(57)【要約】  本発明は、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物、典型的にはPATのplant milking（商標）技術を用いて得られた根抽出物を含有している化粧用または皮膚用の組成物に関する。さらに本発明は、皮膚、粘膜または皮膚付属器に影響を及ぼす障害または疾患の予防または治療における使用、血管障害の予防または治療における使用、および外部または内部由来の皮膚老化の予防または治療における使用のための、この種の組成物に関する。最後に本発明は、皮膚、皮膚付属器、または粘膜の、それらの状態または外観を改善させることを目的とした美容的手入れ方法であって、そのような組成物またはそのような抽出物を投与することを含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含有している化粧用または皮膚用の組成物：
−有効成分としてのニンジンボク抽出物であって、没食子酸当量として示される、乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも５重量％のポリフェノールを含有し、かつ、乾燥抽出物の総重量に対して０．５重量％未満のフラボノイドを含有する、ニンジンボク抽出物、および
−必要に応じて、特に皮膚用的または化粧用的に許容可能である、適切な賦形剤。
【請求項２】
前記ニンジンボク抽出物が、乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも１．５重量％のジカフェオイルキナ酸を含有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ニンジンボク抽出物において、ジカフェオイルキナ酸の総重量に対して少なくとも４０重量％のジカフェオイルキナ酸が４，５−ジカフェオイルキナ酸異性体の形態である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ニンジンボク抽出物が、乾燥抽出物の総重量に対して０．０５重量％未満のフラボノイドを含有している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％、有利には０．０１〜５重量％、の前記ニンジンボク抽出物を、好ましくは液体形態で含有している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
局所投与に好適な製剤の形態、特に、クリーム、エマルジョン、ミルク、軟膏、ローション、オイル、水溶液または含水アルコール溶液またはグリコール溶液、粉末、パッチ、スプレー、シャンプー、ニス剤または外部適用のための他の任意の製品などの製剤の形態、である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
以下の予防および／または治療に用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物：
−皮膚および／もしくは粘膜および／もしくは皮膚付属器の障害もしくは疾患；
−敏感肌、ならびに／または
−内部または外部由来の皮膚老化。
【請求項８】
血管障害の予防および／または治療に用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記血管障害が、顔の紅皮症、皮膚紅斑、酒さ、掻痒症、特に皮下の毛細血管の膨張に起因する、赤味を伴う反応性の皮膚および／または粘膜から選択されるものである、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化粧用組成物を、好ましくは局所的に、投与することを含んでなる、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の、それらの状態または外観を改善させることを目的とした美容的手入れ方法。
【請求項１１】
前記組成物が、時間的老化または光で誘発された老化に対する製品として使用される、請求項１０に記載の美容的手入れ方法。
【請求項１２】
前記組成物が、脱色素化製品または美白製品として、特に、着色した皮膚の処置において、またはシミを減少させるために使用される、請求項１０に記載の美容的手入れ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニンジンボク（Vitex negundo）のポリフェノール強化抽出物を含有している化粧用または皮膚用の組成物に関する。本発明の組成物は、皮膚、粘膜または皮膚付属器に影響を及ぼす障害または疾患の予防または治療、および血管障害の予防または治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ニンジンボクは、中国ニンジンボク（Chinese chaste tree）として一般に知られており、例えば、フランスではMuguet bleu、レユニオンではnoti、タミルではChinduravam Notchi、中国ではHuang Pingと呼ばれている。ニンジンボクは、クマツヅラ科（Verbenaceae）またはシソ科（Lamiacea）の分類に属するインド固有の低木であり、高さは１〜２メートルに到達し、３〜５ミリメートルの大きさの小さい青色〜紫色の花を持つ。伝統的に薬剤で最も一般的に使用されている部分である葉は皮針形の３つまたは５つの小葉からなる。この植物は、世界の至る所に広く分配しているが、アフガニスタン、パキスタン、スリランカ、東アフリカおよびマダガスカルで発見されており、アジア、ヨーロッパおよび北アメリカで広く栽培されている。
【０００３】
ニンジンボクの植物化学的特性については、Vishal R.Tandon（Natural Product Radiance 2005, 4(3), 162−165）およびVishwanathanら（EJBS 2010, 3(1), 30−42）が記載しており、下表に要約する。
【０００４】
【表１】
2019508394.tif 000002
【０００５】
自然環境で育てられたか得られたニンジンボク植物の様々な部分の抽出物は多数の薬理学的性質を有する。特に、下記が確認されている：
−特に腹膜に投与した葉および根の抽出物の、鎮痛作用；
−特に関節炎および関節症に対する、葉、根および種子の抗炎症特性
−フラボノイドからなるエタノール系葉抽出物の抗真菌効果（Sathiamoorthyら、Bioorg Med. Chem. Lett. 2007, 17(1), 239−242）；
−精油、およびエタノール系抽出物または酢酸エチル抽出物の特定の菌株に対する抗菌効果。
【０００６】
さらに、ニンジンボクは、レユニオンではチクングンヤ熱の発生の治療でも使用されている（S. SAVRIAMA − Ethnopharmacologia, no. 52, 2014）。
【０００７】
伝統的には、ニンジンボクは、主に葉、および稀に根が、煎じ薬として使用されることが多い。
【０００８】
アーユルベーダの習慣では、ニンジンボク植物はその駆虫および駆虫薬の特性を目的に使用される。
【０００９】
しかしながら、これらのすべての用途では、植物の全部または一部の破壊を伴う。しかし、新しい規則では、それから派生する生物学的多様性の利用および有益性の共有を制御することが図られている。特に、名古屋議定書および国際標準（ＩＳＯ  ２６０００）では、持続可能な開発および社会的責任の点からの基準を考慮した指針が提供されている。
【００１０】
さらに、「伝統的な」ニンジンボク抽出物は植物化学的組成（即ち、有効成分、特にポリフェノール、の濃縮物）を有しており、それは化粧用または皮膚用の適用には適していない。特に、高含有量のフラボノイドを有するニンジンボク抽出物は、ＣＮ１０４５８６７００（フラボン含量は８２．５％以上）およびHuangら（Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2015, 108, 11−20）に記載されている。
【００１１】
従って、化粧用および／または皮膚用に最適化されたニンジンボク抽出物を含有しており、また、社会的および環境的に持続可能な開発の原則を尊重する、新規の化粧用および／または皮膚用組成物の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
出願人は、特に、Plant Advanced Technologiesという会社のPlant Milking（商標）技術（この技術は、具体的には国際特許出願第０１／３３９４２号に記載されている）の変型に従った気耕栽培によって得られたニンジンボクのポリフェノール強化抽出物が、今までに報告されたことの無い植物化学的組成ならびに化粧用および／または皮膚用特性を有することを見出した。特に、そのようなニンジンボク抽出物がそのように（それらの特性を目的に）使用されるのは初めてのことである。
【００１３】
例えば、それらは、乾燥抽出物の総重量に対して、没食子酸当量として示される少なくとも５重量％のポリフェノールを含有し、これは土の中で育てられた植物から得られたニンジンボク抽出物より高い。それにもかかわらず、本発明の抽出物はフラボノイドをほとんど含有していないか、全く含有していない。
【００１４】
更に、これらの特別な気耕条件下、特に適切な培養液および適切な誘導物質を用いて栽培されたニンジンボクは、この植物について先行技術で通常記載されているような分子、特に、広く記載されているフラボノイドであるビテキシンおよびその誘導体を産出しないことが実証され、これは通常の土質条件下で育てられた母植物とは異なる。
【００１５】
出願人は、ニンジンボクのこれらポリフェノール強化抽出物が、抗炎症特性、酸化防止特性および汚染防止特性を有していることをさらに見出した。しかしながら、炎症現象、ラジカル攻撃、汚染およびＵＶ曝露によって増強された現象は、時間および化学線による老化現象が原因である。従って、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物、およびそれを含有している化粧用および皮膚用の組成物は、特に皮膚、粘膜または皮膚付属器の、時間および化学線による老化現象に対しての老化防止治療に有用である。
【００１６】
従って、本発明は、有効成分としてのニンジンボクのポリフェノール強化抽出物、および必要に応じて適切な賦形剤を含有している化粧用または皮膚用の組成物に関する。
【００１７】
また、本発明は、皮膚、粘膜または皮膚付属器の障害または疾患の予防または治療、および血管障害の予防または治療で使用するための、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物を含有している化粧用または皮膚用の組成物にも関する。
【００１８】
また、本発明は、本発明の組成物を投与することを含んでなるか、または投与することからなる、皮膚、粘膜または皮膚付属器の、それの状態または外観を改善させることを目的とした美容的手入れ方法にも関する。
【発明の具体的説明】
【００１９】
定義
「ニンジンボクのポリフェノールが豊富な抽出物（polyphenol−rich extract of Vitex negundo）」または「ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物（polyphenol−enriched extract of Vitex negundo）」は、本発明においては、没食子酸当量として示される、乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも５重量％、例えば５重量％〜１０重量％の間、のポリフェノールを含有しているニンジンボク抽出物を指す。これらのパーセンテージは、とりわけＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイにより得られる。
【００２０】
Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイでは、フェノール類はすべてＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（市販されている）によって酸化させる。後者は、リンタングステン酸（Ｈ３ＰＷ１２Ｏ４０）とリンモリブデン酸（Ｈ３ＰＭｏ１２Ｏ４０）の混合物であり、これはフェノール系の物質の酸化でタングステン（Ｗ８Ｏ２３）およびモリブデン（Ｍｏ８Ｏ２３）の青色酸化物の混合物に還元される。産生された青色の最大吸収は、約７５０〜７６０ｎｍである。それは酸化したフェノール系化合物の量に比例する。この方法で使用される参照フェノールは没食子酸である。従って、このアッセイによって得られる結果は、「乾燥抽出物の総重量に対する、没食子酸当量として示されるポリフェノールの重量％」として示される。
【００２１】
それにもかかわらず、「ニンジンボクのポリフェノールが豊富な抽出物」または「ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物」は、フラボノイドをほとんど含んでいないか、全く含んでいない。フラボノイドは置換されていてもよい１５個の炭素原子の骨格を有する、ポリフェノールのサブクラスであり、この１５炭素原子の骨格は、フェニル環で置換された、６員の複素環（酸素化されている）に縮合したフェニル環からなる、第一の二環構造を含んでなる。フラボノイド含有量は、乾燥抽出物の総重量に対する重量％で示され、特に、Mai（J. Sci. ２０１０；３７（３）：４８９−４９７、より詳細には第２．５節、４９１頁を参照のこと）およびSinghら（International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences、第７巻、第２版、２０１５、１４４〜１４７頁、より詳細には１４５頁の「Total flavonoid content」の節を参照のこと）によって記載されているクロマトグラフ法などの当業者に周知の方法によって測定される。
【００２２】
好ましくは、「ニンジンボクのポリフェノールが豊富な抽出物」または「ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物」は、ジカフェオイルキナ酸（dicaffeoylquinic acid：ＤＣＱ）の誘導体、とりわけ、３，５−ジ−カフェオイル−キナ酸（３，５−ＤＣＱ）および４，５−ジ−カフェオイル−キナ酸（４，５−ＤＣＱ）が富化されている。
【００２３】
「ジカフェオイルキナ酸」（本明細書では「ＤＣＱ」として省略することがある）という用語は、４つのアルコール官能基のうちの２つがコーヒー酸でエステル化されたキナ酸分子から構成されているジエステルを指す。従って、ジカフェオイルキナ酸は一般式（Ｉ）を有する酸である：
【化１】
2019508394.tif 000003
［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４とＲ５のラジカルのうちの任意の２つは、カフェイル基を表し、他の２つは水素原子を表わす］。
【００２４】
「カフェイル基」という用語は、コーヒー酸に由来する、一般式（ＩＩ）を有するラジカルを指す。
【化２】
2019508394.tif 000004
【００２５】
従って、ＤＣＱの種々の異性体は、一般式（Ｉ）を有する酸であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は下表のとおり定義される。
【００２６】
【表２】
2019508394.tif 000005
【００２７】
本発明では、植物の「一部（part）」という用語は、根、茎、葉、果実、皮、種子または核果などの植物の任意の構成部分を指す。
【００２８】
本発明において、「植物の気耕栽培」という表現は、植物根が固体培地または液体培地にさえも接触していない、土壌がない栽培方法を指し、それらは、例えば国際特許出願ＷＯ０１／３３９４２号に記載されているように、閉鎖された環境で培養液を噴霧すること（アトマイザーによって）により栄養ミスト（nutrient mist）によって栄養補給される。
【００２９】
「根浸出（root exudation）」という用語は、生きた植物または切断したて（２４時間未満、好ましくは切断してから出来る限りすぐ、理想的には切断した直後）の植物に依然として接着している根と、浸出、噴霧または浸漬によって接触させられた液体を用いた、植物根が含有している代謝産物の回収を指す。特に、根浸出は、切断したておよび／または生きた植物に依然として接着している植物根を、適切な溶媒中で、適切な期間マセレーションを行うことによって実施することができる。
【００３０】
本発明において、「化粧用的に許容可能な（cosmetically acceptable）」という表現は、一般的に安全であり、非毒性であり、かつ生物学的にもほかの面でも望ましくないことがなく、かつ、特にヒトにおいて化粧用途に許容可能である化粧組成物の調製に有用となるものを指す。
【００３１】
本発明において、「皮膚用的に許容可能な（dermatologically acceptable）」という表現は、一般的に安全であり、非毒性であり、かつ生物学的にもほかの面でも望ましくないことがなく、かつ、特にヒトにおいて皮膚用途に許容可能である皮膚組成物の調製に有用となるものを指す。
【００３２】
発明の詳細な説明
第一に、本発明は、有効成分としてのニンジンボクのポリフェノール強化抽出物、および、必要に応じて、適切な、特に皮膚用的にまたは化粧用的に許容可能である賦形剤を含有している化粧用または皮膚用の組成物に関する。
【００３３】
本発明のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の組成物は、好ましくは液体の形態である。しかしながら、抽出物の種々の成分（特にポリフェノール、より詳細にはＤＣＱ）の割合は「乾燥」抽出物の重量に対するものとして示されている。この「乾燥」抽出物は、典型的には恒量の抽出物が得られるまで、１０５℃にてオーブン内で溶媒を蒸発させることによって得られる。従って、このように得られた「乾燥」抽出物は、揮発性物質、とりわけ溶媒、特に水、を本質的に含まない。
【００３４】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、Plant Advanced Technologiesという会社のPlant Milking（商標）技術（この技術は、具体的には国際特許出願第０１／３３９４２号に記載されている）を用いた方法により有利的に得られ、ここでは植物の根を破壊することなく連続的な抽出を行うことが可能である（ミルキング）。ここで、植物の生存率を変更することなく根の最大成長を得るために、植物は気耕的に栽培し、割合および濃度の点で正確に開発された、必須的な、栄養塩類（窒素−Ｎ、リン−Ｐ、カリウム−Ｋ）の溶液で根を噴霧することによって栄養が与えられる。植物は、適当な物質によって時々ストレスが与えられ、および／または誘発されることで、目的のものと認識されている分子（この場合はポリフェノール、特にＤＣＱ、具体的には４，５−ＤＣＱ）のより良好な生産が可能とされる。
【００３５】
本発明のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の組成物は、次の連続工程を含んでなる方法によって得られる：
ａ）ニンジンボクを気耕栽培する工程；
ｂ）好ましくは、植物根を刺激する工程；
ｃ）植物の根浸出により抽出を行う工程；
ｄ）得られたジカフェオイルキナ酸を４，５−ジカフェオイルキナ酸に異性化する工程、および
ｅ）このように得られた抽出物を連続的濾過、特にナノ濾過および／または滅菌濾過により精製および濃縮する工程。
【００３６】
当業者は、一般常識を用いれば、根の成長と目的の分子の濃度を最適化するために種々のミネラル塩の割合および濃度をどのように適応させるか理解する。培養液のミネラル塩濃度は、０．２〜１．６ｍＳの導電率の範囲に有利的に含まれる。
【００３７】
工程ａ）は、１週間〜８週間の範囲の間で有利的に行われる。
【００３８】
刺激の工程ｂ）では、根中の代謝産物含量を著しく増加させることができるので、全体的な植物の生存率を、それを再度利用できるように落とすことなく、根からのマセレーションを行うために選択した溶媒への代謝産物の流れが促進される。換言すると、植物の刺激工程は目的の分子の含量および分泌を促進する。
【００３９】
有利的には、刺激の工程ｂ）は、ジャスモン酸誘導体、エチレン発生体（ethylene generator）、キチン、キトサンおよびそれらの混合物から選択されるエリシターの溶液を植物に噴霧することによって行われる。さらに、工程ｂ）は、１日〜２週間の範囲の期間で有利的に行われる。
【００４０】
工程ｂ）は工程ａ）と同時または工程ａ）の後に行うことができる。工程ｂ）を工程ａ）と同時に行う場合（この場合は、工程ａ）の方が長いために工程ａ）の終わりが好ましい）、刺激溶液を培養液に加えることができる。
【００４１】
その後、このように栽培した植物には、目的の分子（即ち、ポリフェノール、特にジカフェオイルキナ酸）が強化された抽出物を得るために、抽出用溶媒、ｐＨおよび抽出時間の点から定義された条件下での根浸出による抽出工程ｃ）を行う。この工程ｃ）では、パーコレーションまたは浸漬によって根と接触するに至った液体を用いて、植物根によって放出された代謝産物（ＤＣＱ）の回収が可能となる。
【００４２】
有利的には、根浸出の工程ｃ）は、３０分〜９６時間、特に１２時間〜７２時間、より詳細には２４時間〜４８時間の間、根にマセレーションを行うことによって行われる。根浸出の期間は、植物の生存率を変化させず、かつ資源の減損を引き起こさない一方で目的の化合物の高い含量での抽出を促進するように選択される。抽出は、酸性のｐＨで有利的に行われる。
【００４３】
異性化の工程ｄ）は、当業者に知られた技術によって、特に、抽出物のｐＨを連続的に再調整することによって行われる（酸性ｐＨでの抽出、強塩基性溶液による塩基性ｐＨへの再調整、および強酸の添加による酸性ｐＨへの最終再調整）。工程ｄ）では、含有されているジカフェオイルキナ酸のほとんどが４，５−ジカフェオイルキナ酸異性体の形態であるという点を特徴とするニンジンボク抽出物を得ることが可能となる。
【００４４】
最後に、工程ｄ）に従って得られた抽出物には、連続的濾過、具体的にはナノ濾過および／または滅菌濾過による精製および濃縮の最終工程ｅ）を行う。この工程では、最終的なニンジンボクのポリフェノール強化（特に、ＤＣＱ強化）抽出物を得ることができる。
【００４５】
このように得られた抽出物は、液体または固体の形態でもよい。固体形態の抽出物は、例えばマルトデキストリンなどの担体を用いても用いなくても、噴霧化または凍結乾燥するなどの、当業者に知られた方法に従い、液体抽出物を乾燥させることによって得られる。
【００４６】
本発明の組成物のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、乾燥抽出物の総重量に対して、没食子酸当量として、有利的には少なくとも５重量％、例えば５重量％〜１０重量％の間、特に少なくとも６重量％、より具体的には少なくとも７重量％のポリフェノールを含有している。
【００４７】
換言すると、本発明のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、有利的にポリフェノールを少なくとも７重量％含有し、このパーセンテージは、当該抽出物の乾燥抽出物の総重量（場合により乾燥担体を追加する前の総重量）に対するものであり、あるいは液体抽出物１ｍＬあたりにポリフェノール１．３ｍｇを含有し、より特定的には合計ＤＣＱを少なくとも５重量％、または液体抽出物１ｍＬあたりにＤＣＱを１．１ｍｇ含有している。
【００４８】
この抽出物中に存在するポリフェノールの中でも、特にＤＣＱを目的にしている。従って、本発明の有利的な変種では、本発明による抽出物は、ＤＣＱの含量、より具体的には主に４，５−ＤＣＱを含む種々の異性体の混合物によって特徴づけることができる。
【００４９】
従って、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも１．５重量％、特に少なくとも２．５重量％、より具体的には少なくとも４重量％、特に少なくとも５重量％、好ましくは少なくとも６重量％のジカフェオイルキナ酸を含有している。当該ジカフェオイルキナ酸は、３，４−ジカフェオイルキナ酸（３，４−ＤＣＱ）、３，５−ジカフェオイルキナ酸（３，５−ＤＣＱ）、および４，５−ジカフェオイルキナ酸（４，５−ＤＣＱ）の異性体である。好ましくは、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物では、ジカフェオイルキナ酸の総重量に対して、ジカフェオイルキナ酸の少なくとも４０重量％が４，５−ジカフェオイルキナ酸異性体の形態である。
【００５０】
上記の方法によって得られたニンジンボクのポリフェノール強化抽出物には、先行技術では通常ニンジンボク抽出物に大量に存在しているフラボノイドを非常に少量で含有しているという特徴がある。特に、上述の条件下で栽培されたニンジンボク植物は、ビテキシンおよびその誘導体などのフラボノイドを非常に少量で合成し、分泌する。
【００５１】
従って、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、乾燥抽出物の総重量に対して０．５重量％未満、好ましくは０．２重量％未満、具体的には０．１重量％未満、より具体的には０．０５重量％未満、特に０．０１重量％未満のフラボノイドを含有している。
【００５２】
本発明の有利的な変種によれば、化粧用または皮膚用の組成物は、組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％、典型的には０．０１〜５重量％のニンジンボクポリフェノール強化抽出物を含有している。これらの組成物では、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は液体の形態であることが好ましい。
【００５３】
所望の投与類型に応じて、本発明の組成物および／または活性組成物は、少なくとも１つの皮膚用的に許容可能な賦形剤、または１つの化粧用的に許容可能な賦形剤をさらに含有することができる。第一の変種によれば、外部の局所的経路を介した、特に皮膚、皮膚付属器および／または粘膜、具体的には例えば紫外線または汚染などの環境に敏感であるかまたはそれらにより損傷した皮膚、皮膚付属器および／または粘膜、への投与に好適な賦形剤を使用する。
【００５４】
有利には、組成物は、特に、クリーム、エマルジョン、ミルク、軟膏、ローション、オイル、水溶液または含水アルコール溶液またはグリコール溶液、粉末、パッチ、スプレー、シャンプー、ニス剤または外部適用のための他の任意の製品を含む、局所投与に好適な製剤の形態で存在する。
【００５５】
本発明の組成物は、例えば、増粘剤、保存剤、芳香剤、染料、ケミカルフィルターまたはミネラルフィルター、保湿剤、温泉水等から選択される、当業者に知られた少なくとも１つの皮膚用または化粧用のアジュバントをさらに含有していてもよい。
【００５６】
組成物は、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物に加えて、少なくとも１つの他の活性化合物をさらに含有していてもよい。
【００５７】
また、本発明は、さらに、
−皮膚および／もしくは粘膜および／もしくは皮膚付属器の障害または疾患、
−血管障害、ならびに／または
−加齢に伴う障害
の予防および／または治療に使用するための、本発明の組成物に関する。
【００５８】
特に、本発明の組成物は、炎症反応、酸化反応、汚染に結びついた、または結びついていないラジカル攻撃に関係する障害、未熟、正常または成熟／老齢に関係なく、皮膚、皮膚付属器（毛髪および爪）および／または粘膜（歯茎、歯根膜の構造、生殖器粘膜）のバリアまたはホメオスタシスの障害の予防および／または治療を意図している。
【００５９】
特に、本発明の組成物は、特に皮膚、粘膜または皮膚付属器の時間および化学線による老化に対する、アンチエイジング処置に有用である。
【００６０】
有利的には、本発明の組成物は、以下の反応、障害または疾患の予防および／または治療に使用することができる：
−皮膚、特に、酒さ、顔の紅皮症、敏感肌、反応性皮膚、皮膚乾燥（乾燥症）、乾燥した皮膚（dehydrated skin）、赤味を帯びた皮膚、皮膚紅斑、老化した皮膚または紫外線により老化した皮膚、光で過敏になった皮膚、着色した皮膚（黒皮症、炎症後色素形成等）、弛緩性皮膚；
−粘膜、例えば、潜在的な歯肉炎を伴う歯茎および歯根膜の構造（新生児の敏感な歯茎、喫煙やその他による衛生問題）、歯周病または潜在的な炎症を伴う男性もしくは女性の外部もしくは内部の生殖器、および／あるいは
−紫外線曝露に起因する炎症性およびラジカル反応、および／または汚染物もしくは固有の反応に関する障害であって、老化、バリア障害、血管障害、赤味等を引き起こす障害。
【００６１】
また、本発明の組成物は、特に血管障害を予防および／または治療するため、特に血管を保護するため、および／または血液循環、特に血液小循環に作用するために有用である。血管障害は典型的には次から選択される：顔の紅皮症、皮膚紅斑、酒さ、掻痒症、特に皮下の毛細血管の膨張に起因する、赤味を伴う反応性の皮膚および／または粘膜。特に、本発明の組成物は、顔の紅皮症の予防および／または治療、ならびに内因性または外因性の原因に関係する皮膚老化の予防および／または治療に有用である。
【００６２】
従って、本発明の組成物は、顔の紅皮症、皮膚紅斑、酒さ、掻痒症、特に皮下の毛細血管の膨張に起因する、赤味を伴う反応性の皮膚および／または粘膜などの病態に発生することがある皮下の毛細血管の（慢性的）膨張の予防および／または治療に有利的に使用することができる。
【００６３】
また、本発明の組成物は、特に老化および光で誘発された老化の予防において、時間および化学線による老化に対する製品として有利的に使用される。
【００６４】
また、本発明の組成物は、創傷治癒および皮膚組織に関係する障害の予防および／または治療において、創傷治癒製品として有利的に使用される。
【００６５】
創傷治癒および皮膚組織に関係する障害は、創傷治癒の過程および弛緩性皮膚、ストレッチマーク、乾燥パッチ（dry patches）、あかぎれ、特に胸の肉割れなどの皮膚組織からもたらされる障害を指す。
【００６６】
特に、本発明の組成物は、未熟、正常、成熟／老齢に関係なく、皮膚、皮膚付属器（毛髪および爪）および／または粘膜（歯茎、歯根膜の構造、生殖器粘膜）のバリアまたはホメオスタシスの障害の予防および／または治療において、保湿製品として使用される。
【００６７】
皮膚、皮膚付属器および／または粘膜のバリアの障害は、表皮の外層の障害を指す。
【００６８】
皮膚、皮膚付属器および／または粘膜のホメオスタシスの障害は、乾癬、おむつかぶれ、アトピー性皮膚炎、皮膚乾燥（乾燥症）、乾燥した皮膚および光で過敏になった皮膚などの、細胞の再生および平衡の過程に起因する障害を指す。
【００６９】
また、本発明の組成物は、あらゆる種類の光線に起因する炎症、特に日焼けの治療および／または防止に有利的に使用される。
【００７０】
また、本発明の組成は、特に着色した皮膚（黒皮症、炎症後の色素形成等）の治療における、または例えば、シミを減少させるための、脱色素製品または美白（lightening）製品として有利的に使用される。
【００７１】
また、本発明は、本発明の組成物を、好ましくは局所経路を介して投与することを含んでなるか、投与することからなる、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜を、それらの状態および／または外観を改善させることを目的にした美容的手入れ方法に関する。
【００７２】
特に、本発明は、本発明の組成物を、皮膚に適用することを含んでなるか、適用することからなる、皮膚の、その老化を防止することを目的にした美容的手入れ方法に関する。
【００７３】
有利的には、本発明の美容的手入れ方法においては、本発明の組成物は、時間的老化または光で誘発された老化に対する製品として、または保湿製品として使用される。特に、本発明の美容的手入れ方法においては、本発明の組成物は、特に着色した皮膚（黒皮症、炎症後色素形成等）の治療における、または例えば、シミを減少させるための、脱色素製品または美白製品として使用される。
【００７４】
本発明の化合物および組成物の、最適な投与、投薬計画および医薬形態は、例えば、患者の年齢または体重、その患者の全身状態の重症度、治療に対する耐性、観察される副作用、皮膚タイプなどの、患者に適応させた皮膚用および／または化粧用治療で一般的に考慮する基準に従い決定することができる。
【実施例】
【００７５】
以下の例は例示を目的に提供され、本発明の範囲をいかなる方法によっても制限しない。
【００７６】
１．本発明のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の調製
ポリフェノール、特にＤＣＱが強化されたニンジンボクのポリフェノール抽出物は、以下の方法によって得られる。
ａ）確定した培養液（導電率が０．２〜１．６ｍＳの範囲の、１５／１０／３０  Ｎ／Ｐ／Ｋの組成を有するもの）でのＰＡＴにより特許が付与された方法によってニンジンボクを気耕栽培する；
ｂ）上述のエリシターを用いて１週間の期間植物を刺激する；
ｃ）室温にて４８時間およびｐＨ１．６で、２回、７０／３０のプロピレングリコール／水混合物中で植物根をマセレーションすることによって目的の分子を抽出する；抽出の終わりに、プロピレングリコールの濃度は６０％に再調整する；
ｄ）得られた溶液は、連続的なｐＨ調整工程を経て最終ｐＨの３．５に到達する；
ｅ）抽出物はナノ濾過および滅菌濾過を含む連続的濾過によって精製（ナノ濾過による塩の除去）および濃縮する。
【００７７】
このように得られたニンジンボクの液体ポリフェノール強化抽出物には以下の特徴がある（乾燥抽出物（dry extract：ＤＥ）の％は、恒量の抽出物が得られるまで１０５℃で換気されたオーブン内で溶媒を蒸発させることによって得られた）。
・乾燥抽出物：１．８％（ｍ／ｍ）
・ポリフェノールの総含有量（没食子酸当量）：９．５％／ＤＥ
・ジカフェオイルキナ酸誘導体の総含有量（ＨＰＬＣ）：６．５％／ＤＥ
・４，５−ＤＣＱの含有量（ＨＰＬＣ）：３．３％／ＤＥ
・灰分含有量：１４．５％。
【００７８】
「従来の」ニンジンボク抽出物との比較
従来の技術による土壌中で同一の環境（温室）で栽培した、若いニンジンボク植物に由来した乾燥した根および乾燥した葉の抽出物（「非ＰＡＴ抽出物（non−PAT extract）」と呼ばれる）を以下の方法によって得た。
ａ）ニンジンボクの乾燥した根または葉を粉砕する。
ｂ）得られた原料を、ｐＨ１．６で７０／３０のグリセリン／水混合物中で室温にて別々に抽出する。
ｃ）抽出物を濾過によって精製する。
【００７９】
工程ａ、ｂ、ｃおよびｅを含んでなるが異性化の工程（ｄ）を含まない上記の方法によって得られたニンジンボク抽出物（「ＰＡＴ抽出物」と呼ばれる）とこの抽出物を比較した。
【００８０】
ＨＰＬＣによって得られたアッセイ値は、以下のとおり（％は、目的の分子の濃度／得られた全体抽出物の乾燥抽出物）である。
【００８１】
【表３】
2019508394.tif 000006
【００８２】
ＰＡＴ抽出物がフラボノイドを含まないことが理解できる。しかし、具体的には、それは、ポリフェノール、特にヒドロキシ桂皮酸誘導体をはるかに高濃度で含有している。
【００８３】
ＩＩ．生物活性
以下の試験（ＩＩ．４の節での皮膚外植片試験を除く）においては、実施例１の方法（異性化の工程ｄ）を含んでなる方法）に従って得られた、本発明のニンジンボクの液体抽出物を使用した。それは、様々な希釈で続けて試験した。その後、本発明のニンジンボク抽出物は初期の抽出物の濃度と比較した濃度によって特徴づけられ、その濃度は対応する乾燥抽出物の％として示されている。
【００８４】
ＩＩ．１．皮膚繊維芽細胞およびメラニン化した再構成表皮（epidermises）に対する活性の事前スクリーニング
皮膚繊維芽細胞に対する遺伝子発現変調テストを使用して、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物およびメラニン化した再構成表皮の潜在的な生物活性を調査した。従って、ＰＣＲ配列により、繊維芽細胞およびメラニン化した再構成表皮に対して、皮膚および化粧の生理学において主要な目的である９５個の遺伝子の発現を研究した。
【００８５】
ａ．材料および方法：
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物（０．０１％、乾燥分）を、６時間および２４時間、繊維芽細胞またはメラニン化した再構成ヒト表皮の培地に加えた。
【００８６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（マイクロ流体カード）によって選択マーカーの発現を評価した。研究を行ったマーカーの発現の対照に対する変化は、相対的発現（ＲＱ、ＲＱ＞１：増加、ＲＱ＜１：減少）として示した。
【００８７】
ｂ．結果
最も有意な結果は、下表に示され、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、一定のマーカーの遺伝子発現を変化させることにより、以下の作用が特に興味深いと思われることが示唆された。 
−皮膚のマトリックスの治癒および強化：
（上昇）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（Urokinase−type plasminogen activator：ＰＬＡＵ）：皮膚治癒中の再上皮化過程の間の角化細胞移動で役割を果たす；
（上昇）デルマトポンチン（Dermatopontin（ＤＰＴ））：皮膚マトリックスの構成成分、繊維芽細胞付着の役割を果たし、コラーゲン原線維発生を活性化する；
（下降）ＣＹＲ６１タンパク質：皮膚マトリックス成分の生産により、メタロプロテイナーゼを活性化させることにより、かつ炎症性サイトカインの発現を活性化させることにより皮膚マトリックスのリモデリングの役割を果たす。
−抗菌、抗酸化および抗炎症性の防御：
（上昇）ヘムオキシゲナーゼ１（Haem oxygenase 1：ＨＭＯＸ１）：ヘムの分解に関係する、酸化ストレスに対する保護的な役割；
（上昇）ラクトトランスフェリン（Lactotransferrin：ＬＴＦ）：鉄を結合するその能力により抗菌作用を有し、再上皮化、角化細胞および繊維芽細胞の増殖を刺激し、かつ細胞外マトリックス成分の合成を活性化する；
（下降）プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２（Prostaglandin G/H synthase 2：ＰＴＧＳ２）：プロスタグランジン合成に触媒作用を及ぼす酵素、炎症の活性化に関与するマーカー。
−真皮−上皮接合部：
（上昇）コラーゲン７アルファ１（Collagen 7 alpha 1：ＣＯＬ７Ａ１）：真皮−上皮接合部の成分、原繊維を形成し、基底膜を真皮に付着させることを可能にする。
（上昇）ラミニンベータ−３サブユニット（Laminin beta−3 subunit：ＬＡＭＢ３）：基底膜を真皮に付着させることを可能にする基底膜の構成成分。
−剥離過程：
（下降）カリクレイン５（Kallikrein 5：ＫＬＫ５）：角膜層の成熟に関係する。
【００８８】
【表４】
2019508394.tif 000007
【００８９】
ＩＩ．２．皮膚のマトリックス
ａ．はじめに
皮膚マトリックスおよびその老化に対するニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の潜在能力を研究するために、その細胞外マトリックス（extracellular matrix：ＥＣＭ）マーカーの遺伝子発現レベルに対するその効果を評価した。研究は正常な皮膚繊維芽細胞上で行なった。２８歳のドナー、５４歳のドナーからの細胞を用いて年齢の関数としての繊維芽細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで連続的複製によって老化させた２８歳のドナーからの繊維芽細胞に対してもニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の効果を評価した。
【００９０】
ｂ．材料および方法
２８歳のドナーからの健常なヒトの繊維芽細胞を、０．００５％および０．０１％のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物で２４時間および４８時間処理した。並行して、繊維芽細胞をモノプロピレングリコール（抽出溶媒）で処理することによって対照（対照細胞）を調製した。選択マーカーの遺伝子発現は定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【００９１】
結果は、スチューデントｔ−検定によって統計的に分析した：
ｎｓ  ｐ＞０．０５：有意ではない、＊０．０１＜ｐ＜０．０５：有意、＊＊０．００１＜ｐ＜０．０１：非常に有意、＊＊＊ｐ＜０．００１：高度に有意。
【００９２】
遺伝子発現のレベルは、相対的な量（ＲＱ）として表され、対照細胞に対する治療の効果を増加割合として表した。
【００９３】
ｃ．結果
ｃ．１．「幼若」繊維芽細胞
研究は、第ＩＩ．４節および第ＩＩ．５節で使用した２８歳のドナーからの健常なヒトの表皮繊維芽細胞に対して行った。下に示された結果は、４８時間の治療継続期間に相当する。
【００９４】
【表５】
2019508394.tif 000008
【００９５】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、エラスチン、フィブリリン、デコリンおよびコラーゲンＶＩＩの遺伝子発現を顕著に増加させた。これらのタンパク質はすべて皮膚マトリックスの構造的タンパク質である。エラスチンおよびフィブリリンは真皮の弾性に関与するマーカーである。デコリンはコラーゲンネットワークの適切な会合を制御する。コラーゲンＶＩＩは真皮−上皮接合部中に存在するマーカーであり、表皮にマトリックスを強く固定することを可能にする。従って、これらのマーカーを増加させることにより、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、真皮の適切な構造を維持することを促進するようである。
【００９６】
ｃ．２．「老齢」繊維芽細胞
研究は、第ＩＩ．４節および第ＩＩ．５節で使用した５４歳のドナーからの健常なヒトの表皮繊維芽細胞に対して行った。下に示された結果は、２４時間の治療継続期間に相当する。
【００９７】
【表６】
2019508394.tif 000009
【００９８】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、コラーゲンＩＩＩ、デコリン、デルマトポンチン、コラーゲンＩＶの遺伝子発現を顕著に増加させ、かつマーカーＭＭＰ１を顕著に減少させた。これらのタンパク質はすべて皮膚マトリックスの発生に関与する。上で記載したように、デコリンはコラーゲンネットワークの適切な会合を制御し、コラーゲンＩＶは、コラーゲンＶＩＩと同様に、真皮−上皮接合部中に存在するマーカーであり、表皮にマトリックスを強く固定することを可能にする。ＭＭＰ１としては、コラーゲンの分解を触媒する酵素である。従って、ＭＭＰ１を阻害し、他のマーカーを増加させることにより、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、真皮マトリックスの適切な構造を維持することを促進するようである。
【００９９】
ｃ．３．「老化」繊維芽細胞
研究は、２８歳のドナーからの健常なヒトの表皮繊維芽細胞に対して行った。繊維芽細胞は連続的な複製によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで老化させた。老化マーカーの評価（マーカーベータ−ガラクトシダーゼの増加、遺伝子マーカーｐ２１の増加（＋１４５％））によって老化を確認した。下に示された結果は、２４時間の治療継続期間に相当する。
【０１００】
【表７】
2019508394.tif 000010
【０１０１】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、デコリン、コラーゲンＶＩ、およびサーチュイン１の遺伝子発現を増加させた。最初の２つのマーカーは皮膚マトリックスの構造および基底膜への適切な接着に関与している。サーチュイン１は細胞老化を遅延させる長寿のマーカーである。従って、これらのマーカーを増加させることにより、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、真皮マトリックスの適切な構造を維持し、かつ細胞老化を遅延させることを促進するようである。
【０１０２】
ｄ．結論
皮膚マトリックスに対するニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の好ましい効果は、「幼若」繊維芽細胞、「老齢」繊維芽細胞および「老化」繊維芽細胞に示された。従って、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、真皮マトリックスの適切な構造を維持することを促進し、かつ皮膚の老化から皮膚を保護することを促進するようである。
【０１０３】
ＩＩ．３．酸化防止および抗炎症性の作用
ａ．ニンジンボク抽出物の酸化防止効果の評価
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の酸化防止効果は、培養中の角化細胞へのＤＣＦＨ−ＤＡ（２’，７’−ジクロロフルオレセンジアセテート）の取り込みを使用して評価する。この分子は酸化していない状態で非蛍光マーカーである。酸化条件（この場合、過酸化水素、Ｈ２Ｏ２によって引き起こされたストレス）下では、ＤＣＦＨ−ＤＡは蛍光を出射する分子であるＤＣＦに分解される。このように測定された蛍光は、Ｈ２Ｏ２および／または有効成分の存在下で細胞によって生産された活性酸素種（reactive oxygen species ：ＲＯＳ）の量に比例する。
【０１０４】
ａ．１．材料および方法
健常なヒト角化細胞について、０．０００５％、０．００１％および０．００５％（ｗ／ｖ）の濃度のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物、ならびに０．０１６％、０．０３％および０．１６％のモノプロピレングリコール（研究を行ったニンジンボク抽出物の濃縮物に含まれていた溶媒の濃縮物に相当する対照）、１０μＭのケルセチンまたは５００μＭのビタミンＣ（後者の２つの分子は酸化防止剤の参照としての役割を果たす）の存在下で、２４時間、事前にインキュベートを行った。
【０１０５】
その後、細胞を０．５ｍＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡの存在下で１時間処理した。
【０１０６】
酸化は、２０分間１００μＭのＨ２Ｏ２を添加することによって引き起こした。試験された製品での第二の処理は、Ｈ２Ｏ２ストレス（事前処理と同一の濃度）で同時に行った。
【０１０７】
最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、ＲＯＳの量に相当する蛍光密度（fluorescence density：ＤＦＵ）の測定を行った。
【０１０８】
並行して、ニュートラルレッドアッセイにより生物学的に活性な細胞の数を決定した。各条件について測定したＲＯＳ（活性酸素種）の量は、ニュートラルレッドアッセイによって決定された生細胞の数に標準化した。
【０１０９】
分散の一因子分析、その後のテューキーの検定（GraphPad PRISMソフトウェアバージョン5.02、GraphPad Software、アメリカ合衆国California San Diego）により、結果の有意性を確認した。
【０１１０】
ａ．２．結果
【表８】
2019508394.tif 000011
【０１１１】
ＲＯＳ生産の増加はＨ２Ｏ２処理の後に観察され、それによりモデルを確認した。ケルセチンおよびビタミンＣは、Ｈ２Ｏ２処理後のＲＯＳの生産を著しく減少させた。これらの２つの参照の酸化防止効果は、確かにこのモデルで確認された。
【０１１２】
３つの濃度でのニンジンボクのポリフェノール強化抽出物はＨ２Ｏ２ストレスにより誘発されたＲＯＳ生産を著しく減少させた。
【０１１３】
ａ．３．結論
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、Ｈ２Ｏ２により誘発されたストレスに対する強い酸化防止効果を示した。
【０１１４】
ｂ．ニンジンボク抽出物の抗炎症性効果の評価
炎症反応は、任意の環境的ストレスに対する身体の正常、即時的および過渡的な反応である。しかしながら、一定の病理学または生理学的な条件下では、この炎症反応は悪化することがあり、制御されなければ組織損傷につながることがある。皮膚では、角化細胞は環境的ストレスに対する炎症反応の開始に関与する最初の細胞の１つである。
【０１１５】
その後、「ストレス」を受けた角化細胞は以下を放出する：
−免疫系に関与するカスケード反応を引き起こす一次サイトカイン（ＩＬ１α、ＩＬ１βまたはＴＮＦα）、または二次サイトカイン（ＩＬ８）。
−プロスタノイドの群の一種であるプロスタグランジン（ＰＧＥ）。ＰＧＥ２および他のＰＧＥの合成につながるプロスタグランジンの合成経路は、炎症性の刺激によって引き起こされる。
【０１１６】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の抗炎症作用は、ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）での治療により、角化細胞に対して引き起こされた炎症モデルについて評価した。サイトカインインターロイキン−１ベータ（ＩＬ１β）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の放出を分析した。
【０１１７】
ｂ．１．材料および方法
健常なヒト角化細胞について、０．０００５％、および０．００１％の濃度のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物、ならびに０．０１５％、および０．０３％のモノプロピレングリコール（対照の溶媒）、０．１μＭのデキサメサゾンならびに０．１μＭのインドメタシン（後者の２つの分子は、それぞれサイトカインおよびプロスタグランジンの抗炎症性の参照としての役割を果たす）で、２４時間、事前処理を行った。
【０１１８】
その後、一晩１０μｇ／ｍＬのＰＭＡを添加して炎症を引き起こした。
【０１１９】
その後、ＩＬ１βおよびＰＧＥ２のアッセイを細胞培養上澄み中で行った。
【０１２０】
並行して、ニュートラルレッドアッセイにより生物学的に活性な細胞の数を決定した。各条件について測定したサイトカインの量は、ニュートラルレッドアッセイによって決定した生細胞数に標準化した。
【０１２１】
分散の一因子分析、その後のテューキーの検定（GraphPad PRISMソフトウェアバージョン5.02、GraphPad Software、アメリカ合衆国California San Diego）により、結果の有意性を確認した。 
【０１２２】
ｂ．２．結果
【表９】
2019508394.tif 000012
【０１２３】
１０μｇ／ｍＬのＰＭＡは、角化細胞上澄み中のＩＬ１βの放出を著しく増加させたので、ＰＭＡは確かに炎症を引き起こした。０．１μＭのデキサメサゾンは、２４時間の事前処理として、ＰＧＥ２の放出を減少させた。この参照の抗炎症効果はこのように確かに確認された。
【０１２４】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、２４時間の事前処理として、２つの濃度でＩＬ１βの放出を著しく減少させ、このようにＰＭＡに対する抗炎症作用を示した。
【０１２５】
【表１０】
2019508394.tif 000013
【０１２６】
１０μｇ／ｍＬのＰＭＡは、角化細胞上澄み中のＰＧＥ２の放出を著しく増加させたので、ＰＭＡは確かに炎症を引き起こした。０．１μＭのインドメタシンおよびデキサメサゾンは、２４時間の事前処理として、ＰＧＥ２の放出を著しく減少させた。この２つの参照の抗炎症効果はこのように確かに確認された。
【０１２７】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、２４時間の事前処理として、２つの濃度でＰＧＥ２の放出を著しく減少させ、このようにＰＭＡに対する抗炎症作用を示した。
【０１２８】
ｂ．３．結論
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の抗炎症効果は、炎症状態でのインターロイキン−１ベータおよびプロスタグランジンＥ２の放出に対するその作用の結果、実証された。
【０１２９】
ＩＩ．４．皮膚外植片に対する老化防止効果
皮膚老化の過程では、真皮の変質が一般的に説明される。繊維芽細胞中の皮膚マトリックスの遺伝子発現に関する研究結果（とりわけ、エラスチン、フィブリリン、コラーゲンＶＩＩ、およびデコリンの増加）に従い、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物の潜在的な老化防止効果を、皮膚外植片モデルで評価した。
【０１３０】
ａ．ニンジンボク抽出物の剤形化
この試験のために、ニンジンボク抽出物（液体）は、クリームの総重量に対して当該抽出物を０．０８重量％または２重量％含有しているクリーム組成物中で使用した。
【０１３１】
ｂ．材料および方法
４６歳のドナーからの皮膚外植片を、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物を０．８％および２％含有しているクリームで局所的または非局所的（ＮＴ：対照外植片）に処理した。５日間、１日当たり１回の適用を行った。その後、外植片は免疫蛍光法分析のためにパラフィン中に固定して包埋した。
【０１３２】
Image Jソフトウェアを用いて蛍光定量化を行った。平均では、１つの外植片当たりに１０個の画像が得られた。
【０１３３】
ｃ．結果
【表１１】
2019508394.tif 000014
【０１３４】
ｄ．結論
２％のニンジンボクのポリフェノール強化抽出物を有する製剤は、エラスチン、コラーゲンＶＩＩおよびＫｌｏｔｈｏの発現を著しく増加させた。
【０１３５】
エラスチンは皮膚の細胞外マトリックスの本質的な成分である。このタンパク質は、真皮の弾性に大きく寄与する。コラーゲンＶＩＩとしては、真皮−上皮接合部のマーカーである。後者は、真皮を表皮へしっかりと固定するので、皮膚の全体的な構造の維持を助ける。
【０１３６】
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質は老化過程に関与するタンパク質であり、長寿に関係していると考えられている。その増加は、長寿の誘発を促進するので皮膚の老化を遅延させる。
【０１３７】
これらの種々のマーカーを刺激することにより、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、外植片モデルに対して老化防止効果を示した。
【０１３８】
ＩＩ．５．ＤＮＡ損傷からの保護
活性酸素種（ＲＯＳ）または紫外線（ＵＶ）放射などの多くの内部および外部の要因がＤＮＡの損傷を誘発して著しい細胞の損傷を引き起こすことがあり、従って皮膚の老化が促進される。このＤＮＡの損傷を修復することができる機序は存在する。しかしながら、老化の過程で、ＤＮＡの修複機序の低下が観察された。これらの機序の活性化を誘発させるニンジンボク抽出物の能力を健常なヒト繊維芽細胞で研究した。
【０１３９】
ａ．材料および方法
０．００１％および０．０１％（ｗ／ｖ）のニンジンボク抽出物で健常なヒトの繊維芽細胞を４８時間処理した。並行して、繊維芽細胞をモノプロピレングリコール（対照細胞）で処理することにより抽出溶媒の対照を調製した。研究は健常なヒトの繊維芽細胞で行った。４８時間の処理後、細胞はトリプシンで処理して凍結させた。
【０１４０】
これらの細胞ペレットから核抽出物を調製し、タンパク質アッセイを行った。
【０１４１】
その後、抽出物を特定の一連のＤＮＡ損傷を含有しているプラスミドによって機能化したチップ上に置いた：
−８ｏｘｏＧ（ｐ８ｏｘｏＧ）
−アルキル化塩基（ｐＥｔｈｅｎｏ）
−グリコール（ｐＧｌｙｃｏｌｓ）
−脱塩基部位（ｐＡｂａｓ）
−光化学反応の生成物（ピリミジン二量体および６〜４光化学反応の生成物）（ｐＣＰＤ−６４）
−シスプラチン付加物（ｐＣｉｓＰ）
−ベンゾ［ａ］ピレン付加物（ｐＢＰＤＥ）。
【０１４２】
抽出物中に含有していたＤＮＡ修復酵素は、ＤＮＡの再合成中に病変（または病変に隣接するＤＮＡ断片）を切除し、ＤＮＡマーカー（ｄＮＴＰ−ビオチン）を組み込む。組み込まれたビオチンは、蛍光色素であるＣｙ−５に結合したストレプトアビジンにより明らかになる。蛍光シグナルはスキャナを用いて定量化する。それは各病変についての各抽出物の切除／再合成の能力に比例する。この試験は塩基切除修復（base excision repair：ＢＥＲ）、ヌクレオチド切除修復（nucleotide excision repair：ＮＥＲ）および鎖間架橋修復（interstrand crosslink repair：ＩＣＬＲ）の系を特徴付けるために使用する。
【０１４３】
ｂ．結果
【表１２】
2019508394.tif 000015
【０１４４】
ｃ．結論
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（ｐ８ｏｘｏＧ）、脱塩基部位（ｐＡｂａｓ）、ベンゾ［ａ］ピレン付加物（ｐＢＰＤＥ）およびアルキル化塩基（ｐＥｔｈｅｎｏ）のＤＮＡ修複経路を促進する。従って、それは、修復されていないＤＮＡの損傷によって引き起こされた皮膚の早期老化を低減させることをたすけるようである。
【０１４５】
ＩＩ．６．老化角化細胞／ニューロンの共培養物中の神経分布の活性化
表皮は、脊髄に沿って位置する脊髄神経節の知覚ニューロンに由来する多数の自由神経終末からなる。これらのニューロンには、例えば接触、熱、痛みなどの情報を送信する軸索がある。神経分布密度は老化の過程で変化する。従って、所与の部位の神経分布は若年成人より高齢者において低い。この現象はその者の環境を知覚する個人の能力の減少に結びつく。知覚ニューロンの特性のうちの一つは、部分的にこの自由終末の密度を失った皮膚領域に神経を再分布するそれらの能力である。角化細胞は、ニューロンが表皮の最外層へ自由終末を放出することを可能にする成長因子を放出する。この研究の目的は、近くニューロンの向性に対するニンジンボク抽出物の可能性および老化角化細胞の存在下で投射を放出するそれらの能力を評価することである。
【０１４６】
ａ．材料および方法
知覚ニューロンはヒト線維芽細胞から得られたｈｉＰＳ細胞に由来する。ｈｉＰＳ細胞は３３歳のドナーおよび５９歳のドナーからの角化細胞で共培養した。様々な濃度（０．００３％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％（ｗ／ｖ））のニンジンボク抽出物で、０．１％のモノプロピレン・グリコール（対照の抽出溶媒）と樹状突起の伸長の陽性の参照としての役割を果たす神経成長因子（nerve growth factor：ＮＧＦ）５０ｎｇ／ｍＬとで共培養物を処理した。
【０１４７】
６日間共培養を行った後、細胞を２％のパラホルムアルデヒド溶液で固着し、抗−β−チューブリン抗体で標識した。蛍光顕微鏡を使用して標識を観察し、共培養物１つあたりに画像を２０個取得した。知覚ニューロン投射の長さは標識細胞体の数により測定し標準化した。統計学はすべてｔ−検定およびＡＮＯＶＡ検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）を使用して行われた。
【０１４８】
ｂ．結果
【表１３】
2019508394.tif 000016
【０１４９】
合計の神経突起長さおよび細胞１個当たりの神経突起の長さは、３３歳の角化細胞と比べて５９歳の角化細胞での共培養物中で著しく減少した。
【０１５０】
【表１４】
2019508394.tif 000017
【０１５１】
５０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦは、合計の神経突起の長さおよび細胞１個当たりの神経突起長さを著しく増加させた。この結果はモデルを有効にする。
【０１５２】
ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、ヒト知覚ニューロン／老化角化細胞共培養物中の合計の神経突起の長さおよび細胞１個当たりの神経突起長さを著しく増加させた。
【０１５３】
ｃ．結論
従って、ニンジンボクのポリフェノール強化抽出物は、皮膚老化の過程で観察される皮膚の知覚ニューロンネットワークの低下を防止する助けとなるように考えられ、従って年齢に伴い現われる感覚の喪失から皮膚を保護するように考えられる。
【０１５４】
ＩＩ．７．脱色素効果
ニンジンボク抽出物を含有している本発明の組成物の脱色素効果は、臨床試験の間にプラセボに対して評価した。
【０１５５】
これらの試験では、プラセボは化粧用の有効成分を一切含有していない（化粧用の添加剤のみ）クリームであり、本発明の組成物は、本発明のニンジンボク抽出物を１重量％さらに含んでなる、プラセボと同一の組成物のクリームである。
【０１５６】
【表１５】
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【０１５７】
ａ．プロトコール
試験は被験体２５人での２つのグループのパネルに対して行った：健常、年齢４０〜６０歳のフォトスキンタイプ１〜ＩＩＩの白人女性。様々な臨床基準により封入体を決定した。
【０１５８】
Ｄ０が研究の開始時（本発明の組成物またはプラセボを含有しているクリームを適用する前）であることを留意すべきである。
【０１５９】
グループＩは、本発明の組成物を顔および手に適用し、一方でグループＩＩはプラセボを顔および手に適用した。グループＩおよびＩＩの両方は、本発明の組成物およびプラセボをそれぞれ、５６日間、１日２回適用した。
【０１６０】
本発明の組成物の効果は、額、頬および手の一点上での比色測定によって評価した。測定したパラメーターは、輝度（Ｌ＊）（任意のユニット（arbitrary unit：ａ．ｕ．）で表す）および個別類型角度（individual typology angle：ＩＴＡ）である。
【０１６１】
測定は３ｍｍのヘッドを用いて分光測色計（Minolta）で行った。
Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間のパラメーターＬ＊は、測定した皮膚色の輝度の情報を与える。
Ｌ＊：明度または輝度に相当；
ａ＊：緑色〜赤色の軸上での色の色相および彩度を表わす；
ｂ＊：青色〜黄色の軸上での色の色相および彩度を表わす。
Ｌ＊値が高ければ高いほど、皮膚色は明るく、白い。
【０１６２】
ＩＴＡは、皮膚の色調についての情報を与える。高い角度は言い換えるとより白い皮膚色となる。
・測定領域：皮膚色は、事前に領域を区切りマーキングマスクを使用してマークした頬、額または手に対して測定した。
・試験するクリームの適用：本発明の組成物またはプラセボを含有しているクリームを通常のクリームのように手または顔の全体に適用した。
【０１６３】
ｂ．結果
試験した各領域に対する本発明の組成物の効能を決定するために、Ｄ０およびＤ＝５６Ｌ＊でのＬ＊およびＩＴＡ（ΔＬおよびΔＩＴＡ）の測定結果を比較した。
【０１６４】
手の上：一点上のプラセボと比較して、有効成分は著しく大いに輝度を増加させて、皮膚を白くした：
ΔＬ＊（組成物）：＋６％
ΔＬ＊（プラセボ）＝＋３％
本発明の組成物が好ましく、２つの測定の差異は顕著である。
ΔＩＴＡ（組成物）：＋４８％
ΔＩＴＡ（プラセボ）＝＋２３％
本発明の組成物が好ましく、２つの測定の差異は顕著である。
【０１６５】
額の上：額の上のプラセボと比較して、有効成分は著しく大いに輝度を増加させて、皮膚を白くした：
ΔＬ＊（組成物）：＋３％
ΔＬ＊（プラセボ）＝＋０．７％
本発明の組成物が好ましく、２つの測定の差異は顕著である。
ΔＩＴＡ（組成物）：＋１１％
ΔＩＴＡ（プラセボ）＝＋１．２％
本発明の組成物が好ましく、２つの測定の差異は顕著である。
【０１６６】
頬の上：頬の上のプラセボと比較して、有効成分は著しく大いに輝度を増加させて、皮膚を白くした：
ΔＬ＊（組成物）：＋３％
ΔＬ＊（プラセボ）＝＋１．５％
本発明の組成物が好ましく、２つの測定の差異は顕著である。
ΔＩＴＡ（組成物）：＋１５％
ΔＩＴＡ（プラセボ）＝＋７％
本発明の組成物が好ましく、２つの測定の差異は顕著である。
【０１６７】
ｃ．結論
本発明の組成物は、手の一点上、および額または頬上の両方のプラセボと比較して、顕著な脱色素および美白効果を有する。
【０１６８】
ＩＩＩ．局所適用のための化粧用および皮膚用の組成物
局所適用のためのいくつかの組成物を下記に示す。実施例１のニンジンボク（ＶＮ）のＰＡＴ抽出物は、クレンジング水、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、オイル、ミルク、ローション、シャンプー、発泡性製品およびスプレーなどの種々の化粧用製品に組み入れることができ、それらの組成物は、例示を目的に下記に示す。
【０１６９】
【表１６】
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【０１７０】
【表１７】
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【０１７１】
【表１８】
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【国際調査報告】
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