(57)【要約】本発明は、様々な態様において、治療及び／または診断目的のための抗原特異的Ｔ細胞及びそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特定及び特性決定を可能にする抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化及び／または増大を提供し、さらに治療用の抗原特異的遺伝子操作Ｔ細胞の生成も提供する。豊富化及び／または増大のステップ中に磁界の存在下で常磁性ナノａＡＰＣをインキュベートすることで、Ｔ細胞表面上の常磁性粒子の磁気的クラスター化を通じてＴ細胞が活性化される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定する方法であって、
自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子を用いて、不均一なＴ細胞集団を磁気的に豊富化させ増大させることと、
前記増大されたＴ細胞を前記ＭＨＣペプチドリガンドによって選別して、所望の抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ることと、
前記Ｔ細胞集団中のＴＣＲ遺伝子またはその一部をシークエンシングすることと、
を含む前記方法。
【請求項２】
Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不均一なＴ細胞集団が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、以前活性化していたＴ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記不均一なＴ細胞集団が、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、または腫瘍からのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記不均一なＴ細胞集団が白血球搬出法によって単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記不均一なＴ細胞集団がＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、または制御性Ｔ細胞に関して豊富化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記不均一なＴ細胞集団が、少なくとも１０６個のＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、または制御性Ｔ細胞を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で約２日〜約９週間、任意選択で少なくとも約１週間の間増大される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で約５日〜約２週間の間増大される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞選別が、前記ＭＨＣペプチド抗原提示複合体を用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞集団における、抗原ペプチドのライブラリーへの反応性をスクリーニングする方法であって、
常磁性ナノ粒子のカクテルを用いて、前記集団中の抗原特異的Ｔ細胞を磁気的に豊富化させ増大させることであって、前記常磁性ナノ粒子カクテルの各粒子が、目的抗原ペプチドを提示する表面結合したＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する、前記豊富化させ増大させることと、
前記増大されたＴ細胞を表現型的に評価することと、
を含む前記方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞集団が、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、または腫瘍からのものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞集団が白血球搬出法によって単離される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞集団がＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋細胞に関して豊富化される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞集団が、少なくとも１０６個のＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋細胞を含有する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で少なくとも約２日間増大される、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
増大された細胞のサイトカイン発現が評価される、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
連続的豊富化及び増大がフロースルー分画により実施され、各連続的豊富化及び増大が異なる目的抗原ペプチドを試験する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも６回の連続的豊富化及び増大が実施され、任意選択で少なくとも１０回の連続的豊富化及び増大のステップが実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各連続的豊富化及び増大のステップが５〜約２０個の目的抗原ペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも７５種の抗原が試験され、任意選択で少なくとも１００種の抗原が試験される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞集団が、がん患者、自己免疫障害を有する患者、または感染性疾患を有する患者からのものである、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞の増大方法であって、
自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子を用いて、異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞を含むＴ細胞集団を磁気的に豊富化させ増大させることを含み、前記ＭＨＣペプチド抗原提示複合体が、前記異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される、前記方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞集団における前記異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体の初期出現頻度が少なくとも約２０％である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子操作されたＴ細胞が、培地中で少なくとも１０日間、任意選択で１０〜２０日間、任意選択で１０〜１４日間増大される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗原特異的Ｔ細胞集団を調製する方法であって、
患者または好適なドナーからのＴ細胞を含む試料を提供することと、
前記試料を、常磁性であり自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を含む第１のナノ粒子に接触させることであって、前記ＭＨＣペプチド複合体がＭＨＣ結合ナノ粒子の受動的充填によって調製される、前記接触させることと、
前記常磁性ナノ粒子の近くに磁界を配置することと、
前記常磁性粒子に結びついた抗原特異的Ｔ細胞を回収することと、
任意選択で前記回収されたＴ細胞を磁界の存在下で増大させることと、
を含む前記方法。
【請求項２９】
Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＨＣ結合ナノ粒子が、過剰なペプチド抗原とのインキュベートにより少なくとも約２日間受動的に充填される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
自らの表面にリンパ球共刺激リガンドを有する第２のナノ粒子が、回収されたＴ細胞の豊富化または増大中に添加される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のナノ粒子が常磁性であり、前記第２のナノ粒子が回収されたＴ細胞の増大中に添加される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のナノ粒子が常磁性ではなく、抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化中に添加される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２のナノ粒子がポリマーであり、任意選択でＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＬＡ、またはＰＬＡ−ＰＥＧを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、以前活性化していたＴ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞集団が、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、または腫瘍からのものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞集団が白血球搬出法によって単離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞集団がＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、または制御性Ｔ細胞に関して豊富化される、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｔ細胞集団が、少なくとも１０６個のＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、または制御性Ｔ細胞を含有する、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で約２日〜約９週間増大される、請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で約５日〜約４週間増大される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１ラウンドの追加の磁気的豊富化及び増大が実施される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者ががん患者である、請求項２８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者に対する前記増大された抗原特異的Ｔ細胞の養子移入をさらに含む、請求項２８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＭＨＣペプチド抗原提示複合体及びリンパ球共刺激リガンドを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む医薬組成物によってブーストすることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を産生する方法であって、
自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子を用いて、Ｔ細胞集団を磁気的に豊富化させ増大させることで、豊富化され増大された抗原特異的Ｔ細胞集団を調製することと、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により前記Ｔ細胞集団を形質転換することと、
を含む前記方法。
【請求項４７】
Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＭＨＣ結合ナノ粒子が、過剰なペプチド抗原とのインキュベートにより少なくとも約２日間受動的に充填される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
自らの表面に結合したリンパ球共刺激リガンドを有する第２のナノ粒子が、回収されたＴ細胞の豊富化または増大中に添加される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２のナノ粒子が常磁性であり、前記第２のナノ粒子が回収されたＴ細胞の増大中に添加される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のナノ粒子が常磁性ではなく、抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化中に添加される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２のナノ粒子がポリマーであり、任意選択でＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＬＡ、またはＰＬＡ−ＰＥＧを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、以前活性化していたＴ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項４６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｔ細胞集団が、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、または腫瘍からのものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｔ細胞集団が白血球搬出法によって単離される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞集団がＣＤ８＋細胞に関して豊富化される、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｔ細胞集団が、少なくとも１０６個のＣＤ８＋細胞を含有する、請求項４６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で約５日〜約９週間増大される、請求項４６〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
磁気的に豊富化された細胞が、培地中で約５日〜約４週間増大される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１ラウンドの追加の磁気的豊富化及び増大が実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者ががん患者である、請求項４６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
患者に対する前記ＣＡＲを発現する前記Ｔ細胞集団の養子移入をさらに含む、請求項４６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＭＨＣペプチド抗原提示複合体及びリンパ球共刺激リガンドを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む医薬組成物によってブーストすることをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＣＡＲを発現するＴ細胞を増大させる方法であって、
請求項４６に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞集団を提供することと、
自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子の存在下で、前記Ｔ細胞集団を磁気的に増大させることと、
を含む前記方法。
【請求項６５】
Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
がんを有する患者を治療する方法であって、
請求項４６または６１に記載の方法に従って調製されるＣＡＲ−Ｔを投与することと、
前記患者に対し、ＭＨＣと複合した前記目的抗原とリンパ球共刺激リガンドとを提示する人工抗原提示細胞を投与することと、
を含む前記方法。
【請求項６７】
同種幹細胞移植後に再発した血液癌を有する患者を治療する方法であって、
好適なドナーからのＴ細胞を含む試料を提供することと、
前記試料を、常磁性であり自らの表面に（１）ＭＨＣペプチド抗原提示複合体であって、ＭＨＣ結合ナノ粒子の受動的充填によって調製される前記ＭＨＣペプチド抗原提示複合体（シグナル１）と、（２）抗ＣＤ２８共刺激リガンド（シグナル２）とを含むナノ粒子に接触させることと、
前記常磁性ナノ粒子の近くに磁界を配置することと、
前記常磁性粒子に結びついた抗原特異的Ｔ細胞を回収することと、
前記回収されたＴ細胞を増大させることと、
前記患者に対し、増大されたＴ細胞を投与することと、
を含む前記方法。
【請求項６８】
前記患者が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＭＨＣがＭＨＣ−Ｉｇである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
抗原特異的Ｔ細胞が、磁気カラムと、２〜５種の腫瘍関連ペプチド抗原を提示する常磁性ナノａＡＰＣとを用いて、磁気的に豊富化され活性化される、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
１種以上のペプチド抗原が、サバイビン、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ＲＨＡＭＭ、及びＰＲ３から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ペプチド抗原が、部位特異的結合を通じて同じまたは異なる粒子集団上にシグナル１及びシグナル２を提示する調製されたナノａＡＰＣに受動的に充填される、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で少なくとも５分間インキュベートされる、請求項６７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｔ細胞及び前記常磁性ナノ粒子が、磁界の存在下で５分間〜５時間インキュベートされる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｔ細胞が、培地中で少なくとも約５日間増大される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
増大された細胞が前記対象に１回〜約４回投与される、請求項６７〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ナイーブな抗原特異的前駆体は希少であり１００万に１つというほど少ないものであり得るため、抗原特異的Ｔ細胞の増大は困難である。（例えば）養子療法に必要とされる多数の腫瘍特異的Ｔ細胞を産生するには、従来の方法ではリンパ球を何週にもわたり抗原で刺激し、多くの場合、この後に労力のかかるプロセスでＴ細胞選択及びサブクローニングが行われる。さらに、リンパ球（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ）の増大に現状使用されている様々なプロセスは、ある程度枯渇した表現型を示すＴ細胞を生成する傾向がある。Ｓａｃｈａｍｉｔｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４  Ａｐｒ  １７；５：１７６を参照。
【０００２】
治療目的及び診断目的の両方において、枯渇した表現型を示さないＴ細胞を含めて、多数及び／または高出現頻度の抗原特異的Ｔ細胞を迅速に産生することができる技術が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、様々な態様において、治療及び／または診断目的のための抗原特異的Ｔ細胞及びそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特定及び特性決定を可能にする抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化及び／または増大を提供し、さらに治療用の抗原特異的遺伝子操作Ｔ細胞の生成も提供する。豊富化及び／または増大のステップ中に磁界の存在下で常磁性ナノａＡＰＣをインキュベートすることで、Ｔ細胞表面上の常磁性粒子の磁気的クラスター化を通じてＴ細胞が活性化される。
【０００４】
様々な態様において、本発明は、養子免疫療法のための抗原特異的Ｔ細胞集団を増大する方法を提供し、当該Ｔ細胞には異種Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作Ｔ細胞が含まれる。本発明の実施形態に従って増大されたＴ細胞は多機能表現型(Ｔｃｍ、Ｔｅｍ）を示し、これは、枯渇した表現型により近い抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いて非特異的に増大されたＴ細胞とは対照的である。
【０００５】
一部の実施形態において、本発明は、特に抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化及び増大のために構成された人工抗原提示細胞を提供し、これには抗原提示複合体（シグナル１）及びリンパ球共刺激シグナル（シグナル２）（例えば、抗ＣＤ２８）を別々のビーズに分離して、制御レベル及びプロセスのバリエーションの追加を可能にすることが含まれる。
【０００６】
さらに他の態様において、本発明は、多数の候補抗原における、Ｔ細胞集団中の反応特異性をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、磁気カラム及び常磁性ａＡＰＣによる抗原特異的Ｔ細胞の連続的豊富化を用い、陰性分画をこの後の豊富化ステップに使用する。各豊富化ステップにおいて、異なるペプチド抗原を提示するａＡＰＣのカクテルによる提示を通じて、数種の候補抗原をバッチ処理することができる。各連続的豊富化ステップで複数の候補抗原ペプチドをスクリーニングすることができるため、当該方法によって、元の試料中の抗原特異的Ｔ細胞前駆体の出現頻度を減らすことなく、少なくとも７５種の抗原の試験が容易に可能になる。
【０００７】
例示的な実施形態において、本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群などの血液悪性腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。一部の実施形態において、当該患者は同種幹細胞移植後に再発している。ＨＬＡが一致するドナーからのＴ細胞供給源を用いることで、抗原特異的Ｔ細胞は、磁気カラムを少なくとも２種または３種の腫瘍関連ペプチド抗原を提示する常磁性ナノａＡＰＣ（複数可）と共に用いて、磁気的に豊富化され活性化される。ペプチド抗原は、調製されたナノａＡＰＣに受動的に充填され、リガンドは、免疫グロブリン配列のＦｃ部分のＣ末端付近で遺伝子操作によりタンパク質に組み入れた遊離システインを通じて、粒子に化学的に結合する。例えば、ａＡＰＣは、同じまたは異なるナノ粒子集団上にシグナル１及びシグナル２を含むことができる。
【０００８】
一部の実施形態において、磁気的活性化は少なくとも５分間、例えば５分〜５時間または５分〜２時間発生し、次に培地中で少なくとも５日間、一部の実施形態においては最大３週間、増大が行われる。得られたＣＤ８＋  Ｔ細胞は表現型的に特性決定して、セントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型及び多機能性であることを確認することができる。増大されたＴ細胞は、抗腫瘍応答を確立するために患者に投与することができる。
【０００９】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｔ細胞活性化の文脈におけるシグナル１及びシグナル２（左パネル）と、常磁性粒子上での人工抗原提示細胞の構築（右パネル）を示す図である。同種のＴ細胞のみがａＡＰＣによって活性化される。
【図２】本発明の実施形態によるナノ粒子上に提示され得る異なる共刺激シグナル（シグナル２）を示し、またシグナル２を別々の粒子上に設置することにより達成されるシグナル２の制御を示す図である。
【図３】磁界の存在下でのＴ細胞の表面上における常磁性粒子とＴ細胞共受容体（ＣＤ３ε）とのクラスター化を実証する図である。
【図４】磁界の存在によって常磁性ａＡＰＣを有するＴ細胞の増殖が増強されることと、この増強が別々のナノ粒子上に存在するシグナル２の量に依存することとを示す図である。
【図５Ａ】シグナル１及びシグナル２が、別々のナノ粒子上に存在する場合であってもＴ細胞の増大を支援し得ること（Ａ、左パネル）と、得られたＣＤ８  Ｔ細胞が両方のシグナルを提示するａＡＰＣによって活性化されたものと同等であること（Ａ、右パネル）とを示す図である。
【図５Ｂ】両方のシグナルを提示するａＡＰＣにより活性化されたＴ細胞のサイトカイン分泌プロファイル（分泌したサイトカインまたはエフェクター分子の数）を、別々の粒子上で提示されるシグナルを有する場合と比較して示す図である。
【図６Ａ】別々にシグナル１及びシグナル２を含有する常磁性ビーズにおける磁界の存在下でのクラスター化を、クラスター化しないポリスチレン粒子と比較して示す図である。
【図６Ｂ】磁気的増大システムで観察された増大の増加を示す図である。
【図７】シグナル１及び２が十分に近接してクラスター化した場合に最適なＴ細胞増大が見られることを示す図である。粒子サイズの増加につれて、Ｓ１＋Ｓ２アプローチの有効性が減少する（右パネル）。それに対し、両方のシグナルを含有するナノ粒子は反対の効果を示す（左パネル）。
【図８】共刺激のタイプを変化させて活性化プロファイルをカスタマイズすることができることを示す図である。
【図９】クローン型Ｔ細胞受容体をシークエンシングする前の細胞精製に使用されるゲーティングスキームを示す図である。最初にナイーブＴ細胞を採取し、Ｅ＋Ｅシステムを用いてナノａＡＰＣで刺激した。７日目に細胞を採取し、フローサイトメトリーにより解析した。左パネルは、培地中で見られたリンパ球集団限定の事象の総数を示している。中央パネルでは、生／死細胞を染色し生細胞に排他的に限定したものであり、右パネルでは、ｔｒｐ−２ペプチドで充填したＭＨＣ＿Ｉｇ二量体を染色に使用し、陽性の細胞のみを選別した（およそ１８．３％）。次にこれらの細胞をＴＣＲシークエンシングに送った。結果は図１０に示されている。
【図１０】ＴＣＲシークエンシング解析に基づいて生産的クローン及び非生産的クローンの数を示す図である。
【図１１Ａ】上位クローン（Ｃａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５；３４８（６２３６）：８０３−８（２０１５）において、＞０．１％の出現頻度及び＞１００リードとして特定）の出現頻度（パネルＡ）を示す図であり、磁気的豊富化及び増大の後の生産的クローンの出現頻度（パネルＢ）と比較するものである。
【図１１Ｂ】磁気的豊富化及び増大の後の生産的クローンの出現頻度（パネルＢ）を示す図である。
【図１２】総リードのパーセントに基づいてＴ細胞クローン型の出現頻度を示す図である。
【図１３】全クローンについてのＶ及びＪのペアリングの３Ｄヒストグラムである。
【図１４】総リードに基づいた、上位１０種のクローンについてのＶ及びＪのペアリングの３Ｄヒストグラムである。
【図１５】健康なドナーからの機能的に活性のヒトネオ抗原特異的ＣＤ−８＋  Ｔ細胞の産生を示す図である。磁気的豊富化及び増大のプロセスを用いて、ＭＣＦ−７乳癌からの３個のネオエピトープを同時に試験した。
【図１６】部位特異的ＭＨＣ結合を有するナノ粒子へのペプチドの受動的充填により、１週間後に増大が高められたことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、様々な態様において、治療及び／または診断目的のための抗原特異的Ｔ細胞及びそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特定及び特性決定を可能にする抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化及び／または磁気的増大を提供し、さらに治療用の抗原特異的遺伝子操作Ｔ細胞の生成も提供する。磁気的豊富化とは、磁気カラムによってＴ細胞集団から抗原特異的Ｔ細胞を分離し、一方他の細胞（非同種のＴ細胞を含む）が通過できるように、自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子を使用することを指す。豊富化されたＴ細胞の増大は、磁界の存在下でも不在下でも起こり得る。増大の磁気的増強とは、自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子及び１種以上のリンパ球共刺激リガンド（同じ粒子上でも異なる粒子上でもよい）を用いたＴ細胞の増大及び／または活性化を指し、磁界の存在によってナノ粒子及びＴＣＲの磁気的クラスター化が誘導され、それによって活性化及びその後の抗原特異的Ｔ細胞分画の増大が推進される。Ｔ細胞増大を推進するための、ナノスケール人工抗原提示細胞に対する磁気的クラスター化はＵＳ２０１６／００５１６９８に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。様々な実施形態において、豊富化及び増大のプロセスは磁気的活性化を含み、このときシグナル１及びシグナル２（同じまたは異なるナノ粒子集団上にある）を有する常磁性ナノａＡＰＣは、磁界の存在下でインキュベートされる。概して、磁界の存在下でのインキュベートは、少なくとも５分間、または少なくとも１０分間、または少なくとも１５分間、または少なくとも３０分間、または少なくとも１時間、または少なくとも２時間行われる。例えば、磁界の存在下でのインキュベートは、５分〜約２時間、または約１０分〜約１時間行われ得る。
【００１２】
様々な態様において、本発明は、養子免疫療法のための抗原特異的Ｔ細胞集団を増大する方法を提供し、当該Ｔ細胞には異種Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作Ｔ細胞が含まれる。養子免疫療法はｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫細胞の活性化及び増大を伴い、得られた細胞は、がんなどの疾患治療のために患者に移行させる。例えば養子移入を通じて、抗原特異的な細胞傷害性（ＣＤ８＋）リンパ球（ＣＴＬ）の応答を誘導することは、十分な数及び出現頻度の活性化された抗原特異的ＣＴＬを（希少な前駆体細胞からの場合も含めて）比較的短時間で産生することができれば、魅力的な療法となるであろう。このアプローチは一部の実施形態においては、疾患の再発を防止する長期記憶ももたらし得る。がん免疫治療及びＣＴＬを伴う免疫療法に加え、本発明はＣＤ４＋  Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞を含めた他の免疫細胞についても有用であり、したがって、特に感染性疾患及び自己免疫疾患に広く適用可能である。さらに、本発明の実施形態に従って増大されたＴ細胞は、枯渇した表現型により近い抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により非特異的に増大されたＴ細胞とは対照的に、多機能表現型（Ｔｃｍ、Ｔｅｍ）を示す。
【００１３】
一部の実施形態において、セントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型を有するＴ細胞（それぞれＴｃｍまたはＴｅｍ）が本開示に従って生成され、次に、当該細胞にキメラ抗原受容体または異種ＴＣＲが導入されて、養子療法に用いるＣＡＲ−Ｔ細胞が生成される。このような細胞は、本明細書で説明されているプロセスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで活性化及び増大させることができる。
【００１４】
さらに他の実施形態において、ナノ粒子は、シグナル１としてＣＡＲ−Ｔ受容体（例えば、ＣＤ１９）と結合するリガンドを含む。これらの実施形態によるナノ粒子は、磁気性活性化及びその後のＣＡＲ−Ｔ細胞の増大を可能にする。
【００１５】
例えば、様々な実施形態において、本発明の実施形態に従って増大されたＣＤ８＋リンパ球は以下の表現型を含む：ＰＤ−１低発現型；セントラルメモリー表現型（ＣＤ３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ＋）；及びエフェクターメモリー表現型（ＣＤ３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ−）。一部の実施形態において、本発明の実施形態に従って豊富化及び増大されたＣＤ８＋リンパ球は、同種の抗原で充填されたａＡＰＣで刺激すると、炎症マーカー（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１β、ＧｒｚＢ、及び／またはパーフォリン）を生成する。
【００１６】
一部の態様において、本発明は、表現型的に及び／または遺伝子型的に特性決定して生産的かつ有効な抗原特異的ＴＣＲを特定することができる、多数の抗原特異的Ｔ細胞を迅速に産生する方法を提供する。例えば、当該態様において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定する方法を提供する。当該方法は、本明細書でさらに詳細に説明するように、表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子を用いて、不均一なＴ細胞集団を磁気的に豊富化させ増大させることを含む。次に、増大されたＴ細胞を、ＭＨＣペプチドリガンドを用いて（例えば、フローサイトメトリーによって）選別して、抗原特異的ＴＣＲに関して高度に豊富化されたＴ細胞集団を得る。次に、ＴＣＲレパートリーをシークエンシング及び／またはプロファイリングすることができる。増大されたＴ細胞の機能的特性決定と共に、定義された親和性を有するＴＣＲを短時間で特定することができる。このようなＴＣＲは、養子療法に用いる遺伝子操作されたＴ細胞を産生するための異種発現に有用である。
【００１７】
当該態様における本発明により、十分な数のＴ細胞をわずか数日でシークエンシング用に産生することが可能になる。例えば一部の実施形態において、磁気的に豊富化された細胞は、培地中で約２日〜最大９週間、または一部の実施形態では５日〜約２週間（例えば、約１週間）増大される。ＤＮＡシークエンシングは、パイロシークエンシング、次世代シークエンシング（ＮＧＳ；ＤＮＡまたはＲＮＡシークエンシング）、または合成によるシークエンシングを含めた任意の公知のプロセスを用いて行うことができる。概して、シークエンシングはＴＣＲアルファ及び／またはベータ鎖を含み、これにはＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子領域によって形成されるＴＣＲの相補性決定領域（例えば、ベータ受容体鎖のＣＤＲ３）が含まれる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、Ｔ細胞における、候補抗原ペプチドのライブラリーへの反応性をスクリーニングする方法を提供する。様々な実施形態において、当該方法は、常磁性ナノ粒子のカクテルを用いて、集団中の抗原特異的Ｔ細胞を磁気的に豊富化させ増大させることであって、常磁性ナノ粒子の各々が、自らの表面に、候補抗原ペプチドを提示するＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する、豊富化させ増大させることを含む。当該方法はさらに、豊富化され増大されたＴ細胞を、例えば候補ペプチドとの反応性について表現型的に評価することを含む。
【００１９】
一部の実施形態において、最初の磁気的豊富化ステップからのフロースルー分画により、連続的な磁気的豊富化が実施され、各連続的豊富化において、異なる目的抗原ペプチドまたは異なる抗原ペプチドのセットが用いられる。例えば、一部の実施形態において、少なくとも６回、または少なくとも１０回、または少なくとも２０回の連続的な磁気的豊富化が実施される。各連続的豊富化ステップで５〜約２０種の候補抗原ペプチドをスクリーニングすることができるため、当該方法で３０〜４００種の抗原を試験することが可能である。様々な実施形態において、元の試料中の抗原特異的Ｔ細胞前駆体の出現頻度を減らすことなく、少なくとも５０種の抗原が試験され、または少なくとも７５種の抗原が試験され、または少なくとも１００種の抗原が試験され、または少なくとも１５０種の抗原が試験され、または少なくとも２００種の抗原が試験され、または少なくとも３００種の抗原が試験される。
【００２０】
他の態様において、本発明は、異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞の増大方法を提供する。当該方法は、異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞を含むＴ細胞集団を、磁気的に豊富化させ磁気的に増大させることを含む。豊富化及び増大は、自らの表面に、異種のまたは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されるＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する、常磁性ナノ粒子によって行われる。一部の実施形態において、当該方法は、約１０％〜約４０％（例えば、少なくとも約２０％）の抗原特異的出現頻度で開始して、高い出現頻度及び多数の抗原特異的Ｔ細胞を約１０〜１４日以内に生成する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、磁気的豊富化及び増大を用いて抗原特異的Ｔ細胞集団を調製する方法であって、ＭＨＣペプチド複合体がＭＨＣ結合ナノ粒子の受動的充填によって調製される方法を提供する。ナノ粒子の受動的充填は、ペプチド存在下でのＭＨＣのリフォールディングと対比され、その後に抗原提示複合体の粒子表面に対する結合または付着が行われる。特定の抗原ペプチドに関与していない粒子のバッチを調製することにより、当該プロセスのワークフロー及びコストが大きく改善される。全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３４，０１３号に開示されているように、ペプチド存在下のアルカリ剥離、急速中和、及びリフォールディングによるペプチド抗原のＭＨＣ−Ｉｇに対する能動的充填によって、対応する受動的に充填されたＭＨＣ−ＩｇよりもＴ細胞染色に関して１０〜１００倍強力なリガンドが生成された。しかし、本発明の実施形態は、用いるものが受動的に充填されたＨＬＡ−Ｉｇリガンドであっても、優れた機能性を有する抗原特異的Ｔ細胞のロバストな豊富化及び増大を提供する。例えば、一部の実施形態において、ＭＨＣ結合ナノ粒子は過剰なペプチド抗原とのインキュベートにより、少なくとも約２日間受動的に充填される。
【００２２】
本発明の様々な態様において、磁気的豊富化及び増大がシグナル１（ＭＨＣペプチド複合体）及びシグナル２（例えば、抗ＣＤ２８）の両方を含有するａＡＰＣと共に記載されているが、一部の実施形態におけるａＡＰＣはシグナル１のみ含有する。自らの表面に結合したリンパ球共刺激リガンドを有する第２のナノ粒子が、回収されたＴ細胞の豊富化ステップ中または増大中に添加される。「シグナル２」（例えば、リンパ球共刺激リガンド）を別々の粒子に提供することにより、刺激のタイミング及びタイプをコントロールすることができる。また、第２のナノ粒子は常磁性であってもよく、第２のナノ粒子が常磁性の場合、ＭＨＣペプチド抗原提示複合体を提示する第１のナノ粒子と磁気的にクラスター化することが可能になる。このような実施形態において、ナノ粒子は小さいままであることが好ましく、例えば約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満であることが好ましい。したがって、一部の実施形態において、第２のナノ粒子は常磁性であり、第２のナノ粒子は豊富化ステップ（複数可）中に回収されたＴ細胞の増大中に添加される。
【００２３】
一部の実施形態において、第２のナノ粒子は常磁性ではなく、抗原特異的Ｔ細胞の磁気的豊富化中に添加される。カラムがシグナル２ナノ粒子に対し磁気的に結合することはないため、シグナル２ナノ粒子は非特異的Ｔ細胞の磁気的捕捉をもたらさない。一部の実施形態において、非常磁性ナノ粒子アプローチを連続的豊富化に使用して、各豊富化ステップにおける損失または非同種のＴ細胞の不要な保持を防止する。第２のナノ粒子は、既知のポリマー材料のいずれかを含めた任意の非常磁性材料とすることができ、これにはポリスチレンもしくはラテックスの粒子、またはＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＬＡ、またはＰＬＡ−ＰＥＧを含む粒子が含まれる。
【００２４】
さらに他の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を産生する方法であって、自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子を用いてＴ細胞集団を磁気的に豊富化させ増大させて、豊富化され増大された抗原特異的Ｔ細胞集団を調製することと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いてＴ細胞集団を形質転換することと、を含む方法を提供する。
【００２５】
様々な実施形態において、患者はがん患者であり、増大されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、任意選択で生体適合性のａＡＰＣの投与による再活性化により、当該患者に養子移入することができる。一部の実施形態において、当該方法は、ＭＨＣペプチド抗原提示複合体及びリンパ球共刺激リガンドを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む医薬組成物によってブーストして、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲ−Ｔ細胞を増大させ再活性化させることを含む。治療的用法に適したａＡＰＣは、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０５５４２に記載されている。
【００２６】
関係する実施形態において、本発明は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を増大させて生成プロセスを増強する方法を提供する。例えば、当該方法は、上述のようなＣＡＲを発現するＴ細胞集団を提供することと、自らの表面にＭＨＣペプチド抗原提示複合体を有する常磁性ナノ粒子の存在下で、Ｔ細胞集団を磁気的に豊富化させ及び／または増大させることと、を含み得る。
【００２７】
例示的なＣＡＲとしては、モノクローナル抗体に由来し、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、または他のＴＣＲシグナリングドメインに融合している短鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物が挙げられる。ＣＡＲは、例えばＣＤ１９を標的とすることにより、悪性Ｂ細胞を標的とすることができる。
【００２８】
様々な態様において、本発明は、刺激シグナルを捕捉し免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＴＬなどの抗原特異的Ｔリンパ球）に送達する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いる。ａＡＰＣ上に存在しＴ細胞活性化を支援するシグナルには、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩと関連して提示され、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する抗原ペプチドであるシグナル１；及びＴ細胞応答を調節する１種以上の共刺激リガンドであるシグナル２、が含まれる。本明細書で説明されているように、シグナル１及びシグナル２は別々の粒子上で供給することができ、シグナル２についての粒子材料選択（例えば、常磁性または非常磁性）によって、当該方法に対し追加の機能性がもたらされ得る。シグナル１リガンド及びシグナル２リガンドは、リガンドが粒子上で機能的な方向性を維持できるように、部位特異的様式でナノ粒子に化学結合していてもよい。
【００２９】
当該システムの一部の実施形態において、シグナル１は単量体、二量体、または多量体のＭＨＣコンストラクトによって付与される。二量体のコンストラクトは、一部の実施形態では免疫グロブリン重鎖配列の可変領域またはＣＨ１もしくはＣＨ２領域との融合により、創出される。ＭＨＣ複合体は、１種以上の抗原ペプチドで充填される。シグナル２は、Ｂ７．１（Ｔ細胞受容体ＣＤ２８の天然のリガンド）またはＣＤ２８の活性化抗体である。シグナル１リガンド及びシグナル２リガンドは、グリコシル基のバリエーションまたは遊離システインスルフヒドリル基の修飾を含んでもよい。
【００３０】
一部の態様において、本発明は、養子移入に用いる抗原特異的Ｔ細胞集団を調製する方法を提供する。このような態様において、Ｔ細胞は、患者または好適なドナーからのものである。ａＡＰＣは、目的の疾患（例えば、腫瘍タイプ）に共通する抗原を提示する場合もあれば、個別化に基づいて選択される１種以上の抗原を提示する場合もある。増大ステップは、一部の実施形態では約３日〜約２週間、または約５日〜約１０日間（例えば、約１週間）進めることができる。次に、豊富化及び増大のプロセスは、抗原特異的細胞を最適に増大させる（及びさらなる純度を得る）ために、１回以上繰り返すことができる。この後の豊富化及び増大のラウンドに関しては、試料中の増加した抗原特異的Ｔ細胞集団の増大を支援するために、追加のａＡＰＣをＴ細胞に添加してもよい。ある特定の実施形態において、最終ラウンド（例えば、ラウンド２、３、４、または５）の増大はｉｎ  ｖｉｖｏで生じ、このとき生体適合性のナノＡＰＣは増大されたＴ細胞集団に添加され、次に患者に注入される。
【００３１】
ある特定の実施形態において、当該方法は、抗原特異的Ｔ細胞の約１０００〜１０，０００倍の増大（またはそれ以上）を提供し、約１０８個より多い抗原特異的Ｔ細胞が、例えば約１ヵ月未満、もしくは約３週間未満、もしくは約２週間未満のスパンで、または約１週間で産生される。得られた細胞は、疾患治療のために患者に投与することができる。ａＡＰＣは、一部の実施形態において得られた抗原特異的Ｔ細胞調製物と共に、患者に投与してもよい。
【００３２】
個別化に基づいてＴ細胞抗原を選択する際に、各々が候補抗原ペプチドを提示するａＡＰＣのライブラリーを対象または患者からのＴ細胞でスクリーニングし、各ａＡＰＣペプチドに対するＴ細胞の応答を測定または定量化する。Ｔ細胞応答は、一部の実施形態では分子的に定量化することができ、例えば、サイトカイン発現または他のＴ細胞活性化の代理マーカーの発現を定量化することにより（例えば、免疫組織化学検査または発現された遺伝子の増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により）行われる。一部の実施形態において、定量化ステップは約１５時間から４８時間の間、培地中で実施される。他の実施形態において、Ｔ細胞応答は、細胞内シグナリング（例えば、Ｃａ２＋シグナリング、またはＴ細胞活性化の初期の間に生じる他のシグナリング）を検出することにより測定され、次に、約１５分〜約５時間以内（例えば、約１５分〜約２時間以内）にナノａＡＰＣを含む培地から定量化することができる。最もロバストな応答を示すペプチドが、免疫療法（一部の実施形態における、本明細書で説明されている養子免疫療法アプローチを含む）に選択される。一部の実施形態において、特にがん免疫療法に関して、患者の腫瘍が（例えば、次世代シークエンシングを用いて）遺伝子的に解析され、患者の固有の変異シグネチャー（例えば、患者の腫瘍のＤＮＡ内に、非腫瘍細胞中では生じない固有の変異を含む）から腫瘍抗原が予測される。このような予測抗原（「ネオ抗原」）を合成し、本明細書で説明されているａＡＰＣプラットフォームを用いて、患者のＴ細胞に対しスクリーニングする。ひとたび反応抗原が特定／確認されると、ａＡＰＣは、本明細書で説明されている豊富化及び増大プロトコル用に調製することができ、または一部の実施形態ではａＡＰＣを患者に直接投与することができる。
【００３３】
一部の態様において、対象または患者のＴ細胞は、（本明細書で説明されているように）各々がペプチド抗原を提示する常磁性ナノａＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングする。各々に対するＴ細胞応答を測定または定量化し、それによって患者のＴ細胞レパートリーに関して、よって対象または患者の状態に関して、有用な情報がもたらされる。例えば、変異タンパク質、過剰発現タンパク質、及び／または腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍応答の数及び独自性は、リスクを階層化するためのバイオマーカーとして使用することができ、一部の実施形態では、コンピューターに実装された分類子アルゴリズムを伴い、薬物耐性または薬物感受性に関する応答プロファイルを分類する場合もあれば、免疫療法（例えば、チェックポイント阻害療法または養子Ｔ細胞移入療法）の候補として応答プロファイルを階層化する場合もある。例えば、このようなＴ細胞応答の数または強度は、疾患進行のリスクの高さに反比例する可能性があり、及び／または患者が免疫療法（チェックポイント阻害療法、養子Ｔ細胞移入、または他のがん免疫療法が挙げられ得る）に対してなし得る応答に直接関係する可能性がある。
【００３４】
さらに他の態様及び実施形態において、患者のＴ細胞は、各々が候補ペプチド抗原を提示する常磁性ナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングされる。例えば、当該アレイまたはライブラリーは、腫瘍関連抗原を提示する場合もあれば、自己抗原を提示する場合もあれば、様々な感染性疾患に関係するＴ細胞抗原を提示する場合もある。当該アレイまたはライブラリーを患者のＴ細胞と共にＴ細胞受容体のクラスター化を促すための磁界の存在下でインキュベートすることにより、Ｔ細胞応答の存在、及び／またはこのＴ細胞応答の数もしくは強度を迅速に測定することができる。この情報は、例えば、準臨床的腫瘍、自己免疫疾患もしくは免疫疾患、または感染性疾患の診断に有用であり、また、潜在的な病原または治療Ｔ細胞、Ｔ細胞抗原を含めた疾患の生物学についての初期的な理解、そして薬物または免疫療法の対象に相当する目的のＴ細胞受容体についての理解をもたらすことができる。
【００３５】
本発明は、抗原特異的免疫細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの検出、豊富化、及び／または増大が治療的または診断的に望ましいがん及び他の疾患のための免疫療法を提供する。本発明は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、及び制御性Ｔ細胞を含めた抗原特異的Ｔ細胞に加え、対応リガンドがａＡＰＣの表面に提示されるＮＫＴ細胞またはＢ細胞についても、検出、豊富化、及び／または増大が広く適用可能である。
【００３６】
一部の実施形態において、患者はがん患者である。患者への養子移入に用いるための抗原特異的ＣＴＬのｅｘ  ｖｉｖｏでの豊富化及び増大により、ロバストな抗腫瘍免疫応答がもたらされる。当該方法に従って治療または評価され得るがんには、歴史的に免疫応答の誘発が不十分ながん、または再発率の高いがんが含まれる。例示的ながんとしては、癌腫、肉腫、及びリンパ腫を含めた様々なタイプの固形がんが挙げられる。様々な実施形態において、当該がんは、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、結腸癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腺管癌、肝癌、膵臓癌、腎臓がん、子宮内膜癌、精巣癌、胃癌、口腔粘膜異形成、ポリポーシス、頭頸部癌、浸潤性口腔癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫、移行性扁平上皮尿路癌、脳癌、神経芽腫、及び膠腫である。
【００３７】
一部の実施形態において、当該がんは、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫を含めた血液悪性腫瘍である。例えば、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、小児急性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、悪性皮膚Ｔ細胞、菌状息肉症、非ＭＦ皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、及びＴ細胞豊富型皮膚リンパ腫過形成であり得る。
【００３８】
様々な実施形態において、当該がんはステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである。一部の実施形態において、当該がんは転移性及び／または再発性である。一部の実施形態において、当該がんは症状発現前であり、本明細書で説明されているスクリーニングシステムで検出される（例えば、結腸癌、膵臓癌、または早期検出が難しい他のがん）。
【００３９】
一部の実施形態において、患者は感染性疾患を有する。感染性疾患は、患者への養子移入に用いるための抗原特異的免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋  Ｔ細胞）のｅｘ  ｖｉｖｏでの豊富化及び増大によって、生産的／防御的免疫反応が増強または提供され得る疾患であり得る。治療され得る感染性疾患としては、細菌、ウイルス、プリオン、真菌、寄生虫、蟯虫などが原因となるものが挙げられる。このような疾患としては、ＡＩＤＳ、Ｂ／Ｃ型肝炎、ＣＭＶ感染症、及び移植後リンパ球増殖症（ＰＴＬＤ）が挙げられる。例えば、ＣＭＶは、臓器移植患者に見られる最も一般的なウイルス病原体であり、骨髄移植または末梢血幹細胞移植を受けた患者における病的状態または脂肪の主原因である。これは、このような患者の免疫不全状態に起因するものであり、免疫不全状態によって、血液反応陽性患者における潜在性ウイルスの再活性化または血液反応陰性個体における日和見感染の余地が生じる。これらの治療に対する有用な代替策は、移植手順の開始前に講じる予防的な免疫治療レジメンであり、これは患者または適切なドナーに由来するウイルス特異的ＣＴＬの産生を伴うものである。ＰＴＬＤは顕著な割合の移植患者に発生し、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染に起因するものである。ＥＢＶ感染は、米国における成人人口のおよそ９０％に存在すると考えられている。活動的なウイルス複製及び感染は免疫システムによって抑制されているが、ＣＭＶの場合のように、移植療法によって免疫不全状態にある個体は制御を担うＴ細胞集団を喪失しており、ウイルスが再活性化する余地が与えられる。このことは、移植プロトコルに対する重大な障害となる。また、ＥＢＶは、様々な血液癌及び非血液癌の腫瘍促進にも関与し得る。バイオフィルムを伴う感染症、または非プランクトン状態におけるマトリックス支持型の細菌成長に関しては、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が解決に重要であり得る。バイオフィルムマトリックスに侵入する活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞を動員する抗原特異的応答は、抗生物質抵抗性の微生物感染の除去に有効であることが判明する可能性がある。
【００４０】
一部の実施形態において、患者は、患者に養子移入するための制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋）をｅｘ  ｖｉｖｏで豊富化及び増大することにより有害な免疫応答が弱められ得る自己免疫疾患を有する。治療され得る自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、尋常性天疱瘡、アジソン病、ヘルペス状皮膚炎、セリアック病、及び橋本病が挙げられる。一部の実施形態において、患者は自己免疫疾患または免疫状態（例えば、前文に記載のもの）を有する疑いがあり、本明細書で説明されているような常磁性ナノａＡＰＣのライブラリーに対するＴ細胞応答の評価は、この免疫状態の特定または確認に有用である。
【００４１】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、及び制御性Ｔ細胞などの抗原特異的Ｔ細胞の豊富化及び増大に関与する。一部の実施形態において、本発明は抗原特異的ＣＴＬの豊富化及び増大に関与する。前駆Ｔ細胞は、患者から、または好適なＨＬＡ適合ドナーから得ることができる。前駆Ｔ細胞は複数の供給源から得ることができ、これには末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、及び腫瘍が含まれる。一部の実施形態において、試料は患者からのＰＢＭＣ試料である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣ試料は目的Ｔ細胞集団（例えば、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、または制御性Ｔ細胞）の単離に使用する。一部の実施形態において、前駆Ｔ細胞は、当業者に公知のあらゆる技法（例えば、フィコール分離）を用いて、対象から収集された血液単位から得られる。例えば、個体の循環血からの前駆Ｔ細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出法によって得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞及び前駆Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含めたリンパ球を含有する。白血球搬出法は、血液試料から白血球を分離する検査法である。
【００４２】
アフェレーシスによって収集される細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、この後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れる。洗浄ステップは、当業者に公知の方法により、例えば、半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を製造業者の指示に従って使用することにより、行うことができる。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液に、例えばＣａフリーＭｇフリーＰＢＳに再懸濁させることができる。代替方法として、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁させてもよい。
【００４３】
所望に応じて、赤血球を溶解し単球を枯渇させることにより、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントを通じた遠心処理により、前駆Ｔ細胞を末梢血リンパ球から単離することができる。
【００４４】
所望に応じて、Ｔ細胞の分集団を、存在し得る他の細胞から分離することができる。例えば、特定のＴ細胞の分集団、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞を、ポジティブセレクションまたはネガティブセレクションの技法によってさらに単離することができる。他の豊富化技法としては、細胞選別及び／または負の磁性免疫付着もしくはフローサイトメトリーを介した選択が挙げられ、例えば、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する。
【００４５】
ある特定の実施形態において、白血球搬出法によって白血球を収集し、この後に市販の磁気的豊富化カラムなどの公知のプロセスを用いて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に関して豊富化する。次に、ａＡＰＣ試薬による磁気的豊富化を用いて、ＣＤ８豊富化細胞を抗原特異的Ｔ細胞に関して豊富化する。様々な実施形態において、少なくとも約１０５個、または少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個のＣＤ８豊富化細胞を、抗原特異的Ｔ細胞の豊富化のために単離する。
【００４６】
様々な実施形態において、免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞）を含む試料を、磁気的性質を有する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に接触させる。常磁性材料は、磁界に対しわずかな正の感受性を有する。常磁性材料は磁界によって誘引され、また常磁性材料は外部場が除去されると磁気的性質を保持しない。例示的な常磁性材料としては、以下に限定されないが、マグネシウム、モリブデン、リチウム、タンタル、及び酸化鉄が挙げられる。磁気的豊富化に適した常磁性ビーズは市販されている（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ、ＭＡＣＳ  ＭＩＣＲＯＢＥＡＤＳＴＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。一部の実施形態において、ａＡＰＣ粒子は鉄デキストランビーズ（例えば、デキストランでコーティングされた酸化鉄ビーズ）である。
【００４７】
抗原提示複合体は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体に提示するための抗原を有する抗原収容溝を含む。抗原提示複合体は、例えばＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子とすることができ、二量体または多量体のＭＨＣを提供するために連結または繋留させることができる。一部の実施形態において、ＭＨＣは単量体であるが、ナノ粒子上の緊密な会合が結合活性及び活性化に十分である。一部の実施形態において、ＭＨＣは二量体である。二量体のＭＨＣクラスＩコンストラクトは、免疫グロブリン重鎖配列との融合によって構築することができ、次に１つ以上のジスルフィド結合を通じて（そして会合した軽鎖により）会合する。一部の実施形態において、シグナル１複合体は、ＣＤ１ファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、及びＣＤ１ｅ）などの非古典的ＭＨＣ様分子である。ＭＨＣ多量体は、ペプチドリンカーまたは化学リンカーを通じての直接的繋留によって創出される場合もあれば、ビオチン部分を通じたストレプトアビジンとの会合を介して多量体となる場合もある。一部の実施形態において、抗原提示複合体は、免疫グロブリンとの融合を伴うＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの分子複合体であり、これは、免疫グロブリン骨格がもたらす安定性及び分泌効率に基づいて、安定性が極めて高く生成が容易である。
【００４８】
免疫グロブリン配列を有するＭＨＣクラスＩ分子複合体は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６８，４１１号で説明されている。このようなＭＨＣクラスＩ分子複合体は、立体構造的にインタクトな様式で免疫グロブリン重鎖の末端に形成することができる。抗原ペプチドが結合しているＭＨＣクラスＩ分子複合体は、抗原特異的リンパ球受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）に安定的に結合することができる。様々な実施形態において、免疫グロブリン重鎖配列は全長ではなく、Ｉｇヒンジ領域と、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインの１つ以上とを含む。Ｉｇ配列は可変領域を含んでも含まなくてもよいが、可変領域配列が存在する場合は、この可変領域は完全であっても部分的であってもよい。当該複合体は、さらに免疫グロブリン軽鎖を含むことができる。可変鎖配列が欠如しているＭＨＣクラスＩリガンド（例えば、ＨＬＡ−Ｉｇ）は、粒子との部位特異的結合に使用することができ、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０５５４２で説明されている。
【００４９】
例示的なＭＨＣクラスＩ分子複合体は、少なくとも２つの融合タンパク質を含む。第１の融合タンパク質は、第１のＭＨＣクラスＩα鎖及び第１の免疫グロブリン重鎖（またはヒンジ領域を含むその一部）を含み、第２の融合タンパク質は、第２のＭＨＣクラスＩα鎖及び第２の免疫グロブリン重鎖（またはヒンジ領域を含むその一部）を含む。第１及び第２の免疫グロブリン重鎖は会合して、２つのＭＨＣクラスＩペプチド収容溝を含むＭＨＣクラスＩ分子複合体を形成する。免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＡの重鎖であり得る。一部の実施形態において、ＩｇＧ重鎖はＭＨＣクラスＩ分子複合体の形成に使用される。多価のＭＨＣクラスＩ分子複合体が望ましい場合、ＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖をそれぞれ２価または４価の分子をもたらすために使用することができる。
【００５０】
例示的なクラスＩ分子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅが挙げられ、これらは個別に用いることも任意の組合せで用いることもできる。一部の実施形態において、抗原提示複合体はＨＬＡ−Ａ２リガンドである。本明細書においてＭＨＣという用語は、各場合においてＨＬＡで置き換えることができる。
【００５１】
例示的なＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、米国特許第６，４５８，３５４号、米国特許第６，０１５，８８４号、米国特許第６，１４０，１１３号、及び米国特許第６，４４８，０７１号で説明されており、これらは全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、少なくとも４つの融合タンパク質を含む。２つの第１の融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖（またはヒンジ領域を含むその一部）及び（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインを含む。２つの第２の融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリンκまたはλ軽鎖（またはその一部）及び（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインを含む。２つの第１の融合タンパク質及び２つの第２の融合タンパク質は会合してＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を形成する。各第１の融合タンパク質のＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメイン及び各第２の融合タンパク質のＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩペプチド収容溝を形成する。
【００５２】
免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＡの重鎖であり得る。一部の実施形態において、ＩｇＧ１重鎖は、２つの抗原収容溝を含む２価の分子複合体の形成に使用される。任意選択で、重鎖の可変領域が含まれてもよい。ＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖は、それぞれ５価または４価の分子複合体をもたらすために使用することができる。
【００５３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの免疫グロブリン鎖と細胞外ドメインとの間に挿入されるペプチドリンカーを含むことができる。リンカー配列の長さは柔軟性に応じて変動し得る。
【００５４】
一部の実施形態における免疫グロブリン配列は、ヒト化モノクローナル抗体配列である。
【００５５】
概してシグナル２はＴ細胞作用分子であり、すなわち、前駆Ｔ細胞または抗原特異的Ｔ細胞に対する生物学的影響を有する分子である。このような生物学的影響としては、例えば、前駆Ｔ細胞のＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２）、または制御性Ｔ細胞への分化；及び／またはＴ細胞の増殖が挙げられる。したがって、Ｔ細胞作用分子としては、Ｔ細胞共刺激分子、接着分子、Ｔ細胞成長因子、及び制御性Ｔ細胞誘導物質分子が挙げられる。一部の実施形態において、ａＡＰＣは少なくとも１種のこのようなリガンドを含み、任意選択で、ａＡＰＣは少なくとも２、３、または４種のこのようなリガンドを含む。
【００５６】
ある特定の実施形態において、シグナル２はＴ細胞共刺激分子である。Ｔ細胞共刺激分子は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に寄与する。このような分子としては、以下に限定されないが、ＣＤ２８（抗体を含む）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０Ｌ）、Ｂ７ｈ（Ｂ７ＲＰ−１）、ＣＤ４０、ＬＩＧＨＴに特異的に結合する分子、ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体、及びＯＸ４０に特異的に結合する抗体が挙げられる。一部の実施形態において、共刺激分子（シグナル２）は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）もしくはその一部、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、または単鎖抗体、または他の抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体もしくは抗原結合活性を有するその一部であり、または完全ヒト型抗体もしくは抗原結合活性を有するその一部である。
【００５７】
（同じまたは別々のナノ粒子上で）用いられ得る共刺激リガンドの組合せとしては、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２７及び抗ＣＤ２８／抗４１ＢＢが挙げられる。これらの共刺激リガンドの比は、増大をもたらすために変化させることができる。
【００５８】
例示的なシグナル１及びシグナル２はＷＯ２０１４／２０９８６８で説明されており、遊離スルフヒドリル（例えば、不対システイン）を有することで、定常領域を適切な化学官能性を有するナノ粒子支持体に結合できるようにするリガンドについて説明されている。
【００５９】
ナノａＡＰＣに有用な接着分子は、ナノａＡＰＣとＴ細胞またはＴ細胞前駆体との接着を媒介するために使用することができる。有用な接着分子としては、例えば、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３が挙げられる。
【００６０】
一部の実施形態において、シグナル１はペプチドＨＬＡ−Ａ２複合体によってもたらされ、シグナル２はＢ７．１  Ｉｇまたは抗ＣＤ２８によってもたらされる。例示的な抗ＣＤ２８モノクローナル抗体は９．３ｍＡｂ（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３  １７７：１６５）であり、これはある特定の実施形態ではヒト化され、及び／または完全にインタクトな抗体もしくは抗原結合断片としてビーズに結合され得る。
【００６１】
一部の実施形態は、Ｔ細胞の増殖及び／または分化に作用するＴ細胞成長因子を用いる。Ｔ細胞成長因子の例としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン）及びスーパー抗原が挙げられる。所望に応じて、サイトカインは、融合タンパク質を含む分子複合体中に存在してもよく、またはａＡＰＣによってカプセル化されてもよい。特に有用なサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ガンマインターフェロン、及びＣＸＣＬ１０が挙げられる。任意選択で、サイトカインは増大ステップ中に培地成分によってのみ提供される。
【００６２】
ナノ粒子は任意の材料から作製することができ、材料は所望の磁気的性質によって適切に選択することができ、例えば、鉄、ニッケル、コバルトなどの金属、または希土類金属の合金を含むことができる。また、常磁性材料としては、マグネシウム、モリブデン、リチウム、タンタル、及び酸化鉄も挙げられる。材料（細胞を含む）の豊富化に好適な常磁性ビーズは市販されており、これには鉄デキストランビーズ、例えばデキストランでコーティングされた酸化鉄ビーズが含まれる。磁気的性質を必要としない本発明の態様において、ナノ粒子は、セルロース、セラミック、ガラス、ナイロン、ポリスチレン、ゴム、プラスチック、またはラテックスなどの非金属または有機（例えば、ポリマー）材料で作製されてもよい。ナノ粒子を調製するための例示的な材料は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはＰＬＡ及びこれらのコポリマーであり、このような実施形態に関して用いることができる。ポリマー及びコポリマーを含めて用いられ得る他の材料には、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９に記載されているものが含まれる。
【００６３】
一部の実施形態において、磁性粒子は生体適合性である。これは、豊富化され増大された細胞と共にａＡＰＣが患者に送達されることになる実施形態において特に重要である。例えば、一部の実施形態において、磁性粒子は生体適合性の鉄デキストラン常磁性ビーズである。
【００６４】
様々な実施形態において、粒子のサイズ（例えば、平均直径）は約１０〜約５００ｎｍ以内、または約２０〜約２００ｎｍ以内である。特に、ａＡＰＣが患者に送達されることになる実施形態において、マイクロスケールａＡＰＣは、リンパ管によって運搬されない程度に大きく、また皮下注射した場合、注射部位にとどまる。静脈内注射した場合、ａＡＰＣは毛細血管床にとどまる。事実上、マイクロスケールビーズの輸送が不十分であることにより、最適な免疫療法のためにａＡＰＣが輸送されるべきであるような研究は排除されている。ナノａＡＰＣの輸送及び体内分布は、マイクロスケールａＡＰＣよりも効率性が高い可能性がある。例えば、ａＡＰＣが最も有効であり得る２つの有望な部位は、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞が存在するリンパ節と、腫瘍そのものである。直径が約５０〜約２００ｎｍのナノ粒子は、リンパ管によって取り込まれ、リンパ節まで輸送され、Ｔ細胞の大きなプールにアクセスできるようになり得る。参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９で説明されているように、ナノａＡＰＣの皮下注射によって、対照または静脈内注射したビーズの場合よりも腫瘍成長が小さくなるという結果が得られた。
【００６５】
磁気的クラスター化に関しては、ナノ粒子のサイズは１０〜２５０ｎｍの範囲、または一部の実施形態では２０〜１００ｎｍの範囲である。細胞−ナノ粒子界面における受容体−リガンド相互作用については十分に分かっていない。しかし、ナノ粒子結合及び細胞活性化は、膜空間組織化に感受性を有し（これはＴ細胞活性化中に特に重要である）、磁界は、クラスター結合したナノ粒子の活性化増強を操作するために使用され得る。例えば、Ｔ細胞活性化によって、ナノスケールＴＣＲクラスター化の持続的増強状態が誘導され、ナノ粒子は大きな粒子とは異なる形でこのクラスター化に感受性を有する。
【００６６】
さらに、ナノ粒子のＴＣＲクラスターとの相互作用は、受容体トリガーの増強に活用することができる。Ｔ細胞活性化はシグナリングタンパク質の集合によって媒介され、直径数百ナノメータ−の「シグナリングクラスター」は、最初にＴ細胞−ＡＰＣ接触部位の周辺で形成され、内部へ移動する。本明細書で説明されているように、外部磁界を使用して、抗原特異的Ｔ細胞（希少なナイーブ細胞を含む）を豊富化させ、ＴＣＲに結合した磁性ナノａＡＰＣの集合を推進させることができ、それによってＴＣＲクラスターの集合及びナイーブＴ細胞の活性化増強がもたらされる。磁界は、常磁性粒子に対し適切に強い力を発揮することができるが、他の点では生物学的に不活性であることから、粒子の挙動を制御する強力なツールとなる。常磁性ナノａＡＰＣに結合しているＴ細胞は、外部印加磁界の存在下で活性化される。ナノａＡＰＣはそれ自体が磁化しており、磁界源にも磁界内の付近のナノ粒子にも誘引され、ビーズ及びＴＣＲ集合体がａＡＰＣ媒介の活性化をブーストするように誘導する。
【００６７】
ナノａＡＰＣはより多くのＴＣＲに結合し、以前活性化していたＴＣＲがナイーブＴ細胞よりも大きく活性化するように誘導する。加えて、外部磁界の印加によってナイーブ細胞上でのナノａＡＰＣ集合が誘導され、Ｔ細胞の増殖がｉｎ  ｖｉｔｒｏとその後のｉｎ  ｖｉｖｏの養子移入の両方で増強される。重要なことには、黒色腫養子免疫療法モデルにおいて、磁界中でナノａＡＰＣにより活性化されたＴ細胞は腫瘍拒絶を媒介する。したがって、印加磁界の使用によって、他の方法では刺激に対する応答性が不十分なナイーブＴ細胞集団の活性化が可能になる。ナイーブＴ細胞は、高い増殖能力と長期にわたる強いＴ細胞応答をもたらす優れた能力により、がん免疫療法に関し分化が進んだサブタイプよりも有効であることが示されているため、このことは免疫療法の重要な特徴である。したがって、ナノａＡＰＣは、磁界によるＴ細胞の活性強化のために使用して、ナイーブな前駆体から増大された抗原特異的Ｔ細胞の収量や活性を高め、例えば感染症、がん、もしくは自己免疫疾患を有する患者のための細胞療法を改善することができ、または免疫抑制性の患者に予防的保護をもたらすことができる。
【００６８】
分子は、吸着により、または共有結合を含めた直接的化学結合により、ナノ粒子に直接付着していてもよい。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６を参照。分子自体は、求核基、離脱基、または求電子基を含めた様々な化学官能基を用いて直接的に活性化することができる。活性化を行う官能基としては、アルキル及びハロゲン化アルキル、アミン、スルフヒドリル、アルデヒド、不飽和結合、ヒドラジド、イソシアナート、イソチオシアナート、ケトン、及び化学結合を活性化することが知られている他の基が挙げられる。代替方法として、小分子カップリング試薬の使用により、小分子をナノ粒子に結合させることができる。カップリング試薬の非限定的な例としては、カルボジイミド、マレイミド、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビスクロロエチルアミン、二官能性アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、無水物などが挙げられる。他の実施形態において、当技術分野において周知のように、ビオチン−ストレプトアビジン連結またはカップリングなどの親和性結合を通じて、分子をナノ粒子に結合させることができる。例えば、ストレプトアビジンは、共有結合または非共有結合によってナノ粒子に結合することができ、ビオチン化分子は、当技術分野において周知の方法を用いて合成することができる。
【００６９】
ナノ粒子に対する共有結合が企図されている場合、支持体は、典型的にはリンカーを通じての好適な反応物質との共有結合に利用できる、１種以上の化学部分または官能基を含有するポリマーでコーティングすることができる。例えば、アミノ酸ポリマーは、適切なリンカーを介して分子を共有結合させるのに利用できる、リジンのεアミノ基などの基を有することができる。本開示では、第２のコーティングをナノ粒子に適用してこのような官能基を提供することも企図されている。
【００７０】
活性化の化学作用は、分子とナノ粒子の表面との特定の安定した結合を可能にするために使用され得る。タンパク質と官能基との付着に使用することができる方法は多数存在する。例えば、一般的なクロスリンカーであるグルタルアルデヒドを使用して、２ステッププロセスでタンパク質アミン基をアミノ化したナノ粒子表面に付着させることができる。得られた連結は加水分解的に安定である。他の方法としては、タンパク質上のアミンと反応するｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含有するクロスリンカー、アミン−、スルフヒドリル−、またはヒスチジン−含有タンパク質と反応する活性ハロゲンを含有するクロスリンカー、アミンまたはスルフヒドリル基と反応するエポキシドを含有するクロスリンカー、マレイミド基とスルフィドとの間の結合、及び還元的アミノ化後のペンダント糖部分の過ヨウ素酸酸化によるタンパク質アルデヒド基形成、の使用が挙げられる。
【００７１】
一部の実施形態において、シグナル１及び／またはシグナル２のリガンドは、免疫グロブリン配列のＦｃ領域において遺伝子操作された遊離システインを通じて粒子と化学的に結合している。
【００７２】
同じまたは異なる粒子上で同時に使用された場合の特定のリガンドの比は、抗原または共刺激リガンド提示においてナノ粒子の有効性を高めるように変動させることができる。例えば、ナノ粒子は、ＨＬＡ−Ａ２  Ｉｇ及び抗ＣＤ２８（または他のシグナル２リガンド）と様々な比で結合させることができ、例えば、約３０：１、約２５：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約０．５：１、約０．３：１、約０．２：１、約０．１：１、または約０．０３：１で結合させることができる。一部の実施形態において、当該比は２：１〜１：２である。支持体に結合させるタンパク質の総量は、例えば、約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌの粒子であり得る。サイトカイン放出及び成長などのエフェクター機能の要件は、シグナル１とシグナル２との間でＴ細胞活性化及び分化の場合よりも異なり得るため、これらの機能は別々に決定してもよい。
【００７３】
ナノ粒子の構成は、不規則な形状から球状に至るまで、及び／またはでこぼこしたもしくは不規則な表面から滑らかな表面に至るまで、様々であり得る。非球状のａＡＰＣは、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０８６５００で説明されている。
【００７４】
ある特定の実施形態において、ａＡＰＣは、５０〜１００ｎｍの範囲（例えば、およそ８５ｎｍ）の常磁性粒子であり、ＰＤＩ（サイズ分布）は０．２未満、または一部の実施形態では０．１未満である。ａＡＰＣの表面電荷は、０〜−１０ｍＶ、例えば−２〜−６ｍＶとすることができる。ａＡＰＣは１粒子当たり１０〜１２０リガンド、例えば１粒子当たり約２５〜約１００のリガンドを有することができ、遊離システインを通じて粒子に結合しているリガンドは免疫グロブリン配列のＦｃ領域に導入される。粒子は、約１：１の比のＨＬＡ二量体：抗ＣＤ２８を含有することができ、これらは同じまたは異なる集団の粒子上に存在することができる。ナノ粒子は、同種のＴ細胞を強力に増大する一方で、非同種のＴＣＲに対しては、ペプチド抗原の受動的充填によっても刺激を示さない。粒子は、凍結乾燥形態で少なくとも２年または３年間安定である。
【００７５】
ａＡＰＣはＴ細胞に抗原を提示するため、ナイーブＴ細胞からのものを含めた抗原特異的Ｔ細胞の豊富化及び増大の両方に使用することができる。ペプチド抗原は、例えば、がん、がんのタイプ、感染性疾患などの所望の療法に基づいて選択される。一部の実施形態において、当該方法はがん患者の治療のために行われ、患者に対し特異的なネオ抗原が特定され、ａＡＰＣ充填のために合成される。一部の実施形態において、３種から１０種の間のネオ抗原が腫瘍の遺伝子解析（例えば、核酸シークエンシング）を通じて、その後に予測的バイオインフォマティクスを通じて特定される。本明細書で示されるように、当該方法において、いくつかの抗原を共に（別々のａＡＰＣ上で）、機能の損失なく用いることができる。一部の実施形態において、抗原は天然、非変異のがん抗原であり、その多くが公知である。この個別化に基づいた抗原特定のプロセスは、以下でさらに詳細に説明する。
【００７６】
様々な抗原を抗原提示複合体に結合させることができる。抗原の性質は、使用する抗原提示複合体のタイプに依存する。例えば、ペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩのペプチド収容溝に結合させることができる。非古典的ＭＨＣ様分子は、リン脂質、複合糖質などの非ペプチド抗原（例えば、ミコール酸及びリポアラビノマンナンなどの細菌の膜成分）の提示に使用することができる。免疫応答を誘導可能な任意のペプチドは、抗原提示複合体に結合させることができる。抗原ペプチドとしては、腫瘍関連抗原、自己抗原、同種抗原、及び感染病原体の抗原が挙げられる。
【００７７】
「腫瘍関連抗原」には、由来する腫瘍によって排他的に発現される固有の腫瘍抗原、多くの腫瘍で発現されるが正常成人組織では発現されない共通腫瘍抗原（腫瘍胎児性抗原）、及び腫瘍が生じた正常な組織によっても発現される組織特異的抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、例えば、胚抗原、異常な翻訳後修飾による抗原、分化抗原、変異した腫瘍遺伝子または腫瘍抑制物質の産物、融合タンパク質、またはオンコウイルスタンパク質とすることができる。
【００７８】
様々な腫瘍関連抗原が当技術分野において公知であり、その多くが市販されている。腫瘍胎児性抗原及び胚抗原としては、がん胎児性抗原及びアルファ−フェトプロテイン（通常、高度発現は発達中の胚に限られるが、それぞれ肝臓及び結腸の腫瘍でしばしば高度に発現）、ＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、乳癌、及び膠腫で発現）、胎盤アルカリホスファターゼシアリル−ルイスＸ（腺癌で発現）、ＣＡ−１２５及びＣＡ−１９（胃腸、肝臓、及び婦人科系腫瘍で発現）、ＴＡＧ−７２（結腸直腸腫瘍で発現）、上皮糖タンパク質２（多くの癌腫で発現）、膵臓腫瘍胎児性抗原、５Ｔ４（胃癌で発現）、アルファフェトプロテイン受容体（複数の腫瘍タイプ、特に乳房腫瘍で発現）、及びＭ２Ａ（生殖細胞新生物で発現）が挙げられる。
【００７９】
腫瘍関連分化抗原としては、チロシナーゼ（黒色腫で発現）及び特定の表面免疫グロブリン（リンパ腫で発現）が挙げられる。
【００８０】
変異した腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子産物としては、いずれも多くの腫瘍タイプで発現されるＲａｓ及びｐ５３、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（乳癌及び婦人科系がんで発現）、ＥＧＦ−Ｒ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、網膜芽腫遺伝子産物、ｍｙｃ（肺癌に関連）、ｒａｓ、ｐ５３、乳癌に関連する非変異型、ＭＡＧＥ−１、及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、肺癌、及び他のがんに関連）が挙げられる。融合タンパク質としては、慢性骨髄性白血病で発現されるＢＣＲ−ＡＢＬが挙げられる。オンコウイルスタンパク質としては、ＨＰＶ１６型、Ｅ６、及びＥ７が挙げられ、これらは子宮頸癌で見られる。
【００８１】
組織特異的抗原としては、メラノトランスフェリン及びＭＵＣ１（膵臓癌及び乳癌で発現）；ＣＤ１０（一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原、すなわちＣＡＬＬＡとして以前から知られている）または表面免疫グロブリン（Ｂ細胞白血病及びリンパ腫で発現）；ＩＬ−２受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫で発現）；前立腺特異的抗原及び前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺癌で発現）；ＧＰ１００、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ−１、チロシナーゼ、ｇｐ７５／褐色、ＢＡＧＥ、及びＳ−１００（黒色腫で発現）；サイトケラチン（様々な癌腫で発現）；ならびにＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７（リンパ腫で発現）が挙げられる。
【００８２】
また、腫瘍関連抗原としては、変質した糖脂質抗原及び糖タンパク質抗原、例えばノイラミン酸含有スフィンゴ糖脂質（例えば、黒色腫及び一部の脳腫瘍で発現するＧＭ２及びＧＤ２）；血液型抗体、特にＴ及びシアル酸付加Ｔｎ抗原（癌腫で異常に発現し得る）；ならびにＣＡ−１２５及びＣＡ−１９−９などのムチン（卵巣癌に発現）またはグリコシル化不十分ＭＵＣ−１（乳癌及び膵臓癌に発現）も挙げられる。
【００８３】
例えば、一部の実施形態において、治療対象の患者は膀胱癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、及びＭＵＣ−１抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は脳癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、及びＣＭＶ抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は乳癌を有し、ＭＵＣ−１、サバイビン、ＷＴ−１、ＨＥＲ−２、及びＣＥＡ抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は子宮頸癌を有し、ＨＰＶ抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は結腸直腸癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１、ＭＵＣ−１、及びＣＥＡ抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は食道癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は頭頸部癌を有し、ＨＰＶ抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は腎臓癌または肝癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は肺癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、及びＭＵＣ−１抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は黒色腫を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＲＴ−１、及びＧＰ−１００の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は卵巣癌を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、及びメソテリン抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は前立腺癌を有し、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、及びＰＳＭＡ抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は肉腫を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者はリンパ腫を有し、ＥＢＶ抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者は多発骨髄腫を有し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、及びＳＯＸ２抗原の１種以上を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。一部の実施形態において、治療対象の患者はリンパ腫を有し、ＥＢＶ抗原を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。
【００８４】
一部の実施形態において、治療対象の患者は急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群を有し、サバイビン、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ＲＨＡＭＭ及びＰＲ３抗原の１種以上（１、２、３、４、または５種を含む）を用いてＴ細胞が豊富化され増大される。
【００８５】
「感染病原体の抗原」としては、原虫、細菌、真菌（単細胞及び多細胞の両方）、ウイルス、プリオン、細胞内寄生虫、蟯虫、及び免疫応答を誘導し得る他の感染病原体の成分が挙げられる。
【００８６】
細菌抗原としては、グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性細菌、嫌気性菌、例えばＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅファミリーの生物、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｅ、Ｃａｐｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の生物、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｖｉｎｅａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ならびにＴｒｏｐｈｅｒｙｍａの抗原が挙げられる。
【００８７】
原虫感染病原体の抗原としては、マラリア原虫、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種、及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種の抗原が挙げられる。
【００８８】
真菌抗原としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ目の生物、黒色真菌症（ｃｈｏｒｏｍｙｃｏｓｉｓ）及び足菌腫を誘導する生物ならびにＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の生物、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、ならびにＭａｌａｓｓｅｚｉａの抗原が挙げられる。
【００８９】
ウイルスペプチド抗原としては、以下に限定されないが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ＲＳウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、及びＣＭＶの抗原が挙げられる。特に有用なウイルスペプチド抗原としては、ＨＩＶタンパク質、例えばＨＩＶ  ｇａｇタンパク質（以下に限定されないが、膜アンカー（ＭＡ）タンパク質、コアカプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質が挙げられる）、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）、Ｅ型肝炎タンパク質（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原などが挙げられる。
【００９０】
抗原ペプチドを含めた抗原は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６８，４１１号で説明されているように、能動的または受動的に、抗原提示複合体の抗原収容溝に結合させることができる。任意選択で、抗原ペプチドはペプチド収容溝に共有結合していてもよい。
【００９１】
所望に応じて、ペプチド繋留を使用して、抗原ペプチドをペプチド収容溝に連結させることができる。例えば、複数のクラスＩ  ＭＨＣ分子の結晶学的解析により、β２Ｍのアミノ末端は、ＭＨＣペプチド収容溝に存在する抗原ペプチドのカルボキシル末端からの距離がおよそ２０．５オングストロームと、非常に近接していることが示されている。したがって、長さがおよそ１３アミノ酸の比較的短いリンカー配列を使用して、ペプチドをβ２Ｍのアミノ末端に繋留させることができる。配列が適切であれば、当該ペプチドはＭＨＣ結合溝に結合する（米国特許第６，２６８，４１１号を参照）。
【００９２】
ａＡＰＣに結合している抗原特異的Ｔ細胞は、磁気的豊富化を用いて、または他の細胞選別もしくは細胞捕捉の技法を用いて、結合していない細胞から分離することができる。この目的に使用され得る他のプロセスとしては、フローサイトメトリー及び他のクロマトグラフィー手段（例えば、抗原提示複合体または本明細書で説明されている他のリガンドの固定を伴うもの）が挙げられる。一実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞は、所望の抗原特異的Ｔ細胞の正の選択に十分な期間、ビーズと共にインキュベートすることによって、例えば抗原提示複合体／抗ＣＤ２８結合常磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））と共にインキュベートすることによって、単離（または豊富化）される。
【００９３】
一部の実施形態において、Ｔ細胞集団において以前活性であったＴ細胞を、例えばＣＤ４４に対する抗体を用いて実質的に枯渇させ、集団をナイーブＴ細胞に関しては豊富化されたままにしておくことができる。ナノａＡＰＣとこの集団との結合は、ナイーブＴ細胞を実質的に活性化させるのではなく、ナイーブ細胞の精製を可能にすると考えられる。
【００９４】
さらに他の実施形態において、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＢ細胞（または他の免疫エフェクター細胞）を標的とするリガンドを常磁性ナノ粒子に組み込み、これらの細胞集団を磁気的に豊富化させ、任意選択で、以下で説明するように培地中で増大させることができる。追加の免疫エフェクター細胞リガンドは、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９で説明されている。
【００９５】
理論に拘泥することは望まないが、不要な細胞を除去することで、サイトカイン及び成長シグナルの競合が低減され、抑制的な細胞が除去される場合もあれば、単に、目的細胞を増大させるための物理的スペースがより多くもたらされる場合もある。
【００９６】
次に、豊富化されたＴ細胞を培地中で増大させ、任意選択である期間の間磁石に近づけて磁界を生成し、ａＡＰＣに結合した細胞のＴ細胞受容体クラスター化を増強する。ナノａＡＰＣを用いた培地への刺激は、可変量の時間の間、例えば、約５分〜約７２時間（例えば、約０．５、２、６、１２、３６、４８、または７２時間、さらに持続的な刺激）行うことができる。高度に豊富化された抗原特異的Ｔ細胞培地における刺激時間の効果を評価することができる。抗原特異的Ｔ細胞を培地に戻し、当技術分野において公知であるように、細胞成長、増殖速度、様々なエフェクター機能などについて解析することができる。このような条件は、所望の抗原特異的Ｔ細胞応答に応じて変動し得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、培地中で約２日〜最大３週間、または一部の実施形態では約５日〜約２週間、もしくは約５日〜約１０日増大される。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、培地中で約１週間増大され、その後に第２の豊富化及び増大ステップが任意選択で実施される。一部の実施形態において、２、３、４、または５ラウンドの豊富化及び増大が実施される。
【００９７】
この１ラウンド以上の豊富化及び増大（例えば、約７日）の後、試料における抗原特異的Ｔ細胞の成分は、少なくとも約１％のＴ細胞となり、または一部の実施形態では、試料中少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、もしくは少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約２５％のＴ細胞となる。さらに、これらのＴ細胞は概して活性化状態を示す。患者から単離された元の試料から、様々な実施形態における抗原特異的Ｔ細胞は、（約７日で）約１００倍〜約１０，０００倍、例えば少なくとも約１００倍、または少なくとも約２００倍増大される。２週間後、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１０００倍、または様々な実施形態では少なくとも約２０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、もしくは少なくとも約５，０００倍増大される。一部の実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞は、２週間後に５０００倍超または１０，０００倍超増大される。この１ラウンド以上の豊富化及び増大（１週間または２週間）の後、少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個、または少なくとも約１０８個、または少なくとも約１０９個の抗原特異的Ｔ細胞が得られる。
【００９８】
ナノａＡＰＣがＴ細胞前駆体の増大、活性化、及び分化に及ぼす効果は、当業者に公知のあらゆる方法でアッセイすることができる。増殖アッセイを用いて、培地中のＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞、または制御性Ｔ細胞の増加を、各タイプのＴ細胞に特異的なマーカーの検出によって測定することにより、機能を迅速に決定することができる。このようなマーカーは、当技術分野において公知である。ＣＴＬは、クロムリリースアッセイを用いたサイトカイン生成または細胞溶解活性のアッセイによって検出することができる。
【００９９】
適切なエフェクター機能を用いて抗原特異的Ｔ細胞を産生することに加えて、抗原特異的Ｔ細胞の有効性に関する別のパラメーターは、Ｔ細胞が病態部位に行き来することを可能にするホーミング受容体の発現である（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，７０８−１２，１９９９；Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ＆  Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，９２−９７，２０００）。
【０１００】
例えば、エフェクターＣＴＬの有効性は、以下の表現型のホーミング受容体と結びつけられている：ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、及びＣＣＲ７−。したがって、ナノａＡＰＣに誘導及び／または増大されるＣＴＬ集団は、これらのホーミング受容体の発現に関して特性決定することができる。ホーミング受容体の発現は、最初の刺激条件に結びつけられた複合形質である。これは、共刺激複合体及びサイトカイン環境の両方によって制御されるものと推定される。関与している重要なサイトカインの１つは、ＩＬ−１２である（Ｓａｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。以下で論じるように、ナノａＡＰＣは、個別に別々の成分（例えば、Ｔ細胞エフェクター分子及び抗原提示複合体）を変化させて、生物学的結果パラメーターを最適化する可能性をもたらす。任意選択で、抗原特異的Ｔ細胞集団中のホーミング受容体プロファイルに作用するようにＩＬ−１２などのサイトカインを最初の誘導培地に含めることができる。
【０１０１】
任意選択で、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞集団は、同じナノａＡＰＣまたは第２のナノａＡＰＣのいずれかと共に、第１の細胞集団中の抗原特異的Ｔ細胞よりも数が増加した抗原特異的Ｔ細胞を含む第２の細胞集団の形成に十分な期間の間、インキュベートを継続することができる。典型的には、このようなインキュベートは３〜２１日間、好ましくは７〜１０日間行われる。
【０１０２】
好適なインキュベート条件（培地、温度など）には、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の培養に使用されるものや、ＤＣまたは人工抗原提示細胞を用いて抗原特異的Ｔ細胞の形成を誘導するために用いる当技術分野で公知のものが含まれる。例えば、Ｌａｔｏｕｃｈｅ  ＆  Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４０５−０９，Ａｐｒｉｌ  ２０００；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，５９２１−３０，１９９７；Ｍａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，１４３−４８，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００２を参照。以下の具体的な例も参照されたい。
【０１０３】
増殖シグナルの大きさを評価するために、抗原特異的Ｔ細胞集団をＣＦＳＥで標識し、細胞分裂の速度及び数について解析することができる。Ｔ細胞は、抗原が結合しているナノａＡＰＣを用いた１〜２ラウンドの刺激後にＣＦＳＥで標識することができる。この時点では、抗原特異的Ｔ細胞は、総細胞集団の２〜１０％に相当するはずである。抗原特異的Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の分裂の速度及び数の後にＣＦＳＥの喪失となるように、抗原特異的染色を用いて検出することができる。刺激後の様々な時間（例えば、１２、２４、３６、４８、及び７２時間）に、抗原提示複合体及びＣＦＳＥの両方に関して細胞を解析することができる。抗原が結合していないナノａＡＰＣを用いた刺激を使用して、増殖のベースラインレベルを決定することができる。任意選択で、３Ｈ−チミジンの取込みを監視することによって増殖を検出することができる。
【０１０４】
ナノａＡＰＣを用いて得られた抗原特異的Ｔ細胞は、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、リンパ内投与、及び腫瘍内投与を含めた任意の適切な経路によって患者に投与することができる。患者には、ヒト患者及び獣医学患者の両方が含まれる。
【０１０５】
抗原特異的制御性Ｔ細胞は、免疫抑制効果を達成するため、例えば、移植患者における移植片対宿主病の治療もしくは予防のために、または自己免疫疾患（例えば、上に記載した疾患またはアレルギー）の治療もしくは予防のために使用することができる。制御性Ｔ細胞の使用は、例えば、ＵＳ２００３／００４９６９６、ＵＳ２００２／００９０７２４、ＵＳ２００２／００９０３５７、ＵＳ２００２／００３４５００、及びＵＳ２００３／００６４０６７で開示されており、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
これらの方法に従って調製した抗原特異的Ｔ細胞は、約５〜１０×１０６ＣＴＬ／ｋｇ体重（約７×１０８ＣＴＬ／治療）〜最大約３．３×１０９ＣＴＬ／ｋｇ体重（約６×１０９ＣＴＬ／治療）の範囲の用量で患者に投与することができる（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３３，１０３８−４４，１９９５；Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２，１６３７−４４，２０００）。他の実施形態において、患者は、用量当たり約１０３、約５×１０３、約１０４、約５×１０４、約１０５、約５×１０５、約１０６、約５×１０６、約１０７、約５×１０７、約１０８、約５×１０８、約１０９、約５×１０９、または約１０１０細胞の静脈内投与を受けることができる。さらに他の実施形態において、患者は、例えば、２００μｌのボーラス中約８×１０６または約１２×１０６細胞の結節内注射を受けることができる。任意選択で細胞と共に投与されるナノＡＰＣの用量としては、用量当たり少なくとも約１０３、約５×１０３、約１０４、約５×１０４、約１０５、約５×１０５、約１０６、約５×１０６、約１０７、約５×１０７、約１０８、約５×１０８、約１０９、約５×１０９、約１０１０、約５×１０１０、約１０１１、約５×１０１１、または約１０１２ナノａＡＰＣが挙げられる。
【０１０７】
例示的な実施形態において、豊富化及び増大のプロセスは、患者に由来する同じ試料に対し、繰り返し実施される。Ｔ細胞集団は０日目に豊富化され活性化され、次に好適な期間（例えば、約３〜２０日）の間培地中に置く。その後、ナノａＡＰＣを使用して、目的抗原に対し再び豊富化させ増大させ、さらに集団の純度を高め、さらなるＴ細胞増大のために追加の刺激をもたらすことができる。ナノａＡＰＣ及び豊富化されたＴ細胞の混合物は、この後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで適切な期間の間再び培養してもよく、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる増大及び治療効果のために直ちに患者に再注入してもよい。豊富化及び増大は、所望の増大が達成されるまで何回でも繰り返すことができる。
【０１０８】
一部の実施形態において、ナノａＡＰＣのカクテル（各ナノａＡＰＣが異なる抗原に対するもの）は、複数の抗原に対する抗原Ｔ細胞を同時に豊富化させ増大させるためにすぐに使用することができる。この実施形態において、複数の異なるナノａＡＰＣのバッチ（各々が異なるＭＨＣペプチドを有する）は、各目的抗原に対するＴ細胞を同時に豊富化させるために合わせて使用することになる。得られたＴ細胞プールは豊富化され、これらの抗原の各々に対し活性化されることになり、よって複数の抗原に対する応答が同時に培養され得る。これら複数の抗原は単一の治療介入に関係する場合が考えられ、例えば、単一の腫瘍上に存在する複数の抗原である可能性がある。
【０１０９】
一部の実施形態において、患者は、１種以上のチェックポイント阻害剤を用いた免疫療法を受け、その次に養子移入により抗原特異的Ｔ細胞を投与されるか、または患者の腫瘍の遺伝子解析を通じてｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定されたネオ抗原を有するａＡＰＣの直接投与が行われる。様々な実施形態において、チェックポイント阻害剤（複数可）はＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の１つ以上を標的とし、これにはこのような標的に対する抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその一部、またはそのヒト化もしくは完全ヒト型のバージョンが含まれ得る。一部の実施形態において、チェックポイント阻害剤療法はイピリムマブまたはＫｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）を含む。
【０１１０】
一部の実施形態において、患者は約１〜５ラウンドの養子免疫療法を受ける（例えば、１、２、３、４、または５ラウンド）。一部の実施形態において、養子免疫療法の各投与は、チェックポイント阻害剤療法のラウンドと同時に、またはその後に（例えば、約１日〜約１週間後）行われる。一部の実施形態において、養子免疫療法は、チェックポイント阻害剤投与の約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、または約１週間後に提供される。
【０１１１】
さらに他の実施形態において、患者に対する養子移入またはナノａＡＰＣの直接注入は、ビーズ上のリガンドとして、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の１つ以上を標的とするリガンドを含む。このような実施形態において、当該方法は、可溶性のチェックポイント阻害剤療法の投与における、ある特定の副作用を回避することができる。
【０１１２】
一部の態様において、本発明は個別化されたがん免疫療法を提供する。当該方法は、患者が反応する抗原を特定するためのａＡＰＣを使用し、その次に適切なペプチドが充填されたａＡＰＣを患者に投与するか、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの抗原特異的Ｔ細胞の豊富化及び増大を行うことで遂行される。
【０１１３】
ゲノムワイドシークエンシングは、がん生物学への理解を劇的に変えるものであった。がんのシークエンシングにより、多くのヒトのがんの発生に関与する分子的プロセスに関し、重要なデータがもたらされた。３つの主な細胞プロセス、（１）細胞運命、（２）細胞生存、及び（３）ゲノム維持の調節経路に関与する重要遺伝子において、推進変異（ｄｒｉｖｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が特定された。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，１５４６−５８（２０１３）。
【０１１４】
また、ゲノムワイドシークエンシングはがん免疫療法に対するアプローチに革命を起こす可能性も有する。シークエンシングデータからは、がん免疫療法に関し、共通の標的だけではなく個別化された標的についての情報ももたらされ得る。原理上、変異タンパク質は免疫システムに対し異質であり、また推定上の腫瘍特異的抗原である。実際に、シークエンシングの試みにより、千単位とは言えないとしても百単位の関連免疫標的が定義されている。限られた研究からは、このようなネオエピトープに対するＴ細胞応答は、がん患者に見いだされる場合もあればがんワクチンによって誘導される場合もあることが示されている。しかし、特定のがんに対するこのような応答の出現頻度や、このような応答がどの程度患者間で共有されるのかについては、よく分かっていない。腫瘍特異的免疫応答に対する理解が限定的である主な理由の１つは、有望な免疫学的関連標的を検証するための現状のアプローチが煩雑であり、多くの時間を要することである。
【０１１５】
したがって一部の態様において、本発明は、がんのネオ抗原に対するＴ細胞応答検出のための高スループットプラットフォームに基づいたアプローチを提供する。このアプローチは、がん抗原に対するＴ細胞応答が出現頻度の低いものであっても検出するために本明細書で説明されているａＡＰＣプラットフォームを使用する。このような応答についての出現頻度や個人間の可変性を理解することには、がんワクチンや個別化されたがん免疫療法を設計する上で重要な意義があると考えられる。
【０１１６】
中枢トレランスが自己タンパク質に対するＴ細胞応答を抑止しても、発がん性変異はＴ細胞応答を形成し得るネオエピトープを誘導する。全エクソーム解析に由来する変異一覧により、このようなネオエピトープを特定するための出発点がもたらされる。ＨＬＡ結合予測アルゴリズム（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ６０９４（２００９）を用いて、各々のがんが７〜１０個までのネオエピトープを有し得ることが予測された。ある同様のアプローチでは数百個の腫瘍ネオエピトープが推定された。しかし、このようなアルゴリズムはＴ細胞応答の予測の精度が低い可能性があり、予測されたＨＬＡ結合エピトープのうち、ＨＬＡと関連して結合することが予想されるものはわずか１０％である（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  Ｃ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３０，３０９−１８（２０１０））。したがって、予測されたエピトープは、このような有望なネオエピトープに対するＴ細胞応答が存在するかについて検証されなければならない。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、ナノａＡＰＣシステムは、様々ながんにおける、または特定の患者のがんにおけるＴ細胞応答を誘導するネオエピトープをスクリーニングするために使用される。がんは、例えば全エクソーム解析により、遺伝子解析することができる。例えば、２４例の進行した腺癌のパネルにおいて、腫瘍当たり平均約５０種の変異が特定された。解析したおよそ２０，０００例の遺伝子のうち、１３２７例が少なくとも１種の変異を有し、１４８例が２つ以上の変異を有し、９７４例のミスセンス変異が特定され、さらに少数の欠失及び挿入が見られた。
【０１１８】
変異タンパク質における重複する９つのアミノ酸ウインドウから、候補ペプチドのリストを作成することができる。変異したアミノ酸を含有する全９つのＡＡウインドウと、各タンパク質からの２つの非変異「対照」とが選択されることになる。これらの候補ペプチドは、正味ＭＨＣ及び安定化マトリックス法（ＳＭＭ）を含めたＭＨＣ結合予測アルゴリズムのコンセンサスを用いて、ＭＨＣ結合について計算的に評価されることになる。ナノａＡＰＣ及びＭＨＣ結合アルゴリズムが、主にＨＬＡ−Ａ２アレル向けに開発されている。コンセンサス予測の感受性カットオフは、扱いやすい数の変異を含有するペプチド（約５００）及び非変異対照ペプチド（約５０）が特定されるまで調整することができる。
【０１１９】
次にペプチドライブラリーを合成する。ＭＨＣ（例えば、Ａ２）を有するａＡＰＣをマルチウェルプレートに入れ、ペプチドで受動的充填する。ＣＤ８  Ｔ細胞は、Ａ２陽性の健康なドナー及びＡ２陽性のがん患者両方のＰＢＭＣから単離することができる。この後、豊富化ステップに向け、単離したＴ細胞を充填したａＡＰＣと共にインキュベートする。インキュベートの次に、プレートまたは培養フラスコを磁界に置き、ａＡＰＣに結合していない無関係なＴ細胞を含有する上清を除去する。ａＡＰＣに結合している残りのＴ細胞を培養し、７〜２１日間増大させる。ａＡＰＣを用いた再刺激及び細胞内ＩＦＮγ蛍光染色を用いて抗原特異的増大を評価する。
【０１２０】
一部の実施形態において、患者のＴ細胞をナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングし、結果を診断または予後判定の目的で使用する。例えば、変異したタンパク質、過剰発現したタンパク質、及び／または他の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍応答の数及び特定は、リスクを階層化するためのバイオマーカーとして使用することができる。例えば、このようなＴ細胞応答の数は、疾患進行のリスクまたは化学療法に対する耐性もしくは非応答性のリスクに反比例し得る。他の実施形態において、患者のＴ細胞をナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングし、Ｔ細胞応答の存在、またはこれらのＴ細胞の応答の数もしくは強度から、患者が準臨床的腫瘍を有することが特定され、及び／または腫瘍生物学の初期的な理解がもたらされる。
【０１２１】
一部の実施形態において、患者または対象のＴ細胞を、各々が異なる候補ペプチド抗原を提示する常磁性ａＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングする。このスクリーニングによって、対象または患者のＴ細胞レパートリーに関する豊富な情報がもたらされる可能性があり、またスクリーニングの結果は診断または予後判定の目的に有用である。例えば、変異したタンパク質、過剰発現したタンパク質、及び／または他の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍応答の数及び特定は、リスクを階層化するための、免疫療法の有効性を監視するための、または免疫療法治療の結果を予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。さらに、このようなＴ細胞応答の数または強度は、疾患進行のリスクに反比例する場合もあれば、化学療法に対する耐性もしくは非応答性のリスクを予測する場合もある。他の実施形態において、対象または患者のＴ細胞を、各々が候補ペプチド抗原を提示するナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングし、Ｔ細胞応答の存在、またはこれらのＴ細胞の応答の数もしくは強度から、例えば自己免疫疾患を特定することにより、または患者が準臨床的腫瘍を有することを特定することにより、患者の健康状態に関する情報がもたらされる。これらの実施形態において、当該プロセスは潜在的な疾患状態を特定するだけではなく、疾患生物学の初期的な理解をもたらす。
【０１２２】
例示的な実施形態において、患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群などの血液癌を有し、一部の実施形態において、当該患者は同種幹細胞移植後に再発している。ＨＬＡが一致するドナーからのＴ細胞供給源を用いることで、抗原特異的Ｔ細胞は、磁気カラムと、任意選択でサバイビン、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ＲＨＡＭＭ、及びＰＲ３から選択される２〜５種の腫瘍関連ペプチド抗原を提示する常磁性ナノａＡＰＣとを用いて、磁気的に豊富化され活性化される。抗原は、部位特異的結合を通じて同じまたは異なる粒子集団上にシグナル１及びシグナル２を提示する調製されたナノａＡＰＣに受動的に充填される。
【０１２３】
磁気的活性化は、少なくとも５分〜５時間または５分〜２時間発生し、次に培地中で少なくとも５日間、一部の実施形態においては最大２週間または最大３週間、増大が行われ得る。得られたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、表現型的に特性決定して以下を確認することができる：ＰＤ−１低発現型；セントラルメモリー表現型（ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ６２Ｌ＋）；及びエフェクターメモリー表現型（ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ６２Ｌ−）。増大されたＴ細胞は、抗腫瘍応答を確立するために、１回〜約４回患者に投与することができる。
【０１２４】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の例示的な実施例に基づいて当業者には明らかなものとなる。
【実施例】
【０１２５】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化のために、デキストランコーティング酸化鉄ナノ粒子などの常磁性粒子上に構築することができる。図１。シグナル１及びシグナル２の存在によってＴ細胞の活性化及び増大がもたらされる。常磁性粒子を使用することにより、シグナル１及び／またはシグナル２のクラスター化が磁界によって誘導される。図３及び図６Ａ。
【０１２６】
別々のナノ粒子上にある共刺激シグナル（シグナル２）の提示を制御することにより、共刺激シグナルのタイプを制御し変化させることができる。図２。常磁性粒子の使用時に磁界が存在することでＴ細胞の増殖が増強されるが、この効果は、シグナル１とは別のナノ粒子上に存在するシグナル２の量に依存する。図４。得られたＴ細胞は、シグナル１及び２が同じ粒子上に存在しても異なる粒子上に存在しても、質的に同じである。図５。
【０１２７】
抗原特異的Ｔ細胞の最も大きな増大は、別々の（常磁性または非常磁性）ビーズ上にシグナル１及びシグナル２の両方が存在するときに観察され、両方の粒子が常磁性であるときに最も大きな増大が観察された。図６。
【０１２８】
粒子サイズの増加につれて、Ｓ１＋Ｓ２アプローチの有効性が減少する。それに対し、両方のシグナルを含有するナノ粒子は反対の効果を示す。したがって、シグナル１及びシグナル２に別々のナノ粒子を使用する場合、粒子は２００ｎｍ以下、例えば１００ｎｍまたは３０ｎｍにとどめることが好ましく、このような粒子が高レベルの増大を支援した。図７。
【０１２９】
各シグナルを別々のビーズに設置することにより、共刺激のタイプを変化させて活性化プロファイルをカスタマイズすることができる。例えば、５０／５０の抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２７を含有するシグナル２のビーズ、ならびに２５／７５の抗ＣＤ２８及び抗４１ＢＢを含有するシグナル２のビーズは、高レベルの増大を支援した。図８。
【０１３０】
磁気的豊富化及び増大によって、所望の抗原特異性を有する新規のＴＣＲの迅速な特定につながる。図９、図１０。豊富化され増大されたＴ細胞は、ＴＣＲシークエンシングに用いる純度の高い抗原特異的Ｔ細胞集団を産生するように選別された四量体または二量体であり得る。これは、非常に短時間で十分なＴＣＲシークエンシングを行う上で十分な材料を特定及び産生するための迅速な方法である。
【０１３１】
磁気的豊富化により、高出現頻度の生産的なクローン型がもたらされた。図１１、図１２。これらの結果は、出現頻度がより均等に分散しているＣａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．の結果（図１１Ａ）と好対照をなすものである。クローンは、Ｖ及びＪのペアリングの出現頻度について評価することができる（図１３、図１４）。
【０１３２】
磁気的豊富化及び増大により、Ｔ細胞集団における、ネオ抗原を含めた候補抗原に対する反応性をスクリーニングすることが可能になる。スクリーニングは、バッチ方式で行うことができる。図１５。例えば、機能的に活性のヒトネオ抗原特異的ＣＤ−８＋  Ｔ細胞は、健康なドナーから特定された。磁気的豊富化及び増大のプロセスを用いて、ＭＣＦ−７乳癌からの３個のネオエピトープを同時に試験した。したがって、ポリクローナルＣＤ８  Ｔ細胞集団の応答は、変異した抗原からの予測ネオエピトープに対して検出することができる。このようなＴ細胞集団は典型的には非常に希少であり、四量体解析などの従来の技法では検出できないことが多い。
【０１３３】
連続的豊富化によって、このプロセスがより効率的になる。連続的豊富化を用いて、磁気的豊富化ステップにおける陰性の細胞集団（所望の抗原に対し陰性の結合していないＴ細胞のみを含有する）を、今度は別の抗原ペプチドセットで充填した新規のナノ粒子と共にインキュベートする。このプロセスは、各実行において１０〜１５種の異なるペプチド充填ナノ粒子と共に、複数回（例えば、少なくとも６回）繰り返すことができる。これにより、最低９０種の異なる抗原について単一の試料を調べる連続的なＥ＋Ｅアプローチが可能になる。
【０１３４】
図１６は、部位特異的ＭＨＣ結合を有するナノ粒子へのペプチドの受動的充填により、１週間後に増大が高められたことを示している。ＣＤ８＋  Ｔ細胞をナイーブＣ５７ＢＬ／６脾臓から単離し、１０７細胞当たり２０ｕＬの粒子にてＴｒｐ２ペプチドで充填したナノ粒子（Ｋｂ  Ｉｇ二量体／ａＣＤ２８）と共に、４℃で１時間インキュベートした。次に、磁気カラムを用いてナノ粒子に結合した細胞を単離し、９６ウェルプレートで７日間培養した。７日目に細胞を採取し、カウントし、抗ＣＤ８抗体及びＴｒｐ２／ｋｂ五量体で染色した。対照に関しては、Ｋｂ五量体及び無関係なペプチドを使用した。
【０１３５】
分子のＦＣ末端における遺伝子操作された遊離システインを介し部位特異的方式でシグナル１及びシグナル２が共有結合するナノ粒子の設計及び構築は、ナノ粒子を非常に安定したものにし、その貯蔵寿命を長くする。これによって、大規模な未充填バッチ（後から目的ペプチドで受動的に充填する）の生成が可能になる。例えば、充填プロセス中に、未充填の粒子を過剰なペプチドと共に４℃で最低３日間インキュベートする。その後に、磁気カラム上の充填されたナノ粒子を洗浄することにより、結合していない遊離ペプチドを除去する。常磁性粒子はカラム上に保持され、遊離ペプチドは洗い流される。激しい洗浄（３〜５回）の後、磁石を除去し、粒子を溶離する。この受動的充填アプローチは、システムに高い抗原的柔軟性を導入し、製造コストを低減し、カスタムメイドの患者専用の複数抗原／粒子カクテル（５〜１０種の抗原）を生成するためのバッチ処理アプローチを可能にし、ネオエピトープ特定のための高スループットスクリーニング（＞５０個のエピトープ）を可能にする。
【０１３６】
現状のパフォーマンスにおいては、およそ１：１の比のシグナル１及びシグナル２（抗ＣＤ２８）ならびに粒子当たりの高タンパク質密度（８０〜２００のリガンド）が使用されている。粒子は、５０〜１５０ｎｍの範囲にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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