(57)【要約】  本発明は、環境流入を促進できるエネルギーを用いた細胞のリプログラミング装置に関し、より詳細には、分化した細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを加えて多能性特性を有する新たなタイプの多能性細胞または前記分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞へのリプログラミングを誘導するという効果を有する。【選択図】図１
2019508069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞および培養培地を収容するように設けられた培養チャンバーと、
培養チャンバー内の細胞および培養培地に超音波、レーザーおよび熱のうちの少なくとも一つの物理的刺激を加えることにより、エネルギーを提供できるように設けられた一つ以上の機構と、を備える、細胞のリプログラミング装置。
【請求項２】
前記機構は、超音波を照射する超音波発生装置、レーザーを照射するレーザー照射装置および温度調節装置のうちの一つ以上を備える、請求項１に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項３】
培養チャンバー内の湿度を調節するための湿度調節装置および培養チャンバー内の二酸化炭素の量を調節するためのガス調節装置のうちのいずれか一方以上をさらに備える、請求項２に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項４】
培養チャンバー内の温度、湿度、二酸化炭素の量のうちの一つ以上を調節するための入力部を有するディスプレイ部をさらに備える、請求項３に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項５】
機構が超音波発生装置を備え、
ディスプレイ部は、超音波周波数、および時間を設定できるように設けられる、請求項４に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項６】
培養チャンバーには細胞を収容するサンプルチューブが配置され、
超音波発生装置は、サンプルチューブに向けて昇降自在に設けられる、請求項２に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項７】
培養チャンバーにはサンプルチューブを支持するためのサンプルチューブホルダーが設けられる、請求項６に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項８】
サンプルチューブは、二重チューブ構造を有する、請求項６に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項９】
超音波発生装置には、超音波トランスデューサーが取り替えできるように設けられる、請求項２に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１０】
温度調節装置は、培養チャンバーの周りに設けられた熱線を備える、請求項２に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１１】
複数本のサンプルチューブが取り付け自在に設けられたオートサンプラーと、
オートサンプラーに搭載されたいずれか一つのサンプルチューブに向けて超音波を発生させるように設けられた超音波発生装置と、を備える、細胞のリプログラミング装置。
【請求項１２】
オートサンプラーは、回転自在に設けられ、
超音波発生装置は、昇降自在に設けられる、請求項１１に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１３】
オートサンプラーが回転する場合、超音波発生装置は上昇した状態である、請求項１２に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１４】
超音波処理された培養培地が貯留された培養培地タンクと、
前記培養培地タンク内の培養培地が供給される一つ以上の培養フラスコと、
培養フラスコとサンプルチューブを流体が移動可能なようにつなげるインジェクションチューブと、をさらに備える、請求項１１に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１５】
超音波の加えられたサンプルチューブ内の細胞は、インジェクションチューブにより培養フラスコに移動するように設けられる、請求項１４に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１６】
複数の培養フラスコを移送するための移送ベルトをさらに備える、請求項１４に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１７】
培養フラスコが収容されるインキュベーターと、
インキュベーター内の培養フラスコの培養培地が回収される回収タンクと、
インキュベーター内の培養フラスコに培養培地を供給し、培養フラスコ内の培養培地を回収タンクに回収するためのサーキュレーターと、をさらに備える、請求項１５に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１８】
培養フラスコは、両側に流動通路がそれぞれ設けられる、請求項１４に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項１９】
培養フラスコの両側の流動通路は、互いに異なる高さに位置する、請求項１８に記載の細胞のリプログラミング装置。
【請求項２０】
インキュベーターには、載置された培養フラスコを振とうさせるためのシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）が設けられる、請求項１７に記載の細胞のリプログラミング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波、レーザーまたは熱処理などによって環境流入を促進できる細胞のリプログラミング装置および方法に関する。本発明を支援した韓国国家研究開発事業は、韓国保健福祉部の先端医療技術の開発事業であって、課題固有番号ＨＩ１４Ｃ３２９７、虚血性脳損傷モデルにおけるマイクロＲＮＡ追跡システムを用いた生体内幹細胞の分布および神経分化モニターリング法の開発事業であり、主管実施機関であるカソリック・クァンドン・ユニヴァーシティ・インダストリー・テクノロジー・ホールディングス・カンパニー・リミテッドが支援した。また、本発明を支援した韓国国家研究開発事業は、韓国未来創造科学部の中堅研究者支援事業であり、課題固有番号２０１３Ｒ１Ａ２Ａ２Ａ０１０６８１４０、マイクロＲＮＡに基づく幹細胞分化追跡放射線生体分子映像法の開発事業であり、主管実施機関であるカソリック・クァンドン・ユニヴァーシティ・インダストリー・テクノロジー・ホールディングス・カンパニー・リミテッドが支援した。
【背景技術】
【０００２】
体細胞を他の種類の細胞、前駆細胞および幹細胞などにリプログラミングする方法は、細胞治療、疾患モデルおよび移植において臨床的に重要な技術である。近年、これらの技術は、いくつかの多能性遺伝子および種々の分化特異的な発現遺伝子などを標的とする分子および化学方法によって試みられた。しかしながら、従来の方法は、安定性と効率性において指摘を受けており、過程が複雑であるといったデメリットを有している。
【０００３】
細胞は、様々な環境に露出されており、このような環境は、細胞が世代を経ることに伴い、短時間または長時間にかけて細胞の遺伝子の発現に影響を及ぼし、環境の変化によるストレスにより細胞の遺伝子発現プログラムが調節される。細胞培養環境における培地成分は、様々な物質とイオンを含んでおり、このような環境の細胞内への流入は、細胞の変化を促進できる画期的な方法になり得る。しかしながら、細胞は、リン脂質から構成された細胞膜により、細胞培地の様々な成分中への、極性の度合いおよびサイズの多様性に起因して、細胞の伝達および流入がスムーズに行われていないのが現状である。近年、超音波により発生したマイクロバブルと空洞現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）効果による外部環境の細胞内への流入可能性が報告され、超音波刺激が細胞の発達にポジティブな効果を及ぼすという報告がある。なお、超音波によりＡＴＰが引き起こされ、このようなＡＴＰが細胞膜の受容体と反応して、物質の輸送を誘発するという報告もある。
【０００４】
このような側面から、本発明者らは、超音波などの物理的刺激を用いて、体細胞膜に一時的な損傷を与えるとともに、超音波による培地の空洞現象効果を用いて、様々な物質を細胞内に伝達する方法を工夫し、物理的刺激による環境流入を用いた細胞のリプログラミング方法、いわゆる「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ；ＥＮＴＥＲ細胞」を開発することにより、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、分化した細胞に、超音波、レーザーまたは熱処理などによって環境流入を促進できる細胞のリプログラミング装置を提供することを解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した課題を解決するために、本発明の一側面によれば、細胞および培養培地を収容するように設けられた培養チャンバーと、培養チャンバー内の細胞および培養培地に超音波、レーザーおよび熱のうちの少なくとも一つの物理的刺激を加えることにより、エネルギーを提供できるように設けられた一つ以上の機構と、を備える、細胞のリプログラミング装置が提供される。
【０００７】
また、前記機構は、超音波を照射する超音波発生装置、レーザーを照射するレーザー照射装置および温度調節装置のうちの一つ以上を備えていてもよい。
【０００８】
さらに、細胞のリプログラミング装置は、培養チャンバー内の湿度を調節するための湿度調節装置および培養チャンバー内の二酸化炭素の量を調節するためのガス調節装置のうちのいずれか一方以上をさらに備えていてもよい。
【０００９】
さらにまた、細胞のリプログラミング装置は、培養チャンバー内の温度、湿度、二酸化炭素の量のうちの一つ以上を調節するための入力部を有するディスプレイ部をさらに備えていてもよい。
【００１０】
さらにまた、機構が超音波発生装置を備え、ディスプレイ部は、超音波周波数、および時間を設定できるように設けられてもよい。
【００１１】
さらにまた、培養チャンバーには、細胞を収容するサンプルチューブが配置され、超音波発生装置は、サンプルチューブに向けて昇降自在に設けられてもよい。
【００１２】
さらにまた、培養チャンバーには、サンプルチューブを支持するためのサンプルチューブホルダーが設けられてもよい。
【００１３】
さらにまた、サンプルチューブは、二重チューブ構造を有してもよい。
【００１４】
さらにまた、超音波発生装置には、超音波トランスデューサーが取り替えできるように設けられてもよい。
【００１５】
さらにまた、温度調節装置は、培養チャンバーの周りに設けられた熱線を備えていてもよい。
【００１６】
また、本発明の他の側面によれば、複数本のサンプルチューブが取り付け自在に設けられたオートサンプラーと、オートサンプラーに搭載されたいずれか一つのサンプルチューブに向けて超音波を発生させるように設けられた超音波発生装置と、を備える、細胞のリプログラミング装置が提供される。
【００１７】
また、オートサンプラーは、回転自在に設けられ、超音波発生装置は、昇降自在に設けられてもよい。
【００１８】
さらに、オートサンプラーが回転する場合、超音波発生装置は上昇した状態であってもよい。
【００１９】
さらにまた、細胞のリプログラミング装置は、超音波処理された培養培地が貯留された培養培地タンクと、前記培養培地タンク内の培養培地が供給される一つ以上の培養フラスコと、培養フラスコとサンプルチューブを流体が移動可能なようにつなげるインジェクションチューブと、をさらに備えていてもよい。
【００２０】
さらにまた、超音波の加えられたサンプルチューブ内の細胞は、インジェクションチューブにより培養フラスコに移動するように設けられてもよい。
【００２１】
さらにまた、細胞のリプログラミング装置は、複数の培養フラスコを移送するための移送ベルトをさらに備えていてもよい。
【００２２】
さらにまた、細胞のリプログラミング装置は、培養フラスコが収容されるインキュベーターと、インキュベーター内の培養フラスコの培養培地が回収される回収タンクと、インキュベーター内の培養フラスコに培養培地を供給し、培養フラスコ内の培養培地を回収タンクに回収するためのサーキュレーターと、をさらに備えていてもよい。
【００２３】
さらにまた、培養フラスコは、両側に流動通路がそれぞれ設けられてもよい。
【００２４】
さらにまた、培養フラスコの両側の流動通路は、互いに異なる高さに位置してもよい。
【００２５】
さらにまた、それぞれの流動通路には、栓が取り付けられてもよい。
【００２６】
さらにまた、少なくとも一つの栓は、培養培地の流動のためのインジェクター（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）が取り付けられるように設けられてもよい。
【００２７】
さらにまた、インキュベーターには、載置された培養フラスコを振とうさせるためのシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）が設けられてもよい。
【発明の効果】
【００２８】
以上述べたように、本発明の一実施例に係る細胞のリプログラミング装置は、次のような効果を有する。
【００２９】
分化した細胞に、超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを加えて多能性特性を有する新たなタイプの多能性細胞または前記分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞へのリプログラミングを誘導するという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１の実施例に係る細胞のリプログラミング装置を示す概念図である。
【図２】本発明の第１の実施例に係る細胞のリプログラミング装置を示す概念図である。
【図３】図１に示す細胞のリプログラミング装置を構成する超音波トランスデューサーの様々な実施例を示す概念図である。
【図４】図１に示す細胞のリプログラミング装置を構成するサンプルチューブを示す概念図である。
【図５】本発明の第２の実施例に係る細胞のリプログラミング装置を示す概念図である。
【図６】本発明の第２の実施例に係る細胞のリプログラミング装置を示す概念図である。
【図７】本発明の第２の実施例に係る細胞のリプログラミング装置を示す概念図である。
【図８】図５に示す細胞のリプログラミング装置を構成する培養フラスコを示す図である。
【図９】培養フラスコに取り付けられるインジェクターを示す図である。
【図１０】培養フラスコにインジェクターが取り付けられた状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の一実施例に係る細胞のリプログラミング装置について、添付図面を参照して詳細に説明する。
【００３２】
また、図面符号に関わらず、同一のまたは対応する構成要素には、同一または類似の参照番号を付し、それについての重複する説明は省略し、説明の便宜のために、図示された各構成部材のサイズおよび形状は、誇張または縮小される場合がある。
【００３３】
本発明は、分化した細胞および培養培地の混合物に、環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、前記物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法に関するものである。
【００３４】
本発明は、分化した細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などの環境流入を促進できる物理的刺激を与えながら、目的とするリプログラミングされた細胞を誘導できる任意の培地において分化した細胞を培養して多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）細胞；または前記分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞、例えば、肝細胞、造骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、星状細胞、角質細胞、毛根細胞、膵臓β細胞または心筋細胞などに細胞のリプログラミングを誘導できることを特徴とする。
【００３５】
一例によれば、リプログラミングされた細胞を多能性細胞にすることを目指す場合、分化した細胞と幹細胞培養培地を混合し、物理的刺激を与えて一定時間培養することにより、分化した細胞は多能性細胞にリプログラミングされ得る。
【００３６】
他の例によれば、リプログラミングされた細胞を、分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞にすることを目指す場合、分化した細胞と目的とする分化細胞の分化誘導培地を混合し、物理的刺激を与えて一定時間培養することにより、分化した細胞は表現型が異なる任意の分化細胞にリプログラミングされ得る。
【００３７】
本発明の細胞のリプログラミング方法は、分化した細胞への物理的刺激によって細胞外の環境流入に伴って分化した細胞のリプログラミングが誘導されるものと認められる。このような環境流入とは、物理的刺激が与えられた分化した細胞から排出される遺伝物質、化学物質、小分子、またはエキソソーム；または培養培地成分などの隣り合う分化した細胞への流入を意味する。
【００３８】
本発明の細胞のリプログラミング方法によれば、分化した細胞への環境流入は、多能性マーカーと三胚葉マーカーを安定的に発現する多能性細胞と、前記分化した細胞とは表現型が異なる分化細胞へのリプログラミングの方向性を決め得るものと認められる。
【００３９】
加えて、リプログラミングの方向性は、培養培地の種類により決められ得るものと認められる。
【００４０】
すなわち、上述したように、分化した細胞から多能性細胞へのリプログラミングは、分化した細胞と幹細胞培養培地の混合物に物理的刺激を与えた場合に誘導可能であり、分化した細胞から表現型が異なる任意の分化細胞へのリプログラミングは、分化した細胞と任意の分化細胞の分化誘導培地の混合物に物理的刺激を与えた場合に誘導され得る。
【００４１】
分化した細胞への環境流入に関して、本発明者らは、特に、物理的刺激による細胞膜損傷と細胞分泌物質（エキソソーム）を考慮した。すなわち、超音波、レーザー、または熱処理は、エネルギーによる温度上昇、超音波により生成されるマイクロバブルの振動、液体のフロー生成誘導、すなわち、細胞膜に沿ってマイクロストリーム生成を誘導し、このような効果によって細胞膜に微細な損傷を加え、孔の生成を誘導することによって、外部物質の吸収が増加するようにするが、これは、細胞内Ｃａ２＋濃度変化、すなわち、細胞内Ｃａ２＋濃度変化分析は、細胞膜に損傷や膜の流動性が増加する場合、瞬間的に細胞内（ｃｙｔｏｓｏｌ）Ｃａ２＋濃度が増加することを反映し、細胞膜の流動性の増加を確認することであり、本発明の一具体例によれば、超音波処理直後、Ｃａ２＋濃度が速く増加してから、徐々に減少し、超音波を処理しない対照群の水準まで減少することから、細胞膜の損傷が誘導された後、回復されることが分かった。また、超音波によるＡＴＰの発生および増加が様々な細胞性ストレスに対する反応および細胞膜内ＡＴＰ受容体と反応してエンドサイトーシスを誘導するものと知られている。すなわち、ＡＴＰ濃度と細胞損傷および細胞内への物質の流入との関連性があり、これを確認するために、超音波処理を行った後、細胞におけるＡＴＰ濃度を分析した結果、未処理対照群に比べて高い水準のＡＴＰ濃度が現れた。なお、ＡＴＰにより影響を受ける細胞膜内イオノトロピック型Ｐ２Ｘ受容体と代謝型Ｐ２Ｙ受容体の発現も、また超音波処理された細胞において対照群に比べて活性化された。このような結果は、超音波で細胞内損傷のみならず、細胞の外部環境の流入可能性を示唆する。
【００４２】
一方、エキソソームは、内部に遺伝情報物質（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでいるものと知られているが、細胞膜の損傷により細胞膜外に排出されたエキソソームが、周辺の他の細胞に再び入る過程を通じて、エキソソーム内に存在する遺伝情報物質が伝達され得る。したがって、超音波処理による刺激によって細胞内低発現されるか、あるいは、発現が抑制された状態に維持された多能性マーカーの発現が誘導ないし促進されると同時に、細胞膜に損傷が生ずることによって、前記発現が誘導ないし促進された多能性マーカーを含む細胞内に存在するエキソソームが外部に排出されて、周辺細胞に伝達される。ここで、周辺細胞も細胞膜が部分的に損傷された状態であるため、細胞膜の流動性が増加し、細胞内にエキソソームが入る効率が正常状態に比べてさらに高いものと推定され、このようなエキソソーム内に存在する前記発現誘導ないし促進された多能性関連遺伝情報が伝達され、多能性細胞が作られるものと考えられた。本発明の一具体例において、多能性細胞誘導過程中に培養培地を回収し、培地内のエキソソームを抽出し、エキソソーム内に多能性細胞関連多能性マーカーが存在するかを確認した結果、知られた多能性マーカーが高い発現程度を示すことが確認され、本発明者らのこのような仮説を裏付けるものと考えられた。また、このような超音波、レーザーまたは熱処理においても、核型奇形がなく、正常であるものと現われた。
【００４３】
このような仮説は、細胞膜の損傷によるエキソソームの放出誘導により、多能性細胞を製造できることを可能にする。
【００４４】
前記分化した細胞として、哺乳類由来の真皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞などを含む体細胞；子宮癌細胞（ＨｅＬａ）、肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）などを含む癌細胞；または肺上皮細胞（Ｌ１３２  ｃｅｌｌ）を含む器官内組織細胞などを使用することができる。
【００４５】
本明細書において、用語「体細胞」とは、成体を構成する細胞であって、分化能および自己生産能が制限された細胞を意味する。一実現例によれば、前記体細胞は、哺乳類の皮膚、毛髪、脂肪を構成する体細胞であってもよく、好ましくは、哺乳類由来の線維芽細胞であってもよいが、これに制限されない。
【００４６】
本明細書において、用語「多能性細胞」とは、物理的刺激、厳格な意味として、超音波、レーザー、または熱処理後に多能性を獲得した細胞のことをいう。本明細書において前記多能性は、包括的に幹細胞で発現される多能性マーカーを安定的に発現する状態を意味する。また、三つの種類の内胚葉、外胚葉及び中胚葉の三胚葉マーカーを発現する状態を意味する。前記多能性細胞は、「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅａｉａ−ｂａｓｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ；ｅｓ／ＥＮＴＥＲ」細胞と使用され得る。
【００４７】
本発明に係る多能性細胞は、外部環境によって分化誘導が良好に行われ、幹細胞の属性に比べて分化属性が強い前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の属性がさらに強いという点から、公知の誘導万能幹細胞と差別化された特徴を有する。すなわち、誘導万能幹細胞のような胚芽幹細胞を細胞治療剤として使用する場合、ある程度分化過程を経る用意段階が要求され、癌に変わることができる危険要素を内包し、逆分化誘導因子の導入のためにウイルスベクターを使用することによる安全性の問題が提起されるが、本発明の多能性細胞は、遺伝子変異のための逆分化誘導因子または化学物質などの逆分化誘導物質を別に導入することなく、誘導されるので、他の種類の細胞と共同培養を通じる培養が必要ないため、細胞汚染（他の細胞が混ざる問題点）の問題点がなく、インビボ実験において癌細胞と類似のテラトーマを形成せず、癌発生の問題点がないため、安全性が確保されている。言い換えれば、本発明の多能性細胞は、誘導過程が単純で、短いため、自己細胞を処理し、移植時まで時間を画期的に短縮できるというメリットを有する。
【００４８】
前記多能性細胞は、ＯＣＴ３／４、Ｓ０Ｘ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４、またはＡＦＰのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは中胚葉および内胚葉からなる三胚葉マーカー遺伝子を安定的に発現することを特徴とする。
【００４９】
本明細書において、用語「リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」は、分化能がない細胞またはある程度分化能がある細胞など互いに異なる態様で存在する分化した細胞から最終的に新たな類型の細胞または新たな類型の分化潜在力を有する状態に復元または切替えできるプロセスを意味する。本発明によれば、分化した細胞は、環境流入を促進できる物理的刺激を受けるとき、多能性細胞または分化した細胞とは表現型が異なる、目的とする任意の分化細胞にリプログラミングされてもよい。
【００５０】
前記分化細胞は、例えば、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ２、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰまたは０４のうちのいずれか一つを発現する神経細胞（「ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ｎ／ＥＮＴＥＲ」という）；Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つを発現する筋肉細胞（「ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ｍ／ＥＮＴＥＲ」という）；ＡＦＰ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つを発現する肝細胞（「ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ｈ／ＥＮＴＥＲ」という）；またはＰｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つを発現する脂肪細胞（「ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ａ／ＥＮＴＥＲ」という）を含んでいてもよいが、これらに制限されない。
【００５１】
本明細書において、「培養培地」は、包括的な意味において、インビトロ細胞培養に用いられる培地であり、本発明においては、幹細胞培養培地または分化誘導培地を意味し、前記幹細胞培養培地は、さらに具体的に、胚芽幹細胞培養培地を意味する。また、「分化誘導培地」は、通常の幹細胞の分化細胞への誘導に使用する培地であり、例えば、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地などを使用することができるが、これらに制限されない。
【００５２】
本発明の細胞のリプログラミング方法において、図１を参照して具体的に説明すれば、次の通りである。
【００５３】
まず、培養培地と分化した細胞を混合し、前記混合物に物理的刺激を与える。
【００５４】
分化した細胞の混合物に物理的刺激を与える前に、培養培地に物理的刺激を与えて細胞のリプログラミング効率を高めることができる。
【００５５】
前記物理的刺激は、超音波、レーザー、または熱処理のうちのいずれか一つであってもよい。
【００５６】
前記培養培地に対する超音波処理は、出力強度１Ｗ／ｃｍ２〜２０Ｗ／ｃｍ２の超音波を１〜２０分、具体的に、出力強度２Ｗ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２の超音波を５〜１５分、より具体的に、出力強度３Ｗ／ｃｍ２〜７Ｗ／ｃｍ２の超音波を７〜１３分間行うこともできる。
【００５７】
培養培地に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを１分〜２０分、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを３分〜１５分、さらに具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを５分〜１０分間照射することができる。前記波長帯域は、例えば、４００ｎｍ、８０８ｎｍ、８８０ｎｍの波長を使用できる。
【００５８】
培養培地に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で５分〜２０分間行うことができる。
【００５９】
分化した細胞に物理的刺激を与える場合、所定の強さで露出させることが好ましく、この範囲を脱する場合、細胞生存率が減少することがある。
【００６０】
したがって、培養培地と分化した細胞の混合物に対する超音波処理は、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２〜３Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間、より具体的に、出力強度０．７Ｗ／ｃｍ２〜２Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間、さらに具体的に、出力強度０．８Ｗ／ｃｍ２〜１．５Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間行うことができる。
【００６１】
培養培地と分化した細胞の混合物に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを１秒〜２０秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを３秒〜１０秒、さらに具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを４秒〜６秒間照射してもよい。前記波長帯域は、例えば、４００ｎｍ、８０８ｎｍ、８８０ｎｍの波長を使用できる。
【００６２】
培養培地と分化した細胞の混合物に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で１分〜１０分間露出した後、０℃〜４℃の温度条件で５〜１０秒間露出して行ってもよい。
【００６３】
次いで、物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養し、リプログラミングされた細胞を得る。
【００６４】
物理的刺激が与えられた混合物の培養は、浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）または付着培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）方式を通じて多能性マーカーまたは分化マーカーを安定的に発現するスフェロイドが形成される期間、すなわち、２日〜１０日間行うことができるが、特にこれに制限されるものではない。
【００６５】
本発明の一具体例によれば、浮遊培養は、付着培養に比べてさらに高いスフェロイド形成効率を示す。また、浮遊培養は、付着培養に比べてスフェロイドの数とサイズがさらに大きくて、一定のサイズ分布を示す。
【００６６】
本発明の一具体例によれば、超音波またはレーザー処理されたヒト皮膚線維芽細胞の浮遊培養時に、略３日目から多能性マーカーまたは分化マーカーの発現が増加するかあるいは安定化され、この時期からリプログラミングが始まるものと認められる。また、熱処理されたヒト皮膚線維芽細胞の浮遊培養時に、略８日目から多能性マーカーの発現が増加するかあるいは安定化され、この時期からリプログラミングが始まるものと認められる。
【００６７】
前記多能性マーカー、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０などが発現されることを通じて、スフェロイドが多能性を有することを確認できる。多能性マーカーの確認は、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫細胞化学法により分析できるが、特にこれに制限されるものではない。
【００６８】
また、本発明の多能性細胞は、三胚葉マーカー、すなわち外胚葉（ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ）、内胚葉（ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ）マーカーを高い水準に発現する特徴を示す。
【００６９】
他の具体例において、分化誘導培地において皮膚線維芽細胞に対して物理的刺激を与える場合、培養後約２日〜６日の間にスフェロイドが形成され得る。
【００７０】
分化マーカーは、神経細胞にリプログラミングされる場合、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ２、ＴｕＪｌ、ＧＦＡＰまたは０４のうちのいずれか一つであってもよい。
【００７１】
筋肉細胞にリプログラミングされる場合、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つであってもよい。
【００７２】
肝細胞にリプログラミングされる場合、ＡＦＰ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つであってもよい。
【００７３】
脂肪細胞にリプログラミングされる場合、オイルレッドＯ染色され、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つであってもよい。
【００７４】
また、本発明の多能性細胞は、増殖マーカータンパク質であるＫｉ−６７を発現し、増殖能を有する特徴がある。
【００７５】
また、前記リプログラミングされた多能性細胞を栄養細胞と共培養する場合、多能性細胞の増殖が増加し得る。
【００７６】
さらに、本発明の細胞のリプログラミング方法は、前記多能性細胞を分化誘導培地において培養する段階をさらに含んでいてもよい。前記分化誘導培地の種類に応じて、多能性細胞は、目的とする分化細胞に分化し得る。
【００７７】
前記分化誘導培地として、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地などを使用できるが、特にこれらに制限されるものではない。
【００７８】
以下、上述した細胞リプログラミング方法を行い得る細胞のリプログラミング装置を、添付図面を参照して具体的に説明する。
【００７９】
上述したように、細胞に加えられる物理的刺激は、超音波、レーザーまたは熱処理のうちのいずれか一つであってもよい。
【００８０】
図１および図２は、本発明の第１の実施例に係る細胞のリプログラミング装置１００を示す概念図であり、図３は、図１に示す細胞のリプログラミング装置を構成する超音波トランスデューサー２２０−１、２２０−２、２２０−３の様々な実施例を示す概念図であり、図４は、図１に示す細胞のリプログラミング装置を構成するサンプルチューブ１６０を示す概念図である。
【００８１】
図１および図２を参照すると、本発明の一実施例に係る細胞のリプログラミング装置１００は、細胞および培養培地を収容するように設けられた培養チャンバー１１０と、培養チャンバー１１０内の細胞および培養培地に超音波、レーザーおよび熱のうちの少なくとも一つの物理的刺激を加えることにより、エネルギーを提供できるように設けられた一つ以上の機構と、を備える。
【００８２】
また、前記機構は、超音波を照射する超音波発生装置２００、レーザーを照射するレーザー照射装置および温度調節装置１２０のうちの一つ以上を備えていてもよい。
【００８３】
さらに、細胞のリプログラミング装置１００は、培養チャンバー１１０内の湿度を調節するための湿度調節装置１３０および培養チャンバー１１０内の二酸化炭素の量を調節するためのガス調節装置１４０のうちのいずれか一方以上をさらに備えていてもよい。
【００８４】
さらにまた、細胞のリプログラミング装置１００は、培養チャンバー１１０内の温度、湿度、二酸化炭素の量のうちの一つ以上を調節するための入力部を有するディスプレイ部１５０をさらに備えていてもよい。
【００８５】
さらにまた、機構が超音波発生装置２００である場合、ディスプレイ部１５０は、超音波周波数、および時間を設定できるように設けられてもよい。
【００８６】
具体的に、本発明は、細胞および培養培地を収容できる培養チャンバー１１０、および前記培養チャンバー１１０の一側に配置され、前記細胞および培養培地に環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できるエネルギーを提供できる機構を備える。なお、リプログラミングされた細胞は、分化した細胞および培養培地の混合物に環境流入を促進できるエネルギーを提供し、前記エネルギーが提供された混合物を一定時間培養して分化した細胞から誘導されたものである、分化した細胞からリプログラミングされた細胞の誘導装置を提供する。
【００８７】
前記培養チャンバー１１０は、通常、細胞の培養に使用可能なチャンバーを意味してもよい。また、培養チャンバー１１０は、細胞の培養が可能なように温度、湿度、および／またはガスなどが調節可能なチャンバーであってもよい。例えば、培養チャンバー１１０は、温度制御部と二酸化炭素制御部とを備え、培養チャンバー１１０内の細胞培養条件は、目的及び細胞の種類に応じて当業者の水準で適宜調節され得る。
【００８８】
また、前記培養チャンバー１１０は、細胞の浮遊培養または単層培養方式を用いてもよく、このような培養が可能な構造よりなることが好ましい。例えば、浮遊培養のための撹拌器が具備された培養チャンバーであってもよい。
【００８９】
前記環境流入を促進できるエネルギーを提供できる装置は、超音波を照射できる超音波発生装置２００、レーザーを照射できるレーザー発生装置（図示せず）、または温度調節装置１２０を備えていてもよい。なお、前記温度調節装置１２０は、後述するサンプルチューブホルダー１７０を介してその機能が実現されてもよい。
【００９０】
前記超音波発生装置２００は、周波数が１０ｋＨｚ〜１００ＭＨｚである超音波を発生する公知の超音波装置であれば、制限なしに使用できる。前記超音波発生装置は、超音波発生部（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）２１０および超音波トランスデューサー（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）２２０：２２０−１、２２０−２、２２０−３を備えていてもよい。なお、超音波発生装置２００は、超音波トランスデューサー２２０が取り替えできるように設けられてもよい。また、超音波発生装置２００は、超音波チャンバー２０１内に設けられてもよい。
【００９１】
前記レーザー発生装置は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを発生し、１〜１５Ｗ出力で、パルス持続時間が１ｍｓ〜９００ｍｓであり、周波数が１〜１００Ｈｚであるレーザー装置を使用できるが、特にこれに制限されるものではない。
【００９２】
温度調節装置１２０は、−４０℃〜９９．９℃の範囲の温度の調節が可能な公知の温度調節装置を使用できるが、特にこれに制限されるものではない。例えば、前記温度調節装置１２０は、培養チャンバーの周りに設けられた熱線であってもよい。
【００９３】
本発明の分化した細胞からリプログラミングされた細胞の誘導装置は、培養培地と分化した細胞の混合物に前記超音波発生装置、レーザー発生装置、または温度調節装置を用いて超音波、レーザー、または熱処理し、一定時間培養して多能性細胞または分化細胞へのリプログラミングを誘導することができる。このとき、リプログラミング効率を高めるために、培養培地を分化した細胞と混合する前に、培養培地に超音波、レーザー、または熱処理を予め行ってもよい。
【００９４】
また、細胞のリプログラミング装置１００は、培養チャンバーの湿度を調節するための湿度調節装置１３０を備えていてもよい。上述した、温度調節装置１２０、湿度調節装置１３０およびガス調節装置（二酸化炭素制御部）１４０により、培養チャンバー１１０内の温度、湿度、および二酸化炭素の量を適宜に調節することができる。
【００９５】
さらに、前記細胞のリプログラミング装置１００は、上述した温度、湿度、および二酸化炭素の量を調節するためのディスプレイ部１５０を備えていてもよい。ユーザーは、ディスプレイ部を操作することにより、培養チャンバー１１０内の温度、湿度、および二酸化炭素の量を調節することができる。前記ディスプレイ部１５０は、タッチ入力方式またはボタン入力方式の入力部を備えていてもよい。
【００９６】
さらにまた、超音波チャンバー２０１には、細胞を収容するサンプルチューブ１６０が配置され、超音波発生装置２００は、サンプルチューブ１６０に向かって昇降自在に設けられてもよい。また、超音波チャンバー２０１には、サンプルチューブ１６０を支持するためのサンプルチューブホルダー１７０が設けられてもよい。さらに、サンプルチューブ１６０は、二重チューブ構造を有してもよい。なお、サンプルチューブホルダー１７０は、温度調節機能を有してもよく、例えば、ヒート（ｈａｅｔ）ブロックとして設けられてもよい。
【００９７】
具体的に、培養チャンバー１１０は、超音波が加えられる細胞を収容するサンプルチューブ（ｓａｍｐｌｅ  ｔｕｂｅ）１６０を備えていてもよい。また、前記超音波発生装置２００は、前記サンプルチューブ１６０内に超音波を発生するように配置され、これにより、超音波チャンバー２０１には、サンプルチューブ１６０を支持するためのサンプルチューブホルダー（ｓａｍｐｌｅ  ｔｕｂｅ  ｈｏｌｄｅｒ）１７０が設けられる。一方、サンプルチューブ１６０の出入りおよび様々なサイズのサンプルチューブ１６０に対応できるように、前記超音波発生装置２００、具体的に、超音波トランスデューサー２２０は、昇降自在に設けられてもよい。なお、前記ディスプレイ部１５０を操作することにより、超音波発生装置２００、特に、超音波トランスデューサー２２０を上昇または下降させることができる。
【００９８】
また、前記超音波トランスデューサー２２０が昇降自在に取り付けられる移送部２３０は、下降の際にサンプルチューブ１６０の入口を閉塞するように設けられてもよい。さらに、超音波チャンバー２０１内の温度、湿度、およびガス水準を維持するために、前記超音波発生装置２００およびサンプルチューブ１６０を取り囲む蓋体１１１が設けられてもよい。前記蓋体１１１は、開閉自在に取り付けられてもよく、ガラスまたは透明樹脂などの透明な材質から形成されてもよい。
【００９９】
図３を参照すると、超音波発生装置２００は、サンプルチューブのサイズおよび超音波の放射特性に応じて、種々の超音波トランスデューサー２２０−１、２２０−２、２２０−３が取り替えできるように取り付けられてもよい。
【０１００】
図４を参照すると、サンプルチューブ１６０は、二重チューブ１６１、１６２構造を有してもよい。また、サンプルチューブホルダー１７０内にサンプルチューブ１６０が嵌入してもよい。このとき、サンプルチューブ１６０は、耐火性および耐熱性に優れた材質（例えば、樹脂材質）から形成されてもよく、サンプルチューブホルダー１７０がサンプルホルダーを取り囲むことにより、防音効果を実現することができる。具体的に、前記サンプルチューブホルダー１７０は、細胞の汚染を防ぐために密閉された空間として設けられることが好ましく、超音波による騒音の遮断できる防音機能を有することが好ましい。一方、サンプルチューブホルダー１７０は、温度調節装置（例えば、熱線）の機能を果たすように設けられてもよい。
【０１０１】
図５〜図７は、本発明の第２の実施例に係る細胞のリプログラミング装置３００を示す概念図であり、図８および図１０は、細胞のリプログラミング装置３００を構成する培養フラスコ１８０を示す図である。
【０１０２】
図５を参照すると、図１〜図４に基づいて説明した細胞のリプログラミング装置１００は、大型自動化設備に適用可能である。
【０１０３】
図５および図６を参照すると、本発明の第２の実施例に係る細胞のリプログラミング装置３００は、複数本のサンプルチューブ１６０が取り付け自在に設けられたオートサンプラー５００およびオートサンプラー５００に搭載されたいずれか一つのサンプルチューブに向けて超音波を発生させるように設けられた超音波発生装置４００を備える。
【０１０４】
また、オートサンプラー５００は、回転自在に設けられる。さらに、前記超音波発生装置４００は、第１の実施例と同様に、超音波発生部４１０、超音波トランスデューサー４２０および移送部４３０を備える。このとき、超音波トランスデューサー４２０は、昇降自在に設けられてもよい。
【０１０５】
さらに、オートサンプラー５００が回転する場合、超音波発生装置４００は上昇した状態であってもよい。
【０１０６】
さらにまた、細胞のリプログラミング装置３００は、超音波処理された培養培地が貯留された培養培地タンク３３０、前記培養培地タンク３３０内の培養培地が供給される一つ以上の培養フラスコ１８０、および培養フラスコ１８０とサンプルチューブ１６０を流体が移動可能なようにつなげるインジェクションチューブ３１２をさらに備えていてもよい。
【０１０７】
加えて、超音波の加えられたサンプルチューブ１６０内の細胞は、インジェクションチューブ３１２により培養フラスコ１８０に移動するように設けられてもよい。
【０１０８】
また、細胞のリプログラミング装置３００は、複数の培養フラスコ１８０を移送するための移送ベルト３２０をさらに備えていてもよい。
【０１０９】
さらに、細胞のリプログラミング装置３００は、培養フラスコ１８０が収容されるインキュベーター６００、インキュベーター６００内の培養フラスコ１８０の培養培地が回収される回収タンク６１０、およびインキュベーター６００内の培養フラスコ１８０に培養培地を供給し、培養フラスコ１８０内の培養培地を回収タンク６１０に回収するためのサーキュレーター６２０をさらに備えていてもよい。
【０１１０】
さらにまた、培養フラスコ１８０は、両側に流動通路がそれぞれ設けられてもよく、かつ、培養フラスコの両側の流動通路は、互いに異なる高さに位置してもよい。また、それぞれの流動通路には、栓１８１、１８２が取り付けられてもよい。なお、少なくとも一つの栓１８２は、培養培地の流動のためのインジェクター（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）１９１が取り付けられるように設けられてもよい。
【０１１１】
具体的に、第２の実施例に係る自動の細胞のリプログラミング装置３００は、複数本のサンプルチューブが取付けできるオートサンプラー（ａｕｔｏ  ｓａｍｐｌｅｒ）を備える。前記オートサンプラーは、回転自在に設けられる。
【０１１２】
また、上述した超音波発生装置４００が設けられる。ここで、前記超音波発生装置４００は、オートサンプラー５００に搭載されたいずれか一つのサンプルチューブの内部に向けて超音波を発生できるように配置される。例えば、超音波発生装置４００の位置は、固定位置であってもよい。いうまでもなく、上述したように、超音波発生装置４００は、移送部４３０などを通じて、高さ方向に沿って上昇および下降できるように設けられてもよい。
【０１１３】
例えば、前記オートサンプラー５００が回転する過程において、前記超音波発生装置４００（具体的に、超音波トランスデューサー）は、上昇した状態であってもよく、位置されたサンプルチューブ１６０に向けて超音波を発生する過程において、前記超音波発生装置４００（具体的に、超音波トランスデューサー）は下降された状態であってもよい。
【０１１４】
そのとき、オートサンプラー５００が回転することに伴い、複数本のサンプルチューブ１６０が超音波トランスデューサー４２０に向かって移動し、超音波トランスデューサー４２０は、位置しているサンプルチューブ１６０に向けて超音波を発生させる。すなわち、ユーザーがオートサンプラー５００に複数本のサンプルチューブを搭載すると、それぞれのサンプルチューブ１６０は、オートサンプラー５００により、順番に超音波トランスデューサー４２０側に移動し、サンプルチューブ１６０内の細胞に超音波が加えられ得る。
【０１１５】
また、超音波の加えられた細胞は、インジェクションチューブ（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ）３１２（「第２のインジェクションチューブ」ともいう）によって培養フラスコ１８０（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｌａｓｋ）に向かって移送され得る。すなわち、オートサンプラー５００の回転過程において、いずれか一つのサンプルチューブ１６０には超音波が加えられてもよく、超音波の加えられたサンプルチューブ１６０内の細胞は、インジェクションチューブ３１２により培養フラスコ１８０に向かって移動されてもよい。
【０１１６】
第１の実施例において説明したように、第２の実施例に係る自動細胞のリプログラミング装置３００においても、内部温度、ガス、湿度などが調節可能であり、外部とは密閉された装置（無菌施設）として実現されてもよい。なお、超音波トランスデューサー４２０も、レーザーまたは熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加え得るヒートスティック（ｈｅａｔ  ｓｔｉｃｋ）に用途を変更してもよい。
【０１１７】
また、前記自動細胞のリプログラミング装置３００には、超音波処理された培養培地が貯留された培養培地タンク３３０（ｍｅｄｉａ  ｔａｎｋ）が設けられる。前記培養培地タンク３３０内の培養培地は、第１のインジェクションチューブ３１１を介して培養フラスコ１８０に供給される。一方、複数の培養フラスコ１８０は、移送ベルト（ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｌｔ）３２０などの移送部によりオートサンプラー５００側からインキュベーター６００側に向かって移送される。なお、培養培地タンク３３０内には、一つ以上の超音波トランスデューサー４２０が設けられる。
【０１１８】
さらに、前記自動細胞のリプログラミング装置３００には、培養フラスコ１８０内の培養培地が回収される回収タンク６１０（ｗａｓｔｅ  ｔａｎｋ）がさらに設けられてもよい。培養培地の超音波処理に関して、超音波処理装置４００が培養培地タンク３３０に設けられ、一つ以上の超音波トランスデューサー４２０によって培養培地タンク３３０内の培養培地に超音波を発生させる。そのとき、超音波の強度および時間を設定かつ調節するためのディスプレイ部１５０（図１を参照）が設けられてもよい。なお、超音波が印加される時間をカウントするためのタイマーが設けられてもよい。
【０１１９】
そのとき、インキュベーター６００内の培養フラスコ１８０に培養培地を供給し、培地の交換時間になると、培養フラスコ１８０内の培養培地を回収タンク６１０に回収するためのサーキュレーター６２０（Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ）が設けられてもよい。前記サーキュレーター６２０は、タイマー６２１に設定された培地の交換時間が経過すれば、培養フラスコ１８０内の培養培地を回収タンク６１０に回収するように設けられ、超音波トランスデューサー４２０により超音波が処理された培養培地を、培養培地タンク３３０からそれぞれの培養フラスコ１８０とサーキュレーター６２０（Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ）に供給するように設けられた。
【０１２０】
また、インキュベーター６００には、載置された培養フラスコを振とうさせるためのシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）６０１が設けられてもよい。例えば、シェーカー６０１は、培養フラスコをまるでシーソーのように振とうさせるように設けられてもよい。
【０１２１】
一方、前記インキュベーター６００は、第１の実施例において説明した培養チャンバー１１０と同様に、内部温度、ガス、湿度が設定および調節されてもよく、外部とは密閉された装置（無菌施設）として具現されてもよい。
【０１２２】
図８〜図１１を参照すると、培養フラスコ１８０は、インジェクションチューブ側およびインキュベーター６００側において自動的に培地の注入および回収ができるように両側においてそれぞれドッキング可能な構造を有してもよい。図８および図１０を参照すると、培養フラスコ１８０の両側（例えば、表／裏）には、それぞれ流動通路が設けられてもよい。それぞれの流動通路には、ゴムまたは樹脂材質の栓１８１、１８２が設けられてもよい。特に、ドッキングされる部分は、ゴム材質から形成されることにより、培養培地が外に出ないように設けられてもよい。とりわけ、培地の回収に際して適正量のみを回収できるようにドッキングされる部分の高さが調節されている。例えば、培地の廃水時には、裏側の流動通路の高さまでの培地が回収されてもよい。なお、図９および図１０を参照すると、少なくとも一つの栓は、培養培地の流動のために、インジェクター１９１と結合するように設けられてもよい。
【０１２３】
上述した本発明の好適な実施例は、単なる例示に過ぎず、本発明に関する通常の知識を有する当業者であれば、本発明の思想と範囲内において様々な修正、変更、付加が可能である筈であり、このような修正、変更および付加は、下記の特許請求の範囲に属するものと見なすべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明の一実施例に係る細胞のリプログラミング装置は、分化した細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを加えて多能性特性を有する新たなタイプの多能性細胞または前記分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞へのリプログラミングを誘導するという効果を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2019508069.tif 000014
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