(57)【要約】  本願は、昆虫フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体として有用であり得る不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートの生合成に有用な組換え微生物に関する。本明細書に記載されるＣ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートは、メタセシス反応の基質として使用されて、標的化合物及びフェロモンのレパートリーを拡大し得る。本願は、フェロモン経路と、誘引及び殺虫害虫防除手法における使用に好適な毒性タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子の生成経路とを共発現する組換え微生物に更に関する。また、組換え微生物を使用して不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートを生成する方法、並びに組換え微生物及び／又は任意選択で生成物アルコール、アルデヒド、又はアセテートの１つ以上を含む組成物も提供される。
2019503657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
（ａ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び
（ｂ）（ａ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、前記対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。
【請求項２】
前記脂肪アシルデサチュラーゼが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有するデサチュラーゼである、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記脂肪アシルデサチュラーゼがＺ１１デサチュラーゼである、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記Ｚ１１デサチュラーゼが、カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アカオビコハマキ（Argyrotaenia velutiana）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、又はタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種の生物由来である、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記Ｚ１１デサチュラーゼが、脂肪アシル−ＣｏＡの、Ｚ１１−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，１１−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１５：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−６，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−８，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１４−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ）−４，６，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｅ）−７，１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｚ）−４，６，１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１７：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−８，１１−１７：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１８：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１４−１８：アシル−ＣｏＡ、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記脂肪アシルデサチュラーゼがＺ９デサチュラーゼである、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記Ｚ９デサチュラーゼが、アワノメイガ（Ostrinia furnacalis）、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nobilalis）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、タバコガ（Helicoverpa assulta）、又はアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）種の生物由来である、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記Ｚ９デサチュラーゼが、脂肪アシル−ＣｏＡの、Ｚ９−１１：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−４，９−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１５：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−６，９−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１７：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１８：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−５，９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−９，１２，１５−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−１８：アシル−ＣｏＡ、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
（ａ）飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び
（ｂ）（ａ）からの前記多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、前記対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。
【請求項１１】
飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
（ａ）飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する、脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び
（ｂ）（ａ）からの前記多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、前記対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。
【請求項１３】
飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する、脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記脂肪アシルコンジュガーゼが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有するコンジュガーゼである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼが、カブラヤガ（Agrotis segetum）、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）、又はオオタバコガ（Helicoverpa amigera）種の生物由来である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記脂肪アシルレダクターゼが、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの、（Ｚ）−３−ヘキセノール、（Ｚ）−３−ノネノール、（Ｚ）−５−デセノール、（Ｅ）−５−デセノール、（Ｚ）−７−ドデセノール、（Ｅ）−８−ドデセノール、（Ｚ）−８−ドデセノール、（Ｚ）−９−ドデセノール、（Ｚ）−９−テトラデセノール、（Ｚ）−９−ヘキサデセノール、（Ｚ）−１１−テトラデセノール、（Ｚ）−７−ヘキサデセノール、（Ｚ）−１１−ヘキサデセノール、（Ｅ）−１１−テトラデセノール、又は（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエノール、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエノール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエノール、（Ｅ，Ｚ）−７，９−ドデカジエノール、（Ｚ）−１３−オクタデセノール、又はこれらの組み合わせから選択される脂肪アルコール生成物への変換を触媒する、請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
（ａ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、前記対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
（ａ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；
（ｂ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；
（ｃ）（ｂ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、（ｂ）の前記生成物と比べて２炭素の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の内因性又は外因性核酸分子；
（ｄ）（ｃ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、前記対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び
（ｅ）（ｄ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。
【請求項１９】
前記アシル−ＡＣＰシンテターゼが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである、請求項１８に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記アシル−ＡＣＰシンテターゼが、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）種の生物由来である、請求項１８又は１９に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼが可溶性デサチュラーゼである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
前記脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼが、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、又はキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物由来である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
脂肪酸シンターゼ複合体をコードする前記１つ以上の核酸分子が内因性核酸分子である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
脂肪酸シンターゼ複合体をコードする前記１つ以上の核酸分子が外因性核酸分子である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼが、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、及びキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物由来である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
デヒドロゲナーゼをコードする前記核酸分子が前記組換え微生物にとって内因性である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
デヒドロゲナーゼをコードする前記核酸分子が前記組換え微生物にとって外因性である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
デヒドロゲナーゼをコードする前記内因性又は外因性核酸分子が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、大腸菌（Escherichia coli）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、又はカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）種の生物から単離される、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物であって、
（ａ）Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；
（ｂ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；
（ｃ）（ｂ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸への変換を触媒する少なくとも１つの外因性脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；
（ｄ）（ｃ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸のＣｏＡ活性化から誘導される一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、（ｃ）の前記生成物と比べて２炭素以上の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒するエロンガーゼをコードする１つ以上の内因性又は外因性核酸分子；及び
（ｅ）：（ｄ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子
を発現する組換え微生物。
【請求項３０】
前記アシル−ＡＣＰシンテターゼが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである、請求項２９に記載の組換え微生物。
【請求項３１】
前記アシル−ＡＣＰシンテターゼが、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）種の生物由来である、請求項２９又は３０に記載の組換え微生物。
【請求項３２】
前記脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼが可溶性デサチュラーゼである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３３】
前記脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼが、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、又はキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物由来である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３４】
前記組換え微生物が、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み、前記アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼが、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３５】
Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３６】
昆虫にとって毒性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を発現する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３７】
昆虫にとって毒性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする前記核酸が昆虫病原生物に由来する、請求項３６に記載の組換え微生物。
【請求項３８】
前記昆虫病原生物が、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及びセラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）から選択される、請求項３７に記載の組換え微生物。
【請求項３９】
前記核酸分子がバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）毒素をコードする、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４０】
発現時に昆虫にとって毒性のある小分子を生成する代謝経路を発現するように改変される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４１】
一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４２】
脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項４１に記載の組換え微生物。
【請求項４３】
脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する前記酵素が、ＸＰ＿５０４４０６、ＸＰ＿５０４８５７、ＸＰ＿５０４３１１、ＸＰ＿５００８５５、ＸＰ＿５００８５６、ＸＰ＿５００４０２、ＸＰ＿５０００９７、ＸＰ＿５０１７４８、ＸＰ＿５００５６０、ＸＰ＿５０１１４８、ＸＰ＿５０１６６７、ＸＰ＿５００２７３、ＢＡＡ０２０４１、ＣＡＡ３９３６６、ＣＡＡ３９３６７、ＢＡＡ０２２１０、ＢＡＡ０２２１１、ＢＡＡ０２２１２、ＢＡＡ０２２１３、ＢＡＡ０２２１４、ＡＡＯ７３９５２、ＡＡＯ７３９５３、ＡＡＯ７３９５４、ＡＡＯ７３９５５、ＡＡＯ７３９５６、ＡＡＯ７３９５８、ＡＡＯ７３９５９、ＡＡＯ７３９６０、ＡＡＯ７３９６１、ＡＡＯ７３９５７、ＸＰ＿００２５４６２７８、ＢＡＭ４９６４９、ＡＡＢ８０８６７、ＡＡＢ１７４６２、ＡＤＬ２７５３４、ＡＡＵ２４３５２、ＡＡＡ８７６０２、ＣＡＡ３４６１２、ＡＢＭ１７７０１、ＡＡＡ２５７６０、ＣＡＢ５１０４７、ＡＡＣ８２９６７、ＷＰ＿０１１０２７３４８、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項４２に記載の組換え微生物。
【請求項４４】
脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項４１に記載の組換え微生物。
【請求項４５】
脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する前記酵素が、ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、ＣＡＧ７９２１４、ＡＡＡ３４３２２、ＡＡＡ３４３６１、ＡＡＡ３４３６３、ＣＡＡ２９９０１、ＢＡＡ０４７６１、ＡＡＡ３４８９１、ＡＡＢ０８６４３、ＣＡＢ１５２７１、ＢＡＮ５５７４９、ＣＡＣ４４５１６、ＡＤＫ１６９６８、ＡＥＩ３７６３４、ＷＰ＿０００９７３０４７、ＷＰ＿０２５４３３４２２、ＷＰ＿０３５１８４１０７、ＷＰ＿０２６４８４８４２、ＣＥＬ８０９２０、ＷＰ＿０２６８１８６５７、ＷＰ＿００５２９３７０７、ＷＰ＿００５８８３９６０、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項４４に記載の組換え微生物。
【請求項４６】
ペルオキシソームバイオジェネシスに関与する１つ以上のタンパク質の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項４１に記載の組換え微生物。
【請求項４７】
ペルオキシソームバイオジェネシスに関与する前記１つ以上のタンパク質が、ＸＰ＿５０５７５４、ＸＰ＿５０１９８６、ＸＰ＿５０１３１１、ＸＰ＿５０４８４５、ＸＰ＿５０３３２６、ＸＰ＿５０４０２９、ＸＰ＿００２５４９８６８、ＸＰ＿００２５４７１５６、ＸＰ＿００２５４５２２７、ＸＰ＿００２５４７３５０、ＸＰ＿００２５４６９９０、ＥＩＷ１１５３９、ＥＩＷ０８０９４、ＥＩＷ１１４７２、ＥＩＷ０９７４３、ＥＩＷ０８２８、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項４６に記載の組換え微生物。
【請求項４８】
１つ以上の不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ中間体の生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項４１に記載の組換え微生物。
【請求項４９】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む、請求項４８に記載の組換え微生物。
【請求項５０】
前記１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが、ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ及びＣＴＲＧ＿０６２０９、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項４９に記載の組換え微生物。
【請求項５１】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼを含む、請求項４８に記載の組換え微生物。
【請求項５２】
前記１つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼが、ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ若しくはＣＴＧ＿０４３９０、又はこれらのホモログから選択される、請求項５１に記載の組換え微生物。
【請求項５３】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上のアシル−ＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼを含む、請求項４８に記載の組換え微生物。
【請求項５４】
前記１つ以上のアシル−ＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼが、ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１７６４及びＣＴＲＧ＿０１７６５、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項５３に記載の組換え微生物。
【請求項５５】
脂肪アルデヒド中間体を酸化する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項４１に記載の組換え微生物。
【請求項５６】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項５５に記載の組換え微生物。
【請求項５７】
前記１つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼが、ＹＡＬＩ０Ａ１７８７５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ１５４００ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０１２９８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ２３７９３ｇ、ＣＴＲＧ＿０５０１０及びＣＴＲＧ＿０４４７１、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項５６に記載の組換え微生物。
【請求項５８】
脂肪アセテート生成物を消費する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される、請求項４１に記載の組換え微生物。
【請求項５９】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上のステロールエステラーゼを含む、請求項５８に記載の組換え微生物。
【請求項６０】
前記１つ以上のステロールエステラーゼが、ＹＡＬＩ０Ｅ３２０３５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ００５２８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１１３８、ＣＴＲＧ＿０１６８３及びＣＴＲＧ＿０４６３０、又はこれらのホモログからなる群から選択される、請求項５９に記載の組換え微生物。
【請求項６１】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼを含む、請求項５８に記載の組換え微生物。
【請求項６２】
前記１つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼが、１つ以上のＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ１００１０ｇ、ＣＴＲＧ＿０００５７及びＣＴＲＧ＿０６１８５、又はこれらのホモログを含む、請求項６１に記載の組換え微生物。
【請求項６３】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼを含む、請求項５８に記載の組換え微生物。
【請求項６４】
前記１つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼが、１つ以上のＹＡＬＩ０Ｃ１４５２０ｇ、ＣＴＲＧ＿０３３６０及びＣＴＲＧ＿０５０４９、又はこれらのホモログを含む、請求項６３に記載の組換え微生物。
【請求項６５】
前記１つ以上の内因性酵素が１つ以上の細胞外リパーゼを含む、請求項５８に記載の組換え微生物。
【請求項６６】
前記１つ以上の細胞外リパーゼが、１つ以上のＹＡＬＩ０Ａ２０３５０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ１９１８４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０９３６１ｇ、ＣＴＲＧ＿０５９３０、ＣＴＲＧ＿０４１８８、ＣＴＲＧ＿０２７９９、ＣＴＲＧ＿０３０５２及びＣＴＲＧ＿０３８８５、又はこれらのホモログを含む、請求項６５に記載の組換え微生物。
【請求項６７】
真核微生物である、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６８】
前記真核微生物が酵母である、請求項６７に記載の組換え微生物。
【請求項６９】
前記酵母が、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、ザイゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、パキソレン属（Pachysolen）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、及びミクソザイマ属（Myxozyma）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項７０】
前記酵母が油産生酵母である、請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項７１】
前記油産生酵母が、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、及びリポミセス属（Lipomyces）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項７０に記載の組換え微生物。
【請求項７２】
前記油産生酵母が、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、リポミセス・スタルケイ（Lipomycesstarkey）、Ｌ．リポフェルス（L. lipoferus）、Ｃ．レブカウフィ（C. revkaufi）、Ｃ．プルケリマ（C. pulcherrima）、Ｃ．ウチリス（C. utilis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullans）、Ｔ．クタネウム（T. cutaneum）、クリプトコッカス・カルバツス（Cryptococcus curvatus）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、及びＲ．グラミニス（R. graminis）から選択される種のメンバーである、請求項７１に記載の組換え微生物。
【請求項７３】
原核微生物である、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７４】
前記原核微生物が、大腸菌属（Escherichia）、クロストリジウム属（Clostridium）、ザイモモナス属（Zymomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、クレブシエラ属（Klebsiella）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、及びブレビバクテリウム属（Brevibacterium）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項７３に記載の組換え微生物。
【請求項７５】
請求項１〜７４のいずれか一項に記載の組換え微生物を使用して一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する方法であって、前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが生成されるまで、炭素源を供給する原料が入った培養培地で前記組換え微生物を培養することを含む方法。
【請求項７６】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを回収するステップを更に含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記回収するステップが蒸留を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記回収するステップが、膜に基づく分離を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記炭素源が、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、及び一酸化炭素から選択される、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記糖が、グルコース、フルクトース、及びスクロースからなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが昆虫フェロモンである、請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記昆虫フェロモンが、（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセニルアセテート、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエナール、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカ−９，１−ジエナール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン−１−オール、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエニルアセテート、（Ｚ）−３−ノネン−１−オール、（Ｚ）−５−デセン−１−オール、（Ｚ）−５−デセニルアセテート、（Ｅ）−５−デセン−１−オール、（Ｅ）−５−デセニルアセテート、（Ｚ）−７−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−７−ドデセニルアセテート、（Ｅ）−８−ドデセン−１−オール、（Ｅ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−８−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−９−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセン−１−オール、（Ｚ）−１１−テトラデセン−１−オール、（Ｚ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｅ）−１１−テトラデセン−１−オール、（Ｅ）−１１−テトラデセニルアセテート、（９Ｚ，１２Ｅ）−テトラデカジエニルアセテート、（Ｚ）−７−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−７−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−９−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−１３−オクタデセン−１−オール、及び（Ｚ）−１３−オクタデセナールからなる群から選択される、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを不飽和Ｃ３〜Ｃ１０炭化水素とメタセシスし、それにより伸長型一不飽和若しくは多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、若しくはアセテート、又はトランケート型一不飽和若しくは多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、若しくはアセテートを形成することを更に含む、請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
請求項１〜７４のいずれか一項に記載の１つ以上の組換え微生物を含む組成物。
【請求項８５】
１つ以上の一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及び／又はアセテートを更に含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが昆虫フェロモンである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記昆虫フェロモンが、（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセニルアセテート、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエナール、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカ−９，１−ジエナール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン−１−オール、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエニルアセテート、（Ｚ）−３−ノネン−１−オール、（Ｚ）−５−デセン−１−オール、（Ｚ）−５−デセニルアセテート、（Ｅ）−５−デセン−１−オール、（Ｅ）−５−デセニルアセテート、（Ｚ）−７−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−７−ドデセニルアセテート、（Ｅ）−８−ドデセン−１−オール、（Ｅ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−８−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−９−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセン−１−オール、（Ｚ）−１１−テトラデセン−１−オール、（Ｚ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｅ）−１１−テトラデセン−１−オール、（Ｅ）−１１−テトラデセニルアセテート、（９Ｚ，１２Ｅ）−テトラデカジエニルアセテート、（Ｚ）−７−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−７−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−９−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−１３−オクタデセン−１−オール、及び（Ｚ）−１３−オクタデセナールからなる群から選択される、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
昆虫にとって毒性のある１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又は小分子を更に含む、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
昆虫にとって毒性のある前記タンパク質、ポリペプチド、又は小分子が前記組換え微生物によって生成される、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールが、表１に列挙される一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つ以上である、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項９１】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールが、表２ａに列挙される一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つ以上である、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項９２】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールが、本明細書に列挙される一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つ以上である、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項９３】
前記脂肪アシルコンジュガーゼが、コドリンガ（Cydia pomonella）、エンドウシンクイ（Cydia nigricana）、ホソバヒメハマキ（Lobesia botrana）、ゴママダラメイガ（Myelois cribrella）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、マッソンマツカレハ（Dendrolimus punctatus）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、カイコガ（Bombyx mori）、キンセンカ（Calendula officinalis）、キカラスウリ（Trichosanthes kirilowii）、ザクロ（Punica granatum）、ツルレイシ（Momordica charantia）、ホウセンカ（Impatiens balsamina）、及びリンゴウスチャイロハマキ（Epiphyas postvittana）種の生物由来である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９４】
前記少なくとも１つの脂肪アシルコンジュガーゼが、Ａ０Ａ０５９ＴＢＦ５、Ａ０Ａ０Ｍ３Ｌ９Ｅ８、Ａ０Ａ０Ｍ３Ｌ９Ｓ４、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＨ８、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＳ８、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＨ８、Ｂ６ＣＢＳ４、ＸＰ＿０１３１８３６５６．１、ＸＰ＿００４９２３５６８．２、ＡＬＡ６５４２５．１、ＮＰ＿００１２９６４９４．１、ＮＰ＿００１２７４３３０．１、Ｑ４Ａ１８１、Ｑ７５ＰＬ７、Ｑ９ＦＰＰ８、ＡＹ１７８４４４、ＡＹ１７８４４６、ＡＦ１８２５２１、ＡＦ１８２５２０、Ｑ９５ＵＪ３、及びこれらのホモログからなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，０５４号に対する優先権利益を主張し、及び２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，６０５号に対する優先権利益を主張する。前述の出願の各々は、本明細書において参照により明示的に援用される。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に付随する配列表は紙の複製物の代わりにテキスト形式で提供され、及び本明細書によって参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、PRVI_007_02WO_SeqList_ST25.txtである。このテキストファイルは約５４ＫＢであり、２０１６年１１月１５日に作成されており、ＥＦＳ−Ｗｅｂから電子的に提出されるものである。
【０００３】
技術分野
本願は、昆虫フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体として有用であり得る不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートの生合成に有用な組換え微生物に関する。本願は、本組換え微生物を使用して不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートを生成する方法、並びにこれらの化合物の１つ以上及び／又は本組換え微生物を含む組成物に更に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
世界的な食糧需要の増大に伴い、有効な害虫防除の必要性が高まっている。従来の殺虫剤は、容易に入手可能で即効性があり、且つ確実性が高いため、最も普及している化学防除剤の１つである。しかしながら、これらの化学薬品の過剰使用、誤用、及び乱用が、耐性のある害虫、自然生態系の改変、及びある場合には環境被害につながっている。
【０００５】
昆虫フェロモンの使用による害虫集団の防除は、従来の殺虫剤に代わる実行可能で安全であり、且つ環境に優しい選択肢として支持が広がっている。１９５０年代後期に発見されて以来、これらの分子は、大量捕獲、誘引殺虫、及び交信撹乱を含めた種々の方法による昆虫集団の削減において有効性を示す。後者の交信撹乱方法は、とりわけ非毒性の害虫防除手段に相当し、合成フェロモンが天然に存在するフェロモンをマスクする能力を利用して、それにより混乱及び交信撹乱を生じさせるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
農業用昆虫防除におけるフェロモンの潜在的可能性は大きいが、現在利用可能な技法を用いたフェロモン合成はコストが極めて高く、これは、高価作物以外でのこの持続可能な技術の普及を妨げている。従って、昆虫フェロモン並びに関連するフレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体の費用効率の高い生産に向けた新規技術を開発する必要がある。本発明者らは、低コスト原料から合成昆虫フェロモンを含めた広範囲に及ぶ不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートを生成する能力を有する組換え微生物の開発によってこの必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
開示の概要
本願は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートから選択される１つ以上の化合物を生成する生合成経路を有する組換え微生物に関する。本明細書に記載される組換え微生物は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートから選択される、昆虫フェロモン、フレグランス、又はフレーバー剤などの少なくとも１つの化合物の生成に用いられ得る。
【０００８】
一実施形態では、本組換え微生物は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する生合成経路を含む。従って、第１の態様において、本願は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関し、この組換え微生物は、（ａ）：飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｂ）：（ａ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールは昆虫フェロモンである。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールはフレグランス又はフレーバー剤である。一部の実施形態では、本組換え微生物は、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み、このアルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼは、（ｂ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有する。一部の実施形態では、本組換え微生物は、（ｂ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む。
【０００９】
一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有するデサチュラーゼである。
【００１０】
一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、脂肪酸又はその誘導体、例えば脂肪酸ＣｏＡエステルなどのＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、又はＣ１３位に二重結合を生じさせる能力を有する。
【００１１】
一例示的実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ１１デサチュラーゼである。本明細書に記載される様々な実施形態において、Ｚ１１デサチュラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アカオビコハマキ（Argyrotaenia velutiana）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、又はタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種の生物から単離することができる。更なるＺ１１−デサチュラーゼ、又はそれらをコードする核酸配列は、カイコガ（Bombyx mori）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、サウスウエスタンコーンボーラー（Diatraea grandiosella）、ミスジアオリンガ（Earias insulana）、クサオビリンガ（Earias vittella）、コナガ（Plutella xylostella）、カイコガ（Bombyx mori）又はアメリカウリノメイガ（Diaphania nitidalis）から単離することができる。例示的実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、GenBank受託番号ＪＸ６７９２０９、ＪＸ９６４７７４、ＡＦ４１６７３８、ＡＦ５４５４８１、ＥＵ１５２３３５、ＡＡＤ０３７７５、ＡＡＦ８１７８７、及びＡＹ４９３４３８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アカオビコハマキ（Argyrotaenia velutiana）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、又はタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種の生物由来のＺ１１デサチュラーゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来の配列番号９、１８、２４及び２６から選択される配列を含む。他の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、カブラヤガ（Agrotis segetum）由来の配列番号１０及び１６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）由来の配列番号１１及び２３から選択される配列を含む。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）由来の配列番号１２、１７及び３０から選択される配列を含む。更なる実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来の配列番号１３、１９、２５、２７及び３１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはキメラポリペプチドを含む。一部の実施形態では、完全な又は部分的なＺ１１デサチュラーゼが別のポリペプチドに融合される。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼのＮ末端天然リーダー配列が別の種由来のオレオシンリーダー配列に置換される。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、配列番号１５、２８及び２９から選択される配列を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、脂肪アシル−ＣｏＡの、Ｚ１１−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，１１−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１５：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−６，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−８，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１４−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ）−４，６，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｅ）−７，１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｚ）−４，６，１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１７：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−８，１１−１７：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１８：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１４−１８：アシル−ＣｏＡ、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する。
【００１３】
別の例示的実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ９デサチュラーゼである。本明細書に記載される様々な実施形態において、Ｚ９デサチュラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、アワノメイガ（Ostrinia furnacalis）、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nobilalis）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、タバコガ（Helicoverpa assulta）、又はアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、GenBank受託番号ＡＹ０５７８６２、ＡＦ２４３０４７、ＡＦ５１８０１７、ＥＵ１５２３３２、ＡＦ４８２９０６、及びＡＡＦ８１７８８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはアワノメイガ（Ostrinia furnacalis）由来の配列番号２０に示される配列を含む。他の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはカラントシュートボーラー（Lampronia capitella）由来の配列番号２１に示される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼはアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来の配列番号２２に示される配列を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、脂肪アシル−ＣｏＡの、Ｚ９−１１：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−４，９−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１５：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−６，９−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１７：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１８：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−５，９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−９，１２，１５−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−１８：アシル−ＣｏＡ、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する。
【００１５】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、続く２つの二重結合の不飽和化の触媒能を有する二機能性デサチュラーゼを発現し得る。
【００１６】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする２つ以上の外因性核酸分子を発現し得る。例えば、組換え微生物は、Ｚ１１デサチュラーゼをコードする外因性核酸分子とＺ９デサチュラーゼをコードする別の外因性核酸分子とを発現し得る。
【００１７】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、独立に又は脂肪アシルデサチュラーゼと共に、飽和又は一不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの、共役多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒するように作用する脂肪アシルコンジュガーゼを発現し得る。
【００１８】
一実施形態において、本開示は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物を提供し、この組換え微生物は、（ａ）飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｂ）（ａ）からの多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。
【００１９】
別の実施形態では、本組換え微生物は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する。
【００２０】
更なる実施形態において、本開示は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物を提供し、この組換え微生物は、（ａ）飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｂ）（ａ）からの多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。
【００２１】
別の実施形態では、本組換え微生物は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する、脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する。
【００２２】
更に別のある実施形態では、脂肪アシルコンジュガーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有するコンジュガーゼである。
【００２３】
特定の実施形態では、コンジュガーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、コドリンガ（Cydia pomonella）、エンドウシンクイ（Cydia nigricana）、ホソバヒメハマキ（Lobesia botrana）、ゴママダラメイガ（Myelois cribrella）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、マッソンマツカレハ（Dendrolimus punctatus）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、カイコガ（Bombyx mori）、キンセンカ（Calendula officinalis）、キカラスウリ（Trichosanthes kirilowii）、ザクロ（Punica granatum）、ツルレイシ（Momordica charantia）、ホウセンカ（Impatiens balsamina）、及びリンゴウスチャイロハマキ（Epiphyas postvittana）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、コンジュガーゼは、GenBank受託番号又はUniprotデータベース：Ａ０Ａ０５９ＴＢＦ５、Ａ０Ａ０Ｍ３Ｌ９Ｅ８、Ａ０Ａ０Ｍ３Ｌ９Ｓ４、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＨ８、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＳ８、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＨ８、Ｂ６ＣＢＳ４、ＸＰ＿０１３１８３６５６．１、ＸＰ＿００４９２３５６８．２、ＡＬＡ６５４２５．１、ＮＰ＿００１２９６４９４．１、ＮＰ＿００１２７４３３０．１、Ｑ４Ａ１８１、Ｑ７５ＰＬ７、Ｑ９ＦＰＰ８、ＡＹ１７８４４４、ＡＹ１７８４４６、ＡＦ１８２５２１、ＡＦ１８２５２０、Ｑ９５ＵＪ３から選択される配列を含む。
【００２４】
本明細書に記載される様々な実施形態において、脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ、即ち、脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼ、又はそれをコードする核酸配列は、カブラヤガ（Agrotis segetum）、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）、又はオオタバコガ（Helicoverpa amigera）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、レダクターゼは、GenBank受託番号ＪＸ６７９２１０及びＨＧ４２３１２８、及びUniprot受託番号Ｉ３ＰＮ８６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、カブラヤガ（Agrotis segetum）、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）、又はオオタバコガ（Helicoverpa amigera）種の生物由来の脂肪アシルレダクターゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、このレダクターゼはカブラヤガ（Agrotis segetum）由来の配列番号１に示される配列を含む。他の実施形態では、このレダクターゼはエジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）由来の配列番号２に示される配列を含む。一部の実施形態では、このレダクターゼは、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）由来の配列番号３及び３２から選択される配列を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼは、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの、（Ｚ）−３−ヘキセノール、（Ｚ）−３−ノネノール、（Ｚ）−５−デセノール、（Ｅ）−５−デセノール、（Ｚ）−７−ドデセノール、（Ｅ）−８−ドデセノール、（Ｚ）−８−ドデセノール、（Ｚ）−９−ドデセノール、（Ｚ）−９−テトラデセノール、（Ｚ）−９−ヘキサデセノール、（Ｚ）−１１−テトラデセノール、（Ｚ）−７−ヘキサデセノール、（Ｚ）−１１−ヘキサデセノール、（Ｅ）−１１−テトラデセノール、又は（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエノール、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエノール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエノール、（Ｅ，Ｚ）−７，９−ドデカジエノール、（Ｚ）−１３−オクタデセノール、又はこれらの組み合わせから選択される脂肪アルコール生成物への変換を触媒する。
【００２６】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする２つ以上の外因性核酸分子を発現し得る。かかる組換え微生物は、有利には、様々な昆虫フェロモンのブレンドの作製に用いられ得る。
【００２７】
上記の第１の態様に記載される生合成経路に加え、本願は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸から誘導される飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰ中間体を利用して不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する追加の生合成経路を提供する。従って、第２の態様において、本願は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関し、この組換え微生物は、（ａ）：Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；（ｂ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；（ｃ）（ｂ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、（ｂ）の生成物と比べて２炭素の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の内因性又は外因性核酸分子；（ｄ）：（ｃ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｅ）（ｄ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドＣ６〜Ｃ２４の、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を発現する。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールは昆虫フェロモンである。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールはフレグランス又はフレーバー剤である。一部の実施形態では、本組換え微生物は、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み、このアルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼは、（ｅ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有する。一部の実施形態では、本組換え微生物は、（ｅ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む。
【００２８】
一部の実施形態では、アシル−ＡＣＰシンテターゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである。
【００２９】
本明細書に記載される様々な実施形態において、アシル−ＡＣＰシンテターゼ、又はそれをコードする核酸は、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）種の生物から単離することができる。
【００３０】
一部の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは可溶性デサチュラーゼである。本明細書に記載される様々な実施形態において、脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼ、又はそれをコードする核酸は、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、又はキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物から単離することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする２つ以上の外因性核酸分子を発現し得る。
【００３２】
上記に記載したとおり、脂肪酸伸長酵素、即ち脂肪酸シンターゼ複合体を利用して、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの鎖長をα炭素において追加の２炭素だけ伸長させることができる。一部の実施形態では、この追加の２炭素は内因性マロニル−ＣｏＡに由来する。一実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の核酸分子は内因性核酸分子であり、即ち、この核酸分子は組換え微生物にとって天然である。別の実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の核酸分子は外因性核酸分子である。
【００３３】
本明細書に記載される様々な実施形態において、脂肪アルデヒド形成アシル−ＡＣＰレダクターゼ、即ち、脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼ、又はそれをコードする核酸配列は、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、及びキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物から単離することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼをコードする２つ以上の外因性核酸分子を発現し得る。かかる組換え微生物は、有利には、様々な昆虫フェロモンのブレンドの作製に用いられ得る。本発明に係る例示的ブレンドには、（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール（Ｚ１１−１６：Ａｌｄ）及び（Ｚ）−９−ヘキサデセナール（Ｚ９−１６：Ａｌｄ）が含まれる。一実施形態では、ブレンドの比は、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、又は９９：１比の（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール（Ｚ１１−１６：Ａｌｄ）対（Ｚ）−９−ヘキサデセナール（Ｚ９−１６：Ａｌｄ）である。例示的実施形態では、ブレンドは９７：３比の（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール（Ｚ１１−１６：Ａｌｄ）対（Ｚ）−９−ヘキサデセナール（Ｚ９−１６：Ａｌｄ）であり、ヘリコベルパ属（Helicoverpa）未交尾雌の主要成分に対応する。
【００３５】
上述のとおり、第２の態様に係る組換え微生物は、（ｄ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する能力を有するデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは内因性核酸分子によってコードされる。別の実施形態では、デヒドロゲナーゼは外因性核酸分子によってコードされる。例示的実施形態では、デヒドロゲナーゼをコードする内因性又は外因性核酸分子は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、大腸菌（Escherichia coli）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、又はカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）種の生物から単離される。
【００３６】
上記の第１及び第２の態様に記載される生合成経路に加え、本願は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸から誘導される飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰ中間体を利用して不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する追加の生合成経路を提供する。従って、第３の態様において、本願は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関し、この組換え微生物は、（ａ）：Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；（ｂ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；（ｃ）（ｂ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸への変換を触媒する少なくとも１つの外因性脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；（ｄ）（ｃ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸のＣｏＡ活性化から誘導される一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、（ｃ）の生成物と比べて２炭素以上の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒するエロンガーゼをコードする１つ以上の内因性又は外因性核酸分子；及び（ｅ）：（ｄ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールは昆虫フェロモンである。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールはフレグランス又はフレーバー剤である。一部の実施形態では、本組換え微生物は、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み、このアルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼは、（ｅ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有する。一部の実施形態では、本組換え微生物は、（ｅ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む。
【００３７】
この第３の態様に係る一部の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを利用して一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰを対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸に変換することができる。詳細な実施形態では、可溶性脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを使用して遊離脂肪酸を放出させ、ＣｏＡチオエステルに再活性化させることができる。Ｑ４１６３５、Ｑ３９４７３、Ｐ０５５２１．２、ＡＥＭ７２５１９、ＡＥＭ７２５２０、ＡＥＭ７２５２１、ＡＥＭ７２５２３、ＡＡＣ４９７８４、ＣＡＢ６０８３０、ＥＥＲ８７８２４、ＥＥＲ９６２５２、ＡＢＮ５４２６８、ＡＡＯ７７１８２、ＣＡＨ０９２３６、ＡＣＬ０８３７６、及びこれらのホモログを含めた脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを使用し得る。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡは、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの鎖長をα炭素において追加の２炭素ずつ伸長させるのに利用し得るエロンガーゼの基質としての役割を果たし得る。一部の実施形態では、追加の２炭素は内因性マロニル−ＣｏＡに由来する。
【００３８】
上記に記載したとおり、一部の実施形態では、第１、第２、又は第３の態様に係る組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有するアルコールオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む。特定の実施形態では、アルコールオキシダーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ヨモギギク（Tanacetum vulgare）、ホホバ（Simmondsia chinensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）、又はカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、アルコールオキシダーゼは、GenBank受託番号Ｑ００９２２、Ｆ２ＱＹ２７、Ｑ６ＱＩＲ６、Ｑ８ＬＤＰ０、及びＬ７ＶＦＶ２から選択される配列を含む。
【００３９】
代替的実施形態では、脂肪アルコールは、限定はされないが、ＴＥＭＰＯ−ブリーチ、ＴＥＭＰＯ−銅−空気、ＴＥＭＰＯ−ＰｈＩ（ＯＡｃ）２、スワーン酸化、又は貴金属−空気の使用を含めた化学的方法を用いて脂肪アルデヒドに変換されてもよい。
【００４０】
上記に記載したとおり、一部の実施形態では、第１又は第２の態様に係る組換え微生物は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含む。特定の実施形態では、アセチルトランスフェラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、オオカバマダラ（Danaus plexippus）、ニセアメリカタバコガ（Heliotis virescens）、カイコガ（Bombyx mori）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、カブラヤガ（Agrotis segetum）、ニシキギ（Euonymus alatus）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、GenBank受託番号ＡＹ２４２０６６、ＡＹ２４２０６５、ＡＹ２４２０６４、ＡＹ２４２０６３、ＡＹ２４２０６２、ＥＨＪ６５２０５、ＡＣＸ５３８１２、ＮＰ＿００１１８２３８１、ＥＨＪ６５９７７、ＥＨＪ６８５７３、ＫＪ５７９２２６、ＧＵ５９４０６１から選択される配列を含む。
【００４１】
代替的実施形態では、脂肪アルコールは、化学的方法を用いて、例えば、塩化アセチル、無水酢酸、塩化ブチリル、無水酪酸、塩化プロパノイル及びプロピオン酸無水物など、化学剤を利用した化学的触媒作用によって脂肪アセテートに変換されてもよい。
【００４２】
一部の実施形態では、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は、発現時に昆虫にとって毒性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を発現するように更に改変されてもよい。本開示に好適な例示的毒物産生遺伝子は、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、及びストレプトミセス属（Streptomyces）のメンバーなどの昆虫病原生物から得ることができる。例示的実施形態では、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（「Ｂｔ」）毒素をコードする核酸を発現するように更に改変されてもよい。追加的又は代替的実施形態では、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は、クモ毒など、他の毒性タンパク質をコードする核酸を発現するように更に改変されてもよい。
【００４３】
一部の実施形態では、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は、発現時に昆虫にとって毒性のあるオリゴヌクレオチドを生成するＲＮＡｉ分子を発現するように更に改変されてもよい。
【００４４】
一部の実施形態では、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は、発現時に昆虫にとって毒性のある小分子を生成する代謝経路を発現するように更に改変されてもよい。毒性小分子の非限定的な例としては、アザジラクチン、スピノサド、アベルメクチン、ピレトリン、及び様々なテルペノイドが挙げられる。
【００４５】
本明細書に記載される様々な実施形態において、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は、酵母、糸状菌類、又は藻類などの真核微生物であっても、或いは、細菌などの原核微生物であってもよい。例えば、好適な宿主細胞としては、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クロストリジウム属（Clostridium）、ザイモモナス属（Zymomonas）、大腸菌属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、クレブシエラ属（Klebsiella）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、及びストレプトミセス属（Streptomyces）からなる群から選択される属の細胞を挙げることができる。
【００４６】
一部の実施形態では、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路を含む組換え微生物は酵母である。好適な酵母の例としては、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、ザイゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、パキソレン属（Pachysolen）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、又はミクソザイマ属（Myxozyma）からなる群から選択される属の酵母が挙げられる。特定の実施形態では、酵母は油産生酵母である。本開示での使用に好適な例示的油産生酵母としては、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、及びリポミセス属（Lipomyces）のメンバー、例えば、限定はされないが、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、リポミセス・スタルケイ（Lipomycesstarkey）、Ｌ．リポフェルス（L. lipoferus）、Ｃ．レブカウフィ（C. revkaufi）、Ｃ．プルケリマ（C. pulcherrima）、Ｃ．ウチリス（C. utilis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullans）、Ｔ．クタネウム（T. cutaneum）、クリプトコッカス・カルバツス（Cryptococcus curvatus）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、及びＲ．グラミニス（R. graminis）の種が挙げられる。
【００４７】
当該技術分野において理解されるであろうとおり、内因性酵素は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテート生合成経路の上流又は経路中の重要な基質及び／又は中間体を望ましくない副生成物に変換し得る。従って、一部の実施形態では、本組換え微生物は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテート生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。
【００４８】
一実施形態では、本組換え微生物は、脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＸＰ＿５０４４０６、ＸＰ＿５０４８５７、ＸＰ＿５０４３１１、ＸＰ＿５００８５５、ＸＰ＿５００８５６、ＸＰ＿５００４０２、ＸＰ＿５０００９７、ＸＰ＿５０１７４８、ＸＰ＿５００５６０、ＸＰ＿５０１１４８、ＸＰ＿５０１６６７、ＸＰ＿５００２７３、ＢＡＡ０２０４１、ＣＡＡ３９３６６、ＣＡＡ３９３６７、ＢＡＡ０２２１０、ＢＡＡ０２２１１、ＢＡＡ０２２１２、ＢＡＡ０２２１３、ＢＡＡ０２２１４、ＡＡＯ７３９５２、ＡＡＯ７３９５３、ＡＡＯ７３９５４、ＡＡＯ７３９５５、ＡＡＯ７３９５６、ＡＡＯ７３９５８、ＡＡＯ７３９５９、ＡＡＯ７３９６０、ＡＡＯ７３９６１、ＡＡＯ７３９５７、ＸＰ＿００２５４６２７８、又はこれらのホモログから選択される１つ以上の酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。組換え細菌微生物に関連して、組換え細菌微生物は、ＢＡＭ４９６４９、ＡＡＢ８０８６７、ＡＡＢ１７４６２、ＡＤＬ２７５３４、ＡＡＵ２４３５２、ＡＡＡ８７６０２、ＣＡＡ３４６１２、ＡＢＭ１７７０１、ＡＡＡ２５７６０、ＣＡＢ５１０４７、ＡＡＣ８２９６７、ＷＰ＿０１１０２７３４８、又はこれらのホモログから選択される１つ以上の酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【００４９】
別の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、ＣＡＧ７９２１４、ＡＡＡ３４３２２、ＡＡＡ３４３６１、ＡＡＡ３４３６３、ＣＡＡ２９９０１、ＢＡＡ０４７６１、ＡＡＡ３４８９１、又はこれらのホモログから選択される１つ以上の酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。組換え細菌微生物に関連して、組換え細菌微生物は、ＡＡＢ０８６４３、ＣＡＢ１５２７１、ＢＡＮ５５７４９、ＣＡＣ４４５１６、ＡＤＫ１６９６８、ＡＥＩ３７６３４、ＷＰ＿０００９７３０４７、ＷＰ＿０２５４３３４２２、ＷＰ＿０３５１８４１０７、ＷＰ＿０２６４８４８４２、ＣＥＬ８０９２０、ＷＰ＿０２６８１８６５７、ＷＰ＿００５２９３７０７、ＷＰ＿００５８８３９６０、又はこれらのホモログから選択される１つ以上の酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【００５０】
組換え微生物が酵母微生物である実施形態では、本組換え微生物は、ペルオキシソームアセンブリ及び／又はペルオキシソーム酵素移入に関与する１つ以上の酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。組換え酵母微生物は、ＸＰ＿５０５７５４、ＸＰ＿５０１９８６、ＸＰ＿５０１３１１、ＸＰ＿５０４８４５、ＸＰ＿５０３３２６、ＸＰ＿５０４０２９、ＸＰ＿００２５４９８６８、ＸＰ＿００２５４７１５６、ＸＰ＿００２５４５２２７、ＸＰ＿００２５４７３５０、ＸＰ＿００２５４６９９０、ＥＩＷ１１５３９、ＥＩＷ０８０９４、ＥＩＷ１１４７２、ＥＩＷ０９７４３、ＥＩＷ０８２８６、又はこれらのホモログから選択される１つ以上の酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【００５１】
別の実施形態では、本組換え微生物は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを妨げる、即ち、経路基質又は生成物の、望ましくない副生成物への変換を触媒する１つ以上の内因性レダクターゼ又はデサチュラーゼ酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。
【００５２】
別の実施形態では、本組換え微生物は、所望の生成物、例えば、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応する不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの望ましくない変換を触媒する１つ以上の内因性アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼ酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。
【００５３】
別の実施形態では、本組換え微生物は、１つ以上の不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ中間体の生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ及びＣＴＲＧ＿０６２０９、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ及びＣＴＧ＿０４３９０、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のアシル−ＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１７６４及びＣＴＲＧ＿０１７６５、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のアシル−ＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【００５４】
別の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪アルデヒド中間体を酸化する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ａ１７８７５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ１５４００ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０１２９８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ２３７９３ｇ、ＣＴＲＧ＿０５０１０及びＣＴＲＧ＿０４４７１、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【００５５】
別の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪アセテート生成物を消費する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のステロールエステラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ３２０３５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ００５２８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１１３８、ＣＴＲＧ＿０１６８３及びＣＴＲＧ＿０４６３０、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のステロールエステラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ１００１０ｇ、ＣＴＲＧ＿０００５７及びＣＴＲＧ＿０６１８５、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｃ１４５２０ｇ、ＣＴＲＧ＿０３３６０及びＣＴＲＧ＿０５０４９、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上の細胞外リパーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ａ２０３５０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ１９１８４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０９３６１ｇ、ＣＴＲＧ＿０５９３０、ＣＴＲＧ＿０４１８８、ＣＴＲＧ＿０２７９９、ＣＴＲＧ＿０３０５２及びＣＴＲＧ＿０３８８５、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上の細胞外リパーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【００５６】
組換え微生物が酵母微生物である実施形態では、外因性不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテート経路遺伝子の１つ以上が、サイトゾル、ミトコンドリア、又は小胞体からなる群から選択される酵母コンパートメントに局在する酵素をコードする。例示的実施形態では、外因性経路遺伝子の１つ以上が、小胞体に局在する酵素をコードする。別の実施形態では、少なくとも２つの外因性経路遺伝子が、小胞体に局在する酵素をコードする。更に別の実施形態では、全ての外因性経路遺伝子が、小胞体に局在する酵素をコードする。
【００５７】
第４の態様において、本願は、本明細書に記載されるとおりの組換え微生物を使用して不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが生成されるまで、炭素源を供給する原料が入った培養培地で組換え微生物を培養すること、及び任意選択で不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを回収することを含む。生成後、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートは、限定はされないが、蒸留、膜に基づく分離、ガスストリッピング、溶媒抽出、及び拡張吸着流動床を含め、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて発酵培地から単離し得る。
【００５８】
一部の実施形態では、組換え微生物、例えば酵母は、乾燥微粒子の形態で回収及び作製されてもよい。酵母が関わる実施形態では、酵母を乾燥させて粉末状酵母を作製し得る。一部の実施形態では、粉末状酵母の作製方法は、液体酵母組成物を空気中で噴霧乾燥し、続いて任意選択で更に乾燥させることを含む。一部の実施形態では、組換え微生物組成物は乾燥時に不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを含み得る。
【００５９】
本明細書に記載されるとおり、本開示の好ましい組換え微生物は、アルカン及び脂肪酸を炭素源として利用する能力を有し得る。しかしながら、当該技術分野において理解されるであろうとおり、限定はされないが、様々な糖（例えば、グルコース、フルクトース、又はスクロース）、グリセロール、アルコール（例えば、エタノール）、有機酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、一酸化炭素、並びに前述のアルカン及び脂肪酸を含め、種々の炭素源を利用し得る。例示的実施形態では、本組換え微生物は、好気的条件下で炭素源を不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートに変換し得る。
【００６０】
上記に指摘したとおり、本願は、本明細書に記載されるとおりの組換え微生物を使用して１つ以上の不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する方法を提供する。一部の実施形態では、生成物は昆虫フェロモンである。本開示を携えた当業者は理解するであろうとおり、種々の異なる外因性及び内因性酵素を組換え宿主微生物で発現させて所望の昆虫フェロモンを生成することができる。本明細書に記載される組換え微生物及び方法を用いて生じさせることが可能な脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、又は脂肪アセテートの形態の例示的昆虫フェロモンとしては、限定はされないが、（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセニルアセテート、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエナール、（９Ｚ，１１Ｅ）−ヘキサデカジエナール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエン−１−オール、（７Ｅ，９Ｚ）−ドデカジエニルアセテート、（Ｚ）−３−ノネン−１−オール、（Ｚ）−５−デセン−１−オール、（Ｚ）−５−デセニルアセテート、（Ｅ）−５−デセン−１−オール、（Ｅ）−５−デセニルアセテート、（Ｚ）−７−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−７−ドデセニルアセテート、（Ｅ）−８−ドデセン−１−オール、（Ｅ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−８−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−８−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−ドデセン−１−オール、（Ｚ）−９−ドデセニルアセテート、（Ｚ）−９−テトラデセン−１−オール、（Ｚ）−１１−テトラデセン−１−オール、（Ｚ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｅ）−１１−テトラデセン−１−オール、（Ｅ）−１１−テトラデセニルアセテート、（Ｚ）−７−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−７−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−９−ヘキサデセナール、（Ｚ）−９−ヘキサデセニルアセテート、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン−１−オール、（Ｚ）−１３−オクタデセン−１−オール、及び（Ｚ）−１３−オクタデセナールが挙げられる。
【００６１】
第５の態様において、本願は、本明細書に記載される昆虫フェロモン生成組換え微生物の１つ以上を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本組成物は、組換え微生物によって生成される１つ以上の昆虫フェロモンを更に含み得る。更なる実施形態では、組換え微生物によって生成される１つ以上の毒性タンパク質又はポリペプチドを更に含み得る。
【００６２】
図面の簡単な説明
本開示の例示的実施形態を図面に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】飽和脂肪アシル−ＣｏＡの、不飽和脂肪アルコールへの変換を示す。
【図２】飽和脂肪酸の、一不飽和又は多価不飽和脂肪アルデヒド、アルコール、又はアセテートへの変換を示す。
【図３】飽和脂肪酸の、一不飽和又は多価不飽和脂肪アルデヒド、アルコール、又はアセテートへの追加的な変換経路を示す。
【図４】飽和脂肪酸の、様々なトリエン、ジエン、エポキシド、及び奇数鎖フェロモンへの変換経路を示す。
【図５】Ｗ３０３Ａ及びＢＹ４７４２  ΔＰＯＸ１からのＺ１１−ヘキサデセノール生成を示す。空のベクター（ＥＶ）、エジプトヨトウ（S. littoralis）レダクターゼ（ＦＡＲ−ＳＬ）、オオタバコガ（H. armigera）レダクターゼ（ＦＡＲ−ＨＡ）、カブラヤガ（A. segetum）レダクターゼ（ＦＡＲ−ＡＳ）を発現する株。エラーバーは、Ｎ＝２の生物学的に独立した試料から求めた標準偏差を表す。
【図６Ａ】空のベクターを発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を用いたＺ１１−ヘキサデセン酸の生体内変化産物の試料クロマトグラムを示す。黒色の線：基質添加なし。紫色の線：基質としてＺ１１−ヘキサデセン酸を加えた。
【図６Ｂ】オオタバコガ（Helicoverpa armigera）アルコール形成レダクターゼを発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を用いたＺ１１−ヘキサデセン酸の生体内変化産物の試料クロマトグラムを示す。黒色の線：基質添加なし。紫色の線：基質としてＺ１１−ヘキサデセン酸を加えた。
【図７Ａ】Ｚ１１−ヘキサデセノール標準化合物のＧＣ−ＭＳフラグメンテーションパターンの比較を示す。
【図７Ｂ】生物学的に誘導したＺ１１−ヘキサデセノールのＧＣ−ＭＳフラグメンテーションパターンの比較を示す。
【図８】Ｗ３０３Ａ（野生型）及びＢＹ４７４２  ΔＰＯＸ１（β酸化欠失突然変異体）の生成物分析のため回収した時点におけるバイオマスを示す。空のベクター（ＥＶ）、エジプトヨトウ（S. littoralis）レダクターゼ（ＦＡＲ−ＳＬ）、オオタバコガ（H. armigera）レダクターゼ（ＦＡＲ−ＨＡ）、カブラヤガ（A. segetum）レダクターゼ（ＦＡＲ−ＡＳ）を発現する株。エラーバーは、Ｎ＝２の生物学的に独立した試料から求めた標準偏差を表す。
【図９】標準物質を用いて作成したＺ１１−ヘキサデセノール検量線を示す。試料は実施例３の材料及び方法に記載する抽出及び分析方法で作成した。エラーバーは、Ｎ＝３の試料から求めた標準偏差を表す。
【図１０】伸長ＯＬＥ１プロモーター配列（淡黄色）、ＯＬＥ１プロモーター（オレンジ色）、ＯＬＥ１リーダー配列（濃い灰色）、昆虫デサチュラーゼ配列などのシントン（薄い灰色）、及びＶＳＰ１３ターミネーター配列（青色）を含むｐＯＬＥ１カセットを示す。
【図１１Ａ】ｐＯＬＥ１カセットのバリデーション、及び補完アッセイを示す。ＹＰＤ＋パルミトレイン酸。Ｄａｓｈｅｒ＝ＧＦＰシントン。
【図１１Ｂ】ｐＯＬＥ１カセットのバリデーション、及び補完アッセイを示す。ＹＰＤ−パルミトレイン酸。Ｄａｓｈｅｒ＝ＧＦＰシントン。
【図１１Ｃ】ｐＯＬＥ１カセットのバリデーション、及び補完アッセイを示す。ＣＭ−Ｕｒａグルコース＋パルミトレイン酸。Ｄａｓｈｅｒ＝ＧＦＰシントン。
【図１１Ｄ】ｐＯＬＥ１カセットのバリデーション、及び補完アッセイを示す。ＣＭ−Ｕｒａグルコース−パルミトレイン酸。Ｄａｓｈｅｒ＝ＧＦＰシントン。
【図１１Ｅ】ｐＯＬＥ１カセットのバリデーション、及び補完アッセイを示す。図１１Ａ〜図１１Ｄの株のマップ。Ｄａｓｈｅｒ＝ＧＦＰシントン。
【図１２Ａ】ＹＰＤ上でのＵＦＡなしでのΔＯＬＥ１成長の補完を示す。
【図１２Ｂ】ＣＭ−Ｕｒａグルコース上でのＵＦＡなしでのΔＯＬＥ１成長の補完を示す。
【図１３Ａ】Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１デサチュラーゼ（青色）、キメライラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼ（赤色）を発現するΔＯＬＥ１株の完全脂肪酸スペクトルを示す。
【図１３Ｂ】Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１デサチュラーゼ（赤色）及びキメライラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼ（青色）を発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１株の５．５分〜８分の保持時間内に範囲を絞った脂肪酸スペクトルを示す。
【図１４Ａ】標準化合物の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸のＧＣ−ＭＳフラグメンテーションパターンの比較を示す。
【図１４Ｂ】生物学的に誘導した（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸のＧＣ−ＭＳフラグメンテーションパターンの比較を示す。
【図１５】パルミチン酸及びパルミトレイン酸を補足した培養下における様々な脂肪アルコール経路変異体を発現するΔＯＬＥ１からのＣ１６脂肪アルコール生成を示す。エラーバーは代謝産物定量化精度の５％の不確かさを表す。
【図１６】パルミチン酸を供給したとき（黒色）及びパルミチン酸及びパルミトレイン酸を供給したとき（オレンジ色）の脂肪アルコール経路ＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃを発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を用いた生体内変化産物Ｃ１６脂肪酸の代表的なクロマトグラムを示す。パルミチン酸を供給した陰性対照株（空のベクターを有する）（紫色）のプロファイル。
【図１７】脂肪アルコール経路ＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＳＬ＿ｒｅｄｕｃ（青色）、ＳＣ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ（赤色）、ＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ（緑色）、ＳＣ＿ｄｅｓａｔ−ＳＬ＿ｒｅｄｕｃ（ピンク色）を発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）の細胞ペレットにおいて（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸が検出されたことを示す。
【図１８】パルミチン酸のみを補足した培養下における様々な脂肪アルコール経路変異体を発現するΔＯＬＥ１からのＣ１６脂肪アルコール生成を示す。エラーバーは代謝産物定量化精度の５％の不確かさを表す。
【図１９Ａ】（Ｚ）−１１−ヘキサデセノールの検出を示す。標準物質のフラグメンテーションパターン。フォローアップ実験でｍ／ｚ２９７．３を用いてアルコールを選択的に検出した。内部標準も検出するため、質量２０８及び３８７．３も含めた。
【図１９Ｂ】（Ｚ）−１１−ヘキサデセノールの検出を示す。特定のマスフラグメントの検出に加え、保持時間を第二段階の確認として用いた。保持時間は６．２２である。
【図１９Ｃ】（Ｚ）−１１−ヘキサデセノールの検出を示す。同じ方法でＳＩＭモード（２９７．３）において検出したときの２つの異なる位置異性体９Ｚ−及び１１Ｚ−ヘキサデセノールの比較。
【図２０】ｐＸＩＣＬ発現カセット構成を示す。Ｃ．アルビカンス（C. albicans）ＯＬＥ１リーダー−カブラヤガ（A. segetum）デサチュラーゼ融合物も示す。
【図２１Ａ】ｍＣｈｅｒｒｙ対照の組込みを示す。陰性（水のみ）対照形質転換プレート。
【図２１Ｂ】ｍＣｈｅｒｒｙ対照の組込みを示す。ｐＰＶ０１３７  ｍＣｈｅｒｒｙ形質転換プレート。
【図２１Ｃ】ｍＣｈｅｒｒｙ対照の組込みを示す。陰性対照クローンからのパッチプレート。
【図２１Ｄ】ｍＣｈｅｒｒｙ対照の組込みを示す。ｐＰＶ０１３７クローンからのパッチプレート。
【図２２】観察された総コロニーの関数としての組込み効率を示す。形質転換にＤＮＡを加えない対照プレートは３５０コロニーを有することが観察された（オレンジ色の線で示す）。陽性組込み体であることが確認されたクローンの割合は総コロニー数と正の相関がある。６，０００総コロニーを超えると急激な増加が観察される。このデータは、陽性組込み体の存在によって観察されるバックグラウンド成長が増加することを示唆する。一部の形質転換については効率が十分に高く、バックグラウンド集団が陽性組込み体集団と比べて小さくなった。
【図２３】カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）ＳＰＶ０５３株のクロマトグラムオーバーレイを示す。ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）対照実験と比較して、クルミマダラメイガ（A. transitella）（青色）及びアメリカタバコガ（H. Zea）（緑色）デサチュラーゼについて６．２２分に明らかなピークを認めることができる。従って、Ｚ−１１−ヘキサデセン酸の形成は、活性Ｚ１１−デサチュラーゼを発現する株にのみ観察可能である。
【図２４Ａ】１１Ｚ−位置異性体の確認を示す。２４５ｍ／ｚのイオンフラグメントの特異的ピークが、クルミマダラメイガ（A. transitella）又はアメリカタバコガ（H. Zea）のいずれかに由来するＺ１１−デサチュラーゼを発現するＣ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３にのみ観察された。
【図２４Ｂ】１１Ｚ−位置異性体の確認を示す。標準物質のフラグメンテーションパターン。
【図２４Ｃ】１１Ｚ−位置異性体の確認を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ対照のフラグメンテーションパターンは図２４Ｂ、図２４Ｄ及び図２４Ｅのものと著しく異なる。
【図２４Ｄ】１１Ｚ−位置異性体の確認を示す。発現したアメリカタバコガ（H. Zea）由来のデサチュラーゼを含む試料中の新規に形成された化合物のフラグメンテーションパターンは標準と一致する。
【図２４Ｅ】１１Ｚ−位置異性体の確認を示す。発現したクルミマダラメイガ（A. transitella）由来のデサチュラーゼを含む試料中の新規に形成された化合物のフラグメンテーションパターンは標準と一致する。
【図２５Ａ】テトラデカン酸メチルとインキュベートした種々のＣ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３株のＧＣ−ＦＩＤクロマトグラムを示す。スペクトル全体。クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）由来のＺ１１−デサチュラーゼを発現する株についてＺ１１−Ｃ１６：１ピークの出現を観察することができる。
【図２５Ｂ】テトラデカン酸メチルとインキュベートした種々のＣ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３株のＧＣ−ＦＩＤクロマトグラムを示す。Ｃ１４〜Ｃ１８範囲の拡大。４．８分に新規ピークが見え、これはＺ１１−Ｃ１４：１に対応する可能性がある。Ｚ９−Ｃ１８：１近傍に別のピークも見え、これはＺ１１−Ｃ１８：１に対応する可能性がある。
【図２６】コドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ変異体のみが、ＳＰＶ１４０スクリーニングで検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生成することを示す。対照＝ＳＰＶ１４０のｐＰＶ１０１組込み体、イラクサギンウワバ（T. ni）天然＝天然コドン使用のイラクサギンウワバ（T. ni）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９５）、イラクサギンウワバ（T. ni）ＨＳ  ｏｐｔ＝ヒト（Homo sapiens）コドン最適化したイラクサギンウワバ（T. ni）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９６）、イラクサギンウワバ（T. ni）ＨＳ  ｏｐｔ  Ｙｌリーダー＝ヒト（Homo sapiens）コドン最適化した、且つスワッピングしたＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１リーダー配列を有するイラクサギンウワバ（T. ni）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９７）、アメリカタバコガ（H. Zea）天然＝天然コドン使用のアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９８）、アメリカタバコガ（H. Zea）ＨＳ  ｏｐｔ＝ヒト（Homo sapiens）コドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ１９９）、アメリカタバコガ（H. Zea）ＨＳ  ｏｐｔ  Ｙｌリーダー＝ヒト（Homo sapiens）コドン最適化した、且つスワッピングしたＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１リーダー配列を有するアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ２００）、クルミマダラメイガ（A. transitella）天然＝天然コドン使用のクルミマダラメイガ（A. transitella）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＰＶ２０１）。全てのデータは３つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２７】コドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ変異体のみが、ＳＰＶ３００スクリーニングで検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を産生することを示す。ラベルは親株及びデサチュラーゼ発現カセットのプラスミドを示す。ｐＰＶ１０１＝ｈｒＧＦＰ対照、ｐＰＶ１９８＝天然コドン使用のアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ、ｐＰＶ１９９＝ヒト（Homo sapiens）コドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ、ｐＰＶ２００＝ヒト（Homo sapiens）コドン最適化した、且つスワッピングしたＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１リーダー配列を有するアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ、ｐＰＶ２０１＝天然コドン使用のクルミマダラメイガ（A. transitella）Ｚ１１デサチュラーゼ。
【図２８】ＳＰＶ１４０及びＳＰＶ３００バックグラウンドにおけるデサチュラーゼスクリーニングの最終細胞密度を示す。デサチュラーゼカセットを組み込むＳＰＶ３００株がより高い細胞密度に成長した。
【図２９】ヒト（H. sapiens）コドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼを発現するＳＰＶ１４０及びＳＰＶ３００株の個々の分離株Ｚ１１−ヘキサデセン酸力価を示す。
【図３０】カンジダ・ビスワナチイ（トロピカリス）（Candida viswanathii（tropicalis））のＺ１１−１６ＯＨ生成株（ＳＰＶ０４９０）と対照株（ＳＰＶ０４８８）とを比べた抽出代謝産物のクロマトグラムオーバーレイを示す。
【図３１】一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路との競合を低下又は消失させるために欠失させ又は破壊し得る経路を示す。
【図３２Ａ】ｐＥＸＰクローンのＹＰＤ培地におけるＺ９−１６ＯＨ及びＺ１１−１６ＯＨ力価を示す。２つの独立したコンピテント細胞調製物（Ｃｏｍｐ．細胞調製物１、Ｃｏｍｐ．細胞調製物２）からＴＥＦプロモーター下でアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＥＸＰプロモーター下でオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現する１０個の分離株を親陰性対照（ＳＰＶ３００）及びデサチュラーゼ単独陰性対照（ＳＰＶ４５９  Ｈｚ＿ｄｅｓａｔ単独）と比較した。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。＊半限定Ｃ：Ｎ＝８０条件下におけるクローン５及びクローン１８からの１レプリケートが試料ワークアップの間に失われたため、その条件の力価は単一データ点によるものである（Ｎ＝１、Ｃｏｍｐ．細胞調製物１クローン１８及びＣｏｍｐ．細胞調製物２クローン５）。
【図３２Ｂ】ｐＥＸＰクローンの半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地におけるＺ９−１６ＯＨ及びＺ１１−１６ＯＨ力価を示す。２つの独立したコンピテント細胞調製物（Ｃｏｍｐ．細胞調製物１、Ｃｏｍｐ．細胞調製物２）からＴＥＦプロモーター下でアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＥＸＰプロモーター下でオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現する１０個の分離株を親陰性対照（ＳＰＶ３００）及びデサチュラーゼ単独陰性対照（ＳＰＶ４５９  Ｈｚ＿ｄｅｓａｔ単独）と比較した。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。＊半限定Ｃ：Ｎ＝８０条件下におけるクローン５及びクローン１８からの１レプリケートが試料ワークアップの間に失われたため、その条件の力価は単一データ点によるものである（Ｎ＝１、Ｃｏｍｐ．細胞調製物１クローン１８及びＣｏｍｐ．細胞調製物２クローン５）。
【図３３Ａ】ｐＥＸＰ１クローンのＹＰＤ培地における１６炭素脂肪酸種のプロファイルを示す。ＴＥＦプロモーター下でアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＥＸＰプロモーター下でオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現する５つの選択クローンの１６炭素脂質プロファイルを親陰性対照（ＳＰＶ３００）及びデサチュラーゼ単独陰性対照（ＳＰＶ４５９  Ｈｚ＿ｄｅｓａｔ単独）と比較する。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。
【図３３Ｂ】ｐＥＸＰ１クローンの半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地における１６炭素脂肪酸種のプロファイルを示す。ＴＥＦプロモーター下でアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＥＸＰプロモーター下でオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現する５つの選択クローンの１６炭素脂質プロファイルを親陰性対照（ＳＰＶ３００）及びデサチュラーゼ単独陰性対照（ＳＰＶ４５９  Ｈｚ＿ｄｅｓａｔ単独）と比較する。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。
【図３４】ｐＴＡＬ１クローンの半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地におけるＺ９−１６ＯＨ及びＺ１１−１６ＯＨ力価を示す。ＴＥＦプロモーター下でアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＴＡＬプロモーター下でオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現する９つの分離株を親陰性対照（ＳＰＶ３００）及びＥＸＰプロモーターを用いてオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲ発現をドライブする陽性Ｂｄｒ経路対照（ＳＰＶ５７５、ＳＰＶ５７８）と比較した。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。
【図３５】ｐＴＡＬ１クローンの半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地における１６炭素脂肪酸種のプロファイルを示す。ＴＥＦプロモーター下でアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＥＸＰプロモーター下でオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現する５つの選択クローンの１６炭素脂質プロファイルを親陰性対照（ＳＰＶ３００）及びＥＸＰプロモーターを用いてオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲ発現をドライブする陽性Ｂｄｒ経路対照（ＳＰＶ５７５、ＳＰＶ５７８）と比較する。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。＊は、レプリケートの１つが試料処理中に失われた、Ｎ＝１のクローンを示す。
【図３６】４８時間の生物変換後の半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地における完全Ｂｄｒ経路ｐＴＡＬ１スクリーニング（アメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ（ｐＴＥＦ）及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現する株）の完全脂質プロファイルを示す。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。＊は、レプリケートの１つが試料処理中に失われた、Ｎ＝１のクローンを示す。
【図３７Ａ】２４時間の生物変換後の半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地におけるＳＰＶ４７１（天然Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）のＺ９−１６ＯＨ力価を示す。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。
【図３７Ｂ】２４時間の生物変換後の半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地におけるＳＰＶ４７１（天然Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）の脂肪酸力価を示す。エラーバーは、各株及び条件についてのテクニカルレプリケート（Ｎ＝２）から測定したＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。
【図３８】２４時間の生物変換後の半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地におけるＳＰＶ４７１（天然Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）完全脂質プロファイルを示す。
【図３９Ａ】ＳＰＶ４７１（天然Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）Ｚ９−１６ＯＨ力価の経時変化を示す。１６Ａｃｉｄの生物変換は半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地でパルミチン酸メチル（１６Ａｃｉｄ）基質を使用して行った。
【図３９Ｂ】ＳＰＶ４７１（天然Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）Ｚ９−１６Ａｃｉｄ力価の経時変化を示す。１６Ａｃｉｄの生物変換は半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地でパルミチン酸メチル（１６Ａｃｉｄ）基質を使用して行った。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
配列
配列番号１〜配列番号３８の配列表は本願の一部であり、参照によって本明細書に援用される。この配列表は本文書の末尾に提供される。
【００６５】
詳細な説明
定義
本開示を解釈する際、以下の定義及び略記を用いるものとする。
【００６６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。従って、例えば「フェロモン」という表現は複数のかかるフェロモンを含み、及び「微生物」という表現は１つ以上の微生物への言及を含むなどとする。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」、又はこれらの任意の他の変化形は、非排他的包含を含むことが意図される。要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を含み得る。更に、反する旨が明記されない限り、「又は」は排他的「又は」でなく、包含的「又は」を指す。
【００６８】
用語「約」及び「およそ」は、本明細書で数値を修飾して使用されるとき、その明示された値を挟んだ近い範囲を示す。「Ｘ」が値であった場合、「約Ｘ」又は「およそＸ」は０．９Ｘ〜１．１Ｘの値、又は一部の実施形態では０．９５Ｘ〜１．０５Ｘの値を指示し得る。「約Ｘ」又は「およそＸ」という任意の表現は、少なくともその値Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、及び１．０５Ｘを具体的に指示する。従って、「約Ｘ」及び「およそＸ」は、例えば「０．９８Ｘ」のクレーム限定についての明細書のサポートを教示及び提供することが意図される。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「微生物の」、「微生物（microbial organism）」、及び「微生物（microorganism）」は、古細菌、細菌又は真核生物（後者の真核生物には、酵母及び糸状菌、原虫、藻類、又は高等原生生物界（Protista）が含まれる）のドメイン内に含まれる顕微鏡的細胞として存在する任意の生物を含む。従って、この用語は、顕微鏡的サイズを有する原核又は真核細胞又は生物を包含することが意図され、全ての種の細菌、古細菌、及び真正細菌並びに真核微生物、例えば酵母及び真菌が含まれる。また、化学物質の作成のため培養することのできる任意の種の細胞培養物も含まれる。
【００７０】
本明細書に記載されるとおり、一部の実施形態では、本組換え微生物は原核微生物である。一部の実施形態では、原核微生物は細菌である。「細菌」、又は「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は以下のとおりの少なくとも１１の異なる分類を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、これには２つの主要な細区分がある：（１）高Ｇ＋Ｃ群（放線菌類（Actinomycetes）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、ミクロコッカス（Micrococcus）など）（２）低Ｇ＋Ｃ群（桿菌（Bacillus）、クロストリジウム類（Clostridia）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、ブドウ球菌類（Staphylococci）、レンサ球菌類（Streptococci）、マイコプラズマ類（Mycoplasmas））；（２）プロテオバクテリア門（Proteobacteria）、例えば、紅色光合成細菌＋非光合成グラム陰性菌（最も「一般的な」グラム陰性菌を含む）；（３）シアノバクテリア（Cyanobacteria）、例えば酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータ類（Spirochetes）及び関連種；（５）プランクトミセス（Planctomyces）；（６）バクテロイデス（Bacteroides）、フラボバクテリア（Flavobacteria）；（７）クラミジア（Chlamydia）；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気光合成生物も）；（１０）放射線耐性ミクロコッカス及び近縁類；（１１）サーモトガ属（Thermotoga）及びサーモサイホ属（Thermosipho）好熱菌類。
【００７１】
「グラム陰性菌」には、球菌、非腸内桿菌、及び腸内桿菌が含まれる。グラム陰性菌の属としては、例えば、ナイセリア属（Neisseria）、スピリルム属（Spirillum）、パスツレラ属（Pasteurella）、ブルセラ属（Brucella）、エルシニア属（Yersinia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ボルデテラ属（Bordetella）、大腸菌属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、ビブリオ属（Vibrio）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バクテロイデス属（Bacteroides）、アセトバクター属（Acetobacter）、アエロバクター属（Aerobacter）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アゾトバクター属（Azotobacter）、スピリルム属（Spirilla）、セラチア属（Serratia）、ビブリオ属（Vibrio）、リゾビウム属（Rhizobium）、クラミジア属（Chlamydia）、リケッチア属（Rickettsia）、トレポネーマ属（Treponema）、及びフゾバクテリウム属（Fusobacterium）が挙げられる。
【００７２】
「グラム陽性菌」には、球菌、非胞子形成桿菌、及び胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性菌の属としては、例えば、アクチノミセス属（Actinomyces）、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、リステリア属（Listeria）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、ノカルジア属（Nocardia）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、及びストレプトミセス属（Streptomyces）が挙げられる。
【００７３】
用語「組換え微生物」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書では同義的に使用され、内因性酵素を発現又は過剰発現するか、ベクターに含まれる異種酵素など、組込みコンストラクト中の異種酵素を発現するように遺伝子修飾されている、又は内因性遺伝子の発現の変化を有する微生物を指す。「変化」とは、遺伝子の発現、又は１つ以上のポリペプチド又はポリペプチドサブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は１つ以上のポリペプチド又はポリペプチドサブユニットの活性が上方制御又は下方制御されて、その変化がない場合に観察されるものと比べて発現、レベル、又は活性が高くなる又は低くなることを意味する。例えば、用語「変化させる」は「阻害する」を意味し得るが、この語句「変化する」の使用はこの定義に限定されない。用語「組換え微生物」及び「組換え宿主細胞」は、特定の組換え微生物を指すのみならず、かかる微生物の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解される。突然変異又は環境の影響のいずれかに起因して後続の世代である種の修飾が起こり得るため、かかる子孫は実際上は親細胞と同一でないこともあるが、それでもなお本明細書で使用されるとおりのこの用語の範囲内に含まれる。
【００７４】
遺伝子配列に関する用語「発現」は、遺伝子の転写を指し、及び適切な場合、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。従って、文脈から明らかであろうとおり、タンパク質の発現はオープンリーディングフレーム配列の転写及び翻訳によって生じる。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は選択の配列によってコードされる所望の産物の量のいずれかに基づき決まり得る。例えば、選択の配列から転写されたｍＲＮＡは、ｑＲＴ−ＰＣＲによるか、又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量化し得る（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照されたい）。選択の配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法、例えば、ＥＬＩＳＡによるか、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることによるか、又はウエスタンブロッティング若しくはラジオイムノアッセイなど、かかる活性と独立した、タンパク質を認識して結合する抗体を用いるアッセイを利用することにより定量化し得る。Sambrook et al., 1989、前掲を参照されたい。
【００７５】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書では用語「核酸」と同義的に使用され、限定はされないが、任意の長さの一本鎖又は二本鎖センス又はアンチセンスデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び適切な場合、ｓｉＲＮＡを含めた、任意の長さの一本鎖又は二本鎖センス又はアンチセンスリボ核酸（ＲＮＡ）を含め、ヌクレオチド、ヌクレオシド又はこれら類似体を含む２つ以上の単量体で構成された有機ポリマーを指す。用語「ヌクレオチド」は、プリン又はピリミジン塩基及びリン酸基に結合したリボース又はデオキシリボース糖からなる幾つかの化合物のいずれかを指し、核酸の基本的な構造単位である。用語「ヌクレオシド」は、デオキシリボース又はリボースと組み合わさったプリン又はピリミジン塩基からなる（グアノシン又はアデノシンとしての）化合物を指し、特に核酸に見られる。用語「ヌクレオチド類似体」又は「ヌクレオシド類似体」は、１つ以上の個々の原子が異なる原子又は異なる官能基に置き換えられているそれぞれヌクレオチド又はヌクレオシドを指す。従って、用語のポリヌクレオチドには、任意の長さの核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体及び断片が含まれる。３ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドはヌクレオチドオリゴマー又はオリゴヌクレオチドとも称される。
【００７６】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドには「遺伝子」が含まれること、及び本明細書に記載される核酸分子には「ベクター」又は「プラスミド」が含まれることが理解される。従って、用語「遺伝子」は、「構造遺伝子」とも称され、１つ以上のタンパク質又は酵素の全て又は一部を含む特定のアミノ酸配列をコードする、且つ例えば遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得るポリヌクレオチドを指す。遺伝子の転写領域には、イントロン、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び３’−ＵＴＲを含めた非翻訳領域、並びにコード配列が含まれ得る。
【００７７】
用語「酵素」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の化学的又は生化学的反応を触媒又は促進する任意の物質を指し、これには、通常、全面的又は部分的に１つ又は複数のポリペプチドで構成された酵素が含まれるが、ポリヌクレオチドを含む異なる分子で構成された酵素が含まれてもよい。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しない」は、本開示の微生物又は酵素活性に関連して使用されるとき、その微生物又は酵素が、言及される種の野生型株を含めた、言及される種の天然に存在する株には通常見られない少なくとも１つの遺伝子変化を有することを意味するように意図される。遺伝子変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸付加、核酸欠失及び／又は微生物の遺伝物質の他の機能破壊が含まれる。かかる修飾は、例えば、言及される種の異種、相同、又は異種及び相同の両方のポリペプチドについてのコード領域及びその機能的断片を含む。更なる修飾は、例えば、修飾が遺伝子又はオペロンの発現を変化させる非コード調節領域を含む。例示的な天然に存在しない微生物又は酵素活性としては、上記に記載されるヒドロキシル化活性が挙げられる。
【００７９】
用語「外因性」は、様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関連して本明細書で使用されるとき、自然中の所与の酵母、細菌、生物、微生物、又は細胞に通常は又は天然では見られない及び／又はそれによって産生されない分子を指す。
【００８０】
他方で、用語「内因性」又は「天然」は、様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関連して本明細書で使用されるとき、自然中の所与の酵母、細菌、生物、微生物、又は細胞に通常又は天然で見られる及び／又はそれによって産生される分子を指す。
【００８１】
用語「異種」は、本明細書において修飾された宿主細胞に関連して使用されるとき、以下の少なくとも１つが真である様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等を指す：（ａ）その分子が宿主細胞にとって外来性（「外因性」）である（即ち、そこに天然では見られない）；（ｂ）その分子が所与の宿主微生物又は宿主細胞に天然で見られる（例えば、「それにとって内因性」である）が、細胞における非天然の位置又は非天然の量で産生される；及び／又は（ｃ）その分子は内因性ヌクレオチド又はアミノ酸配列とヌクレオチド又はアミノ酸配列が異なり、そのため内因的に見られるとおりの内因性ヌクレオチド又はアミノ酸とヌクレオチド又はアミノ酸配列が異なる分子が細胞において非天然の（例えば、天然で見られるよりも多い）量で産生される。
【００８２】
用語「ホモログ」は、第１のファミリー又は種の元の酵素又は遺伝子に関連して本明細書で使用されるとき、第１のファミリー又は種の元の酵素又は遺伝子に対応する第２のファミリー又は種の酵素又は遺伝子であることが機能、構造、又はゲノム分析によって決定される第２のファミリー又は種の異なる酵素又は遺伝子を指す。ホモログは、多くの場合、機能、構造、又はゲノム上の類似性を有する。遺伝子プローブ及びＰＣＲを用いて酵素又は遺伝子のホモログを容易にクローニングし得る技法は公知である。クローニングされた配列のホモログとしてのアイデンティティは、機能アッセイを用いて、及び／又は遺伝子のゲノムマッピングにより確認することができる。
【００８３】
タンパク質は、遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が第２の遺伝子と類似したアミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質と「相同性」を有し、又は「相同」である。或いは、タンパク質は、２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質と相同性を有する。従って、用語「相同タンパク質」は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するように意図される。特定の例では、２つのタンパク質間の相同性は、進化によって関係付けられた、その共通の祖先を示唆する。
【００８４】
用語「脂肪酸」は、本明細書で使用されるとき、構造Ｒ−ＣＯＯＨ（式中、ＲはＣ６〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状又は環状炭化水素であり、及びカルボキシル基は１位にある）の化合物を指す。詳細な実施形態では、ＲはＣ６〜Ｃ２４飽和又は不飽和直鎖炭化水素であり、及びカルボキシル基は１位にある。
【００８５】
用語「脂肪アルコール」は、本明細書で使用されるとき、式Ｒ−ＯＨ（式中、ＲはＣ６〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状又は環状炭化水素である）を有する脂肪族アルコールを指す。詳細な実施形態では、ＲはＣ６〜Ｃ２４飽和又は不飽和直鎖炭化水素である。
【００８６】
用語「脂肪アシル−ＣｏＡ」は、構造Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１（式中、Ｒ１は補酵素Ａである）を有する化合物を指し、及び用語「脂肪アシル−ＡＣＰ」は、構造Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１（式中、Ｒ１はアシルキャリアータンパク質ＡＣＰである）を有する化合物を指す。
【００８７】
序論
本開示は、低コスト原料から高価値の生成物を費用効率良く生産する新規技術の必要性に対処するものである。具体的には、本発明者らは、合成昆虫フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体を含めた広範囲に及ぶ不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートを低コスト原料から生成する能力を有する組換え微生物の開発によってこの必要性に対処した。従って、本開示の態様は、低コスト原料から高価値産物を生成するように組換え微生物を改変することができ、それにより高価値産物を生成するための従来の合成方法を回避し得るという本発明者らの発見に基づく。
【００８８】
上記で考察したとおり、組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを合成するように改変することができる。本明細書に記載されるとおり合成した一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールは、対応するアルデヒド又はアセテートに更に変換することができる。従って、本開示の様々な実施形態を用いて、脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートから選択される種々の昆虫フェロモンを合成することができる。加えて、本明細書に記載される実施形態はまた、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体の合成にも用いることができる。
【００８９】
フェロモン
上記に記載したとおり、本開示の実施形態は、組換え微生物を用いた１つ以上の昆虫フェロモンの合成を提供する。フェロモンは、種内における化学的コミュニケーション機能のため特定の昆虫によって分泌される揮発性の化学的化合物である。即ち、フェロモンは、同じ種のメンバーに社会的反応を惹起する、分泌又は排泄される化学的因子である。とりわけ、警報フェロモン、食物の道標フェロモン、性フェロモン、集合フェロモン、自己顕示フェロモン、解発フェロモン、起動フェロモン、及び縄張りフェロモンがあり、これらは行動又は生理に影響を及ぼす。
【００９０】
本明細書に開示される組換え微生物及び方法を用いて合成することのできる昆虫フェロモンの非限定的な例としては、表１に掲載する直鎖アルコール、アルデヒド、及びアセテートが挙げられる。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
【表２】
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【００９３】
【表３】
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【００９４】
【表４】
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【００９５】
【表５】
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【００９６】
【表６】
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【００９７】
【表７】
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【００９８】
【表８】
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【００９９】
【表９】
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【０１００】
一部の態様において、本開示に教示されるとおり合成されるフェロモンには、表２ａに掲載される昆虫の行動を調節する表２ａに掲載される少なくとも１つのフェロモンが含まれる。他の態様において、本明細書に開示される組換え微生物及び方法を用いて合成することのできる昆虫フェロモンの非限定的な例としては、表２ａに掲載されるアルコール、アルデヒド、及びアセテートが挙げられる。しかしながら、本明細書に記載される微生物は、表１及び表２ａに掲載されるＣ６〜Ｃ２０フェロモンの合成に限定されない。むしろ、本開示の微生物はまた、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体を含めた、様々なＣ６〜Ｃ２４一不飽和又は多価不飽和脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートの合成においても利用することができる。
【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
【表１１】
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【０１０３】
多くのフェロモンは、末端水素が官能基によって置換されている炭化水素骨格を含む（Ryan MF (2002). Insect Chemoreception. Fundamental and Applied. Kluwer Academic Publishers）。表２ｂは一部の一般的な官能基をその式、接頭辞及び接尾辞と共に示す。隣接炭素からの水素の喪失によって生じた１つ以上の二重結合の存在によって分子の不飽和度が決まると共に、炭化水素の呼称が−アン（-ane）（多重結合なし）から−エン（-ene）に変わる。２つ及び３つの二重結合の存在は、名称がそれぞれ−ジエン及び−トリエンで終わることにより示される。各二重結合の位置は、それが始まる炭素の位置に対応する数字によって表され、各炭素は、官能基に結合しているものから付番される。官能基が結合している炭素を−１−と呼ぶ。フェロモンは、限定はされないが、１０（デカ−）、１２（ドデカ−）、１４（テトラデカ−）、１６（ヘキサデカ−）、又は１８（オクタデカ−）炭素長を数える炭化水素鎖長を有し得る。二重結合の存在は別の効果を有する。二重結合は、分子を２つの可能な配置（各々、異なる分子である幾何異性体に相当する）の一方に固定することにより分子の回転を妨げる。これらは、炭素鎖が二重結合のそれぞれ反対側（トランス）又は同じ側（シス）で接続しているとき、Ｅ（ドイツ語のEntgegen、反対に由来）又はＺ（Zusammen、一緒）のいずれかで呼ばれる。
【０１０４】
【表１２】
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【０１０５】
本明細書に記載されるフェロモンは、ＩＵＰＡＣ命名法又は当業者に公知の様々な略称若しくは変化形を用いて参照することができる。例えば、（１１Ｚ）−ヘキサデセン−１−アールはまた、Ｚ−１１−ヘキサデセン−１−アール、Ｚ−１１−ヘキサデセナール、又はＺ−ｘ−ｙ：Ａｌｄ（式中、ｘは二重結合の位置を表し、及びｙは炭化水素骨格中の炭素の数を表す）とも書くことができる。炭化水素骨格上の官能基を特定するために本明細書で用いられる及び当業者に公知の略称には、アルデヒドを示す「Ａｌｄ」、アルコールを示す「ＯＨ」、及びアセチルを示す「Ａｃ」が含まれる。また、鎖中の炭素数は、数詞を用いるよりむしろ、数字を用いて示すこともできる。従って、本明細書で使用されるとき、１６炭素で構成される不飽和炭素鎖は、ヘキサデセン又は１６と書くことができる。
【０１０６】
同様の略称及び派生語が、フェロモン前駆体を記載するため本明細書で用いられる。例えば、（１１Ｚ）−ヘキサデセン−１−アールの脂肪アシル−ＣｏＡ前駆体は、（１１Ｚ）−ヘキサデセニル−ＣｏＡ又はＺ−１１−１６：アシル−ＣｏＡとして特定することができる。
【０１０７】
本開示は、合成過程の１つ以上の段階についての基質の生成物への変換を触媒する１つ以上の異種酵素を含む組換え微生物を用いた一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、及びアセテートの合成に関する。
【０１０８】
デサチュラーゼ
本開示は、脂肪アシル基質を対応する不飽和脂肪アシル基質に不飽和化する酵素を記載する。
【０１０９】
一部の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡ又はアシル−ＡＣＰの、対応する不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ又はアシル−ＡＣＰへの変換を触媒するためデサチュラーゼが使用される。デサチュラーゼは、少なくとも２つの水素原子を取り除くことにより飽和脂肪酸又は脂肪酸誘導体、例えば、脂肪アシル−ＣｏＡ又は脂肪アシル−ＡＣＰ（本明細書ではまとめて「脂肪アシル」と称される）における炭素−炭素二重結合の形成を触媒して対応する不飽和脂肪酸／アシルを生成させる酵素である。デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのメチル末端に対する内部炭素又は脂肪酸／アシルのカルボニル末端に対する内部炭素でこの酵素が二重結合形成を選択的に触媒する能力に基づき分類される。オメガ（ω）デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのメチル末端に対する固定的な内部炭素で炭素−炭素二重結合の形成を触媒する。例えば、ω３デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのメチル末端から３番目の炭素と４番目の炭素との間で二重結合の形成を触媒する。デルタ（Δ）デサチュラーゼは、脂肪酸のカルボキシル基又は脂肪アシルＣｏＡのカルボニル基から特定の位置で炭素−炭素二重結合の形成を触媒する。例えば、Δ９デサチュラーゼは、脂肪酸のカルボキシル末端又は脂肪アシルＣｏＡのカルボニル基からＣ９〜Ｃ１０の炭素間で二重結合の形成を触媒する。
【０１１０】
本明細書で使用されるとき、デサチュラーゼは、そのデサチュラーゼが二重結合の形成を触媒する位置、及び結果として得られる不飽和炭化水素の幾何配置（即ち、Ｅ／Ｚ）に関連して記載することができる。従って、本明細書で使用されるとき、Ｚ９デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのカルボニル末端からＣ９〜Ｃ１０の炭素間で二重結合の形成を触媒し、それにより２つの炭化水素をシス又はＺ配置で炭素−炭素二重結合の反対側に配向させるΔデサチュラーゼを指す。同様に、本明細書で使用されるとき、Ｚ１１デサチュラーゼは、脂肪酸／アシルのカルボニル末端からＣ１１〜Ｃ１２の炭素間で二重結合の形成を触媒するΔデサチュラーゼを指す。
【０１１１】
デサチュラーゼは保存された構造モチーフを有する。膜貫通デサチュラーゼのこの配列モチーフは、［ＨＸ３−４ＨＸ７−４１（３個の非Ｈｉｓ）ＨＸ２−３（１個の非Ｈｉｓ）ＨＨＸ６１−１８９（４０個の非Ｈｉｓ）ＨＸ２−３（１個の非Ｈｉｓ）ＨＨ］によって特徴付けられる。可溶性デサチュラーゼの配列モチーフは、［Ｄ／ＥＥＸＸＨ］が２つ出現することによって特徴付けられる。
【０１１２】
一部の実施形態では、デサチュラーゼは、脂肪アシル−ＣｏＡにおける二重結合の形成を触媒する脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼである。一部のかかる実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有する。従って、本組換え微生物に使用されるデサチュラーゼは、基質の鎖長に基づき選択することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルデサチュラーゼは、不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの末端ＣｏＡに対して所望の炭素で二重結合の形成を触媒する能力を有する。従って、一部の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡのカルボニル基から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３位で二重結合挿入を触媒するデサチュラーゼを本組換え微生物で使用するように選択することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルデサチュラーゼは、得られる不飽和脂肪アシル−ＣｏＡがシス又はトランス（即ちＺ又はＥ）幾何配置を有するように飽和脂肪アシル−ＣｏＡにおける二重結合の形成を触媒する能力を有する。
【０１１５】
一部の実施形態では、デサチュラーゼは、脂肪アシル−ＡＣＰにおける二重結合の形成を触媒する脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼである。一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有する。従って、本組換え微生物に使用されるデサチュラーゼは、基質の鎖長に基づき選択することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは、不飽和脂肪アシル−ＡＣＰの末端カルボニルに対して所望の炭素で二重結合の形成を触媒する能力を有する。従って、一部の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰのカルボニル基から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３位で二重結合挿入を触媒するデサチュラーゼを本組換え微生物で使用するように選択することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される脂肪アシルデサチュラーゼは、得られる不飽和脂肪アシル−ＡＣＰがシス又はトランス（即ちＺ又はＥ）幾何配置を有するように飽和脂肪アシル−ＣｏＡにおける二重結合の形成を触媒する能力を有する。
【０１１８】
一実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ１１デサチュラーゼである。一部の実施形態では、カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アカオビコハマキ（Argyrotaenia velutiana）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、又はタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種の生物由来のＺ１１デサチュラーゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来の配列番号９、１８、２４及び２６から選択される配列を含む。他の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、カブラヤガ（Agrotis segetum）由来の配列番号１０及び１６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）由来の配列番号１１及び２３から選択される配列を含む。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）由来の配列番号１２、１７及び３０から選択される配列を含む。更なる実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来の配列番号１３、１９、２５、２７及び３１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはキメラポリペプチドを含む。一部の実施形態では、完全な又は部分的なＺ１１デサチュラーゼが別のポリペプチドに融合される。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼのＮ末端天然リーダー配列が別の種由来のオレオシンリーダー配列に置換される。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、配列番号１５、２８及び２９から選択される配列を含む。
【０１１９】
一実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ９デサチュラーゼである。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、アワノメイガ（Ostrinia furnacalis）由来の配列番号２０に示される配列を含む。他の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）由来の配列番号２１に示される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来の配列番号２２に示される配列を含む。
【０１２０】
脂肪アシルレダクターゼ
本開示は、脂肪アシル基質を対応する脂肪アルコール又はアルデヒドに還元する酵素を記載する。
【０１２１】
一部の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する脂肪アルコールへの変換を触媒するため脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼが使用される。一部の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する脂肪アルデヒドへの変換を触媒するため脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼが使用される。脂肪アシルレダクターゼは、脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する脂肪アルコールへの還元又は脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する脂肪アルデヒドへの還元を触媒する酵素である。脂肪アシル−ＣｏＡ及び脂肪アシル−ＡＣＰは、Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１（式中、ＲはＣ６〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状又は環状炭化水素であり、及びＲ１はＣｏＡ又はＡＣＰを表す）の構造を有する。詳細な実施形態では、ＲはＣ６〜Ｃ２４飽和又は不飽和直鎖炭化水素である。「ＣｏＡ」は、脂肪酸の合成及び酸化に関わる非タンパク質アシルキャリアー群である。「ＡＣＰ」は、脂肪酸の合成に用いられる脂肪酸シンターゼのアシルキャリアータンパク質、即ちポリペプチド又はタンパク質サブユニットである。
【０１２２】
従って、一部の実施形態において、本開示は、脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する脂肪アルコールへの還元を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼを提供する。例えば、Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−ＣｏＡは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの２つの分子が酸化されてＮＡＤ（Ｐ）＋になるとＲ−ＣＨ２ＯＨ及びＣｏＡ−ＳＨに変換される。従って、一部のかかる実施形態において、本明細書に記載される組換え微生物は、脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する脂肪アルコールへの還元を触媒する異種脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼを含み得る。例示的実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む。
【０１２３】
他の実施形態において、本開示は、脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する脂肪アルデヒドへの還元を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼを提供する。例えば、Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−ＡＣＰは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの１つの分子が酸化されてＮＡＤ（Ｐ）＋になるとＲ−（ＣＯ）−Ｈ及びＡＣＰ−ＳＨに変換される。一部のかかる実施形態において、本明細書に記載される組換え微生物は、脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する脂肪アルデヒドへの還元を触媒する異種脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼを含み得る。例示的実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、カブラヤガ（Agrotis segetum）、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）、又はオオタバコガ（Helicoverpa amigera）種の生物由来の脂肪アシルレダクターゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、カブラヤガ（Agrotis segetum）由来の配列番号１に示される配列を含む。他の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）由来の配列番号２に示される配列を含む。一部の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）由来の配列番号３及び３２から選択される配列を含む。
【０１２５】
アシル−ＡＣＰシンテターゼ
本開示は、脂肪酸を対応する脂肪アシル−ＡＣＰに結合させる酵素を記載する。
【０１２６】
一部の実施形態では、脂肪酸の、対応する脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するためアシル−ＡＣＰシンテターゼが使用される。アシル−ＡＣＰシンテターゼは、脂肪酸をＡＣＰに結合させて脂肪酸アシル−ＡＣＰを生じさせる能力を有する酵素である。一部の実施形態では、脂肪酸の、対応する脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するためアシル−ＡＣＰシンテターゼが使用されてもよい。一部の実施形態では、アシル−ＡＣＰシンテターゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである。１つのかかる実施形態では、本明細書に記載される組換え微生物は、脂肪酸の、対応する脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する異種アシル−ＡＣＰシンテターゼを含み得る。例示的実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む。
【０１２７】
脂肪酸シンターゼ複合体
本開示は、脂肪酸における炭素鎖の伸長を触媒する酵素を記載する。
【０１２８】
一部の実施形態では、脂肪酸における炭素鎖の開始及び伸長を触媒するため脂肪酸シンターゼ複合体が使用される。「脂肪酸シンターゼ複合体」は、脂肪酸上の炭素鎖の開始及び伸長を触媒する酵素群を指す。ＡＣＰが脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）経路の酵素と共に、生成される脂肪酸の長さ、飽和度、及び分枝形成を調節する。この経路のステップは、脂肪酸生合成（ｆａｂ）及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。所望の生成物に応じて、これらの遺伝子の１つ以上を減弱させ、発現させ、又は過剰発現させることができる。例示的実施形態では、これらの遺伝子の１つ以上が過剰発現する。
【０１２９】
脂肪酸シンターゼの主要なクラスは２つある。Ｉ型（ＦＡＳ  Ｉ）系は単一の大きい多機能性ポリペプチドを利用し、哺乳類及び真菌類の両方に共通している（但しシンターゼの構造配列は真菌類と哺乳類とで異なる）。Ｉ型ＦＡＳ系はまた、ＣＭＮ細菌群（コリネバクテリウム、マイコバクテリア、及びノカルジア）にも見られる。ＩＩ型ＦＡＳ（ＦＡＳ  ＩＩ）は、脂肪酸合成に個別的な単機能酵素を使用することによって特徴付けられ、古細菌及び細菌に見られる。
【０１３０】
ＦＡＳ  Ｉ多酵素ポリペプチド及びＦＡＳ  ＩＩ酵素のドメインは大部分が保存されているため、ＦＡＳ  Ｉ及びＦＡＳ  ＩＩの伸長及び還元機構は実質的に同様である。
【０１３１】
脂肪酸は、一連の脱炭酸性クライゼン縮合反応によってアセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡから合成される。この経路のステップは、脂肪酸生合成（ｆａｂ）及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。この経路の説明については、例えば、Heath et al., Prog. Lipid Res. 40:467, 2001（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。理論によって制限されるものではないが、細菌では、アセチル−ＣｏＡがアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ、４つの別個の遺伝子ａｃｃＡＢＣＤによってコードされるマルチサブユニット酵素）によってカルボキシル化されてマロニル−ＣｏＡを形成する。酵母では、アセチル−ＣｏＡが、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２によってコードされるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵母等価物によってカルボキシル化される。細菌では、マロン酸基がマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）によってＡＣＰに転移してマロニル−ＡＣＰが形成される。酵母では、マロニル−パルミチルトランスフェラーゼドメインがマロニル−ＣｏＡのマロニルをＦＡＳ複合体のＡＣＰドメインに付加する。次に縮合反応が起こり、ここでマロニル−ＡＣＰがアシル−ＣｏＡと合体してβ−ケトアシル−ＡＣＰが生じる。このようにして、炭化水素基質が２炭素伸長する。
【０１３２】
伸長後、β−ケト基がケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、及びエノールレダクターゼ（ＥＲ）の連続作用によって完全飽和炭素鎖に還元される。伸長した脂肪酸鎖はＡＣＰのホスホパンテテイン補欠分子族に共有結合的に結合しつつこれらの活性部位の間を運ばれる。初めに、β−ケトアシル−ＡＣＰがＮＡＤＰＨによって還元されてβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰを形成する。細菌では、このステップはβ−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）によって触媒される。等価な酵母反応がＦＡＳのケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインによって触媒される。次にβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰが脱水してトランス−２−エノイル−ＡＣＰを形成し、これは、細菌ではβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼ（ＦａｂＡ）又はβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（ＦａｂＺ）のいずれか、又は酵母ではＦＡＳのデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインによって触媒される。細菌におけるＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ（それぞれＦａｂｌ、ＦａｂＫ、及びＦａｂＬ）及び酵母におけるＦＡＳのエノールレダクターゼ（ＥＲ）ドメインがトランス−２−エノイル−ＡＣＰを還元すると、アシル−ＡＣＰが形成される。続くサイクルは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（細菌ではそれぞれＦａｂＢ及びＦａｂＦ、又は酵母ではβ−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメイン）によるマロニル−ＡＣＰとアシル−ＡＣＰの縮合から開始される。
【０１３３】
一部の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰから基質と比べて２炭素の伸長を有する対応する脂肪アシル−ＡＣＰへの伸長を触媒するため脂肪酸シンターゼ複合体を使用することができる。
【０１３４】
デヒドロゲナーゼ
本開示は、脂肪アルデヒドの脂肪アルコールへの変換を触媒する酵素を記載する。一部の実施形態では、脂肪アルデヒドの脂肪アルコールへの変換を触媒するためアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、表３）が使用される。アルカン代謝活性型生物、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２４４（Hou et al. 1983）、シュードモナス・ブタノボラ（Pseudomonas butanovora）ＡＴＣＣ  ４３６５５（Vangnai and Arp 2001）、及びアシネトバクター属種（Acinetobacter sp.）株Ｍ−１（Tani et al. 2000）から同定された幾つものＡＤＨが、短鎖〜中鎖アルキルアルコール（Ｃ２〜Ｃ１４）に対して活性があることを示す。加えて、Sigmaから市販されているＡＤＨ、ウマ肝臓ＡＤＨ及びパン酵母ＡＤＨが、長さＣ１０以上の基質に対する検出可能な活性を有する。より長鎖の脂肪アルコールに対する既報告の活性は、基質の難可溶化の影響を受け得る。Sigmaの酵母ＡＤＨは、Ｃ１２〜Ｃ１４アルデヒドに対する活性がほとんど乃至全くないことが（Tani et al. 2000）によって観察され、しかしながら、Ｃ１２及びＣ１６ヒドロキシ−ω−脂肪酸に対する活性は観察されている（Lu et al. 2010）。最近になって、ＬａｄＡヒドロキシラーゼを用いてＣ１５〜Ｃ３６アルカンを分解する生物であるゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）ＮＧ８０−２から２つのＡＤＨが特徴付けられた。両方のＡＤＨにメタノールから１−トリアコンタノール（Ｃ３０）への活性が検出され、ＡＤＨ２については１−オクタノール及びＡＤＨ１についてはエタノールが好ましい基質であった（Liu et al. 2009）。
【０１３５】
全細胞生物変換におけるＡＤＨの使用は、主にケトンからのキラルアルコールの生成に焦点が置かれている（Ernst et al. 2005）（Schroer et al. 2007）。Schroer et al.は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）由来のＡＤＨ及びイソプロパノールによる共役補因子再生を用いて、アセト酢酸メチルからの７９７ｇの（Ｒ）−メチル−３ヒドロキシブタノエートの生成（空時収率２９ｇ／Ｌ／ｈ）を報告した（Schroer et al. 2007）。全細胞形質転換における脂肪族アルコール酸化の例が、商業的に入手されたＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）で、ヘキサノールのヘキサナール（Presecki et al. 2012）への及び２−ヘプタノールの２−ヘプタノン（Cappaert and Larroche 2004）への変換について報告されている。
【０１３６】
【表１３】
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【０１３７】
【表１４】
2019503657.tif 000016
【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
【表１６】
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【０１４０】
【表１７】
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【０１４１】
【表１８】
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【０１４２】
【表１９】
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【０１４３】
【表２０】
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【０１４４】
【表２１】
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【０１４５】
【表２２】
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【０１４６】
【表２３】
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【０１４７】
【表２４】
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【０１４８】
【表２５】
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【０１４９】
【表２６】
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【０１５０】
アルコールオキシダーゼ
本開示は、脂肪アルコールを脂肪アルデヒドに酸化する酵素を記載する。
【０１５１】
一部の実施形態では、脂肪アルコールの脂肪アルデヒドへの変換を触媒するためアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）が使用される。アルコールオキシダーゼは、分子酸素の使用による副生成物としての過酸化水素の形成を介した電子移動により、アルコールの、対応するアルデヒド（又はケトン）への変換を触媒する。ＡＯＸ酵素はフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を必須補因子として利用し、反応媒体中の酸素を用いて再生する。カタラーゼ酵素をＡＯＸにカップリングすると、水及び酸素への触媒変換による過酸化水素の蓄積を回避し得る。
【０１５２】
ＡＯＸは、基質特異性に基づき４種類：（ａ）短鎖アルコールオキシダーゼ、（ｂ）長鎖アルコールオキシダーゼ、（ｃ）芳香族アルコールオキシダーゼ、及び（ｄ）第二級アルコールオキシダーゼに分類することができる（Goswami et al. 2013）。所望の基質の鎖長に応じて、これらの４種類のうちのあるメンバーが評価候補として他のメンバーより好適である。
【０１５３】
短鎖アルコールオキシダーゼ（限定はされないが、現在ＥＣ  １．１．３．１３に分類されているものを含む、表４）は、Ｃ１〜Ｃ８炭素の範囲の低鎖長アルコール基質の酸化を触媒する（van der Klei et al. 1991）（Ozimek et al. 2005）。カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）及びコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）（旧ピキア・パストリス（Pichia pastoris））などのメチロトローフ酵母由来の脂肪族アルコールオキシダーゼは、第一級アルカノールの、対応するアルデヒドへの酸化を触媒し、非分枝状短鎖脂肪族アルコーを選好する。最も広い基質特異性が、プロパルギルアルコール、２−クロロエタノール、２−シアノエタノールを含め、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼに認められる（Dienys et al. 2003）。アルコール酸化で直面する主な課題は、アルデヒド生成物の高い反応性である。２つの液相系（水／溶媒）を利用することにより、アルデヒド生成物が酸に更に変換される前に反応相からアルデヒド生成物をインサイチュで除去することができる。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）アルコールオキシダーゼをウシ肝臓カタラーゼと組み合わせて用いたヘキサノールからのヘキサナール生成が、水相中の安定アルコールオキシダーゼの存在を利用することにより二相系において達成された（Karra-Chaabouni et al. 2003）。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼは、二相性有機反応系を用いたとき、Ｃ６の脂肪族アルコールをＣ１１に酸化させることが可能であった（Murray and Duff 1990）。（Karra-Chaabouni et al. 2003）及び（Murray and Duff 1990）による二相系におけるアルコールオキシダーゼの使用方法は、全体として参照により援用される。
【０１５４】
長鎖アルコールオキシダーゼ（限定はされないが、現在ＥＣ  １．１．３．２０に分類されているものを含む；表５）には、炭素鎖長が６より大きいアルコール基質を酸化させる脂肪アルコールオキシダーゼ、長鎖脂肪酸オキシダーゼ、及び長鎖脂肪アルコールオキシダーゼが含まれる（Goswami et al. 2013）。Banthorpe et al.は、ヨモギギク（Tanacetum vulgare）の葉から精製された長鎖アルコールオキシダーゼを報告し、これはヘキサ−トランス−２−エン−１−オール及びオクタン−１−オールを含めた飽和及び不飽和長鎖アルコール基質を酸化させることが可能であった（Banthorpe 1976）（Cardemil 1978）。ホホバ（Simmondsia chinensis）（Moreau, R.A., Huang 1979）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（Cheng et al. 2004）、及びミヤコグサ（Lotus japonicas）（Zhao et al. 2008）を含めた他の植物種も長鎖アルコールオキシダーゼの供給源として報告されている。脂肪アルコールオキシダーゼは主に酵母種から報告されており（Hommel and Ratledge 1990）（Vanhanen et al. 2000）（Hommel et al. 1994）（Kemp et al. 1990）、これらの酵素は長鎖脂肪酸代謝において重要な役割を果たす（Cheng et al. 2005）。長鎖アルカン及び脂肪酸を分解し及びそこで成長する酵母種由来の脂肪アルコールオキシダーゼは、脂肪アルコールの酸化を触媒する。カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）由来の脂肪アルコールオキシダーゼがミクロソーム細胞画分として単離され、様々な基質について特徴付けられている（Eirich et al. 2004）（Kemp et al. 1988）（Kemp et al. 1991）（Mauersberger et al. 1992）。長さＣ８〜Ｃ１６の第一級アルコールについて有意な活性が観察され、報告されているＫＭは１０〜５０μＭの範囲である（Eirich et al. 2004）。記載されるアルコールオキシダーゼは、例えば、全細胞カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）（Gabelman and Luzio 1997）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）（Duff and Murray 1988）（Murray and Duff 1990）について記載されるとおり中鎖脂肪族アルコールのアルデヒドへの変換に使用し得る。炭化水素基質上で成長する間に糸状菌類由来の長鎖アルコールオキシダーゼが生成された（Kumar and Goswami 2006）（Savitha and Ratledge 1991）。ミヤコグサ（Lotus japonicas）由来の長鎖脂肪アルコールオキシダーゼ（ＬｊＦＡＯ１）が大腸菌（E. coli）で異種発現しており、１−ドデカノール及び１−ヘキサデカノールを含めたアルコール酸化に対する広い基質特異性を呈している（Zhao et al. 2008）。
【０１５５】
【表２７】
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【０１５６】
【表２８】
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【０１５７】
【表２９】
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【０１５８】
【表３０】
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【０１５９】
【表３１】
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【０１６０】
【表３２】
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【０１６１】
【表３３】
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【０１６２】
【表３４】
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【０１６３】
【表３５】
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【０１６４】
【表３６】
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【０１６５】
【表３７】
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【０１６６】
【表３８】
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【０１６７】
【表３９】
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【０１６８】
【表４０】
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【０１６９】
【表４１】
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【０１７０】
【表４２】
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【０１７１】
【表４３】
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【０１７２】
【表４４】
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【０１７３】
【表４５】
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【０１７４】
【表４６】
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【０１７５】
【表４７】
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【０１７６】
【表４８】
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【０１７７】
【表４９】
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【０１７８】
【表５０】
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【０１７９】
【表５１】
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【０１８０】
【表５２】
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【０１８１】
【表５３】
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【０１８２】
【表５４】
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【０１８３】
【表５５】
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【０１８４】
【表５６】
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【０１８５】
アセチルトランスフェラーゼ
本開示は、アルコールを脂肪アセテートに変換する酵素を記載する。
【０１８６】
一部の実施形態では、脂肪アルコールの脂肪アセテートへの変換を触媒するためアセチルトランスフェラーゼが使用される。アセチルトランスフェラーゼは、アセチル基をアセチル−ＣｏＡからアルコールへと転移させることにより酢酸エステルを生成することが可能な酵素である。一部の実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは２．３．１．８４のＥＣ番号を有し得る。
【０１８７】
アセチルトランスフェラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、限定はされないが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、オオカバマダラ（Danaus plexippus）、ニセアメリカタバコガ（Heliotis virescens）、カイコガ（Bombyx mori）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、カブラヤガ（Agrotis segetum）、ニシキギ（Euonymus alatus）種の生物を含め、様々な生物から単離することができる。例示的実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、GenBank受託番号ＡＹ２４２０６６、ＡＹ２４２０６５、ＡＹ２４２０６４、ＡＹ２４２０６３、ＡＹ２４２０６２、ＥＨＪ６５２０５、ＡＣＸ５３８１２、ＮＰ＿００１１８２３８１、ＥＨＪ６５９７７、ＥＨＪ６８５７３、ＫＪ５７９２２６、ＧＵ５９４０６１から選択される配列を含む。更なる例示的アセチルトランスフェラーゼペプチドについては、米国特許出願公開第２０１０／０１９９５４８号（本明細書において参照により援用される）を参照し得る。
【０１８８】
脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰから、デノボ脂肪酸生合成により合成された遊離脂肪酸を放出する。この反応は脂肪酸生合成を終了させる。植物では、脂肪酸生合成はプラスチドで起こり、従ってプラスチド局在アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが必要である。全ての植物の栄養組織においてアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの主な生成物はオレイン酸塩（Ｃ１８：０）、及びそれより程度は少ないがパルミチン酸塩（Ｃ１６：０）である。放出された遊離脂肪酸はプラスチドエンベロープにおいて補酵素Ａと再エステル化され、プラスチドから運び出される。
【０１８９】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼには２つのアイソフォーム、ＦａｔＡ及びＦａｔＢがある。これらのアイソフォームの基質特異性が植物における飽和脂肪酸の鎖長及びレベルを決定する。ＦａｔＡの活性はＣ１８：１−ＡＣＰで最も高い。ＦａｔＡは、Ｃ１８：１−ＡＣＰと比較したときに他のアシル−ＡＣＰに対する活性が極めて低い。ＦａｔＢの活性はＣ１６：０−ＡＣＰで最も高い。また、Ｃ１８：１−ＡＣＰ、続いてＣ１８：０−ＡＣＰ及びＣ１６：１−ＡＣＰでも著しく高い活性を有する。ＦａｔＡ及びＦａｔＢの速度論的研究からは、種々のアシル−ＡＣＰとのそれらの基質特異性はＫｍよりむしろＫｃａｔ値から生じたことが示される。種々の基質とのこれらの２つのアイソフォームのＫｍ値はマイクロモル濃度程度で同様である。ＦａｔＡ及びＦａｔＢのドメイン交換は、アイソフォームのＮ末端がその基質特異性を決定することを示す（Salas JJ and Ohlrogge JB (2002) Characterization of substrate specificity of plant FatA and FatB acyl-ACP thioesterases. Arch Biochem Biophys 403(1): 25-34)）。種子に主に中鎖長飽和脂肪酸を蓄積する植物について、それらは特殊化したＦａｔＢ及び／又はＦａｔＡチオエステラーゼと共に進化した（Voelker T and Kinney AJ (2001) Variations in the biosynthesis of seed-storage lipids. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 335-361）。例えば、ラウリン酸塩（１２：０）は、ココナツの優勢な種子油である。対応して、ココナツ種子に中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が検出された。
【０１９０】
一実施形態では、１つ以上の脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、Ｑ４１６３５、Ｑ３９４７３、Ｐ０５５２１．２、ＡＥＭ７２５１９、ＡＥＭ７２５２０、ＡＥＭ７２５２１、ＡＥＭ７２５２３、ＡＡＣ４９７８４、ＣＡＢ６０８３０、ＥＥＲ８７８２４、ＥＥＲ９６２５２、ＡＢＮ５４２６８、ＡＡＯ７７１８２、ＣＡＨ０９２３６、ＡＣＬ０８３７６、及びこれらのホモログからなる群から選択される。
【０１９１】
毒性タンパク質又はポリペプチドの発現
本開示は、組換え微生物によってコードされる毒性タンパク質、ペプチド、又は小分子を記載する。一部の実施形態では、毒性タンパク質、ペプチド、又は小分子は昆虫フェロモンと共に生合成的に生成される。
【０１９２】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、昆虫にとって毒性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を発現する。一部の実施形態では、毒性タンパク質又はポリペプチドは昆虫病原生物由来である。一部の実施形態では、昆虫病原生物は、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及びセラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）から選択される。詳細な実施形態では、核酸分子はバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）毒素をコードする。
【０１９３】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、発現時に昆虫にとって毒性のある小分子を生成する代謝経路を発現するように改変される。
【０１９４】
例示的実施形態では、本明細書に記載される組換え微生物によって生成される昆虫フェロモンを使用することにより、害虫を誘引し、続いて本明細書に記載される組換え微生物によって同時生成された毒性タンパク質、ペプチド、又は小分子などの毒性物質でその害虫を根絶し得る。
【０１９５】
組換え微生物を使用したフェロモンの生合成
上記で考察したとおり、第１の態様において、本開示は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関する。第１の態様の例示的な実施形態を図１に示す。青色の線は、不飽和脂肪アシルＣｏＡ変換の基質としての役割を果たす飽和アシル−ＣｏＡの生成に用いられる生化学的経路を示す。基質の不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの変換は、宿主の内因性又は外因性酵素によって実施されてもよい。緑色の線は、酵素をコードする外因性核酸分子によって触媒される変換を示す。従って、一部の実施形態では、飽和脂肪アシル−ＣｏＡの一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの変換は、外因性核酸分子によってコードされる少なくとも１つのデサチュラーゼによって触媒される。更なる実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの一不飽和又は多価不飽和脂肪アルコールへの変換は、外因性核酸分子によってコードされる少なくとも１つのレダクターゼによって触媒される。灰色の破線は、アルコールオキシダーゼ又は酸化剤を用いた一不飽和又は多価不飽和脂肪アルデヒドの生成、及びアセチルトランスフェラーゼ又はアセチルクロリドなどの化学物質を用いた一不飽和又は多価不飽和脂肪アセテートの生成など、フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体の合成の下流ステップを示す。赤色のバツ印は宿主にとって天然の経路の欠失又は下方制御を示し、これは改変経路へのフラックスを増加させる。
【０１９６】
従って、一実施形態では、本組換え微生物は、（ａ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｂ）（ａ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。一部の実施形態では、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡは宿主微生物の内因性酵素を用いて生成されてもよい。他の実施形態では、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡは宿主微生物の１つ以上の外因性酵素を用いて生成されてもよい。
【０１９７】
上記に記載したとおり、脂肪アシルデサチュラーゼは、例えば飽和脂肪アシル−ＣｏＡ分子上の炭化水素鎖の不飽和化を触媒して、対応する不飽和脂肪アシルＣｏＡ分子を生じさせる。一部の実施形態では、外因性脂肪アシルデサチュラーゼは、炭化水素鎖に６〜２４個の炭素を有する脂肪アシル−ＣｏＡ分子において少なくとも１つの二重結合の形成を触媒するように選択し、組換え微生物で発現させることができる。従って、一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有するデサチュラーゼである。
【０１９８】
本明細書に記載される外因性脂肪アシルデサチュラーゼは、炭化水素鎖上の所望の位置で不飽和化を触媒するように選択することができる。従って、一部の実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼは、脂肪酸又は例えば脂肪酸ＣｏＡエステルなどのその誘導体のＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、又はＣ１３位に二重結合を生じさせる能力を有する。
【０１９９】
宿主において１つ又は２つ以上の脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼを発現させて、炭化水素鎖上の複数の位置で不飽和化を触媒することができる。一部の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼは宿主微生物にとって異種である。従って、様々な実施形態が、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む組換え微生物を提供する。
【０２００】
一例示的実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ１１デサチュラーゼである。Ｚ１１脂肪アシルデサチュラーゼは、基質のカルボニル基から１１番目の炭素と１２番目の炭素との間の二重結合形成を触媒する。本明細書に記載される様々な実施形態において、Ｚ１１デサチュラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アカオビコハマキ（Argyrotaenia velutiana）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、又はタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種の生物から単離することができる。更なるＺ１１−デサチュラーゼ、又はそれらをコードする核酸配列は、カイコガ（Bombyx mori）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、サウスウエスタンコーンボーラー（Diatraea grandiosella）、ミスジアオリンガ（Earias insulana）、クサオビリンガ（Earias vittella）、コナガ（Plutella xylostella）、カイコガ（Bombyx mori）又はアメリカウリノメイガ（Diaphania nitidalis）から単離することができる。例示的実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、GenBank受託番号ＪＸ６７９２０９、ＪＸ９６４７７４、ＡＦ４１６７３８、ＡＦ５４５４８１、ＥＵ１５２３３５、ＡＡＤ０３７７５、ＡＡＦ８１７８７、及びＡＹ４９３４３８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アカオビコハマキ（Argyrotaenia velutiana）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、又はタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）種の生物由来のＺ１１デサチュラーゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来の配列番号９、１８、２４及び２６から選択される配列を含む。他の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、カブラヤガ（Agrotis segetum）由来の配列番号１０及び１６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）由来の配列番号１１及び２３から選択される配列を含む。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）由来の配列番号１２、１７及び３０から選択される配列を含む。更なる実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来の配列番号１３、１９、２５、２７及び３１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼはキメラポリペプチドを含む。一部の実施形態では、完全な又は部分的なＺ１１デサチュラーゼが別のポリペプチドに融合される。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼのＮ末端天然リーダー配列が別の種由来のオレオシンリーダー配列に置換される。特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、配列番号１５、２８及び２９から選択される配列を含む。
【０２０１】
特定の実施形態では、Ｚ１１デサチュラーゼは、脂肪アシル−ＣｏＡの、Ｚ１１−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，１１−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１５：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−６，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−８，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−１１，１４−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ）−４，６，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｅ）−７，１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｚ）−４，６，１１，１３−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１７：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−８，１１−１７：アシル−ＣｏＡ、Ｚ１１−１８：アシル−ＣｏＡ、Ｅ１１−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−１１，１４−１８：アシル−ＣｏＡ、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する。
【０２０２】
別の例示的実施形態では、脂肪アシルデサチュラーゼはＺ９デサチュラーゼである。Ｚ９脂肪アシルデサチュラーゼは、基質のカルボニル基から９番目の炭素と１０番目の炭素との間の二重結合形成を触媒する。本明細書に記載される様々な実施形態において、Ｚ９デサチュラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、アワノメイガ（Ostrinia furnacalis）、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nobilalis）、ハスオビハマキ（Choristoneura rosaceana）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、タバコガ（Helicoverpa assulta）、又はアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、GenBank受託番号ＡＹ０５７８６２、ＡＦ２４３０４７、ＡＦ５１８０１７、ＥＵ１５２３３２、ＡＦ４８２９０６、及びＡＡＦ８１７８８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、アワノメイガ（Ostrinia furnacalis）由来の配列番号２０に示される配列を含む。他の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）由来の配列番号２１に示される配列を含む。一部の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来の配列番号２２に示される配列を含む。
【０２０３】
特定の実施形態では、Ｚ９デサチュラーゼは、脂肪アシル−ＣｏＡの、Ｚ９−１１：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１２：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−７，９−１２：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−５，９−１３：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−４，９−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１４：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１５：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−６，９−１５：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｅ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１１−１６：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１７：アシル−ＣｏＡ、Ｅ９−１８：アシル−ＣｏＡ、Ｚ９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−５，９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−３，６，９−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−９，１２，１５−１８：アシル−ＣｏＡ、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−１８：アシル−ＣｏＡ、又はこれらの組み合わせから選択される一不飽和又は多価不飽和生成物への変換を触媒する。
【０２０４】
飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの不飽和化は、複数の反応を通じて進めることにより多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡを生成し得る。一部の実施形態では、本組換え微生物は、少なくとも２つの二重結合の形成を触媒する能力を有する二機能性デサチュラーゼを発現し得る。一部の実施形態では、本組換え微生物は、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する２つ以上の脂肪アシルデサチュラーゼをコードする２つ以上の外因性核酸分子を発現し得る。例えば、本組換え微生物は、Ｚ１１デサチュラーゼをコードする外因性核酸分子とＺ９デサチュラーゼをコードする別の外因性核酸分子とを発現し得る。従って、得られる多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡは、９番目の炭素と１０番目の炭素との間に二重結合を有し、且つ１１番目の炭素と１２番目の炭素との間に別の二重結合を有し得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、独立に又は脂肪アシルデサチュラーゼと共に飽和又は一不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの共役多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒するように作用する脂肪アシルコンジュガーゼを発現し得る。
【０２０６】
一実施形態において、本開示は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物を提供し、この組換え微生物は、（ａ）飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｂ）（ａ）からの多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。
【０２０７】
別の実施形態では、本組換え微生物は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する。
【０２０８】
更なる実施形態において、本開示は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの内因性又は外因性供給源から多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物を提供し、この組換え微生物は、（ａ）飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｂ）（ａ）からの多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を発現する。
【０２０９】
別の実施形態では、本組換え微生物は、飽和又は一不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒する、脂肪アシルデサチュラーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子及び脂肪アシルコンジュガーゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する。
【０２１０】
更に別の実施形態では、脂肪アシルコンジュガーゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪アシル−ＣｏＡを基質として利用する能力を有するコンジュガーゼである。
【０２１１】
特定の実施形態では、コンジュガーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、コドリンガ（Cydia pomonella）、エンドウシンクイ（Cydia nigricana）、ホソバヒメハマキ（Lobesia botrana）、ゴママダラメイガ（Myelois cribrella）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、マッソンマツカレハ（Dendrolimus punctatus）、カラントシュートボーラー（Lampronia capitella）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、カイコガ（Bombyx mori）、キンセンカ（Calendula officinalis）、キカラスウリ（Trichosanthes kirilowii）、ザクロ（Punica granatum）、ツルレイシ（Momordica charantia）、ホウセンカ（Impatiens balsamina）、及びリンゴウスチャイロハマキ（Epiphyas postvittana）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、コンジュガーゼは、GenBank受託番号又はUniprotデータベース：Ａ０Ａ０５９ＴＢＦ５、Ａ０Ａ０Ｍ３Ｌ９Ｅ８、Ａ０Ａ０Ｍ３Ｌ９Ｓ４、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＨ８、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＳ８、Ａ０Ａ０Ｍ３ＬＡＨ８、Ｂ６ＣＢＳ４、ＸＰ＿０１３１８３６５６．１、ＸＰ＿００４９２３５６８．２、ＡＬＡ６５４２５．１、ＮＰ＿００１２９６４９４．１、ＮＰ＿００１２７４３３０．１、Ｑ４Ａ１８１、Ｑ７５ＰＬ７、Ｑ９ＦＰＰ８、ＡＹ１７８４４４、ＡＹ１７８４４６、ＡＦ１８２５２１、ＡＦ１８２５２０、Ｑ９５ＵＪ３から選択される配列を含む。
【０２１２】
上記に記載したとおり、脂肪アシルレダクターゼは、例えば不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ分子上のカルボニル基の還元を触媒して対応する不飽和脂肪酸分子を生じさせる。一部の実施形態では、脂肪アルコール形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼはその微生物にとって異種である。従って、様々な実施形態は、不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ分子上のカルボニル基の還元を触媒して対応する不飽和脂肪酸分子を生じさせる脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む組換え微生物を提供する。
【０２１３】
一部の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、カブラヤガ（Agrotis segetum）、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）、又はオオタバコガ（Helicoverpa amigera）種の生物由来である。一部の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼをコードする核酸配列がコドン最適化される。一部の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、  カブラヤガ（Agrotis segetum）由来の配列番号１に示される配列を含む。他の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）由来の配列番号２に示される配列を含む。一部の実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）由来の配列番号３及び３２から選択される配列を含む。
【０２１４】
例示的実施形態では、脂肪アシルレダクターゼは、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの、（Ｚ）−３−ヘキセノール、（Ｚ）−３−ノネノール、（Ｚ）−５−デセノール、（Ｅ）−５−デセノール、（Ｚ）−７−ドデセノール、（Ｅ）−８−ドデセノール、（Ｚ）−８−ドデセノール、（Ｚ）−９−ドデセノール、（Ｚ）−９−テトラデセノール、（Ｚ）−９−ヘキサデセノール、（Ｚ）−１１−テトラデセノール、（Ｚ）−７−ヘキサデセノール、（Ｚ）−１１−ヘキサデセノール、（Ｅ）−１１−テトラデセノール、又は（Ｚ，Ｚ）−１１，１３−ヘキサデカジエノール、（１１Ｚ，１３Ｅ）−ヘキサデカジエノール、（Ｅ，Ｅ）−８，１０−ドデカジエノール、（Ｅ，Ｚ）−７，９−ドデカジエノール、（Ｚ）−１３−オクタデセノール、又はこれらの組み合わせから選択される脂肪アルコール生成物への変換を触媒する。
【０２１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組換え微生物は複数の脂肪アシルレダクターゼを含み得る。従って、かかる実施形態では、本組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも２つの外因性核酸分子を発現する。
【０２１６】
上記で考察したとおり、第２の態様において、本願は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関する。第２の態様の例示的実施形態を図２に示す。青色の線は、宿主にとって内因性の生化学的経路、例えば、ｎ−アルカン、脂肪アルコール、又は脂肪アルデヒドを脂肪酸に変換する経路、又は脂肪酸の脂肪アシル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、又はジカルボン酸への変換を示す。基質からの不飽和脂肪酸への変換は、宿主の内因性又は外因性酵素によって実施され得る。黄色の線は、酵素をコードする外因性核酸分子によって触媒される変換を示す。従って、一部の実施形態では、飽和脂肪酸の飽和脂肪アシル−ＡＣＰへの変換は少なくとも１つの飽和脂肪アシル−ＡＣＰシンテターゼによって触媒されることができ、ここで脂肪アシル−ＡＣＰシンテターゼは外因性核酸分子によってコードされる。更なる実施形態では、飽和脂肪アシル−ＡＣＰの一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰへの変換は少なくとも１つの脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼによって触媒されることができ、ここで脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは外因性核酸分子によってコードされる。更に別の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰは、脂肪酸シンターゼ複合体及び炭素源、例えばマロニル−ＡＣＰを用いて相対的に少なくとも２炭素伸長させることができる。１つのかかる実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する２炭素伸長一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰへの変換は少なくとも１つの脂肪酸シンターゼ複合体によって触媒されることができ、ここで脂肪酸シンターゼ複合体は１つ以上の外因性核酸分子によってコードされる。更に別の実施形態では、伸長した一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰの一不飽和又は多価不飽和脂肪アルデヒドへの変換が脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼによって触媒されることができ、ここで脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼは外因性核酸分子によってコードされる。一部の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アルデヒドは対応する一不飽和又は多価不飽和脂肪アルコールに変換されることができ、ここで基質の生成物への変換はデヒドロゲナーゼによって触媒され、デヒドロゲナーゼは内因性又は外因性核酸分子によってコードされる。破線は、アセチルトランスフェラーゼ又はメタセシス、又は続く化学転換を利用した機能化フェロモンの生成など、本開示の下流ステップを示す。赤色のバツ印は宿主にとって天然の経路の欠失又は下方制御を示し、これは改変経路へのフラックスを増加させる。
【０２１７】
一実施形態では、本組換え微生物は、（ａ）：Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；（ｂ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；（ｃ）（ｂ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、（ｂ）の生成物と比べて２炭素の伸長を有する対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒する脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の内因性又は外因性核酸分子；（ｄ）：（ｃ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子；及び（ｅ）（ｄ）からの一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドＣ６〜Ｃ２４の、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を発現する。一部の実施形態では、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸は宿主微生物の内因性酵素を用いて生成され得る。他の実施形態では、飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸は宿主微生物の１つ以上の外因性酵素によって生成され得る。
【０２１８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の、対応する飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰへの変換を触媒するアシル−ＡＣＰシンテターゼを含む。一部の実施形態においてアシル−ＡＣＰシンテターゼは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４炭素原子の鎖長を有する脂肪酸を基質として利用する能力を有するシンテターゼである。例示的実施形態では、本組換え微生物は、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）種の生物由来の異種アシル−ＡＣＰシンテターゼを含み得る。
【０２１９】
一部の実施形態では、本組換え微生物は脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼを含む。一部の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは可溶性デサチュラーゼである。他の実施形態では、脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、又はキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物由来である。
【０２２０】
一部の実施形態では、本組換え微生物は脂肪酸シンターゼ複合体を含む。一部の実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の核酸分子は内因性核酸分子である。他の実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体をコードする１つ以上の核酸分子は外因性核酸分子である。
【０２２１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＡＣＰの、対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼを含む。例示的実施形態では、脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼは、ハナテンジクアオイ（Pelargonium hortorum）、オオトウワタ（Asclepias syriaca）、及びキャッツクロー（Uncaria tomentosa）種の生物由来である。一部の実施形態では、本組換え微生物は、不飽和脂肪アルデヒドを対応する不飽和脂肪アルコールに変換するデヒドロゲナーゼを含む。一部の実施形態では、デヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は組換え微生物にとって内因性である。他の実施形態では、デヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は組換え微生物にとって外因性である。例示的実施形態では、デヒドロゲナーゼをコードする内因性又は外因性核酸分子は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、大腸菌（Escherichia coli）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、又はカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）種の生物から単離される。
【０２２２】
上記で考察したとおり、第３の態様において、本願は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換え微生物に関する。第２の態様の例示的実施形態を図３に示す。青色の線は、宿主にとって内因性の生化学的経路、例えば、ｎ−アルカン、脂肪アルコール、又は脂肪アルデヒドを脂肪酸に変換する経路、又は脂肪酸の脂肪アシル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、又はジカルボン酸への変換を示す。基質の不飽和脂肪酸への変換は、宿主の内因性又は外因性酵素によって実施され得る。黄色の線は、酵素をコードする外因性核酸分子によって触媒される変換を示す。従って、一部の実施形態では、飽和脂肪酸の飽和脂肪アシル−ＡＣＰへの変換は少なくとも１つの飽和脂肪アシル−ＡＣＰシンテターゼによって触媒されることができ、ここで脂肪アシル−ＡＣＰシンテターゼは外因性核酸分子によってコードされる。非天然飽和脂肪アシル−ＡＣＰチオエステルは、不飽和化に好適であり、且つβ酸化又は脂肪酸伸長に用いられるＣｏＡ−チオエステルとは異なる基質を作り出す。更なる実施形態では、飽和脂肪アシル−ＡＣＰの一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰへの変換は少なくとも１つの脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼによって触媒されることができ、ここで脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼは外因性核酸分子によってコードされる。更に別の実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＡＣＰは脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼによって対応する一不飽和又は多価不飽和脂肪酸に変換されることができる。詳細な実施形態では、可溶性脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを使用して遊離脂肪酸を放出させ、ＣｏＡチオエステルに再活性化させることができる。Ｑ４１６３５、Ｑ３９４７３、Ｐ０５５２１．２、ＡＥＭ７２５１９、ＡＥＭ７２５２０、ＡＥＭ７２５２１、ＡＥＭ７２５２３、ＡＡＣ４９７８４、ＣＡＢ６０８３０、ＥＥＲ８７８２４、ＥＥＲ９６２５２、ＡＢＮ５４２６８、ＡＡＯ７７１８２、ＣＡＨ０９２３６、ＡＣＬ０８３７６、及びこれらのホモログを含めた脂肪アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを使用し得る。更なる実施形態では、一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡは、エロンガーゼ及び炭素源、例えばマロニル−ＡＣＰを用いて相対的に少なくとも２炭素伸長させることができる。更に別の実施形態では、伸長した一不飽和又は多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡの一不飽和又は多価不飽和脂肪アルコールへの変換が脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼによって触媒されることができ、ここで脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼは外因性核酸分子によってコードされる。破線は、アセチルトランスフェラーゼ又はメタセシス、又は続く化学転換を利用した機能化フェロモンの生成など、本開示の下流ステップを示す。赤色のバツ印は宿主にとって天然の経路の欠失又は下方制御を示し、これは改変経路へのフラックスを増加させる。
【０２２３】
本明細書に教示されるとおり生成される脂肪アルコールを更に変換して、昆虫フェロモン、フレグランス、フレーバー、及びポリマー中間体などの下流生成物を生成することができ、これにはアルデヒド又はアセテート官能基が利用される。従って、一部の実施形態では、本組換え微生物は、アルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み、このアルコールオキシダーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼは、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アルデヒドへの変換を触媒する能力を有する。他の実施形態では、本組換え微生物は、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの、対応するＣ６〜Ｃ２４脂肪アセテートへの変換を触媒する能力を有するアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの内因性又は外因性核酸分子を更に含み得る。特定の実施形態では、アセチルトランスフェラーゼ、又はそれをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、オオカバマダラ（Danaus plexippus）、ニセアメリカタバコガ（Heliotis virescens）、カイコガ（Bombyx mori）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、カブラヤガ（Agrotis segetum）、ニシキギ（Euonymus alatus）種の生物から単離することができる。例示的実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、GenBank受託番号ＡＹ２４２０６６、ＡＹ２４２０６５、ＡＹ２４２０６４、ＡＹ２４２０６３、ＡＹ２４２０６２、ＥＨＪ６５２０５、ＡＣＸ５３８１２、ＮＰ＿００１１８２３８１、ＥＨＪ６５９７７、ＥＨＪ６８５７３、ＫＪ５７９２２６、ＧＵ５９４０６１から選択される配列を含む。
【０２２４】
組換え微生物
本開示は、様々な外因性酵素を発現するように改変することのできる微生物を提供する。
【０２２５】
本明細書に記載される様々な実施形態において、組換え微生物は真核微生物である。一部の実施形態では、真核微生物は酵母である。例示的実施形態では、酵母は、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、ザイゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、パキソレン属（Pachysolen）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、及びミクソザイマ属（Myxozyma）からなる群から選択される属のメンバーである。
【０２２６】
本発明者らは、カンジダ属（Candida）及びヤロウイア属（Yarrowia）などの油産生酵母が、意外にも、Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール基質及び生成物に対して高い耐性を有することを発見した。従って、かかる一例示的実施形態では、本発明の組換え微生物は油産生酵母である。更なる実施形態では、油産生酵母は、ヤロウイア属（Yarrowia）、カンジダ属（Candida）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、及びリポミセス属（Lipomyces）からなる群から選択される属のメンバーである。更に別の実施形態では、油産生酵母は、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、リポミセス・スタルケイ（Lipomyces starkey）、Ｌ．リポフェルス（L. lipoferus）、Ｃ．レブカウフィ（C. revkaufi）、Ｃ．プルケリマ（C. pulcherrima）、Ｃ．ウチリス（C. utilis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullans）、Ｔ．クタネウム（T. cutaneum）、クリプトコッカス・カルバツス（Cryptococcus curvatus）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、及びＲ．グラミニス（R. graminis）から選択される種のメンバーである。
【０２２７】
一部の実施形態では、本組換え微生物は原核微生物である。例示的実施形態では、原核微生物は、大腸菌属（Escherichia）、クロストリジウム属（Clostridium）、ザイモモナス属（Zymomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、クレブシエラ属（Klebsiella）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、及びブレビバクテリウム属（Brevibacterium）からなる群から選択される属のメンバーである。
【０２２８】
一部の実施形態では、本組換え微生物を使用して、本明細書に開示される一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが生成される。
【０２２９】
従って、別の態様において、本発明は、本明細書に記載される組換え微生物を使用して一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートが生成されるまで、炭素源を供給する原料が入った培養培地で組換え微生物を培養することを含む。更なる実施形態では、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートは回収される。回収は、蒸留、膜に基づく分離、ガスストリッピング、溶媒抽出、及び拡張吸着流動床など、当該技術分野において公知の方法によることができる。
【０２３０】
一部の実施形態では、原料は炭素源を含む。本明細書に記載される様々な実施形態において、炭素源は、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、及び一酸化炭素から選択され得る。更なる実施形態では、糖は、グルコース、フルクトース、及びスクロースからなる群から選択される。
【０２３１】
酵素改変
組換え微生物の酵素は、基質の生成物への変換の１つ以上の側面が向上するように改変することができる。本開示の方法での使用向けに更に改変し得る酵素の非限定的な例としては、デサチュラーゼ（例えば、脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼ又は脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼ）、アシル−ＡＣＰシンテターゼ、脂肪酸シンテターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼ、及びアルコールオキシダーゼ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。これらの酵素は、触媒活性の向上、選択性の向上、安定性の向上、様々な発酵条件（温度、ｐＨ等）に対する耐性の向上、又は様々な代謝基質、生成物、副生成物、中間体等に対する耐性の向上のため改変することができる。
【０２３２】
デサチュラーゼ酵素は、不飽和基質の不飽和化における触媒活性の向上、炭化水素選択性の向上、Ｅ型生成物と比べたＺ型生成物、又はＺ型生成物と比べたＥ型生成物の選択性の向上のため改変することができる。例えば、Ｚ９脂肪アシルデサチュラーゼは、飽和脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの基質の生成物への変換における収率が向上するように、及びそれに加えて又は代えて、対応するＺ−９脂肪アシル−ＣｏＡの生成のための９位における不飽和化の選択性が向上するように改変することができる。更なる非限定的な例において、脂肪アシル−ＡＣＰシンテターゼはＡＣＰライゲーション活性の向上のため改変することができ；脂肪酸シンターゼ複合体酵素は、脂肪酸基質の伸長の触媒活性の向上のため改変することができ；脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼは、脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する脂肪アルコールへの還元における触媒活性の向上のため改変することができ；脂肪アルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼは、脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する脂肪アルデヒドへの還元における触媒活性の向上のため改変することができ；デヒドロゲナーゼは、脂肪アシル−ＡＣＰの、対応する脂肪アルコールへの変換における触媒活性の向上のため改変することができ；アルコールオキシダーゼは、脂肪アルコールの、対応する脂肪アルデヒドへの変換における触媒活性の向上のため改変することができ；及びアセチルトランスフェラーゼは、脂肪アルコールの、対応する脂肪アセテートへの変換における触媒活性の向上のため改変することができる。
【０２３３】
用語「触媒活性の向上」は、特定の酵素活性に関連して本明細書で使用されるとき、非改変デサチュラーゼ（例えば脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼ又は脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼ）、脂肪アルコール又はアルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼ、アシル−ＡＣＰシンテターゼ、脂肪酸シンテターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、アシルトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼ、又はアルコールオキシダーゼ酵素など、同等の非改変酵素と比べて計測したレベルよりも高いレベルの酵素活性を指す。例えば、特異的酵素の過剰発現は、その酵素に関する細胞の活性レベルの増加につながり得る。デサチュラーゼ（例えば脂肪アシル−ＣｏＡデサチュラーゼ又は脂肪アシル−ＡＣＰデサチュラーゼ）、脂肪アルコール又はアルデヒド形成脂肪アシルレダクターゼ、アシル−ＡＣＰシンテターゼ、脂肪酸シンテターゼ、脂肪酸シンターゼ複合体、アシルトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼ、又はアルコールオキシダーゼ酵素に突然変異を導入して、触媒活性が向上した改変酵素を得ることができる。酵素活性を増加させる方法は当業者に公知である。かかる技法には、プラスミドコピー数を増加させること及び／又はより強力なプロモーターの使用及び／又は活性化リボスイッチの使用によって酵素の発現を増加させること、突然変異の導入によって酵素の負の調節を軽減すること、特異的突然変異の導入によって比活性を増加させ及び／又は基質に対するＫＭを低下させることによるか、又は定向進化によることが含まれ得る。例えば、Methods in Molecular Biology (vol. 231), ed. Arnold and Georgiou, Humana Press (2003)を参照されたい。
【０２３４】
代謝改変−経路フラックスを増加させるための酵素過剰発現及び遺伝子欠失／下方制御
本明細書に記載される様々な実施形態において、本明細書に記載される生合成経路に関与する組換え微生物の外因性及び内因性酵素は過剰発現させてもよい。
【０２３５】
用語「過剰発現した」又は「過剰発現」は、基礎レベルのｍＲＮＡを発現する又は基礎レベルのタンパク質を有する同様の対応する非修飾細胞と比較したときの、タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの上昇（例えば異常レベル）、及び／又は細胞中のタンパク質のレベルの上昇を指す。詳細な実施形態では、ｍＲＮＡ又はタンパク質は、遺伝子ｍＲＮＡ、タンパク質、及び／又は活性の増加を呈するように改変された微生物において少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、１５倍又はそれ以上過剰発現し得る。
【０２３６】
一部の実施形態では、本開示の組換え微生物は、基質脂肪酸を合成する酵素的能力を含む宿主から作成される。この具体的な実施形態では、脂肪酸の合成又は蓄積を増加させることにより、例えば、改変された脂肪アルコール生成経路に利用可能な脂肪酸の量を増加させることが有用であり得る。
【０２３７】
一部の実施形態では、脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテート生成経路に関与する内因性又は外因性酵素の発現を増加させて脂肪酸から脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートへのフラックスを増加させ、それにより脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートの合成又は蓄積の増加を生じさせることが有用であり得る。
【０２３８】
一部の実施形態では、内因性又は外因性酵素の発現を増加させて補酵素の細胞内レベルを増加させることが有用であり得る。一実施形態では、補酵素はＮＡＤＨである。別の実施形態では、補酵素はＮＡＤＰＨである。一実施形態では、ペントースリン酸経路におけるタンパク質の発現が増加することによりＮＡＤＰＨの細胞内レベルが増加する。ペントースリン酸経路は、還元当量の供給に重要な異化経路であり、且つ生合成反応に重要な同化経路である。一実施形態では、グルコース−６−ホスフェートを６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＺＷＦ１である。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＺＷＦ１（ＹＮＬ２４１Ｃ）である。一実施形態では、Ｄ−グルコピラノース−６−ホスフェートを６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換するグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼを過剰発現させる。別の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼは細菌由来のｚｗｆである。特定の実施形態では、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のｚｗｆ（ＮＰ＿４１６３６６）である。一実施形態では、６−ホスホＤ−グルコノ−１，５−ラクトンをＤ−グルコン酸６−ホスフェートに変換する６−ホスホグルコノラクトナーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは酵母のＳＯＬ３である。特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＳＯＬ３（ＮＰ＿０１２０３３）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは酵母のＳＯＬ４である。特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＳＯＬ４（ＮＰ＿０１１７６４）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは細菌のｐｇｌである。特定の実施形態では、６−ホスホグルコノラクトナーゼは大腸菌（E. coli）のｐｇｌ（ＮＰ＿４１５２８８）である。一実施形態では、Ｄ−グルコン酸６−ホスフェートをＤ−リブロース５−ホスフェートに変換する６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ１である。特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＧＮＤ１（ＹＨＲ１８３Ｗ）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＧＮＤ２である。特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＧＮＤ２（ＹＧＲ２５６Ｗ）である。一部の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のｇｎｄである。特定の実施形態では、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のｇｎｄ（ＮＰ＿４１６５３３）である。一実施形態では、Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェート及びＤ−セドヘプツロース７−ホスフェートをβ−Ｄ−フルクトフラノース６−ホスフェート及びＤ−エリトロース４−ホスフェートに相互変換するトランスアルドラーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは酵母のＴＡＬ１である。特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＴＡＬ１（ＮＰ＿０１３４５８）である。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは酵母のＮＱＭ１である。特定の実施形態では、トランスアルドラーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＮＱＭ１（ＮＰ＿０１１５５７）である。一部の実施形態では、トランスアルドラーゼは細菌のｔａｌである。特定の実施形態では、トランスアルドラーゼは大腸菌（E. coli）のｔａｌＢ（ＮＰ＿４１４５４９）である。特定の実施形態では、トランスアルドラーゼは大腸菌（E. coli）のｔａｌＡ（ＮＰ＿４１６９５９）である。一実施形態では、Ｄ−エリトロース４−ホスフェート及びＤ−キシルロース５−ホスフェートをβ−Ｄ−フルクトフラノース６−ホスフェート及びＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートに相互変換する及び／又はＤ−セドヘプツロース７−ホスフェート及びＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートをＤ−リボース５−ホスフェート及びＤ−キシルロース５−ホスフェートに相互変換するトランスケトラーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは酵母のＴＫＬ１である。特定の実施形態では、トランスケトラーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＴＫＬ１（ＮＰ＿０１５３９９）である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは酵母のＴＫＬ２である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＴＫＬ２（ＮＰ＿００９６７５）である。一部の実施形態では、トランスケトラーゼは細菌のｔｋｔである。特定の実施形態では、トランスケトラーゼは大腸菌（E. coli）のｔｋｔＡ（ＹＰ＿０２６１８８）である。特定の実施形態では、トランスケトラーゼは大腸菌（E. coli）のｔｋｔＢ（ＮＰ＿４１６９６０）である。一実施形態では、Ｄ−リボース５−ホスフェート及びＤ−リブロース５−ホスフェートを相互変換するリボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼは酵母のＲＫＩ１である。特定の実施形態では、リボース−５−リン酸ケトールイソメラーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＫＩ１（ＮＰ＿０１４７３８）である。一部の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼは細菌のｒｐｉである。特定の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼは大腸菌（E. coli）のｒｐｉＡ（ＮＰ＿４１７３８９）である。特定の実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼは大腸菌（E. coli）のｒｐｉＢ（ＮＰ＿４１８５１４）である。一実施形態では、Ｄ−リブロース５−ホスフェート及びＤ−キシルロース５−ホスフェートを相互変換するＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼを過剰発現させる。一部の実施形態では、Ｄ−リブロース−５��リン酸３−エピメラーゼは酵母のＲＰＥ１である。特定の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＥ１（ＮＰ＿０１２４１４）である。一部の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは細菌のｒｐｅである。特定の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼは大腸菌（E. coli）のｒｐｅ（ＮＰ＿４１７８４５）である。
【０２３９】
一実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼの発現を増加させて補酵素の細胞内レベルを増加させる。一実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＤ−トレオ−イソシトレートを２−オキソグルタレートに酸化させると同時にＮＡＤＰＨを生じる。別の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはＤ−トレオ−イソシトレートを２−オキサロスクシネートに酸化すると同時にＮＡＤＰＨを生じる。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは酵母由来のＩＤＰである。特定の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＩＤＰ２（ＹＬＲ１７４Ｗ）である。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは細菌由来のｉｃｄである。特定の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のｉｃｄ（ＮＰ＿４１５６５４）である。
【０２４０】
一部の実施形態では、マレートをピルベートに脱炭酸すると同時にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生じるリンゴ酸酵素の発現を増加させて補酵素の細胞内レベルを増加させる。一実施形態では、リンゴ酸酵素はＮＡＤ＋依存性である。別の実施形態では、リンゴ酸酵素はＮＡＤＰ＋依存性である。一実施形態では、リンゴ酸酵素は細菌由来のＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のｍａｅＡ（ＮＰ＿４１５９９６）である。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはカセイ菌（Lactobacillus casei）由来のｍａｅＥ（ＣＡＱ６８１１９）である。別の実施形態では、リンゴ酸酵素は酵母由来のミトコンドリアＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のＭＡＥ１（ＹＫＬ０２９Ｃ）である。別の実施形態では、リンゴ酸酵素は寄生線虫由来のミトコンドリアＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはブタ回虫（Ascaris suum）由来のＭ８１０５５である。一実施形態では、リンゴ酸酵素は細菌由来のＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のｍａｅＢ（ＮＰ＿４１６９５８）である。一実施形態では、リンゴ酸酵素はトウモロコシ由来のＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼはトウモロコシ（Zea mays）由来のｍｅ１である。
【０２４１】
一部の実施形態では、アルデヒドをカルボン酸に酸化させると同時にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生じるアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を増加させて補酵素の細胞内レベルを増加させる。一実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼはＮＡＤ＋依存性である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼはＮＡＤＰ＋依存性である。一実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは細菌由来のＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のａｌｄＡ（ＮＰ＿４１５９３３）である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは酵母由来の細胞質ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のＡＬＤ６（ＹＰＬ０６１Ｗ）である。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは細菌由来の細胞質ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ＮＡＤＰ＋依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のａｌｄＢ（ＮＰ＿４１８０４５）である。
【０２４２】
一実施形態では、補酵素の細胞内レベルを増加させるための酵素の過剰発現には、補基質の補充と酵素の過剰発現との併用が含まれる。一実施形態では、酵素の過剰発現をそのの補基質の補充と併用すると、生化学的経路を通じたフラックスが増加する。一実施形態では、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼを補基質と共に発現させる。特定の実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼをイソプロパノール補基質と共に発現させる。一実施形態では、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋依存性グルコースデヒドロゲナーゼを補基質と共に発現させる。特定の実施形態では、グルコースデヒドロゲナーゼをグルコース補基質と共に発現させる。
【０２４３】
一実施形態では、トランスヒドロゲナーゼの発現を増加させてＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを相互変換する。一部の実施形態では、トランスヒドロゲナーゼはピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは細菌由来である。特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは大腸菌（E. coli）由来のｐｎｔＡＢ（βサブユニット：ＮＰ＿４１６１１９；αサブユニット：ＮＰ＿４１６１２０）である。一部の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはヒト由来である。特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはヒト（Homo sapiens）由来のＮＮＴ（ＮＰ＿０３６４７５）である。特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはジャガイモ（Solanum tuberosum）由来である。特定の実施形態では、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼはホウレンソウ（Spinacea oleracea）由来である。
【０２４４】
一部の実施形態では、内因性又は外因性タンパク質の発現を増加させて小胞体（ＥＲ）膜増殖を誘導することが有用であり得る。一部の実施形態では、小胞体膜増殖を誘導して脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートの生成を向上させることができる。一実施形態では、ＥＲに面する１つ以上のループを含有する不活性化ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）の発現を増加させる。特定の実施形態では、１つ以上のループは不活性化ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの膜貫通ドメイン６〜７の間にある。一部の実施形態では、不活性化ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）ＹＡＬＩ０Ｅ０４８０７ｐの最初の５００アミノ酸又は最初の５００アミノ酸の部分配列をコードする不活性化タンパク質又はキメラを含む。他の実施形態では、不活性化ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＭＧ１（ＮＰ＿０１３６３６．１）の最初の５２２アミノ酸又は最初の５２２アミノ酸の部分配列をコードする不活性化タンパク質又はキメラを含む。他の実施形態では、不活性化ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＭＧ２（ＮＰ＿０１３５５５．１）の最初の５２２アミノ酸又は最初の５２２アミノ酸の部分配列をコードする不活性化タンパク質又はキメラを含む。一部の実施形態では、１つ以上の調節タンパク質の発現を増加させて、脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートの生成を向上させる。特定の実施形態では、調節タンパク質はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＡＣ１転写因子（ＮＰ＿１１６６２２．１）を含む。特定の実施形態では、調節タンパク質はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）由来のＨＡＣ１転写因子（ＹＡＬＩ０Ｂ１２７１６ｐ）を含む。
【０２４５】
合成又は蓄積の増加は、例えば、上述の脂肪アルコール経路酵素の１つ以上をコードする核酸を過剰発現させることによって達成し得る。１つ又は複数の脂肪アルコール経路酵素の過剰発現は、例えば、１つ又は複数の内因性遺伝子の発現増加によるか、又は１つ又は複数の外来遺伝子の発現、又はその発現の増加によって生じさせることができる。従って、天然に存在する生物は、脂肪アルコール生合成経路酵素をコードする１つ以上の核酸分子の過剰発現によって非天然の脂肪アルコール生成微生物が生じるように容易に修飾することができる。加えて、脂肪アルコール生合成経路中の酵素の活性の増加をもたらす内因性遺伝子の突然変異誘発により、天然に存在しない生物を生じさせることができる。
【０２４６】
本開示を携えた当業者であれば、上記に例示したとおりの当該技術分野において周知の方法を用いて脂肪アルコール経路酵素をコードする少なくとも１つの核酸を脂肪アルコールの生成に十分な量で外因的に発現するように本開示の組換え微生物を構築することができるとおり、本明細書に記載される組換え微生物を容易に構築することが可能であろう。
【０２４７】
天然に存在しない脂肪アルコール生成宿主を構築し、及びその発現レベルを試験する方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換え及び検出方法によって実施することができる。かかる方法については、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)；Ausubo et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999)を参照することができる。
【０２４８】
当該技術分野において公知の種々の機構を用いて外因性又は内因性遺伝子を発現、又は過剰発現させることができる。例えば、宿主生物で機能性の発現制御配列に作動可能に連結された、本明細書に例示されるとおりの１つ以上の脂肪アルコール生合成経路酵素コード核酸を有する１つ又は複数の発現ベクターを構築することができる。本発明の微生物宿主生物における使用に適用可能な発現ベクターとしては、宿主染色体への安定組込みのため操作可能なベクター及び選択配列又はマーカーを含め、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム及び人工染色体が挙げられる。例えば、抗生物質又は毒素耐性を提供し、栄養要求欠損を補完し、又は培養培地にない必須栄養素を供給する選択可能なマーカー遺伝子も含まれ得る。発現制御配列には、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどが含まれてもよく、これらはその技術分野において周知である。２つ以上の外因性コード核酸を共発現させる場合、両方の核酸を例えば単一の発現ベクターに挿入しても、又は別個の発現ベクターに挿入してもよい。単一ベクター発現については、コード核酸を１つの共通の発現制御配列に作動可能に連結してもよく、又は１つの誘導性プロモーター及び１つの構成的プロモーターなど、異なる発現制御配列に連結してもよい。代謝又は合成経路に関与する外来性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を用いて確認することができる。
【０２４９】
発現制御配列は当該技術分野において公知であり、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現をもたらすものが含まれる。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987)）。例示的発現制御配列については、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。
【０２５０】
様々な実施形態において、発現制御配列はポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。「作動可能に連結された」とは、適切な分子（例えば転写活性化因子タンパク質）がその発現制御配列に結合したときに遺伝子発現を可能にするような方法でポリヌクレオチド配列と発現制御配列とが結び付いていることが意味される。作動可能に連結されたプロモーターは、転写及び翻訳の向きに見て選択のポリヌクレオチド配列の上流に位置する。作動可能に連結されたエンハンサーは選択のポリヌクレオチドの上流、その範囲内、又はその下流に位置し得る。
【０２５１】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを生成する生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。
【０２５２】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一部のかかる実施形態では、脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する酵素は、ＸＰ＿５０４４０６、ＸＰ＿５０４８５７、ＸＰ＿５０４３１１、ＸＰ＿５００８５５、ＸＰ＿５００８５６、ＸＰ＿５００４０２、ＸＰ＿５０００９７、ＸＰ＿５０１７４８、ＸＰ＿５００５６０、ＸＰ＿５０１１４８、ＸＰ＿５０１６６７、ＸＰ＿５００２７３、ＢＡＡ０２０４１、ＣＡＡ３９３６６、ＣＡＡ３９３６７、ＢＡＡ０２２１０、ＢＡＡ０２２１１、ＢＡＡ０２２１２、ＢＡＡ０２２１３、ＢＡＡ０２２１４、ＡＡＯ７３９５２、ＡＡＯ７３９５３、ＡＡＯ７３９５４、ＡＡＯ７３９５５、ＡＡＯ７３９５６、ＡＡＯ７３９５８、ＡＡＯ７３９５９、ＡＡＯ７３９６０、ＡＡＯ７３９６１、ＡＡＯ７３９５７、ＸＰ＿００２５４６２７８、ＢＡＭ４９６４９、ＡＡＢ８０８６７、ＡＡＢ１７４６２、ＡＤＬ２７５３４、ＡＡＵ２４３５２、ＡＡＡ８７６０２、ＣＡＡ３４６１２、ＡＢＭ１７７０１、ＡＡＡ２５７６０、ＣＡＢ５１０４７、ＡＡＣ８２９６７、ＷＰ＿０１１０２７３４８、又はこれらのホモログからなる群から選択される。
【０２５３】
他の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一部のかかる実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素は、ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、ＣＡＧ７９２１４、ＡＡＡ３４３２２、ＡＡＡ３４３６１、ＡＡＡ３４３６３、ＣＡＡ２９９０１、ＢＡＡ０４７６１、ＡＡＡ３４８９１、ＡＡＢ０８６４３、ＣＡＢ１５２７１、ＢＡＮ５５７４９、ＣＡＣ４４５１６、ＡＤＫ１６９６８、ＡＥＩ３７６３４、ＷＰ＿０００９７３０４７、ＷＰ＿０２５４３３４２２、ＷＰ＿０３５１８４１０７、ＷＰ＿０２６４８４８４２、ＣＥＬ８０９２０、ＷＰ＿０２６８１８６５７、ＷＰ＿００５２９３７０７、ＷＰ＿００５８８３９６０、又はこれらのホモログからなる群から選択される。
【０２５４】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、ペルオキシソームバイオジェネシスに関与する１つ以上のタンパク質の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。かかる実施形態では、ペルオキシソームバイオジェネシスに関与する１つ以上のタンパク質は、ＸＰ＿５０５７５４、ＸＰ＿５０１９８６、ＸＰ＿５０１３１１、ＸＰ＿５０４８４５、ＸＰ＿５０３３２６、ＸＰ＿５０４０２９、ＸＰ＿００２５４９８６８、ＸＰ＿００２５４７１５６、ＸＰ＿００２５４５２２７、ＸＰ＿００２５４７３５０、ＸＰ＿００２５４６９９０、ＥＩＷ１１５３９、ＥＩＷ０８０９４、ＥＩＷ１１４７２、ＥＩＷ０９７４３、ＥＩＷ０８２８、又はこれらのホモログからなる群から選択される。
【０２５５】
一部の実施形態では、本組換え微生物は、１つ以上の不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ中間体の生合成経路と競合する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ及びＣＴＲＧ＿０６２０９、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ及びＣＴＧ＿０４３９０、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のグリセロールリン脂質アシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のアシル−ＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１７６４及びＣＴＲＧ＿０１７６５、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のアシル−ＣｏＡ／ステロールアシルトランスフェラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【０２５６】
別の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪アルデヒド中間体を酸化する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ａ１７８７５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ１５４００ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０１２９８ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ２３７９３ｇ、ＣＴＲＧ＿０５０１０及びＣＴＲＧ＿０４４７１、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【０２５７】
別の実施形態では、本組換え微生物は、脂肪アセテート生成物を消費する経路内の反応を触媒する１つ以上の内因性酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。一実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のステロールエステラーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｅ３２０３５ｇ、ＹＡＬＩ０Ｅ００５２８ｇ、ＣＴＲＧ＿０１１３８、ＣＴＲＧ＿０１６８３及びＣＴＲＧ＿０４６３０、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のステロールエステラーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｄ１７５３４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｆ１００１０ｇ、ＣＴＲＧ＿０００５７及びＣＴＲＧ＿０６１８５、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のトリアシルグリセロールリパーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ｃ１４５２０ｇ、ＣＴＲＧ＿０３３６０及びＣＴＲＧ＿０５０４９、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上のモノアシルグリセロールリパーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。別の実施形態では、１つ以上の内因性酵素は１つ以上の細胞外リパーゼを含む。組換え酵母微生物に関連して、組換え酵母微生物は、ＹＡＬＩ０Ａ２０３５０ｇ、ＹＡＬＩ０Ｄ１９１８４ｇ、ＹＡＬＩ０Ｂ０９３６１ｇ、ＣＴＲＧ＿０５９３０、ＣＴＲＧ＿０４１８８、ＣＴＲＧ＿０２７９９、ＣＴＲＧ＿０３０５２及びＣＴＲＧ＿０３８８５、又はこれらのホモログからなる群から選択される１つ以上の細胞外リパーゼの活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように改変される。
【０２５８】
別の実施形態では、本組換え微生物は、不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコール、アルデヒド、又はアセテートを妨げる、即ち、経路基質又は生成物の、望ましくない副生成物への変換を触媒する１つ以上の内因性レダクターゼ又はデサチュラーゼ酵素の活性を欠失し、破壊し、変異させ、及び／又は低下させるように操作される。
【０２５９】
微生物合成からの生成物の化学変換
本開示は、組換え微生物によって合成された生成物を下流生成物に変換するために用いることのできる化学変換を記載する。
【０２６０】
一部の実施形態では、微生物によって生成された不飽和脂肪アルコール、アルデヒド、アセテート、又はカルボン酸が続く化学変換を受けることにより、フェロモン、フレグランス、フレーバー、ポリマー、又はポリマー中間体を生成することができる。化学転換の非限定的な例としては、エステル化、メタセシス、及び重合が挙げられる。
【０２６１】
不飽和脂肪カルボン酸は、当該技術分野において公知の方法によってエステル化することができる。例えば、フィッシャーエステル化反応を用いて脂肪カルボン酸を対応する脂肪酸エステルに変換することができる。例えば、Komura, K. et al., Synthesis 2008. 3407-3410を参照されたい。
【０２６２】
炭素鎖の伸長は、不飽和脂肪アルコールをその伸長型誘導体に変換する公知の方法によって実施することができる。オレフィンメタセシス触媒を実施して脂肪炭素鎖上の炭素の数を増加させ、対応する不飽和生成物にＺ型又はＥ型立体化学を付与することができる。
【０２６３】
一般に、反応条件下で安定であり、且つ脂肪基質上の官能基（例えば、アルコール、エステル、カルボン酸、アルデヒド、又はアセテート）と非反応性の任意のメタセシス触媒を本開示で用いることができる。かかる触媒は、例えば、Grubbs（Grubbs, R.H., “Synthesis of large and small molecules using olefin metathesis catalysts.” PMSE Prepr., 2012）（本明細書において全体として参照により援用される）によって記載されるものである。シス選択的など、オレフィンの所望の異性体に応じたメタセシス触媒、例えば、Shahane et al.（Shahane, S., et al. ChemCatChem, 2013. 5(12): p. 3436-3459）（本明細書において全体として参照により援用される）によって記載されるものの１つを使用し得る。シス選択性を呈する特異的触媒１〜５を以下に示し（スキーム１）、これについては以前記載されている（Khan, R.K., et al. J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(28): p. 10258-61；Hartung, J. et al. J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(28): p. 10183-5.；Rosebrugh, L.E., et al. J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(4): p. 1276-9.；Marx, V.M., et al. J. Am. Chem. Soc., 2013. 135(1): p. 94-7.；Herbert, M.B., et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2013. 52(1): p. 310-4；Keitz, B.K., et al. J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(4): p. 2040-3.；Keitz, B.K., et al. J. Am. Chem. Soc., 2012. 134(1): p. 693-9.；Endo, K. et al. J. Am. Chem. Soc., 2011. 133(22): p. 8525-7）。
【化１】
2019503657.tif 000059
【０２６４】
更なるＺ選択的触媒が（Cannon and Grubbs 2013；Bronner et al. 2014；Hartung et al. 2014；Pribisko et al. 2014；Quigley and Grubbs 2014）に記載されており、これらは本明細書において全体として参照により援用される。その優れた安定性及び官能基耐性のため、一部の実施形態においてメタセシス触媒は、限定はされないが、式上＋２酸化状態である金属中心を持ち、１６の電子数を有し、ペンタ配位した、及び一般式ＬＬ’ＡＡ’Ｍ＝ＣＲｂＲｃ又はＬＬ’ＡＡ’Ｍ＝（Ｃ＝）ｎＣＲｂＲｃ；（式中、
Ｍはルテニウム又はオスミウムであり；
Ｌ及びＬ’は、各々独立して、任意の中性電子供与体リガンドであり、ホスフィン、スルホン化ホスフィン、ホスフィト、ホスフィニト、ホスホニト、アルシン、スチブナイト、エーテル、アミン、アミド、イミン、スルホキシド、カルボキシル、ニトロシル、ピリジン、チオエーテル、又は複素環式カルベンから選択され；及び
Ａ及びＡ’は、ハロゲン、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシド、アリールオキシド、Ｃ２〜Ｃ２０アルコキシカルボニル、アリールカルボキシレート、Ｃ１〜Ｃ２０カルボキシレート、アリールスルホニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルスルホニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルスルフィニルから独立して選択されるアニオン性リガンドであり；各リガンドは、任意選択でＣ１〜Ｃ５アルキル、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシで置換されているか；又はハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、又はＣ１〜Ｃ５アルコキシによって任意選択で置換されているフェニル基で置換されており；及びＡ及びＡ’は一緒になって任意選択で二座リガンドを含んでもよく；及び
Ｒｂ及びＲｃは、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ２０カルボキシレート、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルスルホニル及びＣ１〜Ｃ２０アルキルスルフィニルから独立して選択され、Ｒｂ及びＲｃの各々は、任意選択でＣ１〜Ｃ５アルキル、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシで置換されているか、又はハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、又はＣ１〜Ｃ５アルコキシによって任意選択で置換されているフェニル基で置換されている）の中性ルテニウム又はオスミウム金属カルベン錯体を含む（Pederson and Grubbs 2002）。
【０２６５】
「十分に定義付けられた触媒（well defined catalysts）」などの他のメタセシス触媒も使用することができる。かかる触媒としては、限定はされないが、Grubbs et al.（Tetrahedron 1998, 54: 4413-4450）によって記載されるシュロック（Schrock）のモリブデンメタセシス触媒、２，６−ジイソプロピルフェニルイミドネオフィリデンモリブデン（ＶＩ）ビス（ヘキサフルオロ−ｔ−ブトキシド）、及びCouturier, J. L. et al.（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31: 628）によって記載されるバセット（Basset）のタングステンメタセシス触媒が挙げられる。
【０２６６】
本開示の方法において有用な触媒としてはまた、Peryshkov, et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133: 20754-20757；Wang, et al. Angewandte Chemie, 2013, 52: 1939-1943；Yu, et al. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134: 2788-2799；Halford.  Chem. Eng. News, 2011, 89 (45): 11；Yu, et al. Nature, 2011, 479: 88-93；Lee.  Nature, 2011, 471: 452-453；Meek, et al. Nature, 2011: 471, 461-466；Flook, et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133: 1784-1786；Zhao, et al. Org Lett., 2011, 13(4): 784-787；Ondi, et al.  “High activity, stabilized formulations, efficient synthesis and industrial use of Mo- and W-based metathesis catalysts” XiMo Technology Updates, 2015: http://www.ximo-inc.com/files/ximo/uploads/ download/Summary _3.11.15.pdf；Schrock, et al. Macromolecules, 2010: 43, 7515-7522；Peryshkov, et al. Organometallics 2013: 32, 5256-5259；Gerber, et al. Organometallics 2013: 32, 5573-5580；Marinescu, et al. Organometallics 2012: 31, 6336-6343；Wang, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013: 52, 1939 - 1943；Wang, et al. Chem. Eur. J. 2013: 19, 2726-2740；及びTownsend et al. J. Am. Chem. Soc. 2012: 134, 11334-11337によって記載されるものも挙げられる。
【０２６７】
本開示の方法において有用な触媒としてはまた、国際公開第２０１４／１５５１８５号；国際公開第２０１４／１７２５３４号；米国特許出願公開第２０１４／０３３００１８号；国際公開第２０１５／００３８１５号；及び国際公開第２０１５／００３８１４号に記載されるものも挙げられる。
【０２６８】
本開示の方法において有用な触媒としてはまた、米国特許第４，２３１，９４７号；米国特許第４，２４５，１３１号；米国特許第４，４２７，５９５号；米国特許第４，６８１，９５６号；米国特許第４，７２７，２１５号；国際公開第１９９１／００９８２５号；米国特許第５，０８７７，１０号；米国特許第５，１４２，０７３号；米国特許第５，１４６，０３３号；国際公開第１９９２／０１９６３１号；米国特許第６，１２１，４７３号；米国特許第６，３４６，６５２号；米国特許第８，９８７，５３１号；米国特許出願公開第２００８／０１１９６７８号；国際公開第２００８／０６６７５４号；国際公開第２００９／０９４２０１号；米国特許出願公開第２０１１／００１５４３０号；米国特許出願公開第２０１１／００６５９１５号；米国特許出願公開第２０１１／００７７４２１号；国際公開第２０１１／０４０９６３号；国際公開第２０１１／０９７６４２号；米国特許出願公開第２０１１／０２３７８１５号；米国特許出願公開第２０１２／０３０２７１０号；国際公開第２０１２／１６７１７１号；米国特許出願公開第２０１２／０３２３０００号；米国特許出願公開第２０１３／０１１６４３４号；国際公開第２０１３／０７０７２５号；米国特許出願公開第２０１３／０２７４４８２号；米国特許出願公開第２０１３／０２８１７０６号；国際公開第２０１４／１３９６７９号；国際公開第２０１４／１６９０１４号；米国特許出願公開第２０１４／０３３００１８号；及び米国特許出願公開第２０１４／０３７８６３７号に記載されるものも挙げられる。
【０２６９】
本開示の方法において有用な触媒としてはまた、国際公開第２００７／０７５４２７号；米国特許出願公開第２００７／０２８２１４８号；国際公開第２００９／１２６８３１号；国際公開第２０１１／０６９１３４号；米国特許出願公開第２０１２／０１２３１３３号；米国特許出願公開第２０１３／０２６１３１２号；米国特許出願公開第２０１３／０２９６５１１号；国際公開第２０１４／１３４３３３号；及び米国特許出願公開第２０１５／００１８５５７号に記載されるものも挙げられる。
【０２７０】
本開示の方法において有用な触媒としてはまた、以下の表に示すものも挙げられる。
【０２７１】
【表５７】
2019503657.tif 000060
【０２７２】
【表５８】
2019503657.tif 000061
【０２７３】
【表５９】
2019503657.tif 000062
【０２７４】
【表６０】
2019503657.tif 000063
【０２７５】
【表６１】
2019503657.tif 000064
【０２７６】
【表６２】
2019503657.tif 000065
【０２７７】
本開示の方法において有用な触媒としてはまた、米国特許出願公開第２００８／０００９５９８号；米国特許出願公開第２００８／０２０７９１１号；米国特許出願公開第２００８／０２７５２４７号；米国特許出願公開第２０１１／００４００９９号；米国特許出願公開第２０１１／０２８２０６８号；及び米国特許出願公開第２０１５／００３８７２３号に記載されるものも挙げられる。
【０２７８】
本開示の方法において有用な触媒としては、国際公開第２００７／１４０９５４号；米国特許出願公開第２００８／０２２１３４５号；国際公開第２０１０／０３７５５０号；米国特許出願公開第２０１０／００８７６４４号；米国特許出願公開第２０１０／０１１３７９５号；米国特許出願公開第２０１０／０１７４０６８号；国際公開第２０１１／０９１９８０号；国際公開第２０１２／１６８１８３号；米国特許出願公開第２０１３／００７９５１５号；米国特許出願公開第２０１３／０１４４０６０号；米国特許出願公開第２０１３／０２１１０９６号；国際公開第２０１３／１３５７７６号；国際公開第２０１４／００１２９１号；国際公開第２０１４／０６７７６７号；米国特許出願公開第２０１４／０１７１６０７号；及び米国特許出願公開第２０１５／００４５５５８号に記載されるものが挙げられる。
【０２７９】
触媒は、典型的には反応混合物中に準化学量論的量（例えば触媒量）で提供される。特定の実施形態では、この量は、どの試薬が化学量論的に過剰であるかに応じて、化学反応の限定試薬を基準として約０．００１〜約５０ｍｏｌ％の範囲である。一部の実施形態では、触媒は限定試薬に対して約４０ｍｏｌ％以下で存在する。一部の実施形態では、触媒は限定試薬に対して約３０ｍｏｌ％以下で存在する。一部の実施形態では、触媒は、限定試薬に対して約２０ｍｏｌ％未満、約１０ｍｏｌ％未満、約５ｍｏｌ％未満、約２．５ｍｏｌ％未満、約１ｍｏｌ％未満、約０．５ｍｏｌ％未満、約０．１ｍｏｌ％未満、約０．０１５ｍｏｌ％未満、約０．０１ｍｏｌ％未満、約０．００１５ｍｏｌ％未満、又はそれ以下で存在する。一部の実施形態では、触媒は、限定試薬に対して約２．５ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％の範囲で存在する。一部の実施形態では、反応混合物は約０．５ｍｏｌ％の触媒を含有する。触媒錯体の分子式が２つ以上の金属を含む場合、反応に使用されるその触媒錯体の量はそれに従い調整され得る。
【０２８０】
ある場合には、本明細書に記載される方法は溶媒の非存在下（例えばニート）で実施することができる。ある場合には、本方法は１つ以上の溶媒の使用を含み得る。本開示における使用に好適であり得る溶媒の例としては、限定はされないが、ベンゼン、ｐ−クレゾール、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、グリコール、ジエチルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、酢酸エチル、ピリジン、トリエチルアミン、ピコリンなど、並びにこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、溶媒は、ベンゼン、トルエン、ペンタン、塩化メチレン、及びＴＨＦから選択される。特定の実施形態では、溶媒はベンゼンである。
【０２８１】
一部の実施形態では、本方法は減圧下で実施される。これは、メタセシス反応の間にエチレンなどの揮発性副生成物が生成され得る場合に有利であり得る。例えば、反応槽からエチレン副生成物を除去すると、有利には、メタセシス反応の平衡が所望の生成物の形成の方にシフトし得る。一部の実施形態では、本方法は約７６０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約７００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約６５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約６００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約５５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約５００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約４５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約４００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約３５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約３００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約２５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約２００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１００トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約９０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約８０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約７０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約６０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約５０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約４０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約３０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約２０トル未満の圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約２０トルの圧力で実施される。
【０２８２】
一部の実施形態では、本方法は約１９トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１８トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１７トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１６トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１５トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１４トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１３トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１２トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１１トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１０トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１０トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約９トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約８トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約７トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約６トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約５トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約４トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約３トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約２トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は約１トルの圧力で実施される。一部の実施形態では、本方法は、約１トル未満の圧力で実施される。
【０２８３】
一部の実施形態では、２つのメタセシス反応物は等モル量で存在する。一部の実施形態では、２つのメタセシス反応物は等モル量では存在しない。特定の実施形態では、２つの反応物は約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、又は１：２０のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約１０：１のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約７：１のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約５：１のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約２：１のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約１：１０のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約１：７のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約１：５のモル比で存在する。特定の実施形態では、２つの反応物は約１：２のモル比で存在する。
【０２８４】
一般に、本明細書に開示されるメタセシス触媒の多くとの反応が、１５％より良い、５０％より良い、７５％より良い、又は９０％より良い収率をもたらす。加えて、反応物及び生成物は、沸点の少なくとも５℃の差、２０℃より大きい差、又は４０℃より大きい差をもたらすように選択される。加えて、メタセシス触媒の使用により、副生成物よりもはるかに速い生成物形成が可能となり、これらの反応を実際上可能な限り迅速に行うためにこれは望ましい。詳細には、反応は約２４時間未満、１２時間未満、８時間未満、又は４時間未満で実施される。
【０２８５】
当業者は、時間、温度及び溶媒が互いに依存し得ること、及び１つを変更すると、本開示の方法によるピレスロイド生成物及び中間体の調製に他も変更する必要があり得ることを理解するであろう。メタセシスステップは種々の温度及び時間で進行させ得る。一般に、本開示の方法における反応は数分〜数日の反応時間を用いて行われる。例えば、約１２時間〜約７日の反応時間を用いることができる。一部の実施形態では、１〜５日の反応時間を用いることができる。一部の実施形態では、約１０分〜約１０時間の反応時間を用いることができる。一般に、本開示の方法における反応は約０℃〜約２００℃の温度で行われる。例えば、反応は１５〜１００℃で行うことができる。一部の実施形態では、反応は２０〜８０℃で行うことができる。一部の実施形態では、反応は１００〜１５０℃で行うことができる。
【０２８６】
不飽和脂肪エステルは、エステルを対応するアルデヒド又はアルコールに選択的に還元するが、二重結合は還元しない好適な還元剤を用いて還元することができる。不飽和脂肪エステルは、ハロゲン化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）又はVitride（登録商標）を使用して対応する不飽和脂肪アルデヒドに還元することができる。不飽和脂肪アルデヒドは、例えばＤＩＢＡＬ又はVitride（登録商標）で対応する脂肪アルコールに還元することができる。一部の実施形態では、不飽和脂肪エステルは、ＡｌＨ３又は９−ボラビシクロ（３．３．１）ノナン（９−ＢＢＮ）を使用して対応する脂肪アルコールに還元することができる。（Galatis, P. Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis. 2001. New York: John Wiley & Sons；及びCarey & Sunderburg. Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, 5th edition. 2007. New York. Springer Sciencesを参照されたい）。
【０２８７】
フェロモン組成物及びその使用
上記に記載したとおり、本明細書に記載される方法によって作られる生成物はフェロモンである。本発明の方法により調製されるフェロモンは、昆虫防除組成物としての使用向けに製剤化することができる。フェロモン組成物は担体を含んでもよく、及び／又はディスペンサーに入っていてもよい。担体は、限定はされないが、不活性な液体又は固体であり得る。
【０２８８】
固体担体の例としては、限定はされないが、充填剤、例えば、カオリン、ベントナイト、ドロマイト、炭酸カルシウム、タルク、粉末マグネシア、フラー土、ワックス、セッコウ、珪藻土、ゴム、プラスチック、チャイナクレー、ミネラル土類、例えば、シリカ、シリカゲル、シリケート、アタクレー（attaclay）、石灰石、チョーク、黄土、クレー、ドロマイト、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、粉砕合成材料、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、チオ尿素及び尿素、植物由来の生成物、例えば、穀物ミール、樹皮ミール、木材ミール及び堅果殻ミール、セルロース粉末、アタパルジャイト、モンモリロナイト、雲母、バーミキュライト、合成シリカ及び合成ケイ酸カルシウム、又はこれらの組成物が挙げられる。
【０２８９】
液体担体の例としては、限定はされないが、水；アルコール、例えば、エタノール、ブタノール又はグリコール、並びにこれらのエーテル又はエステル、例えば、酢酸メチルグリコール；ケトン、例えば、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、又はイソホロン；アルカン、例えば、ヘキサン、ペンタン、又はヘプタン；芳香族炭化水素、例えば、キシレン又はアルキルナフタレン；鉱物油又は植物油；脂肪族塩素化炭化水素、例えば、トリクロロエタン又は塩化メチレン；芳香族塩素化炭化水素、例えば、クロロベンゼン；水溶性又は強極性溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又はＮ−メチルピロリドン；液化ガス；蝋、例えば、蜜蝋、ラノリン、セラック蝋、カルナウバ蝋、果実蝋（シロヤマモモ蝋又はサトウキビ蝋など）、カンデリラ蝋、他の蝋、例えば、マイクロクリスタリン、オゾケライト、セレシン、又はモンタン；塩、例えば、モノエタノールアミン塩、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、二リン酸水素アンモニウム、一リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素アンモニウムナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウム又はカルバミン酸アンモニウム、これらの混合物が挙げられる。餌又は摂食刺激物質も担体に加えることができる。
【０２９０】
共力薬
一部の実施形態では、本フェロモン組成物を活性化学剤と組み合わせて相乗効果を生じさせる。本教示の方法によって得られる相乗効果はコルビー（Colby）の式（即ち（Ｅ）＝Ｘ＋Ｙ−（Ｘ×Ｙ／１００）に従い定量化することができる。Colby, R. S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations”, 1967 Weeds, vol. 15, pp. 20-22（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。従って、「相乗的」とは、その存在のおかげで所望の効果を相加的な量より多く増加させる成分が意図される。本方法のフェロモン組成物及び補助剤は、農業用活性化合物及びまた農業用補助化合物の有効性を相乗的に高めることができる。
【０２９１】
従って、一部の実施形態では、フェロモン組成物は共力薬と共に製剤化することができる。用語、「共力薬」は、本明細書で使用されるとき、フェロモン用量を減量するため、又は少なくとも１つの昆虫種を誘引するフェロモンの有効性を増進するため、フェロモンと共に使用することのできる物質を指す。共力薬は、フェロモンの非存在下で独立した昆虫誘引剤であっても、又はそうでなくてもよい。
【０２９２】
一部の実施形態では、共力薬は、鱗翅目（Lepidoptera）の少なくとも１つの種を誘引する揮発性植物化学物質である。用語、「植物化学物質」は、本明細書で使用されるとき、植物種に天然に存在する化合物を意味する。詳細な実施形態では、共力薬は、β−カリオフィレン、イソカリオフィレン、α−フムレン、イナロール、Ｚ３−ヘキセノール／ヘキセニルアセテート、β−ファルネセン、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される。
【０２９３】
フェロモン組成物はフェロモン及び共力薬を混合形態又は他の組み合わせ形態で含有することができ、又はそれはフェロモン及び共力薬を非混合形態で独立して含有してもよい。
【０２９４】
殺虫剤
フェロモン組成物は１つ以上の殺虫剤を含み得る。一実施形態では、殺虫剤は当業者に公知の化学的殺虫剤である。化学的殺虫剤の例としては、限定はされないが、シフルトリン、ペルメトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、フェンバレレート、フルシトリネート、アジンホスメチル、メチルパラチオン、ブプロフェジン、ピリプロキシフェン、フロニカミド、アセタミプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、アセフェート、マラチオン、キナルホス、クロルピリホス、プロフェノホス、ベンダイオカルブ、ビフェントリン、クロルピリホス、シフルトリン、ダイアジノン、除虫菊、フェンプロパトリン、キノプレン、殺虫ソープ又はオイル、ネオニコチノイド、ジアミド、アベルメクチン及び誘導体、スピノサド及び誘導体、アザジラクチン、ピリダリル、及びこれらの混合物を含めたピレスロイド系又は有機リン系殺虫剤の１つ以上が挙げられる。
【０２９５】
別の実施形態では、殺虫剤は、当業者に公知の１つ以上の生物学的殺虫剤である。生物学的殺虫剤の例としては、限定はされないが、アザジラクチン（ニーム油）、天然ピレトリン由来の毒素、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiencis）及びビューベリア・バシアナ（Beauveria bassiana）、ウイルス（例えば、CYD-X（商標）、CYD-X HP（商標）、Germstar（商標）、Madex HP（商標）及びSpod-X（商標））、ペプチド（Spear-T（商標）、Spear-P（商標）、及びSpear-C（商標））が挙げられる。
【０２９６】
別の実施形態では、殺虫剤は、神経及び筋肉を標的とする殺虫剤である。例としては、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害薬、例えば、カーバメイト系（例えば、メトミル及びチオジカルブ）及び有機リン系（例えば、クロルピリホス）、ＧＡＢＡ作動性クロライドチャネル拮抗薬、例えば、シクロジエン有機塩素系（例えば、エンドスルファン）及びフェニルピラゾール系（例えば、フィプロニル）、ナトリウムチャネル修飾薬、例えばピレトリン系及びピレスロイド系（例えば、シペルメトリン及びλ−シハロトリン）、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）作動薬、例えば、ネオニコチノイド系（例えば、アセタミプリド、チアクロプリド、チアメトキサム）、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）アロステリック修飾薬、例えば、スピノシン系（例えば、スピノーズ（spinose）及びスピネトラム）、クロライドチャネル活性化薬、例えば、アベルメクチン系及びミルベマイシン系（例えば、アバメクチン、エマメクチン安息香酸塩）、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）遮断薬、例えば、ベンスルタップ及びカルタップ、電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬、例えば、インドキサカルブ及びメタフルミゾン、リアノジン受容体修飾薬、例えば、ジアミド系（例えばクロラントラニリプロール及びフルベンジアミド）が挙げられる。別の実施形態では、殺虫剤は、呼吸を標的とする殺虫剤である。例としては、プロトン勾配の破壊によって酸化的リン酸化を脱共役させる化学物質、例えばクロルフェナピル、及びミトコンドリア複合体Ｉ電子伝達阻害薬が挙げられる。
【０２９７】
別の実施形態では、殺虫剤は、中腸を標的とする殺虫剤である。例としては、昆虫中腸膜を破壊する微生物、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）及びバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）が挙げられる。
【０２９８】
別の実施形態では、殺虫剤は、成長及び発生を標的とする殺虫剤である。例としては、幼若ホルモン模倣体、例えば、幼若ホルモン類似体（例えばフェノキシカルブ）、キチン生合成阻害薬、タイプ０、例えばベンゾイル尿素（例えば、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、及びノバルロン）、及びエクジソン受容体作動薬、例えばジアシルヒドラジン系（例えば、メトキシフェノジド及びテブフェノジド）が挙げられる。
【０２９９】
安定剤
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は、組成物の安定性を増進する１つ以上の添加剤を含み得る。添加剤の例としては、限定はされないが、脂肪酸及び植物油、例えば、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ベニバナ油、キャノーラ油、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０３００】
充填剤
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は１つ以上の充填剤を含み得る。充填剤の例としては、限定はされないが、１つ以上の鉱物クレー（例えばアタパルジャイト）が挙げられる。一部の実施形態では、誘引剤組成物は１つ以上の有機増粘剤を含み得る。かかる増粘剤の例としては、限定はされないが、メチルセルロース、エチルセルロース、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３０１】
溶媒
別の実施形態によれば、本開示のフェロモン組成物は１つ以上の溶媒を含み得る。溶媒を含有する組成物は、ハケ塗り、浸漬、ロール塗り、吹き付け、又はその他の方法で、使用者がフェロモンコーティングを付与しようとする被塗物（例えばルアー）に液体組成物を適用することによって適用され得る液体組成物を使用者が利用する場合に望ましい。一部の実施形態では、使用する溶媒は、フェロモン組成物の１つ以上の成分を可溶化、又は実質的に可溶化するように選択される。溶媒の例としては、限定はされないが、水、水性溶媒（例えば、水とエタノールの混合物）、エタノール、メタノール、塩素化炭化水素、石油溶媒、テルペンチン、キシレン、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３０２】
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は有機溶媒を含む。有機溶媒は主に乳化性濃縮物の製剤、ＵＬＶ製剤に使用され、及びそれより程度は少ないが、顆粒状製剤に使用される。時に溶媒の混合物が使用される。一部の実施形態において、本開示は、ケロシン又は精製パラフィンなどの脂肪族パラフィン系オイルを含めた溶媒の使用を教示する。他の実施形態において、本開示は、キシレン並びにＣ９及びＣ１０芳香族溶媒の高分子量画分など、芳香族溶媒の使用を教示する。一部の実施形態では、製剤を水中に乳化させたときの結晶化を防ぐ共溶媒として塩素化炭化水素が有用である。アルコールは時に、溶解力を増加させる共溶媒として使用される。
【０３０３】
可溶化剤
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は可溶化剤を含む。可溶化剤はサーファクタントであり、限界ミセル濃度を上回る濃度では水中でミセルを形成し得る。このとき、ミセルは、ミセルの疎水性部分の内部に水不溶性材料を溶解させ又は可溶化することが可能である。可溶化に通常用いられるサーファクタントのタイプは、非イオン剤：モノオレイン酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタンエトキシレート；及びオレイン酸メチルエステルである。
【０３０４】
結合剤
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は１つ以上の結合剤を含み得る。結合剤は、前記組成物を塗布する材料の表面へのフェロモン組成物の結合を促進するために使用し得る。一部の実施形態では、結合剤は、フェロモン組成物及び／又は材料の表面への別の添加剤（例えば、殺虫剤、昆虫成長調整物質など）の結合を促進するために使用し得る。例えば、結合剤は、ペンキ及びコーティングに典型的に用いられる合成又は天然樹脂を含み得る。これらは、塗布表面が、コーティングの構造的完全性はなおも維持しつつ、昆虫に組成物の成分（例えば、殺虫剤、昆虫成長調整物質など）をかじり取らせ摂食させるのに十分な脆さとなるように修飾されてもよい。
【０３０５】
結合剤の非限定的な例としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニル、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体及びポリ酢酸ビニル、又はこれらの組成物；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、タルク又はポリエチレングリコール、又はこれらの組成物などの滑沢剤；シリコーンエマルション、長鎖アルコール、リン酸エステル、アセチレンジオール、脂肪酸又は有機フッ素化合物などの消泡剤、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩、トリニトリロ三酢酸塩又はポリリン酸塩、又はこれらの組成物などの錯化剤が挙げられる。
【０３０６】
一部の実施形態では、結合剤はまた充填剤及び／又は増粘剤としても役割も果たす。かかる結合剤の例としては、限定はされないが、セラック、アクリル、エポキシ、アルキド、ポリウレタン、亜麻仁油、キリ油、及びこれらの任意の組み合わせの１つ以上が挙げられる。
【０３０７】
界面活性剤
一部の実施形態では、本フェロモン組成物は界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は液体農業用組成物に添加される。他の実施形態では、界面活性剤は固形製剤、特に適用前に担体で希釈するように設計された固形製剤に添加される。従って、一部の実施形態では、本フェロモン組成物はサーファクタントを含む。サーファクタントは時に、噴霧タンク混合物に対する補助剤として単独で、或いは鉱物油若しくは植物油などの他の添加剤と共に使用され、標的に対するフェロモンの生物学的性能を向上させる。界面活性剤はアニオン性、カチオン性、又は非イオン性の性質であってもよく、乳化剤、湿潤剤、懸濁剤として、又は他の目的で用いることができる。一部の実施形態では、サーファクタントは、アルキルエトキシレート、直鎖脂肪族アルコールエトキシレート、及び脂肪族アミンエトキシレートなど、非イオン剤である。製剤の技術分野で従来用いられている且つ本製剤にも使用し得るサーファクタントは、McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood, N.J.,1998、及びEncyclopedia of Surfactants, Vol. I-III, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81に記載されている。一部の実施形態において、本開示は、芳香族スルホン酸、例えば、リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸及びジブチルナフタレンスルホン酸の、及びアリールスルホン酸塩の脂肪酸の、アルキルエーテルの、ラウリルエーテルの、脂肪アルコール硫酸塩の及び脂肪アルコールグリコールエーテル硫酸塩のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩、スルホン化ナフタレン及びその誘導体とホルムアルデヒドとの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドとの縮合物、フェノール又はフェノールスルホン酸とホルムアルデヒドとの縮合物、フェノールとホルムアルデヒド及び亜硫酸ナトリウムとの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシ化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール又はノニルフェノール、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、エトキシ化ヒマシ油、エトキシ化トリアリールフェノール、リン酸化トリアリールフェノールエトキシレートの塩、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、亜硫酸リグニン廃液又はメチルセルロース、又はこれらの組成物を含めたサーファクタントの使用を教示する。
【０３０８】
一部の実施形態において、本開示は、ジエタノールアンモニウムラウリル硫酸塩などのアルキル硫酸塩；カルシウムドデシルベンゼンスルホン酸塩などのアルキルアリールスルホン酸塩；ノニルフェノール−Ｃ１８エトキシレートなどのアルキルフェノール−アルキレンオキシド付加生成物；トリデシルアルコール−Ｃ１６エトキシレートなどのアルコール−アルキレンオキシド付加生成物；ステアリン酸ナトリウムなどのセッケン；ナトリウムジブチルナフタレンスルホン酸塩などのアルキルナフタレンスルホン酸塩；スルホコハク酸ナトリウムジ（２−エチルヘキシル）などのスルホコハク酸塩のジアルキルエステル；オレイン酸ソルビトールなどのソルビトールエステル；塩化ラウリルトリメチルアンモニウムなどの第４級アミン；ステアリン酸ポリエチレングリコールなど、脂肪酸のポリエチレングリコールエステル；エチレンオキシドと酸化プロピレンとのブロック共重合体；モノアルキル及びジアルキルリン酸エステルの塩；ダイズ油、菜種／キャノーラ油、オリーブ油、ヒマシ油、ヒマワリ種油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、パーム油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、キリ油などの植物油；及び上記の植物油のエステル、特にメチルエステルを含めた他の好適な界面活性剤を教示する。
【０３０９】
湿潤剤
一部の実施形態では、本フェロモン組成物は湿潤剤を含む。湿潤剤は、液体に加えたときに液体とそれが展着する表面との間の界面張力を低減することによってその液体の展着力又は浸透力を増加させる物質である。湿潤剤は、農薬製剤中に２つの主な機能：加工及び製造中に可溶性液体濃縮物又は懸濁濃縮物を作製するための粉末の水に対する濡れ速度を高めるため；及び噴霧タンク又は他のベッセル内で生成物を水と混合するときに濡れ性粉末の濡れ時間を短縮し、及び水分散性顆粒への水の浸透を向上させるために使用される。一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物に使用される湿潤剤の例は、濡れ性粉末、懸濁濃縮物、及び水分散性顆粒製剤を含め、ラウリル硫酸ナトリウム；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム；アルキルフェノールエトキシレート；及び脂肪族アルコールエトキシレートである。
【０３１０】
分散剤
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は分散剤を含む。分散剤は、粒子の表面上に吸着して粒子が分散した状態を保つことを促進し、その再集合を防ぐ物質である。一部の実施形態では、分散剤は、製造中の分散及び懸濁を促進し、及び噴霧タンク内で粒子が水中に再び分散することを確実にするため、本開示のフェロモン組成物に添加される。一部の実施形態では、分散剤は、濡れ性粉末、懸濁濃縮物、及び水分散性顆粒に使用される。分散剤として使用されるサーファクタントは粒子表面上に強力に吸着する能力を有し、粒子の再集合に対する電荷的又は立体的バリアを提供する。一部の実施形態では、最も一般的に用いられるサーファクタントは、アニオン性、非イオン性、又はこれらの２つのタイプの混合物である。
【０３１１】
一部の実施形態では、濡れ性粉末製剤について、最も一般的な分散剤はリグノスルホン酸ナトリウムである。一部の実施形態では、ナフタレンスルホン酸ナトリウムホルムアルデヒド縮合物などの高分子電解質を用いると、懸濁濃縮物が極めて良好な吸着及び安定化をもたらす。一部の実施形態では、エトキシ化トリスチリルフェノールリン酸エステルも使用される。一部の実施形態では、アルキルアリールエチレンオキシド縮合物及びＥＯ−ＰＯブロック共重合体などが、時に懸濁濃縮物の分散剤としてアニオン剤と組み合わされる。
【０３１２】
ポリマーサーファクタント
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物はポリマーサーファクタントを含む。一部の実施形態では、ポリマーサーファクタントは、非常に長い疎水性「骨格」と、「櫛」サーファクタントの「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖とを有する。一部の実施形態では、これらの高分子量ポリマーは、疎水性骨格が粒子表面上へのアンカリング点を多く有するため、懸濁濃縮物に極めて良好な長期安定性を付与することができる。一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物に使用される分散剤の例は、リグノスルホン酸ナトリウム；ナフタレンスルホン酸ナトリウムホルムアルデヒド縮合物；トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステル；脂肪族アルコールエトキシレート；アルキルエトキシレート；ＥＯ−ＰＯブロック共重合体；及びグラフト共重合体である。
【０３１３】
乳化剤
一部の実施形態では、本開示のフェロモン組成物は乳化剤を含む。乳化剤は、ある液相の液滴の別の液相中における懸濁液を安定化させる物質である。乳化剤がなければ、これらの２つの液体は２つの不混和性液相に分離し得る。一部の実施形態において、最も一般的に用いられる乳化剤ブレンドには、１２個以上のエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノール又は脂肪族アルコールと、ドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩とが含まれる。８〜１８の範囲の親水性−親油性バランス（「ＨＬＢ」）値が、通常、良好な安定エマルションをもたらす。一部の実施形態において、時に少量のＥＯ−ＰＯブロック共重合体サーファクタントを加えることによりエマルション安定性を向上させることができる。
【０３１４】
ゲル化剤
一部の実施形態では、本フェロモン組成物はゲル化剤を含む。増粘剤又はゲル化剤は主に懸濁濃縮物、エマルション、及びサスポエマルションの製剤中に、液体のレオロジー又は流れ特性を改良し、且つ分散した粒子又は液滴の分離及び沈降を防ぐために使用される。増粘剤、ゲル化剤、及び沈降防止剤は、概して２種類、即ち水不溶性微粒子と水溶性ポリマーとに分けられる。クレー及びシリカを用いて懸濁濃縮物製剤を作製することが可能である。一部の実施形態では、本フェロモン組成物は、限定はされないが、モンモリロナイト、例えばベントナイト；ケイ酸アルミウニムマグネシウム；及びアタパルジャイトを含めた１つ以上の増粘剤を含む。一部の実施形態において、本開示は、増粘剤としての多糖類の使用を教示する。最も一般的に用いられる多糖類のタイプは、種子及び海藻の天然抽出物又はセルロースの合成誘導体である。一部の実施形態はキサンタンを利用し、一部の実施形態はセルロースを利用する。一部の実施形態において、本開示は、限定はされないが、グアーガム；ローカストビーンガム；カラギーナン；アルギン酸塩；メチルセルロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）；ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）を含めた増粘剤の使用を教示する。一部の実施形態において、本開示は、加工デンプン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、及びポリエチレンオキシドなど、他のタイプの沈降防止剤の使用を教示する。別の良好な沈降防止剤はキサンタンガムである。
【０３１５】
消泡剤
一部の実施形態では、界面張力を低下させるサーファクタントの存在により、製造時の混合操作中及び噴霧タンクを用いた適用時に水性製剤に泡立ちが生じ得る。従って、一部の実施形態では、起泡傾向を抑えるため、製造段階で、又は瓶／噴霧タンクへの充填前に、多くの場合に消泡剤が添加される。概して、２つのタイプの消泡剤、即ちシリコーン系と非シリコーン系とがある。シリコーン系は、通常ジメチルポリシロキサンの水性エマルションであり、一方、非シリコーン系消泡剤はオクタノール及びノナノールなどの水不溶性油、又はシリカである。いずれの場合にも、消泡剤の機能は、気水界面からサーファクタントを排除することである。
【０３１６】
保存剤
一部の実施形態では、本フェロモン組成物は保存剤を含む。
【０３１７】
追加的な活性薬剤
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は１つ以上の昆虫摂食刺激物質を含み得る。昆虫摂食刺激物質の例としては、限定はされないが、粗綿実油、フィトールの脂肪酸エステル、ゲラニルゲラニオールの脂肪酸エステル、他の植物アルコールの脂肪酸エステル、植物抽出物、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０３１８】
本開示の別の実施形態によれば、本フェロモン組成物は１つ以上の昆虫成長調整物質（「ＩＧＲ」）を含み得る。ＩＧＲは、昆虫の成長を変えて奇形の昆虫を作り出すために用いられ得る。昆虫成長調整物質の例としては、例えばジミリンが挙げられる。
【０３１９】
本開示の別の実施形態によれば、誘引剤組成物は、捕獲した昆虫を不妊化し又は他の形でその生殖能力を遮断して、それにより以降の世代の集団を減少させる１つ以上の昆虫不妊化剤を含み得る。場合により、不妊化昆虫を生存させて非捕獲昆虫と交尾に関して競合させることが、直に殺虫するより有効である。
【０３２０】
噴霧可能組成物
一部の実施形態では、本明細書に開示されるフェロモン組成物は、噴霧可能組成物（即ち、噴霧可能なフェロモン組成物）として製剤化することができる。噴霧可能組成物には、水性溶媒、例えば、水、又は水とアルコール、グリコール、ケトン、又は他の水混和性溶媒との混合物を使用することができる。一部の実施形態では、かかる混合物の含水量は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％である。一部の実施形態では、噴霧可能組成物は濃縮物、即ち、フェロモンと水性溶媒中の他の添加剤（例えば、蝋様物質、安定剤など）との濃縮懸濁液であり、溶媒（例えば水）を加えることにより最終使用濃度に希釈され得る。
【０３２１】
一部の実施形態では、噴霧可能組成物中におけるフェロモン及びその位置異性体の担体として蝋様物質を使用することができる。蝋様物質は、例えば、生分解性蝋、例えば蜜蝋、カルナウバ蝋など、カンデリラ蝋（炭化水素蝋）、モンタン蝋、セラック及び同様の蝋、飽和又は不飽和脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸又はステアリン酸、脂肪酸アミド及びエステル、ヒドロキシ脂肪酸エステル、例えばヒドロキシエチル又はヒドロキシプロピル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、及び低分子量ポリエステル、例えばポリアルキレンスクシネートであってもよい。
【０３２２】
一部の実施形態では、噴霧可能なフェロモン組成物と共に安定剤を使用することができる。安定剤は、濃縮物の粒径を調節し、及び／又はフェロモン組成物の安定懸濁液の調製を可能にするために用いられ得る。一部の実施形態では、安定剤はヒドロキシルポリマー及び／又はエトキシ化ポリマーから選択される。例としては、エチレンオキシド・酸化プロピレン共重合体、多価アルコール、例えば、デンプン、マルトデキストリン及び他の可溶性炭水化物又はこれらのエーテル若しくはエステル、セルロースエーテル、ゼラチン、ポリアクリル酸並びにこれらの塩及び部分エステルなどが挙げられる。他の実施形態では、安定剤としては、ポリビニルアルコール及びその共重合体、例えば部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニルを挙げることができる。安定剤は、粒径の調節及び／又は安定懸濁液の調製に十分なレベル、例えば水溶液の０．１％〜１５％で使用し得る。
【０３２３】
一部の実施形態では、噴霧可能なフェロモン組成物と共に結合剤を使用することができる。一部の実施形態では、結合剤は分散液を更に安定化させ、及び／又は標的場所（例えば、トラップ、ルアー、植物など）への噴霧された分散液の接着性を向上させる役割を果たし得る。結合剤は、多糖、例えば、アルギン酸塩、セルロース誘導体（アセテート、アルキル、カルボキシメチル、ヒドロキシアルキル）、デンプン又はデンプン誘導体、デキストリン、ガム（アラビア、グアー、ローカストビーン、トラガカント、カラギーナンなど）、スクロースなどであってもよい。結合剤はまた、ポリビニルピロリドンなどの非炭水化物水溶性ポリマー、又は酸及び／又は塩形態のポリアクリル酸又はポリメタクリル酸などの酸性ポリマー、又はかかるポリマーの混合物であってもよい。
【０３２４】
マイクロカプセル化フェロモン
一部の実施形態では、本明細書に開示されるフェロモン組成物は、Ill’lchev, AL et al., J. Econ. Entomol. 2006;99(6):2048-54；及びStelinki, LL et al., J. Econ. Entomol. 2007;100(4):1360-9に開示されるようなマイクロカプセル化フェロモンとして製剤化することができる。マイクロカプセル化フェロモン（ＭＥＣ）は、ポリマーカプセル内に封入されたフェロモンの小液滴である。このカプセルは周囲環境へのフェロモンの放出速度を制御し、十分に小さいため、噴霧殺虫剤に用いられるのと同じ方法で適用される。マイクロカプセル化フェロモン製剤の野外有効寿命は、とりわけ、気候条件、カプセルサイズ及び化学的特性に依存して、数日〜１週間を僅かに超える範囲であり得る。
【０３２５】
徐放製剤
フェロモン組成物は、大気中への徐放をもたらすように、及び／又は放出後の分解から保護されるように製剤化することができる。例えば、フェロモン組成物は、マイクロカプセル、生分解性フレーク及びパラフィン蝋ベースのマトリックスなどの担体に含まれてもよい。或いは、フェロモン組成物は、徐放噴霧可能なものとして製剤化することができる。
【０３２６】
特定の実施形態では、本フェロモン組成物は、当業者に公知の１つ以上のポリマー剤を含み得る。ポリマー剤は、環境への組成物の放出速度を制御し得る。一部の実施形態では、ポリマー誘引剤組成物は環境条件の影響を受け難い。ポリマー剤はまた、環境への組成物の持続的な放出を可能にする持続放出剤であってもよい。
【０３２７】
ポリマー剤の例としては、限定はされないが、セルロース、カゼインなどのタンパク質、フッ化炭素系ポリマー、水素化ロジン、リグニン、メラミン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡＣ）などのビニルポリマー、ポリカーボネート、ポリビニリデンジニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアミド−アルデヒド、ポリビニルアルデヒド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリビニリデン、シリコーン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。セルロースの例としては、限定はされないが、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロース、プロピオン酸酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０３２８】
徐放製剤又は持続放出製剤に用いることのできる他の薬剤としては、脂肪酸エステル（セバシン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸エステルなど）又は脂肪アルコール（ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、トリデセノール、テトラデカノール、テトラデセノール、テトラデカジエノール、ペンタデカノール、ペンタデセノール、ヘキサデカノール、ヘキサデセノール、ヘキサデカジエノール、オクタデセノール及びオクタデカジエノールなど）が挙げられる。
【０３２９】
本発明の方法により調製されるフェロモン、並びにそのようなフェロモンを含有する組成物は、様々な環境下の昆虫の行動及び／又は成長を制御するために使用することができる。このフェロモンを使用して、例えば、雄又は雌昆虫を特定の標的範囲に誘引し、又はそこから忌避させることができる。このフェロモンを使用して昆虫を誘引して、被害を受け易い作物範囲から引き離すことができる。また、このフェロモンを使用して、例えば、昆虫モニタリング、大量捕獲、ルアー／誘引殺虫又は交信撹乱戦略の一環として昆虫を誘引することができる。
【０３３０】
ルアー
本開示のフェロモン組成物はルアーに塗布又は噴霧されてもよく、又はその他の方法でルアーにフェロモン組成物を含浸させてもよい。
【０３３１】
トラップ
本開示のフェロモン組成物は、任意の昆虫種、例えば鱗翅目（Lepidoptera）の昆虫を誘引するために一般的に用いられるものなど、トラップにおいて使用し得る。かかるトラップは当業者に周知であり、多くの州及び国で昆虫根絶計画において一般的に用いられている。一実施形態では、トラップは、フェロモン組成物を保持するための１つ以上の隔壁、容器、又は貯蔵用の入れ物を備える。従って、一部の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのフェロモン組成物が充填されたトラップを提供する。従って、本開示のフェロモン組成物は、例えばトラップに毒性物質を組み込んで捕獲した昆虫を殺虫することによる、昆虫モニタリング、大量捕獲、交信撹乱、又はルアー／誘引殺虫戦略の一環として例えば昆虫を誘引するため、トラップにおいて使用することができる。
【０３３２】
大量捕獲は、保護しようとする作物に高密度のトラップを置き、作物が被害を受ける前に大部分の昆虫を除去することを含む。ルアー／誘引殺虫技法も同様であるが、但し昆虫はルアーに誘引された後、致死剤に曝される。致死剤が殺虫剤である場合、ディスペンサーにまた、有効量の殺虫剤を摂食するよう昆虫を誘き寄せる餌又は摂食刺激物質が入っていてもよい。殺虫剤は当業者に公知の殺虫剤であってよい。殺虫剤は誘引剤組成物と混合されてもよく、又はトラップ内に別々に存在してもよい。混合物は昆虫の誘引と殺虫との二重の機能を果たし得る。
【０３３３】
かかるトラップは任意の好適な形態をとることができ、殺虫トラップは必ずしも毒性物質を組み込んでいる必要はなく、任意選択で昆虫は、溺死又は感電死など、他の手段によって殺虫してもよい。或いは、トラップが昆虫を真菌又はウイルスに感染させ、それが後に昆虫を殺虫してもよい。昆虫が殺虫されない場合であっても、トラップは雌の昆虫がいる場所から雄の昆虫を取り除いて繁殖を防ぐ役割を果たし得る。
【０３３４】
当業者は、種々の異なるトラップが可能であることを理解するであろう。かかるトラップの好適な例としては、ウォータートラップ、粘着トラップ、及びワンウェイトラップが挙げられる。粘着トラップは多くの種類が出ている。粘着トラップの一例は、三角形又は楔形断面のボール紙製の構造物で、内表面が不乾性粘着物質で被覆されているものである。昆虫が粘着面に接触して、捕虫される。ウォータートラップは水及びデタージェントの受け皿を備え、それを用いて昆虫が捕獲される。デタージェントによって水の表面張力を失わせることにより、受け皿に誘引された昆虫を水に溺れさせる。ワンウェイトラップでは昆虫はトラップに入ることはできるが、出ることはできない。本開示のトラップは、昆虫が一層誘引されるように鮮やかな色に着色されてもよい。
【０３３５】
一部の実施形態では、本組成物を含むフェロモントラップが他の種類の捕虫機構と組み合わされてもよい。例えば、フェロモン組成物に加え、トラップは、蛾を誘引するため１つ以上の蛍光灯、１つ以上の粘着性基材及び／又は１つ以上の着色表面を含んでもよい。他の実施形態では、本組成物を含むフェロモントラップは、他の種類の捕虫機構を有しなくてもよい。
【０３３６】
トラップは野外に１年のうちいつでも設置することができる。当業者は、特定のトラップに使用する適切な組成物量を容易に決定することができ、及びまた、保護しようとする作物畑の１エーカー当たりのトラップの適切な密度も決定することができる。
【０３３７】
トラップは、昆虫の被害を受ける（又は潜在的に被害を受ける可能性のある）範囲に位置決めすることができる。概して、トラップは樹木又は植物上に又はその近くに置かれる。フェロモンの芳香が昆虫をトラップに誘引する。次に昆虫はトラップ内に捕らわれ、動けなくなり、及び／又は例えばトラップに存在する致死剤によって殺虫され得る。
【０３３８】
トラップはまた、単純に雄が雌の位置を特定できないよう雌が放つフェロモンを圧倒するように果樹園内に置かれてもよい。これに関連して、トラップとしては、単純な器具、例えばフェロモンを分注する保護された吸液芯（wickable）以上のものは何も必要ない。
【０３３９】
本開示のトラップは完成品形態で提供されてもよく、ここでは本開示の化合物は既に適用されている。かかる例では、化合物の半減期に応じて化合物は露出していてもよく、又は他のアロマディスペンサーで標準的なものなど、従来方法で密封されていてもよく、この密封はトラップが所定位置に置かれた後に限り取り除かれる。
【０３４０】
或いは、トラップは別個に販売されてもよく、トラップが所定位置に置かれた後に捕獲のための所定量を適用し得るように、本開示の化合物が分注可能な様式で提供されてもよい。従って、本開示は、化合物をサシェ又は他のディスペンサーに提供し得る。
【０３４１】
ディスペンサー
フェロモン組成物は、特定の環境において組成物を放出するためのディスペンサーと併せて使用することができる。当該技術分野において公知の任意の好適なディスペンサーを使用し得る。かかるディスペンサーの例としては、限定はされないが、エアロゾル放出器、手作業で適用するディスペンサー、フェロモンがゆっくりと放出される透過性バリアを有するリザーバを含むバブルキャップ、フェロモン組成物を含浸させたゴム、プラスチック、革、綿、脱脂綿、木材又は木材産物でできたパッド、ビーズ、チューブ、ロッド、スパイラル又はボールが挙げられる。例えば、フェロモン組成物が蒸発するポリ塩化ビニルラミネート、ペレット、顆粒、ロープ又はスパイラル、又はゴムセプタム。当業者は、所望の適用、貯蔵、輸送又は取扱い方法に好適な担体及び／又はディスペンサーを選択することが可能であろう。
【０３４２】
別の実施形態では、フェロモン物質それ自体を含有する粉末によって雄の昆虫を汚染させる装置が用いられ得る。汚染された雄は次に飛び去り、大気にフェロモン物質を充満させることによるか、又は本物の雌よりむしろ汚染された雄に他の雄を誘引することにより、交信撹乱源を供給する。
【０３４３】
行動修正
本明細書に開示される方法により調製したフェロモン組成物を使用して、昆虫の行動を制御又は調節し得る。一部の実施形態では、標的の昆虫の行動は、特に、昆虫が特定の場所に誘引されるが前記場所と接触はしないように、又はかかる昆虫が実際に前記場所に接触するように、組成物中のフェロモンと位置異性体との比率を変えることによって調整可能な方法で調節し得る。従って、一部の実施形態では、フェロモンを使用して昆虫を誘引して、被害を受け易い作物範囲から引き離すことができる。従って、本開示はまた、ある場所に昆虫を誘引する方法も提供する。この方法は、ある場所に有効量のフェロモン組成物を投与することを含む。
【０３４４】
交信撹乱方法は、捕獲された昆虫の総数又は総量を定期的にモニタリングすることを含み得る。モニタリングは、例えば、毎日、毎週、隔週、毎月、３ヵ月に１回、又は監視者によって選択された任意の他の時間など、所定期間中に捕獲された昆虫の数をカウントすることにより実施し得る。捕獲された昆虫のかかるモニタリングは、その特定の期間についての昆虫個体数を推定することを促進し、それにより総合的害虫管理システムにおける害虫防除の詳細なタイプ及び／又は投薬量を決定することを促進し得る。例えば、昆虫個体数が多いことが見出されると、必然的に昆虫の駆除方法の使用が必要となる。新しい生息場所における被害の早期警告は、その集団が手に負えなくなる前に対策を取ることを可能にし得る。逆に、昆虫個体数が少ないことが見出されると、その集団のモニタリングを継続することで十分であるという判断につながり得る。昆虫集団は、昆虫が特定の閾値に達したときにのみ、それらの昆虫が防除するように定期的にモニタされ得る。これにより、費用効率の高い昆虫防除がもたらされ、殺虫剤使用の環境影響が低減される。
【０３４５】
交信撹乱
本開示の方法により調製されるフェロモンはまた、交尾の阻害にも使用することができる。交信撹乱は、昆虫を混乱させて交尾場所の特定及び／又は求愛を阻害し、それにより交尾を防ぎ、生殖周期を遮断する人工刺激（例えば、本明細書に開示されるとおりのフェロモン組成物）を導入することによって害虫を防除するように設計された害虫管理法である。
【０３４６】
鱗翅目（Lepidoptera）の種など、農業上関心がもたれる多くの昆虫種では、雌がその種の性フェロモンを成す特定の化学的ブレンドのトレイルを空中に放つ。この空中のトレイルはフェロモンプルームと称される。その種の雄はフェロモンプルームに含まれる情報を用いて放出元の雌（「コーリング」雌として知られる）の居場所を特定する。交信撹乱は、雌の昆虫が産生する性フェロモンを模倣するように設計された合成フェロモンを昆虫の生息場所に導入することにより、雄の昆虫がプルームを辿る自然な反応を利用する。従って、一部の実施形態では、交信撹乱に利用される合成フェロモンは、標的の昆虫によって産生されない、性フェロモンの化学構造を有するフェロモン及びその位置異性体を含む合成的に誘導されたフェロモン組成物である。
【０３４７】
交信撹乱の一般的な効果は、天然のフェロモンプルームをマスクすることにより雄の昆虫を混乱させて、交尾相手を探し出そうとするのを利用して雄に「偽のフェロモンのトレイル」を辿らせ、雄が「コーリング」雌に反応する能力に影響を及ぼすことである。結果的に、雄集団が雌の居場所を特定して交尾に成功する可能性が低くなり、これが最終的には繁殖の中止及び昆虫被害の縮小につながる。
【０３４８】
交信撹乱戦略には、混乱、トレイルのマスキング及び偽のトレイルの追随が含まれる。昆虫を高濃度のフェロモンに絶えず曝露させると、雌の昆虫が放出する正常なレベルのフェロモンに雄の昆虫が反応できなくなり得る。トレイルのマスキングはフェロモンを用いて雌が放出するフェロモンのトレイルを破壊する。偽のトレイルの追随は、高濃度のフェロモンのスポットを多数配置して雄に辿るべき多くの偽のトレイルを提示することにより行われる。十分に多量に放出されると、雄の昆虫は天然の性フェロモン源（雌の昆虫）を探し出すことができず、交尾が起こり得なくなる。
【０３４９】
一部の実施形態では、吸液芯又はトラップが少なくとも小昆虫の繁殖期に等しい期間にわたってフェロモンを放出し、ひいては交信撹乱を引き起こすように適合され得る。小昆虫が長い繁殖期を有する場合、又は繁殖期を繰り返す場合、本開示は、フェロモンをある期間、特に約２週間、及び一般的には約１〜４週間及び最長６週間にわたって放出することが可能な吸液芯又はトラップを提供し、これは続く同様のトラップと交替又は交換され得る。フェロモン組成物を含有する複数のトラップが、例えば作物畑に隣接する場所に置かれてもよい。トラップの位置、及び地面からのトラップの高さは、当業者に公知の方法に従い選択し得る。
【０３５０】
或いは、本フェロモン組成物は、害虫の交尾の阻害に一般的に用いられるような、マイクロカプセル又はツイストタイ（twist-ties）などの製剤から分注されてもよい。
【０３５１】
誘引殺虫
誘引殺虫方法は、性フェロモンなどの誘引剤を利用して殺虫性の化学物質、表面、装置等に標的種の昆虫を誘き寄せ、大量死滅させて、最終的には個体数を抑制するものであり、大量捕獲と同じ効果があり得る。例えば、合成雌性フェロモンを用いて雄の害虫、例えば蛾を誘き寄せる場合、誘引殺虫戦略では、多数の雄の蛾を長期間にわたって死滅させることにより交尾及び繁殖を低下させ、最終的に害虫の個体数を抑制しなければならない。誘引殺虫手法は、トラップの手入れ又は他の頻繁な保守が不要であるため、大量捕獲の有利な代替法であり得る。本明細書に記載される様々な実施形態では、組換え微生物が、（ｉ）昆虫フェロモンの生成経路、及び（ｉｉ）昆虫にとって毒性のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子を共発現し得る。このようにして、組換え微生物は、誘引殺虫手法における使用に好適な物質を同時生成することができる。
【０３５２】
当業者には明らかなとおり、特定の適用に使用されるフェロモン又はフェロモン組成物の量は、被害のタイプ及びレベル；使用する組成物のタイプ；活性成分の濃度；どのように組成物を提供するか、例えば、使用するディスペンサーのタイプ；取り扱う場所のタイプ；本方法が用いられる時間の長さ；並びに温度、風速及び風向、雨量及び湿度などの環境因子など、幾つかの要因に応じて変わり得る。当業者は、所与の適用に使用するフェロモン又はフェロモン組成物の有効量を決定することができるであろう。
【０３５３】
本明細書で使用されるとき、「有効量」は、所望の結果に影響を及ぼすのに十分な本開示のフェロモン組成物の量を意味する。有効量は１回以上の投与で投与することができる。例えば、有効量の組成物とは、所与の昆虫を所与の場所に誘引するのに十分なフェロモン組成物の量を指し得る。更に、有効量の組成物とは、所与の場所における目的とする特定の昆虫集団の交尾を阻害するのに十分なフェロモン組成物の量を指し得る。
【実施例】
【０３５４】
実施例
仮想例１．メタセシス及び化学変換による酵素的に誘導されたゴンド酸からのフェロモン生成物の生成
この仮想例は、種々の脂肪酸をフェロモン又はフェロモン前駆体の生合成生成の出発物質として使用し得ることを示す。本明細書に開示される生合成プロセスから得られる生成物を更なる化学変換に供して種々の生成物を生じさせることができる。
【化２】
2019503657.tif 000066
【０３５５】
酵素によるオレイン酸の２炭素伸長により、ゴンド酸が得られる。エステル化後、次にゴンド酸脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をＺ選択的オレフィンメタセシスによってＣ１１不飽和を含むＣ１６及びＣ１８  ＦＡＭＥ生成物に変換することができる。エステルを還元すると、アルデヒド及び脂肪アルコールフェロモン材料が生成され得る。脂肪アルコール生成物のアセチル化により、対応する脂肪アセテートフェロモンを生じさせることができる。加えて、ゴンド酸は、酵素的に修飾されたオレイン酸に同じ化学転換を適用することにより、Ｃ２０脂肪アルデヒド、アルコール及びアセテートフェロモンに直接変換することができる。
【０３５６】
仮想例２：個別調整された合成ブレンド
この仮想例は、本明細書に開示される組換え微生物を使用して昆虫フェロモンの合成ブレンドを作成し得ることを示す。
【化３】
2019503657.tif 000067
【０３５７】
上記のスキームに示されるとおり、テトラデシル−ＡＣＰ（１４：ＡＣＰ）を使用して、組換え微生物でＥ−及びＺ−テトラデセニルアセテート（Ｅ１１−１４：ＯＡｃ及びＺ１１−１４：ＯＡＣ）フェロモンのブレンドを生成することができる。このブレンドは種々の昆虫、例えば、ハスオビハマキ（Choristoneura roseceana）（ハマキガ科（Tortricidae）の蛾）によって生成される。
【０３５８】
同様に、ヘキサデシル−ＡＣＰ（１６：ＡＣＰ）を使用して、組換え微生物でＺ−及びＥ−ヘキサデセニルアセテートフェロモン（Ｅ１１−１６：ＯＡｃ及びＺ１１−１６：ＯＡｃ）のブレンドを生成することができる。
【０３５９】
微生物を異なるデサチュラーゼ、又はレダクターゼ等の他の酵素で改変して、フェロモンの所望のブレンドを生成することができる。本発明の組換え微生物及び方法を用いて生成可能な特に関連性のある１つのブレンドは、９７：３比の（Ｚ）−１１−ヘキサデセナール（Ｚ１１−１６：Ａｌｄ）及び（Ｚ）−９−ヘキサデセナール（Ｚ９−１６：Ａｌｄ）である。
【０３６０】
実施例３：Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における膜貫通アルコール形成レダクターゼの発現
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変は、合成経路の機能発現を必要とする。１つのかかる経路は、脂肪アシル−ＣｏＡの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子がある種の昆虫（並びに脂肪アルコールレダクターゼの場合にはある種の微細藻類）に見られ、好ましい生成宿主である酵母における合成経路の構築に使用することができる。幾つもの膜貫通デサチュラーゼ及びアルコール形成レダクターゼ変異体をスクリーニングして、単一の昆虫脂肪アルコール又は脂肪アルコールのブレンドの高レベル合成を可能にする集団を同定し得る。加えて、これらの酵素を複数の宿主（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica））にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
【０３６１】
手法の概要
昆虫由来の３つのアルコール形成レダクターゼを選択した。
【０３６２】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における発現にコドン最適化して、レダクターゼをコードする核酸を合成した（シントン）。
【０３６３】
所与のレダクターゼをコードする各核酸をＧａｌ１プロモーター下のエピソーム発現カセットにサブクローニングした。
【０３６４】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）野生型及びβ酸化欠失突然変異体を発現コンストラクトで形質転換した。
【０３６５】
異種タンパク質をガラクトースによって誘導し、及びレダクターゼの機能発現をインビボでＺ１１−ヘキサデセン酸のＺ１１−ヘキサデセノールへの生物変換によって評価した。
【０３６６】
ＧＣ−ＭＳ分析を用いて代謝産物を同定及び定量化した。
【０３６７】
結果
アルコール形成レダクターゼ変異体をＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｗ３０３（野生型）及びＢＹ４７４２  ΔＰＯＸ１（β酸化欠失突然変異体）における活性に関してスクリーニングした。酵素活性の評価には、Ｚ１１−ヘキサデセン酸を基質として選択した。インビボ生物変換アッセイから、エジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、及びカブラヤガ（Agrotis segetum）に由来する酵素変異体（Ding, B-J., Loefstedt, C. Analysis of the Agrotis segetum pheromone gland transcriptome in the light of sex pheromone biosynthesis. BMC Genomics 16:711 (2015)）をＷ３０３Ａで発現させるとＺ１１−ヘキサデセノール生成がもたらされ、タンパク質誘導から４８時間以内にそれぞれ約３７μＭ（８ｍｇ／Ｌ）、約７０μＭ（約１６ｍｇ／Ｌ）、及び１１μＭ（約３ｍｇ／Ｌ）にまで達したことが示された（図５及び図６）。生物学的に生成されたＺ１１−ヘキサデセノールは、ＧＣ−ＭＳによって決定するとき、Ｚ１１−ヘキサデセノール標準物質（Bedoukian）と一致した（図７）。ＢＹ４７４２  ΔＰＯＸ１はまた、重要なβ酸化経路酵素の欠失がＺ１１−ヘキサデセン酸の分解を制限し得たため、発現宿主としても調べた。しかしながら、β酸化欠失突然変異体におけるレダクターゼ変異体の発現は、野生型宿主における発現と比較したときに生成物力価を低下させた（図５）。ＢＹ４７４２  ΔＰＯＸ１を宿主として使用したときの力価低下の１つの寄与因子は、Ｗ３０３と比較したときのバイオマスの減少であった（図８）。
【０３６８】
従って、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における少なくとも２つのアルコール形成レダクターゼの機能発現が、Ｚ１１−ヘキサデセン酸のＺ１１−ヘキサデセノールへの生物変換をもたらした。
【０３６９】
結論
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における昆虫膜貫通アルコール形成レダクターゼの機能発現が実証された。試験したレダクターゼの中で、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）に由来する変異体がＺ１１−ヘキサデセン酸に対して最も高活性である。
【０３７０】
他の脂肪酸基質の生物変換を調べて酵素の可塑性を評価することができる。
【０３７１】
材料及び方法
株の樹立及び機能発現アッセイ
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｗ３０３（MATA ura3-1 trp1-1 leu2-3_112 his3-11_15 ade2-1 can1-100）及びＢＹ４７４２（MATa POX1::kanMX his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）を発現宿主として使用した。脂肪アルコールレダクターゼ変異体をコードするＤＮＡ配列をＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）における発現が最適化されるように再設計した（配列番号１〜３）。生じたシントン（Genscript）をｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターにＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位を使用してクローニングして、Ｇａｌ１プロモーターを利用したタンパク質発現を促進した。得られたプラスミドコンストラクトを使用してＷ３０３を形質転換し、ＣＭ寒天培地（２％グルコース含有、及びウラシル不含）（Teknova）で陽性形質転換体を選択した。機能発現を評価するため、ＣＭ寒天培地（２％グルコース含有、及びウラシル不含）にパッチした２つの陽性形質転換クローンを使用して、２４ディープウェルプレートフォーマットを用いてＣＭ液体培地を播種した。タンパク質発現を誘導するため、次に、２８℃で成長させておいた一晩培養物にガラクトース、ラフィノース、及びＹＮＢをそれぞれ２％、１％、及び６．７ｇ／Ｌの最終濃度となるように補足した。タンパク質誘導の２４時間後、生物変換基質Ｚ１１−ヘキサデセン酸（エタノール中）又はヘプタデカン酸（エタノール中）を３００ｍｇ／Ｌの最終濃度となるように加えた。生物変換アッセイを２８℃で４８時間進めた後、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。
【０３７２】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ検出
Hagstroem et al.（Hagstroem, A. K., Lienard, M. A., Groot, A. T., Hedenstroem, E. & Loefstedt, C. Semi-Selective Fatty Acyl Reductases from Four Heliothine Moths Influence the Specific Pheromone Composition. PLoS One 7: e37230 (2012)）の変法により脂質を抽出した。１．５ｍＬ細胞培養物を１５ｍＬファルコンチューブに移した。この細胞懸濁液を１ｍＬ  ５Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。５μＬテトラデカン二酸（エタノール中１０ｍＭ）を内部標準として加えた。１．５ｍＬヘキサンを加えることによりこの混合物を抽出し、次に３７℃、２５０ｒｐｍで１時間振盪した。相分離を促進するため、試料を２０００ｇで１０分間遠心した。次に１ｍＬの有機ヘキサン相を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この試料を９０℃で３０分間加熱することにより溶媒を除去した。試料を蒸発乾固させた後、５０μＬのＢＳＴＦＡ（１％のトリメチルクロロシランを含有するＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド）を加えた。１．５ｍＬプラスチックチューブを１０秒間にわたり２回激しく振盪した。ガラスインサートが入ったスクリューキャップＧＣガラスバイアルに移す前に、試料を１分間（１３０００ｒｐｍ）遠心した。バイアルをキャップし、９０℃で３０分間加熱した。この方法によって生じたトリメチルシリルエステルを続いてＧＣ−ＭＳ分析によって分析した。ＧＣ−ＭＳパラメータを表６に指定する。ＳＩＭモード（特徴的生成物及びＩＳイオン）を使用すると、バックグラウンドノイズの低下により検出感度が高まり、２．４μＭ（０．６ｍｇ／Ｌ）もの低量の生成物の検出が可能となる。スプリット比を更に低下させると、今後の適用向けに更なる感度上昇の可能性がもたらされる。図９に示すＺ１１−ヘキサデセノール検量線を使用して、酵母から生成されたＺ１１−ヘキサデセノールを定量化した。容易に区別されるヘプタデカノール生成物が成功したＧＣ−ＭＳランのベンチマークに用いられた可能性があるため、ヘプタデカン酸の生物変換も試験した。しかしながら、試験したレダクターゼのいずれも、ヘプタデカン酸に対して何ら活性を示さなかった。
【０３７３】
【表６３】
2019503657.tif 000068
【０３７４】
実施例４：Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における膜貫通デサチュラーゼの発現
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。１つのかかる経路は、脂肪アシル−ＣｏＡの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。幾つもの膜貫通デサチュラーゼ及びアルコール形成レダクターゼ変異体をスクリーニングして、単一の昆虫脂肪アルコール又は脂肪アルコールのブレンドの高レベル合成を可能にする集団を同定し得る。加えて、これらの酵素を複数の宿主（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica））にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
【０３７５】
手法の概要
デサチュラーゼ（昆虫由来：カブラヤガ（Agrotis segetum）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、及び海洋性珪藻：タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana））の小さい組をテストケースとして選択して、機能発現アッセイ、代謝産物抽出方法、及び分析化学を調査し及び確立した。
【０３７６】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）におけるデサチュラーゼの発現用合成カセットを構築した。このカセットは、ＯＬＥ１プロモーター領域、ＯＬＥ１  Ｎ末端リーダー配列、及びＶＳＰ１３ターミネーターからなる。
【０３７７】
この発現カセットをＧＦＰ変異体の発現によって機能性に関して試験した。このカセットがバリデートされたことにより、昆虫デサチュラーゼの発現の調査へのその利用が可能であった。
【０３７８】
異種デサチュラーゼを含有する発現コンストラクトでＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１を形質転換した。デサチュラーゼの機能性を、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）を外因的に補充しない場合のΔＯＬＥ１の成長をレスキューする能力によって評価した。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）デサチュラーゼ（ＯＬＥ１）を補完成功の陽性対照として使用した。
【０３７９】
ヘキサデカン酸（パルミチン酸）の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（パルミトバクセン酸）へのインビボ生物変換によってデサチュラーゼの機能性をバリデートした。
【０３８０】
ＧＣ−ＭＳ分析を用いて代謝産物を同定及び定量化した。
【０３８１】
結果
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）において膜貫通デサチュラーゼ変異体をスクリーニングした。当初３つの変異体を試験して、機能発現アッセイ、代謝産物抽出方法、及び分析化学を調査及び確立した。これらのデサチュラーゼをＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）において機能発現させるため、ｐＯＬＥ１カセットと呼ばれるエピソーム合成発現カセット（図１０）を構築し、これは、ＯＬＥ１プロモーター領域、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１の最初の２７アミノ酸をコードするＮ末端リーダー配列、及びＶＰＳ１３（原生胞子の膜形成に関与するタンパク質、これのターミネーターは、ＲＮＡ半減期を延長させることにより潜在的に異種タンパク質発現を増加させることが既に特徴付けられている）のターミネーター領域からなった。ｐＯＬＥ１カセットの機能性をそのＧＦＰ発現能力によってバリデートした（図１１Ａ〜図１１Ｅ）。続いて、昆虫デサチュラーゼシントン、及び酵母ＯＬＥ１シントンをｐＯＬＥ１カセットにクローニングし、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１株で発現させた。ＯＬＥ１対立遺伝子（これはパルミトイル：ＣｏＡ／ステアロイル：ＣｏＡ（ｚ）−９−デサチュラーゼをコードする）を欠失させると、それを機能性昆虫デサチュラーゼのスクリーニングツールとして利用することが可能になるため、この株を選択した。具体的には、活性デサチュラーゼであれば、ＵＦＡを外因的に補充する必要なしに成長を補完することが可能になり得る。ｐＯＬＥ１カセットを使用してＯＬＥ１を発現させると、ＵＦＡなしでのΔＯＬＥ１成長の成長が補完された（図１１Ａ〜図１１Ｅ）；従って、これは補完アッセイの陽性対照としての役割を果たす。昆虫デサチュラーゼを発現させたとき、本発明者らは、それらがＵＦＡなしでのΔＯＬＥ１成長を様々な程度でレスキューしたことを観察した。富栄養培地（ＹＰＤ）寒天プレート上では、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１の発現は最も高いレベルの成長をもたらし、それにイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼが続いた（図１２Ａ）。後者は、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼによる不飽和脂肪アシル：ＣｏＡの生成がΔＯＬＥ１における欠損した（Ｚ）−９−ヘキサデセノイル：ＣｏＡ生合成のサロゲートとしての役割を果たし得ることを示した。Ｔ．シュードナナ（T. pesudonana）及びカブラヤガ（A. segetum）デサチュラーゼの発現はＹＰＤ上での成長をそれほど良好にはレスキューしないように見えた（図１２Ａ）。最少培地（ＣＭ−Ｕｒａグルコース）寒天プレート上にパッチしたとき、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１及びイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼの発現のみが、外因性ＵＦＡなしでのΔＯＬＥ１成長をレスキューした（図１２Ｂ）。Ｔ．シュードナナ（T. pseudonana）及びカブラヤガ（A. segetum）デサチュラーゼの発現は最少培地寒天上でのΔＯＬＥ１の成長をもたらさなかったことから、ＵＦＡの生成におけるそれらの活性が限られていることが示唆される（結果は図示せず）。カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）においてデサチュラーゼライブラリをスクリーニングすると、クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼの機能発現が同定された。これらのデサチュラーゼをΔＯＬＥ１で発現させたとき、それらはＹＰＤ培地及びＣＭ−Ｕｒａグルコース培地の両方でイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼの発現と同程度にＵＦＡなしでの成長をもたらした（図１２Ｂ）。
【０３８２】
パルミチン酸の昆虫特異的ＵＦＡへのインビボ生物変換によって異種デサチュラーゼの機能発現を更に特徴付けた。パルミチン酸を含有する最少培地で約９６時間培養した後、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼを発現するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１の全脂肪酸分析から、天然酵母ＯＬＥ１デサチュラーゼを発現する対照株に存在しない新規脂肪酸種（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の生成が明らかになった（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。カブラヤガ（A. segetum）、又はＴ．シュードナナ（T. pseudonana）デサチュラーゼを発現する株には、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸は検出されない（結果は図示せず）。イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼを発現するΔＯＬＥ１株には、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸に加え、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸も検出された（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。この培養条件下で、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼを発現するΔＯＬＥ１のＣ１６脂肪酸は、約８４．７％のヘキサデカン酸、５．６％の（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸及び９．８％の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸で構成される。比較すると、ＯＬＥ１デサチュラーゼを発現するΔＯＬＥ１のＣ１６脂肪酸画分は、約６８．６％のヘキサデカン酸及び３１．４％の（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸で構成される。イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼを発現するΔＯＬＥ１における（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸生合成は約１．５ｍｇ／Ｌを占める。全脂肪酸及びこの混合物中の各脂肪酸の量は定量化することができる。生物学的に生成された（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸はまた、ＧＣ−ＭＳによって決定するとき、標準物質（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（Larodan）の保持時間及びフラグメンテーションパターンとも一致する（図１４Ａ〜図１４Ｂ）。従って、生物学的に生成された（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の位置異性体及び立体異性体が確認された。クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼのインビボでの特徴付けも行うことができる。
【０３８３】
要約すれば、ＵＦＡ、即ち（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）を外因的に補充しない場合のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１の成長のレスキュー能力を有する少なくとも３つの昆虫デサチュラーゼが同定された。
【０３８４】
発現コンストラクトを担持するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１の富栄養培地（ＹＰＤ）上での成長の程度は以下のデサチュラーゼ含量の順序であった：ＯＬＥ１、イラクサギンウワバ（T. ni）、Ｔ．シュードナナ（T. pseudonana）、及びカブラヤガ（A. segetum）。
【０３８５】
発現コンストラクトを担持するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１の最少培地（ＣＭグルコース、ウラシル不含）上での成長の程度は以下のデサチュラーゼ含量の順序であった：ＯＬＥ１、イラクサギンウワバ（T. ni）。
【０３８６】
クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼを使用した補完アッセイも行ったところ、インビボ生物変換アッセイによって示されたカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）における機能発現が実証された。これらのデサチュラーゼはまた、並びにイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼも、少なくとも富栄養及び最少培地上でのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１成長を補完した。
【０３８７】
Ｔ．シュードナナ（T. pseudonana）及びカブラヤガ（A. segetum）デサチュラーゼの発現は、インキュベーション時間を１４日にまで延長した後であっても、ＵＦＡを含まない最少培地上でのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１の成長をもたらさなかった。Ｔ．シュードナナ（T. pseudonana）又はカブラヤガ（A. segetum）デサチュラーゼを担持する株には、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸は観察されなかった。
【０３８８】
結論
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における昆虫由来の膜貫通デサチュラーゼの機能発現が達成された。
【０３８９】
所与の異種デサチュラーゼの活性は、外因性パルミトレイン酸補充なしでのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１の成長を補完するその能力、及びパルミチン酸を昆虫フェロモン前駆体（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸に変換するその能力から評価することができる。
【０３９０】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における昆虫デサチュラーゼの機能発現及び／又は活性は、配列の起源に応じて幅広く異なる。上記の基準によって測定したとき、イラクサギンウワバ（T. ni）に由来する変異体が、カブラヤガ（A. segetum）及びＴ．シュードナナ（T. pseudonana）と比較して最良の活性を呈した。
【０３９１】
クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）に由来するデサチュラーゼは、並びにイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼも、ΔＯＬＥ１を補完した。これらのデサチュラーゼを使用した生物変換アッセイを行うことができる。
【０３９２】
他の脂肪酸基質の生物変換を調べて酵素の可塑性を評価することができる。
【０３９３】
材料及び方法
株の樹立及び機能発現アッセイ
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１（MATA OLE1::LEU2 ura3-52 his4）を発現宿主として使用した。ＯＬＥ１プロモーター領域（配列番号５及び６）、２７Ｎ末端アミノ酸のＯＬＥ１リーダー配列をコードするヌクレオチド（配列番号７）、及びＶＰＳ１３ターミネーター配列（配列番号８）を含むｐＯＬＥ１と呼ばれる合成発現カセット（図１０、配列番号４）を作成し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターのＳａｃＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間にクローニングした。ｐＯＬＥ１カセットの機能性を試験するため、ＳｐｅＩ部位と及びＮｏｔＩ部位との間にDasher GFPシントンを挿入してｐＯＬＥ１−ＧＦＰプラスミドを作成した。コンピテントΔＯＬＥ１をｐＯＬＥ１−ＧＦＰで形質転換し、ＵＦＡを含有するＣＭ−Ｕｒａグルコース寒天プレート（Teknova）に置いた（２０ｍｍ  ＣＭ−ＵＲＡグルコース寒天プレートに、１％テルジトール（tergitol）及び３μＬパルミトレイン酸を含有する１００μＬ  ＣＭ−Ｕｒａグルコース培地を塗布した）。３０℃で５日間インキュベートした後、ΔＯＬＥ１形質転換体の緑色の呈色によって示されるとおり、Dasher GFP発現が見えた。この結果から、ｐＯＬＥ１カセットが異種タンパク質発現をドライブする能力を有したことが示された。ＯＬＥ１活性を回復させることにより、ΔＯＬＥ１補完性の検証を実施した。具体的には、リーダー配列を欠くｐＯＬＥ１カセットに天然Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１シントンを挿入してｐＯＬＥ１−ＯＬＥ１プラスミドを作成した。ΔＯＬＥ１の形質転換、及びＵＦＡを含有するＣＭ−Ｕｒａグルコース寒天での選択後、ＵＦＡを含まないＹＰＤ及びＣＭ−Ｕｒａグルコースにシングルコロニーをパッチした。３０℃で５日間インキュベートした後、成長を観察した（図１１Ａ〜図１１Ｅ）。予想どおり、Dasher GFP発現はＵＦＡなしでのΔＯＬＥ１成長を補完できなかった（図１１Ａ〜図１１Ｅ）。デサチュラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を合成し（クローニング目的で用いられる制限部位を除去するヌクレオチド変化を含めた）、ＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ部位を用いてｐＯＬＥ１にクローニングした（Genscript、配列番号９〜１３）。昆虫デサチュラーゼによるΔＯＬＥ１の補完アッセイをＯＬＥ１デサチュラーゼと同様に実施した。
【０３９４】
機能発現を評価するため、ＵＦＡを含有するＣＭ−Ｕｒａグルコース寒天培地にパッチしておいた２つの陽性形質転換クローンを１．５ｍＬのパルミチン酸（エタノール中）含有ＣＭ−Ｕｒａグルコース液体培地に３００ｍｇ／Ｌの最終濃度で、及び６．７ｇ／ＬでＹＮＢに接種した。（ｚ）−１１−ヘキサデセン酸異性体を確認するため、２０ｍＬの培養物を作成した。生物変換アッセイを２８℃で９６時間進行させた後、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。
【０３９５】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ検出
全脂質組成並びに（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸定量化は、Moss et al. (1982)（Moss, C. W., Shinoda, T. & Samuels, J. W. Determination of cellular fatty acid compositions of various yeasts by gas-liquid chromatography. J. Clin. Microbiol. 16: 1073-1079 (1982)）及びYousuf et al (2010)（Yousuf, A., Sannino, F., Addorisio, V. & Pirozzi, D. Microbial Conversion of Olive Oil Mill Wastewaters into Lipids Suitable for Biodiesel Production. J. Agric. Food Chem. 58: 8630-8635 (2010)）による変法に基づいた。通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット状細胞（１．５ｍＬプラスチックチューブ内）を５％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム含有メタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を１．８ｍＬスクリューキャップＧＣ−バイアルに移した。この混合物を９０℃のヒートブロックで１時間加熱した。４００  ２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。１ｍＭヘプタデカン酸を含有する５００μＬクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心した後、４５０μＬの有機相を新しい１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。水相を２回目に５００μＬクロロホルムで、今回はヘプタデカン酸なしに抽出した。合わせた有機相を９０℃で蒸発させた。室温に冷却した後、残留する脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を溶解し、０．２Ｍ  ＴＭＳＨ（水酸化トリメチルスルホニウム）を含有するメタノール中で誘導体化した。
【０３９６】
ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）誘導体のフラグメンテーションパターンを標準物質のＤＭＤＳ誘導体と比較することにより、生物学的に生成された（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の位置選択性を決定した。酵母培養物を１２のアリコートに分けた（開発した手順におけるいかなるパラメータも変更しないようにした）。細胞をペレット化すると、これにより平均６３ｍｇの細胞（ｃｃｗ）（１８ｍＬの培養物から７５５ｍｇ）が得られた。このペレットを上記に記載したとおり塩基性メタノリシスに供した。しかしながら、酸性化後、これらの試料を５０ｍＬファルコンチューブに合わせた。合わせた試料を１０ｍＬクロロホルムで２回抽出した。この混合物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心すると、より良好な相分離が実現した。合わせた有機相、これらは新しい５０ｍＬ  Falconに合わせ、１０ｍＬのブライン及び１０ｍＬの水で連続的に洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空濃縮した。濃縮した油を１．５ｍＬクロロホルム中に溶解させて、１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。クロロホルムを９０℃で蒸発させた。残りの試料は５０μＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中に溶解させた。５０μＬを１、５、１０及び２０μＬに分け、インサートのないＧＣ−バイアルに移した。各バイアルに２００μＬ  ＤＭＤＳ（ジメチルジスルフィド）及び５０μＬ  ＭＴＢＥ（６０ｍｇ／ｍＬヨウ素含有）を加えた。この混合物を５０℃で４８時間加熱した後、１００μＬ飽和チオ硫酸ナトリウム溶液を加えることにより過剰なヨウ素を除去した。試料をプラスチックバイアルに移し、５００μＬジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機相を新しい１．５ｍＬプラスチックバイアルに移し、９０℃で蒸発させた。試料を５０μＬ  ＤＣＭに取り、ＧＣ−バイアルに移した。この試料をHagstroem et al. (2013)の方法（Hagstroem, A. K. et al. A moth pheromone brewery: production of (Z)-11-hexadecenol by heterologous co-expression of two biosynthetic genes from a noctuid moth in a yeast cell factory. Microb. Cell Fact. 12: 125 (2013)）を用いてＧＣ−ＭＳによって分析した（表７）。
【０３９７】
【表６４】
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【０３９８】
実施例５：昆虫脂肪アルコール合成用の生成プラットフォームとしてのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。１つのかかる経路は、脂肪アシル−ＣｏＡの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。幾つもの遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、単一の昆虫脂肪アルコール又はそのブレンドの高レベル合成能を有する経路の作成を可能にする酵素活性を同定した。加えて、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すため、これらの酵素を複数の宿主（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica））にわたってスクリーニングした。
【０３９９】
手法の概要
パルミチン酸からの（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の合成を可能にするため選択の機能性膜貫通デサチュラーゼ変異体を発現するようにＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を予め改変した。これにより、変異体を同定して、それらの生物変換性能に基づき順位付けすることが可能であった（実施例４を参照されたい）。
【０４００】
（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸からの（Ｚ）−１１−ヘキサデセノール（Ｚ１１−１６ＯＨ）の合成を可能にするため選択の機能性膜貫通レダクターゼ変異体を発現するようにＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を予め改変した。これにより、変異体を同定して、それらの生物変換性能に基づき順位付けすることが可能であった（実施例３を参照されたい）。
【０４０１】
これまでのスクリーニングで同定された最も高活性の変異体デサチュラーゼ及びレダクターゼを含む幾つかの脂肪アルコール経路をアセンブルした。
【０４０２】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｗ３０３Ａ及びΔＯＬＥ１を経路コンストラクトで形質転換した。組換え酵母がパルミチン酸からＺ１１−１６ＯＨを合成する能力によって経路の機能性を評価した。
【０４０３】
ＧＣ−ＭＳ分析を用いて代謝産物を同定及び定量化した。
【０４０４】
結果
目標は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の１つ以上の昆虫脂肪アルコール生合成経路を改変することであった。これまでに、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における昆虫由来の幾つかの膜貫通デサチュラーゼの機能発現が実証された（実施例４を参照されたい）。簡潔に言えば、ＯＬＥ１プロモーター領域、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１の最初の２７アミノ酸をコードするＮ末端リーダー配列、及びＶＰＳ１３のターミネーター領域からなる発現カセットを設計することにより、異種デサチュラーゼ発現が可能であった。活性デサチュラーゼのスクリーニングは、２つの手法を用いることにより行った。第一に、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）を外因的に加えない場合のΔＯＬＥ１成長をレスキューするその能力に関して活性デサチュラーゼをスクリーニングし、第二に、パルミチン酸の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸への生物変換に関するインビボスクリーニングによって活性デサチュラーゼをスクリーニングした。これらのスクリーニング戦略により、幾つかの活性変異体を同定し、それらの相対活性を順位付けすることが可能になった。これらのスクリーニング結果に基づき、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（ＴＮ＿ｄｅｓａｔ）及びＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）（ＳＣ＿ｄｅｓａｔ）由来のデサチュラーゼを脂肪アルコール経路におけるコンビナトリアル発現用に選択した。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）デサチュラーゼはパルミトレイン酸及びオレイン酸を形成することが知られている。
【０４０５】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における昆虫由来の幾つかの膜貫通アルコール形成レダクターゼの機能発現が既に実証済みであった（実施例３を参照されたい）。ＧＡＬ１プロモーター及びＣＹＣターミネーターを含む発現カセットを使用して、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）におけるレダクターゼの機能発現を可能にした。（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸のＺ１１−１６ＯＨへのインビボ生物変換によって幾つかのレダクターゼをスクリーニングすることにより、活性変異体を同定し、それらの相対活性を順位付けすることが可能になった。このスクリーニングに基づき、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）（ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ）、及びエジプトヨトウ（Spodoptera littoralis）（ＳＬ＿ｒｅｄｕｃ）由来のレダクターゼを脂肪アルコール経路のアセンブリ用に選択した。
【０４０６】
コンビナトリアルアセンブリにより、４つの脂肪アルコール経路、即ち、ＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ、ＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＳＬ＿ｒｅｄｕｃ、ＳＣ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ、及びＳＣ＿ｄｅｓａｔ−ＳＬ＿ｒｅｄｕｃが作成された。ＳＣ＿ｄｅｓａｔを含む経路を昆虫Ｚ１１−１６ＯＨ合成の陰性対照として供した。これらの経路を有するコンストラクトでＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１及びＷ３０３Ａを形質転換し、パルミトレイン酸を塗布した２％グルコース含有ＣＭ−Ｕｒａ上で成長した形質転換体を単離した。脂肪アルコール生成に関して試験するため、２％グルコース、１％ラフィノース、２％ガラクトースを含有するＣＭ−Ｕｒａ培地に個々のクローンを接種した。３００ｍｇ／Ｌパルミチン酸、及び３６０ｍｇ／Ｌパルミトレイン酸を生物変換基質として加えた。パルミトレイン酸なしにパルミチン酸を用いた生物変換も試験した。パルミチン酸及びパルミトレイン酸の存在下で約９６時間培養した後、培養ブロス分析により、それぞれＳＣ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ、及びＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃを有するΔＯＬＥ１株の培養物中に主要なＣ１６アルコール生成物として約０．２ｍｇ／Ｌ、及び約０．３ｍｇ／ＬのＺ１１−９ＯＨが合成されたことが明らかになった（図１５、図１６）。イラクサギンウワバ（T. ni）又はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）デサチュラーゼ、及びオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを含む経路にも微量のＺ１１−１６ＯＨが検出された。概して、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸はイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼから生合成されなければならないが、パルミトレイン酸を外因的に加えると、Ｚ９−１６ＯＨの合成用の基質がより容易に利用可能となるため、パルミチン酸及びパルミトレイン酸の存在下では、Ｚ９−１６ＯＨ合成がＺ１１−１６ＯＨ合成よりも有利であったことが予想された。脂肪酸分析も実施した。この結果によれば、昆虫デサチュラーゼを含む経路では、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）デサチュラーゼを発現する経路と比べて（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（図１７）の蓄積がより高いことが示された。微量とはいえ、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）デサチュラーゼを有する経路からのＺ１１−１６ＯＨ、及び（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の検出（これは予想外であった）から、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）デサチュラーゼによる小規模なΔ１１不飽和化活性の可能性が開かれる。Ｚ１１−１６ＣＯＯＨ脂肪酸部分の低レベルの合成もＺ９−１４ＣＯＯＨ脂肪アシル中間体の伸長から誘導することができる。図１５に示されるデータはまた、オオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを含む経路と比較して、エジプトヨトウ（S. littoralis）レダクターゼを含めると、Ｚ９−１６ＯＨ力価が（最大約３０倍）低下したことも示した。エジプトヨトウ（S. littoralis）レダクターゼを用いる経路には、Ｚ１１−１６ＯＨは検出することができなかった。これらの結果は、エジプトヨトウ（S. littoralis）レダクターゼと比較してオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを用いた（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の優れた生物変換を示したレダクターゼスクリーニングアッセイと一致する。
【０４０７】
ＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＨＡ＿ｒｅｄｕｃ及びＴＮ＿ｄｅｓａｔ−ＳＬ＿ｒｅｄｕｃを発現するΔＯＬＥ１株により、パルミチン酸の生物変換を単独でも（パルミトレイン酸を外因的に加えることなく）試験した（図１８）。培養ブロス分析から、優勢な不飽和Ｃ１６脂肪酸生成物としてのＺ１１−１６ＯＨの合成が決定された（図１６）。このアッセイでは、それぞれオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼ及びエジプトヨトウ（S. littoralis）レダクターゼを有する経路により、最大０．２２ｍｇ／Ｌ、及び０．０５ｍｇ／ＬのＺ１１−１６ＯＨが合成された。生物学的に生成されたＺ１１−１６ＯＨはまた、ＧＣ−ＭＳ（ＳＩＭ）によって決定するときに保持時間も一致し、標準物質Ｚ１１−１６ＯＨと同様の特徴的な２９７．３ｍ／ｚピークを呈した。従って、生物学的に生成されたＺ１１−１６ＯＨの位置異性体及び立体異性体が確認された（図１９）。更に、Ｚ９−１６ＯＨ（０．０１ｍｇ／Ｌ）はまた、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼ及びオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを共発現する株の培養物にも観察された。このことから、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼもΔ９不飽和化活性を有し得ることが示唆された。
【０４０８】
ＯＬＥ１欠失は成長を損なう。従って、インタクトなＯＬＥ１対立遺伝子を有する宿主であるＷ３０３Ａにおいても経路発現を調べた。しかしながら、成長の改善にも関わらず、この宿主における経路発現はＺ１１−１６ＯＨ力価の２倍を超える低下をもたらした。この結果は、ＯＬＥ１の産物である内因性不飽和脂肪アシル：ＣｏＡによるＯＬＥ１プロモーター（これが異種デサチュラーゼ発現をドライブした）の抑制に起因するものと思われた。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＯＬＥ１プロモーターは、従来、飽和及び不飽和脂肪酸によってそれぞれ正及び負の調節を受けることが分かっている構造領域によって特徴付けられている（Choi, J-Y. et al. Regulatory Elements That Control Transcription Activation and Unsaturated Fatty Acid-mediated Repression of the Saccharomyces cerevisiae OLE1 Gene. J. Biol. Chem. 271: 3581-3589 (1996)）。シス転写調節に加え、不飽和脂肪酸はまた、ＯＬＥ１プロモーターエレメントとも相互作用してｍＲＮＡ安定性を調節する（Gonzales, C. I. et al. Fatty acid-responsive control of mRNA stability. Unsaturated fatty acid-induced degradation of the Saccharomyces OLE1 transcript. J. Biol. Chem. 271: 25801-25809 (1996)）。ＯＬＥ１プロモーターのこの固有の複雑さに起因して、Ｓ．クルイベリ（S.kluyveri）由来のＯＬＥ１プロモーターなど（Kajiwara, S. Molecular cloning and characterization of the v9 fatty acid desaturase gene and its promoter region from Saccharomyces kluyveri. FEMS Yeast. Res. 2: 333-339 (2002）、調節されない直交性プロモーターを利用した昆虫デサチュラーゼ発現のドライブについて、脂肪アルコール生成の増進のため調べることができる。
【０４０９】
要約すれば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１において合成フェロモン経路変異体が機能的に発現すると、パーム油脂肪酸（パルミチン酸及びパルミトレイン酸）からの、それぞれ最大約０．２ｍｇ／Ｌ及び０．３ｍｇ／ＬのＺ１１−１６ＯＨ及びＺ９−１６ＯＨの合成が生じた。
【０４１０】
最も高い脂肪アルコールをもたらした改変経路は、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼ及びオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを含む。
【０４１１】
Ｚ１１−１６ＯＨを生成した株において、この経路の中間体である（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の蓄積も観察された。
【０４１２】
Ｚ１１−１６ＯＨは生成されず、陰性対照株（ベクターのみを含む）において僅かに痕跡量のＺ９−１６ＯＨが検出されたに過ぎなかった。
【０４１３】
保持時間及びフラグメンテーションパターンを標準物質化合物とＧＣ−ＭＳによって比較することにより、生物学的に生成されたＺ１１−１６ＯＨの位置化学及び立体化学が確認された。
【０４１４】
結論
昆虫フェロモンの脂肪アルコール前駆体であるＺ１１−１６ＯＨ及びＺ９−１６ＯＨの合成のためのパン酵母の改変が実証された。
【０４１５】
脂肪アルコール生成はデサチュラーゼ及びレダクターゼ変異体の選択に応じて様々である。
【０４１６】
（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の蓄積から、アルコール形成レダクターゼの性能を高めることによる更なる脂肪アルコール改良の可能性が示唆された。しかしながら、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の検出は、それがリン脂質として小胞体膜以外の任意の膜（ミトコンドリア膜、ペルオキシソーム、核膜など）に取り込まれ、従って、そのＣｏＡチオエステル部分における（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸をその基質として利用しなければならないアルコール形成レダクターゼ（恐らくは小胞体内へと移行した）に到達できないことに起因した可能性もある。
【０４１７】
脂肪アルコール力価を増加させる培養条件を調べることができる。イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼは、経路において、高活性を示し且つΔＯＬＥ１成長をイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼよりも速くレスキューした別の変異体であるクルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼに置き換えることができる。この合成経路は、パルミチン酸及びパルミトレイン酸などの疎水性基質に対して高い接着特性を有する酵母であるカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）に取り込むことができる。微生物による生成プラットフォームへの基質の接近容易性を高めることにより、生成物力価及び収率を改善し得ると予測できる。
【０４１８】
材料及び方法
株の樹立及び機能発現アッセイ
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１（MATA OLE1::LEU2 ura3-52 his4)、及びＷ３０３Ａ（MATA ura3-1 trp1-1 leu2-3_112 his3-11_15 ade2-1 can1-100）を発現宿主として使用した。分子設計により、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを利用してレダクターゼシントンを切り出すコンビナトリアル経路アセンブリ（実施例３を参照されたい）及びｐＯＬＥ１−デサチュラーゼコンストラクトを含有するプラスミドへのサブクローニング（実施例４を参照されたい）が可能である。コンピテント酵母を経路コンストラクトで形質転換し、ＣＭ−Ｕｒａグルコース寒天プレート（Teknova）にプレーティングした。ΔＯＬＥ１形質転換の場合、コロニーのプレーティングには、１％テルジトール（tergitol）及び３μＬパルミトレイン酸を含有する１００μＬ  ＣＭ−Ｕｒａグルコース培地を塗布した２０ｍＭ  ＣＭ−Ｕｒａグルコース寒天プレートを利用した。
【０４１９】
機能発現を評価するため、６．７ｇ／ＬのＹＮＢ、２％グルコース、１％ラフィノース、及び２％ガラクトースを含有する約２０ｍＬ  ＣＭ−Ｕｒａ液体培地に形質転換体を接種した。脂肪酸基質、即ちパルミチン酸（エタノール中）を３００ｍｇ／Ｌの最終濃度で加えた。パルミトレイン酸を３６０ｍｇ／Ｌの最終濃度で加えた。生物変換アッセイを２８℃で９６時間進行させた後、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。
【０４２０】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ検出
脂肪酸分析は実施例４に記載されるとおりであり、但し試料は２回抽出するのでなく、試料は１ｍＭヘプタデカン酸メチル（Ｃ１７：０Ｍｅ）を含有するクロロホルムで１回抽出したのみであった。脂肪アルコール分析は実施例３に記載されるとおりであり、但しヘキサン（テトラデカン二酸を含有する）でなく、クロロホルム（１ｍＭヘプタデカン酸メチルを含有する）を使用した。抽出時間は１時間から２０秒間に短縮した。その後、試料は１．５ｍＬプラスチックチューブでなく、１．８ｍＬ  ＧＣバイアルに収集した。質量分析計はＳＩＭモード（ｍ／ｚ  ２０８、２９７．３及び３８７．３）で使用した。
【０４２１】
実施例６：カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）における膜貫通デサチュラーゼの発現
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。１つのかかる経路は、脂肪アシル−ＣｏＡの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。幾つもの遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、単一の昆虫脂肪アルコール又はそのブレンドの高レベル合成能を有する経路の作成を可能にする酵素活性を同定した。加えて、これらの酵素を複数の宿主（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica））にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
【０４２２】
手法の概要
デサチュラーゼ（昆虫由来：カブラヤガ（Agrotis segetum）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、アワノメイガ（Ostrinia furnacalis）、及びカラントシュートボーラー（Lampronia capitella）及び海洋性珪藻：タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana））の小さい組をテストケースとして選択して、機能発現アッセイ、代謝産物抽出方法、及び分析化学を調査し及び確立した。
【０４２３】
ＳＰＶ０５３におけるｐＸＩＣＬ発現カセットからのｍＣｈｅｒｒｙ対照の組込み及び機能発現の成功が確認された。
【０４２４】
ＳＰＶ０５３バックグラウンドで同じｐＸＩＣＬベクターを使用する組換えデサチュラーゼライブラリを組み込んだ（図２０）。１つの変異体、カブラヤガ（Agrotis segetum）のＺ１１デサチュラーゼもクローニングして、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）Ｏｌｅ１ｐの最初の２７アミノ酸が昆虫デサチュラーゼのＮ末端に融合したタンパク質生成物を作製した（配列番号１５）。
【０４２５】
ヘキサデカン酸（パルミチン酸）の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（パルミトバクセン酸）へのインビボ生物変換によってデサチュラーゼの機能性をバリデートした。
【０４２６】
ＧＣ−ＦＩＤ及びＧＣ−ＭＳ分析を用いて代謝産物を同定及び定量化した。
【０４２７】
結果
ライブラリ構築
この試験は、Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）（ＳＰＶ０５３）における膜貫通デサチュラーゼ変異体のスクリーニングに焦点を置いた。スクリーニングには、パルミトイル−ＣｏＡ（Ｃ１６：０）に対して既報告のＺ１１デサチュラーゼ活性を有する５つの昆虫デサチュラーゼ（配列番号１６〜１９、２３）及び既報告のＺ９デサチュラーゼ活性を有する３つの昆虫デサチュラーゼ（配列番号２０〜２２）を含めた。１つの変異体、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ＯＬＥ１  Ｎ末端の２７アミノ酸が昆虫配列の上流に融合したカブラヤガ（A. segetum）由来のＺ１１デサチュラーゼ（配列番号１６）もサブクローニングした（図２０、配列番号１５）。構築時点では、カブラヤガ（A. segetum）Ｚ１１デサチュラーゼは陽性対照であると考えられ、及びＣ．アルビカンス（C. albicans）ＯＬＥ１融合物は、カンジダ属（Candida）リーダー配列を含めると機能発現が向上し得るかどうかを試験するために構築した。このコンストラクトは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）デサチュラーゼスクリーニングで使用されるものを模倣するように設計した（実施例４を参照されたい）。最後に、組込み及び発現に関する陽性対照及び組換えデサチュラーゼ活性に関する陰性対照としての役割を果たすように、ｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質（配列番号１４）を発現する対照コンストラクトを含めた（図２１Ａ〜図２１Ｄ）。
【０４２８】
ＳＰＶ０５３への線状化プラスミドの形質転換効率はコンストラクト間で大幅に異なった。低効率であるものの、各変異体につき少なくとも３つのクローン分離株が同定された（表８及び表９）。ゼオシン選択下ではゼオシン耐性マーカーの存在が成長速度を増加させるはずであるため、形質転換プレート上の大型コロニーが陽性組込み体である可能性がより高いという仮定がなされていた。スクリーニング結果の分析から、大型コロニーの数は形質転換効率と相関しないことが示唆された。代わりに、総コロニー（小及び大）の数が、観察された効率と最良に相関した（図２２）。加えて、ある場合には、小コロニー中に陽性クローンが認められた。低いプレーティング密度では、成長速度が組込みイベントと相関し得る（即ち陽性組込み体はより速く成長する）可能性がある。コロニーをＹＰＤ＋ゼオシンにパッチし直す二次スクリーニングが、陽性組込み体のエンリッチメントに有効であることが分かった。パッチの速い成長は、形質転換プレート上のコロニーの一般的な集団と比べて陽性組込み体である可能性が高かった。
【０４２９】
【表６５】
2019503657.tif 000070
【０４３０】
【表６６】
2019503657.tif 000071
【０４３１】
機能発現アッセイ
一連のインビボ生物変換実験によって異種デサチュラーゼの機能発現を特徴付けた。エタノール（誘導のため）及び飽和酸基質（パルミチン酸、パルミチン酸メチル、ミリスチン酸メチル）を補足した富栄養（ＹＰＤ）培地又は限定（ＣＭグルコース）培地において、昆虫デサチュラーゼを発現するＣ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３由来の株を培養した。小規模（２ｍｌ）培養物は２４ディープウェルプレートで合計７２時間、最初の２４時間が経った後に基質を追加して培養した。
【０４３２】
初回のスクリーニングでは、パルミチン酸基質を補足した複数の生物変換培地を調べた。細胞脂質含量の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析により、２つの機能性パルミトイル−ＣｏＡ（Ｚ）−１１デサチュラーゼが同定された。クルミマダラメイガ（A. transitella）又はアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼを発現する株（ＳＰＶ０３０５−ＳＰＶ０３１０）は、（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸標準で溶出した、ｍＣｈｅｒｒｙ対照株（ＳＰＶ０３０２−ＳＰＶ０３０４）では観察されない脂肪酸種を生成した（図２３）。試験した他の株は非天然脂肪酸種を生成しなかった（データは示さず）。Ｃ１６画分の近似脂肪酸組成を表１０に掲載する。天然パルミトイル−ＣｏＡ（Ｚ）−９デサチュラーゼがなおもＳＰＶ０５３バックグラウンドに存在し、これは、デサチュラーゼの（Ｚ）−９／（Ｚ）−１１特異性を厳密には決定できないことを意味する。培地中にパルミチン酸を補足すると、アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ発現株について（Ｚ）−１１／（Ｚ）−９ヘキサデセン酸比が０．６から１．４に上昇した。（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸力価は、クルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼを発現する株について約５．６２ｍｇ／Ｌであり、及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼを発現する株について５．９６ｍｇ／Ｌであることが観察された。パルミチン酸メチル補足でも同様の性能が観察された（データは示さず）。
【０４３３】
【表６７】
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【０４３４】
推定（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸種の更なる特徴付けに十分なバイオマスを作成するため、生物変換アッセイを振盪フラスコ内の２０ｍｌにスケールアップした。観察された種は（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸標準と共に及び（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸標準とは独立して溶出したが、異なる脂肪酸異性体（例えば（Ｅ）−９−ヘキサデセン酸）が（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸と同様の保持時間を有し得た可能性があった。異なる立体異性体がＤＢ−２３上で別様に溶出することに伴い、（Ｅ）−１１−ヘキサデセン酸の発生を除外することができた。（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸生成の最終的な確認は、ＤＭＤＳ誘導体化脂肪酸の質量分析検出を用いて１１−位置選択性を確認することにより完了した。この誘導体化技法を用いると、（Ｚ）−１１及び（Ｅ）−１１異性体も原則的に解くことができた。実験試料のフラグメンテーションパターンは（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸標準に一致させることができた（図２４Ａ〜図２４Ｅ）。この技法を用いて、クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ発現株の両方の特定の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸位置異性体及び立体異性体の生成が確認された。
【０４３５】
最後に、ミリスチン酸メチル（Ｃ１４：０）を基質としてデサチュラーゼライブラリ全体に関して試験した。クルミマダラメイガ（A. transitella）又はアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼのいずれかを発現する株において、ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）と（Ｚ）−９−テトラデセン酸（Ｚ９−Ｃ１４：１）との間に溶出する非天然脂肪酸種が観察された（図２５Ａ）。この非天然種は（Ｚ）−１１−テトラデセン酸であることが仮定され、このことは標準物質で確認することができる。加えて、カブラヤガ（A. segetum）Ｚ１１デサチュラーゼ、アワノメイガ（O. furnacalis）Ｚ９デサチュラーゼ、及びアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ９デサチュラーゼが全て、ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）ピークのすぐ後に溶出した肩ピークを生じた（図２５Ｂ）。全ての株において他のＣ１４由来種（例えばテトラデカン二酸）が観察された。これらの結果は、クルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼがミリストイル−ＣｏＡに対して何らかの活性を有することを示唆する。インビボでのデサチュラーゼ基質特異性に関して更なる結論を導き出すには、未知の種の確認及び定量化が必要である。
【０４３６】
要約すれば、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＡＡＦ８１７８７）及びクルミマダラメイガ（Amyelois transitella）（ＪＸ９６４７７４）由来の２つのデサチュラーゼをＳＰＶ０５３で発現させて、内因的に産生されるか又は補足されるかのいずれかのパルミチン酸からの（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の合成をもたらした。
【０４３７】
Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３におけるアメリカタバコガ（H. Zea）及びクルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼの機能発現が富栄養（ＹＰＤ）培地及び限定（ＣＭグルコース）培地の両方におけるインビボ生物変換アッセイを用いて確認された。活性デサチュラーゼが細胞内（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸を生じさせ、これはｍＣｈｅｒｒｙ発現対照株では観察されなかった。アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼを発現するＳＰＶ０５３のＣ１６脂肪酸組成は、約５０．０％ヘキサデカン酸、３０．９１％（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸及び１９．１％（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸である。パルミチン酸を補足すると、組成物は５８．１％ヘキサデカン酸、１７．５％（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸及び２４．４％（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸である。クルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼを発現するＳＰＶ０５３のＣ１６脂肪酸組成は、５５．５％ヘキサデカン酸、１４．５％（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸及び３０．０％（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸である。比較すると、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＳＰＶ０５３は、約７２．９％ヘキサデカン酸、２７．１％（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸及び（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸無しのＣ１６脂肪酸組成を生じた。（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸は、機能性Ｚ１１デサチュラーゼを発現する両方の株において約５．５ｍｇ／Ｌで生成された。
【０４３８】
イラクサギンウワバ（T. ni）、Ｔ．シュードナナ（T. pseudonana）、又はカブラヤガ（A. segetum）デサチュラーゼを含む株では（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸は観察されなかった。
【０４３９】
アメリカタバコガ（H. Zea）、アワノメイガ（O. furnacalis）、又はカラントシュートボーラー（L. capitella）由来のＺ９昆虫デサチュラーゼを発現する株について、脂肪酸組成の違いは観察されなかった。
【０４４０】
ＤＭＤＳ誘導体化後のＧＣ−ＭＳによって標準物質化合物の保持時間及びフラグメンテーションパターンと比較することにより、生物学的に生成された（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の位置異性体及び立体異性体が確認された。
【０４４１】
ミリスチン酸メチルを補足したクルミマダラメイガ（A. transitella）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼを発現するＳＰＶ０５３の生物変換では、ｍＣｈｅｒｒｙ発現陰性対照株に観察されない未同定の代謝産物が生成された。この代謝産物のＧＣ保持時間は、ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）と（Ｚ）−９−テトラデセン酸との間であることが認められる。
【０４４２】
結論
Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３における昆虫由来の膜貫通デサチュラーゼの機能発現が達成された。
【０４４３】
Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）におけるスクリーニングによって同定された活性デサチュラーゼはまた、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ΔＯＬＥ１で発現させたときにＯＬＥ１機能も補完した（実施例４を参照されたい）。
【０４４４】
インビボアッセイを用いて非天然脂肪酸異性体（例えば（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸）に関するＣ．トロピカリス（C. tropicalis）におけるデサチュラーゼ活性をアッセイすることができる。パルミチン酸又はミリスチン酸メチルなどの飽和酸基質を補足することにより、向上した比の非天然脂肪酸を生成することができる。
【０４４５】
昆虫デサチュラーゼの機能発現及び／又は活性は、Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）ＳＰＶ０５３では配列起源に応じて幅広く異なる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）スクリーニングで観察された結果と同様に（実施例４を参照されたい）、カブラヤガ（A. segetum）及びＴ．シュードナナ（T. pseudonana）変異体は検出可能な（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸を生成しなかった。興味深いことに、イラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼも、アッセイ条件下で検出可能な（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸を生成することができなかった。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）アッセイと異なり、イラクサギンウワバ（T. ni）発現コンストラクトはキメラＯＬＥ１リーダー配列を含まなかった。
【０４４６】
機能性アメリカタバコガ（H. Zea）変異体及び非機能性イラクサギンウワバ（T. ni）変異体に対するＣ．アルビカンス（C. albicans）ＯＬＥ１リーダー配列の包含を試験することができる。
【０４４７】
Ｃ１４特異的デサチュラーゼを同定するため更なるデサチュラーゼ変異体の機能発現を調べることができる。
【０４４８】
機能性デサチュラーゼをレダクターゼ変異体と共に発現させて、続いて不飽和脂肪アルコール生成に関するスクリーニングを実施することができる。
【０４４９】
材料及び方法
株の樹立
遺伝子の記録には従来手法を用いた。ＣＴＧロイシンコドンをＴＴＡに置き換えたことを除き、天然配列は変化させなかった。GenscriptによるＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、全ての遺伝子をｐＰＶ００５３にクローニングした。大腸菌（E. coli）ＮＥＢ１０βへの形質転換後、Zyppyプラスミドミニプレップキット（Zymo Research、Irvine, CA）を用いてプラスミドをミニプレップした。ＢｓｉＷＩ（New England Biolabs、Ipswich, MA）で消化することによりプラスミドを線状化した後、ＳＰＶ０５３に形質転換した。消化後、Clean and Concentrator Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を使用してＤＮＡを単離した。約１μｇのＤＮＡを電気穿孔によって形質転換した。ＴＥ＋１００ｍＭ酢酸リチウム＋ＤＴＴとインキュベートする代わりに、細胞はＴＥ＋１００ｍＭ酢酸リチウムのみで２時間インキュベートした。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックＰＣＲにより遺伝子タイピングを行った。低効率転換の更なるスクリーニングに二段階手法を取った。約６０コロニーをＹＰＤ＋３００μｇ／ｍｌゼオシンに再パッチし、一晩成長させた。急速に成長した（２４時間以内の高密度増殖）一部のパッチをコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。急速に成長するパッチの圧倒的多数が陽性組込み体として同定された。
【０４５０】
機能発現アッセイ
ＹＰＤ及びＣＭグルコースにおけるパルミチン酸補足
陽性分離株をＹＰＤ＋３００μｇ／ｍｌゼオシンに再パッチし、一晩成長させて、次に４℃で保存した。株をパッチプレートから２４ディープウェルプレート（四角形ウェル、ピラミッド形底）内の２ｍｌのＹＰＤに接種した。各デサチュラーゼ変異体及びｍＣｈｅｒｒｙ発現対照株につき３つの陽性クローンを接種した。ディープウェルプレートを３０℃、１０００ｒｐｍ、及び８０％湿度でInfors HT Multitron Proプレートシェーカーにおいて２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物を１ｍｌの等量に分けて２組の同一プレートを作製した。両組のプレートとも５００×ｇで遠心することによりペレット化した。一方の組のプレートは２ｍｌのＹＰＤ＋０．３％（ｖ／ｖ）エタノールに再懸濁し、第２の組は２ｍｌのＣＭグルコース＋０．３％エタノールに再懸濁した。この段階でエタノールを加えて、ＩＣＬプロモーターからの組換え酵素発現を誘導した。培養物を同じ条件下で更に２４時間インキュベートした後、エタノール中９０ｇ／Ｌストック溶液からの培養物に３００ｍｇ／Ｌパルミチン酸を加えた。この結果は、新鮮０．３％エタノールをパルミチン酸と併せて加えることであった。一部の株はまた、パルミチン酸を加えることなく培養した。これらの培養物は代わりに０．３％エタノールを加えた。全ての培養物を更に２４時間インキュベートした後、最後に０．３％エタノールを加えた。更に２４時間インキュベートした後、１．５ｍｌの各培養物を１．７ｍｌ微量遠心管に回収し、ペレット化した。上清は新鮮なチューブに保管し、ペレットは以下に記載するとおり処理した。一部の上清試料はまた抽出して、細胞外培地中の遊離酸を調べた。
【０４５１】
代替基質による反復スクリーニング
パルミチン酸及びパルミチン酸メチルの両方を基質として使用してｍＣｈｅｒｒｙ対照及び確認された陽性変異体を再スクリーニングした。培養は、エタノールストック溶液（パルミチン酸メチル９４ｇ／Ｌストック、３１３ｍｇ／Ｌ最終濃度）から等モル量（１．１７ｍＭ）の基質を加えて上記に記載したとおり行った。株の完全なパネルでも、８４ｇ／Ｌストックのミリスチン酸メチル（Ｃ１４：０）を使用して同じプロトコルを繰り返した。基質の最終濃度は再び１．１７ｍＭであった。
【０４５２】
（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸異性体の確認
（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸合成を確認するためインビボ生物変換アッセイをスケールアップした。株ＳＰＶ０３０２、ＳＰＶ０３０３、及びＳＰＶ０３０４（ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＳＰＶ０３０４、ＳＰＶ０３０５、及びＳＰＶ０３０６（クルミマダラメイガ（A. transitella）Ｚ１１デサチュラーゼ）、並びにＳＰＶ０３０７、ＳＰＶ０３０８、及びＳＰＶ０３０９（アメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ）の２ｍｌ  ＹＰＤシード培養物をInfors HT Multitronプレートシェーカーにおいて３０℃、１０００ｒｐｍ、８０％湿度で一晩成長させた。３つのクローン分離株の各々からの２００μｌの一晩培養物をプールし、２０ｍｌ  ＹＰＤが入った単一の１２５ｍｌバッフル付きフラスコに接種した。得られた３つのフラスコを３０℃及び２５０ｒｐｍ（Inforsフラスコシェーカー）で２４時間成長させた。培養物を５００×ｇで遠心することによりペレット化し、２０ｍｌのＹＰＤ＋０．３％（ｖ／ｖ）エタノールに再懸濁し、１２５ｍｌバッフル付き振盪フラスコに戻した。培養物を更に２４時間インキュベートした後、エタノール中９０ｇ／Ｌストックの３００ｍｇ／Ｌパルミチン酸（１フラスコ当たり２２１μｌ）を加えた。２４時間インキュベートした後、誘導を持続させるため各フラスコに更なる０．３％（ｖ／ｖ）エタノール（２２１μｌ）を加えた。フラスコを更に２４時間インキュベートした後、ＦＡＭＥ分析及びＤＭＤＳ誘導体化のため細胞を回収した。
【０４５３】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ検出
全脂質組成並びに（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸定量化は、Moss et al. (1982)及びYousuf et al (2010)による変法に基づいた。通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット化した細胞（１．５ｍＬプラスチックチューブ内）を、５％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を１．８ｍＬスクリューキャップＧＣ−バイアルに移した。この混合物を９０℃のヒートブロックで１時間加熱した。４００  ２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。１ｍＭヘプタデカン酸を含有する５００μＬクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心した後、４５０μＬの有機相を新しい１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。水相を２回目に５００μＬクロロホルムで、今回はヘプタデカン酸なしに抽出した。合わせた有機相を９０℃で蒸発させた。室温に冷却した後、残留する脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を溶解し、０．２Ｍ  ＴＭＳＨ（水酸化トリメチルスルホニウム）を含有するメタノール中で誘導体化した。
【０４５４】
ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）誘導体のフラグメンテーションパターンを標準物質のＤＭＤＳ誘導体と比較することにより、生物学的に生成された（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸の位置選択性を決定した。酵母培養物を１２のアリコートに分けた（開発した手順におけるいかなるパラメータも変更しないようにした）。細胞をペレット化すると、これにより平均６３ｍｇの細胞（ｃｃｗ）（１８ｍＬの培養物から７５５ｍｇ）が得られた。このペレットを上記に記載したとおり塩基性メタノリシスに供した。しかしながら、酸性化後、これらの試料を５０ｍＬファルコンチューブに合わせた。合わせた試料を１０ｍＬクロロホルムで２回抽出した。この混合物を３０００ｒｐｍで１０分間遠心すると、より良好な相分離が実現した。合わせた有機相を新しい５０ｍＬファルコンに合わせ、１０ｍＬのブライン及び１０ｍＬの水で連続的に洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空濃縮した。濃縮した油を１．５ｍＬクロロホルム中に溶解させて、１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。クロロホルムを９０℃で蒸発させた。残りの試料は５０μＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中に溶解させた。５０μＬを１、５、１０及び２０μＬに分け、インサートのないＧＣ−バイアルに移した。各バイアルに２００μＬ  ＤＭＤＳ（ジメチルジスルフィド）及び５０μＬ  ＭＴＢＥ（６０ｍｇ／ｍＬヨウ素含有）を加えた。この混合物を５０℃で４８時間加熱した後、１００μＬ飽和チオ硫酸ナトリウム溶液を加えることにより過剰なヨウ素を除去した；しかしながら、カンジダ属（Candida）株からのデタージェントの過剰形成に起因して、層が十分に混合されなかった。従って試料を１５ｍＬファルコンチューブ内で希釈して、２００μＬ、３．５５ｍＬ  ＭＴＢＥ（ヨウ素及び分析物を含有する）、５００μＬジクロロメタン、１．５ｍＬ水及び１ｍＬエタノールの最終試料組成とした。有機相を１．８ｍＬガラスバイアルにおいて８５℃で段階的に蒸発させた。試料を５００μＬジクロロメタンに取り、試料を実施例４にあるとおりHagstroem et al. (2013)の方法を用いたＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０４５５】
実施例７：ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）における膜貫通デサチュラーゼの発現
背景及び理論的根拠
微生物による脂肪酸からの昆虫脂肪アルコールの生成の改変には、合成経路の機能発現が必要である。１つのかかる経路は、脂肪アシル−ＣｏＡの、位置特異的及び立体特異的不飽和脂肪アシル−ＣｏＡへの、及び続く脂肪アルコールへの変換を媒介する膜貫通デサチュラーゼ、及びアルコール形成レダクターゼを含む。これらの酵素をコードする幾つもの遺伝子が、ある種の昆虫並びにある種の微細藻類に見られる。或いは、位置特異的及び立体特異的デサチュラーゼを使用して、脂肪酸前駆体リッチな微生物油を生成することができる。次に微生物油は誘導体化し、活性成分に還元することができる。幾つもの遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、単一の昆虫脂肪酸及びアルコール又はそのブレンドの高レベル合成能を有する経路の作成を可能にする酵素活性を同定した。加えて、これらの酵素を複数の宿主（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・ビスワナチイ（トロピカリス）（Candida viswanathii（tropicalis））、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica））にわたってスクリーニングすることにより、これらの膜貫通タンパク質の最適発現に好適な宿主を見つけ出すための検索を最適化し得る。
【０４５６】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）及びＣ．ビスワナチイ（トロピカリス）（C. viswanathii（tropicalis））におけるデサチュラーゼの初期スクリーニングにより、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）から３つの活性Ｚ１１−Ｃ１６：１デサチュラーゼ変異体が同定された。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）スクリーニングは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｏｌｅ１ｐ  Ｚ９デサチュラーゼのＮ末端リーダー配列が完全長昆虫Ｚ１１デサチュラーゼ配列に融合したコード配列を使用した。この戦略はこれまでに科学文献においてＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）で真核生物デサチュラーゼを発現させるために用いられている。上記のデサチュラーゼの３つ全てが、ＯＬＥ１欠失バックグラウンドで発現させたとき、Ｏｌｅ１ｐリーダー融合を伴うＺ１１デサチュラーゼ活性を示した。Ｃ．アルビカンス（C. albicans）Ｏｌｅ１ｐリーダー配列を伴う同様の設計をアメリカタバコガ（H. Zea）由来のＺ１１デサチュラーゼで用いた。このＯｌｅ１ｐ−アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ融合物は、活性であるものの、Ｚ１１−ヘキサデセン酸力価を有意に増加させることはなかった。加えて、従来どおり最適化したクルミマダラメイガ（A. transitella）Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）及びＣ．ビスワナチイ（C. viswanathii）の両方で活性であった。以下の研究は、２つの異なるＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）株、ＳＰＶ１４０及びＳＰＶ３００におけるアメリカタバコガ（H. Zea）、イラクサギンウワバ（T. ni）、及びクルミマダラメイガ（A. transitella）Ｚ１１デサチュラーゼの機能発現を試験することに焦点を置いた。アメリカタバコガ（H. Zea）及びイラクサギンウワバ（T. ni）デサチュラーゼには天然配列及びヒト（Homo sapiens）コドン最適化した配列の両方を使用した一方、クルミマダラメイガ（A. transitella）には天然配列のみを使用した。最後に、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）Ｏｌｅ１ｐ  Ｚ９ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼのＮ末端は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）又はＣ．アルビカンス（C. albicans）のいずれに由来するＯｌｅ１ｐのＮ末端よりも昆虫デサチュラーゼと一層緊密にアラインメントする。このアラインメントに基づき、２つの更なるデサチュラーゼバージョンを作成した。推定リーダー配列をＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）Ｏｌｅ１ｐからイラクサギンウワバ（T. ni）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼに交換した。
【０４５７】
手法の概要
Ｚ１１デサチュラーゼ（昆虫由来：クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni））の焦点を絞ったライブラリ（これらはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）又はＣ．ビスワナチイ（C. viswanathii）のいずれかにおいて活性が観察された）を、ＵＲＡ３選択マーカーを有するＸＰＲ２遺伝子座を標的とするダブルクロスオーバーカセットにクローニングした。タンパク質コード配列は、天然昆虫配列（配列番号２４、２５）、ヒト（Homo sapiens）最適化コード配列（配列番号２６、２７）、又はＮ末端８４塩基（アメリカタバコガ（H. Zea）、配列番号２９）又は８１塩基（イラクサギンウワバ（T. ni）、配列番号２８）がＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１（ＹＡＬＩ０Ｃ０５９５１）遺伝子のＮ末端９６塩基と交換されているヒト（Homo sapiens）最適化配列のいずれかを使用する。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）及びＣ．ビスワナチイ（C. viswanathii）スクリーニングと異なり、リーダー配列キメラは、宿主リーダー配列が完全長デサチュラーゼコード配列のＮ末端に連結されているのではなく、リーダー配列の直接的な交換を試験する。クルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼについては、天然コード配列のみを使用した（配列番号３０）。
【０４５８】
これらの７つのデサチュラーゼコンストラクトの各々をＳＰＶ１４０（ＰＯ１ｆ）及びＳＰＶ３００（Ｈ２２２  ΔＰ  ΔＡ  ΔＦ  ΔＵＲＡ３）に形質転換し、部位特異的組込みが確認された。
【０４５９】
デサチュラーゼ活性は、ＹＰＤ培地におけるヘキサデカン酸（パルミチン酸）の（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸（パルミトバクセン酸）へのインビボ生物変換によって試験した。
【０４６０】
ＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて代謝産物を同定及び定量化した。
【０４６１】
結果
株の樹立
ＸＰＲ２遺伝子座への組込みを標的とするＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）発現カセットを含むｐＰＶ１０１ベクターにデサチュラーゼ変異体をクローニングした。
【０４６２】
天然昆虫配列（配列番号２４、２５）、ヒト（Homo sapiens）にコドン最適化した完全長昆虫配列（配列番号２６、２７）、又は推定リーダー配列がＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１デサチュラーゼ由来のリーダー配列に置換されているもの（配列番号２８、２９）でイラクサギンウワバ（T. ni）及びアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼを各々合成した。天然昆虫コード配列を用いてクルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼも合成した（配列番号３０）。７つ全てのデサチュラーゼ変異体をＳＰＶ１４０に形質転換した。以前の活性結果に基づき、アメリカタバコガ（H. Zea）及びクルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼ変異体のみをＳＰＶ３００に形質転換した。
【０４６３】
機能発現アッセイ
Ｃ．ビスワナチイ（C. viswanathii）ＳＰＶ０５３における膜貫通デサチュラーゼ発現に使用したプロトコルの変法によって機能的活性を評価した（実施例６を参照されたい）。簡潔に言えば、昆虫デサチュラーゼを発現するＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＳＰＶ１４０及びＳＰＶ３００由来の株を富栄養（ＹＰＤ）培地で培養してバイオマスを生じさせた。ＹＰＤで生じたバイオマスを使用して、小規模（２ｍｌ）培養物をパルミチン酸と共に２４ディープウェルプレートにおいて合計４８時間培養した（詳細については材料及び方法を参照されたい）。
【０４６４】
イラクサギンウワバ（T. ni）、アメリカタバコガ（H. Zea）、及びクルミマダラメイガ（A. transitella）変異体の初期スクリーニングでは、ヒト（Homo sapiens）にコドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ変異体のみが検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生成した（図２６）。天然アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼの発現は１００±５ｍｇ／Ｌ  Ｚ１１−ヘキサデセン酸の生成をもたらし、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１リーダー配列を含むバージョンは８３±１１ｍｇ／Ｌを生成した。図２６に見られるとおり、他の主要な脂肪酸種の分布は機能性デサチュラーゼ発現の影響を比較的受けなかった。活性株では、Ｚ１１−ヘキサデセン酸が脂肪酸種の１０％（ｇ／ｇ）を占めた（細胞外表面に吸着し得るパルミチン酸基質を含む）。
【０４６５】
ＳＰＶ１４０バックグラウンドにおける活性変異体をＳＰＶ３００由来デサチュラーゼ株と比較してフォローアップ実験を行った。ｈｒＧＦＰを発現する親ＳＰＶ３００及びＳＰＶ１４０を陰性対照として使用した。同じ生物変換アッセイプロトコルを使用した。ＳＰＶ１４０にあるとおり、ヒト（H. sapiens）最適化変異体のみが検出可能な活性を生じた（図２７）。ＳＰＶ３００株はより高い最終細胞密度に成長した（ＳＰＶ３００  ＯＤ６００＝２６〜２８、ＳＰＶ１４０  ＯＤ６００＝１９〜２２）（図２８）。ヒト（H. sapiens）コドン最適化した天然アメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１−デサチュラーゼを発現する株（ｐＰＶ１９９）について、最も高い力価が観察された。再度試験したＳＰＶ１４０株は１１３±１ｍｇ／Ｌ（５．５±０．２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）のＺ１１−ヘキサデセン酸を生じたが、これは最初の実験で観察された力価よりも１３％高い（図２９）。同じデサチュラーゼを発現するＳＰＶ３００株は、より広範囲の生成能力を生じた。平均してそれらは８９±１８ｍｇ／Ｌ（３．３±１．２ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）のＺ１１−ヘキサデセン酸を生成したが、１つのクローンは１２４ｍｇ／Ｌ（４．６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）のＺ１１−ヘキサデセン酸を生成した。
【０４６６】
要約すれば、ヒト（Homo sapiens）コドン最適化したアメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ変異体のみが検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生成した。現在のアッセイ条件下では、ＳＰＶ３００と比べてＳＰＶ１４０バックグラウンドで僅かに高い力価が観察された。表１１にＺ１１−ヘキサデセン酸力価を要約する。
【０４６７】
【表６８】
2019503657.tif 000073
【０４６８】
ＳＰＶ３００では、ｐＰＶ２００（ヒト（Homo sapiens）コドン最適化したＹ．リポリティカ（Y. lipolytica）ＯＬＥ１−アメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼ）の１つの非部位特異的組込み体を試験した。この組込み体は検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生成しなかったが、これらの２つの部位特異的組込み体は５５±１ｍｇ／Ｌを生成した。
【０４６９】
ＳＰＶ１４０又はＳＰＶ３００由来株のペレットからは主要なヒドロキシ又は二酸ピークは観察されず、現在のアッセイ条件下で（比較的低い基質濃度、富栄養培地）、ＳＰＶ３００におけるβ−酸化／ω−酸化遺伝子の欠失によってＺ１１−ヘキサデセン酸蓄積は増加しなかった。
【０４７０】
結論
アメリカタバコガ（H. Zea）Ｚ１１デサチュラーゼは活性であり、約５００ｍｇ／Ｌ  パルミチン酸基質から約１００ｍｇ／Ｌ  Ｚ１１−ヘキサデセン酸の生成をもたらす。３つの陽性組込み体及び２４ウェルプレートアッセイにおけるレプリケート実験にわたって機能発現が実証された。
【０４７１】
アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼは、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）における活性にコドン最適化（ヒト（Homo sapiens）又は潜在的にＹ．リポリティカ（Y. lipolytica））が必要であった。
【０４７２】
イラクサギンウワバ（T. ni）Ｚ１１デサチュラーゼは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）で活性であるものの、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）では検出可能なＺ１１−ヘキサデセン酸を生成しない。
【０４７３】
Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）株のアッセイの再現性はグリセロールストックから出発して確認することができる。
【０４７４】
クルミマダラメイガ（A. transitella）デサチュラーゼは、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）における発現にコドン最適化することができる。
【０４７５】
Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）は候補生成宿主であるため、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）に活性デサチュラーゼの更なるコピーを組み込むことができ、生物変換を向上させる培養条件を同定することができ、及び基質変換を定量化することができる。
【０４７６】
材料及び方法
株の樹立
全てのデサチュラーゼ遺伝子を合成した（Genscript）。天然配列又はヒト（Homo sapiens）コドン最適化のいずれかを使用した。合成した遺伝子はｐＰＶ１０１にサブクローニングした。プラスミドを形質転換し、Zyppyプラスミドミニプレップキット（Zymo Research、Irvine, CA）を使用して大腸菌（E. coli）ＥＰＩ４００からプレップした。Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を使用して約１〜２μｇの線状化ＤＮＡを形質転換した。形質転換混合物全体をＣＭグルコース  −ｕｒａ寒天プレートにプレーティングした。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックＰＣＲにより遺伝子タイピングを行った。
【０４７７】
機能発現アッセイ
ＹＰＤにおけるパルミチン酸補足
陽性分離株をＹＰＤに再パッチし、一晩成長させ、次に４℃で保存した。株をパッチプレートから２４ディープウェルプレート（四角形ウェル、ピラミッド形底）内の２ｍｌのＹＰＤに接種した。各デサチュラーゼ変異体につき３つの陽性クローンを接種した。ＳＰＶ１４０及び親ＳＰＶ３００におけるｐＰＶ１０１の３つの分離株を陰性対照として使用した。ディープウェルプレートを２８℃及び２５０ｒｐｍでInfors Multitron冷却フラスコシェーカーにおいて２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、１ｍｌ容積の各培養物を５００×ｇで遠心することによりペレット化した。各ペレットを２ｍｌのＹＰＤに再懸濁した。エタノール中９０ｇ／Ｌストック溶液からの培養物に５００ｍｇ／Ｌパルミチン酸を加えた。この結果、０．５％エタノールをパルミチン酸基質と共に加えることになった。培養物は全て、４８時間インキュベートした後にエンドポイント試料を採取した。最終細胞密度はTecan Infinite 200proプレートリーダーで測定した。０．７５又は０．８ｍｌの各培養物を１．７ｍｌ微量遠心管に回収し、ペレット化した。上清を除去し、ペレットを以下に記載するとおり処理した。
【０４７８】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＦＩＤ分析
全脂質組成並びに（Ｚ）−１１−ヘキサデセン酸定量化は、Moss et al. (1982)及びYousuf et al (2010)による変法に基づいた。通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット化した細胞（１．５ｍＬプラスチックチューブ内）を、５％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を１．８ｍＬクリンプバイアルに移した。この混合物を９０℃のヒートブロックで１時間加熱した。４００  ２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。１ｍＭヘプタデカン酸メチルを含有する５００μＬクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心した後、４５０μＬの有機相をＧＣバイアルに移した。脂質の分析及び脂肪酸の定量化のため、５０μＬの０．２Ｍ  ＴＭＳＨ（メタノール中水酸化トリメチルスルホニウム）を加え、試料をＧＣ−ＦＩＤによって分析した。
【０４７９】
実施例８：昆虫脂肪アルコール合成用の生成プラットフォームとしてのカンジダ・ビスワナチイ（トロピカリス）（Candida viswanathii（tropicalis））
背景及び理論的根拠
昆虫膜貫通デサチュラーゼ及びレダクターゼの変異体を予めスクリーニングし、カンジダ・ビスワナチイ（Candida viswanathii）又はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のいずれかにおけるそれらの機能発現に基づき順位付けした（実施例３、４及び６を参照されたい）。アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）デサチュラーゼ及びオオタバコガ（Helicoverpa armigera）レダクターゼを選択してＣ．ビスワナチイ（C. viswanathii）における合成昆虫脂肪アルコール経路をアセンブルした。カンジダ属（Candida）イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）プロモーター下にあるコドン最適化アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼと、カンジダ属（Candida）転写伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター下にあるコドン最適化オオタバコガ（H. armigera）レダクターゼとの同時発現を完全脂肪アルコール経路のゲノム組込みによって達成した。組換え株（ＳＰＶ０４９０）の培養物において単純炭素源及びパルミチン酸を使用してＺ１１−１６ＯＨの蓄積を達成した。
【０４８０】
手法の概要
推定構成的Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）プロモーター（ｐＴＥＦ）によってドライブされるオオタバコガ（Helicoverpa armigera）レダクターゼと対にした機能性アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）デサチュラーゼ（実施例６を参照されたい）を含む組込みプラスミドを設計した。
【０４８１】
ヘキサデカン酸（パルミチン酸）のＺ１１−１６ＯＨへのインビボ生物変換によって完全経路の機能性を評価した。
【０４８２】
ＧＣ−ＦＩＤ及びＧＣ−ＭＳ分析を用いて代謝産物を同定及び定量化した。
【０４８３】
結果
ＩＣＬプロモーター下にあるアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＴＥＦプロモーター下にあるオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼを発現するように改変されたカンジダ属（Candida）の培養物にＺ１１−１６ＯＨの蓄積が検出された（表１２及び図３０）。
【０４８４】
【表６９】
2019503657.tif 000074
【０４８５】
材料及び方法
株の樹立
２つの発現カセットを含む組込みプラスミド（ｐｐＶ０２２８）を設計した。第一のカセットは、Ｃ．ビスワナチイ（C. viswanathii）ＩＣＬプロモーター（配列番号３３）によってドライブされるアメリカタバコガ（H. Zea）コドン最適化デサチュラーゼ（配列番号３１）を含む。第２のカセットは、Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）ＴＥＦプロモーター（配列番号３４）によってドライブされるコドン最適化オオタバコガ（H. armigera）レダクターゼ（配列番号３２）を含む。ＩＣＬプロモーターカセットの遺伝子発現はＩＣＬターミネーター配列（配列番号３５）によって終結する。ＴＥＦプロモーターカセットの遺伝子発現はＴＥＦターミネーター配列（配列番号３６）によって終結する。遺伝子の記録には従来手法を用いた。天然遺伝子ＣＴＧロイシンコドンをＴＴＡに置き換えたことを除き、配列は変化させなかった。大腸菌（E. coli）ＮＥＢ１０βへの形質転換後、Zyppyプラスミドミニプレップキット（Zymo Research、Irvine, CA）を用いてプラスミドをミニプレップした。ＢｓｉＷＩ（New England Biolabs、Ipswich, MA）で消化することによりプラスミドを線状化した後、ＳＰＶ０５３に形質転換した。消化後、Clean and Concentrator Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を使用してＤＮＡを単離した。約３〜５μｇのＤＮＡを電気穿孔によって形質転換した。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックＰＣＲにより遺伝子タイピングを行った。低効率転換の更なるスクリーニングに二段階手法を取った。約１００コロニーをＹＰＤ＋２５０μｇ／ｍｌゼオシンに再パッチし、一晩成長させた。急速に成長した（２４時間以内の高密度増殖）一部のパッチをコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。
【０４８６】
機能発現アッセイ
ＹＰＤにおけるパルミチン酸補足
陽性分離株をＹＰＤ＋３００μｇ／ｍｌゼオシンに再パッチし、一晩成長させ、次に４℃で保存した。株をパッチプレートから２４ディープウェルプレート（四角形ウェル、ピラミッド形底）内の２ｍｌのＹＰＤに接種した。各デサチュラーゼ及びレダクターゼ変異体につき４つの陽性クローンを接種し、及び各デサチュラーゼ及びｍＣｈｅｒｒｙ発現対照株につき３つの陽性クローンを接種した。ディープウェルプレートを３０℃、１０００ｒｐｍ、及び８０％湿度でInfors HT Multitron Proプレートシェーカーにおいて２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、１ｍｌ容積の各培養物を５００×ｇで遠心することによりペレット化した。各ペレットは２ｍｌのＹＰＤ＋０．３％（ｖ／ｖ）エタノールに再懸濁した。この段階でエタノールを加えて、ＩＣＬプロモーターからの組換え酵素発現を誘導した。培養物を同じ条件下で更に２４時間インキュベートした後、エタノール中９０ｇ／Ｌストック溶液からの培養物に３００ｍｇ／Ｌパルミチン酸を加えた。この結果は、新鮮０．３％エタノールをパルミチン酸と併せて加えることであった。全ての培養物を更に２４時間インキュベートした後、最後に０．３％エタノールを加えた。更に２４時間インキュベートした後、１．５ｍｌの各培養物を１．７ｍｌ微量遠心管に回収し、ペレット化した。上清を除去し、ペレットを以下に記載するとおり処理した。
【０４８７】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ検出
通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット化した細胞（１．５ｍＬプラスチックチューブ内）を、５％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を１．８ｍＬクリンプバイアルに移した。この混合物を９０℃のヒートブロックで１時間加熱した。４００μＬ  ２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。１ｍＭヘプタデカン酸メチルを含有する５００μＬクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心した後、４５０μＬの有機相をＧＣバイアルに移した。有機相を９０℃のヒートブロックにおいて３０分間蒸発させた。１％トリメチルクロロシランを含有する５０μＬ  Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミドに残渣を溶解した。ガラスインサートに移す前に、この混合物を９０℃で５分加熱した。この試料をＧＣ−ＭＳによって分析した（表１３）。
【０４８８】
【表７０】
2019503657.tif 000075
【０４８９】
実施例９：ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）由来の昆虫脂肪アルコール生成
背景及び理論的根拠
パルミチン酸からの昆虫脂肪アルコール（Ｚ１１−１６ＯＨ及びＺ９−１６ＯＨ）合成の生成プラットフォームとしてヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）を改変した。
【０４９０】
Ｚ１１デサチュラーゼ（実施例７）及び脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）の機能発現を個々に確認した後、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）において完全Ｚ１１−１６ＯＨ及びＺ９−１６ＯＨ経路（Ｂｄｒ）を改変した。脂肪アルコール力価を改善する目的で、成長促進用に設計した培養物と比べた脂質貯蔵の誘発用に設計した培養物も調べた。成長条件は高いバイオマス生成に有利であるが、改変経路によって用いられる脂肪アシル−ＣｏＡプールサイズを制限し、脂肪アシル−ＣｏＡ中間体を膜合成に向ける。逆に、脂質貯蔵条件は脂肪アシル−ＣｏＡの生成の強力な落ち込みを生じさせ、これは望ましい。しかしながら、脂肪体への脂肪アシル−ＣｏＡ輸送はＦＡＲ活性に関して強い競合を生じる。この第２のシナリオ下では、細胞にＺ１１−１６Ａｃｉｄ又はＺ９−１６Ａｃｉｄが蓄積するとしても、その大部分はＦＡＲにとって到達できない。他方で、脂質貯蔵条件下では脂質再動員の連続的なフラックスがあってもよく、これはＦＡＲに利用可能なＺ１１−１６ＣｏＡ又はＺ９−１６ＣｏＡの持続的なプールにつながる。
【０４９１】
手法の概要
２つの生物不飽和化−還元（Ｂｄｒ）経路変異体をＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ（ＳＰＶ３００）バックグラウンドで試験した。第１は、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）Ｚ１１デサチュラーゼをオオタバコガ（Helicoverpa armigera）脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）と対にした組換え発現を組み合わせてＺ１１−１６ＯＨ合成経路を作り出した。第２は、天然Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）Ｚ９デサチュラーゼ活性をオオタバコガ（H. armigera）脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）発現と組み合わせてＺ９−１６ＯＨ経路を作り出した。
【０４９２】
アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現する２つの組込みプラスミドを構築した。デサチュラーゼ発現にはＴＥＦプロモーターを使用し、レダクターゼ発現にはＥＸＰ１（エクスポートタンパク質）又はＴＡＬ１（トランスアルドラーゼ）プロモーターを使用した。
【０４９３】
Ｈ２２２  ΔＰΔＡΔＦ（ＳＰＶ３００）バックグラウンドへのＺ１１−１６ＯＨ経路カセットの組込みの成功はコロニーＰＣＲによって確認した。
【０４９４】
１６Ａｃｉｄ（パルミチン酸）のＺ１１−１６ＯＨ（Ｚ−１１−ヘキサデセノール）へのインビボ生物変換によって完全Ｚ１１−１６ＯＨ経路の機能性を評価した。
【０４９５】
ＴＥＦプロモーターによってドライブされるオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現する予め構築したＳＰＶ４７１（Ｈ２２２  ΔＰΔＡΔＦ由来）を使用した１６Ａｃｉｄ（パルミチン酸）のインビボ生物変換によって完全Ｚ９−１６ＯＨ経路の機能性を評価した。
【０４９６】
ＧＣ−ＭＳ分析を用いてＺ９−１６ＯＨ及びＺ１１−１６ＯＨを同定及び定量化した。ＧＣ−ＦＩＤ分析を用いて脂肪酸を同定及び定量化した。
【０４９７】
概要
アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ（ｐＴＥＦ）及びオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼ（ｐＥＸＰ１）を発現する１０個の分離株をスクリーニングした。インビボ生物変換アッセイにより、全ての分離株からのＺ１１−１６ＯＨ生成が確認された。
【０４９８】
１０ｇ／Ｌパルミチン酸メチルを補足したＹＰＤ培地において、比較的低い、検出可能なＺ１１−１６ＯＨ力価（０．２６±０．０９ｍｇ／Ｌ）が観察された。Ｚ１１−１６Ａｃｉｄ前駆体は２２０±１１ｍｇ／Ｌで測定された（クローン２、４、９、１７、２３間）。
【０４９９】
Ｃ：Ｎ比が約８０の半限定培地において、より高いＺ１１−１６ＯＨ力価が観察された。１０個全ての分離株にわたってＺ１１−１６ＯＨは２．６５±０．３６ｍｇ／Ｌで生成された。Ｚ１１−１６Ａｃｉｄ前駆体力価は９００±３０ｍｇ／Ｌであった。１つの分離株（ＳＰＶ５７８）は３．６８±０．３１ｍｇ／Ｌ  Ｚ１１−１６ＯＨ（Ｚ１１−１６Ａｃｉｄ  ８４０±１４ｍｇ／Ｌ）を生成した。
【０５００】
アメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ（ｐＴＥＦ）及びオオタバコガ（H. armigera）レダクターゼ（ｐＴＡＬ１）を発現する９個の分離株をスクリーニングした。インビボ生物変換アッセイにより、全ての分離株からのＺ１１−１６ＯＨ生成が確認された。
【０５０１】
１つの分離株（ＳＰＶ６０３）は半限定培地（Ｚ１１−１６Ａｃｉｄ  １．３６ｇ／Ｌ）で６．８２±１．１１ｍｇ／Ｌ  Ｚ１１−１６ＯＨを生成した。
【０５０２】
先に試験したレダクターゼ株、ＳＰＶ４７１（オオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）は、半限定培地（約８０のＣ：Ｎ比）を用いると４．３０±２．３３ｍｇ／Ｌ  Ｚ９−１６ＯＨ及び４５０±８０ｍｇ／Ｌ  Ｚ９−１６Ａｃｉｄを生成した。
【０５０３】
【表７１】
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【０５０４】
結果
株の樹立
文献のエビデンスから、昆虫デサチュラーゼ及びＦＡＲは両方とも、活性部位が細胞質に向かって配向した小胞体の膜に局在することが示唆される。機能変異体のうち、アメリカタバコガ（H. Zea）由来のＺ１１デサチュラーゼ及びオオタバコガ（H. armigera）由来のＦＡＲを選択し、１つ仮説は、同じ属（ヘリコベルパ属（Helicoverpa））由来の酵素であれば、ＥＲ膜に起こり得るタンパク質間相互作用をより良好に保つことができるであろうというものであった。
【０５０５】
２つの新規コンストラクトをGenscriptから注文し、先にアセンブルしたアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼプラスミド、ｐＰＶ０１９９にクローニングした。Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）由来のＥＸＰ１又はＴＡＬ１のいずれかのプロモーターを有する２つのＦＡＲシントンをこの発現カセットにクローニングした。
【０５０６】
１つのデュアル発現プラスミド（ＥＸＰ１プロモーターを含む）を親株ＳＰＶ３００（Ｈ２２２  Δｐｏｘ１  Δｐｏｘ２  Δｐｏｘ３  Δｐｏｘ４  Δｐｏｘ５  Δｐｏｘ６  Δａｄｈ１  Δａｄｈ２  Δａｄｈ３  Δａｄｈ４  Δａｄｈ５  Δａｄｈ６  Δａｄｈ７  Δｆａｏ１  Δｕｒａ３）に形質転換した。同じ親株の２つの異なるコンピテント細胞調製物を形質転換して、コンピテント細胞調製物によって生じる株性能のばらつきを研究した。約２５％のＵＲＡ＋  クローンが、ＸＰＲ２遺伝子座における標的組込み体であることが確認された（調製物１について２０％、調製物２について３３％）。Ｃｏｍｐ．細胞調製物１からの２つのクローン及びＣｏｍｐ．細胞調製物２からの８つ全ての標的クローンを機能発現アッセイにおけるスクリーニングに選択した。
【０５０７】
第２のデュアル発現プラスミド（ＴＡＬ１プロモーターを含む）を同じ親株（ＳＰＶ３００）に組み込んだ。２３個のコロニーをチェックＰＣＲによってスクリーニングし、及び１１個が標的組込み体であることが分かった（４８％）。９個の組込み体を機能発現アッセイにおけるスクリーニングに選択した。
【０５０８】
ＳＰＶ４７１（オオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現するＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ）の構築は先述のとおりであった。
【０５０９】
Ｚ１１−１６ＯＨ機能発現アッセイ
インビボ２４ウェルプレートアッセイを用いてＺ１１−１６ＯＨの生成を判定した。このアッセイは、スクリーニングデサチュラーゼ及びレダクターゼ変異体に用いられる設計、並びに脂肪酸蓄積を増加させるために用いられる条件に基づいた。１０ｇ／Ｌパルミチン酸メチルを生物変換基質として補足した富栄養培地（ＹＰＤ）及び半限定培地を使用した。半限定培地は約８０のＣ：Ｎ比を有し、５ｇ／Ｌグリセロール及び６０ｇ／Ｌグルコースを含んだ（更なる詳細については材料及び方法を参照されたい）。
【０５１０】
ＴＥＦプロモーターによってドライブされるアメリカタバコガ（H. Zea）デサチュラーゼ及びＥＸＰ１プロモーターによってドライブされるオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを有する株の初期スクリーニングから、Ｚ１１−１６ＯＨの生成にＦＡＲの存在が必要であることが確認された。いかなる条件下においても、親及びデサチュラーゼ単独対照株の両方からヘキサデセノールは観察されなかった。両方の培地条件下で、完全デサチュラーゼ−レダクターゼ経路を発現するクローンからＺ１１−１６ＯＨ及び程度は少ないがＺ９−１６ＯＨが検出された。富栄養培地で変換を完了させたとき、０．２６±０．０９ｍｇ／Ｌ  Ｚ１１−１６ＯＨ及び０．０６±０．０１ｍｇ／Ｌ  Ｚ９−１６ＯＨが生成された（図３２Ａ）。半限定培地を使用したとき、Ｚ１１−１６ＯＨ力価の１０倍の増加及びＺ９−１６ＯＨ力価の３倍の増加が観察された（図３２Ｂ）。全経路クローンでは、２．６５±０．２９ｍｇ／Ｌ  Ｚ１１−１６ＯＨ及び０．１８±０．０２ｍｇ／Ｌ  Ｚ９−１６ＯＨが生成された。Ｚ９−１６ＯＨと比べたＺ１１−１６ＯＨのエンリッチメントが、位置特異的Ｂｄｒ経路を改変し得る可能性を裏付けている。テクニカルレプリケート間の一貫性は、半限定培地条件下ではクローン間で異なった。クローン２、４、６、９、及び１７の力価はＣＶ＜２０と一致した。クローン１、７、及び２３はＣＶ＞４０％を有した。クローン１７について最も高い一貫したＺ１１−１６ＯＨ力価、３．６８±３１ｍｇ／Ｌが観察された（表１５）。
【０５１１】
【表７２】
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【０５１２】
完全経路クローンの脂質プロファイルも定量化した。簡単にするため、図３３Ａ〜図３３Ｂでは、選択のクローンについて１６炭素脂肪酸種をプロットする。一般に、完全Ｂｄｒ経路クローンはデサチュラーゼ単独対照よりも少ないＺ１１−１６Ａｃｉｄを蓄積した（ＹＰＤにおいて０．２５＜０．５ｇ／Ｌ、半限定において０．８〜１．０＜１．５ｇ／Ｌ）。完全Ｂｄｒ経路クローンにおいてＺ１１−１６Ａｃｉｄ力価が低いのは、デュアル発現カセットにおけるデサチュラーゼ発現の低下、又は潜在的にＦＡＲ及び続く副生成物経路によるＺ１１−１６Ａｃｉｄ消費に起因し得る。ＹＰＤでは１６Ａｃｉｄ力価に傾向は観察されなかったが、半限定培地では、デサチュラーゼ単独株及び完全経路株について１６Ａｃｉｄ力価は同様であった。
【０５１３】
ｐＥＸＰクローンの判定に用いる同じ半限定培地条件下で、第２のデュアル発現カセット（ｐＴＡＬ−Ｈａ＿ＦＡＲ）を使用した株をアッセイした。９個のｐＴＡＬクローンをＳＰＶ３００（親）、ＳＰＶ５７５（ｐＥＸＰ−Ｈａ＿ＦＡＲクローン４）、及びＳＰＶ５７８（ｐＥＸＰ−Ｈａ＿ＦＡＲクローン１７）対照に対してアッセイした。予想どおり、陰性対照からはアルコール生成物は観察されなかった。ｐＥＸＰ陽性対照株からのアルコール力価は、ｐＥＸＰクローンの初期アッセイで観察された結果を再現した（図３４、表１６）。１つの外れ値のクローン、クローン９を除き、ｐＴＡＬクローン（４．１９±０．１６ｍｇ／Ｌ）及びｐＥＸＰクローン（４．１０±０．２２ｍｇ／Ｌ）からのＺ１１−１６ＯＨ力価は同等であった。クローン９は６．８２±１．１１ｍｇ／ＬのＺ１１−１６ＯＨを生成した。ｐＥＸＰクローンでの最初のアッセイのとおり、Ｚ９−１６ＯＨの低いが検出可能な力価が観察された（図３４、表１６）。
【０５１４】
【表７３】
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【０５１５】
第２の（ｐＴＡＬ）完全経路スクリーニングにおける全ての株の脂質プロファイルも定量化した。簡単にするため、図３５には１６炭素脂肪酸種をプロットする。予想どおり、デサチュラーゼを発現する株についてのみＺ１１−１６Ａｃｉｄが存在する。完全脂質プロファイルは先に観察されたものと同様であった（図３６）。Ｚ９−１８Ａｃｉｄ（オレイン酸）は、Ｚ１１−１６Ａｃｉｄに次いで２番目に最も豊富な脂肪酸種であった
【０５１６】
Ｚ９−１６ＯＨ機能発現アッセイ
インビボフラスコ規模アッセイを用いてＺ９−１６ＯＨ生成を試験した。親対照株のＨ２２２  ΔＰΔＡΔＦ（ＳＰＶ３００）を、オオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲを発現する株（Ｚ９−１６ＣｏＡ前駆体（ＳＰＶ４７１）の合成を天然Ｚ９デサチュラーゼ活性に頼る）と比較した。プレートアッセイを模倣するＹＰＤシード培養によってバイオマスを作成した。生物変換フラスコをＺ１１−１６ＯＨプレートアッセイにおいて用いた同じ半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地に初期ＯＤ６００＝１又はＯＤ６００＝４で接種した（詳細については材料及び方法を参照されたい）。予想どおり、対照フラスコは検出可能なＺ９−１６ＯＨを生成しなかったが、ＳＰＶ４７１フラスコは２４時間のインキュベーション後に最大４．３０±２．２３ｍｇ／Ｌを生成した（図３７Ａ〜図３７Ｂ）。レプリケート間には大きいばらつきがあったが、全てのＳＰＶ４７１（オオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲ）レプリケートが１ｍｇ／Ｌ力価を超えた。播種密度を増加させてもＺ９−１６Ａｃｉｄ又はＺ９−１６ＯＨ力価は増加しなかった。２４時間における前駆体Ｚ９−１６Ａｃｉｄ力価は、Ｚ１１−１６ＯＨの生成に用いられるデュアル発現カセット株について観察されたＺ１１−１６Ａｃｉｄ前駆体よりも著しく低かった（＜０．５ｇ／Ｌ）。他の脂肪酸種の相対的存在量も、先に観察されたプロファイルと同様であり、次に最も豊富な種としてＺ９−１８Ａｃｉｄがあった（図３８）。４８時間の経過中に脂質試料及びアルコール試料の両方を採取して、Ｚ９−１６ＯＨ力価及び脂質力価の時間変化を作成した。Ｚ９−１６ＯＨ力価は２４時間でピークとなり、その後２日目にわたって低下した（図３９Ａ）。Ｚ９−１６Ａｃｉｄは最初の２４時間で急速に増加し、その後次の２４時間にわたって安定化し、又はゆっくりと増加した（図３９Ｂ）。用いた分析的方法は細胞ペレットのみを利用するため、Ｚ９−１６ＯＨ力価の低下は、アルコール生成物が下流で消費又は分泌されるという仮説を裏付けている。アルコール生成物は酸化されるか（ω−酸化）、遊離アルコールとして分泌されるか、又は誘導体化されてエステルとして分泌され得る。ＦＩＤ及びＭＳ  ＳＣＡＮ検出を用いた上清試料の分析から、検出可能なＺ９−１６ＯＨ又はＺ９−１６ＯＨ誘導体がないことが明らかになり、酸化経路を通じた消費の仮説を裏付けている。
【０５１７】
結論
ヘリコベルパ属（Helicoverpa）Ｚ１１デサチュラーゼと脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼとの組み合わせ発現は、Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）Ｈ２２２  ΔＰΔＡΔＦ（ＳＰＶ３００）における力価＞１ｍｇ／ＬでのＺ１１−１６ＯＨの生成につながった。
【０５１８】
高いＣ：Ｎ比条件が、富栄養培地条件と比べてＺ１１−１６ＯＨ力価を改善した。
【０５１９】
脂質蓄積条件下では、天然Ｚ９デサチュラーゼ及びオオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲ活性の組み合わせが、＞１ｍｇ／Ｌ  Ｚ９−１６ＯＨの合成に十分である。
【０５２０】
力価は、例えば、脂肪アルコール生成物及び／又は脂肪酸前駆体を消費する経路を欠失させるか；オオタバコガ（H. armigera）ＦＡＲよりも高い代謝回転率を呈するＦＡＲ変異体を同定するか；及び／又は経路コピー数を増加させることにより増加する。
【０５２１】
望ましくない主要な副生成物を同定する。
【０５２２】
１つ以上の内因性アセチルトランスフェラーゼの活性によって脂肪アルコール生成物の一部が脂肪アセテートに変換される可能性を調べる。
【０５２３】
改良された宿主株を改変することにより、ω−酸化経路及び脂質貯蔵経路の成分を除去する。
【０５２４】
Ｙ．リポリティカ（Y. lipolytica）にデサチュラーゼ及びＦＡＲの更なるコピーを組み込む。
【０５２５】
材料及び方法
株の樹立
全てのデサチュラーゼ及びレダクターゼ遺伝子はGenscriptから注文した。ヒト（Homo sapiens）コドン最適化を用いた（Genscriptアルゴリズム）。新しく合成した発現カセットをGenscriptによってＳａｐＩ制限部位を用いてｐＰＶ１９９にサブクローニングした。プラスミドを形質転換し、大腸菌（E. coli）ＥＰＩ４００からZyppy Plamsid Miniprep Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を用いてプレップした。プラスミドをＰｍｅＩ（New England Biolabs、Ipswich, MA）で消化し、Zymoclean Gel DNA recovery Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を用いたゲル抽出によって精製した。Clean and Concentrator Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を用いてＤＮＡを更に濃縮した。Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research、Irvine, CA）を用いて約１〜２μｇのＤＮＡを形質転換した。製造者のプロトコルを以下のとおり変更した：２ｍｌ  ＹＰＤシード培養物はコンピテント細胞調製前日の午前９時に接種した。シードは８時間（午後５時まで）成長させて、その後２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに入った４０ｍｌのＹＰＤ（又は１２５ｍｌバッフル付きフラスコ内の２０ｍｌ）を０．０００５の初期ＯＤ６００になるように接種した。培養物は２８℃及び２５０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。ＯＤ６００＝０．５〜１で細胞を回収した。製造者の指示にあるとおり１０ｍｌの培養物を１ｍｌの溶液２に再懸濁する（ＯＤ６００約１０）代わりに、１０ｍｌのＳＰＶ１４０培養物を０．５ｍｌに再懸濁した（ＯＤ６００約２０〜３０）。溶液２アリコートは全て、チューブを密閉されたスタイロフォームボックスに置いた後−８０℃のフリーザーに入れることによりゆっくりと−８０℃に凍結した。１．７ｍｌエッペンドルフ試験管内のコンピテント細胞の５０μｌアリコートを氷上で解凍し、水中に溶出したＤＮＡを直接細胞に加え、及び５００μｌの溶液３を用いて穏やかにピペッティングしながら細胞を懸濁した。チューブを２８℃で３時間、３０分毎に穏やかにボルテックスしながらインキュベートした。形質転換混合物全体をＣＭグルコース  −ｕｒａ寒天プレートにプレーティングした。陽性組込み体は部位特異的であることが分かり、チェックＰＣＲにより遺伝子タイピングを行った。
【０５２６】
Ｚ１１−１６ＯＨ機能発現アッセイ
陽性分離株をＹＰＤに再パッチし、一晩成長させ、次に４℃で保存した。株をパッチプレートから２４ディープウェルプレート（四角形ウェル、ピラミッド形底）内の２ｍｌのＹＰＤに接種した。各パッチからレプリケート接種を行った。陰性対照株はグリセロールストックからＹＰＤにストリーク（struck out）し、個々のコロニーを使用して接種した。ディープウェルプレートを２８℃及び２５０ｒｐｍでInfors Multitron冷却フラスコシェーカーにおいて２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、０．８５ｍｌ容積の各培養物を８００×ｇで遠心することによりペレット化した。各ペレットは２ｍｌのＹＰＤ又は半限定培地のいずれかに再懸濁した（以下の表１７に記載する）。培養物に１０ｇ／Ｌパルミチン酸メチル（約５０℃に予熱した）を加えた。培養物は全て、４８時間インキュベートした後にエンドポイント試料を採取した。最終細胞密度はTecan Infinite 200proプレートリーダーで測定した。１．５ｍｌ（アルコール分析）又は５００μｌ（脂質分析）を１．７ｍｌ微量遠心管に移し、ペレット化した。上清を清浄なチューブに移し、試料を以下に記載するとおり処理した。
【０５２７】
【表７４】
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【０５２８】
Ｚ９−１６ＯＨ機能発現アッセイ
ＳＰＶ３００（陰性対照）及びＳＰＶ４７１をＹＰＤ寒天プレートにストリーク（struck out）し、一晩成長させ、次に４℃で保存した。株をコロニーから２ｍｌのＹＰＤに接種し、１４ｍｌ丸底培養管において２８℃及び２５０ｒｐｍで約８時間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍｌの培養物を使用して１２５ｍｌバッフル付き振盪フラスコ内の２０ｍｌのＹＰＤを接種した。振盪フラスコを２８℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。インキュベーション後、Tecan Infinite 200proプレートリーダーを使用して振盪フラスコ内の細胞密度を測定した。適切な容積の培養物をペレット化することにより、細胞を２５ｍｌの半限定Ｃ：Ｎ＝８０培地（上記表１７を参照されたい）に初期ＯＤ６００＝１（約１ｇＤＣＷ／Ｌ）又は４（約４ｇＤＣＷ／Ｌ）で再懸濁した。この再懸濁培養物を２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに加えた。５０℃に予熱した後にニートなパルミチン酸メチルを１０ｇ／Ｌの最終濃度で加えた。基質を加えた後、フラスコを２８℃及び２５０ｒｐｍで２日間インキュベートした。１２、１８、２４、３６、４２、及び４８時間目に５００μｌ（脂質分析）及び１．５ｍｌ（アルコール分析）の試料を１．７ｍｌ微量遠心管に採取した。試料をペレット化し、上清を清浄な微量遠心管に移した。
【０５２９】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ検出
アルコール分析
通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット化した細胞（１．５ｍＬプラスチックチューブ内）を、５％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を１．８ｍＬクリンプバイアルに移した。この混合物を９０℃のヒートブロックで１時間加熱した。４００μＬ  ２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。１ｍＭヘプタデカン酸メチルを含有する５００μＬクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心した後、４５０μＬの有機相をＧＣバイアルに移した。有機相を９０℃のヒートブロックにおいて３０分間蒸発させた。１％トリメチルクロロシランを含有する５０μＬ  Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミドに残渣を溶解した。ガラスインサートに移す前に、この混合物を９０℃で５分加熱した。この試料をＧＣ−ＭＳによって分析した（表１８）。
【０５３０】
【表７５】
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【０５３１】
脂質分析
全脂質組成は、Moss et al. (1982)及びYousuf et al (2010)による変法に基づいた。通常約１０ｍｇ〜８０ｍｇのペレット化した細胞（１．５ｍＬプラスチックチューブ内）を、５％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウムを含有するメタノール中に再懸濁した。アルカリ性細胞懸濁液を１．８ｍＬガラスクリンプＧＣ−バイアルに移した。この混合物を９０℃のヒートブロックで１時間加熱した。４００μＬ  ２．５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する前に、バイアルを放冷して室温に戻した。１ｍＭヘプタデカン酸メチルを含有する５００μＬクロロホルムを加え、この混合物を激しく振盪し、次に水相及び有機相の両方を１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで遠心した後、４５０μＬの有機相を新しい１．８ｍＬガラススクリューキャップＧＣ−バイアルに移した。室温に冷却した後、残留する脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を溶解し、０．２Ｍ  ＴＭＳＨ（水酸化トリメチルスルホニウム）を含有するメタノール中で誘導体化した（表１９）。
【０５３２】
【表７６】
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【０５３３】
【表７７】
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【０５３４】
【表７８】
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【０５３５】
【表７９】
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【０５３６】
【表８０】
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【０５３７】
【表８１】
2019503657.tif 000086
【０５３８】
【表８２】
2019503657.tif 000087
【０５３９】
【表８３】
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【０５４０】
【表８４】
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【０５４１】
【表８５】
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【０５４２】
【表８６】
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【０５４３】
【表８７】
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【０５４４】
【表８８】
2019503657.tif 000093
【０５４５】
【表８９】
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【０５４６】
【表９０】
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【０５４７】
【表９１】
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【０５４８】
【表９２】
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【０５４９】
【表９３】
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【０５５０】
【表９４】
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【０５５１】
【表９５】
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【０５５２】
前述の詳細な説明は理解を明解にするために提供されるに過ぎず、当業者には変更形態が自明であろうとおり、そこから不必要な限定が理解されてはならない。
【０５５３】
本開示はその具体的な実施形態に関連して説明されているが、更なる変更形態が可能であることが理解されるであろうと共に、本願は、一般に本開示の原理に従い、且つ本開示が関係する技術分野内で公知の又は慣習的な実践の範囲内にあるとおりの、並びに以上に示される及び以下の添付の特許請求の範囲にあるとおりの本質的な特徴に適用され得るとおりの本開示からのかかる逸脱を含む、本開示の任意の変形形態、使用、又は適合形態を包含することが意図される。
【０５５４】
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の、特許請求の範囲を含めた開示、図及び／又は図面は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ）】
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【図７Ｂ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2019503657.tif 000112
【図１１Ｂ】
2019503657.tif 000113
【図１１Ｃ】
2019503657.tif 000114
【図１１Ｄ】
2019503657.tif 000115
【図１１Ｅ】
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【図１２】
2019503657.tif 000117
【図１３Ａ】
2019503657.tif 000118
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2019503657.tif 000120
【図１４Ｂ】
2019503657.tif 000121
【図１５】
2019503657.tif 000122
【図１６】
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【図１７】
2019503657.tif 000124
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2019503657.tif 000127
【図２１】
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【図２２】
2019503657.tif 000129
【図２３】
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【図２４】
2019503657.tif 000131
【図２５】
2019503657.tif 000132
【図２６】
2019503657.tif 000133
【図２７】
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【図２８】
2019503657.tif 000135
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2019503657.tif 000139
【図３３】
2019503657.tif 000140
【図３４】
2019503657.tif 000141
【図３５】
2019503657.tif 000142
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
2019503657.tif 000145
【図３９】
2019503657.tif 000146
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月19日(2018.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換えヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）微生物であって、
ａ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒するHelicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼをコードする異種核酸分子；及び
ｂ）ａ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、前記対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする異種核酸分子
を含む組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項２】
前記Helicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼがアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来である、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項３】
前記Helicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼがＺ９又はＺ１１デサチュラーゼである、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項４】
Helicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼをコードする前記異種核酸分子が配列番号１３、１９、２２、２５、２７、２９及び３１からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項５】
fao1遺伝子の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項６】
以下から選択される１つ以上の内因性酵素の活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：
ａ）脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つ以上の酵素；
ｂ）１つ以上の脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ；
ｃ）１つ以上の脂肪アルコールオキシダーゼ；
ｄ）脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の酵素；及び
ｅ）１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
以下から選択される１つ以上の内因性酵素の活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：
ａ）脂肪アシル−ＣｏＡの、ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、及びＣＡＧ７９２１４からなる群から選択されるα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する１つ以上の酵素；
ｂ）１つ以上の脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ；
ｃ）１つ以上の脂肪アルコールオキシダーゼ；
ｄ）脂肪酸の、ＸＰ＿５０４４０６、ＸＰ＿５０４８５７、ＸＰ＿５０４３１１、ＸＰ＿５００８５５、ＸＰ＿５００８５６、ＸＰ＿５００４０２、ＸＰ＿５０００９７、ＸＰ＿５０１７４８、ＸＰ＿５００５６０、ＸＰ＿５０１１４８、ＸＰ＿５０１６６７、及びＸＰ＿５００２７３からなる群から選択されるω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の酵素；及び
ｅ）ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ及びＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇからなる群から選択される１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する以下の酵素のそれぞれの活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、及びＣＡＧ７９２１４。
【請求項９】
ＦＡＯ１酵素、及び、脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する以下の酵素のそれぞれ、の活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、及びＣＡＧ７９２１４。
【請求項１０】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールがＺ９−１６ＯＨ及び／又はＺ１１−１６ＯＨである、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項１１】
飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する能力を有する組換えヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）微生物であって、
ａ）飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡへの変換を触媒するHelicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼをコードする異種核酸分子；及び
ｂ）ａ）からの前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡの、前記対応する一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールへの変換を触媒する微細藻類脂肪アルコール形成脂肪アシルレダクターゼをコードする異種核酸分子
を含み、
以下の遺伝子の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：fao1、Pox1、Pox2、Pox3、Pox4、Pox5、及びPox6。
【請求項１２】
前記Helicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼがアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）由来である、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項１３】
前記Helicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼがＺ９又はＺ１１デサチュラーゼである、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項１４】
Helicoverpa属脂肪アシルデサチュラーゼをコードする前記異種核酸分子が配列番号１３、１９、２２、２５、２７、２９及び３１からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項１５】
以下から選択される１つ以上の内因性酵素の活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：
ａ）１つ以上の脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ；
ｂ）脂肪酸のω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の酵素；及び
ｅ）１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項１６】
以下から選択される１つ以上の内因性酵素の活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：
ａ）１つ以上の脂肪アルコールデヒドロゲナーゼ；
ｂ）脂肪酸の、ＸＰ＿５０４４０６、ＸＰ＿５０４８５７、ＸＰ＿５０４３１１、ＸＰ＿５００８５５、ＸＰ＿５００８５６、ＸＰ＿５００４０２、ＸＰ＿５０００９７、ＸＰ＿５０１７４８、ＸＰ＿５００５６０、ＸＰ＿５０１１４８、ＸＰ＿５０１６６７、及びＸＰ＿５００２７３からなる群から選択されるω−ヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する１つ以上の酵素；及び
ｃ）ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ及びＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇからなる群から選択される１つ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項１７】
脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する以下の酵素のそれぞれの活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、及びＣＡＧ７９２１４。
【請求項１８】
ＦＡＯ１酵素、及び、脂肪アシル−ＣｏＡのα，β−エノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する以下の酵素のそれぞれ、の活性の欠失、破壊、変異、及び／又は低下を含む、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物：ＣＡＡ０４６５９、ＣＡＡ０４６６０、ＣＡＡ０４６６１、ＣＡＡ０４６６２、ＣＡＡ０４６６３、及びＣＡＧ７９２１４。
【請求項１９】
前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールがＺ９−１６ＯＨ及び／又はＺ１１−１６ＯＨである、請求項１１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物。
【請求項２０】
飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸の内因性又は外因性供給源から一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールを生成する方法であって、前記一不飽和又は多価不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールの生成に適した炭素源を供給する原料が入った培養培地で、請求項１に記載の組換えヤロウイア・リポリティカ微生物を培養することを含む方法。
【請求項２１】
前記不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールが昆虫脂肪アルコールである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記不飽和Ｃ６〜Ｃ２４脂肪アルコールが昆虫フェロモンである、請求項２０に記載の方法。
【国際調査報告】
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