(57)【要約】本発明は、α−シヌクレイン分子に結合して、α−シヌクレインアミロイド形成凝集、α−シヌクレイン細胞傷害、及びα−シヌクレインの伝播を阻害する、阻害性ペプチドに関する。（例えば、α−シヌクレインにより介在される症状または疾患、例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症、またはＭＳＡなどを有する対象を治療するための）阻害性ペプチドを作製及び使用するための方法について記載する。【選択図】図５
2019524685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害する少なくとも１種の阻害性ペプチドを含む、組成物であって、
（ａ）前記阻害性ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000039
を含み、かつ
前記阻害性ペプチド内におけるアミノ酸の少なくとも１つが、非天然アミノ酸を含む、及び／または
前記阻害性ペプチドが非相同ペプチドタグに結合している、
前記組成物。
【請求項２】
前記阻害性ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000040
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非天然アミノ酸が、
Ｄ型アミノ酸、または
Ｎ−メチル基部分を含むアミノ酸
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記非相同ペプチドタグが、
ペプチド溶解性を向上させるアミノ酸配列、
前記ペプチドのモニタリングを容易にするアミノ酸配列、及び／または
哺乳動物細胞へのペプチド侵入を容易にするアミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記非相同ペプチドタグが、
複数のアルギニン残基、
複数のリジンアミノ酸、及び／または
アミノ酸配列ＴＡＴ
を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記阻害性ペプチドが６〜３０アミノ酸長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
複数種の阻害性ペプチドを含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のペプチドと、ペプチド安定化賦形剤を含む薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
α−シヌクレインと、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のペプチド組成物とを含む、複合体。
【請求項１０】
容器内にパッケージ化された請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のペプチドを含む、キット。
【請求項１１】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の阻害性ペプチドをコードする、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のペプチドを作製する方法であって、前記ペプチドを化学的に合成すること、または前記ペプチドを組換え的に作製することを含む、前記方法。
【請求項１３】
α−シヌクレインアミロイド原線維を、α−シヌクレイン凝集を抑制または阻害するのに十分な量の請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の阻害性ペプチドと接触させることを含む、α−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を抑制または阻害するための方法。
【請求項１４】
前記α−シヌクレインアミロイド原線維がインビボ環境内にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
α−シヌクレインアミロイド原線維のサイズもしくは増殖速度、またはα−シヌクレインアミロイド原線維の伝播速度を調節する方法であって、
前記原線維を、ある量の請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の阻害性ペプチドと、前記阻害性ペプチドがα−シヌクレインの残基６８〜７８または残基４７〜５６と接触する環境で、接触させること
を含み、
それにより、前記接触させたα−シヌクレインアミロイド原線維が、調節されたサイズまたは増殖速度を示す、
前記方法。
【請求項１６】
生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の有無を観察する方法であって、
（ａ）生体試料を、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合するペプチドと混合することと、
（ｂ）前記ペプチドを、前記生体試料内に存在する可能性のあるα−シヌクレインアミロイド原線維に結合させることと、
α−シヌクレインアミロイド原線維と前記ペプチドとで形成された複合体の存在について混合物（ｂ）をモニターすることと
を含み、
ＭＲＩもしくはＰＥＴまたはその他のイメージング法による前記複合体の存在が、前記生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の存在を示す、前記方法。
【請求項１７】
α−シヌクレインアミロイド原線維と前記ペプチドとで形成された複合体の存在が、前記ペプチドに結合した検出可能標識を用いてモニターされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能標識が非相同ペプチドタグを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000041
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
パーキンソン病を患っていることが疑われる個体から採取した生体試料に対して実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
2019524685.tif 000042
から選択されるペプチドを含む修飾ペプチドであって、
前記ペプチド内におけるアミノ酸の少なくとも１つが、少なくとも１つのメチル化アミノ酸残基を含む、前記修飾ペプチド。
【請求項２２】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、α−シヌクレインのシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）を阻害する方法。
【請求項２３】
変異α−シヌクレインを、変異α−シヌクレインの凝集を抑制または阻害するのに十分な量の請求項２１に記載の阻害性ペプチドと接触させることを含む、変異α−シヌクレインの凝集を抑制または阻害するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月２９日に出願された「ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ−ＢＡＳＥＤ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ  ＯＦ  ＡＬＰＨＡ−ＳＹＮＵＣＬＥＩＮ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＩＯＮ」と題された米国仮出願シリアル番号６２／３５６，４１０に対する米国特許法１１９（ｅ）条の優先権を主張するものであり、その内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援に関する記載
本発明は、国立衛生研究所による認可番号ＡＧ０２９４３０のもとで、政府による支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は参照として本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩのコピー（＿＿＿に作成）の名称は＿＿＿であり、そのサイズは＿＿＿バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）は共に、神経細胞内におけるタンパク質、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）の異常蓄積を特徴とする神経変性疾患の部類であるシヌクレイノパチーに分類される。これらは共に、２番目に最も一般的な神経変性疾患の形態を構成する。脳の可溶性画分と膜結合画分の両方に存在するシナプス前タンパク質α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）は、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）において凝集する。これらの凝集体は、レビー小体の主成分であり、この神経変性疾患の組織学的特徴を規定するものであり、また神経細胞傷害を伴うことが示されている（参照文献７）。任意の特定の機序に束縛されるものではないが、このこと及びその他２つの所見は、凝集α−ｓｙｎがパーキンソン病の分子的原因であることを示していることを示唆している（参照文献８）。第１の所見は、遺伝型ＰＤを有する家族は、Ａ５３Ｔなどのα−ｓｙｎにおける変異及び大量のレビー小体を有するということである（参照文献９、１０、１１）。第２の所見は、α−ｓｙｎをコードする二重または三重遺伝子を有する家族は早期発症型ＰＤを発症し、これはおそらくα−ｓｙｎが高い局所濃度でアミロイド内へと無理に入り込むためである（参照文献１２、１３）。
【０００５】
構造試験に基づき、α−ｓｙｎ原線維についての多数の異なるモデルが提唱されている。限定的なタンパク質加水分解試験及びＮＭＲ試験により、原線維コアが残基３０〜１００で構成されていることが示唆されている（Ｍｉａｋｅ  Ｈ（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（２１）：１９２１３−１９２１９）。結晶構造試験及びＮＭＲ試験により、α−ｓｙｎ原線維の異なるモデルが示唆されている。短いセグメントの結晶構造に基づく１つのモデルにおいて、シートあたりの２つのモノマーは、伸びた立体ジッパーを形成する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２５（７５７０）：４８６−４９０）。ｓｓＮＭＲに基づく第２のモデルでは、アミロイド層あたりに１つのモノマーを有するグリークキートポロジーが示されている（Ｔｕｔｔｌｅ  ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３（５）：４０９−４１５）。これらの試験を総合すると、α−ｓｙｎが多型の原線維構造を形成可能であることが示唆される。ＮＡＣｏｒｅと呼ばれるα−ｓｙｎのセグメント６８〜７８は、α−ｓｙｎ原線維のコアを形成し得る。ＮＡＣｏｒｅは、アミロイド沈着物内に見られるＮＡＣ（非アミロイドβ成分）ドメインの３５残基内に存在している（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２５（７５７０）：４８６−４９０）。ＮＡＣｏｒｅは直ちに凝集し、その凝集体は、全長α−ｓｙｎと同様の回折パターン及び細胞傷害性などの性質を示す。加えて、相同体であるβ−シヌクレインは、残基７４〜８４を含有せずアミロイド沈着物内には存在しておらず、残基７１〜８２を除去することにより、インビトロ及びショウジョウバエモデルにおいて凝集及び毒性が抑制されることが以前より示されている（Ｇｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（４）：２３８０−２３８６、及びＰｅｒｉｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７（１２）：３３３８−３３４６）。加えて、Ｔｈｒ７２における修飾により、β−シヌクレインの凝集傾向が妨げられる。
【０００６】
本発明者らは最近、増大中の凝集体を特異的に「キャッピング」するように設計された短いアミノ酸阻害剤を利用することにより、アルツハイマー病関連タンパク質Ｔａｕ及び精液由来ＨＩＶウイルス感染エンハンサー（ＳＥＶＩ）の凝集を効率的に停止させることが可能であることを示した（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（参照文献３６）；米国特許番号８，７５４，０３４（参照文献５７））。本発明者らはまた、同様の設計戦略が、ｐ５３アミロイド形成を阻害しがん細胞株内における変異ｐ５３機能を援助し腫瘍増殖を抑制する設計された細胞貫通ペプチドをもたらし得ることを示した（米国特許出願２０１４／０３７３８７）（参照文献５８）。それゆえ、α−シヌクレインアミロイド凝集（パーキンソン病及び関連神経変性疾患におけるレビー小体（ＬＢ）の形態の細胞内沈着物の主成分）を標的とする魅力的な治療領域が存在する。
【０００７】
α−シヌクレイン凝集及び／または細胞傷害を防止及び／または阻害する物質を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
α−ｓｙｎアミロイド形成については広く特徴付けされてはいるが、α−ｓｙｎ凝集を阻害可能またはα−ｓｙｎ凝集体（「シード」）の細胞から細胞へのプリオン様伝播を抑制可能な医薬品の開発についてはほとんど進歩していない。有望なアプローチとしては、α−ｓｙｎ凝集体を隔離する抗体、及びα−ｓｙｎモノマーに結合する小分子安定化剤が挙げられる（例えば、Ｍａｎｄｌｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ  １０（１）．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０２４−０１５−０００８−９；Ｗｒａｓｉｄｌｏ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｂｒａｉｎ：ａｗｗ２３８を参照のこと）。ＮＡＣｏｒｅの原子構造を鋳型として用い、本発明者らは、α−ｓｙｎシードに結合してそれらの増大及び伸長を妨げる、新しい部類の阻害剤であるペプチド薬剤を開発した。以下に示すように、これらの阻害剤は、多数のモデル系におけるα−シヌクレイン原線維形成及びシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）、ならびにα−シヌクレイン凝集体の伝播を阻害する。
【０００９】
本明細書で開示する本発明は多数の実施形態を有する。本発明の一実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害する少なくとも１種の阻害性ペプチドを含む、組成物である。本発明の典型的な実施形態では、阻害性ペプチドは、配列
2019524685.tif 000003
を含む。任意選択的に、阻害性ペプチドは、配列
2019524685.tif 000004
を含む。本発明の特定の実施形態では、組成物は複数種の阻害性ペプチドを含む。通常、阻害性ペプチド（複数可）は６〜３０アミノ酸長である。
【００１０】
本発明の阻害性ペプチド組成物では、阻害性ペプチド内におけるアミノ酸のうちの少なくとも１つは、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸、またはＮ−メチル基部分を含むアミノ酸）を含んでいてもよく、及び／または、阻害性ペプチドは非相同ペプチドタグに結合している。このような非相同ペプチドタグとしては、ペプチド溶解性を向上させるアミノ酸配列、ペプチドのモニタリングまたは処理を容易にするアミノ酸配列、または、哺乳動物細胞へのペプチド侵入を容易にするアミノ酸配列が挙げられる。任意選択的に、これらのペプチド組成物は、薬学的に許容される担体及びペプチド安定化賦形剤を含む。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン凝集を阻害する阻害性ペプチドをコードする、発現ベクターである。関連実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害するペプチドまたはこのようなペプチドをコードする発現ベクターを含む、キットである。本発明の実施形態はまた、本明細書で開示するペプチドを化学的に合成することまたは本明細書で開示するペプチドを組換え的に作製することにより、本明細書で開示するペプチドを作製する方法を含む。本発明の更に別の実施形態は、α−シヌクレインと、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン凝集を阻害するペプチドとを含む、複合体である。
【００１２】
本発明の更に別の実施形態は、α−シヌクレインアミロイド原線維を、α−シヌクレイン凝集を抑制または阻害するのに十分な量の本明細書で開示する阻害性ペプチドと接触させることを含む、α−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を抑制または阻害するための方法である。任意選択的に本方法では、α−シヌクレインアミロイド原線維はインビボ環境内にある。代替的に本方法では、α−シヌクレインアミロイド原線維はインビトロ環境内にある。本発明の関連実施形態は、接触させたα−シヌクレインアミロイド原線維が調節されたサイズまたは増殖速度を示すように阻害性ペプチドがα−シヌクレイン残基６８〜７８と接触する環境で、原線維を、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害する少なくとも１種のある量の阻害性ペプチドと接触させることを含む、α−シヌクレインアミロイド原線維のサイズまたは増殖速度を調節する方法である。
【００１３】
本発明の更に別の実施形態は、生体試料を、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合するペプチドと混合し、生体試料内に存在する可能性のあるα−シヌクレインアミロイド原線維にペプチドを結合させてから、α−シヌクレインアミロイド原線維とペプチドとで形成された複合体の存在についてこの混合物をモニターすることを含む、生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の有無を観察する方法であり、上記複合体の存在は、生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の存在を示す。本実施形態では、本発明者らの阻害剤のうちの１種は、放射性標識、放射線不透過性標識、蛍光色素、蛍光タンパク質、比色標識などのイメージング剤（例えば、ＭＲＩまたはＰＥＴなどのイメージング法を容易にする）に結合することが可能であり、本発明者らの阻害剤は、患者の脳内でα−シヌクレイン原線維に結合して、増悪後の診断をするための原線維のイメージングを可能とする。
【００１４】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態により当業者に明らかとなるであろう。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の実施例については、本発明の一部の実施形態を示してはいるが、例示として示されており限定するものではないということを理解すべきである。本発明の趣旨を逸脱することなく本発明の範囲内の多くの変更及び修正を実施することは可能であり、本発明は全てのこのような修正を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。
【００１６】
【図１】α−ｓｙｎシーディング阻害剤の設計。（Ａ）α−ｓｙｎ凝集阻害剤の構造ベース設計。ＮＡＣｏｒｅの構造は、立体ジッパーを形成する自己相補的な２枚のβシートで構成される。一方または両方の末端に結合する３種類の阻害剤（栗色、オレンジ及びシアン）を同定した。（Ｂ）Ｒｏｓｓｅｔｔａで計算した異なる阻害剤の結合エネルギーは、Ｓ３７及びＳ６２が両方の界面に結合する一方で、Ｓ７１が一方の界面に結合すると予測されるに過ぎないことを示している。３種類全ての阻害剤の形状相補性は高い。（Ｃ）α−ｓｙｎ凝集及び阻害剤の効果を測定するためのチオフラビンＴアッセイ。５０μＭのα−ｓｙｎ及び５倍モル過剰の阻害剤を加えた。
【図２】阻害剤の存在下で形成されたα−ｓｙｎ凝集体にはシーディング能力がない。（Ａ）細胞培養シーディングアッセイの実験設計。阻害剤の存在下でα−ｓｙｎを凝集させ、ＹＦＰ標識ＷＴ  α−ｓｙｎまたはＡ５３Ｔ  α−ｓｙｎ（グリーン）を発現するＨＥＫ２９３細胞に混合物をトランスフェクションした。Ａ５３Ｔは、早期発症型パーキンソン病を引き起こすα−シヌクレインの家族性変異体である。トランスフェクションすると、内在性α−ｓｙｎは蛍光点（レッド）を形成した。（Ｂ）ＮＡＣｏｒｅはα−ｓｙｎ原線維のシーディング能力に影響を及ぼさない。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）ＷＴ発現細胞とＡ５３Ｔ発現細胞の両方においてウェルあたりに形成された粒子の総数をカウントすることにより測定した際、１０、５、２及び１倍過剰のＳ３７、Ｓ６１及びＳ６２内で凝集させた５０μＭのα−ｓｙｎにはシーディング能力がなかった。（Ｆ）ＷＴ発現細胞とＡ５３Ｔ発現細胞の両方においてウェルあたりに形成された粒子の総数をカウントすることにより測定した際、過剰のＳ７１内で凝集させた５０μＭのα−ｓｙｎにはシーディング能力がなかった。結果については平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。二元ＡＮＯＶＡで統計的有意性を解析した。
【図３】阻害剤は細胞培養液中においてシーディングを防止する。（Ａ）細胞培養シーディングアッセイの実験設計。異なる量の阻害剤を１２５ｎＭの組換えα−ｓｙｎ原線維にトランスフェクションし、凝集を経時的にモニターした。（Ｂ）ＮＡＣｏｒｅはシーディング能力に影響を及ぼさない。（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）Ｓ３７、Ｓ６１、Ｓ６２及びＳ７１は、α−ｓｙｎのシーディング能力を抑制する。ウェルあたりでカウントした粒子の全てのデータを記録し、緩衝液で処理したウェルにおいてカウントした粒子に対し正規化した。結果については平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。二元ＡＮＯＶＡで統計的有意性を解析した。
【図４】ＰＤ脳組織から抽出したフィラメントは、インビトロ及び細胞培養液中においてα−ｓｙｎ凝集体をシーディングする。（Ａ）ＰＤ脳組織からサルコシル不溶性タンパク質フィラメントを抽出するためのプロトコル。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）３種類の異なる対象に由来する２％のシードは、ＴｈＴ蛍光を４〜１０倍増加させて迅速なα−ｓｙｎ凝集を誘導する。（Ｅ、Ｆ、Ｇ）ＰＤ対象由来のフィラメントによりシーディングされたα−ｓｙｎは、α−ｓｙｎ単独と比較してより多くの粒子を誘導する。ウェルあたりでカウントした粒子の全てのデータを記録し、緩衝液で処理したウェルにおいてカウントした粒子に対し正規化した。結果については平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。二元ＡＮＯＶＡで統計的有意性を解析した。
【図５】阻害剤は、ＰＤ組織から抽出したフィラメントによるシーディングを防止する。４種類の異なる対象由来のフィラメントについてα−ｓｙｎ凝集体シーディングの試験を行い、ＴｈＴアッセイでモニターした。Ｓ６１及びＳ６２は、試験を行った全てのシードに対して有効であった。Ｓ７１はシードＢ及びＤに対して有効であった。
【図６】ＰＤフィラメントシード及び阻害剤の存在下で形成されたα−ｓｙｎ原線維にはシーディング能力がない。（Ａ）細胞培養シーディングアッセイの実験設計。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）３種類の異なるＰＤ脳から抽出した組織によるシーディングの阻害に関して、阻害剤の試験を行った。Ｓ７１が３種類全てのシードに対して有効であった一方、Ｓ６１はシードＢに対して有効であった。それぞれのウェルでカウントした粒子の全てのデータを記録し、緩衝液で処理したウェルにおいてカウントした粒子に対し正規化した。結果については平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。二元ＡＮＯＶＡで統計的有意性を解析した。
【図７】阻害剤は、細胞培養液中においてＰＤフィラメントによりシーディングされたα−ｓｙｎ原線維によるシーディングを抑制する。（Ａ）細胞培養シーディングアッセイの実験設計。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）２種類の異なるＰＤ関連フィラメントの存在下で形成されたα−ｓｙｎ原線維を、ＹＦＰ−α−ｓｙｎ  ＨＥＫ細胞にトランスフェクションして、その後最長６日間にわたり蛍光を測定した。Ｓ３７は、１２．５μＭ〜１．２５μＭの濃度でシーディングを防止した。Ｓ６１は、２日目に顕著な効果でシーディングを防止した。Ｓ７１は、６．２５μＭの濃度でシーディングを抑制した。ウェルあたりでカウントした粒子の数の全てのデータを記録し、トランスフェクション前の０日目にカウントした粒子に対し正規化した。結果については平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示している。二元ＡＮＯＶＡで統計的有意性を解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語、表記及びその他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語について、明確性及び／または迅速な参照のために本明細書において定義するが、本明細書におけるこのような定義の包含は、当技術分野において一般に理解される意味と比較して有意な相違を示すと必ずしも解釈されるものではない。本明細書において記載または参照する技術及び手法の多くは、当業者にとって良く理解されているものであり、通常の方法を用いて一般に採用されている。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的においてそれら全体が本明細書に参照として組み込まれる。好ましい実施形態の記載では、本明細書の一部を形成し、本発明を実施可能な特定の実施形態を例示として示す添付図面を参照してもよい。本発明の範囲を逸脱することなく、その他の実施形態を利用可能であること、また構造的な変更を実施可能であることを理解すべきである。
【００１８】
１４０アミノ酸のタンパク質であるα−シヌクレインは、疾患状態にある神経細胞のアミロイド沈着物内に存在する。α−ｓｙｎアミロイド形成と増悪との因果関係は、アミロイド量を増加させる遺伝子重複及び家族性変異もまた早期発症型ＰＤを引き起こし、孤発性ＰＤ患者の９０％超がα−ｓｙｎ沈着物に陽性染色を示すという所見により裏付けられている。本明細書で開示する本発明は、α−ｓｙｎ凝集を停止させるための構造ベースのアプローチを提供する。本発明者らは、ＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣの原子構造がα−ｓｙｎアミロイドシード内に保存されており、内在タンパク質をジッパーコンフォメーションにリクルートするという仮説を立てた。ＮＡＣｏｒｅの原子構造を使用して、本発明者らは原線維形成を妨げる阻害剤を開発してインビトロ及び細胞培養液中におけるそれらの効果を試験した。同一手法を使用して、ＰｒｅＮＡＣに基づく阻害剤を開発することもできる。更なるモノマーの付加を防止するために、原線維の末端をキャッピングして阻害剤を最適化する。本発明者らは、ＮＡＣｏｒｅセグメントと良好に相互作用するペプチド配列を設計するためにソフトウェアＲｏｓｅｔｔａを使用した。Ｒｏｓｅｔｔａが使用するエネルギー関数は、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、結合エネルギーを評価するためのその他の事項の１つを考慮に入れている。特定の残基が設計ペプチドの特定位置で良好な結合を生成することを上記で示したが、残りの配列を更に改良しつつ、その特定の残基を固定して更なる設計を回避してもよい。本発明者らは、配列の最適なセットが同定されるまで、固定及び再設計のこのプロセスを繰り返し実施した。この合理的な設計プロセスにより、実験で試験可能なサンプリングと比較して数桁超多い阻害剤配列のコンピュータによるサンプリングが可能となった。
【００１９】
本発明者らは、α−ｓｙｎの凝集及び毒性における分子的機序に関する構造情報を探索するために、ＮＡＣドメイン及び隣接領域内におけるペプチドセグメントの結晶に対するスクリーニングを実施した。ＺｉｐｐｅｒＤＢアルゴリズム（参照文献５５）を使用して、ＮＡＣドメイン内における結晶化可能なアミロイド形成セグメントを同定した。詳細には、本発明者らは、α−ｓｙｎの主要セグメントである残基６８〜７８（α−ｓｙｎの凝集と細胞傷害の両方におけるその重要な役割から本明細書ではＮＡＣｏｒｅと呼び、ＮＡＣｏｒｅは、１４０残基である全長α−シヌクレインの、３５残基ＮＡＣ（Ｎｏｎ  Ａｍｉｌｏｉｄ−β  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；非アミロイド−β成分）ドメイン（残基６１〜９５）の原線維形成コアである）を同定して濃縮した。一部の試験では、本発明者らはＮＡＣｏｒｅのサブフラグメント（残基６９〜７７からなる）を利用した。その他の試験では、本発明者らはα−シヌクレインの残基４７〜５６（ＰｒｅＮＡＣと呼ばれ、別の立体ジッパーを形成する）の構造を結晶化して同定した。同定したセグメントを化学合成して結晶化してから、微小結晶構造解析及び微小電子回折（ＭｉｃｒｏＥＤ）を用いてそれらの三次元構造を決定した。
【００２０】
最も有効な阻害剤を見つけ出すために、ほぼ１００種類の異なる設計について、阻害剤設計の連続ラウンド最適化による実験的な試験を行った。例えば、本発明者らは、Ｎ末端上またはＣ末端上のタグの位置が阻害剤の有効性に影響を及ぼし得るということを観察した。加えて、付加された修飾の種類もまた阻害剤の効果に影響を及ぼし得る。本発明者らの事例では、Ｔｈｒ７２におけるＴｒｐ置換のみが有効である一方で、Ａｒｇ置換は有効ではなかった。コンピュータによるアプローチは、成功した設計を１つ同定するのには十分有力ではないが、本発明者らが候補阻害剤探索の対象を絞り込むことを可能とし、それにより、合理的な設計による改良を可能とする。
【００２１】
シーディングの防止におけるキャッピング阻害剤の有効性について、細胞ベースアッセイを用いた試験を行った。この系では、ナノモル量のα−ｓｙｎシードのトランスフェクションによって内在タンパク質の凝集が引き起こされた。その凝集体はアミロイド形成性（アミロイド特異的小分子への結合性）を示し、細胞分裂時に正確に伝達され、また著しい特異性を示す（Ｓａｎｄｅｒｓ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｎ  ８２（６）：１２７１−１２８８）。例えば、α−ｓｙｎ原線維は唯一、α−ｓｙｎタンパク質を凝集体へとシーディングさせ得る。とりわけ、この系では、本発明者らは凝集体形成時における急性細胞死を観察しておらず、細胞増殖を緩やかに鈍化させるに過ぎない。本発明者らの阻害剤は、２〜３日間有効な阻害剤の単回処理により、この系における点形成を防止した。
【００２２】
アミロイド病との関係において、シーディングとは、結合組織に沿った、凝集した異常タンパク質の連続的な伝達のことである。このプロセスは、神経変性疾患の増悪及び重症度の一因となる。異常シードの構造特性に関する情報が部分的に欠けていることにより、今日までのところ、シーディングを特異的に標的とする医薬品は存在していない。本出願は、例えば、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）凝集体に特異的に結合し、α−ｓｙｎ凝集及び／またはα−ｓｙｎ細胞傷害を阻止、阻害及び／または低下させるペプチドの設計、合成及び特徴付けに関する。ペプチド阻害剤は、増大中のα−シヌクレイン凝集体を特異的に「キャッピング」する。一部の実施形態では、ペプチドは、細胞内へのペプチドの送達を亢進する細胞貫通ペプチドに融合する。
【００２３】
細胞内α−ｓｙｎのアミロイド原線維への自発的な凝集を除き、増悪に寄与する第２の現象は、α−ｓｙｎ凝集体のプリオン様伝播である（Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ（２０１５）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９（６２４８）：１２５５５５５−１−１２５５５５５−９）。Ｂｒａａｋ  ｓｔａｇｉｎｇは、異常が時間の経過とともに徐々に結合脳領域全体に伝播することを示し、細胞培養モデル及び動物モデルは、少量のα−ｓｙｎ凝集体がシードとして作用して天然タンパク質の凝集を誘導し得ることを示している（例えば、Ｂｒａａｋ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２４（２）：１９７−２１１；Ｂｒａａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｄｖ  Ａｎａｔ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１：１−１１９；Ｍａｓｕｄａ−Ｓｕｚｕｋａｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒａｉｎ  １３６（４）：１１２８−１１３８；Ｄｅｓｐｌａｔｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６（３１）：１３０１０−１３０１５；Ｌｕｋ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０６（４７）：２００５１−２００５６を参照のこと）。人間から人間へと伝染し得る標準的なプリオンとは異なるが、「シーディング」のこの現象は、増悪を駆動するようである。
【００２４】
患者から採取した原線維は、シーディング能力に違いが観察され、株様特性を示している。ＰＤ患者から採取した原線維はインビトロでα−ｓｙｎ凝集の劇的な増加を引き起こし、細胞培養モデルにおいて、シーディング試料は点形成を増加させた。とりわけ、患者由来のα−ｓｙｎフィラメントが細胞培養液中でシーディングするというこれまでの報告とは異なり、本発明者らのアッセイにおいて、本発明者らは、細胞培養液中におけるシーディングを観察しなかった（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１２（３８）：Ｅ５３０８−Ｅ５３１７；及び  Ｗｏｅｒｍａｎ  ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１２（３５）：Ｅ４９４９−Ｅ４９５８）。これまでの報告が黒質組織を利用した一方で、本発明者らは、シーディング能力が異なり得る前頭組織及び側頭組織を使用した。これまでの報告では実際に、異なる脳領域から採取した原線維は、異なる株を暗示するシーディング能力の違いが示されていた（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１２（３８）：Ｅ５３０８−Ｅ５３１７）。更に、異なる阻害剤は、異なるシードに対する有効性が異なっていた。例えば、Ｓ６１はシードＡ及びＢのみに対して有効であった一方、Ｓ７１はシードＢ及びＤに対して有効であった。近年、全長α−ｓｙｎ原線維のＮＭＲ構造が報告され、それによると、原線維のコア内にセグメント６８〜７８は存在するが、伸びたジッパーコンフォメーションにはＮＡＣｏｒｅセグメントが存在しなかった（Ｔｕｔｔｌｅ  ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３（５）：４０９−４１５）。あるいは、そこに記載された阻害剤がＮＭＲ構造内のＮＡＣｏｒｅのコンフォメーションに結合可能であってもよい。ＮＭＲ構造と立体ジッパー構造が別々の多形であるということも考えられる。ヒト対象内の異なる多形を識別するための診断法がない状態では、理論的には、異なる多形を標的とする異なる阻害剤のカクテルが有用となり得る。
【００２５】
本発明者らは、コンピュータによる方法と、α−ｓｙｎ凝集体の伝播を防止することを目的とした一連の阻害剤を開発するための合理的な設計との組み合わせを使用した。本発明者らのアプローチは、α−ｓｙｎアミロイド原線維のコアの原子構造を決定することによってのみ可能となり、増悪においてシーディングが役割を果たすその他の疾患にこのアプローチを採用することができる。阻害剤は、インビトロ及び細胞培養モデルにおけるα−シヌクレインの凝集を防止する。阻害剤はまた、インビトロと細胞培養モデルの両方における患者由来のα−シヌクレイン原線維によるシーディングの防止に効果を示す。本発明者らの結果は、α−ｓｙｎの異常シードが立体ジッパーを含有するというエビデンスを提供し、ＰＤ及び関連するシヌクレイノパチーに使用可能な、伝播及び増悪を標的とした治療アプローチを示唆している。同様に、本発明者らの阻害剤は、ＰＤ及び関連するシヌクレイノパチーの診断アプローチに使用可能である。
【００２６】
本発明者らは、変異、過剰発現またはその他の細胞性因子が、接着性の「立体ジッパー」セグメント（アミロイド凝集体の基本的な構成単位であると提唱されている）を露出させることにより、天然α−シヌクレイン構造を不安定化させ得るという仮説を立てた（参照文献１８、１９）。そのため本発明者らは、α−シヌクレイン凝集体のアミロイド突起の高解像度像を作成した。次いで本発明者らは、α−シヌクレイン６９〜７７構造またはα−シヌクレイン６８〜７８構造を鋳型として用いて、増大中のα−シヌクレイン凝集体を特異的に「キャッピング」する阻害剤を設計するためのＲｏｓｅｔｔａベースの方法（参照文献３６）を利用することにより、更なるα−シヌクレイン凝集を妨害及び阻害した。
【００２７】
本発明者らは、ＮＡＣｏｒｅ［６８−ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ−７８］（配列番号：４６）の原子構造を鋳型として利用し、コンピュータによるアプローチ及び構造ベースのアプローチを使用してペプチド阻害剤を設計した。ＮＡＣｏｒｅの原子構造は、立体ジッパーを形成する自己相補的な一対のβシートを示した（Ｓａｗａｙａ  ＭＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４７（７１４３）：４５３−４５７）。Ｒｏｓｓｅｔｔａベースのコンピュータモデリングにより、阻害剤が立体ジッパーの界面に結合して原線維を「キャッピング」することが予測された。本発明者らは、ジッパーの一方または両方の末端に都合良く結合する３種類の候補阻害剤Ｓ３７、Ｓ６１及びＳ７１を同定した（図１）。３種類の阻害剤の結合エネルギー及び形状相補性も良好である（図１Ｂ）。全ての阻害剤は、ＮＡＣｏｒｅの天然配列のほとんどの残基を保持しているが、１つまたは複数の修飾残基を含有している。Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．は、ＮＡＣｏｒｅ内のより小さな９残基セグメント［６９−ＡＶＶＴＧＶＴＡＶ−７７］（配列番号：４８）が、ＮＡＣｏｒｅと比較してより緩やかに凝集し、構造がＮＡＣｏｒｅに類似していることを示した。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）はまた、ＰｒｅＮＡＣと呼ばれ配列ＧＶＶＨＧＶＴＴＶ残基４７〜５６を有する、α−ｓｙｎの第２のセグメントについて記載している。この配列に対して設計された阻害剤はまた、α−ｓｙｎの原線維形成を阻害し得る。
【００２８】
本発明者らが設計した阻害剤の自己凝集を防止するために、本発明者らは、１つまたは複数の修飾に加えてより短いセグメントを使用した。Ｓ３７は、Ｔｈｒ７２にＷ変異を、またＣ末端に別のポリ−リジンタグを有し、電荷−電荷斥力を生じさせる。立体ジッパー原線維の両方の先端部に結合することが予測された。Ｓ６１及びＳ６２はＳ３７と同一の阻害剤配列を保持しているが、溶解性を補助し自己凝集を防止するために、ポリ−リジンタグの代わりにＴＡＴタグが付加されている。Ｓ７１は、βシートに沿った水素結合を弱めるメチル化グリシンをＧｌｙ７３に有し、また溶解性及び細胞貫通のための別のＴＡＴタグを有している。
【００２９】
本発明者らは、インビトロ凝集アッセイを用いて阻害剤の効果について試験を行った。組換え的に精製したα−ｓｙｎを阻害剤の存在下で凝集させ、チオフラビンＴ、アミロイド結合色素の蛍光を測定することによってモニターした。３種類の阻害剤全ては、ＴｈＴ蛍光を著しく低下させて凝集を防止した（図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ）。
【００３０】
本発明者らは、阻害剤が細胞培養モデルにおいて凝集を防止する効果について試験を行った。これらのアッセイ用に、本発明者らは、ＹＦＰ標識全長ＷＴ  α−ｓｙｎ及びＡ５３Ｔ  α−ｓｙｎを安定的に発現する２種類のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を利用した（Ｓａｎｄｅｒｓ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｎ  ８２（６）：１２７１−１２８８）。このモデルでは、組換え原線維のリポフェクタミン介在性トランスフェクションにより、蛍光点として見える内在性ＹＦＰ標識タンパク質が凝集する。加えて、これらの点は、時間の経過とともにそのサイズを拡大させその数を増加させる。経時的な凝集体のこの増殖は「シーディング」現象を示しており、それにより、少量のアミロイド原線維が内在性タンパク質の凝集を誘導する。親ペプチドセグメント、すなわちＮＡＣｏｒｅの、シーディングに対する効果を確認するために、本発明者らは先ず、ＮＡＣｏｒｅについて試験を行った。モル過剰のＮＡＣｏｒｅの存在下で、α−ｓｙｎが凝集した（図２Ｂ）。その混合物を細胞にトランスフェクションしてから点形成を可視化し、ウェルあたりの粒子として点の数をカウントした。予想どおり、ＮＡＣｏｒｅは、どちらの細胞株においても点形成の有意な減少を生じさせなかった。本発明者らは次に、１０、５、２及び１倍過剰に相当する５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭ及び５０μＭの阻害剤の存在下で、５０μＭのα−ｓｙｎを凝集させた。その後、その混合物を細胞にトランスフェクションし、蛍光イメージングで最長３日間にわたり凝集を経時的にモニターした（図２Ａ）。Ｓ３７は、ＷＴ発現細胞株とＡ５３Ｔ発現細胞株の両方において、最長２日間にわたりシーディングに有意な減少を生じさせた。Ｓ３７と同様に、Ｓ６１（図２Ｄ）もまた、両方の細胞株において、２倍過剰、５倍過剰及び１０倍過剰の最大効果で点形成の減少を生じさせた。Ｓ６２（図２Ｅ）の存在下で形成された凝集体にもまたシーディング能力がなかった（全ての阻害剤濃度において大幅に少ない粒子が形成された）。等モル比及び亜化学量論比のＳ７１について試験を行ったところ、凝集体のシーディング能力に低下が見られた（図２Ｆ）。これらの結果は、阻害剤が、シーディング能力を有する凝集体の形成を防止していることを示唆している。
【００３１】
本発明者らは、細胞培養モデルにおけるシーディングを防止する阻害剤の効果について試験を行った（図３Ａ）。本発明者らは、異なる阻害剤と共にα−ｓｙｎ原線維をトランスフェクションした。親凝集ペプチドであるＮＡＣｏｒｅは、α−ｓｙｎ原線維のシーディング能力に影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。Ｓ３７は、１２．５μＭ濃度と６．２５μＭ濃度の両方の細胞株において、最長２日間にわたりシーディングに有意な減少を生じさせた（図３Ｃ）。２．５μＭ濃度及び１．２５μＭ濃度のＳ６１は、ＷＴ  α−ｓｙｎ細胞において最長６日間続き、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  ＨＥＫ細胞において最長２日間続く、長期にわたるシーディングの減少を生じさせた（図３Ｄ）。Ｓ６２は、両方の細胞株において１２．５μＭ及び６．２５μＭの濃度で有効であった（図３Ｅ）。Ｓ７１は１．２５μＭの低濃度で有効であった。興味深いことに、本発明者らは、より高濃度のこれら阻害剤を加えてもシーディングが防止されないことを観察し、そのことは、最大効果を有する限界濃度範囲であることを示唆した。まとめると、これらの結果は、阻害剤が原線維シードをキャッピングしてそれらの伸長を防止可能であることを示唆している。
【００３２】
本発明者らは、凍結剖検ＰＤ脳組織から不溶性タンパク質凝集体を抽出した。本発明者らは、ある対象の黒質領域及び前頭領域ならびに別の対象の側頭領域及び前頭領域を含む、４体の異なる対象由来の組織を得た。イオン性界面活性剤サルコシルによる沈殿を含む上記のプロトコル（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ８（１）：１５９−１６８）を使用して、本発明者らは不溶性タンパク質凝集体を抽出した（図４Ａ）。インビトロ及び本発明者らの細胞培養モデルにおいて、全ての試料は、α−ｓｙｎ凝集体をしっかりとシーディングした。２％のシードをインビトロ添加することにより、時間の遅れにわずかな減少を伴って、ＴｈＴ蛍光が４〜１０倍（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ）増加した。次いで、シーディング試料をＨＥＫ細胞にトランスフェクションした。ＴｈＴアッセイと一致して、全てのシーディング試料は迅速に点形成を誘導した（図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ）。その結果、ＰＤ脳組織から抽出した原線維は組換えタンパク質をシーディングし、シーディングにより形成された凝集体は、細胞培養液中において迅速な点形成を誘導する。
【００３３】
本発明者らは、異なる阻害剤がＰＤ抽出シードの存在下でα−ｓｙｎ凝集を防止する効果について試験を行った。Ｓ７１及びＳ６２は、ＴｈＴ蛍光アッセイ（図５）で測定した全てのシードに対する効果を示し、最も有効であった。Ｓ６１も２種類の異なるシードの凝集を抑制した（図５Ｂ、図５Ｄ）一方、Ｓ３７はＴｈＴ蛍光のわずかな低下を示した（図５Ｄ）。本発明者らは次に、ＰＤシード及び異なる阻害剤の存在下で形成されたα−ｓｙｎ凝集体のシーディング能力について試験を行った（図６Ａ）。Ｓ７１の存在下で形成された凝集体（図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄ）は、ＷＴ発現ＨＥＫ細胞とＡ５３Ｔ発現ＨＥＫ細胞の両方において点形成を誘導しなかった。Ｓ６１も効果を示した（図６Ｃ）。インビトロアッセイと一致して、Ｓ３７は凝集体のシーディング能力抑制に有効ではなかった。まとめると、これらの結果は、Ｓ６２及びＳ７１が、シーディング能力を有する原線維の形成を防止可能であることを示唆している。
【００３４】
本発明者らは、阻害剤が細胞培養液においてＰＤ原線維によるシーディングを防止する効果について試験を行った。ＰＤ原線維の存在下で形成されたα−ｓｙｎ凝集体を、異なる阻害剤と共にＷＴ  ＨＥＫ細胞にトランスフェクションした（図７Ａ）。Ｓ３７は、１２．５μＭ〜１．２５μＭの濃度で、２種類の異なるＰＤフィラメントの点形成を最長２日間にわたり防止した（図７Ｂ）。Ｓ３７と同様、Ｓ６１も１２．５μＭ〜１．２５μＭの濃度で最長２日間にわたり効果を示し、Ｓ７１もほぼ同等の濃度でシーディングを防止した。これらの結果は、阻害剤が、細胞培養液におけるシーディングを強力に防止することを示唆している。
【００３５】
直上の本開示は、多数の本発明の実施形態に関する研究について記載している。本明細書で開示する本発明は、このような阻害性ペプチド；本発明の阻害性ペプチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物；α−シヌクレイン分子（例えば、モノマー、小さな凝集体、オリゴマーまたは原線維）を有効量の本発明のペプチド阻害剤と接触させること、または、有効量の本発明のペプチド阻害剤を対象に投与すること、を含む、阻害性ペプチドを使用してα−シヌクレイン凝集及び／またはα−シヌクレイン細胞傷害を阻止、阻害及び／または防止するための方法；ならびに、コンピュータ関連の実施形態、例えば、本明細書に記載の構造に基づいた阻害性ペプチドまたは小分子を設計及び得るための方法、を提供する。
【００３６】
本発明の阻害性ペプチドの利点は以下を含む。（１）合成ペプチドは高価ではない。（２）合成ペプチドの組成及び小さなサイズのおかげで、細胞貫通及びタンパク質の安定化は困難ではない。加えて、細胞内へのペプチドの送達を亢進する細胞貫通ペプチドに当該ペプチドを融合させることができる。（３）それら融合物は予想外に安定しており、それら融合物はタンパク質加水分解されず、インビボ（例えば、体内）で機能するための十分に長い半減期を示す。（４）ペプチド阻害剤はそれらの標的に特異的であるため、例えば、多くの標的に結合可能な小分子と比較して、副作用の機会がより少ない。
【００３７】
本明細書で開示する本発明は多数の実施形態を有する。本発明の一実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害する少なくとも１種の阻害性ペプチドを含む物質の組成物である。以下の実施例において開示するように、これらペプチドの実施形態は、以下の表１に示すＳ３７、Ｓ６２及びＳ７１を含む。
2019524685.tif 000005
【００３８】
表中、Ｎ−ｍｅ−Ｇｌｙは、メチル化アミノ基を有するグリシンのことを意味する。太字は阻害剤配列を意味する。太字ではないものは、可溶化タグまたは可溶化リンカーのいずれかであるタグのことを意味する。
【００３９】
本発明の典型的な実施形態では、阻害性ペプチドは、配列
2019524685.tif 000006
を含む。任意選択的に、阻害性ペプチドは、配列
2019524685.tif 000007
を含む。本発明の特定の実施形態では、組成物は複数種の阻害性ペプチドを含む。通常、阻害性ペプチド（複数可）は６〜３０アミノ酸長である。これら阻害性ペプチドのうちのいずれかの活性変異体も含まれる。本明細書では、上記配列を有する阻害性ペプチド（活性変異体を含む）を「本発明の阻害性ペプチド」と呼ぶ場合がある。
【００４０】
本発明の阻害性ペプチド組成物では、阻害性ペプチド内におけるアミノ酸のうちの少なくとも１つは、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸、またはＮ−メチル基部分を含むアミノ酸）を含む、及び／または、阻害性ペプチドは非相同ペプチドタグに結合している。このような非相同ペプチドタグとしては、インビボまたはインビトロにおいてペプチド溶解性を向上させるアミノ酸配列（例えば、複数のアルギニン残基）、インビボまたはインビトロにおいてペプチドのモニタリングまたは処理を容易にするアミノ酸配列（複数のリジンアミノ酸またはヒスチジンアミノ酸）、または、哺乳動物細胞へのペプチド侵入を容易にするアミノ酸配列（例えば、細胞貫通ペプチド配列）が挙げられる。本発明の別の態様は、本発明の阻害性ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。本明細書では、このような医薬組成物を「本発明の医薬組成物」と呼ぶ場合がある。任意選択的に、本明細書で開示するペプチド組成物は、薬学的に許容される担体及びペプチド安定化賦形剤を含む。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン凝集を阻害する阻害性ペプチドをコードする、発現ベクターである。任意選択的に、発現ベクターは、哺乳動物細胞にポリペプチドを送達するために使用されるレンチウイルスなどの発現ベクターである。この場合、本発明の別の実施形態は、哺乳動物細胞を、細胞内でＤＮＡが発現するように細胞に形質導入するベクターと接触させることにより、α−シヌクレイン凝集を阻害する阻害性ペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞（例えば、エクスビボ細胞またはインビボ細胞）内に送達するための方法である。
【００４２】
別の実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害するペプチド、またはこのようなペプチドをコードする発現ベクターを含む、キットである。本発明の実施形態はまた、本明細書で開示するペプチドを化学的に合成することまたは本明細書で開示するペプチドを組換え的に作製することにより、本明細書で開示するペプチドを作製するための方法を含む。本発明の更に別の実施形態は、α−シヌクレインと、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン凝集を阻害するペプチドとを含む、複合体である。
【００４３】
別の実施形態は、α−シヌクレインの原線維形成を阻害するように、ＰｒｅＮＡＣ（α−シヌクレインの残基４７〜５６：ＧＶＶＨＧＶＴＴＶＡ）の構造について設計されたペプチドである。
【００４４】
本発明の更に別の実施形態は、α−シヌクレインアミロイド原線維を、α−シヌクレイン凝集を抑制または阻害するのに十分な量の本明細書で開示する阻害性ペプチドと接触させることを含む、α−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を抑制または阻害するための方法である。任意選択的に本方法では、α−シヌクレインアミロイド原線維はインビボ環境内にある。代替的に本方法では、α−シヌクレインアミロイド原線維はインビトロ環境内にある。本発明の関連実施形態は、接触させたα−シヌクレインアミロイド原線維が調節されたサイズまたは増殖速度を示すように、阻害性ペプチドがα−シヌクレイン残基６８〜７８と接触する環境で、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害する少なくとも１種の阻害性ペプチドと原線維を接触させることを含む、α−シヌクレインアミロイド原線維のサイズまたは増殖速度を調節するための方法である。
【００４５】
本明細書で開示するペプチド阻害剤は、脳内におけるパーキンソン病の伝播を停止させるための治療薬として使用可能である。代替的に、本明細書で開示するペプチド阻害剤は、パーキンソン病、レビー小体型認知症及び多系統萎縮症などの疾患におけるα−シヌクレインタンパク質の異常凝集シードを認識するための診断用プローブとして使用可能である。この場合、本発明の実施形態は、生体試料をα−シヌクレイン残基６８〜７８に結合するペプチドと接触させてから、その生体試料内に凝集シードが存在する場合、ペプチドがα−シヌクレインタンパク質の凝集シードに結合するかどうかを観察することを含む、生体試料内のα−シヌクレインタンパク質の凝集シードを観察するための方法を含む。これらの方法では通常、ペプチドの観察を容易にするために、非相同ペプチドタグを阻害性ペプチドに結合させる。これらの方法では任意選択的に、生体試料は、パーキンソン病、レビー小体型認知症または多系統萎縮症を患っていることが疑われる個体に由来する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確に定めない限り、複数の指示対象を含む。例えば、上記の事例において、医薬組成物は、同一であるかまたは異なっていてもよい１つまたは複数の本発明の阻害性ペプチド分子を含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の別の態様は、α−シヌクレイン分子（例えば、α−シヌクレインのモノマー、小さな凝集体、オリゴマーまたは原線維）と、本発明の阻害性ペプチドとを含む、複合体である。α−シヌクレイン分子と本発明の阻害性ペプチドは、互いに結合、コンジュゲートまたは別の方法で会合していてもよい。α−シヌクレインと阻害性ペプチドは、共有結合または非共有結合していてもよい。
【００４８】
本発明のその他の態様は、本発明の阻害性ペプチドをコードするポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；当該ポリヌクレオチドまたは発現ベクターをトランスフェクションされた細胞；及び、当該トランスフェクション細胞内で当該ペプチドを発現させて、細胞を培養し、当該ペプチドを回収することにより作製することを含む、当該ペプチドを作製するための方法、を含む。
【００４９】
本発明の別の態様は、α−シヌクレイン分子を、有効量の本発明の阻害性ペプチドまたは医薬組成物と接触させることを含む、α−シヌクレイン分子（例えば、α−シヌクレインのモノマー、小さな凝集体、オリゴマーまたは原線維）の凝集を阻害する（防止する、停止させる）ための方法である。α−シヌクレイン分子は、培養液中または対象内における溶液中または細胞内にあってもよい。一実施形態では、モノマー、オリゴマーまたは小さな凝集体であるα−シヌクレイン分子の接触は、α−シヌクレイン分子の凝集（オリゴマー化、更なるオリゴマー化及び／または原線維形成）を防止する。別の実施形態では、凝集形態のα−シヌクレインまたは原線維の接触は、凝集形態または原線維の更なる凝集（原線維化）を防止する。
【００５０】
本方法の一実施形態では、接触させたα−シヌクレインタンパク質分子は、原線維化α−シヌクレインの存在が介在する疾患または症状（本明細書では、α−シヌクレイン介在性疾患もしくは症状、またはシヌクレイノパチーと呼ぶ場合がある）、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症及び多系統萎縮症などを有する対象内にある。α−シヌクレイン異常はまた、その他の関連する神経変性疾患、例えば、孤発性のアルツハイマー病及び家族性のアルツハイマー病の両方などに認められる。
【００５１】
本発明の別の態様は、有効量の本発明の阻害性ペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、α−ｓｙｎ介在性疾患または症状、例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症または多系統萎縮症などを有する対象を治療するための方法である。治療は、対象内におけるα−シヌクレイン凝集及び／またはα−シヌクレイン細胞傷害ならびに異常の伝播（シーディング）の阻止（防止）または阻害をもたらすことができる。
【００５２】
本発明の別の態様は、α−シヌクレイン凝集及び／またはα−シヌクレイン細胞傷害を阻害する本明細書に記載のペプチドを同定するためのコンピュータで実行する方法である。本発明の別の態様は、任意選択的に容器内にパッケージ化された本発明の阻害性ペプチドを含むキットである。本発明の別の態様は、本発明の阻害性ペプチドを化学的に合成することまたは本発明の阻害性ペプチドを組換え的に作製することを含む、本発明の阻害性ペプチドを作製するための方法である。
【００５３】
本発明の更に別の実施形態は、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合するペプチドを生体試料と混合し、生体試料内に存在する可能性のあるα−シヌクレインアミロイド原線維に当該ペプチドを結合させてから、α−シヌクレインアミロイド原線維とペプチドとで形成された複合体の存在についてこの混合物をモニターすることを含む、生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の有無を観察するための方法であり、上記複合体の存在は、生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の存在を示す。任意選択的に本方法では、α−シヌクレインアミロイド原線維とペプチドとで形成された複合体の存在は、ペプチドに結合した検出可能標識（例えば、非相同ペプチドタグ）を用いてモニターされる。本発明の例示的な実施形態では、ペプチドは、配列
2019524685.tif 000008
を含む。通常、方法は、パーキンソン病を患っていることが疑われる個体から採取した生体試料に対して実施される。例えば、ＰＤの存在または状態を観察するように設計された診断法に、例えば、臨床症状前の疾患初期を検出するように設計された診断法に、治療処置の効果（または効果の欠如）を追跡するように設計された診断法に、本発明のこのような実施形態を使用してもよい。
【００５４】
本発明のペプチド阻害剤は、意図されていないタンパク質ではなくα−シヌクレインに特異的に（選択的に、優先的に）結合する。ペプチド阻害剤が結合するタンパク質は、例えば、モノマー、小さな凝集体、オリゴマーまたは原線維であってもよい。例えば、結合性は、２倍超、５倍超、１０倍超、１００倍超または２００倍超強力であってもよく、あるいは、意図されていない標的に対する結合性が全く検出されなくてもよい。通常の方法、例えば、競合結合アッセイまたはその他の好適な解析法などを使用して、結合の特異性を測定してもよい。
【００５５】
上で記載した阻害性ペプチドの活性変異体も含まれる。「活性変異体」とは、本明細書に記載する阻害性ペプチドの特性（例えば、α−シヌクレインに結合する能力、及び／または、α−シヌクレイン原線維化（凝集）及び／またはα−シヌクレイン細胞傷害を阻止、阻害または防止する能力）のうちの少なくとも１つを保持する変異体のことである。本明細書で使用する場合、原線維化とは、線維または原線維、例えば、アミロイド原線維などの形成のことを意味する。
【００５６】
好適な活性変異体はペプチド模倣化合物（天然模倣ペプチドの生化学的及び／または生物学的作用（複数可）を模倣可能な非ペプチド構造要素（例えば、本明細書で開示する方法に記載のペプチドの構造及び／または結合活性（例えば、水素結合及び疎水性パッキング相互作用など）を模倣するように設計された非ペプチド構造要素を含む）を含有する任意の化合物）を含む。本明細書では、その活性変異体を含む本発明の阻害性ペプチドを「ペプチド化合物」または「化合物」と呼ぶ場合がある。
【００５７】
一実施形態では、阻害性ペプチドの活性変異体は、出発阻害性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはそれら両方のいずれかにおいて、１〜３（例えば、１、２または３）アミノ酸だけ短くなる。別の実施形態では、活性変異体は、出発阻害性ペプチドのＣ末端において、１、２、３または４アミノ酸だけ、例えば、α−シヌクレイン内に活性変異体が生じる位置におけるアミノ酸残基だけ長くなる（伸長する）。
【００５８】
様々なその他の種類の活性変異体が含まれる。一部の実施形態では、上記のアミノ酸以外のアミノ酸は置換される。これらのアミノ酸は、ペプチド阻害剤をタンパク質加水分解から保護するのに役立ち得る、または別の方法でペプチドを安定化させるのに役立ち得る、及び／または、その他の方法で所望の薬力学的特性に寄与し得る。一部の実施形態では、非天然アミノ酸は、側鎖が標的との水素結合相互作用及び／または無極性相互作用を最適化することから、阻害剤をより固く標的に結合させる。加えて、非天然アミノ酸は、検出可能なマーカー、例えば、阻害定数などの値を測定するために使用できる強力な蛍光マーカーなどを導入する機会を提供する。例えば、ペプトイド、βアミノ酸、Ｎ−エチル化アミノ酸及び小分子模倣薬などのペプチド模倣薬も含まれる。
【００５９】
一実施形態では、配列内のアミノ酸を非天然アミノ酸で置換する。１００超の非天然アミノ酸が市販されている。これらとしては、例えば、以下のものが挙げられる。
ＬＥＵと置換可能な非天然アミノ酸：
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ＴＨＲと置換可能な非天然アミノ酸：
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ＩＬＥと置換可能な非天然アミノ酸：
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ＡＲＧと置換可能な非天然アミノ酸：
2019524685.tif 000012
ＴＹＲと置換可能な非天然アミノ酸：
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ＬＹＳと置換可能な非天然アミノ酸：
2019524685.tif 000014
【００６０】
別の実施形態では、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）のＬ型アミノ酸がＤ型アミノ酸で置換される。
【００６１】
別の実施形態では、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）のＮ−メチル化残基がペプチドに含まれる。
【００６２】
本発明の阻害性ペプチドは、例えば、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、非天然アミノ酸、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【００６３】
活性変異体としては、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に様々なタグを含む分子が挙げられる。例えば、本発明の阻害性ペプチドは、そのＮ末端及び／またはそのＣ末端におけるタグとして、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上のリジン残基；１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上のアルギニン残基；１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上のグルタミン酸残基；１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上のアスパラギン酸残基；これらアミノ酸残基の組み合わせ；または、当業者に明らかであろうその他の極性タグを含んでいてもよい。その他の活性変異体としては、α−シヌクレインに対する阻害性ペプチドの親和性を向上させるα−シヌクレイン配列の変異体が挙げられる。
【００６４】
一実施形態では、阻害剤は、本明細書に記載するα−シヌクレインの線維形成セグメントの原子構造を阻害剤設計の基礎として用い、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（参照文献６３）が記載した方法（特にこの方法に関し、参照として本明細書に組み込まれる）により設計された小分子である。Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．のこの方法により同定され得る好適な小分子は、当業者にとって明らかであろう。
【００６５】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドのアミノ酸のうちの１、２または３つが、上記の非天然アミノ酸などの非天然側鎖を有するアミノ酸で、または、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（参照文献６３）が設計した小分子の架橋（例えば、Ｌｙｓ残基のεアミノ基を介して）により修飾された側鎖を有するアミノ酸で置換されるように修飾される。一部の代表的な線維結合分子を以下に示す。これらの活性変異体は、増大中のα−シヌクレイン凝集体をキャッピングするだけではなく、修飾側鎖を介して、立体ジッパーの側面に結合する（立体ジッパーの側面に留められる）ことによりペプチドの阻害活性を向上させることができる。
【００６６】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（参照文献６３）が設計した線維結合化合物としては、
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が挙げられる。
【００６７】
本発明の一実施形態では、本発明の阻害性ペプチドは、本明細書に記載の方法などの通常の手法を用いて単離または精製される。「単離」とは、通常は結合している構成成分、例えば、ペプチドが合成された後の構成成分から分離することを意味する。単離ペプチドは、ペプチド配列を含有するタンパク質の開裂産物であってもよい。「精製」阻害性ペプチドは、例えば、９０％超、９５％超、９８％超または９９％超の純度であってもよい。
【００６８】
一実施形態では、本発明の阻害性ペプチドの細胞透過性を向上させるために、様々な細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）のいずれかにペプチドを融合する。ＣＰＰは通常、比較的高存在比の正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンまたはアルギニンのいずれかを含有するアミノ酸組成物を有している、あるいは、極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するアミノ酸組成物を有している。これらの２種類の構造はそれぞれ、ポリカチオン性または両親媒性と呼ばれる。ＣＰＰの第３の部類は、実効電荷が低い、または、細胞取り込み性にとって非常に重要な疎水性アミノ酸基を有する、無極性残基のみを含有する疎水性ペプチドである。本発明の阻害性ペプチドに融合可能な一部の標準的なＣＰＰを表２に示す。
【００６９】
（表２）
・名称  配列
参照文献−オリジナルまたはレビュー
・ポリＡＲＧ  ｎＲ  式中４＜ｎ＜１７（例えば、ｎ＝５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）（配列番号：８）
Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ，Ｋ．，Ｐｅｌｋｅｙ，Ｅ．Ｔ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．Ｂ．（２０００）．Ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｎａｂｌｅ  ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ：ｐｅｐｔｏｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，１３００３−８．
・ポリＬＹＳ  ｎＫ  式中４＜Ｋ＜１７（例えば、Ｋ＝５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）
・Ｄ−ポリＡＲＧ  ｎＲ  式中４＜ｎ＜１７（例えば、ｎ＝５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）
・Ｄ−ポリＬＹＳ  ｎＫ  式中４＜Ｋ＜１７（例えば、Ｋ＝５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）
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・ＡＣＰＰ、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４−小文字はＤ−ａａを示す。これら配列の一部における記号「＿」は、当技術分野において認知されている様々なプロテアーゼ開裂部位のいずれかを挿入可能な位置を示す。
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【００７０】
別の実施形態では、ＣＰＰはポリＤ（１〜１６）である。
【００７１】
分子の細胞侵入時における安定性及び薬力学的特性を向上させるためには、一般的に、ＣＰＰの長さはかなり短い、例えば、約３０アミノ酸未満であることが望ましい。
【００７２】
一部の実施形態では、ＣＰＰは本発明のペプチドに直接結合（融合）する。その他の実施形態では、阻害剤がその活性を保持するように、リンカーにより高荷電ＣＰＰを阻害剤ペプチドから分離することが望ましい。様々なリンカーの任意のものを使用してもよい。リンカーのサイズは、例えば、１〜７の範囲または更にそれ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６または７つのアミノ酸）であってもよい。例えば、リンカーは、Ｎ末端におけるＱＶＴＮＶＧ、Ｃ末端におけるＱＫＴＶＥＧ、または、阻害性ペプチドのＮ末端側に１、２、３、４または５つの連続アミノ酸を有するそのトランケート型であってもよい。
【００７３】
本発明の実施形態では、阻害性ペプチドは検出可能に標識されている。例えば、阻害性ペプチドの作用機序及び／または細胞内位置についてより適切に理解するために、標識ペプチドを使用してもよい。検出を可能とする好適な標識（例えば、検出可能なシグナルをもたらすまたは検出され得る）は一般的であり当業者に周知である。好適な検出可能標識としては、例えば、放射性活性剤、蛍光標識などが挙げられる。このような標識をタンパク質に結合させるための方法、または、このような標識の存在及び／または量を検出するためのアッセイは一般的であり周知である。
【００７４】
当技術分野において認知されている様々な方法のいずれかを用いて、本発明の阻害性ペプチドを合成（例えば、化学的に、または、好適な宿主細胞内における組換え発現により）することができる。本発明の方法に使用するための十分な量の阻害性ペプチドを作製するために、当業者は、例えば、通常の手法を用いて、ペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を作製して、発現ベクター（配列はプロモーターまたはエンハンサーなどの発現制御配列の制御下にある）にその核酸を挿入してから、ペプチドを直接合成することができる。例えば、（ａ）末端に好適なリンカーを有するＤＮＡを新しく合成してそのＤＮＡをベクターにクローニングする、（ｂ）完全なＤＮＡ配列をベクターにクローニングする、または、（ｃ）オーバーラップしたオリゴヌクレオチドから開始して、通常のＰＣＲベースの遺伝子合成法を用いてそれらオリゴヌクレオチド同士を結合させ、得られたＤＮＡをベクターに挿入することができる。好適な発現ベクター（例えば、プラスミドベクター、ファージを含むウイルスのベクター、人工ベクター、酵母ベクター、真核生物ベクターなど）は当業者にとって明らかであり、ベクターを作製するための方法、目的の配列を挿入するための方法、核酸がコードするタンパク質を発現させるための方法、及び、発現タンパク質を単離または精製するための方法についても同様である。
【００７５】
本発明の別の態様は、１種または複数種の阻害性ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。医薬組成物の構成成分は、例えば、放射性もしくは蛍光標識で、または、例えば、陽電子放出分光法（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による検出に好適な標識で検出可能に標識されていてもよい。例えば、放射性標識、放射線不透過性標識、蛍光色素、蛍光タンパク質、比色標識などからなる群から選択される検出可能標識に、本発明のペプチドを結合させてもよい。一部の実施形態では、阻害性ペプチドは、所望の用途に有効な量で存在する。
【００７６】
「薬学的に許容される」とは、概ね安全、非毒性であり、生物学的または他の点においても有害ではない医薬組成物の調製に有用であることを意味し、獣医学的な医薬品用途に加えヒト用の医薬品用途に許容されるものを含む。例えば、化合物の「薬学的に許容される塩」とは、本明細書で定義するとおり、薬学的に許容され、親化合物の所望の薬理活性を有する塩のことを意味する。
【００７７】
本発明の別の態様は、本発明の阻害性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明の実施形態では、ポリヌクレオチドは、好適な細胞への導入（例えば、トランスフェクションにより）後、コードするタンパク質の産生を促進するために、調節制御配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）と機能的に連結している。その他の実施形態は、発現ベクターを含む細胞、及び、細胞を培養しペプチドを回収することにより作製することを含む、本発明の阻害性ペプチドを作製するための方法を含む。
【００７８】
本出願の全体にわたり使用する場合、「約」とは、値の±５％のことを意味する。
【００７９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するためのキットである。キットは、好適な量の本発明の阻害性ペプチド、ペプチドを作製するための試薬、それらの機能または活性を測定するためのアッセイ用試薬などを含んでいてもよい。本発明のキットは、方法を実施するための取扱説明書を含んでいてもよい。本発明のキットのその他の任意の要素としては、好適な緩衝液、培養液成分など；本明細書に記載する結晶構造の構造表示を提供するコンピュータまたはコンピュータ可読媒体；容器；またはパッケージ材料が挙げられる。好適な制御を実施するための試薬もまた含まれていてもよい。キットの試薬は、試薬が、例えば、凍結乾燥状態または安定化した液体として安定している状態で、容器内に入っていてもよい。試薬はまた、単一使用形態、例えば、対象に投与するための単一反応形態であってもよい。
【００８０】
様々な通常の方法のいずれかにより、本発明の候補阻害性ペプチドの特徴付けを実施してもよい。例えば、α−シヌクレイン凝集もしくはα−シヌクレイン細胞傷害、または細胞から細胞への伝播を抑制または阻害する能力について、ペプチドをアッセイしてもよい。アッセイはインビトロまたはインビボで実施してもよい。好適なアッセイは当業者に明らかであり、一部の好適なアッセイは本明細書に記載されている。
【００８１】
本発明の一態様は、α−シヌクレインプロトフィラメントを、有効量の１種または複数種の本発明の阻害性ペプチドと接触させることを含む、α−シヌクレイン凝集を抑制または阻害するための方法である。このような方法を溶液中または細胞（例えば、培養液中または対象内の細胞）内で実施してもよい。
【００８２】
本発明の別の態様は、有効量の本発明の阻害性ペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、原線維化α−シヌクレインの存在が介在する疾患または症状（本明細書では、α−シヌクレイン介在性疾患または症状と呼ぶ場合がある）を有する対象を治療するための方法である。このような疾患または症状の中には、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症または多系統萎縮症がある。本発明の別の態様は、このような疾患または症状（例えば、ＰＤ）の発症を防止するための方法、または、このような疾患または症状の初期段階にある対象を治療するための方法、もしくは、症状または疾患の進行を防止または阻害するためにこのような疾患または症状が進行中の対象を処置するための方法である。
【００８３】
本明細書では、本発明の阻害性ペプチドまたは医薬組成物を「阻害剤」と呼ぶ場合がある。
【００８４】
「有効量」の本発明の阻害剤は、測定可能な量の所望の効果、例えば、α−シヌクレイン凝集またはα−シヌクレイン細胞傷害の阻害を誘導可能な量であり、診断用アッセイにおいては、目的とする標的、例えば、α−シヌクレイン凝集体などを検出可能な量であり、または、治療する方法においては、測定可能な量により、治療する疾患または症状の症候を抑制または改善可能な量である。
【００８５】
「対象」は、本発明の方法で治療可能な症状または疾患と関連する凝集（原線維化）α−シヌクレイン分子を有する任意の対象（患者）であってもよい。本発明の一実施形態では、対象はＰＤを有する。典型的な対象としては、哺乳動物などの脊椎動物が挙げられ、実験動物、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類及びヒトを含む。
【００８６】
本発明の阻害剤は、選択した投与経路、例えば、経口、経鼻、腹腔内、または非経口、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路、または皮下経路、または組織への注入、に適合した様々な形態の医薬組成物として製剤化することができる。
【００８７】
阻害剤を投与するための好適な経口形態としては、ロゼンジ剤、トローチ剤、錠剤、カプセル剤、発泡錠、口腔内崩壊錠、胃における滞留時間を延長するように設計されたフローティング錠、口腔内貼付剤及び舌下錠が挙げられる。
【００８８】
本発明の阻害剤を、不活性希釈剤または同化性食用担体などの薬学的に許容される媒体と配合して、全身投与、例えば、経口で投与してもよく、あるいは、吸入またはガス注入により投与してもよい。本発明の阻害剤は、コーティングまたは非コーティングされたハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセル内に封入されていてもよく、錠剤へと圧縮されていてもよく、または、対象の食事の食品に直接混合されていてもよい。経口治療投与用に、化合物を１種または複数種の賦形剤と混ぜ合わせて、経口摂取錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用してもよい。ヒトへの投与に好適な組成物用の用語「賦形剤」とは、限定するわけではないが、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ  ｅｄ．（２００６）（以下、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）に記載されている組成物成分を含むことを意味する。
【００８９】
阻害剤を微粒子状の不活性担体と混ぜ合わせて、対象が吸入または対象にガス注入してもよい。このような組成物及び製剤は、少なくとも０．１％の化合物を含有する必要がある。組成物及び製剤のパーセンテージは、当然変化してもよく、好都合には、任意の単位投与剤形の重量の約２％〜約６０％であってもよい。
【００９０】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウムなど；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど；及び、甘味剤、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームなど、を含有していてもよく、あるいは、風味剤、例えば、ペパーミント、冬緑油またはチェリーフレーバーなどを添加してもよい。単位投与剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の原料に加えて、液体担体、例えば、植物油またはポリエチレングリコールなどを含有していてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、ならびに、風味剤、例えば、チェリーフレーバーまたはオレンジフレーバーなどを含有していてもよい。
【００９１】
コーティング剤として、あるいは、固体単位投与剤形の物理的形状を調節するために、様々なその他の原料を提供してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤を、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などでコーティングしてもよい。当然、任意の単位投与剤形を調製するのに用いる任意の原料は、用いる量において、薬学的に許容されかつ実質的に非毒性でなければならない。
【００９２】
加えて、持続放出製剤及び持続放出デバイスに阻害剤を組み込んでもよい。例えば、徐放性カプセル剤、徐放性錠剤及び徐放性丸剤に阻害剤を組み込んでもよい。一部の実施形態では、発泡錠、口腔内崩壊錠、胃における滞留時間を延長するように設計されたフローティング錠、口腔内貼付剤及び舌下錠からなる群から選択される剤形を使用して、組成物を投与する。
【００９３】
阻害剤はまた、注入または注射により静脈内投与または腹腔内投与されてもよい。阻害剤の溶液を、水中で、任意選択的に、非毒性の界面活性剤と混合して、調製してもよい。分散液剤はまた、グリセロール内、液体ポリエチレングリコール内、トリアセチン内及びこれらの混合物内、ならびに油内で調製してもよい。保管及び使用における通常の条件下において、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有していてもよい。
【００９４】
注射または注入に好適な医薬品剤形としては、滅菌注射または滅菌注入用の溶液または分散液（任意選択的に、リポソーム内に封入された）の即時調製に適した化合物を含む、滅菌水溶液もしくは滅菌分散液または滅菌粉末を挙げることができる。全ての例において、最終的な剤形は、製造及び保管の条件下において、滅菌、液体及び安定である必要がある。液体担体または媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合液を含む溶媒または液体分散媒体であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液剤の場合には所定の粒径を維持することにより、または、界面活性剤の使用により、適度な流動性を維持してもよい。
【００９５】
必要に応じ、適切な溶媒中の所定量の化合物を上で挙げた様々なその他の成分と混合し、続いて濾過滅菌することにより、滅菌注射用液剤を調製する。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌粉末の例において、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分の粉末に加えて任意の追加的な所望の成分を得る、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。
【００９６】
局所投与用に、化合物を純粋な形態で利用してもよい。しかしながら、通常、化合物を、固体または液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と配合した組成物または製剤として皮膚に投与することが望ましい。
【００９７】
有用な固体担体としては、微粉化固体、例えば、タルク、クレイ、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。その他の固体担体としては、通常の非毒性ポリマーナノ粒子または微小粒子が挙げられる。有用な液体担体としては、任意選択的に非毒性の界面活性剤を使用して、化合物を効果的な濃度で溶解または分散させることのできる、水、アルコールもしくはグリコール、または水／アルコール／グリコールの混合液が挙げられる。任意の用途における特性を最適化するために、香料などの補助剤及び追加の抗菌剤を添加してもよい。得られた液体組成物を、吸収パッドから塗布してもよく、包帯及びその他のドレッシング材に浸みこませるために使用してもよく、または、ポンプタイプスプレーまたはエアゾールスプレーを使用して患部に噴霧してもよい。
【００９８】
本発明のペプチドまたは医薬組成物の有用な用量は、それらのインビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することができる。マウス及びその他の動物における有効投与量からヒト用に推定するための方法は当業者に周知である。
【００９９】
例えば、液体組成物（ローションなど）中における化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％または約０．５〜１０重量％であってもよい。半固体組成物または固体組成物（ゲルまたは粉末）中の濃度は、約０．１〜５重量パーセントまたは約０．５〜２．５重量％であってもよい。
【０１００】
本発明の薬剤の有効投与量及び投与経路は従来のものである。薬剤の正確な量（有効投与量）は対象間で異なり、例えば、対象の種、年齢、体重及び全身状態または臨床症状、治療する任意の疾患の重症度または機序、使用する特定の薬剤または媒体、投与方法及び投与スケジュールなどに依存する。当業者に周知の通常の手法により、治療有効投与量を実験的に決定することができる。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。例えば、細胞培養アッセイまたは好適な動物モデルのいずれかを用いて、有効投与量を最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定してもよい。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定してもよい。治療投与量はまた、同等の治療薬の投与量から類推することにより選択してもよい。
【０１０１】
特定の投与方法及び投与レジメンは、症例の詳細（例えば、対象、疾患、関係する疾患状態、及び治療が予防的であるかどうか）を考慮に入れて、担当臨床医により選択される。治療は、数日間〜数ヶ月間、または数年間にわたる、１日量または複数日量の化合物（複数可）を含んでいてもよい。
【０１０２】
しかしながら、通常、好適な用量は、１日あたり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、レシピエントの体重１キログラムあたり１日あたり約０．１ｍｇ超、または、レシピエントの体重１キログラムあたり１日あたり約１〜約１０ｍｇの範囲などである。例えば、好適な投与量は、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重、または、３０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。
【０１０３】
阻害剤は、例えば、単位投与剤形あたり０．０５〜１００００ｍｇ、０．５〜１００００ｍｇ、５〜１０００ｍｇ、または、約１００ｍｇの活性成分を含有する単位投与剤形で都合良く投与される。一部の実施形態では、投与単位は、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、または、約１００ｍｇの活性成分を含有する。
【実施例】
【０１０４】
実施例Ｉ−パーキンソン病のα−シヌクレインの毒性コア：目に見えない結晶の構造
本発明者らは、α−ｓｙｎの凝集及び毒性における分子的機序に関する構造情報を探索するために、ＮＡＣドメイン及び隣接領域内におけるペプチドセグメントの結晶に対するスクリーニングを実施した。
【０１０５】
２つのセグメント：ＮＡＣｏｒｅ、残基６８ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ７８（配列番号：４６）；及びＰｒｅＮＡＣ、４７ＧＶＶＨＧＶＴＴＶＡ５６（配列番号：４７）の広範囲にわたる結晶スクリーニングにより、非結晶のアモルファス凝集体が生成されたようである。しかし、電子顕微鏡による検査において、本発明者らは、その凝集体が断面わずか５０〜３００ｎｍの細長いナノ結晶のクラスターであるために、通常の光学顕微鏡では見えないことを発見した。本発明者らは、ＳＡＣＬＡとＬＣＬＳの両方の自由電子レーザーにおいて、ＮＡＣｏｒｅの秩序立った結晶性を確認した。本発明者らはまた、本発明者らがＳｕｂＮＡＣｏｒｅと命名したＮＡＣｏｒｅ内の９残基フラグメント、６９ＡＶＶＴＧＶＴＡＶ７７（配列番号：４８）が、ＮＡＣｏｒｅナノ結晶と比較して体積が１，０００〜１０，０００倍大きい結晶を生成することを発見した。その結果、本発明者らは、アミロイド様原線維の構造を決定するため、これらのより大きな結晶にシンクロトロン法（参照文献１８、１９）を適用することができた。この９残基フラグメントはＮＡＣｏｒｅと比較して２残基欠いているだけであるが、以下に記載するα−ｓｙｎの毒性に関する洞察を鑑みるに毒性（参照文献２０）ではない。
【０１０６】
ＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣの目に見えない結晶の構造を決定するために、本発明者らはＭｉｃｒｏＥＤ（参照文献２１）に目を向けた。ＭｉｃｒｏＥＤでは、極低温条件下、透過型電子顕微鏡内のナノ結晶に極めて低線量の電子ビームを照射して回折パターンを得る。本発明者らの実験に使用した２００ｋｅＶにおける波長は極めて小さく（０．０２５Å）、エワルド球は実質的な平面であり、２Ｄスライスから３Ｄ逆格子空間にほぼ類似した回折パターンを示す。ビーム内において結晶は絶えず回転しているため、一連のこのような回折パターンを収集する（参照文献５）。複数の結晶から収集した回折データをまとめてスケーリングして完全な３Ｄ回折データセットを作成する。ＭｉｃｒｏＥＤは、ニワトリ卵白リゾチーム（参照文献６、５）、ウシ肝臓カタラーゼ（参照文献２２）及びＣａ２＋−ＡＴＰアーゼ（参照文献２３）の既知の構造に成功裏に適用された。しかし、ＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣは、初めてＭｉｃｒｏＥＤで決定したこれまで未知であった構造である。
【０１０７】
ＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣについて、本発明者らは、凍結水和状態でホーリーカーボンＱｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッドの表面上に平坦状で優先的に配向したナノ結晶由来の電子回折パターンを収集した。最初に適切な大きさの結晶でグリッドをスクリーニングし、回折用の候補結晶をスクリーニングした。本発明者らは、固定軸周りを絶えず一方向回転することでデータを収集するための強い回折を示す結晶を使用して、固定時間間隔における一連の回折フレームを得た（参照文献５）。針状結晶は通常、回折に必要な長さ（最良の回折パターンを示すまっすぐで１００〜３００ｎｍ幅の結晶の長さ）を超えている。複数の結晶由来のデータを統合、スケーリング及びマージした。
【０１０８】
ＳｕｂＮＡＣｏｒｅの原子モデル及び完全なβストランドモデルをそれぞれプローブとして用い、複数の結晶のＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣのデータセットを分子置換で位相を調整した。ＳｕｂＮＡＣｏｒｅプローブ構造及びＮＡＣｏｒｅ構造因子から計算した回折相は密度マップの差分を示し、欠損した残基の位置を、続く精密化の後には、２つの水分子及びいくつかの水素原子の位置を明確に示した。ＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣの完全なモデルをＭｉｃｒｏＥＤデータに対して精密化し、１．４Åの解像度で許容されるＲ因子を有する構造を得た。精密化計算に電子散乱因子を使用した（参照文献２４）。
【０１０９】
ＮＡＣｏｒｅペプチド鎖の構造は、ほぼ完全に伸びたβストランドである。これらのＮＡＣｏｒｅ鎖は、部位特異的スピンラベル（参照文献２５、２６）により予測されているように、βシートへと正しく配向した状態で積み重なる。アミロイド突起では通常であるようにシートは対となり、原線維形成タンパク質の短いセグメントから形成された多くのアミロイド様原線維内の突起としてこれまで見られたように、そのシートの対は標準的な立体ジッパープロトフィラメントを形成する。この立体ジッパーに特有の特徴は、ジッパーの１１残基幅が本発明者らがこれまで観察したよりも長く、完全に乾燥している代わりに界面内において、それぞれのシートの対が２つの水分子を含有し、それぞれがスレオニン側鎖と結合していることである。また、本発明者らのＮＡＣｏｒｅ結晶では、それぞれのシートが２つのぴったりとした界面を形成している。鎖あたり２６８Å２の接触可能な埋没表面積を有する界面Ａは、相対するシート内における鎖の末端残基が互いに向かって曲がっていることから、界面Ｂ（１６７Å２）と比較してより広範囲にわたり、おそらくより強力である。ＰｒｅＮＡＣの構造は、残基グリシン５１においてねじれたβストランドを形成するペプチド鎖を示す。これらの鎖は、互いにかみ合って立体ジッパープロトフィラメントを形成するＮＡＣｏｒｅ構造のようなβシートの対となるように配列される（図３）。特に留意されたいが、ＰｒｅＮＡＣの５残基セグメント（５１ＧＶＴＴＶ５５）（配列番号：４９）は、ＮＡＣｏｒｅの５残基セグメント（７３ＧＶＴＡＶ７７）（配列番号：５０）とは１残基だけ異なり、それらの主鎖及び同一側鎖同士は、１．５Åのα炭素ＲＭＳ偏位で緊密に重なり合っている。このことは、ＮＡＣｏｒｅのより弱い界面Ｂが、ＮＡＣｏｒｅとＰｒｅＮＡＣの間の仮想界面を模倣していることを意味する。本発明者らは以下で、α−ｓｙｎのこれら２つのセグメント間において起こり得る接触の重要性を示す。
【０１１０】
ＮＡＣｏｒｅの構造と全長α−ｓｙｎ原線維の関連性は、それらの回折パターンの類似点により確かめられる。特に、全長及びＮ末端アセチル化（参照文献２７）α−ｓｙｎタンパク質の配向させた原線維の線維回折パターンは、配向させたＮＡＣｏｒｅナノ結晶の回折と同一の主要ピークを示す。３種類全ての原線維は、それらの回折パターンにおいて、２．４Åに強い反射を示す。この反射は、立体ジッパーにおける一方のβシートがもう一方のβシートに対し線維軸に沿って２．４Å（βストランド間の４．８Åの空間の２分の１）だけ移動することにより、２枚のシートが互いにしっかりとかみ合うようになるため、ＮＡＣｏｒｅ内で起こる。３種類全ては、βストランドの積層と、立体ジッパーの隣接βシート間の交互配置の両方によりもたらされるＮＡＣｏｒｅ内において、強い４．６Åの反射を共有しており、その一方で、ほぼ８．２Åにおいて共有された反射は、α−ｓｙｎ原線維を構成する隣接したβシートの対間の距離に起因して起こると考えられる。線維回折パターンのこの比較は、ＮＡＣｏｒｅの構造が本発明者らの完全α−ｓｙｎの毒性原線維の突起に類似していることを強く示唆している。
【０１１１】
ＮＡＣｏｒｅとＰｒｅＮＡＣを組み合わせた構造により、Ａ５３Ｔ早期発症型変異α−ｓｙｎの規則正しいセグメントの多くについての推測上のモデルを本発明者らが構築することが可能となる。このモデルの実験的裏付けは、そのモデルについてシミュレートした線維回折と、α−ｓｙｎ原線維及びＮ−アセチルα−ｓｙｎ原線維ならびに配向させたＮＡＣｏｒｅナノ結晶の測定回折パターンの一致によるものである。本発明者らは上記で、ＮＡＣｏｒｅのより弱い界面ＢがＰｒｅＮＡＣとＮＡＣｏｒｅの仮想相互作用を模倣していることについて言及した。事実、より弱いＮＡＣｏｒｅ界面Ｂ内で相互作用している側鎖（Ｇ７３、Ｔ７５及びＶ７７）は、ＰｒｅＮＡＣとＮＡＣｏｒｅの仮想界面で相互作用している側鎖（Ｇ５１、Ｔ５３、Ｖ５５）と同一である。
【０１１２】
α−ｓｙｎにより形成された細胞傷害性アミロイドの同一性及び構造は、依然として、集中的な研究の対象である（参照文献１７、２８、２９、３０、３１、３２）。過去１０年間にわたるエビデンスの量は、科学的な見解を、レビー小体内に毒性要素として存在する十分に発達したアミロイド原線維からより小さな一過性のアミロイドオリゴマーへと偏らせてきた。しかし最近では、原線維を支持する定量的な議論が進んでいる（参照文献３３）。任意の特定の機序に束縛されるものではないが、神経芽細胞腫細胞に対するＮＡＣｏｒｅの細胞傷害性に関する本発明者らの実験は、原線維が毒性であるという見解と一致しているということが示唆されている。本発明者らは、７２時間振盪及び凝集させたＮＡＣｏｒｅが、大量の原線維を示し、新たに溶解したＮＡＣｏｒｅと比較してより毒性であり、同様に凝集させた完全α−ｓｙｎと同じ程度毒性であることを発見している。本発明者らはまた、２残基だけ短いＳｕｂＮＡＣｏｒｅと比較して、ＮＡＣｏｒｅの細胞傷害性がより高いことを発見している。このことは、ＳｕｂＮＡＣｏｒｅと比較した際の、ＮＡＣｏｒｅのより迅速な原線維形成と一致している。これらの観察結果は、本発明者らによるＮＡＣｏｒｅ及びα−ｓｙｎの凝集試料内に存在するが目に見えない非原線維のオリゴマー集合体の形成を排除しない。もちろん、ＮＡＣｏｒｅは全長α−ｓｙｎのフラグメントに過ぎず、膜破壊に関与しているタンパク質のＮ末端の膜結合モチーフの大部分を欠いている（参照文献３４、３５）。しかし、ＮＡＣｏｒｅが、全長α−ｓｙｎ凝集及び毒性の全ての特徴を総括する最小要素であることも明らかである。
【０１１３】
極めて小さなサイズのＮＡＣｏｒｅはアミロイド結晶に特有であり、関心対象の様々なその他生物学的結晶でも同様である。アミロイド結晶について、極めて小さなサイズは原線維のプロトフィラメントを形成するβシートの自然なねじれの結果であると本発明者らは推測している。結晶格子は、ねじれを抑制し、これらの結晶内に、結晶が成長するに従い増加するひずみを生成する。このひずみは最終的に、更なるβストランドの追加を防止して、針状結晶の厚みを制限する。本発明者らの知見では、より長いセグメント（例えば、９残基と比較して１１残基）は更にそれ以上の結晶成長を制限し、１１残基ＮＡＣｏｒｅ及び１０残基ＰｒｅＮＡＣについては、ひずみは光学顕微鏡では見えないナノ結晶を生成する。これらの結晶は、固定及び通常のシンクロトロンデータ収集には小さ過ぎるが、ＭｉｃｒｏＥＤによる解析には理論上適している。本発明者らのＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣの構造は、ＭｉｃｒｏＥＤが生体物質の新しく正確な構造を原子解像度で決定可能であることを示している。この発見は、ナノ結晶だけが成長可能な、重要なその他の生体物質にＭｉｃｒｏＥＤを適用するための道を開く。本発明者らの特定の用途では、本発明者らは、非常に重要なＮＡＣドメインのコアの原子配置について学ぶことができた。このことは、α−ｓｙｎによるアミロイド形成の阻害剤の構造ベースの設計（参照文献３６）についての機会をもたらす。
【０１１４】
方法
結晶化
ＳｕｂＮＡＣｏｒｅ、すなわち６９ＡＶＶＴＧＶＴＡＶ７７（配列番号：４８）の微結晶を、ＣＳ  Ｂｉｏから購入した合成ペプチドから成長させた。懸滴蒸発により、結晶を室温で成長させた。４８ｍＭの水酸化リチウム中２．９ｍｇ／ｍｌ濃度で、凍結乾燥ペプチドを水中に溶解させた。ペプチドを２：１比率のリザーバ含有０．９Ｍリン酸アンモニウム及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．６）中で混合した。
【０１１５】
ＮＡＣｏｒｅ、すなわち６８ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶ７８（配列番号：４６）のナノ結晶を、ＣＳ  Ｂｉｏから購入した合成ペプチドから成長させた。滅菌水中１ｍｇ／ｍｌの濃度で合成したペプチド（ＣＳＢｉｏ）の１０バッチを、速度設定９のＴｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ軌道混合プレート上、３７℃で一晩振盪した。不溶性物質を３０％（重量／体積）グリセロールで洗浄してから、回折前、水中に室温で保管した。試料は原線維と結晶の混合物を含有していた。
【０１１６】
ＰｒｅＮＡＣ、すなわち４７ＧＶＶＨＧＶＴＴＶＡ５６（配列番号：４７）のナノ結晶を、ＩｎｎｏＰｅｐから購入した合成ペプチドから成長させた。合成したペプチドの結晶化試験品をバッチで調製した。ペプチドの重さを量り、０．１％  ＤＭＳＯを含む滅菌濾過済みの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。この溶液を、速度設定９のＴｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ軌道混合プレート上、３７℃で一晩振盪した。
【０１１７】
データの収集及び処理
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅａｍの微焦点ビームライン２４−ＩＤ−Ｅのシンクロトロン放射を使用して、ＳｕｂＮＡＣｏｒｅの微結晶由来のＸ線回折データを収集した。ビームラインには、ＡＤＳＣ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ３１５  ＣＣＤ検出器が搭載されていた。５μｍビーム直径を使用した０．９７９１Å波長の５°ウェッジで、単結晶由来のデータを収集した。本発明者らは、針軸に沿った３つの異なるセクションに由来するデータを使用した。データ収集用に結晶を極低温冷凍した（１００Ｋ）。ＨＫＬのＤｅｎｚｏ／Ｓｃａｌｅｐａｃｋ、プログラムスイートを使用して、データを処理して縮小した（参照文献３７）。
【０１１８】
Ｌｉｎｅａｒ  Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＬＣＬＳ）−ＳＬＡＣのＣＸＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｘ−ｒａｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ）のＸＦＥＬ放射線を使用して、ＮＡＣｏｒｅのナノ結晶由来のＸ線回折データを収集した。Ｘ線パルスの光子エネルギーは８．５２ｋｅＶ（１．４５Å）であった。それぞれの４０ｆｓパルスは、６０％のビームライン透過率を考慮に入れた試料位置において最大６×１０１１個の光子を含有していた。ビームの直径は約１μｍであった。本発明者らは、１ｍＬの水中に懸濁させた約２５μｌ濃度のペレット化物質を使用した。液体ジェットインジェクター及びガスダイナミック仮想ノズルを使用して、ＸＦＥＬビームに試料を注入した（参照文献３８）。マイクロジェット幅は約４μｍであり、流速は４０μｌ／分であった。試料は液体ジェットの顕著なスパッタリングを生じさせた。ｃｃｔｂｘ．ｘｆｅｌを使用してＸＦＥＬデータを処理した（参照文献３９、４０）。
【０１１９】
ＭｉｃｒｏＥＤ技術（参照文献５、６）を使用して、ＮＡＣｏｒｅ及びＰｒｅＮＡＣのナノ結晶由来の電子回折データを収集した。これらのナノ結晶は通常、凝集している。塊をばらばらにするために、約１００μＬ容量のナノ結晶を超音波処理浴内に３０分間置いた。グリッド上の結晶密度に最適化した適切な希釈後のナノ結晶を、ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌホーリーカーボンＥＭグリッド上に２〜３μｌの滴で付着させた。その後、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ  Ｍａｒｋ  ＩＶ（ＦＥＩ）を使用し、全てのグリッドを乾燥させて、液体エタンに沈めることによってガラス化してから、保管用の液体窒素へと移した。Ｇａｔａｎ  ６２６クライオホルダーを使用して、凍結水和させたグリッドをクライオＴＥＭに移した。２００ｋＶで作動させたＦＥＧ搭載ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０  ＴＥＭを使用して回折パターン及び結晶画像を収集し、下部に取り付けたＴＶＩＰＳ  Ｆ４１６  ＣＭＯＳカメラ（四角面積あたりのサイズがそれぞれ１５．６μｍである、センサーサイズ４０００平方ピクセル）を使用して記録した。２０００平方ピクセルサイズの最終画像を生成する２×２ピクセルビニングのローリングシャッターモードで検出器を作動させることにより、回折パターンを記録した。約１ミクロンの照明スポットサイズを有する選択エリアの開口部を使用して、画像あたり３〜４秒間の露光時間で個々の画像フレームを取得した。この形状は、毎秒０．１ｅ−／Å２未満の電子線量と等しい。それぞれの露光中、毎秒０．３°の速度（フレームあたり１．２°ウェッジに相当する）で、結晶をビーム内で絶えず回転させた。それぞれが回転軸に対して異なる方向を向いたいくつかの結晶に由来する回折データを収集した。これらのデータセットはそれぞれ、４０°〜８０°の範囲の逆格子空間のウェッジに及んだ。
【０１２０】
多結晶ゴールドスタンダードを使用して、また、ＸＦＥＬデータ内の対応する反射を用いた電子回折実験における顕著な反射を参照することにより、試料と検出器の距離較正を実施した。サーモライシンデータセットに対する光学測定したタイル位置を精密化することによりｃｃｔｂｘ．ｘｆｅｌで、６４タイルＣＳＰＡＤ検出器のｘ／ｙ位置の較正を実施した（参照文献３９）。
【０１２１】
一般的なＸ線データ処理プログラムとの互換性を得るために、ｔｉｆｆ形式またはＴＶＩＰＳ形式からＳＭＶ結晶形式へと回折画像を変換した。本発明者らは、回折画像をインデックスするためにＸＤＳを使用し（参照文献４１）、異なる結晶に由来するデータセットをまとめてマージ及びスケーリングするためにＸＳＣＡＬＥを使用した。最終データセットを構築するために、ＮＡＣｏｒｅ用に４つの結晶由来のデータをマージした一方で、ＰｒｅＮＡＣ用に３つの結晶由来のデータをマージした。
【０１２２】
構造決定
プログラムＰｈａｓｅｒ（参照文献４２）を使用して、ＳｕｂＮＡＣｏｒｅ用の分子置換溶液を得た。探索モデルを、９アラニン残基で構成された幾何学的に完全なβストランドで構成した。プログラムＲＥＦＭＡＣ（参照文献４３）で結晶学的精密化を実施した。プログラムＰｈａｓｅｒ（参照文献４２）を使用して、ＮＡＣｏｒｅ用の分子置換溶液を得た。探索モデルを、あらかじめ決定したＳｕｂＮＡＣｏｒｅ構造で構成した。プログラムＰｈｅｎｉｘ（参照文献４４）で結晶学的精密化を実施した。プログラムＰｈａｓｅｒ（参照文献４２）を使用して、ＰｒｅＮＡＣ用の分子置換溶液を得た。探索モデルを、配列ＧＶＴＴＶＡを有する６残基で構成された幾何学的に完全なβストランドで構成した。プログラムＰｈｅｎｉｘ（参照文献４４）で結晶学的精密化を実施した。
【０１２３】
ＣＯＯＴ（参照文献４５）を使用して、全てのセグメントのモデル構成を実施した。最終モデルの座標及び構造因子は、ＰＤＢコード４ＲＩＫ（ＳｕｂＮＡＣｏｒｅ）、４ＲＩＬ（ＮＡＣｏｒｅ）及び４ＺＮＮ（ＰｒｅＮＡＣ）でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託されている。構造はＰｙｍｏｌ（参照文献４６）を使用して作図された。
【０１２４】
α−シヌクレイン
ヒト野生型α−ｓｙｎ構築物を、配列：
2019524685.tif 000022
を用いて、あらかじめ特徴付けた（ｐＲＫ１７２、アンピシリン、Ｔ７プロモーター）（参照文献４７）。
【０１２５】
α−シヌクレインの精製
公表されているプロトコルに従い全長α−ｓｙｎを精製した（参照文献３１）。α−ｓｙｎ構築物を、野生型α−ｓｙｎタンパク質発現用に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を補足した１００ｍＬのＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｂｒｏｔｈ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）内で単一コロニーを培養し、３７℃で一晩増殖させた。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補足した１リットルのＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒを含む２Ｌ振盪フラスコを、１０ｍＬの一晩培養液と共にインキュベートし、ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＵＶ／ＶＩＳ  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で測定した際に、培養液がＯＤ６００  約０．６〜０．８に達するまで３７℃で増殖させた。終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を加えてから、３０℃で４〜６時間増殖させた。５，５００×ｇの遠心分離を４℃で１０分間行うことにより細胞を回収した。細胞ペレットを凍結させて−８０℃で保存した。
【０１２６】
細胞ペレットを氷上で解凍して溶解緩衝液（１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁させてから、超音波処理により溶解した。１５，０００×ｇの遠心分離を４℃で３０分間行うことにより、粗細胞溶解物を清澄化した。清澄化した細胞溶解物を煮沸してから、遠心分離で細胞デブリを除去した。攪拌しながら氷上のタンパク質溶液にＨＣｌを滴定で加えることにより、上清のタンパク質をｐＨ３．５の酸で沈殿させてから、更に、１５，０００×ｇの遠心分離を４℃で３０分間行った。上清を緩衝液Ａ（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で透析した。透析後、０．４５μｍシリンジ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ  １４８３１）に通して溶液を濾過してから、２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ  Ｑ  ＨＰ  １６／１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に充填した。５カラム容量の緩衝液ＡでＱ−ＨＰカラムを洗浄してから、１００％までの直線勾配の５カラム容量の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を使用してタンパク質を溶出した。約５０〜７０％の緩衝液Ｂでタンパク質を溶出し、ピーク画分をプールした。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過器を使用して、プールした試料を約１０倍に濃縮した。濾過緩衝液（２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化したＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−７５  ＨＲカラムに、約５ｍｌの濃縮試料を充填した。ゲル濾過カラムからピーク画分をプールしてから、５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で透析して３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。０．２μｍ孔径のフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ  １４８３１）に通してこれらを濾過し、４℃で保存した。
【０１２７】
Ｎ末端をアセチル化した組換え発現全長α−ｓｙｎを調製し、Ｄｅｒ−Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．によるプロトコル（参照文献２５）に基づいて以下のように精製した。
【０１２８】
α−ｓｙｎプラスミドを、Ｎ末端をアセチル化するための分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）由来のヘテロ二量体タンパク質アセチル化複合体（ｐＡＣＹＣ−ＤＵＥＴ、クロラムフェニコール、Ｔ７プロモーター）と共発現させた（参照文献４８）。アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する培地を使用して、２つのベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に同時形質転換した。アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するＴＢ培地内で細胞培養物を増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧでα−ｓｙｎを発現するように一晩２５℃で誘導した。遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレットを溶解緩衝液（１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、及び１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオライド）中に再懸濁させてから、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して細胞を溶解した。溶解物を煮沸してから、遠心分離でデブリを除去した。遠心分離後、タンパク質画分についても、氷上で低ｐＨで沈殿により除去した。残存上清のｐＨを滴定で調整してから、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で透析した。得られたタンパク質溶液を、緩衝液Ａを用いて平衡化した５ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填してから、直線勾配の緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してα−ｓｙｎを含有する画分を同定してから、回収して濃縮し、更に、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、サイズ排除（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  １６／６０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで画分の純度を評価した。
【０１２９】
ＬＣ−ＭＳ２７でアセチル化タンパク質を特徴付けた（参照文献４９）。想定平均質量は、α−シヌクレインが１４４６０．１Ｄａであり、アセチル化α−シヌクレインが１４５０２．１Ｄａであった。観測平均質量は、α−シヌクレインが１４４６４．０Ｄａであり、アセチル化α−シヌクレインが１４５０６．０Ｄａであった。観測平均質量と想定平均質量の間の４Ｄａの変化は器差によるものである。
【０１３０】
阻害剤の合成
９８％超の純度があり１００％  ＤＭＳＯ中に１０ｍＭ濃度で溶解した阻害剤を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．から商業的に入手した。溶解した阻害剤を０．１μＭフィルターで濾過し、その後に使用するまで２０μＬアリコートを−２０℃で保存した。
【０１３１】
チオフラビンＴアッセイ
シーディングアッセイ用にタンパク質を凝集させるのに使用した条件とＴｈＴを加える以外は同じ条件下で、５０μＭのタンパク質濃度で原線維形成アッセイを実施した。全てのアッセイを黒色Ｎｕｎｃ  ９６ウェルオプティカルボトムプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎマイクロプレートリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で、プレートを６００ｒｐｍ、回転直径３ｍｍ、３７℃で攪拌した。積分時間を２００μｓとし、λｅｘ  ＝  ４４４ｎｍ、λｅｍ  ＝  ４８２ｎｍを使用して、３０分毎に蛍光測定値を記録した。
【０１３２】
凝集アッセイ
０．１Ｍ硫酸ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウムで精製α−シヌクレインを透析し、速度９のＴｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅ振盪器内、５０μＭ、３７℃で５〜６日間振盪することにより凝集させた。
【０１３３】
ＰＤヒト脳組織からのサルコシル不溶性タンパク質フィラメントの抽出
ＵＣＬＡ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＢＴＴＲ）からヒト凍結脳組織を入手した。上記のプロトコルを使用してサルコシル不溶性タンパク質を抽出した。要約すると、ダウンス型ホモジナイザーを使用して、凍結組織を氷冷ＰＢＳ中、２００ｍｇ／ｍＬでホモジナイズした。次いで、５０ｍｇ／ｍＬ、総容積１ｍＬとなるようにホモジネートを緩衝液Ａ（１０ｍＭ  トリス  ７．４、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％  スクロース）中で希釈して、２０，７００ｇの遠心分離を４℃で２０分間行った。上清を遠心分離チューブに回収し、ペレットを０．５ｍＬの緩衝液Ａ中に再懸濁させてから、２０，７００ｇの遠心分離を４℃で２０分間行った。上清を共にプールした。その後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中１５０μｌの１０％サルコシル（重量／体積）を加えてから、７００ｒｐｍの水平回転振盪器上、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＳＷ  ５５  Ｒｏｔｏｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、溶液に対して１００，０００ｇの遠心分離を４℃で１時間行った。上清を廃棄し、５ｍＬの緩衝液Ａでペレットを洗浄してから、１００，０００ｇの遠心分離を４℃で２０分間行った。１００μｌの５０ｍＭ  トリス、Ｐｈ７．４中にペレットを再懸濁した。
【０１３４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養
ＹＦＰ標識ＷＴ  α−ｓｙｎ及びＡ５３Ｔ  α−ｓｙｎを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｄｒ．Ｍａｒｃ  Ｄｉａｍｏｎｄからの寛大な寄贈品であった。加湿インキュベータ内、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中、５％ＣＯ２下、細胞を３７℃で増殖させた。
【０１３５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのシーディング
９０μＬの培地中の１０，０００個の細胞を９６ウェル黒壁プレート（Ｃａｔ  ＃３６６０）にプレーティングしてから、一晩接着させた。１２５ｎＭの最終モノマー濃度でα−ｓｙｎをトランスフェクションした。リポフェクタミン２０００をＯｐｔｉＭＥＭ培地（２．５＋１７．５μＬ）中に希釈し、室温で５分間インキュベートした。タンパク質凝集体をＯｐｔｉＭＥＭ培地（１：２０）中に希釈し、水浴超音波処理器中、低パルスで３分間超音波処理を行った。次いで、希釈したリポフェクタミンとタンパク質試料を１：１で混合し、室温で２０分間インキュベートした後、それぞれのウェルに１０μＬを加えた。全ての試料を３連で加え、実験を最低２回繰り返した。α−ｓｙｎ原線維を阻害剤と共トランスフェクションするために、原線維及び阻害剤をＯｐｔｉＭＥＭ中に希釈し、超音波処理後、３時間インキュベートした。
【０１３６】
細胞における細胞内点の測定
偏りのない測定を可能とするＣｅｌｉｇｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して、点形成及び細胞増殖の測定を行った。蛍光ＧＦＰチャネルを使用してウェルを画像化し、Ｃｅｌｉｇｏ解析ソフトウェアを使用してコンフルエンスを判定した。ウェル全体の画像を撮影し、粒子解析によるＩｍａｇｅＪで粒子をカウントした。同一の設定を使用して、１枚のプレートのウェルに対し全ての日に解析を行った。それぞれのウェルでカウントした総粒子をコンフルエンスについて正規化し、ウェルあたりの粒子として記録した。
【０１３７】
原線維形成及び検出
５０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．５中の精製α−ｓｙｎを、Ｔｏｒｅｙ  Ｐｉｎｅ振盪器内、５００μＭの濃度、３７℃で振盪した。ＳｕｂＮＡＣｏｒｅ及びＮＡＣｏｒｅの原線維試料を作製するために、５ｍＭの水酸化リチウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、及び０．１ＭのＮａＣｌ中で終濃度５００μＭとなるように凍結乾燥ペプチドを溶解し、全ての試料を、Ｔｏｒｅｙ  Ｐｉｎｅ振盪器中、３７℃で７２時間振盪した。アッセイ用の細胞を加える直前に凍結乾燥ペプチドを溶解することにより、新たに溶解した試料を調製した。
【０１３８】
濁度測定法を使用して、ＮＡＣｏｒｅとＳｕｂＮＡＣｏｒｅの凝集を比較した。５ｍＭのＬｉＯＨ及び１％  ＤＭＳＯを含む１．６ｍＭの試料緩衝液中に、ペプチド試料を新たに溶解してから、ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０．１μｍ）に通して濾過した。２００μＬの試料／ウェル（試料あたり３〜４点の複製）を含む黒色ＮＵＮＣ９６ウェルプレートを使用して測定を実施した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎマイクロプレートリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ）内、プレートを３００ｒｐｍ、回転直径３ｍｍ、３７℃で攪拌した。３〜１５分毎に、３４０ｎｍにおける吸光度の測定値を記録した。
【０１３９】
陰性染色の透過型電子顕微鏡検査
細胞傷害性試料について、電子顕微鏡を用いて原線維の存在を評価した。要約すると、５μＬの試料を、新たにグロー放電した炭素被覆電子顕微鏡グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）上に直接配置した。４分間のインキュベーション後、５μＬの蒸留水でグリッドを２回すすいでから、２％酢酸ウラニルで１分間染色した。ＦＥＩ  Ｔ１２電子顕微鏡上で試験片を検査した。
【０１４０】
原線維の回折
精製α−ｓｙｎ（Ｎ末端のアセチル化を伴うもの及び伴わないもの）から形成された原線維を遠心分離で濃縮し、洗浄してから、２本のガラスキャピラリー間で乾燥させながら配向させた。同様に、ＮＡＣｏｒｅナノ結晶も濃縮し、洗浄してから、２本のガラスキャピラリー間で乾燥させながら配向させた。ＨＴＣイメージングプレート及び内蔵Ｘ−Ｓｔｒｅａｍクライオクーリングデバイスを搭載したＲｉｇａｋｕ回転陽極生成装置により生成された１．５４ÅのＸ線を使用した回折に用いるクライオピン上に、配向させた原線維またはナノ結晶を載せた。１８０ｍｍの距離で全てのパターンを収集し、Ａｄｘｖソフトウェアパッケージを使用して解析を行った。
【０１４１】
細胞傷害性アッセイ
１０％ウマ血清及び５％ウシ胎児血清を補足したＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣ；ｃａｔ．＃  ３０−２００１）内で接着性ＰＣ１２細胞を培養してから、最終容量９０μｌとなるようにウェルあたり１０，０００個でプレーティングした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ａｑｕｅｏｕｓ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＭＴＴ，Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃４１００）を用いて、全てのＭＴＴアッセイを実施した。９６ウェルプレートで５％ＣＯ２下、細胞を３７℃で２０時間培養してから、試料（Ｃｏｓｔａｒ  ｃａｔ．＃  ３５９６）を加えた。９０μＬの培地を含有するそれぞれのウェルに１０μＬの試料を加えてから、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、１５μＬの色素溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃４１０２）をそれぞれのウェルに加えてから、５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。これに続き、それぞれのウェルに１００μｌのｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ／Ｓｔｏｐ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃４１０１）を加えた。室温での１２時間のインキュベーション後、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。７００ｎｍにおけるバックグラウンド吸光度を記録した。１％（重量／体積）ＳＤＳで処理した細胞を０％還元とし、試料緩衝液で処理した細胞を１００％還元として、データを正規化した。
【０１４２】
製造業者の取扱説明書に従いＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ  ＃Ｇ７８９０）を使用して、ラクトースデヒドロゲナーゼアッセイを実施した。要約すると、９６ウェル黒壁透明底（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃａｔ  ＃０７−２００−５８８）組織培養プレートに、最終容量９０μＬとなるようにウェルあたり１０，０００個の細胞で、細胞をプレーティングした。５％ＣＯ２下、細胞を３７℃で更に２０時間インキュベートしてから、試料を加えた。次に１０μｌの試料をそれぞれのウェルに加えてから、細胞を更に２４時間インキュベートした。１００μｌの試薬をそれぞれのウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。５０μＬの停止液を加えて反応を停止させた。それぞれ５６０ｎｍ及び５９０ｎｍの励起波長及び放出波長を使用して蛍光を測定した。緩衝液で処理した細胞を０％放出とし、０．１％のトリトンＸ−１００で処理した細胞を１００％放出として使用し、データを正規化した。
【０１４３】
ＮＡＣｏｒｅ：ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ（配列番号：４６）の構造の原子座標を下記表３に示す。ＰｒｅＮＡＣの原子座標を下記表４に示す。
【０１４４】
ＮＡＣｏｒｅの原子構造は、しっかりとかみ合って立体ジッパーを形成する自己相補的なβシートの対から形成されたアミロイド原線維を示す。Ｒｏｓｓｅｔｔａベースのコンピュータモデリングにより、阻害剤のそれぞれは、立体ジッパーの先端部に結合するように設計され、その結果、原線維を「キャッピング」することにより、更なるα−シヌクレイン分子の原線維への付加が防止される。本発明者らは、ジッパーの一方または両方の末端に都合良く結合する３種類の候補阻害剤Ｓ３７、Ｓ６１及びＳ７１を設計した。３種類の阻害剤のそれぞれにおいて計算した原線維に対する結合エネルギー及び形状相補性はまた、結合にとって好ましい。阻害剤のそれぞれは、ＮＡＣｏｒｅの天然配列のほとんどの残基を保持しているが、１つまたは複数の修飾残基も含有している。Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．は、ＮＡＣｏｒｅ内のより小さな９残基セグメント［６９〜７７］が、ＮＡＣｏｒｅと比較してより緩やかに凝集し、構造がＮＡＣｏｒｅに類似していることを示した。本発明者らが設計した阻害剤の自己凝集を防止するために、本発明者らは、１つまたは複数の修飾に加えてより短いセグメントを使用した。Ｓ３７は、Ｔｈｒ７２にＷ変異を、またＣ末端に別のポリ−リジンタグを有し、電荷−電荷斥力を生じさせる。立体ジッパー原線維の両方の先端部（すなわち、上段及び下部）に結合することが予測された。Ｓ６１及びＳ６２はＳ３７と同一の阻害剤配列を保持しているが、溶解性を補助し自己凝集を防止するために、ポリ−リジンタグの代わりにＴＡＴタグが付加されている。Ｓ７１は、βシートに沿った水素結合を弱めるメチル化グリシンをＧｌｙ７３に有し、また溶解性及び細胞貫通のための別のＴＡＴタグを有している。
【０１４５】
実施例ＩＩ：コンピュータによる設計
α−シヌクレインの線維形成セグメントの原子構造をベースとして、本発明者らは、凝集を阻害する一連の阻害剤を設計した。本発明者らは、増大中のα−シヌクレイン凝集体を特異的に「キャッピング」するペプチド阻害剤を設計した。ＺｉｐｐｅｒＤＢアルゴリズム（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）（参照文献５５）を使用して、ＮＡＣドメイン内における結晶化可能なアミロイド形成セグメントを同定した。このドメインは、α−シヌクレインの凝集及び毒性に必要かつ十分であると報告されている（Ｂｏｄｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（参照文献２０）。同定したセグメント（残基６９〜７７及び残基６８〜７８からなるα−シヌクレインセグメント）を化学合成して結晶化してから、微小結晶構造解析及び微小電子回折（ＭｉｃｒｏＥＤ）を用いてそれらの三次元構造を決定した。本発明者らは次いで、α−シヌクレイン６９〜７７構造またはα−シヌクレイン６８〜７８構造を鋳型として用いてα−シヌクレイン凝集を妨害する阻害剤を設計するためのそれらの工程にＲｏｓｅｔｔａベースの方法（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）（参照文献３６）を利用した。実験的な特徴付けにより推定上の阻害剤を同定及び選択した。
【０１４６】
実施例ＩＩＩ−第２ラウンドの設計−合理的な、配列ベースの設計
設計の別のラウンドでは、本発明者らは、いくつかのα−シヌクレインアミロイド形成セグメント４７〜５６、６８〜７８及び８４〜９４から開始した。天然アミノ酸配列内における２つの独立した残基にＮ−メチル化を導入した。これらのＮ−メチルアミノ酸において、追加のメチル基はアミン水素を置換する。その結果、水素結合が妨げられ、アミノ酸の成長末端上へのペプチドモノマーの付加が妨げられる。Ｎ−メチル化に加えて、天然α−シヌクレイン配列からの追加の極性／荷電アミノ酸の伸長は、ペプチド阻害剤の全体的な溶解性を向上させるとみなされた。
【０１４７】
（表３）
2019524685.tif 000023
2019524685.tif 000024
2019524685.tif 000025
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2019524685.tif 000028
2019524685.tif 000029
【０１４８】
ＰｒｅＮＡＣ：ＧＶＶＨＧＶＴＴＶＡ（配列番号：４７）の構造の原子座標を以下の表４に示す。
【０１４９】
（表４）
2019524685.tif 000030
2019524685.tif 000031
2019524685.tif 000032
2019524685.tif 000033
【０１５０】
参照文献
2019524685.tif 000034
2019524685.tif 000035
2019524685.tif 000036
2019524685.tif 000037
2019524685.tif 000038
【０１５１】
上記の記載内容から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に見極めることができ、また、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の変更及び修正を行い、様々な用途及び条件に適合させて、本発明を最大限に利用することができる。上記の実施形態は単なる例示と解釈されるべきであり、いかなる方法によってでも本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に引用した全ての出願、特許及び刊行物、ならびに図面における開示内容全体は、特にそれらが引用する情報に関し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019524685.tif 000043
【図２】
2019524685.tif 000044
【図３】
2019524685.tif 000045
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019524685.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月16日(2019.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を阻害する少なくとも１種の阻害性ペプチドを含む、組成物であって、
（ａ）前記阻害性ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000050
を含み、かつ
前記阻害性ペプチド内におけるアミノ酸の少なくとも１つが、非天然アミノ酸を含む、及び／または
前記阻害性ペプチドが非相同ペプチドタグに結合している、
前記組成物。
【請求項２】
前記阻害性ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000051
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非天然アミノ酸が、
Ｄ型アミノ酸、または
Ｎ−メチル基部分を含むアミノ酸
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非相同ペプチドタグが、
ペプチド溶解性を向上させるアミノ酸配列、
前記ペプチドのモニタリングを容易にするアミノ酸配列、及び／または
哺乳動物細胞へのペプチド侵入を容易にするアミノ酸配列
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記非相同ペプチドタグが、
複数のアルギニン残基、
複数のリジンアミノ酸、及び／または
アミノ酸配列ＴＡＴ
を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記阻害性ペプチドが６〜３０アミノ酸長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
複数種の阻害性ペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される阻害性ペプチドと、ペプチド安定化賦形剤を含む薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
α−シヌクレインと、請求項１〜６のいずれか一項に定義される阻害性ペプチドとを含む、複合体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される阻害性ペプチドをコードする、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される阻害性ペプチドを作製する方法であって、前記阻害性ペプチドを化学的に合成すること、または前記阻害性ペプチドを組換え的に作製することを含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される阻害性ペプチドを含み、前記阻害性ペプチドをα−シヌクレインアミロイド原線維に接触させるように用いられることを特徴とする、α−シヌクレイン（配列番号：１）凝集を抑制または阻害するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記α−シヌクレインアミロイド原線維がインビボ環境内にある、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に定義される阻害性ペプチドを含む、α−シヌクレインアミロイド原線維のサイズもしくは増殖速度、またはα−シヌクレインアミロイド原線維の伝播速度を調節するための医薬組成物であって、
前記阻害性ペプチドがα−シヌクレインの残基６８〜７８または残基４７〜５６と接触する環境で、前記阻害性ペプチドを前記原線維に接触させ、それにより、前記接触させたα−シヌクレインアミロイド原線維が、調節されたサイズまたは増殖速度を示すことを可能にするように用いられることを特徴とする、
前記医薬組成物。
【請求項１５】
生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の有無を観察する方法であって、
（ａ）生体試料を、α−シヌクレインの残基６８〜７８に結合するペプチドと混合することと、
（ｂ）前記ペプチドを、前記生体試料内に存在する可能性のあるα−シヌクレインアミロイド原線維に結合させることと、
α−シヌクレインアミロイド原線維と前記ペプチドとで形成された複合体の存在について混合物（ｂ）をモニターすることと
を含み、
ＭＲＩもしくはＰＥＴまたはその他のイメージング法による前記複合体の存在が、前記生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の存在を示す、前記方法。
【請求項１６】
α−シヌクレインアミロイド原線維と前記ペプチドとで形成された複合体の存在が、前記ペプチドに結合した検出可能標識を用いてモニターされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能標識が非相同ペプチドタグを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000052
を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
パーキンソン病を患っていることが疑われる個体から採取した生体試料に対して実施される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
2019524685.tif 000053
から選択されるペプチドを含む修飾ペプチドであって、
前記ペプチド内におけるアミノ酸の少なくとも１つが、少なくとも１つのメチル化アミノ酸残基を含む、前記修飾ペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
[本発明1001]
α−シヌクレインの残基68〜78に結合することによりα−シヌクレイン（配列番号：1）凝集を阻害する少なくとも1種の阻害性ペプチドを含む、組成物であって、
（ａ）前記阻害性ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000054
を含み、かつ
前記阻害性ペプチド内におけるアミノ酸の少なくとも1つが、非天然アミノ酸を含む、及び／または
前記阻害性ペプチドが非相同ペプチドタグに結合している、
前記組成物。
[本発明1002]
前記阻害性ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000055
を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記非天然アミノ酸が、
Ｄ型アミノ酸、または
Ｎ−メチル基部分を含むアミノ酸
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
前記非相同ペプチドタグが、
ペプチド溶解性を向上させるアミノ酸配列、
前記ペプチドのモニタリングを容易にするアミノ酸配列、及び／または
哺乳動物細胞へのペプチド侵入を容易にするアミノ酸配列
を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
前記非相同ペプチドタグが、
複数のアルギニン残基、
複数のリジンアミノ酸、及び／または
アミノ酸配列ＴＡＴ
を含む、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
前記阻害性ペプチドが6〜30アミノ酸長である、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
複数種の阻害性ペプチドを含む、本発明1001から本発明1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
本発明1001から本発明1006のいずれかのペプチドと、ペプチド安定化賦形剤を含む薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1009]
α−シヌクレインと、本発明1001から本発明1008のいずれかのペプチド組成物とを含む、複合体。
[本発明1010]
容器内にパッケージ化された本発明1001から本発明1008のいずれかのペプチドを含む、キット。
[本発明1011]
本発明1001から本発明1008のいずれかの阻害性ペプチドをコードする、発現ベクター。
[本発明1012]
本発明1001から本発明1008のいずれかのペプチドを作製する方法であって、前記ペプチドを化学的に合成すること、または前記ペプチドを組換え的に作製することを含む、前記方法。
[本発明1013]
α−シヌクレインアミロイド原線維を、α−シヌクレイン凝集を抑制または阻害するのに十分な量の本発明1001から本発明1008のいずれかの阻害性ペプチドと接触させることを含む、α−シヌクレイン（配列番号：1）凝集を抑制または阻害するための方法。
[本発明1014]
前記α−シヌクレインアミロイド原線維がインビボ環境内にある、本発明1013の方法。
[本発明1015]
α−シヌクレインアミロイド原線維のサイズもしくは増殖速度、またはα−シヌクレインアミロイド原線維の伝播速度を調節する方法であって、
前記原線維を、ある量の本発明1001から本発明1008のいずれかの阻害性ペプチドと、前記阻害性ペプチドがα−シヌクレインの残基68〜78または残基47〜56と接触する環境で、接触させること
を含み、
それにより、前記接触させたα−シヌクレインアミロイド原線維が、調節されたサイズまたは増殖速度を示す、
前記方法。
[本発明1016]
生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の有無を観察する方法であって、
（ａ）生体試料を、α−シヌクレインの残基68〜78に結合するペプチドと混合することと、
（ｂ）前記ペプチドを、前記生体試料内に存在する可能性のあるα−シヌクレインアミロイド原線維に結合させることと、
α−シヌクレインアミロイド原線維と前記ペプチドとで形成された複合体の存在について混合物（ｂ）をモニターすることと
を含み、
ＭＲＩもしくはＰＥＴまたはその他のイメージング法による前記複合体の存在が、前記生体試料中におけるα−シヌクレインアミロイド原線維の存在を示す、前記方法。
[本発明1017]
α−シヌクレインアミロイド原線維と前記ペプチドとで形成された複合体の存在が、前記ペプチドに結合した検出可能標識を用いてモニターされる、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記検出可能標識が非相同ペプチドタグを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記ペプチドが、配列：
2019524685.tif 000056
を含む、本発明1016の方法。
[本発明1020]
パーキンソン病を患っていることが疑われる個体から採取した生体試料に対して実施される、本発明1016の方法。
[本発明1021]
2019524685.tif 000057
から選択されるペプチドを含む修飾ペプチドであって、
前記ペプチド内におけるアミノ酸の少なくとも1つが、少なくとも1つのメチル化アミノ酸残基を含む、前記修飾ペプチド。
[本発明1022]
本発明1001から本発明1006のいずれかの組成物を投与することを含む、α−シヌクレインのシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）を阻害する方法。
[本発明1023]
変異α−シヌクレインを、変異α−シヌクレインの凝集を抑制または阻害するのに十分な量の本発明1021の阻害性ペプチドと接触させることを含む、変異α−シヌクレインの凝集を抑制または阻害するための方法。
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態により当業者に明らかとなるであろう。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の実施例については、本発明の一部の実施形態を示してはいるが、例示として示されており限定するものではないということを理解すべきである。本発明の趣旨を逸脱することなく本発明の範囲内の多くの変更及び修正を実施することは可能であり、本発明は全てのこのような修正を含むものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
ＮＡＣｏｒｅ、すなわち６８ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶ７８（配列番号：４６のアミノ酸１〜１０）のナノ結晶を、ＣＳ  Ｂｉｏから購入した合成ペプチドから成長させた。滅菌水中１ｍｇ／ｍｌの濃度で合成したペプチド（ＣＳＢｉｏ）の１０バッチを、速度設定９のＴｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ軌道混合プレート上、３７℃で一晩振盪した。不溶性物質を３０％（重量／体積）グリセロールで洗浄してから、回折前、水中に室温で保管した。試料は原線維と結晶の混合物を含有していた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019524685000001.app
【国際調査報告】
2019524685.tif 000058
2019524685.tif 000059
2019524685.tif 000060
2019524685.tif 000061
2019524685.tif 000062