(57)【要約】本発明は、改変エンベロープウイルスであって、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、改変エンベロープウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを使用して癌を治療する方法に関する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される改変エンベロープウイルスであって、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、改変エンベロープウイルス。
【請求項２】
前記ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０アミノ酸を含む群から選択される長さを有する、請求項１に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項３】
複数の前記ペプチドは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入される、請求項１または２に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項４】
前記ペプチドは同一であるか；前記ペプチドは、互いに９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を超える配列同一性を有するか；または前記ペプチドは、多くの異なる抗原を表す、請求項３に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ拘束性である、請求項１から４のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項７】
前記ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ拘束性ペプチドおよびＭＨＣ−ＩＩ拘束性ペプチドの混合物を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項８】
前記ペプチドは、複数の異なる抗原を含む融合分子を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項９】
前記ペプチドは、少なくとも１つの切断部位も含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１０】
前記ペプチドは、少なくとも１つの免疫プロテアソームプロセシング部位も含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１１】
前記ペプチドは、１組の免疫プロテアソームプロセシング部位の間に配置され、その上流または下流は、少なくとも１つの切断部位である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１２】
前記ペプチドは、非共有結合的に前記ウイルスエンベロープに付着させられるか、またはそれに挿入される／それを通過して挿入される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１３】
前記ペプチドは、細胞透過性ペプチドもしくはコレステロール複合ペプチドのいずれかを使用して、非遺伝的に前記ウイルスエンベロープに付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１４】
前記ペプチドは、
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号１）、ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２）、ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号３）、ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４）、ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６）、ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮまたはＣ末端のＡＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ（配列番号７）、ＣＰＰ配列；および
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのコレステロール部分ＮまたはＣ末端
を含む群から選択される細胞透過性ペプチドもしくはコレステロール複合ペプチドのいずれかを使用して、非遺伝的に前記ウイルスエンベロープに付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１５】
前記ペプチドは、
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号８）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号９）；
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号１０）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号１１）；
ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）；
ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１３）；
ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１４）；
ＡＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号１５）；
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬ（配列番号１６）；
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１７）；
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１８）；
ＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＲＶＲＲＡＬＩＳＣ−コレステロール（配列番号１９）；
コレステロール−ＣＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号２０）；
コレステロール−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２１）；
コレステロール−ＣＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）；
コレステロール−ＣＲＷＥＫＩＳＶＹＤＦＦＶＷＬＹＫＬＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３）；
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ−ＦＩＴＣ（配列番号２４）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号２５）；
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号２６）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号２７）；
ＦＩＴＣ−ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２８）；
ＦＩＴＣ−ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）；
ＦＩＴＣ−ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３０）および
ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号３１）
を含む群から選択される、請求項１４に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１６】
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される非遺伝的に改変された異なるエンベロープウイルスの組み合わせが提供される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１７】
前記組み合わせは、前記ウイルスのウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを含むよう改変された前のウイルスのいずれか２、３、４、５、６または７つを含む、請求項１６に記載の改変エンベロープウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルスと、適した担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
癌を治療するための方法であって、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される改変エンベロープウイルスに個体を曝露するステップを含み、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、方法。
【請求項２０】
前記方法は、選択された期間の後、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される別の改変エンベロープウイルスに前記個体を曝露するステップを伴い、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有し、さらに前記ウイルスは、事前の曝露に使用されたものとは異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記別の改変エンベロープウイルスは、最初の改変エンベロープウイルスと同じまたは大部分が同じ前記ペプチドでコーティングされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上のウイルスへの曝露後に、前記個体は、チェックポイントインヒビターにさらに曝露される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
癌を治療するための方法であって、少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを発現する改変ウイルスに個体を曝露するステップと、その後、選択された期間の後、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択されるエンベロープウイルスに前記個体を曝露するステップとを含み、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された同じまたは大部分が同じ前記ペプチドを有する、方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを発現する改変ウイルスに個体を曝露するステップの後、または単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択されるエンベロープウイルスに前記個体を曝露するステップの後のいずれかで、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された同じまたは大部分が同じ前記ペプチドを有し、チェックポイントインヒビターに前記個体を曝露するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
実質的に本明細書に記載されるとおりの、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の改変エンベロープウイルス、請求項１８に記載の医薬組成物および請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変エンベロープウイルスであって、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、改変エンベロープウイルス、それを含む医薬組成物、およびそれを使用して癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効な癌治療薬に対する現在のパラダイムは、腫瘍浸潤性腫瘍特異的エフェクターＴ細胞の活性の増強およびその量の増加である。ＣＤ８＋  Ｔ細胞と名づけられたこれらのエフェクターＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍に対する防御免疫応答の重要な構成要素である。これらの腫瘍特異的ＣＴＬは、腫瘍組織に見出すことができ、腫瘍浸潤ＣＴＬの量と患者の生存の間に明らかな相関関係がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
腫瘍微小環境内における負のフィードバック系を妨げるよう機能し、既存の抗腫瘍免疫応答を増大させるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイント分子を標的とする抗体の最近の認可は、非常に大きな臨床上の刺激をもって迎えられた。これらの免疫チェックポイントインヒビター抗体の使用は、癌患者の１０〜２０％に長続きする応答をもたらすことができる。しかしながら、残りの８０〜９０％の患者は、抗腫瘍免疫応答の欠如または腫瘍微小環境のその他の免疫抑制側面のために応答しない。チェックポイントインヒビター療法に応答する患者集団を拡大するために、本発明者らは、広い抗腫瘍免疫を増大させるまたは引き起こすためおよび腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞を腫瘍微小環境にリクルートするためのＰｅｐｔｉＥＮＶと呼ばれるエンベロープウイルスベクタープラットフォームを開発した。
【０００４】
有利にも、本発明者らは、免疫賦活性ＰｅｐｔｉＥＮＶウイルスおよび免疫チェックポイントインヒビター抗体の組み合わせにより患者を治療することによって、免疫チェックポイントインヒビター療法に対するレスポンダーの量が増加することを予想している。
【０００５】
本特許出願は、ＰｅｐｔｉＥＮＶプラットフォームについて記載し、これは、後で、抗原提示細胞上に容易に交差提示され得る免疫調節ペプチドをウイルスエンベロープにコーティングおよび挿入する新規の方法を含む。現在、免疫系を活性化する目的でペプチドをウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させる方法は存在しない。ＷＯ２００５／０６０５４１は、ウイルス膜を崩壊させ、破壊するためにウイルス外被に挿入される抗ウイルスペプチドについて教示している。
【０００６】
一部のウイルスは、その防御タンパク質カプシドを覆うウイルスエンベロープを有する。エンベロープは、一般に宿主細胞膜（リン脂質およびタンパク質）の部分に由来するが、いくらかのウイルス糖タンパク質を含む。これは、ウイルスが宿主免疫系を回避するのに役立つ場合もある。エンベロープの表面にある糖タンパク質は、宿主の膜にあるレセプター部位を特定し、それと結合する役割をする。ウイルスエンベロープは、その後、宿主の膜と融合して、カプシドおよびウイルスゲノムが宿主に侵入し、感染させるのを可能にする。ウイルス膜と宿主細胞膜の融合による宿主細胞への侵入に加えて、一部のウイルスは、代わりに侵入機構としてエンドサイトーシスを使用する場合がある。
【０００７】
本質的に、本発明者らは、既知の治療的および臨床的に認められたウイルスを使用し、抗ウイルス免疫を犠牲にして抗腫瘍免疫を増大させる新規の方法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によると、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される改変エンベロープウイルスであって、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、改変エンベロープウイルスが提供される。
【０００９】
本明細書における改変エンベロープウイルスに対する言及は、そのウイルスエンベロープに前記少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを含むよう非遺伝的に改変されたウイルスに対するものである。誤解を避けるために、前記ウイルスは、それを目的に適した状態にする任意のその他の遺伝的改変を含んでも、または含まなくてもよいが、ウイルスエンベロープへまたはそれを通過させた前記少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドの付着は非遺伝的に行われる。
【００１０】
当業者は、一部のウイルスが、その防御タンパク質カプシドを覆うウイルスエンベロープを有することを認識するであろう。エンベロープは、一般に宿主細胞膜（リン脂質およびタンパク質）の部分に由来するが、いくらかのウイルス糖タンパク質を含む。これは、ウイルスが宿主免疫系を回避するのを助ける場合もある。エンベロープの表面にある糖タンパク質は、宿主の膜にあるレセプター部位を特定し、それと結合する役割をする。感染の過程において、ウイルスエンベロープは、宿主の膜と融合し、カプシドおよびウイルスゲノムが宿主に侵入し、感染させることを可能にする。したがって、ウイルスエンベロープに付着させられたか、またはそれに挿入されたか、またはそれを通過させられたペプチドを抗原として使用して、免疫応答を誘発することができる。
【００１１】
本明細書における抗腫瘍ペプチドに対する言及は、腫瘍に対して免疫応答を誘発することができるペプチドに対するものである。
【００１２】
本明細書における腫瘍特異的ペプチドに対する言及は、特定の１つ以上の腫瘍に対して免疫応答を誘発することができるペプチドに対するものである。
【００１３】
好適な実施形態において、前記ペプチドは、患者で同定されたもの、または患者固有のものである。
【００１４】
当業者には明白なとおり、ペプチドの厳密な性質は、治療される腫瘍の性質に関連して変化する場合があり、実際に、技術の特異性は、さまざまな抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドがさまざまなタイプの癌が現れている個体を治療するために使用されることになり、さまざまな抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドが同じタイプの癌が現れている個体を治療するために使用されてもよいことを意味する。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態において、前記ペプチドは、８〜５０の間のアミノ酸長、理想的には１５〜３５アミノ酸長である。最も理想的には、前記ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０アミノ酸を含む群から選択される長さを有する。
【００１６】
最も理想的には、複数の前記ペプチドは、ウイルスエンベロープに付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入される。これらのペプチドは、同一であってもよく、または軽微な改変のみ、すなわち、互いに９０％を超える配列同一性、最も理想的には、互いに９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性を有する同じ抗原であってもよい。あるいは、多くの異なる抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドが、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入される。
【００１７】
より好ましくは、前記ペプチドはまた、以下に限定されないが、カテプシン切断部位またはフューリン切断部位などの少なくとも１つの切断部位を含む。より好ましくは、さらに、前記ペプチドは、少なくとも１つの免疫プロテアソームプロセシング部位を含む。これらの部位および複合ペプチドの構造に対するその相対的な配置の例を図７に示す。理想的には、１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドが１組の免疫プロテアソームプロセシング部位の間に配置され、その上流は、少なくとも１つの切断部位、理想的にはフューリン切断部位であり、それにカテプシン切断部位が（上流に）続く。
【００１８】
有利にも、本発明者らは、これらのペプチドが、選択されたエンベロープウイルス（ＨＳＶ−１および−２、ワクシニア、ＶＳＶ、ＭｅＶ、マラバウイルスならびにＮＤＶ）に付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入された場合、抗ウイルス免疫を抗腫瘍免疫に変えることによって増加した腫瘍特異的な免疫応答を誘発し、抗腫瘍効果を激しく増大させることができることを発見した。
【００１９】
他と比較してこのプラットフォームの簡潔さは、患者で同定された抗腫瘍誘発腫瘍特異的ペプチドを非遺伝的にウイルスエンベロープに付着させるか、またはそれに挿入する／それを介して挿入することによって、医学的に認められたウイルスを臨床的に使用することができることである。これは、単に前記患者由来の腫瘍特異的ペプチドの新規のセットでウイルスをコーティングすることによって、ＭＨＣ−Ｉ上に提示される患者の腫瘍抗原の変化に非常に急速に反応することができることを意味する。
【００２０】
本発明の別の重要な特徴は、遺伝的に導入された改変を有するウイルスは、新しい改変またはペプチドが導入される度に検査段階を通過する必要があるため、これらのプラットフォームを個別化医療に使用するのが実質的に不可能になる他のプラットフォームと比較して、このプラットフォームに選択されるウイルスは、たった一度厳格な品質管理および認可段階を通過する必要があるだけであるため、時間および費用の節約になることである。
【００２１】
本発明の別の好適な実施形態において、前記ペプチドは、（ＰｅｐＳｃａｎまたはＯｎｔｏｒｅｓから購入した）細胞透過性ペプチドまたはコレステロール複合ペプチドのいずれかを使用して、前記ウイルスエンベロープに付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入される。
【００２２】
当業者に知られているとおり、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、（ナノサイズの粒子から小さな化学分子およびＤＮＡの大きなフラグメントまで）さまざまな分子装置の細胞の摂取／取り込みを促進する短いペプチドである。この「カーゴ」は、共有結合を介した化学結合または非共有結合性相互作用のいずれかによりペプチドと結びつけられる。ＣＰＰの働きは、エンドサイトーシスにより通常生じるプロセスである、カーゴを細胞に送達することである。
【００２３】
ＣＰＰは、一般に高い相対的存在量のリジンもしくはアルギニンなどの正電荷アミノ酸を含むか、または極性／電荷アミノ酸および非極性疎水性アミノ酸の交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかのアミノ酸組成を有する。これら２種類の構造は、それぞれポリカチオン性または両親媒性と呼ばれる。ＣＰＰの第３のクラスは、低い正味荷電の無極性残基のみを含む疎水性ペプチドであるか、または細胞の取り込みに非常に重要な疎水性アミノ酸グループを有する。
【００２４】
本発明は、前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドと連結される場合に、任意の既知のＣＣＰの使用を想定する。
【００２５】
作用のメカニズムの説明によって縛られることを望まないが、本発明者らは、ＣＰＰは、通常そのカーゴを、脂質二重層を介して送達するが、本発明者らの免疫源性ペプチドとともにＣＰＰ配列から成るペプチドは、部分的に脂質二重層を通過する一方で、その一部は、場合によって、物理的な疎水性・親水性相互作用により、排他的ではないにしても、本発明者らの目的に対しては十分に膜に固着するようであることを考慮する。
【００２６】
前記ペプチドと複合体形成される場合のＣＰＰの例を図７Ｂに示す。
【００２７】
これもまた当業者に知られているとおり、コレステロール複合ペプチドは、コレステロールに付着させられた短いペプチドである。本発明者らは、それらがウイルスエンベロープに入り、その結果、複合ペプチドをウイルス外被内に固定することを発見した。これらのペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端にコレステロール複合体が形成されてもよい。
【００２８】
再び、作用のメカニズムの説明によって縛られることを望まないが、本発明者らは、コレステロールは脂質膜の構成成分であるため、コレステロール複合ペプチドが膜のその「通常の」場所を見つけることを考慮する。実際、本発明者らは、コレステロールにあるヒドロキシ基が膜リン脂質およびスフィンゴ脂質の極性頭部基と相互作用する一方で、他方の脂質の非極性脂肪酸鎖に並んで大きいステロイドおよび炭化水素鎖は膜に埋め込まれると推測する。
【００２９】
コレステロール複合ペプチドの例を図７Ａに示す。
【００３０】
本発明の好適な実施形態において、前記エンベロープに付着させるか、またはそれに挿入する／それを介して挿入するためのペプチドは、
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号１）ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２）ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号３）ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４）ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６）ＣＰＰ配列；
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのＮもしくはＣ末端にＡＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ（配列番号７）ＣＰＰ配列；または
前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドのコレステロール部分ＮまたはＣ末端を含む。
【００３１】
さらに別の本発明の好適な実施形態において、前記エンベロープに付着させるか、またはそれに挿入する／それを介して挿入するためのペプチドは、以下のものの１つを含み、配列ＳＩＩＮＦＥＫＬは、ＭＨＣ−Ｉ拘束性エピトープまたはペプチドの単なる代表である：
【００３２】
ＣＰＰペプチド：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号８）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号９）
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号１０）
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号１１）
ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）
ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１３）
ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１４）
ＡＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ（配列番号１５）
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬ（配列番号１６）
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１７）
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１８）（ここで、ＲＷＥＫＩおよびＹＫＬＲＷＥＫＩは、免疫プロテアソームプロセシング部位である）。
【００３３】
コレステロール複合ペプチド：
ＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＲＶＲＲＡＬＩＳＣ−コレステロール（配列番号１９）
コレステロール−ＣＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号２０）
コレステロール−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２１）
コレステロール−ＣＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）または
コレステロール−ＣＲＷＥＫＩＳＶＹＤＦＦＶＷＬＹＫＬＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３）
【００３４】
したがって、前記抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドは、細胞透過性ペプチドもしくはコレステロール複合ペプチドのいずれかを使用して、前記ウイルスエンベロープに付着させられるか、またはそれに挿入される／それを介して挿入されるのが最も好ましい。
【００３５】
一般にウイルス粒子は、それを３７℃でおよそ１５分インキュベートすることによって、前記ＣＰＰペプチドまたはコレステロール複合ペプチドと複合体形成させた。
【００３６】
さらに別の好適な実施形態において、前記改変エンベロープウイルスは、ＭＨＣ−Ｉ特異的であるため、理想的にはＣＤ８＋Ｔ細胞と名づけられたエフェクターＴ細胞、具体的には細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）の活性化のための抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ−Ｉ提示により免疫応答を誘発する少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドとともに提供される。
【００３７】
さらにまたはあるいは、前記改変エンベロープウイルスは、ＭＨＣ−ＩＩ特異的であるため、理想的にはＣＤ４＋（ヘルパーＴ）細胞応答の活性化のための抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ−ＩＩ提示により免疫応答を誘発する少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドとともに提供される。
【００３８】
したがって、本発明はまた、単独で、またはＭＨＣ−Ｉエピトープと組み合わせて、個体の免疫応答を増大させるためのウイルスエンベロープにコーティングされた異なるＭＨＣ−ＩＩエピトープの使用を可能にする。
【００３９】
さらにまたはあるいは、本発明は、複数の異なる抗原を含む融合分子を含むペプチドの使用も可能にする。
【００４０】
さらにより好ましくは、異なる前記改変エンベロープウイルスの組み合わせであって、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される、異なる前記改変エンベロープウイルスの組み合わせが提供される。したがって、本発明は、前のウイルスのいずれかの少なくとも２つの使用に関し、さらに前のウイルスのいずれか３、４、５、６または７つの組み合わせの使用にまで拡大する。
【００４１】
したがって、本発明は、前記ペプチドでコーティングされた特定の種／属のプライム（プライミング）ウイルスによる処置に同じ前記ペプチドでコーティングされた別の特定の種／属のブースト（ブースティング）ウイルス（免疫学的に異なるウイルス）による処置が続く、プライム・ブースト免疫ウイルス療法を可能にする２つの異なるウイルス型またはウイルス骨格の使用に関する。プライム・ブースト免疫ウイルス療法は、プライム・ブースト法によって引き起こされた免疫応答の大部分を前記ペプチドに向けることによって、腫瘍特異的なＴ細胞免疫応答を劇的にさらに増加させることができる。
【００４２】
本発明を行うとき、本明細書に記載されるとおりに改変されたエンベロープウイルスは、本明細書に記載されるとおりに改変されているが、同じペプチドを提示する別のエンベロープウイルスまたは同じペプチドを提示するよう遺伝的もしくは非遺伝的に改変されたアデノウイルスなどの任意のその他のウイルスと組み合わせてプライム・ブースト免疫ウイルス療法に使用されてもよい。
【００４３】
当業者は、エンベロープウイルス、すなわち、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）は、最も研究されている腫瘍崩壊エンベロープウイルスであり、Ｔ−ＶＥＣ（Ｉｍｌｙｇｉｃ）と呼ばれるＨＳＶ−１の遺伝子操作型は、第ＩＩＩ相臨床試験において効果を示した最初の腫瘍崩壊性ウイルスであり、手術ができない黒色腫の治療用にＦＤＡおよびＥＭＥＡの両方によって認可された最初の腫瘍崩壊性ウイルスであるため、これらの治療的および臨床的に認められたウイルスの抗ウイルス免疫を犠牲にして抗腫瘍免疫をブーストする新規の方法を導入することが決定的に重要であることを認識するであろう。
【００４４】
したがって、本発明の第２の態様によると、
１）単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される改変エンベロープウイルスであって、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、改変エンベロープウイルスと、
２）適した担体と
を含む医薬組成物が提供される。
【００４５】
したがって、本発明の第３の態様によると、癌を治療するための方法であって、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される改変エンベロープウイルスに個体を曝露するステップを含み、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有する、方法が提供される。
【００４６】
より好ましくは、さらに、前記方法は、選択された期間の後、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択される別の改変エンベロープウイルスに前記個体を曝露するステップを伴い、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを有し、さらに前記ウイルスは、事前の曝露に使用されたものとは異なる。あるいは、プライム・ブースト免疫ウイルス療法において、前記方法は、選択された期間の後、これもまた遺伝的もしくは非遺伝的に同じペプチドを提示するよう改変されたアデノウイルスなどの任意の別のウイルスに前記個体を曝露するステップを伴う。あるいは、さらにもう一度、前記方法は、ブースター療法を提供するために、選択されたペプチドを発現するよう遺伝的もしくは非遺伝的を含むいずれかの方法で改変された任意のウイルスを最初に使用し、続いて、同じペプチドを有する本発明の改変ウイルスを使用することによって実施されてもよい。
【００４７】
このようにプライム・ブースト免疫ウイルス療法を実施することができる。
【００４８】
理想的には、ウイルスに個体を曝露する前記ステップは、腫瘍内、結節内、腹腔内または静脈内注射を含む。
【００４９】
最も好ましくは、本明細書において言及される癌としては、以下の癌のいずれか１つ以上が挙げられる：上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵癌、絨毛癌、ガストリン産生腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチン産生腫瘍、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵癌、グルカゴノーマ、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃癌。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つの抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドを発現する改変ウイルスに個体を曝露するステップの後、または単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ワクシニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、マラバウイルスおよびニューカッスル病（ＮＤＶ）ウイルスを含む群から選択されるエンベロープウイルスに前記個体を曝露するステップの後のいずれかで、前記ウイルスは、ウイルスエンベロープに非遺伝的に付着させられたか、またはそれに挿入された／それを介して挿入された同じまたは大部分が同じ前記ペプチドを有し、チェックポイントインヒビターに前記個体を曝露するステップを含む方法。チェックポイントインヒビターは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイント分子を阻害する。
【００５１】
本発明の添付の特許請求の範囲においておよび先行する明細書において、明確な言語または必然的含意のため文脈がそうでないことを必要とする場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的な意味で使用される。すなわち、本発明のさまざまな実施形態において明記した特徴の存在を規定するが、さらなる特徴の存在または追加を除外しない。
【００５２】
本明細書において引用されているあらゆる特許または特許出願を含む、すべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。どの参考文献も先行技術を構成すると認めるものではない。さらにどの先行技術も当該技術分野における通常の一般知識の一部を構成すると認めるものではない。
【００５３】
本発明のそれぞれの態様の好適な特徴は、任意の他の態様に関連して記載されるとおりであってもよい。
【００５４】
本発明の他の特徴は、以下の例から明白になるであろう。一般的に言えば、本発明は、（添付の特許請求の範囲および図を含む）本明細書において開示されている特徴のあらゆる新規のもの、またはあらゆる新規の組み合わせにも及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例とともに記載されている特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、矛盾しない限り、本明細書に記載されている任意の他の態様、実施形態または例に対して適用できると理解されるべきである。
【００５５】
さらに、別のことが明記されていない限り、本明細書中で開示されているあらゆる特徴は、同じまたは類似の目的にかなう代替的な特徴によって置き換えられてもよい。
【００５６】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体をとおして、文脈が別のことを必要としない限り、単数は、複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈が別のことを必要としない限り、本明細書は、複数ならびに単独を意図すると理解されるべきである。
【００５７】
次に、本発明の実施形態を、以下の図を参照して例としてのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】抗腫瘍、腫瘍特異的ペプチドがＣＰＰまたはコレステロール複合ペプチドのいずれかを使用して、異なるウイルスエンベロープに付着させられたときに、本発明者らが得たデータの概要を示す。
【図２】ＣＰＰ含有ペプチドを、単純ヘルペスウイルス１のエンベロープに付着させることができることを示すグラフである。ＣＰＰを含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドを、ＨＳＶ−１と複合体形成させ、サンドイッチＥＬＩＳＡを複合体の検出のために使用した。抗ＨＳＶ−１抗体を９６ウェルプレートの底部にコーティングし、ＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体をウェル中でインキュベーションした。結合していない部分を洗浄後、抗ＦＩＴＣ  ＨＲＰ複合抗体をＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体の検出のために使用した。図２下側パネルは、ＣＰＰ含有ペプチドを、ＨＳＶ−１と複合体形成させると、拡散時間が短縮されたことを示している。蛍光相関分光法を使用して、ＨＳＶ−１と複合体を形成したペプチドの拡散動態を分析した。
【図３−１】上側パネルは、コレステロール含有ペプチドを、ワクシニアウイルスのエンベロープに付着させることができることを示すグラフである。コレステロール含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドを、ワクシニアウイルスと複合体形成させた。３６％ショ糖クッションおよび超遠心分離によるＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体の精製後、精製した複合体をフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．複合ペプチドを伴わないワクシニアウイルスおよびＢ．コレステロール含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドと複合体を形成したワクシニアウイルス。下側パネルは、コレステロール含有ペプチドを、ワクシニアウイルスのエンベロープに付着させることができることを示すグラフである。コレステロール含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドを、ワクシニアウイルスと複合体形成させ、複合体の検出にサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。抗ワクシニアウイルス抗体を９６ウェルプレートの底部にコーティングし、ＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体をウェル中でインキュベーションした。結合していない部分を洗浄後、抗ＦＩＴＣ  ＨＲＰ複合抗体をＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体の検出のために使用した。
【図３−２】コレステロール含有ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドが、樹状細胞によって容易に提示されることを示すグラフである。マウス脾細胞にコレステロール含有ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを適用し、ＣＤ１１ｃ陽性ＤＣ集団によるＭＨＣＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬの提示をフローサイトメトリーによって測定した。
【図４−１】上側パネルは、ＣＰＰ含有ペプチドをワクシニアウイルスのエンベロープに付着させることができることを示すグラフである。ＣＰＰ含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドをワクシニアウイルスと複合体形成させた。３６％ショ糖クッションおよび超遠心分離によるＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体の精製後、精製した複合体をフローサイトメトリーによって分析した。Ａ．複合ペプチドを伴わないＨＳＶ−１およびＢ．ＣＰＰ含有ＦＩＴＣ標識ペプチドと複合体を形成したＨＳＶ−１。下側パネルは、ＣＰＰ含有ペプチドをエンベロープワクシニアウイルスに付着させることができることを示すグラフである。ＣＰＰ含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドをワクシニアウイルスと複合体形成させ、複合体の検出にサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。抗ワクシニアウイルス抗体を９６ウェルプレートの底部にコーティングし、ＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体をウェル中でインキュベーションした。結合していない部分を洗浄後、抗ＦＩＴＣ  ＨＲＰ複合抗体をＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体の検出のために使用した。
【図４−２】ＣＰＰ含有ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドが樹状細胞によって容易に提示されることを示すグラフである。マウス脾細胞にＣＰＰ含有ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを適用し、ＣＤ１１ｃ陽性ＤＣ集団によるＭＨＣＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬの提示をフローサイトメトリーによって測定した。
【図５】上側パネルは、ＰｅｐｔｉＥＮＶが非常に低いウイルス量でもＤＣ活性化を誘発することができることを示すグラフである。ワクシニアウイルスをＣＰＰまたはコレステロール含有ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと複合体形成させ、マウス脾細胞の感染に使用した。感染の２時間後、ＤＣ活性化マーカーの発現に関してフローサイトメトリーによって樹状細胞を分析した。下側パネルは、ＰｅｐｔｉＥＮＶが非常に低いウイルス量でもＣＤ１１ｃ陽性ＤＣによる特異的抗腫瘍ＭＨＣクラスＩエピトープの提示を誘発することができることを示すグラフである。ワクシニアウイルスをＣＰＰまたはコレステロール含有ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと複合体形成させ、マウス脾細胞の感染に使用した。２時間後に、ＣＤ１１ｃ陽性ＤＣ集団によるＭＨＣＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬの提示をフローサイトメトリーによって測定した。
【図６】ＰｅｐｔｉＥＮＶウイルス・ペプチド複合体形成がウイルス感染性に影響を与えないことを示すグラフである。ＰｅｐｔｉＥＮＶの感染性を通常の複合体を形成していないウイルスと比較し、細胞生存率を感染の３日後に測定した。
【図７】Ａ）コレステロール複合免疫調節ペプチドおよびＢ）Ｎ末端の細胞透過性ペプチド配列を有する免疫調節ペプチドを示す概略図である。要素の異なる機能配列に対する色分け：濃いグレー：コレステロール（Ａ）または細胞透過性配列（Ｂ）。赤：カテプシンＤ／Ｅ切断部位。青：フューリン切断部位。緑：免疫プロテアソームプロセシング部位。黒：ＭＨＣ−Ｉ拘束性エピトープ。
【図８−１】さまざまな異なるＣＰＰ配列を、抗腫瘍ペプチドをウイルスエンベロープに付着させるために使用することができることを示すグラフである。ＣＰＰ含有、ＦＩＴＣ標識ペプチドをワクシニアウイルスと複合体形成させ、複合体の検出にサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。抗ワクシニアウイルス抗体を９６ウェルプレートの底部にコーティングし、ＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体をウェル中でインキュベーションした。結合していない部分を洗浄後、抗ＦＩＴＣ  ＨＲＰ複合抗体をＰｅｐｔｉＥＮＶ複合体の検出のために使用した。
【図８−２】同上。
【図９】ＣＰＰ含有ペプチドが全く抗ウイルス効果を有さず、感染性または腫瘍崩壊性効果を失うことなくウイルスエンベロープに安全に付着させることができることを示すグラフである。４つの異なる細胞株、Ａ５４９、ＭＤＭＢＡ４３６、Ｂ１６Ｆ１０およびＢ１６−ＯＶＡをウイルス感染性に関して試験し、ＰｅｐｔｉＥＮＶを未改変ウイルスと比較した。
【図１０】ＣＰＰまたはコレステロール部分によってウイルスエンベロープに固定された抗腫瘍ペプチドが広範な抗腫瘍免疫を誘発して、腫瘍増殖の増強された抑制およびさらに長い生存期間につながることを示すグラフである。Ａ．Ｍｏｃｋ（注射媒体のみにより処置された）、ワクシニアウイルスのみ、コレステロール部分によりウイルスエンベロープに付着させられた抗腫瘍ペプチドを伴うＰｅｐｔｉＥＮＶ（ＰｅｐｔｉＥＮＶ  ＶＡＣＶ／ｃｈｏｌ）およびＣＰＰ部分によりウイルスエンベロープに付着させられた抗腫瘍ペプチドを伴うＰｅｐｔｉＥＮＶ（ＰｅｐｔｉＥＮＶ  ＶＡＣＶ／ｃｐｐ）の群間の腫瘍増殖の比較。Ｂ．ＰｅｐｔｉＥＮＶ  ＶＡＣＶ／ｃｐｐ、ワクシニアウイルスのみ、抗腫瘍ペプチド単独（ウイルスなし）またはＭｏｃｋで処置したマウス群のカプラン・マイヤー生存期間曲線。Ｃ．処置された腫瘍における腫瘍特異的なＴ細胞のフローサイトメトリー分析。ＰｅｐｔｉＥＮＶは、腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞の腫瘍微小環境への広範な浸透を引き起こすことができる。Ｄ．腫瘍微小環境におけるウイルス特異的なＴ細胞のフローサイトメトリー分析。ＰｅｐｔｉＥＮＶは、未改変ワクシニアウイルスと同等の抗ウイルス免疫を誘発するが、特に、未改変ワクシニアウイルスによっては示されない広範な抗腫瘍免疫を誘発する。
【図１１】ＰｅｐｔｉＥＮＶ  ＶＡＣＶ／ｃｈｏｌおよびＰｅｐｔｉＥＮＶ  ＶＡＣＶ／ｃｐｐ処置マウスが強力な抗腫瘍免疫応答を誘発し、腫瘍再曝露から保護されるが、Ｍｏｃｋ処置マウスは保護されないことを示すグラフである。５０００００のＢ１６−ＯＶＡ細胞を前の腫瘍移植と反対の脇腹に注射し、マウスを１４日間追跡した。ＰｅｐｔｉＥＮＶで処置されたマウスでは腫瘍増殖が観察されなかったが、Ｍｏｃｋ処置群では腫瘍発生率は１００％であった。
【図１２】ＣＰＰ部分によって単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）エンベロープに固定された抗腫瘍ペプチドが強力な抗腫瘍免疫を誘発して、腫瘍増殖の増強された抑制につながることを示すグラフである。Ａ．ＰｅｐｔｉＥＮＶ  ＨＳＶ−１／ｃｐｐ、ＨＳＶ−１のみおよびＭｏｃｋ処置群の腫瘍増殖曲線。Ｂ．処置された腫瘍における腫瘍特異的なＴ細胞のフローサイトメトリー分析。ＰｅｐｔｉＥＮＶは、腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞の腫瘍微小環境への広範な浸透を引き起こすことができる。
【図１３】ＣＰＰ含有抗腫瘍ペプチドのウイルスエンベロープに対する高い親和性を確認するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を示すグラフである。２サイト結合動態フィットモデルをＳＰＲデータの解析に使用した。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
特定の説明
材料および方法：
ペプチド：
この研究に使用したペプチドを以下に列挙する。すべて、ＰｅｐＳｃａｎから購入した。
ＣＰＰペプチド：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号８）
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ−ＦＩＴＣ（配列番号２４）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号２５）
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号２６）
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号２７）
ＦＩＴＣ−ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２８）
ＦＩＴＣ−ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）
ＦＩＴＣ−ＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３０）
ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＫ−ＦＩＴＣ（配列番号３１）
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１７）
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬＹＫＬＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１８）
【００６０】
コレステロール複合ペプチド：
ＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＲＶＲＲＡＬＩＳＣ−コレステロール（配列番号１９）
ＦＩＴＣ−ＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＲＶＲＲＡＬＩＳＣ−コレステロール（配列番号３２）
コレステロール−ＣＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号２０）
コレステロール−ＣＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ−ＦＩＴＣ（配列番号３３）
コレステロール−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２１）
コレステロール−ＣＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）
コレステロール−ＣＲＷＥＫＩＳＶＹＤＦＦＶＷＬＹＫＬＲＷＥＫＩＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３）
【００６１】
細胞株
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株Ｖｅｒｏ（Ｂ）ならびにマウス黒色腫細胞株Ｂ１６／ＯＶＡおよびＢ１６−Ｆ１０を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＭＢＡ４３６を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
【００６２】
ウイルスの産生
単純ヘルペスウイルス１をＶｅｒｏ細胞中で産生し、ショ糖密度勾配超遠心分離により精製し、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）中で溶出した。
【００６３】
ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  ｒｅｓｅｒｖｅ株（ＶＶＤＤ−ｍＤＡＩ−ＲＦＰ）をＡ５４９細胞中で産生し、３６％ショ糖クッション超遠心分離により精製し、１ｍＭトリス（ｐＨ９．０）中で溶出した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡ
２．５×１０７のワクシニアウイルス粒子を、８ｕｇのＣＰＰペプチド−ＦＩＴＣまたはコレステロール複合ペプチド−ＦＩＴＣのいずれかと１００ｕｌのＤＭＥＭ中、３７℃で１５分間、複合体形成させた。複合体形成後、結合していないペプチドを、１ｍＭトリス（ｐＨ９．０）における３６％ショ糖クッションにより超遠心分離（２０，０００ｇ、４０〜８０分）によって除去した。ＥＬＩＳＡのために、抗ワクシニアポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を、ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルイムノプレートに２ｕｇ／ｍｌの濃度で４℃において一晩コーティングした。ワクシニア・ペプチド複合体を、３７℃または室温で３０〜６０分間インキュベーションし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗ＦＩＴＣ抗体（Ａｂｃａｍ）で検出した（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中１：５０００希釈）。
【００６５】
２．５×１０７の単純ヘルペス１ウイルス粒子を、８ｕｇのＣＰＰペプチド−ＦＩＴＣまたはコレステロール複合ペプチド−ＦＩＴＣのいずれかと１００ｕｌのＤＭＥＭ中、３７℃で１５分間、複合体形成させた。ＥＬＩＳＡのために、抗ＨＳＶ−１ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を、ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルイムノプレートに２ｕｇ／ｍｌの濃度で４℃において一晩コーティングした。ＨＳＶ−１・ペプチド複合体を、３７℃または室温で３０〜６０分間インキュベーションし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗ＦＩＴＣ抗体（Ａｂｃａｍ）で検出した（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中１：５０００希釈）。
【００６６】
フローサイトメトリー
５×１０７のワクシニアウイルス粒子を、２４ｕｇのＣＰＰペプチド−ＦＩＴＣまたはコレステロール複合ペプチド−ＦＩＴＣのいずれかと２００ｕｌのＤＭＥＭ中、３７℃で１５分間、複合体形成させた。複合体形成後、結合していないペプチドを、１ｍＭトリス（ｐＨ９．０）における３６％ショ糖クッションによる超遠心分離（２０，０００ｇ、４０〜８０分）によって除去し、ＰＢＳ中の２％ホルマリンに溶出した。固定後、３６％ショ糖クッションによるさらなる超遠心分離（２０，０００ｇ、４０〜８０分）によりホルマリンを除去し、ペレットを１×超高純度ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で溶出した。フローサイトメトリーをＡｐｏｇｅｅ  Ａ５０  Ｍｉｃｒｏフローサイトメーター（Ａｐｏｇｅｅ）を用いて実施し、複合体を評価するためにＦＩＴＣ検出を使用した。
【００６７】
交差提示実験
８００μＬの１０％  ＲＰＭＩ−１６４０培養培地中の２×１０６の脾臓細胞を、２００μＬのＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号８）、ＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＲＶＲＲＡＬＩＳＣ−コレステロール（配列番号１９）またはコレステロール−ＣＲＶＲＲＡＬＩＳＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（配列番号２０）ペプチド希釈液（０．１９μｇ／μＬ）とともにインキュベーションした。
【００６８】
ワクシニア・ペプチド複合体を、ＥＬＩＳＡ用に記載されるとおり調製した。インキュベーションの２時間後、細胞を洗浄し、ＳＩＩＮＦＥＫＬと結合したＡＰＣ抗マウスＨ−２ＫｂまたはＡＰＣ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１，  κ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｔｒｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ、米国）のいずれかで染色し、サンプルをフローサイトメトリーによって分析した。
【００６９】
細胞生存率アッセイ
サンプルの発光を測定するためにＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびマルチウェルプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｃａｎ；ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して細胞生存率を測定した。
【００７０】
表面プラズモン共鳴
測定は、マルチパラメトリックＳＰＲ  Ｎａｖｉ（商標）２２０Ａ機器（Ｂｉｏｎａｖｉｓ  Ｌｔｄ、タンペレ、フィンランド）を使用して実施した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）をランニングバッファーとして使用した。実験全体をとおして２０μＬ／分の一定の流量を使用し、温度を＋２０℃に設定した。表面プラズモン励起のために６７０ｎｍの波長のレーザー光を使用した。
【００７１】
二酸化ケイ素表面を有するセンサースライドを、５分のプラズマ処理に続く、センサーをイソプロパノール中の５０ｍＭ  ＡＰＴＥＳにおいて４時間インキュベートすることによるＡＰＴＥＳ（（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン）でのコーティングによって活性化した。その後、センサーを洗浄し、ＳＰＲ装置に入れ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．１×１０７ｐｆｕのＶＡＣＶをおよそ１２分間注入することによって、ウイルスを２つの試験チャネルのセンサー表面にその場で固定し、続いてＰＢＳによる３分の洗浄を行った。その後、ＣＰＰ含有抗腫瘍ペプチドまたはＣＰＰ配列を含まないペプチド（非相互作用対照）を、同時にフロー細胞の両方のフローチャネルに注入し、１．２３ｕＭから１００ｕＭの範囲でペプチド濃度を高めた。
【００７２】
動物実験
すべての動物実験にＣ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウス系統を使用した。３５００００のＢ１６−ＯＶＡ細胞をマウスの右脇腹に注射し（再曝露実験では、細胞を左脇腹に注射した）、腫瘍サイズがおよそ５０ｍｍ３に達したら（注射後１０〜１２日）、マウスを未改変ウイルス、ＰｅｐｔｉＥＮＶプラットフォーム、ペプチドのみまたは注射媒体のみ（Ｍｏｃｋ）で処置した。マウスを０、２日目に処置した後、８〜１０日目にブースター処置を与えた。腫瘍サイズが許容される最大に達するまで、腫瘍を１日おきに測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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