(57)【要約】  本発明は、凝固因子に対する蛍光発生基質であって、蛍光染料を含む蛍光発生基質及び蛍光発生基質と接合された消光剤を含む血液サンプル中の凝固因子を検出するためのバイオセンサーに係り、前記バイオセンサーは、全血または血漿を含む血液サンプル中の凝固因子を迅速且つ正確に検出し、これによって抗凝固剤の任意の逆転効果を最小化したり、除去するのに有用なバイオセンサーを開示する。
2019532301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固因子に対する蛍光発生基質であって、蛍光染料を含む蛍光発生基質；及び
前記蛍光発生基質と接合された消光剤；
を含む、血液サンプル中の凝固因子を検出するためのバイオセンサー。
【請求項２】
前記凝固因子は、
凝固因子ＩＩａまたはＸａである請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記血液サンプルは、血漿または全血である請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記血液サンプルは、１倍ないし１，０００倍希釈された血漿または全血である請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記蛍光染料は、
２−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｎ−メチル−アントラニロイル（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル（ダンシル）、５−[（２−アミノエチル）アミノ]ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセテート（ＤＭＡＣＡ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（ＭＣＡ）、ローダミン、ローダミン１０１、ローダミン１１０及びレソルフィンからなる群から選択された少なくともいずれか一つである請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記蛍光染料が、
前記凝固因子と前記蛍光発生基質の間の加水分解反応によって前記蛍光発生基質から解離されるか、または前記蛍光染料が１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光（Ｏｘａｌｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＯＤＩ−ＣＬ）試薬から形成された高エネルギー中間体と相互作用する時発光することを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬は、ＯＤＩ及びＨ２Ｏ２を含む請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記消光剤は、
２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）エチレンジアミン（ＥＤＤｎｐ）、４−ニトロ−フェニルアラニン、３−ニトロ−チロシン、パラ−ニトロアニリン（ｐＮａ）、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル（ＤＡＢＣＹＬ）及び７−ニトロ−ベンゾ[２，１，３]オキサジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）からなる群から選択された少なくともいずれか一つである請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオセンサーを緩衝剤中の凝固因子を含む血液サンプルと混合して反応させる段階；
１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬を前記反応された混合物に添加する段階；及び
ＣＬ強度を測定する段階；
を含む凝固因子を検出する方法。
【請求項１０】
室温（２１±２℃）または３７℃でバイオセンサー内での前記血液サンプルと蛍光発生基質の間の反応時間が１０秒ないし１２０分であることを特徴とする請求項９に記載の凝固因子を検出する方法。
【請求項１１】
ＣＬ強度の測定がＯＤＩ−ＣＬ試薬を添加した後、１ないし１０秒間実施される請求項９に記載の凝固因子を検出する方法。
【請求項１２】
前記凝固因子が凝固因子ＩＩａまたはＸａであることを特徴とする請求項９に記載の凝固因子を検出する方法。
【請求項１３】
前記血液サンプルは、
血漿または全血であることを特徴とする請求項９に記載の凝固因子を検出する方法。
【請求項１４】
前記緩衝剤がＰＢＳＴ、ＰＢＳ、ＴＢＳＴ及びＴＢＳからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の凝固因子を検出する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のバイオセンサーを緩衝剤中の凝固因子を含む血液サンプルと混合して反応させる段階；
１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬を前記反応された混合物に添加する段階；
ＣＬ強度を測定する段階；及び
ＣＬ強度を標準強度と比べる段階
を含む血液サンプル中の凝固因子を定量する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のバイオセンサー；及び
容器；
を含む血液サンプル中の凝固因子を定量するためのキット。
【請求項１７】
緩衝剤；及び
１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬；
をさらに含む請求項１６に記載の血液サンプル中の凝固因子を定量するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短時間で血液サンプルの中から血液凝固因子を検出するための化学発光バイオセンサー、凝固因子をモニタリングする方法、血液サンプル中の凝固因子を定量する方法、及び血液サンプル中の凝固因子を定量するためのキットに関する。本バイオセンは、凝固因子に対する蛍光発生基質（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であって、蛍光染料を含む蛍光発生基質及び前記蛍光発生基質と接合された消光剤を含み、凝固因子を迅速且つ正確に検出できる血液凝固因子検出のためのバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な凝固、つまり、血液凝塊を形成する過程は、この過程が出血を停止させて傷が癒されるようにするので、出血を伴う傷害において非常に重要である。しかし、血液は体内を移動する間は凝固されてはならないが、その理由は、凝固が凝固亢進状態または血栓形成傾向を起こすことがあるためである。血流を通して移動できる静脈または静脈系の血液凝塊は、深部静脈血栓症または肺塞栓症を誘発することがある。また、動脈の血液凝塊は、主要臓器に向かう血液の流れを妨げることがある。よって、動脈血栓症は、心臓麻痺、脳卒中、重度足痛症、歩行困難及び四肢欠損のような、いくつかの重度病態を招くことがある。
【０００３】
出血、血栓症及び脳卒中を予防するために、多様な種類の抗凝固剤が開発された。特に、抗凝固剤は数多くの心血管病態の予防及び治療用製剤として広く使われている。抗凝固剤は、図１ａで示す凝固因子（例えば、ＩＩａ、Ｘａ）の活性（濃度）を剤御するために開発された。これは、適切な抗凝固剤を用いて因子ＩＩａまたは因子Ｘａの活性を減少させることで出血、血栓症及び脳卒中を予防できるためである。最近、本発明者らは、ワーファリン、フェンプロクモン、Ｃｏｕｍａｄｉｎ及びヘパリンのような従来の抗凝固剤の代りに径口用抗凝固剤（ＤＯＡＣ）の使用増加を関心をもって注目した。現在、因子Ｘａを抑えるＤＯＡＣ（例：リバーロキサバン、アピキサバン、エジキサバン）及び因子ＩＩａを抑えるＤＯＡＣ（ｄＰ：ダビガトラン）が広く使われている。
【０００４】
抗凝固剤は、急性または慢性血栓塞栓症を予防または治療することができる。しかし、過度な出血のような抗凝固剤の逆転効果（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）は、臓器の間の衰弱性疾患を誘発するか、命を脅かすこともある。一般に、抗凝固剤の逆転効果は、即時、または数時間内で発生することがある。抗凝固剤の効果を正確に検出する最も優れた方法は、患者が抗凝固剤を取った後も活性を維持する特定凝固因子（例えば、因子ＩＩａ及びＸａ）の迅速な定量である。残念なことに、短時間（数分（ｍｉｎｕｔｅ））内で血液凝固因子を直接定量することができる分析方法は、まだ利用できない。
【０００５】
代替方法として試験管条件で凝固時間を測定するために利用できる国際標準比（ＩＮＲ）は、因子ＩＩａ抗凝固剤の効果を研究するために広く使われている。しかし、ＩＮＲ値は、患者の疾患に頼るため、ＩＮＲを利用してＩＩａ抗凝固剤の逆転効果は予測し難い。例えば、人工心臓弁膜を持つ患者から決められたＩＮＲ値は、予測ＩＮＲ標的範囲より低い。
【０００６】
最近、２種のＤＮＡアプタマーを使う複数の高感度バイオセンサーが因子ＩＩａを定量するために開発された。しかし、ＤＮＡアプタマーは、ヒト由来サンプル（例えば、血漿、全血）中、因子ＩＩａに速かに結合することができないため、このようなバイオセンサーは、因子ＩＩａ抗凝固剤の逆転効果を正確、且つ迅速に予測するために適用することができない。ＤＮＡアプタマーと因子ＩＩａ間の結合速度を増進させるため、ヒト由来サンプルは、適切な緩衝剤で１００倍ないし１０，０００倍で希釈された。また、バイオセンサーを用いて因子ＩＩａを定量するためには、何回もの恒温培養と洗浄が必要となる。よって、このようなバイオセンサーは、抗凝固剤の逆転効果を迅速に検出するのには使用できない。
【０００７】
ＩＮＲ及び部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、因子Ｘａ抗凝固剤の評価に適しない。しかし、因子Ｘａ抗凝固剤に結合する２種のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ酵素免疫測定法は、因子Ｘａ抗凝固剤の効果を研究するために使われてもよい。しかし、時間消耗的なサンドイッチ酵素免疫測定法を利用して因子Ｘａ抗凝固剤の逆転効果を速かに予測することは依然として難しい。
【０００８】
体内で酵素として作用するプロテアーゼは、特異的内因性ペプチドとタンパク質のアミノ酸側鎖に結合してこのような特異的内因性ペプチドとタンパク質を認識して加水分解することができる。特異的内因性ペプチド及びタンパク質は、特異的酵素と反応することができる基質である。加水分解反応を使用して、ヒトの疾患を早期診断するために適用されるバイオマーカーである特異的プロテアーゼの定量及び検出のために、吸光度及び蛍光検出を利用した様々な種類のバイオセンサーが開発された。図１ｂは、吸光度または蛍光を測定するためのプロテアーゼと、発色団または蛍光染料と接合された基質間の反応の基本概念を示す。プロテアーゼ濃度の増加とともに、吸光度または蛍光強度は増加する。血液凝固因子ＩＩａ及びＸａは、プロテアーゼタンパク質として知られている。よって、凝固因子ＩＩａまたはＸａと反応きる多様な基質が開発された。また、これら凝固因子ＩＩａまたはＸａを定量するために、ＵＶ−可視吸光度または蛍光検出を用いた複数のバイオセンサーが開発された。残念ながら、このようなバイオセンサーは、ヒト由来サンプルに含まれた血液凝固因子ＩＩａまたはＸａを定量するに必要な時間が長すぎるため、短時間（数分（ｍｉｎｕｔｅ））内でＩＩａまたはＸａ凝固剤の逆転効果を検出するには適切ではない。
【０００９】
図１ｃに図示された反応機構から生成される１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬが吸光度及び蛍光検出より１０倍ないし１０００倍感度が高いことは知られてきた。また、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの動的範囲は、吸光度または蛍光検出を用いることよりずっと広い。図１ｃで図示された発光団は、図１ｄで図示されたように、高エネルギー中間体からエネルギーを収容し、明るくて迅速な発光を放出できる蛍光染料である。
【００１０】
しかし、任意の有害な逆転作用を最小化したり、除去するために数分以内に血液サンプル中の凝固因子ＩＩａ、Ｘａを検出／定量する高感度バイオセンサーはまだ開発されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、血液の凝固因子を検出するためのもので、血液内の凝固因子と反応する蛍光発生基質とこれらに接合された消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含んで血液サンプル中の凝固因子を検出するためのバイオセンサーが提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一側面によれば、凝固因子に対する蛍光発生基質として、蛍光染料を含む蛍光発生基質；及び前記蛍光発生基質と接合された消光剤を含む、血液サンプル中の凝固因子を検出するためのバイオセンサーが提供される。凝固因子は、凝固因子ＩＩａまたはＸａであってもよく、血液サンプルは血漿または全血である。血液サンプルは、１倍ないし１，０００倍希釈された血漿または全血であってもよい。蛍光染料は、２−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｎ−メチル−アントラニロイル（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル（ダンシル）、５−[（２−アミノエチル）アミノ]ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセテート（ＤＭＡＣＡ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（ＭＣＡ）、ローダミン、ローダミン１０１、ローダミン１１０及びレソルフィンからなる群から選択された少なくとも一つであってもよい。蛍光染料は、蛍光染料が凝固因子と蛍光発生基質の間の加水分解反応によって蛍光発生基質から解離される時、及び蛍光染料が１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬から形成された高エネルギー中間体と相互作用する時発光することがある。１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬は、ＯＤＩ及びＨ２Ｏ２を含むことができる。消光剤は、２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）エチレンジアミン（ＥＤＤｎｐ）、４−ニトロ−フェニルアラニン、３−ニトロ−チロシン、パラ−ニトロアニリン（ｐＮａ）、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル（ＤＡＢＣＹＬ）及び７−ニトロ−ベンゾ[２，１，３]オキサジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）からなる群から選択された少なくとも一つである。
【００１３】
本発明のまた別の側面によれば、血液サンプル中の凝固因子を検出する方法は、バイオセンサーを緩衝剤中で凝固因子を含む血液サンプルと混合して反応させる段階；１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬を前記反応された混合物に添加する段階；及びＣＬ強度を測定する段階。室温（２１±２℃）または３７℃でのバイオセンサーで血液サンプルと蛍光発生基質間の反応時間は、１０秒ないし１２０分であってもよい。ＣＬ強度の測定は、ＯＤＩ−ＣＬ試薬を添加した後、１秒ないし１０秒間実施することができる。凝固因子は、凝固因子ＩＩａまたはＸａであってもよく、血液サンプルは、血漿または全血であってもよい。緩衝剤は、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ８．５−０．１  Ｔｗｅｅｎ２０）及びＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ８．５）からなる群から選択されてもよい。
【００１４】
本発明の別の側面において、血液サンプル中の凝固因子を定量する方法は次を含む：バイオセンサーを緩衝剤中の凝固因子を含む血液サンプルと混合して反応させる段階；１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬を前記反応された混合物に添加する段階；ＣＬ強度を測定する段階；及びＣＬ強度を標準強度と比べる段階。
【００１５】
本発明のまた別の側面において、血液サンプル中の凝固因子を定量するためのキットは次を含む：バイオセンサー及び容器。キットは、緩衝剤；及び１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００１６】
前記構成を有する本発明によるバイオセンサーは、次のような効果がある。
【００１７】
血液サンプルに含まれた凝固因子に対する発光基質として蛍光染料を含む蛍光発生基質、及びこれと接合した消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を備えて数分内に血液サンプル中の凝固因子（例えば、ＩＩａ、Ｘａ）を検出／定量することができるメリットがある。
【００１８】
バイオセンサーは、全血または血漿を含む血液サンプル中の凝固因子を迅速且つ正確に検出し、これによって抗凝固剤の任意の逆転効果を最小化したり、除去するために有用なメリットがある。
【００１９】
本発明の効果は、以上で言及した効果に剤限されず、言及されていないまた別の効果は、請求範囲の記載から当業者にとって明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】血液凝固カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）でのＸａ及びＩＩａの機能を示す図面；
【図１ｂ】プロテアーゼと発色団、または蛍光染料と接合された基質間の加水分解反応に対するダイヤグラム；
【図１ｃ】１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬの反応機構を示し、ここでＬは基底状態下の発光団であり、Ｌ*は、励起状態下の発光団である図面；
【図１ｄ】迅速なＯＤＩ−ＣＬスペクトルを図示するグラフ；
【図２ａ】凝固因子ＩＩａ（５ｎＭ）または凝固因子Ｘａ（５ｎＭ）の不在及び存在下の相対的ＣＬ強度を示すグラフ；
【図２ｂ】血漿中の因子ＩＩａ及び因子Ｘａのようなバイオマーカーの不在下の化学発光共鳴エネルギー伝達（ＣＲＥＴ）を示す図面；
【図２ｃ】蛍光発生基質及びプロテアーゼ酵素の存在下におけるＯＤＩ−ＣＬ反応を示す図面；
【図２ｄ】蛍光発生基質と凝固因子ＩＩａまたはＸａ間の加水分解反応を示す図面；
【図２ｅ】蛍光発生基質と凝固因子（例えば、ＩＩａ、Ｘａ）間の加水分解反応によって形成された蛍光染料（例：ＡＭＣ）の存在下におけるＯＤＩ−ＣＬ反応を示す図面；
【図３ａ】ＰＢＳ中の特異的基質接合されたＡＭＣを利用した凝固因子ＩＩａの存在下の血漿の効果を示すグラフ；
【図３ｂ】ＰＢＳ中の特異的基質接合されたＡＭＣを利用した凝固因子Ｘａの存在下の血漿の効果を示すグラフ；。
【図３ｃ】１０％ヒト血漿中の凝固因子ＩＩａ（６．８ｎＭ）の定量のための緩衝剤の選択を示すグラフ；。
【図３ｄ】１０％ヒト血漿中の凝固因子Ｘａ（１０ｎＭ）の定量のための緩衝剤の選択を示すグラフ；
【図４ａ】ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用した迅速バイオセンサーを用いる凝固因子ＩＩａの定量のための校正曲線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を示すグラフ；
【図４ｂ】ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用した迅速バイオセンサーを用いる凝固因子Ｘａの定量のための校正曲線を示すグラフ；
【図４ｃ】ヒト血漿中の凝固因子ＩＩａの定量のためのＯＤＩ−ＣＬと蛍光検出との間の相関関係（Ｎ＝１０）を示すグラフ（各値の誤差範囲は、４％ないし７％）；
【図４ｄ】ヒト血漿中の凝固因子Ｘａの定量のためのＯＤＩ−ＣＬと蛍光検出との間の相関関係（Ｎ＝１０）を示すグラフ（各値の誤差範囲は４％ないし７％）；
【図５ａ】全血中の凝固因子ＩＩａの不在及び存在下における恒温培養時間の効果を示すグラフ；
【図５ｂ】全血中の凝固因子Ｘａの不在及び存在下における恒温培養時間の効果を示すグラフ；
【図５ｃ】全血中のＩＩａ蛍光発生基質と凝固因子ＩＩａとの間の反応（恒温培養）時間の延長による相対的ＣＬ強度の増加を示すグラフ（Ｎ＝５）；
【図５ｄ】全血中のＸａ蛍光発生基質と凝固因子Ｘａとの間の反応（恒温培養）時間の延長による相対的ＣＬ強度の増加を示すグラフ（Ｎ＝５）；
【図６ａ】ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いた全血中の微量水準の凝固因子ＩＩａを速かに定量することができる校正曲線を示すグラフ；
【図６ｂ】ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いて全血中の微量水準の凝固因子Ｘａを速かに定量できる校正曲線を示すグラフ；
【図６ｃ】ＡＭＣと接合されたＸａ蛍光発生基質の選択性及び特異性を示すグラフ；
【図６ｄ】ＡＭＣと接合されたＩＩａ蛍光発生基質の選択性及び特異性を示すグラフ；
【図７】発光団（蛍光染料）としてＡＭＣ（１２．５μＭ）の存在下において、ＯＤＩ−ＣＬ反応で血漿の効果を図示するグラフ（各サンプルは、ＴＢＳＴ中のＡＭＣとＨ２Ｏで希釈された特定％濃度のヒト血漿の混合物（容積比＝１：１）として製造）；
【図８】４種の異なる緩衝液中のＡＭＣ（２５μＭ）の相対的ＣＬ強度を示すグラフ；
【図９】１０％ヒト血漿中のＩＩａ（３．４ｎＭ）の定量のための異なる反応（恒温培養）時間にわたるＣＬ３．４／ＣＬ０を示すグラフ；
【図１０】ヒト全血中のＸａを定量するための希釈効果を図示するグラフ（希釈された全血と蛍光発生基質の反応時間は２分、４分、１０分）；
【図１１】発光団（蛍光染料）としてＡＭＣ（２５μＭ）の存在下において、ＯＤＩ−ＣＬ反応で全血中の成分の効果を示すグラフ；
【図１２ａ】ＯＤＩ−ＣＬ検出を用いたバイオセンサーを開発するために適用されたＩＩａ蛍光発生基質の特異性と選択性を図示するグラフ（濃度：[ＩＩａ]＝２８．６ｎｇ／ｍｌ、[グルコース]＝１０６ｎｇ／ｍｌ、[ヘモグロビン]＝１０６ｎｇ／ｍｌ、[ＨＳＡ]＝１０６ｎｇ／ｍｌ、[ＩｇＧ]＝１０６ｎｇ／ｍｌ）；及び
【図１２ｂ】ＯＤＩ−ＣＬ検出を用いたバイオセンサーを開発するために適用されたＸａ蛍光発生基質の特異性と選択性を示すグラフ（濃度：[Ｘａ]＝１０．８ｎｇ／ｍｌ、[グルコース]＝１０６ｎｇ／ｍｌ、[ヘモグロビン]＝１０６ｎｇ／ｍｌ、[ＨＳＡ]＝１０６ｎｇ／ｍｌ、[ＩｇＧ]＝１０６ｎｇ／ｍｌ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、凝固因子に対する蛍光発生基質として、蛍光染料を含む蛍光発生基質；及び前記蛍光発生基質と接合された消光剤を含む、血液サンプル中の凝固因子を検出するためのバイオセンサーが提供される。蛍光染料は、蛍光染料が凝固因子と蛍光発生基質との間の加水分解反応によって蛍光発生基質から解離される時、及び蛍光染料が１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬から形成された高エネルギー中間体と相互作用する時発光する。１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光（ＯＤＩ−ＣＬ：Ｏｘａｌｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬は、ＯＤＩ（Ｏｘａｌｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）及びＨ２Ｏ２を含むことができる。
【００２２】
蛍光発生基質で使われる蛍光染料は、２−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｎ−メチル−アントラニロイル（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル（Ｄａｎｓｙｌ）５−[（２−アミノエチル）アミノ]−ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセテート（ＤＭＡＣＡ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（ＭＣＡ）、ローダミン、ローダミン１０１、ローダミン１１０及びレソルフィンの中で少なくとも一つであってもよい。(２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｙｌ（Ａｂｚ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｎｔｈｒａｎｉｌｏｙｌ（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）、５−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ（Ｄａｎｓｙｌ）、５−[（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ]−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＡＮＳ）、７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ａｃｅｔａｔｅ（ＤＭＡＣＡ）、７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ（ＡＭＣ）、（７−ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌ）ａｃｅｔｙｌ（ＭＣＡ）、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１０１、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０ａｎｄ  ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ)
本明細書では、一例として、ＡＭＣ（７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉ）を使用しているが、他の蛍光染料を単独で、または互いに組み合わせて使うことができる。
【００２３】
バイオセンサーで使われる消光剤は、２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）エチレンジアミン（ＥＤＤｎｐ）、４−ニトロ−フェニルアラニン、３−ニトロ−チロシン、パラ−ニトロアニリン（ｐＮａ）、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル（ＤＡＢＣＹＬ）及び７−ニトロ−ベンゾ[２，１，３]オキサジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）のうち、少なくとも一つであってもよい。(２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＤＮＰ）、Ｎ−（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＥＤＤｎｐ）、４−Ｎｉｔｒｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、３−Ｎｉｔｒｏ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ、ｐａｒａ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ（ｐＮａ）、４−（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｙｌ（ＤＡＢＣＹＬ）ａｎｄ  ７−Ｎｉｔｒｏ−ｂｅｎｚｏ[２、１、３]ｏxａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ（ＮＢＤ）)
本発明の凝固因子は、血液凝固過程の経路に関わる任意の凝固因子種類であってもよい。多様な凝固因子の中で、因子ＩＩａ（トロンビン）及び因子Ｘａが好ましい。
【００２４】
図２ａで図示されたように、凝固因子ＩＩａまたはＸａに対する蛍光発生基質中の蛍光染料（例：ＡＭＣ）は、凝固因子ＩＩａまたはＸａの不在下ではＯＤＩ−ＣＬ検出システムで発光しない。これは蛍光染料（ＡＭＣ；発光団Ｌ）が図２ｂに図示されたような化学発光共鳴エネルギー伝達（ＣＲＥＴ）によって蛍光発生基質と接合された消光剤ＱへのＯＤＩとＨ２Ｏ２伝達エネルギーの間の反応から形成された高エネルギー中間体によって励起されるためである。図２ａは、凝固因子（５ｎＭ）の存在下で相対的ＣＬ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）強度が凝固因子の不在下の相対的ＣＬ強度よりずっと高いことを示す。結果は、図２ｃで図示された反応計画によって説明される。蛍光発生基質は、蛍光発生基質と凝固因子の加水分解反応によって分離された。よって、消光剤と結合しない蛍光染料（発光団）は、ＯＤＩ−ＣＬ反応で発光してもよい。図２ｄは、凝固因子ＩＩａまたはＸａと凝固因子に対する特異的蛍光発生基質の間の加水分解反応の結果として蛍光染料（ＡＭＣ）が分離することを図示する。図２ｅで図示された例にて、ＯＤＩ−ＣＬ反応から形成された高エネルギー中間体Ｘによって励起されたＡＭＣは、（青色）の光を放出する。
【００２５】
ＩＩａ特異的蛍光発生基質及びＸａ特異的蛍光発生基質の例示的構造は、下記表１で示す。
【００２６】
【表１】
2019532301.tif 000003
本発明において、血液サンプルは、血漿または全血中の一つであってもよい。血液サンプルは、そのまま使うか、１倍ないし１，０００倍希釈して使うことができる。蛍光染料としてＡＭＣ（１２．５μＭ）を使用するＯＤＩ−ＣＬ反応で血漿使用の効果を図７で示す。図７に示すように、０．１％ないし１０％血漿（１０倍ないし１０００倍希釈）中のＡＭＣの相対的ＣＬ強度は、統計的に許容される誤差範囲（＜５％）内で一定した。ヒト血漿中の一部の成分がＯＤＩ−ＣＬ反応で抑剤剤または消光剤として作用することがあるので、１００％血漿中の相対的ＣＬ強度は、０．１％ないし１０％血漿中の相対的ＣＬ強度より低かった。
【００２７】
図３ａ及び図３ｂは、血漿の濃度によるバイオセンサーから放出されたＯＤＩ−ＣＬの感度を示す。ヒト血漿の成分を希釈した時、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ／ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）の割合（ＣＬＩＩａ／ＣＬ０またはＣＬＸａ／ＣＬ０）が増加した。よって、１０倍ないし１０００倍希釈されたヒト血漿を用いるバイオセンサーは、１００％ヒト血漿を用いるバイオセンサーより感度が高いことがある。また、１０％ヒト血漿での反応シグナル／バックグラウンドシグナルの割合は、０．１％ヒト血漿での反応シグナル／バックグラウンドシグナルの割合より約５０％低かった。このような結果は、１０倍希釈されたヒト血漿で作動されたバイオセンサーの検出限界（ＬＯＤ＝３σ）が１０００倍希釈されたヒト血漿を利用して生成されたバイオセンサーの検出限界ほど低いか、これより若干高いことがあることを示す。σは、凝固因子ＩＩａまたはＸａの不在下で測定した背景値の標準偏差である。
【００２８】
本発明において、バイオセンサーに含まれた凝固因子に特異的なペプチドは、緩衝剤中の凝固因子と反応することがある。緩衝剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０を持つリン酸塩緩衝された食塩水（ＰＢＳＴ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、リン酸塩緩衝された食塩水（ＰＢＳ：ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ−２０を持つＴｒｉｓ緩衝された食塩水（ＴＢＳＴ：Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ８．５−０．１  Ｔｗｅｅｎ２０）及びＴｒｉｓ緩衝された食塩水（ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ８．５）のいずれか一つであってもよい。図８に図示されたように、ＴＢＳ中のＡＭＣ（２５μＭ）から放出された光は、別の緩衝液中のものより明るい。結果は、図２ｄで示すように、ＴＢＳが凝固因子ＩＩａまたはＸａとＡＭＣと接合された特異的基質間の加水分解反応によって形成される微量水準のＡＭＣを速かに定量できるＯＤＩ−ＣＬバイオセンサーの最高の緩衝液であることを示唆する。しかし、図３ｃ及び３ｄは、凝固因子ＩＩａとＡＭＣと結合された基質の間の加水分解反応のための最上の緩衝剤がＴＢＳＴである一方、ＰＢＳは、凝固因子Ｘａと基質の間の加水分解反応のための最上の緩衝剤であることを示す。このような結果は、凝固因子とＡＭＣと接合された特異的基質の間の加水分解反応によって形成されたＡＭＣの収率が緩衝液の種類に頼ることを示す。例えば、図３ｃは、ＴＢＳＴの中で２分間の加水分解反応後、測定された相対的ＣＬ強度が最も強いことを示す。よって、図８及び図３ｃで示す結果は、ＴＢＳＴ中の２分間の加水分解反応から形成されたＡＭＣの濃度が別の緩衝液中のものより高いことを示す。すなわち、ＴＢＳＴ中の加水分解反応は、別の緩衝液中の加水分解反応より速い。別の例として、図３ｄは、ＰＢＳの中で２分間の加水分解反応後に形成されたＡＭＣの濃度がＰＢＳＴ、ＴＢＳ及びＴＢＳＴ中のＡＭＣ濃度より高いため、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いる凝固因子Ｘａを定量するための最上の緩衝液がＰＢＳということを示す。前記結果に基づいて、ＴＢＳＴは、ヒト由来サンプルの中でＩＩａを検出／定量するために好ましい一方、ＰＢＳは、ヒト由来サンプルの中でＸａを検出／定量するために好ましいことがある。
【００２９】
本発明において、室温（２１±２℃）または３７℃でバイオセンサー内の血液サンプルと蛍光発生基質の間の反応（加水分解）時間は、約１０秒ないし１２０分の範囲で剤御されてもよい。好ましくは、反応（加水分解）時間は、１分ないし３０分、及び最も好ましくは、１分ないし４分となるように調節することができる。図９は、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの感度が凝固因子とＡＭＣと接合された基質の間の加水分解反応に必要な恒温培養時間に頼ることを示す。加水分解反応（恒温培養）時間が増加するにつれ、ＣＬ３．４／ＣＬ０は増加した。４分間の恒温培養後に測定された相対的ＣＬ強度を用いて計算されたＣＬ３．４／ＣＬ０は、５分間の恒温培養後のものと類似した。よって、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサー、及びＴＢＳＴ中のＡＭＣと接合された基質を利用して１０％ヒト血漿中の凝固因子ＩＩａを定量するための反応（加水分解）時間を４分にすることができる。また、図９の本発明の例示的な実施形態によれば、１分間の恒温培養時間も可能である。これは、１分間の恒温培養で作動するバイオセンサーの感度が４分間の恒温培養後に生成されたものほど優れないものと予測されても、１分間の恒温培養（加水分解）後に検出された３．４ｎＭが１０％ヒト血漿中の正常範囲（１０ないし１５ｎＭ）より低いためである。よって、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーは、１０％ヒト血漿とＴＢＳＴ中のＡＭＣと接合された基質の混合物の短時間恒温培養（１ないし４分）を利用する凝固因子ＩＩａの迅速な定量のために可能である。
【００３０】
反応（加水分解）時間は、ＰＢＳの中で１０％ヒト血漿中の凝固因子Ｘａを感知できるバイオセンサーにも適用される。下記表は１０％ヒト血漿中の因子Ｘａを定量するためのＯＤＩ−ＣＬ及び蛍光（従来）の正規化された強度を示す。
【００３１】
【表２】
2019532301.tif 000004
表２で示すように、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーは、蛍光検出を利用した従来のセンサーよりずっと感度が高い。ＯＤＩ−ＣＬは、周りの条件下で僅か２分間の恒温培養期間で０．０２ｎＭ  Ｘａを検出できる一方、蛍光検出は、光源を作動する間で発生する高い背景値によって３０分間の恒温培養でも０．１１ｎＭ  Ｘａを充分に感知することができなかった。従来の方法である蛍光検出を利用したバイオセンサーの感度を用いて、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーと比べた。（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｓ／Ａｓｓａｙ−Ｋｉｔ／Ｆａｃｔｏｒ−Ｘａ／ｄａｔａｓｈｅｅｔ．ｐｈｐ？ｐｒｏｄｕｃｔｓ_ｉｄ＝８４１６３４）。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、前記説明のようなバイオセンサーを用いて血液サンプル中の凝固因子を検出／定量する方法。前記方法は、バイオセンサーを緩衝液中の凝固因子を含む血液サンプルと混合して反応させる段階；１，１'−オキサリルジイミダゾール化学発光ＯＤＩ−ＣＬ試薬を前記反応された混合物に添加する段階；及びＣＬ強度を測定する段階を含む。室温（２１±２℃）または３７℃でバイオセンサー内の血液サンプルと蛍光発生基質の間の反応（加水分解）時間は、１０秒ないし１２０分であってもよく、ＣＬ強度の測定は、ＯＤＩ−ＣＬ試薬を添加した後、１秒ないし１０秒間行っても良い。
【００３３】
凝固因子ＩＩａ及びＸａと、ＡＭＣと接合された基質の２分間恒温培養を用いることで、図４ａ及び４ｂに図示されたように、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーは、広い線形校正曲線で微量水準のＩＩａ及びＸａを速かに定量することができる。因子ＩＩａを定量するための線形校正曲線の動的範囲は、０．３ないし２７．２ｎＭ程度で広範囲であった。因子ＩＩａを分析できるバイオセンサーのＬＯＤは、１０４ｐＭ程度で低かった。また、因子Ｘａを分析するための線形校正曲線の動的範囲は、０．２５ないし２０ｎＭ程度で広範囲であった。バイオセンサーのＬＯＤは、４４ｐＭ程度で低かった。図４ａ及び図４ｂと同様に優れる線形校正曲線を有するバイオセンサーを用いることで、本発明は、既存のバイオセンサーの場合のような１００倍ないし１０，０００倍希釈された血漿の代りに、単に１０倍希釈された血漿サンプルを利用して凝固因子の正確、且つ費用面で効率的で、迅速な定量を達成する。図４ｃ及び図４ｄは、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーと蛍光検出を利用した従来のバイオセンサーの間の優れる相関関係を示す。このような結果は、混合物（例えば、特異的蛍光発生基質、因子ＩＩａまたは因子Ｘａ）の２分恒温培養を伴うＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーが凝固因子を定量化するために費用面で効率的、且つ迅速に使用し易い診断方法であってもよいことを示す。
【００３４】
下記表３は、本発明の例示的な実施形態によるＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーが優れる正確度、精度及び回収率で凝固因子ＩＩａ及びＸａを定量できることを示す。よって、本発明によるバイオセンサーは、従来のバイオセンサーよりずっと速かに統計学的に許容される再現性によってヒト血漿中の因子ＩＩａ及びＸａを定量することができる。
【００３５】
【表３】
2019532301.tif 000005
全血中の因子ＩＩａ及び因子Ｘａの分析
本発明の例示的な実施形態によるバイオセンサーは、サンプルとして全血とともに使用してもよい。図１０は、全血サンプルに対するバイオセンサーの適用を示し（ここで、全血サンプルは、脱イオン化Ｈ２Ｏで１０倍ないし４０倍希釈された）、これは、またＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーが１０倍希釈された血漿中の因子ＩＩａ及びＸａの定量と同様に１０倍希釈された全血中の微量水準の凝固因子を速かに定量できることを示す。図５ａ及び図５ｂは、またＡＭＣと接合された因子ＩＩａ（または、因子Ｘａ）基質が因子ＩＩａまたはＸａを含有しない陰性サンプルの中で非常に安定的で、混合物（例えば、陰性サンプルとＡＭＣと接合されたＩＩａまたはＸａ基質）の３つの異なる恒温培養時間後に測定された相対的ＣＬ強度（背景）が統計的に許容される誤差範囲（＜５％）内で一定したことを示す。微量水準のＩＩａ及びＸａを含有する患者のサンプル（例えば、１０倍希釈された全血）で放出された光の強さは、恒温培養時間の延長に比例して増加した。患者サンプル中のＩＩａ（２．５ｎＭ）またはＸａ（５ｎＭ）が添加されたサンプルの相対的ＣＬ強度は、純粋な患者サンプルの相対的ＣＬ強度より高かっただけでなく、恒温培養時間に頼った。
【００３６】
図５ｃ及び５ｄに示すように、全血サンプルの相対的ＣＬ強度は、各全血サンプル中のＩＩａ及びＸａ濃度が相違であるため、他の４種の全血サンプルの相対的ＣＬ強度と相違した。しかし、各全血サンプルの相対的ＣＬ強度は、恒温培養時間の延長に比例して増加された。よって、図５ｃ及び５ｄは、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーが統計的に許容される精度及び再現性で患者サンプル（例えば、１０倍希釈した全血）の中で微量水準のＩＩａまたはＸａを迅速に定量できることを示す。
【００３７】
図１１に示すように、１０％全血中のＡＭＣの相対的ＣＬ強度は、０．１％及び１％全血中の相対的ＣＬ強度より約５０％低いことに対し、１０％血漿中のＡＭＣの相対的ＣＬ強度は、０．１％及び１％血漿中の相対的ＣＬ強度と同一であった（図７参照）。また、１００％全血中のＡＭＣの相対的ＣＬ強度は、０．１％及び１％全血中の強度より約６０倍低かった。図１１に示す結果は、ＯＤＩ−ＣＬ反応で放出されるＡＭＣの量子効率が１０％の全血サンプル、及び１００％の全血サンプル中に存在する一部抑剤剤によって減少することを示す。図７及び図１１に示す結果によれば、ヒト全血はＯＤＩ−ＣＬ反応で強力な抑剤剤として作用することがある一部の成分を含むことができると予測される。ＯＤＩ−ＣＬ反応で全血サンプルを用いることと係る短所を克服するために、混合物（例えば、ＡＭＣと接合されたＩＩａまたはＸａ基質と１０倍希釈された全血サンプル）の４分恒温培養を出血、血栓症及び脳卒中を速かに診断して予防できるＯＤＩ−ＣＬ検出を利用した高感度バイオセンサーの開発のために選択した。よって、好ましくは、全血中のＩＩａ及びＸａを定量するために反応（加水分解）時間は、血漿中のものより２倍長く設定することができる。
【００３８】
図６ａ及び図６ｂの線形校正曲線は、ＯＤＩ−ＣＬ検出と混合物の４分恒温培養を用いたバイオセンサーが患者全血中のＩＩａ及びＸａを速かに定量できることを示す。ＩＩａ及びＸａを定量できるバイオセンサーのＬＯＤは、全血の中で６６及び１８ｐＭ程度で低かった。表４で示すように、全血中でバイオセンサーに適用された４分反応（加水分解）時間が血漿中でバイオセンサーから選択された２分反応（加水分解）時間より長いので、全血中のバイオセンサーのＬＯＤは、血漿中のバイオセンサーのＬＯＤより低かった。このような結果は、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの感度がプロテアーゼ酵素（例えば、因子ＩＩａ、因子Ｘａ）とＡＭＣと結合した基質の間の加水分解反応のための反応時間に頼ることを示す。よって、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーのＬＯＤは、血漿または全血中の蛍光発生基質と凝固因子ＩＩａまたはＸａ間の加水分解反応のための恒温培養時間によって異なると予測される。
【００３９】
【表４】
2019532301.tif 000006
表４は、血漿及び全血中のＩＩａ及びＸａを定量できるＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの感度が血清及び血漿のような１０倍ないし１００倍希釈されたヒト由来サンプルで作動する別の方法ほど低いことを示す。
【００４０】
蛍光染料（ＡＭＣ）を有する凝固因子ＩＩａ及びＸａに対する蛍光発生基質は、優れる特異性と選択性を有する。図１２ａ及び１２ｂは、本発明の蛍光発生基質が全血に存在する別の主要タンパク質（例えば、グルコース、ヘモグロビン、ＨＳＡ、ＩｇＧ）と反応しないことを示す。全血（例：１０％）が微量水準のＩＩａ及びＸａを含むので、主なタンパク質の不在及び存在下におけるバイオセンサーの相対的ＣＬ強度は、恒温培養時間が延長されることにつれ増加されてもよい。
【００４１】
また、図６ｃ及び６ｄは、ＡＭＣと接合された凝固因子ＩＩａ及びＸａに対する蛍光発生基質が抗凝固剤の存在下で活性ＩＩａまたはＸａと特異的で選択的に反応できるか否かを試す実験に関する。図６ｃ及び６ｄは、バイオセンサーに適用されたＡＭＣと接合された凝固因子ＩＩａ及びＸａに対する蛍光発生基質が優れる特異性と選択性を有することを示す。ＡＭＣと接合されたＩＩａ基質は、ＩＩａ抗凝固剤（例：ダビガトラン）と結合されていない活性ＩＩａと特異的に相互作用できる一方、Ｘａ蛍光発生基質は、Ｘａ抗凝固剤（例：リバーロキサバン）と結合されていない活性Ｘａと選択的に反応してもよい。よって、バイオセンサーは、図６ｃに図示されたように、微量水準の活性ＩＩａがダビガトランを含む患者の全血に存在することを確認させてくれた。Ｘａは、ダビガトランと結合しないため、ダビガトランを含む患者の全血中でＸａとＡＭＣと接合されたＸａ基質間の反応後に測定された相対的ＣＬ強度は強力であった（図６ｃ）。図６ｄに図示されたように、バイオセンサーは、リバーロキサバンを含む患者の全血中の活性Ｘａの濃度が非常に低いことを確認させてくれた。また、図６ｄは、ＩＩａとＡＭＣと接合されたＩＩａ基質の反応後に測定された相対的ＣＬ強度がＸａ抗凝固剤の存在下で患者の全血中で強力であったことを示す。結論的に、図６ｃ及び６ｄに図示された結果は、ＡＭＣと接合された基質で作動するバイオセンサーが優れた選択性及び特異性で、出血、血栓症及び脳卒中を予防するために適用されてもよいことを示す。
【００４２】
表５は、全血に対するバイオセンサーの正確度、精度及び回収率がヒト血漿に対するほど優れることを示す。
【００４３】
【表５】
2019532301.tif 000007
したがって、本発明の例示的な実施形態によるＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーは、従来のバイオセンサーに比べて許容可能な再現性によって全血中の凝固因子ＩＩａ及びＸａを速かに定量する。
【００４４】
さらに、表６は、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いて定量された全血中のＩＩａ及びＸａの濃度が統計的に許容される誤差範囲内で蛍光検出を利用した従来の方法を用いて測定されることと同一であることを示す。
【００４５】
【表６】
2019532301.tif 000008
前記説明のようなバイオセンサー、及びバイオセンサーの使用方法は、キットの形態で提供されてもよい。本発明の一実施形態として、キットは、前記説明したバイオセンサー及び容器を含む。キットは、緩衝剤及びＯＤＩ−ＣＬ試薬（例えば、ＯＤＩ及びＨ２Ｏ２）をさらに含むことができる。
【００４６】
したがって、本発明は、迅速な凝固試験のための新しい装置として適用されてもよいＯＤＩ−ＣＬ検出を利用した費用面で効率的なバイオセンサーを提供する。蛍光染料（発光団）は、凝固因子（例えば、ＩＩａ、Ｘａ）と特異的蛍光発生基質の間の迅速な反応で形成されてもよい。溶液の中でＯＤＩ−ＣＬ試薬（例えば、ＯＤＩ、Ｈ２Ｏ２）を添加して放出される光の強度は、血液サンプル（例えば、血漿、全血）中の凝固因子濃度の増加に比例して増加した。ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの広い動的範囲は、統計学的に許容可能な正確度、精度及び再現性によって患者の出血及び凝固を診断及び検出することができると予測される。また、ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの分析手続きは、サンプルの前処理、時間消耗的な数回の恒温培養と洗浄が必要ないため、迅速且つ簡単である。結論的に、本発明のＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーの概念及び原理は癌、心臓疾患及び感染性疾患（例：ＨＩＶ、ＳＡＲ、ジカウィルス）のようなヒト疾患の早期診断及び迅速な検出のために広く適用されてもよい。
【００４７】
実施例
本明細書に記載の実験は、下記材料及び手続きを利用して実施した。
【００４８】
化学物質及び材料
ヒト血漿来由のトロンビン（凝固因子ＩＩａ、１００ＵＮ）及びトロンビンの蛍光発生基質（ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、ＨＣｌ、２５ｍｇ）は、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で購入した。因子Ｘａ（ヒト）天然タンパク質は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で購入した。因子Ｘａの蛍光発生基質（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、ＡｃＯＨ）は、クリオペブ（Ｃｒｙｏｐｅｐ）で購入した。蛍光染料（蛍光団）としてＡＭＣは、７−アミノ４−メチルクマリンである。プーリングされた（ｐｏｏｌｅｄ）ヒト供与体（１  ｇ）とともに凍結乾燥された正常血漿は、ＬＥＥバイオソリューション（Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）で購入した。ビス（２，４，６−クロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰＯ）及び４−メチルイミダゾール（４ＭＩｍＨ）は、ＴＣＩアメリカ（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）で購入した。３及び３０％Ｈ２Ｏ２は、ＶＷＲで購入した。脱イオン化Ｈ２Ｏ（ＨＰＬＣ等級）、エチルアセテート、イソプロピルアルコール及び高濃度ＰＢＳ（ｐＨ７．４、２０×）、ＴＢＳ（ｐＨ７．４×１０）、ＰＢＳＴ及びＴＢＳＴは、ＥＭＤで購入した。８ウェルＥＩＡ／ＲＩＡストリップ−ウェルプレートは、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）で購入した。ヒト血漿及び全血は、アメリカメリーランド州ヘイガーズタウン所在のメリタスメディカルセンター（Ｍｅｒｉｔｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって提供された。
【００４９】
ＯＤＩ−ＣＬ検出で使用する、凝固因子ＩＩａまたはＸａと特異的蛍光発生基質の間の化学的反応確認
実験１：ＯＤＩ−ＣＬ反応において、因子ＩＩａまたは因子Ｘａの不在下の蛍光発生基質単独の背景（図２ａ）。
【００５０】
各蛍光発生基質（５ｍｇ／ｍｌ）を原液としてＤＭＳＯに溶解させた。原液を冷凍庫（−８０℃）で貯蔵した。実験を行う前に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈された蛍光発生基質（５μｇ／ｍｌ）の作業溶液を製造した。各作業溶液（１０μｌ）を硼硅酸試験管（１２ｍｍ×７５ｍｍ）に注入した。前記試験管を２個の注射器ポンプを備えたルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｉｎｃ）の検出領域に挿入した。イソプロピルアルコールに溶解された１００ｍＭ  Ｈ２Ｏ２（２５μｌ）をルミノメーターの第１注射器ポンプを通して分配した。第２注射器ポンプを使用してＯＤＩ（２５μｌ）を添加することで各蛍光基質が因子ＩＩａまたは因子Ｘａの不在下で発光できるか否かを調べた。このような手続きによって、本発明者らは、ＯＤＩ−ＣＬ反応で因子ＩＩａ及び因子Ｘａの不在下の蛍光発生基質の背景値を決めることができた。
【００５１】
実験２：蛍光発生基質と凝固因子の反応から形成されたＡＭＣのＣＬ放出（図２ａ）
各凝固因子（ＩＩａまたはＸａ、５ｎＭ）を脱イオン化Ｈ２Ｏで１０倍希釈された血漿で製造した。各蛍光発生基質（５μｇ／ｍｌ）をＰＢＳの中で製造した。ストリップ−ウェル内の因子ＩＩａ（５０μｌ）と因子ＩＩａの蛍光発生基質（５０μｌ）の混合物を周りの条件で２分間恒温培養した。また、ストリップ−ウェル内の因子Ｘａ（５０μｌ）と因子Ｘａの蛍光発生基質（５０μｌ）の混合物を周りの条件で２分間恒温培養した。恒温培養後、各混合物（１０μｌ）を硼硅酸試験管に挿入した。Ｈ２Ｏ２（２５μｌ）及びＯＤＩ（２５μｌ）をルミノメーターの２個の注射器ポンプを通して連続的に分配して試験管内で放出された光の相対的ＣＬ強度を測定した。
【００５２】
実験３：凝固因子を定量するための蛍光及びＯＤＩ−ＣＬの感度（表２）
１０％ヒト血漿中の１２種の因子Ｘａの標準物（０ないし１０ｎＭ）を製造した。因子Ｘａの蛍光発生基質（５μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中で製造した。各標準溶液（５０μｌ）をストリップ−ウェル内で蛍光発生基質（５０μｌ）と混合した。混合物を周りの条件で２分間恒温培養した。恒温培養後、実験１及び２で説明したことと同一な方法で作動されるルミノメーターを使って各サンプルの相対的ＣＬ強度を測定した。各サンプルの蛍光強度を測定するために、ストリップ−ウェル内の混合物を周りの温度で３０分間恒温培養した。恒温培養後、ストリップ−ウェルで放出された蛍光の強度をマイクロプレートのリーダー（テカン社（Ｔｅｃａｎ、Ｉｎｃ）のＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ  １０００）を利用して測定した。最後に、凝固因子を定量するためのＯＤＩ−ＣＬ検出の感度を蛍光検出の感度と比べた。
【００５３】
実験４：ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを利用するヒト血漿中の凝固因子の定量（表３）
因子ＩＩａ及び因子Ｘａの標準物を脱イオン化Ｈ２Ｏで希釈された１０％血漿を利用して製造した。未知のサンプルは、１００％血漿を利用して製造した。次いで、各サンプルを脱イオン化Ｈ２Ｏで１０倍希釈した。各標準物またはサンプル（５０μｌ）を蛍光発生基質を含むストリップ−ウェル（ｓｔｒｉｐ−ｗｅｌｌ）に分配した。ストリップ−ウェル内の混合物を周りの条件で２分間恒温培養した。因子ＩＩａの蛍光発生基質（５ｕｇ／ｍｌ）をＴＢＳＴ中で製造した。また、因子Ｘａの蛍光発生基質（５ｕｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中で製造した。恒温培養後、ＯＤＩ−ＣＬ試薬を添加して各混合物から放出された光をルミノメーターを用いて２秒間測定した。
【００５４】
実験５：ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いるヒト全血中の凝固因子の定量（表５）
因子ＩＩａ及び因子Ｘａの標準物を脱イオン化Ｈ２Ｏで希釈された１０％全血を利用して製造した。未知の全血サンプルを脱イオン化Ｈ２Ｏで１０倍希釈した。各標準物またはサンプル（５０μｌ）を蛍光発生基質を含むストリップ−ウェルに分配した。ストリップ−ウェル内の混合物を周りの条件下で４分間恒温培養した。因子ＩＩａの蛍光発生基質（２５μｇ／ｍｌ）をＴＢＳＴ中で製造した。また、因子Ｘａの蛍光発生基質（２５μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中で製造した。４分間恒温培養した後、ＯＤＩ−ＣＬ試薬を添加することで各混合物から放出された光をルミノメーターを用いて２秒間測定した。
【００５５】
実験６：１０倍希釈された血漿及び全血中のＩＩａ及びＸａを定量するためのＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーと蛍光検出を用いた従来方法の間の相関関係（表４）
ＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーと蛍光検出を利用した従来の方法の間の相関関係を確認するために、１０倍希釈された血漿または全血（例えば、標準物、サンプル）中のＩＩａ及びＸａの濃度を蛍光検出を利用したマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ  １０００、Ｔｅｃａｎ、Ｉｎｃ）で決めた。従来の方法を使用するＩＩａ及びＸａを定量するためのＩＩａ及びＸａの蛍光発生基質の濃度は、実験４及び５に記載のＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いた時と同一であった。各標準物またはサンプル（５０μＬ）を黒いウェルで蛍光発生基質（５０μｌ）と混合した。多様な混合物を含む黒いウェル−プレート（９６ウェル、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を蛍光検出を利用したマイクロプレートリーダーに挿入し、室温で３０分間恒温培養した。恒温培養後、各ウェルから放出された蛍光の相対的強度を４４０ｎｍの放出波長（励起波長：３４２ｎｍ）から測定した。従来の方法を用いて血漿及び全血サンプル中のサンプル濃度を決めた後、これをＯＤＩ−ＣＬ検出を利用したバイオセンサーを用いたことに比べて新規方法と従来の方法の間の相関関係を確認した。
【００５６】
実験データの分析
本明細書で観察された全ての実験結果は、マイクロソフトアクセル及びシグマプロット１２．５（Ｓｙｓｔａｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ。）の統計ツールを用いて分析した。
【００５７】
前記説明したバイオセンサー及び方法は、単に本発明の原理の例示的な実施形態であるだけで、これを使用するための別の組成物及び方法は、本発明の趣旨及び範囲から脱することなく、当業者によって考案されることが理解されなければならない。また、開示されている内容は、開示部分を含んで開示された部分からなる実施形態に関するものであることが理解されなければならない。
【図１ａ】
2019532301.tif 000009
【図１ｂ】
2019532301.tif 000010
【図１ｃ】
2019532301.tif 000011
【図１ｄ】
2019532301.tif 000012
【図２ａ】
2019532301.tif 000013
【図２ｂ】
2019532301.tif 000014
【図２ｃ】
2019532301.tif 000015
【図２ｄ】
2019532301.tif 000016
【図２ｅ】
2019532301.tif 000017
【図３ａ】
2019532301.tif 000018
【図３ｂ】
2019532301.tif 000019
【図３ｃ】
2019532301.tif 000020
【図３ｄ】
2019532301.tif 000021
【図４ａ】
2019532301.tif 000022
【図４ｂ】
2019532301.tif 000023
【図４ｃ】
2019532301.tif 000024
【図４ｄ】
2019532301.tif 000025
【図５ａ】
2019532301.tif 000026
【図５ｂ】
2019532301.tif 000027
【図５ｃ】
2019532301.tif 000028
【図５ｄ】
2019532301.tif 000029
【図６ａ】
2019532301.tif 000030
【図６ｂ】
2019532301.tif 000031
【図６ｃ】
2019532301.tif 000032
【図６ｄ】
2019532301.tif 000033
【図７】
2019532301.tif 000034
【図８】
2019532301.tif 000035
【図９】
2019532301.tif 000036
【図１０】
2019532301.tif 000037
【図１１】
2019532301.tif 000038
【図１２ａ】
2019532301.tif 000039
【図１２ｂ】
2019532301.tif 000040
【国際調査報告】
2019532301.tif 000041
2019532301.tif 000042