(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３８と特異的に結合するポリペプチドに関し、したがって、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患の診断、ならびに治療的および予防的処置に好適である。また、ポリペプチドを含むコンジュゲートおよび医薬組成物も開示される。加えて、本発明は、生体試料におけるＣＤ３８および／またはＣＤ３８発現細胞の検出方法への、かかるポリペプチドの使用に関する。抗原結合性ポリペプチドが用いられる、ＣＤ３８および／またはＣＤ３８発現細胞の精製および濃縮プロセスもまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００ｎＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３８と特異的に結合する少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
ＩＳＶＤが、腫瘍細胞増殖を阻害する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＣＤ３８が、ヒトＣＤ３８（配列番号４６５）である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１１７〜１７４、および
（ｂ）配列番号１１７〜１７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３〜２９０、および
（ｄ）配列番号２３３〜２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９〜４０６、および
（ｆ）配列番号３４９〜４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＩＳＶＤが、
−ＣＤＲ１が配列番号１１７〜１７４により表され、ＣＤＲ２が配列番号２３３〜２９０により表され、ＣＤＲ３が配列番号３４９〜４０６により表されるＩＳＶＤ、
−配列番号１〜５８により表されるＩＳＶＤ、および、
−配列番号１〜５８のいずれか１つとの少なくとも８０％以上の配列同一性により表されるＩＳＶＤ、
からなる群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＣＤＲが、以下からなる群から選ばれる、請求項４〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド：
ＣＤＲ１が配列番号１１７であり、ＣＤＲ２が配列番号２３３であり、ＣＤＲ３が配列番号３４９である、
ＣＤＲ１が配列番号１１８であり、ＣＤＲ２が配列番号２３４であり、ＣＤＲ３が配列番号３５０である、
ＣＤＲ１が配列番号１１９であり、ＣＤＲ２が配列番号２３５であり、ＣＤＲ３が配列番号３５１である、
ＣＤＲ１が配列番号１２０であり、ＣＤＲ２が配列番号２３６であり、ＣＤＲ３が配列番号３５２である、
ＣＤＲ１が配列番号１２１であり、ＣＤＲ２が配列番号２３７であり、ＣＤＲ３が配列番号３５３である、
ＣＤＲ１が配列番号１２２であり、ＣＤＲ２が配列番号２３８であり、ＣＤＲ３が配列番号３５４である、
ＣＤＲ１が配列番号１２３であり、ＣＤＲ２が配列番号２３９であり、ＣＤＲ３が配列番号３５５である、
ＣＤＲ１が配列番号１２４であり、ＣＤＲ２が配列番号２４０であり、ＣＤＲ３が配列番号３５６である、
ＣＤＲ１が配列番号１２５であり、ＣＤＲ２が配列番号２４１であり、ＣＤＲ３が配列番号３５７である、
ＣＤＲ１が配列番号１２６であり、ＣＤＲ２が配列番号２４２であり、ＣＤＲ３が配列番号３５８である、
ＣＤＲ１が配列番号１２７であり、ＣＤＲ２が配列番号２４３であり、ＣＤＲ３が配列番号３５９である、
ＣＤＲ１が配列番号１２８であり、ＣＤＲ２が配列番号２４４であり、ＣＤＲ３が配列番号３６０である、
ＣＤＲ１が配列番号１２９であり、ＣＤＲ２が配列番号２４５であり、ＣＤＲ３が配列番号３６１である、
ＣＤＲ１が配列番号１３０であり、ＣＤＲ２が配列番号２４６であり、ＣＤＲ３が配列番号３６２である、
ＣＤＲ１が配列番号１３１であり、ＣＤＲ２が配列番号２４７であり、ＣＤＲ３が配列番号３６３である、
ＣＤＲ１が配列番号１３２であり、ＣＤＲ２が配列番号２４８であり、ＣＤＲ３が配列番号３６４である、
ＣＤＲ１が配列番号１３３であり、ＣＤＲ２が配列番号２４９であり、ＣＤＲ３が配列番号３６５である、
ＣＤＲ１が配列番号１３４であり、ＣＤＲ２が配列番号２５０であり、ＣＤＲ３が配列番号３６６である、
ＣＤＲ１が配列番号１３５であり、ＣＤＲ２が配列番号２５１であり、ＣＤＲ３が配列番号３６７である、
ＣＤＲ１が配列番号１３６であり、ＣＤＲ２が配列番号２５２であり、ＣＤＲ３が配列番号３６８である、
ＣＤＲ１が配列番号１３７であり、ＣＤＲ２が配列番号２５３であり、ＣＤＲ３が配列番号３６９である、
ＣＤＲ１が配列番号１３８であり、ＣＤＲ２が配列番号２５４であり、ＣＤＲ３が配列番号３７０である、
ＣＤＲ１が配列番号１３９であり、ＣＤＲ２が配列番号２５５であり、ＣＤＲ３が配列番号３７１である、
ＣＤＲ１が配列番号１４０であり、ＣＤＲ２が配列番号２５６であり、ＣＤＲ３が配列番号３７２である、
ＣＤＲ１が配列番号１４１であり、ＣＤＲ２が配列番号２５７であり、ＣＤＲ３が配列番号３７３である、
ＣＤＲ１が配列番号１４２であり、ＣＤＲ２が配列番号２５８であり、ＣＤＲ３が配列番号３７４である、
ＣＤＲ１が配列番号１４３であり、ＣＤＲ２が配列番号２５９であり、ＣＤＲ３が配列番号３７５である、
ＣＤＲ１が配列番号１４４であり、ＣＤＲ２が配列番号２６０であり、ＣＤＲ３が配列番号３７６である、
ＣＤＲ１が配列番号１４５であり、ＣＤＲ２が配列番号２６１であり、ＣＤＲ３が配列番号３７７である、
ＣＤＲ１が配列番号１４６であり、ＣＤＲ２が配列番号２６２であり、ＣＤＲ３が配列番号３７８である、
ＣＤＲ１が配列番号１４７であり、ＣＤＲ２が配列番号２６３であり、ＣＤＲ３が配列番号３７９である、
ＣＤＲ１が配列番号１４８であり、ＣＤＲ２が配列番号２６４であり、ＣＤＲ３が配列番号３８０である、
ＣＤＲ１が配列番号１４９であり、ＣＤＲ２が配列番号２６５であり、ＣＤＲ３が配列番号３８１である、
ＣＤＲ１が配列番号１５０であり、ＣＤＲ２が配列番号２６６であり、ＣＤＲ３が配列番号３８２である、
ＣＤＲ１が配列番号１５１であり、ＣＤＲ２が配列番号２６７であり、ＣＤＲ３が配列番号３８３である、
ＣＤＲ１が配列番号１５２であり、ＣＤＲ２が配列番号２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号３８４である、
ＣＤＲ１が配列番号１５３であり、ＣＤＲ２が配列番号２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号３８５である、
ＣＤＲ１が配列番号１５４であり、ＣＤＲ２が配列番号２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号３８６である、
ＣＤＲ１が配列番号１５５であり、ＣＤＲ２が配列番号２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号３８７である、
ＣＤＲ１が配列番号１５６であり、ＣＤＲ２が配列番号２７２であり、ＣＤＲ３が配列番号３８８である、
ＣＤＲ１が配列番号１５７であり、ＣＤＲ２が配列番号２７３であり、ＣＤＲ３が配列番号３８９である、
ＣＤＲ１が配列番号１５８であり、ＣＤＲ２が配列番号２７４であり、ＣＤＲ３が配列番号３９０である、
ＣＤＲ１が配列番号１５９であり、ＣＤＲ２が配列番号２７５であり、ＣＤＲ３が配列番号３９１である、
ＣＤＲ１が配列番号１６０であり、ＣＤＲ２が配列番号２７６であり、ＣＤＲ３が配列番号３９２である、
ＣＤＲ１が配列番号１６１であり、ＣＤＲ２が配列番号２７７であり、ＣＤＲ３が配列番号３９３である、
ＣＤＲ１が配列番号１６２であり、ＣＤＲ２が配列番号２７８であり、ＣＤＲ３が配列番号３９４である、
ＣＤＲ１が配列番号１６３であり、ＣＤＲ２が配列番号２７９であり、ＣＤＲ３が配列番号３９５である、
ＣＤＲ１が配列番号１６４であり、ＣＤＲ２が配列番号２８０であり、ＣＤＲ３が配列番号３９６である、
ＣＤＲ１が配列番号１６５であり、ＣＤＲ２が配列番号２８１であり、ＣＤＲ３が配列番号３９７である、
ＣＤＲ１が配列番号１６６であり、ＣＤＲ２が配列番号２８２であり、ＣＤＲ３が配列番号３９８である、
ＣＤＲ１が配列番号１６７であり、ＣＤＲ２が配列番号２８３であり、ＣＤＲ３が配列番号３９９である、
ＣＤＲ１が配列番号１６８であり、ＣＤＲ２が配列番号２８４であり、ＣＤＲ３が配列番号４００である、
ＣＤＲ１が配列番号１６９であり、ＣＤＲ２が配列番号２８５であり、ＣＤＲ３が配列番号４０１である、
ＣＤＲ１が配列番号１７０であり、ＣＤＲ２が配列番号２８６であり、ＣＤＲ３が配列番号４０２である、
ＣＤＲ１が配列番号１７１であり、ＣＤＲ２が配列番号２８７であり、ＣＤＲ３が配列番号４０３である、
ＣＤＲ１が配列番号１７２であり、ＣＤＲ２が配列番号２８８であり、ＣＤＲ３が配列番号４０４である、
ＣＤＲ１が配列番号１７３であり、ＣＤＲ２が配列番号２８９であり、ＣＤＲ３が配列番号４０５である、および、
ＣＤＲ１が配列番号１７４であり、ＣＤＲ２が配列番号２９０であり、ＣＤＲ３が配列番号４０６である。
【請求項１０】
各々が、２００ｐＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３８と特異的に結合する第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＦＡＣＳアッセイにおけるＥＣ５０が、１９０ｐＭ以下、例えば１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、もしくはさらにはそれ未満、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０未満、もしくはさらにはそれ未満、例えば１６ｐＭ未満であり、および／または、
ポリペプチドが、競合ＦＡＣＳにおいて決定されたときに、最大１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくはさらには最大２ｎＭ、例えば１ｎＭのＩＣ５０によりＣＤ３８と結合し、および／または、
前記ポリペプチドが、好ましくは競合ＦＡＣＳにおいて決定されたときに、ベンチマークのＩＣ５０よりも、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％もしくはさらには１００％良好なＩＣ５０によりＣＤ３８と結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ＣＤ３８と結合できる少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤが異なる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ＣＤ３８と結合できる少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤがＣＤ３８上の異なるエピトープと結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
少なくとも２つのＩＳＶＤが互いに直接連結するか、またはリンカーを介して互いに連結する、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
リンカーが、配列番号４８２〜４９４に記載のリンカーの群から選択される、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
さらに、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結される１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、かかる基、残基、部分または結合単位のない対応するポリペプチドと比較し増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
１つ以上の増加した半減期を有するポリペプチドを提供する他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質と結合できる結合単位、Ｆｃ部、抗体定常ドメイン、および血清タンパク質と結合できる小タンパク質またはペプチド、からなる群から選ばれる、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
薬剤、例えば毒素もしくは毒素部分、またはイメージング剤をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＩＳＶＤが、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよびラクダ化ＶＨからなる群から選ばれる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
さらにＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが、直接連結するかまたはリンカーを介して連結する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の第１のポリペプチドと、請求項２４または２５に記載の第２のポリペプチドと、を含み、前記ポリペプチドのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが、Ｆｃ部を形成する、イムノグロブリン構築物。
【請求項２７】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが同じである、請求項２６に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項２８】
第１のポリペプチドのＣＨ２ドメインが、第２のポリペプチドのＣＨ２ドメインと対をなし、および／または、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインが、第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインと対をなす、請求項２６または２７に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項２９】
第１のポリペプチドが、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含み、第２のポリペプチドが、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３０】
第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項２９に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３１】
第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項２９に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３２】
第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、請求項２９に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３３】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが同じである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３４】
第１のＩＳＶＤがＣＤ３８の第１のエピトープと結合し、第２のＩＳＶＤがＣＤ３８上の第２のエピトープと結合し、前記第１のエピトープが前記第２のエピトープと異なり、好ましくは前記第１のエピトープが前記第２のエピトープと重複しない、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３５】
薬剤、例えば毒素もしくは毒素部分、またはイメージング剤をさらに含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物。
【請求項３６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物を含む医薬組成物。
【請求項３７】
ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患の治療的処置方法に用いられる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物、または請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
高増殖性疾患または自己免疫性疾患の治療的処置方法に用いられる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物、または請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性的リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性的骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ＣＤ３８発現固形腫瘍、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、グレーブス病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、水疱性類天疱瘡、糸球体腎炎、脈管炎または喘息、バラケル・サイモンズ（Ｂａｒｒａｑｕｅｒ−Ｓｉｍｏｎｓ）症候群、自己免疫心疾患、炎症性腸疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、非定型溶血性尿毒症症候群および虚血再灌流傷害および移植臓器の拒絶の治療的処置方法に用いられる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のイムノグロブリン構築物、または請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載の核酸分子または請求項４１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４３】
（ａ）請求項４０に記載の核酸分子の発現を可能にする条件下で、請求項４２に記載の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）培養物からポリペプチドを単離することと、を含む、
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドの組換え産生方法。
【請求項４４】
−配列番号１〜５８により表されるポリペプチドの存在下で、ＣＤ３８への競合阻害剤ポリペプチドの結合を決定することと、
−前記競合阻害剤ポリペプチドのＣＤ３８に対する結合が、配列番号１〜５８により表されるポリペプチドの非存在下での、ＣＤ３８への競合阻害剤の結合と比較し、配列番号１〜５８により表されるポリペプチドの存在下で、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、４０％、５０％またはさらにはそれ以上、例えば８０％、９０％またはさらには１００％減少する競合阻害剤ポリペプチドを検出することと、
を含む、
配列番号１〜５８により表されるポリペプチドと競合する競合阻害剤ポリペプチドを決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクダ科の重鎖抗体のＶＨＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む抗原結合性ポリペプチドに関する。ポリペプチドは、特異的にＣＤ３８と結合し、したがって、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患の診断、ならびに治療的および予防的処置に好適である。抗原結合性ポリペプチドを含むコンジュゲートおよび医薬組成物もまた開示される。加えて、本発明は、生体試料におけるＣＤ３８および／またはＣＤ３８発現細胞の検出方法への、かかる抗原結合性ポリペプチドの使用に関する。抗原結合性ポリペプチドが用いられる、ＣＤ３８および／またはＣＤ３８発現細胞の精製および濃縮プロセスもまた記載される。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面マーカーＣＤ３８は、約４２ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、免疫系細胞の、また他の細胞の表面にも発現する（１）。ＣＤ３８は、短い細胞内Ｎ末端ドメインと、膜貫通ヘリックスと、タンパク質のＣ末端に位置する長い細胞外ドメインと、からなる（２）。
【０００３】
ＣＤ３８は多機能酵素であり、二次メッセンジャーであるＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）およびサイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）の合成の重要なステップが触媒される。これらのシグナル分子は、細胞内Ｃａ２＋レベルの調節に関与する（３〜５）。さらに、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼとの相互作用の際、ＣＤ３８は、免疫応答を調節しうることがさらに示唆されている（６）。そのリガンドであるＣＤ３１との結合により、ＣＤ３８によるサイトカインのさらなる増加が誘導される（７）。
【０００４】
ＣＤ３８は、多くの造血障害において上方制御されることが知られている。例えば、ＣＤ３８は、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫の細胞表面上、ならびに白血病の経過で出現する様々な細胞において高いレベルで発現することが知られている。臨床的には、ＣＤ３８の存在は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）のマーカーとして、既にルーチン的に用いられている（８）。ＣＬＬにおいては、Ｂリンパ球の強い増大が見られる（９）。高レベルのＣＤ３８は、予後不良のＣＬＬ患者のマーカーである。ＣＤ３８は、Ｂリンパ球の増殖および増大に影響すると考えられる（８）。
【０００５】
また、ＨＩＶ−Ｉ感染の場合、ＣＤ３８は予後マーカーである。Ｔ細胞上でのＣＤ３８の発現増加は、疾患進行の指標である一方、発現減少は、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）治療の有効性の指標とみなされている（１０）。診断および治療に使用可能であるＣＤ３８に対するモノクローナル抗体は、従来技術で周知である（８）。ヒト抗ＣＤ３８抗体は現在、多発性骨髄腫の処置のフェーズＩおよびＩＩの臨床試験中である。参照文献（１１〜１３）では、癌または自己免疫性疾患の処置における、アポトーシスによる、または細胞傷害性機構によるＣＤ３８発現細胞を除去するＣＤ３８特異的抗体の使用が開示されている。
【０００６】
ヒト医療分野におけるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の使用の短所は、それらの投与後の安定性がしばしば不十分であることに起因する。加えて、モノクローナル抗体の製造に要する経費は非常に高い。特にヒト化抗体は、ヒトへの使用に好適であるために低免疫原性であるべきであるが、その調製は労働およびコスト集約的である。加えて、丸ごとの抗体は、それらのサイズ上の理由から組織への浸透性が限られる。したがって、治療におけるそれらの欠点のかなりの改善が、効率面および経済面で現実的な療法のためには必要となる。
【０００７】
従来技術において、抗体の投与の課題に関連する課題を解決するための幾つかのストラテジーが開発されている。これらのストラテジーは主に、完全ＩｇＧ抗体の断片の使用に基づくものである。例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２が治療目的で用いられている。しかしながら、これらの断片はしばしば、完全抗体と比較し抗原に対する特異性および／または親和性が低くなる。さらにその上に、これらの断片はしばしば、水溶液への低い溶解性のみを示す。
【０００８】
したがって、可溶性で、製造が容易で、容易に組織を透過し標的と結合する、改善された薬剤に対するニーズが存在する。
【０００９】
補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）の次に、癌に対する最適な治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の機能にとり非常に重要な機構であり（Beum et al. 2008 J. Immunology 181:822-832）、このエフェクター機能は、化学療法の処置後であっても完全に保存される。ＣＤＣ活性は、抗体のＦｃ部分によって媒介される。しかしながら、この活性は幾つかの抗体によっては生じる（Manches et al. 2003 Blood 101:949-954）が、その全てによって生じるわけではない（Cardarelli et al. 2002 Cancer Immunology, Immunotherapy 51: 15-24、Wang et al. 2004 Angiogenesis 7:335-345）。一般的に、Ｆｃ部を欠く抗体断片はＣＤＣ活性を媒介しない。
【００１０】
Ｆｃ部に連結されたイムノグロブリン単一可変ドメインを含む構築物が公知である。例えば、欧州特許出願公開第０６９８０９７号およびHamers-Castermanら(Nature 1993, June 3; 363 (6428): 446-8)に記載されるように、ラクダ科動物からの天然の「重鎖抗体」は、ヒンジ領域を介してＦｃ部に連結される天然の単一可変ドメイン（「ＶＨＨドメイン」と称される）を含む。興味深いことに、これらの参照文献のさらなる記載によると、これらの重鎖抗体は従来の４鎖型抗体に存在するＣＨ１ドメインを欠き、ＶＨＨが、ヒンジを介してＦｃ部のＣＨ２ドメインに直接連結されている。Ablynx NV名による国際公開第２００９／０６８６３０号は、ヒトＦｃ部に連結されうる、結合特性の改善された様々なＩＳＶＤを記載している。
【００１１】
ラクダ科動物の重鎖のみの抗体に由来するＣＤ３８特異的なナノボディおよびＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質が、Fumeyら(PEGS Europe November 2014ポスター)に記載されている。著者は、これらのナノボディがインビボでＣＤ３８を発現する腫瘍を検出することを示している。その上に、ナノボディ−Ｆｃ融合タンパク質は強力な補体依存性細胞傷害性を示す。
【００１２】
有効な免疫療法は、特異的に標的と結合し、同時にＣＤＣを活性化させるべきである。しかしながら、現在まで得られた結果は、抗ＣＤ３８ナノボディ−Ｆｃ融合タンパク質が免疫療法に有用であることを確立した一方で、特定のナノボディによって標的とされるＣＤ３８上のいずれのエピトープが特に治療目的に有利なのかは不明なままである。このように、抗ＣＤ３８ＩＳＶＤを治療的に効果的にする具体的な機能特性に対するさらなる洞察に対するニーズ、ならびに、様々なタイプの癌および他の状態、例えば炎症性疾患の処置により有効である改善された治療用ＣＤ３８結合剤に対するニーズが存在する。さらに、改善された診断法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、様々なＣＤ３８のエピトープと特異的に結合できるＩＳＶＤを初めて提供するものである。ＩＳＶＤにより認識されるエピトープ、すなわちエピトープ１（「Ｅ１」）、エピトープ２、（「Ｅ２」）およびエピトープ３（「Ｅ３」）が重複しないことが、エピトープビニング実験で明らかとなった。エピトープ１およびエピトープ３と結合するＩＳＶＤを組み合わせることで、ＩＳＶＤ個々と比べて相乗効果が示された。その上に、この組合せはベンチマークを上回った。立体配置的な制限にもかかわらず、エピトープ１およびエピトープ３と結合するＩＳＶＤを含むバイパラトピック（biparatopic）な構築物が、個々のＩＳＶＤの対応する組合せと同様の効果を示した。様々な幅広いＣＤ３８発現腫瘍細胞株ならびにヒト患者に由来する腫瘍細胞に対して、バイパラトピックなＦｃ構築物が有効であることもまた示された。予想外にも、少なくとも１つのＩＳＶＤがエピトープ２と結合するＩＳＶＤの組合せ（例えばＥ２およびＥ１の組合せまたはＥ２およびＥ３の組合せ）は、かかるＩＳＶＤが欠如する組合せ（例えば組合せＥ１＋Ｅ３）を上回ることを見出した。
【００１４】
本発明のＩＳＶＤは特に、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる障害の診断において、および／または治療的処置への使用に好適である。
【００１５】
したがって、本発明は、２００ｐＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３８と特異的に結合する少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関し、好ましくは前記ＩＳＶＤが腫瘍細胞増殖を阻害する。さらにより好ましくは、前記ＣＤ３８はヒトＣＤ３８（配列番号４６５）である。
【００１６】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１１７〜１７４、および
（ｂ）配列番号１１７〜１７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３〜２９０、および
（ｄ）配列番号２３３〜２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９〜４０６、および
（ｆ）配列番号３４９〜２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００１７】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００１８】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００１９】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００２０】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記ＩＳＶＤが、
−ＣＤＲ１が配列番号１１７〜１７４により表され、ＣＤＲ２が配列番号２３３〜２９０により表され、ＣＤＲ３が配列番号３４９〜４０６により表されるＩＳＶＤ、
−配列番号１〜５８により表されるＩＳＶＤ、および、
−配列番号１〜５８のいずれか１つと少なくとも８０％以上の配列同一性により表されるＩＳＶＤ、
からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００２１】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記ＣＤＲが、以下からなる群から選択される：
ＣＤＲ１が配列番号１１７であり、ＣＤＲ２が配列番号２３３であり、ＣＤＲ３が配列番号３４９である、
ＣＤＲ１が配列番号１１８であり、ＣＤＲ２が配列番号２３４であり、ＣＤＲ３が配列番号３５０である、
ＣＤＲ１が配列番号１１９であり、ＣＤＲ２が配列番号２３５であり、ＣＤＲ３が配列番号３５１である、
ＣＤＲ１が配列番号１２０であり、ＣＤＲ２が配列番号２３６であり、ＣＤＲ３が配列番号３５２である、
ＣＤＲ１が配列番号１２１であり、ＣＤＲ２が配列番号２３７であり、ＣＤＲ３が配列番号３５３である、
ＣＤＲ１が配列番号１２２であり、ＣＤＲ２が配列番号２３８であり、ＣＤＲ３が配列番号３５４である、
ＣＤＲ１が配列番号１２３であり、ＣＤＲ２が配列番号２３９であり、ＣＤＲ３が配列番号３５５である、
ＣＤＲ１が配列番号１２４であり、ＣＤＲ２が配列番号２４０であり、ＣＤＲ３が配列番号３５６である、
ＣＤＲ１が配列番号１２５であり、ＣＤＲ２が配列番号２４１であり、ＣＤＲ３が配列番号３５７である、
ＣＤＲ１が配列番号１２６であり、ＣＤＲ２が配列番号２４２であり、ＣＤＲ３が配列番号３５８である、
ＣＤＲ１が配列番号１２７であり、ＣＤＲ２が配列番号２４３であり、ＣＤＲ３が配列番号３５９である、
ＣＤＲ１が配列番号１２８であり、ＣＤＲ２が配列番号２４４であり、ＣＤＲ３が配列番号３６０である、
ＣＤＲ１が配列番号１２９であり、ＣＤＲ２が配列番号２４５であり、ＣＤＲ３が配列番号３６１である、
ＣＤＲ１が配列番号１３０であり、ＣＤＲ２が配列番号２４６であり、ＣＤＲ３が配列番号３６２である、
ＣＤＲ１が配列番号１３１であり、ＣＤＲ２が配列番号２４７であり、ＣＤＲ３が配列番号３６３である、
ＣＤＲ１が配列番号１３２であり、ＣＤＲ２が配列番号２４８であり、ＣＤＲ３が配列番号３６４である、
ＣＤＲ１が配列番号１３３であり、ＣＤＲ２が配列番号２４９であり、ＣＤＲ３が配列番号３６５である、
ＣＤＲ１が配列番号１３４であり、ＣＤＲ２が配列番号２５０であり、ＣＤＲ３が配列番号３６６である、
ＣＤＲ１が配列番号１３５であり、ＣＤＲ２が配列番号２５１であり、ＣＤＲ３が配列番号３６７である、
ＣＤＲ１が配列番号１３６であり、ＣＤＲ２が配列番号２５２であり、ＣＤＲ３が配列番号３６８である、
ＣＤＲ１が配列番号１３７であり、ＣＤＲ２が配列番号２５３であり、ＣＤＲ３が配列番号３６９である、
ＣＤＲ１が配列番号１３８であり、ＣＤＲ２が配列番号２５４であり、ＣＤＲ３が配列番号３７０である、
ＣＤＲ１が配列番号１３９であり、ＣＤＲ２が配列番号２５５であり、ＣＤＲ３が配列番号３７１である、
ＣＤＲ１が配列番号１４０であり、ＣＤＲ２が配列番号２５６であり、ＣＤＲ３が配列番号３７２である、
ＣＤＲ１が配列番号１４１であり、ＣＤＲ２が配列番号２５７であり、ＣＤＲ３が配列番号３７３である、
ＣＤＲ１が配列番号１４２であり、ＣＤＲ２が配列番号２５８であり、ＣＤＲ３が配列番号３７４である、
ＣＤＲ１が配列番号１４３であり、ＣＤＲ２が配列番号２５９であり、ＣＤＲ３が配列番号３７５である、
ＣＤＲ１が配列番号１４４であり、ＣＤＲ２が配列番号２６０であり、ＣＤＲ３が配列番号３７６である、
ＣＤＲ１が配列番号１４５であり、ＣＤＲ２が配列番号２６１であり、ＣＤＲ３が配列番号３７７である、
ＣＤＲ１が配列番号１４６であり、ＣＤＲ２が配列番号２６２であり、ＣＤＲ３が配列番号３７８である、
ＣＤＲ１が配列番号１４７であり、ＣＤＲ２が配列番号２６３であり、ＣＤＲ３が配列番号３７９である、
ＣＤＲ１が配列番号１４８であり、ＣＤＲ２が配列番号２６４であり、ＣＤＲ３が配列番号３８０である、
ＣＤＲ１が配列番号１４９であり、ＣＤＲ２が配列番号２６５であり、ＣＤＲ３が配列番号３８１である、
ＣＤＲ１が配列番号１５０であり、ＣＤＲ２が配列番号２６６であり、ＣＤＲ３が配列番号３８２である、
ＣＤＲ１が配列番号１５１であり、ＣＤＲ２が配列番号２６７であり、ＣＤＲ３が配列番号３８３である、
ＣＤＲ１が配列番号１５２であり、ＣＤＲ２が配列番号２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号３８４である、
ＣＤＲ１が配列番号１５３であり、ＣＤＲ２が配列番号２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号３８５である、
ＣＤＲ１が配列番号１５４であり、ＣＤＲ２が配列番号２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号３８６である、
ＣＤＲ１が配列番号１５５であり、ＣＤＲ２が配列番号２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号３８７である、
ＣＤＲ１が配列番号１５６であり、ＣＤＲ２が配列番号２７２であり、ＣＤＲ３が配列番号３８８である、
ＣＤＲ１が配列番号１５７であり、ＣＤＲ２が配列番号２７３であり、ＣＤＲ３が配列番号３８９である、
ＣＤＲ１が配列番号１５８であり、ＣＤＲ２が配列番号２７４であり、ＣＤＲ３が配列番号３９０である、
ＣＤＲ１が配列番号１５９であり、ＣＤＲ２が配列番号２７５であり、ＣＤＲ３が配列番号３９１である、
ＣＤＲ１が配列番号１６０であり、ＣＤＲ２が配列番号２７６であり、ＣＤＲ３が配列番号３９２である、
ＣＤＲ１が配列番号１６１であり、ＣＤＲ２が配列番号２７７であり、ＣＤＲ３が配列番号３９３である、
ＣＤＲ１が配列番号１６２であり、ＣＤＲ２が配列番号２７８であり、ＣＤＲ３が配列番号３９４である、
ＣＤＲ１が配列番号１６３であり、ＣＤＲ２が配列番号２７９であり、ＣＤＲ３が配列番号３９５である、
ＣＤＲ１が配列番号１６４であり、ＣＤＲ２が配列番号２８０であり、ＣＤＲ３が配列番号３９６である、
ＣＤＲ１が配列番号１６５であり、ＣＤＲ２が配列番号２８１であり、ＣＤＲ３が配列番号３９７である、
ＣＤＲ１が配列番号１６６であり、ＣＤＲ２が配列番号２８２であり、ＣＤＲ３が配列番号３９８である、
ＣＤＲ１が配列番号１６７であり、ＣＤＲ２が配列番号２８３であり、ＣＤＲ３が配列番号３９９である、
ＣＤＲ１が配列番号１６８であり、ＣＤＲ２が配列番号２８４であり、ＣＤＲ３が配列番号４００である、
ＣＤＲ１が配列番号１６９であり、ＣＤＲ２が配列番号２８５であり、ＣＤＲ３が配列番号４０１である、
ＣＤＲ１が配列番号１７０であり、ＣＤＲ２が配列番号２８６であり、ＣＤＲ３が配列番号４０２である、
ＣＤＲ１が配列番号１７１であり、ＣＤＲ２が配列番号２８７であり、ＣＤＲ３が配列番号４０３である、
ＣＤＲ１が配列番号１７２であり、ＣＤＲ２が配列番号２８８であり、ＣＤＲ３が配列番号４０４である、
ＣＤＲ１が配列番号１７３であり、ＣＤＲ２が配列番号２８９であり、ＣＤＲ３が配列番号４０５である、
ＣＤＲ１が配列番号１７４であり、ＣＤＲ２が配列番号２９０であり、ＣＤＲ３が配列番号４０６である、ポリペプチドに関する。
【００２２】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、各々が２００ｐＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３８に特異的に結合する第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含む、ポリペプチドに関する。
【００２３】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００２４】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００２５】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００２６】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、
−ＦＡＣＳアッセイにおけるＥＣ５０が１９０ｐＭ以下であり、例えば１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００ｐＭ未満、もしくはさらにはそれ未満、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０ｐＭ未満、もしくはさらにはそれ未満、例えば１６ｐＭ未満であり、および／または、
−前記ポリペチドが、好ましくは競合ＦＡＣＳで決定されたとき、最大１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくはさらには最大２ｎＭ、例えば１ｎＭのＩＣ５０によりＣＤ３８と結合し、および／または、
−前記ポリペチドが、好ましくは競合ＦＡＣＳで決定されたとき、ベンチマークのＩＣ５０よりも、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、またはさらには１００％良好なＩＣ５０によりＣＤ３８と結合する、ポリペプチドに関する。
【００２７】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、ＣＤ３８と結合できる少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤが異なる、ポリペプチドに関する。
【００２８】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、ＣＤ３８と結合できる少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤがＣＤ３８上の異なるエピトープと結合する、ポリペプチドに関する。
【００２９】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記少なくとも２つのＩＳＶＤが互いに直接連結するか、またはリンカーを介して互いに連結する、ポリペプチドに関する。
【００３０】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、リンカーが配列番号４８２〜４９４を有するリンカーの群から選択される、ポリペプチドに関する。
【００３１】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、さらに、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結される１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、ポリペプチドに関する。
【００３２】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、かかる基、残基、部分または結合単位のない対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、ポリペプチドに関する
【００３３】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記１つ以上の増加した半減期を有するポリペプチドを提供する他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質と結合できる結合単位、Ｆｃ部、抗体定常ドメイン、ならびに血清タンパク質と結合できる小分子タンパク質またはペプチドからなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００３４】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、薬剤、例えば毒素もしくは毒素部分、またはイメージング剤をさらに含む、ポリペプチドに関する。
【００３５】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記ＩＳＶＤが、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよびラクダ化ＶＨからなる群から選ばれる、ポリペプチドに関する。
【００３６】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインをさらに含む、ポリペプチドに関する。
【００３７】
したがって、本発明は、本明細書に記載される、前記ＣＨ２および前記ＣＨ３ドメインが、直接連結するかまたはリンカーを介して連結する、ポリペプチドに関する。
【００３８】
さらなる特に好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載される第１のポリペプチドおよび本明細書に記載される第２のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドの前記ＣＨ２ドメインおよび前記ＣＨ３ドメインがＦｃ部を形成する、イムノグロブリン構築物に関する。
【００３９】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが同じである、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４０】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ２ドメインが前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ２ドメインと対をなし、および／または前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインが前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと対をなす、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４１】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のポリペプチドが、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含み、前記第２のポリペプチドが、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含む、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４２】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４３】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４４】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれ、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選ばれる、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４５】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが同じである、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４６】
また、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤがＣＤ３８の第１のエピトープと結合し、前記第２のＩＳＶＤがＣＤ３８上の第２のエピトープと結合し、前記第１のエピトープが前記第２のエピトープと異なり、好ましくは前記第１のエピトープが前記第２のエピトープと重複しない、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４７】
また、本発明は、本明細書に記載される、薬剤、例えば毒素もしくは毒素部分、またはイメージング剤をさらに含む、イムノグロブリン構築物にも関する。
【００４８】
加えて、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドまたは本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物を含む、医薬組成物に関する。
【００４９】
本発明は、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患の治療的処置方法に用いられる、本明細書に記載されるポリペプチド、本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物または本明細書に記載される医薬組成物に関する。
【００５０】
本発明は、高増殖性疾患または自己免疫性疾患の治療的処置方法に用いられる、本明細書に記載されるポリペプチド、本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物または本明細書に記載される医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明は、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性的リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性的骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ＣＤ３８発現固形腫瘍、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、グレーブス病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、水疱性類天疱瘡、糸球体腎炎、脈管炎または喘息、バラケル・サイモンズ（Barraquer-Simons）症候群、自己免疫心疾患、炎症性腸疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、非定型溶血性尿毒症症候群および虚血再灌流傷害および移植臓器の拒絶の治療的処置の方法に用いられる、本明細書に記載されるポリペプチド、本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物または本明細書に記載される医薬組成物に関する。
【００５２】
また、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸分子にも関する。
【００５３】
また、本発明は、本明細書に記載される核酸分子を含む発現ベクターにも関する。
【００５４】
また、本発明は、本明細書に記載される核酸分子または本明細書に記載される発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００５５】
また、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドの組換え産生のための方法にも関し、
（ａ）本明細書に記載される核酸分子の発現を可能にする条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養することと、
（ｂ）培養物からポリペプチドを単離することと、を含む。
【００５６】
また、本発明は、配列番号１〜５８により表されるポリペプチドと競合する競合阻害剤ポリペプチドを決定する方法にも関し、
−配列番号１〜５８により表されるポリペプチドの存在下で、ＣＤ３８への前記競合阻害剤ポリペプチドの結合を決定することと、
−配列番号１から５８により表されるポリペプチドの非存在下での、ＣＤ３８への競合阻害剤の結合と比較し、配列番号１〜５８により表されるポリペプチドの存在下で、前記競合阻害剤ポリペプチドのＣＤ３８に対する結合が、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、４０％、５０％またはさらにはそれ以上、例えば８０％、９０％またはさらには１００％減少する競合阻害剤ポリペプチドを検出することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】イムノグロブリン構築物の例を示す模式図。この場合、構築物は２つのポリペプチド（１）および（２）を含み、各々が２つの定常ドメイン（７）および（８）、「第１の」ＩＳＶＤ（３）ならびに「第２の」ＩＳＶＤ（４）を含む。第１のＩＳＶＤ（３）は、任意に好適なリンカー（５）を介して第２のＩＳＶＤ（４）に連結し、また任意に（かつ通常は）好適なリンカーまたはヒンジ領域（６）を介して定常ドメインにも連結する。ポリペプチド（１）の定常ドメイン（７）および（８）、ならびにポリペプチド鎖（２）の対応する定常ドメイン（７）および（８）が、一緒になってＦｃ部（９）を形成する。
【図２Ａ】（Ａ）ＣＤ３８特異的ナノボディが解離速度を低いｎＭ域において示す。ヒト血液５０μＬのサンプルを、ＲＴで３０分間、連続タイトレーションされた、精製された一価のナノボディとインキュベートした。細胞を二回洗浄し、結合したＮｂをＦＩＴＣコンジュゲート抗ｃ−ｍｙｃ（９Ｅ１０）により検出した。
【図２Ｂ】Ｔ細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３により染色した。赤血球を溶解させ、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。リンパ球およびＣＤ３陰性細胞においてゲーティングを実施した。
【図２Ｃ】（Ｂ）ＦＡＣＳ分析により、血液中の白血球上のＣＤ３８へのＶＨＨの結合を確認する（ＣＤ１６＋ＮＫ細胞およびＣＤ１９ｉｎｔＢ細胞のサブセット）。
【図３】補体の給源としての２０％のプールされたヒト血清の存在下、図３に示すように、ＬＰ−１骨髄腫細胞を３７℃で１ｈ、２μｇのＦｃ融合タンパク質とインキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みから細胞死を決定した。
【図４】組合せ対個別の構築物のタイトレーション。補体の給源としてのプールされたヒト血清の存在下、ＬＰ−１骨髄腫細胞を３７℃で２ｈ、異なる濃度のイムノグロブリン構築物とインキュベートした。ヨウ化プロピジウムによる染色から細胞死を決定した。
【図５】別々のエピトープを認識するＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質の組合せが、ＣＡ４６リンパ腫細胞に対し強力な細胞傷害性を示す：ＫＳＶ０３７（Ａ）、ＫＳＶ０６４（Ｂ）。ＣＡ４６リンパ腫細胞を４℃で２０ｍｉｎ、ダラツムマブｓｃＦｖ−Ｆｃと、個々のＮｂ−Ｆｃ（２μｇ／１２０μＬ）と、または２つのＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質（各１μｇ）の組合せと（Ａ）、またはＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質およびダラツムマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（各１μｇ）の組合せと（Ｂ）、インキュベートし、その後、２０μＬの天然ヒト血清または不活性化ヒト血清（５６℃で３０ｍｉｎインキュベートして補体成分を不活性化）のいずれかを追加した。細胞を３７℃で６０ｍｉｎさらにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ヨウ化プロピジウム中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
【図６Ａ】（Ａ）バイパラトピックイムノグロブリン構築物が、初代骨髄腫細胞（ＫＳＶ１２３）に対し強力な細胞傷害性を示す。ミエローマ患者からの初代骨髄細胞をフィコール密度勾配遠心により精製し、洗浄し、４℃で１０ｍｉｎ、ダラツムマブｓｃＦｖ、バイパラトピックＮｂ−Ｎｂ２１１−１０ＧＳ−１２１Ｆｃ融合タンパク質または無関係対照Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質（各２μｇ／１２０μＬ）、または２１１Ｎｂ−Ｆｃおよび１２１Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質（各１μｇ／１２０μＬ）の組合せとインキュベートし、その後１０μＬのヒト血清を追加した。細胞を３７℃で６０ｍｉｎさらにインキュベートし、洗浄し、蛍光色素コンジュゲートしたＣＤ５６、ＣＤ４５に対するｍＡｂまたは適切なＣＤ３８特異的Ｎｂ（Ｎｂ−Ｆｃ融合物のものとは独立した別のものと結合）を用い４℃で６０ｍｉｎ対比染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ヨウ化プロピジウム中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。骨髄腫細胞のＰＩ染色を、ＣＤ５６＋／ＣＤ４５ｌｏ細胞のゲーティングにより評価した。
【図６Ｂ】（Ｂ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＤａｒａｓｃＦｖ）および完全ＩｇＧ（ダラツムマブＨ＋Ｌ）のフォーマットにおける、ダラツムマブと比較したバイパラトピック抗ＣＤ３８ＶＨＨ−Ｆｃ構築物のＣＤＣ。数値はＰＩ陽性細胞の％を示す。
【図７】バイパラトピックイムノグロブリン構築物は、補体因子Ｃ１ｑとの高い結合能を示す。
【図８】バイパラトピックイムノグロブリン構築物は、広範囲な癌に対して細胞傷害性である。
【図９】様々なエピトープと結合するバイパラトピックイムノグロブリン構築物が、ベンチマークよりも細胞傷害性である。
【図１０】Ａｌｅｘａ６８０コンジュゲートナノボディは、インビボでＣＤ３８＋腫瘍を優良に区別する。Ａ）Ｎｂ注入前、ならびに１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈおよび４８ｈ後に光学的分子イメージングを実施した。同一の量のシグナル強度を全て等しいレベルにし、適正な目視比較を可能にした。腫瘍より下のシグナルが腎臓に対応する。尾部および足部のシグナルは、おそらく標識Ｎｂを含む尿との接触を反映する。Ｂ）ＣＤ３８陽性およびＣＤ３８陰性腫瘍のＴ／Ｂ比を、目的領域（ＲＯＩ）から決定した。半定量分析における、腫瘍および正常組織（後肢）の周辺のＲＯＩを描画した。バックグラウンドシグナルを腫瘍周辺のＲＯＩの放射効率から減算することによって、ＣＤ３８陽性およびＣＤ３８陰性腫瘍のＴ／Ｂ比率を算出した。Ｔ／Ｂ比率を時間の関数としてプロットする。
【図１１−１】２８種の一価の精製された抗ＣＤ３８ＶＨＨおよびベンチマークとしてのダラツムマブｓｃＦｖによる、Octet RED384（ForteBio）の生物発光分析による、タンデムなエピトープビニング解析のセンサーグラム。第２のアナライトの会合および解離のセンサーグラムを記録した。結合捕捉レベルを、ロードの終わりに１０秒間の時間枠にて評価した。Ｗａｒｄの方法に従い、非階層的なクラスター形成を行った。
【図１１−２】２８種の一価の精製された抗ＣＤ３８ＶＨＨおよびベンチマークとしてのダラツムマブｓｃＦｖによる、Octet RED384（ForteBio）の生物発光分析による、タンデムなエピトープビニング解析のセンサーグラム。第２のアナライトの会合および解離のセンサーグラムを記録した。結合捕捉レベルを、ロードの終わりに１０秒間の時間枠にて評価した。Ｗａｒｄの方法に従い、非階層的なクラスター形成を行った。
【図１２】抗ＣＤ３８ＶＨＨ−Ｆｃと、ダラツムマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（ダラツムマブｈｃ）および完全ＩｇＧフォーマット（ダラツムマブＨ＋Ｌ）との組合せによりＣＤＣを測定した。ダラツママブとは異なるエピトープを認識するＶＨＨ−Ｆｃは、フォーマットに関係なく、ダラツムマブｈｃおよびダラツムマブＨ＋ＬのいずれのＣＤＣをも増強する。ファミリー数を「ｆ」で示す。
【図１３】ＣＤ３８のＧＤＰＲシクラーゼ活性に対する抗ＣＤ３８ＶＨＨの効果。Ａ）ＣＤ３８のＧＤＰＲシクラーゼ活性を阻害するかまたは強化する、様々なＶＨＨの濃度における蛍光のトレース。基質のより速い変換は、ＣＤ３８酵素感作および高い傾き（ＲＦＵ／ｓ）を示す一方、より遅い変換および低い傾きは、酵素活性の阻害を示す。Ｂ）４００ｎＭのＶＨＨの一回用量による、ＣＤ３８酵素活性の阻害または強化。白色のバーはエピトープ２ＶＨＨを、灰色はエピトープ１を、黒のバーはエピトープ３を示す。
【図１４】ＣＤ３８のｃＧＤＰＲシクラーゼ活性の強化または阻害に対する、抗ＣＤ３８ＶＨＨの組合せの相乗効果。
【図１５】ダラツムマブ（ダラツムマブＨ＋Ｌ）と比較した、バイパラトピック抗ＣＤ３８ＶＨＨのＡＤＣＣ活性。ＣＤ３８＋ＣＡ４６細胞を標的細胞として用いた。ＣＤ１６をトランスフェクションしたＮＫ９２エフェクター細胞対標的細胞の比率が３：１となるよう、エフェクターを追加した。細胞殺傷を３時間後に評価した。
【図１６】ＣＤ３８＋ＣＡ４６同所異種移植モデルにおける、腫瘍成長および生存に対するバイパラトピックＣＤ３８ＶＨＨ−−ＦｃＷＦ２１１−１０ＧＳ−ＷＦ１２１−Ｆｃの効果。
【図１７】エピトープビニングの結果および交差ブロッキング分析の階層的クラスタリングにより定義されるＣＤ３８上のＶＨＨエピトープのベン図。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
特に記載または定義がない限り、使用する全ての用語は、当分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは当業者にとり明らかである。参照として、例えば標準的なハンドブック、例えばSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd. Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、F. Ausubelら（Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987）、Lewin（Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985）、Oldら（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981）、Roittら（Immunology (6th. Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001）、Roittら（Roitt's Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001）、およびJanewayら（Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005）、ならびに本明細書において引用される一般的な背景技術が挙げられる。
【００５９】
特に明記しない限り、具体的に詳細に記載しない全ての方法、ステップ、技術および操作は、当業者には明らかであるように、自体公知の方法で実施可能であり、実施された。参照として、例えば標準的なハンドブックおよび本明細書に記載の一般的背景技術、およびその中の引用参照文献、ならびに、例えば以下のレビュー：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000)、Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)が挙げられ、これらは、親和性成熟や、イムノグロブリンなどのタンパク質の特異性および他の所望の特性を改善するための他の技術などのタンパク質工学の技術を記載する。
【００６０】
本明細書で用いられる「配列」という用語（例えば「イムノグロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語中）は、一般的に、前後関係がより限定された解釈を必要としない限り、然るべきアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両者を包含すると理解すべきである。
【００６１】
アミノ酸残基は、標準的な３文字表記、または１文字表記でのアミノ酸コードにより示される。参照として、国際公開第０８／０２００７９号の４８ページの表Ａ−２が挙げられる。
【００６２】
核酸またはアミノ酸は、例えば、それが得られた反応媒体または培養培地と比較し、通常、前記給源または培地中で会合する、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、または少なくとも１つの混入物質、不純物もしくは微量成分などの少なくとも１つの他の成分からそれが分離されたとき、「（本質的に）単離された（形態）」と考えられる。特に少なくとも２倍に、特に少なくとも１０倍に、より具体的には少なくとも１００倍に、また最大で１０００倍以上に精製されたとき、核酸またはアミノ酸は「（本質的に）単離された」と考えられる。「（本質的に）単離された形態で」ある核酸またはアミノ酸は、好適なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などの好適な技術を使用して決定したときに、好ましくは本質的に均質である。
【００６３】
あるヌクレオチド配列またはアミノ配列が、それぞれ、別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を「含む」か、または「本質的に」別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列「からなる」といわれるときは、それぞれ、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、前者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に組み込まれていることを意味しうるが、このことはより通常には、それぞれ、前者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、その配列中に、それぞれ、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチを含むことを一般的に意味し、前者の配列が実際に生成されたまたは得られた方法とは無関係である（例えば、本明細書に記載されるいかなる好適な方法によるものであってもよい）。非限定的な例として、本発明のポリペプチドが、イムノグロブリン単一可変ドメインを含むといわれるときは、前記イムノグロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列中に組み込まれていることを意味しうるが、より通常には、本発明のポリペプチドが、その配列中にイムノグロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを一般的に意味し、本発明の前記ポリペプチドが生成されたまたは得られた方法とは無関係である。また、核酸またはヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むといわれるときは、挙げられている前者の核酸またはヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例えばポリペプチド）として発現されるとき、後者のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が前記発現産物の一部をなす（言い換えると、後者のヌクレオチド配列が、挙げられている前者のより大きな核酸またはヌクレオチド配列と同じ読み枠である）。
【００６４】
「本質的に、〜からなる」とは、本発明の方法で使用するイムノグロブリン単一可変ドメインが、正確に本発明のポリペプチドと同じであるか、または、イムノグロブリンの単一可変ドメインのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に、１〜２０アミノ酸残基、例えば１〜１０アミノ酸残基、好ましくは１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６アミノ酸残基などの限定された数のアミノ酸残基を有する本発明のポリペプチドに対応する。
【００６５】
２つ以上のヌクレオチド配列を比較する場合、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のヌクレオチド配列の対応する部位のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を、［第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数］で除算し、［１００％］で乗算することにより算出することができ、第１のヌクレオチド配列と比較し、第２のヌクレオチド配列のヌクレオチドの欠失、挿入、置換または追加は、単一ヌクレオチド（位置）の相違と考えられる。代替的には、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＮＣＢＩのＢｌａｓｔのｖ２．０などの配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズムを用いて、標準的な設定を用いて算出できる。配列同一性の程度を決定するための他の幾つかの技術、コンピューターアルゴリズムおよび設定は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号、欧州特許出願公開第０９６７２８４号、欧州特許出願公開第１０８５０８９号、国際公開第００／５５３１８号、国際公開第００／７８９７２号、国際公開第９８／４９１８５号および英国特許出願公開第２３５７７６８号に記載されている。通常、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを上記で概説した算出方法に従って決定する目的には、ヌクレオチド数の最も大きいヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、別のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
【００６６】
２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的には、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列間の「配列同一性」（また本明細書において「アミノ酸同一性」とも称される）のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列の対応する位置のアミノ酸残基と同一である第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の数］を、［第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］で乗算することにより算出することができ、第１のアミノ酸配列と比較し、第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の欠失、挿入、置換または追加は、単一アミノ酸残基（位置）の相違として、すなわち、本明細書で定義される「アミノ酸相違」と考えられる。代替的には、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を、例えば、ヌクレオチド配列の配列同一性の程度の決定に関して上記したような公知のコンピューターアルゴリズムを用いて、同様に標準的な設定を用いて算出することができる。通常、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを上記で概説した算出方法に従って決定する目的には、アミノ酸残基数の最も大きいアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、別のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
【００６７】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換、すなわち、アミノ酸残基が類似する化学構造を有する他のアミノ酸残基により置換され、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的性質にほとんど、または本質的に影響しないアミノ酸置換と一般的に称される置換を考慮できる。かかる保存的アミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号、英国特許出願公開第２３５７７６８号、国際公開第９８／４９１８５号、国際公開第００／４６３８３号および国際公開第０１／０９３００号から当分野において周知であり、またかかる置換の（好ましい）タイプおよび／または組合せは、国際公開第０４／０３７９９９号および国際公開第９８／４９１８５号、ならびにその中のさらなる引用参照文献の該当する教示を基礎として選択することができる。
【００６８】
かかる保存的置換は、好ましくは、以下のグループ（ａ）〜（ｅ）中の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基により置換される置換である。（ａ）小さい脂肪族、無極性または低極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性、負荷電残基およびそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｉｎ；（ｃ）極性、正荷電残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌおよびシステイン；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好適な保存的置換は、以下の通りである。ＡｌａからＧｌｙ、またはＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ、またはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａ、またはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ、またはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ、またはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ、またはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｉｎ、またはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅの、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕ。
【００６９】
また、本明細書に記載されるポリペプチドに適用されるいずれかのアミノ酸置換は、Schulzらにより開発された、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度分析（Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978）、ChouおよびFasman により開発された構造形成ポテンシャル分析（Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978）、Eisenbergら（Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984）、KyteおよびDoolittle（J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981）ならびにGoldmanら（Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986）により開発されたタンパク質の疎水性パターン分析に基づいてもよく、これらの全内容を全て本明細書に参照により援用する。ナノボディの一次、二次および三次構造に関する情報は、本明細書の詳細な説明、および上で引用の一般的背景技術に記載されている。また、これに関して、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造が、例えばDesmyterら（Nature Structural Biology, 3: 803, 1996）、Spinelliら（Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996）およびDecanniereら（Structure, 7 (4): 361, 1999）に開示されている。従来公知のＶＨドメインにおいて、ＶＨ／ＶＬのインターフェースを形成する幾つかのアミノ酸残基およびそれらの位置における可能なラクダ化置換に関する詳しい情報が、上で引用の従来技術文献に存在する。
【００７０】
アミノ酸配列および核酸配列は、それらが全長において１００％の配列同一性（本明細書で定義される）を有する場合、「完全に同じ」であるものとする。
【００７１】
２つのアミノ酸配列を比較するとき、「アミノ酸の相違」という用語は、第１の配列内のある位置において、第２の配列と比較し、単一アミノ酸残基が挿入、欠失または置換されていることを指し、すなわち、２つのアミノ酸配列が、１つ、２つもしくはそれ以上のかかるアミノ酸の相違を含みうることが理解される。
【００７２】
「アミノ酸の相違」は、１、２、３または最大４つの置換、欠失、挿入またはそれらのいかなる組み合わせであってもよいが、それは本発明のポリペプチドの特性を改善するか、または少なくとも、本発明のポリペプチドの所望の特性、または所望の特性のバランスもしくは組合せを損なわないものである。この点、本発明の結果として得られるポリペプチドは少なくとも、１、２、３または最大４つの置換、欠失または挿入を有さない、１つ以上のＣＤＲ配列を含むポリペプチドと比較し、例えば親和性を表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に、同じ、ほぼ同じ、またはより高い親和性で、ＣＤ３８と結合すべきものである。
【００７３】
例えば、また本発明のポリペプチドの発現に用いる宿主生物に応じて、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（例えば１つ以上のグリコシル化部位）を除去するように、かかる欠失および／または置換を設計でき、それは当業者の技量の範囲内である。
【００７４】
本明細書にて用いられている「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」または「ファミリー」とは、同一の長さを有する（すなわち、それらの配列中に同数のアミノ酸を有する）一群のナノボディおよび／またはＶＨＨ配列であって、（Ｋａｂａｔ付番に従い）位置８から位置１０６間のアミノ酸配列が８９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を指す。
【００７５】
交換可能に用いられる用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、イムノグロブリン、通常の抗体、イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明に係るポリペプチドなどの抗原結合性分子により、より具体的には前記分子の抗原結合部位により認識される、ポリペプチドまたはタンパク質などの大分子中の部分のことを指す。エピトープは、イムノグロブリンのための最小限の結合部位を定め、それによりイムノグロブリンの特異的な標的を表す。
【００７６】
エピトープを認識する抗原結合性分子（例えば本発明のイムノグロブリン、通常抗体、イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）の部分は、「パラトープ」と称される。
【００７７】
特定のエピトープ、抗原、またはタンパク質（またはその少なくとも一部、断片もしくはエピトープ）と「結合する」ことができるか、「特異的に結合する」ことができるか、「親和性を有する」か、および／または「特異性を有する」ポリペプチド（本発明のイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または一般的な抗原結合分子またはその断片）は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質「に対する」または「を標的とする」と言われ、またはかかるエピトープ、抗原またはタンパク質に対する「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原または「抗」タンパク質（例えば「抗」ＣＤ３８）であると言われる。
【００７８】
「特異性」という用語は、国際公開第０８／０２００７９号の５３〜５６頁のパラグラフｎ）に記載の意味を有し、またその記載によると、特定の抗原結合性分子または抗原結合性タンパク質（例えば本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）と結合できる異なるタイプの抗原または抗原決定基の数のことを指す。国際公開第０８／０２００７９号（参照により本明細書に援用）の５３〜５６頁に記載のように、抗原結合性タンパク質の特異性は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定することができ、また同文献は、（本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドなどの）抗原結合性分子と該当する抗原との間の結合を測定するための幾つかの好ましい技術を記載している。典型的には、抗原結合性タンパク質（例えば本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチド）は、１０−５〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１０−７〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２Ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは１０７〜１０１２Ｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは１０８〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの会合定数（ＫＡ）により）それらの抗原と結合する。１０−４ｍｏｌ／Ｌ超のいかなるＫＤ値（または１０４Ｍ−１より低いいかなるＫＡ値）は一般的に、非特異的結合を示すものとして考えられる。好ましくは、本発明の一価のポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（例えば１０〜５ｎＭの間、またはそれ以下）の親和性で所望の抗原と結合する。抗原結合性タンパク質による抗原または抗原決定基への特異的な結合は、いかなる好適な自体公知の方法を用いても決定することができ、例えば、Scatchard分析または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ならびにサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当分野において公知のその変法、ならびに本明細書に記載の他の方法が挙げられる。当業者に明らかなように、また国際公開第０８／０２００７９号の５３〜５６頁に記載されるように、解離定数は実際であるかまたは見かけの解離定数でもよい。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えば国際公開第０８／０２００７９号の５３〜５６頁に記載の技術が含まれる。
【００７９】
イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドは、（上記のＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度および／またはＫｏｎ速度として好適に表した場合に）イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原と結合する場合と比較し、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍以上の親和性で、第１の抗原と結合するとき、第２の標的または抗原よりも第１の標的または抗原に「特異的である」ものとする。例えば、イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドは、前記イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原と結合する場合と比較し、少なくとも１０倍低いＫＤ値、例えば少なくとも１００倍低い、好ましくは少なくとも１０００倍低い、またはさらにはそれより低いＫＤ値で、第１の標的または抗原に結合しうる。好ましくは、イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはポリペプチドが、第２の標的または抗原と比較し第１の標的または抗原に「特異的である」というときは、それらが（本明細書で定義されるように）前記第１の標的または抗原に対するものであるが、前記第２の標的または抗原に対するものではないことをいう。
【００８０】
本明細書において交換可能に用いられる「（交差）ブロッキングする」、「（交差）ブロッキングされた」、「（交差）ブロッキング」、「競合的結合」、「（交差）競合する」および「（交差）競合すること」および「（交差）競合」の用語は、イムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤による、他のイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは結合剤による所定の標的への結合を妨げる能力を意味する。イムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤が、別のものの標的への結合を妨げることを可能にする程度、すなわち、本発明における交差ブロッキングをしうるか否かは、例えば競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上にディスプレイされたＩＳＶＤに対して精製されたＩＳＶＤのスクリーニングを行うなどの、競合的結合アッセイを用いて決定できる。あるＩＳＶＤのＣＤ３８への結合が、別のＩＳＶＤ（例えば競合ＥＬＩＳＡにおける精製ＩＳＶＤ）のＣＤ３８への結合と競合する場合、前記ＩＳＶＤは、同じエピトープビン（bin）に属し、例えばＣＤ３８上の同じまたは類似のエピトープと結合する。ＩＳＶＤのＣＤ３８への結合が、別のＩＳＶＤ（例えば競合ＥＬＩＳＡにおける精製ＩＳＶＤ）のＣＤ３８への結合と競合しないかまたは部分的に競合するのみである場合、前記ＩＳＶＤは、異なるエピトープビンに属し、例えばＣＤ３８上の同じまたは類似のエピトープと結合しない。特に好適な定量的交差ブロッキングアッセイとしては、例えば、細胞に発現させたＣＤ３８に対する、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）結合アッセイが挙げられる。（交差）ブロッキングの程度は、例えば（減少した）チャネル蛍光により測定することができる。
【００８１】
エピトープおよびエピトープビンは、ＩＳＶＤとＣＤ３８との複合体の結晶構造を（例えばＸ線結晶解析によって）解析することによって同定する（ならびにＩＳＶＤをエピトープビンに割り当てる）ことができる（参照として、例えばLi et al. 2016 Nature Sci. Rep. 6:27055/DOI:10.1038/srep27055が挙げられる）。一般的に、異なるエピトープビンに属するＩＳＶＤは、ＣＤ３８上の異なるアミノ酸残基と複合体を形成すると考えられる。しかしながら、異なるＩＳＶＤが、例えば本明細書に記載されるアッセイにおいて、各々競合しない場合、ＩＳＶＤは、これらのＩＳＶＤのＣＤ３８との複合体が、幾つかの（しかし全てでない）アミノ酸残基を共有しているとしても、異なるエピトープビンに割り当てられうることが理解される。
【００８２】
本発明において、ＣＤ３８に特異的なＩＳＶＤが３つの異なる非重複エピトープと本質的に結合することが明らかとなり、それらを仮に「エピトープ１」、「エピトープ２」および「エピトープ３」と命名し、それぞれのＩＳＶＤはまた、本明細書においては「エピトープ１ＩＳＶＤまたはＶＨＨ」、「エピトープ２ＩＳＶＤまたはＶＨＨ」、および「エピトープ３ＩＳＶＤまたはＶＨＨ」と命名する。ダラツムマブのエピトープは、図１７に示すようにエピトープ１ＩＳＶＤ、およびエピトープ２ＩＳＶＤの一部、およびエピトープ３ＩＳＶＤと重複する。
【００８３】
ＩＳＶＤファミリー、例えばＶＨＨファミリーのｌ−９．２ａ、ｌ−９．２ｂ、ｌ−９．３ｂ、Ｓ−１４ａ、ｌ−１４．１ａ、ｌ−１４．２ｂ、ｌ−１５．１ｂ、ｌ−１５．２ａ、Ｉ−１５．２ｂ、ｌ−１５．３ａ、ｓ−１５ａおよびｓ−１６ａは、エピトープ１を認識し、結合する。これらのファミリーは、代表的なエピトープ２ＩＳＶＤまたはＶＨＨ（例えばＭＵ１０６７、Ｕ５２３、ＪＫ２）、またはエピトープ３ＩＳＶＤまたはＶＨＨ（例えばＷＦ３６、ＷＦ１５２、ＷＦ１００）と競合しない。
【００８４】
ＩＳＶＤファミリー、例えばＶＨＨファミリーのｌ−９．１ｃ、ｌ−１９．１ａ、ｌ−１９．１ｂ、ｌ−１９．２ａおよびｌ−１９．２ｂは、エピトープ２を認識し、結合する。これらのファミリーは、代表的なエピトープ１ＩＳＶＤまたはＶＨＨ（例えばＭＵ１０６８、ＭＵ２７４、ＭＵ２１１）、またはエピトープ３ＩＳＶＤまたはＶＨＨ（例えばＷＦ３６、ＷＦ１５２、ＷＦ１００）と競合しない。
【００８５】
ＩＳＶＤファミリー、例えばＶＨＨファミリーのｌ−８．１ａ、ｌ−８．１ｂ、ｌ−８．２ａ、ｌ−８．２ｆ、ｌ−８．３ａ、ｌ−１２ｂ、ｌ−１７ａ、ｌ−１７ａ、ｌ−１７ｂ、ｌ−１７ｃ、ｓ−１９ａ、ｓ−１９ｂ、ｓ−２４ａ、ｓ＋／−２４ｂ、ｓ−２４ｃ、ｓ＋／−２４ｄおよびｌ−２４ａは、エピトープ３を認識し、結合する。これらのファミリーは、代表的なエピトープ１ＩＳＶＤまたはＶＨＨ（例えばＭＵ１０６８、ＭＵ２７４、ＭＵ２１１）、またはエピトープ２ＩＳＶＤまたはＶＨＨ（例えばＭＵ１０６７、ＭＵ５２３、ＪＫ２）と競合しない。
【００８６】
前記の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドは、少なくとも２つのＩＳＶＤ（例えばＣＤ３８と結合できる第１のＩＳＶＤおよびＣＤ３８と結合できる第２のＩＳＶＤ）を含み、前記第１のＩＳＶＤは、本明細書で定義されるように競合アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは細胞上に発現されたＣＤ３８との蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）結合アッセイ）において、前記第２のＩＳＶＤにより競合しない（例えば、前記第１のＩＳＶＤおよび前記第２のＩＳＶＤは、ＣＤ３８上の異なるエピトープと結合して、異なるエピトープビンに属する）。
【００８７】
イムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤が、本発明に従い交差ブロッキングするかまたは交差ブロッキングできるか否かを決定するための好適なＦＡＣＳアッセイを、以下に全般的に記載する。本明細書に記載されるイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤のいずれかを用いてアッセイを実施できることはいうまでもない。ＦＡＣＳ装置（例えばFACS Canto; Becton Dickinson社）を、製造業者の推奨に従い操作する。
【００８８】
ＣＤ３８への結合に関する２つの結合剤（例えば２つのイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／またはナノボディ）間での「（交差）ブロッキング」または「（交差）競合」を評価する際、ヒトＣＤ３８を過剰発現する細胞（例えばＦｌｐ−ｌｎ（商標）２９３細胞）およびバックグラウンド細胞株として親細胞を使用し、ＦＡＣＳ競合実験を実施できる。様々な検出試薬が使用可能であり、例えば、モノクローナルＡＮＴ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich社、cat# F1804）、モノクローナル抗Ｃ−ｍｙｃ抗体（Sigma-Aldrich社、cat# WH0004609M2）、モノクローナル抗ＨＩＳタグ抗体（Sigma-Aldrich社、cat# SAB1305538）が挙げられ、各々様々な標識を有しうる。例えば、http://www.thefcn.org/flow-fluorochromesに記載の広範囲にわたるフルオロフォアを、フローサイトメトリーの標識として使用できる。フルオロフォア（または単に「Ｆｌｕｏｒ」）は典型的には、ＣＤ３８を認識する抗体、例えばナノボディなどのイムノグロブリン単一可変ドメイン、または検出試薬として用いられる抗体と結合される。
限定されないが、例えばAlexa Fluor（登録商標）、DyLight（登録商標）、ローダミン、ＰＥ、ＦＩＴＣおよびＣｙ３とコンジュゲートした抗体などの各種のコンジュゲート抗体が利用できる。各フルオロフォアは、特徴的なピーク励起および放出波長を示す。使用可能な標識の組合せは、フルオロフォアの励起に用いるランプ（単数もしくは複数）もしくはレーザー（単数もしくは複数）の波長、および使用可能な検出器に依存する。
【００８９】
ＣＤ３８と結合させるための２つの試験結合剤（ＡおよびＢと称する）間の競合を評価する際、未標識の（コールドな）結合剤Ａの希釈系列を調製し、標識付きの結合剤Ｂ＊と共に（例えば２０００００個の）細胞に追加する。試験混合物の結合剤Ｂ＊の濃度は、細胞上に発現されるＣＤ３８上の結合部位を容易に飽和させる程に十分高くなければならない。細胞上に発現されるＣＤ３８上の、前記結合剤に対する結合部位を飽和させる結合剤Ｂ＊の濃度は、ＣＤ３８細胞上への結合剤Ｂ＊のタイトレーション系列、および結合に関するＥＣ５０値の測定により決定できる。飽和濃度で働くために、結合剤Ｂ＊を、１００×ＥＣ５０濃度で用いてもよい。
【００９０】
結合剤Ａおよび結合剤Ｂ＊の混合物で細胞をインキュベートし、細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳにおけるリードアウトを実施できる。最初に、散乱プロファイルから測定した生の細胞にゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
【００９１】
また別の結合剤Ｂ＊の溶液を調製する。この溶液の結合剤Ｂ＊は、（結合剤ＡおよびＢ＊の）試験混合物と同じ緩衝液中に含まれ、同じ濃度でなければならない。またこの別の溶液を細胞に追加する。インキュベートおよび細胞の洗浄の後、ＦＡＣＳにおけるリードアウトを実施できる。最初に、散乱プロファイルから測定した生の細胞にゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
【００９２】
結合剤Ｂ＊の別の溶液によりインキュベートされた細胞の蛍光と比較し、結合剤ＡおよびＢ＊の混合物によりインキュベートされた細胞の蛍光の減少は、細胞上に発現したＣＤ３８との結合に関して、結合剤Ｂ＊の結合が結合剤Ａによって（交差）ブロッキングされていることを示す。
【００９３】
本発明の交差ブロッキングするイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤は、上記のＦＡＣＳ交差ブロッキングアッセイにおいてＣＤ３８と結合するものであり、その結果、アッセイの間、第２のイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤の存在下で記録される蛍光は、（別の標識されたイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤について測定した）最大蛍光の８０％〜０．１％の間（例えば８０％〜４％）、具体的には最大蛍光の７５％〜０．１％の間（例えば７５％〜４％）、より具体的には最大蛍光（上記のように定義）の７０％〜０．１％の間（例えば７０％〜４％）である。
【００９４】
また、ＣＤ３８との結合に関する２つの試験結合剤（Ａ＊およびＢ＊と称する）間の競合は、ＣＤ３８発現細胞に両結合剤（各々異なるフルオロフォアで標識）を追加することによっても評価できる。インキュベートおよび細胞の洗浄の後、ＦＡＣＳにおけるリードアウトを実施できる。各フルロフォアのゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。１つのフルオロフォア蛍光の減少または欠如が、細胞上に発現されたＣＤ３８と結合する結合剤による（交差）ブロッキングを示す。
【００９５】
標的に対するイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤が、本明細書で定義されるように（交差）ブロッキングするか否か、（交差）ブロッキングできる否か、競合的に結合するか否か、または（交差）競合的か否かを決定する他の方法は、Xiao-Chi Jiaら（Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004）、Millerら（Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011）、および／または本明細書に記載される方法に記載されている。
【００９６】
本明細書において交換可能に用いられる用語「免疫応答を増強すること」および「免疫応答を誘導すること」は、補体系、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の１つ以上の応答（単数または複数）の活性化、刺激または増殖をもたらすプロセスを指す。本発明のポリペプチドおよびイムノグロブリン構築物は、免疫応答、例えば補体系の活性化、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞の増殖または活性化を誘導できる。補足活性、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化を測定するための好適なアッセイは、本発明に係る分野において公知であり、例えば、Buillard et al. 2013, J. Exp. Med. Vol. 210, 9: 1685-1693、Zhou et al. October 2010, J. Immunother. Vol. 33, No 8、およびHanabuchi 2006, Blood, Vol. 107, No 9: 3617-3623にそれぞれ記載されている。「免疫応答」という用語には、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」（「ＡＤＣＣ」）、「補体依存性細胞傷害性」（「ＣＤＣ」）、「抗体依存性細胞ファゴサイトーシス」（「ＡＤＣＰ」）および「補足依存性細胞傷害性」（「ＣＤＣＣ」）が含まれる。補体系は、オプソニン化、走化性、炎症、溶解およびアポトーシスをもたらすカスケードの起点となる。断片結晶化可能部分（Ｆｃ部）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面レセプター、および補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する、抗体のテール領域である。この特性によって、抗体がさらに免疫系を活性化させることが可能となる。
【００９７】
免疫応答は、様々なアッセイにより決定することができ、限定されないが、ＦＡＣＳ、増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、細胞殺傷アッセイ、ファゴサイトーシスアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例えばＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーターアッセイ）、Ｔ細胞活性化アッセイ、細胞表面レセプター結合アッセイ、および活性化の公知マーカー発現またはサイトカインの分泌を測定するアッセイが挙げられ、いずれも当分野において周知である。
【００９８】
本明細書で用いられる「補体依存性細胞傷害性」（「ＣＤＣ」）という用語は、抗体により媒介される補体活性化のプロセスを指し、細胞またはビリオン上の標的へ抗体が結合する結果、ＭＡＣ（膜障害複合体）アセンブリによって膜孔が形成され、細胞溶解に至るプロセスである。ＣＤＣは、実施例のセクションにて説明されるように、正常ヒト血清が補体給源として用いられるＣＤＣアッセイなどのインビトロアッセイによって、またはＣ１ｑ効率アッセイにおいて評価することができ、それらは全て当業者に周知である。
【００９９】
本明細書で用いられる用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」（「ＡＤＣＣ」）とは、結合した抗体の定常領域を認識するＦｃ受容体発現細胞により、抗体で被覆された標的細胞またはビリオンを殺傷するメカニズムを指す。ＡＤＣＣは、周知の方法を使用して測定できる。
【０１００】
本明細書で用いられる用語「抗体依存性細胞ファゴサイトーシス」（「ＡＤＣＰ」）とは、食細胞による内在化によって、抗体で被覆された標的細胞またはビリオンを除去するメカニズムを指す。内在化された、抗体で被覆された標的細胞またはビリオンは、ファゴソームと呼ばれるベシクル中に包含され、これはその後１つ以上のリソソームと融合してファーゴリソソームを形成する。ＡＤＣＰは、van BijらのJournal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Pages 677-685に記載されるように、エフェクター細胞としてマクロファージを用いたインビトロ細胞傷害性アッセイおよびビデオ顕微鏡観察を用いて評価できる。
【０１０１】
本明細書で用いられる用語「補足依存性細胞傷害性」（「ＣＤＣＣ」）とは、標的細胞またはビリオンを、抗体により媒介される補体活性化の結果として、標的細胞またはビリオンに共有結合した補体３（Ｃ３）切断産物を認識する補体受容体を発現する細胞で殺傷するメカニズムを指す。ＡＤＣＣにおいて記載したように、ＣＤＣＣは同様の方法で評価できる。
【０１０２】
本明細書で用いられる「腫瘍細胞増殖を阻害する」という用語は、インビトロでの腫瘍細胞の増殖、またはインビボでの腫瘍成長が、例えば、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上、例えば１００％減少することを指す。
【０１０３】
本明細書における「効力」という用語は、イムノグロブリン構築物、ベンチマーク、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたはナノボディなどの剤の尺度、その生物学的活性である。剤の効力は、例えば実施例のセクションで説明されるように、当分野において公知のいかなる好適な方法で測定してもよい。細胞培養ベースの効力アッセイは通常、剤により生じる生理学的反応を測定し、比較的短期間内に結果が得られるため、生物学的活性を測定するための好ましいフォーマットである。生成物の作用メカニズムに基づく様々な形態の細胞ベースのアッセイが使用可能であり、その例としては、限定されないが、増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、細胞殺傷アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例えばＮＦ−κΒルシフェラーゼレポーターアッセイ）、Ｔ細胞活性化アッセイ、細胞表面レセプター結合アッセイ、および機能的に必須なタンパク質または他のシグナル分子（例えば、リン酸化タンパク質、酵素、サイトカイン、ｃＡＭＰなど）の誘導／抑制を測定するアッセイ、および、活性化に係る公知のマーカーの発現またはサイトカイン分泌を測定するアッセイが挙げられ、それらは全て公知技術である。細胞ベースの効力アッセイから得られる結果は、対応するベンチマーク（実施例セクションを参照）において得られた反応に対する本発明のイムノグロブリン構築物との比較によって定まる「相対的な効力」として表すことができる。
【０１０４】
化合物（例えば本発明のイムノグロブリン構築物）がベンチマーク（例えば参照化合物）より強力であるとは、化合物（例えば本発明のイムノグロブリン構築物）により得られる反応が、所定のアッセイにおいて、少なくとも１．５倍、例えば２倍、好ましくは少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、またはさらには少なくとも１０倍、参照化合物（例えばベンチマーク）による反応より良好である（例えば機能的に良好である）場合をいう。
【０１０５】
本発明のポリペプチドの「有効性」をいうときは、ポリペプチド濃度を飽和させたときの、効果そのものの最大強度の計測を行う。有効性とは、本発明のポリペプチドにより得られる最大の反応を示す。それは所望の（治療的）効果を生じさせるポリペプチドの能力を意味する。本発明のポリペプチドの有効性は、インビボのモデルを用いて評価できる。
【０１０６】
本発明のイムノグロブリン構築物、イムノグロブリン単一可変ドメインおよびポリペチドの、ならびにそれを含む組成物の有効性または効力は、自体公知の好適なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、および/または動物モデル、またはそれらの組み合わせを用いて、関連する具体的な疾患または障害に応じて試験することができる。好適なアッセイおよび動物モデルは当業者にとり明らかであり、例えば、リガンド置換アッセイ（例えばBurgess et al., Cancer Res 2006 66:1721-9）、イムノグロブリン構築アッセイ（例えば国際公開第２００９／００７４２７Ａ２号、Ｇｏｅｔｓｃｈ、２００９）、シグナル伝達アッセイ（例えばBurgess et al., Mol Cancer Ther 9:400-9）、増殖／生存アッセイ（例えばPacchiana et al., J Biol Chem 2010 Sep M110.134031）、細胞接着アッセイ（例えばHolt et al., Haematologica 2005 90:479-88）および遊走アッセイ（例えばKong-Beltran et al., Cancer Cell 6:75-84）、内皮細胞スプラウティングアッセイ（例えばWang et al., J Immunol. 2009; 183:3204-11）、およびインビボ異種移植モデル（例えばJin et al., Cancer Res. 2008 68:4360-8）、ならびに、下記の実験セクションにおいて、および本明細書において引用する先行技術で使用されるアッセイおよび動物モデルが挙げられる。インビトロでの前記第１の標的の阻害を表す方法として、ＩＣ５０が挙げられる。
【０１０７】
本発明のポリペチドの「半減期」は、一般的に、国際公開第０８／０２００７９号の５７ページのパラグラフｏ）に記載されるように定義され、その記載によると、例えば天然のメカニズムによるポリペチドの分解および／またはポリペチドのクリアランスもしくは隔離により、ポリペチドの血清中濃度がインビボにおいて５０％減少するのに要する時間のことを指す。本発明のポリペプチドのインビボ半減期は、薬物動態学的分析など、自体公知のいかなる方法で決定してもよい。好適な方法は当業者に明らかであると考えられ、例えば一般的には、国際公開第０８／０２００７９号の５７頁のパラグラフｏ）に記載の方法であってもよい。国際公開第０８／０２００７９号の５７頁のパラグラフｏ）に記載のように、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表すことができる。参照として、例えば標準的なハンドブック、例えばKennethら（Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc., 1986）、ならびにM GibaldiおよびD Perron（"Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982）が挙げられる。用語「半減期の増加」または「増加した半減期」とは、国際公開第０８／０２００７９号の５７頁のパラグラフｏ）にも定義され、具体的にはｔ１／２−βの増加を指すが、ｔ１／２−αおよび／またはＡＵＣ、またはその両方の増加を伴っても伴わなくともよい。
【０１０８】
特に明記しない限り、用語「イムノグロブリン」および「イムノグロブリン配列」は、本明細書において、重鎖抗体または従来の４鎖型抗体のいずれを指すものとして用いられるときでも、フルサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメインまたは断片（限定されないが、抗原結合性ドメインまたは断片（例えばそれぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメイン）を含む）を包含する一般的な用語として用いられる。
【０１０９】
本明細書で用いられる（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」なる用語は、残りのタンパク質とは独立に、その三次構造を保持する能力を有する、フォールディングされたタンパク質構造を意味する。一般的に、ドメインは、タンパク質の個別の機能特性を担い、多くの場合、タンパク質の残りの部分および／またはドメインの機能の損失なしに、他のタンパク質へ追加もしくは移動させることができ、またはそこから除去することができる。
【０１１０】
本明細書で用いられる「イムノグロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖（例えば従来の４鎖型抗体の、または重鎖抗体の鎖など）の球状領域を、または、本質的に、かかる球状領域からなるポリペプチドを指す。イムノグロブリンドメインは、それらが抗体分子に特徴的な、約７つの逆平行β鎖が２つのβシートとして配列した２層サンドイッチからなり、任意に保存されたジスルフィド結合によって安定化されたイムノグロブリンの折り畳み構造を保持していることを特徴とする。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「イムノグロブリン可変ドメイン」とは、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」として、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」として、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」として、「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」として、当分野において記載され、および、本質的に、本明細書において後述される４つの「フレームワーク領域」からなる、イムノグロブリンドメインを意味し、前記フレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」により中断され、それらは、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」として、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」として、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」として、それぞれ当分野において記載され、また本明細書で後述される。このように、イムノグロブリン可変ドメインの一般構造または配列は、以下の通り示すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。抗原結合部位を有することによって抗体に抗原に対する特異性を付与するのが、イムノグロブリン可変ドメイン（単数または複数）である。
【０１１２】
「単一可変ドメイン」と交換可能に用いられる「イムノグロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が単一のイムノグロブリンドメインに存在し、またそれにより形成される分子として定義される。これにより、イムノグロブリン単一可変ドメインが、２つのイムノグロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来型の」イムノグロブリンまたはそれらの断片とは別のものとなる。典型的には、従来型のイムノグロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、抗原結合部位に寄与しており、すなわち合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与している。
【０１１３】
上記の定義を考慮すると、従来の４鎖型抗体（当分野において公知の、例えばイムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＭ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＤまたはイムノグロブリンＥ分子）の抗原結合性ドメイン、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖまたはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片の抗原結合性ドメイン、またはかかる従来型の４鎖型抗体に由来するｄｉａｂｏｄｙ（いずれも公知）の抗原結合性ドメインは、通常、これらの場合、抗原の各エピトープへの結合が、通常、１つの（単一の）イムノグロブリンドメインのみでは起こらず、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインによる一対の（会合した）イムノグロブリンドメインによって、すなわちイムノグロブリンドメインのＶＨ−ＶＬによって、はじめて各抗原のエピトープと共同で結合するため、イムノグロブリン単一可変ドメインとは考えない。
これとは対照的に、イムノグロブリン単一可変ドメインは、更なるイムノグロブリン可変ドメインとの組合せなしに抗原のエピトープと特異的に結合できる。イムノグロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨまたはＶＬドメインにより形成される。ゆえに、イムノグロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位が、３つのＣＤＲのみにより形成される。
【０１１４】
このように、単一可変ドメインは、それが単一の抗原結合単位（すなわち、単一の抗原結合性ドメインが他の可変ドメインと相互作用して機能的な抗原結合性単位を形成する必要がない、本質的に単一の可変ドメインからなる、機能的な抗原結合単位）を形成できる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）もしくは好適なその断片、または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列またはＶＨＨ配列）もしくは好適なその断片、であってもよい。
【０１１５】
本発明の一態様において、イムノグロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり、より具体的には、イムノグロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖型抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列であるか、または重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列であってもよい。
【０１１６】
例えば、イムノグロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（もしくは（単一）ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸）、「ｄＡｂ」またはｄＡｂ（もしくはｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸）、またはナノボディ（本明細書において定義され、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）、他の単一可変ドメイン、またはそれらのいかなる好適な断片、であってもよい。
【０１１７】
具体的には、イムノグロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（登録商標）（本明細書で定義される）またはその好適な断片であってもよい。なお、ナノボディ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）はAblynx N.V.社の登録商標である。ナノボディの一般的説明については、下のさらなる記載、また、例えば本明細書で引用する国際公開第０８／０２００７９号（１６頁）に記載の従来技術をさらに参照してもよい。
【０１１８】
「ＶＨＨドメイン」（別名、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片およびＶＨＨ抗体）は、最初は「重鎖抗体」（すなわち「軽鎖欠損抗体」、Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993）の抗原結合性イムノグロブリン（可変）ドメインとして開示されたものである。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖型抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と称される）から、および従来の４鎖型抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と称される）から、区別するために選ばれたものである。ＶＨＨおよびナノボディの更なる説明に関する参照としては、Muyldermans のレビュー（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）、ならびに背景技術においても言及した以下の特許出願：Vrije Universiteit Brussel大学による国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９５／０４０７９号および国際公開第９６／３４１０３号、ユニリーバ社の国際公開第９４／２５５９１号、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第００／４０９６８号、国際公開第００／４３５０７号、国際公開第００／６５０５７号、国際公開第０１／４０３１０号、国際公開第０１／４４３０１号、欧州特許出願公開第１１３４２３１号および国際公開第０２／４８１９３号、Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号、国際公開第０１／２１８１７号、国際公開第０３／０３５６９４号、国際公開第０３／０５４０１６号および国際公開第０３／０５５５２７号、Algonomics社およびAblynx社の国際公開第０３／０５０５３１号、カナダ国家研究会議（National Research Council of Canada）による国際公開第０１／９０１９０号、Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号（欧州特許出願公開第１４３３７９３号）、ならびにAblynx社による国際公開第０４／０４１８６７号、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０６２５５１号、国際公開第０５／０４４８５８号、国際公開第０６／４０１５３号、国際公開第０６／０７９３７２号、国際公開第０６／１２２７８６号、国際公開第０６／１２２７８７号および国際公開第０６／１２２８２５号、およびAblynx社によるさらに公開された特許出願が挙げられる。これらの出願に記載の更なる従来技術、特に国際公開第０６／０４０１５３号の４１〜４３頁に記載の参照文献リストを参照してもよく、当該リストおよび参照文献は、参照により本明細書に援用される。これらの参照文献に記載のように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的にヒト化したナノボディ）は、特に１つ以上のフレームワーク配列に存在する、１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴づけることができる。ナノボディに関する更なる説明、具体的にはナノボディのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分または断片、誘導体または「ナノボディ融合体」、多価構築物（幾つかのリンカー配列に関する非限定的な例を包含する）、ならびに、ナノボディの半減期を増加させる異なる修飾およびそれらの調製、については、例えば国際公開第０８／１０１９８５号および国際公開第０８／１４２１６４号に記載されている。ナノボディの更なる一般的説明についての参照として、例えば本明細書において引用する、国際公開第０８／０２００７９号（１６頁）に記載の従来技術が挙げられる。
【０１１９】
「ドメイン抗体」（また、「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」としても公知、「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」の語は、GlaxoSmithKline社のグループの商標として使用されている）は、例えば欧州特許出願公開第０３６８６８４号、Ward et al.（Nature 341: 544-546, 1989）、Holt et al.（Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003）、および国際公開第０４／０６８８２０号、ならびにＤｏｍａｎｔｉｓ社の国際公開第０６／０３０２２０号、国際公開第０６／００３３８８号および国際公開第０３／００２６０９号および他の公開された特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ科の哺乳動物の、特にヒト４鎖型抗体のＶＨまたはＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合性ドメインとして（すなわち、ＶＬまたはＶＨドメインの各々との対によってではなく）エピトープに結合させるためには、例えばヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリーを用いて、かかる抗原結合性に関する具体的な選抜を行う必要がある。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様、約１３〜約１６ｋＤａの分子量を有し、完全にヒト配列に由来する場合、例えばヒトの治療的使用のためのヒト化を必要としない。
【０１２０】
なお、哺乳類の起源でないため、本発明の前後関係においては好ましさが低いが、単一可変ドメインを特定のサメの種由来のものとしてもよいことに留意すべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、国際公開第０５／１８６２９号を参照）。
【０１２１】
そのように、本発明の意味においては、「イムノグロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」という用語には、ヒト以外の給源の、好ましくはラクダ科の動物を給源とし、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体から誘導されるポリペプチドが含まれる。前述したように、それらはヒト化してもよい。さらに、当該用語は非ラクダ科動物（例えばマウスまたはヒト）を給源とし、それを、例えばDavies and Riechmann（FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996）およびRiechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231 : 25-38, 1999）に記載のように「ラクダ化」した誘導ポリペプチドを含んでもよい。
【０１２２】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）の図２に示すようなラクダ科動物由来のＶＨＨドメインへの適用と同様、Kabatら（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）で示されるＶＨドメインに関する一般的な付番方法に従い付番される。ＶＨドメインのアミノ酸残基に付番するための代替法であって、ＶＨＨドメインにも同様に適用できる方法も当分野において公知である。しかしながら、本願の明細書、特許請求の範囲および図面では、特に明記しない限り、上記の通りＶＨＨドメインに適用されるKabat付番に従い行う。
【０１２３】
留意点としては、 ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインに関して当分野で周知であるが、各ＣＤＲのアミノ酸残基の総数は変動しうるものであり、Kabat付番により示されるアミノ酸残基の総数と対応しえないということである（すなわち、Kabat付番に従う１つ以上の位置が、実際の配列中に存在しないか、または、実際の配列が、Kabat付番から考えられる数より多くのアミノ酸残基を含む場合がありうる）。これは、一般的にはKabat付番が実際の配列中のアミノ酸残基の実際の付番に対応する場合も、また対応しない場合もあることを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０の範囲、多くの場合１１２〜１１５の間の範囲である。しかしながら、より短いおよびより長い配列も、本明細書に記載される目的に適しうる点に留意すべきである。
【０１２４】
ＣＤＲ領域の決定は、様々な方法に従い実施できる。Kabatに従うＣＤＲの決定においては、ＶＨＨのＦＲ１が、位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１が、位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２が、位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２が、位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３が、位置６６−９４のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３が、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４が、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【０１２５】
しかしながら、本願においては、ＣＤＲ配列はKontermann and Dubel（Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010）に従い決定されたものである。この方法によれば、ＦＲ１は位置１〜２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置２６〜３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は位置５０〜５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置５９〜９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は位置１０３〜１１３（Kabat付番に従う）のアミノ酸残基を含む。
【０１２６】
ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのイムノグロブリン単一可変ドメインは、ヒト化することができる。具体的には、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化されたイムノグロブリン単一可変ドメインは、以前の段落で一般的に定義されるイムノグロブリン単一可変ドメインであってもよいが、（本明細書で定義される）ヒト化置換であり、および／または、それに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基（具体的には少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在するものである。潜在的に有用なヒト化置換は、天然のＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較し、その後、このように決定される１つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（またはそれらの組み合わせ）を、本明細書に記載のいずれかの自体公知の方法に従い、前記ＶＨＨ配列中に導入し、得られるヒト化ＶＨＨ配列を、標的との親和性に関して、安定性に関して、発現の容易性およびレベルに関して、および／または、他の目的の特性に関して試験することにより、確認できる。このようにして、試行錯誤を減少させつつ、他の適切なヒト化置換（またはその好適な組合せ）を、本明細書の開示に基づき当業者が決定できる。また、前記に基づいて、イムノグロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）（のフレームワーク領域）を、部分的にヒト化でき、または完全にヒト化できる。
【０１２７】
１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列内に１つ以上の変異を導入することによって、イムノグロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインおよびヒト化されたＶＨＨドメインを含む）を親和性成熟させることもでき、かかる変異により、それぞれの親分子と比較し、得られるイムノグロブリン単一可変ドメインの各抗原に対する親和性が改善される。本発明の親和性成熟されたイムノグロブリン単一可変ドメイン分子は、公知技術の方法により、例えば、Marks et al. （Biotechnology 10:779-783, 1992）、 Barbas, et al.（Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994）、Shier et al.（Gene 169: 147-155, 1995）、Yelton et al.（Immunol. 155: 1994-2004, 1995）、Jackson et al.（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、 Hawkins et al.（J. Mol. Biol. 226: 889 896, 1992）、Johnson and Hawkins（Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996）の記載に基づき調製できる。
【０１２８】
イムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばドメイン抗体またはナノボディ）を出発物質としてポリペプチドを設計／選抜および／または調製するプロセスは、本明細書において、前記イムノグロブリン単一可変ドメインを「フォーマット化する」とも称され、ポリペプチドの一部を構成するイムノグロブリン単一可変ドメインは、「フォーマット化された」または「フォーマットされた形の」ポリペプチドと称される。イムノグロブリン単一可変ドメインをフォーマット化できる方法の例、およびかかるフォーマットの例は、本明細書の開示に基づき当業者に自明であり、かかるフォーマット化されたイムノグロブリン単一可変ドメインは、本発明の更なる側面を構成する。
【０１２９】
例えば、限定されないが、１つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインを、ポリペプチドの調製用の「結合単位」、「結合ドメイン」または「ビルディングブロック」（これらの用語は交換可能に用いられる）として用いることができ、それらは任意に、（すなわち、ＣＤ３８上の同一または他のエピトープに対する、および／またはＣＤ３８以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質または標的に対する）結合単位として有用な１つ以上の更なるイムノグロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
【０１３０】
一価のポリペプチドは、１つの結合単位（例えばイムノグロブリン単一可変ドメインなど）のみを含むかまたは本質的にそれからなる。２つ以上の結合単位（例えばイムノグロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、本明細書において「多価」ポリペプチドとも称され、かかるポリペプチド中の結合単位／イムノグロブリン単一可変ドメインはまた、本明細書において「多価フォーマット」として存在すると称される。例えば、「二価」ポリペプチドは、２つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（任意にリンカー配列を介して連結）を含むことができ、一方、「三価」ポリペプチドは、３つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（任意に２つのリンカー配列を経て連結）を含むことができ、一方、「四価」ポリペプチドは、４つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（任意に３つのリンカー配列を介して連結）を含むことができる。
【０１３１】
多価ポリペプチドにおいて、二つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインは、同一でもよく、または異なってもよく、同じ抗原または抗原決定基に対するものであってもよく（例えば同じ部分（単数または複数）またはエピトープ（単数または複数）に対して、または異なる部分またはエピトープに対して）、あるいは異なる抗原または抗原決定基に、あるいはそのいかなる好適な組合せに対するものであってもよい。少なくとも１つの結合単位が第１の抗原（すなわちＣＤ３８）を標的とし、少なくとも１つの結合単位が第２の抗原（すなわちＣＤ３８と異なる）を標的とする、少なくとも２つの結合単位（例えばイムノグロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペチドは、「多重特異的」ポリペチドとも呼ばれ、かかるポリペチドに存在する結合単位(例えばイムノグロブリン単一可変ドメインなど)はまた、本明細書において「多重特異的フォーマット」でもあると称される。このように、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＣＤ３８）を標的とする少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインと、第２の抗原（すなわちＣＤ３８と異なる）を標的とする少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメインと、を含むのに対し、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＣＤ３８）を標的とする少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインと、第２の抗原（すなわちＣＤ３８と異なる）を標的とする少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメインと、第３の抗原（すなわちＣＤ３８および第２の抗原と異なる）を標的とする少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメインと、を含む。
【０１３２】
例えば、「バイパラトピックポリペプチド」または「トリパラトピックポリペプチド」などの「マルチパラトピックポリペプチド」は、各々が異なるパラトープ（本明細書においてさらに記載される）を有する２つ以上の結合単位を含むか、または本質的にそれらからなる。
【０１３３】
ＣＤ３８結合剤
広範囲な免疫、スクリーニング、特徴解析および複合的ストラテジーに基づき、本発明の発明者は予想外にも、イムノグロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが、ＣＤ３８の様々なエピトープに結合し、従来技術に記載のＣＤ３８をアンタゴナイズする分子と比較し、ＣＤ３８により媒介される免疫応答を調節する好ましい特性を示すことを見出した。
【０１３４】
本発明は、ＣＤ３８（好ましくはヒトＣＤ３８）に対する特異性を有し、および／または、それに結合するポリペプチド（また本明細書において「本発明のポリペプチド」と称される）を提供する。ＣＤ３８（分化抗原群３８）（別名、サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー細胞などの多くの免疫細胞の表面に存在する糖タンパク質である。ＣＤ３８はまた、細胞接着、シグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達において機能を発揮する。好ましい態様では、タンパク質、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＤ３８（ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＢＡＡ１８９６６．１（配列番号４６５））に結合する。特に好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、特異的にＣＤ３８のＣ末端に局在化する細胞外ドメインと結合する。ヒトＣＤ３８における、ＣＤ３８細胞外ドメインは、アミノ酸４２〜３００にわたる。
【０１３５】
【化１】
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【０１３６】
本発明により提供されるポリペプチドおよびイムノグロブリン構築物は、本明細書においてさらに定義されるように、様々な免疫療法、例えば様々な癌、免疫不全および感染症の処置において使用できる。
【０１３７】
したがって、本発明は、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較し、他の有利な特性（例えば調製が容易であること、良好な安定性、および／または製品コストの削減）に加えて、改善された望ましい治療的および／または薬理特性と関連する特定の機能特性を有する、ＣＤ３８と結合するポリペプチドおよびイムノグロブリン構築物を提供する。
【０１３８】
本発明は、ＣＤ３８への結合に特に適するアミノ酸残基のストレッチ（配列番号１１７〜１７４、配列番号２３３〜２９０および配列番号３４９〜４０６、表Ａ−１）を提供する。特に、本発明は、ＣＤ３８に結合し、ストレッチの前記ＣＤ３８への結合が（本明細書に記載されるように）免疫応答を増強するアミノ酸残基の配列を提供する。これらのアミノ酸残基のストレッチは、本発明のポリペプチド中に、特に、それらが本発明のポリペプチドの抗原結合部位の（一部を）形成する態様で存在してもよく、および／または組み込まれてもよい。これらのアミノ酸残基のストレッチは、ＣＤ３８に対して作製された重鎖抗体のＣＤＲ配列またはＶＨＨ配列として得られたものである。これらのアミノ酸残基のストレッチは、本明細書において、「本発明のＣＤＲ配列（単数または複数）」と（すなわち、それぞれ「本発明のＣＤＲ１配列（単数または複数）」、「本発明のＣＤＲ２配列（単数または複数）」および「本発明のＣＤＲ３配列（単数または複数）」として）も称される。
【０１３９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、２００ｐＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３８と特異的に結合する、少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関し、好ましくは、前記ＣＤ３８はヒトＣＤ３８（配列番号４６５）である。
【０１４０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、前記ＩＳＶＤが腫瘍細胞増殖を阻害するポリペプチドに関する。
【０１４１】
しかしながら、本発明は、最も広義には、これらのアミノ酸残基のストレッチによって、本発明のポリペプチドが、（本明細書で定義される）特定の親和性および効力によりＣＤ３８と結合できる限り、これらのアミノ酸残基のストレッチが本発明のポリペプチドにおいて有する特定の構造的役割または機能に限定されない点に留意すべきである。このように、一般的に、本発明は最も広義には、特定の親和性、アビディティ、有効性および／または効力によりＣＤ３８と結合でき、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲ配列、特に二つ以上のかかるＣＤＲ配列の好適な組合せを、１つ以上の更なるアミノ酸配列を介して、全ポリペプチドがＣＤ３８と結合できる結合ドメインおよび／または結合単位を形成する態様で各々適切に連結された形で含む、一価のポリペプチド（また本明細書において「本発明の一価のポリペプチド（単数または複数）」と称される）を提供する。しかしながら、本発明の一価のポリペプチド中にかかるＣＤＲ配列が１つだけ存在する場合であっても、本発明の一価のポリペプチドのＣＤ３８との結合能力が十分に提供される点にも留意すべきであり、例えば参照として、国際公開第０３／０５０５３１号に記載のいわゆる「促進断片（Expedite fragments）」が挙げられる。
【０１４２】
エピトープビニング実験で、ＩＳＶＤは、３つの異なる非重複エピトープ：エピトープ１、エピトープ２およびエピトープ３と結合することが解っている。ＩＳＶＤは、それに応じて分類されうる。
【０１４３】
具体的かつ非限定的な側面では、本発明の一価のポリペプチドは、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
および／または（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
および／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｄ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列。
【０１４４】
具体的かつ非限定的な側面では、本発明の一価のポリペプチドは、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
および／または（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
および／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列。
【０１４５】
具体的かつ非限定的な側面では、本発明の一価のポリペプチドは、以下からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基のストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
および／または（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列；
および／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列。
【０１４６】
特に、本発明の一価のポリペプチドは、１つの抗原結合部位を含む一価のポリペプチドであってもよく、その際、前記抗原結合部位は、上記のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列（またはそのいかなる好適な組合せ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを有する。しかしながら、好適な側面では、本発明の一価のポリペプチドは、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列および／または本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される１以上（例えば２つ以上の）アミノ酸残基のストレッチを含む。好ましくは、本発明の一価のポリペプチドは、それぞれ、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列および本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される、３つのアミノ酸残基のストレッチを含む。本明細書において本発明の好ましい一価のポリペプチドとされるＣＤＲの組合せを、表Ａ−１に列記する。
【０１４７】
さらに、本発明は、本発明の一価のポリペプチドの（またはその発現に用いる本発明の核酸）給源、または、本発明の一価のポリペプチドまたは核酸を生成させるまたは取得する（またはそのために用いた）方法に関して、何ら限定されない点にさらに留意すべきである。このように、本発明の一価のポリペプチドは、（いかなる適切な種に由来する）天然の一価のポリペプチドでも、または合成もしくは半合成の一価のポリペプチドでもよい。
【０１４８】
さらに、限定されないがヒト骨格または非イムノグロブリン骨格などの他の「骨格」に対して、前記の１つ以上のＣＤＲを「グラフトする」ことができることも、当業者に自明である。適切な骨格およびかかるＣＤＲグラフトの技術は当業者に自明であり、例えば米国特許第７，１８０，３７０号、国際公開第０１／２７１６０号、欧州特許出願公開第０６０５５２２号、欧州特許出願公開第０４６０１６７号、米国特許第７，０５４，２９７号、Nicaise et al.（Protein Science 13: 1882-1891, 2004）、Ewert et al.（Methods 34: 184-199, 2004）、Kettleborough et al.（Protein Eng. 4: 773-783, 1991）、O' Brien and Jones（Methods Mol. Biol. 207: 81-100, 2003）、Skerra（J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000）およびSaerens et al.（J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005）、およびその中の更なる引例などにより公知技術である。例えば、マウスまたはラットのＣＤＲをヒトフレームワークおよび骨格上へグラフトする技術自体も公知であり、また同様に用いることにより、本発明の一価のポリペプチドについて本明細書において定義されるＣＤＲ配列の１つ以上と、１つ以上のヒトフレームワーク領域または配列と、を含むキメラタンパク質が提供される。アミノ酸配列を提示するための適切な骨格は当業者に自明であり、例えば、限定されないが、イムノグロブリン（すなわち本明細書で上記したイムノグロブリン配列以外の）に基づくかまたはそれに由来する結合骨格、プロテインＡドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）など）に由来するタンパク質骨格、テンダミスタット（tendamistat）、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞レセプター、人工アンキリンリピート、アビマー（avimers）およびＰＤＺドメイン（Binz et al. Nat. Biotech., 23: 1257, 2005）、ならびに、限定されないがＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーなどの、ＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合部分（Ulrich et al. Comb. Chem. High Throughput Screen 9: 619-32, 2006）が挙げられる。
【０１４９】
本発明の前記一価のポリペプチドにおいて、ＣＤＲは、更なるアミノ酸配列に連結されてもよく、および／またはアミノ酸配列を介して各々連結されてもよく、その際、前記アミノ酸配列は、好ましくはフレームワーク配列であるか、またはフレームワーク配列として作用するアミノ酸配列であるか、または一緒にＣＤＲを提示するための骨格を形成する。
【０１５０】
好適かつ非限定的な態様では、本発明の一価のポリペプチドは、少なくとも２つのフレームワーク配列に連結される少なくとも３つのＣＤＲ配列を含み、その際、３つのＣＤＲ配列のうちの好ましくは少なくとも１つはＣＤＲ３配列であり、その他の２つのＣＤＲ配列はＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列であり、好ましくは、１つがＣＤＲ１配列であり、１つがＣＤＲ２配列である。特に好適かつ非限定的な態様では、本発明の一価のポリペプチドは、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、その際、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、本発明の一価のポリペプチドに関して本明細書で定義されるとおりであり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。本発明のかかる一価のポリペプチドにおいて、フレームワーク配列は、いかなる適切なフレームワーク配列であってもよく、適切なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブックおよび本明細書の更なる開示および従来技術に基づき、当業者に明らかである。
【０１５１】
したがって、本発明の一価のポリペプチドは、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１１７〜１７４、および
（ｂ）配列番号１１７〜１７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され、および／または、
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３〜２９０、および
（ｄ）配列番号２３３〜２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され、および／または、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９〜４０６、および
（ｆ）配列番号３４９〜４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される。
【０１５２】
さらに好適なＣＤＲ配列は、表Ａ−１において表す。
【０１５３】
また、得られる結合剤の配列分析では、別々のファミリーが同定された。対応する配列を、表Ａ−２に示す。別々のファミリーへの分類は、ＣＤＲの配列の類似性および相違に基づくものとした。全てのファミリーの代表的なものを、ＣＤ３８への結合親和力およびＣＤＣ活性に基づいて単離した（実施例を参照）。
【０１５４】
１つの具体的かつ非限定的な側面では、本発明の一価のポリペプチドは、イムノグロブリンフォールドを含む一価のポリペプチド、または適切な条件（生理的条件などの）下で、（すなわちフォールディングによって）イムノグロブリンフォールドを形成できる一価のポリペプチドであってもよい。参照として、特に、Halaby et al.（J. Protein Eng. 12: 563-71, 1999）によるレビューが挙げられる。好ましくは、適切にイムノグロブリンフォールドを形成するようにフォールディングされるとき、アミノ酸残基のストレッチは、ＣＤ３８との結合のための抗原結合部位を適切に形成することが可能である。したがって、好適な側面では、本発明の一価のポリペプチドは、例えばイムノグロブリン単一可変ドメインなどのイムノグロブリンである。
【０１５５】
したがって、フレームワーク配列は好ましくは、イムノグロブリンフレームワーク配列（の好適な組合せ）、またはイムノグロブリンフレームワーク配列から（例えば配列最適化（例えばヒト化またはラクダ化）によって）誘導されるフレームワーク配列である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）などのイムノグロブリン単一可変ドメイン、および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）から誘導されるフレームワーク配列であってもよい。特に好適な一側面では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列から誘導されたフレームワーク配列（前記フレームワーク配列が任意に部分的に、または、完全にされてもよい）または、（本明細書で定義されるように）ラクダ化された従来型のＶＨ配列のいずれかである。
【０１５６】
フレームワーク配列は、好ましくは、本発明の一価のポリペプチドが、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸配列）などのイムノグロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸）、「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸）、ナノボディ（登録商標）、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列、であるようなものであってもよい。また、適切なフレームワーク配列は、例えば標準的なハンドブックおよび本明細書の更なる開示および従来技術に基づき、当業者に明らかである。
【０１５７】
特に、本発明の一価のポリペプチドに存在するフレームワーク配列は、１つ以上のホールマーク残基（国際公開第０８／０２００７９号の表Ａ−３〜Ａ−８において定義される）を含んでもよく、すなわち、本発明の一価のポリペプチドはナノボディである。かかるフレームワーク配列（の好適な組み合わせ）の幾つかの好適かつ非限定的な例は、本明細書における更なる開示から明らかとなる（例えば表Ａ−１を参照）。
一般的に、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的にヒト化されたナノボディ）は、具体的には、１つ以上のフレームワーク配列（例えば、さらに国際公開第０８／０２００７９号、６１頁第２４行目〜９８頁第３行目に記載）内に１つ以上の「ホールマーク残基」が存在することにより特徴づけることができる。
【０１５８】
より具体的には、本発明は、ＦＲ１―ＣＤＲ１―ＦＲ２―ＣＤＲ２―ＦＲ３―ＣＤＲ３―ＦＲ４の（一般）構造を有するアミノ酸配列の、少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドの提供に関し、式中、ＦＲ１からＦＲ４はフレームワーク領域１から４にそれぞれ該当し、ＣＤＲ１からＣＤＲ３は相補性決定領域１から３にそれぞれ該当し、ｉ）配列番号１〜５８のアミノ酸配列（表Ａ−３を参照）の少なくとも１つと少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、その際、 アミノ酸同一性の程度を決定するために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される。この点、参照として、配列番号１〜５８（表Ａ−２を参照）のイムノグロブリン単一可変ドメイン中のフレームワーク１の配列（配列番号５９〜１１６）、フレームワーク２の配列（配列番号１７５〜２３２）、フレームワーク３の配列（配列番号２９１〜２３２）、フレームワーク４の配列（配列番号４０７〜４６４）を列挙する表Ａ−１、または、ｉｉ）表Ａ−１にて図示するフレームワーク配列の組合せ、が挙げられ、その際、ｉｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔ付番に従う位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８のアミノ酸残基の１つ以上が、国際公開第０８／０２００７９号の表Ａ−３から表Ａ−８に記載のホールマーク残基から選択される。
【０１５９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、ＩＳＶＤが、
−ＣＤＲ１が配列番号１１７〜１７４により表され、ＣＤＲ２が配列番号２３３〜２９０により表され、ＣＤＲ３が配列番号３４９〜４０６により表されるＩＳＶＤ、
−配列番号１〜５８により表されるＩＳＶＤ、および、
−配列番号１〜５８のいずれか１つと少なくとも８０％以上の配列同一性により表されるＩＳＶＤ、
からなる群から選択される、ポリペプチドを提供する。
【０１６０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、ＣＤＲが、以下からなる群から選択される：
ＣＤＲ１が配列番号１１７であり、ＣＤＲ２が配列番号２３３であり、ＣＤＲ３が配列番号３４９である；
ＣＤＲ１が配列番号１１８であり、ＣＤＲ２が配列番号２３４であり、ＣＤＲ３が配列番号３５０である；
ＣＤＲ１が配列番号１１９であり、ＣＤＲ２が配列番号２３５であり、ＣＤＲ３が配列番号３５１である；
ＣＤＲ１が配列番号１２０であり、ＣＤＲ２が配列番号２３６であり、ＣＤＲ３が配列番号３５２である；
ＣＤＲ１が配列番号１２１であり、ＣＤＲ２が配列番号２３７であり、ＣＤＲ３が配列番号３５３である；
ＣＤＲ１が配列番号１２２であり、ＣＤＲ２が配列番号２３８であり、ＣＤＲ３が配列番号３５４である；
ＣＤＲ１が配列番号１２３であり、ＣＤＲ２が配列番号２３９であり、ＣＤＲ３が配列番号３５５である；
ＣＤＲ１が配列番号１２４であり、ＣＤＲ２が配列番号２４０であり、ＣＤＲ３が配列番号３５６である；
ＣＤＲ１が配列番号１２５であり、ＣＤＲ２が配列番号２４１であり、ＣＤＲ３が配列番号３５７である；
ＣＤＲ１が配列番号１２６であり、ＣＤＲ２が配列番号２４２であり、ＣＤＲ３が配列番号３５８である；
ＣＤＲ１が配列番号１２７であり、ＣＤＲ２が配列番号２４３であり、ＣＤＲ３が配列番号３５９である；
ＣＤＲ１が配列番号１２８であり、ＣＤＲ２が配列番号２４４であり、ＣＤＲ３が配列番号３６０である；
ＣＤＲ１が配列番号１２９であり、ＣＤＲ２が配列番号２４５であり、ＣＤＲ３が配列番号３６１である；
ＣＤＲ１が配列番号１３０であり、ＣＤＲ２が配列番号２４６であり、ＣＤＲ３が配列番号３６２である；
ＣＤＲ１が配列番号１３１であり、ＣＤＲ２が配列番号２４７であり、ＣＤＲ３が配列番号３６３である；
ＣＤＲ１が配列番号１３２であり、ＣＤＲ２が配列番号２４８であり、ＣＤＲ３が配列番号３６４である；
ＣＤＲ１が配列番号１３３であり、ＣＤＲ２が配列番号２４９であり、ＣＤＲ３が配列番号３６５である；
ＣＤＲ１が配列番号１３４であり、ＣＤＲ２が配列番号２５０であり、ＣＤＲ３が配列番号３６６である；
ＣＤＲ１が配列番号１３５であり、ＣＤＲ２が配列番号２５１であり、ＣＤＲ３が配列番号３６７である；
ＣＤＲ１が配列番号１３６であり、ＣＤＲ２が配列番号２５２であり、ＣＤＲ３が配列番号３６８である；
ＣＤＲ１が配列番号１３７であり、ＣＤＲ２が配列番号２５３であり、ＣＤＲ３が配列番号３６９である；
ＣＤＲ１が配列番号１３８であり、ＣＤＲ２が配列番号２５４であり、ＣＤＲ３が配列番号３７０である；
ＣＤＲ１が配列番号１３９であり、ＣＤＲ２が配列番号２５５であり、ＣＤＲ３が配列番号３７１である；
ＣＤＲ１が配列番号１４０であり、ＣＤＲ２が配列番号２５６であり、ＣＤＲ３が配列番号３７２である；
ＣＤＲ１が配列番号１４１であり、ＣＤＲ２が配列番号２５７であり、ＣＤＲ３が配列番号３７３である；
ＣＤＲ１が配列番号１４２であり、ＣＤＲ２が配列番号２５８であり、ＣＤＲ３が配列番号３７４である；
ＣＤＲ１が配列番号１４３であり、ＣＤＲ２が配列番号２５９であり、ＣＤＲ３が配列番号３７５である；
ＣＤＲ１が配列番号１４４であり、ＣＤＲ２が配列番号２６０であり、ＣＤＲ３が配列番号３７６である；
ＣＤＲ１が配列番号１４５であり、ＣＤＲ２が配列番号２６１であり、ＣＤＲ３が配列番号３７７である；
ＣＤＲ１が配列番号１４６であり、ＣＤＲ２が配列番号２６２であり、ＣＤＲ３が配列番号３７８である；
ＣＤＲ１が配列番号１４７であり、ＣＤＲ２が配列番号２６３であり、ＣＤＲ３が配列番号３７９である；
ＣＤＲ１が配列番号１４８であり、ＣＤＲ２が配列番号２６４であり、ＣＤＲ３が配列番号３８０である；
ＣＤＲ１が配列番号１４９であり、ＣＤＲ２が配列番号２６５であり、ＣＤＲ３が配列番号３８１である；
ＣＤＲ１が配列番号１５０であり、ＣＤＲ２が配列番号２６６であり、ＣＤＲ３が配列番号３８２である；
ＣＤＲ１が配列番号１５１であり、ＣＤＲ２が配列番号２６７であり、ＣＤＲ３が配列番号３８３である；
ＣＤＲ１が配列番号１５２であり、ＣＤＲ２が配列番号２６８であり、ＣＤＲ３が配列番号３８４である；
ＣＤＲ１が配列番号１５３であり、ＣＤＲ２が配列番号２６９であり、ＣＤＲ３が配列番号３８５である；
ＣＤＲ１が配列番号１５４であり、ＣＤＲ２が配列番号２７０であり、ＣＤＲ３が配列番号３８６である；
ＣＤＲ１が配列番号１５５であり、ＣＤＲ２が配列番号２７１であり、ＣＤＲ３が配列番号３８７である；
ＣＤＲ１が配列番号１５６であり、ＣＤＲ２が配列番号２７２であり、ＣＤＲ３が配列番号３８８である；
ＣＤＲ１が配列番号１５７であり、ＣＤＲ２が配列番号２７３であり、ＣＤＲ３が配列番号３８９である；
ＣＤＲ１が配列番号１５８であり、ＣＤＲ２が配列番号２７４であり、ＣＤＲ３が配列番号３９０である；
ＣＤＲ１が配列番号１５９であり、ＣＤＲ２が配列番号２７５であり、ＣＤＲ３が配列番号３９１である；
ＣＤＲ１が配列番号１６０であり、ＣＤＲ２が配列番号２７６であり、ＣＤＲ３が配列番号３９２である；
ＣＤＲ１が配列番号１６１であり、ＣＤＲ２が配列番号２７７であり、ＣＤＲ３が配列番号３９３である；
ＣＤＲ１が配列番号１６２であり、ＣＤＲ２が配列番号２７８であり、ＣＤＲ３が配列番号３９４である；
ＣＤＲ１が配列番号１６３であり、ＣＤＲ２が配列番号２７９であり、ＣＤＲ３が配列番号３９５である；
ＣＤＲ１が配列番号１６４であり、ＣＤＲ２が配列番号２８０であり、ＣＤＲ３が配列番号３９６である；
ＣＤＲ１が配列番号１６５であり、ＣＤＲ２が配列番号２８１であり、ＣＤＲ３が配列番号３９７である；
ＣＤＲ１が配列番号１６６であり、ＣＤＲ２が配列番号２８２であり、ＣＤＲ３が配列番号３９８である；
ＣＤＲ１が配列番号１６７であり、ＣＤＲ２が配列番号２８３であり、ＣＤＲ３が配列番号３９９である；
ＣＤＲ１が配列番号１６８であり、ＣＤＲ２が配列番号２８４であり、ＣＤＲ３が配列番号４００である；
ＣＤＲ１が配列番号１６９であり、ＣＤＲ２が配列番号２８５であり、ＣＤＲ３が配列番号４０１である；
ＣＤＲ１が配列番号１７０であり、ＣＤＲ２が配列番号２８６であり、ＣＤＲ３が配列番号４０２である；
ＣＤＲ１が配列番号１７１であり、ＣＤＲ２が配列番号２８７であり、ＣＤＲ３が配列番号４０３である；
ＣＤＲ１が配列番号１７２であり、ＣＤＲ２が配列番号２８８であり、ＣＤＲ３が配列番号４０４である；
ＣＤＲ１が配列番号１７３であり、ＣＤＲ２が配列番号２８９であり、ＣＤＲ３が配列番号４０５である；
ＣＤＲ１が配列番号１７４であり、ＣＤＲ２が配列番号２９０であり、ＣＤＲ３が配列番号４０６である、ポリペプチドを提供する。
【０１６１】
本発明のイムノグロブリン（特にイムノグロブリン単一可変ドメイン）は、全て「改良されたイムノグロブリン可変ドメイン」の名称の以下の同時係属中の米国仮特許出願に記載の特定の変異／アミノ酸残基を含んでもよい：米国仮特許出願第６１／９９４５５２号（２０１４年５月１６日に出願）；米国仮特許出願第６１／０１４，０１５号（２０１４年６月１８日に出願）；米国仮特許出願第６２／０４０，１６７号（２０１４年８月２１日に出願）；および米国仮特許出願第６２／０４７，５６０号（２０１４年９月８日に出願）（いずれもＡｂｌｙｎｘ社が出願人）。
【０１６２】
特に、本発明のイムノグロブリン（特にイムノグロブリン単一可変ドメイン）は、好適には、（ｉ）位置１１２でＫまたはＱを含むか、または（ｉｉ）位置１１０でＫまたはＱを、および位置１１でＶを含むか、または（ｉｉｉ）位置８９でＴを含むか、または（ｉｖ）位置８９でＬを、および位置１１０でＫまたはＱを含むか、または（ｖ）位置１１でＶを、および位置８９でＬを含むか、または（ｉ）から（ｖ）のあらゆる好適な組合せを含む。
【０１６３】
前記同時係属中の米国仮特許出願にも記載されるように、本発明のイムノグロブリンが上記の（ｉ）から（ｖ）のいずれか１つ（またはその好適な組合せ）に係る変異を含むとき、
−  位置１１のアミノ酸残基は、好ましくはＬ、ＶまたはＫから選択され（最も好ましくはＶである）、
−  位置１４のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから最適に選択され、
−  位置４１のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから最適に選択され、
−  位置８９のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＶまたはＬから最適に選択され、
−  位置１０８のアミノ酸残基は、好ましくはＱまたはＬから最適に選択され、
−  位置１１０のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから最適に選択され、
−  位置１１２のアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから最適に選択される。
【０１６４】
前記同時係属中の米国仮特許出願に記載されるように、前記の変異は、本発明のイムノグロブリンおよび化合物へのいわゆる「既存抗体」の結合を防止または減少させることに効果的である。この目的においては、本発明のイムノグロブリンは、（任意に前記変異との組合せで）Ｃ末端伸長部（Ｘ）ｎを含んでもよく（式中、ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４または５（好ましくは１または２、例えば１）であり、各Ｘは、独立に選択される、（好ましくは天然の）アミノ酸残基であり、好ましくは、各々アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立に選択される）、その参照として、前記米国仮特許出願および国際公開第１２／１７５７４１号が挙げられる。特に、本発明のイムノグロブリンは、タンパク質、ポリペプチドまたは他の化合物またはそれらを含む構築物のＣ末端を形成するとき、かかるＣ末端伸長部を含んでもよい（また、参照として、前記米国仮特許出願および国際公開第１２／１７５７４１号が挙げられる）。
【０１６５】
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば配列番号１〜５８）と競合する競合剤（例えばポリペプチド）を決定する方法に関し、該方法では、本発明のポリペプチドの非存在下での競合剤のＣＤ３８に対する結合と比較し、ポリペプチドである本明細書に記載のポリペプチドが、ＣＤ３８への結合、例えばｈＣＤ３８（配列番号４６５）との結合に関して、該競合剤と競合するかまたは交差ブロッキングし、本発明のポリペプチドの存在下で、該競合剤のＣＤ３８に対する結合が、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば８０％、９０％または１００％（すなわち所定のアッセイにおいて検出不可能な程度で）減少する。例えば、競合および交差ブロッキングは、公知技術のいかなる手段（例えば競合ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳアッセイ）で測定することができる。
【０１６６】
本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば配列番号１〜５８）と競合する競合剤に関し、該競合剤は、ＣＤ３８との結合に関して本明細書に記載されるポリペプチドと競合するかまたは交差ブロッキングし、前記競合剤の存在下で、前記競合剤がない場合の本発明のポリペプチドによるＣＤ３８への結合と比較し、本発明のポリペプチドのＣＤ３８に対する結合は、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば８０％、さらには、例えば少なくとも９０％または１００％（すなわち所定のアッセイにおいて検出不可能な程度で）減少する。一側面では、本発明は、配列番号１〜５８のうちの１つなどの本発明のポリペプチドによるＣＤ３８との結合を交差ブロッキングするポリペプチド、および／または配列番号１〜３８のうちの少なくとも１つによって、ＣＤ３８との結合が交差ブロッキングされるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、特異的にＣＤ３８と結合する少なくとも１つのＶＨ、ＶＬ、ｄＡｂ、イムノグロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、ＣＤ３８との結合が、好ましくはＣＤ３８の活性を調節する。
【０１６７】
イムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤が、本発明に従い交差ブロッキングするかまたは交差ブロッキングできるか否かを決定するための適切なＦＡＣＳアッセイを、以下に記載する。本明細書に記載されるイムノグロブリン、抗体、イムノグロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは他の結合剤のいずれかを用いてアッセイを実施できることはいうまでもない。ＦＡＣＳ装置（例えばFACS Canto; Becton Dickinson社）を、製造業者の推奨に従い操作する。
【０１６８】
ゆえに、さらに好適な側面では、本発明は、配列番号１〜５８により表されるポリペプチドと競合する競合阻害剤ポリペプチドを決定する方法に関し、該方法は、配列番号１〜５８により表されるポリペプチドの存在下で、ＣＤ３８への前記競合ポリペプチドの結合を決定することと、配列番号１から５８により表されるポリペプチドの存在下での前記競合ポリペプチドのＣＤ３８に対する結合が、配列番号１から５８により表されるポリペプチドが存在しない場合と比較し、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば８０％、９０％または１００％減少する競合ポリペプチドを検出することと、を含む。
【０１６９】
二価結合においては、熱力学的側面と同様に、制御的な側面からの利点が存在する。しかしながら、立体配置的自由度が制限されるとき、エピトープへの結合には、かなりの立体配置的制約が同時に存在することが公知である。両方のパラトープが同一であるとき、二価結合は（例えば普通抗体の）結合活性を増加させる場合があるが、これは異なるパラトープの場合には明らかでない。特に、エピトープが第１のパラトープと結合するとき、これにより第２のエピトープへの第２のパラトープの結合が妨げられる。特に、親和性が異な場合には顕著である。本発明者らは、多価ポリペプチドが、多価フォーマットにおけるこれらの立体配置的制約または標的親和性の相違にもかかわらず、本質的に、対応する一価のポリペプチドの組合せと同程度の、免疫応答における活性および効率を示すことを見出した。本発明者らはまた、異なるＣＤ３８のエピトープに対するＩＳＶＤを含む多価ポリペプチドが、通常の抗体に基づくベンチマーク分子と比較し、免疫応答を強化するということを見出した。
【０１７０】
ゆえに、本発明はさらに、多価ポリペプチド（また、本明細書において「本発明の多価ポリペプチド」と称される）に関し、該ポリペプチドは、ＣＤ３８を標的とする少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（またはその適切な断片）と、さらに、（好ましくはＣＤ３８を標的とする）１つのイムノグロブリン単一可変ドメインと、を含むかまたは、（本質的に）それからなる。
【０１７１】
好適な一側面では、本発明の多価ポリペプチドは、２つ以上のヒトＣＤ３８に対するイムノグロブリン単一可変ドメインを含むかまたは、本質的にそれからなる。２つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインは、１つ以上のペプチドリンカーを介して任意に連結されてもよい。
【０１７２】
本発明の多価ポリペプチドでは、２つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）は、同一でもよくまたは異なってもよく、同じ抗原または抗原決定基（例えば同じ部分またはエピトープ、または異なる部分またはエピトープ）を標的とすることができ、あるいは、異なる抗原または抗原決定基を標的とすることができ、あるいは、そのいかなる好適な組合せであってもよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、以下を含んでもよい：
（ａ）２つの同一のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）；
（ｂ）タンパク質または抗原の第１の抗原決定基を標的とするナノボディなどの第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および前記タンパク質または抗原の同じ抗原決定基を標的とするナノボディなどの第２のイムノグロブリン単一可変ドメインであって、前記第１のイムノグロブリン単一可変ドメインが前記第２のＩＳＶＤと異なる；
（ｃ）タンパク質または抗原の第１の抗原決定基を標的とするナノボディなどの第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および前記タンパク質または抗原の（前記第１の抗原決定基と異なる）他の抗原決定基を標的とするナノボディなどの第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン；または
（ｄ）第１のタンパク質または抗原を標的とするナノボディなどの第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン、およびナノボディなどの、第２の（すなわち前記第１のタンパク質または抗原と異なる）タンパク質または抗原を標的とする第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン。同様に、本発明の三価ポリペプチドは、例えば限定されないが、以下を含んでもよい：
（ａ）３つの同一のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）；
（ｂ）タンパク質または抗原の第１の抗原決定基に対するナノボディなどの２つの同一のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および同じタンパク質または抗原の異なる抗原決定基を標的とするナノボディなどの、第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン；
（ｃ）タンパク質または抗原の第１の抗原決定基に対するナノボディなどの２つの同一のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および前記第１のタンパク質または抗原と異なる第２のタンパク質または抗原を標的とするナノボディなどの第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン；
（ｄ）第１のタンパク質または抗原の第１の抗原決定基を標的とするナノボディなどの第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン、前記第１のタンパク質または抗原の、前記第１の抗原決定基と異なる第２の抗原決定基を標的とするナノボディなどの第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および前記第１のタンパク質または抗原と異なる第２のタンパク質または抗原を標的とするナノボディなどの第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン；または
（ｅ）第１のタンパク質または抗原を標的とするナノボディなどの第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン、前記第１のタンパク質または抗原と異なる第２のタンパク質または抗原を標的とするナノボディなどの第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン、およびナノボディなどの、前記第１および第２のタンパク質または抗原と異なる第３のタンパク質または抗原を標的とする第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン。
【０１７３】
少なくとも２つのイムノグロブリン単一可変ドメインを含む（ナノボディなどの）本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）が、第１の抗原（すなわちＣＤ３８）を標的とし、少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）が、第２の抗原（すなわちＣＤ３８と異なる）を標的とするため、本発明では「多重特異的な」ポリペプチドとも呼ばれ、かかるポリペプチドに存在するイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）はまた、本明細書において、「多重特異的なフォーマット」である、と称される。このように、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＣＤ３８）を標的とするナノボディなどの少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン、および第２の抗原（すなわちＣＤ３８と異なる）を標的とするナノボディなどの少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであり、あるいは、本発明の「三重特異的」ポリペプチドは、少なくとも１つの、第１の抗原（すなわちＣＤ３８）を標的とするナノボディなどのイムノグロブリン単一可変ドメイン、および第２の抗原（すなわちＣＤ３８と異なる）を標的とするナノボディなどの少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメイン、および第３の抗原（すなわち両方のＣＤ３８および第２の抗原と異なる）を標的とするナノボディなどの少なくとも１つの更なる抗原イムノグロブリン単一可変ドメイン、その他、を含むポリペプチドである。
【０１７４】
したがって、一側面では、本発明の多価ポリペプチドは、本発明の二価ポリペプチドの場合、その最も単純な形態では、ＣＤ３８を標的とする第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、およびＣＤ３８を標的とする同一の第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を含み、前記第１および第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）が、（本明細書で定義される）リンカー配列を介して任意に連結されてもよく、本発明の三価ポリペプチドの場合、その最も単純な形態では、ＣＤ３８を標的とする第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、ＣＤ３８を標的とする同一の第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、およびＣＤ３８を標的とする同一の第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を含み、前記第１、第２および第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）は、１つ以上、具体的には２つのリンカー配列を介して任意に連結されてもよい。
【０１７５】
別の側面では、本発明の多価ポリペプチドは、ＣＤ３８を標的とする第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、および第２の抗原を標的とする第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を含み、前記第１および第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）が、（本明細書で定義される）リンカー配列を介して任意に連結されてもよい、本発明の二重特異性ポリペプチドでもよく、あるいは、本発明の多価ポリペプチドは、ＣＤ３８を標的とする第１のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、第２の抗原を標的とする第２のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、および第３の抗原を標的とする第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）、を含み、前記第１、第２および第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）が、１つ以上、具体的には２つのリンカー配列を介して任意に連結されてもよい、本発明の三重特異性ポリペプチドでもよい。
【０１７６】
別の態様において、本発明のポリペプチドは、三価の、二重特異性ポリペプチドである。本発明の三価、二重特異性ポリペプチドは、その最も単純な形態では、ＣＤ３８に対するナノボディなどの、２つの同一のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および他の抗原（例えば血清アルブミン）を標的とする第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）を含み、前記第１、第２および第３のイムノグロブリン単一可変ドメイン（例えばナノボディ）が、１つ以上、具体的には２つのリンカー配列を介して任意に連結されてもよい、（本明細書で定義される）三価ポリペプチドでもよい。
【０１７７】
更なる態様において、本発明のポリペプチドは、マルチパラトピックポリペプチド（また、本明細書において「本発明のマルチパラトピックポリペプチド」と称される）であり、例えば（ａ）「本発明のバイパラトピックポリペプチド」または「本発明のトリパラットピックポリペプチド」である。本明細書で用いられる用語「マルチパラトピック」（抗原）結合分子または「マルチパラトピック」ポリペプチドとは、少なくとも２つの（すなわち２つまたはそれ以上の）イムノグロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、その際、「第１の」イムノグロブリン単一可変ドメインはＣＤ３８を標的とし、「第２の」イムノグロブリン単一可変ドメインはＣＤ３８を標的とし、これらの「第１」および「第２」のイムノグロブリン単一可変ドメインは、異なるパラトープを有する。したがって、マルチパラトピックポリペプチドは、ＣＤ３８に対する２つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインを含むかまたはそれらからなり、少なくとも１つの「第１の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１のエピトープを標的とし、少なくとも１つの「第２の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１のエピトープと異なるＣＤ３８上の第２のエピトープを標的とする。
【０１７８】
更なる特に好適な側面では、本発明のポリペプチドは、バイパラトピックポリペプチドである。本明細書で用いられる「バイパラトピック」（抗原）結合分子または「バイパラトピック」ポリペプチドという用語は、ＣＤ３８を標的とする「第１の」イムノグロブリン単一可変ドメインおよびＣＤ３８を標的とする「第２の」イムノグロブリン単一可変ドメインを含み、「第１」および「第２」のイムノグロブリン単一可変ドメインが、異なるパラトープを有するポリペプチドを意味する。したがって、バイパラトピックポリペプチドは、ＣＤ３８に対する２つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインを含むかまたはそれらからなり、「第１の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１のエピトープを標的とし、「第２の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１のエピトープと異なるＣＤ３８上の第２のエピトープを標的とする。
【０１７９】
別の態様において、本発明のポリペプチドは、トリパラトピックポリペプチドである。本明細書で用いられる「トリパラトピック」（抗原）結合分子または「トリパラトピック」ポリペプチドという用語は、ＣＤ３８を標的とする「第１の」イムノグロブリン単一可変ドメイン、ＣＤ３８を標的とする「第２の」イムノグロブリン単一可変ドメイン、およびＣＤ３８を標的とする「第３の」イムノグロブリン単一可変ドメイン、を含み、これらの「第１の」、「第２の」および「第３の」イムノグロブリン単一可変ドメインが、異なるパラトープを有するポリペプチドを意味する。したがって、トリパラトピックポリペプチドは、ＣＤ３８に対する３つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインを含むかまたはそれらからなり、「第１の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１のエピトープを標的とし、「第２の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１のエピトープと異なるＣＤ３８上の第２のエピトープを標的とし、「第３の」イムノグロブリン単一可変ドメインは、ＣＤ３８上の第１および第２のエピトープと異なるＣＤ３８上の第３のエピトープを標的とする。
【０１８０】
本発明の多価ポリペプチドに存在する２つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）、または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）からなってもよく、それらは、従来の４鎖型抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列からなってもよい。好適な側面では、それらは、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸）、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸）、「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸）、ナノボディ（登録商標）（ＶＨＨを含むが、これに限定されない）、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列、からなる。２つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインは、部分的に、または完全に、ヒト化されたナノボディまたは部分的に、または完全にヒト化されたＶＨＨからなってもよい。本発明の好ましい側面では、本発明の多価ポリペプチドに含まれるイムノグロブリン単一可変ドメインは、本明細書で定義される、本発明の１つ以上の一価のポリペプチドである。
【０１８１】
一態様では、本発明が、各々が２００ｎＭ未満のＥＣ５０値でＣＤ３８に特異的に結合する、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含む、本明細書に記載されるポリペプチドを提供する。
【０１８２】
一態様では、本発明が、ＣＤ３８と結合できる少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤが異なる、本明細書に記載されるポリペプチドを提供する。
【０１８３】
一態様では、本発明は、ＣＤ３８と結合できる少なくとも２つのＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤがＣＤ３８上の異なるエピトープと結合する、本明細書に記載されるポリペプチドを提供する。
【０１８４】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され、
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、ポリペプチドを提供する。
【０１８５】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、ポリペプチドを提供する。
【０１８６】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、前記第１のＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、ポリペプチドを提供する。
【０１８７】
本発明の多価ポリペプチドのＣＤ３８への結合は、結合実験において測定できる。典型的なアッセイとしては、限定されないが、ＣＤ３８を細胞表面に露出させるアッセイが挙げられる（実施例参照）。本発明の多価ポリペプチドのＣＤ３８への結合を測定するための好適なアッセイはＦＡＣＳ分析であり、例えば実施例にて説明されるＦＡＣＳアッセイが挙げられ、当該アッセイでは、本発明の多価ポリペプチドを細胞上に発現したＣＤ３８に結合させる。本発明のポリペプチドをＣＤ３８に結合させるための幾つかの好適なＥＣ５０および／またはＫＤ値は、本明細書における更なる詳細な説明および実施例から明らかとなる。
【０１８８】
かかるＦＡＣＳ結合実験において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−８Ｍ以下の、より好ましくは１０−９Ｍ以下の、より好ましくは１０−１０Ｍ以下の、例えば１０−１１Ｍの、ヒトＣＤ３８との結合におけるＥＣ５０値を示しうる。例えば、かかるＦＡＣＳ結合実験において、本発明の多価ポリペプチドは、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍの、例えば１０−１１Ｍ〜１０−１０Ｍの、１０−１０Ｍ〜１０−９Ｍの、または１０−１１Ｍ〜１０−１０Ｍの、ヒトＣＤ３８との結合におけるＥＣ５０値を示しうる。
【０１８９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、
−  ＦＡＣＳ分析のＥＣ５０が、１９０ｐＭ以下、例えば１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０または１００未満、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５または２０未満、例えば１６ｐＭ未満であり、および／または、
−  前記ポリペプチドが、最大１００ｎＭ、例えば５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、好ましくは最大２ｎＭ、例えば１ｎＭ、のＩＣ５０によりＣＤ３８と結合し、および／または
−  ベンチマークのＩＣ５０と比較し、好ましくは競合ＦＡＣＳによる測定において、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％または１００％優れたＩＣ５０によりＣＤ３８と結合する、ポリペプチドを提供する。
【０１９０】
本発明の多価ポリペプチドは、ＣＤ３８と結合し、免疫応答を調節（すなわち増加、促進、刺激または増強）できる。より具体的には、本発明のポリペプチドは免疫応答を強化でき、例えばＣＤＣ活性を強化する。
【０１９１】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のポリペプチドがＦｃ部に結合するとき、免疫応答（例えばＣＤＣ）が効率的に誘導されることを観察した。さらに、２つの一価のＦｃ構築物、すなわちＣＤ３８上の異なるエピトープに対する各々の組合せが、対応するベンチマークよりはるかに良好な効力（例えば免疫応答）を示した。また、ＣＤ３８上の異なるエピトープに対するＩＳＶＤを含む二価のポリペプチドがＦｃ構築物においてフォーマット化されるとき、このＦｃ構築物もまた、対応するベンチマークよりはるかに良好な効力（例えば免疫応答）を示した。
【０１９２】
本発明において「ベンチマーク」とは、本明細書に記載されるパフォーマンス、すなわち分子の１つ以上の機能的な特徴、例えば親和性、効率および効力を評価するための評価の基準として用いられる。特定のイムノグロブリン構築物は、特定のベンチマークの適切さを決定し、それは当業者によって、容易に評価できる。ゆえに、特に好適な側面では、本発明は、２つのポリペプチド（各々「本発明のポリペプチド」）を含み、各ポリペプチドが、通常、適切なヒンジ領域またはリンカーを介して、１つ以上の定常ドメイン（例えばＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）に連結される１つ以上のＩＳＶＤを含み、それらが、最終的な構築物においてＦｃ部を一緒に形成する、イムノグロブリン構築物を提供する。
【０１９３】
このように、「本発明のイムノグロブリン構築物」は、一般的に（本明細書で定義される）Ｆｃ部を含み、その際Ｆｃを形成する２つのポリペプチドが各々、任意に適切なリンカーまたはヒンジ領域を介して、（本明細書において定義される）２つ以上の単一可変ドメインに連結する。かかる構築物は、例えば欧州特許出願公開第１６２１５５４号、国際公開第０２／０５６９１０号または国際公開第２００９／０６８６３０号に記載のものであってもよい。
【０１９４】
本発明のポリペプチドおよび本発明の構築物を形成する際のそれらの使用は、本発明の更なる側面である。また、特定の本発明の側面では、本明細書にさらに記載されるように、本発明のこれらのポリペプチドは、そのように（すなわち他のポリペプチド鎖との相互作用なしで、および／または本発明のイムノグロブリン構築物の一部としてでなく）使用されうる。
【０１９５】
好ましくは、本発明の構築物では、本発明の各ポリペプチドは、少なくとも１つ、例えば１つ、２つまたは３つのＩＳＶＤ、より好ましくは２つのＩＳＶＤのみを含む。換言すれば、本発明のイムノグロブリン構築物は、好ましくは合計４つの（すなわち各ポリペプチドに２つの）ＩＳＶＤを含む。
【０１９６】
また、本発明の各ポリペプチドは、通常２つの定常ドメイン（例えばＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤに由来するＦｃ部の場合）、または３つの定常ドメイン（例えばＩｇまたはＩｇＥに由来するＦｃ部の場合）を含み、それにより、最終的な構築物において、２つのポリペプチド鎖の定常ドメインが、Ｆｃ部例えば、ＩｇＧ（例えばＩｇＧｌ、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３またはｌｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭに由来するＦｃ部、またはその誘導体、類縁体、変異体、部分もしくは断片（キメラＦｃ部を含む）を形成し、それらは、本明細書にさらに記載されるエフェクター機能を有してもよく、または有さなくともよい。
【０１９７】
４つの単一可変ドメインおよび（例えばＩｇＧまたはＩｇＡまたはその類縁体、変異体または誘導体に由来するＦｃ部を形成する）４つの定常ドメインを有する本発明の構築物を、非限定的な図１に図示する。前記構築物は、２つのポリペプチド（１）および（２）を含み、各々２つの定常ドメイン（７）および（８）、「第１の」ＩＳＶＤ（３）および「第２の」ＩＳＶＤ（４）を含む。第１のＩＳＶＤ（３）は、任意に適切なリンカー（５）を介して第２のＩＳＶＤ（４）に連結し、また任意に（また通常）適切なリンカーまたはヒンジ領域（６）を介して定常ドメインに連結する。ポリペプチド（１）の定常ドメイン（７）および（８）、ならびにポリペプチド鎖（２）の対応する定常ドメイン（７）および（８）は、共にＦｃ部（９）を形成する。２つのポリペプチド対に存在する対応する定常ドメインは、例えば共有結合で各々結合し、例えば、ポリペプチド１上のＣＨ２ドメインは、ポリペプチド２上のＣＨ２ドメインと対になり、ポリペプチド１上のＣＨ３ドメインは、ポリペプチド２上のＣＨ３ドメインと対になる、等。
【０１９８】
したがって、本発明の一側面では、本発明のイムノグロブリン構築物において、前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ２ドメインは、前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ２ドメインと対をなし、および／または、前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと対をなす、イムノグロブリンのＦｃ部は、（従来技術において、当業者に公知のように）パパインによる抗体の消化後、典型的に生じる抗体の断片として定義され、それは、イムノグロブリンの２つのＣＨ２−ＣＨ３領域、および連結領域（例えばヒンジドメイン）を含む。抗体重鎖の定常ドメインは、抗体のアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＡＩ、ｌｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を定義する。
【０１９９】
Ｆｃ部は、補体系のＦｃ受容体およびタンパク質と呼ばれる細胞表面レセプターと共に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などの抗体のエフェクター機能を媒介する。
【０２００】
本明細書で用いられる「ＣＨ２ドメイン」または「ＣＨ２ドメイン」という用語は、イムノグロブリンのＣＨ２ドメインを指す。このように、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番システムに従うとアミノ酸２２８〜３４０に対応する。しかしながら、ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかでもよい。
【０２０１】
本明細書で用いられる「ＣＨ３ドメイン」または「ＣＨ３ドメイン」という用語は、イムノグロブリンのＣＨ３ドメインを指す。このように、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番システムに従うとアミノ酸３４１〜４４７に対応する。しかしながら、ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかでもよい。
【０２０２】
ＣＨ２ドメイン、ヒンジおよびＣＨ３ドメインを含む好適な領域は、配列番号４６６および４６７により表される。
【化２】
2019503167.tif 000003
【化３】
2019503167.tif 000004
【０２０３】
例えばScheuplein et al. 2010などの当業者に公知のいずれかの好適な方法によって、Ｆｃ部を含む本発明のポリペプチドを調製できる。例えば、適切な制限酵素部位が隣接するプライマーを用いたＰＣＲ増幅、およびそれに続く発現ベクターｐＭＥの消化およびそれに対するライゲーションにより、マウスＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分への融合タンパク質として個々のＩＳＶＤを再クローニングすることが可能である。
【０２０４】
本発明の一側面では、本発明のポリペプチドはさらに、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含み、好ましくは、前記ＣＨ２および前記ＣＨ３ドメインは直接連結されるかまたはリンカーを介して連結される。
【０２０５】
好適かつ非限定的な本発明の側面では、本発明のイムノグロブリン構築物は、（任意に適切なリンカーを介して）一対の第２のＩＳＶＤに連結される一対の第１のＩＳＶＤに（任意に適切なリンカーまたはヒンジ領域を介して）連結されるＦｃ部を含み（すなわち、本明細書にさらに記載されるように、各ポリペプチドが結合してＦｃ部を形成する）、すなわち、本明細書で示す構築物およびＩＳＶＤは、
−  両方の第１のＩＳＶＤが、ＣＤ３８の第１の標的、抗原エピトープ、抗原決定基、一部、ドメインまたはサブユニットを標的とし、
−  両方の第２のＩＳＶＤが、ＣＤ３８の第２の標的、抗原、エピトープ、抗原決定基、一部、ドメインまたはサブユニットを標的とし、
ＣＤ３８の第１の標的、抗原エピトープ、抗原決定基、一部、ドメインまたはサブユニットが、ＣＤ３８の第２の標的、抗原エピトープ、抗原決定基、一部、ドメインまたはサブユニットと異なる。
【０２０６】
他の側面によれば、本発明の１つ以上のポリペプチドは（任意に適切なリンカーまたはヒンジ領域を介して）、１つ以上の定常ドメインに（例えば、Ｆｃ部を形成するための部分もしくは全部として使用できる、２つまたは３つの定常ドメイン）、Ｆｃ部に、ＩｇＧタイプの抗体定常領域に、および／または、１つ以上の抗体部分、断片またはドメインに連結させることができ、それにより、本発明のポリペプチドに１つ以上のエフェクター機能を付与し、および／または１つ以上のＦｃ受容体と結合する能力を付与することができる。例えば、この目的のために、限定されないが、１つ以上の更なるアミノ酸配列は、抗体中の、例えば（本明細書に記載されるように）重鎖抗体、好ましくは従来型のヒト４鎖型抗体由来の１つ以上のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含んでもよく、および／または、例えばＩｇＧ由来の（例えばＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３またはｌｇＧ４由来の）、ＩｇＥ由来の、または他のヒトＩｇ（例えばＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭ）由来のＦｃドメイン（の一部）を形成してもよい。例えば国際公開第９４／０４６７８号は、ラクダ化ＶＨＨドメイン（すなわちナノボディ）またはそのヒト化誘導体を含む重鎖抗体を開示しており、そこでは、ラクダ科ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインがヒトＣＨ２およびＣＨ３ドメインと置換され、それにより、ナノボディ、ならびにヒトＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む（がＣＨ１ドメインを含まない）、各々２つの重鎖からなるイムノグロブリンが提供され、当該イムノグロブリンが、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインにより提供されるエフェクター機能を有し、また当該イムノグロブリンが、いかなる軽鎖の存在なしでも機能できる。
【０２０７】
具体的には、本発明のイムノグロブリン構築物は、ベンチマークと比較し、（実際のまたは見かけの）ＫＤ値、（実際のまたは見かけの）ＫＡ値、Ｋｏｎ速度および／またはＫｏｆｆ速度として、適切に測定および／または表される親和性で、標的と結合する。
【０２０８】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを含むイムノグロブリン構築物に関し、当該イムノグロブリン構築物は、例えばリガンド競合アッセイ、競合ＦＡＣＳ、機能的細胞アッセイ（リガンドにより誘導される走化性の抑制等）、アルファースクリーンアッセイなど（好ましくは競合ＦＡＣＳ）によって測定した場合、ベンチマークのＩＣ５０よりも少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、または１００％またはそれ以上良好なＩＣ５０で標的と結合する。
【０２０９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを含むイムノグロブリン構築物に関し、前記イムノグロブリン構築物は、例えばリガンド競合アッセイ、競合ＦＡＣＳ、機能的細胞アッセイ（リガンドにより誘導される走化性の抑制等）、アルファースクリーンアッセイなど（好ましくは競合ＦＡＣＳ）によって測定した場合、ベンチマークのＩＣＳ０よりも少なくとも１．５倍、例えば２倍、３倍または４倍、さらには５倍または１０倍良好なＩＣ５０で標的と結合する。
【０２１０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを含み、例えばリガンド競合アッセイ、競合ＦＡＣＳ、機能的細胞アッセイ（リガンドにより誘導される走化性の抑制等）、アルファースクリーンアッセイなど（好ましくは競合ＦＡＣＳ）によって測定した場合、２００ｎＭ〜０．０１ｎＭの間の、例えば０．０１、０．０５、０．１、０．１５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｎＭのＩＣ５０を有するイムノグロブリン構築物に関する。
【０２１１】
したがって、本発明は、さらにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、好ましくは前記ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが直接連結されるかまたはリンカーを介して連結される、本発明の第１のポリペプチドと、さらにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、好ましくは前記ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが直接連結されるかまたはリンカーを介して連結される、本発明の第２のポリペプチドと、を含み、前記ポリペプチドの前記ＣＨ２ドメインおよび前記ＣＨ３ドメインがＦｃ部を形成する、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１２】
本発明の更なる好ましい一態様では、イムノグロブリン構築物中の前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは同一である。
【０２１３】
一態様では、本発明は、前記第１のポリペプチドが、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含み、前記第２のポリペプチドが、第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤを含む、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１４】
一態様では、本発明は、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１５】
一態様では、本発明は、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８、および
（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３４、１４０、１４４、１４６、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４、および
（ｄ）配列番号２４７、２４８、２５０、２５６、２６０、２６２、２６６、２６７、２６８、２６９、２７１、２７４のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０、および
（ｆ）配列番号３６３、３６４、３６６、３７２、３７６、３７８、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１６】
一態様では、本発明は、前記第１のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６、および
（ｂ）配列番号１２９、１６３、１６４、１６５、１６６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２、および
（ｄ）配列番号２４５、２７９、２８０、２８１、２８２のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８、および
（ｆ）配列番号３６１、３９５、３９６、３９７、３９８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
前記第２のＩＳＶＤが、本質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、
（ｉ）ＣＤＲ１が、
（ａ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および
（ｂ）配列番号１、３、４、９、１０、２０、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、
（ｃ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、および
（ｄ）配列番号２３３、２３５、２３６、２４１、２４２、２５２、２７５、２７６、２７７、２７８、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、
（ｅ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、および
（ｆ）配列番号３４９、３５１、３５２、３５７、３５８、３６８、３９１、３９２、３９３、３９４、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６のアミノ酸配列に対し４、３、２または１アミノ酸の相違を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１７】
一態様では、本発明は、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが同一である、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１８】
一態様では、本発明は、前記第１のＩＳＶＤがＣＤ３８の第１のエピトープと結合し、前記第２のＩＳＶＤがＣＤ３８上の第２のエピトープと結合し、前記第１のエピトープが前記第２のエピトープと異なり、好ましくは前記第１のエピトープが前記第２のエピトープと重複しない、イムノグロブリン構築物に関する。
【０２１９】
本発明の一価のポリペプチドおよび本発明の多価ポリペプチド（本発明のイムノグロブリン構築物に含むか否かを問わない）は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでもよく、またはさらに含まなくともよい。これらの一価のポリペプチドおよび多価ポリペプチド（更なる基、残基、部分または結合単位の有無を問わない）はいずれも、「本発明の化合物」、「本発明の構築物」および／または「本発明のポリペプチド」と呼ばれる。
【０２２０】
例えば、かかる更なる基、残基、部分または結合単位は、１つ以上の更なるアミノ酸配列でもよく、そうすると、当該ポリペプチドは（融合）タンパク質または（融合）ポリペプチドとなる。好適かつ非限定的な側面では、前記１つ以上他の基、残基、部分または結合単位は、イムノグロブリンである。さらにより好ましくは、前記１つ以上他の基、残基、部分または結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸、ナノボディ（例えば例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨ配列）からなる群から選択されるイムノグロブリン単一可変ドメインである。
【０２２１】
上述の通り、更なる結合単位（例えば異なる抗原特異性を有するイムノグロブリン単一可変ドメイン）を連結して多重特異的なポリペプチドを形成することができる。２以上の特異性のイムノグロブリン単一可変ドメインを結合することによって、二重特異性、三重特異性等の構築物を形成しることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、１つ、２つ、３つまたはそれ
以上のＣＤ３８に対するイムノグロブリン単一可変ドメインと、他の標的に対する１つのイムノグロブリン単一可変ドメインと、を含んでもよい。かかる構築物およびその修飾物はいずれも、（当業者に容易に想定できるように）、「本発明の化合物、本発明の構築物および／または本発明のポリペプチド」という本明細書で用いられる用語に包含される。
【０２２２】
上記の化合物、構築物および／またはポリペプチドにおいて、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のイムノグロブリン単一可変ドメイン、および１つ以上の基、残基、部分または結合単位は各々、直接に、および／または１つ以上の適切なリンカーまたはスペーサを介して連結されてもよい。例えば、１つ以上の基、残基、部分または結合単位がアミノ酸配列であるとき、リンカーはアミノ酸配列でもよく、その結果、得られるポリペプチドは融合（タンパク質）または融合（ポリペプチド）となる。
【０２２３】
１つ以上の更なる基、残基、部分または結合単位は、いかなる適切なおよび／または目的のアミノ酸配列でもあってもよい。更なるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドの（生物学的）特性を変化させても、または変化させなくともよく、影響してもよく、また、本発明のポリペプチドに更なる官能性を付与しても、または付与しなくともよい。好ましくは、更なるアミノ酸配列は、それが本発明のポリペプチドに１つ以上の所望の特性または官能性を付与するものである。
【０２２４】
かかるアミノ酸配列の例は、当業者に明らかであり、一般的には、通常抗体およびその断片に基づくペプチド融合において用いられるあらゆるアミノ酸配列（限定されないが、ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）を含んでもよい。参照としては、例えばHolliger and Hudson (Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005)によるレビューが挙げられる。
【０２２５】
例えば、かかるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドそれ自体と比較し、半減期、溶解性または吸収を増加させ、免疫原性または毒性を減少させ、好ましくない副作用を排除または軽減し、および／または他の有利な特性を付与し、および／または、本発明の化合物、構築物またはポリペプチドの望ましくない特性を減少させるアミノ酸配列でもよく、またはそうでなくてもよい。かかるアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質であり、例えばヒト血清アルブミン（例えば国際公開第００／２７４３５号を参照）またはハプテン分子（例えば循環抗体により認識されるハプテン、例えば国際公開第９８／２２１４１号を参照）である。
【０２２６】
タグまたは他の機能性部分（例えば毒素、標識、放射性化学物質など）をさらに含む、本発明のイムノグロブリンまたはポリペプチドを含む化合物、構築物および／またはポリペプチドも本発明に包含される。
【０２２７】
あるいは、更なる基、残基、部分または結合単位は、例えば、単独で生物学的におよび／または薬理的に活性を有するか、または活性を有さない化学基、残基、部分であってもよい。例えば、限定されないが、かかる基は、本発明の１つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインまたは一価のポリペプチドに連結されることにより、本発明のポリペプチドの「誘導体」を形成しうる。
【０２２８】
したがって、本発明は最も広義には、本発明のポリペプチドの誘導体である化合物、構築物および／またはポリペプチドも包含する。かかる誘導体は一般的には、本発明のポリペプチド中の、および／または本発明のポリペプチドを形成するアミノ酸残基の１つ以上の修飾によって、具体的には化学的および／または生物学的（例えば酵素的）修飾によって得ることが可能である。
【０２２９】
かかる修飾の例、ならびに、かかる修飾および潜在的用途およびかかる修飾による利点を導入するために用いることができる態様、方法および技術により修飾できるポリペプチド配列中の（すなわちタンパク質骨格、または好ましくは側鎖上への）アミノ酸残基の例は、当業者に明らかである（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013を参照）。
【０２３０】
例えば、かかる修飾では、（例えば共有結合的な連結、または他のいずれかの好適な方法により）、本発明のポリペプチドの内部および表面への１つ以上の官能基、残基または、部分への、特に、１つ以上の官能基、残基または部分への導入を行ってもよく、それにより、本発明のポリペプチドに１つ以上の所望の特性または官能性が付与される。かかる官能基の例は、当業者に明らかである。
【０２３１】
例えば、かかる修飾では、（例えば共有結合的な連結、または他のいずれかの好適な方法により）、１つ以上の官能基の導入を行ってもよく、それにより、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性および／または吸収性が増加し、本発明のポリペプチドの免疫原性および／または毒性が減少し、本発明のポリペプチドのいずれかの好ましくない副作用を排除または軽減し、および／または、他の有利な特性を付与し、および／または、本発明のポリペプチドの望ましくない特性を減少させ、または前記の２つ以上のいかなる組合せを生じさせる。かかる官能基、およびそれらを導入する技術の例は当業者に明らかであり、通常、前記で引用した一般的な先行文献に記載のいずれの官能基および技術、ならびに、医薬用タンパク質の修飾のための、特に、抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の修飾のための官能基および公知技術それ自体が含まれ、参照として、例えばRemington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)が挙げられる。かかる官能基は、例えば、本発明のポリペプチドに（例えば共有結合で）直接連結されてもよく、または任意に適切なリンカーまたはスペーサを介して連結されてもよく、これらはまた当業者に明らかである。
【０２３２】
更なるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させるかもしくはないか、変更するか、あるいは影響するものであってもよく、また本発明のポリペプチドに、更なる官能性を付与するかまたは付与しなくともよい。例えば、かかるアミノ酸残基は以下のとおりである：
ａ）例えば異種起源の宿主細胞または宿主生物における発現の結果として、Ｎ末端Ｍｅｔ残基を含みうる。
ｂ）合成により、宿主細胞からポリペプチドを分泌させるシグナル配列またはリーダー配列を形成できる（例えば、本発明のポリペプチドの発現に用いる宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドをプレ、プロまたはプレプロ形態とすることができる）。適切な分泌リーダーペプチドは当業者に明らかであり、本明細書においてさらに記載されうる。通常、かかるリーダー配列はポリペプチドのＮ末端基に連結されるが、最も広義の態様における本発明はそれに限定されない。
ｃ）例えば、前記配列または残基に対する親和性に基づく技術を用い、「タグ」（例えばポリペプチドの精製を可能にまたは容易にするアミノ酸配列または残基）を形成できる。その後、前記配列または残基を（例えば化学的または酵素的切断によって）除去し、ポリペプチドを得ることができる（その際、前記タグは任意に、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列またはポリペプチド鎖に連結されてもよく、または切断可能モチーフを含んでもよい）。かかる残基の幾つかの好適かつ非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基およびｍｙｃタグ（例えばＡＡＡＥＱＫＵＳＥＥＤＬＮＧＡＡ、配列番号２０６）である。
ｄ）官能化された、および／または、官能基の結合部位として機能しうる１つ以上のアミノ酸残基でもよい。適切なアミノ酸残基および官能基は当業者に明らかで、本発明のポリペプチドの誘導体の場合、本明細書に記載のアミノ酸残基および官能基が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３３】
一態様では、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位（任意に１つ以上のペプチドのリンカーを介して連結される）をさらに含む、本明細書に記載されるポリペプチドに関する。
【０２３４】
本発明の具体的側面では、本発明の対応するポリペプチドと比較し増加した半減期を有する化合物または構築物を調製する。かかる半減期延長部分を含む本発明のポリペチドの例としては、限定されないが、例えば、イムノグロブリン単一可変ドメインが、１つ以上の血清タンパクまたはその断片（例えば（ヒト））血清アルブミンまたはその適切な断片）、または、血清タンパク質（例えば血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン））と結合できる１つ以上の結合単位（例えばドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一のドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列またはラクダ化ＶＨ配列）、血清イムノグロブリン（例えばＩｇＧ）、トランスフェリンまたは国際公開第０４／００３０１９号に列挙されるいずれか１つの他の血清タンパク質、に適切に連結されたポリペチド、イムノグロブリン単一可変ドメインが、Ｆｃドメイン（例えばヒトＦｃ）、抗体定常領域（例えばＩｇＧ由来の抗体定常領域）またはその適切な一部または断片に連結されたポリペプチド、または、１つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインが、血清タンパクと結合できる１つ以上の小分子タンパク質またはペプチドに最適に連結されたポリペチド（例えば、限定されないが、国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号または国際公開第０２／０７６４８９号に記載のタンパク質およびペプチド）が挙げられる。参照としては、ｄＡｂについては国際公開第０３／００２６０９号および国際公開第０４／００３０１９号、Harmsen et al. (Vaccine 23: 4926-42, 2005)、欧州特許出願公開第０３６８６８４号、ならびにＡｂｌｙｎｘ社による国際公開第０８／０２８９７７号、国際公開第０８／０４３８２１号および国際公開第０８／０６８２８０号、ならびに国際公開第０８／０４３８２２号が挙げられる。
【０２３５】
具体的かつ非限定的な本発明の側面では、本発明のポリペチドは、ＣＤ３８に対する本発明の１つ以上のＩｇ単一可変ドメインおよび／または一価のポリペチドの他に、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１つのＩｇ単一可変ドメインを含んでもよい。これらのヒト血清アルブミンに対するイムノグロブリン単一可変ドメインは、前述のＡｂｌｙｎｘ社による出願に広義に記載されているものであってもよい（例えば国際公開第０４／０６２５５１を参照）。増加した半減期を付与し、本発明のポリペプチドにおいて使用できる幾つかの特に好ましいナノボディとしては、国際公開第０６／１２２７８７号（表ＩＩおよびＩＩＩを参照）において開示されるナノボディ  ＡＬＢ−１からＡＬＢ−１０が挙げられ、中でも、ＡＬＢ−８（国際公開第０６／１２２７８７号の配列番号６２）、ならびに国際公開第２０１２／１７５４００号において開示されるナノボディ（国際公開第２０１２／１７５４００号の配列番号１〜１１）、および「改良されたイムノグロブリン単一可変ドメイン」の名称の出願係属中の米国仮特許出願第６２／０４７，５６０号（出願日：２０１４年９月８日、出願人：Ａｂｌｙｎｘ社）において開示される配列番号１０９のナノボディが特に好ましい。
【０２３６】
特に好適かつ非限定的な本発明の側面では、本発明は、少なくとも１つのイムノグロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）と、さらに本明細書に記載されるイムノグロブリン単一可変ドメインと結合する１つ以上の（好ましくは１つの）血清アルブミン、例えば、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ８、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ（表Ａ−４を参照）のイムノグロブリン単一可変ドメインと結合する血清アルブミンと、を含む、本発明のポリペプチドを提供する。
【０２３７】
【表１】
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【０２３８】
したがって、本発明のポリペプチドは、例えば三価の、二重特異性ポリペプチドでもよく、２つのイムノグロブリン単一可変ドメイン、好ましくは本発明のＣＤ３８に対する一価のポリペプチドと、（ヒト）血清アルブミンを標的とする第３のイムノグロブリン単一可変ドメインと、を含み、前記第１、第２および第３のイムノグロブリン単一可変ドメインは、１つ以上、特に３つのリンカー配列を介して任意に連結されてもよい。
【０２３９】
エフェクター機能を提供するように本発明のポリペプチドに最適に連結されうる他のアミノ酸配列は、当業者に明らかであり、所望のエフェクター機能を基礎として選択されうる。参照としては、例えば国際公開第０４／０５８８２０号、国際公開第９９／４２０７７号、国際公開第０２／０５６９１０号および国際公開第０５／０１７１４８号、ならびに上記のHolliger and Hudsonのレビュー、ならびに国際公開第０９／０６８６２８号が挙げられる。Ｆｃ部または抗体定常領域に対する本発明のポリペプチドのカップリングにより、本発明の対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期がもたらされうる。
【０２４０】
本発明の１つ以上のポリペプチドと、長いインビボ半減期を有する１つ以上の定常ドメインを含む他の適切な構築物が、当業者に明らかである。一般的に、増加した半減期を有するいかなる融合タンパク質または誘導体は、好ましくは５０ｋＤ以上の分子量（腎臓吸収のためのカットオフ値）を有する。
【０２４１】
他の具体的かつ非限定的な側面では、本発明のポリペプチドは、天然、合成または半合成の定常ドメイン（またはその類縁体、誘導体、変異体、部分または断片）に、（任意に適切なリンカーまたはヒンジ領域を介して）連結させてもよく、それらはイムノグロブリン構築物（すなわち従来の４鎖型抗体で天然に存在する定常ドメインと比較し）の自己会合が減少する（または本質的にない）傾向がある。かかるモノマーとしての（すなわち自己会合しない）Ｆｃ鎖誘導体またはその断片は、当業者に明らかである。例えば、Helm et al. (J. Biol. Chem. 271: 7494, 1996)は、本発明のポリペプチド鎖に使用できるモノマー状のＦｃ鎖誘導体を記載する。
【０２４２】
また、かかるモノマー状Ｆｃ鎖異型は、好ましくは、（由来するＦｃ部に応じて）補体または適切なＦｃ受容体と結合することが未だできるもの、および／または、由来するＦｃ部のエフェクター機能の一部もしくは全部を未だ有する（または未だ目的とする使用に適するレベルへの減少にとどまっている）ものである。あるいは、本発明のかかるポリペプチド鎖では、モノマー状Ｆｃ鎖は、ポリペプチド鎖に増加した半減期を付与するために使用でき、その場合、モノマー状Ｆｃ鎖は完全にまたは本質的にエフェクター機能を有さないものであってもよい。
【０２４３】
通常、増加した半減期を有する本発明のポリペプチドは、好ましくは、対応するイムノグロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドそれ自体の半減期と比較し少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍、半減期が長い。通常、増加した半減期を有する本発明のポリペプチドは、好ましくは、対応するイムノグロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドそれ自体の半減期と比較し、１時間以上、好ましくは２時間以上、好ましくは６時間以上、例えば１２時間以上、または２４、４８または７２時間以上、半減期が長い。
【０２４４】
他の好適かつ非限定的な態様において、本発明のかかるポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは、少なくとも４８時間、さらに好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトの血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、好ましくは少なくとも１０日（例えば約１０〜１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日以上（例えば約１４〜１９日）の半減期を有しうる。
【０２４５】
一態様では、本発明は、前記１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、かかる基、残基、部分または結合単位のない対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、本明細書に記載されるポリペプチドに関する。
【０２４６】
一態様では、本発明は、前記１つ以上の増加した半減期を有するポリペプチドを提供する他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質と結合できる結合単位、Ｆｃ部、抗体定常ドメイン、ならびに血清タンパク質と結合できる小分子タンパク質またはペプチドである、本明細書に記載されるポリペプチドに関する。具体的な例は、本発明のポリペプチドを（例えばＰＥＧ化によって）化学修飾し、その半減期を増加させた、本発明の誘導体ペプチドである（下記参照）。これは、半減期を増加させておよび／または医薬用タンパク質の免疫原性を低下させるために最も広く用いられる技術の１つであり、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧ）などの適切な薬理的に許容できるポリマーの付加を含む。一般的に、いかなる適切な形態のＰＥＧ化も使用可能であり、例えば抗体および抗体断片の分野で用いられるＰＥＧ化（限定されないが（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ）を用いることができ、参照としては、例えばChapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002)、Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003)、Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003)および国際公開第０４／０６０９６５）が挙げられる。例えばNektar Therapeutics社（米国）から、タンパク質のＰＥＧ化用の各種試薬も市販されている。
【０２４７】
好ましくは、特にシステイン残基を介する部位特異的ＰＥＧ化が用いられる（例えばYang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003）を参照。例えば、この場合、本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基にＰＥＧを付加することが可能であり、本発明のポリペプチドを、ＰＥＧ付加用の１つ以上のシステイン残基が最適に導入されるよう修飾してもよく、または、ＰＥＧ付加のための１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合させてもよく、いずれも、当業者に公知のタンパク質工学的技術を直接使用できる。
【０２４８】
好ましくは、本発明のポリペプチドの場合、５０００ダルトン以上の、例えば１０，０００以上および２００，０００未満の、例えば１００，０００未満、例えば２０，０００〜８０，０００ダルトンの範囲の分子量のＰＥＧが用いられる。
【０２４９】
本発明のマーカーポリペプチドの使用目的に応じて、さらにもう別の修飾として、１つ以上の検出可能マーカーまたは他のシグナル発生基もしくは部分を導入してもよい。適切な標識およびそれらを付加し、使用し、検出する技術は、当業者に明らかであり、例えば、限定されないが、蛍光マーカー（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンおよび蛍光金属（例えばランタノイド由来の１５２Ｅｕまたは他の金属）、リン光性標識、化学発光標識または生物発光標識（ルミナール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキサレートエステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびその類縁体）、放射性同位元素（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅおよび７５Ｓｅ）、金属、金属キレートもしくは金属カチオン（例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａなどの金属カチオン）、または特にインビボ、インビトロまたはｉｎ  ｓｉｔｕでの診断およびイメージング用に適する他の金属もしくは金属カチオン（例えば１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ）、ならびにクロモフォアおよび酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコール糖−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエスチラーゼ）。他の適切な標識が、当業者に明らかであり、例えばＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出できる部分が挙げられる。
【０２５０】
本発明のかかるマーカーポリペプチドは、例えばインビトロ、インビボまたはインサイチュアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡなどの公知のイムノアッセイおよび他の「サンドイッチアッセイ」など）、ならびに（具体的な標識の選択により）インビボの診断およびイメージング目的に使用することができる。
【０２５１】
当業者に明らかであるように、例えば上記金属または金属カチオンの１つをキレート化するために、キレート基を導入する他の修飾を行ってもよい。例えば、適切なキレート基として、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５２】
さらに別の修飾として、特定の結合対（例えばビオチン−（ストレプト）アビジン結合対）の一部分である官能基を導入してもよい。かかる官能基を用いることにより、結合対の残り半分を結合させた他のタンパク質、ポリペプチドまたは化学物質に、いわゆる結合対の形成によって、本発明のポリペプチドを結合させることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、ビオチンとコンジュゲートさせ、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートさせた他のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と連結させることができる。例えば、本発明のかかるコンジュゲートポリペプチドは、例えば検出可能なシグナル発生剤をアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした診断システムにおいて、レポーターとして用いることができる。かかる結合対は、例えば本発明のポリペプチドを、医薬用途に適する担体などの担体に結合するために用いることもできる。１つの非限定的な例は、Cao and Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000)に記載のリポソーム製剤である。またかかる結合対を用いて、治療的活性剤を本発明のポリペプチドに連結させてもよい。
【０２５３】
他の有望な化学的および酵素的修飾も当業者に明らかである。研究用途（例えば機能−活性の関係の試験）用に、かかる修飾を導入してもよい。参照としては、例えばLundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997)が挙げられる。
【０２５４】
好ましくは、前記化合物、構築物、ポリペプチドおよび／または誘導体は、本明細書において定義される（すなわち本発明のポリペプチドのために定義される）親和性（最適には、ＫＤ値（実際のまたは見かけの）、ＫＡ値（実際のまたは見かけの）、Ｋｏｎ速度および／またはＫｏｆｆ速度、あるいは本明細書にさらに記載されるＩＣ５０値として測定され、および／または表される）によりＣＤ３８と結合する。かかる誘導体はまた、通常、本明細書で定義されるＣＤ３８効率および／または効力を有する。
【０２５５】
特異性の観点から、本発明のポリペプチドは、イメージング剤とのコンジュゲートに非常に適する。抗体へコンジュゲートするための適切なイメージング剤は公知であり、本発明のポリペプチドへのコンジュゲートにも同様に有用である。適切なイメージング剤としては、限定されないが、有機分子、酵素標識、放射能標識、有色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイド、蛍光マーカー、金属標識、ビオチン、化学発光、生物発光、クロモフォアおよびそれらの混合物、からなる群から好ましくは選択される。
【０２５６】
したがって、本発明は、限定されないが、好ましくは有機分子、酵素標識、放射能標識、有色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイド、蛍光マーカー、金属標識、ビオチン、化学発光、生物発光、クロモフォアおよびそれらの混合物群から選択される分子を含むイメージング剤をさらに含む、本発明のポリペプチドに関する。
【０２５７】
本発明のかかる化合物、構築物および／またはポリペプチド、およびその誘導体は、（本明細書で定義されるように）本質的に単離された形態であってもよい。
【０２５８】
本発明はさらに、本明細書に記載される化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞および組成物を調製する方法に関し、本明細書に記載される核酸分子または本明細書に記載される発現ベクターを含む宿主細胞が含まれる。
【０２５９】
幾つかの態様では、本発明のポリペプチドは、薬剤とコンジュゲートさせてポリペプチド−薬剤コンジュゲート（ＰＤＣ）を形成する。同時の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬剤（例えば細胞毒性もしくは細胞増殖抑制性剤、毒素または毒素部分）の局所送達への抗体−薬剤コンジュゲートの使用が腫瘍への薬剤の標的特異的送達を可能にする抗腫瘍用途において用いられ、より高い薬効、低い毒性等の提供を可能にする。これらのＡＤＣは、（１）モノクローナル抗体、（２）そのコンジュゲート用のリンカー、（３）毒素部分または毒素、の３つの成分を有する。この技術の概要は、Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010)、Carter et al., Cancer J. 14(3): 154 (2008)、およびSenter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009)に記載され、参照により全開示内容を本明細書に援用する。ＰＤＣはまた、（１）、ポリペプチド、（２）そのコンジュゲート用のリンカー、（３）薬剤（例えば毒素部分または毒素）の３つの成分を有する。当業者であれば、ＡＤＣの技術、方法、手段等がＰＤＣに同様に適用できると認識するであろう。
【０２６０】
本発明は、薬剤（例えば毒素または毒素部分）を含む本発明のポリペプチド（本発明のイムノグロブリン構築物に含むか否かを問わず）を提供する。
【０２６１】
薬剤（例えば毒素部分または毒素）は、いかなる好適な方法を用いてポリペプチドに連結またはコンジュゲートすることもできる。通常、コンジュゲートは、公知のように、ポリペプチドへの共有結合によってなされ、一般的にはリンカー（通常ペプチド結合）に依存する。例えば、薬剤（例えば毒素部分または毒素）は、直接に、または適切なリンカーを介してポリペプチドに共有結合される。適切なリンカーとしては、切断不可能もしくは切断可能なリンカー（例えば、細胞内の酵素（例えば、細胞エステラーゼ、カテプシンＢなどの細胞プロテアーゼ）のための切断部位を含むｐＨ切断可能なリンカー）を含んでもよい（実施例のセクションを参照）。かかる切断可能なリンカーを用いることにより、ポリペプチドが内在化された後、薬剤（例えば毒素部分または毒素）を放出できるリガンドを調製できる。薬剤（例えばポリペプチドに対する毒素部分または毒素）を連結またはコンジュゲートする様々な方法が使用可能である。選択される具体的な方法は、薬剤（例えば連結またはコンジュゲートする毒素部分または毒素、およびポリペプチド）に依存する。必要に応じて、末端の官能基を含むリンカーを、ポリペプチドおよび薬剤（例えば毒素部分または毒素）の連結に使用できる。通常、コンジュゲーションは、反応性官能基を含む（または反応性官能基を有するために修飾された）毒素部分または毒素などの薬剤を、リンカーにより、または直接に、ポリペプチドと反応させることによって実施される。共有結合は、適切な条件で第２の化学基と反応できる化学成分または官能基を含む（または含むために修飾された）毒素部分または毒素などの薬剤を反応させ、それにより共有結合を形成させることによりなされる。必要に応じて、いずれかの好適な方法を用いて、適切な反応性化学基をポリペプチドに、またはリンカーに付加することができる（Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。多くの適切な反応化学基の組合せが従来技術において公知であり、例えば、求電子基と反応できるアミン基、例えばトシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などが挙げられる。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などと反応できる。アルデヒド官能基はアミンまたはヒドラジド含有分子とカップリングでき、アジド基は三価のリン基と反応してホスホロアミデートまたはホスホロイミデート結合を形成できる。活性基を分子に導入する好適な方法が公知である（例えばHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。
【０２６２】
後述するように、ＰＤＣの薬剤はいかなる数の薬剤であってもよく、限定されないが、細胞増殖抑制性剤、細胞毒性剤（例えば化学療法剤）、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、菌類、植物または動物由来の酵素活性を有する毒素またはその断片）、毒素部分、または放射性同位元素（すなわちラジオコンジュゲート）が挙げられる。他の態様では、本発明はさらに、ＰＤＣの使用方法を提供する。
【０２６３】
本発明に用いられる薬剤には、（特に癌の処置に用いられる）細胞毒性剤が含まれる。かかる薬剤には、一般的には、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗剤、天然物質およびそれらの類縁体が含まれる。典型的な細胞毒性剤の種類としては、酵素阻害剤が挙げられ、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤およびチミジル酸シンターゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ切断酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカアルカロイド薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤およびタキソールが挙げられる。
【０２６４】
例えば、これらのクラスのメンバーとしては、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５‐フルオロウラシル、６‐メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシダイン（leurosideine）、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体（例えばエトポシドまたはリン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン）、タキサン（タキソール、タキソテールレチン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトセシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン、エンジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリケアマイシン、カンプトセシン、メイタンシノイド（ＤＭ１を含む）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）およびメイタンシノイド（ＤＭ４））およびそれらの類縁体が挙げられる。
【０２６５】
薬剤（例えば毒素）は、ポリペプチド−毒素コンジュゲートとして使用でき、細菌毒素（例えばジフテリア毒素）、リシン（ricin）などの植物性毒素、小分子毒素（例えばゲルダナマイシン）（Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581、Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028、Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）、メイタンシノイド（欧州特許出願公開第１３９１２１３号、Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、ならびにカリケアマイシン、（Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928、Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ抑制を含むメカニズムによって、それらの細胞障害能および細胞抑止効果を発揮するものであってもよい。
【０２６６】
本発明のポリペプチドと、小分子毒素、例えばメイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシンおよびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のうちの１つ以上と、のコンジュゲートが本発明に包含される。
【０２６７】
本発明のポリペプチドにコンジュゲートできる抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、ＬＬ−Ｅ３３２８８錯体として米国特許第５０５３３９４号、および第５７７０７１０号で記載される公知の薬剤のファミリー、ならびにエスペラマイシン（米国特許第５８７７２９６号）などの他の薬剤が挙げられる。
【０２６８】
使用できる薬剤、例えば酵素活性を有する毒素および断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、細菌性シュードモナス外毒素ＰＥ３８、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第９３／２１２３２号を参照。
【０２６９】
本発明にはさらに、本発明のポリペプチドと、核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼ）、ＤＮａｓｅ）との間で形成されるＰＤＣが包含される。
【０２７０】
腫瘍の選択的な破壊のために、本発明のポリペプチドは、高放射性原子を含んでもよい。様々な放射性同位元素が、放射性標識コンジュゲート抗体の産生に利用できる。その例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Βｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。
【０２７１】
放射性標識または他の標識を、公知の方法に採用してもよい。例えば、生合成、または水素の代わりにフッ素−１９などを含む適切なアミノ酸前駆物質を使用した化学的アミノ酸合成によって、ペプチドを合成できる。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識を、ペプチドのシステイン残基を介して付加することができる。イットリウム９０は、リジン残基を経て付加することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）を用いてヨウ素１２３を導入できる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」（Chatal, CRC Press 1989）に詳細に他の方法が記載されている。
【０２７２】
ＡＤＣの分野の当業者に公知のいずれかの技術を用い、ポリペプチド−薬剤コンジュゲート化合物を産生することができる。簡潔には、ポリペプチド−薬剤コンジュゲート化合物は、抗体単位としての本発明のポリペプチド、薬剤、および任意に薬剤と結合剤を接続するリンカーを含みうる。
【０２７３】
薬剤または抗体−薬剤コンジュゲートが、細胞に対する細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性効果を及ぼすか否かを決定する方法は公知である。一般的に、抗体−薬剤コンジュゲートの細胞傷害性または細胞増殖抑制活性などの効果は、以下のとおり測定することができる：
細胞培地中で、標的タンパク質を発現する哺乳動物細胞に抗体−薬剤コンジュゲートを曝露させる；
約６時間から約５日の期間、細胞をインキュベートする；
および細胞生存度を測定する。
細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、抗体−薬剤コンジュゲートによる生存度（増殖）変化、細胞傷害性およびアポトーシス（カスパーゼ活性化）誘導を測定することができる。これらの方法は、ＰＤＣにも同様に適用できる。
【０２７４】
したがって、本発明は、さらに薬剤（例えば毒素または毒素部分またはイメージング剤）を含む、本発明のポリペプチド（本発明のイムノグロブリン構築物に含まれるか否かを問わず）に関する。明確さを期すため、本発明はまた、薬剤（例えば毒素または毒素部分またはイメージング剤）をさらに含む、（本発明のポリペプチドを含む）イムノグロブリン構築物に関する。
【０２７５】
本発明の多価ポリペプチドは、一般的には、少なくとも本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチドを、本発明の１つ以上の更なるイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチドに、任意に１つ以上の適切なリンカーを介して適切に連結させ、本発明の多価ポリペプチドを得るステップを含む方法により調製できる。本発明のポリペプチドはまた、一般的には、本発明のポリペプチドをコードする核酸を準備し、好適な方法で前記核酸を発現させ、発現された本発明のポリペプチドを回収する、ステップを少なくとも含む方法によって調製できる。かかる方法は公知の方法で実施することができ、（例えば本明細書にさらに記載される方法および技術を基礎とし）当業者に明らかである。
【０２７６】
本発明の多価ポリペプチドを調製する方法は、好適な方法で本発明および例えば１つ以上のリンカーの二つ以上のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチドを連結するステップを少なくとも含んでもよい。本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチド（およびリンカー）は、従来技術において公知のいずれかの方法によって、また本明細書にさらに記載されている方法で連結できる。好適な技術としては、本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチド（およびリンカー）をコードする核酸配列を連結し、多価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製することが挙げられる。アミノ酸または核酸を連結する技術は当業者に明らかであり、参照としては、標準的なハンドブックである、Sambrook et al.およびAusubel et al.（前記）、ならびに下記の実施例が挙げられる。
【０２７７】
本発明はまた、イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明の多価ポリペプチドを調製するための本発明の一価のポリペプチドの使用に関する。多価ポリペプチドの調製方法は、イムノグロブリン単一可変ドメインのおよび／または本発明の一価のポリペプチドを、任意に１つ以上のリンカーを介して、本発明の少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチドに連結させることを含む。次に、本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインまたは一価のポリペプチドを、結合ドメインまたは結合単位として用い、２つ（例えば二価ポリペプチドにおいて）、３つ（例えば三価ポリペプチドにおいて）、４つ（例えば四価において）またはそれ以上（例えば多価ポリペプチドにおいて）の結合単位を含む多価ポリペプチドを提供および／または調製する。この点、本発明のイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチドは、結合ドメインまたは結合単位として用いることにより、多価（例えば２つ、３つ、４つまたはそれ以上の結合単位を含む、本発明の二価、三価または四価）のポリペプチドを提供および／または調製する。
【０２７８】
本発明はまた、多価ポリペプチドを調製するための、本発明の（本明細書に記載される）イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または（特に）一価のポリペプチドの使用に関する。多価ポリペプチドの調製方法は、イムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明の一価のポリペプチドを、任意に１つ以上のリンカーを介して、本発明の少なくとも１つの更なるイムノグロブリン単一可変ドメインおよび／または一価のポリペプチドに連結させることを含む。
【０２７９】
本発明の多価ポリペプチドに用いられる適切なスペーサまたはリンカーは、当業者に明らかで、一般的に、アミノ酸配列を連結するために従来技術において使用されるいかなるリンカーまたはスペーサであってもよい。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサは、医薬的使用を目的とするポリペプチドを構築する用途に適する。
【０２８０】
幾つかの特に好適なスペーサとしては、従来技術において抗体断片または抗体ドメインを連結するために用いられるスペーサおよびリンカーが挙げられる。これらには、上記で引用した一般的背景技術に記載のリンカー、ならびに、例えば従来技術においてｄｉａｂｏｄｙまたはＳｃＦｖ断片を構築するために用いられるリンカーが挙げられる（しかしながら、この点、ｄｉａｂｏｄｙおよびＳｃＦｖ断片の場合、使用するリンカー配列は、関連するＶＨおよびＶＬドメインと一緒に完全な抗原結合部位を形成するのを可能にする長さ、柔軟性および他の特性を有さなければならないことに留意すべきであるが、本発明のポリペプチドにおいて使用するリンカーの長さまたは柔軟性については、各イムノグロブリン単一可変ドメインは完全な抗原結合部位を単独で形成するため、特に制限はない）。
【０２８１】
例えば、リンカーは適切なアミノ酸配列、具体的には１〜５０アミノ酸配列、好ましくは１〜３０、例えば１〜１０アミノ酸残基でありうる。かかるアミノ酸配列の幾つかの好適な例としては、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型などのｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、国際公開第９９／４２０７７号に記載）、ヒンジ様領域（例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または類似の配列（例えば国際公開第９４／０４６７８に記載）が挙げられる。
【０２８２】
他の特に好適な幾つかのリンカーを表Ａ−５に示す。
【表２】
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【０２８３】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、前記少なくとも２つのＩＳＶＤが互いに直接連結されるか、またはリンカーを介して相互に連結され、好ましくは、当該リンカーが配列番号４８２〜４９４のリンカーの群から選択される、ポリペプチドを提供する。
【０２８４】
他の適切なリンカーとしては、一般的に、有機化合物またはポリマー（特に医薬用のタンパク質への使用に適するもの）が挙げられる。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインの連結に用いられる（例えば国際公開第０４／０８１０２６号を参照）。
【０２８５】
使用するリンカーが本発明のポリペプチドに１つ以上の他の好ましい特性または官能性を付与し、および／または、（例えば本発明のポリペプチド誘導体に関して本明細書に記載されるように）誘導体の形成のために、および／または官能基の結合のために１つ以上の部位を付与することも、本発明の範囲内である。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含むリンカーは、親水性を向上させることができる一方、小さいエピトープまたはタグを形成するかまたは含むリンカーは、検出、同定および／または精製用に使用することができる。また、本明細書の開示に基づき、当業者であれば、任意に幾つかの限られたルーチン実験を行った後に、本発明の特定のポリペプチドへの使用に最適なリンカーを決定することができる。
【０２８６】
本発明のポリペプチドおよび核酸は、公知の方法をそのまま使用し調製することができ、それは本明細書における更なる記載から当業者に明らかである。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製に関する公知の、具体的には、抗体断片（限定されないが（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片が含まれる）の調製のためのいずれかの方法をそのまま使用し調製することができる。ポリペプチドおよび核酸を調製する幾つかの好適かつ非限定的な方法には、本明細書に記載される方法および技術が含まれる。
【０２８７】
本発明のポリペプチドを産生する方法は、次のステップを含みうる：
−適切な宿主細胞または宿主生物（また本明細書において「本発明の宿主」と称される）において、または本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（また本明細書において「本発明の核酸」と称される）の他の適切な発現系において、発現させるステップと、次に任意に：
−このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または生成するステップ。
【０２８８】
具体的には、かかる方法は、以下のステップを含みうる：
本発明の前記宿主が本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現および／または産生する条件下で、本発明の宿主を培養および／または維持するステップと、
次に任意に、このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または精製するステップ。
【０２８９】
本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドの組換え産生方法に関し、当該方法は、
（ａ）本発明の核酸分子の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）培養物からポリペプチドを単離することと、を含む。
【０２９０】
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸またはヌクレオチド配列（また「本発明の核酸」と呼ばれる）に関する。本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ（例えば目的の宿主細胞または宿主生物における発現に特に適するコドン選択がなされたＤＮＡ）でもよい。
【０２９１】
本発明の一態様によれば、本明細書で定義されるように、本発明の核酸は本質的に単離された形態である。本発明の核酸はまた、ベクター（例えばプラスミド、コスミドまたはＹＡＣ）の形態であっても、ベクター中に存在しても、および／またはベクターの一部であってもよく、また本質的に単離された形態であってもよい。
【０２９２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【０２９３】
本発明の核酸が、本明細書に記載される本発明のポリペプチドに関する情報に基づいて、公知の方法をそのまま使用し調製または取得することができ、および／または、適切な天然の給源から単離することもできる。また、当業者に明らかなように、本発明の核酸を調製するために、幾つかのヌクレオチド配列、例えば、イムノグロブリン単一可変ドメインまたは本発明の一価のポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸、および例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸は、好適な方法で連結されうる。
【０２９４】
本発明の核酸を生成させる技術は当業者に明らかで、例えば、限定されないが、自動化ＤＮＡ合成、部位特異的変異導入、２つ以上の天然のおよび／または合成された配列（またはその２つ以上の部分）を結合すること、不完全長の発現産物の発現をもたらす変異の導入、１つ以上の制限酵素部位の導入（例えば適切な制限酵素を用いて容易に切断でき、および／またはライゲーションできるカセットおよび／または領域の作製）、および／または１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応による変異導入が挙げられる。これらの、および他の技術は当業者に明らかであり、参照としては、標準的なハンドブックである、Sambrook et al.およびAusubel et al.（前記）、ならびに下記の実施例が挙げられる。
【０２９５】
本発明の核酸は、遺伝子構築物中に存在し、および／またはその一部である形態であってもよく、それは当業者に明らかである。かかる遺伝子構築物は、一般的に、１つ以上の公知の遺伝子構築物中のエレメント、例えば、１つ以上の適切な調節エレメント（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）、および本明細書において参照される遺伝子構築物の更なるエレメントと任意に連結した本発明の少なくとも１つの核酸を含む。本発明の少なくとも１つの核酸を含むかかる遺伝子構築物はまた、本明細書において「本発明の遺伝子構築物」と称される。
【０２９６】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡでもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物は、目的の宿主細胞または宿主生物の形質転換に適する形態、目的の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの導入に適する形態、または目的の宿主生物における自立複製、維持または遺伝に適する形態、であってもよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾン）の形態であってもよい。特に、前記ベクターは、発現ベクター、すなわちインビトロおよび／またはインビボで（例えば適切な宿主細胞、宿主生物または発現系において）遺伝子発現を可能にするベクターであってもよい。
【０２９７】
好適かつ非限定的な態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）本発明の少なくとも１つの核酸、
ｂ）作動可能に連結した、プロモーターおよび任意に適切なターミネーターなどの１つ以上の調節エレメント、
および任意にｃ）１つ以上の公知の遺伝子構築物の更なるエレメント、を含み、
これらの「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」および「作動可能に連結」の用語は、従来技術におけるそれらの通常の（さらに本明細書に記載される）意味を有し、遺伝子構築物に存在する前記「更なるエレメント」は、例えば３’または５’ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、および／または形質転換または導入（効率）を促進または増加できるエレメントでありうる。かかる遺伝子構築物におけるこれらの、また他の適切なエレメントは当業者に明らかであり、例えば使用する構築物のタイプ、目的の宿主細胞または宿主生物、目的の本発明のヌクレオチド配列を（例えば構成的に、一時的にまたは誘導可能な発現を介して）発現させる方法、および／または用いられる形質転換方法に依存しうる。例えば、抗体および抗体断片（限定されないが（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含む）の発現および産生のための公知の制御配列、プロモーターおよびターミネーターをそのまま、本質的に類似する方法で使用できる。
【０２９８】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物においては、少なくとも１つの前記本発明の核酸、前記調節エレメント、および任意に１つ以上の前記更なるエレメントは、各々「作動可能に連結され」、一般的には、それによりそれらが各々機能的な関係にあることを意味する。例えば、前記プロモーターがコード配列の転写および／または発現を開始し、または制御／調整することができる場合、プロモーターは、コード鎖に「作動可能に連結される」と考えられる（前記コード配列が前記プロモーターの「制御下」であると理解されなければならない）。通常、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結されるとき、それらは同じ方向を向き、また通常同じ読み枠で存在するであろう。それらはまた、通常本質的に隣接するが、これはまた必須ではない。
【０２９９】
本発明のヌクレオチド配列を、例えば、上記のSambrook et al.およびAusubel et al.,のような一般的な概説書の技術を使用して、上記の１つ以上の更なるエレメントに最適に連結することによって、本発明の遺伝子構築物が通常提供されうる。
【０３００】
本発明の遺伝子構築物は多くの場合、公知の適切な（発現）ベクターをそのまま使用し、本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって得られる。適切な発現ベクターの幾つかの好適かつ非限定的な例は、下記の実施例において使用され、ならびに本明細書において記載されるものである。
【０３０１】
一般的に、医薬用途のために、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物を、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物、ならびに少なくとも１つの薬理学的に許容される担体、希釈液または賦形剤および／またはアジュバント、ならびに、任意に、１つ以上の薬学的活性を有するポリペプチドおよび／または化合物をさらに含む医薬調製物または組成物として調製できる。非限定的な例として、かかる製剤は、経口投与、非経口投与（例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下注射、または静脈内点滴）、局所投与、吸入による投与、スキンパッチ、インプラント、坐薬など、による投与に適する形態であってもよく、非経口投与が、好ましい。かかる適切な投与形態（投与方法に応じて、固体状、半固体状、液体状）、ならびにその調製に用いられる方法および担体は、当業者に明らかであり、本明細書においてさらに記載されている。かかる製剤または組成物は、本明細書において一般的に「医薬組成物」と称される。ヒト以外の生物に用いられる製剤または組成物は、本明細書において一般的に「獣医用組成物」と称される。
【０３０２】
このように、更なる側面では、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、本発明の少なくとも１つの化合物、本発明の少なくとも１つの（イムノグロブリン）構築物または本発明の少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つの好適な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち医薬用途に適する）と、任意に１つ以上の更なる活性物質と、を含む医薬組成物に関する。具体的な側面では、本発明は、配列番号１〜５８または前記配列番号１〜５８に含まれるＣＤＲ、の少なくとも１つ、または配列番号１１７〜１７４、２３３〜２９０または３４９〜４０６の少なくとも１つ（表Ａ−１を参照）を含むＩＳＶＤと、少なくとも１つの好適な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち医薬用途に適する）と、任意に１つ以上の更なる活性物質と、を含む医薬組成物に関する。
【０３０３】
一般的に、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、公知のいかなる好適な方法をそのまま使用し製剤化および投与することができる。参照としては、例えば前記で引用した一般的背景技術（具体的には国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６７号および国際公開第０８／０２００７９号）、ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)、Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)、またはHandbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば２５２〜２５５頁を参照）が挙げられる。
【０３０４】
本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、通常抗体および抗体断片（ＳｃＦｖおよびｄｉａｂｏｄｙを含む）および他の薬学的に活性を有するタンパク質のためのいずれかの公知の方法をそのまま使用し、製剤化および投与することができる。かかる製剤およびその調製方法は当業者に明らかであり、例えば非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管こう内、動脈内または鞘内投与）、または局所投与（すなわち経皮または皮内投与）に適する調製物が挙げられる。
【０３０５】
非経口投与用の調製物は、例えば点滴または注射に適する無菌液、懸濁液、分散液またはエマルジョンであってもよい。例えば、かかる調製物のための好適な担体または希釈液として、国際公開第０８／０２００７９号の１４３頁に記載のものが挙げられるが、これに限定されない。通常、水溶液または懸濁液が好ましい。
【０３０６】
このように、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、例えば、薬理学的に許容されるビヒクル（例えば不活性希釈剤または吸収性の接触可能な担体）と組み合わせて、経口投与により全身投与されうる。それらは、ハードまたはソフトゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤中に圧縮してもよく、または患者の食物中に直接添加してもよい。処置的な経口投与の場合、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、１つ以上の賦形剤と組み合わせてもよく、消化可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハなどの形態で用いられる。かかる組成物および調製物は、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物を少なくとも０．１％含まなければならない。組成物および調製物中のそれらのパーセンテージは、当然ながら変化し、好適には所定の単位用量形態において約２〜約６０重量％としうる。かかる処置的に有用な組成物中の本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物の量は、有効量レベルが得られる程度の量である。
【０３０７】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤および甘味料または香料（例えば国際公開第０８／０２００７９号の１４３〜１４４頁に記載）を含んでもよい。単位用量形態がカプセルであるとき、上記のタイプの材料に加えて、液体担体（例えば植物油またはポリエチレングリコール）を含んでもよい。その他種々の物質を、コーティング剤として、あるいはその他固形状の単位用量形態の物理的形態を調節するために添加させてもよい。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルをゼラチン、ワックス、シェラックまたは砂糖等でコーティングしてよい。シロップまたはエリキシルは、本発明のポリペプチド、化合物および／または構築物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素および調味料（例えばサクランボまたはオレンジ味）を含みうる。当然ながら、いかなる単位用量形態の調製の際に使用するいかなる材料も、その使用量は薬理学的に許容されるもので、また実質的に無毒性でなければならない。さらに、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、徐放性製剤およびデバイスに組み込んでもよい。
【０３０８】
経口投与用の調製物および製剤では、本発明の（イムノグロブリン）構築物は、胃内環境に抵抗し、腸に移動できるよう、腸溶性コーティングにより提供してもよい。さらに一般的にいえば、経口投与用の調製物および製剤は、消化管内のいかなる目的部位への送達のために最適に調製することができる。さらに、適切な坐薬を用いて消化管への送達を行ってもよい。
【０３０９】
本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、点滴または注射により、静脈内または腹腔内投与してもよい。具体例は、国際公開第０８／０２００７９号の１４４および１４５頁、または国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２９７５号（全文書）にさらに記載されている。
【０３１０】
局所投与の場合、本発明のポリペプチド、化合物および／または構築物は、純粋形態において投与でき、すなわちそのとき、それらは液体である。しかしながら、皮膚病理学的に許容できる担体との組み合わせで、固体または液体状の組成物または製剤として皮膚に投与することが一般的に望ましい。具体例は、国際公開第０８／０２００７９号の１４５頁にさらに記載されている。
【０３１１】
本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物の有効な投与量は、動物モデルにおけるそれらのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することにより決定できる。マウスおよび他の動物の有効量からヒトへの用量を推定する方法が公知であり、例えば米国特許第４９３８９４９号明細書を参照。
【０３１２】
一般的に、液体組成物（例えばローション剤）中の本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物の濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％である。半固体または固体状組成物（例えばゲルまたは粉末）中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは０．５〜２．５重量％である。
【０３１３】
処置上必要となる本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物の量は、選択される特定のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物のみならず、投与経路、処置しようとする症状の状態、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、また最後は担当医師または臨床医の裁量によっても変化する。また、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物の投与量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植または器官に応じて変化する。
【０３１４】
望ましい投与は、単回投与、または適切な間隔で投与される一日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の分割投与において好適に行うことができる。各分割投与自体、例えば適切な投与間隔でさらに分割することができる。
【０３１５】
投与レジメンには、長期間の毎日投与が含まれうる。「長期間」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数か月または数年の期間を意味する。本明細書において教示されるルーチン試験のみを用い、当業者は、この用量範囲の必要な変更を決定できる。投与量は、何らかの合併症が生じた場合に、個々の医師により調整されてもよい。
【０３１６】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドまたは本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物を含む、医薬組成物に関する。
【０３１７】
本発明はさらに、本明細書に記載されるポリペプチド、化合物および／またはイムノグロブリン構築物、核酸、宿主細胞および組成物の用途および使用、ならびにＣＤ３８関連の疾患、障害または症状（例えば各種の癌および炎症性疾患）の予防および／または処置方法に関する。幾つかの好適かつ非限定的な用途および使用が、本明細書の更なる説明から明らかとなる。
【０３１８】
本発明のポリペプチド、化合物および／または構築物は通常、免疫応答を強化するために用いることができる。特に、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、本明細書に記載されるような適切なアッセイによって測定した場合、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物がない場合のＣＤＣ活性の状態と比較し、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上、例えば１００％、ＣＤＣ活性を強化できる。
【０３１９】
別の側面では、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物は、本明細書に記載されるような適切なアッセイによって測定した場合に、本発明のポリペプチド、化合物および／または（イムノグロブリン）構築物がない場合の個人の腫瘍、無進行生存および／または全体的な生存率と比較し、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上、例えば１００％、腫瘍成長を阻害し、腫瘍後退を誘導し、無進行生存を増加させ、および／または腫瘍を有する個人の全体的な生存率を向上させることができる。
【０３２０】
更なる態様において、本発明は、少なくとも１つのＣＤ３８関連の疾患、障害または症状の予防または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物のおよび／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３２１】
本発明の前後関係において、「予防または処置」という用語は、疾患を予防および／または処置することが含まれるのみならず、また一般的に、疾患の発症を防止し、減速させ、または疾患の進行を逆転させ、疾患に関連する１つ以上の徴候の発症を防止または遅延させ、疾患に関連する１つ以上の徴候を低減および／または緩和し、それらに関連するいかなる疾患および／または徴候の重症度および／または期間を減少させ、および／または、それらに関連するいかなる疾患および／または徴候重症度の増加を防止し、疾患によって生じるいかなる生理的損傷も予防、低減または逆転させること、また通常では、処置を受ける患者に有益なあらゆる薬理学的行動が含まれる。
【０３２２】
処置を受ける対象は、いかなる温血動物でもあってもよいが、特に哺乳動物、具体的にはヒトである。当業者に明らかなように、処置を受ける対象は、具体的には、本明細書に記載の疾患、障害および症状に罹患するか、またはそのリスクを有する人物である。
【０３２３】
本発明は、ＣＤ３８、その生物学的または薬理活性、および／またはＣＤ３８が関与する生物学的経路またはシグナル伝達、に関連する少なくとも１つの疾患、障害または症状の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物の中でおよび／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。具体的には、前記薬学的有効量は、ＣＤ３８、その生物学的または薬理的活性、および／またはＣＤ３８が関連する生物学的経路またはシグナル伝達を、刺激し、増強しまたはアゴナイズするのに十分な量、および／または、体内循環中において、ＣＤ３８、その生物学的または薬理的活性、および／またはＣＤ３８が関連する生物学的経路またはシグナル伝達（特にＣＤ３８により媒介される免疫応答）を刺激し、増強しまたはアゴナイズするのに十分なレベルの、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、および／または本発明の（イムノグロブリン）構築物を提供する量でありうる。
【０３２４】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、本発明の化合物のおよび／または本発明の（イムノグロブリン）構築物を患者に投与することによって予防および／または処置できる少なくとも１つの疾患、障害または症状の予防または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物および／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３２５】
具体的には、本発明は、本明細書において、列記される疾患、障害および条件からなる群から選択される少なくとも１つの疾患、障害および／または条件の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物および／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３２６】
本発明はまた、免疫応答（例えばＣＤＣ活性）を強化する方法に関する。
【０３２７】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞の増殖または活性化を強化する方法に関する。
【０３２８】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害する方法に関する。
【０３２９】
本発明はまた、ＣＤ３８が媒介する疾患の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物および／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３３０】
具体的には、本発明は、免疫応答（例えばＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性、ＣＤＣＣ活性、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞の増殖または活性化）を強化する方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物のおよび／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３３１】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害する方法に関する。前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物のおよび／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３３２】
本発明はまた、癌の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効量の本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の（イムノグロブリン）構築物のおよび／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３３３】
具体的には、本発明は、免疫応答の増加または活性化を強化する方法に関し、前記方法は、薬学的有効量の、
少なくとも１つの配列番号１〜５８または
前記配列番号１〜５８に含まれるＣＤＲ、
または配列番号１１７〜１７４、２３３〜２９０または３４９〜４０６の少なくとも１つを含むＩＳＶＤ、
それを含む（イムノグロブリン）構築物および／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３３４】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害する方法に関する。前記方法は、薬学的有効量の、少なくとも１つの配列番号１〜５８または前記配列番号１〜５８に含まれるＣＤＲ、または配列番号１１７〜１７４、２３３〜２９０または３４９〜４０６の少なくとも１つを含むＩＳＶＤ、それを含む（イムノグロブリン）構築物および／またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０３３５】
一態様では、本発明は、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患の治療的処置方法に用いられる、本明細書に記載されるポリペプチド、本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物または本明細書に記載される医薬組成物に関する。
【０３３６】
一態様では、本発明は、高増殖性疾患または自己免疫性疾患の治療的処置方法に用いられる、本明細書に記載されるポリペプチド、本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物または本明細書に記載される医薬組成物に関する。
【０３３７】
一態様では、本発明は、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性的リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性的骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ＣＤ３８発現固形腫瘍、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、グレーブス病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、水疱性類天疱瘡、糸球体腎炎、脈管炎または喘息、バラケル・サイモンズ（Barraquer-Simons）症候群、自己免疫心疾患、炎症性腸疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、非定型溶血性尿毒症症候群および虚血再灌流傷害および移植臓器の拒絶の治療的処置への使用のための、本明細書に記載されるポリペプチド、本明細書に記載されるイムノグロブリン構築物または本明細書に記載される医薬組成物に関する。
【０３３８】
更なる態様では、本発明は、ＣＤ３８発現する細胞の阻害および／または殺傷のための方法に関する。
【０３３９】
本発明のポリペプチドは、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患を診断する方法への使用に特に適する。診断は、ＣＤ３８を高発現する細胞または組織の検出に基づく。これらの細胞および組織は、本発明のポリペプチドを結合させた後、適切なマーカーにより検出することができる。
【０３４０】
ＣＤ３８の発現増加が関与する多数の疾患が報告されている。例えば、ＣＤ３８の発現増加は、特定の高増殖性疾患（例えば前立腺腫瘍などの幾つかの悪性腫瘍、および特に血液癌（例えば非ホジキンリンパ腫））において示されている。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）などの、Ｂリンパ球上のＣＤ３８の発現増加を示すリンパ腫は、この発現増加を基礎として診断することができる。
【０３４１】
新生物疾患に加え、特定の細胞におけるＣＤ３８の発現増加を示す自己免疫性疾患および炎症性疾患が公知である。例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性硬化症および喘息などのこれらの疾患は、本発明の抗原結合性ポリペプチドを使用して診断することができる。
【０３４２】
このように、本発明はまた、細胞におけるＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患を診断する方法に関し、当該方法は、
（ａ）患者のサンプルに存在するポリペプチドとＣＤ３８の複合体の形成を可能にする条件下で、患者から得た生体サンプルと本発明のポリペプチドとを接触させることと、
（ｂ）患者のサンプル中において、ポリペプチドとＣＤ３８発現細胞との複合体を検出することと、を含み、
ステップ（ｂ）における複合体の存在は、ＣＤ３８の発現増加によって特徴づけられる疾患への患者の罹患を示すものである。
【０３４３】
診断される疾患は、好ましくは高増殖性疾患または自己免疫性疾患である。特に好ましくは、前記疾患は以下からなる群から選択される：バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性的リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、慢性的骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ＣＤ３８発現固形腫瘍、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、グレーブス病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、水疱性類天疱瘡、糸球体腎炎、脈管炎または喘息、バラケル・サイモンズ（Barraquer-Simons）症候群、自己免疫心疾患、炎症性腸疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、非定型溶血性尿毒症症候群および虚血再灌流傷害および移植臓器の拒絶。
【０３４４】
本発明の好ましい態様では、悪性非ホジキンリンパ腫の診断方法は、好ましくは多発性骨髄腫、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬまたはＡＬＬである。
【０３４５】
生体サンプルは、患者からの組織サンプル（例えば腫瘍から得た組織標本）であってもよい。それはさらに、例えば血液またはリンパ液などの体液サンプルでもよい。前記サンプルは、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球を含む血液サンプルであってもよい。診断される疾患に応じて、体液の特定のフラクションでもよい。例えば、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬまたはＡＬＬの診断方法で分析される（Ｂリンパ球を含む）患者の血液フラクションである。
【０３４６】
診断の間にステップ（ｂ）で検出できる複合体の数を、同じ条件で分析された参照サンプルと比較する。参照サンプルは、検出しようとする疾患（例えば多発性骨髄腫、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ＡＭＬまたはＡＬＬ）について診断された患者由来のものであってもよい。この場合、患者の試料および参照サンプル中の複合体数がほぼ同一である測定結果は、当該患者がそれぞれの疾患に罹患する確率が高いと診断されることを示す。あるいが、参照サンプルは、健常な個人に由来するものであってもよい。この場合、参照サンプルと比較し、患者サンプル中の複合体数の測定値は著しく異なり、例えば増加しており、すなわちこの測定結果は、当該患者がそれぞれの疾患に罹患する確率が高いと診断されることを示す。
【実施例】
【０３４７】
材料および方法：
タンパク質の産生およびラマの免疫：
酵母細胞の分泌タンパク質として３つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位が不活性化されたＣＤ３８変異体の細胞外ドメインが製造され、Hon Cheung Lee（香港）より厚意により提供された。ＣＤ３８の真核生物発現ベクターは、Fabio Malavasi（トリノ）より厚意により提供された。Ｓｐｅｃｏｌアジュバント（４００μＬ総容積中５０μｇ）（Boersma、1992 #85、Koch-Nolte、2007 #2、Alzogaray、2011 #1）と共に乳化した精製組換えタンパク質を用い、２匹のラマ（Lama glama）（１０、２５と表示）に皮下免疫した。２匹のラマ（５３８および５３９と表示）に、ｃＤＮＡのバリスティック免疫により免疫を行った。Judyith Appelton博士（コーネル大学、ＮＹ（デーリー、２００５＃99））の厚意により提供されたラマｌｇＧ２およびｌｇＧ３と反応するモノクローナル抗体を用いた血清の連続希釈系列において、組換えＣＤ３８をコーティングしたマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）上のＥＬＩＳＡによって、液性免疫応答をモニターした。第３または第４のブースター後、１０〜１４日後に動物から採血した。
【０３４８】
ファージディスプレイライブラリーの構築およびＣＤ３８に特異的なナノボディの選抜
Ficoll-Paque（商標）（GE Healthcare社、Chalfont St Giles、UK）勾配遠心により、単核細胞を１２０ｍｌの血液から単離した。ＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen社、Carlsbad、CA）を用いてこれらの細胞から精製したＲＮＡを基に、ランダム六量体プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。ナノボディをコードする領域を、ナノボディに特異的な縮重プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ（NEB社、Ipswich、MA）により順次消化し、ＰｅｌＢリーダーペプチドの下流、キメラＨｉｓ６×−Ｍｙｃエピトープタグ（Zarebski, 2005 #86;Alzogaray, 2011 #1）の上流に、ｐＨＥＮ２ファージミドベクターにクローニングした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Stratagene社、La Jolla、CA）を形質転換し、４．０×１０５〜１０７クローンの規模のライブラリーを得た。１０倍過剰のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（GE Healthcare社、Chalfont St Giles、UK）で感染させた形質転換体の培養液上清から、ファージ粒子をポリエチレングリコールにより沈殿させた。ＣＤ３８を固定したマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp社、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）上で、またはＣＤ３８をトランスフェクションしたＹａｃ−１細胞を含む溶液中で、特異的ファージのパニングを実施した。ファージ粒子（１．６×１０１４）を、ＰＢＳ（１０％のＣａｒｎａｔｉｏｎ無脂肪粉ミルク（Nestle社、Glendale、CA）中、室温で撹拌しながら、６０分間、ＣＤ３８またはＣＤ３８トランスフェクション細胞とインキュベートした。十分に洗浄した後、結合したファージを、５０ｍＭのジエチルアミンによりＥＬＩＳＡプレートから溶出させ、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。トリプシン処理によって、トランスフェクション細胞からファージを溶出させた。同じ手順で、溶出させたファージをタイトレーションし、さらに１または２ラウンドのパニングに供した。ＴＧ１大腸菌細胞（Stratagene社、La Jolla、CA）の感染を基に、すべてのステップにおいてファージ力価を測定した。プラスミドＤＮＡをシングルコロニーから単離し、ｐＨＥＮ２に特異的なフォワードおよびリバースプライマーを使用してシークエンス解析を行った。
【０３４９】
ナノボディの産生および再フォーマッティング
ＨＢ２１５１大腸菌細胞（GE Healthcare、Chalfont St Giles、UK）におい内で、モノマーのナノボディを発現させた。細菌培養液のＯＤ６００が０．５に達したときにＩＰＴＧ（Roche社、Rotkreuz、Switzerland）によりタンパク質の発現を誘導し、細胞を３７℃で３〜４ｈさらに培養し、その後回収した。浸透圧ショックおよび高速遠心分離による細菌残渣の除去によって、ペリプラズムのライセートを得た。固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって、大腸菌のペリプラズムライセートからナノボディを簡易精製した。
【０３５０】
ｐＣＳＥ２．５ベクター（Schirrmann, 2010 #58）（Thomas Schirrmann氏（Braunschweig）の厚意により提供された）に、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いて、選抜されたナノボディのコード領域をサブクローニングした。（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを使用した、２つのナノボディを融合させるＰＣＲによって、バイパラトピックナノボディを構築した。ヒンジおよびマウスＩｇＧ２ｃまたはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの上流にＧＳリンカーで連結された１または２個のナノボディをコードする配列を、ｐＣＳＥ２．５ベクターにサブクローニングすることによって、ナノボディＦｃ融合フォーマットを作製した。公開された配列（国際公開第２０１１／１５４４５３）を用いた遺伝子合成により、ダラツムマブｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を作製したが、その際、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位を側方に有する１５ＧＳリンカーを介してＶＨドメインおよびＶＬドメインを融合させ、ヒンジおよびマウスＩｇＧ２ｃまたはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの上流側に、ｐＣＳＥ２．５ベクターにクローニングした。
【０３５１】
無血清培地において培養した、一過的ににトランスフェクションしたＨＥＫ−６Ｅ細胞内において、組換えｍｙｃ−ｈｉｓタグ付きナノボディ、ナノボディ−Ｆｃ融合タンパク質およびｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。トランスフェクションの６日後、遠心分離により清澄な上清を回収した。細胞上清中のナノボディを、既知量のマーカータンパク質との比較において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって定量した。その際、１０μＬ上清のサンプルを、標準タンパク質（アルブミン４μｇ、ＩｇＨ２μｇ、ＩｇＬ１μｇ、リゾチーム０．４μｇ、アルブミン１μｇ、ＩｇＨ０．５μｇ、ＩｇＬ０．２５μｇ、リゾチーム０．１μｇ）と並べてサイズ分画を行った。組換えＮｂの収量は、典型的に、０．５〜３μ／１０μＬで変動した。
【０３５２】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Sigma社、St Louis、MO）を用い、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりＭｙｃ−Ｈｉｓタグ付きナノボディを精製した。
【０３５３】
プロテインＧ−セファロース（GE-Healthcare社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、Ｆｃ−融合タンパク質を精製した。
【０３５４】
ＥＬＩＳＡ
組換えＣＤ３８（１００ｎｇ／１００μＬＰＢＳ／ウェル）を、４℃で一晩、９６ウェルのＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA）に吸着させた。ウェルをＰＢＳにより二回洗浄し、５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳで室温で２時間ブロッキングした。ナノボディ含有ペリプラズムライセート（ＰＢＳで１：１０に希釈）で３０分間、ウェルをインキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した後、結合したナノボディを、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｃ−ｍｙｃのｍＡｂ９Ｅ１０（Sigma社、St Louis、MO）および基質としての（ＴＭＢ）（Sigma社、St Louis、MO）で検出した。Victor3 ELISAリーダー（Perkin-Elmer社、Waltham、MA）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０３５５】
アフィニティー解析では、１０μｇ／ｍｌのＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて一価のナノボディの希釈系列を調製し、６０分間ウェルをインキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により３回ウェルを洗浄した。結合した抗体を、基質としてペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｃ−ｍｙｃのｍＡｂ９Ｅ１０およびＴＭＢを用いて検出した。
【０３５６】
エピトープ解析では、ＲＴで３０分間、過剰な一価のナノボディまたはナノボディ−Ｆｃ融合タンパク質（５００ｎｇ／１００μＬのＰＢＳ、１％ＢＳＡ）を用いてウェルをプレインキュベートした後、プレコンジュゲートＶＨＨ−抗ｃ−ｍｙｃを添加し、ＲＴで２０分間、さらにインキュベートした。Victor3 ELISAリーダー（Perkin-Elmer社、Waltham、MA）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０３５７】
ＦＡＣＳ
ナノボディ含有ペリプラズムライセート（ＰＢＳで１：１０に希釈）を用い、３０分間、非トランスフェクションＹａｃ−１細胞およびヒトＣＤ３８により安定にトランスフェクションしたＹａｃ−１細胞をインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡによる洗浄後、結合したナノボディを、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｃ−ｍｙｃのｍＡｂ９Ｅ１０（Sigma社、St Louis、MO）により検出した。
【０３５８】
アフィニティー解析では、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを用いて一価のナノボディの系列希釈を調製し、ＣＤ３８−トランスフェクション細胞を６０分間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにより３回、細胞を洗浄した。結合した抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｃ−ｍｙｃのｍＡｂ９Ｅ１０を用いて検出した。
【０３５９】
Ｎｂの解離の解析では、ＣＤ３８トランスフェクション細胞の２つの別々のアリコートを、４℃で２０分間、細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ４５０（eBioscience社）、またはＡｌｅｘａ６４８コンジュゲートＮｂとインキュベートした。細胞を４回洗浄し、ＦＡＣＳ解析の前に、１：１の比率で混合し、４℃で０、２０、６０または１８０分間、さらにインキュベートした。幾つかの実験においては、細胞混合後、０、０．５および１６ｈにおいて解析した。標的細胞からのＮｂの解離、およびｅＦｌｕｏｒ４５０標識された細胞との会合を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar社）を使用して解析した。
【０３６０】
エピトープ解析の場合、細胞をＲＴで３０分間、過剰な一価のナノボディまたはモノクローナル抗体（２μｇ/１００μＬのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）とプレインキュベートし、その後、蛍光色素コンジュゲートナノボディ（０．５μＬのＰＢＳ中５００ｎｇ）を添加し、ＲＴで２０分間さらにインキュベートした。細胞を洗浄し、BD-FACS Cantoを用いたフローサイトメトリーにより解析した。FlowJoソフトウェア（Treestar社）を使用してデータを解析した。
【０３６１】
補体依存性の細胞傷害性アッセイ
骨髄腫（ＬＰ−１）またはバーキットリンパ腫（Daudi、CA46、Jijoye 13）細胞株を、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質と共に４℃で１０分間プレインキュベートし、その後
ヒト血清（１５％）を添加し、３７℃で１ｈさらにインキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ解析の前にＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／ヨウ化プロピジウム中に再懸濁した。
【０３６２】
骨髄腫患者から得た骨髄細胞を、フィコール密度勾配遠心により精製し、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質と４℃で１０分間プレインキュベートし、その後ヒト血清（１５％）を添加し、３７℃で１ｈさらにインキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＤ４５およびＣＤ５６に対する蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて、ならびに、適切な蛍光色素がコンジュゲートしたＣＤ３８特異的Ｎｂを用いて（ダラツムマブ−ｓｃＦｖ−Ｆｃにより処置された細胞はＮｂ−ＪＫ３６、バイパラトピック２１１−１０ＧＳ−１２１Ｎｂ−ＦｃではＮｂ−ＭＵ５２３に）、４℃で３０分間染色した。次に細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ解析の前にＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／ヨウ化プロピジウム中に再懸濁した。
【実施例１】
【０３６３】
免疫によるＣＤ３８に特異的な重鎖抗体の誘導
４匹のラマをＣＤ３８で免疫し、重鎖抗体を誘導した。具体的には、各種のプロトコルに従い、ラマ１０および２５をＣＤ３８の組換えヒト非グリコシル化細胞外ドメイン（配列番号４６５）で免疫、ブースター免疫し、一方、他のラマ５３８、５３９を、基本的に先行文献（Koch-Nolte et al 2007 FASEB J. 21:3490-3498）の記載に従い、ＣＤ３８発現ベクター（完全配列を発現する）で免疫した。各ラマに、２週間の投与間隔により４回、抗原の投与を行った。各投与は、プラスミドをコンジュゲートさせた金粒子（１ショットあたり０．５ｍｇの金粒子上へＤＮＡを１μｇコンジュゲート）を、皮膚に６００ｐｓｉの圧力で１２ショット投与することで行った。最終的な遺伝子免疫の３週間後、２×１０７のＣＤ３８でトランスフェクションしたＨｅｋ２９３細胞を単回ブーストした。時間経過に伴う体液性免疫応答の誘導をモニターするため、定期的に血液サンプルを採取した。Ｂ細胞組織の単離のため、第４のＤＮＡ免疫の３および９日後（ＰＢＬ１およびＰＢＬ２）、ならびに細胞ブーストの４および８日後（ＰＢＬ３およびＰＢＬ４）に、これらの動物から血液を採取した。製造業者の指示に従い、フィコールハイパックを使用し、血液サンプルから末梢血単核細胞を調製した。プロテインＧおよびプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ラマ血清からイムノグロブリンサブクラスを精製した。最初に、免疫後の血清をプロテインＧ−セファロースカラムにアプライした。結合したＩｇＧタンパク質の溶出の際、サブタイプに従った分画が実施されるように（２５）、緩衝液のｐＨ値を選択した。重鎖ｌｇＧ２ｃサブタイプ抗体をｐＨ３．５で溶出させ、一方、ＩｇＧ１抗体をカラムからｐＨ２．７で溶出させた。プロテインＧカラムに結合しなかったフラクションをプロテインＡカラムにアプライした。ｐＨ４．５および２．７において、重鎖ＩｇＧ２ｂサブタイプ抗体が溶出された。ＩｇＧサブクラスの精製をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により確認した。
【０３６４】
体液性免疫応答の誘導に成功したこと、および免疫血清の反応性、ならびに精製されたＩｇＧサブクラスをＥＬＩＳＡにより確認した。対照抗原ＥＤＩＮ（Staphylococcus aureus由来の酵素−毒素）と比較し、免疫後血清および精製ＩｇＧサブクラスは、組換えヒトＣＤ３８に対する具体的な反応性を示した（データ示さず）。
【実施例２】
【０３６５】
免疫したラマのファージディスプレイライブラリーに由来する、ＣＤ３８特異的なＶＨＨの選抜および配列解析
ファージディスプレイライブラリーを作製するため、RNeasy Midiキット（Qiagen GmbH社、Hilden）を用い、最終注入後のラマの末梢血リンパ球からＲＮＡを単離し、逆転写によってｃＤＮＡに変換させた。逆転写の際、ＲＮＡ中の異なる位置で結合するランダムヘキサマーを用いた。ＶＨＨをコードするのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。要約すると、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを容易にするように設計されたファージミドベクター（ｐＨＥＮ２、Ｃ末端６ＨＩＳおよびｍｙｃタグを含む）に、ＰＣＲ増幅されたＶＨＨレパートリーを、特定の制限酵素部位を介してクローニングした。次にライゲーション産物で大腸菌を形質転換し、ＶＨＨ断片を発現するファージライブラリーを作成した。標準的なプロトコル（例えば、本明細書において引用するＡｂｌｙｎｘ社による国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０６２５５１号、国際公開第０５／０４４８５８号および他の従来技術および出願を参照）に従い、ファージを調製した。各１２個のランダムに選抜されたクローンのＤＮＡのシークエンス解析の結果、広範なＶＨＨレパートリーのクローニングに成功したことが確認された。選抜された細胞全てを使用して、免疫後のファージライブラリーからのＣＤ３８特異的なＶＨＨの選抜を行った。トランスフェクションしなかった１×１０７個のＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、M. musculusの胎生期の結合組織）とインキュベートするネガティブ選抜により非特異的ＶＨＨを除去した。２または３ラウンドの選抜を、ＣＤ３８でトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞で行った。各選抜ラウンドの後、特定のクローンの強化がシークエンシングにより検出された。二回以上検出されたクローン、またはＣＤＲ領域中にごく少数のアミノ酸置換を有する複数のクローンを、ファミリーとして定義した。
【実施例３】
【０３６６】
大腸菌細胞におけるＶＨＨの組換え発現
上記で同定された代表的なファミリーのＶＨＨを大腸菌において発現させた。ファージアウトプットを用いて大腸菌を感染させ、個々のＶＨＨクローンを解析した。標準的なプロトコル（例えば、本明細書において引用するＡｂｌｙｎｘ社による国際公開第０３／０３５６９４号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０６２５５１号および他の従来技術および出願を参照）に従い、ペリプラズム抽出物を調製した。要約すると、光学密度が０．５に達するまで、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する１００ｍｌの２×ＹＴ培地（BD Difco社、Heidelberg）中で形質転換菌体を再懸濁した。イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によりタンパク質発現を誘導し、３ｈ後、細胞を遠心分離した終了させた。浸透圧ショックによって、外側の細胞壁を破壊し、ＶＨＨを含有するペリプラズム画分を回収した。金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって、ＨＩＳタグを介してＶＨＨを精製した。その後ＶＨＨをＰＢＳに対して透析し、タンパク質濃度の測定後、４℃で貯蔵した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により精製されたＶＨＨの純度、完全性および濃度を確認した（図示せず）。培養液１リットルあたり０．１〜１０ｍｇの収率で、モノマー状ＶＨＨが精製された。
【実施例４】
【０３６７】
フローサイトメトリーによる選抜されたＶＨＨの結合特異性の解析
４．１  ＣＤ３８でトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３およびＬＰ−１骨髄腫細胞に対する結合
フローサイトメトリーを用い、ＣＤ３８トランスフェクション後ＮＩＨ−３Ｔ３細胞および親細胞への結合性を測定することによって、各種のファミリーを代表する精製された一価の抗ＣＤ３８ＶＨＨの結合特異性を測定した。結合強度を増加させるため、ＶＨＨを、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃマーカーを標的とする蛍光標識抗体と、１：７のモル比でプレインキュベートし、二価フォーマット（抗ｃ−ｍｙｃ−ＦＩＴＣ、９Ｅ１０ＡｂＤ、Serotec）を模倣させた。４℃で３０分間、蛍光色素コンジュゲート抗体１μｇと共に１×１０６個の細胞をインキュベートした。二回の洗浄、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、FACS CaliburまたはFACS Canto（BD Biosciences社、Heidelberg）上のフローサイトメトリーにより解析した。ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ（Treestar社、Stanford, US）を使用してデータを評価した。
【０３６８】
２８種のＶＨＨファミリーが、トランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽細胞のヒトＣＤ３８への特異的結合を示したが、非トランスフェクション細胞では示さなかった（データ示さず）。ＣＤ３８を発現するＬＰ−１骨髄腫細胞株との結合によって、選抜された抗ＣＤ３８ＶＨＨのＣＤ３８への用量依存的結合がさらに確認された（データ示さず）。
【０３６９】
４．２  白血球およびヒト腫瘍細胞株上の天然ＣＤ３８に対する結合
次に、精製された一価の抗ＣＤ３８ＶＨＨの、末梢血白血球（ＰＢＭＣ）の細胞表面上の天然ＣＤ３８への結合に関して、フローサイトメトリー解析した。その際、過剰量のＦＩＴＣ標識抗Ｃ−ｍｙｃ抗体によるＶＨＨの系列希釈（５０ｎｇ〜１６ｐｇにわたる）を用いて、５０μＬのヒト血液をＲＴで３０分間インキュベートした。ＣＤ３８を強く発現するＮＫ細胞およびＢリンパ球と、ＣＤ３８を弱く発現するＴリンパ球とを区別するため、ＡＰＣ標識抗ＣＤ３抗体を用いた。赤血球細胞を洗浄し、溶解バッファーにより溶解させた後、フローサイトメトリーにより結合を試験した。クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）の毒素Ｂに特異的なＶＨＨ（ＶＨＨのＬ−１４）をネガティブコントロールとして用いた。ポジティブコントロールとして、ＣＤ３８に対するＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体（抗ヒトＣＤ３８−ＦＩＴＣ、１Ａ１０、BD Biosciences社）を用いた。リンパ球を前方および側方の散乱光として定義した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、ＣＤ３陰性細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。ＶＨＨのバックグラウンド結合は、ＣＤ３８抗体のコントロールのレベルを超えなかった。ネガティブコントロールのＶＨＨのＬ−１４は結合を示さなかった。タイトレーション曲線は、解析したＶＨＨの結合能に関する半定量性を表し（図２Ａ）、そこで示される高いＭＦＩは、遅い解離速度および高い結合能を示す。
【０３７０】
ＰＢＭＣプール内のＶＨＨによるＢリンパ球およびＮＫ細胞サブセットへの結合を、さらに単離直後のＰＢＭＣ上のマルチカラーＦＡＣＳ解析によりさらに解析した。Alexa Fluor 647プロテインラベリングキット（Molecular Probes社、Eugene, USA）を用い、ＶＨＨのサブセットを蛍光色素Ａｌｅｘａ−６４７にコンジュゲートし、４℃で３０分間、０．１％のＢＳＡを添加した０．１ｍＬのＰＢＳ中で、１×１０６のＰＢＭＣと結合させた。ＣＤ３８を強く発現するＮＫ細胞およびプラズマ細胞を区別するため、ＣＤ１６（３Ｇ８）に対するＡＰＣ−Ｃｙ７標識モノクローナル抗体およびＣＤ１９（ＨＩ  Ｂ１９）に対するＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体を用いる対比染色により細胞を染色した。直接標識した抗ＣＤ３８  １Ａ１０抗体を参照として用いた。
【０３７１】
結合後の結果を図２Ｂに示す。
【０３７２】
これらの結果は、ＮＫ細胞およびプラズマ細胞上のＣＤ３８の染色を示す。
【０３７３】
４．３  可溶性ＣＤ３８に対する結合
可溶性、非グリコシル化、組換えヒトＣＤ３８に対する、精製された一価の抗ＣＤ３８ＶＨＨの選抜クローンの結合能を、マイクロスケール熱泳動により解析した。この方法は、熱泳動（すなわち温度勾配に沿った分子の移動）の原理に基づく。温度勾配を赤外線レーザーで発生させ、蛍光顕微鏡観察によって勾配内の分子の動きを追い、測定した。相互作用が存在するとき、溶液中の分子の熱泳動による移動度は変化する。測定の際、モノマー状の非標識ＶＨＨの系列希釈を用い、ＭＳＴ緩衝液（２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣＩ、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．５ｍＭのＤＴＴ）中のＡｌｅｘａ６４７をコンジュゲートさせた一定濃度（１２．５ｎＭおよび５ｎＭ）のＣＤ３８と１０分間インキュベートした。各バッチをNanoTemper Monolith NT.115において解析した。蛍光値の変化を、平均化した蛍光に対するパーセンテージ変化として測定し、ＶＨＨ濃度として考慮した。独立に実施した２回の試験の測定結果から、GraphPad Prismソフトウェアを用い、解離定数ＫＤを算出した。
【０３７４】
ＭＵ３９７（配列番号３３）、ＭＵ１０６８（配列番号３４）、ＭＵ１０６７（配列番号４９）、ＭＵ５２３（配列番号４７）、ＭＵ２７４（配列番号３５）などの様々なＶＨＨが、ナノモル範囲（１〜６ｎＭ）の低いＫＤ値でＣＤ３８と結合し、高親和性を示した（表４．３Ａに示す）。
【０３７５】
【表３】
2019503167.tif 000007
【０３７６】
さらに、ヒトＣＤ３８タンパク質に対する、様々な一価の精製されたＶＨＨの解離（結合ｏｆｆ）速度定数をOctet RED384（ForteBio社）のバイオルミネセンス動態アッセイで測定した。酢酸緩衝液（ｐＨ６）中でＡＲ２Ｇバイオセンサー表面上へのヒトＣＤ３８の直接の固定化を行い、１００ｎＭのＨＣｌにより検体の再生を行った。検体は、最初に飽和量１μＭで、次に非常に速いｏｎ速度を示すＶＨＨについてはさらに１００ｎＭで試験した。参照として、ダラツムマブ（Ｄａｒａ  ｓｃＦｖ）のｓｃＦｖおよびネガティブコントロールとして無関係なｃＡｂｌｙｓ３  ＶＨＨを用いた。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ動力学モデルを使用し、センサーグラムをフィットさせた。非特異的結合は、同時平行の参照センサー値を減算することによって、ｏｆｆ速度アッセイにおいて補正した。
【０３７７】
ｏｆｆ速度を表４．３Ｂに示す。ｏｆｆ速度は２．２Ｅ−３から７．８Ｅ−５１／ｓの範囲であり、ダラツムマブｓｃＦｖでは４．４Ｅ−０３  １／ｓのｏｆｆ速度であった。
【０３７８】
【表４】
2019503167.tif 000008
【０３７９】
４．４  配列解析
ＣＤ３８特異的な結合が確認された代表的なクローンのシークエンシングを行った。
配列を表Ａ−３に示す。
【実施例５】
【０３８０】
ＶＨＨファミリーの違いによる、認識されるエピトープの多様性
様々なＶＨＨファミリーによって認識されるＣＤ３８タンパク質上のエピトープを評価するため、様々なファミリーの代表的な精製ＶＨＨを、少量の蛍光標識ＶＨＨのセットに対してビニングした（binned）。具体的には、ＶＨＨのサブセットを、Alexa Fluor 647プロテインラベリングキット（Molecular Probes, Eugene, USA）を用いて蛍光色素Ａｌｅｘａ−６４７にコンジュゲートさせ、次にエピトープマッピングに用いた。さらに、ダラツムマブのｓｃＦｖもＡｌｅｘａ−６４７で標識し、同じパネルに含めた。
【０３８１】
１００μＬのＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ中の、５×Ｅ５のＬＰ−１骨髄腫細胞を、ＲＴで１０分間、５μｇの非コンジュゲート型ＶＨＨとプレインキュベートし、さらにＲＴで３０分間、ＦＡＣＳ解析の前に、５００ｎｇのＡｌｅｘａ−６４７コンジュゲートＶＨＨとインキュベートした。ＦＡＣＳシグナルの減少は、非コンジュゲート型ＶＨＨの競合的結合を示す。ＡＲＴ２特異的なＶＨＨをネガティブコントロールとして用い、それはＣＤ３８への結合を示さなかった。それぞれの蛍光色素コンジュゲートＶＨＨの非コンジュゲート型誘導体をポジティブコントロールとして用いた。
【０３８２】
ＦＡＣＳ実験の結果を表５Ａにまとめる。
【０３８３】
【表５】
2019503167.tif 000009
ここで、接頭辞「Ｊｋ」を有するＶＨＨは、本発明では接頭辞「ｊｋ」、「Ｊｋｏ」または「ｊｋｏ」によって示されることもある。
【０３８４】
ＣＤ３８特異的なＶＨＨは３つの異なる非重複エピトープと実質的に結合し、それらを仮に「エピトープ１」、「エピトープ２」および「エピトープ３」と称する。ダラツムマブエピトープは、エピトープ１、およびエピトープ２の一部、およびエピトープ３のＶＨＨクローンと重複する。
【０３８５】
ＶＨＨファミリーｌ−９．２ａ、ｌ−９．２ｂ、ｌ−９．３ｂ、Ｓ−１４ａ、ｌ−１４．１ａ、ｌ−１４．２ｂ、ｌ−１５．１ｂ、ｌ−１５．２ａ、ｌ−１５．２ｂ、ｌ−１５．３ａ、ｓ−１５ａおよびｓ−１６ａは、エピトープ１を認識し結合する。これらのファミリーは、代表的なエピトープ２（ＭＵ１０６７、ＭＵ５２３、ＪＫ２）またはエピトープ３（ＷＦ３６、ＷＦ１５２、ＷＦ１００）のＶＨＨと競合しない。
【０３８６】
ＶＨＨファミリーｌ−９．１ｃ、ｌ−１９．１ａ、ｌ−１９．１ｂ、ｌ−１９．２ａおよびｌ−１９．２ｂは、エピトープ２を認識し結合する。これらのファミリーは、代表的なエピトープ１（ＭＵ１０６８、ＭＵ２７４、ＭＵ２１１）またはエピトープ３（ＷＦ３６、ＷＦ１５２、ＷＦ１００）のＶＨＨと競合しない。
【０３８７】
ＶＨＨファミリーｌ−８．１ａ、ｌ−８．１ｂ、ｌ−８．２ａ、ｌ−８．２ｆ、ｌ−８．３ａ、ｌ−１２ｂ、ｌ−１７ａ、ｌ−１７ａ、ｌ−１７ｂ、ｌ−１７ｃ、ｓ−１９ａ、ｓ−１９ｂ、ｓ−２４ａ、ｓ＋／−２４ｂ、ｓ−２４ｃ、ｓ＋／−２４ｄおよびｌ−２４ａは、エピトープ３を認識し結合する。これらのファミリーは、代表的なエピトープ１（ＭＵ１０６８、ＭＵ２７４、ＭＵ２１１）またはエピトープ２（ＭＵ１０６７、ＭＵ５２３、ＪＫ２）のＶＨＨと競合しない。
【０３８８】
表５Ｂは、エピトープビニングの結果を要約したものである。
【表６】
2019503167.tif 000010
【０３８９】
ＶＨＨは細胞上の結合競合に基づき３つの非重複エピトープ群に分類できる一方で、ダラツムマブの競合阻害剤および非競合阻害剤が群内に存在する。この交差ブロッキングは、エピトープの重複、またはＣＤ３８のコンフォメーション安定化の相違に起因する立体障害を示すといえる。ＶＨＨのＣＤ３８への同時結合をさらに評価するため、２８種の一価の精製された抗ＣＤ３８ＶＨＨおよびベンチマークとしてのダラツムマブｓｃＦｖを用いた、Octet RED384（ForteBio）上の生物発光分析による、タンデムによるエピトープビニング解析を行った。ＡＲ２Ｇバイオセンサー表面上へ、１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３８を直接固定化した（酢酸緩衝液（ｐＨ６）中）。ＣＤ３８バイオセンサーの再生は、１００ｎＭのＨＣｌによる５秒間の再生パルスを５回行い、実施した。１００ｎＭの飽和濃度のＶＨＨをＣＤ３８と結合させ、一方、ダラツムマブｓｃＦｖでは１μΜで行った。第２の検体の結合および解離のセンサーグラムを記録した。結合捕捉レベルを、ロード後１０秒間の時間枠にて評価した。Ｗａｒｄの方法に従い、非階層的なクラスタリングを行った。
【０３９０】
結果を図１１にまとめる。
【０３９１】
交差ブロッキングＦＡＣＳにより前回同定された３つのエピトープビンを、タンデムのエピトープビニングにより確認した。一般的に、双方向性ブロッキングが各エピトープ群内で観察された。各群内に下位クラスターを割り当てることができる。エピトープ３内では、ダラツムマブと競合したファミリー３、７、１８および２１から構成されるサブグループが同定された（クラスター３．１）。エピトープ群１内では、（それぞれ８、１１、１４および１７）から構成されるサブグループはまた、クラスター３．１内のファミリーのサブセットと競合したが、クラスター３．２のファミリーとは競合しなかった。エピトープ群２内では、ファミリー４は、ダラツムマブと同時にＣＤ３８と結合できるが、他の２つのファミリー１９および２０は競合した。
【０３９２】
ファミリー９はエピトープ１内でビニングされたが、またエピトープ２および幾つかのエピトープ３のファミリーとも競合し、それは、結合するＣＤ３８のコンフォメーションが、他のエピトープ１ファミリーのそれとは異なることを示唆する。置き換えに似た挙動が、ファミリー７およびファミリー９のＶＨＨで観察され、第２のＶＨＨとの結合の間の解離を示すものである。いかなる理論にも拘束されないが、これらのＶＨＨは、他のＶＨＨファミリーの場合とは異なる、ＣＤ３８のコンフォメーションと結合することを示すといえる。
【０３９３】
エピトープ１およびエピトープ２内の様々なＶＨＨのエピトープを、ＣＤ３８タンパク質との共結晶化により決定した。ＣＤ３８−Ｕ３７５（ｆａｍ５、ｌ−９．２、エピトープ１）、ＣＤ３８−ＭＵ５５１（ｆａｍ２０、ｌ−１９．２、エピトープ２）およびＣＤ３８−ＭＵ１０５３（ｆａｍ１４、ｌ−１５．３、エピトープ１）の構造に関する情報は、それぞれ、ＰＤＢコード５Ｆ２１、５Ｆ１０および５Ｆ１Ｋ（Li et al. 2016, Scientific reports）に記載されている。３つの全てのＶＨＨは、細胞および組換えタンパク質との結合においてダラツムマブと競合し、それはエピトープの重複を示唆する。これに従えば、ダラツムマブの結合にとり重要であると記載されるＣＤ３８のＳｅｒ２７４は、２つのエピトープ１ＶＨＨ各々による、ＣＤ３８上のフットプリントの一部である。ファミリー５および１４は、エピトープ１内の２つの下位クラスターに分離される。これは、部分的なフットプリントの重複と整合するものである。
【実施例６】
【０３９４】
様々なＮｂ−Ｆｃの組合せが、強力な補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示す
抗体療法は、癌処置において非常に強力であることが証明されている。標的の腫瘍細胞を殺傷するために抗体医薬が採用する２つの重要なメカニズムは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）である。抗ＣＤ３８ＶＨＨの潜在的ＣＤＣ活性を評価するため、各種の選抜されたＶＨＨを、基本的に国際公開第２００９／０６８６３０号に記載のように、ヒトＦｃ尾部（ｈＦｃ、ＩｇＧ１）との遺伝子融合体として産生させた。
【０３９５】
６．１  ＣＤ３８発現ヒト腫瘍細胞株に対するＣＤＣ
ＷＦ２１１−ｈＦｃは、エピトープ１と結合するＷＦ２１１（配列番号４２、ファミリーｓ−１６ａ）をベースとし、ＷＦ１２１−ｈＦｃは、エピトープ３と結合するＷＦ１２１（配列番号４３、ファミリーｌ−１７ａ）をベースとする。ポジティブコントロールとして、ｓｃＦｖ−Ｄａｒａ−ｈＦｃを用いた。ｓｃＦｖ−Ｄａｒａ−ｈＦｃは、ダラツムマブの単鎖Ｆｖドメインをベースとするが、本発明のＶＨＨとの直接比較を容易にするため、前記Ｆｖドメインを同様にｈＦｃとコンジュゲートさせた。
【０３９６】
対応するネガティブコントロールとして、マウスＡＲＴ２．２（ｓ＋１６ａのｈＦｃ）または毒素Ｂ（６０１）に対するＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた。
【０３９７】
補体の給源としての２０％のプールされたヒト血清の存在下、ＬＰ−１骨髄腫細胞を３７℃で１ｈ、２μｇのＦｃ融合タンパク質とインキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みから細胞死を測定した。
【０３９８】
結果を図３に示す。
【０３９９】
ＷＦ１２１−ｈＦｃおよびＷＦ２１１−ｈＦｃは、ネガティブコントロール（ｓ＋１６ａ−ｈＦｃ）とほぼ同等の細胞傷害性を有する。対照的に、ダラツムマブｓｃＦｖ−ｈＦｃは、約３４％のＰＩ陽性細胞に見られる、ＣＤＣ媒介性細胞傷害性の増加を示す。予想外にも、ＷＦ１２１−ｈＦｃおよびＷＦ２１１−ｈＦｃの（「組合せ」）の、エピトープ１とエピトープ３の両方への結合は、約９２％のＰＩ陽性細胞に見られる、明らかな相乗的細胞傷害性を示す。
【０４００】
６．２  組合せ対個別の構築物のタイトレーション
さらに、組合せ対個別における、Ｎｂ−ｈＦｃ融合タンパク質の細胞傷害性を評価するため、実施例６．１の記載と実質的に同じ条件で、用量を変化させてタイトレーションを実施した。
【０４０１】
結果を図4に示す。
【０４０２】
結果は、個別の部分１つのみによる結合と比較し、同時にエピトープ１およびエピトープ３を結合させた組合せでは、優れた効果が得られることを裏付けるものである。
【０４０３】
６．３  ＣＡ４６ヒト・バーキットリンパ腫における、ダラツムマブとの組合せ
使用される部分に関連するエピトープの違いの重要性を評価するため、実施例６．１の実験を繰り返したが、本試験では、ＷＦ１３９ｈＦｃ（配列番号５２）＋ＷＦ４２ｈＦｃ（配列番号１０）の組合せ（両方のナノボディがエピトープ３と結合）と、ＷＦ２１１ｈＦｃ（配列番号４２）＋ＷＦ４２ｈＦｃ（配列番号１０）の組合せ（各ナノボディがそれぞれエピトープ１および３と結合）を比較した。コントロールとして、ｔｏｘＢ（６０１）およびダラツムマブｈＦｃ（エピトープ１と結合）を用いた。ＣＡ４６ヒト・バーキットリンパ腫細胞における細胞傷害性を試験した。
【０４０４】
結果を図５に示す。これらの結果は、組合せ（本実施例ではＣＤ３８のエピトープ１およびエピトープ３に対する結合物質）が相乗効果を発揮するという知見を裏付けるものである。さらに、前記結果は、各種の癌に存在する２つの異なるエピトープと結合させたときの細胞傷害性効果が、一般的に適用できることを示すものである。
【０４０５】
ＣＤ３８上の２つの異なるエピトープとの結合を見出すことがさらに一般的に適用できる（すなわち結合剤の特定のフォーマットに限定されない）か否かを判断するため、異なるＶＨＨｓおよびダラツムマブｈＦｃを用いて実験を繰り返した。（１）ダラツムマブと競合せず、（２）ダラツムマブと組み合わされたＶＨＨは相乗効果を示すことが証明された。この組合せにより、細胞死の顕著な増加（ダラツムマブｈＦｃ単独での１６％から、組合せでの８７％）がもたらされた。一方、（１）ダラツムマブと競合し、（２）ダラツムマブと組み合わされたＶＨＨは、相乗効果を示さなかった（表６．４）。前記結果は、各種の癌に存在する２つの異なるエピトープと結合させたときの細胞傷害性効果が、一般的に適用できることを示すものである。
【０４０６】
６．４  ダウディ・ヒト・バーキットリンパ腫における、抗ＣＤ３８ＶＨＨ−Ｆｃとダラツムマブとの組合せの、ダラツムマブｈＦｃおよびダラツムマブＨ＋Ｌとの比較
異なるエピトープと結合する、ダラツムマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（ダラツムマブｈＦｃ）と、それと競合しないＶＨＨ−Ｆｃとの組合せが、ＣＤＣ媒介性の細胞殺傷効果を非常に増加させることを示した。次のステップにおいて、発明者らは、ＶＨＨ−Ｆｃもまた、従来のダラツムマブフォーマット、すなわち２つの軽鎖および２つの重鎖から構成される完全ＩｇＧ（ダラツムマブＨ＋Ｌ）と相乗作用するか否かを試験しようと試みた。この目的において、通常抗体フォーマットのダラツムマブを、完全長のダラツムマブの軽鎖および重鎖をコードする各発現ベクターの、ＨＥＫ−６Ｅへの同時トランスフェクションを経て産生させた。ＣＤ３８、ＣＡ４６を発現している２つの異なる細胞株およびダウディ・ヒト・バーキット−リンパ腫細胞において、ダラツムマブｈＦｃおよびダラツムマブＨ＋Ｌ単独、ならびに異なる抗ＣＤ３８ＶＨＨ−Ｆｃの組合せによりＣＤＣ細胞傷害性を試験した。
【０４０７】
結果を図１２に示す。結果は、ダラツムマブとは異なるエピトープを認識する抗ＣＤ３８ＶＨＨ−Ｆｃは、フォーマットに関係なく、ダラツムマブｈＦｃおよびダラツムマブＨ＋ＬのいずれのＣＤＣをも強化することを示す。
【０４０８】
エピトープ１（ＷＦ２１１、ＭＵ２７４）、エピトープ２（ＪＫ２、ＭＵ１０６７）およびエピトープ３（ＪＫ３６、ＷＦ１００）の代表的なＶＨＨ−Ｆｃメンバーを用いて、ＶＨＨ−Ｆｃの組合せにより誘導されるＣＤＣのより広範囲な解析を実施した。
【０４０９】
結果を図６．４に示す。
【０４１０】
結果が、ＷＦ２１１−ＦｃおよびＭＵ２７４−Ｆｃ（すなわちエピトープ１と結合する２つの異なるＶＨＨ−Ｆｃメンバー）のいずれのＣＤＣも、エピトープ２またはエピトープ３に結合するＶＨＨ−Ｆｃによって劇的に強化されるが、エピトープ１と結合している他のＶＨＨ−Ｆｃメンバーでは強化されないことを示す。対照的に、ＪＫ２−ＦｃおよびＭＵ１０６７−Ｆｃ（すなわちエピトープ２と結合するＶＨＨ−Ｆｃメンバー）のＣＤＣは、エピトープ１またはエピトープ３に結合するＶＨＨ−Ｆｃメンバーによって劇的に強化されるが、エピトープ２と結合する他のＶＨＨ−Ｆｃメンバーでは強化されないことを示す。さらに、ＪＫ３６−ＦｃおよびＷＦ１００−Ｆｃ（すなわちエピトープ３と結合するＶＨＨ−Ｆｃメンバー）のＣＤＣは、エピトープ１またはエピトープ２に結合するＶＨＨ−Ｆｃメンバーによって劇的に強化されるが、エピトープ３と結合する他のＶＨＨ−Ｆｃメンバーでは強化されないことを示す。最後に、ダラツムマブｈＦｃのＣＤＣは、エピトープ２またはエピトープ３と結合するＶＨＨ−Ｆｃメンバー（ｂ）のサブセットによって劇的に強化されるが、エピトープ１と結合するＶＨＨ−Ｆｃメンバーでは強化されないことを示す。以上から、各種の癌に存在する２つの異なるエピトープと結合させたときの細胞傷害性効果が、一般的に適用できることが示される。
【０４１１】
【表７】
2019503167.tif 000011
【実施例７】
【０４１２】
バイパラトピックイムノグロブリン構築物
エピトープ１およびエピトープ３に対する結合剤の組合せによる驚くべき結果に鑑み、本発明の発明者らは、バイパラトピック構築物の試験を試みた。バイパラトピック構築物は、個々の部分の組合せを凌ぐ各種効果（製造および承認の容易性を含む）を奏するものである。例えば、医薬当局による臨床的使用に関する販売承認を得るためには、組合せの個々の部分に関する承認および医学関係書類が必要となるからである。一方、バイパラトピック構築物には、両方の成分の比率ならびに位置を変更できないという固有の欠点が存在する。例えば、バイパラトピック構築物では、個々の結合部分の位置が他の部分の結合能に影響しうるからである。
【０４１３】
７．１  バイパラトピック構築物は、初代骨髄サンプル中の骨髄腫細胞に対する細胞傷害性を有する
実施例６．１と同様、バイパラトピックイムノグロブリン構築物を含む各種の構築物を癌細胞において試験したが、本試験では骨髄腫患者に由来する初代骨髄細胞を用いた。
【０４１４】
構築物２１１−１０ＧＳ−１２１−ｈＦｃは、ＷＦ２１１（配列番号４２）およびＷＦ１２１（配列番号４３）をベースとし、これらと同じ部分を含む。これらの結合部分を１０ＧＳリンカーを介して連結し、ｈＦｃを後続させた。ポジティブコントロールとして、ｓｃＦｖ−Ｄａｒａ−ｈＦｃを用いた。構築物ｓ＋１６ａ−ｈＦｃをネガティブコントロールとして用いた。
【０４１５】
補体の給源としての２０％のプールされたヒト血清の存在下、骨髄腫患者の調製直後の骨髄細胞を３７℃で１ｈ、２μｇのＦｃ融合タンパク質とインキュベートした。次に細胞を４℃で異なるｍＡｂで染色し、ＰＩ染色の取り込みにより細胞死を測定した。
【０４１６】
結果を図６Ａに示す。
【０４１７】
結果から、バイパラトピックイムノグロブリン構築物の細胞傷害性活性が、エピトープ１およびエピトープ３に対する２つの結合剤の組合せよりわずかに低いことが解る。これは、予想外にも、構築物中の個々の部分の位置などの、構築物中の立体配置的制約は、細胞傷害性に対する影響としては限られたものであることを意味する 。
【０４１８】
さらに、バイパラトピックイムノグロブリン構築物は、ベンチマークより少なくとも２．５倍の細胞傷害性を示す。さらに、バイパラトピックイムノグロブリン構築物の細胞傷害性を、従来のＩｇＧフォーマットのダラツムマブと直接比較した。その際、ＬＰ−１骨髄腫細胞、ＣＡ４６バーキットリンパ腫細胞およびダウディ・バーキットリンパ腫細胞を、実質的に上記の方法に従い、３７℃で２ｈ、補体の給源としてプールしたヒト血清２０％の存在下、２μｇのＦｃ−融合タンパク質または４μｇのダラツムマブＨ＋Ｌとインキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みから細胞死を測定した。
【０４１９】
結果を図６Ｂに示す。
【０４２０】
結果は、様々な範囲の癌において、バイパラトピックイムノグロブリン構築物が、ダラツムマブと比較し優れた細胞傷害性を示すことを確認するものである。
【０４２１】
７．２  バイパラトピック構築物は、補体因子Ｃ１ｑとの高い結合能を示す
前述のように、補体系は、ファゴサイトーシスおよび細胞傷害性を促進する白血球の直接の溶解または補充によって、宿主防御、外来細胞、微生物およびセルデブリスの除去に関する主要な機能を発揮する。それは４０以上の血漿中および細胞タンパク質（レセプターおよび調節因子）を含む。古典経路は抗原抗体複合体（免疫複合体）の形成により起動し、それは特にＣ１ｑからなるＣ１複合体と結合する。
【０４２２】
バイパラトピックイムノグロブリン構築物の補体因子Ｃ１ｑへの結合を評価するために、ＬＰ１骨髄腫細胞を、示されるＮｂ−ＦｃまたはＮｂ−Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質の飽和量（２μｇ／１２０μＬ）で、4℃で２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、さらに４℃で３０分間、ＦＩＴＣコンジュゲートＣ１ｑでインキュベートした。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。
【０４２３】
結果を図７に示す。
【０４２４】
バイパラトピックイムノグロブリン構築物が補体因子Ｃ１ｑとの高い結合能を示すことが解る。
【０４２５】
７．３  バイパラトピック構築物は各種の異なる癌において、ダラツムマブより高い細胞傷害性を示す
広い概念での妥当性を評価するため、実質的に実施例７．１に示されるバイパラトピックイムノグロブリン構築物を各種の細胞系において試験した。本試験ではイムノグロブリン構築物３６−３５ＧＳ−１０６７−ｈＦｃを用いたが、それはエピトープ３と結合するＪＫ３６（配列番号３１）、およびエピトープ２と結合するＭＵ１０６７（配列番号４９）をベースとするものである。これらの結合部分を、３５ＧＳリンカーを介して連結し、ｈＦｃを後続させた。ポジティブコントロールとして、ｓｃＦｖ−Ｄａｒａ−ｈＦｃを用いた。構築物ｓ＋１６ａ−ｈＦｃをネガティブコントロールとして用いた。ＬＰ−１骨髄腫細胞、ＣＡ４６バーキットリンパ腫細胞およびダウディ・バーキットリンパ腫細胞を、実質的に上記の方法に従い、３７℃で２ｈ、補体の給源としてプールしたヒト血清２０％の存在下、２μｇのＦｃ融合タンパク質とインキュベートした。次に細胞を４℃で異なるｍＡｂで染色し、ＰＩ染色の取り込みにより細胞死を測定した。
【０４２６】
結果を図８に示す。結果から、バイパラトピックイムノグロブリン構築物が様々な癌において細胞傷害性を示すことが解る。さらに、イムノグロブリンバイパラトピック構築物は、全ての場合において高い効率、すなわちベンチマークより高い細胞傷害性を示す。
【０４２７】
７．４  エピトープ２結合剤を有するバイパラトピック構築物が、他の組合せよりも優れる
実施例５にて言及したように、異なるＮｂファミリーのＣＤ３８に対する結合は、３つの異なる非重複エピトープ（すなわちエピトープ１、エピトープ２およびエピトープ３）に割り当てることができる。異なるエピトープの組合せが効力に対し影響を及ぼすか否かを評価するため、ダラツムマブｈＦｃとの比較による、全ての組合せの評価実験を行った。バイパラトピックイムノグロブリン構築物は、特定のエピトープのための代表的なＶＨＨから作製した。ＶＨＨをＧＳリンカーにより連結し、ヒトＦｃテールをＣ末端にコンジュゲートさせた。
【０４２８】
【表８】
2019503167.tif 000012
【０４２９】
実質的に実施例６．３にて説明したように、様々なバイパラトピックイムノグロブリン構築物を試験し、ＣＡ４６バーキット−リンパ腫細胞系における細胞傷害性を解析した。
【０４３０】
結果を図９に示す。
【０４３１】
結果から、様々なエピトープを有する抗ＣＤ３８ＶＨＨのいずれのバイパラトピック組合せも、ベンチマークより高い細胞傷害性を示すことが解る。驚くべきことに、エピトープ２に対する結合剤を含む組合せは、これらの結合剤を含まない組合せより効力が高い。
【実施例８】
【０４３２】
ＩＳＶＤは、インビボでＣＤ３８陽性腫瘍を正確に識別する
結合試験の結果に鑑み、特定のＣＤ３８ＩＳＶＤはインビボ条件でＣＤ３８と結合することができ、インビボでＣＤ３８陽性腫瘍を検出するためのイメージング剤として使用できるか否かを検討する。安定的にＣＤ３８をトランスフェクションしたＤＣ２７．１０マウスリンパ腫細胞および非トランスフェクションＤＣ２７．１０細胞を、ヌードマウスの左右の横腹に皮下注入することによる、二側面腫瘍モデルを用いた。腫瘍移植の７日後、近赤外蛍光のＡｌｅｘａ−６８０色素をコンジュゲートした一価のＶＨＨ、すなわちＡＦ６８０−ＭＵ１０６７（ファミリー２０、ｌ−１９．２ａ、エピトープ２）を５０μｇ、マウスの尾静脈から注入した。マウスおよび組織における生体でのインビボ分布を、４８時間にわたり生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ２００）によってモニターした。総放射効率を、Living Image 4.2ソフトウェア（Caliper Life Sciences社）により測定した。バックグラウンドに対する腫瘍比率は、腫瘍取り込み値を、後肢から測定したバックグラウンド値で除算することにより算出した。
【０４３３】
結果を図１０に示す。
【０４３４】
ＡＦ６８０標識ＶＨＨはインビボでＣＤ３８発現腫瘍を検出する一方、ＣＤ３８陰性腫瘍または正常組織ではシグナルが示されない。抗ＣＤ３８ＩＳＶＤはインビボでＣＤ３８発現腫瘍に対する優れた識別能を発揮する。
【実施例９】
【０４３５】
ＣＤ３８のＧＤＰＲシクラーゼ活性の抗ＣＤ３８ＶＨＨによる調節
次に発明者らは一価の精製された抗ＣＤ３８ＶＨＨがＣＤ３８の酵素活性を妨害できるか否かを検討した。ＣＤ３８は、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）からのサイクリックＧＤＰ−リボース（ｃＧＤＰＲ）の合成を触媒する。ｃＧＤＰＲの合成は、簡便には蛍光測定によってモニターできる（Deckert et al. 2014 Clin. Cane. Res. 20:4574-83）。
【０４３６】
簡潔には、ＣＤ３８が触媒するＮＧＤからサイクリックＧＤＰ−リボースへの変換を、蛍光測定（それぞれ３００ｎｍおよび４１０ｎｍの励起および放出波長）により、時間経過とともにモニターした。ＣＤ３８の組換え細胞外ドメイン（ａａ４４〜３００、５ｎＭ）を、黒色の９６ウェルプレートの反応緩衝液中、ＲＴで１５分間、０．４〜４００ｎＭの濃度で、一価のＶＨＨと共に１５分間プレインキュベートし、その後、８０μΜの最終濃度でＮＧＤ（Sigma社）を添加した。独立したアッセイを３重のウェルを用いて実施した。ＣＤ３８のないウェルの測定値をバックグラウンドとして用い、全ての測定値から減算した。ＥＸ３００／ＥＸ４１０測定値を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）対時間でプロットした。Ｎｂがない場合のコントロール試料と比較したＧＤＰＲの産生（パーセント）を、（サンプルのＲＦＵ／コントロール試料のＲＦＵ  ×１００）算出した。
【０４３７】
結果を、図１３（パネルＡおよびＢ）に示す。
【０４３８】
エピトープ２（すなわちファミリー４、１９および２０）（ｌ−９．１、ｌ−１９．１ａ、ｌ−１９．２ａ）を認識する全３つのファミリーのＶＨＨは、用量依存的に、ＣＤ３８によるＮＧＤのｃＧＤＰＲへの変換を阻害し（図１３Ａ）、そのうちＭＵ１０６７が最も強力なＶＨＨであった（図１３Ｂ）。幾つかの他のＶＨＨ、すなわちエピトープ１からのファミリー１４（ＭＵ１０５３）および１１（ＪＫ２２）、ならびにエピトープ３からのファミリー２（ＪＫ３６）および１５（ＪＫ１９）も、酵素活性を一部アンタゴナイズした。エピトープ２ＶＨＨが、ＣＤ３８のＧＤＰＲシクラーゼ活性に対する最も強力なアンタゴニストであった。対照的に、ファミリー９（ＭＵ５３７、ｓ−１４、エピトープ１）およびファミリー７（ＷＦ１４、ｌ−１２ｂ、エピトープ３）の２つのＶＨＨは、ＣＤ３８の触媒作用によるｃＧＤＰＲの合成を強化した（図１３Ａ）。
【０４３９】
次に、発明者らは、ＣＤ３８のＧＤＰＲシクラーゼ活性に対する、非重複エピトープの抗ＣＤ３８ＶＨＨの組合せの効果の解析を試みた。ＶＨＨを１：１の比率で混合し、次に系列希釈を調製して同じ酵素活性アッセイを行った結果、相乗的な阻害効果または増強効果が示された。
【０４４０】
結果を図１４に示す。
【０４４１】
結果は、２つの非重複阻害ＶＨＨの組合せ、すなわちファミリー４（ＪＫ２、Ｉ−９．１ａ、エピトープ２）とファミリー２（ＪＫ３６、ｌ−８．２ａ、エピトープ３）との組み合わせが、ＣＤ３８の酵素活性を相乗的に阻害し、ゆえに協同的作用を示すものである。最も強力なエピトープ２のＶＨＨであるＭＵ１０６７（ファミリー２０、ｌ−１９．２ａ）の阻害はＪＫ３６の添加によってさらに改善されず、このＶＨＨのみによって既に最大の抑制に達したことを示唆するものである。
【０４４２】
相乗効果はまた、２つの異なる強化ＶＨＨ、ファミリー９（ＭＵ７３８、ｓ−１４ａ）およびファミリー７（ＷＦ１４，ｌ−１２ｂ）を組み合わせた結果ＣＤ３８の酵素活性が強化されたときにも観察され、協同作用を示すものである。興味深いことに、ファミリー９のＶＨＨであるＷＦ６９またはＭＵ７３８がＣＤ３８にすでに結合しているとき、置き換え作用（結合の間の解離）がファミリー７のＷＦ１４の場合に観察され、これらのＶＨＨが異なるコンフォメーションのＣＤ３８と結合することを示唆するものである。
【０４４３】
これらの結果は、ＣＤ３８上の２つの非重複エピトープのターゲティングが、最大抑制に至るまで、ＣＤ３８によるＧＤＰＲシクラーゼ活性に対して相乗効果を発揮することを示すものである。
【実施例１０】
【０４４４】
抗ＣＤ３８ＶＨＨ−ＦｃによるＡＤＣＣ
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗ＣＤ３８ＶＨＨ−Ｆｃ構築物の能力を評価するため、マイクロプレートアッセイを用い、ルシフェラーゼをトランスフェクションした標的細胞からのルシフェラーゼ活性の喪失を細胞死の指標として測定した。その際、ＣＤ３８を発現する５×１０４個の、ルシフェラーゼをトランスフェクションしたＣＡ４６バーキットリンパ腫細胞を、ＶＨＨ−Ｆｃ構築物またはダラツムマブの完全ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の系列希釈と共に、４℃で１０分間インキュベートした。エフェクター細胞として、ＣＤ１６をトランスフェクションしたＮＫ９２細胞を、エフェクター：標的細胞が３：１の比率となるように添加し、細胞を37℃で３時間さらにインキュベートした。細胞を遠心分離してペレット状にし、０．１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、７５０μＬの最終濃度のルシフェリンを添加し、ＲＴで１０分間のさらにインキュベートした。ルシフェラーゼ活性をマイクロプレートプレートリーダー（Victor社）で測定した。
【０４４５】
結果を図１５に示す。
【０４４６】
結果は、バイパラトピックＶＶＨ−ＦｃであるＪＫ３６−１５ＧＳ−ＭＵ１０６７−ＦＣ（Ｅ３−Ｅ２）およびＷＦ２１１−１０ＧＳ−ＷＦ１２１−Ｆｃが、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｈｃ）および完全ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）フォーマットのダラツムマブよりもより効果的にＣＡ４６細胞のＡＤＣＣを媒介し、また最大の溶解率は３５−１５ＧＳ−１０６７−ＦＣおよび２１１−１０ＧＳ−１２１−Ｆｃでは８５％、それに対してダラツムマブｈｃでは６０％、ダラツムマブＨ＋Ｌでは６５％であった。
【実施例１１】
【０４４７】
ヒトＣＤ３８＋ＣＡ−４６腫瘍の異種移植モデルにおける、ダラツムマブと比較したＶＨＨ−Ｆｃのインビボ効果
Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウスの全身ヒト異種移植モデルを用い、ダラツムマブと比較したバイパラトピックＶＨＨ−Ｆｃの治療効果を試験した。ルシフェラーゼをトランスフェクションしたＣＡ４６細胞の静脈内注射の１週間後、ルシフェリンの静脈内注射を行い、その１５分後、腫瘍の増殖が、生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ２００）によって検出された。動物（群当たりのｎ＝５）に対し、７日目から（すなわち腫瘍の移植がＩＶＩＳにより検出されてから）バイパラトピックＷＦ２１１−１０ＧＳ−ＷＦ１２１−ＦＣ（Ｅ１−Ｅ３）、無関係ＶＨＨ−Ｆｃ、またはダラツムマブｓｃＦｖ−Ｆｃ（ダラツムマブｈｃ）を２ｍｇ／ｋｇ（５０μｇ総量／マウス）で毎週、腹腔内投与した。注射は合計６回、ｄ４９まで連続して行った（３００μＬ／マウス）。腫瘍増殖は、ルシフェリンの注入後イメージング解析によって７日毎にモニターした。
【０４４８】
腫瘍増殖および全体的な生存率の結果を図１６に示す。
【０４４９】
結果は、バイパラトピックＣＤ３８ＶＨＨ−ＦｃのＷＦ２１１−１０ＧＳ−ＷＦ１２１−ＦＣはダラツムマブｈｃと同程度に腫瘍増殖を阻害することを示すものである。さらに、処置により生存期間が延長され、対照群のマウスの５０％は５０日も生存できなかったが、ダラツムマブｈｃで処置したマウスの５０％が８５日目まで生存し、２１１−１０ＧＳ−１２１−Ｆｃで処置したマウスの５０％は１０５日目まで生存した。
【０４５０】
このデータは、バイパラトピックＶＨＨ−Ｆｃ構築物はＣＤ３８陽性腫瘍に対する治療効果を示し、生存率を改善することを示す。
【実施例１２】
【０４５１】
エピトープビン
上記のＩＳＶＤの結果に鑑み、本発明の発明者らは、エピトープビンを再検討することができた。エピトープ１ビン、エピトープ２ビンおよびエピトープ３ビンは、２つのメインサブクラスターに分割できる：
（ｉ）エピトープ１．１（Ｅ１．１）およびエピトープ１．２（Ｅ１．２）：
エピトープ１．１ＩＳＶＤおよびエピトープ１．２ＩＳＶＤはいずれも、ダラツムマブと競合する。
（ｉｉ）エピトープ２．１（Ｅ２．１）およびエピトープ２．２（Ｅ２．２）：
エピトープ２．１ＩＳＶＤはダラツムマブと競合せず、一方、エピトープ２．２ＩＳＶＤはダラツムマブと競合する。
（ｉｉ）エピトープ３．１（Ｅ３．１）およびエピトープ３．２（Ｅ３．２）：
エピトープ３．２ＩＳＶＤはダラツムマブと競合せず、一方、エピトープ３．１ＩＳＶＤはダラツムマブと競合する。
結果を要約するベン図を図１７に示す。これらのビニングは、Ｅ３．２のファミリーを、エピトープ１ＩＳＶＤおよびエピトープ２ＩＳＶＤ、ならびにダラツムマブと組み合わせたとき、それらがＥ３．１ファミリーよりもパートナーとして広範囲に使用されうることを示唆する。
【０４５２】
参考文献
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【０４５３】
【表９−１】
2019503167.tif 000013
【表９−２】
2019503167.tif 000014
【表９−３】
2019503167.tif 000015
【表９−４】
2019503167.tif 000016
【表９−５】
2019503167.tif 000017
【０４５４】
【表１０−１】
2019503167.tif 000018
【表１０−２】
2019503167.tif 000019
【０４５５】
【表１１−１】
2019503167.tif 000020
【表１１−２】
2019503167.tif 000021
【表１１−３】
2019503167.tif 000022
【図１】
2019503167.tif 000023
【図２Ａ】
2019503167.tif 000024
【図２Ｂ】
2019503167.tif 000025
【図２Ｃ】
2019503167.tif 000026
【図３】
2019503167.tif 000027
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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