(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）のＬＩＭキナーゼ阻害剤およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物（式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２、およびＺは、特許請求の範囲に定義される通りである）、ならびにＬＩＭＫ介在性疾患の処置および／または予防のためのそれらの使用に関する。  【化１】2019532944.tif 000077【選択図】なし
2019532944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2019532944.tif 000066
の化合物であって、式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの少なくとも１つがハロまたはシアノを表すとの条件で、それぞれ独立して、Ｈ、ハロまたはシアノを表し；
Ｚは、単結合、−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＲ１’Ｒ１’’−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、オキサゾリルまたはオキサジアゾリルを表し；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、オキサシクロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールを表し、ここでアルキル基、アリール基、アリールアルキル基およびヘテロアリール基は、任意選択で、ハロ、アルキル、ハロアルキルおよびアルコキシから選択される１つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ１’およびＲ１’’は、それぞれ独立して、ハロ、アルキル、アルコキシアルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、ここでアリール基およびヘテロアリール基は、任意選択で、ハロ、アルキル、ハロアルキルおよびアルコキシから選択される１つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルオキシカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキルまたはアミノカルボニルアルキルを表し；
Ｙ１は、ＮまたはＣＨを表し；
Ｙ２は、ＮまたはＣＲ５を表し；
Ｒ３は、ＨまたはＮＨＲ６を表し；
Ｒ４は、Ｈ、ＮＲ７Ｒ８を表すか、またはＲ４は、Ｙ２がＣＲ５を表す場合にＲ５と結合しており；
Ｒ５は、Ｈを表すか、またはＲ５は、Ｒ４と結合しており、ここで、Ｒ４とＲ５が共に結合している場合、−Ｒ４−Ｒ５−は−ＮＨ−ＣＨ＝ＣＲ９−を表し；
Ｒ６は、Ｈまたはアリールを表し；
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、アリール、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モルフォリニルまたはピペラジニルを表し；
Ｒ９は、Ｈ、ハロまたはアルキルを表し；
ただし、Ｒ３とＲ４が両方ともＨであることはなく；
ただし、Ｙ１がＣＨであり且つＲ３がＨである場合には、Ｙ２はＮではなく；
ただし、Ｙ１がＮであり且つＹ２がＣＨであり且つＲ３がＮＨＲ６であり且つＲ４がＨである場合には、Ｒ６はＨではなく；
ただし、式Ｉの化合物は、Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドではない、
化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩｄまたはＩｅ：
【化２】
2019532944.tif 000067
を有する、請求項１に記載の化合物であって、式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１およびＹ２は請求項１で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項３】
式Ｉａ−Ｕ０、Ｉａ−Ｕ１ａ、Ｉａ−Ｕ１ｂ、Ｉａ−Ｕ３ａ、Ｉａ−Ｕ３ｂまたはＩａ−Ｕ８：
【化３】
2019532944.tif 000068
を有する、請求項１または２に記載の化合物であって、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＸ１は請求項１で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項４】
式Ｉａ−Ｕ０−１’：
【化４】
2019532944.tif 000069
を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物であって、式中、Ｘ１、Ｒ１およびＲ２は請求項１で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項５】
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド；
エチル  ２−（４−（３−（２，６−ジフルオロフェニルスルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）アセテート；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミド；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−３，３，３−トリフルオロプロパン−１−スルホンアミド；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２−（２，６−ジフルオロフェニル）−２−オキソアセトアミド；
ｔｅｒｔ−ブチル  （３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）カルバメート；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド；
２，６−ジフルオロ−Ｎ−（２−フルオロ−３−（２−（２−ヒドロキシエチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）ベンゼンスルホンアミド；
２−（４−（３−（２，６−ジフルオロフェニルスルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）−Ｎ−メチルアセトアミド；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）シクロプロパンスルホンアミド；
およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、医薬。
【請求項８】
ＬＩＭＫ関連疾患の処置および／または予防に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項９】
前記ＬＩＭＫ関連疾患が、増殖性病態、神経変性障害、神経発達障害、心血管疾患および血管疾患、眼疾患、気道疾患、炎症性疾患、皮膚疾患、腸疾患、腎疾患、骨疾患、ウイルス性疾患、薬物中毒ならびに神経線維腫症から選択される、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記増殖性病態が、腫瘍、癌、新生物、過形成、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、および血管における平滑筋細胞増殖から選択される、請求項９に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
前記増殖性病態が、
癌腫、たとえば、膀胱、乳房、結腸、腸、直腸、腎臓、上皮、肝臓、肺、食道、胆嚢、卵巣、子宮、子宮内膜、膵臓、胃、頸部、甲状腺、前立腺、精巣、皮膚、脳、神経、骨の癌腫など；
リンパ系の造血器腫瘍、たとえば白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫など；
骨髄系の造血器腫瘍、たとえば急性骨髄性白血病（急性前骨髄球性白血病を含む）、慢性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群など；
間葉系起源の腫瘍、たとえば線維肉腫または横紋筋肉腫など；
中枢神経系または末梢神経系の腫瘍、たとえばアストロサイトーマ、神経芽細胞腫、グリオーマまたはシュワン腫など；
メラノーマ；セミノーマ；テラトカルシノーマ；骨肉腫；色素性乾皮症；
ケラトアカントーマ；甲状腺濾胞癌；またはカポジ肉腫
から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
前記ＬＩＭＫ関連疾患が急性骨髄性白血病である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を製造するプロセスであって、以下のステップ：
（ａ）強力な塩基の存在下で中間体（Ａ）
【化５】
2019532944.tif 000070
（式中、ＰＧはアミノ保護基を表し、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は請求項１で定義される通りである）を中間体（Ｂ）
【化６】
2019532944.tif 000071
（式中、Ｙ１およびＹ２は請求項１で定義される通りであり、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して、請求項１で定義されるＲ３もしくはＲ４をそれぞれ表すか、あるいはＲ３もしくはＲ４の前駆体をそれぞれ表す）と反応させて中間体（Ｃ）
【化７】
2019532944.tif 000072
を得るステップ、
（ｂ）Ｎ−ブロモスクシンイミドおよび中間体（Ｄ）
【化８】
2019532944.tif 000073
（式中Ｒ２’は、請求項１で定義されるＲ２を表すか、あるいはＲ２の前駆体を表す）の存在下で中間体（Ｃ）を反応させることによりチアゾール環を形成して中間体（Ｅ）
【化９】
2019532944.tif 000074
を得るステップ、
（ｃ）ＰＧを除去するように適合させた条件下で中間体（Ｅ）を脱保護して中間体（Ｆ）
【化１０】
2019532944.tif 000075
を得るステップ、
（ｄ）請求項１で定義されるＺ−リンカーに適合させた適切なカップリング反応により、中間体（Ｆ）に請求項１で定義されるＲ１部分を導入して式Ｉ’
【化１１】
2019532944.tif 000076
の化合物を得るステップ、および
Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が、それぞれＲ２、Ｒ３またはＲ４の前駆体を表す場合には、Ｒ２’のＲ２への変換および／またはＲ３’のＲ３への変換および／またはＲ４’のＲ４への変換という１つ以上の追加的な中間工程または最終工程を実施するステップ、
を含むことを特徴とするプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナーゼ阻害剤、より具体的にはＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）阻害剤、当該阻害剤を含む医薬組成物、ならびに、癌、より具体的には急性骨髄性白血病などの増殖性病態を含むＬＩＭＫ介在性疾患の処置および／または予防における当該阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＩＭキナーゼファミリーは、２つのメンバー：ＬＩＭキナーゼ１（ＬＩＭＫ１）およびＬＩＭキナーゼ２（ＬＩＭＫ２）からなる。
【０００３】
ＬＩＭキナーゼは、いくつかの上流のシグナリング経路により制御されており、主にＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅの下流で作用する（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ，  ２００７，  ８５，  ５５５−５６８）。多くの他のキナーゼと同様に、活性化ループにおけるリン酸化が、ＬＩＭＫの活性の増大をもたらす。ＬＩＭＫ１およびＬＩＭＫ２は両方とも、ＲｈｏエフェクターのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）によりリン酸化される。Ｐａｋ１、Ｐａｋ２、Ｐａｋ４、および筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連のＣｄｃ４２−結合キナーゼ（ＭＲＣＫα）もまた、それぞれ、ＬＩＭＫ１および／またはＬＩＭＫ２をリン酸化し、活性化することが報告されている。
【０００４】
ＬＩＭＫの主な基質は、コフィリン１、コフィリン２、およびデストリンであり、これらは大抵、一般に「コフィリン」と呼ばれている。
【０００５】
ＬＩＭキナーゼは、コフィリンタンパク質の活性を調節することにより、アクチン細胞骨格の構築に影響を与える。特に、ＬＩＭキナーゼは、コフィリンをリン酸化し、それにより、コフィリンのアクチン切断活性を不活化することにより作用し、アクチンの脱重合および反矢じり端の形成の速度を変化させる。よってＬＩＭキナーゼは、細胞の形態および運動性の調節において主要な役割を果たしている。
【０００６】
このアクチン骨格の調節を介して、ＬＩＭＫは、ウィリアムズ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、頭蓋内動脈瘤、肺高血圧症、緑内障、心血管障害、または増殖性疾患、たとえば癌および転移などのいくつかの病態に関与している（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ，  ２００７，  ８５，  ５５５−５６８；  Ｍａｎｅｔｔｉ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ２０１２，  １２，  ５４３−５６０）。特に、リン酸化コフィリンと非リン酸化コフィリンとの間の均衡の混乱は、腫瘍細胞の浸潤および転移の重要な決定要因であり、このうちの、特に固形腫瘍において、ＬＩＭＫは中心的な役割を果たしている。
【０００７】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、不均一な血液悪性疾患である。ＡＭＬに関する治療介入は、ほとんど効果がなく、新規の処置が期待されている。近年のプロテオーム解析からの報告により、ＡＭＬとアクチン細胞骨格の構成要素（コフィリン、アクチン、モエシン、エズリン、ＰＡＫ１）との間に予期せぬ関連が示されている（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２０１１，  ７４（６），  ８４３−８５７；  Ｌｕｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２０１２，  ７５（１８），  ５７３４−５７４８；  Ｂｒａｏｕｄａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  ２０１１，  ４０（３），  ９４３−９５１；  Ｈａｂｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２０１３，  ７８，  ２３１−２４４）。これに沿う形で、ＡＭＬで高頻度に見いだされるチロシンキナーゼ受容体および転写因子の変異は、アクチン細胞骨格の動態を変化させる（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９９８，  １７（６），  ６９９−７０８；  Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，  ２０１１，  ２０，  ３５７−３６９）。特に、アクチンの調節の鍵となる構成要素（ＰＫＣｚｅｔａ、ＦＡＫ）を標的とすることが、ＡＭＬ細胞の増殖抑制効果をもたらすことが示された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ２００９，  １０９（１），  ２０３−２１３；  Ｄｅｓｐｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２０１２，  ３０（８），  １５９７−１６１０）。Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ／ＲＯＣＫ経路は、アクチンの動態の主要な調節因子であり、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、またはＢＣＲ−Ａｂｌ変異ＡＭＬ細胞においてこの経路を標的化すると、選択的な抗白血病効果を誘発する（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，  ２０１１，  ２０，  ３５７−３６９）。よって、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ経路を標的とすることは、新規のＡＭＬ処置にとって魅力的な好機と思われる（Ｋｕｚｅｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ２００８，  ８（４），  ２６１−２６７；  Ｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ２０１２，  １３（１０），  ９００−９０８）。ＬＩＭキナーゼは、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ経路に関与する最後のキナーゼである。いくつかの報告から、白血病においてＬＩＭＫまたはその基質であるコフィリンを標的とすること（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ２００９，  １０９（１），  ２０３−２１３；Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  ２０１０，  ２０（９），  ２９９４−２９９７）は、治療上有益であり得ることが示唆されている。特に、ＬＩＭＫを阻害することは、マウス白血病モデルにおいて抗白血病活性を発揮することが明らかとなっている（Ｐｒｕｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１２，  ７２（１７），  ４４２９−４４３９）。
【０００８】
様々なＬＩＭＫ関連疾患を処置するためのＬＩＭＫ阻害剤として、小分子が提案された（たとえば国際特許公開公報第２０１５／０２５１７２号；同第２０１５／１５０３３７号；同第２０１４／００２１０１号；同第２０１１／０９１２０４号；同第２００６／０８４０１７号；Ｐｒｕｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１２，  ７２（１７），  ４４２９−４４３９；  Ｍａｎｅｔｔｉ，  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  ２０１２，  ３２（５），  ９６８−９９８参照）。
【０００９】
しかしながら、上流の構成要素（主に受容体型チロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ）（ＦＬＴ３、ＢＣＲ−Ａｂｌなど）またはＬＩＭＫの受容体（ＣＸＣＲ４（Ｆｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  ２０１２，  Ｓｕｐｐｌ  １，  Ｓ１３７−１４０））を標的とする薬物を使用する、いくつかのＡＭＬにおける臨床試験が現在行われているにもかかわらず、現時点で、ＡＭＬを処置するために利用可能なＬＩＭキナーゼを標的とする作用物質はない。
【００１０】
よって、ＬＩＭＫ関連疾患を処置するため、より具体的にはＡＭＬを処置するための、新規のＬＩＭＫ阻害剤が必要とされている。
【００１１】
出願人は本明細書において、強力なＬＩＭＫ阻害剤であることが実験パートにおいて明らかにされた、以下で定義される式Ｉの化合物を提供する。
【発明の概要】
【００１２】
よって本発明は、式Ｉ：
【化１】
2019532944.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２およびＺは、以下で定義される通りである）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。
【００１３】
一実施形態では、本発明に係る化合物は、以下に定義される式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、またはＩｅの化合物である。一実施形態では、本発明の化合物は、以下に定義される式Ｉａ−Ｕ０、Ｉａ−Ｕ１ａ、Ｉａ−Ｕ１ｂ、Ｉａ−Ｕ３ａ、Ｉａ−Ｕ３ｂ、またはＩａ−Ｕ８の化合物である。一実施形態では、本発明の化合物は、以下に定義される式Ｉａ−Ｕ０−１の化合物である。一実施形態では、本発明の化合物は、
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド；
エチル  ２−（４−（３−（２，６−ジフルオロフェニルスルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）アセテート；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミド；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−３，３，３−トリフルオロプロパン−１−スルホンアミド；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２−（２，６−ジフルオロフェニル）−２−オキソアセトアミド；
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）カルバメート；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド；
２，６−ジフルオロ−Ｎ−（２−フルオロ−３−（２−（２−ヒドロキシエチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）ベンゼンスルホンアミド；
２−（４−（３−（２，６−ジフルオロフェニルスルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）−Ｎ−メチルアセトアミド；
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）シクロプロパンスルホンアミド；および
それらの薬学的に許容される塩または溶媒和物
からなる群から選択される。
【００１４】
また本発明は、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
また本発明は、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む医薬に関する。
【００１６】
また本発明は、目的として、ＬＩＭＫ関連疾患の処置および／または予防に使用するための、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有する。
【００１７】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、増殖性病態、神経変性障害、神経発達障害、心血管疾患および血管疾患、眼疾患、気道疾患、炎症性疾患、皮膚疾患、腸疾患、腎疾患、骨疾患、ウイルス性疾患、薬物中毒、および神経線維腫症から選択される。
【００１８】
一実施形態では、増殖性病態は、腫瘍、癌、新生物、過形成、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、および血管における平滑筋細胞増殖から選択される。
【００１９】
一実施形態では、増殖性病態は、
−癌腫、たとえば膀胱、乳房、結腸、腸、直腸、腎臓、上皮性、肝臓、肺、食道、胆嚢、卵巣、子宮、子宮内膜、膵臓、胃、頸部、甲状腺、前立腺、精巣、皮膚、脳、神経、骨の癌腫など；
−リンパ系の造血器腫瘍、たとえば、白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫など；
−骨髄系の造血器腫瘍、たとえば急性骨髄性白血病（急性前骨髄球性白血病を含む）、慢性骨髄性白血病、または骨髄異形成症候群など；
−間葉系起源の腫瘍、たとえば線維肉腫または横紋筋肉腫など；
−中枢神経系または末梢神経系の腫瘍、たとえばアストロサイトーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、またはシュワン腫など；
−メラノーマ；セミノーマ；テラトカルシノーマ；骨肉腫；色素性乾皮症；
−ケラトアカントーマ；甲状腺濾胞癌；またはカポジ肉腫
から選択される。
【００２０】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、急性骨髄性白血病である。
【００２１】
さらに本発明は、本発明に係る化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を製造するプロセスであって、以下のステップ：
ａ）強力な塩基の存在下で中間体（Ａ）
【化２】
2019532944.tif 000004
（式中、ＰＧはアミノ保護基を表し、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は式Ｉで定義される通りである）を中間体（Ｂ）
【化３】
2019532944.tif 000005
（式中、Ｙ１およびＹ２は式Ｉで定義される通りであり、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して、それぞれに式Ｉで定義されるＲ３もしくはＲ４をそれぞれ表すか、あるいはＲ３もしくはＲ４の前駆体をそれぞれ表す）と反応させて中間体（Ｃ）
【化４】
2019532944.tif 000006
を得るステップ、
ｂ）Ｎ−ブロモスクシンイミドおよび中間体（Ｄ）
【化５】
2019532944.tif 000007
（式中、Ｒ２’は、式Ｉで定義されるＲ２を表すか、あるいはＲ２の前駆体を表す）の存在下で中間体（Ｃ）を反応させることによりチアゾール環を形成して中間体（Ｅ）
【化６】
2019532944.tif 000008
を得るステップ、
ｃ）ＰＧを除去するように適合させた条件下で中間体（Ｅ）を脱保護して中間体（Ｆ）
【化７】
2019532944.tif 000009
を得るステップ、
ｄ）式Ｉで定義される−Ｚ−リンカーに適合させた適切なカップリング反応により、中間体（Ｆ）に式Ｉで定義されたＲ１部分を導入して式Ｉ’
【化８】
2019532944.tif 000010
の化合物を得るステップ、および
Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が、それぞれＲ２、Ｒ３またはＲ４の前駆体を表す場合には、Ｒ２’のＲ２への変換および／またはＲ３’のＲ３への変換および／またはＲ４’のＲ４への変換という１つ以上の追加的な中間工程または最終工程を実施するステップ、
を含むことを特徴とするプロセスに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２３】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を表し、ここでのアルキルは以下に定義される通りである。適切なアルコキシ基として、たとえば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｎ−ペントキシが挙げられる。
【００２４】
「アルコキシアルキル」は、−アルキル−Ｏ−アルキル基を表し、ここでのアルキルは以下に定義される通りである。
【００２５】
「アルキル」は、式ＣｎＨ２ｎ＋１のヒドロカルビルラジカルを表す（式中ｎは、１以上の数字である）。一般に、本発明のアルキル基は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖状または分岐状であってもよい。適切なアルキル基として、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびその異性体（たとえばｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル）、ならびにヘキシルおよびその異性体（たとえばｎ−ヘキシル、ｉ−ヘキシル）が挙げられる。
【００２６】
「アルキルアミノカルボニルアルキル」は、−アルキル−ＣＯ−ＮＨ−アルキル基を表し、ここでのアルキルは上記で定義される通りである。このような基の例として、−ＣＨ２−ＣＯＮＨＭｅがある。
【００２７】
「アルキルオキシカルボニルアルキル」は、−アルキル−ＣＯ−Ｏ−アルキル基を表し、ここでのアルキルは上記で定義される通りである。このような基の例として、−ＣＨ２−ＣＯＯＥｔがある。
【００２８】
「アミノアルキル」は、−アルキル−ＮＨ２基を表し、ここでのアルキルは上記で定義される通りである。
【００２９】
「アミノカルボニルアルキル」は、−アルキル−ＣＯ−ＮＨ２基を表し、ここでのアルキルは上記で定義される通りである。このような基の例として、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２がある。
【００３０】
「アリール」は、通常５〜１２個の原子、好ましくは６〜１０個の原子を含み、少なくとも１つの環が芳香環である、単環（すなわちフェニル）、または共に縮合もしくは共有結合した複数の芳香環（たとえばナフチル）を有する、多価不飽和芳香族ヒドロカルビル基を表す。芳香環は、任意選択でこれに縮合する１〜２個の追加的な環（シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールのいずれか）を含んでもよい。またアリールは、本明細書中に列挙された炭素環系の部分的水素付加誘導体を含むことが意図される。アリールの非限定的な例として、フェニル、ビフェニリル、ビフェニレニル、５−または６−テトラリニル、ナフタレン−１−または−２−イル、４−、５−、６または７−インデニル、１−２−、３−、４−または５−アセナフチレニル（ａｃｅｎａｐｈｔｙｌｅｎｙｌ）、３−、４−、または５−アセナフテニル（ａｃｅｎａｐｈｔｅｎｙｌ）、１−または２−ペンタレニル、４−または５−インダニル、５−、６−、７−、または８−テトラヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、１，４−ジヒドロナフチル、１−、２−、３−、４−、または５−ピレニルが挙げられる。
【００３１】
「アリールアルキル」は、−アルキル−アリール基を表し、ここでのアルキルおよびアリールは本明細書中定義される通りである。
【００３２】
「シクロアルキル」は、環状のアルキル基、すなわち、１つの環状構造を有する、一価飽和ヒドロカルビル基を表す。シクロアルキル基は、環に３つ以上の炭素原子を含み得るが、一般に、本発明では、３〜１０個、より好ましくは３〜８個の炭素原子、さらにより好ましくは３〜６個の炭素原子を含み得る。シクロアルキル基の例として、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００３３】
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを表す。好ましいハロ基は、フルオロおよびクロロである。
【００３４】
「ハロアルキル」は、１つ以上のハロ基で置換されたいずれかのアルキル基を表す。ハロアルキルの非限定的な例として、ＣＦ３、ＣＨＦ２、およびＣＨ２Ｆがある。
【００３５】
「ヘテロアリール」は、通常５〜６個の原子を含む、共に縮合または共有結合している１〜２個の環を含む、５〜１２個の炭素原子の芳香環または環系を表し、；このうちの１つが芳香族であり；これら環のうち１つ以上の環の１つ以上の炭素原子を、酸素原子、窒素原子、または硫黄原子に置き換えることができ、ここでの窒素および硫黄ヘテロ原子は任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意選択で四級化されていてもよい。このような環は、通常、環あたり１〜４個、好ましくは１または２個のヘテロ原子を含む。このような環は、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルの環に融合していてもよい。このようなヘテロアリールの非限定的な例として、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、オキサトリアゾリル、チアトリアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、ジオキシニル、チアジニル、トリアジニル、イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾリル、チエノ［３，２−ｂ］フラニル、チエノ［３，２−ｂ］チオフェニル、チエノ［２，３−ｄ］［１，３］チアゾリル、チエノ［２，３−ｄ］イミダゾリル、テトラゾロ［１，５−ａ］ピリジニル、インドリル、インドリジニル、イソインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、１，３−ベンゾオキサゾリル、１，２−ベンゾイソオキサゾリル、２，１−ベンゾイソオキサゾリル、１，３−ベンゾチアゾリル、１，２−ベンゾイソチアゾリル、２，１−ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、１，２，３−ベンゾオキサジアゾリル、２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル、１，２，３−ベンゾチアジアゾリル、２，１，３−ベンゾチアジアゾリル、チエノピリジニル、プリニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、６−オキソ−ピリダジン−１（６Ｈ）−イル、２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル、６−オキソ−ピルダジン（ｐｙｒｕｄａｚｉｎ）−１（６Ｈ）−イル、２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル、１，３−ベンゾジオキソリル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニルが挙げられる。
【００３６】
「ヒドロキシアルキル」は、−アルキル−ＯＨ基を表し、ここでのアルキルは上記に定義される通りである。
【００３７】
「オキサシクロアルキル」は、１つ以上の炭素原子が酸素原子と交換されているシクロアルキル基を表す。このようなオキサシクロアルキルの非限定的な例として、オキサシクロプロパニル（エチレンオキシド）、オキサシクロペンタニル（テトラヒドロフリル）、オキサシクロヘキサニル（テトラヒドロピラニル）が挙げられる。
【００３８】
「患者」は、医療の受診を待機している、または医療を受診している、または医療の対象である／対象となるであろう温血動物、より好ましくはヒトを表す。用語「ヒト」は、両性の任意の成長段階にある（すなわち新生児、幼児、若年、青年、成年（若年の成人、中年の成人、および高齢者を含む））対象を表す。
【００３９】
「溶媒和物」は、化学量論的または準化学量論的な量の１つ以上の薬学的に許容される溶媒分子、たとえばエタノールを含む、本発明の化合物を表す。用語「水和物」は、上記溶媒が水である場合の溶媒和物を表す。
【００４０】
「〜を処置する（ｔｒｅａｔ）」、「〜を処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患の発症の治療上の処置、予防的または予防上の手段、および延期を表し、この目的は、標的の病態または障害を遅延、予防、または遅くする（弱める）ことである。処置を必要とする対象は、ＬＩＭ関連疾患をすでに有する対象、およびＬＩＭＫ関連疾患を有する傾向のある対象、またはＬＩＭ関連疾患を予防もしくは遅延すべき対象を含む。処置の成功および疾患の改善を評価するためのパラメータは、熟練の技術者によく知られている通常の手段により容易に測定可能である。
【００４１】
「〜を予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「〜を予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、病態もしくは疾患、および／もしくはそれに付随する症状の発症を遅延もしくは妨げる、患者が病態もしくは疾患を獲得しないようにする、または患者が病態もしくは疾患を獲得するリスクを低減させる方法を表す。
【００４２】
「治療上有効量（またはより単純に「有効量」）は、投与する患者に所望の治療上または予防上の効果をもたらすために十分な、活性物質または活性成分（たとえばＬＩＭＫアンタゴニスト）の量を意味する。
【００４３】
「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」またはその変化形（たとえば「〜を投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」）は、病態、症状、または疾患を処置または予防すべき患者に、単独、または薬学的に許容される組成物の一部として、活性物質または活性成分（たとえばＬＩＭＫアンタゴニスト）を提供することを意味する。
【００４４】
「薬学的に許容される」は、医薬組成物の成分が、互いに適合可能であり、その患者に有害ではないことを意味する。
【００４５】
「ＬＩＭＫの阻害剤」は、ＬＩＭＫの生物学的活性を減弱、阻害、対抗、相殺、または減少させるいずれかの作用物質を表す。ＬＩＭＫアンタゴニストは、ＬＩＭＫの生物学的機能を阻害または中和する作用物質；ＬＩＭＫに対するＬＩＭＫ基質（たとえばコフィリン）の結合を防止する作用物質であってよい。
【００４６】
「選択性の比率」は、キナーゼの阻害の測定値に対応するパラメータとＬＩＭＫの阻害の測定値に対応する同じパラメータとの間の比率を表す。通常、このパラメータはＩＣ５０である。
【００４７】
詳細な説明
本発明は、式Ｉ
【化９】
2019532944.tif 000011
の化合物およびその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関し、式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの少なくとも１つがハロまたはシアノを表すとの条件で、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、またはシアノを表し；
Ｚは、単結合、−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＲ１’Ｒ１’’ −ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、オキサゾリル、またはオキサジアゾリルを表し；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、オキサシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールを表し、ここでアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、およびヘテロアリール基は、任意選択で、ハロ、アルキル、ハロアルキル、およびアルコキシから選択される１つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ１’およびＲ１’’は、それぞれ独立して、ハロ、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、またはヘテロアリールを表し、ここでアリール基およびヘテロアリール基は、任意選択で、ハロ、アルキル、ハロアルキル、およびアルコキシから選択される１つ以上の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルオキシカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキル、またはアミノカルボニルアルキルを表し；
Ｙ１は、ＮまたはＣＨを表し；
Ｙ２は、ＮまたはＣＲ５を表し；
Ｒ３は、ＨまたはＮＨＲ６を表し；
Ｒ４は、Ｈ、ＮＲ７Ｒ８を表すか、またはＲ４は、Ｙ２がＣＲ５を表す場合にＲ５と結合しており；
Ｒ５は、Ｈを表すか、またはＲ５は、Ｒ４と結合しており、ここで、Ｒ４とＲ５が共に結合している場合、−Ｒ４−Ｒ５−は、−ＮＨ−ＣＨ＝ＣＲ９−を表し；
Ｒ６は、Ｈまたはアリールを表し、ここでアリール基は、任意選択で、１つ以上のハロ基（好ましくは１つ以上のＦ）で置換されていてもよく；
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、アリール、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モルフォリニル、またはピペラジニルを表し；
Ｒ９は、Ｈ、ハロ、またはアルキルを表し；
ただし、Ｒ３とＲ４が両方ともＨであることはなく；
ただし、Ｙ１がＣＨであり且つＲ３がＨである場合、Ｙ２はＮではなく；
ただし、Ｙ１がＮであり且つＹ２がＣＨであり且つＲ３がＮＨＲ６であり且つＲ４がＨである場合、Ｒ６はＨではなく；
ただし、式Ｉの化合物は、Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド）ではない。
【００４８】
好適には、−Ｚ−部分に隣接する−ＮＨ−基は、生理的ｐＨで脱プロトン化されている。
【００４９】
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、電子求引基、たとえばハロまたはシアノなど、好ましくはハロ、より好ましくはＣｌまたはＦを表す。一実施形態では、Ｘ１はハロまたはシアノを表し、Ｘ２およびＸ３はＨであり、好ましくは、Ｘ１はハロ、特にＦを表し、Ｘ２およびＸ３はＨである。別の実施形態では、Ｘ２はハロまたはシアノを表し、Ｘ１およびＸ３は、Ｈであり、好ましくは、Ｘ２はハロ、特にＦを表し、Ｘ１およびＸ３はＨである。別の実施形態では、Ｘ３はハロまたはシアノを表し、Ｘ２およびＸ１はＨであり、好ましくは、Ｘ３はハロ、特にＦを表し、Ｘ２およびＸ１はＨである。
【００５０】
一実施形態では、式Ｉにおいて、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、オキサシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールを表し、ここでアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、オキサシクロアルキル基、アリールアルキル基、およびヘテロアリール基は、任意選択で、ハロ、アルキル、ハロアルキル、およびアルコキシから選択される１つ以上の基で置換されており、好ましくは、Ｒ１は、任意選択でハロおよびアルコキシから選択される１つ以上、好ましくは１〜５個の基で置換されている、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、またはアリールを表す。特定の実施形態では、Ｒ１は、任意選択で１つ以上、好ましくは１〜５個のアルコキシ基で置換されている、アルキル基、好ましくは直鎖状または分岐状のＣ３〜Ｃ５アルキル基を表す。特定の実施形態では、Ｒ１は、ハロアルキル基、好ましくは直鎖状のＣ３ハロアルキル基を表す。特定の実施形態では、Ｒ１は、シクロアルキル基、好ましくはシクロプロピルを表す。別の特定の実施形態では、Ｒ１は、任意選択で１つ以上、好ましくは１〜５個のハロ基で置換されている、アリール基を表し、好ましくは、Ｒ１は、２，６−ジフルオロフェニルを表す。
【００５１】
一実施形態では、式Ｉにおいて、Ｚは、単結合、−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＲ１’Ｒ１’’ −ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、オキサゾリル、またはオキサジアゾリルを表す。Ｚがオキサゾリルまたはオキサジアゾリルを表す場合、これは、以下の部分：
【化１０】
2019532944.tif 000012
に対応する。
【００５２】
特定の実施形態では、Ｚは、−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＲ１’Ｒ１’’−ＣＯ−、または−Ｏ−ＣＯ−を表し、好ましくは、Ｚは、−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＣＯ−、または−Ｏ−ＣＯ−を表し、より好ましくは、Ｚは、−ＳＯ２−を表す。好ましい実施形態では、Ｚは−ＳＯ２−を表す。
【００５３】
一実施形態では、式Ｉにおいて、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルオキシカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキル、またはアミノカルボニルアルキルを表す。一実施形態では、Ｒ２は、Ｃ２−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４ヒドロキシアルキル、アルキルオキシカルボニルアルキル、またはアルキルアミノカルボニルアルキルを表し、より好ましくは、Ｒ２は、ｔｅｒｔ−ブチル、ヒドロキシプロピル、−ＣＨ２−ＣＯＯＥｔ、または−ＣＨ２−ＣＯＮＨＣＨ３を表し、さらにより好ましくは、Ｒ２は、ｔｅｒｔ−ブチルを表す。
【００５４】
式Ｉの化合物において、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ３、およびＲ４の定義は、チアゾール環に結合したピリジン誘導体部分が、Ｕ０、Ｕ１ａ、Ｕ１ｂ、Ｕ２Ａ、Ｕ２ｂ、Ｕ３ａ、Ｕ３ｂ、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７ａ、Ｕ７ｂ、Ｕ７ｃ、Ｕ７ｄ、およびＵ８：
【化１１】
2019532944.tif 000013
から選択される式（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、式Ｉに定義される通りである）を有するような定義である。
【００５５】
上記の部分は全て、共通して、少なくとも１つのアミン基で置換されたピリジン由来のコア（ピリジン−４イル、ピリミジン−４−イル、１，３，５−トリアジン−４−イル）を有し、場合によって、二環式のスキャフォールド（ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）を形成する。
【００５６】
特に好ましいピリジン誘導体部分は、Ｕ０、Ｕ１ａ、Ｕ１ｂ、Ｕ３ａ、Ｕ３ｂ、およびＵ８の部分であり、さらにより好ましくはＵ０およびＵ８の部分である。
【００５７】
一実施形態では、式Ｉにおいて、Ｙ１がＮで、Ｙ２がＣＨで、かつＲ４がＨである場合を除き、Ｒ６はＨを表す。別の実施形態では、Ｒ６はアリール基を表し、ここでアリール基は、任意選択で１つ以上のハロ基、好ましくは１つ以上のＦで置換されている。一実施形態では、Ｒ６は、置換されていないアリール基を表す。
【００５８】
一実施形態では、式Ｉにおいて、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、アリール、アルキル、または可溶化基、たとえばヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モルフォリニル、またはピペラジニルを表す。一実施形態では、Ｒ７またはＲ８がアリール基を表す場合、Ｒ７またはＲ８は、置換されていないアリール基を表す。
【００５９】
一実施形態では、式Ｉにおいて、Ｒ９はＨを表す。別の実施形態では、式Ｉにおいて、Ｒ９は、たとえばメチルなどのアルキル基を表す。別の実施形態では、式Ｉにおいて、Ｒ９は、たとえばＣｌなどのハロを表す。
【００６０】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、またはＩｅ：
【化１２】
2019532944.tif 000014
の化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物であり、式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１およびＹ２は、上記で定義される通りである。
【００６１】
一実施形態では、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、またはＩｅにおいて、Ｘ２およびＸ３はＨである。
【００６２】
一実施形態では、式Ｉａの化合物は、Ｉａ−Ｕ０、Ｉａ−Ｕ１ａ、Ｉａ−Ｕ１ｂ、Ｉａ−Ｕ３ａ、Ｉａ−Ｕ３ｂ、またはＩａ−Ｕ８：
【化１３】
2019532944.tif 000015
の化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＸ１は、上記で定義される通りである）。
【００６３】
一実施形態では、特に好ましい式Ｉａの化合物は、上記に定義した式Ｉａ−Ｕ０
【化１４】
2019532944.tif 000016
の化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物であり、式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ６は、上記で定義される通りである。
【００６４】
本発明の化合物に近い化学構造を有する化合物は、先行技術においてＲａｆキナーゼ阻害剤として開示されており、より具体的には、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤として、たとえば中国特許公開公報第１０３９３６７３０号、国際特許公開公報第２０１４／１９４１２７号、同第２０１２／１１３７７４号、同第２０１１／１６１２１６号、同第２０１１／０５９６１０号、同第２０１０／１０４８９９号、および同第２００９／１３７３９１号に開示されている。
【００６５】
ＬＩＭキナーゼおよびＲａｆキナーゼは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の下流で作用しており、系統学的に近縁である（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００２，  ２９８，  １９１２−１９３４）。しかしながら、ＬＩＭキナーゼおよびＲａｆキナーゼは、シグナリング経路において明確に異なる役割を有しており、それぞれの阻害に関して異なるアウトカムをもたらすことが、明確に確立されている。実際に、Ｒａｆキナーゼの主な標的は、直接的な基質のリン酸化を伴うが、同様に異なる転写因子の活性化を介した幅広い転写の修飾をも伴う異なる機構を介して増殖、分化、および生存を制御するＭＥＫ／ＥＲＫ経路である。対照的に、ＬＩＭキナーゼは、Ｒｈｏ／ＬＩＭＫ経路の最も下流のキナーゼである。ＬＩＭキナーゼは、主に、コフィリンの調節を介して細胞骨格の動態を調節する。
【００６６】
シグナリング経路での位置および基質特異性におけるこれらの差異は、阻害されると異なる表現型をもたらす（小分子、ＲＮＡ干渉、またはＫＯモデルによる）。たとえば、これらの差異は、臨床において、異なるパターンのＲａｆ／ＬＩＭキナーゼのｍＲＮＡ発現を伴う白血病患者の異なるトランスクリプトームプロファイリングを反映する異なる寄与を白血病誘発に関してもたらす。
【００６７】
ＬＩＭＫの選択的阻害剤（特にＲａｆキナーゼと比較して選択的なもの）を提供することは、特にオフターゲットおよび副作用を回避するため、関心が集まっている。
【００６８】
実験パートで証明されているように、本発明の化合物は、Ｒａｆキナーゼと比較して（特にＢ−Ｒａｆキナーゼと比較して）ＬＩＭＫに選択的な阻害剤である。
【００６９】
一実施形態では、測定したＩＣ５０  ＬＩＭＫ１で測定したＩＣ５０  Ｂ−Ｒａｆを除算することにより計算される、Ｂ−Ｒａｆと比較したＬＩＭＫ１の選択性の比率は、２超、好ましくは４超、より好ましくは６超、さらにより好ましくは８超、さらにより好ましくは１０超である。一実施形態では、式Ｉａ−Ｕ０の化合物は、式Ｉａ−Ｕ０−１：
【化１５】
2019532944.tif 000017
の化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物であり、式中、
Ｘ１、Ｒ１、およびＲ２は、式Ｉで定義される通りであり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、それぞれ独立してＨまたはハロを表す。
【００７０】
一実施形態では、式Ｉａ−Ｕ０−１において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、全てがＨであり、よって、式Ｉａ−Ｕ０の化合物は、式Ｉａ−Ｕ０−１’：
【化１６】
2019532944.tif 000018
の化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物である（式中、Ｘ１、Ｒ１、およびＲ２は、式Ｉで定義される通りである）。
【００７１】
一実施形態では、式Ｉａ−Ｕ０−１において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４のうちの１つ以上がハロを表す場合、これは、好ましくはフッ素原子を表す。
【００７２】
特に好ましい式Ｉの化合物は、以下の表１に列挙した化合物ならびにその薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
【表１】
2019532944.tif 000019
2019532944.tif 000020
2019532944.tif 000021
【００７３】
より好ましい式Ｉの化合物は、表１に列挙した化合物１、２、５、８、および９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物である。さらに好ましい式Ｉの化合物は、表１に列挙した化合物１、８、および９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
【００７４】
表１において、用語「Ｃｐｄ」は、化合物を意味する。表１の化合物は、ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  バージョン１２．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して命名した。
【００７５】
本発明の化合物における不斉炭素由来の結合は、一般に、
【化１７】
2019532944.tif 000022
を用いて表されている。不斉炭素原子由来の結合を表すための実線または破線の楔形のいずれかを使用することは、示された立体異性体のみが含まれることを意味することを示すという意味である。
【００７６】
本発明の化合物は、本明細書中上記に定義した式Ｉの化合物を含み、それらの塩、溶媒和物、複数の構成要素の複合体、液晶、多型、および晶癖、それらのプロドラッグ、プロドラッグおよび互変異性体、ならびに式Ｉの同位体標識化合物を含む。
【００７７】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。薬学的に許容される塩は、その酸付加塩を含む。適切な酸付加塩は、非毒性の塩を形成する酸から形成される。例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、サイクラミン酸塩、エジシル酸塩、エタンスルホン酸塩（エシレート）、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチレート（ｎａｐｈｔｈｙｌａｔｅ）、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシラート、トリフルオロ酢酸塩、およびキシナホ酸塩（ｘｉｎｏｆｏａｔｅ  ｓａｌｔｓ）が挙げられる。
【００７８】
本発明の化合物は、塩形成剤の使用を介して塩の形態で調製してもよい。適切な酸は、好ましくは、限定するものではないが、薬学的に許容される塩を形成すると考えられる酸である（たとえばＷｅｒｍｕｔｈ，  Ｃ．  Ｇ．；  Ｓｔａｈｌ，  Ｐ．  Ｈ．  Ｉｎ  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００２参照）。このような塩は、付随する塩中間体の化学的な純度を高めるためおよび／または貯蔵寿命を高めるために形成されてもよい。上述の関連する塩形成剤の例として、限定するものではないが、適用可能なありとあらゆる立体異性体を含む、以下の酸：ＨＣｌ、硫酸、リン酸、酢酸、エタンスルホン酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、マンデル酸、コハク酸、フェニルプロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸が挙げられる。好ましい塩形成剤として、ＨＣｌが挙げられる。
【００７９】
式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩は、これらの方法：
式Ｉの化合物を所望の酸と反応させることによる方法；
式Ｉの化合物の適切な前駆体から酸に不安定な保護基を除去することによる方法；または
適切な酸との反応もしくは適切なイオン交換カラムの手段により、式Ｉの化合物の１つの塩を別の塩に変換することによる方法
のうちの１つ以上により、調製してもよい。
【００８０】
さらに、一般的には、本発明の化合物の塩に関しては、薬学的に許容される塩が好ましいが、最も広い意味での本発明は、薬学的に許容されていない塩をも含むことに留意すべきであり、これをたとえば本発明の化合物の単離および／または精製において使用してもよい。たとえば、光学活性のある酸または塩基で形成された塩を使用して、式Ｉの化合物の光学活性異性体の分離を促進できるジアステレオマーの塩を形成してもよい。
【００８１】
式Ｉの特定の化合物において、互変異性体のプロトトロピー平衡が存在していてもよく、よっていずれかまたは両方の互変異性体が存在し得る。本発明の化合物の全ての互変異性体型は、どの特定の互変異性体が描写または命名されているかどうかに関わらず、適用可能であれば常に、本発明の範囲内にある。
【００８２】
本明細書中使用する場合、用語「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生体内変化による産物が、生物学的に活性のある薬物をもたらす、たとえばエステルなどの式Ｉの化合物の薬理学的に許容される誘導体を意味する。プロドラッグは、一般に、バイオアベイラビリティの増加を特徴とし、ｉｎ  ｖｉｖｏで、生物学的に活性のある化合物へと容易に代謝される。
【００８３】
本明細書中使用する場合、用語「プレドラッグ」は、修飾されて薬物種を形成するいずれかの化合物を意味し、修飾は、体内または体外のいずれかで、および薬物の投与が適応される身体の領域にプレドラッグが達する前または後に、起こり得る。
【００８４】
式Ｉの化合物は、当業者に公知である反応を伴う異なる方法により、調製することができる。
【００８５】
さらに本発明は、式Ｉ
【化１８】
2019532944.tif 000023
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１、Ｙ２、およびＺは、上記に定義される通りである）
の化合物を製造するプロセスであって、以下のステップ：
ａ）強力な塩基の存在下で中間体（Ａ）
【化１９】
2019532944.tif 000024
（式中、ＰＧはアミノ保護基を表す）を中間体（Ｂ）
【化２０】
2019532944.tif 000025
（式中、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して、上記に定義されるＲ３およびＲ４を表すか、あるいはＲ３もしくはＲ４の保護された前駆体をそれぞれ表す）と反応させて中間体（Ｃ）
【化２１】
2019532944.tif 000026
を得るステップ、
ｂ）Ｎ−ブロモスクシンイミドおよび中間体（Ｄ）
【化２２】
2019532944.tif 000027
（式中Ｒ２’は、上記に定義されるＲ２を表すか、あるいはＲ２の前駆体を表す）の存在下で中間体（Ｃ）を反応させることによりチアゾール環を形成して中間体（Ｅ）
【化２３】
2019532944.tif 000028
を得るステップ、
ｃ）ＰＧに適合させた条件下で中間体（Ｅ）を脱保護して中間体（Ｆ）
【化２４】
2019532944.tif 000029
を得るステップ、
ｄ）−Ｚ−リンカーに適合させた適切なカップリング反応により、中間体（Ｆ）にＲ１部分を導入して式Ｉ’
【化２５】
2019532944.tif 000030
の化合物を得るステップ、および
Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が、それぞれＲ２、Ｒ３またはＲ４の前駆体を表す場合には、Ｒ２’のＲ２への変換および／またはＲ３’のＲ３への変換および／またはＲ４’のＲ４への変換という１つ以上の追加的な中間工程または最終工程を実施するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【００８６】
用語「アミノ保護基」は、アミン官能基の保護基を表す。適切なアミノ保護基ならびに対応する脱保護状態は、当業者に公知である。好ましい実施形態では、アミノ保護基は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アリールスルホニル、メトキシメチル、パラ−メトキシベンジルまたはベンジルを含む群において選択される。一実施形態では、アミノ保護基はＢｏｃである。この場合、脱保護は、酸性条件で行われ得る。
【００８７】
一実施形態では、ステップａ）で使用される強力な塩基は、リチウム  ビス（トリメチルシリル）アミド（ＬｉＨＭＤＳ）である。
【００８８】
ステップｄ）において、Ｚが−ＳＯ２−を表す場合、カップリングは、中間体（Ｇ）、Ｒ１−ＳＯ２−Ｃｌの存在下、好ましくはピリジンの存在下で行われる。この反応の溶媒は、好ましくはテトラヒドロフランである。
【００８９】
ステップｄ）において、Ｚが−ＣＯ−ＣＯ−を表す場合、カップリングは、中間体（Ｈ）、Ｒ１−ＣＯ−ＣＯＯＨの存在下で行われる。この場合、カップリングは、好ましくは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩、２−ピリジノール  １−オキシドおよびトリエチルアミンの存在下で行われる。この反応の溶媒は、好ましくはジメチルホルムアミドである。
【００９０】
ステップｄ）において、Ｚが−Ｏ−ＣＯ−を表す場合、中間体（Ｅ）は、式Ｉの化合物に直接対応してもよく、たとえばＰＧがＢｏｃ基（ｔＢｕ−Ｏ−ＣＯ−）を表す場合、Ｒ１−Ｚ−に相当してもよい（式中Ｒ１はアルキル基であり、Ｚは−Ｏ−ＣＯ−である）。
【００９１】
実施例のセクションで説明されている反応スキームは単なる例示であり、本発明を限定すると決して解釈すべきではない。
【００９２】
ＬＩＭＫを阻害する方法
また本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＬＩＭＫ活性（たとえばＬＩＭＫ１活性および／またはＬＩＭＫ２活性）を阻害する方法であって、本発明に係る式Ｉの化合物の有効量とＬＩＭＫ（たとえばＬＩＭＫ１および／またはＬＩＭＫ２）を接触させるステップを含む、方法に関する。
【００９３】
一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞におけるＬＩＭＫの活性（たとえばＬＩＭＫ１の活性および／またはＬＩＭＫ２の活性）を阻害する方法であって、本発明に係る式Ｉの化合物の有効量と上記細胞を接触させるステップを含む、方法に関する。
【００９４】
ＬＩＭＫの活性の阻害の判定に適したアッセイは、本明細書中記載されており、および／または当該分野で公知である。
【００９５】
本発明のさらなる特性では、そのような処置を必要とする患者のＬＩＭＫの活性を調節（たとえば阻害）する医薬の製造のための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の使用であって、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の有効量を上記患者に投与するステップを含む、使用を提供する。
【００９６】
好ましくは、患者は、温血動物、好ましくはヒトである。
【００９７】
細胞増殖を阻害する方法
本明細書中記載の式Ｉの化合物は、（ａ）細胞増殖を調節（たとえば阻害）し、（ｂ）細胞周期の進行を阻害し、（ｃ）アポトーシスを促進し、または（ｄ）これらのうちの１つ以上の組み合わせを行う。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞増殖を調節（たとえば阻害）する方法、細胞周期の進行を阻害する方法、アポトーシスを促進する方法、またはこれらのうちの１つ以上の組み合わせを行う方法であって、本発明に係る式Ｉの化合物の有効量と細胞を接触させるステップを含む、方法に関する。
【００９９】
化合物が細胞増殖を阻害するかどうかの決定に適したアッセイは、本明細書中記載されており、かつ／または当該分野で公知である。
【０１００】
ＬＩＭＫ関連疾患の処置および／または予防での使用
また本発明は、少なくとも１つの式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、活性成分として含む医薬に関する。
【０１０１】
さらに本発明は、ＬＩＭＫ関連疾患を処置および／または予防するための医薬の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【０１０２】
よって本発明の化合物は、特にＬＩＭＫ関連疾患の予防および／または処置において、医薬として有用である。よって、一実施形態では、本発明は、ＬＩＭＫ関連疾患の予防および／または処置で使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。
【０１０３】
また本発明は、患者においてＬＩＭＫ関連疾患の発症を遅延させる方法を提供する。
【０１０４】
好ましくは、患者は、温血動物、より好ましくはヒトである。
【０１０５】
本発明の別の態様は、ＬＩＭＫ関連疾患の処置の方法であって、本明細書中記載されるように式Ｉの化合物の治療上有効量を、処置を必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
【０１０６】
ＬＩＭＫ関連疾患
用語「ＬＩＭＫ関連疾患」は、ＬＩＭＫがある役割を果たすことがわかっているいずれかの疾患を表す。この用語はまた、ＬＩＭＫ阻害剤による処置により軽減するいずれかの疾患をも意味する。
【０１０７】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、
増殖性病態（以下の詳細を参照）；
神経変性障害または神経発達障害、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、ウィリアムズ症候群など；
心血管疾患および血管疾患、たとえば高血圧、肺高血圧症、肺血管狭窄、狭心症、脳血管攣縮、くも膜下出血後の虚血、頭蓋内動脈瘤、アテローム性動脈硬化症など；
眼疾患、たとえば緑内障、黄斑変性症などの変性網膜疾患、糖尿病黄斑浮腫による視力喪失、網膜静脈閉塞増殖性硝子体網膜症に続発する黄斑浮腫による視力喪失；前部ブドウ膜炎、汎ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、および後部ブドウ膜炎などの炎症性眼疾患、緑内障濾過手術の失敗、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、後嚢混濁、白内障形成、角膜創傷治癒の異常、眼の疼痛および高眼圧症など；
気道疾患、たとえば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維症、肺線維症、肺気腫、慢性気管支炎、喘息、肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、および鼻炎、および呼吸促迫症候群など；
炎症性疾患、たとえばクローン病、潰瘍性大腸炎、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患など；
皮膚疾患、たとえば瘢痕、角化症、不全角化、顆粒層肥厚、表皮肥厚、角化異常症、海綿状変化、および潰瘍形成など；
腸疾患、たとえば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、胃腸炎、イレウス、回腸炎、虫垂炎、およびクローン病など；
腎疾患、たとえば腎線維症または腎機能障害など；
骨疾患、たとえば骨粗しょう症および変形性関節症など；
ウイルス性疾患、たとえばレトロウイルス性疾患、特にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のレトロウイルス性疾患など；
薬物中毒；
神経線維腫症
から選択される。
【０１０８】
用語「増殖性病態」は、新生物または過形成の増殖などの、望ましくない過剰なまたは異常な細胞の、望まないまたは制御されない細胞増殖を表す。
【０１０９】
一実施形態では、増殖性病態は、良性、前悪性、または悪性の細胞増殖を特徴とし、限定するものではないが、新生物、過形成、および腫瘍（たとえば組織球腫（ｈｉｓｔｏｃｙｔｏｍａ）、グリオーマ、アストロサイトーマ、骨腫）、癌（以下を参照）、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害（たとえば結合組織の線維増殖性障害）、肺線維症、アテローム性動脈硬化、血管における平滑筋細胞増殖、たとえば血管形成術後の狭窄または再狭窄などが挙げられる。
【０１１０】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、ＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）（たとえばＬＩＭＫ１および／またはＬＩＭＫ２）を過剰発現する癌細胞を特徴とする癌であり、またはさらにはＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）（たとえばＬＩＭＫ１および／またはＬＩＭＫ２）を過剰発現する癌細胞を特徴とする。別の実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、たとえば一部の白血病のように、ＬＩＭＫの過剰発現を伴わないＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）（たとえばＬＩＭＫ１および／またはＬＩＭＫ２）に関連する進行を特徴とする癌であり、またはさらには当該進行を特徴とする。
【０１１１】
一実施形態では、処置は、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化器癌、胃癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、腎細胞腫、膀胱癌、膵臓癌、脳癌、神経癌、グリオーマ、肉腫、骨肉腫、骨癌、鼻咽頭癌（たとえば頭部癌、頸部癌）、皮膚癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、メラノーマ、悪性メラノーマ、リンパ腫、または白血病の処置である。
【０１１２】
一実施形態では、癌は、
癌腫、たとえば、膀胱、乳房、結腸（たとえば結腸直腸癌、たとえば結腸腺癌および結腸腺腫）、腸、直腸、腎臓、上皮、肝臓、肺（たとえば腺癌、小細胞肺癌、および非小細胞肺癌）、食道、胆嚢、卵巣、子宮、子宮内膜、膵臓（たとえば膵外分泌細胞腫）、胃、頸部、甲状腺、前立腺、精巣、皮膚（たとえば扁平上皮癌）、脳、神経、骨の癌腫；
リンパ系の造血器腫瘍、たとえば白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫；
骨髄系の造血器腫瘍、たとえば急性骨髄性白血病（急性前骨髄球性白血病を含む）、慢性骨髄性白血病、または骨髄異形成症候群；
間葉系起源の腫瘍、たとえば線維肉腫または横紋筋肉腫；
中枢神経系または末梢神経系の腫瘍、たとえばアストロサイトーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、またはシュワン腫；
メラノーマ；セミノーマ；テラトカルシノーマ；骨肉腫；色素性乾皮症；
ケラトアカントーマ；甲状腺濾胞癌；またはカポジ肉腫
から選択される。
【０１１３】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、癌の転移、特に転移性乳癌である。
【０１１４】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。特定の実施形態では、処置される患者は、ＦＬＴ３変異を伴う急性骨髄性白血病を罹患していると診断されている。
【０１１５】
一実施形態では、ＬＩＭＫ関連疾患は、肉腫である。
【０１１６】
併用療法
一実施形態では、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩または溶媒和物は、併用療法の一部として投与されてもよい。よって、活性成分本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に加え、追加的な治療物質および／または活性成分を含む組成物および医薬の同時投与を含む実施形態、ならびに組成物および医薬が、本発明の範囲内に含まれている。このような複数の薬物レジメンは、多くの場合「併用療法」と呼ばれており、ＬＩＭＫの調節が介在するまたはＬＩＭＫの調節に関連する疾患または症状のいずれかの処置および／または予防に使用され得る。このような治療物質の組み合わせの使用は、処置を必要とする患者または当該患者となるリスクのある対象における上述の障害の処置に関して特に適切である。
【０１１７】
式ＩのＬＩＭＫ阻害剤の化合物またはその薬学的に許容される塩および溶媒和物に加え、活性物質の使用を必要とし得る治療有効性の必要条件に加えて、補助治療、すなわち本発明のＬＩＭＫ阻害剤の化合物により行われる機能を補完および補足する補助治療を表す活性成分を伴う薬物の併用の使用を強制するまたは高く推奨するさらなる理論的根拠が、存在し得る。補助的処置を目的として使用される好適な補助的治療物質は、ＬＩＭＫが介在するまたはＬＩＭＫに関連する疾患または症状を直接処置または予防する代わりに、基礎となるまたは根底にあるＬＩＭＫ調節疾患または症状から直接もたらされるまたは間接的に伴う疾患または症状を処置する薬物を含む。
【０１１８】
本発明のさらなる特性では、式Ｉの化合物、その薬学的に許容される塩または溶媒和物は、その有効性を改善するため、およびそれに関連する二次的な作用を最小限にするために、たとえばアントラサイクリン化合物（特に、限定するものではないが、ダウノルビシン―そのリポソーム製剤を含む、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン）、ＡＴＲＡ、亜ヒ酸、アルキル化薬（特に、限定するものではないがメルファラン、シクロホスファミド、アムサクリン、ブスルファン、トレオスルファン）、シタラビンおよびその誘導体（特に、限定するものではないがデシタビン、フルダラビン）、キナーゼ阻害剤（特に限定するものではないが、ＦＬＴ３阻害剤および／またはｃ−Ｋｉｔ阻害剤）、Ｂｃｌ−２阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、ビンカアルカロイド（特に限定するものではないが、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、グルココルチコイド（特に限定するものではないが、プレドニゾロン）、葉酸拮抗剤（特に限定するものではないが、メトトレキサート）、エトポシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム、または全身放射線照射との併用療法において使用され得る。
【０１１９】
本発明の上述の実施形態の組み合わせでは、式Ｉの化合物、その薬学的に許容される塩または溶媒和物と、他の治療活性物質とを、別々のまたは互いを組み合わせたいずれかの剤形の観点、および順次または同時のいずれかのその投与時間の観点から、投与してもよい。よって、１つの構成要素の作用物質の投与は、他の構成要素の作用物質の投与の前であってもよく、当該投与と同時であってもよく、または当該投与の後であってもよい。
【０１２０】
さらなる実施形態では、本発明の化合物、それらの薬学的に許容される塩または溶媒和物は、放射線照射処置および／または外科的処置と組み合わせて使用してもよい。「放射線照射処置」は、特に、放射線療法および全身放射線照射を表している。このような組み合わせは、ＬＩＭＫの調節が介在するまたはＬＩＭＫの調節に関連する疾患または症状のいずれかの処置および／または予防に使用され得る。このような組み合わせの使用は、処置を必要とする患者または当該患者になるリスクのある対象の中での上述の障害の処置に関して特に適切である。このような組み合わせでは、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、または溶媒和物は、放射線照射処置および／または外科的処置の前、当該処置と同時、または当該処置の後に、投与されてもよい。
【０１２１】
医薬組成物
また本発明は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。上述の場合、本発明は、活性成分としての本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、または溶媒和物に加え、追加的な治療物質および／または活性成分を含む医薬組成物をも包有している。
【０１２２】
一般的に、薬学での使用では、本発明の化合物は、少なくとも１つの本発明の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、および／またはアジュバントと、任意選択で１つ以上のさらなる薬学的活性化合物とを含む医薬調製物として、製剤化され得る。
【０１２３】
非限定的な例として、このような製剤は、経口投与、非経口投与（静脈内注射、筋肉内注射もしくは皮下注射、もしくは静脈内注入）、局所投与（眼投与を含む）、吸入による投与、皮膚パッチによる投与、インプラントによる投与、坐薬による投与などに適した形態であり得る。このような適切な投与形態は、投与様式と共に方法、ならびにその調製に使用される担体、希釈剤および賦形剤に応じて、固体、半固体、または液体であってもよく、このことは当業者に明らかである：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版を参照されたい。
【０１２４】
一部の好ましいが非限定的な当該調製物の例として、ボーラスとしての投与のためおよび／または連続投与のための、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、薬包、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル剤、軟膏、クリーム、ローション剤、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、坐薬、滴剤、滅菌注射可能液剤、および滅菌包装散剤（通常、使用前に再構成される）が挙げられ、これらは、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、セルロース、滅菌（水）、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、食用油、植物油、および鉱油、またはそれらの適切な混合物などの、当該製剤化にそれ自体が適している担体、賦形剤、および希釈剤と共に製剤化されてもよい。本製剤は、任意選択で、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、分散剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、保存剤、甘味剤、香料、流動調節剤、放出剤などの、医薬製剤において一般に使用されている他の物質を含むことができる。また本組成物は、その中に含まれている活性化合物の急速な放出、持続的放出、または遅延放出を提供するように製剤化されてもよい。
【０１２５】
本発明の医薬製剤は、好ましくは単位投与剤形であり、たとえば箱、ブリスター、バイアル、ビン、薬包、アンプル、または他のいずれかの適切な単回投与もしくは複数回投与用のホルダーもしくはコンテナ（適切にラベルが貼られていてもよい）に、適切に包装されていてもよく、任意選択で、製品の情報および／または使用説明書を含む１つ以上のリーフレットを伴ってもよい。一般に、このような単位剤形は、少なくとも１つの本発明の化合物を０．１〜１０，０００ｍｇ含む。
【０１２６】
通常、予防または処置される症状、および投与経路に応じて、本発明の活性化合物は、通常、患者の体重１ｋｇあたり０．００１〜１５０ｍｇ／日で投与され、これは１日１回の投与として投与してもよく、１日１回以上に分割して投与してもよく、または、たとえば点滴注入を使用して本質的に連続して投与してもよい。
【０１２７】
一実施形態では、本発明の活性化合物は、１日１回の投与として投与されるか、１日１回、２回または３回以上に分割して投与されるか、または、たとえば点滴注入を使用して本質的に連続して投与される。
【０１２８】
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。これら実施例は、本発明の特定の実施形態を表すように意図されており、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【０１２９】
実施例
略語
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸；
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸；
ＦＢＳ：ウシ胎児血清；
ＧＳＴ：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；
ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸；
ＮＰ−４０：４−ノニルフェニルポリ（エチレングリコール）；
ＰＶＤＦ膜：フッ化ポリビニリデン膜；
ＲＩＰＡ：放射性免疫沈降アッセイ；
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所培地；
ＲＴ：室温；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動；
ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水
【０１３０】
Ｉ．ケミストリーの実施例
Ｉ．１．化合物１の合成
メチル  ３−アミノ−２−フルオロベンゾエート
【化２６】
2019532944.tif 000031
ＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中の３−アミノ−２−フルオロ安息香酸（１．０ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）の溶液を、濃Ｈ２ＳＯ４（０．５ｍＬ）で処理し、３時間加熱還流させた。さらなる量の濃Ｈ２ＳＯ４（０．３ｍＬ）を添加し、媒体を２時間還流させた。次にこの反応物を、ＷＥにわたって（over the WE）５０℃で攪拌した。固体の炭酸水素ナトリウムを注意深く添加し、メタノールを減圧下で蒸発させた。この残渣を、ＥｔＯＡｃと水との間で分配した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機物を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を真空下で濃縮して表題の化合物（１．２ｇ、定量的）を得た。
【０１３１】
メチル  ３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロベンゾエート
【化２７】
2019532944.tif 000032
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中のメチル  ３−アミノ−２−フルオロベンゾエート（２．０ｇ、１１．８２ｍｍｏｌ）の溶液を、ピリジン（１．９１ｍＬ、２３．６５ｍｍｏｌ）および２，６−ジフルオロベンゼンスルホニルクロリド（２．４０ｍＬ、１７．１７ｍｍｏｌ）で、０℃で処理した。この反応混合物を、室温で一晩攪拌した。媒体を水に注ぎ、ＨＣｌ水溶液（１Ｍ）を添加した。水層を、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機物を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ｃＨｅｘ  ８／２〜１０／０）による精製により、表題の化合物（２．５５ｇ，６２％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ−）：３４４．２（Ｍ−１）
【０１３２】
Ｎ−（３−（２−（２−クロロピリミジン−４−イル）アセチル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【化２８】
2019532944.tif 000033
リチウム  ビス（トリメチルシリル）アミド（ＴＨＦ中１Ｍ、４．０５ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、冷却した（０℃）、ＴＨＦ（３ｍＬ）中のメチル  ３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロベンゾエート（４００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。１０分間攪拌した後、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の２−クロロ−４−メチルピリミジン（１７８ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、反応混合物を、２時間にわたり室温に温めた。塩化アンモニウムの飽和水溶液を、媒体に添加した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出した（２回）。合わせた有機物を、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。ＤＣＭ／ｃＨｅｘ中での褐色固体の研和により、ケトンおよびエノールの混合物として表題の化合物（４２０ｍｇ、８２％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：４４２．０−４４４．０（Ｍ＋１）
【０１３３】
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−クロロピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【化２９】
2019532944.tif 000034
Ｎ−ブロモスクシンイミド（８０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、ジメチルアセトアミド（２ｍＬ）中のＮ−（３−（２−（２−クロロピリミジン−４−イル）アセチル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（２００．０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を、室温で１時間攪拌し、次に、２，２，２−トリメチルチオアセトアミド（５８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間攪拌した後に、媒体を６０℃で攪拌した。反応が完了した後、媒体を、水とＥｔＯＡＣとの間で分配した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機物を水および塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ、１／０〜０／１）による精製により、表題の化合物（１３５ｍｇ、５５％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：  ５３９．２−５４１．２  （Ｍ＋１）
【０１３４】
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（化合物１）
【化３０】
2019532944.tif 000035
触媒の濃ＨＣｌの存在下で、ｉＰｒＯＨ（１ｍＬ）中のＮ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−クロロピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（５０．０ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）およびアニリン（９．０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）の懸濁物を、１００℃で１時間、次いで８０℃で一晩、攪拌した。混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で分配した。有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を真空下で濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ｃＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ、１／０〜０／１）による精製により、表題の化合物１（４０ｍｇ、７２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．０９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２Ｈｚ）；７．８４（ｂｓ，  １Ｈ）；７．７２（ｍ，  １Ｈ）；７．４８（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．７Ｈｚ）；７．４４−７．３６（ｍ，  ３Ｈ）；７．２９（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．５Ｈｚ）；７．２４（ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．３Ｈｚ）；７．０２（ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．７Ｈｚ）；６．９２（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．７Ｈｚ）；６．２８（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２Ｈｚ）；１．４８（ｓ，  ９Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５９６．２  （Ｍ＋１）
【０１３５】
Ｉ．２．化合物２の合成
エチル  ２−（５−（２−クロロピリミジン−４−イル）−４−（３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロフェニル）チアゾール−２−イル）アセテート
【化３１】
2019532944.tif 000036
Ｎ−  ブロモスクシンイミド（２２１ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を、ジメチルアセトアミド（４．５ｍＬ）中の上述で得たＮ−（３−（２−（２−クロロピリミジン−４−イル）アセチル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（５００ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次に、エチル  ３−アミノ−３−チオオキソプロパノエート（２００ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間攪拌した後に、媒体を、水とＥｔＯＡｃとの間で分配した。有機層を、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を真空下で濃縮した、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、９５／５〜０／１）による精製により、表題の化合物（１６０ｍｇ、２５％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５６９．５−５７１．５（Ｍ＋１）
【０１３６】
エチル  ２−（４−（３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）アセテート（化合物２）
【化３２】
2019532944.tif 000037
触媒の濃ＨＣｌの存在下で、ｉＰｒＯＨ（１．５ｍＬ）中のエチル  ２−（５−（２−クロロピリミジン−４−イル）−４−（３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロフェニル）チアゾール−２−イル）アセテート（２００．０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）およびアニリン（５８μＬ、０．６３ｍｍｏｌ）の懸濁物を、マイクロ波の照射下で、１２０℃で３０分間攪拌した。０℃で冷却した後、上清を除去した。ｉＰｒＯＨ中の残りのゴム質の超音波処理および研和により、表題の化合物２（１９６ｍｇ、８９％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：６２６．５（Ｍ＋１）
【０１３７】
Ｉ．３．化合物３の合成
４−（４−（３−アミノ−２−フルオロフェニル）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）チアゾール−５−イル）−Ｎ−フェニルピリミジン−２−アミン
【化３３】
2019532944.tif 000038
濃ＨＣｌ（３４μＬ）の存在下で、ｉＰｒＯＨ（３．７ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−クロロピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）カルバメート（化合物６の合成を参照）（１７０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）およびアニリン（５１ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の懸濁物を、マイクロ波の照射下で、１２０℃で２時間攪拌した。この混合物を真空下で濃縮し、残渣を、ＥｔＯＡｃと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で分配した。有機層を、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ  １／０〜０／１）による残渣の精製により、表題の化合物（１０２ｍｇ、６６％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：４２０．４（Ｍ＋１）
【０１３８】
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミド（化合物３）
【化３４】
2019532944.tif 000039
冷却した（０℃）、ＴＨＦ（１．１ｍＬ）中の４−（４−（３−アミノ−２−フルオロフェニル）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）チアゾール−５−イル）−Ｎ−フェニルピリミジン−２−アミン（４７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、およびピリジン（１０μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、プロピルスルホニルクロリド（１４μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。５０℃で１時間加熱した後に、混合物を、ＥｔＯＡｃとＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）との間で分配した。有機層をＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で乾燥させた。分取ＴＬＣ（ｃＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ  ７／３）による残渣の精製により、表題の化合物３（２２ｍｇ、３７％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５２６．４（Ｍ＋１）
【０１３９】
Ｉ．４．化合物４の合成
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−３，３，３−トリフルオロプロパン−１−スルホンアミド（化合物４）
【化３５】
2019532944.tif 000040
冷却した（０℃）、ＴＨＦ（０．７ｍＬ）中の４−（４−（３−アミノ−２−フルオロフェニル）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）チアゾール−５−イル）−Ｎ−フェニルピリミジン−２−アミン（３０ｍｇ、７１μｍｏｌ）、およびピリジン（１３μＬ、１５７μｍｏｌ）の溶液に、３，３，３−トリフルオロプロパンスルホニルクロリド（２０μＬ、１５７μｍｏｌ）を添加した。５０℃で一晩加熱した後に、混合物を、ＥｔＯＡｃとＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）との間で分配した。有機層を、ＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で乾燥させた。分取ＴＬＣ（ｃＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ  ７／３）による残渣の精製により、表題の化合物４（１２ｍｇ、３１％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５８０．５（Ｍ＋１）
【０１４０】
Ｉ．５．化合物５の合成
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２−（２，６−ジフルオロフェニル）−２−オキソアセトアミド（化合物５）
【化３６】
2019532944.tif 000041
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の４−（４−（３−アミノ−２−フルオロフェニル）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）チアゾール−５−イル）−Ｎ−フェニルピリミジン−２−アミン（２０ｍｇ、４７μｍｏｌ）および２−（２，６−ジフルオロフェニル）−２−オキソ酢酸（２８ｍｇ、１５０μｍｏｌ）の混合物に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２２ｍｇ、１１０μｍｏｌ）、２−ピリジノール１−オキシド（０．５ｍｇ、４μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２０μＬ、１４０μｍｏｌ）を添加した。室温で１時間攪拌した後に、混合物を、ＥｔＯＡｃと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で分配した。有機層を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、ＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ）、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を真空下で濃縮した。分取ＴＬＣ（ｃＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ  ７５／２５）による残渣の精製により、表題の化合物（６．４ｍｇ、２２％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５８８．４（Ｍ＋１）
【０１４１】
Ｉ．６．化合物６の合成
メチル  ３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−フルオロベンゾエート
【化３７】
2019532944.tif 000042
冷却した（０℃）、ＴＨＦ（１７７ｍＬ）中のメチル  ３−アミノ−２−フルオロベンゾエート（６００ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリホスゲン（５２６ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、３時間還流させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ＴＨＦ／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２５ｍＬ／１５５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、トリエチルアミン（４９４μＬ、３．５５ｍｍｏｌ）で処理し、５０℃で２時間加熱した。真空下で濃縮した後、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ｃＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ  １／０〜８／２）による残渣の精製により、表題の化合物（７９０ｍｇ、８１％）を得た。
【０１４２】
ｔｅｒｔ−ブチル  （３−（２−（２−クロロピリミジン−４−イル）アセチル）−２−フルオロフェニル）カルバメート
【化３８】
2019532944.tif 000043
リチウム  ビス（トリメチルシリル）アミド（ＴＨＦ中１Ｍ、１０．２６ｍＬ、１０．２６ｍｍｏｌ）の溶液を、冷却した（０℃）ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のメチル  ３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−フルオロベンゾエート（７９０ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。１０分間攪拌した後、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の２−クロロ−４−メチルピリミジン（４５２ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、反応混合物を、１時間にわたり４０℃に温めた。媒体に、塩化アンモニウム飽和水溶液を添加した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出した（２回）。合わせた有機物を、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ｃＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ  １／０〜０／１）による残渣の精製により、表題の化合物（８８０ｍｇ、８２％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：３６６．３−３６８．３（Ｍ＋１）
【０１４３】
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−クロロピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）カルバメート
【化３９】
2019532944.tif 000044
Ｎ−ブロモスクシンイミド（１０７ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、ジメチルアセトアミド（５．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（２−クロロピリミジン−４−イル）アセチル）−２−フルオロフェニル）カルバメート（２００．０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を、室温で１時間攪拌し、次に、２，２，２−トリメチルチオアセトアミド（７０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間攪拌した後、媒体を５０℃で一晩加熱した。混合物を水に注ぎ、懸濁物をろ過した。固体を真空下で乾燥させて、表題物質（２２０ｍｇ、８６％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：４６３．３−４６５．３（Ｍ＋１）
【０１４４】
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）カルバメート（化合物６）
【化４０】
2019532944.tif 000045
触媒の濃ＨＣｌ（４μＬ）の存在下で、ｉＰｒＯＨ（１．６ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−クロロピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）カルバメート（７７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、およびアニリン（２３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の懸濁物を、マイクロ波の照射下で、１００℃で３時間攪拌した。混合物を真空下で濃縮した。分取ＴＬＣ（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ  ８／２）による残渣の精製により、表題の化合物６（１５ｍｇ、１７％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５２０．５（Ｍ＋１）
【０１４５】
Ｉ．７．化合物７の合成
４−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
【化４１】
2019532944.tif 000046
ＴＨＦ（２７ｍＬ）中の４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（４１８ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）、およびパラジウムテトラキス（１５７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）のあらかじめ脱気した溶液に、トリメチルアルミニウム（２．７２ｍＬ、５．４４ｍｍｏｌ、トルエン中２Ｍ）の溶液を添加した。一晩還流させた後に、混合物を０℃に冷却し、塩化アンモニウム飽和水溶液をゆっくりと添加することによりクエンチした。媒体をＥｔＯＡで希釈した。混合物をろ過し、ろ液をデカントした。有機層を塩水で洗浄し、ろ過し、真空下で濃縮して、純粋ではない表題の化合物（３３８ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：１３４．１（Ｍ＋１）
【０１４６】
４−メチル−７−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン
【化４２】
2019532944.tif 000047
水素化ナトリウム（３６ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、６０重量％）を、冷却した（０℃）、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の純粋ではない４−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（８０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。０℃で１０分間攪拌した後、２−（トリメチルシリル）エトキシメチルクロリド（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、２時間にわたり室温でゆっくりと攪拌した。混合物を、塩化アンモニウム飽和水溶液を添加することにより、注意深くクエンチした。水層をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。合わせた有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。シリカ上でのクロマトグラフィー（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ）による残渣の精製により、表題の化合物（８５ｍｇ、５３％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：２６４．３（Ｍ＋１）。
【０１４７】
２，６−ジフルオロ−Ｎ−（２−フルオロ−３−（２−（７−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アセチル）フェニル）ベンゼンスルホンアミド
【化４３】
2019532944.tif 000048
リチウム  ビス（トリメチルシリル）アミド（ＴＨＦ中１Ｍ、１．０１ｍＬ、１．０１ｍｍｏｌ）の溶液を、冷却した（０℃）、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中のメチル  ３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロベンゾエート（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。１０分間攪拌した後、ＴＨＦ（１ｍＬ）中の４−メチル７−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（７６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、反応混合物を室温に温めた。２時間攪拌した後、塩化アンモニウム飽和水溶液を、媒体に添加した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した（２回）。合わせた有機物を、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して、ケトンおよびエノールの混合物として表題の化合物（１７０ｍｇ、定量（ｑｕａｎｔ））を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５７７．４（Ｍ＋１）
【０１４８】
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（７−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【化４４】
2019532944.tif 000049
Ｎ−クロロスクシンイミド（１１．５ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を、ジメチルアセトアミド（１ｍＬ）中の２，６−ジフルオロ−Ｎ−（２−フルオロ−３−（２−（７−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アセチル）フェニル）ベンゼンスルホンアミド（５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次に２，２，２−トリメチルチオアセトアミド（１０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を添加した。媒体を６５℃で一晩加熱した。次に、混合物を水とＥｔＯＡｃとの間で分配した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機物を、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で濃縮した。分取ＴＬＣ（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ  ７／３）による精製により、表題の化合物（８ｍｇ、１３％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：６７４．６（Ｍ＋１）．
【０１４９】
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【化４５】
2019532944.tif 000050
ＴＦＡ（０．２５ｍＬ）中のＮ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（７−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で３０分間攪拌した。この混合物を真空下で濃縮し、残渣をＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、アンモニアを含むメタン（５０μＬ、７Ｎ）の溶液を添加した。室温で３０分間攪拌した後に、混合物を真空下で濃縮した。この残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄した。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を真空下で濃縮した。ｃＨｅｘ／ＤＣＭ（９／１）における残渣の研和により、表題の化合物（３．６ｍｇ、５５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  ９．１２  （ｂｓ，  １Ｈ）；  ８．７６  （ｓ，  １Ｈ）；７．６９−７．６６  （ｍ，  １Ｈ）；  ７．６２−７．５８  （ｂｓ，  １Ｈ）；  ７．５７−７．５５  （ｍ，  １Ｈ）；  ７．５２−７．４６  （ｍ，  １Ｈ）；  ７．２１  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ７．９Ｈｚ）；  ７．０９  （ｂｓ，  １Ｈ）；  ６．９６  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．７Ｈｚ）；  ５．７６  （ｂｓ，  １Ｈ）；  １．５１  （ｓ，  ９Ｈ）．  ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：  ５４４．４  （Ｍ＋１）
【０１５０】
Ｉ．８．化合物８の合成
２，６−ジフルオロ−Ｎ−（２−フルオロ−３−（２−（２−ヒドロキシエチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）フェニル）ベンゼンスルホンアミド（化合物８）
【化４６】
2019532944.tif 000051
ＬＡＨ溶液（ＴＨＦ中２Ｎ、２４０μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を、冷却した（０℃）、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の化合物２（エチル  ２−（４−（３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）アセテート）（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。室温で４時間攪拌した後、さらに３当量のＬＡＨ（ＴＨＦ中２Ｎ、２４０μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温でさらに２時間攪拌した。反応を、０℃のＨＣｌ水溶液（１Ｎ）を添加することによりクエンチした。こ混合物を、ＥｔＯＡｃと水との間で分配した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出し（２回）、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。２つの連続する分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９６／４）による残渣の精製により、表題の化合物８（３．７ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５８４．５（Ｍ＋１）
【０１５１】
Ｉ．９．化合物９の合成
２−（４−（３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）−Ｎ−メチルアセトアミド（化合物９）
【化４７】
2019532944.tif 000052
ＭｅＯＨ（１．６ｍＬ）中の化合物２（エチル  ２−（４−（３−（（２，６−ジフルオロフェニル）スルホンアミド）−２−フルオロフェニル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−２−イル）アセテート）（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液を、メチルアミン溶液（ＭｅＯＨ中９．８Ｎ、３２５μＬ、３．２ｍｍｏｌ）で処理した。室温で３０分間攪拌した後、混合物を真空下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃに溶解し、得られた有機層を、塩化アンモニウム飽和水溶液、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ  １／０〜９５／５）による残渣の精製により、表題化合物９（６０ｍｇ、５８％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：６１１．５（Ｍ＋１）
【０１５２】
Ｉ．１０．化合物１０の合成
Ｎ−（３−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（２−（フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）チアゾール−４−イル）−２−フルオロフェニル）シクロプロパンスルホンアミド（化合物１０）
【化４８】
2019532944.tif 000053
シクロプロピルスルホニルクロリド（１０μＬ、９５μｍｏｌ）を、ピリジン（１ｍＬ）中の４−（４−（３−アミノ−２−フルオロフェニル）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）チアゾール−５−イル）−Ｎ−フェニルピリミジン−２−アミン（２０ｍｇ、４７μｍｏｌ）の溶液に添加した。室温で２日間（２ｄ）攪拌した後、シクロプロピルスルホニルクロリド（１０μＬ、９５μｍｏｌ）を添加した。混合物を、さらに２日間攪拌した。混合物を真空下で濃縮し、残渣を、ＥｔＯＡｃと塩化アンモニウム飽和水溶液との間で分配した。有機層を、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で乾燥した。分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９５／５）による残渣の精製により、表題化合物１０（９ｍｇ、３６％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ＋）：５２４．５（Ｍ＋１）
【０１５３】
ＩＩ．生物学的な実施例
ＩＩ．１．ＬＩＭＫ１キナーゼのアッセイ
材料および方法
化合物を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐａｎｌａｂｓ  Ｉｎｃが行ったＬＩＭＫアッセイで試験した。ＬＩＭＫ１（ｈ）を、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ｍｇ／ｍＬのコフィリン、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および［ガンマ−３３Ｐ］−ＡＴＰと共にインキュベートする。反応を、Ｍｇ／ＡＴＰの混合物の添加により、開始する。室温で４０分間インキュベートした後に、反応を、０．５％の濃度までリン酸を添加することにより、停止させる。次に、反応物１０μＬを、Ｐ３０  ｆｉｌｔｅｒｍａｔにスポットし、０．４２５％のリン酸で４分間４回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後に、乾燥およびシンチレーションでの計測を行う。化合物を、１０；３；１；０．３；０．１；０．０３；０．０１；０．００３；０．００１μＭ、および１５μＭのＡＴＰで試験した。次に、ＩＣ５０  ＬＩＭＫ１を決定する。
【０１５４】
結果
結果を以下の図２に提示し、以下のように表す：「＋」は、５００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５０００ｎＭを意味し：「＋＋」は、１００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５００ｎＭを意味し；「＋＋＋」は、１０ｎＭ＜ＩＣ５０＜１００ｎＭを意味し；「＋＋＋＋」は、ＩＣ５０＜１０ｎＭを意味する。
【表２】
2019532944.tif 000054
【０１５５】
ＩＩ．２．ＬＩＭＫ２キナーゼアッセイ
材料および方法
ＬＩＭＫ２キナーゼアッセイ（化合物１）
化合物を、ＬＩＭＫ２アッセイで試験し、アッセイは、１．５μｌの化合物または対照としての当量のＤＭＳＯ、１μｌ（６．２５ｎｇ）のＮ末端６Ｈｉｓタグ付き組み換えヒトＬＩＭＫ２フラグメント１−６３８（Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃０９−１０６、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＮＰ−４０、５％のグリセロール、０．１％の２−メルカプトエタノール、１ｍｇ．ｍＬ−１のウシ血清アルブミン中）、ならびに８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ＝７．０）、２００μＭのＥＤＴＡ、１１０μＭの組み換えＧＳＴ−コフィリン１、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および３６０μＭのＡＴＰを含む混合物を含む最終容量１２．５μｌで行った。アッセイを、３０℃で１０分間行った後に、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー４０μｌを添加することにより終了させた。次に、試料を、１５００μＬのＨ２Ｏに希釈し、次に１００μＬを、２００μＬのＴＢＳで希釈する。次に、５μＬを、ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ  ＩＰＶＨ０００１０）にスポットする。室温で２０分間インキュベートした後、膜を、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、および５％のＢＳＡを用いて、攪拌しながら室温で１時間ブロッキングした。膜を、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を用いて攪拌しながら室温で１０分間３回すすぎ、次に、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、および１％のＢＳＡに希釈した抗ホスホ−Ｓｅｒ３−コフィリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃３３１３、１／１０００倍希釈）抗体を用いて室温で１時間すすいだ。次に、膜を、ＴＢＳＴ中で攪拌しながら室温で１０分間、３回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１１−０３６−１５２）と共に、室温で攪拌しながら１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ中、室温で１０分間、３回洗浄した後、リン酸化したコフィリンの検出を、化学発光キットＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ２１３２）を使用して行った。次に、ＩＣ５０  ＬＩＭＫ２を決定する。
【０１５６】
ＬＩＭＫ２キナーゼアッセイ（化合物９）
ＬＩＭＫ２（ｈ）を、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．６３ｍｇ／ｍＬのコフィリン、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および［９−３３Ｐ−ＡＴＰ］（必要に応じた特定の活性および濃度）と共にインキュベートする。反応を、Ｍｇ／ＡＴＰの混合物の添加により開始する。室温で１２０分間インキュベートした後、反応を、リン酸を０．５％の濃度となるよう添加することにより、停止させる。停止した反応物１０μｌを、Ｐ３０  ｆｉｌｔｅｒｍａｔにスポットし、０．４２５％のリン酸中で４分間、４回洗浄し、メタノール中で１回洗浄した後に、乾燥させ、シンチレーションによる計測を行う。化合物を、１０；３；１；０．３；０．１；０．０３；０．０１；０．００３；０．００１μＭ、および１５μＭのＡＴＰで試験した。次に、ＩＣ５０  ＬＩＭＫ２を決定した。
【０１５７】
結果
結果を以下の表３に提示し、以下のように表す：「＋」は、５００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５０００ｎＭを意味し：「＋＋」は、１００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５００ｎＭを意味し；「＋＋＋」は、１０ｎＭ＜ＩＣ５０＜１００ｎＭを意味し；「＋＋＋＋」は、ＩＣ５０＜１０ｎＭを意味する。
【表３】
2019532944.tif 000055
【０１５８】
ＩＩ．３．キナーゼ選択性の解析
材料および方法
キナーゼ選択性を、５８個の組み換えタンパク質キナーゼのパネルについて行った。アッセイを、ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒ  ｐａｎｅｌ  ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、各キナーゼに関するそれぞれのＫｍ  ＡＴＭで、５μＭの阻害剤の存在下で行った。１μＭの阻害剤の存在下で測定した残留活性を、阻害剤の非存在下で決定した活性のパーセントとして表す。
【０１５９】
結果
化合物１に関する結果を、以下の表４に提示し、以下のように表す：「−」は、５０％≦残留活性を意味し；「＋」は、１０％≦残留活性＜５０％を意味し；「＋＋」は、３％≦残留活性＜１０％  ｎＭを意味し；「＋＋＋」は、残留活性＜３％を意味する。
【表４】
2019532944.tif 000056
【０１６０】
Ｂ−Ｒａｆに関して、ＩＣ５０を同様に決定し、上記で報告したＬＩＭＫ１  ＩＣ５０（パートＩＩ．１）と比較して、Ｂ−Ｒａｆに対するＬＩＭＫに関する本発明の化合物の選択性を定量化した。
【０１６１】
結果を以下の表５に提示し、以下のように表す：「＋」は、５００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５００００ｎＭを意味し：「＋＋」は、１００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５００ｎＭを意味し；「＋＋＋」は、１０ｎＭ＜ＩＣ５０＜１００ｎＭを意味し；「＋＋＋＋」は、ＩＣ５０＜１０ｎＭを意味する。
【表５】
2019532944.tif 000057
【０１６２】
化合物１に関して、ＩＣ５０  ＬＩＭＫ１（ｎＭ）でＩＣ５０  Ｂ−Ｒａｆ（ｎＭ）を除算することにより計算した、Ｂ−Ｒａｆに対するＬＩＭＫ１の選択性の比率は、約２０であると決定された。
【０１６３】
ＩＩ．４．細胞増殖アッセイおよび細胞コフィリンリン酸化状態のウェスタンブロット解析
材料および方法
細胞株および細胞培養
最初に、ＭＶ４−１１細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＶ４−１１細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）および２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５９２０２Ｃ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  １０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％ＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１６４】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。ＭＶ４−１１細胞を、ウェルあたり５，０００個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖は、製造元の推奨に従いＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを使用して評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１６５】
細胞コフィリンのリン酸化状態のウェスタンブロット解析
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０４６）において、２×１０６個の細胞を含む培地１．５ｍＬを、化合物で２時間処理する。次に細胞を回収し、細胞の溶解を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ５７２６）を補充したＲＩＰＡバッファーを使用して、４℃で行う。４℃、１５０００ｇで３０分間遠心分離した後に、上清をＬａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、９５℃で５分間加熱することにより変性を行う。試料１０μＬを、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動に供する。電気泳動による転写（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ  ＩＰＶＨ０００１０）を、０．１％のＴｗｅｅｎ２０および５％のＢＳＡを含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）を用いて、攪拌しながら室温で１時間ブロッキングする。この膜を、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を用いて、攪拌しながら室温で１０分間、３回すすぎ、次に、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、および１％のＢＳＡに希釈した抗ホスホ−Ｓｅｒ３−コフィリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃３３１３、１／１０００倍希釈）抗体または抗コフィリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃３３１２，  １／１０００倍希釈）を用いて、室温で１時間すすいだ。次に膜を、ＴＢＳＴ中で、攪拌しながら室温で１０分間、３回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１１−０３６−１５２）と共に、攪拌しながら室温で１時間インキュベートする。ＴＢＳＴにおいて室温で１０分間、３回洗浄した後、総コフィリンまたはリン酸化コフィリンの検出を、化学発光キットのＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ２１３２）を使用して行った。化合物の各濃度に関して、リン酸化コフィリンと総コフィリンとの間の比率を決定する。次に、この比率を、対照の比率（すなわち、ＤＭＳＯで処理した細胞由来の比率）のパーセンテージとして表す。次に、ＩＣ５０を決定する。
【０１６６】
結果
細胞増殖の結果を、以下の表６に提示し、以下のように表す：「＋」は、５μＭ＜ＧＩ５０を意味する；「＋＋」は、１μＭ＜ＧＩ５０≦５μＭを意味し、「＋＋＋」は、ＧＩ５０≦１μＭを意味する。
【表６】
2019532944.tif 000058
【０１６７】
細胞のコフィリンのリン酸化状態の結果を、以下の表７に提示し、以下のように表す：「＋」は、１μＭ≦ＩＣ５０を意味し；「＋＋」は、０．２μＭ≦ＩＣ５０＜１μＭを意味し；「＋＋＋」は、ＩＣ５０＜０．２μＭを意味する。
【表７】
2019532944.tif 000059
【０１６８】
ＩＩ．５．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択性アッセイ
材料および方法
ＬＩＭＫ１キナーゼアッセイ
化合物を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐａｎｌａｂｓ  Ｉｎｃが行うＬＩＭＫ１アッセイで試験した。ＬＩＭＫ１（ｈ）は、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ｍｇ／ｍＬのコフィリン、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および［ガンマ−３３Ｐ］−ＡＴＰと共にインキュベートする。この反応を、Ｍｇ／ＡＴＰ混合物の添加により開始する。室温で４０分間インキュベートした後、反応を、リン酸を０．５％の濃度まで添加することにより停止させる。次に、反応物１０μＬを、Ｐ３０  ｆｉｌｔｅｒｍａｔにスポットし、０．４２５％のリン酸で４分間、４回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーションによる計測を行う。化合物を、１０；３；１；０．３；０．１；０．０３；０．０１；０．００３；０．００１μＭ、および１５μＭのＡＴＰで試験した。次に、ＩＣ５０  ＬＩＭＫ１を決定する。
【０１６９】
Ｂ−Ｒａｆキナーゼアッセイ
化合物を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐａｎｌａｂｓ  Ｉｎｃが行うＢ−Ｒａｆアッセイで試験した。Ｂ−Ｒａｆ（ｈ）を、２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎｄａｔｅ）、０．５ｍＭの６−グリセロリン酸、１％のグリセロール、３４ｎＭの不活性のＭＥＫ１、６９ｎＭの不活性のＭＡＰＫ２、０．５ｍｇ／ｍＬのミエリン塩基性タンパク質、および１０ｍＭの酢酸マグネシウムおよび［ガンマ−３３Ｐ］−ＡＴＰと共にインキュベートする。反応は、Ｍｇ／ＡＴＰ混合物の添加により開始する。室温で４０分間インキュベートした後、反応を、リン酸を０．５％の濃度となるまで添加することにより、停止させる。次に、反応物１０μＬをＰ３０  ｆｉｌｔｅｒｍａｔにスポットし、０．４２５％のリン酸で４分間、４回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後、乾燥させ、シンチレーションによる計測を行う。化合物を、１０；３；１；０．３；０．１；０．０３；０．０１；０．００３；０．００１μＭ、および１２０μＭのＡＴＰで試験した。次に、ＩＣ５０  Ｂ−Ｒａｆを決定する。
【０１７０】
選択性の比率を、ＩＣ５０  ＬＩＭＫ１（ｎＭ）でＩＣ５０  Ｂ−Ｒａｆ（ｎＭ）を除算することにより計算する。
【０１７１】
結果
結果を、以下の表８に提示し、以下のように表す：「＋」は、５００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５０００ｎＭを意味し；「＋＋」は、１００ｎＭ≦ＩＣ５０＜５００ｎＭを意味し；「＋＋＋」は、１０ｎＭ＜ＩＣ５０＜１００ｎＭを意味し；「＋＋＋＋」は、ＩＣ５０＜１０ｎＭを意味する。
【０１７２】
化合物８（Ｎａ）および９（Ｎａ）は、それぞれ、化合物８および化合物９のナトリウム塩を表す。
【表８】
2019532944.tif 000060
【０１７３】
ＩＩ．６．細胞選択性のアッセイ
材料および方法
ＨＬ−６０
細胞株および細胞培養
最初に、ＨＬ−６０細胞株を、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入した。ＨＬ−６０細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  １０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで培養する。細胞を、５％ＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１７４】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。ＨＬ−６０細胞を、ウェルあたり６２５０個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１７５】
Ｋ−５６２
細胞株および細胞培養
最初に、Ｋ−５６２細胞株を、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入した。Ｋ−５６２細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  １０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％ＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１７６】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。Ｋ−５６２細胞を、ウェルあたり１５６２個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１７７】
Ｋａｓｕｍｉ−１
細胞株および細胞培養
最初に、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ｋａｓｕｍｉ−１細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  ２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％のＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１７８】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。Ｋａｓｕｍｉ−１細胞を、ウェルあたり２００００個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１７９】
ＭＯＬＭ−１３
細胞株および細胞培養
最初に、ＭＯＬＭ−１３細胞株を、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入した。ＭＯＬＭ−１３細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  ２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％のＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１８０】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。ＭＯＬＭ−１３細胞を、ウェルあたり１５６２個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１８１】
ＭＯＬＭ−１４
細胞株および細胞培養
最初に、ＭＯＬＭ−１４細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＯＬＭ−１４細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）を補充したＭＥＭ  ａｌｐｈａ  １０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％のＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１８２】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。ＭＯＬＭ−１４細胞を、ウェルあたり３０００個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１８３】
ＭＶ４−１１
細胞株および細胞培養
最初に、ＭＶ４−１１細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入した。ＭＶ４−１１細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）、および２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５９２０２Ｃ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  ２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％のＣＯ２下、３７℃で維持した。
【０１８４】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。ＭＶ４−１１細胞を、ウェルあたり５，０００個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１８５】
ＴＨＰ−１
細胞株および細胞培養
最初に、ＴＨＰ−１細胞株を、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入した。ＴＨＰ−１細胞を、１００Ｕ／ｍＬ−１のペニシリン、０．１ｍｇ．ｍＬ−１のストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐ０６−０７１００）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  ２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで培養する。細胞を、５％のＣＯ２下、３７℃で培養した。
【０１８６】
細胞増殖アッセイ
アッセイを、９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏｏｎｅ  ６５５０９０）で行った。ＴＨＰ−１細胞を、ウェルあたり５，０００個の細胞で播種する。次に、化合物（または当量のＤＭＳＯ）を添加し、細胞を４８時間増殖させる。増殖を、製造元の推奨に従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して、評価する。結果を、ＤＭＳＯ対照と比較したＧＩ５０（増殖阻害５０％：増殖が５０％阻害される濃度）として表す。
【０１８７】
ウェスタンブロット解析（すべての細胞株に関して）
細胞のコフィリンのリン酸化状態のウェスタンブロット解析
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０４６）において、２×１０６個の細胞を含む１．５ｍＬの培地を、化合物で２時間処理する。次に、細胞を回収し、細胞の溶解を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ５７２６）を補充したＲＩＰＡバッファーを使用して、４℃で行う。４℃、１５０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清をＬａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、９５℃で５分間加熱することにより変性を行う。試料１０μＬを、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動に供する。電気泳動による転写（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ  ＩＰＶＨ０００１０）を、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０および５％のＢＳＡを含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ＴＢＳ）を用いて、攪拌しながら室温で１時間ブロッキングする。膜を、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を用いて、攪拌しながら室温で１０分間すすぎ、次に、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、および１％のＢＳＡで希釈した抗ホスホ―Ｓｅｒ３−コフィリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃３３１３，  １／１０００倍希釈）抗体または抗コフィリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃３３１２，  １／１０００倍希釈）を用いて、室温で１時間すすぐ。次に、膜を、ＴＢＳＴ中で攪拌しながら、室温で１０分間、３回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１１−０３６−１５２）と共に、室温で攪拌しながら１時間インキュベートする。ＴＢＳＴにおいて、室温で１０分間、３回洗浄した後、総コフィリンまたはリン酸化コフィリンの検出を、化学発光キットのＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ２１３２）を使用して行った。各化合物の濃度に関して、リン酸化コフィリンと総コフィリンとの間の比率を決定する。次に、この比率を、対照の比率（すなわちＤＭＳＯで処理した細胞由来の比率）のパーセンテージとして表す。次に、ＩＣ５０  ホスホ―Ｓｅｒ３−コフィリン／全体のコフィリンを決定する。
【０１８８】
細胞のＭＥＫ１リン酸化状態のウェスタンブロット解析
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０４６）において、２×１０６個の細胞を含む培地１．５ｍＬを、化合物で２時間処理する。次に、細胞を回収し、細胞の溶解を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ８３４０）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ５７２６）を補充したＲＩＰＡバッファーを使用して、４℃で行う。４℃、１５０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清を、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、９５℃で５分間加熱することにより変性を行う。試料１０μＬを、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動に供する。電気泳動による転写（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ  ＩＰＶＨ０００１０）を、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０および５％のＢＳＡを含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４（ＴＢＳ））を用いて、攪拌しながら室温で１時間ブロッキングする。膜を、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を用いて、攪拌しながら室温で１０分間、３回すすぎ、次に、ＴＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、および１％のＢＳＡで希釈した抗ホスホ―Ｓｅｒ２１８／２２２−ＭＥＫ１（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−４６１，  １／１０００倍希釈）抗体または抗ＭＥＫ１（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−６４１，  １／１０００倍希釈）を用いて、室温で１時間すすいだ。次に、膜を、ＴＢＳＴ中で、攪拌しながら室温で１０分間、３回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃７１１−０３６−１５２）と共に、室温で攪拌しながら１時間インキュベートする。ＴＢＳＴにおいて、室温で１０分間、３回洗浄した後、総コフィリンまたはリン酸化コフィリンの検出を、化学発光キットのＥＣＬ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ２１３２）を使用して行った。化合物の各濃度に関して、リン酸化コフィリンと総コフィリンとの間の比率を決定する。次に、この比率を、対照の比率（すなわちＤＭＳＯで処理した細胞由来の比率）のパーセンテージとして表す。次に、ＩＣ５０  ホスホ―Ｓｅｒ３−コフィリン／全体のＭＥＫを決定する。
【０１８９】
選択性の比率を、ＩＣ５０  ホスホ―Ｓｅｒ３−コフィリン／総コフィリンの値（μＭ）でＩＣ５０  Ｐ−ＭＥＫ／全体のＭＥＫの値（μＭ）を除算することにより計算する。
【０１９０】
結果
化合物１に関する結果を、以下の表９に提示し、以下のように表す：「＋」は、１μＭ≦ＩＣ５０を意味し；「＋＋」は、０．２μＭ≦ＩＣ５０＜１μＭを意味し；「＋＋＋」は、ＩＣ５０＜０．２μＭを意味する。
【表９】
2019532944.tif 000061
【０１９１】
化合物８に関する結果を、以下の表１０に提示し、以下のように表す：「＋」は、１μＭ≦ＩＣ５０を意味し；「＋＋」は、０．２μＭ≦ＩＣ５０＜１μＭを意味し；「＋＋＋」は、ＩＣ５０＜０．２μＭを意味する。
【表１０】
2019532944.tif 000062
【０１９２】
化合物８（Ｎａ）、すなわち化合物８のナトリウム（Ｎａ）塩に関する結果を、以下の表１１に提示し、以下のように表す：「＋」は、１μＭ≦ＩＣ５０を意味し；「＋＋」は、０．２μＭ≦ＩＣ５０＜１μＭを意味し；「＋＋＋」は、ＩＣ５０＜０．２μＭを意味する。
【表１１】
2019532944.tif 000063
【０１９３】
化合物９に関する結果を、以下の表１２に提示し、以下のように表す：「＋」は、１μＭ≦ＩＣ５０を意味し；「＋＋」は、０．２μＭ≦ＩＣ５０＜１μＭを意味し；「＋＋＋」は、ＩＣ５０＜０．２μＭを意味する。
【表１２】
2019532944.tif 000064
【０１９４】
化合物９（Ｎａ）、すなわち化合物９のナトリウム（Ｎａ）塩に関する結果を、以下の表１３に提示し、以下のように表す：「＋」は、１μＭ≦ＩＣ５０を意味し；「＋＋」は、０．２μＭ≦ＩＣ５０＜１μＭを意味し；「＋＋＋」は、ＩＣ５０＜０．２μＭを意味する。
【表１３】
2019532944.tif 000065
【国際調査報告】
2019532944.tif 000078
2019532944.tif 000079
2019532944.tif 000080
2019532944.tif 000081