(57)【要約】ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）とを連結することにより、代替的な構造を有する天然に存在しないヌクレアーゼを形成するための組成物が、本明細書中に開示される。これらのリンカーを含む組成物を作製および使用する方法も記載される。ＤＮＡ結合ドメイン、野生型または操作された切断ドメイン、および該ＤＮＡ結合ドメインと該切断ドメインとの間のアミノ酸リンカーを含み、該リンカーが、配列番号６〜２８１のいずれかに示されているとおりの配列を含む、融合分子。
2019503198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合ドメイン、野生型または操作された切断ドメイン、および該ＤＮＡ結合ドメインと該切断ドメインとの間のアミノ酸リンカーを含む融合分子であって、該リンカーが、配列番号６〜２８１のいずれかに示されているとおりの配列を含む、融合分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬ−エフェクタードメイン、または一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
前記リンカーが、前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端と前記切断ドメインのＣ末端との間に伸びている、請求項１または請求項２に記載の融合分子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の第１の融合分子と、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の野生型または操作された切断ドメインを含む第２の融合分子とを含む、二量体。
【請求項５】
前記第２の融合分子が、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記切断ドメインとの間のリンカーをさらに含み、該リンカーが、配列番号６〜２８１のいずれかに示されているとおりの配列を含む、請求項４に記載の二量体。
【請求項６】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、二本鎖標的ＤＮＡにおいてＤＮＡの逆鎖または同じ鎖に結合する、請求項４または請求項５に記載の二量体。
【請求項７】
標的二本鎖ＤＮＡにおいて二本鎖または一本鎖の切断部を作る、請求項４から６のいずれかに記載の二量体。
【請求項８】
前記第１および第２の融合分子の前記ＤＮＡ結合ドメインが、６〜１１塩基対だけ離れた標的部位に結合する、請求項４から７のいずれかに記載の二量体。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかに記載の融合分子または請求項４から７のいずれかに記載の二量体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれかに記載の１つもしくはそれを超える融合分子、または請求項４から７のいずれかに記載の二量体を含む、単離された細胞。
【請求項１１】
細胞内の細胞クロマチンを改変する方法であって、該方法が、
該細胞クロマチンが改変されるように請求項４から７のいずれかに記載の二量体で該細胞クロマチンを切断する工程を含み、ここで、該二量体が、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドを使用して該細胞に導入される、方法。
【請求項１２】
前記改変が、挿入および／または欠失を前記細胞クロマチンに導入する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変が、ドナー配列のインテグレーションを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれかに記載の融合分子を含むキット。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の被験体を処置する方法において使用するための請求項１から３のいずれかに記載の融合分子または請求項４から７のいずれかに記載の二量体であって、ここで、該方法が、該融合分子または二量体を該被験体の細胞に導入する工程を含み、該融合分子または二量体が、該細胞の内因性遺伝子座が改変されるように該内因性遺伝子座を切断する、融合分子または二量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月２日に出願された米国仮出願第６２／２９０，０６５号の利益を請求し、その開示は、その全体が参照として本明細書により援用される。
【０００２】
連邦支援の研究によってなされた発明に対する権利に関する声明
該当なし。
【背景技術】
【０００３】
技術分野
本開示は、ゲノム編集およびタンパク質工学の分野におけるものである。
【０００４】
背景
人工ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「一本鎖ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび／またはＡｒｇｏｎａｕｔｅシステムに基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来し、「ＴｔＡｇｏ」として知られるもの（Ｓｗａｒｔｓら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９１）：２５８−２６１）は、切断ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ヌクレオチドまたはポリペプチド）を含み、ゲノム配列の標的化変更に使用されている。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、外因性配列を挿入するため、１つまたはそれを超える内因性遺伝子を不活性化するため、遺伝子発現パターンが変更された生物（例えば、作物）および細胞株を作製するためなどに使用されている。例えば、９，２５５，２５０；９，０４５，７６３；９，００５，９７３；８，９５６，８２８；８，９４５，８６８；８，７０３，４８９；８，５８６，５２６；６，５３４，２６１；６，５９９，６９２；６，５０３，７１７；６，６８９，５５８；７，０６７，３１７；７，２６２，０５４；７，８８８，１２１；７，９７２，８５４；７，９１４，７９６；７，９５１，９２５；８，１１０，３７９；８，４０９，８６１；米国特許公開２００３０２３２４１０；同２００５０２０８４８９；同２００５００２６１５７；同２００５００６４４７４；同２００６００６３２３１；同２００８０１５９９９６；同２０１０００２１８２６４；同２０１２００１７２９０；同２０１１０２６５１９８；同２０１３０１３７１０４；同２０１３０１２２５９１；同２０１３０１７７９８３および同２０１３０１７７９６０および同２０１５００５６７０５を参照のこと。例えば、ゲノム配列を切断するためにヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ）の対が、使用され得る。その対の各メンバーは、通常、ヌクレアーゼの１つまたはそれを超える切断ドメイン（またはハーフドメイン）に連結された操作された（天然に存在しない）ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ＤＮＡ結合タンパク質が、それらの標的部位に結合するとき、それらのＤＮＡ結合タンパク質に連結された切断ドメインは、二量体化およびその後のゲノムの切断が生じることができるように、通常、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮの対の間に置かれる。
ヌクレアーゼ対の切断活性は、ジンクフィンガーと切断ドメインとをつないでいるリンカー（「ＺＣ」リンカー）の長さ、アミノ酸組成および標的部位（結合部位）間の距離（ギャップ）に関係することが示された。例えば、米国特許第９，３９４，５３１号；同第８，７７２，４５３号；同第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号；Ｓｍｉｔｈら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９；Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７；米国公開第２０１５００６４７８９号を参照のこと。ヌクレアーゼ融合タンパク質の対を使用すると、その融合タンパク質に対する結合部位が（各結合部位の近傍端から計測して）５または６ヌクレオチド離れて配置されているとき、現在利用可能なＺＣリンカーおよび切断ハーフドメインで最適な切断が得られた。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号を参照のこと。米国特許公開２００９０３０５４１９および同２０１５００６４７８９には、種々のリンカー配列（種々のギャップ間隔に関して）を使用し、および／またはＦｏｋＩ切断ドメインのＮ末端残基を修飾することによるＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの連結が記載されている。
しかしながら、人工ヌクレアーゼが、代替的な構成で、かつ結合部位が６、７、８塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れている内因性ゲノム配列を切断し得る、標的化された改変を可能にする方法および組成物がなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書
【特許文献１５】米国特許第９，３９４，５３１号明細書
【特許文献１６】米国特許第８，７７２，４５３号明細書
【特許文献１７】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献１８】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１５／００６４７８９号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００９／０３０５４１９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｗａｒｔｓら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９１）：２５８−２６１
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９
【非特許文献３】Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより、ヌクレアーゼ、例えば、従来のリンカー（テール・トゥ・テール構成を使用するもの）と比べて同じかまたは変更された標的部位構造（構成）および／または間隙（ギャップ）の優先度を有するヌクレアーゼを形成するための組成物が、本明細書中に開示され、この構成としては、ヘッド・トゥ・テール構成（この構成では、二量体のＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡの同じ鎖に結合する）、ヘッド・トゥ・ヘッド構成（この構成では、ＤＮＡ結合ドメインが、切断ドメインのＮ末端に作動可能に連結している）、ならびに対称および非対称のテール・トゥ・テール構成が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡの標的化された切断に使用するための、これらのリンカーを含む融合分子、ならびにこれらの融合分子の二量体も記載される。本開示は、細胞内において、細胞クロマチンを目的の領域において標的化切断するためおよび／または目的の所定領域における相同組換えのためにこれらの融合分子およびその組成物を使用する方法も提供する。
【０００８】
したがって、１つの態様において、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬ−エフェクタードメイン、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの一本鎖ガイド（ｓｇ：ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ）を、ヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、野生型または操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン）などの機能的ドメインに連結するのに使用するためのアミノ酸配列が、本明細書中に記載される。リンカーは、任意のＤＮＡ結合ドメインを機能的ドメイン（例えば、切断ドメイン）に連結するために使用される。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）のＮ末端もしくはＣ末端から、またはポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）の５’末端もしくは３’末端から伸びている。ある特定の実施形態において、そのアミノ酸リンカー配列は、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかの最後の残基と切断ドメインのＮ末端またはＣ末端との間に伸びている。他の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、ポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）の任意の部分と会合する。リンカーは、任意の長さ、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７残基長またはそれより長い残基長を含め、４〜２２アミノ酸長であり得る。他の実施形態において、リンカーは、図４、５、６、７、８、９、１１、または１９に示されているとおりの任意のリンカー（配列番号６〜２８１）を含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、図１１または図１９Ｂに示されているとおりのリンカーを含む。さらに、リンカーは、５、６、７、８、９、１０、１１塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れている対になった標的部位に使用されてもよい。
【０００９】
なおもさらなる態様において、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）、機能ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ、Ｃａｓヌクレアーゼなど）を含み、ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間の（それらを連結する）本明細書中に記載されるようなリンカーも含む融合分子が、本明細書中に記載される。ある特定の実施形態において、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、切断ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間のリンカーを含み、該リンカーは、配列番号６〜２８１のいずれかに示されているとおりの配列を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態において、リンカーは、図１１または図１９Ｂに示されているとおりのリンカーを含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態において、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）、およびＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端にあるＦｏｋＩ切断ドメインを含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端と切断ドメインのＣ末端との間に伸びている。ヌクレアーゼ切断ドメインは、１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換を含む任意の方法で改変され得る。融合分子のいずれも、野生型または操作された切断ドメインを含むことができ、操作された切断ドメインは、ヘテロ二量体のみが形成されるような、二量体形成面に対する１つまたはそれを超える改変、および／またはヌクレアーゼが一本鎖切断部を作るという点でニッカーゼであるような、触媒ドメインに対する１つまたはそれを超える改変を有する切断ドメインを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、切断ドメインは、切断ハーフドメインであり得る。
【００１０】
別の態様において、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む第１の融合分子と、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の野生型または操作された切断ドメインを含む第２の融合分子とを含む、二量体が、本明細書中に記載される。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの融合分子は、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。他の実施形態において、両方の融合分子が、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。なおもさらなる実施形態において、その二量体のＤＮＡ結合ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６（またはそれを超える）塩基対、好ましくは、６〜１１塩基対だけ離れた配列（例えば、二本鎖ＤＮＡ内）を標的化する。重要なことに、本明細書中に記載されるリンカーは、構成要素が従来のテール・トゥ・テール構造で（対称または非対称のいずれかのリンカーを使用して）向かい合ったＤＮＡ鎖に結合するとき、および／または構成要素が同じＤＮＡ鎖に結合するとき（ヘッド・トゥ・テール）もしくは代替的な（例えば、ヘッド・トゥ・ヘッド）構造で向かい合ったＤＮＡ鎖に結合するときに、二量体の形成を可能にする。したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインが新しいヘッド・トゥ・ヘッドまたはヘッド・トゥ・テール構造またはテール・トゥ・テール構造にある（任意のＤＮＡ結合ドメインを有する）二量体をもたらす。例えば、図１Ｂ、１Ｃ、および図１９Ｂを参照のこと。ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、およびｓｇＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意のＤＮＡ結合ドメインを使用して、これらの構造を用いることができる。したがって、本明細書中に記載される任意の二量体は、二本鎖標的ＤＮＡにおいてＤＮＡの逆鎖または同じ鎖に結合してもよく、標的二本鎖ＤＮＡにおいて二本鎖または一本鎖の切断部を作ってもよい。
【００１１】
別の態様において、本明細書中に記載されるような任意のリンカーまたは融合分子（またはそれらの構成要素）をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、それらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
【００１２】
なおも別の態様において、本明細書中に記載されるような任意のポリペプチド（例えば、融合分子）および／またはポリヌクレオチドを含む細胞もまた、提供される。１つの実施形態において、それらの細胞は、各々が本明細書中に開示されるようなリンカー（および／または切断ドメイン）を含む融合分子対を含む。
【００１３】
なおも別の態様において、細胞クロマチンをゲノムの目的の領域において標的化切断するための方法；細胞内において相同組換えを生じさせる方法；感染を処置する方法；および／または疾患を処置する方法が提供される。それらの方法は、融合分子対を発現させることによって細胞内において細胞クロマチンを目的の所定領域において切断する工程を含み、その融合分子のうちの少なくとも１つは、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。ある特定の実施形態において、一方の融合ポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなリンカーを含み、他の実施形態では、両方の融合分子が、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。さらに、本明細書中に記載される任意の方法において、融合ポリペプチド対は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する結合部位が、５、６、７、８、９、１０、１１塩基対またはそれさえも超える塩基対だけ離れているとき、標的化された領域を切断する。ある特定の実施形態において、その対の各メンバーは、ＤＮＡの同じ鎖に結合する。他の実施形態において、その対の各メンバーは、向かい合ったＤＮＡ鎖にヘッド・トゥ・ヘッドまたはテール・トゥ・テール構造で結合する。標的化された切断は、ドナー（例えば、トランスジーン）配列のインテグレーションを含む、挿入および／または欠失によるもの（非相同および／または相同の修復機構によるもの）を含む、標的ＤＮＡの改変をもたらし得る。
【００１４】
本明細書中に記載されるようなリンカーは、細胞内において、細胞クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法および／または目的の所定領域における相同組換えのための方法において使用され得る。細胞には、培養細胞、生物の中の細胞、ならびにそれらの細胞および／またはそれらの子孫が処置後に生物に戻される場合に処置のために生物から取り出された細胞が含まれる。細胞クロマチンにおける目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部であり得る。
【００１５】
融合分子は、細胞内において、例えば、その融合分子（またはその成分）をその細胞に送達することによって、またはその融合分子をコードするポリヌクレオチドをその細胞に送達することによって発現され得、ここで、そのポリヌクレオチドは、ＤＮＡである場合、転写され、細胞に送達されるＲＮＡ分子または細胞に送達されるＤＮＡ分子の転写物は、翻訳されることにより、融合タンパク質が生成される。細胞にポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するための方法は、本開示の他の箇所に提示される。
【００１６】
したがって、別の態様において、細胞クロマチンを目的の領域において切断するための方法は、（ａ）その目的の領域において第１の配列を選択する工程；（ｂ）第１のＤＮＡ結合ドメインを第１の配列に結合するように操作する工程；（ｃ）その細胞内で第１の融合分子を発現させる工程（第１の融合分子は、第１のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）および切断ドメイン（またはハーフドメイン）を含む）；および（ｄ）その細胞内で第２の融合分子を発現させる工程（第２の融合分子は、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の切断ドメイン（またはハーフドメイン）を含む）を含み得、ここで、それらの融合分子のうちの少なくとも１つは、本明細書中に記載されるようなリンカーを含み、さらに、細胞クロマチンが目的の領域において切断されるように、第１の融合分子は、第１の配列に結合し、第２の融合分子は、第１の配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する第２の配列に結合する。ある特定の実施形態において、両方の融合分子が、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。
【００１７】
他の実施形態において、本開示は、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼが、細胞の細胞クロマチンを標的化し、切断するように、本明細書中に記載されるようなリンカーを含むそれらのヌクレアーゼをその細胞に導入することによって細胞クロマチンを切断する方法を提供する。そのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴｔＡｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムまたはそれらの組み合わせを含み得る。そのヌクレアーゼは、任意の形態で、例えば、タンパク質の形態で、ｍＲＮＡの形態で、またはウイルス（ＡＡＶ、ＩＤＬＶなど）ベクターもしくは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）上に保持された状態で、細胞に導入され得る。ある特定の実施形態において、上記方法は、（ａ）目的の領域において第１および第２の配列を選択する工程（ここで、その第１および第２の配列は、２〜５０ヌクレオチド離れている）；（ｂ）第１のＤＮＡ結合ドメインを第１の配列に結合するように操作する工程；（ｃ）第２のＤＮＡ結合ドメインを第２の配列に結合するように操作する工程；（ｄ）細胞内で第１の融合分子を発現させる工程（第１の融合分子は、第１の操作されたＤＮＡ結合ドメイン、本明細書中に記載されるような第１のリンカーおよび第１の切断ドメイン（またはハーフドメイン）を含む）；（ｅ）細胞内で第２の融合分子を発現させる工程（第２の融合分子は、第２の操作されたＤＮＡ結合ドメイン、第２のリンカーおよび第２の切断ハーフドメインを含む）を含み；ここで、その第１の融合分子は、第１の配列に結合し、第２の分子は、第２の配列に結合し、それにより、目的の領域において細胞クロマチンが切断される。ある特定の実施形態において、第１および第２の融合分子は、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。
【００１８】
細胞クロマチンの領域を変更する方法、例えば、標的化変異を導入する方法もまた提供される。ある特定の実施形態において、細胞クロマチンを変化させる方法は、細胞クロマチン内の所定の部位において二本鎖断裂をもたらす１つまたはそれを超える標的化ヌクレアーゼ、およびその断裂の領域内の細胞クロマチンのヌクレオチド配列に対して相同性を有するドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入する工程を含む。細胞のＤＮＡ修復プロセスは、二本鎖断裂の存在によって活性化され、ドナーポリヌクレオチドは、その断裂の修復のための鋳型として使用され、その結果、細胞クロマチンの中にドナーのヌクレオチド配列の全部または一部が導入される。したがって、細胞クロマチン内の配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。
【００１９】
標的化された変更としては、点変異（すなわち、単一の塩基対を異なる塩基対に変換すること）、置換（すなわち、複数の塩基対を長さが同一の異なる配列に変換すること）、１つまたはそれを超える塩基対の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｏｒ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）、１つまたはそれを超える塩基対の欠失および上述の配列の変更の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖状または環状であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、１つもしくはそれを超える送達物質（例えば、リポソーム、ポロキサマー）との複合体として、またはウイルス送達ビヒクル、例えば、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内に含められた状態で、細胞に送達され得る。ドナー配列は、１０〜１，０００ヌクレオチド（またはそれらの間の任意の整数値のヌクレオチド）またはそれより長い長さの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ドナーは、標的化切断部位と相同な領域に隣接する完全長の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ドナーは、相同領域を欠き、相同性非依存的機構（すなわち、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座にインテグレートされる。他の実施形態において、ドナーは、細胞において使用するため（すなわち、遺伝子修正のため）の相同領域に隣接するより小さい核酸断片を含む。いくつかの実施形態において、ドナーは、機能的な構成要素または構造上の構成要素（例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなど）をコードする遺伝子を含む。他の実施形態において、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／または目的の遺伝子の発現を調節する制御エレメントをコードする配列を含む。他の実施形態において、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／または目的の遺伝子の発現を調節する目的の制御タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＴＦ、ＴＡＬＥ  ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＴＦ）である。
【００２１】
ある特定の実施形態において、相同組換えの頻度は、細胞を細胞周期のＧ２期で停止することによって、および／または相同組換えに関わる１つもしくはそれを超える分子（タンパク質、ＲＮＡ）の発現を活性化することによって、および／または非相同末端結合に関わるタンパク質の発現もしくは活性を阻害することによって、高められ得る。
【００２２】
ヌクレアーゼ対を使用する本明細書中に記載される任意の方法において、そのヌクレアーゼ対の第１および第２のヌクレアーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れた標的部位に結合し得る。ある特定の実施形態において、対になった標的部位の標的部位は、６、７、８、９または１０塩基対離れている。さらに、それらの任意の方法において、第２のジンクフィンガー結合ドメインは、第２の配列に結合するように操作され得る。
【００２３】
さらに、本明細書中に記載される任意の方法において、融合分子は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００２４】
上述の任意の方法の場合において、細胞クロマチンは、染色体、エピソームまたはオルガネラゲノムの中に存在し得る。細胞クロマチンは、原核細胞および真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞およびヒト細胞を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの細胞に存在し得る。
【００２５】
別の態様において、本明細書中に記載されるようなリンカーまたは本明細書中に記載されるようなリンカーをコードするポリヌクレオチド；補助的な試薬；ならびに必要に応じて指示書および好適な容器を含むキットが、本明細書中に記載される。そのキットは、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドも含み得る。
【００２６】
本明細書中に記載されるいずれのタンパク質、方法およびキットにおいても、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）は、タイプＩＩＳ切断ドメイン、例えば、ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインを含み得る。
【００２７】
これらの態様および他の態様は、概して、開示に照らすと当業者には容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、ヌクレアーゼデザインの例示的な構成を表す。図１Ａは、現在使用されている代表的な構成を示す。図１Ｂは、ヘッド・トゥ・テール構成を示す。図１Ｃは、ヘッド・トゥ・ヘッド構成を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、ヌクレアーゼデザインの例示的な構成を表す。図１Ａは、現在使用されている代表的な構成を示す。図１Ｂは、ヘッド・トゥ・テール構成を示す。図１Ｃは、ヘッド・トゥ・ヘッド構成を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、ヌクレアーゼデザインの例示的な構成を表す。図１Ａは、現在使用されている代表的な構成を示す。図１Ｂは、ヘッド・トゥ・テール構成を示す。図１Ｃは、ヘッド・トゥ・ヘッド構成を示す。
【００２９】
【図２】図２は、選択に使用されるＦｏｋＩ−ＺＦＰリンカーライブラリーのデザインを表す。長さおよび組成の両方がランダム化されたリンカーを、Ｎ末端ＦｏｋＩドメイン（配列番号１）とＣ末端ＺＦＰドメイン（例示的な配列は配列番号２〜５に示されている）との間にクローニングした。
【００３０】
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｆは、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のスクリーニング手順を使用したｃｃｄＢの誘導を表す。簡潔には、示された間隔（indicated  spacing）だけ離れた標的部位を含むｃｃｄＢプラスミドと、一定のパートナーであるＺＦＮとを保有する細菌細胞を、Ｎ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にリンカーライブラリーを含む第２のＺＦＮで形質転換した。ＺＦＮ発現を誘導し、続いてｃｃｄＢトキシンを誘導した。細胞を一晩にわたってインキュベートし、サンプルをＬＢ、アンピシリン／スペクチノマイシン（Ａ／Ｓ）、およびカナマイシン（Ｋａｎ）のプレートに播種した。選択されたリンカーを新たなベクターにサブクローニングし、選択を９ラウンド繰り返した。各グラフの左のバーは、ＬＢプレート上の細胞数を示す。中央のバーは、Ａ／Ｓプレート上の細胞数を示し、左のバーは、Ｋａｎプレート上の細胞数を示す。図３Ａは、標的部位間の６塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｂは、標的部位間の７塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｃは、標的部位間の８塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｄは、標的部位間の９塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｅは、標的部位間の１０塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｆは、標的部位間の１１塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｆは、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のスクリーニング手順を使用したｃｃｄＢの誘導を表す。簡潔には、示された間隔（indicated  spacing）だけ離れた標的部位を含むｃｃｄＢプラスミドと、一定のパートナーであるＺＦＮとを保有する細菌細胞を、Ｎ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にリンカーライブラリーを含む第２のＺＦＮで形質転換した。ＺＦＮ発現を誘導し、続いてｃｃｄＢトキシンを誘導した。細胞を一晩にわたってインキュベートし、サンプルをＬＢ、アンピシリン／スペクチノマイシン（Ａ／Ｓ）、およびカナマイシン（Ｋａｎ）のプレートに播種した。選択されたリンカーを新たなベクターにサブクローニングし、選択を９ラウンド繰り返した。各グラフの左のバーは、ＬＢプレート上の細胞数を示す。中央のバーは、Ａ／Ｓプレート上の細胞数を示し、左のバーは、Ｋａｎプレート上の細胞数を示す。図３Ａは、標的部位間の６塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｂは、標的部位間の７塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｃは、標的部位間の８塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｄは、標的部位間の９塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｅは、標的部位間の１０塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｆは、標的部位間の１１塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｆは、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のスクリーニング手順を使用したｃｃｄＢの誘導を表す。簡潔には、示された間隔（indicated  spacing）だけ離れた標的部位を含むｃｃｄＢプラスミドと、一定のパートナーであるＺＦＮとを保有する細菌細胞を、Ｎ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にリンカーライブラリーを含む第２のＺＦＮで形質転換した。ＺＦＮ発現を誘導し、続いてｃｃｄＢトキシンを誘導した。細胞を一晩にわたってインキュベートし、サンプルをＬＢ、アンピシリン／スペクチノマイシン（Ａ／Ｓ）、およびカナマイシン（Ｋａｎ）のプレートに播種した。選択されたリンカーを新たなベクターにサブクローニングし、選択を９ラウンド繰り返した。各グラフの左のバーは、ＬＢプレート上の細胞数を示す。中央のバーは、Ａ／Ｓプレート上の細胞数を示し、左のバーは、Ｋａｎプレート上の細胞数を示す。図３Ａは、標的部位間の６塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｂは、標的部位間の７塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｃは、標的部位間の８塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｄは、標的部位間の９塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｅは、標的部位間の１０塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｆは、標的部位間の１１塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｆは、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のスクリーニング手順を使用したｃｃｄＢの誘導を表す。簡潔には、示された間隔（indicated  spacing）だけ離れた標的部位を含むｃｃｄＢプラスミドと、一定のパートナーであるＺＦＮとを保有する細菌細胞を、Ｎ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にリンカーライブラリーを含む第２のＺＦＮで形質転換した。ＺＦＮ発現を誘導し、続いてｃｃｄＢトキシンを誘導した。細胞を一晩にわたってインキュベートし、サンプルをＬＢ、アンピシリン／スペクチノマイシン（Ａ／Ｓ）、およびカナマイシン（Ｋａｎ）のプレートに播種した。選択されたリンカーを新たなベクターにサブクローニングし、選択を９ラウンド繰り返した。各グラフの左のバーは、ＬＢプレート上の細胞数を示す。中央のバーは、Ａ／Ｓプレート上の細胞数を示し、左のバーは、Ｋａｎプレート上の細胞数を示す。図３Ａは、標的部位間の６塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｂは、標的部位間の７塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｃは、標的部位間の８塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｄは、標的部位間の９塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｅは、標的部位間の１０塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｆは、標的部位間の１１塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｆは、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のスクリーニング手順を使用したｃｃｄＢの誘導を表す。簡潔には、示された間隔（indicated  spacing）だけ離れた標的部位を含むｃｃｄＢプラスミドと、一定のパートナーであるＺＦＮとを保有する細菌細胞を、Ｎ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にリンカーライブラリーを含む第２のＺＦＮで形質転換した。ＺＦＮ発現を誘導し、続いてｃｃｄＢトキシンを誘導した。細胞を一晩にわたってインキュベートし、サンプルをＬＢ、アンピシリン／スペクチノマイシン（Ａ／Ｓ）、およびカナマイシン（Ｋａｎ）のプレートに播種した。選択されたリンカーを新たなベクターにサブクローニングし、選択を９ラウンド繰り返した。各グラフの左のバーは、ＬＢプレート上の細胞数を示す。中央のバーは、Ａ／Ｓプレート上の細胞数を示し、左のバーは、Ｋａｎプレート上の細胞数を示す。図３Ａは、標的部位間の６塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｂは、標的部位間の７塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｃは、標的部位間の８塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｄは、標的部位間の９塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｅは、標的部位間の１０塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｆは、標的部位間の１１塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｆは、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のスクリーニング手順を使用したｃｃｄＢの誘導を表す。簡潔には、示された間隔（indicated  spacing）だけ離れた標的部位を含むｃｃｄＢプラスミドと、一定のパートナーであるＺＦＮとを保有する細菌細胞を、Ｎ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にリンカーライブラリーを含む第２のＺＦＮで形質転換した。ＺＦＮ発現を誘導し、続いてｃｃｄＢトキシンを誘導した。細胞を一晩にわたってインキュベートし、サンプルをＬＢ、アンピシリン／スペクチノマイシン（Ａ／Ｓ）、およびカナマイシン（Ｋａｎ）のプレートに播種した。選択されたリンカーを新たなベクターにサブクローニングし、選択を９ラウンド繰り返した。各グラフの左のバーは、ＬＢプレート上の細胞数を示す。中央のバーは、Ａ／Ｓプレート上の細胞数を示し、左のバーは、Ｋａｎプレート上の細胞数を示す。図３Ａは、標的部位間の６塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｂは、標的部位間の７塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｃは、標的部位間の８塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｄは、標的部位間の９塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｅは、標的部位間の１０塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示し、図３Ｆは、標的部位間の１１塩基対間隔を使用したｃｃｄＢの誘導結果を示す。
【００３１】
【図４】図４（配列番号６〜８４）は、４〜２２アミノ酸のリンカーのライブラリーを使用する、示されているラウンド後に細菌選択から得られた例示的なリンカーを示す。
【００３２】
【図５】図５（配列番号８５〜１６１）は、７塩基対の標的間隔（target  spacing）に対して４〜２２アミノ酸のリンカーのライブラリーを使用する細菌選択から得られた例示的なリンカーを示す。
【００３３】
【図６】図６（配列番号１６２〜２２０）は、８塩基対の標的間隔に対して４〜２２アミノ酸のリンカーのライブラリーを使用する細菌選択から得られた例示的なリンカーを示す。
【００３４】
【図７】図７（配列番号２２１〜２２９）は、９塩基対の標的間隔に対して４〜２２アミノ酸のリンカーのライブラリーを使用する細菌選択から得られた例示的なリンカーを示す。
【００３５】
【図８】図８（配列番号２３０〜２５３）は、１０塩基対の標的間隔に対して４〜２２アミノ酸のリンカーのライブラリーを使用する細菌選択から得られた例示的なリンカーを示す。
【００３６】
【図９】図９は、ＣＣＲ５またはＡＡＶＳ１を標的とするヌクレアーゼ内においてインビボで試験したリンカー（上から配列番号７８、８０、６２、７１、８１、８２、８３、９、３６、１６、７２、６９、８４、５５、３７、５１、７７、４５、４０、１０、４１、４７、２４、６３、および９（６ｂｐ間隔）、ならびに上から配列番号１１４、１３８、１００、９１、１０９、１５４、１４７、１３６、８８、１６０、１４２、１６１、１３２、および９３（７ｂｐ間隔））を用いて得られた結果の概略である。６塩基対または７塩基対のいずれかの間隔でヘッド・トゥ・テールＣＣＲ５標的部位を有するようにＡＡＶＳ１遺伝子座が改変された細胞株を作製した。これらの部位における試験したリンカーについてのＮＨＥＪ活性は、「ＣＣＲ５」の欄にある。同様に、６塩基対または７塩基対のいずれかの間隔でヘッド・トゥ・テールＡＡＶＳ１標的部位を有するようにＣＣＲ５遺伝子座が改変された細胞株を作製した。これらの部位における試験したリンカーについてのＮＨＥＪ活性は、「ＡＡＶＳ１」の欄にある。網掛けの四角は、さらなる研究において使用したリンカーを示す。
【００３７】
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、示されているリンカーを用いての、示されている標的部位におけるヌクレアーゼ活性（ＮＨＥＪ活性）を示す。図９にあるように、ＡＡＶＳ１遺伝子座において示された間隔でＣＣＲ５標的部位を有する細胞株においてＣＣＲ５  ＺＦＮを試験し、その逆も同様に試験した。図１０Ａは、ＤＮＡ結合ドメインがＣＣＲ５を標的とする、６ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ｂは、ＤＮＡ結合ドメインがＡＡＶＳ１を標的とする、６ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ｃは、ＤＮＡ結合ドメインがＣＣＲ５を標的とする、７ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ｂは、ＤＮＡ結合ドメインがＡＡＶＳ１を標的とする、７ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ａおよび１０Ｃにおいて、最左のバーは、６ｂｐ間隔における活性を示し、左から２番目のバーは、７ｂｐ間隔における活性を示し、左から３番目のバーは、８ｂｐ間隔における活性を示し、中央のバーは、９ｂｐ間隔における活性を示し、右から３番目のバーは、１０ｂｐ間隔における活性を示し、右から２番目のバーは、１１ｂｐ間隔における活性を示し、最右のバーは、ＡＡＶＳ１遺伝子座における野生型ＣＣＲ５標的部位（ＡＷ）に対する活性を示す。図１０Ｂおよび１０Ｄにおいて、最左のバーは、６ｂｐ間隔における活性を示し、左から２番目のバーは、７ｂｐ間隔における活性を示し、左から３番目のバーは、８ｂｐ間隔における活性を示し、右から３番目のバーは、９ｂｐ間隔における活性を示し、右から２番目のバーは、１０ｂｐ間隔における活性を示し、最右のバーは、ＣＣＲ５遺伝子座における野生型ＡＡＶＳ１標的部位（ＣＷ）に対する活性を示す。
【図１０Ｃ−Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、示されているリンカーを用いての、示されている標的部位におけるヌクレアーゼ活性（ＮＨＥＪ活性）を示す。図９にあるように、ＡＡＶＳ１遺伝子座において示された間隔でＣＣＲ５標的部位を有する細胞株においてＣＣＲ５  ＺＦＮを試験し、その逆も同様に試験した。図１０Ａは、ＤＮＡ結合ドメインがＣＣＲ５を標的とする、６ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ｂは、ＤＮＡ結合ドメインがＡＡＶＳ１を標的とする、６ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ｃは、ＤＮＡ結合ドメインがＣＣＲ５を標的とする、７ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ｂは、ＤＮＡ結合ドメインがＡＡＶＳ１を標的とする、７ｂｐ間隔スクリーニングから選択されたリンカーを使用したヌクレアーゼ活性を示す。図１０Ａおよび１０Ｃにおいて、最左のバーは、６ｂｐ間隔における活性を示し、左から２番目のバーは、７ｂｐ間隔における活性を示し、左から３番目のバーは、８ｂｐ間隔における活性を示し、中央のバーは、９ｂｐ間隔における活性を示し、右から３番目のバーは、１０ｂｐ間隔における活性を示し、右から２番目のバーは、１１ｂｐ間隔における活性を示し、最右のバーは、ＡＡＶＳ１遺伝子座における野生型ＣＣＲ５標的部位（ＡＷ）に対する活性を示す。図１０Ｂおよび１０Ｄにおいて、最左のバーは、６ｂｐ間隔における活性を示し、左から２番目のバーは、７ｂｐ間隔における活性を示し、左から３番目のバーは、８ｂｐ間隔における活性を示し、右から３番目のバーは、９ｂｐ間隔における活性を示し、右から２番目のバーは、１０ｂｐ間隔における活性を示し、最右のバーは、ＣＣＲ５遺伝子座における野生型ＡＡＶＳ１標的部位（ＣＷ）に対する活性を示す。
【００３８】
【図１１】図１１（配列番号７８、６２、８０、８１、７１、８２、８３、および８４（６ｂｐ間隔のＬ１〜Ｌ８）ならびに８８、１０９、１１４、１００、９１、１３８、１４７、１５４（７ｂｐ間隔のＬ１〜Ｌ８））は、可搬性研究（portability  study）におけるさらなる試験のために選択されたリンカーを示す。
【００３９】
【図１２】図１２は、可搬性研究の実験設定を示す。次の構成のそれぞれにつき、１０個のＺＦＮ対をデザインした：１）テール・トゥ・テール構成、２）６塩基対間隔のヘッド・トゥ・テール構成、３）７塩基対間隔のヘッド・トゥ・テール構成、および４）８塩基対間隔のヘッド・トゥ・テール構成。二量体のＤＮＡ結合ドメインの標的部位間における７塩基対および８塩基対の両方の間隔について、一定のＺＦＮ（constant  ZFN）（ＺＦＮ＃１）における標準的リンカー（Ｌ０）との比較のために、さらなるリンカー（Ｌ７ｃ５）も試験した。ＺＦＮ＃２の６．１〜６．８は、６塩基対間隔のために選択されたリンカーＬ１〜Ｌ８を表す（図１０を参照のこと）。ＺＦＮ＃２の７．１〜７．８は、７塩基対間隔のために選択されたリンカーＬ１〜Ｌ８を表す（図１０を参照のこと）。ＺＦＮ＃２の８．１〜８．２は、８塩基対間隔のために選択されたリンカーを表す（図示せず）。
【００４０】
【図１３】図１３は、標的部位間に６塩基対の間隔をあけたヘッド・トゥ・テール構成における様々なリンカーを用いて行われた可搬性研究の結果（ＮＨＥＪ率）を示す。Ｌ０対は、テール・トゥ・テール構成を使用した対を示す。
【００４１】
【図１４】図１４は、ヌクレアーゼ二量体の標的部位間に７ｂｐ間隔をあけたヘッド・トゥ・テール構成における様々なリンカーを用いて行われた可搬性研究の結果（ＮＨＥＪ率）を示す。Ｌ０対は、テール・トゥ・テール構成を使用した対を示す。
【００４２】
【図１５】図１５は、可搬性研究からの、示されているＺＦＮ（図１１および１３を参照のこと；Ｌ７／Ｎ６ａ（配列番号８３）；Ｌ５／Ｎ６ｂ（配列番号７１）；Ｌ８／Ｎ６ｃ（配列番号８４）；Ｌ８／Ｎ７ａ（配列番号１５４）；Ｌ３／Ｎ７ｂ（配列番号１１４）；Ｌ４／Ｎ７ｃ（配列番号１００））のＮＨＥＪ活性に関する偏性ヘテロ二量体（obligate  heterodimer）ＦｏｋＩドメインの極性の比較である。いずれかの可能な配向におけるＦｏｋＩドメインを用いてＺＦＮを試験した。
【００４３】
【図１６】図１６は、テール・トゥ・テール構造（左パネル）、ヘッド・トゥ・テール６ｂｐ間隔構造（中央パネル）、およびヘッド・トゥ・テール７ｂｐ間隔構造（右パネル）における示されているリンカーを有する、ＡＡＶＳ１を標的とするヌクレアーゼのＮＨＥＪ活性の概略である。ＺＦＮは、ＡＡＶＳ１遺伝子のイントロン１内にある高感受性部位を標的とした。
【００４４】
【図１７】図１７は、テール・トゥ・テール構造（左パネル）、ヘッド・トゥ・テール６ｂｐ間隔構造（中央パネル）、およびヘッド・トゥ・テール７ｂｐ間隔構造（右パネル）における示されているリンカーを有する、ＡＡＶＳ１を標的とするヌクレアーゼのＮＨＥＪ活性の概略である。ＺＦＮは、ＡＡＶＳ１遺伝子のイントロン１から高感受性部位（図１６）を除外したものを標的とした。
【００４５】
【図１８】図１８は、ヘッド・トゥ・ヘッド構造において示された間隔をあけた、示されているリンカー（Ｎ６ａ、配列番号８３：Ｎ６ｂ、配列番号７１；Ｎ７ａ、配列番号１５４、およびＮ７ｂ、配列番号１１４）を有する、ＡＡＶＳ１を標的とするヌクレアーゼのＮＨＥＪ活性の概略である。
【００４６】
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、対称または非対称のいずれかのリンカーを使用した、テール・トゥ・テール構成におけるリンカーの選択の結果を示す。図１９Ａは、選択のための実験設定を示し、選択手順は、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載されている。図１９Ｂは、示された間隔をあけた、選択された例示的なリンカーと、示されている構造および間隔の、ＣＣＲ５遺伝子座におけるＣＣＲ５  ＺＦＮ内のこれらのリンカーのインビボ活性を示す。また、各細胞株に対するＡＡＶＳ１コントロールも示されている。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、対称または非対称のいずれかのリンカーを使用した、テール・トゥ・テール構成におけるリンカーの選択の結果を示す。図１９Ａは、選択のための実験設定を示し、選択手順は、米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載されている。図１９Ｂは、示された間隔をあけた、選択された例示的なリンカーと、示されている構造および間隔の、ＣＣＲ５遺伝子座におけるＣＣＲ５  ＺＦＮ内のこれらのリンカーのインビボ活性を示す。また、各細胞株に対するＡＡＶＳ１コントロールも示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより人工ヌクレアーゼを形成するための組成物、および例えば、標的化切断に続く非相同末端結合によって；標的化切断に続く、外因性ポリヌクレオチド（細胞のヌクレオチド配列と相同な１つまたはそれを超える領域を含む）とゲノム配列との間の相同組換えによって；１つまたはそれを超える内因性遺伝子の標的化された不活性化によって、細胞のヌクレオチド配列を標的化変更するためにこれらのヌクレアーゼを使用する方法が、本明細書中に記載される。
【００４８】
本発明は、従来の構造（図１Ａ）以外の構造でヌクレアーゼが活性であるように、切断ドメイン（またはハーフドメイン）とＤＮＡ結合ドメインとの間に配置されたタンパク質（アミノ酸）リンカーを含む。リンカーは、それがＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端とヌクレアーゼ（切断）ドメインのＮ末端またはＣ末端との間に伸びているように置かれていてもよい。したがって、本明細書中に記載されるようなリンカーは、ヘッド・トゥ・テール構成（二量体の両方のＤＮＡ結合構成要素が同じＤＮＡ鎖に結合するもの、図１Ｂ）およびヘッド・トゥ・ヘッド構造（図１Ｃ）において活性であるヌクレアーゼ二量体をもたらす。これらのリンカーと任意のＤＮＡ結合ドメインを使用して、所望の構造、例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬ−エフェクタードメイン結合タンパク質、ｓｇＲＮＡなどをもたらすことができる。
【００４９】
通則
本方法の実施、ならびに本明細書中に開示される組成物の調製および使用は、別段示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに当該分野の技術範囲内である関連分野における従来の手法を用いる。これらの手法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的な改訂版；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”  （Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。
【００５０】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、直鎖状または環状の立体配座であり、一本鎖または二本鎖の形態である、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーのことを指す。本開示の目的では、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定すると解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸の部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対形成する。
【００５１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたはそれを超えるアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５２】
「結合する」とは、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有結合性の相互作用のことを指す。その相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の構成要素のすべてが、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれより低い解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度のことを指し：高い結合親和性は、より低いＫｄと相関する。「非特異的結合」とは、標的配列に依存しない、任意の目的の分子（例えば操作されたヌクレアーゼ）と高分子（例えばＤＮＡ）との間に生じる非共有結合性の相互作用を指す。
【００５３】
「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合することのできる分子である。そのようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きなタンパク質内のドメイン、またはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、一方、他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）であり、一方、他の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）のガイドＲＮＡ構成要素である。
【００５４】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（これにより、ホモ二量体、ホモ三量体などが形成され）、かつ／またはそれは、異なるタンパク質の１つもしくはそれを超える分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多いタイプの結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００５５】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたはそれを超えるジンクフィンガーを通じて配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。
【００５６】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれを超えるＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。その反復ドメインは、その同種の標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関わる。単一の「反復単位」（「リピート」とも称される）は、代表的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照のこと。
【００５７】
ジンクフィンガードメインおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたはそれを超えるアミノ酸の変更）によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。ゆえに、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、デザインおよび選択である。デザインされたＤＮＡ結合タンパク質は、そのデザイン／組成が主に合理的な基準に由来する天然に存在しないタンパク質である。デザインに対する合理的な基準には、置換の規則ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥのデザイン（カノニカルおよび非カノニカルＲＶＤ）および結合データの情報を格納しているデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化されたアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第９，４５８，２０５号；同第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照のこと；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照のこと。
【００５８】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然では見られず、その生成が主に、実験的なプロセス（例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択）に由来する。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４および米国特許公開番号２０１１０３０１０７３を参照のこと。
【００５９】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関わると考えられている原核生物Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら、同書，Ｇ．Ｓｈｅｎｇら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２）を参照のこと。「ＴｔＡｇｏシステム」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡをはじめとした、必要とされる構成要素のすべてである。
【００６０】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の破損のことを指す。切断は、種々の方法によって惹起され得、それらの方法としては、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解が挙げられるがこれらに限定されない。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡの切断は、平滑末端または付着末端のいずれかを生成し得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【００６１】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるもの）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」および「右および左切断ハーフドメイン」は交換可能に使用され、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
【００６２】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。全体として参照により本明細書に援用される、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号ならびに米国特許公開番号２０１１０２０１０５５も参照のこと。
【００６３】
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖であり得る、任意の長さのヌクレオチド配列のことを指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列のことを指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間のもしくはそれより大きい任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。
【００６４】
「相同であるが同一でない配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、配列が第２の配列と同一でない、第１の配列のことを指す。例えば、変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、その変異遺伝子の配列と相同であるが同一でない。ある特定の実施形態において、２つの配列の間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用して、それらの間の相同組換えが可能であるのに十分な程度である。２つの相同であるが同一でない配列は、任意の長さであり得、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチドほど小さい可能性もあるし（例えば、標的化された相同組換えによるゲノムの点変異の修正の場合）、１０キロベースまたはそれを超える長さほど大きい可能性もある（例えば、染色体の中の所定の異所部位における遺伝子挿入の場合）。相同であるが同一でない配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）が、使用され得る。
【００６５】
核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を測定するための手法は、当該分野で公知である。代表的には、そのような手法は、ある遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、この形式で決定され、比較され得る。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列のそれぞれのヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸との厳密な一致のことを指す。２つまたはそれを超える配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを測定することによって比較され得る。核酸配列であってもアミノ酸配列であっても、２つの配列の同一性パーセントは、アラインメントされた２つの配列の間の厳密なマッチ数をより短い配列の長さで除算し、それに１００を乗算した値である。本明細書中に記載される配列に関して、所望の配列同一性の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％およびそれらの間の任意の整数値である。代表的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００６６】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間で安定した二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化されたフラグメントのサイズ測定によって測定され得る。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して測定されるとき、それらの配列が、それらの分子の規定の長さにわたって、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示すとき、互いに実質的に相同である。本明細書中で使用されるとき、実質的に相同とは、指定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列のことも指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系に対して規定された、例えば、ストリンジェントな条件下における、サザンハイブリダイゼーション実験において識別され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。
【００６７】
２つの核酸フラグメントの選択的ハイブリダイゼーションは、以下のとおり測定され得る。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的に同一の核酸配列は、標的分子に対する完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害し得る。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を用いて評価され得る。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性を用いて、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで様々な条件を用いて、行うことができる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合、非特異的結合事象の非存在下では、その第２のプローブは標的にハイブリダイズしないような部分的な程度の配列同一性さえも欠く第２のプローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性しか有しないプローブ）を使用して、非特異的結合が存在しないことが評価され得る。
【００６８】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用するとき、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、そのプローブと参照配列とが、互いに選択的にハイブリダイズまたは結合して、二重鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より高い配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列のハイブリダイゼーションにとって有用なハイブリダイゼーション条件は、そのプローブと参照配列とが、特定の程度の配列同一性を有する場合、当該分野で公知であるように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００６９】
ハイブリダイゼーションに対する条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチのヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う程度のことを指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチのハイブリッドに対するより低い寛容と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子は、当業者に周知であり、それらの因子としては、温度、ｐＨ、イオン強度および有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド）の濃度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知であるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度によって高まる。
【００７０】
ハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液の構成要素の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーション反応の温度および時間パラメータ、ならびに様々な洗浄条件を変動させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために数多くの等価な条件が使用され得ることは、当該分野で周知である。「組換え」とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセスのことを指す。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞において二本鎖断裂の修復中に生じる、そのような交換の特殊な形のことを指す。このプロセスは、相同なヌクレオチド配列を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖断裂を経験した分子）の修復の鋳型となるために「ドナー」分子を使用し、それは、ドナーから標的への遺伝情報の移転につながるので、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、そのような移転は、断裂された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチの修復、および／またはドナーを使用して、標的の一部になる遺伝情報を再合成する「合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」および／または関連プロセスを伴い得る。そのような特殊なＨＲはしばしば、標的分子の配列を変化させ、その結果、そのドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれる。
【００７１】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを構成する核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ここで、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を２つずつ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物に応じて長さ
は変動する）が、ヌクレオソームコア間に伸びている。通常、ヒストンＨ１の分子がリンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的では、用語「クロマチン」は、原核生物と真核生物の両方のすべてのタイプの細胞核タンパク質を包含すると意味される。細胞クロマチンには、染色体クロマチンとエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【００７２】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合であるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１本またはそれを超える染色体を含み得る。
【００７３】
「エピソーム」は、複製中の核酸、ヌクレオタンパク質複合体、または細胞の染色体の核型の一部でない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００７４】
「接近可能な領域」は、核酸に存在する標的部位が、その標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン内の部位である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造の中に詰め込まれない領域であると考えられている。接近可能な領域の明確な構造は、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対する感度によって検出され得ることが多い。
【００７５】
「標的部位」または「標的配列」は、結合に対する十分な条件が存在すれば結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。
【００７６】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つまたはそれを超える遺伝的な方法、生化学的な方法または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在する」は、その細胞の特定の発生段階および環境条件に関して判定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にだけ存在する分子は、成体の筋細胞に対しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に対しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能性バージョン、正常に機能している内因性分子の機能不全バージョンまたはオルソログ（異なる種に由来する内因性分子の機能性バージョン）を含み得る。
【００７７】
外因性分子は、とりわけ、小分子（例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの）または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の改変された任意の誘導体、または上記の１つもしくはそれを超える分子を含む任意の複合体）であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さであり得る。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号および同第９，２５５，２５９号を参照のこと。核酸には、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または外因性核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または通常はその細胞に存在しない染色体を含み得る。細胞に外因性分子を導入するための方法は、当業者に公知であり、その方法としては、脂質媒介性移入（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的な注射、細胞融合、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階における特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が挙げられ得る。
【００８０】
「融合」分子は、２つまたはそれを超えるサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に、連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子であり得るか、または異なる化学タイプの分子であり得る。融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの融合物）、１つまたはそれを超える切断ドメインと作動的に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）間の融合物、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
細胞における融合分子の発現は、その細胞への融合タンパク質の送達またはある細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、ここで、そのポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳されることにより、融合タンパク質が生成される。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関わり得る。細胞にポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するための方法は、本開示の他の箇所に提示される。
【００８２】
「遺伝子」は、本開示の目的では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下を参照のこと）、ならびに遺伝子産物の生成を制御するすべてのＤＮＡ領域（そのような制御配列が、コード配列および／または転写される配列に隣接するかまたは隣接しないかに関係ない）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅｓ）および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８３】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００８４】
遺伝子発現の「調節」または「改変」とは、遺伝子の活性を変化させることを指す。発現の調節としては、外因性分子（例えば、操作された転写因子）の結合による遺伝子の改変によるものを含む、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。調節は、ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）による遺伝子配列の改変によって達成することもできる。遺伝子の不活性化とは、本明細書中に記載されるように改変されていない細胞と比べたときの、遺伝子発現の任意の減少のことを指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００８５】
「真核生物」細胞としては、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域（例えば、遺伝子または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接した非コード配列）であり、外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えの目的のためのものであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、コード領域の上流または下流の、転写される非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）配列もしくはイントロン）内または転写されない領域内に存在し得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対ほど小さいこともあるし、最大２，０００ヌクレオチド対の長さまたは任意の整数値のヌクレオチド対であることもある。
【００８７】
用語「作動的な連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）は、２つまたはそれを超える構成要素（例えば、配列エレメント）の並置に対して交換可能に使用され、ここで、それらの構成要素は、両方の構成要素が、正常に機能し、それらの構成要素のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの他の構成要素に対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように配置されている。例証の目的で、プロモーターなどの転写制御配列は、その転写制御配列が、１つまたはそれを超える転写制御因子の有無に応答してコード配列の転写レベルをコントロールする場合、コード配列に作動的に連結されている。転写制御配列は、通常、コード配列とシスで作動的に連結されるが、コード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、連続していなかったとしても、コード配列に作動的に連結された転写制御配列である。
【００８８】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動的に連結された」とは、各構成要素が、他の構成要素と連結されていない場合に果たされる機能と同じ機能を他の構成要素と連結した状態で果たすという事実のことを指し得る。例えば、ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、その融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近位（例えば、標的部位のいずれかの側の１〜５００塩基対またはそれらの間の任意の値）でＤＮＡを切断できる場合、そのＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは、作動的に連結された状態である。
【００８９】
本開示の方法において、本明細書中に記載されるような１つまたはそれを超える標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位の標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖断裂（ＤＳＢ）をもたらす。そのＤＳＢは、相同性特異的な（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）修復機構または相同性特異的でない修復機構によって、欠失および／または挿入をもたらし得る。欠失は、任意の数の塩基対を含み得る。同様に、挿入も、任意の数の塩基対を含み得、それには、例えば、断裂の領域におけるヌクレオチド配列に対して相同性を必要に応じて有する「ドナー」ポリヌクレオチドのインテグレーションが含まれる。ドナー配列は、物理的にインテグレートされ得るか、あるいは、ドナーポリヌクレオチドが、相同組換えを介した断裂修復のための鋳型として使用され、その結果、そのドナーにおけるようなヌクレオチド配列の全部または一部が細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチンにおける第１の配列が変更され得、ある特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、１つのヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列によって置き換えられること（すなわち、情報を提供する意味のある配列の置き換え）を表していると理解され得、１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドによって物理的または化学的に置き換えられることを必ずしも必要としない。
【００９０】
ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムのさらなる対が、細胞内でのさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
【００９１】
本明細書中に記載される任意の方法において、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムのさらなる対が、細胞内でのさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
【００９２】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的フラグメント」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持している、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的フラグメントは、対応する天然の分子と比べてより多い数の残基、より少ない数の残基、もしくは同じ数の残基を有し得、かつ／または１つもしくはそれを超えるアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コードする機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を測定するための方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を測定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドがＤＮＡに結合する機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって測定され得る。ＤＮＡの切断は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。あるタンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的と生化学的の両方の相補性によって測定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
【００９３】
用語「被験体」および「患者」は、交換可能に使用され、哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物を指す。したがって、本明細書中で使用される用語「被験体」または「患者」は、本発明の発現カセットが投与され得る任意の哺乳類患者または被験体を意味する。本発明の被験体は、障害を有するもの、または障害を発症するリスクがあるものを含む。
【００９４】
本明細書中で使用される用語「処置する」および「処置」は、症状の重症度および／または頻度の減少、症状および／または根底にある原因の排除、症状の発生および／またはそれらの根底にある原因の防止、および損傷の改善または治療を指す。がんおよび移植片対宿主病は、本明細書中に記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。したがって、「処置する」および「処置」には、以下が含まれる。
（ｉ）哺乳動物における疾患もしくは状態の発生を、特に、かかる哺乳動物がその状態の素因を有しているが、未だそれを有するとは診断されていないときに防止すること、
（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、
（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を緩和すること、すなわち、疾患もしくは状態の後退を起こさせること、または
（ｉｖ）疾患もしくは状態から生じる症状を緩和すること、すなわち、根底にある疾患もしくは状態に対処することなく疼痛を緩和すること。本明細書中で使用されるとき、用語「疾患」および「状態」は、交換可能に使用される場合もあれば、特定の病気または状態が公知の原因物質を有しないかもしれず（そのため病因が未だ解明されておらず）、したがって未だ疾患としては認識されていないが、単に望ましくない状態または症候群として認識されており、臨床医によって多少具体的な一群の症状が同定されているという点で、異なっている場合もある。
【００９５】
「薬学的組成物」とは、本発明の化合物と、哺乳動物、例えばヒトに、生物活性化合物を送達するために当該分野において一般に許容されている媒体との製剤のことを指す。そのような媒体としては、そのための薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、または賦形剤のすべてが挙げられる。
【００９６】
「有効量」または「治療有効量」とは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されたとき、哺乳動物、好ましくはヒトにおける処置をもたらすのに十分な、本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」をなす本発明の組成物の量は、化合物、状態およびその重症度、投与の様式、ならびに処置される哺乳動物の年齢に応じて様々であるが、当業者が自身の知識および本開示を考慮することによって日常的に決定することができる。
【００９７】
リンカー
ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）とヌクレアーゼ（例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン）とを融合する（連結する）アミノ酸配列が、本明細書中に記載される。
【００９８】
現在、ヌクレアーゼ二量体は、向かい合ったＤＮＡ鎖に結合し（図１Ａを参照のこと）、これはヌクレアーゼのデザインを限定し得る。本明細書中に記載されるリンカーは、現在の構造およびヘッド・トゥ・テール構造（図１Ｂ）の両方における結合を可能にし、このことは、標的化されたヌクレアーゼのデザインに利用可能である潜在的な標的部位を、現在使用されている構成と比べて少なくとも３倍増加させる。さらに、本明細書中に記載されるリンカーは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対の標的部位が０〜６塩基対ではない塩基対だけ離れているとき、例えば、７、８、９、１０塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れた標的部位のとき、切断を可能にする。本明細書中に記載されるリンカー配列は、代表的には、約８〜１７アミノ酸長であり、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかを切断ドメインに連結し得るか、あるいは、ポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインの任意の部分と会合し得る。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端の残基と切断ドメインのＮ末端またはＣ末端の残基との間に伸びている。ある特定の実施形態において、リンカーは、切断ドメインのＮ末端とＤＮＡ結合ドメインとの間に（between  the  N-terminal  of  the  cleavage  domain  the  DNA-binding  domain）伸びている。
【００９９】
本明細書中に記載されるようなリンカーの非限定的な例は、図３、４、５、６、７、１０、１１、および１９Ｂに示されている。
【０１００】
本明細書中に記載される融合分子は、選択された切断ドメインのＮ末端領域に対する変更も含み得る。変更には、切断ドメインの１つまたはそれを超えるＮ末端残基の置換、付加および／または欠失が含まれ得る。ある特定の実施形態において、切断ドメインは、ＦｏｋＩに由来し、野生型ＦｏｋＩのＮ末端領域の１つまたはそれを超えるアミノ酸が、置き換えられ、さらなるアミノ酸が、この領域に付加される。例えば、米国特許公開第２０１５００６４７８９号を参照のこと。
【０１０１】
ＤＮＡ結合ドメイン、改変されたＦｏｋＩ切断ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のＺＣリンカーを含む融合タンパク質もまた、本明細書中に記載される。ＦｏｋＩ切断ドメインは、任意の方法で改変され得る。改変の非限定的な例としては、ＦｏｋＩのＮ末端領域（配列番号３２０の残基１５８〜１６９。米国特許公開２００９０３０５４１９を参照のこと）に対する付加、欠失および／または置換が挙げられる。ある特定の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域からの１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸の欠失（例えば、配列番号３２０に示されるとおりの野生型ＦｏｋＩドメインの残基１５８、１５９、１６０および／または１６１のうちの１つまたはそれを超える残基の欠失）を含む。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域からの１つまたはそれを超える欠失および１つまたはそれを超える置換（例えば、残基１５８〜１６１のうちの１つまたはそれを超える残基の欠失および１つまたはそれを超える残りの残基の置換）を含む。Ｎ末端のＦｏｋＩアミノ酸残基に欠失および置換を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５に示されているとおりのＶ２、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６およびＶ８と命名されたタンパク質が挙げられる。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域に１つまたはそれを超える置換を含む。ＦｏｋＩのＮ末端のアミノ酸残基に置換を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５に示されているとおりのＶ９〜Ｖ１６と命名されたタンパク質が挙げられる。なおもさらなる実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩの最もＮ末端の残基（配列番号３２０の残基１５８）に対してＮ末端側に１つまたはそれを超えるさらなるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸残基）を含む。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩの最もＮ末端の残基（配列番号３２０の残基１５８）に対してＮ末端側に１つまたはそれを超えるさらなるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸残基）およびＦｏｋＩのＮ末端領域内に１つまたはそれを超える置換を含む。付加を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５または図１６に示されているタンパク質および米国特許公開番号２００９０３０５４１９に記載されているようなＮ末端のＦｏｋＩアミノ酸残基内の置換が挙げられる。
【０１０２】
代表的には、本発明のリンカーは、リンカーアミノ酸配列を介して融合されたリンカーおよびＤＮＡ結合ドメインをコードする組換え核酸を作製することによって作製される。必要に応じて、それらのリンカーは、ペプチド合成を用いても作製され得、次いで、ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインに連結され得る。
【０１０３】
ヌクレアーゼ
本明細書中に記載されるリンカー配列を有益に使用することにより、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡおよび／またはＴｔａｇｏガイドＲＮＡが、ヌクレアーゼ切断ドメインまたはハーフドメインに連結され、それにより、特異的に標的化された天然に存在しないヌクレアーゼが形成される。ＤＮＡ結合ドメインは、任意のゲノム配列における１２またはそれを超えるヌクレオチドの任意の標的配列を含むがこれに限定されない、遺伝子内の任意の標的配列に結合し得る。
【０１０４】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書中に開示される方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、そのジンクフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するように操作されているという点において、天然に存在しない。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比べて、新しい結合特異性を有し得る。操作する方法としては、合理的なデザインおよび様々なタイプの選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的なデザインとしては、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、ここで、トリプレットヌクレオチド配列またはクワドルプレットヌクレオチド配列の各々は、特定のトリプレット配列またはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれを超えるアミノ酸配列に会合される。例えば、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１０５】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムをはじめとした例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１０６】
標的部位の選択；ＺＦＰ、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）のデザインおよび構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許出願公開番号２００５００６４４７４および同２００６０１８８９８７に詳細に記載されており、それらは全体として参照により本明細書に援用される。
【０１０７】
さらに、これらのおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー（ｍｕｌｔｉ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長またはそれを超えるリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結され得る。６アミノ酸長またはそれを超える例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書中に記載されるタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に任意の組み合わせの好適なリンカーを含み得る。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノム内の目的の領域への結合のためにメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、通常、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；米国特許公開番号２００７０１１７１２８を参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、そのヌクレアーゼに照らして全体として変化し得る（すなわち、そのヌクレアーゼは、同種の切断ドメインを含む）か、または異種の切断ドメインに融合され得る。
【０１０９】
他の実施形態において、本明細書中に記載される方法および組成物において使用される１つまたはそれを超えるヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌は、重要な作物植物において多くの疾患の原因となることが知られている。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する、保存されたタイプＩＩＩ分泌（Ｔ３Ｓ）システムに依存する。これらの注入されるタンパク質には、植物転写活性化因子を模倣して植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴づけられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６およびＷＯ２０１００７９４３０を参照のこと）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中ドメイン（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）を含み、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含む。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（概説として、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓら（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。さらに、植物病原菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であると見出された（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１１０】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見られる配列に依存する。そのリピート配列は、およそ１０２ｂｐを含み、そのリピートは、代表的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。それらのリピートの多型は、通常、１２および１３位に存在し、その結果１２および１３位における超可変二残基（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＲＶＤ）の同一性と、ＴＡＬエフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの同一性との間に１対１の対応が存在するとみられる（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照のこと）。実験的には、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードが決定され、１２および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧが、Ｔに結合し、ＮＩが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮが、ＡまたはＧに結合し、ＩＮＧが、Ｔに結合する。これらのＤＮＡ結合リピートが、新しいリピートの組み合わせおよび数を有するタンパク質に組み立てられることにより、新しい配列と相互作用することおよび植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子が形成された（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結することにより、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）が得られた。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０）＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照のこと。ある特定の実施形態において、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されているようなＮキャップおよび／またはＣキャップを含む。なおもさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインと連結する一本鎖融合タンパク質である。その融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対して配置される場所に依存して、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖断裂をもたらし得る（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１−８  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照のこと）。任意のＴＡＬＥＮを、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたはそれを超えるメガ−ＴＡＬを有する１つまたはそれを超えるＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用してよい。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許公開２０１５００５６７０５を参照のこと。そのシステムのＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（規則的に間隔が入ったクラスター化された短いパリンドロームリピート）遺伝子座およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  １：７；Ｈａｆｔら、２００５．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組み合わせならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡエレメントを含む。
【０１１２】
タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴づけられたシステムの１つであり、標的化されたＤＮＡ二本鎖断裂を４つの逐次工程で行う。第１に、２つの非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡから、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識に対するさらなる必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成によってＣａｓ９を標的ＤＮＡに向かわせる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内で二本鎖断裂をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防ぐための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにそのアレイの発現およびプロセシングに続く、（ｉｉｉ）その異質核酸のＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞では、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの天然の機能に関わり、異質ＤＮＡの挿入などのような機能において役割を果たす。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」としては、天然配列のフラグメントならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されないが、ただし、それらは、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する。本明細書中で企図される生物学的活性は、機能性誘導体がＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合修飾物およびそれらの融合物のいずれも包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはそのフラグメントの好適な誘導体としては、Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメントの変異体、融合物、共有結合修飾物が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメントを含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはそのフラグメントの誘導体は、細胞から入手可能であり得るか、または化学的にもしくはこれらの２つの手順の組み合わせによって合成され得る。その細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、かつ内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように遺伝的に操作された細胞、もしくは外から導入された核酸から（その核酸は内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする）Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作された細胞であり得る。場合によっては、その細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏシステムの一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｓｈｅｎｇら、同書を参照のこと）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは、小さい（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合される。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、その小さいＲＮＡと標的との間のワトソン−クリック塩基対形成によって標的ＲＮＡを認識し、その標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に切断する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４：９７２−９７３）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さい一本鎖ＤＮＡフラグメントに結合し、おそらく、外来ＤＮＡ（ウイルスのＤＮＡであることが多い）を検出し、除去するように機能する（Ｙｕａｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９，４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５１，５９４；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものが挙げられる。
【０１１５】
最もよく特徴づけられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を用いて１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡフラグメントと会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、そのタンパク質−ＤＮＡ複合体が、サードパーティＤＮＡ分子におけるワトソン−クリック相補ＤＮＡ配列に結合するように指向させるように働く。いったん、これらのガイドＤＮＡにおける配列情報が標的ＤＮＡの識別を可能にしたら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。また、そのような機構は、その標的ＤＮＡに結合したままでＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によって支持される（Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。
【０１１６】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質上に載せることができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性は、ガイドＤＮＡによって指向されるので、研究者指定の外因性ガイドＤＮＡと形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、研究者指定の相補的な標的ＤＮＡに向ける。このようにして、ＤＮＡにおいて標的化された二本鎖断裂が生じ得る。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡシステム（または他の生物に由来するオルソロガスなＡｇｏ−ガイドＤＮＡシステム）を使用することにより、細胞内でゲノムＤＮＡの標的化切断が可能になる。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡを切断する場合、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたバージョンのＴｔＡｇｏを使用することが好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合される場合、インビトロで形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処理することが好ましい。さらに、突然変異誘発を介して変更された、３７℃において改善された活性を有するバージョンのＴｔＡｇｏタンパク質を使用することが好ましい。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ断裂を活用するための当該分野における標準的な手法を用いて、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子欠失を含む一連の（ｐａｎｏｐｏｌｙ）結果をもたらすために使用される。
【０１１７】
Ｂ．切断ドメイン
本明細書中に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、あるヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）も含む。ヌクレアーゼ（複数可）は、標的ＤＮＡにおける二本鎖断裂（ＤＳＢ）または一本鎖断裂（ニック）を誘導し得る。いくつかの実施形態において、２つのニックを導入することによってＤＳＢをもたらすために、２つのニッカーゼが使用される。場合によっては、ニッカーゼはＺＦＮであるが、一方、その他においては、ニッカーゼはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。
【０１１８】
本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。１つまたはそれを超えるこれらの酵素（またはそれらの機能的フラグメント）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの起源として使用され得る。
【０１１９】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上に示されたような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。通常、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、切断のために必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得る。
【０１２０】
さらに、上記２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、それらの２つの融合タンパク質がそれらのそれぞれの標的部位に結合すると、切断ハーフドメインが、例えば二量体化することによって、機能的切断ドメインの形成を可能にするような互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインが配置されるように、互いに対して配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近傍端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超えるヌクレオチド対）。通常、切断部位は、それらの標的部位の間にある。
【０１２１】
上で述べたように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインである。異種の切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。１つまたはそれを超えるこれらの酵素（またはそれらの機能的フラグメント）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの起源として使用され得る。
【０１２２】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上に示されたような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。通常、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、切断のために必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、それらの２つの融合タンパク質がそれらのそれぞれの標的部位に結合すると、切断ハーフドメインが、例えば二量体化することによって、機能的切断ドメインの形成を可能にするような互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインが配置されるように、互いに対して配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近傍端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超えるヌクレオチド対）。通常、切断部位は、それらの標的部位の間にある。
【０１２３】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位において）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合部位においてまたは結合部位の近傍においてＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から除去される部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖におけるその認識部位から９ヌクレオチドにおいておよび他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドにおいてＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および操作されていてもよいし操作されていなくてもよい１つまたはそれを超えるジンクフィンガー結合ドメインを含む。ＦｏｋＩの野生型配列（配列番号２８２）を以下に示す。
【化１】
2019503198.tif 000003
【０１２４】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的では、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインであるとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した、細胞配列の標的化された二本鎖切断および／または標的化された置き換えのために、２つの融合タンパク質（各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む）を使用して触媒的に活性な切断ドメインを再構成し得る。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した、標的化された切断および標的化された配列変更に対するパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。
【０１２５】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するタンパク質の任意の部分であり得るか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１２６】
例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５（全体として本明細書に援用される）に記載されている。さらなる制限酵素は、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインも含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照のこと。
【０１２７】
ある特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号（これらのすべての開示は、全体として参照により本明細書に援用される）に記載されているように、ホモ二量体化を最小にするかまたは防ぐ１つまたはそれを超える操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位におけるアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【０１２８】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインとしては、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位におけるアミノ酸残基に変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に変異を含む対が挙げられる。
【０１２９】
したがって、１つの実施形態において、４９０における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。詳細には、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成することによって、および別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成することによって、本明細書中に記載される操作された切断ハーフドメインを調製した。本明細書中に記載される操作された切断ハーフドメインは、異所の切断が最小限であるかまたは無効にされている偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号を参照のこと（この開示は、すべての目的のために全体として参照により援用される）。
【０１３０】
１つより多い変異、例えば、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成する、１つの切断ハーフドメインにおける４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）における変異、および「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成する、別の切断ハーフドメインにおける４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることによる変異；４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を有する切断ドメインが、使用され得；操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対してナンバリングされたもの）に変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含み；および／または操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対してナンバリングされたもの）に変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異および５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照のこと（これらの開示は、すべての目的のために全体として参照により援用される）。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６−１０７を参照のこと）。
【０１３１】
あるいは、ヌクレアーゼは、インビボにおいて、いわゆる「スプリット酵素」技術（例えば、米国特許公開番号２００９００６８１６４を参照のこと）を用いて、核酸標的部位において組み立てられ得る。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現され得るか、または１つのオープンリーディングフレーム内で連結され得、ここで、個々の構成要素は、例えば、自己切断型の２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって、分断されている。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１３２】
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されているような酵母に基づく染色体システムにおいて、使用前に活性についてスクリーニングされ得る。
【０１３３】
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２つのＲＮＡ非コード構成要素：ｔｒａｃｒＲＮＡ、および同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が空けられたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含むプレｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してゲノム操作を達成するためには、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物によって供給されるか、または別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、ここで、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用をもたらす）に融合されて、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ばれる）が形成される（Ｊｉｎｅｋ  同書およびＣｏｎｇ，同書を参照のこと）。
【０１３４】
標的部位
上で詳細に説明されたように、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、任意の最適な配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比べて、新しい結合特異性を有し得る。
【０１３５】
好適な標的遺伝子の非限定的な例は、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（γ）グロビン（胎児型グロビンともいう）遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、Ｈｕｎｇｔｉｎｇｉｎ（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞レセプターアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞レセプターベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ  Ｂ遺伝子、ＨＬＡ  Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、糖質コルチコイドレセプター遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、Ｒａｇ−１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０１３６】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、「セーフハーバー（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ）」遺伝子座、例えば、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミンおよびＣＣＲ５遺伝子ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６（例えば、米国特許第８，７７１，９８５；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国公開第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号、同第２０１３０１７７９６０号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照のこと）、および植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照のこと）を標的化する。
【０１３７】
ドナー
ある特定の実施形態において、本開示は、細胞（例えば幹細胞）のゲノムのヌクレアーゼ媒介性改変に関する。上で述べたように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「トランスジーン」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、指定の領域の欠失のためおよび／もしくは変異遺伝子の修正のため、または野生型遺伝子の発現の増大のためである。そのドナー配列は、通常、それが配置されるゲノム配列と同一でないことは容易に明らかである。ドナー配列は、目的の位置における効率的なＨＤＲを可能にするために相同な２つの領域に隣接した非相同配列を含み得るか、または非相同性特異的修復機構（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）によってインテグレートされ得る。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同でない配列を含むベクター分子を構成し得る。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同ないくつかの不連続な領域を含み得る。さらに、目的の領域に通常存在しない配列を標的化挿入するために、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し得、目的の領域における配列に相同な領域に隣接し得る。
【０１３８】
ヌクレアーゼと同様に、ドナーは、任意の形態で導入され得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、ｍＲＮＡの形態で導入されることにより、改変された細胞における残留ウイルスを排除する。他の実施形態において、ドナーは、ＤＮＡおよび／またはウイルスベクターを用いて当該分野で公知の方法によって導入され得る。例えば、米国特許公開番号２０１０００４７８０５および同２０１１０２０７２２１を参照のこと。ドナーは、環状または直鎖状の形態で細胞に導入され得る。直鎖状の形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つまたはそれを超えるジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方または両方の末端にライゲートされる。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：８８６−８８９を参照のこと。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、末端のアミノ基の付加、ならびに改変されたインターヌクレオチド結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、ドナーは、１ｋｂ長より長い配列（例えば、トランスジーンとも称されるコード配列）、例えば、２〜２００ｋｂ、２〜１０ｋｂ（またはそれらの間の任意の値）の配列を含む。ドナーは、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位も含み得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの対に対する少なくとも２つの標的部位を含む。代表的には、ヌクレアーゼ標的部位は、トランスジーンの切断の場合、トランスジーン配列の外側、例えば、トランスジーン配列に対して５’および／または３’に存在する。ヌクレアーゼ切断部位は、任意のヌクレアーゼに対するものであり得る。ある特定の実施形態において、二本鎖ドナーに含まれるヌクレアーゼ標的部位は、切断されたドナーが相同性非依存的方法によってインテグレートされる内因性標的を切断するために使用されるヌクレアーゼと同じヌクレアーゼに対するものである。
【０１４０】
ドナーは、その発現が、インテグレーション部位における内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように、挿入され得る。しかしながら、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含み得ることが明らかである。そのドナー分子は、内因性遺伝子のすべてもしくはいくつかが発現されるように、または内因性遺伝子が全く発現されないように、その内因性遺伝子に挿入され得る。さらに、発現にとって必要でないが、外因性配列は、転写制御配列または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
【０１４１】
本明細書中に記載されるドナー配列上に保持されるトランスジーンは、ＰＣＲなどの当該分野で公知の標準的な手法を用いて、プラスミド、細胞または他の起源から単離され得る。使用するためのドナーは、環状スーパーコイル状態、環状リラックス状態、直鎖状などをはじめとした様々なタイプのトポロジーを含み得る。あるいは、それらは、標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて化学的に合成されてもよい。さらに、ドナーは、メチル化されてもよいし、メチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌人工染色体または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であり得る。
【０１４２】
本明細書中に記載されるドナーポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非天然の塩基および／または骨格を含み得る。特に、メチル化されたシトシンによるドナー分子の挿入は、本明細書中に記載される方法を用いて行われることにより、目的の領域において転写静止状態が達成され得る。
【０１４３】
外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、目的の任意の配列（外因性配列）を含み得る。例示的な外因性配列としては、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および様々なタイプの発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖の増大および／または遺伝子の増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとしては、例えば、１コピーまたはそれを超えるコピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、ドナーは、細胞における発現が望まれる任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、そのポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、レセプター（細胞表面または核）、ホルモン、リンフォカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、成長因子、および上記のいずれかの機能的フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。それらのコード配列は、例えば、ｃＤＮＡであり得る。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、外因性配列は、標的化されたインテグレーションを起こした細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上に記載されたもの）、およびさらなる機能性をコードする連結された配列を含み得る。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカーなどが挙げられる。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、トランスジーンには、例えば、変異した内因性配列に取って代わる野生型遺伝子が含まれ得る。例えば、野生型（または他の機能的な）遺伝子配列が、幹細胞のゲノムに挿入され得、その遺伝子の内因性コピーが変異される。トランスジーンは、内因性遺伝子座に挿入され得るか、または代わりに、セーフハーバー遺伝子座に標的化され得る。
【０１４７】
本明細書の教示に従うそのような発現カセットの構築では、分子生物学の分野で周知の方法を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと）。トランスジェニック動物を作製するために発現カセットを使用する前に、発現カセットを好適な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換された細胞または不死化細胞株）に導入することによって、選択された調節エレメントに関連するストレス誘導因子に対するその発現カセットの応答性が試験され得る。
【０１４８】
さらに、発現にとって必要でないが、外因性配列は、転写制御配列または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。さらに、目的の遺伝子の調節エレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結されて、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）が形成され得る。例示的なスプライス受容部位配列は、当業者に公知であり、それらとしては、単なる例として、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号３２１）（ヒトＨＢＢ遺伝子由来）およびＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号３２２）（ヒト免疫グロブリン−ガンマ遺伝子由来）が挙げられる。
【０１４９】
非コード核酸配列の標的化された挿入もまた、達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的化された挿入のために使用され得る。
【０１５０】
さらなる実施形態において、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼデザインのための特異的な標的部位である非コード配列を含み得る。続いて、さらなるヌクレアーゼは、元のドナー分子が切断され、目的の別のドナー分子の挿入によって改変されるように、細胞において発現され得る。このようにして、ドナー分子の反復インテグレーションがもたらされ得、目的の特定の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座において形質のスタッキングが可能になる。
【０１５１】
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって送達され得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、インビボにおいて送達される。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、患者へのエキソビボ送達において有用な改変された細胞（例えば、幹細胞）を提供するために、単離された細胞（例えば、自己または異種の幹細胞）に送達される。
【０１５２】
本明細書中に記載されるようなヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されている（それらの開示のすべてが、全体として参照により本明細書に援用される）。
【０１５３】
本明細書中に記載されるようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、１つまたはそれを超えるそれらの構成要素をコードする配列を含む、裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにベクターをはじめとした任意の核酸送達機構を用いても送達され得る。任意のベクター系を使用してよく、それらとしては、プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号ならびに米国特許出願番号１４／２７１，００８もまた参照のこと（これらは全体として参照により本明細書に援用される）。さらに、これらのシステムのいずれもが、処置のために必要な１つまたはそれを超える配列を含み得ることが明らかである。したがって、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼおよびドナー構築物が、細胞に導入されるとき、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じ送達系または異なる送達機構で運ばれ得る。複数の系が使用されるとき、各送達機構は、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列（例えば、１つもしくはそれを超えるヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび／または１つもしくはそれを超えるドナー構築物を運ぶｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）を含み得る。
【０１５４】
ウイルスに基づくおよびウイルスに基づかない従来の遺伝子導入方法が、ヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー構築物を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために使用され得る。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームゲノムまたはインテグレートされたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。
【０１５５】
核酸の非ウイルス性送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップされたＲＮＡ、人工ビリオン、および作用物質によって増強されるＤＮＡの取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーション（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もまた、核酸を送達するために使用され得る。
【０１５６】
さらなる例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照のこと）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
【０１５７】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸を送達するためにＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスのペイロードを核に輸送するために、高度に発展したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を処理するために使用され得、改変された細胞が、被験体に投与される（エキソビボ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを送達するための、ウイルスに基づく従来のシステムとしては、遺伝子導入のための、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへのインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いたとき可能であり、しばしば、挿入されたトランスジーンが長期間にわたって発現される。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。
【０１５８】
レトロウイルスの指向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団が拡大される。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入することまたは感染することができ、代表的には、高ウイルス価をもたらすことができる、レトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に対するパッケージング能を有するシス作用性の末端反復配列を含む。それらのベクターの複製およびパッケージングにとっては、最小のシス作用性ＬＴＲで十分であり、それらのベクターを用いることにより、治療用遺伝子が標的細胞にインテグレートされ、それにより、持続的なトランスジーンの発現が提供される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびそれらの組み合わせに基づくベクターが挙げられる。
【０１５９】
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムが使用され得る。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いると、高力価および高レベルの発現が得られる。このベクターは、比較的単純な系で大量に生成され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドをインビトロで生成する際に、ならびにインビボおよびエキソビボ遺伝子治療手順のために、細胞に標的核酸を形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）をはじめとしたいくつかの刊行物に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ  ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ  ｒｈ１０を含む任意のＡＡＶ血清型、ならびに偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を使用することができる。
【０１６０】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、臨床試験における遺伝子導入のために現在利用可能であり、それらは、形質導入物質を作製するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を必要とするアプローチを用いる。
【０１６１】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験において使用された最初の治療用ベクターだった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％またはそれを超える形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージベクターにおいて観察された（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１６２】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ随伴タイプ２ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターが、ＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）末端逆位配列だけをトランスジーン発現カセットに隣接して保持するプラスミドに由来する。効率的な遺伝子導入、および形質導入された細胞のゲノムへのインテグレーションに起因する安定したトランスジーン送達は、このベクター系にとって重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型ならびにそれらのすべてのバリアントもまた、本発明に従って使用され得る。
【０１６３】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され得、いくつかの異なる細胞型に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランスジーンがＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子に取って代わるように操作され；続いて、その複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増やされる。Ａｄベクターは、インビボにおいて、分化した非分裂細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉に見られる細胞をはじめとした多様なタイプの組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。臨床試験においてＡｄベクターを使用した例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療に関わるものだった（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験において遺伝子導入のためにアデノウイルスベクターを使用したさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１６４】
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生成細胞株によって生成される。それらのベクターは、代表的には、パッケージングおよびその後の宿主へのインテグレーション（妥当な場合）のために必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、代表的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへのインテグレーションに必要とされる、ＡＡＶゲノム由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を有するだけである。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株においてパッケージングされる。また、その細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。そのヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。そのヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くことに起因して、かなりの量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスが感受性である熱処理によって、減少させることができる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して製造することができる（例えば、米国特許第６，７２３，５５１号および同第７，２７１，００２号を参照のこと）。
【０１６５】
２９３またはバキュロウイルス系からのＡＡＶ粒子の精製は、代表的には、ウイルスを産生する細胞の成長に続いて、細胞上清からウイルス粒子を収集すること、または細胞を溶解し、粗溶解物からウイルスを収集することを含む。ＡＡＶは次いで、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、米国特許第７，４１９，８１７号および同第６，９８９，２６４号を参照のこと）、イオン交換クロマトグラフィおよびＣｓＣｌ密度遠心分離法（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、免疫アフィニティクロマトグラフィ（例えば、ＷＯ２０１６１２８４０８）、またはＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した精製をはじめとした当該分野で公知の方法によって精製される。
【０１６６】
多くの遺伝子治療の用途では、遺伝子治療ベクターが、特定の組織タイプに高い特異性の程度で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所与の細胞型に対して特異性を有するように改変され得る。そのリガンドは、目的の細胞型上に存在すると知られているレセプターに対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変され得ること、およびその組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子レセプターを発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス−標的細胞対にまで拡大され得、ここで、その標的細胞は、レセプターを発現し、そのウイルスは、細胞表面レセプターに対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞レセプターに対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作され得る。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用されるものであるが、同じ原理が、非ウイルスベクターにも適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０１６７】
遺伝子治療ベクターは、個々の被験体への、代表的には、下記に記載されるような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所的適用による投与によって、インビボにおいて送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボにおいて細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞に送達され、それに続き、通常、ベクターを組み込んだ細胞について選択した後、それらの細胞を患者に再移植し得る。
【０１６８】
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、インビボにおける細胞の形質導入のために、生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡが、投与され得る。投与は、ある分子を血液細胞または組織細胞との最終的な接触に導くために通常使用される任意の経路による投与であり、それには、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションが含まれるがこれらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者にとって利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために１つより多い経路を使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも速効性かつ効果的な反応を提供できることが多い。
【０１６９】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの導入に適したベクターには、インテグレートしないレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２；米国特許公開番号２００９／０５４９８５を参照のこと。
【０１７０】
薬学的に許容され得るキャリアは、投与される特定の組成物、ならびにその組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、下記に記載されるような、利用可能な薬学的組成物の多種多様の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。
【０１７１】
ヌクレアーゼをコードする配列およびドナー構築物は、同じ系または異なる系を使用して送達され得ることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、ＡＡＶによって運ばれ得るのに対し、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによって運ばれ得る。さらに、異なる系が、同じ経路または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって、投与され得る。それらのベクターは、同時にまたは任意の連続した順序で送達され得る。
【０１７２】
エキソビボ投与とインビボ投与の両方のための製剤としては、液体の形態の懸濁液または乳化液が挙げられる。活性成分は、薬学的に許容され得、かつその活性成分と適合性である賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、組成物は、少量の助剤（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または薬学的組成物の有効性を高める他の試薬）を含み得る。
【０１７３】
キット
本明細書中に記載される任意のリンカーを含むキットおよび／または上記方法のいずれかを実施するためのキットもまた提供される。それらのキットは、代表的には、本明細書中に記載されるようなリンカー配列（または本明細書中に記載されるようなリンカーをコードするポリヌクレオチド）を含む。そのキットは、リンカーだけを供給してもよいし、最適なＤＮＡ結合ドメインおよび／またはヌクレアーゼが容易に挿入され得るベクターを提供してもよい。それらのキットは、細胞、細胞を形質転換するための緩衝液、細胞用の培養液および／またはアッセイを行うための緩衝液も含み得る。代表的には、それらのキットは、そのキットの他の構成要素に付着されたまたはその他の方法で伴う任意の材料（例えば、指示書、包装または広告リーフレット）を含むラベルも含む。
【０１７４】
用途
開示されるリンカーは、切断ドメインを有する操作されたＤＮＡ結合ドメインと連結して、ＤＮＡを切断するためのヌクレアーゼを形成するために都合よく使用される。本明細書中に記載されるようなリンカーは、切断のために使用されるヌクレアーゼ対の標的部位が、様々な間隔であるとき、例えば、標的部位が５または６塩基対ではない塩基対だけ離れている（例えば、７、８、９塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れている）とき、ＤＮＡの切断を可能にする。切断は、ゲノム配列（例えば、細胞クロマチンにおける目的の領域）を相同であるが同一でない配列で置き換えるため（すなわち、標的化された組換え）；ゲノム内の１つまたはそれを超える部位においてＤＮＡを切断し、次いで、その切断部位を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってつなげることによってゲノム配列を欠失させるため；相同組換えを促進する細胞性因子についてスクリーニングするため；および／または野生型配列を変異体配列で置き換えるため、もしくは一方の対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換するための、細胞クロマチンにおける目的の領域（例えば、ゲノム内の、例えば、変異体または野生型の遺伝子内の、所望のまたは所定の部位）での切断であり得る。そのような方法は、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号（全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されている。
【０１７５】
したがって、開示されるリンカーは、特異的に標的化された切断が望ましい任意の方法のために任意のヌクレアーゼにおいて使用され得、および／または任意のゲノム配列を相同であるが同一でない配列で置き換えるために使用され得る。例えば、変異体ゲノム配列が、その野生型対応物によって置き換えられることにより、例えば、遺伝性疾患、遺伝性障害、癌および自己免疫疾患を処置するための方法が提供され得る。同様に、ある遺伝子の一方の対立遺伝子が、本明細書中に開示される標的化された組換えの方法を用いて、異なる対立遺伝子によって置き換えられ得る。実際に、特定のゲノム配列に依存する任意の病態が、任意の様式で、本明細書中に開示される方法および組成物を用いて、癒され得るか、または軽減され得る。
【０１７６】
例示的な遺伝性疾患としては、軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１０２７００）、副腎脳白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ−１抗トリプシン欠損症、アルファ−サラセミア、アルツハイマー（Ａｌｓｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈源性右室、異形成、毛細血管拡張性運動失調、バース症候群、ベータ−サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニー貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｓ）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス，ベータ−グロビンの６つ目のコドンにおけるヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター（Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ）症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全（ＬＡＤ，ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１１６９２０）、白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン（Ｎｅｉｍａｎｎ）・ピック病、骨形成不全症、パーキンソン病、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュバックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル・リンダウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・オールドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ，ＯＭＩＭ  Ｎｏ．３０８２４０）およびＸ連鎖ＳＣＩＤが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
標的化されたＤＮＡ切断および／または相同組換えによって処置され得るさらなる例示的な疾患としては、後天性免疫不全、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ・サックス病）、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｉｄｏｓｉｓ）（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）および血友病が挙げられる。
【０１７８】
感染性のまたはインテグレートされたウイルスゲノムの標的化切断は、宿主におけるウイルス感染症を処置するために使用することができる。さらに、ウイルスに対するレセプターをコードする遺伝子の標的化切断は、そのようなレセプターの発現を阻止し、それにより、宿主生物におけるウイルス感染および／またはウイルス拡散を防ぐために使用することができる。ウイルスレセプター（例えば、ＨＩＶに対するＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４レセプター）をコードする遺伝子の標的化された突然変異誘発は、それらのレセプターをウイルスに結合できなくして、それにより、新たな感染を防ぎ、既存の感染の拡大を阻止するために使用することができる。国際特許公開ＷＯ２００７／１３９９８２を参照のこと。標的化され得るウイルスまたはウイルスレセプターの非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。肝炎ファミリーのウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。他のウイルスまたはそれらのレセプターも標的化され得、それらとしては、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ型など）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；レンチウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる）ＨＩＶ−ＩＩ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）を参照のこと。ＨＩＶに対するレセプターとしては、例えば、ＣＣＲ−５およびＣＸＣＲ−４が挙げられる。
【０１７９】
開示されるリンカーを含むヌクレアーゼは、１つまたはそれを超えるゲノム配列の不活性化（部分的または完全）のためにも使用され得る。不活性化は、例えば、単一の切断事象によって、切断後の非相同末端結合によって、２つの部位における切断の後にそれらの２つの切断部位の間の配列を欠失させるようにつなぐことによって、コード領域内へのミスセンスコドンもしくは非センスコドンの標的化された組換えによって、遺伝子もしくは制御領域を破壊するような、その遺伝子内もしくはその制御領域内への無関係な配列（すなわち、「スタッファー」配列）の標的化された組換えによって、またはイントロンへのスプライス受容配列の組換えを標的化して転写物のミススプライシングを引き起こすことによって、達成され得る。
【０１８０】
ヌクレアーゼによって媒介される内因性遺伝子の不活性化（例えば、ノックアウト）は、例えば、アポトーシスまたはタンパク質産生（例えば、フコシル化などの翻訳後修飾）に関わる遺伝子が欠損した細胞株を作製するために使用され得る。ＺＦＮによって媒介される不活性化は、トランスジェニック生物（例えば、植物、げっ歯類およびウサギ）を作製するためにも使用され得る。
【０１８１】
さらに、ヌクレアーゼは、対をなす２つのハーフ部位の間のＤＮＡ配列に対して特異性を有するとみられないので、本明細書中に記載されるようなリンカーを有するヌクレアーゼは、得られる一本鎖オーバーハングが任意の所望の配列を有するようにＤＮＡを切断するようにデザインされ得る。特に、本明細書中に記載されるようなリンカーは、開始時の配列に対して、これらの一本鎖オーバーハングのサイズと位置の両方に影響するようにデザインされ得る。したがって、本明細書中に記載されるようなリンカーは、ヌクレアーゼ対の１つまたはそれを超えるヌクレアーゼに組み込まれたとき、切断後に、より均一な末端をもたらし得る。したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、ヌクレアーゼで切断されたＤＮＡをより効率的にクローニングするためにも使用され得、これは、バイオテクノロジーおよび基礎科学の多くの領域において広く適用できる。
【０１８２】
したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、遺伝子改変の用途におけるヌクレアーゼ媒介性切断の改善に対して広範な有用性を提供する。本明細書中に記載されるようなリンカーは、部位特異的突然変異誘発、または標準的なクローニング、合成生物学のための大きなゲノムの構築、大きな配列の新しいタイプのＲＦＬＰ解析における多くの用途において使用されるサブクローニングによって、任意の既存のヌクレアーゼに容易に組み込まれ得るか、または極端に大きいＤＮＡ配列が関わる新しいタイプのクローニングを可能にさえし得る。堅固なリンカーを有するヌクレアーゼの潜在的な特性は、ＤＮＡコンピューティングなどの用途においても理想的であり得る。
【０１８３】
以下の実施例は、ヌクレアーゼが１つまたはそれを超えるＺＦＮを含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは、単に例示の目的のためであること、ならびに他のＤＮＡ結合ドメイン、例えばＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、ｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム）などを使用することができることが、認識される。操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインの天然に存在するものと異種切断ドメインとの融合物、ならびに操作された一本鎖ガイドＲＮＡを使用するＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどのヌクレアーゼシステムをはじめとした、他のヌクレアーゼを使用することもできる。
【実施例】
【０１８４】
（実施例１）
リンカーの選択
２０１５００６４７８９に記載されるように細菌選択系からリンカーを選択した。完全にランダム化された４〜２２アミノ酸のリンカーライブラリーを、ＺＦＮ二量体のＺＦＮのうちの一方のＮ末端ＦｏｋＩドメインとＣ末端ＺＦＰ結合ドメインとの間にクローニングした（図２）。２つのＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＮ）結合部位間に６、７、８、９、１０、または１１塩基対の間隔をあけた標的に選択を行った（これらの結合部位はＤＮＡの同じ鎖上にあった）。
【０１８５】
この選択では、ＺＦＮをコードするプラスミド（ＺＦＮの発現がアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される）、およびＴ７プロモーターから細菌ｃｃｄＢトキシンを発現し、ＺＦＮ標的部位を含むプラスミド（ｐＴｏｘ）で細菌を形質転換した。この系は、約１０８という複雑度および高ストリンジェンシーオプション（生存に必要な＞１００切断事象）を有する非常に大きなリンカーライブラリーを検索することができる。
【０１８６】
発現されたＺＦＮは、ｐＴｏｘを切断して、ｐＴｏｘの分解をもたらし；次いで、細胞死滅のためにｃｃｄＢトキシンのスイッチをオンにし；生存したもの（ＺＦＮによって切断されたｐＴｏｘを有するもの）を増幅し、リンカーをコードする遺伝子を、次のサイクルのために新しいプラスミドに再クローニングした。４、６、および９ラウンドの選択後にリンカーを配列決定した。選択されたリンカーの分析は、結合部位間のスペーサーの長さと相関した長さの傾向を示した。選択されたリンカー配列を図４〜８および１１に示す。
【０１８７】
（実施例２）
インビボ活性
次いで、リンカーをインビボでの活性についてスクリーニングした。米国特許第７，９５１，９２５号（ＣＣＲ５）および同第８，１１０，３７９号（ＡＡＶＳ１）に開示される、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに切断ドメイン（野生型または操作されたＦｏｋＩ）を融合する選択されたリンカーを使用して、ＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１標的部位（しかし同じＤＮＡ鎖上にある）を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を調製した。
【０１８８】
選択された構成はヒトゲノムには見出されないため、ＡＡＶＳ１遺伝子座において示したギャップ間隔を伴ってヘッド・トゥ・テールＣＣＲ５標的部位を有するようにＫ５６２細胞を操作した。ヘッド・トゥ・テールＣＣＲ５スクリーニングからの最も性能の良いリンカーを使用して、ＣＣＲ５遺伝子座にヘッド・トゥ・テール構造のＡＡＶＳ１標的部位を有するように第２の組の細胞株を操作した。選択されたリンカーを、それらが選択されたギャップ間隔におけるＺＦＮとして試験した。
【０１８９】
図９および１０に示されるように、例示的なＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１遺伝子座においてテール・トゥ・テールコントロールと同様かまたはそれよりも良好な活性を示した多くのリンカーが同定された。
【０１９０】
このデータは、記載されるリンカーを含むヌクレアーゼが、標的部位が同じ鎖上にある（ヘッド・トゥ・テール構造）ときに活性であることを証明している。
【０１９１】
（実施例３）
可搬性研究
前出の２つのスクリーニングから、６および７塩基対間隔それぞれにつき上位８つのリンカー（図１１に示す）をさらなる試験のために選択した。この可搬性研究の実験デザインは図１２に示されている。次の３つの構成のそれぞれについて、ＣＴＬＡ４遺伝子に対する１０個のＺＦＮ対をデザインした：１）テール・トゥ・テール、２）６塩基対間隔のヘッド・トゥ・テール、および３）７塩基対間隔のテール・トゥ・テール。ヘッド・トゥ・テール構成については、１０個一組のＺＦＮ対を各間隔につき上位８つのリンカーのそれぞれを用いて試験した。７塩基対間隔では、一定のＺＦＮは、標準的リンカー（Ｌ０）または拡張されたリンカー（Ｌ７ｃ５）のいずれかを含んだ。８塩基対間隔のために選択されたさらなる２つのリンカーも含めた。トランスフェクションはＫ５６２細胞内で行った。
【０１９２】
図１３および１４は、一定のＺＦＮに標準的リンカー（Ｌ０）を使用した可搬性研究における各対についてのＮＨＥＪ活性を示す。１０個のＺＦＮ対は左側の縦列に記載されており、８個のリンカーは上部の横列に記載されている。下部にあるのが１０個のテール・トゥ・テールＺＦＮ対である。図面に示されているように、６および７塩基対間隔のヘッド・トゥ・テールＺＦＮに対する最良のリンカーの平均活性は、テール・トゥ・テール構成に対する平均よりも高かった。
【０１９３】
図１５は、ヘッド・トゥ・テール構造にある図１３および１４のＺＦＮのうち６つのＮＨＥＪ活性の比較を示している。ここでは、各対における２つのＺＦＮ間でＦｏｋＩドメインの極性が切り替わった。これらの結果は、選択されたリンカーが、偏性ヘテロ二量体ＦｏｋＩのいずれの極性においても高度に活性なＺＦＮを可能にすることを示している。
【０１９４】
図１６および１７は、６塩基対間隔（Ｎ６ａ、Ｎ６ｂ、Ｎ６ｃ）および７塩基対間隔（Ｎ７ａ、Ｎ７ｂ、Ｎ７ｃ）のそれぞれについて上位３つのリンカーを比較する、ＡＡＶＳ１イントロン１に対してデザインされたＺＦＮについてのＮＨＥＪ活性を示している。図１６は、ＡＡＶＳ１遺伝子のイントロン内にある高感受性部位を標的とするＺＦＮを示し、一方で図１７は、ＡＡＶＳ１遺伝子のイントロン１全体から高感受性部位を除外したものを標的とするＺＦＮを示している。次の構成のそれぞれにつき、１９個のＺＦＮ対をデザインした：１）テール・トゥ・テール構成、２）６塩基対間隔のヘッド・トゥ・テール構成、および３）７塩基対間隔のヘッド・トゥ・テール構成。このデータは、記載されるリンカーが、複数の遺伝子およびデザインにわたって高度に活性であるヘッド・トゥ・テール構成のＺＦＮを可能にすることを示している。
【０１９５】
（実施例４）
ヘッド・トゥ・ヘッド構成
次いで、６および７塩基対間隔のそれぞれについて、実施例３において同定された２つの最良のリンカーを、ヘッド・トゥ・ヘッド構成で試験するために選択した（図１Ｃを参照のこと）。５、６、７、８、または９塩基対間隔のそれぞれにつき、１１個の対をデザインした。６、７、および８塩基対間隔は、４つすべてのリンカーを使用したが、５塩基対間隔は、最良の６塩基対リンカー２つのみを使用し、９塩基対間隔は、最良の７塩基対リンカー２つのみを使用した。
【０１９６】
図１８に示されているように、試験されたすべてのリンカーで、７、８、および９塩基対間隔における高レベルの遺伝子改変が達成された。
【０１９７】
このように、本明細書中に記載されるリンカーは、同じＤＮＡ鎖上の標的部位に結合するようデザインされた（例えば、ヘッド・トゥ・テール構成）、または標準から逆転した構成（例えば、テール・トゥ・テール構成）で向かい合ったＤＮＡ鎖上の標的部位に結合するようデザインされた（例えば、ヘッド・トゥ・ヘッド構成）ヌクレアーゼに組み込まれると、高い活性を示す。
【０１９８】
（実施例５）
間隔が拡大されたテール・トゥ・テール構成
５〜６塩基対間隔を使用する従来のＺＦＮと比べて、７、８、または９塩基対間隔のいずれかを用いるテール・トゥ・テール構成のＺＦＮについても、選択を行った。この選択におけるＺＦＮの設定は図１９Ａに示されている。両方のＺＦＮが同じ選択されたリンカーを含む場合（図１９Ａ上部）、この構成を対称テール・トゥ・テールと呼ぶ。この構成は、リンカーライブラリーおよびホモ二量体標的部位を含む単一のＺＦＮを使用して選択した。一方のＺＦＮが選択されたリンカーを含み、他方のＺＦＮがＬ０リンカー（すなわち、ＬＲＧＳＱＬＶＫＳ、配列番号２８３）を含む場合、この構成を非対称テール・トゥ・テールと呼ぶ。この構成は、Ｌ０リンカーを含む一定のＺＦＮと、ヘテロ二量体標的部位上にリンカーライブラリーを含むものとを使用して選択した。選択は、実施例１および米国特許公開番号２０１５００６４７８９に記載のように行った。
【０１９９】
図１９Ｂは、インビボで試験した各構成の構造および間隔についての例示的なリンカーを示している。ＣＣＲ５遺伝子座において示されている間隔でＣＣＲ５標的部位を有するようにＫ５６２細胞を操作した。ＣＣＲ５  ＺＦＮを使用したこれらの構造のそれぞれについて、最も性能の高いリンカーが示されている。この表には、細胞株のそれぞれに対する陽性コントロールであるＡＡＶＳ１  ＺＦＮも示されている。このデータは、標準より大きな間隔において非対称または対称のいずれかのテール・トゥ・テール構造を使用したＺＦＮが、代表的なテール・トゥ・テールＺＦＮと同様に機能したことを示している。
【０２００】
図１９Ｂからの例示的なリンカーを、可搬性研究におけるさらなる試験のために使用する。次の構成のそれぞれにつき、８つのＺＦＮ対をデザインする：１）５または６塩基対間隔のテール・トゥ・テール（比較用）、２）７塩基対間隔のテール・トゥ・テール、３）８塩基対間隔のテール・トゥ・テール、および４）９塩基対間隔のテール・トゥ・テール。７、８、および９塩基対間隔については、例示的なリンカーのパネルを対のうちの一方のＺＦＮにクローニングし、インビボで（実施例３と同様の様式で）試験する。すべてのＺＦＮが活性であることが示されている。
【０２０１】
本明細書中で言及されたすべての特許、特許出願および刊行物は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０２０２】
開示は、理解を明確にするという目的のために例証および例示という意図でいくらか詳細に提供されてきたが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変が実施され得ることは、当業者には明らかである。したがって、前述の記載および例は、限定と解釈されるべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｂ】
2019503198.tif 000020
【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2019503198.tif 000027
【図１７】
2019503198.tif 000028
【図１８】
2019503198.tif 000029
【図１９Ａ】
2019503198.tif 000030
【図１９Ｂ】
2019503198.tif 000031
【配列表】
2019503198000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月2日(2018.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合ドメイン、野生型または操作された切断ドメイン、および該ＤＮＡ結合ドメインと該切断ドメインとの間のアミノ酸リンカーを含む融合分子であって、該リンカーが、以下のとおりの配列：ＳＧＳＬＲＧＶＤＰＭＷＨ（配列番号７８）；ＳＧＲＳＰＥＭＤＷＣ（配列番号６２）；ＧＡＳＬＧＰＰＷＣＰ（配列番号８０）；ＳＧＬＰＭＧＳＹＧＳ（配列番号８１）；ＳＧＱＳＰＧＤＶＧＦ（配列番号７１）；ＳＧＡＩＹＡＲＰＩＥ（配列番号８２）；ＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ（配列番号８３）；ＳＧＶＫＲＤＳＥＩＩ（配列番号８４）；ＳＱＡＴＰＴＬＹＹＴＰＬ（配列番号８８）；ＳＧＱＰＭＦＳＷＳＤ（配列番号１０９）；ＳＧＥＲＲＱＳＨＶＬ（配列番号１１４）；ＳＧＡＩＲＣＨＤＥＦＷＦ（配列番号１００）；ＳＧＡＬＱＥＰＷＳＩ（配列番号９１）；ＳＧＦＮＨＳＳＣＤＶＶＹ（配列番号１３８）；ＱＳＧＫＩＡＳＰＨＶＶＩ（配列番号１４７）；ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ（配列番号１５４）；ＭＧＤＥＨＲＫＬＲＬＭＳＱＭＲＬＱＶＤ（配列番号２５４）；ＫＰＲＴＤＲＫＩＦＳＬＲＬＡＮ（配列番号２５５）；ＮＰＬＰＲＮＫＹＰＳＰＹＦＬＨ（配列番号２６６）；ＡＰＰＡＡＳＫＳＲＴＷＥＭＲＲ（配列番号２６７）；ＬＮＲＰＫＬＮＴＲＰＨＹＴＳＶ（配列番号２６８）；ＱＴＲＰＰＲＳＦＣＭＬＡＭＴＧ（配列番号２６９）；ＭＨＧＰＲＬＰＰＬＫＬＣＧＡＷＳＩＧ（配列番号２７０）；ＧＰＲＶＶＴＲＲＶＬＡＴＶＴＶＡ（配列番号２７１）；ＬＧＭＶＳＲＰＲＬＮＱＲＡＰＩＰＫＳ（配列番号２７２）；ＱＹＰＲＨＰＴＴＳＫＲＩＧＰＴＤＲＶＬＴ（配列番号２７３）；ＹＰＲＥＡＴＳＲＲＥＴＤＩＬＮＳＫＲＬＬＳ（配列番号２７４）；ＱＣＮＰＶＬＫＣＲＴＩＫＰＧＰＳＡＡ（配列番号２７５）；ＱＰＴＷＭＫＳＰＲＫＫＲＹＰＴＧＲＬＴＡＱ（配列番号２７６）；ＤＰＥＹＬＳＱＲＶＰＲＲＲＱＫＰＰＭＴＲＰＹ（配列番号２７７）；ＭＥＱＲＶＲＡＴＮＰＲＲＲＬＡＩＬＴＴＥＳＦＭ（配列番号２７８）；ＱＳＰＮＭＩＱＲＴＰＫＲＲＴＰＬＴＩＰＬＲ（配列番号２７９）；ＡＧＮＣＡＲＬＴＶＲＰＰＦＳＨＰ（配列番号２８０）；またはＥＲＰＰＲＳＬＡＳＰＰＨＡＬＬＬ（配列番号２８１）を含む、融合分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬ−エフェクタードメイン、または一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
前記リンカーが、前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端と前記切断ドメインのＣ末端との間に伸びている、請求項１または請求項２に記載の融合分子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の第１の融合分子と、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の野生型または操作された切断ドメインを含む第２の融合分子とを含む、二量体。
【請求項５】
前記第２の融合分子が、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記切断ドメインとの間のリンカーをさらに含み、該リンカーが、以下のとおりの配列：ＳＧＳＬＲＧＶＤＰＭＷＨ（配列番号７８）；ＳＧＲＳＰＥＭＤＷＣ（配列番号６２）；ＧＡＳＬＧＰＰＷＣＰ（配列番号８０）；ＳＧＬＰＭＧＳＹＧＳ（配列番号８１）；ＳＧＱＳＰＧＤＶＧＦ（配列番号７１）；ＳＧＡＩＹＡＲＰＩＥ（配列番号８２）；ＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ（配列番号８３）；ＳＧＶＫＲＤＳＥＩＩ（配列番号８４）；ＳＱＡＴＰＴＬＹＹＴＰＬ（配列番号８８）；ＳＧＱＰＭＦＳＷＳＤ（配列番号１０９）；ＳＧＥＲＲＱＳＨＶＬ（配列番号１１４）；ＳＧＡＩＲＣＨＤＥＦＷＦ（配列番号１００）；ＳＧＡＬＱＥＰＷＳＩ（配列番号９１）；ＳＧＦＮＨＳＳＣＤＶＶＹ（配列番号１３８）；ＱＳＧＫＩＡＳＰＨＶＶＩ（配列番号１４７）；ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ（配列番号１５４）；ＭＧＤＥＨＲＫＬＲＬＭＳＱＭＲＬＱＶＤ（配列番号２５４）；ＫＰＲＴＤＲＫＩＦＳＬＲＬＡＮ（配列番号２５５）；ＮＰＬＰＲＮＫＹＰＳＰＹＦＬＨ（配列番号２６６）；ＡＰＰＡＡＳＫＳＲＴＷＥＭＲＲ（配列番号２６７）；ＬＮＲＰＫＬＮＴＲＰＨＹＴＳＶ（配列番号２６８）；ＱＴＲＰＰＲＳＦＣＭＬＡＭＴＧ（配列番号２６９）；ＭＨＧＰＲＬＰＰＬＫＬＣＧＡＷＳＩＧ（配列番号２７０）；ＧＰＲＶＶＴＲＲＶＬＡＴＶＴＶＡ（配列番号２７１）；ＬＧＭＶＳＲＰＲＬＮＱＲＡＰＩＰＫＳ（配列番号２７２）；ＱＹＰＲＨＰＴＴＳＫＲＩＧＰＴＤＲＶＬＴ（配列番号２７３）；ＹＰＲＥＡＴＳＲＲＥＴＤＩＬＮＳＫＲＬＬＳ（配列番号２７４）；ＱＣＮＰＶＬＫＣＲＴＩＫＰＧＰＳＡＡ（配列番号２７５）；ＱＰＴＷＭＫＳＰＲＫＫＲＹＰＴＧＲＬＴＡＱ（配列番号２７６）；ＤＰＥＹＬＳＱＲＶＰＲＲＲＱＫＰＰＭＴＲＰＹ（配列番号２７７）；ＭＥＱＲＶＲＡＴＮＰＲＲＲＬＡＩＬＴＴＥＳＦＭ（配列番号２７８）；ＱＳＰＮＭＩＱＲＴＰＫＲＲＴＰＬＴＩＰＬＲ（配列番号２７９）；ＡＧＮＣＡＲＬＴＶＲＰＰＦＳＨＰ（配列番号２８０）；またはＥＲＰＰＲＳＬＡＳＰＰＨＡＬＬＬ（配列番号２８１）を含む、請求項４に記載の二量体。
【請求項６】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、二本鎖標的ＤＮＡにおいてＤＮＡの逆鎖または同じ鎖に結合する、請求項４または請求項５に記載の二量体。
【請求項７】
標的二本鎖ＤＮＡにおいて二本鎖または一本鎖の切断部を作る、請求項４から６のいずれかに記載の二量体。
【請求項８】
前記第１および第２の融合分子の前記ＤＮＡ結合ドメインが、６〜１１塩基対だけ離れた標的部位に結合する、請求項４から７のいずれかに記載の二量体。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかに記載の融合分子または請求項４から７のいずれかに記載の二量体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれかに記載の１つもしくはそれを超える融合分子、または請求項４から７のいずれかに記載の二量体を含む、単離された細胞。
【請求項１１】
細胞内の細胞クロマチンを改変する方法であって、該方法が、
該細胞クロマチンが改変されるように請求項４から７のいずれかに記載の二量体で該細胞クロマチンを切断する工程を含み、ここで、該二量体が、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドを使用して該細胞に導入される、方法。
【請求項１２】
前記改変が、挿入および／または欠失を前記細胞クロマチンに導入する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変が、ドナー配列のインテグレーションを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれかに記載の融合分子を含むキット。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の被験体を処置する方法において使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１から３のいずれかに記載の融合分子または請求項４から７のいずれかに記載の二量体を含み、ここで、該方法が、該組成物を該被験体の細胞に導入する工程を含み、該融合分子または二量体が、該細胞の内因性遺伝子座が改変されるように該内因性遺伝子座を切断する、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
これらの態様および他の態様は、概して、開示に照らすと当業者には容易に明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＤＮＡ結合ドメイン、野生型または操作された切断ドメイン、および該ＤＮＡ結合ドメインと該切断ドメインとの間のアミノ酸リンカーを含む融合分子であって、該リンカーが、配列番号６〜２８１のいずれかに示されているとおりの配列を含む、融合分子。
（項目２）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬ−エフェクタードメイン、または一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、項目１に記載の融合分子。
（項目３）
前記リンカーが、前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端と前記切断ドメインのＣ末端との間に伸びている、項目１または項目２に記載の融合分子。
（項目４）
項目１から３のいずれかに記載の第１の融合分子と、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の野生型または操作された切断ドメインを含む第２の融合分子とを含む、二量体。
（項目５）
前記第２の融合分子が、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記切断ドメインとの間のリンカーをさらに含み、該リンカーが、配列番号６〜２８１のいずれかに示されているとおりの配列を含む、項目４に記載の二量体。
（項目６）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、二本鎖標的ＤＮＡにおいてＤＮＡの逆鎖または同じ鎖に結合する、項目４または項目５に記載の二量体。
（項目７）
標的二本鎖ＤＮＡにおいて二本鎖または一本鎖の切断部を作る、項目４から６のいずれかに記載の二量体。
（項目８）
前記第１および第２の融合分子の前記ＤＮＡ結合ドメインが、６〜１１塩基対だけ離れた標的部位に結合する、項目４から７のいずれかに記載の二量体。
（項目９）
項目１から３のいずれかに記載の融合分子または項目４から７のいずれかに記載の二量体をコードするポリヌクレオチド。
（項目１０）
項目１から３のいずれかに記載の１つもしくはそれを超える融合分子、または項目４から７のいずれかに記載の二量体を含む、単離された細胞。
（項目１１）
細胞内の細胞クロマチンを改変する方法であって、該方法が、
該細胞クロマチンが改変されるように項目４から７のいずれかに記載の二量体で該細胞クロマチンを切断する工程を含み、ここで、該二量体が、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドを使用して該細胞に導入される、方法。
（項目１２）
前記改変が、挿入および／または欠失を前記細胞クロマチンに導入する工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記改変が、ドナー配列のインテグレーションを含む、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
項目１から３のいずれかに記載の融合分子を含むキット。
（項目１５）
ヒトまたは動物の被験体を処置する方法において使用するための項目１から３のいずれかに記載の融合分子または項目４から７のいずれかに記載の二量体であって、ここで、該方法が、該融合分子または二量体を該被験体の細胞に導入する工程を含み、該融合分子または二量体が、該細胞の内因性遺伝子座が改変されるように該内因性遺伝子座を切断する、融合分子または二量体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｆ】
2019503198.tif 000032
【国際調査報告】
2019503198.tif 000033
2019503198.tif 000034
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