(57)【要約】  本発明は、水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための方法、ならびに少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染量を決定するための少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の使用、および水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための上記方法の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性調製物中の微生物汚染を検出するまたは決定するための方法であって、
ａ）少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物を準備するステップ、
ｂ）少なくとも１種の溶菌剤を準備するステップ、
ｃ）微生物汚染物を含まないＡＴＰが前記水性調製物に溶解されるように前記水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な濃度でかつ時間の間ステップａ）の前記水性調製物をステップｂ）の前記少なくとも１種の溶菌剤と接触させるステップ、および
ｄ）ステップｃ）の前記水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定するステップであって、ＡＴＰ含有量が＞０であるとき前記微生物汚染の存在が検出されるまたは前記微生物汚染の量が決定される、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の粒状物質が、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも６５％のＲｙの白色度を有する白色鉱物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）の前記少なくとも１種の粒状物質が、天然粉砕炭酸カルシウム、天然および／または合成の沈降炭酸カルシウム、ドロマイト、表面改質炭酸カルシウム、ハイドロマグネサイト、ハイドロキシアパタイト、カオリン、タルク、バライト、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、二酸化チタンおよびそれらの混合物を含む群から選択され、ならびに好ましくは前記少なくとも１種の粒状物質が、天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）の前記水性調製物が、
（ｉ）２〜１２、好ましくは６〜１２かつより好ましくは７〜１０．５のｐＨ値、および／または
（ｉｉ）前記水性調製物の総重量に基づいて、最高８５．０重量％、好ましくは１０．０〜８２．０重量％、かつより好ましくは２０．０〜８０．０重量％の固形分
を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の前記水性調製物が、製紙配合物、紙用コーティング配合物、繊維配合物、食品配合物、医薬製剤、美容配合物、プラスチック配合物および／または塗料配合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種の粒状物質が、方法ステップａ）〜ｄ）の間に前記水性調製物の水相から分離されずおよび／またはステップａ）の前記水性調製物が、方法ステップａ）〜ｄ）の間に１００倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されずかつ最も好ましくは希釈されない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＴＰが、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、酵母菌、藻類またはそれらの混合物を含む微生物汚染物に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前記少なくとも１種の溶菌剤が、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸（ＰＣＡ）、クエン酸、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、クロルヘキシジン（ＣＨＥＸ）、超音波処理、他の非イオン界面活性剤、陰イオンおよび陽イオン界面活性剤、リソスタフィンまたはリゾチームなどの細菌特異的溶菌酵素、プロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素、抗生物質、アルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシド、ベタン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、プロタミン、アミンおよび陽イオンポリマー、抗菌性ポリマー、細孔形成ポリマー、膜活性ポリマー、および／または細胞壁活性ポリマー、バクテリオファージ、トリトンＸなどの界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）の前記少なくとも１種の溶菌剤が、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンの存在によって、好ましくは二価陽イオンの存在によってかつ最も好ましくはステップａ）で準備される前記水性調製物の少なくとも１種の粒状物質の存在によって阻害されることなく十分な溶菌をもたらす、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）の前記少なくとも１種の溶菌剤が、少なくとも１種のキレート剤、好ましくはＥＤＴＡの十分な量とともに準備される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＴＰの量が、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いることによって決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｃ）およびｄ）が、同時に、または所定の順序で別々に行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｃ）およびｄ）が、少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いることによって同時に行われる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
発光シグナルをモニターすることによってステップｄ）で前記微生物汚染の存在が検出されるまたは前記微生物汚染の量が決定される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ルミノメータを用いることによってステップｄ）で前記微生物汚染の存在が検出されるまたは前記微生物汚染の量が決定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物汚染の量が、
（ｉ）ステップｃ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定すること、
（ｉｉ）前記水性調製物中に存在する前記ＡＴＰ含量が本質的に完全に加水分解されおよび／または前記水性調製物中に存在する前記微生物汚染が本質的に完全に死滅させられるようにステップａ）の水性調製物を処理すること、および方法ステップａ）〜ｄ）を通して前記水性調製物を処理すること、ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定される前記ＡＴＰ含有量からステップ（ｉｉ）の後で決定される前記ＡＴＰ含有量を差し引くこと
によってステップｄ）で決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染を検出するためまたは微生物汚染の量を決定するための少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の使用。
【請求項１８】
少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染を検出するためまたは微生物汚染の量を決定するための請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１９】
前記検出下限（ＬｏＤ）または定量限界が、≦１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは≦１×１０３ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは≦１×１０２ｃｆｕ／ｍＬである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性調製物中の微生物汚染の検出または微生物汚染の量を決定するための方法、ならびに少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染の検出または微生物汚染の量を決定するための少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の使用、および水性調製物中の微生物汚染の検出または微生物汚染の量を決定するための上記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
実際には、水性調製物および特に、鉱物、充填剤または顔料などの水不溶性固体の懸濁液、分散液またはスラリーは、製紙、塗料、ゴムおよびプラスチックの業界において製紙ならびに水性ラッカーおよび水性塗料用のコ−ティング、充填剤、増量剤および顔料として広範囲に使用されている。例えば、炭酸カルシウム、タルクまたはカオリンの懸濁液またはスラリーは、コート紙の調製において充填剤および／または成分として製紙業で大量に使用されている。一般的な水不溶性固体の水性調製物は、調製物の総重量に基づいて０．１〜９９．０重量％の水不溶性固形分を有する懸濁液、スラリーまたは分散液の形態で、水、水不溶性固体化合物および任意選択で分散剤などのさらなる添加剤を含むことを特徴とする。一般的な水性調製物は、４５．０〜７８．０重量％の固形分を有する白色鉱物分散液（ＷＭＤ）である。そのような調製物中で例えば分散剤および／または研削助剤として使用されてよい水溶性ポリマーおよびコポリマーは、例えば米国特許第５，２７８，２４８号に記載される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述した水性調製物は、真菌、酵母菌、原虫および／または好気性菌および嫌気性菌などの微生物による混入をしばしば受けて、調製物の特性の変化、例えば、粘度および／またはｐＨの変化、変色またはその他の品質パラメータの低下を生じ、これは、水性調製物の商業的価値に悪影響を与える。したがって、そのような水性調製物は通常、調製物の微生物の状態を決定するためのプレートカウントまたはディップスライドなどの従来法によって検査される。
【０００４】
しかし、そのような検査は、微生物汚染と、調製物が殺生物剤で処理されるべきかどうかの疑問とに関する結果を得るために一般的に最大で４８時間かかる。
【０００５】
当技術分野では、微生物汚染の検出または微生物汚染の量の決定を速めるための手法が提案されている。例えば、米国特許出願公開第２０１１／００７６７０６Ａ１号は、試料中の細菌の量を決定する、または試料中の細菌の種類を決定する、試料中の細菌の存在を検出するための分析方法および関連するキットを記載する。特に、試料中の細菌の存在を検出する、または細菌の量を決定するための方法が提供され、方法は（ａ）試料中に存在するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）活性の第１の量を決定すること、（ｂ）ステップ（ａ）の試料中の細菌を十分に溶解する濃度でおよび時間の間、溶解剤と上記試料を接触させること、および（ｃ）ステップ（ｂ）と同時に、またはそれに続いて、試料中に存在するＡＴＰ活性の第２の量を決定し、それによって試料中の細菌の存在を決定することを含み、記載される。試料は好ましくは、血液、血漿、尿、血小板、気管支洗浄液、唾液、創傷液、涙、脳脊髄液、羊水、および胸膜液からなる群から選択される生体試料である。国際公開第２０００／０４６３９２Ａ１号は、鉱物および／または顔料および／または充填剤および／または繊維状物質を含有する懸濁剤、乳濁液または分散液の微生物汚染を量的におよび／または質的に決定するための方法に関し、方法は、鉱物および／または顔料および／または充填剤および／または繊維状物質を分離するために、微生物によって分解される得る１種または複数種の有機物質が懸濁液、乳濁液または分散液の試料に添加され、試料が混合され、任意選択でインキュベートされ、次いで遠心分離されることを特徴とする。上澄みの水相中の微生物の数および／または大きさおよび／または種類は、１または複数のインキュベーション後に決定される。
【０００６】
しかし、そのような検査は、粒状物質を含まない溶液用に開発されており、したがって、利用可能な検査方法は、粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染物を検出する、または決定するには不十分である。
【０００７】
したがって、粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染物の検出または決定のための方法、およびその結果が迅速に得られる適切な方法の必要性が依然として存在する。
【０００８】
したがって、本発明の一目的は、粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染物の検出または決定のための方法を提供することである。したがって、特に、本発明の一目的は、粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染物を検出するまたは決定するための、迅速に、好ましくは数分以内に、例えば３０分以内に行なうことができる方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、粒状物質を含む水性調製物を１００倍を超えて、より好ましくは１０倍を超えて希釈することなく、またはさらにまったく希釈することなく、水性調製物中の微生物汚染物を検出する、または決定するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明に記述され、特許請求の範囲に定められる方法および使用によって解決され得る。
【００１０】
本出願の一態様によれば、水性調製物中の微生物汚染を検出するまたは微生物汚染の量を決定するための方法が提供され、方法は、
ａ）少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物を準備するステップ、
ｂ）少なくとも１種の溶菌剤を準備するステップ、
ｃ）微生物汚染物を含まないＡＴＰ（アデノシン三リン酸）が水性調製物中に溶解するように、水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な濃度でおよび時間の間、ステップａ）の水性調製物をステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤と接触させるステップ、
ｄ）ステップｃ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定するステップであって、ＡＴＰの含量が＞０であるとき微生物汚染の存在が検出されまたは微生物汚染の量が決定される、ステップ
を含む。
【００１１】
本発明によれば、「水性」調製物という用語は、液相が水を含む、好ましくは水からなる系を指す。しかし、上記の用語は、水性調製物の液相がメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１種の少量の水混和性有機溶媒を含むことを除外しない。水性調製物が少なくとも１種の水混和性有機溶媒を含む場合、水性調製物の液相は、少なくとも１種の水混和性有機溶媒を水性調製物の液相の総重量に基づいて、０．１〜４０．０重量％、好ましくは０．１〜３０．０重量％、より好ましくは０．１〜２０．０重量％および最も好ましくは０．１〜１０．０重量％の量で含む。例えば、水性調製物の液相は、水からなる。
【００１２】
本発明の意味において水性「調製物」は、少なくとも１種の粒状物質と水および任意選択でさらに添加剤を含む懸濁液またはスラリーである。懸濁液またはスラリーは通常、大量の粒状物質を含有し、それらが形成される液体よりも粘着性があり、一般に密度が高い。
【００１３】
本発明の意味において「粒状物質」という用語は水不溶性物質、好ましくは２５℃で＜０．０２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５℃で＜０．０１５ｇ／Ｌの水中の溶解度を有する物質を指すことが理解されよう。
【００１４】
本発明の意味において「溶菌剤」という用語は、ＡＴＰが生成調製物中に存在する微生物汚染物を含まないように微生物汚染物を溶解するのに適した薬剤を指す。
【００１５】
「含んでいる」という用語が本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために、「からなる」という用語は、用語「含んでいる」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定められる場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示することも理解されるべきである。
【００１６】
不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」が単数名詞を指すときに使用される場合、これは、他に特に明記しない限り、その名詞の複数形を含む。
【００１７】
「得ることができる」または「定めることができる」および「得られる」または「定められる」という用語は、同じ意味で用いられる。例えばこれは、文脈上明確に示されない限り、「得られる」という用語が、例えばある実施形態が例えば「得られる」という用語に続く一連のステップによって得られなければならないことを示すことを意味しないが、そのような限定的な理解は、好ましい実施形態として「得られる」または「限定される」という用語に常に含まれることを意味する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の使用に言及する。
【００１９】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染の検出または微生物汚染の量を決定するための、本明細書に記載の方法の使用に言及する。一実施形態において、検出下限（ＬｏＤ）または定量限界は、１≦１０４ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは１≦１０３ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１≦１０２ｃｆｕ／ｍＬであり、単位ｃｆｕはコロニー形成単位を指す。
【００２０】
水性調製物中の微生物汚染を検出するまたは微生物汚染の量を決定するための本発明の方法の好ましい実施形態または技術的な詳細が以下で参照されるとき、これらの好ましい実施形態または技術的な詳細も本明細書に記載の本発明の使用を指す（適用可能な限り）ことを理解すべきである。例えば、本発明の方法の水性調製物中の少なくとも１種の粒状物質が好ましくは、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも６５％のＲｙ白色度を有する白色鉱物であることが設定されている場合、本発明の使用は好ましくは、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも６５％のＲｙ白色度を有する白色鉱物である少なくとも１種の粒状物質を含む。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、少なくとも１種の粒状物質は、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも６５％のＲｙ白色度を有する白色鉱物である。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、ステップａ）の少なくとも１種の粒状物質は、天然粉砕炭酸カルシウム、天然および／または合成の沈降炭酸カルシウム、ドロマイト、表面改質炭酸カルシウム、ハイドロマグネサイト、ハイドロキシアパタイト、カオリン、タルク、バライト、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、二酸化チタンおよびそれらの混合物を含む群から選択され、ならびに好ましくは、少なくとも１種の粒状物質は天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを含む。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ステップａ）の水性調製物は、
（ｉ）２〜１２、好ましくは６〜１２およびより好ましくは７〜１０．５のｐＨ値、および／または
（ｉｉ）水性調製物の総重量に基づいて、最高８５．０重量％、好ましくは１０．０〜８２．０重量％、およびより好ましくは２０．０〜８０．０重量％の固形分
を有する。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、ステップａ）の水性調製物は、製紙配合物、紙用コーティング配合物、繊維配合物、食品配合物、医薬製剤、美容配合物、プラスチック配合物および／または塗料配合物である。
【００２５】
本発明の別の実施形態によれば、少なくとも１種の粒状物質は方法ステップａ）〜ｄ）の間で水性調製物の水相から分離されず、および／またはステップａ）の水性調製物は方法ステップａ）〜ｄ）の間に、１００倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されずおよび最も好ましくは希釈されない。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ＡＴＰは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、酵母菌、藻類またはそれらの混合物を含む微生物汚染物に由来する。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸（ＰＣＡ）、クエン酸、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、クロルヘキシジン（ＣＨＥＸ）、超音波処理、他の非イオン界面活性剤、陰イオンおよび陽イオン界面活性剤、リソスタフィンまたはリゾチームなどの細菌特異的溶菌酵素、プロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素、抗生物質、アルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシド、ベタン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、プロタミン、アミンおよび陽イオンポリマー、抗菌性ポリマー、細孔形成ポリマー、膜活性ポリマーおよび／または細胞壁活性ポリマー、バクテリオファージ、トリトンＸなどの界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群から選択される。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンの存在によって、好ましくは二価陽イオンの存在によっておよび最も好ましくはステップａ）でもたらされた水性調製物の少なくとも１種の粒状物質の存在によって阻害されることなく十分な溶菌をもたらす。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、少なくとも１種のキレート剤、好ましくはＥＤＴＡの十分な量とともに準備される。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、ＡＴＰの含有量は、発光検出によって支援されるルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いることによって決定される。
【００３１】
本発明の別の実施形態によれば、ステップｃ）およびｄ）は同時に、または所定の順序で別々に行われる。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ステップｃ）およびｄ）は少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いることによって同時に行われる。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、発光シグナルをモニターすることによってステップｄ）で微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定される。
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、ルミノメータを用いることによってステップｄ）で微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定される。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態によれば、微生物汚染の量は、
（ｉ）ステップｃ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定すること、
（ｉｉ）水性調製物中に存在するＡＴＰ含量が本質的に完全に加水分解されおよび／または水性調製物中に存在する微生物汚染物を本質的に完全に死滅させるようにステップａ）の水性調製物を処理すること、および方法ステップａ）〜ｄ）を通して水性調製物を処理すること、ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定されるＡＴＰ含有量からステップ（ｉｉ）の後で決定されるＡＴＰ含有量を差し引くこと
によってステップｄ）で決定される。
【００３６】
上記に示したように、水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための本発明の方法は、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を含む。以下において、本発明のさらなる詳細および特に、水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための本発明の方法の前述のステップに言及する。当業者は、本明細書に記載の多くの実施形態が組み合わされ、または共に適用されてよいことを理解するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ステップａ）の特徴：水性調製物の準備
本発明の方法のステップａ）により、水性調製物が準備される。
【００３８】
本方法のステップａ）で準備される水性調製物は少なくとも１種の粒状物質を含む任意の水性調製物であり得ることが理解されよう。
【００３９】
ステップａ）の水性調製物は、好ましくは水性懸濁液である。
【００４０】
本発明の意味において「水性懸濁液」という用語は、溶媒および少なくとも１種の無機粒状物質および／または少なくとも１種の有機物質を含む系を指し、ここで少なくとも１種の無機粒状物質の粒子の少なくとも一部は溶媒中に不溶性固形物として存在する。
【００４１】
それと対照的に、「水溶液」という用語は、分離した固形粒子、すなわち粒状物質の粒子が溶媒中に観察されない系を指す。
【００４２】
ステップａ）で準備される水性調製物は、少なくとも１種の粒状物質を含む。
【００４３】
本発明の意味において「少なくとも１種」の粒状物質という用語は、その粒状物質が１種または複数種の粒状物質を含む、好ましくは、１種または複数種の粒状物質からなることを意味する。
【００４４】
本発明の一実施形態において、少なくとも１種の粒状物質は、１種の粒状物質を含む、好ましくは１種の粒状物質からなる。あるいは、少なくとも１種の粒状物質は、２種以上の粒状物質を含む、好ましくは２種以上の粒状物質からなる。例えば、少なくとも１種の粒状物質は、２または３種の粒状物質を含む、好ましくは２または３種の粒状物質からなる。
【００４５】
好ましくは、少なくとも１種の粒状物質は、１種の粒状物質を含む、好ましくは１種の粒状物質からなる。
【００４６】
本発明の一実施形態において、少なくとも１種の粒状物質は少なくとも１種の無機粒状物質である。
【００４７】
例えば、少なくとも１種の粒状物質、好ましくは少なくとも１種の無機粒状物質は、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも６５％のＲｙ白色度を有する白色鉱物である。好ましくは、少なくとも１種の粒状物質、好ましくは少なくとも１種の無機粒状物質は、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも７５％のＲｙ白色度、より好ましくは少なくとも８０％のＲｙ白色度および最も好ましくは少なくとも８５％のＲｙ白色度を有する白色鉱物である。
【００４８】
少なくとも１種の粒状物質、例えば、少なくとも１種の無機粒状物質は好ましくは、天然粉砕炭酸カルシウム、天然および／または合成の沈降炭酸カルシウム、ドロマイト、表面改質炭酸カルシウム、ハイドロマグネサイト、ハイドロキシアパタイト、カオリン、タルク、バライト、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、二酸化チタンおよびそれらの混合物を含む群から選択されることが理解されよう。
【００４９】
本発明の一実施形態において、少なくとも１種の粒状物質、例えば少なくとも１種の無機粒状物質は、天然粉砕炭酸カルシムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを含む。
【００５０】
本発明の意味において「粉砕炭酸カルシウム」（ＧＣＣ）は、天然源、例えば石灰石、大理石または白亜から得られ、かつ粉砕、篩分けおよび／または例えばサイクロンもしくは分類機による、湿式および／または乾式による細分化などの処理を通して加工される炭酸カルシウムである。
【００５１】
本発明の意味において「沈降炭酸カルシウム」（ＰＣＣ）は、合成物質であり、通常、水性の環境で二酸化炭素と石灰の反応に続く沈降によって、または水中のカルシウムと炭酸イオン源の沈降によって得られる。
【００５２】
「表面改質炭酸カルシウム」は、表面反応ＧＣＣまたはＰＣＣを特徴とし得る。表面反応炭酸カルシウムは、水性懸濁液の形でＧＣＣまたはＰＣＣを準備し、上記懸濁液にＨ３Ｏ＋イオンドナーを添加することによって調製され得る。好適なＨ３Ｏ＋イオンドナーは、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、またはその混合物である。次のステップでは、炭酸カルシウムは二酸化炭素ガスで処理される。硫酸または塩酸などの強いＨ３Ｏ＋イオンドナーがＨ３Ｏ＋イオンドナー処理ステップで使用される場合、二酸化炭素がｉｎ  ｓｉｔｕで自動的に形成する。あるいは、またはそれに加えて、二酸化炭素は外部供給源から提供されてよい。表面反応炭酸カルシウムは、例えば、米国特許第２０１２／００３１５７６Ａ１号、国際公開第２００９／０７４４９２Ａ１号、欧州特許第２，２６４，１０９Ａ１号、欧州特許第２，０７０，９９１Ａ１号、欧州特許第２，２６４，１０８Ａ１号、国際公開第００／３９２２２Ａ１号、国際公開第２００４／０８３３１６Ａ１号、または国際公開第２００５／１２１２５７Ａ２号に記載される。
【００５３】
本発明の意味において「ハイドロマグネサイト」は、Ｍｇ５（ＣＯ３）４（ＯＨ）２・４Ｈ２Ｏの化学組成を有する、水和炭酸マグネシウム含有鉱物である。それは通常、蛇紋石または水滑石などのマグネシウム含有鉱物の風化産物に関連して生じる。
【００５４】
本発明の意味において「ドロマイト」は、ＣａＭｇ（ＣＯ３）２（“ＣａＣＯ３・ＭｇＣＯ３”）の化学組成を有する、炭酸カルシウム含有鉱物、すなわち炭酸カルシウムマグネシウム鉱物である。ドロマイト鉱物は、ドロマイト総重量に基づいて、少なくとも３０．０重量％のＭｇＣＯ３、好ましくは３５．０重量％を超える、およびより好ましくは４０．０重量％を超えるＭｇＣＯ３を含有し得る。
【００５５】
天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムおよび／または表面改質炭酸カルシウムは、さらに表面処理されてもよい。したがって、天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムおよび／または表面改質炭酸カルシウムを少なくとも１種の疎水化剤で処理して、接触面積の少なくとも一部に疎水化剤を含有する処理層を含む天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを得ることができる。
【００５６】
疎水化剤は、Ｃ４〜Ｃ２４の炭素原子総数を有する脂肪族カルボン酸、および／もしくはその置換基にＣ２〜Ｃ３０の炭素原子総数を有する直鎖基、分岐鎖基、脂肪族基および環状基から選択される基でモノ置換された無水コハク酸からなる少なくとも１つのモノ置換無水コハク酸、および／もしくは１または複数のリン酸モノエステルと、１または複数のリン酸ジエステルとのリン酸エステル混合物から選択できる。
【００５７】
天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムおよび／または表面改質炭酸カルシウムを少なくとも１つのモノ置換無水コハク酸でおよび／または少なくとも１つのリン酸エステル混合化合物および表面処理に適した化合物で処理するプロセスは、欧州特許第２，７２２，３６８Ａ１号および欧州特許第２，７７０，０１７Ａ１号に記載されており、したがってこれらを参照により本明細書に組み入れる。
【００５８】
天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを処理するための好適な脂肪族カルボン酸は、例えば、４と２４との間の炭素原子を有する脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸である。
【００５９】
本発明の意味において脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸は、１または複数の直鎖カルボン酸、分岐鎖カルボン酸、飽和カルボン酸、不飽和カルボン酸および／または脂肪族カルボン酸から選択されてよい。好ましくは、脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸はモノカルボン酸であり、すなわち脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸は単一のカルボキシル基が存在することを特徴とする。上記カルボキシル基は、炭素骨格の末端に配置される。
【００６０】
本発明の一実施形態において、脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸は、飽和した非分岐カルボン酸から選択される、すなわち、脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸は好ましくは、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸およびそれらの混合物からなるカルボン酸の群から選択される。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸は、オクタノン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００６２】
例えば、脂肪族直鎖カルボン酸または脂肪族分岐鎖カルボン酸はステアリン酸である。
【００６３】
ステップａ）で準備される水性調製物の少なくとも１種の粒状物質、好ましくは少なくとも１種の無機粒状物質は、検査される生成物の種類に関与する物質（複数可）で従来使用される粒径分布を有し得る。一般に、粒子の９０％は、６マイクロメータ（μｍ）未満のｅｓｄ（ＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓのＳｅｄｉｇｒａｐｈ５１２０シリーズを用いて周知の沈降技術によって測定される球相当径）を有する。粗粒状物質は、一般に１〜５μｍの範囲で粒子ｅｓｄ（すなわち、少なくとも９０重量％）を有してよい。微細粒状物質は、一般に２μｍ未満の粒子ｅｓｄを有してよく、例えば５０．０〜９９．０重量％が２μｍ未満であり、好ましくは６０．０〜９０．０重量％が２μｍ未満である。水性調製物中の少なくとも１種の粒状物質は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＳｅｄｉｇｒａｐｈ（商標）５１２０を用いて測定すると０．１〜５μｍ、好ましくは０．２〜２μｍおよび最も好ましくは０．３５〜１μｍ、例えば０．７μｍの重量メジアン粒径ｄ５０値を有することが好ましい。
【００６４】
水性調製物中に分散される、そのような無機粒状物質、好ましくは無機粒状物質を維持するため、およびしたがって水性調製物の粘度が経時的に実質的に同じ状態のままであることを確実にするために、分散剤などの添加剤がステップａ）の水性調製物中に存在し得る。本発明による好適な分散剤は、好ましくはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、フマル酸、無水マレイン酸、イソクロトン酸、アコニット酸（シスまたはトランス）、メサコン酸、シナピン酸、ウンデシレン酸、アンゲリカ酸、カネル酸（ｃａｎｅｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ヒドロキシアクリル酸、アクロレイン、アクリルアミド、アクリロニトリル、ジメチルアミノエチルメタクリラート、ビニルピロリドン、スチレン、アクリル酸およびメタクリル酸のエステルならびにこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーおよび／またはコモノマーから作られるホモポリマーまたはコポリマーであり、ここでポリ（アクリル酸）および／またはポリ（メタクリル酸）の塩が分散剤として好ましい。
【００６５】
それに加えて、またはあるいは、ステップａ）の水性調製物は、少なくとも１種の有機粒状物質を含む。例えば、少なくとも１種の有機粒状物質は、グリコール、ＣＭＣまたは澱粉などの糖質、セルロースとセルロース系パルプ、グリセロールおよびそれらの混合物から選択される。
【００６６】
本発明の一実施形態において、ステップａ）の水性調製物は、少なくとも１種の無機粒状物質および少なくとも１種の有機粒状物質を含む。あるいは、ステップａ）の水性調製物は、少なくとも１種の無機粒状物質または少なくとも１種の有機粒状物質を含む。
【００６７】
好ましくは、ステップａ）の水性調製物は、少なくとも１種の無機粒状物質である少なくとも１種の粒状物質を含む。より好ましくは、少なくとも１種の粒状物質は、天然粉砕炭酸カルシウム、天然および／または合成の沈降炭酸カルシウム、ドロマイト、表面改質炭酸カルシウム、ハイドロマグネサイト、ハイドロキシアパタイト、カオリン、タルク、バライト、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、二酸化チタンおよびそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１種の無機粒状物質であり、かつ最も好ましくは、少なくとも１種の粒状物質は天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを含む。
【００６８】
このように、ステップａ）の水性調製物は、好ましくは水性懸濁液である。
【００６９】
ステップａ）で準備される水性調製物の固形分は最高８５．０重量％であり得ることが理解されよう。例えば、水性調製物の固形物は、ＣａＣＯ３の乾燥重量に基づいて、１０．０〜８２．０重量％、およびより好ましくは２０．０〜８０．０重量％である。
【００７０】
ステップａ）で準備される水性調製物のｐＨは、幅広い範囲で変化してよく、好ましくはそのような水性調製物について一般的に観察されるｐＨ範囲である。したがって、ステップａ）の水性調製物は好ましくは２〜１２のｐＨ値を有することが理解されよう。例えば、ステップａ）の水性調節物は、６〜１２かつより好ましくは７〜１０．５のｐＨ値を有する。特に明記しない限り、ｐＨは、実施例の節に記載の方法に従って測定される。
【００７１】
一般的に、ステップａ）で準備される水性調製物は、ＬＶ−３スピンドルを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ−ＩＩＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒを用いて１００ｒｐｍの速度で測定して、５０〜２，０００ｍＰａ・ｓかつ好ましくは８０〜８００ｍＰａ・ｓの範囲である粘度を有する。
【００７２】
本発明による水性調製物は、当技術分野で知られている方法、例えば、水不溶性固形物、好ましくは無機粒状物質を、適切な場合には分散剤を加えて、および適切な場合にはさらに水中の添加剤を加えて分散する、懸濁する、またはスラリー状にすることによって生成できる。
【００７３】
ステップａ）で準備される水性調製物は、水性調製物が少なくとも１種の粒状物質を含む場合その微生物の状態が決定されるべきである、任意の水性調製物であってよい。
【００７４】
例えばステップａ）の水性調製物は、製紙配合物、紙用コーティング配合物、繊維配合物、食品配合物、医薬製剤、美容配合物、プラスチック配合物および／または塗料配合物である。
【００７５】
ステップｂ）の特徴：少なくとも１種の溶菌剤の準備
本発明の方法のステップｂ）により、少なくとも１種の溶菌剤が準備される。
【００７６】
本発明の意味において「少なくとも１種」の溶菌剤という用語は、溶菌剤が１種または複数種の溶菌剤を含む、好ましくは１種または複数種の溶菌剤からなることを意味する。
【００７７】
本発明の一実施形態において、少なくとも１種の溶菌剤は、１種の溶菌剤を含む、好ましくは１種の溶菌剤からなる。あるいは、少なくとも１種の溶菌剤は、２種以上の溶菌剤を含む、好ましくは２種以上の溶菌剤からなる。例えば、少なくとも１種の溶菌剤は、２または３種の溶菌剤を含む、好ましくは２または３種の溶菌剤からなる。
【００７８】
好ましくは、少なくとも１種の溶菌剤は、１種の溶菌剤を含む、好ましくは１種の溶菌剤からなる。
【００７９】
少なくとも１種の溶菌剤は、ＡＴＰが水性調製物中に存在し得る微生物汚染物を含まないように細孔の溶解または形成が生じるように細胞膜または細胞壁の浸透性を変えるまたは微生物汚染物の細胞膜もしくは細胞壁の完全性を破壊するのに適している任意の薬剤であり得ることが理解されよう。
【００８０】
本発明による好ましい溶菌剤としては、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸（ＰＣＡ）、クエン酸、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、クロルヘキシジン（ＣＨＥＸ）、超音波処理、他の非イオン界面活性剤、陰イオンおよび陽イオン界面活性剤、リソスタフィンまたはリゾチームなどの細菌特異的溶菌酵素、プロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素、抗生物質、アルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシド、ベタン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、プロタミン、アミン、および陽イオンポリマー、抗菌性ポリマー、細孔形成ポリマー、膜活性ポリマー、および／または細胞壁活性ポリマー、バクテリオファージ、トリトンＸなどの界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群から選択さる溶菌剤が挙げられる。
【００８１】
本発明の一実施形態において、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸（ＰＣＡ）、クエン酸、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、クロルヘキシジン（ＣＨＥＸ）、超音波処理、他の非イオン界面活性剤、陰イオンおよび陽イオン界面活性剤、トリトンＸなどの界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群から選択される。例えば、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、トリトンＸなどの界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群から選択される。
【００８２】
ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンの存在によって阻害されることなく十分な溶解を与えることが理解されよう。
【００８３】
好ましくは、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、二価陽イオンの存在によって阻害されることなく十分な溶解を与える。本発明の意味において「二価陽イオン」という用語は、２の結合価を有する陽イオン、例えば、２つのイオン価を有する金属陽イオンを指す。例えば、二価陽イオンは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオンおよびそれらの混合物からなる群から選択できる。二価陽イオンは、硫酸塩、スルホン酸塩、グルコン酸塩、炭酸塩、塩化物または臭化物などの塩またはハロゲン化物として提供されてよい。
【００８４】
最も好ましくは、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、ステップａ）で準備される水性調製物の少なくとも１種の粒状物質の存在によって阻害されることなく十分な溶解を与える。少なくとも１種の粒状物質は好ましくは、天然粉砕炭酸カルシウム、天然および／または合成の沈降炭酸カルシウム、ドロマイト、表面改質炭酸カルシウム、ハイドロマグネサイト、ハイドロキシアパタイト、カオリン、タルク、バライト、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、二酸化チタンおよびそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１種の無機粒状物質であり、かつ最も好ましくは、少なくとも１種の粒状物質は天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを含む。
【００８５】
本発明の一実施形態において、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、十分な量の少なくとも１種のキレート剤と共に供給される。キレート剤は二価陽イオンなどの遊離陽イオンを除去できしたがってそれらの阻害作用を防止するので、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤と、少なくとも１種のキレート剤との同時供給は有利であることが理解されよう。
【００８６】
少なくとも１種のキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、および１，２−シクロエキサンジニトリロ四酢酸（ＣＤＴＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸、リグニンスルホン酸、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、少なくとも一種のキレート剤は、一般的に入手可能であり低価格の理由から、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡからなる群から選択される。最も好ましくは、少なくとも１種のキレート剤はＥＤＴＡである。
【００８７】
少なくとも１種のキレート剤は、十分な濃度で供給されるのが好ましい。十分な濃度は、細胞溶解物から十分な遊離ＡＴＰを供給するのに十分なレベルならびにＡＴＰ決定を阻害しないレベルをもたらすことに基づいて、経験的に決定できる。
【００８８】
好ましくは、少なくとも１種のキレート剤は、少なくとも１種の溶菌剤の量の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも１種の溶菌剤の量の約２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％に相当する量で供給される。
【００８９】
しかし、異なるキレート剤がｐＨに応じて異なるキレート能力を有し得ることを当業者は認識するであろう。このように、本発明の外部パラメータは、それ以外はルシフェラーゼアッセイの反応条件と同じ条件（例えば、ｐＨは７．０〜１０．５、など）下でキレート能力がＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の能力に匹敵するとして、少なくとも１種のキレート剤の量におけるある程度の可変性を含む。言い換えれば、少なくとも１種のキレート剤の量を調節して、それ以外は同じ条件（少なくとも１種のキレート剤を除いては、他のすべての試薬および試薬濃度は同じ）下で、ＥＤＴＡのキレート能力に匹敵する、またはそれを上回るキレート能力をもたらすことができる。
【００９０】
ステップｃ）の特徴：水性調製物を少なくとも１種の溶菌剤と接触させる
本発明の方法のステップｃ）に従って、ステップａ）の水性調製物は、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤と接触される。本発明の一条件は、微生物汚染物を含まないＡＴＰが水性調製物中に溶解されるように、水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な濃度で、および時間の間ステップａ）の水性調製物をステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤と接触させることである。
【００９１】
したがって、ステップａ）の水性調製物は、水性調製物中で検出される、またはその量が決定される微生物汚染物を含み得ることが理解されよう。ステップａ）の水性調製物は、分析される水性調製物中、例えば、製紙配合物、紙用コーティング配合物、繊維配合物、食品配合物、医薬製剤、美容配合物、プラスチック配合物および／または塗料配合物中で一般的に見つかる微生物汚染物を含み得る。
【００９２】
好ましくは、微生物汚染物はグラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、酵母菌またはそれらの混合物を含む。
【００９３】
本発明の一実施形態において、微生物汚染物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、藻類または酵母菌を含む、好ましくはそれらからなる。あるいは、微生物汚染物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、藻類および酵母菌から独立して選択される２種以上の微生物汚染物を含む、好ましくは２種以上の微生物汚染物からなる。例えば、微生物汚染物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、藻類および酵母菌から独立して選択される２または３種の微生物汚染物を含む、好ましくは２または３種の微生物汚染物からなる。好ましくは、微生物汚染物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、藻類および酵母菌から独立して選択される２または３種の微生物汚染物を含む、好ましくは２または３種の微生物汚染物からなる。
【００９４】
グラム陽性菌およびグラム陰性菌は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，“Ｂｒｏｃｋ”，Ｍａｄｉｇａｎ  ＭＴ，Ｍａｒｔｉｎｋｏ  ＪＭ，Ｐａｒｋｅｒ  Ｊ，１９９７，  第８版に記載されていることが理解されよう。特に、そのような細菌は、それぞれが多数の細菌ファミリーを含む、進化的な非常に遠縁なクラスの細菌を代表する。グラム陰性菌は２層の膜（外膜と内膜）によって特徴づけられ、一方、グラム陽性菌は１層の膜だけを含む。通常、前者は大量のリポ多糖と、ペプチドグリカンの薄い単層とを含み、一方、後者には実質的にリポ多糖がなく、ペプチドグリカンの厚い多層および殻はタイコ酸を含む。これらの差のために、グラム陽性菌およびグラム陰性菌は、環境の影響に異なって反応する。グラム陽性菌とグラム陰性菌を識別する方法としては、ＤＮＡ配列決定技術または生化学的特性化による種同定が挙げられる。あるいは、膜の数が、薄切片透過型電子顕微鏡によって直接決定され得る。
【００９５】
例えば、グラム陰性菌およびグラム陽性菌は、メチロバクテリウム属種（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大腸菌）などのエシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）などのシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ブデロビブリオ属種（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、フラボバ  テリウム属種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、リゾビウム属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、スフィンゴバクテリウム属種（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、クロモバクテリウム属種（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、ヒホミクロビウム属種（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、レプトトリックス属種（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）、マイクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などのスタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アグロマイセス属種（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アシドボラックス属種（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．）、およびそれらの混合物を含む群から選択できる。
【００９６】
例えば、グラム陰性菌およびグラム陽性菌は、エシェリキア・コリなどのエシェリキア属種、スタフィロコッカス・アウレウスなどのスタフィロコッカス属種およびこれらの混合物から選択される。
【００９７】
それに加えて、またはあるいは、酵母菌は、サッカロミケス亜門（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、タフリナ菌亜門（Ｔａｐｈｒｉｎｏｍｙｃｏｔｉａ）、シゾサッカロミケス綱（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ハラタケ亜門（Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、シロキクラゲ綱（Ｔｒｅｍｅｌｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プクシニア菌亜門（Ｐｕｃｃｉｎｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、ミクロボトリウム菌綱（Ｍｉｃｒｏｂｏｔｒｙｏｍｙｃｅｔｅｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ビスワナチイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）およびこれらの混合物などのカンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウィア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ）およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆａｒｍａｎｓ）などのクリプトコックス属種、チゴサッカロマイセス属種（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）などのロドトルラ属種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、およびこれらの混合物を含む群から選択できる。
【００９８】
それに加えて、またはあるいは、カビは、アクレモニウム属種（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ムコール属種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ）、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、スタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐ．）、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、デマチアセ属種（Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）、フォーマ属種（Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．）、ユーロチウム属種（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｓｐ．）、スコプラリオプシス属種（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、アウレオバシジウム属種（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、モニリア属種（Ｍｏｎｉｌｉａ  ｓｐ．）、ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐ．）、ステムフィリウム属種（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｓｐ．）、カエトミウム属種（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐ．）、ミセリア属種（Ｍｙｃｅｌｉａ  ｓｐ．）、ニューロスポラ属種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、ウロクラジウム属種（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．）、パエシロマイセス属種（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ワレミア属種（Ｗａｌｌｅｍｉａ  ｓｐ．）、クルブラリア属種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、およびこれらの混合物からなる群から選択できる。
【００９９】
少なくとも１種の溶菌剤は、微生物汚染物を含まないＡＴＰが水性調製物中に溶解されるように水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な濃度で、および時間の間水性調製物に加えられることが理解されよう。
【０１００】
一般に、水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な少なくとも１種の溶菌剤の量は、もし存在するならば、微生物汚染物、および使用される少なくとも１種の溶菌剤によって変化し得る。少なくとも１種の溶菌剤の量は、当業者に既知の、または本出願に記載の一般的な方法を使用して経験的に決定されてよい。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、少なくとも１種の溶菌剤は、水性調製物の総重量に基づいて、０．０１重量％〜５．０重量％の範囲の濃度で水性調製物に加えられる。例えば、少なくとも１種の溶菌剤としてトリトンＸなどの界面活性剤が使用される場合、少なくとも１種の溶菌剤は、水性調製物の総重量に基づいて、０．２５重量％〜１．０重量％の範囲の濃度で水性調製物に加えられる。少なくとも１種の溶菌剤としてセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が使用される場合、少なくとも１種の溶菌剤は、水性調製物の総重量に基づいて、０．０２重量％〜０．０８重量％の範囲の濃度で水性調製物に加えられる。
【０１０２】
一般的に、ステップａ）の水性調製物およびステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、当業者に既知の任意の従来の手段によって接触させられる。
【０１０３】
接触ステップｃ）は好ましくは、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤をステップａ）の水性調製物に加えることによって行われる。
【０１０４】
本発明の一実施形態において、ステップａ）の水性調製物をステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤と接触させるステップは、少なくとも１種の溶菌剤が混合下で水性調製物に加えられることで行われる。十分な混合は、水性調製物を振盪することによって、または完全な混合をもたらし得る撹拌によって果たすことができる。本発明の一実施形態において、接触ステップｃ）は、水性調製物と少なくとも１種の溶菌剤との完全な混合を確実に行うために撹拌下で行われる。そのような撹拌は、連続的に、または断続的に行われ得る。
【０１０５】
本発明の一条件は、接触ステップｃ）が、微生物汚染物を含まないＡＴＰが水性調製物中に溶解するように水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な時間の間行われることである。したがって、接触は、ＡＴＰ量のさらなる増加が水性調製物中で検出されないような時間の間行われることが理解されよう。接触時間は、当業者に既知の、または本出願に記載の一般的な方法を使用して経験的に決定されてよい。
【０１０６】
例えば、ステップｃ）において水性調製物を少なくとも１種の溶菌剤と接触させるために十分な時間は、３〜３０分間の範囲、好ましくは３〜２０分間の範囲、より好ましくは３〜１０分間の範囲、かつ最も好ましくは約５分間である。接触は一般的に、少なくとも１種の溶菌剤が水性調合物中に完全に混合されると始まる。
【０１０７】
接触ステップｃ）は１または複数回、繰り返されることが理解されよう。
【０１０８】
ステップｃ）で得られる水性調製物は、好ましくはステップａ）で準備される水性調製物の固形分に相当する固形分を有する。したがって、ステップｃ）で得られる水性調製物は、好ましくは最高８５．０重量％の固形分を有することが理解されよう。例えば、ステップｃ）で得られる水性調製物の固形分は、ステップｃ）で得られる水性調製物の総重量に基づいて、１０．０〜８２．０重量％、かつより好ましくは２０．０〜８０．０重量％である。
【０１０９】
それに加えて、またはあるいは、ステップｃ）で得られる水性調製物のｐＨは、ステップａ）で準備される水性調製物のｐＨに好ましくは相当する。したがって、ステップｃ）で得られる巣性調製物は、好ましくは２〜１２のｐＨ値を有することが理解されよう。例えば、ステップｃ）で得られる水性調製物は、６〜１２かつより好ましくは７〜１０．５のｐＨ値を有する。
【０１１０】
一般的に、ステップｃ）で得られる水性調製物は、ＬＶ−３スピンドルを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ−ＩＩＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒを用いて１００ｒｐｍの速度で測定される、好ましくは５０〜２，０００ｍＰａ・ｓの範囲、かつ好ましくは８０〜８００ｍＰａ・ｓの範囲である粘度を有する。
【０１１１】
ステップｄ）の特徴：ＡＴＰ含有量を決定する
本発明の方法のステップｃ）に従って、ＡＴＰ含有量が決定される。本発明の一条件は、ＡＴＰ含有量が＞０であるとき、微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定されることである。
【０１１２】
微生物汚染物の検出または決定は当業者に既知のあらゆる手段で行われ得ることが理解されよう。例えば、ＡＴＰ依存性ルミネセンス生成酵素を、ＡＴＰ含有量を決定するために使用できる。好ましくは、ＡＴＰ含有量は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いて決定される。
【０１１３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬は、当業者に周知である。一般に、ルシフェラーゼは、ルミネセンスを生成するその能力によって定義される。より正確には、ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの酸化を触媒し、それによってオキシルシフェリンと光子を生成することが知られている。その触媒産物が光を含むルシフェラーゼは、感度、検出可能な産物を提供し、したがって水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量の決定を可能にする。
【０１１４】
例えば、一般的なホタル（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅホタル科）のルシフェラーゼなどのカブトムシルシフェラーゼを、本発明で使用できる。カブトムシルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼと呼ばれることが多いが、ホタルルシフェラーゼは実際のところカブトムシルシフェラーゼ綱の亜群である。カブトムシルシフェラーゼは、カブトムシ自体のランタンから、または当技術分野で周知のタンパク質発現系から精製できる。
【０１１５】
ＡＴＰ依存性反応を触媒し発光を生成するすべてのルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、ルシフェラーゼフラグメント、および変異型ルシフェラーゼフラグメントが本発明のために使用され得ることが理解されよう。ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、ルシフェラーゼフラグメント、および変異型ルシフェラーゼフラグメントは好ましくは、ステップａ）で準備される水性調製物のｐＨ条件下で、より好ましくは２〜１２、さらに好ましくは６〜１２かつ最も好ましくは７〜１０．５のｐＨで安定であるように、選択されることが理解されよう。特に、カブトムシルシフェラーゼ、具体的には北米ホタルフォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のホタルルシフェラーゼを使用できる。あるいは、遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質によって算出された、Ｍｒ  ６１ｋＤａのおよそ５５０アミノ酸からなるＰ．ピラリス  ルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｙ）を使用できる。本発明による他のホタルルシフェラーゼとしては、フォツリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）ホタルルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｅ２、５４５アミノ酸残基、ＧｅｎＢａｎｋ  ２１９０５３４）、ならびに米国特許出願第２００３／０１０４５０７号に開示される種々の変異型ルシフェラーゼが挙げられ、これらはＬｕｃＰｐｅ２（例えば、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（別名７８−０Ｂ１０）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（別名９０−１Ｂ５）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（別名１３３−１Ｂ２）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（別名１４６−１Ｈ２））に由来し、およびＵｌｔｒａＧｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの種々の市販のルシフェラーゼが挙げられる。ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３、およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６を作製する方法は、米国特許出願第２００３／０１０４５０７号に開示されており、その全体を参照によって本明細書に組み込む。
【０１１６】
好ましくは、ルシフェラーぜは、単離された形態および／または精製された形態で提供される。純度は、当業者に既知の任意の手段によって決定できる。例えば、純度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色またはシルバー染色を用いて非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて決定できる。ルシフェラーゼは、天然のルシフェラーゼ生成供給源から、または外因性ルシフェラーゼによってコードされたポリヌクレオチドを発現する組換え細胞から単離されてよい。ルシフェラーゼを生成するための方法は、当業者には周知である。
【０１１７】
カブトムシルシフェラーゼの天然起源の基質は、ホタルルシフェリンである。ルシフェリンは、ポリテロサイクリック有機酸である、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ２−チアゾリ−４−カルボン酸（ルシフェリン）である。ルシフェリンは、ホタルなどの天然源から単離されてよく、または合成されてもよい。合成ルシフェリンは、天然起源のルシフェリンと同じ構造を有してよく、または、それが類似的に機能する限り、変異体もしくは誘導体であり得る。本発明で使用するための例示的なルシフェリン誘導体としては、６−デオキシアミノルシフェリン、Ｄ−ルシフェリンメチルエステル、Ｄ−ルシフェリル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−ルシフェリル−Ｌ−Ｎ  α−アルギニン、Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−サルフェートおよびＤ−ルシフェリン−Ｏ−フォスフェート、試料中の成分によりルシフェリンへとエステラーゼによって加水分解される、または作用されるルシフェラーゼのエステルが挙げられるが、これらに限定されない。有用なルシフェリン類似体の他の例としては、それぞれ緑色および赤色光スペクトルで発光する、ナフチルルシフェリンおよびキノリルルシフェリンが挙げられる。
【０１１８】
ルシフェラーゼ触媒反応は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応から発光シグナルを発生する。
【０１１９】
したがって、発光シグナルをモニターすることによってステップｄ）で微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定されることが好ましい。そのようなモニタリングは、当業者に周知のそれぞれの手段によって行われてよい。例えば、ルミノメータを使用してステップｄ）で微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定される。ルミノメータは当業者にとって周知であり、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＵＳＡから入手可能である。
【０１２０】
本発明の一実施形態において、ステップｄ）は、接触ステップｃ）の間に、または接触ステップの後で行われる。
【０１２１】
例えば、ステップｄ）は、接触ステップｃ）の間に行われる。あるいは、ステップｄ）は、接触ステップｃ）の後で行われる。
【０１２２】
したがって、ステップｃ）およびｄ）は、同時に、または所定の順序で別々に行われる。例えば、ステップｃ）およびｄ）は所定の順序で別々に行われる、すなわちステップｄ）はステップｃ）の後で行われる。あるいは、ステップｃ）およびｄ）は、同時に行われる。
【０１２３】
好ましくは、ステップｃ）およびｄ）は、少なくとも１つの融解物質を含むルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いて同時に実施される。
【０１２４】
一実施形態において、使用される少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬は、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，（ＵＳＡ）である。
【０１２５】
本発明の一実施形態において、微生物汚染の量は、
（ｉ）ステップｃ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定すること、
（ｉｉ）水性調製物中に存在するＡＴＰ含量が本質的に完全に加水分解されるように、および／または水性調製物中に存在する微生物汚染物が本質的に完全に死滅されるように、ステップａ）の水性調製物を処理すること、および方法ステップａ）〜ｄ）を通して水性調製物を処理すること、ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）において決定されるＡＴＰ含有量からステップ（ｉｉ）の後に決定されるＡＴＰ含有量を差し引くこと
によってステップｄ）で決定される。
【０１２６】
処理ステップ（ｉｉ）は、水性調製物中に存在するＡＴＰ含量を本質的に完全に加水分解させるおよび／または水性調製物中に存在する微生物汚染物を本質的に完全に死滅させるのに適した、当業者に既知の任意の手段によって行われてよい。ＡＴＰ含量を加水分解することおよび／または微生物汚染物を死滅させることは、当業者に周知の方法によって行われてよい。例えば、加水分解することおよび／または死滅させることは、水性調製物をオートクレーブ処理する、または無菌化することによって達成できる。
【０１２７】
それに加えて、またはあるいは、微生物汚染の量は、
（ｉ）ステップｃ）を除いてステップｄ）までの処理の後に、ステップｄ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定すること、
（ｉｉ）ステップｄ）までの処理の後に、ステップａ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定すること、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定されるＡＴＰ含有量からステップ（ｉｉ）の後に決定されるＡＴＰ含有量を差し引くこと
によってステップｄ）で決定される。
【０１２８】
本発明の一条件は、ステップａ）で準備される水性調製物が少なくとも１種の粒状物質を含むことである。また、ステップｄ）の水性調製物が少なくとも１種の粒状物質を含むことが好ましい。好ましくは、ステップｄ）の水性調製物の少なくとも１種の粒状物質は、ステップａ）で準備される水性調製物と同じである。
【０１２９】
したがって、少なくとも１種の粒状物質は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に水性調製物の水相から分離されないことが好ましい。
【０１３０】
ステップａ）の水性調製物は特定の倍数を超えて希釈されないことをさらに理解されたい。
【０１３１】
好ましくは、ステップａ）の水性調製物は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に１００倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されずかつ最も好ましくは希釈されない。
【０１３２】
本発明の一実施形態において、少なくとも１種の粒状物資は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に水性調製物の水相から分離されず、またはステップａ）の水性調製物は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に１００倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されずかつ最も好ましくは希釈されない。あるいは、少なくとも１種の粒状物質は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に水性調製物の水相から分離されず、およびステップａ）の水性調製物は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に１００倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されずかつ最も好ましくは希釈されない。
【０１３３】
したがって、ステップｄ）で得られる水性調製物は好ましくは、ステップａ）で準備される水性調製物の固形分におよび／またはステップｃ）で得られる水性調製物の固形分に相当する、すなわち同等のまたはできる限り近い量の固形分を有する。したがって、ステップｄ）で得られる水性調製物は最高８５．０重量％の固形物を有することが理解されよう。例えば、ステップｄ）で得られる水性調製物の固形分は、ステップｄ）で得られる水性調製物の総重量に基づいて、１０．０〜８２．０重量％、かつより好ましくは２０．０〜８０．０重量％である。
【０１３４】
それに加えて、またはあるいは、ステップｄ）で得られる水性調製物のｐＨは好ましくは、ステップａ）で準備される水性調製物のｐＨにおよび／またはステップｃ）で得られる水性調製物のｐＨに相当する、すなわち同等である、またはできる限り近い。したがって、ステップｄ）で得られる水性調製物は、好ましくは２〜１２のｐＨ値を有することが理解されよう。例えば、ステップｄ）で得られる水性調製物は、６〜１２かつより好ましくは７〜１０．５のｐＨ値を有する。
【０１３５】
一般的に、ステップｄ）で得られる水性調製物は、ＬＶ−３スピンドルを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ−ＩＩＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒを用いて１００ｒｐｍの速度で測定して、好ましくは５０〜２，０００ｍＰａ・ｓの範囲、かつ好ましくは８０〜８００ｍＰａ・ｓの範囲である粘度を有する。
【０１３６】
したがって、本発明の方法は、いくつかの改善された特性を提供する。まず第一に、本発明の方法は、特定の粘度を有する粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染物を検出する、または決定するのに適している。さらに、本発明の方法は、最小限の作業ステップ（例えば、粒状物質を分離せず、希釈せずに（または最小限の希釈））で、迅速に、好ましくは数分以内、例えば３０分以内に行うことができる。それに加えて、本発明の方法は、水性調製物を１００倍を超えて希釈することなく行うことができる。溶解反応は、水性調製物およびその粒状物質（例えば、それは二価陽イオンを含んでいる）の阻害に左右されない。検出反応（および、またはそのための酵素）は、水性調製物およびその粒状物質のｐＨ範囲内（例えばｐＨ７〜１０．５）で安定である。したがって、本発明の方法は、必要に応じて、水性調製物を殺生物剤で処理することによる直接作用が可能であるように、水性調製物の微生物の状態を極めて迅速に決定することを可能にする。
【０１３７】
使用
得られた良好な結果を鑑みて、本発明は、さらなる態様において、本明細書に定めるように少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための、少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の使用に言及する。検出または決定は、発光測定の手段によって行われることが好ましい。そのような発光測定は、当業者に周知の方法および機器によって行われてよい。
【０１３８】
本発明の方法の技術的詳細を検討する場合、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬、少なくとも１種の溶菌剤、水性調製物、微生物汚染物およびその好ましい実施形態の定義に関して、上の記載を参照されたい。
【０１３９】
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書に定めるように、水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための方法の使用に言及する。
【０１４０】
したがって、本発明は水性調製物中の微生物汚染を検出する、または微生物汚染の量を決定するための方法の使用に言及し、方法は、
ａ）少なくとも１種の粒状物質を含む水性調製物を準備するステップ、
ｂ）少なくとも１種の溶菌剤を準備するステップ、
ｃ）微生物汚染物を含まないＡＴＰが水性調製物中に溶解されるように、水性調製物中に存在する微生物汚染物を溶解するのに十分な濃度でかつ時間の間ステップａ）の水性調製物をステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤と接触させるステップ、
を含み、
ステップｃ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定し、ここでＡＴＰの含有量が＞０であるとき、微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定される。
【０１４１】
少なくとも１種の粒状物質は、ＤＩＮ５３１６３に従って測定される少なくとも６５％のＲｙ白色度を有する白色鉱物である。
【０１４２】
本使用の一実施形態において、ステップａ）の少なくとも１種の粒状物質は、天然粉砕炭酸カルシウム、天然および／または合成の沈降炭酸カルシウム、ドロマイト、表面改質炭酸カルシウム、ハイドロマグネサイト、ハイドロキシアパタイト、カオリン、タルク、バライト、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、二酸化チタンおよびそれらの混合物を含む群から選択され、および好ましくは、少なくとも１種の粒状物質は天然粉砕炭酸カルシウムおよび／または合成沈降炭酸カルシウムを含む。
【０１４３】
本使用の別の実施形態において、ステップａ）の水性調製物は、
（ｉ）２〜１２、好ましくは６〜１２、より好ましくは７〜１０．５のｐＨ値、および／または
（ｉｉ）ＣａＣＯ３乾燥総重量に基づいて、最高８５．０重量％、好ましくは１０．０〜８２．０重量％、より好ましくは２０．０〜８０．０重量％の固形分
を有する。
【０１４４】
本使用のさらに別の実施形態において、ステップａ）の水性調製物は、製紙配合物、紙用コーティング配合物、繊維配合物、食品配合物、医薬製剤、美容配合物、プラスチック配合物および／または塗料配合物である。
【０１４５】
本使用の一実施形態において、少なくとも１種の粒状物質は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に水性調製物の水相から分離されず、および／またはステップａ）の水性調製物は、方法ステップａ）〜ｄ）の間に１００倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されずかつ最も好ましくは希釈されない。
【０１４６】
本使用の別の実施形態において、ＡＴＰは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、カビ、酵母菌、藻類、またはそれらの混合物を含む微生物汚染物に由来する。
【０１４７】
本発明のさらに別の実施形態において、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸（ＰＣＡ）、クエン酸、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、クロルヘキシジン（ＣＨＥＸ）、超音波処理、他の非イオン界面活性剤、陰イオンおよび陽イオン界面活性剤、リソスタフィンまたはリゾチームなどの細菌特異的溶菌酵素、プロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素、抗生物質、アルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシド、ベタン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、プロタミン、アミンおよび陽イオンポリマー、抗菌性ポリマー、細孔形成ポリマー、膜活性ポリマーおよび／または細胞壁活性ポリマー、バクテリオファージ、トリトンＸなどの界面活性剤からなる群から選択される。
【０１４８】
本使用の一実施形態において、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンの存在によって、好ましくは二価陽イオンの存在によって、最も好ましくはステップａ）で準備される水性調製物の少なくとも１種の粒状物質の存在によって阻害されることなく十分な溶菌をもたらす。
【０１４９】
本使用の別の実施形態において、ステップｂ）の少なくとも１種の溶菌剤は、少なくとも１種のキレート剤、好ましくはＥＤＴＡの十分な量とともに供給される。
【０１５０】
本使用のさらに別の実施形態において、ＡＴＰ含有量は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いて決定される。
【０１５１】
本使用の一実施形態において、ステップｃ）およびｄ）は、同時に、または所定の順序で別々に行われる。
【０１５２】
本使用の別の実施形態において、ステップｃ）およびｄ）は、少なくとも１種の溶菌剤を含有するルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いて同時に行われる。
【０１５３】
本使用のさらに別の実施形態において、発光シグナルをモニターすることによってステップｄ）で微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定される。
【０１５４】
本使用の一実施形態において、ルミノメータを使用することによってステップｄ）で微生物汚染の存在が検出される、または微生物汚染の量が決定される。
【０１５５】
本使用の別の実施形態において、微生物汚染の量は、
（ｉ）ステップｃ）の水性調製物中に存在するＡＴＰ含有量を決定すること、
（ｉｉ）水性調製物中に存在するＡＴＰ含量が本質的に完全に加水分解されるように、および／または水性調製物中に存在する微生物汚染物を本質的に完全に死滅させるように、ステップａ）の水性調製物を処理すること、および方法ステップａ）〜ｄ）を通して水性調製物を処理すること、ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定されるＡＴＰ含有量からステップ（ｉｉ）の後に決定されるＡＴＰ含有量を差し引くこと
によってステップｄ）で決定される。
【０１５６】
本発明の方法の技術的詳細を検討する場合、方法およびその好適な実施形態の定義に関して、上の記載をさらに参照されたい。
【０１５７】
検出下限（ＬｏＤ）または定量限界は≦１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは≦１×１０３ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは≦１×１０２ｃｆｕ／ｍＬであることが好ましい。
【０１５８】
以下の実施例はさらに本発明を例示するが、本発明を例示した実施形態に制限することを意図しない。
【０１５９】
実施例
１．材料
炭酸カルシウムスラリーＡ、ＢおよびＣを使用した。これらの炭酸カルシウムスラリーの特徴は、以下の表１に概要を述べる：
【０１６０】
【表１】
2019508019.tif 000003
【０１６１】
２．測定方法
以下の測定方法を用いて、実施例および特許請求項の範囲に示されるパラメータを評価する。
【０１６２】
スラリーｐＨ測定
スラリー（または懸濁液）のｐＨを、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｓｅｖｅｎ  Ｅａｓｙ  ｐＨメーターとＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＩｎＬａｂ（登録商標）ＩｎＬａｂ４１３  ＳＧ  ｐＨ電極を用いて、２０〜２５℃で測定する。機器の３点校正（セグメント方法による）を、２１．７℃で４．０１、７．０および９．２のｐＨ値を有する市販（Ａｌｄｒｉｃｈから）の緩衝液（例えばＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｄｕｒａｃａｌ緩衝液）を用いて最初に行う。既報告のｐＨ値は、機器によって検出されるエンドポイント値である（測定されるシグナルが最後の６秒間にわたる平均と０．１ｍＶ未満異なるときがエンドポイントである）。
【０１６３】
検査された炭酸カルシウムスラリーのｐＨ範囲は、以下の通りである；
・炭酸カルシウムスラリーＡについては、８．５〜１０（１００ｇ／Ｌ［２０℃］）、
・炭酸カルシウムスラリーＢについては、８．５〜１０．７（１００ｇ／Ｌ［２０℃］）、
・炭酸カルシウムスラリーＣについては、８．５〜１１．５（１００ｇ／Ｌ［２０℃］）。
【０１６４】
水性スラリーの固形分
スラリー固形分（「乾燥重量」としても知られている）を、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから市販されているＭｏｉｓｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ＨＲ７３を以下の設定で使用して決定する：温度１２０℃、自動スイッチオフ３、５〜２０ｇのスラリーの標準乾燥。
【０１６５】
粒状炭酸カルシウム含有物質の粒径分布（直径＜Ｘの粒子の質量％）および重量メジアン径（ｄ５０）
粒状炭酸カルシウム含有物質の重量メジアン粒径および粒径質量分布を沈降法、すなわち重量測定場での沈降挙動の分析によって決定した。測定は、Ｓｅｄｉｇｒａｐｈ（商標）５１２０で行なった。あるいは、測定を、レーザー回折によって行なってよく、すなわち、粒子が球体に近いと仮定して、分散された粒状試料をレーザー光が通過するときに散乱光の強度を測定することによって、粒径を粒子体積に関して決定する。測定を、Ｓｙｍｐａｔｅｃ、ＧｅｒｍａｎｙのＨＥＬＯＳ粒径分析器で行ない、粒径分布全体で密度が一定であると仮定して、重量分布と同等と考えることができる。
【０１６６】
方法および機器は、当業者に知られており、充填剤および顔料の粒径を決定するのに一般に使用されている。測定は、０．１重量％のＮａ４Ｐ２Ｏ７の水溶液中で行われる。試料を、高速スターラーと超音波を使用して分散させる。
【０１６７】
密度
密度測定を、ＤＩＮ  ＥＮ  ３２３に従って行なった。
【０１６８】
粘度
本発明のために、「粘度」または「Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度」という用語は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を指す。Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を、この目的のために、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（ＲＶＴ型）粘度計を２５℃±１℃、１００ｒｐｍで、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶ−スピンドルセットの適切なスピンドルを使用して測定し、ｍＰａ・ｓで明示する。当業者は、自身の技術知識に基づいて、測定すべき粘度範囲について適切なＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶスピンドルセットからスピンドルを選択するであろう。例えば、２００と８００ｍＰａ・ｓの間の粘度範囲に対して、スピンドル番号３を使用でき、４００と１７６００ｍＰａ・ｓの間の粘度範囲に対して、スピンドル番号４を使用でき、８００と３２２００ｍＰａ・ｓの間の粘度範囲に対しては、スピンドル番号５を使用できる。
【０１６９】
残留物
残留物をＩＳＯ７８７／７に従って決定した。
【０１７０】
Ｔａｐｐｉ白色度
顔料白色度Ｒ４５７を、ＩＳＯ２４６９：１９９４（ＤＩＮ５３１４５−２：２０００およびＤＩＮ５３１４６：２０００）に従い、Ｄａｔａｃｏｌｏｒ社からのＥＬＲＥＰＨＯ  ３０００を使用して、測定した。
【０１７１】
白色度ＣＩＥ  Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊
ＣＩＥＬＡＢ  Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊座標を、ＤＩＮ６１７４に従いＤａｔａｃｏｌｏｒ社からのＥＬＲＥＰＨＯ  ３０００と、基準として硫酸バリウムを使用して測定した。
【０１７２】
Ｒｙ（Ｃ／２°）
Ｒｙ（Ｃ／２°）を、ＤＩＮ５３１６３に従って決定した。
【０１７３】
３．実施例
実施例１：７５％の固形分を有するＣａＣＯ３スラリーＡ
炭酸カルシウムスラリーＡの３つの試料をオートクレーブ処理した。１０３ｃｆｕ／ｍＬの試料と１０４ｃｆｕ／ｍＬの試料を得るために、オートクレープ処理したスラリーの試料に、定められた細菌種菌を播種した。３種の異なるスラリー試料（オートクレープ処理済み、１０３ｃｆｕ／ｍＬ、１０４ｃｆｕ／ｍＬ）をＧｌｏｍａｘ（登録商標）２０／２０ルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）およびＢａｃＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を用いて２〜５回測定し、細菌を定量するためにＴＳＡプレート上に並行して播いた。
【０１７４】
さらに希釈せずに検査した（検査試薬の添加による全体希釈は２であった）、７５％の固形分を有する炭酸カルシウムスラリーＡの結果を図１に示す。アッセイ感度は、バックグラウンドレベル（ここでは約１，１００ＲＬＵ）を超える測定したすべての試料によって定められるように、約１Ｅ３（１×１０３）ｃｆｕ／ｍＬであった。ＲＬＵを、Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）２０／２０ルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）対ＴＳＡ上で評価したｃｆｕ／ｍＬによって測定した。データポイントは、標準偏差を伴う三つ組の平均を表す。
【０１７５】
実施例２：７０％の固形分を有するＣａＣＯ３スラリーＢ６０
汚染された炭酸カルシウムスラリーＢの試料をオートクレーブ処理した。曲線の異なる点について、オートクレーブ処理したスラリー中で汚染スラリーの１０倍段階希釈を以下の通り調製した。
・１：１０希釈：１ｍＬの汚染されたスラリー（最初の汚染された炭酸カルシウムスラリーＢ）＋９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＢ
・１：１００希釈：１ｍＬの１：１０希釈したスラリー＋９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＢ
・１：１，０００希釈：１ｍＬの１：１００希釈したスラリー＋９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＢ
・１：１０，０００希釈：１ｍＬの１：１，０００希釈したスラリー＋９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＢ
【０１７６】
次いで、異なって希釈したスラリーをＧｌｏｍａｘ（登録商標）２０／２０ルミノメータ（Ｐｏｍｅｇａから入手可能、各希釈スラリーについての測定は３回）およびＢａｃＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を用いて検査し、ＴＳＡプレート上の細菌を定量するために１０倍希釈してＴＳＡ上に播いた。
【０１７７】
結果は以下の通りである：
バックグラウンドレベル用のオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＢ：
・ＴＳＡ上の＜１００ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより１，８６２ＲＬＵ
汚染された炭酸カルシウムスラリーＢ：
・ＴＳＡ上の２００ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより３，７２９ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の２．３６Ｅ＋０３ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより１５，０９０ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の５．１８Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより１３３，９４８ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の１．９８Ｅ＋０５ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより８２５，７５８ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の３．６０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより１，４１７，５７５ＲＬＵ
【０１７８】
さらに希釈せずに検査した（検査試薬の添加による全体希釈は２であった）、７０％の固形分を有するＣａＣＯ３スラリー炭酸カルシウムスラリーＢの結果を図２に示す。アッセイ感度は、バックグラウンドレベル（本明細書では約５Ｅ３ＲＬＵ）を超える全測定試料によって定められるように、約１Ｅ３（１×１０３）ｃｆｕ／ｍＬであった。ＲＬＵを、Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）２０／２０ルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）対ＴＳＡ上で評価したｃｆｕ／ｍＬによって測定した。データポイントは、標準偏差を伴う三つ組の平均を表す。
【０１７９】
実施例３：５０％の固形分を有するＣａＣＯ３スラリーＣ
汚染された炭酸カルシウムスラリーＣの試料をオートクレーブ処理した。曲線の異なる点について、オートクレーブ処理したスラリー中で汚染スラリーの１０倍段階希釈を以下の通り調製した。
・１：１０希釈：１ｍＬの汚染スラリー（最初の汚染された炭酸カルシウムスラリーＣ）＋  ９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＣ
・１：１００希釈：１ｍＬの１：１０希釈したスラリー＋９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＣ
・１：１，０００希釈：１ｍＬの１：１００希釈したスラリー＋９ｍＬのオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＣ
【０１８０】
次いで、異なって希釈したスラリーをＧｌｏｍａｘ（登録商標）２０／２０ルミノメータ（Ｐｏｍｅｇａから入手可能、各希釈スラリーについて測定は３回）およびＢａｃＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を用いて検査し、ＴＳＡプレート上の細菌を定量するために１０倍希釈してＴＳＡ上に播いた。
【０１８１】
結果は以下の通りである：
バックグラウンドレベル用のオートクレーブ処理した炭酸カルシウムスラリーＣ：
・ＴＳＡ上の＜１００ｃｆｕ／ｍＬ、１２，４６４ＲＬＵ
汚染された炭酸カルシウムスラリーＣ：
・ＴＳＡ上の１００ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより１５，３５６ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の８００ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより１９，３９７ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の５．３６Ｅ＋０３ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより６８，３５８ＲＬＵ
・ＴＳＡ上の５．２５Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｍＬ、ルミノメータにより４７６，８９３ＲＬＵ
【０１８２】
さらに希釈せずに（検査試薬の添加による全体希釈は２であった）検査した、５０％の固形分を有する炭酸カルシウムスラリーＣの結果も図３に示す。アッセイ感度は、バックグラウンドレベル（ここでは約２０，０００ＲＬＵ）を超える測定したすべての試料によって定められるように、約１Ｅ２（１×１０２）ｃｆｕ／ｍＬであった。ＲＬＵを、Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）２０／２０ルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）対ＴＳＡ上で評価したｃｆｕ／ｍＬによって測定した。データポイントは、標準偏差を伴う三つ組の平均を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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