(57)【要約】本開示の態様は、ポリヌクレオチドアセンブリのための組成物および方法に関する。いくつかの実施態様において、ターミネーターオリゴヌクレオチドが提供される。
2019503712.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙ−Ｘ−Ｚ−Ｏステムループを含む天然に存在しない核酸配列、ここで：
ａ．Ｙは５〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である；
ｂ．Ｘは３〜１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドは、ＹおよびＺがステムを形成する場合、Ｘ内のいかなる他のヌクレオチドとも塩基対形成しない；
ｃ．Ｚは５〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙと少なくとも７０％の相補性を有している；および
ｄ．Ｏは存在しないか、またはＹとＺとの間に形成されたステムから突出しているオーバーハングであるかのいずれかである。
【請求項２】
Ｘがループを形成する、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
Ｏが縮重配列を含む、請求項１または２に記載の核酸配列。
【請求項４】
１以上のｄＴ−ビオチンを含む、請求項１または２に記載の核酸配列。
【請求項５】
Ｙ−Ｘ−Ｚが配列番号１の配列を有する、請求項１または２に記載の核酸配列。
【請求項６】
天然に存在しない核酸配列のライブラリーであって、各メンバーはＹ−Ｘ−Ｚ−Ｏステムループを含み：
ａ．Ｙは５〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である；
ｂ．Ｘは３〜１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドは、ＹおよびＺがステムを形成する場合、Ｘ内のいかなる他のヌクレオチドとも塩基対形成しない；
ｃ．Ｚは５〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙと少なくとも７０％の相補性を有している；および
ｄ．ＯはＹとＺとの間に形成されたステムから突出しているオーバーハングであり、Ｎ個の縮重位置を有する縮重配列を含む；
ここでライブラリーは少なくとも４Ｎのメンバーを含む。
【請求項７】
各メンバーが１以上のｄＴ−ビオチンを含む、請求項６に記載のライブラリー。
【請求項８】
全てのメンバーが同一のＹ−Ｘ−Ｚを有する、請求項６または７に記載のライブラリー。
【請求項９】
Ｙ−Ｘ−Ｚが配列番号１の配列を有する、請求項８に記載のライブラリー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の核酸配列を核酸分子に結合することを含む、核酸分子を修飾する方法。
【請求項１１】
前記結合が連結を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
以下を含む、標的核酸をアセンブルする方法：
ａ．５’末端構成オリゴヌクレオチド、少なくとも１つの中央の構成オリゴヌクレオチドおよび３’末端構成オリゴヌクレオチドをアセンブルする、ここで各構成オリゴヌクレオチドは２つの付着末端を有し、所定の順番で完全にアセンブルする場合に構成オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのサブコンストラクトを形成するように、少なくとも１つの付着末端が別の構成オリゴヌクレオチドの付着末端に適合し、ここで５’末端構成オリゴヌクレオチドは５’プライマー結合部位を有し、３’末端構成ヌクレオチドは３’プライマー結合部位を有する；
ｂ．ターミネーターを工程（ａ）からのアセンブリ産物の両端に結合させる、ここでターミネーターはアセンブリ産物のオーバーハングに適合するオーバーハングを有する；および
ｃ．完全なアセンブリ産物を、５’プライマー結合部位および３’プライマー結合部位に対するプライマーを用いて選択的に増幅する。
【請求項１３】
以下を含む、標的核酸をアセンブルする方法：
ａ．５’末端構成オリゴヌクレオチド、少なくとも１つの中央の構成オリゴヌクレオチドおよび３’末端構成オリゴヌクレオチドをアセンブルする、ここで少なくとも１つの中心の各構成オリゴヌクレオチドは、所定の順番で完全にアセンブルされる場合に構成オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのサブコンストラクトを形成するように、それぞれが別の構成オリゴヌクレオチドの付着末端に適合する２つの付着末端を有し、ここで５’末端構成オリゴヌクレオチドは５’平滑末端を有し、３’末端構成ヌクレオチドは３’平滑末端を有する；
ｂ．ターミネーターを工程（ａ）からの部分的なアセンブリ産物に結合させる、ここでターミネーターは部分的なアセンブリ産物のオーバーハングに適合するオーバーハングを有し、ターミネーターは標識を含む；および
ｃ．部分的なアセンブリ産物を標識の結合パートナーを用いて除去する。
【請求項１４】
５’末端構成オリゴヌクレオチドが５’プライマー結合部位を有し、３’末端構成オリゴヌクレオチドが３’プライマー結合部位を有し、該方法がさらに、完全なアセンブリ産物を５’プライマー結合部位および３’プライマー結合部位に対するプライマーを用いて増幅することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標識がビオチンであり、結合パートナーがアビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンのうち１つまたはそれ以上である、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／２７０，１３１号の利益および優先権を主張し、この開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、インビトロ(in vitro)の核酸合成およびアセンブリのための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換え核酸および合成核酸は、研究、工業、農業および医学において多くの応用がある。組換え核酸および合成核酸は、大量のポリペプチド（酵素、抗体、成長因子、受容体、および医学、工業または農業の多様な目的で使用され得る他のポリペプチドを含む）を発現し、取得するために使用され得る。組換え核酸および合成核酸はまた、遺伝子組み換え生物（組換え細菌、酵母、哺乳類、植物、および他の生物を含む）を作製するのに使用され得る。遺伝子組み換え生物は、研究（例えば、疾患の動物モデルとして、生物学的プロセスを理解するためのツールとして、など）、工業（例えば、タンパク質発現のためのホスト生物として、工業製品を作製するためのバイオリアクターとして、環境修復のためのツールとして、工業的な用途を有する天然化合物の単離または改変のため、など）、農業（例えば、収量が増加し、または疾患もしくは環境ストレスに対する抵抗性が増加した組み換え作物など）および他の応用において使用され得る。組換え核酸および合成核酸はまた、治療用組成物（例えば、遺伝子発現の改変のため、遺伝子治療のため、など）または診断ツール（例えば、病状のためのプローブとしてなど）として使用され得る。
【０００４】
既存の核酸（例えば、天然に存在する核酸）を改変し、組換え核酸を作製するための多数の技術が開発されている。例えば、核酸の増幅、変異誘発、ヌクレアーゼ消化、連結、クローニングおよび他の技術の組合せが、多種の組換え核酸を作成するのに使用され得る。化学的に合成されたポリヌクレオチドは、核酸増幅、変異誘発およびクローニングのためのプライマーまたはアダプターとしてよく使用される。
【０００５】
また、デノボ(de novo)核酸アセンブリのための技術が開発されており、これによって核酸が作成（例えば、化学合成）およびアセンブルされ、対象のより長い標的核酸が作成される。例えば、オリゴヌクレオチドを研究、工業、農業および／または医学に使用できるより大きな合成核酸にアセンブルするための種々のマルチプレックスアセンブリ技術が開発されている。しかしながら、現在利用できるアセンブリ技術の一つの制限は、相対的に高いエラー率および特定の遺伝子をアセンブルできないこと（例えば、高いＧＣ含量または解析の困難性による）である。したがって、改善されたアセンブリ方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示のある態様は、Ｙ−Ｘ−Ｚ−Ｏステムループを含む天然に存在しない核酸配列に関し、ここで：
ａ．Ｙは５〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である；
ｂ．Ｘは３〜１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドは、ＹおよびＺがステムを形成する場合、Ｘ内のいかなる他のヌクレオチドとも塩基対形成しない；
ｃ．Ｚは５〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙと少なくとも７０％の相補性を有する；および
ｄ．Ｏは存在しないか、またはＹとＺとの間に形成されたステムから突出しているオーバーハングであるかのいずれかである。
【０００７】
いくつかの実施態様において、Ｘはループを形成する。Ｙは５’からＸまで、または３’からＸまでであり得ることに注意すべきである。言い換えると、Ｏは５’突出／オーバーハングまたは３’突出／オーバーハングであり得る。
【０００８】
Ｏは、縮重配列を含み得る（例えば、近接していてもよく、または近接していなくてもよいＮ個の縮重位置を有する、ここでＮは任意の整数である）。核酸配列は、１以上のｄＴ−ビオチンを含み得る。ある実施態様において、Ｙ−Ｘ−Ｚ部分は、配列番号１の配列を有する。
【０００９】
別の態様は、天然に存在しない核酸配列のライブラリーに関し、各メンバーはＹ−Ｘ−Ｚ−Ｏステムループを含み、ここで：
ａ．Ｙは５〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である；
ｂ．Ｘは３〜１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドは、ＹおよびＺがステムを形成する場合、Ｘ内のいかなる他のヌクレオチドとも塩基対形成しない；
ｃ．Ｚは５〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙと少なくとも７０％の相補性を有する；および
ｄ．ＯはＹとＺとの間に形成されたステムから突出している５’または３’オーバーハングであり、Ｎ個の縮重位置を有する縮重配列を含む；
ここでライブラリーは少なくとも４Ｎのメンバーを含む。
【００１０】
いくつかの実施態様において、ライブラリーの各メンバーは、１以上のｄＴ−ビオチンを含み得る。全てのメンバーまたはそのサブセットは同一のＹ−Ｘ−Ｚを有し得る。ある実施態様において、各メンバーのＹ−Ｘ−Ｚ部分またはそのライブラリーメンバーのサブセットは配列番号１の配列を有する。
【００１１】
さらなる態様は、本明細書に開示される核酸配列（例えばターミネーター）を核酸分子に結合することを含む、核酸分子を修飾する方法に関する。いくつかの実施態様において、結合の工程は連結を含む。
【００１２】
さらなる態様は、標的核酸をアセンブルする方法に関し、これは以下を含む：
ａ．５’末端構成オリゴヌクレオチド、少なくとも１つの中央の構成オリゴヌクレオチド、および３’末端構成オリゴヌクレオチドをアセンブルする、ここで各構成オリゴヌクレオチドは２つの付着末端を有し、所定の順番で完全にアセンブルする場合に構成オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのサブコンストラクトを形成するように、少なくとも１つの付着末端が別の構成オリゴヌクレオチドの付着末端に適合し、ここで５’末端構成オリゴヌクレオチドは５’プライマー結合部位を有し、３’末端構成オリゴヌクレオチドは３’プライマー結合部位を有する；
ｂ．ターミネーターを工程（ａ）からのアセンブリ産物の両端に結合させる、ここでターミネーターはアセンブリ産物のオーバーハングに適合するオーバーハングを有する；および
ｃ．完全なアセンブリ産物を、５’プライマー結合部位および３’プライマー結合部位に対するプライマーを用いて選択的に増幅する。
【００１３】
標的核酸をアセンブルするさらに別の方法が本明細書において提供され、これは以下を含む：
ａ．５’末端構成オリゴヌクレオチド、少なくとも１つの中央の構成オリゴヌクレオチド、および３’末端構成オリゴヌクレオチドをアセンブルする、ここで少なくとも１つの中心の各構成オリゴヌクレオチドは、所定の順番で完全にアセンブルする場合に構成オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのサブコンストラクトを形成するように、それぞれが別の構成オリゴヌクレオチドの付着末端に適合する２つの付着末端を有し、ここで５’末端構成オリゴヌクレオチドは５’平滑末端を有し、３’末端構成ヌクレオチドは３’平滑末端を有する；
ｂ．ターミネーターを工程（ａ）からの部分的なアセンブリ産物に結合させる、ここでターミネーターは部分的なアセンブリ産物のオーバーハングに適合するオーバーハングを有し、ターミネーターは標識を含む；および
ｃ．部分的なアセンブリ産物を標識の結合パートナーを用いて除去する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、５’末端構成オリゴヌクレオチドは５’プライマー結合部位を有し、３’末端構成オリゴヌクレオチドは３’プライマー結合部位を有し、ここで該方法はさらに、完全なアセンブリ産物を、５’プライマー結合部位および３’プライマー結合部位に対するプライマーを用いて増幅することを含む。ある実施態様において、部分的なアセンブリ産物の除去を促進するために、標識はビオチンであり得、結合パートナーはアビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンのうち１つまたはそれ以上であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、サブコンストラクトのサブアセンブリ中でのターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。
【００１６】
【図２Ａ】図２Ａは、標的のアセンブリ中でのターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、標的のアセンブリ中でのターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。
【００１７】
【図３】図３は、サブアセンブリ中でのビオチン−ターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。
【００１８】
【図４】図４は、ビオチンを含む、および含まないターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な設計を示す。
【００１９】
【図５】図５は例示的なアセンブリ戦略を示す。
【００２０】
【図６】図６は例示的なターミネーターオリゴヌクレオチドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示の態様は、核酸分子のアセンブリのための組成物および方法に関する。本開示の態様はさらに、オリゴヌクレオチド（例えば、構成オリゴまたはサブコンストラクト）からヘアピン含有ターミネーターオリゴヌクレオチドを用いてポリヌクレオチド（例えば、標的核酸またはサブアセンブリ中間体）をアセンブルするための組成物および方法に関する。いくつかの実施態様において、本明細書に開示されるターミネーターオリゴヌクレオチドは、アセンブリ効率および／または正確性を改善し得、望ましくないまたは不正確なアセンブリ産物の除去に役立ち得る。
【００２２】
標的核酸をアセンブルするための一つの戦略は、標的核酸の配列を分析し、それを互いに適合する（例えば相補的な）付着末端を有する２以上の構成オリゴヌクレオチドに、２以上の構成オリゴヌクレオチドが共に標的核酸にアセンブル（例えば、連結）され得るようにパース(parse)することである。アセンブリは、階層的、連続的および／または１段階のアセンブリを用いて実行され得る。例示のみの目的で、オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤ（それぞれは構成オリゴヌクレオチドである）のＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ標的への階層的アセンブリは、Ａ＋ＢおよびＣ＋Ｄ（それぞれはサブコンストラクトまたはサブアセンブリである）を最初にアセンブルし、次いでＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄをアセンブルすることを含み得る。連続的なアセンブリは、Ａ＋Ｂ（第１のサブコンストラクトまたはサブアセンブリ）をアセンブルし、次いでＡ＋Ｂ＋Ｃ（第２のサブコンストラクトまたはサブアセンブリ）をアセンブルし、最後にＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ（標的）をアセンブルすることを含み得る。１段階のアセンブリは、１つの反応においてＡ、Ｂ、ＣおよびＤを組み合わせ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄを生成する。構成オリゴヌクレオチドの一部をある戦略を用いてアセンブルし、別の部分を異なる戦略を用いてアセンブルする場合に、種々の戦略が混合し得ることに注意すべきである。
【００２３】
構成オリゴヌクレオチドは（例えば、以下でより詳細に記述される固相担体上で）化学的に合成され得る。いくつかの実施態様において、構成オリゴヌクレオチドは、１以上の構成オリゴヌクレオチドの増幅を必要とせずに、直接のサブアセンブリまたは全体のアセンブリを可能とするのに十分な量合成され得る。ある実施態様において、化学合成後の構成オリゴヌクレオチドは、最初にサブコンストラクトへのサブアセンブリを受け得、サブコンストラクトは（例えばポリメラーゼに基づく反応において）増幅され得、次いで第２のサブコンストラクトまたは最終標的へのさらなるアセンブリを受け得る。いくつかの実施態様において、１以上の構成オリゴヌクレオチドがアセンブリ前に増幅され得る。
【００２４】
増幅を促進するために、１以上の構成オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトは、プライマーがポリメラーゼ連鎖反応において結合またはアニールできる１以上のプライマー結合部位を含むように設計され得る。プライマー結合部位は、全ての構成オリゴヌクレオチドもしくはそのサブセット、または２以上のサブコンストラクトに共通（すなわち、同一）するように設計され得る。ユニバーサルプライマー結合部位（および対応するユニバーサルプライマー）を用いて、そのようなユニバーサルプライマー結合部位を有する全ての構成オリゴヌクレオチドまたはサブコンストラクトをポリメラーゼ連鎖反応において増幅できる。１以上の選択された構成オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトに特異的なプライマー結合部位はまた、選択された構成オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトを標的とした特異的な増幅を可能にするように設計され得る。いくつかの実施態様において、１以上の構成オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトは、１以上の外側のプライマーおよび内側のプライマーが結合し得る一方または両方の末端に、ネスト化した、または連続的なプライマー結合部位を含み得る。ある実施例において、構成オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトはそれぞれ、外側のプライマー対および内側のプライマー対のための結合部位を有する。外側のプライマー対の一方または両方はユニバーサルプライマーであり得る。あるいは、外側のプライマー対の一方または両方は固有のプライマーであり得る。いくつかの実施態様において、アセンブリ前に、各構成オリゴヌクレオチドは個別に増幅される。構成オリゴヌクレオチドはまた、増幅のための１以上のプールにプールされ得る。ある実施例において、全ての構成オリゴヌクレオチドを単一のプールで増幅する。特定の実施態様において、増幅された構成オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼに基づくアセンブリまたは連結を介してアセンブルされる。増幅された構成オリゴヌクレオチドは、階層的もしくは連続的に、または一段階の反応において、標的核酸にアセンブルされ得る。
【００２５】
１以上のプライマー結合部位は、最終標的核酸に組み込まれる構成オリゴヌクレオチドの一部となるように設計され得る。いくつかの実施態様において、各プライマー結合部位の全部または一部は、構成オリゴヌクレオチドの中心部の外側の隣接領域の形式であり得、ここで中心部は最終標的核酸に組み込まれ、隣接領域はアセンブリ前に除去される必要がある。このため、１以上の制限部位が隣接領域の除去を可能にするように設計され得る。
【００２６】
１以上の上記工程が、ターミネーターオリゴヌクレオチドの使用によって促進され得る。例えば、サブアセンブリおよび／またはアセンブリ中に、不完全なサブアセンブリ産物またはアセンブリ産物（例えば、１以上の構成オリゴヌクレオチドがサブコンストラクトまたは最終コンストラクトから欠損している場合）が存在し得る。これらの不完全な産物はサイズが近いため、完全に正しくアセンブルされた産物から除去または分離することは困難である。続くポリメラーゼに基づく増幅において、不完全な分子は大抵、完全なアセンブリ産物と共に増幅される。不完全な産物の増幅を抑制するために、ターミネーターオリゴヌクレオチドが、完全なアセンブリ産物の増幅に影響を与えることなく不完全な産物の増幅を不利にするように、サブアセンブリ産物またはアセンブリ産物の一方または両方の末端に結合し得る。ターミネーターオリゴヌクレオチドは、続く除去のために結合パートナーに結合され得る１以上の標識（ビオチンおよび／またはジゴキシゲニンなど）を含み得る。このように、正確なアセンブリ産物が濃縮および／または精製され得る。
【００２７】
定義
利便性のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において利用される特定の用語を以下にまとめる。他に定義されない限り、本明細書における全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の通常の技術を有する者によって一般的に理解される意味と同じ意味を持つ。
【００２８】
本明細書における冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つよりも多い（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法上の対象を指す。例示の目的で、「要素(an element)」は１つの要素または１よりも多い要素を意味する。
【００２９】
本明細書において、用語「約」は２０％以内を意味し、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内を意味する。用語「実質的」は５０％よりも大きいことを意味し、好ましくは８０％よりも大きく、最も好ましくは９０％または９５％よりも大きいことを意味する。
【００３０】
本明細書において、「複数」は１よりも多い（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれ以上、例えば、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくはそれ以上またはそれらの間の任意の整数）ことを意味する。
【００３１】
「アセンブリ」は、短いＤＮＡ配列（構成オリゴヌクレオチド）が特定の順番で結合し、より長いＤＮＡ配列（標的）を形成する方法を意味する。「サブアセンブリ」は、構成オリゴヌクレオチドのサブセットが結合し、最終標的の一部であるサブコンストラクトを形成する場合の中間の工程または産物を意味する。
【００３２】
「ＣＥＬ」または「付着末端連結」は、互いに少なくとも部分的に相補的な付着末端を用いて、所定の順番でＤＮＡフラグメントを連結する方法を指す。付着末端は、制限酵素消化によって生成され得、または固相担体上で直接合成され得る。
【００３３】
本明細書において、「チップ」は、平面に結合した多くのオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡマイクロアレイを指す。チップ上のオリゴヌクレオチドは任意の長さであり得る。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは約２００ヌクレオチド以下である。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得る。
【００３４】
用語「相補的」または「相補性」は、２つの核酸配列が標準的なワトソン−クリックの相補性規則に従って、少なくとも部分的に塩基対形成できることを意味する。例えば、２つの粘着末端は部分的に相補的であり得、ここであるオーバーハング領域は別のオーバーハング領域または別の全てのオーバーハングと相補的であり、アニールする。ギャップは、ポリメラーゼおよび単一のヌクレオチドの存在下で鎖伸長によって埋められ得、その後または同時に連結反応が起こる。
【００３５】
「コンストラクト」は、完全な標的配列を含むＤＮＡ配列を指す。一般に、コンストラクトはアセンブルされていることを意味する。「サブコンストラクト」は、典型的に階層的なアセンブリ中の中間の産物である、完全な標的配列の一部を意味する。
【００３６】
本明細書において、「溶出物」は、チップから切断され、さもなければ取り出され、溶液にプールされた複数のオリゴヌクレオチドの混合物を指す。
【００３７】
本明細書における「ライブラリー」は、オリゴヌクレオチド（例えば、ターミネーター）の多様な収集物または混合物を指す。特定の実施態様において、ライブラリーは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０．．．２４、３４、４４、５４．．．Ｎ４個のメンバーを含み得、ここでＮは任意の整数である（例えば、ターミネーターの縮重部分の長さを示す）。
【００３８】
本明細書における「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」、または他の文法上相当するものは、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を意味する。ポリヌクレオチドは任意の長さ（例えば、２０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００などを含む）のポリマーである。本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの共有結合したヌクレオチド残基を含む核酸分子であり得る。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは１０〜１，０００ヌクレオチド長であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは１０〜５００ヌクレオチド長または５００〜１，０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約２０〜約３００ヌクレオチド長（例えば、約３０〜２５０、約４０〜２２０ヌクレオチド長、約５０〜２００ヌクレオチド長、約６０〜１８０ヌクレオチド長、または約６５〜約１５０ヌクレオチド長）、約１００〜約２００ヌクレオチド長、約２００〜約３００ヌクレオチド長、約３００〜約４００ヌクレオチド長、または約４００〜約５００ヌクレオチド長であり得る。しかしながら、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドも使用され得る。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に用いられ、ヌクレオチドの天然に存在するポリマー形態、または天然に存在しない合成ポリマー形態を指す。一般に、用語「核酸」は「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の両方を含み、「ポリヌクレオチド」はより長い核酸（例えば１，０００ヌクレオチドより大きい、５，０００ヌクレオチドより大きい、１０，０００ヌクレオチドより大きい、など）を指し得、「オリゴヌクレオチド」はより短い核酸（例えば、１０〜５００ヌクレオチド、２０〜４００ヌクレオチド、４０〜２００ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチドなど）を指し得る。
【００３９】
本開示の核酸分子は、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子を形成する、天然に存在するヌクレオチドから形成され得る。あるいは、天然に存在する核酸は、その性質を変化させる構造修飾（ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）など）を含み得る。天然に存在する塩基または人工塩基を用いる核酸分子の固相合成は当分野で周知である。この用語は、相当するもの、ヌクレオチド類似体から作成されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を含み、記載された実施例に適用可能なものとして、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるはずである。本開示に有用なヌクレオチドは、例えば、天然に存在するヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）またはヌクレオチドの天然の修飾もしくは合成的修飾、または人工塩基を含む。いくつかの実施態様において、核酸の配列は天然に存在しない（例えば、ｃＤＮＡもしくは相補的ＤＮＡ配列、または人工的に設計された配列）。
【００４０】
核酸ヌクレオシドは通常、リン酸ジエステル結合によって結合している。核酸が文字列によって表される場合は常に、ヌクレオシドは左から右に５’から３’の順であることが理解される。ＩＵＰＡＣの表記法に従って、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、「Ｔ」はデオキシチミジンを意味し、「Ｕ」はリボヌクレオシドであるウリジンを意味する。さらに、２種以上のヌクレオチドがその位置に生じ得る場合に使用される文字もある：「Ｗ」（すなわち、弱い結合）はＡまたはＴを表し、「Ｓ」（強い結合）はＧまたはＣを表し、「Ｍ」（アミノ）はＡまたはＣを表し、「Ｋ」（ケト）はＧまたはＴを表し、「Ｒ」（プリン）はＡまたはＧを表し、「Ｙ」（ピリミジン）は、ＣまたはＴを表し、「Ｂ」はＣ、ＧまたはＴを表し、「Ｄ」はＡ、ＧまたはＴを表し、「Ｈ」はＡ、ＣまたはＴを表し、「Ｖ」はＡ、ＣまたはＧを表し、「Ｎ」は任意の塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ（Ｕ）を表す。核酸配列は、４つの天然デオキシヌクレオチドに限定されず、リボヌクレオシドおよび非天然のヌクレオチドを含み得ることが理解される。ヌクレオチド配列中の「／」または括弧内に与えられたヌクレオチドは代替のヌクレオチドを指す（ＤＮＡ配列中のＴの代わりとなるＲＮＡ配列中の代替のＵなど）。したがって、Ｕ／ＴまたはＵ（Ｔ）は、ＵまたはＴのいずれかであり得る１つのヌクレオチド位置を示す。同様に、Ａ／ＴはヌクレオチドＡまたはＴを指し；Ｇ／ＣはヌクレオチドＧまたはＣを指す。ＵとＴとの間の機能的同一性により、本明細書におけるＵまたはＴへのあらゆる言及は、ＴまたはＵの他方としての開示としても理解される。例えば、（ＲＮＡの）配列ＵＵＣＧへの言及は（対応するＤＮＡの）配列ＴＴＣＧの開示としても理解される。単純性のみのために、これらの選択肢の１つのみが本明細書で記述される。相補的なヌクレオチドまたは塩基は、塩基対形成できるヌクレオチドまたは塩基（ＡおよびＴ（またはＵ）；ＧおよびＣ；ＧおよびＵなど）である。
【００４１】
動詞として使用される場合、「パースする」は標的配列をアセンブリに適合するフラグメントに切断する方法を指す。いくつかの実施態様において、適合するフラグメントは、フラグメントが所定の順に連結することを可能にする、適合する粘着末端を有する。名詞として使用される場合、「パース」は、より大きなＤＮＡ配列に共にアセンブルされ得る一組のフラグメントを意味する。
【００４２】
一般に、「ステムループ」配列（「ヘアピン」と互換的に用いられる）は、互いに逆相補体である単一のＤＮＡまたはＲＮＡ分子内の少なくとも２つの領域が、相補的領域がハイブリダイズして「ステム」を形成し、非相補的領域が「ループ」を形成するように、１以上の非相補的領域によって分離されている配列を指す。
【００４３】
「標的」は、本明細書で開示される１以上の方法を用いて合成またはアセンブルされる、（例えば、顧客に注文されるような）既知のヌクレオチド配列の核酸を意味する。
【００４４】
「ターミネーター」、「ターミネーターオリゴヌクレオチド」または「ターミネーターオリゴ」は、ステム部分の自由端が別の核酸配列（例えば、構成オリゴヌクレオチドまたはサブコンストラクト）と結合（例えば連結）し得る、ステムループを含む核酸配列を指す。ステム部分は、高い融解温度（例えば、６５℃より高い温度、６８℃より高い温度、７０℃より高い温度または７２℃より高い温度）を持つように設計され得る。ステム部分は一度結合すると、温度がその融解温度よりも低い場合に自己アニールする傾向があり、これによって結合した核酸がさらなる反応（ポリメラーゼ連鎖反応など）に関与することを防ぐ。ターミネーターは、結合パートナーとの結合により（結合している核酸と共に）ターミネーターの除去を促進する、１以上の標識（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）を含むように設計され得る。
【００４５】
本明細書において、「包含する」、「含む」、「有する」、「含有する」、「伴う」およびその変形は、その後に記載された項目およびそれに相当するもの、ならびにさらなる項目を包含することを意味する。「からなる」は、要素または特徴の限定された範囲に関してクローズドエンド(close-ended)として理解される。「から本質的になる」は特定の要素または工程の範囲を限定するが、特許請求の範囲に記載された発明の基本的および新規な特徴に実質的に影響を与えない要素または工程を除外しない。
【００４６】
本明細書において、組換え核酸技術、合成生物学、および分子生物学の分野で使用される他の用語は、適合する分野の当業者によって一般的に理解される。
【００４７】
合成オリゴヌクレオチド
典型的に、オリゴヌクレオチド合成は、伸長しているオリゴヌクレオチド鎖に１つのヌクレオチドを付加する各サイクルを含む合成の至る所で、サイクルを反復する様式で実行される多数の化学的工程を含む。サイクル中に含まれる化学的工程は、さらなる鎖伸長のために官能基を遊離させる脱保護の工程、合成されるオリゴヌクレオチドにヌクレオチドを組み込む結合の過程、およびオリゴヌクレオチド合成において使用される特定の化学に必要な他の工程（ホスホロアミダイトの化学に必要な酸化の工程など）である。場合により、結合の工程において伸長しなかったこれらの官能基をブロックするキャッピングの工程がサイクル中に挿入され得る。ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成が３’→５’方向に行われている場合、末端ヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基に付加され得、またはオリゴヌクレオチド合成が５’→３’方向に行われている場合、末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基に付加され得る。
【００４８】
明確性のために、本明細書において二本鎖核酸の２つの相補鎖をプラス鎖（Ｐ）およびマイナス鎖（Ｎ）と呼ぶ。この指定は、これらの鎖がコード配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖であることを意味することを意図しない。これらは、核酸の配列または機能に関わらず、核酸（例えば、標的核酸、中間の核酸フラグメントなど）の２つの相補鎖であることのみを指す。したがって、いくつかの実施態様において、Ｐ鎖はコード配列のセンス鎖であり得るが、他の実施態様において、Ｐ鎖はコード配列のアンチセンス鎖であり得る。本明細書において、相補的な核酸または相補的な核酸領域の言及は、それらが天然ＤＮＡに典型的な逆平行の様式でハイブリダイズできるように、互いに逆相補体である配列を有する核酸またはその領域を指すことが認識されるはずである。
【００４９】
本開示のいくつかの態様において、本明細書に記述される方法に従って合成あるいは調製されたオリゴヌクレオチドは、対象の標的ポリヌクレオチドのアセンブリのための構成要素として使用され得る。
【００５０】
オリゴヌクレオチドは固相担体上で合成され得る。本明細書において、用語「固相担体」、「担体」および「支持体」は互換的に用いられ、ポリマー（核酸など）が合成または固定化される、多孔性または非多孔性の溶媒不溶性物質を指す。本明細書において、「多孔性」は、物質が実質的に均一な直径（例えばｎｍ領域）の孔を含むことを意味する。多孔性物質は、限定されないが、紙および合成フィルターなどを含み得る。そのような多孔性物質において、反応は孔の内部で起こり得る。担体は、多数の形状（ピン、細片、プレート、ディスク、ロッド、ベンド(bend)、円柱構造、粒子（ビーズおよびナノ粒子など）など）のいずれか１つを有し得る。いくつかの実施態様において、担体は平面状（例えばチップ）である。担体は可変の幅を有し得る。
【００５１】
担体は親水性であり得、または親水性にすることができる。担体は、無機粉末（シリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナなど）；天然高分子材料、特にセルロース系材料およびセルロース由来の材料（繊維含有紙など、例えば濾紙、クロマトグラフィーの紙など）；合成または修飾された天然に存在するポリマー（ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリル酸塩、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、ポリ（エチレンテレフタラート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ガラス、調節多孔ガラス(controlled pore glass)、磁性調節多孔ガラス、セラミックス、および金属など）；それら単独または他の材料と組み合わせて使用されるいずれかを含み得る。
【００５２】
いくつかの実施態様において、複数の異なる一本鎖オリゴヌクレオチドが、種々の特徴の固相担体に固定化される。いくつかの実施態様において、担体に結合するオリゴヌクレオチドはその５’末端または３’末端を介して付着し得る。いくつかの実施態様において、担体に結合するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、縮重した結合配列）、リンカー（例えば、光切断リンカーまたは化学リンカー）を介して担体上に固定化され得る。３’末端は５’末端の下流の配列を意味し、５’末端は３’末端の上流の配列を意味することが認識されるはずである。例えば、オリゴヌクレオチドは、後続の反応に関与しないヌクレオチド配列またはリンカーを介して担体上に固定化され得る。
【００５３】
本開示の特定の実施態様は、不活性な支持体および多孔性反応層から構成される固相担体を利用し得る。多孔性反応層は、予め合成されたオリゴヌクレオチドの固定化のため、またはオリゴヌクレオチドの合成のための化学的機能性を提供し得る。いくつかの実施態様において、アレイの表面を、核酸の固定化または共有結合に適した反応基を含む物質で処理または被覆してもよい。オリゴヌクレオチドの固定化またはインサイチュ(in situ)の合成に適した反応基を有する、当分野で公知のあらゆる物質が使用され得る。
【００５４】
いくつかの実施態様において、多孔性反応層は反応性ヒドロキシ基を含むように処理され得る。例えば、多孔性反応層はスクロースを含み得る。
【００５５】
本開示のいくつかの態様において、３’ホスホリル基で終結するオリゴヌクレオチドは、固相担体に結合した化学リン酸化試薬を含む固相担体上で３’→５’方向に合成され得る。いくつかの実施態様において、リン酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの合成前に、多孔性層に共役され得る。例示的な実施態様において、リン酸化試薬はスクロースと共役し得る。例えば、リン酸化試薬は２−［２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エチル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトであり得る。いくつかの実施態様において、３’リン酸化オリゴヌクレオチドは固相担体から放出され得、本明細書に記述される方法に従って後続の修飾を受け得る。いくつかの実施態様において、３’リン酸化オリゴヌクレオチドは水酸化アンモニウムを用いて固相担体から放出され得る。
【００５６】
いくつかの実施態様において、アセンブリ用の合成オリゴヌクレオチドが設計され得る（例えば、配列、サイズおよび順番）。合成オリゴヌクレオチドは標準的なＤＮＡ合成技術（例えば、ホスホロアミダイト法）を用いて作製され得る。合成オリゴヌクレオチドは、本明細書においてより詳細に記述される任意の適切な技術を用いて、固相担体（マイクロアレイなど）上で合成され得る。オリゴヌクレオチドは、増幅を受ける前にマイクロアレイから溶出され得、またはマイクロアレイ上で増幅され得る。種々のオリゴヌクレオチドが種々の長さを有するように設計され得ることが認識されるはずである。
【００５７】
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、米国特許第７，５６３，６００号、米国特許出願第１３／５９２，８２７号およびＷＯ２０１４／００４３９３号に記述されるように（例えばアレイフォーマット上で）合成され得、これらは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは共通の担体上でインサイチュにおいて合成され、ここで各オリゴヌクレオチドは支持体上の別々の、または分離した機構(discrete feature)（またはスポット）上で合成される。いくつかの実施態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドは担体または機構の表面と結合する。本明細書において、用語「アレイ」は、オリゴヌクレオチドまたはさらなる反応のための相補的なオリゴヌクレオチドを保存、送達(route)、増幅および放出するための分離した機構の配置を指す。アレイは平面状であり得る。ある実施態様において、担体またはアレイはアドレス可能(addressable)である：担体は、担体上の特定の所定の位置（すなわち「アドレス」）に、２以上のアドレス可能な分離した機構を含む。したがって、アレイの各オリゴヌクレオチド分子は、担体上の既知の規定された位置に局在する。各オリゴヌクレオチドの配列は、担体上の位置から決定され得る。さらに、アドレス可能な担体またはアレイは、個々の分離された体積（液滴など）の直接的な制御を可能にする。規定された機構のサイズは、機構上に微小体積の液滴の形成を可能にするように選択され得、各液滴は互いに分離した状態で保持される。本明細書に記述されるように、機構は典型的に、必ずではないが、２つの隣接する機構間の液滴が混合しないことを保証する機構間の空間によって分離されている。機構間は典型的に、その表面上にいかなるオリゴヌクレオチドも保有せず、不活性な空間に対応する。いくつかの実施態様において、機構および機構間はそれらの親水性または疎水性の性質において異なり得る。
【００５８】
オリゴヌクレオチドは一本鎖核酸であり得る。しかしながら、いくつかの実施態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドが本明細書に記述されるように使用され得る。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは本明細書に記述されるように化学合成され得る。いくつかの実施態様において、核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）は使用前に増幅され得る。得られた生成物は二本鎖であり得る。１以上の修飾塩基（例えばヌクレオチド類似体）が組み込まれ得る。修飾の例は、限定されないが、以下のうち１つ以上を含む：メチル化塩基（シトシンおよびグアニンなど）；ユニバーサル塩基（ニトロインドール、ｄＰおよびｄＫ、イノシン、ウラシルなど）；ハロゲン化塩基（ＢｒｄＵなど）；蛍光標識された塩基；非放射性標識（ビオチン（ｄＴの誘導体として）およびジゴキシゲニン（ＤＩＧ）など）；２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；放射性ヌクレオチド；共役後修飾（ｄＲ−ＮＨ−２（デオキシリボース−ＮＥｂ）など）；アクリジン（６−クロロ−２−メトキシアクリジン）；およびスペーサー「アーム」を配列内に付加するための合成中に使用されるスペーサーホスホルアミド（Ｃ３、Ｃ８（オクタンジオール）、Ｃ９、Ｃ１２、ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）およびＣ１８など）。
【００５９】
様々な実施態様において、合成一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドは天然に存在しなくてもよい（例えば、それらがヘミメチル化（一方の鎖のみがメチル化されている）またはセミメチル化（一方または両方の鎖における通常のメチル化部位の一部のみがメチル化されている）または低メチル化（一方または両方の鎖における通常のメチル化部位よりも多くの部位がメチル化されている）され、または天然に存在しないメチル化パターン（通常のメチル化部位のいくつかが一方または両方の鎖においてメチル化され、かつ／または通常非メチル化されている部位がメチル化されている）を有するような方法で、非メチル化または修飾された（例えば、インビトロにおいて化学的または生化学的に修飾された）オリゴヌクレオチド）。対照的に、天然に存在するＤＮＡは典型的に、（例えばインビボでのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によるＤＮＡのシトシン環のＣ５位における）メチル化などのエピジェネティック修飾を含む。ＤＮＡメチル化は、Jin et al., Genes & Cancer 2011 Jun; 2(6): 607-617に概説され、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００６０】
ターミネーターオリゴヌクレオチドの設計
ある態様において、天然に存在しない人工のターミネーターが本明細書で提供される。いくつかの実施態様において、ターミネーターは１以上のステムループ配列を含み得る。いくつかの場合において、ステムループ配列は、約７〜約２００ヌクレオチド長、１０〜１００ヌクレオチド長、１５〜８０ヌクレオチド長、２０〜５０ヌクレオチド長または２５〜４０ヌクレオチド長であり得る。ステムループ配列は、設計に応じてより短く、またはより長くてもよい。
【００６１】
各ステムループ内において、１以上のループ構造が設計され得る。ループは、ループの基部におけるヌクレオチドおよびステムと結合しているヌクレオチドの２つのヌクレオチドが相補的（例えば、Ａ−ＴまたはＧ−Ｃ）である場合に、完全なループであり得る。一般に、ステムの上部におけるループは完全なループである。ループはまた、ループの基部におけるヌクレオチドおよびステムに結合しているヌクレオチドの２つのヌクレオチドが塩基対形成しない（例えば、ＡとＡ、ＴとＴ、ＡとＧ、ＴとＣなど）場合、半分のループであり得る。ステムループは１以上の完全なループおよび／または半分のループを有し得る。ループのサイズ（ループの基部におけるヌクレオチドおよびステムに結合しているヌクレオチドの２つのヌクレオチドを除く）は、ホストが大腸菌などの細菌である場合、３〜１２ヌクレオチドまたは４〜１０ヌクレオチドまたは５〜８ヌクレオチドの間のいずれかであり得る。ホストが酵母または哺乳類細胞である場合、ループサイズはより大きくてもよい（例えば、最大で１５ヌクレオチドもしくは２０ヌクレオチドまたはそれ以上）。
【００６２】
ステム部分は、塩基対形成している２つのフラグメント間において１００％の相補性を有する必要はない。利便性のために、ステムの一方のフラグメントをプラスまたは＋フラグメントと名付け、他方をマイナスまたは−フラグメントと名付ける。いくつかの実施態様において、ステムは、塩基対形成している２つのフラグメント間において、少なくとも約９８％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約５０％の相補性を有し得る。１００％未満の相補性である場合、プラスフラグメントは、マイナスフラグメントと比較して、１以上のミスマッチ、１以上の挿入（ループを形成するように連続的な挿入、または非連続的な挿入）、および／または１以上の欠失（マイナスフラグメント上でループを形成するように連続的な欠失、または非連続的な欠失）を含み得る。
【００６３】
ステム部分は、高い融解温度（例えば、６５℃より高い温度、６８℃より高い温度、７０℃より高い温度、または７２℃より高い温度）を有するように設計され得る。そのため、ステム部位は、温度がその融解温度よりも低い場合に自己アニールする傾向があり、これによってヘアピン構造を形成する。別の核酸に一度結合すると、ヘアピンは結合している核酸がさらなる反応（ポリメラーゼ連鎖反応など）に関与することを防ぐように作用し得る。この目的のために、ステム部分は、高いＧＣ含量（例えば、５０％よりも高い、６０％よりも高い、または７０％よりも高いＧＣ含量）を有するように設計され得る。
【００６４】
特定の実施態様において、ステム部分の自由端は別の核酸配列（例えば、構成オリゴヌクレオチドまたはサブコンストラクト）と結合（例えば連結）し得る。ステム部分の自由端は平滑末端であり得、または粘着末端を含み得る。粘着末端は、５’または３’オーバーハングであり得る。オーバーハングは任意の長さであり得る（例えば、１〜１００ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、または２〜１０ヌクレオチド）。いくつかの実施態様において、オーバーハングは４〜８、４〜６、または４ヌクレオチド長である。オーバーハングは縮重配列を含み得、本質的に任意の配列とのアニーリングおよび連結を可能にし得る。例えば、オーバーハングは４ヌクレオチド長の縮重配列であり得、４＾４＝２５６個の可能性のある配列を有し得る。いくつかの実施態様において、ターミネーターのライブラリーは、ユニバーサルなステムループ配列または２以上のステムループ配列と共に、縮重したオーバーハング部分の可能性のある全ての配列を含む場合に提供され得る。
【００６５】
ターミネーターは、１以上の標識を含むように設計され得、その結合パートナーとの結合によりターミネーター（および／または結合している核酸）の除去を促進し得る。標識はビオチンおよび／またはジゴキシゲニンであり得る。ターミネーターは当分野で公知の方法で標識され得る。標識は、標識されたヌクレオチドを介して、直接的（例えばビオチン化／ジゴキシゲニン化したヌクレオチドを用いて）、または反応基を保有するヌクレオチド類似体の組み込みおよびそれに続くビオチン化／ジゴキシゲニン化を介して間接的のいずれかによって、ターミネーターに酵素的に導入され得る。オリゴヌクレオチドはまた、York et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 1 e4)に記述される方法に従ってビオチン化され得、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００６６】
標識されたターミネーター（およびそれに結合する分子）はアフィニティー精製および／または除去され得る。当業者が理解するように、ビオチンの結合パートナーはアビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンを含む。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）の結合パートナーは抗ＤＩＧ抗体を含む。結合パートナーは、捕捉手段（ビーズ、カラムまたは他のあらゆる固相表面など）と共役し得、それに続く標識されたターミネーターおよびそれに結合した分子の除去を促進し得る。
【００６７】
いくつかの実施態様において、本開示は、Ｙ−Ｘ−Ｚ−Ｏステムループを含む天然に存在しない核酸配列を提供する、ここで：Ｙは５〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である；Ｘは３〜１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、その各ヌクレオチドはＸ内のいかなる他のヌクレオチドとも塩基対形成しない；Ｚは５〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、Ｙと少なくとも７０％の相補性を有する；およびＯは存在しないか、ＹとＺとの間に形成されるステムから突出したオーバーハングであるかのいずれかである。Ｘはステムループのループ部分であり、いくつかの実施態様において、３〜８ヌクレオチド長、４〜６ヌクレオチド長または５〜６ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施態様において、ステムループは１以上のｄＴ−ビオチンを含み得る。いくつかの例において、ステムループは図６に示されるように配列番号１の配列を有し得る。
【００６８】
いくつかの実施態様において、Ｙは少なくとも６０％、少なくとも５０％または少なくとも４０％のＧ／Ｃ含量を有する。Ｙは５’からＸまで、または３’からＸまでであり得る。特定の実施態様において、Ｙは１２〜１８ヌクレオチド長、１４〜１６ヌクレオチド長、１６〜１８ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１５〜３０ヌクレオチド長、１８〜２７ヌクレオチド長、２１〜２４ヌクレオチド長、２４〜２８ヌクレオチド長、または２５〜２９ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施態様において、Ｙは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
【００６９】
Ｙの長さは、Ｚの長さを（相補性によって）決定し、この長さはＹと実質的に同じヌクレオチド長を持つように選択され得る。ＺはＹと同じ長さであり得、Ｙとの１以上のミスマッチを有し得る。ＺはまたＹと比較して１以上の挿入を有し得、これによってＹとアニールした場合に１以上の突出またはループを形成する。実質的に相補的なＹとＺの長さ（ヘアピンのステム）は、塩基対におけるステムの長さを決定する。本明細書に記述されるように、ステムは必ずしも１００％の相補的ではないが、ＹおよびＺについて非相補的な対立する塩基は制限され得る。
【００７０】
特に、ＹおよびＺはそれぞれｍおよびｎヌクレオチド長であり得、Ｙはヌクレオチドｙ１〜ｙｍからなり、Ｚはヌクレオチドｚ１〜ｚｎからなる。好ましくは、ヘアピンのステムの終点が相補的であるように、ｚ１はｙ１に相補的であり、ｚｎはｙｍに相補的である。ＹおよびＺは少なくとも６０％相補的であり得、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的であり得る。相補性は最も好ましくは少なくとも７０％であり、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。非相補性（ミスマッチ、挿入および／または欠失など）はあり得るが、制限されるべきである。いくつかの制限された非相補性が互いに隣接して配置され、１以上のさらなるループを形成し得る。
【００７１】
Ｏは、平滑末端のターミネーターの場合には存在しなくてもよい。Ｏはまた、ターミネーターが粘着末端を有する場合に、５’または３’オーバーハングであり得る。Ｏは１〜１００ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、２〜１０ヌクレオチド、４〜８ヌクレオチド、４〜６ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド長であり得る。Ｏは縮重配列を含み得る。
【００７２】
ターミネーターはまた、１以上の制限酵素（ＲＥ）部位を含むように設計され得る。ＲＥ部位は、任意のＩＩ型ＲＥ部位（ＩＩＰ型またはＩＩＳ型など）および修飾された部位またはハイブリッドの部位であり得る。ＩＩＰ型酵素は、４〜８塩基対長の対称な（または回文の）ＤＮＡ配列を認識し、一般にその配列内を切断する。例：ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＭｓｐＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＮｃｉＩ、ＳｆｉＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＰｓｈＡＩ、ＢｇｌＩ、ＸｃｍＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｃｉＩ、ＴｓｅＩ、ＰｓｐＧＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｐｏＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｔＮＩ、およびＮｃｉＩ。ＩＩＳ型制限酵素は認識部位から０〜２０塩基離れた部位に、単一の二本鎖切断を作成する。例として、限定されないが、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＣＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｓｍＡＩ、ＥａｒＩ、ＭｌｙＩ（平滑末端化）、ＰｌｅＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＭｎｌＩ、ＳａｐＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＨｇａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｂｖＩ、ＥｃｉＩ、ＦｏｋＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＢｓｅＧＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、ＡｃＩＷＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、Ｂｓｔ６Ｉ、ＢｓｔＭＡＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＰｐｓＩ、ＳｃｈＩ（平滑末端化）、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＳｍｕＩ、ＢｆｕＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＡＩ、ＢｓｔＶ２Ｉ、ＡｓｕＨＰＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＬｗｅＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｔＶ１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、およびＢｃｇＩが含まれる。このような酵素およびこれらの認識部位および切断部位を考慮した情報は、商業上の供給業者（New England Biolabs, Inc. (Ipswich, Mass., U.S.A.)など）から入手可能である。
【００７３】
ＲＥ部位は、メチル化感受性ヌクレアーゼ（ＭｓｐＪＩ、ＳｇｅＩおよびＦｓｐＥＩなど）で消化され得るようにメチル化されてい得る。そのようなヌクレアーゼはＩＩＭ型およびＩＩＳ型の両方の性質を有する；したがって、このヌクレアーゼはメチル化特異的４ｂｐ部位であるｍＣＮＮＲ（Ｎ＝ＡまたはＴまたはＣまたはＧ；Ｒ＝ＡまたはＧ）のみを認識し、この認識配列の外側のＤＮＡを切断する。
【００７４】
図４に示すように、ターミネーターは２以上のＲＥ部位（例えば、２、３、４またはそれ以上のＲＥ部位）を含み得る。１以上のＲＥ部位はＩＩＳ型部位（ＡａｒＩおよびＢｓａＩ部位など）であり得る。１以上のＲＥ部位はＩＩＰ型部位（ＳａｃＩ部位など）であり得る。１以上のＲＥ部位はハイブリッドなＩＩＳ−Ｍ型ＲＥ（ＦｓｐＥＩなど）によって認識され得る。
【００７５】
ターミネーターまたはターミネーターのライブラリーは化学合成され得る。いくつかの実施態様において、ターミネーターは構成オリゴヌクレオチドを保有するチップと同一であり得るチップ、または異なり得るチップ上で合成され得る。合成後、ターミネーターは切断され得、チップから構成オリゴヌクレオチドと同一の溶出液または異なる溶出液に流出され得る。
【００７６】
いくつかの実施態様において、ターミネーターは、ステム部分および／またはループ部分において（例えば、ｄＴ−ビオチンを介して）ビオチン化され得る。ターミネーターは、当分野で公知の方法に従ってビオチン化され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、York et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 1 e4)に記述される方法に従ってビオチン化され得、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。ビオチン化された生成物は、（例えばビーズ、カラムまたは他の表面に結合してい得る）アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンを用いてアフィニティー精製され得る。
【００７７】
アセンブリ中のターミネーターオリゴヌクレオチドの使用
いくつかの実施態様において、本明細書に開示されるターミネーターオリゴは１以上のアセンブリの工程において使用され得る。例えば、サブアセンブリおよび／またはアセンブリ中に、不完全なサブアセンブリ産物またはアセンブリ産物（例えば、１以上の構成オリゴヌクレオチドがサブコンストラクトまたは最終コンストラクトから欠損している場合）が存在し得る。これらの不完全な産物はサイズが近いため、完全に正しくアセンブルされた産物から除去または分離することが困難である。続くポリメラーゼに基づく増幅において、不完全な分子は大抵、完全なアセンブリ産物と共に増幅される。不完全な産物の増幅を抑制するために、ターミネーターオリゴヌクレオチドは、完全なアセンブリ産物の増幅に影響を与えることなく不完全な産物の増幅を不利にするように、サブアセンブリ産物またはアセンブリ産物の一方または両方の末端に結合し得る。
【００７８】
図１は、サブコンストラクト（例えば６００〜９００ヌクレオチド長）のサブアセンブリ中におけるターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。工程１において、サブアセンブリの初期段階では、構成オリゴヌクレオチドＡ、ＢおよびＣが溶液（例えば、構成オリゴヌクレオチドが合成されたチップからの溶出液）中に存在する。構成オリゴヌクレオチドＡ、ＢおよびＣはまた、（１）それらのユニバーサルプライマー結合部位に対する１以上のユニバーサルプライマー、または（２）それらの個々のプライマー結合部位に対する１以上の特異的なプライマー、または（３）（１）および（２）の両方、を用いた、チップからの直接的な溶出液の増幅産物であり得る。ユニバーサルプライマー結合部位が外来性であり、アセンブルされる標的核酸の一部ではない限り、制限酵素の消化は外来性配列を除去し、かつ所望の付着末端を作成するのに使用され得る。付着末端の独自性はアセンブリの特定の順序を決定する（すなわち、各対の付着末端は、Ａの３’末端のみがＢの５’末端とアニールおよび連結し、Ｂの３’末端のみがＣの５’末端とアニールおよび連結することを保証するのに十分、特有である）。
【００７９】
図１の工程１を参照すると、ＡおよびＣはそれぞれ、サブアセンブリ産物の後の増幅（工程４）のためのプライマー領域およびターミネーターオリゴとの後の連結（工程３）のための粘着末端を有するように設計され得る。プライマー領域は共通または特異的であり得る。プライマー領域は、最終標的核酸に組み込まれる構成オリゴヌクレオチドの一部となるように設計され得る。いくつかの実施態様において、各プライマー領域の全部または一部は、構成ヌクレオチドの中心部分の外側の近接領域の形式であり得、ここで中心部分は最終標的核酸に組み込まれ、近接領域はアセンブリ前に除去される必要がある。そのため、１以上の制限部位が近接領域の除去を可能とするように設計され得る。
【００８０】
図１の工程２において、サブアセンブリの後期段階では、完全なアセンブリ産物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）ならびに不完全なアセンブリ産物（Ａ＋Ｂ）および（Ｂ＋Ｃ）が存在する。
【００８１】
図１の工程３において、サブアセンブリ産物はターミネーターオリゴと連結し得る。さらに、ターミネーターオリゴは自己連結し、ダブルヘアピンを形成し得る。各ターミネーターオリゴは縮重配列（例えば、４ヌクレオチド長）のオーバーハングを有し得、任意の他のオーバーハングとのアニールおよび連結を可能にし得る。
【００８２】
図１の工程４において、連結したサブアセンブリ産物は、上述のように構成オリゴヌクレオチドＡおよびＣにおいて予め設計されているプライマー領域に特異的なプライマーを用いて増幅される。理論に拘束されることを意図しないが、以下の１以上の理由のため、不完全なアセンブリ産物の増幅は減少または抑制されると考えられる：（１）ＰＣＲの伸長温度（例えば、７２℃または使用するポリメラーゼおよび製造者の推奨に応じた他の温度）において、ターミネーターにおけるステム部分の高い融解温度は、ターミネーターがそのステムループ構造に留まることを可能とし、これはポリメラーゼのさらなる進行を防ぐ；および（２）ターミネーターは二本鎖核酸の２つの相補鎖の両方に物理的に結合しており、それらがプライマー（分子間反応）とではなく、互いに（分子内反応によって）アニールする可能性を高める。
【００８３】
ターミネーターは、標的核酸が（例えば、高いＧＣ含量、低いＧＣ含量、二次構造、および／または反復配列によって）増幅またはアセンブルすることが困難な領域を有する場合に、特に有用である。図１、工程４ａおよび４ｂに示すように、完全なアセンブリ産物が増幅され得る。
【００８４】
サブアセンブリ後、２以上のサブコンストラクトが最終標的にアセンブルされ得る。図２Ａ〜２Ｂは、標的のアセンブリ中におけるターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。本実施例におけるターミネーターオリゴはＲＥ部位および標識を含む。ビオチンは説明の目的のみのために例として使用されるが、他の標識（ＤＩＧなど）もまた使用され得ることを注記しておく。さらに、２以上のＲＥ部位がターミネーターにおいて設計され得る。
【００８５】
図２Ａ、工程１において、サブアセンブリの終わりに、高純度のサブコンストラクトが得られ、これは例えばサブコンストラクトの長さを減少させることによって達成され得る。各サブコンストラクトは、ユニバーサルプライマー領域または特有のプライマー領域を両端に有し得る。プライマー領域は制限酵素消化によって除去され得、所望の平滑末端または粘着末端を露出し得る。例えば、図２Ａの工程２に示されるように、２つの末端サブコンストラクトは、それらが消化によってそれぞれ１つの平滑末端と１つの粘着末端を有するように設計され得、中心のサブコンストラクトは２つの粘着末端を有する。このように、ターミネーターとの連結の際に、２つの各末端サブコンストラクトは結合している１つのターミネーターを有し、中心のコンストラクトは、工程２に示されるように、両端に結合している２つのターミネーターを有する。自己連結したターミネーターもまた存在する。次に工程３において、外来性ターミネーターおよび自己連結したターミネーターはサイズ選択によって除去され得る。例えば、Beckman Coulterからの固相可逆的固定化(Solid Phase Reversible Immobilization；ＳＰＲＩ)ビーズを用いてもよい。図２Ｂの工程４において、ターミネーターが結合したサブコンストラクトは（例えばターミネーターオリゴヌクレオチド内にあらかじめ設計された制限酵素部位を介して）消化および適合する粘着末端の連結を受け得る。消化反応および連結反応はワンポット反応で起こり得る。結果物は、（例えば不完全な消化によって）未だ結合しているターミネーターを有する部分的または不完全にアセンブルされた産物の両方、ならびにターミネーターを持たない完全にアセンブルされた標的である。不完全なアセンブリ産物は、ストレプトアビジンビーズまたはタンパク質スラリー(protein-slurry)に基づく精製を用いて除去され得る。次いで、精製された完全なアセンブリ産物はさらに精製、配列決定および／またはベクターにクローン化され得る。
【００８６】
別のアセンブリ戦略は、サブアセンブリを促進するためにビオチン標識されたターミネーターを用いる。図３は、サブアセンブリ中におけるビオチン−ターミネーターオリゴヌクレオチドの例示的な使用を示す。工程１〜３は、各末端構成オリゴヌクレオチドがターミネーターと連結しない平滑末端を有することを除いて、図１と類似している。結果として、完全なサブアセンブリ産物はターミネーターと連結せず、不完全なサブアセンブリ産物はターミネーターと連結する。工程４において、完全なサブアセンブリ産物は、ストレプトアビジンビーズまたはタンパク質スラリーに基づく精製を用いて精製され、次いで増幅される。
【００８７】
図５は、さらなる例示的なアセンブリ戦略を示す。これは、標的またはその一部がパースできない(un-parseable)（すなわち、アセンブリのために配列を適合するフラグメント中にパースできない）場合に、特に有用である。一つの例は、大型のポリＡトラック（Ａ）ｎまたはｎ個のＡをアセンブルするのを保証できない他の反復配列である。図５の工程１に示されるように、パースできない要素はオーバーハング（例えば４ヌクレオチド長）を付加され得、１以上のメチル化されたＲＥ部位（例えばＦｓｐＥＩ部位）または平滑末端を生成する酵素（ＭｌｙＩなど）によって認識される部位を含むヘルパーフラグメントと共にアセンブルされ得る。工程２に示されるアセンブリ後、環状分子が作成される。環状分子はベクター骨格であり得る。工程３において、環状分子は、ヘルパーフラグメントを（例えばＦｓｐＥＩまたはＭｌｙＩを用いて）除去するように消化される。ヘルパーフラグメントは（例えばＳＰＲＩビーズを用いて）除去される。残存した消化産物は分子内結合を形成するように連結され得る。
【００８８】
標的ポリヌクレオチドは、全ての構成オリゴヌクレオチドを混合し、共に連結するワンポット反応において作成され得る。連結はまた、連続的（１つずつオリゴヌクレオチドを連結する）または階層的（オリゴヌクレオチドのサブプールを１以上のサブコンストラクトへと連結し、次いで最終標的コンストラクトへと連結する）に実行され得る。１以上の構成オリゴヌクレオチド、１以上のサブコンストラクト、および／または最終標的コンストラクトは天然に存在しなくてもよい（例えば、それらがヘミメチル化またはセミメチル化または低メチル化され、または天然に存在しないメチル化パターンを有するような方法（例えばインビトロにおける化学的修飾または生化学的修飾）で脱メチル化または修飾されている）ことを注記しておく。そのような天然に存在しないメチル化およびメチル化パターンは、例えば遺伝子発現を制御するのに使用され得る。
【００８９】
アセンブリ前の構成オリゴヌクレオチドの増幅は任意である。いくつかの実施態様において、全ての構成オリゴヌクレオチドは、（例えば、構成オリゴヌクレオチドが比較的均一で、かつ十分な量で提供される場合に）増幅せずに共にアセンブルされ得る。特定の実施態様において、構成オリゴヌクレオチド（例えば少数しか存在しない構成オリゴヌクレオチド）の１つのサブセットのみがアセンブリ前に増幅される。アセンブリは１つの工程でなされ得、または２以上の工程で階層的になされ得、または１回に１つの構成オリゴヌクレオチドを添加することによって連続的になされ得、またはいくつかの構成オリゴヌクレオチドがある方法を用いてアセンブルされ、他の構成オリゴヌクレオチドが別の方法でアセンブルされる、前記の任意の組合せでなされ得る。ある例において、構成オリゴヌクレオチドは増幅せずに、２以上のサブコンストラクトにまずアセンブルされ得る。サブコンストラクトは場合により増幅され得、次いで１以上の工程で、所定の標的配列を有する最終コンストラクトにアセンブルされ得る。
【００９０】
本開示の方法および組成物は、長いポリヌクレオチド（例えば１０ｋｂ以上）のアセンブリにおいて使用され得る。特定の実施態様において、チップで合成された短いオリゴヌクレオチド（例えば１００〜８００ｂｐまたは５００〜８００ｂｐ）は、本開示の方法および組成物を用いて、または用いずに、中間のポリヌクレオチドにまずアセンブルされ得る。次いで、中間のポリヌクレオチドはプラスミドにクローン化され得、これは宿主に導入され得、培養、単離および精製を介して増幅され得、本開示の方法および組成物を用いて切断され得、次いでさらなるアセンブリを受け得る。この方法は長い最終産物がアセンブルされるまで、複数回反復され得る。
【００９１】
さらに、または直接的な連結もしくはポリメラーゼによって補助されたアセンブリの代替として、他の方法もまた、本開示の切断産物をアセンブルするのに使用され得る。いくつかの実施態様において、切断産物は、例えばZhang et al., Nucleic acids research 40.8 (2012): e55-e55および米国特許出願公開第２０１３００４５５０８号に記述されるように、ＳＬｉＣＥ（シームレスライゲーションクローニング抽出；Seamless Ligation Cloning Extract）を介して相同組換えを受け得、これらは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。簡潔に述べると、ＳＬｉＣＥは、最適化されたλプロファージＲｅｄ組換えシステムを含むように設計されたＲｅｃＡ欠損細菌株由来の細菌細胞抽出物における短い相同性領域（１５〜５２ｂｐ）間のインビトロの組換えに基づく、制限部位に非依存的なクローン化／アセンブリ法である。他の組換え方法（酵母またはファージにおける組換えなど）もまた使用され得る。切断産物は、例えばGibson et al., Nature Methods 6 (5): 343-345および米国特許出願公開第２００９０２７５０８６号および第２０１０００３５７６８号に記述されるようにギブソンアセンブリを受け得、これらは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。ギブソンアセンブリにおいて、約２０〜４０塩基対を含み、近接するＤＮＡフラグメントと重複するＤＮＡフラグメントは、３つの酵素（エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡリガーゼ）と共に混合される。ワンチューブ(one-tube)反応において、エキソヌクレアーゼは近接するＤＮＡフラグメントがアニールできるようにオーバーハングを作成し、ＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチドを組み込み、あらゆるギャップを埋め、リガーゼはＤＮＡフラグメントを共有結合させる。
【００９２】
本明細書で開示される１以上のターミネーターオリゴおよびプライマーは、ターミネーターが結合している産物または増幅産物がメチル化感受性ヌクレアーゼ（ＭｓｐＪＩ、ＳｇｅＩおよびＦｓｐＥＩなど）によって消化され得るように、メチル化され得る。そのようなヌクレアーゼはＩＩＭ型およびＩＩＳ型の両方の性質を有する；したがって、このヌクレアーゼはメチル化特異的４ｂｐ部位であるｍＣＮＮＲ（Ｎ＝ＡまたはＴまたはＣまたはＧ；Ｒ＝ＡまたはＧ）のみを認識し、この認識配列の外側のＤＮＡを切断する。メチル化されたプライマーおよびその使用は、Chen et al., Nucleic Acids Research, 2013, Vol. 41, No. 8, e93に開示され、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００９３】
理解されるように、本開示の組成物およびシステムは、バイオテクノロジー、特に合成のバイオテクノロジーの様々な領域において有用である。例えば、本開示の方法は利用され得る。
【００９４】
本開示の様々な態様は、単独、組合せ、または前記で記述されている実施態様において具体的に議論されていない多様な配置において使用され得、したがって、本願における前記の説明に記載された要素または図に示された要素の詳細および配置に限定されない。例えば、ある実施態様に記述された態様は、他の実施態様に記述された態様とあらゆる様式で組み合わされ得る。
【００９５】
請求項の要素を修飾する、請求項における「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の使用はそれ自体では、ある請求項の要素の別の請求項の要素に対するいかなる優先順位、先行、もしくは順序、または方法が実行される時間的順序も暗示せず、特定の名前を持つある請求項の要素を（順序を示す用語の使用がなければ）同一の名前を持つ別の要素から区別し、請求項の要素を区別するための単なる標識として使用される。
【００９６】
また、本明細書で使用される用語および専門用語は説明の目的であり、限定するものとして考慮されるべきではない。本明細書において、「包含する」、「含む」または「有する」、「含有する」、「伴う」およびそれらの変形の使用は、その後に記載されている項目およびそれらの対応物ならびに追加の項目を包含することを意味する。「から本質的になる」は、その後に記載されている項目の包含を意味し、本発明の基本的性質および新規な性質に実質的に影響を与えない、記載されていない項目を除外しないことを意味する。
【００９７】
参照による取り込み
本明細書と共にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出され、「127662015301SequenceListing.txt」と題名が付けられ、２０１６年１２月２１日に作成され、４２４バイトのサイズであるＡＳＣＩＩテキストファイルは、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００９８】
本明細書で言及された全ての出版物、特許および配列データベースのエントリーは、個々の出版物または特許が具体的かつ個別に示され、参照によって取り込まれるように、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【図１】
2019503712.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019503712000001.app
【国際調査報告】
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