(57)【要約】【解決手段】ヒト多能性幹細胞(hPSC)から脊髄グルタミン酸作動性介在ニューロン（V2a 介在ニューロン）を生成する方法を提供する。本開示の方法では、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ(Shh) シグナル経路活性化剤及びNotch シグナル経路阻害剤を含む神経誘導培地で第１の集団のhPSCをインビトロで培養してもよく、培養により、CHX10+ V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成する。hPSC由来の脊髄グルタミン酸作動性介在ニューロンを含む非ヒト動物モデル、及び非ヒト動物モデルを生成する方法を更に提供する。
2019517257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞(hPSC)集団から脊髄グルタミン酸作動性介在ニューロンを生成する方法であって、
レチノイン酸シグナル経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ(Shh) シグナル経路活性化剤、及びNotch シグナル経路阻害剤を含む神経誘導培地に第１の集団のhPSCをインビトロで培養し、
培養により、CHX10+V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、レチノイン酸受容体作動薬を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レチノイン酸受容体作動薬は、レチノイン酸又はレチノイン酸の誘導体を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Shh シグナル経路活性化剤はスムーズンド作動薬を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記スムーズンド作動薬はパルモルファミン又はパルモルファミンの誘導体であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Notch シグナル経路阻害剤は、Notch 受容体活性化の阻害剤を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記Notch 受容体活性化の阻害剤はNotch 受容体拮抗薬であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Notch 受容体活性化の阻害剤はγセクレターゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記γセクレターゼ阻害剤は、N-[(3,5-ジフルオロフェニル)アセチル]-L-アラニル-2-フェニル]グリシン-1,1-ジメチルエチルエステル(DAPT)であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約20nM〜約500 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約30nM〜約300 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約100 nMの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Shh シグナル経路活性化剤は、約50nM〜約500 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記Shh シグナル経路活性化剤は、約30nM〜約300 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Shh シグナル経路活性化剤は、約100 nMの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Notch シグナル経路阻害剤は、約250 nM〜約10μＭの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記Notch シグナル経路阻害剤は、約500 nM〜約５μＭの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Notch シグナル経路阻害剤は、約１μＭの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培養する際に、前記第１の集団のhPSCを順番に、
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地、及び
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤、前記Shh シグナル経路活性化剤及び前記Notch シグナル経路阻害剤を含む第２の神経誘導培地
と、CHX10+V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成するのに十分な条件下で接触させることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
培養する際に、前記第１の集団のhPSCを順番に、
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地、
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤及び前記Shh シグナル経路活性化剤を含む第２の神経誘導培地、及び
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤、前記Shh シグナル経路活性化剤及び前記Notch シグナル経路阻害剤を含む第３の神経誘導培地
と、CHX10+V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成するのに十分な条件下で接触させることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の神経誘導培地は前記Notch シグナル経路阻害剤を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の神経誘導培地は、前記Notch シグナル経路阻害剤を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の神経誘導培地及び前記第２の神経誘導培地は、前記Notch シグナル経路阻害剤を含まないことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の集団のhPSCを、前記第１の神経誘導培地と接触させてから約２日後に、前記第２の神経誘導培地と接触させることを特徴とする請求項１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
hPSC集団を、前記第１の神経誘導培地と接触させてから７〜13日間、培養することを特徴とする請求項１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の神経誘導培地は、一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を更に含むことを特徴とする請求項１９〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の神経誘導培地及び前記第３の神経誘導培地は、前記一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を含まないことを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
前記一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を、Noggin、dorsomorphin、LDN193189 、SB431542又はこれらの組合せから選択することを特徴とする請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の集団のhPSCを、細胞外マトリクス成分の被覆体を有する細胞培養基質で培養することを特徴とする請求項１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞培養基質は、Matrigel（登録商標）の被覆体を有することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
培養する際に、約5,000 〜約120,000 細胞/cm2の密度で細胞培養基質に前記第１の集団のhPSCを播種することを特徴とする請求項１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
hPSCは、胚性幹細胞(ESC) 又は人工多能性幹細胞(iPSC)を含むことを特徴とする請求項１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
hPSCはH7 ESCであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
hPSCはH1 ESCであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
hPSCはWTC iPSCであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
hPSCはWTB iPSCであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の集団の培養細胞の10％〜60％は、CHX10+V2a介在ニューロンであることを特徴とする請求項１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の集団の培養細胞の20％〜40％は、CHX10+V2a介在ニューロンであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の集団の培養細胞の30％は、LHX3+であることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
FOXN4 、CHX10 、SOX14 、Nf軽鎖及びβIII チューブリンから選択された一又は複数の遺伝子に関して、前記第１の集団のhPSCと比較して、前記第２の集団の培養細胞の遺伝子発現を濃縮することを特徴とする請求項１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の集団の培養細胞の少なくとも一部を神経成熟基質に再播種し、
播種された前記第２の集団の培養細胞を神経成熟培地で培養することにより、成熟したCHX10+ V2a介在ニューロン集団を生成することを特徴とする請求項１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４２】
成熟したV2a 介在ニューロン集団は電気的に興奮性であることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ヒトV2a 介在ニューロン成長の非ヒト動物モデルであって、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の方法に従って生成されたV2a 介在ニューロン、又は前記V2a 介在ニューロンの成熟型を有することを特徴とする非ヒト動物モデル。
【請求項４４】
哺乳動物であることを特徴とする請求項４３に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項４５】
前記哺乳動物は齧歯動物であることを特徴とする請求項４４に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項４６】
前記非ヒト動物モデルの脊髄は前記V2a 介在ニューロン、又は前記V2a 介在ニューロンの成熟型を有することを特徴とする請求項４３〜４５のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【請求項４７】
前記非ヒト動物モデルの脊髄はV2a 介在ニューロンの成熟型を有し、前記V2a 介在ニューロンの成熟型は、前記脊髄の吻側−尾側軸に沿って延びている神経突起を有することを特徴とする請求項４６に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項４８】
前記神経突起は前記脊髄の吻側−尾側軸に沿って少なくとも３mm延びていることを特徴とする請求項４７に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項４９】
前記神経突起は、シナプス後構造及び／又はシナプス前構造を有することを特徴とする請求項４７又は４８に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項５０】
前記神経突起は、宿主ニューロンに関連したシナプス前構造を有することを特徴とする請求項４９に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項５１】
前記V2a 介在ニューロン、又は前記V2a 介在ニューロンの成熟型はNeuN及び／又はVGlut2を発現することを特徴とする請求項４３〜５０のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【請求項５２】
ヒトV2a 介在ニューロン成長の非ヒト動物モデルを生成する方法であって、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の方法に従って生成されたCHX10+ V2a介在ニューロンを含む細胞集団を、非ヒト動物に移植することを特徴とする方法。
【請求項５３】
前記細胞集団を脊髄に移植することを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞集団を前記脊髄の前角に移植することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞集団を、104細胞／移植部位〜106 細胞／移植部位の密度で移植することを特徴とする請求項５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５６】
前記非ヒト動物は哺乳動物であることを特徴とする請求項５２〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物は齧歯動物であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記CHX10+V2a介在ニューロンの少なくとも一部はVGlut2を発現することを特徴とする請求項５２〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００１】
脊髄は、運動制御との関連で重要であって、成長中に神経管の別個の前駆領域から発生する複数のニューロン種を含んでいる。興奮性V2a 介在ニューロンは特に、移動運動及び呼吸活性への寄与のために中枢パターン発生器の重要な要素である。しかしながら、ヒトV2a 介在ニューロンの頑強なソースの欠如は、分子プロファイリングと、中枢神経系の損傷の後にV2a 介在ニューロンの治療可能性を検査する能力とを制限する。
【課題を解決するための手段】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞(hPSC)から脊髄グルタミン酸作動性介在ニューロン（V2a 介在ニューロン）を生成する方法を提供する。本開示の方法では、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、ソニックヘッジホッグ(Shh) シグナル経路活性化剤及びNotch シグナル経路阻害剤を含む神経誘導培地で第１の集団のhPSCをインビトロで培養してもよく、培養により、CHX10+ V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞が生成される。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１Ａ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示す概略図である。
【図１Ｂ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示すグラフである。
【図１Ｃ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示すグラフである。
【図１Ｄ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示すグラフである。
【図１Ｅ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示すグラフである。
【図１Ｆ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示す画像である。
【図１Ｇ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示す画像である。
【図１Ｈ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団へのヒト多能性幹細胞(hPSC)のインビトロ分化を示す画像である。
【図２】本開示の実施形態に従ってDAPT濃度がV2a 介在ニューロン収率に影響を及ぼすことを示すグラフの集合体である。
【図３】インビトロ神経発生、及び本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、hPSCからのV2a 介在ニューロン分化を示すグラフの集合体である。図3Dでは、各ｘ軸分類が左から右にH7 ESC、H1 ESC、WTC iPSC及びWTB iPSCを含んでいる。
【図４】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、V2a 介在ニューロン集団への異なるhPSCの分化を示すグラフ及び画像の集合体である。
【図５Ａ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、インビトロでの運動ニューロンに亘るV2a 介在ニューロンへのhPSCの特異的な分化を示す概略図である。
【図５Ｂ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、インビトロでの運動ニューロンに亘るV2a 介在ニューロンへのhPSCの特異的な分化を示すグラフである。
【図５Ｃ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、インビトロでの運動ニューロンに亘るV2a 介在ニューロンへのhPSCの特異的な分化を示す画像である。
【図５Ｄ】本開示の実施形態に従ってモルフォゲンシグナル経路を調節することによる、インビトロでの運動ニューロンに亘るV2a 介在ニューロンへのhPSCの特異的な分化を示すグラフである。
【図６−１】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビトロ成熟を示す概略図である。
【図６−２】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビトロ成熟を示す画像の集合体である。
【図７−１】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンを成熟させる電気生理学的特性を示す画像及びグラフの集合体である。
【図７−２】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンを成熟させる電気生理学的特性を示すグラフの集合体である。
【図８Ａ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｂ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示すグラフである。
【図８Ｃ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す概略図である。
【図８Ｄ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｅ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｆ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｇ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｈ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｉ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｊ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｋ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｌ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図８Ｍ】本開示の実施形態に従った、インビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンのインビボ成熟を示す画像である。
【図９】本開示の実施形態に従った、マウス脊髄の前角に移植されるインビトロのhPSC由来のV2a 介在ニューロンの成熟を示す画像の集合体である。
【図１０Ａ】V2a 介在ニューロン培養物の単細胞RNAseq解析結果を示す図である。V2a 介在ニューロン培養物のtSNEプロットが７つのクラスタを示す。
【図１０Ｂ】V2a 介在ニューロン培養物の単細胞RNAseq解析結果を示す図である。クラスタＢ（金ドット）に覆われているCHX10 発現（黒ドット）を示す。白丸が集団の残りを表す。
【図１０Ｃ】V2a 介在ニューロン培養物の単細胞RNAseq解析結果を示す図である。クラスタ毎のトップ20の全体的で差次的に発現した遺伝子のヒートマップを示す。発現値は個々の遺伝子毎に正規化され、青色が低い発現を示し、黄色が高い発現を示す。クラスタ毎のGO期間は全体的な対比較によって決定される。
【図１０Ｄ】V2a 介在ニューロン培養物の単細胞RNAseq解析結果を示す図である。各クラスタで見つけられた細胞の割合を示す。
【図１０Ｅ】V2a 介在ニューロン培養物の単細胞RNAseq解析結果を示す図である。クラスタ間の関係を示すデンドログラムである。
【図１０Ｆ】V2a 介在ニューロン培養物の単細胞RNAseq解析結果を示す図である。クラスタ解析に基づくV2a 介在ニューロン培養物を有する異なる細胞型の解釈を示す。
【図１１】クラスタＡ及びクラスタＢを識別する遺伝子の選択バイオリン図を示す。クラスタＡ及びクラスタＢに関する代表的な遺伝子が、Ａ：Ｂの対比較からのトップ50の差次的に発現した遺伝子から選ばれた。
【図１２】クラスタＤ及びクラスタＥを識別する遺伝子の選択バイオリン図を示す。クラスタＤ及びクラスタＥに関する代表的な遺伝子が、Ｄ：Ｂ及びＥ：Ｂの対比較からのトップ50の差次的に発現した遺伝子から夫々選ばれた。
【図１３】クラスタＣ、クラスタＦ及びクラスタＧを識別する遺伝子の選択バイオリン図を示す。クラスタＣ、クラスタＦ及びクラスタＧに関する代表的な遺伝子が、Ｃ：Ｂ、Ｆ：Ｂ及びＧ：Ｂの対比較からのトップ50の差次的に発現した遺伝子から夫々選ばれた。
【図１４】追加のV2a 介在ニューロン遺伝子及びそれらのクラスタ同一性を示すチャートである。各円グラフは、遺伝子に関して少なくとも１つのリードを有する細胞の数及び遺伝子のクラスタ同一性を報告している。クラスタＢ内に見つけられた細胞の割合が、クラスタＦで見つけられた細胞の割合を分類するFOXN4 以外の全ての遺伝子に関してチャートで分類されている。
【図１５】V2a 介在ニューロン成熟培養物のスケジュールを示す。
【図１６】培養の20日目、30日目、40日目、50日目及び60日目のV2a 介在ニューロンのCHX10 （緑）及び神経核（青）の標識化に関する免疫染色画像を示す。（パネルＢ〜Ｆ）βIII チューブリン（赤）に関する免疫染色を示す。（パネルＧ〜Ｋ）神経フィラメント（NF、赤）に関する免疫染色を示す。（パネルＬ〜Ｐ）NeuN（赤）に関する免疫染色を示す。（パネルＱ〜Ｙ）小胞グルタミン酸輸送体２（VGLUT2、赤）の免疫染色を示す。スケールバー＝50μｍ。
【図１７】インビトロでの成熟培養物の定量化を示すグラフである。（パネルＡ）観察視界領域によって正規化された培養時間に亘るβIII チューブリンの量を示す。50日目の量は20日目の量より多かった（p<0.05、one-way ANOVA 及びTukey 事後比較）。（パネルＢ）観察視界領域によって正規化された培養時間に亘る神経フィラメントの量を示す。60日目、50日目及び30日目の量は20日目の量より多かった（p<0.05、one-way ANOVA 及びTukey 事後比較）。（パネルＣ）培養時間に亘るCHX10+細胞の割合を示す。20日目の割合は他の全ての時点より大きかった。50日目の量は20日目の量より多かった（p<0.05、one-way ANOVA 及びTukey 事後比較）。（パネルＤ）観察視界領域によって正規化された培養時間に亘るHoechst+細胞の数を示す。30〜60日目は20日目より多かった。50日目の量は20日目の量より多かった（p<0.05、one-way ANOVA 及びTukey 事後比較）。
【図１８】移植細胞が突起部分を伸ばし、宿主ニューロンと共にシナプスを形成する。（パネルA i-iii ）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 （白）、Homer （緑）及びNeuN（赤）の免疫染色を示す。(i) 移植部位の吻側の組織の挿入図である。水平方向の矢印は、灰白質に伸びた神経突起を指している。垂直方向の矢印は、白質に更に伸びた神経突起を指している。(ii)  ２つの移植部位間の組織の挿入図である。(iii) 移植部位の尾側の組織の挿入図である。ボックスは、パネルＢ〜Ｅに示されている領域を強調している。（パネルＢ〜Ｅ）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 （白）、Homer （緑）及びNeuN（赤）の免疫染色を示す。矢印は、Stem121 、Homer 及びNeuNの共存を指している。（パネルＦ〜Ｉ）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 （白）、シナプトフィジン（緑）及びNeuN（赤）の免疫染色を示す。矢じりは、Stem121 、シナプトフィジン及びNeuNの共存を指す。（パネルＪ〜Ｍ）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 （白）、NeuN（赤）及びGRIP1 （緑）の免疫染色を示す。
【図１９】様々な再播種条件下の凍結−解凍後のCHX10+細胞の割合を示すグラフである。
【図２０】図20A は、GSK3阻害剤であるCHIRでの処置後のCHX10+細胞の割合を示すグラフである。図20B は、CHX10 及び様々な後脳、頸部及び胸部のマーカに関する遺伝子発現の倍率変化を示すグラフである（パネルＢ）。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
定義
量、長さなどの測定可能な値を参照する場合、本明細書で使用されている「約」という用語は、指定値から±20％又は±10％、より好ましくは±５％、更に好ましくは±１％、更により好ましくは±0.1 ％の変化を包含することが意図されている。
【０００５】
本明細書で使用されている「インビトロ」は、生体の外側の環境について記述する。環境は、フラスコ、皿又はあらゆる他の好適な容器内の組織培地であってもよく、又は組織培地内の身体部分、組織又は組織片であってもよい。
【０００６】
「分化」は、細胞運命とも称されるある特殊機能を呈する細胞をもたらす細胞内で生じる生理的変化及び／又は形態的変化（例えば、遺伝子及び／又はタンパク質発現パターン及び／又は形態の変化）を指す。変化は、分化細胞が異なる細胞運命を呈する能力を失う不可逆変化であってもよい。変化は、成熟した成体（例えば体）細胞に関して部分的であってもよく、又は実質的に全部であってもよい。部分的に変化した細胞は、体細胞の生理的特徴及び／又は形態的特徴の一部を示してもよいが、他のものを失ってもよい。細胞が、細胞運命に向かって少なくとも部分的な、実質的に不可逆的な変化を示す場合、細胞は体細胞運命に「関与」してもよく、場合によっては、あらゆる分化手がかりを与える必要なしに、体細胞の欠いている生理的特徴及び／又は形態的特徴の多くを成長させてもよい。ニューロンの場合、場合によっては、分化が、単一のニューロンに作用する空間手がかりにより細胞レベルに軸索ガイダンス又は他の非対称性の成長変化を含まなくてもよい。従って、インビトロの成熟ニューロンは、インビボの状況で分化して成長した同一のニューロンに似た神経突起分岐パターンを必ずしも有する必要がない場合がある。
【０００７】
本明細書で使用されている「マーカ」は、遺伝子の発現（RNA 転写発現又はタンパク質発現）レベルが細胞運命、又は一若しくは複数の細胞運命のための前駆細胞に特異的である遺伝子を指す。
【０００８】
本明細書で使用されている「モルフォゲン」は、適切な成長のために細胞の適切な分化及び／又は運動を指示するために成長する有機体内に空間手がかり及び／又は時間手がかりを与える生物的シグナル分子を指す。
【０００９】
本明細書で使用されているように、「幹細胞」という用語は、増殖するために誘導され得る未分化細胞を指す。幹細胞は自己保持又は自己再生することができ、各細胞分裂で少なくとも１つの娘細胞が更に幹細胞になることを意味する。幹細胞を胚組織、出生後組織、幼若組織又は成体組織から得ることができる。幹細胞は多能性又は多分化能であってもよい。本明細書で使用されている「前駆細胞」という用語は、幹細胞由来の未分化細胞を指し、それ自体は幹細胞ではない。ある前駆細胞は、２以上の細胞型に分化することができる子孫をもたらすことができる。
【００１０】
幹細胞は、中胚葉、内胚葉及び外胚葉の身体の組織系統のいずれかの細胞を形成することができる多能性幹細胞を含んでいる。従って、例えば、幹細胞は、ヒト胚性幹(ES)細胞；ヒト内部細胞塊(ICM) ／エピブラスト細胞；ヒト原始外胚葉細胞；ヒト原始内胚葉細胞；ヒト原始中胚葉細胞；及びヒト始原生殖(EG)細胞から選択され得る。幹細胞は、これらに限定されないが造血幹細胞又は神経前駆細胞のような組織全体又は組織を構成する複数の細胞系統を形成することができる多分化能幹細胞を更に含んでいる。幹細胞は、有機体全体を形成することができる全能性幹細胞を更に含んでいる。ある実施形態では、幹細胞は部分的な分化細胞又は分化する細胞である。ある実施形態では、幹細胞は、再プログラミング又は脱分化された人工多能性幹細胞(iPSC)である。
【００１１】
「ヒト多能性幹細胞(hPSC)」は、ヒト組織又はヒト細胞（例えばヒト胚細胞、ヒト体細胞など）から得られた多能性幹細胞(PSC) を指す。
【００１２】
「発現」は、細胞による遺伝子産物の検出可能な生成を指す。遺伝子産物は、「遺伝子発現」と称され得る転写産物（つまりRNA ）であってもよく、又は遺伝子産物は、状況に応じて転写産物の翻訳産物（つまりタンパク質）であってもよい。
【００１３】
「V2a 介在ニューロン」は、脊髄及び後脳で見出されるグルタミン酸作動性（つまり興奮性）介在ニューロンのサブタイプを指す。V2a 介在ニューロンは、他のニューロンに対して、CHX10 又はSOX14 のようなV2a 特異的なマーカのより高い発現に基づき、脊髄の他の介在ニューロン及び運動ニューロンから識別されてもよい（同一の前駆細胞を共有してもよい）。従って、本開示の方法によって生成されるV2a 介在ニューロンは、hPSCから分化した細胞（つまり、CHX10+細胞）のCHX10 の高いタンパク質又は遺伝子発現レベルによって識別され得る。V2a 介在ニューロンは、同一の前駆体を共有する一又は複数の神経細胞サブタイプで更に高度に発現するFOXN4 及びLHX3のような他のマーカのより高度な発現を更に有し得る。
【００１４】
本明細書で使用されている「培養」は、細胞に好適な環境を与えることにより、一又は複数の細胞を成長させる（つまり、分裂により増殖させる）、維持する（つまり、細胞を生き続けさせる及び／又は分化せずに成長させる）、及び／又は分化することを指す。細胞の生存、成長及び／又は分化につながるインビトロ環境（例えば好適な細胞培地）を細胞に与えてもよい。哺乳類細胞を成長させる、維持する及び／又は分化するためのインビトロ環境は、例えば培養器によって与えられる好適な温度（例えば約37℃）及び好適な大気圧（例えば約５％のCO2 、加湿雰囲気）を含んでもよい。
【００１５】
本明細書で使用されている「播種する」は、最初の細胞集団に好適な培養環境を与える（例えば細胞を細胞培地に追加する）ことにより、細胞の培養を開始することを指す。場合によっては、細胞は最初に浮遊しており、細胞が培養されるにつれて細胞培養基質に付着する。
【００１６】
本明細書で使用されている「非ヒト動物モデル」は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)（例えばV2a 介在ニューロンの細胞運命に関与するhPSC由来の細胞）を分化することにより得られた細胞を移植して成長させるための代わりの宿主として使用され得る非ヒト動物を指してもよい。
【００１７】
本開示を更に記載する前に、開示された主題は、記載されている具体的な実施形態に限定されず、言うまでもなくそれ自体変わり得ると理解されるべきである。本明細書で使用されている専門用語は、具体的な実施形態について説明するためだけのものであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００１８】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈上明らかに別段の規定がない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が開示された主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として開示された主題の範囲内に更に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も開示された主題に更に包含される。
【００１９】
特に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、開示された主題が属する技術分野の当業者によって共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で記載されているものと同様又は同等の方法又は材料は、開示された主題の実施又はテストのために使用され得るが、ここでは好ましい方法及び材料が記載されている。本明細書に述べられている全ての刊行物は、引用されている刊行物に関連して本方法及び／又は本材料を開示して記載すべく参照によって本明細書に組み込まれている。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「ａ」、「an」及び「the 」は、文脈上明らかに別段の規定がない限り、複数の指示対象を含むということに留意されねばならない。従って、例えば、「介在ニューロン」への言及はこのような複数の介在ニューロンを含んでおり、「阻害剤」への言及は、当業者に公知の一又は複数の阻害剤及びこの均等物などへの言及を含んでいる。更に、特許請求の範囲がいかなる選択的な要素も除外して記載されていることを留意すべきである。従って、この記載は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（solely）」、「のみの（only）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（negative）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
【００２１】
明瞭化のために別々の実施形態の内容に述べられている開示された主題のある特徴が、１つの実施形態に組み合わせて更に提供されてもよいことが認識される。逆に、簡潔化のために１つの実施形態の内容に述べられている開示された主題の様々な特徴が、別々に又はあらゆる適切なサブ組み合わせで更に提供されてもよい。本開示に係る実施形態の全ての組み合わせは、開示された主題によって明確に包含されており、各々及び全ての組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての下位組み合わせも、本開示によって明確に包含されており、各々及び全ての下位組み合わせが個別に明示的に本明細書に開示されているかのように、本明細書に開示される。
【００２２】
本明細書に記載されている刊行物は、本出願の出願日に先立ってその開示のためだけに提供されている。本明細書では、開示された手段がこのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであると解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があるかもしれない。
【００２３】
詳細な説明
上記に要約されているように、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から脊髄グルタミン酸作動性介在ニューロン（V2a 介在ニューロン）を生成する方法を提供する。本開示の方法では、V2a 介在ニューロンの細胞運命に少なくとも関与する細胞集団へのhPSCの分化を生じさせるのに十分なように、hPSCでの発生的なシグナル経路の修飾因子の組合せを含む培地、例えば神経誘導培地でhPSCをインビトロで培養する。V2a 介在ニューロンをインビトロ又はインビボで成熟させて、成熟V2a 介在ニューロンの一又は複数の特徴を得てもよい。
【００２４】
hPSC由来のV2a 介在ニューロン
本方法によって生成される細胞集団は、V2a 介在ニューロンに特異的な少なくとも１つのマーカを発現して一又は複数の遺伝子の発現レベルに基づき（つまり、一又は複数のマーカに基づき）他の脊髄介在ニューロン又は未分化hPSCと識別され得る細胞を含む。インビトロでのhPSC由来の細胞との関連で使用される「V2a 介在ニューロン」は、実質的に成熟したV2a 介在ニューロンと、V2a 介在ニューロンの細胞運命に関与する部分的に分化した細胞とを含むように意図されている。細胞集団に亘って平均した遺伝子の発現レベルは、例えばリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR) を使用して、例えば細胞集団から分離した核酸を含むサンプルのRNA 転写レベルを測定することにより測定されてもよい。例えば遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な検出可能な抗体（例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な一次抗体であって、一次抗体に特異的な検出可能に標識化された二次抗体によって結合されると検出可能な一次抗体）を、細胞集団からの透過性細胞と接触させ、その後、フローサイトメトリーを行うことによって、例えば個々の細胞の遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルを測定することにより、単細胞分解での遺伝子の発現レベルを測定してもよい。或いは、組織片の細胞又はスライド上の細胞の単細胞分解での遺伝子の発現レベルを免疫組織化学法によって測定してもよい。
【００２５】
（VSX2；遺伝子ID：338917としても知られている）CHX10 は、V2a 介在ニューロンの細胞運命に関与する細胞のためのマーカであってもよい。従って、ある実施形態では、本開示の方法に従ってhPSCから生成されるV2a 介在ニューロンは、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCのCHX10 の発現のレベルより高いレベルで、又はV2a 介在ニューロンと同一の前駆細胞から得ることのできる非V2a 介在ニューロン細胞（例えば運動ニューロン又は他の介在ニューロン）と比較してより高いレベルでCHX10 を発現する。hPSCから生成された個々のV2a 介在ニューロンは、本開示の方法に従って培養された細胞集団内の高いCHX10 発現に基づき、例えばフローサイトメトリーを使用して識別されてもよく、「CHX10+細胞」と称されてもよい。ある実施形態では、本開示の方法に従って培養したhPSCから生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、又はV2a 介在ニューロンと同一の前駆細胞から得ることのできる非V2a 介在ニューロン細胞（例えば運動ニューロン又は他の介在ニューロン）と比較して、CHX10 発現の少なくとも1,000 倍高い測定レベルを含めて、少なくとも10倍高い、例えば少なくとも50倍高い、少なくとも100 倍高い、少なくとも500 倍高い測定レベルを有してもよい。
【００２６】
SOX14 （遺伝子ID：8403）は、V2a 介在ニューロンの細胞運命に関与する細胞のためのマーカであってもよい。従って、ある実施形態では、本開示の方法に従ってhPSCから生成されるV2a 介在ニューロンは、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCのSOX14 の発現のレベルより高いレベルで、又はV2a 介在ニューロンと同一の前駆細胞から得ることのできる非V2a 介在ニューロン細胞（例えば運動ニューロン又は他の介在ニューロン）と比較してより高いレベルでSOX14 を発現する。hPSCから生成された個々のV2a 介在ニューロンは、本開示の方法に従って培養された細胞集団内の高いSOX14 発現に基づき、例えばフローサイトメトリーを使用して識別されてもよく、「SOX14+細胞」と称されてもよい。ある実施形態では、本開示の方法に従って培養したhPSCから生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSC集団と比較して、又はV2a 介在ニューロンと同一の前駆細胞から得ることのできる非V2a 介在ニューロン細胞（例えば運動ニューロン又は他の介在ニューロン）集団と比較して、SOX14 タンパク質又はRNA 転写物の発現の少なくとも1,000 倍高い測定レベルを含めて、少なくとも５倍高い、例えば少なくとも10倍高い、少なくとも50倍高い、少なくとも100 倍高い測定レベルを有してもよい。
【００２７】
FOXN4 （遺伝子ID：121643）は、V2a 介在ニューロンの細胞運命に関与する細胞をもたらし得る脊髄の前駆細胞のためのマーカであってもよい。従って、ある実施形態では、本開示の方法に従ってhPSCから生成されるV2a 介在ニューロンは、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCのFOXN4 の発現のレベルより高いレベルで、又は同一の脊髄の前駆細胞を共有しない細胞と比較してより高いレベルでFOXN4 を発現する。hPSCから生成された個々のV2a 介在ニューロンは、本開示の方法に従って培養された細胞集団内の高いFOXN4 発現に基づき、例えばフローサイトメトリーを使用して識別されてもよく、「FOXN4+細胞」と称されてもよい。ある実施形態では、本開示の方法に従ってhPSCから生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、FOXN4 発現の少なくとも100 倍高い測定レベルを含めて、少なくとも５倍高い、例えば少なくとも10倍高い、少なくとも50倍高い測定レベルを有してもよい。
【００２８】
LHX3（遺伝子ID：8022）は、V2a 介在ニューロンの細胞運命に関与する細胞をもたらし得る脊髄の前駆細胞のためのマーカであってもよい。従って、ある実施形態では、本開示の方法に従ってhPSCから生成されるV2a 介在ニューロンは、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCのLHX3の発現のレベルより高いレベルで、又はV2a 介在ニューロンと同一の前駆細胞から得ることのできる非V2a 介在ニューロン細胞（例えば運動ニューロン又は他の介在ニューロン）と比較してより高いレベルでLHX3を発現する。hPSCから生成された個々のV2a 介在ニューロンは、本開示の方法に従って培養された細胞集団内の高いLHX3発現に基づき、例えばフローサイトメトリーを使用して識別されてもよく、「LHX3+ 細胞」と称されてもよい。ある実施形態では、本開示の方法に従ってhPSCから生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、LHX3タンパク質又はRNA 転写物の発現の少なくとも100 倍高い測定レベルを含めて、少なくとも５倍高い、例えば少なくとも10倍高い、少なくとも50倍高い測定レベルを有してもよい。
【００２９】
GATA3 （遺伝子ID：2625）は、V2a 介在ニューロンの脊髄の前駆細胞から分化されるが、非V2a 介在ニューロンの細胞運命、例えばV2b 介在ニューロンの細胞運命に関与する細胞のためのマーカであってもよい。場合によっては、本開示の方法に従ってhPSCから生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、GATA3 タンパク質又はRNA 転写物の発現の２倍以下上昇した測定レベルを含めて、10倍以下、例えば５倍以下、４倍以下、３倍以下上昇した測定レベルを有してもよい。
【００３０】
（MNX1；遺伝子ID：3110としても知られている）HB9 は、非V2a 介在ニューロンの細胞運命、例えば脊髄の運動ニューロンの細胞運命に関与する細胞のためのマーカであってもよい。場合によっては、本開示の方法に従ってhPSCから生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、HB9 タンパク質又はRNA 転写物の発現の２倍以下上昇した測定レベルを含めて、10倍以下、例えば５倍以下、４倍以下、３倍以下上昇した測定レベルを有してもよい。
【００３１】
場合によっては、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、本開示の方法に従って生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団のV2a 介在ニューロンマーカの発現の測定レベルの上昇は、V2a 介在ニューロンに特異的でないマーカ（例えばV2a 介在ニューロンの脊髄の前駆細胞又は脊髄の前駆細胞の非V2a 子孫のためのマーカ）の発現の測定レベルの上昇より、少なくとも５倍高く、例えば少なくとも10倍高く、少なくとも20倍高く、少なくとも50倍高く、少なくとも100 倍高く、少なくとも500 倍高く、少なくとも1,000 倍高い。注目するV2a 介在ニューロン特異的マーカは、例えばCHX10 を含む。注目する非V2a 介在ニューロン特異的マーカは、GATA3 、HB9 及びPAX6（遺伝子ID：5080）を含む。
【００３２】
場合によっては、V2a 介在ニューロンが得られた未分化hPSCと比較して、本開示の方法に従って生成されたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団の神経細胞マーカの発現のレベルの上昇は、非神経細胞マーカ（例えばグリア細胞型又は網膜細胞型のためのマーカ）の発現の上昇より、少なくとも５倍高く、例えば少なくとも10倍高く、少なくとも20倍高く、少なくとも50倍高い。注目する神経細胞マーカはNF及びβIII チューブリンを含む。注目するグリアマーカは、PDFGRA（遺伝子ID：5156）、CSPG4 （遺伝子ID：1464）、SOX10 （遺伝子ID：6663）及びGFAP（遺伝子ID：2670）を含む。注目する網膜マーカは、THY1（遺伝子ID：7070）、（RBP3としても知られている）IRBP（遺伝子ID：5949）及びCRX （遺伝子ID：1406）を含む。
【００３３】
本開示は、hPSCからV2a 介在ニューロンを生成する効率的な方法を提供する。従って、ある実施形態では、本開示の方法に従って神経誘導培地で培養した後（例えば、以下に更に記載するように複数の神経誘導培地の最後で培養した後）の細胞の約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上はCHX10+細胞である。ある実施形態では、本開示の方法に従って神経誘導培地で培養した後（例えば、以下に更に記載するように複数の神経誘導培地の最後で培養した後）の細胞内のCHX10+細胞の割合は、約10％〜約60％、例えば約20％〜約55％、約25％〜約50％の範囲内である。場合によっては、入力hPSC細胞毎に生成されたCHX10+細胞の平均数は、約５以上、例えば約７以上、約10以上、約12以上、約15以上である。ある実施形態では、入力hPSC細胞毎に生成されたCHX10+細胞の平均数は、約５〜約25、例えば約７〜約20、約10〜約15の範囲内である。
【００３４】
ある実施形態では、本開示の方法に従って神経誘導培地で培養した後（例えば、以下に更に記載するように複数の神経誘導培地の最後で培養した後）の細胞の約30％以上、例えば約35％以上、約40％以上、約45％以上はLHX3+ 細胞である。ある実施形態では、本開示の方法に従って神経誘導培地で培養した後（例えば、以下に更に記載するように複数の神経誘導培地の最後で培養した後）の細胞内のLHX3+ 細胞の割合は、約30％〜約60％、例えば約40％〜約55％、約45％〜約55％の範囲内である。
【００３５】
本明細書では、CHX10+細胞であるV2a 介在ニューロン、例えばV2a 介在ニューロンの細胞運命に関与し、インビトロでhPSCから得られ、以下に述べる好適な条件下で更に培養されて、成熟ニューロンの機能的特性を示す細胞であるV2a 介在ニューロンを更に提供する。成熟V2a 介在ニューロンは、ニューロンを示すあらゆる特性を示してもよい。ニューロンの特性は、例えば電気生理学的活性、ニューロン関連の遺伝子の発現、神経突起の伸長、及び神経突起へのシナプスマーカの局在性を含む。電気生理学的に活性する細胞は、電気的に興奮性であってもよく、例えば、カルシウム指示薬を使用したカルシウムイメージングによって測定されるような、自発的な電気生理学的活性、又は例えば、電極を使用した細胞を通る電流の注入により生じさせる活動電位発火によって測定されるような誘発性電気生理学的活性を含んでもよい。
【００３６】
V2a 介在ニューロンは、神経成熟培地で培養されながら、CHX10 の発現を経時的に更に低下させてもよい。従って、ある実施形態では、成熟V2a 介在ニューロンを含む細胞集団は、神経誘導培地での培養の終わりにhPSCから得られたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団よりCHX10 のより低い発現（例えばCHX10+細胞のより低い割合）を有する。
【００３７】
場合によっては、成熟V2a 介在ニューロンは、約1.0 ／秒(s) 以上、例えば約2.0 /s以上、3.0 /s以上、5.0 /s以上、10/s以上、15/s以上の最高率で電流注入（例えば20pAの電流注入）に応じて活動電位を発火する。
【００３８】
場合によっては、CHX10 及びニューロンに関連する遺伝子の両方が、成熟するにつれてV2a 介在ニューロンによって発現し得る。好適なニューロン関連の遺伝子は、例えば小胞グルタミン酸輸送体（例えばVGlut1）及び（Rbfox3としても知られている）NeuNを含んでもよい。CHX10 を発現する成熟V2a 介在ニューロンは、GABA放出に関連する遺伝子を発現しなくてもよい。
【００３９】
注目するシナプスマーカは、例えばGRIP1 のようなシナプス後マーカ、又はシナプトフィジンのようなシナプス前マーカを含んでもよい。
【００４０】
方法
hPSC細胞からV2a 介在ニューロンを生成する方法
本開示の方法では、CHX10 発現(CHX10+)細胞（例えばCHX10+ V2a介在ニューロン）へのhPSCの分化を生じさせるのに十分なように、レチノイン酸シグナル経路活性化剤（例えばレチノイン酸のようなレチノイン酸受容体作動薬）、ソニックヘッジホッグ(Shh) シグナル経路活性化剤（例えばパルモルファミンのようなスムーズンド作動薬）、及びNotch シグナル経路阻害剤（例えばN-[（3,5-ジフルオロフェニル）アセチル]-L-アラニル-2-フェニル]グリシン-1,1-ジメチルエチルエステル(DAPT)のようなγセクレターゼ阻害剤）を含む神経誘導培地でhPSCをインビトロで培養してもよい。V2a 介在ニューロンは神経外胚葉前駆細胞から得られるので、本開示の目的のために「hPSC」は、別途記載のない限り、例えば、以下に更に記載するようにSmall Mothers Against Decapentaplegic (SMAD)阻害剤を含む初期の分化培地でhPSC集団を培養することによって、神経外胚葉前駆細胞に少なくとも部分的に分化したhPSCを含むように意図されている。
【００４１】
レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、レチノイン酸シグナル経路を活性化するあらゆる好適な分子（ポリペプチド、小分子、核酸など）であってもよい。レチノイン酸シグナル経路は、レチノイン酸のようなレチノイン酸受容体(RAR) の作動薬を使用して活性化されてもよい。レチノイン酸は、レチノイン酸受容体(RAR) に結合することにより作用し、レチノイン酸受容体(RAR) は、レチノイン酸応答要素(RARE)と称される領域でレチノイドＸ受容体(RXR) とヘテロ二量体としてDNA に結合する。RAR へのレチノイン酸リガンドの結合はRAR の立体構造を変えるため、近くの遺伝子、例えばHox 遺伝子の転写を生じさせるか又は抑制する他のタンパク質の結合に影響を及ぼす。レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、レチノイン酸及びレチノイン酸の誘導体のようなレチノイン酸受容体作動薬を含む。好適なレチノイン酸シグナル経路活性化剤として、限定はしないが、オールトランス型レチノイン酸、合成レチノイドec23、Ch55、TTNPB 、フェンレチニド、AC261066、アダパレン、AC55649 、AM80、AM580 、BMS 753 及びタザロテンが含まれる。
【００４２】
Shh シグナル経路活性化剤は、Shh シグナル経路を活性化するあらゆる好適な分子（ポリペプチド、小分子、核酸など）であってもよい。Shh は、Shh 信号を細胞に形質導入するパッチト(Ptc) 及びスムーズンド(Smo) の原形質膜複合体と相互作用することにより、シグナルを伝達する。Ptc は、細胞膜のSmo に結合することによりShh のシグナル伝達を抑制するとみなされる。Shh リガンドが存在する状態で、この抑制は軽減され、Smo はシグナルを伝達することができる。脊椎動物では、ジンクフィンガータンパク質であるGN1 、GN2 及びGN3 はShh シグナル伝達の下流側のメディエータであり、Shh 依存的な標的遺伝子の転写反応の制御に関与する。Shh シグナル経路活性化剤はスムーズンド作動薬を含む。好適なスムーズンド作動薬として、限定はしないが、SAG (9-シクロヘキシル-N-[4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-(1-ナフタレンイルオキシ)-9H-プリン-6-アミン)、パルモルファミン(9-シクロヘキシル-N-[4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-(1-ナフタレンイルオキシ)-9H-プリン-6-アミン)、及び20(S)-ヒドロキシコレステロールが含まれる。
【００４３】
Notch シグナル経路阻害剤は、Notch 受容体の活性化によって媒介されるシグナル伝達を阻害するあらゆる好適な分子（ポリペプチド、小分子、核酸など）であってもよい。Notch のリガンドによる活性化によって、ADAMファミリーのプロテアーゼによるS2部位での分裂が生じて、細胞外領域を放出する。その後、Notch の残りの切断された膜貫通型に、γセクレターゼの標的である膜内の２つの部位S3及びS4での分裂を施す。Notch 細胞内領域(ICD) は、ICD がNotch 標的遺伝子の転写を調節する神経核に転位する。Notch シグナル経路阻害剤は、Notch 受容体活性化の阻害剤、例えばNotch 受容体拮抗薬を含む。場合によっては、Notch 受容体活性化の阻害剤はγセクレターゼ阻害剤であり、γセクレターゼ阻害剤として、N-[(3,5-ジフルオロフェニル)アセチル]-L-アラニル-2-フェニル]グリシン-1,1-ジメチルエチルエステル(DAPT)；N-2((2S)-2-(3,5-ジフルオロフェニル)-2-ヒドロキシエタノイル)-N1-((7S)-5-メチル-6-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[b,d]アゼピン-7-yl)-L-アラニンアミド(LY411575)；L-685,458；BMS-299897；MK0752；及びMRK-003が含まれるが、これらに限定されない。Notch シグナル経路の他の阻害剤は、限定はしないが、抗Notch 抗体及びこれらの抗原結合断片と、抑制性核酸（例えば低分子干渉RNA 、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びモルホリノオリゴ）とを含む。
【００４４】
神経誘導培地は、神経細胞型へのhPSCの分化を促進するあらゆる好適な培地であってもよい。神経誘導培地は基本培地及び一又は複数のサプリメントを含んでもよい。好適な基本培地は、限定はしないが、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Ham’s F12 、KODMEM培地（ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地）、RPMI 1640 及びMEM を含む。好適なサプリメントは、限定はしないが、N2サプリメント、L-グルタミン、ヘパリン、非必須アミノ酸、抗生物質（例えば、ペニシリン−ストレプトマイシン、アスコルビン酸及び脳由来神経栄養因子(BDNF)を含む。他の好適な培地は、Life Technologies 製のNeurobasal（商標）培地及びNSC （商標）、Lonza 製のPNGM（商標）、Millipore 製の神経幹細胞基本培地、及びStemCell Technologies 製のStemdiff（商標）を含む。
【００４５】
このパラグラフでは、明細書を通して、文脈上別段の明示がない限り、「１つの(a) 」又は「その(the) 」レチノイン酸シグナル経路活性化剤への言及は、その例としてレチノイン酸受容体作動薬、例えばレチノイン酸を含むとみなされる。神経誘導培地に存在するレチノイン酸シグナル経路活性化剤の量は、V2a 介在ニューロンにhPSCを分化するのに適切な量であってもよい。場合によっては、レチノイン酸シグナル経路活性化剤を既知の濃度で神経誘導培地に追加する。場合によっては、レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約20nM以上、例えば約30nM以上、約40nM以上、約50nM以上、場合によっては約500 nM以下、例えば約400 nM以下、約300 nM以下、約200 nM以下の濃度で神経誘導培地に存在する。場合によっては、レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約20nM〜約500 nM、例えば約30nM〜約400 nM、約40nM〜約300 nM、約50nM〜約200 nMの範囲内の濃度で神経誘導培地に存在する。ある実施形態では、レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約100 nMの濃度で神経誘導培地に存在する。ある実施形態では、神経誘導培地内のレチノイン酸シグナル経路活性化剤の濃度は、培養中の異なる時点で異なってもよい。
【００４６】
このパラグラフでは、明細書を通して、文脈上別段の明示がない限り、「１つの(a) 」又は「その(the) 」Shh シグナル経路活性化剤への言及は、その例としてスムーズンド作動薬、例えばパルモルファミンを含むとみなされる。神経誘導培地に存在するShh シグナル経路活性化剤の量は、V2a 介在ニューロンにhPSCを分化するのに適切な量であってもよい。場合によっては、Shh シグナル経路活性化剤を既知の濃度で神経誘導培地に追加する。場合によっては、Shh シグナル経路活性化剤は、約20nM以上、例えば約30nM以上、約40nM以上、約50nM以上、場合によっては約500 nM以下、例えば約400 nM以下、約300 nM以下、約250 nM以下、約225 nM以下、約200 nM以下、約175 nM以下、約150 nM以下の濃度で神経誘導培地に存在する。場合によっては、Shh シグナル経路活性化剤は、約20nM〜約500 nM、例えば約30nM〜約400 nM、約30nM〜約300 nM、約40nM〜約250 nM、約40nM〜約225 nM、約40nM〜約200 nM、約50nM〜約175 nM、約50nM〜約150 nMの範囲内の濃度で神経誘導培地に存在する。ある実施形態では、Shh シグナル経路活性化剤は、約100 nMの濃度で神経誘導培地に存在する。ある実施形態では、神経誘導培地内のShh シグナル経路活性化剤の濃度は、培養中の異なる時点で異なってもよい。
【００４７】
このパラグラフでは、明細書を通して、文脈上別段の明示がない限り、「１つの(a) 」又は「その(the) 」Notch シグナル経路阻害剤への言及は、その例としてγセクレターゼ阻害剤、例えばDAPTを含むとみなされる。神経誘導培地に存在するNotch シグナル経路阻害剤の量は、V2a 介在ニューロンにhPSCを分化するのに適切な量であってもよい。場合によっては、Notch シグナル経路阻害剤を既知の濃度で神経誘導培地に追加する。場合によっては、Notch シグナル経路阻害剤は、約250 nM以上、例えば約350 nM以上、約500 nM以上、約750 nM以上、場合によっては約10μＭ以下、例えば約5.0 μＭ以下、約3.0 μＭ以下、約2.0 μＭ以下の濃度で神経誘導培地に存在する。場合によっては、Notch シグナル経路阻害剤は、約250 nM〜約10μＭ、例えば約350 nM〜約5.0 μＭ、約500 nM〜約5.0 μＭ、約750 nM〜約3.0 μＭの範囲内の濃度で神経誘導培地に存在する。ある実施形態では、Notch シグナル経路阻害剤は、約１μＭの濃度で神経誘導培地に存在する。ある実施形態では、神経誘導培地内のNotch シグナル経路阻害剤の濃度は、培養中の異なる時点で異なってもよい。
【００４８】
本開示の方法に従ってhPSCを神経誘導培地で培養する際に、hPSCを分化する時間に亘って複数の神経誘導培地を使用してもよい（例えば図1B参照）。培養する態様では、レチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地とhPSC集団を第１の時間、接触させ、その後、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、Shh シグナル経路活性化剤及びNotch シグナル経路阻害剤を含む第２の神経誘導培地と細胞を第２の時間、接触させてもよい。培養する態様では、Shh シグナル経路活性化剤ではなくレチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地とhPSC集団を第１の時間、接触させ、その後、レチノイン酸シグナル経路活性化剤及びShh シグナル経路活性化剤を含む第２の神経誘導培地と細胞を第２の時間、接触させ、その後、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、Shh シグナル経路活性化剤及びNotch シグナル経路阻害剤を含む第３の神経誘導培地と細胞を接触させてもよい。
【００４９】
ある実施形態では、レチノイン酸シグナル経路活性化剤を使用したhPSCの分化を開始した後、Notch シグナル経路阻害剤を神経誘導培地に追加する。従って、場合によっては、Notch シグナル経路阻害剤を第１の神経誘導培地に追加せず、Shh シグナル経路活性化剤と共に第２の神経誘導培地に追加する。言い換えれば、ある実施形態では、hPSCを培養する際に、Shh シグナル経路活性化剤又はNotch シグナル経路阻害剤ではなくレチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地とhPSC集団を第１の時間、接触させ、その後、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、Shh シグナル経路活性化剤及びNotch シグナル経路阻害剤を含む第２の神経誘導培地と細胞を第２の時間、接触させる。
【００５０】
本明細書に記載されている神経誘導培地の一又は複数として、Wnt シグナル伝達活性化剤、例えば小分子Wnt シグナル伝達活性化剤、例えばGSK3阻害剤、例えば小分子GSK3阻害剤、例えばCHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-yl)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル)が含まれてもよい。開示された方法に関連して使用され得る追加のWnt シグナル伝達活性化剤として、CHIR 99021三塩酸塩(6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-yl)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル三塩酸塩)、WAY-316606 (5-(フェニルスルホニル)-N-4-ピペリジニル-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンスルホンアミド塩酸塩)、（ヘテロ）アリールピリミジン、IQ1 (2-[2-(4-アセチルフェニル)ジアゼニル]-2-(3,4-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1(2H)-イソキノリニリデン)アセトアミド)、QS11 ((2S)-2-[2-(インダン-5-イルオキシ)-9-(1,1'-ビフェニル-4-yl)メチル)-9H-プリン-6-イルアミノ]-3-フェニル-プロパン-1-ol)、SB-216763 (3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-yl)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、BIO(6-ブロモインディルビン-3'-オキシム)、LY2090314 (3-(9-フルオロ-2-(ピペリジン-1-カルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-[1,4]ジアゼピノ[6,7,1-hi]インドール-7-yl)-4-(イミダゾ[1,2-a]ピリジン-3-yl)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、DCA （ジクロロ酢酸ナトリウム）、2-アミノ-4-[3,4-(メチレンジオキシ)ベンジル-アミノ]-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジンが含まれる。Wnt シグナル伝達活性化剤は神経誘導培地にあらゆる好適な濃度で存在してもよく、分化中のあらゆる好適な時点で導入されてもよい。例えば、Wnt シグナル伝達活性化剤は、約0.1 μＭ〜約10μＭ、例えば約１μＭ〜約５μＭ、例えば約２μＭの濃度で神経誘導培地に存在してもよい。例えば、細胞集団の吻側／尾側の同一性を変えることが望まれる場合、例えば尾側の表現型を示す細胞の割合を増加させることが望まれる場合、Wnt シグナル伝達活性化剤の使用は興味深い場合がある。加えて、Wnt シグナル伝達活性化剤の導入は、集団内のCHX10+細胞の割合を増加させるようである。
【００５１】
ある実施形態では、レチノイン酸シグナル経路活性化剤及びShh シグナル経路活性化剤を使用したhPSCの分化を開始した後、Notch シグナル経路阻害剤を神経誘導培地に追加する。従って、場合によっては、Notch シグナル経路阻害剤を第１の神経誘導培地又は第２の神経誘導培地に追加せず、第３の神経誘導培地に追加する。ある実施形態では、神経誘導培地へのレチノイン酸シグナル経路活性化剤の追加と同時的にNotch シグナル経路阻害剤を神経誘導培地に追加する。従って、場合によっては、Notch シグナル経路阻害剤を第１の神経誘導培地及び第２の神経誘導培地に追加する。
【００５２】
「接触させる」は、基質又は懸濁液で成長する細胞集団を培地と共に浸す及び／又は曝すあらゆる好適な方法を指し得る。場合によっては、接触させる際に、細胞集団を含む区画に培地を追加して、ある時間、細胞を培地に置いておく。場合によっては、接触させる際に、例えば細胞全体に亘る培地の流れとして、細胞集団を含む区画に培地を連続的に追加する。
【００５３】
例えば、本明細書に記載されているあらゆる実施形態、具体的には上記に記載されている実施形態に記載されているような第１の時間は、約１日以上、例えば約２日以上、約３日以上であってもよく、場合によっては約１日、約２日又は約３日であってもよい。例えば、本明細書に記載されているあらゆる実施形態、具体的には上記に記載されている実施形態に記載されているような第２の時間は、約１日以上、例えば約２日以上、約３日以上、約４日以上、約５日以上、約６日以上、約７日以上、約８日以上、約９日以上、約10日以上であってもよく、場合によっては、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約10日であってもよい。例えば、本明細書に記載されているあらゆる実施形態、具体的には上記に記載されている実施形態に記載されているような第３の時間は、約５日以上、例えば約６日以上、約７日以上であってもよく、場合によっては、約５日、約６日又は約７日であってもよい。ある実施形態では、第１の時間は約２日であり、第２の時間は約３日であり、第３の時間は約７日である。
【００５４】
本明細書に開示されている方法に従ってhPSCをV2a 介在ニューロンに分化するために、神経誘導培地（つまり、一又は複数の神経誘導培地の全て）での培養に、あらゆる好適な延べ日数をかけてもよい。場合によっては、約７日以上、例えば約９日以上、約11日以上、約12日以上、hPSCを神経誘導培地で培養し、場合によっては、約13日以下、例えば約12日以下、約11日以下、hPSCを神経誘導培地で培養する。ある実施形態では、約７日〜約13日間、例えば約９日〜約13日間、約11日〜約13日間、hPSCを神経誘導培地で培養する。ある実施形態では、約12日間、hPSCを神経誘導培地で培養する。
【００５５】
本開示の態様に従ってhPSCを培養する際に、神経外胚葉前駆細胞（つまり、脊髄ニューロン前駆体をもたらし得る前駆細胞を含む、神経細胞型及びそれらの前駆体をもたらし得る前駆細胞）へのhPSC集団の分化を促進するためのあらゆる好適な方法を更に含んでもよい。一般に、このような方法として、hPSCのSmall Mothers Against Decapentaplegic (SMAD)シグナル経路のシグナル伝達の阻害が含まれてもよい。従って、本方法では、本明細書に既に記載されているステップに加えて、一又は複数、例えば２以上のSMADシグナル経路阻害剤を、hPSCを培養する培地に追加することにより、hPSCの神経外胚葉分化を促進するのに十分な条件でhPSCを培養してもよい。場合によっては、一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を神経誘導培地に追加する。ある実施形態では、神経誘導培地（例えば第１の神経誘導培地）は、Shh シグナル経路活性化剤ではなく、一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤及びレチノイン酸シグナル経路活性化剤（例えばレチノイン酸のようなレチノイン酸受容体作動薬）を含む。ある実施形態では、本方法で、一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を含むが、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、Shh シグナル経路活性化剤又はNotch シグナル経路阻害剤を含まない初期の分化培地でhPSCを培養する。
【００５６】
初期の分化培地は、神経外胚葉前駆細胞へのhPSCの分化を促進するためのあらゆる好適な培地であってもよい。場合によっては、初期の分化培地は、幹細胞をフィーダ細胞無しで培養するための無血清の培地である。初期の分化培地は、mTeSRTM 1、KSR (Invitrogen)、又はxeno-free KSR (Invitrogen)、StemPro （登録商標）(Invitrogen)及びHEScGRO (Millipore)、DMEM ベースの培地及び同種のものであってもよい。初期の分化培地は、p160-Rho-associated coiled kinase(ROCK)の阻害剤を含んでもよい。ROCK阻害剤は、これに限定されないがY-27632 のようなキナーゼのあらゆる好適な阻害剤であってもよい。
【００５７】
一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤は、SMADシグナル経路を阻害するあらゆる好適な分子（ポリペプチド、小分子、核酸など）であってもよい。場合によっては、SMADシグナル経路阻害剤は、これに限定されないがLDN193189 、SB431542又はこれらの組合せのようなアクチビン受容体様キナーゼ(ALK) の阻害剤を含む。ある実施形態では、SMADシグナル経路阻害剤は、LDN193189 、dorsomophorine又はnoggin及びSB431542を含む。
【００５８】
初期の分化培地として、Wnt シグナル伝達活性化剤、例えば小分子Wnt シグナル伝達活性化剤、例えばGSK3阻害剤、例えば小分子GSK3阻害剤、例えばCHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-yl)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル)が含まれてもよい。このような分化培地が、選択的に又は加えて本明細書に記載されているような神経誘導培地に含まれてもよい。開示された方法に関連して使用され得る追加のWnt シグナル伝達活性化剤として、CHIR 99021三塩酸塩(6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-yl)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル三塩酸塩)、WAY-316606 (5-(フェニルスルホニル)-N-4-ピペリジニル-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンスルホンアミド塩酸塩)、（ヘテロ）アリールピリミジン、IQ1 (2-[2-(4-アセチルフェニル)ジアゼニル]-2-(3,4-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1(2H)-イソキノリニリデン)アセトアミド)、QS11 ((2S)-2-[2-(インダン-5-イルオキシ)-9-(1,1'-ビフェニル-4-yl)メチル)-9H-プリン-6-イルアミノ]-3-フェニル-プロパン-1-ol)、SB-216763 (3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-yl)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、BIO(6-ブロモインディルビン-3'-オキシム)、LY2090314 (3-(9-フルオロ-2-(ピペリジン-1-カルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-[1,4]ジアゼピノ[6,7,1-hi]インドール-7-yl)-4-(イミダゾ[1,2-a]ピリジン-3-yl)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、DCA （ジクロロ酢酸ナトリウム）、2-アミノ-4-[3,4-(メチレンジオキシ)ベンジル-アミノ]-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジンが含まれる。Wnt シグナル伝達活性化剤は初期の分化培地にあらゆる好適な濃度で存在してもよく、分化中のあらゆる好適な時点で導入されてもよい。例えば、Wnt シグナル伝達活性化剤は、約0.1 μＭ〜約10μＭ、例えば約１μＭ〜約５μＭ、例えば約２μＭの濃度で初期の分化培地に存在してもよい。例えば、細胞集団の吻側／尾側の同一性を変えることが望まれる場合、例えば尾側の表現型を示す細胞の割合を増加させることが望まれる場合、Wnt シグナル伝達活性化剤の使用が考えられる場合がある。加えて、Wnt シグナル伝達活性化剤の導入は、集団内のCHX10+細胞の割合を増加させるようである。
【００５９】
例えば、好適な初期の分化培地プロトコルでは、例えば本明細書に記載されているような濃度のWnt シグナル伝達活性化剤、例えば本明細書に記載されているようなWnt シグナル伝達活性化剤の存在下で、高密度、例えば約100K細胞/cm2 〜約150K細胞/cm2、例えば約110K細胞/cm2 〜約130K細胞/cm2、例えば約120K細胞/cm2でhPSCを播種してもよい。初期の分化培地プロトコルは、より低密度、例えば約15K 細胞/cm2〜約30K 細胞/cm2、例えば約25K 細胞/cm2で細胞を分離して再播種するステップを有してもよい。その後、培養プロトコルが、本明細書に記載されているように進んでもよい。
【００６０】
初期の分化培地でのhPSCの培養を、神経外胚葉前駆細胞へのhPSC集団の分化を促進するためにあらゆる好適な時間で継続してもよい。場合によっては、hPSCを初期の分化培地で約４日〜約６日間、例えば約５日間、培養する。
【００６１】
V2a 介在ニューロン集団を生成するためにhPSCをインビトロで培養する合計時間（つまり、初期の分化培地及び一又は複数の神経誘導培地での合計時間）は、細胞を各培地で培養する時間の長さに応じて異なってもよい。ある実施形態では、hPSCをインビトロで培養する合計時間は、約13日以上、例えば約15日以上、約16日以上、約17日以上であり、場合によっては、約25日以下、例えば約23日以下、約21日以下、約19日以下、約18日以下、約17日以下である。ある実施形態では、hPSCを初期の分化培地及び一又は複数の神経誘導培地で合計約13日〜約25日、例えば約15日〜約23日、約15日〜約21日、約15日〜約19日、約16日〜約18日、インビトロで培養し、初期の分化培地及び一又は複数の神経誘導培地に、逐次的な時間又は同一の時間、曝してもよい。ある実施形態では、hPSCを初期の分化培地及び一又は複数の神経誘導培地で約17日間、培養し、初期の分化培地及び一又は複数の神経誘導培地に、逐次的な時間又は同一の時間、曝してもよい。
【００６２】
本開示の方法の内のいずれかに従ってhPSCを培養する際に、最初のhPSC集団と共に培養物（例えば細胞培養基質）を播種してもよい。従って、培養物を播種すると、（神経外胚葉前駆体の分化の促進を含む）V2a 介在ニューロンの分化を生じさせるためのhPSCの培養は、細胞が播種されて細胞培養基質に付着すると、細胞培養基質からの細胞の分離を含まなくてもよい。最初のhPSC集団は、基質上に適切な密度のhPSCを得るためにあらゆる好適な数のhPSCを含んでもよい。場合によっては、5,000 細胞/cm2以上、例えば10,000細胞/cm2以上、15,000細胞/cm2以上、20,000細胞/cm2以上の密度でhPSCを細胞培養基質に播種し、場合によっては、120,000 細胞/cm2以下、例えば100,000 細胞/cm2以下、80,000細胞/cm2以下、60,000細胞/cm2以下、40,000細胞/cm2以下、30,000細胞/cm2以下の密度でhPSCを細胞培養基質に播種する。ある実施形態では、5,000 細胞/cm2〜120,000 細胞/cm2、例えば10,000細胞/cm2〜100,000 細胞/cm2、15,000細胞/cm2〜60,000細胞/cm2、20,000細胞/cm2〜30,000細胞/cm2、例えば約25,000細胞/cm2の密度でhPSCを細胞培養基質に播種する。
【００６３】
本開示の更なる態様では、V2a 介在ニューロンを含む細胞集団の細胞を別の基質（例えば神経成熟基質）に再播種し、播種された細胞を神経成熟培地で培養することにより、神経誘導培地でhPSCから生成されたV2a 介在ニューロン（例えば、上述されているように複数の神経誘導培地の最後で培養した後のCHX10+ V2a介在ニューロン集団）の成熟を生じさせるためのインビトロ法が含まれる。再播種する際、あらゆる好適な方法を使用して、神経誘導培地に曝すことによりhPSCを分化した基質（つまり神経誘導基質）から細胞を分離してもよい。限定はしないが、酵素的及び／又は機械的な分離法によって細胞を分離してもよい。
【００６４】
hPSCから得られたV2a 介在ニューロンを含む細胞集団をあらゆる好適な密度で再播種してもよい。ある実施形態では、約50,000細胞/cm2〜約150,000 細胞/cm2、例えば約100,000 細胞/cm2の密度で細胞を再播種する。
【００６５】
成熟処理では更に、神経成熟培地で培養する前のある時間、レチノイン酸シグナル経路活性化剤（例えばレチノイン酸のようなレチノイン酸受容体作動薬）、Shh シグナル経路活性化剤（例えばパルモルファミンのようなスムーズンド作動薬）及びNotch シグナル経路阻害剤（例えばDAPTのようなγセクレターゼ阻害剤）並びにY-27632 のようなROCK阻害剤を含む神経誘導培地で、再播種された細胞を培養してもよい。従って、場合によっては、本開示の方法では、神経誘導培地にhPSCからのV2a 介在ニューロンを含む細胞集団を生成した後、細胞集団を基質に再播種し、レチノイン酸シグナル経路活性化剤、Shh シグナル経路活性化剤、Notch シグナル経路阻害剤及びROCK阻害剤を含む神経誘導培地と、再播種された細胞を接触させ、その後、神経成熟培地と接触させる。再播種された細胞は、あらゆる好適な時間、神経誘導培地に置いておいてもよく、場合によっては、約３日間のような約２日〜約４日間、神経誘導培地にあってもよい。細胞は、V2a 介在ニューロンの成熟を生じさせるために、あらゆる好適な時間、神経成熟培地にあってもよく、場合によっては、約20日以上、例えば約25日以上、約30日以上、約40日以上、約50日以上、約60日以上、約100 日以上、神経誘導培地にあってもよい。
【００６６】
神経成熟培地は、V2a 介在ニューロンの成熟を促進するためのあらゆる好適な培地であってもよい。好適な培地は、限定はしないが、Life Technologies 製のNeurobasal（商標）培地及びNSC （商標）、Lonza 製のPNGM（商標）、Millipore 製の神経幹細胞基本培地、及びStemCell Technologies 製のStemdiff（商標）を含む。限定はしないが、B27 サプリメント及び神経細胞増殖因子のようなあらゆる好適なサプリメントが神経成熟培地に補充されてもよい。好適な増殖因子は、限定はしないが、BDNF、グリア細胞株由来の神経栄養因子(GDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)及びインスリン様増殖因子(IGF) を含む。
【００６７】
hPSCをV2a 介在ニューロンに分化するためのあらゆる好適な細胞培養基質を使用してhPSCをインビトロで培養してもよい。場合によっては、基質は、実質的に平坦な２次元の基質、例えば培養フラスコの表面である。基質は、細胞を培養するためのあらゆる好適な材料、例えばポリスチレンのようなプラスチック、ガラスなどから形成されてもよい。或いは、ヒドロゲル、多孔性足場などのあらゆる好適な３次元基質を使用してもよい。ある実施形態では、V2a 介在ニューロンへのhPSCの分化を促進するための好適な被覆材料で基質が覆われている。場合によっては、これらに限定されないが、Matrigel（登録商標）、フィブロネクチン、ラミニンのような細胞外マトリクス成分で基質が覆われている。場合によっては、基質は、限定はしないが、ポリオルニチン、ポリリジン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ポリグリコール酸(PGA) 、ポリ乳酸(PLA) 及び乳酸・グリコール酸重合体(PLGA)の被覆体を含んでもよい。hPSCを付着性細胞培養物又は懸濁細胞培養物で培養してもよい。例えば、ある実施形態では、hPSCを付着性単層として培養してもよい。hPSCを3D細胞凝集体として、例えば足場材料が存在しない状態で、好適な細胞培養懸濁液で更に培養してもよい。
【００６８】
hPSCは、本開示の方法で使用するためのあらゆる好適なhPSCであってもよい。場合によっては、hPSCはヒト胚性幹細胞(ESC) である。好適なヒトESC として、様々な入手可能なヒトES系統、例えばBG01 (hESBGN-01)、BG02 (hESBGN-02)、BG03 (hESBGN-03) (BresaGen, Inc.; Athens, Ga.)；SA01 (Sahlgrenska 1)、SA02 (Sahlgrenska 2) (Cellartis AB; Goeteborg, Sweden)；ES01 (HES-1)、ES01 (HES-2)、ES03 (HES-3)、ES04 (HES-4)、ES05 (HES-5)、ES06 (HES-6) (ES Cell International; Singapore)；UC01 (HSF-1)、UC06 (HSF-6) (University of California, San Francisco; San Francisco, Calif.)；WA01 (H1)、WA07 (H7)、WA09 (H9)、WA09/Oct4D10 (H9-hOct4-pGZ)、WA13 (H13)、WA14 (H14) (Wisconsin Alumni Research Foundation; WARF; Madison, Wis.)のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。細胞株の名称は、国立衛生研究所(NIII)コード、その後の括弧内の提供者コードとして与えられる。注目する実施形態は、H7 ESC又はH1 ESCに関連して使用するために本明細書に記載されているあらゆる方法を含む。
【００６９】
場合によっては、hPSCは人工多能性幹(iPS) 細胞であり、iPS 細胞は、体細胞、例えば分化体細胞から生じた多能性幹細胞である。iPS 細胞は、神経幹細胞を含む細胞運命に関与する幹細胞、及び様々なタイプの成熟細胞に自己再生及び分化することができる。あらゆる好適な方法を使用して、皮膚線維芽細胞を含む体細胞からiPS 細胞を生成することができる。iPS 細胞は、Oct-3/4 及びSox2をコードする一又は複数の発現構成体を用いて体細胞を遺伝子改変することにより、体細胞（例えば皮膚線維芽細胞）から生成され得る。ある実施形態では、体細胞は、Oct-3/4 、Sox2、c-myc 及びK1f4をコードするヌクレオチド配列を有する一又は複数の発現構成体を用いて遺伝子改変される。ある実施形態では、体細胞は、Oct-4 、Sox2、Nanog 及びLIN28 をコードするヌクレオチド配列を有する一又は複数の発現構成体を用いて遺伝子改変される。好適なタンパク質形質導入法が更に、例えば核酸及び／又はウイルスに基づく方法の代わりとして利用されてもよい。好適なiPS 細胞はWTC iPSC及びWTB iPSCを含む。注目する実施形態は、WTC iPSC及びWTB iPSCに関連して使用するために本明細書に記載されているあらゆる方法を含む。
【００７０】
hPSC細胞からV2a 介在ニューロンを生成する方法
ヒトV2a 介在ニューロンの成長及び発達の非ヒト動物モデル、つまりヒトV2a 介在ニューロンの成長及び発達のためのインビボモデルを生成する方法を本明細書では更に提供する。本方法では、CHX10+ V2a介在ニューロン（つまり神経誘導培地で培養されたが、神経成熟培地で再播種されて培養されていないCHX10+細胞）を含む細胞集団を非ヒト動物に移植してもよい。細胞集団を宿主動物内のあらゆる好適な位置に移植してもよく、場合によっては、脊髄の一又は複数の脊髄分節に移植してもよい。各脊髄分節では、細胞集団を一又は複数の異なる部位に移植してもよい。場合によっては、宿主動物からのV2a 介在ニューロンが一般的に見られる脊髄の前角に細胞集団を移植する。成熟したV2a 介在ニューロンの一又は複数の特性を得るために、移植したCHX10+細胞を宿主環境で成長させてもよい。
【００７１】
脊髄に移植される細胞の数はあらゆる好適な数であってもよく、例えば、102細胞／移植部位〜106細胞／移植部位、例えば5.0 ×102細胞／移植部位〜5.0 ×105細胞／移植部位、5.0 ×103細胞／移植部位〜5.0 ×105細胞／移植部位、又は5.0 ×104細胞／移植部位〜5.0 ×105細胞／移植部位、例えば約1.25×105細胞／移植部位であってもよい。
【００７２】
非ヒト動物はあらゆる好適な動物であってもよく、哺乳動物であってもよい。哺乳動物はあらゆる好適な哺乳動物であってもよく、齧歯動物（例えばマウス、ラットなど）、ウサギ目の動物（例えばウサギなど）、ネコ科の動物（例えばネコなど）、イヌ科の動物（例えばイヌなど）、有蹄動物（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、サル又は非ヒト霊長類などであってもよいが、これらに限定されない。
【００７３】
本開示の方法に従ってhPSCから得られたV2a 介在ニューロン又はV2a 介在ニューロンの成熟型を含む非ヒト動物モデルを本開示では更に提供する。非ヒト動物モデルは、上述されているようなあらゆる好適な非ヒト動物から選ばれた宿主動物であってもよい。ある実施形態では、V2a 介在ニューロン又はV2a 介在ニューロンの成熟型は脊髄、例えば宿主動物の脊髄の前角にある。
【００７４】
宿主動物のV2a 介在ニューロンの成熟型は、成熟したV2a 介在ニューロンに関連した一又は複数の特性を示してもよい。場合によっては、成熟したV2a 介在ニューロンは、例えば免疫組織化学法によって評価されるような発現のバックグラウンドレベルより高いレベルでNeuN及び／又はVGlut2を発現する。ある実施形態では、宿主のV2a 介在ニューロンの成熟型は、脊髄の吻側−尾側軸に沿って延びている神経突起（例えば軸索及び／又は樹状突起）を有する。脊髄の吻側−尾側軸に沿った神経突起の長さは、例えばV2a 介在ニューロンの成熟の程度、V2a 介在ニューロンの移植部位、移植後の経過時間などに応じて異なってもよい。場合によっては、神経突起は、脊髄の吻側−尾側軸に沿って５mm以上を含む３mm以上、例えば４mm以上、延びている。神経突起は、神経突起の長さに沿って一又は複数の機能的シナプスを含む場合がある。場合によっては、神経突起は一又は複数のシナプス前構造及び／又はシナプス後構造を有する。場合によっては、シナプス前構造は宿主ニューロンに関連付けられている（例えば、並置されている）。
【００７５】
有用性
本方法及び本動物モデルは、ヒトV2a 介在ニューロンの成長及び機能の態様を理解し、中枢神経系(CNS) の損傷を処置すべく新生細胞治療のためにヒトV2a 介在ニューロンを使用することが望ましい多くの用途で使用されてもよい。
【００７６】
場合によっては、シナプス後宿主標的にシナプスを形成してシナプス前宿主ニューロンからシナプス入力を受ける成熟V2a 介在ニューロンを与えることにより、シナプス前宿主ニューロンとシナプス後宿主ニューロンとの機能的な中継を確立するために、ヒトV2a 介在ニューロンを脊髄に移植する方法を研究すべく、非ヒト動物モデルを使用してもよい。
【００７７】
場合によっては、本開示に従ってhPSC（例えばhESC又はiPSC）から得られたヒトV2a 介在ニューロンを患者の損傷した脊髄に移植することができ、患者の脊髄のV2a 介在ニューロンの成熟が神経損傷を修復し、損傷した脊髄に関連した神経学的異常の少なくとも一部を回復させ得る。
【００７８】
本開示の例示的な非制限態様
上述された本主題の実施形態を含む態様は、単独で又は一若しくは複数の他の態様若しくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の記載を制限することなく、１〜63と番号が付された本開示のある非制限態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者に明らかであるように、個々に番号が付された態様の各々は、先の又は以下の個々に番号が付された態様のいずれかと共に使用されてもよく、又は組み合わせられてもよい。これは、態様のこのような全ての組合せの裏付けを与えることを意図しており、以下明示的に提供される態様の組合せに限定されない。
【００７９】
付記１．ヒト多能性幹細胞(hPSC)集団から脊髄グルタミン酸作動性介在ニューロンを生成する方法であって、
レチノイン酸シグナル経路活性化剤、
ソニックヘッジホッグ(Shh) シグナル経路活性化剤、及び
Notch シグナル経路阻害剤
を含む神経誘導培地に第１の集団のhPSCをインビトロで培養し、
培養により、CHX10+V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成することを特徴とする方法。
【００８０】
付記２．前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、レチノイン酸受容体作動薬を含むことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８１】
付記３．前記レチノイン酸受容体作動薬は、レチノイン酸又はレチノイン酸の誘導体を含むことを特徴とする付記２に記載の方法。
【００８２】
付記４．前記Shh シグナル経路活性化剤はスムーズンド作動薬を含むことを特徴とする付記１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【００８３】
付記５．前記スムーズンド作動薬はパルモルファミン又はパルモルファミンの誘導体であることを特徴とする付記４に記載の方法。
【００８４】
付記６．前記Notch シグナル経路阻害剤は、Notch 受容体活性化の阻害剤を含むことを特徴とする付記１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００８５】
付記７．前記Notch 受容体活性化の阻害剤はNotch 受容体拮抗薬であることを特徴とする付記６に記載の方法。
【００８６】
付記８．前記Notch 受容体活性化の阻害剤はγセクレターゼ阻害剤を含むことを特徴とする付記６に記載の方法。
【００８７】
付記９．前記γセクレターゼ阻害剤は、N-［(3,5-ジフルオロフェニル)アセチル]-L-アラニル-2-フェニル］グリシン-1,1-ジメチルエチルエステル(DAPT)であることを特徴とする付記８に記載の方法。
【００８８】
付記１０．前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約20nM〜約500 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
付記１１．前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約30nM〜約300 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１０に記載の方法。
【００９０】
付記１２．前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤は、約100 nMの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１１に記載の方法。
【００９１】
付記１３．前記Shh シグナル経路活性化剤は、約50nM〜約500 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
付記１４．前記Shh シグナル経路活性化剤は、約30nM〜約300 nMの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１３に記載の方法。
【００９３】
付記１５．前記Shh シグナル経路活性化剤は、約100 nMの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１４に記載の方法。
【００９４】
付記１６．前記Notch シグナル経路阻害剤は、約250 nM〜約10μＭの範囲内の濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【００９５】
付記１７．前記Notch シグナル経路阻害剤は、約500 nM〜約５μＭの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１６に記載の方法。
【００９６】
付記１８．前記Notch シグナル経路阻害剤は、約１μＭの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記１７に記載の方法。
【００９７】
付記１９．培養する際に、前記第１の集団のhPSCを順番に、
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地、及び
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤、前記Shh シグナル経路活性化剤及び前記Notch シグナル経路阻害剤を含む第２の神経誘導培地
と、CHX10+V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成するのに十分な条件下で接触させることを特徴とする付記１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【００９８】
付記２０．培養する際に、前記第１の集団のhPSCを順番に、
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤を含む第１の神経誘導培地、
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤及び前記Shh シグナル経路活性化剤を含む第２の神経誘導培地、及び
前記レチノイン酸シグナル経路活性化剤、前記Shh シグナル経路活性化剤及び前記Notch シグナル経路阻害剤を含む第３の神経誘導培地
と、CHX10+V2a介在ニューロンを含む第２の集団の培養細胞を生成するのに十分な条件下で接触させることを特徴とする付記１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【００９９】
付記２１．前記第２の神経誘導培地は前記Notch シグナル経路阻害剤を含むことを特徴とする付記２０に記載の方法。
【０１００】
付記２２．前記第１の神経誘導培地は、前記Notch シグナル経路阻害剤を含むことを特徴とする付記２１に記載の方法。
【０１０１】
付記２３．前記第１の神経誘導培地及び前記第２の神経誘導培地は、前記Notch シグナル経路阻害剤を含まないことを特徴とする付記２０に記載の方法。
【０１０２】
付記２４．前記第１の集団のhPSCを、前記第１の神経誘導培地と接触させてから約２日後に、前記第２の神経誘導培地と接触させることを特徴とする付記１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１０３】
付記２５．hPSC集団を、前記第１の神経誘導培地と接触させてから７〜13日間、培養することを特徴とする付記１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１０４】
付記２６．前記第１の神経誘導培地は、一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を含むことを特徴とする付記１９〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０１０５】
付記２７．前記第２の神経誘導培地及び前記第３の神経誘導培地は、前記一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を含まないことを特徴とする付記２０〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１０６】
付記２８．前記一又は複数のSMADシグナル経路阻害剤を、Noggin、dorsomorphin、LDN193189 、SB431542又はこれらの組合せから選択することを特徴とする付記２６又は２７に記載の方法。
【０１０７】
付記２９．前記第１の集団のhPSCを、細胞外マトリクス成分の被覆体を有する細胞培養基質で培養することを特徴とする付記１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
付記３０．前記細胞培養基質は、Matrigel（登録商標）の被覆体を有することを特徴とする付記２９に記載の方法。
【０１０９】
付記３１．培養する際に、約5,000 〜約120,000 細胞/cm2の密度で細胞培養基質に前記第１の集団のhPSCを播種することを特徴とする付記１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
付記３２．hPSCは、胚性幹細胞(ESC) 又は人工多能性幹細胞(iPSC)を含むことを特徴とする付記１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
付記３３．hPSCはH7 ESCであることを特徴とする付記３２に記載の方法。
【０１１２】
付記３４．hPSCはH1 ESCであることを特徴とする付記３２に記載の方法。
【０１１３】
付記３５．hPSCはWTC iPSCであることを特徴とする付記３２に記載の方法。
【０１１４】
付記３６．hPSCはWTB iPSCであることを特徴とする付記３２に記載の方法。
【０１１５】
付記３７．前記第２の集団の培養細胞の10％〜60％は、CHX10+V2a介在ニューロンであることを特徴とする付記１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
付記３８．前記第２の集団の培養細胞の20％〜40％は、CHX10+V2a介在ニューロンであることを特徴とする付記３７に記載の方法。
【０１１７】
付記３９．前記第２の集団の培養細胞の30％以上は、LHX3+であることを特徴とする付記１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
付記４０．FOXN4 、CHX10 、SOX14 、Nf軽鎖及びβIII チューブリンから選択された一又は複数の遺伝子に関して、前記第１の集団のhPSCと比較して、前記第２の集団の培養細胞の遺伝子発現を濃縮することを特徴とする付記１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０１１９】
付記４１．前記第２の集団の培養細胞の少なくとも一部を神経成熟基質に再播種し、
播種された前記第２の集団の培養細胞を神経成熟培地で培養することにより、成熟したCHX10+V2a介在ニューロン集団を生成することを特徴とする付記１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０１２０】
付記４２．成熟したV2a 介在ニューロン集団は電気的に興奮性であることを特徴とする付記４１に記載の方法。
【０１２１】
付記４３．ヒトV2a 介在ニューロン成長の非ヒト動物モデルであって、付記１〜４０のいずれか１つに記載の方法に従って生成されたV2a 介在ニューロン、又は前記V2a 介在ニューロンの成熟型を有することを特徴とする非ヒト動物モデル。
【０１２２】
付記４４．哺乳動物であることを特徴とする付記４３に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２３】
付記４５．前記哺乳動物は齧歯動物であることを特徴とする付記４４に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２４】
付記４６．前記非ヒト動物モデルの脊髄は前記V2a 介在ニューロン、又は前記V2a 介在ニューロンの成熟型を有することを特徴とする付記４３〜４５のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【０１２５】
付記４７．前記非ヒト動物モデルの脊髄はV2a 介在ニューロンの成熟型を有し、前記V2a 介在ニューロンの成熟型は、前記脊髄の吻側−尾側軸に沿って延びている神経突起を有することを特徴とする付記４６に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２６】
付記４８．前記神経突起は前記脊髄の吻側−尾側軸に沿って少なくとも３mm延びていることを特徴とする請求項４７に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２７】
付記４９．前記神経突起は、シナプス後構造及び／又はシナプス前構造を有することを特徴とする付記４７又は４８に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２８】
付記５０．前記神経突起は、宿主ニューロンに関連したシナプス前構造を有することを特徴とする付記４９に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２９】
付記５１．前記V2a 介在ニューロン、又は前記V2a 介在ニューロンの成熟型はNeuN及び／又はVGlut2を発現することを特徴とする付記４３〜５０のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【０１３０】
付記５２．ヒトV2a 介在ニューロン成長の非ヒト動物モデルを生成する方法であって、付記１〜４０のいずれか１つに記載の方法に従って生成されたCHX10+V2a介在ニューロンを含む細胞集団を、非ヒト動物に移植することを特徴とする方法。
【０１３１】
付記５３．前記細胞集団を脊髄に移植することを特徴とする付記５２に記載の方法。
【０１３２】
付記５４．前記細胞集団を前記脊髄の前角に移植することを特徴とする付記５３に記載の方法。
【０１３３】
付記５５．前記細胞集団を、104細胞／移植部位〜106細胞／移植部位の密度で移植することを特徴とする付記５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３４】
付記５６．前記非ヒト動物は哺乳動物であることを特徴とする付記５２〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
付記５７．前記哺乳動物は齧歯動物であることを特徴とする付記５６に記載の方法。
【０１３６】
付記５８．前記CHX10+V2a介在ニューロンの少なくとも一部はVGlut2を発現することを特徴とする付記５２〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
付記５９．培養する際に、前記hPSCを付着性単層として培養することを特徴とする付記１〜４２及び付記５２〜５８のいずれか１つに記載の方法、又は付記４３〜５１のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【０１３８】
付記６０．CHX10+V2a介在ニューロンを含む前記第２の集団の培養細胞を凍結して、その後、解凍し、凍結及び解凍は、CHX10+V2a介在ニューロンの割合に著しく影響を及ぼさないことを特徴とする付記１〜４２及び付記５２〜５９のいずれか１つに記載の方法、又は付記４３〜５１のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【０１３９】
付記６１．前記第２の集団の培養細胞の少なくとも一部を、ROCK阻害剤（例えば本明細書に記載されているあらゆるROCK阻害剤）を含む培地に再播種することを特徴とする付記１〜４２及び付記５２〜６０のいずれか１つに記載の方法、又は付記４３〜５１のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【０１４０】
付記６２．前記ROCK阻害剤は、約0.1 μＭ〜約10μＭ、例えば約１μＭ〜約５μＭの濃度で前記神経誘導培地に存在することを特徴とする付記６１に記載の方法又は非ヒト動物モデル。
【０１４１】
付記６３．本明細書に記載されているようなWnt シグナル伝達活性化剤、例えば小分子GSK3阻害剤のような小分子Wnt シグナル伝達活性化剤、例えばCHIR99021 を含む初期の分化培地及び／又は神経誘導培地に、前記第１の集団のhPSCをインビトロで培養することを特徴とする付記１〜４２及び付記５２〜６２のいずれか１つに記載の方法、又は付記４３〜５１及び６２のいずれか１つに記載の非ヒト動物モデル。
【０１４２】
実施例
以下の実施例は、開示された主題をどのように作製して使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載されるのであって、本発明者らが自身の発明であるとみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が、行われた全ての又は唯一の実験であると表すことを意図するものでもない。使用された数（例えば数量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別途記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又はその近傍である。例えば、bp（塩基対）、kb（キロベース）、pl（ピコリットル）、ｓ又はsec （秒）、min （分）、ｈ又はhr（時）、aa（アミノ酸）、kb（キロベース）、bp（塩基対）、nt（ヌクレオチド）、i.m.（筋肉内）、i.p.（腹腔内）、s.c.（皮下）などの標準的な略語が使用され得る。
【０１４３】
材料及び方法
以下の材料及び方法を実施例で使用した。
【０１４４】
ヒト多能性幹細胞の培養
hPSC（H7及びH1 hESC、WTC 及びWTB iPSC）を70％の培養密度に成長させ、Accutase (Accutase, San Diego, CA)を使用して継代し、（５分間37℃で培養した）単細胞に分離した。mTeSR (StemCell Technologies, location)の10μＭのROCK阻害剤（Y-27632, Selleckchem, Houston, Tx）を用いて１cm2 当たり10,000細胞の密度で、Matrigel（登録商標）で覆われた培養器（ESC に適したhESC及びiPSCのために減少した増殖因子）に分離細胞を再播種した。
【０１４５】
V2a 介在ニューロンの分化
Matrigelで覆われた24ウェルプレートに5,000 〜100,000 細胞/cm2で10μＭのROCK阻害剤及び二重SMAD阻害剤である0.2 μＭのLDN193189 及び10μＭのSB431542(StemGent, Cambridge, MA)が補充されたmTeSR にhPSCを播種した。３日目に、培地を、二重SMAD阻害剤のみが補充されたmTeSR に変えた。５日目に、二重SMAD阻害剤及び10nM〜10μＭのレチノイン酸(Sigma Aldrich)が補充された神経誘導培地（DMEM F:12 (Corning)、N2サプリメント(Life Technologies,  Carlsbad, CA)、L-グルタミン(VWR) 、２μg/mlのヘパリン(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)、非必須アミノ酸(VWR) 、新鮮な0.4 μg/mlのアスコルビン酸(Sigma Aldrich)が補充されたペニシリン−ストレプトマイシン(VWR)、及び10ng/ml の脳由来神経栄養因子(BDNF, R&D Systems, Minneapolis, MN)）に基本培地を切り替えた。７日目に、二重SMAD阻害が停止し、10nM〜10μＭのレチノイン酸、10nM〜10μＭのpur (EMD Millipore, Darmstast, Germany)及び100 nM〜10μＭのN-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT)を神経誘導培地に追加した。分化を通じて培地を２〜３日毎に変え、新鮮なサプリメントを最大17日間、毎回追加した。
【０１４６】
神経細胞の成熟（プロトコル１）
分化の17日目に、培養物をAccutase（37℃で45分間；15分毎に粉砕）を用いて分離し、以前と同一の濃度のRA、pur 及びDAPT並びに10μＭのROCK阻害剤を含む神経誘導培地に、Matrigelで覆われたTCPS又はガラスカバースリップ（Warner Instruments, Hamden CT）に100,000 細胞/cm2で播種した。３日後、神経成熟培地（10 ng/mlのBDNF、GDNF、CNTF及びIGF が補充されたNeurobasal(Life Technologies)及びB27 サプリメント(Life Technologies)）に培地を切り替えた。培養の残り時間、３〜４日毎に培地を完全に変えた。
【０１４７】
神経細胞の成熟（プロトコル２）
分化の17日目に、培養物をAccutase（37℃で45分間；15分毎に粉砕）を用いて分離し、100 nMのRA、100 nMのpur 及び１μＭのDAPT並びに10μＭのROCK阻害剤を含む神経誘導培地に、Matrigelで覆われたマイクロスライド８ウェル（ibidi, Martinsreid, Germany）又はガラスカバースリップ（Warner Instruments, Hamden CT）に100,000 細胞/cm2で播種した。３日後、神経成熟培地（10 ng/mlのBDNF、GDNF、CNTF及びIGF （R&D Systems）が補充されたBrainPhys 及びSM1 サプリメント(Stemcell Technologies)）に培地を切り替えた。培養の残り時間、３〜４日毎に培地を完全に変えた。
【０１４８】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
サンプルを溶解し、RNA をE.Z.N.A. Total RNAキット(Omega Biotek, Norcross, GA)を使用して抽出した。RNA (500 ng)を、iScript cDNA合成キット(BioRad, Hercules, CA)を使用してcDNAに逆転写した。RT-qPCR を、Fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies)を使用して行い、以下の表１に記載されているプライマを、Step One Plus Real-Time PCR システム(Life Technologies)を用いて61℃でアニールした。倍率変化を、ΔΔCt法を使用して計算した。高処理遺伝子発現解析のために、Fluidigmを使用した。予め増幅したcDNAサンプル及びプライマを、Sso Fast EvaGreen Supermix (BioRad)を用いて混合し、その後、96.96 ダイナミックアレイ集積流体回路(IFC) にロードし、BioMark HDシステムで実行した。
【０１４９】
【表１−１】
2019517257.tif 000003
【０１５０】
【表１−２】
2019517257.tif 000004
【０１５１】
フローサイトメトリー
分化の17日目に、細胞を、Accutaseを使用して完全に分離し、固定／透過処理(FP)及び洗浄／透過処理(WP)バッファを含むTranscription Factor Buffer Set(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を使用して染色した。分離したサンプルを最初に４℃で45分間FPバッファに固定し、その後、５％の正常なロバ血清(NDS, Jackson Laboratories, Bay Harbor, ME)を含むWPバッファを用いて20分ブロックした。Chx10 、Lhx3及び適切に一致する種アイソタイプ対照に対する一次抗体を、以下の表２に示されている濃度で２％のNDS を含むWPバッファに追加し、45分間４℃で培養した。洗浄／permバッファを用いて２回洗浄した後、1:200 の希釈の二次抗体ロバ抗マウスIgG, Alexa Fluor 488 (Life Technologies)をWPバッファに追加し、45分間４℃で培養した。WPバッファを用いて２回洗浄した後、サンプルを35μｍフィルタに通し、BD Accuri C6(BD)サイトメータ（各々最小20,000イベント）を用いて評価した。サイトメトリ解析をFlowJo V10 (Flowjo, Ashland, OR)を使用して行った。
【０１５２】
【表２】
2019517257.tif 000005
【０１５３】
免疫細胞化学法及び撮像
サンプルを30分間４％のパラホルムアルデヒド(VWR) を用いて固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) に15分間４℃で0.1 ％のTriton（商標）-X（オクチルフェノールエトキシレート）を用いて透過処理し、その後、５％のNDS を含むPBS を用いて１時間４℃でブロックした。一次抗体（表２）を２％のNDS を含むPBS に希釈して、一晩培養した。サンプルを室温で15分間PBS を用いて３回洗浄し、その後、２％のNDS を含むPBS に希釈された二次抗体(Life Technologies)を用いて培養した。Hoechst をサンプルに10分間、追加し、その後洗浄し、Zeiss Axio Observerを使用して撮像してフォトショップ（登録商標）を使用して処理した。
【０１５４】
単細胞RNAseq 
培養の17日目に、細胞をAccutaseを用いて分離した。Chromium Single Cell 3’ v1 Library and Gel Bead Kit (10x Genomics, San Francisco, CA)を使用したChromium Controller 及びライブラリ調製による液滴封入を通した単細胞解析のために略8,000 の細胞を調製した。Covaris S2ソニケータを使用してcDNAを剪断し、cDNA増幅中にPCR を12サイクル実行した。ライブラリをNextSeq 500 (Illumina, San Diego, CA)で配列決定した。配列を逆多重化し、10xGenomics Cellranger v 1.2のデフォルト設定を使用してヒトリファレンスゲノムhg19に整列させた。Ensembl version 70を使用して遺伝子にアノテーションを付けた。Cellrangerフィルタリングの後、8500万を超える有効リードが、トランスクリプトームに70％を超えてマッピングされたままであった。下流解析を、Seurat (Macosko EZ, et al. (2015) Cell 161(5):1202-1214; Satija R, et al. (2015) Nat Biotechnol 33(5):495-502)を使用して行い、500 〜5000の特有の遺伝子を発現しない細胞を除去した。Seuratの「MeanVarPlot 」機能（0.25以上の発現カットオフ；0.50以上の分散カットオフ）を用いて高分散遺伝子のサブセットを決定し、決定した高分散遺伝子のサブセットを使用して細胞をクラスタに分類した（主成分１〜12；クラスタ分解能パラメータ＝0.5 ）(van der Maaten LJP HG (2008) Journal of Machine Learning Research 9:2579-2605)。クラスタ毎にトップ20の差次的に発現した遺伝子をヒートマップにプロットした。生データは、受入番号GSE97564でSRA で入手可能である。PANTHER (Ashburner M, et al. (2000) Nat Genet 25(1):25-29; Gene Ontology C (2015) Nucleic Acids Res 43(Database issue):D1049-1056)及びGOrilla (Eden E., et al. (2007) PLoS Comput Biol 3(3):e39; Eden E., et al. (2009) BMC Bioinformatics 10:48)を使用して、統計的に有意な差次的に発現した遺伝子(p ≦ 0.05)に遺伝子オントロジー解析を行った。
【０１５５】
カルシウムイメージング及び解析
培養物をPBS を用いて洗浄し、培地をNeurobasal及びFluo4 AM(10μM, Life Technologies)と30分間37℃で取り換えた。その後、培養物を新鮮なNeurobasalで洗浄し、37℃で更なる30分間、回収可能な状態にし、その後、Zeiss Axio Observerで記録した。
【０１５６】
広視野のカルシウム映像を解析するために、位相画像から細胞体を識別し、対応する蛍光緑色チャネルで注目領域(ROI) として選択した。注目領域毎の平均蛍光強度を、MATLAB (MathWorks, Natick, M)を使用して毎秒2.38フレームのサンプリングレートで経時的に測定し、ROI 内のカルシウム変動を評価した。ノイズを最小化するために、各トレースの平均を計算して全体から減算した。最低でも20のROI を視野毎に識別した。
【０１５７】
電気生理学的検査
ニューロン（27日目、41日目、63日目）を、内液（(mM)：100K グルコン酸塩、20 KCl、10 HEPES 、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、10 Na-クレアチンリン酸及び0.2 ％のビオサイチン；オスモル濃度300 mOsm）が充填されたガラスピペット電極を使用して細胞全体の構成に記録した一方、暖かいACSF((mM)：126 NaCl、26 NaHCO3、3.0 KCl、1.25 NaH2PO4、2.0 CaCl2、2 MgCl2及び20 デキストロース；オスモル濃度320 mOsm、T=33℃；95％のO2及び５％のCO2の混合物を用いた泡立て、pH＝7.3 〜7.35）を用いて潅流した。細胞全体の構成を達成した直後に静止膜電位を測定した。20pAの1.5 s の脱分極電流を注入し、電流固定（ベースライン電圧を、低い一定の負電流を注入することにより、−60〜−70mVの間に維持した）で電圧応答を測定することにより、活動電位を導き出した。活動電位を、Igor Pro（登録商標）、Wavemetricsの特注ソフトウェアを使用して解析した。
【０１５８】
脊髄移植
カリフォルニア州のサンフランシスコ大学でIACUC に従って全ての動物研究を行った。17日目に、Accutaseを使用して培養物を45分間分離してPBS を用いて洗浄し、約５×105細胞／μＬで氷冷のDMEMに再懸濁し、移植まで氷の上に維持した。12週齢のメスのC57Bl/6j SCID マウスにイソフルランを使用して麻酔をかけ、背面の椎弓切除をT9で行って、脊髄を露出させた。脊柱を安定させ、分離細胞を、椎弓切除部位の吻側縁部及び尾側縁部で脊髄の前角に４つの注入部位（約1.25×105細胞／部位）に亘って両側に移植した。露出した脊髄の筋肉組織を縫合して閉じ、皮膚を止血鉗子で閉じた。抗生物質（エンロフロキサシン）を10日間毎日（腹腔内、2.5 mg/kg ）与えた。２週後、動物を安楽死させ、PBS 、その後に４％のパラホルムアルデヒドを用いて経心的に潅流した。移植部位の中心にある脊髄組織の２cm切片を収集して一晩ポスト固定した。
【０１５９】
組織処理及び免疫蛍光法
脊髄を埋め込んで、20μｍの切片を矢状面で得た。切片を、15分間PBS で0.3 ％のTriton-Xを用いて、又は10分間、氷冷のアセトンを用いて透過処理した。その後、全ての切片をPBS で10％のNDS 、５％のウシ血清アルブミン及び0.1 ％のtriton-xを用いてブロックした。切片を、表２に示された一次抗体を用いて培養した。切片を３回洗浄し、１時間ブロッキング溶液で適切な二次抗体(1:500) で培養し、その後、対比染色し、DAPIを含むProlong Gold Antifade を使用してカバースリップを切片に取り付けた。Zeiss Axio Observer倒立広視野顕微鏡及びApotome構造化照明アタッチメントを使用してＺスタック画像（１μｍのステップサイズ）を得た。Ｚスタック画像に最大値投影法を行い、切片の厚さ全体に及ぶ１つの２次元画像を作成した。
【０１６０】
統計解析
Prism ６ソフトウェアを用いて統計解析を行った。特に断りのない限り、３つの生物学的複製から全てのデータに関して平均及び±標準偏差を計算した。２つのグループを比較するとき、独立ｔ検定を行った。３以上のグループを特定するとき、一元配置分散分析(ANOVA) 、必要に応じてTukey の多重比較検定を使用した。全ての比較で、有意性をp<0.05と定めた。
【０１６１】
凍結及び解凍
V2a 介在ニューロンの分化の17日目に、細胞を、15分毎に粉砕して45分間Accutaseを用いて酵素的に分離した。その後、細胞をPBS で洗浄して遠心分離し、10％のDMSO、40％のFBS 、並びにBDNF、RA、AA、Pur 、DAPT及び10μＭのROCK阻害剤(Y27632)が補充された50％の神経誘導培地に再懸濁した。サンプルをクライオバイアルに入れ、少なくとも24時間、−80℃の冷凍庫でMr. Frosty（商標）に保存した。その後、サンプルをMr. Frosty（商標）から取り出し、長期保存のために−80℃の冷凍庫又は液体窒素に保存した。解凍のために、サンプルを水槽に置き、10μＭのROCK阻害剤を含む神経誘導培地で回収し、遠心分離した。細胞を、BDNF、RA、AA、Pur 、DAPT及び10μＭのROCK阻害剤を含む神経誘導培地に再懸濁し、24ウェルプレートに播いた。培養物を、解析前の３日間、培養器で回収した。
【０１６２】
再播種
17日目に、V2a 培養物を上述したように分離した。その後、24ウェルの内の１つのウェルを、BDNF、RA、AA、Pur 、DAPT及び１μＭのROCK阻害剤を含む培地にMatrigelで覆われた24ウェルの１ウェルに再播種した。培養物を、解析前の３日間、培養器で回収した。
【０１６３】
吻側／尾側同一性を特定するためのWnt 活性化
「D0 CHIR 処置」グループに関して、GSK3阻害剤である２μＭのCHIR990201を０日目〜７日目、V2a 介在ニューロンプロトコルに追加した。「D-2 CHIR処置」グループに関して、多能性幹細胞を、２日間２μＭのCHIR990201が存在する状態でより高い密度（120k細胞/cm2）で最初に播種した。その後、細胞を分離し、25k/cm2で再播種し、V2a 介在ニューロンプロトコルを開始した。CHIR990201を０日目〜７日目、培地組成物に維持した。更なる培養及び解析を、上述したように進めた。
【０１６４】
実施例１：ヒトPSC 由来のV2a 介在ニューロンの分化は、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ及びNotch シグナル伝達の阻害によって決まる
ヒトPSC (hPSC)からV2a 介在ニューロンを分化するために、V2a 関与に関係するモルフォゲン及びシグナル経路（RA、Shh 及びNotch 阻害剤、DAPT）の濃度を逐次的に変えて、17日目にhPSCから分化したCHX10+の割合を調べた。Shh 作動薬、パルモルファミン、（pur 、１μＭ）及びDAPT（５μＭ）（両方共７日目に開始）の一定濃度で５日目に開始する100 nMのRA濃度により、17日目にCHX10+集団（約６％、図1C）が生じた。同様に、100 nMのRA及び５μＭのDAPTの濃度で７日目に開始する100 nMのpur 処置により、分化の17日後に約30％のChx10+細胞が生じた（図1D）。更に、RＡ及びpur の濃度が一定（各々100 nM）の状態でDAPTの濃度を７日目の初めに変えて、１μｍ及び５μＭのDAPTにより、比較可能なCHX10+集団（約15％；図1E）が生じた。形態形成の手がかりの特定の濃度に関わらず、CHX10+細胞は、培養物の分化中、相対的に均一に分布したようである（図1F〜1H）。
【０１６５】
図1A〜1H：モルフォゲンの濃度がV2a 介在ニューロン集団を調節する。（図1A）成長する神経管の概略図である。体節から放出されるレチノイン酸(RA)、並びに底板及び脊索から放出されるソニックヘッジホッグ(Shh) は、神経管の異なる前駆領域をパターン化する。（図1B）V2a 介在ニューロンプロトコルのスケジュールを示す。（図1C）RA濃度が変わり、Shh 作動薬、パルモルファミン(pur) 及びDAPTが一定に維持されたときのCHX10 発現のフローサイトメトリー解析結果を示す。V.C グループ、10nMグループ、30nMグループ及び１μＭグループと比較して* = p<0.05。（図1D）pur 濃度が変わり、RA及びDAPTが一定に維持されたときのChx10 発現のフローサイトメトリー解析を示す。全てのグループと比較して＄=p<0.05。（図1E）DAPT濃度が変わり、RA及びpur が一定に維持されたときのCHX10 発現のフローサイトメトリー結果を示す。V.C 、100 nM及び500 nMと比較して＃= p<0.05。（図1F〜1H）100nM RA（図1F）、100nM pur（図1G）又は１μＭDAPT （図1H）を用いた分化のCHX10 及び神経核の標識化の免疫染色画像を示す。スケールバー＝100μm、ｎ=２〜３。
【０１６６】
１μＭ及び５μＭのDAPT濃度が、V2a 介在ニューロン分化の同様の効率をもたらしたので、CHX10+細胞の収率に対する両方の濃度の影響を、更に進める前に検査した。DAPTのような小分子阻害剤のより高い濃度は多くの場合より細胞傷害性であり得るので、細胞の総数及び入力多能性細胞当たりのChx10+細胞の収率を検査した。より低いDAPT濃度（１μＭ）は、５μＭのDAPTで処置された培養物より多くの生細胞をもたらした（440 万の細胞対285 万の細胞、図2B）。更に、入力多能性細胞当たりのCHX10+細胞の数が、１μＭのDAPTを使用して約50％増加した（図2C）。分化の５日目、７日目又は10日目にDAPT処置を開始してNotch 阻害の開始を変えることにより（図2E）、CHX10+細胞の同様の割合をもたらし、従って、Shh 受容体活性化作用と一致すべく、今後の全ての研究のためにDAPTを７日目に追加した。加えて、25,000細胞/cm2の播種密度により、5,000 細胞/cm2及び100,000 細胞/cm2と比較してCHX10+細胞のより大きな割合をもたらした（図2E）。加えて、前駆体のマーカでありV2a 介在ニューロンに関与するLHX3が、V2a 介在ニューロンの分化の17日目に全ての細胞の略半分だけ発現した（46.3％）。全体として、これらの結果は、Notch 阻害と組み合わせたRA及びShh 受容体活性化作用を使用して推定上のV2a 介在ニューロンに確実に分化するhPSCの能力を実証している。
【０１６７】
図2A〜2E：DAPT濃度はV2a 介在ニューロンの収率に影響を及ぼす。（図2A）１μＭ及び５μＭのDAPTを用いた17日目のCHX10 発現のフローサイトメトリー解析結果を示す。（図2B）（100 nMのRA及び100 nMのpur を使用し）１μＭ及び５μＭのDAPTを使用したV2a 介在ニューロンの分化の17日目の24ウェル培養当たりの細胞の総数を示す。独立ｔ検定による＊= p<0.05。（図2C）入力多能性幹細胞当たりの17日目のCHX10+細胞の総数を示す。（図2D）DAPTが５日目、７日目、10日目、13日目に追加されたときの17日目のCHX10 又は溶媒対照群（V.C.、DMSO）のフローサイトメトリー解析結果を示す。V.C.と比較して＃= p<0.05。V.C.及び13日目と比較して＄= p<0.05。（図2E）３つの異なる最初の播種密度を使用した17日目のCHX10 のフローサイトメトリー解析結果を示す。5k及び100kと比較して＆= p<0.05。5kと比較して＾= p<0.05。全てのデータは平均±標準偏差として報告され、統計比較を、one-way ANOVA 及びTukey の多重比較検定を使用して行った。
【０１６８】
実施例２：V2a 分化の特異性
分化の最初の17日間を通した遺伝子発現解析を行って、V2a 介在ニューロン細胞集団の時間変化を特徴付けた（図3A）。多能性遺伝子POU5F1発現が３日目までに減少し、17日間を通して下方制御され続けた。神経管成長中に発現した初期の神経マーカは、７日目までに増加した（PAX6及びNES （ネスチン））。神経管腹側で発現した脊髄細胞型の他のマーカ（GATA3 、OLIG2 、HB9 及びSIM1）は早くも３日目に始まり、分化を通して発現を増加させ続けた。p2領域(FOXN4) 及び関与するV2a 介在ニューロンのためのマーカ（CHX10 及びSOX14 ）の発現は10日目に始まり、15日目までに高度に上方制御された。神経細胞遺伝子（NEFL (NF)、TUBB3 （βIIIチューブリン））は、17日目であらゆるグリア（PDFGRA、CSPG4 、SOX10 及びGFAP）又は網膜細胞型（THY1、IRBP及びCRX ）より高度に発現した（夫々約70倍及び約10倍）ようであった（図3B）。V2a 介在ニューロンの分化のためのもたらされたプロトコル（100 nMのRA、100 nMのpur 及び１μＭのDAPT）を複数のhPSC系統（H7 ESC、H1 ESC、WTC iPSC及びWTB iPSC）で検査して再現性を決定した。Chx10+集団が、25.4％〜48.6％の範囲内の効率で検査された系統の全てで確実に得られた（図3C）。脊髄の神経細胞マーカの遺伝子発現を、４つのhPSC細胞株の各々に関して17日目に検査し、高いCHX10 発現を一貫して検出したが、他の神経細胞マーカ（PAX6、HB9 及びGATA3 ）の発現レベルは、異なる細胞株間で同様に低かった（図3D）。識別可能な空間パターンが、分化培養物でCHX10+細胞に関して観察されなかった（図4A）。V2a 介在ニューロンプロトコルは、４つの異なる細胞株に亘って同一の条件（100 nMのRA、100 nMのpur 及び１μＭのDAPT）で独立した12回を超えて再現され、20％を超えるCHX10+割合が常に達成された（図4B）。これらのデータは、V2a 介在ニューロンの濃縮した培養物を再現性よくもたらし得る頑強な神経細胞分化処理の確立を実証している。
【０１６９】
図3A〜3D：V2a 介在ニューロンプロトコルはhPSC神経発生を確実に増加させる。（図3A）未分化H7 hESC と比較したV2a 介在ニューロンの分化に亘る遺伝子発現解析結果を示す。（図3B）H7 hESC と比較した17日目の神経細胞遺伝子発現、グリア遺伝子発現及び網膜遺伝子発現を示す。（図3C）V2a 介在ニューロンプロトコルで分化されたヒトESC （H7、H1）及びiPSC（WTB 及びWTC ）のCHX10 割合を示す。（図3D）PSC と比較した17日目の遺伝子発現を示す。CHX10 発現に関して、H7及びWTC と比較して＊= p<0.05。GATA3 発現に関して、H1と比較して＃= p<0.05。全てのグループに関して、n=3 。
【０１７０】
図4A〜4B：V2a 介在ニューロンの分化は複数のヒトPSC 系統に有効である。（図4A、パネルi-iv）V2a 介在ニューロンプロトコルを使用して分化されたH7 ESC（図6A、パネルｉ）、H1 ESC（図4A、パネルii）、WTB iPSC（図4A、パネルiii ）及びWTC iPSC（図4A、パネルiv）のCHX10 、βIII チューブリン及び標識化神経核に関する免疫染色画像を示す。スケールバー＝100 μm。（図4B）様々なPSC 系統の複数の独立したV2a 介在ニューロンの分化からのCHX10+細胞の割合を示す。
【０１７１】
V2a 介在ニューロンプロトコルの特異性を検査するために、同様のヒト運動ニューロンプロトコルとの直接比較を行った（図5A）。V2a 介在ニューロンの分化は約30％のCHX10+細胞をもたらしたが、運動ニューロンの分化はごく僅かなCHX10+細胞しかもたらさなかった（１％未満、図5B）。より多くのCHX10+神経核及びより大量のβIII チューブリン発現が、運動ニューロン条件と比較してV2a 介在ニューロン条件を使用して観察された（図5C、パネルi-ii）。加えて、V2a 介在ニューロンの分化培養物でごく僅かに観察されたのと比較して、多くのOLIG2+（前駆運動ニューロンマーカ）神経核が運動ニューロンの分化によってもたらされた（図5C、パネルiii-iv）。興味深いことに、神経細胞遺伝子（NEFL(NF)、TUBB3 （βIII チューブリン）及びPAX6）の発現は、運動ニューロンと比較してV2a 介在ニューロンの分化と共に増加したが、V2a 介在ニューロンの転写因子（CHX10 及びSOX14 ）は運動ニューロンの分化と比較して最も高い発現（約100 倍）を示した一方、運動ニューロンのマーカ（OLIG2 及びHB9 ）は２つの分化処理間で比較可能なままであった（図5D）。まとめると、これらの結果は、V2a 分化条件が同様のヒト運動ニューロンプロトコルに対して介在ニューロン集団(CHX10+)に関して特に高めることを実証している。
【０１７２】
図5A〜5D：V2a 介在ニューロンプロトコルは標準的な運動ニューロンの分化と比較してV2a 介在ニューロン集団を特に増加させる。（図5A）運動ニューロン（上側）及びV2a 介在ニューロン（下側）の分化プロトコルを対照させるスケジュールを示す。（図5B）運動ニューロン及びV2a 介在ニューロンの分化に関するCHX10 のフローサイトメトリー解析結果を示す。独立ｔ検定による＊=p<0.005、n=3 。（図5C）運動ニューロンプロトコル（図5C、パネルｉ）及びV2a 介在ニューロンプロトコル（図5C、パネルii）を用いて分化された培養物のCHX10 及び神経核に関する免疫染色画像（図5C、パネルi-ii）とβIII チューブリン（赤）に関する免疫染色画像とを示す。（図5C、パネルiii-iv）運動ニューロンプロトコル（図5C、パネルiii ）及びV2a 介在ニューロンプロトコル（図5C、パネルiv）を用いて分化された培養物のOLIG2 に関する免疫染色画像を示す。スケールバー＝100μｍ。（図5D）17日目の運動ニューロンの培養物と比較した17日目のV2a 介在ニューロンの培養物の遺伝子発現を示す、n=3 。
【０１７３】
実施例３：単細胞RNAseq解析
単細胞RNAseq解析を行って、上記の実験から得られた異種培養物の細胞組成物を定義した。クラスタＢ（図10B ）内に含まれるCHX10+細胞の77％と共に12の主成分（図10A ）を用いてｋ平均クラスタリングによって細胞の（Ａ〜Ｇと指定された）７つの別個のクラスタを識別した。トップの全体的に差次的に発現した遺伝子を使用して、集団全体を定める７つのクラスタの一般的な表現型を識別した（図10C 及び（以下の）表３）。遺伝子オントロジー(GO)解析及びトップの差次的に発現した遺伝子の個々の検査（図11〜13）は、クラスタＡ及びクラスタＢが関与するニューロン［神経フィラメント培地ポリペプチド(NEFM)及びNSG1］であり、クラスタＣはグリア細胞（PLP1及びTTHY1 ）であり、クラスタＤ及びクラスタＥはニューロン前駆体(NEUROD1) であり、クラスタＦは有糸分裂的に活性な神経細胞（FOXN4 、PTTG1 及びUBE2C ）を含み、クラスタＧは、間葉系細胞／筋細胞（TAGLN 及びCOL1A1）から構成されたことを示唆している（図11〜13）。全体として、単細胞RNAseqデータは、培養物の大部分が、関与の異なる段階（64％の完全に関与するニューロン、15％の神経前駆体及び５％の有糸分裂神経前駆体）でニューロンであった（約85％）ことを示した。非神経細胞は、分化細胞の残りの部分を構成した（13％のグリア及び２％の間葉系／筋；図10D ）。クラスタＡ及びクラスタＢは、相互に最も密接に関連するものであり（図10E ）、多くの高度に発現した遺伝子（GAP43 及びNEFM）並びにGO期間（成長円錐及び軸索）を共有した。CHX10+細胞の大部分を含むクラスタＢは、SOX21 、SHOX2 、LHX3及びオルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT) のような興奮性V2a 介在ニューロン表現型と一致する多くの遺伝子と、後脳／頸部の同一性と一致するHOX 遺伝子［ホメオボックスB5(HOXB5) ］とを発現する細胞を含んだ（図14）。クラスタＤ及びクラスタＥの両方は初期のニューロン(NEUROG1) と識別されたが、クラスタＤの細胞は、クラスタＥの細胞（UBE2S 及びMT2A）と比較してより多く関与したニューロン表現型（RND2及びIGDCC3）を示した（図12）。更に、p2マーカのFOXN4 を発現する細胞の80％は、有糸分裂的に活性なクラスタＦ内に含まれた（図14）。まとめると、これらのデータは、（17日目の）V2a 分化培養物が、神経前駆体（クラスタＤ及びクラスタＥ）及び有糸分裂細胞（クラスタＦ）のプールから生じる主に有糸分裂後の興奮性ニューロン（クラスタＡ及びクラスタＢ）をもたらし（図10F ）、V2a 介在ニューロン表現型と一致するマーカを発現する濃縮した細胞集団を含むことを示唆している。
【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
実施例４：長期培養は、V2a 介在ニューロンの成熟プロファイルを高める(A)
V2a 介在ニューロンの成熟を検査するために、分化培養物を17日後に分離し、サブコンフルエンスで再播種し、神経細胞の成熟（プロトコル１）に従って培養の20日目、30日目、40日目及び50日目に分析した（図6A）。CHX10+細胞は20日目にβIII チューブリンを発現したが、βIII チューブリン発現は50日目までに観察されなくなった（図6E）。成熟ニューロンのマーカである神経フィラメント(NF)の発現は、早くも20日目に短い神経突起に観察されたが、より長い神経突起伸長が30日目に観察され始め、50日目までに、大きく細長い神経束が培養物全体に見つけられた（図6F〜6I）。グルタミン酸作動性ニューロンのマーカである小胞グルタミン酸輸送体２（VGlut2）は早期に検出されなかった（20日目、図6J）が、この発現が、後の段階の培養で一部の細胞に観察された（図6K〜6M）。VGlut2は培養の40日目にCHX10 集団の一部によって発現し、分化した推定上のV2a 介在ニューロンがグルタミン酸作動性運命及び更に成熟した表現型を取り入れていたことを示した（図6L）。要するに、時間的な表現型発現パターンは、限定的ながら、V2a 介在ニューロン培養のインビトロでの進行する成熟を支援している。
【０１７６】
図6A〜6M：V2a 介在ニューロンはインビトロでの限られた成熟を示す。（図6A）V2a 介在ニューロン成熟培養のスケジュールを示す。（図6B〜6M）培養の20日目、30日目、40日目及び50日目のV2a 介在ニューロンのCHX10 及び神経核の標識化に関する免疫染色画像を示す。（図6B〜6E）βIII チューブリンに関する免疫染色を示す。（図6F〜6I）神経フィラメント(NF)に関する免疫染色を示す。図6Iの白い矢じりは神経束を示す。（図6J〜6M）小胞グルタミン酸輸送体２(VGLUT2)の免疫染色を示す。スケールバー＝50μｍ。
【０１７７】
カルシウムイメージングを行って、神経細胞の成熟の機能指標として長期培養中の自発的な神経電気活動を検出した。異なる時点で、Fluo4 がロードされた細胞の個々の細胞体を視覚的に識別し（白い矢印、図7A〜7B）、ピクセル蛍光強度の経時的な平均変化を測定した。カルシウム変動は最初20日目に観察されなかったが、振幅及び周波数の増加と共に、より古い培養物（40日目）で頻繁に観察された（図7C）。個々の細胞の細胞全体のパッチクランプ記録を行い、分化細胞の経時的な電気生理学的特性を評価した。静止膜電位は培養時間を通して著しく変化せず、約−40mVのままであった（図7D）。しかしながら、V2a 培養物の活動電位周波数は、一定の電流注入（20pA；図7E）に応じて培養の際に経時的に増加した。表現型発現パターンと一致して、分化細胞の電気生理学的特性は、V2a 介在ニューロン培養物の経時的な相当な成熟を示唆している。
【０１７８】
図7A〜7E：電気生理学的特性は、培養時間と共に成熟度が増したことを示す。（図7A、パネルi-iv）20日目、30日目、40日目及び50日目の培養物の代表的な位相画像を示す。（図7B、パネルi-iv）カルシウムの代表的な蛍光画像を示す。赤色の矢じりは、注目領域がカルシウムイメージングのために選択された細胞体を示す。（図7C、パネルi-iv）経時的なピクセル強度の代表的なトレースを示す。（図7D）27日目、41日目及び63日目の電流−固定パッチされたニューロンの静止膜電位を示す。（図7E、パネルi-ii）27日目、41日目及び63日目の20pAの電流注入（図7E、パネルi ）に応じた代表的な活動電位トレースを示す。27日目、41日目及び63日目の電流固定パッチされたニューロンの活動電位周波数を示す。27日目及び41日目と比較して＊= p<0.05（図7E、パネルii）。比較を、one-way ANOVA 及びTukey の多重比較検定を使用して行った。27日目、41日目及び63日目に関して夫々、ｎ＝５、６及び９。
【０１７９】
実施例５：長期培養は、V2a 介在ニューロンの成熟プロファイルを高める(B)
V2a 介在ニューロンの成熟を検査するために、分化培養物を17日後に分離し、再播種し、神経細胞の成熟（プロトコル２）に従って培養の20日目、30日目、40日目、50日目及び60日目に分析した（図15）。20日目までに、CHX10+細胞は神経細胞マーカであるβIII チューブリン及び神経フィラメントを発現し、発現は、培養の60日間を通して持続した（図16、パネルＢ〜Ｋ及び図17、パネルＡ及びパネルＢ）。一部のニューロン核(NeuN)はCHX10+細胞と共存し、NeuN発現は60日目まで継続した（図16、パネルＬ〜Ｐ）。グルタミン酸作動性ニューロンのマーカである小胞グルタミン酸輸送体２（VGlut2）は早期に検出されなかった（20日目、図16、パネルＱ）が、後の段階（60日目）の培養物では大量であり、成熟グルタミン酸作動性運命の取り入れを示した（図16、パネルＹ）。多くのCHX10+神経核が最初に容易に発見された（20日目；図16、パネルＢ）が、CHX10+細胞の識別は、発現の低下及び培養物の細胞の総数の増加のため、経時的に低下した（図17、パネルＣ及びパネルＤ）。全体として、時間的な表現型発現パターンは、限定的ながら、V2a 介在ニューロン培養のインビトロでの進行する成熟を支援している。
【０１８０】
実施例６：移植されたhPSC由来のV2a 介在ニューロンは成体マウスの脊髄で生存して成熟する
脊髄の環境内のhPSC由来のV2a 介在ニューロンの生理反応を、分化培養物をC57/SCIDマウスの未処置の脊髄に移植することにより検査した。V2a 介在ニューロン培養物（約45％のCHX10+細胞；図8A〜8B）を胸椎レベル９(T9)に移植し、脊髄を組織学的解析のために２週間後に採取した（図8C）。移植細胞を、ヒト細胞質タンパク質（Stem121 、図8D）及びヒト核抗原（HNA 、図8E）のためのマーカを使用して矢状切片で観察した。HNA+神経核は、脊髄の吻側／尾側軸に沿った限られた移動で移植部位にとどまった。Stem121+細胞が、５mmの距離に亘って吻側方向及び尾側方向の両方に延びる突起（図8G）と共に移植部位に観察された（図8F）。移植されたV2a 介在ニューロンの表現型を評価するために、異なるマーカのパネルを用いた組織学的染色を成体マウスの脊髄に行った。HNA+細胞の大部分がCHX10 を同時発現し、従って、移植されたV2a 介在ニューロンの生存を確認した（図8H〜8J）。更に、多くのCHX10+細胞が更にNeuN（図8K、矢印及び挿入図）並びにVGlut2（図8L及び挿入図）を発現し、グルタミン酸作動性表現型へのV2a 介在ニューロンの神経細胞の成熟を示した。偶発的なGABA+細胞が移植部位の近傍で見つけられたが、CHX10+/GABA+細胞は検出されず（図8M及び挿入図）、Oct4+細胞が、移植細胞を含む脊髄切片のいずれにも観察されなかった（図9A〜9D）。Stem121+細胞はシナプス後マーカのGRIP1 を発現し（図9E〜9H）、Stem121+突起は、宿主ニューロンに直接隣り合うシナプス前マーカのシナプトフィジンと同時的に標識化し（図9I〜9L及び挿入図）、シナプス形成及び宿主組織との移植細胞の一体化を示した。移植されたhPSC由来のV2a 介在ニューロンは、マウスの脊髄の複数の位置に突出した（図18、パネルA）。Stem121+突起は白質内に突出し、多くのStem121+が、同様に隣り合う灰白質に分岐した（図18、パネルA、ｉ）。移植されたニューロンは更に、別個の移植部位間に軸索を突出させた（図18、パネルＡ、ii）。宿主細胞との移植された細胞集団の推定上のシナプス形成は、移植部位に隣り合って観察された（図18、パネルＡ、iii ）。シナプス後マーカのHOMER は、隣接しているヒト細胞神経突起(Stem121+)に直接近接して宿主ニューロン(NeuN+) に見つけられ、宿主組織との移植細胞のシナプス形成を示唆した（図18、パネルＢ〜Ｅ）。加えて、シナプス前マーカのシナプトフィジンを発現するヒト細胞神経突起の終末が、宿主ニューロンに直接隣り合って観察された（図18、パネルＦ〜Ｉ）。Stem121+細胞はシナプス後マーカのGRIP1 を更に発現した（図18、パネルＪ〜Ｍ）。これらの結果は、移植されたhPSC由来のV2a 介在ニューロンが生存して成熟し、成体マウスの脊髄の宿主細胞にシナプスを形成するような長い突起を伸ばすことを実証している。
【０１８１】
図8A〜8M：ヒトPSC 由来のV2a 介在ニューロンは成体マウスの脊髄で生存して成熟する。（図8A）17日目のV2a 介在ニューロン培養物のCHX10 及びDAPI神経核の標識化に関する免疫染色を示す。（図8B）移植に使用されたV2a 介在ニューロン培養物のCHX10 のフローサイトメトリー解析結果を示す。（図8C）成体マウスの脊髄への細胞移植、及び移植の２週間後に採取された脊髄組織の区分の概略を示す。（図8D）T9の尾側の矢状組織切片のStem121 （ヒト細胞質タンパク質、白）の免疫染色を示す。（図8E）移植部位の近くのHNA （ヒト核抗原、白）の免疫染色を示す。（図8F）移植部位（図8G）及び移植部位の中心から５mmの位置のStem121 （白）免疫染色を示す。（図8H〜8J）移植部位でのV2a 介在ニューロンのHNA （白）及びCHX10 （緑）の免疫染色を示す。（図8K）移植されたV2a 介在ニューロンのNeuN及びCHX10 （緑）の免疫染色と神経核標識化とを示す。（図8K）の挿入図は、NeuN+/CHX10+神経核のより高い倍率の画像を含む。（図8L）移植されたV2a 介在ニューロンのVGLUT2及びCHX10 の免疫染色と神経核標識化（青）とを示す。（図8L）の挿入図は、移植されたV2a 介在ニューロンのCHX10+神経核に隣り合うVGlut2標識化のより高い倍率の画像を含む。（図8M）移植されたV2a 介在ニューロンのGABA及びCHX10 の免疫染色と神経核標識化とを示す。（図8M）の挿入図は、GABA-/CHX10+細胞に隣り合うGABA+/CHX10-細胞のより高い倍率の画像を含む。
【０１８２】
図9A〜9L：移植細胞は成熟神経細胞マーカを発現する。（図9A〜9D）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 、Oct4及びDAPIの神経核標識化に関する免疫染色画像を示す。（図9E〜9H）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 、NeuN及びGRIP1 の免疫染色画像を示す。（図9I〜9L）移植されたV2a 介在ニューロンのStem121 、NeuN及びシナプトフィジンの免疫染色画像を示す。挿入図は、宿主Stem121-/NeuN+ニューロンに隣り合う共存するシナプトフィジン及びStem121 発現（矢印）のより高い倍率の画像を含む。
【０１８３】
実施例７：培養されたV2a 介在ニューロンは、凍結−解凍手順を通してCHX10 の割合を維持する
上記の材料及び方法に記載されているように、V2a 介在ニューロン培養物を凍結して解凍した。図19に示されているように、解凍されたサンプルのCHX10+の割合は、17日目のサンプル、及び分離されて10μＭのROCK阻害剤に再播種されて３日間回収されたサンプル（10μＭRe）と略同一であった。細胞を凍結して解凍する能力により、効率のプレスクリーニング、分化のバッチ及び大規模な動物研究のための規模拡大が可能になる。
【０１８４】
実施例８：培養物のCHX10+細胞の割合を増加させるための再播種
V2a 介在ニューロン培養物を、上記の材料及び方法に記載されているようにROCK阻害剤の様々な濃度を使用して再播種した。図19に示されているように、CHX10+細胞の割合は、17日目のサンプル(D17) 及び10μＭのROCK阻害剤と共に再播種されたサンプル（10μＭのRe）と比較して、１μＭのROCK阻害剤と共に再播種した後、２倍を超えた。この方法は、V2a 介在ニューロンの高純度の培養物を有することが有益な表現型の特徴分析、成熟及び／又は動物研究のために利用され得る。
【０１８５】
実施例９：吻側／尾側同一性を特定するためのWnt 活性化
V2a 介在ニューロンプロトコルへの小分子CHIR99021 （「CHIR」）（GSK3阻害剤及び、ひいてはWNT 活性化剤）の追加を、上記の材料及び方法に記載されているように検査した。図20A 及び図20B に示されているように、D0でのCHIRの追加は、CHX10+細胞の割合を減少させず、頸部及び胸部の遺伝子発現を僅かに増加させた。D2でのCHIRの追加、及びCHIRを用いた継代は、CHX10+細胞の割合を大幅に増加させて、更に頸部及び胸部の遺伝子発現を増加させた。これらの結果は、Wnt 活性化が、CHX10+細胞の増加をもたらし、より尾側の表現型を示す頸部及び胸部のHOX 発現を増加させるという考えを支持している。CHIR処置の時間は、CHX10+細胞の割合及びHOX 遺伝子発現プロファイルを調節する。吻側−尾側同一性の特定は、表現型の特徴分析及び移植研究のための仕様に重要であるので、これらの結果は重要である。
【０１８６】
引用文献
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【０１８７】
本開示はその具体的な実施形態に関して説明されているが、当業者には様々な変更をなし得ること、及び本開示の主旨及び範囲から逸脱せずに等価物に置き換え得ることを理解すべきである。加えて、特定の状況、材料、物質組成、処理、処理ステップ又はステップに適合するため、本開示の目的、主旨及び範囲には多くの改変を行い得る。このような改変は全て、添付の特許請求の範囲内にあると意図される。
【０１８８】
本出願は、2016年５月31日に出願された米国仮特許出願第62／343,747 号の利益を主張するものであり、その出願全体を参照によって本明細書に組み込む。
【図１Ａ】
2019517257.tif 000007
【図１Ｂ】
2019517257.tif 000008
【図１Ｃ】
2019517257.tif 000009
【図１Ｄ】
2019517257.tif 000010
【図１Ｅ】
2019517257.tif 000011
【図１Ｆ】
2019517257.tif 000012
【図１Ｇ】
2019517257.tif 000013
【図１Ｈ】
2019517257.tif 000014
【図２】
2019517257.tif 000015
【図３】
2019517257.tif 000016
【図４】
2019517257.tif 000017
【図５Ａ】
2019517257.tif 000018
【図５Ｂ】
2019517257.tif 000019
【図５Ｃ】
2019517257.tif 000020
【図５Ｄ】
2019517257.tif 000021
【図６−１】
2019517257.tif 000022
【図６−２】
2019517257.tif 000023
【図７−１】
2019517257.tif 000024
【図７−２】
2019517257.tif 000025
【図８Ａ】
2019517257.tif 000026
【図８Ｂ】
2019517257.tif 000027
【図８Ｃ】
2019517257.tif 000028
【図８Ｄ】
2019517257.tif 000029
【図８Ｅ】
2019517257.tif 000030
【図８Ｆ】
2019517257.tif 000031
【図８Ｇ】
2019517257.tif 000032
【図８Ｈ】
2019517257.tif 000033
【図８Ｉ】
2019517257.tif 000034
【図８Ｊ】
2019517257.tif 000035
【図８Ｋ】
2019517257.tif 000036
【図８Ｌ】
2019517257.tif 000037
【図８Ｍ】
2019517257.tif 000038
【図９】
2019517257.tif 000039
【図１０Ａ】
2019517257.tif 000040
【図１０Ｂ】
2019517257.tif 000041
【図１０Ｃ】
2019517257.tif 000042
【図１０Ｄ】
2019517257.tif 000043
【図１０Ｅ】
2019517257.tif 000044
【図１０Ｆ】
2019517257.tif 000045
【図１１】
2019517257.tif 000046
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2019517257.tif 000049
【図１５】
2019517257.tif 000050
【図１６】
2019517257.tif 000051
【図１７】
2019517257.tif 000052
【図１８】
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【図１９】
2019517257.tif 000054
【図２０】
2019517257.tif 000055
【配列表】
2019517257000001.app
【国際調査報告】
2019517257.tif 000056
2019517257.tif 000057