(57)【要約】  本発明は、グルカゴン受容体に選択的に結合して活性化し、金属イオンに結合可能なキレート部分を含むエキセンディン−４ペプチドアナログ、および例えばＰＥＴイメージングにおけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
Ｔｚａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ１０−Ｓｅｒ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｘ４０−Ｒ１  （Ｉ）
を有するペプチド化合物であって、
Ｘ２は、Ｓｅｒおよびｄ−Ｓｅｒから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ７は、ＴｈｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、フェニルグリシン、Ｔｈｒ、２−フルオロフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１２は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１３は、Ｇｌｎ、ＴｙｒおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１４は、Ｌｅｕ、ＮｌｅおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｉｂおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１７は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｌａおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＡｌａから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ２０は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、ＬｙｓおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６がＧｌｕであり、Ｘ２０がＬｙｓである場合、Ｘ１６およびＸ２０の側鎖は、ラクタムを介した環状リングを形成してよく、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａおよびβ−Ａｌａから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＧｌｕおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ４０は、Ｃｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）、Ｃｙｓ（ＶＳ−ＮＯ２Ａ）、Ｃｙｓ（ｍａｌ−ＤＯＴＡ）、Ｃｙｓ（ｍａｌ−ＮＯＴＡ）、Ｃｙｓ（ｍａｌ−ＮＯＤＡＧＡ）、Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）、Ｌｙｓ（ＮＯＴＡ）、Ｌｙｓ（ＰＥＧ−ＤＯＴＡ）およびＬｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ２０のアミノ酸の１つがＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）である場合、Ｘ４０は存在しなくてよく、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには、Ｇｄ３＋、Ｇａ３＋、Ｃｕ２＋、（Ａｌ−Ｆ）２＋、Ｙ３＋、Ｔｃ３＋、Ｉｎ３＋、Ｌｕ３＋およびＲｅ３＋から選択される金属イオンが配位してもしなくてもよく、
Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２を表す；
または、それらの金属錯体または塩または溶媒和物。
【請求項２】
Ｘ２は、Ｓｅｒおよびｄ−Ｓｅｒから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ３は、Ｇｌｎであり、
Ｘ７は、ＴｈｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１２は、Ｌｙｓであり、
Ｘ１３は、Ｇｌｎであり、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６は、ＳｅｒおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１７は、ＡｒｇおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇであり、
Ｘ２０は、ＧｌｎおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６がＧｌｕであり、Ｘ２０がＬｙｓである場合、Ｘ１６およびＸ２０の側鎖は、ラクタムを介した環状リングを形成してよく、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａであり、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｇｌｕであり、
Ｘ４０は、Ｃｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）であり、
ＤＯ３Ａには、Ｇｄ３＋、Ｇａ３＋、Ｃｕ２＋、（Ａｌ−Ｆ）２＋、Ｙ３＋、Ｔｃ３＋、Ｉｎ３＋、Ｌｕ３＋およびＲｅ３＋から選択される金属イオンが配位してもしなくてもよく、
Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２を表す、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物；
または、それらの金属錯体または塩または溶媒和物。
【請求項３】
配列番号３〜９０の化合物ならびにそれらの金属錯体、塩または溶媒和物から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
配列番号６、８、１３、１４、３５、３６、４９、５０、６０、６１、７９、８０、８５および８６の化合物ならびにそれらの金属錯体、塩または溶媒和物から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属イオンＧａ３＋が担持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属イオンＧｄ３＋が担持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属放射性ヌクレオチドイオン（Ｃｕ−６４）２＋、（Ｇａ−６８）３＋、（Ａｌ−Ｆ−１８）２＋、（Ｙ−８６）３＋が担持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属放射性ヌクレオチドイオン（Ｇａ−６７）３＋、（Ｔｃ−９９ｍ）３＋、（Ｉｎ−１１１）３＋が担持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには（Ｃｕ−６７）２＋、（Ｙ−９０）３＋、（Ｉｎ−１１１）３＋、（Ｌｕ−１７７）３＋、（Ｒｅ−１８６）３＋および（Ｒｅ−１８８）３＋から選択される金属放射性ヌクレオチドイオンが担持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物、または生理学的に許容される塩またはそれらのいずれかの溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に医薬組成物中に活性剤として存在する請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
生体および関連組織におけるグルカゴン受容体の可視化のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
医学の分野で、特にヒトの医学の分野での使用のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
生体および関連組織におけるグルカゴン受容体のＭＲＩによる可視化のための請求項６に記載の化合物。
【請求項１５】
生体および関連組織におけるグルカゴン受容体のＰＥＴによる可視化のための請求項７に記載の化合物。
【請求項１６】
生体および関連組織におけるグルカゴン受容体のＳＰＥＣＴによる可視化のための請求項８に記載の化合物。
【請求項１７】
放射線療法での使用のための請求項９に記載の化合物。
【請求項１８】
低血糖、血液グルコースレベルの上昇の治療用、またはインスリンを用いた補助療法としての、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
患者の低血糖を治療する方法であって、該患者に有効量の少なくとも１つの請求項１〜９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む前記方法。
【請求項２０】
非経口的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカゴン受容体に選択的に結合して活性化し、金属イオンに結合可能なキレート部分を含むエキセンディン−４ペプチドアナログに関する。好ましい金属イオンは、例えばポジトロン断層法（ＰＥＴ）または単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって検出可能な放射性核種である。得られた化合物は、特に肝臓においてグルカゴン受容体を過剰発現する細胞を視覚化するために有用であり、ならびにグルカゴン受容体の過剰発現を特徴とする神経内分泌腫瘍を検出および治療する方法にも有用である。本発明は、適した薬剤の生産方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液腺によって産生される３９アミノ酸ペプチドである（非特許文献１）。エキセンディン−４は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体の活性化因子であるが、グルカゴン受容体を有意に活性化しない。
【０００３】
エキセンディン−４のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
【０００４】
グルカゴンは、血中グルコースが低い場合、血流中に放出される２９アミノ酸ペプチドである。グルカゴンのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＯＨ
【０００５】
ポジトロン断層法（ＰＥＴ）は、対象の３次元画像を生成することができる、日常的に使用される核医学イメージング技術である。陽電子放出核種を含む適切な放射性トレーサを注入後、陽電子の消滅から生じる一対の直交するガンマ線が検出される。３次元画像は、計算による再構成後に得ることができ；正確な解剖学的な局在は、ＣＴ  Ｘ線スキャンの同時記録によって保証されることが多い。
【０００６】
３次元画像を提供する別の核医学断層撮影イメージング技術は、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）である。この方法は、適した放射性同位体が発するガンマ線を検出することに基づいている。
【０００７】
これらの方法は、代謝活性のモニタリングのために１８−フルオロデオキシグルコースを使用することによって、一般に、組織を検査し、生理学的プロセスをモニターするために利用される。あるいは、マーカー放射性同位体を特定のリガンドに結合させて、特定の組織または受容体、例えばＧＰＣＲに対して特異性を示す放射性リガンドを作製することができる。
【０００８】
ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによる単一受容体タイプの特異的検出は、トレーサーリガンドと目的の受容体との選択的相互作用を必要とする。イメージング部分を有する選択的ＧＬＰ−１受容体アゴニストが記載されている（特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００９】
本発明は、グルカゴン受容体（ＧＣＧ−Ｒ）と選択的に相互作用するイメージングリガンドを含む。
【００１０】
本発明のペプチドは、１位に４−チアゾリルアラニンを含む。
【００１１】
合成ペプチドの１位における４−チアゾリルアラニンの使用は、ＧＬＰ−１受容体アゴニストについて特許文献２に記載されている。驚くべきことに、反対に、本発明の４−チアゾリルアラニンは、１位に天然ヒスチジンを有するペプチド（天然グルカゴン）と比較して、ＧＬＰ−１受容体での活性が非常に低い高活性グルカゴン受容体アゴニストを提供する。
【００１２】
したがって、本発明の化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴのようなイメージング技術を使用するインビボでのグルカゴン受容体の研究に非常に適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】Ｍａｒｔｉ  Ｂ．ら、ＷＯ２００６０２４２７５
【特許文献２】ＷＯ０７１４０２８４
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｅｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：７４０２〜０５、１９９２
【非特許文献２】Ｓｅｌｖａｒａｊｕ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１３、５４、１〜６
【非特許文献３】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｏ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２０１４、９９（５）：１５１９〜１５２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本明細書では、グルカゴン受容体に強力かつ選択的に結合して活性化し、金属イオンに結合可能なキレート部分を含むエキセンディン−４アナログが提供され、分子をイメージング研究、例えばＰＥＴ研究に適したものにする。すべての化合物は、１位に人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンを有する。このことは、驚くべきことに、１位のみが異なる（Ｈｉｓの代わりに１位がＴｚａ）同一の化合物を互いに比較した場合、ＧＬＰ１受容体と対比してグルカゴン受容体への選択性がより高くなる。したがって、本発明は、イメージング技術、例えばＰＥＴ技術を使用するインビボでのグルカゴン受容体の研究によく適した高選択性グルカゴン受容体アゴニストを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、式（Ｉ）
Ｔｚａ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ１０−Ｓｅｒ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３２−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｘ４０−Ｒ１  （Ｉ）
を有するペプチド化合物であって、
Ｘ２は、Ｓｅｒおよびｄ−Ｓｅｒから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ７は、ＴｈｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、フェニルグリシン、Ｔｈｒ、２−フルオロフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１２は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１３は、Ｇｌｎ、ＴｙｒおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１４は、Ｌｅｕ、ＮｌｅおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｉｂおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１７は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｌａおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＡｌａから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ２０は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、ＬｙｓおよびＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６がＧｌｕであり、Ｘ２０がＬｙｓである場合、Ｘ１６およびＸ２０の側鎖は、ラクタムを介した環状リングを形成してよく、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａおよびβ−Ａｌａから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、ＧｌｕおよびＳｅｒから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ４０は、Ｃｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）、Ｃｙｓ（ＶＳ−ＮＯ２Ａ）、Ｃｙｓ（ｍａｌ−ＤＯＴＡ）、Ｃｙｓ（ｍａｌ−ＮＯＴＡ）、Ｃｙｓ（ｍａｌ−ＮＯＤＡＧＡ）、Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）、Ｌｙｓ（ＮＯＴＡ）、Ｌｙｓ（ＰＥＧ−ＤＯＴＡ）およびＬｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）から選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ２０のアミノ酸の１つがＣｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）である場合、Ｘ４０は存在しなくてよく、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには、Ｇｄ３＋、Ｇａ３＋、Ｃｕ２＋、（Ａｌ−Ｆ）２＋、Ｙ３＋、Ｔｃ３＋、Ｉｎ３＋、Ｌｕ３＋およびＲｅ３＋から選択される金属イオンが配位してもしなくてもよく、
Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２を表す；
または、それらの金属錯体または塩または溶媒和物、を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、
Ｘ２は、Ｓｅｒおよびｄ−Ｓｅｒから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ３は、Ｇｌｎであり、
Ｘ７は、ＴｈｒおよびＡｉｂから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１２は、Ｌｙｓであり、
Ｘ１３は、Ｇｌｎであり、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１５は、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６は、ＳｅｒおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１７は、ＡｒｇおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１８は、Ａｒｇであり、
Ｘ２０は、ＧｌｎおよびＬｙｓから選択されるアミノ酸を表し、
Ｘ１６がＧｌｕであり、Ｘ２０がＬｙｓである場合、Ｘ１６およびＸ２０の側鎖は、ラクタムを介した環状リングを形成してよく、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２８は、Ａｌａであり、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ３２は、Ｇｌｕであり、
Ｘ４０は、Ｃｙｓ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）であり、
ＤＯ３Ａには、Ｇｄ３＋、Ｇａ３＋、Ｃｕ２＋、（Ａｌ−Ｆ）２＋、Ｙ３＋、Ｔｃ３＋、Ｉｎ３＋、Ｌｕ３＋およびＲｅ３＋から選択される金属イオンが配位してもしなくてもよく、
Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２を表す、式（Ｉ）を有するペプチド化合物；
または、それらの金属錯体または塩または溶媒和物を提供する。
【００１８】
式（Ｉ）のペプチド化合物の特定の例は、配列番号３〜９０の化合物ならびにそれらの塩または溶媒和物である。
【００１９】
式（Ｉ）のペプチド化合物の特定の例は、配列番号６、８、１３、１４、３５、３６、４９、５０、６０、６１、７９、８０、８５および８６の化合物ならびにそれらの塩または溶媒和物である。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには担持されない式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡにはＧｄ３＋、Ｇａ３＋、Ｃｕ２＋、（Ａｌ−Ｆ）２＋、Ｙ３＋、Ｔｃ３＋、Ｉｎ３＋、Ｌｕ３＋およびＲｅ３＋から選択される金属イオンが担持される式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属イオンＧａ３＋が担持される式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属イオンＧｄ３＋が担持される式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには金属放射性ヌクレオチドイオン（Ｃｕ−６４）２＋、（Ｇａ−６８）３＋、（Ａｌ−Ｆ−１８）２＋、（Ｙ−８６）３＋が担持される式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには１個の金属放射性ヌクレオチドイオン（Ｇａ−６７）３＋、（Ｔｃ−９９）３＋、（Ｉｎ−１１１）３＋が担持される式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、
ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＮＯ２ＡまたはＮＯＤＡＧＡには（Ｃｕ−６７）２＋、（Ｙ−９０）３＋、（Ｉｎ−１１１）３＋、（Ｌｕ−１７７）３＋、（Ｒｅ−１８６）３＋および（Ｒｅ−１８８）３＋から選択される１個の金属放射性ヌクレオチドイオンが担持される式（Ｉ）を有するペプチド化合物を提供する。
【００２７】
好ましい化合物は、表１に列挙した配列番号３〜９０のペプチドまたは金属錯体またはそれらの塩もしくは溶媒和物である。
【００２８】
【表１】
2019508480.tif 000002
【００２９】
【表２】
2019508480.tif 000003
【００３０】
【表３】
2019508480.tif 000004
【００３１】
【表４】
2019508480.tif 000005
【００３２】
【表５】
2019508480.tif 000006
【００３３】
【表６】
2019508480.tif 000007
【００３４】
配列６０および６１において、星印（「＊」）は、Ｇｌｕ１６とＬｙｓ２０との間のラクタム架橋の形成を示す。
【００３５】
本発明の化合物は、グルカゴン受容体に特異的に結合することができる。本発明の化合物は、グルカゴンに対する受容体に結合すると細胞内ｃＡＭＰ形成を刺激することができるという観察によって確認されるグルカゴン受容体アゴニストである。化合物は、グルカゴン受容体での天然グルカゴンの相対活性と比較して、少なくとも０．１％、好ましくは０．５％、より好ましくは１．０％、さらにより好ましくは１０．０％の相対活性を示す。
【００３６】
本発明の化合物は、ＧＬＰ１に対する受容体での結合の際に細胞内ｃＡＭＰ形成を刺激することができるという観察によって確認されるように、ＧＬＰ１受容体も活性化する。本発明の所与の化合物の活性（ＧＬＰ１受容体におけるＧＬＰ１の活性と比較してその活性によって表される）は、グルカゴン受容体における同一化合物の活性（グルカゴン受容体におけるグルカゴンの活性と比較してその活性によって表される）と比較して１％未満、より好ましくは０．５％未満、さらにより好ましくは０．１％未満である。
【００３７】
驚くべきことに、１位に４−チアゾリルアラニンを有する式Ｉのペプチド化合物は、この位置にヒスチジンを有する誘導体と比較して、グルカゴン受容体活性化の増加を示し、ＧＬＰ−１受容体の活性に対する選択性を非常に高めることが見出された。ヒスチジンは、グルカゴンの１位に天然に存在するアミノ酸であり、グルカゴン受容体の活性化機構において重要であることが示されている（Ｕｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３００、７４７〜７５０、１９９３）。
【００３８】
さらに、本発明の化合物は、好ましくは、４℃、２５℃または４０℃で、酸性または生理的ｐＨ値、例えばｐＨ４．５またはｐＨ７．４で良好な安定性を有する。好ましくは、２５℃で７日後のこれらの緩衝液中の化合物の純度は８０％より高く、１４日後では６０％より高い。
【００３９】
さらに、本発明の化合物は、金属イオンに結合可能なキレート部分を含有し、分子をイメージング研究、例えばＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ研究に適したものにする。キレート部分は、金属陽イオンへの強力な結合を確実にするために、電子対供与元素を含有する非環状または環状構造を表す。強力なキレート化は、放射性同位体の浸出を防止するための画像診断法としての使用のための前提条件であり、全身毒性、バックグラウンドシグナルの増加および関心領域でのシグナルの減少をもたらす場合がある。最適なキレート部分の選択は、放射性金属錯体の特質によって決まる。高頻度に使用されるキレート部分およびそれらの対応する名称の例は、スキーム１に列挙され、より多くの例は、例えばＷａｄａｓ  Ｔ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０、１１０、２８５８〜２９０２に見られる。
【００４０】
【化１】
2019508480.tif 000008
【００４１】
ある特定の実施形態では、すなわち式（Ｉ）の化合物が遺伝的にコードされたアミノ酸残基を含む場合、本発明はさらに、前記化合物をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡである）、そのような核酸を含む発現ベクター、およびそのような核酸または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、担体との混合剤中に本発明の化合物を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は、薬学的に許容される組成物であり、および担体は、薬学的に許容される担体である。本発明の化合物は、金属錯体、例えばガリウム（ＩＩＩ）錯体、塩、例えば薬学的に許容される塩、または溶媒和物、例えば水和物の形態である。さらに別の態様では、本発明は、特にヒトの医学における診断治療を含む医療の方法で使用するための組成物を提供する。
【００４３】
本発明の化合物およびその製剤は、好ましくは、ＰＥＴ技術を用いて、生体および関連組織におけるグルカゴン受容体を視覚化するために主に使用される。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
定義
本発明のアミノ酸配列は、Ｎｌｅ（ノルロイシン）のような他のアミノ酸の一般に認められている３文字コードと同様に、天然に存在するアミノ酸のための従来の１文字および３文字コードを含む。
【００４５】
さらに、表２に示すアミノ酸について以下のコードを用いた。
【００４６】
【表７】
2019508480.tif 000009
【００４７】
「天然エキセンディン−４」という用語は、配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２（配列番号１）を有する天然エキセンディン−４を表す。
【００４８】
本発明は、上記に定義されたペプチド化合物を提供する。
【００４９】
本発明のペプチド化合物は、ペプチドによって連結されたアミノカルボン酸の直鎖骨格、すなわちカルボキサミド結合を含む。他に示さない限り、好ましくは、アミノカルボン酸はα−アミノカルボン酸であり、より好ましくは、Ｌ−α−アミノカルボン酸である。ペプチド化合物は、３９または４０アミノカルボン酸の骨格配列を含む。
【００５０】
誤解を避けるために、本明細書で提供される定義において、ペプチド部分の配列は、改変が可能であると示された位置の少なくとも１つにおいて天然のエキセンディン−４とは異なることが一般に意図される。ペプチド部分内のアミノ酸は、従来のＮ末端からＣ末端方向に１から４０まで連続的に番号が付けられていると考えられる。ペプチド部分内の「位置」への言及は、それに応じて構築されるべきであり、天然エキセンディン−４および他の分子内で位置を、例えば、エキセンディン−４においてＨｉｓは１位、Ｇｌｙは２位、．．．Ｍｅｔは１４位、．．．およびＳｅｒは３９位と呼ぶべきである。
【００５１】
さらなる態様では、本発明は、担体との混合剤中に本明細書に記載の本発明の化合物、金属錯体、またはその塩もしくは溶媒和物を含む組成物を提供する。
【００５２】
本発明はまた、組成物が薬学的に許容される組成物であり、担体が薬学的に許容される担体である組成物を提供する。
【００５３】
ペプチド合成
当業者は、本発明に記載のペプチドを製造するためのさまざまな異なる方法を認識している。これらの方法は、合成法および組換え遺伝子発現を含むが、これに限定されない。したがって、これらのペプチドを製造する１つの方法は、溶液中または固体支持体上での合成、それに続く単離および精製である。ペプチドを製造する異なる方法は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列が導入された宿主細胞における遺伝子発現である。あるいは、遺伝子発現は、細胞系を使わずに達成可能である。上記の方法をどのように組み合わせてもよい。
【００５４】
本発明のペプチドを製造する好ましい方法は、適した樹脂上での固相合成である。固相ペプチド合成は十分に確立された方法である（例えば：ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ．、１９８４；Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ−ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照）。固相合成は、開裂可能なリンカーを有する不活性固体支持体に、そのカルボキシ末端でＮ末端保護アミノ酸を結合させることによって開始される。この固体支持体は、最初のアミノ酸のカップリングを可能にする任意のポリマー、例えばトリチル樹脂、クロロトリチル樹脂、ワング樹脂またはリンクアミド樹脂であり、カルボキシ基（またはリンク樹脂のカルボキサミド）と樹脂との結合が酸に敏感である（Ｆｍｏｃ法を用いる場合）。ポリマー支持体は、ペプチド合成中にα−アミノ基を脱保護するために使用される条件下で安定でなければならない。
【００５５】
最初のアミノ酸が固体支持体にカップリングされた後、このアミノ酸のα−アミノ保護基が除去される。次いで、残りの保護されたアミノ酸は、例えば、ＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵまたはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）などの適したアミドカップリング試薬を用いて、ペプチド配列によって示される順序で、次々にカップリングされ、ここで、ＢＯＰ、ＨＢＴＵおよびＨＡＴＵは、第三級アミン塩基と共に使用される。あるいは、遊離されたＮ末端は、アミノ酸以外の基、例えばカルボン酸などで官能化される。
【００５６】
最終的にペプチドは樹脂から切断され、脱保護される。このことは、キングのカクテルを用いて達成できる（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６）。次いで、必要に応じて、原料をクロマトグラフィ、例えば分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製できる。
【００５７】
次いで、合成されたペプチドは、金属イオン、例えばＧａ３＋を組み込むことができるキレート部分を含有する側鎖を結合させることによってさらに修飾される。ペプチド骨格中の結合点がリジンである場合、側鎖は、適したアミド化基、例えば、ヒドロキシルスクシンイミドエステル、またはマイケル付加を介してビニルスルホン基との反応によって連結される。他の場合では、結合側がシステインのチオールである場合、マレイミド官能性またはマイケル付加を介してビニルスルホン基との反応によって側鎖を結合させることができる。次いで、必要に応じて原料は脱保護され、クロマトグラフィ、例えば、分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製される。本発明の化合物に結合する側鎖は、表３に要約される。
【００５８】
本発明の化合物については、表４に列挙した構成要素を使用した。ＶＳ−ＤＯ３ＡおよびＶＳ−ＮＯ２Ａの構成要素を除いて、これらの構成要素は、市販で入手可能である。ＶＳ−ＤＯ３Ａの合成は、実施例１に記載され、ＶＳ−ＮＯ２Ａの合成も同様に行うことができる。
【００５９】
【表８】
2019508480.tif 000010
【００６０】
【表９】
2019508480.tif 000011
【００６１】
【表１０】
2019508480.tif 000012
【００６２】
【表１１】
2019508480.tif 000013
【００６３】
【表１２】
2019508480.tif 000014
【００６４】
ペプチドの側鎖の錯化部分をさらに適した金属イオン、例えばＧａ３＋で荷電することができる。これを達成するために、側鎖を有するペプチドを、適した溶媒中、所望の陽イオンの適した塩で加熱する。次いで、必要に応じて、原料をクロマトグラフィ、例えば分取ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＰＥによって精製できる。
【００６５】
効力
本明細書で使用される場合、「効力」または「インビトロ効力」という用語は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＬＰ−１またはグルカゴンに対する受容体を活性化する化合物の能力の尺度である。数値的には、「ＥＣ５０値」として表され、用量反応実験において、応答（例えば細胞内ｃＡＭＰの形成）の最大値の半分の増加を誘導する化合物の有効濃度である。
【００６６】
治療用途および診断用途
本発明の化合物は、グルカゴン受容体アゴニストである。そのようなアゴニストは、低血糖を標的とする臨床的必要性に対処するための治療上の利益を最初に提供する場合がある。
【００６７】
その結果、本発明のグルカゴン受容体アゴニストは、軽度から中程度低血糖の治療または重度の低血糖の事象において使用される場合がある。
【００６８】
診断用途という用語は、生体および関連組織におけるグルカゴン受容体の検出および／または定量化のための使用を表す。
【００６９】
これは、特定の組織において、グルカゴン受容体への所与の用量の治療的結合の受容体占有状態の測定を含むが、これに限定されない。グルカゴン受容体は、例えば、腎臓、脳、脾臓および胸腺のリンパ球細胞、肝臓の実質細胞、ならびに肝臓の内皮細胞およびクッパー細胞、心臓、脂肪組織、腸管平滑筋組織および内分泌系膵臓細胞において同定され、発現は特に肝臓で高い（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、３１、２４３〜２５６およびその中に引用された参考文献）。受容体占有研究は、グルカゴン受容体に影響を及ぼす前記治療薬の最適用量を同定するための選択肢を示す。
【００７０】
さらに、グルカゴン受容体シンチグラフィは、特に、グルカゴン受容体を強く発現する細胞の存在の増加、例えば肝臓、リンパ節、腸間膜／大網／腹膜、肺または副腎における、例えばグルカゴノーマの転移、によって特徴付けられる疾患の診断に適用可能である。
【００７１】
当業者は、意図したイメージング技術によって、担持に適した金属イオンを選択できる。ＭＲＩ測定には（Ｇｄ−６８）３＋、ＰＥＴ測定には（Ｃｕ−６４）２＋、（Ｇａ−６８）３＋、（Ａｌ−Ｆ−１８）２＋もしくは（Ｙ−８６）３＋、またはＳＰＥＣＴ測定には（Ｇａ−６７）３＋、（Ｔｃ−９９ｍ）３＋もしくは（Ｉｎ−１１１）３＋を含むが、これに限定されない。
【００７２】
「治療用途」という用語は、放射線療法において使用する本発明に記載のペプチドの適用を示す。これは、（Ｃｕ−６７）２＋、（Ｙ−９０）３＋、（Ｉｎ−１１１）３＋、（Ｌｕ−１７７）３＋、（Ｒｅ−１８６）３＋または（Ｒｅ−１８８）３＋のような、適した放射性核種を有する前記ペプチドの負荷、精製および品質管理を含む。
【００７３】
＞９８％の負荷効能が得られた場合、製造が適切であると考えられる。放射性製剤は、許容可能な医薬組成物の一部として患者に注入することができる。適用される用量は、例えば、使用目的（治療または診断）、疾患状態（良性または悪性）、腫瘍の大きさおよび位置の検討事項に応じて医師が選択し、放射性同位体を負荷する。
【００７４】
医薬組成物
「医薬組成物」という用語は、混合された場合に相溶性であり、投与される成分を含有する混合物を示す。医薬組成物は、１つまたはそれ以上の生物活性分子を含む場合がある。さらに、医薬組成物は、活性成分または不活性成分と考えられるかどうかにかかわらず、担体、溶媒、アジュバント、皮膚軟化剤、増量剤、安定剤および他の成分を含む場合がある。医薬組成物を製造する当業者のための指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．編、２０００、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに見られる。
【００７５】
本発明のエキセンディン−４ペプチド誘導体またはその金属錯体または塩または溶媒和物は、医薬組成物の一部として、許容される医薬品担体、希釈剤または賦形剤と共に投与される。「薬学的に許容される担体」は、それと共に投与される物質の治療特性を保持しながら、生理学的に許容される担体である。標準的な許容される医薬品担体およびその製剤は、当業者に知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．編、２０００、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されている。薬学的に許容される担体の一例は生理食塩水溶液である。
【００７６】
許容される医薬品担体または希釈剤には、経口、直腸、経鼻または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内および経皮を含む）投与に適した製剤に使用されるものが含まれる。本発明の化合物は、一般的に静脈内に投与される。
【００７７】
「塩」または「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳動物での使用に安全および効果的な本発明の化合物の塩を意味する。薬学的に許容される塩には、酸付加塩および塩基性塩が挙げられるが、これらに限定されない。酸付加塩の例は、塩化物、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸（水素）塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、トシル酸塩またはメシル酸塩を含む。塩基性塩の例は、無機陽イオンを有する塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、およびアミン塩のような有機陽イオンを有する塩を含む。薬学的に許容される塩のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．編、２０００、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、またはＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ、Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ編、２００２、Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄおよびＷｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙの共同出版に記載されている。
【００７８】
「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物またはその塩と溶媒分子、例えば有機溶媒分子および／または水との複合体を意味する。
【００７９】
「金属錯体」という用語は、本発明の化合物と金属イオン（例えば、遷移金属の）とのキレート錯体を意味し、多座（多重結合）リガンドは、いくつかのリガンドの原子を介して金属イオンに結合する化合物の一部である；（金属イオンに対して２、３または４個の結合を有するリガンドが一般的である）。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内または静脈内）、経口、直腸、局所および経口（例えば舌下）投与に適したものであるが、最も適した投与様式は、生物活性成分の特定の使用、およびそれぞれの場合に使用される式（Ｉ）の化合物の性質に個々の場合ごとに依存する。一般的に、本発明の化合物の意図された使用のための投与経路は、静脈内投与である。
【００８１】
方法
以下のように略語を用いた：
２Ｆ−Ｐｈｅ  ２−フルオロフェニルアラニン
ＡＡ  アミノ酸
ｃＡＭＰ  環状アデノシン一リン酸
Ｂｏｃ  ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＯＰ  （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｔＢｕ  第三級ブチル
ＣＴ  コンピューター断層撮影法
ＣＴＣ  ２−クロロトリチルクロリド
ＤＩＣ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＥＤＴ  エタンジチオール
Ｆｍｏｃ  フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＧＣＧ  グルカゴン
ＧＬＰ−１  グルカゴン関連ペプチド１
ＨＡＴＵ  ２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ  ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィ
ＭＲＩ  磁気共鳴イメージング
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ＰＥＴ  ポジトロン断層法
ＲＰ−ＨＰＬＣ  逆相高速液体クロマトグラフィ
ｓ．ｃ．  皮下
ＳＰＥ  固相抽出
ＳＰＥＣＴ  単一光子放射断層撮影
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
Ｔｌｅ  ｔｅｒｔ−ロイシン
ＴＲＩＳ  トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
Ｔｒｔ  トリチル
Ｔｚａ  ４−チアゾリルアラニン
ＵＰＬＣ  超高速液体クロマトグラフィ
ＵＶ  紫外線
【００８２】
ペプチド化合物の一般的合成
材料：
固相ペプチド合成のために、ＣＴＣ−樹脂または装填済みＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ワング樹脂またはリンク−アミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）を使用した。ＣＴＣ−樹脂は、ＣＢＬ  Ｐａｔｒａｓから購入し、装填量は１．４ｍｍｏｌ／ｇであった。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ワング樹脂は、Ｂａｃｈｅｍから購入し、装填量は０．５ｍｍｏｌ／ｇであった。リンク−アミド樹脂は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入し、装填量は０．２３ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００８３】
Ｆｍｏｃ保護天然アミノ酸は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  ＢｉｏｔｅｃｈまたはＢａｃｈｅｍから購入した。以下の標準アミノ酸を合成の全体にわたって使用した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。
【００８４】
さらに、以下の特別なアミノ酸を、上記と同一の製造業者から購入した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｚａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｂａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｎｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−２Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｌｅ−ＯＨ。
【００８５】
固相ペプチド合成は、標準Ｆｍｏｃ化学およびＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化を使用してＰｒｅｌｕｄｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）で行った。溶媒としてＤＭＦを使用した。脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦで２×２．５分。洗浄：７×ＤＭＦ。カップリング：ＤＭＦ中に２：５：１０の２００ｍＭ  ＡＡ／５００ｍＭ  ＨＢＴＵ／２ＭＤＩＰＥＡで２ｘ２０分。洗浄：５ｘＤＭＦ。
【００８６】
合成されたすべてのペプチドを、８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水、５％チオアニソール、２．５％ＥＤＴから成るキングの切断カクテルを用いて樹脂から切断した。次いで粗ペプチドをジエチルエーテルまたはジイソプロピルエーテル中で沈殿させ、遠心分離し、凍結乾燥した。ペプチドを分析用ＨＰＬＣで分析し、ＥＳＩ質量分析法によって確認した（表５参照）。粗ペプチドを従来の分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製手順によって精製した。
【００８７】
一般的な分取ＨＰＬＣ精製手順：
粗ペプチドを、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＳｙｓｔｅｍまたはＪａｓｃｏセミ分取ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのいずれかで精製した。精製される粗ペプチドの量によって、異なるサイズの分取ＲＰ−Ｃ１８−ＨＰＬＣカラムおよび異なる流量を使用した。溶離液として、アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ（Ｂ）および水＋０．１％ＴＦＡ（Ａ）を用いた。生成物含有画分を回収し、凍結乾燥して精製生成物を、一般的にはＴＦＡ塩として得た。
【００８８】
エキセンディン−４誘導体の安定性試験：
安定性試験について、標的濃度は、ｍ−クレゾール（３０ｍＭ）、塩化ナトリウム（８５ｍＭ）およびポリソルベート２０（８μＭ）を含有するｐＨ７．３  ＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭ）またはｐＨ４．５  ｍ−クレゾール（２５ｍＭ）およびグリセリン（２２０ｍＭ）を含有するメチオニン緩衝液（２０ｍＭ）中に０．５ｍｇ／ｍＬの純粋化合物であった。溶液は、４℃、２５℃または４０℃で１４日間保存した。その後、溶液をＵＰＬＣで分析した。
【００８９】
ＵＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８  １．７μｍカラム（２．１×１００ｍｍ）を装着したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓシステムで、４０℃、グラジエント溶出、０．５ｍＬ／分の流量で行い、２１５および２８０ｎｍでモニターした。グラジエントは、１９．２分にわたって１０％Ｂ〜９０％Ｂ、次いで９０％Ｂで０．８分として設定した。緩衝液Ａ＝水中に０．１％ギ酸、およびＢ＝アセトニトリル中に０．１％ギ酸。
【００９０】
１４日後の「純度％」は、以下の式、
純度％＝［（ｔ１４の相対純度％）×１００）］／ｔ０の相対純度％
ｔ０での相対純度％に対する１４日目の相対純度％によって定義される。
【００９１】
ｔ０における相対的純度％は、以下の式、
ｔ０における相対純度％＝［（ｔ０におけるピーク面積）×１００］／ｔ０におけるすべてのピーク面積の合計
ｔ０におけるペプチドのピーク面積を、ｔ０におけるすべてのピーク面積の合計で除することによって算出した。
【００９２】
同様に、ｔ１４における相対的純度％は、以下の式、
ｔ１４における相対純度％＝［（ｔ１４におけるピーク面積）×１００］／ｔ１４におけるすべてのピーク面積の合計
ｔ１４におけるペプチドのピーク面積を、ｔ１４におけるすべてのピーク面積の合計で除することによって算出した。
【００９３】
同様に、７日後の純度％を算出することができる。
【００９４】
グルカゴン受容体効能のインビトロ細胞アッセイ：
それぞれの受容体に対する化合物のアゴニズムは、ヒトＧＬＰ−１またはグルカゴン受容体を安定的に発現するＨＥＫ−２９３細胞株のｃＡＭＰ応答を測定する機能性アッセイによって決定した。
【００９５】
細胞のｃＡＭＰ含量をＨＴＲＦ（均一性時間分解蛍光法）に基づくＣｉｓｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．のキット（カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）を用いて測定した。調製のために、細胞をＴ１７５培養フラスコに分割し、培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中でほぼコンフルエントになるまで一晩増殖させた。次いで、培地を除去し、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを欠くＰＢＳで洗浄し、続いてアクターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ６９６４）でプロテイナーゼ処理した。剥離した細胞を洗浄し、アッセイ緩衝液（１×ＨＢＳＳ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＩＢＭＸ）に再懸濁し、細胞密度を測定した。次いでそれらを４０００００細胞／ｍｌに希釈し、２５μｌアリコートを９６ウェルプレートのウェルに分注した。測定のために、アッセイ緩衝液中の試験化合物２５μｌをウェルに添加し、続いて室温で３０分間インキュベートした。溶解緩衝液（キット構成要素）に希釈したＨＴＲＦ試薬の添加後、プレートを１時間インキュベートし、続いて６６５／６２０ｎｍの蛍光比を測定した。最大応答（ＥＣ５０）の５０％活性化を引き起こす濃度を決定することにより、アゴニストのインビトロ効力を定量化した。
【００９６】
例示的な理由から、側鎖に結合したＶＳ−ＤＯ３Ａ構成要素を有するＣ末端システインアミドを持つ天然グルカゴンの誘導体（配列番号２）を合成した。
Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｌ−Ｍ２７−Ｎ−Ｔ−Ｃ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）−ＮＨ２
【００９７】
合成中、特にシステイン含有ペプチドとＶＳ−ＤＯ３Ａ構成要素との抱合ステップの間に、２７位のメチオニンの迅速な酸化が観察され、凝集も観察されたが、これは既に天然グルカゴン配列に対して先例がある。それでも少量の標的化合物が得られた。実施例５のように、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体活性化について、得られた誘導体を試験した。Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｌ−Ｍ２７−Ｎ−Ｔ−Ｃ（ＶＳ−ＤＯ３Ａ）−ＮＨ２は、グルカゴン受容体を０．７ｐＭ（ＥＣ５０  ｈＧＬＵＣＲ）およびＧＬＰ−１受容体を１６．１ｐＭ（ＥＣ５０  ｈＧＬＰ−１Ｒ）でそれぞれ活性化した。
【００９８】
一方、本発明の化合物は、合成または保存中に酸化されるメチオニンを含まず、凝集がはるかに少ない傾向があり、ＧＬＰ−１受容体の活性化が非常に低下する。
【実施例】
【００９９】
本発明は、以下の実施例によってさらに示される。
【実施例１】
【０１００】
ＶＳ−ＤＯ３Ａ構成要素（［４，１０−ビス−カルボキシメチル−７−（２−エテンスルホニル−エチル）−１，４，７，１０テトラアザ−シクロドデカ−１−イル］−酢酸）の合成
【化２】
2019508480.tif 000015
【０１０１】
ＤＯ３Ａ−ｔＢｕ（４，１０−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−１，４，７，１０テトラアザ−シクロドデカ−１−イル）−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．５ｇ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、０℃でジビニルスルホン（５ｍＬ）のＤＭＦ／水１：１（２０ｍＬ）溶液を添加した。混合物を室温にし、２時間撹拌した。混合物をＲＰクロマトグラフィによって直接精製して、ＶＳ−ＤＯ３Ａ−ｔＢｕ（［４，１０−ビス−ｔｅｒｔブトキシカルボニルメチル−７−（２−エテンスルホニル−エチル）−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１−イル］−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）を得た。
【０１０２】
ＶＳ−ＤＯ３Ａ−ｔＢｕのＴＦＡ／水１９：１（７５ｍＬ）溶液を、室温で１日撹拌した。ＴＦＡを注意深く蒸発させ、残りの溶液を凍結乾燥して、粗ＶＳ−ＤＯ３Ａ（［４，１０−ビス−カルボキシメチル−７−（２−エテンスルホニル−エチル）−１，４，７，１０テトラアザ−シクロドデカ−１−イル］−酢酸）を得て、それをさらに精製せずに直接使用した。
【実施例２】
【０１０３】
配列番号３５の合成
方法に記載の固相合成は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍリンク−アミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）、１００〜２００メッシュ、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの装填量で行った。Ｆｍｏｃ合成戦略をＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化で適用した。１位のＦｍｏｃ−Ｔｚａ−ＯＨおよび１４位のＦｍｏｃ−Ｔｌｅ−Ｎｌｅ−ＯＨを固相合成プロトコールで使用した。ペプチドを、キングのカクテルを用いて樹脂から切断した（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６）。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【０１０４】
次いで精製ペプチド（５３ｍｇ）をｐＨ７緩衝液に溶解し、溶液に実施例１で製造したＶＳ−ＤＯ３Ａ構成要素（１４ｍｇ）を加えた。ｐＨ１０緩衝液を用いて、ｐＨをｐＨ７に再調整した。溶液を室温で１６時間撹拌し、次いで酢酸を用いてｐＨ４に酸性化した。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【実施例３】
【０１０５】
配列番号３６の合成
実施例２で合成されたペプチド（配列番号３５）を酢酸塩緩衝液ｐＨ４．６（１０ｍＬ）に溶解し、ガリウム（ＩＩＩ）−硫酸塩水和物（４．８ｍｇ）を加えた。混合物を８０℃で１５分間撹拌し、次いで室温にした。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【実施例４】
【０１０６】
配列番号１５の合成
方法に記載の固相合成は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍリンク−アミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）、１００〜２００メッシュ、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの装填量で行った。Ｆｍｏｃ合成戦略をＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化で適用した。１位のＦｍｏｃ−Ｔｚａ−ＯＨ、７位のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨおよび１４位のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨを固相合成プロトコールで使用した。ペプチドを、キングのカクテルを用いて樹脂から切断した（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６）。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【０１０７】
次いで遊離チオールを有するペプチドを水／アセトニトリル（１０／１）に溶解した後、還元剤ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（２．５当量）を添加した。ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液でｐＨ＝７に調整した。最終的に、ｍａｌ−ＤＯＴＡ構成要素（２．５当量）を添加した。反応物を室温で１０分間撹拌した。所望の生成物の形成および出発物質の全消費量をＬＣＭＳによって確認した。
粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【実施例５】
【０１０８】
配列番号２６の合成
方法に記載の固相合成は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍリンク−アミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）、１００〜２００メッシュ、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの装填量で行った。Ｆｍｏｃ合成戦略をＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化で適用した。ペプチドを、キングのカクテルを用いて樹脂から切断した（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６）。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【０１０９】
ペプチドを水／アセトニトリル（１０／１）に溶解した後、ＤＩＰＥＡ（６０当量）を９＜ｐＨ＜１０になるように添加した。次いでＤＯＴＡ構成要素を添加した（１当量）。ＬＣＭＳで判断したように、出発材料の完全な変換に達するためには、構成要素０．２当量の連続添加が必要であった。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【実施例６】
【０１１０】
配列番号２９の合成
方法に記載の固相合成は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍリンク−アミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）、１００〜２００メッシュ、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの装填量で行った。Ｆｍｏｃ合成戦略をＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化で適用した。ペプチドを、キングのカクテルを用いて樹脂から切断した（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６）。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【０１１１】
ペプチドを４ｍＬ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ＝９）に溶解した。ＳＰＤＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳエステル（１当量）を混合物に滴下しながら添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で１０分間撹拌した。ＬＣＭＳで判断したように、完全な変換に達するためには、ＮＨＳエステル０．２当量の連続添加が必要であった。ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（５当量）およびｍａｌ−ＮＯＴＡ構成要素（８当量）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。
粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（両方の緩衝液とも０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）における分取ＨＰＬＣにより精製した。
最終的に、ＬＣ−ＭＳにより精製ペプチドの分子量を確認した。
【０１１２】
同様に、配列番号３〜６１、７９、８０、８５および８６のペプチドを合成した、表１を参照。
【０１１３】
さらに、配列番号６２〜７８、８１〜８４および８７〜９１のペプチドを同様に合成できる。
【０１１４】
【表１３】
2019508480.tif 000016
【０１１５】
【表１４】
2019508480.tif 000017
【０１１６】
【表１５】
2019508480.tif 000018
【実施例７】
【０１１７】
化学的安定性
ペプチド化合物の化学的安定性を方法に記載したように評価した。結果を表５に示す。
【０１１８】
【表１６】
2019508480.tif 000019
【０１１９】
【表１７】
2019508480.tif 000020
【実施例８】
【０１２０】
ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体についてのインビトロデータ
方法に記載のように、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＬＵＣ  Ｒ）およびヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１Ｒ）を発現する細胞を、濃度を上げて列挙した化合物に曝露し、形成されたｃＡＭＰを測定することによって、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体におけるペプチド化合物の効力を測定した。
【０１２１】
ヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１Ｒ）およびヒトグルカゴン受容体（ｈＧＬＵＣ  Ｒ）で活性を有するエキセンディン−４誘導体の結果を表６に示す。
【０１２２】
【表１８】
2019508480.tif 000021
【０１２３】
【表１９】
2019508480.tif 000022
【０１２４】
【表２０】
2019508480.tif 000023
【実施例９】
【０１２５】
比較試験
１位に人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンを含むエキセンディン−４誘導体の選択を、１位にヒスチジンを有する対応する化合物と比較して試験した。１位のヒスチジンは、グルカゴンにおける受容体の活性化に必須であるが、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４を含む多くの関連ペプチドにおいても必須である。したがって、人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンが、１位に天然のヒスチジンを有する同一の化合物と比較して、受容体の同等の活性化をもたらすことは驚くべきことである。さらに、グルカゴン効果を逆調節（counterregulates）するＧＬＰ−１受容体の活性化は、人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンの導入によって驚くほど減少する。これにより、より高いＧＣＧ／ＧＬＰ−１活性比を有するより選択的なグルカゴン受容体アゴニストがもたらされる。基準ペア化合物ならびにＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体（ｐＭで示される）における対応するＥＣ５０値を表７に示す。
【０１２６】
【表２１】
2019508480.tif 000024
【０１２７】
表７：１位に人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンを含むエキセンディン−４誘導体対１位に天然アミノ酸ヒスチジンを有するエキセンディン−４誘導体の比較。天然グルカゴン（配列番号２）の値も示されている。ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体でのＥＣ５０値をｐＭで示す。
【配列表】
2019508480000001.app
【国際調査報告】
2019508480.tif 000025
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