(57)【要約】  原料から標的タンパク質を回収するための方法であって、前記原料は前記標的タンパク質と宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸、又はそれらの２種以上の組み合わせから選択される少なくとも１種の不純物化合物とを含み、前記標的タンパク質は流体力学半径Ｒｈ１によって特徴付けられ、前記不純物化合物は流体力学半径Ｒｈ２によって特徴付けられ、ここでＲｈ１＞Ｒｈ２であり、以下の工程（ｉ）〜（ｉｖ）及び任意で工程（ｖ）を含む、方法：（ｉ）正に荷電されたアミノ基を含有する少なくとも１種の架橋ポリマーを含む高分子メッシュを提供する工程であって、前記ポリマーは可変に設定可能な細孔サイズ排除限界Ｒｈｉによって特徴付けられる工程；（ｉｉ）前記高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界ＲｈｉをＲｈ２＜Ｒｈｉ且つＲｈ１＞Ｒｈｉとなるように適合させる工程；（ｉｉｉ）前記高分子メッシュを前記原料と接触させる工程；（ｉｖ）排除された標的タンパク質を含有する原料から、保持された不純物化合物を含有する高分子メッシュを分離する工程。【選択図】図２
2019533012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料から標的タンパク質を回収するための方法であって、前記原料は前記標的タンパク質と宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸、又はそれらの２種以上の組み合わせから選択される少なくとも１種の不純物化合物とを含み、任意でアルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物、若しくはそれらの断片、又はそれらの２種以上の組み合わせをさらに含み、前記原料は溶液又は懸濁液の形態であり、及び前記標的タンパク質は流体力学半径Ｒｈ１によって特徴付けられ、前記不純物化合物は流体力学半径Ｒｈ２によって特徴付けられ、ここでＲｈ１＞Ｒｈ２であり、前記方法は以下の工程（ｉ）〜（ｉｖ）及び任意で工程（ｖ）を含む、方法：
（ｉ）正に荷電されたアミノ基を含有する少なくとも１種の架橋ポリマーを含む高分子メッシュを提供する工程であって、前記ポリマーは可変に設定可能な細孔サイズ排除限界Ｒｈｉによって特徴付けられる工程；
（ｉｉ）前記高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界ＲｈｉをＲｈ２＜Ｒｈｉ且つＲｈ１＞Ｒｈｉとなるように流体力学半径Ｒｈ１及びＲｈ２に適合させる工程；
（ｉｉｉ）前記高分子メッシュを前記原料と、高分子メッシュ中に不純物化合物を保持させ且つ標的タンパク質を高分子メッシュから排除させるのに十分な時間接触させる工程；
（ｉｖ）保持された不純物化合物を含有する高分子メッシュを、排除された標的タンパク質を含有する原料から分離して、精製された原料を得る工程；及び
（ｖ）任意で、標的タンパク質を前記精製された原料から単離する工程。
【請求項２】
標的タンパク質を原料から回収するための方法であって、前記原料は前記標的タンパク質と宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸、又はそれらの２種以上の組み合わせから選択される少なくとも１種の不純物化合物とを含み、及び任意でアルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物、若しくはそれらの断片、又はそれらの２種以上の組み合わせをさらに含み、前記原料は溶液又は懸濁液の形態であり、及び前記標的タンパク質は流体力学半径Ｒｈ１によって特徴付けられ、前記不純物化合物は流体力学半径Ｒｈ２によって特徴付けられ、ここでＲｈ１＞Ｒｈ２であり、前記方法は以下の工程（ｉ）、及び（ｉｉｉ）〜（ｉｖ）、及び任意で工程（ｖ）を含む、方法：
（ｉ）正に荷電されたアミノ基を含有する少なくとも１種の架橋ポリマーを含む高分子メッシュを提供する工程であって、前記ポリマーがＲｈ２＜Ｒｈｉ及びＲｈｉ＞Ｒｈｉとなるような細孔サイズ排除限界Ｒｈｉによって特徴付けられる工程；
（ｉｉｉ）前記高分子メッシュを前記原料と、高分子メッシュ中に不純物化合物を保持させ且つ標的タンパク質を高分子メッシュから排除させるのに十分な時間接触させる工程；
（ｉｖ）保持された不純物化合物を含有する高分子メッシュを、排除された標的タンパク質を含有する原料から分離して、精製された原料を得る工程；及び
（ｖ）任意で、標的タンパク質を前記精製された原料から単離する工程。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｉ）における前記設定、又は工程（ｉｉ）における前記適合、又は工程（ｉ）における前記設定及び工程（ｉｉ）における前記適合は、以下のうちの１つ以上により行われる、方法：ポリマーの構造を変化させること；高分子メッシュを生成するために使用する架橋剤を選択すること；高分子メッシュの架橋度を選択すること；高分子メッシュの調製及び使用のための溶媒を変更すること、特に溶媒のｐＨを変更してこれにより高分子メッシュのプロトン化度を変更することによって、高分子メッシュの膨潤の度合いを制御すること；及び高分子メッシュが高分子メッシュと支持体とを含む複合材に含まれる場合には、ポリマーの濃度及び固定化される量を制御すること。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）における前記接触の前に、工程（ｉｉ）において得られた前記高分子メッシュを８未満のｐＨに平衡化することを含む、請求項１又は３に記載の方法；又は
工程（ｉｉｉ）における前記接触の前に、工程（ｉ）によって提供された前記高分子メッシュを８未満のｐＨに平衡化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉｉ）は、７以上のｐＩ（等電点）を有する中性又は正に荷電された化合物を、前記平衡化された高分子メッシュによって低減することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１又は請求項１に従属する請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供され又は工程（ｉｉ）において適合される高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは、１〜２０ｎｍの範囲に設定され又は適合される、方法；又は
請求項２又は請求項２に従属する請求項４又は５に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供される高分子メッシュの前記細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは１〜２０ｎｍの範囲内である、方法。
【請求項７】
請求項１又は請求項１に従属する請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供され又は工程（ｉｉ）において適合される高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは、３〜１０ｎｍの範囲に設定され又は適合される方法；又は
請求項２又は請求項２に従属する請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供される高分子メッシュの前記細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは３〜１０ｎｍの範囲内である、方法。
【請求項８】
請求項６又は７のいずれか１項に記載の方法であって、前記高分子メッシュ中に保持されるべき前記不純物化合物は４ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈ２を有する不純物化合物から選択される、方法。
【請求項９】
前記不純物化合物は宿主細胞タンパク質である、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質は抗体である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記原料は発酵ブロス懸濁液である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は対流輸送を適用しない一工程バッチプロセスとして行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記高分子メッシュは複合材料の一部である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）は、ポリ（ビニルアミン）若しくはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）又はそれらの混合物を、前記正に荷電されたアミノ基を含有する架橋ポリマーに変換することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ｉ）支持材料の少なくとも細孔体積を、少なくとも１種の架橋性ポリマー又はコポリマーと少なくとも１種の架橋剤との溶液で充てんする工程と、
ｉｉ）前記架橋性ポリマーを架橋によってその場で固定化する工程と、
を含み、前記支持材料は粒子状、薄膜状、又はモノリシックである、
複合材料の合成のためのプロセス。
【請求項１６】
前記架橋性ポリマーはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）若しくはポリ（ビニルアミン）、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
請求項１５又は１６によって調製された複合材料。
【請求項１８】
２０ｎｍ〜５ｍｍの平均細孔サイズを有する多孔質支持材料を含む複合材料であって、
８未満のｐＨの適用条件下で、前記多孔質支持材料の全細孔体積を架橋一級又は二級アミノ基含有ポリマーで充てんし、
前記複合材料は、インバースサイズ排除クロマトグラフィ（ｉＳＥＣ）によってｐＨ６の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中でプルラン標準物質を用いて決定される細孔サイズ分布によって特徴付けられ、ここで
４ｎｍ以上の流体力学半径Ｒｈを有する分子、特に２１．７ｋＤａの分子量及びＲｈ＝３．９８ｎｍを有する較正されたプルラン標準物質は細孔体積の少なくとも９０％から排除され、及び
全細孔体積の少なくとも３５％は、流体力学半径Ｒｈ＝２．１３ｎｍを有するプルラン標準物質６．２ｋＤにアクセス可能な細孔によって表される、
複合材料。
【請求項１９】
全細孔体積の少なくとも１５％は流体力学半径Ｒｈ＝２．７ｎｍを有するプルラン標準物質１０．０ｋＤａにアクセス可能である、請求項１８に記載の複合材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不要化合物と標的化合物とを含有する溶液又は懸濁液から前記不要化合物を分離するための、ポリマーゲル又は複合材料のいずれかを含む高分子メッシュの使用に関する。本発明はまた、この目的に適した特定の高分子メッシュ、及び前記高分子メッシュを含む複合材料の調製プロセスに関する。本発明はまた、前記高分子メッシュを用いて発酵ブロスから標的タンパク質を回収するための方法に関する。詳細には、本発明は、前記複合材料の使用による遺伝子組み換えタンパク質、好ましくは抗体及び抗体断片の分離に関する。
【背景技術】
【０００２】
精製された可溶性巨大分子は全産業に渡って非常に重要な物質である。主に医薬及び医療の分野では、治療及び診断目的が主であるが組織工学のような技術のためにも、生体高分子物質に対する需要が拡大していることが報告されている。利用可能なクロマトグラフ法の中でも、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、低容量、低解像度、及び低速度が原因で酷く生産性が低いことに起因して、ポリッシング目的を除く大規模な操作のためには有用ではないと考えられている。特に、分子のサイズによる分離は、最大でも充填カラム内部の一回の総液体体積以内で行われるため、ＳＥＣにおける負荷容量は一般に非常に限定的である。これにより、特別の固定相の間隙体積と細孔体積との比率、並びに細孔サイズ分布が、ＳＥＣにおける限定されたサンプル体積に寄与する主要な特性となる。
【０００３】
巨大分子の未精製溶液、例えばほぼあらゆる種類の生物学的出発原料からの粗抽出物、特に生存又は死滅組織、種々の培養技術の組織及び細胞培養物からの粗抽出物中の様々な不純物の莫大な数に起因して、従来のクロマトグラフィ精製プロセスにおける第一工程は通常、標的化合物の結合（「捕捉」）を含んでおり、一方、不要な生成物の大部分が全く結合されずに残るか、又は選択的溶出工程によって標的から分離されて、この工程中標的物質の前後に、結合された不純物が放出され得る。
【０００４】
しかしながら、第一工程において不純物の大部分を結合し、精製された標的化合物が未結合のまま溶液中に残ることは、生成物の回収及び全体的なプロセスの合理化の点で極めて有利であろう。主に抗体精製の目的のためには、このアプローチは、未精製の供給溶液中に存在するおよそ１０，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量を示す付随的なタンパク質の大部分の結合を可能としなければならない。タンパク質のこの分子量範囲はおよそ１．５ｎｍ〜５ｎｍの流体力学半径Ｒｈの分子サイズに相当する。
【０００５】
対応する問題は、一般には先行技術によりこの方法では解決されなかった。
【０００６】
抗体及び他のタンパク質の精製のために、種々の支持材料とアミノポリマーとを含む複合吸収剤を分離剤として用いる幾つかの方法が報告されている。支持材料は粒子、フィルター媒体、又は膜のいずれかであった。ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、及びポリ（ビニルアミン）が共有結合的に又は架橋後に支持体に結合された好ましい官能性アミノポリマーであった。
【０００７】
この目的のためには基本的に、フィルター材料又は粒子による充填層が結合及び溶出のために種々の緩衝液で灌流され、その間に供給物のうちの特定の化合物が保持されることを特徴とするクロマトグラフ法が適用されてきた。
【０００８】
粒子系の複合材料に関して、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７の特許出願ファミリー（「ＷＯ９９４」ファミリー）は球状シリカ及びポリスチレンスルホネート支持体の由来の不明なポリビニルアミンによるコーティングを含んでいる。通常、これらの複合材はさらに誘導体化され、種々の薬剤化合物の選択的分離に特化されている。ポリ（ビニルアミン）コーティングの結合は一般に、以下の二工程手順によって達成される。即ち、細孔を有する支持材料にポリマー水溶液を染み込ませた後、この材料を乾燥し、第２工程において、析出したポリマーを再溶解しない適切な有機溶媒中に架橋剤を溶解した後、懸濁液中で架橋を行う。
【０００９】
特許文献８は、複数のポリアミンを保持するマトリクスを含む、タンパク質分離に使用するための複合分離媒体を開示しており、複数のポリアミンはマトリクスに共有結合されている。
【００１０】
特許文献９は、生物学的流体から汚染物質を除去する方法に関し、この方法は、多孔質鉱物酸化物マトリクスの上部を覆うが共有結合はしていない架橋疎水性高分子メッシュであって、前記多孔質鉱物酸化物マトリクス内部の細孔体積は、前記疎水性メッシュで実質的に満たされている架橋疎水性高分子メッシュと前記生物学的流体を接触させ、それによって１０，０００ダルトン未満の平均分子量を有する疎水性の両性分子を除去することを含む。
【００１１】
特許文献１０には、非多孔質コアと、生体分子を結合するための荷電性のペンダント基又は親和性リガンドのいずれかを含む高分子ベースマトリクス、例えば、デキストランとで構成される粒子状材料が記載されている。この荷電性のペンダント基はポリエチレンイミン又は変性ポリエチレンイミンであり、触手様の構造を形成し得る。この材料はＤＮＡ等の生体巨大分子の分離に利用される。
【００１２】
特許文献１１には、複数の細孔を有する支持体部材と前記支持体部材の細孔を充てんしているマクロ多孔質架橋ゲルとを含む複合材料が開示されている。
【００１３】
特許文献１２は、膜に固定化された架橋ポリアミンコーティングを使用する生物学的試料の精製に関する。
【００１４】
複合材を調製する試みの多くは、支持材料の体積又は表面の空のスペースの内部でのモノマーの重合に関係している。このようなプロセスは、生じたポリマー鎖の前記表面への共有結合も含む場合がある。本発明では重合反応を扱うことは好ましくなく、成形済みのポリマーの使用について述べている。
【００１５】
成形済みポリマーの支持材料への永続的な固定化を含む複合材料の合成のためには、基本的に以下の２つの方法が利用可能である。
【００１６】
・支持材料表面へのポリマーの共有結合
・架橋を介した表面上への又は細孔中へのポリマーの固定化。
【００１７】
共有結合はより面倒で費用がかかり、それに加えて表面に結合される層の厚さに関して制限を受けることになる。一方、支持体表面が平坦又は不均質であるならば、単に安定性の理由により、膜、布帛、又は組織を用いる場合と同様に、それは好ましい方法である。
【００１８】
架橋は、得られるメッシュが良好に捕捉され及び厚みのある層を形成し得ることから、必要とされる労力がより少なく且つ多孔質材料を用いて適用可能である。一方、多孔質粒子は意図に反して接着し合う場合があり及び／又は細孔が塞がれる場合があるため、多孔質粒子をこの方法でコーティングするには大きな問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／００７７９３号
【特許文献２】国際公開第２０１３／００７７９９号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０３７９９１号
【特許文献４】国際公開第２０１３／０３７９９２号
【特許文献５】国際公開第２０１３／０３７９９３号
【特許文献６】国際公開第２０１３／０３７９９４号
【特許文献７】国際公開第２０１３／０３７９９５号
【特許文献８】国際公開第９０／１４８８６号
【特許文献９】国際公開第９５／２５５７４号
【特許文献１０】米国特許第６，７８３，９６２号
【特許文献１１】国際公開第２００４／０７３８４３号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１０／０２００５０７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ポリマーを粒子又は多孔質のモノリシック支持材料の細孔に架橋を介して結合するためには、さらに以下の２つの合成経路が利用可能である。
【００２１】
・最初にポリマーを支持体の内部表面に沈殿させ、その後、前記ポリマーを再溶解することができない溶媒中に溶解された架橋剤を加えた後これらの成分間の反応を開始し所望の架橋度が得られるまで続けることによって沈殿した材料を架橋する。
【００２２】
この手順により細孔の閉塞及び粒子の連結は両方とも確実に回避される。一方、本発明内で示されるように（図実施形態１．１〜１．４及び表２参照）、ポリマーに対するアクセス性に関して、異なる、そしてあまり望ましくないモルフォロジーが得られる。
【００２３】
・支持体の細孔をポリマーと架橋剤との混合物で充てんするためのそれらの同時添加と、それに続くこれらの成分間の反応の開始。反応は所望の架橋度が得られるまで続けられ、それによって、中間の物理的操作を必要とすることなく得られるポリマーメッシュの固定化が媒介される。
【００２４】
溶解された成形済みポリマー及び架橋剤を反応のために多孔質支持材料に同時に大量に又は大きな体積で導入すると、支持材料の細孔を塞いで変性された生成物の物質移動が乏しくなってしまうおそれがあるため、当業者はそのようなことは避けるであろう。
【００２５】
しかしながら意外なことに、本発明の合成条件下では閉塞も連結も起こらないことが分かった。加えて、官能性ポリマーと反応性架橋剤とを予め混合することは一般には推奨されない。しかしながら、本発明で使用されるように、架橋反応が高度な温度で開始される場合に限りこの関連法は好ましい。
【００２６】
基本的には先行技術では複合材の「一工程合成」は避けられ、常に最終品ではない複合材の中間又は後乾燥が行われていた。さらに、先行技術では、支持体細孔体積の外側に反応性溶液が存在することは回避された。支持体細孔のポリマーによる閉塞及び粒子の意図されない連結はすなわち克服できない問題であるように思われていたが、今般本発明によって解決された。
【００２７】
したがって、製造プロセスを終える前の上流での乾燥もまたこれまで、そうしたリスクを防ぐために最良の方法と思われていた。
【００２８】
標的化合物のための捕捉工程を回避するという概念は、不要化合物の大部分が「ポジティブに」吸着され、及びこのようにして低減されることを特徴とする一種の「ネガティブクロマトグラフィ」と定義される場合がある。この目標を実現するための戦略を以下の工程Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩにおいて概説する。前記「排除による非結合」を、例えば表面と分子との同じ電荷に起因して標的化合物が吸収剤から単に反発されるだけのアプローチから区別することが重要である。以下の３つの部分からなる識別機構が、本発明の材料及び方法により可能となる特長、即ち戦略である。
【００２９】
Ｉ．遺伝子組み換え抗体からの、標的物質の分子量を下回る分子量を示す物質、例えば宿主細胞タンパク質の大部分及びＢＳＡの低減であって、前記不純物は対応する発酵プロセスにおいて使用される宿主細胞及び細胞培養媒体に由来し得る。
【００３０】
ＩＩ．核酸、ウイルス及びそれらの断片のような高分子量化合物やナノ粒子の同時低減。
【００３１】
ＩＩＩ．標的化合物、一般にはメッシュ細孔の体積に侵入するには大きすぎる分子、例えばタンパク質を回収し、同時に媒体の外側表面への（それらの強力な）結合を回避する。
【００３２】
したがって、本発明の目的は、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩに基づいて目標に到達することが可能な精製プロセスを可能にする方法及び材料を提供することである。
【００３３】
前記「ネガティブ」分離工程は標的化合物の特定のメッシュ細孔体積からの立体的排除によって実現され、一方でより小さな分子サイズの不純物はこの体積に入り込み、そこで保持され、内部表面に共有的に結合されるか吸着され、又は分割機構によってメッシュ体積へと分配されるか単純に包含され得る。吸着は好ましくは、主としてイオン力、水素結合力、分散力、ファンデルワールス力、及び配位（リガンド交換、ドナー−アクセプター）力を含む、非共有相互作用によって達成される。
【００３４】
したがって、本発明の材料は、原則として吸着、分割クロマトグラフィ、及びサイズ排除クロマトグラフィの利点を組み合わせ、標的化合物を排除されたまま残し、一方不純物は高分子メッシュの内部に保持される。
【００３５】
したがって、本発明は、少なくとも１種の標的化合物と少なくとも１種の不純物とを含む原料から標的化合物を回収する方法であって、ろ過された又は未精製の原料を少なくとも１種の高分子メッシュと十分な時間に渡り接触させて、少なくとも１種の不純物を高分子メッシュによって保持させ、次いで前記高分子メッシュを少なくとも１種の標的化合物を含有する精製後の原料から分離し、及び任意で、前記少なくとも１種の標的化合物を前記原料から単離することを特徴とする方法を提供する。
【００３６】
加えて、標的化合物の外側表面への望ましくない吸着のために残される面積はほとんどないため、多孔質材料の全粒子表面に対する外側粒子表面の寄与が比較的小さく、このことが所望のネガティブ吸着効果を大いに助長する。
【００３７】
同時に著しく大きな内側表面が、内部細孔体積に入り込むことのできる大量の低分子サイズ不純物に対する高い結合能力を提供する。さらに、それらの分子のサイズに起因して内部細孔体積からやはり排除されたまま残る特定の低濃度であるが高荷電及び高分子量の汚染物、例えば、核酸及びウイルス粒子及びそれらの断片が、媒体外側表面に効率的に捕捉されるようになり、それによって立体的に排除された標的化合物に対する吸着競合物として働き得る。
【００３８】
本発明が、薬物又は薬物代謝物のような小分子の結合だけではなく、およそ５ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈと同等の、分子量およそ１００，０００Ｄａまでの巨大分子の前記高分子メッシュの内部への結合を可能にするということを強調することが重要である。さらに、標的化合物は高分子メッシュの細孔体積に結合されずに、排除されたまま残る。このアプローチは、望ましくない化合物が結合されないまま残り、通常はごく少ない数の標的物質が、それらが吸着される多孔質スペースに浸透する制限アクセス法とは全く対照的である。
【００３９】
本発明の精製戦略はこれまでは普通ではなかったが、一般的な分離の問題を解決するために有益な方法を暗示している。しかしながら、植物抽出物又は細胞培養上清のような未精製の溶液中の不純物の数は、莫大な異なる構造を含む数千部位に及ぶ範囲に渡るため、一工程で９０％超の低減レベルに到達するためには複合材料によって非常に高い全般的な親和性が提供されなければならない。概して、本発明は以下の教示を提供する：
【００４０】
・巨大分子のための効率的な精製プロセスであって、標的分子は固定相又は吸収材の高分子メッシュの細孔から排除され、一方で不純物の大部分は内部細孔によって保持されることを特徴とするプロセス。前記内部細孔は固定化された高分子コイルの内部及びそれらの間の体積を含む。
【００４１】
・高分子メッシュを含む複合材のための迅速で簡単で安価で且つ堅牢な合成プロセスであって、溶媒Ａ中に溶解されたポリマーと架橋剤との混合物を支持材料に加え、反応及び溶媒Ｂ中での膨潤後にナノ多孔質メッシュを生成することを特徴とし、反応混合物の体積は好ましくは懸濁された支持材料の細孔体積を上回る。
【００４２】
・架橋ポリマーを含む、ソフトゲル又は複合材のいずれかの高分子メッシュの材料設計であって、このメッシュは、特定の溶媒中で、少なくともＲｈ１の流体力学半径を有する有益な分子の排除によって特定される細孔サイズを示し、一方でＲｈ１未満の流体力学半径を有する少なくとも１種の不要化合物は前記メッシュに浸透した後で内部細孔によって保持されることを特徴とする、材料設計。
【００４３】
本発明に関して、実際に最も重要な応用分野は生命工学である。それとは別に、他のポリマー精製の問題もまた本発明の対象である。
【００４４】
例えば抗体のような標的タンパク質を含有する発酵ブロス又は体液から出発するような生体分離において、その目標は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、天然に生ずるか又は細胞増殖用の媒体の内容物として導入されるＢＳＡやトランスフェリンのような豊富な防御又は飼料タンパク質、及び内毒素、並びに病原菌又はそれらの断片等の物質を低減させることである。加えて、より良好な細胞増殖又は保存を達成するために添加されることの多い界面活性剤も、好ましくは低減されるべきである。
【００４５】
このように生体分離における一般的な課題は、以下のａ）〜ｇ）に挙げるような物質の低減である。実際に、関連する分離の問題を一工程又は二工程で且つ低いコストレベルで解決するために利用可能な方法及び材料は存在していない。
【００４６】
標的化合物を含有する原料として発酵ブロス（ろ過前若しくはろ過後）又は細胞培養上清（ＣＣＳ）を使用する場合、その標的化合物は遺伝子組み換えタンパク質、好ましくは抗体であり、及びその原料は不純物として以下の部類の化合物を含む：
ａ）少なくとも１００，０００ダルトンの分子量を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、他の核酸、タンパク質、及び有機物質；
ｂ）１００，０００ダルトン未満の分子量を有するプロテアーゼを含めた宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）；
ｃ）アルブミン（ＢＳＡ、ＨＳＡ、卵白アルブミン）；
ｄ）細胞培養媒体中に存在する他のタンパク質並びに栄養分又は細胞代謝に由来する種々の分子量の物質；
ｅ）内毒素；
ｆ）界面活性剤；及び
ｇ）細菌、及びウイルス等の微生物、又はそれらの断片。
【００４７】
したがって、本発明の目的は、後述するような改良及び進歩を示す、精製方法を提供すること、この目的のために好適な分離材料、及び前記分離材料の合成のためのプロセスを提供することである。
【００４８】
本発明の目的は、好ましくは構造的に異なる物質の部類に属する数種の不純物の溶液（原料）からの同時除去を達成し、一方で少なくとも１種の標的化合物は未結合のまま残って高収率で回収される分離方法及び精製プロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４９】
予期せぬことに、本発明の高分子メッシュは宿主細胞タンパク質、核酸、及び栄養タンパク質を非常に高度に同時除去することが可能であることが見出され（実施例参照）、一方ヒト血漿からの抗体の複雑な混合物は高い収率で回収された。
【００５０】
本発明はこのように、ソフトゲル又は複合材料のいずれかの高分子メッシュの利用に関する。ソフトゲルとは、モノマーと架橋剤とから合成されるか又は好ましくは成形済みのポリマーと架橋剤とから合成され、こうして共有又は非共有的架橋によって固定化された結合されたポリマー鎖又はコイルを含む多孔質固体材料を生ずるメッシュを意味する。
【００５１】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、各ソフトゲルは、架橋官能性ポリマー、好ましくは架橋アミノ基含有ポリマーと種々の架橋剤とを含む。上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたより好ましい実施形態では、前記複合材料は好ましくは、多孔質支持材料に固定化されて複合材を形成する架橋アミノ基含有ポリマーを含む。
【００５２】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた別の実施形態では、前記ポリマーは支持材料の表面に共有結合され、及び任意でさらに架橋されていてもよい。
【００５３】
不要化合物と標的化合物とを含有する溶液（原料）からの不要化合物の分離のために、ソフトゲル及び複合材の両方を使用することができる。
【００５４】
本発明の標的化合物は、ポリマー、好ましくは生体ポリマー、より好ましくはタンパク質、及び最も好ましくは抗体を含む。
【００５５】
供給溶液又は懸濁液は合成又は天然起源の少なくとも２つの溶解された物質を含み、好ましくはろ過済みである（細胞培養上清）か、又は細胞及びデブリのような固体断片を未だ含有している発酵ブロスを含む。
【００５６】
有利な改良された分離技術は下記を可能とすべきである。
【００５７】
１．精製され溶解された標的化合物から不純物を同時に高度に分離すること。
【００５８】
２．樹脂への結合及びそれに続く溶出が全体のプロセスコストに寄与し生成物の収率も低下させ得ることから、標的化合物の捕捉を回避すること。通常の捕捉手順の代わりに、不純物の大部分の不可逆的な又は少なくとも強力な結合を目標とした。
【００５９】
３．高価な装置及び材料の必要性、並びに時間のかかる操作に起因する有益な標的化合物の損失及び分解を減らすことによって、供給溶液又は懸濁液から、例えば発酵ブロスから、標的化合物を迅速及び安価に精製すること。
【００６０】
４．好ましくは、分離材料を通した貫流を特徴とするクロマトグラフィ工程を回避すること。特に、より弱い結合を示す不純物は標的化合物と共溶出し得るため、貫流又は灌流はそれらの不純物の低減のためには不利である。
【００６１】
５．未結合の精製された標的化合物を含有する精製後の溶液を、この有益な化合物の有意な部分が複合材料に吸着することなしに、高収率で迅速に得ること。
【００６２】
６．好ましくは再生を必要とせず一サイクル後に分離材料を処分し、それにより企図された数のプロセスサイクルの退屈な検証を回避すること。
【００６３】
Ｒｈ１未満の流体力学半径を有する少なくとも１種の化合物と、Ｒｈ１以上の流体力学半径を有する少なくとも１種の標的化合物とを含む原料から標的化合物を回収するための、下記の工程を含む方法を提供する本発明に従って、上述の技術的問題１〜６、好ましくは問題１、２、及び５は解決され、前記目的は達成された：
【００６４】
前記原料を少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュと十分な時間に渡り接触させる工程であって、Ｒｈ１未満の流体力学半径を有する少なくとも１種の化合物は高分子メッシュによって保持される工程と、その後Ｒｈ１以上の流体力学半径を有する少なくとも１種の標的化合物を含有する精製後の原料から高分子メッシュを分離する工程と、任意で、原料から標的化合物を単離する工程。
【００６５】
Ｒｈ１は「排除限界」として定義され、１ｎｍ〜２０ｎｍ、好ましくは３ｎｍ〜１０ｎｍ、最も好ましくは４ｎｍ〜６ｎｍの範囲である。
【００６６】
単離するとは精製された標的化合物を、抽出、蒸留、凍結乾燥、又は他の既知の手順を利用して固体又は抽出物として得ることを意味する。
【００６７】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、前記高分子メッシュは少なくとも１種のアミノポリマーを含む。
【００６８】
特に、本発明によれば、少なくとも１種の標的タンパク質と、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他の核酸を含み、及び任意でアルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物、又はそれらの断片を含む不純物とを含む溶液又は懸濁液のいずれかの原料から、標的タンパク質を回収するための方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
ｉ）前記原料を少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュと十分な時間に渡り接触させる工程であって、少なくとも１種の不純物化合物は保持される工程、
ｉｉ）次いで、高分子メッシュを少なくとも１種の標的タンパク質を含有する精製後の原料から分離する工程、及び
ｉｉｉ）任意で、標的タンパク質を原料から単離する工程。
【００６９】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、標的化合物は溶解されており、別の実施形態では、標的化合物は少なくとも部分的に懸濁されている。不純物もまた少なくとも部分的に懸濁されている。
【００７０】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、溶液又は懸濁液は好ましくはろ過された又は未精製の発酵ブロスである。
【００７１】
前記少なくとも１種の保持された化合物は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他の核酸、アルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物を含む部位のサブセットである。
【００７２】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、工程ｉｉ）によって精製供給物中に残存する前記少なくとも１種の標的化合物は、高分子メッシュ体積から排除された。
【００７３】
任意で、工程ｉｖ）内で、高分子メッシュは弱溶媒で洗浄され、得られた溶液を更なる処理のために収集する。
【００７４】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、アミノポリマーはポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）のいずれかである。
【００７５】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、上記の原料は少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュと十分な時間に渡り接触され、この際４ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈ２を有する前記少なくとも１種の不純物化合物はアミノポリマー含有高分子メッシュによって保持され、一方で４ｎｍ以上の流体力学半径Ｒｈ１を有する少なくとも１種の標的タンパク質は精製後の供給物中に残存する。
【００７６】
定義により、高分子メッシュの細孔体積は、固定化された高分子コイルにより橋渡しされるウェブの内部の特定の体積とみなされる。外側ウェブの表面及び支持材料の外側表面はこのメッシュ体積には寄与しない。
【００７７】
高分子メッシュにより保持されるとは、吸着等の非共有若しくは共有結合機構に起因する、又は分割、サイズ排除、若しくは抽出機構に起因する、メッシュ細孔の内部での低減を意味する。
【００７８】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、高分子メッシュは複合材料を含む。
【００７９】
それに応じて、本発明は、工程ｉ）に対応する分離用の複合材料の合成のための方法であって、多孔質支持材料が、架橋官能性ポリマー、好ましくはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）、直鎖若しくは分子鎖ポリ（ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（エチレンイミン）、若しくはポリリジン、又はこのようなアミノポリマーを含有するコポリマーで充てんされる方法を提供する。
【００８０】
さらに、本発明によれば、ポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）の組成は５％〜８０％、好ましくは１０％〜４０％、より好ましくは１０％〜２０％のポリ（ビニルホルムアミド）を含んでいる。
【００８１】
さらに、工程ｉ）に従う又はそれに匹敵するいずれかの接触のために、アミノポリマー含有高分子メッシュを予め、水性緩衝液、又は好ましくは一塩基酸の、塩溶液と混合することによって、ｐＨ８未満、好ましくはｐＨ３〜７．５、より好ましくはｐＨ４〜７、最も好ましくはｐＨ６〜６．８に平衡化する。前記平衡化はまた、ソフトゲルを処理する規則でもある。平衡化された高分子メッシュにおける緩衝液又は塩の濃度は５００ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ〜２００ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭである。使用の前に、平衡化された高分子メッシュは前記緩衝液又は塩溶液で少なくとも湿潤され、好ましくは少なくとも細孔体積が充てんされている。
【００８２】
好ましい一塩基酸はギ酸、酢酸、スルファミン酸、塩酸、過塩素酸、又はグリシンである。好ましい陽イオンはアンモニウム、アルキルアンモニウム、ナトリウム、及びカリウムである。
【００８３】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、前記塩は酢酸アンモニウムである。
【００８４】
任意で、標的化合物が塩基性である場合、原料のｐＨを４〜７の範囲に調節する。
【００８５】
以下は本発明による標的化合物を分離するための方法の好ましい実施形態である。
【００８６】
本発明の分離方法は好ましくは、原料、例えば、ろ過溶液又は細胞及び細胞デブリ等を未だ含有している未精製懸濁液のいずれかを表す発酵ブロスに関係する。
【００８７】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、標的化合物として遺伝子組み換えタンパク質を含み、不純物として宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、及びＢＳＡを含む溶液又は懸濁液をアミノポリマー含有高分子メッシュと接触させ、原料から不純物を同時に低減させる。
【００８８】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、アミノポリマー含有高分子メッシュを用いてＢＳＡが５％（ｗ／ｖ）溶液から完全に低減された。
【００８９】
予期せぬことに、ｐＩ（等電点）値７以上の不純物が本発明の高分子メッシュを適用して少なくとも９５％まで低減されたことが分かった（実施例）。宿主細胞特異性のＥＬＩＳＡを等電点電気泳動と組み合わせて用い、低減された前記中性及び塩基性化合物の大部分が宿主細胞タンパク質であったことが示された（「方法」参照）。
【００９０】
故に、下記実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、７以上のｐＩを示す又は塩基性の性質を示しイオン性相互作用が可能な宿主細胞タンパク質は、アミノ含有ポリマーを含む正に荷電された高分子メッシュを用いた場合、５０％まで、好ましくは８０％まで、最も好ましくは少なくとも９０％まで低減される。
【００９１】
したがって本発明は、正に荷電されたアミノ基含有高分子メッシュ、好ましくは複合材、最も好ましくはポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）を含む複合材を適用して、７以上のｐＩを有する化合物を低減するための方法を提供する。
【００９２】
前記高分子メッシュは、ｐＨ８未満、好ましく７未満の溶液による平衡化の後では、正に荷電される。
【００９３】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、５ｎｍを超える、好ましくは４ｎｍを超える流体力学半径Ｒｈ１を示す標的化合物及び較正済みの試験物質は、使用溶媒条件下でメッシュ細孔体積から立体的に排除され，こうして他の構成成分から分離される。したがって本発明は、正に荷電されたアミノ基含有高分子メッシュを適用して４ｎｍを超える流体力学半径Ｒｈ１を示す化合物を回収するための方法であって、前記化合物の少なくとも８０％、好ましくは９０％が液相中に残存する方法を提供する。
【００９４】
分子量と流体力学半径との関係についても「方法」の項を参照のこと。
【００９５】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）の手順内でクロマトグラフィの代わりに一工程バッチ吸着プロセスを用い、精製後の供給溶液を沈降又は遠心分離によって不純物が負荷された複合吸収材から除去することを特徴とする。
【００９６】
バッチ低減は拡散機構による操作であるということが強調される。好ましくは、対流輸送機構、例えば貫流を必要とするカラム等の装置は適用されない。
【００９７】
当業者は、一理論段分離工程と同等なワンユニットの操作を適用しただけでは満足のいく精製を期待しないであろう。というのも、通常こうした手順では複雑な試料混合物については十分な選択性が見出されていないためである。クロマトグラフィカラム又は選択的勾配溶出技術においては、複雑な供給物中の種々の化合物の結合定数の幅広い分布に起因して、良好な分離のためには常に多くの段数を必要とするであろうということが共通原則である。しかし本発明を用いれば、サイズ排除機構によって、高分子量の標的物質に対する種々の不純物への選択性が生まれる。故に、本発明の材料及び方法を用いて設計されるような吸着とサイズ排除機構との組み合わせによって、高度な精製が可能となる。
【００９８】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、工程ｉ）の持続時間は５〜３０分間である。
【００９９】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、単一の精製工程により効率的な不純物の低減が達成できる。
【０１００】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料は３μｍ〜１０ｍｍ、好ましくは２０μｍ〜５００μｍ、最も好ましくは３５μｍ〜２００μｍの平均粒子サイズを有する粒子状材料である。
【０１０１】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、標的化合物はポリマー、好ましくは生体ポリマー、より好ましくはタンパク質である。生体ポリマーは、生体によって一旦生成された５００Ｄａを超える分子量を有するペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、及びいずれかの他の化合物を含んでいる。
【０１０２】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、タンパク質は抗体、ペグ化された抗体又は抗体の他の誘導体、又は抗体断片である。
【０１０３】
したがって、本発明は工程ｉ）、ｉｉ）、及び任意でｉｉｉ）を含み、標的化合物が抗体であることを特徴とする精製プロセスに関する。
【０１０４】
ここで抗体とは、タンパク質合成のためのいずれかの種類の細胞培養若しくは細胞非含有系からの遺伝子組み換えタンパク質としての又は生物学的流体若しくは組織から単離された、ヒト又は他の起源の、いずれかの免疫グロブリンを意味する。
【０１０５】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい一実施形態では、予期せぬことに、アミノポリマー含有高分子メッシュと接触させた後２０分後でもポリクローナル抗体（ｈＩｇＧ）混合物から凝集物が形成されないことが分かった。それに対して、多くの従来の捕捉プロセスでは、樹脂表面への非共有的結合後の収率の低下に悩まされている。加えて、アフィニティカラムからでさえも、抗体の有意な部分が溶出工程中の凝集物の形成に起因し失われてしまう。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１ａ】図１ａ（図実施形態１．１）は複合吸収材バッチ０７についての、メタノール、エチレングリコール、及び既知の異なる流体力学半径（Ｒｈｉ）を有する６種のプルラン標準物質の正味溶出体積Ｖｅ（μｌ）対Ｒｈｉのプロットである。
【図１ｂ】図１ｂ（図実施形態１．２）は複合吸収材バッチ０７についての、分布係数（Ｋａｖ値、即ち、細孔体積分布画分）対図実施形態１．１と同じ試験物質の流体力学半径Ｒｈｉのプロットである。
【図１ｃ】図１ｃ（図実施形態１．３）は比較例の複合吸収材バッチ１９と本発明例の複合吸収材バッチ０７についての、メタノール、エチレングリコール、及び既知の異なる流体力学半径（Ｒｈｉ）を有する６種のプルラン標準物質の正味溶出体積Ｖｅ（μｌ）対Ｒｈｉのプロットである。
【図１ｄ】図１ｄ（図実施形態１．４）は比較例の複合吸収材バッチ１９と本発明例の複合吸収材バッチ０７についての、分布係数（Ｋａｖ値、即ち、細孔体積分布画分）対図実施形態１．１と同じ試験物質の流体力学半径Ｒｈｉのプロットである。
【図２】実施例４によるＣＨＯ  Ｋ１細胞株からの細胞培養上清（ＣＣＳ）の濃縮溶液の等電点電気泳動（ＩＥＦ）を示す図である。
【図３】２つのｐＨ条件下での２つの複合材バッチ０７及び０９による及び塩の存在又は非存在下での実施例５による処理後の、細胞培養上清ＣＣＳ  ＢＨＫ−２１からのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の低減を示す図である。
【図４．１】実施例３による吸収材細孔からのｈＩｇＧの排除を示す図である。
【図４．２】実施例３による吸収材細孔からのｈＩｇＧの排除を示す図である。
【図５】本発明の目的を要約する図である。
【図６】全体的概念を要約する図である。
【図７】作業原理を要約する図である。
【図８】可能なプロセスの一例におけるバッチ低減材料を要約する図である。
【図９】バッチ結果を要約する図である。
【図１０】回収ｈＩｇＧの点でのバッチ結果を要約する図である。
【図１１】ＨＣＰ及びＤＮＡの低減におけるバッチ結果を要約する図である。
【図１２】概要を要約する図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
典型的な必須の技術的特徴の組み合わせによって非常の多くの可能な実施形態の設計が可能となる。以下の項目が本発明による重要な実施形態とみなされるが、包括的であることは求めない。
【０１０８】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、不要化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、アルブミン、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、内毒素、界面活性剤、バクテリア、及びウイルスから選択される。コーティングタンパク質、Ｓ層、細胞断片、又はデブリのような前記不要化合物の断片もまた本実施形態の範囲内である。
【０１０９】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、標的化合物は抗体であり、上に挙げた不純物ａ）、ｂ）及びｃ）のみが前記溶液から低減される。上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、標的化合物は抗体であり、上に挙げた不純物ａ）及びｂ）のみが溶液から低減される。上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、標的化合物は抗体であり、不純物（不要化合物）としてＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質のみが溶液から低減される。
【０１１０】
好ましくは、汚染物質又は不純物は原料（例えば生物学的流体、発酵プロセスの上清、又はろ過前の発酵ブロス）から原料中のそれぞれの合計量の９０％超、９５％超、９９％超の程度で低減され、標的物質の全体量の１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下が付随的に結合する。
【０１１１】
したがって本発明は、工程ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）を含む精製プロセスであって、不純物が少なくとも９０％まで低減され、一方で標的タンパク質が少なくとも９０％まで回収されることを特徴とするプロセスに関する。
【０１１２】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、宿主細胞タンパク質は少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の量まで低減される。
【０１１３】
したがって、本発明は、宿主細胞タンパク質が供給物から初期濃度の少なくとも９０％まで低減される精製プロセスに関する。
【０１１４】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、ある体積の特定の原料（例えば、細胞培養物又はその上清のような、固体物質の除去前か後の発酵プロセスからのもの）を懸濁液中で十分な量のアミノポリマー含有複合材料と接触させる。適当な時間撹拌又は振盪した後、例えば、吸引、ろ過、又は好ましくは沈降又は遠心分離によって、複合材料を該低減済みの供給溶液から分離する。
【０１１５】
原料が、細胞、細胞断片、又は組織等を含有する懸濁液であった場合、これらの固体は複合材料とともに除去される。残留する遠心分離物、濾液、又は画分は精製された標的化合物を含有する。
【０１１６】
粒子状の複合材料を用いる場合、いくらかの標的化合物が粒子間の間隙体積中に残存する場合がある。この場合、標的含有溶液の大部分を置換するために、一外部空洞体積の非常に弱い溶媒を適用する。純度及び収率によって、この追加の体積を標的の主要画分と合わせてもよく、又は別の精製工程に供してもよい。細胞培養上清からの抗体精製の場合には、置換のための溶媒はただの水、又は標的タンパク質、好ましくは抗体のｐＩから十分に遠い弱緩衝液である。
【０１１７】
弱溶媒又は弱緩衝液は好ましくはクロマトグラフィの溶出力を示さず、及び供給物の不純物化合物の大部分に対する溶解性が低いことを特徴とする。
【０１１８】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、原料の複合材料に対する比率は５〜１００ｌ／ｋｇの範囲であり、好ましい接触時間は５〜６０分である。
【０１１９】
複合材料は好ましくはプロセスサイクルの終わりに処分され、即ち、それらは１回使用向けに設計されているため、標的化合物が許容可能な程度まで未結合のまま液相中に残存する限り、結合物質のその後の溶出は通常必要ない。しかしいずれかの結合化合物の溶出及び単離は本発明の範囲内であり、いずれかの既知の溶出方法を適用することにより達成することができる。
【０１２０】
ＡＰＩ（医薬的有効成分）のために定められている厳しい品質要求を満たすために、新規な技術的知識に従って精製された標的化合物は１つ又は２つの追加の精製工程を必要とする場合がある。これは検出限界未満の低減が必要である場合、又は宿主細胞タンパク質のような複雑で不均質な部類の副生成物又は不純物を最終的なＡＰＩの質量基準で１０ｐｐｍ未満のレベルまで除去しなければならない場合に当てはまる場合がある。
【０１２１】
他のいずれかの精製工程と連続する上記又は下記の実施形態のいずれかの高分子メッシュの使用は故に、本発明の対象である。上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、イオン交換又はアフィニティクロマトグラフィ工程、又はいずれかの他の精製工程の前又は後でのそれらの使用は本発明の範囲内であり、特にアフィニティ系の分離工程、例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又は双方の組み合わせを収穫するいずれかの種類の分離媒体に対する標的化合物の選択的吸着が考えられる。加えて、膜ろ過、デプスろ過とのいずれかの組み合わせ又はモノリシック分離剤の適用は本発明の範囲内であるとみなされる。上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたより好ましい実施形態では、イオン交換又はアフィニティクロマトグラフィ工程又は他の精製工程の前後に、高分子メッシュが使用される。
【０１２２】
したがって、本発明は、いずれかの更なるクロマトグラフィ又は非クロマトグラフィ精製工程に先だって、上述の工程ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）が未精製の供給懸濁液又は溶液を用いて行われることを特徴とする、１つ以上の追加の分離工程との組み合わせに関する。
【０１２３】
標的化合物は高分子メッシュから排除されるが、少量がその外側表面に吸着される場合がある。標的化合物の十分な収率及び／又は回収率を達成するために、高分子メッシュの外側表面へのこの標的化合物の有意な量の結合を回避することが必要である。高分子メッシュの細孔直径における必然的な分布に起因して、また外側表面との潜在的な相互作用に起因して、少量の標的物質の損失を全く回避することは不可能であることが多い。これらの損失は有益な物質の全体としての回収率を低下させる場合があるため、こうした損失を最小限に抑えるべく本発明内で追加の戦略が組み合わされた。
【０１２４】
高分子メッシュの特別な多孔性により提供される排除効果とともに、本発明はこうして以下の一般的な設計原理もまた採用している：
【０１２５】
Ａ１．水性環境における適用のためには、移動相と接触されるポリマー部分は極性であって、標的化合物の極性及び／又は電荷に近くなければならない。その結果として、溶媒化された標的化合物は複合材料から離間されそれらには結合しない。
【０１２６】
Ａ２．したがって、有機溶媒中では、脂肪親和性の標的は親水性のポリマーにより反発を受け、またその逆も成り立つ。
【０１２７】
Ｂ１．ポリマーが電荷を帯びている場合、結合緩衝液のｐＨは、標的化合物がイオン種である限りはその等電点（ｐＩ）の＋／−１ユニットとしてその分子をほぼ未荷電状態に保つようにする。
【０１２８】
Ｂ２．より好ましくは、高分子メッシュを、供給物と接触させる前に、標的タンパク質の等電点（ｐＩ）の＋／−１ユニットのｐＨ、最も好ましくは標的化合物の結合が最小限に抑えられるｐＨに調節された緩衝液又は溶媒で平衡化する。
【０１２９】
標的化合物との前記望ましくない相互作用を避けるために、好ましくは２０分未満の接触時間内は、予備メッシュ平衡化のｐＨ条件は十分な未変化状態に保たれる。
【０１３０】
Ｃ．高い塩濃度（好ましくは１００ｍＭ超のＮａＣｌと当量、又は１０ｍＳ／ｃｍ超の伝導度）が極性の結合力（主に高分子メッシュの外側表面上でのイオン性の電荷相互作用）を低下させ、及びしたがって標的化合物はあまり引きつけられない。それでも、高分子メッシュ内部の強い、例えば多価の結合力は、やはり高い塩負荷で流入する分子を吸着することができる。
【０１３１】
Ｄ．発酵プロセスからの少量のＤＮＡのような大きな巨大分子鎖分子の、外側表面への多価の強い結合は、標的分子がそのＤＮＡそのものと相互作用しない限り、競合する置換によって標的分子の結合を妨害し又は抑制することになる。
【０１３２】
本発明の高分子メッシュの使用はしたがって、標的化合物の結合を回避するか最小限に抑えるようなｐＨ及びイオン強度に調節された溶媒又は緩衝液を用いて、又は好ましくは原料の溶媒と比較して低い溶出強度の溶媒を用いて、高分子メッシュをすすぎ及び平衡化する予備工程を含む。この対策はより低い結合定数を示す不純物の結合も改善する。
【０１３３】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の工程ｉ）、ｉｉ）、及び任意でｉｉｉ）はしたがって、上記のＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤに基づく１つ以上の対策と組み合わされる。
【０１３４】
「標的化合物」とは本発明による精製に供されるいずれかの有益な物質を指す。
【０１３５】
安価な複合材料の調製のための方法を提供することもまた本発明の目標である。前記複合材料は、種々の物質の分離又は精製方法、例えば、数種の構造的に異なる部類の物質を溶液（原料）から同時除去することを可能にする。
【０１３６】
前記目標は以下を含むプロセスにより達成され：
少なくとも多孔質支持材料の細孔体積を、少なくとも１種の官能性ポリマー又はコポリマーと少なくとも１種の架橋剤との溶液（反応混合物）で充てんする工程、及び前記官能性ポリマーを架橋によってその場で固定化する工程、この際支持材料は粒子状、ペリクル状、又はモノリシックである。
【０１３７】
ペリクル状とは、固体粒子又は材料が多孔質層でコーティングされていることを意味する。
【０１３８】
モノリシックとは、少なくとも０．５ｍｍの厚みを示す支持材料の均質多孔片を意味する。
【０１３９】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、細孔は官能性ポリマーと架橋剤との混合物で充てんされ、及び予備的な又は中間の乾燥を行わずに一工程プロセス中で反応される。下記の実施形態のいずれかと組み合わせた別の実施形態では、細孔を充てんした後、架橋反応を開始する前に溶媒を完全に又は部分的に除去してもよい。エポキシド架橋剤又は周囲温度で反応しない架橋剤を用いる場合には、この溶媒の減少は好ましくは３０℃未満の温度での蒸留によって達成される。溶媒の所望の部分が除去されたら、架橋反応を５０℃以上の温度で開始する。下記の実施形態のいずれかと組み合わせた別の実施形態では、この溶媒の部分的な又は完全な除去の後に、空の空間を異なる溶媒で部分的に又は完全に充てんしてもよい。
【０１４０】
これらの上述の場合すべてにおいて、初期の細孔充てん工程の間に既に架橋剤が存在した。そして反応は多孔質支持体の内部又は界面で行われる。但し、支持材料は粒子状又はモノリシックアイテムのアセンブリ、例えばスタックであり、前記プロセスは、別法として以下を含む：
【０１４１】
支持材料（細孔体積及び粒子間又は層間の間隙体積）のうちの少なくとも沈降体積（「方法」参照）を前記反応混合物で充てんすること、又は
任意で、反応混合物を含有する前記沈降体積の１２０％までの過剰な反応混合物を適用すること。
【０１４２】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、支持材料は、細孔中への液体の自発的な染み込みを適用して反応溶液で充てんされる。先行技術により既知の細孔充てんのいずれかの他の方法も適用可能である。
【０１４３】
しかしながら、染み込み技術を用いて、多孔質粒子支持材料の全細孔体積を完全に充てんすることは難しい。また細孔体積の決定（「方法」を比較のこと）は常にある程度の誤差を含むため、適用すべき反応液の必要な体積を正確に決定するのはさらにより難しくなる。したがって、例えば単に液体の表面張力のために、粒子の有意な画分が外側表面上で液体によりやや過負荷となることはまず避けられない。結局、決定された細孔体積に等しい体積だけしか反応混合物を加えなかった場合には、他の粒子の細孔部分は必然的に完全には充てんされないこととなる。
【０１４４】
製造プロセス中に全粒子を一度に液体と接触させることは基本的に不可能であるため、不均質な粒子充てんのこの問題は特に大きな量を処理する場合には、さらにより深刻となる。
【０１４５】
特化された用途に関しては、支持材料のアクセス可能な表面を架橋ポリマーで完全に覆うことは絶対的な要求である。したがって上述した種類及び程度の不正確さは無視できない。ポリマーで覆われていない支持体表面画分は、選択性及び主に分離プロセス中の回収に負の影響を与えることになる。特にシリカ等の極性の支持材料又は他の極性媒体上のタンパク質標的化合物では、標的化合物のこれらのスポットへのより強い吸着が存在する場合がある。
【０１４６】
前記問題は、十分過剰な反応混合物体積を適用して支持体表面全体の完全な湿潤及びポリマー被覆を可能にすることで回避することができる。この場合、しかしながら、粒子体積の外側のあらゆる架橋反応を防止することが必要となる。さらに、反応混合物の調製後の十分なポットライフ時間の間のポリマーと架橋剤との急速な反応も許容されない。
【０１４７】
驚くべきことに、粒子間の間隙体積が部分的に又は完全に反応溶液を含有する場合でも、いずれの粒子も互いに融着されないことが分かった。いずれかの説明に拘泥されるものではないが、この場合（実施例１）、架橋剤はおそらく多孔質支持材料によって吸着される。したがって、ある程度過剰のポリマー架橋剤溶液が適用されるならば複合材の調製は負の影響を受けない。反応が沈降された支持材料を用いて撹拌、振盪、又は他の移動なしで行われることになるため、これらの予想外の知見は、特に大量の複合材料を製造しながらでも、本発明による製造プロセスの簡略化を可能にする。
【０１４８】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、少なくとも支持材料の細孔体積は、反応溶液で、好ましくは細孔体積に対して過剰な溶液で充てんされ、より好ましくは沈降体積及び最も好ましくは沈降体積よりわずかに過剰な量が添加される。故に上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、官能性ポリマー、好ましくはポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）と、ビスエポキシド、好ましくはエチレングリコール−、プロピレングリコール−、ブタンジオール−、又はヘキサンジオールジグリシジルエーテルとの溶液が、少なくとも細孔体積の量、好ましくは沈降体積の量、及び最も好ましくは全沈降体積の１１０％〜１２０％の量で提供される。この際、支持材料の細孔は完全に充てんされた。予期せぬことに、反応の終わりに、細孔の外側にポリマーゲルが形成されることもなく粒子が接着し合うこともない。
【０１４９】
同様に上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、粒子間の間隙体積が完全に液体で充てんされ及び反応溶液の薄い液体膜が沈降された固体の上部を覆うように、過剰な、好ましくは支持材料沈降体積の１１０％〜１２０％の、官能性ポリマーの架橋剤含有溶液が添加される。
【０１５０】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたより好ましい実施形態では、架橋剤は架橋性ポリマーと共に水中又は水溶液中において適用される。好ましくは上述のビスエポキシド、最も好ましくはヘキサンジオールジグリシジルエーテルを用いる２％（ｖ／ｖ）未満の架橋剤量でさえ完全には水に溶解しないが、驚くべきことに形成されたエマルションは支持材料細孔の内部に分配され、こうして安定な架橋高分子メッシュを生成する。
【０１５１】
水性媒体のみを使用することは合成プロセス及びその後の洗浄及び平衡化にとって有利である。
【０１５２】
予備的な細孔充てんを含む反応の目的のために、架橋性ポリマー又はコポリマーは好ましくは、ポリマーを収縮させることになる溶媒又は緩衝液中に溶解される。こうして個々のポリマーコイル又はポリマー体の分子体積が最小化されて、狭い細孔内に最大量のポリマーを誘導することが可能となる。
【０１５３】
ポリアクリレート又は他の酸性ポリマーの場合には、酸性ｐＨ範囲内で膨潤が抑えられ、非解離形態を生成する。アミノ含有ポリマーの場合には、塩基性のｐＨがこの所望の分子の収縮を生ずる。ポリビニルアルコールのような中性のポリマーは好ましくは、例えば水−プロパノール混合物を用いて、テータ点に近い水性混合物中に溶解される。
【０１５４】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、本発明はしたがって非膨潤溶媒、溶媒混合物、又は緩衝液を用いて調製された反応溶液による細孔充てん工程に関する。
【０１５５】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、反応混合物は、官能性ポリマー又はコポリマーと、架橋剤と、及び任意で、例えば緩衝化合物、塩、又は溶媒若しくは溶媒混合物中に適用され共に溶解、懸濁、若しくは乳化された原料反応物質に由来する種々の副生物等の補助物質と、を含む。
【０１５６】
本発明はまた、特定の溶媒又は緩衝液中である細孔サイズ分布を示す架橋された成形済みのポリマーを含む高分子メッシュであって、以下を特徴とする高分子メッシュを提供する：
【０１５７】
十分に膨潤されたポリマーメッシュの細孔サイズの上限は、流体力学半径Ｒｈ１（ｎｍ）を有するポリマー標準分子の排除によって規定され、一方で細孔体積全体の予め選択され規定された画分は、Ｒｈ１〜Ｒｈ２（Ｒｈ１＞Ｒｈ２）の流体力学半径を有するポリマー標準分子に対してはアクセス可能なままである。
【０１５８】
水溶液中での適用のための好ましいポリマー標準分子はポリエチレンオキシド、デキストラン、及びプルランである。
【０１５９】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、前記高分子メッシュは、アクセス可能な細孔体積の内部に浸透物質のうちの少なくとも１種を保持することが可能である。
【０１６０】
前記排除特性は複合材の設計に限定されず、ソフトゲルの実施形態も対象とする。
【０１６１】
Ｒｈ１の好ましい値は５ｎｍ、より好ましくは４ｎｍである。Ｒｈ２の好ましい値は２ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ、最も好ましくは０．２ｎｍである。
【０１６２】
Ｒｈ１及びＲｈ２の限定による好ましい範囲は１．５ｎｍ〜５ｎｍであるが、それは細孔サイズのこの範囲は基本的に１０，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量を有するタンパク質に対してアクセス可能であるためである。
【０１６３】
以下は本発明による前記高分子メッシュの調製の好ましい実施形態である。
【０１６４】
少なくとも４つの等しい又は異なる繰り返し単位を有するコポリマー、重縮合生成物（例えば、ポリアミド）、及びオリゴマー又は分子は、本発明の関するポリマーの定義の範囲内であるとみなす。
【０１６５】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、個々の架橋性ポリマー又はコポリマー鎖は少なくとも１つの官能基を含んでいる（「官能性ポリマー」）。
【０１６６】
基本的に、官能性ポリマーとは少なくとも１つ以上の同一の又は異なる官能基を含むいずれの種類のポリマーであってもよい。
【０１６７】
好ましくは、官能性ポリマーは少なくとも１つのＯＨ−、ＳＨ−、ＣＯＯＨ−、ＳＯ３Ｈ、又はアミノ基を有している。
【０１６８】
好ましいヒドロキシル含有官能性ポリマーはポリ（ビニルアルコール）、アガロース、及びセルロースである。好ましいカルボキシル含有ポリマーはポリ（アクリレート）又はポリ（メタクリレート）である。
【０１６９】
固定化されたポリマー又はコポリマーが官能化されている場合、１分子当たり少なくとも１つの架橋性基を示す。
【０１７０】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、官能性ポリマーは少なくとも４つのアミノ基を有するアミノ基含有ポリマー又はオリゴマー、より好ましくはポリアミンである。アミノ基は一級及び二級である。
【０１７１】
ポリマーのアミノ基含有誘導体、例えばアミノ基を有するポリビニルアルコール又は多糖は本発明の範囲に含まれる。上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、ポリアミンはポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）である。
【０１７２】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、官能性ポリマーは水に可溶である。
【０１７３】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、反応化合物は水に可溶であるか又は少なくとも乳化される。
【０１７４】
本発明の他の目的は、例えば出発原料又は中間体のいずれかの精製等の、前処理を必要としない、適度な温度での一操作工程のみを含む、複合材料の効率的な一般的合成手順を提供することである。
【０１７５】
加えて、最も好ましい実施形態では、前記複合材料の合成及び洗浄及び平衡化は有機溶媒の使用を回避する。
【０１７６】
一工程及びその場とは、所望される生成物を得るために、１つの作業操作内ですべての反応物が混合され、反応され、及び複合材が洗浄されることを意味する。主として、架橋を介する固定化は完全な反応混合物の適用と同時に又は適用後に達成される。
【０１７７】
特に、架橋剤が添加される前に乾燥工程が適用されることはない。
【０１７８】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、架橋反応は細孔充てん中に既に開始されるのではなく、その後に、好ましくは高温下又はｐＨシフトを伴って開始される。エポキシド架橋剤による架橋はこのように、好ましくは５０℃を超える温度で開始され、室温では３０分後に、さらには２時間後でも目に見えるゲル化は起こらない。
【０１７９】
アミノ含有ポリマーのカルボニルジイミダゾールのような反応性架橋剤による架橋は７未満、好ましくは６未満のｐＨ値で抑制され、及び好ましくは７を超えるｐＨ、より好ましくは８を超えるｐＨに調節した後に開始されることとなるが、それはプロトン化されたアミノ基の反応速度が大変遅いためである。下記の実施形態のいずれかと組み合わせた別の実施形態では、架橋剤をまず支持材料細孔中に適用し、任意で樹脂を少なくとも部分的に乾燥し、そして最後にポリマー溶液を導入して架橋を行う。
【０１８０】
本発明はまた、以下を含む複合材料の調製プロセスも提供する：
【０１８１】
少なくとも多孔質支持材料の細孔体積を少なくとも１種の官能性ポリマー又はコポリマーと少なくとも１種の架橋剤との溶液（反応混合物）で充てんすることと、前記官能性ポリマーを架橋によって固定化することであって、この際前記反応混合物は、塩、緩衝液、及び／又は他の化合物を含有していて、これらは複合材生成物には組み込まれない。
【０１８２】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、この複合材合成のために、各試薬の製造プロセスからの塩及び他の副生物を未だ含有している工業品質の未精製ポリマー又はポリマー溶液及び架橋剤が使用される。
【０１８３】
予期せぬことに、いずれかの副生物、主に塩又は不純物は再現性のある架橋プロセスを妨げないことがわかった。未反応の、例えば、過剰の化合物と共に、それらは反応物質の同時固定化後のその後の洗浄工程によって複合材から除去される。この種の処理は、予め反応性化合物を濃縮又は洗浄するための労力及びコスト全般を節約する。したがって、高価な高品質等級の化学品の代わりに安価な工業品質ポリマー及び架橋剤を使用することができる。
【０１８４】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、複合材合成のために、未精製のポリアミンが使用され、より好ましくは塩、水酸化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、及びポリマー製造プロセスからの他の副生物を含有する未精製のポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）溶液が使用される（実施例１）。
【０１８５】
１０ｎｍ〜５ｍｍの平均細孔サイズを有する支持材料が好ましく、２０ｎｍ〜５００ｎｍの細孔サイズがより好ましく、２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲が最も好ましい。
【０１８６】
多孔質支持材料の形態は特に限定されず、例えば、膜、不織組織、モノリシック、又は粒子状の材料とすることができる。粒子状及びモノリシックの多孔質材料が支持体として好ましい。ペリクル材料もまた本発明の範囲に含まれる。粒子状の多孔質支持材料の形状は不規則又は球状のいずれかとすることができる。上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、多孔質支持材料は好ましくは実質的に不規則な形状を有する。
【０１８７】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料はモノリシック又は粒子状の材料である。
【０１８８】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料は金属酸化物、半金属酸化物、セラミック材料、ゼオライト、又は天然若しくは合成のポリマー材料で構成される。
【０１８９】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料は多孔質シリカゲルである。
【０１９０】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料は多孔質セルロース、キトサン、又はアガロースである。
【０１９１】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料は多孔質ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエーテルケトン、ポリアルキルエーテル、ポリアリールエーテル、ポリビニルアルコール、又はポリスチレンである。
【０１９２】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、多孔質支持材料は１〜５００μｍの平均粒子サイズを有する粒子状の材料である。
【０１９３】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、モノリシック支持材料は少なくとも０．５ｍｍの高さ及び任意の直径を有する円板、円環、円筒、又は中空円筒である。
【０１９４】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、支持材料は２０ｎｍ〜１００ｎｍの平均細孔サイズ（直径）（ＤＩＮ６６１３３に従い水銀圧入によって分析）及び少なくとも１００ｍ２／ｇの表面積（ＤＩＮ６６１３２によるＢＥＴ表面積）を有するシリカ、アルミナ、又は二酸化チタンである。
【０１９５】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、支持材料は少なくとも１５０ｍ２／ｇの表面積を有する不規則形状シリカ、アルミナ、又は二酸化チタンである。
【０１９６】
ｉＳＥＣ条件（図実施形態１．１、１．２、１．３、及び１．４からなる図１参照）下でｐＨ６において２０ｍＭ酢酸アンモニウム中に溶解され測定された場合に、６ｎｍ以下の流体力学半径Ｒｈを有する高分子プルラン標準物質のアクセスを可能にする、２０〜３０ｎｍの平均細孔直径を示す不規則形状シリカゲル材料がさらにより好ましい。
【０１９７】
少なくとも１５０ｍ２／ｇ、好ましくは２５０ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積及び少なくとも１．５ｍｌ／ｇ、好ましくは１．８ｍｌ／ｇの細孔体積（水銀圧入）を有する不規則シリカが最も好ましい。調製用タンパク質精製目的のためのシリカ及びシリカ誘導体の使用はまれであり、且つ５０ｎｍより大きい平均細孔サイズが、通常有機支持材料で達成される先行技術における好ましい範囲である。
【０１９８】
無機支持材料もまた乾燥状態において利用可能であり、最初の乾燥及びポリマー精製工程を行わずに細孔を単純に充てんすることによって溶解された試薬の導入が可能である。
【０１９９】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた最も好ましい実施形態では、２５ｎｍの平均細孔直径を有するシリカゲル、好ましくは支持材料Ｄａｖｉｓｉｌ２５０の細孔を、ビスエポキシド架橋剤とポリビニルアミン、Ｌｕｐａｍｉｎ５０／９５（平均分子量５０．０００Ｄａ、おおよそ９５％までの加水分解物）若しくはＬｕｐａｍｉｎ４５／７０（平均分子量４５．０００Ｄａ、約７０％までの加水分解物）又は同等の仕様を有する材料との混合物を含有する水溶液で９〜１１のｐＨにおいて充てんし、５０〜６０℃の温度で２４〜４８時間反応させる。
【０２００】
したがって、本発明は、多孔質支持材料とアミノ基含有ポリマーとを含む複合材料の合成のためのプロセスであって、支持材料が２０ｎｍ〜１００ｎｍの平均細孔直径を有するシリカゲルであり、細孔がアミノ基含有ポリマーと架橋剤との混合物で充てんされ、及び好ましくは予備の又は中間の乾燥を含まない一工程プロセスにおいて反応され、こうしてアミノ基含有ポリマーを架橋によって固定化することを特徴とするプロセスに関する。
【０２０１】
（官能性）ポリマーが支持材料の細孔内部に固定化される場合、それらは乾燥状態ではいずれの観測可能なメッシュ多孔性も示さない。このような複合材を乾燥した後では、少なくとも架橋度が２５％未満に留まる限り、ＢＥＴ窒素吸着又は水銀圧入ポリシメトリーのような確立された方法を用いておおよそベースの支持材料の細孔サイズ分布が再び見られる。この挙動は、排除されるポリマー体積に近い値までのメッシュの収縮を引き起こすポリマーコイル内部の強い接着力に起因し得る。例えばポリアクリレート又はポリアミンを用いる場合のように、官能基がそのままの状態で電荷を帯びている場合には、結果として得られる排除体積はわずかに大きくなり得る。
【０２０２】
溶媒によって又は懸濁液中で湿潤される場合には、ポリマー構造は基本的に異なるモルフォロジーを表す。十分な溶媒化がなされると、ポリマーメッシュは、可能な最大体積に達して古典的なヒドロゲル構造に及ぶまで膨潤する。この場合、得られる高分子メッシュの多孔性は溶媒の性質（極性等）、ｐＨ、イオン強度、及び界面活性剤等の補助剤の濃度に依存する。
【０２０３】
本発明に従い、官能性ポリマー、特に荷電ポリマーを扱う場合、ポリマーの固定化プロセス中においては支持材料細孔を充てんする度合いを、また分離における複合材の使用中においては「充てんされた又は占有された細孔」を識別することが重要である。
【０２０４】
ポリマー結合の第一のケースでは、支持体の細孔体積全体が試薬の溶液で充てんされる。後者のケースにおいて、選択された溶媒中での架橋ポリマー及び得られるメッシュの膨潤挙動に起因して、メッシュ細孔は満たされており、即ち特定の流体力学半径Ｒｈ１の分子にとってもはやアクセス可能ではない。各々の特定のケースにおいて、潜在的な膨潤挙動は利用可能なポリマーの文献から推定可能である。このように細孔の充てん度は、適切な溶媒及びｐＨの選択により実現、調節、及び制御可能である。
【０２０５】
適切な溶媒とは、当業者には既知であるポリマー溶媒化の規則に従って高分子メッシュを膨潤可能である溶媒を意味する。詳細はＨ．Ｇ．Ｅｌｉａｓ、Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌｅ、Ｈｕｔｈｉｇ＆Ｗｅｐｆ、Ｂａｓｅｌ、Ｂｄ．１（１９９０）、ｐ．１４５−２０７を参照のこと。
【０２０６】
複合材料を用いるが本発明の圧力安定性ポリマーゲルをも用いる場合、細孔体積及び細孔体積画分を決定するための方法はｉＳＥＣである。剛性の多孔質材料に使用するような水銀圧入又はＢＥＴ窒素吸着としてのプロトコルは、メッシュが乾燥後に崩壊してしまうためここでは適用不可である。
【０２０７】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、アミノ基含有ポリマーが、好ましくは８．５より上、より好ましくは９〜１２、最も好ましくは１０〜１１のｐＨで収縮状態で支持材料に導入され、これにより細孔充てんの条件下での溶解ポリマーの最大密度が可能となる。８未満のｐＨにて架橋及び膨潤した後では、最初の支持体細孔体積内部の高分子メッシュにより占められた空間が増大し、最終的には酸性ｐＨにおいて最大となる。
【０２０８】
下記の実施形態のいずれかと組み合わせた好ましい実施形態では、本発明の目的は少なくとも１種の収縮架橋性ポリマーの少なくとも１種の架橋剤との反応によって達成され、このようにして特定の溶媒又は緩衝液中で選択的に膨潤され又は収縮されるメッシュを形成する。
【０２０９】
使用条件下で、適切な溶媒又は溶媒混合物を選ぶことによって細孔充てんの度合いを所望のレベルに調節することができる。定義により、選択され及び良好に規定された流体力学半径Ｒｈ１を有する標準分子がそれ以上メッシュ細孔に入り込めないならば、高分子メッシュの細孔は満たされているとみなされる。本発明では、「方法」の項で概説し図１（図実施形態１．１〜１．４）に実証されるようなインバースサイズ排除クロマトグラフィ（ｉＳＥＣ）の方法を用いてこの膨潤の度合いを較正し及び適合させ、及びさらに精製プロセスの間制御しつつ、選択された緩衝液の存在によって対応する膨潤状態を維持する。
【０２１０】
基本的に、規定された最小の（「又は臨界の」）流体力学半径を有する分子の特定の細孔体積画分からの立体的排除が起こるということは、図実施形態１．１〜１．４及び実施例によってモデル標的化合物として使用されるプルラン分子量標準物質との比較によって実証される通りである。
【０２１１】
実施例のポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）含有複合材では、２０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸アンモニウム溶液を用いて膨潤の度合いが調節される。その後の不純物の低減のために、複合材を好ましくは５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で７未満、より好ましくは３〜７のｐＨに平衡化する。
【０２１２】
したがって、好ましい実施形態では、及び上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、ポリマー膨潤の度合いは、較正用に良好に規定された分子サイズのポリマー標準物質の選択と、適切な溶媒又は溶媒混合物を加えることによる高分子メッシュの付随する調節を利用して、インバースサイズ排除クロマトグラフィによって決定される。
【０２１３】
本発明によれば、適切な溶媒中ではアクセス可能なメッシュ細孔体積は膨潤条件下で増大し、及び収縮条件下で減少する。メッシュ細孔サイズ体積及びメッシュサイズ分布は常に、特定の連結ポリマーコイル又は小球内部の又はそれらの間の空間に関連付けられるのであって、支持材料中の最初に利用可能な又は最終的に残存する空間にではない。
【０２１４】
支持材料に導入され及び固定化されるポリマーの量は、好ましくは各反応溶液におけるポリマー濃度により制御される。
【０２１５】
それに対し、適用条件下での支持体細孔充てんの度合い及びメッシュサイズ分布は、ポリマーの溶媒依存性の膨潤及びその総固定化量により制御される。両パラメータを共に採用して、固定化されるポリマーの全体量及び膨潤度合いによって、ポリマーにより充てんされる全細孔体積の割合を調節することが可能となる。
【０２１６】
上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせたさらに好ましい実施形態では、適用条件下での支持体細孔充てんの度合い及びメッシュサイズ分布は、異なるポリマー量の導入及び固定化及びその後の細孔サイズ分布の測定によって達成され及び決定される。固定化されるべきポリマーの量は好ましくは反応溶液中のポリマー濃度により調節される。このようにして、固定化されることのできる可能な最大ポリマー量が前記目的のために容易に解明される。
【０２１７】
充てんの度合いは、ポリマー−架橋剤溶液の導入の前後に湿潤及び乾燥材料を秤量することにより正確に決定され及び標準化される。
【０２１８】
溶解された標的ポリマー、例えばタンパク質の分離又は精製のために、種々の不純物の保持を少なくとも１種の標的化合物の立体的排除と同時に達成することがさらに有利である。
【０２１９】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明は、高分子メッシュの使用のための材料及び方法、好ましくは数種の構造的に異なる部類の物質の、溶液、好ましくは原料からの同時除去を達成するとともに、少なくとも１種の標的化合物が実質的に未結合のまま残り高収率で回収される複合材料の使用のための材料及び方法を提供する。この標的化合物の収率は好ましくは８０％、より好ましくは９０％、及び最も好ましくは９５％超である。
【０２２０】
上記の及び下記の本発明のさらなる目的もまた、以下に概説する実施形態により達成される。
【０２２１】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明は、適切な溶媒で平衡化された場合に上限の、しかし可変の細孔サイズＲｈｉを示し、これにより細孔体積内部にこの排除限界Ｒｈｉ（ｎｍ）未満の流体力学半径を有する化合物の有意な量、最初の含有量の好ましくは５０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％超を保持することができる一方で、高分子メッシュの細孔はＲｈｉ以上の流体力学半径を有する少なくとも１種の標的化合物についてはアクセス不可であり、これにより溶液中、好ましくは精製供給物中に前記標的化合物を回収することが可能となる、高分子メッシュの合成及び利用のための方法を提供する。メッシュの溶媒依存性の膨潤によって、この排除限界Ｒｈｉは可変のサイズである。溶媒の強度及びｐＨ以外の、Ｒｈｉを制御する主要なパラメータは、官能性ポリマーの構造、架橋剤の性質、架橋度、及び複合材の場合には支持材料の細孔サイズ分布である。
【０２２２】
用語Ｒｈｉとは、一連の異なるサイズが膨潤度の関数として得られることを示す。それに対して、Ｒｈ１及びＲｈ２は特定の適用ケースにおいて固定された距離を示している。
【０２２３】
吸着、分割、及びサイズ排除を組み合わせる前記目的は好ましくは、以下を含む複合材料の使用によって達成される：
【０２２４】
５ｎｍ〜５ｍｍの平均細孔サイズを有する多孔質支持材料、ここで、多孔質支持材料の全細孔体積はポリマーで充てんされ、このポリマーは架橋されてこれによりメッシュを形成し、このメッシュは、適切な溶媒で平衡化したときに流体力学半径Ｒｈｉ（ｎｍ）の標準分子を排除し、それによりＲｈｉ（ｎｍ）以上の流体力学半径を有する合成及び天然の巨大分子のための排除限界を提供する。
【０２２５】
標的化合物が抗体である場合には、前記排除効果は、このメッシュが５ｎｍを超える、好ましくは４ｎｍを超える流体力学半径Ｒｈ１を示す分子にとってアクセス不可な状態である場合に達成される。
【０２２６】
同様に上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明は、４ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈを有する化合物の有意な量、好ましくは最初の含有量の５０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％超を保持できる規定されたメッシュ細孔体積を示し、一方で細孔体積のこの画分が抗体にとってアクセス不可である、ソフトゲル又は複合材料の合成及び使用を提供する。
【０２２７】
本発明の文脈における細孔体積とは、特定の細孔体積画分全体の積分値又は合計を意味し、それらの画分の各々が細孔サイズの下限及び上限によって規定される。
【０２２８】
同様に上述の又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明は、それらのメッシュ細孔体積内に４ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈ２を有する化合物の有意な量、好ましくは最初の含有量の５０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％超を保持可能であり、一方で細孔体積のこの画分が抗体等の４ｎｍ以上のＲｈ１を有する標的化合物にとってアクセス不可であり、及び一方で高分子量を有する所望されない生成物の別の部分は外側表面に結合される、規定された細孔サイズ分布を示すソフトゲル又は複合材料の合成及び使用を提供する。
【０２２９】
上述した別の所望されない生成物は、好ましくは１００，０００Ｄａを超える分子量を有する核酸及び／又は宿主細胞タンパク質である。
【０２３０】
タンパク質精製の上述の目的は、好ましくは以下を含む複合材料の使用によって達成される：
【０２３１】
２０ｎｍ〜５ｍｍの平均細孔サイズを有する多孔質支持材料、ここで、この多孔質支持材料の全細孔体積はｐＨ８未満の適用条件下で架橋アミノ基含有ポリマーで充てんされ、
前記複合材料は、４ｎｍ以上の流体力学半径Ｒｈを有する分子、特に２１．７ｋＤａの分子量を有しＲｈ＝３．９８ｎｍの較正されたプルラン標準物質が、細孔体積の少なくとも９０％から排除され、且つ、全細孔体積の少なくとも３５％が、流体力学半径Ｒｈ＝２．１３ｎｍのプルラン標準物質６．２ｋＤにアクセス可能である細孔により表される、細孔サイズ分布によって特徴付けられる。
【０２３２】
任意で、上記複合材料の全細孔体積の少なくとも１５％が、流体力学半径＝２．７ｎｍのプルラン標準物質１０．０ｋＤａにアクセス可能な細孔により表され得る。
【０２３３】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、上記のアミノ基含有ポリマーは好ましくはポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）を含んでいる。
【０２３４】
それぞれ３５％及び１５％のこれら向上された細孔体積画分は、例えば選択された溶媒又は緩衝液中で基本的におよそ２ｎｍ〜４ｎｍの分子流体力学半径Ｒｈを表すおよそ１０，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量を有するタンパク質のための、有意な結合能力を提供するために有利である。
【０２３５】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明は、ポリ（ビニルアミン）又はポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）と架橋剤とを含む懸濁された高分子メッシュの使用であって、Ｒｈ＝３．９８ｎｍを超える流体力学半径を示すプルラン標準物質が細孔体積から実質的に排除され、このようにして各溶媒における細孔直径の上限を規定し、一方でメッシュ体積が流体力学半径Ｒｈ２＝２．１３ｎｍのプルラン標準物質６．２ｋＤに対してアクセス可能であることを特徴とする、使用を提供する。
【０２３６】
実質的に、とは細孔体積の少なくとも９０％がアクセス可能でないことを意味する。
【０２３７】
アミノポリマーを含む高分子メッシュは好ましくは水溶液中で各ポリマーを架橋することによって得られ、この際ｐＨは８〜１３、好ましくは９〜１２、最も好ましくは１０〜１１とする。
【０２３８】
細孔アクセス性及び排除限界は常に、ｐＨ６の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中でプルラン標準物質を用いてｉＳＥＣによって決定される（図１及び「方法」参照）。
【０２３９】
供給溶液は合成又は天然起源の混合物を含む。好ましくは供給物は、ろ過済み発酵ブロス（細胞培養上清）又は細胞及び細胞デブリのような固体を未だ含有する粗発酵ブロスである。
【０２４０】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、官能性ポリマーの平均分子量は好ましくは２，０００〜２，０００，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００〜１，０００，０００ダルトン、さらにより好ましくは１５，０００〜２００，０００ダルトン、最も好ましくは２０，０００〜１００，０００ダルトンである。
【０２４１】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明によるポリマーの固定化のために、先行技術により既知の任意の架橋剤が適用可能である。
【０２４２】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、ポリマーがアミノ基を有する限りにおいて、架橋剤は好ましくはビスオキシラン又はスクシニック若しくはグルタリックジアルデヒド等のビスアルデヒドである。ビスアルデヒドを架橋剤として使用する場合、安定化のためにその後に還元工程を行うのが有利である。
【０２４３】
２種よりも多い反応性基を有する架橋剤もまた適用可能である。
【０２４４】
好ましくは架橋剤は、高分子メッシュの形成の際に化学的に活性化される試薬を表すべきである。
【０２４５】
あるいは、先行技術、特にペプチド合成から既知の試薬及び手順を用いて、ポリマーを化学的活性化の対象として導入してもよい。
【０２４６】
前記ポリマーはまた先験的に反応性でもある。この場合ポリマーの官能基は、反応性の又は活性化されたポリマー、例えばポリ（マレイン酸）の無水物若しくはポリオキシランを適用することで、架橋プロセスそのものの間に又はその後に生成されてもよい。
【０２４７】
どちらの場合も、架橋剤又はポリマーも先行技術のカルボジイミド試薬、好ましくは水溶性カルボジイミドを用いて活性化して、反応全体を非水性条件下で行えるようにしてもよい。
【０２４８】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、アクリルポリマーをこのようにしてジアミン、ジオール、又はジスルフィドにより架橋する。あるいは、活性化されたジカルボン酸を使用して、アミノ含有又はヒドロキシル含有又はチオール含有ポリマーを架橋する。
【０２４９】
上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、架橋度は好ましくは５％〜３０％、より好ましくは７％〜２０％、及び最も好ましくは１０％〜１５％である。
【０２５０】
合成のために、調製の条件下で架橋剤及び架橋性ポリマーと反応しないか又はゆっくりしか反応せず、且つ前記反応物を好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｖ）溶液まで溶解する任意の溶媒を使用してもよい。この文脈におけるゆっくりとは、比較例１において実証されるように、選択された温度においてポリマー架橋剤溶液のみを用いて少なくとも３０分までに目に見えるゲル化が起こらないことを意味する。
【０２５１】
上記又は下記で概説される実施形態のいずれかと組み合わせて、支持材料の細孔内部に固定化された架橋ポリマーの量は好ましくは少なくとも１％ｗ／ｗ（ポリマー及び架橋剤の重量／乾燥複合材料の重量）、より好ましくは５％〜１０％ｗ／ｗ、及び好ましくは２５％ｗ／ｗ未満である。
【０２５２】
合成プロセスのための温度範囲は好ましくは２０℃〜１８０℃、より好ましくは４０℃〜１００℃、及び最も好ましくは５０℃〜７０℃である。
【０２５３】
関連する反応時間は好ましくは１時間〜１００時間、より好ましくは８時間〜６０時間、及び最も好ましくは１８時間〜４８時間である。
【０２５４】
略語及び定義
部分体積（μｌ）
吸収材の多孔性データを得るために必要、充填クロマトグラフィカラムを用い規定された流体力学半径Ｒｈの分子標準物質を注入することによって測定。この体積は信号時間に流量を掛け合わせることによって決定された。
【０２５５】
Ｖｅ
正味溶出体積Ｖｅはクロマトグラフィ系のカラム外体積を全体の溶出体積から差し引くことにより得られる。Ｖｅはカラムの総空隙体積Ｖ０に等しい。Ｖｅｎは個々の標準物質ｎの溶出体積である。
【０２５６】
Ｖ０
カラムの総空隙体積は細孔体積Ｖｐと間隙体積Ｖｉとの合計である。
【０２５７】
Ｖｉ
間隙体積Ｖｉは粒子間の体積である。
【０２５８】
ＶＰ
吸収材の細孔体積Ｖｐは総多孔質空間から成る。
【０２５９】
ｈＩｇＧ
ポリクローナルヒト免疫グロブリンＧ
【０２６０】
Ｓ層タンパク質、細胞表面の小片
【０２６１】
材料
細胞培養上清（ＣＣＳ）
ＣＨＯ−Ｋ１、Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ、バッチＲＰ  ＳＺ２９２／０１
細胞株ＣＨＯ−Ｋ１の模擬媒体
伝導度：１５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０
ＨＣＰ含有量：１２０μｇ／ｍｌ、ＤＮＡ含有量：１０００ｎｇ／ｍｌ。
表１．１及び１．２の低減実験に使用
【０２６２】
ＣＣＳ  ＢＨＫ−２１：Ｉｎｖｉｖｏ、Ｂｅｒｌｉｎ、バッチＲＰ  ＳＺ３５２／０１、細胞株ＢＨＫ−２１の模擬媒体は５％のＢＳＡを含有し、図３に示したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）低減に使用。
【０２６３】
供給物
特定のＣＣＳにヒト血漿（Ｏｃｔａｇａｍ、１０％溶液、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、ウィーン）からのｈＩｇＧを２ｍｇ／ｍｌ添加した。
ＳＥＣによる分析によると、Ｏｃｔａｇａｍは２．５％〜３．５％の凝集物を含有していた。
【０２６４】
支持材料
シリカゲル：Ｄａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ）、公称平均細孔サイズ２５０Å、粒子サイズ４０−６３μｍ（ｌｏｔ：１０００２４１８１０）
Ｅｕｒｏｓｉｌ  Ｂｉｏｓｅｌｅｃｔ３００−５、５μｍ、３００Å、Ｋｎａｕｅｒ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｇｅｒａｔｅ、ベルリン、ドイツ。
【０２６５】
ポリマー
ポリ（ビニルホルムアミド−コ−ポリビニルアミン）水溶液、Ｌｕｐａｍｉｎ４５−７０（ＢＡＳＦ）、供給元：ＢＴＣ  Ｅｕｒｏｐｅ、モンハイム、ドイツ、実施例１の実施形態のために、１０００ｇのＬｕｐａｍｉｎ４５−７０を２６０ｇの水酸化ナトリウム（１０％ｗ／ｖ）と共に８０℃で５時間加熱することによって部分的に加水分解。最後に１７０ｇの１０％塩酸を用いてｐＨを９．５に調節した。実施例１ａのためには、水酸化ナトリウムによる加水分解及び塩酸によるｐＨ調節を行わない未処理のＬｕｐａｍｉｎ４５−７０溶液を用いた。
【０２６６】
架橋剤
ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、Ｉｐｏｘ  ＲＤ１８、Ｉｐｏｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ラウプハイム（ドイツ）、ｌｏｔ１６０９２）
【０２６７】
方法及び測定
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）
供給物中のｈＩｇＧの濃度及び精製後の溶液中のｈＩｇＧの回収率は下記の条件下でＳＥＣを用いて決定した。
カラム：東ソーＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ７．８＊３００ｍｍ（粒子サイズ５μｍ）
移動相：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
注入体積：１００μｌ−移動相で希釈された試料
流量：１ｍｌ／分
検出器：ＤＡＤ２８０ｎｍ、ｈＩｇＧ溶液（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）を外部標準物質として使用
温度：２０℃±１℃
【０２６８】
乾燥質量の決定
複合材を各５カラム体積の水で５回、次いで各５カラム体積のメタノールで５回洗浄する。０．５ｇの試料を、減圧下（０．１ｍｂａｒ）８０℃で１２時間、次いで重量が一定となるまで２時間を２〜３回、乾燥した後、支持材料及び複合材の乾燥質量を決定した。
【０２６９】
種々の複合吸収材の細孔サイズ分布及び細孔体積画分
細孔直径及び種々の流体力学半径を有するポリマー分子のための排除限界に関連付けられるアクセス可能な細孔体積画分は、インバースサイズ排除クロマトグラフィ（ｉＳＥＣ）を用いて決定された。この目的のために、複合材料を１ｍｌ（５０×５ｍｍ）クロマトグラフィカラム中に充填し、２０ｍＭ水性酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６を用いて平衡化し、２つの低分子量標準物質、及び既知の規定平均分子量Ｍｗの６種の市販プルランポリマー標準物質（ＰＰＳ、マインツ、ドイツ、詳細については図実施形態１．１−１．４参照）の選択を適用して較正した。
【０２７０】
プルラン標準物質のＭｗの決定は、移動相として水、ナトリウムアジド０．００５％を流量１ｍｌ／分で３０℃で用いて、ＰＳＳにてＳＥＣにより行われた。３つの分析カラム、各８×３００ｍｍ（ＰＳＳ  ＳＵＰＲＥＭＡ１０μｍ、１００Å／３０００Å／３０００Å）が８×５０ｍｍ予備カラム（ＰＳＳ  ＳＵＰＲＥＭＡ１０μｍ）と直列に組み合わせて使用された。試料濃度は１ｇ／ｌであり、各測定において２０μｌの体積が注入された。検出はＰＳＳＷｉｎＧＰＣデータ取得システムと連結された屈折率（Ｒｌ）モニター（ＡｇｉｌｅｎｔＲＩＤ）を用いて行われた。
【０２７１】
特定の複合材料において特定の標準物質にとってアクセス可能な細孔体積画分Ｋａｖを、正味溶出体積Ｖｅｎ（μｌ）を評価することによって得た。
【０２７２】
したがって、Ｋａｖとは、所与の流体力学半径Ｒｈを有する特定の標準物質がアクセスできる全細孔体積の画分を記述する。Ｋａｖ値１を表す総液体体積Ｖｔ＝Ｖｅ＝Ｖ０の決定のためにはメタノールを使用する。２１０，０００Ｄａのプルラン標準物質を使用して、細孔から既に排除されているため粒子外の液体体積を表し、したがってＫａｖが０（細孔体積０％）を表す充填複合材粒子間の間隙体積Ｖｉを決定する（図１も参照）。Ｖ０とＶｉとの差が細孔体積Ｖｐである。
【０２７３】
【表１】
2019533012.tif 000003
【０２７４】
部分細孔体積は、保持されないプルランポリマー標準物質だけでなく保持されない小分子によってもアクセス可能である複合吸収材におけるそれぞれの体積画分として定義される。保持されないとは、細孔体積画分のみを決定するために、固定相の表面上でそれぞれの標準物質の相互作用又は結合が起こらないことを意味する。本発明の支持材料及び複合材については、これはアルコール及び親水性炭水化物、好ましくは水性溶媒系において既知の流体力学半径（Ｒｈ）を示すプルランに対して当てはまる。
【０２７５】
プルランのＲｈ値は分子量Ｍｗから実験式Ｒｈ＝０．０２７Ｍｗ０．５（Ｉ．Ｔａｔａｒｏｖａら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、１１９３（２００８）、ｐ．１３０）によって計算された。
【０２７６】
ＩｇＧのＲｈ値は文献（Ｋ．Ａｈｒｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、１００９（２００３）、ｐ．９５、図４）から引用した。
【０２７７】
ＣＣＳ  ＣＨＯ  Ｋ１における宿主細胞タンパク質の等電点ｐＩ値の分布
リストに示したように、既知のｐＩの標準タンパク質で較正された、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（詳細については図２参照）により決定（実施例４）。
【０２７８】
ＤＮＡの決定
ＤＮＡの定量は、ＤＮＡ抽出キット、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サウスポート（米国）を用いたＤＮＡ抽出後に、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬キット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ダルムシュタット（ドイツ）を用いて行った。
【０２７９】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の決定
ＨＣＰの定量は、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サウスポート（米国）製のＣｙｇｎｕｓ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質第３世代（Ｆ５５０）を用いて行った。
【実施例】
【０２８０】
実施例１
複合吸収材バッチ０７（表１）の調製
７０４μｌ（６５８ｍｇ）のヘキサンジオールジグリシジルエーテル（Ｍｗ２３０．２、ｄ＝１．０７ｇ／ｍｌ）架橋剤を４２ｍｌの水に溶解した。この架橋剤溶液を１５ｍｌのポリ（ビニルホルムアミド−コ−ポリビニルアミン）（Ｌｕｐａｍｉｎ４５−７０、部分加水分解物、「材料」参照）の水溶液に加えた。混合後、３ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ１１に調節した。
【０２８１】
１０ｇのシリカゲルＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０、４０−６３μｍ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ）、乾燥粉末、を直径８ｃｍの平底ステンレス皿中に沈降させた。その層高は８ｍｍであった。３９．５ｇのポリマー−架橋剤溶液を加えてシリカ上に均等に分配しつつ、溶液を急速に細孔中に染み込ませた。得られたペーストを旋回振盪器で６００ｒｐｍで１分間振盪して、１〜３ｍｍの液体フィルムで覆われた滑らかな表面の均質な塊を得た。前記皿をステンレスの蓋で閉じて、ペーストを６０℃の乾燥炉中でさらなる混合又は移動なしに４８時間加熱し、４９．６ｇの湿気を含んだ複合材を得た。
【０２８２】
次いで、４１．３ｇのこの未だウェットなペーストをフリット上で２５ｍｌの水で５回洗浄した。その後複合材ケーキを３１．６ｍｌの１０％硫酸中に懸濁し、周囲温度にて２時間滑らかな振盪下で処理して未反応のエポキシ基を加水分解した。最後に生成物をもう一度２５ｍｌの水で５回フリット上で洗浄した後、２０％エタノール／水中で保管した。
【０２８３】
目標とする架橋度に応じて架橋剤の量（体積）を変更した以外はこの方法で表１中の他のバッチを調製した。
【０２８４】
参考例１
（架橋ポリビニルアミンゲルの調製）
支持材料を用いない場合の反応を調べるために、３ｍｌの実施例１のポリマー−架橋剤溶液を５０℃で２４時間加熱した。６時間後、ゲル化が見られた。２４時間後、一片の透明な固体弾性ゲルが得られた。
【０２８５】
実施例１ａ
小粒子支持材料を用いた複合吸収材の調製
１ｍｌ（９３５ｍｇ）のヘキサンジオールジグリシジルエーテル（Ｍｗ２３０．２、ｄ＝１．０７ｇ／ｍｌ）架橋剤を５９ｍｌの水とともに振盪し、均質なエマルジョンを形成した。この架橋剤溶液を２１ｍｌのポリ（ビニルホルムアミド−コ−ポリビニルアミン）（Ｌｕｐａｍｉｎ４５−７０、未精製及び未処理）の水溶液に加えた。
混合後、０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ１０に調節した。
２５ｇのシリカＥｕｒｏｓｉｌ  Ｂｉｏｓｅｌｅｃｔ３００−５、５μｍ、乾燥粉末、を直径１２ｃｍの平底ステンレス皿中に沈降させた。この層高は約１５ｍｍであった。４６ｇのポリマー−架橋剤溶液を加えてシリカ上に均等に分配しつつ、溶液を細孔中に染み込ませ、粘着性で粘液性の塊を形成した。ポリマー−架橋剤溶液の１．５ｍｌの部分及び最終的に４ｍｌの希釈ポリマー（３ｍｌの水で希釈された１ｍｌのポリ（ビニルホルムアミド−コ−ポリビニルアミン））を加えた後、懸濁液はむらなく均質となった。得られたペーストは高さ約１ｍｍの液体フィルムで覆われていた。この皿をステンレスの蓋で閉じた後、このバッチを６５℃の乾燥炉中でさらに混合又は移動することなく２１時間加熱し、７２ｇの湿気を含んだ複合材を得た。
【０２８６】
次いで、このペーストを蒸留水で１５０ｍｌの体積となるように希釈し、得られた懸濁液を分取ＨＰＬＣポンプを用いて２５０×２０ｍｍＨＰＬＣカラム中に吸い上げた。充填された複合材層を次いで２５０ｍｌの水で洗浄した。未反応のエポキシ基を加水分解するべく、１００ｍｌの２ｎ塩酸をカラム中に吸い上げ、周囲温度で２時間そこに留めた。この工程及びその後の水によるすすぎの間に背圧が増大したので、充填された複合材を最後に３００ｍｌのエタノールで洗浄すると、流量１０ｍｌ／分にて圧力は５バールまで下がった。生成物をカラムから除去し周囲温度で乾燥した。窒素含有量は１．１８％と判定され、炭素含有量は２．９９％と判定された。
【０２８７】
参考／比較例２
国際公開第２０１３／０３７９９４号（先行技術）による複合材料バッチ１９の調製
１０ｇのシリカゲルＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０、４０−６３μｍの細孔に実施例１のポリ（ビニルホルムアミド−コ−ポリビニルアミン）を完全に染み込ませた。この工程１の中間生成物を重量が一定となるまで５０℃で乾燥した。その後この乾燥吸収材をエチレングリコールジグリシジルエーテルを含有するイソプロパノール（３０ｍｌイソプロパノール中１２１ｍｇ）中に懸濁し、５５℃で５時間撹拌した。
【０２８８】
その後、この工程２の生成物をろ過し、イソプロパノール、０．５Ｍトリフルオロ酢酸、水、及びメタノールで洗浄した。
【０２８９】
図実施形態１．３及び１．４に示すように、細孔体積及び細孔サイズ分布は複合材料バッチ０７で得られた性質とは異なっている。詳細については表２を参照のこと。
【０２９０】
【表２】
2019533012.tif 000004
【０２９１】
分子量１００，０００Ｄａ未満のタンパク質のための捕捉空間として、Ｒｈ＝２ｎｍ〜Ｒｈ＝４ｎｍとの間の体積画分が重要である。したがって宿主細胞タンパク質に対する高い結合能力を提供するために、この範囲内でできるだけ大きな体積を生成することが有利である。バッチ０７は前記範囲内で約４４％の総体積を示し、一方、二工程合成バッチ１９の生成物は約１９％の細孔体積画分しか示していない。加えて、バッチ１９では２．７ｎｍ〜４ｎｍのＲａ範囲内の細孔体積画分はわずか４％しかない。
【０２９２】
基本的に、バッチ０７及び１９のデータは、異なる合成法によって、得られる複合材の異なる細孔サイズ分布及びしたがって異なるモルフォロジーが作り出されるということを示している。
【０２９３】
実施例２
表１．１に示した実施例１により調製された複合材料及び表１．２に示した市販の比較材料の分離能の分析
複合材料の分離能を測定するために、不純物又は不要化合物の標的物質からの低減（分離）の度合いを決定する。この目的のために、選択的アッセイを用いて供給物中の個々の構成成分又は物質部類の濃度を決定する。分離工程後に、精製された画分を用いてこの濃度測定を繰り返す。このようにして、これらの濃度及び関連する体積から純度及び回収率の両方を算出することが可能である。
【０２９４】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）除去に関して、未精製供給溶液を、新規な複合材料との特別の接触時間を経た低減後の上清画分と比較することにより、Ｃｙｇｎｕｓ  ＣＨＯ  ＨＣＰ第３世代Ｅｌｉｓａアッセイを用いて精製の効率を判定した。
【０２９５】
Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬キットを適用してｄｓＤＮＡを決定した。ｈＩｇＧ回収率を定量的ＳＥＣにより決定した。
【０２９６】
一般的な低減手順
供給物は、２ｍｇ／ｍｌのｈＩｇＧ（ポリクローナル抗体Ｏｃｔａｇａｍ、詳細については「材料」参照のこと）を加えた未処理及び未希釈の細胞培養上清ＣＨＯ−Ｋ１とした。４００ｍｇの湿気を含んだ平衡化吸収材を２ｍｌの供給物とともにファルコン管又は遠心分離管を用いてインキュベートした。５分間の穏やかな振盪の後に、遠心分離によって上清を分離した後分析した。
【０２９７】
ｈＩｇＧの回収率は定量的ＳＥＣ（装置については、「方法及び測定」参照）により決定した。クロマトグラム中の主ピーク（９７〜９８％）はモノマーに関連し及びより早い溶出ピーク（２〜３％）は、元のｈＩｇＧ（Ｏｃｔａｇａｍ）調製品中に既に存在していた免疫グロブリン凝集物に関連する。較正及び回収率の決定は主ピークを参照する。
【０２９８】
吸収材は供給物と接触させる前は湿潤状態にあったため、関連する空隙体積により総液体体積は増大されている。したがって物質濃度は低下することになる。空隙体積は典型的には樹脂重量の７０％〜９０％である。したがって、最終的な物質濃度は低減工程後に各希釈率により補正される。
【０２９９】
この精製手順の間、凝集物の量は一定であることが分かった。これに対し、先行技術の吸収材及び分離プロトコルを用いると、多くの場合凝集物の形成が観察される。
【０３００】
巨大分子ＤＮＡはｈＩｇＧよりもはるかに大きく、したがって一般には複合材細孔系から排除される。ｈＩｇＧもまた実施例３に示されるように排除される。
【０３０１】
結果
支持材料シリカゲルＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０  ４０−６３μの、加水分解ポリ（ビニルホルムアミド−コ−ポリビニルアミン）Ｌｕｐａｍｉｎ４５−７０（ＢＡＳＦ）及び種々の量の架橋剤ヘキサンジオールジグリシジルエーテルによる細孔充てん後に得られた複合吸収材の結果を表１に示す。
【０３０２】
添加する架橋剤の体積を、指定された架橋度を得るために変更した。複合材バッチ０７を調製するために使用した７０４μｌの体積は１０％の架橋度を表している。他のすべての条件は実施例１と同様とした。
【０３０３】
供給物体積と吸収材質量との比率は５：１（２ｍｌ供給物：０．４ｇ吸収材）とした。
【０３０４】
すべての吸収材は供給物と接触させる前に５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６で平衡化した。
【０３０５】
【表３】
2019533012.tif 000005
【０３０６】
ＤＮＡ分析はＤＮＡ抽出後にＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて行った（「方法」参照）。
【０３０７】
ＨＣＰ分析はＣｙｇｎｕｓ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ、ＣＨＯ第３世代（Ｆ５５０）を用いて行った、「方法」参照。
【０３０８】
比較例３
市販のアミノ含有吸収材の分離能の分析
実施例２に記載のものと同様の低減手順を用いて、特別の試験条件下で正に荷電された基を示す市販のアミノ含有吸収材の分離能を測定した。
【０３０９】
表１．２は、市販のアミノ含有アニオン交換吸収材Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ａｍｉｎｏ６５０Ｍ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、グリースハイム（ドイツ）；Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ６５０Ｍ、Ｔｏｓｏｈ；及びＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、リトルチャルフォント（英国）についての結果を示す。
【０３１０】
供給物体積と吸収材質量との比率は５：１（２ｍｌ供給物：０．４ｇ吸収材）とした。すべての吸収材は供給物と接触させる前に５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６．５で平衡化した。
【０３１１】
【表４】
2019533012.tif 000006
【０３１２】
ＤＮＡ分析は、ＤＮＡ抽出後にＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて行った（「方法」参照）。ＨＣＰ分析はＣｙｇｎｕｓ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ、ＣＨＯ第３世代（Ｆ５５０）を用いて行った、「方法」参照。
【０３１３】
結果
表１．１から分かるように、ＨＣＰ及びＤＮＡを同時に高い程度（９２％超）まで低減させる本発明の複合吸収材の能力と共に、８０％〜９６％のｈＩｇＧ回収率が達成された。
【０３１４】
インバースサイズ排除クロマトグラフィ（ｉＳＥＣ）により、流体力学半径Ｒｈ＞４ｎｍのプルランポリマー標準物質が複合材料の細孔から９０％超まで排除されたことが示された（図実施形態１．２参照）。ＩｇＧは４．５〜５ｎｍのＲｈを特徴とし、そのためこれもまたこれらの細孔から排除される（詳細については実施例３を参照のこと）。
【０３１５】
加えて、ＤＮＡ（仔牛胸腺からのナトリウム塩、タイプ１、繊維、Ｓｉｇｍａ）の動的結合能力がおよそ１．２ｍｇ／ｍｌ複合材であることが示された。その後に注入されたＤＮＡ部分は約０．５ｍｌの間隙体積Ｖｉ（充填粒子間の体積）において１ｍｌカラムから溶出され、一方でより小さなポリマー標準物質及びメタノールは尚、内部細孔体積に対するアクセスを有する。このことは、巨大分子ＤＮＡが複合吸収材の外側表面に結合されているだけであることを示している。巨大分子ＤＮＡはｈＩｇＧよりもはるかに大きく、したがって一般には複合材細孔系から排除される。実施例３に示されるようにｈＩｇＧもまた排除される。
【０３１６】
実施例３
ｈＩｇＧに対する結合能力の決定
この実験の目的は、ｈＩｇＧは吸収材細孔から排除され、非常に少量のみが吸収材の外部に結合されることを示すことである。
【０３１７】
約１ｍｌの吸収材バッチ０７（実施例１及び表１．１）を１ｍｌカラム（５０×５ｍｍ）中に充填し２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６で平衡化した。
【０３１８】
１０％Ｏｃｔａｇａｍ原液から５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で希釈することによりｈＩｇＧ試験溶液（ｃ＝２ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【０３１９】
負荷工程中の流量は０．２ｍｌ／分、洗浄中は１ｍＬ／分とした。
【０３２０】
溶出液中の光学密度を２８０ｎｍにてモニタリングした。
【０３２１】
全体の溶出体積は、（カラム内体積、即ち、充填カラムの液体体積Ｖｔ＝Ｖｅ）＋（クロマトグラフィ系のカラム外体積）の２つの寄与から成る。
【０３２２】
充填カラムの総液体体積Ｖｔはメタノールのサンプルを流すことによって９７２μｌと決定され、間隙体積Ｖｉはプルラン４８．８００Ｄａを用いて５２３μｌと決定された。吸収材の細孔体積Ｖｐはその差であり、故に４４９μｌである。
【０３２３】
ｈＩｇＧ信号の溶出は６３０μｌの体積にて始まった（図４．１）。この全溶出体積から、クロマトグラフィ系のカラム外体積を表す４４μｌを減算した。したがって、ｈＩｇＧのための正味保持体積は５８６μｌであった。この体積は９７２μｌのカラム液体体積Ｖｔよりも有意に小さく、ｈＩｇＧが細孔系内にアクセスを有さないということを示している。
【０３２４】
突破の瞬間、５２３μｌの間隙体積Ｖｉが未結合のｈＩｇＧで充てんされた。したがって、最初に５８６μｌ−５２３μｌ＝６３μｌの差分体積で含有されていたｈＩｇＧの量が突破の瞬間に複合材バッチ０７に結合されていた。故に１２６μｇが１ｍｌの複合材に結合された。この小さな吸着量はおそらく、実際の塩濃度の条件下で粒子の小面積の外側表面に結合している６未満のｐＩを有する抗体に関連している。
【０３２５】
複合材をｈＩｇＧで飽和させた後の追加の物質注入
複合材バッチ０７で充填されたこのカラムをｈＩｇＧで飽和させた後、同じ緩衝液条件下であるが流量１ｍｌ／分にて、ｈＩｇＧ溶液の等しい５回の５０μｇ注入を行った（図４．２）。
【０３２６】
すべてのクロマトグラムは同一であった。０．４５分後に既に突破が起こり、ピークの最大値には０．５７２分又は５７２μｌで到達した。４４μｌのカラム外体積を減算することにより、５２８μｌの体積が得られ、カラム中の間隙体積Ｖｉとよく合致した。
【０３２７】
このことは、一旦ｈＩｇＧで飽和された複合材にｈＩｇＧがそれ以上結合しないこと及び細孔系からのｈＩｇＧの排除を証明している。
【０３２８】
したがって、少量の吸着ｈＩｇＧが粒子の外側表面にのみ結合されるとともに、４．５〜５．５ｎｍの流体力学半径Ｒｈを有するｈＩｇＧの大部分は未結合のままであり、またさらには、４ｎｍのＲｈ未満のサイズを有する複合材の細孔に入り込むことは不可能である（図１の実施形態）。
【０３２９】
図１より、４ｎｍを超えるＲａを有する分子は概して、複合材の細孔の少なくとも９０％から排除されると結論づけることができる。
【０３３０】
実施例４
等電点電気泳動によるＣＣＳ  ＣＨＯ−Ｋ１の特性決定及び塩基性（正に荷電された）宿主細胞タンパク質の低減
等電点電気泳動（ＩＥＦ）を使用してＣＣＳにおけるタンパク質の電荷不均質性を決定するとともに、その中におけるｐＩ７．５超の塩基性タンパク質の存在を実証した。
【０３３１】
ＩＥＦストリップのｐＨ範囲を、既知の等電点を有するタンパク質を含有する市販のキットを利用して較正した。同条件下で調査された模擬ＣＣＳの染色ゲルは、ｐＩ３〜ｐＩ１０の帯域の広い分布、及び８を超える高いｐＩを有するタンパク質の画分を示した。したがって、ＣＣＳ中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の有意な量が塩基性である（図２）。
【０３３２】
定量的ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡによると、ｈＩｇＧ補充ＣＣＳから精製されたｈＩｇＧは例えば９８．７％（表１．１、バッチ０７）のＨＣＰ低減を示し、粗ＣＣＳ中に存在する塩基性宿主細胞タンパク質の大部分がこのように除去されたことを実証した。個々のＩＥＦ分析は、以下に挙げる既知のｐＩを有する９種のタンパク質標準物質（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて較正された。
【０３３３】
【表５】
2019533012.tif 000007
【０３３４】
ＣＣＳ  ＣＨＯ  Ｋ１の等電点電気泳動（ＩＥＦ）のための条件（ゲル：４−１５％  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）、７ｃｍＩＰＧ／ｐｒｅｐ  ｗｅｌｌ、２５０μｌ、ストリップ：７ｃｍＩＰＧストリップ  ｐＨ３〜ｐＨ１０直線勾配、染色方法：クマシーブリリアントブルーＲ−２５０）により、ｐＩ４〜ｐＩ１０の帯域の広い分布（図２参照）及びｐＩ７．５超のタンパク質の塩基性画分が示された。
【０３３５】
結論：予期せぬことに、アミノ基含有複合材はアニオン種（ｐＩ２−６）を結合するだけでなく、最も重要なことにはＨＣＰの群からの、カチオン性（ｐＩ８−１１）及び中性の化合物も結合する。これらの結果は、複合材の平衡化のために５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．５未満を用いた場合に、一般的にそうであるように正に荷電された固定化ポリビニルアミンを用いて得られる。５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を用いてｐＨ６．５に平衡化した場合、複合材はＣＣＳ  ＣＨＯ  Ｋ１中のＨＣＰの９９．８％までを除去した（表１．１、バッチ０６）。したがって、驚くべきことにＨＣＰ及び他の不純物の低減はそれらの等電点とはかなりの程度無関係と思われることが分かった。
【０３３６】
同じ条件下でＨＣＰの８１．８％しか除去しない従来の強アニオン交換Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（表１．２参照）と比較して、本発明のポリ（ビニルアミン）含有シリカ吸収材材料は、２ｍｇ／ｍｌポリクローナルｈＩｇＧの存在下で全ＨＣＰのリストを最大で９９．８％低減し、ポリクローナルｈＩｇＧを最大で９６％まで回収した。
【０３３７】
実施例５、及び図３の説明
２つのｐＨ条件下での２つの複合材バッチ０７及び０８による、及び塩の存在又は非存在下での実施例２による処理後の、細胞培養上清ＣＣＳ  ＢＨＫ−２１（「材料」参照）からのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の低減
【０３３８】
図３は、約５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを栄養分として含有しｈＩｇＧ（２ｍｇ／ｍＬ）を添加したＣＣＳＩｎｖｉｖｏＢＨＫ−２１で構成される供給物（レーン９）を用いて、一バッチ工程でＢＳＡが検出レベルまで低減された（レーン３−８）ことを示している。この低減は、実施例２に従い表１．１の複合材バッチ０７及び０８を用いて６つの独立した実験において行われた。
【０３３９】
通常のｐＨ６．５の５０ｍＭ酢酸アンモニウムでの平衡化（レーン５及び８）に加えて、５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６．５を１５０ｍＭのＮａＣｌと共に用いて複合材を平衡化した（レーン４及び７）。加えて、両方の複合材をｐＨ７．４の５０ｍＭ酢酸アンモニウムと１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて平衡化した（レーン３及び６）。
【０３４０】
このように、ＢＳＡの定量的除去が塩の存在下且つ高いｐＨ下でも機能するということが実証された。
【０３４１】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥの特定のレーン３−８に適用された精製試料、レーン９における供給物
１、マーカータンパク質（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓタンパク質）
２、ブランク
３、バッチ０８（５０ｍＭ水性酢酸アンモニウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで平衡化された複合材）により精製
４、バッチ０８（５０ｍＭ水性酢酸アンモニウムｐＨ６．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで平衡化された複合材）により精製
５、バッチ０８（塩を用いず５０ｍＭ水性酢酸アンモニウムｐＨ６．５で平衡化された複合材）により精製
６、バッチ０７（５０ｍＭ水性酢酸アンモニウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで平衡化された複合材）により精製
７、バッチ０７（５０ｍＭ水性酢酸アンモニウムｐＨ６．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで平衡化された複合材）により精製
８、バッチ０７（塩を用いず５０ｍＭ水性酢酸アンモニウムｐＨ６．５で平衡化された複合材）により精製
９、供給物ＣＣＳ  Ｉｎｖｉｖｏ  ＢＨＫ−２１（バッチＲＰ＿ＳＺ＿３５２／０１）＋ｈＩｇＧ２ｍｇ／ｍＬは５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する
【０３４２】
図実施形態１．１
複合吸収材バッチ０７。メタノール、エチレングリコール、及び既知の異なる流体力学半径（Ｒｈｉ）を有する６種のプルラン標準物質の正味溶出体積Ｖｅ（μｌ）対Ｒｈｉのプロット。
【０３４３】
吸収材の細孔体積Ｖｐ及び粒子間の間隙体積Ｖｉは１ｍｌ（５０×５ｍｍ）公称樹脂体積の充填カラムを用いてｉＳＥＣにより決定される（ダイヤグラムＶｅ）。支持材料Ｄａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０及び種々の複合材料で充填されたカラムにおいて、最小の標準メタノールについて完全にアクセス可能な、９６５μｌ〜９９８μｌの総液体体積Ｖｔ＝Ｖｅ（Ｖｅはカラム外体積を差し引いた場合に決定される正味溶出体積）が測定された。粒子間の間隙体積Ｖｉは４５０μｌ〜５３０μｌと決定された。特定の体積画分における偏差は個々のカラム充填材料の量並びに充填密度における少しの違いに起因する。Ｒｈ＞９ｎｍの標準物質はシリカＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０の細孔にアクセス不可であり、４４９μｌの間隙体積Ｖｉを通過した後単独で移動した後、同じ体積内で溶出している。例えば、図実施形態１．１のカラム中の例えばＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０シリカの総細孔体積Ｖｐは差分：９９８μｌ−４４９μｌ＝５４９μｌである。較正されたプルラン標準物質はそれらの特定の流体力学半径Ｒｈに応じた体積画分に浸透する。種々の複合材の体積比は同様にして測定される。
【０３４４】
図実施形態１．２
複合吸収材バッチ０７。分布係数（Ｋａｖ値、即ち、細孔体積分布画分、「方法」参照；Ｋａｖは個々の物質にとって利用可能な細孔体積の画分と等価）対図実施形態１．１と同じ試験物質の流体力学半径Ｒｈｉのプロット。
【０３４５】
分布係数Ｋａｖはある細孔直径を超える特定の分子標準物質ｎのために利用可能な細孔体積画分Ｖｅｎとして定義され、即ち、Ｋａｖ＝Ｖｅｎ−Ｖｉ／Ｖｅ−Ｖｉである。上方のｉＳＥＣ曲線（Ｓｉｌｉｃａ２５０）は支持材料Ｄａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０の細孔サイズ分布を示しており、排除限界はＲｈ＝９ｎｍであり及び４ｎｍのＲｈにおいてアクセス可能な細孔体積画分Ｋａｖが０．３６である（総細孔体積の３６％が流体力学半径４ｎｍ〜９ｎｍのポリマー標準物質に与えられる）。これは４ｎｍのＲｈを有する分子に対し細孔体積の３６％がアクセス可能であることを示している。
【０３４６】
下方の３本の曲線は各実験操作を用いて得られた実施形態バッチ０７（表１．１）の多孔性を示している。ポリマー固定化後、細孔の５％未満（Ｋａｖ＝０．０５）のみが４ｎｍ以上の値を示す。
【０３４７】
これは、特定の直径の分子に対するアクセス可能性に関して、使用条件下で充てんされ／満杯の又は占有された細孔についての物理的な証拠であり、
出発原料Ｄａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０においては細孔の３６％超が４〜９ｎｍの範囲に見られるが、架橋ポリマーメッシュの固定化後の生成物バッチ０７中には対応する細孔体積のうちの３０％超は存在していない。これは明らかにポリマーネットワークによる、ちょうどこの体積の空間占有及び分割に起因する。
【０３４８】
換言すれば：最初は総細孔体積の３６％超を示していた４ｎｍ〜９ｎｍのＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０の細孔体積の３０％超は消失し、それはこのサイズの細孔は、それよりかなり小さな細孔を示す高分子メッシュによって占有されたためである。より小さな支持体細孔もすべてが高分子メッシュを含有している。したがって、複合材の多孔性はｐＨ６において膨潤状態にある（小さなスポンジ様の）高分子メッシュの内部細孔によって確立される。
【０３４９】
しかし、低分子量の標準メタノールは支持材料の全細孔体積並びに複合材の全細孔体積に入り込む。そのため、複合材多孔性曲線の傾斜はＤａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０曲線の傾斜よりもかなり急である。
【０３５０】
Ｄａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０の壁部のみがコーティングされているならば、各細孔の中央に常に隙間が残されているため、複合材のＫａｖ曲線は、少なくとも４ｎｍ〜９ｎｍのＲｈ範囲において、Ｄａｖｉｓｉｌ  ＬＣ２５０曲線に平行となることが予測されよう。
【０３５１】
記載された立体的排除効果は、充填された又は懸濁された新規の複合材料の外部体積においてかなりの程度まで未結合のまま残される例えば抗体に対する、複合材内部の高分子メッシュの精製能をもたらす原因であり、一方でより低い分子量の構成成分、例えば、宿主細胞タンパク質は固定化されたポリマーの細孔に入り込み、それらはそこで捕捉され得る。
【０３５２】
複合材細孔の約４０％が、１００．０００分子量未満のほとんどのタンパク質の流体力学半径を含む２ｎｍ〜４ｎｍのＲｈを有する分子にとってアクセス可能であるということが極めて重要である。ポリマーも通常の作業条件下で正に荷電されているにもかかわらず、細孔のこの画分内で、ｐＩ＞７．０の正に荷電された塩基性のものを含めほとんどの宿主細胞タンパク質は捕捉される（実施例３及び図２参照）。
【０３５３】
図実施形態１．３
比較例の複合吸収材バッチ１９と本発明例の複合吸収材バッチ０７。メタノール、エチレングリコール、及び既知の異なる流体力学半径（Ｒｈｉ）を有する６種のプルラン標準物質の正味溶出体積Ｖｅ（μｌ）対Ｒｈｉのプロット。
【０３５４】
図実施形態１．４
比較例の複合吸収材バッチ１９と本発明例の複合吸収材バッチ０７。分布係数（Ｋａｖ値、即ち、細孔体積分布画分、「方法」参照；Ｋａｖは個々の物質にとって利用可能な細孔体積の画分と等価）対図実施形態１．１と同じ試験物質の流体力学半径Ｒｈｉのプロット。
【０３５５】
複合材料バッチ０７とは対照的に、第一工程後の予備的な乾燥を含む二工程で合成されたバッチ１９は、ナノメータ範囲において非常に異なる多孔性を示す。２．７ｎｍ〜４ｎｍの流体力学半径で細孔体積の４％のみが利用可能であり、一方でバッチ０７は同じ範囲で２２％の体積画分を与える。詳細については表２を参照のこと。
【０３５６】
図２
この種の試料における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のｐＩスペクトルの可視化のために典型的な、実施例４によるＣＨＯ  Ｋ１細胞株からの細胞培養上清（ＣＣＳ）の濃縮溶液の等電点電気泳動（ＩＥＦ）。かなりの数の中性及び塩基性宿主細胞タンパク質が７〜１０のｐＩ範囲において密に集中していることが分かる。
【０３５７】
ＣＣＳ中のタンパク質の電荷不均質性を判定するため並びにその中のｐＩ７．５を超える塩基性タンパク質の存在を実証するために、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を使用した。
【０３５８】
ＩＥＦストリップのｐＨ範囲を既知の等電点を有するタンパク質を含有する市販のキットを利用して較正した。同条件下で調査された模擬ＣＣＳの染色ゲルは、ｐＩ３〜ｐＩ１０の帯域の広い分布、及び８を超える高いｐＩを有するタンパク質の画分を示している。したがって、ＣＣＳ中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のかなりの量が塩基性である。
【０３５９】
図３
２つのｐＨ条件における２つの複合材バッチ０７及び０９による及び塩の存在又は非存在下での実施例５による処理後の細胞培養上清ＣＣＳ  ＢＨＫ−２１からのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の低減。
【０３６０】
図４
実施例３による吸収材細孔からのｈＩｇＧの排除であって、微小な部分のみが吸収材の外側表面に結合している。
図４の説明、実施例３も参照のこと
この実験の目的は、ｈＩｇＧが吸収材細孔から排除され、非常に少量のみが吸収材の外部に結合されるということを示すことであった。
【０３６１】
動的容量測定の条件下で、突破の瞬間（図４．１）、５２３μｌの間隙カラム体積Ｖｉが未結合のｈＩｇＧで充てんされた。したがって、最初に溶出体積と空隙との差（５８６μｌ−５２３μｌ＝６３μｌ）で含有されていたｈＩｇＧの量が、突破の瞬間に複合材バッチ０７に結合されていた。故に１２６μｇが１ｍｌの複合材に結合された。
【０３６２】
複合材バッチ０７で充填されたこのカラムを１２６μｇのｈＩｇＧで飽和させた後、同じ緩衝液条件下であるが流量１ｍｌ／分にて、ｈＩｇＧ溶液の等しい５回の５０μｇ注入を行った（図４．２）。
【０３６３】
すべてのクロマトグラムは同一であった。０．４５分後に既に突破が起こり、０．５７２分又は５７２μｌでピークの最大値に到達した。４４μｌのカラム外体積を減算することにより、５２８μｌの体積が得られ、カラム中の間隙体積Ｖｉとよく合致した。
【０３６４】
図５〜１２は、本発明の目的、全体的概念、作業原理、１つの可能なプロセスにおけるバッチ低減材料、バッチ結果、ｈＩｇＧ回収率の点でのバッチ結果、ＨＣＰ及びＤＮＡの低減におけるバッチ結果、及び概要を要約している。
【０３６５】
他の態様では、本発明は以下の項目に関する。
【０３６６】
１．原料から標的タンパク質を回収するための方法であって、前記原料は溶液又は懸濁液の形態であり、少なくとも１種の標的タンパク質と、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは他の核酸、又はそれらの２種以上の組み合わせから選択される少なくとも１種の不純物化合物とを含み、及び任意でアルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物、若しくはそれらの断片、又はそれらの２種以上の組み合わせを含み、前記方法は、
ｉ）前記原料を少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュと十分な時間に渡り接触させる工程であって、この際少なくとも１種の不純物化合物が保持される工程と、
ｉｉ）その後、高分子メッシュを少なくとも１種の標的タンパク質を含有する精製後の原料から分離する工程と、
ｉｉｉ）任意で、標的タンパク質を原料から単離する工程と、
を含む、方法。
【０３６７】
２．少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュによって保持される前記少なくとも１種の不純物化合物は、精製後の原料中に残存する標的タンパク質の流体力学半径よりも小さい流体力学半径Ｒｈ１を示し、
好ましくは、少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュによって保持される前記少なくとも１種の不純物化合物は、４ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈ１を示し、及び精製後の原料中に残存する少なくとも１種の標的タンパク質は４ｎｍ以上の流体力学半径Ｒｈ１を示す、項目１に記載の方法。
【０３６８】
３．少なくとも１種のアミノポリマーを含む前記高分子メッシュは、前記原料と接触させる工程の前に８未満のｐＨに平衡化される、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
【０３６９】
４．前記標的タンパク質は抗体である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７０】
５．ｐＨ８未満に平衡化された少なくとも１種のアミノポリマーを含む高分子メッシュによって７以上のｐＩを有する化合物が初期濃度の少なくとも５０％まで低減される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７１】
６．前記不純物化合物は宿主細胞タンパク質である、項目５に記載の方法。
【０３７２】
７．前記宿主細胞タンパク質は原料から初期濃度の少なくとも９０％まで低減される先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７３】
８．前記原料は発酵ブロス懸濁液である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７４】
９．ｉ）及びｉｉ）の手順内で一工程バッチ吸着プロセスが使用され、対流輸送が適用されないことを特徴とする、先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７５】
１０．前記高分子メッシュは複合材料の一部である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７６】
１１．前記アミノポリマーはポリ（ビニルアミン）若しくはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）、又はそれらの混合物のいずれかである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
【０３７７】
１２．ｉ）支持材料の少なくとも細孔体積を少なくとも１種の架橋性ポリマー又はコポリマーと少なくとも１種の架橋剤との溶液で充てんする工程と、
ｉｉ）前記架橋性ポリマーを架橋によってその場で固定化する工程と、
を含み、前記支持材料は粒子状、ペリクル状、又はモノリシックである、
複合材料の合成プロセス。
【０３７８】
１３．前記架橋性ポリマーはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）若しくはポリ（ビニルアミン）、又はそれらの混合物である、項目１２に記載のプロセス。
【０３７９】
１４．項目１２又は１３によって調製された複合材料。
【図１ａ】
2019533012.tif 000008
【図１ｂ】
2019533012.tif 000009
【図１ｃ】
2019533012.tif 000010
【図１ｄ】
2019533012.tif 000011
【図２】
2019533012.tif 000012
【図３】
2019533012.tif 000013
【図４．１】
2019533012.tif 000014
【図４．２】
2019533012.tif 000015
【図５】
2019533012.tif 000016
【図６】
2019533012.tif 000017
【図７】
2019533012.tif 000018
【図８】
2019533012.tif 000019
【図９】
2019533012.tif 000020
【図１０】
2019533012.tif 000021
【図１１】
2019533012.tif 000022
【図１２】
2019533012.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月16日(2019.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料から標的タンパク質を回収するための方法であって、前記原料は前記標的タンパク質と宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸、又はそれらの２種以上の組み合わせから選択される少なくとも１種の不純物化合物とを含み、任意でアルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物、若しくはそれらの断片、又はそれらの２種以上の組み合わせをさらに含み、前記原料は溶液又は懸濁液の形態であり、及び前記標的タンパク質は流体力学半径Ｒｈ１によって特徴付けられ、前記不純物化合物は流体力学半径Ｒｈ２によって特徴付けられ、ここでＲｈ１＞Ｒｈ２であり、前記方法は以下の工程（ｉ）〜（ｉｖ）及び任意で工程（ｖ）を含む、方法：
（ｉ）正に荷電されたアミノ基を含有する少なくとも１種の架橋ポリマーを含む高分子メッシュを提供する工程であって、前記ポリマーは可変に設定可能な細孔サイズ排除限界Ｒｈｉによって特徴付けられる工程；
（ｉｉ）前記高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界ＲｈｉをＲｈ２＜Ｒｈｉ且つＲｈ１＞Ｒｈｉとなるように流体力学半径Ｒｈ１及びＲｈ２に適合させる工程；
（ｉｉｉ）前記高分子メッシュを前記原料と、高分子メッシュ中に不純物化合物を保持させ且つ標的タンパク質を高分子メッシュから排除させるのに十分な時間接触させる工程；
（ｉｖ）保持された不純物化合物を含有する高分子メッシュを、排除された標的タンパク質を含有する原料から分離して、精製された原料を得る工程；及び
（ｖ）任意で、標的タンパク質を前記精製された原料から単離する工程。
【請求項２】
標的タンパク質を原料から回収するための方法であって、前記原料は前記標的タンパク質と宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸、又はそれらの２種以上の組み合わせから選択される少なくとも１種の不純物化合物とを含み、及び任意でアルブミン、内毒素、界面活性剤、及び微生物、若しくはそれらの断片、又はそれらの２種以上の組み合わせをさらに含み、前記原料は溶液又は懸濁液の形態であり、及び前記標的タンパク質は流体力学半径Ｒｈ１によって特徴付けられ、前記不純物化合物は流体力学半径Ｒｈ２によって特徴付けられ、ここでＲｈ１＞Ｒｈ２であり、前記方法は以下の工程（ｉ）、及び（ｉｉｉ）〜（ｉｖ）、及び任意で工程（ｖ）を含む、方法：
（ｉ）正に荷電されたアミノ基を含有する少なくとも１種の架橋ポリマーを含む高分子メッシュを提供する工程であって、前記ポリマーがＲｈ２＜Ｒｈｉ及びＲｈｉ＞Ｒｈｉとなるような細孔サイズ排除限界Ｒｈｉによって特徴付けられる工程；
（ｉｉｉ）前記高分子メッシュを前記原料と、高分子メッシュ中に不純物化合物を保持させ且つ標的タンパク質を高分子メッシュから排除させるのに十分な時間接触させる工程；
（ｉｖ）保持された不純物化合物を含有する高分子メッシュを、排除された標的タンパク質を含有する原料から分離して、精製された原料を得る工程；及び
（ｖ）任意で、標的タンパク質を前記精製された原料から単離する工程。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｉ）における前記設定、又は工程（ｉｉ）における前記適合、又は工程（ｉ）における前記設定及び工程（ｉｉ）における前記適合は、以下のうちの１つ以上により行われる、方法：ポリマーの構造を変化させること；高分子メッシュを生成するために使用する架橋剤を選択すること；高分子メッシュの架橋度を選択すること；高分子メッシュの調製及び使用のための溶媒を変更すること、特に溶媒のｐＨを変更してこれにより高分子メッシュのプロトン化度を変更することによって、高分子メッシュの膨潤の度合いを制御すること；及び高分子メッシュが高分子メッシュと支持体とを含む複合材に含まれる場合には、ポリマーの濃度及び固定化される量を制御すること。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）における前記接触の前に、工程（ｉｉ）において得られた前記高分子メッシュを８未満のｐＨに平衡化することを含む、請求項１又は３に記載の方法；又は
工程（ｉｉｉ）における前記接触の前に、工程（ｉ）によって提供された前記高分子メッシュを８未満のｐＨに平衡化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉｉ）は、７以上のｐＩ（等電点）を有する中性又は正に荷電された化合物を、前記平衡化された高分子メッシュによって低減することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１又は請求項１に従属する請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供され又は工程（ｉｉ）において適合される高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは、１〜２０ｎｍの範囲に設定され又は適合される、方法；又は
請求項２又は請求項２に従属する請求項４又は５に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供される高分子メッシュの前記細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは１〜２０ｎｍの範囲内である、方法。
【請求項７】
請求項１又は請求項１に従属する請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供され又は工程（ｉｉ）において適合される高分子メッシュの前記可変の細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは、３〜１０ｎｍの範囲に設定され又は適合される方法；又は
請求項２又は請求項２に従属する請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）において提供される高分子メッシュの前記細孔サイズ排除限界Ｒｈｉは３〜１０ｎｍの範囲内である、方法。
【請求項８】
請求項６又は７のいずれか１項に記載の方法であって、前記高分子メッシュ中に保持されるべき前記不純物化合物は４ｎｍ未満の流体力学半径Ｒｈ２を有する不純物化合物から選択される、方法。
【請求項９】
前記不純物化合物は宿主細胞タンパク質である、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質は抗体である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記原料は発酵ブロス懸濁液である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は対流輸送を適用しない一工程バッチプロセスとして行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記高分子メッシュは複合材料の一部である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）は、ポリ（ビニルアミン）若しくはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）又はそれらの混合物を、前記正に荷電されたアミノ基を含有する架橋ポリマーに変換することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ｉ）支持材料の少なくとも細孔体積を、少なくとも１種の架橋性ポリマー又はコポリマーと少なくとも１種の架橋剤との溶液で充てんする工程と、
ｉｉ）前記架橋性ポリマーを架橋によってその場で固定化する工程と、
を含み、前記支持材料は粒子状、薄膜状、又はモノリシックである、
複合材料の合成のためのプロセス。
【請求項１６】
前記架橋性ポリマーはポリ（ビニルホルムアミド−コ−ビニルアミン）若しくはポリ（ビニルアミン）、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
２０ｎｍ〜５ｍｍの平均細孔サイズを有する多孔質支持材料を含む複合材料であって、
８未満のｐＨの適用条件下で、前記多孔質支持材料の全細孔体積を架橋一級又は二級アミノ基含有ポリマーで充てんし、
前記複合材料は、インバースサイズ排除クロマトグラフィ（ｉＳＥＣ）によってｐＨ６の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中でプルラン標準物質を用いて決定される細孔サイズ分布によって特徴付けられ、ここで
４ｎｍ以上の流体力学半径Ｒｈを有する分子、特に２１．７ｋＤａの分子量及びＲｈ＝３．９８ｎｍを有する較正されたプルラン標準物質は細孔体積の少なくとも９０％から排除され、及び
全細孔体積の少なくとも３５％は、流体力学半径Ｒｈ＝２．１３ｎｍを有するプルラン標準物質６．２ｋＤにアクセス可能な細孔によって表される、
複合材料。
【請求項１８】
全細孔体積の少なくとも１５％は流体力学半径Ｒｈ＝２．７ｎｍを有するプルラン標準物質１０．０ｋＤａにアクセス可能である、請求項１７に記載の複合材料。
【国際調査報告】
2019533012.tif 000024
2019533012.tif 000025