(57)【要約】  がん転移を抑制するための薬剤の製造におけるアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の使用であって、薬剤が、治療有効量のアミノ酸第一鉄キレート組成物及び医薬的に許容し得る担体を含む組成物を治療有効量含むものを開示する。アミノ酸第一鉄キレート含有組成物で調製された薬剤は、がん転移を抑制する効果を有する。
2019536789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん転移を抑制するための薬剤の製造におけるアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の使用であって、前記薬剤が、治療有効量のアミノ酸第一鉄キレート組成物及び医薬的に許容し得る担体を含むものである、使用。
【請求項２】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物におけるアミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸の重量比が、１：１〜１：４である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物におけるアミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸の重量比が、１：１．５〜１：２．５である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の前記治療有効量が、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の前記治療有効量が、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物が、無機鉄とアミノ酸とを混合し、６０℃〜９０℃で８時間〜４８時間加熱することにより調製されて、前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物が得られ、無機鉄対アミノ酸の重量比が１：１．２〜１：１．５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記無機鉄が、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、又はピロリン酸第一鉄であり、前記アミノ酸がグリシンである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物が更に還元剤を含み、前記還元剤が、アスコルビン酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、リンゴ酸、スルホン酸、コハク酸、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が、経腸剤形又は非経腸剤形である、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記経腸剤形が経口投与剤形であり、前記経口投与剤形が、溶液、エマルション、懸濁液、粉末剤、錠剤、丸薬、薬用キャンディ、トローチ剤、チューインガム、又はカプセル剤である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記がんが、メラノーマ、肝臓がん、結腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、白血病、脳腫瘍、低悪性度星状細胞腫、高悪性度星状細胞腫、下垂体腺腫、髄膜腫、ＣＮＳリンパ腫、乏突起膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経膠腫、頭頸部腫瘍、咽頭がん、口腔咽頭がん、鼻咽頭がん、唾液腺腫瘍、下咽頭がん、甲状腺がん、口腔腫瘍、胸壁腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胸腺腫、縦隔腫瘍、男性乳がん、腹−骨盤腫瘍、肝腺がん、肝細胞腫、胆のうがん、胆管がん、すい臓がん、小腸腫瘍、大腸腫瘍、肛門がん，膀胱がん、腎細胞がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、子宮肉腫、又は皮膚がんである、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記がんが、乳腺がん又は肺がんである、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤が、がん細胞遊走を抑制するか、がん細胞侵入を抑制するか、又はマトリックスメタロプロテアーゼ若しくは組織メタロプロテアーゼ阻害因子の発現を抑制するために使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬剤が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ−３、又は組織メタロプロテアーゼ阻害因子−２の発現を抑制するために使用される、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の使用、及び特にがん転移抑制のための薬剤の製造における使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性転移としても知られているがん転移は、がんが難治性であることの主たる理由である。がん転移とは、がん細胞が体内で原発部位から別の臓器や組織へ広がることを意味する。このため、がんの治療はより困難になっており、通常、がんは根絶できないものであって、治療といっても、放射線療法及び化学療法によりがん細胞の増殖を抑制することにより患者の延命を行うことしかできないことが示されている。
【０００３】
がん転移は非常に複雑な過程である。現在の研究は、別の臓器や組織へのがん細胞転移に関する主たる理由が、がん細胞の侵入能力にあることを立証している。がん細胞は異常に活発で、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を大量に分泌している。ＭＭＰは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を消化することができるため、がん細胞は、周囲組織に侵入し、他の臓器へ広がることができる。とりわけ、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３は、がん転移と密接に関連していることが判明した。研究によると、炎症性サイトカインは、ＭＭＰ発現を誘導する。更に、ＭＭＰは、組織メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）により抑制される。しかしながら、組織メタロプロテアーゼ阻害因子−２（ＴＩＭＰ−２）は、ＭＭＰに対する抑制効果を呈するが、ＴＩＭＰ−２の発現はがん転移と正の相関関係にあることを示す参考文献がある。がん転移ががん患者の主たる死亡原因であるにしても、対がん研究は、依然としてがん腫の原位置での成長に対処することに重点を置いている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記理由により、がん転移抑制の要望に応えるため、本発明の目標は、がん転移抑制を目的とする薬剤の製造のためのアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の使用を実現することであり、前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物は、がん細胞遊走、がん細胞侵入、がん細胞におけるＭＭＰ関連タンパク質発現、又はがん細胞におけるＴＩＭＰ関連タンパク質発現を抑制する効果を有するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明は、がん転移を抑制するための薬剤の製造におけるアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の使用を実現する技術的手段を採用する。前記薬剤は、治療有効量のアミノ酸第一鉄キレート含有組成物及び医薬的に許容し得る担体を含む。
【０００６】
本発明において、用語「アミノ酸第一鉄キレート含有組成物」は、無機鉄とアミノ酸とを混合することにより製造されたアミノ酸第一鉄キレート（ｆｅｒｒｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｌａｔｅ）を含有する組成物を指す。
【０００７】
好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物におけるアミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸の重量比は、１：１〜１：４である。
【０００８】
好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物におけるアミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸の重量比は、１：１．５〜１：２．５である。
【０００９】
好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の治療有効量は、ｍｇ／ｋｇ／日〜ｍｇ／ｋｇ／日である。
好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の治療有効量は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００１０】
好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の治療有効量は、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００１１】
本発明によると、血液量は６５ｋｇのヒトの約１／１３を占めることから、治療有効量の計算は、本明細書の実施形態で使用されるアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの濃度及び相対血液量に基づいている。具体的には、０．２ｍｇ／ｋｇ／日の治療有効量は、１μｇ／ｍＬのアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の濃度に１３／６５を乗じることより算出される。同様に、２００ｍｇ／ｋｇ／日の治療有効量は、１０００μｇ／ｍＬのアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の濃度に１３／６５を乗じることにより算出される。即ち、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日のアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の治療有効量は、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの濃度から算出される。
【００１２】
更に好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物は、無機鉄とアミノ酸とを混合し、６０℃〜９０℃で８時間〜４８時間加熱することにより調製され、無機鉄対アミノ酸の重量比は１：１．２〜１：１．５であるものとする。
【００１３】
更に好ましくは、無機鉄は、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、ピロリン酸第一鉄、又はそれらの任意の組み合わせである。
【００１４】
更に好ましくは、前記アミノ酸はグリシンである。
【００１５】
更に好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物は、９５重量％〜１００重量％の割合でグリシン酸第一鉄キレートを含有する。更に好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物は、９８重量％〜９９．９重量％の割合でグリシン酸第一鉄キレートを含有する。
【００１６】
更に好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物は更に還元剤を含む。還元剤には、限定される訳ではないが、アスコルビン酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、リンゴ酸、スルホン酸、コハク酸、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００１７】
本発明において、用語「がん転移を抑制する（こと）」は、原発部位から別の臓器又は組織へのがん細胞転移を有効に制御することを指す。とりわけ、がん転移を抑制することには、限定される訳ではないが、がん細胞遊走、がん細胞侵入、がん細胞におけるＭＭＰ関連タンパク質発現、又はがん細胞におけるＴＩＭＰ関連タンパク質発現を抑制することが含まれる。
【００１８】
本発明によると、用語「治療有効量」は、所定の期間にわたってがん転移を軽減又は抑制するための投与量を指す。本発明によると、治療有効量は、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の投与が、肺がん若しくは乳腺がん（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）の転移を低減させ、がん細胞遊走を抑制し、がん細胞侵入を抑制し、がん細胞におけるＭＭＰ関連タンパク質の発現を抑制し、又はがん細胞におけるＴＩＭＰ関連タンパク質の発現を抑え込む場合の特定の量を指す。本発明によると、治療有効量はまた、がん細胞遊走を低減させるか又はがん細胞侵入を低減させる量をいう。
【００１９】
本発明において、「医薬的に許容し得る担体」には、溶媒、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定剤、キレート剤、希釈剤、ゲル形成剤、保存料、滑沢剤、界面活性剤、及び他の類似した担体又は本発明にとって好適である担体が含まれる。
【００２０】
本発明によると、「薬剤」は、限定される訳ではないが、液状溶液、エマルジョン、懸濁液、粉末剤、錠剤、丸薬、薬用キャンディ、トローチ剤、チューインガム、カプセル剤、リポソーム、座薬、及び他の類似した投与剤形又は本発明にとって好適である投与剤形等、液体、半固体、及び固体投与剤形を含む様々な形態で調製され得る。
【００２１】
好ましくは、薬剤は、経腸剤形又は非経腸剤形である。
【００２２】
更に好ましくは、前記経腸剤形は、限定される訳ではないが、溶液、エマルジョン、懸濁液、粉末剤、錠剤、丸薬、薬用キャンディ、トローチ剤、チューインガム、又はカプセル剤を含む、経口投与剤形である。
【００２３】
更に好ましくは、前記がんには、限定される訳ではないが、メラノーマ、肝臓がん、結腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、白血病、脳腫瘍、低悪性度星状細胞腫、高悪性度星状細胞腫、下垂体腺腫、髄膜腫、ＣＮＳリンパ腫、乏突起膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経膠腫、頭頸部腫瘍、咽頭がん、口腔咽頭がん、鼻咽頭がん、唾液腺腫瘍、下咽頭がん、甲状腺がん、口腔腫瘍、胸壁腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胸腺腫、縦隔腫瘍、男性乳がん、腹−骨盤腫瘍、肝腺がん、肝細胞腫、胆のうがん、胆管がん、すい臓がん、小腸腫瘍、大腸腫瘍、肛門がん，膀胱がん、腎細胞がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、子宮肉腫、及び皮膚がんが含まれる。
【００２４】
更に好ましくは、前記がんは、乳腺がん又は肺がんである。
【００２５】
更に好ましくは、前記薬剤は、がん細胞遊走を抑制するか、がん細胞侵入を抑制するか、又はマトリックスメタロプロテアーゼ若しくは組織メタロプロテアーゼ阻害因子の発現を抑制するために使用される。
【００２６】
更に好ましくは、前記薬剤は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ−３、又は組織メタロプロテアーゼ阻害因子−２の発現を抑え込むために使用される。
【００２７】
本発明のアミノ酸第一鉄キレート含有組成物は、がん転移を抑制する効果を有する。更に、本発明は、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物が、強力にがん細胞遊走及びがん細胞侵入を抑制し、がん細胞におけるＭＭＰ関連タンパク質又はＴＩＭＰ関連タンパク質の発現を抑制することができることを立証している。
【００２８】
以下、図面については、実例及び説明に過ぎず、本発明の範囲を限定する意図はないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】０μｇ／ｍＬ（対照群）、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び２５μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した乳腺がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の遊走を示す（４０倍の倍率）。
【図１Ｂ】図１Ａの画像を定量化（対照群を基線とする）した後の乳腺がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の遊走の棒グラフを示す。
【図２Ａ】０μｇ／ｍＬ（対照群）、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した非小細胞肺がん細胞（Ａ５４９）の遊走を示す（４０倍の倍率）。
【図２Ｂ】図２Ａの画像を定量化（対照群を基線とする）した後の非小細胞肺がん細胞（Ａ５４９）の遊走の棒グラフを示す。
【図３Ａ】０μｇ／ｍＬ（対照群）、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した乳腺がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の侵入を示す（４０倍の倍率）。
【図３Ｂ】図３Ａの画像を定量化（対照群を基線とする）した後の乳腺がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の侵入の棒グラフを示す。
【図４Ａ】０μｇ／ｍＬ（対照群）、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した非小細胞肺がん細胞（Ａ５４９）の侵入を示す（４０倍の倍率）。
【図４Ｂ】図４Ａの画像を定量化（対照群を基線とする）した後の非小細胞肺がん細胞（Ａ５４９）の侵入の棒グラフを示す。
【図５Ａ】０μｇ／ｍＬ（対照群）及び１００μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した乳腺がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のＭＭＰ関連タンパク質の分泌を示す。対照群のＭＭＰ関連タンパク質及びＴＩＭＰ関連タンパク質の発現は左パネルに示されており、処理した乳腺がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のＭＭＰ関連タンパク質及びＴＩＭＰ関連タンパク質の発現は右パネルに示されている。
【図５Ｂ】図５Ａにおいて抗体によりＭＭＰ関連タンパク質及びＴＩＭＰ関連タンパク質を検出するためのアレイのマップを示す。Ｐｏｓ（Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｈ３、及びＨ４の位置）は正の対照を意味し、Ｎｅｇ（Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｇ３、及びＧ４の位置）は負の対照を意味する。Ｐｏｓの位置にある黒丸及びＮｅｇの位置にある空白は、ＭＭＰ抗体アレイにおけるＭＭＰ関連タンパク質及びＴＩＭＰ関連タンパク質の発現を計算するための基準として用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本目的を達成するために本発明において採用した技術的特徴について、図面と合わせながら下記の好ましい実施形態を通じてさらに説明する。
【００３１】
調製例１：アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の調製
アミノ酸第一鉄キレート含有組成物を、以下の要領で調製した。硫酸第一鉄及びグリシン（９８％を超える純度）を、１：１．３の重量比で混合し、６０℃〜９０℃で８時間〜４８時間加熱することにより、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物を得、ここで、アミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸のキレート比は１：１〜１：４であるものとし、得られたアミノ酸第一鉄キレート含有組成物の濃度を、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、及び１０００μｇ／ｍｌに調節した。前記組成物をＡ１と命名した。
【００３２】
調製例２：乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養
３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び１％グルタミン（２００ｍＭ）を含むＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）−１６４０培地中で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞を培養した。約７０％〜８０％の集密度に到達したとき、細胞を継代する。
【００３３】
調製例３：組成物Ａ１による乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の処理
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞を、６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、前記細胞を、０μｇ／ｍＬ（対照群として）、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬの濃度の調製例１で得た組成物Ａ１で処理し、次いで３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータにて２４時間培養した。
【００３４】
調製例４：非小細胞肺がん細胞Ａ５４９の培養
３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び１％グルタミン（２００ｍＭ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、Ａ５４９非小細胞肺がん細胞を培養した。約７０％〜８０％の集密度に到達したとき、細胞を継代する。
【００３５】
調製例５：組成物Ａ１による非小細胞肺がん細胞Ａ５４９の処理
Ａ５４９非小細胞肺がん細胞を、６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、前記細胞を、０μｇ／ｍＬ（対照群として）、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬの濃度の調製例１で得た組成物Ａ１で処理し、次いで３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータにて２４時間培養した。
【実施例】
【００３６】
実施例１：がん細胞遊走に対する組成物Ａ１の効果
本実施形態の細胞遊走アッセイでは２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）；３５３０４７）を使用した。そのコンパニオンプレートは、より多くの栄養分を含有する培地を含み、カルチャーインサート中の細胞がカルチャーインサートの底部にあるポリカーボネート製メンブレンを通過するのを誘導することになる。従って、ポリカーボネート製メンブレンを通過することによってコンパニオンプレートに到達する細胞量により細胞株の遊走能を評価することができる。細胞遊走アッセイ方法について以下の通り説明する。
【００３７】
（１）調製例３で得られたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞及び調製例４で得られたＡ５４９非小細胞肺がん細胞を、両方とも２４時間組成物Ａ１で処理した。各ウェル中の細胞を別々に集め、ＰＢＳで２回洗浄した後、２時間細胞を飢餓させるため、血清不含有、調製例で示された投与量の組成物Ａ１含有又は不含有のＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬに懸濁した。
【００３８】
（２）３００μＬの細胞懸濁液（１×１０５のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞、１．５×１０５のＡ５４９非小細胞肺がん細胞）を、遊走アッセイ２４−ウェルプレートのカルチャーインサートに別々に加え、次いでこれらを、１０％ＦＢＳを含有する培地６００μＬを含むコンパニオンプレートに入れた。
【００３９】
（３）遊走アッセイ２４−ウェルプレートを、細胞を遊走させるため３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータ中で８時間〜１６時間（乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１については８時間及び非小細胞肺がん細胞Ａ５４９については１６時間）インキュベーションした。
【００４０】
（４）カルチャーインサートを取り出した後、アピカルプレート中の培地を除去した。細胞を固定するため、カルチャーインサートをメタノールに８分間浸漬した。次いで、メタノールからカルチャーインサートを取り出し、プレートを風乾した。
【００４１】
（５）カルチャーインサート中の細胞を、１時間１０倍希釈ギムザ液で染色し、カルチャーインサートのメンブレンの上部表面の細胞を、綿棒により完全に拭い取った。
【００４２】
（６）カルチャーインサートのポリカーボネート製メンブレンを通過してポリカーボネート製メンブレンの下部表面に付着した細胞を定量化した。
【００４３】
結果を図１Ａ〜図２Ｂに示した。まず、全実験群（それぞれ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び２５μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した）において遊走しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞の量は、基線である、対照群において遊走しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞の量と比べて著しく減少していることが、図１Ａ及び図１Ｂから見てとれる。更に、組成物Ａ１の濃度が増加すると、遊走しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞の量は減少した。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬの組成物Ａ１でそれぞれ処理した、遊走しているＡ５４９非小細胞肺がん細胞の量は、基線と比べて著しく減少していることが見てとれる。結果は、乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合と一致している。更に、遊走している細胞の量は、組成物Ａ１の濃度と逆比の関係にある。即ち、組成物Ａ１は、がん細胞遊走を抑制する効果を有する。
【００４４】
実施例２：がん細胞侵入に対する組成物Ａ１の効果
本実施形態の細胞侵入アッセイは、実施例１の細胞遊走アッセイと同様であり、異なるのは本実施例で使用した装置であった。本侵入アッセイでは、２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）；３５４４８０）を使用し、カルチャーインサートの底部にあるポリカーボネート製メンブレンをマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）マトリックスの追加層で被覆した。前記マトリゲルマトリックスは、マウス肉腫から抽出された基底膜調製物であり、生物における細胞外マトリックスを模倣することができるため、細胞はそれを容易には通過することができない。細胞は、ヒドロラーゼを分泌することによってマトリゲルマトリックスで被覆されたポリカーボネート製メンブレンを通過することしかできない。従って、コンパニオンプレートにおいて、マトリゲルマトリックスで被覆されたポリカーボネート製メンブレンを通過する細胞の量は、細胞株の侵入能力を示す。細胞侵入アッセイの方法について以下の通り説明する。
【００４５】
（１）調製例３で得られたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞を、２４時間組成物Ａ１で処理した。各ウェル中の細胞を別々に集め、ＰＢＳで２回洗浄した後、２時間細胞を飢餓させるため、血清不含有、調製例で示された投与量の組成物Ａ１含有又は不含有のＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬに懸濁した。
【００４６】
（２）５００μＬの血清不含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を、細胞侵入アッセイ２４ウェルプレートのアピカルプレートに添加した。次いで、前記２４ウェルプレートを、２時間インキュベータ中でインキュベーションし、カルチャーインサートの底部にあるマトリゲルマトリックスを湿らせた。
【００４７】
（３）３００μＬの細胞懸濁液（６×１０４のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞、３×１０５のＡ５４９非小細胞肺がん細胞）を、侵入アッセイ２４−ウェルプレートのカルチャーインサートに別々に加え、次いでこれらを、１０％ＦＢＳを含有する培地６００μＬを含む基礎プレートに入れた。
【００４８】
（４）侵入アッセイ２４−ウェルプレートを、細胞を侵入させるため３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータ中で２０時間〜２４時間（乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１については２０時間及び非小細胞肺がん細胞Ａ５４９については２４時間）インキュベーションした。
【００４９】
（５）アピカルプレートを取り出した後、アピカルプレート中の培地を除去した。細胞を固定するため、アピカルプレートをメタノールに８分間浸漬した。次いで、メタノールからカルチャーインサートを取り出し、プレートを風乾した。
【００５０】
（６）アピカルプレート中の細胞を、１時間１０倍希釈のギムザ液で染色した。カルチャーインサートのメンブレンの上部表面及びマトリゲルマトリックス上の細胞を綿棒により全部拭い取った。
【００５１】
（７）カルチャーインサートのマトリゲルマトリックス被覆ポリカーボネート製メンブレンを通過し、ポリカーボネート製メンブレンの下部表面に付着した細胞を定量化した。
結果を図３Ａ〜図４Ｂに示した。まず、図３Ａ及び図３Ｂを参照されたい。全実験群（それぞれ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び２５μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した）において侵入しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞の量は、基線である、対照群において侵入しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞の量と比べて著しく減少していた。更に、組成物Ａ１の濃度が増加すると、侵入しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞の量は減少した。
【００５２】
図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬの組成物Ａ１でそれぞれ処理した、侵入しているＡ５４９非小細胞肺がん細胞の量は、基線と比べて著しく減少していた。結果は、乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合と一致している。更に、侵入している細胞の量は、組成物Ａ１処理濃度と逆比の関係にある。従って、実施例２の結果は、組成物Ａ１ががん細胞侵入を抑制する効果を有することを示している。
【００５３】
実施例３：ＭＭＰ関連タンパク質およびＴＩＭＰ関連タンパク質の分泌に対する組成物Ａ１の効果
調製例２で得られたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺がん細胞を、６ウェルプレートにおいて３×１０５／ウェルの密度で播種した。翌日、細胞を、１００μｇ／ｍＬの濃度での調製例１で得られた組成物Ａ１により処理した。組成物Ａ１の処理を受けなかったがん細胞を、対照群として用いた。次いで、細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２下のインキュベータ中で２４時間培養した。２４時間の処理後、各ウェル中の培地を別々に集め、１×フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＰ）をそこに添加し、細胞を除去するため５分間の遠心分離にかけた。次いで、培地を試験サンプルとして採取した。ＭＭＰ抗体アレイ（ａｂｃａｍ社から購入、製品番号ａｂ１３４００４）を用いてアッセイを実施した。実験方法は、アッセイキットにより提供されたプロトコルに従うもので、以下のように説明される。
【００５４】
（１）アレイを、８ウェルプレートに別々に入れ、続いて２ｍＬのブロッキングバッファーを加え、次いで室温で３０分間緩やかに回転させながらインキュベーションした。
【００５５】
（２）ブロッキングバッファーを除去し、次いで１ｍＬの試験サンプル（各群の培養培地）を加え、緩やかに回転させながら２時間インキュベーションした。
【００５６】
（３）インキュベーション後、培養培地をプレートから取り出した。
【００５７】
（４）２ｍＬの洗浄バッファー１を加え、緩やかに回転させながら室温で５分間アレイを洗浄し、次いで洗浄バッファー１を除いた。このステップを２回繰り返した。
【００５８】
（５）２ｍＬの洗浄バッファー２を加え、緩やかに回転させながら室温で５分間アレイを洗浄し、次いで洗浄バッファー２を除いた。このステップを１回繰り返した。
【００５９】
（６）１ｍＬの一次抗体溶液、ビオチン−コンジュゲート抗サイトカインを加え、緩やかに回転させながら室温で２時間インキュベーションした。
【００６０】
（７）一次抗体溶液を除いた。ここで工程（４）及び工程（５）を繰り返すことにより、アレイを洗浄した。
【００６１】
（８）２ｍＬの二次抗体溶液、ＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジンを加え、緩やかに回転させながら室温で２時間インキュベーションした。
【００６２】
（９）二次抗体溶液を除いた。ここで工程（４）及び工程（５）を繰り返すことにより、アレイを洗浄した。
【００６３】
（１０）各アレイを８ウェルプレートから取り出した。アレイに残っている液体を除去した。５００μＬの検出バッファーをアレイに加えた。２分間待ち、Ｘ線フィルムでシグナルを検出した。
【００６４】
結果を図５Ａ及び図５Ｂに示した。ＭＭＰ関連タンパク質及びＴＩＭＰ関連タンパク質を検出するアレイの画像を、図５Ａに示し、アレイのマップを図５Ｂに示した。１００μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では（図５Ａの右パネルの実験群で示されている）、Ｅ１及びＥ２の位置でのＭＭＰ−１発現が、図５Ａの左パネルにおけるＥ１及びＥ２の位置で示された対照群のＭＭＰ−１発現より著しく低かった。乳腺がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＭＭＰ−３の発現（Ｇ１及びＧ２の位置で示されている）及びＴＩＭＰ−２の発現（Ｅ３及びＥ４の位置で示されている）（図５Ａの右パネル）もまた、対照群と比較して僅かに低減されていた。これらの結果は、本出願の組成物Ａ１ががん細胞においてＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＴＩＭＰ−２の発現を抑え込めることを示しており、また、組成物Ａ１が、ＭＭＰ関連タンパク質又はＴＩＭＰ関連タンパク質の発現を抑制することにより、がん細胞の侵入能力を低減させる可能性があることを示唆している。
【００６５】
上記実施形態は、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明は、いかなる局面においても本発明を制限する意図は無いものとする。好ましい実施形態を上記で開示しているが、これらの実施形態は、いかなる局面においても本発明を制限する意図はないものとする。当業者であれば、本発明の技術的解決策の範囲から逸脱することなく、均等内容の変形又は修正、均等内容の実施形態として内容に何らかの小さな修正を加えながら上記開示を利用することができるはずである。本発明の精神及び原理の範囲内で為された修正、均等内容の置き換え、改良等も全て本発明の範囲内に含まれるものとする。
【図１Ａ】
2019536789.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月24日(2019.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の組成物アミノ酸第一鉄キレート組成物及び医薬的に許容し得る担体を含む組成物を治療有効量含む、がん転移を抑制するための医薬。
【請求項２】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物におけるアミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸の重量比が、１：１〜１：４である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物におけるアミノ酸第一鉄キレートの第一鉄対アミノ酸の重量比が、１：１．５〜１：２．５である、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の前記治療有効量が、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の前記治療有効量が、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物が、無機鉄とアミノ酸とを混合し、６０℃〜９０℃で８時間〜４８時間加熱することにより調製されて、無機鉄対アミノ酸の重量比が１：１．２〜１：１．５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
前記無機鉄が、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、又はピロリン酸第一鉄であり、前記アミノ酸がグリシンである、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物が更に還元剤を含み、前記還元剤が、アスコルビン酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、リンゴ酸、スルホン酸、コハク酸、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
前記医薬が、経腸剤形又は非経腸剤形である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
前記経腸剤形が経口投与剤形であり、前記経口投与剤形が、溶液、エマルション、懸濁液、粉末剤、錠剤、丸薬、薬用キャンディ、トローチ剤、チューインガム、又はカプセル剤である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記がんが、メラノーマ、肝臓がん、結腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、白血病、脳腫瘍、低悪性度星状細胞腫、高悪性度星状細胞腫、下垂体腺腫、髄膜腫、ＣＮＳリンパ腫、乏突起膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経膠腫、頭頸部腫瘍、咽頭がん、口腔咽頭がん、鼻咽頭がん、唾液腺腫瘍、下咽頭がん、甲状腺がん、口腔腫瘍、胸壁腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胸腺腫、縦隔腫瘍、男性乳がん、乳腺がん、腹−骨盤腫瘍、肝腺がん、肝細胞腫、胆のうがん、胆管がん、すい臓がん、小腸腫瘍、大腸腫瘍、肛門がん，膀胱がん、腎細胞がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、子宮肉腫、又は皮膚がんである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１２】
前記がんが、乳腺がん又は肺がんである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記医薬が、がん細胞遊走を抑制するか、がん細胞侵入を抑制するか、又はマトリックスメタロプロテアーゼ若しくは組織メタロプロテアーゼ阻害因子の発現を抑制するために使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１４】
前記医薬が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ−３、又は組織メタロプロテアーゼ阻害因子−２の発現を抑制するために使用される、請求項１３に記載の医薬。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の使用、及び特にアミノ酸第一鉄キレート含有組成物を含む、がん転移抑制のための医薬に関するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
上記理由により、がん転移抑制の要望に応えるため、本発明の目標は、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物を含む、がん転移抑制を目的とする医薬を実現することであり、前記アミノ酸第一鉄キレート含有組成物は、がん細胞遊走、がん細胞侵入、がん細胞におけるＭＭＰ関連タンパク質発現、又はがん細胞におけるＴＩＭＰ関連タンパク質発現を抑制する効果を有するものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明は、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物を含む、がん転移を抑制するための医薬を実現する技術的手段を採用する。前記医薬は、治療有効量のアミノ酸第一鉄キレート含有組成物及び医薬的に許容し得る担体を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
好ましくは、アミノ酸第一鉄キレート含有組成物の治療有効量は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明において、「医薬的に許容し得る担体」には、溶媒、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、ゲル形成剤、保存料、滑沢剤、界面活性剤、及び他の類似した担体又は本発明にとって好適である担体が含まれる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明によると、「医薬」は、限定される訳ではないが、液状溶液、エマルジョン、懸濁液、粉末剤、錠剤、丸薬、薬用キャンディ、トローチ剤、チューインガム、カプセル剤、リポソーム、座薬、及び他の類似した投与剤形又は本発明にとって好適である投与剤形等、液体、半固体、及び固体投与剤形を含む様々な形態で調製され得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
好ましくは、医薬は、経腸剤形又は非経腸剤形である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
更に好ましくは、前記医薬は、がん細胞遊走を抑制するか、がん細胞侵入を抑制するか、又はマトリックスメタロプロテアーゼ若しくは組織メタロプロテアーゼ阻害因子の発現を抑制するために使用される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
更に好ましくは、前記医薬は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ−３、又は組織メタロプロテアーゼ阻害因子−２の発現を抑え込むために使用される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
（１）調製例３で得られたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞及び調製例５で得られたＡ５４９非小細胞肺がん細胞を、両方とも２４時間組成物Ａ１で処理した。各ウェル中の細胞を別々に集め、ＰＢＳで２回洗浄した後、２時間細胞を飢餓させるため、血清不含有、調製例で示された投与量の組成物Ａ１含有又は不含有のＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬに懸濁した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
（１）調製例３で得られたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞及び調製例５で得られたＡ５４９非小細胞肺がん細胞を、２４時間組成物Ａ１で処理した。各ウェル中の細胞を別々に集め、ＰＢＳで２回洗浄した後、２時間細胞を飢餓させるため、血清不含有、調製例で示された投与量の組成物Ａ１含有又は不含有のＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬに懸濁した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
（７）カルチャーインサートのマトリゲルマトリックス被覆ポリカーボネート製メンブレンを通過し、ポリカーボネート製メンブレンの下部表面に付着した細胞を定量化した。
結果を図３Ａ〜図４Ｂに示した。まず、図３Ａ及び図３Ｂを参照されたい。全実験群（それぞれ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬの組成物Ａ１で処理した）において侵入しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞の量は、基線である、対照群において侵入しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞の量と比べて著しく減少していた。更に、組成物Ａ１の濃度が増加すると、侵入しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞の量は減少した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
（６）１ｍＬの抗体溶液、ビオチン−コンジュゲート抗サイトカインを加え、緩やかに回転させながら室温で２時間インキュベーションした。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
（７）抗体溶液を除いた。ここで工程（４）及び工程（５）を繰り返すことにより、アレイを洗浄した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（８）２ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジン溶液を加え、緩やかに回転させながら室温で２時間インキュベーションした。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（９）ＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジン溶液を除いた。ここで工程（４）及び工程（５）を繰り返すことにより、アレイを洗浄した。
【国際調査報告】
2019536789.tif 000013
2019536789.tif 000014
2019536789.tif 000015
2019536789.tif 000016