(57)【要約】本発明は、非共有結合性相互作用を介して生物学的分子と相互作用する複素環式環系を含む液体組成物に関する。複素環式環と生物学的分子との間の非共有結合性相互作用は、静電相互作用から、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、および疎水性相互作用に及ぶ相互作用を含む。本発明の一実施形態は、複素環式環、合成ステムおよび生物学的分子を含む合成物であって、該複素環式環が（ａ）該合成ステムに共有結合的に連結されており、（ｂ）該生物学的分子と非共有結合的に会合している合成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複素環式環、合成ステムおよび生物学的分子を含む合成物であって、該複素環式環が（ａ）該合成ステムに共有結合的に連結されており、（ｂ）該生物学的分子と非共有結合的に会合している、合成物。
【請求項２】
前記非共有結合的会合が、アンチカオトロピック塩への曝露時に安定である、請求項１に記載の合成物。
【請求項３】
前記非共有結合的会合が疎水性相互作用を含む、請求項２に記載の合成物。
【請求項４】
前記疎水性相互作用が、π相互作用、π−π相互作用およびπスタッキング相互作用からなる群より選択される、請求項３に記載の合成物。
【請求項５】
前記合成ステムが置換炭化水素または非置換炭化水素を含む、請求項１に記載の合成物。
【請求項６】
前記合成ステムが小分子薬物を含む、請求項１に記載の合成物。
【請求項７】
前記合成ステムがＰＥＧを含む、請求項１に記載の合成物。
【請求項８】
前記複素環式環が複素環式芳香族第４級アミンを含む、請求項１に記載の合成物。
【請求項９】
前記複素環式環が水混和性である、請求項１に記載の合成物。
【請求項１０】
前記複素環式環がピリジニウム環を含む、請求項８に記載の合成物。
【請求項１１】
前記複素環式環が約３〜約１０のｐＨ範囲にわたって正に荷電している、請求項９に記載の合成物。
【請求項１２】
前記生物学的分子が、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡリガンドからなる群より選択される、請求項１に記載の合成物。
【請求項１３】
１コピーを超える前記複素環式環が前記合成ステムに共有結合的に連結されている、請求項１に記載の合成物。
【請求項１４】
前記複素環式環が前記合成ステムに共有結合的に連結されており、同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合しており、複数コピーの該生物学的分子が同じ合成ステムに連結されている、請求項１２に記載の合成物。
【請求項１５】
前記合成ステムが非水相中で分子と共有結合的または非共有結合的に会合しており、前記複素環式環が水相中で同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合している、請求項１３に記載の合成物。
【請求項１６】
前記非共有結合的会合が、生理学的条件下で可逆的または部分的に可逆的である、請求項１２に記載の合成物。
【請求項１７】
前記合成ステムが前記小分子薬物に共有結合的に付着されており、前記複素環式環が同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合している、請求項１２に記載の合成物。
【請求項１８】
前記合成ステムが小分子薬物または高分子薬物に共有結合的に連結されており、前記複素環式環が前記生物学的分子に非共有結合的に会合しており、前記生物学的分子が同じ種類のものであるか、または互いに異なるものである、請求項１２に記載の合成物。
【請求項１９】
腫瘍学もしくは免疫学またはその両方の疾患の処置のための医薬としての、請求項６または１７または１８に記載の合成物の使用であって、前記小分子または前記生物学的分子が、腫瘍学もしくは免疫学またはその両方の疾患の処置のための薬物である、使用。
【請求項２０】
感染症もしくは炎症またはその両方の疾患の処置のための医薬としての、請求項６または１７または１８に記載の合成物の使用であって、前記小分子または前記生物学的分子が、腫瘍学もしくは免疫学またはその両方の疾患の処置のための薬物である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、複素環式環系を含む液体組成物に関する。
【０００２】
関連出願の引用
本ＰＣＴ出願は、米国仮出願第６２／３８１，１３４号（２０１６年８月３０日出願）に対する優先権を主張する。上記仮出願の教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
他の化学部分に対する、および／または表面に対するタンパク質および核酸などの高分子の結合は、生物製剤、ワクチンおよび診断薬の開発および製造の重要な側面となっている。これらの連結は、診断デバイス、薬物送達デバイスおよび医療デバイスにおいて使用されるもののような構造物の表面にタンパク質を会合させるために、ならびに／または分子を互いに連結するために使用される（例えば、タンパク質のＰＥＧ化、抗体−薬物コンジュゲート、酵素もしくは蛍光マーカーまたはビオチン（アビジン複合体を形成する場合）によるタンパク質（抗体および抗原を含む）の標識、ならびにワクチン開発のための担体タンパク質−多糖コンジュゲートの生産）。これらの連結は、典型的には、連結すべき化学的実体と反応して両実体との共有結合を形成する、化学的水溶性コンジュゲーションリンカーを使用した共有結合を使用する。これらの結合は、生物学的系において比較的安定であると考えられるが、生物製剤製品の開発および製造におけるそれらの使用は、それらが、コンジュゲートされているタンパク質を不可逆的に化学的に修飾／変化させるという事実によって複雑化される。
【０００４】
あるいは、静電結合は、生物製剤および医薬製剤中の異なる化学的実体を会合させるために首尾よく使用されている。静電結合は、製品に開発または製剤化されているタンパク質を化学的に修飾しないので、このプロセスは、より簡便かつより商業的に拡張可能である。しかしながら、生体液中に多いＰＯ４３−、ＳＯ４２−およびＮＨ４＋のようなアンチカオトロピック塩／イオンの存在下では、静電結合は不安定であり得る（Ｑｕｅｉｒｏｚ，ＴｏｍａｚおよびＣａｂｒａｌ，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１  Ｍａｙ  ４；８７（２）：１４３−５９）；（Ｐａｈｌｍａｎ，ＲｏｓｅｎｇｒｅｎおよびＨｊｅｒｔｅｎ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｓａｌｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９７７  Ｊａｎ  ２１；１３１：９９−１０８）。多くの場合、患者への投与時に、化学的実体間の連結が安定であることが望ましいので、これらの用途における静電結合の使用は限界を有する。さらに、静電結合は、結合している２つの実体の電荷が反対であり、十分な規模のものであることに依存するが、生理学的ｐＨ下でこの条件を達成することは困難であることが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｑｕｅｉｒｏｚ，ＴｏｍａｚおよびＣａｂｒａｌ，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１  Ｍａｙ  ４；８７（２）：１４３−５９
【非特許文献２】Ｐａｈｌｍａｎ，ＲｏｓｅｎｇｒｅｎおよびＨｊｅｒｔｅｎ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｓａｌｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９７７  Ｊａｎ  ２１；１３１：９９−１０８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態の概要
本発明の一実施形態は、複素環式環、合成ステムおよび生物学的分子を含む合成物であって、該複素環式環が（ａ）該合成ステムに共有結合的に連結されており、（ｂ）該生物学的分子と非共有結合的に会合している合成物に関する。
本発明の一実施形態では、非共有結合的会合は、アンチカオトロピック塩への曝露時に安定である。
【０００７】
本発明の一実施形態では、非共有結合的会合は、疎水性相互作用を含む。
【０００８】
本発明の一実施形態では、疎水性相互作用は、π相互作用、π−π相互作用およびπスタッキング相互作用からなる群より選択される。
【０００９】
本発明の一実施形態では、生物学的分子は、本発明の合成物を使用して表面と非共有結合的に会合している。
【００１０】
別の実施形態では、表面は、粒子表面ではない。
【００１１】
別の実施形態では、表面は、ナノ粒子表面ではない。
【００１２】
本発明の一実施形態では、合成ステムは、置換炭化水素または非置換炭化水素を含む。
【００１３】
本発明の一実施形態では、合成ステムは、小分子薬物を含む。
【００１４】
本発明の一実施形態では、合成ステムは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００１５】
本発明の一実施形態では、合成物中の複素環式環は、水混和性である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、複素環式環は、複素環式芳香族第４級アミンを含む。
【００１７】
本発明の一実施形態では、複素環式環は、ピリジニウム環を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態では、複素環式環は、約３〜約１０のｐＨ範囲にわたって正に荷電している。
【００１９】
本発明の一実施形態では、生物学的分子は、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡリガンドからなる群より選択される。
【００２０】
本発明の一実施形態では、複素環式環、合成ステムおよび生物学的分子を含む合成物であって、該複素環式環が（ａ）該合成ステムに共有結合的に連結されており、（ｂ）該生物学的分子と非共有結合的に会合しており、１コピーを超える該複素環式環が該合成ステムに共有結合的に連結されている合成物に関する。
【００２１】
本発明の一実施形態では、複素環式環は、合成ステムに共有結合的に連結されており、同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合しており、複数コピーの生物学的分子が同じ合成ステムに連結されている。
【００２２】
本発明の一実施形態では、合成ステムは、非水相中で分子と共有結合的または非共有結合的に会合しており、複素環式環は、水相中で同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合している。
【００２３】
本発明の一実施形態では、非共有結合的会合は、生理学的条件下で可逆的または部分的に可逆的である。
【００２４】
本発明の一実施形態では、合成ステムは、前記小分子薬物に共有結合的に付着されており、前記複素環式環は、同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合している。一実施形態における小分子薬物は、腫瘍学または免疫学の疾患を処置するために使用される。一実施形態における小分子薬物は、感染症または炎症の疾患を処置するために使用される。
【００２５】
本発明の一実施形態では、合成ステムは、小分子薬物または高分子薬物に共有結合的に連結されており、前記複素環式環は、前記生物学的分子に非共有結合的に会合しており、前記生物学的分子は、同じ種類のものであるか、または互いに異なるものである。
【００２６】
本発明の一実施形態では、複素環式環は、ピリジニウム環系である。
【００２７】
本発明の一実施形態では、ピリジニウム環は、小分子薬物に共有結合的に付着されており、所望の特異性を有する抗体にも疎水的に結合して、抗体−薬物−複合体（ＡＤＣｏｍ）を形成する。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ピリジニウム環は、小分子薬物に共有結合的に付着されており、生物学的タンパク質もしくはＤＮＡ、または受容体に結合するリガンドに疎水的に結合して、細胞または組織への標的送達を促進する。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、ピリジニウム環は、ＰＥＧ鎖に共有結合的に付着されており、ピリジニウムは、生物製剤タンパク質に疎水的に結合する。タンパク質−ピリジニウム−ＰＥＧ複合体は、動物に投与される場合、タンパク質のみよりも長い生物学的半減期を有する。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、合成ステムは、複数コピーのピリジニウム環が共有結合的に付着された炭化水素ポリマーステムである。ピリジニウム環は、生物製剤に結合して、複合体を形成する。複合体は、非共有結合的に結合しているので、動物に投与されると徐々に解離し、生物製剤の持続放出を提供する。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、合成ステムは、複数コピーのピリジニウム環が共有結合的に付着された炭化水素ポリマーステムである。ピリジニウム環系は、細胞表面受容体特異性を有する生物製剤抗体に結合して、複合体を形成する。複合体は、被験体に投与されると細胞表面受容体に結合し、受容体を効率的に架橋し、それにより、刺激に応答するように細胞をより良く活性化する。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、合成ステムは、複数コピーのピリジニウム環が共有結合的に付着された炭化水素ポリマーステムである。ピリジニウム環系は、１つを超える生物製剤または診断用試薬タンパク質に結合して、タンパク質の複合体を形成する。例えば、ピリジニウム構築物に結合した酵素と複合体化した所望の特異性を有する抗体は、診断アッセイにおいて、またはＥＬＩＳＡもしくは他のイムノアッセイ診断において比色反応に使用され得る。
【００３３】
本発明の一実施形態では、ピリジニウム環は、複数コピーの小さな薬物が付着された炭化水素ステムに共有結合的に付着されている。ピリジニウム−薬物複合体は、アルブミンのようなタンパク質と混合される場合、投与時の薬物製剤のバイオアベイラビリティおよび半減期を改善する。
【００３４】
本発明の一実施形態では、ピリジニウム環は、複数コピーの診断マーカーが付着された炭化水素ステムに共有結合的に付着されている。このピリジニウム−診断用構築物と、所望の特異性を有するタンパク質リガンドまたは抗体とを混合して、複合体を形成する。次いで、複合体を投与し、リガンド／抗体が所望の受容体／抗原に結合して、診断分析のためのマーカーをターゲティングする。
【００３５】
一実施形態では、炭化水素ステムに結合したピリジニウムを使用して、イムノアッセイプレートのようなプラスチック表面をコーティングし、それにより、プレートの表面上にピリジニウムをコーティングする。次いで、ピリジニウムコーティング表面を使用して、診断アッセイにおいて使用するために、疎水性結合によってタンパク質をコーティングし得る。
【００３６】
当業者であれば、直下に要約されている図面に関して議論されている以下の「特定の実施形態の詳細な説明」から、本発明の様々な実施形態の利点をより十分に認識するはずである。
【００３７】
実施形態の上記特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、複素環式環系を有する合成ステムの例を概略的に示す。この概略図は、縮尺どおりに描写されていないことに留意されたい。２０面体および点描円は、２つの異なるタイプの生物学的分子を概略的に表す。
【００３９】
【図２ａ】図２ａは、合成ステムにつながれたピリジニウム環系およびフルオロフォアを示す。
【００４０】
【図２ｂ】図２ｂは、複数コピーの生物学的分子とコンジュゲートされたピリジニウム環系を示す。
【００４１】
【図３】図３は、合成ステムにつながれたピリジニウム環系および発色団を示す。
【００４２】
【図４】図４は、合成ステムにつながれたピリジニウム環系およびビオチンを示す。
【００４３】
【図５】図５は、合成ステムにつながれたピリジニウム環系およびフルオロフォアを生産するための合成スキームを示す。
【００４４】
【図６ａ】図６ａは、合成ステムにつながれたピリジニウム環系および発色団を生産するための合成スキームを示す。
【００４５】
【図６ｂ】図６ｂは、２つの異なる生物学的分子（抗体および別の異なるタンパク質）がピリジニウム環系にコンジュゲートされている実施形態を示す。
【００４６】
【図７】図７は、合成ステムにつながれたピリジニウム環系およびビオチンを生産するための合成スキームを示す。
【００４７】
【図８】図８は、本発明の合成物を作製するために使用され得る複素環式環系の例を示す。
【００４８】
【図９】図９は、本発明の合成物を作製するために使用され得る荷電複素環式アミンの例を示す。
【００４９】
【図１０】図１０は、複素環式環合成物の濃度と、合成物に結合した結合ＩｇＧの量との間の関係を示す。
【００５０】
【図１１】図１１は、ＰＥＧ化ピリジニウム環系を生産するための合成スキームを示す。
【００５１】
【図１２】図１２は、ＥＬＩＳＡ研究のための本発明の実施形態を示す。（Ａ）目的の抗原に特異的な抗体をピリジニウム−ビオチン構築物と予混合する。（Ｂ）ピリジニウムは、抗体に非共有結合的に疎水的に結合して、ビオチンで抗体を標識する（これは、ビオチンをこれらの抗体に共有結合的に連結させる事前の必要性に取って代わる）。（Ｃ）次いで、ビオチン標識抗体を、その抗体が特異的である抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加し、続いて、未結合抗体を除去する。（Ｄ）アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をビオチンに結合させ、未結合ビオチン−ＨＲＰを洗い流した後、ＥＬＩＳＡ読み取り機器において測定される比色反応においてＨＲＰ用基質を使用することによって、残りの結合ビオチン標識抗体を検出および測定する。
【００５２】
【図１３】図１３は、本発明の薬物持続放出を示しており、１つの（またはそれを超える）生物学的分子を、（この例では）炭化水素鎖に付着された複数のピリジニウム環から構成される構築物と混合する。１コピーの構築物に対する複数の生物学的分子の結合、および同様に１つの生物学的分子に対する数コピーの構築物の結合は、最終的には、投与され得る大きな複合体の形成をもたらす。生物学的分子に対するピリジニウムの結合は可逆的であるので、投与された複合体は徐々に解離して、生物学的分子を持続放出の方法で放出し得る。
【００５３】
【図１４】図１４は、クロマトグラフィーへの本発明の適用を示しており、（Ａ）複数のピリジニウム環（この例での複素環式芳香環）を有するクロマトグラフィーマトリックスを、（Ｂに示されているように）ピリジニウムに疎水的に結合する生物学的分子と混合する。続いて、クロマトグラフィーマトリックスから未結合物質を洗浄し得、カオトロピック剤を使用してマトリックスから生物学的分子を溶出させ得る（この図に示されていない工程）。
【００５４】
【図１５】図１５は、ピリジニウム環との疎水性結合によって抗体に連結された薬物を示す。
【００５５】
【図１６】図１６は、ＰＢＳおよび生理食塩水の存在下における、ＩｇＧとのピリジニウム−フルオレセイン構築物の結合親和性曲線を示す。
【００５６】
【図１７】図１７は、ＰＢＳおよび生理食塩水の存在下における、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）とのピリジニウム−フルオレセイン構築物の結合親和性曲線を示す。
【００５７】
【図１８】図１８は、生理食塩溶液下における、ＩｇＧおよびＨＳとのピリジニウム構築物の比較結合親和性曲線を示す。
【００５８】
【図１９】図１９は、ＰＢＳ溶液下における、ＩｇＧおよびＨＳＡとのピリジニウム構築物の比較結合親和性曲線を示す。
【００５９】
【図２０】図２０は、ＩｇＧおよびＢＳＡを用いたピリジニウム構築物のＥＬＩＳＡアッセイ結果を示す。
【００６０】
【図２１】図２１は、デキストランの過ヨウ素酸塩での酸化を示す。
【００６１】
【図２２】図２２は、デキストランの還元的アミノ化を示す。
【００６２】
【図２３】図２３は、代表的なペプチドバソプレシン（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）とピリジニウム構築物との間の疎水性結合を示しており、芳香環間の疎水性相互作用は、破線で示されている。
【００６３】
【図２４】図２４は、疎水性塩基スタッキングおよびインターカレーション型相互作用を示す、核酸とピリジニウム構築物との間の疎水性結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明の一態様では、本発明者らは、アンチカオトロピック塩を含有する溶液中であっても、タンパク質の疎水性領域との疎水性結合を形成して、タンパク質と、脂質二重層、多層壁プレートに存在する膜もしくはプラスチック表面、または医療機器の金属表面のような表面、またはＰＥＧおよび長鎖糖（例えば、デキストラン）のような他の化学的実体との間に安定な連結を形成する能力も有する水混和性有機部分を使用する。（１０４ｍｇ／リットルを超える）優れた水溶性または混和性を有するという特性を有する化学部分であって、ＬｏｇＰによって測定した場合に疎水性溶媒中にあることを依然として好む（０を超えるＬｏｇＰを有する）化学部分はほとんどない。このような化合物の１つの非限定的な例は、複素環式芳香族化合物ピリジンである。図９に示されている他の複素環式芳香族アミンおよび複素環式環系を、複素環式環中のアミンを介して他の化学部分に共有結合的に結合させて、第４級アミンを形成することができ、これにより、そのアミンは、水溶液のｐＨとは無関係に正電荷に固定されるので、依然として水溶性である。同様の相互作用は、複素環式環系に存在する複素環の原子、例えば酸素および硫黄を介して得られ得る。ピリジニウム化合物の代わりに使用され得る様々な複素環式化合物の例は、図８に示されている。
【００６５】
同程度の特徴を有する他の有機化合物としては、他の複素環式芳香族化合物、例えばピロール（pyrole）、ピラン、オキソラン、ならびに複素環式非芳香族化合物、例えばピペリジン（piperdine）、オキサン、オキソロン、チエタンおよびチイランが挙げられる。これらの特性を有する他の非複素環式有機化合物としては、フェノール、２−ブトキシエタノール、酪酸、ジメトキシエタン（dimethloxyethane）、フルフリルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノールおよびプロパン酸が挙げられる。
【００６６】
本発明は、水溶性であるという特性を示す特定の化合物が、驚くべきことに、ピリジニウムのように疎水性溶媒を好むようであるという予想外の発見に基づく。これらの化合物は、タンパク質との安定な疎水性結合を形成する。本発明は、タンパク質を表面および他の化学的実体に安定的に連結するために有用である。連結は、さもなければイオン結合を不安定化するアンチカオトロピック塩溶液中で安定である。本発明は、特に生物製剤、医薬製剤、ワクチンならびに診断用ヒトおよび家畜製品の開発において広範囲の用途を有する。
定義
【００６７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、特に文脈上必要がない限り、以下の用語は、示されている意味を有するものとする。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「合成ステム」は、１個を超える炭素、例えば２個、４個、６個、８個、１０個、２０個、４０個または５０個の炭素原子からなる炭化水素鎖を指す。合成ステム上の炭素原子は、ハロゲン化物、酸素、窒素、硫黄、リンまたはそれらの組み合わせで場合により置換されている。合成ステムまたはその一部は、多くの小分子薬物のように合成化学によって生成され得るか、または糖／多糖を含む天然ポリマーのように生物学的に生産され、次いで、化学反応および／またはリンカーによって複素環式環に共有結合的に付着され得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「複素環式環」は、その環のメンバーとして少なくとも２つの異なる元素の原子を有する環状化合物である。好ましくは、異なる元素は、窒素、酸素、硫黄およびそれらの組み合わせから選択される。化合物は、それが環を形成するからこそ環状であるので、それは、少なくとも４個の原子を含み、５個、６個、７個、８個またはそれを超える原子を含み得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「生物学的分子」は、生物学的プロセスによって、生体内で、インビトロ生物学的プロセスで、または天然生物学的プロセスを置き換えるために使用され得る合成インビトロプロセスによって生産される分子を指す。生物学的分子としては、大きな高分子、例えばタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質および核酸、ならびに小分子、例えば一次代謝産物、二次代謝産物および天然産物が挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「静電相互作用」は、カチオンとアニオンとの間の相互作用を指す。静電相互作用は、荷電イオンの性質に応じて、引力的または斥力的のいずれかであり得る。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「非共有結合性相互作用」は、分子間または分子内の電磁相互作用の分散型バリエーションを指す。非共有結合性相互作用は、一般に、５つのカテゴリー（静電、π効果、ファンデルワールス力、水素結合および疎水性相互作用）に分類され得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「水素結合相互作用」は、電気陰性原子と、別の電気陰性原子に結合した水素原子との間の引力（双極子−双極子）相互作用のタイプである。水素結合相互作用は、ファンデルワールス力よりも強いが共有結合またはイオン結合よりも弱い傾向がある。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「ファンデルワールス相互作用」は、互いに非常に近い２個またはそれを超える原子または分子間で誘導される電気的相互作用によって駆動される相互作用である。ファンデルワールス相互作用は、分子間のすべての分子間引力の中で最弱である。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「疎水性相互作用」は、電子またはプロトンの共有を伴わない、異なる分子上の非荷電置換基間のエントロピー駆動性相互作用である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「アンチカオトロピック塩」は、溶液中の疎水性効果を増加させる水溶液中の分子である。硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、フッ化ナトリウムおよびフッ化アンモニウムは、アンチカオトロピック塩／イオンのいくつかの非限定的な例である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「π−π相互作用」は、π系を伴う非共有結合性相互作用のタイプである。複素環式環または芳香環中における電子が豊富なπ系は、金属（カチオン性または中性）、アニオン、別の分子およびさらに別のπ系と相互作用し得る。π系を伴う非共有結合性相互作用は、タンパク質−リガンド認識などの生物学的事象に極めて重要であり得る。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「水相」は、不均一系の均一部分であり、水、または化合物もしくは化合物の混合物の水溶液からなる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「非水性相」は、物質の凝集力が、分子または原子を所与の位置に保持して熱運動性を抑止するために十分に強い固相を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「小分子薬物」は、細胞、組織または生物内の生物学的プロセスに影響を及ぼし得、変化させ得、または遮断し得る低分子量（好ましくは、１０〜１００ダルトン、１００、１５０、２５０、５００および＜９００ダルトン）の有機化合物である。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「高分子薬物」は、細胞または被験体への投与により治療効果を提供するより小さなサブユニット（単量体）の重合によって一般に作られる非常に大きな分子（好ましくは、＞９００ダルトン、１ｋ〜５ｋ、５ｋ〜１０ｋ、１０ｋ〜５０ｋ、５０ｋ〜１００ｋダルトン）、例えばタンパク質を指す。高分子薬物バイオポリマー（核酸、タンパク質、炭水化物およびポリフェノール）ならびに大きな非ポリマー分子（例えば、脂質およびマクロサイクル）の最も一般的な例。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「発色団」は、特定の波長の可視光を吸収し、他のものを透過または反射して、発色をもたらす分子である。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「フルオロフォア」は、光励起により光を再放射し得る蛍光化合物である。フルオロフォアは、典型的には、いくつかの複合芳香族基を含有するか、またはいくつかのπ結合を有する平面もしくは環状分子を含有する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「相互作用」または「相互作用する」という用語は、例えば、付着、接着または結合を介した、活性医薬成分と合成ステムとの間の物理的関係を指す。
【００８６】
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを指す；好ましくは、核酸は、長さが１０ｋｂまたはそれ未満（５ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ）であり、コードまたは非コードであり得る。「オリゴヌクレオチド」は短い核酸であり、ＰＮＡ、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは両方を含み得、８〜５００、好ましくは１０〜２５０、１５〜３０、１５〜５０および２０〜３００ヌクレオチドまたは塩基対であり得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ベニア抗体、抗体断片および小さな免疫タンパク質（ＳＩＰ）をカバーする（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００２）１０２，７５−８５を参照のこと）。抗体は、免疫系によって生成されるタンパク質であって、特定の抗原を認識してそれに結合することができるタンパク質である。標的抗原は、一般に、複数の抗体上のＣＤＲによって認識される多数の結合部位（エピトープとも称される）を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、１つを超える対応する抗体を有し得る。抗体は、全長免疫グロブリン分子または全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、目的の標的の抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を含む。抗体は、任意のタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）−任意のクラス−例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２−またはそのサブクラスのものであり得る。抗体は、マウス、ヒト、ウサギまたは他の種のものであり得るか、またはそれらに由来し得る。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合領域または可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；単一ドメイン抗体（ｄＡｂを含む）、ラクダ科動物ＶＨＨ抗体および軟骨魚類のＩｇＮＡＲ抗体が挙げられる。抗体およびその断片は、代替的な非免疫グロブリンスキャフォールド、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、非ペプチド骨格に包含されるポリペプチドループを含む構造化ポリペプチド、天然受容体またはそれらのドメインに基づく結合分子によって置き換えられ得る。
【００８９】
本発明は、活性医薬成分を含む合成物の調製において有用な化学組成物の水性分散液に関する。
【００９０】
本発明は、非共有結合性相互作用を介してタンパク質と相互作用する複素環式環系を含む液体組成物に関する。複素環式環とタンパク質分子との間の非共有結合性相互作用は、静電相互作用から、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、および疎水性相互作用に及ぶ相互作用を含む。いかなる理論にも縛られるものではないが、これらの相互作用は、静電気力または疎水性力（π−π相互作用を含む）を介して起こり得ると考えられる。いくつかの実施形態では、活性医薬成分は、生理学的条件下で加水分解または結合破壊を受けて、医薬成分の放出をもたらすことができるステムに共有結合的に連結されている。
【００９１】
本発明はまた、複素環式環系を有する活性医薬成分の合成物を介して、活性医薬成分に対する生物学的応答を増強する方法に関する。
【００９２】
本発明はまた、予防的および／または治療的のいずれかで、複素環式環系を有する活性医薬成分のこれらの合成物を調製および使用するための方法に関する。
【００９３】
例示的な一実施形態では、化学組成物は、水性加水分解に対して安定な疎水性有機材料を含む。本発明において有用な疎水性有機材料の例としては、いかようにも限定されないが、有機ワックス、例えば蜜ろうおよびカルナウバワックス、セチルアルコール、セテアリルアルコール（ceteryl  alcohol）、ベヘニルアルコール、脂肪酸および脂肪酸エステルが挙げられる。２５℃超の融点を有する有機ワックスは、化学組成物における使用に好ましい。いくつかの実施形態では、疎水性有機材料は、薬学的に許容され得る油をさらに含み得る。薬学的に許容され得る油の例としては、限定されないが、鉱油、植物起源（トウモロコシ、オリーブ、ピーナッツ、ダイズなど）の油、およびシリコーン流体、例えばＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＤＣ２００が挙げられる。これらの実施形態のうちのいくつかは、２５℃超の融点を有する１％〜１００％の有機ワックスと、０〜９９％の薬学的に許容され得る油とを含み得る。
【００９４】
例示的な一実施形態では、化学組成物は、安定化成分を含む。このような安定化成分の例としては、限定されないが、キトサン、荷電乳化剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムおよび脂肪酸またはそれらの塩が挙げられる。脂肪酸の例としては、限定されないが、ミリスチン酸およびベヘン酸が挙げられる。
【００９５】
例示的な一実施形態では、化学組成物は、乳化成分を含む。このような乳化成分の例としては、乳化剤、限定されないが、セチルトリメチルアンモニウムブロミドおよびセチルピリジニウムハライド、キトサン、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパンメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ミリスチン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ポリエチレンステアリルエーテル、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、例えばＡＯＴ、Ｂｒｉｊ７００およびそれらの組み合わせが挙げられる。本開示を読んだ当業者によって理解されるように、代替乳化剤（alternative  emulsifier）も使用され得る。乳化成分は、約０．０１％〜約１０％または約０．０５％〜約５％または約０．１％〜約２％または約０．５％５〜約２％または約１．０％〜約２．０％のレベルで存在し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、化学組成物は、医薬成分を送達すべき細胞上の表面受容体のリガンドである部分であって、医薬成分をそれらの細胞にターゲティングする部分をさらに含む。例えば、マンノース受容体などの細胞表面受容体によって認識される多糖を化学組成物の合成ステムに連結し、それにより、それらの受容体を有する細胞への合成ステムを含む医薬成分の送達を改善し得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明の化学組成物は、有機溶媒を本質的に含まないプロセスを介して調製される。
【００９８】
一実施形態では、化学組成物は、溶融脂質またはワックスの存在下で硬化プロセスに供される。非限定的な例として、一実施形態では、固体脂質またはワックスをその溶融温度よりも上昇させて、溶融脂質またはワックスを形成する。次いで、超音波ホーンまたは高圧ホモジナイザーを使用して、溶融材料を、合成ステム、複素環式環および医薬成分を含む化学組成物に分散させる。次いで、化学組成物および溶融材料を含む得られたエマルジョンを室温に冷却する。
【００９９】
本発明の一実施形態では、化学組成物は、ワクチンの送達において有用であり、この場合、活性医薬成分は、タンパク質、好ましくはサブユニットワクチン抗原、例えば限定されないが、破傷風トキソイドもしくはｇｐ１４０、または核酸、例えば限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＳｈＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらの実施形態は、アニオン性アジュバント、例えば限定されないが、ポリ（ＩＣ）またはＣｐＧＢをさらに含み得る。
【０１００】
サブユニットワクチン抗原および化学組成物中の活性医薬成分がワクチン製剤である一実施形態では、組成物を被験体に投与して、抗原に対して被験体を免疫化し得る。
【０１０１】
化学組成物において使用される活性医薬成分としては、いかようにも限定されないが、ワクチン、栄養剤、化粧品および診断剤を含む薬物が挙げられる。本発明において使用するための活性医薬成分の例としては、限定されないが、鎮痛薬、抗狭心症剤、抗喘息薬、抗不整脈剤、抗血管新生剤、抗菌剤、抗良性前立腺肥大症剤、抗嚢胞性線維症剤、抗凝固剤、抗鬱薬、抗糖尿病薬、抗てんかん剤、抗真菌剤、抗痛風剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗マラリア剤、抗片頭痛剤、抗ムスカリン剤、抗新生物剤、抗肥満症剤、抗骨粗鬆症剤、抗パーキンソン病剤、抗原虫剤、抗甲状腺剤、抗尿失禁剤、抗ウイルス剤、抗不安薬、ベータ遮断薬、心臓変力剤、認知増強物質、コルチコステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤、利尿薬、勃起不全改善剤、必須脂肪酸、胃腸剤、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、ホルモン、免疫抑制物質、角質溶解症薬、ロイコトリエンアンタゴニスト、脂質調節剤、マクロライド、筋弛緩物質、非必須脂肪酸、栄養剤、栄養油、プロテアーゼ阻害剤および刺激物質が挙げられる。
【０１０２】
したがって、本発明の化学組成物は、組成物中に存在する活性医薬成分で処置可能な障害または疾患を患っている被験体の処置において予防的および治療的に有用である。
【０１０３】
本発明の化学組成物は、活性医薬成分を選択細胞または組織にターゲティングする方法、および選択細胞または組織にターゲティングされる医薬製剤を生産する方法において有用である。これらの方法では、化学組成物は、非共有結合性相互作用を介してタンパク質に結合する複素環式環成分を含む。化学製剤は、細胞または組織にターゲティングすべき活性医薬成分であって、化学組成物から放出されると治療利益をもたらす活性医薬成分をさらに含む。
【０１０４】
上記本発明の実施形態は、単なる例示であることを意図する；多数のバリエーションおよび改変は、当業者に明らかであろう。このようなバリエーションおよび改変はすべて、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内であることを意図する。
【０１０５】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例証するために提供される。
【０１０６】
下記いくつかの実施形態では、モデル例としてピリジニウム環系を使用して、様々な用途における利用法を例証している。本発明は、ピリジニウム環化合物のみに限定されると決して解釈されるべきではない。図１、６、８および９に例示されているように、他の複素環式系、例えばピロリジン（pyrolidine）環系、ピペリジン環系、オキサラン環系、インドール環系、チアン環系、オキセピン環系などは、ピリジン環系の代わりに使用され得る。当業者であれば、本明細書に記載されている教示に基づいて、当技術分野における通常の知識を身に着けて、本明細書に記載される他の複素環式環系でピリジニウム環系を容易に置き換えて、ピリジニウムに基づく実施形態の場合に見られるのと同様の有用性を有する類似の実施形態を達成し得ることを理解するであろう。本発明はまた、複数種の複素環式環系が存在し、複数コピーの同じ複素環式環系も存在するいくつかの実施形態を企図する。これらの実施形態は、実施例に記載されているのと同様の有用性を有する化合物を生成するために使用されるものとする。
【実施例】
【０１０７】
実施例１−ピリジニウム構築物の合成
図１は、１種類を超える複素環式環系が合成ステムに付着された複素環式化学合成物の非限定的な例を示す。それはまた、医薬成分（２０面体として表されている）または診断マーカー（点描の球として表されている）またはそれらの組み合わせをさらに含む複素環式化学合成物を示す。図２〜４は、発色団、フルオロフォアまたはビオチンを有するピリジニウム環系を含む構築物の非限定的な例を示す。
【０１０８】
以下の実施例は、図５に示されているように、複素環式ピリジニウム環、合成ステムおよび発色団を含む化学合成物の生産において利用される合成プロセスを詳述する。当業者であれば、当技術分野における知識を使用して、この合成プロセスを場合により改変して、複数の複素環式環および複数の発色団を含む化学製剤を生産し得ることを理解するだろう。ピリジニウム構築物のための合成カップリング反応は、長さゼロの架橋剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を使用したペプチドカップリング反応を使用した。それにより、第１級アミンおよびカルボン酸が互いに反応して、アミド結合を形成する。具体的には、１−（４−カルボキシブチル）ピリジニウム（１００ｍｇ；０．５５ｍｍｏｌ）、ピレンメチルアミン（１２７ｍｇ；０．５５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１５０ｍｇ；０．７８ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１４０ｍｇ；１００ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。一滴のトリエチルアミンを添加した。反応物を３０分間かけて３５℃に加熱し、粗製物を精製用２６ｇＣ１８カラム（移動相Ａ：１０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム、移動相Ｂ：アセトニトリル、勾配：５〜９５％水溶液）に注入して、最終生成物１−（５−オキソ−５−（ピレン−１−イルメチルアミノ）ペンチル）ピリジニウム（分子量＝３９３）を回収した。1H  NMR  (予測,  δ)  1.3  (4H,  m),  1.53  (2H,  m),  2.13  (2H,  t),  4.91  (2H,  s),  7.62  (1H,  m),  7.71  (4H,  m),  7.82  (1H,  m),  7.88  (1H,  m),  8.00  (1H,  m),  8.12  (1H,  m),  8.18  (1H,  d),  8.22  (2H,  m),  8.74  (1H,  m),  8.89  (2H,  m).
【０１０９】
以下の実施例は、図６に示されているように、複素環式ピリジニウム環、合成ステムおよびフルオロフォアを含む化学合成物の生産において利用される合成プロセスを詳述する。当業者であれば、当技術分野における知識を使用して、この合成プロセスを場合により改変して、複数の複素環式環および複数のフルオロフォアを含む化学製剤を生産し得ることを理解するだろう。
【０１１０】
ピリジニウム構築物のための合成カップリング反応は、長さゼロの架橋剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を使用したペプチドカップリング反応を使用した。それにより、第１級アミンおよびＮＨＳ−エステルが互いに反応して、アミド結合を形成する。具体的には、ＮＨＳ−フルオレセイン（１００ｍｇ；０．２１１ｍｍｏｌ）、１−（２−アミノエチルピリジニウム）（３７ｍｇ；０．３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５８ｍｇ；０．３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。一滴のトリエチルアミンを添加した。反応物を３０分間かけて３５℃に加熱し、粗製物を精製用２６ｇＣ１８カラム（移動相Ａ：１０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム、移動相Ｂ：アセトニトリル、勾配：５〜９５％水溶液）に注入して、最終生成物１−（２−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イルカルボキサミド）エチル）ピリジニウム（分子量４８１）を回収した。1H  NMR  (予測,  δ)  1.60  (2H,  t),  3.02  (2H,  t),  6.40  (2H,  m),  6.62  (2H,  m),  7.15  (2H,  m),  7.98  (1H,  s),  8.07  (1H,  m),  8.16  (1H,  m),  8.22  (2H,  m),  8.56  (1H,  s),  8.74  (1H,  t),  8.89  (2H,  m),  9.89  (2H,  s)
以下の実施例は、図７に示されているように、複素環式ピリジニウム環、合成ステムおよびビオチンを含む化学合成物の生産において利用される合成プロセスを詳述する。当業者であれば、当技術分野における知識を使用して、この合成プロセスを場合により改変して、複数の複素環式環および複数単位のビオチンを含む化学製剤を生産し得ることを理解するだろう。
【０１１１】
ピリジニウム−ビオチン構築物のための合成カップリング反応は、長さゼロの架橋剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を使用したペプチドカップリング反応を使用した。それにより、第１級アミンおよびＮＨＳ−エステルが互いに反応して、アミド結合を形成する。具体的には、ＮＨＳ−ビオチン（６８ｍｇ；０．２ｍｍｏｌ）、１−（２−アミノエチルピリジニウム）（３７ｍｇ；０．３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５８ｍｇ；０．３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。一滴のトリエチルアミンを添加した。反応物を３０分間かけて３５℃に加熱し、粗製物を精製用２６ｇＣ１８カラム（移動相Ａ：１０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム、移動相Ｂ：アセトニトリル、勾配：５〜９５％水溶液）に注入して、最終生成物１−（２−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エチル）ピリジニウム（分子量３４９）を回収した。1H  NMR  (予測,  δ)  1.25  (2H,  m),  1.62  (6H,  m),  2.13  (2H,  t),  2.85  (2H,  d),  3.15  (2H,  t),  3.36  (1H,  m),  4.59  (2H,  m),  6.0  (2H,  s),  8.01  (1H,  s),  8.22  (2H,  m),  8.74  (1H,  m),  8.89  (2H,  m).
【０１１２】
また、当業者であれば、上記合成スキームはピリジニウム系複素環式環系に限定されず、むしろ図８および９に記載されている他の複素環式環系に適合するように改変されるものであることを容易に認識するであろう。当技術分野における知識を用いて合成プロセスを容易に改変して、いくつかのバージョンの構築物を生成することができ、その一部は、図１に例示されている。図１１は、ＰＥＧ化ピリジニウム構築物の合成を示す非限定的な例である。
実施例２−蛍光アッセイを使用した、ピリジニウム構築物と生物学的分子との結合の定量分析
【０１１３】
この実施例は、フルオロフォアを含有するピリジニウム構築物とタンパク質との間の相互作用を例証する。目的の生体分子として、ヒトＩｇＧ１またはアルブミンを使用するものとする。実施例１に記載されているように、フルオロフォアを含有するピリジニウム構築物を合成および精製する。
【０１１４】
溶液中で、フルオロフォアを含有するピリジニウム構築物をヒトＩｇＧ１またはアルブミンと混合する。分子篩ろ過によって、タンパク質およびタンパク質結合構築物から未結合遊離ピリジニウム構築物を分離し得る；例えば、１０，０００ｍｗカットオフ膜を使用すると、未結合ピリジニウム構築物は膜を容易に通過するが、１５０，０００ｍｗのＩｇＧ１のようなタンパク質は保持される。次いで、保持蛍光について、タンパク質含有画分をアッセイし得る。タンパク質画分中の保持蛍光活性は、タンパク質に対するピリジニウム構築物の結合を表す。
【０１１５】
あるいは、フィルタを通過する未結合蛍光ピリジニウム構築物も測定し得る。蛍光ピリジニウム構築物がタンパク質に結合すると、フィルタを通過する蛍光の量は、初期結合反応に含まれるタンパク質の量が増加するにつれて減少する。アッセイでは、単独でインキュベートした蛍光ピリジニウム構築物と、比較のために漸増量のタンパク質と共にインキュベートした蛍光ピリジニウム構築物とを使用するであろう。その後の分析では、膜を通過する未結合蛍光−ピリジニウム−構築物の量を評価する。当技術分野で確立されている標準的なプロトコールにしたがって、蛍光光度計ですべての蛍光測定を行う。
【０１１６】
あるいは、タンパク質の量を一定に維持し、蛍光−ピリジニウム構築物で滴定することによっても、蛍光結合アッセイを行うものとする。別の実験において、ピリジニウムに共有結合的に連結していないフルオロフォアをタンパク質と共に滴定し、濃度範囲のバックグラウンド蛍光測定として使用する。インキュベーション後、未結合構築物または未結合フルオロフォアからタンパク質を分離し、タンパク質画分の蛍光を測定する。これら２つの結合アッセイ（構築物対フルオロフォアのみ）間の蛍光の差異は、タンパク質に対するピリジニウム結合から生じる結合を半定量的に表す。
【０１１７】
図１０に示されているデータ表は、タンパク質（ＩｇＧ）とピリジニウム構築物、例えばＣＰＣ（セチルピリジニウムクロリド）およびＣＰＢ（セチルピリジニウムブロミド）との間の結合実験からの結果を示す。比較のために、ＰＢＳおよび水条件下で、ＩｇＧとの結合について、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）などの非複素環式分子も試験した。
【０１１８】
ＣＰＣ（セチルピリジニウムクロリド）を０．３３ｗｔ／ｖｏｌ．％および０．１０ｗｔ／ｖｏｌ％で試験し、ＣＰＢを１ｗｔ／ｖｏｌ％で試験した。別の試験において、水およびＰＢＳ緩衝溶液の存在下で、実験を行った。タンパク質をピリジニウム構築物と一晩結合させた後、遊離ＩｇＧ（タンパク質）を測定することによって、未結合ＩｇＧおよびピリジニウム結合ＩｇＧの割合を決定した。結果は、アンチカオトロピック剤であるリン酸塩を含有するＰＢＳ緩衝液中であっても、ＣＰＣおよびＣＰＢがＩｇＧに十分に結合することを示している。アンチカオトロピック剤の存在下であっても、ＣＰＣおよびＣＰＢがタンパク質に強く結合することは、タンパク質とピリジニウム構築物との間の結合が疎水的な性質であることを示している。結果はまた、水およびＰＢＳの両方において、より低濃度のＣＰＣおよびＣＰＢをベースとする構築物が、タンパク質のより良好な結合をもたらしたことを示している。他方、ＣＴＡＢは複素環式環系を欠くが、ＣＰＣまたはＣＰＢと同じ電荷を有するにもかかわらず、前記条件下ではＩｇＧタンパク質に結合しなかったが、これは、ＣＴＡＢが、疎水性または静電相互作用を介してＩｇＧに結合することができないことを示している。同様のアッセイを行って、目的の他のタンパク質に対する良好な結合を可能にするピリジニウム構築物の最適濃度を同定し得る。
【０１１９】
以下の実験を使用することによって、ピリジニウム構築物とタンパク質との間で起こる相互作用の性質を確認し得る。静電相互作用を破壊して疎水性相互作用を強化するリン酸塩のようなアンチカオトロピック剤／塩の存在下で、上記結合アッセイを反復する。インキュベーション中の（アンチカオトロピック塩）リン酸塩の添加によって、ピリジニウム構築物とタンパク質との間の結合相互作用が依然として影響を受けないかまたは強化された可能性がある場合、それは、ピリジニウム構築物とタンパク質との間の相互作用が、疎水的な性質であることを意味する。反対に、エタノールのようなカオトロピック剤を結合反応に添加し得るが、静電結合ではなく疎水性結合に悪影響を与えるはずである。インキュベーション中の（カオトロピック試薬）エタノールの添加によって、ピリジニウム構築物とタンパク質との間の結合相互作用が減少するかまたは弱体化された可能性がある場合、それはまた、ピリジニウム構築物とタンパク質との間の相互作用が、疎水的な性質であることを意味する。
【０１２０】
定量的測定の別のバリエーションは、平衡反応における遊離蛍光−ピリジニウム構築物対結合蛍光−ピリジニウム構築物によって示される蛍光を測定することであり、この平衡反応では、蛍光−ピリジニウム構築物の量を一定に保持し、タンパク質を結合反応に滴定する。分子篩膜によって、これらの反応におけるタンパク質を遊離構築物から分離し、遊離蛍光の量を測定する。次いで、遊離ピリジニウム構築物対結合ピリジニウム構築物の量を計算する。Ｐｏｌｌａｒｄら（Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｏｌｌａｒｄ，ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２１：４０６１−６７，２０１０）により記載されるように、これらの分析から、これらの相互作用の結合定数および親和性を計算し得る。アンチカオトロピック剤およびカオトロピック剤の存在下におけるこれらの結合定数の分析は、疎水性相互作用によって、ピリジニウムがタンパク質に結合していることを示すであろう。
【０１２１】
定量的測定の別のバリエーションは、マイクロスケール熱泳動を使用して、タンパク質に結合したピリジニウム構築物の蛍光を測定することである。（ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ）。マイクロスケール熱泳動は、微視的温度勾配における微視的実体またはバイオポリマーまたは高分子の指向性運動である。それらの構造／立体配座の変化による生体分子の水和殻の任意の変化は、温度勾配に沿った運動の相対変化をもたらし、結合親和性を決定するために使用される。ＭＳＴは、表面への固定化を必要とせずに、溶液中で相互作用を直接測定することを可能にする（固定化不要技術）。ＭＳＴは、タンパク質または他の大きな生物学的分子と相互作用する蛍光リガンドの解離定数（Ｋｄ）を効率的に測定し得る。
【０１２２】
ＭＳＴは、温度勾配に沿った分子の指向性運動（熱泳動と称される効果）に基づく。空間温度差ΔＴは、ソレット係数ＳＴによって定量される、高温領域における分子濃度の枯渇をもたらす：ｃｈｏｔ／ｃｃｏｌｄ＝ｅｘｐ（−ＳＴΔＴ）
【０１２３】
熱泳動は、分子と溶媒との間の界面に依存する。一定の緩衝液条件下で、熱泳動は、分子のサイズ、電荷および溶媒和エントロピーを調べる。蛍光標識分子（Ａ）の熱泳動は、典型的には、サイズ、電荷および溶媒和エントロピーの差異により、分子−標的複合体（ＡＴ）の熱泳動と有意に異なる。分子の熱泳動のこの差異を使用して、一定の緩衝液条件下の滴定実験において結合を定量する。
【０１２４】
キャピラリー内の蛍光分布（Ｆ）をモニタリングすることによって、蛍光標識分子の熱泳動運動を測定する。キャピラリー内に集束され、水によって強く吸収されるＩＲレーザーによって、微視的温度勾配を生成する。レーザースポットにおける水溶液の温度は、ΔＴ＝５Ｋまで上昇する。ＩＲレーザーのスイッチを入れる前は、キャピラリー内で均一な蛍光分布Ｆｃｏｌｄが観察される。ＩＲレーザーのスイッチを入れると、タイムスケールによって分離される２つの効果が新たな蛍光分布Ｆｈｏｔに寄与する。熱緩和時間は速く、温度ジャンプに対するその局所的環境依存性応答により、色素の蛍光の結合依存性低下を誘導する。より遅い拡散タイムスケール（１０秒）では、分子は、局所的に加熱された領域から外側の低温領域に移動する。加熱領域では、分子の局所濃度は、それが定常状態分布に達するまで減少する。
【０１２５】
質量拡散（Ｄ）は枯渇の動態を決定し、ＳＴは、温度上昇ΔＴ下における定常状態濃度比ｃｈｏｔ／ｃｃｏｌｄ＝ｅｘｐ（−ＳＴΔＴ）≒１−ＳＴΔＴを決定する。正規化蛍光Ｆｎｏｒｍ＝Ｆｈｏｔ／Ｆｃｏｌｄは、温度ジャンプ∂Ｆ／∂Ｔに加えて、主にこの濃度比を測定する。線形近似では、Ｆｎｏｒｍ＝１＋（∂Ｆ／∂Ｔ−ＳＴ）ΔＴである。蛍光強度および熱泳動枯渇の直線性により、未結合分子Ｆｎｏｒｍ（Ａ）および結合複合体Ｆｎｏｒｍ（ＡＴ）からの正規化蛍光は、直線的に重なり合う。標的に結合した分子の割合をｘとすることによって、標的Ｔの滴定中に変化する蛍光シグナルは、Ｆｎｏｒｍ＝（１−ｘ）Ｆｎｏｒｍ（Ａ）＋ｘＦｎｏｒｍ（ＡＴ）によって与えられる。
【０１２６】
定量的結合パラメータは、結合基質の系列希釈を使用することによって得られるものとする。希釈系列の様々な濃度の対数に対してＦｎｏｒｍをプロットすることによって、シグモイド結合曲線が得られる。この結合曲線を質量作用の法則の非線形解と直接フィッティングして、解離定数ＫＤを決定し得る。同様に、前述のように、カオトロピック試薬およびアンチカオトロピック試薬の存在下で、解離定数を決定するものとする。
実施例３−ビオチンアッセイを使用した、ピリジニウム構築物と生物学的分子との結合の定量分析
【０１２７】
この実施例は、ビオチンを含有するピリジニウム構築物とタンパク質との間の相互作用を例証する。目的の生体分子として、ヒトＩｇＧ１またはアルブミンを使用するものとする。実施例１に記載されているように、ビオチンを含有するピリジニウム構築物を合成および精製する。
【０１２８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、タンパク質に対するビオチン含有ピリジニウム構築物の結合を定量し得る。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、入射光によって刺激される負誘電率材料と正誘電率材料との間の界面における伝導電子の共鳴振動である。入射光子の振動数が、正電荷原子核の復元力に抗して振動する表面電子の固有振動数と一致すると、共鳴条件が確立される。サブ波長スケールのナノ構造におけるＳＰＲは、ポラリトンまたはプラズモンの性質であり得る。
【０１２９】
ＳＰＲは、平面金属（典型的には、金もしくは銀）表面上への、または金属表面上への材料の吸着を測定するための多くの標準的なツールの基盤である。それは、多くのカラーベースバイオセンサーアプリケーションおよび異なるラボオンチップセンサーの背後にある基本原理である。特に指示がない限り、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用して、ＳＰＲ測定を実施するものとする。（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）
【０１３０】
タンパク質は、センサーチップの表面に固定化されたリガンドに結合するので、Ｂｉａｃｏｒｅは、質量蓄積を測定し得る。この実施例では、アビジンコーティングセンサーチップをＳＰＲ測定に使用する。最初に、ピリジニウム−ビオチン構築物でアビジンコーティングセンサーチップを処理して、ピリジニウム−ビオチン構築物でアビジンコーティングチップ表面を確実に飽和させる。ビオチンとアビジンとの間の高い親和性（約１０〜１５ＭのＫＤ）により、これが可能である。
【０１３１】
マイクロフローシステムを介して、目的のタンパク質を含む溶液をピリジニウム構築物被膜センサーチップ表面上に注入する。タンパク質がピリジニウム構築物に結合するにつれて、ＳＰＲシグナル（応答単位ＲＵで表される）の増加が観察される。所望の会合時間の後、タンパク質を含まない溶液（通常は、アンチカオトロピック剤を含有する緩衝液）をマイクロフルイディクス上に注入して、ピリジニウム構築物とタンパク質との間の結合複合体の解離を可能にする。ピリジニウム構築物とタンパク質リガンドとの間の複合体の解離は、ＳＰＲシグナルの減少をもたらすであろう（応答単位ＲＵで表される）。これらの会合速度（「ｏｎ速度」、ｋａ）および解離速度（「ｏｆｆ速度」、ｋｄ）から、平衡解離定数（「結合定数」、ＫＤ）を計算し得る。（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。
実施例４−ＥＬＩＳＡ半定量分析におけるピリジニウム−ビオチン構築物
【０１３２】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を使用して液体サンプル中の物質（通常は、抗原）の存在を検出する分析生化学アッセイである。ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイを使用して、様々なタンパク質に対する特定のピリジニウム構築物の結合の親和性を決定し得る。
【０１３３】
最初に、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるマルチウェルプレートを目的のタンパク質（抗原）でコーティングする。所望の抗原に対する特異性を有する別の抗体タンパク質をピリジニウム−ビオチン構築物と共にインキュベートして、ピリジニウムを抗体タンパク質に非共有結合的に結合させ、ビオチンを抗体に連結（標識）する。次いで、様々な濃度でこのビオチン標識抗体をウェルに添加し、インキュベートして、抗体を抗原に特異的に結合させる。このインキュベーションおよび洗浄後、続いて、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートまたはアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（これらは、標準的なＥＬＩＳＡ試薬である）と共にプレートをインキュベートする。アビジンは、抗原に特異的に結合した抗体に連結されたビオチンに結合するであろう。続いて、未結合アビジンコンジュゲートを洗い流した後、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのための標準的なＥＬＩＳＡ基質を使用して、ＥＬＩＳＡ比色反応を発色させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取る。
【０１３４】
別のバリエーションのＥＬＩＳＡアッセイは、最初にウサギＩｇＧでプレートウェルをコーティングするものである。ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、バックグラウンドノイズを低下させるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でＩｇＧコーティングウェルをブロッキングして、ウェルの残りの表面を飽和させる。対照ウェルのセットは、上記のように、ＢＳＡのみでコーティングおよびブロッキングする。次いで、ＩｇＧでコーティングしてＢＳＡでブロッキングしたウェルを、ＰＢＳ緩衝液中でピリジニウム−ビオチン構築物と反応させる。フェムトモル範囲の漸増量のピリジニウム−ビオチン構築物を異なるウェルに添加する。ＰＢＳ緩衝液でこれらのウェルを洗浄し、ＰＢＳ中で一定量のアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応させる。次いで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって、反応の比色生成物を検出する。ＥＬＩＳＡ実験の結果は、図２０に示されている。
【０１３５】
低濃度のＩｇＧ対ＢＳＡにおけるピリジニウム構築物の希釈曲線の差異は全く異なるが、これは、ＰＢＳ緩衝液の存在下におけるＢＳＡのものと比較した場合、低濃度であってもＩｇＧの結合親和性が強いことを示している。
【０１３６】
様々な濃度のアンチカオトロピック剤の存在下でＥＬＩＳＡ実験を行って、どのタンパク質が、特定のピリジニウム構築物と最も強い疎水性相互作用を示すかを決定し得る。同様に、様々な濃度のカオトロピック剤を用いて同じアッセイを反復して、ｐＨまたは電荷などの外部摂動に対して回復力のあるタンパク質−ピリジニウム構築物ペアを同定し得る。
実施例５−抗原の検出および半定量における、抗原特異的抗体を標識するためのピリジニウム−蛍光色素構築物
【０１３７】
蛍光色素−ピリジニウム構築物を使用して、その受容体、リガンドまたは（抗体の例では）抗原に特異的に結合し得る抗体を含む生物学的分子を蛍光標識し得る。蛍光光度計または蛍光顕微鏡によって、ピリジニウム−蛍光色素によって標識された生物学的分子とそのリガンドとの間のこの結合を検出する。
【０１３８】
細胞の表面上で、または組織中でリガンドが発現されると、生物学的分子と細胞または組織との間の結合が検出され、蛍光顕微鏡を使用して半定量される。
【０１３９】
リガンドが精製分子である場合、ＥＬＩＳＡに使用されるもののようなアッセイプレートのウェルにそれを吸着させ、次いで、リガンドでコーティングされたウェル中で、ピリジニウム−蛍光色素によって標識された生物学的分子をインキュベートし得る。ウェルを洗浄して未結合物質を除去した後、蛍光光度計によって、残りの結合蛍光標識生物学的分子を測定する。
実施例６−生物学的分子の持続放出製剤を生成するための、複数コピーのピリジニウムを有するピリジニウム構築物の使用。
【０１４０】
図１ｄのようなピリジニウム構築物と、より多数の共有結合的に結合したピリジニウムを有するより大きな合成ステムとを、治療用抗原特異性を有する抗体タンパク質を含む治療用生物学的分子と共にインキュベートする。複数コピーの治療用生物学的分子を、これらの生物製剤によって複合体中に捕捉されたピリジニウム基に疎水的に非共有結合的に結合させる。これらの複合体は、非経口投与され得る製剤である。生物学的分子とピリジニウムとの結合は非共有結合的な性質であるので、これらの結合は可逆的であり、複数のピリジニウム構築物に結合した生物学的分子の注入巨大複合体が徐々に解離して、生物製剤を持続放出の様式で放出するような有用な解離速度を有するように操作され得る。小分子薬物の持続放出のための製剤は、非常に有益であることが証明されている；大きな生物学的治療用分子の同程度の持続放出製剤も適用可能であろう。
実施例７．生物学的分子を架橋するための複数コピーのピリジニウム構築物の使用。
【０１４１】
合成ステム上に２つまたはそれを超えるピリジニウム環を有する構築物を使用して、生物学的分子に非共有結合的に連結し得る。これらの実施形態における合成ステムは、比較的短い炭化水素リンカー（２つのピリジニウム分子を有する場合）または長い炭化水素（合成もしくは生物学的、例えば多糖）であり得る。タンパク質を含む２つの生物学的分子を複数コピーのピリジニウム構築物と混合すると、２つの生物学的分子が複合体化する。この複合体化は、２つの生物学的活性の連結を可能にし得る。例として、（抗体のような）目的の結合特異性を有するタンパク質と、（西洋ワサビペルオキシダーゼのような）酵素タンパク質との複合体化は、ＥＬＩＳＡのようなアッセイにおいて診断用途を有し得る。結合特異性が疾患標的に対するものであり、酵素活性が疾患に対する治療効果を有する場合、これらのアプローチは、治療的処置として機能し得る。
【０１４２】
本発明の別の実施形態は、細胞表面上の受容体を含む細胞受容体分子に対するリガンドである２つの生物学的分子を架橋するためのピリジニウム環の使用を伴う。多くの細胞活性化シグナルは、大きな分子、分子複合体または物体上のリガンドに対するそれらの結合によって架橋されている細胞表面上の１つまたはそれを超える受容体を伴う。ピリジニウム構築物によるリガンドの複合体化は、より容易に有効に細胞受容体を架橋し得るのでリガンドに対する生物学的応答を活性化し得る、これらのリガンドの形態を提供するはずである。ピリジニウム構築物を使用して、抗体製品を含む生物製剤を非共有結合的に架橋し得る。標的部位における生物製剤の輸送および放出のためのシャトルまたはデポーとして、大きなピリジニウム構築物および複合体を使用し得る。生物製剤を多価実体に変換し、それを標的または受容体の細胞表面に架橋させることによって活性を増強するために、小さなピリジニウム構築物を使用し得る。
実施例８．表面をコーティングするためのピリジニウム構築物の使用。
【０１４３】
本発明の一実施形態では、ピリジニウム構築物は、異なる用途のために、目的の表面に結合する合成ステムを有する。表面に対するステムのこの結合は、共有結合または非共有結合のいずれかによるものであり得る。表面に対するステムの結合は、ピリジニウム分子で表面をコーティングし、続いて、ピリジニウム分子は、生物学的分子で処理され、非共有結合的な疎水性結合によって生物学的分子に結合し得る。生物学的分子に対するピリジニウムのこの結合は、それらの生物学的分子で表面をコーティングする。このコーティングプロセスは、診断薬、工業用コーティング、および医療用インプラントのコーティングを含む広範囲の用途を提供する。
実施例９−薬物の標的送達における、抗体を含む生物学的分子に対する小分子薬物の会合のためのピリジニウム−薬物構築物の使用。
【０１４４】
小分子薬物をピリジニウムに共有結合的に連結すること（芳香環中の窒素を介して可能である）によって、薬物−ピリジニウム構築物を合成し得る。この薬物−ピリジニウム構築物は、治療目的の結合特異性を有する抗体タンパク質を含む生物学的分子に非共有結合的に疎水的に結合し得る。例えば、薬物−ピリジニウム構築物中の薬物は、腫瘍の細胞傷害性薬物、および目的の腫瘍抗原に対する特異性を有する抗体であり得る。この実施形態では、毒性薬物−ピリジニウム構築物は、腫瘍特異的抗体に非共有結合的に結合され、薬物−ピリジニウム−抗体のこの三元複合体は、治療的に投与されるであろう。非経口投与により、抗体は、処置患者における腫瘍によって発現されている腫瘍抗原に特異的に結合するまで全身循環する。腫瘍に対する抗体の結合は、小分子薬物を抗体分子に共有結合的に連結する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のように、細胞傷害性薬物を腫瘍に特異的に送達するであろう。しかしながら、ＡＤＣは、ＡＤＣ製品が腫瘍細胞によって内在化されるにつれてリンカーが加水分解され得るように、薬物を抗体に付着する共有結合リンカーを操作することを必要とする。薬物が細胞傷害性であるためには薬物が抗体から放出されなければならず、薬物が共有結合的に結合していることから、放出を促進するためにリンカーの放出に加水分解が必要であるので、これは必須要件である。本発明によれば、薬物−ピリジニウム構築物は、抗体に非共有結合的に結合しているので、加水分解なしにそれらの抗体から放出される。したがって、本発明のこの態様は、標準のＡＤＣ製品に対する大きな利点を提供する。
実施例１０．生物学的分子のＰＥＧ化。
【０１４５】
生物学的分子のＰＥＧ化は、ネイティブな非ＰＥＧ化形態の同じ生物学的分子と比較して、動物およびヒトに注射した場合により長い半減期およびより低い免疫原性を媒介することが証明されている。生物学的分子のＰＥＧ化は、典型的には、タンパク質を含む生物学的分子へのＰＥＧの化学的共有結合的コンジュゲーションを必要としていた。本発明の一実施形態では、より長い半減期および／または減少した免疫原性を付与する部分、例えばＰＥＧを、複素環式化合物（この例は、ピリジニウム環系である）に共有結合的に連結する。次いで、ＰＥＧ−ピリジニウム複合体を生物学的分子と非共有結合的に会合させ、それにより、より長い半減期および／または減少した免疫原性を生物製剤に付与する。本発明によれば、単一コピーまたは複数コピーのピリジニウムを有するピリジニウム構築物を合成ステム（これはＰＥＧであるか、またはＰＥＧを含有する）に共有結合的に連結し、次いで、ステムが生物学的分子と相互作用して、ＰＥＧが生物学的分子と非共有結合的に会合したＰＥＧ化生物学的分子を形成する。これらのＰＥＧ含有構築物中のピリジニウムは、生物学的分子に疎水的に結合し、それにより、ＰＥＧを生物学的分子に会合させるであろう。ピリジニウム構築物によってＰＥＧ化された生物学的分子は、動物およびヒトに投与された場合に、より長い半減期を有し、より低い免疫原性であろう。
実施例１１．クロマトグラフィーのためのピリジニウムの使用。
【０１４６】
合成ステムがクロマトグラフィーマトリックスであり得るか、またはクロマトグラフィーマトリックスに共有結合的に付着された分子リンカーであり得るクロマトグラフィー媒体のために、複素環式化合物、例えばピリジニウムを使用し得る。これらのマトリックスとしては、（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのように）アガロース、（Ｓｅｐｈａｄｅｘのように）デキストラン、セルロースおよびシリカが挙げられる。クロマトグラフィーマトリックスは、ピリジニウムまたは他の水混和性複素環式化合物がマトリックスに付着され得るが、水性緩衝液中で相互作用し得る固体構造物を提供する。クロマトグラフィーを通過する水溶性生物学的分子は、それらの疎水性ドメインを介してピリジニウム基と相互作用し、これらの生物学的分子をクロマトグラフィー媒体に非共有結合的に結合するであろう。
【０１４７】
続いて、これらの結合生物学的分子（この例では、生物学的受容体）を使用して、抗体と抗原との間のような特異的受容体リガンド相互作用によって、他の水溶性生物学的リガンドと相互作用する。これらの用途では、アルブミンのような非特異的生物学的分子遮断薬を使用して、クロマトグラフィーを処理して、リガンドとの遊離ピリジニウムの結合を遮断し得る。受容体−リガンド相互作用（これは、静電的な性質であることが多い）の結合後、受容体−リガンド結合の静電相互作用を破壊するが、受容体へのピリジニウムの疎水性結合に影響を及ぼさないアンチカオトロピック剤を使用して、クロマトグラフィー媒体からリガンドを溶出させる。
【０１４８】
あるいは、クロマトグラフィーマトリックス上のピリジニウムへの生物学的分子の結合後、疎水性相互作用を破壊するカオトロピック剤を使用して、結合した生物学的分子を溶出させ得る。カオトロピック剤としては、
・ブタノール
・エタノール
・塩化グアニジニウムを含むグアニジニウム塩、
・過塩素酸リチウム
・酢酸リチウム
・塩化マグネシウム
・フェノール
・プロパノール
・ドデシル硫酸ナトリウム
・チオ尿素
・尿素
が挙げられる。
実施例１２−マイクロスケール熱泳動を使用した、ピリジニウム構築物の結合の定量分析
【０１４９】
Ｎａｎｏ  Ｔｅｍｐｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｏｎｏｌｉｔｈ／）によって開発されたＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５システムを使用して、高分子とのピリジニウム構築物の結合親和性を測定した。Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５機器は、温度勾配を経時的に適用しながら、蛍光標識または固有蛍光サンプルと高分子などの結合パートナーとの間の相互作用の強度を測定する。単独の場合の、および漸増濃度の結合パートナーの存在下における熱勾配下の蛍光標識構築物の分子運動性を比較する。この後、リガンドの濃度に対して正規化蛍光をプロットする当てはめ曲線から結合親和性（Ｋｄ）を計算する。
【０１５０】
この実験を行って、ＰＢＳ緩衝液および生理食塩水の存在下で、漸増濃度の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）とのフルオレセイン含有ピリジニウム構築物の結合親和性を測定した。２つの異なる溶液（ＰＢＳおよび生理食塩水）中の漸増ＩｇＧ濃度における結合親和性曲線の結果は、図１６に示されている。
【０１５１】
１２．５μＭ〜３５０ｐＭの濃度範囲でＩｇＧタンパク質を試験し、ピリジニウム−フルオレセイン構築物は５００ｎＭの濃度であった。同様に、ＨＳＡを伴う実験では、ＨＳＡタンパク質は１２５μＭ〜３．５ｎＭの濃度範囲であり、ピリジニウム−フルオレセイン構築物は５００ｎＭの濃度であった。
【０１５２】
しかし、驚くべきことに、両溶液中のＩｇＧに結合したピリジニウム−フルオレセイン構築物は、異なる結合親和性を有していた。ＰＢＳ中のＩｇＧに対するピリジニウム−フルオレセイン構築物の結合親和性（Ｋｄ）は２０ｎｍであったのに対して、生理食塩水中のＩｇＧに対するピリジニウム−フルオレセイン構築物のＫｄは１．５μＭであった。
【０１５３】
理論に縛られるものではないが、結合親和性の差異は、ピリジニウム構築物と高分子との間の相互作用の性質の差異に主に起因すると想定される。ＰＢＳの存在下では、構築物と高分子との間の相互作用の性質は、主に疎水的な性質であるのに対して、構築物と高分子との間の相互作用の性質は、主に静電的な性質である。
【０１５４】
同様の条件下で、ＩｇＧの代わりにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて、実験を反復した。２つの異なる溶液（ＰＢＳおよび生理食塩水）中の漸増ＨＳＡ濃度における結合親和性曲線の結果は、図１７に示されている。結果により、ＨＳＡに対するピリジニウム構築物の結合親和性は、驚くべきことに、生理食塩溶液下におけるＩｇＧのものと同程度であることが示された。しかしながら、興味深いことに、ＨＳＡに対するピリジニウム構築物の結合親和性は、ＰＢＳ溶液下におけるＩｇＧのものよりもはるかに低かった。
【０１５５】
図１８は、生理食塩溶液下におけるＩｇＧおよびＨＳとのピリジニウム構築物の比較結合親和性曲線を示す。図１９は、ＰＢＳ溶液下におけるＩｇＧおよびＨＳＡとのピリジニウム構築物の比較結合親和性曲線を示す。
【０１５６】
理論に縛られるものではないが、生理食塩水条件下では、ＨＳＡおよびＩｇＧに対するピリジニウム構築物の結合親和性は、同様の静電結合電位に起因して同様であると想定される。ＨＳＡのｐＩは５．６であり、ＩｇＧのｐＩは６．５であり、生理食塩溶液中の生理学的条件下では、両タンパク質は負に荷電しているのに対して、ピリジニウム構築物は正に荷電している。したがって、両タンパク質に対する見掛けの静電結合は、ほぼ同じ親和性である。
【０１５７】
しかしながら、ＰＢＳ溶液の場合、結合親和性は、主に疎水的な性質である。データは、ＰＢＳ下では、ピリジニウム構築物の疎水性相互作用がＩｇＧでより高いことを示している。これは、ピリジニウム構築物とＩｇＧのタンパク質残基との間に強いπ−π相互作用があることを意味している。免疫グロブリンベースの生物薬物を利用して疾患を処置する特定の医薬用途では、ＩｇＧに対するピリジニウム構築物の高い結合親和性が望ましいであろう。１つの適用可能性は、ピリジニウム構築物を使用して２分子のＩｇＧを連結して活性を増加させること、またはピリジニウム構築物を介して化学毒性薬物をＩｇＧに付着させてそれらの活性を増強することであり得る。
実施例１３−デキストラン−ピリジニウム構築物の合成
【０１５８】
以下の実施例は、図２１および２２に示されているように、複素環式ピリジニウム環、合成ステムおよびデキストランを含む化学合成物の生産において利用される合成プロセスを詳述する。当業者であれば、当技術分野における知識を使用して、この合成プロセスを場合により改変して、複数の複素環式環および複数の炭水化物部分を含む化学製剤を生産し得ることを理解するだろう。
【０１５９】
デキストラン−ピリジニウム構築物の合成を２段階で行う。第１段階は、デキストランの過ヨウ素酸塩での酸化と、ピリジニウムアミンによる酸化デキストランの還元的アミノ化とを伴い、その結果、デキストラン−ピリジニウム構築物が形成される。約１ＫＤａ〜約５００，０００ＫＤａ、好ましくは約１０ＫＤａ〜約１００，０００ＫＤａ、より好ましくは約５ＫＤａ〜約１００ＫＤａの範囲の異なる分子量のデキストランを用いて、プロセスを反復し得る。過ヨウ素酸塩の濃度を変更することによって、デキストランにおける酸化量を変化させ得る。デキストランにおける酸化は、約５％〜約１００％酸化、好ましくは約５％〜約５０％酸化、より好ましくは約５％〜約２５％酸化の範囲であり得る。また、ピリジニウムアミンの濃度を変更することによって、デキストラン構築物に組み込まれるピリジニウム環の量を変化させ得る。デキストランにおけるピリジニウム組み込みは、約１％〜約１００％、好ましくは約５％〜約５０％、より好ましくは約５％〜約２５％ピリジニウム組み込みの範囲であり得る。
【０１６０】
図２１に示されているデキストランの過ヨウ素酸塩での酸化の第１段階を以下のように行う。様々な濃度の２ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液でデキストランの水溶液（６ｋＤａ；約３３残基；７ｍＬ中１ｇまたは約１５重量／体積％；約２３ｍｍｏｌ）を酸化して、室温で５％、１０％および２０％の理論酸化を得た。４時間後、反応を停止させた。得られた溶液を水に対して３日間透析し、次いで、Ｊ  Ｍａｉａら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ４６（２００５），９６０４−９６１４（この内容は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる）に記載されているように凍結乾燥した。
【０１６１】
図２２に示されている酸化デキストランおよびピリジニウムアミンによる還元的アミノ化の第２段階を以下のように行う。例示的な実施例は５％酸化デキストランを使用するが、このプロセスは、他の範囲の酸化デキストランおよび様々な分子量のデキストランの場合にも等しく適用可能であるので、本発明を限定すると決して解釈されるべきではない。
【０１６２】
５０ｍｇの５％酸化６ｋＤａデキストラン（約２７０ｍｍｏｌ）を１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで、６０ｍｇ（約２９０ｍＭ；１：１当量）のピリジニウムを溶液に添加した。複数の氷酢酸でそれをフォローアップして、溶液を酸性化した。イミンの形成を促進するために、反応物を室温で２時間撹拌した。イミンの形成後、１００ｍｇのトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（約４７０ｍｍｏｌ、１．７当量）を添加した。反応物を一晩撹拌し、Ａｂｄｅｌ−Ｍａｇｉｄ，Ｋ．Ｇ  Ｃａｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ａ  Ｍａｒｙａｎｏｆｆ，Ｒ．Ｄ  Ｓｈａｈ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，３８４９−３８６２（この内容は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる）に記載されているように水中で一晩透析して、完全な反応物を精製した。
【０１６３】
このようにして生産されたデキストラン−ピリジニウム構築物は、抗体または生物製剤と複合体を形成する能力を有し、抗体または生物製剤を経時的に放出し得、それにより、持続放出製剤として機能し得る。
実施例１４−ピリジニウム構築物とペプチドとの結合の定量分析
【０１６４】
この実施例は、ビオチンを含有するピリジニウム構築物とペプチドとの間の相互作用を例証する。ペプチドの非限定的な例としては、限定されないが、バソプレッシン、ブラジキニン、コリベリン（colivellin）、メリチン、ニューロメジン、ニューロテンシンなどが挙げられる。実施例１に記載されているように、ビオチンを含有するピリジニウム構築物およびフルオレセインを含有するピリジニウム構築物を合成および精製する。
【０１６５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、実施例３に記載されているように、ペプチドに対するビオチン含有ピリジニウム構築物の結合を定量し得る。簡潔に言えば、マイクロフローシステムを介して、目的のペプチド（０．００１〜１０ｕｇ／ｍｌ）を含む溶液をピリジニウム構築物被膜センサーチップ表面上に注入する。ペプチドがピリジニウム構築物に結合するにつれて、ＳＰＲシグナル（応答単位ＲＵで表される）の増加が観察される。所望の会合時間の後、ペプチドを含まない溶液（通常は、アンチカオトロピック剤を含有する緩衝液）をマイクロフルイディクス上に注入して、ピリジニウム構築物とペプチドとの間の結合複合体の解離を可能にする。ピリジニウム構築物とペプチドリガンドとの間の複合体の解離は、ＳＰＲシグナルの減少をもたらすであろう（応答単位ＲＵで表される）。これらの会合速度（「ｏｎ速度」、ｋａ）および解離速度（「ｏｆｆ速度」、ｋｄ）から、平衡解離定数（「結合定数」、ＫＤ）を計算し得る。（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）
【０１６６】
理論に縛られるものではないが、ＰＢＳなどの適切な緩衝液条件下では、図８に例示されているピリジニウム構築物および他の複素環式構築物は、ペプチド残基と疎水性相互作用を主に形成すると想定される。ペプチド実体の等電点に関連するｐＨの変化により、分子がより極性になると、複素環式環系とペプチドとの間の相互作用は主に静電的になると予想される。
【０１６７】
実施例２および１２に記載されているように、マイクロスケール熱泳動技術を用いることによって、蛍光ピリジニウム構築物およびペプチドを使用して、結合分析も実施し得る。
実施例１５−ピリジニウム構築物と核酸との結合の定量分析
【０１６８】
この実施例は、ビオチンを含有するピリジニウム構築物と核酸との間の相互作用を例証する。核酸の非限定的な例としては、限定されないが、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖オリゴヌクレオチド、プラスミド、二本鎖ヌクレオチド、ヘアピンループ構造、および３’または５’オーバーハングを有するヌクレオチド二重鎖が挙げられる。実施例１に記載されているように、ビオチンを含有するピリジニウム構築物およびフルオレセインを含有するピリジニウム構築物を合成および精製する。
【０１６９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、実施例３に記載されているように、核酸に対するビオチン含有ピリジニウム構築物の結合を定量し得る。簡潔に言えば、マイクロフローシステムを介して、目的の核酸（０．００１〜１０ｕｇ／ｍｌ）を含む溶液をピリジニウム構築物被膜センサーチップ表面上に注入する。核酸がピリジニウム構築物に結合するにつれて、ＳＰＲシグナル（応答単位ＲＵで表される）の増加が観察される。所望の会合時間の後、核酸を含まない溶液（通常は、アンチカオトロピック剤を含有する緩衝液）をマイクロフルイディクス上に注入して、ピリジニウム構築物と核酸との間の結合複合体の解離を可能にする。ピリジニウム構築物と核酸リガンドとの間の複合体の解離は、ＳＰＲシグナルの減少をもたらすであろう（応答単位ＲＵで表される）。これらの会合速度（「ｏｎ速度」、ｋａ）および解離速度（「ｏｆｆ速度」、ｋｄ）から、平衡解離定数（「結合定数」、ＫＤ）を計算し得る。（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）
【０１７０】
理論に縛られるものではないが、ＰＢＳなどの適切な緩衝液条件下では、図８に例示されているピリジニウム構築物および他の複素環式構築物は、π−πスタッキング相互作用によって作り出される疎水性ポケットの塩基間にインターカレートすることによって、核酸と疎水性相互作用を主に形成すると想定される。ｐＨの変化により、核酸がより極性になると、複素環式環系と核酸との間の相互作用は主に静電的になると予想される。
【０１７１】
実施例２および１２に記載されているように、マイクロスケール熱泳動技術を用いることによって、蛍光ピリジニウム構築物および核酸を使用して、結合分析も実施し得る。
他の実施形態
【０１７２】
上記説明から、本明細書に記載される本発明に対して変形および改変を行って、ピリジニウム以外の他の複素環式構造および複素環式芳香族構造の使用を含む様々な利用および条件にそれを採用し得ることは明らかであろう。このような実施形態も添付の特許請求の範囲内である。
【０１７３】
本明細書の変数の任意の定義における要素のリストに関する記載は、列挙されている要素の任意の単一の要素または組み合わせ（または下位の組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書の実施形態に関する記載は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせたその実施形態を含む。
【０１７４】
本明細書で言及されている刊行物および特許出願はすべて、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示すものである。刊行物および特許出願はすべて、個々の各刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
（項目１）
複素環式環、合成ステムおよび生物学的分子を含む合成物であって、該複素環式環が（ａ）該合成ステムに共有結合的に連結されており、（ｂ）該生物学的分子と非共有結合的に会合している、合成物。
（項目２）
前記非共有結合的会合が、アンチカオトロピック塩への曝露時に安定である、項目１に記載の合成物。
（項目３）
前記非共有結合的会合が疎水性相互作用を含む、項目２に記載の合成物。
（項目４）
前記疎水性相互作用が、π相互作用、π−π相互作用およびπスタッキング相互作用からなる群より選択される、項目３に記載の合成物。
（項目５）
前記合成ステムが置換炭化水素または非置換炭化水素を含む、項目１に記載の合成物。
（項目６）
前記合成ステムが小分子薬物を含む、項目１に記載の合成物。
（項目７）
前記合成ステムがＰＥＧを含む、項目１に記載の合成物。
（項目８）
前記複素環式環が複素環式芳香族第４級アミンを含む、項目１に記載の合成物。
（項目９）
前記複素環式環が水混和性である、項目１に記載の合成物。
（項目１０）
前記複素環式環がピリジニウム環を含む、項目８に記載の合成物。
（項目１１）
前記複素環式環が約３〜約１０のｐＨ範囲にわたって正に荷電している、項目９に記載の合成物。
（項目１２）
前記生物学的分子が、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡリガンドからなる群より選択される、項目１に記載の合成物。
（項目１３）
１コピーを超える前記複素環式環が前記合成ステムに共有結合的に連結されている、項目１に記載の合成物。
（項目１４）
前記複素環式環が前記合成ステムに共有結合的に連結されており、同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合しており、複数コピーの該生物学的分子が同じ合成ステムに連結されている、項目１２に記載の合成物。
（項目１５）
前記合成ステムが非水相中で分子と共有結合的または非共有結合的に会合しており、前記複素環式環が水相中で同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合している、項目１３に記載の合成物。
（項目１６）
前記非共有結合的会合が、生理学的条件下で可逆的または部分的に可逆的である、項目１２に記載の合成物。
（項目１７）
前記合成ステムが前記小分子薬物に共有結合的に付着されており、前記複素環式環が同じまたは異なる生物学的分子と非共有結合的に会合している、項目１２に記載の合成物。
（項目１８）
前記合成ステムが小分子薬物または高分子薬物に共有結合的に連結されており、前記複素環式環が前記生物学的分子に非共有結合的に会合しており、前記生物学的分子が同じ種類のものであるか、または互いに異なるものである、項目１２に記載の合成物。
（項目１９）
前記小分子が、腫瘍学もしくは免疫学またはその両方の疾患を処置するために使用される、項目６に記載の合成物。
（項目２０）
前記小分子が、感染症もしくは炎症またはその両方の疾患を処置するために使用される、項目６に記載の合成物。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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