(57)【要約】  本発明は、対象において免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節する方法に関し、当該方法は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を変更する化合物を対象に投与することを含む。本発明は、対象においてＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節するための化合物、並びにそのような化合物の同定するためのスクリーニング方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節する方法であって、前記対象に、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記化合物がＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させ、前記免疫応答及び／又はサイトカイン産生が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増大したＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性がＩＲＦ３依存性サイトカイン転写を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜１１のいずれか１つ以上と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列又はその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコード化する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、前記対象における前記ポリヌクレオチドの発現を指揮するプロモータに機能的に連結される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドを発現ベクター中で投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１１のいずれか１つ以上に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列又はその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的に活性なフラグメントは機能的無秩序領域が欠けている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させ、前記免疫応答及び／又はサイトカイン産生が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、Ｃ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の低下がＩＲＦ３依存性サイトカイン転写を増加させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子である、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが前記Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現を減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ分子又はそれに由来するプロセッシングされたＲＮＡ分子から選択される、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが前記対象に投与された導入遺伝子から発現される、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドがＣ６ｏｒｆ１０６に結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、又はＸＮＡアプタマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物がＣ６ｏｒｆ１０６と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが抗体又は抗原結合フラグメントである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫応答がＩＦＮ応答である、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫応答がＩ型ＩＦＮ応答である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サイトカインがＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αのうちの１つ、それ以上、又は全部である、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が抗ウイルス免疫応答、自己免疫応答、炎症反応から選択される、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が抗ウイルス免疫応答であり、前記免疫応答及び／又はサイトカイン産生が増大する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫応答が炎症反応であり、前記免疫応答及び／又はサイトカイン産生が減少する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が以下の疾患、すなわち、感染、免疫不全、自己免疫疾患、炎症性疾患又はがんのうちの１つ以上を有する、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記感染がウイルス感染である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスが、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス及びコロナウイルスから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象に、前記ウイルスに対する免疫応答を刺激する少なくとも１つの抗原も投与する、請求項３０から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記自己免疫疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、関節リウマチ、多発性関節炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、喘息、１型糖尿病、２型糖尿病、狼瘡又は慢性閉塞性肺疾患から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象にさらに、前記がんに対する免疫応答を刺激する少なくとも１つの抗原も投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
対象における感染、免疫不全又はがんの治療及び／又は予防方法であって、前記対象に、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
対象における自己免疫疾患の治療及び／又は予防方法であって、前記対象に、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３８】
Ｃ６ｏｒｆ１０６が、配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が動物である、請求項１から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が哺乳類である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象がヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節するための薬物の製造におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物の使用。
【請求項４３】
対象における感染、免疫不全又はがんを治療するための薬物の製造におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物の使用。
【請求項４４】
対象における自己免疫疾患を治療するための薬物の製造におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加させる化合物の使用。
【請求項４５】
対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生の調節で使用するためのＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物。
【請求項４６】
ウイルス感染又はがんの治療において使用するためのＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物。
【請求項４７】
自己免疫疾患の治療において使用するためのＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる化合物。
【請求項４８】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を同定する方法であって、
ｉ）細胞を候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が前記細胞においてＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加又は低下させるかを判定すること
を含む、前記方法。
【請求項４９】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を同定する方法であって、
ｉ）細胞を候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞においてＩＲＦ３依存性サイトカイン転写を増加させるか又は低下させるかを判定すること
を含む、前記方法。
【請求項５０】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物を同定する方法であって、
ｉ）細胞を候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が前記細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を減少させるか否かを判定すること
を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６ｍＲＮＡの前記レベルを決定することを含む、請求項４８から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質の前記レベルを決定することを含む、請求項４８から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合する化合物を同定する方法であって、
ｉ）配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列又はその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドを候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が前記ポリペプチドと結合するか否かを判定すること
を含む、前記方法。
【請求項５４】
前記候補化合物が抗体もしくはそのフラグメント、アプタマー又は小分子である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物をコンピュータで同定する方法であって、
ｉ）配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列又はその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、及び
ｉｉ）前記構造に潜在的に結合する化合物について設計又はスクリーニングすること、及び／又は
ｉｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を減少させる化合物について設計又はスクリーニングすること
を含む、前記方法。
【請求項５６】
ｉｉ）において設計又はスクリーニングされた前記化合物を、Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節するその能力について試験することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ｉｉ）において設計又はスクリーニングされた前記化合物を、ウイルス感染を調節するその能力について試験することをさらに含む、請求項５５又は請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記天然に存在する分子と比べて改変された活性を有する天然に存在するＣ６ｏｒｆ１０６ポリペプチドの単離及び／又は組換え変異体。
【請求項５９】
配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むが、機能的ＵＢＡ様ドメイン、機能的無秩序領域，及び／又は機能的ＦＷドメインが欠損している、請求項５８に記載の単離及び／又は組換え変異体。
【請求項６０】
配列番号１〜１１のいずれか１つの約７６のＮ末端アミノ酸アミノが欠損している、請求項５８又は請求項５９に記載の単離及び／又は組換え変異体。
【請求項６１】
請求項５９又は６０に記載の単離及び／又は組換え変異体をコード化する単離及び／又は外因性ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節する方法であって、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を対象に投与することを含む前記方法に関する。本発明はまた、対象におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変するための化合物、ならびにそのような化合物を同定するためのスクリーニング法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫関連疾患の治療及び／又は予防の新規方法を開発するために免疫応答のモジュレータを同定する必要がある。特に、ウイルス、細菌、原生動物又は真菌感染などの感染に対する免疫応答を増大させる新規方法が必要とされる。新興感染性疾患は、そのような感染に対して利用可能な治療又は予防法がないことが多いので特に問題である。例えば、野生生物や家畜から出現する人畜共通ウイルスは、ヒトや動物の健康に深刻な脅威をもたらし、次の大流行の最も有力な原因と認識されている。新興感染性疾患は、予測不可能であり、またヒトのための抗ウイルス治療法などの有効な抑制手段がないために、新興感染性疾患の勃発の抑制は、多くの場合困難である。したがって、免疫応答を増大させて感染に対する防御を提供する免疫系のモジュレータが必要とされている。
【０００３】
さらに、対象が免疫不全、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において免疫不全を経験している場合、免疫応答を増大させるための免疫応答の新規モジュレータも必要とされる。
【０００４】
さらに、過敏性又は不適切な免疫応答を低下させることができる免疫応答のモジュレータが必要とされている。これは、自己免疫疾患などの慢性炎症の疾患において特に重要である。そのようなモジュレータはまた、損傷、例えば外傷に起因する損傷によって引き起こされる炎症についても興味深い。そのようなモジュレータは炎症を軽減できる。
【０００５】
したがって、感染、免疫不全、自己免疫疾患及びがんなどの疾患を治療するための方法で使用できる、免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節するための新規標的、方法及び化合物を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節することで、免疫応答及び／又はサイトカイン産生が調節されることを特定した。
【０００７】
したがって、一態様において、本発明は、対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節する方法であって、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明者らは、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質がＩＲＦと結合することも見出した。したがって、一実施形態において、化合物は、Ｃ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を改変する。
【０００９】
一実施形態では、化合物はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させ、免疫応答及び／又はサイトカイン産生は減少する。一実施形態では、増加したＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性はＩＲＦ３依存性サイトカイン転写を減少させる。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加させることで、ＮＦ−κＢ活性は低下する。そのような化合物の例としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１１のいずれか１つ以上又はその生物学的に活性なフラグメントと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象においてポリヌクレオチドを発現させるプロモータと機能的に連結される。一実施形態において、ポリヌクレオチドは発現構築物である。
【００１１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは発現ベクター中で投与される。任意の好適な発現ベクターを使用することができ、その例としては、真核生物、原核生物又はウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター又はそれに由来するベクターである。
【００１２】
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１〜１１のいずれか１つ以上又はその生物学的に活性なフラグメントと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的ＵＢＡ様ドメインが欠けている。一実施形態では、ＵＢＡ様ドメインは配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＵＢＡ様ドメインは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的ＦＷドメインが欠けている。一実施形態において、ＦＷドメインは配列番号５７に示されるアミノ酸を含む。一実施形態において、ＦＷドメインは配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＦＷドメインは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的無秩序領域が欠けている。一実施形態において、無秩序領域は配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、無秩序領域は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一実施形態では、化合物はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させ、そして免疫応答及び／又はサイトカイン産生が増加する。一実施形態では、化合物はＣ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を減少させる。一実施形態では、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させることで、ＩＲＦ３依存性サイトカイン転写は増加する。一実施形態では、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させることでＮＦ−κＢ活性が増大する。
【００１４】
一実施形態において、化合物は細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６の転位置を改変する。
【００１５】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加又は低下させる化合物の例としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドはＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現を減少させる。Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子発現を減少させるために使用することができるポリヌクレオチドの例としては、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子又はそれに由来するプロセッシングされたＲＮＡ分子から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアプタマーである。
【００１７】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは対象に投与された導入遺伝子から発現される。一実施形態において、導入遺伝子は核酸構築物中にある。一実施形態において、導入遺伝子は発現ベクター中にある。
【００１８】
一実施形態において、ポリヌクレオチドはＣ６ｏｒｆ１０６と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる。一実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、又はＸＮＡアプタマーである。一実施形態において、アプタマーはＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現を減少させる。一実施形態において、アプタマーはＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる。
【００１９】
一実施形態において、化合物はＣ６ｏｒｆ１０６と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる。一実施形態において、化合物は抗体又は抗原結合フラグメントである。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。
【００２０】
一実施形態において、化合物は、遺伝子改変をＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はその調節領域に導入するために標的化されたプログラム可能なヌクレアーゼである。
【００２１】
一実施形態において、免疫応答はＩＦＮ応答である。一実施形態において、免疫応答はＩ型ＩＦＮ応答である。
【００２２】
一実施形態において、サイトカインはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αのうちの１つ、それ以上、又は全部である。一実施形態において、サイトカインはＩＦＮ−αである。一実施形態において、サイトカインはＩＦＮ−βである。一実施形態において、サイトカインはＴＮＦ−αである。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の増加は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αのうちの１つ、それ以上、又は全部の転写を阻害する。一実施形態において、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αの転写調節は、ＩＲＦ３及びＮＦκＢ翻訳とは無関係である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の増加はＩＦＮ−α転写を阻害する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の増加はＩＦＮ−β転写を阻害する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の増加はＴＮＦ−α転写を阻害する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の増加は下流のＩＦＮ及び／又はＴＮＦ−αシグナル伝達、例えばＩＳＧ１５又はＩκＢα活性を調節しない。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の低下はＩＦＮ−α転写を増大させる。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の低下はＩＦＮ−β転写を増大させる。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性の低下はＴＮＦ−α転写を増大させる。
【００２３】
一実施形態において、免疫応答は、抗ウイルス免疫応答、自己免疫応答及び炎症反応から選択される。
【００２４】
一実施形態において、免疫応答は抗ウイルス免疫応答であり、免疫応答及び／又はサイトカイン産生は増加する。
【００２５】
一実施形態において、免疫応答は炎症反応であり、免疫応答及び／又はサイトカイン産生は減少する。
【００２６】
一実施形態において、対象は以下の疾患：感染、免疫不全、自己免疫疾患、炎症性疾患又はがんのうちの１つもしくはそれ以上に罹患している。
【００２７】
一実施形態において、感染はウイルス感染である。一実施形態において、ウイルスはマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。
【００２８】
一実施形態において、ウイルスは：モノネガウイルス、ヘルペスウイルス又はニドウイルス目の形態である。
【００２９】
一実施形態において、ウイルスは、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉａｄｅ）及びコロナウイルスから選択される。
【００３０】
一実施形態において、ウイルスはモノネガウイルス目由来である。一実施形態において、モノネガウイルスは、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス及びボルナウイルスから選択される。
【００３１】
一実施形態において、対象にはさらに、免疫応答を刺激する少なくとも１つの抗原も投与される。一実施形態において、少なくとも１つの抗原は、植物抗原（例えば花粉）、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏｎ）抗原、又は腫瘍抗原である。一実施形態において、対象に、ウイルスに対する免疫応答を刺激する抗原を投与する。
【００３２】
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６活性を低下させる化合物を、少なくとも１つの抗原又はワクチン組成物とともに投与して、少なくとも１つの抗原又はワクチン組成物に対する免疫応答を増大させる。
【００３３】
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６活性を低下させる化合物を少なくとも１つのがん抗原とともに投与して、少なくとも１つのがん抗原に対する免疫応答を増大させる。
【００３４】
一実施形態において、自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、関節リウマチ、多発性関節炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、喘息、１型糖尿病、２型糖尿病、狼瘡又は慢性閉塞性肺疾患から選択される。
【００３５】
一実施形態において、対象には、がんに対する免疫応答を刺激する抗原も投与される。
【００３６】
一態様において、本発明は、対象における感染又はがんを治療及び／又は予防する方法であって、前記対象にＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物を投与することを含む前記方法を提供する。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、対象における自己免疫疾患の治療及び／又は予防方法であって、前記対象にＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる化合物を投与することを含む前記方法を提供する。
【００３８】
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
一実施形態において、対象は動物である。一実施形態において、対象は哺乳類である。一実施形態において、対象はヒトである。
【００４０】
一態様において、本発明は、対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節するための薬物の製造におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物の使用を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、対象における感染、免疫不全又はがんを治療するための薬物の製造におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物の使用を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、対象における自己免疫疾患を治療するための薬物の製造におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加させる化合物の使用を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節するのに使用するためのＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ウイルス感染又はがんの治療で使用するためのＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、自己免疫疾患の治療で使用するためのＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる化合物を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、対象における免疫応答及び／又はサイトカイン産生の調節で使用するための、Ｃ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を改変する化合物を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を同定する方法であって、
ｉ）細胞を候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加させるか又は低下させるかを判定することを含む前記方法を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物を同定する方法であって、
ｉ）細胞を候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞においてＩＲＦ３依存性サイトカイン転写を増加させるか、又は減少させるかを判定することを含む前記方法を提供する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる化合物を同定する方法であって、
ｉ）細胞を候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が、前記細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を減少させるか否かを判定することを含む前記方法を提供する。
【００５０】
一実施形態において、方法は、ウイルス感染を調節するその能力について化合物を試験することをさらに含む。一実施形態において、ウイルス感染をインビトロ、インオボ又はインビボで評価する。一実施形態において、ウイルス感染をインビトロで評価する。一実施形態において、ウイルス感染をＨｅＬａ細胞においてインビトロで評価する。
【００５１】
一実施形態において、方法は、細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６ｍＲＮＡのレベルを決定することを含む。一実施形態において、細胞は哺乳類又はトリ細胞である。一実施形態において、細胞はＨｅＬａ細胞などのヒト細胞である。一実施形態において、ｍＲＮＡレベルはｑＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲによって決定する。
【００５２】
一実施形態において、方法は、細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質のレベルを決定することを含む。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質のレベルは、イムノアッセイによって決定する。例示的イムノアッセイフォーマットには、イムノブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素イムノアッセイが含まれる。
【００５３】
別の態様では、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合する化合物を同定する方法であって、
ｉ）配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列又はその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドを候補化合物と接触させ、そして
ｉｉ）前記化合物が前記ポリペプチドと結合するか否かを判定することを含む前記方法を提供する。
【００５４】
一実施形態において、候補化合物は抗体又はそのフラグメント、アプタマー又は小分子である。
【００５５】
別の態様では、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物をコンピュータにより同定する方法であって、
ｉ）配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列又はその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドの三次元構造モデルを作成し、そして
ｉｉ）構造に潜在的に結合する化合物について設計又はスクリーニングし、及び／又は
ｉｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を改変する化合物について設計又はスクリーニングすることを含む前記方法を提供する。
【００５６】
一実施形態において、方法は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性と結合し調節するその能力について、ｉｉ）において設計又はスクリーニングした化合物を試験することをさらに含む。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性と結合し調節する能力は、イムノアッセイによって決定される。例示的イムノアッセイフォーマットには、イムノブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素イムノアッセイが含まれる。
【００５７】
一実施形態において、方法は、ｉｉ）において設計又はスクリーニングした化合物を、ウイルス感染を調節するその能力について試験することをさらに含む。一実施形態において、ウイルス感染をインビトロ、インオボ又はインビボで評価する。一実施形態において、ウイルス感染をインビトロで評価する。一実施形態において、ウイルス感染をＨｅＬａ細胞においてインビトロで評価する。
【００５８】
一実施形態では、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節することによりＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる。
【００５９】
一実施形態では、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節することでＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる。
【００６０】
一態様において、本発明は、天然に存在する分子と比較して改変された活性を有する天然に存在するＣ６ｏｒｆ１０６ポリペプチドの単離及び／又は組換え変異体を提供する。
【００６１】
一実施形態において、本発明は、配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むが、機能的ＵＢＡ様ドメインが欠けている単離及び／又は組換えポリペプチドを提供する。一実施形態において、ＵＢＡ様ドメインは配列番号１〜１１のいずれか１つの約７６のＮ末端アミノ酸アミノが欠けている。一実施形態において、ＵＢＡ様ドメインは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＵＢＡ様ドメインは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むが、機能的ＦＷドメインが欠けている単離及び／又は組換えポリペプチド。一実施形態において、ＦＷドメインは配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＦＷドメインは配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＦＷドメインは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、配列番号１〜１１のいずれか１つと少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むが、機能的無秩序領域が欠けている単離及び／又は組換えポリペプチド。一実施形態において、無秩序領域は配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、無秩序領域は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００６２】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコード化する単離及び／又は外因性ポリヌクレオチドを提供する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコード化する単離及び／又は外因性ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は１つ又はそれ以上の賦形剤をさらに含む。一実施形態において、組成物は免疫応答を刺激する少なくとも１つの抗原をさらに含む。
【００６４】
本明細書中で開示されているか又は本願の明細書中で示されているステップ、特徴、整数、組成物及び／又は化合物は、個々にもしくは集合的に、及び２つ以上の前記ステップ又は特徴の組み合わせ。
【００６５】
本明細書中の任意の実施形態は、特に別段の表示がない限り、任意の他の実施形態に準用されるものとする。例えば、当業者は、本発明の方法について前記で概要を示した化合物の例は本発明の使用に等しく適用されることを理解するであろう。
【００６６】
本発明は、例示のみを目的とする本明細書中で記載する特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。機能的に等価な生成物、組成物及び方法は、本明細書中で記載するように、明らかに本発明の範囲内に含まれる。
【００６７】
本明細書全体にわたって、特に別の記載のない限り、又は文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一のステップ、組成物、ステップの群又は組成物の群に関する言及は、１つ及び複数（すなわち、１つもしくはそれ以上）のそれらのステップ、組成物、ステップの群又は組成物の群を包含すると解釈されるべきである。
【００６８】
本発明を、以下の非限定的実施例によって、そして添付の図面を参照して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ｃ６ｏｒｆ１０６ノックダウンはウイルス産生を減少させる。（Ａ）及び（Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、Ｃ６ｏｒｆ１０６を標的とするｓｉＲＮＡプール又は非特異的ＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）で４８時間トランスフェクトさせた。細胞を、ヘンドラ（ＨｅＶ）、おたふくかぜ（ＭｕＶ）、Ａ型インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又は西ナイルウイルス（ＷＮＶ）で感染多重度（ｍｏｉ）５にて２４時間感染させた。この時点で、Ｖｅｒｏ細胞に関するＴＣＩＤ５０によってウイルス産生を分析した。エラーバーは少なくとも３連の標準偏差±１を意味し、有意差（星印によって示す）はＤｕｎｎの多重比較試験（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）での一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。（Ｃ）ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後の細胞数。データをｓｉＮＥＧ値に対して正規化する。（Ｄ）前記ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ）アッセイによって測定した、相対的な細胞代謝活性。
【図２】Ｃ６ｏｒｆ１０６は、２つの推定上の機能ドメイン及び無秩序Ｃ末端領域を有する脊椎動物種にわたって高度に保存されている。Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列はＮＣＢＩ（受入番号Ｑ９Ｈ６Ｋ１．２）から提供され、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してＥｎｓｅｍｂｌ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から予想した様々な脊椎動物Ｃ６ｏｒｆ１０６配列と整列させた。星印は同一の残基を示し、ボックスは、それぞれ推定ＵＢＡ様ドメイン及びＦＷドメインの位置を示す。無秩序なＣ末端（Ｇｌｏｂｐｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｏｂｐｌｏｔ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｃｇｉＤｉｃｔ．ｐｙ）及びＰＳＩ予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｃｓ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｉｐｒｅｄ）によって予測。
【図３】Ｃ６ｏｒｆ１０６ノックダウンはポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してサイトカイン転写を増強する。ＨｅＬａ細胞を、Ｃ６ｏｒｆ１０６を標的とするｓｉＲＮＡプールを標的とするｓｉＲＮＡプール又は非特異的ＲＮＡ（ｓｉＮＴ１／ｓｉＮＴ２）で４８時間トランスフェクトし、次いでポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。（Ａ）遺伝子ノックダウンを、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＣ６ｏｒｆ１０６特異的プライマー／抗体を用いたウェスタンブロッティングによってそれぞれ分析した。（Ｂ）インターフェロン及び炎症性サイトカインの相対的発現は、ＧＡＰＤＨ内部標準と比較して、遺伝子特異的プライマーを用いるｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。
【図４】Ｃ６ｏｒｆ１０６過剰発現はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してインターフェロンα／β転写及び分泌を阻害する。ＨｅＬａ細胞をフラグ（Ｆｌａｇ）標識Ｃ６ｏｒｆ１０６（Ｃ６−フラグ）もしくはｅＧＦＰ又はベクター単独（ｐＣＡＧＧ）で２４時間トランスフェクトし、次いでポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。（Ａ）インターフェロン及び炎症性サイトカインの相対的発現は、ＧＡＰＤＨ内部標準と比較して、遺伝子特異的プライマーを用いるｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。（Ｂ）細胞培養上清中へのインターフェロンβ分泌をＥＬＩＳＡによって検出した。
【図５】内因性サイトカイン及びＣ６ｏｒｆ１０６ＲＮＡレベルはポリ（Ｉ：Ｃ）刺激の時間とともに増加する。（Ａ）模擬トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞をポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激し、次いでＲＮＡを抽出し、サイトカインレベルをｑＰＣＲ分析によって決定した。（Ｂ）表示した時点についての、ポリ（Ｉ：Ｃ）（５μｇ／ｍＬ）で刺激した後のＨｅＬａ細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６及びＩＦＮ−ｂｍＲＮＡレベル。エラーバーは３回の独立した実験の標準偏差−／＋１を意味し、そして星印はＤｕｎｎの多重比較試験を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した有意差（０時間と比較）を意味する。（Ｃ）図４においてと同様に処理したＨｅＬａ細胞をＩＦＮ−β−又はＮＦ−κＢ−ホタル及びウミシイタケ−ルシフェラーゼベクターで２４時間トランスフェクトした。細胞可溶化物をポリ（Ｉ：Ｃ）（５μｇ／ｍＬ、６ｈ）で刺激後にルシフェラーゼ活性について分析し、相対レベルをトランスフェクション対照ウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化した。
【図６】ＵＢＡ様ドメインの欠失は、サイトカイン転写に対するＣ６ｏｒｆ１０６の阻害効果を増強する。（Ａ）Ｃ６ｏｒｆ１０６欠失変異体は、コドン最適化ｐＣＡＧＧｓ−Ｃ６ｏｒｆ１０６ベクターをテンプレートとして使用して産生した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、フラグ標識Ｃ６ｏｒｆ１０６欠失変異体又はベクター単独（ｐＣＡＧＧｓ）で２４時間トランスフェクトし、次いでポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。インターフェロン及び炎症性サイトカインの相対的発現は、ＧＡＰＤＨ内部標準と比較して、遺伝子特異的プライマーを用いるｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。（Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、等量のフラグ−ＩＲＦ３及びＣ６欠失変異体発現ベクターで２４時間逆トランスフェクトし、次いで５μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。細胞を次いで溶解し、抗ＩＲＦ３抗体と直接共免疫沈降に供した。ＩＰサンプル（及び入力対照）を次いでウェスタンブロッティングによって抗フラグ及び抗ＩＲＦ３抗体でプローブした。
【図７】Ｃ６ｏｒｆ１０６過剰発現はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答する転写因子の核移行を損なわない。ＨｅＬａ細胞をフラグ標識Ｃ６ｏｒｆ１０６（Ｃ６−フラグ）もしくはｅＧＦＰ又はベクター単独（ｐＣＡＧＧ）で２４時間トランスフェクトし、次いでポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。（Ａ）細胞を抗Ｃ６及び抗ｐ６５抗体で固定し標識し、核染色Ｄａｐｉで対比染色するか、又は（Ｂ）細胞を抗Ｃ６抗体及び抗ＩＲＦ３抗体で固定し標識し、核染色Ｄａｐｉで対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で観察した。
【図８】Ｃ６ｏｒｆ１０６はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答する転写因子の活性化又は核移行を損なわない。ＨｅＬａ細胞を図７で記載するようにして処理した。（Ａ）ポリ（Ｉ：Ｃ）処置済み又は処置なしの、フラグ標識Ｃ６ｏｒｆ１０６（Ｃ６−フラグ）又はｅＧＦＰでトランスフェクトした細胞の処理群のＦｎ／ｃ比。エラーバーは二連の実験からの典型的な実験の標準偏差±１を意味し、星印はＤｕｎｎの多重比較試験を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した有意差を意味する。（Ｂ）図７において処理したＨｅＬａ細胞を溶解し、細胞質フラクションと核フラクションに分離した。フラクションを転写因子ＩＲＦ３及びｐ６５、ならびにＣ６及びローディング対照ＧＡＰＤＨについてプローブした。
【図９】内因性Ｃ６ｏｒｆ１０６ＲＮＡレベルはポリ（Ｉ：Ｃ）刺激の時間とともに増加する。（Ａ）ＨｅＬａ細胞を１０μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で４、６及び９時間刺激し、そして同じ時点での模擬サンプル（左側の棒グラフ）と比較することによって、内因性Ｃ６ｏｒｆ１０６ＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲ（右側の棒グラフ）により評価した。（Ｂ）ＩＦＮ／ＴＮＦ−ａで誘導されたシグナル伝達はＣ６ｏｒｆ１０６過剰発現によって有意に損なわれることはない。
【図１０】Ｃ６ｏｒｆ１０６はＩＲＦ３と複合体を形成する。（Ａ）Ｃ６ｏｒｆ１０６はＩＲＦ３と複合体を形成し、この結合はポリ（Ｉ：Ｃ）によって増強される。図４のように処理したＨｅＬａ細胞を溶解し、抗ＩＲＦ３抗体を用いた間接的免疫沈降に供した。ＩＰサンプル（及び入力対照）を次いでウェスタンブロッティングによって抗Ｃ６抗体及び抗ＩＲＦ３抗体でプローブした。（Ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１０６がＩＲＦ３と複合体を形成することを示すために、ＩＲＦ３単独、又はＣ６ｏｒｆ１０６との組み合わせでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔを溶解し、抗ＩＲＦ３抗体を用いた間接的免疫沈降に供した。ＩＰサンプル及び入力対照をウェスタンブロッティングについては抗フラグ抗体でプローブした。ＩｇＧアイソタイプを免疫沈降実験の負の対照として使用した。
【図１１】Ｃ６−フラグ欠失変異体は異なる細胞内局在及びＩＲＦ３核輸送に対する効果を有する。Ｈｅｌａ細胞を、フラグ標識Ｃ６ｏｒｆ１０６欠失変異体又はベクター単独（ｐＣＡＧＧ）で２４時間トランスフェクトし、次いで５μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。細胞を固定し、抗Ｃ６／フラグ（緑色）及びＩＲＦ３（赤色）抗体で染色し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で観察した。（Ａ）集められた画像は２回の独立した実験を代表するものであり、バーは１０μｍを示す。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して解析して、ＩＲＦ３（Ｂ）又は欠失変異体（Ｃ）のＦｎ／ｃ比を算出した。エラーバーは二連の実験からの典型的な実験の標準偏差±１を意味し、星印はＤｕｎｎの多重比較試験を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した有意差を意味する。各カラムの上のパーセンテージは、０．５の閾値よりも高いＦｎ／ｃ比を有する細胞の割合を表す（Ｄ）（Ａ）におけるようなＨｅＬａ細胞を溶解し、細胞質フラクションと核フラクションに分離した。フラクションを転写因子ＩＲＦ３及びｐ６５、ならびにＣ６及び／又はフラグについてプローブした。
【００７０】
配列表の凡例
配列番号１  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号２  Ｇ．ｇｏｒｉｌｌａ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号３  Ｃ．ｓａｂａｅｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号４  Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号５  Ｍ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号６  Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号７  Ｇ．ｇａｌｌｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号８  Ａ．ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号９  Ｘ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号１０  Ｄ．ｒｅｒｉｏ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号１１  Ｃ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列；
配列番号１２  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列のＵＢＡ様ドメイン；
配列番号１３  Ｃ６ｏｒｆ１０６ＵＢＡ様ドメインのコンセンサス配列；
配列番号１４  プライマーＳａｃＩ−ＳＴＡＲＴ−Ｃ６  Ｆｏｒ；
配列番号１５  プライマーＸｈｏＩ−Ｃ６−フラグＲｅｖ；
配列番号１６  プライマーＸｈｏＩ−Ｃ６（１−２７６）−フラグＲｅｖ；
配列番号１７  プライマーＸｈｏＩ−Ｃ６（１−１９３）−フラグＲｅｖ；
配列番号１８  プライマーＸｈｏＩ−Ｃ６（１−７６）−フラグＲｅｖ；
配列番号１９  プライマーＳａｃＩ−ＳＴＡＲＴ−Ｃ６−ＵＢＡ  Ｆｏｒ；
配列番号２０  プライマーＩＦＮ−α  Ｆｏｒ；
配列番号２１  プライマーＩＦＮ−α  Ｆｏｒ；
配列番号２２  プライマーＩＦＮ−β  Ｆｏｒ；
配列番号２３  プライマーＩＦＮ−β  Ｒｅｖ；
配列番号２４  プライマーＩＬ−６  Ｆｏｒ；
配列番号２５  プライマーＩＬ−６  Ｒｅｖ；
配列番号２６  プライマーＴＮＦ−α  Ｆｏｒ；
配列番号２７  プライマーＴＮＦ−α  Ｒｅｖ；
配列番号２８  プライマーＩＳＧ１５  Ｆｏｒ；
配列番号２９  プライマーＩＳＧ１５  Ｒｅｖ；
配列番号３０  プライマーＩκＢα  Ｆｏｒ；
配列番号３１  プライマーＩκＢα  Ｒｅｖ；
配列番号３２  プライマーｈｕＣ６ｏｒｆ１０６  Ｆｏｒ；
配列番号３３  プライマーｈｕＣ６ｏｒｆ１０６  Ｒｅｖ；
配列番号３４  プライマーＧＡＰＤＨ  Ｆｏｒ；
配列番号３５  プライマーＧＡＰＤＨ  Ｒｅｖ；
配列番号３６  ｓｉＧＥＮＯＭＥヒトＣ６ｏｒｆ１０６ＳＭＡＲＴプール標的配列Ｄ−０１６３３０−０２−；
配列番号３７  ｓｉＧＥＮＯＭＥヒトＣ６ｏｒｆ１０６ＳＭＡＲＴプール標的配列Ｄ−０１６３３０−０３−；
配列番号３８  ｓｉＧＥＮＯＭＥヒトＣ６ｏｒｆ１０６ＳＭＡＲＴプール標的配列Ｄ−０１６３３０−０４−；
配列番号３９  ｓｉＧＥＮＯＭＥヒトＣ６ｏｒｆ１０６ＳＭＡＲＴプール標的配列Ｄ−０１６３３０−１７−；
配列番号４０  Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグタンパク質配列；
配列番号４１  Ｃ６ｏｒｆ１０６（１−２７６）−フラグタンパク質配列；
配列番号４２  Ｃ６ｏｒｆ１０６（１−１９３）−フラグタンパク質配列／Ｃ６ｏｒｆ１０６（ｄｅｌｔａ  ｄｉｓ）−フラグタンパク質配列；
配列番号４３  Ｃ６ｏｒｆ１０６（１−７６）−フラグタンパク質配列；
配列番号４４  Ｃ６ｏｒｆ１０６（ｄＵＢＡ）−フラグタンパク質配列；
配列番号４５  Ｃ６ｏｒｆ１０６（ｄＦＷ）−フラグタンパク質配列；
配列番号４６  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号４７  Ｇ．ｇｏｒｉｌｌａＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号４８  Ｃ．ｓａｂａｅｕｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号４９  Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５０  Ｍ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５１  Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５２  Ｇ．ｇａｌｌｕｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５３  Ａ．ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５４  Ｘ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５５  Ｄ．ｒｅｒｉｏＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５６  Ｃ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓＣ６ｏｒｆ１０６ヌクレオチド配列；
配列番号５７  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列のＦＷドメイン；
配列番号５８  Ｃ６ｏｒｆ１０６  ＦＷドメインのコンセンサス配列；
配列番号５９  Ｃ６（ｄｅｌｔａＦＷ）−フラグタンパク質配列；
配列番号６０  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列のＦＷドメイン；
配列番号６１  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列の無秩序領域；
配列番号６２  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列の無秩序領域
【発明を実施するための形態】
【００７１】
一般的技術及び選択された定義
特に別段の定めのない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語や科学用語は、当業者（例えば、分子生物学、細胞培養、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）により通常理解されるのと同じ意味を有すると解釈される。
【００７２】
別段の定めのない限り、本発明で用いられる細胞培養及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的手順である。そのような技術は、Ｊ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）、Ｔ．Ａ．  Ｂｒｏｗｎ  （ｅｄｉｔｏｒ），  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１），  Ｄ．Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  ＤＮＡ  Ｃ；ｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５  ａｎｄ  １９９６）、及びＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８８，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ），  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｉｔｏｒｓ）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  （１９８８），  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｉｔｏｒｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （現在までのすべての改訂を含む）などの出典の文献全体にわたって記載し説明されている。
【００７３】
「及び／又は」という語、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」あるいは「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味又はいずれかの意味を明確に指示すると解釈される。
【００７４】
本明細書全体にわたって、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、又は「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓもしくはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載した要素、整数もしくはステップ、又は要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、又は要素、整数もしくはステップの群を除外しないと理解される。
【００７５】
本明細書中で言及される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡ又はＲＮＡテクノロジーによって産生又は変更された遺伝子配列を含み、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変するために使用できる。一例では、導入遺伝子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現を抑制することを標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをコード化する。一例では、導入遺伝子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はタンパク質を認識し結合するアプタマーをコード化する。一例では、導入遺伝子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はそのフラグメントを含む。一例では、導入遺伝子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子及び／又はタンパク質を認識し結合する抗体などの結合タンパク質をコード化する。一例では、導入遺伝子は、プログラム可能なヌクレアーゼ及び任意にＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子の認識を目的とする１つ又はそれ以上のターゲティング配列をコード化する。導入遺伝子は当業者が認識する任意の方法によって対象の細胞に導入することができる。導入遺伝子は、染色体に導入される遺伝子配列ならびに染色体外である遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、典型的には、ポリヌクレオチドを発現するために適したプロモータに機能的に連結される本明細書中に記載されるポリヌクレオチドをコード化するオープンリーディングフレームを含む。
【００７６】
「小分子」という語は、本明細書中で使用する場合、２０００ダルトン未満、好ましくは１５００ダルトン未満、さらに好ましくは１０００ダルトン未満、一層好ましくは７５０ダルトン未満、なお一層好ましくは５００ダルトン未満の分子量を有する化合物又は分子を指す。一実施形態において、小分子はポリペプチドではない。
【００７７】
本明細書中で使用する場合、「対象」という語は任意の動物であり得る。一例では、動物は脊椎動物である。例えば、動物は、哺乳類、トリ、節足動物、脊索動物、両生類又は爬虫類であり得る。対象の例としては、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲した野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一例では、哺乳類はヒトである。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という語は、特定の疾病又は疾患の少なくとも１つの症状を軽減又は排除するために充分な治療有効量の本明細書中で記載する化合物を投与することを含む。
【００７９】
本明細書中で使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ又はｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という語は、特定の疾病又は疾患の少なくとも１つの症状の発生を停止又は妨げるために充分な治療有効量の本明細書中で記載する化合物を投与することを含む。一実施形態において、化合物はウイルスによる細胞の感染を軽減する。
【００８０】
本明細書中で使用する場合、「Ｃ６ｏｒｆ１０６及びＩＲＦ３を含む複合体」という語は、少なくともＣ６ｏｒｆ１０６及びＩＲＦ３を含む複合体を指す。複合体は、１つもしくはそれ以上のタンパク質、１つもしくはそれ以上のＲＮＡ分子、１つもしくはそれ以上のＤＮＡ分子又はそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、「ＩＲＦ３を含む複合体」という語は、１つもしくはそれ以上のタンパク質、１つもしくはそれ以上のＲＮＡ分子、１つもしくはそれ以上のＤＮＡ分子、又はそれらの組み合わせを含む複合体であって、ＩＲＦ３タンパク質を含むかもしくはＩＲＦ３タンパク質と結合するものを包含する。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、「マイナス鎖ＲＮＡウイルス」又は「アンチセンス鎖ＲＮＡウイルス」という語は、マイナス又はアンチセンス鎖であって、ＲＮＡをコード化しないＲＮＡの一本鎖から構成される遺伝情報を有するウイルスを含む。
【００８３】
免疫応答
本明細書中で使用する場合、「免疫応答」という語は当該技術分野でのその通常の意味を有し、体液性免疫及び細胞性免疫の両方を包含する。免疫応答は、抗抗原抗体の発生、抗原特異的Ｔ細胞の増殖、腫瘍浸潤性−リンパ球（ＴＩＬ）の増加、抗腫瘍又は抗腫瘍抗原遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答の発生、病原体のクリアランス、病原体及び／又は腫瘍成長及び／又は伝播の抑制、腫瘍減少、転移の減少又は消失、再発までの時間の延長、無病原体又は無腫瘍生存時間の増加、及び生存時間の増加のうちの１つ又はそれ以上として現れる可能性がある。免疫応答は、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、単球及び／又はマクロファージ）の活性化、サイトカイン産生、ケモカイン産生、特異的細胞表面マーカー発現、特に、共刺激分子の発現のうちの１つ又はそれ以上が関与する可能性がある。免疫応答は、体液性、細胞性、Ｔｈ１もしくはＴｈ２応答、又はそれらの組み合わせによって特徴づけることができる。一実施形態において、免疫応答は先天性免疫応答である。
【００８４】
一実施形態において、免疫応答はＩＦＮ応答である。一実施形態において、免疫応答はＩ型ＩＦＮ応答である。一実施形態において、免疫応答はＩＩ型ＩＦＮ応答である。一実施形態において、免疫応答はＩＩＩ型ＩＦＮ応答である。一実施形態において、免疫応答は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮβ及びＴＮＦ−αのうちの１つ又はそれ以上又はすべての発現を含む。一実施形態において、免疫応答は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮβ及びＴＮＦ−αのうちの１つ以上のレベルを測定することによって測定できる。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、「免疫応答を調節する」という語は、刺激に対する免疫応答を増加又は減少させることを指す。免疫応答の調節は、当業者に公知の任意の方法によって測定することができ、例えば、１つ又はそれ以上のサイトカインのレベルを測定することを含み得る。サイトカイン産生を測定するために適した方法の例は、実施例の節で提示する。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、「サイトカイン産生を調節する」という語は、対象におけるサイトカイン産生を増加させること又は減少させることを指す。一実施形態において、サイトカイン産生を調節するとは、対象の細胞によるサイトカインの分泌を増加させること又は減少させることを指す。一実施形態において、サイトカインの産生は、ＩＲＦ３活性が関与する。一実施形態において、サイトカインはＩＦＮ経路にある。一実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮβ及びＴＮＦ−αのうちの１つもしくはそれ以上又は全部である。サイトカイン産生の調節は、本明細書中、実施例の節で記載するものを含むが、それらに限定されない当業者に公知の任意の方法を用いて測定することができる。サイトカイン産生のレベルは、例えば、血液、血清又は血漿サンプルなどの患者サンプル中で測定できる。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、「ＩＦＮ応答」という語は、ＩＦＮ経路を含む免疫応答を指す。一実施形態において、免疫応答はＩ型ＩＦＮ免疫応答である。一実施形態において、免疫応答はＩＩ型ＩＦＮ免疫応答である。一実施形態において、免疫応答はＩＩＩ型ＩＦＮ免疫応答である。一実施形態において、ＩＦＮ応答は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮβ及びＴＮＦ−αのうちの１つもしくはそれ以上又は全部を含む。
【００８８】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物
本明細書中で使用する場合、「Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する」という語は、Ｃ６ｏｒｆ１０６が免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節する能力を改変することを指す。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６ｍＲＮＡ又はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質のレベルを低下させることで、活性を低下させることによりＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６に結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６の活性を調節する化合物、例えばＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下又は阻害する化合物は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変すると考えられる。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６の活性を調節する化合物は、ＩＲＦ３と結合するその能力を調節する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６の活性を調節する化合物は、Ｃ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を調節する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６の活性を調節する化合物はＩＲＦ３と複合体を形成するその能力を調節する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６ｍＲＮＡ又はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質又はその生物学的に活性なフラグメントのレベルを増加させることで、活性を増加させることによってＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６の細胞性輸送に関与するアゴニスト、阻害剤、受容体、又はタンパク質を調節することで、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変することができる。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物は処理する細胞の代謝活性を有意に変更しない。一実施形態において、細胞の代謝活性をアラマーブルーアッセイで評価する。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」又は「減少する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」又は「減少させた（ｒｅｄｕｃｅｄ」又は「減少している（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」という語は、化合物を投与する前の状態で存在するものと比べて、遺伝子発現、タンパク質活性、免疫応答又はサイトカイン産生の消滅させること、減少させること、又はより低いレベルを有することを意味する。一実施形態において、遺伝子発現、タンパク質活性、免疫応答及び／又はサイトカイン産生は、化合物を投与する前の状態で存在するものと比べて、少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％減少する。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ又はｉｎｃｒｅａｓｅｓ又はｉｎｃｒｅａｓｅｄ又はｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」という語は、化合物を投与する前の状態で存在するものと比べて、より高いか又はより大きなレベルの遺伝子発現、タンパク質活性、免疫応答又はサイトカイン産生を有することを指す。一実施形態において、遺伝子発現、タンパク質活性、免疫応答及び／又はサイトカイン産生は、化合物を投与する前の状態で存在するものと比べて、少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％増加する。
ポリヌクレオチド
【００９１】
「ポリヌクレオチド」、及び「核酸」という語は交換可能に用いられる。ポリヌクレオチドはヌクレオチドモノマーのポリマーである。本発明の方法での使用に適したポリヌクレオチドは任意の長さのものであってよく、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、又はそのアナログ、あるいはその混合物を含み得る。本発明の方法での使用に適したポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成起源のものであり得、二本鎖又は一本鎖であり得、そしてその起源又は操作のために、（１）自然界で関連するポリヌクレオチドの全部又は一部と関連しない、（２）自然界で連結しているもの以外のポリヌクレオチド（例えば、プロモータ）と連結している、又は（３）自然界で存在しない。以下はポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコーディング又は非コーディング領域、連鎖分析から規定される座位、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離ＤＮＡ、単離ＲＮＡ、キメラＤＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリ前又は後に加えられる可能性がある。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分でのコンジュゲーションによるなど重合後にさらに改変されてもよい。
【００９２】
「単離ポリヌクレオチド」によって、その天然状態で結合又は連結されるポリヌクレオチド配列から概して分離されたポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、自然に結合又は連結されるポリヌクレオチド配列を少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、そしてさらに好ましくは少なくとも９０％含まない。
【００９３】
「外因性ポリヌクレオチド」によって、無細胞発現系あるいはポリヌクレオチド又はその天然状態と比較して変更された量で発現されたかもしくは変更された割合で発現されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの場合）を自然に含まない細胞中に存在するポリヌクレオチドを意味する。一実施形態において、ポリヌクレオチドを、自然にポリヌクレオチドを含まない細胞に導入する。典型的には、外因性ＤＮＡをｍＲＮＡの転写のためのテンプレートとして使用し、これを次に形質転換細胞内でポリペプチドをコードするアミノ酸残基の連続配列に翻訳する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは細胞に対して内因性であり、その発現は組換え手段によって変更され、例えば、外因性制御配列を関心対象の内因性遺伝子の上流に導入して、形質転換細胞が遺伝子によってコード化されるポリペプチドを発現することを可能にする。
【００９４】
本発明における使用に適した外因性ポリヌクレオチドには、それが存在する細胞系又は無細胞発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、及び前記細胞系又は無細胞系で産生されたポリヌクレオチドであって、その後、他の成分の少なくとも一部から精製されるポリヌクレオチドが含まれる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチド、又は本発明に有用なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、本明細書中で定義するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズし得る。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと比較した場合、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、又は置換である１つ又はそれ以上の変異を有し得る。参照配列と比較して変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在する（すなわち、天然源から単離される）又は合成（例えば、核酸上で部位特異的変異誘発又はＤＮＡシャッフリングを実施することによる）のいずれかであり得る。本発明のポリヌクレオチドはトランケーションを有し得る。トランケーションはＮ末端又はＣ末端トランケーションであり得る。
【００９７】
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変するポリヌクレオチドを改変又は最適化してその活性を増強することができる。ヌクレオチドの改変又はアナログを導入して、ポリヌクレオチドの特性を改善することができる。改善された特性としては、増加したヌクレアーゼ耐性及び／又は増加した細胞膜透過能力が挙げられる。したがって、「ポリヌクレオチド」という語には、合成により改変された塩基、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル−、２−プロピル−及び他のアルキル−アデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン及び６−アザチミン、シュードウラシル、４−チウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及び他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン及び他の置換グアニン、他のアザ及びデアザアデニン、他のアザ及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ
一実施形態において、ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡである。一つの実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現は、ＲＮＡｉのためにｄｓＲＮＡ分子をコード化する導入遺伝子によって減少する。
【００９９】
「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」又は「遺伝子サイレンシング」とは、一般的に、二本鎖ＲＮＡ分子が実質的又は全体的相同性を共有する核酸配列の発現をｄｓＲＮＡ分子減少させるプロセスを指す。しかしながら、ＲＮＡ干渉は非ＲＮＡ二本鎖分子を使用して達成できることが示されている（例えば、米国特許出願第２００７０００４６６７号明細書を参照）。
【０１００】
本発明は、本発明で使用するＲＮＡ干渉のための二本鎖領域を備える及び／又はコード化するポリヌクレオドを含む。ポリヌクレオチドは典型的にはＲＮＡであるが、化学的に改変されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを含み得る。
【０１０１】
二本鎖領域は少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、例えば約１９〜２３個のヌクレオチドでなければならないか、又はそれよりも長くてもよく、例えば３０もしくは５０個のヌクレオチド、又は１００個のヌクレオチドもしくはそれ以上であってよい。全遺伝子転写物に対応する完全長配列を使用することができる。好ましくは、それらは約１９〜約２３ヌクレオチドの長さである。
【０１０２】
標的転写物に対する核酸分子の二本鎖領域の同一性の程度は、少なくとも９０％、さらに好ましくは９５〜１００％でなければならない。核酸分子はもちろん、分子を安定化させるように機能し得る無関係の配列を含んでもよい。
【０１０３】
「短鎖干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」という語は、本明細書中で使用する場合、例えば配列特異的にＲＮＡｉを媒介することによって、遺伝子発現を阻害又は下方調節することができるリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指し、二本鎖部分は５０ヌクレオチド長未満、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡは自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を備える核酸分子であり得、アンチセンス領域は標的核酸分子中のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列又はその一部を含み、センス領域は標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列又はその一部を有する。ｓｉＲＮＡは２つの別個のオリゴヌクレオチドから構築することができ、一方の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的である。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、ｓｉＲＮＡという語は、配列特異的ＲＮＡｉ、例えばミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短い干渉オリゴヌクレオチド、短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉改変オリゴヌクレオチド、化学的に改変されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを媒介することができるポリヌクレオチドを記載するために用いられる他の語と同等であることを意味する。さらに、本明細書中で使用する場合、ＲＮＡｉという語は、配列特異的ＲＮＡ干渉、例えば転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、又はエピジェネティクスを記載するために用いられる他の語と同等であることを意味する。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、転写後レベル又は転写前レベルの両方で遺伝子をエピジェネティックに発現停止させるために使用できる。非限定的例において、ｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変更するためのクロマチン構造のｓｉＲＮＡによる改変に起因し得る。一つの実施形態において、本発明の方法で用いられるｓｉＲＮＡは配列番号３６〜配列番号３９の１つ又はそれ以上である。
【０１０５】
「ｓｈＲＮＡ」又は「短いヘアピンＲＮＡ」によって、約５０個未満のヌクレオチド、好ましくは約１９〜約２３個のヌクレオチドが同じＲＮＡ分子上に位置する相補的配列と塩基対を形成し、前記配列及び相補的配列が、塩基相補性の２つの領域によって形成されるステム構造の上に一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜約１５個のヌクレオチドの不対領域によって隔てられているＲＮＡ分子を意味する。一本鎖ループの配列の例は：５’ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ３’を含む。
【０１０６】
含まれるｓｈＲＮＡは、二重又は二本フィンガー及び多フィンガーヘアピンｄｓＲＮＡであり、ＲＮＡ分子は一本鎖スペーサー領域によって隔てられた２以上のそのようなステム−ループ構造を備える。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「アプタマー」は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質を認識し結合し、その結果、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はタンパク質活性を改変することができる三次元立体構造を有する一本鎖核酸である。一実施形態において、アプタマーはＤＮＡ又はＲＮＡである。一実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡとＲＮＡ及びとの混合物である、及び／又は１つもしくはそれ以上の改変された塩基もしくは塩基アナログを含むことができ、これを本明細書中ではＸＮＡと称する。
【０１０８】
一旦設計されると、二本鎖領域を備えるポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、インビトロ転写、組換え、又は合成手段によって生成することができる。
【０１０９】
ポリペプチド
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という語は、概して交換可能に用いられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合する、及び／又はＣ６ｏｒｆ１０６の発現又は活性を低下させる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１０６の発現又は活性を増加させる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１０６のアゴニスト、阻害剤、受容体又はＣ６ｏｒｆ１０６の輸送及び／もしくは細胞局在に関与する細胞成分に結合する。一つの実施形態において、ポリペプチドはＣ６ｏｒｆ１０６又はその生物学的に活性なフラグメントである。一つの実施形態において、ポリペプチドはＣ６ｏｒｆ１０６とＩＲＦ３とを含む複合体の形成を調節する。
【０１１０】
本発明の以前に、Ｃ６ｏｒｆ１０６の充分に特性化されていなかった（Ｍｕｎｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。本明細書中で使用する場合、「Ｃ６ｏｒｆ１０６」という語は、「未特性化タンパク質Ｃ６ｏｒｆ１０６」、「染色体６オープンリーディングフレーム１０６」、「ＤＪ３９１Ｏ２２．４」又は「ＦＰ８５２」を指す。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ６４７７１又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＧ０００００１９６８２１に相当するＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ１０１１３４９３４又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＧＧＯＧ００００００００３８８に相当するＧ．ｇｏｒｉｌｌａ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ１０３２２１６３１又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＣＳＡＧ０００００００９８１８に相当するＣ．ｓａｂａｅｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ２２４６４７又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＭＵＳＧ００００００５６６９２に相当するＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＭＬＵＧ０００００００２４８２に相当するＭ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ１００６８５１６４又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＣＡＦＧ０００００００１２２９に相当するＣ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ４１９９０２又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００２７７８に相当するＧ．ｇａｌｌｕｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ１００５５２７２０又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＡＣＡＧ００００００１５７４２に相当するＡ．ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＸＥＴＧ００００００３１６０７に相当するＸ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、遺伝子ＩＤ５４１４１５又はＥｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＤＡＲＧ００００００７８０７５に相当するＤ．ｒｅｒｉｏ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、Ｅｎｓｅｍｂｌ識別子ＥＮＳＣＩＮＧ００００００２００５２に相当するＣ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｃ６ｏｒｆ１０６である。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、配列番号４６〜５６あるいは配列番号４６〜５６又はその生物学的に活性なフラグメントに対して、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％同一である配列のいずれか１つ又はそれ以上によってコード化される。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、配列番号１〜１１��対して少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５４％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％又は１００％同一である配列あるいはその生物学的に活性なフラグメントであるアミノ酸を有する。ポリペプチドは、参照ポリペプチドと同じ活性、又は参照ポリペプチドに対して向上した活性を有し得る。
【０１１１】
本明細書中で使用する場合、「生物学的に活性なフラグメント」という語は、免疫応答及び／又はサイトカイン産生を調節する能力を有するＣ６ｏｒｆ１０６のフラグメントを指す。生物学的に活性なフラグメントは、本明細書中で使用する場合、完全長ポリペプチドを除外する。生物学的に活性なフラグメントは、所定の活性を維持する限り、任意のサイズ部分であり得る。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントはＩＲＦ３と結合する。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントはＩＲＦ３を含む複合体と結合する。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは、機能的ＵＢＡ様ドメイン、機能的無秩序領域又は機能的ＦＷドメインから選択される１つ又はそれ以上の推定上ドメインを欠いている（ドメイン及び領域は図２で示される）。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的ＵＢＡ様ドメインを欠いている。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的無秩序領域を欠いている。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的ＦＷドメインを欠いている。一実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは機能的ＵＢＡ様ドメイン及び機能的無秩序領域を欠いている。好ましくは、生物学的に活性なフラグメントは、完全長タンパク質の活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、もしくは少なくとも９０％を維持するか、又は完全長タンパク質に対して増強された活性を有する。好ましくは、生物学的に活性なフラグメントは、完全長タンパク質に対して増強された活性を有する。
【０１１２】
本明細書中で使用する場合、「ユビキチン結合様ドメイン」又は「ＵＢＡ様ドメイン」という語は、図２に示すようなＣ６ｏｒｆ１０６のＮ末端ドメインを指す。一実施形態において、ＵＢＡ様ドメインは、配列番号１〜８のアミノ酸２３〜６３：又は配列番号１０もしくは１１の２５〜６５のアミノ酸残基；又は配列番号９のアミノ酸残基２３〜６６；又は配列番号１２、もしくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記配列のいずれかと少なくとも５０％同一である配列を指す。本明細書中で使用する場合、「機能的ＵＢＡ様ドメイン」が欠けているという表現は、ＵＢＡ様ドメインが欠けている、ＵＢＡ様ドメインのフラグメントが欠けている、又はＵＢＡ様ドメインの機能を妨害する置換、挿入又は欠失などの１つ又はそれ以上の変異をＵＢＡ様ドメイン中に備えるＣ６ｏｒｆ１０６を指す。一実施形態において、ＵＢＡ−ドメインが欠けているＣ６ｏｒｆ１０６は、配列番号１〜１１のいずれか１つの約７６個のＮ末端アミノ酸が欠けている。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、「無秩序領域」という語は、図２で示す残基を備えるＣ６ｏｒｆ１０６のＣ末端領域を指す。一実施形態において、無秩序領域は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を備えるか、又はそれと少なくとも５０％同一である配列である。一実施形態において、無秩序領域は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を備えるか、又はそれと少なくとも５０％同一である配列である。一実施形態において、無秩序領域は、配列番号１〜３のアミノ酸２４１〜２９８：又は配列番号４〜８のアミノ酸残基２４１〜２９１；又は配列番号１０の２４４〜２８５のアミノ酸残基；又は配列番号１１のアミノ酸残基２４４〜２８１；又は配列番号９のアミノ酸残基２４４〜２８１を指すか、又は前記配列のいずれかと少なくとも５０％同一である配列である。
【０１１４】
本明細書中で使用する場合、「ＦＷドメイン」又は「Ｎｂｒ−１様ドメイン」という語は、図２に示すような残基を備えるＣ６ｏｒｆ１０６ドメインを指す。一実施形態において、ＦＷドメインは、配列番号１〜８のアミノ酸９８〜１９０：又は配列番号１０もしくは１１の１００〜１９２のアミノ酸残基；又は配列番号９のアミノ酸残基１００〜１９４を指し；配列番号５７、もしくは配列番号５８、もしくは配列番号”６０に記載するアミノ酸配列を含むか、又は前記配列のいずれかと少なくとも５０％同一である配列である。
【０１１５】
本発明の方法における使用に適したポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対するそのアミノ酸の同一性の程度（％同一性）によるか、又は１つの参照アミノ酸配列に対して別のものに対してよりも高い同一性を有することによって定義することができる。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの％同一性は、典型的には、ギャップ生成ペナルティ＝５、ギャップ伸長ペナルティ＝０．３のパラメータを用いてＧＡＰ分析（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０；ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリー配列は少なくとも１００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。なお一層好ましくは、クエリー配列は少なくとも２５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５０個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。なお一層好ましくは、クエリー配列は少なくとも２９０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は少なくとも２９０個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。なお一層好ましくは、クエリー配列は少なくとも３００アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は少なくとも３００個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。なお一層好ましくは、ＧＡＰ分析はその全長にわたって２つの配列を整列させる。
【０１１６】
配列番号１〜１１のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、本明細書中で定義される核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによるか、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製することができる。そのような変異体は、例えばアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換を備える。欠失、挿入及び置換を組み合わせて、最終構築物に到達することができるが、ただし、最終ポリペプチド産物は所定の活性を有するものとする。
【０１１７】
変異（変更）ポリペプチドは、当該技術分野で公知の任意の技術を使用して、例えば、指向進化又は合理的設計法（下記参照）を使用して調製することができる。変異／変更ＤＮＡから誘導される産物は、本明細書中で記載するＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節する能力を有するか否かを判定するための技術を用いて容易にスクリーニングすることができる。
【０１１８】
アミノ酸配列変異の設計に際して、変異部位の位置及び変異の性質は、改変される特徴（複数可）に依存する。変異の部位は、個々に又は連続して、例えば、（１）まず保存的アミノ酸選択肢で置換し、次に達成される結果に応じてよりラジカルな選択肢で置換することによるか、（２）標的残基を欠失させることによるか、又は（３）配置された部位に隣接して他の残基を挿入することによって、改変することができる。
【０１１９】
アミノ酸配列欠失は、概して約１〜１５残基、さらに好ましくは約１〜１０残基、典型的には約１〜５の連続残基の範囲である。
【０１２０】
置換変異体では、ポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換型変異誘発について最も興味深い部位には、活性部位（複数可）として特定される部位、例えば基質又は補助因子結合部位が含まれる。他の興味深い部位は、様々な株又は種から得られる特定の残基が同一であるものである。これらの位置は生物学的活性にとって重要であり得る。これらの部位、特に、少なくとも３つの他の同等に保存された部位の配列内に含まれるものは、好ましくは比較的保存的に置換される。そのような保存的置換を「例示的置換」の見出しの下に示す。
【０１２１】
好ましい実施形態において、変異体（ｍｕｔａｎｔ／ｖａｒｉａｎｔ）ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較した場合に、１もしくは２もしくは３もしくは４個だけ、又は１もしくは２もしくは３もしくは４個以下の保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を表１に提示する。当業者ならわかるように、そのような小さな変化は、細胞において発現される場合にポリペプチドの活性を変更しないことは当然予測できる。
【０１２２】
【表１】
2019503998.tif 000002
【０１２３】
さらに、必要に応じて、非天然アミノ酸又は合成アミノ酸アナログをポリペプチド中への置換又は付加として導入することができる。そのようなアミノ酸としては、共通のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及びアミノ酸アナログ一般が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
合成中又は合成後に、例えば、ビオチニル化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、抗体分子又は他の細胞性リガンドへの結合などによって異なって改変されるポリペプチドも範囲内に含まれる。これらの改変は、ポリペプチドの安定性及び／又は生物活性を増加させる働きをし得る。
【０１２５】
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変するポリペプチドは、その活性及び／又は安定性を増強するように改変又は最適化することができる。これは、多様化又は選択によって起こり得る。指向進化において、ランダム変異誘発をタンパク質に適用し、選択レジームを使用して、所望の性質、例えば増大した活性を有する変異体を選択する。さらに、変異及び選択のラウンドを次に適用する。典型的な指向進化戦略は以下の３ステップを含む：
【０１２６】
１）多様化：ポリペプチドをランダムに変異させ、及び／又は組換えて、遺伝子変異体の大きなライブラリを作製する。変異体遺伝子ライブラリは、エラープローンＰＣＲにより構築することができる（例えば、Ｌｅｕｎｇ，  １９８９；Ｃａｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，  １９９２を参照）、親テンプレートから調製されるＤＮａｓｅＩ消化フラグメントのプールから構築することができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，  １９９４ａ；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  １９９４ｂ；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、変性オリゴヌクレオチドから構築することができる（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｃｏｃｏ，  ２００２）、あるいは両者の混合物から、又はさらには未消化親テンプレートから構築することができ（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｅｇｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、そして通常はＰＣＲにより組み立てられる。ライブラリは、相同又は非相同組換えのいずれかによってインビボ又はインビトロで組換えられた親配列から作製することもできる（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｖｏｌｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；Ｓｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。変異体遺伝子ライブラリはまた、関心対象の遺伝子を好適なベクターにサブクローニングし、ベクターを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＸＬ−１  ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「変異誘発」株に形質転換し、そして形質転換された細菌を好適な世代数増殖させることによって構築することもできる。変異体遺伝子ライブラリはまた、関心対象のポリペプチドをＨａｒａｙａｍａ（１９９８）によって広範に記載されているようなＤＮＡシャッフリング（すなわち、ランダムフラグメンテーション及び再構築による選択された変異体遺伝子のプールのインビトロ相同的組換え）に供することによって構築することもできる。
【０１２７】
２）選択：ライブラリを、スクリーン又は選択を使用して所望の特性を有する変異体（ｍｕｔａｎｔ（ｖａｒｉａｎｔ））の存在について試験する。スクリーンが手作業による高性能な変異体の同定及び単離を可能にする一方で、選択は全ての非機能性変異体を自動的に除去する。スクリーンは既知の保存されたアミノ酸モチーフの存在についてスクリーニングすることを含み得る。代替的に、又は付加的に、スクリーンは、細胞又はトランスジェニック非ヒト生物もしくはその部分において変異ポリヌクレオチドを発現すること、そして例えばＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節する能力のレベルを分析すること、例えば細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分中あるいは細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分から抽出された結果としての産物のレベルを定量すること、そして変異ポリヌクレオチドが欠けている対応する細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分に対して産物のレベルを判定すること、そして場合によって、親（非変異）ポリヌクレオチドを発現することを含み得る。別法として、スクリーンは、細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分で標識された基質を供給し、そして細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分中、あるいは細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分から抽出された基質又は産物のレベルを、変異ポリヌクレオチドが欠けている対応する細胞又はトランスジェニック非ヒト生物又はその部分に対して判定すること、そして場合によって親（非変異）ポリヌクレオチドを発現することを含み得る。
【０１２８】
３）増幅：選択又はスクリーンで同定された変異体を何倍も複製して、どのような変異が起こったかを理解するために研究者らがそれらのＤＮＡを配列決定することを可能にする。
【０１２９】
つまり、これら３つのステップは、指向進化の「ラウンド」と称する。ほとんどの実験は複数ラウンドを必要とする。これらの実験では、先のラウンドの「勝者」を次のラウンドで多様化させて、新しいライブラリを創出する。実験の最後で、すべての発生したタンパク質又はポリヌクレオチド変異体を、生化学的方法を用いて特性化する。
【０１３０】
結合剤
一実施形態において、ポリペプチドは結合剤である。一実施形態において、結合剤は抗体又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６の発現又は活性を低下させる。いくつかの実施形態において、抗体は、受容体、阻害剤又はそのアゴニストなどの、Ｃ６ｏｒｆ１０６が相互作用するポリペプチドと結合する。一実施形態において、抗体は、細胞を透過するか又は細胞に取り込まれる（受動的に又は積極的に）ように改変された抗体である。
【０１３１】
「抗体」という語は、本明細書中で使用する場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、融合ダイアボディ、トリアボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、インタクト分子を含むキメラ抗体ならびにそれらのフラグメント、及び他の抗体様分子を包含する。抗体は、例えば、限定されるものではないが、ＶＨ又はＶＬドメインのいずれかを含むドメイン抗体、重鎖可変領域の二量体（ＶＨＨ、ラクダ科について記載のとおり）、軽鎖可変領域の二量体（ＶＬＬ）、直接もしくはリンカーを介して結合し得る軽（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域のみを含むＦｖフラグメント、又は重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメントを含む、様々な形態の改変を含む。当業者は、抗体がＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙで入手可能なもの（例えば、ｓｃ−３９８４９０）などのＣ６ｏｒｆ１０６と結合する任意の抗体であり得ることを理解するであろう。
【０１３２】
一緒に結合して一本鎖抗体を形成する重及び軽鎖の可変領域からなるｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）ならびにダイアボディやトリアボディなどのｓｃＦｖのオリゴマーも「抗体」という語に含まれる。可変領域及び定常領域の一部を含むＦａｂ、（Ｆａｂ’）２及びＦａｂＦｃ２フラグメントなどの抗体のフラグメントも含まれる。相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体フラグメント及び抗体フラグメントのオリゴマーも含まれる。Ｆｖの重及び軽鎖成分は、同じ抗体又は異なる抗体から誘導することができ、それによってキメラＦｖ領域を産生することができる。抗体は、動物（例えばマウス、ウサギ又はラット）のものであってもよいし、又はキメラであってもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）。抗体は当該技術分野で公知の任意の方法によって産生することができる。
【０１３３】
本明細書中で提供されたガイドライン及び前述の参考文献及びＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  （１９８８）のような刊行物で記載された当業者に周知の方法を使用して、本発明の方法で使用する抗体を容易に作製することができる。
【０１３４】
抗体は、軽鎖及び重鎖が直接又はリンカーを介して結合し得る可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖を含むＦｖ領域であり得る。本明細書中で使用する場合、リンカーは、軽及び重鎖と共有結合し、それらが対象とするエピトープに特異的に結合することができる立体構造を達成することができるように、２つの鎖間に充分な間隔及び柔軟性を提供する分子を指す。タンパク質リンカーは、融合ポリペプチドのＩｇ部分の内在性成分として発現することができるので、特に好ましい。
【０１３５】
一つの実施形態において、抗体は細胞内伝達の能力を有する。細胞内伝達の能力を有する抗体には、ラクダ及びラマ抗体、サメ抗体（ＩｇＮＡＲ）、ｓｃＦｖ抗体、細胞内抗体又はナノボディ、例えばｓｃＦｖ細胞内抗体及びＶＨＨ細胞内抗体などの抗体が含まれる。そのような抗原結合剤は、Ｈａｒｍｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  （２００７）、Ｔｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって記載されているようにして作製することができる。酵母ＳＰＬＩＮＴ抗体ライブラリは、タンパク質−タンパク質相互作用を妨害できる細胞内抗体について試験するために利用可能である（例えば、それらの産生方法については、Ｖｉｓｉｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）を参照のこと）。そのような薬剤は、細胞透過ペプチド配列又は核局在化ペプチド配列、例えばＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）で開示されているものを含み得る。Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ又はＤｉａｔｏペプチドベクター、例えばＤｅ  Ｃｏｕｐａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）及びＭｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）で開示されているものもインビボ送達に有用である。
【０１３６】
さらに、抗体は、細胞透過剤、例えば細胞透過性ペプチドに融合させることができる。細胞透過性ペプチドとしては、Ｔａｔペプチド、ペネトラチン、短い両親媒性ペプチド、例えばＰｅｐ科及びＭＰＧ科由来のもの、オリゴアルギニン及びオリゴリジンが挙げられる。一例では、細胞透過性ペプチドはまた、脂質（Ｃ６〜Ｃ１８脂肪酸）ドメインとコンジュゲートさせて、細胞内送達を改善する（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。細胞透過性ペプチドの例は、Ｈｏｗｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）及びＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）で見出すことができる。したがって、本発明はまた、共有結合（例えば、ペプチド結合）により、場合によってＮ末端又はＣ末端で、細胞透過性ペプチド配列に融合した抗体の使用も提供する。
【０１３７】
Ｃ６ｏｒｆ１０６又はその生物学的に活性なフラグメントを含む、本発明の方法における使用に適したポリペプチドは、天然のポリペプチドの産生及び回収、組換えポリペプチドの産生及び回収、ならびにポリペプチドの合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む様々な方法で産生することができる。一実施形態において、ポリペプチドを産生するために有効な条件下でポリペプチドを発現することができる細胞を培養し、そしてポリペプチドを回収することができる細胞を培養することによって、単離ポリペプチドを産生する。有効な培養条件には、ポリペプチド産生を可能にする、有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件が含まれるが、これに限定されるものではない。有効な培地とは、細胞を培養してポリペプチドを産生する任意の培地を指す。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素及びホスフェート源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養素、例えばビタミンを有する水性培地を含む。細胞は、従来型の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、及びペトリ皿中で培養することができる。培養は、宿主細胞に適切な温度、ｐＨ及び酸素含有量で実施することができる。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
【０１３８】
プログラム可能なヌクレアーゼ
一実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子を改変することによってＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変するプログラム可能なヌクレアーゼである。本明細書中で使用する場合、「プログラム可能なヌクレアーゼ」という語は、「標的化」（「プログラム」）されて所定のゲノム位置を認識し編集するヌクレアーゼに関する。一実施形態において、タンパク質は、「標的化」又は「プログラム」されて、遺伝子修飾をＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はその調節領域に導入する、プログラム可能なヌクレアーゼである。一実施形態において、遺伝子改変は、欠失、置換であるか、又はＣ６ｏｒｆ１０６もしくはその調節領域中にある。
【０１３９】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインの組み合わせによってゲノム位置を認識するようにプログラムすることができる。ＺＦＰはＤＮＡ配列中の特定の３ｂｐを認識し、ＺＦＰの組み合わせを用いて特定のゲノム位置を認識することができる。一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写アクチベータ様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインによってゲノム位置を認識するようにプログラムすることができる。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ又はそれ以上のＲＮＡ配列によってゲノム位置を認識するようにプログラムすることができる。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ又はそれ以上のＤＮＡ配列によってプログラムすることができる。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ又はそれ以上のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列によってプログラムすることができる。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及びハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列の１つ又はそれ以上によってプログラムすることができる。
【０１４０】
本開示にしたがって使用できるプログラム可能なヌクレアーゼとしては、細菌のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システム由来のＲＮＡに誘導された操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベータ様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びアフゴノートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
一実施形態において、ヌクレアーゼはＲＮＡにガイドされる操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。一実施形態において、ＲＧＥＮは古細菌ゲノム由来であるか、又はその組換え体形である。一実施形態において、ＲＧＥＮは細菌ゲノム由来であるか、又はその組換え体形である。一実施形態において、ＲＧＥＮはＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系由来である。一実施形態において、ＲＧＥＮはＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系由来である。一実施形態において、ＲＧＥＮはＩＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系由来である。一実施形態において、ヌクレアーゼはクラスＩ  ＲＧＥＮである。一実施形態において、ヌクレアーゼはクラスＩＩ  ＲＧＥＮである。一実施形態において、ＲＧＥＮは多成分酵素である。一実施形態において、ＲＧＥＮは一成分酵素である。一実施形態において、ＲＧＥＮはＣＡＳ３である。一実施形態において、ＲＧＥＮはＣＡＳ１０である。一実施形態においてＲＧＥＮはＣＡＳ９である。一実施形態において、ＲＧＥＮはＣｐｆ１である（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。一実施形態において、ＲＧＥＮは単一のＲＮＡ又はＤＮＡによって標的とされる。一実施形態において、ＲＧＥＮは、複数のＲＮＡ及び／又はＤＮＡによって標的とされる。一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼはＤＮＡプログラムされたアフゴノートであり得る（国際公開第１４／１８９６２８号パンフレット）。一実施形態において、ＣＡＳ９はＳｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である。
【０１４２】
小分子
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物は小分子である。一実施形態において、小分子はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加させる。一実施形態において、小分子はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる。一実施形態において、小分子はＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子と結合し、そしてその発現を阻害する。一実施形態において、小分子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質と結合して、Ｃ６ｏｒｆ１０６がその正常な機能を果たす能力を低下させ、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる。一実施形態において、小分子はＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質と結合して、その活性を増強して、それによりＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加させる。一実施形態において、小分子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６の細胞性輸送又は局在化に関与するアゴニスト、受容体又はタンパク質などの、Ｃ６ｏｒｆ１０６と相互作用するポリペプチドと結合し、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下又は増加させる。
【０１４３】
一実施形態において、投与される化合物は、不活性又は比較的低活性であるが、投与後に、化合物が欠損した同質遺伝子の細胞と比較した場合、細胞の集団において抗ウイルス遺伝子の発現及び／又はタンパク質活性を減少させる化合物に変換（例えば代謝）される前駆体化合物であり得る。それらの実施形態において、投与される化合物は、プロドラッグと称する場合がある。代替的に又は付加的に、投与される化合物は代謝されて、前記化合物を欠く同質遺伝子の細胞と比較した場合、細胞の集団における抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質活性の発現の低下で活性がある活性代謝物を産生することができる。そのような活性代謝物の使用も、本開示の範囲内に含まれる。
【０１４４】
化合物中に存在する置換基に応じて、化合物は場合によって塩の形態で存在してもよい。本発明における使用に適した化合物の塩は、対イオンが薬剤的に許容される塩である。好適な塩としては、有機又は無機酸又は塩基と形成されるものが挙げられる。特に、酸と形成される好適な塩としては、鉱酸、強有機カルボン酸、例えば、非置換であるか又は例えばハロゲンで置換された１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸、例えば飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えばヒドロキシカルボン酸、例えばアミノ酸と形成される塩、あるいは有機スルホン酸、例えばハロゲンで置換されているか又は置換されていない（Ｃ１〜４）アルキルスルホン酸又はアリールスルホン酸などと形成される塩が挙げられる。薬剤的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、及びグルタミン酸、リジン及びアルギニンから形成されるものが挙げられる。薬剤的に許容される塩基塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム及びナトリウムの塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム及びマグネシウムの塩、ならびに有機塩基との塩、例えば、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコミン（ｇｌｕｃｏｍｉｎｅ）、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ低級アルキルアミン、ジ低級アルキルアミンもしくはトリ低級アルキルアミン、例えばエチルプロピルアミン、ｔ−ブチルプロピルアミン、ジエチルプロピルアミン、ジイソプロピルプロピルアミン、トリエチルプロピルアミン、トリブチルプロピルアミンもしくはジメチルプロピルアミン、又はモノヒドロキシ低級アルキルアミン、ジヒドロキシ低級アルキルアミンもしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンが挙げられる。対応する内部塩も形成され得る。
【０１４５】
有機化学及び／又は医薬品化学技術分野の当業者は、多くの有機化合物が、その中で反応するか又はそれから析出もしくは結晶化する溶媒と複合体を形成し得ることを理解するであろう。これらの複合体は、「溶媒和物」として知られている。例えば、水との複合体は「水和物」として知られている。水和物などの溶媒和物は、原薬が化学量論量又は非化学量論量のいずれかで結晶格子中に水などの溶媒を取り込む場合に存在する。原薬は、これらが任意の段階で遭遇し得るため、水和物などの溶媒和物の存在についてルーチン的にスクリーニングされる。したがって、本発明に有用な化合物は水和物などの溶媒和物の形態で存在し得ることは理解されるであろう。本発明における使用に適した化合物の溶媒和形態は、関連する溶媒が薬剤的に許容されるものである。例えば、水和物は薬剤的に許容される溶媒和物の一例である。
【０１４６】
本発明に有用な化合物は、非晶質形態又は結晶性形態で存在し得る。多くの化合物は複数の多形体で存在し、全てのそのような形態の化合物の使用は、本開示に包含される。
【０１４７】
本開示に有用な小分子は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質に対する結合について候補化合物のライブラリをスクリーニングし、次いで結合する化合物のいずれかがＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させるか否かを判定するなどの標準的手順を用いて同定することができる。一実施形態において、本発明の化合物のスクリーニングは、前記化合物がインビトロ、インオボ又はインビボでウイルス感染を調節するか否かを評価することを含む。本開示で有用な小分子はまた、既知ライブラリ化合物のスクリーニングを含み得るコンピュータによるスクリーニングの標準的手順を使用して同定して、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はタンパク質と結合しＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を低下させる候補を特定することもできる。
【０１４８】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達
核酸構築物
一実施形態において、ポリヌクレオチドは核酸構築物である。一実施形態において、核酸構築物は導入遺伝子を含み得る。本明細書中で使用する場合、「核酸構築物」とは、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはアプタマー）、プログラム可能なヌクレアーゼを「ガイド」もしくは「標的化」するＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列、又はベクター中のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをコード化する任意の核酸分子を指す。典型的には、核酸構築物は、二本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせである。さらに、核酸構築物は、典型的には、ポリヌクレオチドをコード化するオープンリーディングフレームと機能的に連結された好適なプロモータを含む。核酸構築物は、例えば二本鎖ＲＮＡ分子の第１の一本鎖をコード化する第１のオープンリーディングフレームを含んでもよく、相補的な（第２の）鎖は、異なるか又は好ましくは同じ核酸構築物による第２のオープンリーディングフレームによってコード化される。核酸構築物は線状フラグメント又は環状分子であってよく、複製可能であっても複製可能でなくてもよい。当業者は本発明の核酸構築物が好適な発現ベクター内に含まれ得ることを理解するであろう。核酸構築物のレシピエント細胞へのトランスフェクション又は形質転換によって細胞が核酸構築物によってコード化されるＲＮＡ又はＤＮＡ分子を発現することが可能になる。
【０１４９】
別の例では、核酸構築物は、同じものの複数のコピー、及び／又は二本鎖領域を備える複数の異なるＲＮＡ分子、例えば短いヘアピンＲＮＡを含む１つもしくはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上）を発現し得る。一実施形態において、核酸構築物は、１つ又はそれ以上アプタマーアプタマーをコード化する配列、又はアプタマーを産生するように処理することができる配列を発現することができる。一例では、核酸構築物は、相同的組換えに適した構築物である。
【０１５０】
核酸構築物はまた、さらなる遺伝要素も含み得る。構築物に含まれ得る要素の種類は決して限定されず、当業者によって選択され得る。いくつかの実施形態において、核酸構築物は宿主細胞に導入遺伝子として挿入される。一実施形態において、宿主細胞は免疫細胞である。一実施形態において、免疫細胞は白血球である。一実施形態において、白血球はリンパ球又は食細胞である。一実施形態において、リンパ球はＴ細胞又はＢ細胞である。そのような場合では、導入遺伝子挿入プロセスからＲＮＡ分子をコード化する配列を保護するため、そして外部転写リードスルーの危険性を減らすために設計された構築物に、「スタッファー」フラグメントを含めることが望ましい場合がある。スタッファーフラグメントを構築物に含めて、例えばプロモータとコーディング配列及び／又はターミネータ成分との間の距離を増加させることもできる。スタッファーフラグメントは５〜５０００ヌクレオチド又はそれ以上の任意の長さであり得る。プロモータ間に１つ又はそれ以上のスタッファーフラグメントが存在し得る。複数のスタッファーフラグメントの場合、それらは同じ長さ又は異なる長さであり得る。スタッファーＤＮＡフラグメントは好ましくは異なる配列である。好ましくは、スタッファー配列は、それらが挿入された細胞、又はその子孫内で見いだされるものと同じ配列を含む。さらなる実施形態において、核酸構築物は、二本鎖ＲＮＡ（複数可）をコード化するオープンリーディングフレーム（複数可）に隣接するスタッファー領域を備える。
【０１５１】
別法として、核酸構築物は、転位因子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（複数可）をコード化するオープンリーディングフレームに隣接する末端逆方向反復配列を特徴とするトランスポゾンを含み得る。好適なトランスポゾンの例としては、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｍａｒｉｎｅｒ及びＧａｌｌｕｈｏｐが挙げられる。
【０１５２】
核酸構築物に含まれ得るさらなる遺伝要素の他の例としては、レポーター遺伝子、例えばＧＦＰ又はＲＦＰなどの蛍光マーカータンパク質の１つもしくはそれ以上の遺伝子；容易に分析される酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニカル（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃａｌ）アセチルトランスフェラーゼ又は分泌された胚性アルカリホスファターゼ；又はホルモンもしくはサイトカインなどのそれらに対してイムノアッセイが容易に利用可能なタンパク質が挙げられる。実施形態で使用され得る他の遺伝要素としては、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコジン酸（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｄｉｃ）ホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸リダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ又は薬物耐性などの選択的成長優位性を細胞に対して付与するタンパク質をコードするものが挙げられる。
【０１５３】
一実施形態において、さらなる遺伝要素は、対象における免疫応答を刺激する抗原をコード化する１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドであり得る。
【０１５４】
核酸構築物が細胞にトランスフェクトされる場合、プロモータ及び任意のさらなる遺伝要素が、宿主ゲノム中に自然に存在するヌクレオチド配列から構成されることが望ましい。一実施形態において、核酸構築物はプロモータを備える。当業者であれば、構成的プロモータ又は誘導性プロモータなどのプロモータを本発明において使用できることを理解するであろう。一実施形態において、プロモータは、Ｐｏｌ  Ｉ、Ｐｏｌ  ＩＩ又はＰｏｌ  ＩＩＩプロモータである。
【０１５５】
発現ベクター
場合によっては、ポリヌクレオチド又は核酸構築物を発現ベクターに挿入することが望ましい可能性がある。一実施形態において、発現ベクターを細胞に移入することができ、前記細胞を使用して本発明の方法における使用に適したポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを産生することができる。一実施形態において、発現ベクターを対象の細胞に移入し、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを対象において発現させることができる。
【０１５６】
したがって、例えば、対象由来の細胞をＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドで操作して、ポリペプチドをエクスビボでコード化することができる。操作された細胞を次いで、ポリヌクレオチド又はポリペプチドで処理される対象に提供することができる。この実施形態において、細胞を、例えば、本発明の方法に有用なポリペプチドをコード化するＲＮＡを含むベクターの使用によって、エクスビボで操作することができ、細胞を形質転換するために使用することができる。そのような方法は当該技術分野で周知であり、本発明におけるそれらの使用は本明細書中の教示から明らかになるであろう。
【０１５７】
さらに、細胞は、当該技術分野で公知の手順によりインビボでのポリペプチドの発現のためにインビボで操作することができる。発現構築物を次いで単離することができる。一例では、パッケージング細胞が今や関心対象の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように、本発明の方法に有用なポリペプチドをコード化するＲＮＡを含むプラスミドベクターでパッケージング細胞を形質導入する。これらのプロデューサー細胞は、細胞のインビボでの操作ならびにポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドのインビボでの発現のために、対象に投与することができる。一実施形態では、発現ベクターを対象に直接投与する。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらや他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかであるはずである。
【０１５８】
本明細書中で使用する場合、「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換することができ、１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドの発現を実施することができるＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは原核生物、真核生物又はウイルスのいずれかであり得る。発現ベクターには、細菌、真菌、内部寄生虫、節足動物、動物、植物及び藻類細胞においてなど、本発明の宿主細胞において機能する（すなわち、遺伝子発現を行う）任意のベクターが含まれる。ベクターはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、又はバクテリオファージであり得る。そのようなベクターは、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、及びウイルス由来のベクター、それらの組み合わせ由来のベクター、例えばプラスミドならびにバクテリオファージ遺伝要素、コスミッド及びファージミド由来のものを含む。一実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである。
【０１５９】
レトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスとしては、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルスが挙げられる。一実施形態において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス由来である。
【０１６０】
そのようなベクターは、ポリペプチドを発現するための１つ又はそれ以上のプロモータを含む。用いることができる好適なプロモータとしては、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ；及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞性プロモータ、例えば、これらに限定されるものではないが、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、及びβ−アクチンプロモータを含む真核生物細胞性プロモータも用いることができる。用いることができるさらなるウイルスプロモータとしては、アデノウイルスプロモータ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、及びＢ１９パルボウイルスプロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適なプロモータの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであろう。
【０１６１】
本発明の方法に有用なポリペプチドをコード化する核酸配列は好適なプロモータの制御下に置かれる。用いることができる好適なプロモータとしては、アデノウイルスプロモータ、例えばアデノウイルス主要後期プロモータ；又は非相同プロモータ、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ；誘導性プロモータ、例えばＭＭＴプロモータ、メタロチオネインプロモータ；熱ショックプロモータ；アルブミンプロモータ；ＡｐｏＡＩプロモータ；ヒトグロビンプロモータ；ウイルスチミジンキナーゼプロモータ、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中で前述の改変レトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモータ；及びヒト成長ホルモンプロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。プロモータは、ポリペプチドをコード化する遺伝子を制御する天然のプロモータであり得る。
【０１６２】
レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトできるパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、及びＭｉｌｌｅｒ（１９９０）で記載されているＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、当該技術分野で公知の任意の手段によってパッケージング細胞に形質導入することができる。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、及びＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、これらに限定されるものではない。１つの代替案では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入することができるか、又は脂質にカップリングさせ、その後、宿主に投与することができる。
【０１６３】
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコード化する核酸配列（複数可）を含む、感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。そのようなレトロウイルスベクター粒子をその後に用いて、真核生物細胞をインビトロ又はインビボのいずれかで形質導入することができる。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコード化する核酸配列（複数可）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｅｍｙｍａｌ）細胞、軟骨細胞、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、及び気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６４】
一実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなど、遺伝子治療に好適である（Ｄａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１６５】
一実施形態において、ベクターは、複数の機能性ＲＮＡもしくはタンパク質又はそれらの組み合わせを発現することができるベクター、例えばＫａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）で記載されているベクターである。そのようなベクターは、プログラム可能なヌクレアーゼ及び１つもしくはそれ以上の「ガイド」又は「ターゲティング」配列の同時投与のために使用できる。そのようなベクターはまた、複数の二本鎖ＲＮＡの同時発現のためにも使用できる。
【０１６６】
一実施形態において、ベクターは、Ｃａｖａｔａｋ（商標）又はＩｍｌｙｇｉｃ（商標）（タリモジーン・ラハーパレプベック）などの、がん細胞を標的とし、好ましくは影響を及ぼすベクターである。
【０１６７】
細胞及び細胞培養
当業者は、本明細書中に記載したポリペプチド又はそのフラグメントが、本明細書中で記載するポリヌクレオチド又は発現ベクターの発現によって細胞培養中で産生することができることを理解するであろう。一例では、細胞は原核生物又は真核生物である。一例では、細胞は、哺乳類、トリ、細菌又は節足動物起源のものである。一例では、細胞は哺乳類である。一例では、細胞は連続細胞株由来である。一例では、細胞は初代細胞株由来である。一例では、細胞は不死化細胞株由来である。一例では、細胞は接着細胞である。一例では、細胞は非接着細胞（浮遊細胞）である。一例では、細胞は免疫細胞である。
【０１６８】
一例では、哺乳類細胞は、ＨＥＫ、ＣＨＯ又はＨｅＬａ細胞である。一例では、細胞はＨｅＬａ細胞である。一例では、細胞はニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）から誘導される一次細胞株由来である。一例では、細胞は、不死化ニワトリ胚細胞株ＰＢＳ−１由来である。一例では、細胞は、ニワトリ線維芽細胞株ＤＦ−１由来である。一例では、細胞は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である。一例では、細胞はＭＤＣＫ３３０１６細胞である。一例では、細胞はＭＤＣＫＣＣＬ３４細胞である。一例では、細胞はアフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ細胞である。一例では、細胞はヒト網膜由来ＰＥＲ．Ｃ６細胞である。一例では、細胞はＡＧＥ１．ＣＲ細胞である。一例では、細胞はＭＲＣ−５二倍体細胞株由来である。一例では、細胞はヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）である。一実施形態において、細胞培養は細菌細胞培養である。一実施形態において、細菌細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一例では、細胞は昆虫細胞である。一例では、昆虫細胞はイラクサギンウワバ由来である。一例では、細胞を血清の不在下で培養することができる。一例では、細胞を血清の存在下で培養する。
【０１６９】
本発明の細胞集団は、インビトロでの細胞の増殖を可能にするいかなる細胞培養培地中でも培養することができる。そのような培地及びプロセスは当業者に公知である（例えば、Ｇｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。本発明の細胞集団を培養するための細胞培養培地の例としては：Ｉｓｃｏｖｅ培地、ＵｌｔｒａＣＨＯ、ＣＤハイブリドーマ無血清培地、ｅｐｉｓｅｒｆ培地、ＭｅｄｉＶ  ＳＦ１０３（無血清培地）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル変法イーグル培地（ＥＭＥＭ）、グラスゴー変法イーグル培地（ＧＭＥＭ）、ＳＭＩＰ−８、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ＶＰ−ＳＦＭ、ＤＭＥＭ系ＳＦＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２、ＶＰＳＦＭ／Ｗｉｌｌｉａｍ培地Ｅ、Ｅｘｃｅｌｌ５２５（ＳＦＭ）、アデノウイルス発現培地（ＡＥＭ）及びＥｘｃｅｌｌ６５６２９（Ｇｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような培地には、さらなる成長因子、例えば限定されるものではないが、アミノ酸、ホルモン、ビタミン及びミネラルを追加してもよいことは、当業者には理解されるであろう。場合によって、そのような培地には、血清、例えばウシ胎仔血清を追加してもよい。
【０１７０】
一例では、細胞は、バッチ細胞培養プロセスを用いて培養する。一例では、細胞は、潅流細胞培養プロセスを用いて培養する。一例では、細胞は、種培地及び産生培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）中で培養する。一例では、細胞は、撹拌槽型リアクターで培養する。一例では、リアクターの容積は約１Ｌ〜約２５００Ｌである。一例では、細胞をウェーブバイオリアクター中で培養する。一例では、細胞を細胞工場システム、例えばＮｕｎｃ細胞工場システムで培養する（Ｇｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０１７１】
免疫応答を刺激する抗原
本発明は、免疫応答を刺激する少なくとも１つの抗原と組み合わせてＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物の使用を提供する。化合物は、少なくとも１つの抗原と混合するか又はコンジュゲートさせて、化合物を対象に投与する場合に保護免疫応答を生じさせることができる。一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６活性を低下させる化合物を少なくとも１つの抗原又はワクチン組成物とともに投与して、少なくとも１つの抗原又はワクチン組成物に対する免疫応答を増加させる。
【０１７２】
「少なくとも１つの抗原」によって、１つ又はそれ以上の抗原型又は抗原決定基を意味する。一実施形態において、抗原を発明の化合物にコンジュゲートさせることができる。
【０１７３】
抗原にコンジュゲートした化合物又は化合物と抗原との組み合わせを含む組成物を、疾患に罹患しているか、又は疾患にかかりやすいか、又は疾患のリスクにある対象に投与することができる。
【０１７４】
本明細書中で使用する場合、「抗原」とは、特異的免疫応答を誘導する能力を有する物質を意味する。抗原は、その生活環ステージのいずれかの全生物、不活性化全生物、全生物から単離されたフラグメント又は成分、生物の可溶化物又は腫瘍可溶化物、当該技術分野で公知の方法により遺伝的又は合成的に操作された特異的抗原であり得る。さらに、選択された抗原は、成熟全生物又はスポロゾイト（オーシスト）のいずれか又は両方から誘導することができる。
【０１７５】
本発明の方法で使用するための抗原はまた、全細胞又はその細胞成分フラクションから構成され得る。そのような細胞又はその細胞成分フラクションは、例えば、腫瘍又は感染組織から誘導することができる。
【０１７６】
好ましい選択された抗原としては、例えば：
花粉；
アレルゲン、特に喘息を誘導するもの；
ウイルス、例えば本明細書中で記載するもの、及び特にインフルエンザ、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、狂犬病、麻疹、Ｂ型肝炎、口蹄病、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２；
細菌、例えば炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、及び淋病の病原体（ｅｔｈｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）；
原虫、例えば、Ｂａｂｅｏｓｉｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ；
真菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、及びヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）；
寄生虫、例えば、蠕虫；ならびに
腫瘍抗原、例えばムチン−１（ＭＵＣ−１）、がん胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＲＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（Ｔ）抗原、テロメラーゼ、スルビビン、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６Ｅ７、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、イディオタイプ、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ−３）、ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、睾丸がん抗原（ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、５Ｔ４、ならびにＧＭ−２及びＧＤ−２ガングリオシド．
由来の抗原が挙げられる。
【０１７７】
抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖又はオリゴ糖（遊離もしくはタンパク質担体にコンジュゲートしたもの）、又はそれらの混合物であり得る。タンパク質及びペプチドは、抽出物もしくは可溶化物の一部、天然源から精製したもの、固相合成によって合成したもの、又は遺伝子組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）によって得られたものであってよい。多糖類及びオリゴ糖類は、天然源から単離することができるか、又は酵素による手順及び／もしくは有機合成法を用いて合成することができる。
【０１７８】
抗原は、組換え宿主細胞における融合タンパク質の産生に際して発現及び精製を促進するために、融合タンパク質の一部を形成してもよい。融合タンパク質の非抗原部分は、概して融合ポリペプチドのＮ末端領域であり、カルボキシ末端配列は抗原配列を含む。融合タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、又は任意の他のタンパク質もしくはその部分、特に結果としての融合タンパク質を生成するためにタンパク質の結合又は他のアフィニティ特性を利用するアフィニティ精製を可能にするものから選択することができる。タンパク質はまた、キャリアタンパク質のＣ末端又はＮ末端と融合させることもできる。融合タンパク質の性質は、その融合タンパク質が産生されるベクター系によって左右される。細菌発現ベクターの一例はｐＧＥＸであり、これは、このベクターに関心対象の遺伝子をサブクローニングすると、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと関心対象のタンパク質とからなる融合タンパク質を産生する。
【０１７９】
別法として、場合によってタンパク質キャリアにカップリングしていてもよい合成ペプチド又はポリペプチドを本発明において用いることができる。合成ペプチド又はポリペプチドは、標準的方法に従って産生することができる。
【０１８０】
有用なペプチド又はポリペプチドは、全ポリペプチドが動物に投与されると、抗体及び／又は抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発することが知られているポリペプチドのエピトープを有する部分を備えていてもよい。このポリペプチド部分のエピトープはポリペプチドの免疫原性又は抗原エピトープである。
【０１８１】
「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫原である場合、抗体及び／又は抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体又はＭＨＣ分子が結合できるタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、概して、抗原エピトープの数よりも少ない。
【０１８２】
抗原エピトープを有するペプチド又はポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清をルーチン的に誘発することは当該技術分野では周知である（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３を参照）。タンパク質反応性血清を誘発することができるペプチドは、しばしば、タンパク質の一次配列で表され、簡単な化学的規則のセットによって特徴づけることができ、インタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ又はカルボキシル末端にも限定されない。
【０１８３】
本発明の抗原エピトープを有するペプチド及びポリペプチドは、好ましくは特定のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは約１５〜３０個のアミノ酸を含む。
【０１８４】
ＣＴＬ上のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープは、抗体によって認識されるものとは異なっていてもよい。通常、ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し細胞表面上に露出した、ペプチド（サイトゾル区画中で酵素により分解されるタンパク質に由来する）を認識する。これらのＣＴＬでよって認識されたペプチドは、ＭＨＣ対立遺伝子特異的配列モチーフにしたがってＭＨＣクラスＩ分子に対して選択的に結合する。これらのペプチドは、発現クローニングによって同定することができ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１を参照）、そして様々なクラスＩ及びクラスＩＩ結合ペプチドアルゴリズムを用いて予測することができる（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０１８５】
別法として、ＣＴＬによって認識されたペプチドは、免疫化のために用いられるタンパク質抗原に由来するペプチドでのインビトロ又はエクスビボ刺激による細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導によって同定することができる。特定のＣＴＬによって認識されるエピトープを有する本発明のペプチド及びポリペプチドは、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸の配列、そしてさらに好ましくは約７〜２０個のアミノ酸の配列である。
【０１８６】
エピトープを有するペプチド及びポリペプチドは、任意の従来型手段によって産生することができる。
【０１８７】
細菌抗原
抗原は、限定されるものではないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．を含む細菌から誘導することができる。
【０１８８】
細菌抗原は、天然、組換え又は合成のものであり得る。そのような細菌抗原としては、細胞表面上に存在する炭水化物決定基と結合する細菌由来のセレクチン又はレクチン、ならびにタンパク質、例えばフィブロネクチン、ラミニン、及びコラーゲンの細菌受容体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８９】
ウイルス抗原
抗原は、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹（Ｖａｒｉｃｅｌｌ−ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス、ヘルペスウイルス（ヒト及び動物）、単純ヘルペスウイルス、パルボウイルス（ヒト及び動物）、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルファウイルス、ブニヤウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ウシＬＶ、ＦｅＩＶ，イヌジステンパーウイルス、イヌ接触伝染性肝炎ウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ＴＧＥウイルス（ブタ）、及び口蹄病及び本明細書中で記載する他のウイルスを含むウイルスから誘導することができる。
【０１９０】
ウイルス抗原は、天然、組換え又は合成のものであり得る。そのようなウイルス抗原としては、感染プロセスを開始するための細胞表面受容体への付着の原因となるウイルス性タンパク質、例えば（ｉ）レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＦｅＬＶなど）及びヘルペスウイルスのエンベロープ糖タンパク質、ならびに（ｉｉ）インフルエンザウイルスのノイラミダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９１】
腫瘍抗原
本発明の一実施形態において、対象はがんに罹患しているか、又はがんを発症する危険性が増大している。
【０１９２】
本発明のがんを治療及び／又は予防する方法は、１つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原を含み得る。腫瘍関連抗原は、天然、組換え、又は合成であり得る。そのような腫瘍関連抗原としては、ＭＵＣ−１及びそのペプチドフラグメント、タンパク質ＭＺ２−Ｅ。多形性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、ＭＡＧＥ−１又はＭＡＧＥ−３及びそのペプチドフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのペプチドフラグメント、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）及びそのペプチドフラグメント、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）及びそのペプチドフラグメント、膵臓腫瘍胎児抗原及びそのペプチドフラグメント、ＣＡ１２５、１５−３，１９−９、５４９、１９５及びそのペプチドフラグメント、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びそのペプチドフラグメント、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）及びそのペプチドフラグメント、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）及びそのペプチドフラグメント、卵巣がん抗原（ＯＣＡ）及びそのペプチドフラグメント、膵臓がん関連抗原（ＰａＡ）及びそのペプチドフラグメント、Ｈｅｒ１／ｎｅｕ及びそのペプチドフラグメント、ｇｐ−１００及びそのペプチドフラグメント、変異体Ｋ−ｒａｓタンパク質及びそのペプチドフラグメント、変異体ｐ５３及びそのペプチドフラグメント、非変異体ｐ５３及びそのペプチドフラグメント、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、キメラタンパク質ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ、テロメラーゼ及びそのペプチドフラグメント、スビビン（ｓｕｖｉｖｉｎ）及びそのペプチドフラグメント、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  タンパク質及びそのペプチドフラグメント、ＷＴ１タンパク質及びペプチドフラグメント、ＬＭＰ２タンパク質及びペプチドフラグメント、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７タンパク質及びペプチドフラグメント、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質及びペプチドフラグメント、イディオタイプタンパク質及びペプチドフラグメント、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質及びペプチドフラグメント、ＰＡＰタンパク質及びペプチドフラグメント、睾丸がんタンパク質（ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｓｔｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びペプチドフラグメント、ならびに５Ｔ４タンパク質及びペプチドフラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の例示的腫瘍抗原（Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０１９３】
疾患
本発明の方法又は化合物で免疫応答を調節することによって治療及び／又は予防される例示的疾患としては：感染、免疫不全、自己免疫疾患、炎症性疾患及びがんが挙げられる。例示的疾患は、調節が必要な、不適切に増加した免疫応答又は不適切に減少した免疫応答を有し得る。例示的疾患は、調節が必要な、不適切に増加又は減少したＩＦＮ応答を有し得る。
【０１９４】
感染
一つの実施形態において、治療及び／又は予防される疾患は感染である。一つの実施形態において、感染は、ウイルス、細菌、真菌、又は原虫感染である。一実施形態において、感染はウイルス感染である。ウイルスは、ウイルスに対する免疫応答が、低下したＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性によって増大する任意のウイルスであり得る。一実施形態において、ウイルスは動物ウイルスである。一実施形態において、動物ウイルスはヒトウイルスである。一実施形態において、ウイルスは非ヒトウイルスである。一実施形態において、ウイルスはマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。
【０１９５】
本発明で使用するためのウイルスの例としては、モノネガウイルス、ヘルペスウイルス及びニドウイルス目のメンバーが挙げられる。一実施形態において、ウイルスはモノネガウイルス目由来である。一実施形態において、モノネガウイルスは、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス及びボルナウイルスから選択される。
【０１９６】
本発明で使用するためのウイルスの例としては、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス及びコロナウイルスから選択される科のウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９７】
オルトミクソウイルス科ウイルスは、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、及びＣ型インフルエンザウイルス、イサウイルス、ソゴトウイルス及び／又はカラナヤウイルス（Ｑｕａｒａｎｊａｖｉｒｕｓ）であり得る。インフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザウイルスであり得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、動物から単離されたＡ型インフルエンザウイルスから選択することができる。一実施形態において、動物はヒト又はトリである。特に、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９及びＨ１６Ｎ３から選択することができる。一つの実施形態において、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７，及び／又はＨ５Ｎ１から選択される。
【０１９８】
レトロウイルスは、例えばヒト免疫不全ウイルスであり得る。
【０１９９】
ヘルペスウイルスウイルスは、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス又はサイトメガロウイルスであり得る。
【０２００】
パラミクソウイルス科ウイルスは、例えば、パラミクソウイルス又は肺炎ウイルス亜科であり得る。一実施形態において、パラミクソウイルスは、例えばアクアパラミクソウイルス、アブラウイルス、フェルラウイルス（Ｆｅｒｌａｖｉｒｕｓ）、ヘニパウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レスピロウイルス、又はルブラウイルスであり得る。一実施形態において、肺炎ウイルス亜科は、例えば、Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏウイルス又はＯｒｔｈｏｐｎｅｕｍｏウイルスであり得る。一実施形態において、パラミクソウイルスはニューカッスル病ウイルスである。
【０２０１】
ラブドウイルスは、例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルスエフェメロウイルス、ペルハブドウイルス（Ｐｅｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、Ｔｉｂｒｏｖｉｒｕｓｋ、ヌクレオラブドウイルス）Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ツパウイルス（Ｔｕｐａｖｉｒｕｓ）ベシクロウイルス、スプリビウイルス（Ｓｐｒｉｖｉｖｉｒｕｓ）、シトラブドウイルス（Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、又はシグマウイルスであり得る。一実施形態において、ラブドウイルスは、狂犬病ウイルス、バス・コンゴウルス（Ｂａｓ−Ｃｏｎｇｏｖｉｒｕｓ）、カラジャスウイルス、チャンディプラウイルス、コカル（Ｃｏｃａｌ）ウイルス、イスファハンウイルス、マラバウイルス、ピリ（Ｐｉｒｙ）ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、チブロガルガン（Ｔｉｂｒｏｇａｒｇａｎ）ウイルス、ダーラムウイルス、パーチラブドウイルス、コイ春ウイルス病ウイルス、Ｈｉｒａｍｅラブドウイルス、感染性造血壊死ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス又はスネークヘッドラブドウイルスであり得る。一実施形態において、水疱性口内炎ウイルスは、水疱性口内炎アラゴアスウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、又は水疱性口内炎ニュージャージーウイルスである。
【０２０２】
フィロウイルスは、例えばエボラウイルス、クエバウイルス又はマールブルグウイルスであってよい。エボラウイルスは、例えば、ブンディブギョエボラウイルス、レストンエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、タイフォーレスト（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）エボラウイルス又はザイールエボラウイルスであり得る。
【０２０３】
ボルナウイルス科は、例えば、コブラ科１ボルナウイルス、哺乳類１ボルナウイルス、スズメ目１ボルナウイルス、スズメ目２ボルナウイルス、オウム目１ボルナウイルス、オウム目２ボルナウイルス又は水鳥１ボルナウイルスであり得る。
【０２０４】
コロナウイルス科ウイルスは、例えばコロナビリナエ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）又はコロビリナエ（Ｃｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ）であり得る。コロナビリナエは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、又はガンマコロナウイルスであり得る。トロビリナエ（Ｔｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ）はアルファコロナウイルス又はベータコロナウイルスであり得る。一実施形態において、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒａｄａｅ）はＳＡＲＳ（重度の急性呼吸器症候群）コロナウイルスであり得る。
【０２０５】
一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、鶏痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、おたふくかぜウイルス、ウマ脳脊髄炎、風疹ウイルス、産卵落下症候群ウイルス、トリ腫瘍溶解性ウイルス、トリ感染性咽頭気管炎ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、感染性ファブリーキウス嚢病、ウシイバラキ（Ｉｂａｒａｋｉ）ウイルス、組換えポックスウイルス、トリアデノウイルスＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型、ブタ日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、感染気管支炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラＥＥＶウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、パルボウイルス、口蹄病ウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタコレラウイルス、Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅウイルス、カバネウイルス、感染性サケ貧血ウイルス、感染性造血壊死ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、ブンディブギョエボラウイルス、レストンエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、タイフォーレスト（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）エボラウイルス、ザイールエボラウイルス、マーブルグ、ＳＡＲＳ及び感染性膵臓壊死ウイルスから選択される。
【０２０６】
一実施形態において、感染は、細菌性感染である。一実施形態において、細菌は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．から選択される。
【０２０７】
一実施形態において、感染は真菌感染である。一実施形態において、真菌感染は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍから選択される。
【０２０８】
一実施形態において、感染は原虫感染である。一実施形態において、原虫は、Ｂａｂｅｏｓｉｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉから選択される。
【０２０９】
免疫不全
一例では、治療及び／又は予防される疾患は免疫不全である。一例では、免疫不全は、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、分類不能型免疫不全症、重症複合免疫不全、後天性免疫不全症候群、白血病、ヒト免疫不全ウイルス、ウイルス性肝炎、例えばＣ型肝炎及び多発性骨髄腫から選択される。
【０２１０】
自己免疫疾患
一例では、治療及び／又は予防される疾患は自己免疫疾患である。一例では、自己免疫疾患の患者は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる化合物で治療され、対象において免疫応答及び／又はサイトカイン産生が減少する。一実施形態において、自己免疫疾患は慢性炎症を特徴とする。一実施形態において、自己免疫疾患は炎症レベルの増加を特徴とする。一実施形態において、自己免疫疾患はＩＦＮ応答の増加を特徴とする。一実施形態において、自己免疫疾患はＩ型ＩＦＮ応答の増加を特徴とする。
【０２１１】
例えば、自己免疫疾患は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無γグロブリン血症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性脂質異常症、自己免疫、免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及びニューロン神経障害、巴洛病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円盤状ループス、ドレスラー症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェグナー肉芽腫症と呼ばれていた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶結性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、低ガンマグロブリン血症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４−関連硬化性疾患、封入体筋炎、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、慢性、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（Ｄｅｖｉｃ’ｓ）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性精神神経疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、突発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レーノー現象（Ｒａｙｎａｕｄｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、後腹膜繊維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子・精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交換性眼炎、高安動脈炎、側��動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、及びウェグナー肉芽腫症から選択される。
【０２１２】
一例では、自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、関節リウマチ、多発性関節炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、喘息、１型糖尿病、２型糖尿病、狼瘡又は慢性閉塞性肺疾患から選択される。
【０２１３】
炎症性疾患
一例では、治療及び／又は予防される疾患は炎症性疾患である。一例では、炎症性疾患は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増大させる化合物の投与によって炎症が減少し、免疫応答及び／又はサイトカイン応答が減少する任意の疾患である。一実施形態において、疾患は慢性である。一実施形態において、炎症性疾患は前記自己免疫疾患のうちの１つによって引き起こされる。一実施形態において、炎症は外傷、例えば、損傷、熱傷又は凍傷に起因する外傷によって引き起こされる。
【０２１４】
がん
一例では、治療及び／又は予防される疾患はがんである。本明細書中で使用する場合、「がん」は、周囲組織に浸潤する、及び／又は新しいコロニー形成部位へ転移する能力を有する細胞の増殖によって特徴づけられる、様々な悪性新生物のいずれかを意味する。一実施形態において、がんは、例えば、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、結腸直腸がん、原発不明癌、子宮頸がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、外陰がんであり得る。一実施形態において、がんは、癌腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍、又は芽細胞腫である。
【０２１５】
化合物の同定方法
一実施形態において、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する本発明の化合物は、スクリーニングによって同定することができる。そのような化合物は当業者に公知の任意の方法によって同定することができ、ｉ）化合物のＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はＣ６ｏｒｆ１０６ｍＲＮＡと結合する能力を評価すること、ｉｉ）化合物のＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子発現を改変する能力を評価すること、ｉｉｉ）化合物のＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質に結合する能力を評価すること、ｉｖ）化合物の細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６活性を改変する能力を評価すること、のうちの１つもしくはそれ以上、又は全部を含み得る。化合物のＣ６ｏｒｆ１０６活性を改変する能力を評価することは、ウイルス感染などの感染に対する化合物の免疫応答を調節する能力を評価することを含み得る。あるいは、化合物のＣ６ｏｒｆ１０６活性を改変する能力は、化合物の免疫応答を誘導する能力を評価することを含み得る。免疫応答を評価することは、化合物による治療に応答するサイトカインのレベルを測定することを含み得るが、これに限定されるものではない。一実施形態において、免疫応答を測定することは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αのうちの１つ又はそれ以上の遺伝子及び／又はタンパク質のレベルを測定することを含む。
【０２１６】
Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子発現
一実施形態において、化合物は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現を減少させることによってＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を減少させ得る。一実施形態において、化合物は、Ｃ６ｏｒｆ１０６遺伝子又はそのフラグメントの発現を増加させることによってＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を増加し得る。そのような化合物をインビトロ、インオボ又はインビボでスクリーニングすることができる。インビトロ実験は、本発明の方法において使用するための候補化合物を細胞に投与し、そして化合物の投与前及び投与後のＣ６ｏｒｆ１０６ｍＲＮＡ発現レベルを評価することを含み得る。インビトロ研究は、任意の好適な細胞株を用いて実施することができる。一実施形態において、細胞株は哺乳類細胞株である。一実施形態において、細胞株はヒト細胞株、例えばＨｅＬａ細胞株である。インオボ研究はトリ卵において実施することができ、インビボ研究は、哺乳類モデル、例えばマウスモデルを用いて実施することができる。遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲを用いて測定することができる。
【０２１７】
組織及び／又は細胞におけるＣ６ｏｒｆ１０６遺伝子の発現レベルの定量的評価を可能にするものを含む、核酸の検出を可能にする任意の好適な技術を使用することができる。例えば、転写された遺伝子のレベルは、ノザンブロッティング、及び／又はＲＴ−ＰＣＲによって決定することができる。定量的（リアルタイム）ＰＣＲの出現とともに、任意のＲＮＡ集団中に存在する転写物のコピー数は、関心対象の遺伝子に適切なプライマーを用いて正確に決定することができる。核酸は、標識することができ、遺伝子アレイ上にハイブリダイズすることができ、その場合、遺伝子濃度は、アレイ中に生成した放射性又は蛍光シグナル遺伝子の強度に正比例する。
【０２１８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、複製コピーが、「上流」及び「下流」プライマーからなる「プライマー対」又は「プライマーセット」、ならびに重合の触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、及び典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用する標的ポリヌクレオチドで構成される反応である。ＰＣＲのための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、「ＰＣＲ」（Ｅｄ．  Ｍ．Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇ  Ｍｏｌｌｅｒ  （２０００）  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ）で教示されている。ＰＣＲは、生物学的サンプルから単離されたｍＲＮＡを逆転写することから得られるｃＤＮＡに関して実施することができる。
【０２１９】
別の核酸増幅技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。まず、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、逆転写酵素を用いてＲＮＡテンプレートから作製し、次いで結果として得られたｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。
【０２２０】
増幅の別の方法は、欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書で開示されているリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。
【０２２１】
Ｑβレプリカーゼも、本発明におけるさらに別の増幅方法として使用することができる。この方法では、標的に対して相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列をＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加する。ポリメラーゼはその後検出することができる複製配列をコピーする。
【０２２２】
制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼを使用して、制限部位の１本の鎖中にヌクレオチド５’α−チオ−トリホスフェートを含む標的分子の増幅を達成する等温増幅方法も、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【０２２３】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、複数ラウンドの鎖置換及び合成、すなわちニック翻訳を伴う核酸の等温増幅を実施する別の方法である。
【０２２４】
標的特異的配列は、サイクリックプローブ反応（ＣＰＲ）を用いて検出することもできる。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの３’及び５’配列ならびに特異的ＲＮＡの中間配列を有するプローブをサンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションしたら、反応をＲＮａｓｅ  Ｈで処理し、プローブの産物は、消化後に放出される独特の産物として同定される。もとのテンプレートを別のサイクリングプローブにアニーリングし、反応を繰り返す。
【０２２５】
等温増幅技術の別の例はＬＡＭＰ（ＤＮＡのループ媒介等温増幅）である。
【０２２６】
さらなる増幅方法は英国特許出願公開第２２０２３２８号明細書、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号明細書に記載され、本発明に従って使用することができる。
【０２２７】
他の核酸増幅手順は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）及び３ＳＲ（国際公開第８８／１０３１５号パンフレット）をはじめとする転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）を含む。
【０２２８】
ヌクレオチド配列の直接配列決定のための方法は当業者に周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ，  （１９９５）及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｈａｐ．  １３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）で見出すことができる。配列決定は、任意の好適な方法、例えば、ジデオキシ配列決定、化学的配列決定、次世代配列決定技術又はそれらの変形によって実施することができる。直接配列決定は、特定の配列の任意の塩基対における変化を決定するという利点を有する。
【０２２９】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムとしては、ＴａｑＭａｎアッセイ及び分子ビーコンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＴａｑＭａｎアッセイ（米国特許第５９６２２３３号明細書）は、一方の末端上にドナー色素を有し、他方の末端にアクセプター色素を有するので、色素対が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって相互作用をする対立遺伝子特異的（ＡＳＯ）プローブを使用する。
【０２３０】
Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性
一実施形態において、本発明の化合物は、タンパク質の発現を減少もしくは増加させることによるか、又はタンパク質の活性を改変することによって、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を調節することができる。そのような化合物は、当業者に公知の任意の方法によって、タンパク質に対して結合する能力についてスクリーニングすることができ、タンパク質の活性のレベルを調節することができる。そのような方法には、イムノアッセイが含まれ得る。
【０２３１】
化合物は、過剰量の他のポリペプチドの存在下でＣ６ｏｒｆ１０６と結合することができる。そのような特異性を達成するために必要なパラメータは、当該技術分野における慣習的方法を用いてルーチン的に決定することができる。好ましくは、結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１倍、又は少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、そしてさらに典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍Ｃ６ｏｒｆ１０６と結合する。
【０２３２】
本明細書中で想定されるスクリーニングアッセイとしては、対象から単離された生物学的サンプル中のタンパク質を検出するための任意の公知アッセイ、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、分画電気泳動、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び分画電気泳動を含む二次元ゲル電気泳動、イムノアッセイ、例えば、小分子（例えば、タンパク質の化合物、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレータ、競合的阻害剤、又は非競合的阻害剤）などのタンパク質の抗体又は非抗体リガンドを用いた検出に基づくシステムが挙げられる。これらの実施形態によると、抗体又は小分子をタンパク質の検出に適した任意の標準的固相又は液相アッセイフォーマットで使用することができる。質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、バイオセンサーテクノロジー、一過性ファイバー光学、又は蛍光共鳴エネルギー移動を使用する、例えば蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの光学的又は蛍光検出は、明らかに本発明に含まれる。質量分析サンプルのハイスループットスクリーニング、特にハイスループット共鳴スペクトロスコピー法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、エレクトロスプレーＭＳ又は非エレクトロスプレーＭＳ）における使用に適したアッセイシステムも想定される。
【０２３３】
好適なイムノアッセイフォーマットとしては、イムノブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素イムノアッセイが挙げられる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、アイソトープでコードされたアフィニティタグ（ＩＣＡＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、バイオセンサーテクノロジー、一過性ファイバー光学テクノロジー又はタンパク質チップテクノロジーを利用した改変イムノアッセイも有用である。
【０２３４】
一つの実施形態において、アッセイは半定量的アッセイ又は定量的アッセイである。
【０２３５】
標準的固相ＥＬＩＳＡフォーマットは、様々なサンプル由来のタンパク質又は抗体の濃度を決定するのに特に有用である。
【０２３６】
そのようなＥＬＩＳＡに基づくシステムは、例えば、既知量の標準に対して検出システムを校正することによるなど、サンプル中のタンパク質又は抗体の量の定量に特に好適である。
【０２３７】
別の形態では、ＥＬＩＳＡは、固体マトリックス、例えば、膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネートディップスティック又はガラス支持体上のＣ６ｏｒｆ１０６と特異的に結合する抗体を固定化することからなる。サンプルを次いで前記抗体と物理的に関係させ、サンプル中の抗原を結合又は「補足」させる。結合したタンパク質を次いで標識された抗体を用いて検出することができる。別法として、第２の（検出）抗体と結合する第３の標識された抗体を使用できる。
【０２３８】
インシリコスクリーニング
一実施形態において、そのような化合物は、当業者に公知の任意の方法によるコンピュータスクリーニングによって同定することができる。この種類の公知技術としては、Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔａｒａｇｈａｖａｎ，  （１９８７）、Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，  （１９８４）、Ｂｅｄｄｅｌｌ，  （１９８５）、Ｈｏｌ，  （１９８６）、Ｖｅｒｌｉｎｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌ，  （１９８４）、Ｗａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  （２００１）、Ｇｏｏｄ，  （２００１）、Ｇａｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ，  （２０００）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）、Ｃｅｒｑｕｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）、Ｋｕｅｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）、Ｗｅｓｔｅｒｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）で提供されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２３９】
化合物がＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質と結合するためには、典型的には、好適なレベルの立体化学的相補性が必要である。一般に、立体化学的相補性を有する分子の設計は、分子と標的受容体との間の「適合」を化学的及び／又は幾何学的に最適化する技術によって達成することができる。本発明によりＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質の立体化学を補完する分子を設計するために少なくとも２つのアプローチがある。
【０２４０】
第１のアプローチは、これに限定されないが、主に幾何学的基準を使用して、三次元構造データベースから分子をコンピュータにより受容体部位へ直接ドッキングさせて、特定の分子の前記部位に対する適合度を評価することである。このアプローチでは、内部自由度数（及び分子立体構造空間中の対応する極小値）は、２つの剛体の幾何的（剛体球）相互作用のみを考慮することによって減少し、この場合、一方の実体（活性部位）は、第２の実体（リガンドとして、補体分子）の結合部位を形成する「ポケット」又は「溝」を含む。
【０２４１】
このアプローチは、Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）及びＥｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって示され、彼らのリガンド設計のアルゴリズムは、カリフォルニア大学理事によって配布された商業的ソフトウェアパッケージ、ＤＯＣＫバージョン４．０に実装され、販売業者によって提供される表題「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＯＣＫ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｓｕｉｔｅ」の文書でさらに記載され、その内容を参照により本明細書中に援用される。Ｋｕｎｔｚアルゴリズムによると、関心対象の領域の形状は、異なる半径を有する一連の重なり合う球として定義される。例えばケンブリッジ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｌｅｎｓｆｉｅｌｄ  Ｒｏａｄ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ２  １ＥＷ，  Ｕ．Ｋ．）によって管理されているケンブリッジ構造データベースシステム、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ラトガース大学、米国ニュージャージー州）によって管理されているタンパク質データバンク、ＬｅａｄＱｕｅｓｔ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．，カリフォルニア州サンリアンドロ）、及びＮＣＩデータベース（国立がん研究所、米国）などの結晶学データの１つ又はそれ以上の現存のデータベースを次いでこのように定義された形状を近似する分子について検索する。
【０２４２】
幾何的パラメータに基づいてこのようにして同定された分子を、次いで、化学的相補性、例えば水素結合、イオン相互作用ファンデルワールス相互作用に関連する基準を満たすように改変することができる。異なるスコアリング機能を用いて、データベースから最良の分子をランク付けし選択することができる（例えば、Ｂｏｈｍ  ａｎｄ  Ｓｔａｈｌ，  １９９９を参照）。Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントルイス）によって販売されているソフトウェアパッケージＦｌｅｘＸは、この直接ドッキングアプローチで使用できるもう１つのプログラムである（Ｒａｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。
【０２４３】
第２の好ましいアプローチは、各化学基（「プローブ」）と部位内及び周囲のサンプル位置での活性部位との相互作用の評価を伴い、その結果、エネルギー値のアレイが得られ、それから選択されたエネルギーレベルでの三次元カウンダー表面を生成させることができる。リガンド設計に対する化学プローブアプローチは、例えば、Ｇｏｏｄｆｏｒｄ（１９８５）によって記載されいくつかの商業的ソフトウェアパッケージ、例えばＧＲＩＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．，  Ｗｅｓｔ  Ｗａｙ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｅｌｍｓ  Ｐａｒａｄｅ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＯＸ２  ９ＬＬ，  Ｕ．Ｋ．の製品）に実装されている。このアプローチにしたがって、異なる化学プローブ、例えば水、メチル基、アミン窒素、カルボキシル酸素、及びヒドロキシルで活性部位をプローブすることによって、部位補体分子にとっての化学的必須条件を最初に特定する。活性部位と各プローブとの間の相互作用について好ましい部位をこのように決定し、結果として得られたそのような部位の三次元パターンから、推定補体分子を生成させることができる。これは、三次元データベースを検索して所望のファルマコフォアパターンを組み入れる分子を特定することができるプログラムによるか、又は入力として好ましい部位及びプローブを用いて新しい設計を実施するプログラムによるかのいずれかで実施することができる。
【０２４４】
所望のファルマコフォアを有する分子を特定するために三次元データベースを検索するのに適したプログラムとしては：ＭＡＣＣＳ  ３Ｄ  ａｎｄ  ＩＳＩＳ／３Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．，カリフォルニア州サンリアンドロ）、ＣｈｅｍＤＢＳ  ３Ｄ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕ．Ｋ．）、及びＳｙｂｙｌ／３ＤＢ  Ｕｎｉｔｙ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）が挙げられる。
【０２４５】
化学構造のデータベースは、ケンブリッジ結晶学データセンター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｕ．Ｋ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｌｔｄ．，（カリフォルニア州サンリアンドロ）、Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  （ミズーリ州セントルイス）、及びＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  （Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  ＯＨ）をはじめとする多くのソースから入手可能である。
【０２４６】
デノボデザインプログラムとしては、Ｌｕｄｉ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｌｅａｐｆｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）、Ａｌａｄｄｉｎ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州アーバイン）、及びＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ（北京大学、中国）が挙げられる。
【０２４７】
模倣物、例えばペプチド模倣物及び有機模倣物を、例えば現行のコンピュータモデル化ソフトウェア（コンピュータ支援の薬物設計又はＣＡＤＤを使用する）（Ｗａｌｔｅｒｓ，  １９９３；  Ｍｕｎｓｏｎ，  １９９５）を用いてペプチド結合部位をフィットさせるために設計することができる。また、そのような技術を用いて調製した模倣物も本開示の範囲内に含まれる。一例では、ＳＯＣＳ−３のペプチド又は領域を模倣する。
【０２４８】
模倣物は、いくつかのペプチド構造から仮想のペプチドモデルを誘導できるソフトウェアを用いて生成することができる。これは、ＳＬＡＴＥアルゴリズム（Ｐｅｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）、Ｄｅ  Ｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７））からのソフトウェアを用いて実施できる。
【０２４９】
ペプチドアナログ、誘導体及び模倣物を設計する他のアプローチも当該技術分野で周知であり、例えば、Ｆａｒｍｅｒ（１９８０）、Ｂａｌｌ  ａｎｄ  Ａｌｅｗｏｏｄ（１９９０）、Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｇａｉｎｏｒ（１９８９）、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８９）、Ｓａｗｙｅｒ（１９９５）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）及びＨｉｒｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）を参照。
【０２５０】
必要ならば、有望な薬物（アゴニスト又はアンタゴニスト）を合成することができるか、又は商業的供給業者などの好適なソースから入手することができる。それを次いで任意の標準的結合アッセイに配置してＣ６ｏｒｆ１０６タンパク質に結合する能力に対するその効果を試験する、及び／又は標準的アッセイに配置して、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質の生物学的活性を調節する能力もしくはウイルス感染を調節する能力を判定することができる。
【０２５１】
本明細書中で記載する薬物スクリーニングアッセイのすべてについて、薬物の構造に対するさらなる精製が概して必要であり、特定の薬物スクリーニングアッセイによって提供されるステップのいずれか及び／又はすべての連続的反復によって行うことができる。
【０２５２】
投与
本発明の方法は、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質活性を改変する化合物又は組成物を対象に対して適切な経路により、単独又は例えば免疫応答を刺激する抗原などの別の化合物と組み合わせて投与することを含む。
【０２５３】
限定されるものではないが、経口、食物、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、血管内又は皮下注射）、及び吸入（例えば、気管支内、鼻腔内又は経口吸入、点鼻剤）投与経路をはじめとする様々な投与経路が可能である。
【０２５４】
一つの実施形態において、化合物又は組成物を粘膜部位に投与する。粘膜部位の例としては、気道、例えば鼻部（例えば、鼻）、気管、気管支及び肺、経口（例えば、口及び歯肉）及び口腔咽頭空洞を含む頬又は経口組織、扁桃腺を含む喉、眼の結膜、胃腸管（例えば、食道、胃、十二指腸、小腸及び大腸、結腸及び直腸）、生殖器官／組織（膀胱、尿管、尿道及び関連組織、陰茎、外陰／膣及び頸部−膣組織、ならびに子宮及び卵管を含むがこれらに限定されない）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２５５】
投与される組成物の処方は、選択された投与経路に応じてさまざまである（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）。
【０２５６】
化合物を含む組成物は生理学的に許容される担体を含み得る。溶液又はエマルジョンに関して、好適な担体としては、水性又はアルコール性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液、例えば食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。非経口担体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は固定油が挙げられる。静脈内担体は、様々な添加剤、防腐剤、又は流体、栄養素又は電解質補充剤などを含む。吸入のために、可溶性組成物を投与に適したディスペンサーにロードすることができる（例えば、アトマイザー、ネブライザー又は加圧エアロゾルディスペンサー）。
【実施例】
【０２５７】
実施例１  物質及び方法
細胞及びウイルス：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）及びＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８１）を成長培地（１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清［ＦＢＳ］、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン［Ｐ／Ｓ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］を追加したイーグル変法イーグル培地［ＥＭＥＭ］）中に維持した。Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）を、前記のようなＦＢＳ、Ｌ−グルタミン及びＰ／Ｓを追加したダルベッコの変法イーグル培地／栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）中で維持した。全細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中で３７℃にて保持した。使用したウイルス株は以下の通りであった：ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）（ヘンドラウイルス／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／ウマ／１９９４／ヘンドラ）；Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ニワトリ／Ｖｉｅｔｎａｍ／００８／２００４  Ｈ５Ｎ１）；おたふくかぜウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ／Ａｔｌａｎｔａ／Ｂｕｌｌ／１９６２）；西ナイルウイルス（ＷＮＶ  ＮＹ９９）；（ＷＮＶ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／Ｃｒｏｗ／１９９９）。
【０２５８】
ＴＣＩＤ５０分析：５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）分析のために、組織培養上清の１０倍希釈を培地中で作製し、９６ウェル組織培養中でＶｅｒｏ細胞を添加した（５×１０４細胞／ウェル）。プレートを３日間（ＨｅＶ、ＶＳＶ）又は６日間（ＷＮＶ、Ｈ５Ｎ１、ＭｕＶ）、３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベートし、そしてｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  効果について採点した。感染価をＲｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法により算出した。
【０２５９】
Ｃ６ｏｒｆ１０６欠失変異体生成：特定の欠失を有する（図６参照）を、Ｃ６ｏｒｆ１０６特異的プライマー（表２）を用いてＱ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；ＮＥＢ）で生成させた。クリーンアップ及び制限消化（ＳａｃＩ及びＸｈｏＩ；ＮＥＢ）後、生成物をｐＣＡＧＧ哺乳類発現ベクターにライゲートし、そして化学的にコンプテントな大腸菌（Ｍａｘ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５コンピテント細胞；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。プラスミドを増幅し、ＱＩＡＧＥＮ  ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキットを製造業者によって指定されるように用いて増幅し抽出した。
【０２６０】
【表２】
2019503998.tif 000003
【０２６１】
トランスフェクション：ＨｅＬａ細胞（７×１０４）を、５０ｎＭのｓｉＲＮＡプール（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；標的配列Ｄ−０１６３３０−０２−ＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＵＡＡ、Ｄ−０１６３３０−０３−ＧＡＧＵＣＡＡＵＡＣＣＵＣＣＧＧＡＵＡ、Ｄ−０１６３３０−０４−ＧＧＧＵＧＧＡＣＵＵＵＵＡＧＧＡＧＵＡ、Ｄ−０１６３３０−１７−ＣＡＧＣＡＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＡＵＵＡを含むｓｉＧＥＮＯＭＥヒトＣ６ｏｒｆ１０６ＳＭＡＲＴプールＭ−０１６３３０−０１−００５０）で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で０．５μＬのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ−１（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して一晩逆トランスフェクトし、その後、培地を除去し、トランスフェクション培地（成長培地−抗生物質）と置換し、そして細胞をさらに２４時間インキュベートした。ＤＮＡトランスフェクションのために、３００ｎｇのＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔアミン２０００とともにインキュベートし、そして使用して、ＨｅＬａ細胞（１．４×１０５／ウェル）を逆転写した。培地をトランスフェクション後約６時間（ｈ．ｐ．ｔ．）で置換し、そしてさらに１８時間インキュベートした。細胞をトランスフェクトした高分子量ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（５〜１０μｇ／ｍＬと１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）で６時間、トランスフェクション培地中で前記のように刺激した。
【０２６２】
ＲＮＡ精製、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：細胞を５００μＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＴｒｉｓｕｒｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）中で溶解させ、そしてＲＮＡを製造業者のプロトコルにしたがって抽出した。ＤＮＡｓｅ処理（ＲＱ１  ＤＮａｓｅ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）後に、５００ｎｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＳｅｎｓｉｆａｓｔ  ＲＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）第１鎖ｃＤＮＡ合成プロトコルを用いてオリゴ−ｄ（Ｔ）及びランダムヘキサマーでＤＮＡに逆転写した。ステップＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳｙｂｒ  ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。遺伝子検出のためのＰＣＲサイクリングは９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルであった。融解曲線分析を実施して、プライマー二量体アーチファクトを除去し、アッセイの特異性を検証した。サイトカイン発現及びウイルスＲＮＡ転写データは、ΔΔＣＴ法を使用して分析し、遺伝子検出のためにグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーを表３に示す。
【０２６３】
【表３】
2019503998.tif 000004
【０２６４】
二重−ルシフェラーゼアッセイ：ＨｅＬａ細胞を、１００ｎｇのＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ又はＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ（ホタル）のいずれか及び５０ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼ構築物とあわせて、１００ｎｇのｅＧＦＰ／Ｃ６−フラグ過剰発現プラスミドで逆トランスフェクトした。２０ｈ．ｐ．ｔで、細胞を上述のようにポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激し、その後、Ｐａｓｓｉｖｅ溶解緩衝液（ＰＬＢ；Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶解させた。可溶化物を次いで、二重ルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の推奨どおりに使用して連続ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。
【０２６５】
免疫沈降細胞及び分画：免疫沈降について、２５μｇの抗体を、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって指定されているとおりにＰｉｅｒｃｅ直接免疫沈降キットを使用して５０μｇのアガロースビーズにカップリングさせた。細胞を提供されたＮＰ−４０溶解緩衝液中に溶解させ、非特異的アイソタイプアガロース対照で４℃にて１時間前もってはっきりさせ（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒ）、次いで約１．５μｇアガロース結合抗体とともに４℃にて一晩インキュベートした。樹脂を複数回洗浄し、次いで非還元サンプル緩衝液（２％ｗ／ｖＳＤＳを含む）を用いて１００℃で１０分間溶出を実施した。細胞質フラクションと核フラクションを、Ｐｉｅｒｃｅ  ＮＥ−ＰＥＲ細胞分画キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者によって指定されている通りに使用して細胞から調製し、ウェスタンブロット分析の前にＢＣＡアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって全タンパク質を定量した。
【０２６６】
ウェスタンブロッティング：細胞を、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ａｓｔｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したＳＤＳ溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｖのＳＤＳ及び１０％のグリセロール）又はＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に溶解させた。タンパク質可溶化物をＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、４〜１２％勾配ＮｕＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル上、１２０Ｖで分離し、次いでＴｒａｎｓＢｌｏｔ  システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜に移した。３％脱脂粉乳／ＴＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中デブロッキングした後、膜を一次抗体とともにブロッキング溶液中で４℃にて一晩インキュベートした。ＨＲＰ結合二次抗体をブロッキング溶液中で１：５０００に希釈し、ブロットしてＲＴで３時間インキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄しリンスし、ＥＣＬ展開溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともにインキュベートし、そしてＣｈｅｍｉ−Ｄｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。
【０２６７】
免疫蛍光検査：細胞をＰＢＳ中４％ｗ／ｖのパラホルムアルデヒド中でＲＴにて２０分間固定し、続いて０．１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過化し、０．２Ｍのグリシンで１０分間、それぞれＲＴにてクエンチした。固定した細胞をＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３０分間ブロックし、次いでブロッキング溶液中一次抗体とともに１時間ＲＴにてインキュベートし、０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で３回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかにコンジュゲートした二次抗体とともにＲＴにて１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで核色素ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍＬ）で対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で観察するか、又はＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔで分析した。
【０２６８】
ＩＦＮ−βＥＬＩＳＡ：トランスフェクトし、次いでポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＨｅＬａ細胞からの細胞培養上清を集め、Ｅｌｉｓａキット．ｃｏｍによって供給されるサンドイッチＥＬＩＳＡキットを製造業者のプロトコルに従って使用して、ＩＦＮ−β分泌について分析した。ＩＦＮ−β濃度は、多項式回帰法を用いて標準と比較することによって算出した。
【０２６９】
実施例２  Ｃ６ｏｒｆ１０６はウイルス感染に必要である
Ｃ６ｏｒｆ１０６を、ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）感染に必要なタンパク質（宿主タンパク質）を調査するｓｉＲＮＡスクリーンで特定した。Ｃ６ｏｒｆ１０６のノックダウンの結果、ＨｅＶ及びＮｉＶ感染性ウイルス産生が有意に減少した。Ｃ６ｏｒｆ１０６についてのスクリーン結果を立証するために、ＨｅＬａ細胞を、Ｃ６ｏｒｆ１０６（５０ｎＭ）を標的とするｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、次いでマイナス鎖ＲＮＡウイルスで２４時間感染させ、その後、ウイルス産生をＶｅｒｏ細胞中ＴＣＩＤ５０で分析した。ＳＭＡＲＴプールｓｉＣ６ｏｒｆ１０６ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から集めた細胞可溶化物は、ｓｉＮＥＧでトランスフェクトした細胞、どの遺伝子も標的としない負の対照ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡと比較したｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方で、Ｃ６ｏｒｆ１０６発現レベルにおいて９０％の減少を示した。図１Ａ及びＢで示すように、ｓｉＣ６ノックダウンはＨｅＬａ細胞におけるウイルス産生を、負の非ターゲティング対照（ｓｉＮＴ１）と比較して約１．５ｌｏｇ（約９５％）で減少させた。これらの実験をパラミクソウイルス（おたふくかぜウイルス；ＭｕＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス（Ａ型インフルエンザＨ５Ｎ１株）又は正のセンスＲＮＡウイルス（西ナイルウイルスＮＹ９９株；ＷＮＶＮＹ９９）での細胞の感染で繰り返した。ＭｕＶ、Ｈ５Ｎ１及びＷＮＶＮＹ９９感染はＣ６ｏｒｆ１０６ノックダウンによっても影響を受けた。ＨｅＶ（パラミクソウイルス）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、ラブドウイルス科）及びＡ型インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）ウイルス（オルトミクソウイルス科）ウイルス価における有意な減少が、感染の２４時間後に集めた上清中で観察された（図Ａ及びＢ）。対照的に、ｓｉＣ６ｏｒｆ１０６はＷＮＶＮＹ９９（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）価に対して重大な影響を及ぼさず、このことは、Ｃ６ｏｒｆ１０６がマイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染を促進することを示唆した。
【０２７０】
細胞に対するＣ６ｏｒｆ１０６ノックダウンの影響を評価するために、健常なＨｅＬａ細胞をＳＭＡＲＴプールｓｉＣ６ｏｒｆ１０６又はｓｉＮＥＧ対照でトランスフェクトし、細胞数をトランスフェクション後７２時間で評価した。細胞数における有意差はトランスフェクション７２時間後のｓｉＣ６ｏｒｆ１０６サイレンシングで観察されなかった（図１Ｃ）。アラマーブルーアッセイは、ｓｉＮＥＧと比較してｓｉＣ６ｏｒｆ１０６  ＳＭＡＲＴプールで処理した細胞における代謝活性で有意な変化を示さなかった（図１Ｄ）。細胞死の正の対照として、アポトーシス誘導と関連する遺伝子である、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）を標的とするＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトした（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。細胞数及び細胞の生存の両方の減少が、ｓｉＰＬＫ１でトランスフェクトされた細胞で観察された（図１Ｄ及びＥ）。
【０２７１】
実施例３  Ｃ６ｏｒｆ１０６は２つの推定上の機能ドメインを有する脊椎動物種の間で高度に保存される
Ｃ６ｏｒｆ１０６アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（受入番号Ｑ９Ｈ６Ｋ１．２）から供給され、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いてＥｎｓｅｍｂｌデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から抽出されたホモログと整列させた。図２に示すように、Ｃ６ｏｒｆ１０６タンパク質配列は脊椎動物種にわたって高度に保存され、ヒト由来の残基の５０％はホヤ（Ｃ．  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）配列と同一である。最高の程度の保存は２つの推定上の機能ドメイン；ユビキチン結合様（ＵＢＡ様）ドメイン、Ｎｂｒ−１様又はＦＷドメインで明らかであり、これは４つのトリプトファン残基によって特徴づけられる（図２を参照）。ユビキチン受容体Ｎｂｒ−１におけるこの後者のドメインは、微小管関連タンパク質ＭＡＰ１Ｂオートファジー経路と微小管ネットワークとの間の潜在的な関連性との相互作用を促進することが示されている（Ｍａｒｃｈｂａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。ＣｌｕｓｔａｌＷデータベースの検索は、Ｃ６ｏｒｆ１０６がＵＢＡ様ドメイン及びＦＷドメインを特徴づける今までに同定された唯一のヒトタンパク質であることを示唆する。
【０２７２】
実施例４  Ｃ６ｏｒｆ１０６ノックダウンはポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してサイトカイン転写を増強する
サイトカイン転写に対するＣ６ｏｒｆ１０６サイレンシングの影響を次に評価した。合成二本鎖ＲＮＡアナログポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を使用してウイルスＲＮＡ複製ならびにインターフェロン及び炎症性サイトカイン転写の誘導を模倣した。ＨｅＬａ細胞を上述のようにＣ６ｏｒｆ１０６  ｓｉＲＮＡで４８時間処理し、次いでトランスフェクトされたポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激し、その後、ＲＮＡを抽出し、インターフェロンα及びβ（ＩＦＮ−α／β）の転写ならびに炎症性サイトカインインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）について分析した。
【０２７３】
図３Ａは、Ｃ６ｏｒｆ１０６特異的抗体を使用して、ＲＮＡレベルでのＣ６ｏｒｆ１０６のノックダウンの成功（ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価して約９０％の減少）及びほぼ検出不可能なタンパク質を示す。ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した非ターゲティング対照（ｓｉＮＴ１／ＮＴ２）において、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの転写はすべて、非刺激細胞と比べて増加した。細胞内ポリ（Ｉ：Ｃ）で処理したＨｅＬａ細胞はＩＦＮ−α／β、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び（ＴＮＦ−α）の強固な上方調節を示した（図５Ａ及びＢ）。ＩＦＮα／β及びＴＮＦ−αの転写誘導は、Ｃ６ｏｒｆ１０６ノックダウン細胞において有意に増強されたが、ＩＬ−６転写は再現性よく変化しなかった（図３Ｂ）。このことは、Ｃ６ｏｒｆ１０６がポリ（Ｉ：Ｃ）誘導抗ウイルスシグナル伝達の負の制御因子として作用することを示唆する。このことは、負のフィードバックループによって予想されるように、内因性Ｃ６ｏｒｆ１０６ＲＮＡレベルがポリ（Ｉ：Ｃ）刺激後の時間とともに増加するという観察結果によりさらに裏付けられる（図９Ａ）。
【０２７４】
実施例５  Ｃ６ｏｒｆ１０６過剰発現はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してインターフェロンα／β転写及び分泌を阻害する。
ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導ＩＦＮシグナル伝達の負の制御因子としてのＣ６ｏｒｆ１０６の潜在的な役割を確認するために、ＨｅＬａ細胞をＣ６ｏｒｆ１０６発現ベクター（ｐＣＡＧＧｓ−Ｃ６−フラグ；配列番号４０）、ならびに非特異的ＧＦＰ過剰発現対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの１８時間後に、細胞をポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激し、そして抽出されたＲＮＡを前述のようにインターフェロン及び炎症性サイトカインについて分析した。ＧＦＰ又はベクター単独（ｐＣＡＧＧ）はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してサイトカイン転写を損なわなかった（図４Ａに示すとおり）が、Ｃ６ｏｒｆ１０６過剰発現の結果、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−α転写が有意に減少した。ＩＬ−６転写物の誘導は、Ｃ６ｏｒｆ１０６による影響を受けなかった。さらに、組織培養上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−βの分泌について評価すると、Ｃ６ｏｒｆ１０６を過剰発現する細胞においてＩＦＮ−β濃度の有意な減少が観察された。ＩＦＮ−βｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの相対的減少が類似しているとすると、これは分泌経路におけるブロックとは対照的に、減少したｍＲＮＡ／タンパク質発現に対するＣ６による減少に起因する。興味深いことに、下流ＩＦＮ及び／又はＴＮＦ−αシグナル伝達は、それぞれＩＦＮ−α又はＴＮＦ−α処理に応答して未変化のＩＳＧ１５又はＩκＢαによって示されるように、Ｃ６ｏｒｆ１０６の発現によって重大な影響を受けなかった（図９Ｂ）。
【０２７５】
Ｃ６ｏｒｆ１０６発現の個々の転写因子の活性に対する影響を、ＩＲＦ３及び／又はＮＦ−κＢ結合部位を含むルシフェラーゼベクターを用いて評価した。細胞内ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して、Ｃ６ｏｒｆ１０６過剰発現の結果、ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞と比較してＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ活性が約７５％減少した（図５Ｃ）。ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼの中程度の減少も観察された。
【０２７６】
実施例６  Ｃ６ｏｒｆ１０６のＵＢＡ様ドメインの欠失はその転写阻害効果を増強する
Ｃ６ｏｒｆ１０６の推定上の機能ドメインのどれがサイトカイン転写に対する影響の原因であるかを決定するために。図６Ａに示すようなＵＢＡ様ドメイン（ΔＵＢＡ）配列番号４４、ＦＷ／Ｎｂｒ−１様ドメイン（ΔＦＷ）配列番号４９及び無秩序領域（Δｄｉｓ）配列番号４２を欠失させることによって発現プラスミドを生成した。図６Ｂに示すように、ＵＢＡ様又はＦＷドメインのいずれかの欠失の結果、完全長Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグと比較した場合にポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して有意に高いＩＦＮα／β及びＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのレベルが得られた。対照的に、無秩序領域の除去は、サイトカイン転写を回復せず、ＩＦＮα／βの場合、実際にこれらのレベルをさらに減少させた。これは、Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグ及び他の欠失変異体と比較して、Δｄｉｓタンパク質自体の全体的なレベルが低いにも関わらず観察された（図１１）。興味深いことに、Δｄｉｓタンパク質の細胞内局在は、完全長Ｃ６ｏｒｆ１０６と同様に。完全長Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグと最も似ており（図１１）、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してＩＲＦ３核移行を損なわなかった。比較すると、ΔＵＢＡ及びΔＦＷタンパク質はどちらも変更された細胞内分布を示し、ΔＵＢＡは核中に保持されるのに対して、ΔＦＷはより細胞質性であった。
【０２７７】
実施例７  Ｃ６ｏｒｆ１０６はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して転写因子の核移行を損なわない
ＩＦＮ−α／β転写は、主に、インターフェロン応答因子３（ＩＲＦ３）ならびに核因子κ−Ｂ（ＮＦκＢ）によって制御され、どちらもＴＬＲ及びＲＬＲリガンド、例えばポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して核に転位する。Ｃ６ｏｒｆ１０６がサイトカイン転写を阻害する機構を調査するために、Ｃ６ｏｒｆ１０６を前述のようにポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＨｅＬａ細胞において発現し、その後、細胞を固定し、Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグ、ＩＲＦ３又はｐ６５（ＮＦκＢ）について標識した。ＩＲＦ３核移行もｐ６５核移行も、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＣ６ｏｒｆ１０６発現細胞において阻害されなかった（図７Ａ、７Ｂ及び図８Ａ）。しかしながら、Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグの核染色はポリ（Ｉ：Ｃ）刺激により増加することが観察され、このことは、Ｃ６ｏｒｆ１０６が上流シグナル伝達事象ではなく、核レベルでの転写に対して影響を及ぼすことを示唆し得た。ＧＦＰと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１０６を発現する未刺激細胞におけるＩＲＦ３及びｐ６５核染色において中程度ではあるが、有意な増加もあった。
【０２７８】
ポリ（Ｉ：Ｃ）などのリガンドによるＲＬＲ／ＴＬＲ活性化後に、シグナル伝達エフェクタのカスケードの結果、ＩＲＦ３リン酸化、二量体化及び核輸送となる。ウイルスＲＮＡ様刺激の認識によりＩＲＦ３活性化をブロックするか否かを評価するために、ＧＦＰ及びＣ６ｏｒｆ１０６発現細胞の核及び細胞質フラクションを単離し、リン酸化ＩＲＦ３についてプローブした（Ｓｅｒ３９６）。ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激は、ＧＦＰ発現細胞及びＣ６ｏｒｆ１０６発現細胞の両方でリン酸化ＩＲＦ３のレベルを増加させた（図８Ｂ）。さらに、ｐ６５、ホスホ−ＩＲＦ３及び全ＩＲＦ３の核内蓄積は、ＧＦＰ−及びＣ６ｏｒｆ１０６発現細胞において同程度まで観察された。Ｃ６ｏｒｆ１０６は、転写因子活性化及び核移行の顆粒のＩＲＦ３／ｐ６５が関与する転写を阻害する。
【０２７９】
実施例８  Ｃ６ｏｒｆ１０６はＩＲＦ３と結合し、この結合はポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して増強される
Ｃ６ｏｒｆ１０６がＩＲＦ３と結合するか否かを評価するため、Ｃ６ｏｒｆ１０６−フラグを前述のようにＧＦＰ−／＋ポリ（Ｉ：Ｃ）と同時発現させ、その後、固定化されたＩＲＦ３抗体との直接共免疫沈降を実施した。図１０Ａに示すように、Ｃ６ｏｒｆ１０６は、ＩＲＦ３免疫沈降化可溶化物において検出することができ、これは、ポリ（Ｉ：Ｃ）の存在下で約４倍増加した。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１０６がＩＲＦ３を結合することを示すために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＩＲＦ３単独、又はＣ６ｏｒｆ１０６と組み合わせたＩＲＦ３でトランスフェクトした。細胞を溶解させ、抗ＩＲＦ３抗体での間接的免疫沈降に供した。ＩＰサンプル及び入力対照をウェスタンブロッティングのために抗フラグ抗体でプローブした。ＩｇＧアイソタイプを免疫沈降実験のための負の対照として使用した。結果は、図１０Ｂに示すように、Ｃ６ｏｒｆ１０６がＩＲＦ３に結合することを実証する。
【０２８０】
当業者であれば、広範に記載された本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるような多くの変形及び／又は変更が本発明に対してなされ得ることが理解されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【０２８１】
本出願は、その全体のその内容を参照により本明細書中に援用される、２０１５年１２月４日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１５９０５０３５号明細書、表題「サイトカイン産生の調節」の優先権を主張する。
【０２８２】
本明細書において議論及び／又は参照されるすべての刊行物は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０２８３】
本明細書に含まれるいかなる文書、行為、材料、装置、物品又は同種のものの論文も、単に本発明の状況を提供することを目的とするものである。これらの事項のいずれか又はすべてが、先行技術の基礎の一部をなすか、又は本出願の各クレームの優先日以前に存在していた本発明の関連技術分野での一般常識であることを認めるものではない。
【０２８４】
参考文献
Bird et al. (1988) Science 242:423-426.
Ball and Alewood (1990) J. Mol. Recognition 3:55.
Bohm and Stahl (1999) M. Med. Chem. Res. 9:445.
Cadwell and Joyce (1992) PCR Methods Appl. 2:28-33.
Cerqueira et al. (2015) Arch Biochem Biophys 582:56-67.
Coco et al. (2001) Nature Biotechnology 19:354-359.
Coco et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1246-1250.
Constantini et al. (2008) Cancer Biotherm Radiopharm. 23:3-24.
Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291.
Daya et al. (2008) Clin. Microbiol Rev. 21(4):583-593.
De Esch et al. (2001) J. Med. Chem. 44:1666-1674.
De Coupade et al. (2005) Biochem J. 390:407-418.
Deshayes et al. (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:537-547.
Eggert et al. (2005) Chemobiochem. 6:1062-1067.
Ewing et al. (2001) J. Comput Aid. Mol. Design 15:411.
Farmer, in Drug Design, E. J. Ariens, ed., Academic Press, New York, 1980, v. 10, pp. 119-143.
Freidinger (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10:270.
Gane and Dean (2000) Curr. Opinion Struct. Biol. 10:401.
Good (2001) Current Opinion in Drug Disc. Devel. 5, 301.
Goodford (1984) J. Med. Chem. 27:557.
Goodford (1985) J. Med. Chem. 28:849.
Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16:76-82.
Harmsen and De Haard (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:13-22.
Hirschman et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:12550-12568.
Hol (1986) Angew. Chem. 25: 767.
Howl et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:767-769.
Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci. USA. 85:5879-5883.
Jiang et al. (2015) Tumour Biol. 36:7881-7889.
Kabadi et al. (2015) Nucleic acid Res. 42:e147.
Koppelhus et al. (2008) Bioconj. Chem. 19:1526-1534.
Kuenemann et al. (2015) Prog. Biophys. Mol. Biol 119:20-32.
Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol. 161:269.
Langer and Hoffmann (2001) Current Pharmaceutical Design 7:509.
Leung et al. (1989) Technique 1:11-15.
Liu et al. (2003) (Plk) Proc Natl Acad Sci, 100(10):5789-94.
Makarova et al. (2015) Nature Reviews Microbiology 13:1-15.
Marchbanks et al. (2012) Int J Biol 2012:208014. doi: 10.1155/2012/208014. Epub 2012 May 10.
Meyer-Losic et al. (2006) J. Med Chem. 49:6908-6916.
Mills et al. (2001) J Comp. Aided Mol Des 15:81-96.
Mills et al. (1997) J Comp. Aided Mol Des 11:175-192.
Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243.
Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855.
Mungall et al. (2003) Nature 425: 805-811.
Munson (ed.), Principles of Pharmacology, 1995, Chapman & Hall, Chapter 12.
Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302. 
Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.
Ness et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1251-1255.
Ostermeier et al. (1999) Nat Biotechnol. 17:1205-1209.
Perkin et al. (1995) J Comp. Aided. Mol. Des. 9:479-490.
Pietersz et al. (2006) Current Medicinal Chemistry 13:1591.
Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 127:31-36.
Rarey et al. (1996) J. Mol. Biol. 261: 470.
Reed and Muench (1938) The American Journal of Hygiene 27:493-497.
Sawyer (1995) "Peptidomimetic design and chemical approaches to peptide metabolism", in MD Taylor and GL Amidon, eds., in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Ch. 17.
Sheridan and Venkataraghavan (1987) Acc. Chem Res. 20:322.
Sieber et al. (2001) Nature Biotechnology 19:456-460.
Smith et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:9947-9962.
Smith et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11113-11123.
Stemmer (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Stemmer (1994b) Nature 370 (6488):389-391.
Sutcliffe et al. (1983) Science 219:660.
Thillet et al. (1988) Journal of Biological Chemistry 263:12500-12508.
Tibary et al. (2007) Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 64:297-313.
Visintin et al. (2008) J. Biotechnol. 135:1-15.
Verlinde and Hol (1984) Structure 2:577.
Volkov et al. (1999) Nucleic Acids Research 27:e18i-vi.
Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", in Klegerman & Groves (eds.), Pharmaceutical Biotechnology, 1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, Ill., pp. 165-174.
Walters et al. (1998) Drug Discovery Today 3:160.
Westermaier et al. (2015) Methods 71:44057.
Zetsche et al. (2015) Cell 163:1-3.
Zhang et al. (2011) Nature Biotechnology 29:149-153. 
Zhang et al. (2015) J. Chem. Inf. Model 54:324-37.
Zhang et al. (2015) Tumour Biol. 36:5979-5985.
Zhao et al. (1998) Nature Biotechnology 16:258261.
【図１】
2019503998.tif 000005
【図２】
2019503998.tif 000006
【図３】
2019503998.tif 000007
【図４】
2019503998.tif 000008
【図５】
2019503998.tif 000009
【図６】
2019503998.tif 000010
【図７】
2019503998.tif 000011
【図８】
2019503998.tif 000012
【図９】
2019503998.tif 000013
【図１０】
2019503998.tif 000014
【図１１】
2019503998.tif 000015
【配列表】
2019503998000001.app
【国際調査報告】
2019503998.tif 000016
2019503998.tif 000017
2019503998.tif 000018