(57)【要約】  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合タンパク質（ＴＦＰ）、１つ以上のＴＦＰを発現するように改変されたＴ細胞、及びがんを含む疾患の治療のためのその使用方法が本明細書で提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメイン
を含む、前記ＴＣＲサブユニット、ならびに
（ｂ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、
前記ＴＦＰがＴ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、前記単離された組み換え核酸分子。
【請求項２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメイン
を含む、前記ＴＣＲサブユニット、ならびに
（ｂ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、
前記ＴＦＰがＴ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、前記単離された組み換え核酸分子。
【請求項３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメイン
を含む、前記ＴＣＲサブユニット、ならびに
（ｂ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、
前記ＴＦＰがＴ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、前記単離された組み換え核酸分子。
【請求項４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメイン
を含む、前記ＴＣＲサブユニット、ならびに
（ｂ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、
前記ＴＦＰがＴ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、前記単離された組み換え核酸分子。
【請求項５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲアルファの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメイン
を含む、前記ＴＣＲサブユニット、ならびに
（ｂ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、
前記ＴＦＰがＴ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、前記単離された組み換え核酸分子。
【請求項６】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）ＴＣＲサブユニットであって、
（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメイン
を含む、前記ＴＣＲサブユニット、ならびに
（ｂ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが作動可能に連結され、
前記ＴＦＰがＴ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、前記単離された組み換え核酸分子。
【請求項７】
ＴＣＲサブユニットと、抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子。
【請求項８】
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインが、作動可能に連結されている、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記ＴＦＰが、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、請求項７〜８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記コードされた抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
前記コードされたリンカー配列が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲの細胞外ドメインを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲの細胞内ドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
前記ＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲの膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲの細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが同じＴＣＲサブユニット由来である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
前記ＴＣＲサブユニットが、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、抗体フラグメントを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
（ｉ）本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ軽鎖結合ドメインの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３に対してそれぞれ７０〜１００％の配列同一性を有する抗ＢＣＭＡ軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ重鎖結合ドメインの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３に対してそれぞれ７０〜１００％の配列同一性を有する抗ＢＣＭＡ重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３をコードする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、本明細書で提供される軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供される軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
重鎖可変領域をコードし、前記重鎖可変領域が、本明細書で提供される重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供される重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
前記ＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
前記コードされたＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
前記コードされたＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
共刺激ドメインをコードする配列を更に含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
前記共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれらに対して少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
前記それらに対して少なくとも１つから最大２０までの修飾が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または前記ＴＦＰへのリガンド結合に反応してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
前記単離された核酸分子が、ｍＲＮＡである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
前記ＴＦＰが、ＣＤ３ゼータのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的フラグメント、及びそれらに対して少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含むＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭと置き換わる、請求項３０に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ゼータのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭと置き換わる、請求項３０に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド類似体が、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホルアミダイトからなる群から選択される、請求項３３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
リーダー配列を更に含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド分子。
【請求項３７】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子。
【請求項３８】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、前記単離された組み換えＴＦＰ分子。
【請求項３９】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することが可能である、前記単離された組み換えＴＦＰ分子。
【請求項４０】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、請求項３７に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４１】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４２】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ軽鎖のアミノ酸配列に対して９５〜１００％の同一性を有する重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４３】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ重鎖のアミノ酸配列に対して９５〜１００％の同一性を有する軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４４】
ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲの細胞外ドメインを含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４５】
リンカー配列による前記ＴＣＲの細胞外ドメイン、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４６】
リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項５７に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項４７】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子。
【請求項４８】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、前記単離された組み換えＴＦＰ分子。
【請求項４９】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することが可能である、前記単離された組み換えＴＦＰ分子。
【請求項５０】
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む、請求項４９に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５１】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶＨＨドメインである、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５２】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に記載の３つのＣＤＲ配列を有する重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５３】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１に記載の３つのＣＤＲ配列を有する重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５４】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列に対して９５〜１００％の同一性を有するＶＨＨドメイン、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５５】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列に対して９５〜１００％の同一性を有するＶＨＨドメイン、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲの細胞外ドメインを含む、請求項４７〜５３のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５７】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５８】
リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項５７に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項５９】
共刺激ドメインをコードする配列を更に含む、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項６０】
細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む、請求項３７〜５９のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項６１】
リーダー配列を更に含む、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ分子。
【請求項６２】
請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする配列を含む核酸。
【請求項６３】
前記核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、請求項６２に記載の核酸。
【請求項６４】
前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項６２または６３に記載の核酸。
【請求項６５】
前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６６】
前記ヌクレオチド類似体が、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホルアミダイトからなる群から選択される、請求項６５に記載の核酸。
【請求項６７】
プロモーターを更に含む、請求項６２〜６６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６８】
前記核酸が、インビトロで転写された核酸である、請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６９】
前記核酸が、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を更に含む、請求項６２〜６８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７０】
前記核酸が、３’ＵＴＲ配列を更に含む、請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７１】
請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクター。
【請求項７２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項７１に記載のベクター。
【請求項７３】
プロモーターを更に含む、請求項７１または７２に記載のベクター。
【請求項７４】
前記ベクターが、インビトロで転写されたベクターである、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７５】
前記ベクターにおける核酸配列が、ポリ（Ａ）尾部を更に含む、請求項７１〜７４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７６】
前記ベクターにおける核酸配列が、３’ＵＴＲを更に含む、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７７】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項６２〜７０のいずれか１項に記載の核酸、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項７８】
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項７７に記載の細胞。
【請求項７９】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項７８に記載の細胞。
【請求項８０】
細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を更に含む、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８１】
前記抑制分子が、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドを含む、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８２】
少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、前記ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の中で、その細胞において及び／またはその細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項８３】
タンパク質複合体であって、
ｉ）ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子、ならびに
ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体、
を含む、前記タンパク質複合体。
【請求項８４】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項８３に記載のタンパク質複合体。
【請求項８５】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている、請求項８３または８４に記載のタンパク質複合体。
【請求項８６】
リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項８５に記載のタンパク質複合体。
【請求項８７】
タンパク質複合体であって、
（ａ）請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされたＴＦＰ、及び
（ｂ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体、
を含む、前記タンパク質複合体。
【請求項８８】
タンパク質複合体であって、
ｉ）ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子、ならびに
ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体、
を含む、前記タンパク質複合体。
【請求項８９】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項８８に記載のタンパク質複合体。
【請求項９０】
前記抗ＢＣＭＡ結合ドメインが、リンカー配列によって前記ＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている、請求項８８または８９に記載のタンパク質複合体。
【請求項９１】
リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項９０に記載のタンパク質複合体。
【請求項９２】
請求項８３〜８７のいずれか１項に記載のタンパク質複合体当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項９３】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされた少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項９４】
ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団の前記Ｔ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個別的にまたは集合的に含み、前記ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の中で、その細胞において及び／またはその細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項９５】
ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団の前記Ｔ細胞が、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされた少なくとも２つのＴＦＰ分子を個別的または集合的に含む、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項９６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項６２〜７０のいずれか１項に記載の核酸、または請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のベクターでＴ細胞を形質導入することを含む、細胞の作製方法。
【請求項９７】
インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞の集団を生成する方法であって、前記ＲＮＡが、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子をコードする核酸を含む、前記方法。
【請求項９８】
哺乳類において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、有効量の請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項６２〜７０のいずれか１項に記載の核酸、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のベクター、または請求項７７〜８２及び８８〜９６のいずれか１項に記載の細胞を前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項９９】
前記細胞が、自己Ｔ細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、有効量の請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項６２〜７０のいずれか１項に記載の核酸、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のベクター、または請求項７７〜８２及び８８〜９６のいずれか１項に記載の細胞を前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０３】
ＢＣＭＡ発現に関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びＢＣＭＡの発現に関連する非がん関連症状からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記疾患が、中皮腫、乳頭漿液性卵巣腺癌、明細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病卵巣癌、混合型ミュラー管卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺腺癌、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の効力を増加させる薬剤と組み合わせて投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記哺乳類では、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する有効量のＴ細胞が投与された哺乳類と比較してより少ないサイトカインが放出される、請求項１０２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、請求項１０２〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
ＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＢＣＭＡに関連する前記疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、請求項１０２〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
薬剤としての使用のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載の単離されたＴＦＰ、請求項６２〜７０のいずれか１項に記載の核酸、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のベクター、請求項８３〜８７のいずれか１項に記載の複合体、または請求項７７〜８２及び８８〜９６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１０】
ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、有効量の請求項１〜３５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子、請求項３６に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、請求項６２〜７０のいずれか１項に記載の核酸、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のベクター、または請求項７７〜８２及び８８〜９６のいずれか１項に記載の細胞を前記哺乳類に投与することを含み、前記哺乳類では、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する有効量のＴ細胞が投与された哺乳類と比較してより少ないサイトカインが放出される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年８月２日に出願された米国仮出願第６２／３７０，１８９号の利益を主張し、それはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血液悪性腫瘍または末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準的治療では治癒不可能である。また、伝統的な治療選択肢はしばしば、重篤な副作用を有する。がん性細胞を排斥するための患者の免疫系を関わらせる多くの試み、すなわち、がん免疫療法と集合的に称されるアプローチがなされてきた。しかしながら、いくつかの障害が、臨床効果の達成をやや困難にしている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されてきたが、これらはしばしば、自己由来であるため、がん免疫療法を健康な組織に向かわせる可能性があるか、または免疫原性に乏しい。更に、がん細胞は複数の機構を使用してそれら自身を見えなくするか、またはがん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に敵対する。
【０００３】
がん細胞上の好適な細胞表面分子に遺伝子操作されたＴ細胞を向け直すことに頼るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾自己Ｔ細胞療法を使用する最近の発展は、がんを治療するために免疫系の力を利用する際に期待できる結果を示している。例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた進行中の治験からの臨床結果は、いくつかの多発性骨髄腫の患者において部分寛解を示した（１つのそのような治験は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖの識別番号ＮＣＴ０２２１５９６７を介して見ることができる）。代替的なアプローチは、自己Ｔ細胞を遺伝子操作するための腫瘍関連ペプチド抗原のために選択されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖の使用である。これらのＴＣＲ鎖は、完全なＴＣＲ複合体を形成し、Ｔ細胞に第２の定義された特異性のためのＴＣＲを提供する。滑膜癌を有する患者においてＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲアルファ及びベータ鎖を発現する改変された自己Ｔ細胞を用いて有望な結果が得られた。
【０００４】
ＣＡＲまたは第２のＴＣＲを発現する遺伝子組み換えＴ細胞がインビトロ／エキソビボでそれぞれの標的細胞を認識及び破壊する能力に加えて、改変Ｔ細胞での成功裏での患者の治療は、Ｔ細胞に強力な活性化、増殖、経時的な持続性の能力があること、及び再発性疾患の場合、「記憶」反応を可能にすることを必要とする。ＣＡＲ  Ｔ細胞の高く管理可能な臨床的効力は、現在、メソテリン陽性Ｂ細胞悪性腫瘍及び、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド発現滑膜肉腫患者に限られる。遺伝子操作されたＴ細胞を様々なヒトの悪性腫瘍に対してより広く作用するように改善する明確な必要性が存在する。ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３デルタを含むＴＣＲサブユニット、ならびに既存のアプローチの限界を克服する潜在性を有する細胞表面抗原に特異的な結合ドメインを有するＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ鎖の新規な融合タンパク質が本明細書に記載されている。ＣＡＲよりも効率的に標的細胞を殺傷するが、同等のまたはより少ないレベルの炎症性サイトカインを放出する新規な融合タンパク質が本明細書に記載されている。これらのサイトカインのレベルの上昇は、養子ＣＡＲ−Ｔ療法についての用量制限毒性と関連しているため、これらの融合タンパク質及びそれらの使用方法は、ＣＡＲに対するＴＦＰの利点を表す。
【発明の概要】
【０００５】
ＢＣＭＡ結合タンパク質、ならびにそのようなＢＣＭＡ結合タンパク質を含む抗体及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）が本明細書で提供される。また、１つ以上のＴＦＰを発現するように改変されたＴ細胞、及び疾患の治療のためのその使用方法が提供される。
【０００６】
１つの態様において、ＴＣＲサブユニットと、抗ＢＣＭＡ結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【０００７】
１つの態様において、ＢＣＭＡ結合領域を含む抗体、例えば、二重特異性抗体をコードする単離された組み換え核酸分子（複数可）が本明細書で提供される。いくつかの例において、抗体は親和性成熟抗体である。いくつかの例において、ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ラクダ科または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの例において、抗体は、配列番号２４を含むＶＨＨ領域を有する。他の例において、抗体は、配列番号２８を含むＶＨＨ領域を有する。いくつかの例において、抗体は、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に記載のＣＤＲ配列を有する単一ドメイン抗体である。いくつかの例において、抗体は、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１に記載のＣＤＲ配列を有する単一ドメイン抗体である。
【０００８】
１つの態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、そのＴＦＰが、ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及びＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニット及び抗体ドメインが作動可能に連結され、ＴＦＰが、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【０００９】
１つの態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、そのＴＦＰが、ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及びＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニット及び抗体ドメインが作動可能に連結され、ＴＦＰが、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【００１０】
１つの態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、そのＴＦＰが、ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及びＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニット及び抗体ドメインが作動可能に連結され、ＴＦＰが、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【００１１】
１つの態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、そのＴＦＰが、ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及びＴＣＲアルファの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニット及び抗体ドメインが作動可能に連結され、ＴＦＰが、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【００１２】
１つの態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、そのＴＦＰが、ＴＣＲの細胞外ドメインの少なくとも一部、及びＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニット及び抗体ドメインが作動可能に連結され、ＴＦＰが、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する、単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【００１３】
１つの態様において、ＴＣＲサブユニットと、抗ＢＣＭＡ結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子が本明細書で提供される。
【００１４】
いくつかの例において、ＴＣＲサブユニット及び抗体ドメインは作動可能に連結されている。いくつかの例において、ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現される際にＴＣＲに合体する。いくつかの例において、コードされた抗原結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている。いくつかの例において、コードされたリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの例において、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲの細胞外ドメインを含む。いくつかの例において、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲの膜貫通ドメインを含む。いくつかの例において、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲの細胞内ドメインを含む。いくつかの例において、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲの膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲの細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが同じＴＣＲサブユニット由来である。いくつかの例において、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマもしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含む。いくつかの例において、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの例において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは抗体フラグメントを含む。いくつかの例において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインはｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。いくつかの例において、単離された核酸分子は、（ｉ）それぞれ本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ軽鎖結合ドメインの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３に対して７０〜１００％の配列同一性を有する抗ＢＣＭＡ軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）それぞれ本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ重鎖結合ドメインの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３に対して７０〜１００％の配列同一性を有する抗ＢＣＭＡ重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３をコードする。いくつかの例において、単離された核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、その軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供される軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの例において、単離された核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、その重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供される重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１５】
いくつかの例において、ＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの例において、コードされたＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの例において、コードされたＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの例において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの例において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれらに対して少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの例において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。いくつかの例において、単離された核酸分子はｍＲＮＡである。
【００１６】
いくつかの例において、ＴＦＰは、ＣＤ３ゼータのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までのそれらに対して修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含むＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。いくつかの例において、そのＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭと置き換わる。いくつかの例において、そのＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭと置き換わる。
【００１７】
いくつかの例において、核酸はヌクレオチド類似体を含む。いくつかの例において、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホルアミダイトからなる群から選択される。
【００１８】
１つの態様において、本明細書で提供される核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド分子が本明細書で提供される。
【００１９】
１つの態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離された組み換えＴＦＰ分子が本明細書で提供される。
【００２０】
１つの態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子であって、そのＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、単離されたＴＦＰ分子が本明細書で提供される。
【００２１】
１つの態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子であって、そのＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することが可能である、単離されたＴＦＰ分子が本明細書で提供される。
【００２２】
いくつかの例において、単離されたＴＦＰ分子は、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む。いくつかの例において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインである。いくつかの例において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で提供される重鎖のアミノ酸配列に対して９５〜１００％の同一性を有する重鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で提供される軽鎖のアミノ酸配列の９５〜１００％の同一性を有する軽鎖、その機能的フラグメント、または少なくとも１つから最大３０までの修飾を有するそのアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、単離されたＴＦＰ分子は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニット、それらの機能的フラグメント、及び少なくとも１つから最大２０までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲの細胞外ドメインを含む。いくつかの例において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている。いくつかの例において、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【００２３】
いくつかの例において、単離されたＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの例において、単離されたＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの例において、単離されたＴＦＰ分子は、リーダー配列を更に含む。
【００２４】
１つの態様において、本明細書で提供されるＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書で提供される。いくつかの例において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの例において、ベクターはプロモーターを更に含む。いくつかの例において、ベクターはインビトロで転写されたベクターである。いくつかの例において、ベクターにおける核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部を更に含む。いくつかの例において、ベクターにおける核酸配列は、３’ＵＴＲを更に含む。
【００２５】
１つの態様において、本明細書で提供されるベクターを含む細胞が本明細書で提供される。いくつかの例において、細胞はヒトＴ細胞である。いくつかの例において、Ｔ細胞はＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの例において、細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を更に含む。いくつかの例において、抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。
【００２６】
１つの態様において、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子が、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の中で、その細胞において及び／またはその細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供される。
【００２７】
１つの態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびに少なくとも１つの内因性ＴＣＲ複合体を含むＴＦＰ分子を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
【００２８】
いくつかの例において、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンのＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマのＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタのＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの例において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている。いくつかの例において、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【００２９】
いくつかの例において、ＴＦＰ分子は、複数のＴＣＲまたはＣＤ３サブユニット由来の配列を含む１つ以上のキメラドメインを含む。いくつかの例において、キメラＴＦＰは、遺伝子編集技術により改変される。
【００３０】
１つの態様において、本明細書に記載のタンパク質複合体当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供される。
【００３１】
１つの態様において、本明細書で提供されるベクターでＴ細胞を形質導入することを含む、細胞の作製方法が本明細書で提供される。
【００３２】
１つの態様において、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞の集団を生成する方法であって、そのＲＮＡが、本明細書で提供されるＴＦＰ分子をコードする核酸を含む、方法が本明細書で提供される。
【００３３】
１つの態様において、哺乳類において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、有効量の本明細書で提供されるＴＦＰ分子を発現するか、または本明細書で提供されるポリペプチド分子を発現する細胞を哺乳類に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。
【００３４】
いくつかの例において、細胞は自己Ｔ細胞である。いくつかの例において、細胞は同種異系Ｔ細胞である。いくつかの例において、哺乳類はヒトである。
【００３５】
１つの態様において、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、有効量の本明細書で提供されるＴＦＰ分子、本明細書で提供される細胞、または本明細書で提供されるポリペプチド分子を哺乳類に提供することを含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの例において、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びＢＣＭＡの発現に関連する非がん関連症状、例えば、全身性エリテマトーデス、高血圧、腎障害からなる群から選択される。いくつかの例において、疾患は、腎細胞癌、多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮内膜癌、及び胃癌からなる群から選択されるがんである。
【００３６】
いくつかの例において、疾患は、形質細胞障害、Ｂ細胞癌、白血病、リンパ腫、またはＢＣＭＡ発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるがんである。
【００３７】
いくつかの例において、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の効力を増加させる薬剤と組み合わせて投与される。そのような薬剤は、例えば、化学療法剤及び／または哺乳類における１つの腫瘍または複数の腫瘍の透過性を増加させることによってＴＦＰ分子を発現する細胞の効力を増加させる薬剤であり得る。いくつかの例において、ＴＦＰ分子を発現する細胞の効力を増加させる薬剤は、シクロホスファミドである。いくつかの例において、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する有効量のＴ細胞が投与された哺乳類と比較して、より少ないサイトカインが哺乳類で放出される。いくつかの例において、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの例において、ＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＢＣＭＡに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
【００３８】
１つの態様において、本明細書で提供される単離された核酸分子、本明細書で提供される単離されたポリペプチド分子、本明細書で提供される単離されたＴＦＰ、本明細書で提供される複合体、本明細書で提供されるベクター、または本明細書で提供される細胞は、薬剤としての使用のためのものである。
【００３９】
１つの態様において、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、有効量の本明細書で提供されるＴＦＰ分子、本明細書で提供される細胞、または本明細書で提供されるポリペプチド分子を哺乳類に提供することを含み、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する有効量のＴ細胞が投与された哺乳類と比較して、より少ないサイトカインが哺乳類で放出される、方法が本明細書で提供される。
【００４０】
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は、各々の個々の出版物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的且つ個別的に示されているのと同じ程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記述されている。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される具体的な実施形態を記述する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明のＴ細胞受容体融合ポリペプチド（ＴＦＰ）の使用を示す概略図である。例示的なＴＦＰは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ及び完全長ＣＤ３イプシロンポリペプチドを含有する。Ｔ細胞によって産生されるかまたはそれに導入される場合、ＴＦＰは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（２つのＣＤ３イプシロンポリペプチド、１つのＣＤ３ガンマポリペプチド、１つのＣＤ３デルタポリペプチド、２つのＣＤ３ゼータポリペプチド、１つのＴＣＲアルファサブユニット及び１つのＴＣＲベータサブユニットを含むことが示されており、水平の灰色セグメントは細胞膜を表す）の他のポリペプチドと会合して再プログラム化されたＴＣＲを形成し、その場合、内因性ＣＤ３イプシロンポリペプチドの一方または両方はＴＦＰによって置換される。
【図２Ａ】本発明の再プログラム化されたＴ細胞受容体融合ポリペプチド（ＴＦＰ）の例示的な変形例を示す概略図を表す。
【図２Ｂ】ｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ及び完全長ＴＣＲ  Ｖαポリペプチド及びｉｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ及び完全長ＴＣＲ  Ｖβポリペプチドを含む抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰを含有するＴＦＰを含有する例示的な再プログラム化されたＴＣＲを示す。
【図２Ｃ】ｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ及び欠失（Δ）ＴＣＲポリペプチド及びｉｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合したＢＣＭＡ  ＶＨＨ及び完全長ＣＤ３イプシロンポリペプチドを含む複数のＴＦＰを含有する例示的な再プログラム化されたＴＣＲを示す。欠失（Δ）ＴＣＲポリぺプチドは、Ｖαの削除によって欠失している。
【図２Ｄ】ｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ及び欠失（Δ）ＴＣＲ  Ｖαポリペプチド及びｉｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ及び欠失（Δ）ＴＣＲ  Ｖβポリペプチドを含む複数のＴＦＰを含有する例示的な再プログラム化されたＴＣＲを示す。欠失（Δ）ＴＣＲポリぺプチドは、Ｖβの削除によって欠失している。
【図３】本発明のＴ細胞受容体融合ポリペプチド（ＴＦＰ）の使用を示す概略図である。例示的なＴＦＰは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した抗ＢＣＭＡ  ＶＨドメイン及び完全長ＣＤ３イプシロンポリペプチドを含有する。Ｔ細胞によって産生されるかまたはＴ細胞に導入される場合、ＴＦＰは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（２つのＣＤ３イプシロンポリペプチド、１つのＣＤ３ガンマポリペプチド、１つのＣＤ３デルタポリペプチド、２つのＣＤ３ゼータポリペプチド、１つのＴＣＲアルファサブユニット及び１つのＴＣＲベータサブユニットを含むことが示されており、水平の灰色セグメントは細胞膜を表す）の他のポリペプチドと会合して再プログラム化されたＴＣＲを形成し、その場合、内因性ＣＤ３イプシロンポリペプチドの一方または両方はＴＦＰによって置換される。
【図４】様々なＴＦＰをコードするＤＮＡ構築物を示す一連の概略図である。
【図５】レンチウイルス形質導入後のＴ細胞上での抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰの表面発現を図示する例示的な棒グラフである。エフェクターＴ細胞は、形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰ構築物のいずれかで形質導入されたかのいずれかであった。ＩＬ−２中で１０日間増殖させた後、それらの表面ＴＦＰ発現がフローサイトメトリーによって決定された。
【図６】抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されたエフェクターＴ細胞を１２日間増殖させてから、１×１０４個のＲＰＭＩ８２２６標的細胞と共に１０：１、または５：１のＥ：Ｔ比で４時間インキュベートした。細胞傷害性率は、フローサイトメトリー細胞傷害性アッセイで決定された。
【図７Ａ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図７Ｂ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図７Ｃ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図７Ｄ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図７Ｅ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図７Ｆ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図７Ｇ】経時的な抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによるＢＣＭＡ形質導入ＨｅＬａ標的細胞の殺傷を図示する例示的な棒グラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。細胞傷害性を示す細胞指数は、ＲＴＣＡアッセイで決定された。そのアッセイを、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で５：１（図７Ｂ）、１：１（図７Ｃ）及び１：５（図７Ｄ）のＥ：Ｔ比で；ならびにＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、及びＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で５：１（図７Ｅ）、１：１（図７Ｆ）及び１：５（図７Ｇ）のＥ：Ｔ比で繰り返した。
【図８Ａ】ＢＣＭＡを有する標的細胞に反応した抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞によるＩＬ−２の放出を図示する例示的なグラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。ＩＬ−２の産生は２プレックスＬｕｍｉｎｅｘによって決定された。
【図８Ｂ】ＢＣＭＡを有する標的細胞に反応した抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞によるＩＦＮ−γの放出を図示する例示的なグラフである。形質導入されなかったか、または抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を７日間増殖させてから、１×１０４個のＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＢＣＭＡのいずれかの標的細胞と共にインキュベートした。ＩＦＮ−γの産生は２プレックスＬｕｍｉｎｅｘによって決定された。
【図９】ＢＣＭＡを有する標的細胞に反応した抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の脱顆粒を図示する例示的なグラフである。形質導入されなかったか、または５０ＭＯＩの抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εもしくは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたかのいずれかであったエフェクターＴ細胞を１３日間増殖させてから、１×１０４個の示されたＢＣＭＡ＋ｖｅ  ＲＰＭＩ８２２６標的細胞と共にインキュベートした。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ゲートにおけるＣＤ１０７＋細胞の百分率が決定された。
【図１０−１】細胞活性化によるＴＦＰ発現の検証を示す一連のグラフである。レンチウイルスの形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによる標的細胞の活性化をフローサイトメトリーによって確認する。ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦＶ（配列番号４５）、ならびに形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した。形質導入されたＴ細胞及びＢＣＭＡ陽性Ｋ５６２標的細胞（灰色棒）を１：１の比で一晩共培養した。形質導入していないＢＣＭＡ陽性Ｔ細胞培養物（ＮＴ）と同様に、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞（黒色棒）を陰性対照として使用した。細胞をＣＤ２５（１０のＡ）及びＣＤ６９（１０のＢ）について染色した。図１０のＣ（ＣＤ２５陽性細胞）及び１０のＤ（ＣＤ６９陽性細胞）は、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）を有するＴＦＰ  Ｔ細胞についての同様の結果を示している。全てのＴＦＰ（いずれの配置でも）は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）を活性化することができたが、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）を活性化することはできなかった。図１０のＥでは、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ（配列番号４５）、及び形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した；図１０のＦでは、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。図に示されているように、陰性対照を除く全てのＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）と比較して、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）と接触した後に、上昇したレベルのグランザイムＢを有していた；図１０のＧ（Ｅ：Ｔ  ３：１）及び図１０のＨ（Ｅ：Ｔ  １：３）では、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ１（配列番号４５）、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）、及びＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＦＲβの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。両方の１０のＧに示されるように、空ベクターを除く全ての構築物は、３：１のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比において腫瘍細胞の数を減少させるのに十分であった。１：３のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比では（１０のＨ）、全ての構築物は、わずかにより多様な効力で腫瘍細胞の数を減少させることができた。中実棒はＢＣＭＡ陰性ＨｅＬａ細胞を表し、空の棒はＢＣＭＡ陽性細胞を表す。
【図１０−２】細胞活性化によるＴＦＰ発現の検証を示す一連のグラフである。レンチウイルスの形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによる標的細胞の活性化をフローサイトメトリーによって確認する。ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦＶ（配列番号４５）、ならびに形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した。形質導入されたＴ細胞及びＢＣＭＡ陽性Ｋ５６２標的細胞（灰色棒）を１：１の比で一晩共培養した。形質導入していないＢＣＭＡ陽性Ｔ細胞培養物（ＮＴ）と同様に、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞（黒色棒）を陰性対照として使用した。細胞をＣＤ２５（１０のＡ）及びＣＤ６９（１０のＢ）について染色した。図１０のＣ（ＣＤ２５陽性細胞）及び１０のＤ（ＣＤ６９陽性細胞）は、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）を有するＴＦＰ  Ｔ細胞についての同様の結果を示している。全てのＴＦＰ（いずれの配置でも）は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）を活性化することができたが、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）を活性化することはできなかった。図１０のＥでは、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ（配列番号４５）、及び形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した；図１０のＦでは、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。図に示されているように、陰性対照を除く全てのＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）と比較して、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）と接触した後に、上昇したレベルのグランザイムＢを有していた；図１０のＧ（Ｅ：Ｔ  ３：１）及び図１０のＨ（Ｅ：Ｔ  １：３）では、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ１（配列番号４５）、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）、及びＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＦＲβの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。両方の１０のＧに示されるように、空ベクターを除く全ての構築物は、３：１のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比において腫瘍細胞の数を減少させるのに十分であった。１：３のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比では（１０のＨ）、全ての構築物は、わずかにより多様な効力で腫瘍細胞の数を減少させることができた。中実棒はＢＣＭＡ陰性ＨｅＬａ細胞を表し、空の棒はＢＣＭＡ陽性細胞を表す。
【図１０−３】細胞活性化によるＴＦＰ発現の検証を示す一連のグラフである。レンチウイルスの形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによる標的細胞の活性化をフローサイトメトリーによって確認する。ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦＶ（配列番号４５）、ならびに形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した。形質導入されたＴ細胞及びＢＣＭＡ陽性Ｋ５６２標的細胞（灰色棒）を１：１の比で一晩共培養した。形質導入していないＢＣＭＡ陽性Ｔ細胞培養物（ＮＴ）と同様に、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞（黒色棒）を陰性対照として使用した。細胞をＣＤ２５（１０のＡ）及びＣＤ６９（１０のＢ）について染色した。図１０のＣ（ＣＤ２５陽性細胞）及び１０のＤ（ＣＤ６９陽性細胞）は、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）を有するＴＦＰ  Ｔ細胞についての同様の結果を示している。全てのＴＦＰ（いずれの配置でも）は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）を活性化することができたが、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）を活性化することはできなかった。図１０のＥでは、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ（配列番号４５）、及び形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した；図１０のＦでは、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。図に示されているように、陰性対照を除く全てのＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）と比較して、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）と接触した後に、上昇したレベルのグランザイムＢを有していた；図１０のＧ（Ｅ：Ｔ  ３：１）及び図１０のＨ（Ｅ：Ｔ  １：３）では、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ１（配列番号４５）、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）、及びＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＦＲβの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。両方の１０のＧに示されるように、空ベクターを除く全ての構築物は、３：１のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比において腫瘍細胞の数を減少させるのに十分であった。１：３のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比では（１０のＨ）、全ての構築物は、わずかにより多様な効力で腫瘍細胞の数を減少させることができた。中実棒はＢＣＭＡ陰性ＨｅＬａ細胞を表し、空の棒はＢＣＭＡ陽性細胞を表す。
【図１１−１】抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ１  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビトロ分析及びインビボ多発性骨髄腫モデルにおけるそれらの効力を示す一連のグラフである。ＣＤ３ε形式のＴＦＰ  Ｔ細胞またはＣＤ２８ζもしくは４１ＢＢζ形式のＣＡＲ  Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ−ＣＤ１９（陰性対照）またはＨｅＬａ−ＢＣＭＡ腫瘍標的細胞と共に３：１（図１１のＡ）または１：３（図１１のＢ）比の標的細胞に対するエフェクターの比でＴ細胞を２４時間培養することによってそれらの細胞溶解活性について試験した。ルシフェラーゼアッセイを実施し、殺傷％を標的細胞単独と比較して計算した（形質導入していないＴ細胞または空のベクターＴ細胞によって証明される）。ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞をまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）によって細胞溶解機能について試験した。Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性腫瘍標的（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と１：３（図１１のＣ）または１：３（図１１のＤ）のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞指数値によって示される細胞インピーダンスを測定して細胞傷害性の潜在性を決定した。形質導入されなかったまたは上記の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲ構築物で形質導入されたエフェクターＴ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と３：１及び１：３のＥ：Ｔ比で上述したＲＴＣＡにおいてインキュベートした。細胞上清中に放出されたサイトカインＩＦＮ−γ（図１１のＥ）及びＩＬ−２（図１１のＦ）を測定した。
【図１１−２】抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ１  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビトロ分析及びインビボ多発性骨髄腫モデルにおけるそれらの効力を示す一連のグラフである。ＣＤ３ε形式のＴＦＰ  Ｔ細胞またはＣＤ２８ζもしくは４１ＢＢζ形式のＣＡＲ  Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ−ＣＤ１９（陰性対照）またはＨｅＬａ−ＢＣＭＡ腫瘍標的細胞と共に３：１（図１１のＡ）または１：３（図１１のＢ）比の標的細胞に対するエフェクターの比でＴ細胞を２４時間培養することによってそれらの細胞溶解活性について試験した。ルシフェラーゼアッセイを実施し、殺傷％を標的細胞単独と比較して計算した（形質導入していないＴ細胞または空のベクターＴ細胞によって証明される）。ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞をまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）によって細胞溶解機能について試験した。Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性腫瘍標的（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と１：３（図１１のＣ）または１：３（図１１のＤ）のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞指数値によって示される細胞インピーダンスを測定して細胞傷害性の潜在性を決定した。形質導入されなかったまたは上記の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲ構築物で形質導入されたエフェクターＴ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と３：１及び１：３のＥ：Ｔ比で上述したＲＴＣＡにおいてインキュベートした。細胞上清中に放出されたサイトカインＩＦＮ−γ（図１１のＥ）及びＩＬ−２（図１１のＦ）を測定した。
【図１１−３】抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ１  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビトロ分析及びインビボ多発性骨髄腫モデルにおけるそれらの効力を示す一連のグラフである。ＣＤ３ε形式のＴＦＰ  Ｔ細胞またはＣＤ２８ζもしくは４１ＢＢζ形式のＣＡＲ  Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ−ＣＤ１９（陰性対照）またはＨｅＬａ−ＢＣＭＡ腫瘍標的細胞と共に３：１（図１１のＡ）または１：３（図１１のＢ）比の標的細胞に対するエフェクターの比でＴ細胞を２４時間培養することによってそれらの細胞溶解活性について試験した。ルシフェラーゼアッセイを実施し、殺傷％を標的細胞単独と比較して計算した（形質導入していないＴ細胞または空のベクターＴ細胞によって証明される）。ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞をまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）によって細胞溶解機能について試験した。Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性腫瘍標的（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と１：３（図１１のＣ）または１：３（図１１のＤ）のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞指数値によって示される細胞インピーダンスを測定して細胞傷害性の潜在性を決定した。形質導入されなかったまたは上記の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲ構築物で形質導入されたエフェクターＴ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と３：１及び１：３のＥ：Ｔ比で上述したＲＴＣＡにおいてインキュベートした。細胞上清中に放出されたサイトカインＩＦＮ−γ（図１１のＥ）及びＩＬ−２（図１１のＦ）を測定した。
【図１１−４】抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ１  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビトロ分析及びインビボ多発性骨髄腫モデルにおけるそれらの効力を示す一連のグラフである。ＣＤ３ε形式のＴＦＰ  Ｔ細胞またはＣＤ２８ζもしくは４１ＢＢζ形式のＣＡＲ  Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ−ＣＤ１９（陰性対照）またはＨｅＬａ−ＢＣＭＡ腫瘍標的細胞と共に３：１（図１１のＡ）または１：３（図１１のＢ）比の標的細胞に対するエフェクターの比でＴ細胞を２４時間培養することによってそれらの細胞溶解活性について試験した。ルシフェラーゼアッセイを実施し、殺傷％を標的細胞単独と比較して計算した（形質導入していないＴ細胞または空のベクターＴ細胞によって証明される）。ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞をまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）によって細胞溶解機能について試験した。Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性腫瘍標的（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と１：３（図１１のＣ）または１：３（図１１のＤ）のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞指数値によって示される細胞インピーダンスを測定して細胞傷害性の潜在性を決定した。形質導入されなかったまたは上記の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲ構築物で形質導入されたエフェクターＴ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と３：１及び１：３のＥ：Ｔ比で上述したＲＴＣＡにおいてインキュベートした。細胞上清中に放出されたサイトカインＩＦＮ−γ（図１１のＥ）及びＩＬ−２（図１１のＦ）を測定した。
【図１１−５】抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ１  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビトロ分析及びインビボ多発性骨髄腫モデルにおけるそれらの効力を示す一連のグラフである。ＣＤ３ε形式のＴＦＰ  Ｔ細胞またはＣＤ２８ζもしくは４１ＢＢζ形式のＣＡＲ  Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ−ＣＤ１９（陰性対照）またはＨｅＬａ−ＢＣＭＡ腫瘍標的細胞と共に３：１（図１１のＡ）または１：３（図１１のＢ）比の標的細胞に対するエフェクターの比でＴ細胞を２４時間培養することによってそれらの細胞溶解活性について試験した。ルシフェラーゼアッセイを実施し、殺傷％を標的細胞単独と比較して計算した（形質導入していないＴ細胞または空のベクターＴ細胞によって証明される）。ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞をまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）によって細胞溶解機能について試験した。Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性腫瘍標的（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と１：３（図１１のＣ）または１：３（図１１のＤ）のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞指数値によって示される細胞インピーダンスを測定して細胞傷害性の潜在性を決定した。形質導入されなかったまたは上記の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲ構築物で形質導入されたエフェクターＴ細胞を、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ）またはＢＣＭＡ陰性標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と３：１及び１：３のＥ：Ｔ比で上述したＲＴＣＡにおいてインキュベートした。細胞上清中に放出されたサイトカインＩＦＮ−γ（図１１のＥ）及びＩＬ−２（図１１のＦ）を測定した。
【図１２Ａ】ｓｃＦｖ２（ＨＬ形式）及びＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの効力を示す一連のグラフである。マウスにＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を接種し、次いで陰性対照として空ベクターＴ細胞及び陽性対照としてｓｃＦｖ１−ＣＤ３εＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ａ）；イプシロン、ガンマ、及びベータ形式のＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｂ）、及びイプシロン、ガンマ及びベータ形式のｓｃＦｖ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｃ）を使用して処置した。各グラフにおける各線は１匹のマウスを表す。データは、数日にわたって経時的なｍｍ３での腫瘍体積を表している。０日目は、腫瘍細胞の接種から３週間後の処置の開始の日を表す。
【図１２Ｂ】ｓｃＦｖ２（ＨＬ形式）及びＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの効力を示す一連のグラフである。マウスにＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を接種し、次いで陰性対照として空ベクターＴ細胞及び陽性対照としてｓｃＦｖ１−ＣＤ３εＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ａ）；イプシロン、ガンマ、及びベータ形式のＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｂ）、及びイプシロン、ガンマ及びベータ形式のｓｃＦｖ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｃ）を使用して処置した。各グラフにおける各線は１匹のマウスを表す。データは、数日にわたって経時的なｍｍ３での腫瘍体積を表している。０日目は、腫瘍細胞の接種から３週間後の処置の開始の日を表す。
【図１２Ｃ】ｓｃＦｖ２（ＨＬ形式）及びＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの効力を示す一連のグラフである。マウスにＲＰＭＩ−８２２６腫瘍細胞を接種し、次いで陰性対照として空ベクターＴ細胞及び陽性対照としてｓｃＦｖ１−ＣＤ３εＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ａ）；イプシロン、ガンマ、及びベータ形式のＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｂ）、及びイプシロン、ガンマ及びベータ形式のｓｃＦｖ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｃ）を使用して処置した。各グラフにおける各線は１匹のマウスを表す。データは、数日にわたって経時的なｍｍ３での腫瘍体積を表している。０日目は、腫瘍細胞の接種から３週間後の処置の開始の日を表す。
【図１３−１】上記の図１１で使用されたＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボでの効力を示す一連のグラフである。ＴＦＰ対ＣＡＲの効力を評価するために、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞及びＮＳＧマウスモデルを使用した。Ｔ細胞注射後８日目からＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ群において腫瘍体積の有意な減少が観察された（図１３のＡ）。腫瘍の平均放射輝度によって評価される腫瘍荷重は、対照と比較して全ての群において有意に減少した（図１３のＢ）。また、ＴＦＰ及び４１ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞群は、ＣＤ２８ζＣＡＲ  Ｔ群と比較して増加した生存率を示した（図１３のＣ）。
【図１３−２】上記の図１１で使用されたＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボでの効力を示す一連のグラフである。ＴＦＰ対ＣＡＲの効力を評価するために、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞及びＮＳＧマウスモデルを使用した。Ｔ細胞注射後８日目からＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ群において腫瘍体積の有意な減少が観察された（図１３のＡ）。腫瘍の平均放射輝度によって評価される腫瘍荷重は、対照と比較して全ての群において有意に減少した（図１３のＢ）。また、ＴＦＰ及び４１ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞群は、ＣＤ２８ζＣＡＲ  Ｔ群と比較して増加した生存率を示した（図１３のＣ）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
１つの態様において、ＴＣＲサブユニットと、抗ＢＣＭＡ結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された核酸分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲの細胞外ドメインを含む。他の実施形態において、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲの膜貫通ドメインを含む。また他の実施形態において、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲの細胞内ドメインを含む。更なる実施形態において、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲの細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲの膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲの細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが同じＴＣＲサブユニット由来である。また更なる実施形態において、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマもしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲの細胞内ドメインを含む。また更なる実施形態において、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体ドメインはｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、（ｉ）本明細書で提供される任意の抗ＢＣＭＡ軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）本明細書で提供される任意の抗ＢＣＭＡ重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大３０、２０または１０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態において、重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大３０、２０または１０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＴＦＰは、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、もしくはＣＤ３ガンマ、もしくはそれらの機能的フラグメント、またはそれらに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大２０、１０または５つまでの修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態において、コードされたＴＦＰは、ＴＣＲのアルファ、ベータ鎖もしくはＴＣＲサブユニットのＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３デルタ、もしくはそれらの機能的フラグメント、またはそれらに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大２０、１０または５つまでの修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、コードされたＴＦＰは、ＴＣＲのアルファ、ベータもしくはゼータ鎖もしくはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４、もしくはそれらの機能的フラグメント、またはそれらに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大２０、１０または５つまでの修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、コードされた抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている。いくつかの例において、コードされたリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの例において、コードされたリンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、コードされた長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、コードされたリンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、コードされた短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。いくつかの例において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大２０、１０または５までの修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、リーダー配列を更に含む。
【００５２】
また、前述の核酸分子のいずれかによってコードされた単離されたポリペプチド分子が本明細書で提供される。
【００５３】
また別の態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離されたＴ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、単離されたＴＦＰ分子は、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインである。他の実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列、もしくはその機能的フラグメント、もしくは本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大３０、２０または１０までの修飾を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列の軽鎖及び重鎖を含む。いくつかの実施形態において、単離されたＴＦＰ分子は、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、もしくはＣＤ３ガンマ、またはそれらに対して少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾から最大２０、１０または５つの修飾を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲの細胞外ドメインを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている。いくつかの例において、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、単離されたＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。他の実施形態において、単離されたＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。また他の実施形態において、単離されたＴＦＰ分子は、リーダー配列を更に含む。
【００５７】
また、前述のＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターはプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターはインビトロで転写されたベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターにおける核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部を更に含む。いくつかの実施形態において、ベクターにおける核酸配列は、３’ＵＴＲを更に含む。
【００５８】
また、記載されたベクターのいずれかを含む細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、細胞はヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態において、細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドに会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を更に含む。いくつかの例において、抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドならびに共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。
【００５９】
別の態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子であって、そのＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、単離されたＴＦＰ分子が本明細書で提供される。
【００６０】
別の態様において、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子であって、そのＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することが可能である、単離されたＴＦＰ分子が本明細書で提供される。
【００６１】
別の態様において、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子が、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の中で、その細胞において及び／またはその細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供される。
【００６２】
別の態様において、ｉ）ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子、及びｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲ複合体を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲの細胞外ドメインに接続されている。いくつかの例において、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【００６４】
また、記載されたタンパク質複合体のいずれか当たり少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書で提供される。
【００６５】
別の態様において、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、その集団のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個別的にまたは集合的に含み、ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、ＴＣＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、ＴＦＰ分子が、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の中で、その細胞において及び／またはその細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が本明細書で提供される。
【００６６】
別の態様において、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、その集団のＴ細胞が、本明細書に記載の単離された核酸分子によってコードされた少なくとも２つのＴＦＰ分子を個別的または集合的に含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が本明細書で提供される。
【００６７】
別の態様において、記載されたベクターのいずれかでＴ細胞を形質導入することを含む、細胞の作製方法が本明細書で提供される。
【００６８】
別の態様において、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞の集団を生成する方法であって、そのＲＮＡが、記載されたＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸を含む、方法が本明細書で提供される。
【００６９】
別の態様において、哺乳類において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、有効量の記載されたＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞を哺乳類に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、細胞は自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類はヒトである。
【００７０】
別の態様において、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、有効量の記載されたＴＦＰ分子のいずれかを含む細胞を哺乳類に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍または前がん状態、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病などの増殖性疾患から選択されるか、またはＢＣＭＡの発現に関連する非がん関連症状である。いくつかの実施形態において、疾患は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「Ｂ−ＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「Ｔ−ＡＬＬ」）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞性白血病、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及び骨髄血液細胞の無効な産生（または異形成）によってまとめられる多様な血液学状態の集合である「前白血病」を含むがこれらに限定されない更なる血液がんまたは血液学状態、及びＢＣＭＡを発現する非定型及び／または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態もしくは増殖性疾患を含むがこれらに限定されないＢＣＭＡの発現に関連する疾患；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される血液がんである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、記載されたＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、記載されたＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞は、ＢＣＭＡに関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
【００７２】
薬剤としての使用のための記載された単離された核酸分子のいずれか、記載された単離されたポリペプチド分子のいずれか、記載された単離されたＴＦＰのいずれか、記載されたタンパク質複合体のいずれか、記載されたベクターのいずれかまたは記載された細胞のいずれかが本明細書で提供される。
【００７３】
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００７４】
用語「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多い（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「約」は、状況及び当業者が知るまたは知り得ることに応じて、プラスまたはマイナス１パーセント未満もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０パーセント、または３０パーセント超を意味し得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」または「個体」には、ヒトなどの哺乳類または非ヒト哺乳類、例えば、家畜、農業用または野生の動物、ならびに鳥、及び水生動物が含まれ得るがこれらに限定されない。「患者」は、疾患、障害または状態に罹患しているかもしくは発症の危険性があるか、またはそうでなければ本明細書で提供される組成物及び方法を必要としている対象である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」は、疾患または状態の治療または改善における任意の成功の兆候を指す。治療することには、例えば、疾患もしくは状態の１つ以上の症状の重症度を低下させること、遅らせることまたは軽減することが含まれ得るか、または疾患、不具合、障害、または悪条件などの症状を患者が経験する頻度を低下させることが含まれ得る。本明細書で使用される場合、「治療または予防」は、疾患もしくは状態のいくらかのレベルの治療または改善をもたらす方法を指すために本明細書で時に使用され、状態の予防を含むがこれに完全に限定されるわけではないその目的に向けられた様々な結果を企図する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「予防すること」は、患者における疾患または状態、例えば、腫瘍形成の予防を指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんの発症の危険性がある個体が本発明の方法で治療され、後に腫瘍または他の形態のがんを発症しない場合、そのときは疾患はその個体において少なくともある期間にわたって予防されている。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、組成物が投与される個体に対して有益な効果を提供するのに、またはそうでなければ有害な有益でない事象を減少させるのに十分な組成物またはその活性成分の量である。「治療有効用量」は、本明細書では、１つ以上の所望のまたは望ましい（例えば、有益な）効果を生み出すために投与される用量を意味し、そのような投与は所与の期間にわたって１回以上存在する。正確な用量は、治療の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって解明可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、一般にｉ）標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びｉｉ）典型的にはＴ細胞内またはその表面上で共に配置された場合に、無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが可能なＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含む。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「Ｂ細胞  本明細書で使用される場合、用語「ＢＣＭＡ」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られるＢ細胞成熟抗原」または「ＢＣＭＡ」または「ＢＣＭ」を指し、分化抗原群２６９タンパク質（ＣＤ２６９）、またはＴＮＦＲＳＦ１３Ａは、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってヒトにおいてコードされるタンパク質である。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識するＴＦＮ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。その受容体は、成熟Ｂリンパ球で優先的に発現し、Ｂ細胞発生及び自己免疫反応にとって重要であり得る。この受容体は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１３ｂ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＴＡＬＬ−１／ＢＡＦＦ）に特異的に結合すること、及びＮＦ−カッパＢ及びＭＡＰＫ８／ＪＮＫ活性化につながることが示されている。それは、リガンドＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬのための非グリコシル化膜内在性受容体である。ＢＣＭＡのリガンドはまた、更なる受容体：ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦを結合させるＴＡＣＩ（膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンド相互作用因子）；ならびにＢＡＦＦに対して制限されるが高い親和性を示すＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体またはＢＲ３）を結合させ得る。同時に、これらの受容体及びそれらの対応するリガンドは、液性免疫、Ｂ細胞発生及びホメオスタシスの異なる側面を調節する。
【００８２】
ＢＣＭＡの発現は典型的にはＢ細胞系統に限られ、最終的なＢ細胞分化が増加することが報告されている。ＢＣＭＡは、ヒト形質芽球、扁桃腺由来の形質細胞、脾臓及び骨髄によってだけでなく、扁桃腺記憶Ｂ細胞によって及びＴＡＣＩ−ＢＡＦＦＲ低表現型を有する胚中心Ｂ細胞によっても発現される（Ｄａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＢＣＭＡは、ナイーブ及びメモリーＢ細胞では実質的に存在しない（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ及びｂ）。ＢＣＭＡ抗原は、細胞表面上に発現されるので抗体に近接可能であるがゴルジ中にも発現される。その発現プロファイルによって示唆されるように、典型的にはＢ細胞の生存及び増殖と関連するＢＣＭＡシグナル伝達は、Ｂ細胞分化の後期段階、ならびに長寿命骨髄形質細胞（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）及び形質芽球（Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）の生存において重要である。更に、ＢＣＭＡはＡＰＲＩＬと高い親和性で結合するので、ＢＣＭＡ−ＡＰＲＩＬシグナル伝達軸は、おそらく最も生理学的に関連性のある相互作用である、Ｂ細胞分化の後期段階で優位を占めることが示唆される。
【００８３】
ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、公共のデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔで見つけることができる。例えば、ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０２２２３で見つけることができる。ヒトＢＣＭＡポリペプチドの標準的な配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０２２２３−１（本明細書では、配列番号４２、付録Ａを参照されたい）。
【００８４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源の無傷の免疫グロブリン、またはそのフラグメントであり得るか、または天然源もしくは組み換え源に由来し得る。
【００８５】
用語「抗体フラグメント」または「抗体結合ドメイン」は、抗原結合ドメイン、すなわち、無傷の抗体の抗原決定可変領域を含有し、且つ標的、例えば、抗原及びその定義されたエピトープに対する抗体フラグメントの認識及び特異的結合を付与するのに十分である抗体の少なくとも一部、またはその組み換え変異体を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体フラグメント、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略される）（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメント及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質であって、その軽鎖及び重鎖の可変領域が、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一ポリペプチド鎖として発現することが可能である、融合タンパク質を指し、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持している。
【００８７】
抗体に関する「重鎖可変領域」または「ＶＨ」（または、単一ドメイン抗体の場合は、例えば、ナノ抗体「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として知られるフランキングストレッチ間に介在する３つのＣＤＲを含有する重鎖のフラグメントを指し、これらのフレームワーク領域は一般に、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持するための骨格を形成する。
【００８８】
指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ領域を、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関していずれの順序で有してもよく、すなわち、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るか、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【００８９】
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＴＦＰ組成物の部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）または重鎖抗体ＨＣＡｂ２４２：４２３−４２６を含む隣接ポリペプチド鎖の一部として抗原結合ドメインが発現する様々な形態で存在し得る。１つの態様において、本発明のＴＦＰ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。更なる態様において、ＴＦＰは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む抗体フラグメントを含む。
【００９０】
用語「抗体重鎖」は、抗体分子中にそれらの天然に存在する立体配座で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、それは通常、抗体が属するクラスを決定する。
【００９１】
用語「抗体軽鎖」は、抗体分子中にそれらの天然に存在する立体配座で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖のアイソタイプを指す。
【００９２】
用語「組み換え抗体」は、組み換えＤＮＡ技術を使用して生成された抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母の発現系によって発現される抗体を指す。その用語はまた、抗体をコードし、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子、または抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味するものと解釈されるべきであり、この場合、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能でよく知られている組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【００９３】
用語「抗原」または「Ａｇ」は、抗体によって特異的に結合され得る、または他の場合には免疫反応を誘発する分子を指す。この免疫反応は、抗体産生、もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。
【００９４】
当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意のマクロ分子が抗原の役割を果たし得ることを理解する。更に、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、そのため、免疫反応を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、「抗原」を、その用語が本明細書で使用される場合、コードすることを理解する。更に、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解する。本発明が、限定されないが、複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫反応を誘発するポリペプチドをコードする様々な組み合わせで配置されることは直ちに明らかである。その上、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解する。抗原は生成されて合成されてもよいし、生体試料に由来してもよいし、ポリペプチドに加えてマクロ分子の場合もあることは直ちに明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生物学的成分を有する流体が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００９５】
用語「抗腫瘍効果」は、様々な手段によって明らかにされ得る生物学的効果を指し、それには、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の低下、またはがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善が含まれるがこれらに限定されない。「抗腫瘍効果」はまた、第１に腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によって明らかにされ得る。
【００９６】
用語「自己」は、任意の材料であって、それが後に個体に再導入されるのと同じ個体に由来するものを指す。
【００９７】
用語「同種異系」は、任意の材料であって、同じ種の異なる動物またはその材料が導入される個体とは異なる患者に由来するものを指す。遺伝子が１つ以上の遺伝子座で同一ではない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
【００９８】
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【００９９】
用語「がん」は、異常細胞の急速且つ制御されない成長によって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的にまたは血流及びリンパ系を介して身体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例は、本明細書に記載されており、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
「ＢＣＭＡの発現に関連する疾患」という成句には、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患またはＢＣＭＡを発現する細胞に関連する状態（例えば、がんもしくは悪性腫瘍もしくは前がん状態などの増殖性疾患、またはＢ細胞発生／免疫グロブリン産生の欠陥（免疫不全）を含む）が含まれるがこれらに限定されない。１つの態様において、がんは、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞白血病、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、非分泌性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、ＰＯＥＭＳ症候群／骨硬化性黒色腫、ＢＣＭＡの発現に関連する非がん関連症状（例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、大腸炎、Ｉ型及びＩＩ型クリオグロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、急性糸球体腎炎、天疱瘡及び類天疱瘡障害、または後天性表皮水疱症）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、及び移植を含むがこれらに限定されない）である。
【０１０１】
用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体フラグメントの結合特性に大きく影響しないかまたはそれを大きく変化させないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が含まれる。修飾は、当該技術分野で知られている標準的技術、例えば、部位特異的突然変異誘発法及びＰＣＲ媒介突然変異誘発法によって本発明の抗体または抗体フラグメントに導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のアミノ酸が含まれる。それ故、本発明のＴＦＰ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられ得、変更されたＴＦＰは、本明細書に記載の機能アッセイを使用して試験され得る。
【０１０２】
用語「刺激」は、刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同種リガンドと結合し、それによって、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、所定の分子の変化した発現、及び／または細胞骨格構造の再編成などを媒介し得る。
【０１０３】
用語「刺激分子」または「刺激ドメイン」は、Ｔ細胞のシグナル伝達経路の少なくともある性状についてＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的方法で調節する一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供するＴ細胞によって発現される分子またはその一部を指す。１つの態様において、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が、ペプチドを担持するＭＨＣ分子と結合することによって開始され、これが、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞反応の媒介につながる。刺激的様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたは「ＩＴＡＭ」として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明において特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）で複合化された外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。
【０１０５】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、その用語が本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰ含有細胞、例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例には、細胞溶解活性及びＴヘルパー細胞活性（サイトカインの分泌を含む）が含まれる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。
【０１０６】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」）を含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ならびにＣＤ６６ｄ  ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０７】
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激反応を媒介する、Ｔ細胞上の同種結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫反応に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれるがこれらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが含まれる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、もしくは天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはそれらの機能的フラグメントを含み得る。用語「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されたアミノ酸配列、または、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿など由来の同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿など由来の同等の残基として定義される。
【０１０８】
用語「コードすること」は、定義されたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれか及びそれに起因する生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて他のポリマー及びマクロ分子の合成用の鋳型の役割を果たすための遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。それ故、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖、及び遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると見なされ得る。
【０１０９】
別段指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という成句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかの型の場合、１つ以上のイントロンを含有し得る程度までイントロンを含み得る。
【０１１０】
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書において交換可能に使用され、特定の生物学的または治療上の結果を達成するのに有効な本明細書に記載される化合物、配合物、材料、または組成物の量を指す。
【０１１１】
用語「内因性」は、有機体、細胞、組織または系に由来するか、またはその内部で産生される任意の材料を指す。
【０１１２】
用語「外因性」は、有機体、細胞、組織または系から導入されるか、またはその外部で産生される任意の材料を指す。
【０１１３】
用語「発現」は、プロモーターによって動作される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
【０１１４】
用語「転移ベクター」は、単離された核酸を含み、且つ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性もしくは両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれるがこれらに限定されない多くのベクターが当該技術分野で知られている。それ故、用語「転移ベクター」には、自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。その用語はまた、細胞内への核酸の転移を促進する非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを更に含むことが解釈されるべきである。ウイルス性転移ベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１５】
用語「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシスエレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野で知られている全てのものが含まれる。
【０１１６】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも非分裂細胞に感染することができることで独特である；それらは、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。
【０１１７】
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に示されるように、自己不活性化レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（商標）遺伝子導入技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが含まれるがこれらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に知られているであろう。
【０１１８】
用語「相同」または「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方のサブユニット部分が同じモノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占められている場合、そのときはそれらはその位置で相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致または相同位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、長さ１０サブユニットのポリマー中５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうちの９）が一致または相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【０１１９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体または抗体フラグメント）であって、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられているものである。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。更に、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエントの抗体にも、取り込まれたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメントの性能を更に洗練及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的な部分は、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含み得る。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照されたい。
【０１２０】
「ヒト」または「完全ヒト」は、抗体または抗体フラグメントなどの免疫グロブリンであって、分子全体がヒト起源のものであるか、または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト型に対して同一のアミノ酸配列からなるものを指す。
【０１２１】
用語「単離された」は、自然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離された」ものではないが、その自然状態の共存物質から部分的にもしくは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在し得る。
【０１２２】
本発明の文脈において、一般に存在する核酸塩基について以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【０１２３】
用語「作動可能に連結された」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列の間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに隣接することができ、例えば、２つのタンパク質のコード領域を結合するために必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０１２４】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、もしくは胸骨内注射、腫瘍内、または注入技術が含まれる。
【０１２５】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、その用語は、参照の核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列だけでなく、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗黙的を包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１２６】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、交換可能に使用され、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有していなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、その用語は、当該技術分野で一般的に、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当該技術分野で一般に、多くのタイプがあるタンパク質と称される長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１２７】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の転写機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０１２８】
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結した遺伝性産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。いくつかの例において、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例において、この配列は、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列及び他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０１２９】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、細胞のほとんどまたは全ての生理条件下で、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１３０】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、実質的に、プロモーターに対応する誘導因子が細胞に存在する場合にのみ、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１３１】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によってコードまたは特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞の場合にのみ、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１３２】
ｓｃＦｖの文脈で使用される用語「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」は、可変重鎖及び可変軽鎖領域を合わせて連結するために単独でまたは組み合わせて使用されるグリシン及び／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。１つの実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（ｎは１以上の正の整数である）を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーには、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態において、リンカーには、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の繰り返しが含まれる。また、本発明の範囲内には、ＷＯ２０１２／１３８４７５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のリンカーが含まれる。いくつかの例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始の直後に真核生物のメッセンジャーＲＮＡの「前」または５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結された末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップの付加は転写と結び付けられ、各々が他方に影響を与えるように同時転写的に起こる。転写開始の直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップ合成複合体によって拘束される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの機能、例えば、その安定性または翻訳の効率を調節するために修飾され得る。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合される一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の好ましい実施形態において、ポリＡは、５０〜５０００であり、好ましくは６４より多く、より好ましくは１００より多く、最も好ましくは３００または４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性または翻訳の効率などのｍＲＮＡの機能を調節するために化学的または酵素的に修飾され得る。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子に対するポリアデニリル部分、またはその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素であるポリアデニレートポリメラーゼの作用を介してプレｍＲＮＡに付加された長い配列のアデニンヌクレオチド（しばしば数百）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は、特定の配列のポリアデニル化シグナルを含有する転写産物に付加される。ポリ（Ａ）尾部及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からのｍＲＮＡの保護に役立つ。ポリアデニル化はまた、転写の終結、核からのｍＲＮＡの取り出し、及び翻訳にとって重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写の直後、核内で起こるが、後に細胞質内でも更に起こり得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の遊離３’末端に付加される。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「一過性」は、統合していない導入遺伝子の数時間、数日または数週間の期間の発現を指し、この場合、発現の期間は、ゲノムに統合された場合または宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含まれた場合の遺伝子の発現のための期間より短い。
【０１３８】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に関与する様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。成句「細胞表面受容体」には、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することが可能な分子及び分子の複合体が含まれる。
【０１３９】
用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生体（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
【０１４０】
用語「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態では通常会合している他の細胞型から分離された細胞を指す。いくつかの例において、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞の集団を指す。他の例において、この用語は単に、それらがそれらの天然の状態で自然に会合している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。
【０１４１】
本明細書で使用される用語「療法的」は、治療を意味する。治療効果は、疾患状態の低下、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【０１４２】
本明細書で使用される用語「予防」は、疾患または疾患状態の防止またはそれらのための保護的治療を意味する。
【０１４３】
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。所定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ＮＨＬ、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌及び腺癌、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などを含むがこれらに限定されないがんに由来する。
【０１４４】
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性の核酸でトランスフェクトされた、形質転換されたまたは形質導入されたものである。細胞は初代対象細胞及びその後代を含む。
【０１４５】
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する同種結合パートナー（例えば、ＢＣＭＡ）を認識し、それに結合するが、必ずしも実質的に試料中の他の分子を認識しないしそれに結合もしない抗体、抗体フラグメントまたは特定のリガンドを指す。
【０１４６】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で示され得る。範囲の形式での記述は、便宜及び簡潔さのためのものにすぎず、本発明の範囲に対する不動の制限と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、具体的に開示された全ての可能な部分的範囲を有すると見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのように具体的に開示される部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を有すると見なされるべきである。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するものを含み、且つ、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％及び９８〜９９％の同一性などの部分的範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１４７】
詳細な説明
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質を使用するがんなどの疾患の治療のための物質の組成物及び使用方法が本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、概して、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びｉｉ）典型的にはＴ細胞内またはその表面上で共に配置された場合に、無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが可能なＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含む。本明細書で提供されるように、ＴＦＰは、キメラ抗原受容体と比較して、かなりの利益を提供する。用語「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」は、ｓｃＦｖの形態で細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義される刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む組み換えポリペプチドを指す。一般に、ＣＡＲの中心細胞内シグナル伝達ドメインは、通常ＴＣＲ複合体と会合して見出されるＣＤ３ゼータ鎖に由来する。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／またはＣＤ２８などの少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合され得る。
【０１４８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
本発明は、ＴＦＰをコードする組み換えＤＮＡ構築物であって、そのＴＦＰが、ＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体フラグメントを含み、その抗体フラグメントの配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、且つそれと同じリーディングフレーム内にある、組み換えＤＮＡ構築物を包含する。本明細書で提供されるＴＦＰは、機能的ＴＣＲ複合体を形成するために、１つ以上の内因性（または代替的に、１つ以上の外因性、もしくは内因性及び外因性の組み合わせ）ＴＣＲサブユニットと会合することが可能である。
【０１４９】
１つの態様において、本発明のＴＦＰは、他に抗原結合ドメインと称される標的特異的結合因子を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を決定する標的抗原の種類と数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するように選択され得る。それ故、本発明のＴＦＰにおける抗原結合ドメインについての標的抗原として作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌及び寄生虫感染症；自己免疫疾患；ならびにがん性疾患（例えば、悪性疾患）に関連するものが含まれる。
【０１５０】
１つの態様において、ＴＦＰ媒介Ｔ細胞反応は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをＴＦＰに操作することによって目的の抗原に向けられ得る。
【０１５１】
１つの態様において、抗原結合ドメインを含むＴＦＰの部分は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。１つの態様において、抗原結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡを標的とする。
【０１５２】
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの機能的フラグメント（単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で知られる代替骨格、例えば、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＤＡＲＰＩＮなどが含まれるがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない抗原に結合する任意のドメインであり得る。同様に、標的抗原を特異的に認識し、結合する天然または合成リガンドが、ＴＦＰのための抗原結合ドメインとして使用され得る。いくつかの例において、抗原結合ドメインは、ＴＦＰが最終的に使用されるのと同じ種由来であることが有益である。例えば、ヒトでの使用については、ＴＦＰの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインのためのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０１５３】
それ故、１つの態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化もしくはヒト抗体もしくは抗体フラグメント、またはマウス抗体もしくは抗体フラグメントを含む。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つ全て）、及び／または本明細書に記載のヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つ全て）を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、１つ以上、例えば、３つ全てのＬＣ  ＣＤＲ及び１つ以上、例えば、３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含む。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つ全て）を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、２つの可変重鎖領域を有し、各々が本明細書に記載のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化またはヒト軽鎖可変領域及び／または本明細書に記載のヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域、例えば、少なくとも２つの本明細書に記載のヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。１つの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨｎｂ）は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾（例えば、置換）から最大３０、２０または１０までの修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの修飾（例えば、置換）から最大３０、２０または１０までの修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインはｓｃＦＶであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば、本明細書に記載のリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。１つの実施形態において、ヒト化抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ｎは１、２、３、４、５、または６、好ましくは３または４である）を含む。ｓ��ＦＶの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配置：軽鎖可変領域−リンカー重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれかであり得る。いくつかの例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１５４】
いくつかの態様において、非ヒト抗体はヒト化され、その抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体またはそのフラグメントとの類似性を増加させるように修飾される。１つの態様において、抗原結合ドメインはヒト化される。
【０１５５】
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、及び第５，５８５，０８９号（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、ベニアリングまたはリサーフェーシング（例えば、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、鎖シャフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、及び例えば、米国特許出願公開第２００５００４２６６４号、米国特許出願公開第２００５００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２），Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００），Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００），Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７），Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６），Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５），Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４），及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている技術を含むがこれらに限定されない当該技術分野で知られている様々な技術を使用して生成され得る。しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されて抗原結合を変更、例えば、改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られている方法によって、例えば、ＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって特定されて、抗原結合及び配列比較に重要なフレームワーク残基を特定し、特定の位置で他とは異なるフレームワーク残基を特定する（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１５６】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトの起源由来のそれに残る１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「取り込み」可変ドメインから取り出される「取り込み」残基と称される。本明細書で提供される場合、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子及びフレームワーク領域由来の１つ以上のＣＤＲを含み、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分がヒト生殖細胞系に由来する。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための多数の技術が当該技術分野でよく知られており、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって、すなわち、ＣＤＲ移植で本質的に実施され得る（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号；及び米国特許第４，８１６，５６７号；第６，３３１，４１５号；第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第６，５４８，６４０号（これらの内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。そのようなヒト化抗体及び抗体フラグメントにおいて、非ヒト種由来の対応する配列による置換は、無傷のヒト可変ドメインよりかなり少ない。ヒト化抗体はしばしば、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのフレームワーク（ＦＲ）残基がげっ歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。抗体及び抗体フラグメントのヒト化はまた、ベニアリングもしくはリサーフェーシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４（１９９４）；及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４））または鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）（これらの内容はそれらの全体が参照により本明書に組み込まれる）によって達成され得る。
【０１５７】
ヒト化抗体の作製に使用される軽及び重の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低下させることである。いわゆる「最良適合」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。げっ歯類のものに最も近いヒト配列は、次いでヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）（これらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）（これらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、４つの全てのフレームワーク領域は、ＶＨ４−４−５９生殖細胞系列配列に由来する。１つの実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列におけるアミノ酸から、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの修飾、例えば、置換を含み得る。１つの実施形態において、フレームワーク領域、例えば、軽鎖可変領域の４つの全てのフレームワーク領域は、ＶＫ３−１．２５生殖細胞系列配列に由来する。１つの実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列におけるアミノ酸から、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの修飾、例えば、置換を含み得る。
【０１５８】
いくつかの態様において、抗体フラグメントを含む本発明のＴＦＰ組成物の部分は、標的抗原に対する高い親和性及び他の有益な生物学的特性を保持しながらヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体フラグメントは、親及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。コンピュータプログラムが利用可能であり、これは、選択された候補の免疫グロブリン配列の推定される３次元立体配座構造を説明及び表示する。これらの表示の調査は、候補の免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補の免疫グロブリンが標的抗原を結合させる能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、ＦＲ残基は、所望の抗体または抗体フラグメントの特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増加が達成されるように、レシピエント及び取り込み配列から選択され、組み合わされ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与している。
【０１５９】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と同様の抗原特異性、例えば、本発明では、ヒトＢＣＭＡに結合する能力を保持し得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ヒトＢＣＭＡに対する結合の親和性及び／または特異性を改善した場合がある。
【０１６０】
１つの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。例えば、１つの態様において、抗原結合ドメインを含む本発明のＴＦＰ組成物の部分は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。１つの態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメント（例えば、ＶＨＨ）を含む抗原結合ドメインに関し、その抗体結合ドメインは、ＢＣＭＡタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合し、その抗体または抗体フラグメントは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び／または可変重鎖を含む。所定の態様において、ｓｃＦｖは、リーダー配列に隣接し、且つそれと同じリーディングフレーム内にある。
【０１６１】
１つの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはラクダ科重鎖（ＶＨＨ）である。１つの態様において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または２官能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。１つの態様において、本発明の抗体及びそのフラグメントは、野生型または向上した親和性を有するＢＣＭＡタンパク質に結合する。
【０１６２】
標的抗原（例えば、ＢＣＭＡまたは融合部分結合ドメインの標的について本明細書の他の箇所に記載される任意の標的抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法も本明細書で提供され、その方法は、本明細書に記載のＶＨ（またはＶＨＨ）ドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入によってＶＨドメインのアミノ酸配列の変異体であるＶＨドメインを提供すること、そのように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと任意に組み合わせること、及びＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組み合わせ（複数可）を試験して、特異的結合メンバーまたは目的の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的で任意に１つ以上の所望の特性を有する抗体抗原結合ドメインを特定することを含む。
【０１６３】
いくつかの例において、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖは、当該技術分野で知られている方法に従って調製され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。ｓｃＦｖ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域を、可動性ポリペプチドリンカーを使用して互いに連結させることによって産生され得る。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／またはアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折りたたみ方及び相互作用のし方に大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカーが用いられる場合（例えば、５〜１０個のアミノ酸）、鎖内の折りたたみが防止される。鎖間の折りたたみもまた、２つの可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成するために必要とされる。いくつかの例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。リンカーの配置及びサイズの例については、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８，米国特許出願公開第２００５０１００５４３号及び第２００５０１７５６０６号、米国特許第７，６９５，９３６号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８号及び第ＷＯ２００７／０２４７１５号を参照されたい。
【０１６４】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ及びＶＨ領域間に約１０、１１、１２、１３、１４、１５または１５を超える残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは１以上の正の整数である）などのグリシン及びセリンの繰り返しの組を含む。１つの実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持または向上させ得、活性研究における優れた効力を生じさせる。いくつかの例において、リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例において、長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。いくつかの例において、リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例において、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１６５】
安定性及び変異
抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子（例えば、可溶性ｓｃＦｖ）の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）に関して評価され得る。１つの実施形態において、ヒト化またはヒトｓｃＦｖは、記載されたアッセイにおいて、親のｓｃＦｖより、約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０セルシウス度、約１１セルシウス度、約１２セルシウス度、約１３セルシウス度、約１４セルシウス度、または約１５セルシウス度よりも高い熱安定性を有する。
【０１６６】
抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性の改善は、続いてＢＣＭＡ−ＴＦＰ構築物全体にもたらされ、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物の治療特性の改善につながる。抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、従来の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃改善され得る。１つの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して１℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して２℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態において、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、または１５℃改善された熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書に開示されるｓｃＦｖ分子と、そのｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬが由来した抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂフラグメントとの間でなされ得る。熱安定性は、当該技術分野で知られている方法を使用して測定され得る。例えば、１つの実施形態において、ＴＭが測定され得る。ＴＭを測定するための方法及びタンパク質安定性を決定する他の方法が以下に記載されている。
【０１６７】
ｓｃＦｖにおける変異（可溶性ｓｃＦｖのヒト化または変異誘発を介して生じる）は、ｓｃＦｖの安定性を変化させ、ｓｃＦｖ及び抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物の全体的な安定性を改善する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性は、ＴＭ、温度変性及び温度凝集などの測定結果を使用してマウスｓｃＦｖに対して比較される。１つの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異したｓｃＦｖが抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物に改善した安定性を付与するように、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１つの変異を含む。別の実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異したｓｃＦｖがＢＣＭＡ−ＴＦＰ構築物に改善した安定性を付与するように、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の変異を含む。
【０１６８】
１つの態様において、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗体フラグメントの所望の機能特性を保持する。１つの特定の態様において、本発明のＴＦＰ組成物は抗体フラグメントを含む。更なる態様において、その抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０１６９】
様々な態様において、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって改変される。１つの特定の態様において、本発明のＴＦＰ組成物は抗体フラグメントを含む。更なる態様において、その抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０１７０】
当業者は、本発明の抗体または抗体フラグメントが、それらがアミノ酸配列の点では変わる（例えば、野生型から）が、所望の活性の点では変わらないように更に修飾され得ることを理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらす追加のヌクレオチド置換がタンパク質に施され得る。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられ得る。別の実施形態において、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に同様の一連のもので置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる保存的置換が行われ得る。
【０１７１】
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０１７２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において同一性率は、同じである２つ以上の配列を指す。２つの配列が、比較ウィンドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してもしくはマニュアルアラインメント及び目視調査によって測定される指定された領域にわたって最大一致のために比較及び整列された場合、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合有する場合は２つの配列は「実質的に同一」である（例えば、特定の領域にわたって、または特定されていない場合、全配列にわたって６０％同一、任意に７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）。任意に、同一性は、少なくとも長さ約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の領域にわたって、またはより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００もしくはそれ以上のアミノ酸）の領域にわたって存在する。
【０１７３】
配列比較については、典型的には、１つの配列が参照配列の役割を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが使用され得るか、または別のパラメータが指定され得る。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性率を計算する。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似方法の検索によって、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、または、マニュアルアラインメント及び目視調査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって行われ得る。配列同一性及び配列類似性率を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公共に利用可能である。
【０１７４】
１つの態様において、本発明は、機能的に等価な分子を生成する出発抗体またはフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＴＦＰに含まれる抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦＶのＶＨまたはＶＬは、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように修飾され得る。本発明は、機能的に等価な分子を生成するために、ＴＦＰ構築物全体の修飾、例えば、ＴＦＰ構築物の様々なドメインの１つ以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。ＴＦＰ構築物は、出発ＴＦＰ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を保持するように修飾され得る。
【０１７５】
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然または組み換え起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、膜結合または膜貫通タンパク質以外の任意のタンパク質に由来し得る。１つの態様において、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合することが可能である。本発明における特定の用途の細胞外ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタ、または代替的な実施形態において、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも細胞外領域（複数可）を含み得る。
【０１７６】
膜貫通ドメイン
一般に、ＴＦＰ配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含有する。代替的な実施形態において、ＴＦＰは、ＴＦＰの細胞外ドメインに対して異種の膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と会合する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または最大１５のアミノ酸）及び／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または最大１５のアミノ酸）を含み得る。１つの態様において、膜貫通ドメインは、ＴＦＰの他のドメインの１つと会合するものが使用される。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするように選択され得るかまたはアミノ酸置換によって修飾され得る。１つの態様において、膜貫通ドメインは、ＴＦＰ−Ｔ細胞表面上の別のＴＦＰとホモ二量化することが可能である。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＴＦＰに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小にするように修飾または置換され得る。
【０１７７】
膜貫通ドメインは、天然または組み換え起源のいずれかに由来し得る。起源が天然の場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。１つの態様において、膜貫通ドメインは、ＴＦＰが標的に結合した場合はいつでも、細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達することが可能である。本発明において、特定の用途の膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み得る。
【０１７８】
いくつかの例において、膜貫通ドメインは、ＴＦＰの細胞外領域、例えば、ＴＦＰの抗原結合ドメインに、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して結合され得る。例えば、１つの実施形態において、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであり得る。
【０１７９】
リンカー
任意に、長さ２〜１０アミノ酸の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、ＴＦＰの膜貫通ドメインと細胞質領域と間の連結を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。例えば、１つの態様において、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号４）のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８０】
細胞質ドメイン
ＴＦＰの細胞質ドメインは、ＴＦＰがＣＤ３ガンマ、デルタまたはイプシロンポリペプチドを含有する場合、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る；ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータサブユニットは一般に、シグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは一般に、ＴＦＰが導入された免疫細胞の標準的エフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。それ故、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、そのような切断部分は、それがエフェクター機能のシグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用され得る。それ故、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことが意図されている。
【０１８１】
本発明のＴＦＰに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するために同時に作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体及び同じ機能を有する任意の組み換え配列が含まれる。
【０１８２】
ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルは、ナイーブＴ細胞の完全な活性化には不十分であること、及び二次及び／または共刺激シグナルが必要であることが知られている。それ故、ナイーブＴ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）及び抗原非依存性様式で作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）によって媒介されると言える。
【０１８３】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的方法、または抑制的方法のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的手法で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１８４】
本発明において特に使用される一次細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄのものが含まれる。１つの実施形態において、本発明のＴＦＰは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。１つの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾されたＩＴＡＭドメイン、例えば、天然のＩＴＡＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する変異したＩＴＡＭドメインを含む。１つの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された及び／または切断されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多いＩＴＡＭモチーフを含む。
【０１８５】
ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをそれだけで含み得るか、または本発明のＴＦＰとの関連で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と組み合わされ得る。例えば、ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＴＦＰの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが含まれる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、インビトロでのヒトＴＦＰ−Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能、及び生存率を向上させることが実証されており、インビボでのヒトＴ細胞の持続及び抗腫瘍活性を増大させる（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。
【０１８６】
本発明のＴＦＰの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結され得る。任意に、例えば、長さ２〜１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の連結を形成し得る。
【０１８７】
１つの実施形態において、グリシン−セリンダブレットが好適なリンカーとして使用され得る。１つの実施形態において、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンが好適なリンカーとして使用され得る。
【０１８８】
１つの態様において、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、第２のＴＦＰ、例えば、同じ標的（ＢＣＭＡ）または異なる標的（例えば、ＣＤ１２３）に対する異なる抗原結合ドメインを含む第２のＴＦＰを更に含み得る。１つの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞が２つ以上の異なるＴＦＰを含む場合、異なるＴＦＰの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第１及び第２のＴＦＰを発現する細胞は、例えば、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインと会合しないフラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして第１のＴＦＰの抗原結合ドメインを有し得、例えば、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインはＶＨＨである。
【０１８９】
別の態様において、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、別の作用物質、例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を向上させる作用物質を更に発現し得る。例えば、１つの実施形態において、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、ＰＤ１は、いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター反応を開始する能力を低下させ得る。抑制分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲベータが含まれる。１つの実施形態において、抑制分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、陽性シグナルを細胞に提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに会合した抑制分子を含む。１つの実施形態において、作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４及びＴＩＧＩＴ、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）などの抑制分子のもの、ならびに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８、例えば、本明細書に記載のもの）及び／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む）である第２のポリペプチドを含む。１つの実施形態において、作用物質は、ＰＤ１の第１のポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）、及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインの第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／または本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化したＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞上で発現される（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２つのリガンド、すなわち、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ１への結合時、Ｔ細胞の活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトのがんにおいて豊富である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所的相互作用を阻害することによって覆され得る。
【０１９０】
１つの実施形態において、作用物質は、抑制分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）は、膜貫通ドメインならびに任意に細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４１ＢＢ及びＣＤ３ゼータと融合され得る（本明細書ではＰＤ１  ＴＦＰとも称される）。１つの実施形態において、ＰＤ１  ＴＦＰは、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰと組み合わせて使用される場合、Ｔ細胞の持続性を向上させる。１つの実施形態において、ＴＦＰは、ＰＤ  １の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＴＦＰである。代替的には、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合するｓｃＦｖなどの抗体または抗体フラグメントを含有するＴＦＰが提供される。
【０１９１】
別の態様において、本発明は、ＴＦＰ発現Ｔ細胞、例えば、ＴＦＰ−Ｔ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の集団は、異なるＴＦＰを発現する細胞の混合物を含む。例えば、１つの実施形態において、ＴＦＰ−Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第１の細胞、及び異なる抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば、第１の細胞によって発現されるＴＦＰ内の抗ＢＣＭＡ結合ドメインとは異なる本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第２の細胞を含み得る。別の例として、ＴＦＰ発現細胞の集団は、例えば、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第１の細胞、及びＢＣＭＡ以外の標的（例えば、別の腫瘍関連抗原）に対する抗原結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第２の細胞を含み得る。
【０１９２】
別の態様において、本発明は、細胞の集団であって、その集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインを有するＴＦＰを発現し、第２の細胞が、別の作用物質、例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を向上させる作用物質を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、１つの実施形態において、作用物質は、抑制分子を抑制する作用物質であり得る。抑制分子は、例えば、いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター反応を開始する能力を低下させ得る。抑制分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲベータが含まれる。１つの実施形態において、抑制分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、陽性シグナルを細胞に提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに会合した抑制分子を含む。
【０１９３】
ＴＦＰをコードするインビトロで転写されたＲＮＡを産生するための方法が本明細書で開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができるＴＦＰをコードするＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、特別に設計されたプライマーでの鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）に続いてポリＡの付加を含み、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸、及び典型的には５０〜２０００塩基の長さのポリＡ尾部を含有する構築物を産生し得る。このように産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。１つの態様において、鋳型はＴＦＰのための配列を含む。
【０１９４】
１つの態様において、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。１つの態様において、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＴＦＰ−Ｔ細胞の産生のため、Ｔ細胞に導入される。１つの実施形態において、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＴＦＰは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入され得る。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成される鋳型を使用するインビトロ転写によって産生される。任意の起源由来の目的のＤＮＡは、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲによってインビトロｍＲＮＡ合成用の鋳型に直接変換され得る。ＤＮＡの起源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡ起源であり得る。インビトロ転写用の所望の鋳型は、本発明のＴＦＰである。１つの実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有する。ＤＮＡは、有機体のゲノム由来の天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。１つの実施形態において、核酸は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を含み得る。核酸はエキソン及びイントロンを含み得る。１つの実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代替的に、天然に存在する有機体で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために合わせて連結される遺伝子の部分を含有するものである。一緒に結合されるＤＮＡの部分は、単一の有機体由来または複数の有機体由来であり得る。
【０１９５】
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロ転写用の鋳型を生成するために使用される。ＰＣＲを実施するための方法は、当該技術分野でよく知られている。ＰＣＲで使用するためのプライマーは、ＰＣＲ用の鋳型として使用されるＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補的であるか、または１つ以上の塩基が非相補的、もしくは不一致であるヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、アニーリングまたは意図されるＤＮＡ標的とのハイブリッド形成が可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に対して実質的に相補的になるように設計され得る。例えば、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲを含む、細胞内で通常転写される核酸の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計され得る。プライマーはまた、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するように設計され得る。１つの実施形態において、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野でよく知られている合成方法によって生成され得る。「フォワードプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の上流のＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、コード鎖に関して増幅されるＤＮＡ配列に対する５の位置を指すために本明細書で使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の下流の二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、コード鎖に関して増幅されるＤＮＡ配列に対する３’の位置を指すために本明細書で使用される。
【０１９６】
ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に開示される方法で使用され得る。試薬及びポリメラーゼは、多数の供給源から商業的に利用可能である。
【０１９７】
安定性及び／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用され得る。ＲＮＡは好ましくは５’及び３’ＵＴＲを有する。１つの実施形態において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲ用のプライマーを設計することを含むがこれに限定されない異なる方法によって変更され得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクションに続いて、最適な翻訳効率を達成するために必要とされる５’及び３’ＵＴＲの長さを変更することができる。
【０１９８】
５’及び３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する内因性５’及び３’ＵＴＲであり得る。代替的には、目的の核酸に対して内因性でないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワード及びリバースプライマーに組み込むことによって、または鋳型の任意の他の修飾によって付加され得る。目的の核酸に対して内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を変更するために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。そのため、３’ＵＴＲは、当該技術分野でよく知られているＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計され得る。
【０１９９】
１つの実施形態において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含有し得る。代替的には、目的の核酸に対して内因性ではない５’ＵＴＲが上述のようにＰＣＲによって付加されている場合、コンセンサスコザック配列は、５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計され得る。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要ではないようである。多くのｍＲＮＡのためのコザック配列の必要性は当該技術分野で知られている。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態において、様々なヌクレオチド類似体が３’または５’ＵＴＲに使用されてｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
【０２００】
遺伝子クローニングを必要とせずに、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を可能にするために、転写のプロモーターが、転写される配列の上流のＤＮＡ鋳型に取り付けられるべきである。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加される場合、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれる。１つの好ましい実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載のＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列は当該技術分野で知られている。
【０２０１】
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、５’末端上のキャップ及び３’ポリ（Ａ）尾部の両方を有し、これらは細胞内でのリボソーム結合、転写の開始、及びｍＲＮＡの安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡ上で、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に好適ではない長い鎖状体産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化したプラスミドＤＮＡの転写は、通常のサイズのｍＲＮＡをもたらすが、これは、転写後にポリアデニル化されても真核生物のトランスフェクションには有効ではない。
【０２０２】
線状ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、転写産物の３’末端を鋳型の最後の塩基を越えて延長することができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３）。
【０２０３】
ＤＮＡ鋳型内へのポリＡ／Ｔストレッチの従来の統合方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡ内に統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドの不安定性を引き起こし得、このことは細菌の細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば、欠失及び他の異常で高度に不純である理由である。これは、クローニング手順を面倒で時間がかかるものにするだけでなく、しばしば信頼できないものにする。それが、クローニングすることなくポリＡ／Ｔ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築を可能にする方法が非常に望ましい理由である。
【０２０４】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴ尾部、例えば、１００Ｔ尾部（サイズは５０〜５０００Ｔであり得る）を含有するリバースプライマーを使用することによってＰＣＲ中に、またはＤＮＡ連結反応もしくはインビトロの組み換えを含むがこれらに限定されない任意の他の方法によってＰＣＲ後に産生され得る。ポリ（Ａ）尾部はまた、ＲＮＡに安定性を提供し、それらの分解を減少させる。一般に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。１つの実施形態において、ポリ（Ａ）尾部は、１００〜５０００アデノシンである。
【０２０５】
ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）を使用してインビトロ転写後に更に延長され得る。１つの実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドまで増加させることは、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍の増加をもたらす。また、３’末端への異なる化学基の結合は、ｍＲＮＡの安定性を増加させ得る。そのような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）尾部にＡＴＰ類似体が組み込まれ得る。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性を更に増大させる。
【０２０６】
５’キャップを付けることはまた、ＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当該技術分野で知られており且つ本明細書に記載されている技術を使用して提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０２０７】
本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡはまた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の配列を含有し得る。ＩＲＥＳ配列は、任意のウイルスの、染色体のまたは人工的に設計された配列であり得、これがｍＲＮＡに対するキャップ非依存性リボソーム結合を開始させ、翻訳の開始を促す。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、酸化防止剤、及び界面活性剤などの、細胞の透過性及び生存能力を促進する因子を含有し得る細胞のエレクトロポレーションに好適な任意の溶質が含まれ得る。
【０２０８】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）もしくはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または微粒子銃粒子送達システム、例えば、「遺伝子銃」（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して標的細胞に導入され得る。
【０２０９】
ＴＦＰをコードする核酸構築物
本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上のＴＦＰ構築物をコードする核酸分子を提供する。１つの態様において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。１つの態様において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０２１０】
所望の分子をコードする核酸配列は、当該技術分野で知られている組み換え法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすることによって、それを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、またはそれを含有する細胞及び組織から直接単離することによって、標準的な技術を使用して得ることができる。代替的には、目的の遺伝子は、クローニングされるのではなく、合成で産生され得る。
【０２１１】
１つの実施形態において、ＴＦＰ構築物の１つ以上のドメイン（例えば、細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメイン）は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ（登録商標）、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、例えば、米国特許第９，３９３，２５７号を参照されたい）、メガヌクレアーゼ（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を含む大きな認識部位を有する天然に存在するエンドデオキシリボヌクレアーゼ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）ｖ１１，６３６〜６４６を参照されたい）などの遺伝子編集技術を使用して改変される。このようにして、キメラ構築物は、立体配座またはシグナル伝達能力などの各サブユニットの望ましい特徴を組み合わせるように改変され得る。参照により本明細書に組み込まれるＳａｎｄｅｒ  ＆  Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１４）ｖ３２，３４７−５５も参照されたい。
【０２１２】
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されているベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それらが導入遺伝子の長期間にわたる安定した統合及び娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期間にわたる遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、それらが肝細胞などの非増殖性細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに対して追加された利点を有する。それらはまた、追加された低免疫原性の利点を有する。
【０２１３】
別の実施形態において、本発明の所望のＴＦＰをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＴＦＰをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、クリスパー、ＣＡＳ９、及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成され得る（参照により本明細書に組み込まれるＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６を参照されたい）。
【０２１４】
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子導入プロトコルを使用して、核酸免疫付与及び遺伝子療法に使用され得る。遺伝子導入のための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。別の実施形態において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０２１５】
核酸は、多数の種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
【０２１６】
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるがこれらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの有機体で機能的である複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０２１７】
多数のウイルスに基づくシステムが、哺乳類細胞への遺伝子導入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子導入システムに都合の良いプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該技術分野で知られている技術を使用してレトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。次いで組み換えウイルスは単離され、インビボまたはエキソビボのいずれかで対象の細胞に導入され得る。多数のレトロウイルスシステムが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当該技術分野で知られている。１つの実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０２１８】
追加のプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置しているが、多数のプロモーターが開始部位の下流に同様に機能要素を含有することが示されている。要素が互いに反転または互いに対して移動される場合にプロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔はしばしば柔軟である。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターに応じて、個々の要素は、協調的または独立的に機能して転写を活性化し得ると思われる。
【０２１９】
哺乳類のＴ細胞においてＴＦＰ導入遺伝子を発現することが可能なプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的導入に関与する伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を動作させる。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳類の発現プラスミドに広く用いられており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのＴＦＰ発現を動作させるのに有効であることが示されてきた（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を動作させることが可能な強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子のプロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列もまた使用され得る。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望まれる場合にオンにすること、または発現が望まれない場合には発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【０２２０】
ＴＦＰポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有することで、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染がなされようとする細胞の集団からの発現細胞の特定及び選択を促進することができる。他の態様において、選択マーカーは、ＤＮＡの別々の片上に担持され、同時トランスフェクション法に使用され得る。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方が、宿主細胞内での発現を可能にするために適切な調節配列に隣接され得る。有用な選択マーカーには、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、例えば、ｎｅｏなどが含まれる。
【０２２１】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を特定するため、及び調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織内に存在しないかまたはそれらによって発現されず、且つ、発現が、いくらか容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。好適な発現系はよく知られており、既知の技術を使用して調製され得るか、または商業的に入手され得る。一般に、最も高いレポーター遺伝子の発現レベルを示す最小の５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターに動作される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。
【０２２２】
細胞内に遺伝子を導入及び発現させる方法は、当該技術分野で知られている。発現ベクターとの関連では、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳類、細菌、酵母、または昆虫の細胞に、当該技術分野における任意の方法によって容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入され得る。
【０２２３】
宿主細胞内へポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入のための一つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０２２４】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、及び特にレトロウイルスベクターは、哺乳類、例えば、ヒトの細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となってきた。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい）。
【０２２５】
宿主細胞内へポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、マクロ分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。他の最先端の核酸の標的化送達の方法、例えば、標的化ナノ粒子または他の好適なサブミクロンサイズの送達システムでのポリヌクレオチドの送達が利用可能である。
【０２２６】
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞内への核酸の導入（インビトロ、エキソビボ、またはインビボ）が企図される。別の態様において、核酸は、脂質と会合され得る。脂質に会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームに付着され、リポソーム内に封入され、リポソームと複合化され、脂質含有溶液に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルと共に含有もしくは複合化され、または他の場合には脂質と会合される場合がある。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中でいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液に散在されてもよく、サイズも形も均一でない凝集体を形成すると思われる。脂質は、天然に存在するかまたは合成の脂質であり得る脂肪性の物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物のクラスが含まれる。
【０２２７】
使用に好適な脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手することができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存され得る。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単一及び多重膜の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重膜及び内側の水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴付けられ得る。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁された場合に自然に形成する。脂質成分は、自己再編成を経てから、閉鎖構造を形成し、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を封入する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは溶液中での構造が異なる組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとり得るか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。また、リポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
【０２２８】
宿主細胞内に外因性核酸を導入するためにまたは他の場合には本発明の阻害剤に細胞を暴露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞内での組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、当業者によく知られている「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法）によってまたは本明細書に記載のアッセイによって検出して、本発明の範囲内に含まれる作用物質を特定することが含まれる。
【０２２９】
本発明は、ＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターを更に提供する。１つの態様において、ＴＦＰベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞に直接形質導入され得る。１つの態様において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物を含むがこれらに限定されないベクターである。１つの態様において、ベクターは、哺乳類のＴ細胞においてＴＦＰ構築物を発現することが可能である。１つの態様において、哺乳類のＴ細胞はヒトＴ細胞である。
【０２３０】
Ｔ細胞源
増殖及び遺伝子組み換えの前に、Ｔ細胞源を対象から入手する。用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生体（例えば、哺乳類）を含むことが意図されている。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の源から入手することができる。本発明の所定の態様において、当該技術分野で入手可能な多数のＴ細胞株が使用され得る。本発明の所定の態様において、Ｔ細胞は、当業者に知られる多数の技術、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離を使用して対象から採取された血液の単位から入手することができる。１つの好ましい態様において、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって入手される。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。１つの態様において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿画分を除去するため、及び細胞をその後の処理工程のために適切な緩衝液または媒体に配するために洗浄され得る。本発明の１つの態様において、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な態様において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、且つマグネシウムを欠き得るか、または２価カチオンの全てではないがその多くを欠き得る。カルシウムの非存在下での最初の活性化工程は、活性化の拡大につながり得る。当業者には容易に理解されるように、洗浄工程は当業者に知られる方法によって、例えば、半自動の「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１セルプロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造者の指示に従って使用することによって達成され得る。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液、例えば、ＣａフリーでＭｇフリーのＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または、緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水に再懸濁され得る。代替的には、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
【０２３１】
１つの態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によってまたは向流遠心エルトリエーションによって枯渇させることによって末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、正または負の選択技術によって更に単離され得る。例えば、１つの態様において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合ビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共に、所望のＴ細胞の正の選択に十分な期間インキュベートすることによって単離される。１つの態様において、その期間は約３０分である。更なる態様において、その期間は、３０分から３６時間またはそれ以上及びその間の全ての整数値に及ぶ。更なる態様において、その期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。更に別の好ましい態様において、その期間は、１０〜２４時間である。１つの態様において、インキュベート期間は２４時間である。腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない任意の状況でＴ細胞を単離するために、より長いインキュベート時間が使用され得る。更に、より長いインキュベート時間を使用することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させることができる。それ故、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単に短縮または延長することによって、及び／または（本明細書で更に記載されるように）Ｔ細胞に対するビーズの比を増加または減少させることによって、培養開始時またはプロセス中の他の時点でＴ細胞の亜集団が優先的に選択または反選択され得る。また、ビーズもしくは他の表面上で抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時または他の所望の時点で優先的に選択または反選択され得る。当業者は、本発明に照らして複数の選択期間もまた使用され得ることを認識するであろう。所定の態様において、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞を活性化及び増殖プロセスで使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞はまた、更なる選択期間に供され得る。
【０２３２】
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び／または選択である。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。所定の態様において、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮または正に選択することが望ましい場合がある。代替的には、所定の態様において、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。
【０２３３】
１つの実施形態において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、及びパーフォリン、または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの１つ以上を発現するＴ細胞集団が選択され得る。細胞発現のスクリーニングのための方法は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法によって決定され得る。
【０２３４】
正または負の選択による所望の細胞集団の単離のため、細胞濃度及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）は変更され得る。所定の態様において、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を大幅に減少させて（例えば、細胞濃度を増加させて）、細胞とビーズの最大接触を確保することが望ましい場合がある。例えば、１つの態様において、２０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。１つの態様において、１０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。更なる態様において、１億個を超える細胞／ｍＬが使用される。更なる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。更に１つの態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍＬからの細胞濃度が使用される。更なる態様において、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高い濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加をもたらし得る。更に、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞、例えば、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕捉を可能にする。そのような細胞集団は、治療的価値を有し得、得ることが望ましいであろう。例えば、高い細胞濃度の使用は、通常はより弱いＣＤ２８の発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０２３５】
関連する態様において、より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合される多量の所望の抗原を発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度においてＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。１つの態様において、使用される細胞の濃度は５×１０６／ｍＬである。他の態様において、使用される濃度は約１×１０５／ｍＬ〜１×１０６／ｍＬ、及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様において、細胞は、回転装置上で様々な長さの時間、様々な速度で、２〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートされ得る。
【０２３６】
刺激用のＴ細胞はまた、洗浄工程の後、凍結され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、凍結及びその後の解凍工程は、細胞集団における顆粒球及びある程度の単球を除去することによってより均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄工程の後、細胞は、凍結溶液に懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で知られており、この文脈で有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯを含有する培地、または例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地の使用を含み、細胞は次いで−８０℃に毎分１の速度で凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存される。他の制御凍結方法は、−２０℃でのまたは液体窒素中での非制御即時凍結と同様に使用され得る。所定の態様において、凍結保存細胞は、本明細書に記載のように解凍及び洗浄され、室温で１時間静置されてから本発明の方法を使用して活性化される。
【０２３７】
また本発明に照らして企図されるものは、本明細書に記載の増殖した細胞が必要とされ得るときの前の期間における対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の採取である。このように、増殖される細胞源は、任意の必要な時点で採取することができ、所望の細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞療法から利益を受けるであろうあらゆる疾患または状態、例えば、本明細書に記載のもののためのＴ細胞療法における後の使用のために単離及び凍結される。１つの態様において、血液試料またはアフェレーシスは、概して健康な対象から採取される。所定の態様において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患の発症の危険性があるがまだ疾患を発症していない概して健康な対象から採取され、目的の細胞は、後の使用のために単離及び凍結される。所定の態様において、Ｔ細胞は、増殖され、凍結され、その後使用され得る。所定の態様において、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後であるが任意の治療の前に患者から採取される。更なる態様において、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６、抗体、または他の免疫消失剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、ならびに放射線照射などの作用物質での治療を含むがこれらに限定されないあらゆる関連する治療様式に先立って、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。
【０２３８】
本発明の更なる態様において、Ｔ細胞は、対象に機能的Ｔ細胞を残す治療の後に、患者から直接採取される。この点に関して、所定のがん治療の後、免疫系に損傷を与える薬物での特定の治療において、治療の直後で、患者が治療から通常回復するであろう期間中に、得られたＴ細胞の品質は、エキソビボでのそれらの増殖能が最適であり得るか、または改善され得ることが観察された。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエキソビボ操作の後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖の向上に好ましい状態にあり得る。それ故、本発明の文脈の範囲内で、Ｔ細胞を含む血液細胞、樹状細胞、または造血系の他の細胞をこの回復期に採取することが企図される。更に、所定の態様において、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員）及び前処置レジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増殖が促進される対象における、特に治療後の所定の時間窓での条件を作成することができる。例示的な細胞タイプには、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が含まれる。
【０２３９】
Ｔ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；及び第７，５７２，６３１号に記載されている方法を一般に使用して活性化及び増殖され得る。
【０２４０】
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質を付着された表面及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触によって増殖され得る。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載のように、例えば、抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせてプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が含まれ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法が使用され得る（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７、１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０２４１】
多様な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスされた末梢血の単核細胞産物は、ヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有し、これは細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多い。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエキソビボでの増殖は、約８〜９日目より前には、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目より後は、Ｔ細胞の集団は次第に増加するＴＣ細胞の集団を含む。したがって、治療の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、抗原特異的なＴＣ細胞のサブセットが単離された場合、このサブセットをより高い程度まで増殖させることが有益な場合がある。
【０２４２】
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖プロセスの過程の間に、大幅に、しかし大部分は再現可能に変化する。それ故、そのような再現性は、活性化されたＴ細胞産物を特定の目的のために調整する能力を可能にする。
【０２４３】
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰが構築されると、様々なアッセイを使用して、限定されないが、抗原刺激後のＴ細胞を増殖する能力、再刺激の非存在下でＴ細胞増殖を持続する能力、及び適切なインビトロ及び動物モデルでの抗がん活性などの分子の活性を評価することができる。抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰの効果を評価するアッセイを以下に更に詳細に説明する。
【０２４４】
一次Ｔ細胞におけるＴＦＰ発現のウェスタンブロット分析を使用して、モノマー及びダイマーの存在を検出することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。極めて簡潔には、ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を、インビトロで１０日より長い間増殖させ、続いて溶解し、還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。ＴＦＰは、ＴＣＲ鎖に対する抗体を使用してウェスタンブロットによって検出される。同じＴ細胞のサブセットを、非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用して共有結合ダイマー形成の評価を可能にする。
【０２４５】
抗原刺激後のＴＦＰ＋Ｔ細胞のインビトロでの増殖は、フローサイトメトリーによって測定され得る。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８及びＡＰＣで刺激し、続いて分析されるプロモーターの制御下で、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターには、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれる。ＧＦＰの蛍光は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット中での培養の６日目にフローサイトメトリーによって評価される（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。代替的には、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をアルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで０日目に刺激し、１日目に、ＴＦＰを発現するバイシストロニックなレンチウイルスベクターを使用して、ｅＧＦＰと共に２Ａリボソームスキッピング配列を使用してＴＦＰで形質導入する。培養物を、ＢＣＭＡ＋Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）または抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）のいずれかで洗浄後に再刺激する。外因性ＩＬ−２を培養物に１日おきに１００ＩＵ／ｍＬで添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズに基づく計数を使用してフローサイトメトリーによって数えられる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。
【０２４６】
再刺激の非存在下で持続するＴＦＰ＋Ｔ細胞の増殖もまた測定され得る（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。簡潔には、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで０日目に刺激し、示されたＴＦＰで１日目に形質導入した後、培養の８日目に平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）をＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンターを使用して測定する。
【０２４７】
動物モデルを使用してＴＦＰ−Ｔ活性を測定することもできる。例えば、免疫不全マウスにおいてがんを治療するためのヒトＢＣＭＡ特異的ＴＦＰ＋Ｔ細胞を使用した異種移植モデルである（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。極めて簡潔には、がんの定着後、マウスを治療群に応じてランダム化する。異なる数の改変Ｔ細胞を１：１の比でがんを有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスに同時注射する。マウス由来の脾臓ＤＮＡにおける各ベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後の様々な時点で評価する。動物を１週間間隔でがんについて評価する。末梢血ＢＣＭＡ＋がん細胞数を、アルファＢＣＭＡ−ゼータＴＦＰ＋Ｔ細胞またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞が注射されたマウスで測定する。その群についての生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。また、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスにおけるＴ細胞注射の４週間後の末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数も分析され得る。マウスにがん細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結されたＴＦＰをコードするバイシストロニックなレンチウイルスベクターによってＴＦＰを発現するように改変されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞は、注射の前に、ｍｏｃｋ形質導入細胞と混合することによって、４５〜５０％入力ＧＦＰ＋Ｔ細胞に正規化され、フローサイトメトリーによって確認される。動物を１週間間隔でがんについて評価する。ＴＦＰ＋Ｔ細胞群についての生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
【０２４８】
用量依存的なＴＦＰ治療反応が評価され得る（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。例えば、末梢血を、２１日目にＴＦＰ  Ｔ細胞、同数のｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞が注射された、またはＴ細胞が注入されなかったマウスにおいて、がんの定着後３５〜７０日で採取する。３５日目及び４９日目に、末梢血ＢＣＭＡ＋がん細胞数の決定のために各群のマウスをランダムに採血し、次いで殺処分する。残りの動物は５７日目及び７０日目に評価する。
【０２４９】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）で先行して記載されている。簡潔には、ＴＦＰ媒介増殖の評価は、マイクロタイタープレートにおいて、洗浄したＴ細胞を、ＢＣＭＡまたはＣＤ３２及びＣＤ１３７を発現する細胞（ＫＴ３２−ＢＢＬ）と、最終的なＴ細胞：ＢＣＭＡを発現する細胞の比が２：１になるように混合することによって実施される。ＢＣＭＡ細胞を発現する細胞は、使用前にガンマ線が照射される。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞を有する培養物に加えてＴ細胞増殖を刺激するための陽性対照として機能させるが、これは、これらのシグナルが長期的なＣＤ８＋Ｔ細胞のエキソビボでの増殖をサポートするためである。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーを使用して製造者によって記載されているように培養物中のＴ細胞を数える。ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ−２Ａが連結されたＴＦＰ発現レンチウイルスベクターで改変されたＴ細胞を使用してＧＦＰの発現によって特定される。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋Ｔ細胞については、ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ビオチン化組み換えＢＣＭＡタンパク質及び二次アビジン・ＰＥ複合体で検出される。Ｔ細胞上でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋の発現はまた、特定のモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で同時に検出される。サイトカインの測定は、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して製造者の指示に従って再刺激の２４時間後に採取された上清について実施する。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造者の指示に従って分析する。
【０２５０】
細胞傷害性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価され得る（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。簡潔には、標的細胞に、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を担持させ、完全ＲＰＭＩ中で２度洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル内で完全ＲＰＭＩ中で標的細胞と様々なエフェクター細胞：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で混合する。培地のみを含有する（自然放出、ＳＲ）またはトリトン−Ｘ１００洗浄剤の１％溶液を含有する（総放出、ＴＲ）追加のウェルも用意する。３７℃で４時間のインキュベート後、各ウェルから上清を採取する。次いで放出された５１Ｃｒをガンマパーティクルカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して測定する。各条件を少なくとも三連で実施し、溶解率を式：溶解％＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）（式中、ＥＲは各実験条件について放出された平均５１Ｃｒを表す）を使用して計算する。
【０２５１】
撮像技術を使用して、腫瘍を有する動物モデルにおけるＴＦＰの特異的輸送及び増殖を評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１５７５−１５８６（２０１１）に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスにがん細胞を静脈内注射し、続いて７日後にＴＦＰ構築物でのエレクトロポレーションの４時間後にＴ細胞を静脈内注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現させるためにレンチウイルス構築物で安定的にトランスフェクトされ、マウスは生物発光について撮像される。代替的には、がん異種移植モデルにおけるＴＦＰ＋Ｔ細胞の単回注射の治療効力及び特異性は以下の通りに測定され得る：ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたがん細胞を注射し、続いて７日後にＢＣＭＡ  ＴＦＰをエレクトロポレーションしたＴ細胞を単回尾静脈注射する。動物を注射後の様々な時点で撮像する。例えば、５日目（処置の２日前）及び８日目（ＴＦＰ＋ＰＢＬの２４時間後）に代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性がんの光子密度ヒートマップが生成され得る。
【０２５２】
本明細書の実施例の節に記載のもの及び当該技術分野で知られているものを含む他のアッセイもまた、本発明の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物を評価するために使用され得る。
【０２５３】
治療適用
ＢＣＭＡ関連疾患及び／または障害
１つの態様において、本発明は、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。１つの態様において、本発明は、疾患を治療するための方法であって、腫瘍の一部がＢＣＭＡに陰性であり、腫瘍の一部がＢＣＭＡに陽性である、方法を提供する。例えば、本発明の抗体またはＴＦＰは、上昇したＢＣＭＡの発現に関連する疾患のための治療を受けた対象を治療するのに有用であり、上昇したレベルのＢＣＭＡのための治療を受けた対象は、上昇したレベルのＢＣＭＡに関連する疾患を呈する。
【０２５４】
１つの態様において、本発明は、哺乳類のＴ細胞での発現用のプロモーターに作動可能に連結された抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰを含むベクターに関する。１つの態様において、本発明は、ＢＣＭＡ発現腫瘍を治療する際に使用するためのＢＣＭＡ  ＴＦＰを発現する組み換えＴ細胞を提供し、ＢＣＭＡ  ＴＦＰを発現する組み換えＴ細胞は、ＢＣＭＡ  ＴＦＰ−Ｔと称される。１つの態様において、本発明のＢＣＭＡ  ＴＦＰ−Ｔは、ＴＦＰ−Ｔが腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の成長が阻害されるように、腫瘍細胞を、その表面上で発現する本発明の少なくとも１つのＢＣＭＡ  ＴＦＰと接触させることが可能である。
【０２５５】
１つの態様において、本発明は、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、ＴＦＰ−Ｔが抗原に反応して活性化され、がん細胞を標的化するように腫瘍細胞を本発明のＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含み、腫瘍の成長が阻害される、方法に関する。
【０２５６】
１つの態様において、本発明は、対象におけるがんを治療する方法に関する。その方法は、がんが対象において治療されるように、本発明のＢＣＭＡ抗体、二重特異性抗体、またはＴＦＰ−Ｔ細胞を対象に投与することを含む。本発明のＢＣＭＡ  ＴＦＰ  Ｔ細胞によって治療可能ながんの例は、ＢＣＭＡの発現に関連するがんである。１つの態様において、がんは骨髄腫である。１つの態様において、がんはリンパ腫である。１つの態様において、がんは結腸癌である。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ治療は、１つ以上の追加の治療と組み合わせて使用され得る。いくつかの例において、そのような追加の治療は、化学療法剤、例えば、シクロホスファミドを含む。いくつかの例において、そのような追加の治療は、外科的切除または放射線治療を含む。
【０２５８】
１つの態様において、細胞療法の方法であって、Ｔ細胞がＴＦＰを発現するように遺伝子組み換えされ、そのＴＦＰ発現Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、方法が本明細書で提供される。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺傷することが可能である。抗体療法とは異なり、ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、インビボで複製することが可能であり、継続した腫瘍制御につながり得る長期持続をもたらす。様々な態様において、患者に投与されたＴ細胞、またはそれらの後代は、患者へのＴ細胞の投与後、少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、または５年間、患者内で存続する。
【０２５９】
いくつかの例において、Ｔ細胞が、ＴＦＰを一過性に発現するように、例えば、インビトロで転写されたＲＮＡによって修飾され、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、一種の細胞療法が本明細書で提供される。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺傷することが可能である。それ故、様々な態様において、患者に投与されたＴ細胞は、患者へのＴ細胞の投与後、１ヶ月未満、例えば、３週間、２週間、または１週間存在する。
【０２６０】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫反応は、能動でも受動免疫反応でもよく、代替的には、直接対間接免疫反応によってもよい。１つの態様において、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞は、ＢＣＭＡ抗原を発現するヒトがん細胞に反応して特定の炎症性サイトカイン分泌及び強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性ＢＣＭＡ阻害に耐性であり、バイスタンダー殺傷を媒介し、及び／または定着したヒト腫瘍の退行を媒介する。例えば、ＢＣＭＡ発現腫瘍の異種フィールド内の抗原のない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞に対してすでに反応しているＢＣＭＡ再指向性Ｔ細胞による間接的な破壊に対して敏感であり得る。
【０２６１】
１つの態様において、本発明のヒトＴＦＰ修飾Ｔ細胞は、哺乳類におけるエキソビボでの免疫付与及び／またはインビボ治療用の一種のワクチンであり得る。１つの態様において、哺乳類はヒトである。
【０２６２】
エキソビボでの免疫付与に関しては、細胞を哺乳類に投与する前に、以下のうちの少なくとも１つがインビトロで行われる：ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＴＦＰをコードする核酸の細胞への導入またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
【０２６３】
エキソビボ手順は、当該技術分野でよく知られており、以下により詳細に論述する。簡潔には、細胞を哺乳類（例えば、ヒト）から単離し、本明細書に開示されるＴＦＰを発現するベクターで遺伝子組み換えする（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする）。ＴＦＰ修飾細胞を哺乳類のレシピエントに投与し、治療的利益を提供することができる。哺乳類のレシピエントは、ヒトでよく、ＴＦＰ修飾細胞は、レシピエントに関して自己移植であり得る。代替的には、細胞は、レシピエントに関して同種異系、同系または異種であり得る。
【０２６４】
造血幹及び前駆細胞のエキソビボでの増殖のための手順は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、本発明の細胞に適用され得る。他の好適な方法は当該技術分野で知られており、そのため、本発明は、細胞の任意の特定のエキソビボでの増殖方法に限定されない。簡潔には、Ｔ細胞のエキソビボでの培養及び増殖は：（１）末梢血採取または骨髄外植片から哺乳類由来のＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞を採取すること；及び（２）そのような細胞をエキソビボで増殖させることを含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載の細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３及びｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子が細胞の培養及び増殖のために使用され得る。
【０２６５】
エキソビボでの免疫付与に関して細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫反応を誘発するインビボでの免疫付与のための組成物及び方法を提供する。
【０２６６】
一般に、本明細書に記載の活性化及び増殖された細胞は、免疫不全の個体で生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。特に、本発明のＴＦＰ修飾Ｔ細胞は、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患、障害及び状態の治療に使用される。所定の態様において、本発明の細胞は、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患、障害及び状態を発症する危険性がある患者の治療に使用される。それ故、本発明は、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患、障害及び状態の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明のＴＦＰ修飾Ｔ細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【０２６７】
１つの態様において、本発明の抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞は、がんまたは悪性腫瘍などの増殖性疾患または前がん状態を治療するために使用され得る。１つの態様において、がんは骨髄腫である。１つの態様において、がんはリンパ腫である。１つの態様において、がんは結腸がんである。更に、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患には、例えば、非定型及び／または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態またはＢＣＭＡを発現する増殖性疾患が含まれるがこれらに限定されない。ＢＣＭＡの発現に関連する非がん関連症状には、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が含まれるがこれらに限定されない。
【０２６８】
本発明の抗体またはＴＦＰで修飾されたＴ細胞は、単独で、または希釈剤及び／または他の成分、例えば、ＩＬ−２もしくは他のサイトカインまたは細胞集団と組み合わされた薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。
【０２６９】
本発明はまた、ＢＣＭＡ発現細胞集団の増殖を阻害するためのまたはその集団を減少させるための方法を提供し、その方法は、ＢＣＭＡ発現細胞を含む細胞の集団を、ＢＣＭＡ発現細胞に結合する本発明の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む。特定の態様において、本発明は、ＢＣＭＡを発現するがん細胞の集団の増殖を阻害するためのまたはその集団を減少させるための方法を提供し、その方法は、ＢＣＭＡ発現がん細胞集団を、ＢＣＭＡ発現細胞に結合する本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む。１つの態様において、本発明は、ＢＣＭＡを発現するがん細胞の集団の増殖を阻害するためのまたはその集団を減少させるための方法を提供し、その方法は、ＢＣＭＡ発現がん細胞集団を、ＢＣＭＡ発現細胞に結合する本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む。所定の態様において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞は、細胞及び／またはがん細胞の分量、数、量または割合を、多発性骨髄腫またはＢＣＭＡ発現細胞に関連する別のがんを有する対象またはその動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下させる。１つの態様において、対象はヒトである。
【０２７０】
本発明はまた、ＢＣＭＡ発現細胞に関連する疾患（例えば、ＢＣＭＡを発現するがん）を予防、治療及び／または管理するための方法を提供し、その方法は、ＢＣＭＡ発現細胞に結合する本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を、必要とする対象に投与することを含む。１つの態様において、対象はヒトである。ＢＣＭＡ発現細胞に関連する障害の非限定的な例には、自己免疫障害（狼瘡など）、炎症性疾患（アレルギー及び喘息など）及びがん（ＢＣＭＡを発現する血液がんまたは非定型がんなど）が含まれる。
【０２７１】
本発明はまた、ＢＣＭＡ発現細胞に関連する疾患を予防、治療及び／または管理するための方法を提供し、その方法は、ＢＣＭＡ発現細胞に結合する本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を、必要とする対象に投与することを含む。１つの態様において、対象はヒトである。
【０２７２】
本発明は、ＢＣＭＡ発現細胞に関連するがんの再発を予防するための方法を提供し、その方法は、それを必要とする対象に、ＢＣＭＡ発現細胞に結合する本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む。１つの態様において、その方法は、それを必要とする対象に、有効量のＢＣＭＡ発現細胞に結合する本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を有効量の別の治療と組み合わせて投与することを含む。
【０２７３】
併用療法
本明細書に記載の抗体またはＴＦＰ発現細胞は、他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用され得る。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が、障害での対象の苦痛の過程において対象に送達されること、例えば、２つ以上の治療が、対象が障害と診断された後、且つ障害が治癒もしくは排除される前または治療が他の理由のために中止される前に送達されることを意味する。いくつかの実施形態において、投与に関して重複が存在するように、１つの治療の送達は、第２の送達の開始時に依然として行われている。これは時に、本明細書では「同時」または「併用送達」と称される。他の実施形態において、１つの治療の送達は、他方の治療の送達の開始前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態において、治療は、併用投与のためにより有効である。例えば、第２の治療はより有効であり、例えば、第１の治療なしで第２の治療が施される場合に見られるより、より少ない第２の治療で同等の効果が見られるか、または第２の治療は症状をより大幅に減少させ、または類似の状況は第１の治療でも見られる。いくつかの実施形態において、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメータの減少が、他方の非存在下で送達される１つの治療で観察されるであろうものより大きくなるようになされる。２つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加的を超える場合がある。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達されるときに依然として検出可能であるようになされ得る。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、「少なくとも１つの追加の治療剤」には、ＴＦＰ発現細胞が含まれる。また、同じもしくは異なる標的抗原、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する複数のＴＦＰを発現するＴ細胞が提供される。また、第１のＴ細胞のサブセットが第１のＴＦＰを発現し、第２のＴ細胞のサブセットが第２のＴＦＰを発現するＴ細胞の集団が提供される。
【０２７５】
本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞及び少なくとも１つの追加の治療剤は、同時に、同じもしくは別々の組成物で、または連続的に投与され得る。連続投与の場合、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は最初に投与され得、追加の薬剤は２番目に投与され得うるか、または投与の順序を入れ替えてもよい。
【０２７６】
更なる態様において、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６、抗体、もしくは他の免疫消失剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び放射線照射、ペプチドワクチン、例えば、Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載されているものと組み合わせて治療レジメンで使用され得る。
【０２７７】
１つの実施形態において、対象には、ＴＦＰ発現細胞の投与に関連する副作用を減少または改善する薬剤が投与され得る。ＴＦＰ発現細胞の投与に関連する副作用には、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及びマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも称される血球貪食性リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）が含まれるがこれらに限定されない。ＣＲＳの症状には、高熱、吐き気、一過性低血圧、低酸素症などが含まれる。したがって、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞を対象に投与すること、及び更にＴＦＰ発現細胞での治療に起因する上昇したレベルの可溶性因子を管理する薬剤を投与することを含み得る。１つの実施形態において、対象内で上昇した可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２及びＩＬ−６のうちの１つ以上である。そのため、この副作用を治療するために投与される薬剤は、これらの可溶性因子のうちの１つ以上を中和する薬剤であり得る。そのような薬剤には、ステロイド、ＴＮＦαの阻害剤、及びＩＬ−６の阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例はエタネルセプト（名称ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）で市場されている）である。ＩＬ−６阻害剤の例はトシリズマブ（名称ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）で市場されている）である。
【０２７８】
１つの実施形態において、対象は、ＴＦＰ発現細胞の活性を向上させる薬剤が投与され得る。例えば、１つの実施形態において、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）は、いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター反応の開始能力を低下させ得る。抑制分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲベータが含まれる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による抑制分子の阻害は、ＴＦＰ発現細胞の性能を最適化し得る。実施形態において、抑制性核酸、例えば、抑制性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＴＦＰ発現細胞において抑制分子の発現を阻害するために使用され得る。実施形態において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。実施形態において、抑制分子は、ＴＦＰ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態において、抑制分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が、ＴＦＰの成分、例えば全ての成分をコードする核酸に連結される。１つの実施形態において、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、作用物質は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体また抗体フラグメント（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１とも称され、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として市場されている；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、かつてチシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６として知られていたもの））であり得る。実施形態において、薬剤は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）に結合する抗体または抗体フラグメントである。実施形態において、薬剤は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、ＴＦＰ発現細胞の活性を向上させる薬剤は、例えば、第１のドメイン及び第２のドメインを含む融合タンパク質であって、第１のドメインが抑制分子またはそのフラグメントであり、第２のドメインが陽性シグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載された細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、陽性シグナルに関連するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７及び／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載の、例えば、ＣＤ３ゼータのものを含み得る。１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＴＦＰを発現したものと同じ細胞によって発現される。別の実施形態において、融合タンパク質は、細胞、例えば、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰを発現しないＴ細胞によって発現される。
【０２８０】
薬学的組成物
本発明の医薬組成物は、ＴＦＰ発現細胞、例えば、本明細書に記載された複数のＴＦＰ発現細胞を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存料を含み得る。本発明の組成物は、１つの態様において、静脈内投与用に製剤化される。
【０２８１】
本発明の薬学的組成物は、治療される（または予防される）疾患に適切な手法で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定され得る。
【０２８２】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、混入物質、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残存抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞もしくはプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される混入物質が実質的になく、例えば、検出レベルではない。１つの実施形態において、細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓＡ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０２８３】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染もしくは転移の程度、及び状態における個体差を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む薬学的組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの例において１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の用量で投与され得ることが一般に述べられ得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの用量において複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０２８４】
所定の態様において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、次いでその後再採血し（またはアフェレーシスが実施され）、本発明に従ってそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは数週間ごとに複数回行われ得る。所定の態様において、Ｔ細胞は１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。所定の態様において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。
【０２８５】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、注入または移植によるものを含む任意の好都合な手法で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与され得る。１つの態様において、本発明のＴ細胞組成物は、患者に対して、皮内または皮下注射によって投与される。１つの態様において、本発明のＴ細胞組成物は、静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射され得る。
【０２８６】
特定の例示的な態様において、対象は、白血球を採取し、エキソビボで濃縮しまたは枯渇させて目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択及び／または単離する白血球除去療法を受けてもよい。これらのＴ細胞分離株は、当該技術分野で知られている方法によって増殖され、１つ以上の本発明のＴＦＰ構築物が導入され得るように処理され、それによって本発明のＴＦＰ発現Ｔ細胞を生成してもよい。それを必要とする対象は、その後標準的な大量化学療法での治療に続いて末梢血幹細胞移植を受けてもよい。所定の態様において、移植の後またはそれと同時に、対象は、本発明の増殖したＴＦＰ  Ｔ細胞の注入を受ける。追加的な態様において、増殖した細胞は、手術の前または後に投与される。
【０２８７】
患者に施される上記の治療の用量は、治療されている状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変わる。ヒト投与のための用量のスケーリングは、当該技術分野で認められた慣行に従って実施され得る。例えば、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））の用量は一般に、成人患者の場合１〜約１００ｍｇの範囲内であり、通常は１〜３０日の期間、毎日投与される。好ましい１日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、いくつかの例において、１日当たり最大４０ｍｇのより多くの用量が使用され得る（米国特許第６，１２０，７６６号に記載されている）。
【０２８８】
１つの実施形態において、ＴＦＰは、例えば、インビトロ転写を使用してＴ細胞内に導入され、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の最初の投与及び１回以上のそれに続く本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与を受け、その１回以上のそれに続く投与は、先の投与後、１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日投与される。１つの実施形態において、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の複数回の投与が、対象（例えば、ヒト）に対して１週間ごとに投与され、例えば、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の２、３、または４回の投与が１週間ごとに投与される。１つの実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１週間ごとに複数回のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与（例えば、１週間ごとに２、３または４回の投与）（本明細書ではサイクルとも称される）を受け、これにＴＦＰ  Ｔ細胞の投与をしない１週間が続き、次いで１回以上の追加のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与（例えば、１週間ごとに複数回のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与）が対象に施される。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、複数サイクルのＴＦＰ  Ｔ細胞を受け、各サイクル間の時間は１０、９、８、７、６、５、４、または３日未満である。１つの実施形態において、ＴＦＰ−Ｔ細胞は、１週間ごとに３回の投与のために１日おきに投与される。１つの実施形態において、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間またはそれ以上投与される。
【０２８９】
１つの態様において、ＢＣＭＡ  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルス性ウイルスベクターを使用して生成される。その方法で生成されるＴＦＰ−Ｔ細胞は、安定的なＴＦＰ発現を有する。
【０２９０】
１つの態様において、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、形質導入後、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、ＴＦＰベクターを一過性に発現する。ＴＦＰの一過性の発現は、ＲＮＡ  ＴＦＰベクターの送達によってもたらされ得る。１つの態様において、ＴＦＰ  ＲＮＡは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
【０２９１】
一過性に発現するＴＦＰ  Ｔ細胞を使用して（特にマウスｓｃＦｖ担持ＴＦＰ  Ｔ細胞で）治療されている患者に生じ得る潜在的な問題は、複数回の治療後のアナフィラキシーである。
【０２９２】
この理論に拘束されるものではないが、そのようなアナフィラキシー反応は、体液性抗ＴＦＰ反応、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＴＦＰ抗体を発生させている患者によって引き起こされる可能性があると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露が１０〜１４日間中断された場合、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けていると思われる。
【０２９３】
患者が一過性ＴＦＰ療法（ＲＮＡ形質導入によって生成されるものなど）の過程で抗ＴＦＰ抗体反応を生成する危険性が高い場合、ＴＦＰ  Ｔ細胞注入の中断は、１０〜１４日より長く続けるべきではない。
【実施例】
【０２９４】
以下の実験実施例を参照することによって本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供され、別段特定されない限り限定することは意図されていない。それ故、本発明は、以下の実施例に限定されるものとして一切解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。更に説明することなく、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用すること、ならびに特許請求された方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に挙げており、本開示の残余を限定するものとして一切解釈されるべきではない。
【０２９５】
実施例１：ＴＦＰ構築物
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物は、短いリンカー（ＳＬ）：ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号１）または長いリンカー（ＬＬ）：ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号２）をコードするＤＮＡ配列のいずれかによってＣＤ３またはＴＣＲ  ＤＮＡフラグメントに連結した抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ））にクローニングすることによって作り出す。
【０２９６】
生成した抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物は、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲα（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体α鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲ  αＣ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒトＴ細胞受容体α定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲβ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＴＣＲβＣ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒトＴ細胞受容体β定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＣＤ３γ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＣＤ３δ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒトＣＤ３δ鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＬＬ＿ＣＤ３ε（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−長いリンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＳＬ＿ＴＣＲβ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−短いリンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＳＬ＿ＣＤ３γ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−短いリンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＳＬ＿ＣＤ３δ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−短いリンカー−ヒトＣＤ３δ鎖）、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＳＬ＿ＣＤ３ε（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−短いリンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）である。
【０２９７】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物であるｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿２８ζは、抗ＢＣＭＡ、部分的なＣＤ２８の細胞外ドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の細胞内ドメイン及びＣＤ３ゼータをコードする合成ＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクターにクローニングすることによって生成される。
【０２９８】
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物は、リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号５）をコードするＤＮＡ配列によってＣＤ３  ＤＮＡフラグメントに連結した抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（ＳＢＩ）にクローニングすることによって作り出した。生成した抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物は、ｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＣＤ３γ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ（またはＶＨＨ）−リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）及びｐ５１０＿抗ＢＣＭＡ＿ＣＤ３ε（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ（またはＶＨＨ）−リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）であった。
【０２９９】
完全長ＢＣＭＡを合成し、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ部位でｐ５１４（ＳＢＩ）にクローニングし、安定な標的細胞株を生成するために使用される構築物ｐ５１４＿ＢＣＭＡを生成した。
【０３００】
抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及び抗カルボアンヒドラーゼ−９（ＣＡＩＸ）ＴＦＰ構築物は、リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号５）をコードするＤＮＡ配列によってＣＤ３  ＤＮＡフラグメントに連結した抗ＦＡＰまたは抗ＣＡＩＸ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（ＳＢＩ）にクローニングすることによって作り出す。生成され得る抗ＦＡＰまたは抗ＣＡＩＸ  ＴＦＰ構築物には、ｐ５１０＿抗ＦＡＰ＿ＣＤ３γ（抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖ−リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）及びｐ５１０＿抗ＦＡＰ＿ＣＤ３ε（抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖ−リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）ならびにｐ５１０＿抗ＣＡＩＸ＿ＣＤ３γ（抗ＣＡＩＸ  ｓｃＦｖ−リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）及びｐ５１０＿抗ＣＡＩＸ＿ＣＤ３ε（抗ＣＡＩＸ  ｓｃＦｖ−リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）が含まれる。
【０３０１】
完全長ＦＡＰ及びＣＡＩＸを合成し、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ部位でｐ５１４（ＳＢＩ）にクローニングし、安定な標的細胞株を生成するために使用され得る構築物ｐ５１４＿ＦＡＰ及びｐ５１４＿ＣＡＩＸを生成し得る。
【０３０２】
例示的な構築物の配列は付録Ａ：配列に開示されている。
【０３０３】
実施例２：抗体配列
抗体配列の生成
ヒトＢＣＭＡポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０２２２３である。ヒトＢＣＭＡポリペプチド、及びそのフラグメントまたはドメインに特異的に結合することが可能な抗体ポリペプチドを提供する。抗ＢＣＭＡ抗体は、様々な技術を使用して生成され得る（例えば、（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）を参照されたい）。マウス抗ＢＣＭＡ抗体が出発材料として使用される場合、マウス抗ＢＣＭＡ抗体のヒト化が臨床環境では望まれ、その場合、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）治療、すなわち、ＴＦＰ．ＢＣＭＡ構築物で形質導入されたＴ細胞での治療を受ける対象において、マウス特異的残基が、ヒト−抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）反応を誘導し得る。ヒト化は、マウス抗ＢＣＭＡ抗体由来のＣＤＲ領域を、ＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域に対する他の修飾を任意に含む、適切なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークに移植することによって達成される。本明細書で提供されるように、抗体及び抗体フラグメント残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。
【０３０４】
ｓｃＦｖの生成
ヒトまたはヒト化抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧを使用してＴＦＰ構築物用のｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、構築物用のコドンを任意に、ヒト由来の細胞における発現に最適化する。ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖに現れる順序は変動し（すなわち、ＶＬ−ＶＨ、またはＶＨ−ＶＬ配置）、「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３が可変ドメインを接続させてｓｃＦｖドメインを生成する。抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖプラスミド構築物は、任意のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティタグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳類の細胞株にエレクトロポレートされ、精製される。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態分析、及びＢＣＭＡ発現細胞の染色が含まれる。
【０３０５】
ＶＬ及びＶＨドメインの例示的な抗ＢＣＭＡ  ＣＤＲならびにそれらをそれぞれコードするヌクレオチド配列を以下に示す。
【０３０６】
抗ＢＣＭＡ
抗ＢＣＭＡ軽鎖ＣＤＲ１
コード配列：ＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号７）
アミノ酸配列：ＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号８）
【０３０７】
抗ＢＣＭＡ軽鎖ＣＤＲ２
コード配列：ＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣ（配列番号９）
アミノ酸配列：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１０）
【０３０８】
抗ＢＣＭＡ軽鎖ＣＤＲ３
コード配列：ＧＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣ（配列番号１１）
アミノ酸配列：ＡＥＴＳＨＶＰＷＴ（配列番号１２）
【０３０９】
抗ＢＣＭＡ重鎖ＣＤＲ１
コード配列：ＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣ（配列番号１３）
アミノ酸配列：ＫＡＳＧＹＳＦＰＤＹＹＩＮ（配列番号１４）
【０３１０】
抗ＢＣＭＡ重鎖ＣＤＲ２
コード配列：ＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧＡＡＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＣＧＧＣ（配列番号１５）
アミノ酸配列：ＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧ（配列番号１６）
【０３１１】
抗ＢＣＭＡ重鎖ＣＤＲ３
コード配列：ＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧ（配列番号１７）
アミノ酸配列：ＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶ（配列番号１８）
【０３１２】
抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域
コード配列：ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＣ（配列番号１９）
アミノ酸配列：ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＥＴＳＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＳ（配列番号２０）
【０３１３】
抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域
コード配列：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧＡＡＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＣＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＡＧＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号２１）
アミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＰＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号２２）
【０３１４】
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ１
コード配列：
【０３１５】
ＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＡＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＡＡＴＴＧＧＴＣＧＣＧＡＧＴＡＴＡＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＴＧＡＴＡＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＧＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＡＧＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣ（配列番号２３）
アミノ酸配列：
ＱＶＨＰＶＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＧＩＦＳＩＮＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＳＩＴＳＲＧＤＴＴＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＡＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＬＫＧＴＤＹＳＧＴＳＴＱＴＦＤＲＱＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＴＰＫＰＱＰＱＰＱＰＱＰＱＰＮＰＴＴＥＳＫＣＰＫＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＳＩ（配列番号２４）
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ１  ＣＤＲ１
ＩＮＶＭＧ（配列番号２５）
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ１  ＣＤＲ２
ＳＩＴＳＲＧＤＴＴＹＡＮＳＶＫＧ（配列番号２６）
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ１  ＣＤＲ３
ＬＫＧＴＤＹＳＧＴＳＴＱＴＦＤＲ（配列番号２８）
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＴＮＩＦＳＩＳＰＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＨＧＦＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＫＶＰＷＧＤＹＨＰＲＮＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＴＰＫＰＱＰＱＰＱＰＱＰＱＰＱＰＮＰＴＴＥＳＫＣＰＫＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＳＩ
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２  ＣＤＲ１
ＩＳＰＭＧ（配列番号２９）
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２  ＣＤＲ２
ＡＩＨＧＦＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）
抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２  ＣＤＲ３
ＶＰＷＧＤＹＨＰＲＮＶＹ（配列番号３１）
【０３１６】
ＴＣＲサブユニット源
ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のサブユニットは全て、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含有する。ヒトＴＣＲ複合体は、ＣＤ３イプシロンポリペプチド、ＣＤ３ガンマポリペプチド、ＣＤ３デルタポリペプチド、ＣＤ３ゼータポリペプチド、ＴＣＲアルファ鎖ポリペプチド及びＴＣＲベータ鎖ポリペプチドを含有する。ヒトＣＤ３イプシロンポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３ガンマポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３デルタポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４３２３４である。ヒトＣＤ３ゼータポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０９６３である。ヒトＴＣＲアルファ鎖の標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＩＳＵ１である。ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域の標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１８５０であり、ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域の配列は、Ｐ０４４３５である。
【０３１７】
ヒトＣＤ３イプシロンポリペプチドの標準的な配列は：ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ（配列番号３２）である。
【０３１８】
ヒトＣＤ３ガンマポリペプチドの標準的な配列は：ＭＥＱＧＫＧＬＡＶＬＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＣＱＮＣＩＥＬＮＡＡＴＩＳＧＦＬＦＡＥＩＶＳＩＦＶＬＡＶＧＶＹＦＩＡＧＱＤＧＶＲＱＳＲＡＳＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬＱＧＮＱＬＲＲＮ（配列番号３３）である。
【０３１９】
ヒトＣＤ３デルタポリペプチドの標準的な配列は：ＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＣＱＳＣＶＥＬＤＰＡＴＶＡＧＩＩＶＴＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴＧＲＬＳＧＡＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬＧＧＮＷＡＲＮＫ（配列番号３４）である。
【０３２０】
ヒトＣＤ３ゼータポリペプチドの標準的な配列は：ＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３５）である。
【０３２１】
ヒトＴＣＲアルファ鎖の標準的な配列は：ＭＡＧＴＷＬＬＬＬＬＡＬＧＣＰＡＬＰＴＧＶＧＧＴＰＦＰＳＬＡＰＰＩＭＬＬＶＤＧＫＱＱＭＶＶＶＣＬＶＬＤＶＡＰＰＧＬＤＳＰＩＷＦＳＡＧＮＧＳＡＬＤＡＦＴＹＧＰＳＰＡＴＤＧＴＷＴＮＬＡＨＬＳＬＰＳＥＥＬＡＳＷＥＰＬＶＣＨＴＧＰＧＡＥＧＨＳＲＳＴＱＰＭＨＬＳＧＥＡＳＴＡＲＴＣＰＱＥＰＬＲＧＴＰＧＧＡＬＷＬＧＶＬＲＬＬＬＦＫＬＬＬＦＤＬＬＬＴＣＳＣＬＣＤＰＡＧＰＬＰＳＰＡＴＴＴＲＬＲＡＬＧＳＨＲＬＨＰＡＴＥＴＧＧＲＥＡＴＳＳＰＲＰＱＰＲＤＲＲＷＧＤＴＰＰＧＲＫＰＧＳＰＶＷＧＥＧＳＹＬＳＳＹＰＴＣＰＡＱＡＷＣＳＲＳＡＬＲＡＰＳＳＳＬＧＡＦＦＡＧＤＬＰＰＰＬＱＡＧＡＡ（配列番号３６）である。
【０３２２】
ヒトＴＣＲアルファ鎖Ｃ領域の標準的な配列は：ＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号３７）である。
【０３２３】
ヒトＴＣＲアルファ鎖Ｖ領域ＣＴＬ−Ｌ１７の標準的な配列は：ＭＡＭＬＬＧＡＳＶＬＩＬＷＬＱＰＤＷＶＮＳＱＱＫＮＤＤＱＱＶＫＱＮＳＰＳＬＳＶＱＥＧＲＩＳＩＬＮＣＤＹＴＮＳＭＦＤＹＦＬＷＹＫＫＹＰＡＥＧＰＴＦＬＩＳＩＳＳＩＫＤＫＮＥＤＧＲＦＴＶＦＬＮＫＳＡＫＨＬＳＬＨＩＶＰＳＱＰＧＤＳＡＶＹＦＣＡＡＫＧＡＧＴＡＳＫＬＴＦＧＴＧＴＲＬＱＶＴＬ（配列番号３８）である。
【０３２４】
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域の標準的な配列は：ＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ（配列番号３９）である。
【０３２５】
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域ＣＴＬ−Ｌ１７の標準的な配列は：ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＴＧＶＳＱＮＰＲＨＮＩＴＫＲＧＱＮＶＴＦＲＣＤＰＩＳＥＨＮＲＬＹＷＹＲＱＴＬＧＱＧＰＥＦＬＴＹＦＱＮＥＡＱＬＥＫＳＲＬＬＳＤＲＦＳＡＥＲＰＫＧＳＦＳＴＬＥＩＱＲＴＥＱＧＤＳＡＭＹＬＣＡＳＳＬＡＧＬＮＱＰＱＨＦＧＤＧＴＲＬＳＩＬ（配列番号４０）である。
【０３２６】
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域ＹＴ３５の標準的な配列は：ＭＤＳＷＴＦＣＣＶＳＬＣＩＬＶＡＫＨＴＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＳＧＨＮＳＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹＦＮＮＮＶＰＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＳＦＳＴＣＳＡＮＹＧＹＴＦＧＳＧＴＲＬＴＶＶ（配列番号４１）である。
【０３２７】
ＴＣＲドメイン及びｓｃＦｖからのＴＦＰの生成
ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４などのリンカー配列を使用してＣＤ３イプシロンまたは他のＴＣＲサブユニット（１Ｃ参照）に組み換えで連結される。様々なリンカー及びｓｃＦｖの構造が利用される。ＴＦＰの生成のため、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして使用した。ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ鎖の任意の可変配列は、ＴＦＰの作製を可能にする。
【０３２８】
ＴＦＰ発現ベクター
プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を可能にするためのシグナル伝達配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にする要素（例えば、ＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１または当該技術分野で知られている他のもの）ならびに選択を可能にする要素（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を含む発現ベクターを提供する。
【０３２９】
好ましくは、ＴＦＰをコードする核酸構築物は、レンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、発現は、ＢＣＭＡ＋標的細胞に反応するＴＦＰ．ＢＣＭＡ形質導入Ｔ細胞（「ＢＣＭＡ．ＴＦＰ」もしくは「ＢＣＭＡ．ＴＦＰ  Ｔ細胞」または「ＴＦＰ．ＢＣＭＡ」もしくは「ＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞反応の量及び質に基づいて認められる。エフェクターＴ細胞反応には、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生及び標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）が含まれるがこれらに限定されない。
【０３３０】
ＴＦＰ．ＢＣＭＡのレンチウイルス転移ベクターは、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子にパッケージされるゲノム材料を産生するために使用される。レンチウイルス転移ベクターのＤＮＡをＶＳＶｇの３つのパッケージング成分、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖをリポフェクタミン試薬と組み合わせて混合し、それらを一緒に２９３細胞にトランスフェクトする。２４及び４８時間後、培地を採取し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入単位の数は、ＳｕｐＴ１細胞での滴定によって決定される。再指向性ＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞は、新たなナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化し、次いで適切な数の形質導入単位を加えて、所望の割合の形質導入されたＴ細胞を得ることによって産生される。これらの修飾Ｔ細胞を、それらが休止し、サイズが減少するまで増殖させ、この時点でそれらを後の分析のために凍結保存する。細胞の数及びサイズは、コールターマルチサイザーＩＩＩを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞（細胞表面上でＴＦＰ．ＢＣＭＡを発現する）の割合及びその発現のそれらの相対的蛍光強度をフローサイトメトリー分析によって決定する。ヒストグラムのプロットから、ＴＦＰの相対的発現レベルが、形質導入された割合とそれらの相対的蛍光強度を比較することによって調べられる。
【０３３１】
いくつかの実施形態において、複数のウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入によって複数のＴＦＰが導入される。
【０３３２】
ヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力及びサイトカイン分泌の評価
ＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞の、細胞表面で発現するＴＦＰを産生する及び標的腫瘍細胞を殺傷し、増殖し、サイトカインを分泌する機能的能力は、当該技術分野で知られているアッセイを使用して決定される。
【０３３３】
ヒトＰＢＭＣ（例えば、ナイーブＴ細胞が、Ｔ細胞、すなわち、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に対して負の選択によって得られる正常なアフェレーシスドナー由来の血液）をヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）で処理し、次いで抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２８ビーズで、例えば、１０％ＲＰＭＩ中、３７℃、５％ＣＯ２で活性化してから、ＴＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを利用して、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、ＴＦＰの細胞表面での存在を確認する。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）産生は、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを使用して測定される。
【０３３４】
実施例１：ヒトＡＬＬマウスモデルにおけるヒトＴＦＰ  Ｔ細胞の効力
初代ヒトＡＬＬ細胞は、インビトロでそれらを培養する必要なしに免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧまたはＮＯＤ）で成長し得る。同様に、培養されたヒトＡＬＬ細胞株は、そのようなマウスにおいて白血病を誘導し得る。ＡＬＬを有するマウスは、例えば、モデルＨＡＬＬＸ５４４７において、ヒトＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞の効力を試験するために使用され得る。このモデルでの読み出しは、静脈内投与されるヒトＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞の非存在下及び存在下でのＡＬＬ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注入後のマウスの生存率である。
【０３３５】
実施例２：インビボ固形腫瘍異種移植マウスモデルにおけるヒトＴＦＰ  Ｔ細胞治療
ヒトＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞の効力はまた、ヒトＢＣＭＡ発現ＡＬＬ、ＣＬＬまたはＮＨＬヒト細胞株に由来する皮下固形腫瘍を有する免疫不全マウスモデルにおいて試験され得る。ヒトＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞治療に反応した腫瘍縮小は、腫瘍サイズのキャリパー測定によって、またはＧＦＰ発現腫瘍細胞によって放出されるＧＦＰの蛍光シグナルの強度を観察することによってのいずれかで評価され得る。
【０３３６】
初代ヒト固形腫瘍細胞は、インビトロでそれらを培養する必要なしに免疫不全マウスで成長し得る。例示的な固形がん細胞には、例えば、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）及び／またはｔｈｅ  Ｂｒｏａｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ，Ｂａｒｒｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８３：６０３（２０１２）を参照されたい）で提供される固形腫瘍細胞株が含まれる。例示的な固形がん細胞には、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頚癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮内膜癌、または胃癌から単離された初代腫瘍細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、治療されるがんは、中皮腫、乳頭漿液性卵巣腺癌、明細胞性卵巣癌、混合型ミュラー管卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌及び乳腺腺癌からなる群から選択される。これらのマウスは、ヒト腫瘍異種移植モデルにおいてＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞の効力を試験するために使用され得る（例えば、Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｃｏｌ．２：２４７（２００７）を参照されたい）。１×１０６〜１×１０７個の初代細胞（ＥＣマトリクス材料中のコラゲナーゼ処理バルク腫瘍懸濁物）または腫瘍フラグメント（ＥＣマトリクス材料中の初代腫瘍フラグメント）の皮下の移植または注射に続いて、腫瘍を治療開始前に２００〜５００ｍｍ３まで成長させる。
【０３３７】
実施例３：多重ＴＦＰポリペプチドの実証、及び多重ヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の使用
本明細書で提供されるＴＦＰポリペプチドは、内因性ＴＣＲサブユニットのポリペプチドと機能的に会合して機能的ＴＣＲ複合体を形成することが可能である。ここで、機能的多重組み換えＴＣＲ複合体を生成するために、レンチウイルスベクターでの複数のＴＦＰがＴ細胞を形質導入するために使用される。例えば、ｉ）ＣＤ３デルタポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインならびにＢＣＭＡ特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントを有する第１のＴＦＰ、及びｉｉ）ＣＤ３ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインならびにＢＣＭＡ特異的抗体フラグメントを有する第２のＴＦＰを含有するＴ細胞を提供する。第１のＴＦＰ及び第２のＴＦＰは、互いに、及び内因性ＴＣＲサブユニットのポリペプチドと相互作用することが可能であり、それによって機能的ＴＣＲ複合体を形成する。
【０３３８】
これらの多重ヒト化ＴＦＰ．ＢＣＭＡ  Ｔ細胞の使用は、上記の実施例で提供されるように液性及び固形腫瘍で実証され得る。
【０３３９】
実施例４：ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の調製
レンチウイルスの産生
適切な構築物をコードするレンチウイルスを以下のように調製する。５×１０６個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、１００ｍｍのディッシュに播種し、一晩で７０〜９０％の密集度に到達させる。２．５μｇの示されたＤＮＡプラスミド及び２０μＬのレンチウイルスパッケージングミックス（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ＃ＶＰ１００；付録Ｂ３参照）を０．５ｍＬの血清を有しないＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地中で希釈し、穏やかに混合する。別のチューブにおいて、３０μＬのＮａｎｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＮＦ１００）を０．５ｍＬの血清を有しないＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地中で希釈し、穏やかに混合する。次いでＮａｎｏＦｅｃｔ／ＤＭＥＭ及びＤＮＡ／ＤＭＥＭ溶液を一緒に混合し、１０〜１５秒間ボルテックスしてから、ＤＭＥＭ−プラスミド−ＮａｎｏＦｅｃｔ混合物を室温で１５分間インキュベートする。前工程からの完全トランスフェクション複合体を細胞のプレートに滴下添加し、揺動させてプレート内のトランスフェクション複合体を均等に分散する。次いでプレートを加湿された５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で一晩インキュベートする。翌日、上清を１０ｍＬの新たな培地に置き換え、２０μＬのＶｉｒａｌＢｏｏｓｔ（５００ｘ、ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＶＢ１００）を追加する。次いでプレートを３７℃で更に２４時間インキュベートする。次いでレンチウイルスを含有する上清を５０ｍＬの滅菌蓋つき円錐状遠心チューブ内に採取し、氷上に置く。４℃で１５分間、３０００ｒｐｍでの遠心分離後、透明な上清を低タンパク質結合性０．４５μｍ滅菌フィルターでろ過し、その後ウイルスを４℃で１．５時間、２５，０００ｒｐｍでの超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、Ｌ８−７０Ｍ）によって単離する。ペレットを取り出し、ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、レンチウイルス濃度／力価を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｑＲＴ−ＰＣＲ滴定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ番号６３１２３５）を使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確立する。任意の残余のプラスミドＤＮＡは、ＤＮａｓｅＩでの処理によって除去する。ウイルスストック調製物は、すぐに感染のために使用するか、または後の使用のために等分し、−８０℃で保存する。
【０３４０】
ＰＢＭＣ単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を全血またはバフィーコートのいずれかから調製する。全血を１０ｍＬのヘパリンバキュテナー内に採取し、すぐに処理するか、または４℃で一晩保存する。およそ１０ｍＬの抗凝固全血を、５０ｍＬの円錐状遠心チューブ内で、２０ｍＬの総体積とするための滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液と混合する（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を有しない）。次いで２０ｍＬのこの血液／ＰＢＳ混合物を１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）の表面上に穏やかに載せてから、ブレーキをかけることなく室温で３０〜４０分間４００ｇで遠心分離する。
【０３４１】
バフィーコートは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入する。Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）は、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）を添加することによって準備し、１０００ｇで１分間遠心分離する。バフィーコートは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も有しない）中で１：３に希釈する。希釈されたバフィーコートをＬｅｕｃｏｓｅｐチューブに移し、ブレーキをかけることなく１０００ｇで１５分間遠心分離する。希釈血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面に見られるＰＢＭＣを含有する細胞層を、Ｆｉｃｏｌｌによる混入を最小限にするように慎重に取り出す。次いで、残余のＦｉｃｏｌｌ、血小板、及び血漿タンパク質を、室温で２００ｇで１０分間遠心分離することによってＰＢＭＣを４０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄することによって除去する。次いで細胞を血球計で数える。洗浄したＰＢＭＣを、ＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％ＡＢ血清及び１．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、ならびに１００μ／ｍＬストレプトマイシンを有する）で一度洗浄する。代替的には、洗浄したＰＢＭＣを断熱バイアルに移し、−８０℃で２４時間凍結してから、後の使用のために液体窒素中で保存する。
【０３４２】
Ｔ細胞活性化
全血またはバフィーコートのいずれかから調製されたＰＢＭＣを、ウイルスの形質導入の前に、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体結合磁気ビーズで２４時間刺激する。新たに単離したＰＢＭＣを、ｈｕＩＬ−２を有しないＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％のＡＢ血清及び１．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、ならびに１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを有する）で一度洗浄してから、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２（１０００ｘストックから；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＣＡＲ−Ｔ培地に１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁する。ＰＢＭＣが事前に凍結されていた場合、それらを解凍し、予め温めた（３７℃）９ｍＬのｃＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１×１０７細胞／ｍＬで、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンの存在下で１×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁してから、ＣＡＲＴ培地で一度洗浄し、ＣＡＲ−Ｔ培地に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、上記の通りＩＬ−２を添加する。
【０３４３】
活性化の前に、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体結合磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、磁気ラックを使用して１ｍＬの滅菌１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄してビーズを溶液から分離してから、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２を有するＣＡＲ−Ｔ培地に再懸濁して４×１０７ビーズ／ｍＬの最終濃度とする。次いでＰＢＭＣ及びビーズを２５μＬ（１×１０６ビーズ）のビーズを１ｍＬのＰＢＭＣに移すことによって１：１のビーズ対細胞比で混合する。次いで所望の数のアリコートを１２ウェルの低付着性または未処理の細胞培養プレートの単一のウェルに分配し、ウイルスの形質導入前に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【０３４４】
Ｔ細胞の形質導入／トランスフェクション及び増殖
ＰＢＭＣの活性化後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートする。レンチウイルスを氷上で解凍し、５×１０６のレンチウイルスを、培地１ｍＬ当たり２μＬのＴｒａｎｓｐｌｕｓ（Ａｌｓｔｅｍ）（最終希釈１：５００）と共に１×１０６細胞の各ウェルに添加する。細胞を更に２４時間インキュベートしてから、ウイルスの添加を繰り返す。代替的には、レンチウイルスを氷上で解凍し、それぞれのウイルスを５μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で５または５０ＭＯＩで添加する。細胞を室温で１００分間１００ｇでスピノキュレートする。次いで細胞を３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２の継続的な存在下で６〜１４日の期間成長させる（総インキュベート時間は、必要とされる最終的なＣＡＲ−Ｔ細胞の数に依存する）。細胞濃度を２〜３日ごとに分析し、その時に培地を追加して細胞懸濁液を１×１０６細胞／ｍＬに維持する。
【０３４５】
いくつかの例において、活性化したＰＢＭＣをインビトロで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡでエレクトロポレートする。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で１対１の比で３日間、３００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で刺激する。ビーズをエレクトロポレーションの前に除去する。細胞を洗浄し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に２．５×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。２００μＬのその細胞懸濁液（５×１０６細胞）を２ｍｍのギャップのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ）に移し、氷上で予冷する。１０μｇのＩＶＴ  ＴＦＰ  ｍＲＮＡを細胞懸濁液に加える。次いでｍＲＮＡ／細胞混合物を、ＥＣＭ８３０  Ｅｌｅｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ）を使用して２００Ｖで２０ミリ秒間エレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、細胞を新たな細胞培養培地（ＡＩＭ  Ｖ  ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）無血清培地＋５％ヒトＡＢ血清＋３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２）に移し、３７℃でインキュベートする。
【０３４６】
細胞染色によるＴＦＰ発現の検証
レンチウイルスの形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰの発現を、抗マウスＦａｂ抗体を使用してフローサイトメトリーによって確認して、マウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを検出する。Ｔ細胞を３ｍＬの染色緩衝液（ＰＢＳ、４％ＢＳＡ）で３回洗浄し、ウェル当たり１×１０６細胞でＰＢＳに再懸濁する。死細胞の排除のため、細胞をＬｉｖｅ  ｄｅａｄ  ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間氷上でインキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬの染色緩衝液に再懸濁する。Ｆｃ受容体をブロックするため、１μＬの１：１００の希釈正常ヤギＩｇＧ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各チューブに加え、氷中で１０分間インキュベートする。１．０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに加え、よく混合し、細胞を３００ｇで５分間遠心分離によってペレット化する。ｓｃＦｖ  ＴＦＰの表面発現は、アイソタイプ対照として機能するビオチン標識正常ポリクローナルヤギＩｇＧ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって検出する。両抗体を１００μＬの反応体積中で１０μｇ／ｍＬで加える。次いで細胞を４℃で４５分間インキュベートし、１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１００μＬの１：１０００の希釈正常マウスＩｇＧを各チューブに加えることによって正常マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックする。次いで細胞を氷上で１０分間インキュベートし、染色緩衝液で洗浄し、１００μＬの染色緩衝液に再懸濁する。次いで細胞を１．０μＬのフィコエリトリン（ＰＥ）標識ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって染色し、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８抗体（クローンＳＫ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びパシフィックブルー抗ヒトＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各チューブに加える。フローサイトメトリーをＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施し、データをＦＡＣＳ  ｄｉｖａソフトウェアを使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析する。形質導入されたＴ細胞の２０％〜４０％が抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰを発現し、ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物の同等のレベルの形質導入及び表面発現を示す（図５）。
【０３４７】
細胞活性化によるＴＦＰ発現の検証
レンチウイルスの形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰによる標的細胞の活性化をフローサイトメトリーによって確認する。ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ（配列番号４５）、ならびに形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）でＴ細胞を形質導入した。形質導入されたＴ細胞（エフェクター細胞）及びＢＣＭＡ陽性Ｋ５６２標的細胞を１：１の比で一晩共培養した。形質導入していないＢＣＭＡ陽性Ｔ細胞培養物と同様に、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞を陰性対照として使用した。細胞を、いずれも標的細胞活性化のマーカーであるＣＤ２５及びＣＤ６９について上述したように染色した。
【０３４８】
結果は図１０に示されている。図１０のＡ（ＣＤ２５陽性細胞）及び１０のＢ（ＣＤ６９陽性細胞）に示されるように、全ての形質導入された細胞は、ＢＣＭＡ陰性対照（黒色棒）、特にＶＨＨ２構築物で形質導入された細胞と比較して、標的細胞集団（灰色棒）においてＣＤ６９及びＣＤ２５の両方の発現を活性化することができ、陽性対照よりも有意に活性化していた。
【０３４９】
同様の実験を、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）を使用して実施した。図１０のＣ（ＣＤ２５陽性細胞）及び１０のＤ（ＣＤ６９陽性細胞）に示されるように、全てのＴＦＰ（いずれの配置）はＢＣＭＡ陽性標的細胞を活性化することができた（灰色棒）。
【０３５０】
次に、分泌されたときに標的細胞のアポトーシスを媒介する細胞傷害性リンパ球の顆粒に貯蔵されているセリンプロテアーゼであるグランザイムＢについて標的細胞を染色した。ＴＦＰ−Ｔ細胞の活性化は、細胞内抗体染色及びフローサイトメトリー分析によって評価される。ＴＦＰ  Ｔ細胞（ｓｄＡｂ  ＶＨＨ２が形質導入された）及びＢＣＭＡ陽性Ｋ５６２標的細胞を上述のように調製し、１：１で共培養する。ＢＣＭＡ陰性細胞を対照として使用した。細胞を固定した後、グランザイムＢ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（商標）マウス抗ヒトグランザイムＢ、クローンＧＢ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔ＃５６０２１３）を洗浄緩衝液で１：１００に希釈する。細胞を１００μｌの希釈抗体に再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ−２０細胞分析器ですぐに分析する。
結果は図１０のＥ（抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞）及び１０のＦ（抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞）に示されており、ＢＣＭＡ陽性標的細胞との接触後のＴＦＰ  Ｔ細胞中のグランザイムＢレベルを示している。図１０のＥでは、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ（配列番号４５）、及び形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）で細胞を形質導入した；図１０のＦでは、ＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＣＲβ、ならびにＨＬ配置のＣＤ３εの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。図に示されるように、陰性対照を除く全てのＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞（黒色棒）と比較して、ＢＣＭＡ陽性標的細胞（灰色棒）と接触した後に上昇したレベルのグランザイムＢを有していた。図１０のＧ（Ｅ：Ｔ  ３：１）及び図１０Ｈ（Ｅ：Ｔ  １：３）では、ＣＤ３εサブユニットに結合したＢＣＭＡ陽性対照ｓｃＦｖ１（配列番号４５）、形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ２（配列番号２８）、及びＬＨ配置の形式ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＴＦＲβの抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ２（配列番号４３）で細胞を形質導入した。両方の１０のＧに示されるように、空ベクターを除く全ての構築物は、３：１のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比において腫瘍細胞の数を減少させるのに十分であった。１：３のＴ細胞に対するエフェクター細胞の比では（１０のＨ）、全ての構築物は、わずかにより多様な効力で腫瘍細胞の数を減少させることができた。中実棒はＢＣＭＡ陰性ＨｅＬａ細胞を表し、空の棒はＢＣＭＡ陽性細胞を表す。
【０３５１】
実施例５：フローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
ＢＣＭＡ標的に対して陽性または陰性のいずれかである標的細胞を蛍光染料であるカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。これらの標的細胞を、未形質導入の、対照のＣＡＲ−Ｔ構築物で形質導入された、またはＴＦＰで形質導入されたエフェクターＴ細胞と混合する。示されたインキュベート期間の後、死対生ＣＦＳＥ標識標的細胞及び陰性対照の標的細胞の割合を各エフェクター／標的細胞培養についてフローサイトメトリーによって決定する。各Ｔ細胞＋標的細胞培養における標的細胞の生存率を、標的細胞のみを含有するウェルに対して計算する。
【０３５２】
エフェクターＴ細胞の細胞傷害活性は、エフェクター及び標的細胞の共インキュベート後に、エフェクターＴ細胞を有しないまたは有する標的細胞における生存標的細胞の数をフローサイトメトリーを使用して比較することによって測定する。ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲ−Ｔ細胞での実験では、標的細胞はＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ−８２２６形質細胞腫／骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１５５）である一方で、陰性対照として使用される細胞はＢＣＭＡ陰性Ｒａｊｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−８６）である。
【０３５３】
標的細胞を一度洗浄し、ＰＢＳに１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。蛍光染料のカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．０３μＭの濃度で細胞懸濁液に加え、細胞を室温で２０分間インキュベートする。反応体積の５倍の体積で完全細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＨＩ−ＦＢＳ）を細胞懸濁液に加えることによって標識化反応を停止させ、細胞を室温で更に２分間インキュベートする。細胞を遠心分離によってペレット化し、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）に２×１０５細胞／ｍＬで再懸濁する。５０マイクロリットルのＣＦＳＥ標識標的細胞懸濁液（１０，０００細胞に相当）を９６ウェルのＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに加える。
【０３５４】
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物で形質導入されたエフェクターＴ細胞を、陰性対照としての未形質導入Ｔ細胞と一緒に洗浄し、細胞傷害性培地に２×１０６細胞／ｍＬまたは１×１０６細胞／ｍＬで懸濁する。５０μＬのエフェクターＴ細胞懸濁液（１００，０００または５０，０００細胞に相当）を、播種した標的細胞に加え、１００μＬの総体積中、それぞれ１０対１または５対１のエフェクター対標的の比にする。次いで培養物を混合し、遠沈させ、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。このインキュベートの直後、７ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標））を製造者によって推奨されているように培養細胞に加え、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーを実施する。フローサイトメトリーデータの分析は、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して実施する。
【０３５５】
ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞の生存の割合は、エフェクターＴ細胞及び標的細胞を有する試料中の生存ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−）の数を、標的細胞のみを有する試料中の生存ＲＰＭＩ−８２２６（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−）細胞の数で除することによって計算される。エフェクター細胞の細胞傷害性は、ＲＰＭＩ−８２２６の殺傷率＝１００％−ＲＰＭＩ−８２２６細胞の生存率として計算される。
【０３５６】
抗ＢＣＭＡ２８ζ  ＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞は、未形質導入のまたは非ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ対照で形質導入されたＴ細胞と比較した場合、ＢＣＭＡ発現細胞に対して細胞傷害性を示し得る。しかしながら、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εで形質導入されたＴ細胞は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ対照よりも標的に対して効果的な細胞傷害性を誘導し得る。抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰはまた、５〜１０：１のエフェクター：標的比において抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲで観察されるよりも高い強い細胞傷害性を媒介し得る。いくらかの細胞傷害性が抗ＢＣＭＡ−ＴＣＲα及び抗ＢＣＭＡ−ＴＣＲβ  ＴＦＰで観察され得る。同様の結果は、代替ヒンジ領域で構築された抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで得られ得る。今度もまた、ＢＣＭＡ発現細胞に対する細胞傷害性は、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞よりも抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞で高い場合がある。
【０３５７】
ＢＣＭＡに特異的なＴＦＰをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレートされたＴ細胞もまた、ＢＣＭＡ発現細胞に対する強い細胞傷害性を示し得る。対照または抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物のいずれでもＢＣＭＡ陰性細胞の有意な殺傷が見られない場合がある一方で、ＢＣＭＡ発現細胞のＢＣＭＡ特異的な殺傷が、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＳＬまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＳＬ  ＴＦＰのいずれかで形質導入されたＴ細胞によって観察され得る。
【０３５８】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なＴＦＰで形質導入されたＴ細胞はまた、ＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６細胞に対して強い細胞傷害性を示した。抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞は、ＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６標的細胞に対する細胞傷害性を効率的に媒介した。１０：１の標的細胞に対するエフェクターの比では、標的細胞のほぼ１００％が殺傷された（図６）。
【０３５９】
同様の実験は、ＦＡＰ．ＴＦＰ及びＣＡＩＸ．ＴＦＰ構築物で行われ得る。
【０３６０】
実施例６：リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰはまた、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）形式において抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲよりも優れた細胞傷害性を示し得る。ＲＴＣＡアッセイは、特殊な９６ウェルプレートの各ウェルでリアルタイムで接着標的細胞単層の電気インピーダンスを測定し、最終的な読み出しを細胞指数と呼ばれる値として示す。細胞指数の変化は、共インキュベートされたＴ細胞エフェクターによる標的細胞の殺傷の結果として標的細胞単層の破壊を示す。それ故、エフェクターＴ細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターＴ細胞の両方を有するウェルの細胞指数を標的細胞のみを有するウェルのそれと比較した変化として評価され得る。
【０３６１】
ＲＴＣＡのための標的細胞は、ＢＣＭＡを発現するＨｅＬａ細胞（ＢＣＭＡ−ＨｅＬａ）と、陰性対照として親の未形質導入ＨｅＬａ細胞である。完全長ヒトＢＣＭＡまたはＢＣＭＡをコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって合成され、ＥＦ１ａプロモーターの制御下で、選択マーカーとしてネオマイシンを担持するデュアルプロモーターのレンチウイルスベクターｐＣＤＨ５１４Ｂ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の複数のクローニング部位に挿入される。次いでＢＣＭＡまたはＢＣＭＡをコードするベクターのいずれかを担持するレンチウイルスをパッケージングする。ＨｅＬａ細胞をＢＣＭＡレンチウイルスで２４時間形質導入し、次いでＧ４１８（１ｍｇ／ｍＬ）で選択する。形質導入されたＢＣＭＡ−ＨｅＬａによるＢＣＭＡの発現は、抗ヒトＢＣＭＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン＃１９Ａ２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、クローン＃ＲＥＡ３１５）でのＦＡＣＳ分析によって確認される。
【０３６２】
接着標的細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質−抗真菌剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養する。ＲＴＣＡを準備するため、５０μＬのＲＰＭＩ培地をＥ−プレート（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ＃：ＪＬ−１０−１５６０１０−１Ａ）の適切なウェルに加える。次いでプレートをＲＴＣＡ  ＭＰ機器（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）内に配置し、適切なプレートのレイアウト及びアッセイスケジュールを製造者のマニュアルに記載されているようにＲＴＣＡ２．０ソフトウェアに入力する。ベースラインの測定は、１００回の測定について１５分毎に実施する。次いで１００μＬの体積中の１×１０４個の標的細胞を各アッセイウェルに加え、細胞を１５分間沈殿させる。プレートを読み取り機に戻し、読み取りを再開する。
【０３６３】
翌日、エフェクターＴ細胞を洗浄し、５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００−３１８））を加えた細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁する。次いでプレートを機器から取り出し、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０＋５％ＡＢ血清）に懸濁したエフェクターＴ細胞を１００，０００細胞または５０，０００細胞で各ウェルに加え、エフェクター対標的比をそれぞれ１０対１または５対１にする。次いでプレートを機器に戻す。測定は、１００回の測定について２分ごとに行い、次いで１０００回の測定について１５分ごとに行う。
【０３６４】
ＲＴＣＡアッセイにおいて、ＢＣＭＡ形質導入細胞の殺傷は、細胞単独または対照のＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞と共インキュベートされた細胞と比較して、エフェクター細胞の添加後の細胞指数の時間依存的減少によって示されるように、抗ＢＣＭＡ−２８ζ  ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞で形質導入されたＴ細胞によって観察され得る。しかしながら、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＴＦＰ発現Ｔ細胞による標的細胞の殺傷は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲで観察されるよりも深く、迅速であり得る。例えば、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の添加の４時間以内に、ＢＣＭＡ発現標的細胞の殺傷は本質的に完了し得る。他のＣＤ３及びＴＣＲ構築物を含む多数のＴＦＰ構築物で形質導入されたＴ細胞を用いると、ほとんどまたは全く殺傷が観察されない場合がある。同様の結果が、代替ヒンジ領域で構築された抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで得られ得る。ＢＣＭＡで形質導入された標的細胞に対する細胞傷害性は、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞よりも抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞で大きい場合がある。
【０３６５】
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞もまた、ＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６細胞に対して強い細胞傷害性を示した。図６に示されるように、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ３εまたはＣＤ３γ形式のＶＨＨ２）ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞は、ＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６標的細胞に対する細胞傷害性を効率的に媒介した。１０：１の標的に対するエフェクターの比で、標的細胞のほぼ１００％が殺傷された（図７）。
【０３６６】
ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用されたウイルス量（ＭＯＩ）に対して用量依存的であり得る。ＢＣＭＡ細胞の殺傷の増加は、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＴＦＰレンチウイルスのＭＯＩの増加と共に観察され得、ＴＦＰの形質導入と細胞傷害活性との関係を更に強固にする。
【０３６７】
実施例７：ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２及びＩＦＮ−γ分泌
同種抗原を有する細胞の認識と関連するエフェクターＴ細胞の活性化及び増殖の別の尺度は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）などのエフェクターサイトカインの産生である。
【０３６８】
ヒトＩＬ−２のためのＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ＃ＥＨ２ＩＬ２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＩＦＮ−γのためのＥＬＩＳＡアッセイ  カタログ＃ＫＨＣ４０１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製品の添付文書に記載の通りに実施する。５０μＬの再構成された標準または試料を二連で９６ウェルプレートの各ウェルに加え、続いて５０μＬのビオチン化抗体試薬を加える。試料は、プレートを数回静かにタップすることによって混合する。次いで標準も試料も含有しない全てのウェルに５０μＬの標準希釈剤を加え、プレートを接着プレートカバーで慎重に密封してから、室温（２０〜２５℃）で３時間インキュベートする。次いでプレートカバーを取り外し、プレート内容物を空にし、各ウェルに洗浄緩衝液を満たす。この洗浄手順を合計３回繰り返し、プレートを紙タオルまたは他の吸収材料で拭く。１００μＬの調製されたストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を各ウェルに加え、新しいプレートカバーを取り付けてから、室温で３０分間インキュベートする。プレートカバーを再び取り外し、プレート内容物を廃棄し、１００μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加える。反応を室温で暗所で３０分間進行させ、その後１００μＬの停止溶液を各ウェルに加える。プレートを評価する。反応停止の３０分以内に、４５０ｎｍ及び５５０ｎｍに設定されたＥＬＩＳＡプレートリーダーで吸光度を測定する。４５０ｎｍの値から５５０ｎｍの値を引き、未知の試料中のＩＬ−２量をＩＬ−２標準曲線から得られた値と比較して計算する。
【０３６９】
代替的には、ヒトＩＬ−２磁気ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＨＣ００２１Ｍ）及びヒトＩＦＮ−γ磁気ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＨＣ４０３１Ｍ）を用いてヒトサイトカイン磁気緩衝液試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＨＢ０００１Ｍ）を使用して２プレックスアッセイを実施する。簡潔には、２５μＬのヒトＩＬ−２及びＩＦＮ−γ抗体ビーズを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、以下のガイドラインを使用して洗浄する：２００μＬの１×洗浄溶液の２回の洗浄、プレートを磁気９６ウェルプレートセパレータ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４１７９）に接触させて置き、ビーズを１分間沈殿させ、液体をデカントする。次いで、５０μＬのインキュベート緩衝液を、二連で１００μＬの再構成された標準または三連で５０μＬの試料（細胞傷害性アッセイからの上清）及び５０μＬのアッセイ希釈剤を有するプレートの各ウェルに加え、合計体積を１５０μＬとする。試料を暗所で３ｍｍの軌道半径を有するオービタルシェーカーを用いて６００ｒｐｍで室温で２時間混合する。同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、１００μＬのヒトＩＬ−２及びＩＦＮ−γビオチン化検出抗体を各ウェルに加える。試料を暗所で３ｍｍの軌道半径を有するオービタルシェーカーを用いて６００ｒｐｍで室温で１時間混合する。同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、１００μＬのストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンを各ウェルに加える。試料を暗所で３ｍｍの軌道半径を有するオービタルシェーカーを用いて６００ｒｐｍで室温で３０分間混合する。同じ洗浄ガイドラインを使用してプレートを３回洗浄し、液体をデカントした後、試料を１５０μＬの１×洗浄溶液に再懸濁する。試料を３ｍｍの軌道半径を有するオービタルシェーカーを用いて６００ｒｐｍで３分間混合し、４℃で一晩保存する。その後、同じ洗浄ガイドラインに従ってプレートを洗浄し、試料を１５０μＬの１×洗浄溶液に再懸濁する。
【０３７０】
プレートをＭＡＧＰＩＸシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）及びｘＰＯＮＥＮＴソフトウェアを使用して読み取る。データの分析は、標準曲線及びサイトカイン濃度を提供するＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して実施する。
【０３７１】
未形質導入のまたは対照のＣＡＲで形質導入されたＴ細胞に対して、抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞は、ＢＣＭＡを内因的に発現する細胞またはＢＣＭＡで形質導入された細胞のいずれかと共に共培養された場合に、より高いレベルのＩＬ−２及びＩＦＮ−γの両方を産生し得る。対照的に、ＢＣＭＡ陰性細胞または未形質導入細胞との共培養では、ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞からほとんどまたは全くサイトカインが放出されない結果となり得る。先の細胞傷害性のデータと一貫して、代替ヒンジ領域で構築された抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰは、ＢＣＭＡを有する標的細胞との共培養で同様の結果を生み出し得る。
【０３７２】
先の細胞傷害性のデータと一致して、ＣＤ３ε及びＣＤ３γ形式の抗ＢＣＭＡ（ＶＨＨ２）は、ＴＦＰ構築物の最大のＩＬ−２及びＩＦＮ−γレベルを生成し得る。しかしながら、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε及び抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞によるサイトカイン産生は、ＴＦＰがはるかに高いレベルの標的細胞の殺傷を示すにもかかわらず、抗ＢＣＭＡ−２８ζ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のそれと同程度であり得る。ＴＦＰはＣＡＲより効率的に標的細胞を殺傷し得るが、同程度またはより低いレベルの炎症性サイトカインを放出し得るという可能性は、高レベルのこれらのサイトカインが、養子ＣＡＲ−Ｔ療法についての用量制限毒性と関連していることから、ＣＡＲに対してＴＦＰの潜在的な利点を表す。
【０３７３】
抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰで形質導入されたＴ細胞はまた、ＢＣＭＡを発現しなかった対照のＨｅＬａ細胞ではなくＢＣＭＡ−ＨｅＬａとの共培養でＩＬ−２及びＩＦＮ−γを産生した（図８）。
【０３７４】
実施例１０：フローサイトメトリーによるＣＤ１０７ａ曝露
Ｔ細胞活性化のための更なるアッセイは、休止細胞における細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）であるＣＤ１０７ａの表面発現である。細胞溶解活性の必要条件であるエフェクターＴ細胞の脱顆粒は、活性化誘導顆粒エキソサイトーシス後、ＣＤ１０７ａの細胞表面への動員をもたらす。それ故、ＣＤ１０７ａの曝露は、細胞傷害性と密接に相関するサイトカイン産生に加えて、Ｔ細胞活性化の更なる尺度を提供する。
【０３７５】
標的及びエフェクター細胞を別々に洗浄し、細胞傷害性培地（ＲＰＭＩ＋５％ヒトＡＢ血清＋１％抗生物質抗真菌剤）に再懸濁する。アッセイは、０．５μＬ／ウェルのＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）抗体（クローンＨ４Ａ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において１００μＬの最終体積中で２×１０５個のエフェクター細胞と２×１０５個の標的細胞を組み合わせることによって実施する。次いで培養物を３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。このインキュベートの直後、１０μＬの１：１０希釈の分泌阻害剤モネンシン（１０００ｘ溶液、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標））を、細胞を乱すことなく各ウェルに慎重に加える。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に２．５時間インキュベートする。このインキュベートに続いて、細胞をＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８抗体（クローンＳＫ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びパシフィックブルー抗ヒトＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、次いで３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、（分析前に１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液及び１００ｕｌのＩＣ固定緩衝液に再懸濁する。
【０３７６】
Ｔ細胞表面でのＣＤ１０７ａの曝露は、フローサイトメトリーによって検出する。フローサイトメトリーは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、フローサイトメトリーデータの分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して実施する。ＣＤ１０７＋ｖｅであるＣＤ３ゲート内のＣＤ８＋エフェクター細胞の割合を、各エフェクター／標的細胞培養について決定する。
【０３７７】
先の細胞傷害性及びサイトカインのデータと一貫して、ＢＣＭＡ発現標的細胞と抗ＢＣＭＡ−２８ζ  ＣＡＲで形質導入されたエフェクターＴ細胞との共培養は、ＢＣＭＡ−ｖｅ標的細胞と共にインキュベートしたエフェクターと比較して、表面ＣＤ１０７ａ発現の増加を誘導し得る。同じ条件下で比較すると、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＬＬまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＬＬ  ＴＦＰ発現エフェクターは、ＣＤ１０７ａ発現の５〜７倍の誘導を呈し得る。代替ヒンジ領域で構築された抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰは、ＢＣＭＡを有する標的細胞との共培養で同様の結果をもたらし得る。
【０３７８】
未形質導入Ｔ細胞と比較して、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３εまたは抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３γ  ＴＦＰで形質導入された細胞は、ＢＣＭＡ＋ｖｅ  ＲＰＭＩ８２２６細胞との共培養でＣＤ１０７ａの表面発現の増加を呈した（図９）。これらの結果は、ＴＦＰで形質導入されたエフェクターＴ細胞が、それらの同種抗原を発現する標的細胞への曝露で活性化し、脱顆粒することを示している。
【０３７９】
実施例８：インビボでのマウス効力研究
抗ＢＣＭＡ（ｓｃＦＶ１、配列番号４５）ＴＦＰで形質導入されたエフェクターＴ細胞のインビボでの抗腫瘍反応を達成する能力を評価するために、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＴＦＰ、抗ＢＣＭＡ−２８ζ  ＣＡＲ、または抗ＢＣＭＡ−４１ＢＢζ  ＴＦＰで形質導入されたエフェクターＴ細胞を、ＢＣＭＡ＋ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ  カタログ＃ＣＲＭ−ＣＣＬ−１５５）、ヒトがん細胞株が接種されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ−／−（ＮＳＧ−ＪＡＸ）マウスに養子移入した。未形質導入Ｔ細胞を対照として使用した。
【０３８０】
材料及び方法
ＲＰＭＩ−８２２６の維持及び増殖
ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞株はＡＴＣＣから入手した（カタログ番号ＣＲＭ−ＣＣＬ−１５５）。これらの細胞をルシフェラーゼでトランスフェクトしてＲＰＭＩ−８２２６Ｌｕｃ株を産生した。細胞を、１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０４３８−０２６、ロット＃１７８５０７９）及び１％抗生物質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５２４０−０６２）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号１０−０４１−ＣＶ）中で２〜３日ごとに継代した。
【０３８１】
レンチウイルス生成
レンチウイルスは、２９３ＴＮプロデューサー細胞株（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＬＶ９００Ａ−１）の一過性トランスフェクションによって調製した。ＴＦＰ／ＣＡＲ構築物は、ＣＤ３イプシロン鎖（ＴＦＰ中）またはＣＤ２８ｚもしくは４１ＢＢｚ（ＣＡＲ中）に融合した抗ＢＣＭＡ一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）を使用して生成した。
【０３８２】
Ｔ細胞の単離及びレンチウイルスの形質導入
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）を使用して全血（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｄｅｎｏｒ  １２、ロット＃Ｗ３１３７１６０４０５２６）から精製した。
【０３８３】
Ｔ細胞をＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃００４１５４４７、ロット＃１７８５０７９）を１：１の比で使用して活性化し、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−０２、ロット＃０５１５１２）の存在下で５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ＃１００−３１８、ロット＃Ｈ６０５ｏｏｌ）、及び１％抗生物質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５２４０−０６２）においてＡｉｍ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１０３５０２５）中で維持した。Ｄｙｎａｂｅａｄで活性化されたＴ細胞を、ポリブレン（５ｕｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＴＲ−１００３−Ｇ）及び１００Ｇで１００分間の遠心接種の存在下で抗ＢＣＭＡ−ＣＤ３ε  ＴＦＰ、抗ＢＣＭＡ−ＣＤ２８ζ  ＣＡＲ及び抗ＢＣＭＡ−４１ＢＢζ  ＣＡＲならびに５１０ベクター単独対照ウイルスについて１０ＭＯＩ（Ｊｕｋａｔ細胞株中の力価に基づく）でレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞活性化の２４時間後及び４８時間後に合計２回の形質導入を実施した。細胞を１１日間増殖させ、凍結させた。
【０３８４】
形質導入効率の決定
形質導入効率はフローサイトメトリーによって決定した。Ｔ細胞を抗ＣＤ３  ＡＰＣ、クローン：ＵＣＨＴ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６１８１１ロット５０９０８６２）、抗ＣＤ４−パシフィックブルー、クローン：ＲＰＡＴ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５２１ロットＢ２３１６１１）、抗ＣＤ８−ＡＰＣＣＹ７、クローン：ＳＫ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５７８３４ロット６０８２８６５）、及び／またはヤギ抗マウスＦＡＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１８０３ロットＳＣ２３６２５３９）を使用して染色した。また、細胞をＺｅｎｏｎ標識（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｚ２５０５５Ａロット１８５１３３３）ＢＣＭＡ−Ｆｃタンパク質で染色して、ＴＦＰ及びＣＡＲの表面発現を検出した。細胞をＢＤ−ＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ２０を使用して分析した。
インビトロ機能アッセイ
全てのインビトロ機能アッセイは活性化後９日目に実施された。
ルシフェラーゼアッセイ：Ｔ細胞を、切断型ＣＤ１９及びルシフェラーゼを過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＢＣＭＡ陰性標的）またはＢＣＭＡ及びルシフェラーゼを過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＢＣＭＡ陽性標的）と共に異なるエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（３：１及び１：３）で２４時間共培養した。細胞を溶解し、製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１５００）を使用してルシフェラーゼアッセイ（ＳＯＰ００２）に供した。
リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）：Ｔ細胞を上記の標的細胞と異なるＥ：Ｔ比で共培養した。細胞傷害性は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ＲＴＣＡ  ＭＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｌａｔｅ）機器を介して９６ウェルプレート（Ｅ−Ｐｌａｔｅ９６）上の細胞センサー電極の電子インピーダンスを測定することによって決定される。最後の読み取り値が細胞指数として示される。細胞指数の変化は、共インキュベートされたＴ細胞による標的細胞の殺傷の結果として標的細胞単層の破壊を示す。サイトカイン分析のための遠心分離後に培養上清を採取し、更なる分析まで−８０℃で保存した。
【０３８５】
サイトカイン測定
ＲＴＣＡアッセイからの培養上清を、ヒトサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネルを使用してサイトカイン放出について分析した。製品の添付文書に記載されているように、ヒトＩＬ−２及びＩＦＮγについてのＥＬＩＳＡアッセイを実施した。データをＭａｇｐｉｘγ  Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで採取し、ｐｇ／ｍｌ量で測定した。
【０３８６】
インビボ研究
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＳＧ）マウスモデルを使用してインビボ効力試験を行った。研究開始の少なくとも６週齢前の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ−／−（ＮＳＧ−ＪＡＸ）マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（品番００５５５７）から入手し、実験使用前に３日間順応させる。接種のためのヒトＢＣＭＡ発現細胞株は、生存細胞数を決定するための採取及びトリパンブルーによる計数の前に対数期培養で維持される。腫瘍攻撃の日に、細胞を５分間３００ｇで遠心分離し、０．５〜１×１０６細胞／１００μＬのいずれかで予め温めた滅菌ＰＢＳに再懸濁する。３×１０６個のＲＰＭＩ−８２２６−Ｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍接種の１９日後、Ｔ細胞をマウス１匹当たり１５×１０６個の細胞で静脈内投与した。１群当たり７匹の動物がいた。生物発光イメージングを研究の３、７、１４、２１、２８及び３５日目に実施した。腫瘍体積を週に２日、キャリパー測定によって測定した。動物の詳細な臨床観察を安楽死まで毎日記録する。死亡または安楽死まで、全ての動物に対して毎週体重測定を行う。試験及び対照物質の養子移入の３５日後に全ての動物を安楽死させる。研究中に瀕死と思われる任意の動物は、獣医師と協議して研究責任者の判断で安楽死させる。
【０３８７】
Ｔ細胞上での効率的なＴＦＰ及びＣＡＲの表面発現
ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞上のｓｃＦｖ２の表面発現を評価した。ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞は、様々なレンチウイルス構築物を使用してＤｙｎａＢｅａｄ（登録商標）刺激Ｔ細胞を形質導入することによって調製した。形質導入したＴ細胞を７日間培養し、フローサイトメトリー分析に供した。抗ＦａｂまたはＢＣＭＡ−Ｆｃ染色によって証明されるように、ＴＦＰ及びＣＡＲ表面発現は、全ての群において４０〜５０％であった。ＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの同等の表面発現を有していた（図１１）。
【０３８８】
インビトロでのＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ細胞の機能
ＴＦＰまたはＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のエフェクター機能は、２つの異なる細胞傷害性アッセイによって評価した。最初のアッセイでは、未形質導入Ｔ細胞、５１０空ベクター対照、ＴＦＰまたはＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ−ルシフェラーゼ発現標的細胞と様々な比（３：１（図１１のＡ）及び１：３（図１１のＢ）のエフェクター：標的）で共培養した。ＨｅＬａ−ＣＤ１９ルシフェラーゼ発現細胞は、ＢＣＭＡ陰性対照として機能した。全てのＴ細胞が３：１でＢＣＭＡ陽性標的細胞を効率的に除去した（９８％〜９９％の死細胞）。１：３のより低いＥ：Ｔ比では、観察された細胞傷害性は３８％〜５３％であった（図１１のＢ）。未形質導入の（ＮＴ）または５１０ベクターのみの対照群では殺傷は認められなかった。
【０３８９】
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰまたはＣＡＲの細胞傷害性もまた、特殊な９６ウェル形式で標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定するリアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）によって測定した。このアッセイでは、形質導入されたＴ細胞の添加後の細胞指数の時間依存的減少によって示されるように、ＴＦＰまたはＣＡＲ形質導入群において３：１のＥ：Ｔ比で強い殺傷が観察された（図１１のＣ）。標的細胞はＴ細胞添加の１０時間以内に除去された。４１ＢＢζ群が最も高い殺傷動態を示し、これにＴＦＰ及びＣＤ２８ζ  ＣＡＲが続いた。それにもかかわらず、群の全てが２４時間の期間の終了時に標的細胞を殺傷した。１：３のＥ：Ｔ比では、殺傷はより遅く、腫瘍細胞はどの群によっても効率的に除去されなかった。ＮＴまたは５１０ベクターのみの群によっては殺傷は観察されなかった。Ｈｅｌａ−ＣＤ１９ルシフェラーゼ細胞は陰性対照として機能し、Ｔ細胞の添加後でさえも成長し続けた（図１１のＤ）。
【０３９０】
エフェクターＴ細胞の活性化及び増殖の別の尺度は、ＩＦＮγ及びＩＬ−２などのサイトカインの産生である。上記のＲＴＣＡアッセイからの培養上清を、２−プレックスＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）キット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してサイトカイン放出について分析した。図１１のＥ（ＩＦＮγ）及び１１のＦ（ＩＬ−２）に示されるように、ＴＦＰ及びＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は両方とも、ＢＣＭＡを発現するＨｅＬａ細胞と共培養した場合、未形質導入のまたは５１０空ベクター対照細胞と比較して、高レベルのＩＦＮγ及びＩＬ−２を３：１及び１：３のＥ：Ｔ比で産生した。最も注目すべきことに、４１ＢＢζ群は１：３のＥ：Ｔ比でより多くのサイトカインを産生した。
【０３９１】
抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで抗腫瘍効力を示す
ｓｃＦｖ２（ＨＬ形式）及びＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞のインビボでの効力を評価するために、陰性対照として空ベクターＴ細胞及び陽性対照としてｓｃＦｖ１−ＣＤ３εＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ａ）；イプシロン、ガンマ、及びベータ形式のＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｂ）、及びイプシロン、ガンマ及びベータ形式のｓｃＦｖ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞（図１２Ｃ）を使用してインビボ研究を上述のように実施した。各グラフにおける各線は１匹のマウスを表す。図１２Ａに示されるように、ベクターのみのＴ細胞で処置したマウスは経時的に成長した腫瘍を有していた一方で、陽性対照はマウスにおいて腫瘍を減少または根絶することができた。図１２Ｂに示されるように、図１２Ｃに示されるｓｃＦｖ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞で処置したマウスと同様に、多数のマウスがＶＨＨ２  ＴＦＰ  Ｔ細胞で処置した後に腫瘍サイズの減少を示した。特に、図１２Ｂでは、ＢＨ１０−ＣＤ３ε及びＣＤ３γ群は注射時にＰＤ１、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３消耗マーカーを共発現した。
【０３９２】
ＴＦＰ対ＣＡＲの効力を評価するために、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞及びＮＳＧマウスモデルを使用した。ＲＰＭＩ８２２６細胞をマウス１匹当たり３×１０６細胞で注射した。１１日目に凍結したＴ細胞を、マウス１匹当たり１５×１０６細胞でインビボ注射する２４時間前に解凍し、回収した。Ｔ細胞注射後８日目からＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ群において腫瘍体積の有意な減少が観察された（図１３のＡ）。この傾向は３７日目まで維持され、その時点で腫瘍が存在しないために研究を終結させた。腫瘍の平均放射輝度によって評価される腫瘍荷重は、対照と比較して全ての群において有意に減少した（図の１３Ｂ）。また、ＴＦＰ及び４１ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞群は、ＣＤ２８ζＣＡＲ  Ｔ群と比較して増加した生存率を示した（図１３のＣ）。これらの結果は、抗ＢＣＭＡ−ＴＦＰ及びＣＡＲ  Ｔ細胞がインビボで多発性骨髄腫腫瘍細胞を殺傷するのに強力であることを実証している。
【０３９３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることが当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく多くの変形、変更、及び置換を当業者は直ちに想起する。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施において採用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を画定すること及びこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造及びそれらの同等物がそれによってカバーされることが意図される。
付録
【０３９４】
【表１−１】
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【０３９５】
【表１−２】
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【０３９６】
【表１−３】
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【０３９７】
【表１−４】
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【０３９８】
【表１−５】
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【０３９９】
【表１−６】
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【０４００】
【表１−７】
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【０４０１】
【表１−８】
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【０４０２】
【表１−９】
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【０４０３】
【表１−１０】
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【０４０４】
【表１−１１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019531056.tif 000047
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