(57)【要約】  本発明は、細胞培養物の感染の部位の数を決定するための方法であって、試料キャリア中に配置された細胞培養物をウイルスに感染させる工程と、透過光法を用いて細胞培養物のすべての感染領域を計数する工程と、感染細胞を蛍光標識で標識する工程と、蛍光分析法を用いて細胞培養物の感染領域を計数する工程と、感染の部位の数を決定するための両方の方法において決定された領域を領域ごとに評価する工程と、を含む、細胞培養物の感染の部位の数を決定するための方法に関する。
2019517249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物の感染の部位の数を決定するための方法であって、
試料キャリア中に配置された細胞培養物をウイルスに感染させる工程と、
透過光法を用いて前記細胞培養物のすべての感染領域を計数する工程と、
感染細胞を蛍光標識で標識する工程と、
蛍光分析法を用いて前記細胞培養物の感染領域を計数する工程と、
感染の部位の数を決定するための両方の方法において決定された領域を領域ごとに評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記感染の部位の数が、前記透過光法によって決定された前記領域と前記蛍光分析法によって決定された前記領域とを組み合わせることによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記透過光法によって同定されるが、前記蛍光分析法によって同定されない領域が計数されない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光分析法によって同定されるが、前記透過光法によって同定されない領域が計数される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光分析法によって同定されるが、前記透過光法によって同定されない領域が、加えて、別個に計数される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
予め定義された限界サイズを超える領域が数回計数される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
サイズ、形および／または蛍光強度に依存して、前記蛍光分析法によって同定され、かつ予め定義された限界サイズを超える領域に関する数が規定される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光分析法によって同定され、かつ予め定義された限界サイズを超える前記領域が、前記透過光法によって決定された領域の対応する前記領域と比較され、少なくともこの領域において同定された空隙の数が計数される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記限界サイズが、試料および／または測定値に依存して、特に自動的に調節される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記透過光法および／または前記蛍光分析法が、特にイメージング法に基づいて、自動的に実行される方法である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養物が、前記透過光法の実行前に染色される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
品質管理のための管理値が、特に自動的に決定される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養物が、希釈されている可能性があるウイルス液を使用して感染させられる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
希釈係数が、感染の部位の数の決定において考慮される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
タイタープレート、特にマイクロタイタープレートが前記試料キャリアとして使用される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
同じ細胞培養物が、前記タイタープレート、特に前記マイクロタイタープレートの各ウェルに存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス液が、滞留時間の後に除去され、後に放出されるウイルス粒子の拡散を妨げるゲル層などのカバーと置換される、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法の実行が、好ましくは数分、特に数日のインキュベーション期間後に行われる、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養物の感染の部位の数を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養物の感染の部位の数を決定するために、まず試料キャリア上で細胞培養物を増殖させることが知られている。適した試料キャリアは、特に、タイタープレートおよびマイクロタイタープレートであり、ここで、細胞培養物が個々のウェル中で増殖され、細胞は、ウェルの底に付着することができる。その後、細胞は、ウイルス液に感染させられる。ウイルス液は、通常希釈され、異なる希釈度のウイルス液が異なるウェルに加えられる。ウイルスの型に特に依存する所定の期間後、ウイルス液が除去され、特にポンプでくみ出される。ウイルス液は、通常、細胞培養物に数分から数時間働く。ウイルス液の除去後、後に放出されるウイルス粒子の拡散を防ぐための培地が通常供給される。特にゲル層として導入されるこのような培地は、細胞培養物をカバーするために使用される。その後、典型的に数日のより長い期間の待機が生じる。この期間の間、感染細胞は死に、そこから出現するウイルスは、隣接する細胞に広がる。これにより、死細胞がもはや見えず、まだ生きているが既に感染している細胞のゾーンに囲まれた比較的大きな領域が形成される。ここで、感染の部位は、ウイルスによる細胞の初期感染が起こった試料キャリア上の領域と定義され、ここで、感染のそれぞれの部位から始まり、細胞が既に感染しているかつ／または既に破壊されている感染領域が形成される。
【０００３】
透過光法を使用して、破壊された領域または生細胞が残っていない領域を計数することが可能である。このような計数は、典型的に、人による、写真撮影または顕微鏡法によるそれぞれの画像の撮影後に行われる。必要な場合、試料は、コントラストの増加のために色素で染色され得る。例えば、メチレンブルーなどの適した、特に非特異的な色素は、生細胞が存在しない領域が観察者に穴としてよりはっきりと明らかになるように、生細胞を標識する。
【０００４】
特に透過光法を用いて細胞培養物の感染の部位の数を決定することは、例えば、後に感染した細胞または異なる方法でウイルスに反応する細胞は、まだ死んでおらず、そのため、対応する穴は透過光法を使用して見ることができないという不都合を有する。これは、例えば、よりゆっくりと反応する細胞にも当てはまり、対応する穴は依然として非常に小さく、したがって目に見えないか、または苦労してのみ目に見える。透過光法の別の不都合は、ウイルスによって引き起こされていない他の空隙がそのような空隙として検出され、誤って計数に含まれることである。このような空隙は、例えば、細胞が洗い流された領域またはコンタミネーションが存在する領域とすることができる。洗い流しは、例えば、ウイルス液が加えられたとき、またはゲルが加えられたときに生じ得る。さらに、透過光法が対応して行われる前に待機しなければならない期間の持続時間は、決定することが困難であり、特にウイルスの型に依存する。期間が短すぎる場合、対応する感染領域は、少数の死細胞のみを有し、対応する穴または空隙を識別することは困難である。期間が長すぎる場合、個々の領域が増殖して、合併し、元々、感染の部位が１つだけであったか、細胞培養物の共通の感染領域を有する複数の感染の部位であったかどうかを決定することは難しい。
【０００５】
さらに、細胞培養物の感染の部位の数を決定するために、特に感染細胞を標識するウイルス特異的蛍光標識で細胞培養物を処理することが知られている。その場合、対応する領域が蛍光を発するので、感染領域を計数することが可能である。しかし、この方法は、隣接する感染領域が互いに識別され得ず、したがって１つの元々の感染の部位としてのみ誤って検出され得るという不都合を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、それを用いてより正確かつより確実に感染の部位の数が決定され得る細胞培養物の感染の部位の数を決定するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、請求項１に記載の方法を用いて本発明により達成される。
【０００８】
本発明によって提供される細胞培養物における感染の部位の数を決定する方法では、まず、試料キャリア中に配置された細胞培養物がウイルスに感染させられる。これは、特に、所望の場合希釈されていてもよいウイルス液を加えることによって行われる。ここで、感染の部位は、ウイルスによる細胞の初期感染が起こった試料キャリア上の領域と定義され、ここで、感染のそれぞれの部位から始まり、細胞が既に感染しているかつ／または既に破壊されている感染領域が形成される。タイタープレート、特にマイクロタイタープレートが好ましくは試料キャリアとして使用され、細胞培養物は、好ましくはウェルの底で増殖している。
【０００９】
次のステップでは、ウイルス感染による細胞の破壊により細胞培養物中に穴が既に形成されている感染している可能性のある領域を決定するために、既知の透過光法が使用される。したがって、透過光法を使用して、生細胞が存在しないすべての領域が決定される。したがって、対応する空隙または穴が決定される。そうすることで、特に、ウイルスによって細胞が死んだ領域だけでなく、コンタミネーションによって、または細胞が洗い流されたために生細胞を含まない領域が決定される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、感染細胞は、特に特異的蛍光標識を使用して標識される。ここで、感染細胞は、ウイルスに基づいておよび／またはウイルスによって直接的に引き起こされる効果に基づいて直接的に標識される。このように、感染領域は、細胞培養物の非感染領域から識別され得る。次いで、蛍光分析法を使用して細胞培養物の感染領域が決定される。そうすることで、大きな蛍光領域は、少なくとも最初に唯一の領域としても計数される。
【００１１】
続いて、２つの方法が本発明によって提供されるように組み合わされ、感染の部位の数を決定するために、２つの方法によって決定された領域が領域ごとに評価される。特に、透過光法によるかまたは蛍光分析法によるかのいずれかの前に決定されたすべての領域が連続的に吟味され、考慮されるそれぞれの領域の感染の部位のそれぞれの数が、２つの方法の組合せから確実に決定される。例えば、２つの方法において決定された領域を合計することが可能である。この場合、個々の領域が２回計数されるので、特に、両者の方法によって決定された領域が１回のみ計数されるように、決定された領域に関して、透過光法および蛍光分析法の決定された結果を重ね合わせることによって整合が行われ得る。したがって、例えば、両方の方法によって感染の部位として同定された領域のみが感染の部位として計数され得る。具体的には、透過光法によって、複数の感染の部位を含む、蛍光分析法によっても検出された領域は、複数の感染として確実に特徴づけられ得る。それによって、細胞培養物における感染の部位の数を決定する精度が著しく改善される。
【００１２】
特に、方法工程、すなわち、上記のように透過光法を適用すること、上記のように特異的標識を用いて感染細胞を標識すること、および上記のように蛍光分析法を適用することの順序は、任意選択であり、ここで、当然、感染細胞を標識することは、常に蛍光分析法の前に行われなければならない。したがって、例えば、特異的標識を使用して試料の感染細胞を標識し、続いて透過光法および蛍光分析法を行うことが可能である。この点で、透過光法および蛍光分析法を同時に試料に行うことが特に好ましい。
【００１３】
本発明による方法の好ましい進展では、２つの方法を用いて決定された領域の評価は、透過光法によって検出されたが、しかしながら、蛍光分析法によって検出されなかった領域が、感染の部位として計数されないように達成される。２つの方法を用いて決定された領域の比較によって、ウイルス感染によって引き起こされなかった空隙または穴を決定することが可能であるが、これは、このような空隙は、蛍光、すなわち、ウイルス感染細胞によって囲まれていないためである。したがって、本発明の方法を使用して、例えば洗い流しまたはコンタミネーションによって形成された空隙を、これらが感染の部位の数の結果を損なわないように、別個に決定することが可能である。特に、これらの領域を別個に計数するまたは評価することも可能である。これにより、試料の品質管理が可能になる。例えば、コンタミネーション、細胞の洗浄などが生じた欠陥の所定の数の場合、評価中に対応する試料を無視することが可能である。これは、特に、対応する空隙の数またはサイズに基づいて自動的に行われ得る。これらの欠陥の頻度およびサイズを管理することは、また、試料調製の品質管理に関して重要である。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施形態では、蛍光法によって検出されるが、透過光法においては検出されない領域が決定される。これらの領域は、細胞培養物の感染の部位として計数される。これらの領域は、ウイルス感染細胞を有するが、対応する数の死細胞が存在する程度まで細胞がまだ損傷されておらず、その後分解し、透過光法によって空の領域として検出され得る領域である。特に、これらの領域を計数し、秤量することさえも可能である。この分析は、例えば、ウイルスの激しく変動する感染速度の兆候を得るために、実現可能であり得る。さらに、それによって、試料調製のある態様の品質管理が可能である。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施形態では、特に両方の方法によって検出された領域が、それらのサイズおよび／または形に関して分析される。具体的には、予め定義された限界サイズを超えた場合、すなわち、感染領域の予め定義された程度または予め定義された表面領域を超えた場合、対応する領域が数回計数され得る。これは、この領域が、一緒に増殖した複数の元々の感染の部位によって形成されているという仮定に基づいている。
【００１６】
好ましくは、そのような領域は、より徹底的に分析される。したがって、蛍光分析法によって検出され、かつ予め定義された限界サイズを超える領域に関して、サイズ、形および／または蛍光強度に依存して感染の部位の数が定義される。さらに、空隙の数を考慮することによって、これらの領域をより徹底的に分析することが可能である。死細胞による蛍光による空隙の数は、好ましくは、この領域において元々感染した感染の部位の最小数である。この数は、おそらく強い蛍光により増加し得る。なぜなら、最初に感染した細胞も、まだ死んでおらず、空隙を形成していないこの領域に存在すると仮定されなければならないからである。
【００１７】
好ましくは、限界サイズは、試料および／または測定値に依存して定義される。例えば、見出された対応する領域のサイズ分布に基づいて限界サイズを決定することが可能である。例えば、見出されたそのような領域の中央値との比較を行うことも可能である。具体的には、種々の領域のサイズの統計値に基づいて限界値の決定が行われ得る。
【００１８】
自動化された方法として透過光法および／または蛍光分析法を行うことが特に好ましい。これは、特にイメージング法に基づいて達成される。画像処理方法を有する自動顕微鏡またはプレート読み取り装置が、この目的に特に適している。したがって、例えば、製造者パーキンエルマーのプレートリーダーＥｎＳｉｇｈｔが適している。
【００１９】
透過光法におけるコントラストを増加させるために、細胞培養物は、染色され得る。これは、それ自体既知の方法および色素、特にメチレンブルーを使用して行われ得る。具体的には、細胞培養物を染色することは、細胞培養物中の空隙をはっきりと見えるようにするために、細胞培養物のすべての細胞を同様に染色する非特異的色素を用いて行われる。おそらく、蛍光法において使用される色素のスペクトル特性を考慮することが必要である。さらに、従来技術の細胞培養物の感染の部位の数を決定するための方法と同様に、細胞の増殖、ウイルス液での細胞の感染およびゲルでのカバーを既知のように行うことができる。特に、細胞培養物は、必要に応じて希釈されていてもよいウイルス液を使用して感染させられ得る。この点に関して、感染の部位の数の決定には、希釈の係数が考慮されることが好ましい。タイタープレート、特にマイクロタイタープレートを使用する場合、同じ細胞培養物が各ウェルに存在し、かつ／または同じウイルス液が場合によって異なる希釈度で加えられることがさらに好ましい。特に、多数のウェルを有するマイクロタイタープレートを使用することによって、異なるウイルス液または異なる薬剤で処理された細胞培養物を使用することも可能である。
【００２０】
本発明の好ましい進展では、品質管理のための管理値が特に自動的に決定される。これは、より詳細な検査、または例えば、死細胞ではなく洗浄またはコンタミネーションによって引き起こされた空隙のみを計数することとすることができる。さらに、重要な管理値は、物体認識の質、特にウイルス感染によって影響されない細胞層の質感、または試料について平均化された特異的感染標識の強度である。さらに、感染の検出された領域のサイズまたは形態に関する詳細は、測定の解釈に使用され得る。
【００２１】
他の非特異的検出法が透過光法の代わりに使用され得る。この目的のための適した方法は、感染に関係なく細胞を標識し、その後顕微鏡的に読まれる蛍光法である。感染特異的標識からの簡単な区別を可能にするために、異なる特性（例えば、発光波長）を有する蛍光色素がこの目的のために好ましい。
同様に、蛍光分析法の代わりに他の感染特異的検出法を実施することが可能である。これらは、非蛍光感染特異的標識を使用する。例えば、これらは、比色法のための色素とすることができる。
適した細胞型を用いて、感染細胞の領域を質感特性に基づいて特別な標識なしで非感染細胞領域と区別することも可能であり得る。
【００２２】
さらに、ウイルスによる細胞培養物の感染の検査以外のためにこの方法を使用することが可能である。例えば、細胞培養物に感染する細菌を用いて、または細菌培養物を常食とするアメーバなどの細胞もしくは（単細胞）生物を用いてこれを使用することも考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】概略的な例としてのタイタープレートのウェルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
添付の図面は、概略的な例としてのタイタープレートのウェルを示す。ウェルの縁内の領域には、前述のようにウイルスに感染させられた細胞培養物が配置される。結果として、異なる領域が形成される。白で図示された領域は、例えば、ウイルス流体などが加えられたときに細胞が洗い流された領域であり、したがって細胞がない領域が形成されている。暗い影をつけられた領域は、蛍光領域、すなわち感染細胞が存在する領域である。この場合、異なる領域が形成され得る。図示された例では、これは、フリーの中心がない領域である。これは、感染細胞を含有するが、死細胞のフリーの中心が形成されていない領域である。
【００２５】
図面の上部には、フリーまたは空の中心を有する感染領域が図示されている。空の中心は、死細胞が存在する領域である。これらは、感染、したがって蛍光細胞に囲まれている。ウェルの左側に示された大きな領域は、一緒に増殖した感染の部位を図示している。その領域は、蛍光、したがって感染細胞によって囲まれた４つの空の中心を有する。
【図１】
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【国際調査報告】
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