(57)【要約】  本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を有し、そして場合によって減少したまたはノックアウトされたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するように操作された酵母株を用い、炭素供給源としてグルコースを用いて、組換え酵母細胞培養中で乳酸を産生するための方法であって、酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、バイオマスを産生するための第一のシード発酵工程、その後、酵母を低ｐＨの培地中で培養する、乳酸を産生するためのシード発酵由来のバイオマスを用いた第二の産生発酵工程を含む、前記方法を提供する。
2019513408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素供給源としてグルコースを用いて、組換え酵母細胞培養において乳酸を産生するための方法であって
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、
ｂ）該シード発酵由来のバイオマスを用いた、乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで酵母を＜５のｐＨの培地中で培養する、
を含む、
ここで前記酵母が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を有し、そして減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有してもよい
前記方法。
【請求項２】
前記酵母が二倍体酵母である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が多数体または異数体酵母である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記産生発酵工程が、≦４．５、特に≦４、特に≦３．５のｐＨであり、特に該産生発酵工程が、３またはそれ未満の最終ｐＨを有し、特に該産生発酵工程が、≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満の最終ｐＨを有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記シード発酵工程が流加条件下で実行され、および／または前記産生発酵工程がバッチプロセス条件下で実行され、特に該シード発酵工程および該産生発酵工程が別個の発酵槽中である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記乳酸が遊離型で産生され、特に、該乳酸が光学的に純粋な異性体型で産生され、特に該乳酸がＤ（−）またはＬ（＋）−乳酸のいずれかである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記酵母が、遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６の１またはそれより多くの減少したまたはノックアウトされた発現を有する、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６遺伝子のプロモーターの１またはそれより多くが、置換されているかまたは欠失している、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６が、特に異種プロモーター、具体的にはグルコース抑制可能プロモーターの調節によって、より具体的にはＨＸＴ２またはＨＸＴ４遺伝子プロモーターの調節によって、条件的に発現される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６の少なくとも１つが欠失している、請求項７〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母が、グルコース制御遺伝子発現を調節するグルコースセンサーと相互作用するタンパク質をコードする１またはそれより多い遺伝子の減少したまたはノックアウトされた発現、特にＳｔｄ１またはＭｔｈ１タンパク質の発現を有する、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ＭＴＨ１遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が少なくとも１つの六炭糖輸送体遺伝子を過剰発現するように修飾されている、請求項１〜１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
前記酵母が、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ３、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ６、ＨＸＴ７、ＨＸＴ８、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１０、ＨＸＴ１１、ＨＸＴ１２、ＨＸＴ１３、ＨＸＴ１４、ＨＸＴ１５、ＨＸＴ１６、ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３およびＲＧＴ２の群より選択される、六炭糖輸送体遺伝子の少なくとも１つを過剰発現するように修飾されている、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用い、乳酸を産生するための２工程発酵系であって、
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母細胞を５〜７のｐＨの細胞培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで該酵母細胞を、３．５未満の最終ｐＨまで、特に、≦３．４、≦３．３、≦３．２、≦３．１、≦３．０、≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満の最終ｐＨまで細胞培地中で培養する、
からなる、
ここで該酵母が、異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードし、そして減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する
前記系。
【請求項１６】
組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用い、乳酸を産生するための２工程発酵系であって、
ａ）第一の発酵槽におけるバイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母細胞を５〜７のｐＨの細胞培地中で培養する、その後、
ｂ）該シード発酵から接種した第二の発酵槽における乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで酵母細胞を３．５未満の最終ｐＨまで細胞培地中で培養する、
からなる、
ここで該酵母が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性および／または減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するように修飾されている
前記系。
【請求項１７】
組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用い、乳酸を産生するための２またはそれより多い発酵槽システムの組み合わせであって、
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵槽、ここで酵母細胞を５〜７のｐＨの細胞培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための、シード発酵から接種した産生発酵槽、ここで酵母細胞を３．５未満の最終ｐＨまで細胞培地中で培養する、
からなる、
ここで該酵母が、異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子をコードし、そして減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する
前記組み合わせ。
【請求項１８】
ｉ）ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子の機能的欠失、
ｉｉ）ＭＴＨ１遺伝子の機能的欠失、
ｉｉｉ）ＨＸＴ１遺伝子の過剰発現、および
ｉｖ）少なくとも１つの異種ＬＤＨ遺伝子
を含む、組換え二倍体酵母株、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。
【請求項１９】
ｉ）ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子の機能的欠失、
ｉｉ）ＭＴＨ１遺伝子の機能的欠失、
ｉｉｉ）ＨＸＴ１遺伝子の過剰発現、および
ｉｖ）少なくとも１つの異種ＬＤＨ遺伝子
を含む、組換え多数体または異数体酵母株、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を有するか、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性および減少したまたはノックアウトされたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するように操作された酵母株を用い、炭素供給源としてグルコースを用いて、組換え酵母細胞培養中で乳酸を産生するための方法であって、バイオマスを産生するための第一のシード発酵工程、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、乳酸を産生するためのシード発酵由来のバイオマスを用いた第二の産生発酵工程を含む、ここで酵母を低ｐＨの培地中で培養する、前記方法を提供する。
【発明の概要】
【０００２】
乳酸は、米国エネルギー省によって、重要な市場成長を示す、糖由来の化学構築ブロック候補の上位３０にランキングされている。２０１３年の乳酸の世界市場は、７１４，２００ｔと概算されており、そして２０２０年までに１，９６０，１００ｔに拡大すると予測され、２０１４年〜２０２０年の間の成長率は１５．５％の年間複合成長率（ＣＡＧＲ）である。
【０００３】
乳酸は長らく、食品産業において保存剤として、そして酸味料として用いられてきている。乳酸の価格は現在、１ｋｇあたりおよそ１．３０〜１．６０ドルである。乳酸はまた、特にエステル化型で溶媒として用いられ、そして医薬品、化粧品および化学産業において、原材料として、ならびに乳酸エステルの産生のために用いられている。乳酸は、再生可能資源から作製される生物分解性プラスチックであるポリ乳酸（ＰＬＡ）の出発材料として、ますます用いられている。
【０００４】
乳酸の市場成長の主な原動力は、生物分解性ポリマーおよび乳酸溶媒の開発における使用である。乳酸は、皮膚美白、抗ニキビおよび抗しわおよびアンチエイジングのための製品に用いられているため、パーソナルケアもまた、迅速に成長中の部門であると予期される。
【０００５】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）は、２０１３年、バイオプラスチック世界市場の１１．４％（およそ１８５ｋｔ）を占めた。ＰＬＡは、１８．８％  ＣＡＧＲの年間市場成長を有し、２０１８年には４３８ｋｔの市場量を生じると予測される。ＰＬＡの品質および技術的適用の範囲は、最近数年間にわたって、迅速に発展してきている。今日、ＰＬＡは、３つの主な適用領域で用いられる：
１．繊維：衣料品、カーペット、服飾品、不織布および他の産業適用
２．フィルムおよびパッケージング：生鮮食品パッケージングおよび食品サービス用品などの他の適用
３．エンジニアリング適用：エレクトロニクス、消費財、自動車産業におけるもの。
【０００６】
再生可能資源由来の生物分解性プラスチック（バイオプラスチック）は、石油化学プラスチックと比較して、広範囲の利点を有する。石油化学プラスチックに比較したＰＬＡの価格バリアを克服すれば、これらの利点は、広範囲の適用に利用可能となるであろう。
【０００７】
そのライフサイクル中のバイオプラスチックの利点は：
・再生可能原料に由来する
・価値ある未精製石油資源の枯渇を伴わない
・低二酸化炭素排出−慣用的な石油に基づくプラスチックより少なくとも３０％低いと考えられる
・生物分解性
・埋め立ておよび廃棄に関連する問題が回避される。
【０００８】
ＰＬＡの出発材料、乳酸を現在の価格の半額で産生することができれば、ＰＬＡ製品のコストに有意に影響を及ぼすであろう。これは、より高価な石油化学プラスチック製品に比較して、ＰＬＡの市場位置を高める機会を提供する。
【０００９】
乳酸は、伝統的に、乳酸細菌を用いて産生されている。特に食品産業に関しては、これらは乳酸を天然に産生するため、最適な産生生物である。乳酸を含有する伝統的な食品の例は、ザウワークラウトおよびヨーグルトである。乳酸発酵細菌によるグルコースに由来する単離乳酸はまた、現代的な食品加工産業においても用いられている。化学産業における乳酸の主な使用は、プラスチック、ポリ乳酸（ＰＬＡ）の製造である。
【００１０】
しかし、プラスチック製造のための原材料としての乳酸に対する要求は、食品における使用よりもはるかに高い。乳酸は、高純度でなければならず、特に、鏡像異性的に純粋でなければならず（すなわち純粋なＤ−またはＬ−乳酸でなければならず）、そしてＰＬＡは、現在、安価な慣用的石油化学プラスチックと競合しているため、非常に安価でなければならない。乳酸価格の非常に決定的な要因は、発酵後の精製である。精製は困難であり、そして高価であるが、これは部分的に、発酵プロセス中に乳酸細菌が低ｐＨに耐容不能であるためであり、部分的に、乳酸細菌が有機窒素源に依存するためである。さらに、乳酸細菌は通常、酸の両方の鏡像異性体を集積させる（Ｓａｕｅｒら，  ２００８，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６，  １００−１０８およびＳａｕｅｒ  Ｍ．ら，  ２０１０，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２７，  ２２９−２５６）。特に、ｐＨ値は、遊離乳酸の精製が、低ｐＨを有する溶液からのみ達成可能であるために、問題となる。これは、発酵中には、塩基を添加することによってｐＨを高く維持しなければならないことを意味する。乳酸の精製のため、発酵ブロスを酸化しなければならず、そして生じる塩（石膏）を廃棄するかまたはリサイクルしなければならず、これは技術的に複雑な処置となる。
【００１１】
これらの問題に対する解決法は、組換え酵母による乳酸の産生である。これらは、乳酸細菌よりも酸に対して耐性があり、ミネラル培地上で増殖および産生可能であり、そして望ましい乳酸鏡像異性体のみを集積させる。ＮａｔｕｒｅＷｏｒｋｓ  ＬＬＣ（Ｃａｒｇｉｌｌ）は、ＰＬＡのいくつかの商業的製造者の１つである。ＰＬＡ製造の基礎となる乳酸は、酵母に基づくプロセスによって産生される（年間約１４０，０００ｔ）。ＮａｔｕｒｅＷｏｒｋｓのプロセスは、組換えＣｒａｂｔｒｅｅ陰性酵母に基づく（Ｍｉｌｌｅｒら  ２０１１，  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １７９−１８８）。発酵プロセスは、３の最終ｐＨ値で、４０〜４５時間に１００〜１３０ｇ／ｌの乳酸を生じる。しかし、この乳酸は、一般市場では入手可能ではなく、同じ場所でＰＬＡにプロセシングされている。
【００１２】
パン酵母によるグルコースからエタノールへの発酵は、存在する中で最も効率的なバイオプロセスの１つである。生産性は、培地から細胞内へのグルコース取り込み率にのみ限定されると考えられる。ピルビン酸（ピルベート）は、エタノール産生において用いられる重要なグルコース由来代謝産物である。ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を欠失させ、そして同時に、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を挿入することによって、エタノールの代謝経路を排除すれば、エタノールの代わりに乳酸を産生する酵母株が生成される。こうした株は、多様な予備的プロジェクトにおいて、すでに開発されてきている（Ｂｒａｎｄｕａｒｄｉら  ２００６，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，  ５：４，  １−１２）。
【００１３】
ＷＯ２００４／０９９４２５は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を欠き、そして外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む一倍体Ｃｒａｂｔｒｅｅ陽性酵母を、グルコースを含む好気性環境で増殖させて用いて、有意な量のエタノールを産生することなく、乳酸を産生するためのこうした方法に関する。
【００１４】
ＷＯ２００９／１４４０１３は、有機酸の生産性の増加を導く六炭糖輸送体遺伝子を過剰発現する酵母を用いて、乳酸を産生するための方法を記載する。
しかし、乳酸産生酵母を改善するためのいくつかの試みがなされてきたが、高価な精製プロセスの必要性を伴わずに、多量の純粋異性体乳酸を産生するための改善されたプロセスを提供する要求はなお満たされていない。
【００１５】
前記要求は、本発明の態様によって解決される。
本発明は、用いる遺伝的に修飾された酵母株に応じて、乳酸の光学的に純粋な異性体、Ｌ（＋）−乳酸またはＤ（−）−乳酸を産生するため、遺伝的に修飾された酵母株を提供する。これらの酵母株の特異的代謝要求とバイオプロセス工学における本発明のアプローチを組み合わせて、本プロセスは、乳酸の産生コストを有意に減少させることが可能である。本発明のプロセスにおける発酵ブロスの純度は、乳酸細菌を用いた慣用的なプロセスと比較して非常に好適であり、これは、後者が有機窒素供給源および高いｐＨ値を必要とし、このどちらも、精製コストを押し上げるためである。酵母系に基づいて確立されたプロセスと比較して、本発明のプロセスは、生産性がより高く、有意に減少した発酵時間のためにより高いスループットが可能であり、そしてしたがって産物の価格がより低くなるため、特に好適である。本発明のプロセスは、ミネラル培地上で、低ｐＨ値での特に高い生産性によって特徴付けられる。
【００１６】
低ｐＨ値での発酵の大きな問題は、特に高い乳酸濃度では、株の生存可能性が限定されることである。これは、全体の生産性を非常に限定する。本発明のプロセスの革新的な側面は、乳酸の効率的な産生中、ストレス条件に細胞が曝露される時間を最小限に維持することを伴う。これは、２工程プロセスによって達成され、該プロセスは、細胞増殖期を乳酸産生期から、時間的、そして場合によってまた空間的にも分離する。
【００１７】
発酵プロセスの第一の工程は、酵母バイオマスの迅速な増加を伴い、そして第二の工程において、グルコースを乳酸に変換する。これによって、酵母増殖中の成長に対する乳酸の阻害効果を回避し、そしてひとたび高い細胞密度に到達したら、高い生産性で最大限の乳酸収量を達成する。
【００１８】
乳酸の続く精製は、標準法によって実行可能である。該プロセスは、慣用技術によって精製可能な発酵ブロスを提供する。さらに、低ｐＨ値での発酵プロセスは、もはや精製前に発酵ブロスを酸性化する必要がなく、続いて、多量の塩の除去が不要になるため、精製プロセスをより安価にする。
【００１９】
本発明は、炭素供給源としてグルコースを用いて組換え酵母細胞培養において乳酸を産生するための方法であって、バイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、乳酸を産生するためのシード発酵由来のバイオマスを用いた産生発酵工程の連続工程を含み、ここで酵母を＜５のｐＨの培地中で培養する、そして前記酵母が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性またはＬＤＨ活性、および減少したまたはノックアウトされたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するように修飾されている、前記方法を提供する。
【００２０】
態様内にはまた、炭素供給源としてグルコースを含有する組換え酵母細胞培養において乳酸を産生するための方法であって、
ａ）シード発酵において、５〜７のｐＨで酵母細胞を培養して、バイオマスを産生し、
ｂ）工程ａ）の細胞を採取し、そして洗浄してもよく、
ｃ）少なくとも３．０のＯＤ６００で、前記細胞を産生発酵に接種し、
ｄ）＜５のｐＨ、特に、２．５未満の最終ｐＨに到達するまで、乳酸を産生する条件下で前記細胞をインキュベーションし、そして
ｅ）細胞培養または細胞培養上清から乳酸を精製する
工程を含み、
前記酵母が二倍体、あるいは多数体または異数体酵母であってよく、組換え乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を有し、および減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有してもよい
前記方法もある。
【００２１】
態様内にはまた、炭素供給源としてグルコースを含有する組換え酵母細胞培養において乳酸を産生するための方法であって、
ａ）シード発酵において、少なくとも１０のＯＤに到達する条件下で、５〜７の一定のｐＨで酵母細胞を培養して、
ｂ）前記細胞を２．５未満の最終ｐＨに到達するまで培養して、乳酸を産生し、そして
ｃ）細胞培養または細胞培養上清から乳酸を精製する
工程を含み、
前記酵母が二倍体、あるいは多数体または異数体酵母であってよく、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を有し、および減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有してもよい
前記方法もある。
【００２２】
本プロセスに用いる前記組換え酵母は、したがって、効率的な乳酸産生のため、代謝的に操作されている。
本発明の態様にしたがって、酵母株は、約８０ｇ／Ｌ  ＬＡ／１００ｇ／Ｌグルコース、特に１２０ｇ／Ｌグルコースあたり約１００ｇ／Ｌ  ＬＡ、より具体的には１５０ｇ／Ｌグルコースあたり約１２０ｇ／Ｌを産生可能であるか、あるいはさらにより多量を産生可能である。特に、こうした産生培地の最終ｐＨは＜３である。
【００２３】
本発明の態様にしたがって、乳酸は、一般的な産業プロセスによって発酵工程から精製され、そして特に、少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９９％の純度を有し、より具体的にはいかなる不純物も含まない。
【００２４】
特定の態様において、産生発酵工程は、≦４．５、特に≦４、特に≦３．５のｐＨであり、より具体的には、産生発酵工程は、３の最終ｐＨを有し、より具体的には、産生発酵工程は、≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満の最終ｐＨを有する。
【００２５】
いくつかの態様において、シード発酵工程は流加条件下で実行される。
いくつかの態様において、産生発酵工程はバッチプロセス条件下で実行される。
本発明にしたがって、シード発酵および産生発酵は同じ容器中で実行可能である。
【００２６】
本発明の特定の態様にしたがって、シード発酵工程および産生発酵工程は別個の発酵槽中である。
本発明の特定の態様にしたがって、産生発酵工程における糖の初期濃度は、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、特に１２％（ｗ／ｗ）またはそれより高く、より具体的には１５％またはそれより高く、そしてより好ましくは２０％またはそれより高い。
【００２７】
本発明の特定の態様にしたがって、産生発酵工程におけるグルコースの初期濃度は、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、特に１２％（ｗ／ｗ）またはそれより高く、より具体的には１５％またはそれより高く、そしてより好ましくは２０％またはそれより高い。
【００２８】
別の態様において、プロセスはスクロースに基づく。産生発酵工程におけるスクロースの初期濃度は、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、特に１２％（ｗ／ｗ）またはそれより高く、より具体的には１５％またはそれより高く、そしてより好ましくは２０％またはそれより高い。
【００２９】
１つの態様にしたがって、乳酸は遊離型で産生され、特に、乳酸は光学的に純粋な異性体型で産生され、特にＤ（−）またはＬ（＋）−乳酸のいずれかである。
本発明の方法は、ゲノム内に安定に組み込まれているか、あるいは機能的でそして安定な遺伝子発現のために適用可能なプラスミドまたはベクターまたは発現カセット上にあるかいずれかで、異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を含む組換え酵母によって実行可能である。前記酵母は、３．５未満のｐＨ、特に３未満のｐＨ、より具体的には２．８未満のｐＨ、より具体的には２．５未満のｐＨ、より具体的には２．２未満のｐＨで、乳酸を産生可能である。
【００３０】
外因性ＬＤＨ遺伝子の導入は、当業者に知られる方法、例えば形質転換、特にエレクトロポレーション、微粒子銃、ＬｉＡｃ／ｓｓ／ＤＮＡ／ＰＥＧ法、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系の使用等によって、実行可能である。
【００３１】
さらなる態様にしたがって、前記組換え酵母は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子の１またはそれより多くの減少したまたはノックアウトされた発現を有する。
【００３２】
特定の態様にしたがって、組換え酵母は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６遺伝子のプロモーターの１またはそれより多くの置換および／または欠失によって、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子の１またはそれより多くの減少したまたはノックアウトされた発現を有する。
【００３３】
別の態様において、組換え酵母は、特に、異種プロモーターの調節により、特にグルコース抑制可能プロモーターにより、より具体的にはＨＸＴ２またはＨＸＴ４遺伝子プロモーターの調節により、条件的に発現される、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子を有する。
【００３４】
別の態様において、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子の少なくとも１つは、組換え酵母において欠失している。
本発明のさらなる特定の態様において、酵母は、グルコース制御遺伝子発現を調節するグルコースセンサーと相互作用するタンパク質をコードする１またはそれより多い遺伝子の減少したまたはノックアウトされた発現、特にＳｔｄ１またはＭｔｈ１タンパク質のこうした発現を有する。
【００３５】
特に、ＭＴＨ１遺伝子は、部分的にまたは完全に欠失している。
さらなる態様において、酵母は、少なくとも１つの六炭糖輸送体遺伝子を過剰発現するように修飾されており、特に、酵母は、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ３、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ６、ＨＸＴ７、ＨＸＴ８、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１０、ＨＸＴ１１、ＨＸＴ１２、ＨＸＴ１３、ＨＸＴ１４、ＨＸＴ１５、ＨＸＴ１６、ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３およびＲＧＴ２の群より選択される、六炭糖輸送体遺伝子の少なくとも１つを過剰発現するように修飾されている。
【００３６】
本発明の態様によってさらに提供されるのは、本明細書に記載するような、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を有し、およびまた減少したかまたはノックアウトされたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性も有してもよい、組換え酵母である。
【００３７】
さらなる態様にしたがって、組換え酵母はまた、減少したまたはノックアウトされたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性も有することも可能である。
本発明はさらに、
ｉ）機能的に欠失されたＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子、
ｉｉ）機能的に欠失されたＭＴＨ１遺伝子、
ｉｉｉ）過剰発現されたＨＸＴ１遺伝子、および
ｉｖ）少なくとも１つの異種ＬＤＨ遺伝子
を含む、組換え酵母株をさらに提供する。
【００３８】
本発明にしたがって用いられる組換え酵母株は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スギヤマエラ属（Ｓｕｇｉｙａｍａｅｌｌａ）、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）およびデッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）より選択される属に属することも可能である。
【００３９】
特定の態様において、酵母株は、クロイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クロイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、トルラスポラ・デルブルエキー（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ザイゴサッカロミセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、スギヤマエラ・リグノハビタンス（Ｓｕｇｉｙａｍａｅｌｌａ  ｌｉｇｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィー（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）より選択される。
【００４０】
最も好ましくは、サッカロミセス属に属し、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ボウラーディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）またはサッカロミセス・パラドクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）である。
【００４１】
組換え酵母は、一倍体または二倍体であることも可能であり、好ましくは二倍体である。
あるいは、酵母細胞はまた、異数体または多数体細胞であってもよい。
【００４２】
好ましい態様にしたがって、組換え酵母細胞は、ストレス耐性である。
好ましくは、酵母細胞は二倍体酵母細胞であり、これは二倍体酵母がしばしば、よりストレス耐性であり、そしてロバストであるためである。酵母はまた、好ましくはストレスフルな環境、例えばフルーツジュースまたはサトウキビジュースのような高濃度糖環境より単離されるか、あるいはＣａｋａｒ  Ｚ．Ｐ．ら（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．  １２，  ２０１２，  １７１−１８２）に例示的に記載されるように、進化工学のための選択圧を用い、適応実験室進化（ＡＬＥ）を用いて、単離されることも可能である。進化工学は、選択圧の存在下で、または選択条件下で行われる長期のケモスタット培養で行われる、反復バッチ培養のより体系的なアプローチを伴う。これらの培養は、野生型で、あるいは遺伝的多様性を増加させるため、化学的または物理的に突然変異誘発された株で実行されることも可能である。最初のモノクローナル集団の自発的または誘導された突然変異誘発は、培養中に適用される選択圧の結果として、最初のモノクローナル集団において、より適した変異体の形成を生じる。これらのより適した変異体は、選択条件下で、元来の細胞よりもより優れて生存しそして増殖することも可能である。したがって、ケモスタットまたは連続バッチ培養において、培養中の細胞総数に対するより適した細胞の数の比は、定期的に増加し、そしてより適した細胞が培養中で多数を占めるであろう（Ｃａｋａｒ，  ２０１２，  Ｓａｕｅｒ  Ｕ（２００１），  Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７３：  １３０−１６６）。
【００４３】
特定の態様において、酵母細胞は、細胞をシード発酵および産生発酵にトランスファーする前に、ストレス条件下で、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多い世代に渡って前培養または培養されることも可能である。前記ストレス条件は、限定されるわけではないが、高い糖濃度、特にスクロースまたはグルコース濃度、糖制限、窒素枯渇、亜硫酸、低ｐＨ、高い溶質濃度によって引き起こされる過剰浸透圧変化、低浸透圧濃度、好気生活または嫌気生活による酸化性ストレス、静水圧、増加したアセトアルデヒドまたはエタノール濃度、内部酸性化、飢餓、温度ストレス、すなわち約２５〜３０℃の最適温度外での培養であることも可能である。
【００４４】
特に、増加したグルコース濃度下で、酵母細胞のストレス条件付けを行う。特に、グルコース濃度は、約１１０ｇ／ｌ、１２０ｇ／ｌ、１３０ｇ／ｌ、１５０ｇ／ｌ、１６０ｇ／ｌまたはそれより多いことも可能である。
【００４５】
１つの態様にしたがって、前記組換えストレス耐性二倍体酵母細胞は、本明細書に記載するように遺伝的に修飾される。特に、前記細胞は、グルコース耐性であり、同じ培地上で両方を増殖させた際、親株よりもより高い増殖率を有する。
【００４６】
サッカロミセス・セレビシエは、限定されるわけではないが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄを含む、多様な供給源より入手可能である。Ｓ．セレビシエには、限定されるわけではないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘＴＭ  Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘＴＭ  Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＧＲＦ１８Ｕ、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ１５８５、ＣＢＳ２９１０、ＣＢＳ７８３３、ＣＢＳ７８３４、７８３５、ＣＢＳ７８３６、ＣＢＳ７８３７、ＣＢＳ７８３８、７８３９、ＣＢＳ７８４０、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ９５６２、ＣＢＳ９５６３、ＣＢＳ９５６４、ＣＢＳ９５６５、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、ＣＬＩＢ２１５、ＣＬＩＢ３２４、ＣＬＩＢ３８２、ＥＣ１１１８、ＥＣ９−８、ＦＬ１００、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎｓパン酵母、ＦｏｓｔｅｒｓＢ、ＦｏｓｔｅｒｓＯ、ＦＹ、Ｇ６００、ＧＳＹ１１３５、Ｉｌ４、ＩＬ−０１、ＩＲ−２、ＪＡＹ２９１、ＪＷＹ６１４７、ＫＲＹ８、ＬＡＮ２１１、Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ  ５６７２、Ｍ１−２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ２−８、Ｍ２２、Ｍ３２、Ｍ３４、Ｍ３７０７、Ｍ３８３６、Ｍ３８３７、Ｍ３８３８、Ｍ３８３９、Ｍ５、Ｍ５２ｂＢ、Ｍ５２ｃＷ、Ｍ８、ＭＭＹ１１２、ＭＵＣＬ２８１７７、Ｎ８５、ＮＡＭ３４−４Ｃ、ＮＣ−０２、ＮＲＲＬ  Ｙ−１２６３２、ＮＹ１３０８、Ｐ２８３、Ｐ３０１、ＰＥ−２、ＰＷ５、Ｅ００８、Ｒ１０３、Ｒｅｄ  Ｓｔａｒパン酵母、ＲＭ１１−１Ａ、Ｓ２２８、Ｓ２８８ｃ、ＳＧＵ５７、Ｓｉｇｍａ１２７８ｂ、ＳＫ１、Ｔ７、Ｔ７３、ＵＣ５、ＵＦＭＧ  Ａ  ９０５、Ｖｉｎ１３、ＶＬ３、Ｗ３０３、ＷＥ３７２、Ｙ１０、Ｙ１２、Ｙ２２０９、Ｙ３８９、Ｙ９、ＹＢ２１０、ＹＪＭ１００４、ＹＪＭＩ１００５、ＹＪＭＩ１００６、ＹＪＭＩ１９７８、ＹＪＭＩ１０８３、ＹＪＭＩ１０９４、ＹＪＭＩ１０９５、ＹＪＭＩ１０９６、ＹＪＭＩ１０９７、ＹＪＭＩ１０９８、ＹＪＭＩ１０９９、ＹＪＭＩ１１００、ＹＪＭＩ１１０１、ＹＪＭＩ１１０２、ＹＪＭＩ１１０３、ＹＪＭＩ１１０４−  ＹＪＭＩ１１２２、ＹＪＭＩ１１２４、ＹＪＭＩ１１２５、ＹＪＭＩ１１２９、ＹＪＭＩ１１３３、ＹＪＭＩ１１３５、ＹＪＭＩ１１３８、ＹＪＭＩ１１３９、ＹＪＭＩ１１４０、ＹＪＭＩ１１４１、ＹＪＭＩ１１４２、ＹＪＭＩ１１４３、ＹＪＭＩ１１４４、ＹＪＭＩ１１４５、ＹＪＭＩ１１４６、ＹＪＭＩ１１７８、ＹＪＭＩ１１９０、ＹＪＭＩ１１９９、ＹＪＭＩ１２０２、ＹＪＭＩ１２０８、ＹＪＭＩ１２４２、ＹＪＭＩ１２４４、ＹＪＭＩ１２４８、ＹＪＭＩ１２５０、ＹＪＭＩ１２５２、ＹＪＭＩ１２５９、ＹＪＭＩ１２７３、ＹＪＭＩ１２８９、ＹＪＭＩ１２９２、ＹＪＭＩ１３０４、ＹＪＭＩ１３０７、ＹＪＭＩ１３１１、ＹＪＭＩ１３２６、ＹＪＭＩ１３３６、ＹＪＭＩ１３３８、ＹＪＭＩ１３４１、ＹＪＭＩ１３４２、ＹＪＭＩ１３５５、ＹＪＭＩ１３５６、ＹＪＭＩ１３８１、ＹＪＭＩ１３８３、ＹＪＭＩ１３８５、ＹＪＭＩ１３８６、ＹＪＭＩ１３８７、ＹＪＭＩ１３８８、ＹＪＭＩ１３８９、ＹＪＭＩ１３９９、ＹＪＭＩ１４００、ＹＪＭＩ１４０１、ＹＪＭＩ１４０２、ＹＪＭＩ１４１５、ＹＪＭＩ１４１７、ＹＪＭＩ１４１８、ＹＪＭＩ１４１９、ＹＪＭＩ１４３３、ＹＪＭＩ１４３４、ＹＪＭＩ１４３９、ＹＪＭＩ１４４３、ＹＪＭＩ１４４７、ＹＪＭＩ１４５、ＹＪＭＩ１４５０、ＹＪＭＩ１４６０、ＹＪＭＩ１４６３、ＹＪＭＩ１４７７、ＹＪＭＩ１４７８、ＹＪＭＩ１４７９、ＹＪＭＩ１５２６、ＹＪＭＩ１５２７、ＹＪＭＩ１５４９、ＹＪＭＩ１５７３、ＹＪＭＩ１５７４、ＹＪＭＩ１５９２、ＹＪＭＩ１６１５、ＹＪＭＩ１８９、ＹＪＭＩ１９３、ＹＪＭＩ１９５、ＹＪＭＩ２２３、ＹＪＭＩ２４４、ＹＪＭＩ２４８、ＹＪＭＩ２６９、ＹＪＭＩ２７０、ＹＪＭＩ２７１、ＹＪＭＩ２８０、ＹＪＭＩ３０８、ＹＪＭＩ３２０、ＹＪＭＩ３２６、ＹＪＭＩ３３２、ＹＪＭＩ３３９、ＹＪＭＩ４２１、ＹＪＭＩ４２８、ＹＪＭＩ４３２、ＹＪＭＩ４３４、ＹＪＭＩ４３５、ＹＪＭＩ４３６、ＹＪＭＩ４３７、ＹＪＭＩ４３９、ＹＪＭＩ４４０、ＹＪＭＩ４５０、ＹＪＭＩ４５１、ＹＪＭＩ４５３、ＹＪＭＩ４５４、ＹＪＭＩ４５５、ＹＪＭＩ４５６、ＹＪＭＩ４６４、ＹＪＭＩ４６６、ＹＪＭＩ４６７、ＹＪＭＩ４７０、ＹＪＭＩ５２１、ＹＪＭＩ５２５、ＹＪＭＩ５４１、ＹＪＭＩ５５４、ＹＪＭＩ５５５、ＹＪＭＩ５６０、ＹＪＭＩ５６１、ＹＪＭＩ６２７、ＹＪＭＩ６３４、ＹＪＭＩ６５３、ＹＪＭＩ６６９、ＹＪＭＩ６７０、ＹＪＭＩ６７１、ＹＪＭＩ６７２、ＹＪＭＩ６７４、ＹＪＭＩ６７６、ＹＪＭＩ６７７、ＹＪＭＩ６７８、ＹＪＭＩ６８１、ＹＪＭＩ６８２、ＹＪＭＩ６８３、ＹＪＭＩ６８９、ＹＪＭＩ６９３、ＹＪＭＩ７８９、ＹＪＭＩ８１０、ＹＪＭＩ８１１、ＹＪＭＩ８１３、ＹＪＭＩ８１５、ＹＪＭＩ８１６、ＹＪＭＩ９３６、ＹＪＭＩ９４５、ＹＪＭＩ９４６、ＹＪＭＩ９４７、ＹＪＭＩ９４８、ＹＪＭＩ９４９、ＹＪＭＩ９５０、ＹＪＭＩ９５１、ＹＪＭＩ９５２、ＹＪＭＩ９５３、ＹＪＭＩ９５４、ＹＪＭＩ９５５、ＹＪＭＩ９５６、ＹＪＭＩ９５７、ＹＪＭＩ９５８、ＹＪＭＩ９５９、ＹＪＭＩ９６０、ＹＪＭＩ９６１、ＹＪＭＩ９６２、ＹＪＭＩ９６３、ＹＪＭＩ９６４、ＹＪＭＩ９６５、ＹＪＭＩ９６６、ＹＪＭＩ９６７、ＹＪＭＩ９６９、ＹＪＭＩ９７２、ＹＪＭＩ９７５、ＹＪＭＩ９７８、ＹＪＭＩ９８１、ＹＪＭＩ９８４、ＹＪＭＩ９８７、ＹＪＭＩ９９０、ＹＪＭＩ９９３、ＹＪＭＩ９９６、ＹＪＳＨ１、ＹＰＨ４９９Ｎ、ＹＰＳ１００９、ＹＰＳ１６３、ＺＴＷ１が含まれる。
【００４７】
特定の態様において、サッカロミセス・セレビシエは、株ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、またはＣＢＳ７９６１である。
特定の態様において、酵母株は、ウラシル、ロイシン、トリプトファンおよび／またはヒスチジンに関して栄養要求性であることも可能である。特に、株は、コードする遺伝子を不活性化することによって、ｕｒａ、ｔｒｐおよびｈｉｓに関して栄養要求性である。
【００４８】
本発明の態様はまた、組換え酵母株を用いて、炭素供給源として糖、例えばグルコースまたはスクロースを用いる、乳酸を産生するための連続２工程発酵系であって
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで酵母を３．５未満のｐＨで、特に約３の最終ｐＨ、より具体的には約２．８、約２．７、約２．６、約２．５、約２．４、約２．３、約２．２の最終ｐＨまで、より具体的には約２．１の最終ｐＨまで、細胞培地培地中で培養する、
からなり、
該酵母が異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をコードし、そして減少したまたは減弱したＰＤＣ活性を有する
前記系も提供する。
【００４９】
あるいは、組換え酵母株を用いて、炭素供給源として糖、例えばグルコースまたはスクロースを用いる、乳酸を産生するための２工程発酵系であって
ａ）第一の発酵槽においてバイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、
ｂ）シード発酵から接種された第二の発酵槽における乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで酵母を３．５未満のｐＨで、特に約３のｐＨまで、より具体的には約２．８、約２．７、約２．６、約２．５、約２．４、約２．３、約２．２のｐＨまで、より具体的には約２．１のｐＨまで、細胞培地中で培養する、
からなり、
酵母が乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性および／または減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するように修飾されている
前記系も提供する。
【００５０】
さらにさらなる態様において、組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用いる、乳酸を産生するための２つの発酵槽システムの組み合わせであって
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵槽、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための、シード発酵から接種される産生発酵槽、ここで酵母を３．５未満のｐＨで、特に約３またはそれ未満の最終ｐＨ、より具体的には約２．８、約２．７、約２．６、約２．５、約２．４、約２．３、約２．２のｐＨまで、より具体的には約２．１のｐＨまで、細胞培地中で培養する、
からなり、
酵母が乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性、および減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するかまたはＰＤＣ活性を持たない
前記系も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】２工程発酵プロセス（本発明のプロセス）における、乳酸細菌対遺伝子修飾酵母を用いた、製造プロセスにおける相違。
【図２】バイオマス増殖および乳酸形成に分けた２工程発酵プロセス。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、組換え酵母を用いて乳酸を産生するための新規方法を提供する。
乳酸（２−ヒドロキシプロピオン酸）は、式ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２Ｈを持つ有機化合物である。カルボキシル基に隣接したヒドロキシル基が存在するため、乳酸はアルファヒドロキシ酸（ＡＨＡ）と分類される。ラクテートと称される共役塩基の形で、いくつかの生化学プロセスにおいて役割を果たす。
【００５３】
溶液中で、乳酸はカルボキシル基からプロトンをイオン化させ、乳酸イオンＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２−を産生する。酢酸と比較して、乳酸のｐＫａは１単位少なく、これは、乳酸が酢酸よりも１０倍容易に脱プロトン化することを意味する。この高い酸性性は、α−ヒドロキシルおよびカルボン酸基の間の分子内水素結合の結果である。
【００５４】
乳酸は、２つの光学異性体からなる鏡像異性である。乳酸は、光学的に活性である、もっとも単純なヒドロキシル酸である。Ｌ（＋）−乳酸は、発酵を通じて、Ｄ（−）−乳酸なしに直接産生されることが可能である（例えば、既知の化学合成は、両方の異性体のラセミ混合物を生じる）。同様に、Ｄ（−）−乳酸は、発酵によって、Ｌ（＋）−乳酸なしに産生可能である。一方は、Ｌ（＋）−乳酸または（Ｓ）−乳酸として知られ、そして他方はその鏡像であって、Ｄ（−）−乳酸または（Ｒ）−乳酸である。等量の２つの混合物は、ＤＬ−乳酸と称される。
【００５５】
乳酸は、吸湿性である。ＤＬ−乳酸は、およそ１７または１８℃の融点より高温では、水およびエタノールと混和性である。Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸は、より高い融点を有する。
【００５６】
用語「培地」は、組換え酵母が増殖可能である、炭素供給源として、限定されるわけではないが、グルコースまたはスクロースなどの糖を含む、十分な栄養素を含む、固体または液体培地を指す。ケモスタット、流加、またはバッチ培養において、培地は液体である。
【００５７】
用語「シード発酵工程」および「接種物発展工程」は、本明細書において、組換え酵母が高密度に増殖し、これを産生発酵工程の接種に使用可能である、培養条件の提供を指す。シード発酵は、したがって、組換え酵母の増殖に最適な条件下で行われる（バイオマス増殖期）。
【００５８】
シード発酵は、約５．０〜７．０のｐＨで行われ、特にｐＨは約５．０である。
場合によって、第一の工程では、グルコースまたはスクロースが制限されている（例えば約１０ｇ／ｌ未満、好ましくは５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは２ｇ／Ｌ未満）。グルコースまたはスクロースは、本明細書において、シード発酵の主な炭素供給源として用いられ、特に、シード発酵培地のグルコース含量は、接種時に１０〜２５ｇ／ｌ、特に１５〜２５ｇ／ｌの間、より具体的には約２０ｇ／ｌである。
【００５９】
この文脈において、低グルコース濃度は、培養のための１０ｇ／Ｌ未満のグルコース、特に５ｇ／Ｌ未満、特に２ｇ／Ｌ未満を意味する。
あるいは、他の炭素供給源が適用可能である可能性もあり、例えば限定されるわけではないが、リグノセルロース由来糖、リグノセルロース加水分解物、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースまたはフルクトースあるいはその任意の混合物である。
【００６０】
さらに、窒素供給源を提供する。
シード発酵は、特に、流加プロセスまたはバッチプロセスとして実行可能であり、流加プロセスが好ましい。
【００６１】
流加条件下で、グルコースおよびエタノールが完全にまたはほぼ完全に消費されるまでバッチ培養が進行した後、新鮮な培地が培養内にフィードされる。フィード培地は、好ましくは、高濃度のグルコースまたはスクロースを、特に２０ｇ／ｌ〜約５００ｇ／Ｌの間で含有する。酵母は、株特異的であり、そしてあらかじめケモスタット培養を用いて決定可能である臨界値での比増殖率を維持するために必要な流速で培養される。増殖率が臨界値を超える場合、酵母の呼吸能が上回り、そして酸素の存在下であっても、基質の発酵が起こるであろう。臨界値で比増殖率を維持すると、エタノール、ラクテート、グリセロールおよびアセテートなどの副産物を形成することなく、消費される基質あたりの高いバイオマス収量が確実になる。
【００６２】
この文脈において、高い糖濃度は、培養のための１０ｇ／Ｌ糖、特に２０ｇ／Ｌ糖またはそれより多くを意味する。
この文脈において、高いグルコース濃度は、培養のための１０ｇ／Ｌグルコース、特に２０ｇ／Ｌグルコースまたはそれより多くを意味する。
【００６３】
この文脈において、高いスクロース濃度は、培養のための１０ｇ／Ｌスクロース、特に２０ｇ／Ｌスクロースまたはそれより多くを意味する。
好ましくは、シード発酵工程は好気性である。
【００６４】
特定の態様において、バイオマスを増加させるために調節される変数は、呼吸商（ＲＱ）、比酸素取り込み率、比二酸化炭素放出率、ｐＨ、バイオマスレベル、比増殖率、酸素分圧（ｐＯ２）、熱生成率、比副産物産生率、およびその組み合わせからなる群より選択可能である。
【００６５】
熱生成率は、冷却器データ、例えば冷却器流速、および／または冷却器からの入口および出口温度に由来する熱除去率から概算可能である。
調節される変数が副産物濃度であるいくつかの態様において、副産物は、イソブチレート、イソ酪酸、ジヒドロキシイソバレレート、ケトイソバレレート、イソブチルアルデヒド、ラクテート、アセトラクテート、アセテート、ホルメート、グリセロール、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００６６】
比二酸化炭素放出率（ＣＥＲ、ミリモル／ｇ／時間）および比酸素取り込み率（ＯＵＲ、ミリモル／ｇ／時間）は、流速、空気の入口および排出口気体組成（ＣＯ２、Ｏ２等）を、例えば質量分析および／または細胞密度測定を用いて測定することによって、計算可能である。比二酸化炭素放出率は、単位時間あたりの、細胞密度に対する、産生される二酸化炭素（出口および入口二酸化炭素濃度の間の相違を乗じた空気流速）の比である。比酸素取り込み率は、細胞密度に対する、消費される酸素（入口および出口酸素濃度の間の相違を乗じた空気流速）の比である。いくつかの態様において、ＯＵＲは、例えば排出口気体分析を用いて、直接測定される。いくつかの態様において、ＣＥＲは、例えば排出口気体分析を用いて、直接測定される。
【００６７】
いくつかの態様において、バイオマス成長期中のＯＵＲセットポイントは、１時間あたり細胞１グラムあたり、約２〜約１０、約２〜約９、約２〜約８、約２〜約７、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、または約２〜約３、約３〜約１０、約３〜約９、約３〜約８、約３〜約７、約３〜約６、または約３〜約５ミリモル（ｍｍｏｌ／（ｇ細胞ｘ時間））である。
【００６８】
いくつかの態様において、バイオマス成長期中のＣＥＲセットポイントは、約１〜約１０、約１〜約９、約１〜約８、約１〜約７、約１〜約６、約１〜約５．５、約１〜約４、約１〜約３、約２．５〜約１０、約２．５〜約９、約２．５〜約８、約２．５〜約７、約２．５〜約６、約２．５〜約５、約２．５〜約４、約２．５〜約３、約２〜約１０、約２〜約９、約２〜約８、約２〜約７、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、または約２〜約３ｍｍｏｌ／（ｇ細胞ｘ時間）である。
【００６９】
呼吸商（ＲＱ）は、ＣＥＲおよびＯＵＲの比である。所定の一定の空気流速に関して、ＲＱを計算するためには、質量分析からの入口および出口気体組成のみが必要である。ＲＱは、酸素取り込み率をバイオリアクター系を通じた炭素流動と組み合わせた調節変数として用いられる。ＲＱは、本質的にスケールから独立である。ＲＱは、例えば排出口気体分析を用いて測定可能である。
【００７０】
比増殖率は、細胞密度またはＯＤ６００データから、あるいは経験的モデル由来のＯＵＲデータから間接的に、概算可能である。
いくつかの態様において、バイオマス成長期中のＲＱセットポイントは、約０．５〜約５、約１〜約５、約２〜約５、約３〜約５、約２〜約４、約２〜約３、約３〜約４、約０．５〜約５、約０．７〜約５、約０．９〜約５、約１．２〜約５、約１．４〜約５、約１．６〜約５、約１．８〜約５、約２．２〜約５、約２．４〜約５、約２．６〜約５、約２．８〜約５、約３．２〜約５、約３．４〜約５、約３．６〜約５、約３．８〜約５、約４．２〜約５、約４．４〜約５、約４．６〜約５、約４．８〜約５、約０．５〜約４、約０．７〜約４、約０．９〜約４、約１．２〜約４、約１．４〜約４、約１．６〜約４、約１．８〜約４、約２．２〜約４、約２．４〜約４、約２．６〜約４、約２．８〜約４、約３．２〜約４、約３．４〜約４、約３．６〜約４、約３．８〜約４、約０．５〜約１．５、約０．６〜約１．５、約０．６５〜約１．５、約０．６７〜約１．５、約０．７〜約１．５、約０．７５〜約１．５、約０．８〜約１．５、約０．９〜約１．５、約０．５〜約１．２、約０．６〜約１．２、約０．６５〜約１．２、約０．６７〜約１．２、約０．７〜約１．２、約０．７５〜約１．２、約０．８〜約１．２、約０．９〜約１．２、約０．５〜約１．０５、約０．６〜約１．０５、約０．７〜約１．０５、約０．７５〜約１．０５、約０．８〜約１．０５、約０．９〜約１．０５、約０．９５〜約１．５、約０．９５〜約１．４、約０．９５〜約１．３、約０．９５〜約１．２、約０．９５〜約１．１または約０．９５〜約１．０５である。
【００７１】
特定の態様において、バイオマスを増加させるために操作される変数は、フィード速度、フィード組成、空気流速、空気組成、撹拌速度、圧、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００７２】
本発明にしたがって、用語「約」には、最大１０％、特に最大５％、より具体的には最大１％の数値偏差が含まれる。例えば、用語「約１０μｇ」は、したがって、９〜１１μｇ、特に９．５〜１０．５μｇ、特に９．９〜１．１μｇの範囲を定義する。
【００７３】
用語「産生発酵工程」は、本明細書において、乳酸が、３またはそれ未満の最終ｐＨで、組換え酵母によって産生される、特に≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満の最終ｐＨが達成可能である、培養条件の提供を指す。
【００７４】
産生発酵は、産生反応装置内にシード発酵から達成される酵母細胞を接種して開始される。好ましくは、接種は、＞５ｇ／Ｌ、好ましくは＞１０ｇ／Ｌ、＞２０ｇ／Ｌ、＞３０ｇ／Ｌ、＞４０ｇ／Ｌ、＞５０ｇ／Ｌの高い細胞密度で酵母細胞を用いる。接種サイズは、発酵性能を決定する際に重要な役割を果たしうる。
【００７５】
接種または発酵産生開始のための酵母細胞の細胞密度は、少なくとも３のＯＤ６００、好ましくは約５のＯＤ６００、好ましくは約６のＯＤ６００、好ましくは約７のＯＤ６００、好ましくは約８のＯＤ６００、好ましくは約９のＯＤ６００、より好ましくは約１０のＯＤ６００であるはずである。
【００７６】
産生培地は、高い糖濃度、特にグルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、加水分解デンプン、ラクトース濃度を含有し、高い乳酸力価を確実にする。培地は、好ましくは栄養素を補充され、高い糖、特にグルコース濃度で、細胞代謝を支持する。
【００７７】
用語「バッチ培養」は、もはや増殖に適切でなくなるまで、増殖する生物の作用によって連続的に改変される固定体積の培地において起こる増殖を伴う、微生物の閉鎖培養を指す。バッチ培養において、好気性培養における分子酸素以外は、微生物増殖に必要なすべての栄養素が培養開始前に培地中に存在する。
【００７８】
バッチ培養は、グルコースが完全にまたはほぼ完全に消費されるまで進行する。
シードおよび乳酸産生発酵に用いられる発酵培地は、本質的にグルコース、または代替物としてスクロース、少なくとも１つの窒素供給源および水を含む基礎培地であることも可能である。
【００７９】
発酵培地で用いられる窒素供給源は、限定されるわけではないが、尿素、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムであることも可能である。
さらに、他の塩、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化第二鉄、マンガン、サルフェート、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、ビオチン、イノシトールおよびチアミンを添加することも可能である。
【００８０】
特に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ビタミン溶液および微量要素より選択される最少培地塩によって、基礎培地に補充することも可能である。
有用なビタミン溶液は、例えば、Ｄ−ビオチン、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸、ニコチン酸、ミオイノシトール、塩酸チアミン、塩酸ピリドキサールおよびｐ−アミノ安息香酸を含有することも可能である。
【００８１】
有用な微量要素は、Ｎａ２ＥＤＴＡ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＫＩであることも可能である。
【００８２】
他の発酵条件、例えば温度、細胞密度、基質（単数または複数）の選択、栄養素の選択等は、一般的に経済的なプロセスを提供するように選択される。特に産生期中の、好ましい温度は、約２５〜４５℃、特に約３０℃である。
【００８３】
培地は緩衝されていてもよいし、あるいはｐＨを維持するかまたは調節するために塩基を添加してもよい。
ｐＨが、約３．５〜約９．０、特に約４．５〜約７．０、特に約５．０〜約７．０の範囲に調節されるかまたは維持されるように、培地を緩衝することも可能であるし、またはシード発酵工程中に剤を添加することによって、ｐＨを調節することも可能である。
【００８４】
当業者に知られる任意の適切な緩衝剤が使用可能であり、特にこれはリン酸緩衝剤である。
好ましいｐＨを調節するために適した剤は、塩基性材料であり、そしてこれには、例えば水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等が含まれる。ここで、慣用的な発酵プロセスで用いられている緩衝剤もまた適切である。
【００８５】
産生発酵工程のｐＨが、典型的には５．５またはそれより高い出発ｐＨから、酸発酵産物のｐＫａまたはそれより低く、例えば１．５〜３．５の範囲、特に１．５〜３．０の範囲、または１．５〜２．５の範囲に低下することを可能にすることが好ましい。
【００８６】
あるいは、産生発酵工程のｐＨは、プロセス全体で、乳酸のｐＫａにまたはそれ未満に維持される。したがって、発酵培地のｐＨは、産生発酵プロセス開始前または開始時に、乳酸のｐＫａまたはそれ未満に調節され、そして産生発酵中、そのレベルに維持される。この特定の態様において、ｐＨは、好ましくは、１．５〜３．５の範囲内、２．０〜３．０の範囲に維持される。
【００８７】
特定の態様において、産生発酵培地の最終ｐＨは、５未満、特に≦４．５、特に≦４、特に≦３．５、特に≦３、特に≦２．５、特に≦２．１５である。
産生発酵は、特に、流加プロセスまたはバッチプロセスとして実行されることも可能であり、バッチプロセスが好ましい。
【００８８】
特定の態様にしたがって、５未満、特に≦４．５、特に≦４、特に≦３．５、特に≦３、特に≦２．５、特に≦２．１５のｐＨが、全産生発酵工程中に維持される。
さらなる特定の態様にしたがって、３未満またはそれに等しいｐＨが全産生発酵工程中に維持される。代替態様において、ｐＨは、≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満のｐＨで維持されなければならない。
【００８９】
発酵、発酵プロセスまたは発酵反応および類似の用語は、本明細書において、プロセスの増殖期および乳酸生合成期の両方を含むよう意図される。
本明細書にさらに記載されるように、いくつかの態様において、バイオリアクターは、第一のシード増殖反応装置および第二の発酵反応装置を含むことも可能である。
【００９０】
本発明記載の用語「バイオリアクター」または「発酵槽」は、生物学的に活性である環境を支持する任意のデバイスまたは系を指し、そしてこれには、１またはそれより多い容器および／またはタワーまたはパイプ配置からなる発酵デバイスが含まれる。バイオリアクターは、一般的に筒状であり、リットルから平方メートルのサイズ範囲であり、そしてしばしばステンレス鋼で作製され、連続撹拌タンク反応装置（ＣＳＴＲ）、バブルカラム反応装置（ＢＣＲ）、またはトリクルベッド反応装置（ＴＢＲ）、あるいは気体−液体接触に適した他の容器または他のデバイスが含まれる。操作様式に基づいて、バイオリアクターは、バッチ、流加または連続（例えば連続撹拌タンク反応装置モデル）と分類されることも可能である。連続バイオリアクターの例はケモスタットである。
【００９１】
上述のように、シードおよび産生発酵は、別個の発酵槽中であることも可能である。したがって、バイオリアクターは、組換え酵母を培養する第一のシード増殖反応装置、および増殖反応装置由来の酵母接種物をフィードし、そして大部分の乳酸を産生する、第二の産生発酵反応装置を含むことも可能である。
【００９２】
一次または第一のまたはシード発酵バイオリアクターはまた、本明細書において、二次、産生発酵バイオリアクターと連続してまたは平行に連結される１またはそれより多い反応装置を含むことも可能である。
【００９３】
産生発酵バイオリアクターの接種のための接種物密度は、好ましくは、少なくとも３のＯＤ６００である。
二次産生発酵バイオリアクターは、本明細書において、一次バイオリアクターと連続してまたは平行に連結されることが可能である任意の数のさらなるバイオリアクターを含むことも可能である。これらのさらなるバイオリアクターの任意の１またはそれより多くはまた、さらなる分離装置に連結されていることも可能である。
【００９４】
低ｐＨ発酵培地からの乳酸の回収は、当業者に知られる方法を用いて実施可能である。精製は、既知の技術によって、例えば遠心分離、ろ過、例えば微量ろ過、限外ろ過、ナノろ過、液体−液体抽出、結晶化、クロマトグラフィ等によって実行可能である。
【００９５】
いくつかの態様において、産生発酵は、５００ｍＭより多い、好ましくは６０ｇ／Ｌより多い、８０ｇ／Ｌより多い、１００ｇ／Ｌより多い、１２０ｇ／Ｌより多い乳酸産生を生じる。
【００９６】
本発明の方法で有用な組換え酵母株は、１またはそれより多い異種ＬＤＨ遺伝子による乳酸デヒドロゲナーゼ活性、そしてさらに、減少したまたは減弱したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。
【００９７】
本発明において、「異種」または「外来性」は、任意の遺伝物質に関して、該遺伝物質が宿主細胞に対して天然でないことを意味する。
用語「遺伝子」は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、あるいはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはＲＮＡ分子をコードする他のＤＮＡ、および発現制御に関与するコード配列隣接領域を指す。
【００９８】
用語「突然変異」は、核酸配列における任意の変化または改変を指す。点、フレームシフト、およびスプライシングを含む、いくつかのタイプが存在する。突然変異は、特異的にまたはランダムに実行されることも可能である。
【００９９】
用語「プラスミド」は、環状、染色体外、場合によって自己複製性のＤＮＡ片を指す。
用語「ゲノム」は、組換え酵母細胞内の染色体（単数または複数）およびプラスミドの両方を含む。
【０１００】
用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」は、ピルビン酸の乳酸への変換を触媒するタンパク質（例えば酵素）を指す。
用語「Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ」は、ピルビン酸のＬ−乳酸への変換を触媒する酵素を指し、具体的にはＥＣ１．１．１．２７と分類される。
【０１０１】
用語「Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ」は、ピルビン酸のＤ−乳酸への変換を触媒する酵素を指し、具体的にはＥＣ１．１．１．２８と分類される。
用語「ＬＤＨ遺伝子」は、発現に際して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生じる遺伝子を指す。本出願で用いられるようなＬＤＨ遺伝子には、発現された際に、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生じる任意の遺伝子が含まれることも可能である。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、立体特異的であることも可能である。すなわち、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、Ｌ−乳酸のみまたはＤ−乳酸のみを産生する反応を触媒可能である。他の乳酸デヒドロゲナーゼは、Ｌ−およびＤ−乳酸の両方を産生する反応を触媒する。Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ピルビン酸からＬ−乳酸への変換を触媒する。
【０１０２】
適切なＬＤＨ遺伝子には、限定されるわけではないが、細菌、真菌、酵母または哺乳動物供給源から得られるものが含まれる。ＬＤＨ遺伝子の例は、Ｌ．ヘルベティクス（Ｌ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．  ｃａｓｅｉ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｌ．ディオリボランス（Ｌ．  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、Ｌ．レウテリ（Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ）、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉｉ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、Ｐ．アシディラクティシ（Ｐ．  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ジョンソニ（Ｌ．  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．デルブルエキー（Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびＬ．ペントスス（Ｌ．  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）から得られるものである。好ましくは、コードされるＬＤＨ酵素は、フルクトース二リン酸に依存せず、例えばＬ．プランタルム由来のＬ−ＬＤＨである。
【０１０３】
特異的Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の例は、ラクトバチルス・プランタルム、Ｌ．ヘルベティクス、Ｌ．カゼイ、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ステアロテルム、ウシ、Ｐ．アシディラクティシ、およびヒトまたはウシ亜科（ｂｏｖｉｎｅ）供給源から得られるものである。
【０１０４】
特異的Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の例は、Ｌ．ヘルベティクス、Ｌ．ジョンソニ、Ｌ．ブルガリクス、Ｌ．デルブルエキー、Ｌ．プランタルムおよびＬ．ペントススから得られるものである。
【０１０５】
これらのＬ−ＬＤＨまたはＤ−ＬＤＨ遺伝子いずれかと同一であるか、あるいは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である機能性遺伝子が適切である。これらの供給源いずれかから得られる天然遺伝子を、必要であれば突然変異誘発に供して、真核開始コドン（ＡＴＧ）で開始するコード配列を提供することも可能である。
【０１０６】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の遺伝物質、およびタンパク質アミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメータを伴うＢＬＡＳＴまたはＳｍａｒｔＢＬＡＳＴソフトウェアを用いて、慣用的に計算可能である。
【０１０７】
組換え酵母細胞は、単一のＬＤＨ遺伝子または複数のＬＤＨ遺伝子、例えば１〜１０のＬＤＨ遺伝子、特に１〜５のＬＤＨ遺伝子を含有することも可能である。形質転換酵母が複数のＬＤＨ遺伝子を含有する場合、個々の遺伝子は、同じ遺伝子のコピーであることも可能であるし、あるいは２またはそれより多い異なるＬＤＨ遺伝子のコピーが含まれることも可能である。外因性ＬＤＨ遺伝子の複数のコピーは、互いに隣接するように、単一遺伝子座に組み込まれていてもよいし、または酵母ゲノム内のいくつかの遺伝子座に組み込まれていてもよい。
【０１０８】
外因性ＬＤＨ遺伝子は、どちらも修飾酵母細胞において機能性である、１またはそれより多いプロモーターおよび１またはそれより多いターミネーターの転写調節下にある。
本発明にしたがって用いられるような用語「プロモーター」は、構造遺伝子の翻訳開始コドンの上流（すなわち５’）に位置し（一般的に約１〜１０００ｂｐ、好ましくは１〜５００ｂｐ、特に１〜１００ｂｐ以内）、そして構造遺伝子の転写開始を調節する、転写されない配列を指す。
【０１０９】
用語「終結配列」は、構造遺伝子の翻訳終了コドンの下流（すなわち３’）に位置し（一般的に約１〜１０００ｂｐ、より典型的には１〜５００塩基対、そして特に１〜１００塩基対以内）、そして構造遺伝子の転写終結を調節する、転写されない配列を指す。
【０１１０】
プロモーターまたはターミネーターは、構造遺伝子のものに対するゲノムにおける位置が、プロモーターまたはターミネーターが、場合によって、その転写調節機能を実行するようなものである場合、構造遺伝子に「機能可能であるように連結」されている。
【０１１１】
プロモーターおよびターミネーター配列は、本発明の組換え酵母細胞に対して天然または外因性であることも可能である。
特に適切なＬＤＨ遺伝子には、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ５６５１２（ＬＤＨ１＿ＬＡＣＰＬ）、配列番号１：
【０１１２】
【化１】
2019513408.tif 000003
【０１１３】
と比較して、少なくとも６０％、特に少なくとも８０％、８５％または９５％の同一性スコアを有するアミノ酸配列を持つ酵素をコードするものが含まれる。
天然酵母細胞プロモーターおよびターミネーターの、それぞれの上流および下流隣接領域を伴った使用は、酵母ゲノムの特定の遺伝子座内へのＬＤＨ遺伝子のターゲティング組込み、および同時のＬＤＨ遺伝子の組込みおよび別の天然遺伝子、例えばＰＤＣ遺伝子の欠失または破壊を可能にしうる。
【０１１４】
複数の外因性ＬＤＨ遺伝子を酵母細胞内に導入する際、異なるＬＤＨ遺伝子を、異なるタイプのプロモーターおよび／またはターミネーターの調節下に置くことも可能である。
外因性ＬＤＨ遺伝子は、酵母ゲノム内にランダムに組み込まれてもよいし、あるいは１またはそれより多いターゲティング位置に挿入されていてもよい。ターゲティングされる位置の例には、ＰＤＣまたはＭＴＨ１遺伝子のものなど、望ましくは欠失または破壊される１またはそれより多い遺伝子の遺伝子座が含まれる。
【０１１５】
用語「欠失」および「破壊」は、遺伝子の全コード領域の除去、あるいは遺伝子がタンパク質もしくはタンパク質の活性型を発現しないか、または有意に減少した活性を持つ酵素を産生するような、それぞれのプロモーターおよび／またはターミネーター領域の、例えば欠失、挿入または突然変異による修飾を指す。欠失または破壊は、遺伝子操作法、強制進化または突然変異誘発、その後、望ましい突然変異体を同定する適切な選択またはスクリーニングによって達成可能である。
【０１１６】
本発明の組換え酵母は、さらに、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６遺伝子のさらなる遺伝子修飾、例えばその欠失または破壊を有し、それによって、酵母がエタノールを産生する能力を減少させる。
【０１１７】
ＰＤＣ１およびＰＤＣ５は、グルコース発酵中に活性であり、ここでＰＤＣ１は、ＰＤＣ５よりも約６倍強く発現される。ＰＤＣ６の発現は弱く、そしてエタノール培地中で誘導されるようである。
【０１１８】
特に、組換え酵母は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ陰性または不活性または減少酵母株であり、減少したかまたは検出不能なピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、そして合成培地中で、単独炭素供給源としてグルコースに依存する好気性環境において、増殖しないかまたは損なわれた増殖を示し、そして最少培地中の好気性環境での増殖中に、エタノールの検出可能な量を産生しない可能性もある（例えば約１ｐｐｍ未満）。
【０１１９】
特に、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子の１、２またはすべてが機能的にノックアウトされるかまたは欠失される。特に、組換え酵母株は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６の両アレルを欠く。
【０１２０】
あるいは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子の１、２またはすべてが、恒常的条件的／誘導性プロモーター、すなわち特定の条件下でまたは選択される補助剤の添加に際して、遺伝子発現を下方制御するかまたは上方制御するプロモーターの調節により、条件的に発現される。特定の態様において、条件的プロモーターは、グルコース抑制可能である。別の特定の態様において、条件的プロモーターはｐＨ依存性であり、好ましくは＞５のｐＨで活性であるが、＜４のｐＨで不活性である。特定の態様において、条件的プロモーターは、ＨＸＴ遺伝子由来、特にＨＸＴ２、ＨＸＴ４、ＨＸＴ１またはＨＸＴ７由来である。
【０１２１】
適切な恒常的プロモーターの例は、解糖酵素由来のプロモーターである。こうした解糖プロモーターの例は、ＴＰＩ１（トリオースリン酸イソメラーゼ１プロモーター、ＴＤＨ３（ＧＡＰＨ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（３−ホスホグリセル酸キナーゼ）プロモーターおよびＰＧＩ１ホスホグルコースイソメラーゼ）プロモーターである。
【０１２２】
サッカロミセス・セレビシエは、グルコース（六炭糖）輸送体に類似のタンパク質をコードする２０の遺伝子を有する（ＨＸＴ１〜ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、およびＲＧＴ２）。これらのＨｘｔタンパク質は、輸送体の主要促進物質スーパーファミリー（ＭＦＳ）に属する。ＭＦＳタンパク質は、その基質を受動的に、エネルギー非依存性に促進される拡散によって輸送し、グルコースは濃度勾配に沿って移動する。六炭糖輸送体遺伝子は、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ３、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ６、ＨＸＴ７、ＨＸＴ８、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１０、ＨＸＴ１１、ＨＸＴ１２、ＨＸＴ１３、ＨＸＴ１４、ＨＸＴ１５、ＨＸＴ１６、ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３およびＲＧＴ２であるが、酵母において有用である六炭糖輸送系をコードする任意の他のさらなる未知の遺伝子もまた、本明細書に含まれる。
【０１２３】
１つの態様にしたがって、上記に列挙される六炭糖輸送体遺伝子の１またはそれより多くが、異種恒常的または誘導性プロモーターを用いて過剰発現される。
さらなる態様にしたがって、酵母は、ＭＴＨ１またはＳＴＤ１遺伝子の機能的欠失を含む。さらなる態様にしたがって、酵母は、ＭＴＨ１遺伝子の過剰発現を含む。Ｓｔｄ１タンパク質は、グルコース制御遺伝子の発現を調節し、そしてグルコースセンサーＳｎｆ３およびＲｇｔ２と相互作用すると推測される。Ｓｔｄ１の相同体、Ｍｔｈ１は、Ｓｎｆ３と相互作用するがＲｇｔ２とはしないと推測される。ＳＴＤ１、ＭＴＨ１、ＳＮＦ３、およびＲＧＴ２の間の遺伝子相互作用は、グルコースシグナル伝達が、少なくとも部分的に、これらの遺伝子産物の相互作用を通じて仲介されることを示唆する。グルコースを欠くかまたは低レベルのグルコースを含む培地において、六炭糖輸送体遺伝子は、Ｓｔｄ１およびＭｔｈ１タンパク質を必要とする機構による抑制に供される。
【０１２４】
本発明の特定の態様にしたがって、ＭＴＨ１遺伝子は、遺伝子発現産物の機能性の欠如を生じる、少なくとも部分的な欠失を含む。
本明細書に記載する方法に特に有用であるのは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子の機能的欠失、ＭＴＨ１遺伝子の機能的欠失、ＨＸＴ１遺伝子の過剰発現、および少なくとも１つの異種ＬＤＨ遺伝子を含む、組換え二倍体酵母株、好ましくはサッカロミセス・セレビシエである。
【０１２５】
本明細書において、用語「一倍体」は、各染色体の１コピー、すなわち対形成しない染色体の単一セットを有する一倍体酵母細胞を指す。
本明細書において、用語「二倍体」は、各染色体の２つの相同コピーを有する二倍体酵母細胞を指す。二倍体状態において、一倍体数は二倍となり、したがってこの状態はまた、２ｎとしても知られる。
【０１２６】
「相同染色体」または「各染色体の相同コピー」は、染色体が、互いに正しく整列して、染色体対を形成することを可能にする、各染色体に沿ったポイントを提供する、同じ遺伝子座中の同じ遺伝子を有することを意味する。しかし、染色体（および遺伝子）は必ずしも同一でなくてもよい。同じ遺伝子が、２つの異なるアレルにコードされることも可能である。アレルは、所定の遺伝子の変異体型である。
【０１２７】
多数性は、染色体の２つの対の相同セットよりも多くを含有する細胞を指し、すなわちこれは染色体の全セットにおける数値上の変化を指す。多数性は、細胞が基本セットより多い、通常３またはそれより多い、染色体の複数セットを有する状態である。
【０１２８】
異数性は、細胞における染色体の異常な数の存在であり、例えば正常セットの１またはそれより多い染色体が失われているかまたは通常のコピー数より多い数で存在している状態である。正倍数性とは異なり、異数体核型は一倍体数の倍数ではない。異数性はまた、１またはそれより多い染色体の重要な部分が、失われているかまたは通常のコピー数より多いコピー数で存在する状態を記載する。
【０１２９】
本明細書記載の二倍体酵母細胞は、非常に低いｐＨで、すなわち２．５よりも低いｐＨであってさえ、８０ｇ／１００ｇグルコースまたはそれより多い量の遊離乳酸を産生可能である。
【０１３０】
本発明は、以下の項目を含む：
１．  炭素供給源として糖、特にグルコースまたはスクロースを用いて、組換え酵母細胞培養において乳酸を産生するための方法であって
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための、シード発酵由来のバイオマスを用いた産生発酵工程、ここで酵母を＜５のｐＨの培地中で培養する
を含む、
ここで前記酵母が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性および／または減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する
前記方法。
【０１３１】
２．  酵母細胞が二倍体、多数体または異数体細胞であり、特に前記酵母細胞がストレス条件下で選択され、そして遺伝子修飾されている、項目２記載の方法。
３．  シード発酵が高グルコース濃度である、項目１または２記載の方法。
【０１３２】
４．  産生発酵が低グルコース濃度である、項目１〜３記載の方法。
５．  乳酸が一般的な産業プロセスによって精製される、項目１〜４のいずれか一項記載の方法。
【０１３３】
６．  乳酸が、少なくとも９０％の純度で、発酵段階から精製される、項目１〜５のいずれか一項記載の方法。
７．  産生発酵工程が、≦４．５、特に≦４、特に≦３．５のｐＨである、項目１〜６のいずれか一項記載の方法。
【０１３４】
８．  産生発酵工程が３またはそれ未満の最終ｐＨを有し、特に≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満の最終ｐＨを有する、項目１〜７のいずれか一項記載の方法。
【０１３５】
９．  シード発酵工程が、流加条件下で実行される、項目１〜８のいずれか一項記載の方法。
１０．  産生発酵工程がバッチプロセス条件下で実行される、項目１〜９のいずれか一項記載の方法。
【０１３６】
１１．  シード発酵工程および産生発酵工程が別個の発酵槽中である、項目１〜１０のいずれか一項記載の方法。
１２．  乳酸が遊離型で産生され、特に、乳酸が光学的に純粋な異性体型で産生され、特に乳酸がＤ（−）またはＬ（＋）−乳酸のいずれかである、項目１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【０１３７】
１３．  酵母が、遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６の１またはそれより多くの減少したまたはノックアウトされた発現を有する、項目１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【０１３８】
１４．  ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６遺伝子のプロモーターの１またはそれより多くが、置換されているかまたは欠失している、項目１３のいずれか一項記載の方法。
【０１３９】
１５．  遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６が、特に異種プロモーター、具体的にはグルコース抑制可能プロモーターの調節によって、より具体的にはＨＸＴ２またはＨＸＴ４遺伝子プロモーターの調節によって、条件的に発現される、項目１４記載の方法。
【０１４０】
１６．  遺伝子ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６の少なくとも１つが欠失している、項目１３〜１５のいずれか一項記載の方法。
１７．  酵母が、グルコース制御遺伝子発現を調節するグルコースセンサーと相互作用するタンパク質をコードする１またはそれより多い遺伝子の減少したまたはノックアウトされた発現、特にＳｔｄ１またはＭｔｈ１タンパク質のこうした発現を有する、項目１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【０１４１】
１８．  ＭＴＨ１遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している、項目１〜１７のいずれか一項記載の方法。
１９．  酵母が少なくとも１つの六炭糖輸送体遺伝子を過剰発現するように修飾されている、項目１〜１８のいずれか一項の方法。
【０１４２】
２０．  酵母が、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ３、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ６、ＨＸＴ７、ＨＸＴ８、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１０、ＨＸＴ１１、ＨＸＴ１２、ＨＸＴ１３、ＨＸＴ１４、ＨＸＴ１５、ＨＸＴ１６、ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３およびＲＧＴ２の群より選択される、六炭糖輸送体遺伝子の少なくとも１つを過剰発現するように修飾されている、項目１〜１９のいずれか一項の方法。
【０１４３】
２１．  産生工程におけるグルコースの初期濃度が少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、特に２０％（ｗ／ｗ）またはそれより多い、より具体的には２５％またはそれより多い、項目１〜２０のいずれか一項記載の方法。
【０１４４】
２２．  １またはそれより多い異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を含み、そして減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）を有する、組換え酵母。
２３．  ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子の１またはそれより多くの減少したまたはノックアウトされた発現を有する、項目２２記載の組換え酵母。
【０１４５】
２４．  ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６遺伝子のプロモーターの１またはそれより多くが置換されているかまたは欠失している、項目２３記載の組換え酵母。
２５．  ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子が、特に異種プロモーター、具体的にはグルコース抑制可能プロモーターの調節によって、より具体的にはＨＸＴ２またはＨＸＴ４遺伝子プロモーターの調節によって、条件的に発現される、項目２３または２４記載の組換え酵母。
【０１４６】
２６．  ＰＤＣ１、ＰＤＣ５および／またはＰＤＣ６をコードする遺伝子の少なくとも１つが欠失している、項目２３〜２５記載の組換え酵母。
２７．  グルコース制御遺伝子発現を調節するグルコースセンサーと相互作用するタンパク質をコードする１またはそれより多い遺伝子の減少したまたはノックアウトされた発現、特にＳｔｄ１またはＭｔｈ１タンパク質のこうした発現を有する、項目２３〜２６のいずれか一項記載の組換え酵母。
【０１４７】
２８．  ＭＴＨ１遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している、項目２３〜２７のいずれか一項記載の組換え酵母。
２９．  少なくとも１つの六炭糖輸送体遺伝子を過剰発現するように修飾されている、項目２３〜２８のいずれか一項記載の組換え酵母。
【０１４８】
３０．  ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ３、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ６、ＨＸＴ７、ＨＸＴ８、ＨＸＴ９、ＨＸＴ１０、ＨＸＴ１１、ＨＸＴ１２、ＨＸＴ１３、ＨＸＴ１４、ＨＸＴ１５、ＨＸＴ１６、ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３およびＲＧＴ２の群より選択される、六炭糖輸送体遺伝子の少なくとも１つを過剰発現するように修飾されている、項目２３〜２９のいずれか一項記載の組換え酵母。
【０１４９】
３１．  ｉ）ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子の機能的欠失、
ｉｉ）ＭＴＨ１遺伝子の機能的欠失、
ｉｉｉ）ＨＸＴ１遺伝子の過剰発現、および
ｉｖ）異種ＬＤＨ遺伝子発現
を含む、組換え酵母株、特に二倍体、多数体または異数体酵母細胞。
【０１５０】
３２．  サッカロミセス・セレビシエ種のものである、項目２３〜３１のいずれか一項の組換え酵母株。
３３．  組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用い、乳酸を産生するための２工程発酵系であって、
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母細胞を５〜７のｐＨの培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで酵母細胞を、３．５またはそれ未満の最終ｐＨまで、特に、≦３．４、≦３．３、≦３．２、≦３．１、≦３．０、≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満のｐＨに到達するまで細胞培地中で培養する、
からなる、
ここで該酵母が、異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードし、そして減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する
前記系。
【０１５１】
３４．  組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用い、乳酸を産生するための２工程発酵系であって、
ａ）第一の発酵槽におけるバイオマスを産生するためのシード発酵工程、ここで酵母細胞を５〜７のｐＨの細胞培地中で培養する、その後、
ｂ）シード発酵から接種した第二の発酵槽における乳酸を産生するための産生発酵工程、ここで酵母細胞を３．５未満のｐＨで、特に≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満のｐＨで、細胞培地中で培養する、
からなる、
ここで該酵母が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性および／または減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するように修飾されている
前記系。
【０１５２】
３５．  組換え酵母株を用いて、炭素供給源としてグルコースを用い、乳酸を産生するための、２またはそれより多い発酵槽システムの組み合わせであって、
ａ）バイオマスを産生するためのシード発酵槽、ここで酵母細胞を５〜７のｐＨの細胞培地中で培養する、その後、
ｂ）乳酸を産生するための、シード発酵から接種した産生発酵槽、ここで酵母細胞を３．５未満のｐＨで、特に≦３．４、≦３．３、≦３．２、≦３．１、≦３．０、≦２．９、≦２．８、≦２．７、≦２．６、≦２．５、≦２．４、≦２．３、≦２．２、≦２．１５またはそれ未満のｐＨで、細胞培地中で培養する、
からなる、
ここで該酵母が、異種乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子をコードし、そして減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有する
前記組み合わせ。
【実施例】
【０１５３】
本明細書記載の実施例は本発明の例示であり、そして本発明に対する限定であることは意図されない。本発明の異なる態様は、本発明にしたがって記載されてきている。本明細書に記載されそして例示される技術に対して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの修飾および変形が作製可能である。したがって、実施例は例示のみであり、そして本発明の範囲に対して限定しないことが理解されなければならない。
【０１５４】
別に示さない限り、実施例において用いる酵母細胞は、二倍体酵母細胞である。
実施例１：異なるグルコースおよび乳酸濃度ならびにｐＨでの発酵性能に関するＳ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２）株の特徴付け
Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２株を、２工程で、バイオリアクターおよび振盪フラスコ中で培養した。１．８ｇ／ｌのＹＮＢ、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および２０ｇ／ｌのグルコースを含有する培地を含む接種物発展工程を用いた。−８０℃で保存したグリセロールバイアル由来の細胞を用いて、０．０５の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）で、接種前培地５０ｍｌに接種した。２４時間増殖させた後、細胞を採取し、そして振盪フラスコおよびバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＤＡＳＧＩＰ  ＤＡＳｂｏｘ  ４、ドイツ）中、それぞれ５０ｍｌおよび７００ｍｌの作業体積で、培養工程における接種物として用いた。培養工程における培地組成および発酵パラメーターを表１および表２に列挙する。すべての培養を３０℃で行い；振盪フラスコを、１８０ｒｐｍに設定した軌道振盪装置中でインキュベーションし；フタル酸水素カリウム緩衝剤を１００ｍＭの濃度まで添加することによって、振盪フラスコ中のｐＨを３．０に維持し；２Ｍ  ＮａＯＨの自動添加によって、バイオリアクター培養中のｐＨを維持した。バイオリアクター培養は、通気および撹拌装置速度を調節することによって、２０％およびそれより高い溶解酸素濃度を維持するようにプログラミングされていた。振盪フラスコおよびバイオリアクター培養から定期的な間隔で試料を抜き取って、６００ｎｍでの光学密度を追跡することによって増殖を測定し、そしてＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍｌ／分で溶出液として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を用いて、グルコース、エタノール、グリセロールおよび乳酸を含む代謝産物に関して、上清を測定した。結果は、培地中の高濃度のグルコースで、そして乳酸の存在下で、ＹＮＢおよび硫酸アンモニウム濃度を増加させることによって、そして初期接種物サイズを増加させることによって、エタノール産生に関する発酵率および収量が有意に改善可能であることを明らかに示す（表１および表２）。
【０１５５】
表１  Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２のバイオリアクター培養
【０１５６】
【表１】
2019513408.tif 000004
【０１５７】
表２  Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２の振盪フラスコ培養
【０１５８】
【表２】
2019513408.tif 000005
【０１５９】
実施例２：スプリット・メーカー（ｓｐｌｉｔ−ｍａｋｅｒ）欠失法を用いた、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６）遺伝子を欠くＳ．セレビシエ株の構築
ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６の両アレルのノックアウトは、選択マーカーとしてカナマイシンおよびハイグロマイシンを用いた、スプリット・メーカー欠失法によって促進された。欠失および検証プライマーのためのプライマー配列を表３に列挙する。アレルの一方の欠失のため、２つの構築物を設計した。各構築物は、ターゲット遺伝子の隣接部の後にＬｏｘＰ部位および選択可能マーカーの１つのほぼ半分を含有した。隣接領域およびＬｏｘＰ部位は、プライマーに含まれ、プライマーは、それぞれ、ｐＰＭ２ａＫ２１およびｐＰＭ２ａ＿ｈｐｈＲ由来のカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択可能マーカーの部分を増幅するために用いられた。ターゲット遺伝子の隣接領域、ＬｏｘＰ部位および選択可能マーカーの１つの一部を含有する２つのＰＣＲ構築物を、ＣＢＳ７９６２株に形質転換した。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、形質転換を行った。形質転換体を選択ＹＰエタノール−グリセロール培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのエタノールおよび１０ｇ／ｌのグリセロール）上にプレーティングし、そして３０℃で３〜４日間インキュベーションした。次いで、ターゲット遺伝子に関する検証プライマーを用いて、単一コロニーをコロニーＰＣＲに供した。以下のようにコロニーＰＣＲを行った：ピペットチップを用いて、酵母コロニーに優しく触れ、そして１．２Ｍのソルビトール、１００ｍＭのリン酸水素ナトリウムおよび１５００Ｕ／ｍｌのリチカーゼ酵素を含有するＰＣＲチューブに移し、そして３７℃で１５分間インキュベーションし；ターゲット遺伝子の検証プライマーおよびテンプレートとしての溶解細胞懸濁物を用いて、ＰＣＲを行った。ｐｄｃ遺伝子の１つのアレルを失ったと検証された酵母コロニーを形質転換に用い、ターゲット遺伝子の隣接領域、ＬｏｘＰ部位および他の選択可能マーカーの一部を含有する２つのＰＣＲ構築物を用いて、ターゲット遺伝子の他方のアレルをノックアウトした。Ｇ４１８およびハイグロマイシンを含有するＹＰエタノール−グリセロール培地プレート上に現れる形質転換体を、ターゲット遺伝子の両アレルの欠失に関して、コロニーＰＣＲを用いて検証した。３つのｐｄｃ遺伝子のうち１つが欠失された、生じた株を、ＣＲＥプラスミドで形質転換し、両方の選択可能マーカーを除去した。その後、ＣＲＥプラスミドを発現している株を非選択ＹＰエタノール−グリセロールプレート上で増殖させて、ＣＲＥプラスミドを含まないコロニーを得た。次いで、ｐｄｃ遺伝子の１つが欠失された酵母株を用いて、上記と同じ方法を用いて、他のｐｄｃ遺伝子をノックアウトした。
【０１６０】
表３  ＰＣＤ欠失および検証プライマーのプライマー配列
【０１６１】
【表３】
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【０１６２】
実施例３：不活性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６）遺伝子を含むＳ．セレビシエ株の構築：ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いたｐｄｃ遺伝子のノックアウト
ターゲット部位に二本鎖ＤＮＡ切断（ｄｓｂ）を誘導し、そして停止コドンを含有する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ相同オリゴを用いてｄｓｂを修復するＲＮＡガイド・エンドヌクレアーゼ活性であるＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いて、ｐｄｃ遺伝子を不活性化する。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、形質転換を行う。エンドヌクレアーゼ酵素ｃａｓ９は、ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＴＥＦ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーター下、セントロメア・プラスミド中で構築される（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）。ＣｈｏｐＣｈｏｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｒｃ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を用いて、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同定する。ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの配列および肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの配列を、それぞれ５’および３’端に含有する、２０ｂｐ  ｇＲＮＡを構築する（表４）。重複プライマーを用いたＰＣＲを用いて、リボザイム−ｇＲＮＡ−リボザイム（ＲＧＲ）構築物を得る（表４）。１ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、２ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、３ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖおよび４ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｆｗを含む４つの共通の重複プライマー、およびｐｄｃ遺伝子のｇＲＮＡに特異的な２つの順方向プライマーを用いて、ＲＧＲを構築するためのＰＣＲを行う（表４）。ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＲＧＲ構築物を、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを含む２μプラスミド中で組み立てる。ｄｓｂの修復を補助するために用いるｄｓＤＮＡオリゴはＰＣＲ構築され、停止コドンを含有し、両端に約９０ｂｐの相同領域が隣接する。ｐｄｃのノックアウトは、一度に１遺伝子ずつ、２工程で行われる。第一の工程において、ｃａｓ９を発現する酵母株は、ｃａｓ９を含有するセントロメア・プラスミドをＣＢＳ７９６２株に形質転換することによって得られる。ｃａｓ９発現株をＰＤＣ１  ＲＧＲプラスミドおよびそのそれぞれのｄｓＤＮＡオリゴで形質転換する。形質転換体を選択ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトンおよび２０ｇ／ｌのグルコース）上にプレーティングし、そして３０℃で３〜４日間インキュベーションする。ＰＣＲを用いて、ＰＤＣ１ノックアウトに関して単一コロニーを検証する。この目的に向け、適切なプライマーを用いた増幅によって、ＰＤＣ遺伝子の存在を検証する。セントロメアｃａｓ９プラスミドを含有するＰＤＣ１ノックアウト株を用いて、上記と同じ方法を用い、２つの他のＰＤＣ遺伝子をノックアウトする。最後のＰＤＣノックアウト形質転換体を選択ＹＰエタノール−グリセロール培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのエタノールおよび１０ｇ／ｌのグルコース）上にプレーティングして、これらのノックアウト株の増殖を可能にする。
【０１６３】
表４  ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９を用いたＰＤＣ不活性化のためのｇＲＮＡ配列、プライマー配列およびｇＲＮＡ構築物配列
【０１６４】
【表４−１】
2019513408.tif 000007
【０１６５】
【表４−２】
2019513408.tif 000008
【０１６６】
実施例４：ウラシル、トリプトファンおよびヒスチジンに関するＳ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２）株栄養要求体の構築：ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いたＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子の不活性化
ターゲット部位に二本鎖ＤＮＡ切断（ｄｓｂ）を誘導し、そして停止コドンを含有する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ相同オリゴを用いてｄｓｂを修復するＲＮＡガイド・エンドヌクレアーゼ活性であるＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いて、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子を不活性化した。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、形質転換を行った。エンドヌクレアーゼ酵素ｃａｓ９は、ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＴＥＦ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーター下、セントロメア・プラスミド中で構築された（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）。ＣｈｏｐＣｈｏｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｒｃ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を用いて、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同定した。ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの配列および肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの配列を、それぞれ５’および３’端に含有する、２０ｂｐ  ｇＲＮＡを構築した（表５）。重複プライマーを用いたＰＣＲを用いて、リボザイム−ｇＲＮＡ−リボザイム（ＲＧＲ）構築物を得た。１ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、２ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、３ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖおよび４ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｆｗを含む４つの共通の重複プライマー、ならびにＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子のｇＲＮＡに特異的な２つの順方向プライマーを用いて、ＲＧＲを構築するためのＰＣＲを行う（表５）。ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＲＧＲ構築物を、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを含む２μプラスミド中で組み立てた。ｄｓｂの修復を補助するために用いるｄｓＤＮＡオリゴはＰＣＲ構築され、２つの停止コドンを含有し、両端に約４０〜５０ｂｐの相同領域が隣接した（表５）。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子のノックアウトは、一度に１遺伝子ずつ、２工程で行われる。第一の工程において、ｃａｓ９を発現する酵母株は、ｃａｓ９を含有するセントロメア・プラスミドをＣＢＳ７９６２株に形質転換することによって得られた。ｃａｓ９発現株をＵＲＡ３  ＲＧＲプラスミドおよびそのそれぞれのｄｓＤＮＡオリゴで形質転換した。形質転換体を選択ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトンおよび２０ｇ／ｌのグルコース）上にプレーティングし、そして３０℃で３〜４日間インキュベーションした。次いで、単一コロニーをＹＮＢ−ウラシル−ＦＯＡ培地（１．８ｇ／ｌのＹＮＢ、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｇ／ｌのグルコース、１ｇ／ｌの５’ＦＯＡおよび５００μｇ／ｍｌのウラシル）およびＹＮＢドロップアウト培地（１．８ｇ／ｌのＹＮＢ、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および２０ｇ／ｌのグルコース）上に複製プレーティングした。上記と同じ方法を用い、ｃａｓ９発現プラスミドを含むＵＲＡ３ノックアウト株を段階的にＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子のノックアウトに供した。
【０１６７】
表５  ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９を用いたｕｒａ３、ｔｒｐ１、およびｈｉｓ３不活性化のためのｇＲＮＡ、プライマー、ｄｓＤＮＡオリゴおよびＲＧＲの配列
【０１６８】
【表５−１】
2019513408.tif 000009
【０１６９】
【表５−２】
2019513408.tif 000010
【０１７０】
ＥＮＧＬＥＲ，  Ｃ．，  ＫＡＮＤＺＩＡ，  Ｒ．  ＆  ＭＡＲＩＬＬＯＮＮＥＴ，  Ｓ．  ２００８．  Ａ  Ｏｎｅ  Ｐｏｔ，  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ，  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，  ３
実施例５：ラクトバチルス・プランタルム由来の異種ＬＤＨ活性を発現する、Ｓ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２およびΔΔΔｐｄｃ）株の構築
ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６の両アレルを欠くＳ．セレビシエ株を、ＬＤＨ遺伝子を含有する２μプラスミドで形質転換した。対照として、Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２の野生型株もまた、ＬＤＨ遺伝子を含有する２μプラスミドで形質転換した。２μの領域は、大きなおよび小さなユニーク領域によって分離された２つの５９９ｂｐ反転リピートを含有し；２μは、各細胞周期で、プラスミドの複数コピーを産生する回転サークル複製を可能にする。前記プラスミドは、ゴールデンゲートアセンブリー法によって構築された（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）。ＬＤＨ遺伝子は、テンプレートとしてラクトバチルス・プランタルムＡＴＣＣ８０１４のゲノム（Ｂｒａｎｄｕａｒｄｉら、２００６）、およびバックボーン１ベクターの適切な融合部位を含有するプライマーを用いて、あらかじめＰＣＲ増幅された。ＬＤＨおよびバックボーン１リンカーのＰＣＲ構築物をＢｂｓＩ切断して、ＬＤＨコード配列を含有するバックボーン１プラスミドを得た。同様に、テンプレートとしてＳ．セレビシエ・ゲノムを用いて増幅された、それぞれの要素のＰＣＲ構築物を用いて、それぞれ、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを含有するバックボーン１プラスミドを構築した。ＬＤＨ、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターのバックボーン１プラスミドを、バックボーン２リンカーとともに、ＢｐｉＩ切断して、ＬＤＨ発現カセットを含むバックボーン２プラスミドを得た。生じたプラスミドを、２μおよびＳ．セレビシエのＯＲＩを含有するバックボーン３リンカーとともに、ＢｂｓＩ切断して、酵母発現プラスミドを得て、該プラスミドを次いで、上述の酵母株の形質転換に用いた。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、両株の形質転換を行った。ΔΔΔｐｄｃ株の形質転換体を、選択ＹＰエタノール−グリセロール培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／ｌのエタノールおよび１０ｇ／ｌのグリセロール）上にプレーティングした。一方、ＣＢＳ７９６２株の形質転換体を、選択ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトンおよび２０ｇ／ｌのグルコース）上にプレーティングした。３０℃で３〜４日間インキュベーションした後、両方の形質転換体から単一コロニーを得た。
【０１７１】
ＢＲＡＮＤＵＡＲＤＩ，  Ｐ．，  ＳＡＵＥＲ，  Ｍ．，  ＤＥ  ＧＩＯＩＡ，  Ｌ．，  ＺＡＭＰＥＬＬＡ，  Ｇ．，  ＶＡＬＬＩ，  Ｍ．，  ＭＡＴＴＡＮＯＶＩＣＨ，  Ｄ．  ＆  ＰＯＲＲＯ，  Ｄ．  ２００６．  Ｌａｃｔａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄ  ｆｒｏｍ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｙｅａｓｔｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，  ｔｈｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｅｘｐｏｒｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，  ５．
ＥＮＧＬＥＲ，  Ｃ．，  ＫＡＮＤＺＩＡ，  Ｒ．  ＆  ＭＡＲＩＬＬＯＮＮＥＴ，  Ｓ．  ２００８．  Ａ  Ｏｎｅ  Ｐｏｔ，  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ，  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，  ３．
実施例６：ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いた条件的発現系の調節下のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む、Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２株の構築
ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６は、パン酵母において恒常的に発現される。本実施例は、ｐｄｃ遺伝子の恒常的発現を不能にし、そしてＨＸＴ２遺伝子またはＨＸＴ４遺伝子のいずれかのプロモーターの調節下で、ｐｄｃ遺伝子の条件的な発現を可能にする説明を提供する。遺伝子、ＨＸＴ２およびＨＸＴ４は、低レベルのグルコース（０．１％）で発現し、そして高レベルのグルコースで抑制される（ＯｚｃａｎおよびＪｏｈｏｎｓｔｏｎ、１９９５）。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いて、ｐｄｃ遺伝子プロモーターを、ＨＸＴ２またはＨＸＴ４遺伝子のプロモーターによって置換する。ターゲット部位に二本鎖ＤＮＡ切断（ｄｓｂ）を誘導し、そしてＨＸＴ２またはＨＸＴ４のプロモーター配列を含有する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ相同オリゴを用いてｄｓｂを修復する、ＲＮＡガイド・エンドヌクレアーゼ活性であるＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いて、ｐｄｃ遺伝子の条件的発現系を可能にする。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、形質転換を行う。エンドヌクレアーゼ酵素ｃａｓ９は、ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＴＥＦ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーター下、セントロメア・プラスミド中で構築される（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）。ｃｈｏｐｃｈｏｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｒｃ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を用いて、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６のプロモーターをターゲティングするｇＲＮＡを同定する。ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの配列および肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの配列を、それぞれ、５’および３’端に含有する、２０ｂｐ  ｇＲＮＡを構築する。１ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、２ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、３ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖおよび４ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｆｗを含む４つの共通の重複プライマー（表６）、ならびにｐｄｃ遺伝子のプロモーターのｇＲＮＡに特異的な２つの順方向プライマーを用いて、リボザイム−ｇＲＮＡ−リボザイム（ＲＧＲ）を構築するためのＰＣＲを行う。ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＲＧＲ構築物を、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを含む２μプラスミド中で組み立てる。ｄｓＤＮＡオリゴは、ＨＸＴ２またはＨＸＴ４遺伝子のプロモーター配列を含有するように設計され、そしてプロモーター配列の両端に、ｐｄｃ遺伝子の天然プロモーターに隣接する領域に相同である４０ｂｐ配列を含有するように設計される。ｐｄｃ遺伝子の恒常的プロモーターの置換は、一度に１遺伝子ずつ、２工程で行われる。第一の工程において、ｃａｓ９を発現する酵母株は、ｃａｓ９を含有するセントロメア・プラスミドを酵母株に形質転換することによって得られる。次いで、ｃａｓ９発現株をＰＤＣ１プロモーターをターゲティングするｇＲＮＡを含有するＲＧＲおよびＨＸＴ２またはＨＸＴ４プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡオリゴで形質転換する。ＣＢＳ７９２株の形質転換体を選択ＹＰＤＥ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトン、１ｇ／ｌのグルコースお��び１０ｇ／ｌのエタノール）上にプレーティングし、そして３０℃で３〜４日間インキュベーションする。次いで、ターゲット領域に関する検証プライマーを用いて、単一コロニーをコロニーＰＣＲに供する。以下のようにコロニーＰＣＲを行う：ピペットチップを用いて、酵母コロニーに優しく触れ、そして１．２Ｍのソルビトール、１００ｍＭのリン酸水素ナトリウムおよび１５００Ｕ／ｍｌのリチカーゼ酵素を含有するＰＣＲチューブに移し、そして３７℃で１５分間インキュベーションし；ターゲット領域に関する検証プライマーおよびテンプレートとしての溶解細胞懸濁物を用いて、ＰＣＲを行う。次いで、ＰＤＣ１プロモーターの代わりにＨＸＴ２またはＨＸＴ４プロモーターを含有すると検証された酵母コロニーを非選択培地上にプレーティングして、ＰＤＣ１プロモーターのｇＲＮＡを含有するプラスミドを除く。次いで、なおｃａｓ９発現プラスミドを含有するこの酵母株を用いて、上記と同じ方法で、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６のプロモーターを一度に１つずつ置換する。
【０１７２】
表６
【０１７３】
【表６】
2019513408.tif 000011
【０１７４】
ＥＮＧＬＥＲ，  Ｃ．，  ＫＡＮＤＺＩＡ，  Ｒ．  ＆  ＭＡＲＩＬＬＯＮＮＥＴ，  Ｓ．  ２００８．  Ａ  Ｏｎｅ  Ｐｏｔ，  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ，  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，  ３．
ＯＺＣＡＮ，  Ｓ．  ＆  ＪＯＨＮＳＴＯＮ，  Ｍ．  １９９５．  Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｙｅａｓｔ  ｈｅｘｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  （ＨＸＴ）  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １５，  １５６４−７２．
実施例７：ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いた、ＭＴＨ１遺伝子において２２５ｂｐ内部領域を欠失させるためのＳ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２およびΔΔΔｐｄｃ）株の構築
ターゲット部位に二本鎖ＤＮＡ切断（ｄｓｂ）を誘導し、そして二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ相同オリゴを用いてｄｓｂを修復するＲＮＡガイド・エンドヌクレアーゼ活性であるＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９系を用いて、ＭＴＨ１遺伝子において、２２５ｂｐ（１６９〜３９３ｂｐ）の領域（表８）を欠失させる。２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて、２つのｄｓｂを誘導し、そして内部欠失配列の５００ｂｐ隣接領域のｄｓＤＮＡオリゴを用いてｄｓｂを修復する。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、形質転換を行う。エンドヌクレアーゼ酵素ｃａｓ９は、ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、ＴＥＦ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーター下、セントロメア・プラスミド中で構築される（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）。ｃｈｏｐｃｈｏｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｒｃ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を用いて、欠失すべきＭＴＨ１の領域内にある２つのｇＲＮＡ（ＭＴＨ１＿ＡおよびＭＴＨ１＿Ｂ）（表８）を同定する。同様に、この領域の外の２つのｇＲＮＡ（ＭＴＨ１＿ＣおよびＭＴＨ１＿Ｄ）を同定する。ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムの配列および肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの配列を、それぞれ５’および３’端に含有する、２０ｂｐ  ｇＲＮＡを構築する（表８）。重複プライマーを用いたＰＣＲを用いて、リボザイム−ｇＲＮＡ−リボザイム（ＲＧＲ）構築物を得る（表８）。１ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、２ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖ、３ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｒｅｖおよび４ｇＲＮＡ＿ａｌｌ＿ｆｗを含む４つの共通の重複プライマー、ならびにＭＴＨ１＿ＡおよびＭＴＨ１＿Ｂ  ｇＲＮＡに特異的な２つの順方向プライマーを用いて、ＲＧＲを構築するためのＰＣＲを行う（表８）。ゴールデンゲートアセンブリーを用いて、両方のＲＧＲ構築物を、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを含む２μプラスミド中で組み立てる。相同組換えによる２２５ｂｐの欠失を補助するために用いるｄｓＤＮＡオリゴはＰＣＲ構築され、内部欠失領域の両側に５００ｂｐ相同領域（表８）を含有する。重複プライマーセット（表８）とともにＣＢＳ７９６２株のゲノムＤＮＡを用いた融合ＰＣＲにおいて、ｄｓＤＮＡオリゴを増幅する。ＭＴＨ１遺伝子の部分的インフレーム欠失を２工程で行う。第一の工程において、ｃａｓ９を発現する酵母株は、ｃａｓ９を含有するセントロメア・プラスミドを酵母株に形質転換することによって得られる。ｃａｓ９発現株をＭＴＨ１＿ＡおよびＭＴＨ１＿Ｂ（または、それぞれ、ＭＴＨ１＿ＣおよびＭＴＨ１＿Ｄ）プラスミドのＲＧＲおよびそのそれぞれのｄｓＤＮＡオリゴで形質転換する。ＣＢＳ７９２およびΔΔΔｐｄｃ株の形質転換体を選択ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトンおよび２０ｇ／ｌのグルコース）上にプレーティングし、そして３０℃で３〜４日間インキュベーションする。次いで、ターゲット遺伝子に関する検証プライマー（表８）を用いて、単一コロニーをコロニーＰＣＲに供した。以下のようにコロニーＰＣＲを行った：ピペットチップを用いて、酵母コロニーに優しく触れ、そして１．２Ｍのソルビトール、１００ｍＭのリン酸水素ナトリウムおよび１５００Ｕ／ｍｌのリチカーゼ酵素を含有するＰＣＲチューブに移し、そして３７℃で１５分間インキュベーションし；ターゲット遺伝子の検証プライマーおよびテンプレートとしての溶解細胞懸濁物を用いて、ＰＣＲを行った。
【０１７５】
表７  ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９を用いたＭＴＨ１内部インフレーム欠失のためのｇＲＮＡ、プライマー、ｄｓＤＮＡオリゴおよびＲＧＲの配列
【０１７６】
【表７−１】
2019513408.tif 000012
【０１７７】
【表７−２】
2019513408.tif 000013
【０１７８】
【表７−３】
2019513408.tif 000014
【０１７９】
実施例８：内因性ＭＴＨ１遺伝子を過剰発現するＳ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２およびΔΔΔｐｄｃ）株の構築
ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６の両アレルを欠くＳ．セレビシエ株を、ＭＴＨ１遺伝子を含有する２μプラスミドで形質転換した。対照として、Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２の野生型株もまた、ＭＴＨ１遺伝子を含有する２μプラスミドで形質転換した。２μの領域は、大きなおよび小さなユニーク領域によって分離された２つの５９９ｂｐ反転リピートを含有し；２μは、各細胞周期で、プラスミドの複数コピーを産生する回転サークル複製を可能にする。前記プラスミドは、ゴールデンゲートアセンブリー法によって構築された（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）。ＭＴＨ１遺伝子は、テンプレートとしてＣＢＳ７９６２株のゲノム、およびバックボーン１ベクターの適切な融合部位を含有する増幅プライマー（表９）を用いて、あらかじめＰＣＲ増幅された。ＭＴＨ１およびバックボーン１リンカーのＰＣＲ構築物をＢｂｓＩ切断して、ＭＴＨ１コード配列を含有するバックボーン１プラスミドを得た。同様に、テンプレートとしてＣＢＳ７９６２ゲノムを用いて増幅された、それぞれの要素のＰＣＲ構築物を用いて、それぞれ、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを含有するバックボーン１プラスミドを構築した。ＭＴＨ１、ＴＰＩ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターのバックボーン１プラスミドを、バックボーン２リンカーとともに、ＢｐｉＩ切断して、ＭＴＨ１発現カセットを含むバックボーン２プラスミドを得た。生じたプラスミドを、２μおよびＳ．セレビシエのＯＲＩを含有するバックボーン３リンカーとともに、ＢｂｓＩ切断して、酵母発現プラスミドを得て、該プラスミドを次いで、上述の酵母株の形質転換に用いた。ＬｉＡｃ／ＰＥＧ／ｓｓ−ＤＮＡプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｃ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／〜ｇｉｅｔｚ／ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍｌ）にしたがって、両株の形質転換を行った。ＣＢＳ７９６２およびΔΔΔｐｄｃ株の形質転換体を、選択ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトンおよび２０ｇ／ｌのグルコース）上にプレーティングした。３０℃で３〜４日間インキュベーションした後、両方の形質転換体から単一コロニーを得た。
【０１８０】
表８  ＭＴＨ１増幅プライマー
【０１８１】
【表８】
2019513408.tif 000015
【０１８２】
ＥＮＧＬＥＲ，  Ｃ．，  ＫＡＮＤＺＩＡ，  Ｒ．  ＆  ＭＡＲＩＬＬＯＮＮＥＴ，  Ｓ．  ２００８．  Ａ  Ｏｎｅ  Ｐｏｔ，  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ，  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，  ３．
実施例９：Ｓ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２−ＬＤＨおよびΔΔΔｐｄｃ−ＬＤＨ）株を用いた乳酸産生
Ｌ．プランタルム由来の異種ＬＤＨ遺伝子を発現するＳ．セレビシエＣＢＳ７９６２株を２工程で振盪フラスコ中で培養した。２０ｇ／ｌのグルコースを含むＹＰＤを接種前培地として用いる接種物発展工程、および２５０ｇ／ｌのグルコースを含むＹＰＤを発酵培地として用いる産生工程。バッチ培養を、１００ｍｌ振盪フラスコ中、３０℃で行った。−８０℃で保存したグリセロールバイアル由来の細胞を用いて、０．０５の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で接種前培地２０ｍｌに接種した。２４時間増殖させた後、細胞を採取し、そしてこれを用いて０．１のＯＤ６００で、発酵培地５０ｍｌに接種した。
【０１８３】
異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ株を、２つの異なる液体培地中、振盪フラスコ中で培養した。アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない１．８ｇ／ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、１ｇ／ｌの尿素、２０ｇ／ｌのエタノールおよび０．５ｇ／ｌのグルコースを含有する接種前培地、ならびに４．５ｇ／ｌのＣａＣＯ３、アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない１．８ｇ／ｌのＹＮＢ、１ｇ／ｌの尿素、１ｇ／ｌのエタノールおよび４０ｇ／ｌのグルコースを含有する発酵培地、ｐＨ５。バッチ培養を１００ｍｌ振盪フラスコ中、３０℃で行った。−８０℃で保存したグリセロールバイアル由来の細胞を用いて、０．１の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）で、接種前培地５０ｍｌに接種した。３６時間増殖させたのち、細胞を採取し、そしてこれを用いて、４．５のＯＤ６００で発酵培地５０ｍｌに接種した。
【０１８４】
培養を３０℃、１８０ｒｐｍでインキュベーションし、そして頻繁な間隔で試料を収集して、ＯＤ６００測定によって増殖を監視した。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍｌ／分で溶出液として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を用いて、グルコース、エタノール、グリセロールおよび乳酸を含む代謝産物に関して、上清を分析した。
【０１８５】
４０時間インキュベーションした後、ＬＤＨを発現するＣＢＳ７９６２は、２５０ｇ／ｌのグルコースを消費し、そして９．４ｇ／ｌの乳酸を産生し、消費グルコース１ｇあたり、乳酸０．０４ｇの収率であった。驚くべきことに、ＬＤＨを発現するΔΔΔｐｄｃ株を乳酸産生に用いた際、乳酸収量の有意な増加が観察された。ＬＤＨを発現するΔΔΔｐｄｃ株は、９６時間インキュベーション後、４０ｇ／ｌのグルコースを完全には消費しないが、この株は、２１．３ｇ／ｌの乳酸を生じ、消費グルコース１ｇあたり、乳酸０．７１ｇの収率であった。
【０１８６】
実施例１０：調節された条件下での乳酸産生のための２工程プロセス
乳酸の産生プロセスは、２工程プロセスにしたがう：第一の工程は、流加プロセスにおける酵母細胞の高細胞密度までの培養であり、そして第二の工程は、高い初期接種物を用いた乳酸産生のためのバッチプロセスである。先に示すように（実施例１）、３．０の低ｐＨでの振盪フラスコ実験において、発酵率およびエタノール収量は、乳酸および高グルコース濃度を含有する培地中、高い初期接種物で有意に改善された。これは、接種物サイズが、発酵性能を決定する際に重大な役割を果たすことを示唆した。
【０１８７】
第一の工程は、１．８ｇ／ｌのＹＮＢ、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および２０ｇ／ｌのグルコースを含有する培地中のバッチ培養で始まる。溶解酸素濃度は、撹拌装置速度および通気率を調節することによって、２０％に維持される。温度およびｐＨは、それぞれ、３０℃および５．０の最適値で維持される。バッチ培養は、新鮮な培地を反応装置内にフィードする前に、グルコースおよびエタノールが完全に消費されるまで進行する。フィード培地は、高濃度のグルコース、５．４ｇ／ｌのＹＮＢおよび１０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する。バッチ培養中のエタノールが消耗されるまで、株特異的である臨界値で比増殖率を維持するために必要な流速で、反応装置内にフィード培地をフィードし、そしてこれは、あらかじめケモスタット培養を用いて決定可能である。臨界値で比増殖率を維持すると、エタノールおよびアセテートなどの副産物を形成することなく、消費される基質あたりの高いバイオマス収量が確実になる。
【０１８８】
流加培養後に細胞を採取し、そして高細胞密度まで産生反応装置内に接種する。産生培地は、高グルコース濃度を含有し、高い乳酸力価を確実にする。培地には必要な栄養素を補充して、高グルコース濃度で細胞代謝を支持する。ｐＨは、発酵性能を決定する際に重要な要因であり、そしてしたがって、プロセスの全体の経済的分析に基づいて、初めから、培地内への塩塩基の添加またはＣａＣＯ３の添加によって、ｐＨを５．０に維持することが、好ましいオプションである可能性もある。
【０１８９】
実施例１１：乳酸産生のための代替２工程プロセス
２工程プロセスにおいて、乳酸の産生プロセスにしたがう：第一の工程は、流加プロセスにおける高細胞密度までの酵母細胞の培養であり、そして第二の工程は、高初期接種を用いた乳酸産生のためのバッチプロセスである。
【０１９０】
乳酸産生の第一の工程：
第一の培養工程のための培地を以下の表にしたがって調製し、グルコースを２５ｇ／Ｌの濃度まで添加する：
【０１９１】
【表９】
2019513408.tif 000016
【０１９２】
成分をＨ２Ｏ中に溶解し、ビタミン溶液および微量要素を添加し、ｐＨを塩酸で５．０に調節する。培地を滅菌ろ過する。
【０１９３】
【表１０】
2019513408.tif 000017
【０１９４】
ビオチンを０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、そしてＨ２Ｏ中で希釈し、次いでｐＨを１Ｍ塩酸で６．５に調節する。すべての他の構成要素を添加し、そして溶液を滅菌ろ過する。
【０１９５】
【表１１】
2019513408.tif 000018
【０１９６】
ＥＤＴＡおよび硫酸亜鉛をＨ２Ｏ中に溶解し、そしてｐＨを水酸化ナトリウムで６．０に調節する。すべての他の構成要素を添加し、そしてｐＨを塩酸で４．０に調節する。溶液を滅菌ろ過する。
【０１９７】
洗浄した酵母細胞を含むＹＰＤ培地上での一晩前培養から、１の光学密度まで、バッチ培養を撹拌タンクリアクターに接種する。撹拌装置速度および通気率を調節することによって、溶解酸素濃度を２０％に維持する。温度およびｐＨを、それぞれ３０℃および５．０に維持する。グルコースが完全に消費されるまで、バッチ培養が進行する。グルコースが終了したら、フィードを開始する。フィード培地は５００ｇ／Ｌのグルコースを含有し、そして２ｘ培地組成は上述の通りである。フィード率は指数関数的であり、そして酵母株の最大増殖率の８０％に対応する。温度およびｐＨをそれぞれ３０℃および５．０に維持する。１００ｇ／Ｌのバイオマス濃度までフィードを続ける。
【０１９８】
細胞の採取および５０ｇ／Ｌ乾燥細胞重量の濃度までの産生反応装置内への接種によって、プロセスの第二の工程を開始する。産生培地は、１５０ｇ／Ｌグルコースを含有する。撹拌装置速度および通気率を調節することによって、溶解酸素濃度を２０％に維持する。温度を３０℃に維持する。ｐＨは調節されないままであり、そして乳酸産生に際して、３未満に減少する。グルコースが完全に消費されるまで、バッチ培養が進行する。
【０１９９】
プロセスの第二の工程の代替法は、１５０ｇ／Ｌのグルコース濃度および５０ｇ／Ｌのバイオマス濃度を得る、第一の反応装置への培地の添加である。撹拌装置速度および通気率を調節することによって、溶解酸素濃度を２０％に維持する。温度を３０℃に維持する。ｐＨは調節されないままであり、そして乳酸産生に際して、３未満に減少する。グルコースが完全に消費されるまで、バッチ培養が進行する。
【０２００】
実施例１２：異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２）株の適応実験室進化（ＡＬＥ）
Ｌ．プランタルム由来の異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ株（実施例５）を適応実験室進化（ＡＬＥ）に供した。培養が１００世代に到達するまで、一晩培養を新鮮な液体発酵培地内に定期的に継代培養することによって、１０ｍＬ培地を含有する１００ｍＬ振盪フラスコ中でＡＬＥを行った。
【０２０１】
炭素供給源の濃度に応じて、接種前培地および２つの異なる発酵培地を用いた：アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、４．５４ｇ／Ｌの尿素および１０ｇ／Ｌのエタノールを含有する接種前培地を用いた。アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、４．５４ｇ／Ｌの尿素、５ｇ／Ｌのエタノールおよび１００ｇ／Ｌのグルコースまたは１５０ｇ／Ｌのグルコースを含有する発酵培地をそれぞれ用いた。各発酵培地（１００および１５０ｇ／Ｌグルコース）に関して４回の独立の進化実験を行った（総数８回）。
【０２０２】
−８０℃で保存したグリセロールバイアルから非進化細胞を用いて、０．２５の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で接種前培地２５ｍＬに接種した。２４時間増殖させた後、細胞を採取し、洗浄し、そしてＡＬＥに用いて、０．５のＯＤ６００で１０ｍＬの発酵培地に接種した。およそ４０回のトランスファーに対応する１００世代に培養が到達するまで、ＡＬＥ実験を行った。培養を２８℃、１８０ｒｐｍでインキュベーションした。ＯＤ６００測定によって、増殖を毎日監視した。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍｌ／分で移動相として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４、ＲＩＤ検出装置を用いて、グルコース、エタノール、酢酸、グリセロールおよび乳酸を含む代謝産物に関して、上清を定期的に分析した。
【０２０３】
１００世代後、進化した株は、非進化株と比較して、改善された増殖率および生産性を示した（表１）。非進化株の最初の２４時間での比増殖率および乳酸濃度は、それぞれ、０．０５４ｈ−１および２．８２ｇ／Ｌであった。１００世代に相当する４０回のトランスファー後、最初の２４時間（出発グルコース濃度１００ｇ／Ｌ）の比増殖率および乳酸濃度は、それぞれ０．０８ｈ−１および５．８ｇ／Ｌであった。１５０ｇ／Ｌのグルコースを含む発酵培地中、４０回のトランスファー後の培養の改善された比増殖率もまた検出した：μ＝０．１０８ｈ−１、そして乳酸産生は、２．５ｇ／Ｌから４．２ｇ／Ｌに改善した。さらに、進化実験中および２４時間インキュベーション後のエタノール濃度は、非進化株に関する２．９ｇ／Ｌから、およそ１００世代後の進化株に関する２．３ｇ／Ｌに添加した。
【０２０４】
【表１２】
2019513408.tif 000019
【０２０５】
実施例１３：部分的に調節されたｐＨ値を伴うバイオリアクターにおけるΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２）の特徴付け
Ｌ．プランタルム由来の異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２株を、２工程でバイオリアクター中で培養した：１０ｇ／Ｌのエタノール、アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および４．５４ｇ／Ｌの尿素を培地として用いるバイオマス集積のための第一の工程、ならびに１００ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのエタノール、アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および４．５４ｇ／Ｌの尿素を発酵培地として用いる産生工程。第一の工程を振盪フラスコ中で行い、そして産生工程をバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ系）中で行った。２２５ｍＬ培地を含有する２０００ｍｌ三角フラスコ中、振盪フラスコ培養を２８℃で増殖させた。ＡＬＥ実験由来の細胞を５０世代後に採取し、そして２．５の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で、第一工程に接種した。３０時間増殖させた後、細胞を採取し、水で洗浄し、そして１．５Ｌバイオリアクター中、５のＯＤ６００で発酵培地３３０ｍｌに接種した。撹拌装置速度および通気率を調節することによって、溶解酸素濃度を３０％に維持した。温度を２８℃の最適値で維持した。ｐＨ値を５の値に１８時間維持し、そして次いでそれ以上は調節しなかった。
【０２０６】
定期的な間隔で試料を採取し、ＯＤ６００により増殖を監視して、そしてＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍＬ／分で移動相として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４、ＲＩＤ検出を用いて、グルコース、エタノール、グリセロール、酢酸および乳酸を含む代謝産物に関して、上清を分析した。ｐＨ調節を停止した最初の６４時間で、ｐＨ値は５から３に減少し、そして次いで、２．８９の最終値にわずかに低下した。乳酸産生は３０．７ｇ／Ｌであり、これは消費グルコース１ｇあたり０．６６ｇの乳酸収量に対応する。エタノールは、バッチを開始した最初の４０時間で消費された。
【０２０７】
【表１３】
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【０２０８】
実施例１４：ｐＨ調節を伴わないバイオリアクターにおけるΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ（ＣＢＳ７９６２）の特徴付け
Ｌ．プランタルム由来の異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエＣＢＳ７９６２株を、２工程でバイオリアクター中で培養した：１０ｇ／Ｌのエタノール、アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および４．５４ｇ／Ｌの尿素を培地として用いるバイオマス集積のための第一の工程、ならびに１００ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのエタノール、アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および４．５４ｇ／Ｌの尿素を発酵培地として用いる産生工程。第一の工程を振盪フラスコ中で行い、そして産生工程をバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ系）中で行った。２２５ｍＬ培地を含有する２０００ｍｌ三角フラスコ中、振盪フラスコ培養を２８℃で増殖させた。ＡＬＥ実験由来の細胞を７５世代後に採取し、そして２．５の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で、第一工程に接種した。３０時間増殖させた後、細胞を採取し、水で洗浄し、そして１．５Ｌバイオリアクター中、５のＯＤ６００で発酵培地３３０ｍｌに接種した。撹拌装置速度および通気率を調節することによって、溶解酸素濃度を３０％に維持した。温度を２８℃の最適値で維持した。発酵の開始から、ｐＨ値をまったく調節しなかった。
【０２０９】
定期的な間隔で試料を採取し、ＯＤ６００により増殖を監視して、そしてＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍｌ／分で移動相として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４、ＲＩＤ検出を用いて、グルコース、エタノール、グリセロール、酢酸および乳酸を含む代謝産物に関して、上清を分析した。
【０２１０】
培養の最初の１５時間以内に、ｐＨは最初の５から２．４５に迅速に低下し、そして次いで、６４時間後、注目に値する２．１５にわずかに減少した。この期間中、２７．６ｇ／Ｌのグルコースが消費され、そして２４．５ｇ／Ｌの乳酸が産生された（これは消費グルコース１ｇあたり、乳酸０．８９ｇの収量にさらに対応する）。エタノールは、４７時間以内に完全に消費された。
【０２１１】
【表１４】
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【０２１２】
実施例１５：振盪フラスコ中、異種ＬＤＨ遺伝子を発現している進化および非進化ΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ株（ＣＢＳ７９６２）の比較
２つの異なる液体培地中、振盪フラスコにおいて、Ｌ．プランタルム由来の異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ株を培養した。アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、４．５４ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのエタノールを含有する接種前培地、ならびにアミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／ＬのＹＮＢ、４．５４ｇ／Ｌの尿素、５ｇ／Ｌのエタノール、１００ｇ／Ｌのグルコースおよび４．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３を含有する発酵培地を用いた。５０ｍＬ培地を含有する５００ｍｌ振盪フラスコ中、そして６の出発ｐＨ値で、２８℃でバッチ培養を行った。−８０℃で保存したグリセロールバイアル由来の非進化細胞を用いて、１の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で接種前培地２５ｍｌに接種した。３３回のトランスファー後、およびおよそ７５世代後に得たＡＬＥ実験由来の細胞を用いて、２の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で接種前培地２５ｍｌに接種した。４０時間増殖させた後、細胞を採取し、洗浄し、そして３のＯＤ６００で発酵培地５０ｍｌに接種した。
【０２１３】
培養を２８℃、１８０ｒｐｍでインキュベーションし、そして頻繁な間隔（２４時間ごと）で試料を収集して、ＯＤ６００測定によって増殖を監視した。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍｌ／分で移動相として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４、およびＲＩＤ検出を用いて、グルコース、エタノール、酢酸、グリセロールおよび乳酸を含む代謝産物に関して、上清を分析した。
【０２１４】
４８時間インキュベーションした後、ＬＤＨを発現する非進化ΔΔΔｐｄｃ株は、１４．６ｇ／Ｌのグルコースを消費し、一方、進化ΔΔΔｐｄｃ株は３２．８ｇ／Ｌを消費し、進化株はより高いグルコース取り込み率を提供した。９０時間インキュベーションした後、非進化株は２３．３ｇ／Ｌを消費した。進化株は、９０時間後、５９．５ｇ／Ｌのグルコースを消費した。エタノールは、非進化株の培養において、９０時間後になお存在していた（１．２２ｇ／Ｌ）一方、進化株によって完全に消費された（ＨＰＬＣによって検出不能）。非進化株は２９．６ｇ／Ｌの乳酸を産生し、そして３のｐＨ値に到達する一方、進化株は、最終的に２．８６のｐＨで５１ｇ／Ｌの乳酸を集積させた。収率は、ｇ／ｇグルコース基準で８６％である。
【０２１５】
【表１５】
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【０２１６】
実施例１６：異なる濃度のグルコースを含む振盪フラスコ中、異種ＬＤＨ遺伝子を発現している進化ΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエ株（ＣＢＳ７９６２）の特徴付け
Ｌ．プランタルム由来の異種ＬＤＨ遺伝子を発現するΔΔΔｐｄｃ  Ｓ．セレビシエを、振盪フラスコ中で培養した。接種前培地および多様な濃度のグルコースを含む３つの異なる発酵培地を用いた。アミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、４．５４ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのエタノールを含有する接種前培地、ならびにアミノ酸を含まずそして（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない３．４ｇ／ＬのＹＮＢ、４．５４ｇ／Ｌの尿素、５ｇ／Ｌのエタノール、４．５ｇ／ＬのＣａＣＯ３および６０ｇ／Ｌのグルコースまたは７０ｇ／Ｌのグルコースまたは８０ｇ／Ｌのグルコースを含有する発酵培地を用いた。５０ｍＬ培地を含有する５００ｍｌ振盪フラスコ中、そして６の出発ｐＨ値で、２８℃でバッチ培養を行った。３３回のトランスファー後（およそ７５世代）に得た適応実験室進化（ＡＬＥ）由来の細胞を用いて、２の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）で接種前培地２５ｍｌに接種した。４０時間増殖させた後、細胞を採取し、洗浄し、そして３のＯＤ６００で発酵培地５０ｍｌに接種した。
【０２１７】
培養を２８℃、１８０ｒｐｍでインキュベーションし、そして頻繁な間隔（２４時間ごと）で試料を収集して、ＯＤ６００測定によって増殖を監視した。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に設置されたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを６０℃で、そして流速０．６ｍｌ／分で移動相として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４、およびＲＩＤ検出を用いて、グルコース、エタノール、酢酸、グリセロールおよび乳酸を含む代謝産物に関して、上清を分析した。
【０２１８】
すべての発酵培地中のグルコース濃度は、インキュベーション中に減少した。インキュベーション９６時間後、ＬＤＨを発現し、そして８０ｇ／Ｌのグルコース上で増殖している進化ΔΔΔｐｄｃ株は、５５．３ｇ／Ｌのグルコースを４９．４ｇ／Ｌの乳酸に変換した。この変換は、消費グルコース１ｇあたり、乳酸０．８９ｇの収量に対応する。６０ｇ／Ｌのグルコースを含む発酵培地中で７２時間インキュベーションした後、グルコースが消耗したため、乳酸産生は最大に到達し、そしてその後、不変のままであった。一方、すべての３つの発酵培地中およびインキュベーション４８時間後、エタノール濃度は検出不能であった。培養中の増殖特性（ＯＤ６００値）およびｐＨプロファイルは、異なる発酵培地中で培養したすべての培養に関して類似であった。
【０２１９】
【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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