(57)【要約】  本発明は我が国の天然資源であるシャシャンボ実抽出物を用いて毒性及び副作用無しで安全に使われることができる憂鬱症予防及び改善用健康機能性食品組成物及び薬学組成物を提供する。【選択図】図１０
2019536798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）実抽出物を有効成分として含む憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品組成物。
【請求項２】
前記シャシャンボ抽出物は、水、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、またはこれらの混合物で抽出されたもののうちから選択されるいずれか１つに可溶な抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品組成物。
【請求項３】
請求項１の健康機能食品組成物が０．０１〜９９．９重量％の量で含まれることを特徴とする、憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品。
【請求項４】
健康機能性食品は、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、顆粒剤、及び液剤のうちから選択されるいずれか１つの形態に製造されることを特徴とする、請求項３に記載の憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）抽出物を有効成分として含む憂鬱症予防及び改善用健康機能性食品組成物または薬学的組成物に関し、より具体的には、天然原料であるシャシャンボ実抽出物を用いて毒性及び副作用無しで安全に使われることができる憂鬱症予防及び改善用薬学組成物及び健康食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
憂鬱症は意欲低下と憂鬱感を主要症状にして多様な認知及び精神身体的症状を起こして日常機能の低下をもたらす疾患をいう。憂鬱障害は感情、思考、身体状態、そして行動などに変化を起こす深刻な疾患で、個人の全般的な生に影響を与える。憂鬱症は一時的な憂鬱感とは異なり、個人的な弱さの表現であるか、意志でなくすことができるのでない。
【０００３】
憂鬱障害はごくありふれた精神疾患の１つで、国家に従う比較で有病率の差をたくさん見せる。米国やヨーロッパ、ニュージーランドなどは主要憂鬱障害終生有病率が１０．１％〜１６．６％で、高い水準を示すことに比べて、韓国や中国をはじめとする非西欧圏国家では５％以下の低い水準の有病率を見せる。
【０００４】
２０１１年保健福祉部の精神疾患状態疫学調査では、主要憂鬱障害終生有病率が６．７％、一年有病率が３．１％であって、２００６年疫学研究に比べて多少高い水準の有病率を見せるが、西欧圏国家に比べて低い水準であり、非西欧圏国家とは似たような水準であるか、または多少高い水準であった。憂鬱症の明らかな原因に対してはまだ明確でないが、他の精神疾患のように多様な生化学的、遺伝的、そして環境的要因が憂鬱症を引き起こすことができる。憂鬱症は他の疾患とは異なり、専門家の適切な治療を受ければ相当な好転を期待することができ、以前の正常な生活に戻ることが可能である。
【０００５】
一方、シャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）はツツジ目の双子葉被子植物で、海辺の山地で育つ。高さが１〜３ｍで、小さな枝は灰褐色乃至灰色であり、ほとんど毛がない。葉は行き違い、厚くて、楕円形または長い楕円形で、厚い革みたいな質感を有する。縁に小歯があり、後面の下に小さな腺点があり、花は６月に咲いて、紅白色が回り、下に垂れ下がる総状花序に腫状の花が１０余個ずつ付いて、苞が残っている。実は漿果で、丸くて白粉で覆われて、直径６ｍｍ位で、１０月に実って食べることができる。
【０００６】
最近、現代人の生活水準が向上するにつれて、副作用がほとんどなく、自然で採取可能な天然資源に対して関心が高まっている。特に、人体に必要な営養素を優秀に含有するか、または疾病の予防と回復に特異に助けになる天然機能性物質を含有した健康食品に対する研究が活発に進行されるにつれて、シャシャンボまたその機能に対する調査が実施されているが、今のところは栄養学的価値や生理活性機能性に対する関連情報が不足した実状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生理活性機能に対しては確実に知られていない天然資源であるシャシャンボの機能性食品組成物及び薬学組成物を提供するために、シャシャンボ実から有効成分を抽出して毒性及び副作用無しで安全に使われることができるシャシャンボ実抽出物を有効成分として含む憂鬱症の予防及び改善用健康機能性食品組成物及び薬学組成物を提供ことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は我が国の天然資源であるシャシャンボ実抽出物を用いて毒性及び副作用無しで安全に使われることができる憂鬱症予防及び改善用健康機能性食品組成物及び薬学組成物を提供する。前記の目的を達成するために、本発明はシャシャンボ実抽出物を有効成分として含む憂鬱症の予防及び改善用健康機能性食品組成物及び薬学組成物を提供する。
【０００９】
憂鬱症予防及び改善機能を有する薬学組成物及び機能性食品組成物の抽出方法はシャシャンボの実に蒸溜水を加え、還流抽出機を用いて１００℃で温度が上がった後、３時間の間加熱、抽出した。
【００１０】
前記水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、またはこれらの混合溶媒のうち、いずれか１つで可溶な抽出物を有効成分として含む抽出物は０．０１〜９９．９重量％の量で含む憂鬱症予防及び改善用健康機能性食品組成物及び薬学組成物を提供する。
【００１１】
前記組成物は、錠剤及びカプセル剤、軟質カプセル剤、顆粒剤、液剤、または飲料のうちから選択された１つ以上の形態に製造できる。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明のシャシャンボ実抽出物は、四肢を全く動かない不動時間を減少させて抗憂鬱効果が比較群であるエスシタロプラムシュウ酸塩より優れることを確認しており、動物実験でシャシャンボ実抽出物、エスシタロプラムシュウ酸塩を投与した時、シャシャンボ実抽出物投与群で対照群よりノルエピネフリン（ノルアドレナリン）の濃度を増加させる傾向性を示すことにより、シャシャンボ実抽出物はノルエピネフリン（ノルアドレナリン）濃度を増加させて抗憂鬱製剤としての効果があるということを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】シャシャンボ実抽出物模式図を示す。
【図２】シャシャンボ実の分画物模式図を示す。
【図３】本発明のシャシャンボ実抽出物を６日間投与した白ねずみに対する強制水泳試験法において、不動時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｔｉｍｅ）、水泳時間（ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｔｉｍｅ）、這い上がった時間（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。
【図４】本発明のシャシャンボ実抽出物を投与したマウスに対する血液で神経伝達物質の増加有無において、対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。
【図５】本発明のシャシャンボ実抽出物がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）に及ぼす細胞毒性程度を示すグラフを示す。
【図６】過酸化水素処理を通じての酸化的ストレス誘導に対するシャシャンボ実抽出物の神経細胞保護効果を示したグラフを示す。
【図７】精神的ストレスホルモンであるコルチコステロン（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）処理を通じての細胞内ストレス誘発及びシャシャンボ実抽出物の濃度に従う神経細胞保護効果を示したグラフを示す。
【図８】本発明のシャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を濃度依存的に増加させる効果を示したグラフを示す。
【図９】本発明のシャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を濃度依存的に抑制する効果を示したグラフを示す。
【図１０】本発明のシャシャンボ実抽出物の溶媒分画物が５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を抑制する効果を示したグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．シャシャンボ実の熱水抽出物の製造
図１は、シャシャンボ実抽出物を得る過程を示す。シャシャンボ実２．０ｋｇに蒸溜水３０Ｌを加え、還流抽出機を用いて１００℃で温度が上がった後、３時間の間加熱、抽出した。得られた抽出物を減圧フィルタ後、減圧濃縮して１０７．０２ｇの濃縮液を得た。
【００１５】
２．シャシャンボ実の極性溶媒、非極性溶媒可溶分画物製造
図２に図示したように、前記シャシャンボ実の熱水抽出物から系統分画を実施してシャシャンボ実抽出物の分画物（１５ｇ）を製造するステップを具体的に説明すると、次の通りである。濃縮液を水で十分に懸濁して２倍体積のヘキサンで１次溶媒移行を３回遂行して水層とヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）  ｅｘｔ．（４１．８ｍｇ）に分離した。また、水層を２倍体積のクロロホルムで２次溶媒移行を３回遂行してＣＨＣｌ３ｅｘｔ．（７９．９ｍｇ）を確保した。エチルアセテートで３次溶媒移行を３回遂行してＥｔＯＡｃ  ｅｘｔ．（３１２．４ｍｇ）を確保した。最後に、ｎ−ブタノールで３次溶媒移行を３回遂行してｎ−ＢｕＯＨ  ｅｘｔ．（５ｇ）を確保した。
【００１６】
３．実験動物及び飼育
シャシャンボ抽出物の抗憂鬱効果測定のための実験動物として生後６週齢の雄ＩＣＲマウスを（株）サムタコ（ＳＡＭＴＡＣＯ、Ｋｏｒｅａ）から購入して動物飼育室で一定の条件（温度：２２±２℃、湿度：５０±５％、明暗：１２時間ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ  ｃｙｃｌｅ）で一週間の間適応させた後、使用した。
【００１７】
４．シャシャンボ抽出物を用いた抗憂鬱動物行動実験
雄ＩＣＲマウスに本発明のシャシャンボ抽出物を経口投与し、比較群には抗憂鬱剤に使われるエスシタロプラムシュウ酸塩を経口投与した。これらは実験によって６日投与した。
【００１８】
薬物投与前の予備実験（ｐｒｅ−ｓｗｉｍ）で、円筒状の水槽（直径２０ｃｍ、高さ４０ｃｍ）に２５℃内外の水道水をシリンダー底から１５ｃｍまで注いだ後、マウスを取り入れて１５分間強制的に水泳させ、水から掬い上げて乾いた手拭いで拭いて、飼育箱子に返した。薬物投与６日後に本試験（ｐｏｓｔ−ｓｗｉｍ）を施行し、シリンダーにマウスを入れて６分間強制水泳を施行しながらビデオ撮影を行った。記録された映像で最初１分間を除いて、残りの５分間の動物の行動を３種類に分類して分析したが、動物が顔を含んだ上体の一部分のみ水面の上に現したまま、若干の動きのみ表し、水の上に浮いている行動（不動姿勢、ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）、シリンダーの周囲を水平方向に動きながら前足と後足をばた足をする行動（水泳、ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）、壁に向けて前足を水の外に蹴り上げる多少激烈に動きながら壁を引っかく行動（這い上がり、ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）に区分して各々の時間を測定した。
【００１９】
図３は、本発明のシャシャンボ実抽出物を６日間投与した白ねずみに対する強制水泳試験法において、不動時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｔｉｍｅ）、水泳時間（ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｔｉｍｅ）、這い上がった時間（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。図３に図示したように、各薬物を６日投与後、強制水泳させる間、不動時間は対照群（２４５．４８±４．０５秒）と比較して見る時、比較群であるエスシタロプラムシュウ酸塩は１６９．６５±７．１５秒、シャシャンボ実抽出物（１００及び２００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）は各々１１４．９８±９．２６秒、１１８．２９±６．３５秒で有意性ある減少を見せた（Ｐ＜０．０１  ａｎｄ  Ｐ＜０．００１）。そして、水泳時間は対照群（５１．８２±３．３８秒）と比較して見る時、比較群であるエスシタロプラムシュウ酸塩は１２８．１６±６．６５秒、シャシャンボ実抽出物（１００及び２００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）は各々１７７．０７±９．７９秒、１７２．２３±６．７２秒で有意性あるように増加を見せた（Ｐ＜０．０１  ａｎｄ  Ｐ＜０．００１）。
【００２０】
前述したように、本発明のシャシャンボ実抽出物は四肢を全く動かない不動時間を減少させるので、抗憂鬱効果が比較群であるエスシタロプラムシュウ酸塩より優れることを確認した。
【００２１】
５．シャシャンボ抽出物を用いた血漿内のノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ、ＮＥ）及びコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＣＯＲ）測定
正常な状態で憂鬱症と関連した神経伝達物質であるＮＥとストレスホルモンであるＣＯＲの濃度変化に及ぼす影響は、各薬物６日投与後、マウスから血漿（ｐｌａｓｍａ）を分離してＡｂｎｏｖａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを使用して製造社の指示に従って測定した。
【００２２】
図４は、本発明のシャシャンボ実抽出物を投与したマウスに対する血液で神経伝達物質の増加有無において、対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。正常な状態でＮＥとＣＯＲの変動に及ぼすシャシャンボ実抽出物の抗憂鬱効能を検証した。憂鬱な気分が感じられる理由は脳の神経細胞で外部に分泌されるセロトニンまたはノルエピネフリン（ノルアドレナリン）の量が少ないためである。シャシャンボ実抽出物を通じてのノルエピネフリン神経伝達物質の増加有無を確認した結果、図４の（Ａ）に図示したように、正常動物にシャシャンボ実抽出物（１００及び２００ｍｇ／ｋｇ）、エスシタロプラムシュウ酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した時、シャシャンボ実抽出物１００及び２００ｍｇ／ｋｇ投与群で対照群よりＮＥの濃度を増加させる傾向性を見せた。したがって、シャシャンボ実抽出物はＮＥ濃度を増加させるので、抗憂鬱製剤としての効能があるということを意味する。
【００２３】
また、図４の（Ｂ）に図示したように、シャシャンボ実抽出物（１００及び２００ｍｇ／ｋｇ）投与群はストレスホルモンであるコルチコステロン数値が対照群と比較して見る時、有意性あるように減少しており、対照群に比べて比較群であるエスシタロプラムシュウ酸塩は減少傾向は見せたが、有意性はなかった。したがって、ストレスを感じる時、コルチコステロンの数値が増加すると知られているが、シャシャンボ実抽出物がストレス性憂鬱症モデルでも抗憂鬱効果を示すことを示唆する。
【００２４】
６．シャシャンボ抽出物を用いた脳神経細胞でストレス緩和活性確認
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌ（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）を１％  ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃｓ／ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓと１０％ＦＢＳを含有したＭＥＭ培地で培養し、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞数が１０５ｃｅｌｌ／ｍｌになるようにシードした後、２４時間培養した。
【００２５】
シャシャンボ実抽出物が神経細胞に及ぼす細胞毒性を確認するために濃度別に処理した。シャシャンボの実抽出物処理２４時間後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙで細胞生存率を測定した。
【００２６】
図５は、本発明のシャシャンボ実抽出物がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）に及ぼす細胞毒性程度を示すグラフを示す。
【００２７】
細胞毒性程度はシャシャンボ実抽出物の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）をＭＴＴを用いて測定して使用濃度の最大安全範囲を設定した。使用細胞株はＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞としてシャシャンボ実熱水抽出物濃度１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌで処理して細胞毒性確認を遂行し、１、３、１０、３０μｇ／ｍｌではｃｏｎｔｒｏｌ（０μｇ／ｍｌ）と比較して有意的な差異が発見されなかった。しかしながら、１００μｇ／ｍｌ濃度ではｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意的な差は見せなかったが、細胞生存度が減少した。本実験の結果で３０μｇ／ｍｌ内で実験を遂行した。
【００２８】
シャシャンボ実抽出物が酸化的ストレスによる神経細胞死滅に及ぼす効果を確認するために、まず、過酸化水素使用濃度決定のために、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を濃度別に２４時間処理して細胞毒性を確認して５０−６０％細胞毒性を見せる濃度を決定して実験に使用した。シャシャンボ実抽出物の神経細胞保護効果確認実験は、実験細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに分株して２４時間培養した後、シャシャンボの実抽出物を２時間処理し、１０μＭ  Ｈ２Ｏ２を処理して２４時間培養させた。２４時間後、細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）はＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いて測定した。
【００２９】
図６は、過酸化水素処理を通じての酸化的ストレス誘導に対するシャシャンボ実抽出物の神経細胞保護効果を示すグラフを示す。図６Ａは過酸化水素使用濃度決定のために使用細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＨ２Ｏ２濃度別に処理して細胞毒性を確認した結果、１０μＭではｃｏｎｔｒｏｌ（０μｇ／ｍｌ）と比較して細胞生存度が５０−６０％有意的細胞毒性を見せるので、実験に使用した。図６Ｂは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）１０  μＭと共に、シャシャンボ実の熱水抽出物を処理した時、濃度０．３、１、３、１０μｇ／ｍｌで各々５４．７５±２．８５％、５２．１８±５．０５％、６９．０１±１．４８％、８０．２４±１．１４％で細胞生存度が有意的に増加したことを確認した（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）。
【００３０】
シャシャンボ抽出物の精神的ストレスに対する抵抗活性を細胞水準で確認するためにストレスホルモンであるコルチコステロンが誘発する神経細胞損傷に保護効果を確認するために実験した。コルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）を濃度別に２４時間処理して細胞毒性を確認して５０−６０％細胞毒性を見せる濃度を決定して実験に使用した。シャシャンボ実抽出物の保護効果実験は、実験細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を９６  ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに分株して２４時間培養した後、シャシャンボ実抽出物を２時間処理し、１ｍＭコルチコステロンを処理して２４時間培養させた。２４時間後、細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）はＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いて測定した。
【００３１】
図７は、精神的ストレスホルモンであるＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ処理を通じての細胞内のストレス誘発及びシャシャンボ実抽出物の濃度に従う神経細胞保護効果を示したグラフを示す。ストレスホルモンであるコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｎｅ）の使用濃度を決定するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ濃度５０、１００、３００、５００、１０００μＭで処理して細胞毒性確認を遂行しており、３００、５００、１０００  μＭ  ではｃｏｎｔｒｏｌ（０μｇ／ｍｌ）と比較して細胞生存度が減少しており、５０−６０％細胞毒性を見せる１ｍＭを実験に使用した。図７Ｂは、ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅと共に、シャシャンボ実の熱水抽出物を処理した時、濃度０．３、１、３、１０μｇ／ｍｌで各々６３．２８±０．４２％、６６．５５±２．２１％、８６．９１±４．２７％、８９．０８±５．４７％で細胞生存度が有意的に増加したことを確認した（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）。
【００３２】
７．シャシャンボ抽出物を用いた５−ＨＴ１Ａ受容体または５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で細胞内Ｃａ２＋活性測定
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌ）をＡＴＣＣから購入し、培養液（ＲＰＭＩ  １６４０、ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  １０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ１００ＩＵ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ  １００μｇ／ｍｌ）を使用して９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｗａｌｌ／ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を分株した後、３７℃、５％  ＣＯ２  インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２４時間培養した。セロトニン１Ａ受容体（５−ＨＴ１Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）またはセロトニン２Ａ受容体（５−ＨＴ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）各々ｃＤＮＡをプラスミドトランスフェクション試薬であるｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて４８時間の間細胞内一時的に発現させた細胞を実験に使用した。
【００３３】
蛍光染色の前に細胞はＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光染料でＦｕｒａ−２／ＡＭを最終５μＭ濃度で処理して３７℃、５％  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで光が遮断された状態で６０分間反応させた。６０分後、ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで１回洗浄した後、細胞内カルシウム濃度測定はｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＨＴＳ）ｓｙｓｔｅｍを用いて３４０／３８０ｎｍの光が選択的に露出するようにした後、デジタル蛍光分析機により分析された３４０／３８０ｎｍ  ｒａｔｉｏ値を測定した。細胞内に存在するＦｕｒａ−２／ＡＭはＣａ２＋と結合した状態では３４０ｎｍでｅｘｃｉｔａｔｉｏｎされ、結合しない状態では３８０ｎｍでｅｘｃｉｔａｔｉｏｎされるので、３４０／３８０ｎｍ  ｒａｔｉｏ値の増加は細胞内Ｃａ２＋と結合したｆｕｒａ−２／ＡＭが多くなったという意味となる。
【００３４】
セロトニン（５−ＨＴ）１００μＭを処理して得た値をｃｏｎｔｒｏｌに使用し、シャシャンボ実抽出物を１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ濃度で１分間前処理した後、５−ＨＴ  １００μＭを処理して細胞内カルシウム量の変化を確認した。参考に、図８と図９で各項目のエラーバーの上に表記された数字は実験に使われた細胞の数を意味する。
【００３５】
図８は、本発明のシャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を濃度依存的に増加させる効果を示したグラフを示す。シャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ１Ａ受容体でセロトニンにより誘導される細胞内Ｃａ２＋の増加でセロトニンと比較して細胞内Ｃａ２＋を活性化させて５−ＨＴ１Ａ受容体の部分的な效顯剤作用剤として効果を確認した。図８に示したように、セロトニン１００μＭを処理したｃｏｎｔｒｏｌよりシャシャンボ実抽出物１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌで各々１０．３１±６．８６％、４７．４５±１．４５％、６２．７３±２．３７％、６７．０８±１．３６％、８８．０９±３．５０％で５−ＨＴ１Ａ受容体−特異的セロトニンにより誘導された細胞内Ｃａ２＋が濃度依存的に活性かされることを確認した。
【００３６】
８．シャシャンボの溶媒分画物を用いた５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子発現された細胞株で細胞内Ｃａ２＋活性測定
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌ）をＡＴＣＣから購入し、培養液（ＲＰＭＩ  １６４０、ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  １０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ  １００ＩＵ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ  １００μｇ／ｍｌ）を使用して９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｗａｌｌ／ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を分株した後、３７℃、５％ＣＯ２  インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２４時間培養した。セロトニン２Ａ受容体（５−ＨＴ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）各々ｃＤＮＡをプラスミドトランスフェクション試薬であるｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて４８時間の間細胞内に一時的に発現させた細胞を実験に使用した。
【００３７】
蛍光染色の前に細胞はＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光染料でＦｕｒａ−２／ＡＭを最終５μＭ濃度で処理して３７℃、５％  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで光が遮断された状態で６０分間反応させた。６０分後、ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで１回洗浄した後、細胞内カルシウム濃度測定はｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＨＴＳ）ｓｙｓｔｅｍを用いて３４０／３８０ｎｍの光が選択的に露出するようにした後、デジタル蛍光分析機により分析された３４０／３８０ｎｍ  ｒａｔｉｏ値を測定した。細胞内に存在するＦｕｒａ−２／ＡＭはＣａ２＋と結合した状態では３４０ｎｍでｅｘｃｉｔａｔｉｏｎされ、結合しない状態では３８０ｎｍでｅｘｃｉｔａｔｉｏｎされるので、３４０／３８０ｎｍ  ｒａｔｉｏ値の増加は細胞内Ｃａ２＋と結合したｆｕｒａ−２／ＡＭが多くなったという意味となる。
【００３８】
セロトニン（５−ＨＴ）１００μＭを処理して得た値をｃｏｎｔｒｏｌに使用し、シャシャンボ実抽出物のヘキサン、クロロホルム、エチルアセテート、ブタノール及び水分画物を１０μｇ／ｍｌ濃度で１分間前処理した後、５−ＨＴ  １００μＭを処理して細胞内カルシウム量の変化を確認した。
【００３９】
図９は、本発明のシャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を濃度依存的に抑制する効果を示したグラフを示す。図９によると、シャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ２Ａ受容体でセロトニンにより誘導される細胞内Ｃａ２＋の増加でセロトニンと比較して細胞内Ｃａ２＋を濃度依存的に抑制されることを確認することができた。図９に示したように、セロトニン１００μＭを処理したｃｏｎｔｒｏｌよりシャシャンボ実抽出物１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌで各々２９．１５±０．８１％、３７．５３±０．４９％、４２．０９±０．９２％、５４．３９±０．５５％、５９．０３±０．４８％で５−ＨＴ２Ａ受容体−特異的セロトニンが誘導する細胞内Ｃａ２＋濃度を抑制した。
【００４０】
図１０は、本発明のシャシャンボ実抽出物の溶媒分画物が５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を抑制する効果を示したグラフを示す。図１０で、各項目のエラーバーの上に表記された数字は実験に使われた細胞の数を意味する。図１０によると、シャシャンボ実抽出物の溶媒分画物に対する５−ＨＴ２Ａ受容体でセロトニンにより誘導される細胞内Ｃａ２＋の増加でセロトニンと比較して細胞内Ｃａ２＋を濃度抑制活性に対する結果を示す。図１０に示したように、シャシャンボ実抽出物の溶媒分画物のヘキサン、クロロホルム、エチルアセテート、ブタノール及び水分画物のうち、エチルアセテート及びブタノール分画物が５−ＨＴ２Ａ受容体でセロトニンにより誘導される細胞内Ｃａ２＋増加に対する阻害活性が最も高かった。
【００４１】
９．シャシャンボ実抽出物を用いた薬剤または健康食品製造
シャシャンボ実抽出物を有効成分とする免疫増強用薬学的組成物または健康食品組成物は錠剤及びカプセル剤、軟質カプセル剤、顆粒剤、液剤形態に製造できる。更に他の適切な実施形態によると、前記組成物は飲料添加剤に製造することができる。前記免疫増強用薬剤または健康食品は、前記シャシャンボ実抽出物を有効成分として含む組成物が０．０１〜９９．９重量％で含まれるように散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール、経皮剤、坐剤、または滅菌注射溶液に剤形化して製造することができる。
【００４２】
滅菌注射液の場合、前記薬学組成物が０．０１〜９９．９重量％で含むようにし、精製水または葡萄糖を９９．９〜０．０１重量％を混合して製造可能であり、カプセル剤の場合、前記薬学組成物を凍結乾燥して０．０１〜９９．９重量％で含むようにし、ビタミン剤、カルシウム剤を９９．９〜０．０１重量％を混合して製造可能である。
【００４３】
前記製造された薬学組成物の１日当たり投与量は前記抽出物が１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重含まれる含有量で提供し、また前記薬学組成物を０．０１〜９９．９重量％で含む憂鬱症症状予防または改善用健康機能性食品にも製造可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明はシャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）実抽出物を有効成分として含む憂鬱症原因と症状疾患の改善のための健康機能性食品組成物を提供することによって、製造原料を自然に棲息する植物に代替するので、製造生産コスト低減と産業化を通じての輸入代替及び輸出効果を期待することができるので、産業上利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月6日(2019.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）実抽出物を有効成分として含む憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品組成物。
【請求項２】
前記シャシャンボ実抽出物は、水、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、及びブタノールからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒で抽出されることを特徴とする、請求項１に記載の憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品組成物。
【請求項３】
請求項１の健康機能食品組成物が０．０１〜９９．９重量％の量で含まれることを特徴とする、憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品。
【請求項４】
健康機能性食品は、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、顆粒剤、及び液剤のうちから選択されるいずれか１つの形態に製造されることを特徴とする、請求項３に記載の憂鬱症の予防または改善用健康機能性食品。
【請求項５】
憂鬱症の予防または改善の有効成分としてシャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）実抽出物を含む組成物の使用。
【請求項６】
前記シャシャンボ実抽出物は、水、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、及びブタノールからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒で抽出されることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明はシャシャンボ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．）抽出物を有効成分として含む憂鬱症予防及び改善用健康機能性食品組成物及び薬学的組成物に関し、より具体的には、天然原料であるシャシャンボ実抽出物を用いて毒性及び副作用無しで安全に使われることができる憂鬱症予防及び改善用薬学組成物及び健康食品組成物に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】シャシャンボ実抽出物模式図を示す。
【図２】シャシャンボ実抽出物の分画物模式図を示す。
【図３】本発明のシャシャンボ実抽出物を６日間投与した白ねずみに対する強制水泳試験法において、不動時間（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｔｉｍｅ）、水泳時間（ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｔｉｍｅ）、這い上がった時間（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。
【図４】本発明のシャシャンボ実抽出物を投与したマウスに対する血液で神経伝達物質及びストレスホルモンの増加有無において、対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。
【図５】本発明のシャシャンボ実抽出物がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）に及ぼす細胞毒性程度を示すグラフを示す。
【図６】過酸化水素処理を通じての酸化的ストレス誘導に対するシャシャンボ実抽出物の神経細胞保護効果を示したグラフを示す。
【図７】精神的ストレスホルモンであるコルチコステロン（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）処理を通じての細胞内ストレス誘発及びシャシャンボ実抽出物の濃度に従う神経細胞保護効果を示したグラフを示す。
【図８】本発明のシャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ１Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を濃度依存的に増加させる効果を示したグラフを示す。
【図９】本発明のシャシャンボ実抽出物が５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を濃度依存的に抑制する効果を示したグラフを示す。
【図１０】本発明のシャシャンボ実抽出物の溶媒分画物が５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で５−ＨＴにより誘導された細胞内Ｃａ２＋の増加を抑制する効果を示したグラフを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
２．シャシャンボ実の極性溶媒、非極性溶媒可溶分画物製造
図２に図示したように、前記シャシャンボ実の熱水抽出物から系統分画を実施してシャシャンボ実抽出物の分画物を製造するステップを具体的に説明すると、次の通りである。濃縮液を水で十分に懸濁して２倍体積のヘキサンで１次溶媒移行を３回遂行して水層とヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）  ｅｘｔ．（４１．８ｍｇ）に分離した。また、水層を２倍体積のクロロホルムで２次溶媒移行を３回遂行してＣＨＣｌ３ｅｘｔ．（７９．９ｍｇ）を確保した。エチルアセテートで３次溶媒移行を３回遂行してＥｔＯＡｃ  ｅｘｔ．（３１２．４ｍｇ）を確保した。最後に、ｎ−ブタノールで４次溶媒移行を３回遂行してｎ−ＢｕＯＨ  ｅｘｔ．（５ｇ）を確保した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
図４は、本発明のシャシャンボ実抽出物を投与したマウスに対する血液で神経伝達物質及びストレスホルモンの増加有無において、対照群、エスシタロプラムシュウ酸塩投与群マウスと比較したグラフを示す。正常な状態でＮＥとＣＯＲの変動に及ぼすシャシャンボ実抽出物の抗憂鬱効能を検証した。憂鬱な気分が感じられる理由は脳の神経細胞で外部に分泌されるセロトニンまたはノルエピネフリン（ノルアドレナリン）の量が少ないためである。シャシャンボ実抽出物を通じてのノルエピネフリン神経伝達物質の増加有無を確認した結果、図４の（Ａ）に図示したように、正常動物にシャシャンボ実抽出物（１００及び２００ｍｇ／ｋｇ）、エスシタロプラムシュウ酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した時、シャシャンボ実抽出物１００及び２００ｍｇ／ｋｇ投与群で対照群よりＮＥの濃度を増加させる傾向性を見せた。したがって、シャシャンボ実抽出物はＮＥ濃度を増加させるので、抗憂鬱製剤としての効能があるということを意味する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
６．シャシャンボ実抽出物を用いた脳神経細胞でストレス緩和活性確認
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌ（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）を１％  ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ／ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓと１０％ＦＢＳを含有したＭＥＭ培地で培養し、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞数が１０５ｃｅｌｌ／ｍｌになるようにシードした後、２４時間培養した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
７．シャシャンボ抽出物を用いた５−ＨＴ１Ａ受容体または５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子が発現された細胞株で細胞内Ｃａ２＋活性測定
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌ）をＡＴＣＣから購入し、培養液（ＲＰＭＩ  １６４０、ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  １０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ１００ＩＵ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  １００μｇ／ｍｌ）を使用して９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｗａｌｌ／ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を分株した後、３７℃、５％  ＣＯ２  インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２４時間培養した。セロトニン１Ａ受容体（５−ＨＴ１Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）またはセロトニン２Ａ受容体（５−ＨＴ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）各々ｃＤＮＡをプラスミドトランスフェクション試薬であるｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて４８時間の間細胞内一時的に発現させた細胞を実験に使用した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
８．シャシャンボ抽出物の溶媒分画物を用いた５−ＨＴ２Ａ受容体遺伝子発現された細胞株で細胞内Ｃａ２＋活性測定
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌ）をＡＴＣＣから購入し、培養液（ＲＰＭＩ  １６４０、ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  １０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ  １００ＩＵ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  １００μｇ／ｍｌ）を使用して９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｗａｌｌ／ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を分株した後、３７℃、５％ＣＯ２  インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２４時間培養した。セロトニン２Ａ受容体（５−ＨＴ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）各々ｃＤＮＡをプラスミドトランスフェクション試薬であるｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて４８時間の間細胞内に一時的に発現させた細胞を実験に使用した。
【国際調査報告】
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