(57)【要約】  本発明は、より優れた送達、遺伝子編集の特異性および選択性を可能にするユニークなモジュラーCRISPR-Cas9アーキテクチャを有する新規送達システムに関する。それは以前に記載された分割Cas9システムを上回る有意な改善を示す。該モジュラーアーキテクチャは「調節性」である。追加の態様は、空間的にも時間的にも制御することができ、誘導性編集の可能性をもたらすシステムに関する。更なる態様は、ホーミング剤への連結を可能にする改変されたウイルスカプシドに関する。【選択図】なし
2019524162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRISPRベースのゲノムまたはエピゲノム編集用の組み換え系であって、
(a) (i)C-インテインをコードするポリヌクレオチド、(ii) C-Cas9をコードするポリヌクレオチド、および(iii) 第一のベクターのためのプロモーター配列、を含む第一の発現ベクター；および
(b) (i)N-Cas9をコードするポリヌクレオチド、(ii) N-インテインをコードするポリヌクレオチド、および(iii)第二のベクターのためのプロモーター配列、を含む第二の発現ベクター
を含んで成り、
ここで任意に、前記第一と第二の発現ベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）またはレンチウイルスベクターであり、そして
前記第一と第二の発現ベクターの同時発現が完全なCas9タンパク質の発現をもたらす、前記組み換え系。
【請求項２】
前記第一の発現ベクターのプロモーター配列が、CMVプロモーターを含んで成る、請求項１に記載の組み換え系。
【請求項３】
前記第二のベクターのプロモーター配列が、gRNA配列に作用可能に連結された第一のプロモーター、任意にsgRNA、および第二のプロモーターを含んで成る、請求項１または２に記載の組み換え系。
【請求項４】
前記第一のプロモーター配列がU6プロモーターである、請求項３に記載の組み換え系。
【請求項５】
前記第二のプロモーター配列がCMVプロモーターである、請求項３または４に記載の組み換え系。
【請求項６】
前記第一の発現ベクターと第二の発現ベクターの双方がポリＡテールを更に含んで成る、請求項１に記載の組み換え系。
【請求項７】
前記第一の発現ベクターがテトラサイクリン応答要素を更に含み、そして／または前記第二の発現ベクターがテトラサイクリン調節性活性化因子を更に含み、あるいは前記第一の発現ベクターがテトラサイクリン調節性活性化因子を更に含み、そして／または第二の発現ベクターがテトラサイクリン応答要素を更に含む、請求項１に記載の組み換え発現系。
【請求項８】
前記テトラサイクリン応答要素がtetOの１以上の反復配列を含む、請求項７に記載の組み換え発現系。
【請求項９】
前記テトラサイクリン応答要素がtetOの７つの反復配列を含む、請求項７に記載の組み換え発現系。
【請求項１０】
前記テトラサイクリン調節性活性化因子がrtTaおよび任意に2Aを含む、請求項７に記載の組み換え発現系。
【請求項１１】
前記C-Cas9がdC-Cas9でありそしてN-Cas9がdN-Cas9である、請求項１に記載の組み換え発現系。
【請求項１２】
前記第一の発現ベクターおよび／または第二の発現ベクターがKRAB、DNMT3AまたはDNMT3Lの１つ以上を更に含む、請求項１１に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１３】
前記第一の発現ベクターおよび／または第二の発現ベクターがVP64、RtAまたはP65の１つ以上を更に含む、請求項１１に記載の組み換え発現系。
【請求項１４】
抑制、サイレンシングまたは下方制御のために標的とされる遺伝子のgRNAを更に含んで成る、請求項１２に記載の組み換え発現系。
【請求項１５】
発現、活性化または上方制御のために標的とされる遺伝子のgRNAを更に含んで成る、請求項１３に記載の組み換え発現系。
【請求項１６】
発現、活性化または上方制御のために標的とされる遺伝子、および場合によりプロモーター、をコードする第三の発現ベクターを更に含む、請求項１５に記載の組み換え発現系。
【請求項１７】
前記第一の発現ベクターおよび／または第二の発現ベクターがmiRNA回路を更に含む、請求項１〜16のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１８】
請求項１に記載の組み換え発現系を含む組成物であって、前記第一の発現ベクターが第一のウイルスカプシド中に封入されており、そして第二の発現ベクターが第二のウイルスカプシド中に封入されており、ここで場合により、第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがAAVまたはレンチウイルスカプシドである組成物。
【請求項１９】
前記AAVがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11またはAAV-DJの１つである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドが、非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagから成る群の１つ以上を含むように改変される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記非天然アミノ酸がN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリンまたはアドネクチンのうちの１つでシュードタイプ化される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがAAV2カプシドである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagが、VP1のアミノ酸残基R447、S578、N587またはS662のところで組み込まれる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがAAV-DJカプシドである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
前記非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagが、VP1のアミノ酸残基N589のところで組み込まれる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第一のウイルスカプシドと第二のウイルスカプシドが連結される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２８】
疼痛管理を必要とする被験体における疼痛管理の方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物が、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3A、TrpV1、SHANK3、NR2B,IL-10、PENK、POMCまたはMVIIA-PCのうちの１以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
処置を必要とする被験体においてマラリアを治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCD81、MUC13またはSR-B1のうちの１つ以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
処置を必要とする被験体においてＣ型肝炎を治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCD81、MUC13、SR-B1、GYPA、GYPC、PKLRまたはACKR1の１つ以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
処置を必要とする被験体において造血幹細胞療法の免疫拒絶を治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCCR5を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
処置を必要とする被験体においてHIVを治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCCR5を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
処置を必要とする被験体において筋ジストロフィーを治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がジストロフィンを標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
処置を必要とする被験体において癌を治療または改善する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がPDCD-1、NODALまたはJAK-2の１つ以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
処置を必要とする被験体においてシトクロムp450疾患を治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCYP2D6を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
処置を必要とする被験体においてアルツハイマー病を治療または予防する方法であって、請求項２７に記載の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がLilrB2を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記被験体が哺乳類である、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体がネズミ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、サル、またはヒト患者である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
VP1のアミノ酸残基R447、S578、N587またはS662の所に非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagを含む改変型AAV2カプシド。
【請求項４０】
前記非天然アミノ酸がN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンである、請求項３９に記載の改変型AAV2カプシド。
【請求項４１】
前記改変型AAV2カプシドがペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリンまたはアドネクチンの１つによりシュードタイプ化される、請求項３９に記載の改変型AAV2カプシド。
【請求項４２】
リポフェクタミンで被覆された請求項３９に記載の改変型AAV2カプシド。
【請求項４３】
VP1のアミノ酸残基N589の所に非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagを含む改変型AAV-DJカプシド。
【請求項４４】
前記非天然アミノ酸がN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンである、請求項４３に記載の改変型AAV-DJカプシド。
【請求項４５】
前記改変型AAV-DJカプシドがペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリンまたはアドネクチンの１つによりシュードタイプ化される、請求項４３に記載の改変型AAV-DJカプシド。
【請求項４６】
リポフェクタミンで被覆された請求項４３に記載の改変型AAV-DJカプシド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、2016年８月18日に出願の米国出願第62/376,855号、2016年11月１日出願の米国出願第62/415,858号、および2017年４月４日出願の米国出願第62/481,589号に対する米国特許法35 U.S.C. 119(e)に基づく優先権を主張する。その全内容が参照として援用される。
【０００２】
本発明の背景の下記記載は、もっぱら本発明を理解する上で役立つために提供され、本発明に対する先行技術を記述または構成すると認めるものではない。
【０００３】
クリスパー（CRISPR）（クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回分の反復配列）から誘導されるRNAガイドエフェクター「CRISPR関連（Cas）システム」の最近の出現は、多様な生物体のゲノムを編集する能力を改変した。
【０００４】
現在、アデノ随伴ウイルス（AAV）が、それらの全体的な安全性、穏和な免疫応答、長いトランス遺伝子発現、高い感染効率ゆえに、遺伝子療法に広く用いられており、臨床試験においても既に使用が始まっている。しかしながら、AAVはほぼ4.5 kbの制限されたパッケージング容量を有するという主たる欠点があり、約4.2 kbのサイズを有する単一のガイドRNAベクターである化膿連鎖球菌ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Cas9（SpCas9）や、遺伝子編集に必要な他の成分を送達することを難しくしている。
【０００５】
よって、この技術的制限を克服するための必要性が当業界にある。本開示は、この必要性を充足し、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【０００６】
ゲノム編集により現在直面している重要な課題の一部は、送達、特異性および生産物選択性である。本開示の態様は、それらの課題を克服する方法に関する（図１）。
【０００７】
一態様では、本開示は、ウイルスと非ウイルス送達アプローチの双方の利点を統合することを目指して、CRISPR−エフェクターのプログラム可能な取り込みと簡易なシュードタイプ化（偽型化）を可能にするモジュラー送達システムに関する。
【０００８】
疾患の遺伝的および病原的基礎の知識が増えることに相まって、CRISPRベースのゲノム編集およびエピゲノム編集のための安全でかつ効率的な遺伝子導入プラットフォームの開発により、様々なヒト疾患を標的とする能力や病気抵抗性を操作する能力を変換することができるようになった。この点で、CRISPR試薬のインビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）送達のために新しい領域のウイルスおよび非ウイルスアプローチが開発されている。
【０００９】
本開示は、より優れた送達、遺伝子編集の特異性および選択性を可能にするユニークなモジュラーCRISPR-Cas9アーキテクチャを有する新規送達システムに関する。それは、以前に記載されたsplit-Cas9システムを上回る有意な改良を示す。当該モジュラーアーキテクチャは「調節性（regulatable）」である。追加の態様は、空間的に且つ時間的に制御可能であるシステムであって、誘導可能な編集の可能性をもたらすシステムに関する。更なる態様は、ホーミング剤への結合を可能にする改変型ウイルスカプシド、すなわち細胞、臓器または組織へのカプシドの標的指向（ターゲティング）および／または局在化を可能にする剤に関する。
【００１０】
本開示の態様は、CRISPRベースのゲノムまたはエピゲノム編集用の組み換え発現系に関する。ある態様では、組み換え発現系が、(a) (i)C-インテインをコードするポリヌクレオチド、(ii) C-Cas9をコードするポリヌクレオチド、および(iii) 第一のベクターのためのプロモーター配列、を含む第一の発現ベクター；並びに(b) (i)N-Cas9をコードするポリヌクレオチド、(ii) N-インテインをコードするポリヌクレオチド、および(iii)第二のベクターのためのプロモーター配列を含んで成る、または本質的にから成る、更にまたはから成り、ここで任意に、第一と第二の発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）またはレンチウイルスベクターであり、そして前記第一と第二の発現ベクターの同時発現が完全なCas9タンパク質の発現をもたらす。
【００１１】
ある態様では、第一の発現ベクターのプロモーター配列が、CMVプロモーターを含んで成り、あるいは本質的にから成り、更にまたはから成る。
【００１２】
ある態様では、第二のベクターのプロモーター配列が、gRNA配列（場合によりsgRNA）に作用可能に連結された第一のプロモーターおよび第二のプロモーターを含んで成り、あるいは本質的にから成り、更にまたはから成る。ある態様では、第一のプロモーター配列がU6プロモーターである。ある態様では、第二のプロモーター配列がCMVプロモーターである。
【００１３】
ある態様では、第一と第二の発現ベクターが、ポリＡテールを更に含んで成り、または本質的にから成り、更にまたはから成る。
【００１４】
ある態様では、第一の発現ベクターがテトラサイクリン応答要素を更に含み、または本質的にから成り、更にまたはから成り、そして／または第二の発現ベクターがテトラサイクリン調節性活性化因子を更に含み、または本質的にから成り、更にまたはから成り、あるいは第一の発現ベクターが更にテトラサイクリン調節性活性化因子を更に含み、または本質的にから成り、更にまたはから成り、そして／または第二の発現ベクターがテトラサイクリン応答要素を更に含み、または本質的にから成り、更にまたはから成る。ある態様では、テトラサイクリン応答要素がtetOの１以上の反復配列を含み、任意にtetOの７つの反復配列を含む。ある態様では、テトラサイクリン調節性活性化因子がrtTaおよび任意に2Aを含む。
【００１５】
ある態様では、C-Cas9がdC-Cas9であり、そしてN-Cas9がdN-Cas9である。更なる態様では、第一の発現ベクターおよび／または第二の発現ベクターが更にKRAB、DNMT3AまたはDNMT3Lの１つ以上を含み、または本質的にから成り、更にまたはから成る。更なる態様では、組み換え発現系が更に抑制、サイレンシングまたは下方制御（ダウンレギュレーション）のための標的遺伝子のgRNAを含み、または本質的にから成り、またはから成る。別の態様では、第一の発現ベクターおよび／または第二の発現ベクターが更にVP64、RtAまたはP65の１つ以上を含み、または本質的にから成り、またはから成る。更なる態様では、組み換え発現系が更に、発現、活性化または上方制御（アップレギュレーション）のための標的遺伝子のgRNAを含み、または本質的にから成り、またはから成る。更に別の態様では、組み換え発現系が更に、発現、活性化、または上方制御のための標的遺伝子と、任意にプロモーターとをコードする第三の発現ベクターを含み、または本質的にから成り、更にまたはから成る。
【００１６】
ある態様では、第一の発現ベクターおよび／または第二の発現ベクターが更にmiRNA回路を含み、または本質的にから成り、またはから成る。
【００１７】
別の態様は、開示された組み換え発現系を含む組成物であって、第一の発現ベクターが第一のウイルスカプシド中に封入されており、そして第二の発現ベクターが第二のウイルスカプシド中に封入されており、ここで場合により、第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがAAVまたはレンチウイルスカプシドである組成物に関する。ある態様では、AAVがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11またはAAV-DJの１つである。
【００１８】
ある態様では、第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドが次の群の１つ以上を含むように改変される：非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTag。ある態様では、非天然アミノ酸がN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンである。
【００１９】
ある態様では、第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリンまたはアドネクチンでシュードタイプ化（偽型化）される。
【００２０】
ある態様では、第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがAAV2カプシドである。更なる態様では、非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagが、VP1のアミノ酸残基R447、S578、N587またはS662のところで組み込まれる。
【００２１】
ある態様では、第一のウイルスカプシドおよび／または第二のウイルスカプシドがAAV-DJカプシドである。更なる態様では、非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagが、VP1のアミノ酸残基N589のところで組み込まれる。
【００２２】
ある態様では、第一のウイルスカプシドと第二のウイルスカプシドが連結される。
【００２３】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体における疼痛管理の方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物が、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3A、TrpV1、SHANK3、NR2B、IL-10、PENK、POMCまたはMVIIA-PCのうちの１以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００２４】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体においてマラリアを治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCD81、MUC13またはSR-B1の１以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００２５】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体においてＣ型肝炎を治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCD81、MUC13、SR-B1、GYPA、GYPC、PKLRまたはACKR1の１以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００２６】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体において造血幹細胞療法の免疫拒絶を治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCCR5を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００２７】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体においてHIVを治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCCR5を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００２８】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体において筋ジストロフィーを治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がジストロフィンを標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００２９】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体において癌を治療または改善する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がPDCD-1、NODALまたはJAK-2の１以上を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００３０】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体においてシトクロムp450疾患を治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がCYP2D6を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００３１】
本開示の幾つかの態様は、必要とする被験体においてアルツハイマーを治療または予防する方法であって、本開示の組成物の有効量を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物がLilrB2を標的とするgRNAをコードするベクターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００３２】
本開示の方法の観点のいずれか１つ以上の態様では、被験体が哺乳類、任意にネズミ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、サル、またはヒト患者である。
【００３３】
更なる態様は、VP1のアミノ酸残基R447、S578、N587またはS662の所に非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagを含む改変型AAV2カプシドに関する。ある態様では、非天然アミノ酸がN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンである。ある態様では、改変型AAV2カプシドがペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリンまたはアドネクチンの１つによりシュードタイプ化（偽型化）される。ある態様では、改変型AAV2カプシドがリポフェクタミンで被覆される。
【００３４】
更なる態様は、VP1のアミノ酸残基N589の所に非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagを含む改変型AAV-DJカプシドに関する。ある態様では、非天然アミノ酸がN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンである。ある態様では、改変型AAV-DJカプシドがペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリンまたはアドネクチンの１つ以上によりシュードタイプ化される。ある態様では、改変型AAV-DJカプシドがリポフェクタミンで被覆される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、CRISPR送達システムに関連した課題および本出願により対処される態様を描写するチャートである。
【００３６】
【図２】図２は、典型的な二重（デュアル）AAVシステムであって、各々が同時発現によって再構成される分割インテイン、split-Cas9を送達する二重AAVシステムの図解を示す。
【００３７】
【図３】図３は、典型的な誘導性split-Cas9システムの図解を示す。
【００３８】
【図４】図４は、(A）KRABリプレッサードメインを有する、遺伝子抑制のための典型的split-Cas9システムを描写し、そして(B)はVP64とRtaドメインを有する、遺伝子活性化のための典型的split-Casシステムである。
【００３９】
【図５】図５は、miRNA回路を有する二重AAVの典型的図解を表す。
【００４０】
【図６】図６は、ウイルス−アプタマー−細胞相互作用の図解を表す。
【００４１】
【図７】図７は、(A)典型的なTK-GFPベクター図、および(B)様々な感染多重度（MOI）でのHEK293T細胞のAAV-DJ TK-GFP形質導入についてのマージした蛍光位相差顕微鏡画像を表す。
【００４２】
【図８】図８は、(A) ApoBを標的とするAAV8誘導性二重Cas9システムを投与し、ドキシサイクリンを投与しない３匹のマウス、(B)ApoBを標的とするAAV8誘導性二重Cas9システムを投与し、200 mgのドキシサイクリンを１週間に３回、４週間の間投与した３匹のマウスが、ドキシサイクリンを投与すると1.7％の挿入・欠失変異（indelと称される）形成を示すことを表す。
【００４３】
【図９】図９はCXR4を標的とするin vitro抑制を表す。293T細胞に二重AAVDJsplit-Cas9ウイルスを形質導入し、３日目に細胞を収得し、RNAを抽出し、RT-qPCRを実施した。
【００４４】
【図１０】図１０は、３匹のマウスにin vivo抑制用にpAAV8_gCD81_KRAB_dCas9ベクターを投与したin vivo抑制を表す。AAV投与後４週目に肝臓を収得し、RNAを抽出し、RT-qPCR実験を実施した。結果は、抑制ベクターを投与したマウスからのCD81遺伝子の35％対野生型抑制を示す。
【００４５】
【図１１】図１１は、抗CD81で染色した肝臓を表す。上から下：一次抗体なしの対照、AAV8 gCD81抑制split-Cas9ベクターを投与したマウス、野生型対照。
【００４６】
【図１２】図１２は、dC-Cas9-Vを用いたin vitro活性化を表し、(a) AAVDJ_VR_dCas9ベクターを使ったRT-qPCRにより測定された、in vitro RHOX活性化の証拠を示す。対照はAAVS1遺伝子座を標的とするgRNAsから成る。(b)AAVDJ_VR_dCas9ベクターを使ったRT-qPCRにより測定された、in vitro ASCL1活性化の証拠を示す。
【００４７】
【図１３】図１３は、(A) UAA濃度を変動させた場合のwrt（野生型）対陰性対照（UAAの不在下）で正規化されたGFP+細胞の数を示すヒストグラムを表す。(B)シンセターゼ濃度を変動させた場合のwrt対陰性対照で正規化されたGFP+細胞の数を示すヒストグラムである。
【００４８】
【図１４】図１４は、同容量の種々の変異体により形質導入された細胞の％を示すヒストグラムを表す。
【００４９】
【図１５】図１５は、同容量の種々の改変体により形質導入された細胞の％を示すヒストグラムを表す。
【００５０】
【図１６】図１６は、モジュラーsplit-Cas9二重AAVシステムによる多目的ゲノム編集を描写する。(a) 左、ゲノム編集用、右、一過性誘導性ゲノム編集用の、インテイン媒介split-Cas9 pAAVsシステムの典型的図解。(b) 左から右、HEK293T細胞中のAAVS1遺伝子座、生体外（ex vivo）CD34+造血幹細胞中の、およびin vivo ApoB遺伝子座における、挿入欠失頻度。(c) 誘導性Cas9（iCas9）AAVに比較した場合のCas9 AAVを用いたin vitro AAVS1遺伝子座編集の相対活性。培地にドキシサイクリンを補足した（dox: 200μg/mL）。(d) Cas9 AAVsと誘導性Cas9 AAVsとの間の生体内ApoB編集の相対活性。ドキシサイクリンと共にまたは無しで生理食塩水を投与したマウスにiCas9 AAVsを形質導入した（dox: 200 mg; 計12回の注入；誤差バーはSEMである）。(e) dCas9-KRABリプレッサー融合タンパク質を通したゲノム抑制の典型図と、dCas9-VP64-RTA融合タンパク質を通したゲノム活性化の典型図。(f) 2種の異なるスペーサーを標的とするHEK293T細胞におけるin vitro CXCR4抑制のエビデンス。(g) 成体マウス肝臓におけるin vivo CD81抑制のエビデンス。(h) 二重gRNAを使ったin vitro ASCL1活性化のエビデンス。(i)成体マウス肝臓におけるin vivo Afp活性化のエビデンス。(j) 肝臓切片の代表的免疫蛍光染色および相対的発現の対応する定量分析を示す：DAPI（下のパネル）および抗CD81（上のパネル）。左パネルは陰性対照（二次抗体染色片）であり、中央のパネルは陽性対照（非標的AAV）であり、右のパネルはCD81 AAVsを形質導入したマウスである（スケールバー：250μm；誤差バーはSEMである）。
【００５１】
【図１７】図１７は、クリックケミストリーハンドルのUAA媒介取り込みによる多目的カプシドシュードタイピングを表す：(a) ウイルスカプシドへのUAA付加と、それに続くクリックケミストリーに基づきエフェクターをUAAに化学結合するためのアプローチの典型的図解。(b) UAAによる置換についてアッセイした表面残基の存在位置（VP1残基が番号付けされている）。(c) 2 mM UAA (0.4 mMリジン)の存在下および非存在下でのAAV2変異体の相対力価：293T細胞に等量のウイルスを形質導入し、蛍光細胞の数を定量した；UAAの不在下ではウイルス会合が全く検出されなかった。(d) Alexa594 DIBOアルキンによるAAVsのフルオロフォアシュードタイピングを実施した：ウイルス上の成功した結合を、293T形質導入後２時間のウイルスの蛍光可視化により確認した（スケールバー：250μm）。(e) アルキンタグ付オリゴヌクレオチドを用いたAAVのオリゴヌクレオチドシュードタイピングを行った：対応する相補的オリゴヌクレオチドを含むAAVのDNAアレイスポット上への選択的捕捉が、それらのスポット上に分散された293T細胞の特異的ウイルス形質導入によって証明された（スケールバー：250μm）。(f) ゲノム編集用エフェクターとカプシドエフェクターにおけるプログラム可能性（programmability）を組み合わせて完全にプログラム可能なモジュレーターAAVを構築する、統合型モジュラーAAVプラットフォームの概念。(g) mAAV統合型システムが機能的であることの確証。すなわち、UAA改変されたAAVが、split-Cas9ベースのゲノム編集ペイロードを組み込むことができ、かつロバストなゲノム編集を実装できることの確証：挿入欠失シグネチャーと代表的NHEJプロファイルが示される。
【００５２】
【図１８】図１８は、mAAVを介したin vivoおよびin vitroゲノム制御を描写する：(a) in vivo mAAV-媒介ゲノム操作のためのワークフローの典型的図解：AAVプラスミドを設計し構築した後、ウイルス産生とイオジキサノール勾配による精製を行う。次いでマウスの尾静脈にまたは腹腔内(IP)注射により約0.5E12-1E12 GCを注射し、４週間目に全組織を処理用に収得する。(b) in vivo CD抑制：マウスに1E12 GCの非ターゲティングまたはCD81ターゲティングAAVを腹腔内（IP）注射により投与した。この実験において、全組織レベルで〜40-60％のCD81抑制が定量的RT-PCRにより観察された。(c) 左：２つの異なるスペーサーgRHOXF2_1とgRHOXF2_2、並びに両者の組み合わせ二重gRHOXF2のターゲティングによる293T細胞でのin vitro RHOXF2活性化。それらの異なる条件下での定量的RT-PCRにより約1.25-7倍の活性化が観察された。右：肝臓でのin vivo Afp活性化：マウスにIP注射により1E12 GCの非ターゲティングAAVまたはAfp AAVを投与した。この実験において定量的RT-PCRにより全組織レベルで〜1.25-3倍のAfp活性化が観察された。
【００５３】
【図１９】図１９は、UAA組み込みについてのシンセターゼおよびUAA濃度の最適化を表す：(a) Y39部位にTAG終結部位を有するGFPレポーター配列中へのUAA組み込み：トランスフェクション後48時間目の293T細胞の蛍光画像が、異なる実験条件下で示される−陰性対照、wt-GFPトランスフェクション、および2 mM UAA〔N-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジン；構造が示される〕の非存在下または存在下でのGFP-Y39TAGレポーターcum tRNA-tRNAシンセターゼトランスフェクション。後者の条件でのUAA組み込みは、ロバストなGFP発現を復元させる。(b) UAA組み込みに対するシンセターゼ量の役割：レポータープラスミドに比較したtRNA-tRNAシンセターゼプラスミドの量の最適化（2 mM UAA存在下）を実施した。5：1の比が、１：１比に比較してほぼ５倍近く高いUAA組み込みを示した。(c) UAA組み込みに対するUAA濃度の最適化：tRNA-tRNAシンセターゼ対レポータープラスミドの5：1比の存在下での一定範囲のUAA濃度を評価した。組み込み効率には何も有意な差は観察されなかったが、高濃度のUAAでは培養物中の細胞死がより多かった。
【００５４】
【図２０】図２０は、AAV表面への種々成分のクリックケミストリー媒介簡易結合による多目的カプシドシュードタイプ化を描写する。(a) 同一の培養条件下で生産されるAAV2-N587UAAとAAV-DJ-N589UAAのウイルス価の比較。(b) UAA組み込みがAAV活性に影響を与えないことの確証（実験は293T細胞中で実施）。(c) 抗体中和に対し抵抗性の「遮蔽AAV」の例示。(d) ブタ血清への暴露後の一定範囲の小分子とポリマー成分に連結されたAAV-DJ-N589UAAウイルスの相対活性（mCherry発現によりアッセイした）。
【００５５】
【図２１】図２１は、AAV-CRISPR抑制と活性化のためのドメイン最適化を示す：(a) AAV-CRISPR抑制のためのドメイン最適化：多重C末端ドメイン融合体の活性：KRABまたはDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT3AまたはDNMT3L）を評価したが、一過性抑制アッセイでは何も有意な追加の抑制は観察されなかった（誤差バーはSEM；細胞：HEK293T、遺伝子座：CXCR4）。(b) AAV-CRISPR活性化のためのドメイン最適化：多重Ｎ末端ドメイン融合体の活性：VP64とVP65を評価し、明らかにVP64ドメインの添加が〜４倍高い遺伝子発現をもたらした（誤差バーはSEMであり；p＝0.0007；HEK293T；遺伝子座：ASCL1）。
【００５６】
【図２２】図２２は、(a) ゲノム制御用のインテイン媒介split-dCas9 pAAVsの図解。(b) KRAB-dCas9-Nrlリプレッサー融合タンパク質によるゲノム抑制を可能にするエフェクターカセットのモジュール使用、およびdCas9-VP64-RTA融合タンパク質によるゲノム活性化のためのアプローチ。(c) 成体マウス肝臓におけるin vivo Afp活性化の証拠。対照マウスには、同力価の非ターゲティングAAV8ウイルスを5E+11 vg/マウスの量投与した（誤差バーはSEMであり；p=0.0117である）。(d) in vitroでの活性化のためのドメイン最適化後（上記の図１）、VP64活性化ドメインをdNCas9ベクター上に付加し、AAV8 5E+11 vg/マウスを投与したマウスにおいてin vivo Afp活性化実験を繰り返した。付加的VP64ドメインを有するAfpでは＞６倍活性化が観察された（誤差バーはSEMであり；p＝0.0271）。
【００５７】
【図２３】図23は、split-Cas9-二重AAVシステムがmdxマウスにおけるジストロフィン発現をレスキューすることを示す。(a) Mdxマウスモデルは、エクソン23に成熟前終結コドンを有する。単一または二重gRNA Cas9システムのいずれかを使用する、２つの異なるアプローチを用いた。単一gRNAは、エクソン23中の終結コドンをターゲティングするように設計された。二重gRNAsはエクソン23の上流と下流をターゲティングし、変異エクソン23の切除を引き起こすように設計され、それによりジストロフィン遺伝子の転写解読枠が回収され、タンパク質発現が復元される。(b)エクソン23欠失についての1E+12 vg/マウスのAAV8 split-Cas9二重dRNAシステムにより形質導入されたmdxマウス中のジストロフィン免疫蛍光。（ジストロフィン、上３つのパネル；核、4’，6’−ジアミジノ−2-フェニルインドール（DAPI）、下３つのパネル；目盛バー：250μm）。(c) Dmd編集のための標的配列の一覧表。gRNA-LおよびgRNA-Rは、エクソン23の切除を工作し、gRNA-Tはエクソン23中の成熟前終結コドンをターゲティングする。PAM配列に下線が付せられている；コード配列は大文字で、イントロン配列は小文字で記される。(d)ジストロフィンのウエスタンブロットは、ジストロフィン発現の回復を示す。WTマウスからのタンパク質に対する比較は、復元されたジストロフィンが二重gRNAと単一gRNAの双方とも正常量の約〜7-10％であることを証明する。
【００５８】
【図２４】図24は、疼痛管理に関する：マウスに1E+12 vg/マウスのAAV5  Nav 1.7 KRAB抑制構成物（dCas9）を髄腔内注射した。明らかなように、約70％の抑制がSCN9A遺伝子（Nav 1.7）に認められ、Nav 1.8が抑制の形跡を全く示さないため、Na 1.7の抑制は特異的であることがわかる。 これは、後根神経節（DRG）を標的とする構成物のin vivo機能性を証明する。
【００５９】
【図２５】図25は、mCherryを発現している1E+12 vg/マウスの種々の血清型（AAV5, AAV1，AAV8，AAV9，AAVDJ）を髄腔内注射したマウスにおけるmCherry発現を示す。１群のマウスは、1E+12 vg/マウスのAAV5 mCherry（AAV5_multiple above）を４週間に渡り週に１回髄腔内注射を受けた。図から分かるように、AAV9とAAVDJは、他の血清型に比較して高い形質導入効率を示す。
【００６０】
【図２６】図26は、SpyTagとKTagを使った２つのAAVカプシドの、またはシュードタイプ化ハイブリダイズ用オリゴヌクレオチドを使った２つのAAVカプシドを連結する操作の図解である。
【００６１】
【図２７】図27は、アジド−アルキン反応で非天然アミノ酸を使ったまたはSpyTagとKTagを使ったシュードタイピングの一般的パラダムを示す。
【００６２】
【図２８】図28は、(a) AAV2-N587UAAとAAV-DJ-N589UAAのウイルス価の比較（誤差バーは±SEMである）および(b) UAA組み込みがAAV活性にマイナスの影響を与えないことの証明（実験は変動するvg/細胞の量のHEK293T中で実施した）（誤差バーは±SEMである）。
【００６３】
【図２９】図29は、(a) SDS-PAGEにより解析したAAVDJとAAVDJ-N589UAAのカプシドタンパク質のクーマシーブルー染色、(b) アルキン−オリゴヌクレオチド（10 kDa）での処理後のAAVDJとAAVDJ-N589UAAのSDS-PAGE解析したカプシドタンパク質のクーマシーブルー染色、(c) アルキン−オリゴヌクレオチドでの処理と、相補的オリゴヌクレオチド−ビオチン接合体での探査、およびそれに続くストレプトアビジン−HRPでの処理後の、未変性AAV-DJとAAV-DJN589UAAのウエスタンブロット分析。
【００６４】
【図３０】図30は、AAV表面へのエフェクターのクリックケミストリー媒介連結を介した多目的カプシドシュードタイピングを示す：(a) 抗体中和に対し抵抗性である「外套（cloaked）AAV」の描写。(b) ブタ血清に暴露した後、AAV-mCherryベースのHEK 293T細胞への形質導入によって分析した、ある範囲の小分子とポリマー成分に結合されたAAVDJとAAVDJ-N589UAAウイルスの相対活性。(c) ブタ血清に暴露した後、AAV-mCherryベースのHEK 293T細胞への形質導入によって分析した、ある範囲の小分子とポリマー成分に結合されたAAVDJとAAVDJ-N589UAAウイルスの相対活性。(d) HEK 293T細胞におけるAAVDJ-N589UAA、AAVDJ-N589UAA＋オリゴおよびAAVDJ-N589UAA＋オリゴ＋リポフェクタミン（1E+5 vg/細胞）のAAVS1編集率（％NHEJ事象）。
【００６５】
【図３１】図31は、AAV中へのUAA組み込みの最適化を示す：(a) UAA組み込みに対するシンセターゼ量の役割：レポータープラスミド（2 mM UAA）に対するtRNAとtRNAシンセターゼプラスミドの量の最適化を実施した。5：1の比が1：1比に比較して５倍近く高いUAA組み込みを示した。(b) UAA組み込みに対するUAA濃度の最適化：レポータープラスミドに対するtRNAとtRNAシンセターゼの5：1比の存在下での一定範囲のUAA濃度を評価した。組み込み効率に有意な差は観察されなかったが、UAA濃度が高いと培養物中の細胞死が増大した。(c) eTF1-E55Dの存在下で、UAA-AAV力価に1.5〜4倍の増加が観察された。
【００６６】
【図３２】図32は、細胞系を超えた「外套（cloaked）AAV」の形質導入効率を示す：具体的には、様々な細胞系におけるAAV-DJ-N589UAAとAAV-DJ-N589UAA＋オリゴ＋リポフェクタミンの形質導入効率を示す。
【００６７】
【図３３】図33は、gRNA-M2MリクルートMCP-VP64およびgRNA-ComリクルートCom-KRABを介して、gRNA構成物がいかに内因性ヒト遺伝子の同時活性化と抑制を媒介するかを示す略図である。
【００６８】
【図３４】図34は、同時活性化と抑制のためのベクター設計を示す（２つのベクター系）。
【００６９】
【図３５】図35は、遺伝子抑制と遺伝子過剰発現のための3つのベクター系を示す。遺伝子抑制のための当該split-Cas9システム（ベクターａとｂ）およびCMVプロモーターと過剰発現のための着目の遺伝子を含む第三のベクター（ベクターｃ）を、マウスに髄腔内注射した（gRNAは異なる遺伝子を標的とするよう交換することができる）。
【００７０】
【図３６】図36は、基盤の編集モデルを含むsplit-Casシステムの図解を示す。
【００７１】
【図３７】図37aは、次の要素：CMVプロモーター、dCInteinCCas9、KRABおよびポリA、を含む二重AAV（pX600）システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列を示す。図37ｂは、図37ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図37ｃは、図37ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７２】
【図３８】図38ａは、次の要素：CMVプロモーター、dCInteinCCas9、DNMT3LおよびポリAを含む二重AAV (pX600)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図38ｂは、図38ａの下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図38ｃは図38ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７３】
【図３９】図39ａは、次の要素：CMVプロモーター、dCInteinCCas9、DNMT3AおよびポリAを含む二重AAV (pX600)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図39ｂは、図39ａの配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図39ｃは図39ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７４】
【図４０】図40ａは、次の要素：U6プロモーターに続くガイドRNAクローニング部位、CMVプロモーター、CP64、およびdNCas9Nintein、を含む二重AAV（Custom）システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図40ｂは、図40ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図40ｃは図40ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７５】
【図４１】図41ａは、次の要素：U6プロモーターに続くガイドRNAクローニング部位、CMVプロモーター、CP65およびdNCas9Nintein、を含む二重AAV（Custom）システム中の２つのベクターうちの１つの典型的配列である。図41ｂは、図41ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図41ｃは図41ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７６】
【図４２】図42ａは、次の要素：miRNA認識部位、Zac、iU6プロモーター、gSa、CMVプロモーターおよびtTRKRAB、を含む二重AAVシステム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図42ｂは、図42ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図42ｃは図42ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７７】
【図４３】図43ａは、次の要素：tetO (Custom)、U6プロモーターに続くガイドRNAクローニング部位、CMVプロモーター、NCas9NInteinおよびM2rtTA、を含む二重AAVシステム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図43ｂは、図43ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図43ｃは図43ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７８】
【図４４】図44ａは、次の要素：tetO、CBLおよびiCInteinCCas9を含む二重AAVシステム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図44ｂは、図44ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図44ｃは図44ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００７９】
【図４５】図45ａは、次の要素：CMVプロモーター、CIntein-CCas9、BE3CおよびポリAを含む二重AAV (pX600)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図45ｂは、図45ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図45ｃは図45ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００８０】
【図４６】図46ａと図46ｂは、次の要素：U6プロモーターに続くガイドRNAクローニング部位、CMVプロモーター、BE3NおよびdNCas9Nintein、を含む二重AAV (Custom)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列を提供する。図46ｃは、図46ａと図46ｂ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図46ｃは図46ａと図46ｂによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００８１】
【図４７】図47ａと図47ｂは、次の要素：CMVプロモーター、Cas9Sa、U6プロモーターおよびgSaを含む二重AAV (pX601)ベクターの典型的配列である。図47ｃは、図47ａと図47ｂ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図47ｄは図47ａと図47ｂによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００８２】
【図４８】図48ａは、次の要素：CMVプロモーター、dCInteinCCas9、VRおよびポリAを含む二重AAV (pX600)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図48ｂは、図48ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図48ｃは図48ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００８３】
【図４９】図49ａは、次の要素：CMVプロモーター、dCInteinCCas9、EcoRVおよびポリAを含む二重AAV (pX600)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図49ｂは、図49ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図49ｃは図49ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００８４】
【図５０】図50ａは、次の要素：U6プロモーターに続くガイドRNAクローニング部位、CMVプロモーター、KRABおよびdNCas9NInteinを含む二重AAV (Custom)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図50ｂは、図50ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図50ｃは図50ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【００８５】
【図５１】図51ａは、次の要素：U6プロモーターに続くガイドRNAクローニング部位、CMVプロモーター、EcoRVおよびdNCas9を含む二重AAV (Custom)システム中の２つのベクターのうちの１つの典型的配列である。図51ｂは、図51ａ中の配列の下線部分および／またはハイライト部分の各々についてのアノテーション情報を提供する。図51ｃは図51ａによりコードされる構成物のグラフィカル地図である。
【図５２】図52は表１を示す。
【図５３】図53は表２ａを示す。
【図５４】図53は表２ｂを示す。
【図５５】図53は表２ｃを示す。
【００８６】
〔表の簡単な説明〕
表１は、実施例１に用いられるガイドRNAスペーサー配列の一覧である。
【００８７】
表２ａは、実施例１に用いられるqPCRプライマーのオリゴヌクレオチド配列の一覧である。
【００８８】
表２ｂは、実施例１に用いられるNGSプライマーのオリゴヌクレオチド配列の一覧である。
【００８９】
表２ｃは、実施例１に用いられるAAV連結用オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列の一覧である。
【００９０】
本開示に従った態様は、下記により詳細に記載されるだろう。しかしながら、本開示の特徴は異なる形態で具体化することができるため、本明細書に記載の態様に限定されると解釈すべきでない。むしろ、それらの態様は、本開示が徹底的かつ完全であり、かつ本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供される。本明細書の説明に用いられる用語は、特定の実施態様を説明するだけの目的であり、限定することを意図するものではない。
〔定義〕
【００９１】
別に定義されない限り、本明細書中で用いる全ての用語（技術用語と科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
汎用される辞書に定義されるもののような用語は、本願および関連技術分野の範囲内の意味と一致する意味を有すると解釈すべきであり、かつ本明細書中でそのように表現上定義されない限り、理想化されたまたは過度に形式ばった意味で解釈すべきではない。下記に明示的に定義されないが、そのような用語はそれらの一般的な意味に従って解釈すべきである。
【００９２】
本記載において用いる用語は、本発明の特定の態様を説明するためのものであり、本発明を限定する意図ではない。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全内容が参照により援用される。
【００９３】
本技術のプラクチスは、異なって指摘されない限り、当業者の技術の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組み換えDNAの従来技術を利用するであろう。
【００９４】
文脈が異なって指摘しない限り、本明細書に記載の発明の種々の特徴は、任意の組み合わせで使用できることを明確に意図している。更に、本開示は、いくつかの態様において、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略できることも想定される。例示すると、配合物が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書に言及されるならば、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか１つまたはそれの組み合わせが単独でまたは任意組み合わせで省略または除外できることが明確に意図される。
【００９５】
明白に異なって指摘しない限り、全ての具体的実施態様、特徴および用語は、列挙された実施態様、特徴または用語と、それらの生物学的同等物の双方を含むものである。
【００９６】
範囲を含む全ての数字表示、例えばpH、温度、時間、濃度および分子量は、必要に応じて、1.0または0.1の増分だけプラス(+)またはマイナス(-）変動する近似値であり、あるいは、±15％の変動、あるいは10％、あるいは５％、あるいは２％の変動である近似値である。常に明示的に言及されるわけではないが、本明細書に記載の試薬は、単に例示であり、そのような試薬の同等物が当業界で知られていることも理解すべきである。
【００９７】
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲に用いる場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに異なって指摘しない限り、複数形も包含するつもりである。
【００９８】
本明細書中で用いる場合の用語「約」は、量や濃度といった測定可能な数値に言及する時、それが特定された量の20％、10％、５％、１％、0.5％または0.1％の変動を包含することを意味する。
【００９９】
本明細書中で用いる「および／または」は、関連づけて列挙された項目の１以上の任意のおよび全ての可能な組み合わせ、並びに別の選択肢（「or」）に解釈される時には組み合わせの欠如を指し、それらを包含する。
【０１００】
本明細書で用いる用語「細胞」は、任意に被験体よりまたは市販の入手源より得られる、原核または真核細胞のいずれかを指すことができる。
【０１０１】
本明細書中で用いる用語「含む」は、組成物や方法が列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味する。本明細書中で用いる場合、移行句「本質的に〜からなる」（およびそれの文法的変形）は、列挙された物質または工程を包含し、記載された実施態様の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを包含するとして解釈すべきである。よって、本明細書中で用いる場合の「本質的に〜から成る」という語は、「含む」と同等であると解釈してはならない。「から成る」は、本明細書中に開示される組成物を投与するための他の成分の微量元素や実質的な投与方法工程を超えるものを排除することを意味する。よって、それらの移行句により定義される態様は本開示の範囲内である。
【０１０２】
核酸配列に対して用いられる時の用語「コードする」は、あるポリヌクレオチドが、天然状態にある時または当業者に周知の方法により操作される時、転写および／または翻訳されて該ポリペプチドおよび／またはその断片のmRNAを産生することができるならば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コード配列をそれから推定することができる。
【０１０３】
用語「同等物」または「生物学的同等物」は、特定の分子、生物学的材料または細胞学的材料に言及する時に相互に交換可能に用いられ、それらがまだ望ましい構造や機能を維持していながら最小の相同性を有するものを意図する。
【０１０４】
本明細書中で用いる場合の用語「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写される過程および／または転写されたmRNAがその後、ペプチド、ポリぺプチドもしくはタンパク質に翻訳される工程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来するならば、発現は真核細胞中でのmRNAのスプライシングを含みうる。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織サンプル中のmRNAまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる；更に、同義遺伝子の発現レベルを、特定サンプルについての発現プロファイルを樹立するために決定することができる。
【０１０５】
本明細書中で用いる場合の用語「機能的」とは、任意の分子、生物学的材料または細胞学的材料を修飾することによって、それが特定の効果を達成することを意図するために用いることができる。
【０１０６】
本明細書中で用いる場合、用語「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指すために相互に交換可能に用いられる。よって、この用語は、限定的でなく、一本鎖、二本鎖または多重鎖のDNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリン塩基とピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然型の、化学的に修飾された、または生化学的に修飾された、非天然型の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
【０１０７】
本明細書中で用いられる用語「単離された」は、他の物質を実質的に含まない分子または生体物質または細胞性物質を指す。
【０１０８】
本明細書中で用いられる用語「臓器」は、個々の生物体の１または複数の機能が、局所的に実施されそして形態学的に分離している、個々の生物体の特定部分である構造を言う。臓器の非限定例としては、皮膚、血管、角膜、胸腺、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、甲状腺および脳が挙げられる。
【０１０９】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、相互に交換可能に且つその最も広範な意味で、アミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の２以上のサブユニットから成る化合物を指すために用いられる。サブユニットはペプチド結合によって連結されてもよい。他の観点では、サブユニットは別の結合、例えばエステル結合、エーテル結合等により互いに連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならないが、制限は、タンパク質のまたはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に置かれる。本明細書中で用いる時、用語「アミノ酸」は、天然型および／または非天然型または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンやＤおよびＬ光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を包含する。ペプチドはそれらの形状により定義することができる。例えば、「二環式ペプチド」は、場合により抗体模倣薬として機能するように工作される、２つの環化部分を含むペプチドのファミリーを指す。
【０１１０】
用語「組織」は、生物体または罹患した生物体の組織、あるいは生物体もしくは罹患した生物体から誘導されたまたはそれらを模倣するように設計された任意の組織を指す。組織は健全である、罹患している、そして／または遺伝的変異を有していてもよい。生物学的組織としては、任意の単一組織（例えば連結しているかもしれない細胞の集団）または生物の体の臓器のまたは体の一部もしくは一領域を構成している組織の一群が挙げられる。組織は均一な細胞性物質を含むことができ、それは体の種々の領域に見つかるような複合構造であってもよく、そのような構造は、例えば肺組織、骨格組織および／または筋肉組織を含みうる胸部をはじめとする体の領域中に見つかる。典型的な組織としては、非限定的に、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆道、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓や腸由来のものが挙げられるが、それに限定されない。
【０１１１】
「有効量」または「有効用量」は、意図する目的を達成するのに十分な量である。一観点では、有効量は言及された治療目的を達成するために機能するもの、例えば、治療的に有効な量である。本明細書中に詳細に記載される通り、有効量または投与量は、目的と組成に依存し、本開示に従って決定することができる。
【０１１２】
本明細書中に記載のような用語「CRISPR」は、規則的に間隔が空けられた短い回分式反復配列経路に頼る配列特異的遺伝子操作技術であり、それはRNA干渉とは異なり、転写レベルで遺伝子発現を制御する。本明細書中で用いる時の用語「gRNA」または「ガイドRNA」は、CRISPR技術を利用した修正のための特異的遺伝子をターゲティングするのに用いられるガイドRNA配列を指す。gRNAを設計する技術および標的特異性のための治療用ポリヌクレオチドを設計する技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Doench他 (2014) Nature Biotechnol. 32(12):1262-7およびGraham他 (2015) Genome Biol. 16: 260参照（これは参照により本明細書中に組み込まれる）。本明細書中で用いる時、gRNAは二重または単一gRNAを指すことができる。両者の非限定的な典型的態様が本明細書中に提供される。
【０１１３】
用語「Cas9」は、この名称により言及されるCRISPRに会合されるエンドヌクレアーゼ（UniProtKB G3ECR1(CAS9_STRTR)）並びにエンドヌクレアーゼ活性を欠いているdead Cas9またはdCas9（例えばRuvCドメインとHNHドメインの両方に変異を有する）を指す。用語「Cas9」は更に、少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または99％の同一性を有するリファレンスCas9の同等物を指すことができるが、他のより大きなCas9タンパク質も含み、それに限定されない。
【０１１４】
用語「インテイン」は、自身を切除することができかつ該タンパク質の残りの部分をタンパク質スプライシングにより連結することができるタンパク質の１クラスを指す。「分割インテイン」とは、２つの遺伝子から由来するインテインを指す。非限定例は、N. punctiforme中の分割インテインである。接頭文字ＮとＣは、分割インテインの関連で、どちらのタンパク質末端にインテインの半分をコードする遺伝子を含むのかを定めるために用いることができる。
【０１１５】
本明細書中で使用される用語「組み換え発現系」とは、組み換えにより形成された特定の遺伝物質の発現のための遺伝子構成物を指す。
【０１１６】
本明細書中で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「AAV」は、この名前と関連しパルボウイルス科（Parvoviridae）デペンドパルボウイルス属（dependoparvovirus）に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。このウイルスの複数の血清型が遺伝子送達に適することが知られており；全ての既知血清型が様々な組織型からの細胞に感染することができる。少なくとも11の連番が付けられたものが従来技術に開示されている。本明細書中に開示される方法に有用な、限定でない典型的な血清型は、11の血清型、例えばAAV2およびAAV8、または変異血清型、例えばAAV-DJのいずれも包含する。
【０１１７】
本明細書中で使用される用語「レンチウイルス」は、この名前と関連付けられレトロイウルス科レンチウイルス属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。幾つかのレンチウイルスが病気を誘発すると知られているが、他のレンチウイルスは遺伝子伝達に適当であることが知られている。例えば、Tomas他(2013) Biochemistry, Genetics and Molecular Biology: “Gene Therapy - Tools and Potential Applications,” ISBN 978-953-51-1014-9, DOI:10.5772/52534を参照のこと。
【０１１８】
本明細書で使用する場合の用語「ベクター」は、非分裂のおよび/またはゆっくり分裂する細胞に感染しそして形質導入する能力、並びに標的細胞のゲノムに統合する能力を保持する組み換えベクターを意図する。ベクターは野生型ウイルスに由来するか、または野生型ウイルスに基づいてもよい。本開示の態様は、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスベクターに関する。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コード配列、例えば遺伝子の発現を調節する任意の配列を言う。プロモーターは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であってよい。「プロモーター」は、転写の開始とその速度が制御されるポリヌクレオチド配列の一領域である制御配列である。プロモーターは調節タンパク質および分子がRNAポリメラーゼや他の転写因子などをそこに結合することができる遺伝要素を含んでもよい。非限定的な典型的プロモーター配列を下記に与える：
【化１】
2019524162.tif 000003
またはその生物学的同等物。
【化２】
2019524162.tif 000004
またはその生物学的同等物。
【０１２０】
それらのベクターに用いるための多数のエフェクター要素が本明細書中に開示される；例えば、テトラサイクリン応答要素（例えばtetO）、tet-調節性活性化因子、T2A、VP64、RtA、KRABおよびmiRNAセンサー回路。それらのエフェクター要素の性質と機能は当業界で一般に知られており、多数のエフェクター要素が商業的に入手可能である。その非限定的な代表的配列が本明細書中に開示され、それの詳細な説明が下記に提供される。
【０１２１】
本明細書中で用いられる用語「アプタマー」は、高い親和性と特異性で１以上の選択された標的に結合することができる一本鎖DNAまたはRNA分子を指す。非限定的な標的はタンパク質またはペプチドを含むがそれに限定されない。
【０１２２】
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、多数の標的タンパク質またはペプチドに高親和性で結合するように工作された小さなタンパク質を含む、１つのタイプの抗体模倣体を指す。一般的な抗体構造は３本の螺旋状束構造に基づき、これはその後特異的標的への結合のために修飾することができる。
【０１２３】
本明細書中で用いられる用語「DARPin」は、設計されたアンキリン反復タンパク質、すなわち標的タンパク質に対して高い特異性と親和性を有する１つのタイプの工作された抗体模倣物を指す。一般に、DARPinは、タンパク質モチーフ（アンキリン）の少なくとも３つの反復配列、場合により４または５つの反復配列を含み、そして約14〜18 kDaの分子量を有する。
【０１２４】
本明細書中で用いる場合の用語「Kuitzドメイン」は、プロテアーゼ阻害剤として機能するタンパク質中に見つかる、ジスルフィド右α＋β折り畳みドメインを指す。一般に、Kunitzドメインは、長さ約50〜60アミノ酸であり、約6 kDaの分子量を有する。
【０１２５】
本明細書中で用いる場合の用語「フィノマー」は、ヒトFyn SH3ドメイン（GeneCards  Ref. FYNに記載）から誘導される小型の結合性タンパク質を指し、それは工作して抗体模倣物にすることができる。
【０１２６】
本明細書中で用いる場合の用語「アンチカリン」は、現在Pieris Pharmaceuticalsにより市販されている１種の抗体模倣物を指し、それの中には抗原に結合できるが抗体に構造的に関連しない人工タンパク質が含まれる。アンチカリンはヒトリプカリンから誘導され、特定の標的に結合するように修飾される。
【０１２７】
本明細書中で用いる場合の用語「アドネクチン」は、抗体模倣物として働く合成結合性タンパク質であるモノボディを指し、それはフィブロネクチンIII型ドメイン（FN3）を使って構築される。
【０１２８】
明確な記述がない場合および異なって意図されない限り、本開示がぺプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、そのようなものの同等物または生物学的同等物は本開示の範囲内であるとする。本明細書中で用いる場合、用語「生物学的同等物」とは参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及する時の「それの同等物」と同義語であり、望ましい構造または機能性を維持しながら最小の相同性を有するものを意図する。本明細書中、具体的に記述しない限り、本明細書中に言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はそれの同等物も包含することが想定される。例えば、同等物は、少なくとも約70％相同性もしくは同一性、または少なくとも約80％相同性もしくは同一性、または少なくとも約90％相同性もしくは同一性、または少なくとも約95％相同性もしくは同一性、または少なくとも約98％相同性もしくは同一性を意味し、そして参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に対して実質的に同等な生物活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、それの同等物とは、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【０１２９】
出願人は、後述するような遺伝子とタンパク質の導入および発現技術に用いられるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列を本明細書中に提供する。本明細書中に提供される配列が、発現産物だけでなく同じ生物学的特性を有するタンパク質を産生する実質的に同じ配列を提供するために利用できるということを、常に明確に言及しないけれども理解しておくべきである。それらの「生物学的に同等の」または「生物学的に活性な」ポリペプチドは本明細書中に記載のような同等のポリヌクレオチドによりコードされる。デフォルト条件下で実行される配列一致法を使って比較した時に、参照ポリペプチドに対して、それらは少なくとも60％、あるいは、少なくとも65％、または少なくとも70％、または少なくとも75％、または少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも98％同一の一次アミノ酸配列を有することができる。幾つかの具体的ポリペプチド配列が特定の実施態様の例として提供される。配列への修飾は、アミノ酸を同様な電荷を有するアミノ酸に置換するものである。加えて、同等なポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件下で参照ポリヌクレオチドまたはそれの相補体にハイブリダイズするものであり、またポリペプチドに関していえば、ストリンジェント条件下で参照がコードするポリヌクレオチドにまたはそれの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。あるいは、同等のポリペプチドまたはタンパク質は、同等のポリヌクレオチドから発現されるものである。
「ハイブリダイゼーション」とは、１以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応のことを指す。水素結合はワトソン・クリック塩基対合、ホーグステイン結合、または他の任意の配列特異的方式により起こりうる。複合体は二重鎖構造を形成する二本の鎖、多重鎖複合体を形成する三本以上の鎖、一本の自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意組み合わせを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲のプロセスの中の一工程、例えばPC反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂といった工程を構成することができる。
【０１３０】
ストリンジェント（緊縮）ハイブリダイゼーション条件の例は以下のものを含む：約25℃〜約37℃のインキュベーション温度；約６×SSC〜約10×SSCのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約25％のホルムアミド濃度；および約４×SSC〜約８×SSCの洗浄溶液。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は以下のものを含む：約40℃〜約50℃のインキュベーション温度；約９×SSC〜約２×SSCの緩衝液濃度；約30％〜約50％のホルムアミド濃度；および約５×SSC〜約２×SSCの洗浄溶液。高ストリンジェント条件の例は以下のものを含む：約55℃〜約68℃のインキュベーション温度；約１×SSC〜約0.1×SSCの緩衝液濃度；約55％〜約75％のホルムアミド濃度；および約１×SSC、0.1×SSCまたは脱イオン水の洗浄溶液。一般に、ハイブリダイゼーション用インキュベーション時間は５分〜24時間であり、１、２またはそれ以上の洗浄工程を伴い、そして洗浄用インキュベーション時間は約１、２または15分間である。SSCは0.15 M NaClと15 mMクエン酸緩衝液である。別の緩衝液系を使ったSSCの同等物も使用できると考えられる。
【０１３１】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列同一性を指す。相同性は、比較の目的で整列させることができる各配列中の１つの位置を互いに比較することによって決定することができる。比較された配列中の１つの位置が同一塩基またはアミノ酸により占有される時、その分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有されるマッチング位置または相同性位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同性の」配列は、本発明の配列の中の１つと40％未満の同一性、あるいは25％未満の同一性を有する。
〔発明を実施する方法〕
【０１３２】
本開示は、より優れた遺伝子送達、遺伝子編集の特異性および選択性を可能にするユニークなモジュラーCRISPR-Cas9アーキテクチャを有する新規送達システムに関する。それは以前に記載されたsplit-Cas9システムを上回る有意な改善を示す。モジュラーアーキテクチャは「調節性」である。追加の態様は、空間的にも時間的にも制御することができ、誘導的編集の可能性を生むシステムに関する。更なる態様は、ホーミング剤への連結を可能にする修飾されたウイルスカプシドに関する。
Split-Casシステム
【０１３３】
一態様では、本開示は、Cas9が二つの半片（C-Cas9とN-Cas9）に分割されそして２つのインテイン成分または「分割インテイン」と融合された「split-Cas9」に関する。例えば、Volz他 (2015) Nat Biotechnol. 33(2):139-42; Wright他 (2015) PNAS 112(10) 2984-89を参照のこと。「分割インテイン」は２つの遺伝子から由来する。「分割インテイン」の非限定例は、もとは藍藻N. punctiformeに由来するC-インテインとN-インテイン配列である。非限定的例のsplit-Cas9は、残基574-1398を含むC-Cas9と、残基１-573を含むN-Cas9とを有する。典型的なsplit-Cas9は、dC-Cas9とdN-Cas9と称される、dCas9の前記残基を含む２つのドメインを含む。
【０１３４】
それらのsplit-Cas9モジュールの非限定的な典型配列は下記に提供される。アミノ酸番号は野生型Cas9に関して提供される。
【化３】
2019524162.tif 000005
【化４】
2019524162.tif 000006
【化５】
2019524162.tif 000007
【化６】
2019524162.tif 000008
【０１３５】
本開示の局面は、CRISPRベースのゲノムまたはエピゲノム編集のための組み換え発現システムであって、（a）(i) C-インテインをコードするポリヌクレオチド、(ii) C-Cas9をコードするポリヌクレオチド、および(iii) プロモーター配列、を含む、または本質的にから成る、またはから成る第一の発現ベクターと、
(b) (i) N-Casをコードするポリヌクレオチド、(ii) N-インテインをコードするポリヌクレオチド、および(iii)プロモーター配列、を含む、または本質的にから成る、またはから成る第二の発現ベクターと
を含む、または本質的にから成る、またはから成り、
ここで前記第一および第二の発現ベクターの同時発現が、機能的Cas9タンパク質の発現をもたらす、前記組み換え発現システムに関する。
【０１３６】
ある態様では、前記組み換え発現システムの第一と第二の発現ベクターの双方が、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【０１３７】
本明細書中に開示されるベクターへのエフェクター要素の付加は、Cas9発現の調節により、CRISPRベースのゲノムまたはエピゲノム編集における特定用途に合わせて組み換え発現系を工作（tailor）できるようにする。開示された「split-Cas9」および／または組み換え発現系の状況下での非限定的な典型的エフェクター要素およびそれらの使用が下記に提供される。下記のエフェクター要素の各々が組み換え発現系における特定機能との関連で記載されると認識すべきである。従って、複数のそれらの機能を所望する場合、複数のエフェクター要素を組み換え発現系中に組み合わせて使用することができる。対比して、ただ１つの機能を所望する場合、対応するエフェクター要素のみを組み換え発現系中に使用することができる。
〔時間的調節のためのエフェクター要素〕
【０１３８】
ある観点では、組み換え発現系の第一および／または第二のベクターは、誘導性発現を可能にするエフェクター機能を含み、または本質的にから成り、更にまたはから成り、ここで特定の外部物質の誘導がベクターの発現を誘導する。一般に、そのような誘導は、その特定の物質とエフェクター要素との間の相互作用によって達成され、転写または翻訳を完成させる。
【０１３９】
そのような誘導性スイッチの非限定例は、本明細書中「Tet-ON」システムと呼ばれるテトラサイクリン依存性システムである。Tet-ONシステムは、下流の遺伝子の転写抑制因子として働くテトラサイクリン応答要素（「TRE」）と、TREに結合しかつTREの下流の遺伝子の発現を可能にする対応するテトラサイクリン調節性活性化因子（「tet-調節性活性因子」）とを含む。tet-調節性活性因子は、TREに結合するためにテトラサイクリンまたはその誘導体（限定されないがドキシシクリンのような）の存在を必要とする。よって、Tet-ONシステムを使うことにより、tet-調節性要素も転写されることを前提として、テトラサイクリンまたはその誘導体（限定されないがドキシサイクリンのような）の添加により、TREの下流の遺伝子の発現を「惹起させる（スイッチを入れる）」ことができる。
【０１４０】
ある態様では、TREがTetO、または場合によりそれの１以上の反復単位またはそれの７つの反復単位を含む。TetOの正準の核酸配列は次の通りである：ACTCCCTATCAGTGATAGAGAA。TREは更にプロモーター配列を含んでもよい。7つのtetOの反復単位と最小CMVプロモーターとを含むそのようなTREの非限定的な例は、次のものである：
【化７】
2019524162.tif 000009
さらなる典型的配列はTetOの７反復単位を含む： 
【化８】
2019524162.tif 000010
【０１４１】
幾つかの態様では、tet-調節性活性化因子は、「逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子」としても知られるrtTAを含む。例えば、Gossen他(1995) Science 268 (5218): 1766-1769参照。tet-調節性活性化因子が複数の遺伝子をコードするベクター（すなわち多シストロン性ベクター）中に提供される場合、tet-調節性活性化因子は、他のベクター生産物からのそれの解離を可能にする「自己切断」ペプチドを含むことができる。そのような自己切断ペプチドの非限定的例は、ピコルナウイルス中に最初に発見された短いタンパク質配列である2Aである。ペプチド2Aは、リボソームに2A要素のC末端のところのペプチド結合の合成をスキップさせることにより機能し、結果として2A配列の末端とそれの下流のペプチドとの間の分離を引き起こす。この「開裂」は、C末端の所のグリシン残基とプロリン残基の間で起こる。2AとrtTAの双方を含むtet-調節性活性化因子の非限定的なアミノ酸配列は下記に与えられる：
【化９】
2019524162.tif 000011
【０１４２】
幾つかの実施態様では、Tet-ONシステムは本明細書に開示される組み換え発現系のようなsplit-Cas-9システム中に統合することができる。
【０１４３】
幾つかの実施態様では、第一のベクターがテトラサイクリン応答要素（「TRE」）を含み、第二のベクターがテトラサイクリン調節性活性化因子「tet-調節性活性化因子」を含む。幾つかの実施態様では、第二のベクターがTREを含み、第一のベクターがtet-調節性活性化因子を含む。
【０１４４】
非限定的例は図面に描写される：C-Cas9ベクターに関しては、Tetオペレーター（tetO）と最小CMVプロモーターを含むTREを、N-Cas9ベクターに関しては、rtTAを含むtet-調節性活性化因子を、場合により付加することができる。それらのシステムへのドキシシクリンの導入は、rtTAをTetOに結合できるようにしそしてC-Cas9の転写を開始させ、遺伝子編集を可能にする（図３）。出願人はこの非限定的典型例のシステムをin vivoで試験し、DOX+ マウスにおいては編集が認められ、DOX- マウスにおいては編集が認められないことを証明した（図７）。
〔組織特異性のためのエフェクター要素〕
【０１４５】
一態様では、組み換え発現系の第一および／または第二のベクターは、組織特異的発現に備えるエフェクター要素または「回路」を含み、または代替的に本質的にから成り、更にまたはから成り、すなわち該組み換え発現系では１以上の特定の組織に存在する１以上の物質、例えばタンパク質、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的成分により、ベクターの発現が誘導される。
【０１４６】
そのような回路の非限定例は調整可能なマイクロRNA（「miRNA」）回路またはスイッチである。miRNAスイッチは、マイクロRNAによりポジティブにまたはネガティブに調節できるように設計することができる遺伝子発現の抑制因子または活性化因子である。
【０１４７】
マイクロRNAは、標的mRNAに対合し、該mRNA鎖を１以上開裂させて２つの切片にし、ポリ(A)テールの短縮を通して該mRNAを脱安定化することにより、そして／またはmRNA翻訳効率を減少させることにより、mRNAを遮断する（サイレンシングする）小さな非コードRNA分子である。特定の組織において発現される特定のmiRNAは、多様なデータベース、例えばmiRmine (guanlab.ccmb.med.umich.edu/mirmine/）とMESAdb (konulab.fen.bilkent.edu.tr/mirna/mirna.php)中に目録掲載されている。本発明に関連付けられるmiRNAおよび対応するmiRNA標的の非限定的例が提供される：
HeLa：
miR-21-5p：uagcuuaucagacugauguuga
挿入される標的：TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGATCTA
HUVEC：
miR-126-3p：ucguaccgugaguaauaaugcg
挿入される標的：CGCATTATTACTCACGGTACGAAGATCAC
心臓：
miR-1a-3p：uggaauguaaagaaguauguau
挿入される標的：ATACATACTTCTTTACATTCCAAGATCAC
肝臓：
miR-122a-5p：uggagugugacaaugguguuug
挿入される標的：CAAACACCATTGTCACACTCCAAGATCAC
またはそれらの各々の生物学的同等物。組織特異的なmiRNAを選択し、このmiRNAにより標的されるmiRNA回路を作製することにより、ベクターの発現を高度に組織特異的となるように較正することができる。
【０１４８】
例えば、典型的なベクターは、5' UTR中のmiRNA標的部位によって負に調節される発現の抑制因子（リプレッサー）から構成されるmiRNA回路を含むことができる。よって、該ベクターが標的組織型に送達されると、該抑制因子が抑制され、対応するベクターが活性化される。反対に、該ベクターがmiRNA部位を含まない間違った組織型に送達されると、ベクターが抑制される。
【０１４９】
ある態様では、第一および／または第二のベクターが特定の組織を標的とするmiRNAスイッチを組み込む。そのような組み込みの非限定的な図解が図５に提供される。ある態様では、miRNAスイッチがmiRNA標的により負に調節される発現の抑制因子を含む。
〔遺伝子編集のためのエフェクター要素〕
【０１５０】
本明細書に開示される組み換え発現系はアクティブCas9またはdCas9 (dead Cas)のいずれも使用することができるので、様々な任意選択のエフェクター要素を本明細書に記載の方策（ライン）に沿って組み込み、ゲノム編集を容易にすることができる。
【０１５１】
ノックアウトおよびノックイン：本明細書に開示される組み換え発現系は、CRISPRベースのゲノム編集またはエピゲノム編集のために設計される。一般に、CRISPRベースのゲノム編集またはエピゲノム編集は、gRNAと標的配列との間の対合を促進するCas9の機能に頼っている。gRNAは、一般に特定の標的遺伝子をターゲティングするよう設計され、更にCRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化CRIPSPR RNA（tracrRNA）を含むことができる。標的遺伝子にCas9-gRNA複合体が対合すると、アクティブCas9酵素が標的特異的開裂を触発して遺伝子を破壊し、そして場合により、ある遺伝子をノックインまたはノックアウトすることができる。これはCRISPR-Cas9遺伝子編集に採用される伝統的なアプローチであり、治療的用途、具体的には遺伝性疾患で、極めて有用であることが分かっている。
【０１５２】
あるいは、dead Cas9（「dCas9」；活性を欠損させたCas9）が使用される場合、Cas9-gRNA複合体は、異なる編集効果、例えば編集；ダウンレギュレーション（下方制御）、抑制もしくはサイレンシング; アップレギュレーション（上方制御）、過剰発現、もしくは活性化; または標的遺伝子のメチル化の改変を含むがそれに限定されない効果のために編成することができる。
【０１５３】
ベース編集：ある態様では、dCas9を使って、組み換え発現系、例えばsplit-Cas9二重AAVシステムに、ベース編集アプローチを組みこんでもよい。
【０１５４】
例えば、シチジンからウリジンへの変換を指令し、従って点変異を修繕するのに有用であるシチジンデアミナーゼ酵素を、第一および／または第二のベクターに組み込むことができる。このアプローチは、二本鎖切断を必要とせず、伝統的なCRISPR-Cas9遺伝子編集によりもたらされるリスクとしてのランダムindelを導入することなく、点変異を有する遺伝子を修正するのに効率的である。従って、このシステムは、的外れの（off-target）ランダム挿入欠失の形成を最小化することによって生産物選択性を増加させる。このアプローチの非限定的例は、第三世代ベースエディタである、APOBEC-XTEN-dCas9（A840H）-UGIを使用し（Komor他(2016) Nature 533: 420-424および補足資料中に開示されている）、このエディタは編集されたＵの反対側にＧを含む未編集鎖にニックを挿入する。本明細書中に記載の組み換え発現系、例えばsplit-Cas9システム中に適応させることができる、Komor他記載のAPOBEC1を含むCas9のための構成物を下記に提供する：
【化１０】
2019524162.tif 000012
更なる例としては、非限定的に、ヒトAID（UniProt Ref No. Q7Z599）、ヒトAPOBEC3G（UniProt Ref No. Q9HC16）、ラットAPOBECl（UniProt Ref No. P38483）、 およびヤツメウナギCDAl（GenBank Ref No. EF094822）が挙げられる。ベース編集の実施態様では、ベースエディタはCas9nickaseを利用する。これは、一本鎖の分断を作る能力を保持しながら、変異しCas9の2つの開裂ドメインのうち１つだけが変異されることになる。例えば、図37に提供される典型的ベース編集構成物は、Cas9開裂ドメイン中にD10A変異を含むだろう。いくつかの態様では、このアプローチはin vivo設定において使用してよい。
【０１５５】
いくつかの実施態様では、組み換え発現系中の第一および／または第二のベクターは、シチジンからウリジンへの変換を指令するシチジンデアミナーゼ酵素をコードし、従って点変異を修正するのに有用である。
【０１５６】
抑制と活性化：ある態様はゲノム調節のためdCas9を用いる組み換え発現系の使用に関する。伝統的なCRISPR-Cas9モデルに従った遺伝子編集の一つの懸念は、永久的に遺伝子を編集した後に発生しうる未知の影響である。未知の機能や酵素に関連した無差別活性を有する多くの遺伝子があるので、これは重要である。このような理由のため、ゲノム制御が有力な代替手段である。それは、遺伝子を編集することから生じうる、可能性ある結果を伴わない（正確な）遺伝子発現の制御が可能になるからである。いくつかの実施態様では、該システムは制御された遺伝子発現のために構成される。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、場合により転写活性化因子または転写抑制因子（リプレッサー）が、dCas9を用いて、組み換え発現系、例えばsplit-Cas9二重AAVシステム中に組み込まれる。このような実施態様では、gRNAは標的遺伝子のプロモーターをターゲティングするように設計される。
【０１５８】
非限定的例の転写抑制因子は、高等脊椎動物において高度に保存された転写抑制モジュールである、「KRAB」(Kruppel-associated box)であり、その典型的配列を下記に与える： 
【化１１】
2019524162.tif 000013
またはその生物学的同等物。 
【０１５９】
非限定的例の転写活性化因子はVP74、RTaおよびp65であり、その典型的配列を以下に提供する：
【化１２】
2019524162.tif 000014
またはその生物学的同等物。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、組み換え発現系中の第一および／または第二のベクターがKRABを含む。さらなる態様では、この組み換え発現系が標的遺伝子をサイレンシング、抑制、または下方制御するために使用される。さらに別の態様では、組み換え発現系が標的遺伝子のプロモーターを標的とするgRNAを含む。
【０１６１】
出願人は、in vitroおよびin vivoでこの系を試験し、in vitroで90％までの抑制およびin vivoで35％抑制を証明した（それぞれ図８および図９）。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、組み換え発現系中の第一および／または第二のベクターが、VP64、RTaおよび／またはp65を含む。さらなる実施態様では、この組み換え発現系が、標的遺伝子を活性化、過剰発現、または上方制御するために使用することができる。さらに別の実施態様では、組み換え発現系が標的遺伝子のプロモーターを標的とするgRNAを含む。標的遺伝子の活性化、過剰発現、または上方制御（アップレギュレーション）に関連する実施態様では、組み換え発現系が、活性化、過剰発現または上方制御のための標的遺伝子をコードする第三のベクターを更に含んでもよい。
【０１６３】
最大40倍のin vitroでの相対的発現の増加が測定された（図11）。
【０１６４】
メチル化：ある実施態様では、場合により組み換え発現系にメチル化調節因子が組み込まれ；従って、標的遺伝子のエピジェネティック修飾を可能にする。このような実施態様では、gRNAは、標的遺伝子のプロモーターを標的とするように設計されてもよい。
【０１６５】
そのようなメチル化調節因子の非限定的例としては、DNMT3AとDNMT3Lが挙げられるがそれに限定されず；その典型的配列を下記に与える：
【化１３】
2019524162.tif 000015
またはそれの各々の生物学的同等物。
【０１６６】
いくつかの実施態様では、組み換え発現系中の第一および／または第二のベクターが、DNMT3AおよびDNMT3Lの一つ以上を含む。更なる実施態様では、この組み換え発現系は、任意に標的遺伝子のメチル化を改変することにより標的遺伝子をサイレンシング、抑制または下方制御するために用いられる。更に別の実施態様では、組み換え発現系が標的遺伝子のプロモーターを標的とするgRNAを含む。
〔特定の用途のためのgRNA〕
【０１６７】
いくつかの実施態様では、組み換え発現系がgRNAを含み、その中で用いられるgRNAに基づいて特定の用途に合わせて工作（tailor）される。従って、いくつかの実施態様では、組み換え発現系の第一または第二のベクターがgRNAをコードする。他の実施態様では、組み換え発現系がgRNAをコードする第三のベクターを含む。ある実施態様では、gRNAが二重gRNA（dgRNA）または単一gRNA（sgRNA）である。
【０１６８】
gRNAを用途に合わせて工作するための非限定的方法の観点は本明細書に開示される。典型的gRNAが与えられる場合、大文字のレタリングはエクソン領域を示し、小文字のレタリングはイントロン領域を示す。
【０１６９】
本開示のgRNAは、特定の哺乳動物種、例えばマウスまたはヒトの相同遺伝子のために設計され、それに対するgRNAは、当業界で既知の技術とツール、例えば非限定的にタンパク質や遺伝子のデータベース、例えばGenBank、BLAST、UniProt、SwissProt、KEGGおよびGeneCardsをはじめとするデータベースを使って見つけることができる。更に、特定の標的および種についての検証済gRNA配列は、CASデータベース（rgenome.net/cas-database/）またはAddGene（addgene.org/crispr/reference/grna-sequence/）またはGeneScript
（genscript.com/gRNA-database.html）のような多数のgRNAデータベースの１つの中に見つけることができる。更にgRNAおよび／または標的遺伝子は、これらの非限定の典型的方法のための、および／または、gRNAおよび／または標的遺伝子に関連する任意の他の疾患もしくは障害のための組み換え発現系によりターゲティングすることができることを理解すべきである。
【０１７０】
用語「抑制する」は、本明細書で使用されるとき、組み換え発現系が転写抑制因子、例えば限定されないがKRAB；dCas9；および１つ以上の開示されたgRNA、を使用することを意図する；該用語は、そのような下方制御、抑制、および／またはサイレンシングのようなそれの発現を減少させるまたは排除する標的遺伝子に対する作用を意図する。用語「活性化する」または「過剰発現させる」は、本明細書で使用されるとき、組み換え発現系がVP64、RTAおよびp65；dCas9；および１つ以上の開示されたgRNAを使用することを意図する。この用語は、上方制御、活性化および／または過剰発現のようなそれの発現を増加させる標的遺伝子に対する作用を意図する。より一般的には、「調節」は、dCas9を用いる組み換え発現系で使用されるgRNAへの言及、一方で「編集」は活性（または「live」）Cas9を用いる組み換え発現系で使用されるgRNAへの言及に使用することができる。
【０１７１】
疼痛管理：いくつかの実施態様では、gRNAが疼痛管理を標的対象とする組み換え発現系において使用される。長期オピオイド使用は薬物中毒や薬物乱用に関連付けられており、世界中で推定3240万の人々がオピオイドを乱用している。加えて、西ヨーロッパと中央ヨーロッパにおいて初回の薬物更生患者の16％がオピオイド乱用の治療を求めており、アジアで45％、北米で22％が治療を求めている。さらに、モルヒネの使用に関係する最近の報告は、慢性狭窄傷害の期間を２倍にし、長引く痛みが慢性疼痛用オピオイドの使用の結果であると予測した。このため、痛みをターゲットとする別の方法を見つけることは世界人口にとって非常に有益である可能性がある。オピオイドペプチドに応答性の遺伝子中の発現の増加と連動して、低から高の無痛性を有する、SCN9A遺伝子中の機能変異の欠失を有するヒトやマウスが存在することは知られている（電位依存性ナトリウムチャンネルNav 1.7をコードする）。SCN9Aに点変異を有するヒトやマウスは、単一のアミノ酸の置換と１つのフレーム内欠失を引き起こす18個のミスセンス変異を含む、この表現型をもたらす。SCN9Aを標的とする典型的なgRNA配列を下記に提供する：
【化１４】
2019524162.tif 000016
【０１７２】
理論に縛られることなく、出願人らは、アクティブCas9を使用することが、永久的な無痛性および／または嗅覚の喪失を引き起こしうる程度に疼痛管理の危険要因となると信じる。具体的には、出願人らは、SCN9A遺伝子中の変異が、嗅覚ニューロン中の機能的NAV1.7ナトリウムチャネルの損失も引き起こし、それが嗅覚の喪失を生じる可能性があることを認識している。従って、上記に提供した例示的gRNAsは、SCN9Aのプロモーター領域を標的とするように設計され、dCas9を用いる本発明の組み換え発現系の実施態様において使用することができる。これらのgRNAを使用する意図は、SCN9Aをサイレンシングまたは下方制御するためである。
【０１７３】
例えば、一態様では、dCas9を使用する本開示の組み換え発現系、例えば二重pAAV9_gSCN9a_dCas9システムは、(i) 手術中の疼痛の予防目的で（この場合組み換え発現系は手術前に患者に投与される）、または（ii）慢性疼痛の使用目的で、使用される。理論に束縛されることなく、組み換え発現系の量は、一回に約１ヶ月の期間、疼痛を低下させておくのに有効であることができる。
【０１７４】
疼痛管理のために標的とすることができる追加の遺伝子は、他のナトリウムチャネル、例えばNav 1.8（SCN10A遺伝子）、1.9（SCN11A遺伝子）および1.3（SCN3A遺伝子）、並びに、カプサイシン受容体およびバニロイド受容体１としても知られる一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（TrpV1）を包含する。同様に抑制されまたは活性化される他の着目の遺伝子は、次のものである：
【表１】
2019524162.tif 000017
命名された一部の標的に利用できるgRNAの非限定例としては次のものが挙げられる：
ノックアウトのためのgRNA：
NAV 1.3：TCGTGGATTTCTATCACTTT
NAV 1.8：CTTGGTAACGTCTTCTCTTG
NAV 1.9：Crgatgrgttcrchhacrgtgrchhaata
TRPV1：TAAGCTGAATAACACCGTTG
抑制のためのgRNA：
NAV 1.3：Crcrgrcttcrctgttctgagatc
NAV 1.8：Gtchhacrgagttcrchhacrcrctgrcrc
NAV 1.9：CAGCCTGGATGGCTTACCTC
TRPV1：GGGACTTACCAGCTAGGTGC
またはそれらの各々の生物学的同等物。さらに別の例示的gRNAを下記に提供する：
【表２】
2019524162.tif 000018
【表３】
2019524162.tif 000019
【表４】
2019524162.tif 000020
【表５】
2019524162.tif 000021
【表６】
2019524162.tif 000022
【表７】
2019524162.tif 000023
またはそれらの各々の生物学的同等物。
【表８】
2019524162.tif 000024
【表９】
2019524162.tif 000025
【表１０】
2019524162.tif 000026
【０１７５】
肝疾患：いくつかの実施態様では、gRNAsは、限定されないがマラリアや肝炎などの肝疾患および肝機能不全に関連する状態を標的とするように設計される。マラリアは、世界106か国の国と地域において、推定33憶人−すなわち世界人口のほぼ半分の人々−が罹患するリスクがある、寄生虫により引き起こされる命に関わる蚊媒介性疾患である。その結果、感染を予防する方法を見つけることは非常に有益であろう。マラリアは、肝臓中の３つの宿主遺伝子：CD81、Sr-b1およびMUC13と関連付けられている。CD81は、Ｃ型肝炎ウイルスの既知受容体でもある。理論に束縛されずに、これらの遺伝子のうちの１つ以上を標的とすることが、前記のような１以上の疾患の宿主への感染能力を妨げると考えられる。したがって、これらの遺伝子標的の調節や編集に合わせて作られたgRNAsを含む本開示の組み換え発現系を使用することは、その治療および／または予防に有用であるだろう。いくつかの実施態様では、これは、それらのgRNAsを含む組み換え発現系の予防的投与を含んでもよい。マラリア、Ｃ型肝炎、またはこれらの遺伝子が関与している他の任意の疾患における使用のためのgRNAsの非限定的例としては、次のものが挙げられる：
CD81：CGAAATTGAAGACGAAGAGC
MUC13：GGAGACTGAGAGAGAGAAGC
Sr-b1：TGATGAGGGAGGGCACCATG
各またはそれの生物学的等価物。
【０１７６】
造血幹細胞療法およびHIV：いくつかの実施態様では、gRNAsは、造血幹細胞（HSC）の免疫拒絶反応を防止するように、そして／またはHIVが宿主細胞に侵入するのを防止するように設計される。HSC遺伝子療法は、多様なヒト造血系疾患、例えば鎌状赤血球貧血などを潜在的に治療することができる。しかしながら、HSC遺伝子療法の現行法は非常に複雑で高価である。現在、造血幹細胞移植法は、１個体（ドナー）からHSCを採取し、別の個体（レシピエント）にそれらを輸液することを必要とする。この方法のいくつかの欠点としては、異物からの細胞による免疫応答（または移植片拒絶）がある。拒絶反応を防ぐために、多くの患者は、それ自体患者を衰弱させてしまう化学療法および／または放射線療法も必要とする。別の欠点は、ドナーからの成熟Ｔ細胞がレシピエントの組織を異種と認識してそれらの組織を攻撃する、移植片対宿主病（GVHD）である。このケースでは、レシピエントは炎症とＴ細胞活性化を抑制するために薬剤投与を受けなければならない。興味深いことに、CCR5コレセプターが、HSC移植片の拒絶反応とHIVが宿主細胞に侵入する能力に関連付けられる。実際、HIVに耐性がある個体は、CCR5遺伝子中にCCR5-δ32と呼ばれる変異を持ち、それはHIVが細胞に感染しないようにする短縮型タンパク質を生成する。従って、両適応症について、CCR5を標的とするgRNAを有する組み換え発現系を利用することができる。非限定的例として次のgRNAが提供される：
CCR5 gRNA：GGTCCTGCCGCTGCTTGTCA
またはその生物学的同等物。
【０１７７】
癌免疫療法：癌免疫療法は、通常、抗体または操作されたＴ細胞のいずれかを使用して癌細胞に対する患者自身の免疫応答を増強することにより、癌と闘うために免疫系の構成成分を利用する。典型的には、Ｔ細胞ベースの療法は、患者からの免疫細胞の抽出に続き濃縮、編集または処置を含む。PDCD-1は、Ｔ細胞免疫応答を停止させるのに重要な役割を果たすので、それをノックアウトすると、癌細胞を排除するＴ細胞の能力を向上させることができ、これらの工作された免疫細胞を用いた処置が、進行がん患者で幾分顕著な応答を発生させた。さらに、非癌関連免疫応答もこのアプローチを用いてモジュレートすることができる。この目的のためのPDCD-1を標的とするgRNAを有する典型的組み換え発現系が本明細書に開示される。非限定的な例として次のgRNAが提供される：
PDCD-1標的配列：
1. AGCCGGCCAGTTCCAAACCC
2. AGGGCCCGGCGCAATGACAG 
またはそれの各々の生物学的同等物。
【０１７８】
シグナル伝達経路の異常活性は癌に至ることがある。例えば、結節の下方制御（ダウンレギュレーション）（TGF-βファミリーの一部、例えばUniprot Ref No. Q96S42）は、転移性黒色腫と関連付けられる分子の下方制御を引き起こし得ること、およびヘッジホッグ経路の遮断が腫瘍増殖を防止できることが証明されている。よって、組み換え発現系は、それらの経路内の標的遺伝子を下方制御するのに用いることができ、従ってそれらの標的に対して特異的なgRNAを設計することにより、癌を治療するのに用いることができる。
【０１７９】
骨髄増殖性癌の大部分は、JAK-2中にV617F変異を示す（例えば、Uniprot Ref No. О60674）。しかしながら、この変異は、あまりにその個体のHSC集団に固執しすぎるので、gRNAが本開示の範囲内でもあるHSC集団中のV617F変異を標的とすることはできない。
【０１８０】
血液疾患：マラリアの臨床症状は、プラスモジウム寄生虫の生活環の血液期の間に発症し、それらの寄生虫は赤血球内に侵入してそこを住みかとし、自身の要求に対して宿主のタンパク質や資源を利用し、宿主細胞の形質転換を引き起こす。ある種の細胞表面レセプター、例えばDuffy、グリコフォリンA/C等は、赤血球内への寄生虫の侵入に必須であることが示されている。さらに、該寄生虫は赤血球中のピルビン酸キナーゼに高度に依存する。これらの遺伝子をノックアウトすることが、マラリア原虫の侵入に対する抵抗性を付与すると考えられる。以下の非限定的例としてのgRNAsは、この目的での構築物のために提供される：
【化１５】
2019524162.tif 000027
またはその生物学的同等物。
【０１８１】
筋ジストロフィー：異常なジストロフィンが他の遺伝子の中でも、筋ジストロフィーに関連づけられている。筋ジストロフィーおよび他の神経変性疾患に使用される典型的gRNAは表１に開示される。
【０１８２】
子宮内胎児特異的ターゲティング：保因者の変異、例えば胎児の父親からの変異に対して特異的なgRNAを設計することができる。これは組み換え発現系が子宮内で（in utero）母体でなく胎児を特異的にターゲティングできるようにする。よって、胎児が母親の中に存在していない病的遺伝子型を提示するならば、それは母親のゲノムに影響を与えることなく、子宮内で解決することができるはずである。
【０１８３】
シトクロムP450系障害：シトクロムP450酵素CYP2D6（例えばUniProt Ref No. P10635）は、改変された薬物代謝と関連することが知られている。特定の母集団（例えば白人）の百分率で表されるこの酵素の多型は、コデインから鎮痛薬モルヒネへの変換を阻害する。CYP2D6の少なくとも２つの活性型または機能性型コピーがコデインの迅速かつ完全な代謝に必要とされる。CYP2D6の２つの不活性型コピーを有する患者では、組み換え発現系中に、患者のCYP2D6の少なくとも１つの活性型コピーを活性化または過剰発現するgRNAを提供すると、コデインの代謝が可能になる。
【０１８４】
特定の基質または特定の生理学的条件への曝露の存在下で、シトクロムP450類（CYP）は、活性酸素種（ROS）を生成するか、あるいは正常な代謝を破壊するまたは体内の組織を損傷する代謝物を生成し得る。CYP遺伝子の活性化または抑制を誘導することができると、薬物−薬物相互作用からの毒性だけでなく、代謝補因子の異常レベルを生む状態からの毒性も防止することができる。
【０１８５】
より一般的に言えば、次世代薬物−薬物相互作用（患者にとって有益である）を惹起するように設計された標的gRNAを使って、一貫性のない薬物応答に対処することができる。
【０１８６】
マクロファージのリプログラミング：マクロファージは、ケモカイン類とサイトカイン類により二極化される異なる亜集団を含み、最終的に免疫応答が炎症前または再生前であるかどうかに影響を及ぼす。マクロファージを標的とし、表現型を再生前状態のM2マクロファージの方に運ぶために、特異的なgRNAを組み換え発現系において使用することができる。
【０１８７】
蚊の忌避：原因は大部分未知であるようだが、蚊や他の昆虫は他の者を避けて一定の者を刺す好みがある。双生児に関する研究は、この誘引する性質に遺伝的要素があるらしいことを示したが、特定の遺伝子はまだ未知である。蚊を誘引する作用に影響する別の因子は、ある個体に蚊を忌避する物質を産生させる遺伝子を改変しうるgRNAを選択することを通して、組み換え発現系が、病気を保有する昆虫がいることが分かっている地域を訪れる人々に対して期間保護を提供することができる。蚊に対して防御することができる、骨髄中のHSCを標的とするgRNAもまた、本開示の範囲内である。
【０１８８】
アルツハイマー病：研究者らは、LilrB2（例えばUniProt Ref No. Q8N423）へのβ−アミロイドの結合がアルツハイマーに至る最初の段階の１つであることを示した。よって、gRNAが組み換え発現系における使用のために想定され、それは次いで、B-アミロイド結合に影響を与えてアルツハイマーの発症を防ぐことができるような、LilrB2のD1D2領域中に点変異を引き起こすことができる。D1はUniprot Ref No. P21728に関連する。D2は、Uniprot Ref No. 14416に関連する。それらの非限定的な典型配列を下記に提供する：
【０１８９】
【表１１】
2019524162.tif 000028
【表１２】
2019524162.tif 000029
【０１９０】
甲状腺ホルモンの産生：甲状腺疾患（甲状腺機能亢進症と機能低下症の両方）は、人口の大きな部分を冒す。甲状腺ホルモンの調節を可能にし、これらの疾患の治療または予防をもたらす、組み換え発現系での使用のためにgRNAsが選択される。
〔エフェクター要素の順序〕
【０１９１】
本明細書に開示されるエフェクター要素は、例えばsplit-Cas9システムのような本開示の組み換え発現系における２つのベクターの各々の中の利用可能なスペースに応じて様々な方法で構成され得ることを理解すべきである。さらに、本明細書に開示されるエフェクター要素は、所望により全長Cas9タンパク質をコードする１つのベクターと、CRISPRベースのゲノムまたはエピゲノム編集用の必要なgRNAをコードするもう１つのベクターを含んで成るCas9システムにおいて使用してもよいことが分かる。図５は、この形式で使用されるmiRNA回路の典型的概略図を提供する。図面は、本明細書中で開示される様々なエフェクター要素の非限定的概略図と該エフェクター要素の順序を提供する。
【０１９２】
例えば、活性化に用いられるエフェクター要素（例えばVP64、RTA、P65）、抑制に用いられる同要素（例えばKRAB）、および／またはメチル化の改変に用いられる同要素（例えばDNMT3A、DNMT3L）は、組み換え発現系（例えばsplit-Cas9システム）の第一の発現ベクターまたは第二の発現ベクターのいずれにも配置することができる。
【０１９３】
TREとtet-調節性活性化因子は、組み換え発現系中の二つの異なるベクターにおいてコードされなければならない。いくつかの実施態様では、tet-調節性活性化因子がN-Cas9解読ベクター上にコードされ、そしてTREがC-Cas9解読ベクター上にコードされる。ある態様では、TREがN-Cas9解読ベクター上にコードされ、そしてtet-調節性要素がC-Cas9解読ベクター上にコードされるという風に逆であってもよい。
【０１９４】
プロモーターの配置も本開示の構築物において考慮すべき事項である。１つの観点では、gRNAを含む構築物は、その上流にコードされるプロモーター、任意にU6プロモーターを有する。同様に、Cas9またはsplit-Cas9の２分割の片方を含む構成物は、その上流にコードされるプロモーター、任意にCMVプロモーターを有する。
〔カプシドの遺伝子操作〕
【０１９５】
本開示の態様は、好ましい特徴を付与するように、例えば非限定的に、１以上の非天然アミノ酸および／またはSpyTag配列もしくは対応するKTag配列の付加を提供するように工作されたウイルスカプシドに関する。ある態様では、ウイルスカプシドがAAVカプシドまたはレンチウイルスカプシドである。
【０１９６】
１以上の非天然アミノ酸、SpyTag配列またはKTag配列を組み込むようにカプシド上の様々な部位を改変することができる。ある態様では、表面に暴露された部位が、１以上の非天然アミノ酸、SpyTag配列またはKTag配列の組み込みに適した部位として同定される。AAV2カプシド中のそのような部位の非限定例は、AAV2中のVP1の残基447、578、87および662である。ある態様では、１以上の非天然アミノ酸、SpyTag配列またはKTag配列の組み込み用の部位が、AAV機能を含まないものである。AAV2に関しては、所定の表面残基が会合を完成すること（例えば残基509−522および561−565）、HSPG結合を付与すること（例えば586−591、484、487およびK532）が知られている。残基138と139は表面に暴露され、AAV2カプシド中に含まれるVP2のＮ末端に見つかる15アミノ酸までを第139, 161, 459, 584および587位に挿入することができる。
【０１９７】
非天然アミノ酸（「UAA」または「非標準アミノ酸」とも称される）は、天然に存在してもよく化学的に合成されてもよいが生来の真核生物または原核生物タンパク質合成に利用される22個の標準アミノ酸の１つではないアミノ酸である。そのようなものの非限定例は、βアミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換されたフェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖状コアアミノ酸、並びにN-メチルアミノ酸が挙げられる。非限定的な非天然アミノ酸は記載されており、Sigma Aldrich社から商業的に入手可能である (sigmaaldrich.com/chemistry/chemistry-products.html?TablePage=16274965) 。更なる非限定例としては、N-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジン、ピロリジンおよび他のリジン誘導体が挙げられる。
【０１９８】
ある態様では、非天然アミノ酸がアジドまたはアルキンを含む。非天然アミノ酸中に含まれる官能基の選択は、追加の成分をウイルスカプシドに付加するためのクリックケミストリーの利用を容易にすることができる。例えば、アジド−アルキン付加は、追加の官能基をアミノ酸上に組み込むための単純な方法である。
【０１９９】
ある態様では、非天然アミノ酸が荷電もしくは非荷電のまたは極性もしくは非極性のアミノ酸である。ある態様では、非天然アミノ酸が高度に負にまたは正に帯電している。非天然アミノ酸の電荷と極性の選択は、ウイルスカプシドを使用して処理されるべき次の工程に依存する。例えば、ウイルスカプシドがリポフェクタミンで被包（封入）されるならば、高度に負に帯電した非天然アミノ酸が望ましいかもしれない。
【０２００】
タンパク質中への非天然アミノ酸の組み込み方法は当技術分野で既知であり、例として配置転換された終止コドン、例えばアンバー変異抑制を利用する、直交性翻訳システムの使用が挙げられる。そのような付加を達成するための直交tRNAシンセターゼの非限定例はMbPylRS、MmPylRSおよびAcKRSを包含するが、それに限定されない。非天然アミノ酸の組み込みは、追加の薬剤の使用により更に増強してもよい。非限定例はeTF1であり、その典型的配列を下記に提供する：
【化１６】
2019524162.tif 000030
【０２０１】
同様の方法を用いて、ウイルスカプシド上にSpyTagまたはKTagを組み込んでもよい。SpyTagは既知配列AHIVMVDAYKPTKであり、それは対応するKTag配列ATHIKFSKRDと対合し、SpyLigase（AddGene社から市販されておりGenBank Ref No. KJ401122酵素と関連する）の存在下で、場合によっては自然に、連結する。
【０２０２】
AAV2およびAAV-DJからの下記AAV配列は、非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTag配列を組み込むことができる典型的な位置を提供する。
【化１７】
2019524162.tif 000031
【化１８】
2019524162.tif 000032
特に断らない限り、AAV2またはAAV-DJ VP1配列中のアミノ酸位置への言及は、上記の開示配列中の残基の位置に基づく。各AAVのVP1が言及される場合、それの生物学的同等物も包含するつもりである。
【０２０３】
いくつかの実施態様では、カプシドに組み込まれた１以上の非天然アミノ酸、SpyTagまたはKTagは、追加の成分を導入するまたはカプシドの表面を「シュードタイプ（偽型）化する」ために使用される。そのような成分としては、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、アフィボディ、DARPin、Kunitzドメイン、フィノマー、二環式ペプチド、アンチカリン、およびアドネクチンが挙げられるがそれらに限定されない。種々の成分は、ウイルスの単離、ウイルスと別のウイルスとの連結、および／または特定の標的細胞、臓器もしくは組織へのウイルスのホーミングをはじめとする、多数の機能に有用であるだろう。
【０２０４】
このようなシュードタイピングはクリックケミストリーを介して達成することができる。SpyTagがカプシドに組み込まれる場合、クリックケミストリーは、シュードタイプ化すべき成分にKTagを接合することを伴う。SpyTagのKTagへの連結を促進する反応を適用することによって（例えばSpyLigaseの導入を通して）、該成分がカプシドの表面に付加される。そのようなシュードタイピングのための配列の非限定例は、双方とも疼痛管理におけるニューロンホーミングのための剤であるサブスタンスＰやRVGに結合されたKTagである。
KTag−サブスタンスＰ：ATHIKFSKRD GSGSGS RPKPQQFFGLM
サブスタンスＰ−KTag：RPKPQQFFGLM GSGSGS ATHIKFSKRD
RVG−KTag：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG GGK GGGSGSGS ATHIKFSKRD
KTag−RVG：ATHIKFSKRD GSGSGS GGK GG YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG
またはそれの生物学的同等物。
【０２０５】
上記典型的な実施態様は、カプシド上へのSpyTagの使用および該成分上へのKTagの使用を示しているが、KTagをカプシド中に組み込みSpyTagを該成分上に結合させるといった逆も実施することができる。非天然アミノ酸に関しては、アジド−アルキン反応（この反応は場合により銅により触媒される）を使って、成分を対応する官能基に付加することができる（例えば非天然アミノ酸がアジドを含み、該成分がアルキンを含む、逆もまた可）。
【０２０６】
ある実施態様では、操作されたカプシドを、共同送達のためにウイルスに連結させることができる。そのような連結は特に、本明細書に開示されるような、Cas9がsplit-Cas9としてコードされる、即ち２つのベクター中にコードされる組み換え発現系の送達に有用である。例えば、一方のカプシドがSpyTagを含み、他方がKTagを含んでもよい；かくして、ウイルスはSpyTagのKTagへの連結を触媒することにより連結されうる。同様に、アジド−アルキン反応を用いてウイルスの連結を促進してもよく、その場合は、一方がアジド含有非天然アミノ酸を含み、他方がアルキン含有非天然アミノ酸を含む。ウイルスの連結の更なる実施態様は、２つのウイルスが互いにハイブリダイズする成分を発現するか、または自発的にもしくは触媒反応を通して連結されうる、１つ以上のシュードタイプ化成分を使って開発することができる。
【０２０７】
更なる態様では、カプシドは免疫遮蔽のために操作されてもよい。AAVのようなウイルスカプシドへの広汎な暴露は、多数の天然ウイルス血清型に対する中和抗体を持つ患者を誘導した。ある態様では、該カプシドは欠失またはシャフリングを通してその免疫系を改変しうる。ある場合には、カプシドはエクソソームと関連しうる。ある態様では、免疫遮蔽のため、特別な試薬がカプシドに組み込まれるかまたはカプシドを被包するのに用いられる。例えば、ポリ（酪酸−コ−グリコール酸）、PEG、VSVG被包、および／または脂質／アミン（例えばリポフェクタミン）被包のようなポリマーの付加を使用することができる。
【０２０８】
免疫遮蔽の非限定例は、リポフェクタミン被包である。例えば、アルキン−オリゴヌクレオチドを非天然アミノ酸含有カプシドに連結させることができる。次いで改変されたウイルスをリポフェクタミンを使って洗浄し、次いで被包を形成させる。
【０２０９】
特定の組織をターゲティングすることに着目して該カプシドに更なる改変を行ってもよい。上述したように、「ホーミング」成分は、特定の標的細胞、臓器または組織に対する該カプシドの局在化を確実にするためのシュードタイピングに利用することができる。
【０２１０】
カプシドを特定の方法の態様に適するようにすることが当業界で知られている、更なる改変をカプシドに実施することができる。そのような方法の例としては、非限定的に次の米国特許中に記載されているものが挙げられる：
米国特許第7,867,484; 7,892,809; 9,012,224; 8,632,764; 9,409,953; 9,402,921; 9,186,419; 8,889,641; 7,790,154; 7,465,583; 7,923,436; 7,301,898; 7,172,893; 7,071,172; 8,784,799; 7,235,235; 6,541,010; 6,531,135; 6,531,235; 5,792,462; 6,982,082; 6,008,035; 5,792,462; 9,617,561; 9,593,346; 9,587,250; 9,567,607; 9,493,788; 9,382,551; 9,359,618; 9,315,825; 9,217,159; 9,206,238; 9,198,984; 9,163,260; 9,133,483; 8,999,678; 8,962,332; 8,962,233; 8,940,290; 8,906,675; 8,846,031; 8,834,863; 8,685,387; 米国特許公開公報第2016/120960; 2017/0096646; 2017/0081392; 2017/0051259; 2017/0043035; 2017/0028082; 2017/0021037; 2017/0000904; 2016/0271192; 2016/0244783; 2916/0102295; 2016/0097040; 2016/0083748; 2016/0083749; 2016/0051603; 2016/0040137; 2016/0000887; 2015/0352203; 2015/0315612; 2015/0230430; 2015/0159173; 2014/0271550, および、それらの特許および特許刊行物に関連したファミリーメンバー、またはそれらの譲渡人もしくは発明者に関連するもの。
〔組合せおよび方法〕
【０２１１】
本明細書中に開示される態様は、限定されないが、１以上の非天然アミノ酸および／またはSpyTag配列もしくは対応するKTag配列の単独でのまたは互いに組み合わせた形での、例えば組成物の形での付加といった、望ましい特徴を付与するように工作されたウイルスカプシドの使用に関する。
【０２１２】
例えば、本明細書に開示される組み換え発現系に含まれる２つのベクターは、各々、１以上の非天然アミノ酸、SpyTag配列またはKTag配列を組み込むように操作されたウイルスカプシド中にパッケージングすることができる。あるいは、該ベクターのうちの１つ以上を未改変のウイルスカプシド中にパッケージングすることができる。
【０２１３】
ベクターの組み合わせは、上述したような利点、特にsplit-Cas9システムの２部分を連結させて両ベクターの送達を確実にする能力、を提供する。更に、ウイルスカプシドがシュードタイプ化される態様では、ホーミング成分の使用により組織特異的送達を達成することができる。
【０２１４】
ある態様では、組み換え発現系、本開示のように操作されたウイルスカプシド、および／または、split-Cas9システムを含む２つのベクターが本明細書に開示されるように操作された２つのウイルスカプシド中に含まれるような組み換え発現系を、被験体に送達することができる。ある態様では、経路および用量は処置すべき被験体または状態に基づいて決定されるだろう。
【０２１５】
限定されないが疼痛管理、肝疾患、HSC療法、HIV、癌の免疫療法、血液疾患、筋ジストロフィー、子宮内胎児ターゲティング、シトクロムp450ベースの疾患、マクロファージのリプログラミング、蚊の忌避、アルツハイマー病、および甲状腺ホルモン産生をはじめとする特定の用途に合うように仕立てられたgRNAが本明細書に開示される。この組み換え発現系に用いられる並びにウイルスカプシドのシュードタイピングに用いられるエフェクター要素は、それらの用途の各々に合わせて最適化することができる。
【０２１６】
例えば、疼痛管理には、上記に開示されたホーミングペプチドが、ウイルスカプシドをニューロンを標的できるようにし、それにより組織特異性を付与することができる。そのような組織特異性を伝える更なる態様としては、非限定的に、組み換え発現系におけるニューロンに特異的なmiRNA回路の使用および／または具体的に開示されたgRNAの使用が挙げられる。
【０２１７】
癌の免疫療法における別の例は、シグナル伝達経路の制御である。その経路のうちのごく少数だけが全身での遺伝子発現を調節するので、この用途においては組織特異性が重要である。
組織特異的促進物質であるmiRNA回路の使用、およびウイルスカプシド中の標的の癌に特異的なホーミングペプチドの組み込みは、処置が確実に所望の標的中の遺伝子だけに作用するようにすることができる。
【０２１８】
HSC療法およびHSCに関与する血液疾患に関して、出願人は、送達の経路が重要であり、従って、ウイルスin situ送達またはin vivo導入、例えば本開示の組み換え発現系または組成物を、骨髄（造血幹細胞（HSC）の貯蔵所である）または胸腺（Ｔ細胞が成熟する所）中に直接注入することを提案する。同様な骨髄送達を、例えばPDCD-1標的gRNAを使って免疫疾患のためにおよび／または癌治療のために、in situまたはin vivo Ｔ細胞編集および／またはHSC編集に利用することができる。HSCおよび／またはＴ細胞は、組織特異的gRNAまたは別のエフェクター要素の選択に基づいて特異的に編集することができ；それにより、免疫疾患を治療または予防することができる。このin situまたはin vivoアプローチは、細胞（例えばHSCおよびＴ細胞）のex vivo（生体外）改変と移植に高度に依存する現存の治療法よりも効果的なアプローチであると思われ、HSC移植またはＴ細胞移植の高い実現性に関連付けられる。更に、in situまたはin vivo送達は、そのような細胞療法のコストを削減する大きな可能性を秘めている。
【０２１９】
あるいは、HSCおよび／またはＴ細胞に関連する上記のおよび癌関連の実施態様において、患者のHSCおよび／またはＴ細胞をex vivo（生体外）で改変しそして患者に送達する（例えば骨髄への直接注射により）ことができる。次いで改変された細胞をin vivoで増殖させることができる。ある実施態様では、該疾患の原因である細胞の既存集団を排除した後、それらの改変細胞を患者に投与する。
【０２２０】
甲状腺関連の実施態様では、時間的調節を有するdCas9システムおよび場合により甲状腺へのホーミング用に改変されたウイルスカプシドを利用することができる。
【０２２１】
更なる方法の態様は、組み換え発現系および／またはヒドロゲルを使用するウイルスカプシドの送達を含んでもよい。ヒドロゲルは生体内の薬物送達用生体材料として使用されている。一定の条件下での薬剤の取り込みと放出を最適化することは、従来より広く研究されている。ヒドロゲル放出特性をチューニングすることで、個別のpHレベル、温度または生理学的条件に従って、特定の組み換え発現系および／またはウイルスカプシドの特異的送達を制御することができる。例えば、組み換え発現系および／またはウイルスカプシドは、例えば組み換え発現系および／またはウイルスカプシドを低pHレベルで放出するようにチューニングすることにより、炎症領域に送達することができる。更にそして理論に縛られずに、最適化されたヒドロゲルは、所定の位置に、組み換え発現系および／またはウイルスカプシドを保持し、かつ非特異的なターゲティングの防止、すなわち被験者に望ましくない副作用からの保護をより多く提供することができる。この送達系は、組み換え発現系および／またはウイルスカプシドの特異性を増加させることができる。
【０２２２】
split-Cas9システムを用いる方法では、Cas9の２分割の部分の力価が等しいことは、機能的Cas9が送達時に確実に生成されるようにするために重要である。これは、２つのベクターを含むウイルスカプシドを組み合わせる（ペアリングする）ことによりおよび／または該ベクターの各々の中のユニーク領域を標的とするためにqPCRを利用し、力価対照（例えばATCC-VR-1616）に相対して各ベクターの力価を決定することにより、確実にすることができる。
【０２２３】
方法の態様はまた、生体適合性をテストするために本発明のウイルスカプシドを使用する方法が想定される。材料の生体適合性をテストするための１つの一般的な方法は、動物モデルを使用しそして組織学と免疫組織化学を実施して各組織に存在する細胞を特徴付けることである。高価であることに加えて、この方法は時間と労力集約的であり、かつ定量することが困難である。一つの可能な代替法は、TK-GFPをパッケージ化しているウイルスカプシドを着目の領域に導入することであろう。TK-GFP AAVを貧食する（食菌する）マクロファージは、次いで発光しレポーター遺伝子を発現させるだろう。ＢおよびＴ細胞上の細胞表面受容体を利用することで、TK-GFP AAVによる形質導入を可能にし、in vivoでリンパ球を定量することができる。マクロファージ貧食作用を促進するか、リンパ球特異的細胞受容体を操作することにより、先天的および／または後天性免疫応答の定量化が可能になるであろう。最終的に、生体材料の試験が、より効率的でかつ利用しやすくなるだろう。
【０２２４】
本発明の使用に適当な用量は、任意の適切な経路、例えば静脈内、経皮、鼻腔内、経口、粘膜、または他の送達方法を介して、および／または単回もしくは複数回投与を介して送達することができる。実際の用量は、使用する組み換え発現系（例えばAAVまたはレンチウイルス）、標的細胞、臓器もしくは組織、被検者並びに求める効果の程度に依存して変化し得ることが理解される。組織、臓器および／または患者のサイズと重量も投薬に影響を及ぼし得る。用量は、追加の薬剤、例えば非限定的に担体を更に含んでもよい。適当な担体の非限定例は当該技術分野で既知である；例えば、水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、ショ糖、デキストラン、寒天、ペクチン、植物性油、リン酸塩緩衝塩溶液、および／または希釈剤。追加の材料、例えばWO 2017/070605の段落[00533]に開示されているものが、本明細書に開示される組成物での使用に適当であるだろう。WO 2017/070605の段階[00534]から[00537]も、本発明において使用できるCRISPR-Casシステムのための投薬規定の非限定例を提供する。一般的に、投薬の考慮事項は当業者に十分理解されている。
【実施例】
【０２２５】
以下の実施例は、本開示を実際に実施する上での様々な場合に使用できる非限定的かつ例示的な手順である。更に、本明細書の下記に開示される全ての参考文献は、その全内容が参考として援用される。
実施例１―典型的なモジュラーAAVシステムの作製
ベクターの設計と構築
【０２２６】
簡潔には、注文合成したrAAV2ベクター骨格への対応する遺伝子ブロック（Integrated DNA Technologies）の連続的組み立てにより、い-Cas9 mAAVベクターを作製した。UAA実験用に、表面残基R447、S578、N587およびS662をコードするヌクレオチドの代わりに「TAG」が挿入された４つの遺伝子ブロックを合成し、それをGibsonアセンブリを使ってpAAV-RC2ベクター（Cell Biolabs）中に挿入した。ETF1-E55Dについては、タンパク質配列をコードする遺伝子ブロックを合成し、GibsonアセンブリによりCAGプロモーターの下流にそれを挿入した。
哺乳類細胞培養
【０２２７】
HEK293T細胞を37℃、5％CO2雰囲気のインキュベータ中で、10％FBSと１％Antibiotic-Antimycotic（抗生剤−抗真菌剤）（ThermoFisher Scientific社）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（10％）中で増殖させ、そしてAAV形質導入用に24ウェルプレートに播種した。pAAV誘導性Cas9ベクターでトランスフェクトした293T細胞に、200μg/mLのドキシサイクリンを補給した。CD34を発現している造血幹細胞（CD34+細胞）を、StemSpanTM（商標）CD34+増殖用サプリメント（10×）が補足された無血清StemSpanTM（商標）SFEMII培地中で増殖させた（全てStemCell Technologies社より）。CD34+細胞を、AAV形質導入用に96ウェルプレートに播種した。
AAVウイルスの生産
【０２２８】
AAV8ウイルスを全てのin vivo研究に使用し、AAVDJをHEK293T細胞中での全てのin vitro研究に使用し、AAV6をCD34+細胞におけるex vivo研究に使用し、そしてAAV2をUAA取り込み研究に使用した。
【０２２９】
大規模生産：ウイルスは、Salk Institute of Biological Studies (La Jolla, CA)での遺伝子導入、ターゲティングおよび治療（gT3）コアによるかまたは当社内のいずれかで調製した。簡潔には、AAV2/8、AAV2/2、AAV2/6、AAV2/DJウイルス粒子を、7.5μｇのpXR-カプシド（pXR-8、pXR-2、pXR-6、pXR-DJ）、7.5μgの組み換え転移ベクター、および22.5μgのpAd5ヘルパーベクターによりトランスフェクトされたHEK293細胞を使用し、15 cmのプレート中で80〜90％周密度にまで生産させた。72時間後、ウイルスを収得し、イオジキサノール勾配を使って精製した。該ウイルスを、100 kDaフィルター（Millipore）を使って〜1 mLの最終容積に濃縮し、標準（ATCC VR-1616）に対するITR領域に特異的なプライマーを使ったqPCRにより定量した。
【０２３０】
AAV-ITR-F: 5’-CGGCCTCAGTGAGCGA-3’ および
【０２３１】
AAV-ITR-R: 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’。
【０２３２】
UAA組み込み：トランスフェクションの２時間前から収穫まで、0.4 mMリジン（DMEM中に通常存在する0.8 mMリジンとは異なる）を含有しかつ10％FBSと2 mM N-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンが補足されたDMEM培地中で、293T細胞を増殖させた。ピロリジル−tRNAとtRNAシンセターゼを含有するプラスミドpAcBacl.tR4-MbPyl（ピーター・シュルツ氏より提供、Addgene #50832）を、コスミドベクターpAAV-RC2（およびその変異体）、組み換え導入用ベクター、および前記カプシドベクターに対して5：1の比でのpAd5ヘルパーベクターにより、293T細胞に同時トランスフェクトした。ウイルスの収得、精製および定量については上記と同じプロトコルに従って行った。機能的活性を更に定量するために、形質導入の48時間後にUAA AAVのフローサイトメトリー分析を実施し、そしてFACSCan Flow CytmeterとCell Questソフトウェア（双方ともBecton Dickinson社）を用いて20,000個の細胞を分析した。
【０２３３】
小規模生産：小規模AAVプレップは、HEK293T細胞を含む６ウェルプレートを用い、PEIを使って0.5μgのpXR-カプシド、0.5μgの組み換え導入用ベクター、および1.5μgのpAd5ヘルパーベクターにより該細胞を同時トランスフェクトすることにより調製した。72時間後に該細胞と上清を収得し、粗製抽出物を細胞に形質導入するために使用した。
動物実験 
【０２３４】
AAV注射：全ての動物実験は、サンディエゴ州カリフォルニア大学の実験動物委員会（Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC）により承認されたプロトコルに従って実施した。全てのマウスはJackson Labs社から取得した。成体C57BL/6Jマウス（10週齢）では尾静脈注射により、または新生児マウス（４週齢）ではIP注射を介して、0.5E+12-1E+12を使ってAAV注射を実施した。注射後４週目に、マウスをC02により人道的に犠牲にした。組織を採取し、RNAlater安定化溶液（ThermoFisher Scientific社）中で凍結した。
【０２３５】
ドキシサイクリン投与：pAAV誘導性Cas9ベクターを用いて形質導入したマウスに、４週間に渡り週３回、0.4 mlのHC1を含む0.9％ NaCl 10 mL中の200 mgドキシサイクリンのIP注射を行った。
【０２３６】
組織学：マウスをC02により人道的に犠牲にした。OCT化合物（VWR）を含む金型中で肝臓を凍結し、ドライアイス／2-メチルブタンスラリー中で凍結させた。組織学は、Moors Cancer Center Histology and Imaging Core Facility（La Jolla, CA）により実施した。肝臓片を病理学用ヘマトキシリンとエオシン（H&E）および抗CD81（BD Biosciences, No. 562240）で染色した。
ゲノムDNA抽出およびNGSプレップ
【０２３７】
細胞および組織からのgDNAを、製造業者のプロトコルに従って、DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）を使って抽出した。次のように次世代シーケンシングライブラリーを調製した。簡単に言えば、4〜10μgのインプットgDNAを、KAPA HifiホットスタートPCRミックス（Kapa Biosystems）を用いて、着目の部位を取り囲む150 bp（表２ｂ）を増幅させるプライマーを使ったPCRにより増幅させた。PCR生成物をゲル精製し（Qiagenゲル抽出キット）、更にPCR精製し（Qiagen PCR精製キット）副産物を除去した。Illuminaキット用のNEBNext Multiplex Oligo (NEB)を使ってライブラリーを作製した。10〜25 ngのインプットDNAを、インデックス作成用プライマーを使って増幅させた。次いでqPCRライブラリー定量キット（Kapa Biosystems, KK4824）を使ってサンプルを精製し定量した。次いで、サンプルをプールし、Illumina Miseq上に4 nM濃度でロードした（150 bpペアエンド法または150シングルエンド法）。データ解析は、CRISPRゲノムアナライザー44を用いて実施した。
遺伝子発現解析およびqRT-PCR
【０２３８】
細胞からのRNAを、RNeasyキット（Qiagen）を使って抽出し、組織からのはRNeasy PlusUniversalキット（Qiagen）を用いて抽出した。Protoscript II逆転写酵素キット（NEB）を使って1 μｇのRNAを逆転写した。KAPA SYBR Fast qpcrキット（Kapa Biosystems）を用い、遺伝子特異的プライマー（表２a）を使ってリアルタイムPCR（qPCR）を実行した。データをGAPDHまたはβ-アクチンに対して正規化した。
AAVシュードタイピング
【０２３９】
Alexa 594 DIBOアルキンテザリング（係留）：AAV2野生型およびAAV2-S578UAAを室温で１時間、TBS中のAlexa 594 DIBOアルキン（双方ともサーモサイエンティフィック社）と共にインキュベートした。過剰の標識をPBSで洗い流した。ウイルス粒子を293T細胞に添加し、細胞を形質導入の２時間後に画像診断した。
【０２４０】
オリゴヌクレオチドテザリング及びDNAアレイ：オリゴＡ’およびＢ’(5μM）をストレプトアビジン官能化アレイ（ArrayIt：SMSFM48）上にスポットし、30分間45室温でインキュベートした。その間に、オリゴＡをクリックケミストリーのプロセス（Click-iT: ThermoFisher Scientific, C10276）によりAAV2-N587UAA_mCherryに連結させ、次いでPBSで洗浄した。次に、該アレイをPBSで洗浄し、各ウェルに改変AAV2-N587UAA_mCherryを添加し、室温で30分間インキュベートし、次いでPBSで洗浄した。最後に、各ウェルに293T細胞を添加した。形質導入の48時間後に、mCherry発現について細胞を画像診断した。
考察 
【０２４１】
例示的なプラットフォームは、コア送達剤としてアデノ随伴ウイルス（AAV）を使って構築される。AAVは、軽度の免疫応答、長期的な導入遺伝子発現、細胞の広範囲に感染能力、および有益な安全性プロファイルのために、遺伝子導入用に非常に好ましい。しかしながら、AAVは限定されたパッケージング容量（〜4.7 kb）を有し、それが大きなCas9様エフェクタータンパク質およびその融合体、更には有効な遺伝子やガイドRNAの発現に必要な成分をその中に組み込むのを難しくしている。かくして出願人は、この制限を回避するためにsplit-Cas9システムを活用した。出願人の送達形式では、スラフィロコッカス・ピロゲネス（Staphyrococcus pyrogenes）Cas9 (SpCas9)タンパク質を、藍藻N.punctiforme由来の分割インテインを使うことによって半分に分割し、それによりCas9半部分の各々がそれの対応する分割インテイン成分に融合され、同時発現させた時に全長Cas9タンパク質が再構成される。この送達形式は２つのrAAVを使用し、そして対応するベクターを適当に設計することによって、得られた残りのパッケージング容量を活用して、フルレンジ（あらゆる種類）のCRISPR-Casゲノム工作機能を可能にする（図16）。
【０２４２】
in vitroおよびin vivo計画において一定範囲の細胞型とゲノム遺伝子座に渡り標的ゲノム編集を確認した。特に、ヒトCD34+造血幹細胞でロバストなAAV6媒介編集が証明された。ヒットと実行アプローチは、ゲノム編集に十分で、実際に長期的ヌクレアーゼ発現にに望ましいので、次にCRISPR-Cas編集活性の小分子制御を可能にするために合成回路の組み込みを工作した。ここで、１つのrAAV構築物は、C-インテイン-C-Cas9融合体の上流にテトラサイクリン応答要素（TRE）を有する最小CMVプロモーターを有するように設計され、そして第二のrAAV構成物では、N-インテイン-N-Cas9融合体とtet-調節可能活性化因子（tetA）の発現を指令するのに完全プロモーターを使用した。ドキシサイクリンの存在下で、tetAはTRE部位に結合してC-Cas9の誘導性発現を可能にし、それによりゲノム編集の一過性調節を可能にする。In vitroとin vivo計画の両方においてこの回路の機能を実証した（図16ｃ）。総合すると、上記のシステムは、ロバストなCRISPR-Cas9ベースのゲノム編集を実行可能にし、そしてtet-調節因子のカップリングにより、AAVからの他の方法では永続的な（変わらない）遺伝子発現の容易な制御ができるようになる。
【０２４３】
次に、KRABドメインの融合を介して標的とするゲノム抑制を操作するために、およびVP64 cum RTAドメインの融合を介して標的とするゲノム活性化を操作するために、dead split-Cas9タンパク質を利用した（図16ｄ）。In vitro実験はAAVDJを使ってHEK293T細胞中で行い、in vivo実験は、10週齢のC57BL/6Jマウスにおいて、AAV8血清型のマウス１匹当たり0.5E12-1E12 AAV8粒子の力価で尾静脈注射を介してAAV送達を行った。形質導入後４週目にマウスを分析した。In vitroとin vivo計画の双方においてかつ多数のゲノム遺伝子座に渡って、RNAおよび免疫蛍光に基づくタンパク質発現により分析すると、標的とされた遺伝子抑制と活性化が確認された（図16ｅ〜ｊ、図18）。特に、CD81遺伝子座において〜80％のin vivo抑制を達成することができ（ｎ＝４）、Afp遺伝子座では＞２倍のin vivo活性化を達成することができた（ｎ＝４）。よってこのシステムは、遺伝子発現の微細な制御方法への道を開き、in vivoゲノム工学用途のための傷跡のない（scarless）アプローチを提供する。
【０２４４】
AAVへのCRISPRエフェクター組み込みにおけるプログラム可能性（プログラマビリティ）の樹立により、次にカプシドシュードタイピングにおける簡便なプログラム可能性を有効にすることに関心を向けた。AAVカプシドタンパク質は、典型的には（力価または機能の著しい損失なしに）大きなペプチドまたは生体分子の挿入に対し柔軟性がない。よって、カプシド修飾を容易にするために、バイオ直交性クリックケミストリー系ハンドルの非天然アミノ酸（UAA）媒介組み込みを利用することによってこの制限を回避する、新規でかつ多目的なアプローチを開発した。まず、AAV2表面上のアクセス可能なアミノ酸部位をコンピューターマッピングし、潜在的な候補部位としてR447、N587、S578およびS662におけるそれらの評価に焦点を当てた（図17B）。着目のUAAは、AAV VP1タンパク質中の対応するアミノ酸位置の所の配置転換されたナンセンスコドン（TAG）により遺伝的にコードされ、直交性UAA特異的tRNA／アミノアシルtRNAシンセターゼ（tRNA /aaRS）ペアを使って、そのUAAをカプシド中に同時翻訳的に組み込んだ（図17A、図19）。それ故にアジドで修飾されたリジンベースのアミノ酸であるN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンをAAV2カプシド表面上に好結果に組み込むことができ、最高の相対生産力価およびウイルス活性を示すことができた（図17C）。
【０２４５】
次に、２つの独立したシュードタイピング実験を介したUAA組み込みにより可能になった簡易型カプシド工作を示す：１つ目は蛍光分子Alexa 594 DIBIOアルキンをウイルス上に結合させるクリックケミストリー反応を実施し、そして細胞の形質導入を通して、改変された蛍光ウイルスをうまく可視化した。２つ目は、クリックケミストリーを介して、AAV表面上にアルキンタグ付オリゴヌクレオチドをつなぎ止め、それらの表面上で培養された細胞の形質導入によるエビデンスとして、対応する相補的オリゴヌクレオチドを有するDNAアレイスポット上の選択的捕捉を証明した。最後に、これらUAA改変AAVは、split-Cas9ベースのゲノム工学ペイロードを組み込むことができること（図17ｆ）およびロバストなゲノム編集を実施することができること（図17ｇ）を確証し、かくして統合されたmAAV送達プラットフォームを樹立することができた。
【０２４６】
まとめると、出願人のアプローチは、Cas9およびdCas9ベースのエフェクターを使って内因性遺伝子の発現を編集し制御し、更にそれらの表面上へのUAAの組み込みによってAAVシュードタイピングを用意する、簡便でかつ単純な方法を提供する。このシステムは、限定されたcargo容量（〜4.7 kb）のために、所望のゲノム工学応用（ゲノム編集や制御を含む）を実施するのに最適である、split-Cas9システムの利用をはじめとする幾つかの利点がある。加えて、このシステムの別の利点は、着目の所望のアクセサリー要素を用いて、高レベルのin vivo転写抑制（〜80％）（図16ｇ、16ｊ）およびin vivo転写活性化（＞2倍増加）（図16ｉ）を達成できることである。更に、出願人は、このシステムを使ってHEK293Tにおいてin vitroで、CD34+ HSC細胞においてin vitroで、およびC57BL/6Jマウスにおいてin vivoで、編集できることを示す。CD34+ HSC細胞をターゲティングする際の高い治療価値を考えると、それらの全てのAAVシステムがこれらの細胞のための多目的な送達剤を開発する上での有力なリソースを提供しうると考えられる。重要であるのは、Cas9ヌクレアーゼの発現を制限する誘導性の合成スイッチを用いてゲノム編集全体を時間的に制御すること、従って高い治療価値のものとなることを証明する（図16ｃ、16ｄ）。このmAAVシステムは、クリックケミストリーのプロセスを介してカプシド表面へのアプタマーの容易でかつ迅速な付加も可能にする。この事実は、AAV標的細胞型特異性を系統的に工作するため、並びに細胞へのAAV形質導入の基礎生物学を研究するための双方に、カプシド表面のプログラム可能なシュードタイピングの機会を宿主に与える。それらのベクターは、指向進化、分子シャフリングおよび進化系統分析に基づいたもののような新規AAVベクターを工作するための別の方策を補足し、更にアプタマーの系統的評価に基づいたモジュラー部品およびAAV活性をモジュレートするための別の成分を可能にするだろう。出願人は、mAAVシステムの幾つかの潜在的制限も注目する：１つ目は、split-Cas9システムの使用は、Cas9活性を回復するにはC-Cas9とN-Cas9の両成分が着目の標的細胞へ同時送達されなければならないために、ターゲティング効率を減少させてしまうだろう。２つ目は、UAAによる該カプシドの改変がウイルス力価を1.5〜５倍低下させる。局所化された組織特異的送達技術の改善およびAAV生産パラメーターの最適化により、上記のような局面は着実に対処されるだろう。CRISPRエフェクター取り込みおよびカプシドシュードタイピングにおける容易なプログラム可能性を通して、それらの多目的mAAV合成送達プラットフォームが、基礎化学および療法適用において広範なユーティリティ（有用性）を有するであろう。
実施例２−AAV2カプシド上への非天然アミノ酸の付加
【０２４７】
以下はプロトコールの概要である：
【０２４８】
１．非標準アミノ酸組み込みの試験
【０２４９】
２．TAGが挿入されたAAVカプシド構成物の作製
【０２５０】
３．そのカプシド中に非標準アミノ酸を含むAAVの作製
【０２５１】
４．MUC-1アプタマーとA549細胞を用いた仮説の試験
【０２５２】
５．MUC-1アプタマーを含む作製されたAAV2が、混合細胞集団の中のA549細胞を選択的に形質導入するために使用できるかどうかを試験
【０２５３】
６．作製されたAAVを用いて、混合細胞集団の中のA549に選択的にCas9を送達し、そして遺伝子編集を確認する
【０２５４】
７．In vitro実験：作製されたAAVのCRISPR-Cas9送達メカニズムを使用しそして標的細胞中の遺伝子編集をチェックする
【０２５５】
GFP遺伝子の中央にTAG終止コドンを含有するGFPレポータープラスミド中への非標準アミノ酸の取り込みを試験することにより実験を始めた。tRNA、tRNAシンセターゼおよび非標準アミノ酸の存在下で、アンバー抑制を利用してGFP発現を回復させた（図13Ａ）。また、レポーター対シンセターゼ比を変化させ（1：1、1：2.5、および1：5）、その結果を図13Bに示す。
【０２５６】
アンバー抑制の方法を用いて、ウイルスカプシドへ非天然アミノ酸を付加した。表面残基R447、S578、N587およびS662の代わりに終止コドンTAGを組み込んだ。ウイルスがtRNA ／シンセターゼペアと非天然アミノ酸の存在下でのみ生産されるだろうという仮説を立てた。これまで実施した実験は、正確にこのことを我々に示しているように見える。非天然アミノ酸の非存在下ではウイルス力価は極端に低く、一方で非天然アミノ酸を添加する場合には数倍（200×）高い。指摘した残基の所に非標準アミノ酸であるN-ε-((2-アジドエトキシ)カルボニル)-L-リジンを含む４種の異なるウイルスを作製した（図14）。
【０２５７】
次に、アルキン基を含むMUC-1アプタマーを設計し、非標準アミノ酸がアジド基を含むのでクリックケミストリーを介して非標準アミノにそれを付加することに注目している。AAV2は、A549肺癌細胞株にはあまり効率的に感染しない。A549細胞は、その表面にMUC-1の過剰発現を示すので、AAV2に付加されたMUC-1アプタマーが、A549細胞に対するウイルスの特異性を改善する助けになると確信する。
実施例３：AAV2-SpyTag
【０２５８】
SpyTagおよびリンカーペプチドを有するSpyTagを、HSPG結合ペプチドを用いてまたは用いずにAAV2カプシドの残基N587の所に導入し、AAV2の４種の変形を構築した（図15）。
実施例４：AAV-DJ
【０２５９】
本システムのより広範な使用を促進するために、AAV-DJ血清型を工作して同様にUAAを組み込んだ。この目的に向かって、タンパク質アラインメントに基づいて、AAV-DJ中のN589残基がAAV2中のN587残基の同等部位として選択された。AAV-DJ-N589UAA ウイルスは、AAV2-N587UAAウイルスよりも5〜15倍高い力価を有することが観察され（図20ａ）、そしてAAV2およびAAV-DJ上のそれぞれ残基N587およびN589の代わりとしてのUAAの組み込みは、ウイルスの活性に負の影響を及ぼさないことが確認された（図20ｂ）。
【０２６０】
血清中にAAV中和抗体が優勢に存在することは、in vivoでの研究および治療用途での有効利用に対する大きな障害となっている。このシステムのプログラミング可能性を利用し、AAVカプシドに新規な表面特性を付与することが可能であり、それによりAAV抗体による中和に対する或る程度のAAVの遮蔽を可能にすることができた（図20ｃ）。そのような「ステルス」AAVを工作することに向けて、AAVカプシド表面上にこのシステムを係留（テザリング）しそしてブタ血清（中和AAV抗体を持つことが知られている（48-50））への暴露後にAAV形質導入能力を測定することにより、低分子とポリマー成分の宿主をスクリーニングした。興味深いことに、脂質による遮蔽が、ブタ血清ベースの中和に対するAAVのほぼ完全な抵抗性をもたらすことが観察された。AAV表面上へのオリゴヌクレオチドの連結を介して達成され、これは次いで市販の脂質ポリマー製剤リポフェクタミンを結合させるのに使用された。とりわけ、wt AAV-DJおよびAAV-DJ-N589ウイルスが完全に中和される条件下であっても、脂質で被覆されたウイルスの活性が観察された（図20ｄ）。更に、それらの改変されたウイルスは、完全なゲノム編集機能を保持しており、そして特にリポフェクタミン被包の存在下で、未改変のウイルスに比較して増強された編集率を示した。このアプローチは、従って、AAVカプシド表面特性のプログラム可能な制御のための道を開き、それによりAAV活性を調節する小分子およびポリマーの体系的評価を可能にする。
実施例５：組織特異性のためのmiRNA
【０２６１】
出願人は、レポーター遺伝子としてTK-GFP（チミジンキナーゼ−GFP融合タンパク質）を使用して、この典型的システムの特異性と送達を評価した。TK-GFPは、PET/SPECTを使った全動物のリアルタイムin vivo 画像診断を可能にし、これはqPCRとして定量的情報を提供しながら、ウイルスがどの組織に感染するかに関する空間的情報を提供する。
実施例６：疼痛管理
【０２６２】
合計９匹のマウスを使用して、C57BL/6Jマウスにおいてそれらの疼痛管理システムを試験した。３匹のマウスにpAAV9_gSCN9a_dCas9システムを注射し、３匹のマウスに空のベクターpAAV9_gempty_dCas9を注射し、そして３匹のSNC9a変異マウス（Scn9atmlDgen）を陽性対照として使用した。また、ヒト神経細胞を使ってin vitroでヒトgRNAを試験した。
実施例７：CD81抑制
【０２６３】
肝臓中の３つのマラリア宿主遺伝子CD81、Sr-b1およびMUC13を抑制し編集するために、それらを標的とするsplit-Cas9およびsplit-dCas9システムを設計した。前記遺伝子は、肝細胞のマラリア原虫の種虫感染に必要な宿主因子である。CD81のin vivo抑制を試験し、35％の抑制を検出した（図８、図９）。図８はAAV8_gCD81_KRAB_dCas9で処理した３匹のマウスと６匹の対照マウスにおけるCD81の相対的発現を示す。図９は、３セットの組織学的サンプルを表す：第一は一次抗体を持たないものであり、第二は比較的高いCD81発現を示す陽性対照であり、第三は低下したCD81発現を示す、AAV8_gCD81_KRAB_dCas9が送達されたセットである。
実施８：疼痛管理
【０２６４】
疼痛には３つの主な特徴がある：持続期間（慢性から急性）、場所（例えば、筋肉、口腔顔面）、並びに原因（例えば神経損傷、炎症）。1) どんな種類の疼痛を当該療法がターゲットとするか、および2) 当該処置が疼痛管理の従来方法（例えばオピオイド）と同様な結果または改善を示すかどうかを更に解明するために、４種類の主要な疼痛モデル（灼熱痛モデル、炎症性痛覚モデル、術後疼痛モデル、および神経障害性疼痛モデル）を利用した。それらの主要モデルを下記の表に要約する。急性痛覚灼熱痛モデルでは、２つの汎用モデルを利用する：ホットプレート試験および「Hargreaves」試験。後者の試験は、薬物または生理学的操作の鎮痛活性についてスクリーニングするアッセイとして、侵害受容性プロセシングを評価するために一般に使われている。第一のモデルでは、動物が有害な熱刺激後に既知行動、例えばジャンピングや足を舐める動作を引き起こすまで、55℃に置いておく。45秒経っても動物が反応しない場合には、組織損傷を避けるためホットプレートを取り除く。次いで対数的に増分する剛性（0.41、0.70、1.20、2.00 g）を有するナイロン繊維であるvon Freyフィラメントを使って機械的閾値を測定する（これは逃避反応を測定する）。次いで、熱侵害受容応答を、Hargreavesとして知られる別の試験において調べた。簡潔には、マウスを加熱（30℃）ガラス表面上のプレキシガラス製の小部屋（キュービクル）内に配置し、前記ガラスの下に置かれた集束投影電球からの光を、１本の後肢足底に向ける。損傷後３時間に渡り30分毎に熱逃避応答を測定した。逃避反応の潜時（PWL：秒）として定義される、光の適用と、後脚を上にあげる逃避反応の発生との間の時間間隔（潜時）を測定する。炎症性疼痛モデルでは、２〜３週間持続する関節／足炎症と相関するロバストで高い機械的アロディニア（異痛）を有するマウスを作製するために、関節炎トランスジェニックK/BxNマウスからの血清を野生型マウスに注入した。上述したようなVon Freyフィラメントによる機械的閾値も測定される。次の術後モデルでは、麻酔下でマウスの後肢足底の皮膚、筋膜および筋肉から切開を行う。術後６日間に渡り傷口周辺の個々の領域においてvon Freyフィラメントを使って逃避反応を測定する。
【表１３】
2019524162.tif 000033
最後に、２つの神経性疼痛モデルを利用する：脊髄神経結紮、およびシスプラチンを用いた化学療法。最初のモデル、Chungモデルとして知られている脊髄神経結紮（SNL）モデルでは、L5およびL6脊髄神経をL4脊髄神経から切開し、後根神経節（DRG）の遠位にしっかりと結び付ける。化学療法モデルの場合、マウスは８週間の間、週あたり5 mg/kgのシスプラチンの投与量を投与される。神経障害性疼痛モデルは、機械的アロディニア（異痛）、冷感異痛および熱痛覚過敏のような行動変化を有することが知られている。この理由により、放射熱の適用による逃避行動の潜時を測定するHargreaves試験並びに機械的刺激に対する疼痛を試験するvon Frey試験の両方を利用する。
【０２６５】
DRG（後根神経節）を標的とするためにどのAAV血清型が最適であるかを決定した後（図25）、いくつかの遺伝子を標的とする実験を実施する。
【表１４】
2019524162.tif 000034
【０２６６】
実験の最初のラウンドでは、最初にSCN9A遺伝子を編集する。SCN9A遺伝子を標的とするsplit-Cas9を有するAAVを、〜1E11-1E12 vg／マウスの量でC57BL/6Jマウスに髄腔内注射した。その後、異なる疼痛モデルを試験するために、陽性対照としてオピオイドを注射したWTマウス、陰性対照としてPBSを注射したマウスと共に、その他のマウスを５グループに分けた。８週目の終わりに、マウスを犠牲にし、DRGからgDNAを抽出し、着目の標的領域（切断部位を取り囲む150 bp）を次世代シーケンシングにより配列決定した。疼痛の永続的喪失は望まないかもしれないため、dCas9と最適化された抑制ドメインによってもSCN9Aをターゲティングした（図33）。加えて、８週目にマウスのDRGニューロンを収得し、RNAシーケンシングを実施して治療後の遺伝子発現の変化を決定した。標的としているいくつかの追加の遺伝子としては、Nav 1.8（SCN10A遺伝子）、1.9（SCN11A遺伝子）および1.3（SCN3A遺伝子）のような他のナトリウムチャネル、並びにカプサイシン受容体およびバニロイド受容体１としても知られるTRP(Transient receptor potential)カチオンチャネルのサブファミリーＶメンバー１（TrpV1）、SHANK3、およびNMDA受容体が挙げられる。遺伝子抑制は無痛状態を達成するには十分でないかもしれないので、遺伝子活性化（または過剰発現）も実施する。
【０２６７】
以前の研究は、SCN9Aの同時抑制とエンケファリン前駆体Penkの上方制御が、無痛表現型に必要であるかもしれないことを示した。この理由のため、RNAヘアピン（MS2、PP7、Com）を有するgRNA構成物を用い、それらの同族RNA結合性タンパク質を活性化／抑制ドメイン上に融合させた。Renkの活性化のために、dN-Cas9プラスミド上にgRNA-MS2構成物を作製し、MS2 RNA同族体であるMCPをVP64活性化部位上に融合させた。同様に、SCN9A特異的gRNA-ComをdN-Cas9上に付加し、そのRNA同族体のCOMをKRAB上に融合させた。従って、特定の位置に最適な活性化／抑制を動員するであろうgRNAにRNAヘアピンが結合されている形の二重AAV dCas9システムを利用することができ、それによって同時の活性化と抑制が可能になる（図33および34）。従って、Penkを活性化しかつ同時にSCN9Aを抑制するAAVをマウスに注入し、マウスの疼痛表現型に何か変化があるかどうかを決定し、そして再びRNA-seqを実施して活性化／抑制の程度を決定する。抑制用のSCN9Aおよび活性化用のPenkに加えて、同時活性化／抑制のための別の遺伝子を標的としている。更に、CRISPRを使って同時活性化／抑制を実施することに加えて、出願人はdCas9-KRAB-gRNA split-AAV構成物による抑制と遺伝子の過剰発現による同時活性化を現在実施している（図35）。
【０２６８】
同等物
別に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、当該技術が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２６９】
本明細書に例示的に記載される当該技術は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の１以上の要素または１以上の限定の非存在下で適切に実施することができる。従って、例えば、「含む」「包含する」、「含有する」等の用語は、広くかつ限定なしに解釈すべきである。さらに、本明細書で用いられる用語および表現は、限定の用語でなく説明の用語として使用されており、そのような用語と表現の使用において、図示もしくは説明される特徴またはその部分の任意の同等物を排除する意図はなく、しかも特許請求される当該技術の範囲内で様々な変更が可能であると認識される。
【０２７０】
従って、ここに提供される材料、方法および実施例は、好ましい態様の代表であり、例示であり、本技術の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
【０２７１】
本技術は、広くかつ一般的に本明細書に記載されている。一般的開示の中に入るより狭い種および亜属のグループ化は各々本技術の一部分を構成する。これは、除外される物が本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、任意の発明内容（subject matter）を除外する但し書きまたは否定的制限を伴う本技術の一般的記述を包含する。
【０２７２】
本技術の特徴または態様がマーカッシュ群として記載されている場合、当業者は、本技術がそれによってマーカッシュ群の個々のメンバーまたはサブグループの点からも記載されていると認識されるだろう。
【０２７３】
本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、あたかもその各々が個別に参照により組み込まれたかのように同程度に、それらの全内容が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【０２７４】
他の態様は、以下の特許請求の範囲に記載される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅ】
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【図１６ｆ】
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【図１６ｇ】
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【図１６ｈ】
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【図１６ｉ】
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【図１６ｊ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｇ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９ａ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７ａ】
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【図３８ａ】
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【図４０ａ】
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【図４１ａ】
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【図４３ａ】
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【図４４ａ】
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【図４５ａ】
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【図４６ａ】
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【図４７ａ】
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【図４８ａ】
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【図４９ａ】
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【図５０ａ】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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