(57)【要約】ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法、標的核酸配列を編集するまたは標的核酸配列の発現を調節するための組成物および構成要素、ならびに操作されたＴ細胞またはＴ細胞前駆体の養子免疫伝達を含んでなるがん免疫療法に関連したそれらの用途が、提供される。2019517788.tif 000194
2019517788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体を含んでなる操作された免疫細胞；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質
を含んでなる組成物であって、
前記作用物質が、前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および／またはＰＤ−１発現を防止しまたは減少させることができる、
組成物。
【請求項２】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸を含んでなる操作された免疫細胞；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質
を含んでなる組成物であって、
前記作用物質が、前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および／またはＰＤ−１発現を防止しまたは減少させることができる、
組成物。
【請求項３】
前記操作された免疫細胞がその表面に前記組換え受容体を発現する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させる、遺伝子破壊
を含んでなる操作された免疫細胞
を含有する細胞集団を含んでなる組成物であって、
前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％または少なくとも約９０％もしくはそれより多くが、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず、ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；ならびに／または
前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％もしくはそれより多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
組成物。
【請求項５】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体であって、前記組換え受容体の前記抗原への結合に際して、操作された免疫細胞が、細胞傷害性を誘導し、増殖し、および／またはサイトカインを分泌することができる、組換え受容体；ならびに
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記遺伝子破壊が、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、任意選択的に、前記防止または減少が、前記組成物中の前記細胞の、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％において、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％において、または７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％より多くにおいて、または約７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％より多くにおいてである、遺伝子破壊
を含んでなる操作された免疫細胞
を含有する細胞集団を含んでなる組成物。
【請求項６】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができる、遺伝子破壊
をそれぞれ含んでなる操作された免疫細胞の集団
を含有する細胞集団を含んでなる組成物であって、
前記操作された免疫細胞が、前記組換え受容体を含むが前記遺伝子破壊を含まない前記組成物中のその他の細胞における、前記組換え受容体の平均発現および／または表面発現レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで前記受容体の発現および／または表面発現を平均して示し、または
前記操作された免疫細胞が、前記ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、かつ、前記組換え受容体を含んでなり前記ＰＤ−１ポリペプチドを発現する前記組成物中の細胞における、平均発現および／または表面レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで前記受容体の発現および／または表面発現を平均して示す、
組成物。
【請求項７】
前記抗原、前記抗原を発現する細胞、および／または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的にインビトロアッセイにおいて測定されるように、任意選択的に１つまたは複数のサイトカインの存在下における、任意選択的に１２、２４、３６、４８、または６０時間のインキュベーションを含んでなる、インビトロアッセイにおいて測定されるように、前記組換え受容体が、前記抗原に特異的に結合すること、操作されたＴ細胞を活性化または刺激すること、細胞傷害性を誘導すること、または前記免疫細胞による増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる、請求項１〜４および６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原、前記抗原を発現する細胞、および／または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的に１種または複数種のサイトカインの存在下における、任意選択的に１２、２４、３６、４８、または６０時間のインキュベーションを含んでなる、任意選択的に前記免疫細胞のＰＤ−Ｌ１発現細胞への曝露を含むまたは含まない、インビトロアッセイにおいて測定されるように、前記操作された免疫細胞が、前記抗原に特異的に結合すること、細胞傷害性、増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる、請求項１〜４、６および７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記結合、細胞傷害性、増殖、生存、またはサイトカイン分泌のレベルまたは程度または規模または持続時間が、同一条件下で評価された、前記組換え受容体を含むが前記ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含まない免疫細胞で検出または観察されたものと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である、請求項７または請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記結合、細胞傷害性、増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌が、中断と、前記抗原、前記抗原発現細胞、および／または前記物質への再曝露とに続いて、任意選択的にインビトロアッセイで測定される、請求項６および８〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫細胞が、対象由来の初代細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫細胞がヒト細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫細胞が白血球細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫細胞が、未分画Ｔ細胞を含んでなる複数のＴ細胞を含んでなり、単離されたＣＤ８＋細胞を含んでなるかもしくはＣＤ８＋Ｔ細胞が富化されており、または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなるかもしくはＣＤ４＋細胞が富化されており、ならびに／または、未感作細胞、エフェクターメモリー細胞、セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞からなる群から選択されるそのサブセットが富化されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、前記組成物中のＴ細胞の百分率、または前記受容体を発現し前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中のＴ細胞の百分率が、組成が同一または実質的に同一であるが前記遺伝子破壊を含有せずまたは前記ＰＤ−１ポリペプチドを発現する細胞集団と、同一または実質的に同一である、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、前記組成物中のＴ細胞の百分率が、任意選択的に、前記免疫細胞のＰＤ−Ｌ１への接触または曝露の非存在下または存在下で比較される同一条件下で評価した際に、前記組換え受容体を含むがＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の前記遺伝子破壊を含まないＴ細胞を含んでなる組成物中の前記表現型を示すＴ細胞の百分率と比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記表現型が、少なくとも１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、６日間、１２日間、２４日間、３６日間、４８日間または６０日間にわたる、３７±２℃または約３７±２℃での前記組成物のインキュベーションに続いて評価される、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記インキュベーションがインビトロで行われる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記インキュベーションの少なくとも一部が、刺激剤の存在下で実施され、前記少なくとも一部は、任意選択的に最大１時間、６時間、２４時間、または４８時間のインキュベーションに及ぶ、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記刺激剤が、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋細胞の増殖を誘導できる作用物質である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記刺激剤が、ＣＤ３に特異的な抗体、ＣＤ２８に特異的な抗体、および／またはサイトカインであるか、またはそれを含んでなる、請求項２０または請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
組換え受容体を含んでなる前記Ｔ細胞が、ＣＣＲ７＋、４−１ＢＢ＋（ＣＤ１３７＋）、ＴＩＭ３＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ｔ−ｂｅｔｌｏｗ、ＩＬ−７Ｒａ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ−２Ｒβ＋、ＣＸＣＲ３＋またはＬＦＡ−１＋から選択される１つまたは複数の表現型マーカーを含んでなる、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項２６または請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項３４または請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記作用物質が、（ａ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｂ）前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうち少なくとも１つを含んでなる、請求項１〜３および７〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記作用物質が、Ｃａｓ９分子と、ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するｇＲＮＡとの少なくとも１つの複合体を含んでなる、請求項１〜３および７〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ガイドＲＮＡが、第１の相補的ドメイン、第１の相補的ドメインと相補的な第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含んでなる、請求項３８または請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインが、連結ドメインによって連結されている、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ガイドＲＮＡが、３’ポリＡテールと５’アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップとを含んでなる、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９である、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、
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からなる群から選択される配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列
2019517788.tif 000171
を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記Ｃａｓ９分子が、活性ＲｕｖＣドメインまたは活性ＨＮＨドメインを欠いている、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｄ１０Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項３９〜４６、４８、および４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
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のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項３９〜４６および４８〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
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のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記遺伝子破壊が、
前記ＰＤＣＤ１遺伝子中に挿入および欠失（インデル）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される二本鎖切断の生成
を含んでなる、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または
前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記組成物中の前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または
前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
請求項４または請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
任意選択的にフローサイトメトリーによる評価で、前記組成物中の前記細胞、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％が、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
ゲノム中の前記遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記組成物中の細胞が、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞が、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞について富化されないまたは選択されない、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記組成物中の各細胞の、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の各細胞の、平均して２以下、５以下、または１０以下のその他の遺伝子が、破壊される、または前記作用物質によって破壊される、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記組成物中の各細胞の、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の各細胞中の、その他の遺伝子が、前記細胞内で破壊されない、または前記作用物質によって破壊されない、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
薬学的に許容可能な緩衝液をさらに含んでなる、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
任意選択的に疾患または病状を有する対象への前記組成物の投与後のある時点で、
前記組換え受容体を発現しＰＤ−１を発現しない細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有し前記組換え受容体を発現する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能である、
請求項１〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ある時点が、投与の、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または約７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記血液またはサンプル中で検出可能な前記細胞が、１マイクロリットルの血液当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個の細胞の濃度で存在し、および／または前記血液中のＴ細胞の少なくとも１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％、またはそれ以上に相当する、請求項６３または６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物の対象への投与に続いて、
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続し；および／または
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなり前記組換え受容体を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続する、
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記速度または時間が、少なくとも１．５倍または２倍または３倍大きい、または少なくとも約１．５倍または２倍または３倍大きい、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸分子を、免疫細胞に導入するステップと；
（ｂ）（ｉ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうちの１つを含んでなる、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、前記免疫細胞に導入するステップと
を含んでなる、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法。
【請求項６９】
（ｉ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうちの１つを含んでなる、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現する免疫細胞に導入するステップ
を含んでなる、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法。
【請求項７０】
前記作用物質が、Ｃａｓ９分子と、ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するｇＲＮＡとの少なくとも１つの複合体を含んでなる、請求項に記載の６８または請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ガイドＲＮＡが、第１の相補的ドメイン、前記第１の相補的ドメインと相補的な第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含んでなる、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインが、連結ドメインによって連結されている、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ガイドＲＮＡが、３’ポリＡテールと５’アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップとを含んでなる、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
導入が、前記細胞を前記作用物質またはその一部にインビトロで接触させるステップを含んでなる、請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記作用物質の導入が、電気穿孔を含んでなる、請求項６８〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記導入が、前記細胞と前記作用物質との接触前、最中または後に、または前記電気穿孔の前、最中または後に、前記細胞をインビトロでインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項７４または請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
（ａ）の導入が形質導入を含んでなり、前記導入するステップが、前記形質導入の前、最中または後に、前記細胞をインビトロでインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記インキュベーションの少なくとも一部が、（ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカイン、および／または（ｉｉ）任意選択的に抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含んでなる１つまたは複数の刺激剤または活性化剤の存在下である、請求項７６または請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
（ａ）の導入が、
形質導入前に、前記細胞を、２０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、任意選択的に約１００Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ−２；１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−７；および／または０．５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５と共にインキュベートするステップと；
形質導入に続いて、前記細胞を、１０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、任意選択的に約５０Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ−２；０．５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−７；および／または０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約０．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５と共にインキュベートするステップと
を含んでなる、請求項７７または請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記インキュベーションが、独立して、最大２４、３６、４８時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日間にわたり、またはおよそ２４、３６、４８時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日間にわたり実施される、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記インキュベーションが、独立して、２４〜４８時間または３６〜４８時間にわたり実施される、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、または５００，０００個の細胞当たりおよそ１マイクログラムの比率で、前記作用物質と接触されられる、請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記インキュベーションが、３０℃±２℃〜３９℃±２℃の温度である；または
前記インキュベーションが、少なくとも３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃、または少なくとも約３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃の温度である、
請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記インキュベーションの少なくとも一部が３０℃±２℃であり、前記インキュベーションの少なくとも一部が３７℃±２℃である、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）の導入するステップと（ｂ）の導入するステップとの間に、前記細胞を休止させるステップをさらに含んでなる、請求項６８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９である、請求項７０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、
2019517788.tif 000174
からなる群から選択される配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項６８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列
2019517788.tif 000175
を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項６８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、請求項６８〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．アウレウスＣａｓ９分子である、請求項７０〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９である、請求項７０〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｃａｓ９分子が、活性ＲｕｖＣドメインまたは活性ＨＮＨドメインを欠いている、請求項７０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｄ１０Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項７０〜８９、９１、および９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000176
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項７０〜８９および９１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000177
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記遺伝子破壊が、
ＰＤＣＤ１遺伝子中に挿入と欠失（インデル）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される二本鎖切断の生成
を含んでなる、請求項６８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、請求項６８〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項６８〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項１００または請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項１００〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項６８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、請求項６８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項６８〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項１０８または請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組換え受容体をコードする前記核酸が、ウイルスベクターである、請求項６８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項１１２または請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記組換えベクターをコードする核酸の導入が、任意選択的にレトロウイルス形質導入である形質導入による、請求項６８〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記免疫細胞が、対象由来の初代細胞である、請求項６８〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記免疫細胞がヒト細胞である、請求項６８〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記免疫細胞が白血球細胞である、請求項６８〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記免疫細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項６８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記免疫細胞が、
未分画Ｔ細胞、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞である、Ｔ細胞
である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
複数の免疫細胞で実施される、請求項６８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記作用物質を導入するステップおよび前記組換え受容体を導入するステップに引き続いて、細胞が、（ａ）前記遺伝子破壊を含有する、または内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞、（ｂ）前記組換え受容体を発現する細胞、または（ａ）および（ｂ）の双方について、富化も選択もされない、請求項６８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
（ａ）前記遺伝子破壊を含有する、または内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞、（ｂ）前記組換え受容体を発現する細胞、または（ａ）および（ｂ）の双方を富化または選択するステップをさらに含んでなる、請求項６８〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記細胞を３７℃±２℃または約３７℃±２℃でインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項６８〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記インキュベーションが、１時間〜９６時間、４時間〜７２時間、８時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、６時間〜２４時間、３６時間〜９６時間、または約１時間〜約９６時間、約４時間〜約７２時間、約８時間〜約４８時間、約１２時間〜約３６時間、約６時間〜約２４時間、約３６時間〜９６時間にわたり実施される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記インキュベーションまたは前記インキュベーションの一部が、刺激剤の存在下で実施される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記刺激剤が、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋細胞の増殖を誘導できる作用物質である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記刺激剤が、ＣＤ３に特異的な抗体、ＣＤ２８に特異的な抗体、および／またはサイトカインであるか、またはそれを含んでなる、請求項１２６または請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記方法によって生成された細胞を薬学的に許容可能な緩衝液中で製剤化するステップをさらに含んでなる、請求項６８〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方である、または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
細胞集団を生成する、請求項６８〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方であり、および／または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
細胞集団を生成する、請求項６８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
ゲノム中の前記遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される、請求項６８〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
請求項６８〜１３２のいずれか一項に記載の方法によって生成される、遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項１３４】
請求項６８〜１３２のいずれか一項に記載の方法によって生成される、複数の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項１３５】
前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方である、または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
請求項１３４に記載の複数の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項１３６】
前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方であり、および／または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
請求項１３４または請求項１３５に記載の複数の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項１３７】
請求項１３３の遺伝子操作された免疫細胞または請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の複数の遺伝子操作された免疫細胞と、任意選択的に薬学的に許容可能な緩衝液とを含んでなる、組成物。
【請求項１３８】
請求項１〜６７および１３７のいずれか一項に記載の組成物を、疾患または病状を有する対象に投与するステップを含んでなる、治療方法。
【請求項１３９】
前記組換え受容体が、前記疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記疾患または病状が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、請求項１３８または請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記がんまたは腫瘍が、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫がん、骨がん、および脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および／または中皮腫である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３、もしくは４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２からなる群から選択される、請求項１３９〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記抗原がＣＤ１９またはＢＣＭＡである、請求項１３９〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記対象に投与された前記操作された細胞が、投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上、ＰＤ−１の発現を減少させるおよび／または消失する、請求項１３８〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記対象に投与された前記操作された細胞が、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上にわたり、前記対象において持続する、請求項１３８〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記組成物の投与後のある時点で、
前記組換え受容体を発現しＰＤ−１を発現しない細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有し前記組換え受容体を発現する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能である、
請求項１３８〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ある時点が、投与の、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または約７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後である、請求項１３８〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記血液またはサンプル中で検出可能な前記細胞が、１マイクロリットルの血液当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個の細胞の濃度で存在し、および／または前記血液中のＴ細胞の少なくとも１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％、またはそれ以上に相当する、請求項１３８〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
投与に続いて、
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続し；および／または
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなり前記組換え受容体を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続する、
請求項１３８〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記速度または時間が、少なくとも１．５倍または２倍または３倍大きい、または少なくとも約１．５倍または２倍または３倍大きい、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１４０〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記腫瘍が、Ｂ細胞由来腫瘍でなく、白血病でなく、および／またはリンパ腫でない、請求項１４０〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記腫瘍またはその細胞が、ＰＤ−１のリガンドを発現するまたはそれを発現することが観察されている、請求項１４０〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させる、遺伝子破壊
を含んでなる操作された免疫細胞
を含んでなる薬学的組成物であって、
前記操作された細胞が、対象への投与前にＰＤ−１の発現の減少および／または消失の表現型を有し、
前記細胞が、前記対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上にわたり前記表現型を保持する、
薬学的組成物。
【請求項１５５】
対象における疾患または病状の治療で使用するための請求項１〜６７、１３７、および１５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記組換え受容体が、前記疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項１５５に記載の使用のための組成物。
【請求項１５７】
前記疾患または病状が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、請求項１５５または請求項１５６に記載の使用のための組成物。
【請求項１５８】
前記疾患または病状が、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫がん、骨がん、および脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および／または中皮腫である、がんまたは腫瘍である、請求項１５５〜１５７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５９】
前記抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３、もしくは４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２からなる群から選択される、請求項１５５〜１５８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６０】
前記抗原がＣＤ１９またはＢＣＭＡである、請求項１５５〜１５９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６１】
対象への前記組成物の投与に続いて、
前記遺伝子破壊を含有し、任意選択的に前記組換え受容体を含有する、１つまたは複数の細胞が、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点、または少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点で、前記対象の組織または生物学的サンプルにおいて、持続し、および／または検出可能であり；および／または
前記対象に由来する生物学的サンプルまたは組織において検出可能な、Ｔ細胞の、または前記組換え受容体を発現するＴ細胞の、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、または９０％が、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点、または少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点で、前記遺伝子破壊を含有する、
請求項１５５〜１６０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６２】
Ｔ細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなり、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる、Ｔ細胞を改変する方法。
【請求項１６３】
Ｔ細胞を２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなり、各複合体が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡ分子を含んでなる、Ｔ細胞を改変する方法。
【請求項１６４】
前記Ｔ細胞が、がんに罹患している対象に由来する、請求項１６２または請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記がんが、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記Ｔ細胞が、がんを有する対象、またはさもなければ前記ＰＤＣＤ１遺伝子のＴ細胞標的位置における変異から利益を得ることができる対象に由来する、請求項１６２〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記接触させるステップが、エクスビボで実施される、請求項１６２〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記Ｔ細胞が組換え受容体を含んでなる、請求項１６２〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記核酸を前記細胞に導入させる条件下で、前記Ｔ細胞を、組換え受容体をコードする核酸と接触させるステップをさらに含んでなる、請求項１６２〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、請求項１６８または請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１６８〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項１７２または請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、請求項１７２〜１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項１７２〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１６８〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、請求項１７１〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項１６８〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項１８０または請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記改変Ｔ細胞が、前記接触させるステップの後に前記対象の身体に戻される、請求項１６４〜１８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
前記Ｔ細胞ががんに罹患している対象に由来し、前記接触させるステップがエクスビボで実施され、前記接触させるステップの後に前記改変Ｔ細胞が前記対象の身体に戻される、請求項１６２〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記接触させるステップの前に、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が形成される、請求項１６２〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記接触させるステップの前に、前記２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が形成される、請求項１６３〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項１６２〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９５】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９６】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９７】
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾される、または３’ポリＡテールを含んでなる、請求項１６２〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾され、かつ３’ポリＡテールを含んでなる、請求項１６２〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、請求項１９７または請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、請求項１９７または請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０１】
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０３】
前記３’ポリＡテールが、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項１９７〜２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記３’ポリＡテールが、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項１９７〜２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項２０３または請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０８】
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、電気穿孔を通じて前記Ｔ細胞に送達される、請求項１６２〜２０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記少なくとも２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、電気穿孔を通じて前記Ｔ細胞に送達される、請求項１６３〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ｇＲＮＡ分子が、前記ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、請求項１６２〜２０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
前記切断効率が、標識抗ＰＤＣＤ１抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記Ｃａｓ９分子が、単一のｇＲＮＡ分子によって誘導され、前記標的ドメインを単一の二本鎖切断で切断する、請求項１６２〜２１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１３】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000178
から選択される、請求項１６２〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、請求項１６２〜２１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＤ１０Ａ変異を有する、請求項１６２〜２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000179
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項１６２〜２１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を有する、請求項１６２〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000180
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項１６２〜２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２２】
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項１６２〜２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項２２２または請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
少なくとも６０％の切断効率によって特徴付けられる、請求項２１０〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
少なくとも８０％の切断効率によって特徴付けられる、請求項２１０〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２７】
少なくとも９０％の切断効率によって特徴付けられる、請求項２１０〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２８】
前記ｇＲＮＡ分子が５未満のオフターゲットによって特徴付けられる、請求項２１０〜２２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記ｇＲＮＡ分子が２未満のエクソンオフターゲットによって特徴付けられる、請求項２１０〜２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３０】
前記オフターゲットが、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される、請求項２２８または請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記オフターゲットが、Ａｍｐ−ｓｅｑによって同定される、請求項２２８または請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３２】
ｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記ｇＲＮＡ分子が、その５’末端で修飾され、および／または３’ポリＡテールを含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３３】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３４】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３５】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３６】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３７】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３８】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２３９】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４０】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４１】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２３２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４２】
前記ｇＲＮＡ分子がその５’末端で修飾されている、請求項２３２〜２４１のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４３】
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、請求項２４２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４４】
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、請求項２４２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４５】
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項２４４に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４６】
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項２４４に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４７】
前記３’ポリＡテールが約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項２３２〜２４６のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４８】
前記３’ポリＡテールが約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項２３２〜２４６のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２４９】
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項２４７または請求項２４８に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５０】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項２４９に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５１】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項２４９に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５２】
前記Ｃａｓ９分子が二本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項２３２〜２５１のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５３】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項２５２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５４】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000181
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２３２〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５５】
前記Ｃａｓ９分子が一本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項２３２〜２５１のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５６】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項２５５に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５７】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＤ１０Ａ変異を有する、請求項２３２〜請求項２５６のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５８】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000182
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２３２〜請求項２５７のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２５９】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＮ８６３Ａ変異を有する、請求項２３２〜２５６のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２６０】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000183
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２５９に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２６１】
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項２３２〜２６０のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２６２】
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項２３２〜２６１のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２６３】
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、請求項２６２に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２６４】
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項２６２または請求項２６３に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
【請求項２６５】
少なくとも２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を含んでなる組成物であって、各複合体が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡ分子を含んでなる、組成物。
【請求項２６６】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２６７】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２６８】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２６９】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２７０】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２７１】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２７２】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２７３】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２７４】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２６５に記載の組成物。
【請求項２７５】
前記ｇＲＮＡ分子がその５’末端で修飾される、請求項２６５〜７４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７６】
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２７７】
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２８０】
前記３’ポリＡテールが、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項２６５〜２７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記３’ポリＡテールが、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項２６５〜２７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８２】
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項２８０または請求項２８１に記載の組成物。
【請求項２８３】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項２８２に記載の組成物。
【請求項２８４】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項２８２に記載の組成物。
【請求項２８５】
前記Ｃａｓ９分子が二本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項２６５〜２８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８６】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項２８５に記載の組成物。
【請求項２８７】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000184
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２６５〜２８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８８】
前記Ｃａｓ９分子が一本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項２６５〜２８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８９】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項２８８に記載の組成物。
【請求項２９０】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＤ１０Ａ変異を有する、請求項２６５〜２８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９１】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000185
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２６５〜２９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９２】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を有する、請求項２６５〜２９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９３】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000186
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２９２に記載の組成物。
【請求項２９４】
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項２６５〜２９３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９５】
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項２６５〜２９４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９６】
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、請求項２９５に記載の組成物。
【請求項２９７】
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項２９５または請求項２９６に記載の組成物。
【請求項２９８】
ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、その５’末端で修飾され、および／または３’ポリＡテールを含んでなる、ｇＲＮＡ分子。
【請求項２９９】
配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３００】
配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０１】
配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０２】
配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０３】
配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０４】
配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０５】
配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０６】
配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０７】
配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項２９８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０８】
その５’末端で修飾されている、請求項２９８〜９４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０９】
５’三リン酸基を欠いている、請求項３０８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１０】
５’キャップを含む、請求項３０８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１１】
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項３１０に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１２】
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項３１０に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１３】
約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される３’ポリＡテールを含んでなる、請求項２９８〜３１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１４】
約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される３’ポリＡテールを含んでなる、請求項２９８〜３１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１５】
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項３１３または３１４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１６】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項３１５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１６】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項３１５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１７】
Ｓ．ピオゲネスｇＲＮＡ分子である、請求項２９８〜３１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１８】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000187
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項２９８〜３１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１９】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000188
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項３１８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２０】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000189
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項３１８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２１】
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000190
のターゲティングドメインの群から選択される、請求項３１８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２２】
モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項２９８〜３２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２３】
キメラｇＲＮＡ分子である、請求項２９８〜３２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２４】
５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、請求項３２３に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２５】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項３２３または請求項３２４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２６】
細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなり、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる、移植のための細胞を作製する方法。
【請求項３２７】
前記ｇＲＮＡ分子が、前記ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、請求項３２６に記載の方法。
【請求項３２８】
前記切断効率が、標識抗ＰＤＣＤ１抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される、請求項３２７に記載の方法。
【請求項３２９】
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾される、または３’ポリＡテールを含んでなる、請求項３２６〜３２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３０】
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾され、かつ３’ポリＡテールを含んでなる、請求項３２６〜３２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３１】
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、請求項３２９または請求項３３０に記載の方法。
【請求項３３２】
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、請求項３２９または請求項３３０に記載の方法。
【請求項３３３】
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３４】
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３５】
前記３’ポリＡテールが、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項３２９〜３３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３６】
前記３’ポリＡテールが、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項３２９〜３３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３７】
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項３３５または請求項３３６に記載の方法。
【請求項３３８】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項３３７に記載の方法。
【請求項３３９】
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項３３７に記載の方法。
【請求項３４０】
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、電気穿孔を通じて前記細胞に送達される、請求項３２６〜３３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４１】
前記Ｃａｓ９分子が、単一のｇＲＮＡ分子によって誘導され、前記標的ドメインを単一の二本鎖切断で切断する、請求項３２６〜３４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４２】
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４３】
前記単一のｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000191
のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項３２６〜３４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４４】
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、請求項３２６〜３４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４５】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｄ１０Ａ変異を有するＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、請求項３２６〜３４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４６】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000192
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項３２６〜３４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４７】
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を有する、請求項３２６〜３４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４８】
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000193
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項３４７に記載の方法。
【請求項３４９】
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項３２６〜３４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５０】
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、請求項３２６〜３４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５１】
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５２】
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項３５０または請求項３５１に記載の方法。
【請求項３５３】
前記ｇＲＮＡ分子が、少なくとも６０％の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、請求項３２６〜３５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５４】
前記ｇＲＮＡ分子が、少なくとも８０％の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、請求項３２６〜３５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５５】
前記ｇＲＮＡ分子が、少なくとも９０％の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、請求項３２６〜３５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５６】
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、５未満のオフターゲットを生じる、請求項３２６〜３５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５７】
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、２未満のエクソンオフターゲットを生じる、請求項３２６〜３５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５８】
前記オフターゲットが、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される、請求項３５６または請求項３５７に記載の方法。
【請求項３５９】
前記オフターゲットが、Ａｍｐ−ｓｅｑによって同定される、請求項３５６または請求項３５７に記載の方法。
【請求項３６０】
前記接触させるステップがエクスビボで実施される、請求項３２６〜３５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６１】
前記細胞が免疫細胞である、請求項３２６〜３６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６２】
前記細胞がリンパ球または抗原提示細胞である、請求項３６１に記載の方法。
【請求項３６３】
前記細胞がＴ細胞、Ｂ細胞または抗原提示細胞である、請求項３６２に記載の方法。
【請求項３６４】
前記細胞がＴ細胞である、請求項３２６〜３６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６５】
前記細胞が組換え受容体を含んでなる、請求項３２６〜３６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６６】
前記核酸を前記細胞に導入させる条件下で、前記細胞を、組換え受容体をコードする核酸と接触させるステップをさらに含んでなる、請求項３２６〜３６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６７】
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、請求項３６５または請求項３６６に記載の方法。
【請求項３６８】
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３６５〜３６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６９】
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、請求項３６８に記載の方法。
【請求項３７０】
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７１】
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項３６９または請求項３７０に記載の方法。
【請求項３７２】
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、請求項３６９〜３７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７３】
前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項３６９〜３７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７４】
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項３７３に記載の方法。
【請求項３７５】
前記組換え受容体が腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項３６５〜３７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７６】
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、請求項３６９〜３７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７７】
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項３６５〜３７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項３７７に記載の方法。
【請求項３７９】
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項３７７または３７８に記載の方法。
【請求項３８０】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項３７９に記載の方法。
【請求項３８１】
請求項１６２〜２３１および３２６〜３８０のいずれか一項に記載の方法によって作製されたＴ細胞。
【請求項３８２】
請求項２３２〜２６４のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなるＴ細胞。
【請求項３８３】
請求項２６５〜２９７のいずれか一項に記載の組成物を含んでなるＴ細胞。
【請求項３８４】
請求項３８１〜３８３のいずれか一項に記載のＴ細胞を前記対象に投与するステップを含んでなる、対象を治療する方法。
【請求項３８５】
治療で使用するための、請求項２３２〜２６４のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、請求項２６５〜２９７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３８１〜３８３のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項３８６】
がんの治療のための医薬の製造における、請求項２３２〜２６４のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体または請求項２６５〜２９７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれその内容全体が参照により援用される、２０１６年５月６日に出願された「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」と題された米国仮特許出願第６２／３３３，１４４号明細書および２０１６年５月６日に出願された「ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」と題された米国仮特許出願第６２／３３２，６５７号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
配列表の参照による援用
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、２０１７年５月４日に作成された７３５０４２００６４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴと題された、サイズが１２，０３１，９２６バイトのファイルとして提供される。配列表の電子形態情報は、その内容全体が参照により援用される。
【０００３】
分野
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法、標的核酸配列を編集するまたは標的核酸配列の発現を調節するための組成物および構成要素、ならびに遺伝子操作Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の養子免疫伝達を含んでなるがん免疫療法に関連したそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
養子療法のために操作された細胞を生成し投与するための様々なストラテジーが利用可能である。例えば、ＣＡＲなどの遺伝子操作された抗原受容体を発現する免疫細胞を操作するためのストラテジー、および細胞における遺伝子発現を抑制または抑圧するためのストラテジーが利用可能である。例えば、エフェクター機能の抑制を回避し、対象への投与時に細胞の活動および／または生存を改善することによって、細胞の有効性を改善するための改善されたストラテジーが必要である。このような要求を満たす方法、細胞、組成物、キット、およびシステムが提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
例えば、対象における疾患および／または病状を処置するための養子細胞療法において使用するための、組換え受容体と、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊またはＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質とを含有する、操作された免疫細胞を含む組成物が提供される。このような組成物または細胞、細胞、細胞集団、組成物を生成または作製するための方法と、このような組成物または細胞を使用する方法もまた提供される。組成物および細胞は、概して、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊、またはＰＤＣＤ１遺伝子発現の防止または減少、またはＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を含む。例えば、対象における疾患および／または病状を処置するための養子細胞療法において使用するための、本方法によって生成されるものなどの、提供された組成物、遺伝子操作された（組換え）細胞表面受容体を発現してＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含有する細胞集団または細胞を対象に投与する方法もまた提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体を含んでなる操作された免疫細胞；および（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質、を含有する組成物が提供され、前記作用物質は、組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、および／または組成物中の組換え受容体を発現する細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および／またはＰＤ−１発現を防止しまたは減少させることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸を含有する操作された免疫細胞；および（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質、を含有する組成物が提供され、前記作用物質は、組成物中の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、および／または組成物中の組換え受容体を発現する細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および／またはＰＤ−１発現を防止しまたは減少させることができる。
【０００８】
本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、組成物は、その表面に組換え受容体を発現する操作された免疫細胞を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊、を含有する操作された免疫細胞を含有する細胞集団を含有する組成物が提供され、前記遺伝子破壊は、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させ、組成物中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％もしくはそれより多くは、遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず、ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％もしくはそれより多くは、遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。
【００１０】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体、（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊、を含有する操作された免疫細胞を含有する細胞集団を含有する組成物が提供され、操作された免疫細胞は、組換え受容体の前記抗原への結合に際して、細胞傷害性を誘導し、増殖し、および／またはサイトカインを分泌することができ、前記遺伝子破壊は、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、任意選択的に、前記防止または減少は、組成物中の細胞のおよび／または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％であるか、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％であるか、または７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％より多い、または約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％より多い。
【００１１】
いくつかの実施形態では、それぞれ（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊、を含有する操作された免疫細胞の集団を含有する細胞集団を含有する組成物が提供され、前記遺伝子破壊は、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、前記操作された免疫細胞は、組換え受容体を含有し遺伝子破壊を含有しない組成物中のその他の細胞における、前記組換え受容体の平均発現および／または表面発現レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで受容体の発現および／または表面発現を平均して示し、または前記操作された免疫細胞は、ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、かつ、組換え受容体を含有しＰＤ−１ポリペプチドを発現する組成物中の細胞における、平均発現および／または表面レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで受容体の発現および／または表面発現を平均して示す。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組換え受容体は、抗原、抗原を発現する細胞、および／または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的にインビトロアッセイにおいて測定され、任意選択的に１つまたは複数のサイトカインの存在下における、任意選択的に１２、２４、３６、４８、または６０時間のインキュベーションを含有する、インビトロアッセイにおいて測定されるように、抗原に特異的に結合すること、操作されたＴ細胞を活性化または刺激すること、細胞傷害性を誘導すること、または免疫細胞による増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、抗原、抗原を発現する細胞、および／または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的に１種または複数種のサイトカインの存在下における、任意選択的に１２、２４、３６、４８、または６０時間のインキュベーションを含有し、任意選択的に免疫細胞のＰＤ−Ｌ１発現細胞への曝露を含むまたは含有しない、インビトロアッセイにおいて測定されるように、抗原に特異的に結合すること、細胞傷害性、増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、結合、細胞傷害性、増殖、生存、またはサイトカイン分泌のレベルまたは程度または規模または持続時間は、同一条件下で評価された、組換え受容体を含有するがＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含有しない免疫細胞で検出または観察されたものと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、結合、細胞傷害性、増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌は、中断と、抗原、抗原発現細胞、および／または物質への再曝露とに続いて、任意選択的にインビトロアッセイで測定される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は対象由来の初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞またはＴ細胞などの白血球細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、未分画Ｔ細胞を含有する複数のＴ細胞を含有し、単離されたＣＤ８＋細胞を含有するかもしくはＣＤ８＋Ｔ細胞が富化されており、または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するかもしくはＣＤ４＋細胞が富化されており、ならびに／または、未感作細胞、エフェクターメモリー細胞、セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞からなる群から選択されるそのサブセットが富化されている。いくつかの実施形態では、非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、組成物中のＴ細胞の百分率、または受容体を発現し遺伝子破壊を含有するＴ細胞の百分率は、組成が同一または実質的に同一であるが遺伝子破壊を含有せずまたはＰＤ−１ポリペプチドを発現する細胞集団と、同一または実質的に同一である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す組成物中のＴ細胞の百分率は、任意選択的にＰＤ−Ｌ１に対する免疫細胞への接触または曝露の非存在下または存在下で比較される、同一条件下で評価された場合に、Ｔ細胞を含有し、組換え受容体を含有するが、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含有しない組成物中の表現型を示すＴ細胞の百分率と比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、表現型は、少なくとも１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、６日間、１２日間、２４日間、３６日間、４８日間または６０日間にわたる、３７±２℃または約３７±２℃での組成物のインキュベーションに続いて評価される。いくつかの実施形態では、インキュベーションはインビトロである。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、刺激剤の存在下で実施され、少なくとも一部は、任意選択的に最大１時間、６時間、２４時間、または４８時間のインキュベーションに及ぶ。いくつかの実施形態では、刺激剤は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導できる作用物質である。いくつかの実施形態では、刺激剤は、ＣＤ３に特異的な抗体、ＣＤ２８に特異的な抗体および／またはサイトカインでありまたはそれを含有する。いくつかの実施形態では、組換え受容体を含有するＴ細胞は、ＣＣＲ７＋、４−１ＢＢ＋（ＣＤ１３７＋）、ＴＩＭ３＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ｔ−ｂｅｔｌｏｗ、ＩＬ−７Ｒａ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ−２Ｒβ＋、ＣＸＣＲ３＋またはＬＦＡ−１＋から選択される、１つまたは複数の表現型マーカーを含有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、組換え受容体は、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、抗体または抗体フラグメントである抗原結合ドメインを含有するＣＡＲなどのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、組換え受容体に含有される抗体フラグメントは、一本鎖フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含有する。いくつかの実施形態では、フラグメントはｓｃＦｖを含有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗原は、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんなどの疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、組換え受容体が結合する抗原は、ＲＯＲｌ、Ｈｅｒ２、Ｌｌ−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）またはインターロイキン１２から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、組換え受容体は、ＩＴＡＭを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含有する共刺激シグナル伝達領域などの共刺激シグナル伝達領域をさらに含有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質は、（ａ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有するターゲティングドメイン、または（ｂ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうち少なくとも１つを含有する。いくつかの実施形態では、作用物質は、Ｃａｓ９分子と、ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するｇＲＮＡとの少なくとも１つの複合体を含有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の相補的ドメイン、第１の相補的ドメインと相補的な第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含有する。いくつかの実施形態では、第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインは、連結ドメインによって連結されている。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、３’ポリＡテールおよび５’アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップを含有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、酵素的に活性なＣａｓ９である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、
2019517788.tif 000003
からなる群から選択される配列を含有する、ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列
2019517788.tif 000004
を含有するターゲティングドメインを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である。いくつかの組成では、Ｃａｓ９分子は、活性ＲｕｖＣドメインまたは活性ＨＮＨドメインを欠く。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０Ａ変異を含有するＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｎ８６３Ａ変異を含有するＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。
【００２２】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、ＰＤＣＤ１遺伝子中に挿入と欠失（インデル）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、二本鎖切断の生成を含有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は、遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は、遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くは、遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くは、遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ゲノム中の遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞および／または組換え受容体を発現する組成物中の細胞は、遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞について富化されないまたは選択されない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組成物中の各細胞において、または組換え受容体を発現する組成物中の各細胞において、平均して２以下、５以下または１０以下のその他の遺伝子が破壊される、または作用物質によって破壊される、例えば、組成物中の各細胞において、または組換え受容体を発現する組成物中の各細胞において、その他の遺伝子は１つも破壊されない、または作用物質によって破壊されない。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物のいずれかは、薬学的に許容可能な緩衝液をさらに含有する。
【００２８】
本明細書では、（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸分子を免疫細胞に導入すること；および（ｂ）（ｉ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうち１つを含む、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を免疫細胞に導入することを含む、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法もまた提供される。
【００２９】
本明細書では、（ｉ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうち１つを含む、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現する免疫細胞に導入することを含む、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法もまた提供される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、作用物質は、Ｃａｓ９分子と、ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するｇＲＮＡとの少なくとも１つの複合体を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の相補的ドメイン、第１の相補的ドメインと相補的な第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインは、連結ドメインによって連結されている。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、３’ポリＡテールおよび５’アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、導入は、インビトロで細胞を作用物質またはその一部と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、作用物質の導入は、電気穿孔を含む。いくつかの実施形態では、導入は、細胞と作用物質との接触前、最中または後に、あるいは電気穿孔の前、最中または後に、細胞をインビトロでインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ａ）における導入は、形質導入を含み、導入は、形質導入の前、最中または後にインビトロで細胞をインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、（ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカイン、および／または（ｉｉ）任意選択的に抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含む、１つまたは複数の刺激剤または活性化剤の存在下である。いくつかの実施形態では、（ａ）における導入は、形質導入前に、細胞を２０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、任意選択的に約１００Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ−２；１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−７；および／または０．５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５と共にインキュベートすること；および形質導入に続いて、細胞を１０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、任意選択的に約５０Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ−２；０．５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−７；および／または０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約０．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５と共にインキュベートすることを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、インキュベーションは、独立して、２４〜４８時間または３６〜４８時間などの、およそ２４、３６、４８時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日間にわたり実施される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、細胞は、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、または５００，０００個の細胞当たりおよそ１マイクログラムの比率で、作用物質と接触される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、インキュベーションは、３０℃±２℃〜３９℃±２℃の温度であり；またはインキュベーションは、少なくとも３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃、または少なくとも約３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃の温度である。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、３０℃±２℃であり、インキュベーションの少なくとも一部は、３７℃±２℃である。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）の導入と（ｂ）の導入との間に細胞を休止させるステップをさらに含む。
【００３６】
本明細書で提供される任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Ｃａｓ９分子は、酵素的に活性なＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、
2019517788.tif 000005
からなる群から選択される配列を含む、ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態５９〜７８では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列
2019517788.tif 000006
を含むターゲティングドメインを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．アウレウスＣａｓ９分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、活性ＲｕｖＣドメインまたは活性ＨＮＨドメインを欠く。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０Ａ変異を含むＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｎ８６３Ａ変異を含むＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、ＰＤＣＤ１遺伝子中に挿入と欠失（インデル）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、二本鎖切断の生成を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、組換え受容体は、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである。いくつかの実施形態では、組換え受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗体または抗体フラグメントである抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは一本鎖フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、フラグメントはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんなどの疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、組換え受容体が結合するものは、ＲＯＲｌ、Ｈｅｒ２、Ｌｌ−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）またはインターロイキン１２から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、組換え受容体は、ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインをはじめとする共刺激シグナル伝達領域などの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えベクターをコードする核酸の導入は形質導入により、それは任意選択的にレトロウイルス形質導入である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は対象由来の初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞またはＴ細胞などの白血球細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、それは未分画Ｔ細胞、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかが、複数の免疫細胞に対して実施される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、作用物質の導入および組換え受容体の導入後に、細胞は、（ａ）遺伝子破壊を含むまたは内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞、（ｂ）組換え受容体を発現する細胞、または（ａ）および（ｂ）の双方について、富化も選択もされない。いくつかの実施形態では、方法のいずれかは、（ａ）遺伝子破壊を含むまたは内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞、（ｂ）組換え受容体を発現する細胞、または（ａ）および（ｂ）の双方について、富化または選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法のいずれかは、細胞を３７℃±２℃または約３７℃±２℃でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、１時間〜９６時間、４時間〜７２時間、８時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、６時間〜２４時間、３６時間〜９６時間、または約１時間〜約９６時間、約４時間〜約７２時間、約８時間〜約４８時間、約１２時間〜約３６時間、約６時間〜約２４時間、約３６時間〜９６時間にわたり実施される。いくつかの実施形態では、インキュベーションまたはインキュベーションの一部は、刺激剤の存在下で実施される。いくつかの実施形態では、刺激剤は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導できる作用物質である。いくつかの実施形態では、刺激剤は、ＣＤ３に特異的な抗体、ＣＤ２８に特異的な抗体および／またはサイトカインでありまたはそれを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、本方法によって生成される細胞を薬学的に許容可能な緩衝液中で製剤化することをさらに含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、細胞集団を生成し、その中では、細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は、１）遺伝子破壊を含み；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含まず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）組換え受容体を発現する、の双方であり、または組換え受容体を発現する細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は、遺伝子破壊を含み、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、細胞集団を生成し、その中では、細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くは、１）遺伝子破壊を含み；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含まず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）組換え受容体を発現する、の双方であり、および／または組換え受容体を発現する細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くは、遺伝子破壊を含み、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。
【００４８】
本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ゲノム中の遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかによって生成される、遺伝子操作された免疫細胞もまた提供される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかによって生成される、複数の遺伝子操作された免疫細胞もまた提供される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、このような遺伝子操作された免疫細胞が提供され、その中では、細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は、１）遺伝子破壊を含み；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含まず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）組換え受容体を発現する、の双方であり、または組換え受容体を発現する細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は、遺伝子破壊を含み、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。
【００５２】
いくつかの実施形態では、複数の遺伝子操作された免疫細胞が提供され、その中では、細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くは、１）遺伝子破壊を含み；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含まず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）組換え受容体を発現する、の双方であり、および／または組換え受容体を発現する、遺伝子破壊を含む細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くは、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された免疫細胞のいずれかまたは本明細書で提供される複数の遺伝子操作された免疫細胞のいずれかと、任意選択的に薬学的に許容可能な緩衝液とを含む組成物もまた提供される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物のいずれかを、疾患または病状を有する対象に投与することを含む治療方法もまた提供される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組換え受容体は、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患などの疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、対象における疾患または病状の治療で使用するための本明細書で提供される薬学的組成物のいずれかもまた提供される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、使用される薬学的組成物のいずれかにおいて、組換え受容体は、がん、腫瘍、自己免疫疾患または自己免疫障害または感染性疾患などの疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する。
【００５８】
本明細書では、Ｔ細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体に接触させることを含む、Ｔ細胞を改変する方法が提供され、その中で１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子は、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、がんに罹患している対象に由来する。いくつかの例では、がんは、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される。
【００５９】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Ｔ細胞は、がんを有する対象に由来し、さもなければ、ＰＤＣＤ１遺伝子のＴ細胞標的位置における変異から恩恵を受け得る対象に由来する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、接触はエクスビボで実施される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、改変Ｔ細胞は、接触処理の後に対象の身体に戻される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Ｔ細胞はがんに罹患している対象に由来し、接触はエクスビボで実施され、改変Ｔ細胞は接触処理の後に対象の身体に戻される。
【００６０】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、接触の前に１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が形成される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含有する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含有する。
【００６２】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端が修飾されているか、または３’ポリＡテールを含有する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端が修飾され３’ポリＡテールを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は５’三リン酸基を欠いている。
【００６３】
いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は５’キャップを含む。場合によっては、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。場合によっては、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。
【００６４】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、３’ポリＡテールは、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、３’ポリＡテールは、約２０個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’ポリＡテールを含むｇＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、電気穿孔を通じてＴ細胞に送達される。
【００６６】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有し、ｇＲＮＡ分子は、標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。いくつかの例では、切断効率は、標識抗ＰＤＣＤ１抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、単一のｇＲＮＡ分子によって誘導され、単一の二本鎖切断で標的ドメインを切断する。いくつかの例では、Ｃａｓ９分子はＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、単一のｇＲＮＡ分子は、以下のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含む：
2019517788.tif 000007
。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子はニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導され、標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で標的ドメインを切断する。場合によっては、Ｃａｓ９分子はＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。場合によっては、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子はＤ１０Ａ変異を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインを含む２つのｇＲＮＡ分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される：
2019517788.tif 000008
。場合によっては、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子は、Ｎ８６３Ａ変異を有する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインを含む２つのｇＲＮＡ分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される：
2019517788.tif 000009
および
【００７２】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はモジュラーｇＲＮＡ分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はキメラｇＲＮＡ分子である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含む。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。
【００７４】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも６０％の切断効率で標的ドメインを切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも８０％の切断効率で標的ドメインを切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも９０％の切断効率で標的ドメインを切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。
【００７５】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、５つ未満のオフターゲットを生成する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、２つ未満のエクソンオフターゲットを生成する。いくつかの態様では、オフターゲットはＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される。場合によっては、オフターゲットはＡｍｐ−ｓｅｑによって同定される。
【００７６】
本明細書ではＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が提供され、その中ではｇＲＮＡ分子は、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有し、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端で修飾され、および／または３’ポリＡテールを含有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７からのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含有する。
【００７８】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はその５’末端が修飾されている。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は５’三リン酸基を欠いている。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。場合によっては、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。
【００７９】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、３’ポリＡテールは、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、３’ポリＡテールは、約２０個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、３’ポリＡテールを含むｇＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含有し、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。
【００８０】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Ｃａｓ９分子は、標的ドメインを二本鎖切断で切断する。いくつかの例では、Ｃａｓ９分子はＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：
2019517788.tif 000010
。
【００８１】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Ｃａｓ９分子は、標的ドメインを一本鎖切断で切断する。場合によっては、Ｃａｓ９分子はＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。いくつかの例では、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子はＤ１０Ａ変異を有する。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：
2019517788.tif 000011
。場合によっては、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子は、Ｎ８６３Ａ変異を有する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：
2019517788.tif 000012
。
【００８３】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はモジュラーｇＲＮＡ分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はキメラｇＲＮＡ分子である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含む。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。
【００８５】
本明細書では、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有するｇＲＮＡ分子が提供され、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端で修飾され、および／または３’ポリＡテールを含有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの例では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含有する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含有する。
【００８７】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はその５’末端が修飾されている。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は５’三リン酸基を欠いている。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子は５’キャップを含む。いくつかの例では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。
【００８８】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドを含有する３’ポリＡテールを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、約２０個のアデニンヌクレオチドを含有する３’ポリＡテールを含有する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、３’ポリＡテールを含むｇＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された。場合によっては、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含有し、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。
【００９０】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はＳ．ピオゲネスｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：
2019517788.tif 000013
。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：ＧＣＣＣＵＧＧＣＣＡＧＵＣＧＵＣＵ（配列番号５１４）；またはＣＡＣＣＵＡＣＣＵＡＡＧＡＡＣＣＡＵＣＣ（配列番号７２３）。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：
2019517788.tif 000014
。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される：
2019517788.tif 000015
。
【００９１】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はモジュラーｇＲＮＡ分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はキメラｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。
【００９２】
本明細書では、細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させることを含む、移植のための細胞を生成する方法が提供され、その中で１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子は、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有し、ｇＲＮＡ分子は、標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。いくつかの態様では、切断効率は、標識抗ＰＤＣＤ１抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される。
【００９３】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端が修飾されているか、または３’ポリＡテールを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端が修飾され３’ポリＡテールを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は５’三リン酸基を欠いている。いくつかの例では、ｇＲＮＡ分子は５’キャップを含む。場合によっては、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。
【００９４】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、３’ポリＡテールは、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドを含有する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、３’ポリＡテールは、約２０個のアデニンヌクレオチドを含む。場合によっては、３’ポリＡテールを含むｇＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、ＤＮＡ鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含み、Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。
【００９５】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、電気穿孔を通じて細胞に送達される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Ｃａｓ９分子は、単一のｇＲＮＡ分子によって誘導され、単一の二本鎖切断で標的ドメインを切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子はＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、単一のｇＲＮＡ分子は、以下のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含有する：
2019517788.tif 000016
。
【００９７】
任意のこのような実施形態のいくつかでは、Ｃａｓ９分子はニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導され、標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で標的ドメインを切断する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｄ１０Ａ変異を有するＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である。いくつかの例では、ターゲティングドメインを含む２つのｇＲＮＡ分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される：
2019517788.tif 000017
。
【００９９】
場合によっては、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子は、Ｎ８６３Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインを含む２つのｇＲＮＡ分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される：
2019517788.tif 000018
。
【０１００】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はモジュラーｇＲＮＡ分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子はキメラｇＲＮＡ分子である。いくつかの例では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含有する。場合によっては、ｇＲＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。
【０１０１】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも６０％の切断効率で標的ドメインを切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも８０％の切断効率で標的ドメインを切断するようにＣａｓ９分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも９０％の切断効率で標的ドメインを切断するように、Ｃａｓ９分子を誘導する。
【０１０２】
任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、５つ未満のオフターゲットを生成する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、２つ未満のエクソンオフターゲットを生成する。いくつかの態様では、オフターゲットはＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される。いくつかの例では、オフターゲットはＡｍｐ−ｓｅｑによって同定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
最初に簡単に図面を説明する。
【０１０４】
（図１Ａ−Ｇ）いくつかの代表的なｇＲＮＡの描写である。
（図１Ａ）部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ピオゲネスに由来する（または部分的に配列をモデルにしている）、モジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４２および４３）；
（図１Ｂ）Ｓ．ピオゲネスに部分的に由来する単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４４）；
（図１Ｃ）Ｓ．ピオゲネスに部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４５）；
（図１Ｄ）Ｓ．ピオゲネスに部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４６）；
（図１Ｅ）Ｓ．ピオゲネスに部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４７）；
（図１Ｆ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に部分的に由来するモジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４８および４９）；
（図１Ｇ）Ｓ．ピオゲネスおよびＳ．サーモフィルスのモジュラーｇＲＮＡ分子のアライメントを描写する（それぞれ出現順に配列番号５０〜５３）。
（図２Ａ−Ｇ）Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  ＢＩＯＬ．２０１３；１０（５）：７２６−７３７）からのＣａｓ９配列のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（配列番号３）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号４）。モチーフ：これは４つの配列に基づくモチーフである：全ての４つの配列中で保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示す。
（図３Ａ−Ｂ）Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌで開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号５４〜１０３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。
（図４Ａ−Ｂ）配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号１０４〜１７７）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
（図５Ａ−Ｃ）Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号１７８〜２５２）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
（図６Ａ−Ｂ）配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号２５３〜３０２）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
（図７Ａ−Ｂ）Ｓ．ピオゲネスおよびナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＣａｓ９配列のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス；Ｎｍ：Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）。モチーフ：これは２つの配列に基づくモチーフである：双方の配列で保存される残基は、単一アミノ酸名称によって示される；「＊」は、２つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示し、「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸または不在を示す。
（図８）Ｎ．メニンジチディスのＣａｓ９をコードする核酸配列を示す（配列番号３０３）。「Ｒ」によって示される配列はＳＶ４０  ＮＬＳであり；「Ｇ」として示される配列はＨＡタグであり；かつ「Ｏ」によって示される配列は、合成ＮＬＳ配列である。残りの（印のない）配列は、読み取り枠（ＯＲＦ）である。
（図９Ａ）Ｃａｓ９（認識（ＲＥＣ）およびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ）の２つのローブに関して、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のドメイン構成、およびアミノ酸位置を含めたＣａｓ９ドメインの構成を描写する概略図を示す。
（図９Ｂ）８３  Ｃａｓ９オルソログ全体にわたる各ドメインパーセント相同性と共に、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ドメイン構成を描写する概略図を示す。
（図１０Ａ）二重鎖構造としてＳ．ピオゲネスに部分的に由来する、単分子ｇＲＮＡ分子の代表的構造を示す（配列番号４０）。
（図１０Ｂ）二重鎖構造としてＳ．アウレウスに部分的に由来する、単分子ｇＲＮＡ分子の代表的構造を示す（配列番号４１）。
（図１１）Ｓ．アウレウスＣａｓ９を使用して、２９３細胞中のＴＲＢＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３は、１つはＳ．アウレウスＣａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＢＣ２遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを要約する。
（図１２）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用して、２９３細胞中のＴＲＢＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３細胞は、１つはＳ．ピオゲネスＣａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、二連のサンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子座の双方で観察された平均％ＮＨＥＪを示す。
（図１３）Ｓ．アウレウスＣａｓ９を使用して、２９３細胞中のＴＲＡＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３細胞は、１つはＳ．アウレウスＣａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＡＣ遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
（図１４）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用して、２９３細胞中のＴＲＡＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３細胞は、１つはＳ．ピオゲネスＣａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＡＣ遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
（図１５）Ｓ．アウレウスＣａｓ９を使用して、２９３細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３細胞は、１つはＳ．アウレウスＣａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＰＤＣＤ１遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
（図１６）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用して、２９３細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３細胞は、１つはＳ．ピオゲネスＣａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＰＤＣＤ１遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
（図１７Ａ−Ｃ）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびＴＲＢＣおよびＴＲＡＣ遺伝子特異的ｇＲＮＡの送達に起因する、ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＣＤ３発現の喪失を示す結果を描写する。
（図１７Ａ）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび示されるｇＲＮＡ
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で電気穿孔され、ＡＰＣ−ＣＤ３抗体で染色され、ＦＡＣＳで分析された、ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。細胞は、電気穿孔の２日および３日後に分析された。
（図１７Ｂ）（Ａ）のプロットのからのＣＤ３陰性集団の定量化を示す。
（図１７Ｃ）ＴＲＢＣ２およびＴＲＡＣ遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから得られた％ＮＨＥＪを示す。
（図１８Ａ−Ｃ）ＴＲＡＣ遺伝子をターゲティングするＳ．アウレウスＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達に起因する、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＣＤ３発現の喪失を示す結果を描写する。
（図１８Ａ）ＴＲＡＣ遺伝子をターゲティングするＳ．アウレウスＣａｓ９／ｇＲＮＡＴＲＡＣ−２３３
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ＲＮＰで電気穿孔され、ＡＰＣ−ＣＤ３抗体で染色され、ＦＡＣＳによって分析された、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を示す。細胞は、電気穿孔の１日、２日、および３日後に分析された。
（図１８Ｂ）（Ａ）のプロットのからのＣＤ３陰性集団の定量化を示す。
（図１８Ｃ）ＴＲＡＣ遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイ％から得られたＮＨＥＪを示す。
（図１９）５’  ＡＲＣＡキャップの構造を示す。
（図２０）Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡでの電気穿孔後における、生存Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の定量化からの結果を描写する。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびそれぞれの修飾ｇＲＮＡで電気穿孔された。電気穿孔の２４時間後、１×１０５個の細胞は、ＦＩＴＣコンジュゲートアネキシンＶ特異的抗体によって室温で１５分間染色され、フローサイトメトリーによる分析直前のヨウ化プロピジウムによる染色がそれに続いた。アネキシンＶまたはＰＩのいずれでも染色されなかった細胞の百分率が、棒グラフで報告される。
（図２１Ａ−Ｃ）ＴＲＡＣをターゲティングするＳ．アウレウスＣａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰの送達に起因する、未感作ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ３発現の喪失を描写する。
（図２１Ａ）（ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000021
があるＳ．アウレウスＣａｓ９／ｇＲＮＡで電気穿孔された未感作ＣＤ３＋Ｔ細胞を描写し、ＴＲＡＣをターゲティングするＲＮＰはＡＰＣ−ＣＤ３抗体で染色され、ＦＡＣＳによって分析された。細胞は、電気穿孔の４日後に分析された。陰性対照は、ターゲティングドメイン
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のあるｇＲＮＡがあり、機能性Ｃａｓ９がない細胞である。
（図２１Ｂ）図２１ＡのプロットからのＣＤ３陰性集団の定量化を描写する。
（図２１Ｃ）ＴＲＡＣ遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイ％から得られたＮＨＥＪを描写する。
（図２２）（ターゲティングドメイン
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がある）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびＰＤＣＤ１  ｇＲＮＡ、またはＰＤＣＤ１をターゲティングする（ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000024
がある）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰの送達後のＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるゲノム編集を描写する。２４、４８、および７２時間目にＰＤＣＤ１遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから得られた、％ＮＨＥＪの定量化。特許請求される例示的標的ｇＲＮＡ（配列番号５０８）を用いて、より高レベルの％ＮＨＥＪがＲＮＰ対ｍＲＮＡ送達で検出された）。
（図２３）ＰＤＣＤ１遺伝子座をターゲティングする異なる標識ｇＲＮＡを含んでなる、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰを有する初代Ｔ細胞の電気穿孔に続く、ＰＤ−１表面発現について陰性である細胞の百分率を示す。
（図２４Ａ）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１の送達後の、活性化初代Ｔ細胞におけるＰＤＣＤ１遺伝子座のゲノム編集を示す。複数の健常ドナーから単離された初代ＣＤ４Ｔ細胞が同一ＲＮＰで処理され、再活性化後に、フローサイトメトリーによってＰＤＣＤ１発現が評価された。複数の実験からのＰＤＣＤ１陰性細胞の百分率の平均がプロットされ、標準偏差はエラーバーで示される。
（図２４Ｂ）ＰＤＣＤ１遺伝子座または対照ＡＡＶＳ１遺伝子座をターゲティングする異なる標識ｇＲＮＡを含んでなるＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰによる電気穿孔に続く、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４およびＰＤ−１の表面発現を示す。
（図２５）ＰＤＣＤ１遺伝子座または対照ＡＡＶＳ１遺伝子座をターゲティングする異なる標識ｇＲＮＡを含んでなるＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰによる電気穿孔に続く、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌの表面発現を示す。
（図１２６）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１遺伝子座（ＰＤ−１ＫＯ）、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＡＡＶＳ１対照（ＡＡＶＳ１−ＫＯ）または未処理対照による電気穿孔に続いて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲまたはモック形質導入対照（モック）で形質導入されたＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞上における、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現のＰＤ−１および代理マーカー（ＥＧＦＲｔ）の表面発現を示す。
（図２７Ａ−２７Ｂ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１遺伝子座（ＰＤ−１ＫＯ）またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＡＡＶＳ１対照（ＡＡＶＳ１−ＫＯ）による電気穿孔に続いて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ）またはモック形質導入対照（モック）で形質導入された、ＣＤ８＋（図２７Ａ）またはＣＤ４＋（図２７Ｂ）Ｔ細胞のＴ細胞表面マーカー発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。表面マーカーＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６９、４１ＢＢ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＴＩＭ３、およびＣＤ４５ＲＯのＭＦＩが示される。
（図２８Ａ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１遺伝子座（ＰＤ−１ＫＯ）またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＡＡＶＳ１対照（ＡＡＶＳ１−ＫＯ）による電気穿孔に続いて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ＋）またはモック形質導入対照（モック）で形質導入されたＴ細胞におけるＰＤＣＤ１遺伝子座にインデルを含有する細胞の百分率を示す。
（図２８Ｂ）使用されたＰＤＣＤ１  ｇＲＮＡと比較した、各配置の欠失または挿入を含有するＭｉＳｅｑ配列解析からの読み取りの相対数を示す。ガイドＲＮＡの位置は、ｘ軸の６０位の周囲の太い垂直線として示される。
（図２９）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ＋）またはモック形質導入対照（モック）で形質導入され、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１遺伝子座またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＡＡＶＳ１対照で電気穿孔された、初代ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞増殖を示す。Ｔ細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）バイオレットを用いて測定されたＣＤ１９発現細胞またはＲＯＲ−１発現対照細胞との共培養の後に評価された。
（図３０Ａ−Ｃ）ＣＤ１９発現細胞またはＲＯＲ−１発現対照細胞との共培養に続いて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ＋）またはモック形質導入対照（モック）で形質導入され、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１遺伝子座またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングＡＡＶＳ１対照で電気穿孔された、初代Ｔ細胞の細胞上清中のサイトカイン分泌を示す。図３０Ａは、細胞上清中のＩＦＮ−γを示す。図３０Ｂは、細胞上清中のインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を示す。図３０Ｃは、細胞上清中の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌を示す。
（図３１）Ｓ．ピオゲネスＤ１０ＡまたはＮ８６３ＡニッカーゼＲＮＰのどちらかのペアで処理された活性化ＣＤ４Ｔ細胞を示す。ＰＭＡ／ＩＯによる再刺激の後に、ＰＤＣＤ１の発現が、ＰＥコンジュゲート抗ＰＤＣＤ１抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価された。ＰＤＣＤ１陰性細胞の百分率は、二連のサンプルの標準偏差を指すエラーバーを有するグラフで表示される。サンプル２５および２６は、陰性対照の役割を果たす、単一のｇＲＮＡを有するＤ１０ＡおよびＮ８６３Ａである一方で、サンプル２７は、陽性対照の役割を果たす、単一のｇＲＮＡを有する野生型Ｃａｓ９である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
詳細な説明
Ｉ．組換え受容体を発現する細胞における、ＰＤ−１ノックアウトのターゲティング
遺伝子組換えまたは操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの組換え受容体を発現する、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの免疫細胞をはじめとする、細胞および細胞組成物が提供される。細胞は、概して、このような組換え受容体またはその産物をコードする１つまたは複数の核酸分子を導入することによって、操作される。このような組換え受容体としては、遺伝子操作されたＴＣＲおよび機能性非ＴＣＲ抗原受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）など、活性化、刺激、および共刺激ＣＡＲおよびそれらの組み合わせなどの操作された抗原受容体が挙げられる。提供された細胞はまた、プログラム死−１（ＰＤ−１）ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を有する。このような遺伝子操作された細胞を生成する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、細胞および組成物は、例えば養子免疫療法などの養子細胞療法で使用され得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、提供された細胞、組成物および方法は、プログラム死−１（ＰＤ−１）とそのリガンドＰＤ−Ｌ１の間の阻害的相互作用に関与する、Ｔ細胞阻害経路またはシグナルの効果を改変しまたは減少させる。いくつかの実施形態では、共刺激阻害受容体またはそのリガンドの片方または双方の上方制御および／または発現は、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞機能を負に制御し得る。ＰＤ−１（コード核酸配列が配列番号５１２０７および５１２０８にそれぞれ記載される例示的アミノ酸）は、Ｂ７：ＣＤ２８共刺激分子ファミリーに属する免疫阻害受容体であり、そのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と反応してＴ細胞機能を阻害する。ＰＤ−Ｌ１（コード核酸配列が配列番号５１２０９および５１２１０にそれぞれ記載される例示的アミノ酸；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２３３５１６もまた参照されたい）は、抗原提示細胞またはがん細胞上で発現されることが主に報告されており、Ｔ細胞発現ＰＤ−１と相互作用してＴ細胞活性化を阻害する。場合によっては、ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞上で発現されることもまた報告されている。場合によっては、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、細胞傷害性Ｔ細胞の活性を抑制し、いくつかの態様では、腫瘍免疫を阻害して腫瘍細胞に免疫逃避を提供し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞上および／または腫瘍微小環境中のＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の発現は、養子Ｔ細胞療法の効力および有効性を減少させ得る。
【０１０７】
したがって、いくつかの実施形態では、このような阻害経路は、養子細胞療法の文脈で、特定の望ましいエフェクター機能を別の様式で損なう場合がある。腫瘍微小環境中の腫瘍細胞および／または細胞は、ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２など）を頻繁に上方制御し、それは次に、ＰＤ−１を発現する腫瘍特異的Ｔ細胞へのＰＤ−１リガンドのライゲーションをもたらし、阻害シグナルを送達する。ＰＤ−１はまた、腫瘍微小環境におけるＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞上で上方制御されることが多く、それは、例えば、抗原受容体または特定のその他の活性化シグナルを通じたシグナル伝達の後に起こり得る。
【０１０８】
場合によっては、このような事象は、ＰＤ−Ｌ１を発現する他の細胞と近接して存在する場合などに、遺伝子操作された（例えば、ＣＡＲ＋）Ｔ細胞が枯渇した表現型を獲得することに寄与し得て、それは次に機能性の減少をもたらし得る。Ｔ細胞の枯渇は、Ｔ細胞機能の進行性喪失および／または細胞の枯渇をもたらし得る（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２９：４７４−４８１）。Ｔ細胞枯渇および／またはＴ細胞持続の欠如は、養子細胞療法の有効性および治療転帰に対する障壁であり；臨床試験は、より大きなおよび／またはより長い抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞への曝露と、治療転帰との間の相関関係を明らかにしている。
【０１０９】
特定の方法は、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断すること、またはがん治療の文脈をはじめとする、Ｔ細胞におけるＰＤ−１発現を破壊することを目的としている。このような遮断または破壊は、遮断抗体、小分子、または阻害的ペプチドの投与によるものであってもよく、またはＴ細胞における、例えば養子移入されたＴ細胞における、ＰＤ−１の発現のノックアウトまたは減少によるものであってもよい。しかし、移入されたＴ細胞におけるＰＤ−１の破壊は、完全に満足できるものでないこともある。場合によっては、ＰＤ−１をコードする遺伝子の破壊が永続的でないこともあり、その結果、細胞表面のＰＤ−１発現の消失は一時的に過ぎない。その他の態様では、細胞における遺伝子破壊の効率は十分に高くはなく、その結果、破壊の対象となる比較的多数の細胞が、標的遺伝子の発現を保持する。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用するなどの特定の破壊方法は、限定的な切断特異性が１つまたは複数の非標的遺伝子の非特異的破壊をもたらすこともあるために、オフターゲット効果をもたらし得る。場合によっては、このような問題は、その中で遺伝子（例えば、ＰＤ−１）の破壊が望まれる、操作された細胞の有効性を制限し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、提供される細胞、組成物、および方法は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるＰＤＣＤ１の発現の減少、欠失、消失、ノックアウトまたは破壊をもたらす。いくつかの態様では、破壊は遺伝子編集によって実施され、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用するなどして、ＰＤ−１遺伝子（ＰＤＣＤ１）に特異的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムなどのクラスター化等間隔短鎖回文構造核酸（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓシステムなどが破壊される。いくつかの実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子座の領域をターゲティングするターゲティングドメインを含有するＣａｓ９とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含有する作用物質が、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、作用物質は、ＰＤＣＤ１ターゲティングされるターゲティングドメインを含有するＣａｓ９とｇＲＮＡとのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、導入は、インビトロで作用物質またはその一部を細胞と接触させることを含み、それは、細胞と作用物質を２４、３６または４８時間または３、４、５、６、７、または８日間に至るまで、培養またはインキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、導入は、作用物質の細胞への送達を行うことをさらに含み得る。様々な実施形態では、本開示による方法、組成物、および細胞は、例えば電気穿孔による、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の細胞への直接送達を利用する。いくつかの実施形態では、ＲＮＰ複合体は、３’ポリＡテールおよび５’アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップを含むように改変されたｇＲＮＡを含む。場合によっては、改変される細胞の電気穿孔は、細胞の電気穿孔に続いて播種の前に、例えば３２℃で、細胞に低温ショックを与えることを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、作用物質を細胞と接触させる前、最中または後に、および／または送達（例えば、電気穿孔）を行う前、その最中または後に、提供される方法は、細胞をサイトカイン、刺激剤および／または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖を誘導できる作用物質の存在下でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、ＣＤ３に特異的な抗体であるかまたはＣＤ２８に特異的な抗体であるまたはそれを含んでなる刺激剤、および／またはサイトカインの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５の１つまたは複数などのサイトカインの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、２４時間、３６時間または４８時間または３、４、５、６、７または８日間に至るなどの、電気穿孔の前後の８日間時間に至る。いくつかの実施形態では、刺激剤（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）および／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５）の存在下のインキュベーションは、電気穿孔の前の２４時間、２５時間または４８時間に至る。
【０１１２】
いくつかの態様では、提供される組成物および方法は、ＰＤＣＤ１遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入される、細胞組成物中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、または約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くは、遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有しないものを含む。いくつかの実施形態では、本開示による方法、組成物および細胞は、ＰＤＣＤ１遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入される、細胞組成物中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、または約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くにおいて、細胞表面などでＰＤ−１ポリペプチドを発現しないものを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入される、細胞組成物中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、または約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くにおいて、双方の対立遺伝子がノックアウトされており、すなわち、このような百分率の細胞が二対立遺伝子欠失を含んでなる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入されている細胞組成物の細胞において、ＰＤＣＤ１遺伝子またはその近く（例えば、切断部位の上流または下流の１００または約１００塩基対内、５０または約５０塩基対内、または２５または約２５塩基対内、または１０または約１０塩基対内）におけるＣａｓ９媒介切断効率（％インデル）が、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である、組成物および方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質（例えば、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）が導入されている細胞組成物の細胞の少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上において、免疫チェックポイント分子ＰＤ−１を介して送達されるシグナルの低下または破壊をもたらす、細胞、組成物、および方法が提供される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、組換え受容体で操作された細胞を含んでなり、ＰＤ−１発現の減少、欠失、消失、ノックアウトまたは破壊（例えば、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊）を含んでなる、提供される開示による組成物は、同一条件下で評価された場合に、組換え受容体で操作されているが、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含まずまたはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、対応組成物または参照組成物の操作された細胞中で発現される組換え受容体と比較して、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の機能特性または活性を保持する。いくつかの実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、抗原に対する特異的結合を保持する。いくつかの実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、抗原結合時に、活性化または刺激性活性を保持して、細胞における細胞傷害性、増殖、生存またはサイトカイン分泌を誘導する。いくつかの実施形態では、提供される組成物の操作された細胞は、同一条件下で評価された場合に、組換え受容体で操作されているが、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含まずまたはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、操作された細胞を含んでなる対応組成物または参照組成物と比較して、機能特性または活性を保持する。いくつかの実施形態では、細胞は、このような対応組成物または参照組成物と比較して、細胞傷害性、増殖、生存またはサイトカイン分泌を保持する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞は、同一条件下で評価された場合に、対応組成物または参照組成物中の細胞の表現型と比較して、免疫細胞または細胞の表現型を保持する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞としては、未感作細胞、エフェクターメモリー細胞、セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の、または組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現して、非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示すＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含んでなるＴ細胞の百分率は、組換え受容体で操作されているが、遺伝子破壊を含有せずまたはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞の対応または参照集団または組成物と、同一または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）と、ＣＣＲ７＋、４−１ＢＢ＋（ＣＤ１３７＋）、ＴＩＭ３＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ｔ−ｂｅｔｌｏｗ、ＩＬ−７Ｒａ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ−２Ｒβ＋、ＣＸＣＲ３＋またはＬＦＡ−１＋から選択される１つまたは複数の表現型マーカーとを含んでなる、Ｔ細胞を含んでなる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、このような特性、活性または表現型は、抗原、抗原発現細胞、および／または抗原−受容体活性化物質の存在下における、細胞のインキュベーションなどによってインビトロアッセイにおいて測定され得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、３７℃±２℃または約３７℃±２℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、最大で１２、２４、３６、４８または６０時間まで、または約１２、２４、３６、４８または６０時間までであり得て、任意選択的に、１種または複数種のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１７）の存在下で行われ得る。いくつかの実施形態では、評価される活性、特性または表現型のいずれかは、電気穿孔、またはその他の作用物質導入に続いて、３、４、５、６、７日後までなどの様々な日数で評価され得る。いくつかの実施形態では、このような活性、特性または表現型は、同一条件下で評価された場合に、組換え受容体で操作されているが、ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含まない細胞を含有する対応組成物の活性と比較して、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％によって保持される。
【０１１７】
本明細書の用法では、「対応組成物」または「対応細胞集団」（「参照組成物」または「参照細胞集団」とも称される）への言及は、同一または実質的に同一条件下で得られ、単離され、作製され、生成されおよび／またはインキュベーションされた、Ｔ細胞または細胞を指すが、ただし、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団に作用物質は導入されなかった。いくつかの態様では、作用物質の導入を含有しないこと以外は、このような細胞またはＴ細胞は、作用物質が導入されているＴ細胞または細胞と完全に同じようにまたは実質的に完全に同じように処理されており、その結果、作用物質の導入以外は、阻害分子の上方制御または発現をはじめとする、細胞の活性または特性に影響を及ぼし得るいかなる１つまたは複数の条件も細胞間で変化せず、または実質的に変化しない。例えば、１つまたは複数の阻害分子（例えば、ＰＤ−１）の発現の減少および／または上方制御の阻害を評価する目的で、作用物質の導入を含むＴ細胞および作用物質の導入を含まないＴ細胞が、Ｔ細胞において１つまたは複数の阻害分子の発現および／または上方制御を導くことが知られている同じ条件下でインキュベートされる。
【０１１８】
ＰＤ−１などの阻害分子をはじめとするＴ細胞マーカーの発現および／またはレベルを評価するための方法および技術は、当技術分野で公知である。このようなマーカーの検出のための抗体および試薬は、当技術分野において周知であり、容易に入手可能である。このようなマーカーを検出するためのアッセイおよび方法としては、細胞内フローサイトメトリーなどのフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、サイトメトリービーズアレイまたはその他の多重法、ウエスタンブロットおよびその他の免疫親和性に基づく方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞は、フローサイトメトリーまたはこのような細胞に特有のマーカーの発現のためのその他の免疫親和性に基づく方法によって検出され得て、次にこのような細胞は、阻害性分子（例えば、ＰＤ−１）などの別の１つまたは複数のＴ細胞表面マーカーについて共染色され得る。いくつかの実施形態では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が生成され得て、非免疫原性選択エピトープとして切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）を含有し、次にそれは、このような細胞を検出するためのマーカーとして使用され得る（例えば、米国特許第８，８０２，３７４号明細書を参照されたい）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、細胞、組成物、および方法は、養子移入される免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）において、ＰＤ−１の欠失、ノックアウト、破壊、または発現の減少を提供する（ＣＡＲまたは遺伝子組換えＴＣＲを発現するように操作された細胞など）。いくつかの実施形態では、方法は、対象来の初代免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの初代細胞上で、エクスビボで実施される。いくつかの態様では、このような遺伝子操作されたＴ細胞を生成または作製する方法は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含有する細胞集団に、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする１つまたは複数の核酸と、免疫阻害分子ＰＤ−１をコードする遺伝子を破壊できる１つまたは複数の作用物質とを導入することを含む。
【０１２０】
本明細書の用法では、「導入する」という用語は、インビトロまたはインビボのどちらかで、細胞にＤＮＡを導入する様々な方法を包含し、このような方法としては形質転換、形質導入、形質移入（例えば、電気穿孔）、および感染が挙げられる。ベクターは、分子をコードするＤＮＡを細胞に導入するのに有用である。可能なベクターとしては、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターなどのその他のベクターが挙げられる。
【０１２１】
Ｔ細胞を含有する細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル、未分画Ｔ細胞サンプル、リンパ球サンプル、白血球細胞サンプル、アフェレーシス生成物、または白血球除去生成物から得られるものなどの、対象から得られる細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、正または負の選択および富化方法を用いて分離または選択され、集団中のＴ細胞が富化され得る。いくつかの実施形態では、集団は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸を導入する工程、および作用物質（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）を導入する工程は、任意の順序で同時にまたは順次実施され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）および１つまたは複数の作用物質（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）の導入後、細胞は、細胞の拡張および／または増殖を刺激する条件下で、培養またはインキュベートされる。
【０１２２】
したがって、経時的に持続性または転写された細胞への曝露を維持する一方で、投与される遺伝子操作された（例えば、ＣＡＲ＋）細胞の活性および効力を増加させることなどによって、改善された有効性を提供することをはじめとする、養子細胞療法においてＴ細胞などの免疫細胞機能を強化する細胞、組成物、および方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞などの遺伝子操作された細胞は、特定の利用可能な方法と比較して、対象にインビボで投与された場合に、増大した拡張および／または持続性を示す。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞などの組換え受容体発現細胞を含有する提供される組成物は、インビボで対象に投与されると持続性が増大する。いくつかの実施形態では、投与に際して、対象におけるＣＡＲ発現Ｔ細胞などの遺伝子操作された細胞の持続性は、ＰＤ−１をコードする遺伝子の発現を減少させまたは妨害する作用物質と共にＴ細胞が導入されない方法によって遺伝子操作された細胞の投与を伴うものなどの代替的方法によって得られるものと比較して、より大きい。いくつかの実施形態では、持続性は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、または少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、投与された細胞の持続性の程度または規模は、対照への投与後に検出または定量され得る。例えば、いくつかの態様では、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、対象の血液または血清または臓器または組織（例えば、疾患部位）中の組換え受容体を発現する細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）の量が評価される。いくつかの態様では、持続性は、１マイクログラムのＤＮＡ当たりの、例えばＣＡＲなどの受容体をコードするＤＮＡまたはプラスミドのコピーとして、または例えば血液または血清などの１マイクロリットルのサンプル当たりの、または１マイクロリットルのサンプル当たりの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または白血球細胞またはＴ細胞の総数当たりの、例えばＣＡＲ発現細胞などの細胞受容体を発現する細胞数として、定量化される。いくつかの実施形態では、受容体に特異的な抗体を一般に使用して受容体を発現する細胞を検出する、フローサイトメトリーアッセイもまた実施され得る。細胞ベースのアッセイもまた使用されてもよく、例えば、疾患または病状を有する細胞、または受容体によって認識される抗原を発現する細胞に対する、細胞傷害性応答などの応答を結合および／または中和および／または誘導できる細胞などの、機能性細胞の数または百分率が検出される。このような実施形態のいずれかでは、組換え受容体に関連する別のマーカー（例えば、ＣＡＲ発現細胞）の発現の程度またはレベルが、投与された細胞を対象の内因性細胞と区別するために使用され得る。
【０１２５】
がん治療の養子療法などにおける、細胞の方法および使用もまた提供される。また、細胞を操作し調製し生成する方法、細胞を含有する組成物、および細胞を生成し投与するための細胞を含有するキットおよび装置もまた提供される。操作された細胞を生成するための方法、化合物、および組成物もまた提供される。細胞単離、遺伝子操作、および遺伝子破壊のための方法が提供される。例えば、遺伝子操作された抗原受容体をコードする、および／または破壊をもたらす作用物質をコードする、ウイルスベクターなどのコンストラクトなどの核酸と、このような核酸を形質導入などによって細胞に導入する方法とが提供される。操作された細胞を含有する組成物、そして養子細胞療法などのために細胞および組成物を対象に投与するための方法、キット、および装置もまた提供される。いくつかの態様では、細胞は対象から単離され、操作され、同一対象に投与される。その他の態様では、それらは一対象から単離され、操作され、別の対象に投与される。
【０１２６】
ＩＩ．遺伝子操作された細胞、および組換え受容体を発現する細胞を生成する方法
例えば養子免疫療法などの養子細胞療法のための細胞と、細胞を生成または作製する方法とが提供される。細胞としては、Ｔ細胞などの免疫細胞が挙げられる。細胞は、１つまたは複数の遺伝子操作された核酸またはその生成物を導入することによって、一般に操作される。このような生成物としては、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および機能性非ＴＣＲ抗原受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの、活性化、刺激、および共刺激ＣＡＲおよびそれらの組み合わせなどの操作された抗原受容体が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はまた、免疫阻害分子ＰＤ−１をコードする遺伝子を破壊できる作用物質（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）と共に、遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸と同時にまたはそれに連続して導入される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、組換え受容体をコードする核酸分子および／または作用物質（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）の導入前、最中および／または後に、インキュベートまたは培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、組換え受容体をコードするウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の細胞への形質導入前、最中または後などの、組換え受容体をコードする核酸分子の導入前、最中または後に、インキュベートまたは培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、細胞と作用物質との接触前、最中または後、あるいは例えば電気穿孔を通じた細胞への作用物質送達の前、最中または後などの、作用物質（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）の導入前、最中または後に、インキュベートまたは培養され得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、組換え受容体をコードする核酸分子を導入し、例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰなどの作用物質を導入する状況の双方であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５などのサイトカインの存在下、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体などの細胞の増殖または活性化を誘導する刺激剤または活性化剤の存在下であり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、方法は、組換え受容体をコードする核酸分子と、例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰなどの作用物質とを導入する前に、細胞を刺激剤または活性化剤（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体）で活性化または刺激することを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションはまた、ＩＬ−２（例えば１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬなど、例えば少なくとも５０Ｕ／ｍＬまたは１００Ｕ／ｍＬ、または約５０Ｕ／ｍＬまたは１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（例えば０．５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬなど、例えば少なくとも５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ）またはＩＬ−１５（例えば０．１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬなど、例えば少なくとも１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬ、または約１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬ）などのサイトカインの存在下でも実施され得る。いくつかの実施形態では、（例えば、形質導入を通じて）組換え受容体をコードする核酸分子を導入する前に、細胞は、２４〜４８時間または２４〜３６時間などの、６時間〜９６時間にわたってインキュベートされる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰなどの作用物質の導入は、組換え受容体をコードする核酸分子の導入後である。いくつかの実施形態では、作用物質を導入する前に、例えば、あらゆる刺激剤または活性化剤を除去することによって、細胞を休止させる。いくつかの実施形態では、作用物質を導入する前に、刺激剤または活性化剤および／またはサイトカインが除去されない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、核酸分子の導入後、および／または例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡなどの作用物質の導入後、細胞は、ＩＬ−２（例えば１Ｕ／ＭＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬなど、例えば少なくとも２５Ｕ／ｍＬまたは５０Ｕ／ｍＬ、または約２５Ｕ／ｍＬまたは５０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（例えば０．５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬなど、例えば少なくとも１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬ、または約１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬ）またはＩＬ−１５（例えば０．１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬなど、例えば少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍＬ、または約０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍＬ）などのサイトカインの存在下で、インキュベート、育成または培養される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、工程の任意の部分または工程全体のインキュベーションは、３０℃±２℃〜３９℃±２℃、例えば、少なくとも３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃、または少なくとも約３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は３０℃±２℃であり、インキュベーションの少なくとも一部は、３７℃±２℃である。
【０１３２】
Ａ．遺伝子操作のための細胞および細胞調製
ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子編集のための特異的抗原および作用物質（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）に結合する組換え受容体は、多種多様な細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、組換え受容体が操作されおよび／またはＰＤＣＤ１標的遺伝子がエクスビボで操作され、得られた遺伝子操作された細胞が対象に投与される。エクスビボ操作のための標的細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。エクスビボ操作のための標的細胞の起源としては、例えば、異種供与者血液、臍帯血、または骨髄もまた挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、例えば操作された細胞などの細胞は、例えばヒト細胞などの哺乳類細胞のような真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ液、またはリンパ器官に由来し、例えばリンパ球をはじめとする骨髄性またはリンパ系細胞などの先天または適応免疫細胞などの免疫系細胞であり、典型的にＴ細胞および／またはＮＫ細胞である。その他の例示的細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をはじめとする、多能性および多能性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞である。治療される対象に関して、細胞は、同種異系および／または自己由来であってもよい。細胞は、典型的には、対象から直接単離されたもの、および／または対象から単離され凍結されたものなどの初代細胞である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）または樹状細胞などのＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、および／または好塩基球などの単球または顆粒球である。一実施形態では、標的細胞は、例えば、対象から生成され、操作されて改変された（例えば、変異誘導された）、または１つまたは複数の標的遺伝子の発現が操作されて、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞などのＴ細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化した、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞に由来する細胞である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、細胞は、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞などの、そして機能、活性化状態、成熟度、分化可能性、拡張、再循環、局在化、および／または持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器またはコンパートメント中の存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイル、および／または分化度によって定義されるその亜集団などの、Ｔ細胞またはその他の細胞型の１つまたは複数のサブセットを含む。
【０１３６】
Ｔ細胞のおよび／またはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の亜型および亜集団としては、未感作Ｔ（ＴＮ）細胞；エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）；メモリーＴ細胞、および幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、または最終分化エフェクターメモリーＴ細胞などのその亜型；腫瘍細胞浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）；未熟Ｔ細胞；成熟Ｔ細胞；ヘルパーＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞；粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然および適応型調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞；ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞などのヘルパーＴ細胞；α／βＴ細胞、およびδ／γＴ細胞が挙げられる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、方法は、対象から細胞を単離し、それらを調製、処理、培養、および／または操作することを含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞の調製は、１つまたは複数の培養および／または調製工程を含む。記載されるような操作のための細胞は、例えば、対象から得られ、またはそれに由来する、生物学的サンプルなどのサンプルから単離されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞がそれから単離される対象は、疾患または病状を有する、または細胞療法を必要とする、またはそれに対して細胞療法が投与される、対象である。いくつかの実施形態における対象は、そのために細胞が単離され、処理され、および／または操作される養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とするヒトである。
【０１３８】
したがって、いくつかの実施形態における細胞は、例えば初代ヒト細胞などの初代細胞である。サンプルとしては、対象から直接採取された、組織、体液、およびその他のサンプル、ならびに分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、および／またはインキュベーションなどの１つまたは複数の処理工程から得られたサンプルが挙げられる。生物学的サンプルは、生物学的起源から直接得られたサンプル、または処理されたサンプルであり得る。生物学的サンプルとしては、それに由来する処理されたサンプルを含めた、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、および汗などの体液や、組織および臓器サンプルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３９】
いくつかの態様では、細胞がそれに由来するまたはそれから単離されるサンプルは、血液であるか、または血液由来サンプルであるか、またはアフェレーシスまたは白血球除去生成物であるか、またはそれに由来する。例示的サンプルとしては、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、その他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸管、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃、またはその他の臓器、および／またはそれに由来する細胞が挙げられる。サンプルには、例えば養子細胞療法などの細胞療法の文脈で、自己由来および同種異系起源のサンプルが含まれる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、Ｔ細胞株などの細胞株に由来する。いくつかの実施形態における細胞は、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタなどの異種起源から得られる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞の単離は、１つまたは複数の調製および／または非親和性ベース細胞分離の工程を含む。いくつかの例では、細胞は、洗浄、遠心分離、および／または１つ以上の試薬の存在下でインキュベートされ、例えば、望まれない成分が除去され、所望の成分が富化され、特定の試薬に感受性の細胞が溶解または除去される。いくつかの例では、細胞は、密度、付着特性、サイズ、感受性および／または特定の成分に対する耐性などの１つまたは複数の特性に基づいて分離される。
【０１４２】
いくつかの例では、対象の循環血液に由来する細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球除去血によって得られる。サンプルは、いくつかの態様では、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞をはじめとするリンパ球；その他の有核白血球細胞；赤血球および／または血小板を含有し、いくつかの態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、対象から採取された血液細胞は洗浄され、例えば血漿画分が除去されて、後続する処理工程のために、細胞は適切な緩衝液または媒体に入れられる。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄液は、カルシウムおよび／またはマグネシウムおよび／または多数のまたは全ての二価カチオンを欠いている。いくつかの態様では、洗浄工程は、製造会社の使用説明書に従って、半自動「通過型」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｂａｘｔｅｒ）で達成される。いくつかの態様では、洗浄ステップは、製造会社の使用説明書に従って、接線流濾過（ＴＦＦ）によって達成される。いくつかの実施形態では、細胞は、洗浄後に、例えばＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有ＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の実施形態では、血液細胞サンプルの成分が除去され、細胞が培地に直接再懸濁される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、方法は、赤血球を溶解し、パーコールまたはフィコール勾配により遠心分離することによる、末梢血からの白血球の調製などの密度に基づく細胞分離法を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、単離法は、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸などの表面マーカーなどの１つまたは複数の特異的分子の細胞における発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。いくつかの実施形態では、このようなマーカーに基づく分離のための任意の既知の方法が用いられてもよい。いくつかの実施形態では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、単離は、いくつかの態様では、例えば、このようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションと、一般にそれに続く、洗浄工程、および、抗体または結合パートナーへの結合を有する細胞の抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの分離による、典型的に細胞表面マーカーである、細胞の１つまたは複数のマーカー発現または発現レベルに基づく、細胞および細胞集団の分離を含む。
【０１４６】
このような分離工程は、試薬に結合している細胞がさらなる使用のために保持される正の選択、および／または抗体または結合パートナーに結合していない細胞が保持される負の選択に基づき得る。いくつかの例では、双方の画分が、さらなる使用のために保持される。いくつかの態様では、負の選択は、不均一集団中の細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能でなく、その結果、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づく分離が最良である場合に、特に有用であり得る。
【０１４７】
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の１００％富化または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現するものなどの特定タイプの細胞の正の選択または富化は、そのような細胞の数または百分率を増加させることを意味するが、必ずしもマーカーを発現しない細胞が完全に不在である必要はない。同様に、マーカーを発現するものなどの特定タイプの細胞の負の選択、除去または枯渇は、そのような細胞の数または百分率を減少させることを意味するが、必ずしもそのような細胞の全てが完全に除去される必要はない。
【０１４８】
いくつかの例では、複数回の分離工程が実施され、１回の工程からの正または負の選択画分が、後続する正または負の選択などの別の分離工程に供される。いくつかの例では、細胞と、それぞれ負の選択の標的となるマーカーに特異的である、複数の抗体または結合パートナーとをインキュベートすることなどによって、単一の分離工程が、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させる得る。同様に、細胞と、様々な細胞型で発現される複数の抗体または結合パートナーとをインキュベートすることによって、複数の細胞型が同時に正に選択され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、表面マーカーなどの１つまたは複数のＴ細胞集団は、１つまたは複数の特定のマーカーについて陽性である（ｍａｒｋｅｒ＋）、またはそれを高レベルで発現する（ｍａｒｋｅｒｈｉｇｈ）細胞、または１つまたは複数のマーカーについて陰性である（ｍａｒｋｅｒ−）、またはそれを比較的低レベルで発現する（ｍａｒｋｅｒｌｏｗ）細胞が、富化されておりまたは枯渇している。例えば、いくつかの態様では、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの１つまたは複数の表面マーカーについて陽性である、またはそれを高レベルで発現する細胞などのＴ細胞の特定の亜集団が、正または負の選択技術によって単離される。場合によっては、このようなマーカーは、Ｔ細胞の特定の集団（非記憶細胞など）に存在しないかまたは比較的低いレベルで発現されるが、Ｔ細胞の特定のその他の集団（記憶細胞など）に比較的より高いレベルで存在しまたは発現されるものである。一実施形態では、細胞（ＣＤ８＋細胞またはＴ細胞など、例えばＣＤ３＋細胞）は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ１２７、および／またはＣＤ６２Ｌについて陽性でありまたはそれを高い表面レベルで発現する細胞が富化されており（すなわち、正に選択される）、および／またはＣＤ４５ＲＡについて陽性でありまたはそれを高い表面レベルで発現する細胞が枯渇している（例えば、負に選択される）。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ２５、ＣＤ２７、および／またはＩＬ７−Ｒα（ＣＤ１２７）について陽性でありまたはそれを高い表面レベルで発現する細胞が、富化されておりまたは枯渇している。いくつかの例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌについて陽性（またはＣＤ４５ＲＡについて陰性）の細胞が富化されている。
【０１５０】
例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を用いて、正に選択され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｂ細胞、単球、またはＣＤ１４などのその他の白血球細胞などの非Ｔ細胞上で発現される陰性の選択マーカーによって、ＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程を使用して、ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が分離される。このようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団は、１つまたは複数の未感作、メモリー、および／またはエフェクターＴ細胞亜集団上で発現される、または比較的高い程度で発現される、マーカーに対する正または負の選択によって、亜集団にさらに分類され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく正または負の選択などによって、未感作、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および／またはセントラルメモリー幹細胞についてさらに富化または枯渇されている。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の富化が実施されて、投与に続く長期生存、拡張および／または生着を改善するなど、有効性を高め、それはいくつかの態様では、このような亜集団において特に堅固である。Ｔｅｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ．１：７２−８２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＣＭ富化ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とを組み合わせることにより、有効性がさらに増強される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ−サブセットの双方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体などを使用して、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分が富化または枯渇され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団は、例えば、セントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞が富化された亜集団などの。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の富化は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、および／またはＣＤ１２７の陽性または高度の表面発現に基づき；いくつかの態様では、それは、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはグランザイムＢを発現しまたは高度に発現する細胞の負の選択に基づく。いくつかの態様では、ＴＣＭ細胞富化ＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、およびＣＤ６２Ｌを発現する細胞の正の選択または富化によって実施される。一態様では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の富化は、ＣＤ４発現に基づいて選択される細胞の陰性画分から出発して行われ、それはＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡの発現に基づく負の選択、およびＣＤ６２Ｌに基づく正の選択を受ける。そのような選択は、いくつかの態様では同時に行われ、その他の態様ではいずれかの順序で順次行われる。いくつかの態様では、ＣＤ８＋細胞集団または亜集団を調製するのに使用されるのと同じＣＤ４発現に基づく選択工程が、ＣＤ４＋細胞集団または亜集団を作製するのにも使用され、その結果、ＣＤ４に基づく分離からの陽性および陰性画分の双方が保持され、任意選択的に１つまたは複数のさらなる正または負の選択工程に続いて、方法の引き続く工程で使用される。
【０１５５】
特定の例では、ＰＢＭＣまたはその他の白血球のサンプルは、ＣＤ４＋細胞の選択に供され、陰性画分および陽性画分の双方が保持される。次に陰性画分は、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ１９の発現に基づく負の選択、およびＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７などのセントラルメモリーＴ細胞のマーカーに基づく正の選択に供され、正の選択および負の選択はどちらの順序でも実施される。
【０１５６】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、未感作、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に分類される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準法によって得られ得る。いくつかの実施形態では、未感作ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＯである。
【０１５７】
一例では、負の選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体混合物は、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズのような固体支持体またはマトリックスに結合され、正および／または負の選択について細胞が分離できるようにする。例えば、いくつかの実施形態では、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術を用いて、分離または単離される（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５８：Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．２：Ｃｅｌｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，ｐ  １７−２５  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｓ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ（著作権）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪで概説される）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作の前に、またはそれに関連してインキュベートおよび／または培養される。インキュベーション工程は、培養、育成、刺激、活性化、および／または増殖を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件としては、集団における細胞の増殖、拡張、活性化および／または生存を誘導するために、抗原曝露を模倣するために、および／または組換え抗原受容体の導入などのための遺伝子操作のために細胞を準備するために、設計されたものが挙げられる。
【０１５９】
条件としては、１つまたは複数の特定の培地；温度；酸素含有量；二酸化炭素含有量；時間；例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンなどの作用物質；および／またはサイトカインなどの刺激因子；ケモカイン；抗原；結合パートナー；融合タンパク質；組換え可溶性受容体；および細胞を活性化するように設計された任意のその他の作用物質が挙げられる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、刺激条件または作用物質は、例えばリガンドなどの、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化できる、１つまたは複数の作用物質を含む。いくつかの態様では、作用物質は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードを活性化しまたは開始する。このような作用物質は、例えば、ビーズなどの固体支持体に結合した抗ＣＤ３や抗ＣＤ２８などの、ＴＣＲ成分および／または共刺激受容体に特異的なものなどの抗体、および／または１つまたは複数のサイトカインを含み得る。任意選択的に、この拡張方法は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を培地に（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）添加する工程をさらに含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、刺激剤は、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬの濃度のＩＬ−２などの、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含む。
【０１６１】
いくつかの態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌらに付与された米国特許第６，０４０，１７７号明細書、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１−６６０、Ｔｅｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ．１：７２−８２、および／またはＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１に記載されるものなどの技術に従って実施される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの培養開始組成物支持細胞を（例えば、得られる細胞集団が、拡張される最初の集団中の各Ｔリンパ球毎に少なくとも約５、１０、２０、または４０個以上のＰＢＭＣ支持細胞を含有するように）添加すること；および培養物を（例えば、Ｔ細胞数を拡張させるのに十分な時間にわたり）インキュベートすることによって拡張される。いくつかの態様では、非分裂支持細胞は、γ照射ＰＢＭＣ支持細胞を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、細胞分裂を防ぐために、ＰＢＭＣに約３０００〜３６００ラドの範囲のγ線が照射される。いくつかの態様では、支持細胞は、Ｔ細胞集団の添加前に培地に添加される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、刺激条件は、例えば、少なくとも約２５℃、一般に少なくとも約３０℃、および一般に約３７℃などのヒトＴリンパ球増殖に適した温度を含む。任意選択的に、インキュベーションは、支持細胞として、非分裂型ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を添加することをさらに含んでなってもよい。ＬＣＬは、約６０００〜１０，０００ラドの範囲のγ線で照射され得る。ＬＣＬ支持細胞は、いくつかの態様では、少なくとも約１０：１の最初のＴリンパ球に対するＬＣＬ支持細胞の比率などの任意の適切な量で提供される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーションおよび／または操作の前または後のいずれかで、細胞を例えば凍結保存するなど、凍結する工程を含む。いくつかの実施形態では、凍結および引き続く解凍工程は、細胞集団中の顆粒球を除去し、単球もある程度は除去する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程に続いて、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの態様では、様々な既知の凍結溶液およびパラメータのいずれかを使用することができる。一例は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または他の適切な細胞凍結媒体を含有するＰＢＳを使用することを伴う。次に、これは、ＤＭＳＯおよびＨＳＡの最終濃度がそれぞれ１０％および４％になるように、媒体で１：１に希釈される。次に、細胞は、一般に毎分１℃の速度で−８０℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞を冷凍保存の前または後に、同一患者に再導入することを含む。
【０１６６】
Ｂ．組換え受容体
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作を通じて導入された組換え受容体をコードする１つまたは複数の核酸と、このような核酸の遺伝子操作された生成物とを含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞は、組換え受容体をコードする核酸分子を（例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの形質導入を通じて）細胞に導入することによって、生成または作製され得る。いくつかの実施形態では、核酸は異種であり、すなわち、通常は細胞に、または細胞から得られたサンプルに存在せず、例えば、通常は操作された細胞に、および／またはこのような細胞が由来する生物に見られない、別の生物または細胞から得られたものなどである。いくつかの実施形態では、核酸は天然に存在せず、複数の異なる細胞型に由来する様々なドメインをコードする核酸のキメラの組み合わせを含んでなるものをはじめとする、天然に見られない核酸などである。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、１つまたは複数の腫瘍抗原などの１つまたは複数の標的抗原に結合するように改変されている。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＲＯＲ１、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂＢ２）、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ−２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ−４０）、ＥＰＨａ２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、ｅｒｂ−Ｂ４、ｅｒｂＢ二量体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＨ５、胎児型アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、（Ｌ１−ＣＡＭ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン、ＴＡＧ７２、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒａ２）、ＣＡ９、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩＭＡＧＥＡｌ、ＨＬＡ−Ａ２ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、がん精巣抗原、メソテリン、マウス型ＣＭＶ、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、Ｏ−アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリン、サイクリンＡ２、ＣＣＬ−１、ＣＤ１３８、病原体特異的抗原およびユニバーサル標識に関連する抗原から選択される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲなどによって、以下の腫瘍抗原の１つまたは複数に結合するように改変されている。腫瘍抗原としては、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＲＡＰ、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ−７、ＣＴ８／ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ｃＴＡＧＥ−１、フィビュリン−１、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｈＣＡＰ−Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ｃｗ、ＨＯＭ−ＨＤ−２１／ガレクチン９、ＨＯＭ−ＭＥＥＬ−４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ−ＲＣＣ−３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、ＫＭ−ＨＮ−３、ＫＭ−ＫＮ−１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＰＰ１１、ＭＳＬＮ、ＮＮＰ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＣＯ−３７、ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−５、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＮＹ−ＲＥＮ−１０、ＮＹ−ＲＥＮ−１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ−ＲＥＮ−２１、ＮＹ−ＲＥＮ−２６／ＢＣＲ、ＮＹ−ＲＥＮ−３／ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＲＥＮ−３３／ＳＮＣ６、ＮＹ−ＲＥＮ−４３、ＮＹ−ＲＥＮ−６５、ＮＹ−ＲＥＮ−９、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＯＧＦｒ、ＰＬＵ−１、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪκ、ＲＨＡＭＭ、ＳＣＰ１、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、またはチロシナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６８】
１．抗原受容体
ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
細胞は、一般に、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、そして遺伝子組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のようなその他の抗原結合受容体などの、機能性非ＴＣＲ抗原受容体をはじめとする、抗原受容体などの組換え受容体を発現する。受容体としては、その他のキメラ受容体も挙げられる。
【０１６９】
ＣＡＲなどの例示的抗原受容体、およびこのような受容体を操作して細胞に導入する方法としては、例えば、国際公開第２０００１４２５７号パンフレット、国際公開第２０１３１２６７２６号パンフレット、国際公開第２０１２／１２９５１４号パンフレット、国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレット、国際公開第２０１３／１６６３２１号パンフレット、国際公開第２０１３／０７１１５４号パンフレット、国際公開第２０１３／１２３０６１号パンフレット、米国特許出願公開第２００２１３１９６０号明細書、米国特許出願公開第２０１３２８７７４８号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１４９３３７号明細書、米国特許第６，４５１，９９５号明細書、米国特許第７，４４６，１９０号明細書、米国特許第８，２５２，５９２号明細書、米国特許第８，３３９，６４５号明細書、米国特許第８，３９８，２８２号明細書、米国特許第７，４４６，１７９号明細書、米国特許第６，４１０，３１９号明細書、米国特許第７，０７０，９９５号明細書、米国特許第７，２６５，２０９号明細書、米国特許第７，３５４，７６２号明細書、米国特許第７，４４６，１９１号明細書、米国特許第８，３２４，３５３号明細書、および米国特許第８，４７９，１１８号明細書、および欧州特許出願第２５３７４１６号明細書に記載されるもの、および／またはＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３  Ａｐｒｉｌ；３（４）：３８８−３９８；Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；２４（５）：６３３−３９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２  Ｍａｒｃｈ  １８（２）：１６０−７５によって記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、抗原受容体としては、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されるようなＣＡＲ、および国際公開第２０１４０５５６６８Ａ１号パンフレットに記載されるものが挙げられる。ＣＡＲの例としては、国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレット、米国特許第８，３３９，６４５号明細書、米国特許第７，４４６，１７９号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１４９３３７号明細書、米国特許第７，４４６，１９０号明細書、米国特許第８，３８９，２８２号明細書、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１０，２６７−２７６（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１；およびＢｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３  ５（１７７）などの前述の文献のいずれかで開示されるようなＣＡＲが挙げられる。国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレット、米国特許第８，３３９，６４５号明細書、米国特許第７，４４６，１７９号明細書、米国特許第２０１３／０１４９３３７号明細書、米国特許第７，４４６，１９０号明細書、および米国特許第８，３８９，２８２号明細書もまた参照されたい。ＣＡＲなどのキメラ受容体は、一般に、例えばｓｃＦｖ抗体フラグメ���トである、抗体の可変重（ＶＨ）鎖領域および／または可変軽（ＶＬ）鎖領域のような抗体分子の一部などの細胞外抗原結合ドメインを一般に含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、受容体によってターゲティングされる抗原は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、それは炭水化物またはその他の分子である。いくつかの実施形態では、抗原は、正常細胞または非標的細胞または組織と比較して、例えば腫瘍または病原性細胞などの疾患または病状の細胞上で、選択的に発現されまたは過剰発現される。その他の実施形態では、抗原は、正常細胞上で発現され、および／または操作された細胞上で発現される。
【０１７１】
受容体によってターゲティングされてもよい抗原としては、αｖβ６インテグリン（ａｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９；ＣＡＩＸまたはＧ２５０としても知られている）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ；ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−２としても知られている）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ−１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、上皮成長因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、切断型上皮成長因子タンパク質（ｔＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮成長因子受容体変異（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ−２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ−４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；Ｆｃ受容体ホモログ５またはＦＣＲＨ５としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体α、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ−アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ−Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ−Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ−ＡＩ）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ＩＬ−２２受容体α（ＩＬ−２２Ｒａ）、ＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒａ２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、κ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｌ１−ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシン富化リピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、メソテリン、ｃ−Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ−１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん胎児性抗原、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲｌ）、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ；５Ｔ４としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、および病原体特異的抗原が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態の受容体によってターゲティングされる抗原としては、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲｌ、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌｌ−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、０ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３、もしくは４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、およびＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）などのサイクリン、および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはその他の病原体によって発現される分子が挙げられる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＲＢＢ２、ＧＤ２、α−葉酸受容体、ルイスＹ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）または腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、病原体特異的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス抗原（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなど）、細菌抗原、および／または寄生性抗原に対して特異的である。
【０１７５】
キメラ受容体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。ＣＡＲなどのキメラ受容体は、一般に例えばｓｃＦｖ抗体フラグメントである、抗体の可変重（ＶＨ）鎖領域および／または可変軽（ＶＬ）鎖領域のような抗体分子の一部などの細胞外抗原結合ドメインを一般に含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、例えばＣＡＲなどの組換え受容体の抗体部分は、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域のようなヒンジ領域および／またはＣＨ１／ＣＬおよび／またはＦｃ領域などの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、定常領域または部分は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１などのヒトＩｇＧである。いくつかの態様では、定常領域の部分は、例えばｓｃＦｖなどの抗原認識成分と、膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域の役割を果たす。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合に続く細胞の応答性の増大をもたらす長さであり得る。例えば、ヒンジ領域などの例示的スペーサーとしては、国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。いくつかの例では、スペーサーは、１２アミノ酸長または約１２アミノ酸長であるか、または１２アミノ酸長以下である。例示的スペーサーとしては、少なくとも約１０〜２２９個のアミノ酸、約１０〜２００個のアミノ酸、約１０〜１７５個のアミノ酸、約１０〜１５０個のアミノ酸、約１０〜１２５個のアミノ酸、約１０〜１００個のアミノ酸、約１０〜７５個のアミノ酸、約１０〜５０個のアミノ酸、約１０〜４０個のアミノ酸、約１０〜３０個のアミノ酸、約１０〜２０個のアミノ酸、または約１０〜１５個のアミノ酸、および列挙されたいずれかの範囲の終点の間の任意の整数を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、約１２個以下のアミノ酸、約１１９個以下のアミノ酸、または約２２９個以下のアミノ酸を有する。例示的スペーサーとしては、ＩｇＧ４ヒンジのみ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結したＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＨ３ドメインに連結したＩｇＧ４ヒンジが挙げられる。
【０１７７】
例示的スペーサーとしては、Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１９：３１５３または国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレットに記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号５１２１３に記載される配列を有し、配列番号５１２１２に記載される配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号５１２１４に記載される配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号５１２１５に記載される配列を有する。いくつかの実施形態では、定常領域または部分はＩｇＤのものである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号５１２１６に記載される配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号５１２１３、５１２１４、５１２１５または５１２１６のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【０１７８】
この抗原認識ドメインは、ＣＡＲの場合にはＴＣＲ複合体などの抗原受容体複合体を通じた活性化を模倣するシグナル伝達成分、および／または別の細胞表面受容体を通じたシグナルなどの１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に一般に連結している。したがって、いくつかの実施形態では、抗原結合成分（例えば、抗体）は、１つまたは複数の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに連結している。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインに融合する。一実施形態では、例えば、ＣＡＲなどの受容体中の１つのドメインに天然に結合する、膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、このようなドメインと、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を避けるために、選択されまたはアミノ酸置換によって修飾されて、受容体複合体のその他の構成員との相互作用が最小化される。
【０１７９】
いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、天然または合成起源のどちらかに由来する。起源が天然である場合、いくつかの態様では、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のαまたはβまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来するものを含む（すなわち少なくともその膜貫通領域を含んでなる）。代案としては、いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、合成される。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは、主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでなる。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端に見いだされるであろう。いくつかの実施形態では、連結は、リンカー、スペーサーおよび／または膜貫通ドメインによるものである。
【０１８０】
細胞内シグナル伝達ドメインとしては、天然抗原受容体を通じたシグナル、このような受容体と共刺激受容体との組み合わせと組み合わせを通じたシグナル、および／または共刺激受容体のみを通じたシグナルを模倣または近似するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、例えばグリシン−セリン二つ組などのグリシンおよびセリンを含有するものなどの例えば２〜１０アミノ酸長のリンカーなどの短いオリゴ−またはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間に存在して、連結を形成する。
【０１８１】
例えばＣＡＲなどの受容体は、一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの実施形態では、受容体は、例えばＣＤ３ζ鎖などの、Ｔ細胞活性化および細胞傷害性を媒介するＴＣＲ  ＣＤ３鎖などの、ＴＣＲ複合体の細胞内成分を含む。したがって、いくつかの態様では、抗原結合部分は、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、および／またはその他のＣＤ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、例えばＣＡＲなどの受容体は、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ１６などの１つまたは複数の追加的な分子の一部をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体は、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３−ζ）またはＦｃ受容体γと、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６との間のキメラ分子を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはその他のキメラ受容体とのライゲーションに際して、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞などの免疫細胞の、正常なエフェクター機能または応答の少なくとも１つを活性化する。例えば、いくつかの状況では、ＣＡＲは、細胞溶解活性またはサイトカインまたはその他の因子の分泌などのＴヘルパー活性などのＴ細胞の機能を誘導する。いくつかの実施形態では、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合、抗原受容体成分の細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分または共刺激分子が、非損傷免疫賦活性鎖の代わりに使用される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、いくつかの実施形態では、天然の状況においてこのような受容体と協調して作用し抗原受容体結合に続くシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列、および／またはこのような分子の任意の誘導体または変異型、および／または同一機能的能力を有する任意の合成配列もまた含む。
【０１８３】
天然ＴＣＲの文脈で、完全な活性化は、一般に、ＴＣＲを通じたシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルもまた必要とする。したがって、いくつかの実施形態では、完全な活性化を促進するために、二次的または共刺激シグナルを生じさせるための成分もまた、ＣＡＲに含まれる。その他の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナルを生じさせるための成分を含まない。いくつかの態様では、追加的なＣＡＲが同一細胞内で発現され、二次的または共刺激シグナルを生じさせるための成分を提供する。
【０１８４】
Ｔ細胞活性化は、いくつかの態様では、ＴＣＲを通じて抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原非依存性様式で作用して二次的または共刺激シグナルを提供するもの（二次的細胞質シグナル伝達配列）との、２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると記載されている。いくつかの態様では、ＣＡＲは、このようなシグナル伝達成分の片方または双方を含む。
【０１８５】
いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている、シグナル伝達モチーフを含有してもよい。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ζ鎖、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３εに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部、またはＣＤ３ζ由来の配列を含有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、およびＩＣＯＳなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。いくつかの態様では、同一ＣＡＲは、活性化成分と共刺激成分の双方を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、活性化ドメインが１つのＣＡＲ内に含まれる一方で、共刺激成分は別の抗原を認識する別のＣＡＲによって提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、どちらも同一細胞上で発現される、活性化または刺激ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲの双方を含む（国際公開第２０１４／０５５６６８号パンフレットを参照されたい）。いくつかの態様では、細胞は、１つまたは複数の刺激または活性化ＣＡＲおよび／または共刺激ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、細胞阻害的ＣＡＲ（ｉＣＡＲ；Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５（２１５）（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１３）を参照されたい、疾患または病状に関連しおよび／またはそれに特異的なもの以外の抗原を認識するＣＡＲなどをさらに含み、それによって疾患ターゲティングＣＡＲを通じて送達された活性化シグナルは、阻害性ＣＡＲのそのリガンドへの結合によって低下しまたは阻害され、例えばオフターゲット効果が減少する。
【０１８８】
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３−ζ）細胞内ドメインに連結した、ＣＤ２８膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインに連結された、キメラＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含んでなる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞質部分中に、例えば２つ以上などの１つまたは複数の共刺激ドメインと、例えば一次活性化ドメインなどの、活性化ドメインとを包含する。例示的ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、および４−１ＢＢの細胞内成分を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはその他の抗原受容体は、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）のような切断型細胞表面受容体などの受容体を発現する細胞の形質導入または操作を確認するために使用されてもよい、細胞表面マーカーなどのマーカーをさらに含む。いくつかの態様では、マーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、または上皮成長因子受容体（例えば、ｔＥＧＦＲ）の全部または一部（例えば、切断型）を含む。いくつかの実施形態では、マーカーをコードする核酸は、例えばＴ２Ａなどの切断可能リンカー配列のようなリンカー配列をコードする、ポリヌクレオチドと作動可能に連結される。国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレットを参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａリボソームスイッチによって隔てられるＣＡＲおよびＥＧＦＲｔをコードするコンストラクトの導入は、同一コンストラクトから２つのタンパク質を発現し得て、その結果、ＥＧＦＲｔは、このようなコンストラクトを発現する細胞を検出するためのマーカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、マーカー、および任意選択的にリンカー配列は、国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレットに開示されているようなものであれば何でもよい。例えば、マーカーは、任意選択的に、Ｔ２Ａ切断可能リンカー配列などのリンカー配列に連結された切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）であり得る。切断型ＥＧＦＲ（例えば、ｔＥＧＦＲ）の例示的ポリペプチドは、配列番号５１２１８に記載されるアミノ酸配列、または配列番号５１２１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す、アミノ酸配列を含んでなる。例示的Ｔ２Ａリンカー配列は、配列番号５１２１７に記載されるアミノ酸配列、または配列番号５１２１７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、マーカーは、Ｔ細胞上に天然に見られない、またはＴ細胞の表面に天然に見られない、例えば、細胞表面タンパク質またはその一部などの分子である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、マーカーは、例えば、細胞表面タンパク質などの分子であり、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系によって、「自己」として認識されないものである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、マーカーは、例えば、成功裏に操作された細胞を選択するための遺伝子操作のマーカーとして使用される以外に、治療機能を果たさず、および／または効果をもたらさない。その他の実施形態では、マーカーは、養子免疫伝達およびリガンドとの遭遇に際して、細胞の応答を増強および／または抑制するための、共刺激または免疫チェックポイント分子などのインビボで遭遇する細胞のリガンドのような、治療分子またはいくつかの所望の効果を発揮する分子であってもよい。
【０１９４】
場合によっては、ＣＡＲは、第１世代、第２世代、および／または第３世代ＣＡＲと称される。いくつかの態様では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合に際してＣＤ３鎖誘導シグナルのみを提供するものであり；いくつかの態様では、第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８またはＣＤ１３７などの共刺激レセプターに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含むものなどの、このようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するものであり；いくつかの態様では、第３世代ＣＡＲは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体または抗体フラグメントを含有する細胞外部分を含む。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、抗体またはフラグメントを含有する細胞外部分と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはフラグメントは、ｓｃＦｖと、ＩＴＡＭを含有する細胞内ドメインとを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖のζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する、膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含有する。細胞外ドメインおよび膜貫通は、直接的または間接的に連結され得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通は、本明細書に記載されるようなスペーサーによって連結される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間などの、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４１ＢＢである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば抗体フラグメントなどの抗体；ＣＤ２８の膜貫通部分またはその機能性変異型でありまたはそれを含有する膜貫通ドメイン；ＣＤ２８またはその機能性変異型のシグナル伝達部分と、ＣＤ３ζまたはその機能性変異型のシグナル伝達部分とを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば抗体フラグメントなどの抗体；ＣＤ２８の膜貫通部分またはその機能性変異型でありまたはそれを含有する膜貫通ドメイン；４−１ＢＢまたはその機能性変異型のシグナル伝達部分と、ＣＤ３ζまたはその機能性変異型のシグナル伝達部分とを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかのこのような実施形態では、受容体は、ヒンジ専用スペーサーなどの、例えばＩｇＧ４ヒンジのようなＩｇヒンジなどの、ヒトＩｇ分子などのＩｇ分子の一部を含有するスペーサーをさらに含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、例えばＣＡＲなどの受容体の膜貫通ドメインは、例えばヒトＣＤ２８（受入番号Ｐ１０７４７．１）の２７アミノ酸膜貫通ドメインなどのヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはその変異型であるか、または配列番号５１２１９に記載されるアミノ酸配列、または配列番号５１２１９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、膜貫通ドメインであり、いくつかの実施形態では、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、配列番号５１２２０に記載されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４１ＢＢである。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその４１アミノ酸ドメインなどの、および／または天然ＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７位にＬＬからＧＧへの置換を有するドメインなどの、そのその機能性変異型または部分を含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５１２２１または５１２２２に記載されるアミノ酸配列、または配列番号５１２２１または５１２２２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号５１２２３に記載されるアミノ酸配列、または配列番号５１２２３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列などの、ヒト４−１ＢＢ（受入番号Ｑ０７０１１．１）の４２アミノ酸細胞質ドメイン、またはその機能性変異型または部分などの、４１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその機能性変異型または部分を含んでなる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、米国特許第７，４４６，１９０号明細書または米国特許第８，９１１，９９３号明細書に記載されるような、ヒトＣＤ３ζ（受入番号Ｐ２０９６３．２）またはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのイソ型３の１１２  ＡＡ細胞質ドメインなどの、ヒトＣＤ３ζ刺激性シグナル伝達ドメイン、またはその機能性変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５１２２４、５１２２５または５１２２６に記載されるアミノ酸配列、または配列番号５１２２４、５１２２５または５１２２６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。
【０２０１】
いくつかの態様では、スペーサーは、配列番号５１２１３に記載されるヒンジ専用スペーサーなどの、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のヒンジのみなどの、ＩｇＧのヒンジ領域のみを含有する。その他の実施形態では、スペーサーは、例えばＩｇヒンジであり、およびＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジなどである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、例えば配列番号３９６に記載されるような、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジなどのＩｇヒンジである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、例えば配列番号５１２１４に記載されるような、ＣＨ３ドメインのみに連結されたＩｇＧ４ヒンジなどのＩｇヒンジである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシン−セリン富化配列、または既知の可撓性リンカーなどのその他の可撓性リンカーであるか、またはそれを含んでなる。
【０２０２】
例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは抗体またはフラグメントを含み、それは、抗原、Ｉｇヒンジ含有スペーサーのいずれかなどのスペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは抗体またはフラグメントを含み、それは、抗原、Ｉｇヒンジ含有スペーサーのいずれかなどのスペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、このようなＣＡＲコンストラクトは、Ｔ２Ａリボソームスキップ要素および／または例えばＣＡＲ下流のｔＥＧＦＲ配列をさらに含む。
【０２０３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用され、最小の長さに限定されない。リンカーまたはペプチドなどの提供される受容体およびその他のポリペプチドをはじめとするポリペプチドは、天然および／または非天然アミノ酸残基をはじめとするアミノ酸残基を含んでもよい。用語はまた、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、およびリン酸化などのポリペプチドの発現後修飾も含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を保持する限り、天然または自然配列に対する修飾を含有してもよい。これらの修飾は、部位特異的変異誘発などのように意図的であってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の変異、またはＰＣＲ増幅に起因する誤りのように偶然的であってもよい。
【０２０４】
ｂ）Ｔ細胞受容体
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または天然に存在するＴ細胞からクローン化されたＴＣＲを含む。したがって、いくつかの実施形態では、標的細胞は、特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子）を含有するように改変されている。ＴＣＲまたはその抗原結合部分としては、腫瘍、ウイルスまたは自己免疫タンパク質の抗原などのターゲティングポリペプチドのペプチドエピトープまたはＴ細胞エピトープを認識するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＰ１００、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ１）、黒色腫抗原Ａ３（ＭＡＧＥ  Ａ３）、ＮＹＥＳＯ１またはｐ５３などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変αおよびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られている）または可変γおよびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られている）またはその抗原結合部分を含有して、ＭＨＣ分子に結合したペプチドに特異的に結合できる分子である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはαβ形態である。典型的に、αβおよびγδ形態で存在するＴＣＲは、一般に構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は、別個の解剖学的位置または機能を有してもよい。一般に、ＴＣＲは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に一般的に関与する、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面で発現され、または発現され得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは完全なＴＣＲまたはその抗原結合部分または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、αβ形態またはγδ形態のＴＣＲなどの非損傷または完全長ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲ未満であるが、ＭＨＣペプチド複合体に結合するなどの、ＭＨＣ分子中の特異的ペプチド結合に結合する、抗原結合部分である。場合によっては、ＴＣＲの抗原結合部分またはフラグメントは、完全長または非損傷ＴＣＲの構造ドメインのほんの一部分を含有し得るが、完全ＴＣＲがそれに結合するＭＨＣペプチド複合体などのペプチドエピトープに依然として結合できる。場合によっては、抗原結合部分は、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖などのＴＣＲの可変ドメインを含有して、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分である。一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣおよび／またはＭＨＣ−ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲの可変ドメインは、抗原認識および結合能力および特異性に主要な寄与体である超可変ループまたはＣＤＲを含有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲまたはその組み合わせは、所与のＴＣＲ分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の様々なＣＤＲは、一般に、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられ、これは一般に、ＣＤＲと比較して、ＴＣＲ分子間の変動性がより低い（例えば、Ｊｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９１３８，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３７４５，１９８８を参照されたい；Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５，２００３もまた参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、抗原結合または特異性に関与する主要ＣＤＲであるか、または抗原認識のための、および／またはペプチド−ＭＨＣ複合体のプロセスされたペプチド部分との相互作用のための、所与のＴＣＲ可変領域上の３つのＣＤＲのうちで最も重要である。いくつかの状況では、α鎖のＣＤＲ１は、特定の抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用し得る。いくつかの状況では、β鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用し得る。いくつかの状況では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ−ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用またはその認識に関与する一次ＣＤＲに最も大きく寄与し、または一次ＣＤＲである。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域は、超抗原結合に一般に関与して抗原認識ではない、さらなる超可変領域（ＣＤＲ４またはＨＶＲ４）を含有し得る（Ｋｏｔｂ（１９９５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，８：４１１−４２６）。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、可変αドメイン（Ｖα）および／または可変βドメイン（Ｖβ）、またはその抗原結合断片を含有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖は、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または短い細胞質テールもまた含有し得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３３，１９９７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、α鎖定常ドメインは、ＴＲＡＣ遺伝子（ＩＭＧＴ命名法）によってコードされ、またはその変異型である。いくつかの実施形態では、β鎖定常領域は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子（ＩＭＧＴ命名法）によってコードされまたはその変異型である。いくつかの実施形態では、定常ドメインは細胞膜に隣接する。例えば、場合によっては、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜隣接定常ドメインと、２つの膜遠位可変ドメインとを含有し、その可変ドメインはそれぞれＣＤＲを含有する。
【０２０９】
ＴＣＲの様々なドメインまたは領域を決定しまたは同定することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの態様では、ＴＣＲの残基は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）番号付与体系によって知られているか、または同定され得る（例えば、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇを参照されたい；Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２  ＆；５５−７７；およびＴｈｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｅｆｒａｎｃ  ａｎｄ  ＬｅＦｒａｎｃ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１もまた参照されたい）。この体系を用いて、ＴＣＲ  Ｖα鎖および／またはＶβ鎖内のＣＤＲ１配列は、残基番号２７〜３８に存在するアミノ酸に対応し、ＴＣＲ  Ｖα鎖および／またはＶβ鎖内のＣＤＲ２配列は、残基番号５６〜６５に存在するアミノ酸に対応し、ＴＣＲ  Ｖα鎖および／またはＶβ鎖内のＣＤＲ３配列は、残基番号１０５〜１１７に存在するアミノ酸に対応する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ジスルフィド結合などによって連結される、２本の鎖αおよびβ（または任意選択的にγおよびδ）のヘテロ二量体であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲの定常ドメインは短い結合配列を含有してもよく、その中ではシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによって２本のＴＣＲ鎖を連結する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが定常ドメイン中に２つのジスルフィド結合を含有するように、ＴＣＲがそれぞれのαおよびβ鎖中に追加的なシステイン残基を有してもよい。いくつかの実施形態では、定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合を含有する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、記載されるような細胞を操作するためのＴＣＲは、実質的に完全長のコード配列が容易に入手できる、Ｖα、β鎖の配列などの、既知のＴＣＲ配列から作製されるものである。細胞供給源からのＶ鎖配列を含む完全長ＴＣＲ配列を得る方法は、良く知られている。いくつかの実施形態では、所与の細胞内のまたはそれから単離された、ＴＣＲをコードする核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または公的に利用可能なＴＣＲ  ＤＮＡ配列の合成などによって、ＴＣＲをコードする核酸は、様々な起源から得られ得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源に由来する細胞などの、生物学的起源から得られ得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はインビボ単離細胞から得られ得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は培養したＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識から、合成的に作製され得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、がん抗原）に対する高親和性Ｔ細胞クローンが同定され、患者から単離され、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、標的抗原のＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）で操作された遺伝子組換えマウスにおいて作製されている。例えば腫瘍抗原を参照されたい（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１６９−１８０  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５７９９−５８０８を参照されたい。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイが使用されて、標的抗原に対するＴＣＲを単離される（例えば、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１４：１３９０−１３９５  ａｎｄ  Ｌｉ（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９−３５４を参照されたい。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、修飾または操作されているものである。いくつかの実施形態では、指向性進化法が使用され、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体に対するより高い親和性などの変化した特性を有するＴＣＲが作製される。いくつかの実施形態では、指向性進化は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４，５５−６２；Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，５３８７−９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９−５４）、またはＴ細胞提示（Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５−８４）をはじめとするが、これに限定されるものではない、提示方法によって達成される。いくつかの実施形態では、提示アプローチは、既知の親ＴＣＲまたは参照ＴＣＲを操作し、または修飾することを伴う。例えば、場合によっては、野生型ＴＣＲが、変異誘発ＴＣＲを生成するための鋳型として使用され得て、ＣＤＲの１つまたは複数の残基が変異され、所望の標的抗原に対するより高い親和性などの所望の改変された特性を有する変異体が選択される。
【０２１４】
記載されるようないくつかの実施形態では、ＴＣＲは、導入されたジスルフィド結合を含有し得る。いくつかの実施形態では、天然ジスルフィド結合は存在しない。いくつかの実施形態では、天然鎖間ジスルフィド結合を形成する、（例えば、α鎖およびβ鎖の定常ドメイン中の）１つまたは複数の天然システインが、例えばセリンまたはアラニンなどの別の残基によって置換される。いくつかの実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、例えばα鎖およびβ鎖の定常ドメイン中などの、αおよびβ鎖上の非システイン残基をシステインに変異させることによって形成され得る。ＴＣＲの例示的非天然ジスルフィド結合は、国際公開第２００６／０００８３０号パンフレットおよび国際公開第２００６０３７９６０号パンフレットに記載される。いくつかの実施形態では、システインは、α鎖の残基Ｔｈｒ４８およびβ鎖のＳｅｒ５７に、α鎖の残基Ｔｈｒ４５およびβ鎖のＳｅｒ７７に、α鎖の残基Ｔｙｒ１０およびβ鎖のＳｅｒ１７に、α鎖の残基Ｔｈｒ４５およびβ鎖のＡｓｐ５９に、および／またはα鎖の残基Ｓｅｒ１５およびβ鎖のＧｌｕ１５に、導入され得る。いくつかの実施形態では、組換えＴＣＲ中の非天然システイン残基（例えば、生じた１つまたは複数の非天然ジスルフィド結合）の存在は、天然ＴＣＲ鎖を含有するミスマッチＴＣＲ対の過剰発現が導入された細胞における、所望の組換えＴＣＲの生成を支援し得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは正に帯電している。場合によっては、ＴＣＲ鎖は細胞質テールを含有する。いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖（例えば、αまたはβ）は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質テールを有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、例えば、細胞質テールを通じて、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と結合する。場合によっては、この構造は、ＴＣＲが、ＣＤ３およびそのサブユニットのような別の分子と結合できるようにする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、タンパク質を細胞膜に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと結合してもよい。ＣＤ３シグナル伝達サブユニット（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３ζ鎖）の細胞内テールは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する、１つまたは複数の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含有する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは完全長ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ−ＴＣＲ）である。ＴＣＲは、細胞結合形態または可溶性形態であってもよい。いくつかの実施形態では、提供される方法の目的のために、細胞結合形態のＴＣＲは細胞の表面で発現される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ｄＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第１のポリペプチドと、ＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第２のポリペプチドとを含有し、第１および第２のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの実施形態では、結合は、天然二量体αβＴＣＲに存在する天然鎖間ジスルフィド結合に相当し得る。いくつかの実施形態では、鎖間ジスルフィド結合は、天然のＴＣＲには存在しない。例えば、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のシステインは、ｄＴＣＲポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込まれ得る。場合によっては、天然および非天然ジスルフィド結合の双方が望ましいこともある。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、膜貫通配列を含有して膜に固着する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ｄＴＣＲは、可変αドメイン、定常αドメイン、定常αドメインＣ末端に付着する第１の二量体化モチーフを含有するＴＣＲα鎖と、可変βドメイン、定常βドメイン、定常βドメインＣ末端に付着する第１の二量体化モチーフを含んでなるＴＣＲβ鎖とを含有し、第１および第２の二量体化モチーフは容易に相互作用して、第１の二量体化モチーフのアミノ酸と第２の二量体化モチーフのアミノ酸との間に共有結合を形成し、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を一緒に連結する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＭＨＣ−ペプチド複合体を結合できるα鎖およびβ鎖を含有する単一のアミノ酸鎖である、ｓｃＴＣＲである。典型的に、ｓｃＴＣＲは、当業者に知られている方法を用いて作製され得て、例えば、国際公開第９６／１３５９３号パンフレット、国際公開第９６／１８１０５号パンフレット、国際公開第９９／１８１２９号パンフレット、国際公開第０４／０３３６８５号パンフレット、国際公開第２００６／０３７９６０号パンフレット、国際公開第２０１１／０４４１８６号パンフレット；米国特許第７，５６９，６６４号明細書；およびＳｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，８５９（１９９６）を参照されたい。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列Ｎ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列Ｎ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端と融合したα鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメントと、配列β鎖の細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメントと、任意選択的に、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列とを含有する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端と融合したＴＣＲβ鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメントと、配列α鎖の細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメントと、任意選択的に、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列とを含有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲがＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するためには、その可変領域配列がこのような結合のために配向されるように、α鎖およびβ鎖が対形成されなくてはならない。ｓｃＴＣＲにおけるαおよびβの対形成を促進する様々な方法が、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、α鎖およびβ鎖を連結して単一のポリペプチド鎖を形成する、リンカー配列が含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーの長さが、ｓｃＴＣＲの標的ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を阻止または減少させるほどに長くないことを確実にしながら、リンカーは、α鎖のＣ末端とβ鎖のＮ末端との間の距離に広がる十分な長さを有するべきであり、または逆もまた同様である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＴＣＲセグメントを連結するｓｃＴＣＲのリンカーは、ＴＣＲ結合特異性を保ちながら単一のポリペプチド鎖を形成できる任意のリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、例えば、式、−Ｐ−ＡＡ−Ｐ−を有してもよく、式中、Ｐはプロリンであり、ＡＡはアミノ酸がグリシンおよびセリンであるアミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態では、第１および第２のセグメントは、その可変領域配列がこのような結合のために配向するように対形成する。場合によっては、リンカーは、第１のセグメントのＣ末端と第２のセグメントのＮ末端との間の距離に広がる十分な長さを有し、または逆もまた同様であるが、ｓｃＴＣＲの標的リガンドへの結合を阻止または減少させるほどには長くない。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、２９、３０、３１または３２個のアミノ酸などの、１０〜３０個のアミノ酸または２６〜４１個のアミノ酸残基などの、約１０〜４５個のアミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、式、−ＰＧＧＧ−（ＳＧＧＧＧ）  ５−Ｐ−または−ＰＧＧＧ−（ＳＧＧＧＧ）  ６−Ｐ−を有し、式中、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである（配列番号５１２２７または５１２２８）。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列
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を有する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、単一アミノ酸鎖の残基間にジスルフィド結合を含有し、それは場合によっては、一本鎖分子のαおよびβ領域間の対形成の安定性を促進し得る（例えば、米国特許第７，５６９，６６４号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、一本鎖分子の、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基とβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基とを連結する、共有結合型ジスルフィド結合を含有する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、天然ｄＴＣＲに存在する天然ジスルフィド結合に対応する。いくつかの実施形態では、天然ＴＣＲ中にジスルフィド結合は存在しない。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、例えば、１つまたは複数のシステインを、ｓｃＴＣＲポリペプチドの第１鎖および第２鎖領域の細胞外配列の定常領域に組み込むことで、非天然ジスルフィド結合に導入される。例示的なシステイン変異としては、上記のいずれかが挙げられる。場合によっては、天然および非天然ジスルフィド結合の双方が望ましいこともある。
【０２２７】
ｓｃＴＣＲは、非ジスルフィド連結切断型ＴＣＲであり、そのＣ末端に融合した異種ロイシンジッパーが、鎖結合を促進する（例えば、国際公開第９９／６０１２０号パンフレットを参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ペプチドリンカーを介してＴＣＲβ可変ドメインに共有結合する、ＴＣＲα可変ドメインを含有する（例えば、国際公開第９９／１８１２９号パンフレットを参照されたい）。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲをはじめとするＴＣＲのいずれかを、Ｔ細胞表面に活性ＴＣＲをもたらす伝達ドメインに連結させ得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞表面に発現される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、膜貫通配列に対応する配列を含有する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣαまたはＣβ膜貫通ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８またはＢ７．１からの膜貫通領域などの非ＴＣＲ起源に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、細胞質配列に対応する配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤ３とＴＣＲ複合体を形成できる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合断片は、約１０−５〜１０−１２Ｍおよびその中の全ての個々の値および範囲にわたる、標的抗原に対する平衡結合定数を有する親和性を示す。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ−ペプチド複合体またはリガンドである。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、結合特性などの１つまたは複数の性質が改変されている、組換え的に生成された天然タンパク質またはその突然変異型であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、またはその他の哺乳類などの様々な動物種の１つから誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲをコードするベクターを作製するために、目的のＴＣＲを発現するＴ細胞クローンから単離された全ｃＤＮＡからα鎖およびβ鎖がＰＣＲ増幅され、発現ベクターにクローン化され得る。いくつかの実施形態では、αおよびβ鎖は、合成的に作製され得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲαおよびβ鎖は単離され、遺伝子発現ベクターにクローン化される。いくつかの実施形態では、転写単位は、単一プロモーターからのメッセージによる（例えば、α鎖およびβ鎖をコードする）遺伝子産物の同時発現を可能にする、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）を含有する、バイシストロニック単位として操作され得る。あるいは、場合によっては、単一のプロモーターが、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に、自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａ）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた、複数の遺伝子（例えば、αおよびβ鎖をコードする）を含有するＲＮＡの発現を誘導してもよい。したがって、ＯＲＦは単一のポリタンパク質をコードし、それは、翻訳中（Ｔ２Ａの場合）または翻訳後のいずれかにおいて、個々のタンパク質に切断される。場合によっては、Ｔ２Ａなどのペプチドは、リボソームに、２Ａ要素のＣ末端におけるペプチド結合の合成のスキップ（リボソームスキッピング）を引き起こし得て、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらす。リボソームスキッピングを誘導し得るペプチドをはじめとする２Ａ切断ペプチドの例は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａである。いくつかの態様では、αおよびβ鎖は、異なるベクターにクローン化される。いくつかの実施形態では、作製されたα鎖およびβ鎖は、例えばレンチウイルスなどのレトロウイルスベクターに組み込まれる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲα遺伝子およびβ遺伝子は、双方の鎖が同時発現するように、ピコルナウイルス２Ａリボソームスキップペプチドを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲの遺伝子移入は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを通じて、またはトランスポゾンを通じて達成される（例えば、Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１３：１０５０−１０６３；Ｆｒｅｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１８：１７４８−１７５７；およびＨａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１８：６７４−６８３を参照されたい。
【０２３３】
２．ベクターおよび操作方法
提供される方法は、このような結合分子を発現する遺伝子操作された細胞を生成するために、ＣＡＲまたはＴＣＲをはじめとする組換え受容体を発現させることを含む。遺伝子操作は、一般に、レトロウイルス形質導入、形質移入、または形質転換などによって、組換えまたは操作された成分をコードする核酸を細胞に導入することを伴う。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入は、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるように、増殖、生存、および／または活性化などの応答を誘導する刺激と組み合わせることなどによって、最初に細胞を刺激することと、それに続く、活性化細胞の形質導入、および臨床適用に十分な数への培養の拡張によって達成される。
【０２３５】
例えば、ＣＡＲのような抗原受容体などの遺伝子操作された成分を導入するための様々な方法は周知であり、提供された方法および組成物と共に使用されてもよい。例示的な方法としては、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルス、形質導入、トランスポゾン、および電気穿孔などを通じた、受容体をコードする核酸を移入するための方法が挙げられる。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、組換え受容体をコードする核酸が、適切な発現ベクターにクローン化され得る。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得て、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターとしては、例えば、プラスミドおよびウイルスなどの、増殖および拡張のために、または発現またはその双方のために、設計されたものなどのベクターが挙げられる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、またはｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）のベクターであり得る。場合によっては、λＧ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターもまた使用され得る。いくつかの実施形態では、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をはじめとする植物発現ベクターが使用され得る。いくつかの実施形態では、動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用される。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、適切な場合、ＤＮＡベースまたはＲＮＡベースかどうかを勘案して、ベクターが導入される宿主タイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳開始および終止コドンなどの制御配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換え受容体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、非天然プロモーターを含有し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターであり得て、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復に見いだされるプロモーターなどのウイルスプロモーターであり得る。当業者に公知のその他のプロモーターもまた検討される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して細胞に移入される。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、γ−レトロウイルスベクターなどの組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入される（例えば、Ｋｏｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４  Ａｐｒ  ３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．２５；Ｃａｒｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２８（１０）：１１３７−４６；Ａｌｏｎｓｏ−Ｃａｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  ２，ｅ９３；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２９（１１）：５５０−５５７を参照されたい。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するレトロウイルスベクターなどのように、長末端反復配列（ＬＴＲ）を有する。大多数のレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスとしては、任意の鳥類または哺乳類細胞源に由来するものが挙げられる。レトロウイルスは、典型的には広宿主性であり、これはヒトをはじめとするいくつかの生物種の宿主細胞に感染できることを意味する。一実施形態では、発現される遺伝子は、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ配列を置換する。いくつかの例示的なレトロウイルス系が、（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号明細書；米国特許第６，２０７，４５３号明細書；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４；Ｓｃａｒｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ  （１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９に記載されている。
【０２４１】
レンチウイルス形質導入の方法は、公知である。例示的方法は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０１：１６３７−１６４４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５０６：９７−１１４；およびＣａｖａｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０２（２）：４９７−５０５に記載される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、電気穿孔を通じてＴ細胞に移入される（例えば、Ｃｈｉｃａｙｂａｍ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（３）：ｅ６０２９８  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｔｅｄｅｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７（１６）：１４３１−１４３７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、遺伝子転位を通じてＴ細胞に移入される（例えば、Ｍａｎｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１（４）：４２７−４３７；Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  ２，ｅ７４；およびＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５０６：１１５−１２６を参照されたい）。免疫細胞に遺伝物質を導入し発現するその他の方法としては、リン酸カルシウム形質移入（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載されるように）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介形質移入；タングステン粒子促進微粒子衝撃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６−７７７（１９９０））；およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿（Ｂｒａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，７：２０３１−２０３４（１９８７））が挙げられる。
【０２４３】
組換え生成物をコードする核酸を移入するためのその他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際公開第２０１４０５５６６８号パンフレット、および米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されるものである。
【０２４４】
いくつかの状況では、刺激因子（例えば、リンフォカインまたはサイトカイン）の過剰発現は、対象にとって有毒なこともある。したがって、いくつかの状況では、操作された細胞は、養子免疫療法における投与の場合のように、インビボで細胞が負の選択を受けやすくする遺伝子セグメントを含む。例えば、いくつかの態様では、細胞は、それらが投与される患者のインビボ状態の変化の結果として排除され得るように、操作される。負の選択可能な表現型は、例えば化合物などの投与された作用物質に対する感受性を与える、遺伝子の挿入に起因してもよい。負の選択遺伝子としては、ガンシクロビル感受性を与える単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ＩＩ：２２３，１９７７）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））が挙げられる。
【０２４５】
いくつかの態様では、細胞はさらに操作されて、サイトカインまたはその他の因子の発現を促進する。
【０２４６】
例えば、導入される遺伝子などの追加的な核酸としては、移入された細胞の生存および／または機能促進することなどによって、治療法の有効性を改善するもの；インビボ生存または局在化を評価するためなどの細胞の選択および／または評価のための遺伝的マーカーを提供する遺伝子；例えば、Ｌｕｐｔｏｎ  Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１１：６（１９９１）；およびＲｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３１９−３３８（１９９２）によって記載されるように、細胞をインビボにおける負の選択に対して感受性にすることによって、安全性を改善するための遺伝子が挙げられ、優勢な正の選択マーカーと負の選択マーカーとの融合に由来する、二機能性選択融合遺伝子の使用について記載する、ＬｕｐｔｏｎらによるＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１などの文献もまた参照されたい。例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌらに付与された米国特許第６，０４０，１７７号明細書第１４〜１７欄を参照されたい。
【０２４７】
Ｃ．ＰＤＣＤ１の遺伝子編集
本明細書で提供される実施形態のいずれにおいても、操作された免疫細胞は、免疫調節に関与する遺伝子をコードする遺伝子座を標的とする遺伝子改変または遺伝子編集の対象となり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集のための標的遺伝子座は、プログラム細胞死（ＰＤ−１）タンパク質をコードする、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１）遺伝子座である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ターゲティング遺伝子座における挿入または欠失、またはターゲティング遺伝子座の「ノックアウト」をもたらし、コードされたタンパク質の発現を消失する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって達成される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子が、１つまたは複数のＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、酵素的に不活性なＣａｓ９またはその変異型と共に使用され得る。ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子の例示的な特徴は、以下に記載される。
【０２４８】
１．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
いくつかの実施形態では、作用物質は、ＰＤＣＤ１遺伝子座の領域をターゲティングするｇＲＮＡを含んでなる。「ｇＲＮＡ分子」は、細胞のゲノムＤＮＡ上の遺伝子座などの標的核酸に対する、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の特異的ターゲティングまたはホーミングを促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、本明細書で「キメラ」ｇＲＮＡと称されることもある単分子（単一ＲＮＡ分子を有する）、またはモジュラー（２つ以上、典型的に２つの別々のＲＮＡ分子を含んでなる）であり得る。
【０２４９】
その上にドメインが示されるいくつかの代表的なｇＲＮＡ構造は、図１に提供される。理論による拘束は望まないが、ｇＲＮＡの活性形態の三次元形態、または鎖内または鎖間相互作用に関して、高度相補性領域は、図１で時に二本鎖として示され、その他の描写は、本明細書で提供される。
【０２５０】
場合によっては、ｇＲＮＡは、５’から３’方向に、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の配列（コード配列は配列番号５１２０８に記載される）などの標的核酸と相補的なターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；（第１の相補的ドメインと相補的な）第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；および任意選択的にテールドメインを含んでなる、単分子またはキメラｇＲＮＡである。
【０２５１】
その他の場合には、ｇＲＮＡは、第１および第２の鎖を含んでなるモジュラーｇＲＮＡである。これらの場合には、第１鎖は、好ましくは５’から３’方向に、（コード配列が配列番号５１２０８に記載されるＰＤＣＤ１遺伝子由来の配列などの標的核酸に相補的な）ターゲティングドメインと、第１の相補的ドメインとを含んでなる。第２の鎖は、一般に、５’から３’方向に、任意選択的に５’伸長ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；および任意選択的にテールドメインを含む。
【０２５２】
これらのドメインについては、以下で簡単に考察される。
【０２５３】
ａ）ターゲティングドメイン
図１は、ターゲティングドメインの配置の例を提供する。
【０２５４】
ターゲティングドメインは、標的核酸の標的配列と、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％相補的であり、例えば、完全に相補的である、相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。標的配列を含んでなる標的核酸鎖は、本明細書で標的核酸の「相補鎖」と称される。ターゲティングドメインの選択の指標は、例えば、Ｆｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３０１１）にある。
【０２５５】
ターゲティングドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含んでなる一方で、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含んでなる。理論による拘束は望まないが、一実施形態において、標的配列とターゲティングドメインとの相補性は、標的核酸とｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。ターゲティングドメインおよび標的配列対合中では、ターゲティングドメイン中のウラシル塩基が、標的配列中のアデニン塩基と対合するものと理解される。一実施形態では、標的ドメインそれ自体が、５’から３’方向に、任意選択の二次ドメイン、およびコアドメインを含んでなる。一実施形態では、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。一実施形態では、ターゲティングドメインは、５〜５０ヌクレオチド長である。ターゲティングドメインがそれと相補的である標的核酸の鎖は、本明細書で相補鎖と称される。ドメインのヌクレオチドのいくつかまたは全ては、例えば、分解を受けにくくし、生体適合性を改善するなどの修飾を有し得る。非限定的例として、標的ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはその他の修飾で、修飾され得る。場合によっては、ターゲティングドメインのヌクレオチドは、例えば、２’メチル化などの２−アセチル化、またはその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。
【０２５６】
様々な実施形態において、ターゲティングドメインは、１６〜２６ヌクレオチド長である（すなわち、１６ヌクレオチド長、または１７ヌクレオチド長、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長。
【０２５７】
例示的ターゲティングドメイン
いくつかの実施形態では、標的配列（標的ドメイン）は、配列番号５１２０８に記載されるＰＤＣＤ１コード配列の任意の部分などのＰＤＣＤ１遺伝子座またはその近くにある。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインに相補的な標的核酸は、ＰＤＣＤ１などの目的遺伝子の初期コード領域に位置する。初期コード領域のターゲティングは、目的遺伝子のノックアウト（すなわち、発現の消失）に使用され得る。いくつかの実施形態では、目的遺伝子の初期コード領域は、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）の直後の配列、または開始コドンの５００ｂｐ内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、または１０ｂｐ未満）の配列を含む。特定の例において、標的核酸は、開始コドンの２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐまたは１０ｂｐ内にある。いくつかの例では、ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、例えば、ＰＤＣＤ１遺伝子座の標的核酸などの標的核酸と、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％相補的であり、例えば完全に相補的であるなど、標的配列と相補的である。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、ＰＤＣＤ１のノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号４８１〜３７４８または１４６５７〜２１０３７のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
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であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
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を含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000028
を含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000029
を含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000030
を含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000031
を含んでなる。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインとしては、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用して、またはＮ．メニンジチディスＣａｓ９を使用して、ＰＤＣＤ１遺伝子をノックアウトするためのものが挙げられる。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインとしては、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用して、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトするためのものが挙げられる。ターゲティングドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０２６２】
一実施形態では、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ニッカーゼを使用して、対向するＤＮＡ鎖に相補的な２つのターゲティングドメインを有する対向するＤＮＡ鎖に２つのニックを生じさせるために二重ターゲティングが使用され、例えば、任意のマイナス鎖ターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡが、プラス鎖ターゲティングドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対形成されてもよい。いくつかの実施形態では、２つのｇＲＮＡは、ＰＡＭが外側を向くようにＤＮＡ上に配向され、ｇＲＮＡの５’末端間の距離は０〜５０ｂｐである。一実施形態では、例えば、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼをターゲティングするためにｇＲＮＡが使用され、２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される１対のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が使用されて、標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断によって標的ドメインが切断される。いくつかの実施形態では、２つのＣａｓ９ニッカーゼは、例えばＲｕｖＣ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えばＤ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有する分子；例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えばＨ８４０ＡなどのＨ８４０に変異を有するＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有する分子；または例えばＨＮＨ活性が不活性化されたＣａｓ９分子、例えばＮ８６３ＡなどのＮ８６３に変異を有するＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有する分子を含み得る。いくつかの実施形態では、２つのｇＲＮＡのそれぞれが、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体を形成する。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、２つのターゲティングドメインは、グループＡの配列のいずれかであるかまたはそれを含んでなるターゲティングドメインを有するｇＲＮＡを含み得て、グループＢの任意のターゲティングドメインを有するｇＲＮＡと対形成し得る（表１Ａ）。いくつかの実施形態では、グループＣのターゲティングドメインを有するｇＲＮＡは、グループＤの任意のターゲティングドメインを有するｇＲＮＡと対形成し得る（表１Ａ）。
【０２６４】
（表１Ａ）
2019517788.tif 000032
【０２６５】
いくつかの実施形態では、２つのターゲティングドメインは、グループＥの配列のいずれかであるかまたはそれを含んでなるターゲティングドメインを有するｇＲＮＡを含み得て、グループＦの任意のターゲティングドメインを有するｇＲＮＡと対形成し得る（表１Ｂ）。
【０２６６】
（表１Ｂ）
2019517788.tif 000033
【０２６７】
いくつかの実施形態では、２つのターゲティングドメインは、表１Ｃの以下の対からのｇＲＮＡ対を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の対は、表１ＣのｇＲＮＡ対を含み、それぞれがＤ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の対は、表１ＣのｇＲＮＡ対を含み、それぞれがＮ８６３Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体を形成する。
【０２６８】
（表１Ｃ）
2019517788.tif 000034
【０２６９】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、それに加えてまたは代案として、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣの１つまたは複数からの遺伝子座をターゲティングすることによって、遺伝子改変または遺伝子編集を受け得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数が、ターゲティングノックアウトまたはノックダウンとしてターゲティングされ、例えば、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼす。一実施形態では、前記アプローチは、１つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）をノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内２つなどのＴ細胞が発現する２つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内３つなどのＴ細胞が発現する３つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内４つなどのＴ細胞が発現する４つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内５つなどのＴ細胞が発現する５つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内６つなどのＴ細胞が発現する６つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内７つなどのＴ細胞が発現する７つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子などのＴ細胞が発現する８つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンすることを含んでなる。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、ＦＡＳのノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号８４６０〜１０７５９または２７７２９〜３２６３５のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、ＢＩＤのノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号１０７６０〜１３２８５または４０２５２〜４５９８０のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４のノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号１３２８６〜１４６５６または４５９８１〜４９２７３のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、ＣＢＬＢのノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号６１１９〜８６３９または３２６３６〜４０２５１のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＮ６のノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号３７４９〜６１１８または２１０３８〜２７７２８のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号４９２７４〜４９９５０のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのノックアウトまたはノックダウンのターゲティングドメインは、配列番号４９９５１〜５１２００のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０２７７】
ｂ）第１の相補的ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、第１の相補的ドメインの例を提供する。第１の相補的ドメインは、下に記載される第２の相補的ドメインと相補的であり、一般に、第２の相補的ドメインと少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する。第１の相補的ドメインは、典型的に５〜３０ヌクレオチド長であり、５〜２５ヌクレオチド長、７〜２５ヌクレオチド長、７〜２２ヌクレオチド長、７〜１８ヌクレオチド長、または７〜１５ヌクレオチド長であってもよい。様々な実施形態において、第１の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
【０２７８】
典型的に第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメイン標的との正確な相補性を有しない。いくつかの実施形態では、第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し得る。例えば、第１の相補的ドメインの１、２、３、４、５または６（例えば、３）ヌクレオチドのセグメントは、二重鎖中で対形成しなくてもよく、非二重鎖化またはループアウト領域を形成してもよい。場合によっては、例えば、３ヌクレオチドのループアウトなどの不対またはループアウト領域が、第２の相補的ドメイン上に存在する。この不対領域は、任意選択的に、第２の相補的ドメインの５’末端から、例えば４ヌクレオチドなどの、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドで開始する。
【０２７９】
第１の相補的ドメインは、５’から３’方向に５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含み得る。一実施形態では、５’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、８または９など４〜９ヌクレオチド長である。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば１ヌクレオチド長などの、１、２、または３ヌクレオチド長である。一実施形態では、３’サブドメインは、例えば、４〜２２、４〜１８、または４〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５などの３〜２５ヌクレオチド長である。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中に１１の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）：
2019517788.tif 000035
。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中に１５の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）：
2019517788.tif 000036
。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中に１６の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）：
2019517788.tif 000037
。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中に２１の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）：
2019517788.tif 000038
。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、交換されて、例えばｇＲＮＡ配列中のポリ−Ｕ配列が除去される（交換ヌクレオチドは下線付き）：
2019517788.tif 000039
。
【０２８５】
第１の相補的ドメインは、天然の第１の相補的ドメインとの相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、Ｎ．メニンジチディスまたはＳ．サーモフィルスの第１の相補的ドメインなどの本明細書で開示される第１の相補的ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０２８６】
第１の相補的ドメインの１つまたは複数の、または全てにさえ至るヌクレオチドが、ターゲティングドメインに関する上記の考察に沿って、修飾を有し得ることに留意すべきである。
【０２８７】
ｃ）連結ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、連結ドメインの例を提供する。
【０２８８】
単分子またはキメラｇＲＮＡにおいて、連結ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補的ドメインを第２の相補的ドメインと連結するのに役立つ。連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインを共有結合的にまたは非共有結合的に連結し得る。一実施形態では、連結は共有結合である。一実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインを共有結合的に連結し、例えば、図１Ｂ〜１Ｅを参照されたい。一実施形態では、連結ドメインは、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインの間に挿入された共有結合であるか、またはそれを含んでなる。典型的に連結ドメインは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０などの１つまたは複数のヌクレオチドを含んでなるが、様々な実施形態において、リンカーは２０、３０、４０、５０長であり得て、または１００ヌクレオチド長にさえ至る。
【０２８９】
モジュラーｇＲＮＡ分子においては、２つの分子は、相補的ドメインのハイブリダイゼーションによって結合し、連結ドメインが存在しないこともある。例えば、図１Ａを参照されたい。
【０２９０】
多種多様な連結ドメインが、単分子ｇＲＮＡ分子中で使用するのに適する。連結ドメインは、共有結合からなり得て、または例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長などの１つまたは少数のヌクレオチド程度に短くあり得る。一実施形態では、連結ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ヌクレオチド長またはそれ以上である。一実施形態では、連結ドメインは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、または２〜５ヌクレオチド長である。一実施形態では、連結ドメインは、例えば、第２の相補的ドメインに対して５’側であるｔｒａｃｒＲＮＡの配列などの天然配列と相同性を共有し、またはそれに由来する。一実施形態では、連結ドメインは、本明細書で開示される連結ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０２９１】
第１の相補的ドメインに関連して上で考察されるように、連結ドメインのヌクレオチドの一部または全てが修飾を含み得る。
【０２９２】
ｄ）５’伸長ドメイン
場合によっては、モジュラーｇＲＮＡは、本明細書で５’伸長ドメインと称される、第２の相補的ドメインに対して５’の追加的な配列を含んでなり得て、例えば、図１Ａを参照されたい。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長である。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長またはそれ以上である。
【０２９３】
ｅ）第２の相補的ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、第２の相補的ドメインの例を提供する。第２の相補的ドメインは、下に記載される第１の相補的ドメインと相補的であり、一般に、第２の相補的ドメインと少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する。例えば、図１Ａ〜図１Ｂに示されるように、場合によっては、第２の相補的ドメインは、例えば、二重鎖領域からループアウトする配列などの第１の相補的ドメインとの相補性を欠く配列を含み得る。
【０２９４】
第２の相補的ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長であってもよく、場合によっては第１の相補性領域より長くあってもよい。例えば、第２の相補的ドメインは、７〜２７ヌクレオチド長、７〜２５ヌクレオチド長、７〜２０ヌクレオチド長、または７〜１７ヌクレオチド長であり得る。より一般的には、相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長であってもよい。
【０２９５】
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、５’から３’方向に、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含んでなる。一実施形態では、５’サブドメインは、例えば、４〜２２、４〜１８、または４〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長などの、３〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、３ヌクレオチド長などの、１、２、３、４または５ヌクレオチド長である。一実施形態では、３’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長などの、４〜９ヌクレオチド長である。
【０２９６】
一実施形態では、第１の相補的ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、第２の相補的ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインとそれぞれ相補的であり、例えば、完全に相補的である。
【０２９７】
第２の相補的ドメインは、天然の第２の相補的ドメインとの相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、Ｎ．メニンジチディスまたはＳ．サーモフィルス、第１の相補的ドメインなどの本明細書で開示される第２の相補的ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
【０２９８】
第２の相補的ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＶＩＩＩに見られる修飾などの修飾を有し得る。
【０２９９】
ｆ）隣接ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、隣接ドメインの例を提供する。
【０３００】
一実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、隣接ドメインは、天然隣接ドメインと相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、Ｎ．メニンジチディスまたはＳ．サーモフィルス隣接ドメインなどの本明細書で開示される隣接ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
【０３０１】
隣接ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、上記の考察に沿って修飾を有し得る。
【０３０２】
ｇ）テールドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、テールドメインの例を提供する。
【０３０３】
図１Ａおよび図１Ｂ〜１Ｆのテールドメインの観察によって見られるように、広範囲のテールドメインが、ｇＲＮＡ分子で使用するのに適する。様々な実施形態において、テールドメインは、０（存在しない）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然テールドメインの５’末端からの配列に由来し、またはそれと相同性を共有し、例えば、図１Ｄまたは１Ｅを参照されたい。テールドメインはまた、任意選択的に、互いに相補的で少なくともいくつかの生理的条件下では二本鎖領域を形成する、配列を含む。
【０３０４】
テールドメインは、天然に存在する隣接テールドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。非限定的例として、本開示の様々な実施形態による所与のテールドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、Ｎ．メニンジチディス、またはＳ．サーモフィルス、テールドメインなどの本明細書で開示される天然に存在するテールドメインと少なくとも５０％の相同性を有してもよい。
【０３０５】
特定例では、テールドメインは、インビトロまたはインビボ転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写に使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型の３’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。Ｕ６プロモーターがインビボ転写に使用される場合、これらのヌクレオチドはＵＵＵＵＵＵ配列であってもよい。交互のｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチドは、様々な数であってもまたはウラシル塩基であってもよく、または交互の塩基を含んでもよい。
【０３０６】
非限定的例として、様々な実施形態において、隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって以下の配列を含んでなる：
2019517788.tif 000040
。
【０３０７】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写のためにＵ６プロモーターが使用される場合などに、３’配列ＵＵＵＵＵＵを含んでなる。
【０３０８】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写のためにＨ１プロモーターが使用される場合などに、３’配列ＵＵＵＵを含んでなる。
【０３０９】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、使用されるｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナル次第で、変動する数の３’Ｕを含んでなる。
【０３１０】
一実施形態では、テールドメインは、Ｔ７プロモーターが使用される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する変動する３’配列を含んでなる。
【０３１１】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、ＲＮＡ分子を作製するために、インビトロ転写が使用される場合などに、ＤＮＡ鋳型に由来する変動する３’配列を含んでなる。
【０３１２】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写を駆動するために、ｐｏｌ−ＩＩプロモーターが使用される場合などに、ＤＮＡ鋳型に由来する変動する３’配列を含んでなる。
【０３１３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、５’［ターゲティングドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［隣接ドメイン］−［テールドメイン］−３’の構造を有し、
ターゲティングドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含んでなり、１０〜５０ヌクレオチド長であり；
第１の相補的ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示される参照の第１の相補的ドメインと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し；
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり；
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補的ドメインと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し；
テールドメインは存在せず、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有する。
【０３１４】
ｈ）例示的キメラｇＲＮＡ
一実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’方向に、例えば、（標的核酸と相補的な）１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含んでなるターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；（第１の相補的ドメインと相補的な）第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなり、（ａ）隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３１５】
一実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。一実施形態では、隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。一実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。一実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。一実施形態では、ターゲティングドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、ターゲティングドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。
【０３１６】
一実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（ターゲティングドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含んでなる）は、以下の配列を含んでなり、その中ではターゲティングドメインが２０個のＮとして描写されるが、それは任意の配列および１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であり得て、その中ではｇＲＮＡ配列に６個のＵが続き、それはＵ６プロモーターの終結シグナルの役割を果たすが、それは不在またはより少数のどちらかであり得る：
2019517788.tif 000041
。
一実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．ピオゲネスｇＲＮＡ分子である。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（ターゲティングドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含んでなる）は以下の配列を含んでなり、その中ではターゲティングドメインが２０個のＮとして描写されるが、それは任意の配列および１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であり得て、その中ではｇＲＮＡ配列に６個のＵが続き、それはＵ６プロモーターの終結シグナルの役割を果たすが、それは不在またはより少数のどちらかであり得る：
2019517788.tif 000042
。
一実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．アウレウスｇＲＮＡ分子である。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、例示的キメラｇＲＮＡのターゲティングドメインは、配列番号４８１〜３７４８のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、例示的なキメラｇＲＮＡにおけるターゲティングドメインは、
2019517788.tif 000043
から選択される配列のいずれかであるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列ＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000044
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000045
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000046
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000047
であるか、またはそれを含んでなる。
【０３２０】
例示的なキメラｇＲＮＡの配列および構造はまた、図１０Ａ〜１０Ｂにも示される。
【０３２１】
ｉ）例示的モジュラーｇＲＮＡ
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、第１および第２の鎖を含んでなる。第１鎖は、好ましくは５’から３’方向に、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含んでなるターゲティングドメイン；第１の相補的ドメインを含んでなる。第２の鎖は、好ましくは５’から３’方向に、任意選択的に５’伸長ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなり、（ａ）隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３２２】
一実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。一実施形態では、隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。一実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３２３】
一実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３２４】
一実施形態では、ターゲティングドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、ターゲティングドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、例示的モジュラーｇＲＮＡのターゲティングドメインは、配列番号４８１〜３７４８のいずれかから選択される配列であるか、またはそれを含んでなる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、例示的なモジュラーｇＲＮＡにおけるターゲティングドメインは、
2019517788.tif 000048
から選択される配列のいずれかであるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000049
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000050
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000051
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000052
であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、配列
2019517788.tif 000053
であるか、またはそれを含んでなる。
【０３２７】
２．ｇＲＮＡを設計する方法
ターゲティングドメインを選択し、設計し、検証する方法をはじめとする、ｇＲＮＡを設計する方法が本明細書に記載される。例示的なターゲティングドメインもまた、本明細書で提供される。本明細書で考察されるターゲティングドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込まれ得る。
【０３２８】
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法は、例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＳＣＩＥＮＣＥ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７−３２；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＮＡＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  １１（２）：１２２−３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載される。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、ソフトウェアツールが利用されて、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性の最小化など、使用者の標的配列中のｇＲＮＡの選択が最適化され得る。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用するそれぞれの可能なｇＲＮＡ選択肢では、ソフトウェアツールが、特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）までのミスマッチ塩基対を含有するゲノム全域で、全ての可能なオフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭのどちらかに先行する）を同定し得る。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に誘導される重み付けスキームを使用して予測され得る。それぞれの可能なｇＲＮＡは、次に、その全予測オフターゲット切断に従って格付けされ得て；最高位のｇＲＮＡは、最大のオンターゲットと最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものに相当する。例えば、ｇＲＮＡベクター構築のための自動化された試薬設計、オンターゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマー設計、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマー設計などのその他の機能もまた、ツールに包含され得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして評価され得る。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、およびＮ．メニンジチディスＣａｓ９と共に使用されるｇＲＮＡが、例えば、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用するなど、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して同定される（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４；３０（１０）：１４７３−１４７５）。特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアは、ゲノムワイドのオフターゲット傾向を計算した後に、ガイドを格付けする。典型的に、長さが１７〜２４の範囲のガイドについて、完全一致から７つのミスマッチまでの一致が検討される。いくつかの態様では、ひとたびオフターゲット部位が計算的に評価されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約される。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定し得る。いくつかの実施形態では、各遺伝子のｇＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを用いて反復要素についてスクリーニングされ得る。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０３３１】
同定に続いて、ｇＲＮＡは、標的部位に対するそれらの距離、それらの直交性、および５’Ｇの存在の１つまたは複数に基づいて階層に格付けされ得る（例えば、Ｓ．ピオゲネスの場合はＮＧＧ  ＰＡＭ、Ｓ．アウレウスの場合はＮＮＧＲＲ（例えば、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ）ＰＡＭ、およびＮ．メニンジチディスの場合は、ＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＮＧＣＴＴＰＡＭなどの関連ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近似一致の同定に基づく）。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体ターゲティングドメインを指してもよい。良好な直交性があるターゲティングドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。これは非限定的例であり、多様なストラテジーを利用して、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、およびＮ．メニンジチディスまたはその他のＣａｓ９酵素と共に使用される、ｇＲＮＡが同定され得るものと理解される。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡは、公的に利用可能なウェブベースのＺｉＦｉＴサーバーを用いて同定され得る（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊａｎ  ２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３５７４、オリジナルの参考文献については、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＮＡＲ  ３５：Ｗ５９９−６０５；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＮＡＲ  ３８：Ｗ４６２−８を参照されたい）。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。いくつかの態様では、各遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ得て、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔ−Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いて、反復要素についてスクリーニングされ得る。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０３３３】
同定に続いて、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡは、例えば５つの階層に格付けされ得る。いくつかの実施形態では、第１階層ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、標的部位に対するそれらの距離、それらの直交性、および５’Ｇ（ＮＧＧ  ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近似一致のＺｉＦｉＴ同定に基づく）の存在に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、１７量体および２０量体の双方のｇＲＮＡが、ターゲティングのために設計される。いくつかの態様では、ｇＲＮＡはまた、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡニッカーゼストラテジーの双方について選択される。ｇＲＮＡを選択する基準、およびいずれのストラテジーに対していずれのｇＲＮＡが使用され得るかという判定は、いくつかの考察に基づき得る。いくつかの実施形態では、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの双方のためのｇＲＮＡが同定される。いずれのｇＲＮＡが二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーに使用され得るかの判定をはじめとする、ｇＲＮＡを選択するためのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＤＮＡ上で、ＰＡＭ上が外側を向き、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。いくつかの態様では、二重ニッカーゼ対で切断することは、合理的な頻度で介在配列全体を欠失させると想定され得る。しかし、二重ニッカーゼ対を使用した切断はまた、ｇＲＮＡのうちの１つのみの部位に頻繁にインデル変異をもたらし得る。候補対構成員は、１つのｇＲＮＡの部位で単にインデル突然変異を引き起こすのと対比して、配列全体をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、第１階層のｇＲＮＡ分子のためのターゲティングドメインは（１）例えば、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中などの標的位置からの妥当な距離、（２）高レベルの直交性、および（３）５’Ｇの存在に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、第２階層のｇＲＮＡの選択では、５’Ｇに対する必要性は除去され得るが、距離の制限が必要であり、高レベルの直交性が要求される。いくつかの実施形態では、第３階層の選択は、同じ距離制限および５’Ｇの必要性を用いるが、良好な直交性の必要性は除去される。いくつかの実施形態では、第４階層の選択は、同じ距離制限を用いるが、良好な直交性および５’Ｇからの開始に対する必要性は除去される。いくつかの実施形態では、第５階層の選択は、良好な直交性および５’Ｇの必要を除去し、より長い配列（例えば、追加的転写標的部位の５００ｂｐ上流または下流などのコード配列の残りの部分）がスキャンされる。場合によっては、いかなるｇＲＮＡも特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断ならびに二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーについて同定される。
【０３３６】
いくつかの態様では、Ｎ．メニンジチディスおよびＳ．アウレウスＣａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の存在についてゲノムＤＮＡ配列をスキャンすることによって手動で同定され得る。これらのｇＲＮＡは、２つの階層に区別され得る。いくつかの実施形態では、第１階層ｇＲＮＡについて、ターゲティングドメインは、開始コドンの下流のコード配列の最初の５００ｂｐ内で選択される。いくつかの実施形態では、第２階層ｇＲＮＡについて、ターゲティングドメインは、残りのコード配列（最初の５００ｂｐの下流）内で選択される。場合によっては、いかなるｇＲＮＡも特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウスおよびＮ．メニンジチディスＣａｓ９と共に使用するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同定する別のストラテジーは、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用し得る。いくつかの態様では、ガイドＲＮＡ設計は、公的ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアを用いて実施される（参考文献：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｈａｔ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４  Ｆｅｂ  １７．Ｂａｅ  Ｓ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｋｉｍ  ＪＳ．ＰＭＩＤ：２４４６３１８１）。前記特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から７つのミスマッチに至るマッチが、１７〜２４の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に評価されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約される。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。一実施形態では、各遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされた。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、同定に続いて、ｇＲＮＡは、標的部位に対するそれらの距離またはそれらの直交性に基づいて、階層に格付けされた（例えば、Ｓ．ピオゲネスの場合はＮＧＧＰＡＭ、Ｓ．アウレウスの場合はＮＮＧＲＲ（例えば、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ）ＰＡＭ、およびＮ．メニンジチディスの場合はＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＮＧＣＴＴ  ＰＡＭなどの妥当なＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく。いくつかの態様では、良好な直交性があるターゲティングドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。
【０３３９】
一例として、Ｓ．ピオゲネスおよびＮ．メニンジチディス標的では、１７量体、または２０量体ｇＲＮＡが設計され得る。別の例として、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、および２４量体ｇＲＮＡをターゲティングするＳ．アウレウスが設計され得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの双方のためのｇＲＮＡが同定される。いずれのｇＲＮＡが二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーに使用され得るかの判定をはじめとする、ｇＲＮＡを選択するためのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＤＮＡ上で、ＰＡＭ上が外側を向き、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。いくつかの態様では、二重ニッカーゼ対で切断することは、合理的な頻度で介在配列全体を欠失させると想定され得る。しかし、二重ニッカーゼ対を使用した切断はまた、ｇＲＮＡのうちの１つのみの部位に頻繁にインデル変異をもたらし得る。候補対構成員は、１つのｇＲＮＡの部位で単にインデル突然変異を引き起こすのと対比して、配列全体をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
【０３４１】
ノックアウトストラテジーを設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネスの階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインが、標的部位からのそれらの距離およびそれらの直交性に基づいて選択される（ＰＡＭはＮＧＧである）。場合によっては、階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、（１）例えば、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中などの標的位置との妥当な距離、および（２）高レベルの直交性に基づいて選択される。いくつかの態様では、階層２  ｇＲＮＡの選択では、高レベルの直交性は要求されない。いくつかの態様では、階層３  ｇＲＮＡは、良好な直交性の要求が除外され、より長い配列（例えば、コード配列の残りの部分）がスキャンされ得る。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３４２】
ノックアウトストラテジー設計するために、いくつかの実施形態では、Ｎ．メニンジチディスのための階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択されて、高レベルの直交性を有した。Ｎ．メニンジチディスのための階層２  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高い直交性は要求されなかった。Ｎ．メニンジチディスのための階層３  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、５００ｂｐ下流の残りのコード配列中で選択された。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０３４３】
ノックアウトストラテジーを設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含有する。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層２  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、直交性のレベルは必要なく、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含有する。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層３  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、下流の残りのコード配列内で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含有する。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層４  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含有する。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層５  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、下流の残りのコード配列内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含有する。場合によっては、いかなるｇＲＮＡも特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３４４】
ノックダウンストラテジーのためのｇＲＮＡ分子を設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネスの階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有する。いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネスの階層２  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高い直交性は要求されない。いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネスの階層３  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（例えば、転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択される。場合によっては、いかなるｇＲＮＡも特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３４５】
ノックダウンストラテジーのためのｇＲＮＡ分子を設計するために、いくつかの実施形態では、Ｎ．メニンジチディスの階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有する。いくつかの実施形態では、Ｎ．メニンジチディスの階層２  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高い直交性は要求されない。いくつかの実施形態では、Ｎ．メニンジチディスのための階層３  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（例えば、転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択される。場合によっては、いかなるｇＲＮＡも特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３４６】
ノックダウンストラテジーのためのｇＲＮＡ分子を設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層１  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高レベルの直交性およびＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層２  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層３  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（例えば、転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層４  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウスの階層５  ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。場合によっては、いかなるｇＲＮＡも特定の階層基準に基づいて同定されない。
【０３４７】
３．Ｃａｓ９
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、Ｎ．メニンジチディス、およびＳ．サーモフィルスＣａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。換言すれば、本明細書の記述の多くが、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、Ｎ．メニンジチディス、およびＳ．サーモフィルスＣａｓ９分子を利用する一方で、その他の生物種からのＣａｓ９分子が、それらを置き換え得る。そのような種としては、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
【０３４８】
Ｃａｓ９分子、またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書での用法では、ｇＲＮＡ分子と相互作用し得て、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含んでなる部位に復帰または局在する分子、またはポリペプチドを指す。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドと言う用語は、本明細書の用法では、天然Ｃａｓ９分子を指し、例えば、表２Ａの最も良く似た天然Ｃａｓ９分子または配列などの参照配列と、例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる、遺伝子操作、改変、または修飾されたＣａｓ９分子、またはＣａｓ９ポリペプチドを指す。
【０３４９】
ａ）Ｃａｓ９ドメイン
結晶構造は、２つの異なる天然細菌Ｃａｓ９分子（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４）について、およびガイドＲＮＡがあるＳ．ピオゲネスＣａｓ９（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物）（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４；およびＡｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）について評価された。
【０３５０】
天然Ｃａｓ９分子は、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブの２つのローブを含んでなり；そのそれぞれは、本明細書に記載されるドメインをさらに含んでなる。図８Ａ〜８Ｂは、一次構造中の重要なＣａｓ９ドメイン構成の概略図を提供する。本開示全体を通じて使用されるドメイン命名法および各ドメインに包含されるアミノ酸残基の番号付与は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるようである。アミノ酸残基の番号付与は、Ｓ．ピオゲネスに由来するＣａｓ９を参照する。
【０３５１】
ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含んでなる。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を有せず、それがＣａｓ９特異的機能ドメインであることが示唆される。ＢＨドメインは、長いα−らせんおよびアルギニンに富む領域であり、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９配列のアミノ酸６０〜９３を含んでなる。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはａｔｒａｃｒＲＮＡなどの反復：抗反復二本鎖の認識に重要であり、したがって標的配列を認識することでＣａｓ９活性に重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９配列のアミノ酸９４〜１７９および３０８〜７１７に、２つのＲＥＣ１モチーフを含んでなる。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直鎖一次構造内ではＲＥＣ２ドメインによって隔てられるが、三次構造に構築されてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその部分はまた、反復：抗反復二本鎖の認識における役割を有してもよい。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９配列のアミノ酸１８０〜３０７を含んでなる。
【０３５２】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも称される）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも称される）、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含んでなる。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリー構成要素との構造類似性を有して、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれＳ．ピオゲネスＣａｓ９配列のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にある、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ、当該技術分野で一般にＲｕｖＣＩドメイン、またはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い）から構築される。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内ではその他のドメインによって直線的に隔離されるが、三次構造内では、３つのＲｕｖＣモチーフに構築されてＲｕｖＣドメインが形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼとの構造的類似性を有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖などの一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ〜ＩＩＩモチーフの間にあり、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９配列のアミノ酸７７５〜９０８を含んでなる。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９．配列のアミノ酸１０９９〜１３６８を含んでなる。
【０３５３】
（１）ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。一実施形態では、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する。例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインのドメインの１つまたは複数を含んでなり得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン、および／または例えば、以下に記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。
【０３５４】
（２）ＲｕｖＣ様ドメイン
一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３つまたはそれ以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長以下である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、約１５アミノ酸長などの約１０〜２０個のアミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。
【０３５５】
（３）Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、切断はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
【０３５６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ：
2019517788.tif 000054
のアミノ酸配列を含んでなる、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、Δ（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または、例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）で表記される、任意のアミノ酸から選択され、または不在である。
【０３５７】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３５８】
実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がある。
【０３５９】
実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がない。
【０３６０】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ：
2019517788.tif 000055
のアミノ酸配列を含んでなる、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０３６１】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号９の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３６２】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
2019517788.tif 000056
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０３６３】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３６４】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
2019517788.tif 000057
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子は、図２Ａ〜２Ｇに示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る（Ｙとして示される））。
【０３６５】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３６６】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図３Ａ〜３Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示される、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図３Ａ〜３Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂで同定された高度に保存された残基の内、１つ、２つ、または３つ全てが存在する。
【０３６７】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図４Ａ〜４Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示される、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図４Ａ〜４Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂで同定された高度に保存された残基の内、１つ、２つ、３つまたは４つ全てが存在する。
【０３６８】
（４）追加的ＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。好ましくは、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
【０３６９】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
2019517788.tif 000058
のアミノ酸配列を含んでなり得て、
式中、
Ｘ１はＶまたはＨであり，
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）であり；
Ｘ３はＭまたはＴである。
【０３７０】
一実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
2019517788.tif 000059
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇまたは図７Ａ〜７Ｂに示される、追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る（Ｂとして示される））。
【０３７１】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
2019517788.tif 000060
のアミノ酸配列を含んでなり得て、
式中、
Ｘ１はＨまたはＬであり；
Ｘ２はＲまたはＶであり；および
Ｘ３はＥまたはＶである。
【０３７２】
一実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
2019517788.tif 000061
のアミノ酸配列を含んでなる。
【０３７３】
一実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１２、１３、１４または１５の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの側面に位置する配列は、式Ｖ：
2019517788.tif 000062
の配列であり、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され、
Ｘ２’はＶ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えばＶ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され、
Ｘ４’はＬ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され；
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるようなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
【０３７５】
（５）ＨＮＨ様ドメイン
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長であるが、４０、３５または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメインは、以下に記載される。
【０３７６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩ：
2019517788.tif 000063
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され；
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０３７７】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１７の配列と、少なくとも１つであるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３７８】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がある。
【０３７９】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がない。
【０３８０】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩＩ：
2019517788.tif 000064
のアミノ酸配列を含んでなるＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０３８１】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１８の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０３８２】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩＩ：
2019517788.tif 000065
のアミノ酸配列を含んでなるＨＮＨ様ドメインを含んでなる。
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０３８３】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１９の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０３８４】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩＩＩ：
2019517788.tif 000066
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含んでなる。
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され；
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され；
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され；Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２０は、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され；
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなＨＮＨ様ドメインを含んでなり得る）。
【０３８５】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０３８６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ：
2019517788.tif 000067
のアミノ酸配列を含んでなる。
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され；
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され；
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され；
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され；
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され；
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され；Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され；
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され；
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され；および
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
【０３８７】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる、アミノ酸配列を含んでなる。
【０３８８】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図５Ａ〜５Ｃまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図５Ａ〜５Ｃまたは図７Ａ〜７Ｂ１で同定された高度に保存された残基の内、片方または双方が存在する。
【０３８９】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図６Ａ〜６Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図６Ａ〜６Ｂ、または図７Ａ〜７Ｂで同定された高度に保存された残基の内、１つ、２つ、３つ全てが存在する。
【０３９０】
ｂ）Ｃａｓ９機能
（１）ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ機能
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断（またはその他の性質）を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド（ｐｅｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書でｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。
【０３９１】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
【０３９２】
一実施形態では、酵素的に活性なまたはｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、双方の鎖を切断して、二本鎖切断をもたらす。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、例えば、それに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメインと、不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。
【０３９３】
いくつかのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と連結してコア標的ドメインに局在するが、標的核酸を切断できず、あるいは効率的な速度で切断できない。皆無のまたはほぼ皆無の切断活性を有するＣａｓ９分子は、本明細書でｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドと称される。例えば、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、切断活性が欠損し得て、または本明細書に記載されるアッセイによる測定で、例えば、標準Ｃａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドの２０、１０、５、１または０．１％未満などの実質的により低い切断活性を有する。
【０３９４】
（２）ターゲティングおよびＰＡＭ
Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と相互作用し得るポリペプチドであり、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含んでなる部位に局在する。
【０３９５】
一実施形態では、標的核酸と相互作用して切断するｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ，ＮＡＧ、ＮＧＡを認識して、その配列から、例えば、３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧおよび／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識して、これらの配列の例えば、３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０，ａｎｄ  Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．ミュータンスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ））を認識して、この配列の例えば、３〜５塩基対など１〜１０塩基対上流で、コア標的核酸配列切断を誘導する。例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．アウレウスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｎ．メニンジチディスのｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣを認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＥＡＲＬＹ  ＥＤＩＴＩＯＮ  ２０１３，１−６を参照されたい。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７：８１６に記載される形質転換アッセイを使用して判定され得る。前述の実施形態では、Ｎは、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかの任意のヌクレオチド残基であり得る。
【０３９６】
本明細書で考察されるように、Ｃａｓ９分子は遺伝子操作されて、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性が改変され得る。
【０３９７】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載される。このようなＣａｓ９分子は、クラスター１〜７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子を含む。
【０３９８】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．ピオゲネス（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア）、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。その他の例示的Ｃａｓ９分子は、ナイセリア・メニンジチディス（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６）のＣａｓ９分子である。
【０３９９】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
配列番号１〜４と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
比較すると、２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり；
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７；Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６に記載される生物種に由来するＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子配列と同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
【０４００】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇのコンセンサス配列のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンス、およびＬ．イノキュアのＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図７Ａ〜７Ｂの配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス、またはＮ．メニンジチディスのＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸を示し、「−」は任意のアミノ酸または不在を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図７Ａ〜７Ｂで開示される配列番号６または７の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。
【０４０１】
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１’の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
【０４０２】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１〜５を含んでなり、十分な追加的Ｃａｓ９分子配列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子などの生物活性分子を提供する。一実施形態では、領域１〜６のそれぞれは、独立して、例えば、図２Ａ〜２Ｇまたは図７Ａ〜７Ｂからの配列などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの対応する残基と、５０％、６０％、７０％、または８０％の相同性を有する。
【０４０３】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（番号付与は図２Ａ〜２Ｇのモチーフ配列に準拠する；図２Ａ〜２ＧのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンス、またはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列の１〜１８０と同一である。
【０４０４】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１’と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたは、Ｌ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列の１２０〜１８０と同一である。
【０４０５】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域２と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたは、Ｌ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列の３６０〜４８０と同一である。
【０４０６】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域３と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５６％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたは、Ｌ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列の６６０〜７２０と同一である。
【０４０７】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域４と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたは、Ｌ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列の８１７〜９００と同一である。
【０４０８】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域５と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の６０％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたは、Ｌ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンスまたはＬ．イノキュアのＣａｓ９のアミノ酸配列の９００〜９６０と同一である。
【０４０９】
ｃ）遺伝子操作または改変Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
例えば、天然Ｃａｓ９分子などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に結合する能力；および核酸上の部位をターゲティングする（またはそれに局在する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
【０４１０】
Ｃａｓ９分子は、遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドを含む（「遺伝子操作」は、この文脈の用法では、単にＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なることを意味して、プロセスまたは起源制限を暗示しない）。遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、（天然またはその他の標準Ｃａｓ９分子と比較して）改変されたヌクレアーゼ活性、または改変されヘリカーゼ活性などの改変された酵素的性質を含んでなり得る。本明細書で考察されるように、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性（二本鎖ヌクレアーゼ活性との対比で）を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のまたは任意のＣａｓ９活性に対する顕著な影響なしに、例えば、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失などの、そのサイズを変化させる改変を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含んでなり得る。例えば、遺伝子操作Ｃａｓ９分子は、内因性野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように改変され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と、配列が異なり得るが、１つまたは複数のＣａｓ９機能に顕著な改変を有しない。
【０４１１】
所望の性質があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの親ポリペプチドの改変などの、いくつかの様式で生成されて、所望の性質を有する改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され得る。例えば、例えば、天然または遺伝子操作Ｃａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子との１つまたは複数の変異または差異が導入され得る。このような変異および差異としては、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失が挙げられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、親Ｃａｓ９分子などの標準と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００、または８０未満の変異などの１つまたは複数の変異または差異を含んでなり得る。
【０４１２】
一実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。一実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有する。
【０４１３】
（１）非切断および修飾切断Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含んでなり、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子）と比較して二本鎖核酸切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【０４１４】
（２）修飾切断ｅａＣａｓ９分子およびｅａＣａｓ９ポリペプチド
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
【０４１５】
一実施形態ではｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメイン（例えば、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１などの本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン）と、不活性なまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。代表的な不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにアスパラギン酸の変異を有し得て、例えば、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号７の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス、またはＳ．サーモフィルスのＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０４１６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６などの本明細書に記載されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８５６に示されるヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得て；例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８７０および／または図２Ａ〜２Ｇの位置８７９に示されるアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメインの１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス、またはＳ．サーモフィルスのＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０４１７】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６などの本明細書に記載されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８５６に示されるヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得て；例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８７０および／または図２Ａ〜２Ｇの位置８７９に示されるアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメインの１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス、またはＳ．サーモフィルスのＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０４１８】
ｄ）標的核酸の片方または双方の鎖を切断する能力の改変
一実施形態では、代表的なＣａｓ９機能は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の１つまたは複数を含んでなる。変異は、例えば、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインなどの１つまたは複数のＲｕｖＣ様ドメイン；ＨＮＨ様ドメイン；ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン外の領域に存在し得る。いくつかの実施形態では、変異は、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様などのＲｕｖＣ様ドメインに存在する。いくつかの実施形態では、変異（１つまたは複数）は、ＨＮＨ様ドメインに存在する。いくつかの実施形態では、変異は、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインなどの双方のＲｕｖＣ様ドメインに存在する。
【０４１９】
Ｓ．ピオゲネス配列に関してＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインに起きてもよい代表的変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。
【０４２０】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン中に、および／またはＨＮＨドメイン中に、標準Ｃａｓ９分子と比較して１つまたは複数の差異を含んでなる、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドであり、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、核酸を切断せず、または野生型よりも有意により低い効率で切断し、例えば、本明細書に記載されるような切断アッセイにおける野性型と比較して、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、標準Ｃａｓ９分子の５０、２５、１０、または１％未満で切断する。
【０４２１】
例えば、置換などの特定の配列が、ターゲティング活性、切断活性などの１つまたは複数の活性に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価することで、またはセクションＩＶに記載される方法によって、評価または予測され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然起源Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
【０４２２】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含んでなり、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ピオゲネス、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ピオゲネス、またはＣ．ジェジュニのＣａｓ９分子）と比較して二本鎖切断の切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ピオゲネス、またはＣ．ジェジュニのＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【０４２３】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性。
【０４２４】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、核酸分子（二本鎖のまたは一本鎖核酸分子のいずれも）を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で核酸分子を切断する、ｅｉＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、Ｃ．ジェジュニまたはＮ．メニンジチディスのＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する実質的切断活性およびＨＮＨドメインに関連する切断活性を欠く。
【０４２５】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．ピオゲネスの固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇまたは配列番号７で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって表示される、Ｓ．ピオゲネスのアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【０４２６】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ピオゲネス）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含んでなる。
【０４２７】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．サーモフィルスの固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中で「−」によって表示される、Ｓ．サーモフィルスのアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【０４２８】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．サーモフィルスＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．サーモフィルスＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含んでなる。
【０４２９】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．ミュータンスの固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中で「−」によって表示される、Ｓ．ミュータンスのアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【０４３０】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ミュータンスＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ミュータンスＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含んでなる。
【０４３１】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）の固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中で「−」によって表示される、Ｌ．イノキュアアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【０４３２】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｌ．イノキュアＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｌ．イノキュアＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、
配列を含んでなる。
【０４３３】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子などの改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、異なる生物種の２つ以上の天然Ｃａｓ９分子などの、例えば、２つ以上の異なるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの融合物であり得る。例えば、１つの生物種の天然Ｃａｓ９分子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含んでなるＳ．ピオゲネス以外の生物種（例えば、Ｓ．サーモフィルス）のＣａｓ９分子の断片に融合され得る。
【０４３４】
（１）ＰＡＭ認識が改変されたまたはＰＡＭ認識がないＣａｓ９分子
天然起源Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．アウレウス、およびＮ．メニンジチディスについて、上に記載されるＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列を認識し得る。
【０４３５】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同一ＰＡＭ特異性を有する。その他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、それに最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性、または天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列が改変されて、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善され；またはＰＡＭ認識要求が排除される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さが増大され、および／またはＣａｓ９特異性が高い同一性レベルに改善されて、例えば、オフターゲット部位が減少されて特異性が増大される。一実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。
【０４３６】
異なるＰＡＭ配列を認識しおよび／またはオフターゲット活性の低下を有するＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、指向性進化を使用して作成され得る。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用され得る代表的な方法およびシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載される。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、セクションＩＶに記載される方法によって評価され得る。
【０４３７】
ＰＡＭ認識を媒介するＰＩドメインの改変が、下で考察される。
【０４３８】
（ｅ）改変ＰＩドメインがある合成Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
現行のゲノム編集法は、使用されるＣａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列によってターゲティングされ得る標的配列の多様性に限りがある。合成Ｃａｓ９分子（またはＳｙｎ−Ｃａｓ９分子）、または合成Ｃａｓ９ポリペプチド（またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチド）は、本明細書での用法では、１つの細菌種に由来するＣａｓ９コアドメインと、機能改変ＰＩドメイン、すなわち、例えば、異なる細菌種に由来する、Ｃａｓ９コアドメインに天然に関連する以外のＰＩドメインとを含んでなるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを指す。
【０４３９】
一実施形態では、改変ＰＩドメインは、Ｃａｓ９コアドメインがそれに由来する天然Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列と、異なるＰＡＭ配列を認識する。一実施形態では、改変ＰＩドメインは、Ｃａｓ９コアドメインがそれに由来する天然Ｃａｓ９によって認識される同一ＰＡＭ配列を認識するが、異なる親和性または特異性で認識する。Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドは、それぞれ、Ｓｙｎ−ｅａＣａｓ９分子またはＳｙｎ−ｅａＣａｓ９ポリペプチドまたはＳｙｎ−ｅｉＣａｓ９分子、Ｓｙｎ−ｅｉＣａｓ９ポリペプチドであり得る。
【０４４０】
Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドの例は、
ａ）例えば、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ピオゲネス、またはＣ．ジェジュニＣａｓ９コアドメインなどの表２Ａまたは２ＢからのＣａｓ９コアドメインなどのＣａｓ９コアドメイン；
ｂ）表４および５から選択される生物種ＸＣａｓ９配列に由来する改変ＰＩドメインを含んでなる。
【０４４１】
一実施形態では、前記改変ＰＩドメインのＲＫＲモチーフ（ＰＡＭ結合モチーフ）は、Ｃａｓ９コアドメインに関連する天然または内因性ＰＩドメインのＲＫＲモチーフの配列と比較した、１、２、または３つのアミノ酸残基における差異；第１、第２、または第３の位置におけるアミノ酸配列の差異；第１および第２の位置、第１および第３の位置、または第２および第３の位置におけるアミノ酸配列の差異を含んでなる。
【０４４２】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインは、表２Ａからの生物種Ｘ  Ｃａｓ９に由来するＣａｓ９コアドメインを含んでなり、前記改変ＰＩドメインは、表２Ａからの生物種Ｙ  Ｃａｓ９に由来するＰＩドメインを含んでなる。
【０４４３】
一実施形態では、生物種Ｘ  Ｃａｓ９のＲＫＲモチーフは、生物種Ｙ  Ｃａｓ９のＲＫＲモチーフ以外である。
【０４４４】
一実施形態では、改変ＰＩドメインのＲＫＲモチーフは、ＸＸＹ、ＸＮＧ、およびＸＮＱから選択される。
【０４４５】
一実施形態では、改変ＰＩドメインは、表２Ａからの前記生物種Ｙの天然ＰＩドメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％相同性を有する。
【０４４６】
一実施形態では、改変ＰＩドメインは、前記表２Ａからの第２の生物種の天然ＰＩドメインのアミノ酸配列と、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１以下のアミノ酸残基が異なる。
【０４４７】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインはＳ．アウレウスコアドメインを含んでなり、改変ＰＩドメインは、Ａ．デニトリフィカンス（Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＩドメイン；Ｃ．ジェジュニＰＩドメイン；Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＰＩドメイン；または表５から選択される生物種ＸのＰＩドメインの改変ＰＩドメインを含んでなる。
【０４４８】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインはＳ．ピオゲネスコアドメインを含んでなり、改変ＰＩドメインは、Ａ．デニトリフィカンスＰＩドメイン；Ｃ．ジェジュニＰＩドメイン；Ｈ．ムステラエＰＩドメイン；または表５から選択される生物種ＸのＰＩドメインの改変ＰＩドメインを含んでなる。
【０４４９】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインはＣ．ジェジュニコアドメインを含んでなり、改変ＰＩドメインは、Ａ．デニトリフィカンスＰＩドメイン；Ｈ．ムステラエＰＩドメイン；または表５から選択される生物種ＸのＰＩドメインの改変ＰＩドメインを含んでなる。
【０４５０】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、前記Ｃａｓ９コアドメインと前記改変ＰＩドメインの間に配置されるリンカーをさらに含んでなる。
【０４５１】
一実施形態では、リンカーは、本明細書の他の箇所に記載される、Ｃａｓ９コアドメインと異種ＰＩドメインの間に配置されるリンカーを含んでなる。適切なリンカーは、セクションＶにさらにに記載される。
【０４５２】
Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子で使用される代表的改変ＰＩドメインは、表４および５に記載される。表４および５で言及される８３Ｃａｓ９オルソログの配列は、表２Ａに提供される。表３は、既知のＰＡＭ配列があるＣａｓ９オルソログ、および対応するＲＫＲモチーフを提供する。
【０４５３】
一実施形態では、Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドはまた、サイズ最適化されてもよく、例えば、Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の欠失、および任意選択的に欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される１つまたは複数のリンカーを含んでなる。一実施形態では、Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＲＥＣ欠失を含んでなる。
【０４５４】
（ｆ）サイズ最適化Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
本明細書に記載される遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子認識などの所望のＣａｓ９特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含んでなる、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、１つまたは複数の欠失および任意選択的に１つまたは複数のリンカーを含んでなる、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Ｃａｓ９分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるＣａｓ９分子を生成する方法、およびこのようなＣａｓ９分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
【０４５５】
例えば、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ピオゲネス、またはＣ．ジェジュニＣａｓ９分子などの欠失があるＣａｓ９分子は、例えば、低下したアミノ酸数を有するなど、対応する天然Ｃａｓ９分子よりも小型である。Ｃａｓ９分子のより小さなサイズは、送達方法の融通性を増大させ、その結果ゲノム編集の有用性を高める。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、結果として生じる本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさず、またはそれを低下させない、１つまたは複数の欠失を含んでなり得る。本明細書に記載される欠失を含んでなるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド中で維持される機能としては、
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力；
および例えば、標的核酸またはａｇＲＮＡなどの核酸分子の認識活性
の１つまたは複数が挙げられる。
【０４５６】
本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの活性は、本明細書または当該技術分野で記載される、活性アッセイを使用して評価され得る。
【０４５７】
（１）欠失に適する領域を同定する
Ｃａｓ９分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。例えば、表２Ａに列挙されるもののいずれか１つなどの様々な細菌種に由来する天然オルソロガスＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の結晶構造にモデル化され得て（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４）、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたＣａｓ９オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの境界面などのＣａｓ９活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
【０４５８】
（２）ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子、またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、本明細書での用法では、ＲＥＣ２ドメインおよびＲＥ１ＣＴドメインの片方または双方に欠失（集合的にＲＥＣ欠失）を含んでなるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを指し、欠失は、同族ドメイン中のアミノ酸残基の少なくとも１０％を構成する。ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）、またはｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドであり得る。代表的ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、
ａ）ｉ）ＲＥＣ２欠失；
ｉｉ）ＲＥＣ１ＣＴ欠失；または
ｉｉｉ）ＲＥＣ１ＳＵＢ欠失
から選択される欠失を含んでなる。
【０４５９】
任意選択的に、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つの欠失のみまたは２つの欠失のみを含む。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲＥＣ２欠失およびＲＥＣ１ＣＴ欠失を含んでなり得る。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲＥＣ２欠失およびＲＥＣ１ＳＵＢ欠失を含んでなり得る。
【０４６０】
概して、欠失は、同族ドメインのアミノ酸の少なくとも１０％を含有し、例えば、ＲＥＣ２欠失は、ＲＥＣ２ドメイン中のアミノ酸の少なくとも１０％を含む。欠失は、その同族ドメインのアミノ酸残基の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％；その同族ドメインの全てのアミノ酸残基；その同族ドメインの外部のアミノ酸残基；その同族ドメインの外部の複数のアミノ酸残基；その同族ドメインのＮ末端に隣接するアミノ酸残基；その同族ドメインのＣ末端に隣接するアミノ酸残基；その同族のＮ末端に隣接するアミノ酸残基、およびその同族ドメインのＣ末端に隣接するアミノ酸残基；その同族ドメインのＮ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基；その同族ドメインのＣ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基；その同族ドメインのＮ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基、およびその同族ドメインのＣ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基を含んでなり得る。
【０４６１】
一実施形態では、欠失は、その同族ドメイン；その同族ドメインのＮ末端アミノ酸残基；その同族ドメインのＣ末端アミノ酸残基を越えない。
【０４６２】
ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、欠失側面に位置する、アミノ酸残基間に配置されるリンカーを含み得る。ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子中のＲＥＣ欠失側面に位置するアミノ酸残基間で使用される適切なリンカーは、セクションＶで開示される。
【０４６３】
一実施形態では、ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、任意のＲＥＣ欠失および結合リンカー以外のアミノ酸配列を含んでなり、例えば、Ｓ．アウレウスＣａｓ９分子、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子、またはＣ．ジェジュニＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９などの表２Ａに記載されるＣａｓ９分子のアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の相同性を有する。
【０４６４】
一実施形態では、ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、任意のＲＥＣ欠失および結合リンカー以外のアミノ酸配列を含んでなり、例えば、Ｓ．アウレウスＣａｓ９分子、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子、またはＣ．ジェジュニＣａｓ９分子などの表２Ａに記載されるＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９のアミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５以下のアミノ酸残基が異なる。
【０４６５】
一実施形態では、ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、任意のＲＥＣ欠失および結合リンカー以外のアミノ酸配列を含んでなり、例えば、Ｓ．アウレウスＣａｓ９分子、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子、またはＣ．ジェジュニＣａｓ９分子などの表２Ａに記載されるＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９のアミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５％以下のアミノ酸残基が異なる。
【０４６６】
配列比較のために、典型的に１つの配列が参照配列の役割を果たし、それと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力されて、必要ならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得てまたは代案のパラメータが指定され得る。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、標準配列と比較して、試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列アラインメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、実施され得る。
【０４６７】
配列同一性百分率および配列類似性を判定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。
【０４６８】
２つのアミノ酸配列間の同一性百分率はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、評価され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのどちらか、およびギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み付け１、２、３、４、５、または６を使用して、判定され得る。
【０４６９】
８３個の天然Ｃａｓ９オルソログについて、代表的ＲＥＣ欠失の配列情報が表２Ａに提供される。異なる細菌種に由来する代表的Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、下に示される。
【０４７０】
（表２Ａ）Ｃａｓ９オルソログのアミノ酸配列
2019517788.tif 000068
2019517788.tif 000069
2019517788.tif 000070
2019517788.tif 000071
2019517788.tif 000072
2019517788.tif 000073
2019517788.tif 000074
2019517788.tif 000075
2019517788.tif 000076
【０４７１】
（表２Ｂ）Ｃａｓ９コアドメインのアミノ酸配列
2019517788.tif 000077
【０４７２】
（表３）同定されたＰＡＭ配列および対応するＲＫＲモチーフ
2019517788.tif 000078
【０４７３】
ＰＩドメインは、表４および５に提供される。
【０４７４】
（表４）改変ＰＩドメイン
2019517788.tif 000079
【０４７５】
（表５）その他の改変ＰＩドメイン
2019517788.tif 000080
2019517788.tif 000081
2019517788.tif 000082
【０４７６】
ｇ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。
【０４７７】
代表的Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３，３９９（６１２１）：８１９−８２３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３，１５３（４）：９１０−９１８；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３，３９９（６１２１）：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする別の代表的核酸は、図８に黒色で示される。
【０４７８】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、化学修飾され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、（例えば、以下の全てなどの１つまたは複数の特性を有する：それは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよび／またはシュードウリジンで置換される。
【０４７９】
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンあまり一般的でないコドンは、一般的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
【０４８０】
さらに、または代案としては、ａＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでなってもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
【０４８１】
配列番号２２は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子をコードする代表的なコドン最適化核酸配列である。配列番号２３は、対応するＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子のアミノ酸配列である。
【０４８２】
配列番号２４は、Ｎ．メニンジチディスのＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列である。配列番号２５は、対応するＮ．メニンジチディスＣａｓ９分子のアミノ酸配列である。
【０４８３】
配列番号２６は、Ｓ．アウレウスＣａｓ９分子のアミノ酸配列である。配列番号３９は、Ｓ．アウレウスのＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列である。
【０４８４】
上記Ｃａｓ９配列のいずれかが、Ｃ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合する場合、停止コドンは除外されるものと理解される。
【０４８５】
ｈ）その他のＣａｓ分子およびＣａｓポリペプチド
本明細書で開示される発明を実施するために、様々なタイプのＣａｓ分子またはＣａｓポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。その他の実施形態では、その他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、例えば、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５，１（６）：ｅ６０およびＭａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，９：４６７−４７７に記載され、双方の参考文献は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、表６００にもまた示される。
【０４８６】
（表６００）Ｃａｓシステム
2019517788.tif 000083
2019517788.tif 000084
2019517788.tif 000085
2019517788.tif 000086
【０４８７】
４．ゲノム編集方法および送達方法
ａ）ゲノム編集アプローチ
一般に、本明細書に記載の方法に従った任意の遺伝子の改変は、任意の機序によって媒介され得て、いずれの方法も特定の機序に限定されないものと理解される。遺伝子の改変に関連し得る例示的な機構としては、非相同末端結合（例えば、古典的または代替）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同指向修復（例えば、内因性ドナー鋳型媒介）、合成依存鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、一本鎖アニーリング、単一鎖侵入、一本鎖切断修復（ＳＳＢＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、ベース切除修復（ＢＥＲ）、鎖間架橋（ＩＣＬ）、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、または無謬性複製後修復（ＰＲＲ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書では、タンパク質ＰＤ−１をコードするＰＤＣＤ１の片方または双方の対立遺伝子をターゲティングノックアウトする例示的方法が記載される。
【０４８８】
（１）遺伝子ターゲティングのためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪはまた、対象遺伝子中の配列挿入を除去す（例えば、欠失させ）るのにも使用され得る。
【０４８９】
理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する；しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て；最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、それらは１００〜２００ｂｐを超える範囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされている。
【０４９０】
ＮＨＥＪは変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、それはまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的配列の近くでターゲティングされる場合、ＮＨＥＪによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁に望まれないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大型のＤＮＡ断片の欠失では、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去され、末端の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。いくつかの実施形態では、１対のｇＲＮＡを使用して２つの二本鎖切断が導入され得て、２つの切断間の介在配列の欠失がもたらされる。
【０４９１】
これらのアプローチの双方を使用して、特定のＤＮＡ配列が欠失され得る；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位に、インデル変異をなおも生成してもよい。
【０４９２】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルが生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子にターゲティングされるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち発現消失）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、または転写開始部位の５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の転写開始部位直後の配列を含む。
【０４９３】
一実施形態では、ＮＨＥＪ媒介インデルが、ＰＤＣＤ１などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中に導入される。遺伝子を標的とする個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対は、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼと共に提供される。
【０４９４】
（２）標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じる一実施形態では、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡが、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている。
【０４９５】
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的でＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する２つのｇＲＮＡが、２つの一本鎖切断を誘導する一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡが、標的位置のヌクレオチドにＮＨＥＪ修復を提供するように、２つの一本鎖切断を配置させるように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド以内に、配置させるように構成されて、二本鎖切断が本質的に模倣される。一実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れており、２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。一実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドのどちらかの側に配置させるように構成される。
【０４９６】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断が生成され得る。二本鎖または対形成一本鎖切断は、標的位置の両側に生成されて、２つの切断で核酸配列が除去されてもよい（例えば、２つの切断間の領域が欠失される）。一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される。交互の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置されるように構成される。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである４つのｇＲＮＡは、２対の一本鎖切断（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じるように構成される。二本鎖切断、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用される場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【０４９７】
ｂ）標的ノックダウン
遺伝子をＤＮＡレベルで変異させることで発現を恒久的に消失するまたは減少させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Ｃａｓ９タンパク質の双方のＤＮＡ切断ドメインで重要な残基を変異させることは（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、触媒能のないＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９、死滅Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９としてもまた知られている）の生成をもたらす。触媒能のないＣａｓ９はｇＲＮＡと複合体形成して、ｇＲＮＡのターゲティングドメインによって特定化されたＤＮＡ配列に局在するが、それは標的ＤＮＡを切断しない。ｄＣａｓ９と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、ｇＲＮＡによって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にする。ｅｉＣａｓ９それ自体は、コード配列中の早期領域に動員された場合に、転写を妨げ得ることが示されている一方で、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＥＲＤ）をＣａｓ９に融合させて、それを遺伝子のプロモーター領域に動員することで達成され得る。プロモーターのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域は、Ｃａｓ９タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内因性転写因子のための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域をターゲティングすることで、おそらくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされてもよい。特に遺伝子抑制については、内因性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９は、クロマチン改変タンパク質に融合され得る。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。
【０４９８】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、既知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）に、および／または標的ＤＮＡの発現を調節できることが疑われる未知のまたは既知の機能がある配列に、ターゲティングされ得る。
【０４９９】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックダウンを使用して、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の発現が低下され得る。本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の２つなどの２つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、双方の遺伝子をターゲティングする個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の３つなどの３つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての３つの遺伝子をターゲティングする個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の４つなどの４つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての４つの遺伝子をターゲティングする個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の５つなどの５つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての５つの遺伝子をターゲティングする個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の６つなどの６つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての６つの遺伝子をターゲティングする個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。
【０５００】
ｃ）一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって使用される反復配列は、一般に３０ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいＤＮＡ合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがＤＮＡ二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、使用される２つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
【０５０１】
ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を改変または修正するのにテンプレート核酸を必要としない。それに代えて、相補的反復配列が使用される。
【０５０２】
ｄ）その他のＤＮＡ修復経路
（１）ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム内の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上で論じたＤＳＢ修復機序とは別個の機序であるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセッシング、ＤＮＡギャップ充填、およびＤＮＡライゲーションの４つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，６１９−６３１（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０５０３】
ＳＳＢが形成する第１段階では、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識して修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合および活性は一過性であり、損傷におけるＳＳＢｒタンパク質複合体の巣状滞留または安定性を促進することで、ＳＳＢｒを加速するようである。議論の余地はあるが、これらのＳＳＢｒタンパク質中で最重要であるのはＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡの３’および５’末端のクリーニングに関与するタンパク質をはじめとする、ＳＳＢｒプロセスの複数の酵素的構成要素と相互作用して、安定化し刺激する分子スキャフォールドとして機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセッシングを促進するいくつかのタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼβ、ＰＮＫ、および３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、およびＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ機能を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０５０４】
全部ではないとしても大多数のＳＳＢの３’および／または５’末端は「損傷を受け」ているため、この末端プロセッシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセッシングは、一般に、末端がライゲーションできるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化状態に回復させ、および／または損傷を受けた５’末端をリン酸部分に、回復させることを伴う。損傷を受けた３’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、およびＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびＡＰＴＸが挙げられる。ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）はまた、末端プロセッシングにも関与する。ひとたび末端がクリーニングされたら、ギャップ充填が起こり得る。
【０５０５】
ＤＮＡギャップ充填段階では、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ１）、ＤＮＡポリメラーゼδ／ε、ＰＣＮＡ、およびＬＩＧ１である。短いパッチ修復および長いパッチ修復の２つのギャップ充填様式がある。短いパッチ修復は、欠損している単一ヌクレオチドを挿入することを伴う。いくつかのＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ以上のヌクレオチドを転置し続けるかもしれない（最高１２塩基の転置が報告されている）。ＦＥＮ１は、転置された５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβをはじめとする複数のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＳＢの修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの起源とタイプによって影響を受ける。
【０５０６】
第４段階では、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）またはＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の連結を触媒する。短いパッチ修復はリガーゼＩＩＩを利用して、長いパッチ修復はリガーゼＩを利用する。
【０５０７】
時に、ＳＳＢＲは、複製−共役する。この経路には、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、およびＦＥＮ１の１つまたは複数が関与し得る。ＳＳＢＲを促進してもよい追加的要素としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼｂ、ＤＮＡポリメラーゼｄ、ＤＮＡポリメラーゼｅ、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、およびＥＲＣＣ１が挙げられる。
【０５０８】
（２）ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、ＭＭＲ、ＢＥＲ、およびＮＥＲの３つの切除修復経路を包含する：切除修復経路は、典型的に、ＤＮＡの１本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ／エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、１〜３０ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像は、Ｌｉ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）１８：８５−９８に記載され、概要は、本明細書で提供される。
【０５０９】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤対合ＤＮＡ塩基上で機能する。
【０５１０】
ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体は、どちらもミスマッチ認識および修復開始に重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６が、塩基−塩基ミスマッチを優先的に認識して、１または２ヌクレオチドの誤対合を同定する一方で、ＭＳＨ２／３は、より大型のＩＤ誤対合を優先的に認識する。
【０５１１】
ｈＭＬＨ１は、ｈＰＭＳ２とヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有しＭＭＲの複数の段階で重要であるｈＭｕｔＬαを形成する。これは、ＥＸＯ１が関与する３’ニック誘導ＭＭＲにおいて重要な役割を果たす、ＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。（ＥＸＯ１は、ＨＲおよびＭＭＲの双方に参加する。）これは、ミスマッチが誘発する切除の終了を制御する。リガーゼＩは、この経路の関連リガーゼである。ＭＭＲを促進してもよい追加的要素としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡ  Ｐｏｌｄ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、およびＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。
【０５１２】
（３）塩基切除修復（ＢＥＲ）
塩基切除修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期全体を通じて活性であり；それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路（次のセクションで考察される）は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，６１９−６３１（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０５１３】
ＤＮＡ塩基損傷に際して、塩基切除修復（ＢＥＲ）が開始されて、プロセスは、５つの主要な段階に簡略化され得る：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）後続の塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップ内への修正ヌクレオチド挿入；および（ｅ）ＤＮＡ骨格内の残りのニックのライゲーション。これらの最終段階は、ＳＳＢＲと類似する。
【０５１４】
第１段階では、損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼが、塩基を糖リン酸骨格に結合するＮグリコシド連結の切断を通じて、損傷を受けた塩基を切除する。次に、関連リアーゼ活性があるＡＰエンドヌクレアーゼ−１（ＡＰＥ１）または二機能性ＤＮＡグリコシラーゼがリン酸ジエステル骨格を切開して、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じた。ＢＥＲの第３段階は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを伴う。ＢＥＲの第４段階は、新規相補的ヌクレオチドを修復ギャップ内に付加するＰｏｌβによって実施され、最終段階で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩがＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールする。これで、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大部分（約８０％）が修復される、短いパッチＢＥＲ経路が完了する。しかし、段階３の５’末端が、末端プロセッシング活性に対して抵抗性であれば、Ｐｏｌβによる１個のヌクレオチド挿入に続いて、ポリメラーゼは複製的ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌδ／εに切り替わり、次にそれは、ＤＮＡ修復ギャップに約２〜８個のヌクレオチドを付加する。これは、５’フラップ構造を作り出し、それは、処理能力要素である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）によって認識され切除される。次にＤＮＡリガーゼＩが、ＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールして、長いパッチＢＥＲを完了する。ＢＥＲ経路を促進してもよい追加的要素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ、Ｐｏｌｅ、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ−１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、およびＡＰＴＸが挙げられる。
【０５１５】
（４）ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。ＮＥＲに関する加的な詳細は、Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，４６５−４８１（２０１４）にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路ＮＥＲは、２つのより小型の経路である、全ゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）と、転写と共役する修復ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）とを包含する。ＧＧ−ＮＥＲおよびＴＣ−ＮＥＲは、ＤＮＡ損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
【０５１６】
ひとたび障害が認識されたら、細胞は、損傷を含有する短い一本鎖ＤＮＡ断片を除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１およびＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷のどちらかの側で損傷を受けた鎖を切断し、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップを生成することで、損傷を除去する。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填合成およびライゲーションを実行するこのプロセスに関与するのは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  ＰｏｌεまたはＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびＤＮＡリガーゼＩまたはＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。ライゲーションステップの実行のために、自己複製細胞が、ＤＮＡ  ＰｏｌεおよびＤＮＡリガーゼＩを利用する傾向がある一方で、非自己複製細胞は、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびｔｈｅＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を利用する傾向がある。
【０５１７】
ＮＥＲは、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、およびＬＩＧ１の要素を伴い得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、およびＴＴＤＡの要素を伴い得る。ＮＥＲ修復経路を促進してもよい追加的要素としては、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ−ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、およびＰＣＮＡが挙げられる。
【０５１８】
（５）鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるＤＮＡ鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ＩＣＬ修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、およびＨＤＲである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のＩＣＬを切除するように動員される一方で、ＴＬＳおよびＨＤＲは、協調して切断された鎖を修復する。ＩＣＬ修復は、以下の要素を伴い得る：例えば、ＸＰＦおよびＲＡＤ５１Ｃなどのエンドヌクレアーゼ、ＲＡＤ５１などのエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼζおよびＲｅｖ１）などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、ＦａｎｃＪなどのファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質。
【０５１９】
（６）その他の経路
哺乳類には、いくつかのその他のＤＮＡ修復経路が存在する。
【０５２０】
損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断の修復経路であり、例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼが関与する。
【０５２１】
誤りのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断修復の別の経路である。
【０５２２】
ｅ）ゲノム編集法におけるｇＲＮＡの例
本明細書に記載されるようなｇＲＮＡ分子を二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかを生成するいずれかのＣａｓ９分子と共に使用して、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャなどの標的核酸の配列が改変され得る。いくつかの例では、標的核酸は、記載されるようないずれかのＰＤＣＤ１遺伝子座またはその近くにある。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子などのリボ核酸分子、およびＣａｓ９タンパク質またはその変異型などのタンパク質は、本明細書で提供される操作された細胞のいずれかに導入される。これらの方法で有用なｇＲＮＡ分子は、以下に記載される。
【０５２３】
一実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つまたは複数を含んでなるように構成される；
ａ）それは、例えば、二本鎖切断を生じるＣａｓ９分子のターゲティングに際して、二本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように配置され得る；
ｂ）それは、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドのターゲティングドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドのターゲティングドメインを有する；
ｃ）（ｉ）隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる；
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディスｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあるか、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディスｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドがあるか、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含んでなり；またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなり；または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールドメインなどの天然起源テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含んでなる。
【０５２４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５２５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５２６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５２７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５２８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５２９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｃの特性を含んでなるように構成される。
【０５３６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ、ｂ、およびｃの特性を含んでなるように構成される。
【０５３７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５３９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５４９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５５９】
一実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つまたは複数を含んでなるように構成される；
ａ）ｇＲＮＡの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子のターゲティングに際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る；
ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）、１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドのターゲティングドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドのターゲティングドメインを有し；
ｃ）（ｉ）隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる；
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディスｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあるか、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディスｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または個の５４ヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがあるか、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含んでなり；またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなり；または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールドメインなどの天然テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含んでなる。
【０５６０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５６９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｃの特性を含んでなるように構成される。
【０５７２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ、ｂ、およびｃの特性を含んでなるように構成される。
【０５７３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５７９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５８９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０５９６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異をＨ８４０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０５９７】
一実施形態では、例えば、第１および第２のｇＲＮＡを含んでなる１対のキメラｇＲＮＡなどの１対のｇＲＮＡは、それらが、以下の特性の１つまたは複数を含んでなるように構成される；
ａ）ｇＲＮＡの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子のターゲティングに際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る；
ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドのターゲティングドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドのターゲティングドメインを有する；
ｃ）以下の片方または双方：
（ｉ）隣接ドメインおよびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる；
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディスｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあるか、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディスｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがあるか、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含んでなり；または（ｏｒ，ｏｒ）それと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなり；または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｓ．アウレウス、またはＮ．メニンジチディステールドメインなどの天然起源テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０個のヌクレオチド、または全ての対応する部分を含んでなる；
ｄ）ｇＲＮＡが、標的核酸とハイブリダイズする際に、それらが、０〜５０、０〜１００、０〜２００、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０ヌクレオチドによって隔てられるように構成される；
ｅ）第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡによって生成される切断が、異なる鎖上にある；
ｆ）ＰＡＭが外側を向く。
【０５９８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０５９９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６００】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｘｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６０９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｃの特性を含んでなるように構成される。
【０６１０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ、ｂ、およびｃの特性を含んでなるように構成される。
【０６１１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６１２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６１３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６１４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６１５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６１６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６１７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６１８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６１９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６２０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６２１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６２２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６２３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６２４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６２５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６２６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６２７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６２８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６２９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６３０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６３１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６３２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６３３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６３４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６３５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６３６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６３７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６３８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６３９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６４０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６４１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６４２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６４３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６４４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６４５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６４６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６４７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６４８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６４９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６５０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６５１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６５２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６５３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６５４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６５５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６５６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６５７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６５８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６５９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６６０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６６１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６６２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【０６６３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【０６６４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６６５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【０６６６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６６７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異をＨ８４０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｎ８６３Ａなどの変異をＮ８６３に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＮ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【０６６８】
（１）遺伝子編集のための作用物質の機能解析
Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のいずれでも、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして評価され得る。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。
【０６６９】
（ａ）結合および切断アッセイ：Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成またはインビトロ転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応前にプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
【０６７０】
代案としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと共に、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成し、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μＬでプレインキュベートされる。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μＬのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
【０６７１】
これらのアッセイの片方または双方を用いて、提供されたｇＲＮＡ分子またはＣａｓ９分子のいずれかの適合性を評価し得る。
【０６７２】
（ｂ）結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。
【０６７３】
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％ネイティブゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されたＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを用いて、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％のグリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μｌで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡは、２０ｐＭの最終濃度で添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡがホスホロイメージングによって視覚化される。
【０６７４】
（ｃ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性を測定するための技術
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）およびその他の技術によって検出され得る。タンパク質の熱安定性は、例えばｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの、好ましい条件下で増大し得る。したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを判定するのに有用である。
【０６７５】
（ｄ）示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦによって測定され得る。ＲＮＰ複合体は、下述されるように、ＲＮＡまたはｇＲＮＡなどのリボヌクレオチドの配列、およびＣａｓ９タンパク質またはその変異型などのタンパク質を含む。この技術は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増大し得る、タンパク質の熱安定性を測定する。
【０６７６】
アッセイは、いくつかの方法で適用され得る。代表的プロトコルとしては、ＲＮＰ形成のための所望の溶液条件を判定するためのプロトコル（アッセイ１、下記参照）、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の所望の化学量論比を試験するためのプロトコル（アッセイ２、下記参照）、例えば、野生型または変異Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子のための有効なｇＲＮＡ分子をスクリーニングするためのプロトコル（アッセイ３、下記参照）、および標的ＤＮＡの存在下におけるＲＮＰ形成を調べるためのプロトコル（アッセイ４）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、アッセイは、１つはｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の最良の化学量論比を試験し、もう１つはＲＮＰ形成のための最良の溶液条件を判定する、２つの異なるプロトコルを用いて実施される。
【０６７７】
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Ｃａｓ９の２μＭ水溶液＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−６６５０）が３８４ウェルプレート内に分注される。次に、様々なｐＨおよび塩を有する溶液中に希釈された、等モル量のｇＲＮＡが添加される。室温で１０秒間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０６７８】
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のｇＲＮＡと２μＭ  Ｃａｓ９を混合して、３８４ウェルプレート内で、室温で１０秒間インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートはＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ接着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための短時間の遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０６７９】
第３のアッセイでは、目的のＣａｓ９分子（例えば、Ｃａｓ９変異タンパク質などのＣａｓ９タンパク質）が精製される。変異ｇＲＮＡ分子のライブラリーが合成され、２０μＭの濃度に再懸濁される。Ｃａｓ９分子は、５×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−６６５０）の存在下で、所定の緩衝液中でそれぞれ１μＡの最終濃度でｇＲＮＡ分子と共にインキュベートされる。室温で１０分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ２（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを用いて、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配が実行される。
【０６８０】
第４のアッセイでは、以下のサンプルに対してＤＳＦ実験が実施される：Ｃａｓ９タンパク質単独、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質と標的ＤＮＡ。成分を混合する順序は、反応液、Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅである。反応溶液は、ＭｇＣｌ２の非存在下または存在下で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。あらゆる気泡を除去するための２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ２（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを用いて、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配が実行される。
【０６８１】
５．標的細胞
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞が操作され得る。
【０６８２】
一実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるような１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異を誘導する）ことで操作される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）の発現が調節される。別の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異を誘導する）ことで、および／または例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節することで、エクスビボで操作されて、対象に投与される。エクスビボ操作のための標的細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。エクスビボ操作のための標的細胞の起源としては、例えば、異種供与者血液、臍帯血、または骨髄もまた挙げられる。
【０６８３】
分子本明細書に記載されるＣａｓ９およびｇＲＮＡは、標的細胞に送達され得る。一実施形態では、標的細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）または樹状細胞などのＴ細胞である。一実施形態では、標的細胞は、例えば、対象から作成されて、操作され、改変された（例えば、変異誘導された）、または例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の標的遺伝子の発現が操作されて、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞などのＴ細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化した、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞に由来する細胞である。
【０６８４】
一実施形態では、標的細胞は、特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子）を含有するように改変されている。別の実施形態では、ＴＣＲは、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＰ１００、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノーマ抗原Ａ３（ＭＡＧＥ  Ａ３）、ＮＹＥＳＯ１またはｐ５３などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【０６８５】
一実施形態では、標的細胞は、特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有するように改変されている。一実施形態では、ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＲＢＢ２、ＧＤ２、α−葉酸受容体、ルイスＹ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）または腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【０６８６】
別の実施形態では、標的細胞は、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲなどによって、以下の腫瘍抗原の１つまたは複数に結合するように改変されている。腫瘍抗原としては、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＲＡＰ、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ−７、ＣＴ８／ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ｃＴＡＧＥ−１、フィビュリン−１、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｈＣＡＰ−Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ｃｗ、ＨＯＭ−ＨＤ−２１／ガレクチン９、ＨＯＭ−ＭＥＥＬ−４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ−ＲＣＣ−３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、ＫＭ−ＨＮ−３、ＫＭ−ＫＮ−１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＰＰ１１、ＭＳＬＮ、ＮＮＰ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＣＯ−３７、ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−５、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＮＹ−ＲＥＮ−１０、ＮＹ−ＲＥＮ−１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ−ＲＥＮ−２１、ＮＹ−ＲＥＮ−２６／ＢＣＲ、ＮＹ−ＲＥＮ−３／ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＲＥＮ−３３／ＳＮＣ６、ＮＹ−ＲＥＮ−４３、ＮＹ−ＲＥＮ−６５、ＮＹ−ＲＥＮ−９、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＯＧＦｒ、ＰＬＵ−１、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪκ、ＲＨＡＭＭ、ＳＣＰ１、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、またはチロシナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０６８７】
ａ）構成要素の標的細胞へのエクスビボ送達の方法
例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、多様な送達方法および剤形を使用して、多様な形態で標的細胞内に導入され得て、例えば、表６および７を参照されたい。Ｃａｓ９またはｇＲＮＡ構成要素が、送達のためにＤＮＡとしてコードされる場合、ＤＮＡは、必須ではないが典型的に制御領域を含んでもよく、例えば、プロモーターを含んでなり、発現をもたらす。Ｃａｓ９分子配列の有用なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、またはＣＡＧプロモーターが挙げられる。ｇＲＮＡの有用なプロモーターとしては、例えば、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度があるプロモーターを選択して、構成要素の発現が調整され得る。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、例えば、ＳＶ４０ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでなってもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊を誘導できる作用物質がＲＮＰ複合体に導入される。ＲＮＰ複合体は、ＲＮＡまたはｇＲＮＡ分子などのリボヌクレオチドの配列、およびＣａｓ９タンパク質またはその変異型などのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書で提供されるＣａｓ９タンパク質と、例えばＰＤＣＤ１を標的とするｇＲＮＡなどの本明細書で提供されるｇＲＮＡ分子とを含んでなる、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として送達される。いくつかの実施形態では、記載されるようないずれかのＰＤＣＤ１をターゲティングする１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９酵素またはその変異型とを含むＲＮＰは、物理的送達（例えば、電気穿孔、粒子銃、リン酸カルシウム移入、細胞圧縮または圧搾）リポソームまたはナノ粒子を通じて、細胞に直接導入される。特定の実施形態では、ＰＤＣＤ１をターゲティングする１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９酵素またはその変異体とを含むＲＮＰは、電気穿孔を通じて導入される。
【０６８８】
表６は、構成要素が標的細胞に送達され得る形式の例を提供する。
【０６８９】
（表６）
2019517788.tif 000087
【０６９０】
表７は、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステム構成要素の様々な送達方法を要約する。
【０６９１】
（表７）
2019517788.tif 000088
【０６９２】
（１）Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはそれらの組み合わせによって、送達され得る。
【０６９３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
【０６９４】
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなり得る。ベクターはまた、例えば、Ｃａｓ９分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含んでなり得る。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０からの）を含んでなり得る。
【０６９５】
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライス受容体またはドナーなどの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され得る。一実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、調節プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。別の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【０６９６】
一実施形態では、ベクターまたは送達ビヒクルは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。一実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。一実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０６９７】
一実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。別の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。別の実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。別の実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。別の実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。別の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。別の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こす。別の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
【０６９８】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えレトロウイルスによって送達される。別の実施形態では、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするものなどの逆転写酵素を含んでなる。一実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。
【０６９９】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０７００】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えアデノウイルスによって送達される。別の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
【０７０１】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えＡＡＶによって送達される。一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、本明細書に記載されるような標的細胞などの宿主細胞に、そのゲノムを組み込み得る。別の実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆおよび／またはＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０、そしてＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶをはじめとする、開示される方法で使用されてもよいＡＡＶ血清型はまた、開示される方法で使用され得る。
【０７０２】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドなどのハイブリッドウイルスによって送達される。
【０７０３】
パッケージング細胞が使用されて、標的細胞を感染させる能力があるウイルス粒子が形成される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと（妥当な場合）引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばＣａｓ９などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに提供される。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベクター複製とＡＡＶ遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
【０７０４】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型の認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長因子などのターゲティングリガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【０７０５】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、特異的標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ）などのが組み込まれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）核膜の分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
【０７０６】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ  ［２０１２］  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０７０７】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、細胞がＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０７０８】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）と組み合わされたリポソームを含んでなり、それはウイルスまたはリポソーム法単独のどちらよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【０７０９】
一実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。一実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）、およびシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である。代表的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質で被覆されたプロタミン核酸複合体に加えて、カチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
【０７１０】
遺伝子移入のための代表的脂質は、下で表８に示される。
【０７１１】
（表８）遺伝子移入のために使用される脂質
2019517788.tif 000089
【０７１２】
遺伝子移入のための代表的なポリマーは、下で表９に示される。
【０７１３】
（表９）遺伝子移入のために使用されるポリマー
2019517788.tif 000090
【０７１４】
一実施形態では、ビヒクルは、ターゲティング修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞アップデートが増大される。一実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。一実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために）。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
【０７１５】
一実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。一実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定細胞をターゲティングする細菌；修飾表面タンパク質を有して標的細胞特異性を改変する細菌）である。一実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれたターゲティングリガンドを有する）。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスのエクスビボ構築によって）。ビヒクルはまた改変されて、ターゲティングリガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、組織ターゲティングが、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンドターゲティングの必要なしに細胞に取り込まれ得る）である。
【０７１６】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などの、Ｃａｓシステムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数と同時に、送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素の１つまたは複数とは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達され得て、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。一実施形態では、核酸分子は、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子をコードする。
【０７１７】
（２）Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質）をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される標的細胞などの細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ［２０１２］Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０７１８】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子と混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子と混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０７１９】
（３）Ｃａｓ９タンパク質およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）（ＲＮＰ）の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質）は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、ｂｙマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ［２０１２］Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡを伴い得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書で提供されるＣａｓ９タンパク質と、例えばＰＤＣＤ１を標的とするｇＲＮＡなどの本明細書で提供されるｇＲＮＡ分子とを含んでなる、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として送達される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰ複合体は、ＲＮＡまたはｇＲＮＡ分子などのリボヌクレオチドの配列、およびＣａｓ９タンパク質またはその変異型などのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、記載されるようないずれかのＰＤＣＤ１をターゲティングする１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９酵素またはその変異型とを含むＲＮＰは、物理的送達（例えば、電気穿孔、粒子銃、リン酸カルシウム移入、細胞圧縮または圧搾）、リポソームまたはナノ粒子を通じて、細胞に直接導入される。特定の実施形態では、記載されるようないずれかのＰＤＣＤ１をターゲティングする１つまたは複数のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９酵素またはその変異型を含むＲＮＰは、電気穿孔を通じて導入される。
【０７２０】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）とｇＲＮＡ分子ありまたはなしで混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）とｇＲＮＡ分子ありまたはなしで混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０７２１】
６．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡなどの核酸中に存在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮＡにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含んでなるヌクレオシドと定義される。
【０７２２】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
【０７２３】
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
【０７２４】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【０７２５】
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解されやすくあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
【０７２６】
ａ）リン酸塩骨格修飾
（１）リン酸基
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
【０７２７】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。いくつかの実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
【０７２８】
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。いくつかの実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
【０７２９】
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
【０７３０】
（２）リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
【０７３１】
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
【０７３２】
（３）リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
【０７３３】
ｂ）糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
【０７３４】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。いくつかの実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。いくつかの実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
【０７３５】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
【０７３６】
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
【０７３７】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
【０７３８】
ｃ）核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
【０７３９】
（１）ウラシル
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−���オ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【０７４０】
（２）シトシン
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０７４１】
（３）アデニン
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０７４２】
（４）グアニン
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０７４３】
ｄ）代表的修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。本明細書に記載されるｇＲＮＡのいずれでも、このセクションに従って修飾され得るものと理解される。本明細書で考察されるように、一過性に発現されまたは送達される核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解を起こしやすくあり得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得る。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載のこれらおよびその他の修飾ｇＲＮＡは、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞などの循環細胞）での安定性の向上を示し、これが観察された改善の原因かもしれない。
【０７４４】
例えば、本明細書で考察されるように、本発明者らは、ｇＲＮＡの５’末端が、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログの組み入れによって修飾された場合に、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞）におけるエクスビボ遺伝子編集における改善を見た。本発明は、５’キャッピングｇＲＮＡで観察された改善が、その他の様式で修飾されたｇＲＮＡに拡張されて、同一タイプの構造的または機能的結果が達成され得るという認識を包含する（例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの組み入れによって、またはインビトロ転写ｇＲＮＡが仔ウシ腸管アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによる処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される場合など）。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、１つまたは複数の修飾（例えば、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチド）を含有してもよく、それはヌクレアーゼに安定性を導入する（例えば、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび／または３’ポリＡテールを含めることで）。
【０７４５】
したがって、一態様では、本明細書で考察される方法および組成物は、５’末端またはその近く（例えば、それらの５’末端の１〜１０、１〜５または１〜２ヌクレオチド以内）で修飾されたｇＲＮＡを使用することによって、特定の細胞を遺伝子編集（例えば、エクスビボ遺伝子編集）するための方法および組成物を提供する。
【０７４６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は５’三リン酸基を欠いている。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの５’末端は５’三リン酸基を欠いている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの５’末端は５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は５’三リン酸基を欠いている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子はターゲティングドメインを含んでなり、ターゲティングドメインの５’末端は５’三リン酸基を欠いている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子はターゲティングドメインを含んでなり、ターゲティングドメインの５’末端は５’キャップを含む。
【０７４７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップ類似体（例えば、限定されるものではないが、Ｇ（１９’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（７’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ３Ｇ（７’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗逆転キャップアナログ（ＡＲＣＡ））の包含によって修飾される。特定の実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000091
を有し、
式中、Ｂ１およびＢ１’のそれぞれは、独立して、
2019517788.tif 000092
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルまたは６員環ヘテロアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであり、；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’のそれぞれは、独立してＨ、Ｆ、ＯＨ、またはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ’およびＹ’のそれぞれは、独立して、ＯまたはＣＨ２である。
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
一実施形態では、Ｂ１’は、
2019517788.tif 000093
である。
【０７４８】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７４９】
一実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、Ｏである。
【０７５０】
一実施形態では、Ｘ’およびＹ’はＯである。
【０７５１】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000094
を有する。
【０７５２】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000095
を有する。
【０７５３】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000096
を有する。
【０７５４】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000097
を有する。
【０７５５】
一実施形態では、ＸはＳであり、ＹおよびＺはＯである。
【０７５６】
一実施形態では、ＹはＳであり、ＸおよびＺはＯである。
【０７５７】
一実施形態では、ＺはＳであり、ＸおよびＹはＯである。
【０７５８】
一実施形態では、ホスホロチオエートは、Ｓｐジアステレオマーである。
【０７５９】
一実施形態では、Ｘ’はＣＨ２であり、Ｙ’はＯである。
【０７６０】
一実施形態では、Ｘ’はＯであり、Ｙ’はＣＨ２である。
【０７６１】
一実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’四リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる。
【０７６２】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000098
を有し、
式中、Ｂ１およびＢ１’のそれぞれは、独立して、
2019517788.tif 000099
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルまたは６員環ヘテロアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであり、；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、またはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’のそれぞれは、独立して、ＯまたはＣＨ２である。
【０７６３】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７６４】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０７６５】
一実施形態では、Ｂ１’は、
2019517788.tif 000100
である。
【０７６６】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７６７】
一実施形態では、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、Ｏである。
【０７６８】
一実施形態では、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’のそれぞれは、Ｏである。
【０７６９】
一実施形態では、Ｘ’はＣＨ２であり、Ｙ’およびＺ’はＯである。
【０７７０】
一実施形態では、Ｙ’はＣＨ２であり、Ｘ’およびＺ’はＯである。
【０７７１】
一実施形態では、Ｚ’はＣＨ２であり、Ｘ’およびＹ’はＯである。
【０７７２】
一実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’五リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる。
【０７７３】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
2019517788.tif 000101
を有し、
式中、
Ｂ１およびＢ１’のそれぞれは、独立して、
2019517788.tif 000102
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルまたは６員環ヘテロアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであり、；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’のそれぞれは、独立してＨ、Ｆ、ＯＨ、またはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’のそれぞれは、独立して、ＯまたはＣＨ２である。
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
一実施形態では、Ｂ１’は、
2019517788.tif 000103
である。
【０７７４】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７７５】
一実施形態では、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、Ｏである。
【０７７６】
一実施形態では、Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’のそれぞれは、Ｏである。
【０７７７】
本明細書の用法では、用語「５’キャップ」は、伝統的なｍＲＮＡの５’キャップ構造だけでなく、これらの類似体もまた包含するものと理解される。例えば、上に示す化学構造に包含される５’キャップ構造に加えて、例えば、メチレン−ビス（ホスホネート）部分を有する四リン酸類似体（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ、Ａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ７（２２）：４７６３−７６を参照されたい）、非架橋酸素のイオウ置換を有する類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，（２００７）ＲＮＡ  １３（１０）：１７４５−１７５５を参照されたい）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＲＮＡ  １０（９）：１４７９−１４８７を参照されたい）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、米国特許第７，０７４，５９６号明細書、およびＪｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＲＮＡ  ９（９）：１  １０８−１１２２、およびＳｔｅｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ  ７（１０）：１４８６−１４９５を参照されたい）が使用されてもよい。本出願はまた、ＯＨまたはＯＭｅの代わりにハロゲン基を有するキャップ類似体（例えば、米国特許第８，３０４，５２９号明細書を参照されたい）；少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有するキャップ類似体（例えば、米国特許第８，１５３，７７３号明細書、およびＫｏｗａｌｓｋａ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＲＮＡ  １４（６）：１  １１９−１１３１を参照されたい）；および少なくとも１つのボラノリン酸またはホスホロセレノ酸結合を有するキャップ類似体（例えば、米国特許第８，５１９，１１０号明細書を参照されたい）；およびアルキニル−誘導体化５’キャップ類似体（例えば、米国特許第８，９６９，５４５号明細書を参照されたい）の使用も包含する。
【０７７８】
一般に、５’キャップは、ｇＲＮＡの化学合成またはインビトロ転写のどちらかの最中に包含され得る。一実施形態では、５’キャップは使用されず、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡは、５’三リン酸基を除去するホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）処理によって修飾される。
【０７７９】
本明細書で考察される方法および組成物は、３’ポリＡテールを含んでなるｇＲＮＡを使用することによって、遺伝子編集するための方法および組成物もまた提供する。このようなｇＲＮＡは、例えば、ｇＲＮＡ分子前駆体のインビトロ転写に続いて、ポリアデノシンポリメラーゼを使用して、ｇＲＮＡ分子前駆体にポリＡテールを付加することによって調製されてもよい。例えば、一実施形態では、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリメラーゼを使用して、酵素的に付加されてもよい。ポリＡテールを含むｇＲＮＡはまた、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製されてもよい。一実施形態では、規定された長さのポリＡテールがＤＮＡ鋳型上でコードされ、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなど）を通じてｇＲＮＡで転写される。ポリＡテールを有するｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡ分子前駆体およびポリＡオリゴヌクレオチドに相補的なスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下における、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼを使用したインビトロ転写に続いて、ポリＡオリゴヌクレオチドをｇＲＮＡ分子前駆体にライゲートすることによって調製されてもよい。例えば、一実施形態では、規定された長さのポリＡテールが合成オリゴヌクレオチドとして合成され、ガイドＲＮＡおよびポリＡオリゴヌクレオチドに相補的なスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼのどちらかによってｇＲＮＡの３’末端にライゲートされる。ポリＡテールを含むｇＲＮＡはまた、１つまたは複数のスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼのどちらかによって共にライゲートされる、１つまたは複数の小片中で合成的に調製されてもよい。
【０７８０】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、例えば、４５個未満のアデニンヌクレオチド、４０個未満のアデニンヌクレオチド、３５個未満のアデニンヌクレオチド、３０個未満のアデニンヌクレオチド、２５個未満のアデニンヌクレオチドまたは２０個未満のアデニンヌクレオチドなどの、５０個未満のアデニンヌクレオチドから構成される。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、例えば、５〜４０個のアデニンヌクレオチド、５〜３０個のアデニンヌクレオチド、１０〜５０個のアデニンヌクレオチド、または１５〜２５個のアデニンヌクレオチドなどの、５〜５０個のアデニンヌクレオチドから構成される。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される。
【０７８１】
本明細書で考察される方法および組成物はまた、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡを使用して、遺伝子編集（例えば、エクスビボ遺伝子編集）するための方法および組成物も提供する。
【０７８２】
このセクションで考察される例示的な修飾のいくつかは、ｇＲＮＡ配列内の任意の位置に含まれてもよい一方で、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近く（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５または１〜２ヌクレオチド以内）に、修飾を含んでなる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその近く（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含んでなる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近くの修飾と、その３’末端またはその近くの修飾との双方を含んでなる。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、真核細胞で発現される遺伝子由来の標的ドメインと相補的であるターゲティングドメインを含んでなり、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端が修飾され、３’ポリＡテールを含んでなる。ｇＲＮＡ分子は、例えば、５’三リン酸基を欠いていてもよい（例えば、ターゲティングドメインの５’末端が５’三リン酸基を欠いている）。一実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、５’三リン酸基を除去するためにホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理することによって修飾され、本明細書に記載されるような３’ポリＡテールを含んでなる。あるいは、ｇＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、５’キャップを含むターゲティングドメインの５’末端）を含んでもよい。一実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、５’キャップ構造またはキャップ類似体、および本明細書に記載されるような３’ポリＡテールの双方を含有する。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、５’キャップは、（例えば、上記のように）任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、例えば、５〜４０個のアデニンヌクレオチド、５〜３０個のアデニンヌクレオチド、１０〜５０個のアデニンヌクレオチド、１５〜２５個のアデニンヌクレオチド、３０個未満のアデニンヌクレオチド、２５個未満のアデニンヌクレオチドまたは約２０個のアデニンヌクレオチドなどの、５〜５０個のアデニンヌクレオチドから構成される。
【０７８３】
なおも別の実施形態では、本発明は、真核細胞で発現される遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡ分子を提供し、ｇＲＮＡ分子は、３０個未満のアデニンヌクレオチド（例えば、２５個未満のアデニンヌクレオチド、１５〜２５個のアデニンヌクレオチド、または約２０個のアデニンヌクレオチド）から構成される、３’ポリＡテールを含んでなる。いくつかの実施形態では、これらのｇＲＮＡ分子は、それらの５’末端でさらに修飾される（例えば、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、５’三リン酸基を除去するホスファターゼ処理によって修飾され、または５’キャップを包含するように修飾される）。
【０７８４】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端および３’末端Ｕリボースが修飾される（例えば、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるように、５’三リン酸基を除去するホスファターゼ処理によって修飾され、または５’キャップを包含するように修飾される）。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される（下に示される）修飾ヌクレオシドをもたらす：
2019517788.tif 000104
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
【０７８５】
別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
2019517788.tif 000105
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
【０７８６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの８位に修飾がある修飾アデノシンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
【０７８７】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近くの修飾と、その３’末端またはその近くの修飾との双方を含んでなる。一実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡは、５’キャップ構造またはキャップアナログと、３’ポリＡテールとの双方を含有する。一実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾されて５’三リン酸基が除去され、３’ポリＡテールを含んでなる。
【０７８８】
前述の事項が末端修飾に焦点を合わせる一方で、本明細書で考察される方法および組成物は、ｇＲＮＡ配列中の１つまたは複数の非末端位置および／または１つまたは複数の末端位置に、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、ｇＲＮＡを使用してもよいものと理解される。
【０７８９】
いくつかの実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、ＳＨ、ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（ＣＮ）から選択される基によって置換される。いくつかの実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾；または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルをはじめとする２’−フルオロ修飾；グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
【０７９０】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては「ロックド」核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、その中では、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の４’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。
【０７９１】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）が挙げられる。
【０７９２】
一般に、ｇＲＮＡ分子としては、酸素を有する５員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾ｇＲＮＡｓとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は２’位置に局在するが、４’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含んでなる。
【０７９３】
いくつかの実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
【０７９４】
ｅ）ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡｓ）は、天然細胞性１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。それらは、例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲなどで、適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。理論による拘束は望まないが、下方制御は、核酸分子安定性の低下または翻訳阻害のどちらかによると考えられる。例えば、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡなどの本明細書で開示されるＲＮＡ種は、例えば、その３’ＵＴＲなどに、ｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択された細胞型内の発現の下方制御を促進するように選択され得る。一例として、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２に対する結合部位の組み込みは、肝臓における対象遺伝子の発現を阻害し得る。
【０７９５】
Ｄ．支配ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９システムの活性を制限するためのその使用
例えば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡなどの核酸を使用しまたはそれを含む、方法および組成物は、「支配ｇＲＮＡ分子」をさらに使用しまたはそれを含み得る。支配ｇＲＮＡは、細胞または対象に導入されたその他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素の活性を制限し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、細胞または対象に導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素をコードする配列を含んでなる、核酸上の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、（ａ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸上；（ｂ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子をターゲティングするターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡをコードする核酸（標的遺伝子ｇＲＮＡ）上；または例えば（ａ）および（ｂ）の双方などの２つ以上の上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素をコードする核酸上の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含んでなる。支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子と複合体形成して、システムの構成要素を不活性化し得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃａｓ９分子をコードする配列を含んでなる、核酸を不活性化する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなる、核酸を不活性化する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に、時間的、発現レベル、またはその他の制限を課す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、オフターゲットまたはその他の望まれない活性を低下させる。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素を負制御するために、コード配列、または例えば、プロモーターなどの制御領域をターゲティングする。例えば、支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子のコード配列を、または例えば、Ｃａｓ９分子コード配列の発現を制御するプロモーターなどの制御領域を、またはそれらの２つの間に配置される配列をターゲティングし得る。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、コード配列を、または例えば、プロモーターなどの標的遺伝子ｇＲＮＡの制御領域をターゲティングする。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ターゲティングまたは標的遺伝子ｇＲＮＡターゲティング、支配ｇＲＮＡ分子、またはそれをコードする核酸などの支配ｇＲＮＡは、例えば、Ｃａｓ９分子またはそれをコードする核酸よりも後に別々に導入される。例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターなどの第１のベクターは、Ｃａｓ９分子および１つまたは複数の標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を導入し得て、例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターなどの第２のベクターは、例えば、Ｃａｓ９ターゲティングまたは標的遺伝子ｇＲＮＡターゲティング、ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を導入し得る。一実施形態では、第２のベクターは、第１のベクターの後に導入され得る。その他の実施形態では、例えば、Ｃａｓ９ターゲティングまたは標的遺伝子ｇＲＮＡターゲティング、支配ｇＲＮＡ分子、またはそれをコードする核酸などの支配ｇＲＮＡ分子は、例えば、同時にまたは同一ベクター内で、Ｃａｓ９分子またはそれをコードする核酸と共に導入され得るが、例えば、しばらくするとＣａｓ９転写が低下するように、後から活性化される、プロモーターまたはエンハンサーなどの転写制御要素の下にある。一実施形態では、転写制御因子は、内因的に活性化される。一実施形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を通じて活性化される。
【０７９６】
典型的に、例えば、Ｃａｓ９ターゲティングｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成要素とは異なる、例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。一実施形態では、「異なる制御領域」は、単に、例えば、調節される双方の配列と機能的に（機能的に）連結するプロモーターなどの１つの制御領域の制御下にないことを指す。一実施形態では、異なるは、制御領域の種類またはタイプが「異なる制御領域」を指す。例えば、Ｃａｓ９ターゲティングｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列は、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成要素をコードする配列よりも低い発現レベルを有し、またはそれよりも後に発現される、例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。
【０７９７】
一例として、例えば、Ｃａｓ９ターゲティング支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列は、例えば、ヒトＵ６核内低分子プロモーター、またはヒトＨ１プロモーターなどの本明細書に記載される制御領域（例えば、プロモーター）の制御下にあり得る。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に制御する構成要素をコードする配列は、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモーターなどの本明細書に記載される制御領域（例えば、プロモーター）の制御下にあり得る。
【０７９８】
ＩＩＩ．組成物および製剤
このような細胞の集団、このような細胞を含有する、および／またはこのような細胞が富化されている組成物もまた提供され、その中では、組換え受容体を発現する細胞が、組成物中の全細胞の、またはＴ細胞またはＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞などの特定のタイプの、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を構成する。組成物としては、養子細胞療法などの投与のための薬学的組成物および製剤が挙げられる。細胞および組成物が、例えば患者などの対象に投与される治療方法もまた提供される。
【０７９９】
所定の用量またはその一部分の投与のための細胞数を含む単位用量形態の組成物などの、薬学的組成物および製剤をはじめとする、投与のための細胞を含む組成物もまた提供される。薬学的組成物および製剤は、一般に、１つまたは複数の任意選択の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加的な治療剤を含む。
【０８００】
「医薬製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない、調製物を指す。
【０８０１】
「薬学的に許容可能な担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８０２】
いくつかの態様では、担体の選択は、特定の細胞および／または投与方法によって、ある程度決定される。したがって、様々な適切な製剤が存在する。例えば、薬学的組成物は保存料を含有し得る。適切な保存料としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられる。いくつかの態様では、２種以上の保存料の混合物が使用される。保存料またはそれらの混合物は、典型的に、全組成物の約０．０００１重量％〜約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）によって記載される。薬学的に許容可能な担体は、一般に、用いられる用量および濃度でレシピエントにとって無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８０３】
いくつかの態様では、緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および様々なその他の酸および塩が挙げられる。いくつかの態様では、２種以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはそれらの混合物は、典型的に、全組成物の約０．００１重量％〜約４重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は、公知である。例示的方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ  ｅｄ．（Ｍａｙ１、２００５）により詳細に記載される。
【０８０４】
製剤は、水溶液を含み得る。製剤または組成物はまた、細胞で治療される特定の適応症、疾患、または病状に有用であり、好ましくは、細胞に対する相補的活性があって各活性が互いに悪影響を及ぼさないものである、２種以上の活性成分もまた含有してもよい。このような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わされて、適切に存在する。したがって、いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および／またはビンクリスチンのような化学療法剤などのその他の薬学的に活性な作用物質または薬物をさらに含む。
【０８０５】
いくつかの実施形態における薬学的組成物は、治療有効量または予防有効量などの、疾患または病状を治療または予防するのに有効な量で細胞を含有する。いくつかの実施形態における治療的または予防的有効性は、治療対象の定期的な評価によってモニタリングされる。所望の投与量は、細胞の単回ボーラス投与、細胞の複数回ボーラス投与、または細胞の持続注入投与によって送達され得る。
【０８０６】
細胞および組成物は、標準的な投与技術、製剤、および／または装置を用いて投与されてもよい。細胞の投与は、自己由来または異種であり得る。例えば、免疫応答性細胞または前駆細胞は、１対象から得られ得て、同一対象または異なる適合性対象に投与され得る。免疫応答性細胞由来またはそれらの子孫由来（例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来）の末梢血は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射または非経口投与をはじめとする、局所注射を通じて投与され得る。治療用組成物（例えば、遺伝子修飾免疫応答細胞を含有する薬学的組成物）が投与される場合、それは、一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。
【０８０７】
製剤としては、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、バッカル、舌下、または坐薬投与のためのものが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞集団は非経口的に投与される。「非経口」という用語は、本明細書の用法では、静脈内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内、および腹腔内投与を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、静脈内、腹腔内または皮下注射による末梢全身送達を用いて対象に投与される。
【０８０８】
いくつかの態様における組成物は、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液などの滅菌液体調製物または粘稠組成物として提供され、いくつかの態様では、それは選択されたｐＨに緩衝化されてもよい。液体製剤は、通常、ゲル、その他の粘稠組成物、および固体組成物よりも調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に、注射によって投与するのに、いくらか都合が良い。他方、粘稠組成物は、特定の組織とのより長い接触時間を提供するために、適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘稠組成物は担体を含んでなり得て、それは例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【０８０９】
無菌注射液は、滅菌水、生理学的生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤の混合物などの溶媒に、細胞を組み入れることによって、調製され得る。組成物は、投与経路および所望の調製物次第で、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存料、着香剤および／または着色料などの補助剤を含有し得る。いくつかの態様では、標準的なテキストが、適切な調製物を作製するために参照されてもよい。
【０８１０】
抗菌保存料、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤をはじめとする、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加剤が添加され得る。微生物活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤によって確実にされ得る。例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の使用により、注射用医薬品形態の持続的吸収がもたらされ得る。
【０８１１】
インビボ投与のために使用される製剤は、一般に滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通過させることによって容易に達成されてもよい。
【０８１２】
ＩＶ．養子細胞療法における投与および使用の方法
細胞、集団、および組成物を投与する方法、ならびにがんをはじめとする疾患、病状、および障害を治療または予防するためのこのような細胞、集団、および組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態では、細胞、集団、および組成物は、例えば、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法を介して、例えば、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法を通じて治療される、特定の疾患または病状を有する対象または患者に投与される。いくつかの実施形態では、インキュベーションおよび／またはその他の処理工程に続いて、操作された組成物および最終生成組成物などの提供される方法によって調製された細胞および組成物は、疾患または病状を有しまたはリスクがある対象などの対象に投与される。いくつかの態様では、それによって方法は、操作されたＴ細胞によって認識される抗原を発現するがんにおける腫瘍量を低下させることなどによって、例えば、疾患または病状の１つまたは複数の症状を寛解させるなどして、治療する。
【０８１３】
養子細胞療法のための細胞の投与方法は公知であり、提供される方法および組成物に関連して使用されてもよい。例えば、養子Ｔ細胞療法方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらに付与された米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号明細書；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，６９０，９１５号明細書；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７−８５に記載される）。例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８−９３３；Ｔｓｕｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４３８（１）：８４−９；Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８を参照されたい。
【０８１４】
本明細書の用法では、「対象」は、ヒトまたはその他の動物などの哺乳類であり、典型的にヒトである。いくつかの実施形態では、例えば、細胞、細胞集団、または組成物が与される患者などの対象は、哺乳類であり、典型的にヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態では、霊長類は、サルまたは類人猿である。対象は男性または女性であり得て、乳児、若年者、青年、成人、および老人対象をはじめとする、任意の適切な年齢であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、齧歯類などの非霊長類哺乳類である。
【０８１５】
本明細書の用法では、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（および「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法的変形）は、疾患または症状または障害、またはそれに関連する症状、悪影響または転帰、または表現型の完全なまたは部分的な改善または低下を指す。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、病態の改善または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられるが、これに限定されるものではない。この用語は、疾患の完全な治癒、またはあらゆる症状の完全な消失、または全ての症状または転帰に対する効果を暗示するものではない。
【０８１６】
本明細書の用法では、「疾患の発生を遅延させる」とは、疾患（がんなど）の発症を延期し、妨げ、減速し、遅らせ、安定化し、抑制しおよび／または遅延させることを意味する。この遅延は、治療される疾患および／または個人の病歴に左右され、様々な時間であり得る。当業者には明白であるように、個人が疾患を発症しないという点で、十分なまたは顕著な遅延は、実質的に予防を包含し得る。例えば、転移の発生などの後期がんが、遅延されてもよい。
【０８１７】
本明細書の用法では、「予防する」は、疾患に罹りやすいがなおも疾患を診断されていない対象における、疾患の発生または再発に対する予防を提供することを含む。いくつかの実施形態では、提供される細胞および組成物を使用して、疾患の発生を遅延させ、または疾患の進行を減速する。
【０８１８】
本明細書の用法では、機能または活性を「抑制」することは、関心のある条件またはパラメータ以外は同じである条件と比較した場合に、あるいは別の条件と比較して、機能または活性を低下させることである。例えば、腫瘍増殖を抑制する細胞は、細胞の非存在下における腫瘍の増殖速度と比較して、腫瘍の増殖速度を低下させる。
【０８１９】
投与の文脈における、例えば、医薬製剤、細胞または組成物などの作用物質の「有効量」は、治療的または予防的結果などの所望の結果を達成するのに必要な投与量／量および必要な期間で、有効な量を指す。
【０８２０】
例えば、医薬製剤または細胞などの作用物質の「治療的有効量」は、疾患、病状、または障害の治療などの所望の治療的結果、および／または治療の薬物動態学的または薬力学的効果を達成するのに必要な投与量および期間で、有効な量を指す。治療有効量は、患者の疾患の状態、年齢、性別、および体重、そして投与される細胞集団などの要素によって異なってもよい。いくつかの実施形態では、提供される方法は、例えば治療有効量などの有効量で、細胞および／または組成物を投与することを伴う。
【０８２１】
「予防有効量」は、所望の予防的な結果を達成するのに必要な投与量および期間で、有効な量を指す。典型的には、しかし必須ではないが、予防的用量は、疾患の前にまたはその初期段階で、対象において使用されるので、予防有効量は治療有効量を下回るであろう。より低い腫瘍量の文脈では、いくつかの態様における予防有効量は、治療有効量よりも高いであろう。
【０８２２】
いくつかの実施形態では、対象は、例えば、化学療法、照射、および／または例えば同種異系ＨＳＣＴのような造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）などの別の治療的介入による処置に続いて、持続性または再発性の疾患を有する。いくつかの実施形態では、投与は、対象が別の治療に対して抵抗性となったにもかかわらず、対象を効果的に治療する。
【０８２３】
養子細胞療法のための細胞の投与方法は公知であり、提供される方法および組成物に関連して使用されてもよい。例えば、養子Ｔ細胞療法方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらに付与された米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号明細書；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，６９０，９１５号明細書；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７−８５に記載される）。例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８−９３３；Ｔｓｕｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４３８（１）：８４−９；Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８を参照されたい。
【０８２４】
いくつかの実施形態では、例えば養子Ｔ細胞療法などの細胞療法は、細胞が、細胞治療を受ける対象から、またはこのような対象由来のサンプルから、単離され、および／または別の様式で調製される、自己由来移入によって実施される。したがって、いくつかの態様では、細胞は、例えば患者などの治療を必要とする対象に由来し、細胞は、単離および処理に続いて同一対象に投与される。
【０８２５】
いくつかの実施形態では、例えば養子Ｔ細胞療法などの細胞療法は、細胞が、例えば第１の対象などの細胞療法を受けるまたは最終的にそれを投与される対象以外の対象から単離され、および／または別の様式で調製される、同種異系移入によって実施される。このような実施形態では、細胞は、次に、例えば同一生物種の第２の対象などの異なる対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、第１および第２の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはスーパータイプを発現する。
【０８２６】
いくつかの実施形態では、対象は、細胞または細胞を含有する組成物の投与前に、例えば腫瘍などの疾患または病状をターゲティングする治療剤によって治療されている。いくつかの態様では、対象は、難治性であるか、またはその他の治療剤に対して非応答性である。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、化学療法、照射、および／または例えば同種異系ＨＳＣＴのような造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）などの別の治療的介入による処置に続いて、持続性または再発性の疾患を有する。いくつかの実施形態では、投与は、対象が別の治療に対して抵抗性となっているにもかかわらず、対象を効果的に治療する。
【０８２７】
いくつかの実施形態では、対象は別の治療剤に応答性であり、治療剤による治療は疾病負荷を軽減する。いくつかの態様では、対象は当初、治療剤に応答性であるが、経時的に疾患または病状の再発を示す。いくつかの実施形態では、対象は再発性でない。いくつかのこのような実施形態では、対象は、例えば、高再発リスクなどの再発の高リスクがあると判定され、したがって細胞が予防的に投与されて、例えば、再発の可能性を低下させ、再発を予防する。
【０８２８】
いくつかの態様では、対象は、別の治療剤による以前の治療を受けていない。
【０８２９】
提供される組成物、細胞、方法、および使用によって治療される疾患、病状、および障害としては、固形腫瘍、血液学的悪性腫瘍、および黒色腫などの腫瘍；例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶなどのウイルスまたはその他の病原体による感染症などの感染性疾患；および寄生虫病が挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患または病状は、腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物、またはその他の増殖性疾患もしくは障害である。このような疾患としては、白血病、リンパ腫、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫、骨がん、および脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および／または中皮腫が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０８３０】
いくつかの実施形態では、疾患または病状は、ウイルス、レトロウイルス、細菌、および原生動物性感染症、免疫不全症、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルスなどであるが、これに限定されるものではない、感染性疾患または病状である。いくつかの実施形態では、疾患または病状は、例えば関節リウマチ（ＲＡ）などの関節炎、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病多発性硬化症、喘息などの自己免疫または炎症性疾患または病状、および／または移植に関連する疾患または病状である。
【０８３１】
いくつかの実施形態では、疾患、障害または病状に関連する抗原は、ＲＯＲ１、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂＢ２）、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ−２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ−４０）、ＥＰＨａ２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、ｅｒｂ−Ｂ４、ｅｒｂＢ二量体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＨ５、胎児型アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、（Ｌ１−ＣＡＭ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン、ＴＡＧ７２、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒａ２）、ＣＡ９、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩＭＡＧＥＡｌ、ＨＬＡ−Ａ２ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、がん精巣抗原、メソテリン、マウス型ＣＭＶ、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、Ｏ−アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリン、サイクリンＡ２、ＣＣＬ−１、ＣＤ１３８、病原体−特異的抗原から選択される。
【０８３２】
いくつかの実施形態では、疾患または障害に関連する抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲｌ、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌｌ−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、０ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３、もしくは４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、およびＭＡＧＥ  Ａ３および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはその他の病原体によって発現される分子からなる群から選択される。
【０８３３】
いくつかの実施形態では、細胞は、所望の投与量で投与され、いくつかの態様では、所望の用量または細胞数または細胞型、および／または所望の細胞型比を含む。したがって、細胞の投与量は、いくつかの実施形態では、総細胞数（または体重１ｋｇ当たりの数）、およびＣＤ４＋対ＣＤ８＋比などの個々の集団または亜型の所望の比率に基づく。いくつかの実施形態では、細胞の投与量は、個々の集団または個々の細胞型の細胞の所望の総数（または体重１ｋｇ当たりの数）に基づく。いくつかの実施形態では、投与量は、所望の総細胞数、所望の比率、および個々の集団の望ましい総細胞数などの特徴の組み合わせに基づく。
【０８３４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞などの細胞の集団または亜型は、例えばＴ細胞の所望の用量などの所望の総細胞量で、またはその許容差異内で投与される。いくつかの態様では、所望の用量は、所望の細胞数であるか、または例えば細胞／ｋｇなどの、細胞が投与される対象の体重単位当たりの所望の細胞数である。いくつかの態様では、所望の用量は、最小細胞数以上、または体重単位当たりの最小細胞数以上である。いくつかの態様では、所望の用量で投与される全総細胞のうち、個々の集団または亜型は、所望の出力比（ＣＤ４＋対ＣＤ８＋比など）で、またはその近くで存在し、例えば、このような比率の一定の許容差異または誤差の範囲内である。
【０８３５】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋細胞の所望の用量および／またはＣＤ８＋細胞の所望の用量などの、個々の集団または亜型の細胞の１つまたは複数の所望の用量で、またはその許容差異内で投与される。いくつかの態様では、所望の用量は、亜型または集団の所望の細胞数であるか、または例えば細胞／ｋｇなどの、細胞が投与される対象の体重単位当たりの所望の細胞数である。いくつかの態様では、所望の用量は、集団または亜型の最小細胞数、または体重単位当たりの集団または亜型の最小細胞数以上である。
【０８３６】
したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、全細胞の所望の固定用量および所望の比率に基づき、および／または例えば個々の亜型または亜集団のそれぞれの１つまたは複数の所望の固定用量に基づく。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、Ｔ細胞の所望の固定または最小用量、およびＣＤ４＋対ＣＤ８＋細胞の所望の比率に基づき、および／またはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の所望の固定または最小用量に基づく。
【０８３７】
特定の実施形態では、細胞または亜型の細胞の個々の集団は、例えば、１００万〜約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または前述の値の任意の２つによって画定される範囲）、例えば、約１０００万〜約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または前述の値の任意の２つによって画定される範囲）、および場合によっては約１億個の細胞〜約５００億個の細胞（例えば、約１．２億個の細胞、約２．５億個の細胞、約３．５億個の細胞、約４．５億個の細胞、約６．５億個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）、またはこれらの範囲の間の任意の値などの約１００万〜約１０００億個の細胞の範囲で対象に投与される。
【０８３８】
いくつかの実施形態では、全細胞の用量および／または細胞の個々の亜集団の用量は、例えば、１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５細胞／ｋｇ、または１×１０６細胞／ｋｇ体重、または約１×１０５細胞／ｋｇ、約１．５×１０５細胞／ｋｇ、約２×１０５細胞／ｋｇ、または約１×１０６細胞／ｋｇ体重などの、１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重などの、１０４〜１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重または約１０４〜約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、１×１０５Ｔ細胞／ｋｇ、１．５×１０５Ｔ細胞／ｋｇ、２×１０５Ｔ細胞／ｋｇ、または１×１０６Ｔ細胞／ｋｇ体重、または、約１×１０５Ｔ細胞／ｋｇ、約１．５×１０５Ｔ細胞／ｋｇ、約２×１０５Ｔ細胞／ｋｇ、または約１×１０６Ｔ細胞／ｋｇ体重などの、１０５〜１０６Ｔ細胞／ｋｇ体重などの、１０４〜１０９Ｔ細胞／キログラム（ｋｇ）体重または約１０４〜約１０９Ｔ細胞／キログラム（ｋｇ）体重で、またはその特定誤差範囲内で投与される。
【０８３９】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、１×１０５ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ、１．５×１０５ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ、２×１０５ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ、または１×１０６ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、または約１×１０５ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ、約１．５×１０５ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ、約２×１０５ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ、または約１×１０６ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重などの、１０５〜１０６ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重などの、１０４〜または１０９または約１０４〜または約１０９ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞／キログラム（ｋｇ）体重で、またはその特定誤差範囲内で投与される。
【０８４０】
いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも約１×１０６、約２．５×１０６、約５×１０６、約７．５×１０６、または約９×１０６ＣＤ４＋細胞、および／または少なくとも約１×１０６、約２．５×１０６、約５×１０６、約７．５×１０６、または約９×１０６ＣＤ８＋細胞、および／または少なくとも約１×１０６、約２．５×１０６、約５×１０６、約７．５×１０６、または約９×１０６Ｔ細胞、またはそれより多いＴ細胞で、またはその特定誤差範囲内で、投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、約１０８〜１０１２または約１０１０〜１０１１Ｔ細胞、約１０８〜１０１２または約１０１０〜１０１１ＣＤ４＋細胞、および／または約１０８〜１０１２または約１０１０〜１０１１ＣＤ８＋細胞で、またはその特定誤差範囲内で投与される。
【０８４１】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞または亜型などの複数の細胞集団または亜型の所望の出力比で、またはその耐容される範囲内で投与される。いくつかの態様では、所望の比率は特定の比率であり得て、または比率範囲であり得て、例えば、いくつかの実施形態では、所望の比率（例えば、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋細胞比）は、５：１〜５：１または約５：１〜約５：１（または約１：５を超えて約５：１未満）、または１：３〜３：１または約１：３〜約３：１（または約１：３を超えて約３：１未満）、例えば、２：１〜１：５または約２：１〜約１：５（または、約５：１、４．５：１、４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、または１：５、または約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．９：１、約１．８：１、約１．７：１、約１．６：１、約１．５：１、約１．４：１、約１．３：１、約１．２：１、約１．１：１、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、または約１：５などの、約１：５を超えて約２：１未満）である。いくつかの態様では、許容差異は、これらの範囲の間の任意の値をはじめとする、所望の比率の約１％、約２％、約３％、約４％約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％以内である。
【０８４２】
疾患の予防または治療のために、適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、細胞が予防目的または治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴および細胞への応答、および主治医の裁量に左右されてもよい。組成物および細胞は、いくつかの実施形態では、一度に、または一連の処置にわたって対象に適切に投与される。
【０８４３】
細胞は、例えば、ボーラス注入によって、例えば、静脈内または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、眼球周囲注射などの注射によって、または後強膜近傍送達などの任意の適切な手段によって投与され得る。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、および鼻腔内、そして所望ならば、局所処置、病巣内投与によって投与される。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、所与の用量が、細胞の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの実施形態では、それは、例えば、３日間以下の期間にわたる細胞の複数回のボーラス投与によって、または細胞の持続注入投与によって投与される。
【０８４４】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、細胞毒性薬または治療剤などの抗体または操作された細胞または受容体または作用物質などの別の治療的介入と共に、任意の順序で、同時または順次に実施されるなどの併用療法の一部として投与される。いくつかの実施形態における細胞は、１つまたは複数の追加的な治療剤と同時投与されるか、または別の治療的介入と関連して、同時にまたは任意の順序で連続して投与される。いくつかの状況では、細胞は、時間的に十分に近い別の治療法と共に同時投与され、その結果、細胞集団は、１つまたは複数の追加的な治療剤の効果を高め、またはその逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加的な治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加的な治療剤の後に投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加的な作用物質は、持続性を高めるために、ＩＬ−２などのサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、方法は、化学療法剤の投与を含んでなる。
【０８４５】
細胞の投与に続いて、いくつかの実施形態における操作された細胞集団の生物学的活性は、例えば、いくつかの既知の方法のいずれかによって測定される。評価されるパラメータとしては、インビボにおける例えばイメージングによる、またはエクスビボにおける例えばＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによる、操作されたまたは天然のＴ細胞またはその他の免疫細胞の抗原への特異的結合が挙げられる。特定の実施形態では、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９−７０２（２００９）、およびＨｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５−４０（２００４）に記載される、細胞傷害性アッセイなどの当該技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定され得る。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性は、ＣＤ  １０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦなどの１つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌をアッセイすることによって測定される。いくつかの態様では、生物学的活性は、腫瘍量または負荷の減少などの臨床転帰を評価することによって測定される。
【０８４６】
特定の実施形態では、操作された細胞は、それらの治療効果または予防効果が増大するように、多数の様式でさらに修飾される。例えば、集団によって発現される操作されたＣＡＲまたはＴＣＲは、直接的に、またはリンカーを介して間接的にのどちらかで、ターゲティング部分にコンジュゲートされ得る。例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲなどの化合物をターゲティング部分にコンジュゲートさせる慣行は、当技術分野で公知である。例えば、Ｗａｄｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ３：１１１（１９９５）、および米国特許第５，０８７，６１６号明細書を参照されたい。
【０８４７】
Ｖ．定義
「約」という用語は、本明細書の用法では、この技術分野の当業者に容易に理解される、各値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体に向けられた実施形態を含む（および記述する）。
【０８４８】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。
【０８４９】
本開示全体にわたり、特許請求された主題の様々な態様が、範囲形式で提示される。範囲形式の記述は、単に便宜上および簡潔さのためのものであり、特許請求された主題の範囲に対する柔軟性のない限界として解釈されるべきではないものと理解すべきである。したがって、範囲の説明は、その範囲内の全ての可能な部分的範囲および個々の数値を具体的に開示したと見なすべきである。例えば、一連の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値、およびその記載された範囲内のその他の記載される値または介在値は、特許請求された主題に包含されるものと理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内で特に除外された限界を条件として、特許請求された主題に包含されてもよい。記載された範囲が、限界の片方または双方を含む場合、その含まれる限界のいずれかまたは総方を除外した範囲もまた、特許請求された主題に含まれる。これは範囲の幅に関わりなく適用される。
【０８５０】
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸部分を記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない。
【０８５１】
本明細書の用法では、「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」および「同一性百分率」は、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して使用される場合、配列同一性の一部としての保存的置換を考慮せずに、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し、最大配列同一性百分率を達成した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列（例えば、ストレプトアビジンムテイン）中のアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を判定するためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術範囲内の様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムをはじめとする、配列を整列させるための適切なパラメータを判定し得る。
【０８５２】
２つの配列間の相同性または配列同一性（用語は本明細書で同義的に使用される）の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され（例えば、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップが挿入され得て、非相同配列は比較目的で無視され得る）。最適アライメントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２重み行列による、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同一の位置数の関数である。
【０８５３】
アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含んでもよい。アミノ酸は、一般に、以下の一般的な側鎖特性に従ってグループ分けされ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０８５４】
非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスで交換することを伴う。
【０８５５】
「修飾物質」は、本明細書の用法では、例えば、対象分子または遺伝子配列の活性（例えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性）、量、分布、または構造を改変し得る作用物質などの実体を指す。一実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の形成を含んでなる。一実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し得る。
【０８５６】
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｋＤの分子量を有する分子を指す。大分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる。
【０８５７】
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、それは５０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基を有する。
【０８５８】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、例えば、正順ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）をはじめとする、ライゲーション媒介修復および／または非鋳型媒介修復を指す。
【０８５９】
例えば、参照Ｃａｓ９分子または参照ｇＲＮＡなどの「参照分子」は、本明細書の用法では、例えば、修飾または候補Ｃａｓ９分子などである対象Ｃａｓ９分子または対象ｇＲＮＡ分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有するとして特徴付けられ得る。参照Ｃａｓ９分子の例としては、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．アウレウス、またはＳ．サーモフィルスのＣａｓ９分子などである、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子が挙げられる。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較されるＣａｓ９分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然または既知の配列などの配列である。
【０８６０】
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示唆する。
【０８６１】
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．７５ｋＤ未満などの約２ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。
【０８６２】
本明細書の用法では、対象は、ヒトおよびその他の哺乳類などの任意の生きている生物を含む。哺乳類としては、ヒト、そして家畜、スポーツ動物、齧歯類、および愛玩動物などの非ヒト動物が挙げられるが、これに限定されるものではない。用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、対象はヒトである。その他の実施形態では、対象は家禽である。
【０８６３】
明細書の用法では、組成物は、細胞をはじめとする、２つ以上の生成物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０８６４】
本明細書の用法では、「富化する」は、１つまたは複数の特定の細胞型または細胞集団に言及する場合、例えば、集団または細胞によって発現されるマーカーに基づく正の選択によって、または枯渇されるべき細胞集団または細胞上に存在しないマーカーに基づく負の選択によって、例えば、総細胞数または組成物容積と比較して、またはその他の細胞型と比較して、細胞型または集団の数または百分率を増加させることを指す。用語は、組成物からその他の細胞、細胞型または集団を完全に除去することを必要とせず、このようにして富化された細胞が、富化組成物中に１００％で、またはその近くで存在することを必要としない。
【０８６５】
本明細書の用法では、細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陽性」であるという記述は、典型的には表面マーカーである特定のマーカーの、細胞上または細胞内の検出可能な存在を指す。表面マーカーに言及する場合、用語は、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって、フローサイトメトリーによって検出される表面発現の存在を指し、染色は、その他の点では同一条件下で、アイソタイプ一致対照またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）ゲーティング対照で同じ手順を実施して検出される染色を実質的に超えるレベルで、フローサイトメトリーによって検出可能であり、および／またはマーカーについて陽性であることが知られている細胞と実質的に同様のレベルであり、および／またはマーカーについて陰性であることが知られている細胞よりも実質的に高いレベルである。
【０８６６】
本明細書の用法では、細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陰性」であるという記述は、典型的には表面マーカーである特定のマーカーの、細胞上または細胞内の実質的に検出可能な存在の欠如を指す。表面マーカーに言及する場合、用語は、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって、フローサイトメトリーによって検出される表面発現の欠如を指し、染色は、その他の点では同一条件下で、アイソタイプ一致対照またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）ゲーティング対照で同じ手順を実施して検出される染色を実質的に超えるレベルで、フローサイトメトリーによって検出不能であり、および／またはマーカーについて陽性であることが知られている細胞よりも実質的に低いレベルであり、および／またはマーカーについて陰性であることが知られている細胞と比較して同様のレベルである。
【０８６７】
「ベクター」という用語は、本明細書の用法では、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、作動可能に連結されている核酸の発現を誘導できる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【０８６８】
「Ｘ」は、アミノ酸配列の文脈で、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
【０８６９】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記およびその他の技術的および科学的用語または用語法は、特許請求された主題に関係する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、明瞭化および／または容易な参照のために、一般に理解される意味を有する用語が本明細書で定義されるが、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも当該技術分野で一般に理解されるものと実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
【０８７０】
本出願で言及された特許文献、科学論文およびデータベースをはじめとする全ての刊行物は、個々の刊行物が個別に参照により援用されるのと同程度に、あらゆる目的のためにその内容全体が参照により援用される。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に援用される特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物に記載された定義に反しているか、さもなければ矛盾する場合、本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に援用される定義よりも優先する。
【０８７１】
本明細書で使用されるセクション見出しは、整理することのみを目的として、記載された主題を制限すると解釈されるものではない。
【０８７２】
ＶＩ．例示的実施形態
提供される実施形態としては、以下が挙げられる。
１．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体を含んでなる操作された免疫細胞；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質
を含んでなる組成物であって、
前記作用物質が、前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および／またはＰＤ−１発現を防止しまたは減少させることができる、
組成物。
２．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸を含んでなる操作された免疫細胞；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質
を含んでなる組成物であって、
前記作用物質が、前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および／またはＰＤ−１発現を防止しまたは減少させることができる、
組成物。
３．
前記操作された免疫細胞がその表面に前記組換え受容体を発現する、実施形態１または実施形態２の組成物。
４．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させる、遺伝子破壊
を含んでなる操作された免疫細胞
を含有する細胞集団を含んでなる組成物であって、
前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％または少なくとも約９０％もしくはそれより多くが、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず、ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；ならびに／または
前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％もしくはそれより多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
組成物。
５．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体であって、前記組換え受容体の前記抗原への結合に際して、操作された免疫細胞が、細胞傷害性を誘導し、増殖し、および／またはサイトカインを分泌することができる、組換え受容体；ならびに
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記遺伝子破壊が、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、任意選択的に、前記防止または減少が、前記組成物中の前記細胞の、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％において、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％において、または７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％より多くにおいて、または約７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％より多くにおいてである、遺伝子破壊
を含んでなる操作された免疫細胞
を含有する細胞集団を含んでなる組成物。
６．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができる、遺伝子破壊
をそれぞれ含んでなる操作された免疫細胞の集団
を含有する細胞集団を含んでなる組成物であって、
前記操作された免疫細胞が、前記組換え受容体を含むが前記遺伝子破壊を含まない前記組成物中のその他の細胞における、前記組換え受容体の平均発現および／または表面発現レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで前記受容体の発現および／または表面発現を平均して示し、または
前記操作された免疫細胞が、前記ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、かつ、前記組換え受容体を含んでなり前記ＰＤ−１ポリペプチドを発現する前記組成物中の細胞における、平均発現および／または表面レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで前記受容体の発現および／または表面発現を平均して示す、
組成物。
７．
前記抗原、前記抗原を発現する細胞、および／または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的にインビトロアッセイにおいて測定されるように、任意選択的に１つまたは複数のサイトカインの存在下における、任意選択的に１２、２４、３６、４８、または６０時間のインキュベーションを含んでなる、インビトロアッセイにおいて測定されるように、前記組換え受容体が、前記抗原に特異的に結合すること、操作されたＴ細胞を活性化または刺激すること、細胞傷害性を誘導すること、または前記免疫細胞による増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる、実施形態１〜４および６のいずれかの組成物。
８．
前記抗原、前記抗原を発現する細胞、および／または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的に１種または複数種のサイトカインの存在下における、任意選択的に１２、２４、３６、４８、または６０時間のインキュベーションを含んでなる、任意選択的に前記免疫細胞のＰＤ−Ｌ１発現細胞への曝露を含むまたは含まない、インビトロアッセイにおいて測定されるように、前記操作された免疫細胞が、前記抗原に特異的に結合すること、細胞傷害性、増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌を誘導することができる、実施形態１〜４、６および７のいずれかの組成物。
９．
前記結合、細胞傷害性、増殖、生存、またはサイトカイン分泌のレベルまたは程度または規模または持続時間が、同一条件下で評価された、前記組換え受容体を含むが前記ＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を含まない免疫細胞で検出または観察されたものと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である、実施形態７または実施形態８の組成物。
１０．
前記結合、細胞傷害性、増殖、生存、および／またはサイトカイン分泌が、中断と、前記抗原、前記抗原発現細胞、および／または前記物質への再曝露とに続いて、任意選択的にインビトロアッセイで測定される、実施形態６および８〜９のいずれかの組成物。
１１．
前記免疫細胞が、対象由来の初代細胞である、実施形態１〜１０のいずれかの組成物。
１２．
前記免疫細胞がヒト細胞である、実施形態１〜１１のいずれかの組成物。
１３．
前記免疫細胞が白血球細胞である、実施形態１〜１２のいずれかの組成物。
１４．
前記免疫細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞である、実施形態１〜１３のいずれかの組成物。
１５．
前記免疫細胞が、未分画Ｔ細胞を含んでなる複数のＴ細胞を含んでなり、単離されたＣＤ８＋細胞を含んでなるかもしくはＣＤ８＋Ｔ細胞が富化されており、または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでなるかもしくはＣＤ４＋細胞が富化されており、ならびに／または、未感作細胞、エフェクターメモリー細胞、セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞からなる群から選択されるそのサブセットが富化されている、実施形態１４の組成物。
１６．
非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、前記組成物中のＴ細胞の百分率、または前記受容体を発現し前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中のＴ細胞の百分率が、組成が同一または実質的に同一であるが前記遺伝子破壊を含有せずまたは前記ＰＤ−１ポリペプチドを発現する細胞集団と、同一または実質的に同一である、実施形態１４または実施形態１５の組成物。
１７．
非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、前記組成物中のＴ細胞の百分率が、任意選択的に、前記免疫細胞のＰＤ−Ｌ１への接触または曝露の非存在下または存在下で比較される同一条件下で評価した際に、前記組換え受容体を含むがＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の前記遺伝子破壊を含まないＴ細胞を含んでなる組成物中の前記表現型を示すＴ細胞の百分率と比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である、実施形態１〜１６のいずれかの組成物。
１８．
前記表現型が、少なくとも１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、６日間、１２日間、２４日間、３６日間、４８日間または６０日間にわたる、３７±２℃または約３７±２℃での前記組成物のインキュベーションに続いて評価される、実施形態１６または実施形態１７の組成物。
１９．
前記インキュベーションがインビトロで行われる、実施形態１８の組成物。
２０．
前記インキュベーションの少なくとも一部が、刺激剤の存在下で実施され、前記少なくとも一部は、任意選択的に最大１時間、６時間、２４時間、または４８時間のインキュベーションに及ぶ、実施形態１８または実施形態１９の組成物。
２１．
前記刺激剤が、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋細胞の増殖を誘導できる作用物質である、実施形態２０の組成物。
２２．
前記刺激剤が、ＣＤ３に特異的な抗体、ＣＤ２８に特異的な抗体、および／またはサイトカインであるか、またはそれを含んでなる、実施形態２０または実施形態２１の組成物。
２３．
組換え受容体を含んでなる前記Ｔ細胞が、ＣＣＲ７＋、４−１ＢＢ＋（ＣＤ１３７＋）、ＴＩＭ３＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ｔ−ｂｅｔｌｏｗ、ＩＬ−７Ｒａ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ−２Ｒβ＋、ＣＸＣＲ３＋またはＬＦＡ−１＋から選択される１つまたは複数の表現型マーカーを含んでなる、実施形態１６〜２２のいずれかの組成物。
２４．
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、実施形態１〜２３のいずれかの組成物。
２５．
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１〜２３のいずれかの組成物。
２６．
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、実施形態２５の組成物。
２７．
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、実施形態２６の組成物。
２８．
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、実施形態２６または実施形態２７の組成物。
２９．
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、実施形態２６〜２８のいずれかの組成物。
３０．
前記抗原が疾患または障害に関連する、実施形態１〜２９のいずれかの組成物。
３１．
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、実施形態３０の組成物。
３２．
前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、実施形態１〜３１のいずれかの組成物。
３３．
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、実施形態１〜３２のいずれかの組成物。
３４．
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態１〜３３のいずれかの組成物。
３５．
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、実施形態３４の組成物。
３６．
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、実施形態３４または実施形態３５の組成物。
３７．
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態３６の組成物。
３８．
前記作用物質が、（ａ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｂ）前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうち少なくとも１つを含んでなる、実施形態１〜３および７〜３７のいずれかの組成物。
３９．
前記作用物質が、Ｃａｓ９分子と、ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するｇＲＮＡとの少なくとも１つの複合体を含んでなる、実施形態１〜３および７〜３８のいずれかの組成物。
４０．
前記ガイドＲＮＡが、第１の相補的ドメイン、第１の相補的ドメインと相補的な第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含んでなる、実施形態３８または実施形態３９の組成物。
４１．
前記第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインが、連結ドメインによって連結されている、実施形態４０の組成物。
４２．
前記ガイドＲＮＡが、３’ポリＡテールと５’アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップとを含んでなる、実施形態４１の組成物。
４３．
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９である、実施形態３９〜４２のいずれかの組成物。
４４．
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、
2019517788.tif 000106
からなる群から選択される配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、実施形態３８〜４３のいずれかの組成物。
４５．
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列
2019517788.tif 000107
を含んでなるターゲティングドメインを含む、実施形態３８〜４４のいずれかの組成物。
４６．
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、実施形態３８〜４５のいずれかの組成物。
４７．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、実施形態３９〜４６のいずれかの組成物。
４８．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、実施形態３９〜４６のいずれかの組成物。
４９．
前記Ｃａｓ９分子が、活性ＲｕｖＣドメインまたは活性ＨＮＨドメインを欠いている、実施形態３９〜４８のいずれかの組成物。
５０．
前記Ｃａｓ９分子が、Ｄ１０Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態３９〜４６、４８、および４９のいずれかの組成物。
５１．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000108
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態４６〜５０のいずれかの組成物。
５２．
前記Ｃａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態３９〜４６および４８〜５１のいずれかの組成物。
５３．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000109
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態５２の組成物。
５４．
前記遺伝子破壊が、
前記ＰＤＣＤ１遺伝子中に挿入および欠失（インデル）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される二本鎖切断の生成
を含んでなる、実施形態１〜５３のいずれかの組成物。
５５．
前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または
前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
実施形態１〜５４のいずれかの組成物。
５６．
前記組成物中の前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；および／または
前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
実施形態４または実施形態５５の組成物。
５７．
任意選択的にフローサイトメトリーによる評価で、前記組成物中の前記細胞、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の細胞の少なくとも９０％または少なくとも約９０％が、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、実施形態１〜５６のいずれかの組成物。
５８．
ゲノム中の前記遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される、実施形態１〜５７のいずれかの組成物。
５９．
前記組成物中の細胞が、および／または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞が、前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞について富化されないまたは選択されない、実施形態１〜５８のいずれかの組成物。
６０．
前記組成物中の各細胞の、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の各細胞の、平均して２以下、５以下、または１０以下のその他の遺伝子が、破壊される、または前記作用物質によって破壊される、実施形態１〜５９のいずれかの組成物。
６１．
前記組成物中の各細胞の、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の各細胞中の、その他の遺伝子が、前記細胞内で破壊されない、または前記作用物質によって破壊されない、実施形態１〜６０のいずれかの組成物。
６２．
薬学的に許容可能な緩衝液をさらに含んでなる、実施形態１〜６１のいずれかの組成物。
６３．
任意選択的に疾患または病状を有する対象への前記組成物の投与後のある時点で、
前記組換え受容体を発現しＰＤ−１を発現しない細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有し前記組換え受容体を発現する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能である、
実施形態１〜６２のいずれかの組成物。
６４．
前記ある時点が、投与の、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または約７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後である、実施形態６３の組成物。
６５．
前記血液またはサンプル中で検出可能な前記細胞が、１マイクロリットルの血液当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個の細胞の濃度で存在し、および／または前記血液中のＴ細胞の少なくとも１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％、またはそれ以上に相当する、実施形態６３または６４の組成物。
６６．
前記組成物の対象への投与に続いて、
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続し；および／または
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなり前記組換え受容体を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続する、
実施形態１〜６５のいずれかの組成物。
６７．
前記速度または時間が、少なくとも１．５倍または２倍または３倍大きい、または少なくとも約１．５倍または２倍または３倍大きい、実施形態６６の組成物。
６８．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸分子を、免疫細胞に導入するステップと；
（ｂ）（ｉ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうちの１つを含んでなる、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、前記免疫細胞に導入するステップと
を含んでなる、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法。
６９．
（ｉ）ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも１つのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、のうちの１つを含んでなる、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現する免疫細胞に導入するステップ
を含んでなる、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法。
７０．
前記作用物質が、Ｃａｓ９分子と、ＰＤＣＤ１遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するｇＲＮＡとの少なくとも１つの複合体を含んでなる、実施形態の６８または実施形態６９の方法。
７１．
前記ガイドＲＮＡが、第１の相補的ドメイン、前記第１の相補的ドメインと相補的な第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含んでなる、実施形態６８〜７０のいずれかの方法。
７２．
前記第１の相補的ドメインおよび第２の相補的ドメインが、連結ドメインによって連結されている、実施形態７１の方法。
７３．
前記ガイドＲＮＡが、３’ポリＡテールと５’アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップとを含んでなる、実施形態６８〜７２のいずれかの方法。
７４．
導入が、前記細胞を前記作用物質またはその一部にインビトロで接触させるステップを含んでなる、実施形態６８〜７３のいずれかの方法。
７５．
前記作用物質の導入が、電気穿孔を含んでなる、実施形態６８〜７４のいずれかの方法。
７６．
前記導入が、前記細胞と前記作用物質との接触前、最中または後に、または前記電気穿孔の前、最中または後に、前記細胞をインビトロでインキュベートするステップをさらに含んでなる、実施形態７４または実施形態７５の方法。
７７．
（ａ）の導入が形質導入を含んでなり、前記導入するステップが、前記形質導入の前、最中または後に、前記細胞をインビトロでインキュベートするステップをさらに含んでなる、実施形態６８〜７６のいずれかの方法。
７８．
前記インキュベーションの少なくとも一部が、（ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５からなる群から選択されるサイトカイン、および／または（ｉｉ）任意選択的に抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を含んでなる１つまたは複数の刺激剤または活性化剤の存在下である、実施形態７６または実施形態７７の方法。
７９．
（ａ）の導入が、
形質導入前に、前記細胞を、２０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、任意選択的に約１００Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ−２；１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−７；および／または０．５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５と共にインキュベートするステップと；
形質導入に続いて、前記細胞を、１０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、任意選択的に約５０Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ−２；０．５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−７；および／または０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、任意選択的に約０．５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５と共にインキュベートするステップと
を含んでなる、実施形態７７または実施形態７８の方法。
８０．
前記インキュベーションが、独立して、最大２４、３６、４８時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日間にわたり、またはおよそ２４、３６、４８時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日間にわたり実施される、実施形態７６〜７９のいずれかの方法。
８１．
前記インキュベーションが、独立して、２４〜４８時間または３６〜４８時間にわたり実施される、実施形態７６〜８０のいずれかの方法。
８２．
前記細胞が、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、または５００，０００個の細胞当たりおよそ１マイクログラムの比率で、前記作用物質と接触されられる、実施形態７４〜８１のいずれかの方法。
８３．
前記インキュベーションが、３０℃±２℃〜３９℃±２℃の温度である；または
前記インキュベーションが、少なくとも３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃、または少なくとも約３０℃±２℃、３２℃±２℃、３４℃±２℃または３７℃±２℃の温度である、
実施形態７６〜８２のいずれかの方法。
８４．
前記インキュベーションの少なくとも一部が３０℃±２℃であり、前記インキュベーションの少なくとも一部が３７℃±２℃である、実施形態７６〜８３のいずれかの方法。
８５．
（ａ）の導入するステップと（ｂ）の導入するステップとの間に、前記細胞を休止させるステップをさらに含んでなる、実施形態６８〜８４のいずれかの方法。
８６．
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９である、実施形態７０〜８５のいずれかの方法。
８７．
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、
2019517788.tif 000110
からなる群から選択される配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、実施形態６８〜８６のいずれかの方法。
８８．
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列
2019517788.tif 000111
を含んでなるターゲティングドメインを含む、実施形態６８〜８７のいずれかの方法。
８９．
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、実施形態６８〜７９のいずれかの方法。
９０．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．アウレウスＣａｓ９分子である、実施形態７０〜８９のいずれかの方法。
９１．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９である、実施形態７０〜９０のいずれかの方法。
９２．
前記Ｃａｓ９分子が、活性ＲｕｖＣドメインまたは活性ＨＮＨドメインを欠いている、実施形態７０〜９１のいずれかの方法。
９３．
前記Ｃａｓ９分子が、Ｄ１０Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態７０〜８９、９１、および９２のいずれかの方法。
９４．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000112
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態８９〜９３のいずれかの方法。
９５．
前記Ｃａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を含んでなるＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態７０〜８９および９１〜９４のいずれかの方法。
９６．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000113
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態９４の方法。
９７．
前記遺伝子破壊が、
ＰＤＣＤ１遺伝子中に挿入と欠失（インデル）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される二本鎖切断の生成
を含んでなる、実施形態６８〜９６のいずれかの方法。
９８．
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、実施形態６８〜９７のいずれかの方法。
９９．
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態６８〜９８のいずれかの方法。
１００．
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、実施形態９９の方法。
１０１．
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、実施形態１００の方法。
１０２．
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、実施形態１００または実施形態１０１の方法。
１０３．
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、実施形態１００〜１０２のいずれかの方法。
１０４．
前記抗原が疾患または障害に関連する、実施形態１００〜１０３のいずれかの方法。
１０５．
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、実施形態１０４の方法。
１０６．
前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、実施形態６８〜１０５のいずれかの方法。
１０７．
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、実施形態６８〜１０６のいずれかの方法。
１０８．
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態６８〜１０７のいずれかの方法。
１０９．
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、実施形態１０８の方法。
１１０．
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、実施形態１０８または実施形態１０９の方法。
１１１．
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態１１０の方法。
１１２．
前記組換え受容体をコードする前記核酸が、ウイルスベクターである、実施形態６８〜１１１のいずれかの方法。
１１３．
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態１１２の方法。
１１４．
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、実施形態１１２または実施形態１１３の方法。
１１５．
前記組換えベクターをコードする核酸の導入が、任意選択的にレトロウイルス形質導入である形質導入による、実施形態６８〜１１４のいずれかの方法。
１１６．
前記免疫細胞が、対象由来の初代細胞である、実施形態６８〜１１５のいずれかの方法。
１１７．
前記免疫細胞がヒト細胞である、実施形態６８〜１１６のいずれかの方法。
１１８．
前記免疫細胞が白血球細胞である、実施形態６８〜１１７のいずれかの方法。
１１９．
前記免疫細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞である、実施形態６８〜１１８のいずれかの方法。
１２０．
前記免疫細胞が、
未分画Ｔ細胞、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、または単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞である、Ｔ細胞
である、実施形態１１９の方法。
１２１．
複数の免疫細胞で実施される、実施形態６８〜１２０のいずれかの方法。
１２２．
前記作用物質を導入するステップおよび前記組換え受容体を導入するステップに引き続いて、細胞が、（ａ）前記遺伝子破壊を含有する、または内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞、（ｂ）前記組換え受容体を発現する細胞、または（ａ）および（ｂ）の双方について、富化も選択もされない、実施形態６８〜１２１のいずれかの方法。
１２３．
（ａ）前記遺伝子破壊を含有する、または内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現しない細胞、（ｂ）前記組換え受容体を発現する細胞、または（ａ）および（ｂ）の双方を富化または選択するステップをさらに含んでなる、実施形態６８〜１２２のいずれかの方法。
１２４．
前記細胞を３７℃±２℃または約３７℃±２℃でインキュベートするステップをさらに含んでなる、実施形態６８〜１２３のいずれかの方法。
１２５．
前記インキュベーションが、１時間〜９６時間、４時間〜７２時間、８時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、６時間〜２４時間、３６時間〜９６時間、または約１時間〜約９６時間、約４時間〜約７２時間、約８時間〜約４８時間、約１２時間〜約３６時間、約６時間〜約２４時間、約３６時間〜９６時間にわたり実施される、実施形態１２４の方法。
１２６．
前記インキュベーションまたは前記インキュベーションの一部が、刺激剤の存在下で実施される、実施形態１２５の方法。
１２７．
前記刺激剤が、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋細胞の増殖を誘導できる作用物質である、実施形態１２６の方法。
１２８．
前記刺激剤が、ＣＤ３に特異的な抗体、ＣＤ２８に特異的な抗体、および／またはサイトカインであるか、またはそれを含んでなる、実施形態１２６または実施形態１２７の方法。
１２９．
前記方法によって生成された細胞を薬学的に許容可能な緩衝液中で製剤化するステップをさらに含んでなる、実施形態６８〜１２８のいずれかの方法。
１３０．
前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方である、または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
細胞集団を生成する、実施形態６８〜１２９のいずれかの方法。
１３１．
前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方であり、および／または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
細胞集団を生成する、実施形態６８〜１３０のいずれかの方法。
１３２．
ゲノム中の前記遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される、実施形態６８〜１３１のいずれかの方法。
１３３．
実施形態６８〜１３２のいずれかの方法によって生成される、遺伝子操作された免疫細胞。
１３４．
実施形態６８〜１３２のいずれかの方法によって生成される、複数の遺伝子操作された免疫細胞。
１３５．
前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方である、または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
実施形態１３４の複数の遺伝子操作された免疫細胞。
１３６．
前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、１）前記遺伝子破壊を含有し；内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず；隣接ＰＤＣＤ１遺伝子、ＰＤＣＤ１遺伝子、および／または機能性ＰＤＣＤ１遺伝子を含有せず；および／またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない；かつ２）前記組換え受容体を発現する、の双方であり、および／または
前記組換え受容体を発現する前記細胞の８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性ＰＤ−１ポリペプチドを発現せず、またはＰＤ−１ポリペプチドを発現しない、
実施形態１３４または実施形態１３５の複数の遺伝子操作された免疫細胞。
１３７．
実施形態１３３の遺伝子操作された免疫細胞または実施形態１３４〜１３６のいずれかの複数の遺伝子操作された免疫細胞と、任意選択的に薬学的に許容可能な緩衝液とを含んでなる、組成物。
１３８．
実施形態１〜６７および１３７のいずれかの組成物を、疾患または病状を有する対象に投与するステップを含んでなる、治療方法。
１３９．
前記組換え受容体が、前記疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する、実施形態１３８の方法。
１４０．
前記疾患または病状が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、実施形態１３８または実施形態１３９の方法。
１４１．
前記がんまたは腫瘍が、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫がん、骨がん、および脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および／または中皮腫である、実施形態１４０の方法。
１４２．
前記抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３、もしくは４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２からなる群から選択される、実施形態１３９〜１４１のいずれかの方法。
１４３．
前記抗原がＣＤ１９またはＢＣＭＡである、実施形態１３９〜１４２のいずれかの方法。
１４４．
前記対象に投与された前記操作された細胞が、投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上、ＰＤ−１の発現を減少させるおよび／または消失する、実施形態１３８〜１４３のいずれかの方法。
１４５．
前記対象に投与された前記操作された細胞が、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上にわたり、前記対象において持続する、実施形態１３８〜１４４のいずれかの方法。
１４６．
前記組成物の投与後のある時点で、
前記組換え受容体を発現しＰＤ−１を発現しない細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり；
前記遺伝子破壊を含有し前記組換え受容体を発現する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能である、
実施形態１３８〜１４５のいずれかの方法。
１４７．
前記ある時点が、投与の、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または約７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間後である、実施形態１３８〜１４６のいずれかの方法。
１４８．
前記血液またはサンプル中で検出可能な前記細胞が、１マイクロリットルの血液当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個の細胞の濃度で存在し、および／または前記血液中のＴ細胞の少なくとも１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％、またはそれ以上に相当する、実施形態１３８〜１４７のいずれかの方法。
１４９．
投与に続いて、
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続し；および／または
前記遺伝子破壊のない前記組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、および／またはＴ細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のＴ細胞の拡張および／または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび／または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなり前記組換え受容体を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および／または持続する、
実施形態１３８〜１４８のいずれかの方法。
１５０．
前記速度または時間が、少なくとも１．５倍または２倍または３倍大きい、または少なくとも約１．５倍または２倍または３倍大きい、実施形態１４９の方法。
１５１．
前記腫瘍が固形腫瘍である、実施形態１４０〜１５０のいずれかの方法。
１５２．
前記腫瘍が、Ｂ細胞由来腫瘍でなく、白血病でなく、および／またはリンパ腫でない、実施形態１４０〜１５１のいずれかの方法。
１５３．
前記腫瘍またはその細胞が、ＰＤ−１のリガンドを発現するまたはそれを発現することが観察されている、実施形態１４０〜１５２のいずれかの方法。
１５４．
（ａ）抗原に特異的に結合する組換え受容体；および
（ｂ）ＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰＤＣＤ１遺伝子の遺伝子破壊であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させる、遺伝子破壊
を含んでなる操作された免疫細胞
を含んでなる薬学的組成物であって、
前記操作された細胞が、対象への投与前にＰＤ−１の発現の減少および／または消失の表現型を有し、
前記細胞が、前記対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上にわたり前記表現型を保持する、
薬学的組成物。
１５５．
対象における疾患または病状の治療で使用するための実施形態１〜６７、１３７、および１５４のいずれかの組成物。
１５６．
前記組換え受容体が、前記疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する、実施形態１５５の使用のための組成物。
１５７．
前記疾患または病状が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、実施形態１５５または実施形態１５６の使用のための組成物。
１５８．
前記疾患または病状が、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫がん、骨がん、および脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および／または中皮腫である、がんまたは腫瘍である、実施形態１５５〜１５７のいずれかの使用のための組成物。
１５９．
前記抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３、もしくは４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２からなる群から選択される、実施形態１５５〜１５８のいずれかの使用のための組成物。
１６０．
前記抗原がＣＤ１９またはＢＣＭＡである、実施形態１５５〜１５９のいずれかの使用のための組成物。
１６１．
対象への前記組成物の投与に続いて、
前記遺伝子破壊を含有し、任意選択的に前記組換え受容体を含有する、１つまたは複数の細胞が、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点、または少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点で、前記対象の組織または生物学的サンプルにおいて、持続し、および／または検出可能であり；および／または
前記対象に由来する生物学的サンプルまたは組織において検出可能な、Ｔ細胞の、または前記組換え受容体を発現するＴ細胞の、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、または９０％が、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点、または少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上の時点で、前記遺伝子破壊を含有する、
実施形態１５５〜１６０のいずれかの使用のための組成物。
１６２．
Ｔ細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなり、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる、Ｔ細胞を改変する方法。
１６３．
Ｔ細胞を２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなり、各複合体が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡ分子を含んでなる、Ｔ細胞を改変する方法。
１６４．
前記Ｔ細胞が、がんに罹患している対象に由来する、実施形態１６２または実施形態１６３の方法。
１６５．
前記がんが、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、実施形態１６４の方法。
１６６．
前記Ｔ細胞が、がんを有する対象、またはさもなければ前記ＰＤＣＤ１遺伝子のＴ細胞標的位置における変異から利益を得ることができる対象に由来する、実施形態１６２〜１６５のいずれかの方法。
１６７．
前記接触させるステップが、エクスビボで実施される、実施形態１６２〜１６６のいずれかの方法。
１６８．
前記Ｔ細胞が組換え受容体を含んでなる、実施形態１６２〜１６７のいずれかの方法。
１６９．
前記核酸を前記細胞に導入させる条件下で、前記Ｔ細胞を、組換え受容体をコードする核酸と接触させるステップをさらに含んでなる、実施形態１６２〜１６８のいずれかの方法。
１７０．
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、実施形態１６８または実施形態１６９の方法。
１７１．
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１６８〜１７０のいずれかの方法。
１７２．
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、実施形態１７１の方法。
１７３．
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、実施形態１７２の方法。
１７４．
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、実施形態１７２または実施形態１７３の方法。
１７５．
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、実施形態１７２〜１７４のいずれかの方法。
１７６．
前記抗原が疾患または障害に関連する、実施形態１７２〜１７５のいずれかの方法。
１７７．
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、実施形態１７６の方法。
１７８．
前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、実施形態１６８〜１７７のいずれかの方法。
１７９．
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、実施形態１７１〜１７８のいずれかの方法。
１８０．
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態１６８〜１７９のいずれかの方法。
１８１．
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、実施形態１８０の方法。
１８２．
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、実施形態１８０または実施形態１８１の方法。
１８３．
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態１８２の方法。
１８４．
前記改変Ｔ細胞が、前記接触させるステップの後に前記対象の身体に戻される、実施形態１６４〜１８３のいずれかの方法。
１８５．
前記Ｔ細胞ががんに罹患している対象に由来し、前記接触させるステップがエクスビボで実施され、前記接触させるステップの後に前記改変Ｔ細胞が前記対象の身体に戻される、実施形態１６２〜１８４のいずれかの方法。
１８６．
前記接触させるステップの前に、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が形成される、実施形態１６２〜１８５のいずれかの方法。
１８７．
前記接触させるステップの前に、前記少なくとも２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が形成される、実施形態１６３〜１８６のいずれかの方法。
１８８．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１６２〜１８７のいずれかの方法。
１８９．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９０．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９１．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９２．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９３．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９４．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９５．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９６．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１８８の方法。
１９７．
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾される、または３’ポリＡテールを含んでなる、実施形態１６２〜１９６のいずれかの方法。
１９８．
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾され、かつ３’ポリＡテールを含んでなる、実施形態１６２〜１９６のいずれかの方法。
１９９．
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、実施形態１９７または実施形態１９８の方法。
２００．
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、実施形態１９７または実施形態１９８の方法。
２０１．
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態２００の方法。
２０２．
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態２００の方法。
２０３．
前記３’ポリＡテールが、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態１９７〜２０２のいずれかの方法。
２０４．
前記３’ポリＡテールが、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態１９７〜２０２のいずれかの方法。
２０５．
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、実施形態２０３または実施形態２０４の方法。
２０６．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、実施形態２０５の方法。
２０７．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、実施形態２０５の方法。
２０８．
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、電気穿孔を通じて前記Ｔ細胞に送達される、実施形態１６２〜２０７のいずれかの方法。
２０９．
前記少なくとも２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、電気穿孔を通じて前記Ｔ細胞に送達される、実施形態１６３〜２０８のいずれかの方法。
２１０．
前記ｇＲＮＡ分子が、前記ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、実施形態１６２〜２０９のいずれかの方法。
２１１．
前記切断効率が、標識抗ＰＤＣＤ１抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される、実施形態２１０の方法。
２１２．
前記Ｃａｓ９分子が、単一のｇＲＮＡ分子によって誘導され、前記標的ドメインを単一の二本鎖切断で切断する、実施形態１６２〜２１１のいずれかの方法。
２１３．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態２１２の方法。
２１４．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000114
から選択される、実施形態１６２〜２１３のいずれかの方法。
２１５．
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、実施形態１６２〜２１１のいずれかの方法。
２１６．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態２１５の方法。
２１７．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＤ１０Ａ変異を有する、実施形態１６２〜２１６のいずれかの方法。
２１８．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000115
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態１６２〜２１７のいずれかの方法。
２１９．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を有する、実施形態１６２〜２１８のいずれかの方法。
２２０．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000116
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２１９の方法。
２２１．
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、実施形態１６２〜２２０のいずれかの方法。
２２２．
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、実施形態１６２〜２２０のいずれかの方法。
２２３．
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、実施形態２２２の方法。
２２４．
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、実施形態２２２または実施形態２２３の方法。
２２５．
少なくとも６０％の切断効率によって特徴付けられる、実施形態２１０〜２２４のいずれかの方法。
２２６．
少なくとも８０％の切断効率によって特徴付けられる、実施形態２１０〜２２４のいずれかの方法。
２２７．
少なくとも９０％の切断効率によって特徴付けられる、実施形態２１０〜２２４のいずれかの方法。
２２８．
前記ｇＲＮＡ分子が５未満のオフターゲットによって特徴付けられる、実施形態２１０〜２２７のいずれかの方法。
２２９．
前記ｇＲＮＡ分子が２未満のエクソンオフターゲットによって特徴付けられる、実施形態２１０〜２２８のいずれかの方法。
２３０．
前記オフターゲットが、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される、実施形態２２８または実施形態２２９の方法。
２３１．
前記オフターゲットが、Ａｍｐ−ｓｅｑによって同定される、実施形態２２８または実施形態２２９の方法。
２３２．
ｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記ｇＲＮＡ分子が、その５’末端で修飾され、および／または３’ポリＡテールを含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３３．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３４．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３５．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３６．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３７．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３８．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２３９．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４０．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４１．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２３２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４２．
前記ｇＲＮＡ分子がその５’末端で修飾されている、実施形態２３２〜２４１のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４３．
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、実施形態２４２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４４．
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、実施形態２４２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４５．
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態２４４のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４６．
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態２４４のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４７．
前記３’ポリＡテールが約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態２３２〜２４６のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４８．
前記３’ポリＡテールが約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態２３２〜２４６のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２４９．
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、実施形態２４７または実施形態２４８のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５０．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、実施形態２４９のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５１．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、実施形態２４９のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５２．
前記Ｃａｓ９分子が二本鎖切断で標的ドメインを切断する、実施形態２３２〜２５１のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５３．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態２５２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５４．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000117
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２３２〜２５３のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５５．
前記Ｃａｓ９分子が一本鎖切断で標的ドメインを切断する、実施形態２３２〜２５１のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５６．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態２５５のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５７．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＤ１０Ａ変異を有する、実施形態２３２〜実施形態２５６のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５８．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000118
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２３２〜実施形態２５７のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２５９．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＮ８６３Ａ変異を有する、実施形態２３２〜２５６のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２６０．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000119
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２５９のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２６１．
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、実施形態２３２〜２６０のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２６２．
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、実施形態２３２〜２６１のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２６３．
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、実施形態２６２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２６４．
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、実施形態２６２または実施形態２６３のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
２６５．
少なくとも２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体を含んでなる組成物であって、各複合体が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるｇＲＮＡ分子を含んでなる、組成物。
２６６．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２６７．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２６８．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２６９．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２７０．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２７１．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２７２．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２７３．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２７４．
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２６５の組成物。
２７５．
前記ｇＲＮＡ分子がその５’末端で修飾される、実施形態２６５〜７４１のいずれかの組成物。
２７６．
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、実施形態２７５の組成物。
２７７．
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、実施形態２７５の組成物。
２７８．
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態２７７の組成物。
２７９．
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態２７７の組成物。
２８０．
前記３’ポリＡテールが、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態２６５〜２７９のいずれかの組成物。
２８１．
前記３’ポリＡテールが、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態２６５〜２７９のいずれかの組成物。
２８２．
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、実施形態２８０または実施形態２８１の組成物。
２８３．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、実施形態２８２の組成物。
２８４．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、実施形態２８２の組成物。
２８５．
前記Ｃａｓ９分子が二本鎖切断で標的ドメインを切断する、実施形態２６５〜２８４のいずれかの組成物。
２８６．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態２８５の組成物。
２８７．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000120
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２６５〜２８６のいずれかの組成物。
２８８．
前記Ｃａｓ９分子が一本鎖切断で標的ドメインを切断する、実施形態２６５〜２８７のいずれかの組成物。
２８９．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態２８８の組成物。
２９０．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子がＤ１０Ａ変異を有する、実施形態２６５〜２８９のいずれかの組成物。
２９１．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000121
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２６５〜２９０のいずれかの組成物。
２９２．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を有する、実施形態２６５〜２９１のいずれかの組成物。
２９３．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000122
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２９２の組成物。
２９４．
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、実施形態２６５〜２９３のいずれかの組成物。
２９５．
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、実施形態２６５〜２９４のいずれかの組成物。
２９６．
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、実施形態２９５の組成物。
２９７．
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、実施形態２９５または実施形態２９６の組成物。
２９８．
ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、その５’末端で修飾され、および／または３’ポリＡテールを含んでなる、ｇＲＮＡ分子。
２９９．
配列番号４８１〜５５５、５６３〜１５１６、１５１７〜３７４８、１４６５７〜１６６７０、および１６６７１〜２１０３７のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または３ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３００．
配列番号５６３〜１５１６から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０１．
配列番号１５１７〜３７４８から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０２．
配列番号１４６５７〜１６６７０から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０３．
配列番号１６６７１〜２１０３７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０４．
配列番号４８１〜５００および５０８〜５４７から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０５．
配列番号５０１〜５０７および５４８〜５５５から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０６．
配列番号５０８、５１４、５７６、５７９、５８２、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０７．
配列番号５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５７６、５７９、５８１、５８２、７６６、および７２３から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態２９８のｇＲＮＡ分子。
３０８．
その５’末端で修飾されている、実施形態２９８〜９４のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３０９．
５’三リン酸基を欠いている、実施形態３０８のｇＲＮＡ分子。
３１０．
５’キャップを含む、実施形態３０８のｇＲＮＡ分子。
３１１．
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態３１０のｇＲＮＡ分子。
３１２．
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態３１０のｇＲＮＡ分子。
３１３．
約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される３’ポリＡテールを含んでなる、実施形態２９８〜３１２のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３１４．
約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される３’ポリＡテールを含んでなる、実施形態２９８〜３１２のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３１５．
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、実施形態３１３または３１４のｇＲＮＡ分子。
３１６．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、実施形態３１５のｇＲＮＡ分子。
３１６．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、実施形態３１５のｇＲＮＡ分子。
３１７．
Ｓ．ピオゲネスｇＲＮＡ分子である、実施形態２９８〜３１６のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３１８．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000123
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態２９８〜３１７のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３１９．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000124
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態３１８のｇＲＮＡ分子。
３２０．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000125
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態３１８のｇＲＮＡ分子。
３２１．
前記ターゲティングドメインが、
2019517788.tif 000126
のターゲティングドメインの群から選択される、実施形態３１８のｇＲＮＡ分子。
３２２．
モジュラーｇＲＮＡ分子である、実施形態２９８〜３２１のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３２３．
キメラｇＲＮＡ分子である、実施形態２９８〜３２２のいずれかのｇＲＮＡ分子。
３２４．
５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、実施形態３２３のｇＲＮＡ分子。
３２５．
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、実施形態３２３または実施形態３２４のｇＲＮＡ分子。
３２６．
細胞を１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させるステップを含んでなり、前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる、移植のための細胞を作製する方法。
３２７．
前記ｇＲＮＡ分子が、前記ＰＤＣＤ１遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記ｇＲＮＡ分子が、前記標的ドメインを少なくとも４０％の切断効率で切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、実施形態３２６の方法。
３２８．
前記切断効率が、標識抗ＰＤＣＤ１抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される、実施形態３２７の方法。
３２９．
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾される、または３’ポリＡテールを含んでなる、実施形態３２６〜３２８のいずれかの方法。
３３０．
前記ｇＲＮＡ分子が、それらの５’末端で修飾され、かつ３’ポリＡテールを含んでなる、実施形態３２６〜３２８のいずれかの方法。
３３１．
前記ｇＲＮＡ分子が５’三リン酸基を欠いている、実施形態３２９または実施形態３３０の方法。
３３２．
前記ｇＲＮＡ分子が５’キャップを含む、実施形態３２９または実施形態３３０の方法。
３３３．
前記５’キャップが、５’−５’三リン酸結合を介して前記ｇＲＮＡ分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態３３２の方法。
３３４．
前記５’キャップが、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、実施形態３３２の方法。
３３５．
前記３’ポリＡテールが、約１０〜約３０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態３２９〜３３４のいずれかの方法。
３３６．
前記３’ポリＡテールが、約２０個のアデニンヌクレオチドから構成される、実施形態３２９〜３３４のいずれかの方法。
３３７．
前記３’ポリＡテールを含む前記ｇＲＮＡ分子が、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製された、実施形態３３５または実施形態３３６の方法。
３３８．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、実施形態３３７の方法。
３３９．
前記ターゲティングドメインの５’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記ＤＮＡ鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するＴ７プロモーター配列を含んでなり、前記Ｔ７プロモーター配列の３’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、実施形態３３７の方法。
３４０．
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、電気穿孔を通じて前記細胞に送達される、実施形態３２６〜３３９のいずれかの方法。
３４１．
前記Ｃａｓ９分子が、単一のｇＲＮＡ分子によって誘導され、前記標的ドメインを単一の二本鎖切断で切断する、実施形態３２６〜３４０のいずれかの方法。
３４２．
前記Ｃａｓ９分子がＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態３４１の方法。
３４３．
前記単一のｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000127
のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態３２６〜３４２のいずれかの方法。
３４４．
前記Ｃａｓ９分子がニッカーゼであり、２つのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の２つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように２つの異なるｇＲＮＡ分子によって誘導される、実施形態３２６〜３４３のいずれかの方法。
３４５．
前記Ｃａｓ９分子が、Ｄ１０Ａ変異を有するＳ．ピオゲネスＣａｓ９分子である、実施形態３２６〜３４４のいずれかの方法。
３４６．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000128
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態３２６〜３４５のいずれかの方法。
３４７．
前記Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９分子が、Ｎ８６３Ａ変異を有する、実施形態３２６〜３４６のいずれかの方法。
３４８．
前記２つのｇＲＮＡ分子が、
2019517788.tif 000129
のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、実施形態３４７の方法。
３４９．
前記ｇＲＮＡ分子がモジュラーｇＲＮＡ分子である、実施形態３２６〜３４８のいずれかの方法。
３５０．
前記ｇＲＮＡ分子がキメラｇＲＮＡ分子である、実施形態３２６〜３４９のいずれかの方法。
３５１．
前記ｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、ターゲティングドメイン；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、実施形態３５０の方法。
３５２．
前記ｇＲＮＡ分子が、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、実施形態３５０または実施形態３５１の方法。
３５３．
前記ｇＲＮＡ分子が、少なくとも６０％の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、実施形態３２６〜３５２のいずれかの方法。
３５４．
前記ｇＲＮＡ分子が、少なくとも８０％の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、実施形態３２６〜３５２のいずれかの方法。
３５５．
前記ｇＲＮＡ分子が、少なくとも９０％の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Ｃａｓ９分子を誘導する、実施形態３２６〜３５２のいずれかの方法。
３５６．
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、５未満のオフターゲットを生じる、実施形態３２６〜３５５のいずれかの方法。
３５７．
前記１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、２未満のエクソンオフターゲットを生じる、実施形態３２６〜３５６のいずれかの方法。
３５８．
前記オフターゲットが、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される、実施形態３５６または実施形態３５７の方法。
３５９．
前記オフターゲットが、Ａｍｐ−ｓｅｑによって同定される、実施形態３５６または実施形態３５７の方法。
３６０．
前記接触させるステップがエクスビボで実施される、実施形態３２６〜３５９のいずれかの方法。
３６１．
前記細胞が免疫細胞である、実施形態３２６〜３６０のいずれかの方法。
３６２．
前記細胞がリンパ球または抗原提示細胞である、実施形態３６１の方法。
３６３．
前記細胞がＴ細胞、Ｂ細胞または抗原提示細胞である、実施形態３６２の方法。
３６４．
前記細胞がＴ細胞である、実施形態３２６〜３６３のいずれかの方法。
３６５．
前記細胞が組換え受容体を含んでなる、実施形態３２６〜３６４のいずれかの方法。
３６６．
前記核酸を前記細胞に導入させる条件下で、前記細胞を、組換え受容体をコードする核酸と接触させるステップをさらに含んでなる、実施形態３２６〜３６５のいずれかの方法。
３６７．
前記組換え受容体が、機能性非ＴＣＲ抗原受容体または遺伝子組換えＴＣＲである、実施形態３６５または実施形態３６６の方法。
３６８．
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態３６５〜３６７のいずれかの方法。
３６９．
前記ＣＡＲが、
抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメイン
を含んでなる、実施形態３６８の方法。
３７０．
前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、実施形態３６９の方法。
３７１．
前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、実施形態３６９または実施形態３７０の方法。
３７２．
前記フラグメントが、ｓｃＦｖを含んでなる、実施形態３６９〜３７１のいずれかの方法。
３７３．
前記抗原が疾患または障害に関連する、実施形態３６９〜３７２のいずれかの方法。
３７４．
前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、実施形態３７３の方法。
３７５．
前記組換え受容体が腫瘍抗原に特異的に結合する、実施形態３６５〜３７４のいずれかの方法。
３７６．
前記抗原が、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、Ｂ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４、ＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンｅ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＩＬ−２２Ｒ−α、ＩＬ−１３Ｒ−α２、ｋｄｒ、κ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１−細胞接着分子（ＣＤ１７１）、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、ＢＣＭＡ、およびインターロイキン１２から選択される、実施形態３６９〜３７５のいずれかの方法。
３７７．
前記組換え受容体が、ＩＴＡＭを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態３６５〜３７６のいずれかの方法。
３７８．
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含んでなる、実施形態３７７の方法。
３７９．
前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、実施形態３７７または３７８の方法。
３８０．
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでなる、実施形態３７９の方法。
３８１．
実施形態１６２〜２３１および３２６〜３８０のいずれかの方法によって作製されたＴ細胞。
３８２．
実施形態２３２〜２６４のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなるＴ細胞。
３８３．
実施形態２６５〜２９７のいずれかの組成物を含んでなるＴ細胞。
３８４．
実施形態３８１〜３８３のいずれかのＴ細胞を前記対象に投与するステップを含んでなる、対象を治療する方法。
３８５．
治療で使用するための、実施形態２３２〜２６４のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、実施形態２６５〜２９７のいずれかの組成物、または実施形態３８１〜３８３のいずれかのＴ細胞。
３８６．
がんの治療のための医薬の製造における、実施形態２３２〜２６４のいずれかのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体または実施形態２６５〜２９７のいずれかの組成物の使用。
【実施例】
【０８７３】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、説明の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０８７４】
実施例１：初代Ｔ細胞におけるＰＤＣＤ１のｇＲＮＡのスクリーニング
ＰＤＣＤ１（プログラム死−１をコードする遺伝子、ＰＤ−１）をターゲティングするための特定のｇＲＮＡを評価するために、ＰＤＣＤ１遺伝子座をターゲティングする異なる標識ｇＲＮＡを含んでなるｇＲＮＡとＣａｓ９（ＲＮＰ）のリボ核タンパク質複合体を作製し、活性化初代Ｔ細胞に電気穿孔によって送達した。本質的に、国際公開第２０１５１６１２７６号パンフレットに記載されるように精製されたＳ．ピオゲネスＣａｓ９タンパク質を、ｇＲＮＡ次第で、１：１、１：１．２５または１：５のＣａｓ９：ｇＲＮＡ比で、少なくとも１５分間にわたり、それぞれの（本質的に、国際公開第２０１５１６１２７６号パンフレットに記載されるように調製された）インビトロ転写ｇＲＮＡと複合体形成させた。
【０８７５】
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて、タンパク質がｇＲＮＡと完全に複合体形成したことを検証した後に、健常ヒトドナーに由来する活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に、電気穿孔を用いてＲＮＰを投与した。ＲＮＰは、１μｇのＲＮＰ／１００，０００細胞の用量で、９６ウェル構成で電気穿孔を用いて、５００，０００個の細胞に添加した。細胞は、電気穿孔後に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地中で培養した。
【０８７６】
ＰＤＣＤ１ノックアウトの効率を評価するために、Ｔ細胞培地中で培養しながら、Ｔ細胞を４８時間にわたり抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して再活性化した。電気穿孔の７日後に、実施例２に記載されるようにＰＥコンジュゲート抗ＰＤ１抗体を使用して、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。ＰＤ−１陰性細胞の百分率は、図２３に示される。表１０００は、このようにして同定された４５％を超えるＰＤＣＤ１ノックアウト効率を有する、６つの例示的なＲＮＰ由来のｇＲＮＡに対する、ターゲティングドメインの配列を提供する。
【０８７７】
（表１０００）
2019517788.tif 000130
【０８７８】
上で同定された各６つのｇＲＮＡの特異性を、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって初代Ｔ細胞において評価した（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１８７−１９７，２０１５を参照されたい）。２つの別々の実験から得られた４つの独立したｇＤＮＡサンプルの結果が、表２０００に要約される。双方向読み取りが４つのサンプルの少なくとも１つに存在する場合、または一方向の読み取りが４つのサンプルの少なくとも２つに存在する場合、オフターゲットと見なされた。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの結果を確認するために、標的ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）を有するｇＲＮＡを使用して調製された、Ｓ．ピオゲネスＲＮＰで処理されたＴ細胞由来の６つの独立したｇＤＮＡに対して、Ａｍｐ−ｓｅｑを実施した。Ａｍｐ−ｓｅｑの結果はＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ結果と同様であり、（ａ）同定されたオフターゲット、および（ｂ）ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって生成されたガイドの順位序列の双方が確認された。
【０８７９】
（表２０００）
2019517788.tif 000131
【０８８０】
実施例２：複数のドナーにわたるＰＤＣＤ１ノックアウト効率の評価
複数のドナーにわたる切断効率を評価するために、ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000132
を有するｇＲＮＡを使用して調製されたＲＮＰターゲティングＰＤＣＤ１を、複数のドナーに由来する活性化初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に電気穿孔した。対照として、ＡＡＶＳ１ターゲティングドメイン（配列番号３８７）を有するｇＲＮＡを使用して調製された対照ＲＮＰを使用して調製されたＲＮＰもまた、活性化された初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に電気穿孔した。次に、ＰＥコンジュゲート抗ＰＤ−１抗体を使用して、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によってＰＤ−１発現を評価した。
【０８８１】
あらかじめ健常ドナーから単離された初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を解凍し、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地中で培養しながら、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して活性化した。４８時間の活性化の後、ビーズを細胞から除去し、１μｇ／１００，０００細胞の用量でＲＮＰと共に、電気穿孔前にさらに２４時間培養した。数日間（３〜４日間）の培養後に、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズまたはＰＭＡ／イオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯ）のどちらかで再刺激した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化の場合、細胞をビーズと共に４８時間インキュベートして、２４時間後にＦＡＣＳによってＰＤ−１発現について評価した。ＰＭＡ／ＩＯ活性化の場合、細胞をＰＭＡ／ＩＯ存在下で２４時間培養し、ＦＡＣＳによるＰＤ−１発現の評価がそれに続いた。その内容全体が参照により本明細書に援用される、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのウェブサイトで入手できる「Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」ｗｗｗ．ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ＿ａｓｓｅｔｓ／ｓｕｐｐｏｒｔ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＿Ｓｕｒｆａｃｅ＿Ｓｔａｉｎｉｎｇ＿Ｆｌｏｗ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿０９１０１２．ｐｄｆに従って、ＰＥコンジュゲート抗ＰＤ−１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＣＡのウェブサイトで入手できる）を用いて、ＰＤ−１発現を評価した。Ｔ細胞選別のゲーティングパラメータは、文献に記載されるように、１つまたは複数のチャネルの蛍光シグナルおよび前方散乱および側方散乱に基づいて設定され、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｄ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｐｐ．２５７−２７６  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｍ．Ｇ．Ｍａｃｅｙ，２００７（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）を参照されたい。活性化条件に関わりなく、ＰＤ−１の発現をＡＡＶＳ１編集群または未処理対照群において評価した。
【０８８２】
図２４Ａでは、ＰＤＣＤ１ノックアウトを有する細胞の百分率が、複数のドナーに対する標準偏差を示すエラーバーと共にプロットされている。上記の実験においてＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）によって検出されたＰＤ−１発現の例は、図２４Ｂに示される。ＰＤ−１の上方制御は、ＡＡＶＳ１編集群または未処理対照群において観察された。ＰＤＣＤ１ターゲティングＲＮＰで処理された細胞において、組成物は、約９０％のＰＤ−１陰性Ｔ細胞を含有することが観察され、細胞において観察された＞９０％のＰＤ−１陰性細胞は、一部のドナーから生成された。
【０８８３】
実施例３：ＰＤＣＤ１ノックアウトは、Ｔ細胞培養物の組成を変化させない
ＰＤＣＤ１の欠失がＣＤ８＋Ｔ細胞培養物の組成に変化をもたらすかどうかを評価するために、ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000133
を有するｇＲＮＡを使用して調製されたＰＤＣＤ１ターゲティングＲＮＰをＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養に送達した。ＡＡＶＳ１ターゲティングドメイン（配列番号３８７）を有するｇＲＮＡを使用して調製されたＲＮＰで処理したＣＤ８＋Ｔ細胞を対照として用いた。
【０８８４】
単離されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地中で培養した。活性化の４８時間後、活性化ビーズを除去し、細胞を一晩培養した。翌日、細胞をＰＤＣＤ１またはＡＡＶＳ１ターゲティングＲＮＰで電気穿孔し、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地中で培養した。
【０８８５】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズによる再活性化後に、フローサイトメトリーによってＰＤ−１発現のレベルを評価するために、細胞の一部を４日目に分割した。残りの細胞（非活性化細胞）をＴ細胞凍結媒体中で凍結させた。ＰＤＣＤ１の欠失により細胞の組成が変化したかどうかを判定するために、ＡＡＶＳ１ガイドおよびＰＤＣＤ１ガイド処理細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地中で解凍した。次に、ＣＤ８＋細胞集団内の亜集団（例えば、未感作、セントラルメモリー、エフェクターメモリーおよび最終分化したエフェクターメモリーをはじめとする）を評価するために、細胞をＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４５ＲＡに対する抗体で染色した。（前方／側方散乱に基づく）生存ＣＤ８＋細胞で検出されたＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡ表面発現レベルが、図２５に示される。これらの２つのマーカーの発現に基づく亜集団は、等高線図の四分区間にマーキングされ、各四分区間内の細胞の百分率が標識される。このプロットは、対照ＡＡＶＳ１ターゲティングＲＮＰで処理された細胞と比較して、ＰＤＣＤ１ターゲティングＲＮＰで処理された細胞中の個体数に大きな変化は観察されなかったことを示す。
【０８８６】
実施例４：キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された細胞におけるＰＤＣＤ１の遺伝子破壊
初代ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、健常ドナーから得られたヒトＰＢＭＣサンプルから、免疫親和性に基づく選択によって単離した。得られた細胞は、レンチウイルス形質導入によってキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作する前に、ヒト血清、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地中で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８試薬と共に、３７℃で２４〜４８時間培養することによって刺激した。形質導入の代理マーカーとして使用するために、Ｔ２Ａリボソームスイッチをコードする配列によって隔てられた、例示的抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸分子と切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）をコードする核酸とを含有するレンチウイルスベクターを用いて、細胞を形質導入した。ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、Ｉｇ由来スペーサー、ヒトＣＤ２８由来膜貫通ドメイン、ヒト４−１ＢＢ由来細胞内シグナル伝達ドメイン、およびヒトＣＤ３ζ由来シグナル伝達ドメインを含んだ。モック形質導入を陰性対照として用いた。
【０８８７】
形質導入に続いて、ヒト血清およびＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地中で、細胞を３６〜４８時間培養した。次に、ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000134
を有するＰＤＣＤ１ターゲティングｇＲＮＡと、（またはターゲティングドメイン
2019517788.tif 000135
を有するＡＡＶＳ１対照ｇＲＮＡと、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９とを使用して調製されたＲＮＰで、細胞を電気穿孔した。次に、細胞を、同一濃度のＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含有する同一培地中で３０℃で一晩、次に電気穿孔後１２〜１５日まで３７℃で培養した。
【０８８８】
Ａ．ＣＡＲおよびＰＤ−１発現
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体にコンジュゲートされたビーズよる２４時間の再刺激の後、ＰＤ−１の細胞表面発現およびＣＡＲ発現（代理マーカーを通じて示される）を電気穿孔後１２日目に評価した。細胞を抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＰＤ１抗体で染色して、フローサイトメトリーによって表面のＣＡＲ発現（代理マーカーＥＧＦＲｔの表面発現によって示される）およびＰＤ−１発現を検証した。結果は、図２６に示される。
【０８８９】
図１８に示されるように、これらの条件下においてＰＤＣＤ１ターゲティングＲＮＰで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％超およびＣＤ４＋Ｔ細胞の９０％超は、ＣＡＲ発現個体群を含めて、ＰＤ−１の表面発現に関して陰性であることが観察された（ＥＧＦＲｔマーカーによって示される）。この結果は、ＣＡＲ形質導入および非ＣＡＲ発現ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞の双方における双方の対立遺伝子における、ＰＤＣＤ１の効率的な欠失と一致した。代理マーカーの表面発現はまた、対照およびＰＤ−１陰性細胞の双方でも観察され、ＰＤ−１ノックアウトが、組換え代理マーカータンパク質の表面発現を妨げないことが示唆された。
【０８９０】
Ｂ．ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＫＯ細胞の表現型評価
修飾され操作されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型特性はまた、表現型、分化状態および／または活性化状態の指標となるものをはじめとする、様々なマーカーの表面発現を評価するフローサイトメトリーによっても評価された。上記のようなＰＤ−１およびＥＧＦＲｔマーカー（ＣＡＲ発現の代理）を認識する抗体に加えて、ＣＣＲ７、４１ＢＢ、ＴＩＭ３、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｌａｇ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９に対して特異的な抗体で、細胞を染色した。各Ｔ細胞亜型ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の各亜集団（ＣＡＲ＋／ＰＤ１＋；ＣＡＲ＋／ＰＤ１−；ＣＡＲ−／ＰＤ１＋；およびＣＡＲ−／ＰＤ１−）中の各マーカーについて検出された平均蛍光強度を判定した。
【０８９１】
図２７Ａ（ＣＤ４＋）および図２７Ｂ（ＣＤ８＋）に記載される結果は、試験された条件下で、様々なマーカーの発現レベルが、ＰＤ−１陰性ＣＡＲ発現細胞（ＣＡＲ＋／ＰＤ１−）およびＰＤ−１陽性ＣＡＲ発現細胞（ＣＡＲ＋／ＰＤ１＋）の間で同様であったことを示唆した。
【０８９２】
Ｃ．ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＰＤＣＤ１欠失
ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるＰＤＣＤ１遺伝子座の破壊は、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列中の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらし得る。上記のように操作されて欠失を受けたＴ細胞は、一次拡張の２０日後および二次拡張の１０日後に、ＭｉＳｅｑ配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、インデルの存在について分析した。ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるインデル数と、ＰＤＣＤ１ターゲティングｇＲＮＡによって導入されたＰＤＣＤ１切断部位と比較したそれらの相対的位置とを判定した。
【０８９３】
図２８Ａに示されるように、ＰＤＣＤ１ターゲティングＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰで電気穿孔されたＣＡＲ＋Ｔ細胞およびモック形質導入Ｔ細胞の９０％超が、一次および二次拡張後にＰＤＣＤ１遺伝子座にインデルを含有した。比較すると、ＰＤＣＤ１インデルは、対照ｇＡＡＳＶ１ターゲティングＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰで電気穿孔された細胞では検出されなかった。図２８Ｂに示されるように、挿入および欠失は、ＰＤＣＤ１ターゲティングｇＲＮＡによって指向される切断部位に、またはその近くに（すなわち、上流または下流の５０塩基対以内に）現れた。結果は、これらの条件下で、ＰＤＣＤ１ターゲティングｇＲＮＡがＣＡＲ発現Ｔ細胞の９０％超においてＰＤＣＤ１の遺伝子破壊に影響を及ぼし、その破壊が複数の拡張を通じて安定していることを実証した。
【０８９４】
実施例５：ＰＤＣＤ１欠失ＣＡＲ発現Ｔ細胞の機能活性
実施例４に記載のようにして生成された、例示的な抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現して、ＰＤ−１遺伝子の発現がノックアウトされた、遺伝子操作されたヒトＴ細胞（ＣＤ８＋またはＣＤ４＋のどちらか）を様々な機能応答について評価した。
【０８９５】
Ａ．細胞溶解活性
形質導入（およびモック形質導入）およびＰＤＣＤ１（または対照）欠失を上の実施例４に記載のように実施した。次に、ＣＤ１９抗原（Ｋ５６２−ＣＤ１９）を発現するＫ５６２標的細胞、または対照抗原（ＲＯＲ１）（Ｋ５６２−ＲＯＲ）を発現する非特異的ＣＤ１９陰性Ｋ５６２対照細胞に対する細胞溶解活性について、細胞を評価した。ＮｕｃＲｅｄ色素の存在下で、４：１のエフェクター：標的比で、標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９またはＫ５６２−ＲＯＲ１）と共に、Ｔ細胞をインキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ定量的細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＮｕｃＲｅｄ色素の細胞の染色強度を評価することにより、標的細胞の溶解を７０時間にわたって測定した。溶解が出現した細胞は、色素の染色強度が低下した。
【０８９６】
結果は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ＋／ＰＤ１＋、ＣＡＲ＋／ＰＤ１−、およびＣＡＲ＋／ＡＡＶＳ１−）が、標的抗原特異的様式で、ＣＤ１９発現標的細胞を同程度に死滅させられることを示した。非特異的抗原を発現する標的細胞とのインキュベーションに続いて、これらの細胞のいずれによっても細胞溶解は観察されなかった。結果は、ＰＤＣＤ１の欠失が、これらの条件下で、抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害活性に影響を及ぼさないことを実証した。
【０８９７】
Ｂ．Ｔ細胞拡張
ＣＤ１９発現標的細胞とのインキュベーションに続くＴ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって評価した。上記のように生成された誘導ターゲティングＰＤＣＤ１（またはＡＡＶＳ１対照）を有するＲＮＰを使用して欠失を受けた、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ＣＡＲ発現するＴ細胞（またはモック対照）をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）細胞増殖アッセイ色素で標識した。細胞を洗浄し、１：１のエフェクター：標的比で、同一標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９またはＫ５６２−ＲＯＲ）と共に、三連で９６時間インキュベートした。Ｔ細胞の分裂は、フローサイトメトリーによって評価されるように、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット色素希釈によって示された。
【０８９８】
図２９に示されるように、Ｋ５６２−ＣＤ１９との共培養後に、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＰＤＣＤ１欠失ありまたはなし）が、抗原特異的様式で、同様の程度まで増殖した。したがって、この結果によりこれらの条件下では、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＰＤＣＤ１の欠失に続いてＣＡＲ抗原特異的様式で増殖し得ることが実証された。
【０８９９】
Ｃ．サイトカイン放出
様々な細胞を抗原発現細胞および対照標的細胞と共にインキュベーションした後、サイトカイン放出もまた評価した。上記のように作製されたＰＤＣＤ１ターゲティングまたはＡＡＶＳ１ターゲティング欠失を受けた、または非形質移入（ＵＴ）のＣＡＲ発現Ｔ細胞（およびモック対照）を標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９またはＫ５６２−ＲＯＲ）と共に、４：１のエフェクター：標的比で三連で共培養した。共培養した細胞を約２４時間インキュベートし、次に多重サイトカイン免疫測定法（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いたＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−２の測定のために、上清を収集した。
【０９００】
結果は、図３０Ａ（ＩＦＮ−γ）、図３０Ｂ（ＴＮＦ−α）、および図３０Ｃ（ＩＬ−２）に記載される。結果は、これらの条件下において、ＰＤＣＤ１欠失および対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、ＣＤ１９発現標的細胞とのインキュベーションに続いて、抗原特異的様式で、同様のレベルサイトカインを分泌したことを示した。
【０９０１】
実施例６：ｇＲＮＡのクローニングおよび最初のスクリーニング
候補ｇＲＮＡの適合性は、本実施例に記載されるように評価され得る。キメラｇＲＮＡについて記載されるが、アプローチはまた、モジュラーｇＲＮＡを評価するのにも使用され得る。
【０９０２】
ベクターにｇＲＮＡをクローニングする
各ｇＲＮＡ毎に、１対の重複オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラｇＲＮＡの上流Ｕ６プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のＤＮＡを生成するために準備される。交互のプロモーターを使用して、インビボ転写（例えば、Ｈ１プロモーター）またはインビトロ転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。
【０９０３】
直鎖ｄｓＤＮＡ分子中でｇＲＮＡをクローニングする（ＳＴＩＴＣＨＲ）
各ｇＲＮＡ毎に、単一オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。Ｕ６プロモーターおよびｇＲＮＡスキャフォールド（例えば、第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインをはじめとする、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに由来する配列をはじめとする、ターゲティングドメイン以外の全てを含む）は、別々にＰＣＲ増幅されて、ｄｓＤＮＡ分子として精製される。ｇＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化されたターゲティングドメインによって連結する、Ｕ６およびｇＲＮＡスキャフォールドを縫い合わせる。結果として生じるｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ生成物）は、形質移入のために精製される。交互のプロモーターを使用して、インビボ転写（例えば、Ｈ１プロモーター）またはインビトロ転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。任意のｇＲＮＡスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するＣａｓ９と適合性のｇＲＮＡが生成されてもよい。
【０９０４】
最初のｇＲＮＡスクリーニング
試験される各ｇＲＮＡは、プラスミド発現Ｃａｓ９および小量のＧＦＰ発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、２９３Ｔ、Ｋ５６２またはＵ２ＯＳなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的（例えば、赤血球系細胞）に関連があってもよい。可能な治療標的細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内因性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子ターゲティング比率に関する重要な情報を提供してもよい。
【０９０５】
形質移入は、（リポフェクタミンまたはＦｕｇｅｎｅなどの）脂質移入を使用して、または（Ｌｏｎｚａヌクレオフェクションなどの）電気穿孔によって実施されてもよい。形質移入に続いて、ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーのどちらかによって判定され、一貫した高レベルの形質移入が確認され得る。これらの予備形質移入は、異なるｇＲＮＡおよび異なるターゲティングアプローチ（１７量体、２０量体、ヌクレアーゼ、二重ニッカーゼなど）を含んでなり、いずれのｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ組み合わせが最大活性を与えるかが判定され得る。
【０９０６】
各ｇＲＮＡの切断効率は、Ｔ７Ｅ１タイプアッセイまたは配列決定によって、標的遺伝子座におけるＮＨＥＪ誘導インデル形成を測定することで、評価されてもよい。代案としては、ＣｅｌＩ／Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼなどのその他のミスマッチ感受性酵素もまた使用されてもよい。
【０９０７】
Ｔ７Ｅ１アッセイでは、ＰＣＲアンプリコンは、およそ５００〜７００ｂｐであり、意図される切断部位は、アンプリコン中に非対称的に配置される。ＰＣＲ産物の増幅、精製、およびサイズ検証に続いて、９５℃に加熱して、次に、緩慢に冷却することで、ＤＮＡは変性され再ハイブリダイズされる。ハイブリダイズＰＣＲ産物は、次に、完全にはマッチしないＤＮＡを認識して切断する、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（またはその他のミスマッチ感受性酵素）で消化される。最初のテンプレートＤＮＡ中にインデルが存在する場合、アンプリコンは変性されて再アニールされ、それは異なるインデルを有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションをもたらし、ひいては完全にはマッチしない二本鎖ＤＮＡをもたらす。消化産物は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動法によって視覚化されてもよい。切断されたＤＮＡの割合（切断および比切断密度で除した分解産物密度）を使用して、次の方程式を使用して、パーセントＮＨＥＪが推定されてもよい：％ＮＨＥＪ＝（１−（１−切断割合） １／２）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２〜５％ＮＨＥＪに至るまで感受性である。
【０９０８】
Ｔ７Ｅ１アッセイの代わりに、またはそれに加えて、配列決定が使用されてもよい。サンガー配列決定では、精製ＰＣＲアンプリコンがプラスミド骨格にクローン化され、形質転換されて、単一プライマーでミニプレップされて配列決定される。Ｔ７Ｅ１によってＮＨＥＪ比率を判定した後に、サンガー配列決定を使用して、インデルの正確な性質が判定されてもよい。
【０９０９】
配列決定はまた、次世代配列決定技術を使用して実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは３００〜５００ｂｐであってもよく、意図される切断部位は非対称的に配置される。ＰＣＲに続いて、例えば、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上の）ハイスループット配列決定で使用される次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデクス）が、アンプリコンの末端に付加されてもよい。この方法は、非常に低いＮＨＥＪ比率の検出を可能にする。
【０９１０】
実施例７：ＮＨＥＪによる遺伝子ターゲティングの評価
遺伝子ターゲティング効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
【０９１１】
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、ゲノムＤＮＡが形質移入細胞の混合集団から単離されてもよく、ＰＣＲを使用して標的領域が増幅されてもよい。ＰＣＲに続いて、所望の変異体（標的遺伝子のノックアウトまたは標的配列モチーフの除去のどちらか）を生成する遺伝子ターゲティング効率が、配列決定によって判定されてもよい。サンガー配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、５００〜７００ｂｐ長であってもよい。次世代配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、３００〜５００ｂｐ長であってもよい。遺伝子機能のノックアウトが目的である場合、配列決定を使用して、遺伝子機能を破壊することが予期されるフレームシフトまたは大規模な欠失または挿入をもたらすＮＨＥＪ誘導インデルを、対立遺伝子の何パーセントが受けたかが評価されてもよい。特定の配列モチーフの除去が目的であれば、配列決定を使用して、この配列に広がる対立遺伝子の何パーセントが、ＮＨＥＪ誘導欠失を受けたかが評価されてもよい。
【０９１２】
実施例８：２９３細胞内のｇＲＮＡのスクリーニング
Ｔ細胞受容体β（ＴＲＢＣ）についてのｇＲＮＡのスクリーニング
標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、４２個のＳ．ピオゲネスおよび２７個のＳ．アウレウスｇＲＮＡが選択された（表３０００）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネスまたはＳ．アウレウス）から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ  ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネスまたはＳ．アウレウス）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３細胞に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８〜７２時間後に細胞から単離された。Ｔ細胞受容体β遺伝子（ＴＲＢＣ）における修飾比率を判定するために、表４０００に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して、標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１−（（１−（切断割合））＾０．５）））。この分析の結果は、図１１および図１２に示される。
【０９１３】
（表３０００）
2019517788.tif 000136
2019517788.tif 000137
2019517788.tif 000138
【０９１４】
（表４０００）
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【０９１５】
Ｔ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）についてのｇＲＮＡのスクリーニング
標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、１８個のＳ．ピオゲネスおよび１３個のＳ．アウレウスｇＲＮＡが選択された（表５０００）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネスまたはＳ．アウレウス）から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ  ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネスまたはＳ．アウレウス）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３細胞に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８〜７２時間後に細胞から単離された。Ｔ細胞受容体α遺伝子（ＴＲＡＣ）における修飾比率を判定するために、表６０００に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して、標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１−（（１−（切断割合））＾０．５）））。この分析の結果は、図１３および図１４に示される。
【０９１６】
（表５０００）
2019517788.tif 000140
【０９１７】
（表６０００）
2019517788.tif 000141
【０９１８】
ＰＤＣＤ１遺伝子についてのｇＲＮＡのスクリーニング
標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、４８個のＳ．ピオゲネスおよび２７個のＳ．アウレウスｇＲＮＡが選択された（表７０００Ａおよび７０００Ｂを参照されたい）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネスまたはＳ．アウレウス）から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ  ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネスまたはＳ．アウレウス）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３細胞に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８〜７２時間後に細胞から単離された。ＰＤ−１遺伝子（ＰＤＣＤ１）における修飾比率を判定するために、表７０００Ｃに列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１−（（１−（切断割合））＾０．５）））。表７０００Ａに示されるこのｇＲＮＡの分析結果は、図１５および図１６に示される。同様の実験は、表７０００Ｂで示されるものをはじめとする、本明細書に記載されるその他のｇＲＮＡで実施され得る。
【０９１９】
（表７０００Ａ）
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2019517788.tif 000143
2019517788.tif 000144
【０９２０】
（表７０００Ｂ）
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2019517788.tif 000146
【０９２１】
実施例９：酵素的合成および初代Ｔ細胞へのｇＲＮＡの送達
ＲＮＡ分子としてのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＴ細胞への送達
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲβ鎖（ＴＲＢＣ−２１０
2019517788.tif 000147
またはＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ−４
2019517788.tif 000148
に対して設計された、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９およびｇＲＮＡが、電気穿孔を通じてＲＮＡ分子としてＴ細胞に送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方が、Ｔ７ポリメラーゼを使用してインビトロ転写された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時に双方のＲＮＡ種に付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子座にＣＤ４＋Ｔ細胞修飾を生成するために、１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１０μｇのＴＲＢＣ−２１０
2019517788.tif 000149
ｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞に導入された。同一実験において、本発明者らはまた、１０μｇのＴＲＡＣ−４
2019517788.tif 000150
ｇＲＮＡと共に、１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡを導入することで、ＴＲＡＣ遺伝子をターゲティングした。ＡＡＶＳ１
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ゲノム部位をターゲティングするｇＲＮＡが、実験対照として使用された。電気穿孔に先だって、Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳおよび組換えＩＬ−２が添加されたＲＰＭＩ  １６４０中で培養された。細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化され、少なくとも３日間増殖された。活性化Ｔ細胞へのｍＲＮＡの導入に引き続いて、電気穿孔の２４、４８、および７２時間後に、ＣＤ３に対して特異的なフルオレセイン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって、細胞上のＣＤ３発現がモニターされた。７２時間目に、ＣＤ３陰性細胞集団が観察された（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＢＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＢＣ２遺伝子座およびＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図１７Ｃ）。
【０９２２】
Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲα鎖
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に対して設計されたＳ．アウレウスＣａｓ９およびｇＲＮＡが、電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加されたブレインハートインフュージョンブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７°Ｃで培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存された。
【０９２３】
細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次に、ＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【０９２４】
ｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成された。５’  ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。細胞への導入前に、精製Ｃａｓ９とｇＲＮＡを混合して、１０分間にわたり複合体を形成させた。ＲＮＰ溶液は、引き続いて電気穿孔によってＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内に導入された。電気穿孔の前後に、細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。細胞上のＣＤ３発現は、ＣＤ３に対して特異的なフルオレセインコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって、電気穿孔の２４、４８、および７２時間後にモニターされた。４８および７２時間目に、ＣＤ３陰性細胞集団が観察された（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図１８Ｃ）。
【０９２５】
実施例１０：Ｔ細胞生存に対するｇＲＮＡ修飾の影響を評価する
ｇＲＮＡ修飾がＴ細胞生存にどのような影響を及ぼすかを評価するために、修飾存在下または不在下で、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ
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と組み合わせて、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９  ｍＲＮＡが、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に送達された。具体的には、（１）５’抗逆転キャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップ（図１９を参照されたい）およびポリＡテールがあるｇＲＮＡ、（２）５’  ＡＲＣＡキャップのみがあるｇＲＮＡ、（３）ポリＡテールのみがあるｇＲＮＡ、（４）いかなる修飾もないｇＲＮＡの４つの異なる修飾の組み合わせが分析された。全ての４つの上述の修飾ｇＲＮＡバージョンを生成するために、ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７プロモーター、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ標的配列
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、およびＳ．ピオゲネスＴＲＡＣＲ配列を含んでなる。全てのｇＲＮＡについて、７．５ｍＭ  ＵＴＰ、７．５ｍＭ  ＧＴＰ、７．５ｍＭ  ＣＴＰ、および７．５ｍＭ  ＡＴＰの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼが使用されて、ｇＲＮＡが生成された。ｇＲＮＡを５’  ＡＲＣＡキャップで修飾するために、６．０ｍＭのＡＲＣＡアナログが、ＮＴＰプールに添加された。その結果、１．５ｍＭのＧＴＰのみが添加された一方で、ＮＴＰプールの残りは、７．５ｍＭ  ＵＴＰ、７．５ｍＭ  ＣＴＰ、および７．５ｍＭ  ＡＴＰの同一濃度のままであった。ｇＲＮＡにポリＡテールを付加するために、インビトロポリメラーゼ反応終了後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製された組換えポリＡポリメラーゼを使用して、転写されたｇＲＮＡ末端に一連のＡが付加された。終止は、ＤＮａｓｅ  ＩによるＤＮＡテンプレートの排除によって達成された。ポリＡテール反応は、およそ４０分間にわたり実施された。ｇＲＮＡ修飾に関わりなく、全てのｇＲＮＡ調製品は、フェノール：クロロホルム抽出と、それに続くイソプロパノール沈殿によって精製された。ひとたびｇＲＮＡが生成したら、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、（５’  ＡＲＣＡキャップおよびポリＡテールにより修飾された）Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび４つの異なる修飾ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡの１つで電気穿孔された。電気穿孔に続いて、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム二重染色を実施することで、細胞生存率が評価された。アネキシンＶおよびＰＩ染色されない生細胞画分が、フローサイトメトリーによって判定された。結果は、図２０に定量化される。生細胞画分に基づいて、電気穿孔によって導入された場合に、５’  ＡＲＣＡキャップおよびポリＡテールの双方で修飾されたｇＲＮＡが、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対して最も毒性が低いと結論付けられる。
【０９２６】
実施例１１：未感作Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
未感作Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲα鎖に対して設計された、ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000155
があるＳ．アウレウスＣａｓ９およびｇＲＮＡが、電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加されたブレインハートインフュージョンブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存された。
【０９２７】
細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次にＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【０９２８】
ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000156
があるｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。この実施形態では、Ｔ細胞は、フィコール勾配と、それに続くＣＤ３磁性ビーズを使用した正の選択によって新鮮臍帯血から単離された。細胞は、引き続いて、１０％ＦＢＳ、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。単離の２４時間後、細胞は、精製Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを室温で１０分間インキュベートすることで生成された、ＲＮＰ溶液で電気穿孔された。細胞上のＣＤ３発現は、電気穿孔の９６時間後に、ＣＤ３に対して特異的なＡＰＣコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってモニターされた。ＣＤ３陰性細胞集団が細胞内で観察され、その中では、ｇＲＮＡおよび非機能性Ｃａｓ９が投与された陰性対照と対比して、機能性ＲＮＰ複合体が提供された（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２１Ｃ）。
【０９２９】
実施例１２：ＲＮＡ分子としてのまたはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰとしてのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への送達によって、ＰＤＣＤ１遺伝子座をターゲティングする
ＲＮＡ分子としてのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への送達
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＰＤＣＤ１遺伝子座に対して設計されたターゲティングドメイン
2019517788.tif 000157
があるＳ．ピオゲネスＣａｓ９およびａｇＲＮＡが、電気穿孔を通じてＲＮＡ分子としてＴ細胞に送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方が、Ｔ７ポリメラーゼを使用してインビトロ転写された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時に双方のＲＮＡ種に付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞修飾を生成するために、ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000158
がある１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１０μｇのｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞に導入された。電気穿孔に先だって、Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ  １６４０中で培養された。２４、４８、および７２時間目に、ゲノムＤＮＡが単離されて、ＰＤＣＤ１遺伝子座においてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２２）。
【０９３０】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000159
があるＰＤＣＤ１遺伝子座に対してＳ．ピオゲネスＣａｓ９およびｇＲＮＡが設計されて、電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加されたブレインハートインフュージョンブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存された。
【０９３１】
細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次にＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【０９３２】
ターゲティングドメイン
2019517788.tif 000160
があるｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。細胞への導入前に、精製Ｃａｓ９とｇＲＮＡを混合して、１０分間にわたり複合体を形成させた。ＲＮＰ溶液は、引き続いて電気穿孔によってＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内に導入された。電気穿孔の前後に、細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。２４、４８、および７２時間目に、ゲノムＤＮＡが単離されて、ＰＤＣＤ１遺伝子座においてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２２）。
【０９３３】
実施例１３：Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９タンパク質の精製
Ｃａｓ９を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、精製した。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドをＲｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換し、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種し、３７℃で一晩培養した。適切な抗生物質が添加されたブレインハートインフュージョンブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーを接種して、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７°Ｃで培養した。一晩の培養後、スタータ培養を、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加して、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養した。温度を徐々に１８℃に低下させ、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現を誘導した。誘導を一晩継続し、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存した。
【０９３４】
細胞を冷凍懸濁液の解凍によって溶解し、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物を遠心分離を通じて清澄化し、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物を捕捉した。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次に、ＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質を溶出した。Ｎｉ溶出剤を等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈し、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）に装入し、ＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への３０カラム容積勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分を貯留し、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮した。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイし、適切に貯留して、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アリコートを−８０℃で保存した。
【０９３５】
実施例１４：ｇＲＮＡのインビトロ転写
修飾Ｔ７プロモーターをコードするＤＮＡ鋳型、ｇＲＮＡ標的配列、およびキメラＳ．ピオゲネスｇＲＮＡスキャフォールドをＰＣＲによってアセンブルした。ＰＣＲに使用した５’センスプライマーは、修飾Ｔ７プロモーター、ｇＲＮＡ標的配列（所望の標的部位に基づいて各ｇＲＮＡについて修飾されている）、およびＳ．ピオゲネスｇＲＮＡ  ｔｒａｃｒ配列の５’末端からの配列からなった
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。３’アンチセンスプライマー
2019517788.tif 000162
は、Ｓ．ピオゲネスｇＲＮＡ  ｔｒａｃｒ配列の３’末端の逆相補体であった。ＰＣＲ反応のＤＮＡ鋳型は、Ｓ．ピオゲネスｇＲＮＡ  ｔｒａｃｒ配列を含有するプラスミドであった。したがって、標的特異的ｇＲＮＡのインビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型として使用された増幅されたＰＣＲ産物は、以下をコードした：修飾Ｔ７プロモーター−ｇＲＮＡ標的配列−Ｓ．ピオゲネスキメラｇＲＮＡスキャフォールド（すなわち、修飾Ｔ７プロモーターと、それに続くｇＲＮＡ）。
【０９３６】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためにＧを必要とすることを所与として、Ｔ７プロモーターは、典型的にはプロモーターの下流の全ＲＮＡ配列の転写を確実にするために、その３’末端に２つのＧを有する。しかし、結果は、生成された転写物が、プロモーター配列のＧの双方でないとしても少なくとも１つを含有してもよいことであり、これは、ｇＲＮＡ特異性、またはｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質間の相互作用を変化させてもよい。ｇＲＮＡ標的配列がＧから開始する場合のこの問題に対処するために、修飾Ｔ７プロモーター配列
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を含む５’センスプライマーを使用して、ｇＲＮＡ  ＰＣＲ鋳型中のＴ７プロモーター配列
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から、２つのＧＧを除去した。Ｇから開始しないｇＲＮＡ標的配列では、修飾Ｔ７プロモーター配列
2019517788.tif 000165
を含む５’センスプライマーを使用して、Ｔ７プロモーターの３’末端のＧの１つのみが除去されるように、ｇＲＮＡ  ＰＣＲ鋳型中でコードされるＴ７プロモーター配列を修飾した。ｇＲＮＡは、Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）Ｔ７  Ｕｌｔｒａ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって生成した。実施例１０では、インビトロ転写プロセスにおいてｇＲＮＡの５’末端にＡＲＣＡキャップが付加され、ポリＡテールｇＲＮＡ配列を末端に付加するＥ−ＰＡＰによる処理がそれに続いたので、実施例１０で使用された全てのｇＲＮＡは、５’末端がＡＲＣＡキャップで修飾され、３’末端がポリＡテールで修飾された。実施例１１〜１３に記載される全ての実験について、ｇＲＮＡは、修飾Ｔ７プロモーターと、ｇＲＮＡと、ｇＲＮＡの３’側のポリＡテール（２０Ａ）とをコードする、ｇＲＮＡ  ＰＣＲ鋳型から、インビトロ転写された。ＡＲＣＡキャップは、インビトロ転写プロセスにおいてｇＲＮＡの５’末端に付加され、したがって、実施例１１〜１３における全てのｇＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップによって５’末端で、ポリＡテールによって３’末端で修飾された）。
【０９３７】
修飾Ｔ７プロモーター配列は、本明細書に記載の配列に限定されない。例えば、Ｔ７プロモーター配列（およびその修飾）は、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ（ウェブサイトアドレスｈｔｔｐ：／／ａｄｄｒｅｓｓ：ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７）の「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７」で言及される配列の少なくともいずれかであり得る。本開示は、３’末端Ｇの１つまたは複数が除去されている（例えば、配列
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がその５’末端にＧを欠く標的配列のすぐ上流に位置する、または配列
2019517788.tif 000167
がその５’末端にＧを有する標的配列のすぐ上流に位置する箇所で）、本明細書に記載されるような修飾Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって、本発明のｇＲＮＡが調製される方法を包含するものと理解される。これらの修飾Ｔ７プロモーターのその他の変種は、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ（その内容全体が参照により本明細書に援用される、ウェブサイトアドレスｈｔｔｐ：／／ａｄｄｒｅｓｓ：ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７）の「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７」で言及される配列の少なくともいずれかを含むその他のＴ７プロモーター配列に基づいて、当業者に認識されるであろう。
【０９３８】
実施例１５：ＰＤＣＤ１ターゲティングｇＲＮＡ対の同定
高い割合のＰＤＣＤ１陰性Ｔ細胞を作製するために、Ｓ．ピオゲネスニッカーゼを使用し得るかどうかを評価するために、実施例８の方法に従って、Ｄ１０ＡおよびＮ８６３Ａニッカーゼの双方を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した。ソフトウェアツールを用いてＰＤＣＤ１  ｇＲＮＡを同定し、ＰＤＣＤ１の遺伝子座にマッピングした。１）２つのｇＲＮＡのＰＡＭ配列が外向きである；および２）予測切断部位（ＰＡＭから４ｂｐ離れた）間の距離が３０ｂｐを超えて９０ｂｐ未満である、の２つの主要な基準に基づいて、ｇＲＮＡ対をさらなる評価のために選択した。実施例９に記載のように、Ｔ７−ベースのインビトロ転写反応を用いて、選択されたｇＲＮＡを作製した。各ｇＲＮＡは、Ｄ１０ＡニッカーゼまたはＮ８６３Ａニッカーゼのどちらかと複合体形成させた。ＤＳＦを用いて複合体形成が完了したことを検証した後（本明細書のセクションＩＶの方法を参照されたい）、列挙された対に対応する２つの適切なＲＮＰを１：１の比で合わせ、１μｇの総ＲＮＰ／１００，０００細胞の用量で、細胞に電気穿孔した。９６ウェル構成（二連）で、ＲＮＰを２５０，０００個の活性化ＣＤ４Ｔ細胞に電気穿孔し、引き続いてＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地中で培養した。３日間の培養後に、細胞をＰＭＡ／ＩＯで２４時間活性化し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＰＤＣＤ１抗体を使用してフローサイトメトリーによって、ＰＤＣＤ１発現を評価した。ＰＤＣＤ１陰性細胞の百分率は、図３１にプロットされる。いくつかのＤ１０Ａニッカーゼ対の送達が、＞９０％のＰＤＣＤ１陰性細胞をもたらした一方で、同一ｇＲＮＡ対は、Ｎ８６３Ａニッカーゼと複合体形成した際に、より低いが検出可能なレベルのＰＤＣＤ１ノックアウトを生じた。単一のニッカーゼＲＮＰが、ＰＤＣＤ１発現の無視できる損失をもたらした一方で、野生型Ｓ．ピオゲネスと複合体形成した単一のｇＲＮＡは、予測されたように高レベルのノックアウトをもたらした。表８０００Ａおよび８０００Ｂは、各ｇＲＮＡ対について使用されたターゲティングドメインの詳細を提供する。
【０９３９】
（表８０００Ａ）
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【０９４０】
（表８０００Ｂ）
2019517788.tif 000169
【０９４１】
実施例１６：Ｎａｌｍ−６播種性腫瘍モデルにおけるＰＤＣＤ１欠失ＣＡＲ発現Ｔ細胞のインビボ活性の評価
ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＮａｌｍ−６腫瘍株細胞をＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ｇｃ−／−（ＮＳＧ）マウスに注射することにより、播種性腫瘍異種移植マウスモデルを作製した。具体的には、０日目に、マウスに、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＮａｌｍ６ヒトＢ細胞前駆体白血病細胞株の５×１０５個の細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼ（Ｎａｌｍ６−ＰＤ−Ｌ１−ｆｆｌｕｃ−ＧＦＰ）で形質移入した。４日間にわたり腫瘍を生着させ、生物発光イメージングを用いて検証した。４日目に、８つの各試験群のマウスに、処置を施さず、または以下のような様々な用量／タイプのうちの１つで、（本質的に実施例４に記載されたように作製された）操作された細胞の単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射を実施した。（１）細胞投与なし（腫瘍単独）；（２）モック対照ベクターで形質導入された１×１０６個のＡＡＶＳ１欠失Ｔ細胞；（３）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を発現する５×１０５個のＡＡＶＳ１欠失細胞；（４）１×１０６個のＡＡＶＳ１欠失抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞；（５）モック対照ベクターで形質導入された１×１０６個のＰＤＣＤ１欠失Ｔ細胞；（６）５×１０５個のＰＤＣＤ１欠失抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞；（７）１×１０６個のＰＤＣＤ１欠失抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞；および（８）モック電気穿孔対照を受けた１×１０６個の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞。
【０９４２】
Ａ．抗腫瘍活性
処置に続いて、経時的な腫瘍増殖を生物発光イメージングによってモニターし、平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を、およそ５〜７日毎に２８日目まで測定した。生物発光イメージングのために、マウスに、ＰＢＳ（１５μｇ／ｇ体重）に再懸濁したルシフェリン基質（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）の腹腔内（腹腔内）注射を実施した。図３２に示されるように、対照マウス（腫瘍単独、およびモック対照−形質導入ＡＡＶＳ１欠損Ｔ細胞またはモック対照−形質導入ＰＤＣＤ１欠損Ｔ細胞で処置されたもの）における腫瘍は、試験の過程にわたって増殖し続けた。比較すると、様々な用量でＰＤＣＤ１欠失抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞投与されたマウスは、試験された治療後の全ての時点で、平均放射輝度の低下を示した。その結果、ＰＤＣＤ１欠失ＣＡＲ＋Ｔ細胞はマウスがんモデルにおいて腫瘍増殖を抑制でき、ＰＤＣＤ１欠失はＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を損なわないことが示された。
【０９４３】
Ｂ．インビボにおけるＰＤＣＤ１ノックアウト細胞の拡張および持続性
骨髄サンプルを第１のサテライト群および対照群のマウスから得た）を分析して、投与されたＰＤＣＤ１欠失細胞のインビボ拡張および持続性を評価した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞絶対数（図３３Ａおよび３３Ｂ）、およびＰＤ１＋Ｔ細胞絶対数（図３４Ａ、３４Ｂ、および３４Ｃ）をフローサイトメトリーによって決定した。
【０９４４】
９日目における骨髄中の循環するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の数の結果は、それぞれ図３３Ａおよび図３３Ｂに示される。結果は、ＰＤＣＤ１欠失ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＡＲ＋対照（ＡＡＶＳ１欠失およびモック電気穿孔）細胞と比較して同様の速度で、投与後のマウスモデルにおいて拡大および持続したことを示した。９日目に骨髄中で観察されたＰＤ１＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋）の数が、それぞれ図３４Ａ、３４Ｂ、および３４Ｃに示される。結果は、ＣＡＲターゲティング抗原を発現しインビボ増殖する腫瘍を有する動物への投与後に、ＰＤＣＤ１のＰＤＣＤ１欠失がＣＡＲ＋細胞で保持され、投与に続いてインビボでＰＤ−１ノックアウトＣＡＲ＋Ｔ細胞が持続するという結論と一致した。
【０９４５】
実施例１７：Ａ５４９皮下腫瘍モデルにおけるＰＤＣＤ１欠失ＣＡＲ発現Ｔ細胞のインビボ活性の評価
高レベルのヒトＣＤ１９を発現するように操作されたＡ５４９肺腺がん細胞をＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ｇｃ−／−（ＮＳＧ）マウスに注射することによって、皮下腫瘍異種移植マウスモデルを作製した。この研究では、異種移植モデルにおけるこれらの細胞中のヒトＣＤ１９の過剰発現は、固形腫瘍の状況におけるＣＤ１９特異的ＰＤＣＤ１  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の評価を可能にした。さらに、Ａ５４９肺腺がん細胞が、インターフェロンγ刺激に応答してＰＤ−Ｌ１を上方制御し得るという別の観察に基づいて、モデルは、ＩＦＮ−γに応答してＰＤ−Ｌ１を発現してもよい、腫瘍環境におけるＣＤ１９特異的ＰＤＣＤ１  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の評価を可能にした。０日目に、Ａ５４９−ｈｕＣＤ１９ｈｉ細胞を免疫不全ＮＳＧマウスに皮下移植した。
【０９４６】
インビトロ実験は、ＣＤ１９標的抗原との相互作用に際して、Ｔ細胞陰性調節分子ＰＤ−１が、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞をはじめとするＣＡＲ  Ｔ細胞上で、上方制御されることを実証する。ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＰＤ−１とＣＤ１９発現腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１との相互作用は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を制限し得る。腫瘍生着後、３つの異なる処理群中のマウスに、実施例４に記載のように作製された、様々な４×１０６個の抗ＣＤ１９ＣＡＲ−を発現するＴ細胞集団の単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射を実施した：（１）ＡＡＶＳ１欠損抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞；（２）ＰＤＣＤ１欠損抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞；および（３）欠失または電気穿孔を受けていない抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞。いかなる操作されたＴ細胞（腫瘍単独）も注射されなかったマウスを、陰性対照として評価した。ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の１１、１４、１９、２３、および２６日後に、腫瘍体積を測定した。結果は、図３５に示される。示されるように、各ＣＡＲ＋細胞組成物の投与は、このＣＤ１９過剰発現肺腺がんモデルにおける未処理の対照で観察されたものと比較して、腫瘍増殖を低下させることが観察された。
【０９４７】
本発明は、例えば、本発明の様々な態様を例証するために提供される特定の開示された実施形態の範囲に限定されることを意図するものではない。記載された組成物および方法に対する種々の改変は、本明細書の記載および教示から明らかになるであろう。このようなバリエーションは、本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく実施されてもよく、本開示の範囲内に入ることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ−１】
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【図２７Ａ−２】
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【図２７Ａ−３】
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【図２７Ｂ−１】
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【図２７Ｂ−２】
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【図２７Ｂ−３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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