(57)【要約】  本発明は、少なくとも１．８ｈのｔ１／２を有する単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドである抗分泌性因子（ＡＦ）１７と称される新規なペプチドに関する。ペプチドは、例えば、動物およびヒトにおける病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化するのに有用である。ＡＦ−１７およびＡＦ−１７の医薬組成物は、例えば、ＴＢＩおよび／またはＴＢＩと関連している二次的脳損傷を治療するかつ／または予防するためだけでなく、後天的脳損傷を治療するかつ／または予防するために、およびがん治療を最適化するために使用される。
2019524742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、前記ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸（ａａ）位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含み、抗分泌性活性を有する、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩。
【請求項２】
配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含む、請求項１に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項３】
配列番号４（ＡＦ−８）に示されたアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含む、請求項１に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項４】
６〜２５アミノ酸長、好ましくは、７、８、１６または１７アミノ酸長のような７〜１７、７〜１６、７〜２０、８〜１７、８〜２０、１７〜２５、１７〜２０アミノ酸長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項５】
少なくとも６、７、８、１６、または１７アミノ酸長であり、最大７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項６】
配列番号７に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ）、または配列番号８に示されたアミノ酸配列（Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）、または配列番号９に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項７】
配列番号７に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ）、または配列番号８に示されたアミノ酸配列（Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）、または配列番号９に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項８】
少なくとも０．２ｈ、好ましくは少なくとも０．５ｈ、１ｈ、または１．５ｈのｔ１／２を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項９】
少なくとも１．８ｈのｔ１／２を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１０】
医学における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１１】
病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態および症状、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、ならびに下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１２】
活性物質の細胞取込みを最適化することにおける使用のため、神経保護のため、および／またはカルベオラを正常化するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１３】
二次的脳損傷から選択されるＴＢＩおよび／またはＴＢＩ関連状態もしくは症状を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１４】
後天的脳損傷を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドと、適した医薬担体とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
活性物質の細胞取込みを最適化することにおける使用のため、神経保護のため、および／またはカルベオラを正常化するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＴＢＩと関連している二次的脳損傷のようなＴＢＩを治療するかつ／または予防することにおける使用のため、または後天的脳損傷を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項２０】
活性物質の細胞取込みを最適化するため、神経保護のためおよび／またはカルベオラを正常化するための方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項２１】
ＴＢＩおよび／またはＴＢＩと関連している二次的脳損傷を治療するかつ／または予防するための方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項２２】
後天的脳損傷を治療するかつ／または予防するための方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項２３】
配列番号７、８または９に示されたアミノ酸配列を本質的に有するペプチドに対する抗体。
【請求項２４】
生物におけるタンパク質またはその相同体もしくは断片を検出するための、配列番号７、８または９に示されたアミノ酸配列を本質的に有するペプチドに対する抗体の使用。
【請求項２５】
相当するペプチドを作製するための、配列番号１〜９のいずれかに示されたアミノ酸配列を本質的に有するペプチドをコードする核酸の使用であって、前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸（ａａ）位置３６番における、配列番号２のアミノ酸（ａａ）位置１番における、配列番号３のアミノ酸（ａａ）位置２番における、または配列番号４のアミノ酸（ａａ）位置２番におけるシステインジスルフィドを含み、抗分泌性活性を有する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗分泌性因子（ＡＦ）は、炎症を抑制し、体液輸送を調節するタンパク質複合体であり、ＡＦ複合体は、修飾プロテアソームに属する。抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質配列上のアミノ酸位置３５〜５０間に位置する止痢配列ＡＦ−１６を含む合成ペプチドは、以前特徴付けられている（特許文献１；特許文献２）。ＡＦ１６は、血漿中で急速に分解することが知られている。本発明は、血漿中でのＡＦ−１６の主要な代謝的運命を開示しており、これは、ＡＦ１６の急速なジスルフィド形成であり、アミノ酸位置２（Ｃ２）でのシステインジスルフィドを含むＡＦ−１６（以下、ＡＦ−１７と称される）をもたらす。可逆的であるこの作用は、急速なペプチダーゼ分解からＡＦ１６を明らかに保護する。この驚くべき見識に基づいて、本発明は、初めて、それを必要とする患者に投与された場合、ＡＦ１６の実質的に延長された半減期をもたらす、ＡＦ−１７を含む合成ペプチドを開示する。
【背景技術】
【０００２】
抗分泌性因子（ＡＦ）
抗分泌性因子（ＡＦ）は、元々、下痢疾患および腸の炎症に対する保護を提供することが報告された４１ｋＤａのタンパク質である（総説に関しては、非特許文献１を参照されたい）。抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、配列決定されており、そのｃＤＮＡは、クローン化されている。抗分泌性活性は、止痢配列の特に４、６、７、８または１６などの少なくとも４〜１６アミノ酸を含む、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質配列（すなわち止痢配列／コンセンサス配列）上のアミノ酸位置３５から５０間に位置するペプチドによって主に発揮されるように見える。免疫化学的および免疫組織化学的調査により、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質が存在し、また身体における大部分の組織および器官によって合成されることがあることが明らかになった。止痢／コンセンサス配列またはその断片を含む合成ペプチドは、以前特徴付けられている（特許文献１；特許文献２）。抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質およびペプチドは、コレラ毒素の負荷後の腸および中枢神経系における脈絡叢におけるなどの病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化することが以前開示された（特許文献１）。したがって、例えば、特許文献１において、ＡＦの内在性合成を誘発するまたは添加されたＡＦの取込みの能力を有する食品および飼料は、浮腫、下痢、脱水症および炎症の治療に有用であることが示唆された。特許文献３は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の形成を誘発する食品の作製のための酵素活性を有する生成物の使用を開示している。特許文献４は、天然の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、それ自体として（ＮＡＳＰ）が濃縮された食品生成物をさらに開示している。
【０００３】
抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質およびその断片は、細胞の喪失および／または獲得と関連している状態の治療において神経組織の修復、ならびに幹細胞および前駆細胞ならびにそれに由来する細胞の増殖、アポトーシス、分化、ならびに／または遊走を改善すること（特許文献２）、コンパートメント症候群の治療および／または予防に関して（特許文献５）、眼内高血圧の治療および／または予防（特許文献６）において同等に有効であることも示された。
【０００４】
本発明者らは、ＡＦが膜における脂質ラフト、受容体および／またはカベオラの構造、分布および複数の機能をモニターするかつ／またはこれらに有利に影響を与えることができ、したがって、細胞膜における脂質ラフトおよび／またはカベオラの構造的組織崩壊および機能障害の治療および／または予防に有用であることをさらに示した（特許文献７）。
【０００５】
本発明者らは、さらに、同じ抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ならびにそのペプチドおよび断片がＦＡＫおよびＣＡＰを介して膜貫通タンパク質、例えばＮＫＣＣ１の生物学的活性化に介入し得ること、したがって、それが病理学的かつ／または乱された細胞におけるイオンチャネルの病理学的活性を直接的に調節し、前記細胞における細胞内圧および膜貫通タンパク質機能を効果的に正常化し、したがって、例えばがん療法において使用される薬物の改善された取込みを可能にすることを明らかにすることができた（特許文献８）。
【０００６】
本発明者らは、ＡＦ１（抗分泌性因子１）と命名されたタンパク質を血液から単離し、そのコード遺伝子を配列決定した。後に、ＡＦ１は、それ自体ＰＳＭＤ４、ＲＰＮ１０またはＳ５ａと命名された１９Ｓプロテアソームサブユニットの構成物であることが示された。細菌エンテロトキシンおよびプロセシングされたシリアルが抗分泌性因子（ＡＦ）の改変された形を誘発することができ、これは、腸における炎症および体液分泌を抑制したことがさらに示された。ＡＦのこの修飾された形は、多糖アガロースに結合することが見出された。α−メチルグルコシドでの溶出後、その濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。
【０００７】
驚くべきことに、プロテアソームがプロセシングされたシリアル（ＳＰＣ）の取込み後に補体因子Ｃ３と反応することが最近実証された。この反応は、以前隠されていた抗分泌性エピトープの暴露をもたらし、プロテアソーム／補体複合体形成は、その不活性型Ｃ３ｃへのＣ３の分割をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ９７／０８２０２
【特許文献２】ＷＯ０５／０３０２４６
【特許文献３】ＷＯ９８／２１９７８
【特許文献４】ＷＯ００／０３８５３５
【特許文献５】ＷＯ０７／１２６３６３
【特許文献６】ＷＯ０７／１２６３６４
【特許文献７】ＷＯ０７／１２６３６５
【特許文献８】ＷＯ２０１０／０９３３２４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ，２００１．２１０：ｐ．３９−７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、ＡＦ−１６の投与から利益を得る多くの医学的状態がある。残念ながら、それは、一度投与された患者の身体において非常に短い半減期を有することが示された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一度投与された患者の身体において実質的に延長された半減期を有する、単離、組換え、または合成的に作製された保護されたＡＦ１６代謝産物（本明細書では、ＡＦ−１７と称される）を初めて提出する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含み、抗分泌性活性を有する、以下、ＡＦ−１７（配列番号７に示された）と称される、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩に関する。
【００１３】
異なる種におけるＡＦ１６の相対的安定性が図１２に示されている。初めて本明細書で文書化されるように、種に関係なく、ＡＦ１６は、１０分以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ1/2）で急速に消えている。本発明者らは、さらに、投与後のペプチドＡＦ−１６の分子の運命を初めて決定することができ、これは、ＡＦの任意の薬理作用の薬物動態学的基礎の徹底的な理解および改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ1/2）を有する新規なＡＦ−ペプチド（ＡＦ−１７）の開発につながり、それを必要とする患者への投与後に活性ＡＦ物質の運命をモニターするための改善された手段を可能にし、結果として、活性ＡＦおよび／またはＡＦペプチドの投薬計画を最適化するための改善された手段につながる。
【００１４】
本発明は、初めて、ＡＦの主要な代謝産物をＡＦ１６（ＡＦ−１７）のシステインジスルフィドと同定する。可逆的であるＡＦ１６の急速なジスルフィド形成は、急速なペプチダーゼ分解からＡＦ１６を明らかに保護し、ＡＦ１６がはるかに高い程度までその標的にインタクトに到達することを可能にし、かつ／またはそれを必要とする患者への投与後の活性ＡＦ物質の運命をモニターするための手段を改善し、結果として最適化された活性ＡＦおよび／またはＡＦペプチドの投薬計画につながる保護機能である。
【００１５】
本明細書で明らかにされるように、本発明者らは、ＡＦ−１７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態学的特性を初めて総合的に扱い研究し、ＡＦ−１７を、それを必要とする患者に直接投与し得ること、および例えば実験３に示されているように、ＡＦ−１７がコレラ毒素の負荷後に、腸におけるなど、病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化するのにＡＦ−１６と少なくとも同じくらい効果的であることを明らかにした。ＡＦ−１６が病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化すること、ＴＢＩ、腫瘍および／または腫瘍関連合併症を治療するかつ／または予防すること、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病および下痢を治療すること、低分子薬物などの所与の薬物の細胞取込みを最適化すること、神経保護、およびカルベオラを正常化することから選択されるがこれらに限定されない様々な種々の疾患および状態に効果的であることが以前示され、かつＡＦ−１７がＡＦ−１６の天然の代謝産物であることを考えれば、本明細書で開示されたＡＦ−１７は、ＡＦ−１６が効果的であることが知られているのと同じ疾患および／または状態を治療するのにＡＦ−１６と少なくとも同じくらい効果的であることが仮定される。
【００１６】
したがって、本発明は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質（ＡＦ−１７）からなる、これを含む、これに由来する、かつ／またはこれに基づく新規な改善された単離組換えまたは合成活性ペプチドおよび医学におけるその使用を開示する。特に、本発明は、本明細書で記載された、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療するためのＡＦ−１７の使用に関する。
【００１７】
さらに、長年にわたる抗分泌性タンパク質（ＡＦ）の広範な研究からよく知られているように、その内在性タンパク質は、タンパク質のコア活性配列（ＡＦ−６、配列番号２に示された）がインタクトである限り、全て、証明された同様の抗分泌性効果を有する多量のより小さいペプチドに転写後にプロセシングされる。したがって、自然環境において、抗分泌性タンパク質（ＡＦ）が分解されるかつ／またはＡＦ−６を含むより小さいペプチドに転写後にプロセシングされることになる、かつそれらのより小さいペプチドの代謝産物がＡＦ−１６の観察された運命と類似して、ＡＦ−６の唯一のシステインにおける、すなわち配列番号２に示されたＡＦ−６のアミノ酸位置１におけるジスルフィドによって少なくとも保護されることにもなることは、当然である。
【００１８】
したがって、本発明は、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、該ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含み、抗分泌性活性ならびに配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドを含まない、配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の同一の断片および／またはその相同体からなるペプチドと比較して改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ1/2）を有する、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩にさらに関する。
【００１９】
現在好ましい実施形態では、本発明の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドは、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含む。
【００２０】
本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドは、６〜２５アミノ酸長、好ましくは６、７、８、９、１６または１７アミノ酸長などの７〜１７、６〜１６、７〜２０、７〜１７、１６〜２５、１６〜２０、１７〜２０、１７〜２５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、それは、少なくとも６、７、１６、または１７アミノ酸長かつ／または最大７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。
【００２１】
本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドは、配列番号７に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ）、または配列番号８に示されたアミノ酸配列（Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）、または配列番号９に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）を典型的に含む。
【００２２】
本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドは、配列番号７に示されたアミノ酸（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ）、または配列番号８に示されたアミノ酸配列（Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）、または配列番号９に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）から典型的になる。
【００２３】
本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドは、少なくとも１．８ｈのｔ１／２などの少なくとも０．２ｈ、好ましくは少なくとも０．２５ｈ、０．３ｈ、０．４ｈ、０．５ｈ、１ｈ、または１．５ｈ、１．９ｈ、２．０ｈ、２．５ｈのｔ１／２を典型的に有する。
【００２４】
本発明は、病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防することにおける使用のためなどの、医学における使用のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドにさらに関する。本発明は、活性物質の細胞取込みを最適化するため、神経保護のためおよび／またはカルベオラを正常化するための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドにさらに関する。
【００２５】
一実施形態では、本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドと、適した医薬担体とを含む医薬および／または化粧品組成物が構想される。
【００２６】
本発明による医薬および／または化粧品組成物は、病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防することにおける使用を目的とする。本発明は、活性物質の細胞取込みを最適化するため、神経保護のためおよび／またはカルベオラを正常化するための本発明による医薬および／または化粧品組成物にさらに関する。
【００２７】
それを必要とする患者における病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化する方法、ならびに／または活性物質の細胞取込みを最適化するため、神経保護のため、および／もしくはカルベオラを正常化するためおよび／もしくは病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防するための方法であって、それを必要とする動物またはヒトに本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドまたは前記ペプチドを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法にも関する。
【００２８】
さらに、本発明は、配列番号７、８または９に示されたアミノ酸配列を本質的に有するペプチドに対する抗体、ならびに哺乳類およびヒトを含めた動物などの生物における前記タンパク質またはその相同体もしくは断片を検出することにおけるその使用に関する。
【００２９】
相当するペプチドを作製するための、配列番号１〜９のいずれかに示されたアミノ酸配列を本質的に有するペプチドをコードする核酸の使用であって、前記ペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸（ａａ）位置３６番における、配列番号２のａａ位置１番における、配列番号３のａａ位置２番にける、および／または配列番号４のａａ位置２番における少なくとも１つのシステインジスルフィドを含む、使用も本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】システインの酸化を示す図である。Ａ：スルフェン酸、Ｂ：スルフィン酸、Ｃ：スルホン酸である。
【図２】ＡＦ１６のＮ−エチルマレイミド類似体（ＡＦ１６−ＮＥＭ）を示す図である。
【図３】ＡＦ１６（Ａ）およびＡＦ１６−ＮＥＭ（Ｂ）のヒト血漿および緩衝液安定性を示す図である。
【図４】ヒト血漿中のＡＦ１６のＬＣ−ＭＳ検出分解生成物を示す図である。
【図５】Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＡＦ１６分解を示す図である。＋ＰＩは、プロテアーゼ阻害剤カクテルを示す。
【図６】Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＡＦ１６分解の代謝産物形成動態を示す図である。青いダイヤモンド形は、ＡＦ１６、赤い四角は、ＡＦ１６＋阻害剤カクテルである。
【図７】Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＡＦ１６分解の代謝産物形成動態を示す図である。青いダイヤモンド形は、ＡＦ１６、赤い四角は、ＡＦ１６＋阻害剤カクテルである。
【図８】Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＡＦ１６分解の代謝産物形成動態を示す図である。青いダイヤモンド形は、ＡＦ１６、赤い四角は、ＡＦ１６＋阻害剤カクテルである。
【図９】Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＡＦ１６の分解、決定された構造の示唆された経路を示す図である。
【図１０】１０℃で２０ｈにわたる異なる沈殿法でのＡＦ１６の相対的安定性を示す図である。２０ｈにわたる３回の同じサンプルの繰返し注入の結果を示す。ＴＣＡおよびＭｅＣＮは、経時的に良好な明らかな安定性を示すことが明らかである。わずかな消失が２０ｈでのＺｎＳＯ４で注目される。経時的な著しい喪失がＭｅＯＨで示されている。ＡＦ１６は、ＭｅＯＨで安定であるが、ペプチドは、アルコール混合物に限定された溶解性を有することがあることが知られているので、喪失は、ペプチド沈殿が原因である可能性がある。
【図１１】１０℃で２０ｈにわたる異なる沈殿法でのＡＦ１６の相対的安定性を示す図である。ＭＳ−強度（イオンカウント）に換算した互いに比較した上で得られたデータのダイヤグラムである。ＴＣＡ沈殿は、最も強いシグナルを示し、参照として設定された。非有機的方法が後れを取っていることが明らかであるが、これは、共溶出抑制イオンによる可能性が高い。最良の安定性を有する２つの方法（ＴＣＡおよびＭｅＣＮ）は、５００倍を超える感度の差異を示しており、したがって、継続的研究に関して、ＴＣＡは、研究にわたって使用されることが選択された。
【図１２】１０℃で２０ｈにわたる異なる沈殿法でのＡＦ１６の相対的安定性を示す図である。
【図１３Ａ】ヒト（最上位）およびラット（最下位）血漿中のＡＦ１６および同定された代謝産物の動態を示す図である。
【図１３Ｂ】ヒト（最上位）およびラット（最下位）血漿中のＡＦ１６および同定された代謝産物の動態を示す図である。
【図１４】５９２．３／５９４．４代謝産物の高解像度スキャンを示す図である。
【図１５】血漿沈殿剤としてＺｎＳＯ４および＋／−ＤＴＴを使用した、ＡＦ１６および同定された代謝産物の動態を示す図である。Ａ：ヒト＋ＤＴＴ、Ｂ：ヒト−ＤＴＴ、Ｃ：ラット＋ＤＴＴおよびＤ：ラット−ＤＴＴである。ＡＦ１６は、完全な円で示されている。
【図１６】ヒト血漿中の主要な同定された生成物の相対的形成を示す図である。
【図１７】ラット血漿中の主要な同定された生成物の相対的形成を示す図である。
【図１８】配列表である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義および略語
略語
ＩＦＰ：間質液圧；
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；
ＡＦ：抗分泌性因子、全長ＡＦタンパク質（配列番号１に示された）
ＡＦ−６：ヘキサペプチドＣＨＳＫＴＲ（配列番号２に示された）；
ＡＦ−７：アミノ酸Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ（配列番号８に示された）からなるペプチド；
ＡＦ−１６：アミノ酸ＶＣＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ（配列番号３に示された）からなるペプチド；
ＡＦ−１７：アミノ酸ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ（配列番号７に示された）からなるペプチド；
ＡＦ−８：セプタペプチドＶＣＨＳＫＴＲ（配列番号４に示された）；
ＡＦ−９：アミノ酸ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ（配列番号９に示された）からなるペプチド；オクタペプチドＩＶＣＨＳＫＴＲ（配列番号５に示された）；
ペンタペプチドＨＳＫＴＲ（配列番号６に示された）；
ＳＰＣ：特別にプロセシングされたシリアル；
ＲＴＴ：ＡＦ（ＡＳＰ）の含有量を測定するためのＳＥ９００００２８−２（刊行物番号４６６３３１）において公表された、ラット小腸における標準化された分泌応答を測定するための方法；
ＡＦ：抗分泌性因子；
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定法；
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；
ＡＰ：アルカリホスファターゼ；
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；
ｍＡｂ：モノクローナル抗体；
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：ナノフロー液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法；
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動。
ＨＳＶ１：単純ヘルペスウイルス−１
ＴＢＩ：外傷性脳損傷
【００３２】
定義
タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基によって構成された生体高分子である。タンパク質は、アミノ酸の線状重合体として、ポリペプチドとも称される。典型的に、タンパク質は、５０〜８００のアミノ酸残基を有し、したがって、約６，０００から約数十万ダルトン以上の範囲内の分子量を有する。小さいタンパク質は、ペプチド、ポリペプチド、またはオリゴペプチドと称される。「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」という用語は、本文脈において互換的に使用される。ペプチドは、２〜５０アミノ酸残基（ａａ）などの非常に少ないアミノ酸残基を有し得る。
【００３３】
「抗分泌性」という用語は、本文脈では、分泌および／または体液輸送を抑制するまたは減少させることを意味する。本文脈では、「抗分泌性因子タンパク質」、「抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質」、「ＡＦ−タンパク質」、ＡＦ、またはその相同体、誘導体もしくは断片という用語は、特許文献１において定義された「抗分泌性因子」または「抗分泌性因子タンパク質」という用語と互換的に使用され、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質またはペプチドまたは抗分泌性および／もしくは等価な機能および／もしくは類似体活性を有するその相同体、誘導体および／もしくは断片を、またはポリペプチドの機能を改変しないその修飾物を表す。したがって、本文脈における「抗分泌性因子」、「抗分泌性因子タンパク質」、「抗分泌性ペプチド」、「抗分泌性断片」、または「抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質」は、その誘導体、相同体または断片も表し得ることが理解されるべきである。これらの用語は、全て本発明の文脈において互換的に使用される。さらに、本文脈では、「抗分泌性因子」という用語は、「ＡＦ」に省略することがある。本文脈における抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、特許文献１およびＷＯ００／３８５３５において以前定義された抗分泌性特性を有するタンパク質も表す。抗分泌性因子は、例えば特許文献２にも開示されている。
【００３４】
ＳＰＣ（Ｃ）は、特別にプロセシングされたシリアル（ＳＰＣ）を含む医療食品である。
【００３５】
「医療食品」は、本文脈では、食品、飼料または栄養補助食品、または特別な食事使用のための食品を表し、これらは、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を用いて製造されている、または代わりに、内在性ＡＦの合成および／または活性化を誘発する能力を有する。前記食品は、液体または粉末などの液体または固体形態の任意の適した食品、または任意の他の適した食材とすることができる。そのような物質の例は、ＷＯ００３８５３５またはＷＯ９１／０９５３６に見出される。
【００３６】
また、抗分泌性因子という用語によって意図されるＳａｌｏｖｕｍ（Ｃ）は、例えばＳＥ９０００２８−２およびＷＯ００／３８５３５に記載されており、以下にさらに記載されている、抗分泌性因子（ＮＡＳＰ）の高い含有量で卵黄において提供される天然の抗分泌性因子（ＮＡＳＰ）である。
【００３７】
本発明の詳細な説明
本発明は、初めて、ＡＦの主要な代謝産物をＡＦ１６（ＡＦ−１７）のシステインジスルフィドと同定する。可逆的であるＡＦ１６の急速なジスルフィド形成は、急速なペプチダーゼ分解からＡＦ１６を明らかに保護し、ＡＦ１６がはるかに高い程度までその標的にインタクトに到達することを可能にし、かつそれを必要とする患者への投与後の活性ＡＦ物質の運命をモニターするための手段を改善し、結果として最適化された活性ＡＦ物質、全長ＡＦ、ＡＦの断片および／またはＡＦペプチドの投薬計画につながる保護機能である。本明細書で初めて文書化されるように、改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ1/2）を有する新規な合成的に作製されたまたは単離組換えＡＦ−ペプチド（ＡＦ−１７）が開示され、これは、それを必要とする患者への投与後の活性ＡＦ物質の運命をモニターするための改善された手段を可能にし、結果として、活性ＡＦおよび／またはＡＦペプチドの投薬計画を最適化するための改善された手段につながる。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、以下でＡＦ−１７（配列番号７に示された）と称される単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含み、該ペプチドが抗分泌性活性を有する、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩に関する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、以下でＡＦ−７（配列番号８に示された）と称される、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを含み、該ペプチドが抗分泌性活性を有する、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩に関する。
【００４０】
さらに別の実施形態では、本発明は、以下でＡＦ−９（配列番号９に示された）と称される、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、配列番号４（ＡＦ−８）に示されたアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含み、該ペプチドが抗分泌性活性を有する、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩に関する。
【００４１】
本明細書で明らかにされるように、本発明者らは、例えば実験３に示されているように、コレラ毒素の負荷後に、腸におけるなど、病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化するのにＡＦ−１６と少なくとも同じくらい効果的である本発明によるペプチドを初めて開示する。本発明によるペプチドは、病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化すること、ＴＢＩ、腫瘍および／または腫瘍関連合併症を治療するかつ／または予防すること、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病および下痢を治療すること、所与の薬物の細胞取込みを最適化すること、神経保護、およびカルベオラを正常化することから選択されるがこれらに限定されない様々な種々の疾患および状態において効果的である。
【００４２】
したがって、本発明は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質（ＡＦ−１７）からなる、これを含む、これに由来する、かつ／またはこれに基づく新規な改善された単離組換えまたは合成活性ペプチドおよび医学におけるその使用を開示する。特に、本発明は、病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防するため、または活性物質の細胞取込みを最適化するため、神経保護のためおよび／またはカルベオラを正常化するための本明細書で記載されたＡＦ−１７、ＡＦ−７、および／またはＡＦ−９の１つまたは組合せの使用に関する。
【００４３】
本発明は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質（ＡＦ−１７）からなる、これを含む、これに由来する、かつ／またはこれに基づく新規な改善された単離組換えまたは合成活性ペプチドおよび特に、抗分泌性因子（ＡＦ）１７と称される新規なペプチドを開示する。そのペプチドは、例えば、ヒトを含めた動物における病理学的体液輸送および／または炎症反応を正常化するために使用される。ＡＦ−１７は、免疫検出に、動物を育てるための飼料添加物として、止痢薬ならびに浮腫、脱水症および／または炎症を伴う疾患に対する薬剤としてさらに使用される。
【００４４】
抗分泌性因子
抗分泌性因子は、身体において天然に生じるタンパク質のクラスである。ヒト抗分泌性因子ＡＦタンパク質は、脳下垂体から単離された場合、３８２〜２８８アミノ酸を含む４１ｋＤａのタンパク質である。本発明による活性部位は、そのタンパク質のＮ末端に近い領域におけるタンパク質に局在していることがあり、特に、配列番号１のアミノ酸１〜１６３、より具体的には、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質配列上のアミノ酸位置３５〜５０に局在している。ＡＦの生物学的効果は、配列番号２（ＡＦ−６）に示された、前記コンセンサス配列の少なくとも６アミノ酸を含む、またはそのポリペプチドおよび／またはペプチドの生物学的機能を改変しないその修飾物を含む任意のペプチドまたはポリペプチドによって発揮される。
【００４５】
本発明者らは、抗分泌性因子が、より詳細には、１９Ｓ／ＰＡ７００ｃａｐにおける、全ての細胞において支配的な構成物、２６Ｓプロテアソームのサブユニットを構成するタンパク質Ｓ５ａ、およびＲｐｎ１０とある程度まで相同であることを示した。本発明では、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、同じ機能的特性を有する相同タンパク質のクラスと定義される。抗分泌性因子は、また、トロンボスポンジン−１に結合することが知られており、がん進行と関連しているアンギオシジン、別のタンパク質アイソフォームと高度に類似している。
【００４６】
本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質および／またはペプチドの相同体、誘導体および断片は、全て類似した生物活性を有する。相同体、誘導体および断片は、本文脈では、天然の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質のものに相当する少なくとも６アミノ酸（配列番号２に示された）を含み、これは、ポリペプチドおよび／またはペプチドの必須の生物学的機能を改変することなく、抗分泌性因子の生物活性を最適化するために、１つまたはそれ以上アミノ酸を変化させることによってさらに修飾されていてもよい。
【００４７】
誘導体によって、本文脈では、直接的または修飾もしくは部分的置換によって別の物質に由来する、本明細書で定義された抗分泌性因子と等価な活性および／または機能的に等価な活性を有するタンパク質が意図されており、ここで、１つまたはそれ以上のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されており、このアミノ酸は、修飾アミノ酸または非天然アミノ酸とすることができる。例えば、本発明による抗分泌性因子誘導体は、Ｎ末端および／またはＣ末端保護基を含み得る。Ｎ末端保護基の一例は、アセチルを含む。Ｃ末端保護基の一例は、アミドを含む。
【００４８】
さらに、本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ペプチド、相同体、誘導体および／または断片のアミノ酸配列と少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるなど、少なくとも７０％同一である任意のアミノ酸配列も本発明の範囲内であると考えられる。
【００４９】
参照アミノ酸配列と少なくとも例えば９５％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片によって、アミノ酸配列が参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり最大５つの点変異を含み得ることを除いて、例えばペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図されている。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中のアミノ酸の最大５％を欠失させ得るまたは別のアミノ酸と置換し得る、または参照配列中の総アミノ酸の最大５％であるいくつかのアミノ酸を参照配列に挿入し得る。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配列中のアミノ酸中に個々にまたは参照配列内の１つまたはそれ以上の隣接する群で散在し得る。
【００５０】
本発明では、ローカルアルゴリズムプログラムが同一性を決定するために最適である。ローカルアルゴリズムプログラム（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎなどの）は、ある配列中のサブ配列を第２の配列中のサブ配列と比較し、サブ配列およびそれらのサブ配列のアラインメントの組合せを見出し、これは、最も高い全体的類似度スコアをもたらす。内部ギャップは、可能であれば、ペナルティを課される。ローカルアルゴリズムは、共通の単一ドメイン、または結合部位のみを有する２つの多ドメインタンパク質を比較するのに良く機能する。
【００５１】
同一性および類似度を決定するための方法は、公的に利用可能なプログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似度を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ（１９９４））ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９０））を含むが、これに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９０））から公的に利用可能である。各配列分析プログラムは、デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルトギャップペナルティを有する。一般に、分子生物学者は、使用されるソフトウェアプログラムによって確立されたデフォルト設定を使用することが期待されている。
【００５２】
本明細書で定義された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質またはペプチドまたは等価な活性を有するその相同体、誘導体および／もしくは断片は、６〜１６アミノ酸など、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸以上などの６アミノ酸以上を含み得る。他の好ましい実施形態では、抗分泌性因子は、７、９または１７アミノ酸からなる。ある特定の実施形態では、本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片は、６、７、８、９、１５、１６または１７アミノ酸からなる。
【００５３】
現在好ましい実施形態では、単離組換えかつ／または合成ペプチドＡＦ−１７（配列番号７に示された）、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩は、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含み、前記ペプチドは、抗分泌性活性を有する。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、単離組換えかつ／または合成ペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩は、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含み、前記ペプチドは、抗分泌性活性を有する。
【００５５】
さらに別の好ましい実施形態では、単離組換えかつ／または合成ペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩は、配列番号４（ＡＦ−８）に示されたアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含み、前記ペプチドは、抗分泌性活性を有する。
【００５６】
本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製し得る、例えば組換えで、合成的にかつ／または化学的に合成し得る、かつ／またはブタの脳下垂体またはトリの卵からなど、抗分泌性因子の天然の供給源から単離し得る。作製後、本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片は、より小さい抗分泌性活性断片への化学的または酵素的切断によって、および／またはアミノ酸の修飾によって、および／またはペプチドのシステインにおけるジスルフィド連結を介した配列番号２のアミノ酸位置１番における、代わりに、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインの付加によってなど、さらにプロセシングされることがある。
【００５７】
精製によって純粋な形で抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を得ることは現在不可能である。しかしながら、特許文献１および特許文献２において以前開示されたように、生物学的に活性な抗分泌性因子タンパク質を組換えでまたは合成的に作製することは可能である。特許文献１もまた、７〜８０アミノ酸のこのタンパク質の生物学的に活性な断片の作製を開示している。
【００５８】
本文脈では、本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片は、哺乳類（ヒトを除く）において作製された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の天然の代謝産物、または組換えで作製され、かつ場合により化学的に修飾された、もしくは合成的に作製されたペプチドである。
【００５９】
本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端保護基をさらに含み得る。Ｎ末端保護基の一例は、アセチルを含む。Ｃ末端保護基の一例は、アミドを含む。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片は、アミノ酸の通常の一文字の略語を使用して、配列番号７〜９、すなわちＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ（本文脈では、ＡＦ−１７とも称される、配列番号７）、Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ（本文脈では、ＡＦ−７とも称される、配列番号８）、ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ（本文脈では、ＡＦ−９とも称される、配列番号９）から選択される。添付の配列表に明記されているように、上に明記された配列中のアミノ酸のいくつかを、他のアミノ酸に置き換え得る。
【００６１】
本発明は、配列番号７〜９によるペプチドのいずれかの２つまたはそれ以上の組合せも意図する。
【００６２】
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示された医薬組成物の使用にも関し、これは、２つもしくはそれ以上の本発明による抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、その相同体、誘導体、ペプチドおよび／または断片を含む。
【００６３】
ジスルフィド
本文脈では、ジスルフィドは、一般構造Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒを有する官能基を表す。その連結は、ＳＳ結合またはジスルフィド架橋とも称され、２つのチオール基のカップリングに通常由来する。正式な言い方では、結合は、その同類物、過酸化物（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｒ）と類似した、パースルフィドである。
【００６４】
システイン（ＣｙｓまたはＣと省略される）は、式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ＞を有する準必須タンパク新生アミノ酸である。それは、コドンＵＧＵおよびＵＧＣによってコードされる。Ｃｙｓにおけるチオール側鎖は、求核剤として酵素反応にしばしば関与する。チオールは、酸化に感受性であり、多くのタンパク質における重要な構造的役割を果たすジスルフィド誘導体システインをもたらす。
【００６５】
システイン残基は、最も化学的に複雑なアミノ酸の１つであり、活性酸素または代謝的に修飾された生体異物／薬物などの反応性求電子剤に対する求核剤としても酸化還元化学反応に典型的に関与する。ＡＦ１６は、配列番号２の位置２に１つのシステイン残基を含有する。ＡＦ−１７、またはＡＦ−７およびＡＦ−９などであるが、これらに限定されない本出願によるペプチドを含む任意の他のジスルフィドは、したがって、他のシステインとの反応（ジスルフィド形成）、求電子剤との反応による、硫黄の両方の酸化に対して保護されており、したがって、タンパク分解活性に対してより靭性がある。
【００６６】
合成
ジスルフィド結合は、スルフヒドリル（−ＳＨ）基の酸化から通常形成される。過酸化水素を含めたいろいろなオキシダントがこの反応を促進する。このような反応は、スルフェン酸中間体を介して進行すると考えられている。実験室では、塩基の存在下でヨウ素がチオールをジスルフィドに酸化するために通例用いられる。代わりに、タンパク質におけるジスルフィド結合は、チオール−ジスルフィド交換によってしばしば形成される。このような反応は、ある場合には、酵素によって媒介され、他の場合には、平衡制御下に、特に、触媒量の塩基の存在下にある。
【００６７】
多くの専門化された方法がジスルフィドを形成するために、有機合成における適用のために開発され、本発明による合成ＡＦ−１７またはＡＦ−７またはＡＦ−９またはＡＦ−７に基づくＡＦ−ジスルフィドペプチドを作製するために用いられ得る。
【００６８】
ＡＦ１６は、図３Ａに示されているように血漿に対する高度な感度を示す。分解の動態は、０．４ｈのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ１／２）を示す。ＡＦ−１７は、ほぼ５倍高い安定性、ｔ１／２＝１．８ｈを有することが予測される。ＡＦ１６は、体循環における酵素および化学分解に高度に感受性である。ＡＦ−１７は、システイン部分が修飾されているので、酵素および化学反応に対して靭性がある。
【００６９】
Ｃａｃｏ−２細胞透過性実験中のＡＦ１６の定量的パイロット実験は、ペプチドの急速な消失を明らかに示した（示さず）。腸に、およびそのようにＣａｃｏ−２細胞の頂端側に、刷子縁ペプチダーゼが存在することがよく知られている。ＡＦ１６の分解の動態は、８分のｔ１／２で記載されているように非常に急速である。
【００７０】
ＡＦ１６および同様の量の同位体標識されたペプチドを実験１に記載されているようにラットおよびヒトの血漿中でインキュベートした。フルスキャンＭＳデータの分析に関して、Ｓｃｉｅｘ，Ｌｉｇｈｔｓｉｇｈｔ製の代謝産物同定ソフトウェアを使用し、これは、品質管理（ＱＣ）サンプルに対するインキュベートされたＭＳ応答を比較し、明らかなピークを質量電荷比（ｍ／ｚ）値を有する代謝産物として割り当てる。最も大きい代謝産物ピーク領域を順位付けし、ある場合には、ＭＳ／ＭＳ断片化によって検証した。スカイライン手法を使用して、小量がモニターされるように創造的で感度の良いＭＲＭ方法においても助けられ、同定されたペプチドの断片化を予測した。
【００７１】
表６は、同定された生成物および３０分のインキュベーションでのそれらの相対量を列挙している。ＭＳ感度は、異なることがあり、したがって、百分率は、変化し得る。結果を再検討すると、同定されたピークの相対的面積に基づいて、表６においてＭ１と命名された１つの代謝産物が他のものよりかなり大きいことが明らかであった。しかしながら、同定された質量ペア（ｍ／ｚ６２５／６３０）は、どの異化生成物（予想されるタンパク質ペプチド結合切断）にも相当しなかった。このペアは、ここで、ＡＦ−１６（ＡＦ−１７）のシステインジスルフィドと同定される。
【００７２】
医学的治療
ＴＢＩ
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、症状および能力障害の広範な範囲を有する複雑な損傷である。外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、頭蓋内損傷としても知られており、それは、外力が脳を外傷性に損傷する場合に生じる。ＴＢＩは、重症度、機構（閉鎖性または穿通性頭部損傷）、または他の機能（例えば、特定の場所においてまたは広範な面積にわたって生じる）に基づいて分類し得る。本文脈では、ＴＢＩは、頭部損傷も含むものとし、すなわちそれは、頭皮および頭蓋骨などの脳以外の構造へのダメージを伴い得る。
【００７３】
ＴＢＩは、特に、子供および若年成人において世界中で死および能力障害の主要な原因である。原因は、落下、自動車事故、および暴力を含む。頭部外傷は、頭蓋内の突然の加速／減速によってまたは運動と突然の衝撃の両方の複雑な組合せによって、頭部への局所的衝撃の結果として生じ得る。損傷の瞬間に生じるダメージに加えて、頭部外傷は、二次的損傷、損傷の直後または数日で起こるいろいろな事象を引き起こす。脳血流量および頭蓋骨内の圧力の変化を含むこれらのプロセスは、最初の損傷からのダメージに実質的に寄与する。
【００７４】
ＴＢＩは、ホストに身体的、認知的、社会的、情緒的、および行動的効果を引き起こし得、結果は、完全な回復から永久的な能力障害または死までにわたり得る。
【００７５】
本文脈では、以下の用語および定義は、ＴＢＩの／ＴＢＩに関する異なる損傷を表し、その全ては、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、該ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドなどの、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含む、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩をそれを必要とする患者に投与することによって治療可能である：閉鎖性頭部損傷、開放性頭部損傷、びまん性軸索損傷、挫傷、貫通性外傷、および二次的損傷。
【００７６】
現在開示された単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、該ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドなどの、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含む、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩は、炎症および細胞損傷または死を促進する化学物質の膨張および放出などの二次的ＴＢＩを治療するかつ／または予防するのに特に有用である。これは、頭蓋内圧を増加させ、脳脊髄液が頭蓋骨からの流れ出るのを妨げ得る脳の膨張を引き起こす。これは、圧力および脳ダメージのさらなる増加を引き起こす。これが制御されず、防がれていない場合、脳は、頭蓋底を脱漏し（押し通し）、呼吸不全および死を引き起こし得る。この二次的損傷の予防は、損傷後の急性の医療ケアの焦点である。
【００７７】
したがって、現在好ましい実施形態における本発明は、二次的ＴＢＩ損傷を治療するかつ／または予防するための医薬組成物の製造のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドの使用に関する。本発明は、二次的ＴＢＩ損傷を治療するかつ／または予防するための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドの使用に、二次的ＴＢＩ損傷を治療するかつ／または予防することにおける使用のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドに、ならびにそれを必要とする患者に前記患者を治療するかつ／または治すのにおよび／またはＴＢＩ損傷の症状を予防するのに十分な量で本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドを投与することによって二次的ＴＢＩ損傷を治療するかつ／または予防する方法に同等に関する。
【００７８】
二次的ＴＢＩ損傷は、以下のものを含む：
・頭蓋内出血（頭蓋骨内の出血）
・脳膨張
・増加した頭蓋内圧（頭蓋骨内の圧力）
・酸素の欠乏と関連している脳ダメージ
・貫通性外傷に共通の頭蓋骨内の感染
・細胞死につながる化学的変化
・頭蓋骨内の増加した体液（水頭症）
【００７９】
後天的脳損傷−
後天的脳損傷は、先天的、分娩時外傷、遺伝性または退行性以外の損傷である。これは、外傷性脳損傷を含む。後天的脳損傷の非外傷性の型では、脳は、通常散在性損傷している。これらの損傷は、外傷性脳損傷に通常含まれないが、症状は、同じ範囲に及ぶ。共通の原因は、無酸素および低酸素である。これらは、脳への酸素の欠乏および脳への不十分な酸素である。それらは、呼吸に関連する、心拍停止または出血に関連する器質的問題のために起こり得る。薬物および中毒も後天的外傷性脳損傷を引き起こし得る。一酸化炭素中毒も脳損傷を引き起こし得る中毒の例である。
【００８０】
現在開示された単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、該ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドなどの、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含む、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩は、後天的脳損傷を治療するかつ／または予防するのに同等に有用である。
【００８１】
したがって、現在好ましい実施形態における本発明は、後天的脳損傷を治療するかつ／または予防するための医薬組成物の製造のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドの使用に関する。本発明は、後天的脳損傷を治療するかつ／または予防するための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドの使用に、後天的脳損傷を治療するかつ／または予防することにおける使用のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドに、および本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドを十分な量でそれを必要とする患者に投与することによって後天的脳損傷を治療するかつ／または予防する方法に同等に関する。
【００８２】
がん
一実施形態では、本発明は、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、該ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドなどの、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含む、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩をそれを必要とする患者に投与することによって特徴付けられる、神経膠芽腫などであるがこれに限定されないがんを治療するための方法に関する。前記方法は、本発明の一実施形態では、最適化された薬物取込みおよびさらなる医薬物質の送達を促進するために使用し得る。
【００８３】
神経膠芽腫などであるがこれに限定されないがんに罹っている哺乳類を治療するための前記方法は、現在好ましい実施形態では、最適化された薬物取込みおよびさらなる医薬物質の送達を促進するために食品、食材および／または栄養補助食品を前記患者に供給し、それによってＡＦの内在性作製を誘発することを含み得る。
【００８４】
前記医薬物質および／または製剤は、本文脈では、坑がん剤、抗腫瘍剤、放射線療法、免疫学的物質および／または細胞ならびに抗生物質、外傷後損傷を標的とする薬物、神経変性を標的とする薬物、ならびに炎症状態に対する薬物からなる群から選択される。前記さらなる医薬物質は、神経膠芽腫（ＧＢＭ腫瘍）などであるがこれに限定されないがんの治療においてナノ粒子および／またはその製剤の形とすることができる。
【００８５】
以下で、本発明の実施形態を詳細に記載することになる。以下に個々に開示される実施形態は、単離または合成ペプチドおよびそのペプチドの意図された使用の例であることに留意されたい。本発明は、これらの例に限定されない。
【００８６】
コンパートメント症候群
さらに、本発明は、一実施形態では、コンパートメント症候群を治療するかつ／または予防するための医薬組成物の製造のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドの使用に関する。本発明は、コンパートメント症候群を治療するかつ／または予防するための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドの使用に、コンパートメント症候群を治療するかつ／または予防することにおける使用のための本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドに、および本発明による単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドを十分な量でそれを必要とする患者に投与することによって、後天的脳損傷を治療するかつ／または予防する方法に同等に関する。
【００８７】
一実施形態では、本発明は、単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、該ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドなどの、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含む、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩をそれを必要とする患者に投与することによって特徴付けられる、コンパートメント症候群またはその症状を治療するかつ／または予防するための方法に関する。前記方法は、本発明の一実施形態では、最適化された薬物取込みおよびさらなる医薬物質の送達を促進するために使用し得る。
【実施例１】
【００８８】
抗分泌性因子タンパク質（ＡＦ１６）のペプチド断片の効果は、いくつかのグループによって様々な薬理学的機構においてかなりよく研究されている。研究の大部分は、タンパク質またはペプチドの薬理的／生理学的効果に焦点を置いている。しかしながら、ＡＦ１６の薬物動態学的見地を扱う報告はより少ない。したがって、様々なマトリックスにおける全ての試験は、ＡＦ、またはおそらくその加えられたペプチド断片が効果を引き起こしている分子種であると仮定している。他の実験室における以前の研究は、実際、ＡＦまたはＡＦ１６が例えばヒトまたはげっ歯類血漿において分解に感受性であることを示したが、詳細な調査は、行われていない。
【００８９】
この実験は、ヒトのプールされた血漿とＡＦ１６薬理学的研究において通例使用されるＣａｃｏ−２細胞の存在下での両方におけるＡＦ１６ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態および分子の運命を理解する努力を集約する。
【００９０】
材料および方法
材料
ＡＦ１６の固形材料および安定同位体標識（ＳＩＬ）ＡＦ１６  ＩＳは、ＬａｎｔｍａｎｎｅｎのＪａｎ  Ｂｒｕｈｎによって提供された。Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＥｗａ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎによって提供された情報に従って、ペプチドは、純度が約７０％であり、他の構成要素は、４×トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および未知数×Ｈ２Ｏであった。しかしながら、簡潔さのために、ペプチドに関する全ての濃度は、１００％であるとみなす。それらは、相対的基準に基づくので、この仮定は、本明細書で提出される結果に影響しない。全ての他の化学物質および消耗品は、一般的な商業的供給源からのものである。
【００９１】
ＡＦ１６のアルキル化および酸化
ＡＦ１６の酸化を試験するために、５０％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）溶液を使用した。２μｌ  Ｈ２Ｏ２を（３５ｍＭ最終濃度）１５μＭ  ＡＦ１６の０．１Ｍ重炭酸アンモニウムの１ｍｌ溶液に添加した。混合後直ちに、溶液を質量分析計（ＭＳ）に注入して（直接注入）、酸化生成物を探した。酸化最終生成物、スルホン酸のみが検出され、その感度の良い多重反応方法（ＭＲＭ）が作られた（表１）。同時実験では、過剰ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加えると、ＤＴＴが酸化に対して保護したことが示された。ＡＦ１６のＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）アルキル化バリアント（ＡＦ１６−ＮＥＭ）を、ＨＰＬＣガラスバイアル中で１０μｌ  ０．１Ｍ  ＮＥＭをＰＢＳ中の２５０μｌ  ２ｍｇ／ｍｌ  ＡＦ１６と混合し、約１ｍＭ溶液をもたらすことによって作製した。ＭＳ分析前に、サンプルを周囲温度で３０分間静置し、密封した。３０分後、５％未満のＡＦ１６が残っており、ＡＦ１６−ＮＥＭの感度の良いＭＲＭ方法が作られた（表１）。
【００９２】
ヒト血漿およびＣａｃｏ−２細胞におけるＡＦ１６安定性
血漿中のＡＦ１６およびＡＦ１６−ＮＥＭ安定性の試験をＨＰＬＣガラスバイアル中３７℃（２０μＭインキュベーション濃度）でプールされたヒト血漿（４人のドナー、２人の女性＋２人の男性）を使用して行った。４つの異なるマトリックスを試験した：血漿：等張６７ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４（ＫＰ）（１：１）、血漿：ＫＰ＋０．１ｍＭ  ＤＴＴ、ＫＰおよびＫＰ＋０．１ｍＭ  ＤＴＴ。インキュベーション時間は、０、１．５および３ｈであった。示された時間で、５０μｌアリコートを抽出し、１５０μｌ氷冷メタノール中でクエンチ／沈降させ、分析まで凍結させた。相対定量をＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで行った。Ｃａｃｏ−２細胞の存在下でのＡＦ１６の運命の調査を３つの別々の時に行った。最初に、定量的測定を０、１５、３０および６０分にわたってＭＲＭ手法を使用して行った（表１）。ここで、ＡＦ１６またはその可能性のあるスルホン酸代謝産物を頂端と基底外側コンパートメントの両方においてモニターした（示さず）。第２の実験は、６０分のインキュベーション中のＡＦ１６の運命の定性的決定であった。ＨＢＳＳ緩衝液中の５０μＭ  ＡＦ１６をＣａｃｏ−２細胞単層の頂端側でインキュベートし、１００μｌアリコートを５、１０、２０、３０および６０分で抽出した。サンプルを１００μｌ  ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを含有する９６ウェルプレート上に置いた。プレートを密封し、フルスキャンＵＰＬＣ−ＭＳ分析まで凍結した（以下および表２を参照されたい）。第３の実験は、第２のミラーであり、唯一の違いは、構造解明を助けるためにＡＦ１６：ＡＦ１６  ＩＳ（１：１）のＨＢＳＳ溶液を使用したことであった。
【００９３】
分析手順
異なるアッセイからの全てのサンプルをＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。以下のシステム、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）に結合されたＷａｔｅｒｓ  ＸＥＶＯ  ＴＱ三連四重極質量分析計（エレクトロスプレーイオン化、ＥＳＩ）を使用した。クロマトグラフ分離のために、一般的な勾配をＣ１８  ＢＥＨ１．７μｍカラム２×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）上で使用した（３分の総走行にわたる１％移動相Ｂから５０％）。移動相Ａは、０．０５％ＴＦＡからなり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルからなった。流速は、０．５ｍｌ／分であった。５μＬのサンプルを注入し、表１に報告した質量分析設定で走らせた。フルスキャンＭＳ分析では、１０μｌを注入したことを除いて同じクロマトグラフィー設定を使用した（フルループ）。ＭＳは、表１におけるコーン電圧を使用して１００〜４００または４００〜７００ｍ／ｚウインドウにおいてイオンをスキャンするように設定した。表２における選択された親イオンの娘スキャン分析に関して、衝突エネルギーを１０、２０および４０Ｖの間で段にした。ＡＦ１６の親イオン、示唆された電荷および保持時間ならびに見出された代謝産物を表２に列挙する。
【００９４】
【表１】
2019524742.tif 000003
【００９５】
【表２】
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【００９６】
結果
ＡＦ１６のアルキル化および酸化
システイン残基は、最も化学的に複雑なアミノ酸の１つであり、酸化還元化学反応にだけでなく、活性酸素または代謝的に修飾された生体異物／薬物などの反応性求電子剤に対する求核剤としても典型的に関与する。ＡＦ１６は、１つのシステイン残基を含有するため、酸化または他の修飾への感度がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じるかどうかを試験することが重要であった。最初に、可能性のあるスルフェン、スルフィンおよびスルホン酸誘導体の分析ＭＳ方法を作ることが可能であるかどうかを確かめるために、過酸化水素でのＡＦ１６の酸化を行った（図１）。過酸化水素は、低次種の検出を可能にするのに強すぎる酸化剤であることが証明され、したがって、スルホン酸類似体に関する方法のみを作った。
【００９７】
後の実験においてシステインの役割をさらに探求するために、Ｓ−アルキル化バリアントをアルキル化試薬Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を使用して作った（図２）。したがって、ＮＥＭ修飾ＡＦ１６は、硫黄の酸化に対して、他のシステインと反応すること（ジスルフィド形成）、求電子剤と反応することから保護されており、非天然アミノ酸であるのでタンパク分解活性に対しておそらくより靭性がある。
【００９８】
ヒト血漿中のＡＦ１６安定性。
ＡＦ１６、安定同位体標識（ＳＩＬ）ＡＦ１６およびアルキル化類似体ＡＦ１６−ＮＥＭを１μＭでヒト血漿：０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．４（ＫＰ）（１：１）、ヒト血漿：ＫＰ（１：１）＋１ｍＭ  ＤＴＴ、ＫＰまたはＫＰ＋１ｍＭ  ＤＴＴで３７℃で３ｈにわたってインキュベートして、安定性を調査した。ＫＰを含めて、血漿に緩衝液能力を提供し、ｐＨ関連効果で結果を混乱させないようにした。結果を図３に示す。
【００９９】
ＡＦ１６は、図３Ａに示されるように、血漿に対する高度な感度を示す。分解の動態は、０．４ｈのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ１／２）を示す。ＤＴＴを含めることには、ｔ１／２を１．１ｈに増加させる保護効果があるように見える。興味深いことに、非天然ＡＦ１６類似体（図３Ｂ）は、ほぼ５倍高い安定性、ｔ１／２＝１．８ｈを有する。ここでも、ＤＴＴは、保護効果、ｔ１／２＝４．２ｈを課す。これらの結果は、ＡＦ１６が体循環における酵素および化学分解に高度に感受性であることを示している。それは、システイン部分が修飾されている場合、ＡＦ１６が酵素および化学反応に対して靭性があることも示している。両方の化合物を有するＤＴＴの効果は、理解することがより難しいが、これは、ＤＴＴがカルボニル生成物、例えば、全てＡＦ１６に存在する、トレオニン、リシン、アルギニンおよびプロリンの形成などの一般的な酸化反応に対して保護することを反映している可能性が最も高い。ＡＦ１６、ＳＩＬ−ＡＦ１６およびＡＦ１６−ＮＥＭの３ｈインキュベーションのフルスキャンＬＣ−ＭＳ分析は、いくつかの興味深い結果を明らかにしており、図４を参照されたい。２つの特徴的な分解生成物が見出され、５番目のペプチド結合（リシンおよびトレオニン）でのおよび１０番目の結合（プロリンおよびグルタメイト）での切断が、理論上の断片ＶＣＨＳＫ−ＴＲＳＮＰ、ＴＲＳＮＰ−ＥＮＮＶＧＬおよびＥＮＮＶＧＬをもたらした。断片ＴＲＳＮＰ−ＥＮＮＶＧＬおよびＥＮＮＶＧＬは、ＬＣ−ＭＳによって検出されたが、ＶＣＨＳＫ−ＴＲＳＮＰは、検出されなかった。おそらく、検出されなかった断片は、インキュベーション中にさらなる分解を受けた。興味深いことに、ＡＦ１６−ＮＥＭでのインキュベーションでは、明白なタンパク分解は、位置５で生じず、これは、Ｎ末端に対して作用するプロテアーゼ、例えばアミノペプチダーゼが除外されていることを示している。
【０１００】
Ｃａｃｏ−２細胞でのＡＦ１６安定性
Ｃａｃｏ−２細胞透過性実験中のＡＦ１６の定量的パイロット実験は、ペプチドの急速な消失を明確に示した（示さず）。腸に、およびそのようなものとしてＣａｃｏ−２細胞の頂端側に、刷子縁ペプチダーゼが存在することはよく知られている。これをさらに調査するために、別個の実験を設計した。Ｃａｃｏ−２細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテルを有するまたは有さない５０μＭ  ＡＦ１６に頂端側で暴露し、１ｈにわたってサンプル採取した。ＡＦ１６分解に関する結果を図５に示す。
【０１０１】
ＡＦ１６の分解の動態は、８分のｔ１／２で説明されるように、非常に急速である。阻害剤カクテルは、分解を著しく遅くする（ｔ１／２＝５７分）が、複雑な動態を完全には示さない。ＡＦ１６の分子の運命を理解するために、ＬＣ−ＭＳ分析を追跡した。抑制剤を有するまたは有さないインキュベーションでは、血漿安定性実験と比較して、いくつかの新規な代謝産物が検出された。しかしながら、これは、使用されたより高いインキュベーション濃度に依存する可能性がある。図６〜８は、実験時間にわたる代謝産物Ｍ１−Ｍ９の形成動態を示し、図９は、これらの生成物に対して仮に決定された構造を示す。
【０１０２】
表３は、それぞれ、３０および６０分後の個々の分子種の相対量、±阻害剤カクテルを示す。明らかに主要な代謝産物（＞１０％）を太字の数字で示す。しかしながら、表３におけるような比較を行う場合、本発明者らが全ての個々のイオンが類似したＭＳ感度を有すると仮定していることを言及することは、重要である。全ての同定された生成物は、特定のペプチド結合での切断に関係している。示唆されたアミノ酸組成物を表４に示す。
【０１０３】
阻害剤カクテルの非存在下では、３つの明らかな代謝産物、Ｍ１、Ｍ３およびＭ６が３０分のインキュベーション後に優位を占める。６０分のインキュベーション後、Ｍ３とＭ６の両方は、減少する一方、Ｍ１は、直線的に増加し続ける（図６Ａ／Ｃおよび７Ｃ）。図９における示唆された経路を見ると、Ｍ３のさらなるＮ末端ペプチド切断がＭ１をもたらしたと仮定することは合理的である。Ｍ６の構造は不明だが、２０分後に比較的急速に減少するので、これも、Ｍ６がＭ１の形成に寄与していることを示している可能性がある。他の代謝産物は、Ｍ１のさらなる分解生成物であることが示唆されたが、当然、より遅い経路によってより直接的な様式でも形成されよう。
【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
阻害剤カクテルは、タンパク分解酵素、Ｂｅｓｔａｔｉｎ（アミノペプチダーゼ）、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）およびＣａｐｔｏｐｒｉｌ（アンジオテンシン変換酵素、カルボキシペプチダーゼ）の３つの抑制剤からなった。これらの酵素の抑制により、Ｍ１、Ｍ３およびＭ６の形成が効果的に最小化されることを理解することは興味深い。さらに、図４、９および表４に示された理論上の生成物Ｍ７は、比較的線形の様式で形成され、抑制剤によって安定化されるように見える。これは、Ｎ末端作用プロテアーゼの抑制と一致している。図８Ａは、Ｍ７が抑制剤なしで最初に非常に急速に形成されるが、おそらく効率的にさらに代謝されることを示唆している。比較的小さいが、主要な代謝産物Ｍ８およびＭ９は、まだ今のところ同定されていない。これら２つの代謝産物が上記のペプチド結合切断よりもより複雑な化学的反応に由来する可能性は、かなりある。しかしながら、未知の代謝産物Ｍ６、Ｍ８およびＭ９の構造を理解しようと試み、既に構造的に割り当てられたものを検証するために、追加の実験をＳＩＬ標識ＡＦ１６を使用して行った。しかしながら、この実験からは、Ｍ６がＳＩＬアミノ酸を含有し、Ｍ８およびＭ９が含有しないという事実以外は、さらなる情報は何も抽出できなかった。しかしながら、これは、さらに探求される必要がある。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
ＡＦ１６または検出された代謝産物のいずれかの透過性もＣａｃｏ−２細胞での６０分のインキュベーション時間後に基底外側でモニターした。しかしながら、代謝産物は、この実験では、抑制されたインキュベーションにおける特徴的なピークを与えるＭ８を除いて見出されなかった。
【０１０８】
結論およびさらなる研究
ＡＦ１６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態をさらに理解するために、いくつかの重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行った。
ＡＦ１６は、例えばポリスチレン表面に最も吸着しやすい。しかしながら、記載された対策は、効果を示さず、それがどのくらい厳しいかを解釈することは難しい。より高い濃度、＞１μＭで、効果は、明らかではなく、したがって、本発明者らのインキュベーションでは、効果は小さい可能性が最も高い。
本研究は、ＡＦ１６ペプチドがヒト血漿とＣａｃｏ−２細胞の両方の存在下でいくつかのペプチド生成物に分解することを示した。
分解は、両方のマトリックスにおいて非常に急速であり、類似した代謝経路を示し、主要な、線状に形成された明らかに安定な生成物としてＭ１をもたらす（５番目のペプチド結合（リシンおよびトレオニン）での切断）。
刷子縁ペプチダーゼの関与が阻害剤カクテルの強い効果によって証明され、これは、８から５５分までｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔ1/2を増加させる。プロテアーゼ抑制剤の存在下での代謝パターンの変化は、興味深いが、現在のところ未知の代謝産物（Ｍ８、Ｍ９）は、抑制剤の非存在下で著しい程度まで形成されない可能性が最も高い。
Ｎ−エチルマレイミドでの位置２でのシステインの保護は、ヒト血漿中のペプチドを大きく安定化する。アミノペプチダーゼの活性の除去による可能性が最も高い。これらの結果を一緒にすると、ＡＦ１６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態は、複雑であり、注意深く、バランスが保たれ、様々な状態下で観察された薬理的効果に解釈される必要があることが強く示唆される。ＡＦ１６がＣａｃｏ−２細胞での短いインキュベーション時間後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで急速に消失することは明らかである。さらに、いくつかの代謝産物がＡＦ１６消失に相当する速度で非常に急速に形成される。ＡＦ１６および代謝産物が類似した効率で同じ標的に対して作用する可能性が十分にある。これは、機能的アッセイにおいて証明されるはずである。
【実施例２】
【０１０９】
ＡＦ１６：血漿ｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性および代謝的運命
導入
この実験は、種間の（ヒト、マウス、ラットおよびイヌ）血漿動態ならびにヒトおよびラット血漿中のＡＦ１６の定性的異化／代謝に関する最新の知見を要約する。
【０１１０】
材料および方法
材料
ＡＦ１６の固形材料および安定同位体標識（ＳＩＬ）ＡＦ１６  ＩＳは、Ｌａｎｔｍａｎｎｅｎ  ＡＢによって提供された。Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＥｗａ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎによって提供された情報に従って、ペプチドは、純度が約７０％であり、他の構成要素は、４×トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および未知数×Ｈ2Ｏであった。しかしながら、簡潔さのために、ペプチドに関する全ての濃度は、１００％であるとみなす。それらは、相対的基準で比較されるので、この仮定は、本明細書で提出される結果に影響しない。ヒトのプールされた血漿（４人のドナー、２人の男性および２人の女性、非喫煙者）は、学術的病院から得た。動物血漿は、Ｎｏｖａｋｅｍｉ  ＡＢからであった。全ての他の化学物質および消耗品は、一般的な商業的供給源からであった。
【０１１１】
血漿プレシピエントの試験
ＡＦ１６のＭＳ感度を最適化するために、明らかな類似した効率を有する最も一般的なタンパク質沈殿剤を試験した。血漿マトリックスは、１：２（血漿：等張リン酸カリウム緩衝液）（ｐＨ７．４）からなり、ＨＰＬＣガラスバイアル中で１：３（血漿：アセトニトリル（ＭｅＣＮ））、１：４（血漿：メタノール（ＭｅＯＨ））、１：３（血漿：硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４：５Ｍ  ＮａＯＨ）（１０％ｗ／ｖ））および１：３（血漿：トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（１０％ｗ／ｖ））で沈殿させた（Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。サンプルをＡＦ１６および同位体標識ＡＦ１６（ＡＦＩＳ）の１０μＭ（最終濃度）１：２混合物で添加した。サンプルを密封し、３５００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清をＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した（以下を参照されたい）。同一のサンプルを異なる時点で３回注入して、オートサンプラー中１０℃で所与の沈殿剤を用いてペプチド安定性を探索した。
【０１１２】
ヒトおよびラット血漿中のＡＦ１６安定性、動態および代謝産物同定
血漿サンプルの全てのインキュベーションは、ＡＦ１６（ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ中の原液１ｍＭ）およびＡＦＩＳ（ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ中の原液０．９ｍＭ）１：２の混合物を利用し、代謝または異化生成物の構造的解釈を助けた。化合物混合物は、任意の他の溶媒の添加前にバイアルの底に常にピペットで移された。血漿中の安定性をヒトのプールされた血漿、Ｗｉｓｔａｒラット血漿、ＣＤ−１マウス血漿およびＢｅａｇｌｅイヌ血漿を使用して密封されたＨＰＬＣガラスバイアル中で３７℃（１０μＭインキュベーション濃度）で行った。インキュベーション時間は、一般に、０（ＱＣサンプル）から２ｈの間であった。各時点で、アリコートを採取し、反応をジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１ｍＭ最終濃度）を含む選択された沈殿剤で停止した。相対定量（ＱＣと比較した）をＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して行った（以下を参照されたい）。代謝産物同定を多重反応モニタリング（ＭＲＭ、スカイライン予測ＭＲＭ）、Ｌｉｇｈｔｓｉｇｈｔソフトウェア（Ｓｃｉｅｘ）強化ＭＳスキャン（ＥＭＳ）、強化作製イオンスキャン（ＥＰＩ）および高解像度スキャン（ＥＲＳ）を使用して行った。
【０１１３】
分析手順
異なるアッセイからの全てのサンプルを、ＥＭＳ、ＥＲＳおよびＥＰＩスキャンに関して線形イオントラップを利用してＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。以下のシステムを使用した；Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０  ＵＨＰＬＣに結合された線形イオントラップを有するＳｃｉｅｘ  ＱＴＲＡＰ  ６５００三連四重極質量分析計（エレクトロスプレーイオン化、ＥＳＩ）。クロマトグラフ分離に関して、一般的な勾配をＣ１８  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍカラム２×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）上で使用した（５〜１５分の総ランにわたって０％移動相Ｂから９０％）。移動相Ａは、０．０５％ＴＦＡ／０．０５％ギ酸からなり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリル０．０５％ＴＦＡ／０．０５％ギ酸からなった。流速は、０．５ｍｌ／分であった。１０μＬのサンプルを注入し、表５に報告された質量分析設定で走らせた。
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
結果および考察
ＡＦ１６  ＭＳ−感度およびＵＨＰＬＣクロマトグラフィーに及ぼす血漿タンパク質沈殿物の衝撃
血漿マトリックスの複雑さにより、どのようにＡＦ１６クロマトグラフィーおよび質量分析法（ＭＳ）感度が異なるタンパク質沈殿法に応答するかを試験することが重要であった。選択された沈殿剤が通例適用され、類似した効率のものであることが示された。結果を図１０および１１に示す。
【０１１６】
図１０は、２０ｈにわたる３回の同じサンプルの繰返し注入の結果を示す。ＴＣＡおよびＭｅＣＮは、経時的に良好明白な安定性を示すことが明らかである。Ａわずかな消失が２０ｈでのＺｎＳＯ４で注目される。経時的な著しい喪失がＭｅＯＨで示されている。ＡＦ１６は、ＭｅＯＨで安定であるが、ペプチドは、アルコール混合物に限定された溶解性を有することがあることが知られているので、喪失は、ペプチド沈殿が原因である可能性がある。さらなる試験が行われるべきである。
【０１１７】
図１１は、ＭＳ−強度（イオンカウント）の観点から互いに比較した上で得られたデータのダイヤグラムである。ＴＣＡ沈殿は、最も強いシグナルを示し、参照として設定した。非有機的方法が後れを取っていることが明らかであるが、これは、共溶出抑制イオンによる可能性が高い。最良の安定性を有する２つの方法（ＴＣＡおよびＭｅＣＮ）は、感度の５００倍を超える差を示し、したがって、引き続く研究に関して、ＴＣＡを研究を通して使用することを選択した。
【０１１８】
ＡＦ１６の血漿安定性
異なる種におけるＡＦ１６の相対的安定性を図１２に示す。種にかかわらず、ＡＦ１６は、１０分以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期（ｔ1/2）で急速に消失している。したがって、任意の薬理作用の薬物動態学的基礎を理解するために、ペプチドの分子の運命を決定することが最も重要である。
【０１１９】
ヒトおよびラット血漿中のＡＦ１６の分子の運命
ＡＦ１６および同様の量の同位体標識されたペプチドを上記のラットおよびヒトの血漿中でインキュベートした。フルスキャンＭＳデータの分析に関して、Ｓｃｉｅｘ，Ｌｉｇｈｔｓｉｇｈｔ製の代謝産物同定ソフトウェアを使用し、これは、インキュベートされたＭＳ応答を品質管理（ＱＣ）サンプルと比較し、明らかなピークを質量電荷比（ｍ／ｚ）値を有する代謝産物として割り当てる。そのソフトウェアは、ペプチドなどの複数電荷化合物に使用するのに現在最適ではなく、したがって、代謝産物検出のヒット率は、かなり高く、各見出されたピークの手動の評価が行われるべきである。次いで、最も大きい代謝産物ピーク領域を順位付けし、場合によっては、ＭＳ／ＭＳ断片化によって検証する。スカイライン手法を使用して、同定されたペプチドの断片化を予測し、低い量がモニターされるように創造的で感度の良いＭＲＭ方法も利用した。
【０１２０】
表６は、３０分のインキュベーションでの同定された生成物およびそれらの相対量を列挙している。しかしながら、この比較は、各生成物が同じＭＳ感度を有すると仮定していることが強調されなければならず、この感度は、異なることがあり、したがって、個々の百分率は、変化し得る。結果を再検討すると、同定されたピークの相対的面積に基づいて、表６においてＭ１と命名された１つの代謝産物が他のものよりもはるかに大きいことが非常に明白であった。しかしながら、同定された質量ペア（ｍ／ｚ６２５／６３０）は、どの異化生成物（予想されるタンパク質ペプチド結合切断）にも相当しなかった。このペアは、ここで、ＡＦ１６のシステインジスルフィドと同定する。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
図１３は、同定された代謝産物の相対的動態を示し、システインジスルフィドＭ１が、ヒトおよびラット血漿中で速度と量の両方において同様に形成されることが明らかであり、これは、ラットが薬理学的研究のための良いモデルであり得ることを示している。ヒトとラット間の最も大きい相違は、Ｍ９の形成であり、これは、ヒトにおいて経時的に直線的に形成されるが、ラットにおいては形成される程度が非常に低い。これへの１つの説明は、より小さい断片のヒト血漿タンパク分解活性がラット血漿中よりも高いということであろう。５９２．３／５９４．４のｍ／ｚペアを有する１つの代謝産物（Ｍ１０）（表６／図１３に示さず）は不明なままであり、ＭＳ／ＭＳ研究およびＥＲＳモードスキャン後に初めて理解された（図１４）。ＥＲＳは、それが13Ｃ同位体パターン上で三重に荷電しており（同位体ピーク間の０．３Ｄａ工程）、Ｍ２ジスルフィド生成物と一致したことを示した。Ｍ２は、明白に低い量で形成されるが、この形成は、ジスルフィドを形成する効率的なシステイン酸化によって不明瞭になるのであろう。代わりに、Ｍ１０は、Ｍ１から形成されるが、それは、可能性が低い。大部分のＮ末端作用ペプチダーゼは、一度に２つのアミノ酸を切断し、ペプチダーゼがジスルフィドにそれほど近く作用し、Ｍ１０を形成することは本発明者らの知る限りでは珍しいので、Ｎ末端バリンの単純な切断は、かなり驚くべきである（Ｍ２を形成する）。
【０１２３】
本当にこれらの生成物、Ｍ１およびＭ１０がジスルフィドであったかをさらに検証するために、反応混合物を、これらの代謝産物との反応を確認しなかったシステイン選択的アルキル化剤Ｎ−エチルマレイミドでインキュベートした（示さず）。
【０１２４】
ＤＴＴの還元能力が酸性条件において低下される可能性があるけれども、ＤＴＴを、ＴＣＡを有するクエンチ溶液において使用した事実を考えると、図１３に示された動態は、驚くべきである。したがって、中性の沈殿剤ＺｎＳＯ４（ＮａＯＨを有さない）を使用した場合に、同じパターンが生じるかどうかを試験した。この沈殿方法は、効率的ではないが、主要なジスルフィド生成物の形成に関するより多くの情報を与えることが期待される。結果を図１５に示す。
【０１２５】
図１３と比較して、図１５から、大きな違いは、示されていないことが明らかであり、また、Ｍ１／Ｍ１０ジスルフィドがＤＴＴ還元に対してどれほど靭性があるかは非常に驚くべきである。
【０１２６】
結論およびさらなる研究
ＡＦ１６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態、およびそれがｉｎ  ｖｉｖｏ状況にどのようにつながり得るのかをさらに理解するために、いくつかの重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験が行われた。
１．トリクロロ酢酸がインキュベーション混合物中の血漿タンパク質を除去し、良好なＭＳ感度およびクロマトグラフィーを維持するための最適な選択として同定された。
２．ＡＦ１６は、以前の研究から血漿中で急速に分解することが知られている。この調査は、これが速度が異なる種間で類似していることも示すことをさらに確証する。
３．ラットとヒトの両方の血漿中での明白な主要な代謝的運命は、ＡＦ１６の急速なジスルフィド形成であることが示される。可逆的であるこの作用は、ＡＦ１６を急速なペプチダーゼ分解から明らかに保護し、この保護は、可逆性がより低いＮ−エチルマレイミド安定化で以前示された。これは、ＡＦ１６がその標的にインタクトに到達することをはるかにより高い程度で可能にする保護機能とみなし得る。
４．Ｍ１／Ｍ１０ジスルフィドは、驚くべきことに、ＤＴＴ還元に対して靭性がある。
【実施例３】
【０１２７】
Ｍ１（ＡＦ−１７）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏで正確に定量化できるように、また、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態学的特性を研究するために、薬理学的研究において使用されるために合成する。
【０１２８】
ＡＦ−１７の生物活性−抗分泌性活性は、以前報告されたラット腸係蹄モデルにおいて測定された（Ｌａｎｇｅ，Ｓ．（１９８２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５，２３９−２４２）。空腸ループに対して３ｐｇのコレラ毒素を負荷した。異なる用量の合成的に作製されたＡＦ−１７、ＡＦ−１６または対照（＝ペプチドなし、緩衝液のみ（ＸＹ））をコレラ毒素の負荷前に静脈内にまたは筋肉内に注入した。腸係蹄における累積体液の重量（ｍｇ／ｃｍ（ｍｇ／ｍｌ））を５時間後に記録した。各ＡＦ調製物を少なくとも６匹のラットにおいて試験した。フィッシャーＰＬＳＤをデータの統計的分析に使用した。
【０１２９】
ＡＦ−１７の生物活性−ＡＦ−１７の生物活性をラットモデルにおいて試験した。コレラ毒素の腸への負荷前２０〜３０秒に静脈内にまたは筋肉内に注入された場合に、ＡＦ−１７が腸液分泌を抑制する能力を表７に示す。緩衝液のみを注入された対照動物では、コレラ毒素は、腸１ｃｍあたり３９０ｍｇ体液の顕著な分泌を引き起こした。
【０１３０】
ＡＦ−１７は、緩衝液への応答とは有意に異なるコレラ分泌の用量依存的抑制を引き起こした（ｐ＜０．００１、ｎ＝６）。
【０１３１】
【表７】
2019524742.tif 000009
【０１３２】
【表８】
2019524742.tif 000010
【０１３３】
参考文献
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2  WO 05/030246
3  WO 97/08202
4  WO 97/08202
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8  WO 07/126364
9  WO 07/126363
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【図１】
2019524742.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩であって、前記ペプチドが配列番号１（ＡＦ）に示された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片および／または等価な活性を有するその相同体に相当し、配列番号２（ＡＦ−６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸（ａａ）位置１番におけるシステインジスルフィドとを少なくとも含み、抗分泌性活性を有する、前記単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド、または等価な機能活性を有するその薬学的に活性な塩。
【請求項２】
配列番号３（ＡＦ−１６）に示されたアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含む、請求項１に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項３】
配列番号４（ＡＦ−８）に示されたアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸位置２番におけるシステインジスルフィドとを含む、請求項１に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項４】
６〜２５アミノ酸長、好ましくは、７、８、１６もしくは１７アミノ酸長のような７〜１７、７〜１６、７〜２０、８〜１７、８〜２０、１７〜２５、１７〜２０アミノ酸長である、または、少なくとも６、７、８、１６、もしくは１７アミノ酸長であり、最大７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５アミノ酸長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項５】
配列番号７に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ）、または配列番号８に示されたアミノ酸配列（Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）、または配列番号９に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項６】
配列番号７に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ）、または配列番号８に示されたアミノ酸配列（Ｃ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）、または配列番号９に示されたアミノ酸配列（ＶＣ（Ｃ）ＨＳＫＴＲ）からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項７】
少なくとも０．２ｈ、好ましくは少なくとも０．５ｈ、１ｈ、または１．５ｈのｔ１／２を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項８】
少なくとも１．８ｈのｔ１／２を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項９】
医学における使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１０】
病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態および症状、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、ならびに下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、または、活性物質の細胞取込みを最適化することにおける使用のため、神経保護のため、および／またはカルベオラを正常化するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１１】
二次的脳損傷から選択されるＴＢＩおよび／またはＴＢＩ関連状態もしくは症状を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１２】
後天的脳損傷を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離組換えかつ／または合成的に作製されたペプチドと、適した医薬担体とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
病理学的体液輸送、感染症、炎症、炎症反応、ＴＢＩ、ＴＢＩ関連状態、腫瘍、腫瘍関連合併症、がん、コンパートメント症候群、神経膠芽腫、糖尿病、および下痢からなるリストから選択される疾患または状態を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、または、活性物質の細胞取込みを最適化することにおける使用のため、神経保護のため、および／またはカルベオラを正常化するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＴＢＩと関連している二次的脳損傷のようなＴＢＩを治療するかつ／または予防することにおける使用のため、または後天的脳損傷を治療するかつ／または予防することにおける使用のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2019524742.tif 000029
2019524742.tif 000030
2019524742.tif 000031
2019524742.tif 000032