ、
（ｄ）前記コンセンサス配列の５１〜５４位におけるアミノ酸残基ＧＳＥＲ（配列番号１８）を含む、もしくはそれからなるＤ−Ｅループ、
（ｅ）前記コンセンサス配列の６０〜６４位におけるアミノ酸残基ＧＬＫＰＧ（配列番号１９）を含む、もしくはそれからなるＥ−Ｆループ、
（ｆ）前記コンセンサス配列の７５〜８１位におけるアミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号２０）を含む、もしくはそれからなるＦ−Ｇループ、または
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組み合わせ
の中の１つまたは複数の位置において修飾されている、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項３２】
少なくとも５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項３３】
少なくとも１０個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項３４】
少なくとも１５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項３５】
前記足場が、１０−９Ｍまたはそれ未満の、１０−１０Ｍまたはそれ未満の、１０−１１Ｍまたはそれ未満の、１０−１２Ｍまたはそれ未満の、１０−１３Ｍまたはそれ未満の、１０−１４Ｍまたはそれ未満の、および１０−１５Ｍまたはそれ未満のＫＤから選択される少なくとも１つのアフィニティーで抗原に結合する、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項３６】
前記ＫＤが表面プラズモン共鳴によって決定される、請求項３５に記載のＣＡＲ。
【請求項３７】
前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３８】
前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むトランスポゾン。
【請求項３９】
前記トランスポゾンが、選択遺伝子をさらに含む、請求項３８に記載のトランスポゾン。
【請求項４０】
前記選択遺伝子が、細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードする、請求項３９に記載のトランスポゾン。
【請求項４１】
前記選択遺伝子が、選択的細胞培養条件によってチャレンジされたときの細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードする、請求項３９に記載のトランスポゾン。
【請求項４２】
前記選択的細胞培養条件が、細胞生存度または生存に有害な化合物を含み、前記遺伝子産物が前記化合物に対する耐性を付与する、請求項４１に記載のトランスポゾン。
【請求項４３】
前記選択遺伝子が、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼ）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１  パラログＣ）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼ）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２  ホメオボックス２）またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３９に記載のトランスポゾン。
【請求項４４】
前記トランスポゾンが、
（ａ）リガンド結合領域と、
（ｂ）リンカーと、
（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドと
を含む誘導性カスパーゼポリペプチドであって、非ヒト配列を含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含む、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項４５】
前記非ヒト配列が、制限部位である、請求項４４に記載のトランスポゾン。
【請求項４６】
前記誘導性カスパーゼポリペプチドの前記リガンド結合領域が、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む、請求項４４または４５に記載のトランスポゾン。
【請求項４７】
前記ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドのアミノ酸配列が、前記配列の３６位に修飾を含む、請求項４６に記載のトランスポゾン。
【請求項４８】
前記修飾が、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）である、請求項４７に記載のトランスポゾン。
【請求項４９】
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号２３）
を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項５０】
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号２４）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項４９に記載のトランスポゾン。
【請求項５１】
誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリンカー領域が、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸によりコードされている、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項５２】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記リンカー領域が、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によりコードされている、請求項５１に記載のトランスポゾン。
【請求項５３】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項５４】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている、請求項４４〜５３のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項５５】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、
GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号２７）
を含むアミノ酸によりコードされている、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項５６】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号２８）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項５５に記載のトランスポゾン。
【請求項５７】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号２９）
を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項４４〜５６のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項５８】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号３０）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項５７に記載のトランスポゾン。
【請求項５９】
前記トランスポゾンが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含む、請求項３８〜５８のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項６０】
前記トランスポゾンが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み、自己切断ペプチドが前記ＣＡＲと前記選択遺伝子の間に位置する、請求項３９〜５８のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項６１】
前記トランスポゾンが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み、自己切断ペプチドが前記ＣＡＲと前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの間に位置する、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項６２】
前記トランスポゾンが少なくとも２つの自己切断ペプチドを含み、第１の自己切断ペプチドが前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドが前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流に位置する、請求項４４〜６１のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項６３】
前記トランスポゾンが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み、第１の自己切断ペプチドが前記ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドが前記ＣＡＲの下流に位置する、請求項３８〜６２のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項６４】
前記少なくとも１つの自己切断ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含む、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項６５】
前記Ｔ２Ａペプチドが、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項６６】
前記ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドが、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項６７】
前記Ｅ２Ａペプチドが、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項６８】
前記ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドが、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項６９】
前記Ｆ２Ａペプチドが、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項７０】
前記ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドが、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項７１】
前記Ｐ２Ａペプチドが、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項７２】
前記ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドが、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のトランスポゾン。
【請求項７３】
前記トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである、請求項３８〜７２のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
【請求項７４】
請求項３８〜７３のいずれか一項に記載のトランスポゾンを含む組成物。
【請求項７５】
トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドをさらに含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
トランスポザーゼ酵素をコードする前記配列がｍＲＮＡ配列である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記トランスポザーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、配列番号１２を含むアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、高活性改変体であり、前記高活性改変体が、配列番号１２の３０、１６５、２８２、および５３８位の１つまたは複数にアミノ酸置換を含む、請求項７７または７８に記載の組成物。
【請求項８０】
配列番号１２の３０位における前記アミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｉ３０Ｖ）である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
配列番号１２の１６５位における前記アミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換（Ｇ１６５Ｓ）である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
配列番号１２の２８２位における前記アミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｍ２８２Ｖ）である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】
配列番号１２の５３８位における前記アミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換（Ｎ５３８Ｋ）である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８４】
前記トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼである、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼが、配列番号２を含むアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むベクター。
【請求項８７】
ウイルスベクターである、請求項８６に記載のベクター。
【請求項８８】
前記ウイルスベクターがレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスもしくはそれらの任意の組み合わせから単離されたか、またはそれらに由来する配列を含む、請求項８７に記載のベクター。
【請求項８９】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスから単離されたか、またはそれに由来する配列を含む、請求項８７または８８に記載のベクター。
【請求項９０】
前記ウイルスベクターが組換えベクターである、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９１】
ナノ粒子ベクターである、請求項８６に記載のベクター。
【請求項９２】
前記ナノ粒子ベクターが、核酸、アミノ酸、ポリマー、ミセル、脂質、有機分子、無機分子またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項９１に記載のベクター。
【請求項９３】
選択遺伝子をさらに含む、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９４】
前記選択遺伝子が、細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードする、請求項９３に記載のベクター。
【請求項９５】
前記選択遺伝子が、選択的細胞培養条件によってチャレンジされたときの細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードする、請求項９３に記載のベクター。
【請求項９６】
前記選択的細胞培養条件が、細胞生存度または生存に有害な化合物を含み、前記遺伝子産物が前記化合物に対する耐性を付与する、請求項９５に記載のベクター。
【請求項９７】
前記選択遺伝子が、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼ）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１  パラログＣ）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼ）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２  ホメオボックス２）またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項９３〜９６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９８】
（ａ）リガンド結合領域と、
（ｂ）リンカーと、
（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドと
を含む誘導性カスパーゼポリペプチドであって、非ヒト配列を含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含む、請求項８６〜９７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９９】
前記非ヒト配列が、制限部位である、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１００】
前記誘導性カスパーゼポリペプチドの前記リガンド結合領域が、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む、請求項９８または９９に記載のベクター。
【請求項１０１】
前記ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドのアミノ酸配列が、前記配列の３６位に修飾を含む、請求項１００に記載のベクター。
【請求項１０２】
前記修飾が、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）である、請求項１０１に記載のベクター。
【請求項１０３】
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号２３）
を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０４】
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号２４）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項１０３に記載のベクター。
【請求項１０５】
誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリンカー領域が、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸によりコードされている、請求項９８〜１０４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０６】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記リンカー領域が、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によりコードされている、請求項１０５に記載のベクター。
【請求項１０７】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている、請求項９８〜１０６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０８】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている、請求項９８〜１０７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０９】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、
GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号２７）
を含むアミノ酸によりコードされている、請求項９８〜１０８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１０】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドが、
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号２８）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１１】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号２９）
を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項９８〜１１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１２】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号３０）
を含む核酸配列によりコードされている、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１３】
少なくとも１つの自己切断ペプチドを含む、請求項８６〜１１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１４】
前記ベクターが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み、自己切断ペプチドが前記ＣＡＲと選択遺伝子の間に位置する、請求項８６〜１１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１５】
前記トランスポゾンが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み、自己切断ペプチドが前記ＣＡＲと前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの間に位置する、請求項９８〜１１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１６】
前記トランスポゾンが少なくとも２つの自己切断ペプチドを含み、第１の自己切断ペプチドが前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドが前記アポトーシス誘導性ポリペプチドの下流に位置する、請求項９８〜１１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１７】
前記ベクターが少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み、第１の自己切断ペプチドが前記ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドが前記ＣＡＲの下流に位置する、請求項８６〜１１６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１８】
前記少なくとも１つの自己切断ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含む、請求項１１３〜１１７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１９】
前記Ｔ２Ａペプチドが、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２０】
前記ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドが、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２１】
前記Ｅ２Ａペプチドが、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２２】
前記ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドが、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２３】
前記Ｆ２Ａペプチドが、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２４】
前記ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドが、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２５】
前記Ｐ２Ａペプチドが、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２６】
前記ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドが、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２７】
請求項８６〜１２６のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物。
【請求項１２８】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む細胞。
【請求項１２９】
請求項３８〜８５のいずれか一項に記載のトランスポゾンまたはトランスポザーゼを含む細胞。
【請求項１３０】
請求項８６〜１２６のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１３１】
細胞表面に前記ＣＡＲを発現する、請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３２】
免疫細胞である、請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞または臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞である、請求項１３２に記載の細胞。
【請求項１３４】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１３２に記載の細胞。
【請求項１３５】
人工抗原提示細胞である、請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３６】
腫瘍細胞である、請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３７】
自己のものである、請求項１１８〜１３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３８】
同種異系のものである、請求項１１８〜１３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３９】
請求項１２８〜１３８のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項１４０】
細胞の表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるための方法であって、
（ａ）細胞集団を得るステップ、
（ｂ）前記細胞集団を、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のＣＡＲまたは前記ＣＡＲをコードする配列を含む組成物に、前記細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切って前記ＣＡＲを移行させるのに十分な条件下で接触させることによって、修飾された細胞集団を生成するステップ、
（ｃ）修飾された前記細胞集団を、前記ＣＡＲの組込みに好適な条件下で、培養するステップ、
（ｄ）細胞表面に前記ＣＡＲを発現する修飾された前記細胞集団の少なくとも１つの細胞を増殖および／または選択するステップ、
を含む、方法。
【請求項１４１】
前記細胞集団が白血球を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記細胞集団がＣＤ４＋およびＣＤ８＋白血球を最適化された比で含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
ＣＤ４＋白血球のＣＤ８＋白血球に対する前記最適化された比が、ｉｎ  ｖｉｖｏには天然に存在しない、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
トランスポゾンまたはベクターが、前記ＣＡＲまたは前記ＣＡＲをコードする前記配列を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項３８から７３のいずれか一項に記載のトランスポゾンが前記ＣＡＲまたは前記ＣＡＲをコードする前記配列を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４６】
前記トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含む、請求項１４４または１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドを含む組成物をさらに含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
トランスポザーゼ酵素をコードする前記配列がｍＲＮＡ配列である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記トランスポザーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、請求項１４７または１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、配列番号１２を含むアミノ酸配列を含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、高活性改変体であり、前記高活性改変体が、配列番号１２の３０、１６５、２８２、および５３８位の１つまたは複数にアミノ酸置換を含む、請求項１４９または１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
配列番号１２の３０位における前記アミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｉ３０Ｖ）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
配列番号１２の１６５位における前記アミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換（Ｇ１６５Ｓ）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
配列番号１２の２８２位における前記アミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｍ２８２Ｖ）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
配列番号１２の５３８位における前記アミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換（Ｎ５３８Ｋ）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５６】
前記トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼである、請求項１４９〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼが、配列番号２を含むアミノ酸配列を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
請求項７６〜１１６のいずれか一項に記載のベクターが前記ＣＡＲまたは前記ＣＡＲをコードする前記配列を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５９】
前記細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切って前記ＣＡＲをコードする前記配列を移行させるのに十分な条件がヌクレオフェクションを含む、請求項１４０、１４４、１４５、または１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
（ｂ）の前記細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切って前記ＣＡＲをコードする前記配列を移行させるのに十分な条件が、指定電圧での１回または複数回の電気パルスの印加、緩衝液、および１つまたは複数のさらなる因子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４０〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記緩衝液が、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記１つまたは複数のさらなる因子が、
（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせ、
（ｂ）塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせ、
（ｃ）細胞培地、
（ｄ）細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路またはこれらの組み合わせの阻害剤、および
（ｅ）１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬
を含む、請求項１６０または１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記組換えヒトサイトカイン、前記ケモカイン、前記インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記塩、前記無機物、前記代謝物またはこれらの任意の組み合わせが、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６５】
前記細胞培地が、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６６】
細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路、またはこれらの組み合わせの前記阻害剤が、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤、ＴＷＳ１１９、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６７】
１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する前記試薬が、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するまたは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ＣＡＲまたは前記ＣＡＲをコードする前記配列の組込みに好適な条件が、緩衝液および１つまたは複数のさらなる因子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４０〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記緩衝液が、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記１つまたは複数のさらなる因子が、
（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、またはこれらの任意の組み合わせ、
（ｂ）塩、無機物、代謝物、またはこれらの任意の組み合わせ、
（ｃ）細胞培地、
（ｄ）細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つまたは複数のアポトーシス経路、またはこれらの組み合わせの阻害剤、および
（ｅ）１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬
を含む、請求項１６８または１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記組換えヒトサイトカイン、前記ケモカイン、前記インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記塩、前記無機物、前記代謝物またはこれらの任意の組み合わせが、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記細胞培地が、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路、またはこれらの組み合わせの前記阻害剤が、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤、ＴＷＳ１１９、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７５】
１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する前記試薬が、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するまたは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７６】
（ｄ）の前記増殖および前記選択を逐次的に行う、請求項１４０〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記増殖を選択の前に行う、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記増殖を選択の後に行う、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７９】
さらなる選択を増殖の後に行う、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
（ｄ）の前記増殖および前記選択を同時に行う、請求項１４０〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記増殖が、修飾された前記細胞集団の少なくとも１つの細胞を抗原と接触させて、前記ＣＡＲにより前記少なくとも１つの細胞を刺激するステップを含む、請求項１４０〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記抗原が支持体の表面に提示される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記支持体がビーズまたは複数のビーズである、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記ビーズまたは複数のビーズが、増殖の後に修飾された前記細胞集団から分離される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記抗原が細胞の表面に提示される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８６】
前記抗原が人工抗原提示細胞の表面に提示される、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記トランスポゾンまたは前記ベクターが選択遺伝子を含み、前記選択ステップが、修飾された前記細胞集団の少なくとも１つの細胞を、前記選択遺伝子が耐性を付与する化合物と接触させることによって、前記選択遺伝子を発現する細胞を、前記選択を生き抜くものとして同定し、前記選択遺伝子を発現することができない細胞を、前記選択ステップを生き抜くことができないものとして同定するステップを含む、請求項１４０〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記増殖ステップおよび前記選択ステップが、端点を含む１０〜１４日の期間にわたり進行する、請求項１４０〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
請求項１４０〜１８８のいずれか一項に記載の増殖および選択された細胞集団を含む組成物。
【請求項１９０】
がんの処置を必要とする被験体におけるがんを処置する方法であって、前記被験体に請求項３７、７４〜８５、１２７、１３９または１８９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項１９１】
前記腫瘍細胞が悪性腫瘍細胞である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記被験体に請求項１３９または１８５の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が自己のものである、請求項１９０または１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が同種異系のものである、請求項１９０または１９１に記載の方法。
【請求項１９４】
自己免疫状態の処置を必要とする被験体の自己免疫状態を処置する方法であって、前記被験体に請求項３７、７４〜８５、１２７、１３９または１８９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが前記被験体の自己免疫細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項１９５】
前記自己免疫細胞が、前記被験体の標的細胞上の自己抗原に特異的に結合するリンパ球である、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記自己免疫細胞がＢリンパ球である、請求項１９４または１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記自己免疫細胞がＴリンパ球である、請求項１９４または１９５に記載の方法。
【請求項１９８】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が自己のものである、請求項１９４〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が同種異系のものである、請求項１９４〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
感染の処置または予防を必要とする被験体における感染を処置または予防する方法であって、前記被験体に請求項３７、７４〜８５、１２７、１３９または１８９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが、感染因子を含む細胞、感染因子に伝染した細胞、または感染因子に曝露された細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項２０１】
前記感染因子が、細菌、ウイルス、酵母または微生物である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記感染因子が、感染、免疫不全状態、炎症状態および増殖性障害のうちの１つまたは複数を誘導しうる、請求項２００または２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記感染が、結核、小頭症、神経変性またはマラリアを引き起こす、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記感染が、前記被験体の胎児で小頭症を引き起こす、請求項２０２または２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記感染因子がウイルスであり、前記ウイルスがジカウイルスである、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記免疫不全状態が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０７】
前記増殖性障害ががんである、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０８】
前記がんが子宮頸がんであり、前記感染因子がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が自己のものである、請求項２００〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が同種異系のものである、請求項２００〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
肥満細胞疾患の処置を必要とする被験体における肥満細胞疾患を処置する方法であって、前記被験体に請求項３７、７４〜８５、１２７、１３９または１８９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが肥満細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項２１２】
前記肥満細胞疾患が肥満細胞の過剰な増殖と関連する障害である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記肥満細胞疾患が肥満細胞症である、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記肥満細胞疾患が肥満細胞の異常な活性と関連する障害である、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記肥満細胞疾患が肥満細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）、アレルギー疾患、喘息または炎症性疾患である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が自己のものである、請求項２１１〜２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１７】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が同種異系のものである、請求項２１１〜２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
変性疾患の処置を必要とする被験体における変性疾患を処置する方法であって、前記被験体に請求項３７、７４〜８５、１２７、１３９または１８９のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが有害な細胞または老化細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項２１９】
前記変性疾患が、神経変性障害、代謝障害、血管障害または老化である、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記変性疾患が神経変性障害であり、前記有害な細胞または前記老化細胞が幹細胞、免疫細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項２１８または２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記変性疾患が代謝障害であり、前記有害な細胞または前記老化細胞が幹細胞、体細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項２１８または２１９に記載の方法。
【請求項２２２】
前記変性疾患が血管障害であり、前記有害な細胞または前記老化細胞が幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項２１８または２１９に記載の方法。
【請求項２２３】
前記変性疾患が老化であり、前記有害な細胞または前記老化細胞が卵母細胞、精子、幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項２１８または２１９に記載の方法。
【請求項２２４】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が自己のものである、請求項２１８〜２２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２５】
前記被験体に請求項１３９または１８５に記載の組成物を投与するステップを含み、前記細胞または細胞集団が同種異系のものである、請求項２１８〜２２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
細胞療法の改変を必要とする被験体における細胞療法を改変する方法であって、前記被験体に請求項３８〜７３のいずれか一項に記載のトランスポゾンを含む細胞を含む組成物を投与するステップを含み、アポトーシスが、前記細胞を誘導剤と接触させることによって前記細胞に選択的に誘導されうる、方法。
【請求項２２７】
細胞療法の改変を必要とする被験体における細胞療法を改変する方法であって、前記被験体に請求項８６〜１２６のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞を含む組成物を投与するステップを含み、アポトーシスが、前記細胞を誘導剤と接触させることによって前記細胞に選択的に誘導されうる、方法。
【請求項２２８】
前記細胞が自己のものである、請求項２２６または２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記細胞が同種異系のものである、請求項２２６または２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
前記細胞療法が養子細胞療法である、請求項２２６〜２２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３１】
前記改変が、前記細胞療法の終了である、請求項２２６〜２３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３２】
前記改変が、前記細胞療法で提供される細胞の一部の枯渇である、請求項２２６〜２３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記誘導剤の阻害剤を投与して、前記細胞療法の改変を阻害し、それによって前記細胞療法の機能および／または有効性を回復させるステップをさらに含む、、請求項２２６〜２３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１６年７月１５日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６２／３６２，７４６、２０１６年１０月６日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６２／４０５，１８０、および２０１７年５月８日に出願された仮出願ＵＳＳＮ６２／５０３，１２７（これら各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を特許請求される。
【０００２】
配列表の援用
２０１７年７月１３日に作成した、サイズが５５ＫＢである「ＰＯＴＨ−００８＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ」という名のテキストファイルの内容は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本開示は分子生物学に関し、より具体的には、キメラ抗原受容体、１つまたは複数のＣＡＲを含有するトランスポゾン、ならびにそれを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
従来の抗体配列またはその断片を使用せずに免疫細胞の特異性を指向させる方法に対する、当技術分野で長年認識されてきたが解決されていない必要性がある。本開示は優れたキメラ抗原受容体を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメイン(ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）であって、抗原認識領域が少なくとも１つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ)とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本開示を通して使用されるように、Ｃｅｎｔｙｒｉｎを含むＣＡＲはＣＡＲＴｙｒｉｎと呼ばれる。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は２つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含み、二重特異性またはタンデムのＣＡＲを産生することができる。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は３つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含み、三重特異性のＣＡＲを産生することができる。ある特定の実施形態では、エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含んでもよい。あるいは、または加えて、ある特定の実施形態では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含んでもよい。
【０００６】
本開示は、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメインであって、抗原認識領域が少なくとも１つのタンパク質足場または抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃ）を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は２つの足場タンパク質または抗体模倣物を含み、二重特異性またはタンデムのＣＡＲを産生することができる。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は３つのタンパク質足場または抗体模倣物を含み、三重特異性のＣＡＲを産生することができる。ある特定の実施形態では、エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含んでもよい。あるいは、または加えて、ある特定の実施形態では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含んでもよい。
【０００７】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を含んでもよい。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ａｔｇｇｃａｃｔｇｃｃａｇｔｃａｃｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇｃａｇｃｔａｇａｃｃａ（配列番号４５）を含む核酸配列によりコードされていてもよい。
【０００８】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含んでもよい。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号４）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、ａｔｃｔａｃａｔｔｔｇｇｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃａｃａｃｔｇｔａｃｔｇｃ（配列番号５）を含む核酸配列によりコードされていてもよい。
【０００９】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含んでもよい。
【００１０】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含んでもよい。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号６）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ｃｇｃｇｔｇａａｇｔｔｔａｇｔｃｇａｔｃａｇｃａｇａｔｇｃｃｃｃａｇｃｔｔａｃａａａｃａｇｇｇａｃａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇａｇａｇｇａａｔａｔｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａａｇｃｇｇａｇａｇｇａｃｇｃｇａｃｃｃｃｇａａａｔｇｇｇａｇｇｃａａｇｃｃｃａｇｇｃｇｃａａａａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇｃａｇａａｇｇａｃａａａａｔｇｇｃａｇａａｇｃｃｔａｔｔｃｔｇａｇａｔｃｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇａｇａｇｇｃａａａｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｃａａａｇｇａｃａｃｃｔａｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃａｔａｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｇ（配列番号７）を含む核酸配列によりコードされていてもよい。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号８）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ａａｇａｇａｇｇｃａｇｇａａｇａａａｃｔｇｃｔｇｔａｔａｔｔｔｔｃａａａｃａｇｃｃｃｔｔｃａｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｔａｃｃｃａｇｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔｃｇａｔｔｃｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｔｇ（配列番号９）を含む核酸配列によりコードされていてもよい。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインの間に位置してもよい。
【００１１】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含んでもよい。ヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０）を含むヒトＣＤ８αアミノ酸配列を含んでもよく、またはＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ヒトＣＤ８αヒンジアミノ酸配列は、ａｃｔａｃｃａｃａｃｃａｇｃａｃｃｔａｇａｃｃａｃｃａａｃｔｃｃａｇｃｔｃｃａａｃｃａｔｃｇｃｇａｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｇａｇｔｃｔｇａｇａｃｃｔｇａｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｇｃｔｇｔｇｃａｃａｃｃａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｃｇａｃ（配列番号１１）を含む核酸配列によりコードされていてもよい。
【００１２】
本開示のＣｅｎｔｙｒｉｎは、タンパク質足場を含んでもよく、足場は抗原に特異的に結合することができる。本開示のＣｅｎｔｙｒｉｎは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むタンパク質足場を含んでもよく、足場は抗原に特異的に結合することができる。少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインはヒトタンパク質に由来することがある。ヒトタンパク質はテネイシン−Ｃでありうる。コンセンサス配列は、
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号１）またはMLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号１３）を含んでもよい。コンセンサス配列は、
atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca（配列番号１４）を含む核酸配列によってコードされうる。コンセンサス配列は、（ａ）コンセンサス配列の１３〜１６位におけるアミノ酸残基ＴＥＤＳ（配列番号１５）を含む、もしくはそれからなるＡ−Ｂループ、（ｂ）コンセンサス配列の２２〜２８位におけるアミノ酸残基ＴＡＰＤＡＡＦ（配列番号１６）を含む、もしくはそれからなるＢ−Ｃループ、（ｃ）コンセンサス配列の３８〜４３位におけるアミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥ（配列番号１７）を含む、もしくはそれからなるＣ−Ｄループ、（ｄ）コンセンサス配列の５１〜５４位におけるアミノ酸残基ＧＳＥＲ（配列番号１８）を含む、もしくはそれからなるＤ−Ｅループ、（ｅ）コンセンサス配列の６０〜６４位におけるアミノ酸残基ＧＬＫＰＧ（配列番号１９）を含む、もしくはそれからなるＥ−Ｆループ、（ｆ）コンセンサス配列の７５〜８１位におけるアミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号２０）を含む、もしくはそれからなるＦ−Ｇループ、または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組み合わせの中の１つまたは複数の位置が修飾されていることがある。本開示のＣｅｎｔｙｒｉｎは、少なくとも５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、少なくとも１０個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインまたは少なくとも１５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含んでもよい。足場は、１０−９Ｍまたはそれ未満の、１０−１０Ｍまたはそれ未満の、１０−１１Ｍまたはそれ未満の、１０−１２Ｍまたはそれ未満の、１０−１３Ｍまたはそれ未満の、１０−１４Ｍまたはそれ未満の、および１０−１５Ｍまたはそれ未満のＫＤから選択される少なくとも１つのアフィニティーで、抗原に結合することができる。ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定してもよい。
【００１３】
本開示は、
【化１】
2019524721.tif 000003
（配列番号２１、太字の配列はＡ０８  Ｃｅｎｔｙｒｉｎのアミノ酸配列を含む）を含むアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴｙｒｉｎ（本明細書においてＡ０８と呼ばれる）を提供する。ある特定の実施形態では、本開示のＡ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎは、
atgggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttccggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggaccaatggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagaccaatgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgagccggatcacagaggactccgccagactgtcttggaccgcccctgacgccgccttcgattcctttccaatccggtacatcgagacactgatctggggcgaggccatctggctggacgtgcccggctctgagaggagctacgatctgacaggcctgaagcctggcaccgagtatgcagtggtcatcacaggagtgaagggcggcaggttcagctcccctctggtggcctcttttaccacaaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgacatctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgcaagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctgcgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaaggggaagtggagaaggacgaggatcactgctgacatgcggcgacgtggaggaaaaccctggcccaatggtcgggtctctgaattgtatcgtcgccgtgagtcagaacatgggcattgggaagaatggcgatttcccatggccacctctgcgcaacgagtcccgatactttcagcggatgacaactacctcctctgtggaagggaaacagaatctggtcatcatgggaaagaaaacttggttcagcattccagagaagaaccggcccctgaaaggcagaatcaatctggtgctgtcccgagaactgaaggagccaccacagggagctcactttctgagccggtccctggacgatgcactgaagctgacagaacagcctgagctggccaacaaagtcgatatggtgtggatcgtcgggggaagttcagtgtataaggaggccatgaatcaccccggccatctgaaactgttcgtcacacggatcatgcaggactttgagagcgatactttctttcctgaaattgacctggagaagtacaaactgctgcccgaatatcctggcgtgctgtccgatgtccaggaagagaaaggcatcaaatacaagttcgaggtctatgagaagaatgac（配列番号２２、この配列は本明細書においてＰ−ＢＭＣＡ−１０１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とも呼ばれる）を含む核酸配列によってコードされていてもよい。
【００１４】
本開示は、本開示のＣＡＲおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００１５】
本開示は本開示のＣＡＲを含むトランスポゾンを提供する。
【００１６】
本開示のトランスポゾンは、トランスポゾンを発現する細胞の同定、濃縮および／または単離のための選択遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）を含んでもよい。例示的な選択遺伝子は、細胞生存度および生存に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、細胞が、選択遺伝子によりコードされている遺伝子産物の非存在下で感受性である（または細胞に対して致死性でありうる）薬物負荷に対する耐性の付与に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子の非存在下での細胞生存度および／または生存に不可欠な１つまたは複数の栄養素を欠いている細胞培地中での生存度および／または生存に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、およびＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチド（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）とを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドであって、非ヒト配列を含まない誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域であってもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」と称されることもある。ある特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよく、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよく、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよく、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、該配列の３６位に修飾を含んでもよい。修飾は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番��２４）を含む核酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含んでもよいリガンド結合領域に特異的な誘導剤は、ＡＰ２０１８７および／またはＡＰ１９０３を含み、これらは両方とも合成薬物である。
【００１８】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、リンカー領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸またはＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列は、制限部位を含まない。
【００１９】
本開示の切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、その配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。あるいは、または加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、その配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２７）を含むアミノ酸、またはＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号２８）を含む核酸配列によりコードされている。
【００２０】
切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのある特定の実施形態では、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＧＳＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２９）を含むアミノ酸配列、またはＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号３０）を含む核酸配列によりコードされている。
【００２１】
本開示のトランスポゾンは、例えば、本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎのうちの１つまたは複数と本開示の選択遺伝子との間に位置する、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよい。本開示のトランスポゾンは、例えば、本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎのうちの１つまたは複数と本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置する、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよい。本開示のトランスポゾンは、少なくとも２つの自己切断ペプチド、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流または直ぐ上流に位置する、第１の自己切断ペプチド、および例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流または直ぐ上流に位置する、第２の自己切断ペプチドを含んでもよい。
【００２２】
少なくとも１つの自己切断ペプチドは、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含んでもよい。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号３３）を含む核酸配列を含んでもよい。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００２３】
本開示のトランスポゾンは、第１および第２の自己切断ペプチドであって、例えば本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎのうちの１つまたは複数の上流に位置する、第１の自己切断ペプチド、および例えば本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎのうちの１つまたは複数の下流に位置する、第２の自己切断ペプチドを含んでもよい。第１および／または第２の自己切断ペプチドは、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含んでもよい。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号３３）を含む核酸配列を含んでもよい。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００２４】
本開示は、本開示のトランスポゾンを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドをさらに含むことがある。トランスポザーゼ酵素をコードする配列は、ｍＲＮＡ配列であってもよい。
【００２５】
本開示のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含んでもよい。本方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体をコードする配列が２つのシス調節性インスレーターエレメントによって挟まれている、プラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。本開示のトランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼまたは適合性酵素を含みうる。ある特定の実施形態では、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態では、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
【００２６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、下記のものと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率において同一のアミノ酸配列を含んでもよい、またはそれからなってもよい：
【化２】
2019524721.tif 000004
【００２７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、下記の配列の３０、１６５、２８２もしくは５３８位のうちの１つもしくは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である：
【化３】
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【００２８】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０、１６５、２８２もしくは５３８位のうちの２つもしくはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０、１６５、２８２もしくは５３８位のうちの３つもしくはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０、１６５、２８２および５３８位の各々にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の３０位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の１６５位におけるアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の２８２位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の５３８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である。
【００２９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素は、３０位におけるアミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換であり、１６５位におけるアミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換であり、２８２位におけるアミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換であり、５３８位におけるアミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である、配列番号１２の配列のアミノ酸配列を含んでもよい、またはそれからなってもよい。ある特定の実施形態では、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素は、下記のものと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率において同一のアミノ酸配列を含んでもよい、またはそれからなってもよい：
【化４】
2019524721.tif 000006
【００３０】
トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２または配列番号２の配列の３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０および５９１位のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８５、５０３、５５２および５７０位のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の８２位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１１９位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からイソロイシン（��）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８５位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８７位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２００位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２０７位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２０９位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２２６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２３５位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号１２の２４０位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２４１位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２４３位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２５８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ��からバリンへの置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１５位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１９位におけるアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３２７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３２８位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４２１位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４３６位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４５６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４７０位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４８５位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５５２位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５７０位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。
【００３１】
トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１２もしくは配列番号２の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０位のうちの１つもしくは複数にアミノ酸置換を含んでもよく、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、そのようなアミノ酸置換をさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１２または配列番号２の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０位のうちの２、３、４、５、６つもしくはそれより多くにアミノ酸置換を含んでもよく、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、そのようなアミノ酸置換をさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１２もしくは配列番号２の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０位にアミノ酸置換を含んでもよく、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、そのようなアミノ酸置換をさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１９４位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３７２位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３７５位におけるアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４５０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５０９位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５７０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位にメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含んでもよい。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が配列番号１２の１９４位にメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含んでもよい実施形態を含む、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２または配列番号２の配列の３７２、３７５および４５０位にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位にメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１２の３７２位にアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１２の３７５位にリシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位にメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１２の３７２位にアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、配列番号１２の３７５位にリシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１２の４５０位にアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を含んでもよい。
【００３２】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ベクターは、組換えベクターであってもよい。
【００３３】
本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスもしくはこれらの任意の組み合わせから単離された配列を含んでもよく、またはこれらのウイルスもしくはそれらの任意の組み合わせに由来する配列を含んでもよい。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離された配列を含んでもよく、またはＡＡＶに由来する配列を含んでもよい。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含んでもよい。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列の隣にシスで位置する２つまたはそれより多くの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、これらに限定されないが、すべての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、これらに限定されないが、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドとを含むＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ８）を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、これに限定されないが、ｒＡＡＶ−ＬＫ０３を含む。
【００３４】
本開示のウイルスベクターは、選択遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は、細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的細胞培養条件に負荷されたときの細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的細胞培養条件は、細胞生存度または生存に有害な化合物を含むこともあり、遺伝子産物は化合物に対する耐性を付与する。本開示の例示的な選択遺伝子としては、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）、またはこれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチドとを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドであって、非ヒト配列を含まない誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域であってもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」と称されることもある。ある特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドとを含む、誘導性カスパーゼポリペプチドであって、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが非ヒト配列を含まない、誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドであって、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが非ヒト配列を含まない、誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドであって、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが非ヒト配列を含まない、誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、該配列の３６位に修飾を含んでもよい。修飾は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２４）を含む核酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含んでもよいリガンド結合領域に特異的な誘導剤は、ＡＰ２０１８７および／またはＡＰ１９０３を含み、これらは両方とも合成薬物である。
【００３６】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、リンカー領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸またはＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列は、制限部位を含まない。
【００３７】
本開示の切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、その配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。あるいは、または加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、その配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２７）を含むアミノ酸、またはＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号２８）を含む核酸配列によりコードされている。
【００３８】
切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのある特定の実施形態では、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＧＳＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２９）を含むアミノ酸配列、またはＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号３０）を含む核酸配列によりコードされている。
【００３９】
本開示のウイルスベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよく、自己切断ペプチドは、ＣＡＲと選択遺伝子の間に位置する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよく、第１の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。本開示のウイルスベクターは、例えば、本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎのうちの１つまたは複数と本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置する、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよい。本開示のウイルスベクターは、少なくとも２つの自己切断ペプチド、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流または直ぐ上流に位置する、第１の自己切断ペプチド、および例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流または直ぐ上流に位置する、第２の自己切断ペプチドを含んでもよい。自己切断ペプチドは、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含んでもよい。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号３３）を含む核酸配列を含んでもよい。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００４０】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子である。本開示の例示的なナノ粒子ベクターは、これらに限定されないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、もしくはこれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、もしくはこれらの任意の組み合わせ）、ポリマー（例えば、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ））、ミセル、脂質（例えば、リポソーム）、有機分子（例えば、炭素原子、シート、繊維、チューブ）、無機分子（例えば、リン酸カルシウムもしくは金）またはこれらの任意の組み合わせを含む。ナノ粒子ベクターは、細胞膜を横切って受動的に輸送されることもあり、または能動的に輸送されることもある。
【００４１】
本開示のナノ粒子ベクターは、選択遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は、細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的細胞培養条件に負荷されたときの細胞生存度および生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的細胞培養条件は、細胞生存度または生存に有害な化合物を含んでもよく、遺伝子産物は化合物に対する耐性を付与する。本開示の例示的な選択遺伝子は、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【００４２】
本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチドとを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドであって、非ヒト配列を含まない誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域であってもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」と称されることもある。ある特定の実施形態では、本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよく、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態では、本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよく、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態では、本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドとを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含んでもよく、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、該配列の３６位に修飾を含んでもよい。修飾は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２４）を含む核酸配列によりコードされている���ある特定の実施形態では、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含んでもよいリガンド結合領域に特異的な誘導剤は、ＡＰ２０１８７および／またはＡＰ１９０３を含み、これらは両方とも合成薬物である。
【００４３】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、リンカー領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸またはＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によりコードされている。ある特定の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列は、制限部位を含まない。
【００４４】
本開示の切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、その配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。あるいは、または加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、その配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチドまたは切断型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態では、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２７）を含むアミノ酸、またはＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号２８）を含む核酸配列によりコードされている。
【００４５】
切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのある特定の実施形態では、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＧＳＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２９）を含むアミノ酸配列、またはＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号３０）を含む核酸配列によりコードされている。
【００４６】
本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよく、自己切断ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子の間に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよく、第１の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよく、第１の自己切断ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子の間に位置し、第２の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよく、第１の自己切断ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子の間に位置し、第２の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの下流、例えば、ＣＡＲと選択遺伝子の間に位置する。本開示のナノ粒子ベクターは、例えば、本開示のタンパク質足場、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎのうちの１つまたは複数と本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置する、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含んでもよい。本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも２つの自己切断ペプチド、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流または直ぐ上流に位置する、第１の自己切断ペプチド、および例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流または直ぐ上流に位置する、第２の自己切断ペプチドを含んでもよい。自己切断ペプチドは、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含んでもよい。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３２）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号３３）を含む核酸配列を含んでもよい。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列を含んでもよく、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００４７】
本開示は、本開示のベクターを含む組成物を提供する。
【００４８】
本開示は、本開示のＣＡＲを含む細胞を提供する。本開示は、本開示のトランスポゾンを含む細胞を提供する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲ、トランスポゾンまたはベクターを含む細胞は、細胞表面にＣＡＲを発現することができる。細胞は、いずれの型の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、免疫細胞である。免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞）、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞または臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞であってもよい。好ましくは、免疫細胞は、Ｔ細胞である。細胞は、本開示の修飾免疫細胞またはＴ細胞を刺激および増殖するために任意選択で使用されうる人工抗原提示細胞であってもよい。細胞は、人工または修飾抗原提示細胞として任意選択で使用されうる腫瘍細胞であってもよい。
【００４９】
養子療法に使用されうる本開示の修飾細胞は、自己のものまたは同種異系のものであってもよい。
【００５０】
本開示は、細胞の表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる方法であって、（ａ）細胞集団を得るステップ、（ｂ）細胞集団を、本開示のＣＡＲを含む組成物またはＣＡＲをコードする配列を含む組成物に、細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲを移入させるのに十分な条件下で接触させることによって、修飾された細胞集団を生成するステップ；（ｃ）修飾された細胞集団を、トランスポゾンの組込みに好適な条件下で、培養するステップ、および（ｄ）細胞表面にＣＡＲを発現する修飾細胞集団の少なくとも１つの細胞を増殖および／または選択するステップを含む方法を提供する。
【００５１】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、細胞集団は、白血球ならびに／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋白血球を含んでもよい。細胞集団は、ＣＤ４＋白血球とＣＤ８＋白血球を、最適化された比で含んでもよい。ＣＤ４＋白血球  対  ＣＤ８＋白血球の最適化された比は、ｉｎ  ｖｉｖｏには天然に存在しない。細胞集団は、腫瘍細胞を含んでもよい。
【００５２】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンまたはベクターは、ＣＡＲまたはＣＡＲをコードする配列を含む。
【００５３】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲをコードする配列を移行させるのに十分な条件はヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）を含む。
【００５４】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲをコードする配列を移行させるのに十分な条件は、指定電圧での１回または複数回の電気パルスの印加、緩衝液、および１つまたは複数のさらなる因子のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加因子は、（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせ、（ｂ）塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせ、（ｃ）細胞培地、（ｄ）細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路またはこれらの組み合わせの阻害剤、および（ｅ）１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬を含んでもよい。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌまたはこれらの任意の組み合わせを含みうる。塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせは、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。細胞培地は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−���ＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路またはこれらの組み合わせの阻害剤は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫまたはこれらの任意の組み合わせを含む。１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬は、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００５５】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲまたはＣＡＲをコードする配列の組込みに好適な条件は、緩衝液および１つまたは複数のさらなる因子のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンまたはベクターは、本開示のＣＡＲまたはＣＡＲをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加因子は、（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせ、（ｂ）塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせ、（ｃ）細胞培地、（ｄ）細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路またはこれらの組み合わせの阻害剤、および（ｅ）１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬を含んでもよい。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはこれらの任意の組み合わせは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌまたはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせは、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール（Ｍａｎｉｔｏｌ）、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。細胞培地は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つもしくは複数のアポトーシス経路またはこれらの組み合わせの阻害剤は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫまたはこれらの任意の組み合わせを含む。１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬は、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００５６】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、増殖および選択ステップは、逐次的に行われる。増殖を選択の前に行ってもよい。増殖を選択の後に行ってもよく、任意選択で、さらなる（すなわち、第２の）選択を増殖後に行ってもよい。
【００５７】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、増殖および選択ステップを同時に行ってもよい。
【００５８】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、増殖は、修飾細胞集団の少なくとも１つの細胞を抗原と接触させてその少なくとも１つの細胞をＣＡＲにより刺激することによって、増殖された細胞集団を生成することを含みうる。抗原を支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の表面に提示させてもよい。支持体は、これらに限定されないが、表面、ウェル、１個もしくは複数のビーズ、およびマトリクスを含む、いずれの形態を有してもよい。支持体は、常磁性または磁性成分をさらに含んでもよい。ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、磁性ビーズである支持体の表面に抗原を提示させることもあり、その場合、磁石を使用して、磁性ビーズを、修飾および増殖された細胞集団から除去または分離することができる。抗原を細胞または人工抗原提示細胞の表面に提示させてもよい。本開示の人工抗原提示細胞は、腫瘍細胞および幹細胞を含むことができるが、これらに限定されない。
【００５９】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンまたはベクターは、選択遺伝子を含み、この場合の選択ステップは、修飾細胞集団の少なくとも１つの細胞を化合物（選択遺伝子は、この化合物に対する耐性を付与するものである）と接触させることによって、選択遺伝子を発現する細胞を、選択を生き抜くものとして同定し、選択遺伝子を発現することができない細胞を、選択ステップを生き抜くことができないものとして同定することを含む。
【００６０】
ＣＡＲを発現させるこの方法のある特定の実施形態では、増殖および／または選択ステップは、１０〜１４日（端点を含む）の期間、実施してもよい。
【００６１】
本開示は、本開示の方法の、修飾、増殖および選択された細胞集団を含む組成物を提供する。
【００６２】
本開示は、それを必要とする被験体におけるがんを処置する方法を提供し、この方法は、被験体に本開示の組成物を投与するステップを含み、ここでＣＡＲは腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、悪性腫瘍細胞であり得る。本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を被験体に投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、自己のものであってもよい。被験体に、本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、同種異系のものであってもよい。
【００６３】
本開示は、それを必要とする被験体の自己免疫状態を処置する方法であって、被験体に本開示の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが被験体の自己免疫細胞上の抗原に特異的に結合する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、自己免疫細胞は被験体の標的細胞上の自己抗原に特異的に結合するリンパ球であってもよい。ある特定の実施形態では、自己免疫細胞はＢリンパ球（すなわち、Ｂ細胞）であってもよい。ある特定の実施形態では、自己免疫細胞はＴリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）であってもよい。被験体に本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は自己のものであってもよい。被験体に本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は同種異系のものであってもよい。
【００６４】
本開示は、それを必要とする被験体における感染を処置する方法であって、被験体に本開示の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが、感染因子を含む細胞、感染因子に伝染した（ｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）細胞、または感染因子に曝露された細胞上の抗原に特異的に結合する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、感染因子に伝染した細胞は、感染因子に空気伝染（例えば、感染因子が空気に媒介されるまたは吸入される）または流体伝染（例えば、感染因子が水または生体液（biological fluid）で運搬される）し得る。宿主細胞の感染を引き起こす感染因子は、細菌、ウイルス、酵母または微生物でありうる。感染因子は、細胞または細胞の宿主生物（被験体）において、これらに限定されないが、ウイルス感染、免疫不全状態、炎症状態および増殖性障害を含む、例示的な状態を誘導しうる。ある特定の実施形態では、感染は、結核、小頭症、神経変性またはマラリアを引き起こす。ある特定の実施形態では、感染は、被験体の胎児で小頭症を引き起こす。感染が被験体の胎児で小頭症を引き起こすものを含む、ある特定の実施形態では、感染因子はウイルスであり、ウイルスはジカウイルスである。ある特定の実施形態では、免疫不全状態は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。ある特定の実施形態では、増殖性障害はがんである。ある特定の実施形態では、がんは子宮頸がんであり、感染因子はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。被験体に本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は自己のものであってもよい。被験体に本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は同種異系のものであってもよい。
【００６５】
本開示は、それを必要とする被験体における肥満細胞疾患を処置する方法であって、被験体に本開示の組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが肥満細胞上の抗原に特異的に結合する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは被験体の肥満細胞上の抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、肥満細胞疾患は、これらに限定されないが、肥満細胞の過剰な増殖と関連する障害、異常な活性を有する肥満細胞と関連する障害、および異常な数の肥満細胞と異常な肥満細胞活性の両方と関連する障害を含みうる。肥満細胞の過剰な増殖と関連する例示的な障害は、これらに限定されないが、肥満細胞症、皮膚肥満細胞症（例えば、色素性蕁麻疹（urticaria pigmentosa）または斑丘疹皮膚肥満細胞症（maculopapular cutaneousmastocytosis））、全身性肥満細胞症（肥満細胞性白血病を含む）、および局所的肥満細胞増殖を含む。異常な活性を有する肥満細胞と関連する例示的な障害は、これらに限定されないが、肥満細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）または肥満細胞活性化障害（ＭＣＡＤ）、アレルギー疾患（アナフィラキシーを含む）、喘息、炎症性疾患（例えば、関節組織の自己免疫関連炎症、関節炎などを含む）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。被験体に本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は自己のものであってもよい。被験体に本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を投与するステップを含む、ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は同種異系のものであってもよい。本開示は、それを必要とする被験体における変性疾患を処置する方法であって、被験体に本開示の組成物を被験体に投与するステップを含み、ＣＡＲが有害な細胞または老化細胞上の抗原に特異的に結合する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは被験体の有害な細胞または老化細胞上の抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、変性疾患としては、これらに限定されないが、神経変性障害、代謝障害、血管障害および老化を含みうる。例示的な神経変性障害は、これらに限定されないが、ニューロン、グリア細胞またはミクログリアの１つまたは複数の機能または有効性の喪失と関連する障害を含む。例示的な神経変性障害は、これらに限定されないが、ニューロン、グリア細胞またはミクログリアの１つまたは複数の機能に干渉するかまたはその有効性を減少させるシグナル伝達分子、タンパク質またはプリオンの１つまたは複数の蓄積と関連する障害を含む。例示的な代謝障害は、これらに限定されないが、ミトコンドリア障害、電子伝達系の妨害、ＡＴＰの細胞生産の妨害、ニューロン、グリア細胞またはミクログリアのうちの１つまたは複数における、１つまたは複数のミトコンドリアの機能の喪失またはその有効性の減少と関連する障害を含む。例示的な代謝障害は、これらに限定されないが、循環血流の喪失またはニューロン、グリア細胞もしくはミクログリアへの血流の減少（例えば脳卒中）；ニューロン、グリア細胞またはミクログリアの一過的または永続的な低酸素状態（例えば、細胞におけるフリーラジカルの放出に十分な）；睡眠状態中にニューロン、グリア細胞またはミクログリアの老��物の除去の有効性を減少させるのに十分な、被験体の睡眠状態中の循環ＣＮＳの喪失またはニューロン、グリア細胞もしくはミクログリアへのＣＮＳ流の減少と関連する障害を含む。例示的な老化障害は、これらに限定されないが、ニューロン、グリア細胞またはミクログリアの１つまたは複数の染色体の短縮の増加または短縮テロメア；ニューロン、グリア細胞またはミクログリアのテロメラーゼの機能の喪失またはその有効性の減少；またはニューロン、グリア細胞またはミクログリアのＤＮＡ修復メカニズムの機能の喪失またはその有効性の減少と関連する障害を含む。ある特定の実施形態では、有害な細胞または老化細胞は、有害な細胞または老化細胞を含むネットワークの別の細胞の機能に干渉するかまたはその有効性を減少させ、有害な細胞または老化細胞の標的化された除去が、ネットワークの機能を改善または回復し、有効性を増加させる。ある特定の実施形態では、有害な細胞または老化細胞は、第二の細胞の機能または有効性を転換することができ、有害な細胞または老化細胞の標的化された除去は第二の細胞の形質転換を妨げる。ある特定の実施形態では、変性疾患は神経変性障害であり、有害な細胞または老化細胞は幹細胞、免疫細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである。ある特定の実施形態では、変性疾患は代謝障害であり、有害な細胞または老化細胞は幹細胞、体細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである。ある特定の実施形態では、変性疾患は血管障害であり、有害な細胞または老化細胞は幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである。ある特定の実施形態では、変性疾患は老化であり、有害な細胞または老化細胞は卵母細胞、精子、幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである。本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を被験体に投与するステップを含むある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は自己のものであってもよい。本開示の修飾細胞または細胞集団を含む組成物を被験体に投与するステップを含むある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は同種異系のものであってもよい。
【００６６】
本開示は、それを必要とする被験体における細胞療法を改変する方法であって、被験体に、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む組成物のトランスポゾンまたはベクターを含む細胞を含む組成物を投与するステップを含み、細胞と誘導剤を接触させることにより細胞においてアポトーシスを選択的に誘導することができる、方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、自己のものである。ある特定の実施形態では、細胞は、同種異系のものである。この方法のある特定の実施形態では、細胞療法は、養子細胞療法である。この方法のある特定の実施形態では、細胞療法の改変は、細胞療法の終了を含む。この方法のある特定の実施形態では、細胞療法の改変は、細胞療法に提供される細胞の一部分の枯渇を含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞療法の改変を阻害するために誘導剤の阻害剤を投与するステップをさらに含み、それによって細胞療法の機能および／または有効性を回復させる。
【００６７】
本開示の細胞療法を改変する方法を使用して、例えば、回復の徴候、または疾患の重症度／進行を減少させる徴候、疾患寛解／停止の徴候、および／または有害事象の発生に応じて、療法を終了させるまたは減弱することができる。疾患の徴候もしくは症状が再出現する、もしくは重症度において増加する、かつ／または有害事象が解消されれば、誘導剤を阻害することにより本開示の細胞療法を再開することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＣＡＲＴｙｒｉｎを含むトランスポゾンを含む７６７６塩基対の本開示のｐｉｇｇｙＢａｃ  ＣＡＲＴｙｒｉｎ構築物（ＣＤ８ａシグナルペプチド、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ、ＣＤ８ａヒンジ配列、および膜貫通配列、ならびにＣＤ３ｚ共刺激ドメインを含む）を示す模式図である。
【００６９】
【図２】図２は、本開示のＰ−ＢＣＭＡ−１０１構築物のアミノ酸配列の模式図である。
【００７０】
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは、本開示のＰ−ＢＣＭＡ−１０１構築物の核酸配列の模式図である。
【図３Ｂ】同上。
【００７１】
【図４】図４は、本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎの構築を示す模式図ならびにＣｅｎｔｙｒｉｎおよび抗体の特徴を対比する表である。
【００７２】
【図５Ａ】図５Ａは、５μｇのＣＡＲＴｙｒｉｎ  ｍＲＮＡによるエレクトロポレーション後のＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を示す、一連の細胞ソーティングプロットである。
【００７３】
【図５Ｂ】図５Ｂの左のパネルは、対照のＫ５６２細胞株およびＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞株によるチャレンジ後のＣＡＲＴｙｒｉｎ機能を示す一連の細胞ソーティングプロットであり、右のパネルは、左のパネルのプロットの定量を示すグラフである（ＢＣＭＡ発現株Ｕ２６６によるチャレンジのデータを加えた）。
【００７４】
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｔ細胞のエレクトロポレーション中に使用したｍＲＮＡの量の関数としてＣＡＲＴｙｒｉｎ活性を示すグラフである。
【００７５】
【図６】図６は、マウスのＡ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍チャレンジ研究のタイムラインを示す模式図である。
【００７６】
【図７】図７は、Ａ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎ処置マウスの完全な（１００％）生存を示す対のグラフである。腫瘍量は、Ｍ−タンパク質の存在によって評価された。保護された動物ではＭ−タンパク質は検出不能だった。
【００７７】
【図８】図８は、本開示の例示的な誘導性切断型カスパーゼ９ポリペプチドを示す模式図である。
【００７８】
【図９】図９は、ヌクレオフェクション後１２日目の、単独での治療剤（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）を発現するように修飾された細胞、または本開示の誘導性カスパーゼポリペプチド（ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼにより細胞に導入されたｉＣ９構築物（「安全スイッチ」としても公知）によりコードされている）と併せてＣＡＲＴｙｒｉｎを発現するように修飾された細胞における、生細胞のエリア（ゲートされた右下象限）からアポトーシス細胞により占有されたエリア（左上象限）に移動する細胞の存在量を、誘導剤（ＡＰ１９０３）の漸増投薬量の関数として示す、一連のフローサイトメトリープロットである。
【００７９】
【図１０】図１０は、ヌクレオフェクション後１９日目の、単独で治療剤（ＣＡＲＴｙｒｉｎ）を発現するように修飾された細胞、または本開示の誘導性カスパーゼポリペプチド（ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼにより細胞に導入されたｉＣ９構築物（「安全スイッチ」としても公知）によりコードされている）と併せてＣＡＲＴｙｒｉｎを発現するように修飾された細胞における、生細胞のエリア（ゲートされた右下象限）からアポトーシス細胞により占有されたエリア（左上象限）に移動する細胞の存在量を、誘導剤（ＡＰ１９０３）の漸増投薬量の関数として示す、一連のフローサイトメトリープロットである。
【００８０】
【図１１】図１１は、図９（左のグラフ）または図１０（右のグラフ）のいずれかに示されている凝集結果の定量を示す１対のグラフである。具体的には、これらのグラフは、１２日目（図９および左のグラフ）または１９日目（図１０および右のグラフ）のいずれかにおける細胞生存パーセントに対するｉＣ９安全スイッチの影響を、各々の修飾された細胞型についてｉＣ９スイッチの誘導剤（ＡＰ１９０３）の濃度の関数として示す。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
本開示は、少なくとも１つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含むキメラ抗原受容体を提供する。本開示のキメラ抗原受容体は、１つより多くのＣｅｎｔｙｒｉｎを含んでもよい。例えば、二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的に結合する２つのＣｅｎｔｙｒｉｎを含みうる。
【００８２】
本開示のＣｅｎｔｙｒｉｎは抗原に特異的に結合する。抗原に特異的に結合する１つまたは複数のＣｅｎｔｙｒｉｎを含む本開示のキメラ抗原受容体を使用して、細胞（例えば、細胞傷害性免疫細胞）の特異性を特異的抗原へ指向させることができる。
【００８３】
本開示のＣｅｎｔｙｒｉｎは、ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）を含むコンセンサス配列を含んでもよい。
【００８４】
本開示のキメラ抗原受容体は、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲのシグナルペプチドを含んでもよい。本開示のヒンジ／スペーサードメインは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４のヒンジ／スペーサー／ストーク（stalk）を含んでもよい。本開示の細胞内ドメインまたはエンドドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むことがあり、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含んでもよい。例示的な膜貫通ドメインは、これらに限定されないが、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインを含む。
【００８５】
本開示は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞（Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血からのＴ細胞を含む）、臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞などの、遺伝子修飾細胞であって、これらの細胞に本開示のＣＡＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎを導入することにより１つまたは複数の抗原に対して特異的であるようにされた、遺伝子修飾細胞を提供する。本開示の細胞は、本開示のＣＡＲまたはＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするトランスポゾン、および本開示のトランスポザーゼをコードする配列（好ましくは、本開示のトランスポザーゼをコードする配列はｍＲＮＡ配列である）を含むプラスミドの電気移入（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）により、修飾することができる。
【００８６】
組換え／修飾細胞のエピソームに維持されているまたはゲノムに組み込まれている、本開示のトランスポゾン。トランスポゾンは、非ウイルス遺伝子移入増進のためにトランスポゾンおよびトランスポザーゼを利用する２成分ｐｉｇｇｙＢａｃシステムの一部であってもよい。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンはキメラ抗原受容体をコードする配列が２つのシス調節性インスレーターエレメントによって挟まれている、プラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼはｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。
【００８７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、抗原受容体をコードする配列が２つのシス調節性インスレーターエレメントに挟まれている、プラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態では、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
【００８８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、下記のものと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率において同一のアミノ酸配列を含んでもよい、またはそれからなってもよい：
【化５】
2019524721.tif 000007
【００８９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、下記の配列の３０、１６５、２８２もしくは５３８位のうちの１つもしくは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である：
【化６】
2019524721.tif 000008
【００９０】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０、１６５、２８２もしくは５３８位のうちの２つもしくはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の３０、１６５、２８２もしくは５３８位のうちの３つもしくはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の配列の以下の３０、１６５、２８２および５３８位の各々にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の３０位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の１６５位におけるアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の２８２位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２の配列の５３８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である。
【００９１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素は、３０位におけるアミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換であり、１６５位におけるアミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換であり、２８２位におけるアミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換であり、５３８位におけるアミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である、配列番号１２の配列のアミノ酸配列を含んでもよい、またはそれからなってもよい。ある特定の実施形態では、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポザーゼ酵素は、下記のものと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率において同一のアミノ酸配列を含んでもよい、またはそれからなってもよい：
【化７】
2019524721.tif 000009
【００９２】
トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２または配列番号２の配列の３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０および５９１位の１つまたは複数にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８５、５０３、５５２および５７０位の１つまたは複数にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の８２位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１１９位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からイソロイシン（Ｉ）への置換��ある。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８５位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１８７位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２００位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２０７位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２０９位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２２６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２３５位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号１２の２４０位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２４１位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２４３位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２５８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からバリン��の置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１５位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３１９位におけるアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３２７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３２８位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４２１位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４３６位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４５６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４７０位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４８５位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５５２位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５７０位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。
【００９３】
トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１２または配列番号２の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０位の１つもしくは複数にアミノ酸置換を含んでもよく、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、そのようなアミノ酸置換をさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１２または配列番号２の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０位の２、３、４、５、６つもしくはそれより多くにアミノ酸置換を含んでもよく、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、そのようなアミノ酸置換をさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０、１６５、２８２および／または５３８位に上記の変異を含む実施形態を含む、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が配列番号１２または配列番号２の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０位にアミノ酸置換を含んでもよく、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が、そのようなアミノ酸置換をさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の１９４位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３７２位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の３７５位におけるアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の４５０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５０９位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態では、配列番号１２または配列番号２の５７０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含んでもよい。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含んでもよい実施形態を含む、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２または配列番号２の配列の３７２、３７５および４５０位にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１２の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１２の３７５位におけるリシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１２の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１２の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、配列番号１２の３７５位におけるリシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１２の４５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を含んでもよい。
【００９４】
足場タンパク質
本開示のタンパク質足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質、コード核酸または相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、組み合わせ、製剤、デバイス、ならびにそれらの作製および使用方法に由来し得る。好ましい実施形態では、タンパク質足場は、ヒトテネイシン−Ｃ（本明細書では以降「テネイシン」）からの複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からなる。さらなる好ましい実施形態では、本発明のタンパク質足場は、１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列である。本開示のタンパク質足場は、様々な分子、例えば、細胞の標的タンパク質に結合するように設計することができる。好ましい実施形態では、本開示のタンパク質足場は、野生型および／もしくは改変体形態の抗原に結合するように設計することができる。
【００９５】
本開示のタンパク質足場は、さらなる分子または部分、例えば、抗体のＦｃ領域、アルブミン結合ドメイン、または半減期に影響を及ぼすその他の部分を含んでもよい。さらなる実施形態では、本開示のタンパク質足場は、該タンパク質足場をコードしうる核酸分子に結合することができる。
【００９６】
本開示は、複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づく少なくとも１つのタンパク質足場を宿主細胞において発現させるための少なくとも１つの方法であって、少なくとも１つのタンパク質足場が検出可能なおよび／または回収可能な量で発現される条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
【００９７】
本開示は、（ａ）本明細書に記載の複数のＦＮ３ドメインおよび／またはコード核酸のコンセンサス配列に基づくタンパク質足場と、（ｂ）好適なおよび／または薬学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含む、少なくとも１つの組成物を提供する。
【００９８】
本開示は、タンパク質足場のライブラリーを生成する方法であって、タンパク質足場が、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質、好ましくは、複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列、より好ましくは、ヒトテネイシンからの複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくものである、方法を提供する。ライブラリーは、足場の一部分、例えばループ領域の中の、特定の位置における分子中のアミノ酸またはアミノ酸数を（変異により）変化させることにより足場の逐次的生成を行うことによって、形成される。ライブラリーは、単一ループのアミノ酸組成を変化させることにより、または複数のループをもしくは足場分子のさらなる位置を同時に変化させることにより、生成することができる。変化させるループを、状況に応じて延長または短縮することができる。各位置の可能性のあるすべてのアミノ酸を含むように、またはアミノ酸の設計されたサブセットを含むように、そのようなライブラリーを生成することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはＣＩＳディスプレイ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームディスプレイなど）、酵母、細菌およびファージディスプレイなどの、ディスプレイによるスクリーニングに、ライブラリーメンバーを使用することができる。
【００９９】
本開示のタンパク質足場は、還元条件下での安定性、および高濃度での溶解度などの、生物物理的特性の向上を提供し、それらは、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの原核細胞系において、酵母などの真核細胞系において、およびウサギ網状赤血球ライセート系などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、発現され、フォールディングされうる。
【０１００】
本開示は、本発明の足場ライブラリーを標的に対してパニングし、結合物質を検出することにより、特定の標的に結合する足場分子を生成する方法を提供する。他の関連態様では、本開示は、所望の活性を有する、例えば、ある特定のアフィニティーで標的タンパク質に結合することができる、タンパク質足場を生成またはアフィニティー成熟させるために使用することができる、スクリーニング方法を含む。アフィニティー成熟は、ファージディスプレイまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイなどのシステムを使用する変異誘発と選択の反復ラウンドにより遂行することができる。このプロセスでの変異誘発は、特定の足場残基に対する部位特異的変異誘発、エラープローンＰＣＲに起因するランダム変異誘発、ＤＮＡシャフリングおよび／またはこれらの技術の組み合わせの結果であることもある。
【０１０１】
本開示は、限定ではないが哺乳動物由来の足場を含む、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質のコンセンサス配列に基づく単離された、組換えおよび／または合成タンパク質足場、ならびにコンセンサスＦＮ３配列に基づくタンパク質足場をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物およびコード核酸分子を提供する。本開示は、診断および治療組成物、方法およびデバイスを含む、そのような核酸およびタンパク質足場の作製および使用方法を、これらに限定されないが、さらに含む。
【０１０２】
本開示のタンパク質足場は、局所投与、経口投与、または血液脳関門を通過することができること、哺乳動物細胞発現に対して資源に応じてタンパク質の発現増加が可能であるＥ．Ｃｏｌｉにおいて発現させることができること、複数の標的にまたは同じ標的の複数のエピトープに結合する二重特異性またはタンデム分子に操作されることができること、薬物、ポリマーおよびプローブとコンジュゲートさせることができること、高濃度に製剤化することができること、ならびにそのような分子が罹病組織および腫瘍に有効に浸透することができることなどの、従来の治療薬を超える利点をもたらす。
【０１０３】
さらに、タンパク質足場は、抗体の可変領域を模倣する、それらのフォールディング構造（ｆｏｌｄ）に関する抗体の多くの特性を有する。この配向によってＦＮ３ループを抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）に同様に曝露することができる。タンパク質足場は、細胞標的に結合することができるはずであり、ある特定の結合または関連特性を改善するようにループを変化させること、例えば、アフィニティー成熟させることができる。
【０１０４】
本開示のタンパク質足場の６つのループのうちの３つは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）、すなわち抗原結合領域に、位相幾何学的に対応するが、残りの３つのループは、抗体ＣＤＲと同様に表面に露出されている。これらのループは、配列番号１３の残基１３〜１６、２２〜２８、３８〜４３、５１〜５４、６０〜６４、および７５〜８１に、またはその辺りにわたる。好ましくは、残基２２〜２８、５１〜５４、および７５〜８１のまたはその辺りのループ領域は、結合特異性およびアフィニティーのために変えられる。これらのループ領域の１つまたは複数を他のループ領域でおよび／またはそれらの配列を骨格部分として維持する他のストランドでランダム化してライブラリーに追加し、特定のタンパク質標的に対して高いアフィニティーを有するライブラリーから強力な結合物質を選択することができる。ループ領域の１つまたは複数は、タンパク質との抗体ＣＤＲ相互作用と同様に標的タンパク質と相互作用することができる。
【０１０５】
本開示の足場は、抗体模倣物を含んでもよい。
【０１０６】
用語「抗体模倣物」は、標的配列に特異的に結合し、天然に存在する抗体とは異なる構造を有する、有機化合物を記述することを意図したものである。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、または小分子を含みうる。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原でありうる。抗体模倣物は、これらに限定されないが、優れた溶解度、組織浸透、熱および酵素に対する安定性（例えば、酵素的分解に対する耐性）、ならびにより低い生産コストを含む、抗体を超える優れた特性を提供することができる。例示的な抗体模倣物は、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アフィリン（ａｆｆｌｉｌｉｎ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、およびアビマー（ａｖｉｍｅｒ）（アビディティー多量体（ａｖｉｄｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ）としても公知）、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド（Ｋｕｎｉｔｚ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、およびモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
本開示のアフィボディ分子は、ジスルフィド架橋が一切ない１つもしくは複数のアルファヘリックスを含む、またはそれからなるタンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファヘリックスを含む、またはそれらからなる。例えば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含んでもよい。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含んでもよい。
【０１０８】
本開示のアフィリン分子は、例えばガンマ−Ｂクリスタリンまたはユビキチンのいずれかの、露出したアミノ酸の修飾により産生されたタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原への抗体のアフィニティーを機能的に模倣するが、構造的には抗体を模倣しない。アフィリンを作製するために使用されるいずれのタンパク質足場においても、正しくフォールディングされたタンパク質分子中の溶媒または可能性のある結合パートナーに接近しやすいアミノ酸は、露出したアミノ酸と見なされる。これらの露出したアミノ酸のいずれか１つまたは複数を、標的配列または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。
【０１０９】
本開示のアフィマー分子は、特異的標的配列に対する高アフィニティー結合部位を提供するペプチドループを提示するように操作された高安定性タンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、逆平行ベータシートの頂部に位置するアルファヘリックスを含む共通三次構造を共有しうる。
【０１１０】
本開示のアフィチン分子は、その構造が、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来しうる、人工タンパク質足場を含む。本開示のアフィチンは、標的配列に選択的に結合し、標的配列は、抗原全体であってもよく、またはその一部であってもよい。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合タンパク質の結合表面の１つまたは複数のアミノ酸配列をランダム化し、結果として得られたタンパク質をリボソームディスプレイおよび選択に付すことによって、製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ゲノム内で、またはペプチド、タンパク質、ウイルスもしくは細菌の表面で見いだすことができる。本開示のある特定の実施形態では、アフィチン分子を酵素の特異的阻害剤として使用することができる。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質またはその誘導体を含んでもよい。
【０１１１】
本開示のアルファボディ分子は、細胞浸透アルファボディ（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）（ＣＰＡＢ）と称されることもある。本開示のアルファボディ分子は、様々な標的配列（抗原を含む）に結合する小型タンパク質（典型的には１０ｋＤａ未満）を含む。アルファボディ分子は、細胞内標的配列に到達することができ、該配列に結合することができる。構造的には、本開示のアルファボディ分子は、一本鎖アルファヘリックス（天然に存在するコイルドコイル構造に類似している）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように修飾されている１つまたは複数のアミノ酸を含むタンパク質足場を含んでもよい。分子の結合特異性に関係なく、本開示のアルファボディ分子は、正しいフォールディングおよび熱安定性を維持する。
【０１１２】
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質または小分子のいずれかにおける標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含んでもよい。本開示のアンチカリン分子を、例えば、モノクローナル抗体またはそれらの断片の代わりに使用してもよい。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはそれらの断片より優れた組織浸透および熱安定性を示すことができる。本開示の例示的なアンチカリン分子は、おおよそ２０ｋＤａの質量を有する、約１８０のアミノ酸を含みうる。構造的には、本開示のアンチカリン分子は、ループによりペアごとに接続されている逆平行ベータストランドを含むバレル構造と結合しているアルファヘリックスとを含む。好ましい実施形態では、本開示のアンチカリン分子は、ループによりペアごとに接続されている８つの逆平行ベータストランドを含むバレル構造および結合しているアルファヘリックスを含む。
【０１１３】
本開示のアビマー分子は、標的配列（抗原であってもよい）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内のまたは異なる標的内の複数の結合部位を認識することができる。本開示のアビマーが、１つより多くの標的を認識する場合、アビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、各々がおおよそ３０〜３５アミノ酸の２つまたはそれより多くのペプチド配列を含んでもよい。これらのペプチドは、１つまたは複数のリンカーペプチドによって接続されていることもある。アビマーのペプチドの１つまたは複数についてのアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメインに由来することもある。アビマーは、ジスルフィド結合および／またはカルシウムを任意選択で含んでもよい、硬い構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較して高い熱安定性を示すことができる。
【０１１４】
本開示のＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、標的配列に対して高い特異性および高いアフィニティーを有する、遺伝子操作された、組換えまたはキメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質に由来し、任意選択で、アンキリンタンパク質の少なくとも３つのリピートモチーフ（反復構造ユニットとも称される）を含む。アンキリンタンパク質は、高アフィニティータンパク質間相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きい標的相互作用表面を含む。
【０１１５】
本開示のフィノマーは、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する小型結合タンパク質（約７ｋＤａ）であって、抗体と同等のアフィニティーおよび同等の特異性で標的配列および分子に結合するように操作された小型結合タンパク質を含む。
【０１１６】
本開示のクニッツドメインペプチドは、クニッツドメインを含むタンパク質足場を含む。クニッツドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的には、本開示のクニッツドメインは、ジスルフィドに富むアルファ＋ベータフォールディング構造を含む。この構造は、ウシ膵臓トリプシンインヒビターにより例示される。クニッツドメインペプチドは、特異的タンパク質構造を認識し、競合的プロテアーゼ阻害剤として役立つ。本開示のクニッツドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）に由来する）を含んでもよい。
【０１１７】
本開示のモノボディは、サイズが一本鎖抗体に匹敵する小型タンパク質（約９４個のアミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）である。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含む標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つまたは複数の別個のタンパク質または標的配列を特異的に標的とすることができる。好ましい実施形態では、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣する、およびより好ましくは、フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する、タンパク質足場を含む。フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメイン、およびそのモノボディ模倣物は、バレルを形成する７つのベータシートを含有し、かつそれぞれの側面に抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する３つの露出したループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディには、金属イオンのための結合部位が一切なく、中央のジスルフィド結合もない。ループＢＣおよびＦＧを修飾することにより、多重特異性モノボディを最適化することができる。本開示のモノボディは、アドネクチンを含んでもよい。
【０１１８】
そのような方法は、有効量の、少なくとも１つの足場タンパク質を含む組成物または医薬組成物を、症状、効果またはメカニズムのそのようなモジュレーション、処置、緩和、予防または低減を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に投与するステップを含むことができる。有効量は、本明細書に記載されるまたは関連技術分野において公知であるように、公知の方法を使用して行われ、決定されるような、単回（例えば、ボーラス）、複数回もしくは連続投与による約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの量、または単回、複数回もしくは連続投与により血清中濃度０．０１〜５０００μｇ／ｍｌという血清中濃度を達成するための量、またはこれらのうちの任意の有効な範囲もしくは値を含むことができる。
【０１１９】
足場タンパク質の産生および生成
本開示の少なくとも１つの足場タンパク質を、当技術分野において周知であるような、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または不死化細胞のクローン集団によって、任意選択で産生させることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７〜２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９４〜２００１年）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、（１９９７〜２００１年）を参照されたい。
【０１２０】
足場タンパク質からのアミノ酸を変化、付加および／または欠失させて、免疫原性を低下させることができ、または結合、アフィニティー、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、アビディティー、特異性、半減期、安定性、溶解度、もしくは当技術分野において公知の任意の他の好適な特性を低下、向上もしくは修飾することができる。
【０１２１】
任意選択で、抗原に対する高いアフィニティーおよび他の有利な生物学的特性を保持した足場タンパク質を操作し得る。この目標を達成するために、足場タンパク質を、任意選択で、親配列および操作された配列の三次元モデルを使用する親配列および様々な概念上操作された産物の分析プロセスにより、調製することができる。三次元モデルは市販されており、当業者に知られている。選択された候補配列のほぼ確実な三次元コンフォメーション構造を図示および表示するコンピュータプログラムであって、可能性のある免疫原性を測定することができるコンピュータプログラムが、利用可能である（例えば、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、Ｃａｌｉｆ．のＸｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム）。これらの表示の精査により、候補配列が機能する上での残基の可能性の高い役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補足場タンパク質の能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、残基を、標的抗原に対するアフィニティーなどの所望の特性が達成されるように親配列および参照配列から選択し、組み合わせることができる。あるいは、または上記手順に加えて、他の好適な操作方法を使用することができる。
【０１２２】
足場タンパク質のスクリーニング
類似のタンパク質または断片への特異的結合についてのタンパク質足場のスクリーニングは、ヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡディスプレイ）またはペプチドディスプレイライブラリー、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイを使用して、便利に達成することができる。この方法は、所望の機能または構造を有する個々のメンバーについてペプチドの大きなコレクションをスクリーニングすることを含む。提示されるヌクレオチドまたはペプチド配列は、長さが３〜５０００ヌクレオチドもしくはアミノ酸またはそれより長いこともあり、高頻度に５〜１００アミノ酸長でありえ、多くの場合、約８〜２５アミノ酸長でありうる。ペプチドライブラリーを生成するための直接化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が記載されている。１つのタイプは、バクテリオファージまたは細胞の表面でのペプチド配列の提示を含む。各バクテリオファージまたは細胞は、提示される特定のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。そのような方法は、ＰＣＴ特許公開第９１／１７２７１号、同第９１／１８９８０号、同第９１／１９８１８号および同第９３／０８２７８号に記載されている。
【０１２３】
ペプチドのライブラリーを生成するための他のシステムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学合成法と組換え法の両方の態様を有する。ＰＣＴ特許公開第９２／０５２５８号、同第９２／１４８４３号、および同第９６／１９２５６号を参照されたい。米国特許第５，６５８，７５４号および同第５，６４３，７６８号も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクター、およびスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）のような供給業者から市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，９３９，６６６号、同第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号、同第５，５１８，８８９号、同第５，５３４，６２１号、同第５，６５６，７３０号、同第５，７６３，７３３号、同第５，７６７，２６０号、同第５８５６４５６号；Ｄｙａｘに譲渡された同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，８３７，５００号；Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された同第５，８８５，７９３号；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された同第５，７５０，３７３号；Ｘｏｍａに譲渡された同第５，６１８，９２０号、同第５，５９５，８９８号、同第５，５７６，１９５号、同第５，６９８，４３５号、同第５，６９３，４９３号、同第５，６９８，４１７号；Ｃｏｌｌｉｇａｎ、上掲；Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上掲を参照されたい。
【０１２４】
本開示のタンパク質足場は、ヒトまたは他の哺乳動物タンパク質に広範なアフィニティー（ＫＤ）で結合することができる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのタンパク質足場は、表面プラズモン共鳴またはＫｉｎＥｘＡ法によって当業者により実施されるように決定して、高いアフィニティーで、例えば、これらに限定されないが０．１〜９．９（またはこれらの中の任意の範囲もしくは値）×１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、またはこれらの中の任意の範囲もしくは値などの、約１０−７Ｍであるかまたはそれ未満のＫＤで、標的タンパク質に任意選択で結合することができる。
【０１２５】
任意の好適な方法を使用して、抗原に対するタンパク質足場のアフィニティーまたはアビディティーを実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，  Ｗ．  Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８４年）；Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９２年）；および本明細書に記載の方法を参照されたい）。特定のタンパク質足場−抗原相互作用のアフィニティー測定値は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合、変わることがある。したがって、アフィニティーおよび他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、好ましくは、タンパク質足場および抗原の標準化溶液、および本明細書に記載の緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。
【０１２６】
競合アッセイを本開示のタンパク質足場に関して行って、どのようなタンパク質、抗体および他のアンタゴニストが標的タンパク質への結合について本発明のタンパク質足場と競合するのか、および／またはエピトープ領域を共有するのかを、決定することができる。これらのアッセイは、当業者には容易に公知であるように、タンパク質上の限られた数の結合部位についてアンタゴニストまたはリガンド間の競合を評価する。タンパク質および／または抗体を競合前または後に固定化または不溶化し、標的タンパク質に結合した試料を、例えば、デカント（タンパク質／抗体を事前に不溶化した場合）により、または遠心分離（タンパク質／抗体を競合反応後に沈殿させた場合）により、非結合試料から分離する。また、競合的結合は、機能が、タンパク質足場の標的タンパク質への結合により変化するのか、またはその結合の欠如により変化するのか、例えば、タンパク質足場分子が、例えば標識の、酵素活性を阻害するのか、または増強するのかによって、決定することができる。当技術分野において周知であるように、ＥＬＩＳＡおよび他の機能アッセイを使用してもよい。
【０１２７】
核酸分子
タンパク質足場をコードする本開示の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくは任意の他の形態などの、ＲＮＡの形態であってもよく、またはクローニングにより得られるかもしくは合成により産生されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡをこれらに限定されないが含む、ＤＮＡ形態であってもよく、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖もしくは一本鎖であってもよく、または任意のこれらの組み合わせであってもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分が、センス鎖としても公知のコード鎖であってもよく、またはアンチセンス鎖とも称される非コード鎖であってもよい。
【０１２８】
本開示の単離された核酸分子は、１つまたは複数のイントロンを任意選択で有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、これに限定されないが、少なくとも１つのタンパク質足場の少なくとも１つの指定部分を含む、核酸分子；標的タンパク質に結合するタンパク質足場またはループ領域についてのコード配列を含む核酸分子；および上記のものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、本明細書に記載されるようなおよび／または当技術分野において公知であるようなタンパク質足場を依然としてコードする核酸分子を含むことができる。もちろん、遺伝コードは、当技術分野において周知である。したがって、本発明の特異的タンパク質足場をコードするそのような縮重核酸改変体を生成することは、当業者には慣例的なことである。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上掲を参照のこと、そのような核酸改変体は、本発明に含まれる。
【０１２９】
本明細書で述べられるように、タンパク質足場をコードする核酸を含む本開示の核酸分子は、それ自体でタンパク質足場断片のアミノ酸配列をコードするもの；タンパク質足場全体またはその一部分についてのコード配列；タンパク質足場、断片または一部分についてのコード配列、ならびに転写、スプライシングを含むｍＲＮＡプロセシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定化）において役割を果たす転写された非翻訳配列などの、非コード５’および３’配列（しかし、これらに限定されない）を含むさらなる非コード配列とともに、少なくとも１つのイントロンなどの上述のさらなるコード配列を伴う、または伴わない、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列などのさらなる配列；さらなる機能性を提供するものなどの、さらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列をコードするものを含むことができるが、これらに限定されない。したがって、タンパク質足場をコードする配列を、タンパク質足場断片または部分を含む融合タンパク質足場の精製を助長するペプチドをコードする配列などの、マーカー配列と、融合させることができる。
【０１３０】
本明細書に記載のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本開示は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズする、単離された核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出および／または定量に使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託ライブラリー内の部分的または完全長クローンを同定すること、単離すること、または増幅させることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトまたは哺乳動物核酸ライブラリーからのｃＤＮＡから単離された、さもなければそれと相補的な、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列である。
【０１３１】
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％完全長配列、好ましくは少なくとも８５％または９０％完全長配列、およびより好ましくは少なくとも９５％完全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーを正規化して、稀な配列の表示を増加させることができる。低または中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、排他的にではないが、通常は、相補配列に対する配列同一性が低下した配列に関して用いられる。同一性がより高い配列には、任意選択で、中等度および高ストリンジェンシー条件を用いることができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガスまたはパラロガス配列を同定するために用いることができる。
【０１３２】
任意選択で、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質足場の少なくとも一部分をコードすることになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに用いることができる核酸配列を包含する。例えば、各々全体が参照により本明細書に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、上掲を参照されたい。
【０１３３】
核酸の構築
本開示の単離された核酸は、当技術分野において周知であるような、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、および／または（ｄ）これらの組み合わせを使用して作製することができる。
【０１３４】
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて便利に配列を含んでもよい。例えば、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を、ポリヌクレオチドの単離に役立つように核酸に挿入することができる。また、翻訳可能な配列を、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立つように挿入することができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。コード配列を含まない本開示の核酸は、任意選択で、本開示のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプターまたはリンカーである。
【０１３５】
さらなる配列を、そのようなクローニングおよび／または発現配列に、クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化するように、ポリヌクレオチドの単離に役立つように、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を改善するように付加させることができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は、当技術分野において周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上掲を参照されたい）。
【０１３６】
核酸を構築するための組換え法
本開示の単離された核酸組成物、例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはこれらの任意の組み合わせは、当業者に公知の任意の数のクローニング法を使用して生物学的供給源から得ることができる。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー内の所望の配列を同定するために使用される。ＲＮＡの単離、ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上掲を参照されたい）。
【０１３７】
核酸スクリーニングおよび単離方法
本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。プローブを使用してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、同じまたは異なる生物における相同遺伝子を単離することができる。様々な程度のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーをアッセイで用いることができること、およびハイブリダイゼーションまたは洗浄媒体がストリンジェントでありうることは、当業者には理解される。ハイブリダイゼーションの条件が、よりストリンジェントになると、二重鎖形成が起こるためのプローブと標的との間に、より大きな程度の相補性が存在するはずである。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、およびホルムアミドなどの部分的に変性させる溶媒の存在のうちの１つまたは複数により、制御することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば０％〜５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作によって、反応物溶液の極性を変化させることにより、便利に変えられる。検出可能な結合に求められる相補性（配列同一性）度は、ハイブリダイゼーション媒体および／または洗浄媒体のストリンジェンシーに従って変わることになる。相補性の程度は、最適には１００％、または７０〜１００％、またはこれらの中の任意の範囲もしくは値である。しかし、プローブおよびプライマーの小さい配列差異を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄媒体のストリンジェンシーを低下させることにより、補償することができることは理解されるべきである。
【０１３８】
ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅方法は当技術分野において周知であり、そのような方法を、本明細書で提示される教示およびガイダンスに基づいて、過度の実験なしに本開示に従って使用することができる。
【０１３９】
公知のＤＮＡまたはＲＮＡ増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連増幅プロセス（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号；Ｔａｂｏｒらの同第４，７９５，６９９号および同第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓの同第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎらの同第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓの同第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらの同第５，０６６，５８４号；Ｇｅｌｆａｎｄらの同第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒらの同第４，９９４，３７０号、Ｂｉｓｗａｓの同第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄの同第４，６５６，１３４号を参照されたい）、ならびに二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅（商標名ＮＡＳＢＡである、Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号）を含むが、これらに限定されず、前記参照文献の全内容が参照により本明細書に援用される。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上掲を参照されたい）。
【０１４０】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本開示のポリヌクレオチドおよび関連遺伝子の配列を直接ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから増幅することができる。ＰＣＲおよび他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法も、例えば、発現させるべきタンパク質をコードする核酸配列のクローニングに、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸の作製に、核酸シークエンシングに、または他の目的に有用でありうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法による当業者に指示するのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、上掲、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上掲、およびＡｕｓｕｂｅｌ、上掲、ならびにＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７年）、およびＩｎｎｉｓら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）において見いだされる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販のキットは、当技術分野において公知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、長いＰＣＲ産物の収量を改善することができる。
【０１４１】
核酸を構築するための合成方法
本開示の単離された核酸を、公知の方法による直接化学合成により調製することもできる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上掲を参照されたい）。化学合成は、一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生し、その一本鎖オリゴヌクレオチドを、相補配列とのハイブリダイゼーションにより、または鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いる重合により、二本鎖ＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡの化学合成を約１００塩基またはそれより多い塩基の配列に限定することができるが、より長い配列を、より短い配列のライゲーションにより得ることができることは、当業者には認識される。
【０１４２】
組換え発現カセット
本開示は、本開示の核酸を含む組換え発現カセットをさらに提供する。本開示の核酸配列、例えば、本開示のタンパク質足場をコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列を使用して、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、所期の宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を指示する転写開始調節配列に作動可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを通常は含むことになる。異種プロモーターと非異種（すなわち、内在性）プロモーターの両方を、本開示の核酸の発現を指示するために用いることができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、プロモーター、エンハンサーまたは他のエレメントとして役立つ単離された核酸を、非異種形態の本開示のポリヌクレオチドの適切な位置（イントロンの上流、下流またはイントロン内）に導入して、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方制御または下方制御することができる。例えば、内在性プロモーターを、変異、欠失および／または置換によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで変化させることができる。
【０１４４】
ベクターおよび宿主細胞
本開示は、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および当技術分野において周知であるような組換え技術による少なくとも１つのタンパク質足場の産生にも関する。例えば、各々全体が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲、Ａｕｓｕｂｅｌら、上掲を参照されたい。
【０１４５】
例えば、ＰＢ−ＥＦ１ａベクターを使用してもよい。このベクターは、次のヌクレオチド配列を含む：
【化８−１】
2019524721.tif 000010
【化８−２】
2019524721.tif 000011
【化８−３】
2019524721.tif 000012
【０１４６】
ポリヌクレオチドを、任意選択で、宿主内での増殖のための選択可能マーカーを含有するベクターに連結させることができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物の中に、または荷電脂質との複合体の中に導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用してそのウイルスをパッケージし、その後、宿主細胞に形質導入することができる。
【０１４７】
ＤＮＡインサートは、適切なプロモーターに動作可能に連結させるべきである。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、および転写領域内に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することになる。構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されることになるｍＲＮＡの始点に翻訳開始コドンおよび終点に適切に位置する終結コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含み、哺乳動物または真核細胞発現には、ＵＡＡおよびＵＡＧが好ましい。
【０１４８】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能マーカーを含むことが好ましいが、任意選択である。そのようなマーカーは、例えば、これらに限定されないが、アンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ  ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ミコフェノール酸、またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）、ブラストサイジン（ｂｓｄ遺伝子）、真核細胞培養のための耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌もしくは原核生物における培養のためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ  ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢまたはテトラサイクリン耐性遺伝子を含む（上記特許は、全体が参照により本明細書に援用される）。上記宿主細胞についての適切な培養培地および条件は、当技術分野において公知である。好適なベクターは、当業者には容易にわかる。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の公知の方法により果すことができる。そのような方法は、当技術分野において、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上掲、１〜４および１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲、１、９、１３、１５、１６章に記載されている。
【０１４９】
発現ベクターは、本開示の組成物および方法により修飾された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含むことが好ましいが、任意選択である。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞もしくは細胞のサブセットを細胞の規定された別のサブセットと区別する、表面タンパク質、糖タンパク質、またはタンパク質の群を含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物または方法により修飾された細胞を、本開示の組成物または方法により修飾されていない細胞と区別する。そのような細胞表面マーカーは、例えば、これらに限定されないが、「表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）」または「分類決定基（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」タンパク質（「ＣＤ」と略記されることが多い）、例えば、切断型または完全長形態のＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、またはこれらの任意の組み合わせを含む。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｂら、Ｂｌｏｏｄ．  ２０１４年８月２１日、１２４巻（８号）１２７７〜８７頁）をさらに含む。
【０１５０】
発現ベクターは、本開示の組成物および方法により修飾された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な薬物耐性マーカーを含むことが好ましいが、任意選択である。本開示の選択可能な薬物耐性マーカーは、野生型または変異体Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２またはこれらの任意の組み合わせを含むことがある。
【０１５１】
本開示の少なくとも１つのタンパク質足場を、融合タンパク質などの修飾形態で発現させることができ、タンパク質足場は、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域をも含むことができる。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に、荷電アミノ酸の領域を、タンパク質足場のＮ末端に付加させて、精製中またはその後の取り扱いおよび保管中の宿主細胞における安定性および存続を改善することができる。また、ペプチド部分を本開示のタンパク質足場に付加させて、精製を助長することができる。そのような領域は、タンパク質足場またはその少なくとも１つの断片の最終調製前に除去することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上掲、１７．２９〜１７．４２および１８．１〜１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲、１６、１７および１８章などの、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【０１５２】
当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系を熟知している。あるいは、本開示の核酸を、本開示のタンパク質足場をコードする内在性ＤＮＡを含有する宿主細胞において（操作により）オンにすることにより、宿主細胞において発現させることができる。そのような方法は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号および同第５，７３３，７６１号に記載されているように、当技術分野において周知である。
【０１５３】
タンパク質足場、それらの指定部分または改変体の産生に有用な実例となる細胞培養物は、当技術分野において公知であるような細菌、酵母および哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、細胞の単層の形態であることが多いが、哺乳動物細胞懸濁物またはバイオリアクターを使用することもできる。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することができる多数の好適な宿主細胞株が、当技術分野において開発されており、それらは、ＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１０）およびＢＳＣ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを含み、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手することができる。好ましい宿主細胞は、骨髄腫およびリンパ腫細胞などの、リンパ系起源の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【０１５４】
これらの細胞の発現ベクターは、これらに限定されないが、複製起点、プロモーター（例えば、後期または早期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター）、エンハンサー、および／またはプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ  ＡｇポリＡ付加部位）、ならびに転写終結配列などの、発現制御配列の１つまたは複数を含むことができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上掲；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照されたい。本発明の核酸またはタンパク質の産生に有用な他の細胞は公知であり、および／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）、もしくは他の公知の供給源もしくは商業的供給源から入手することができる。
【０１５５】
真核宿主細胞が用いられる場合、ポリアデニル化または転写終結配列が通常はベクターに組み込まれる。終結配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４５巻：７７３〜７８１号（１９８３年））。加えて、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列を、当技術分野において公知であるように、ベクターに組み込むことができる。
【０１５６】
タンパク質足場の精製
タンパク質足場は、これらに限定されないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、周知の方法により、組換え細胞培養物から回収することおよび精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いることができる。例えば、各々全体が参照により本明細書に援用される、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、（１９９７〜２００１年）、例えば、１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。
【０１５７】
本開示のタンパク質足場は、自然精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物または真核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術により産生された産物を含む。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本開示のタンパク質足場は、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。そのような方法は、すべて全体が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上掲、１７．３７〜１７．４２節；Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲、１０、１２、１３、１６、１８および２０章；Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、上掲、１２〜１４章などの、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【０１５８】
アミノ酸コード
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸は、略記されることが多い。アミノ酸名は、当技術分野において十分承知されているように、その１文字コード、その３文字コード、名称、または３つのヌクレオチドコドンによりアミノ酸を指定することにより示すことができる（Ａｌｂｅｒｔｓ，  Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年を参照されたい）。本開示のタンパク質足場は、本明細書に明記されるような、自然変異またはヒトによる操作のどちらかからの１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。機能に不可欠である、本開示のタンパク質足場中のアミノ酸は、当技術分野において公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発により、同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲、８章、１５頁；ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年））。後述の手順は、分子の残基ごとに単一のアラニン変異を導入する。次いで、結果として得られた変異体分子は、これらに限定されないが少なくとも１つの中和活性などの、生物活性について試験される。タンパク質足場結合にとって重要な部位も、結晶化、核磁気共鳴または光アフィニティー標識（ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）などの、構造解析により同定することができる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４巻：８９９〜９０４頁（１９９２年）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５巻：３０６〜３１２頁（１９９２年））。
【０１５９】
当業者には理解されるが、本発明は、本開示の少なくとも１つの生物活性タンパク質足場を含む。生物活性タンパク質足場は、天然（非合成）の、内在性のまたは関連するおよび公知のタンパク質足場の比活性の少なくとも２０％、３０％または４０％、および好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、および最も好ましくは少なくとも８０％、９０％もしくは９５〜９９％のまたはそれより高い、比活性を有する。酵素活性および基質特異性の尺度をアッセイおよび定量する方法は、当業者に周知である。
【０１６０】
別の態様では、本開示は、有機部分の共有結合により修飾される、本明細書に記載のタンパク質足場および断片に関する。そのような修飾は、薬物動態特性が改善された（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期が増加した）タンパク質足場断片を生じさせることができる。有機部分は、直鎖状のもしくは分枝した親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基でありうる。特定の実施形態では、親水性ポリマー基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマーまたはポリビニルピロリドン、および脂肪酸または脂肪酸エステル基（約８〜約４０個の炭素原子を含むことができる）でありうる。
【０１６１】
本開示の修飾タンパク質足場および断片は、抗体に直接または間接的に共有結合している１つまたは複数の有機部分を含むことができる。本開示のタンパク質足場または断片に結合している各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基であることができる。本明細書で使用される用語「脂肪酸」は、モノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、この用語が本明細書で使用される場合、オクタンよりも水においてより可溶性である有機ポリマーを指す。例えば、ポリリシンは、オクタンへの溶解度より水への溶解度のほうが高い。したがって、ポリリシンの共有結合により修飾されたタンパク質足場は、本開示により包含される。本開示のタンパク質足場を修飾するのに好適な親水性ポリマーは、直鎖状であってもよく、または分岐していてもよく、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖類、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸エステル（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｔｅ）など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、およびポリビニルピロリドンを含みうる。好ましくは、本開示のタンパク質足場を修飾する親水性ポリマーは、別々の分子実体として、約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００（ここでの下付文字は、ダルトンでのポリマーの平均分子量である）を使用することができる。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル、脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換されていてもよい。脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換されている親水性ポリマーは、好適な方法を用いることにより調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートとカップリングさせ、脂肪酸または脂肪酸エステル上の活性化されたカルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化されたもの）をポリマー上のヒドロキシル基とカップリングさせることができる。
【０１６２】
本開示のタンパク質足場を修飾するのに好適な脂肪酸および脂肪酸エステルは、飽和されていてもよく、または１つもしくは複数の不飽和ユニットを含有してもよい。本開示のタンパク質足場を修飾するのに好適である脂肪酸は、例えば、ｎ−ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、シス−Δ９−オクタデカノエート（Ｃ１８、オレアート）、全シス−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などを含む。好適な脂肪酸エステルは、直鎖状のまたは分岐した低級アルキル基を含む、ジカルボン酸のモノエステルを含む。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含むことができる。
【０１６３】
修飾されたタンパク質足場および断片は、好適な方法を使用して、例えば、１つまたは複数の修飾剤との反応により、調製することができる。「修飾剤」は、この用語が本明細書で使用される場合、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第２の化学基と反応することによって、修飾剤と第２の化学基の間に共有結合を形成することができる、化学的部分または官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、求電子基、例えば、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などを含む。チオールと反応することができる活性化基は、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などを含む。アルデヒド官能基をアミン含有分子またはヒドラジド含有分子とカップリングさせることができ、アジド基は、三価亜リン酸基と反応してホスホルアミデートまたはホスホルイミド結合を形成することができる。活性化基を分子に導入するための好適な方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９６年）を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に、直接結合させることができ、またはリンカー部分、例えば、１個または複数の炭素原子が、酸素、窒素または硫黄などのヘテロ原子により置換されていてもよい、二価Ｃ１〜Ｃ１２基を介して結合させることができる。好適なリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−、および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−を含む。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレート間にアミド結合を形成することにより、産生することができる。Ｂｏｃ保護基を産物からトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により除去して、第一級アミンを露出させることができ、この第一級アミンを、記載したような別のカルボキシレートとカップリングさせることができ、または無水マレイン酸と反応させ、結果として得られる産物を環化して、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を産生することができる。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＷＯ９２／１６２２１を参照されたく、この特許文献の全教示は参照により本明細書に援用される）。
【０１６４】
本開示の修飾されたタンパク質足場は、タンパク質足場または断片を修飾剤と反応させることにより産生させることができる。例えば、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることにより、部位特異的でない方法で、有機部分をタンパク質足場に結合させることができる。本開示のタンパク質足場の特異的部位に結合している有機部分を含む、修飾されたタンパク質足場および断片は、逆タンパク質分解（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）（Ｆｉｓｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、３巻：１４７〜１５３頁（１９９２年）；Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：４１１〜４１７頁（１９９４年）；Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６巻（１０号）：２２３３〜２２４１頁（１９９７年）；Ｉｔｏｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、２４巻（１号）：５９〜６８頁（１９９６年）；Ｃａｐｅｌｌａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、５６巻（４号）：４５６〜４６３頁（１９９７年））、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９６年）に記載されている方法などの、好適な方法を使用して調製することができる。
【０１６５】
さらなる治療活性成分を含むタンパク質足場組成物
本開示のタンパク質足場化合物、組成物または組み合わせは、任意の好適な助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、例えば、これらに限定されないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存薬、アジュバントなどのうちの少なくとも１つをさらに含んでもよい。薬学的に許容される助剤が好ましい。そのような滅菌溶液の非限定的な例およびそれらを調製する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）１９９０年があるが、これに限定される。当技術分野において周知である、または本明細書に記載される、タンパク質足場、断片または改変体組成物の投与方式、溶解度および／または安定性にとって好適である、薬学的に許容される担体は、慣用的に選択することができる。
【０１６６】
本組成物に有用な薬学的賦形剤および添加剤は、これらに限定されないが、単独でまたは組み合わせで１〜９９．９９重量または容量％を含む、単独でまたは組み合わせで存在しうる、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖およびオリゴ糖；誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖など、ならびに多糖類または糖ポリマーを含む、糖）を含む。例示的なタンパク質賦形剤は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能力の点でも機能することができる代表的なアミノ酸／タンパク質成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを含む。１つの好ましいアミノ酸は、グリシンである。
【０１６７】
本発明での使用に好適な炭水化物賦形剤は、例えば、単糖類、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類、例えば、ラフィノース、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；ならびにアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどを含む。本発明での使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。
【０１６８】
タンパク質足場組成物は、緩衝剤またはｐＨ調節剤も含むことができ、通常は、緩衝剤は、有機酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤は、有機酸塩、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸もしくはフタル酸の塩、Ｔｒｉｓ、トロメタミン塩酸塩、またはリン酸緩衝液を含む。本組成物での使用に好ましい緩衝剤は、有機酸塩、例えば、クエン酸塩である。
【０１６９】
加えて、本発明のタンパク質足場組成物は、ポリマー賦形剤／添加剤、例えば、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）（例えば、シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、矯味矯臭剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、静電防止剤、界面活性剤（例えば、ポリソルベート、例えば「ＴＷＥＥＮ  ２０」および「ＴＷＥＥＮ  ８０」）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含むことができる。
【０１７０】
本発明によるタンパク質足場、部分または改変体組成物での使用に好適なこれらのおよびさらなる公知の薬学的賦形剤および／または添加剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９９５年）に、および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、Ｎ．Ｊ．（１９９８年）に収載されているように、当技術分野において公知であり、前記参考文献の開示は、すべてが参照により本明細書に援用される。好ましい担体または賦形剤材料は、炭水化物（例えば、糖類およびアルジトール）および緩衝剤（例えば、クエン酸塩）またはポリマー作用物質である。例示的な担体分子は、関節内送達に有用でありうる、ムコ多糖類、ヒアルロン酸である。
【０１７１】
白血球搬出産物からのＴ細胞単離
白血球搬出産物または血液は、閉鎖系および標準的な方法を使用して臨床現場で被験体から採取することができる（例えば、ＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）。好ましくは、産物は、標準的な白血球搬出採取バッグにおいて標準的な病院または機関の白血球搬出手順に従って採取される。例えば、本開示の方法の好ましい実施形態では、白血球搬出中に通常使用されるものに加えてさらなる抗凝固剤または血液添加剤（ヘパリンなど）は含まれない。
【０１７２】
あるいは、白血球（ＷＢＣ）／末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｓｅｐａｘ  ２（閉鎖／自動化）を使用）またはＴ細胞（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（閉鎖／自動化）を使用）は全血から直接単離することができる。しかしながら、特定の被験体（例えば、がんと診断および／または処置された被験体）では、ＷＢＣ／ＰＢＭＣの収量は、全血から単離された場合、白血球搬出によって単離された場合よりも著しく低いことがある。
【０１７３】
白血球搬出手順および／または直接細胞単離手順はいずれも本開示の任意の被験体に使用することができる。
【０１７４】
白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物は遮蔽された容器に充填され、臨床プロトコールでの使用が許可される標準的な病院または機関の血液採取手順に従って、制御された室温（＋１９℃から＋２５℃）に維持されるべきである。白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物は冷凍されるべきではない。
【０１７５】
白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物の細胞濃度は、輸送中、１ｍＬ当たり０．２×１０９個の細胞を超えるべきではない。白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物の激しい混合は避けるべきである。
【０１７６】
白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物を、例えば終夜保管しなければならない場合、制御された室温に維持されなければならない（上記と同じ）。保管中、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物の濃度は、１ｍＬ当たり０．２×１０９個の細胞を超えてはならない。
【０１７７】
好ましくは、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物の細胞は自己の血漿中で保管されるべきである。ある特定の実施形態では、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物の細胞濃度が１ｍＬ当たり０．２×１０９個の細胞より高い場合、産物は自己の血漿で希釈されるべきである。
【０１７８】
好ましくは、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物は、標識および分離手順を開始するときに２４時間を過ぎてはならない。白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物は、閉鎖および／または自動化系を使用して細胞標識のために処理および／または調製することができる（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ）。
【０１７９】
自動化系は、場合により、フィコレーション（ficolation）、および／または細胞産物（例えば、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物）の洗浄によって、さらなるバフィーコート単離を行うことができる。
【０１８０】
閉鎖および／または自動化系を使用して、Ｔ細胞単離（例えば、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物から）のために細胞を調製および標識することができる。
【０１８１】
ＷＢＣ／ＰＢＭＣには直接ヌクレオフェクトしてもよいが（容易であり、追加のステップが省略される）、本開示の方法は、ヌクレオフェクションの前に最初にＴ細胞を単離するステップを含んでもよい。ＰＢＭＣに直接ヌクレオフェクトする容易な戦略は、ＣＡＲシグナル伝達によって媒介されるＣＡＲ＋細胞の選択的増殖を必要とし、それ自体は、Ｔ細胞を機能的に消耗させることによって産物のｉｎ  ｖｉｖｏ効率を直接低減する劣った増殖方法であることがわかっている。産物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、またはこれらの任意の組み合わせを含むＣＡＲ＋細胞の不均一な組成物である可能性があり、患者間の産物の変動性を増加させ、投薬およびＣＲＳ管理をより困難にする。Ｔ細胞は、腫瘍抑制および殺滅において主要なエフェクターであると考えられるため、自己の産物の製造のためのＴ細胞単離が他のより不均一な組成物に優る顕著な利益をもたらすことがある。
【０１８２】
Ｔ細胞は、一方向性の標識手順で標識した細胞の濃縮または標識した細胞の枯渇によって、直接単離することができ、または二段階の標識手順で間接的に単離することができる。本開示の特定の濃縮戦略により、Ｔ細胞は細胞採取バッグに、非標識細胞（非標的細胞）は陰性画分バッグに採取することができる。本開示の濃縮戦略とは対照的に、非標識細胞（標的細胞）は細胞採取バッグに採取され、標識細胞（非標的細胞）は陰性画分バッグまたは非標的細胞バッグにそれぞれ採取される。選択試薬は、これに限定されないが、抗体でコーティングされたビーズを含みうる。抗体でコーティングされたビーズは、修飾および／または増殖ステップの前に除去されるか、または修飾および／または増殖ステップの前に細胞上に保持することができる。細胞マーカーの以下の非限定的な例の１つまたは複数を、Ｔ細胞の単離に使用することができる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、および／またはこれらの任意の組み合わせ。Ｔ細胞の単離の方法は、Ｔ細胞の単離に使用することができる以下の細胞マーカーの非限定的な例の１つまたは複数に特異的に結合するおよび／または検出可能に標識する１つまたは複数の試薬を含んでもよい：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、および／またはこれらの任意の組み合わせ。これらの試薬は、「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）」（「ＧＭＰ」）グレードであってもなくてもよい。試薬は、これらに限定されないが、Ｔｈｅｒｍｏ  ＤｙｎａＢｅａｄｓおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ製品を含みうる。本開示のＴ細胞を単離する方法は、標識および／または単離するステップの複数回の反復を含んでもよい。本開示のＴ細胞を単離する方法の任意の時点で、望まない細胞および／または望まない細胞型は、望まない細胞および／または望まない細胞型の正のまたは負の選択ステップによって本開示のＴ細胞産物組成物から枯渇されることがある。本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４、ＣＤ８、および／または別のＴ細胞マーカーを発現することができるさらなる細胞型を含有してもよい。
【０１８３】
Ｔ細胞のヌクレオフェクションの本開示の方法は、例えば、ヌクレオフェクション後にＴＣＲシグナル伝達を介して単離ステップまたは選択的増殖ステップを含むＷＢＣ／ＰＢＭＣの集団または組成物のＴ細胞のヌクレオフェクションのプロセスにより、Ｔ細胞単離のステップを除外してもよい。
【０１８４】
特定の細胞集団は、Ｔ細胞濃縮および／またはソーティング前または後に正または負の選択によって枯渇されてもよい。細胞産物組成物から枯渇されてもよい細胞組成物の例は、骨髄系細胞、ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔ  Ｒｅｇ）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球、肥満細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞）、誘導性ナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。
【０１８５】
本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでもよい。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離または選択手順中に別々の採取バッグに単離することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに別々に処置され、または特定の比で再構成（同じ組成物への組み合わせ）後に処置することができる。
【０１８６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を再構成することができる特定の比は、使用された増殖技術の型および有効性、細胞培地、および／またはＴ細胞産物組成物の増殖に利用される増殖条件に依存することがある。可能なＣＤ４＋：ＣＤ８＋比の例は、これらに限定されないが、５０％：５０％、６０％：４０％、４０％：６０％、７５％：２５％、および２５％：７５％を含む。
【０１８７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍細胞殺滅に強力な能力を示すが、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力および機能を支持するのに必要な多くのサイトカインを提供する。正常なドナーから単離されたＴ細胞は、主にＣＤ４＋であるため、Ｔ細胞産物組成物は、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に調節され、そうでなければｉｎ  ｖｉｖｏで存在するであろうＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の比を改善する。最適化された比は、自己Ｔ細胞産物組成物のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖にも使用することができる。Ｔ細胞産物組成物の人工的に調節されたＣＤ４＋：ＣＤ８＋比を考慮して、本開示の産物組成物が任意の天然に存在するＴ細胞の集団と著しく異なり、著しくより大きな利点を提供することができることに注意することが重要である。
【０１８８】
Ｔ細胞単離の好ましい方法は、手つかずの汎Ｔ細胞を産生する負の選択戦略を含みえ、生じるＴ細胞組成物は、操作されておらず、かつ天然に存在するＴ細胞の種類／比を含有するＴ細胞を含むことを意味する。
【０１８９】
正または負の選択に使用することができる試薬は、これらに限定されないが、磁性細胞分離ビーズを含む。磁性細胞分離ビーズは、本開示のＴ細胞単離方法の次のステップを行う前にＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択された集団、またはＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の混合された集団から取り除かれても取り除かれなくても、または枯渇されても枯渇されなくてもよい。
【０１９０】
Ｔ細胞組成物およびＴ細胞産物組成物は、凍結保存、標準的なＴ細胞培養培地での保管、および／または遺伝子修飾のために調製されてもよい。
【０１９１】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはこれらの任意の部分は、高い回復、生存度、表現型、および／または機能的能力を有するヒト細胞を保管および回復させるのに最適化された標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができる。市販の凍結保存培地および／またはプロトコールを使用することができる。本開示の凍結保存方法は、冷凍関連毒性を減らすＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（例えば、ＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ（商標）ＤＭＳＯ不含凍結保存培地）を含んでもよい。
【０１９２】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはこれらの任意の部分は、培養培地中で保管できる。本開示のＴ細胞培養培地は、細胞保管、細胞遺伝子修飾、細胞表現型および／または細胞増殖に最適化することができる。本開示のＴ細胞培養培地は１つまたは複数の抗生物質を含んでもよい。細胞培養培地内への抗生物質の包含が、トランスフェクション効率および／またはヌクレオフェクションによる遺伝子修飾後の細胞収量を下げうるため、特定の抗生物質（またはそれらの組み合わせ）およびこれらのそれぞれの濃度は、最適なトランスフェクション効率および／またはヌクレオフェクションによる遺伝子修飾後の細胞収量のために変更することができる。
【０１９３】
本開示のＴ細胞培養培地は血清を含んでもよく、さらには、血清組成物および濃縮物は最適な細胞結果のために変更することができる。ヒトＡＢ血清は、Ｔ細胞の培養のためにＦＢＳ／ＦＣＳよりも好ましい。なぜなら、本開示のＴ細胞培養培地での使用のために企図されているが、ＦＢＳ／ＦＣＳは異種タンパク質を誘導し得るからである。血清は、培養物中のＴ細胞組成物の投与が意図される被験体の血液から単離されてもよく、したがって、本開示のＴ細胞培養培地は自己の血清を含んでもよい。無血清培地または代用血清も、本開示のＴ細胞培養培地で使用することができる。本開示のＴ細胞培養培地および方法のある特定の実施形態では、無血清培地または代用血清は、これらに限定されないが、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す、より健康な細胞を含む、培地への異種血清の補足に優る利点を提供することができる。
【０１９４】
Ｔ細胞培養培地は市販の細胞増殖培地を含んでもよい。例示的な市販の細胞増殖培地は、これらに限定されないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９５】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはこれらの任意の部分は、遺伝子修飾のために調製することができる。遺伝子修飾のためのＴ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはこれらの任意の部分の調製は、細胞洗浄および／または所望のヌクレオフェクション緩衝液への再懸濁を含んでもよい。凍結保存Ｔ細胞組成物は、ヌクレオフェクションによる遺伝子修飾のために解凍および調製することができる。凍結保存細胞は、標準的なまたは公知のプロトコールに従って解凍することができる。凍結保存細胞の解凍および調製を最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｏｌｓ  Ａｌｂｕｔｅｉｎ（２５％ヒトアルブミン）を解凍および／または調製プロセスで使用することができる。
【０１９６】
自己Ｔ細胞産物組成物の遺伝子修飾
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはこれらの任意の部分は、例えば、エレクトロポレーションなどのヌクレオフェクション戦略を使用して遺伝子修飾することができる。ヌクレオフェクトされる細胞の総数、ヌクレオフェクション反応の総容積、および試料の調製の正確なタイミングを最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を産生することができる。
【０１９７】
ヌクレオフェクションおよび／またはエレクトロポレーションは、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ａｍａｘａ、ＭａｘＣｙｔｅ  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ、および／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｏｎを使用して達成することができる。これらに限定されないが、プラスチックポリマー電極を含む非金属電極系がヌクレオフェクションに好ましい場合がある。
【０１９８】
ヌクレオフェクションによる遺伝子修飾の前に、Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはそれらの任意の部分は、ヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁されてもよい。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は市販のヌクレオフェクション緩衝液を含む。本開示のヌクレオフェクション緩衝液を最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を産生することができる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、これらに限定されないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液およびこれらの任意の組み合わせを含みうる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、１つまたは複数のさらなる因子を含み、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を産生することができる。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンおよびこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なサイトカイン、ケモカイン、およびインターロイキンは、これらに限定されないが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌおよびこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせを含む。例示的な塩、無機物、および代謝物は、これらに限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地およびこれらの任意の組み合わせなどの培地を含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路およびこれらの組み合わせの阻害剤を含む。例示的な阻害剤は、これらに限定されないが、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫおよびこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、細胞送達を増強する、核送達または輸送を増強する、核への核酸の助長された輸送を増強する、染色体上（ｅｐｉ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）の核酸の分解を増強する、および／またはＤＮＡ媒介毒性を減少させるように、１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬を含む。１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する例示的な試薬は、これらに限定されないが、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、およびこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９９】
トランスポゾンおよびトランスポザーゼを含む転位試薬は、ヌクレオフェクション緩衝液への細胞の添加前、同時、または後に本開示のヌクレオフェクション反応に添加することができる（任意選択で、ヌクレオフェクション反応バイアルまたはキュベット内に含有される）。本開示のトランスポゾンは、プラスミドＤＮＡ、線状化プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ＤＯＧＧＹＢＯＮＥ（商標）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ鋳型、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、タンパク質−核酸組み合わせ、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本開示のトランスポゾンは、１つまたは複数のＴＴＡＡ部位、１つまたは複数の末端逆位配列（ＩＴＲ）、１つまたは複数の末端反復配列（ＬＴＲ）、１つまたは複数のインスレーター、１つまたは複数のプロモーター、１つまたは複数の完全長もしくは切断された遺伝子、１つまたは複数のポリＡシグナル、１つまたは複数の自己切断２Ａペプチド切断部位、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、１つまたは複数のエンハンサー、１つまたは複数のレギュレーター、１つまたは複数の複製起点、およびこれらの任意の組み合わせをコードする、１つまたは複数の配列を含んでもよい。
【０２００】
本開示のトランスポゾンは、１つまたは複数の完全長もしくは切断された遺伝子をコードする１つまたは複数の配列を含んでもよい。本開示のトランスポゾンによって導入された完全長および／または切断された遺伝子は、シグナルペプチド、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（Ｃｅｎｔｙｒｉｎを含むＣＡＲ−Ｔ）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬物耐性遺伝子、腫瘍抗原、同種または自己抗原、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリ−ペプチド、蛍光タンパク質、変異タンパク質またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数をコードしてもよい。
【０２０１】
本開示のトランスポゾンは水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示のさらなる因子、またはこれらの任意の組み合わせ中で調製されてもよい。
【０２０２】
本開示のトランスポゾンは、臨床的安全性を最適化および／または製造可能性を改善するために設計することができる。非限定的な例としては、本開示のトランスポゾンは、不必要な配列または領域を除去するおよび／または非抗生物質の選択マーカーを含むことによって、臨床的安全性を最適化および／または製造可能性を改善するために設計することができる。本開示のトランスポゾンはＧＭＰグレードであってもなくてもよい。
【０２０３】
本開示のトランスポザーゼ酵素は、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、タンパク質−核酸組み合わせまたはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数の配列によってコードされてもよい。
【０２０４】
本開示のトランスポザーゼ酵素は、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示のさらなる因子またはこれらの任意の組み合わせ中で調製されてもよい。本開示のトランスポザーゼ酵素またはそれらをコードもしくは送達する配列／構築物はＧＭＰグレードであってもなくてもよい。
【０２０５】
本開示のトランスポゾンおよびトランスポザーゼ酵素は任意の手段によって細胞に送達することができる。
【０２０６】
本開示の組成物および方法は、本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）による細胞への送達を含むが、送達のためのプラスミドの使用により、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼの細胞の染色体ＤＮＡへの組込みが可能になり、継続的なトランスポザーゼ発現をもたらすことができる。したがって、本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ酵素は、染色体組込みのあらゆる可能性を排除するために、ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれかとして細胞に送達することができる。
【０２０７】
本開示のトランスポゾンおよびトランスポザーゼは、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをヌクレオフェクション反応に導入する前に単独でまたは互いに組み合わせて事前にインキュベートされてもよい。トランスポゾンおよびトランスポザーゼのそれぞれの絶対量、ならびに相対量、例えばトランスポザーゼに対するトランスポゾンの比は最適化することができる。
【０２０８】
任意選択でバイアルまたはキュベット中でのヌクレオフェクション反応の調製に続いて、反応はヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）装置にロードされ、製造業者のプロトコールにしたがって電気パルスの送達のために活性化することができる。本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ（または本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする配列）の細胞への送達に使用される電気パルス条件は、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を産生するために最適化することができる。Ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術を使用する場合、Ａｍａｘａ  ２Ｂまたは４Ｄヌクレオフェクターのための様々なヌクレオフェクションプログラムの各々が企図される。
【０２０９】
本開示のヌクレオフェクション反応に続いて、細胞は細胞培地に穏やかに添加することができる。例えば、Ｔ細胞がヌクレオフェクション反応を受ける場合、Ｔ細胞をＴ細胞培地に添加することができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地は、いずれか１つまたは複数の市販の培地を含みうる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、より優れた生存度、より高いヌクレオフェクション効率を有し、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型を示し、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を産生するように最適化することができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地およびこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、本開示の１つまたは複数のさらなる因子を含み、生存度、ヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存度、細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を増強しうる。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンおよびこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なサイトカイン、ケモカイン、およびインターロイキンは、これらに限定されないが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌおよびこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なさらなる因子としては、これらに限定されないが、塩、無機物、代謝物またはこれらの任意の組み合わせを含む。例示的な塩、無機物、および代謝物は、これらに限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌ��レオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地およびこれらの任意の組み合わせなどの培地を含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路およびこれらの組み合わせの阻害剤を含む。例示的な阻害剤は、これらに限定されないが、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫおよびこれらの任意の組み合わせを含む。例示的なさらなる因子は、これらに限定されないが、細胞送達を増強する、核送達または輸送を増強する、核への核酸の助長された輸送を増強する、染色体上の核酸の分解を増強する、および／またはＤＮＡ媒介毒性を減少させるように、１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬を含む。１つまたは複数の核酸を修飾または安定化する例示的な試薬は、これらに限定されないが、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、およびこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２１０】
本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、室温で使用され、または例えば、３２℃から３７℃（端点を含む）の間に事前に温められてもよい。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、細胞の生存度および／または本開示のトランスポゾンまたはそれらの部分の発現を維持または増強する任意の温度に事前に温められてもよい。
【０２１１】
本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、組織培養フラスコまたはディッシュ、Ｇ−Ｒｅｘフラスコ、バイオリアクターもしくは細胞培養バッグ、または任意の他の標準的な容器中に含有されてもよい。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培養物（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物を含む）は静置しておいてもよく、または代わりにそれらを摂動してもよい（例えば、揺する、旋回する、または振盪する）。
【０２１２】
ヌクレオフェクション後の細胞培養物は、遺伝子修飾細胞を含んでもよい。ヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物は遺伝子修飾Ｔ細胞を含んでもよい。本開示の遺伝子修飾細胞は、規定した期間休止されるか、または例えばＴ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加により、増殖を刺激されるかのいずれかであってもよい。ある特定の実施形態では、本開示の遺伝子修飾細胞は、規定した期間休止されるか、または例えばＴ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加により、増殖を直ちに刺激されるかのいずれかであってもよい。本開示の遺伝子修飾細胞は、順応するのに十分な時間、転位が生じるのに十分な時間、および／または正もしくは負の選択のための十分な時間が与えられるように休止され得、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を生じてもよい。本開示の遺伝子修飾細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間またはそれより長い時間にわたって休止されてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の遺伝子修飾細胞は、例えば終夜にわたって休止されてもよい。特定の態様では、終夜は約１２時間である。本開示の遺伝子修飾細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれより長い日数にわたって休止されてもよい。
【０２１３】
本開示の遺伝子修飾細胞は、ヌクレオフェクション反応後、かつエキスパンダー（ｅｘｐａｎｄｅｒ）技術の追加前に選択することができる。遺伝子修飾細胞の最適な選択のため、細胞は少なくとも２〜１４日間ヌクレオフェクション後の細胞培地中で休止され、修飾細胞の同定（例えば、非修飾細胞から修飾細胞の区別）を助長することができる。
【０２１４】
本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションが成功した場合、ヌクレオフェクション後２４時間の早期に、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎおよび本開示の選択マーカーの発現は、修飾Ｔ細胞で検出可能でありうる。トランスポゾンの染色体上の発現により、選択マーカーのみの発現は、非修飾Ｔ細胞（トランスポゾンの組込みが成功しなかった細胞）から修飾Ｔ細胞（トランスポゾンの組込みが成功した細胞）を区別できない。トランスポゾンの染色体上の発現が、選択マーカーによる修飾細胞の検出をあいまいにする場合、ヌクレオフェクトされた細胞（修飾および非修飾細胞の両方）は、一定期間（例えば２〜１４日間）休止され、細胞の発現を終わらせ、または全ての染色体上のトランスポゾン発現を喪失させることができる。この延長された休止期に続いて、修飾Ｔ細胞のみが選択マーカーの発現が陽性なままであるはずである。この延長された休止期の長さは、各ヌクレオフェクション反応および選択プロセスに最適化されてもよい。トランスポゾンの染色体上の発現が、選択マーカーによる修飾細胞の検出をあいまいにする場合、選択はこの延長された休止期なしで行われてもよいが、追加の選択ステップが後の時点で含まれうる（例えば、増殖ステージ中または後のいずれか）。
【０２１５】
本開示の遺伝子修飾細胞の選択は、任意の手段によって行われてもよい。本開示の方法のある特定の実施形態では、本開示の遺伝子修飾細胞の選択は、特定の選択マーカーを発現する細胞を単離するステップによって行うことができる。本開示の選択マーカーは、トランスポゾンの１つまたは複数の配列によってコードされていてもよい。本開示の選択マーカーは、転位の成功の結果として修飾細胞によって発現することができる（すなわち、トランスポゾンの１つまたは複数の配列によってコードされていない）。ある特定の実施形態では、本開示の遺伝子修飾細胞は、ヌクレオフェクション後の細胞培地の有害な化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含有する。有害な化合物は、例えば、修飾細胞に選択マーカーによって付与された耐性が無く、細胞死をもたらす抗生物質または薬物を含んでもよい。例示的な選択マーカーは、これらに限定されないが、以下の遺伝子：ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、およびＮＫＸ２．２の１つまたは複数の野生型（ＷＴ）または変異体形態を含む。例示的な選択マーカーは、これらに限定されないが、表面発現選択マーカーまたは表面発現タグを含み、それぞれＡｂでコーティングされた磁性ビーズ技術またはカラム選択によって標的化することができる。タンパク質精製に使用されるものなどの切断可能なタグは、効率的なカラム選択、洗浄、および溶出のために本開示の選択マーカーに加えることができる。ある特定の実施形態では、本開示の選択マーカーは、天然には修飾細胞（修飾Ｔ細胞を含む）によって発現されず、したがって、修飾細胞の物理的単離に有用であることがある（例えば、細胞ソーティング技術による）。本開示の例示的な選択マーカーは、天然には修飾細胞（修飾Ｔ細胞を含む）によって発現されず、これらに限定されないが、ＣＤ２７１、ＣＤ１９ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＲＱＲ８、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３およびこれらの任意の組み合わせの完全長、変異または切断形態を含む。
【０２１６】
本開示の遺伝子修飾細胞は、ヌクレオフェクション反応に続いて選択的に増殖させることができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞は、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によって選択的に増殖させることができる。ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞は、標的で覆われた試薬（例えば、標的を発現する腫瘍株もしくは正常細胞株または標的において覆われているエキスパンダービーズ）との接触によって刺激することができる。あるいは、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞は、照射された腫瘍細胞、照射された同種異系の正常細胞、照射された自己のＰＢＭＣとの接触によって刺激することができる。刺激に使用された標的発現細胞による本開示の細胞産物組成物の混入を最小限にするため、例えば、細胞産物組成物が被験体に直接投与される場合、刺激はＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質によってコーティングされたエキスパンダービーズを使用して行うことができる。ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によるＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞の選択的増殖は、修飾Ｔ細胞を機能的に消耗させることを避けるように最適化することができる。
【０２１７】
本開示の選択された遺伝子修飾細胞は、凍結保存され、規定した期間休止され、またはＣｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増殖のために刺激されうる。本開示の選択された遺伝子修飾細胞は、凍結保存され、規定した期間休止され、またはＣｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増殖のために直ちに刺激されうる。選択された遺伝子修飾細胞がＴ細胞である場合、Ｔ細胞はＴ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増殖のために刺激することができる。本開示の選択された遺伝子修飾細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間またはそれより長い時間にわたって休止されてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の選択された遺伝子修飾細胞は、例えば終夜、休止されてもよい。ある特定の態様では、終夜は約１２時間である。本開示の選択された遺伝子修飾細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれより長い日数にわたって休止されてもよい。選択された本開示の遺伝子修飾細胞は、任意の時間休止されてもよく、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、および／または増殖技術の追加の際に、より優れた／速い増殖を示す細胞を生じる。
【０２１８】
選択された遺伝子修飾細胞（本開示の選択された遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）は、高い回復、生存度、表現型、および／または機能的能力を有するヒト細胞を保管および／または回復させるために最適化することができる任意の標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができる。本開示の凍結保存方法は、市販の凍結保存培地および／またはプロトコールを含んでもよい。
【０２１９】
選択された遺伝子修飾細胞（本開示の選択された遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）の転位効率は任意の手段によって評価することができる。例えば、エキスパンダー技術の適用前に、選択された遺伝子修飾細胞（本開示の選択された遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）によるトランスポゾンの発現は、蛍光標示細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。選択された遺伝子修飾細胞（本開示の選択された遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）の転位効率の決定は、トランスポゾン（例えば、ＣＡＲ）を発現する選択された細胞の百分率を決定するステップを含んでもよい。あるいは、または加えて、Ｔ細胞の純度、トランスポゾン発現（例えばＣＡＲ発現）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒および／または殺滅を媒介するＣＡＲ（トランスポゾンに送達される）の能力、および／または選択された遺伝子修飾細胞（本開示の選択された遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）の表現型は、任意の手段によって評価することができる。
【０２２０】
本開示の細胞産物組成物は、特定のリリース（release）基準に合う際に被験体への投与のためにリリースすることができる。例示的なリリース基準は、これらに限定されないが、細胞表面上にＣＡＲを検出可能なレベルで発現する修飾、選択および／または増殖されたＴ細胞の特定の百分率を含みうる。
【０２２１】
自己Ｔ細胞産物組成物の遺伝子修飾
本開示の遺伝子修飾細胞（遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）は、エキスパンダー技術を使用して増殖させることができる。本開示のエキスパンダー技術は、市販のエキスパンダー技術を含んでもよい。本開示の例示的なエキスパンダー技術は、ＴＣＲを介する本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞の刺激を含む。本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞の刺激のための全ての手段が企図されているが、ＴＣＲを介する本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞の刺激が好ましい方法であり、優れたレベルの殺滅能力を有する産物を産生する。
【０２２２】
ＴＣＲを介して本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するため、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＤｙｎａＢｅａｄｓをビーズ対Ｔ細胞比３：１で使用することができる。エキスパンダービーズが生分解性ではない場合、ビーズはエキスパンダー組成物から除去されてもよい。例えば、ビーズは約５日後にエキスパンダー組成物から除去されてもよい。ＴＣＲを介して本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するため、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ試薬が使用されてもよい。ＴＣＲを介して本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するため、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３／ＣＤ２８またはＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ試薬が使用されてもよい。この技術は、可溶性の四量体抗体複合体が期間後に分解され、プロセスからの除去を必要としないため好ましいことがある。
【０２２３】
人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、標的抗原を共発現するように操作され、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用されてもよい。人工ＡＰＣは腫瘍細胞株を含んでもよく、または腫瘍細胞株に由来してもよく（例えば、不死化骨髄性白血病株Ｋ５６２を含む）、複数の共刺激分子または技術（例えばＣＤ２８、４−１ＢＢＬ、ＣＤ６４、ｍｂＩＬ−２１、ｍｂＩＬ−１５、ＣＡＲ標的分子など）を共発現するように操作されてもよい。本開示の人工ＡＰＣが共刺激分子と組み合わされる場合、望ましくない表現型および機能的能力、すなわち最終分化したエフェクターＴ細胞の発生または出現を防ぐために条件は最適化されてもよい。
【０２２４】
照射されたＰＢＭＣ（自己または同種）は、いくつかの標的抗原、例えばＣＤ１９を発現することがあり、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。あるいは、または加えて、照射された腫瘍細胞はいくつかの標的抗原を発現することがあり、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。
【０２２５】
プレートに結合したおよび／または可溶性の抗ＣＤ３、抗ＣＤ２および／または抗ＣＤ２８刺激は、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。
【０２２６】
抗原でコーティングされたビーズは標的タンパク質を提示することができ、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。あるいは、または加えて、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質によってコーティングされたエキスパンダービーズは本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。
【０２２７】
増殖方法は、ＴＣＲまたはＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎにより、および遺伝子修飾Ｔ細胞の表面に発現されたＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよび／または他のマーカーを介して、本開示の細胞またはＴ細胞の刺激を導く。
【０２２８】
増殖技術は、ヌクレオフェクション後すぐ、ヌクレオフェクション後おおよそ２４時間までに本開示の細胞に適用することができる。様々な細胞培地を増殖手順中に使用することができるが、本開示の望ましいＴ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地は、例えば、より優れた生存度、細胞表現型、全増殖、ｉｎ  ｖｉｖｏでの存続、生着、および／またはＣＡＲ媒介殺滅のより優れた能力を示す細胞を産生することができる。本開示の細胞培地は、本開示の遺伝子修飾細胞の増殖、表現型、および機能を改善／増強するために最適化することができる。増殖したＴ細胞の好ましい表現型は、Ｔ幹細胞メモリー細胞、Ｔセントラルメモリー細胞、Ｔエフェクターメモリー細胞の混合物を含んでもよい。Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓは主に、臨床で優れた性能をもたらしうるセントラルメモリーＴ細胞を産生することができる。
【０２２９】
例示的な本開示のＴ細胞増殖培地は、部分的にまたは全体的に、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ培地、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。本開示のＴ細胞増殖培地は、１つまたは複数のさらなる因子をさらに含んでもよい。本開示のＴ細胞増殖培地に含めることができるさらなる因子は、生存度、細胞表現型、全増殖を増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの存続、生着、および／またはＣＡＲ媒介殺滅の能力を増大する。本開示のＴ細胞増殖培地に含めることができるさらなる因子は、これらに限定されないが、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、および／またはインターロイキン、例えばＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。本開示のＴ細胞増殖培地に含めることができるさらなる因子は、これらに限定されないが、塩、無機物、および／または代謝物、例えば、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはこれらの任意の組み合わせを含む。本開示のＴ細胞増殖培地に含めることができるさらなる因子は、これらに限定されないが、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、および／またはアポトーシス経路の阻害剤、例えば��ＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫまたはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２３０】
本開示のＴ細胞増殖培地に含めることができるさらなる因子は、これらに限定されないが、細胞送達を増強し、核送達または輸送を増強し、核酸の核への助長された輸送を増強し、染色体上の核酸の分解を増強し、および／またはＤＮＡ媒介毒性を減少させるように核酸を修飾または安定化する試薬、例えば、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２３１】
本開示の遺伝子修飾細胞は、選択可能な薬物または化合物の使用によって増殖プロセス中に選択することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンが、培養培地に添加される薬物への耐性を遺伝子修飾細胞に付与する選択マーカーをコードすることができる場合、選択は増殖プロセス中に起こることがあり、選択が起こるのにおおよそ１〜１４日の培養を必要とすることがある。本開示のトランスポゾンによってコードされる選択マーカーとして使用することができる薬物耐性遺伝子の例は、これらに限定されないが、遺伝子ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＮＫＸ２．２、またはこれらの任意の組み合わせの野生型（ＷＴ）または変異体形態を含む。培養培地に添加され、選択マーカーが耐性を付与することができる、対応する薬物または化合物の例は、これらに限定されないが、Ｇ４１８、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン（Mephalan）、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、ベセナム（Becenum）（カルムスチン）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カルムブリス（Carmubris）（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（Clafen）（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エロツズマブ、エムプリシティ（エロツズマブ）、Ｅｖａｃｅｔ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、ファリーダック（パノビノスタット）、イキサゾミブクエン酸エステル、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、レナリドマイド、リポドックス（LipoDox）（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサフォル）、ネオザール（Neosar）（シクロホスファミド）、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸エステル）、パミドロン酸二ナトリウム、パノビノスタット、プレリキサフォル、ポマリドマイド、ポマリスト（ポマリドマイド）、レブリミド（レナリドマイド）、シノビル（Synovir）（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（Thalomid）（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２３２】
本開示のＴ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎプロセスは、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒの細胞培養バッグ、Ｇ−Ｒｅｘフラスコ、または任意の他の好適な容器および／または反応器で生じることができる。
【０２３３】
本開示の細胞またはＴ細胞培養物は、安定に維持され、揺すられ、旋回され、または振盪されてもよい。
【０２３４】
本開示の細胞またはＴ細胞増殖プロセスは、これらに限定されないが、培養期間、細胞濃度、Ｔ細胞培地添加／除去のスケジュール、細胞サイズ、総細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、増殖する細胞集団における遺伝子修飾細胞の百分率、サプリメントの使用および組成、エキスパンダー技術の追加／除去、またはこれらの任意の組み合わせを含む、特定の条件を最適化することができる。
【０２３５】
本開示の細胞またはＴ細胞増殖プロセスは、結果生じる増殖した細胞集団の形成前の予め規定された終点まで継続することができる。例えば、本開示の細胞またはＴ細胞増殖プロセスは、予め決定された時間継続することができる：少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間；少なくとも１、２、３、４、５、６ヵ月、または少なくとも１年。本開示の細胞またはＴ細胞増殖プロセスは、結果生じる培養物が予め決定された全体細胞密度に達するまで継続することができる：容積（μｌ、ｍｌ、Ｌ）当たり１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個の細胞またはその間の任意の密度。本開示の細胞またはＴ細胞増殖プロセスは、結果生じる培養物の遺伝子修飾細胞が本開示のトランスポゾンの発現の予め決定されたレベルを示すまで継続することができる：１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％またはその間の任意の百分率の発現閾値レベル（発現の最小、最大または平均レベルは、結果生じた遺伝子修飾細胞が臨床的に効果的であることを示している）。本開示の細胞またはＴ細胞増殖プロセスは、非修飾細胞の割合に対する結果生じる培養物の遺伝子修飾細胞の割合が予め決定された閾値に達するまで継続することができる：少なくとも１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１またはこの間の任意の比。
【０２３６】
リリースのための遺伝子修飾自己Ｔ細胞の分析
遺伝子修飾細胞の百分率は本開示の増殖プロセスの間または後に評価することができる。本開示の遺伝子修飾細胞によるトランスポゾンの細胞における発現は、蛍光標示細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。例えば、ＦＡＣＳは、本開示のＣＡＲを発現している細胞またはＴ細胞の百分率を決定するために使用することができる。あるいは、または加えて、遺伝子修飾細胞またはＴ細胞の純度、本開示の遺伝子修飾細胞またはＴ細胞によって発現されたＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒および／または殺滅を媒介するＣＡＲの能力、および／またはＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型を評価することができる。
【０２３７】
被験体への投与を意図する本開示の組成物は、組成物が安全であり、医薬品としての製剤および／または被験体への投与に効果的であることを示す１つまたは複数の「リリース基準」を満たす必要があることがある。リリース基準は、本開示の組成物（例えば、本開示のＴ細胞産物）が、それらの細胞表面上に検出可能なレベルの本開示のＣＡＲを発現するＴ細胞の特定の百分率を含む要件を含んでもよい。
【０２３８】
増殖プロセスは、特定の基準が満たされるまで継続するべきである（例えば、特定の総数の細胞を達成すること、メモリー細胞の特別な集団を達成すること、特定のサイズの集団を達成すること）。
【０２３９】
特定の基準は増殖プロセスが終わるべき時点で信号を送る。例えば、細胞は、細胞サイズが３００ｆＬに達すると、製剤化、再活性化、または凍結保存されるべきである（そうでなければ、この閾値を超えたサイズに達する細胞は死に始めることがある）。細胞の集団が３００ｆＬより少ない平均細胞サイズに達してすぐの凍結保存は、細胞が凍結保存前に完全に静止した状態に達していないため解凍および培養時によりよい細胞の回復をもたらすことがある（完全な静止サイズはおおよそ１８０ｆＬである）。増殖の前に、本開示のＴ細胞は約１８０ｆＬの細胞サイズを有することがあるが、増殖後３日では、それらの細胞サイズは４倍より大きくなり、おおよそ９００ｆＬになることがある。次の６〜１２日間にわたり、Ｔ細胞の集団はゆっくりと細胞サイズを減少させ、１８０ｆＬで完全に静止する。
【０２４０】
製剤のための細胞集団を調製するプロセスは、これらに限定されないが、細胞集団の細胞を濃縮するステップ、細胞を洗浄するステップ、および／または薬物耐性もしくは特定の表面発現マーカーに対する磁性ビーズのソーティングを介する細胞のさらなる選択のステップを含みうる。製剤のための細胞集団を調製するプロセスは、最終産物の安全性および純度を確実にするソーティングステップをさらに含みうる。例えば、患者由来の腫瘍細胞が、本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するために使用されていた場合、または患者由来の腫瘍細胞が、製剤のために調製されている本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するために遺伝子修飾されていた場合、患者由来の腫瘍細胞が最終産物に含まれないことが重要である。
【０２４１】
細胞産物注入および／または注入のための凍結保存
本開示の医薬製剤は、注入、凍結保存、および／または保管のためにバッグに分配されてもよい。
【０２４２】
本開示の医薬製剤は、標準的なプロトコール、および任意選択で注入可能な凍結保存培地を使用して凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（cryopreservant）（例えば、ＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ（商標）ＤＭＳＯ不含凍結保存培地）が使用して、凍結関連毒性を低減することができる。本開示の凍結保存された医薬製剤は、後日患者への注入のために保管することができる。有効な処置は、本開示の医薬製剤の複数回投与を必要とすることがあり、したがって、医薬製剤は、凍結して保管することができるが個々の用量の解凍のために分けられた予めアリコートにされた「用量」で包装されてもよい。
【０２４３】
本開示の医薬製剤は、室温で保管してもよい。有効な処置は、本開示の医薬製剤の複数回投与を必要とすることがあり、したがって、医薬製剤は、一緒に保管することができるが個々の用量の投与のために分けられた予めアリコートにされた「用量」で包装されてもよい。
【０２４４】
本開示の医薬製剤は、将来、例えば状態の寛解および再発後、同種異系療法の場合に投与が必要でありうる同じ患者へのさらなる用量の生成のための、その後の再増殖および／または選択のために記録することができる。
【０２４５】
製剤
上述のように、本開示は、薬学的に許容される製剤中に少なくとも１つのタンパク質足場を含む、リン酸緩衝液と食塩水または選択された塩を好ましくは含む安定した製剤、ならびに保存薬を含有する保存溶液および製剤、ならびに薬学的または獣医学的使用に好適な複数回使用用保存製剤を提供する。保存製剤は、少なくとも１つの公知保存薬、または任意選択で、水性希釈剤中の少なくとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、ポリマーまたはこれらの混合物からなる群より選択されるものを含有する。約０．００１５％、または任意の範囲、値もしくはその中の部分などの、当技術分野において公知であるような任意の好適な濃度または混合物を使用することができる。非限定的な例は、保存薬なし、約０．１〜２％ｍ−クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１〜３％ベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、約０．００１〜０．５％チメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、約０．００１〜２．０％フェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などを含む。
【０２４６】
上述のように、本発明は、包装材料と、任意選択で水性希釈剤中の、処方された緩衝剤および／または保存薬を有する少なくとも１つのタンパク質足場の溶液を含む少なくとも１つのバイアルとを含む製造品であって、前記包装材料が、そのような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間またはそれより長時間の期間にわたって保持することができることを示すラベルを含む、製造品を提供する。本発明は、包装材料と、凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場を含む第１のバイアルと、処方された緩衝剤または保存薬の水性希釈剤を含む第２のバイアルとを含む製造品であって、前記包装材料が、水性希釈剤中の少なくとも１つのタンパク質足場を再構成して、２４時間またはそれより長時間の期間にわたって保持することができる溶液を形成するように患者に指示するラベルを含む、製造品をさらに含む。
【０２４７】
本発明に従って使用される少なくとも１つのタンパク質足場は、哺乳動物細胞またはトランスジェニック調製物からのものを含む、組換え手段により産生させることができ、または本明細書に記載されるような、もしくは当技術分野において公知であるような他の生物学的供給源から精製することができる。
【０２４８】
本発明の製品中の少なくとも１つのタンパク質足場の範囲は、再構成時に得られる量、湿潤／乾燥系での場合、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を含むがより低濃度およびより高濃度が使用可能であり、所期の送達ビヒクルに依存し、例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、経肺、経粘膜、または浸透圧もしくはマイクロポンプ法とは異なる。
【０２４９】
好ましくは、水性希釈剤は、任意選択で、薬学的に許容される保存薬をさらに含む。好ましい保存薬は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはこれらの混合物からなる群より選択されるものを含む。製剤に使用される保存薬の濃度は、抗菌効果を生じさせるのに十分な濃度である。そのような濃度は、選択される保存薬に依存し、当業者によって容易に決定される。
【０２５０】
他の賦形剤、例えば、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、緩衝剤、抗酸化剤、および保存向上剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）を希釈剤に、任意選択で、および好ましくは、添加することができる。グリセリンなどの等張剤は、公知の濃度で一般に使用される。生理学的に忍容される緩衝剤が、改善されたｐＨ制御を提供するために添加されるのが好ましい。製剤は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０、および約ｐＨ５〜約ｐＨ９の好ましい範囲、および約６．０〜約８．０の最も好ましい範囲などの、広範なｐＨに及びうる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８〜約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝液、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【０２５１】
他の添加剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（モノパルミチン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（ポリオキシエチレン・ポリプロピレンブロックコポリマー）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような、薬学的に許容される可溶化剤；またはポリソルベート２０もしくは８０またはポロクサマー１８４もしくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール（ｐｏｌｙｌ）、他のブロックコポリマーなどの、非イオン性界面活性剤；ならびにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡなどのキレート剤を、任意選択で、凝集を低減させるために製剤または組成物に添加することができる。これらの添加剤は、製剤を投与するためにポンプまたはプラスチック容器が使用される場合、特に有用である。薬学的に許容される界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を弱める。
【０２５２】
本発明の製剤は、水性希釈剤中において、少なくとも１つのタンパク質足場と、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールまたはこれらの混合物からなる群より選択される保存薬とを混合するステップを含む方法により調製することができる。水性希釈剤中において、少なくとも１つのタンパク質足場と、保存薬とを混合するステップは、従来の溶解および混合手順を使用して行われる。好適な製剤を調製するために、例えば、緩衝溶液中の測定された量の少なくとも１つのタンパク質足場を、緩衝溶液中の所望の保存薬と、所望の濃度のタンパク質および保存薬を提供するのに十分な量で併せる。この方法のバリエーションは、当業者には認識される。例えば、成分が添加される順序、さらなる添加剤が使用されるかどうか、製剤が調製される温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段に合わせて最適化することができる因子である。
【０２５３】
特許請求される製剤を、患者に、透明溶液として提供することができ、あるいは再構成される凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場のバイアルと、水、水性希釈剤中の保存薬および／または賦形剤、好ましくは、リン酸緩衝液および／もしくは食塩水および選択された塩を収容している第２のバイアルを含む、デュアルバイアルとして、提供することができる。単一の溶液バイアルかまたは再構成を必要とするデュアルバイアルを、複数回再使用することができ、そのようなバイアルは、患者の単一または複数の処置サイクルに十分なものでありうるため、現在利用可能な処置レジメンより便利な処置レジメンを提供することができる。
【０２５４】
特許請求される本製造品は、即時から２４時間またはそれより長時間に及ぶ期間にわたる投与に有用である。したがって、今般特許請求される製造品は、患者に有意な利点をもたらす。本発明の製剤は、任意選択で、約２℃〜約４０℃の温度で安全に保管することができ、かつタンパク質の生物活性を長期間保持することができるため、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２もしくは９６時間またはそれより長時間の期間にわたって保持および／または使用することができることを示すパッケージラベルが許容される。保存希釈剤が使用される場合、そのようなラベルは、１〜１２カ月、半年、１年半および／または２年までの使用を含むことができる。
【０２５５】
本発明の少なくとも１つのタンパク質足場の溶液は、水性希釈剤の中の少なくとも１つのタンパク質足場を混合するステップを含む方法により調製することができる。混合するステップは、従来の溶解および混合手順を使用して行われる。好適な希釈剤を調製するために、例えば、水または緩衝液中の測定された量の少なくとも１つのタンパク質足場を、所望の濃度のタンパク質および任意選択で保存薬または緩衝剤を提供するのに十分な量で併せる。この方法のバリエーションは、当業者には認識される。例えば、成分が添加される順序、さらなる添加剤が使用されるかどうか、製剤が調製される温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段に合わせて最適化することができる因子である。
【０２５６】
特許請求される製品を、患者に、透明溶液として提供することができ、または再構成される凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場のバイアルと、水性希釈剤を収容している第２のバイアルを含む、デュアルバイアルとして、提供することができる。単一の溶液バイアルかまたは再構成を必要とするデュアルバイアルを、複数回再使用することができ、そのようなバイアルは、患者の単一または複数の処置サイクルに十分なものでありうるため、現在利用可能な処置レジメンより便利な処置レジメンを提供する。
【０２５７】
薬局、診療所または他のそのような機関および施設に、透明溶液を提供することにより、または再構成される凍結乾燥された少なくとも１つのタンパク質足場のバイアルと、水性希釈剤を収容している第２のバイアルを含む、デュアルバイアルを提供することにより、特許請求される製品を患者に間接的に提供することができる。この場合の透明溶液は、最大１リットルまたはさらにはそれより大きいサイズであってもよく、したがって、大型のリザーバを提供することができ、このリザーバから、少なくとも１つのタンパク質足場溶液のより少ない分量を、より小さいバイアルに移すために１回または複数回取り出すことができ、薬局または診療所によって顧客および／または患者に提供することができる。
【０２５８】
単一バイアルシステムを含む認知されているデバイスは、溶液を送達するためのペン型注射器デバイス、例えば、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏｊｅｃｔ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｏｒｅｇ．（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ、ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．、ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）により作製または開発されたような、ＢＤ  Ｐｅｎ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、およびＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ−ｔｉｐ  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）、および同様に好適なデバイスを含む。デュアルバイアルシステムを含む認知されているデバイスは、再構成された溶液の送達のためのカートリッジ内で凍結乾燥薬物を再構成するペン型注射器システム、例えば、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）を含む。好適な他のデバイスの例は、充填済みシリンジ、自動注射器、無針注射器、および無針ＩＶ注入セットを含む。
【０２５９】
今般特許請求される製品は、包装材料を含む。包装材料は、監督機関により求められる情報に加えて、製品を使用することができる条件を提供する。本発明の包装材料は、少なくとも１つのタンパク質足場を水性希釈剤で再構成して溶液を形成するための指示、およびその溶液を２バイアル、湿潤／乾燥、製品については２〜２４時間またはそれより長時間の期間にわたって使用するための指示を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品については、ラベルは、そのような溶液を２〜２４時間またはそれより長時間の期間にわたって使用することができることを示す。今般特許請求される製品は、ヒトでの薬学的製品の使用に有用である。
【０２６０】
本発明の製剤は、少なくとも１つのタンパク質足場と選択された緩衝剤、好ましくは、食塩水または選択された塩を含有するリン酸緩衝液とを混合するステップを含む方法により、調製することができる。水性希釈剤中において少なくとも１つのタンパク質足場と緩衝剤とを混合するステップは、従来の溶解および混合手順を使用して行われる。好適な製剤を調製するために、例えば、水または緩衝液中の測定された量の少なくとも１つのタンパク質足場を、水中の所望の緩衝化剤と、所望の濃度のタンパク質および緩衝剤を提供するのに十分な量で併せる。この方法のバリエーションは、当業者には認識される。例えば、成分が添加される順序、さらなる添加剤が使用されるかどうか、製剤が調製される温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段に合わせて最適化することができる因子である。
【０２６１】
特許請求される安定または保存製剤を、患者に、透明溶液として提供することができ、または再構成される凍結乾燥されたタンパク質足場のバイアルと、水性希釈剤中の保存薬もしくは緩衝剤および賦形剤を収容している第２のバイアルを含む、デュアルバイアルとして、提供することができる。単一溶液バイアルかまたは再構成を必要とするデュアルバイアルを、複数回再使用することができ、そのようなバイアルは、患者の単一または複数の処置サイクルに十分なものでありうるため、現在利用可能な処置レジメンより便利な処置レジメンを提供する。
【０２６２】
タンパク質足場を安定化する他の製剤または方法は、タンパク質足場を含む凍結乾燥粉末の透明溶液以外のものをもたらすことがある。非透明溶液には、微粒子懸濁物を含む製剤もあり、前記微粒子は、可変寸法の構造であって、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェアまたはリポソームとして様々に公知である構造のタンパク質足場を含有する組成物である。活性薬剤を含有する、そのような比較的均一な、本質的に球形の、微粒子製剤は、米国特許第４，５８９，３３０号で教示されているように、活性薬剤およびポリマーを含有する水性相と非水性相を接触させ、その後、非水性相を蒸発させて、水性相からの粒子を合体させることによって形成することができる。多孔質マイクロ粒子は、米国特許第４，８１８，５４２号で教示されているように、連続溶媒に分散された活性薬剤およびポリマーを含有する第１の相を使用し、フリーズドライまたは希釈−抽出−沈殿により懸濁物から前記溶媒を除去して、調製することができる。そのような調製に好ましいポリマーは、ゼラチン  寒天、デンプン、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｅｄ）、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（イプシロン（ｅｐｉｓｉｌｏｎ）−カプロラクトン）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルタミド）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン／エチレングリコール／１，６−ジイソシアナトヘキサン）およびポリ（メチルメタクリレート）からなる群より選択される、天然または合成コポリマーまたはポリマーである。特に好ましいポリマーは、ポリエステル、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、およびポリ（イプシロン−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）である。ポリマーおよび／または活性薬剤を溶解するのに有用な溶媒は、水、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンゼン、またはヘキサフルオロアセトン・セスキ水和物を含む。活性薬剤含有相を第２の相とともに分散させる方法は、前記第１の相に圧力をかけて強制的にノズルの開口部を通して、液滴の形成を果すことを含みうる。
【０２６３】
乾燥粉末製剤は、凍結乾燥以外の方法、例えば、噴霧乾燥、または蒸発による溶媒抽出による方法、または結晶質組成物の沈殿、それに続いての水性もしくは非水性溶媒を除去する１もしくは複数のステップによる方法の結果として得ることができる。噴霧乾燥タンパク質足場調製物の調製は、米国特許第６，０１９，９６８号で教示されている。タンパク質足場に基づく乾燥粉末組成物は、溶媒中のタンパク質足場および任意選択で賦形剤の溶液またはスラリーを、吸入可能な乾燥粉末をもたらす条件下で噴霧乾燥させることによって生成することができる。溶媒は、容易に乾燥させることができる極性化合物、例えば、水およびエタノールを含むことができる。タンパク質足場の安定性は、酸素の非存在下で、例えば、窒素ブランケットのもとで、または乾燥ガスとして窒素を使用することにより、噴霧乾燥手順を行うことによって、増強することができる。別の比較的乾燥した製剤は、ＷＯ９９１６４１９で教示されているように、ヒドロフルオロアルカン噴霧体を通常は含む懸濁媒体に分散された複数の有孔微細構造の分散物である。安定化した分散物を、定量吸入器を使用して患者の肺に投与することができる。噴霧乾燥された医薬の商業的製造に有用な装置は、Ｂｕｃｈｉ  Ｌｔｄ．またはＮｉｒｏ  Ｃｏｒｐ．により製造されている。
【０２６４】
本明細書に記載の安定または保存製剤または溶液のいずれかにおける少なくとも１つのタンパク質足場は、本発明に従って、様々な送達方法によって、患者に投与することができ、そのような方法は、当技術分野において周知であるような、ＳＣもしくはＩＭ注射、経皮、経肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、または当業者に認められている他の手段を含む。
【０２６５】
治療適用
本発明は、当技術分野において公知であるような、または本明細書に記載されるような、細胞、組織、器官、動物または患者における疾患をモジュレートまたは処置する方法であって、本発明の少なくとも１つのタンパク質足場を使用して、例えば、細胞、組織、器官、動物もしくは患者に治療有効量のタンパク質足場を投与して、または細胞、組織、器官、動物もしくは患者を治療有効量のタンパク質足場と接触させて、モジュレートまたは処置する方法も提供する。本発明は、細胞、組織、器官、動物または患者における、これに限定されないが悪性疾患を含む、疾患をモジュレートまたは処置する方法も提供する。
【０２６６】
本発明は、細胞、組織、器官、動物または患者における、これらに限定されないが、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄系白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性疾患に伴う高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭部がん、頸部がん、遺伝性非ポリポーシスがん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞癌、精巣がん、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、がん関連骨吸収、がん関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの悪性疾患をモジュレートまたは処置する方法も提供する。
【０２６７】
本発明のいずれの方法も、少なくとも１つのタンパク質足場を含む組成物または医薬組成物の有効量を、そのようなモジュレーション、処置または治療を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に投与するステップを含むことができる。そのような方法は、そのような疾患または障害を処置するための共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）または併用療法であって、前記少なくとも１つのタンパク質足場、その指定部分または改変体の投与が、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤および放射性薬品のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１つの前に、それと同時に、および／またはその後に投与するステップをさらに含む、共投与または併用療法を任意選択でさらに含むことができる。好適な投薬量は、当技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓら編、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．（２０００年）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００、豪華版、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ、Ｃａｌｉｆ．（２０００年）；Ｎｕｒｓｉｎｇ  ２００１  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ、第２１版、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ、Ｐａ．、２００１年；Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｇｕｉｄｅ  ２００１、Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｓｔａｎｇ編、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，  Ｉｎｃ、Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ、Ｎ．Ｊ．を参照されたく、これらの参照文献の各々は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０２６８】
好ましい用量は、約０．１〜９９および／もしくは１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはその任意の範囲、値もしくは部分、あるいは単回もしくは複数回の投与により血清中濃度約０．１〜５０００μｇ／ｍｌという血清中濃度を達成するための用量、またはその任意の範囲、値もしくは部分を任意選択で含むことができる。本発明のタンパク質足場の好ましい投薬量範囲は、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇから約３、約６または約１２ｍｇまでである。
【０２６９】
あるいは、投与される投薬量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびにその投与方式および経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度、同時の処置の種類、処置の頻度、ならびに所望される効果などの、公知の因子に依存して変わりうる。通例、活性成分の投薬量は、体重１キログラム当たり約０．１〜１００ミリグラムでありうる。１投与当たりまたは徐放形態で、１キログラムにつき通常は０．１〜５０および好ましくは０．１〜１０ミリグラムが、所望の結果を得るのに有効である。
【０２７０】
非限定的な例として、単回用量、注入用量または反復用量を使用して、１〜４０日目の少なくとも１時点、または代替的にもしくは加えて１〜５２週目の少なくとも１時点、または代替的にもしくは加えて１〜２０年の少なくとも１時点、またはこれらの任意の組み合わせの時点において、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇまたはその任意の範囲、値もしくは部分の、本発明の少なくとも１つのタンパク質足場の１回のまたは定期的な投薬量として、ヒトまたは動物の処置を提供することができる。
【０２７１】
内部投与に好適な剤形（組成物）は、一般に、１単位または１容器当たり約０．００１ミリグラム〜約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの医薬組成物中の活性成分は、通常、組成物の全重量に基づいて約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在することになる。
【０２７２】
非経口投与のために、タンパク質足場を、薬学的に許容される非経口用ビヒクルと会合している、またはそれと別々に提供される、溶液、懸濁物、エマルジョン、粒子、粉末または凍結乾燥粉末として、製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および約１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も、使用することができる。ビヒクルまたは凍結乾燥粉末は、等張性を維持するための添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持するための添加剤（例えば、緩衝剤および保存薬）を含有することができる。製剤は、公知のまたは好適な技術により滅菌される。
【０２７３】
好適な医薬担体は、当分野の標準参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．  Ｏｓｏｌの最新版に記載されている。
【０２７４】
代替的な投与
本発明による少なくとも１つのタンパク質足場の薬学的有効量を投与するために、多くの公知のおよび開発された方式を、本発明に従って使用することができる。経肺投与が下記の説明の中で使用されるが、他の投与方式を本発明に従って好適な結果で使用することができる。ここで説明されるまたは当技術分野において公知の吸入または他の方式による投与に好適な様々なデバイスおよび方法のいずれかを使用して、担体の中の、溶液、エマルジョン、コロイドもしくは懸濁物としての、または乾燥粉末としての、本発明のタンパク質足場を送達することができる。
【０２７５】
非経口製剤および投与
非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として、滅菌水または食塩水、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含有することができる。注射用の水性または油性懸濁物は、公知の方法に従って、適切な乳化剤または湿潤剤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｒ）および懸濁化剤を使用することにより、調製することができる。注射用の薬剤は、水溶液、溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁物などの、非毒性で非経口投与可能な希釈剤でありうる。使用可能なビヒクルまたは溶媒として、水、リンゲル液、等張食塩水などが許容される。通常の溶媒または懸濁溶媒として、滅菌不揮発性油を使用することができる。これらのために、天然または合成または半合成脂肪油または脂肪酸、天然または合成または半合成モノまたはジまたはトリグリセリドを含む、任意の種類の不揮発性油および脂肪酸を使用することができる。非経口投与は当技術分野において公知であり、非経口投与は、これらに限定されないが、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているようなガス加圧式無針注射デバイス、および米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているようなレーザー穿孔デバイス（ｌａｓｅｒ  ｐｅｒｆｏｒａｔｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を含み、特許文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０２７６】
代替的な送達
本発明は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、経膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内または経皮手段による、少なくとも１つのタンパク質足場の投与に、さらに関する。少なくとも１つのタンパク質足場組成物は、非経口（皮下、筋肉内もしくは静脈内）または任意の他の投与に使用するために、特に、溶液または懸濁物の形態で調製することができ；経膣または直腸投与の際に使用するために、特に、これらに限定されないがクリームおよび坐剤などの、半固体形態で調製することができ；頬側または舌下投与のために、例えば、これらに限定されないが、錠剤またはカプセルの形態で調製することができ；または鼻腔内使用のために、例えば、これらに限定されないが、粉末、点鼻薬（ｎａｓａｌ  ｄｒｏｐ）またはエアロゾルまたはある特定薬剤の形態で調製することができ；または経皮使用のために、例えば、これらに限定されないが、皮膚構造を修飾するためのもしくは経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるためのジメチルスルホキシドなどの化学的促進剤（全体が参照により本明細書に援用される、Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒら、「Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」、Ｈｓｉｅｈ，  Ｄ．  Ｓ．編、５９〜９０頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４年））を伴う、あるいはタンパク質およびペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布（ＷＯ９８／５３８４７）を可能にする、またはエレクトロポレーションなどの、一過性輸送経路を生じさせるための、もしくはイオントフォレーシスなどの、皮膚を通しての荷電薬物の移動を増加させるための電場の印加、またはソノフォレーシスなどの、超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号および同第４，７６７，４０２号）を可能にする、酸化剤を伴う、ゲル、軟膏、ローション、懸濁物またはパッチ送達システムの形態で調製することができる（上記刊行物および特許は、全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２７７】
経肺／経鼻投与
経肺投与のために、好ましくは、少なくとも１つのタンパク質足場組成物は、肺の下気道または洞への到達に有効な粒径で送達される。本発明によれば、少なくとも１つのタンパク質足場を、吸入による治療剤の投与のための当技術分野において公知の様々な吸入または鼻用デバイスのいずれによっても送達することができる。患者の洞または肺胞内にエアロゾル化した製剤を堆積させることができるこれらのデバイスは、定量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、噴霧器などを含む。タンパク質足場の経肺または経鼻投与を導くのに好適な他のデバイスも、当技術分野において公知である。すべてのそのようなデバイスは、エアロゾルでタンパク質足場を調剤するための投与に好適な製剤を使用することができる。そのようなエアロゾルは、溶液（水性および非水性両方）からなってもよく、または固体粒子からなってもよく。
【０２７８】
Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器のような定量吸入器は、通常は噴霧体ガスを使用し、吸息中に作動する必要がある（例えば、ＷＯ９４／１６９７０、ＷＯ９８／３５８８８を参照されたい）。Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｓｐｉｒｏｓ（商標）吸入器（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより販売されているデバイス、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）のような、乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を使用する（全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，６６８，２１８号  Ａｓｔｒａ、欧州特許第２３７５０７号  Ａｓｔｒａ、ＷＯ９７／２５０８６  Ｇｌａｘｏ、ＷＯ９４／０８５５２  Ｄｕｒａ、米国特許第５，４５８，１３５号  Ｉｎｈａｌｅ、ＷＯ９４／０６４９８  Ｆｉｓｏｎｓ）。ＡＥＲｘ（商標）Ａｒａｄｉｇｍ、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、およびＡｃｏｒｎ  ＩＩ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５，４０４，８７１号  Ａｒａｄｉｇｍ、ＷＯ９７／２２３７６）のようなネブライザー（上記参照文献は、全体が参照により本明細書に援用される）は、溶液からエアロゾルを生じさせるが、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは、小粒子エアロゾルを発生させる。市販の吸入デバイスのこれらの具体的な例は、本発明の実施に好適な具体的なデバイスの代表であることを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図したものではない。
【０２７９】
好ましくは、少なくとも１つのタンパク質足場を含む組成物は、乾燥粉末吸入器または噴霧器により送達される。本発明の少なくとも１つのタンパク質足場を投与するための吸入デバイスについてのいくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利なことに、信頼性があり、再現性があり、正確である。吸入デバイスは、良好に呼吸できるように、任意選択で、小さい乾燥粒子、例えば、約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍの乾燥粒子を送達することができる。
【０２８０】
噴霧剤（ｓｐｒａｙ）としてのタンパク質足場組成物の投与
タンパク質足場組成物を含む噴霧剤は、圧力下で、少なくとも１つのタンパク質足場の懸濁物または溶液を強制的にノズルに通すことにより生じさせることができる。所望のアウトプットおよび粒径を獲得するために、ノズルのサイズおよび構成、印加圧力ならびに液体供給速度を選択することができる。例えば、毛管またはノズルフィードと接続している電場により、エレクトロスプレーを生じさせることができる。有利なことに、噴霧器により送達される少なくとも１つのタンパク質足場組成物の粒子は、約１０μｍ未満の粒径、好ましくは約１μｍ〜約５μｍおよび最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの範囲の粒径を有する。
【０２８１】
噴霧器での使用に好適な少なくとも１つのタンパク質足場組成物の製剤は、通常、水溶液中のタンパク質足場組成物を、溶液１ｍｌ当たり少なくとも１つのタンパク質足場組成物約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、もしくはｍｇ／ｇｍ、またはその中の任意の範囲、値もしくは部分の濃度で含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存薬、界面活性剤および好ましくは亜鉛などの、薬剤を含むことができる。製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物などの、タンパク質足場組成物の安定化のための賦形剤または薬剤も含むことができる。タンパク質足場組成物の製剤化に有用なバルクタンパク質は、アルブミン、プロタミンなどを含む。タンパク質足場組成物の製剤化に有用な典型的な炭水化物は、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどを含む。タンパク質足場組成物製剤は、エアロゾルの形成中の溶液の霧化により引き起こされるタンパク質足場組成物の表面誘起凝集を低減または防止することができる、界面活性剤も含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの、様々な従来の界面活性剤を、用いることができる。量は、一般に、製剤の０．００１〜１４重量％の間の範囲である。本発明のために特に好ましい界面活性剤は、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。タンパク質足場などのタンパク質、または指定部分もしくは改変体の製剤のための当技術分野において公知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。
【０２８２】
ネブライザーによるタンパク質足場組成物の投与
本発明のタンパク質足場組成物を、ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの、ネブライザーにより投与することができる。通常は、ジェットネブライザーの場合、圧縮空気源を使用して、開口部を通して高速空気ジェットを生じさせる。ガスがノズルを越えて膨張すると、低圧領域が作られ、それにより、液体レザバに接続された毛管を通してタンパク質足場組成物の溶液が引っ張られる。毛管からの液体流は、毛管から出ると剪断されて不安定なフィラメントおよび液滴になり、その結果、エアロゾルが生じる。所与のジェットネブライザーから所望の性能特性を獲得するために、様々な構成、流速、およびバッフルのタイプを用いることができる。超音波ネブライザーの場合、高周波電気エネルギーを使用して、通常は圧電変換器を用いて、振動、機械エネルギーを生じさせる。このエネルギーが、タンパク質足場組成物の製剤に、直接、またはカップリング流体を介して伝達され、その結果、タンパク質足場組成物を含むエアロゾルが生じる。有利には、ネブライザーにより送達されるタンパク質足場組成物の粒子は、約１０μｍ未満の粒径、好ましくは約１μｍ〜約５μｍおよび最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの範囲の粒径を有する。
【０２８３】
ジェットまたは超音波のいずれかのネブライザーでの使用に好適な少なくとも１つのタンパク質足場の製剤は、通常は、溶液１ｍｌ当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの濃度の少なくとも１つのタンパク質足場を含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存薬、界面活性剤および好ましくは亜鉛などの、薬剤を含むことができる。製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物などの、少なくとも１つのタンパク質足場組成物の安定化のための賦形剤または薬剤も含むことができる。少なくとも１つのタンパク質足場組成物の製剤化に有用なバルクタンパク質は、アルブミン、プロタミンなどを含む。少なくとも１つのタンパク質足場の製剤化に有用な典型的な炭水化物は、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどを含む。少なくとも１つのタンパク質足場製剤は、エアロゾルの形成中の溶液の霧化により引き起こされる少なくとも１つのタンパク質足場の表面誘起凝集を低減または防止することができる、界面活性剤も含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステルなどの、様々な従来の界面活性剤を、用いることができる。量は、一般に、製剤の約０．００１〜４重量％の間の範囲である。本発明のために特に好ましい界面活性剤は、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。タンパク質足場などのタンパク質の製剤のための当技術分野において公知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。
【０２８４】
定量吸入器によるタンパク質足場組成物の投与
定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴霧体、少なくとも１つのタンパク質足場、および任意の賦形剤または他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物として、キャニスターの中に収容されている。計量弁（ｍｅｔｅｒｉｎｇ  ｖａｌｖｅ）の作動により、混合物が、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、および最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍのサイズ範囲の粒子を好ましくは含有するエアロゾルとして、放出される。ジェットミリング、噴霧乾燥、臨界点凝結などを含む、当業者に公知の様々な方法により産生されたタンパク質足場組成物の製剤を用いることによって、所望のエアロゾル粒径を得ることができる。好ましい定量吸入器は、３ＭまたはＧｌａｘｏにより製造されたおよびヒドロフルオロカーボン噴霧体を用いるものを含む。定量吸入器デバイスで使用するための少なくとも１つのタンパク質足場の製剤は、非水性媒体中の懸濁物、例えば、界面活性剤の補助の下、噴霧体に懸濁された懸濁物として少なくとも１つのタンパク質足場を含有する微細に分割された粉末を、通常は含む。噴霧体は、この目的で用いられる任意の従来の材料、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む）、ＨＦＡ−１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ヒドロフルオロアルカン−２２７）などでありうる。好ましくは、噴霧体は、ヒドロフルオロカーボンである。例えば、噴霧体中の懸濁物として少なくとも１つのタンパク質足場を安定化するために、または活性薬剤を化学的分解から保護するなどのために、界面活性剤を選択することができる。好適な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン、大豆レシチン、オレイン酸などを含む。一部の事例では、エタノールなどの溶媒を使用する溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤のための当技術分野において公知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。本明細書に記載されないデバイスによる少なくとも１つのタンパク質足場組成物の経肺投与により本発明の方法を達成することができることは、当業者には認識される。
【０２８５】
経口製剤および投与
経口投与用の製剤は、腸壁の透過性を人工的に上昇させるためのアジュバント（例えば、レゾルシノールならびに非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテル）の共投与、ならびに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）およびトラジロール）の共投与に依拠する。経口、頬側、粘膜、経鼻、経肺、経膣、膜貫通または直腸投与が意図された、タンパク質とタンパク質足場と少なくとも２つの界面活性剤の組み合わせとを含む親水性薬剤の送達のための製剤は、米国特許第６，３０９，６６３号で教示されている。経口投与のための固体型の剤形の活性成分化合物を、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成または半合成ポリマー、およびグリセリドを含む、少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は、他のタイプの添加剤、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、パラベン、保存剤、例えばソルビン酸、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール、抗酸化剤、例えばシステイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、芳香剤なども含有することができる。
【０２８６】
錠剤および丸剤を腸溶性コーティング調製物にさらに加工することができる。経口投与用の液体調製物は、医学的使用に許容されうるエマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁物および溶液調製物を含む。これらの調製物は、前記分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。インスリンおよびヘパリンのための薬物送達システムとしてリポソームも記載されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。つい最近、混合アミノ酸の人工ポリマー（プロテイノイド）のマイクロスフェアが医薬品を送達するために使用された（米国特許第４，９２５，６７３号）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号および米国特許第５，８７１，７５３号に記載されている担体化合物であって、生物活性薬剤を経口送達するために使用される担体化合物は、当技術分野において公知である。
【０２８７】
粘膜用製剤および投与
生物活性薬剤を経口投与するための製剤であって、マイクロカプセルを生じさせるように１つまたは複数の生体適合性ポリマーまたはコポリマー賦形剤に、好ましくは、１つの生体分解性ポリマーまたはコポリマーにカプセル化されており、活性薬剤が、結果として生じるマイクロカプセルの適正なサイズのため、動物の、他に「パイエル板」または「ＧＡＬＴ」としても公知の集合リンパ小節に到達し吸収され、胃腸管を通過した薬剤に起因する有効性の損失のない、製剤。同様の集合リンパ小節を、気管支（ｂｒｏｎｃｈｅｉ  ｔｕｂｅ）（ＢＡＬＴ）および大腸において見いだすことができる。上記組織は、一般に粘膜関連リンパ組織（ｍｕｃｏｓａｌｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ）（ＭＡＬＴ）と称される。粘膜表面による吸収のために、少なくとも１つのタンパク質足場を投与する組成物および方法は、複数のサブミクロン粒子を含むエマルジョンと、粘膜付着性高分子と、生理活性ペプチドと、水性連続相とを含み、エマルジョン粒子の粘膜付着を達成することにより粘膜表面による吸収を促進する（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明のエマルジョンの適用に好適な粘膜表面は、角膜、結膜、頬側、舌下、経鼻、経膣、経肺、胃、腸および直腸投与経路を含むことができる。経膣または直腸投与用の製剤、例えば坐剤は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオ脂などを含有することができる。鼻腔内投与用の製剤は、固体であってもよく、賦形剤として例えばラクトースを含有することができ、または点鼻薬の水性もしくは油性溶液であってもよい。頬側投与のための賦形剤は、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプン（ｐｒｅｇｅｌｉｎａｔｉｎｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）などを含む（米国特許第５，８４９，６９５号）。
【０２８８】
経皮製剤および投与
経皮投与のために、少なくとも１つのタンパク質足場は、リポソームもしくはポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア（別段の記述がない限り、まとめてマイクロ粒子と称される）などの、送達デバイスにカプセル化される。合成ポリマー、例えば、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびこれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリホスファゼン、ならびに天然ポリマー、例えば、コラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンおよび他のタンパク質、アルギネートおよび他の多糖類、ならびにこれらの組み合わせで作製されたマイクロ粒子を含む、多数の好適なデバイスが公知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。
【０２８９】
長期投与および製剤
長期間にわたって、例えば、単回投与から１週間〜１年の期間、本発明の化合物を被験体に送達することが、望ましいこともある。様々な緩徐放出、デポーまたはインプラント剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液への低い溶解度を有する化合物の薬学的に許容される非毒性塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノもしくはジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸との、酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属陽イオンとの塩、または例えばＮ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成された、有機陽イオンとの塩；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、例えば、亜鉛タンニン酸塩を含有することができる。加えて、本発明の化合物または、好ましくは、今述べたものなどの比較的不溶性の塩を、注射に好適なゲル、例えば、モノステアリン酸アルミニウムの、例えばゴマ油とのゲルに、製剤化することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、亜鉛タンニン酸塩、パモ酸塩などである。注射用の別のタイプの緩徐放出デポー製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されているようなポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどの、緩徐分解性、非毒性、非抗原性ポリマーへのカプセル化のために分散される化合物または塩を含有する。化合物または、好ましくは、上記のものなどの比較的不溶性の塩を、特に動物での使用のために、コレステロールマトリクスシラスティックペレットに製剤化することもできる。さらなる緩徐放出、デポーまたはインプラント製剤、例えば、気体または液体リポソームが、文献で公知である（米国特許第５，７７０，２２２号および「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、１９７８年）。
【０２９０】
養子細胞療法としての修飾細胞の注入
本開示は、本開示の１つまたは複数のＣＡＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する修飾細胞であって、それを必要とする被験体に投与するために選択および／または増殖された修飾細胞を提供する。本開示の修飾細胞は、室温および体温を含む任意の温度で保管するために製剤化することができる。本開示の修飾細胞は、凍結保存およびその後の解凍のために製剤化することができる。本開示の修飾細胞は、滅菌包装からの被験体への直接投与のために薬学的に許容される担体中で製剤化することができる。本開示の修飾細胞は、最低レベルの細胞機能およびＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を保証するための細胞生存度および／またはＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現レベルの指示薬とともに薬学的に許容される担体中で製剤化することができる。本開示の修飾細胞は、さらなる増殖を阻害するためのおよび／または細胞死を防止するための１つまたは複数の試薬とともに処方された密度で薬学的に許容される担体中で製剤化することができる。
【０２９１】
誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、既存の誘導性ポリペプチドより優れている。なぜなら、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのほうが、はるかに免疫原性が低いからである。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、組換えポリペプチドであり、したがって、天然に存在しないが、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを産生するように組み換えられる配列は、宿主ヒト免疫系が「非自己」と認識し、その結果、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞、または誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドもしくは誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞を含む組成物を受容する被験体において、免疫応答を誘導する可能性がある、非ヒト配列を含まない。
【０２９２】
本開示は、リガンド結合領域と、リンカーと、アポトーシス促進性ペプチドとを含む、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドであって、非ヒト配列を含まない誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態では、アポトーシス促進性ペプチドは、カスパーゼポリペプチドである。ある特定の実施形態では、カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ９ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、カスパーゼ９ポリペプチドは、切断型カスパーゼ９ポリペプチドである。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、天然に存在しないものでありうる。
【０２９３】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、これらに限定されないが、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、およびカスパーゼ１４を含む。本開示のカスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびカスパーゼ１０を含む、アポトーシスに関連するカスパーゼポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびカスパーゼ１０を含む、アポトーシスを開始させるカスパーゼポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ３、カスパーゼ６およびカスパーゼ７を含む、アポトーシスを実行するカスパーゼポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０２９４】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して１つまたは複数の修飾を有するアミノ酸または核酸配列によりコードされていてもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列を、コドン最適化することができる。本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸および／または核酸配列への１つまたは複数の修飾は、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、または活性化を増加させることができる。あるいは、または加えて、本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸および／または核酸配列への１つまたは複数の修飾は、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの免疫原性を減少させることができる。
【０２９５】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型カスパーゼポリペプチドと比較して切断されたものであり得る。例えば、カスパーゼポリペプチドは、本開示の誘導性カスパーゼポリペプチドを含む細胞においてアポトーシスを開始させることに加えて局所炎症応答を活性化する可能性を除去または最小化するために、カスパーゼ活性化および動員ドメイン（ＣＡＲＤ）をコードする配列が除去されるように切断されたものであり得る。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列をスプライシングして、野生型カスパーゼポリペプチドと比較して本開示のカスパーゼポリペプチドの改変体アミノ酸配列を形成することができる。本開示のカスパーゼポリペプチドは、組換えおよび／またはキメラ配列によりコードされていてもよい。本開示の組換えおよび／またはキメラカスパーゼポリペプチドは、１つまたは複数の異なるカスパーゼポリペプチドからの配列を含んでもよい。あるいは、または加えて、本開示の組換えおよび／またはキメラカスパーゼポリペプチドは、１種または複数の種からの配列（例えば、ヒト配列および非ヒト配列）を含んでもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドは、天然に存在しないものでありうる。
【０２９６】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域は、本開示の第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドと本開示の第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの二量体化であって、アポトーシス促進性ポリペプチドの架橋および細胞におけるアポトーシスの開始を活性化または誘導する二量体化を助長または促進する、いずれのポリペプチド配列を含んでもよい。
【０２９７】
リガンド結合（「二量体化」）領域は、天然または非天然リガンド（すなわち、誘導剤）、例えば非天然合成リガンドを使用して誘導が可能になる、いずれのポリペプチドまたはその機能性ドメインを含んでもよい。リガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの性質およびリガンド（すなわち、誘導剤）の選択に依存して、細胞膜の内側にあっても、外側にあってもよい。受容体を含む、多種多様なリガンド結合ポリペプチドおよびそれらの機能性ドメインが、公知である。本開示のリガンド結合領域は、受容体からの１つまたは複数の配列を含んでもよい。特に興味深いのは、リガンド（例えば、低分子有機リガンド）が公知であるか、または容易に産生されうる、リガンド結合領域である。これらのリガンド結合領域または受容体は、これらに限定されないが、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体などはもちろん、「非天然」受容体も含むことができ、「非天然」受容体は、抗体、特に重鎖または軽鎖サブユニット、それらの変異した配列、確率的手順、コンビナトリアル合成などにより得られるランダムアミノ酸配列から得ることができる。ある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域（ａ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される。
【０２９８】
１つまたは複数の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、天然ドメインまたはその切断型活性部分のいずれかとしての、少なくとも約５０アミノ酸、かつ約３５０アミノ酸未満、通例、２００アミノ酸未満でありうる。結合領域は、例えば、小さい（ウイルスベクターでの効率的トランスフェクションを可能にするために、＜２５ｋＤａ）こともあり、単量体であることもあり、非免疫原性であることもあり、二量体化できるように構成されうる、合成により入手可能な、細胞透過性、非毒性リガンドを有することもある。
【０２９９】
１つまたは複数の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの設計および適切なリガンド（すなわち、誘導剤）の利用可能性に依存して、細胞内にあることもあり、または細胞外にあることもある。疎水性リガンドについては、結合領域は、膜のどちら側にあってもよいが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドについては、結合領域は、結合に利用可能である形態でリガンドを内在化するための輸送システムがある場合を除き、通常は細胞膜の外側にある。細胞内受容体については、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、または誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むトランスポゾンもしくはベクターは、受容体ドメイン配列の５’もしくは３’にシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードすることもあり、または受容体ドメイン配列の５’に脂質結合シグナル配列を有することもある。受容体ドメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインの間にある場合、受容体ドメインは、細胞外にある。
【０３００】
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖または軽鎖、特に、断片、より特に、可変領域のすべてもしくは一部、または高アフィニティー結合を生じさせるために重鎖と軽鎖の融合体を、本開示のリガンド結合領域として使用することができる。企図される抗体は、免疫応答を誘発せず、一般に、末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）で発現されない細胞外ドメインなどの、異所的に発現されたヒト産物であるものを含む。そのような例は、低アフィニティー神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、および胚性表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）を含むが、これらに限定されない。またさらに、生理的に許容されるハプテン分子に対する抗体を調製し、個々の抗体サブユニットを結合アフィニティーについてスクリーニングすることができる。サブユニットをコードするｃＤＮＡを単離し、定常領域の欠失、可変領域の複数の部分の欠失、可変領域の変異誘発などにより修飾して、リガンドに対する適切なアフィニティーを有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このようにして、ほぼあらゆる生理的に許容されるハプテン化合物を、リガンドとして、またはリガンドのエピトープを得るために、用いることができる。結合領域またはドメインが公知であり、結合のための有用なまたは公知のリガンドがある、天然受容体を、抗体ユニットの代わりに用いることができる。
【０３０１】
受容体を多量体化するために、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域／受容体ドメインのリガンドは、該リガンドが、リガンド受容体領域に各々が結合できる少なくとも２つの結合部位を有することができるという意味で、多量体のもの（すなわち、第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域に結合することができる第１の結合部位、および第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域に結合することができる第２の結合部位を有し、第１および第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域が同一であるかまたは異なる、リガンド）であってもよい。したがって、本明細書で使用される用語「多量体リガンド結合領域」は、多量体リガンドに結合する、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を指す。本開示の多量体リガンドは、二量体リガンドを含む。本開示の二量体リガンドは、リガンド受容体ドメインに結合することができる２つの結合部位を有することができる。ある特定の実施形態では、本開示の多量体リガンドは、個々の分子が、通常は、少なくとも約１５０Ｄａ、かつ約５ｋＤａ未満、通例、約３ｋＤａ未満である、小さい合成有機分子の二量体またはより高次のオリゴマー、通常は約四量体以下である。合成リガンドと受容体の様々なペアを用いることができる。例えば、天然受容体を含む実施形態では、二量体ＦＫ５０６をＦＫＢＰ１２受容体とともに使用することができ、二量体化シクロスポリンＡをシクロフィリン受容体とともに、二量体化エストロゲンをエストロゲン受容体とともに、二量体化グルココルチコイドをグルココルチコイド受容体とともに、二量体化テトラサイクリンをテトラサイクリン受容体とともに、二量体化ビタミンＤをビタミンＤ受容体とともに、などを使用することができる。あるいは、より高次のリガンド、例えば、三量体のものを使用することができる。非天然受容体、例えば、抗体サブユニット、修飾された抗体サブユニット、可撓性リンカーによって隔てられているタンデムでの重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなる一本鎖抗体、または修飾された受容体およびそれらの変異した配列などを含む実施形態のために、多種多様な化合物のいずれを使用してもよい。本開示の多量体リガンドを含むユニットの有意な特徴は、各結合部位が、高いアフィニティーで受容体に結合することができること、および好ましくは、それらのユニットを化学的に二量体化することができることである。また、方法は、リガンドの疎水性／親水性のバランスをとるために利用可能であり、したがって、それらのリガンドは、大半の適用のために、機能的レベルで血清に溶解することができ、さらに原形質膜を通過して拡散することができる。
【０３０２】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの活性化を、例えば、誘導剤により媒介される化学誘導二量体化（ＣＩＤ）によって遂行して、条件付きで制御されるタンパク質またはポリペプチドを産生してもよい。本開示のアポトーシス促進性ポリペプチドは、誘導性であるばかりでなく、これらのポリペプチドの誘導は、不安定な二量体化剤の分解または単量体競合阻害剤の投与に起因して、可逆的でもある。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンド結合領域は、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む。リガンド結合領域が３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、ある特定の実施形態では、誘導剤は、ＡＰ１９０３、合成薬物（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−，１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９Ｃｌ）  ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０；分子量：１４１１．６５））を含みうる。リガンド結合領域が３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、ある特定の実施形態では、誘導剤は、ＡＰ２０１８７（ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−８０−８および分子式：Ｃ８２Ｈ１０７Ｎ５Ｏ２０）を含むことがある。ある特定の実施形態では、誘導剤は、例えばＡＰ１５１０などの、ＡＰ２０１８７類似体である。本明細書で使用される誘導剤ＡＰ２０１８７、ＡＰ１９０３およびＡＰ１５１０は、交換可能に使用されうる。
【０３０４】
ＡＰ１９０３  ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．により製造されており、注射用ＡＰ１９０３薬品は、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．により作製されている。これは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５（２５０ｍｇ／ｍＬ、ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化される。室温で、この製剤は、透明な、やや黄色い溶液である。冷凍すると、この製剤は、可逆的に相転移を経て、その結果、乳白色の溶液が得られる。この相転移は、再び室温に温めると逆転する。充填量は、３ｍＬガラスバイアルに２．３３ｍＬ（１バイアル当たり合計おおよそ１０ｍｇの注射用ＡＰ１９０３）である。ＡＰ１９０３を投与する必要性を決定する際に、例えば、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットを使用して、ＩＶ注入により２時間にわたって単回固定用量の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を患者に投与することができる。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者について個別に算出され、体重が≧１０％変動しない限り、再計算されない。その算出用量が、注入前に、０．９％生理食塩水中、１００ｍＬで希釈される。ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４名の健常ボランティアが、２時間にわたってＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでの注射用ＡＰ１９０３の単回用量で処置された。ＡＰ１９０３血漿中レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたりおおよそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲であった。初回注入期間後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿中レベルが、用量後０．５、２および１０時間の時点で、それぞれ最大濃度のおおよそ１８、７および１％に低下した。注射用ＡＰ１９０３は、すべての用量レベルで安全であり、良好に忍容されたことが示され、有利な薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  Ｊ  Ｄら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４１巻：８７０〜９頁、２００１年。
【０３０５】
使用される注射用ＡＰ１９０３の固定用量は、例えば、２時間にわたって静脈内注入される０．４ｍｇ／ｋｇでありうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の有効なシグナル伝達に必要なＡＰ１９０３の量は、１０〜１００ｎＭ（１６００Ｄａ  ＭＷ）である。これは、１６〜１６０μｇ／Ｌ、または約０．０１６〜１．６μｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋｇ）に等しい。１ｍｇ／ｋｇまでの用量は、上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において良好に忍容された。したがって、０．４ｍｇ／ｋｇは、治療用細胞と組み合わせたこの第Ｉ相研究のＡＰ１９０３についての安全かつ有効な用量でありうる。
【０３０６】
本開示のリガンド結合をコードするアミノ酸および／または核酸配列は、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して配列の１つまたは複数の修飾を含有しうる。例えば、本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸および／または核酸配列は、コドン最適化配列であってもよい。１つまたは複数の修飾は、野生型ポリペプチドと比較して本開示のリガンド結合領域に対するリガンド（例えば、誘導剤）の結合アフィニティーを増加させることができる。あるいは、または加えて、１つまたは複数の修飾は、野生型ポリペプチドと比較して本開示のリガンド結合領域の免疫原性を低下させることができる。本開示のリガンド結合領域および／または本開示の誘導剤は、天然に存在しないものでありうる。
【０３０７】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、リガンド結合領域と、リンカーと、アポトーシス促進性ペプチドとを含み、該誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態では、非ヒト配列は、制限部位を含む。リンカーは、アポトーシス促進性ポリペプチドの相互作用および活性化が細胞におけるアポトーシスを開始させるような、アポトーシス促進性ポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、または活性化を、リガンド結合領域の二量体化時に可能にする、いずれの有機または無機材料を含んでもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ｇ／Ｓリッチアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ＧＳ」リンカー）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むポリペプチドである。好ましい実施形態では、リンカーは、ポリペプチドであり、該ポリペプチドをコードする核酸は、制限エンドヌクレアーゼの制限部位を含有しない。本開示のリンカーは、天然に存在しないものでありうる。
【０３０８】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを、細胞において、その細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始および／または調節することができる任意のプロモーターの転写調節下で、発現させることができる。本明細書で使用される用語「プロモーター」は、遺伝子を転写するためのＲＮＡポリメラーゼの最初の結合部位として作用するプロモーターを指す。例えば、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを、哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始および／または調節することができる任意のプロモーターの転写調節下で、発現させることができ、そのようなプロモーターは、これらに限定されないが、天然、内在性、外来性および異種プロモーターを含む。好ましい哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含む。したがって、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを、ヒト細胞において、ヒト細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始および／または調節することができる任意のプロモーターの転写調節下で、発現させることができ、そのようなプロモーターは、これらに限定されないが、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含む。ヒト細胞における発現のための例示的なプロモーターは、これらに限定されないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β−アクチンプロモーター、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを含み、これらの各々を使用して、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの高レベルの発現を得ることができる。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を達成するための、当技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモーターの使用も、企図されるが、ただし、発現レベルが、細胞においてアポトーシスを開始させるのに十分なものであることを条件とする。周知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現レベルおよび発現パターンを最適化することができる。
【０３０９】
特異的な生理的または合成シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの誘導性発現を可能にすることができる。エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞における目的の遺伝子の発現調節を可能にするように設計される。それは、事実上、導入遺伝子の基礎発現レベルを可能にせず、２００倍を超える誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）を可能にする、厳密に調節された発現メカニズムからなる。このシステムは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づいており、エクジソンまたは類似体、例えばムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａが、受容体に結合し、その受容体が、プロモーターを活性化して、下流導入遺伝子の発現をオンにすると、高レベルのｍＲＮＡ転写物が得られる。このシステムでは、ヘテロ二量体受容体の両方の単量体が１つのベクターから構成的に発現されるが、目的の遺伝子発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にある。したがって、このタイプのシステムの目的のベクターへの操作は、有用でありうる。有用でありうる別の誘導性のシステムは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）またはＴｅｔ−Ｏｎ（商標）システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）であり、該システムは、元々はＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄにより開発された（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：５５４７〜５５５１頁、１９９２年；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８巻：１７６６〜１７６９頁、１９９５年）。このシステムもまた、高レベルの遺伝子発現をテトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンに応答して調節することができるようにする。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）システムでは、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下でオンにされるが、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システムでは、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの非存在下でオンにされる。これらのシステムは、テトラサイクリンオペレーター配列（テトラサイクリンリプレッサーが結合する）と、テトラサイクリンリプレッサータンパク質という、Ｅ．ｃｏｌｉのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節エレメントに基づいている。目的の遺伝子は、プラスミド内の、テトラサイクリン応答性エレメントが内部に存在しているプロモーターの後ろにクローニングされる。第２のプラスミドは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システム内の、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６ドメインと野生型テトラサイクリンリプレッサーとで構成されている、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子と呼ばれる調節エレメントを含有する。したがって、ドキシサイクリンの非存在下では、転写は、構成的にオンである。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）システムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化する。遺伝子療法ベクター産生のために、産生細胞をテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で増殖させ、毒性である可能性のある導入遺伝子の発現��防止することができるように、しかしベクターが患者に導入されたときには遺伝子発現が構成的にオンになるように、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システムを使用することができる。
【０３１０】
一部の状況では、遺伝子療法ベクターにおける導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する異なるウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに依存して利用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｊ．  Ｊ．ら、１９９７年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５巻：６１７〜４８頁において総説されている。あまり強力ではないＣＭＶプロモーターの修飾バージョンも、導入遺伝子の発現レベル低下が所望される場合に使用されてきた。造血細胞における導入遺伝子の発現が所望される場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが、使用されることが多い。所望される効果に依存して使用される他のウイルスプロモーターは、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１Ａ、Ｅ２ＡもしくはＭＬＰ領域からのもの、ＡＡＶ  ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ、ならびにトリ肉腫ウイルスを含む。
【０３１１】
他の例では、発生上調節されている、および特定の分化した細胞において活性であるプロモーターが、選択されることもある。したがって、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞では活性でなくてもよいが、例えば、その多能性幹細胞が、より成熟した細胞に分化した場合には、そのプロモーターは活性化されうる。
【０３１２】
同様に、非標的化組織に対する潜在的毒性または望ましくない効果を低下させるために、組織特異的プロモーターが、特異的組織または細胞における転写を果すために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比較して低減された発現をもたらしうるが、より限られた発現および免疫原性も、もたらしうる（Ｂｏｊａｋ，  Ａ．ら、２００２年、Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０巻：１９７５〜７９頁；Ｃａｚｅａｕｘ．，  Ｎ．ら、２００２年、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０巻：３３２２〜３１頁）。例えば、組織特異的プロモーター、例えばＰＳＡ関連プロモーターもしくは前立腺特異的腺性カリクレイン、または筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子を、必要に応じて使用することができる。
【０３１３】
組織特異的または分化特異的プロモーターの例は、以下のもの：Ｂ２９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単核球細胞）、ＣＤ４３（白血球および血小板）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、デスミン（筋肉）、エラスターゼ−１（膵腺房細胞）、エンドグリン（内皮細胞）、フィブロネクチン（分化している細胞、治癒している組織）、およびＦｌｔ−１（内皮細胞）、ＧＦＡＰ（アストロサイト）を含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
ある特定の適応症では、遺伝子療法ベクターの投与後、特定の時点で転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカイン調節可能であるもののようなプロモーターを用いて行われる。使用することができるサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターは、ＫおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら、（１９８７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻、２３４５〜２３５１頁）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら、（１９８８年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻（８号）、３１９５〜３２０７頁）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら、（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻、１９０５〜１９１２頁）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（ＰｏｌｉおよびＣｏｒｔｅｓｅ、（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、８２０２〜８２０６頁）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９０年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、６１８１〜６１９１頁）、ＩＬ−８、アルファ１酸性糖タンパク質（ＰｒｏｗｓｅおよびＢａｕｍａｎｎ、（１９８８年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、８巻、４２〜５１頁）、アルファ１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、２３９４〜２４０１頁、１９８８年）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら、（１９９１年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、２８８７〜２８９５頁）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸、および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイド誘導性）、ストロメリシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦにより誘導可能）、アルファ２マクログロブリンおよびアルファ１アンチキモトリプシンを含む。他のプロモーターは、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、およびクレアチンを含む。
【０３１５】
単独でのまたは別のものとの組み合わせでの上記プロモーターのいずれかが、所望される作用に依存して有用でありうると、予想される。プロモーター、および他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。加えて、プロモーターのこのリストを徹底的なものとも限定的なものとも見なすべきではなく、他のプロモーターが、本明細書で開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
【実施例】
【０３１６】
（実施例１：Ｐ−ＢＣＭＡ−１０１（別名：抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴｙｒｉｎ（Ａ０８））の特徴付け）
本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎの発現は、ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列のＴ細胞へのｍＲＮＡエレクトロポレーション後に評価された。ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞の機能性は、腫瘍株に対する脱顆粒によって測定された。特徴付けは、機能性との関連をさらにアッセイする。
【０３１７】
図４はＡ０８  抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴｙｒｉｎの構造を示す。
【０３１８】
図５〜８は、Ｐ−ＢＣＭＡ−１０１（Ａ０８  抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする）のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの特徴付けを実証する。
【０３１９】
Ａ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価は、ヒト初代Ｔ細胞のレンチウイルスによる形質導入後の高レベルの表面発現およびＢＣＭＡ＋腫瘍細胞に対する強い細胞傷害性機能（例えば増殖）を実証した（図５Ａ〜Ｃを参照）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこの強力な性能にしたがって、Ａ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎのｉｎ  ｖｉｖｏで機能する能力を評価した。
【０３２０】
図６は、Ａ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎを使用するマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ研究のための処置スケジュールを示す。この研究の結果は、Ｐ−ＢＣＭＡ−１０１（Ａ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする）によって処置されたマウスの１００％が２１日まで生存したことを示す（図７を参照）。２１日目の処置された動物のこの完全な生存は、ゼロ腫瘍量（Ｍ−タンパク質の存在量によって評価、これは２１日目にこれらの動物で検出されなかった）の成果を伴った（図７を参照）。図８は、対照動物ならびにＰ−ＢＣＭＡ−１０１によって処置された動物での腫瘍量をさらに示す一連の写真を提供する。Ａ０８  ＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する動物は対照と比較して腫瘍量の減少を実証する。
【０３２１】
（実施例２：ヒト汎Ｔ細胞へｐｉｇｇｙＢａｃにより組み込まれたｉＣ９安全スイッチの発現および機能）
Ａｍａｘａ  ４Ｄヌクレオフェクターを使用して、４つのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンのうちの１つをヒト汎Ｔ細胞にヌクレオフェクトした。「模擬」条件を受ける修飾Ｔ細胞には、空のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンをヌクレオフェクトした。修飾Ｔ細胞は、治療剤（ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列）のみを含有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、または組み込まれているｉＣ９配列と治療剤（ＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列）とを含有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンのいずれかを受けた。
【０３２２】
図８は、リガンド結合領域と、リンカーと、切断型カスパーゼ９ポリペプチドとを含有するｉＣ９安全スイッチの模式図を提供するものである。具体的には、ｉＣ９ポリペプチドは、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を含むＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む、リガンド結合領域を含有する。ｉＣ９ポリペプチドのＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２４）を含む核酸配列によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を含むアミノ酸、およびＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２６）を含む核酸配列によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域をコードする核酸配列は、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＳＬＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２７）を含むアミノ酸によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域をコードする核酸配列は、ＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡ���ＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号２８）を含む核酸配列によりコードされる。
【０３２３】
ｉＣ９安全スイッチを試験するために、４つの修飾されたＴ細胞の各々を、０、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または１０００ｎＭのＡＰ１９０３（ＡＰ１９０３は誘導剤）とともに２４時間インキュベートした。蛍光インターカレーターである７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を、アポトーシスを受ける細胞のマーカーとして使用して、フローサイトメトリーにより、生存度を評価した。
【０３２４】
細胞生存度は、１２日目に評価した（図９を参照されたい）。データは、ｉＣ９構築物を含有する細胞における誘導剤の濃度増加に伴って右下から左上象限への細胞集団のシフトを示すが、この効果は、ｉＣ９構築物を欠く細胞（ＣＡＲＴｙｒｉｎのみを受けたもの）では観察されず、これらの細胞は、誘導剤の濃度に関係なく、これら２つのエリア間に均等に分布している。さらに、細胞生存度を１９日目に評価した（図１０を参照されたい）。データは、図９（ヌクレオフェクション後１２日目）に示されているのと同じ傾向を見せるが、左上象限への集団のシフトは、このより遅い時点（ヌクレオフェクション後１９日目）でのほうが顕著である。
【０３２５】
凝集結果の定量を行った。それを図１１に提供する。この図１１は、１２日目（図９および左のグラフ）または１９日目（図１０および右のグラフ）のいずれかにおける細胞生存パーセントに対するｉＣ９安全スイッチの有意な影響を、各々の修飾された細胞型についてｉＣ９スイッチの誘導剤（ＡＰ１９０３）の濃度の関数として示す。ｉＣ９安全スイッチの存在は、大多数の細胞において１２日目までにアポトーシスを誘導し、その効果は、１９日目までによりいっそう著しくなる。
【０３２６】
この研究の結果は、ｉＣ９安全スイッチが、誘導剤（例えば、ＡＰ１９０３）と接触すると活性細胞の除去に極めて有効であることを示す。なぜなら、ＡＰ１９０３は、本研究の最低濃度（０．１ｎＭ）ででさえアポトーシスを誘導するからである。さらに、ｉＣ９安全スイッチをトリシストロン性ベクターの一部として機能的に発現させることができる。
【０３２７】
参照による組み入れ
あらゆる相互参照または関連特許または出願を含む、本明細書に引用したすべての文献は、明確な除外または別段の限定がない限り、その全体がここに参照により本明細書に援用される。いずれの文献の引用も、それが、本明細書で開示または特許請求するいずれかの発明に対する先行技術であることを認めるものではなく、それが、単独でまたはいずれかの他の参照文献（単数もしくは複数）との組み合わせで、いずれかのそのような発明を教示、提案または開示していることを認めるものでもない。さらに、本書における用語のいずれかの意味または定義が、参照により援用される文献における同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する場合には、本書における用語に割り当てられた意味または定義が優先するものとする。
【０３２８】
他の実施形態
本開示の特定の実施形態を例証し、説明してきたが、本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な他の変更および修飾を行うことができる。添付の特許請求の範囲の範囲は、本開示の範囲内であるすべてのそのような変更および修飾を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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