(57)【要約】本発明は、KRAS突然変異に関連する悪性腫瘍の1つ以上の症状を予防、治療又は改善するための方法及び組成物を提供する。哺乳動物の腫瘍細胞を同定する工程、ここで腫瘍細胞は（i）KRAS遺伝子の突然変異及び（ii）KRASタンパク質の異常な発現レベルの少なくとも１つを有する;哺乳動物に、GST-πの発現を減少させるのに活性な1つ以上のRNAi分子を含む治療有効量の組成物を投与する工程を含む。【選択図】図１
2019508379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GST-πの標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むRNAi分子及び薬学的に許容される
賦形剤を含む、KRAS遺伝子の突然変異又は野生型KRAS遺伝子の過剰発現に関連する腫瘍の
治療又は処置のための医薬組成物。
【請求項２】
前記RNAi分子が、配列番号287の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む二重鎖領
域を有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記RNAi分子が、配列番号184に対応するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、
配列番号158に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを有する、請求項１記載の医
薬組成物。
【請求項４】
前記RNAi分子がsiRNA又はshRNAである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記薬学的に許容される賦形剤が、1種以上の脂質化合物を含む、請求項１記載の医薬
組成物。
【請求項６】
前記薬学的に許容される賦形剤が脂質ナノ粒子を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記薬学的に許容される賦形剤がRNAi分子を封入する脂質ナノ粒子を含む、請求項１記
載の医薬組成物。
【請求項８】
KRAS突然変異に関連する悪性腫瘍の1つ以上の症状を、それを必要とする哺乳動物にお
いて予防、治療又は改善する方法であって、
（i）KRAS遺伝子の突然変異及び（ii）KRASタンパク質の異常な発現レベルの少なくと
も1つを含む、哺乳動物の腫瘍細胞を同定する工程;及び
前記哺乳動物に、GST-πの発現を減少させるのに活性な1つ以上のRNAi分子を含む組成
物の治療有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトであり、前記GST-πがヒトGST-πである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記RNAi分子がsiRNA又はshRNAである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記RNAi分子が、配列番号287の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む二重鎖領
域を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記RNAi分子が、配列番号184に対応するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、
配列番号158に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを有する、請求項８記載の方
法。
【請求項１３】
前記RNAi分子が、前記哺乳動物におけるGST-πの発現を減少させる、請求項８記載の方
法。
【請求項１４】
前記投与が、哺乳動物におけるGST-πの発現を少なくとも5日間で少なくとも5％減少さ
せる、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が、前記哺乳動物の悪性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％
、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％
減少させる、請求項８記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、前記悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減するか、又は前記悪性腫瘍の進行を
遅延させるか若しくは終了させる、請求項８記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が、前記被験体における悪性腫瘍細胞の増殖を減少させる、請求項８記載の方
法。
【請求項１８】
前記投与が、前記被験体における悪性腫瘍細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、
又は少なくとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を低下させる、請
求項８記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍細胞が、正常細胞と比較して野生型KRASタンパク質の発現レベルの増加したも
のである、請求項８記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が、野生型GST-πRNA又はタンパク質を過剰発現する、請求項８記載の方
法。
【請求項２１】
腫瘍細胞が、残基12、13及び61のうち1以上でKRASタンパク質に変異を有している、請
求項８記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍細胞がKRASタンパク質に変異を含み、前記腫瘍が肺癌、結腸癌及び膵臓癌から
選択される癌である、請求項８記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍細胞がKRASタンパク質に変異を含み、腫瘍が肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌及び
結腸直腸癌からなる群から選択される肉腫である、請求項８記載の方法。
【請求項２４】
前記悪性腫瘍が、肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌、大腸癌、乳癌及び線維肉腫の群から選
択される肉腫である、請求項８記載の方法。
【請求項２５】
前記悪性腫瘍が、肺、結腸、膵臓、胆嚢、肝臓、乳房及びそれらの任意の組み合わせの
群から選択される解剖学的領域に位置する、請求項８記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が1日当たり1〜12回行われる、請求項８記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が、1、2、3、4、5、6又は7日間の期間行われる、請求項８記載の方法。
【請求項２８】
前記投与が、1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間の期間行われる、請求項８記載の方
法。
【請求項２９】
前記投与が、12週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、RNAi分子の0.01〜2mg/kgの
用量である、請求項８記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、GST-πRNAi分子について、平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*分/mLであり
、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項８記載の方法。
【請求項３１】
前記投与が、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所
、輸液又は吸入である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より
詳細には、本発明は、癌細胞がKRAS突然変異を含むか又は異常なKRAS発現レベルを示すKR
AS関連癌を予防、治療又は改善するための腫瘍療法に関する。本発明はさらに、GST-πの
発現を阻害する1つ以上のRNAi分子を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
この出願は、ND7023946WO_SL.txtと名付けられたASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 
【背景技術】
【０００３】
グルタチオンS-トランスフェラーゼ（IUBMB EC 2.5.1.18）は、多くの疎水性化合物と
還元型グルタチオンを有する求電子性化合物との結合を触媒することで解毒に重要な役割
を果たす酵素のファミリーである。それらの生化学的、免疫学的及び構造的特性に基づい
て、可溶性GSTは、4つの主なクラス：アルファ、ミュー、パイ及びシータに分類される。
これらのタイプのいくつかは、近接した又は最終的な発癌物質、特にマイケル反応アクセ
プター、ジフェノール、キノン、イソチオシアネート、ペルオキシド、ビシナルジメルカ
プタンなどを含む求電子剤を解毒することによって発癌を防止するように作用することが
示唆されている。しかしながら、腫瘍性細胞では、特定の形態が発現することが知られて
おり、抗癌剤に対する耐性に関与することが知られている。
【０００４】
GST-π遺伝子（GSTP1）は、生体異物代謝において機能すると考えられる、機能的に異
なる、GSTP1変異タンパク質をコードする多型遺伝子であり、癌の感受性において役割を
果たす可能性がある。GST-π遺伝子は、腫瘍細胞において豊富に発現している。例えば、
Aliya S. et al. Mol Cell Biochem., 2003年11月; 253（1-2）：319-327。グルタチオン
S-トランスフェラーゼ-πは、ヒトにおいてGSTP1遺伝子によってコードされる酵素である
。例えば、Bora PS、et al. （Oct.1991）J. Biol. Chem., 266（25）：16774-16777。GS
T-πアイソザイムはGSHのいくつかのアルキル化抗癌剤とのコンジュゲーションを触媒す
ることが示されており、これはGST-πの過剰発現が腫瘍細胞抵抗をもたらすことを示唆し
ている。
【０００５】
胃癌、食道癌、結腸癌、膵臓癌、肝細胞癌及び胆道癌を含む様々な消化管悪性腫瘍を有
する患者において、血清GST-πレベルの上昇が観察された。良性の胃腸疾患を有する患者
は正常なGST-πを有したが、慢性肝炎及び肝硬変を有する患者の一部はわずかに上昇した
。ステージIII又はIVの胃癌患者の80％以上及びステージI並びにIIの患者の約50％におい
て、血清GST-πの上昇を示した。例えば、Niitsu Y、et al. Cancer、1989年1月15日; 63
（2）：317-23。口腔癌患者において血漿中のGST-πレベルの上昇が認められたが、良性
口腔疾患患者は正常なGST-πレベルであった。GST-πは、化学療法に対する応答の評価、
術後腫瘍切除能又は腫瘍負荷のモニタリング、及び口腔癌患者における腫瘍の再発の予測
のための有用なマーカーであることが判明した。例えば、Hirata S. et al. Cancer、199
2 Nov 15:70（10）:2381-7参照。
【０００６】
免疫組織化学的研究により、組織学的に腺癌又は扁平上皮癌に分類される多くの癌がGS
T-πを発現することが明らかにされている。血漿又は血清のGST-πレベルは、消化管の癌
患者の30〜50％において増加する。このタイプはまた、シスプラチン及びダウノルビシン
などの抗癌剤に対する耐性に関与することが示唆されており、癌組織におけるその発現は
、癌患者における予後値とすることができる。
【０００７】
正常ヒトKRAS遺伝子（V-Ki-ras2キルステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）の
タンパク質産物は、正常組織においてシグナル伝達機能を果たし、KRAS遺伝子の変異は、
多くの癌の発生の推定上の一歩である。たとえば、Kranenburg O、2005年11月、Biochim.
Biophys. Acta、1756（2）：81-82参照。KRASタンパク質はGTPアーゼであり、いくつか
のシグナル伝達経路に関与している。KRASは、成長因子の増殖に必要なタンパク質及びc-
Raf並びにPI3-キナーゼなどの他の受容体のシグナルを活性化する分子オン/オフスイッチ
として機能する。
【０００８】
KRASにおける突然変異は、肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌及び大腸癌などの悪性腫瘍に関
連する可能性がある。ヒト大腸癌において、KRAS突然変異は、AP-1の活性化を介してGST-
πの過剰発現を誘導すると考えられる。例えば、Miyanishiら、Gastroenterology、2001;
121（4）：865-74参照。
【０００９】
突然変異KRASは、結腸癌（Burmer GC、Loeb LA、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、
86（7）:2403-2407）、膵臓癌（Almoguera Cら、1988、Cell、53（4）：549-554）及び肺
癌（Tam IYら、2006、Clin. Cancer Res.、12（5）:1647-1653）において見いだされてい
る。KRASは肺腺癌におけるRAS変異の90％を占める（Forbes Sら、Cosmic 2005. Br J Can
cer、2006; 94：318-322）。
【００１０】
KRAS遺伝子は、大腸癌においても増幅されることがある。KRAS増幅は、KRAS突然変異と
相互に排他的となる。例えば、Valtorta Eら、2013、Int. J.Cancer、133（5）:1259-65
参照。野生型KRASの増幅も、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び肺癌において観察されている。例
えば、Chen Yら、2014、PLoS ONE、9（5）:e98293参照。
【００１１】
GST-πの発現は、いくつかの抗癌剤に対する耐性に関連し得る種々の癌細胞において増
加する。例えば、Banら、Cancer Res., 1996,56（15）:3577-82; Nakajimaら、J Pharmac
ol Exp Ther., 2003、306（3）:861-9。
【００１２】
GST-πを抑制する薬剤は、細胞内でアポトーシスを誘導するものとして開示されている
。しかし、そのような組成物及び技術はまた、オートファジーを引き起こし、種々の薬剤
による作用の組み合わせを必要とした。例えば、US2014/0315975A1を参照されたい。さら
に、GST-πの抑制は、腫瘍を縮小又は抑制することは見出されていない。例えば、GST-π
を過剰発現する癌において、腫瘍の重量はGST-πの抑制によって影響されなかったが、他
の効果が観察された。例えば、Hokaiwadoら、Carcinogenesis、2008,29（6）：1134-1138
を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
KRASに関連する悪性疾患を有する患者のための治療を開発するための方法及び組成物が
緊急に必要とされている。
【００１４】
悪性腫瘍を予防又は治療するための方法及び組成物が必要とされている。悪性腫瘍を予
防、治療、低減又は縮小するためのRNAi分子、及び他の構造並びに組成物に対する継続的
な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、GST-πのsiRNA阻害剤による処置によって、悪性腫瘍の大きさをin vivoで低
下させることができるといった驚くべき発見に関する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、KRAS突然変異を含む又は異常なKRAS発現レベルを示す悪性腫
瘍は、GST-πの発現を調節するsiRNA剤による処置によって減少させることができる。
【００１７】
本発明は、悪性腫瘍に対する核酸に基づく治療化合物のための方法及び組成物に関する
。いくつかの実施形態において、本発明は、GST-πの発現をサイレンシングすることがで
きるRNAi分子、構造及び組成物を提供する。本開示の構造及び組成物は、悪性腫瘍の予防
、治療又はサイズ縮小に使用することができる。
【００１８】
本発明は、被験体における新生物を治療するために使用できる組成物及び方法を提供す
る。特に、本発明は、不要なオートファジーを伴わずにKRAS関連新生物を治療するための
GST-π核酸分子又はポリペプチドの発現を減少させることができる治療用組成物を提供す
る。
【００１９】
いくつかの態様では、本発明は、GST-π核酸分子の少なくともフラグメントに対応する
か又はそれに相補的であり、細胞内でGST-π発現を減少させる阻害性核酸分子を含む。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、GST-π核酸分子の少なくともフラグメントに対応す
るか、又はそれに相補的であり、細胞におけるGST-π発現を減少させる二本鎖阻害核酸分
子を特徴とする。特定の実施形態では、二本鎖核酸分子は、siRNA又はshRNAである。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、上述した阻害性核酸分子をコードするベクターを
含む。ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルスベクター又はレンチウイルスベクターとすることができる。さらなる実施形態では、
ベクターは、哺乳動物細胞における発現に適したプロモーターを含むことができる。さら
なる実施形態は、KRAS突然変異を含有するか又は異常なKRAS発現レベルを示す癌細胞であ
って、ベクター又は上記態様のいずれか1つの阻害性核酸分子を含むことができる癌細胞
を含んでいる。さらなる実施形態では、細胞はインビボにおける腫瘍性細胞であってもよ
い。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、KRAS突然変異を含むか又は異常なKRAS発現を示す
悪性腫瘍細胞におけるGST-π発現を減少させる方法を含む。方法は、GST-π核酸分子の少
なくとも一部に対応するか又はそれに相補的な阻害性核酸分子の有効量と細胞を接触させ
る工程を含み、当該阻害性核酸分子がGST-πポリペプチドの発現を阻害することができ、
これにより細胞中のGST-π発現を減少させる。
【００２３】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、遺伝子発現を阻害するために活性であるアン
チセンス核酸分子、低分子干渉RNA（siRNA）又は二本鎖RNA（dsRNA）とすることができる
。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、悪性腫瘍におけるGST-π転写又は翻訳を減少
させることができる。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、悪性腫瘍細胞におけるGST-π発現を減少させる方法で
あり、当該細胞がヒト細胞、腫瘍細胞、インビボ細胞又はインビトロ細胞とすることがで
きる。
【００２６】
本発明の実施形態はまた、KRAS突然変異を含有するか又は異常なKRAS発現レベルを示す
新生物を有する被験体を治療するための方法を提供することができる。方法は、GST-π核
酸分子に対応するか又はそれに相補的な阻害性核酸分子の有効量を被験体に投与する工程
を含み、当該阻害性核酸分子がGST-πポリペプチドの発現を阻害し、これにより新生物を
治療する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療前又は治療なしのサイズと比
較して新生物のサイズを減少させることができる。
【００２７】
様々な実施形態において、阻害性核酸分子は、リポソーム、ポリマー、マイクロスフェ
ア、ナノ粒子、遺伝子治療ベクター、又は裸のDNAベクター中に送達することができる。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、例えば、新生物癌細胞がKRAS突然変異を含有するか
又は異常なKRAS発現レベルを示す新生物を有するヒト患者等の被検者を治療する方法を特
徴としている。特定の実施形態では、本方法は、阻害性核酸分子の有効量を被験体に投与
する工程を含み、ここで阻害性核酸分子がGST-πポリペプチドの発現を阻害する、アンチ
センス核酸分子、siRNA又はdsRNAである。
【００２９】
特定の実施形態では、新生物の細胞はGST-πを過剰発現する。
【００３０】
特定の実施形態において、新生物は、悪性腫瘍、又は肺癌、又は膵臓癌とすることがで
きる。
【００３１】
本発明の実施形態は以下を含む：
KRAS遺伝子の突然変異又は野生型KRAS遺伝子の過剰発現に関連する腫瘍の処置又は治療
のための医薬組成物であって、当該組成物はRNAi分子及び薬学的に許容される賦形剤を含
み、RNAi分子はGST-πにおける標的配列に対応するヌクレオチド配列を含んでいる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、GST-πmRNAの標的配列に対応するヌクレオチ
ド配列を含む二重鎖領域を有するRNAi分子を含んでいる。
【００３３】
特定の態様において、RNAi分子は、遺伝子発現を抑制するために活性であるsiRNA又はs
hRNAである。
【００３４】
医薬組成物は、1つ以上の脂質化合物のような薬学的に許容される賦形剤を含むことが
できる。脂質化合物は、脂質ナノ粒子を含むことができる。特定の実施形態では、脂質ナ
ノ粒子はRNAi分子を封入（カプセル化）することができる。
【００３５】
本発明はさらに、それを必要とする哺乳動物におけるKRAS突然変異に関連する悪性腫瘍
の1つ以上の症状を予防、治療又は改善するための方法であって、
（i）KRAS遺伝子の突然変異及び（ii）KRASタンパク質の異常な発現レベルの少なくと
も1つを含む、哺乳動物の腫瘍細胞を同定する工程；及び
前記哺乳動物に、GST-πの発現を減少させるのに活性な1つ以上のRNAi分子を含む組成
物の治療有効量を投与する工程を含む。
【００３６】
このような方法では、哺乳動物をヒトとすることができ、GST-πをヒトGST-πとするこ
とができる。RNAi分子は、siRNA、shRNA又はマイクロRNAとすることができる。
【００３７】
特定の実施形態では、RNAi分子は二重鎖領域を有することができ、二重鎖領域はGST-π
mRNAの標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むことができる。RNAi分子は、哺乳動物
においてGST-πの発現を減少させることができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、投与は、哺乳動物におけるGST-πの発現を少なくとも5日間
で少なくとも5％減少させることができる。特定の実施形態では、投与は、哺乳動物の悪
性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少な
くとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％減少させることができる。さらな
る実施形態では、この方法は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減することができ、又は悪
性腫瘍の進行を遅延若しくは終了させることができる。
【００３９】
特定の実施形態では、投与は、被験体における悪性腫瘍細胞の増殖を減少させることが
できる。投与は、被験体の悪性腫瘍細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、又は少な
くとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を減少させることができる
。
【００４０】
一般に、腫瘍細胞は、正常細胞におけるレベルと比較して、野生型KRASタンパク質の発
現のレベルを増加させることができる。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、野生
型GST-πRNA又はタンパク質を過剰発現する。
【００４１】
特に、腫瘍細胞は、残基12、13及び61の1つ以上においてKRASタンパク質に変異を有す
ることができる。
【００４２】
本発明は、腫瘍細胞がKRASタンパク質に変異を有することができ、腫瘍を肺癌、大腸癌
及び膵臓癌から選択される癌とすることを企図している。
【００４３】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞はKRASタンパク質に変異を有することができ、腫瘍
を肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌及び大腸癌からなる群から選択される肉腫とすることがで
きる。特定の実施形態では、悪性腫瘍は、肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌、大腸癌、乳癌及
び線維肉腫の群から選択される肉腫とすることができる。また、悪性腫瘍は、肺、結腸、
膵臓、胆嚢、肝臓、乳房、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択される解剖学的領
域に位置することができる。
【００４４】
本発明の態様は、1日1回から12回の投与を行う方法を提供することができる。投与は、
1、2、3、4、5、6又は7日間の期間にわたって行うことができる。特定の実施形態では、
投与は、1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間の期間にわたって行うことができる。
【００４５】
投与のための用量は、12週間までの期間において、1日に少なくとも1回、RNAi分子の0.
01〜2mg/kgとすることができる。いくつかの実施形態では、投与は、GST-πRNAi分子につ
いて、1〜1000μg/分/mLの平均AUC（0-最終）及び0.1〜50μg/mLの平均Cmaxを提供するこ
とができる。
【００４６】
投与は、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所、輸
液又は吸入とすることができる。
【００４７】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面と併せて以下の実施形態の説明から明らかに
なるであろうが、これらに対する変形及び修飾は、本開示の新規な概念の精神及び範囲か
ら逸脱することなく影響を受けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図1は、GST-πを標的とする本発明のsiRNAがインビボにおいて同所性肺癌腫瘍を著しく減少させたことを示している。GST-πsiRNAを、A549同所性肺癌腫瘍を提示する無胸腺ヌードマウスに2mg/kgの用量でリポソーム製剤として投与した。最終原発腫瘍重量は、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した。GST-πsiRNAは、この6週間の研究において肺癌腫瘍の阻害に対して有意な効力を示した。図1に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終原発腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。
【図２】図2は、GST-πsiRNAについてインビボにおける腫瘍阻害効力を示している。A549細胞を用いた癌異種移植モデルを、0.75mg/kgで比較的低用量のsiRNAで使用した。GST-πsiRNAは、数日以内に有利な腫瘍阻害を示した。36日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終腫瘍平均体積は対照と比較して約2倍有意に減少した。
【図３】図3は、図2のエンドポイントにおけるGST-πsiRNAのインビボでの腫瘍阻害効力を示している。GST-πsiRNAは、平均腫瘍重量が2倍以上減少するといった有利な腫瘍阻害を示した。
【図４】図4は、本発明のGST-πsiRNAがインビトロにおいてアポトーシスにより癌細胞死を大幅に増加させたことを示している。GST-πsiRNAは、細胞生存率の低下に関連するアポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションを引き起こした。図4に示すように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜6日後に大きく増加した。
【図５】図5は、本発明のGST-πsiRNAがA549異種移植片腫瘍に対するインビボにおけるノックダウン効果を呈することを示している。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、胸腺欠損ヌード（nu/nu）雌マウス（Charles River）において、GST-πを標的とするsiRNAを用いることで観察された。図5に示すように、4mg/kgの用量では、注入後24時間でGST-πmRNAにおいて約40％の有意な減少が検出された。
【図６】図6は、本発明のGST-πsiRNAがin vivoで膵臓癌異種移植片腫瘍を阻害したことを示している。GST-πsiRNAは、6〜8週齢の胸腺欠損ヌード雌マウスの膵臓癌異種移植片腫瘍にリポソーム製剤で投与した場合、インビボで遺伝子サイレンシング効力をもたらした。図6に示すように、用量応答は、GST-πを標的とするsiRNAの0.375mg/kg〜3mg/kgの範囲の用量で得られた。GST-πsiRNAは投与後数日以内に有利な腫瘍阻害を示し、腫瘍体積はエンドポイントで約2倍減少した。
【図７】図7は、本発明のGST-πsiRNAにおける血清安定性が増加したことを示している。図7に示すように、GST-πsiRNAのセンス鎖（図7、上部）及びアンチセンス鎖（図7、下部）の血清中の半減期（t1/2）は約100分であった。
【図８】図8は、血漿中において、本発明のGST-πsiRNAが製剤として安定性が向上したことを示している。図8は、50％ヒト血清中のGST-πsiRNAのリポソーム製剤のPBS中でのインキュベーション及び様々な時点での残存するsiRNAの検出を示している。図8に示すように、GST-πsiRNAの製剤の血漿中半減期（t1/2）は100時間より有意に長かった。
【図９】図9は、GST-πsiRNAのガイド鎖のインビトロノックダウンを示す。図9に示すように、GST-πsiRNAのガイド鎖ノックダウンは、効果を示さないスクランブル配列を有する対照と比較して、ほぼ指数関数的であった。
【図１０】図10は、図9のGST-πsiRNAにおけるパッセンジャー鎖についてのインビトロノックダウンを示している。図10に示すように、GST-πsiRNAについてパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウンは緩やかに低減しており、本質的に効果が無いことを示している。
【図１１】図11は、いくつかの高活性GST-πsiRNAのガイド鎖についてインビトロノックダウンを示している。図11に示すように、GST-πsiRNAのガイド鎖ノックダウン活性はほぼ指数関数的であった。
【図１２】図12は、図11のGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖についてインビトロノックダウンを示している。図12に示すように、GST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウン活性は、約500pM未満に有意に低下した。
【図１３】図13は、高活性GST-πsiRNAのガイド鎖についてのインビトロノックダウンを示している。図13に示すように、GST-πsiRNAのガイド鎖ノックダウン活性はほぼ指数関数的であった。
【図１４】図14は、図13のGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖についてのインビトロノックダウンを示している。図14に示すように、GST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウン活性は有意に減少した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、被験体における新生物の治療のため、GST-π核酸分子又はポリペプチドの発
現を減少させる治療組成物を利用する方法を提供する。ここで新生物は、KRAS突然変異を
含むか又は異常なKRAS発現レベルを示す細胞と関連している。
【００５０】
本発明の治療用組成物は、阻害性核酸分子、例えばsiRNA、shRNA及びアンチセンスRNA
を含むことができる。
【００５１】
GST-πは、GSTP1遺伝子によってコードされ、グルタチオン抱合を触媒する酵素を示す
。GST-πは、ヒトを含む様々な動物に存在し、その配列情報はNCBIデータベースアクセッ
ション番号（例えば、ヒト：NP_000843（NM_000852）、ラット：NP_036709（NM_012577）
、マウス：NP_038569（NM_013541）等）で与えられる。
【００５２】
「GST-πポリペプチド」は、GST-πコード配列によってコードされるタンパク質の少な
くとも一部と実質的に同一であるタンパク質又はタンパク質改変体又はその断片を意味す
る。「GST-π核酸分子」とは、GST-πポリペプチド又はその変異体又はその断片をコード
するポリヌクレオチドを意味する。
【００５３】
生物個体間の遺伝子配列又はアミノ酸配列の変異の発生は、タンパク質の生理学的機能
を損なうものでなくともよい。本発明におけるGST-π及びGSTP1遺伝子は、本明細書に記
載のGST-π配列と同一の配列を有するタンパク質又は核酸に限定されるものではなく、上
記配列と1以上のアミノ酸が異なる配列、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の
アミノ酸又は塩基が異なる配列であって、既知のGST-πと同等の機能を有するものを含む
ことができる。
【００５４】
ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼ遺伝子（GST-π）、完全CDS、GenBankアクセッ
ション番号：U12472の配列を表1に示す。
【００５５】
【表１】
2019508379.tif 000003
2019508379.tif 000004
【００５６】
KRAS関連悪性腫瘍又はKRAS関連癌は、本明細書において、（a）体細胞KRAS突然変異を
含む癌細胞又は腫瘍細胞、若しくは（b）KRASの異常発現レベルを有する癌細胞又は腫瘍
細胞であって、特に限定されないが、正常な非癌細胞で見出されるレベルと比較したとき
の、KRASをコードするDNAの増幅、KRAS遺伝子の過剰発現又はKRAS遺伝子の過小発現を含
む癌細胞又は腫瘍細胞、として定義される。
【００５７】
表2は、KRASタンパク質のアミノ酸配列を示し、癌に関連する突然変異を同定している
。
【００５８】
【表２】
2019508379.tif 000005
【００５９】
QIAGENのTHERASCREEN KRAS TESTは、大腸癌細胞におけるKRAS遺伝子の7つの突然変異の
存在を検出するために設計された遺伝子検査である。
【００６０】
治療用組成物
被験体がKRAS突然変異又はKRAS増幅に関連する、例えば肺癌又は膵臓癌といった新生物
を有すると診断された後、GST-πの抑制を伴う治療方法が選択される。
【００６１】
一実施形態では、本発明の阻害性核酸分子は、約1〜100mg/kg、例えば、1、5、10、20
、25、50、75又は100mg/kgの投薬量で全身投与される。
【００６２】
さらなる実施形態において、投薬量を約25〜500mg/m2/日の範囲とすることができる。
【００６３】
ここで、GST-πを抑制する薬剤としては、GST-πの産生及び/又は活性を抑制する薬剤
、GST-πの分解及び/又は不活性化を促進する薬剤などが挙げられる。GST-π産生を抑制
する薬剤としては、RNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、GST-πをコードするDNA
のDNA/RNAキメラポリヌクレオチド又はそれらを発現するベクターが挙げられる。
【００６４】
GST-π及びRNAi分子
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の
核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
【００６５】
本発明の実施形態は、小核酸分子を用いたGST-π発現の遺伝子サイレンシングのための
組成物及び方法を提供することができる。核酸分子としては、RNA干渉（RNAi分子）、短
鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）及び短鎖ヘアピンRNA
（shRNA）分子において活性な分子が含まれる。そのような分子は、GST-π遺伝子発現に
対するRNA干渉を媒介することができる。
【００６６】
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の
治療において使用することができる。
【００６７】
本発明の核酸分子及び方法は、GST-πをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレート
するために使用される。
【００６８】
本発明の組成物及び方法は、１以上の核酸分子を含むことができ、単独で或いは組み合
わせて、GST-πタンパク質及び/又はGST-πタンパク質をコードする遺伝子、例えば、悪
性腫瘍等の疾患、並びにGST-πに関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与する
タンパク質及び/又はGST-πをコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる
。
【００６９】
本発明の組成物及び方法は、GST-πの例示的な配列を参照して記載される。当業者は、
本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するGST-π遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子
及び転写変異体といった変異体、並びにGST-π遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含
む多型を対象とすることを理解するであろう。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、GST-pi遺伝子、例えばヒトGST-
piの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することがで
きる。
【００７１】
本発明のRNAi分子は、GST-πを標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用い
て、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによ
って更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
【００７２】
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォ
ブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる
。
【００７３】
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるGS
T-π標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、
相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分
子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
【００７４】
いくつかの態様では、本発明の組成物及び方法は、GST-πmRNAに対して活性であるRNAi
分子を含み、RNAi分子はGST-π配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示のRNAi分子は、GST-πRNAに対して活性を有すること
ができ、RNAi分子は、変異体GST-πをコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に
関連することが当該分野で公知の突然変異GST-pi遺伝子のRNAに相補的な配列を含んでい
る。
【００７６】
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、GST-π遺伝子発現のサイレンシングを媒
介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００７７】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表3に示す。
【００７８】
【表３】
2019508379.tif 000006
2019508379.tif 000007
【００７９】
表3の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。
小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デ
オキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。
【００８０】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表4に示す。
【００８１】
【表４】
2019508379.tif 000008
【００８２】
表4の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味す
る。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'
-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味す
る、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオ
キシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチ
ド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【００８３】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表5に示す。
【００８４】
【表５】
2019508379.tif 000009
【００８５】
表5の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味す
る。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'
-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味す
る、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオ
キシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチ
ド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【００８６】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表6に示す。
【００８７】
【表６】
2019508379.tif 000010
【００８８】
表6の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味す
る。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'
-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味す
る、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオ
キシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチ
ド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【００８９】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表7に示す。
【００９０】
【表７】
2019508379.tif 000011
【００９１】
表7の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味す
る。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'
-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味す
る、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオ
キシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチ
ド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【００９２】
GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表8に示す。
【００９３】
【表８】
2019508379.tif 000012
【００９４】
表8の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味す
る。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'
-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味す
る、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオ
キシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチ
ド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、RNAi分子は、siRNA（低分子干渉RNA）、miRNA（マイク
ロRNA）、shRNA（ショートヘアピンRNA）、ddRNA（DNA指向性RNA）、piRNA（Piwi相互作
用RNA）、又はrasiRNA（反復関連siRNA）及びその改変形態といった二重RNAを含んでいる
がこれに限定されない。これらのRNAi分子は、市販されているか、又は既知の配列情報な
どに基づいて設計及び調製され得る。アンチセンス核酸には、RNA、DNA、PNA、又はその
複合体が含まれる。本明細書中で使用される場合、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドは、
標的遺伝子の発現を阻害するDNA及びRNAからなる二本鎖ポリヌクレオチドを含むがこれに
限定されない。
【００９６】
実施形態では、本発明の薬剤は治療剤としてsiRNAを含む。siRNA分子は、約10〜50又は
それ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約15〜45ヌクレオ
チドの長さを有することができる。siRNA分子は、約19〜40ヌクレオチドの長さを有する
ことができる。siRNA分子は、19〜23ヌクレオチドの長さを有することができる。本発明
のsiRNA分子は、標的mRNAに対するRNAiを媒介することができる。Ambion、Inc.（Austin
、TX）及びMIT（Cambridge、MA）のWhitehead Institute of Biomedical Researchのよう
な商業的に入手可能な設計ツール及びキットにより、siRNAの設計及び生産が可能である
。
【００９７】
GST-πを調節し、悪性腫瘍を治療するための方法
本発明の実施形態は、GST-π及び/又はGST-πタンパク質の発現をダウンレギュレート
又は阻害するために使用することができるRNAi分子を提供することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明のRNAi分子は、悪性腫瘍など疾患又は状態に関連
し得るGST-πハプロタイプ多型から生じるGST-π及び/又はGST-πタンパク質の発現をダ
ウンレギュレート又は阻害するために使用することができる。
【００９９】
GST-πタンパク質又はmRNAレベルのモニタリングを使用して、遺伝子サイレンシングを
特徴づけることができ、本発明の化合物及び組成物の有効性を決定することができる。
【０１００】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の遺伝子の発現を調節するために、単独で又は他のsiRNA
と組み合わせて使用することができる。
【０１０１】
本開示のRNAi分子は、GST-πに関連する疾患（悪性腫瘍を含む）の予防又は治療、又は
症状もしくは症状の改善のために、単独で又は組み合わせて、又は他の既知の薬物と組み
合わせて使用することができる。
【０１０２】
本発明のRNAi分子は、配列特異的様式でGST-πの発現を調節又は阻害するために使用す
ることができる。
【０１０３】
本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがGST-πmRNAに少なくとも部分的に
相補的であるガイド鎖を含むことができる。
【０１０４】
特定の態様において、悪性腫瘍は、本発明のRNAi分子を用いたRNA干渉によって治療す
ることができる。
【０１０５】
悪性腫瘍の治療は、適切な細胞ベースのモデル、ならびにエクスビボ又はインビボの動
物モデルにおいて特徴づけることができる。
【０１０６】
悪性腫瘍の治療は、罹患組織の細胞におけるGST-πmRNAのレベル又はGST-πタンパク質
のレベルを決定することによって特徴づけられる。
【０１０７】
悪性腫瘍の治療は、罹患した器官又は組織の非侵襲的な医学的走査によって特徴づけら
れる。
【０１０８】
本発明の実施形態は、それを必要とする被験体におけるGST-π関連疾患又は状態の症状
を予防、治療、又は改善するための方法を含むことができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するた
めの方法は、本発明のRNAi分子を被験体に投与することでGST-π遺伝子の発現を当該被験
体又は生物において調節することを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させるこ
とによって、細胞又は生物におけるGST-π遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を
企図する。
【０１１１】
GST-π阻害性核酸分子は、GST-π発現を減少させるために一本鎖又は二本鎖核酸分子と
して採用されるヌクレオチドオリゴマーであっても良い。1つのアプローチでは、当該GST
-π阻害性核酸分子は、RNA干渉（RNAi）媒介性のGST-π遺伝子発現ノックダウンに使用さ
れる二本鎖RNAである。一実施形態では、二本鎖RNA（dsRNA）分子が作製され、これは本
発明のヌクレオチドオリゴマーにおける8〜25（例えば8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 
20, 21, 22, 23, 24, 25）の連続したヌクレオチドを含むことができる。dsRNAは、二重
鎖を有するRNAの2つの相補鎖又は自己二重鎖を有する単一のRNA鎖（小さなヘアピン（sh
）RNA）とすることができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、dsRNAは、約21又は22塩基対であるが、より短くても長
くてもよく、約29ヌクレオチドまでであってもよい。二本鎖RNAは、標準的な技術、例え
ば化学合成又はインビトロ転写を用いて作製することができる。キットは、例えばAmbion
（Austin、Tex.）及びEpicentre（Madison、Wis.）から入手可能である。
【０１１３】
哺乳動物細胞においてdsRNAを発現させるための方法は、Brummelkamp et al. Science 
296：550-553, 2002; Paddison et al. Genes＆Devel. 16：948-958, 2002; Paulら Natu
re Biotechnol. 20: 505-508, 2002; Suiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-552
0, 2002; Yuら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99：6047-6052, 2002; Miyagishiら、Natur
e Biotechnol. 20: 497-500, 2002;及びLeeら、Nature Biotechnol. 20: 500-505 2002を
参照されたい。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
GST-π遺伝子に「対応する」阻害性核酸分子は、少なくとも二本鎖遺伝子の断片を含み
、二本鎖阻害性核酸分子の各鎖が標的GST-π遺伝子の相補鎖に結合できる。阻害性核酸分
子は、参照となるGST-π配列と完全に対応する必要はない。
【０１１５】
一実施形態において、siRNAは、標的核酸と少なくとも約85％、90％、95％、96％、97
％、98％又はさらには99％の配列同一性を有する。例えば、1〜2塩基対のミスマッチを有
する19塩基対の二重鎖は、本発明の方法において有用であると考えられる。他の実施形態
においては、阻害性核酸分子のヌクレオチド配列は、1, 2, 3, 4, 5又はそれ以上のミス
マッチを示す。
【０１１６】
本発明によって提供される阻害性核酸分子は、siRNAに限定されず、GST-π核酸分子又
はポリペプチドの発現を減少させるのに十分な任意の核酸分子を含む。本明細書で提供さ
れるDNA配列のそれぞれは、例えば、GST-πの発現を減少させるための治療用アンチセン
ス核酸分子の発見及び開発において使用することができる。本発明はさらに、触媒性RNA
分子又はリボザイムを提供する。そのような触媒RNA分子は、インビボでGST-π核酸分子
の発現を阻害するために使用することができる。アンチセンスRNA内にリボザイム配列を
含めることにより、RNA切断活性が分子上に付与され、それによって構築物の活性が向上
する。標的RNA特異的リボザイムの設計及び使用は、Haseloffら、Nature 334：585-591, 
1988及び米国特許出願公開第2003/0003469 A1号に記載されている。これらの各々は参照
により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
本発明の様々な実施形態において、触媒核酸分子は、ハンマーヘッド又はヘアピンモチ
ーフに形成される。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossiら、Aids Research
and Human Retroviruses、8：183, 1992に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、H
ampelら、Biochemistry、28：4929,1989及びHampel et al. Nucleic Acids Research, 18
: 299, 1990に記載されている。当業者であれば、酵素的核酸分子に必要とされるのは、
標的遺伝子RNA領域の1つ以上に相補的な特異的基質結合部位であることを認識し、分子に
RNA切断活性を付与するその基質結合部位内又はその周囲のヌクレオチド配列を有するこ
とを認識する。
【０１１８】
表9は、GST-πのmRNAコード配列を示す。
【０１１９】
【表９】
2019508379.tif 000013
【０１２０】
GST-π産生又は活性を抑制する薬物は、特異性が高く、副作用の可能性が低いという点
で、RNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、GST-πをコードするDNAのDNA/RNAキメラ
ポリヌクレオチド又はそれを発現するベクターであってもよい。
【０１２１】
GST-πの抑制は、GST-π抑制が利用されていない場合と比較して、細胞中のGST-πの発
現又は活性が抑制されることによって決定され得る。GST-πの発現は、任意の公知の技術
によって評価することができる。これらの例示としては、抗GST-π抗体を利用した方法、
EIA、ELISA、IRA、IRMA、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フ
ローサイトメトリー法、GST-π又はその固有の断片をコードする核酸又は転写産物（mRNA
）又は当該核酸のスプライシング産物と特異的にハイブリダイズする核酸を利用するハイ
ブリダイゼーション方法、ノーザンブロット法、サザンブロット法及び様々なPCR法を挙
げることができる。
【０１２２】
GST-πの活性は、例えばRaf-1（特にリン酸化Raf-1）又はEGFR（特にリン酸化EGFR）の
ようなGST-πへの結合を含むタンパク質の既知の活性を分析することによって評価するこ
とができる。これには、例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、質量分析法、プル
ダウン法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等を挙げることができる。
【０１２３】
GST-πが特定の細胞で発現されているかどうかは、細胞内のGST-πの発現を検出するこ
とで決定することができる。GST-πの発現は、当該分野で公知の任意の技術によって検出
することができる。
【０１２４】
突然変異したKRASの例には、特に限定されないが、継続的なKRASの活性化を引き起こし
、内在性GTPaseを阻害する突然変異又はグアニンヌクレオチド交換速度を増加させる突然
変異が含まれる。そのような突然変異の特定の例には、例えば、ヒトKRASにおけるアミノ
酸12, 13及び/又は61の突然変異（内因性GTPaseを阻害する）、及びヒトKRASにおけるア
ミノ酸116及び/又は119の突然変異（グアニンヌクレオチド交換速度の増加）（Bos、Canc
er Res.1989; 49（17）：4682-9、Leviら、Cancer Res. 1991; 51（13）：3497-502）。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態では、突然変異KRASは、ヒトKRASのアミノ酸12, 13, 61, 
116及び119の少なくとも1つに突然変異を有するKRASとすることができる。本発明の一実
施形態では、突然変異KRASは、ヒトKRASのアミノ酸12に突然変異を有する。いくつかの実
施形態において、突然変異KRASは、GST-πの過剰発現を誘導するものであってもよい。突
然変異KRASを有する細胞は、GST-πの過剰発現を示してもよい。
【０１２６】
突然変異KRASの検出は、任意の公知の技術、例えば、既知の突然変異配列にトクイテキ
ナ核酸プローブ手段により選択的ハイブリダイゼーション、酵素ミスマッチ切断方法、配
列決定方法（Bos、Cancer Res.1989; 49 （17）：4682-9）及びPCR-RFLP法（Miyanishiら
、Gastroenterology.2001; 121（4）：865-74）を用いて行うことができる。
【０１２７】
GST-π発現の検出は、任意の公知の技術を用いて行うことができる。GST-πが過剰発現
されているか否かは、例えば、KRAS変異を有する細胞におけるGST-πの発現の程度を、正
常KRASを有する同じタイプの細胞におけるGST-πの発現の程度と比較することによって評
価することができる。この状況では、突然変異KRASを有する細胞におけるGST-πの発現の
程度が、正常KRASを有する同型の細胞におけるGST-πの発現の程度を超える場合、GST-π
は過剰発現されている。
【０１２８】
一態様では、本発明は、上記態様のいずれかの阻害性核酸分子をコードするベクターを
特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。別の実施
形態では、ベクターは、哺乳動物細胞における発現に適したプロモーターを含む。
【０１２９】
本発明の組成物中に処方される活性RNA干渉誘導成分の量は、投与の利益を上回る副作
用を引き起こさない量とすることができる。このような量は、培養細胞を用いたインビト
ロ試験、マウス、ラット、イヌ、ブタ等のモデル動物での試験により測定することができ
、これらの試験方法は当業者には明らかである。
【０１３０】
配合される活性成分の量は、薬剤又は組成物が投与される様式に依存して変更すれば良
い。例えば、組成物の複数の単位が1回の投与に使用される場合、組成物の1単位中に処方
される活性成分の量は、1回の投与に必要な有効成分の量を前記複数単位で割ることによ
って決定することができる。
【０１３１】
本発明はまた、GST-πを抑制する薬剤又は組成物の製造方法、並びに薬剤悪性腫瘍を縮
小又は収縮させるための剤又は組成物を製造する際のGST-πを抑制する薬剤の使用に関す
る。
【０１３２】
RNA干渉
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異
的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、
25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1
999、Vol. 13、pp. 139-141参照。
【０１３３】
細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズ
ムはまだ完全には理解されていない。細胞内の特定のdsRNAは、ダイサー酵素、リボヌク
レアーゼIII酵素の作用を受けることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 10
1、25〜33頁; Hammondら、Nature、2000、Vol. 404、pp.293-296参照。ダイサーは、dsRN
AをsiRNAであるdsRNAのより短い断片に加工することができる。
【０１３４】
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチ
ド長の塩基対二重鎖領域を含むことができる。
【０１３５】
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアー
ゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、s
iRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するア
ンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNA
の切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbas
hirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
【０１３６】
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖
の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siR
NA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１３７】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一
部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチ
センス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む
ことができる。
【０１３８】
RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレ
ギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 1
01、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000
/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2
000/01846; Melloら、国際公開第2001/029058号パンフレット参照。
【０１３９】
本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレー
トする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコー
ドするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本
発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味してい
る。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、
本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少
なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそ
れ以上で低下すれば良い。
【０１４０】
RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、
よってウイルス複製に影響を及ぼす。
【０１４１】
RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセ
ンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少
なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を
有する二重鎖領域を形成することができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2
5, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4
5, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。
【０１４３】
特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して
活性な二重鎖領域の長さを有することができる。
【０１４４】
さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変
換されるダイサー基質として活性とすることができる。
【０１４５】
いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセ
ンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二重鎖
領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれか
によって当該二重鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列
である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。
【０１４６】
本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオ
チド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよ
い。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプ
タマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標
的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において
標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分
子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい
。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然
に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。
例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechno
l., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照
。
【０１４７】
非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポ
リアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜1
00個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙
げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15
、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschk
eら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、W
O1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、V
ol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。
【０１４８】
RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバ
ーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそ
れ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を
有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレ
オチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。
【０１４９】
RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良
い。
【０１５０】
RNAi分子は、二重鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二重鎖領域の末端まで塩
基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。
【０１５１】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバー
ハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有する
ことができる。
【０１５２】
RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい
。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい
。
【０１５３】
RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RN
Ai分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。
【０１５５】
さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有する。
【０１５６】
5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。
【０１５７】
特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオ
ーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１５８】
さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端が
オーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０１５９】
RNAi分子は、二重鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。
【０１６０】
RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド
又はリボヌクレオチドとすることができる。
【０１６１】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他
方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバ
ーハングを有さなくてもよい。
【０１６２】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他
の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバー
ハングを有さなくてもよい。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は
全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。
【０１６４】
ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシン
グされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/
0244858参照。
【０１６５】
ダイサー基質dsRNAは、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるの
に十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）
ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非
対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAは、ダイサー結合の配向を指示し、dsR
NAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していても
よい。
【０１６６】
RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希
釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
【０１６７】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス
物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能
する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験
体に送達又は投与することができる。
【０１６８】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム
内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸
複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に
局所投与することができる。
【０１６９】
送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジ
ョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベー
ス及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいて
も良い。
【０１７０】
本発明のGST-π阻害性核酸分子は、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤の単位
剤形で投与することができる。従来の製薬実務を用いて、過度の細胞増殖によって引き起
こされる疾患に罹患している患者に化合物を投与するための適切な製剤又は組成物を提供
することができる。患者は症状が現れる前に投与を開始することができる。例えば、非経
口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼科、脳室内、肝内、嚢
内、髄腔内、膀胱内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐薬、又は経口投与が含まれる。例
えば、治療用製剤は、液体溶液又は懸濁液の形態とすることができる。経口投与の場合、
製剤は、錠剤又はカプセル剤の形態とすることができる。鼻腔内製剤としては、粉末、点
鼻薬又はエアロゾルの形態とすることができる。
【０１７１】
本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本
発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【０１７２】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現
させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとするこ
とができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる
。
【０１７３】
例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的
であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ
以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。
【０１７４】
核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、
任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解して
いる。
【０１７５】
いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラ
クトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構
築物の転写のためである。
【０１７６】
脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によ
って、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。
【０１７７】
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用する
ことができる。
【０１７８】
上記方法の一実施形態では、阻害性核酸分子は、約5〜500mg/m2/日、例えば、5、25、5
0、100、125、150、175、200、225、250、275又は300mg/m2/日である。
【０１７９】
製剤を製造するための当該分野で公知の方法は、例えば、"Remington：The Science an
d Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro、Lippincourt Williams ＆ Wilkins、Phil
adelphia、Pa., 2000で見つけることができる。
【０１８０】
非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレング
リコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油又は水素化ナフタレンを含むこ
とができる。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー
又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を
制御することができる。GST-π阻害性核酸分子のための他の潜在的に有用な非経口送達シ
ステムには、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入シス
テム及びリポソームが含まれる。吸入のための製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含む
ことができ、又は例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩及
びデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、又は点鼻薬の形態で投与する油性溶
液であってもよい。
【０１８１】
処方物は、新生物の疾患又は状態の治療を提供するために、治療上有効な量（例えば、
病的状態を予防、排除又は軽減する量）でヒト患者に投与することができる。本発明のヌ
クレオチドオリゴマーの好ましい投与量は、障害のタイプ及び程度、特定の患者の全体的
な健康状態、化合物賦形剤の製剤及びその投与経路などの変数に依存することができる。
【０１８２】
悪性腫瘍を減少させるための上記の方法の全ては、インビトロ方法又はインビボ方法の
いずれであっても良い。投薬量は、当技術分野で知られているように、培養細胞等を用い
たin vitro試験によって決定され得る。有効量は、KRAS関連腫瘍における腫瘍サイズを少
なくとも10％、少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なく
とも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なく
とも90％、最大100％まで縮小する量としても良い。
【０１８３】
本発明の医薬組成物は、KRAS関連疾患の治療に有効である。疾患としては、異常細胞増
殖による疾患、KRAS突然変異による疾患、GST-π過剰発現による疾患などが挙げられる。
【０１８４】
異常細胞増殖による疾患としては、悪性腫瘍、過形成、ケロイド、クッシング症候群、
原発性アルドステロン症、赤血球増加症、真性赤血球増加症、白血球増加症、過形成性瘢
痕、扁平苔癬及び白子症が挙げられる。
【０１８５】
KRAS突然変異による疾患の例には、悪性腫瘍（癌又は悪性新生物とも呼ばれる）が含ま
れる。
【０１８６】
GST-π過剰発現による疾患の例には、悪性腫瘍が含まれる。
【０１８７】
癌の例には、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血
管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫及び骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍
、頭頸部癌腫、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓
癌、胆嚢癌、胆管癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮
膚癌、白血病及び悪性リンパ腫などのがん腫を挙げることができる。
【０１８８】
癌は、上皮悪性腫瘍及び非上皮悪性腫瘍を含む。癌は、身体のあらゆる部位、例えば、
脳、頭頸部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、
大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、前立腺、精巣
、子宮、卵巣、皮膚、線条筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、
骨髄、血液、血管系、リンパ節などのリンパ系、リンパ液等に存在することができる。
【０１８９】
本発明の一実施形態において、癌は、上記に定義された突然変異KRASを有する癌細胞を
含む。別の実施形態では、癌は、ホルモン依存性増殖因子又は増殖因子非依存性増殖を示
す癌細胞を含む。さらなる実施形態において、癌は、GST-π過剰発現を示す癌細胞を含む
。
【実施例】
【０１９０】
実施例１：GST-πを標的とする本発明のsiRNAは、インビトロで遺伝子サイレンシング
に活性であることが見出された。遺伝子ノックダウンのためのGST-πsiRNAの用量依存的
活性は、約250ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した
。
【０１９１】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、siRNAノックダウン効率を決定
した。表10に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、表3のsiRNAで観察さ
れた。
【０１９２】
【表１０】
2019508379.tif 000014
【０１９３】
表10に示すように、表3のGST-πsiRNAの活性は、17〜235pMの範囲であり、インビボで
使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
【０１９４】
実施例２：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有
する本発明のGST-πsiRNAの構造は、インビトロにおける遺伝子ノックダウン活性を予想
外に且つ有利に増加させることが示された。
【０１９５】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造BU2’（配列番号133及び15
9）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表11に示すように、構造BU2’
に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
【０１９６】
【表１１】
2019508379.tif 000015
【０１９７】
表11に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有す
る構造BU2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しな
いGST-πsiRNAと比較して、驚くべきことに予想外に6倍まで増加した。
【０１９８】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置3、5及び7、又は位置4、6及び8
に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域のデオキ
シヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性
を有することを示している。
【０１９９】
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについ
て表11に示される活性は、5〜8pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多く
の用途に非常に適していた。
【０２００】
実施例３：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有
する本発明のGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且
つ有利に増加させることが示された。
【０２０１】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造A9’（配列番号185及び197
）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表12に示すように、GST-πmRNA
の用量依存的ノックダウンが、構造A9’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０２０２】
【表１２】
2019508379.tif 000016
【０２０３】
表12に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有
する構造A9’に基づくGST-πsiRNAの活性は、驚くべきことに、二重鎖領域にデオキシヌ
クレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して24倍まで増加した。
【０２０４】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域における位置4、6及び8、又は位置1、
3、5及び7、又は位置3〜8、又は位置5〜8位、又は位置3、5及び7に3〜6個のデオキシヌク
レオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有
しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示し
ている。
【０２０５】
アンチセンス鎖のシード領域に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAに
ついて表12に示す活性は、1〜15pMの範囲であり、これは、インビボで使用される薬物剤
を含む多くの用途に非常に適していた。
【０２０６】
実施例４：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有
するGST-πsiRNAの構造は、インビトロにおける遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ
有利に増加させることが示された。
【０２０７】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B13’（配列番号209及び22
4）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表13に示すように、GST-πmRNA
の用量依存的ノックダウンが、構造B13’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０２０８】
【表１３】
2019508379.tif 000017
【０２０９】
表13に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有す
る構造B13’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しな
いGST-πsiRNAと比較して予想外に増加した。
【０２１０】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置4、6及び8に3つのデオキシヌク
レオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを含
まないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することが示し
ている。
【０２１１】
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについ
て表13に示す活性は、11pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む
多くの用途に非常に適していた。
【０２１２】
実施例５：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有
するGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に
増加させた。
【０２１３】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B4’（配列番号263及び275
）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表14に示すように、GST-πmRNA
の用量依存的ノックダウンが構造B4’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０２１４】
【表１４】
2019508379.tif 000018
【０２１５】
表14に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に6個のデオキシヌクレオチドを有す
る構造B4’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しな
いGST-πsiRNAと比較して予想外に2倍以上増加した。
【０２１６】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域内の位置3〜8に位置する6個のデオキ
シヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチ
ドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を有すること
を示している。
【０２１７】
アンチセンス鎖のシード領域に6個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの表14
に示す活性は、113pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多く
の用途に非常に適していた。
【０２１８】
実施例６：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有
するGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に
増加させた。
【０２１９】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B2’（配列番号239及び251
）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表15に示すように、構造B2’に
基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
【０２２０】
【表１５】
2019508379.tif 000019
【０２２１】
表15に示すように、アンチセンス鎖のシード領域内に3〜4個のデオキシヌクレオチドを
有する構造B2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有
しないGST-πsiRNAと比較して驚くべきことに4倍まで増加した。
【０２２２】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置5〜8、又は位置1、3、5及び7、
又は位置3、5及び7に位置する3〜4個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-
πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを含まないGST-πsiRNAと比較して予想外
に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０２２３】
アンチセンス鎖のシード領域に3〜4個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAに
ついて表15に示す活性は、30〜100pMの範囲であり、これは、インビボで使用される薬物
剤を含む多くの用途に非常に適している。
【０２２４】
実施例７：1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを含むGST-πsiRNAの
構造は、インビトロで予想外に増加した遺伝子ノックダウン活性を示した。
【０２２５】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造BU2’（配列番号133及び15
9）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表16に示すように、構造BU2’
に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
【０２２６】
【表１６】
2019508379.tif 000020
【０２２７】
表16に示すように、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造BU2’に基づくGS
T-πsiRNAの活性は、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して、驚く
べきことに10倍まで増加した。
【０２２８】
これらのデータは、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πs
iRNAが、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝
子ノックダウン活性を有することを示している。
【０２２９】
1つ以上2'-Fデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表16に示す活性は、3
〜13pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた
。
【０２３０】
実施例８：1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを含むGST-πsiRNAの
構造は、インビトロで意外にも増加した遺伝子ノックダウン活性を示した。
【０２３１】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B13’（配列番号209及び22
4）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表17に示すように、GST-πmRNA
の用量依存的ノックダウンが構造B13'に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０２３２】
【表１７】
2019508379.tif 000021
【０２３３】
表17に示すように、非オーバーハング位置に3つの2'-Fデオキシヌクレオチドを有する
構造B13’に基づくGST-πsiRNAの活性は、驚くべきことに、2'-Fデオキシヌクレオチドを
有しないGST-πsiRNAと比較して約3倍増加した。
【０２３４】
これらのデータは、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πs
iRNAが、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝
子ノックダウン活性を有することを示している。
【０２３５】
1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表17に示される活性
は、6pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常
に適していた。
【０２３６】
実施例９：同所性A549肺癌マウスモデル。本発明のGST-πsiRNAは、インビボで同所性
肺癌腫瘍の顕著な減少を示すことができる。この実施例において、GST-πsiRNAは、無胸
腺ヌードマウスの同所性肺癌腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、in vivoで遺伝子
ノックダウン効力をもたらした。
【０２３７】
一般に、同所性腫瘍モデルは、薬効及び効力、ならびに改善された予測能力に関して直
接の臨床的関連性を示すことができる。同所性腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞は、細胞が
由来する同種の器官に直接移植される。
【０２３８】
ヒト肺癌A549に対するsiRNA製剤の抗腫瘍有効性を、処置群及びビヒクル対照群の剖検
時に測定した最終原発腫瘍重量を比較することによって評価した。
【０２３９】
図1は、構造BU2（配列番号63及び128）に基づくGST-πsiRNAのインビボでの同所性肺癌
腫瘍阻害を示している。同所性A549肺癌マウスモデルを、GST-πを標的とするsiRNAの2mg
/kgで比較的低用量で使用した。
【０２４０】
GST-πsiRNAは、この6週間の研究において有意で予想外に有利な肺腫瘍阻害効力を示し
た。図1に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、最終腫
瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。
【０２４１】
この研究のために、5〜6週齢の雄NCr nu/nuマウスを使用した。実験期間中、実験動物
をHEPA濾過環境に維持した。使用前にsiRNA製剤を4℃で保存し、マウスに注射する10分前
に室温に温めた。
【０２４２】
外科的同所移植（SOI）の日に、このA549ヒト肺癌同所性モデルについて、ストック腫
瘍を、A549腫瘍異種移植片を有する動物の皮下部位から採取し、RPMI-1640培地に入れた
。壊死組織を除去し、生存組織を1.5〜2mm3に切断した。動物をイソフルラン吸入で麻酔
し、手術領域をヨウ素及びアルコールで滅菌した。約1.5cmの横断切開を、マウスの左胸
壁に、一対の外科用ハサミを用いて行った。3番目と4番目の肋間に肋間切開を行い、左肺
を露出させた。1つのA549腫瘍断片を8-0の外科的縫合糸（ナイロン）で肺の表面に移植し
た。胸壁は6-0の外科用縫合糸（シルク）で閉じられた。肺は、胸腔内の残りの空気を引
き出すために、25G×1/2針の3ccシリンジを使用して胸腔内穿刺により再膨張させた。胸
壁は6-0の外科用絹縫合糸で閉じられた。上記操作の全ての手順は、HEPA濾過層流フード
の下で7倍の倍率顕微鏡を用いて行った。
【０２４３】
腫瘍移植の3日後、モデル担癌マウスを、群当たり10匹のマウスの群に無作為に分けた
。目的の群については、腫瘍移植の3日後に10匹のマウスの治療を開始した。
【０２４４】
目的の群について、処方物は、（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：
DPPE-PEG-2K：DSPE-PEG-2K）のリポソーム組成物とした。リポソームはGST-πsiRNAをカ
プセル化した。
【０２４５】
試験エンドポイントについては、処置開始後42日で実験マウスを屠殺した。原発腫瘍を
切除し、その後の分析のために電子天秤で秤量した。
【０２４６】
化合物の毒性の評価について、処置群及び対照群におけるマウスの平均体重は、実験期
間全体にわたって正常範囲内に維持された。毒性の他の症状はマウスにおいて観察されな
かった。
【０２４７】
実施例１０：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示
した。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボ
で遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
【０２４８】
図2は、GST-πsiRNA（配列番号158及び184）の腫瘍阻害効力を示す。癌異種移植モデル
を、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。
【０２４９】
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。36日
後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、腫瘍体積は対照と比較して2倍減少
した。
【０２５０】
図3に示すように、GST-πsiRNAは、最終日に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示し
た。特に、腫瘍重量は2倍以上減少した。
【０２５１】
組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30
：20：20：5）を有するリポソーム製剤としてGST-πsiRNAを2回の注射（1日目及び15日目
）で投与した。
【０２５２】
癌異種移植モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。10％ウシ胎仔血清及び100U/ml
ペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充した培養培地中で細胞を維持した。
接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプ
シン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、ト
リパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清
を含まない培地中で5×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したB
Dマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
【０２５３】
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーの胸腺ヌードマウス（nu/nu）雌マウス
、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり7〜8匹のマウスとした。
【０２５４】
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5
×106個のA549細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔を
かけられなかった。
【０２５５】
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫
瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。確立された腫瘍が約120〜175mm
3に達すると、平均腫瘍体積は約150mm3であり、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群
の平均腫瘍体積の10％以内になるように、マウスを様々なビヒクル対照及び処置群に割り
当てた。理想的には、腫瘍体積のCV％を25％未満とした。同じ日に、試験品及び対照ビヒ
クルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍体積を第1週に3回、研究終了の日を含む残り
の週に2回モニターした。
【０２５６】
投薬投与のために、投与日に、試験品を-80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した
。注射器にアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回戻した。全ての試験品には
、0.75mg/kgでIV、q2wX2、10ml/kgで投与した。
【０２５７】
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。体重をモニターし、初回投与の
7日以内に毎日記録した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週に
２回記録した。
【０２５８】
最初の投薬の28日後に腫瘍を採取するために、腫瘍体積を測定し、重量測定のために腫
瘍を切開し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。
【０２５９】
実施例１１：本発明のGST-πsiRNAは、in vitroで癌細胞のアポトーシスにより癌細胞
死の増加を示した。GST-πsiRNAはGST-πノックダウンをもたらし、アポトーシスのバイ
オマーカーであるPUMAのアップレギュレーションをもたらし、細胞生存率の低下を伴った
。
【０２６０】
シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe
置換リボヌクレオチドの組合せを含むGST-πsiRNA配列番号158及び184は、予期せず癌細
胞のアポトーシスを増加させた。
【０２６１】
GST-πsiRNA配列番号158及び184に対するPUMAの発現レベルを図4に示した。図4に示す
ように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜4日後に大きく増加し
た。
【０２６２】
これらのデータは、シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌク
レオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組み合わせを含むGST-πsiRNAの構造が、予
想外に癌細胞のアポトーシスを増加させることを示している。
【０２６３】
PUMAバイオマーカーに関するプロトコルは以下の通りとした。トランスフェクションの
1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプ
レートに2×103細胞/ウェルで播種し、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュ
ベーターで培養した。翌日、トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μl
のOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）と交換した。次
いで、0.2μlのLipofectamine RNAiMAX（Life Technologiesカタログ番号13778-100）を4
.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合した。1μlのsiRNA（ストック濃度1μM）を4μlのO
pti-MEM Iと混合し、RNAiMAX溶液と混合し、次いで穏やかに混合した。混合物を室温で10
分間インキュベートし、RNA-RNAiMAX複合体を形成させた。10μlのRNA-RNAiMAX複合体を
ウェル当たりに添加し、siRNAの最終濃度を10nMとした。細胞を2時間インキュベートし、
培地を2％FBSを含む新鮮なOpti-MEM I還元血清培地に交換した。トランスフェクションの
1、2、3、4及び6日後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄し、次いで50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液
（Life Technologiesカタログ番号4391851C）を用いて室温で約5〜30分溶解した。5μlの
停止溶液を添加し、室温で2分間インキュベートした。PUMA（BBC3、Cat＃Hs00248075、Li
fe Technologies）のmRNAレベルをTAQMANを用いてqPCRにより測定した。
【０２６４】
実施例１２：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示
すことができた。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植腫瘍に投与された場合、
インビボで遺伝子ノックダウン効力を提供することができる。
【０２６５】
図5は、GST-πsiRNA（配列番号63及び128）の腫瘍阻害効力を示している。GST-πmRNA
の用量依存的ノックダウンは、GST-πを標的とするsiRNAでインビボで観察された。癌異
種移植片モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量と共に使用した
。
【０２６６】
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。図5に
示すように、GST-πsiRNAで処理すると、脂質製剤に注射してから4日後にGST-πmRNA発現
が有意に減少した。4mg/kgの高用量では、注入後24時間で約40％の有意な減少が検出され
た。
【０２６７】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PE
G-2K）（25：30：20：20：5）を有する10mL/kgのリポソーム製剤として単回注射で投与し
た。
【０２６８】
癌異種移植片モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。細胞を、10％ウシ胎仔血清及
び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持し
た。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をト
リプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し
、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。血清を含
まないRPMI培地中で細胞を4×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解
凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
【０２６９】
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー胸腺ヌード（nu/nu）雌マウス、免疫不
全、6〜8週齢、1群当たり3匹のマウスであった。
【０２７０】
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及び注射器を用いて、2×10
6のA549細胞の接種材料0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけ
られなかった。
【０２７１】
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫
瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。腫瘍容積を週2回モニターした
。確立された腫瘍が約350〜600mm3に達すると、マウスを様々な時点で群に割り当てた。
同じ日に、試験品を投与レジメンに従って投与した。
【０２７２】
投薬投与のために、確立された腫瘍が約350〜600mm3に達した日に、試験品を4℃の冷蔵
庫から取り出した。シリンジにアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回戻して
均一な溶液を作製した。
【０２７３】
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。研究の終了日を含む残りの数週
間、体重を数週間監視し、週2回記録した。
【０２７４】
腫瘍の収集のために、動物を過量のCO2で犠牲にし、投与後0、24、48、72及び96（任意
）及び168時間で腫瘍を解剖した。腫瘍を最初に湿潤し、KD、分布及びバイオマーカー分
析のために3つの部分に分けた。試料を液体窒素中で急速冷凍し、処理する準備が整うま
で-80℃で保存した。
【０２７５】
実施例１３：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで膵臓癌異種移植片腫瘍を阻害した。G
ST-πsiRNAは、リポソーム製剤で膵臓癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボで遺
伝子ノックダウン効力をもたらした。
【０２７６】
この異種移植モデルでは、各マウスに、2.5×106のPANC-1細胞接種物0.1mlを右脇腹に
皮下接種した。胸腺欠損ヌード雌マウス（6〜8週齢、Charles River）を用いた。腫瘍の
大きさは、最も近い0.1mmまで測定した。確立された腫瘍が約150〜250mm3（平均腫瘍体積
約200mm3）に達すると、マウスを、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群における平均
腫瘍体積の10％以内になるように、様々なビヒクル対照及び処置群に割り当てた。同じ日
に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍容積を第1週に3回、
研究終了日を含めて残りの週では2回モニターした。
【０２７７】
図6は、GST-πsiRNA（配列番号63及び128）の腫瘍阻害効力を示している。図6に示すよ
うに、用量応答は、GST-πを標的とするsiRNAの0.375mg/kg〜3mg/kgの範囲の用量で得ら
れた。GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で、且つ予想外に有利な腫瘍阻害効力を示
した。したがって、GST-πsiRNAは、エンドポイントで有意で、且つ予想外に有利な腫瘍
阻害効力を示した。
【０２７８】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PE
G-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤で投与した。
【０２７９】
実施例１４：本発明のGST-πsiRNAは、増加した血清安定性を示した。
図7は、ヒト血清中でのインキュベーション及びHPLS/LCMSによる様々な時点での残りの
siRNAの検出を示している。図7に示すように、GST-πsiRNA（配列番号63及び128）のセン
ス鎖（図7、上段）及びアンチセンス鎖（図7、下段）の両方の血清中の半減期（t1/2）は
約100分であった。
【０２８０】
実施例１５：本発明のGST-πsiRNAは、血漿中での製剤中の安定性の向上を示した。
図8は、血漿中での製剤のインキュベーション及び様々な時点での残りのsiRNAの検出を
示している。図8に示すように、GST-πsiRNA製剤（配列番号63及び128）の血漿中半減期
（t1/2）は100時間よりも有意に長かった。
【０２８１】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）
（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤で調製した。リポソームナノ粒子のz平均
サイズは40.0nmであり、siRNAは91％カプセル化されていた。
【０２８２】
製剤をPBS中の50％ヒト血清中で40分、1.5時間、3時間、24時間及び96時間インキュベ
ートした。GST-πsiRNAの量は、ELISAベースのアッセイによって決定した。
【０２８３】
実施例１６：本発明のGST-πsiRNAは、パッセンジャー鎖によるオフターゲット効果の
低下を示した。
【０２８４】
GST-πsiRNA（配列番号158及び184）について、図9は、効果を示さなかったスクランブ
ル配列を有する対照と比較して、ガイド鎖についてのインビトロノックダウンがほぼ指数
関数的であったことを示している。このsiRNAのIC50を5pMで測定した。図10は、同じGST-
πsiRNAのパッセンジャー鎖のインビトロノックダウンを示している。図10に示すように
、GST-πsiRNAについてパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウンは100倍以上大き
く減少した。
【０２８５】
GST-πsiRNA（配列番号189及び201）、（配列番号191及び203）及び（配列番号192及び
204）に関して、図11は、ガイド鎖のインビトロノックダウンはおよそ指数関数的であっ
たことを示している。これらのsiRNAのIC50を、それぞれ6、7及び5pMで測定した。図12に
示すように、これらのGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のインビトロノックダウンは、少
なくとも10倍まで有意に減少した。これらのGST-πsiRNAはすべて、二重鎖領域のシード
領域にデオキシヌクレオチドを有し、当該二重鎖領域には他の修飾はなかった。
【０２８６】
GST-πsiRNA（配列番号219及び234）について、図13は、この高活性なGST-πsiRNAのガ
イド鎖についてのインビトロノックダウンがほぼ指数関数的であったことを示している。
このsiRNAのIC50を11pMで測定した。図14に示すように、このGST-πsiRNAのパッセンジャ
ー鎖に対するインビトロノックダウンは、100倍を超えて有意に減少した。このGST-πsiR
NAは、二重鎖領域のシード領域にデオキシヌクレオチドを有し、当該二重鎖領域には他の
修飾はなかった。
【０２８７】
オフターゲット効果は、Renillaルシフェラーゼ遺伝子をコードする発現レポータープ
ラスミドpsiCHECK-2を用いて決定した（二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム
、Promega、カタログ番号：E1960）。siRNA濃度は典型的には50pMであった。プロトコル
：1日目、HeLa細胞を5〜7.5×103/100μl/ウェルで播種した。2日目、約80％の細胞コン
フルエンスでの同時トランスフェクション。3日目に、細胞を採取してルシフェラーゼ活
性測定を行った。ルシフェラーゼ活性を、プロメガ社のルシフェラーゼアッセイシステム
（E4550）を用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。
【０２８８】
psiCHECK-2ベクターは、Renillaルシフェラーゼのレポーター遺伝子に融合した標的遺
伝子の発現の変化をモニタリングすることができる。siRNA構築物を多重クローニング領
域にクローニングし、ベクターをHeLa細胞にsiRNAとともに同時トランスフェクションし
た。特定のsiRNAが標的mRNAに結合し、RNAiプロセスを開始する場合、融合Renillaルシフ
ェラーゼ：構築mRNAは切断され、続いて分解され、Renillaルシフェラーゼシグナルを減
少させる。
【０２８９】
例えば、BU2’構造を有するsiRNAのためのプラスミド挿入物は以下の通りとした：
PsiCHECK-2（F）プラスミド挿入物：
配列番号288
ctcgag gggcaacTGAAGCCTTTTGAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（R）プラスミド挿入物：
配列番号289
ctcgag cTgggacagCAGGGTCTCAAAAGGCTTCagTTgccc gcggccgc
【０２９０】
実施例１７：本発明のGST-πsiRNAは、シード依存性の意図しないオフターゲット遺伝
子サイレンシングである、miRNA様オフターゲット効果が有利に減少したことを示した。
【０２９１】
GST-πsiRNA（配列番号158及び184）、（配列番号189及び201）、（配列番号191及び20
3）、（配列番号192及び204）及び（配列番号219及び234）に関して、miRNAを模倣するオ
フターゲット活性は、本質的に無視できることが判明した。これらのGST-πsiRNAのシー
ド依存性の意図しないオフターゲット遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖の標的活性より
も少なくとも10倍〜100倍小さかった。
【０２９２】
miRNA関連オフターゲット効果を試験するために、アンチセンス鎖の5’末端の1~8位の
位置である、シード含有領域全体に相補的ではあるが残りの非シード領域（位置9〜21）
相補的ではない、1〜4回反復のシード適合標的配列を、ルシフェラーゼmRNAの3'UTRに対
応する領域に導入して、シード依存性の意図しないオフターゲット効果の効率を決定した
。プラスミド挿入物を用いて、シード領域における完全なマッチング及び非シード領域に
おけるミスマッチ（バルジ）を有するmiRNAを模倣した。
【０２９３】
例えば、BU2’構造を有するsiRNAについてのプラスミド挿入物は以下の通りとした：
PsiCHECK-2（Fmi1）プラスミド挿入物：
配列番号290
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi2）プラスミド挿入物：
配列番号291
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi3）プラスミド挿入物：
配列番号292
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT
gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi4）プラスミド挿入物：
配列番号293
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTG
cT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
【０２９４】
さらなる定義
本明細書中で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、及び各用語が使用される
特定の文脈において、当技術分野における通常の意味を有する。用語が詳細に説明されて
いるか否か、又は本明細書で論じられているかどうかは特に重要ではない。本開示におけ
る実施例の説明は例示的なものに過ぎず、決して本発明の範囲及び意味を限定するもので
はない。
【０２９５】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明
が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参
考文献は、本発明で使用される特定の用語の一般的な定義を提供することができる：Sing
letonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第2版、1994）；ケンブ
リッジ科学技術辞典（Walker ed., 1988）；R. Rieger et al., The Genetics、5th Ed. 
（編）、Springer Verlag（1991）；Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of
Biology (1991)
【０２９６】
「新生物（neoplasia）」は、細胞分裂の不適切な高レベル、不適切な低レベルのアポ
トーシス、又はその両方によって引き起こされるか又は結果として起こる任意の疾患を意
味することができる。例えば、癌は新生物の一例である。癌は、例えば、急性白血病、急
性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、
急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血
病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）
、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖症等の白血病、及び、非上皮性悪性
腫瘍（肉腫）及び上皮性悪性腫瘍（線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、
脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管路表皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユ
ーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁
平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄
様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス
腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状
細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神
経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）といった固形腫瘍が含まれる
。リンパ増殖性障害もまた、増殖性疾患であると考えられている。
【０２９７】
「核酸」は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸又はその類似体のオリゴマー又はポリマー
を意味する。この用語は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるオリゴ
マーならびに同様に機能する非天然部分を有するオリゴマーを含む。そのような修飾又は
置換オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼの存在下での安定性の向上などの特性
のために、しばしば天然形態よりも好ましい。
【０２９８】
「実質的に同一」とは、タンパク質又は核酸分子が、参照アミノ酸配列（例えば、本明
細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ）又は核酸配列（例えば、本明細書中に記載さ
れる核酸配列）と少なくとも50％の同一性を示すことを意味する。好ましくは、そのよう
な配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベル又は核酸において少なくとも60
％、より好ましくは80％又は85％、さらにより好ましくは90％、95％又はさらには99％同
一である。
【０２９９】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Grou
pのSequence Analysisソフトウェアパッケージ、University of Wisconsin Biotechnolog
y Centre、1710 University Avenue、Madison、Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP、又は
PILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使って測定される。そのようなソフトウェアは、様々な
置換、欠失、及び/又は他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一又は類
似の配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシ
ン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アス
パラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニ
ン、チロシンである。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、e-3とe-1
00との間の確率スコアが密接に関連する配列を示すBLASTプログラムを使用することがで
きる。
【０３００】
「阻害性核酸」とは、単鎖又は二本鎖RNA、siRNA（短い干渉RNA）、shRNA（ショートヘ
アピンRNA）又はアンチセンスRNA若しくはその一部若しくはその模倣物を意味し、哺乳動
物細胞に投与された場合に、標的遺伝子の発現の減少をもたらす（例えば、10％、25％、
50％、75％、又はさらには90〜100％）。典型的には、核酸インヒビターは、標的核酸分
子の少なくとも一部又はそのオルソログを含むか又は対応するか、又は標的核酸分子の相
補鎖の少なくとも一部を含む。
【０３０１】
「アンチセンス核酸」とは、RNA-RNA又はRNA-DNA相互作用によって標的RNAに結合し、
標的RNAの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（総説として、Steinら 1993; W
oolfら、米国特許第5,849,902号）。典型的には、アンチセンス分子は標的配列に相補的
であり、アンチセンス分子の単一の連続した配列に沿っている。しかし、特定の実施形態
では、アンチセンス分子は基質分子がループを形成し、及び/又はアンチセンス分子が結
合してアンチセンス分子がループを形成するように基質に結合することができる。したが
って、アンチセンス分子は、2つ（又はそれ以上）の非隣接基質配列に相補的であっても
良いし、又はアンチセンス分子の2つ（又はそれ以上）の非隣接配列部分が標的配列又は
その両方に相補的であってもよい。現在のアンチセンス戦略の総説についてはSchmajuk N
Aら、1999; Delihas Nら、1997; Aboul-Fadl T、2005参照。
【０３０２】
「siRNA」という用語は、低分子干渉RNAを指す。siRNAは、参照又は標的遺伝子配列に
「対応する」又は一致する二本鎖RNAである。このマッチングは、siRNAの各鎖が標的配列
の少なくとも一部に結合することができる限り完全である必要はない。siRNAを用いて遺
伝子発現を阻害することができる（例えば、Bass、2001、Nature、411,428,429; Elbashi
rら、2001、Nature、411、494、498; 及びZamoreら、Cell 101：25-33（2000））。
【０３０３】
本明細書に記載された実施形態は限定的ではなく、当業者は、本明細書に記載の修飾の
特定の組み合わせを、改善されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験
なしに試験することができることを容易に理解することができる。
【０３０４】
本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のため
にその全体が参考として援用される。
【０３０５】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これ
らは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説
明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説
明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変
更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にある
ことは、当業者にとって極めて明らかである。
【０３０６】
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の
言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「
少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（com
prises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（includin
g）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべ
きである。
【０３０７】
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個
の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個
々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについて
は、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサ
ブグループを含むことを認識するであろう。
【０３０８】
それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用する
ことができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解
釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
【０３０９】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。
本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴
と置き換えることができる。
【図１】
2019508379.tif 000022
【図２】
2019508379.tif 000023
【図３】
2019508379.tif 000024
【図４】
2019508379.tif 000025
【図５】
2019508379.tif 000026
【図６】
2019508379.tif 000027
【図７】
2019508379.tif 000028
【図８】
2019508379.tif 000029
【図９】
2019508379.tif 000030
【図１０】
2019508379.tif 000031
【図１１】
2019508379.tif 000032
【図１２】
2019508379.tif 000033
【図１３】
2019508379.tif 000034
【図１４】
2019508379.tif 000035
【配列表】
2019508379000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月17日(2018.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むGST-πの発現を阻害する核酸分子であって、前記鎖が二重鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖は配列番号１９７のヌクレオチド配列又は修飾を有する当該ヌクレオチド鎖を含み、前記センス鎖は配列番号１８５のヌクレオチド配列又は修飾を有する当該ヌクレオチド鎖を含む（これらヌクレオチド配列において、A、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUであり、NはA、C、G、U、2'-OMe置換U、a、c、g、u、t、修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである（a、c、g、u及びtはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-C、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-U及び2'-デオキシ-T））、核酸分子。
【請求項２】
前記修飾が、2’-デオキシヌクレオチド、2’-O-アルキル置換ヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が複数の位置にデオキシヌクレオチドを有し、前記複数の位置が以下のうちの1つである、請求項１記載の核酸分子。
アンチセンス鎖の5’末端からの位置4、6及び8のそれぞれ;
アンチセンス鎖の5’末端からの位置3、5及び7のそれぞれ; 
アンチセンス鎖の5’末端からの位置1、3、5及び7のそれぞれ; 
アンチセンス鎖の5’末端からの位置3〜8のそれぞれ;又は
アンチセンス鎖の5’末端からの位置5〜8のそれぞれ
【請求項４】
前記二重鎖領域内に1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを有する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
上記アンチセンス鎖及び上記センス鎖は、下記表のIDで示される組み合わせであることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【表１】
2019508379.tif 000036
ここで、表中の大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味し、小文字a、u、g、c及びtはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味し、下線は2'-OMe置換体を意味し、小文字のfは2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味する。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項記載の核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
前記担体が脂質分子又はリポソームを含む、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び癌腫から選ばれる少なくとも一種に対する治療のための請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜５いずれか１項記載の核酸分子を含むベクター又は細胞。
【国際調査報告】
2019508379.tif 000037
2019508379.tif 000038
2019508379.tif 000039