(57)【要約】  本発明は、人体と接触する、又は人体内に入ることが意図される医療機器及び流体上からリポポリサッカライドを低減させるための方法及びシステムを対象とする。一実施形態では、本発明は、１つ以上のエンドトキシンを検出可能な濃度で含有する溶液を、上記の溶液にステアリン酸塩、好ましくはステアリン酸カルシウムの懸濁液を添加することで上記のエンドトキシンの検出可能量を低減させ、また任意でステアリン酸塩を除去することにより処理する方法に関する。本発明は更に、医療機器を処理するための方法、及び機器又は哺乳類の組織表面をステアリン酸塩懸濁液と接触させることにより上記の哺乳類上のエンドトキシン検出可能量を低減させる処理の方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数のエンドトキシンを検出可能な濃度で含有する溶液を処理する方法であって、
ａ．ステアリン酸塩の懸濁液を前記溶液に添加して、前記エンドトキシンの検出可能量を低減させることと、
ｂ．任意で前記ステアリン酸塩を除去することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記溶液は水性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液は水であり、前記ステアリン酸塩は実質的に水溶性ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステアリン酸塩は、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸アルミニウムから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムであり、前記溶液は水又は食塩水である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
医療機器を処理するための方法であって、ａ）前記機器を、水又は非水溶媒中ステアリン酸塩の懸濁液と接触させて、前記医療機器上のエンドトキシンの検出可能量を低減させることを含む、方法。
【請求項７】
前記機器は縫合糸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記機器は水と接触し、前記ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類の組織表面をステアリン酸塩懸濁液と接触させて、前記哺乳類のエンドトキシンの検出可能量を低減させることを含む、処理方法。
【請求項１０】
前記ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムである、請求項９に記載の処理方法。
【請求項１１】
前記ステアリン酸塩懸濁液は抗生物質療法との組み合わせで送達される、請求項９に記載の処理方法。
【請求項１２】
前記ステアリン酸塩懸濁液は哺乳類の胃腸管内／上に送達される、請求項９に記載の処理方法。
【請求項１３】
前記ステアリン酸塩懸濁液は、抗生物質の量と少なくとも等しい量で送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステアリン酸塩懸濁液は、水／食塩水キャリア中に懸濁されたステアリン酸カルシウムを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
水／食塩水キャリア中に懸濁されたステアリン酸カルシウムを含有する前記ステアリン酸塩懸濁液は、外科手術までに創傷部位からエンドトキシンを除去する、又は敗血症の重症度及び／若しくは発生を低減させるための洗浄液として用いられる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人体と接触する、又は人体内に入ることが意図される医療機器及び流体上からリポポリサッカライドを減少させるための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポグリカン及びエンドトキシンとしても知られるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、脂質及び多糖類から構成される大分子である。ＬＰＳは、グラム陰性細菌の外膜の主要成分であり、細菌の構造的一体性に寄与し、かつ特定の種類の化学的侵食から膜を保護する。ＬＰＳは、その死が、グラム陰性細菌が突然変異するか又は除去されるかの結果をもたらす、グラム陰性細菌にとって極めて重要である。
【０００３】
ＬＰＳは、ヒト免疫系などの正常な動物の免疫系から強い応答を誘発する。血中のエンドトキシンの存在は、内毒素血症と称される。これは、免疫応答が激しく発せられた場合には敗血症性ショックを引き起こす場合がある。循環系、神経、及び眼に曝露する医療機器で許容されるエンドトキシン濃度は厳しく規制されている。
【０００４】
エンドトキシン汚染を除去するために用いられる一部の通常用いられる技術は、限外濾過及びイオン交換クロマトグラフィである。限外濾過は、水からのエンドトキシンの除去には効果的であるが、物理力によって損傷され得るタンパク質の存在下では効率の悪い方法である。エンドトキシンの負の正味荷電を利用するアニオン交換体は、エンドトキシン吸着のために広く用いられてきた。しかしながら、負荷電したタンパク質が汚染除去される必要がある場合、これらがマトリックス上に共吸着して、生体物質の著しい喪失をもたらす場合がある。更に、正味正に荷電したタンパク質はエンドトキシンとの複合体を形成する場合がある。事前に除去する試みとしては、数多くの方法が含まれるが、これらは、高価な設備、労力を要するプロセス、並びに不安定で高価な薬剤及び生物製剤に適用範囲が限定されることを要する。
【０００５】
製薬産業では、低エンドトキシン濃度の生成物を生成するいくつかの代替的経路が知られている。しかしながら、これらの多様性はエンドトキシン除去におけるジレンマを示す。薬理タンパク質（pharmacoproteins）のために、製造プロセスの特性を利用して、特定の生成物要件に適合するように調整された、いくつかの手順が開発されてきた。したがって、各手順は完全に異なる方法で問題に対処しており、これらのいずれも広範囲に適用可能でないということが判明している。例えば陰イオン交換クロマトグラフィは、ウロキナーゼなどの正に荷電したタンパク質の汚染除去に有用である可能性がある。しかしながら、負に荷電したタンパク質の汚染除去は、吸着による生成物の相当量の喪失を伴う。ミオグロビン（１８０００Ｄａ）などの小タンパク質の場合は、限外濾過が大型エンドトキシン凝集体の除去に有用となり得る。免疫グロブリン（１５００００Ｄａ）などの大タンパク質の場合は、限外濾過は効果的とならない。更に、エンドトキシンとタンパク質との相互作用によってエンドトキシンモノマーがタンパク質と共に膜を透過すると、限外濾過は失敗する。現在では、特定の生成物のために特別に設計された手順環境をもたらす、薬学的及び生物学的用途でエンドトキシンを除去する万能の手段は存在しない。
【０００６】
エンドトキシンは温度及びｐＨ安定であると考えることができ、そのため、エンドトキシンの除去は、タンパク質精製中の下流プロセスにおける最も困難な課題の１つとなる。いずれの方法の成功にも影響を及ぼす２つの重要な要因は、用いられるクロマトグラフィ担体又は媒体に対するエンドトキシン及びタンパク質抗原の親和性、並びにタンパク質抗原に対するエンドトキシンの結合性である。第３の要因は、温度、ｐＨ、洗浄剤（界面活性剤）、溶媒、及び変性剤などの要因によって、タンパク質に対するエンドトキシンの親和性がいかに改質され得るかである。
【０００７】
通常、エンドトキシン除去に用いられる手順は、選択性、吸着容量、及びタンパク質の回復の点において不十分である。タンパク質非含有溶液からエンドトキシンを選択的に除去する場合、エンドトキシンと水との異なるサイズを利用した限外濾過によって、又は疎水性吸着剤若しくはアニオン交換体を用いた非選択的吸着によって、エンドトキシンを除去するのは容易である。
【０００８】
エンドトキシン汚染を除去するために用いられる一部の通常用いられる技術は、限外濾過及びイオン交換クロマトグラフィである。限外濾過は、水からのエンドトキシンの除去には効果的であるが、物理力によって損傷され得るタンパク質の存在下では不十分な方法である。エンドトキシンの負の正味荷電を利用するアニオン交換体は、エンドトキシン吸着のために広く用いられてきた。しかしながら、負荷電したタンパク質が汚染除去される必要がある場合、これらがマトリックス上に共吸着して、生体物質の著しい喪失をもたらす場合がある。更に、正味正に荷電したタンパク質はエンドトキシンとの複合体を形成し、それによりタンパク質がカラムに沿ってエンドトキシンを引っ張り、その結果、エンドトキシン除去効率が最小化する。
【０００９】
遺伝子組換え型タンパク質調製品からエンドトキシンを除去するために、汚染エンドトキシンがゲルに結合することを期待して、セファロース４Ｂに固定化されたポリミキシンＢを含有するカラムにタンパク質溶液をパスしてもよい。同様に、セファロース４Ｂに固定化されたヒスチジンもまた、タンパク質溶液からエンドトキシンを捕捉する能力を有する。ポリミキシンＢ親和性クロマトグラフィは、溶液中のエンドトキシンを低減させるのに効果的である。ペプチド抗生物質であるポリミキシンＢは、大半のエンドトキシンのリピドＡ部分に対して非常に高い結合親和性を有する。Ｋａｒｐｌｕｓらは、「Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７年１２月２４日；１０５（２）：２１１〜２０）と題する論文で、非イオン性洗浄剤であるオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドによってエンドトキシンをタンパク質から分離した後にエンドトキシンが効果的に吸収され得るポリミキシンＢ親和性クロマトグラフィの改善された方法を報告している。
【００１０】
Ｂ  Ｄａｖｉｅｓ、Ｊ  Ｃｏｈｅｎによる「Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ」（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１１；１１：６５〜７１）と題された論文は、カチオン性ポリペプチド抗生物質の群であるポリミキシンについて説明している。これらの抗菌特性に加えて、ポリミキシンはエンドトキシンと結合してエンドトキシンを中和することができる。この論文は、敗血症を有する患者における特定の血球吸着のために固相担体に結合させたポリミキシンを使用することにより、リポポリサッカライド結合特性を保持しつつ全身的な毒性作用を最小化する可能性について論じている。このシステムは日本で長年にわたり広く用いられているが、効力に関する説得力ある臨床的証拠が欠けている。近年のイタリアにおける研究はいくつかの有望なデータを有する。ポリミキシンはこの方法を研究するために用いられる主な剤であるが、その他の分子もエンドトキシンを結合させる能力を有しており、そのうちのいくつかは、つい最近になってその他のエンドトキシン除去装置の基盤として提案されている。臨床の実践にこうした装置を使用する可能性を評価するために入手可能な証拠が精査されている。
【００１１】
上記の方法は、タンパク質を比較的高く回復させながら、タンパク質溶液からエンドトキシンを除去するのにかなり効果的である。しかしながら、これらの親和性相（affinity phases）は、エタノール中の強い水酸化ナトリウムからなる標準的な脱パイロジェン条件では洗浄することができない。これらの担体は、タンパク質の存在下で相当な効率の低下を被る。したがって、一般的にこれらは上記の問題に適用可能ではない。
【００１２】
膜ベースのクロマトグラフィは、主にタンパク質分離のための分取法に成功裏に用いられてきた。それでもなお、膜クロマトグラフィは結合能力によって制限されるため、この技術は普遍的に採用されていない。
【００１３】
ステアリン酸カルシウムは、縫合糸、薬剤、及びカテーテルなどの製品を含む多くの医療用途で用いられている。製薬及び化粧品産業は、粉末及び顆粒用の抗凝固添加剤、並びに錠剤をプレスするための賦形剤として、多くの場合ステアリン酸カルシウムを使用している。ステアリン酸塩は「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）物質であり、動物中に見出され、賦形剤として広く用いられている。
【００１４】
米国特許第４，１８５，６３７号「Ｃｏａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｔｕｒｅｓ」は、改善された固定特性（tie-down properties）を有する多繊維縫合糸を開示しており、上記の縫合糸は、揮発性有機溶媒中にＣ６以上の脂肪酸の多価金属イオン塩のゲルを含む組成物の約１〜５重量％の乾燥残渣でコーティングされている。脂肪酸塩は、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩、又は亜鉛塩であり得る。脂肪酸塩は、更に、カルシウム塩又はマグネシウム塩であってもよく、あるいは脂肪酸塩はステアリン酸カルシウムであってもよい。
【００１５】
国際公開特許第２０１３／０９２４１６号「Ｄｒｕｇ−ｃｏａｔｅｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ」は、その表面の少なくとも一部上に、少なくとも１つの薬剤及び少なくとも１つの親油性潤滑剤を、１００重量％の薬剤に対して０．１〜５００重量％の少なくとも１つの親油性潤滑剤の比で担持する医療機器を開示しているが、少なくとも１つの薬剤は、パクリタキセル、三酸化ヒ素、コルチコイドの親油性誘導体、及びシロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、バイオリムス、テムシロリムスから選択され、少なくとも１つの親油性潤滑剤はＣ６〜Ｃ３０モノカルボン酸塩であり、少なくとも１つの薬剤及び少なくとも１つの潤滑剤は、同時に同じ溶媒又は溶媒の混合物中に適用されるか、あるいは薬剤でコーティングされた装置が少なくとも１つの潤滑剤からなる追加層でコーティングされる。これは、Ｃ６〜Ｃ３０モノカルボン酸塩が、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、パルミチン酸マグネシウム、パルミチン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ミリスチン酸カルシウム、ラウリン酸マグネシウム、ラウリン酸カルシウム、カプリル酸マグネシウム、カプリル酸カルシウム、カプリル酸マグネシウム、カプリル酸カルシウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、パルミトレイン酸マグネシウム、又はパルミトレイン酸カルシウムから選択される医療機器を更に開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
複雑、高価であるか、又は生物製剤などの特定の構成成分には作用し得ない、ナノ濾過又荷電濾過などのその他の技術又はＬＰＳ除去法を置き換える必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
要約すると、本発明は、人体と接触する、又は人体内に入ることが意図される医療機器及び流体上からリポポリサッカライドを低減させるための方法及びシステムを対象とする。一実施形態では、本発明は、１つ以上のエンドトキシンを検出可能な濃度で含有する溶液を、上記の溶液にステアリン酸塩、好ましくはステアリン酸カルシウムの懸濁液を添加することで上記のエンドトキシンの検出可能量を低減させ、また任意でステアリン酸塩を除去することにより処理する方法に関する。溶液は、水性であるか、又はより好ましくは水、若しくは生理的食塩水である。
【００１８】
代替的実施形態では、本発明は、機器を、水、食塩水、又は非水溶媒中ステアリン酸塩懸濁液と接触させて、上記の医療機器上のエンドトキシンの検出可能量を低減させることにより、医療機器を処理するための方法を対象とする。機器は、例えば、縫合糸であり得る。機器は、好ましくは、水又は食塩水と接触し、ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムである。
【００１９】
代替的実施形態では、本発明は、哺乳類の組織表面をステアリン酸塩懸濁液と接触させることにより上記の哺乳類上のエンドトキシンの検出可能量を低減させる処理方法を対象とする。ステアリン酸塩は好ましくはステアリン酸カルシウムである。ステアリン酸塩懸濁液は、抗生物質療法と組み合わせて送達され得る。ステアリン酸塩懸濁液は哺乳類の胃腸管上に送達され得、ステアリン酸塩懸濁液は抗生物質の量と少なくとも等しい量で送達され得る。これらの治療法に有用なステアリン酸塩懸濁液は、水又は食塩水担体中に懸濁したステアリン酸カルシウムを含有し得る。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは、ステアリン酸カルシウムなどの特定のステアリン酸塩が、ＬＰＳを含有するシステム、機器、又は流体（水など）と直接接触するように配置されると、エンドトキシン活性を制御することができることを発見した。一般に塩であると考えられるステアリン酸カルシウムは、カルシウムを有する２つの長鎖脂肪酸を含み、室温では実質的に水に溶けない化合物である。これら直鎖の飽和一塩基酸は、動物脂肪中に豊富に見出され、また綿実、トウモロコシ、大豆、ココヤシ、及びヤシ油中に様々な程度で見出される。これらの純粋状態では、これらの酸は、蝋様の感触を有する固形、結晶質、不透明な白色物質である。これは、安定剤又は乳化剤の形態で、潤滑剤から食品及び医薬品まで様々な異なる生産プロセスで複数の用途を有する。
【００２１】
本発明の一態様によると、任意の生物製剤（例えばタンパク質）溶液又は懸濁液を含む水又は水溶液などの液体は、ステアリン酸カルシウム（ＣａＳｔ）などのステアリン酸塩を用いて精製が実施される。検出可能なＬＰＳに対する効果は、ステアリン酸塩の用量に依存し、温度に依存せず、ＬＰＳ制御効果の急激な開始を示した。いかなる理論にも束縛されるものではないが、ＣａＳｔなどのステアリン酸塩はＬＰＳを不活性化するため、これは標準的アッセイであっても検出不可能であると思われる。特に好ましいＣａＳｔの量は、０．２ｇのＣａＳｔ／５ｍＬの液体である。しかしながら、下記の実施例では、ＣａＳｔ０．００７ｇ／液体５ｍＬの低濃度であってもＬＰＳの低減が示された。
【００２２】
一態様では、ＣａＳｔ粉末懸濁液を処理された液体に添加して、任意で撹拌を加える。数秒から数時間にわたる曝露時間が過ぎると、液体は測定可能なＬＰＳを実質的に含まない。任意で、水溶性を欠如したステアリン酸塩の結果として、液体を、濾過、デカント、沈殿、遠心分離など、又はこれらの組み合わせなどの任意の既知の方法でステアリン酸塩粉末から分離してもよい。
【００２３】
別の態様では、水性含有液体（aqueous-containing liquids）を、カラム上又はフィルタ上に支持された又は固定されたステアリン酸塩の中に、又はその上でパスさせることによって処理してもよい。更に別の態様では、こうした液体を、ステアリン酸塩粒子で充填した流動床又は充填床の中にパスさせることによって処理してもよい。
【００２４】
本発明の一態様によると、縫合糸、針、メッシュ、シリンジ、移植片、コンタクトレンズ、医療機器貯蔵容器などなどの医療機器は、ＣａＳｔなどのステアリン酸塩を含有する水性懸濁液中で処理され、任意で撹拌を加える。医療機器を水中ＣａＳｔ懸濁液に曝露することは、医療機器の表面からＬＰＳを除去するものと期待される。一態様では、ＣａＳｔ粉末を水に添加して懸濁液を形成し、処理された医療機器を懸濁液中に浸漬させて、任意で撹拌を加える。
【００２５】
医療機器、特に吸収性医療機器を水又は水溶液に曝露することは常に望ましいわけではない。本発明の一態様によれば、医療機器、特に縫合糸、メッシュなどの吸収性医療機器は、ステアリン酸塩懸濁液又は溶液を含有する溶媒中で処理して、任意で撹拌を加える。一態様では、ＣａＳｔ粉末を有機溶媒含有溶液に添加して、処理された医療機器を溶媒中に浸漬させて、任意で撹拌を加える。数秒から数時間にわたる曝露時間が過ぎると、機器を取り除いて任意で乾燥又は洗浄する。好適な有機溶媒の例としては、アルキルアセテート、特にエチルアセテートなどのアセテート類、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、特に例えばプロパノール、イソプロパノール、及びブタノールなどの低級アルキルアルコールなどのアルコール類、並びにシクロヘキサンなどの環状アルカン類が挙げられる。
【００２６】
本発明の一態様によると、生物学的溶液はステアリン酸塩懸濁液で処理してもよい。一態様では、ＣａＳｔ粉末懸濁液を処理された液体に添加して、任意で撹拌してもよい。数秒から数時間にわたる曝露時間が過ぎると、液体はＬＰＳを含まなくなり、使用することができる。任意で、濾過、デカント、沈殿、遠心分離など、又はこれらの組み合わせなどの任意の既知の方法により、液体をステアリン酸塩粉末から分離してもよい。
【００２７】
別の態様では、液体を、カラム上又はフィルタ上に支持された又は固定されたステアリン酸塩の中又は上にパスさせることによって処理して、ＬＰＳを除去してもよい。更に別の態様では、液体を、ステアリン酸塩粒子で充填した流動床又は充填床の中にパスさせることによって処理してもよい。
【００２８】
別の態様では、血液又は血液製剤若しくは誘導体を、カラム上又はフィルタ上に支持又は固定されたステアリン酸塩の中又は上にパスさせることによって処理してＬＰＳを除去してもよく、あるいは貯蔵容器上の懸濁液、粉末、又はコーティングとしてのステアリン酸塩に曝露した状態で貯蔵してもよい。本態様によれば、血液及び血液製剤の貯蔵時間は向上され得る。ＬＰＳの血小板機能に対する影響は、ＣａＳｔなどのステアリン酸塩によって打ち消されることが期待される。現在、濃縮血小板は、投与前の最大５日間を室温で維持される。収集中に血小板に導入されたいかなるグラム陰性細菌も、貯蔵中は増殖を続ける。この汚染の結果として、血小板の廃棄、及びこの救命用血液製剤の投与後、穏やかな反応から激しい反応がもたらされる場合がある。血小板をステアリン酸カルシウム又は等価の化合物に曝露することによって、コスト及び効力が大幅に改善される。
【００２９】
本発明の一態様によると、ヒト及び動物を含む哺乳類は、ＬＰＳ関連疾患を予防的に、又は急性疾患に対して治療され得る。治療は、懸濁液及び固定化ステアリン酸塩を含む様々な形態のステアリン酸塩を用いて血液を治療すること、又は胃腸管を治療することによるものが想到され得る。多量のステアリン酸塩を含有する経口投与形態が想到される。抗生物質などの経口又は局所投与形態への添加剤としてのステアリン酸塩が想到される。固形投与形態、粉末、懸濁液、及び同様物の投与のための任意の形態のステアリン酸塩が用いられ得る。
【００３０】
一態様では、ステアリン酸塩は抗菌剤、例えば抗生物質の投与前に供給される。一態様では、ステアリン酸塩は抗菌剤、例えば抗生物質の投与後に供給される。一態様では、ステアリン酸塩は抗菌剤、例えば抗生物質の投与と同時に供給される。一態様では、ステアリン酸塩は、抗菌剤、例えば抗生物質の投与の前、投与と同時、又は投与の後の任意の組み合わせで供給される。
【００３１】
別の態様では、外科的洗浄液を哺乳類の身体、創傷、又は身体内の、身体に結合した、若しくは身体から分離した組織の任意の部分に適用してよく、洗浄液はＣａＳｔなどのステアリン酸塩の懸濁液を含む。外科的洗浄液は、外科手術の前、最中、若しくは後で、又は外科手術の前、最中、若しくは後の任意の組み合わせで適用してよい。
【００３２】
別の態様では、本発明は、洗浄液としての懸濁液中でステアリン酸塩又はＣａＳｔを使用することによって敗血症の開始を低減することに関する。この材料がこうした方法で用いられる時、これは患部内に配置され、続いて吸引によって除去される。細胞に結合した全てのエンドトキシンは、洗浄溶液中のＣａＳｔによって中和されたエンドトキシンと共に除去される。こうして、自由なエンドトキシン、タンパク質に結合したエンドトキシン、及びＣａＳｔに結合したエンドトキシンは除去され、身体の相互作用を著しく低減させ、あらゆる生理学的効果を軽減させる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、腹腔内窩の選択的汚染除去に関する。グラム陰性細菌量（腹腔内窩内などの）が低減すると、続いて敗血症及び菌血症が低減する。これは、ＣａＳｔを送達可能な外科的洗浄液の形態内に適用することによって達成され得る。ＣａＳｔの最少濃度は、効果的であることが求められ、その作用機序はエンドトキシンを急激に中和する。
【００３４】
一態様では、ステアリン酸カルシウムは循環系に直接導入される。別の態様では、ステアリン酸カルシウムは、エンドトキシンの体外除去で求められるように、間接的に導入される。
【００３５】
別の態様では、ＣａＳｔなどのステアリン酸塩は微粉化されて、１０ｎｍ、１００ｎｍ、１μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、３００μｍ、５００μｍ、又はこれらの組み合わせなどの５ｎｍ〜５００μｍなどの約１ｎｍ〜約１ｍｍの寸法を有する粒子を形成する。
【実施例】
【００３６】
実施例１．
水及び水溶液（様々なエンドトキシン供給源を有するＬＰＳを含有する）をステアリン酸カルシウム（ＣａＳｔ）（粉末懸濁液として）に曝露すると、ＬＰＳの低減を示したか、又はあるいは検出可能なＬＰＳを一切示さない（効果はＣａＳｔの投与量に依存する）。様々な量のステアリン酸カルシウム粉末（ＰＭＣ  ＢＩＯＧＥＮＩＸ、２１．８マイクロメートル、植物由来）を無菌試験管に添加した。既知のエンドトキシン濃度の水溶液５ｍＬ（エンドトキシン非含有水を既知のエンドトキシン濃度の水溶液でスパイクすることにより生成）を、各試験管に添加して、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃデジタルボルテックスミキサを用いて激しくボルテックスし（１分間）、続いて温水浴（３７℃）中に１時間配置した。１時間後、温水浴から管を取り除いて激しくボルテックスした（１分間）。針を備えた無菌シリンジを用いて、ステアリン酸カルシウムを除去することなく溶液を抽出した。続いてこの溶液のエンドトキシン濃度を試験した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｓ．Ｃ．）のＥｎｄｏｓａｆｅ  ＭＣＳマルチカードリッジシステムを用いたエンドトキシン定量化のためのカイネティック発色法。
【００３７】
表１は、ＬＰＳを含有する２００μＬの溶液でスパイクした５ｍＬの水を含有する５ｍＬ試験管にＣａＳｔを添加した試験の結果を示す。試験管に添加した合計ＬＰＳは約５ＥＵであり、処理後に検出されたＬＰＳは初期濃度の３％〜８％であった。データは、約０．２５ｇのＣａＳｔを５ｍＬの水に添加すると、検出可能なＬＰＳ量が著しく低減したことを示す。
【００３８】
【表１】
2019508074.tif 000002
【００３９】
表２は、ＬＰＳを含有する１０００μＬの溶液でスパイクした５ｍＬの水を含有する５ｍＬ試験管にＣａＳｔを添加し、ＬＰＳ濃度がはるかに高かった同様の試験の結果を示す。試験管に添加した合計ＬＰＳは約１４４００ＥＵであり、処理後に検出されたＬＰＳは初期濃度の０．０７％〜０．０８％であった。データは、約０．２５ｇのＣａＳｔを５ｍＬの水に添加すると、検出可能なＬＰＳ量が著しく低減したことを示す。
【００４０】
【表２】
2019508074.tif 000003
【００４１】
表３は、ＬＰＳを含有する１０００μＬの溶液でスパイクした５ｍＬの水を含有する５ｍＬ試験管にＣａＳｔを添加し、ＬＰＳ濃度がはるかに高かった同様の試験の結果を示す。試験管に添加した合計ＬＰＳは約１４４００ＥＵであり、処理後に検出されたＬＰＳはＣａＳｔに依存しており、添加されたＣａＳｔ量の関数であった。ＣａＳｔの添加は０．００２７ｇから０．２５ｇの約１００倍の範囲であり、処理後に検出されたＬＰＳは、初期濃度のパーセントとしてそれぞれ７７％〜０．１９％の範囲であった。データは、５ｍｌの水に約０．０５〜０．２５ｇのＣａＳｔを添加すると検出可能ＬＰＳの量は初期濃度の１％未満に、より具体的には初期濃度の０．２％未満に低下したことを示す。ＣａＳｔの量がより低いと、ＬＰＳはそれほど大きく低下せず、０．０１ｇのＣａＳｔを添加すると処理後に２０％のＬＰＳが検出される結果となり、０．００２７ｇのＣａＳｔを添加すると処理後に７７％のＬＰＳが検出される結果となった。観察された濃度応答は、ステアリン酸カルシウムの質量が増加すると、検出されるエンドトキシン活性はゼロに近づくことを示す。要約すると、エンドトキシンを除去／中和するステアリン酸塩の能力を促進する因子が３つ存在する。これらの３つの因子は、重要性の順に列記されているとは限らないが、濃度、曝露時間、及びミクロレベルでの溶液中のエネルギーである。
【００４２】
【表３】
2019508074.tif 000004
【００４３】
データは、ＣａＳｔで処理した水は、検出可能なＬＰＳ又はエンドトキシン活性が著しく低下する結果となり、添加ＣａＳｔ量が高いほどＬＰＳ濃度はゼロに近づくことを示す。
【００４４】
実施例２．水性懸濁液中での縫合糸試験
ＣａＳｔの水性懸濁液中での縫合糸の処理を以下の通り実施した。使用した縫合糸は、９０％グリコリド、及び１０％Ｌ−ラクチドから製造されたコポリマーから製造された、片寸法が１，６９センチメートル（２７インチ）のＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０）縫合糸であった。使用したエンドトキシン供給源は、滞留（sitting）（又は停滞）雨水（ＳＲＷ）であり、ＬＲＷで希釈して（３９８０ＥＵ／ｍＬ）の濃度を得た。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｓ．Ｃ．）製のＥｎｄｏｓａｆｅ  ＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）を用いた。使用したステアリン酸カルシウムはＰＭＣ  ＢＩＯＧＥＮＩＸ（＜２１．８マイクロメートル、植物由来）であった。
【００４５】
８ストランドの縫合糸を、１度に１０分間ＬＰＳ（エンドトキシン）溶液と共に管内に配置した。縫合糸を２０分間乾燥させ、続いて丸底の管内に配置した。ＬＡＬ試薬水中５重量％のＣａＳｔの懸濁液を調製した。（１０ｍＬのＬＲＷ中０．５ｇのＣａＳｔ）。１つの縫合糸を各管内に配置して、この溶液中で約１０秒間ボルテックスした。縫合糸を取り出して２０分間乾燥させ、続いて丸底の管内に配置した。これを３つの縫合糸に対して実施した。対照としての役割を果たす３つの縫合糸片は、いかなる溶液にも浸さずに試験管内に配置した。３ｍＬのＬＡＬ試薬水を各試験管に添加して、１分間激しくボルテックスし、続いて３７℃の温水浴中に１時間配置した。続いてこれらを取り出し、１分間激しくボルテックスし、希釈し、ＭＣＳシステム上で試験した。ステアリン酸カルシウムと混合された水も試験した。２つの縫合糸を、ステアリン酸カルシウムと混合されたＬＲＷに浸した。２つの縫合糸を浸す前にＬＲＷをステアリン酸カルシウムから分離した。これらは、ＭＣＳ上でエンドトキシンに関しても試験した。結果を表４〜６に示す。
【００４６】
【表４】
2019508074.tif 000005
【００４７】
【表５】
2019508074.tif 000006
【００４８】
【表６】
2019508074.tif 000007
【００４９】
上記の結果に基づくと、ＣａＳｔの水性懸濁液中での処理は、医療機器上、及び医療機器と接触した溶液中を含むＬＰＳ又はエンドトキシン活性の著しい減少をもたらす。
【００５０】
実施例３．有機溶媒中での縫合糸試験
医療機器（吸収性縫合糸によって例示される）をＬＰＳで汚染し、続いて非水溶媒中でＣａＳｔに曝露し、その後ＬＰＳに関して試験し、検出されたＬＰＳ濃度は著しく低下していた。
【００５１】
９０％グリコリド、及び１０％  Ｌ−ラクチドから製造されたコポリマーから製造された吸収性のＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０）縫合糸（サイズ１、長さ６９ｃｍ（２７インチ））をＬＰＳ（エンドトキシン）を含有する溶液に曝露した（雰囲気温度で、エンドトキシン溶液（ＳＲＷ、濃度３９８０ＥＵ／ｍＬ）を含む管内に９ストランドのＶｉｃｒｙｌ縫合糸を１度に１０分間浸漬させた）。排気ドラフト（vented chemical hood）中で縫合糸を２０分間風乾して、丸底内に配置して乾燥させた。続いて縫合糸をエチルアセテート（ＥｔＡｃ）含有ＣａＳｔに浸漬させ、１０秒間簡単にボルテックスし、排気ドラフト中で２０分間乾燥させ、雰囲気温度のエンドトキシン非含有水中で抽出した。続いて、エンドトキシン非含有水（ＬＲＷ）中で抽出された縫合糸を、エンドトキシン定量化のためのカイネティック発色法（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｓ．Ｃ．））を用いてＬＰＳに関して試験した。
【００５２】
表７は、ＥｔＡｃ中で縫合糸をＣａＳｔに曝露した後にＬＰＳを実験的に検出した結果を示す。
【００５３】
【表７】
2019508074.tif 000008
【００５４】
試料１〜３は、対照としてＣａＳｔを含有しないＥｔＡｃに曝露させた。表７から分かるように、溶媒中で処理した後で約８０ＥＵのＬＰＳが検出された。試料４〜６は、５％のステアリン酸カルシウムを含有するＥｔＡｃに曝露させた。再び表７を参照すると、溶媒中で処理した後で約２３ＥＵのＬＰＳが検出された。試料７〜９は、更なる対照としていかなる溶媒系の処理にも曝露させず、溶媒中で処理しない場合は約１０５ＥＵのＬＰＳが検出された。溶媒中のＣａＳｔは、ＬＰＳの著しい低減をもたらした。
【００５５】
上記の試験と同様に、同様に汚染させた同種の吸収性縫合糸を、３つの溶媒（エタノール、シクロヘキサン、イソプロパノール）中でＣａＳｔに曝露させた。続いて縫合糸をＬＰＳに関して試験した。表８は、これらの溶媒中で縫合糸をＣａＳｔに曝露した後にＬＰＳを実験的に検出した結果を示す。溶媒のみでは、検出されたＬＰＳのみの活性は約１０％低下する結果となった。ＣａＳｔ１％懸濁液（ＣａＳｔはわずかに溶媒可溶性であり得た）の存在下で、ＬＰＳの活性は７５〜９５％低下した。
【００５６】
使用された縫合糸は長さ６９センチメートル（２７インチ）の吸収性ラクチド−グリコリド縫合糸の長片であった。用いられたエンドトキシン供給源は、停滞雨水（ＳＲＷ）及びＬＲＷ（３９８０ＥＵ／ｍＬ）であった。７ストランドの縫合糸を、１度に１０分間エンドトキシン溶液と共に管内に配置した。縫合糸を２０分間乾燥させ、続いて丸底の管内に配置した。様々な溶媒（イソプロパノール、シクロヘキサン、及びエタノール）中１重量％ステアリン酸カルシウムの溶液を調製した。１つの縫合糸を各管内に配置して、この溶液中で約１０秒間ボルテックスした。縫合糸を取り出して２０分間乾燥させ、続いて丸底の管内に配置した。これを６つの縫合糸に対して実施した。対照としての役割を果たす１つの縫合糸片は、いかなる溶液にも浸さずに試験管内に配置した。３ｍＬのＬＡＬ試薬水を各試験管に添加して、激しくボルテックスし、続いて３７℃の温水浴中に１時間配置した。続いてこれらを取り出して、激しくボルテックスし、希釈して、ＭＣＳシステム上で試験した。
【００５７】
【表８】
2019508074.tif 000009
【００５８】
上記の結果に基づくと、ＣａＳｔ含有溶媒中の処理は、検出可能なＬＰＳ又はエンドトキシン活性の著しい低下をもたらす。
【００５９】
実施例４．溶媒中の創傷包帯の試験
吸収性支持体上の乾燥フィブリノゲン及び乾燥トロンビンを含有する創傷包帯を以下のように試験した。パッドをＬＰＳでスパイクし、続いてＣａＳｔ含有シクロヘキサンに曝露して、検出可能ＬＰＳに対する影響を測定した。
【００６０】
３つの２．５４×５センチメートル（１×２インチ）包帯片をエンドトキシンでスパイクして、８．９ＥＵのＬＰＳを得た。この片を２０分間乾燥させてから、５０ｍＬのポリプロピレン円錐管内に配置した。７．５ｍＬのＬＡＬ試薬水＋２．５ｍＬの０．２５Ｍトリス緩衝液を管１に添加した。０．１ｇのＣａＳｔを含む１０ｍＬのシクロヘキサンを管２に添加した。１０ｍＬのシクロヘキサンを管３に添加した。管を閉鎖し、続いて、管が継続して回転して包帯が液体と絶えず接触するように、ボトルローラローテータ機（bottle roller rotator machine）上に１５分間配置した。
【００６１】
続いて管１の溶液を希釈して、ＭＣＳシステム上でエンドトキシンに関して試験した。フィブリンパッド片を管２及び管３から取り出して新しい管の中に配置し、７．５ｍＬのＬＡＬ試薬水＋２．５ｍＬの０．２５Ｍトリス緩衝液中で抽出した。続いて、溶液を、ＭＣＳシステム上でエンドトキシン（ＬＰＳ）に関して試験した。結果を表９に示す。
【００６２】
【表９】
2019508074.tif 000010
【００６３】
結果は、ＬＰＳは純シクロヘキサン中で処理した後では９ＥＵから６ＥＵに低減し、シクロヘキサン＋ＣａＳｔ中で処理した後では９ＥＵから２ＥＵに低減したことを示し、これはＣａＳｔが医療機器上のＬＰＳ活性の低下に大きな影響を有していることを示す。
【００６４】
実施例５．キレート剤及び界面活性剤を用いた試験
ＥＤＴＡ及びポリソルベート２０を抽出溶液に添加することによって、これらの２つの物質に導入された時のエンドトキシン活性が回復する可能性を試験して、ＬＰＳ／エンドトキシン活性の恒久的な除去を検証するために、ＥＤＴＡ及びポリソルベート２０試薬を加えて更なる試験を実施した。
【００６５】
試験は、ＥＤＴＡ及びポリソルベート２０を添加した水溶液中で実施し、一部の溶液には懸濁されたＣａＳｔが様々な量で存在した。ステアリン酸カルシウムを秤量して、５ｍＬのエンドトキシン溶液でスパイクした。管を１分間ボルテックスして、３７度の浴に１時間配置した。管を浴から取り出して、再度１分間ボルテックスした。溶液を希釈して、エンドトキシン定量化のためのカイネティック発色法（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｓ．Ｃ．））を用いてエンドトキシンに関して試験した。ＥＤＴＡの効果を測定するために、０．１５５ｇの０．１Ｍ化合物をステアリン酸カルシウム抽出溶液に添加した。４マイクロＬの化合物をステアリン酸カルシウム及びＥＤＴＡを含む抽出溶液に添加することによって、ポリソルベート２０の効果を測定した。これらの試料を徹底的にボルテックスして、エンドトキシン定量化のためのカイネティック発色法（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｓ．Ｃ．））を用いて試験した。驚くべきことに、ＥＤＴＡ及びＴｗｅｅｎ２０の存在下ではＬＰＳ／エンドトキシン活性は回復しなかった。結果を表１０に示す。
【００６６】
【表１０】
2019508074.tif 000011
【００６７】
結果は、キレート剤及び界面活性剤の存在下であっても、特に１ｍＬあたりのＣａＳｔが０．０２８グラム及び０．０１８グラムの高濃度では、ＣａＳｔによるＬＰＳ処理の著しい低減又は弱化はなかったことを示す。
【００６８】
実施例６．様々なＬＰＳ供給源の試験
実験室で培養したエンドトキシン及び天然のエンドトキシンは大きく異なる。したがって、上記の方法では、様々なエンドトキシン供給源を用いてエンドトキシンの活性を試験した。実験室で培養したエンドトキシンは精製されているが、天然のエンドトキシンはタンパク質及びリン脂質などのその他の物質と共存する。このステアリン酸カルシウムを用いてエンドトキシン活性を除去する方法は、様々な天然のエンドトキシン供給源からエンドトキシン活性を除去するのに効果的であることが示された。
【００６９】
実験室で培養したエンドトキシンは、典型的にはフェノールを用いた抽出により精製され、透析され、酢酸／９５％エタノールで処理され、リボヌクレアーゼ／デオキシリボヌクレアーゼで処理され、続いて再度水に対して透析される。この実験で用いられた実験室で培養したエンドトキシンは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって供給された。
【００７０】
エレクトレットフィルタを用いて天然の空中エンドトキシンを捕捉した。エレクトレットフィルタは、空気が流れてそれを通過した時に電荷を生じさせ、その他の粒子と共にエンドトキシンを捕捉する絶縁ポリマー繊維から製造される。フィルタをエンドトキシン非含有水中に長期間配置することによってエンドトキシンをフィルタから抽出した。
【００７１】
エンドトキシンの２つの他の天然供給源を、周辺環境中の水試料から得た。一方の供給源は、滞留雨水のプールであり、もう一方はラリタン川沿いの小さな水たまりであった。滞留雨水（ＳＲＷ）を、塩素処理及び０．２μｍフィルタによって精製した。ラリタン川の水（ＲＲＷ）はいかなるようにも改変しなかった。全てのエンドトキシン供給源に対して同じ試験手順を実施した。以下のデータから、全ての供給源に関して、本発明の方法を用いたエンドトキシン活性の除去に非常に似通った傾向が見られることが分かる。
【００７２】
実施例１で説明したものと同様の手順を用いて試験を実施した。結果を表１１に示す。
【００７３】
【表１１】
2019508074.tif 000012
【００７４】
データは、ＣａＳｔの質量が増加すると、検出された又は回復したエンドトキシンの濃度が低下して０％に近づくことを示す。ステアリン酸カルシウム０．１グラム以上の濃度で、全てのエンドトキシン供給源（両方の実験室標準及び２つの天然供給源）に対して、回復したエンドトキシンのパーセントは５％未満であった。ＣａＳｔは、全てのＬＰＳ供給源の活性の著しい低下をもたらした。
【００７５】
実施例７．その他の試薬
ろう、パラフィンを含むその他の試薬を、エンドトキシン除去に関して試験し、その結果を表１２に示す。
【００７６】
【表１２】
2019508074.tif 000013
【００７７】
上記で示す通り、本発明者らは、蜜ろうを試験して、これはＬＰＳ活性の低下に効果的に作用しないことを発見した。その他のステアリン酸塩もまた試験され、ＣａＳｔほど強力ではないが、ＬＰＳの低下における活性を有することを示した。驚くべきことに、ＣａＳｔが、表１２に示すろうなどの試験されたその他の試薬と比べてはるかに効果的であることが発見された。
【００７８】
実施例８．水からＬＰＳを除去するためにＣａＳｔでコーティングされたメッシュキャリアを用いる
実験手順：水又は溶液からエンドトキシンを除去するためのポリプロピレンメッシュのコーティング
Ｅｔｈａｓｅｗろう（ソルビタンモノパルミテート５０％と、ソルビタントリステアラート２０％と、２０モル％のエチレンオキシドを含有するソルビタントリステアラート３０％と、の混合物であるＥｔｈａｓｅｗ（商標）ろう）をステアリン酸カルシウムと５０／５０の重量比で混合し、１５０℃のホットプレート上で加熱し、一体に混合し、５×２．５４センチメートル（２×１インチ）のポリプロピレンメッシュ片に適用して、冷却させた。
【００７９】
秤量皿中で１０ｍｌのエチルアセテートと０．５ｇのステアリン酸カルシウムとを混合することにより、別のメッシュ片を調製した。１０×５センチメートル（４×２インチ）のポリプロピレンメッシュ片を、エチルアセテートとＣａＳｔとの混合物に簡単に浸し、取り出して乾燥させた。
【００８０】
いくつかの試験管で、エンドトキシンを含有するＳＲＷ及びＥＶＶ試料を上記の処理されたメッシュと接触させ、また、対照として試験した。ＥＶＶは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た懸濁液形態の精製エンドトキシン調製物である。続いて管を試験管ローラ上に１０ＲＰＭで１５分間配置し、取り出し、希釈し、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＭＣＳ上でエンドトキシンを試験した。結果を表１３に示す。
【００８１】
【表１３】
2019508074.tif 000014
【００８２】
上記で示したように、メッシュキャリアは、水からエンドトキシン又はＬＰＳを除去するのに効果的であり、純ＣａＳｔを加えるとより効果的であったが、ステアリン酸塩のその他の形態もまた、エンドトキシン活性の除去にいくらか効果的であった。
【００８３】
実施例９．超音波処理に基づく溶液の撹拌に対するステアリン酸カルシウム（ＣａＳｔ）の効力
０．０４ｇのＣａＳｔ懸濁液を含有する１０ｍｌのＬＲＷ水（ＬＡＬ試薬水、エンドトキシン非含有）をＭｉｓｏｎｉｘ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（モデル：Ｓ−４０００、振幅：３０、時間３０秒）を用いて超音波処理し、続いて懸濁液を雰囲気温度で１ヶ月間貯蔵した。続いて１ｍｌの上記の懸濁液を１０ｍｌのエンドトキシン含有水ＳＲＷに添加し、混合溶液中で得られたエンドトキシン濃度を１５分後及び３０分後に測定し、その結果を表１４に示す。
【００８４】
【表１４】
2019508074.tif 000015
【００８５】
上記の表に示す通り、１ヶ月の保存期間の後であっても、ＣａＳｔ懸濁液は、接触からわずか１５又は３０分後に約４８％〜約６２％の濃度で、エンドトキシンの除去に効果的であった。
【００８６】
実施例１０．ＣａＳｔ懸濁液の効力に対する貯蔵の効果
予混合されたＣａＳｔ懸濁液（超音波処理及びボルテックスされた）の効力を試験して、即座に調製された懸濁液と、エンドトキシン含有溶液と接触する前に９０分、５日、及び１ヶ月の保存期間又は滞留時間を有する懸濁液と、の効力を比較した。
【００８７】
即時混合試験：
超音波処理：ステアリン酸カルシウム（ＣａＳｔ）＋ＳＲＷ  超音波処理された試料：１０ｍＬのＬＲＷ中の０．０４ｇのＣａＳｔ及び０．０２ｇのＣａＳｔを含有する試験管を振幅３０で３０秒間超音波処理した。続いて１０ｍＬのＳＲＷを超音波処理されたＣａＳｔ混合物に導入した。続いてこれを５秒間ボルテックスして、超音波処理されたＣａＳｔを完全に混和した。続いてこの混合物を、１５分の相互作用後に試験して、エンドトキシン低減のパーセントを測定した。
【００８８】
ボルテックス処理：ステアリン酸カルシウム（ＣａＳｔ）＋ＳＲＷのボルテックスされた試料：１０ｍＬのＬＲＷ中の０．０４ｇのＣａＳｔ及び０．０２ｇのＣａＳｔを含む試験管をボルテックスした。続いて１０ｍＬのＳＲＷをボルテックスされたＣａＳｔ混合物に導入した。続いてこれを５秒間ボルテックスして、超音波処理されたＣａＳｔを完全に混和した。続いてこの混合物を、１５分の相互作用後に試験して、エンドトキシン低減のパーセントを測定した。
【００８９】
続いてこれらの混合物を、１５分間の相互作用後に、希釈度１：２０００で、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＭＣＳ上で試験した。
【００９０】
エンドトキシン含有溶液と接触する前に９０分、５日、及び１ヶ月の保存期間又は滞留時間を有する懸濁液の試験。
【００９１】
試験試料を上記の通り調製し、超音波処理し、ボルテックスしたが、エンドトキシン含有溶液（ＳＲＷ）と接触する前に９０分、５日、及び１ヶ月の保存期間又は滞留時間を与えた。滞留時間を経た後、上記の即時混合試験と同様に、続いて１０ｍＬのＳＲＷを超音波処理又はボルテックスされたＣａＳｔ混合物に導入した。続いてこれを５秒間ボルテックスして、超音波処理されたＣａＳｔを完全に混和した。続いてこの混合物を、１５分の相互作用後に試験して、エンドトキシン低減のパーセントを測定した。続いてこれらの混合物を、１５分間の相互作用後に、希釈度１：２０００で、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＭＣＳ上で試験した。
【００９２】
＊保存期間１ヶ月の試料は、０．０４ｇのＣａＳｔでのみ試験し、１５分の相互作用後、及び相互作用から３０分後の除去のパーセントを測定した。
【００９３】
上記の試験の結果を表１５及び１６に示す。
【００９４】
【表１５】
2019508074.tif 000016
【００９５】
【表１６】
2019508074.tif 000017
【００９６】
データは、調製からかなりの貯蔵時間が経過した後でも、ＣａＳｔ懸濁液は効果的であり、効力に実質的な低下がないことを示す。
【００９７】
実施例１１．様々なステアリン酸塩ＣａＳｔ、ＭｇＳｔ、ＡｌＳｔの存在下で様々な撹拌技術を用いた時のＬＰＳ除去の運動学。
【００９８】
表１７、１８、１９は、ＣａＳｔ、ＭｇＳｔ、ＡｌＳｔの存在下で様々な撹拌技術を用いた時のＬＰＳ除去の運動学のデータを示す。
【００９９】
実験手順：各ステアリン酸塩種（ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸アルミニウム、及びステアリン酸マグネシウム）の３つの試料を試験管に量り入れした。５ｍＬのＳＲＷを各管に添加した。各溶液を、超音波処理、ボルテックス、又は試験管軸転に基づく撹拌後のエンドトキシン除去に関して試験した。超音波処理試料を、それぞれの指定された時間間隔で３０秒間、マグニチュード３０で超音波処理した。ボルテックス試料を、それぞれの指定された時間間隔で３０秒間、２５００ＲＰＭでボルテックスした。回転試料は１０ｒｐｍで絶え間なく軸転した。試料を、１分、２０分、４０分、６０分、及び８０分の時点でエンドトキシンに関してＭＣＳ上で試験した。
【０１００】
【表１７】
2019508074.tif 000018
【０１０１】
【表１８】
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【０１０２】
【表１９】
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【０１０３】
ＣａＳｔはＬＰＳの除去において効果的であり、より高い除去パーセンテージをより早く達成することが分かる。驚くべきことに、本発明者らは、ステアリン酸カルシウムが他の塩形態よりもはるかに効果的であることを発見した。超音波処理が最も効果的であり、続いてボルテックス、続いて管軸転であった。
【０１０４】
実施例１２．ステアリン酸塩が存在しない場合の撹拌の効果
ＬＰＳに対する撹拌の効果を評価する対照試験を実施し、その結果を表１６に示す。。試験は、いかなる添加された試薬も存在しない場合でＳＲＷ試料の初期濃度及び撹拌の効果を測定する対照試験であった。５ｍＬのＳＲＷを３つの別個の試験管に添加した。「超音波処理されたＳＲＷ」は、マグニチュード３０で３０秒間超音波処理された（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．のＵｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ  ＮＹ））。「ＳＲＷボルテックス」は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのデジタルボルテックスミキサを用いて２，５００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスされ、「ＳＲＷ軸転」は、試験管ローラ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、１０ｒｐｍで３０秒間軸転された。これらの試験試料からの抽出物を直ちに１：４０００に希釈して、ＭＣＳを用いて試験した。試験試料を希釈して１２０分後に再度試験し、もう１度エンドトキシン濃度を測定した。
【０１０５】
表２０に示す結果は、いかなるステアリン酸塩試薬も存在しない場合、エンドトキシンの検出量に対する撹拌の効果は最小限であることを示す。
【０１０６】
【表２０】
2019508074.tif 000021
【０１０７】
実施例１３．動物試験
体重２５０〜３００ｇで、５日間順化させた３０匹のメスラットを用いて動物試験を実施した。全てのラットは１８ゲージ針を用いて腹腔内注射を投与された。ラットを６つの群に分けた。陰性対照（ＮＣ−１）は、５匹のラットに５ｍＬの生理食塩水を投与した。陰性対照（ＮＣ−２）は、５匹のラットに５ｍＬの生理食塩水中の０．２ｇステアリン酸カルシウムを投与した。陽性対照（ＰＣ−１）は、５匹のラットに５ｍＬの食塩水中の２５０万ＥＵを投与した。第２陽性対照（ＰＣ−２）は、５匹のラットに５ｍＬの生理食塩水溶液中の５００万エンドトキシン単位を投与した。２つの実験群が実施された。５匹のラットからなる試験群（Ｔ−１）に、５ｍＬの生理食塩水中の２５０万ＥＵ及び０．２ｇステアリン酸カルシウムの混合物を投与した。５匹のラットからなる第２の試験群（Ｔ−２）に、５ｍＬの生理食塩水中の５００万ＥＵ及び０．２ｇステアリン酸カルシウムの混合物を投与した。
【０１０８】
４時間後に人道的エンドポイント基準を満たし、その後調査から除外された陽性対照試験体を除いた全ての動物は４日間観察された。表２１に示す結果は、ステアリン酸カルシウム試験群試料（Ｔ−１及びＴ−２）には毒性又は有害作用がなく、これに対し、エンドトキシンのみを投与された陽性対照試料では１００％の重篤な毒性が存在したことを示した。これは、ステアリン酸カルシウムのエンドトキシン中和能力の効力を実証する。陰性対照試料もまた毒性を有さなかった。
【０１０９】
【表２１】
2019508074.tif 000022
【０１１０】
〔実施の態様〕
（１）  １つ又は複数のエンドトキシンを検出可能な濃度で含有する溶液を処理する方法であって、
ａ．ステアリン酸塩の懸濁液を前記溶液に添加して、前記エンドトキシンの検出可能量を低減させることと、
ｂ．任意で前記ステアリン酸塩を除去することと、を含む、方法。
（２）  前記溶液は水性である、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記溶液は水であり、前記ステアリン酸塩は実質的に水溶性ではない、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記ステアリン酸塩は、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸アルミニウムから選択される、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムであり、前記溶液は水又は食塩水である、実施態様１に記載の方法。
【０１１１】
（６）  医療機器を処理するための方法であって、ａ）前記機器を、水又は非水溶媒中ステアリン酸塩の懸濁液と接触させて、前記医療機器上のエンドトキシンの検出可能量を低減させることを含む、方法。
（７）  前記機器は縫合糸である、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記機器は水と接触し、前記ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムである、実施態様１に記載の方法。
（９）  哺乳類の組織表面をステアリン酸塩懸濁液と接触させて、前記哺乳類のエンドトキシンの検出可能量を低減させることを含む、処理方法。
（１０）  前記ステアリン酸塩はステアリン酸カルシウムである、実施態様９に記載の処理方法。
【０１１２】
（１１）  前記ステアリン酸塩懸濁液は抗生物質療法との組み合わせで送達される、実施態様９に記載の処理方法。
（１２）  前記ステアリン酸塩懸濁液は哺乳類の胃腸管内／上に送達される、実施態様９に記載の処理方法。
（１３）  前記ステアリン酸塩懸濁液は、抗生物質の量と少なくとも等しい量で送達される、実施態様１１に記載の方法。
（１４）  前記ステアリン酸塩懸濁液は、水／食塩水キャリア中に懸濁されたステアリン酸カルシウムを含有する、実施態様１３に記載の方法。
（１５）  水／食塩水キャリア中に懸濁されたステアリン酸カルシウムを含有する前記ステアリン酸塩懸濁液は、外科手術までに創傷部位からエンドトキシンを除去する、又は敗血症の重症度及び／若しくは発生を低減させるための洗浄液として用いられる、実施態様９に記載の方法。
【国際調査報告】
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