(57)【要約】5'から3'方向に、(i)インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片と、(ii)5免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片と、(iii)膜貫通10ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片とを含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列CTACCACCCCCTTCCTGTCCAG(SEQ ID NO:29)またはTGACCACGCCAATCGTGTCCAG(SEQ ID NO:14)またはCTACCACGCCAATCGTGTCCAG(SEQ ID NO:31)を有する、核酸が、本明細書において報告される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000045
を有する核酸。
【請求項２】
ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000046
を有する核酸。
【請求項３】
5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000047
を有する、核酸。
【請求項４】
5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000048
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸。
【請求項５】
免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、前記第2の核酸断片が、ポリアデニル化シグナルの5'側に、選択可能なマーカーをコードする核酸をさらに含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
前記関心対象のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
発現カセットに含まれる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
前記第2の核酸断片が、5'スプライス供与部位を1つだけ含み、かつ3'スプライス受容部位を1つだけ含む、請求項3〜7のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
前記第2の核酸断片が、免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインをコードするエクソンの後に存在する天然の免疫グロブリン重鎖イントロンであり、該イントロンにおいて少なくとも50個の連続するヌクレオチドが欠失している、請求項3〜8のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記第1の核酸断片が、免疫グロブリン重鎖をコードし、かつ、ゲノム的に組織化された免疫グロブリン重鎖遺伝子の全てのエクソンと、該免疫グロブリン重鎖遺伝子の1つのイントロンを除く全てのイントロンとを含む、請求項3〜9のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
前記第3の核酸断片が膜貫通ドメインの断片をコードし、該膜貫通ドメインの断片が単一のエクソンによってコードされる、請求項3〜10のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインが、M1-M2-エクソン融合物(ゲノムに介在するイントロンを有さない単一のエクソン)によってコードされる免疫グロブリン膜貫通ドメインである、請求項3〜11のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記第2の核酸断片がSEQ ID NO:11のヌクレオチド配列を含む、請求項3〜12のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１４】
前記第3の核酸断片がSEQ ID NO:12のヌクレオチド配列を含む、請求項3〜13のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
安定にトランスフェクトされた細胞を選択するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸の使用。
【請求項１６】
(a) 真核細胞に、免疫グロブリン軽鎖用の第1の発現カセットと、請求項6〜15のいずれか一項に記載の核酸を含む免疫グロブリン重鎖用の第2の発現カセットとを含む1つまたは複数の核酸をトランスフェクトする工程、
(b) トランスフェクトされた該細胞を、該核酸からのプレmRNAの産生に、該プレmRNAのプロセッシングに、およびプロセッシングされたmRNAから免疫グロブリン重鎖への翻訳に適した条件下で培養する工程であって、トランスフェクトされた該細胞が、該プレmRNAの選択的スプライシングによって可溶性免疫グロブリンおよび原形質膜結合型免疫グロブリンを産生する、工程、ならびに
(c) 免疫グロブリンを発現する細胞であるように、原形質膜結合型免疫グロブリンを有する細胞を選択する工程
を含む、免疫グロブリンを発現する真核細胞を選択するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチド産生の分野にある。本明細書において、選択的にスプライシング可能な核酸を含む核酸と、この核酸を含む細胞と、本明細書で報告される核酸から組換え(異種)ポリペプチドを発現する細胞を単離するための方法と、さらに組換え(異種)ポリペプチドを産生するための方法とを報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換えポリペプチドを産生するための発現システムは、最先端技術分野において周知であり、例えば、Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999)156-160に記載されている。薬学的用途において用いられるポリペプチドおよびタンパク質を産生するために、好ましくは、哺乳動物宿主細胞、例えば、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、PER.C6（登録商標）細胞などが用いられる。このポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、例えば、発現プラスミドなどの核酸に含まれた状態で宿主細胞に導入される。発現プラスミドの必須エレメントは、複製起点と選択マーカーとを含む原核生物プラスミド増殖単位、例えば、大腸菌(Escherichia coli)の原核生物プラスミド増殖単位、真核生物選択マーカー、および関心対象の構造遺伝子を発現するための1つまたは複数の発現カセットであり、それぞれの発現カセットは、プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。哺乳動物細胞における一過的発現のために、哺乳動物複製起点、例えば、SV40 OriまたはEBV由来のOriPが含まれ得る。プロモーターとして、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを選択することができる。最適化された転写のために、コザック配列が5'非翻訳領域に含まれ得る。mRNAプロセッシング、特に、転写終結およびプレmRNAスプライシングのために、構造遺伝子の構成(エクソン-イントロン構成)に応じてmRNAスプライシングシグナルが含まれ得、ポリアデニル化シグナルも含まれ得る。
【０００３】
遺伝子の発現は一過的発現または恒久的発現のいずれかで行われる。関心対象のポリペプチドは、細胞から細胞外培地中へのポリペプチドの輸送/分泌に必要なN末端延長(シグナル配列とも知られる)を含む分泌ポリペプチドでもよいか、またはサイトゾルポリペプチドでもよい。
【０００４】
ポリペプチドを大規模産生するためには、高生産細胞株を樹立しなければならない。宿主細胞株、例えば、CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、BHK細胞、COS細胞、PER.C6（登録商標）細胞、またはHEK細胞のトランスフェクションの後、一般的に、異なる特徴を有する複数のクローンが得られる。これは、例えば、一過的にトランスフェクトされたプラスミドから、または安定して組み込まれたプラスミドから発現したポリペプチドが大きく異なることに起因する。それに加えて、細胞に導入される核酸は、選択目的で、選択可能なマーカー、例えば、それがなければ死につながる物質に抵抗する耐性を付与する遺伝子を有する。
【０００５】
トランスフェクションの後に、かつ適切な選択培地中での増殖によって、高生産クローンを単離しなければならない。これは時間がかかり、その結果として費用がかかる。この問題に対処するために、いくつかの方法が開発されている。
【０００６】
これらの方法の1つが遺伝子増幅である。この方法では、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)が欠損している細胞に、DHFRタンパク質を発現するための第1の発現カセットと、関心対象の異種ポリペプチドを発現するための第2の発現カセットとを含むプラスミド/プラスミドをトランスフェクトする。グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジンを枯渇させた培養培地を用いることによって選択増殖条件が確立する。増幅のために、DHFR阻害剤であるメトトレキセート(MTX)を添加する(Kaufman, R.J., et al., J. Mol. Biol. 159 (1982) 601-621; US4,656,134)。
【０００７】
あるいは、異種ポリペプチドの高生産細胞株が望まれる場合、異種ポリペプチドには、レポーター分子、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはβガラクトシダーゼを融合し、間接的な選択マーカーとして使用することができる。選択は、添加した外因性基質または補因子の存在下で行われる。
【０００８】
高生産クローンを特定するためのさらなる方法は、配列内リボソーム進入部位(IRES)を介した、選択可能なマーカー遺伝子と異種ポリペプチドをコードする構造遺伝子とを連結した転写である。この設計では、異種ポリペプチドの発現と選択可能なマーカーの発現を互いに関係づけることができる。
【０００９】
ヒト免疫グロブリンは、特化したリンパ球であるB細胞によって産生される。これらの細胞は免疫グロブリン(sIg)を分泌するだけでなく、免疫グロブリンを原形質膜結合型免疫グロブリン(mIg)として外側の細胞膜上で提示もする。これらのmIgは免疫応答の始まりにおいて重要な役割を果たしている。提示された原形質膜結合型免疫グロブリンは、対応する抗原の細胞受容体になるという機能を有する。
【００１０】
1980年の初めに、分泌型免疫グロブリンと原形質膜結合型免疫グロブリンの起源を扱う論文が発表された。Earlyら(Early, P., 10 et al., Cell 20 (1980) 313-319)は、マウスでは、免疫グロブリン重鎖をコードする2つのmRNA種が単一の免疫グロブリンμ遺伝子の同じ一次転写物に由来すると報告した。分泌型(sIg)と原形質膜結合型(mIg)の形成は重鎖プレmRNAの選択的スプライシングに起因する。sIgアイソフォームについては、免疫グロブリンのドメインをコードする全エクソンと、C末端ドメインをコードするエクソンに続くイントロンがmRNAに保持され、このイントロン中の停止コドンの下流にポリアデニル化シグナルがあり、一次転写物の切断およびポリアデニル化に用いられる。mIgアイソフォームについては、分泌型のC末端ドメインをコードするエクソン(すなわち、それぞれCH3またはCH4)の後ろにある選択的5'スプライス供与部位が定常領域と、膜貫通ドメインをコードする下流エクソンM1およびM2とを連結している。この場合、分泌型の末端アミノ酸および停止コドンをコードする配列と、sIg型の隣接するイントロンポリアデニル化シグナルがスプライシングプロセスによってイントロンと一緒に除去される。
【００１１】
例えば、分泌型免疫グロブリン重鎖をコードするmRNAと原形質膜結合型免疫グロブリン重鎖をコードするmRNAの比は10:1〜100:1である。この比は、主に、プレmRNAスプライシングの間に確立される。翻訳制御機構および翻訳後制御機構は軽微な部分にしか寄与しない(例えば、Xiang, S. D., et al., Immun. Cell Biol. 79 (2001) 472-481を参照されたい)。
【００１２】
細胞の原形質膜に結合している免疫グロブリンは、その分泌型類似体と同じアミノ酸配列と二次構造を有する。違いは、膜貫通ドメインを含む、sIg重鎖のC末端延長である。この膜貫通ドメインの長さは、普通、約40〜約75アミノ酸残基である。マウス免疫グロブリンおよびヒト免疫グロブリンの場合、さらに膜貫通ドメインは、3つの異なる構造領域:13〜67アミノ酸残基のN末端細胞外領域と、25アミノ酸残基の中央の保存された膜貫通ストレッチと、3〜28アミノ酸残基のC末端細胞質領域に分けることができる(Major, J.G., et al., Mol. Immunol. 33 (1996) 5 179-187)。
【００１３】
転写および翻訳の連係を最適化するやり方で、増幅可能で選択可能な遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、および望ましい産物をコードする遺伝子を含む発現プラスミドがWO01/04306に報告されている。WO01/38557では、関心対象の少なくとも2種類のペプチドまたはタンパク質を発現する細胞を特定するために、複数の形質転換/トランスフェクトされた細胞をスクリーニングする方法が報告されている。これらの2種類のペプチド/タンパク質はIRES(配列内リボソーム進入部位)を介して蛍光マーカー遺伝子に連結されている。
【００１４】
イメージングマーカートランスジーンを含むトランスジェニックの動物および細胞がUS2003/0033616で報告されている。US2005/0032127は、蛍光顕微鏡検出方法によって特定の産生能力を基準にして穏やかな条件下で細胞の混合物または細胞培養物から1個の生細胞を非侵襲的に選択するための方法を報告している。分泌タンパク質を産生する細胞を特定および単離するための方法がUS2002/0168702で報告されている。
【００１５】
ハムスタープロモーター、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、増幅可能な選択マーカー遺伝子と機能的に連結された関心対象のタンパク質をコードする遺伝子からなる発現プラスミドがUS2004/0148647において報告されている。
【００１６】
3'スプライス部位のコンセンサス配列がZhang, M., Hum. Mol. Genet. 7 (1998) 919-932によって報告された。
【００１７】
WO01/92291では、抗体およびT細胞受容体ライブラリーが報告されている。選択的スプライシングを用いて真核細胞においてポリペプチド多量体を発現するための方法および構築物がWO2005/089285において報告されている。WO2005/040213では、第VIII因子およびその誘導体の高発現レベルを得るための改良されたcDNAが報告されている。ヒト抗トロンビンIIIミニ遺伝子のインビボ転写が、Prochownik, E.V. and Orkin, S.H.(J. Biol. Chem. 259 (1984) 15386-15392)によって報告されている。Nussaume, L.らは、トウモロコシエレメントアクチベーターから得られた転移遺伝子トラップ(transposable gene trap)におけるスプライス供与部位とスプライス受容部位の機能の分析を報告している(Mol. Gen. Genet. 249 (1995) 91-101)。ヒト遺伝子の発現配列における選択的スプライシングのゲノムワイド検出が、Modrek, B., et al. (Nucleic Acids Res. 29 (2001) 2850-2859)によって報告されている。Danner, D.およびLeder, P.は、膜結合型および分泌型のIgM mRNAの産生におけるRNA切断/ポリ(A)付加部位の役割を報告している(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 8658-8662)。組換え免疫グロブリン融合タンパク質を用いた特定のタンパク質ドメインからのモノクローナル抗体の効率的な作製-ピットフォール(pitfall)および溶液(solution)が、Harris, C.L., et al.(J. Immunol. Meth. 268 (2002) 245-258)によって報告されている。Zhu, Y.らは、ディファレンシャルスプライシングおよび翻訳制御に基づく多重遺伝子レンチウイルスプラスミドを報告している(Mol. Ther. 4 (2001) 375-382)。
【００１８】
Fallot, S.らは、比率が制御されたタンパク質発現と組換え抗体産生への適用のための、選択的スプライシングに基づくバイシストロニックベクターを開示した(Nucl. Acids Res. 37 (2009) e134-e134)。Wang, Z.らは、スプライシング調節に関して、調節エレメントのパーツリストから、組み込まれるスプライシングコードまでを開示した(RNA 14 (2008) 802-813)。Cartegni, L.は、エクソンスプライシングエンハンサーを特定するためのウエブリソースであるESEfinderについて報告した(Nucl. Acids. Res. 31 (2003) 3568-3571)。WO2013/092720は、二重特異性抗体を発現する細胞を選択する方法であって、(a)レンチウイルス粒子集団を用いた形質導入によって真核細胞集団を作製し、それによって、細胞集団の各細胞が、レンチウイルス核酸によってコードされ、かつ2種類もしくはそれ以上の抗原にまたは同じ抗原上の2種類もしくはそれ以上のエピトープに特異的に結合する膜結合型完全長抗体を示す、工程、および(b)真核細胞集団から、示された膜結合型完全長抗体の特性に応じて細胞を選択する工程を含み、レンチウイルス粒子集団の各レンチウイルス粒子が、膜結合型抗体を発現するためのEV71-IRESを含むバイシストロニックな発現カセットを含む、方法を開示している。
【００１９】
WO2007/131774では、5'から3'方向に、インフレーム翻訳停止コドンを有さない、異種ポリペプチドをコードする第1の核酸と、5'スプライス供与部位から始まり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む3'スプライス受容部位で終わる第2の核酸と、膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片、またはGPIアンカーに対するシグナルペプチドをコードする第3の核酸とを含む、核酸が報告されている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、少なくとも部分的には、選択的スプライス受容部位(3'-スプライス部位領域)の特定の改変を用いると、選択的スプライシングされる核酸におけるスプライシング比を調節できるという発見に基づいている。使用する細胞株に対して、例えば、マーカーの発現、すなわち、C末端に膜貫通ドメインを含む関心対象のポリペプチド(すなわち、長い構築物)の発現を取り入れるようにこれらの改変を行うことができる。
【００２１】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000002
を有する核酸である。
【００２２】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000003
を有する核酸である。
【００２３】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000004
を有する、核酸である。
【００２４】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000005
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸である。
【００２５】
1つの態様において、関心対象のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖である。
【００２６】
1つの態様において、前記核酸は発現カセットに含まれる。
【００２７】
1つの態様において、第2の核酸断片は、5'スプライス供与部位を1つだけ含み、かつ3'スプライス受容部位を1つだけ含む。
【００２８】
1つの態様において、第2の核酸断片は、免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインをコードするエクソンの後に存在する天然の免疫グロブリン重鎖イントロンであり、該イントロンにおいて少なくとも50個の連続するヌクレオチドが欠失している。
【００２９】
1つの態様において、第1の核酸断片は、免疫グロブリン重鎖をコードし、かつ、ゲノム的に組織化された免疫グロブリン重鎖遺伝子の全てのエクソンと、該免疫グロブリン重鎖遺伝子の1つのイントロンを除く全てのイントロンとを含む。
【００３０】
1つの態様において、第3の核酸断片は膜貫通ドメインの断片をコードし、膜貫通ドメインの断片は単一のエクソンによってコードされる。
【００３１】
1つの態様において、膜貫通ドメインは、M1-M2-エクソン融合物(ゲノムに介在するイントロンを有さない単一のエクソン)によってコードされる免疫グロブリン膜貫通ドメインである。
【００３２】
1つの態様において、第2の核酸断片はSEQ ID NO:11のヌクレオチド配列を有する。
【００３３】
1つの態様において、第3の核酸断片はSEQ ID NO:12のヌクレオチド配列を有する。
【００３４】
本明細書において報告される一局面は、安定にトランスフェクトされた細胞を選択するための、本明細書において報告される核酸の使用である。
【００３５】
本明細書において報告される一局面は、
(a) 真核細胞に、免疫グロブリン軽鎖用の第1の発現カセットと、本明細書において報告される核酸を含む免疫グロブリン重鎖用の第2の発現カセットとを含む1つまたは複数の核酸をトランスフェクトする工程、
(b)トランスフェクトされた該細胞を、該核酸からのプレmRNAの産生に、該プレmRNAのプロセッシングに、およびプロセッシングされたmRNAから免疫グロブリン重鎖への翻訳に適した条件下で培養する工程であって、トランスフェクトされた該細胞が、該プレmRNAの選択的スプライシングによって可溶性免疫グロブリンおよび原形質膜結合型免疫グロブリンを産生する、工程、ならびに
(c) 免疫グロブリンを発現する細胞であるように、原形質膜結合型免疫グロブリンを有する細胞を選択する工程
を含む、免疫グロブリンを発現する真核細胞を選択するため方法である。
【００３６】
本明細書において報告される一局面は、SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:15のヌクレオチド配列を有する核酸を含む細胞である。
【００３７】
1つの態様において、前記細胞は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、免疫グロブリン重鎖をコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000006
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸を含む。
【００３８】
本明細書において報告される一局面は、以下の工程:
- SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:15のヌクレオチド配列を有する核酸を含む細胞を培養する工程、
- 細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収する工程、
- 任意で、免疫グロブリンを1つまたは複数のクロマトグラフィー工程を用いて精製する工程
を含み、それによって免疫グロブリンを産生する、免疫グロブリンを産生するための方法である。
【００３９】
1つの態様において、前記細胞は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、免疫グロブリン重鎖をコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000007
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸を含む。
【００４０】
全局面の1つの態様において、前記細胞はCHO細胞である。
【００４１】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000008
を有するスプライス受容部位核酸である。
【００４２】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000009
を有する核酸である。
【００４３】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000010
を有する、核酸である。
【００４４】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000011
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸である。
【００４５】
1つの態様において、関心対象のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖である。
【００４６】
1つの態様において、前記核酸は発現カセットに含まれる。
【００４７】
1つの態様において、第2の核酸断片は、5'スプライス供与部位を1つだけ含み、かつ3'スプライス受容部位を1つだけ含む。
【００４８】
1つの態様において、第2の核酸断片は、免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインをコードするエクソンの後に存在する天然の免疫グロブリン重鎖イントロンであり、該イントロンにおいて少なくとも50個の連続するヌクレオチドが欠失している。
【００４９】
1つの態様において、第1の核酸断片は、免疫グロブリン重鎖をコードし、かつ、ゲノム的に組織化された免疫グロブリン重鎖遺伝子の全てのエクソンと、該免疫グロブリン重鎖遺伝子の1つのイントロンを除く全てのイントロンとを含む。
【００５０】
1つの態様において、第3の核酸断片は膜貫通ドメインの断片をコードし、膜貫通ドメインの断片は単一のエクソンによってコードされる。
【００５１】
1つの態様において、膜貫通ドメインは、M1-M2-エクソン融合物(ゲノムに介在するイントロンを有さない単一のエクソン)によってコードされる免疫グロブリン膜貫通ドメインである。
【００５２】
本明細書において報告される一局面は、安定にトランスフェクトされた細胞を選択するための、本明細書において報告される核酸の使用である。
【００５３】
本明細書において報告される一局面は、
(a) 真核細胞に、免疫グロブリン軽鎖用の第1の発現カセットと、本明細書において報告される核酸を含む免疫グロブリン重鎖用の第2の発現カセットとを含む1つまたは複数の核酸をトランスフェクトする工程、
(b) トランスフェクトされた該細胞を、該核酸からのプレmRNAの産生に、該プレmRNAのプロセッシングに、およびプロセッシングされたmRNAから免疫グロブリン重鎖への翻訳に適した条件下で培養する工程であって、トランスフェクトされた該細胞が、該プレmRNAの選択的スプライシングによって可溶性免疫グロブリンおよび原形質膜結合型免疫グロブリンを産生する、工程、ならびに
(c) 免疫グロブリンを発現する細胞であるように、原形質膜結合型免疫グロブリンを有する細胞を選択する工程
を含む、免疫グロブリンを発現する真核細胞を選択するための方法である。
【００５４】
本明細書において報告される一局面は、SEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30のヌクレオチド配列を有する核酸を含む細胞である。
【００５５】
1つの態様において、前記細胞は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、免疫グロブリン重鎖をコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000012
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸を含む。
【００５６】
本明細書において報告される一局面は、以下の工程:、
- SEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30のヌクレオチド配列を有する核酸を含む細胞を培養する工程、
- 細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収する工程、
- 任意で、免疫グロブリンを1つまたは複数のクロマトグラフィー工程を用いて精製する工程
を含み、それによって免疫グロブリンを産生する、免疫グロブリンを産生するための方法である。
【００５７】
1つの態様において、前記細胞は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、免疫グロブリン重鎖をコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000013
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸を含む。
【００５８】
全局面の1つの態様において、前記細胞はCHO細胞である。
【００５９】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000014
を有する核酸である。
【００６０】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000015
を有する核酸である。
【００６１】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000016
を有する、核酸である。
【００６２】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000017
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸である。
【００６３】
1つの態様において、関心対象のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖である。
【００６４】
1つの態様において、前記核酸は発現カセットに含まれる。
【００６５】
1つの態様において、第2の核酸断片は、5'スプライス供与部位を1つだけ含み、かつ3'スプライス受容部位を1つだけ含む。
【００６６】
1つの態様において、第2の核酸断片は、免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインをコードするエクソンの後に存在する天然の免疫グロブリン重鎖イントロンであり、該イントロンにおいて少なくとも50個の連続するヌクレオチドが欠失している。
【００６７】
1つの態様において、第1の核酸断片は、免疫グロブリン重鎖をコードし、かつ、ゲノム的に組織化された免疫グロブリン重鎖遺伝子の全てのエクソンと、該免疫グロブリン重鎖遺伝子の1つのイントロンを除く全てのイントロンとを含む。
【００６８】
1つの態様において、第3の核酸断片は膜貫通ドメインの断片をコードし、膜貫通ドメインの断片は単一のエクソンによってコードされる。
【００６９】
1つの態様において、膜貫通ドメインは、M1-M2-エクソン融合物(ゲノムに介在するイントロンを有さない単一のエクソン)によってコードされる免疫グロブリン膜貫通ドメインである。
【００７０】
本明細書において報告される一局面は、安定にトランスフェクトされた細胞を選択するための、本明細書において報告される核酸の使用である。
【００７１】
本明細書において報告される一局面は、
(a) 真核細胞に、免疫グロブリン軽鎖用の第1の発現カセットと、本明細書において報告される核酸を含む免疫グロブリン重鎖用の第2の発現カセットとを含む1つまたは複数の核酸をトランスフェクトする工程、
(b) トランスフェクトされた該細胞を、該核酸からのプレmRNAの産生に、該プレmRNAのプロセッシングに、およびプロセッシングされたmRNAから免疫グロブリン重鎖への翻訳に適した条件下で培養する工程であって、トランスフェクトされた該細胞が、該プレmRNAの選択的スプライシングによって可溶性免疫グロブリンおよび原形質膜結合型免疫グロブリンを産生する、工程、ならびに
(c) 免疫グロブリンを発現する細胞であるように、原形質膜結合型免疫グロブリンを有する細胞を選択する工程
を含む、免疫グロブリンを発現する真核細胞を選択するための方法である。
【００７２】
本明細書において報告される一局面は、SEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:32のヌクレオチド配列を有する核酸を含む細胞である。
【００７３】
1つの態様において、前記細胞は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、免疫グロブリン重鎖をコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000018
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸を含む。
【００７４】
本明細書において報告される一局面は、以下の工程:
- SEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:32のヌクレオチド配列を有する核酸を含む細胞を培養する工程、
- 細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収する工程、
- 任意で、免疫グロブリンを1つまたは複数のクロマトグラフィー工程を用いて精製する工程
を含み、それによって免疫グロブリンを産生する、免疫グロブリンを産生するための方法である。
【００７５】
1つの態様において、前記細胞は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、免疫グロブリン重鎖をコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000019
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸を含む。
【００７６】
全局面の1つの態様において、前記細胞はCHO細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】改変されたイントロン6領域構築物の概要。この図は、プラスミドpmIgGΔ-B(1)および改変された構築物(2〜7)に由来するエクソンCH3とM1-M2との間の重鎖のゲノム構成を模式的に示す。点変異の位置を黒色の雷記号で示した。CH3の後ろにあるポリアデニル化(p(A))部位を黒色の塗りつぶした丸で図示し、SV40に由来する付加されたp(A)部位を縞模様の丸で図示し、BGHに由来する付加されたp(A)部位を灰色の塗りつぶした丸で図示した。図示したエレメントのサイズおよび位置は一定の尺度に従わずに描かれている。BP: 分岐点;p(Y):ポリピリミジントラクト;ESE: エクソンスプライスエンハンサー。
【図２】ノーザンブロットによるmRNAの分析。A: [α-32P]標識プローブ1(レーン1〜8)またはプローブ2(レーン9〜16)とハイブリダイズしたノーザンブロットのオートラジオグラフィー。各レーンにおいて、安定にトランスフェクトされたプール(レーン1〜7および9〜15)またはトランスフェクトされていないCHO-K1細胞(レーン8および16)から単離した全RNA 10μgを変性アガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロンメンブレンに転写した。B: mIgGまたはsIgGの重鎖をコードする2種類のmRNAアイソフォームの模式図。エクソンをボックスで表した。プローブ1およびプローブ2に相補的な領域を黒色のバーで示した。
【図３】pmIgG-HC-Neoのプラスミド地図。
【図４】pmIgG-HC-Hygのプラスミド地図。
【図５】pmIgG-HC-Puroのプラスミド地図。
【図６】pmIgG-Puro-mut-p(Y)のプラスミド地図。
【図７】pIgG-Puroのプラスミド地図。
【図８】pIgG-Neoのプラスミド地図。
【図９】安定にトランスフェクトされた細胞プールのバッチアッセイ分析。プールを総体積30mlで1ml当たり4*105個の細胞で播種し、振盪フラスコに入れてピューロマイシンなしのHyQ SFM4CHO utility medium中で37℃および5％CO2で培養した。試料を開始時に、ならびに2日後、3日後、4日後、および7日後に採取した。A: 生細胞密度をCASY細胞カウンターで測定した。B: 細胞培養上清中のIgG濃度をELISAによって求めた。
【図１０】mIgG-ピューロマイシン選択システムおよび標準アプローチの概要。A: 実施例6に記載のようにクローン1D5にプラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトし、mIgG-ピューロマイシン選択プロセスを行うワークフローの模式図。B: 実施例6に詳述したように標準アプローチのワークフローを示した。
【図１１Ａ】流加アッセイ。実施例7に記載のようにクローンを播種および培養した。17日目に培養を終わらせ、細胞培養上清中のIgG濃度をプロテインA HPLC分析によって求めた。mIgG-ピューロマイシン選択システムを用いて作製した39個のクローンを用いた第1の流加アッセイ。さらに評価するために、星印を付けたクローンを選択した。
【図１１Ｂ】流加アッセイ。実施例7に記載のようにクローンを播種および培養した。17日目に培養を終わらせ、細胞培養上清中のIgG濃度をプロテインA HPLC分析によって求めた。7個の選択された、mIgG-ピューロマイシンで作製したクローン(I、左部分)、および標準的な選択アプローチからの上位7個のクローン(II、中央)を用いた流加アッセイ。アッセイI、II、および2回の再試験における親細胞株1D5の結果を灰色で示した。右にある破線のカラムは4回の1D5試験の平均力価を表す。標準偏差をエラーバーで表した。
【図１２】pmIgGΔ-Bのプラスミド地図。
【図１３】重鎖定常領域のゲノム構成の地図。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
発明の詳細な説明
本発明を実施するのに有用な方法および技法は、例えば、Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture -a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)に記載されている。
【００７９】
組換えDNA技術を用いると核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、1つ1つのヌクレオチド位置またはいくつかのヌクレオチド位置での置換、変化、交換、欠失、または挿入によって改変することができる。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって行うことができる。このような改変は当業者によって容易に行うことができる(例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Englandを参照されたい)。
【００８０】
定義
本明細書において使用される「核酸」とは、ポリヌクレオチド分子、例えばDNAを指す。このポリヌクレオチド分子は天然ポリヌクレオチド分子でもよく、合成ポリヌクレオチド分子でもよく、1つまたは複数の天然のポリヌクレオチド分子またはその断片と1つまたは複数の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせでもよい。この定義には、1つまたは複数のヌクレオチドが変えられている、例えば、変異誘発によって変えられているか、欠失しているか、または付加されている天然ポリヌクレオチド分子も含まれる。核酸は単離されていてもよく、別の核酸に、例えば、発現プラスミドまたは真核生物宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。核酸は、そのヌクレオチド配列によっても特徴付けられる。対応するコード核酸からアミノ酸配列を推定することは当技術分野において公知であり、コードされるアミノ酸配列から、対応する核酸を導き出すことも当技術分野において公知である。従って、アミノ酸配列は、その核酸によっても特徴付けられる。核酸も、対応するアミノ酸配列によって示される。
【００８１】
本出願内で使用される「プラスミド」という用語は、シャトルプラスミドおよび発現プラスミドならびにトランスフェクションプラスミドを含む。典型的に、プラスミドはまた、原核細胞においてプラスミドが複製するために複製起点(例えば、ColE1およびoriP複製起点)と、原核細胞においてプラスミドが選択されるために選択可能なマーカー(例えば、アンピシリン、ピューロマイシン、ネオマイシン、またはテトラサイクリン耐性遺伝子)とを含む。
【００８２】
「発現カセット」とは、少なくとも、細胞中に含まれる構造遺伝子を発現するために必要な調節エレメントを含む構築物を指す。任意で、発現されたポリペプチドまたはタンパク質の分泌を可能にする付加エレメントが含まれてもよい。一般的に、発現カセットはプロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化部位を含む。
【００８３】
「遺伝子」とは、ポリペプチドまたはタンパク質の発現のために必要なセグメント、例えば、染色体上またはプラスミド上のセグメントを指す。コード領域のそばに、遺伝子は、プロモーター、1つまたは複数のイントロンおよび/またはエクソン、ならびに1つまたは複数のターミネーターを含む他の機能的エレメントを含む。
【００８４】
「構造遺伝子」という用語は、遺伝子のコード領域、すなわち、シグナル配列を有さないが介在イントロンを有するエクソンを指す。
【００８５】
「選択可能なマーカー」とは、対応する選択剤の存在下または非存在下での、その遺伝子を保有する細胞の特異的な選択または非選択を可能にする遺伝子を指す。有用な正の選択可能なマーカーは抗生物質耐性遺伝子である。この選択可能なマーカーを用いると、その遺伝子で形質転換された細胞を、対応する抗生物質の存在下で正選択することができる。形質転換されていない細胞は、選択培地中での選択的培養条件下で、すなわち、選択剤の存在下で増殖または生存することができないと考えられる。選択可能なマーカーは、正、負、または二機能性でもよい。正の選択可能なマーカーはマーカーを保有する細胞を選択することができるのに対して、負の選択可能なマーカーはマーカーを保有する細胞を選択的に排除することができる。典型的には、選択可能なマーカーは薬物耐性を付与するか、宿主細胞の代謝欠損または異化欠損を補う。真核細胞の場合に有用な選択可能なマーカーには、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hyg)、ネオマイシンおよびG418 APH、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(tk)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(選択剤インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(選択剤ヒスチジノールD)の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ネオマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン(Zeocin)、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。さらなる選択可能なマーカー遺伝子はWO92/08796およびWO94/28143に記載されている。
【００８６】
「調節エレメント」という用語は、シスまたは/およびトランスに存在する、関心対象の構造遺伝子の転写および/または翻訳に必要なヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは、通常、プロモーター、転写開始部位および転写終結部位、ならびにポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」という用語は、一次転写産物、すなわち、プレmRNA中に組み込まれる第1の核酸に対応するヌクレオチドを指す。転写開始部位はプロモーター配列と重複してもよい。「転写終結部位」という用語は、転写される関心対象の構造遺伝子の3'末端に通常存在し、RNAポリメラーゼに転写を終結させるヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化シグナル配列またはポリA付加シグナル(p(A))は、核中において、真核生物mRNAの3'末端の特定の部位を切断し、かつ、切断された3'末端に約100〜200個のアデニンヌクレオチドの配列(ポリAテール)を転写後付加するための、シグナルを提供する。ポリアデニル化シグナル配列は、切断部位から約10〜30ヌクレオチド上流に位置するコンセンサス配列AATAAAを含んでよい。翻訳調節エレメントは翻訳開始コドン(AUG)および停止コドン(TAA、TAG、またはTGA)を含む。
【００８７】
「プロモーター」とは、機能的に連結されている遺伝子または核酸配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択された/機能的に連結された配列の発現が考えられている細胞の細胞型において機能する。様々な異なる供給源に由来する構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当技術分野において周知であり(かつ、GenBankのようなデータベースにおいて特定され)、(例えば、ATCCのような寄託機関ならびに他の商業的供給元または個人の供給元から得た)クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である。「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の5'非コード領域または非翻訳領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE; McGehee, R.E. Jr., et al., Mol. Endocrinol. 7(1993)551-60)、環状AMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE;Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1(1990)47-58)、糖質コルチコイド応答エレメント(GRE)、ならびにCRE/ATF(O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267(1992)19938-43)、AP2(Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269(1994)25728-34)、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3(1993)253-64)、およびオクタマー因子などの他の転写因子に対する結合部位が含まれる(大まかには、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987)、およびLemaigre, F.P. and Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14を参照されたい)。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導剤に応じて上昇する。それに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導剤によって調節されない。抑制性プロモーターもまた公知である。例えば、c-fosプロモーターは、成長ホルモンが細胞表面の受容体に結合すると特異的に活性化される。テトラサイクリン(Tet)によって調節される発現は、例えば、CMVプロモーターとそれに続く2つのTetオペレーター部位からなる人工のハイブリッドプロモーターによって実現することができる。Tetリプレッサーは2つのTetオペレーター部位に結合し、転写を阻止する。誘導物質テトラサイクリンを添加すると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から遊離され、転写が進行する(Gossen, M. and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547-5551)。メタロチオネインプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含む他の誘導性プロモーターについては、例えば、Sambrook et al.(前記)およびGossen et al., Curr. Opin. Biotech. 5(1994)516-520を参照されたい。高レベルの発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターとしては、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1α(CHEF-1、例えば、米国特許第5,888,809号を参照されたい)、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター(CMV IE)が挙げられる。
【００８８】
前記プロモーターは、上記で概説したように構成的でもよく誘導性でよい。エンハンサー(すなわち、プロモーターに作用して転写を増大させるシス作動性DNAエレメント)が、プロモーター単独の場合に得られる発現レベルを増大させるためにプロモーターと連携して機能する必要がある場合があり、転写調節エレメントとして含まれる場合がある。多くの場合、プロモーターを含むポリヌクレオチドセグメントはエンハンサー配列(例えば、CMVまたはSV40)も含む。
【００８９】
「機能的に連結される」とは、2つまたはそれ以上の構成要素の並置を指し、そのように記述された構成要素は、意図された様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーはシスに作動して、連結されたコード配列の転写を制御または調節する場合にはコード配列に機能的に連結されている。必ずしもそうではないが、一般的に、「機能的に連結され」ているDNA配列は連続しており、分泌リーダーおよびポリペプチド、またはポリペプチドおよび膜貫通ドメイン、またはポリペプチドおよびGPIアンカーに対するシグナルペプチド、またはポリペプチドおよび翻訳停止コドンなど、2つのタンパク質コード領域を連結することが必要である場合、連続的かつリーディングフレーム中に存在する。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは普通、コード配列の上流に位置しているが、必ずコード配列と連続しているとは限らない。エンハンサーは連続的である必要はない。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合には、エンハンサーはコード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーはコード配列の上流、内部、または下流に、かつプロモーターからかなり離れて配置されてもよい。転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列へと進行するようにポリアデニル化部位がコード配列の下流末端に配置されていれば、ポリアデニル化部位はコード配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR方法論を用いて、および/または便利な制限部位でのライゲーションによって遂行される。便利な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来のやり方に従って使用される。
【００９０】
本明細書において使用される「プレmRNAの産生」という用語は、DNAをその相補的なプレmRNAに転写するプロセスを指す。真核生物DNAは、エクソン(コード)およびイントロン(非コード)と呼ばれる、コード領域および非コード領域から構成されている。DNAをその相補的なプレmRNAに転写するプロセスにおいてエクソンおよびイントロンのゲノム構成は維持される。
【００９１】
本明細書において使用される「プレmRNAのプロセッシング」という用語は、転写後の改変プロセスを指す。この段階において、プレmRNAのイントロンはスプライスアウトされ、すなわちプレmRNAから除去され、プロセッシングされたmRNAの5'末端はキャップされ、かつ3'ポリアデニル化が実施される。最終的な核mRNA、すなわち成熟mRNAが、この段階において得られる。
【００９２】
本出願内で使用される「膜貫通ドメイン」という用語は、DNAレベルで少なくとも1つのエクソンによってコードされ、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。膜貫通ドメインは、一般的に、3つの異なる構造領域:細胞外領域、中央の保存された膜貫通ストレッチ、および細胞質領域を含む。細胞外ドメインは膜貫通ドメインのN末端に存在してもまたはC末端に存在してもよく、同様に、細胞質領域はそれぞれの他方の末端に存在する。1つの態様において、膜貫通ドメインは、N末端からC末端方向に細胞外領域および膜貫通領域を含む。膜貫通ドメインは細胞内領域または細胞質領域をさらに含んでもよい。
【００９３】
本出願内で使用される「膜貫通ドメインの断片」という用語は、細胞膜にまたがる、すなわち、細胞膜の内部にある膜貫通ドメインの一部、すなわち、膜貫通ストレッチを指す。この膜貫通ドメインの断片は細胞膜への組み込みに関して機能する。従って、本明細書において使用される「膜貫通ドメインの断片」は、細胞膜への組み込み機能を発揮することができる限り、任意の起源の膜貫通ドメイン、例えば、完全長野生型ドメインを、その変種または切断型または延長型を含めて指す。従って、1つの態様において、膜貫通ドメインの断片は、細胞膜と一体化するアミノ酸配列である。1つの態様において、膜貫通ドメインの断片は、野生型膜貫通ドメインの切断および/または変異が起きた変種である。1つの態様において、変種は細胞膜と一体化することができる。1つの態様において、野生型膜貫通ドメインは野生型免疫グロブリン膜貫通ドメインである。
【００９４】
「選択的にスプライシング可能な核酸」という用語は、5'スプライス供与部位から始まり、3'スプライス受容部位で終わる核酸を指す。この核酸は翻訳停止コドンとポリアデニル化シグナルを含む。この選択的にスプライシング可能な核酸は、例えば、免疫グロブリン重鎖CH3ドメインまたはCH4ドメインをコードするエクソンの後にあるイントロンのような、対応するプレmRNAから構成的にスプライスアウトされない非コード領域を含む。選択的にスプライシング可能な核酸の5'スプライス供与部位で起こる「選択的スプライシング事象」は、選択的にスプライシング可能な核酸がプレmRNAからスプライスアウトされるか、またはそれが少なくとも部分的に維持され、成熟した(プロセッシングされた)mRNAに含まれるかどうかを決定する事象である。
【００９５】
本明細書において使用される「選択的スプライシング」という用語およびその文法的同義語は、1つまたは複数のイントロンの異なるプロセッシング/スプライシングによって1本のプレmRNAから異なる成熟mRNAを得ることができ、従って、ポリペプチドの異なるアイソフォームを発現することができる、真核細胞におけるプロセスを指す。本発明の1つの態様において、産生されたプレmRNAのイントロンが1つだけ選択的にスプライシングされる場合がある、すなわち、イントロンが1つしか選択的にスプライシングされない場合がある。別の態様において、第2の核酸が選択的にスプライシングされる場合がある。さらなる態様において、第2の核酸は、選択的にスプライシング可能なイントロンを含む。異なるプロセッシングは「イエス/ノー」決定である。すなわち、選択的スプライシングプロセスにおいて、プロセッシングされるイントロン、すなわち「選択的にスプライシング可能な核酸」は少なくとも部分的に保持されるか、またはスプライスアウトされるかのいずれかである。これは、後に続く異なるエクソンをもたらす分岐点機構として理解される必要はない。実際には、これは、選択的にスプライシング可能な核酸がスプライスアウトされるか、または成熟mRNAにおいて少なくとも部分的に維持される機構である。この機構により、選択的にスプライシング可能な核酸、従って、その中に含まれるインフレーム翻訳停止コドンが保持または除去される。
【００９６】
選択的スプライシングは、真核細胞における重要な調節機構である。選択的スプライシングにより、同じプレmRNAから、成熟mRNA中にエクソンの様々な組み合わせを得ることができ、そのため、同じDNAによってコードされる複数の異なるタンパク質を生じることができる。
【００９７】
本明細書において使用される「発現」という用語は、細胞内で起こる転写プロセスおよび/または翻訳プロセスを指す。細胞における所望の産生物の転写レベルは、細胞中に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、選択された配列から転写されたmRNAはPCRによって、またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照されたい)。ポリペプチドは、様々な方法、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物活性を分析することによって、またはウェスタンブロット法、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、NMR、もしくはラジオイムノアッセイ法など、このような活性に依存しないアッセイ法を使用することによって、例えば、ポリペプチドを認識および結合する抗体を用いることによって定量することができる(Sambrook et al., 1989、前記を参照されたい)。
【００９８】
「細胞」という用語は、プラスミドの増殖のために使用される原核細胞と、異種核酸の発現のために使用される真核細胞の両方を含む。1つの態様において、細胞は真核細胞である。1つの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。好ましい1つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、およびPER.C6(登録商標)細胞からなる群より選択される。
【００９９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸からなるポリマーであり、天然に産生されるか、または合成的に産生されるかを問わない。約20個未満のアミノ酸残基からなるポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれることがあるのに対し、100個より多いアミノ酸残基からなるか、または2つもしくはそれ以上のポリペプチド鎖からなるポリペプチドは「タンパク質」と呼ばれることがある。
【０１００】
ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、脂質、カルボン酸エステル、またはそれらの組み合わせなどの非ペプチド性構成要素も含んでよい。ポリペプチドまたはタンパク質が産生される細胞によって非ペプチド性置換基が付加されることがあり、これらは細胞のタイプによって異なることがある。ポリペプチドは、そのアミノ酸配列の点から本明細書において定義される。炭水化物基のような付加は普通、指定されないが、それでもなお存在してよい。
【０１０１】
「異種DNA」または「異種核酸」とは、人間によって細胞に導入された、すなわち、人工的に細胞に導入された、DNA分子もしくは核酸またはDNA分子集団もしくは核酸集団を指す。特定の細胞に対して異種のDNA分子は、そのDNAが非細胞DNA(すなわち、外因性DNA)と組み合わされている限りにおいて、その細胞種に由来するDNA(すなわち内因性DNA)を含んでもよい。例えば、プロモーターを含む細胞DNAセグメントに機能的に連結された、あるポリペプチドをコードする非細胞DNAセグメントを含むDNA分子は異種DNA分子だとみなされる。逆に、異種DNAは、外因性プロモーターに機能的に連結された内因性の構造遺伝子を含んでもよい。
【０１０２】
天然細胞において見出されない、すなわち異種の核酸によってコードされる、ポリペプチドは、「異種」ポリペプチドである。
【０１０３】
本明細書において使用される「生物学的に活性なポリペプチド」という用語は、細胞株およびウイルスを用いたバイオアッセイ法などの人工生物システムにおいて、もしくはそれに投与された時に、または限定されるわけではないが鳥類およびヒトを含む哺乳動物を含む動物にインビボで投与された時に生物学的作用を引き起こす有機分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成のポリペプチドまたはタンパク質などの生物学的高分子を指す。この生物学的作用は酵素の阻害もしくは活性化、結合部位もしくは周囲の受容体もしくはリガンドへの結合、シグナル誘発、またはシグナル調節でもよいが、それに限定されない。1つの態様において、生物学的に活性なポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、および免疫グロブリン結合体からなる群より選択される。
【０１０４】
「アミノ酸」という用語は、直接、または前駆体として核酸によってコードされ得るカルボキシα-アミノ酸の群を示し、アラニン(3文字記号：Ala、1文字記号：A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リシン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)、およびバリン(Val、V)を含む。
【０１０５】
「クローニングプラスミド」は、細胞において自律複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、ファージミド、または細菌人工染色体(BAC)などの核酸である。クローニングプラスミドは、典型的には、プラスミドの本質的な生物学的機能を失わずに決定可能な様式で核酸を挿入することを可能にする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングプラスミドで形質転換された細胞の同定および選択において使用するのに適している選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。選択可能なマーカーには、典型的には、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性、ピューロマイシン耐性、G418耐性、またはアンピシリン耐性を与える遺伝子が含まれる。
【０１０６】
「発現プラスミド」とは、細胞において発現される(異種)ポリペプチドをコードする核酸である。典型的に、発現プラスミドは、原核生物複製起点と原核生物選択マーカーを含む原核生物プラスミド増殖単位、例えば、大腸菌の原核生物プラスミド増殖単位、真核生物選択マーカー、および関心対象の核酸(構造遺伝子)を発現するための1つまたは複数の発現カセットを含み、それぞれの発現カセットは、プロモーター、核酸(構造遺伝子)、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に配置され、このような構造遺伝子はプロモーターと「機能的に連結されている」と言われる。同様に、調節エレメントとコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調整すれば機能的に連結されている。
【０１０７】
「ポリシストロニック転写単位」とは、複数の構造遺伝子が同じプロモーターの制御下にある転写単位である。
【０１０８】
「単離されたポリペプチド」は、汚染性細胞成分、例えば、共有結合していない、炭水化物、脂質、または天然でポリペプチドと関連する他のタンパク質不純物ならびに非タンパク質不純物を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形の、すなわち、少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％超の純度、または99％超の純度のポリペプチドを含む。ある特定の調製物が、単離されたポリペプチドを含むことを示す方法の1つは、この調製物をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色した後に単一バンドが出現することによって示す方法である。しかしながら、「単離された」という用語は、同じポリペプチドが、二量体または選択的にグリコシル化された形もしくは誘導体化された形などの別の物理的形態で存在することを排除しない。
【０１０９】
本明細書において使用される「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。この定義は、変種、例えば、変異のある形態、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を有する形態、切断型、ならびに融合型を含む。認められている免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、例えば、Fv、Fab、およびF(ab)2ならびに単鎖(scFv)を含む様々な形式で存在してもよい(例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426、大まかには、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984) and Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。
【０１１０】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はそれぞれ、仮に存在する場合には、定常領域(一般的にカルボキシル末端部分)を含んでよい。重鎖の定常領域は、(i)食細胞のようなFc受容体を有する細胞、または(ii)ブランベル(Brambell)受容体とも知られる胎児性Fc受容体(FcRn)を有する細胞への抗体の結合を媒介する。これはまた、成分C1qのような古典的な補体系の因子を含む、いくつかの因子への結合も媒介する。さらに、膜貫通ドメインが、免疫グロブリン重鎖のC末端定常ドメイン、すなわち、CH3ドメインまたはCH4ドメインの後ろにあってもよい。この膜貫通ドメインにより原形質膜結合型の免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片または免疫グロブリン融合ポリペプチドの形成が可能になる。
【０１１１】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はそれぞれ、仮に存在する場合には、可変ドメイン(一般的にアミノ末端部分)を含んでよい。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは異なるセグメント、すなわち4種類のフレームワーク領域(FR)と3種類の超可変領域(CDR)を含む。
【０１１２】
「少なくとも1つの断片」という用語は、完全な核酸または完全なポリペプチドの一部分、すなわち、完全な核酸、ポリペプチド、またはドメインの少なくとも20％、少なくとも40％、少なくとも60％、または少なくとも80％を指す。例えば、「免疫グロブリンのCH3ドメインまたはCH4ドメインの少なくとも1つの断片をコードする核酸」とは、完全な免疫グロブリンのCH3ドメインまたはCH4ドメインをコードする核酸の一部分、すなわち、完全な免疫グロブリンのCH3ドメインまたはCH4ドメインをコードする核酸の少なくとも20％、少なくとも40％、少なくとも60％、または少なくとも80％を指す。1つの態様において、免疫グロブリン重鎖の断片は免疫グロブリン重鎖のC末端断片である。
【０１１３】
「インフレーム翻訳停止コドン」という用語は、先行する核酸コード領域を基準にしてリーディングフレームのフレームシフトを伴わずに核酸コード領域の後に続いている、すなわち、翻訳プロセス中に該コード領域の翻訳を終結させる、翻訳停止コドン(TAA、TAG、またはTGA)を示す。インフレーム翻訳停止コドンは、先行する核酸コード領域に機能的に連結されている。
【０１１４】
「インフレーム翻訳停止コドンを有さない」という用語は、指定の核酸中に翻訳停止コドン(TAA、TAG、もしくはTGA)が存在しないこと、および/または、もう1つの選択肢として、核酸コード領域内もしくはその末端に存在し得るが、1塩基対シフトもしくは2塩基対シフトが原因で、プロセッシングされたmRNAの翻訳中には認識されず(すなわち、フレーム外(out-of-frame)であり、先行する核酸に機能的に連結されていない)、従って、翻訳プロセスを終結させない翻訳停止コドンが存在することを示す。
【０１１５】
「転写ターミネーター」という用語は、mRNA合成を終結させるためのシグナルをRNAポリメラーゼに与える、50〜750塩基対長のDNA配列を指す。特に、強力なプロモーターを使用する場合に、RNAポリメラーゼが読み過ごすのを防ぐために、発現カセットの3'末端の非常に効率的な(強力な)ターミネーターが望ましい。非効率的な転写ターミネーターは、望まれない、例えば、プラスミドにコードされた遺伝子発現の理由となり得るオペロン様mRNAの形成を招く場合がある。
【０１１６】
本出願内で使用される「プレmRNAプロセッシング中に構成的に除去されない」および「(対応する)プレmRNAから構成的にスプライスアウトされない」という用語は、プレmRNAプロセッシング中に例外なく起こるとは限らないスプライシングプロセス、すなわち、プレmRNAプロセッシング中に、ある特定のイントロンの核酸が時々にしか除去されないスプライシングプロセスを指す。結果として、同じプレmRNAから2つの異なる成熟mRNAが得られ、一方はイントロンの少なくとも一部分を含み、他方はイントロンを含まない。
【０１１７】
本出願内で使用される「GPIアンカー」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質のC末端に結合される翻訳後修飾物を指す。「GPIアンカー」は、少なくとも1つのエタノールアミンリン酸残基、トリマンノシド(trimannoside)、グルコサミン残基、およびイノシトールリン脂質を含むコア構造を有する。このコア構造にも関わらず、GPIアンカーは、通常、いくらかの微小不均一性を有し、従って、GPIアンカーを有するタンパク質は通常、異なる側鎖修飾物を有する同じコア構造の相同なGPIアンカーを有するタンパク質の混合物である。
【０１１８】
「GPIアンカーに対するシグナルペプチド」という用語は、GPIアンカーが結合される1つのアミノ酸、任意のスペーサーペプチド、および疎水性ペプチドからなる、ポリペプチドまたはタンパク質のC末端アミノ酸配列を指す。このシグナルペプチドのほぼ全て、すなわち、任意のスペーサーペプチドおよび疎水性ペプチドは酵素GPI-トランスアミナーゼによって翻訳後に除去され、GPIアンカーのコアのエタノールアミンリン酸のアミノ基と、GPIアンカーが結合されるアミノ酸との間の結合が形成される。
【０１１９】
細胞選択
異種核酸を用いるトランスフェクションの後、その異種核酸によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を選択しなければならない。選択のためにマーカーを使用しなければならない。マーカーは、そのマーカーが、首尾良くトランスフェクトされた細胞に与えている表現型によって、異種核酸によって首尾良く形質転換された細胞集団中の細胞を示す。マーカーは、首尾良くトランスフェクトされた細胞の選択および単離を容易にする。例えば、選択可能なマーカー、または緑色蛍光タンパク質(GFP)のような検出可能な標識などの様々なマーカーを使用することができる。
【０１２０】
細胞の選択は一段階または多段階で行うことができる。一段階/多段階手法において第1の選択は、例えば、検出可能な標識のような選択可能なマーカーの閾値レベルに基づいて実施することができる。例えば、フローサイトメトリー(例えば、FACS、すなわち蛍光活性化細胞選別(Fluorescence Activated Cell Sorting))による選択の場合、蛍光閾値レベルが設定され、この閾値レベルを上回る蛍光を有する細胞が選択される。あるいは、試料集団の蛍光強度の上位1％〜15％(すなわち、最も強い検出可能標識を有する細胞の15％)、または上位1％〜10％、または上位1％〜5％、または上位5％〜10％、または上位5％〜6％内の細胞を採取してもよい。細胞を選択するための代替方法は、免疫学的結合、例えば、プロテインAまたは特異的な免疫グロブリンでコーティングされた磁気ビーズに対する免疫学的結合である。選択された細胞パネルは、さらなる選択工程のための基本集団と考えることができる。さらなる選択工程は、例えば、単一細胞播種、培養、およびELISA解析(酵素結合免疫吸着測定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay))、または限界希釈クローニング、または選択培地における選択的培養条件下での数日間の培養による増殖、およびさらなるFACS選択、または、例えば、先に実施したFACS選択において検出された蛍光強度に基づいた、より高い閾値レベルを用いたさらなるFACS選択、または免疫沈降法(例えば、WO2005/020924も参照されたい)による。1つの態様において、細胞選択は、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、イムノアフィニティーカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズイムノアフィニティー選別、顕微鏡観察に基づいた単離法、または免疫学的結合の群より選択される方法によって実施される。1つの態様において、細胞選択は、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、イムノアフィニティーカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズイムノアフィニティー選別、顕微鏡観察に基づいた単離法、または免疫学的結合の群より選択される方法と、それに続く、単一細胞播種および培養、限界希釈、または培養による増殖の群より選択される方法と、それに続く、FACS、免疫沈降法、イムノアフィニティーカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズイムノアフィニティー選別、顕微鏡観察に基づいた単離法、またはELISAの群より選択される方法によって実施される。
【０１２１】
当技術分野において公知のトランスフェクション方法の有効性は非常に高く、従って、複数のトランスフェクトされた細胞が得られるので、トランスフェクトされた細胞の発現収率と、マーカーの検出された「強度」を互いに関係づけることも可能にするマーカーが好ましい。従って、関心対象の(異種)ポリペプチドの発現とマーカーの発現をリンクさせることは機能的である。
【０１２２】
本発明
本明細書において報告される核酸は、同じ核酸から、すなわち、IRESが用いられていない同じ発現カセットから関心対象のポリペプチドおよびマーカーを発現させるために、スプライシング方法、すなわち、選択的スプライシングを使用する。本明細書において報告される方法におけるマーカーは、関心対象のポリペプチドの原形質膜結合型である。本明細書において報告される方法では、選択可能なマーカーはN末端部分として関心対象のポリペプチドを含み、C末端部分として膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片が用いられる。従って、産生された関心対象のポリペプチドと、選択可能なマーカーの細胞外部分、すなわち、検出される選択可能なマーカーの一部は同一である。
【０１２３】
本発明は、少なくとも部分的には、選択的スプライス受容部位(3'-スプライス部位領域)の特定の改変を用いると、選択的スプライシングされる核酸におけるスプライシング比を調節できるという発見に基づいている。これらの改変を行うと、使用した細胞株に対して、マーカー、すなわち、C末端に膜貫通ドメインを含む関心対象のポリペプチド(すなわち、長い構築物)の発現を取り入れることができる。このことは、選択的にスプライシング可能な核酸がCHO細胞において用いられる場合に特に有用である(これにより可溶性免疫グロブリンと膜結合型免疫グロブリンの良い比が得られる)。
【０１２４】
選択的スプライシング
DNAの転写の最中に、1コピーのDNA、いわゆるプレメッセンジャーRNA(プレmRNA)が生成される。このプレmRNAは鋳型DNAの1:1コピーである、すなわち、鋳型DNAと同じ要素を含む。例えば、鋳型DNAがゲノムイントロン-エクソン構成を有するのであれば、プレmRNAは同一のゲノムイントロン-エクソン構成を有する。
【０１２５】
エクソンだけが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列の情報を含む。従って、翻訳に先立ってプレmRNAからイントロンを除去しなければならない。このプロセスはRNAスプライシングと呼ばれる。
【０１２６】
「スプライシング可能な核酸」は、少なくとも、5'スプライス供与部位と、3'スプライス受容部位と、受容部位の20〜50塩基上流に通常位置している、いわゆる分岐部位を特徴とする。この構造は、RNAスプライシングの間に、プレmRNAの5'スプライス供与部位から3'スプライス受容部位までの核酸の認識と切出しに影響を及ぼす。スプライシング工程を通じて、ポリペプチドが翻訳される元となる成熟mRNAが生成される。
【０１２７】
しかし、スプライシングプロセスはたった1つしかないわけではない。イントロンが、選択的スプライシング可能なイントロン(=選択的にスプライシング可能な核酸)であれば、このイントロンはスプライシングプロセスの間に強制的に除去されず、維持することができる。従って、このようなイントロンはプレmRNAからのプレmRNAプロセッシングの間に除去されず、成熟mRNA中に(少なくとも部分的に)維持される。インフレーム停止コドンが、この選択的にスプライシング可能なイントロンに存在する場合には、後の翻訳プロセスはこの停止コドンで停止し、短い構築物が産生される。
【０１２８】
イントロンの認識および切出しは、プレmRNA中の付加的なシス作動性エレメントによって調節されることが多い。これらのエレメントはその機能と位置により、それぞれ、エクソンスプライスエンハンサー(ESE)、エクソンスプライスサイレンサー(ESS)、イントロンスプライスエンハンサー(ISE)、またはイントロンスプライスサイレンサー(ISS)と呼ばれる(Black, D. L., Annu. Rev. Biochem. 72 (2003) 291-336)。
【０１２９】
ほとんどの真核生物遺伝子のゲノムDNAはイントロン-エクソン構成を有する。例えば、免疫グロブリン重鎖の分泌型のC末端ドメインをコードするエクソン(すなわち、それぞれ、CH3またはCH4)の中に5'スプライス供与部位が存在する。
【０１３０】
このスプライス供与部位が重鎖プレmRNAのプロセッシングにおいて有効でなければ、このエクソンに続き停止コドンとポリアデニル化シグナルとを含むイントロンは、成熟mRNA中に少なくとも部分的に保持される。次いで、mRNAは、CH3ドメインまたはCH4ドメインで終わる免疫グロブリン重鎖に翻訳され、可溶性免疫グロブリン(=短い構築物)となる。これは、免疫グロブリン分泌細胞における免疫グロブリン重鎖遺伝子のメジャーなプロセッシング経路である。
【０１３１】
このスプライス供与部位が免疫グロブリン重鎖プレmRNAのプロセッシングにおいて有効であれば、それに続くイントロンと停止コドンが除去される。従って、翻訳は免疫グロブリン重鎖のC末端ドメインの後ろで停止しない。さらに、翻訳は続けられ、スプライス供与部位の後ろにあるものが、膜貫通ドメインをコードするエクソンまでスプライシングされる。免疫グロブリン重鎖遺伝子について、このマイナーなプロセッシング経路によって、免疫グロブリン産生細胞の細胞表面に提示される原形質膜結合型免疫グロブリン(=長い構築物)が生じる。
【０１３２】
このプロセスは「選択的スプライシング」と呼ばれ、このプロセスにおいて任意に除去される核酸(すなわちイントロン)は「選択的にスプライシング可能な核酸」と呼ばれる。
【０１３３】
関心対象のポリペプチドをコードする核酸が、選択的にスプライシング可能な核酸によって/を介して、膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする核酸に連結されていれば、すなわち、選択的にスプライシング可能な核酸が、これらの2つの核酸の間に配置され、これらの3つの核酸が機能的に連結されていれば、関心対象のポリペプチドの2種類の変種:可溶性の変種、すなわち、関心対象のポリペプチドしか含まない変種(=短い構築物)と、原形質膜結合型変種、すなわち、該ポリペプチドまたはタンパク質と膜貫通ドメインの両方を含む変種(=長い構築物)が発現される。
【０１３４】
例えば、真核細胞において免疫グロブリン重鎖を組換え発現する場合、ゲノムのイントロン-エクソン構成を有する核酸またはコード領域のみを含む核酸、すなわち、cDNAのいずれかを使用することができる。どちらの場合においても、核酸は、免疫グロブリン重鎖のC末端ドメインをコードするエクソンの後ろにある停止コドンで終了する。その後、ゲノム構成において、選択的にスプライシング可能な核酸と膜貫通ドメインを含む後続のイントロンおよびエクソンが取り除かれる。従って、このような核酸を用いて、可溶性免疫グロブリン重鎖だけを得ることができ、可溶性免疫グロブリン重鎖だけが得られる。
【０１３５】
免疫グロブリンまたはその断片を組換え発現するために、免疫グロブリン重鎖遺伝子のゲノム構成が少なくとも部分的に保持されていれば、すなわち、C末端ドメインをコードするエクソンの後ろにあるイントロン(すなわち、選択的にスプライシング可能な核酸)と、これに続く、免疫グロブリン膜貫通ドメインをコードするエクソンが保持されていれば、選択的スプライシングが可能である。選択的スプライシング事象において、CH3ドメインまたはCH4ドメインをコードするエクソンの3'末端コドンおよび停止コドンはそれぞれイントロン配列として/イントロン配列と共に除去され、異なる成熟mRNAが代わりに生成され、この成熟mRNA中のコード領域、すなわちリーディングフレームの3'末端は、付加的に維持されたエクソンによって伸長される。このmRNAは、付加3'エクソンによってコードされる付加膜貫通ドメインまたはその断片を含む、C末端が伸長した免疫グロブリン重鎖に翻訳される。この延伸された免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリンが集合する間に組み入れられ、その結果、原形質膜結合型免疫グロブリンが生じる。
【０１３６】
このような核酸を用いて、免疫グロブリンを産生するトランスフェクトされた細胞を原形質膜結合型免疫グロブリン変種に基づいて選択することができる。
【０１３７】
WO2007/131774に従って、抗体の2種類の変種、すなわち、分泌型(以下、sIgGと呼ぶ)および膜結合型(以下、mIgGと呼ぶ)を同時に発現する細胞株を作製することができる。両変種とも同じ軽鎖からなるが、重鎖プレmRNAの異なるプロセッシング、すなわち、選択的スプライシングによって生じた異なる重鎖アイソフォームからなる。プレmRNAは切断され、CH3ドメインをコードするエクソンの下流にあるイントロン6内に配置されたポリアデニル化部位でポリアデニル化され、その結果、sIgGという短い重鎖アイソフォームが生じる。競合的に、イントロン6(ポリアデニル化部位を含む)がプレmRNAからスプライシングによって除去され、従って、その結果、長い重鎖アイソフォームmIgGが生じる。このような細胞株は、両アイソフォームの発現を可能にするプラスミドを用いた安定トランスフェクションによって作製される。その目的は、望ましい抗体の分泌型を発現する細胞株を高レベルで作り出し、特定することである。
【０１３８】
理想的には、重鎖トランスジーンの一次転写物は、主に、小さなmRNAアイソフォームにプロセッシングされて、抗体の分泌型sIgGが生じる。膜結合型mIgGにつながる長いmRNAアイソフォームには少量しか完全にプロセッシングされない。
【０１３９】
しかし、細胞株によっては、mIgGの発現レベルがあまりにも高く、その結果としてsIgGの発現レベルが低く、それによって、それぞれの細胞の産生収率が低くなるので、これらの2種類のmRNA変種の発現比は都合が悪いことがある。
【０１４０】
トランスフェクトされたCHO細胞では、例えば、ほぼ等量の両mRNAアイソフォームを確かめることができる。そのために、分泌型sIgGを発現させる場合、mIgGアイソフォームにスプライスされる重鎖プレmRNAの部分は欠けている。
【０１４１】
本発明を、以下において、例示的な関心対象のポリペプチドを用いて概説する。例示的な関心対象のポリペプチドは免疫グロブリンである。これは本発明を限定するものだと理解される必要はない。すなわち、本発明は任意のポリペプチドを用いて実施することができる。
【０１４２】
WO2007/131774において報告されたようにプラスミドpmIgGΔ-Bに基づく改変された核酸を用いることによって2種類のアイソフォームの比を変更できることが見出されている。
【０１４３】
プラスミドpmIgGΔ-Bに基づいて、異なる新たな構築物が生成されている。これらは、重鎖イントロン6の3'-スプライス部位領域内の点変異によって異なる。
- pmIgGΔ-mut-bpはpmIgGΔ-Bとは、分岐点の近くの2塩基対が異なる。
- pmIgGΔ-mut-p(Y)はpmIgGΔ-Bとは、ポリピリミジントラクト内の4塩基対が異なる。
- pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)はpmIgGΔ-Bとは、分岐点とポリピリミジントラクト変異の両方が異なる。
【０１４４】
全変異を標準的な部位特異的変異誘発およびクローニングの手法によってpmIgGΔ-Bに挿入した。プラスミドpmIgGΔ-Bにおける、この領域のDNA配列と、プラスミドpmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、およびpmIgGΔ-mut-bp-p(Y)における挿入された変異とを以下の表に列挙した(変異塩基対を太字で強調した;上の横列は、イントロン6の3'断片、3'-スプライス部位(縦線で図示した)、およびエクソンM1-M2の5'断片の位置を示す;下の横列は、Zhang, M., Hum. Mol. Genet. 7 (1998) 919によって報告されたような、分岐点、ポリピリミジントラクト、および3'-スプライス部位を含む、この領域のコンセンサス配列を示す)。
2019532641.tif 000020
【０１４５】
推定エクソンスプライスエンハンサー(ESE)部位を特定するために、プラスミドpmIgGΔ-Bからの50塩基対の分析に基づいて参照構築物が得られている。この領域は、5'から3'方向に、イントロン6の最後の8塩基対と、エクソンM1-M2の42の隣接する塩基対にまたがっている。
【０１４６】
ヒトSRタンパク質SF2/ASF、SC35、SRp40、およびSRp55の推定ESE部位を、コンピュータプログラム「ESEfinder」(Cartegni, L., et al., Nuc. Acids Res. 31 (2003) 3568を参照されたい)を用いて探索した。このプログラムは、以下の表に示したように2.04536〜5.53775のスコアをもつ11の推定ESE部位を特定した(上の部分は、プラスミドpmIgGΔ-B中のエクソンM1-M2の5'末端近くの50塩基対DNA配列を示す。下の部分は、4種類のヒトSRタンパク質について特定された、この領域中の推定ESE部位、その位置およびDNA配列、ならびにスコアによる評価を示す)。
2019532641.tif 000021
【０１４７】
このインシリコ方法を用いて、推定ESE部位の除去を目的とする9つの塩基対交換が特定された。エクソンM1-M2によってコードされるアミノ酸配列を変えないサイレント変異を選択することを考慮に入れた。
【０１４８】
改変された配列を、ESEfinderプログラムを用いて分析した。改変されていない配列と比較して、3未満のスコアをもつ推定ESE部位は2つしか特定されなかった。これらのインシリコ結果に基づいて、部位特異的変異誘発とDNAクローニングの標準的な方法を用いて、プラスミドpmIgGΔ-Bにおいて9つの塩基対を交換した。改変されたプラスミドをpmIgGΔ-mut-ESEと呼んだ。以下の表は、改変された配列とESEfinderプログラム結果を示す(上の部分は、プラスミドpmIgGΔ-mut-ESE中のエクソンM1-M2の5'末端近くの50塩基対DNA配列を示す。pmIgGΔ-Bと比較した9つの変異塩基対を太字で強調した。下の部分は、4種類のヒトSRタンパク質について特定された、この領域中の推定ESE部位、その位置およびDNA配列、ならびにスコアによる評価を示す)。
2019532641.tif 000022
【０１４９】
sIgGを生合成するために、重鎖のプレmRNAをイントロン6内のポリアデニル化部位でポリアデニル化した。この工程は、mIgGアイソフォームの作製においてスプライシングによるイントロン6の除去と競合する。初期ポリアデニル化を促すために、付加ポリアデニル化部位をイントロン6に付加した。これは、さらなる参照構築物の原因となった。
【０１５０】
プラスミドpmIgGΔ-SV40p(A)をクローニングするために、シミアンウイルス40(SV40)の初期ポリアデニル化部位を含む153bpの断片を、プラスミドpmIgGΔ-Bのイントロン6に、エクソンCH3の停止コドンの71bp下流に挿入した。比較として、ウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化部位を含む237bp断片をプラスミドpmIgGΔ-Bの同じ位置に挿入することによって、プラスミドpmIgGΔ-BGH-p(A)をクローニングした。このプラスミドは標準的な分子生物学的方法を用いて構築した。
【０１５１】
本明細書において報告される方法は、懸濁培養での無血清増殖に予め順応させたCHO-K1細胞(ATCC No. CCL-61; Puck, T.T., et al., J. Exp. Med. 108 (1958), 945-956)を使用し、以下において例示される。3〜4日毎に、細胞を分割して新鮮な培地に入れる。トランスフェクションのために、エレクトロポレーションによって、室温、PBS中で、それぞれのプラスミドDNAを細胞に導入する。細胞に、それぞれの直線化したプラスミドpmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)、pmIgGΔ-mut-ESE、pmIgGΔ-SV40-p(A)、pmIgGΔ-BGH-p(A)、またはpmIgGΔ-Bをトランスフェクトした。その後に、安定にトランスフェクトされた細胞を選択するために、各トランスフェクションの細胞をプールとしてトランスフェクションの1日後から開始して約3週間にわたって選択圧下で培養した。
【０１５２】
抗体重鎖用の発現プラスミド
選択可能なマーカーが細胞内C末端に連結された重鎖mIgG型をコードする3つの異なる発現プラスミドを構築した。
【０１５３】
第1のプラスミドであるpmIgG-HC-Neoは、以下のエレメントを含む(図3を参照されたい)。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域3-33遺伝子(IGHV3-33)の5'非翻訳領域、
1.3 1.3.1 IGHV3-33のリーダーペプチド(L)のcDNA、
1.3.2 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA(VH)、
1.3.3 エクソンCH1-CH3に由来するヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1遺伝子(IGHG1)のcDNA、
1.3.4 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ3遺伝子(IGHG3)のエクソンM1のcDNA、
1.3.5 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ4遺伝子(IGHG4)のエクソンM2のcDNA、
1.3.6 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするcDNA(Neo)
を含む、融合タンパク質のコード配列、
1.4 シミアンウイルス40のポリアデニル化部位(SV40ポリ(A))
から構成される、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼに連結した、重鎖のmIgG型の融合タンパク質の転写単位。
2. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点(pUCori)。
3. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子(Amp)。
【０１５４】
第2のプラスミドであるpmIgG-HC-Hygは、上述したエレメント1.3.6以外は、pmIgG-HC-Neoと同じエレメントを含む。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼcDNAの代わりに、このプラスミドではハイグロマイシン-ホスホトランスフェラーゼのcDNA(Hyg)がM2 cDNAと融合されている(図4を参照されたい)。
【０１５５】
第3のプラスミドであるpmIgG-HC-Puroは、上述したエレメント1.3.6以外は、pmIgG-HC-Neoと同じエレメントを含む。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼcDNAの代わりに、このプラスミドではピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼのcDNA(Puro)がM2 cDNAと融合されている(図5を参照されたい)。
【０１５６】
抗体軽鎖用の発現プラスミド
抗体軽鎖を発現するためにプラスミドpIgG-LCを構築した。このプラスミドは、以下のエレメントを含む。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 ヒト免疫グロブリンκ可変領域3-11(IGKV3-11)遺伝子の5'非翻訳領域、
1.3 1.3.1 IGKV3-11のリーダーペプチドのcDNA、
1.3.2 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変軽鎖cDNA、
1.3.3 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子のcDNA
を含む、免疫グロブリンκ軽鎖のコード配列、
1.4 IGKCのポリアデニル化部位を含む3'非翻訳領域
から構成される、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖の転写単位。
2. 大腸菌におけるプラスミド複製用のベクターpUC18に由来する複製起点。
3. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０１５７】
sIgGおよびmIgG-Puro融合タンパク質用の発現プラスミド
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)は、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgG型とその膜貫通融合変種を発現するために設計した。この変種は、sIgG型、およびmIgG重鎖とピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼの融合タンパク質と同じ軽鎖を含む。これらの2種類の抗体型は、mIgGについて述べたように重鎖融合タンパク質のプレmRNAの選択的プロセッシングによって生じるはずである。さらに、発現プラスミドpmIgGΔ-mut-p(Y)について述べたように4塩基対を交換することによって重鎖のイントロン6のポリピリミジントラクトを変異させた。以下を参照されたい。
【０１５８】
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)は、以下のエレメントからなる。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
1.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
1.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA、
1.5 CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および免疫グロブリンの分泌型に対するポリアデニル化部位を含むイントロン6の隣接5'部分を含むヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2、
1.6 プラスミドpmIgGΔ-mut-p(Y)について下記の表に列挙したポリピリミジントラクト内の4塩基対交換を含む、ヒトIGHG3遺伝子に由来するイントロン6の3'部分、
1.9 ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼcDNAと連結した、
1.8 ヒトIGHG4遺伝子に由来するエクソンM2と連結した、
1.7 ヒトIGHG3遺伝子に由来するエクソンM1、
1.10 シミアンウイルス40のポリアデニル化部位
から構成される、上述のsIgG重鎖またはmIgG重鎖およびピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼの融合タンパク質の転写単位。
2. 2.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
2.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
2.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
2.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変κ鎖cDNA、
2.5 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
2.6 ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. 大腸菌におけるプラスミド複製用のベクターpUC18に由来する複製起点。
4. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０１５９】
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)の構築を図6に図示した。
【０１６０】
sIgGおよびピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgG型と、独立した発現カセットによってコードされるピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼを発現するためにプラスミドpIgG-Puroを対照プラスミドとして設計した。このプラスミドは、以下のエレメントを含む。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
1.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
1.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA、
1.5 CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および分泌型IgG1の重鎖に対するポリアデニル化部位を含む隣接3'非翻訳領域を含むヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2
から構成される、sIgG重鎖の転写単位。
2 2.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
2.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
2.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
2.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変κ鎖cDNA、
2.5 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
2.6 ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. SV40プロモーター、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼcDNA、およびSV40ポリアデニル化部位を含む、哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のベクターpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０１６１】
プラスミドpIgG-Puroの構築を図7に図示した。
【０１６２】
sIgGおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
改善した発現細胞株を作製するために実施例6に記載のように従来のやり方でプラスミドpIgG-Neoを設計した。このプラスミドは、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgGアイソフォームの重鎖および軽鎖、ならびに独立した発現カセットによってコードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。このプラスミドは、以下のエレメントを含む。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
1.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
1.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA、
1.5 CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および分泌型IgG1の重鎖に対するポリアデニル化部位を含む隣接3'非翻訳領域を含むヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2
から構成される、sIgG重鎖の転写単位。
2. 2.1ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
2.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
2.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
2.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変κ鎖cDNA、
2.5 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
2.6 ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. SV40プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼcDNA、およびSV40ポリアデニル化部位を含む、哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のベクターpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０１６３】
プラスミドpIgG-Neoの構築を図8に図示した。
【０１６４】
ヒト免疫グロブリンγ1重鎖に由来する選択的にスプライシング可能な核酸(=第2の核酸断片)はSEQ ID NO:11の核酸配列を有する。
2019532641.tif 000023
【０１６５】
第2の核酸断片の配列は普通1kbを超えるので、表に記載した配列は短縮されており、完全な第2の核酸の全サイズを表している数字で分けられた、第2の核酸断片の最初の100ヌクレオチドと最後の100ヌクレオチドをおおよそで示している。停止コドンには下線を引いた。
【０１６６】
スプライス供与部位は、縦線によって隔てられた、スプライス供与部位の先行するコンセンサス配列と、第2の核酸断片の最初のヌクレオチド6つを含む形式で示されている(例えば、Zhang, M.Q., Human Mol. Gen. 7 (1998) 919-932を参照されたい)。同様に、スプライス受容部位は、縦線によって隔てられた、第2の核酸断片の最後のヌクレオチド6つと、これに続くスプライス受容部位コンセンサス配列を記載することによって示されている。縦線の直後のヌクレオチド(5'スプライス供与部位)と直前のヌクレオチド(3'スプライス受容部位)は、第2の(スプライシング可能な)核酸断片の最初のヌクレオチドと最後のヌクレオチドである。
【０１６７】
ヒト免疫グロブリンγ1重鎖に由来する膜貫通ストレッチ(=第3の核酸断片)はSEQ ID NO:12の核酸配列を有する。
2019532641.tif 000024
【０１６８】
この配列は、3'スプライス受容部位のすぐ後ろにあってもよいか、または、任意の介在配列と共に、すなわち第4の核酸と共に3'スプライス受容部位の後ろにあってもよい。以下の表において、ヒト免疫グロブリンγ1重鎖に由来する第4の核酸配列断片を示した。
2019532641.tif 000025
【０１６９】
結果
一次転写物の選択的RNAプロセッシングによって生じる2種類の重鎖アイソフォームの比を求めるために、安定にトランスフェクトされたクローンのRNAをノーザンブロットによって分析した。従って、7つの安定にトランスフェクトされた細胞プールから全RNAを単離した。さらに、トランスフェクトされていないCHO-K1細胞のRNAを同じ条件下で調製した。次いで、それぞれの場合について、等量の全RNAを変性アガロースゲル電気泳動で分画し、ナイロンメンブレンに転写した。ブロットメンブレンのハイブリダイゼーションのために、2つの異なるDNAプローブを[α-32P]で標識した。図2Bに図示したように、プローブ1は、エクソンCH1とCH3との間の重鎖mRNAに相補的であり、従って、両アイソフォームにハイブリダイズする。対照的に、プローブ2は長いmIgG重鎖mRNAの3'UTRにしか結合しない。メンブレンのハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄の後に、ブロットをオートラジオグラフィーによって分析した(図2Aを参照されたい)。
【０１７０】
プローブ1とのハイブリダイゼーションは、トランスフェクトされた細胞プールについては1.8kbシグナルを示し、これは、sIgGの重鎖をコードする短いmRNAアイソフォームに対応する。レーン1、2、4、および7では、3.3kbのさらなるシグナルが検出される。このバンドは、プローブ2とのハイブリダイゼーションによって明らかにされたように(レーン9、10、12、および15)、mIgGの長いmRNAアイソフォームを表している。分析されたプールは、プローブ1によって検出された1.8kbバンド〜3.3kbバンドの相対シグナル強度の点で異なる。プラスミドpmIgGΔ-BをトランスフェクトしたCHO-K1細胞のプールは、2種類のアイソフォームについて約50:50の比を示す。重鎖イントロン6の3'-スプライス部位領域でのプラスミド改変はプレRNAプロセッシングに影響を及ぼすことが分かる。pmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、またはpmIgGΔ-mut-ESEをトランスフェクトしたプールについては、2種類のアイソフォームの比はsIgGアイソフォームに変わる/シフトしたと観察することができる。pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)、pmIgGΔ-SV40-p(A)、またはpmIgGΔ-BGH-p(A)をトランスフェクトしたプールでは、mIgGアイソフォームはプローブ1を用いても、もっと感度が高いプローブ2を用いても検出されなかった。このことから、これらのプラスミドにおける改変はエクソンCH3とエクソンM1-M2のスプライシングを完全にブロックすることが分かる。
【０１７１】
分岐点およびポリ(Y)トラクトの変異によってスプライシングによるイントロン6の切出しが約90:10のsIgG:mIgG比まで減少することが分かる(構築物mut-bp-p(Y))。この構築物は、本明細書において報告される方法を実施するための好ましい構築物である。
【０１７２】
この方法論は一般的に任意のポリペプチドに適用可能であり、免疫グロブリンに限定されない。唯一の必要な条件は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸がインフレーム停止コドンを有さず、選択的にスプライシング可能な核酸に機能的に連結され、かつこれとインフレームであることである。好ましくは、この選択的にスプライシング可能な核酸は、インフレーム翻訳停止コドンとポリアデニル化部位を含む免疫グロブリンに由来する。これに続く、膜貫通ドメインまたはその断片をコードする核酸は変更可能であり、膜貫通ドメインまたはその断片をコードする任意の核酸より選択することができる。これらのエレメント、すなわち、関心対象のポリペプチドをコードする核酸、選択的にスプライシング可能な核酸、および膜貫通ドメインをコードする核酸は異なる遺伝子ならびに異なる生物から選択し、組み合わせることができる。これらの3種類の核酸は、選択的にスプライシング可能な核酸中の翻訳停止コドンが関心対象のポリペプチドをコードする核酸のリーディングフレームとインフレームになるように組み合わせなければならない、すなわち、リボソームによって認識され、翻訳が終結するように組み合わせなければならない。
【０１７３】
一般的に言うと、選択的スプライシングによって、可溶型の関心対象のポリペプチドのC末端の一部分がイントロンの一部分としてプレmRNAから任意に除去される/され得る。この部分は、分泌型の3'末端コドン、3'非翻訳領域、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルを任意で含む。従って、任意で除去される、5'スプライス供与部位で始まり、3'スプライス受容部位で終わる核酸は、選択的にプロセッシングされない変種のC末端と重複する/重複し得る。
【０１７４】
従って、免疫グロブリン重鎖遺伝子の少なくとも部分的に保持されたゲノム構成を有する本明細書において報告される核酸を用いることによって、関心対象のポリペプチドの2種の変種である短い可溶性変種および長い原形質膜結合型変種を得ることができる。
【０１７５】
上述したものは以下の通りにまとめることができる。
【０１７６】
本明細書において報告される一局面は、核酸配列
2019532641.tif 000026
を有する、免疫グロブリン重鎖構造遺伝子のイントロン6の3'断片である。
【０１７７】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000027
を有する核酸である。
【０１７８】
本明細書において報告される一局面は、核酸配列
2019532641.tif 000028
を有する、免疫グロブリン重鎖構造遺伝子のイントロン6とエクソンM1の接合部の核酸である。
【０１７９】
本明細書において報告される一局面は、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000029
を有するスプライス受容部位核酸である。
【０１８０】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000030
を有する、核酸である。
【０１８１】
本明細書において報告される一局面は、5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片が、その接合部にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000031
を有する、核酸である。
【０１８２】
第2の核酸断片および第3の核酸断片
本発明は、任意の選択的にスプライシング可能な核酸(=第2の核酸断片)を用いて、例えば、非限定的に、本明細書において報告される改変を含む、C3b/C4b受容体(補体受容体1型)(Hourcade, D., et al., J. Exp. Med. 168 (1988) 1255-1270)、ヒト、ニワトリ、およびラットEGFR(Callaghan, T., et al., Oncogene 8 (1993) 2939-2948; Reiter, J.L., and Maihle, N.J., Nuc. Acids Res. 24 (1996) 4050-4056; Petch, L., et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990) 2973-2982)、免疫グロブリン(Ig)α、ε、γ、μ重鎖(Zhang, K., et al., J. Exp. Med. 176 (1992) 233-243; Rogers, J.E., et al., Cell 20 (1980) 303-312; Milcarek, C., and Hall, B., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 2514-2520; Kobrin, B.J., et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986) 1687-1697; Cushley, W., et al., Nature 298 (1982) 77; Alt, F.W., et al., Cell 20 (1980) 293-301; Peterson, M.L., Gene Exp. 2 (1992) 319-327)、ヒトPLA2受容体(Ancian, P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 8963-8970)、ニワトリCek5(Connor, R.J., and Pasquale, E.B., Oncogene 11 (1995) 2429-2438)、ヒトFGFR(Johnson, D.E., et al., Mol. Cell Biol. 11 (1991) 4627-4634)をコードする核酸の群に由来する選択的スプライシング可能な核酸を用いて実施することができる。
【０１８３】
好ましい1つの態様において、第2の核酸断片は、CH3/CH4ドメインをコードするエクソンと、膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードするエクソンとの間の免疫グロブリンのイントロンに基づいている。1つの態様において、第2の核酸断片は、ヒト(hu)免疫グロブリン(Ig)α(アルファ)重鎖、hu Igδ(デルタ)重鎖、hu Igε(イプシロン)重鎖、hu Igγ1、γ2、γ3、およびγ4(ガンマ)重鎖、hu Igμ(ミュー)重鎖、マウスIg重鎖α(アルファ)型、マウスIg重鎖δ(デルタ)型、マウスIg重鎖ε(イプシロン)型、マウスIg重鎖γ1(ガンマ1)型、マウスIg重鎖γ2A(ガンマ2A)型、マウスIg重鎖γ2B(ガンマ2B)型、マウスIg重鎖γ3(ガンマ3)型、およびマウスIg重鎖μ(ミュー)型をコードする核酸の群に基づいている/由来する。
【０１８４】
1つの態様において、第2の核酸断片は、ヒト免疫グロブリンγ1重鎖、ヒト免疫グロブリンγ2重鎖、ヒト免疫グロブリンγ3重鎖、ヒト免疫グロブリンγ4重鎖、ヒト免疫グロブリンε重鎖(1)、およびヒト免疫グロブリンε重鎖(2)をコードする核酸からなる群より選択される核酸に基づいている。
【０１８５】
本発明は、例えば、非限定的に、核酸が、C3b/C4b受容体(補体受容体1型)、(Hourcade, D., et al., J. Exp. Med. 168 (1988) 1255-1270)、ヒト、ニワトリ、およびラットEGFR(Callaghan, T., et al., Oncogene 8 (1993) 2939-2948; Reiter, J.L., and Maihle, N.J., Nuc. Acids Res. 24 (1996) 4050-4056; Petch, L., et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990) 2973-2982)、Igα、ε、γ、μ重鎖(Zhang, K., et al., J. Exp. Med. 176 (1992) 233-243; Rogers, J.E., et al., Cell 20 (1980) 303-312; Milcarek, C., and Hall, B., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 2514-2520; Kobrin, B.J., et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986) 1687-1697; Cushley, W., et al., Nature 298 (1982) 77; Alt, F.W., et al., Cell 20 (1980) 293-301; Peterson, M.L., Gene Exp. 2 (1992) 319-327)、ヒト PLA2 受容体 (Ancian, P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 8963-8970)、ニワトリ Cek5 (Connor, R.J., and Pasquale, E.B., Oncogene 11 (1995) 2429-2438)、ヒト FGFR (Johnson, D.E., et al., Mol. Cell Biol. 11 (1991) 4627-4634)をコードする核酸からなる群より選択される膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードするのであれば、第3の核酸断片を用いて実施することができる。1つの態様において、第3の核酸断片は、ヒト(hu)免疫グロブリン(Ig)α(アルファ)重鎖、hu Igδ(デルタ)重鎖、hu Igε(イプシロン)重鎖、hu Igγ1、γ2、γ3、およびγ4(ガンマ)重鎖、hu Igμ(ミュー)重鎖、マウスIg重鎖α(アルファ)型、マウスIg重鎖δ(デルタ)型、マウスIg重鎖ε(イプシロン)型、マウスIg重鎖γ1(ガンマ1)型、マウスIg重鎖γ2A(ガンマ2A)型、マウスIg重鎖γ2B(ガンマ2B)型、マウスIg重鎖γ3(ガンマ3)型、およびマウスIg重鎖μ(ミュー)型をコードする核酸からなる群より選択される。1つの態様において、第3の核酸断片は、ヒト免疫グロブリンγ1重鎖、ヒト免疫グロブリンγ2重鎖、ヒト免疫グロブリンγ3重鎖、ヒト免疫グロブリンγ4重鎖、ヒト免疫グロブリンε重鎖(1)、およびヒト免疫グロブリンε重鎖(2)をコードする核酸からなる群より選択される。1つの態様において、第3の核酸断片は、ヒト免疫グロブリンδ重鎖、ヒト免疫グロブリンγ1重鎖、ヒト免疫グロブリンγ2重鎖、ヒト免疫グロブリンμ重鎖、マウス重鎖α型、マウス重鎖γ1型、マウス重鎖γ2B型、マウス重鎖γ3型、およびマウス重鎖μ型をコードする核酸からなる群より選択される。
【０１８６】
上記で概説した第3の核酸断片の群に加えて、第3の核酸は、GPIアンカーに対するシグナルペプチドをコードする核酸からなる群より選択することができる。GPIアンカーに対するシグナルペプチドをコードする核酸の群は、ヒトアルカリジエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ(腸、肝臓、および胎盤)、CAMPATH-1抗原、癌胎児性抗原、CD55、CD59、CD90、コンタクチン-1、E48抗原、葉酸受容体AおよびB、GPIアンカー型タンパク質p137、リンパ球機能関連抗原-3、mDIA相互作用タンパク質、5'-ヌクレオチダーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に由来する;マウスLY-6C抗原、LY-6抗原、5'-ヌクレオチダーゼ、OX45抗原、幹細胞抗原-2、血管細胞接着分子-1、Qaリンパ球抗原2(Qa2)に由来する;ウサギトレハラーゼに由来する;ラットブレビカンタンパク質、CD90、グリピカンタンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、MRC OX-45抗原、5'-ヌクレオチダーゼ、膵臓分泌顆粒膜主要糖タンパク質、T細胞表面タンパク質RT6.2に由来する;酵母DNA修復タンパク質PHR1、糖リン脂質アンカー型表面タンパク質1に由来する;ブタアミロイド前駆タンパク質、ジペプチダーゼに由来する;トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)の種々の変種表面タンパク質、多環式酸性反復タンパク質に由来する;コンゴトリパノソーマ(Trypanosoma congolense)変種表面タンパク質YNat1.1に由来する;ニワトリメラノトランスフェリン、中性細胞接着分子に由来する;トルペド・マルモラタ(Torpedo marmorata)アセチルコリンエステラーゼに由来する;ハムスタープリオンタンパク質に由来する;ウシ5'-ヌクレオチダーゼに由来する;粘菌膜タンパク質Gp64、予定胞子特異的抗原に由来する;およびイカSgp1、Sgp2に由来する、GPIアンカーに対するシグナルペプチドをコードする核酸の群を含む。
【０１８７】
第2の核酸断片は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸、すなわち第1の核酸断片に直接連結されてもよく、任意の小さな(9塩基〜21塩基の)介在核酸断片と共に連結されてよい。1つの態様において、任意の介在核酸断片は、前記の第2の核酸が得られたゲノム中の第2の核酸の前にある核酸に由来する。
【０１８８】
同様に、第3の核酸配列は、3'スプライス受容部位のすぐ後ろにあってもよいか、または任意の介在配列と共に3'スプライス受容部位に続いてもよい。
【０１８９】
1つの態様において、前記核酸は、第2の核酸断片と第3の核酸断片の間に第4の核酸断片を含む。1つの態様において、前記核酸は、第1の核酸断片と第2の核酸断片の間に第5の核酸断片を含む。1つの態様において、第3の核酸断片は、第2の核酸断片と(i)同じ遺伝子もしくは生物、または(ii)異なる遺伝子もしくは生物から得られる。すなわち、第3の核酸断片は、ゲノム中で必ず第2の核酸断片と共に組織化されているとは限らない。
【０１９０】
特定の態様
1. 核酸配列
2019532641.tif 000032
を有する、免疫グロブリン重鎖構造遺伝子のイントロン6の3'断片。
2. ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000033
を有する核酸。
3. 核酸配列
2019532641.tif 000034
を有する、免疫グロブリン重鎖構造遺伝子のイントロン6とエクソンM1の接合部の核酸。
4. ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000035
を有する核酸。
5. 5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含み、任意で、選択マーカーをコードする核酸をさらに含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、該第2の核酸断片が、その3'末端にヌクレオチド配列
2019532641.tif 000036
を有する、核酸。
6. 5'から3'方向に、
(i) インフレーム翻訳停止コドンを有さない、関心対象のポリペプチドをコードする第1の核酸断片、
(ii) 免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインの5'スプライス供与部位から始まり、かつ後続の免疫グロブリン重鎖膜貫通ドメインエクソンM1の3'スプライス受容部位で終わり、かつインフレーム翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含み、任意で、選択マーカーをコードする核酸をさらに含む、該第1の核酸断片に機能的に連結された第2の核酸断片、
(iii) 膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする、該第2の核酸に機能的に連結された第3の核酸断片
を含み、ヌクレオチド配列
2019532641.tif 000037
が、該第2の核酸断片および該第3の核酸断片と重複する、核酸。
7. 前記関心対象のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、その断片、および免疫グロブリン鎖またはその断片を含む融合ポリペプチドからなるポリペプチドの群より選択される、態様1〜6のいずれかに記載の核酸。
8. 前記関心対象のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖である、態様1〜7のいずれかに記載の核酸。
9. 発現カセットに含まれる、態様1〜8のいずれかに記載の核酸。
10. 前記膜貫通ドメインの断片が膜貫通領域である、態様5〜9のいずれかに記載の核酸。
11. コードされる前記膜貫通ドメインが免疫グロブリン膜貫通ドメインである、態様5〜10のいずれかに記載の核酸。
12. 前記第2の核酸断片が、5'スプライス供与部位を1つだけ含み、かつ3'スプライス受容部位を1つだけ含む、態様5〜11のいずれかに記載の核酸。
13. 前記第2の核酸断片が、免疫グロブリン重鎖CH3またはCH4ドメインをコードするエクソンの後に存在する天然の免疫グロブリン重鎖イントロンであり、該イントロンにおいて少なくとも50個の連続するヌクレオチドが欠失している、態様5〜12のいずれかに記載の核酸。
14. 前記第1の核酸断片が、免疫グロブリン重鎖をコードし、かつ、ゲノム的に組織化された免疫グロブリン重鎖遺伝子の全てのエクソンと、該免疫グロブリン重鎖遺伝子の1つのイントロンを除く全てのイントロンとを含む、態様5〜13のいずれかに記載の核酸。
15. 前記第3の核酸断片が膜貫通ドメインの断片をコードし、該膜貫通ドメインの断片が単一のエクソンによってコードされる、態様5〜14のいずれかに記載の核酸。
16. 前記膜貫通ドメインが、M1-M2-エクソン融合物(ゲノムに介在するイントロンを有さない単一のエクソン)によってコードされる免疫グロブリン膜貫通ドメインである、態様5〜15のいずれかに記載の核酸。
17. 前記免疫グロブリン膜貫通ドメインがcDNAによってコードされる、態様5〜16のいずれかに記載の核酸。
18. 前記第2の核酸断片が、ヒト(hu)免疫グロブリン(Ig)α(アルファ)重鎖、hu Igδ(デルタ)重鎖、hu Igε(イプシロン)重鎖、hu Igγ1、γ2、γ3、およびγ4(γ)重鎖、hu Igμ(ミュー))重鎖、マウスIg重鎖α(アルファ)型、マウスIg重鎖δ(デルタ)型、マウスIg重鎖ε(イプシロン)型、マウスIg重鎖γ1(ガンマ1)型、マウスIg重鎖γ2A(ガンマ2A)型、マウスIg重鎖γ2B(ガンマ2B)型、マウスIg重鎖γ3(ガンマ3)型、およびマウスIg重鎖μ(ミュー)型をコードする核酸の群に基づいている/由来する、態様5〜17のいずれかに記載の核酸。
19. 前記第2の核酸断片が、ヒト免疫グロブリンγ1重鎖、ヒト免疫グロブリンγ2重鎖、ヒト免疫グロブリンγ3重鎖、ヒト免疫グロブリンγ4重鎖、ヒト免疫グロブリンε重鎖(1)、およびヒト免疫グロブリンε重鎖(2)をコードする核酸からなる群より選択される核酸に基づいている/由来する、態様5〜18のいずれかに記載の核酸。
20. 前記第2の核酸断片がSEQ ID NO:11のヌクレオチド配列を有する、態様5〜19のいずれかに記載の核酸。
21. 前記第3の核酸断片がSEQ ID NO:12のヌクレオチド配列を有する、態様5〜20のいずれかに記載の核酸。
22. 前記選択マーカーをコードする核酸が、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする、態様5〜21のいずれかに記載の核酸。
23. 安定にトランスフェクトされた細胞の選択において使用するための、請求項1〜22のいずれかに記載の核酸。
24. 安定にトランスフェクトされた細胞を選択するための、請求項1〜22のいずれかに記載の核酸の使用。
25. (a) 真核細胞に、免疫グロブリン軽鎖用の第1の発現カセットと、態様1〜4および8〜22のいずれかに記載の核酸を含む免疫グロブリン重鎖用の第2の発現カセットとを含む1つまたは複数の核酸をトランスフェクトする工程、
(b) トランスフェクトされた該細胞を、該核酸からのプレmRNAの産生に、該プレmRNAのプロセッシングに、およびプロセッシングされたmRNAから免疫グロブリン重鎖への翻訳に適した条件下で培養する工程であって、トランスフェクトされた該細胞が、該プレmRNAの選択的スプライシングによって可溶性免疫グロブリンおよび原形質膜結合型免疫グロブリンを産生する、工程、ならびに
(c) 免疫グロブリンを発現する細胞であるように、原形質膜結合型免疫グロブリンを有する細胞を選択する工程
を含む、免疫グロブリンを発現する真核細胞を選択するための方法。
26. - 真核細胞に、2種類の核酸を同時にまたは連続してトランスフェクトする工程であって、一方の核酸が、免疫グロブリン軽鎖用の発現カセットを含み、かつ、他方の核酸が、態様1〜4および8〜21のいずれかに記載の核酸を含む免疫グロブリン重鎖用の発現カセットを含む、工程
を含む、態様25に記載の方法。
27. 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、態様25〜26のいずれかに記載の方法。
28. 前記真核細胞が、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K652細胞、BHK細胞、PER.C6（登録商標）細胞、およびHEK細胞からなる群より選択される、態様25〜27のいずれかに記載の方法。
29. 前記真核細胞がCHO細胞である、態様25〜28のいずれかに記載の方法。
30. (a) 第1のマルチクローニング部位、
(b) 態様1〜22のいずれかに記載の核酸、
(c) 第2のマルチクローニング部位
を含む、核酸。
【０１９１】
免疫グロブリン重鎖遺伝子の少なくとも部分的に保持された全ゲノム構成を有する核酸を宿主細胞に導入することによって、一方で可溶性異種ポリペプチドを発現し、他方で原形質膜結合型異種ポリペプチドを発現する細胞が得られる。例えば、2種類の免疫グロブリン変種を得るためには、すなわち、選択的スプライシングを可能にするためには、免疫グロブリン重鎖遺伝子の全ゲノム構成、すなわち、全てのイントロンとエクソンを維持することは必要でない。選択的スプライス部位を機能的な形で維持することだけが必要である。「機能的スプライス部位」とは、5'スプライス供与部位と3'スプライス受容部位を含み、それによって、プレmRNAから、介在する核酸配列の切出しを可能にする核酸配列である。イントロンの認識および切出しは、プレmRNA上の付加的なシス作動性エレメントによって調節されることが多い。これらのエレメントはその機能と位置により、それぞれ、エクソンスプライスエンハンサー(ESE)、エクソンスプライスサイレンサー(ESS)、イントロンスプライスエンハンサー(ISE)、またはイントロンスプライスサイレンサー(ISS)と呼ばれる(参照により本明細書に組み入れられる、Black, D. L., Annu. Rev. Biochem. 72 (2003) 291-336)。
【０１９２】
関心対象のポリペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞を選択するためには、生物学的活性をアッセイすることによる、または関心対象のポリペプチドを認識し、これに結合する抗体を用いた、このような活性に依存しないアッセイ、例えば、ウェスタンブロッティング、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはラジオイムノアッセイを使用することによる、分光学的方法、例えば、蛍光、ELISA、およびその変種などがあるが、それに限定されるわけではない様々な方法を使用することができる。関心対象の原形質膜結合型ポリペプチドは、C末端以外は、関心対象の可溶性ポリペプチドと同じアミノ酸配列と二次構造を有するので、例えば、可溶性変種と同じ抗体を用いて確かめることができる。
【０１９３】
ポリペプチドの原形質膜結合型変種は、これを発現する細胞にしっかりと結び付けられている。従って、原形質膜結合型変種は、関心対象のポリペプチド、例えば、免疫グロブリンを発現するための核酸を首尾良くトランスフェクトされている細胞を単離するためのマーカーとして使用することができる。
【０１９４】
関心対象のポリペプチドの可溶性変種と関心対象のポリペプチドの原形質膜結合型変種との分子比は、50:50超〜100:0未満、または75:25超〜100:0未満、好ましくは、約90:10である。
【０１９５】
他の態様において、(i)選択的スプライシングされるイントロンの5'スプライス部位は、免疫グロブリンをコードする核酸の正常な停止コドンに対して5'側に位置し、(ii)第2の核酸断片は選択的にスプライシング可能な核酸であり、かつ、(iii)5'スプライス部位は時々にしか使用されず、かつ非構成的に使用され、その結果、正常にプロセッシングされた免疫グロブリン、すなわち、可溶性免疫グロブリンと、選択的にプロセッシングされた免疫グロブリン、すなわち、原形質膜結合型免疫グロブリンとの分子比は75：25超〜100：0未満、好ましくは、約90：10の比となる。
【０１９６】
選択的スプライシングによって除去することができる核酸は、ポリペプチドの少なくとも1つの断片をコードする核酸の後にあり、かつ膜貫通ドメインの少なくとも1つの断片をコードする核酸の前にある。1つの態様において、核酸は、第1の核酸断片と第2の核酸断片および/または第2の核酸断片と第3の核酸断片の間に第4の核酸を含む。すなわち、第4の核酸断片は、例えば、第2の核酸断片の後(すなわち、3'スプライス受容部位の後)かつ第3の核酸断片の5'末端の前に位置する。
【０１９７】
関心対象のポリペプチドをコードする核酸と、膜貫通ドメインをコードする核酸との間に位置する選択的にスプライシング可能な核酸を用いて、関心対象のポリペプチドの2種類の変種である、膜貫通ドメインを有さない関心対象のポリペプチドと、膜貫通ドメインを含む関心対象のポリペプチドを発現することができる。関心対象のポリペプチドは、例えば、ホルモン;サイトカイン;増殖因子;受容体リガンド、アゴニストもしくはアンタゴニスト;細胞障害剤;抗ウイルス剤;イメージング剤;酵素阻害剤;酵素アクチベーターもしくは酵素活性モジュレーター、例えば、アロステリック物質;免疫グロブリン;またはその融合物もしくは断片より選択することができるが、それに限定されるわけではない。1つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン融合物である。
【０１９８】
本発明は、選択的にスプライシング可能な核酸がはめ込まれている限り、任意の関心対象のポリペプチド、任意の膜貫通ドメイン、および任意のGPIアンカーに対するシグナルペプチドを用いて実施することができる。さらに詳細には、5'スプライス供与部位で始まり、3'スプライス受容部位で終わる核酸断片を適切に選択しなければならない。先行するポリペプチドと、後続の膜貫通ドメインまたはGPIアンカーは自由に選択することができる。
【０１９９】
以下の実施例、配列、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明する手法において修正を実施できることが理解されよう。
【実施例】
【０２００】
実施例1
ゲノム断片のクローニングおよび真核生物sIgG/mIgG発現プラスミドの構築
(a) sIgG発現プラスミドpIgGの構築
タンパク質抗原に対して結合特異性を有する免疫グロブリンを発現するためにプラスミドを構築した。このプラスミドは、免疫グロブリンの分泌型sIgGをコードし、以下のエレメントを含む。
1. - ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
- コザックコンセンサス配列(Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15 (1987) 8125-48)を含む合成の5'非翻訳領域、
- シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- 該タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の可変重鎖cDNA、
- CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および分泌型IgG1の重鎖に対するポリアデニル化部位を含む隣接3'非翻訳領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1(IGHG1)遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2
から構成される、ヒトガンマ(γ)1重鎖の転写単位。
重鎖定常領域のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:16に報告した。プラスミドpIgGによってコードされるγ鎖定常領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:17に報告した。
2. - ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
- コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
- シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の可変κ鎖cDNA、
- ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
- ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトカッパ(κ)軽鎖の転写単位。
3. 哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２０１】
(b) sIgG/mIgG発現プラスミドpmIgGの構築
エクソンCH3の下流にあるイントロン(イントロン6)の主要部分、エクソンM1、エクソンM1の下流にあるイントロン(イントロン7)、エクソンM2、およびγ1鎖の膜結合型に対するポリアデニル化シグナルを含む隣接3'非翻訳領域(3'UTR)を含む、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1(IGHG1)遺伝子座の5.2kbゲノム断片を、Expand Long Template PCR System(Roche Diagnostics GmbH, Germany)と以下の表に指定するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによってヒトゲノムDNA(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)から増幅した。
2019532641.tif 000038
*SphI部位の変異誘発のために変化したヌクレオチドを小文字で示している。
【０２０２】
増幅された断片は、「ホモ・サピエンス(Homo sapiens)第14染色体ゲノムコンティグ」(NCBIアクセッション：NT_026437、逆相補鎖)のヌクレオチド87203513-87208691に対応する。サブクローニングしたPCR産物の配列決定により、対応する第14染色体配列と比べて98パーセントの同一性が明らかになり、差異は全てイントロンまたは3'非翻訳領域(3'UTR)中に存在した。エクソンM2停止コドンの219bp下流のSphI制限部位を、上記の表に指定するオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、PCRに基づいた部位特異的変異誘発によって破壊した。次いで、SphI制限部位を介して免疫グロブリンγ1鎖発現プラスミドpIgGの中にクローニングすることによって、この断片をイントロン6の5'隣接部分と結合させ、それによって、ゲノム的に組織化された完全なγ1鎖転写単位を得た。サブクローニングすることによって、タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の分泌型(sIgG)および膜結合型(mIgG)をコードする真核生物発現プラスミドpmIgGを構築した。このプラスミドは、以下のエレメントを含む。
1. - ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
- コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
- シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の可変重鎖cDNA、
- CH1-M2のエクソンと全ての介在イントロン、イントロン6中の分泌型IgG1に対するポリアデニル化部位、および膜結合型IgG1に対するポリアデニル化部位を含む3'UTRを含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1(IGHG1)遺伝子と結合された、JH3-JH4スイッチ領域に由来するマウスIgミュー(μ)エンハンサー(Banerji, J., et al., Cell 33 (1983) 729-740; Gillies, S.D., et al., Cell, 33 (1983) 717-728)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2
から構成される、ヒトγ1重鎖の前述した転写単位。
ゲノム的に組織化された重鎖定常領域のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:26に報告した。プラスミドpmIgGによってコードされるγ鎖定常領域の短い(sIgG)アイソフォームまたは長い(mIgG)アイソフォームのアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:27またはSEQ ID NO:28に報告した。
2. - ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
- コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
- シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の可変κ鎖cDNA、
- ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー(Emorine, L., et al., Nature 304 (1983) 447-449; Picard, D., and Schaffner, W., Nature (1984) 307, 80-82)、および
- ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'UTR
から構成される、ヒトカッパ(κ)軽鎖の転写単位。
3. 哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるベータ(β)-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２０３】
(c) sIgG/mIgG発現プラスミドpmIgGΔ-Bの構築
実施例1(b)に記載したものと同様のやり方で、エクソンCH3の下流にあるイントロン(イントロン6)の主要部分とエクソンM1を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ3(IGHG3)遺伝子座の1.1kbゲノム断片をPCR増幅した(オリゴヌクレオチドについては上記の表を参照されたい)。この断片は「ホモ・サピエンス第14染色体ゲノムコンティグ」(NCBIアクセッション：NT_026437、逆相補鎖)のヌクレオチド87235195-87236300に対応し、98パーセントの配列同一性をもつ。サイレントな、従って、コードされるアミノ酸配列を変えない、エクソンM1内の1ヌクレオチド交換を除く全ての差異が該イントロンの中に存在した。同様に、エクソンM2と、γ4鎖の膜結合型に対するポリアデニル化シグナルを含む隣接3'非翻訳領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ4(IGHG4)遺伝子座の1.6kbゲノム断片をPCR増幅した(オリゴヌクレオチドについては上記の表を参照されたい)。この断片は「ホモ・サピエンス第14染色体ゲノムコンティグ」(NCBIアクセッション：NT_026437、逆相補鎖)のヌクレオチド87087786-87089377に対応し、98パーセントの配列同一性をもつ。差異は全て3'UTR中に存在した。エクソンM2停止コドンの212bp下流のSphI部位を、PCRに基づいた部位特異的変異誘発によって破壊した。両断片をM1とM2との間で結合し、PCR増幅し(オリゴヌクレオチドについては上記の表を参照されたい)、次いで、イントロン6中のSphI部位によってγ1鎖発現プラスミドにクローニングし、それによって、M1とM2との間のイントロン(イントロン7)を欠いているゲノム構成を有するハイブリッドγ1-γ3-γ4鎖発現カセットを得た。サブクローニングすることによって、タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の分泌型sIgGおよび膜結合型mIgGをコードする真核生物発現プラスミドpmIgGΔ-Bを構築した。該プラスミドは、以下のエレメントを含む(図12も参照されたい)。
1. - ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
- コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
- シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の可変重鎖cDNA、
- CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および免疫グロブリンの分泌型に対するポリアデニル化部位を含むイントロン6の隣接5'部分を含むヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2、
- ヒトIGHG3遺伝子に由来するイントロン6の3'部分およびエクソンM1、ならびに
- ヒトIGHG4遺伝子に由来する免疫グロブリンのエクソンM2およびその膜結合型に対するポリアデニル化部位を含む3'非翻訳領域
から構成される、ハイブリッドγ1-γ3-γ4重鎖の上述の転写単位。
重鎖定常領域のゲノム構成を図13に図示し、ヌクレオチド配列をSEQ ID NO:06に報告した。プラスミドpmIgGΔ-Bによってコードされるγ鎖定常領域の短い(sIgG)アイソフォームまたは長い(mIgG)アイソフォームのアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:07またはSEQ ID NO:08に報告した。
2. - ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
- コザックコンセンサス配列を含む合成5'UTR、
- シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- タンパク質抗原に対して結合特異性を有する抗体の可変κ鎖cDNA、
- ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
- ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. 哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２０４】
(d) 3'-スプライス部位変異を有するsIgG/mIgG用のsIgG/mIgG発現プラスミドpmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)の構築
重鎖イントロン6の3'-スプライス部位領域内の点変異の点でプラスミドpmIgGΔ-Bと異なる3種類の発現プラスミドを設計した。プラスミド「pmIgGΔ-mut-bp」を作製するために分岐点の近くの2つの塩基対を交換した。プラスミド「pmIgGΔ-mut-p(Y)」については、ポリピリミジントラクト内の4塩基対を交換した。そして、プラスミド「pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)」については、分岐点の変異とポリピリミジントラクトの変異の両方を組み合わせた。全変異を標準的な部位特異的変異誘発とクローニングの手法によってpmIgGΔ-Bに挿入した。プラスミドpmIgGΔ-Bにおける、この領域のDNA配列と、プラスミドpmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、およびpmIgGΔ-mut-bp-p(Y)における挿入された変異を以下の表に列挙した(変異塩基対を太字で強調した。上の横列は、イントロン6の3'断片、3'-スプライス部位(縦線で図示した)、およびエクソンM1-M2の5'断片の位置を示す。下の横列は、Zhang, M., Hum. Mol. Genet. 7 (1998) 919によって報告されたような、分岐点、ポリピリミジントラクト、および3'-スプライス部位を含む、この領域のコンセンサス配列を示す)。
2019532641.tif 000039
【０２０５】
(e) 3'-スプライス部位変異を有するsIgG/mIgG用のsIgG/mIgG発現プラスミドpmIgGΔ-mut-ESEの構築
推定エクソンスプライスエンハンサー(ESE)部位を特定するために、プラスミドpmIgGΔ-Bからの50塩基対のDNA配列を分析した。この領域は、5'から3'方向に、イントロン6の最後の8塩基対と、エクソンM1-M2の42の隣接する塩基対にまたがっている。ヒトSRタンパク質SF2/ASF、SC35、SRp40、および SRp55の推定ESE部位を、コンピュータプログラム「ESEfinder」(L. Cartegni et al., Nucleic Acids Res 31, 3568 (2003)を用いて探索した。このプログラムは、以下の表に示したように2.04536〜5.53775のスコアをもつ11の推定ESE部位を特定した(上の部分は、プラスミドpmIgGΔ-B中のエクソンM1-M2の5'末端近くの50塩基対のDNA配列を示す。下の部分は、4種類のヒトSRタンパク質について特定された、この領域中の推定ESE部位、その位置およびDNA配列、ならびにスコアによる評価を示す)。
2019532641.tif 000040
【０２０６】
推定ESE部位を除去する9つの塩基対交換がインシリコで特定された。そのため、エクソンM1-M2によってコードされるアミノ酸配列を変えないサイレント変異を選択することを考慮に入れた。改変された配列をESEfinderプログラムを用いて分析した。改変されていない配列と比較して、3未満のスコアをもつ推定ESE部位は2つしか特定されなかった。これらのインシリコ結果に基づいて、部位特異的変異誘発とDNAクローニングの標準的な方法を用いて、プラスミドpmIgGΔ-Bにおいて9つの塩基対を交換した。改変されたプラスミドをpmIgGΔ-mut-ESEと呼んだ。以下の表は、改変された配列とESEfinderプログラム結果を示す(上の部分は、プラスミドpmIgGΔ-mut-ESE中のエクソンM1-M2の5'末端近くの50塩基対DNA配列を示す。pmIgGΔ-Bと比較した9つの変異塩基対を太字で強調した。下の部分は、4種類のヒトSRタンパク質について特定された、この領域中の推定ESE部位、その位置およびDNA配列、ならびにスコアによる評価を示す)。
2019532641.tif 000041
【０２０７】
(f) イントロン6に付加ポリ(A)部位を有するsIgG/mIgG発現プラスミドpmIgGΔ-SV40-p(A)の構築
sIgGを生合成するために、重鎖のプレmRNAがイントロン6内のポリアデニル化部位でポリアデニル化される。この工程は、mIgGアイソフォームの作製するためのスプライシングによるイントロン6の除去と競合する。初期ポリアデニル化を促すために、付加ポリアデニル化部位をイントロン6に付加した。
【０２０８】
プラスミドpmIgGΔ-SV40-p(A)をクローニングするために、シミアンウイルス40(SV40)の初期ポリアデニル化部位を含む153bpの断片を、プラスミドpmIgGΔ-Bのイントロン6に、エクソンCH3の停止コドンの71bp下流に挿入した。比較として、ウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化部位を含む237bp断片をプラスミドpmIgGΔ-Bの同じ位置に挿入することによってプラスミドpmIgGΔ-BGH-p(A)をクローニングした。このプラスミドは標準的な分子生物学的方法を用いて構築した。
【０２０９】
図1は、pmIgGΔ-Bにおける重鎖のイントロン6領域の概要と、前記のプラスミドの改変された特徴の位置を示す。
【０２１０】
膜結合型IgGに細胞内選択マーカーが連結されている発現ベクターの構築
(g) 抗体軽鎖用の発現プラスミド
抗体軽鎖を発現するためにプラスミドpIgG-LCを構築した。プラスミドpIgG-LCは、以下のエレメントを含む。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 ヒト免疫グロブリンκ可変領域3-11(IGKV3-11)遺伝子の5'非翻訳領域、
1.3 1.3.1 IGKV3-11のリーダーペプチドのcDNA、
1.3.2 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変軽鎖cDNA、
1.3.3 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子のcDNA
を含む、免疫グロブリンκ軽鎖のコード配列、
1.4 IGKCのポリアデニル化部位を含む3'非翻訳領域
から構成される、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖の転写単位。
2. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
3. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２１１】
(h) sIgGおよびmIgG-Puro融合タンパク質用の発現プラスミド
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)は、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgG型と、その膜貫通融合変種を発現するために設計した。この変種は、sIgG型、およびmIgG重鎖とピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼの融合タンパク質と同じ軽鎖を含む。これらの2種類の抗体型は、mIgGについて述べたように重鎖融合タンパク質のプレmRNAの選択的プロセッシングによって生じるはずである。さらに、発現プラスミドpmIgGΔ-mut-p(Y)について述べたように4塩基対を交換することによって重鎖のイントロン6のポリピリミジントラクトを変異させた。上記を参照されたい。
【０２１２】
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)は、以下のエレメントからなる。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
1.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
1.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA、
1.5 CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および免疫グロブリンの分泌型に対するポリアデニル化部位を含むイントロン6の隣接5'部分を含む、ヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2、
1.6 プラスミドpmIgGΔ-mut-p(Y)について下記の表に列挙したポリピリミジントラクト内での4つの塩基対交換を含む、ヒトIGHG3遺伝子に由来するイントロン6の3'部分、
1.9 ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼcDNAと連結した、
1.8 ヒトIGHG4遺伝子に由来するエクソンM2と連結した、
1.7 ヒトIGHG3遺伝子に由来するエクソンM1、
1.10 シミアンウイルス40のポリアデニル化部位
から構成される、上述のsIgG重鎖またはmIgG重鎖およびピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼの融合タンパク質の転写単位。
2. 2.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
2.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
2.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
2.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変κ鎖cDNA、
2.5 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
2.6 ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
4. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２１３】
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)の構築を図6に図示した。
【０２１４】
(i) sIgGおよびピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
プラスミドpIgG-Puroは、対照プラスミドとして、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgG型と、独立した発現カセットによってコードされるピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼを発現するために設計した。このプラスミドは、以下のエレメントを含む。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
1.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
1.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA、
1.5 CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および分泌型IgG1の重鎖に対するポリアデニル化部位を含む隣接3'非翻訳領域を含むヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2
から構成される、sIgG重鎖の転写単位。
2. 2.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
2.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
2.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
2.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変κ鎖cDNA、
2.5 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
2.6 ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. SV40プロモーター、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼcDNA、およびSV40ポリアデニル化部位を含む、哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２１５】
プラスミドpIgG-Puroの構築を図7に図示した。
【０２１６】
(j) sIgGおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
プラスミドpIgG-Neoは、実施例6に記載のように従来のやり方で、改善した発現細胞株を作製するために設計した。このプラスミドは、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgGアイソフォームの重鎖および軽鎖と、独立した発現カセットによってコードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。このプラスミドは、以下のエレメントを含む。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
1.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
1.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA、
1.5 CH1-CH3のエクソンと全ての介在イントロン、および分泌型IgG1の重鎖に対するポリアデニル化部位を含む隣接3'非翻訳領域を含むヒトIGHG1遺伝子と結合されたマウスIgμエンハンサー(JH3-JH4スイッチ領域)を含む、マウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2
から構成される、sIgG重鎖の転写単位。
2. 2.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
2.2 コザックコンセンサス配列を含む合成の5'非翻訳領域、
2.3 シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
2.4 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変κ鎖cDNA、
2.5 ヒト免疫グロブリンκ定常領域(IGKC)遺伝子と結合されたマウスイントロン2 Igκエンハンサー、ならびに
2.6 ポリアデニル化部位を含むヒトIGKC遺伝子3'非翻訳領域
から構成される、ヒトκ軽鎖の転写単位。
3. SV40プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼcDNA、およびSV40ポリアデニル化部位を含む、哺乳動物細胞の選択可能なマーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ転写単位。
4. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点。
5. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０２１７】
プラスミドpIgG-Neoの構築を図8に図示した。
【０２１８】
(k) mIgGおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
このプラスミドは、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgGアイソフォームの重鎖と、独立した発現カセットによってコードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。このプラスミドは、以下のエレメントを含む(図3を参照されたい)。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域3-33遺伝子(IGHV3-33)の5'非翻訳領域、
1.3 1.3.1 IGHV3-33のリーダーペプチド(L)のcDNA、
1.3.2 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA(VH)、
1.3.3 エクソンCH1-CH3に由来するヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1遺伝子(IGHG1)のcDNA、
1.3.4 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ3遺伝子(IGHG3)のエクソンM1のcDNA、
1.3.5 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ4遺伝子(IGHG4)のエクソンM2のcDNA、
1.3.6 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするcDNA(Neo)
を含む、融合タンパク質のコード配列、
1.4 シミアンウイルス40のポリアデニル化部位(SV40ポリ(A))
から構成される、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼに連結した重鎖のmIgG型の融合タンパク質の転写単位。
2. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点(pUC ori) 。
3. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子(Amp)。
【０２１９】
(l) mIgGおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
このプラスミドは、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgGアイソフォームの重鎖と、独立した発現カセットによってコードされるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。このプラスミドは、以下のエレメントを含む(図4を参照されたい)。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域3-33遺伝子(IGHV3-33)の5'非翻訳領域、
1.3 1.3.1 IGHV3-33のリーダーペプチド(L)のcDNA、
1.3.2 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA(VH)、
1.3.3 エクソンCH1-CH3に由来するヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1遺伝子(IGHG1)のcDNA、
1.3.4 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ3遺伝子(IGHG3)のエクソンM1のcDNA、
1.3.5 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ4遺伝子(IGHG4)のエクソンM2のcDNA、
1.3.6 ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(Hyg)をコードするcDNA
を含む、融合タンパク質のコード配列、
1.4 シミアンウイルス40のポリアデニル化部位(SV40ポリ(A))
から構成される、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼに連結した重鎖のmIgG型の融合タンパク質の転写単位。
2. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点(pUC ori)。
3. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子(Amp)。
【０２２０】
(m) mIgGおよびピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ用の発現プラスミド
このプラスミドは、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体のsIgGアイソフォームの重鎖と、独立した発現カセットによってコードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。このプラスミドは、以下のエレメントを含む(図5を参照されたい)。
1. 1.1 ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
1.2 ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域3-33遺伝子(IGHV3-33)の5'非翻訳領域、
1.3 1.3.1 IGHV3-33のリーダーペプチド(L)のcDNA、
1.3.2 タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の可変重鎖cDNA(VH)、
1.3.3 エクソンCH1-CH3に由来するヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ1遺伝子(IGHG1)のcDNA、
1.3.4 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ3遺伝子(IGHG3)のエクソンM1のcDNA、
1.3.5 ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域γ4遺伝子(IGHG4)のエクソンM2のcDNA、
1.3.6 ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするcDNA(Puro)
を含む、融合タンパク質のコード配列、
1.4 シミアンウイルス40のポリアデニル化部位(SV40ポリ(A))
から構成される、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼに連結した重鎖のmIgG型の融合タンパク質の転写単位。
2. 大腸菌におけるプラスミド複製用のプラスミドpUC18に由来する複製起点(pUC ori)。
3. 大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子(Amp)。
【０２２１】
実施例2
トランスフェクションおよびプール選択
懸濁培養での無血清増殖に予め順応させたCHO-K1細胞(ATCC No. CCL-61; Puck, T.T., et al., J. Exp. Med. 108 (1958), 945-956)を、懸濁フラスコに入れて8mM L-アラニル-L-グルタミン(Invitrogen)および1×HTサプリメント(Invitrogen)を加えたProCHO4-CDM培地(Cambrex)中で37℃、5％CO2、および湿度95％で培養した。3〜4日毎に、細胞を2×105細胞/mlで分割して新鮮な培地に入れる。トランスフェクションのために、エレクトロポレーションによって室温、200μlのPBSの総体積中で7.5×106個の細胞につき20μgのプラスミドDNAを細胞に導入する。エレクトロポレーションは、Gene Pulser X Cellエレクトロポレーション装置(BioRad)を用いて、2mmギャップキュベットの中で15ms間にシングル160Vパルスを使用する方形波プロトコールを用いて行う。細胞に、直線化したプラスミドpmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)、pmIgGΔ-mut-ESE、pmIgGΔ-SV40p(A)、pmIgGΔ-BGH-p(A)、またはpmIgGΔ-Bをトランスフェクトした。その後に、安定にトランスフェクトされた細胞を選択するために、トランスフェクションの1日後に700μg/ml G418(Roche Applied Science)を培養物に加えて約3週間にわたって、上記で指定した培地中で各トランスフェクションの細胞をプールとして培養した。
【０２２２】
実施例3
ノーザンブロット分析
一次転写物の選択的RNAプロセッシングによって生じる2種類の重鎖アイソフォームの比を明らかにするために、安定にトランスフェクトされたクローンのRNAをノーザンブロットによって分析した。従って、実施例2に記載した7つの安定にトランスフェクトされた細胞プールから全RNAをRNeasyキット(QIAGEN)を用いて単離した。さらに、トランスフェクトされていないCHO-K1細胞のRNAを同じ条件下で調製した。次いで、それぞれの場合において10μgの全RNAを変性アガロースゲル電気泳動で分画し、NorthernMax System (Ambion)を用いてナイロンメンブレンに転写した。ブロットメンブレンのハイブリダイゼーションのために、2つの異なるDNAプローブを、DECAprime IIキット(Ambion)を用いてランダムプライミング(random priming)法によって[α-32P]で標識した。図2Bに図示したように、プローブ1は、エクソンCH1とCH3との間の重鎖mRNAに相補的であり、従って、両アイソフォームにハイブリダイズする。対照的に、プローブ2は長いmIgG重鎖mRNAの3’UTRにしか結合しない。メンブレンのハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄の後に、ブロットをオートラジオグラフィーによって分析した(図2Aを参照されたい)。
【０２２３】
プローブ1とのハイブリダイゼーションは、トランスフェクトされた細胞プールについては1.8kbシグナルを示し、これは、sIgGの重鎖をコードする短いmRNAアイソフォームに対応する。レーン1、2、4、および7では3.3kbのさらなるシグナルが検出される。このバンドは、プローブ2とのハイブリダイゼーションによって明らかにされるように(レーン9、10、12および15)、mIgGの長いmRNAアイソフォームを表している。分析されたプールは、プローブ1によって検出される1.8kbバンド〜3.3kbバンドの相対シグナル強度の点で異なる。プラスミドpmIgGΔ-BをトランスフェクトしたCHO-K1細胞のプールは2種類のアイソフォームについて約50:50の比を示す。重鎖イントロン6の3'-スプライス部位領域でのプラスミド改変はプレRNAプロセッシングに影響を及ぼす。pmIgGΔ-mut-bp、pmIgGΔ-mut-p(Y)、またはpmIgGΔ-mut-ESEをトランスフェクトしたプールについてはsIgGアイソフォームへの大きなシフトが観察される。pmIgGΔ-mut-bp-p(Y)、pmIgGΔ-SV40-p(A)、またはpmIgGΔ-BGH-p(A)をトランスフェクトしたプールでは、mIgGアイソフォームはプローブ1を用いても、もっと感度が高いプローブ2を用いても検出されなかった。このことから、これらのプラスミドにおける改変はエクソンCH3とエクソンM1-M2のスプライシングを完全にブロックすることが分かる。
【０２２４】
実施例4
mIgGに連結された様々なマーカーの機能分析
このアッセイでは、抗体重鎖と、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、またはピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質が安定トランスフェクションの選択可能なマーカーとして適しているかどうか試験した。従って、CHO K1細胞に、抗体軽鎖を発現するプラスミドpIgG-LCと、mIgG重鎖の細胞内C末端が選択可能なマーカーと融合しているものを発現するpmIgG-HC-Neo、pmIgG-HC-Hyg、またはpmIgG-HC-Puroをコトランスフェクトした。該細胞に、リン酸カルシウム沈殿法を用いて等モル量のコトランスフェクト用プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、
・pIgG-LCとpmIgG-HC-Neoとを用いたコトランスフェクションの場合には、600μg/mlネオマイシン、または
・ pIgG-LCとpmIgG-HC-Hygととを用いたコトランスフェクションの場合には、300μg/mlハイグロマイシン、または
・pIgG-LCとpmIgG-HC-Puroを用いたコトランスフェクションの場合には、8μg/mlピューロマイシン
を含む対応する選択培地に、該細胞を移した。
【０２２５】
前記細胞を選択培地中で約2週間培養した。並行して、トランスフェクトされていないCHO K1細胞を対照として、それぞれの選択培地中で培養した。3種類全てのトランスフェクションが、それぞれの融合タンパク質を安定して発現する細胞を生じ、選択圧下で生き残った。対照的に、トランスフェクトされていない細胞はネオマイシン選択圧下またはピューロマイシン選択圧下では完全に死滅し、ハイグロマイシン選択圧下では部分的に死滅した。
【０２２６】
実施例5
プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)を用いた安定トランスフェクションのための選択圧
発現プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)は、抗体のsIgG型ならびにmIgG-Puro融合タンパク質を発現するために設計した。安定トランスフェクションに適した選択圧を見つけるために、CHO DG44細胞にエレクトロポレーションによってpmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトし、2％γ線照射済み胎仔ウシ血清(Gibco)、4mM Ultra glutamine(Cambrex)、およびHTサプリメント(Gibco)を加えたHyQ SFM4CHO utility medium(Hyclone)の中で培養した。トランスフェクションの1日後に、pmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトした細胞を5つの異なる細胞プールに分割し、それぞれ、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、または12μg/mlのピューロマイシンを添加した。対照として、CHO DG44細胞にプラスミドpIgG-Puro(sIgGアイソフォームのみ)をトランスフェクトし、2μg/mlピューロマイシンの選択圧を用いて培養した。全プールにおいて選択圧を3週間にわたって保った。その後、さらに、プールを、ピューロマイシンなしの培養培地中で12日間増大させた。バッチアッセイにおけるプールを比較するために、各プールを総体積30mlで1ml当たり4*105個で播種し、振盪フラスコに入れて培養した。2日後、3日後、4日後、および7日後に細胞数を計数することによって増殖挙動をモニタリングした(図9Aを参照されたい)。2〜6μg/mlピューロマイシンを用いて作製した細胞プールと対照プールは4日以内に1.7*106細胞/mlを上回る細胞数まで増殖したことが観察されたに対して、8〜12μg/mlピューロマイシン選択圧からのプールは最大約1.2*106細胞/mlまで、ゆっくりとした増殖を示した。産生力分析のために、各プールの試料を開始時に、ならびに2日後、3日後、4日後、および7日後に採取した。上清中のsIgG濃度をELISAによって求めた(図9Bを参照されたい)。7日以内に、対照プールと2μg/mlピューロマイシンプールは300ng/ml未満の力価に達した。これより高い選択圧の下で作製した他の全てのプールは、これより大幅に高いsIgG発現を示した。最も高い産生力は、sIgG力価が2.46μg/mlであった8μg/mlピューロマイシンプールにおいて観察され、これに、上清中に2.36μg/ml sIgGがあった4μg/mlピューロマイシンプールが続いた。8μg/mlピューロマイシンプールは約1/2の生細胞密度に達したので、このことは、各細胞の比産生力が、4μg/mlピューロマイシンプールと比較して約2倍の大きさであったことを意味する。
【０２２７】
このバッチアッセイと並行して、CHO DG44細胞に、前記のようにプラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)またはプラスミドpIgG-Puro(対照)をトランスフェクトし、トランスフェクションの1日後に96ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングした。細胞プールと同様に、プレーティング培地は、pmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトした細胞の場合は2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、または12μg/mlのピューロマイシンを含み、pIgG-Puroをトランスフェクトした細胞の場合は2μg/mlピューロマイシンを含んだ。アプローチのたび毎に細胞を2つの96ウェルプレートにプレーティングした。2μg/mまたは4μg/mlのピューロマイシン選択の場合は1ウェル当たり1000個の細胞を使用し、6μg/ml、8μg/ml、または12μg/mlのピューロマイシン選択の場合は1ウェル当たり2000個の細胞を使用した。約2週間後に、得られたクローンの数を計数した(下記の表を参照されたい)。pmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトし、2μg/mlまたは4μg/mlのピューロマイシンを含む培地を用いて培養した細胞は、pIgG-Puroを用いた対照トランスフェクションと同じ範囲内で多数のクローンを生じた。6μg/mlピューロマイシンの選択圧下またはそれを上回る選択圧下で生き残ったクローンはごくわずかしかなかった(1〜3個)。
【０２２８】
（表）プラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトしたCHO DG44細胞に対するピューロマイシン選択圧の評価
2019532641.tif 000042
【０２２９】
まとめると、4〜6μg/mlピューロマイシンは、pmIgG-Puro-mut-p(Y)発現プラスミドをトランスフェクトしたCHO DG44細胞株を開発するための最適な選択圧範囲であると突き止められた。この範囲内で、十分な数の安定クローンが作製可能であり、細胞プールは適切な増殖挙動と産生力を示す。
【０２３０】
実施例6
mIgG-ピューロマイシン選択システムを適用した抗体発現細胞株の改善
(a) mIgG-ピューロマイシン選択システム
このアプローチでは、mIgG-ピューロマイシン選択システムを用いることで既存の抗体発現細胞株が改善されるはずである。従って、3つの独立した発現カセット:1.タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖用、2.タンパク質抗原に特異的に結合する抗体の重鎖用、および3.選択マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼ用を含むプラスミドによるCHO DG44細胞の安定トランスフェクションによって開発された懸濁細胞株1D5を使用した。これに従って、選択剤としてメトトレキセート(MTX)を用いて安定細胞株1D5を作製した。このクローンを、振盪フラスコに入れて、4mMグルタミン、2g/lダイズペプトン、10nM MTX、0.1％HyQ LS1000(コレステロールサプリメント)、および50ng/ml IGF-1 LongR3(インシュリン様増殖因子)を含む培地中で培養した。
【０２３１】
抗体産生力を高めるために、クローン2D3にエレクトロポレーションによってプラスミドpmIgG-Puro-mut-p(Y)をトランスフェクトした。このプラスミドは、クローン1D5によって既に発現されている同じ抗体のsIgGアイソフォームをコードする。さらに、このプラスミドはmIgGピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードし、従って、選択剤としてピューロマイシンの使用を可能にする。トランスフェクションの1日後に、前記細胞を、4〜6μg/mlピューロマイシンが溶解した培地を含む48個の96ウェルプレートに播種し、下記の表に記載のように1ウェル当たり500〜4000個の細胞を用いた。全体的に見て、403個のクローンが選択圧下で現れ、これらの大部分が、最も高いピューロマイシン濃度(6μg/ml)と最も多い播種細胞数(1ウェル当たり4000個の細胞)を用いたアプローチで現れた。クローンの抗体発現を確かめるためにスクリーニングを行わなかった。その代わりに、さらなる培養増大のために160個のクローンをランダムに選択し、20個のクローンに4μg/mlピューロマイシンを使用し、20個のクローンに5μg/mlピューロマイシンを使用し、120個のクローンに6μg/mlピューロマイシンを使用した(以下の表を参照されたい)。
【０２３２】
（表）96ウェルプレートにおけるピューロマイシン選択によって作製した安定にトランスフェクトされたクローンの分布
2019532641.tif 000043
【０２３３】
152個の増大させたクローンの増殖および産生力をバッチアッセイで評価した。従って、細胞を4mlの培地に4*105細胞/mlで播種し、振盪された6ウェルプレートの中で7日間培養した。生細胞密度と上清中でのsIgG力価を測定するために試料を採取した。152個のクローンのうち、十分な増殖と産生力を示した39個を振盪フラスコに入れてさらに増大させ、流加アッセイにおいて評価した(実施例7を参照されたい)。細胞株開発プロセスのワークフローを図10Aに図示した。
【０２３４】
(b) 標準アプローチ
mIgG-ピューロマイシン選択システムと標準アプローチを比較するために、クローン1D5にプラスミドpIgG-Neoをトランスフェクトして、改善した発現細胞株を作製した。このプラスミドは、タンパク質抗原に特異的に結合する抗体(sIgGアイソフォーム)の重鎖および軽鎖と、選択マーカーとして、独立した発現カセットによってコードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。トランスフェクションの後に、該細胞を120個の384ウェルプレートにプレーティングし(約42,000の穴に播種した)、10nM MTXおよび400μg/ml G418の選択圧下で培養した。新たに出現したクローンを、トランスフェクションの2週間後に、細胞培養上清中のIgG濃度を測定するハイスループットスクリーニングELISAで評価した。結果に基づいて、768個のクローンを96ウェルプレートに移した。クローンをハイスループットELISAによって再スクリーニングし、さらなる増大のために、IgG力価が高い88個のクローンを選択した。3回目のクローンスクリーニングを、6ウェルプレートに、規定された細胞数で播種した88個のクローンを用いて行った。培養して7日後に、IgG濃度をプロテインA HPLCによって測定した。十分な増殖と産生力を示した30個のクローンを振盪フラスコ形式までの培養のために選択し、流加アッセイにおいて評価した(実施例7を参照されたい)。細胞株開発プロセスのワークフローを図10Bに図示した
【０２３５】
実施例7
mIgG-ピューロマイシン選択マーカーを用いて作製したクローンの流加分析
mIgG-ピューロマイシン選択プロセスから得た39個のクローンを(実施例6に記載のように)振盪フラスコに入れて増大させ、流加アッセイで評価した。各細胞株を培養培地66mlに1ml当たり4*105個の細胞で播種し、振盪条件下で培養した。開始して3日後から、2mlの供給材料を各クローンに毎日添加した。さらに、クローンに、グルコースを2g/l超の培養培地中濃度を保つように供給し、グルタミンを0.1g/l超に保つように供給した。数日経ってから、生細胞密度と上清中でのsIgG力価を測定するために試料を採取した。IgG濃度をプロテインA HPLC分析によって求めた。図11Aは、流加培養して17日後の全クローンの最終IgG力価を示す。さらに評価するために、高い産生力を示した7個のクローンを選択した。第2の流加アッセイにおいて、選択したクローンを親クローン1D5と比較して分析した。再度、17日後の最終力価をプロテインA HPLCによって求めた。同様に、標準アプローチ(実施例6を参照されたい)によって作製した上位7個のクローンを1D5と一緒に流加アッセイにおいて同等の条件下で評価した。クローン1D5の産生力を2回の追加の流加操作において再試験した(図11Bを参照されたい)。選択マーカーとしてmIgG-ピューロマイシンを用いて作製した7個のクローンは全て、親クローン1D5と比較して抗体発現の明らかな改善を示した。さらに、全クローンの抗体価は、標準アプローチのクローンについて求めた力価より大幅に大きかった。全体的に見て、これはmIgG-ピューロマイシン選択システムの効率が高いことを示している。なぜなら、試験したクローンは、160個のランダムに選択したクローンに由来し、標準アプローチクローンよりもかなり少ない労力で選択されたからである(図10を参照されたい)。
【０２３６】
実施例8
ELISAによるIgG濃度の決定
捕捉試薬としてビオチン化抗ヒトIgG F(ab')2断片を使用し、検出用にペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgG F(ab')2抗体断片を使用するサンドイッチELISAによって細胞培養上清中の免疫グロブリン濃度を決定した。
【０２３７】
ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート(Pierce Reacti-Bind(商標)Streptavidin Coated Polystyrene Strip Plates、コード番号15121)を、室温(RT)で1時間、振盪しながらインキュベートすることによって、希釈緩衝液(希釈緩衝液：0.5％重量/体積(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBS緩衝液)に溶かした0.5μg/mlのビオチン化ヤギポリクローナル抗ヒトIgG F(ab')2抗体断片(F(ab')2<h-Fcγ>Bi; Dianova, Germany、コード番号109-066-098)捕捉抗体(0.1ml/ウェル)でコーティングした。その後、0.3mlより多い洗浄緩衝液(洗浄緩衝液：1％(w/v)Tween 20を含むPBS)でプレートを3回洗浄した。IgGを含む細胞培養上清(試料)を濃度0.5〜20ng/mlまで希釈緩衝液中で系列希釈(2倍)し、ウェルに添加し、振盪しながら室温で1時間インキュベートした。希釈緩衝液に溶かした精製標準抗体(0.5〜20ng/ml)を、IgGタンパク質の検量線を作成するために使用した。0.3ml/ウェルの洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄した後、ヤギポリクローナル抗ヒトF(ab')2特異的IgG(F(ab')2<h-Fcγ>POD; Dianova, Germany、コード番号109-036-098)のペルオキシダーゼ結合F(ab')2断片を用いて、抗ヒトFcγに結合した複合体を検出した。0.3ml/ウェルの洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄した後、ABTS(登録商標)(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)ペルオキシダーゼ基質溶液(Roche Diagnostics GmbH, Germany、コード番号1684302)を用いてプレートを発色させた。10〜30分後、Tecan Spectrafluorplusプレートリーダー(Tecan Deutschland GmbH, Germany)で、試薬ブランク(インキュベーション緩衝液＋ABTS溶液)と比較して405nmおよび490nmで吸光度を測定した。バックグラウンド補正のために、以下の式:
2019532641.tif 000044
に従って、490nmでの吸光度を405nmでの吸光度から差し引いた。
【０２３８】
試料のIgG含有量を検量線から算出した。
【０２３９】
実施例9
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによるIgG濃度の決定
Akta(商標)explorer chromatography unit(GE Healthcare, 旧Amersham Biosciences, Sweden)を用いた分析用アフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清中のIgG濃度を決定した。IgGがアフィニティマトリックスに結合するのを容易にするために、プロテインAセファロースカラムに規定された体積量の細胞培養上清を添加した。このカラムを100mMクエン酸 pH5.0で洗浄し、次いで、結合した抗体を100mMクエン酸 pH3.0で溶出させた。溶出は、280nmでの溶出液のUV吸収を連続的に記録することによってモニタリングした。規定された抗体濃度を含む標準試料を用いて装置をキャリブレーションした後に、取り込まれたUV吸収から試料の抗体濃度を算出した。
【図１】
2019532641.tif 000049
【図２】
2019532641.tif 000050
【図３】
2019532641.tif 000051
【図４】
2019532641.tif 000052
【図５】
2019532641.tif 000053
【図６】
2019532641.tif 000054
【図７】
2019532641.tif 000055
【図８】
2019532641.tif 000056
【図９】
2019532641.tif 000057
【図１０】
2019532641.tif 000058
【図１１Ａ】
2019532641.tif 000059
【図１１Ｂ】
2019532641.tif 000060
【図１２】
2019532641.tif 000061
【図１３】
2019532641.tif 000062
【配列表】
2019532641000001.app
【国際調査報告】
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2019532641.tif 000064
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