(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのペプチド、好ましくは抗原またはそのフラグメントを含む改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、それをコードする核酸配列、および前記核酸配列を含むベクターに関する。また本発明は、疾患または状態、特に癌または感染性疾患の治療のためのワクチンおよび方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントを含む改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする単離された核酸配列。
【請求項２】
前記少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントが、少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１に記載の改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする単離された核酸配列。
【請求項３】
前記少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントが、ネオアンチゲンである、請求項１または２に記載の改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする単離された核酸配列。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗原またはそのフラグメントが、１８位、５１位、５５位、１９１位、１９６位、２１７位、３６８位、およびＣ末端、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸位置でＶＳＶ−Ｇに挿入されており、位置の番号付けが、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）糖タンパク質のアミノ酸配列に関するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする単離された核酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸配列または請求項５に記載のベクターをトランスフェクトされた樹状細胞集団。
【請求項７】
少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸配列によりコードされる、改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸配列、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の樹状細胞、または請求項７に記載の改変されたＶＳＶ−Ｇを含む、組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸配列、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の樹状細胞、または請求項７に記載の改変されたＶＳＶ−Ｇと、任意選択で少なくとも１つのアジュバントとを含むワクチン。
【請求項１０】
その必要がある対象の疾患または症状の予防および／または治療に使用するための、少なくとも１つの抗原またはそのフラグメントを含む改変された水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、それをコードする核酸配列、それをコードする核酸配列を含むベクター、それをコードする核酸配列によりトランスフェクトした樹状細胞集団、または前記改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、もしくは樹状細胞集団と、任意選択で少なくとも１つのアジュバントとを含むワクチン。
【請求項１１】
前記ワクチンが、ポリヌクレオチドワクチンである、請求項１０に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１２】
前記ワクチンが、タンパク質ワクチンである、請求項１０に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１３】
前記疾患が、癌または感染性疾患である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の使用のための改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、樹状細胞集団、またはワクチン。
【請求項１４】
前記改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、樹状細胞集団、またはワクチンが、筋肉内注射、皮内注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはソノポレーションにより、前記対象に投与される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の使用のための改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、樹状細胞集団、またはワクチン。
【請求項１５】
前記改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、樹状細胞集団、またはワクチンが、１つ以上のチェックポイント阻害抗体の前、同時、または後に投与される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の使用のための改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、樹状細胞集団、またはワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の疾患の治療のためのワクチン、たとえば核酸ベースのワクチンの調製および投与のための方法および関連の組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、依然として現代世界における主な死因のうちの１つである。外科手術、放射線照射、および化学療法を含む、現在臨床で実施されている標準治療は、限定的な成功を示す。これら治療は、通常、初期の限局性の腫瘍に対してのみ有効であり、後期のステージの転移性悪性腫瘍に対してはほとんど効果がなく、頻繁に再発をもたらしている。さらに、放射線照射および化学療法で使用されている様々な作用物質は、正常な組織にダメージを与えており、顕著な副作用を引き起こす場合がある。
【０００３】
数十年の間、感染した細胞および癌に対してＴ細胞を活性化させる免疫系の力を利用する治療戦略として、ワクチンが使用されてきた。たとえば、ＤＮＡワクチンは、インフルエンザおよびＨＩＶ−１を含む様々な疾患に対して開発されている（Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２５９：１７４５−１７４９；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．  ＰＮＡＳ．  ９０：４１５６−４１６０）。これら知見は、癌抗原の発見および同定と共に、癌に対するＤＮＡワクチンの研究および開発を推進させてきた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １７０：８５−１００）。
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、組み換えタンパク質、腫瘍細胞、またはウイルスベクターなどの他のワクチンと比較して、費用対効果が良い。腫瘍抗原の同定の増加と共に、近年の分子生物学および組み換え技術の進歩により、プラスミド遺伝子の操作のためのツールが提供されている。ＤＮＡワクチンにおける遺伝子は、結果としての免疫応答を操作するために異なる抗原および様々な他の免疫調節分子をコードするように設計されている。
【０００５】
全ての利点をもってしても、ＤＮＡワクチンは、不十分な免疫原性のため、大部分の癌に対して治療効果をもたらすことに関して限られた成功しか収めていない。ＤＮＡワクチンの潜在力を高めるために様々な戦略が研究されている。抗原をコードするプラスミドは、抗原の発現および提示を促進するように設計されている。
【０００６】
細菌またはウイルス由来のいくつかの成分は、免疫系と相互作用し、アジュバントとして作用できる。たとえば、コレラまたはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素は、粘膜抗原の免疫原性を高めることが示されている（Ｍｏｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｉｎｄｉａｎ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  １３８（５）：７７９−７９５）。細菌ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフは、免疫系に対して強力な刺激性の影響を有し、ＤＮＡワクチンの免疫原性を調節するために使用することができる（Ｋｌｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８（８）：３６３５−９）。さらに最近では、癌ＤＮＡワクチンの有効性は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇウイルスカプシドタンパク質をコードするプラスミドの同時投与により、改善した（Ｌａｍｂｒｉｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２４（９）：１６８６−９６）。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）もまた、ＤＮＡワクチンの有効性を高めるためのアジュバントとして使用されている（Ｍａｒｓａｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６（１５）：７５４４−７５５３；  Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８４（５）：２３３１−２３３９）。さらに、ＶＳＶ−Ｇは、腫瘍の成長の制御および癌細胞殺滅の媒介に寄与する膜融合特性を有することが示されている（Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０（６）：１４９２−１４９７；  Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２（２２）：６５６６−６５７８）。
【０００７】
ＤＮＡワクチンの不十分な免疫原性により、免疫に関して興味深い特性を有する別の核酸ベースの技術である、ｍＲＮＡワクチンへのシフトが促進された（Ｓｃｈｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．  ９（１１）：  １３１９−１３３０；  Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １３（１０）：７５９−８０；  ＭｃＮａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．  ２０１５：７９４５２８）。ＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと同じ好ましい特徴を保持しているが、いくつかのさらなる利点をも提供するため、魅力的である。ＤＮＡとは異なり、ＲＮＡは、細胞にトランスフェクトするために、翻訳が起こる細胞質への流入点の獲得のみを必要とする。さらに、ＲＮＡは、ゲノムに組み込むことができず、よって、発がんの可能性を有していない。
【０００８】
ＶＳＶ−Ｇエンベロープを有するウイルスは広範囲に及ぶ細胞型を形質導入することができるため、ＶＳＶ−Ｇはシュードタイピングのために頻繁に使用されている。ウイルスベクターの指向性を変更するため、腫瘍標的化リガンドを挿入することにより、ＶＳＶ−Ｇ変異体が構築されている（Ｇｕｉｂｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９（１）：７６−８４；  Ａｍｍａｙａｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８７（２４）：１３５４３−１３５５５）。改変されたＶＳＶ−Ｇはまた、中和抗体の産生を促進することが意図されているＨＩＶ−１由来の中和エピトープを有するウイルスベースのワクチンを構築するために得られた（Ｇｒｉｇｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０（１２）：８４９２−８５０１；  Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，  ２００４．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８（１０）：５０７９−５０８７）。最終的に、抗原をコードするプラスミドとＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの同時投与により、癌の進行が遅延し、生存を延長することが示されている（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８４（５）：  ２３３１−２３３９）。
【０００９】
ここで、本出願人は、驚くべきことに、特定の部位に挿入したエピトープを含むＶＳＶ−Ｇタンパク質が、その免疫原性の特性を保持することを例証している。一貫して、本出願人は、そのようなＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードする核酸の投与により、これらのエピトープに対する強力な免疫応答が生成されることを示している。特に、腫瘍性エピトープを含むＶＳＶ−Ｇ配列によるＤＮＡの免疫は、腫瘍の成長に有意な効果をもたらす。
【００１０】
よって、本発明は、少なくとも１つの異種性ペプチド、たとえば抗原またはそのフラグメントを含む水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質をコードする核酸、ならびに免疫のためのその使用に関する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントを含む改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする単離された核酸配列に関する。
【００１２】
一実施形態では、少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含む。一実施形態では、少なくとも１つの腫瘍抗原またはそのフラグメントはネオアンチゲンを含む。
【００１３】
一実施形態では、少なくとも１つの抗原またはそのフラグメントは、１８位、５１位、５５位、１９１位、１９６位、２１７位、３６８位、およびＣ末端、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸位置でＶＳＶ−Ｇに挿入されており、位置の番号付けは、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）に関するものである。
【００１４】
さらに本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターに関する。
【００１５】
さらに本発明は、本発明の核酸または本発明のベクターによりトランスフェクトされた樹状細胞集団に関する。
【００１６】
さらに本発明は、本発明の単離された核酸配列によりコードされる、改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）に関する。
【００１７】
さらに本発明は、本発明の単離された核酸配列、本発明のベクター、本発明の樹状細胞、または本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇを含む組成物に関する。
【００１８】
さらに本発明は、本発明の単離された核酸配列、本発明のベクター、本発明の樹状細胞、または本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇと、任意選択で少なくとも１つのアジュバントとを含むワクチンに関する。
【００１９】
さらに本発明は、その必要がある対象の疾患または症状の予防および／または治療に使用するための、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、それをコードする核酸配列、それをコードする核酸配列を含むベクター、それをコードする核酸配列によりトランスフェクトされた樹状細胞集団、または前記改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、もしくは樹状細胞集団と、任意選択で少なくとも１つのアジュバントとを含むワクチンに関する。
【００２０】
一実施形態では、本発明で使用するためのワクチンは、ポリヌクレオチドワクチンである。一実施形態では、本発明で使用するためのワクチンは、タンパク質ワクチンである。
【００２１】
一実施形態では、疾患または症状は、癌または感染性疾患である。
【００２２】
一実施形態では、本発明で使用するための、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、それをコードする核酸配列、それをコードする核酸配列を含むベクター、それをコードする核酸配列によりトランスフェクトされた樹状細胞集団、または前記改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、もしくは樹状細胞集団を含むワクチンは、筋肉内注射、皮内注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはソノポレーションにより対象に投与される。
【００２３】
一実施形態では、本発明で使用するための、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、それをコードする核酸配列、それをコードする核酸配列を含むベクター、それをコードする核酸配列によりトランスフェクトされた樹状細胞集団、または前記改変されたＶＳＶ−Ｇ、核酸配列、ベクター、もしくは樹状細胞集団を含むワクチンは、１つ以上のチェックポイント阻害抗体の前、同時、または後に投与される。
【００２４】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２５】
「ペプチド」は、ペプチド結合により共に結合している５０個未満のアミノ酸の直鎖状ポリマーを表す；「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共に結合している、少なくとも５０個のアミノ酸の直鎖状のポリマーを表す；「タンパク質」は、具体的には、１つ以上のペプチドまたはポリペプチドと、任意選択で非ポリペプチドの補因子とから形成される機能的な実体を表す。
【００２６】
「シグナルペプチド」は、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドとも呼ばれており、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在しており、特定の細胞区画、たとえば核、小胞体、ゴルジ体などにタンパク質を向けるために使用されているペプチドを表す。一実施形態では、本発明のシグナルペプチドは、４〜３５個のアミノ酸を含む。
【００２７】
「抗原」は、対象の細胞性免疫応答／液性免疫応答を開始し、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の刺激をもたらすことのできるいずれかの分子を表す。一実施形態では、抗原は、抗体またはＴ細胞受容体に結合することができる。生物学的応答を生じる抗原の構造的な態様、たとえば３次元コンフォメーションまたは修飾（たとえばリン酸化など）を、本明細書中では「エピトープ」、「抗原決定基」、または「抗原エピトープのフラグメント」と呼ぶ。
【００２８】
「ネオアンチゲン」または「ネオアンチゲンの」は、ゲノムコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更する１つまたはいくつかの腫瘍特異的変異から生じる、あるクラスの腫瘍抗原を表す。
【００２９】
用語「エピトープ」、「抗原決定基」、および「抗原エピトープのフラグメント」は、互換可能に使用することができる。これらは、免疫系、具体的には抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞により認識される抗原の一部を表している。エピトープは、連続するアミノ酸、またはタンパク質の三次元フォールディングにより近接する連続していないアミノ酸（よって、「コンフォメーションエピトープ」と呼ばれている）の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に曝露した後も保持されており、一方コンフォメーションエピトープは、通常、変性溶媒での処理により失われる。これらは、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞に関する最小結合部位を定義し、よって、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞の特異的な標的を表す。
【００３０】
「Ｔ細胞エピトープ」は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子またはＭＨＣ複合体の形態のクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子が結合することができ、次に、この形態で、ナイーブＴ細胞、細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞、またはＴヘルパーＣＤ４細胞が認識および結合することができるエピトープを表す。Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８Ｔ細胞に認識される場合はＭＨＣクラスＩにより提示され（よってＣＤ８Ｔ細胞エピトープと呼ばれる）、ＣＤ４Ｔ細胞に認識される場合はＭＨＣクラスＩＩにより提示され（よってＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたはヘルパーＴ細胞エピトープと呼ばれる）、またはその両方により提示され得る。
【００３１】
「薬学的に許容される賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与する場合に、有害な反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない賦形剤を表す。これは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。ヒトへの投与では、調製物は、たとえばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制局が要求する滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【００３２】
「免疫原性組成物」は、対象への組成物の投与が、対象において、目的の抗原性分子に対する液性および／または細胞性の免疫応答の発達をもたらす抗原性分子を含む組成物である。一実施形態では、免疫原性組成物は、たとえば注射、吸入、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与により、レシピエントの対象に直接導入され得る。
【００３３】
「ワクチン」は、対象の免疫系を、細菌もしくはウイルスなどの病原体、または腫瘍に応答させることを意味する物質または物質のグループを含むいずれかの調製物を表す。予防用ワクチンは、対象が特定の疾患を有さないよう予防するため、または単に疾患を軽症にするために使用する。このような予防用ワクチンは、疾患の原因となる病原体を、通常、生きた弱毒化もしくは死滅した状態で、または精製もしくは組み換えであるその成分として含む。治療用ワクチンは、対象の特定の疾患、特に癌を治療することを意図している。このような治療用の抗癌ワクチンは、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発する、１つの腫瘍抗原または複数の腫瘍抗原を含む。
【００３４】
「アジュバント」は、予測される応答を得るために、抗原に対する免疫応答を刺激しおよび／または免疫応答を調節する分子を表す。特に、ワクチン製剤におけるアジュバントの添加は、ワクチン製剤に含まれている抗原（複数可）に対する特定の免疫応答を改善、加速、シフト、および／または延長させることを目的としている。アジュバントの利点として、抗原の免疫原性の亢進、免疫応答の性質の変化、有効な免疫を誘導するために必要とされる抗原（複数可）の量の低減、追加免疫の頻度の低減、ならびに高齢者および免疫不全者における免疫応答の亢進が挙げられる。
【００３５】
「遺伝子アジュバント」は、任意の生物学的に活性な因子、たとえばサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンド、および任意にそれらの組み合わせを表し、ベクターにより発現し、抗原をコードするＤＮＡワクチンと共に投与されると、抗原特異的な免疫応答を高める。望ましい遺伝子アジュバントとして、限定するものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＦＮ）（たとえば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）（たとえば、ＩＬ−ｌβ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、ＴＮＦ−α、ならびにそれらの組み合わせをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。遺伝子アジュバントはまた、パラポックスウイルス由来の免疫刺激性ポリペプチド、たとえばパラポックスウイルス株Ｄ１７０１もしくはＮＺ２のポリペプチド、またはパラポックス免疫刺激性ポリペプチドＢ２ＷＬもしくはＰＰ３０であり得る。他のこのような、抗原特異的な免疫応答を高めるさらなる生物学的に活性の因子は、当業者によって容易に選択することができ、公知の技術（たとえばＤＮＡワクチンのための遺伝子アジュバントのレビューに関しては、Ｃａｌａｒｏｔａ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒ，  ２００４．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  ３：Ｓ１３５−４９；  Ｃａｌａｒｏｔａ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒ，  ２００４．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １９９：８４−９９；  Ｋｕｔｚｌｅｒ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒ，  ２００４．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １４（９）：１２４１−４を参照）により構築された同じ因子を含む適切なプラスミドベクターであり得る。
【００３６】
一実施形態では、遺伝子アジュバントは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされていない。別の実施形態では、遺伝子アジュバントは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされている。この実施形態では、遺伝子アジュバントは、それ自身のプロモーターの制御下とすることができ；または遺伝子アジュバントは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によりそれから隔てられた、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇと同じプロモーターの制御下であり得る。
【００３７】
「樹状細胞」は、特定の発達段階で樹状突起と呼ばれる細胞質内の分岐した突起を提示する免疫系の抗原提示細胞を表す。樹状細胞は、抗原に応答して誘導される適応免疫応答の誘因となる特定の機能を有する。
【００３８】
「対象」は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを表す。
【００３９】
一実施形態では、対象は、哺乳類であり得る。哺乳類として、限定するものではないが、すべての霊長類（ヒトおよび非ヒト）、ウシ（畜牛）（乳牛を含む）、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、および医療の受診を待機している、または医療を受けている、または医療の対象であった／対象である／対象となるであろう、他のいずれかの哺乳類、または疾患の発症に関してモニタリングされている哺乳類が、挙げられる。
【００４０】
一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち医療の受診を待機している、または医療を受けている、または医療の対象であったことがある／現在対象である／将来対象となり得る、または疾患の発症に関してモニタリングされている温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は、成年（たとえば１８歳超の対象）である。別の実施形態では、対象は、小児（たとえば、１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。
【００４１】
「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療している）」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」または「ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ（緩和）」は、治療用の処置および予防用（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防上（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）の手段の両方を表し、この目的は、たとえば癌または感染症などの標的とする病態または障害を予防または進行を遅らせる（弱める）ことである。治療の必要がある対象は、すでに障害を有する対象、および障害を有する傾向のある対象、または障害を予防すべき対象を含む。本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、組成物、またはワクチンの治療量を投与した後に、患者が、以下：病原性細胞の数の低減；病原性である総細胞のパーセントの低減；および／または特定の疾患もしくは症状に関連する症状のうちの１つ以上のある程度の軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびにクオリティオブライフの問題の改善のうちの１つ以上の、観察可能なおよび／または測定可能な低減、または非存在を示す場合、対象または哺乳類は、たとえば癌または感染症などの特定の疾患または症状に関する「治療」が成功している。治療の成功および疾患の改善に関する上記のパラメータは、医師に周知の通例の手段により、容易に測定可能である。
【００４２】
ある値の前にある「約」は、上記値の±１０％を意味する。
【００４３】
詳細な説明
１．改変されたＶＳＶ−Ｇ
本発明は、少なくとも１つの異種性ペプチドを含む水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする核酸に関する。「異種性ペプチド」は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質、好ましくはＶＳＶ−Ｇの野生型タンパク質に対して内因性ではないかまたはネイティブでないペプチドを意味する。よって、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの異種性ペプチドを含む改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする核酸に関する。一実施形態では、異種性ペプチドの核酸は、ＶＳＶ−Ｇの核酸に挿入されている。
【００４４】
本発明の意味において、用語「改変されたＶＳＶ−Ｇ」は、同様の用語「キメラＶＳＶ−Ｇ」および「変異体ＶＳＶ−Ｇ」を意味する。すべての用語は本明細書を通して互換可能に使用されている。一実施形態では、キメラＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つの異種性ペプチドを含むＶＳＶ−Ｇである。一実施形態では、変異体ＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つの異種性ペプチドがＶＳＶ−Ｇに挿入されている挿入変異体である。一実施形態では、用語「改変された」、「キメラ」、および「変異体」は、ＶＳＶ−Ｇの野生型タンパク質を参照して使用されている。
【００４５】
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする核酸は、単離された核酸である。
【００４６】
さらに本発明は、少なくとも１つの異種性ペプチドを含む改変された水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）に関する。
【００４７】
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、組み換え型の改変されたＶＳＶ−Ｇである。
【００４８】
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、単離された改変されたＶＳＶ−Ｇである。
【００４９】
１．１．ＶＳＶ−Ｇ
水疱性口内炎ウイルスは、ラブドウイルス科のベジクロウイルス属の構成メンバーである。このゲノムは、５つの主要なタンパク質：糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼまたは大タンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、および核タンパク質（Ｎ）をコードする、マイナス鎖ＲＮＡの単一の分子を説明する。水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、野生型ウイルス粒子の表面コーティングとして機能する膜貫通型タンパク質である。
【００５０】
現在、９つの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株が、ベジクロウイルス属に分類されている：水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、水疱性口内炎アラゴウイルス（ＶＳＡＶ）、カラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）ウイルス（ＣＪＳＶ）、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス（ＩＳＦＶ）、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス（ＭＡＲＡＶ）、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）、およびピリ（Ｐｉｒｙ）ウイルス（ＰＩＲＹＶ）。さらに、他のウイルス株が、暫定的にベジクロウイルス属に分類されている：ソウギョのラブドウイルス、ＢｅＡｎ  １５７５７５ウイルス（ＢｅＡｎ  １５７５７５）、ボテケ（Ｂｏｔｅｋｅ）ウイルス（ＢＴＫＶ）、カルチャキ（Ｃａｌｃｈａｑｕｉ）ウイルス（ＣＱＩＶ）、ウナギウイルスアメリカン（Ｅｅｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）（ＥＶＡ）、グレーロッジ（Ｇｒａｙ  Ｌｏｄｇｅ）ウイルス（ＧＬＯＶ）、ユロナ（Ｊｕｒｏｎａ）ウイルス（ＪＵＲＶ）、クラマス（Ｋｌａｍａｔｈ）ウイルス（ＫＬＡＶ）、クワッタ（Ｋｗａｔｔａ）ウイルス（ＫＷＡＶ）、ラホイヤ（Ｌａ  Ｊｏｙａ）ウイルス（ＬＪＶ）、マルパイススプリングウイルス（ＭＳＰＶ）、マウントエルゴンコウモリウイルス（ＭＥＢＶ）、ペリネト（Ｐｅｒｉｎｅｔ）ウイルス（ＰＥＲＶ）、パイクフライラブドウイルス（ＰＦＲＶ）、ポートン（Ｐｏｒｔｏｎ）ウイルス（ＰＯＲＶ）、ラジ（Ｒａｄｉ）ウイルス（ＲＡＤＩＶ）、コイ春季ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣＶ）、ツパイ（Ｔｕｐａｉａ）ウイルス（ＴＵＰＶ）、潰瘍性疾患ラブドウイルス（ＵＤＲＶ）、およびヤグボグダノバク（Ｙｕｇ  Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃ）ウイルス（ＹＢＶ）。
【００５１】
これらウイルス株の中で、プロテインＧの遺伝子は配列類似性を示している。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、Ｎ末端エクトドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の細胞質側末端を提示している。これは、トランスゴルジネットワーク（小胞体およびゴルジ体）を介して細胞表面に輸送される。
【００５２】
ＭＵＳＣＬＥ（対数期待値による多重配列比較（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  Ｌｏｇ−Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ））を使用した配列アライメントを、以下の表１に示す。
【表１】
2019531090.tif 000002
【００５３】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＶＳＩＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＩＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＶＳＩＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号１を含む、またはこれからなる。
【００５４】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号１の多様体である。一実施形態では、配列番号１の多様体は、配列番号１と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。
【００５５】
用語「同一性」または「同一の」は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係に使用する場合、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間のマッチ数により決定される、ポリペプチド間の配列の関係性の度合いを表す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により対処されるギャップアライメント（存在する場合）を用いて、２つ以上の配列のうちの小さい配列に合わせた配列間で同一のマッチのパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定するものではないが、Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．  Ｌｅｓｋ，  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）；Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｗ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  （Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３）；Ｈｕｇｈ  Ｇ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ａｎｎｅｔｔｅ  Ｍ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １  （Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４）；Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｒｅａｓｕｒｅ  Ｔｒｏｖｅ  ｏｒ  Ｔｒｉｖｉａｌ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７）；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８．  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ４８（５）：１０７３−１０８２に記載されるものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間で最大のマッチを提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムの方法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １２（１  Ｐｔ  １）：３８７−３９５；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−４１０）を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩ���  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−４１０）から公開されている。また、周知のＳｍｉｔｈ  ＷａｔｅｒｍａｎＷｉｎｄｏｗｓアルゴリズムを、同一性を決定するために使用してもよい。
【００５６】
別の実施形態では、配列番号１の多様体は、配列番号１と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書中で、以下の５つの群：
Ｉ．小さな、脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の、負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きな、脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；
Ｖ．大きな、芳香族の残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
のうちの１つの中でのアミノ酸の交換と定義されている。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸」は、当該分野で周知であるアミノ酸の正式名、アミノ酸の３文字表記、またはアミノ酸の１文字表記により表されている。ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように略されている：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ；ロイシンはＬｅｕまたはＬ；イソロイシンはＩｌｅまたはＩ；メチオニンはＭｅｔまたはＭ；バリンはＶａｌまたはＶ；セリンはＳｅｒまたはＳ；プロリンはＰｒｏまたはＰ；スレオニンはＴｈｒまたはＴ；アラニンはＡｌａまたはＡ；チロシンはＴｙｒまたはＹ；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ；グルタミンはＧｌｎまたはＱ；アスパラギンはＡｓｎまたはＮ；リジンはＬｙｓまたはＫ；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ；システインはＣｙｓまたはＣ；トリプトファンはＴｒｐまたはＷ；アルギニンはＡｒｇまたはＲ；グリシンはＧｌｙまたはＧ。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然のアミノ酸および合成のアミノ酸の両方、ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含む。「標準的なアミノ酸」または「天然に存在するアミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般に見いだされる２０個の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準的なアミノ酸残基」は、合成的に調製されているか、または天然の供給源に由来しているかどうかに関わらず、標準的なアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を意味する。たとえば、ナフチル（ｎａｐｈｔｌｙｌ）アラニンを、合成を促進するために、トリプトファンと置換することができる。他の置換できる合成アミノ酸として、限定するものではないが、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、αアミノ酸、たとえばＬ−α−ヒドロキシリシルおよびＤ−α−メチルアラニル、Ｌ−α−メチルアラニル、βアミノ酸、ならびにイソキノリルが挙げられる。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸」は、限定するものではないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および置換を含む、化学的に修飾したアミノ酸をも包有する。本発明のポリペプチドの中に含まれているアミノ酸、特にカルボキシ末端またはアミノ末端に含まれているアミノ酸は、ポリペプチドの活性に有害な影響を与えることなくポリペプチドの循環半減期を変化させることができる、メチル化、アミド化、アセチル化、または他の化学基との置換により、修飾することができる。さらに、ジスルフィド結合が、本発明のポリペプチドに存在していてもよく、または存在していなくてもよい。
【００６１】
別の実施形態では、配列番号１の多様体は、配列番号１の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００６２】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＶＳＮＪＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＮＪＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＶＳＮＪＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号２を含む、またはこれからなる。
【００６３】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号２の多様体である。一実施形態では、配列番号２の多様体は、配列番号２と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号２の多様体は、配列番号２の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００６４】
別の実施形態では、配列番号２の多様体は、配列番号２の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００６５】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＣＨＰＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＣＨＰＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＣＨＰＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号３を含む、またはこれからなる。
【００６６】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号３の多様体である。一実施形態では、配列番号３の多様体は、配列番号３と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号３の多様体は、配列番号３の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００６７】
別の実施形態では、配列番号３の多様体は、配列番号３の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００６８】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＣＯＣＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＣＯＣＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＣＯＣＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号４を含む、またはこれからなる。
【００６９】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号４の多様体である。一実施形態では、配列番号４の多様体は、配列番号４と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号４の多様体は、配列番号４の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００７０】
別の実施形態では、配列番号４の多様体は、配列番号４の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００７１】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＰＩＲＹＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＰＩＲＹＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＰＩＲＹＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号５を含む、またはこれからなる。
【００７２】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号５の多様体である。一実施形態では、配列番号５の多様体は、配列番号５と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号５の多様体は、配列番号５の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００７３】
別の実施形態では、配列番号５の多様体は、配列番号５の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００７４】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＩＳＦＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＩＳＦＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＩＳＦＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号６を含む、またはこれからなる。
【００７５】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号６の多様体である。一実施形態では、配列番号６の多様体は、配列番号６と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号６の多様体は、配列番号６の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００７６】
別の実施形態では、配列番号６の多様体は、配列番号６の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００７７】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＳＶＣＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＳＶＣＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＳＶＣＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＳＶＣＶ−Ｇ）は、配列番号７を含む、またはこれからなる。
【００７８】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号７の多様体である。一実施形態では、配列番号７の多様体は、配列番号７と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号７の多様体は、配列番号７の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００７９】
別の実施形態では、配列番号７の多様体は、配列番号７の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００８０】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＶＳＡＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＡＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＶＳＡＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号５４を含む、またはこれからなる。
【００８１】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号５４の多様体である。一実施形態では、配列番号５４の多様体は、配列番号５４と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号５４の多様体は、配列番号５４の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００８２】
別の実施形態では、配列番号５４の多様体は、配列番号５４の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００８３】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＣＪＳＶ由来のＶＳＶ−Ｇである。一実施形態では、ＣＪＳＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号５５を含む、またはこれからなる。
【００８４】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号５５の多様体である。一実施形態では、配列番号５５の多様体は、配列番号５５と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号５５の多様体は、配列番号５５の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００８５】
別の実施形態では、配列番号５５の多様体は、配列番号５５の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００８６】
一実施形態では、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、ＭＡＲＡＶ由来のＶＳＶ−Ｇ（ＭＡＲＡＶ−Ｇ）である。一実施形態では、ＭＡＲＡＶ由来のＶＳＶ−Ｇは、配列番号５６を含む、またはこれからなる。
【００８７】
一実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、配列番号５６の多様体である。一実施形態では、配列番号５６の多様体は、配列番号５６と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質である。別の実施形態では、配列番号５６の多様体は、配列番号５６の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含む。
【００８８】
別の実施形態では、配列番号５６の多様体は、配列番号５６の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が存在していないかもしくはいずれかのアミノ酸により置換されているタンパク質、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のアミノ酸（連続または非連続）が付加されているタンパク質である。
【００８９】
本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、天然の標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸を含み得る。ポリペプチドの模倣体は、以下の修飾を有するポリペプチドを含む：
ｉ）ペプチジル−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−結合のうちの１つ以上が、−ＣＨ２−カルバメート結合（−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−）、ホスホネート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）結合、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）結合、−ＣＨ２−二級アミン結合により、またはＲがＣ１〜Ｃ４アルキルであるアルキル化ペプチジル結合（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−）などの非ペプチジル結合に置換されている、ポリペプチド；
ｉｉ）Ｎ末端が、−ＮＲＲ１基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基に誘導体化されており、式中のＲおよびＲ１が水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、但しＲおよびＲ１の両方が水素ではない、ポリペプチド；
ｉｉｉ）Ｃ末端が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２に誘導体化されており、式中のＲ２が、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシおよび−ＮＲ３Ｒ４からなる群から選択され、式中のＲ３およびＲ４が、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択される、ポリペプチド。
【００９０】
本発明の一実施形態では、本明細書中記載の改変されたＶＳＶ−Ｇは、当該分野で周知の手段、たとえばホスフェート、アセテート、脂質もしくは炭水化物基などの１つ以上の官能基の付加、および／または１つ以上の保護基の付加により、修飾されている。
【００９１】
たとえば、改変されたＶＳＶ−Ｇは、リン酸塩、酢酸塩、脂質、および炭水化物などの１つ以上の官能基の付加により、修飾することができる。本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇはまた、タンパク質誘導体として存在することもできる。用語「タンパク質誘導体」は、アミノ基（−−ＮＨ−−）を有する化合物、より具体的にはペプチド結合を有する化合物を表す。改変されたＶＳＶ−Ｇは、置換アミドであると考えることができる。アミド基のように、ペプチド結合は、高い度合の共鳴安定化を示す。ペプチド結合におけるＣ−Ｎ単結合は、通常、約４０％の二重結合特徴を有し、Ｃ＝Ｏ二重結合は、約４０％の単結合特徴を有する。「保護基」は、保護されていない官能基を含む望ましくない反応（タンパク質分解など）を防止する基である。アミノ保護基の具体的な例として、ホルミル；トリフルオロアセチル；ベンジルオキシカルボニル；置換したベンジルオキシカルボニル、たとえば（オルト−またはパラ−）クロロベンジルオキシカルボンニルおよび（オルト−またはパラ−）ブロモベンジルオキシカルボニル；ならびに脂肪族オキシカルボニル、たとえばｔ−ブトキシカルボニルおよびｔ−アミルオキシ（ａｍｉｌｏｘｙ）カルボニルが挙げられる。アミノ酸のカルボキシル基は、エステル基への変換を介して保護することができる。エステル基として、ベンジルエステル、置換ベンジルエステル、たとえばメトキシベンジルエステル；アルキルエステル、たとえばシクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、またはｔ−ブチルエステルが挙げられる。グアニジノ部分は、たとえそれが保護基を必要としていなくても、ニトロ；またはアリールスルホニル、たとえばトシル、メトキシベンゼンスルホニル、もしくはメシチレンスルホニルにより保護されてもよい。イミダゾールの保護基として、トシル（ｔｏｓｙ）、ベンジル、ジニトロフェニルが挙げられる。トリプトファンのインドール基は、ホルミルにより保護されてもよく、または保護されていなくてもよい。
【００９２】
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、前記改変されたＶＳＶ−ＧのＮ末端にシグナルペプチドを含む。一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、前記改変されたＶＳＶ−ＧのＣ末端にシグナルペプチドを含む。
【００９３】
一実施形態では、シグナルペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸残基を含む、またはこれからなる。
【００９４】
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇのシグナルペプチドは、配列番号５２（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣ）を含む、またはこれからなる。
【００９５】
別の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇのシグナルペプチドは、配列番号５３（ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ）を有するガウシア  プリンケプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼシグナルペプチドを含む、またはこれからなる。
【００９６】
別の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇのシグナルペプチドは、Ｋｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １１０：１１６４−１１７３；  Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １２０（５）：５１８−５２５；  Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２：１−１７；  Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１．  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ．  ４３：９６−１０２に開示されているシグナルペプチドのいずれを含む、またはこれからなる。これらは、限定するものではないが、以下を含む：
配列番号５７（ＭＤＭＲＡＰＡＧＩＦＧＦＬＬＶＬＦＰＧＹＲＳ）を含むまたはこれからなるハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｉｇκの軽鎖前駆体（変異体Ａ２）のシグナルペプチド；
配列番号５８（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ）を含むまたはこれからなるホモサピエンス血清アルブミンプレプロタンパク質のシグナルペプチド；
配列番号５９（ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬＬＡＶＴＰＧＡＨＰ）を含むまたはこれからなるホモサピエンスイムノグロブリン重鎖のシグナルペプチド；
配列番号６０（ＭＡＷＳＰＬＦＬＴＬＩＴＨＣＡＧＳＷＡ）を含むまたはこれからなるホモサピエンスイムノグロブリン軽鎖のシグナルペプチド；
配列番号６１（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）を含むまたはこれからなるホモサピエンスアズロシジンプレプロタンパク質のシグナルペプチド；
配列番号６２（ＭＡＲＰＬＣＴＬＬＬＬＭＡＴＬＡＧＡＬＡ）を含むまたはこれからなるホモサピエンスシスタチンＳ前駆体のシグナルペプチド；
配列番号６３（ＭＲＳＬＶＦＶＬＬＩＧＡＡＦＡ）を含むまたはこれからなるウィンターフラウンダー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）トリプシノーゲン２の前駆体のシグナルペプチド；
配列番号６４（ＭＳＲＬＦＶＦＩＬＩＡＬＦＬＳＡＩＩＤＶＭＳ）を含むまたはこれからなるキョクトウサソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ）カリウムチャネル遮断剤のシグナルペプチド；
配列番号６５（ＭＧＭＲＭＭＦＩＭＦＭＬＶＶＬＡＴＴＶＶＳ）を含むまたはこれからなるクロフモドキ（Ｃｏｎｕｓ  ｌｅｏｐａｒｄｕｓ）α−コノトキシンｌｐ１．３のシグナルペプチド；
配列番号６６（ＭＲＡＦＬＦＬＴＡＣＩＳＬＰＧＶＦＧ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αガラクトシダーゼ（変異体ｍ３）のシグナルペプチド；
配列番号６７（ＭＫＦＱＳＴＬＬＬＡＡＡＡＧＳＡＬＡ）を含むまたはこれからなるアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）セルラーゼのシグナルペプチド；
配列番号６８（ＭＡＳＳＬＹＳＦＬＬＡＬＳＩＶＹＩＦＶＡＰＴＨＳ）を含むまたはこれからなるネペンテス・グラキリス（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）アスパラギン酸プロテイナーゼ  ネペンテシン１のシグナルペプチド；
配列番号６９（ＭＫＴＨＹＳＳＡＩＬＰＩＬＴＬＦＶＦＬＳＩＮＰＳＨＧ）を含むまたはこれからなるネペンテス・ラフレシアナ（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｒａｆｆｌｅｓｉａｎａ）酸キチナーゼのシグナルペプチド；
配列番号７０（ＭＥＳＶＳＳＬＦＮＩＦＳＴＩＭＶＮＹＫＳＬＶＬＡＬＬＳＶＳＮＬＫＹＡＲＧ）を含むまたはこれからなるＭ２８ウイルスＫ２８プレプロトキシンのシグナルペプチド；
配列番号７１（ＭＫＡＡＱＩＬＴＡＳＩＶＳＬＬＰＩＹＴＳＡ）を含むまたはこれからなるチゴサッカロマイセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）キラー毒素ジゴシン（ｚｙｇｏｃｉｎ）前駆体のシグナルペプチド；
配列番号７２（ＭＩＫＬＫＦＧＶＦＦＴＶＬＬＳＳＡＹＡ）を含むまたはこれからなるコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）Ｏ１３９のコレラ毒素のシグナルペプチド；
配列番号７３（ＭＱＬＬＲＣＦＳＩＦＳＶＩＡＳＶＬＡＱＥＬＴＴＩＣＥＱＩＰＳＰＴＬＥＳＴＰＹＳＬＳＴＴＴＩＬＡＮＧＫ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−アグルチニン接着サブユニットのシグナルペプチド；
配列番号７４（ＭＬＳＬＫＴＬＬＣＴＬＬＴＶＳＳＶＬＡＴＰＶＰＡＲＤＰＳＳＩＱＦＶＨＥＥＮＫＫＲＹＹＤＹＤＨＧＳＬＧＥ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のエキソ−１，３−βグルカナーゼのシグナルペプチド；
配列番号７５（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＬＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の接合フェロモンα因子のシグナルペプチド；
配列番号７６（ＭＫＶＬＤＬＬＴＶＬＳＡＳＳＬＬＳＴＦＡＡＡＥＳＴＡＴＡＤＳＴＴＡＡＳＳＴＡＳＣＮＰＬＫＴＴＧＣＴＰＤＴＡＬＡＴＳＦＳＥＤＦＳＳＳＳＫ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のキチントランスグリコシラーゼのシグナルペプチド；
配列番号７７（ＭＫＬＱＳＬＬＶＳＡＡＶＬＴＳＬＴＥＮＶＮＡＷＳＰＮＮＳＹＶＰＡＮＶＴＣＤＤＤＩＮＬＶＲＥＡＳＧＬＳＤＮＥＴＥＷＬＫＫＲＤＡＹＴＫＥ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のホスホリパーゼＢのシグナルペプチド；
配列番号７８（ＭＫＬＳＡＴＴＬＴＡＡＳＬＩＧＹＳＴＩＶＳＡＬＰＹＡＡＤＩＤＴＧＣＴＴＴＡＨＧＳＨＱＨＫＲＡＶＡＶＴＹＶＹＥＴＶＴＶＤＫＮＧＱＴＶＴＰＴＳＴＥＡＳＳＴＶＡＳＴＴＴＬＩＳＥＳＳＶＴＫＳＳＳＫＶＡＳＳＳＥ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルカナーゼに関連する細胞壁のタンパク質のシグナルペプチド；
配列番号７９（ＭＱＬＲＮＩＬＱＡＳＳＬＩＳＧＬＳＬＡＡＤＳＳＳＴＴＧＤＧＹＡＰＳＩＩＰＣＰＳＤＤＴＳＬＶＲＮＡＳＧＬＳＴＡＥＴＤＷＬＫＫＲＤＡＹＴＫＥＡＬＨＳＦＬＳＲＡＴＳＮＦＳＤＴＳＬＬＳＴＬＦＳＳＮＳＳＮ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のホスホリパーゼＢのシグナルペプチド；
配列番号８０（ＭＩＳＰＩＳＦＬＳＳＬＬＣＬＴＹＬＴＳＡＬＰＩＬＰＫＲＥＶＶＴＲＶＨＴＡＳＴＴＮＶＶＴＤＦＹＳＴＴＴＥ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のエキソ−１，３−βグルカナーゼのシグナルペプチド；
配列番号８１（ＭＬＥＦＰＩＳＶＬＬＧＣＬＶＡＶＫＡＱＴＴＦＰＮＦＥＳＤＶＬＮＥＨＮＫＦＲＡＬＨＶＤＴＡＰＬＴＷＳＤＴＬＡＴＹＡＱＮＹＡＤＱＹＤＣＳＧＶＬＴＨＳＤＧＰＹＧＥＮＬＡＬＧＹＴＤＴＧＡＶＤＡＷＹＧＥＩＳＫＹ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチル化ステロールの輸送に関係する細胞壁関連タンパク質のシグナルペプチド；
配列番号８２（ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＫＩＩＰＡＡＮＫＲＤＤＤＳＮＳＫＦＶＫＬＰＦＨＫＬＹＧＤＳＬＥＮＶＧＳＤＫＫＰＥＶＲＬＬＫＲＡＤＧＹＥＥＩＩＩＴＮＱＱＳＦＹＳＶＤＬＥ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアスパラギン酸プロテアーゼのシグナルペプチド；
配列番号８３（ＭＶＫＬＴＳＩＡＡＧＶＡＡＩＡＡＴＡＳＡＴＴＴＬＡＱＳＤＥＲＶＮＬＶＥＬＧＶＹＶＳＤＩＲＡＨＬＡＱＹＹＳＦＱＶＡＨＰＴＥＴＹ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の細胞壁マンノプロテインのシグナルペプチド；
配列番号８４（ＭＶＫＬＴＳＩＶＡＧＶＡＡＩＡＡＧＶＡＡＡＰＡＴＴＴＬＳＰＳＤＥＲＶＮＬＶＥＬＧＶＹＶＳＤＩＲＡＨＬＡＥＹＹＭＦＱＡＡＨＰＴＥＴＹ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の細胞壁マンノプロテインのシグナルペプチド；
配列番号８５（ＭＱＰＩＴＴＡＳＴＱＡＴＱＫＤＫＳＳＥＫＫＤＮＹＩＩＫＧＬＦＷＤＰＡＣＶＩＡ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の接合フェロモンα因子のシグナルペプチド；
配列番号８６（ＭＶＳＦＲＧＬＴＴＬＴＬＬＦＴＫＬＶＮＣＮＰＶＳＴＫＮＲＤＳＩＱＦＩＹＫＥＫＤＳＩＹＳＡＩＮＮＱＡＩＮＥＫ）を含むまたはこれからなる出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の胞子形成に特異的なエキソ−１，３−ｂ−グルカナーゼのシグナルペプチド；
配列番号８７（ＭＡＦＬＷＬＬＳＣＷＡＬＬＧＴＴＦＧ）を含むまたはこれからなるホモサピエンスキモトリプシノーゲンのシグナルペプチド；
配列番号８８（ＭＱＬＬＳＣＩＡＬＩＬＡＬＶ）を含むまたはこれからなるホモサピエンスインターロイキン−２のシグナルペプチド；
配列番号８９（ＭＮＬＬＬＩＬＴＦＶＡＡＡＶＡ）を含むまたはこれからなるホモサピエンストリプシノーゲン２のシグナルペプチド；
配列番号９０（ＭＤＩＫＶＶＦＴＬＶＦＳＡＬＶＱＡ）を含むまたはこれからなるメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ）のルシフェラーゼのシグナルペプチド；
配列番号９１（ＭＬＬＬＳＡＬＬＬＧＬＡＨＧＹＳ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）１のシグナルペプチド；
配列番号９２（ＭＫＬＬＡＳＶＬＴＩＡＡＡＤＹＡＣＣ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）２Ａのシグナルペプチド；
配列番号９３（ＭＫＩＳＡＧＬＬＧＶＡＬＧＱＮＥＧＳＡＥＡ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）３のシグナルペプチド；
配列番号９４（ＭＫＬＦＡＡＬＳＡＦＳＡＳＶＥＡ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）４Ａのシグナルペプチド；
配列番号９５（ＭＫＬＬＣＳＶＬＬＧＴＶＦＧ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）５Ａのシグナルペプチド；
配列番号９６（ＭＫＩＳＰＬＬＶＶＴＡＶＶＧ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）６Ａのシグナルペプチド；
配列番号９７（ＭＫＩＡＡＴＦＡＡＬＡＳＡＴＥＷＱＧ）を含むまたはこれからなるワカレオタマボヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ  ｄｉｏｉｃａ）のオイコシン（Ｏｉｋｏｓｉｎ）７Ａのシグナルペプチド；
配列番号９８（ＭＫＩＩＩＬＳＶＩＬＡＹＣＶＴＤＮＣ）を含むまたはこれからなるウミホタル（Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ）ルシフェラーゼのシグナルペプチド；
配列番号９９（ＭＡＭＳＬＫＫＩＧＡＩＡＶＧＧＡＭＶＡＴＡＬＡＳＧＶＡＡ）を含むまたはこれからなるメタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）Ｓｌｍｊ１のシグナルペプチド；
配列番号１００（ＭＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡＬＬＳＣＬＴＴＰＡＳＡ）を含むまたはこれからなるＣ型肝炎ウイルス血清型１ｂＥ１タンパク質のシグナルペプチド；
配列番号１０１（ＭＶＧＮＷＡＫＶＬＩＶＭＬＬＦＡＧＶＤＧ）を含むまたはこれからなるＣ型肝炎ウイルス血清型１ｂＥ２タンパク質のシグナルペプチド；
配列番号１０２（ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＤＳＶＴＧ）を含むまたはこれからなる組織プラスミノーゲンアクチベーターのシグナルペプチド；および
配列番号１０３（ＭＤＡＭＫＶＬＬＬＶＦＶＳＰＳＱＶＴＧ）を含むまたはこれからなるシグナルペプチド。
【００９７】
１．２．ペプチド
１．２．１．抗原
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの異種性ペプチドは、抗原またはそのフラグメントである。一実施形態では、抗原のフラグメントはエピトープである。
【００９８】
一実施形態では、本抗原は、非自己抗原であり、すなわち抗原は外来性の抗原である。別の実施形態では、本抗原は宿主のタンパク質であり、すなわち自己抗原である。
【００９９】
「非自己抗原」、「異種性抗原」、または「外来性の抗原」は、それに曝露される対象に対して内因性ではないまたはネイティブではない分子または複数の分子を意味する。外来性の抗原は、免疫応答、たとえば哺乳類における液性応答および／またはＴ細胞介在性の応答を誘発し得る。
【０１００】
外来性の抗原の例として、限定するものではないが、タンパク質（糖タンパク質、ムコタンパク質などの修飾されたタンパク質などを含む）、核酸、炭水化物、プロテオグリカン、脂質、ムチン分子、免疫原性治療剤（抗体、特に非ヒトアミノ酸残基を含む抗体、たとえばげっ歯類の抗体、キメラ抗体／ヒト化抗体、および霊長類化抗体などのタンパク質を含む）、毒素（任意選択で、免疫原性でもあり得る抗体などの標的分子に結合している）、遺伝子治療ウイルスベクター（レトロウイルスおよびアデノウイルスなど）、移植片（移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植される移植片の抗原性の成分、および神経移植片の成分を含む）、感染病原体（細菌およびウイルス、または他の生物、たとえば原生生物など）、同種抗原（すなわち、同じ種の一部のメンバーに存在するが、他のメンバーには存在しない抗原）、たとえば血液型の相違、ヒトリンパ球抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ＨＬＡ）、血小板抗原、移植した臓器で発現した抗原、血液成分、妊娠（Ｒｈ）の因子および血友病の因子（第ＶＴｆｌ因子および第ＩＸ因子）が挙げられる。
【０１０１】
「自己抗原」は、通常体内で発現する抗原を意味する。一実施形態では、自己抗原は、自己免疫疾患の標的である臓器で発現する。一実施形態では、自己抗原は、膵臓、甲状腺、結合組織、腎臓、肺、消化系、または神経系で発現する。別の実施形態では、自己抗原は、膵臓のβ細胞で発現する。
【０１０２】
自己抗原の例として、限定するものではないが、インスリンの抗原性ペプチド、インスリンβ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ  ６５）、ＨＳＰ、サイログロブリン、核タンパク質、アセチルコリン受容体、コラーゲン、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、ＩＣＡ５１２（ＩＡ−２）、およびＩＡ−２β（ｐｈｏｇｒｉｎ）、カルボキシペプチダーゼＨ、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２、甲状腺ペルオキシダーゼ、ネイティブＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体の成分、組織適合抗原、移植片拒絶および変化したペプチドリガンドに関係する抗原が挙げられる。
【０１０３】
１．２．１．１．腫瘍抗原
一実施形態では、本抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原である。
【０１０４】
一実施形態では、本抗原は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。別の実施形態では、本抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。別の実施形態では、本抗原は、癌―生殖系列／癌  精巣抗原（ＣＴＡ）である。
【０１０５】
一実施形態では、そこから本抗原が単離または誘導される腫瘍は、限定するものではないが、メラノーマ、扁平上皮癌、乳癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、脳癌、血管肉腫、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、マスト細胞腫瘍、原発性肝癌、肺癌、膵臓癌、胃腸癌、腎細胞癌、造血器新生物、およびそれらの転移性癌を含む、いずれかの腫瘍または癌である。
【０１０６】
一実施形態では、本抗原は、当業者に公知である任意の腫瘍抗原であり得る。たとえば、本抗原は、腫瘍Ｔ細胞抗原データベースＴＡＮＴＩＧＥＮ（ｈｔｔｐ：／／ｃｖｃ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔａｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から選択される。
【０１０７】
腫瘍抗原の例として、Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５（１７）：５３２３−３７の表３に記載されているものが挙げられ、限定するものではないが、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、Ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ  融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質（Ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、およびＦｏｓ−関連抗原１が、挙げられる。
【０１０８】
腫瘍抗原のさらなる例として、限定するものではないが、７０７−ＡＰ（７０７  アラニン  プロリン）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＡＲＴ−４（Ｔ細胞により認識される腺癌抗原）、ＢＡＧＥ（Ｂ抗原、β−カテニン／ｍ、βカテニン／変異型）、Ｂｃｒ−ａｂｌ（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｃｌｕｓｔｅｒｒｅｇｉｏｎ−Ａｂｅｌｓｏｎ）、ＣＡ−１２５（癌抗原１２５、細胞腫抗原１２５、または炭水化物抗原１２５、ムチン１６またはＭＵＣ１６としても知られている）、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＰ−１（癌胎児性抗原ペプチド―１）、ＣＡＳＰ−８（カスパーゼ８）、ＣＤＣ２７ｍ（細胞分裂周期２７変異型）、ＣＤＫ４／ｍ（サイクリン依存性キナーゼ４変異型）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＴ（癌／精巣（抗原））、Ｃｙｐ−Ｂ（シクロフィリンＢ）、ＤＡＭ（メラノーマ分化抗原（ＤＡＭ−６およびＤＡＭ−１０のエピトープは等価であるが、遺伝子配列は異なっている。ＤＡＭ−６はＭＡＧＥ−Ｂ２とも呼ばれ、ＤＡＭ−１０はＭＡＧＥ−Ｂ１とも呼ばれている））、ＥＧＦ−Ｒ、ＥＬＦ２Ｍ（伸長因子２変異型）、ＥＴＡ（上皮性腫瘍抗原）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１（Ｅｔｓバリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子  ＥＴＳ）、Ｇ２５０（糖タンパク質２５０）、ＧＡＧＥ（Ｇ抗原）、ＧｎＴ−Ｖ（Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼＶ）、Ｇｐ１００（糖タンパク質  １００ｋＤ）、ＨＡＧＥ（ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃｏｓｅ）抗原）、ＨＥＲ−２ｎｅｕ（ヒト上皮性受容体２／神経性）、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ（ＨＬＡ−Ａ２遺伝子におけるα２ドメインのαヘリックスの残基１７０でのアルギニン（Ｒ）のイソロイシン（Ｉ）への交換）、ＨＰＶ−Ｅ６（ヒトパピローマウイルスＥ６）、ＨＰＶ−Ｅ７（ヒトパピローマウイルスＥ７）、ＨＳＰ７０−２Ｍ（ヒートショックタンパク質７０−２、変異型）、ＨＳＴ−２（ヒト印環腫瘍―２）、ｈＴＥＲＴまたはｈＴＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ｉＣＥ（腸管カルボキシエステラーゼ）、ＫＩＡＡ０２０５（データベースに記載されている遺伝子名）、ＬＡＧＥ（Ｌ抗原）、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（低密度脂質の受容体／ＧＤＰ−Ｌ−フコース：β−Ｄ−ガラクトシダーゼ  ２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ）、ＭＡＧＥ（メラノーマ抗原、限定するものではないが、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ１０を含む）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ（Ｔ細胞−１により認識されるメラノーマ抗原／メラノーマ抗原Ａ）、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ミオシン／ｍ（ミオシン変異型）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＭ−１、２、３（ｍｅｌａｎｏｍａｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ、変異型１、２、４）、ＮＡ８８−Ａ（患者Ｍ８８のＮＡ  ｃＤＮＡクローン）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−ｅｓｏｐｈａｇｅｏｕｓ１）、Ｐ１Ａ、Ｐ１５（タンパク質１５）、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂ（ｌ９０ＫＤ  ｂｃｒ−ａｂｌのタンパク質）、Ｐｍｌ／ＲＡＲα（前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体α）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマの優先的発現抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ（腎抗原）、ＲＵ１またはＲＵ２��ｒｅｎａｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ１または２）、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｒｅｊｅｃｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ１または３）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１（転座  Ｅｔｓファミリー白血病／急性骨髄性白血病１）、ＴＰＩ／ｍ（トリオースリン酸イソメラーゼ  変異型）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１（チロシナーゼ関連タンパク質１、またはｇｐ７５）、ＴＲＰ−２（チロシナーゼ関連タンパク質２）、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２（ＴＲＰ−２／イントロン２）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ腫瘍遺伝子）、ならびにｐ５３の変異性発癌型（ＴＰ５３）、ｐ７３、ｒａｓ、ＢＲＡＦ、ＡＰＣ（大腸ポリポーシス）、ｍｙｃ、ＶＨＬ（フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質）、Ｒｂ−１（網膜芽細胞腫、Ｒｂ−２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１、Ｆｌｔ−３が挙げられる。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明の抗原は、Ｐ１Ａ、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ（限定するものではないが、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ１０を含む）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｍｕｃ−１、ｈＴＥＲＴ、ＴＲＰ−１、ＢＣＲ−ａｂｌ、ならびにｐ５３の発癌型変異体（ＴＰ５３）、ｐ７３、ｒａｓ、ＢＲＡＦ、ＡＰＣ（大腸ポリポーシス）、ｍｙｃ、ＶＨＬ（フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質）、Ｒｂ−１（網膜芽細胞腫）、Ｒｂ−２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１、およびＦｌｔ−３からなる群から選択される。
【０１１０】
本発明では、腫瘍抗原は、上述のいずれかの腫瘍抗原に加えて、癌を得るリスクもしくは癌を発症するリスクに関連している他のいずれかの抗原、またはそのような抗原に対する免疫応答が癌に対して治療上の利益を有し得る他のいずれかの抗原を含む。たとえば、癌抗原として、限定するものではないが、腫瘍抗原、１つ以上の変異したアミノ酸を有する哺乳類細胞分子、哺乳類細胞により出生前または新生児期に正常に発現したタンパク質、疫学的作用物質（たとえばウイルス）の挿入により発現が誘導されるタンパク質、遺伝子転位により発現が誘導されるタンパク質、および制御配列の変異により発現が誘導されるタンパク質が挙げられる。また、これら抗原の一部は、他の種類の疾患（たとえば自己免疫性疾患）の抗原としても作用し得る。
【０１１１】
１．２．１．２．ネオアンチゲン
別の実施形態では、本発明の抗原は、ネオアンチゲンである。
【０１１２】
本明細書中で使用する場合、「ネオアンチゲン」は、過去に免疫系により認識されていなかった、新規に形成された抗原である。ネオアンチゲンおよび広義のネオアンチゲン性決定因子（またはネオエピトープ）は、タンパク質が、生化学経路においてグリコシル化、リン酸化、またはタンパク質分解などのさらなる修飾を受ける場合に形成され得る。
【０１１３】
ネオアンチゲン、腫瘍特異的または「体細胞」変異は、腫瘍から単離したＤＮＡを通常の供給源と比較することにより、同定され得る。
【０１１４】
好ましくは、いずれかの適切な合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）プラットフォームを使用して変異を同定することができる。４つの主な合成時解読プラットフォーム：Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ製のＨｉＳｅｑ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製のＳＯＬｉＤシステム、およびＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムが、現在入手可能である。合成時解読プラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより説明されている。これらプラットフォームの各々を、本発明の方法で使用することができる。
【０１１５】
１．２．１．３．病原体の抗原
本発明の一態様では、本発明の抗原は、病原体（完全体の病原体を含む）由来の抗原である。特定の実施形態では、本抗原は、感染性疾患に関連する（たとえば感染性疾患を引き起こすまたは感染性疾患に寄与している）病原体由来である。
【０１１６】
一実施形態では、本発明の抗原は、感染性疾患の抗原である。
【０１１７】
一実施形態では、感染性疾患病原体由来の抗原として、Ｔ細胞により認識されるエピトープを有する抗原、Ｂ細胞により認識されるエピトープを有する抗原、病原体により独占的に発現される抗原、ならびに病原体および他の細胞により発現される抗原が挙げられる。
【０１１８】
一実施形態では、病原体抗原は、完全体の細胞および病原体生物全体、ならびにそのライセート、抽出物、または他の画分を含む。一部の実施形態では、本抗原は、対象において通常病原性ではないと考えられ得るが、それに対する免疫が望ましい生物またはその一部を含む。
【０１１９】
一実施形態では、抗原は、ワクチンを投与すべき感染性疾患病原体に存在する抗原の実質的に全てを表す１つ、２つ、または複数の抗原を含む。他の実施形態では、同じ病原体の２つ以上の異なる株または異なる病原体の抗原を使用して、ワクチンの治療有効性および／または効率を増大させることができる。
【０１２０】
病原体抗原として、限定するものではないが、細菌、ウイルス、寄生生物、または真菌が発現する抗原が挙げられる。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の病原体抗原は、動物に慢性感染性疾患を引き起こす抗原を含む。一実施形態では、本発明の病原体抗原は、ウイルスの抗原を含む。
【０１２２】
ウイルス抗原の例として、限定するものではないが、免疫不全ウイルスのｅｎｖ、ｇａｇ、ｒｅｖ、ｔａｒ、ｔａｔ、ヌクレオカプシドタンパク質、および逆転写酵素（たとえばＨＩＶ、ＦＩＶ）；ＨＢＶ表面抗原およびコア抗原；ＨＣＶ抗原；インフルエンザのヌクレオカプシドタンパク質；パラインフルエンザのヌクレオカプシドタンパク質；ヒト乳頭腫ウイルス１６型のＥ６およびＥ７タンパク質；エプスタイン・バールウイルスＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、およびＥＢＮＡ−２；ヘルペスＬＡＡおよび糖タンパク質Ｄ、ならびに他のウイルス由来の類似のタンパク質が挙げられる。本発明での使用に特に好ましい抗原として、限定するものではないが、ＨＩＶ−１  ｇａｇ、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ、ＨＩＶ−１  ｔａｔ、ＨＩＶ−１  ｎｅｆ、ＨｂｓＡＧ、ＨｂｃＡｇ、Ｃ型肝炎のコア抗原、ＨＰＶのＥ６およびＥ７、ＨＳＶの糖タンパク質Ｄ、ならびに炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）保護抗原が挙げられる。
【０１２３】
細菌性の抗原の例として、限定するものではないが、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）抗原、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）抗原、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）抗原、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）抗原、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）抗原、レプトスピラ‐バイフレクサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｉｆｌｅｘａ）抗原、マイコプラズマ・ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）抗原、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）抗原、クラミジア・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ａｂｏｒｔｕｓ）抗原、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、および百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ，  ＰＴ）が挙げられる。
【０１２４】
真菌および寄生生物の抗原の例として、限定するものではないが、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の抗原およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）抗原が挙げられる。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の抗原は、望ましくないかまたは有害な免疫応答を抑制することができる。一実施形態では、免疫応答は、アレルゲン、自己免疫抗原、炎症性作用物質、ＧＶＨＤに関与している抗原、特定の癌、肺血性ショックの抗原、および移植の拒絶に関与している抗原により引き起こされる。このような化合物として、限定するものではないが、抗ヒスタミン剤、シクロスポリン、副腎皮質ステロイド、ＦＫ５０６、有害な免疫応答の産生に関与しているＴ細胞受容体に対応するペプチド、Ｆａｓリガンド（すなわち、細胞のＦａｓ受容体の細胞外または細胞質基質のドメインに結合することにより、アポトーシスを誘導する化合物）、寛容化またはアネルギーに影響を与えるように提示される適切なＭＨＣ複合体、Ｔ細胞受容体、ならびに自己免疫抗原が挙げられ、これらは好ましくは、細胞性免疫／体液性免疫を高めるまたは抑制することができる生体応答調節剤と組み合わせられる。
【０１２６】
本発明において有用な他の抗原および抗原の組み合わせは、当業者に明らかである。本発明は、上述の抗原の使用に限定されない。
【０１２７】
１．２．２．エピトープ
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの異種性ペプチドは、本明細書中上述の抗原に由来するエピトープである。よって、一実施形態では、本発明の抗原のフラグメントは、エピトープまたは「抗原エピトープフラグメント」を含む、またはこれからなる。一実施形態では、本発明の抗原のフラグメントは、１超、すなわち少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のエピトープまたは「抗原エピトープフラグメント」を含む、またはこれからなる。
【０１２８】
一実施形態では、本エピトープは、当業者に公知のいずれかのエピトープであり得る。たとえば、本エピトープは、免疫エピトープデータベースおよび分析リソース（Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４０５−１２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）から選択される。
【０１２９】
一実施形態では、本エピトープは、本明細書中上述の非自己抗原または外来性抗原に由来する。別の実施形態では、本エピトープは、宿主のタンパク質に由来する。すなわち本エピトープは、本明細書中上述の自己抗原に由来する。
【０１３０】
別の実施形態では、本エピトープは、本明細書中上述のネオアンチゲンに由来する。すなわち本エピトープは、ネオアンチゲン決定因子である。
【０１３１】
一実施形態では、本エピトープは、コンフォメーションエピトープであり、すなわち、抗原のアミノ酸配列の不連続な区分から構成されている。別の実施形態では、本エピトープは直線状のエピトープ、すなわち、抗原のアミノ酸配列の連続した区分から構成されている。
【０１３２】
１．２．２．１．Ｔ細胞エピトープ
一実施形態では、本エピトープはＴ細胞エピトープである。
【０１３３】
１．２．２．１．１．ＣＤ８Ｔ細胞エピトープ
一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープである。一実施形態では、エピトープは、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープである。
【０１３４】
ＣＤ８Ｔ細胞エピトープの例として、限定するものではないが、オボアルブミン由来のエピトープ（配列番号１１を有する）、Ｐ１Ａ由来のエピトープ（配列番号１３を有する）、ＭＡＲＴ−１由来のエピトープ（配列番号１４を有する）、ｇｐ１００由来のエピトープ（配列番号１５を有する）、チロシナーゼ由来のエピトープ（配列番号１６を有する）、ｇｐ７０由来のエピトープ（配列番号１３３を有する）、およびＴＲＰ２由来のエピトープ（配列番号１３４を有する）が挙げられる。
【０１３５】
１．２．２．１．２．ＣＤ４Ｔ細胞エピトープ
一実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープである。一実施形態では、このエピトープは、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープ（またはヘルパーＴ細胞エピトープ）である。
【０１３６】
ＣＤ４Ｔ細胞エピトープの例として、限定するものではないが、オボアルブミン由来のエピトープ（たとえば配列番号１２を有する）、ｐａｎ  ＨＬＡ  ＤＲ−結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）由来のエピトープ（たとえば配列番号１７を有する）、ＶＩＬ１由来のエピトープ（たとえば配列番号１８を有する）、破傷風トキソイドのエピトープ（ＴＴ）由来のエピトープ（たとえば配列番号１９を有する）、ｇｐ１００由来のエピトープ（たとえば配列番号２０を有する）、ＨＭＧＢ１−由来の免疫刺激性ペプチド  ｈｐ９１由来のエピトープ（たとえば配列番号２１を有する）、およびＮＹ−ＥＳＯ−１由来のエピトープ（たとえば配列番号１４３を有する）が挙げられる。
【０１３７】
ＣＤ４Ｔ細胞エピトープのさらなる例として、Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９７  Ｓｅｐ  １６；  ９４（１９）：  １０３１３−１０３１８に開示されているエピトープが挙げられる。
【０１３８】
特異的なＣＤ４応答を標的とするための制限要因は、ＭＨＣクラスＩＩの遺伝子における多くの多型である。よって、一実施形態では、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープであり得る。本明細書中使用される場合、用語「ユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープ」は、アミノ酸の配列が、少なくとも１つのユニバーサルな抗原性（またはユニバーサルな免疫原性または広範囲の）ＣＤ４Ｔ細胞エピトープ（免疫原性キャリアペプチドとも呼ばれている）に由来しているエピトープを表し、複数の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のハプロタイプにより提示されることにより、ヘルパーＣＤ４Ｔ細胞を活性化させ、次に、Ｂ細胞の増殖および分化を刺激することができる。
【０１３９】
ユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープの例として、ｐａｎＨＬＡ  ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）（たとえば配列番号１７を有する）、天然の破傷風の配列、破傷風トキソイド（ＴＴ）由来のエピトープ（たとえば配列番号１９を有する）またはジフテリアトキソイド（ＤＴ）由来のエピトープ、ＶＩＬ１（たとえば配列番号１８を有する）、ＨＭＧＢ１−由来の免疫刺激性ペプチド  ｈｐ９１（たとえば配列番号２１を有する）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（たとえば配列番号１４３を有する）、ＨＩＶ−１由来のスーパーモチーフペプチド（Ｇａｇ  １７１、Ｇａｇ  ２９４、Ｇａｇ  ２９８、Ｐｏｌ  ３０３、Ｐｏｌ  ３３５、Ｐｏｌ  ５９６、Ｐｏｌ  ７１１、Ｐｏｌ  ７１２、Ｐｏｌ  ７５８、Ｐｏｌ  ９１５、Ｐｏｌ  ９５６）、ならびにヘマグルニチンインフルエンザウイルスタンパク質由来のエピトープが挙げられる。
【０１４０】
別の実施形態では、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープは、外来性のＣＤ４Ｔ細胞エピトープ、すなわちＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示することができる外来性のＴ細胞のエピトープであり得る。
【０１４１】
１．２．２．１．３．腫瘍性エピトープ
一実施形態では、本エピトープは、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導することができる。よって、一実施形態では、本エピトープは腫瘍性エピトープであり、好ましくは、本エピトープは、腫瘍性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたは腫瘍性ＣＤ８Ｔ細胞エピトープである。一実施形態では、腫瘍性Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される腫瘍性Ｔ細胞エピトープである。別の実施形態では、腫瘍性Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される腫瘍性Ｔ細胞エピトープである。
【０１４２】
腫瘍性Ｔ細胞エピトープの例として、Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  １３：１５に記載されるものが挙げられる。これは、限定するものではないが、以下の表２に記載のエピトープを含む。
【表２】
2019531090.tif 000003
【０１４３】
１．２．２．１．４．病原性エピトープ
一実施形態では、本エピトープは、病原性抗原に対する免疫応答を誘導することができる。一実施形態では、本エピトープは、病原性エピトープであり；好ましくは、本エピトープは、病原性Ｔ細胞エピトープであり；より好ましくは、本エピトープは、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたは病原性ＣＤ８Ｔ細胞エピトープである。
【０１４４】
一実施形態では、病原性Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される病原体性Ｔ細胞エピトープである。別の実施形態では、病原性Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される病原性Ｔ細胞エピトープである。一実施形態では、本エピトープは、細菌のＴ細胞エピトープ、ウイルスのＴ細胞エピトープ、寄生生物のＴ細胞エピトープ、または真菌のＴ細胞エピトープである。
【０１４５】
病原体のＴ細胞エピトープの例として、限定するものではないが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリジン  Ｏのタンパク質（たとえば配列番号１４４を有する）、インフルエンザウイルス核タンパク質（たとえば配列番号１４５を有する）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）糖タンパク質（ＧＰ）（たとえば配列番号１４６または１４７を有する）、ならびに免疫優性アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）（たとえば配列番号１４８を有する）が、挙げられる。
【０１４６】
一実施形態では、病原性Ｔ細胞エピトープは、ＨＩＶのＴ細胞エピトープである。ＨＩＶのＴ細胞エピトープの例として、限定するものではないが、Ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．  （２０１７）．  ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ．  ［ｏｎｌｉｎｅ］  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ：  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌおよびＹｕｓｉｍ  Ｋ，  Ｋｏｒｂｅｒ  ＢＴＭ，  Ｂｒａｎｄｅｒ  Ｃ，  Ｂａｒｏｕｃｈ  Ｄ，  Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  Ｒ，  Ｈａｙｎｅｓ  ＢＦ，  Ｋｏｕｐ  Ｒ，  Ｍｏｏｒｅ  ＪＰ，  Ｗａｌｋｅｒ  ＢＤ  ａｎｄ  Ｗａｔｋｉｎｓ  ＤＩ  （Ｅｄｓ．）．  （２０１７）．  ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６．  Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，  Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：  Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓに開示されるものが挙げられる。
【０１４７】
一実施形態では、病原性Ｔ細胞エピトープは、限定するものではないが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、またはＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む、肝炎ウイルスのＴ細胞エピトープである。
【０１４８】
１．２．２．１．長鎖ＣＤ４／ＣＤ８エピトープ
一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのエピトープを含む。
【０１４９】
一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含み、この両方がＭＨＣクラスＩ分子により提示される。一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含む。
【０１５０】
一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含み、この両方がＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される。一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含む。
【０１５１】
好ましい実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含み、このうちの少なくとも１つがＭＨＣクラスＩ分子により提示され、このうちの少なくとも１つがＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される。一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含み、このうちの少なくとも１つがＣＤ４Ｔ細胞エピトープであり、このうちの少なくとも１つがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである。
【０１５２】
少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントの例として、限定するものではないが、ｇｐ１００（配列番号２２を有する）およびＰ１Ａ（配列番号２３を有する）が挙げられる。
【０１５３】
一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、２超のエピトープを含む。一実施形態では、本発明に係る抗原のフラグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のエピトープを含む。
【０１５４】
１．２．２．２．２つ以上のエピトープ／ＶＳＶ−Ｇ
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、１超の異種性ペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、２、３、４、またはそれ以上の異種性ペプチドを含む。一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、異種性ペプチドの組み合わせを含む。
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも２つの異種性ペプチドを含む。好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも２つの抗原のフラグメントを含む。好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも２つのエピトープを含む。一実施形態では、少なくとも２つの異種性ペプチド、好ましくは少なくとも２つの抗原のフラグメントまたは少なくとも２つのエピトープは同一であり、すなわち、同じアミノ酸配列を共有している。別の実施形態では、少なくとも２つの異種性ペプチド、好ましくは少なくとも２つの抗原のフラグメントまたは少なくとも２つのエピトープは異なっており、すなわち、同じアミノ酸配列を共有していない。
【０１５６】
より好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つのＣＤ８Ｔ細胞のエピトープと少なくとも別のエピトープとを含む。より好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つのＣＤ４Ｔ細胞エピトープと少なくとも別のエピトープとを含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つのＣＤ８Ｔ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも２つのＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含み、これは、本明細書中上に定義されるように同一であってもよく、または異なっていてもよい。さらにより好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも２つのＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含み、これは、本明細書中上に定義されるように同一であってもよく、または異なっていてもよい。
【０１５７】
一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つの抗原またはそのエピトープ性のフラグメント、好ましくはエピトープ、および少なくとも１つのＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含む。好ましい実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、少なくとも１つのエピトープ、好ましくはＴ細胞エピトープ、および少なくとも１つのＣＤ４Ｔ細胞エピトープ、好ましくはユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含む。
【０１５８】
１．２．３．長さ
１．２．３．１．全体
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、４〜５０個のアミノ酸長、好ましくは５〜２５個のアミノ酸長、より好ましくは６〜２０個のアミノ酸長、さらにより好ましくは８〜１８個のアミノ酸長を有する。
【０１５９】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、４〜１０個のアミノ酸長、４〜１５個のアミノ酸長、４〜２０個のアミノ酸長、４〜２５個のアミノ酸長、または４〜３０個のアミノ酸長を有する。
【０１６０】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、５〜１０個のアミノ酸長、５〜１５個のアミノ酸長、５〜２０個のアミノ酸長、５〜２５個のアミノ酸長、または５〜３０個のアミノ酸長を有する。
【０１６１】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、６〜１０個のアミノ酸長、６〜１５個のアミノ酸長、６〜２０個のアミノ酸長、６〜２５個のアミノ酸長、または６〜３０個のアミノ酸長を有する。
【０１６２】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、７〜１０個のアミノ酸長、７〜１５個のアミノ酸長、７〜２０個のアミノ酸長、７〜２５個のアミノ酸長、または７〜３０個のアミノ酸長を有する。
【０１６３】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、８〜１０個のアミノ酸長、８〜１５個のアミノ酸長、８〜２０個のアミノ酸長、８〜２５個のアミノ酸長、または８〜３０個のアミノ酸長を有する。
【０１６４】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個のアミノ酸長を有する。
【０１６５】
１．２．３．２．ＣＤ４エピトープの長さ
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、５〜２５個のアミノ酸長、好ましくは８〜２２個のアミノ酸長、より好ましくは１０〜２０個のアミノ酸長、さらにより好ましくは１２〜１８個のアミノ酸長を有する。
【０１６６】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、５〜１０個のアミノ酸長、５〜１５個のアミノ酸長、５〜１８個のアミノ酸長、５〜２０個のアミノ酸長、または５〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１６７】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、６〜１０個のアミノ酸長、６〜１５個のアミノ酸長、６〜１８個のアミノ酸長、６〜２０個のアミノ酸長、または６〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１６８】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、７〜１０個のアミノ酸長、７〜１５個のアミノ酸長、７〜１８個のアミノ酸長、７〜２０個のアミノ酸長、または７〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１６９】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、８〜１０個のアミノ酸長、８〜１５個のアミノ酸長、８〜１８個のアミノ酸長、８〜２０個のアミノ酸長、または８〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１７０】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、９〜１０個のアミノ酸長、９〜１５個のアミノ酸長、９〜１８個のアミノ酸長、９〜２０個のアミノ酸長、または９〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１７１】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、１０〜１５個のアミノ酸長、１０〜１８個のアミノ酸長、１０〜２０個のアミノ酸長、または１０〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１７２】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、１１〜１５個のアミノ酸長、１１〜１８個のアミノ酸長、１１〜２０個のアミノ酸長、または１１〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１７３】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ４Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、１２〜１５個のアミノ酸長、１２〜１８個のアミノ酸長、１２〜２０個のアミノ酸長、または１２〜２５個のアミノ酸長を有する。
【０１７４】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個のアミノ酸長を有する。
【０１７５】
１．２．３．３．ＣＤ８エピトープの長さ
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３〜２０個のアミノ酸長、好ましくは３〜１５個のアミノ酸長、より好ましくは５〜１３個のアミノ酸長、さらにより好ましくは７〜１１個のアミノ酸長を有する。
【０１７６】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３〜９個のアミノ酸長、３〜１１個のアミノ酸長、３〜１５個のアミノ酸長、３〜１８個のアミノ酸長、または３〜２０個のアミノ酸長を有する。
【０１７７】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、４〜９個のアミノ酸長、４〜１１個のアミノ酸長、４〜１５個のアミノ酸長、４〜１８個のアミノ酸長、または４〜２０個のアミノ酸長を有する。
【０１７８】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、５〜９個のアミノ酸長、５〜１１個のアミノ酸長、５〜１５個のアミノ酸長、５〜１８個のアミノ酸長、または５〜２０個のアミノ酸長を有する。
【０１７９】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、６〜９個のアミノ酸長、６〜１１個のアミノ酸長、６〜１５個のアミノ酸長、６〜１８個のアミノ酸長、または６〜２０個のアミノ酸長を有する。
【０１８０】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、７〜９個のアミノ酸長、７〜１１個のアミノ酸長、７〜１５個のアミノ酸長、７〜１８個のアミノ酸長、または７〜２０個のアミノ酸長を有する。
【０１８１】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントがＣＤ８Ｔ細胞エピトープである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のアミノ酸長を有する。
【０１８２】
１．２．３．４．長鎖ＣＤ４／ＣＤ８エピトープ
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、２０〜１００個のアミノ酸長、好ましくは２５〜８０個のアミノ酸長、より好ましくは３０〜６０個のアミノ酸長、さらにより好ましくは３０〜４５個のアミノ酸長、さらにより好ましくは３５〜４０個のアミノ酸長を有する。
【０１８３】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細のエピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、２０〜３５個のアミノ酸長、２０〜４０個のアミノ酸長、２０〜４５個のアミノ酸長、２０〜５０個のアミノ酸長、または２０〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１８４】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、２５〜３５個のアミノ酸長、２５〜４０個のアミノ酸長、２５〜４５個のアミノ酸長、２５〜５０個のアミノ酸長、または２５〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１８５】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３０〜３５個のアミノ酸長、３０〜４０個のアミノ酸長、３０〜４５個のアミノ酸長、３０〜５０個のアミノ酸長、または３０〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１８６】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３１〜３５個のアミノ酸長、３１〜４０個のアミノ酸長、３１〜４５個のアミノ酸長、３１〜５０個のアミノ酸長、または３１〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１８７】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３２〜３５個のアミノ酸長、３２〜４０個のアミノ酸長、３２〜４５個のアミノ酸長、３２〜５０個のアミノ酸長、または３２〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１８８】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３３〜３５個のアミノ酸長、３３〜４０個のアミノ酸長、３３〜４５個のアミノ酸長、３３〜５０個のアミノ酸長、または３３〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１８９】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３４〜３５個のアミノ酸長、３４〜４０個のアミノ酸長、３４〜４５個のアミノ酸長、３４〜５０個のアミノ酸長、または３４〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１９０】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、３５〜４０個のアミノ酸長、３５〜４５個のアミノ酸長、３５〜５０個のアミノ酸長、または３５〜６０個のアミノ酸長を有する。
【０１９１】
別の実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つのＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５個のアミノ酸長を有する。
【０１９２】
一実施形態では、異種性ペプチドまたはそのフラグメントが２つ以上のＴ細胞エピトープを含む抗原のフラグメントである場合、上記２つ以上のＴ細胞エピトープは、本明細書中で「スペーサー」と呼ばれている小さなアミノ酸配列により分離されている。
【０１９３】
一実施形態では、スペーサーは、０〜５０個のアミノ酸、好ましくは２〜２５個のアミノ酸、より好ましくは５〜２０個のアミノ酸、より好ましくは７〜１５個のアミノ酸を含む。
【０１９４】
一実施形態では、スペーサーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のアミノ酸を含む。
【０１９５】
１．３．挿入方法
一実施形態では、本発明のペプチドは、組み換えＤＮＡ法によりＶＳＶ−Ｇの中に挿入されている。本発明の核酸は、当該分野で公知の技術を使用して、当業者によって容易に調製することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９２を参照されたい）。たとえば、改変されたＶＳＶ−Ｇの配列は、人為的な遺伝子合成により得られる。このことにより、配列がより良好に発現されるようにコドン利用を適応させることが可能となる（Ａｎｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  ６（６）：６５０−６５９）。次に最適化した配列を、発現ベクターにサブクローニングする。別の例では、ＶＳＶ−Ｇに挿入されるペプチドをコードする核酸配列を含む合成の核酸配列またはベクターは、具体的には、ＶＳＶ−Ｇをコードするエンドヌクレアーゼで切断される特定の核酸配列、またはＶＳＶ−Ｇ配列にあらかじめ付加された明記されたエンドヌクレアーゼ切断核酸配列に適合する制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計されている。望ましいＶＳＶ−Ｇ挿入部位が１つの固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む場合、ペプチドの核酸配列は、好ましくは、配列の両端に適合させた制限部位を含むように操作されている。このようにして、いかなるＶＳＶ−Ｇコードヌクレオチドも除去することなく、ペプチドをコードする配列をＶＳＶ−Ｇ配列に挿入する。目的のコードされるペプチドを伴うコードされるＶＳＶ−Ｇの正常な発現が達成されるように、挿入されるペプチドをコードする核酸配列を、ＶＳＶ−Ｇ配列のリーディングフレームと適合させるように注意する。改変されたＶＳＶ−Ｇはまた、フラグメントの長さまたは末端の適合性に関わらず、複数のＤＮＡフラグメントをアセンブルすることができるギブソンアセンブリクローニングからもたらされ得る。
【０１９６】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたは抗原フラグメントは、いずれかのＶＳＶ−Ｇ許容性挿入部位、好ましくはＶＳＶ−Ｇ許容性エピトープ挿入部位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。
【０１９７】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、高度可変領域で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。一実施形態では、前記高度可変領域は、様々な株由来のＶＳＶ−Ｇの配列アライメントに基づき定義されている。これらの高度可変領域は、タンパク質の安定性および／または機能に影響を与えることなく、配列の修飾を受けることができる。一実施形態では、前記高度可変領域は、タンパク質の表面に露出する領域である。一実施形態では、前記高度可変領域は、αターン、βターン、γターン、δターン、πターン、ωターンを含む露出したターン、ループ、および／またはヘアピンを構成する領域である。少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントの挿入に適した領域は、たとえばタンパク質の構造予測ソフトウェアおよび／またはループモデリングソフトウェアを使用して、当業者に公知の方法により決定することができる。
【０１９８】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、Ｃ末端の末端、すなわちその配列の最後のアミノ酸残基の後で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている
【０１９９】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号１のアミノ酸残基１〜１９；
領域２：配列番号１のアミノ酸残基４２〜６１；
領域３：配列番号１のアミノ酸残基１８４〜２３３；
領域４：配列番号１のアミノ酸残基２５３〜２６８；
領域５：配列番号１のアミノ酸残基２７０〜２８９；
領域６：配列番号１のアミノ酸残基３６２〜３７２；および
領域７：配列番号１のアミノ酸残基５１１の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）に挿入されている。
【０２００】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号２のアミノ酸残基１〜１９；
領域２：配列番号２のアミノ酸残基４２〜６１；
領域３：配列番号２のアミノ酸残基１８４〜２３３；
領域４：配列番号２のアミノ酸残基２５３〜２７２；
領域５：配列番号２のアミノ酸残基２７４〜２９３；
領域６：配列番号２のアミノ酸残基３６６〜３７６；および
領域７：配列番号２のアミノ酸残基５１７の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号２）に挿入されている。
【０２０１】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号３のアミノ酸残基１〜２４；
領域２：配列番号３のアミノ酸残基４７〜６６；
領域３：配列番号３のアミノ酸残基１８９〜２３７；
領域４：配列番号３のアミノ酸残基２５７〜２７６；
領域５：配列番号３のアミノ酸残基２７８〜２９７；
領域６：配列番号３のアミノ酸残基３７０〜３８１；および
領域７：配列番号３のアミノ酸残基５３０の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号３）に挿入されている。
【０２０２】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号４のアミノ酸残基１〜２０；
領域２：配列番号４のアミノ酸残基４３〜６２；
領域３：配列番号４のアミノ酸残基１８５〜２３４；
領域４：配列番号４のアミノ酸残基２５４〜２６９；
領域５：配列番号４のアミノ酸残基２７１〜２９０；
領域６：配列番号４のアミノ酸残基３６３〜３７３；および
領域７：配列番号４のアミノ酸残基５１２の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、水疱性口内炎球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号４）に挿入されている。
【０２０３】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号５のアミノ酸残基１〜２１；
領域２：配列番号５のアミノ酸残基４４〜６３；
領域３：配列番号５のアミノ酸残基１８６〜２３３；
領域４：配列番号５のアミノ酸残基２５３〜２７２；
領域５：配列番号５のアミノ酸残基２７４〜２９３；
領域６：配列番号５のアミノ酸残基３６６〜３７７；および
領域７：配列番号５のアミノ酸残基５２９の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、ピリ（Ｐｉｒｙ）ウイルス（ＰＩＲＹＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号５）に挿入されている。
【０２０４】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号６のアミノ酸残基１〜２３；
領域２：配列番号６のアミノ酸残基４６〜６５；
領域３：配列番号６のアミノ酸残基１８８〜２３６；
領域４：配列番号６のアミノ酸残基２５６〜２７５；
領域５：配列番号６のアミノ酸残基２７７〜２９６；
領域６：配列番号６のアミノ酸残基３６９〜３８０；および
領域７：配列番号６のアミノ酸残基５２３の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス（ＩＳＦＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号６）に挿入されている。
【０２０５】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号７のアミノ酸残基１〜２０；
領域２：配列番号７のアミノ酸残基４４〜６３；
領域３：配列番号７のアミノ酸残基１８６〜２３５；
領域４：配列番号７のアミノ酸残基２５４〜２７０；
領域５：配列番号７のアミノ酸残基２７２〜２９１；
領域６：配列番号７のアミノ酸残基３６４〜３７４；および
領域７：配列番号７のアミノ酸残基５０９の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、コイ春季ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号７）に挿入されている。
【０２０６】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号５４のアミノ酸残基１〜２０；
領域２：配列番号５４のアミノ酸残基４３〜６２；
領域３：配列番号５４のアミノ酸残基１８５〜２３４；
領域４：配列番号５４のアミノ酸残基２５４〜２６９；
領域５：配列番号５４のアミノ酸残基２７１〜２９０；
領域６：配列番号５４のアミノ酸残基３６３〜３７３；および
領域７：配列番号５４のアミノ酸残基５１１の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、アラゴウイルス（ＶＳＡＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号５４）に挿入されている。
【０２０７】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号５５のアミノ酸残基１〜２４；
領域２：配列番号５５のアミノ酸残基４７〜６６；
領域３：配列番号５５のアミノ酸残基１８９〜２３８；
領域４：配列番号５５のアミノ酸残基２５８〜２７７；
領域５：配列番号５５のアミノ酸残基２７９〜２９８；
領域６：配列番号５５のアミノ酸残基３７１〜３８１；および
領域７：配列番号５５のアミノ酸残基５２３の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、カラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）ウイルス（ＣＪＳＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号５５）に挿入されている。
【０２０８】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、
領域１：配列番号５６のアミノ酸残基１〜１９；
領域２：配列番号５６のアミノ酸残基４２〜６１；
領域３：配列番号５６のアミノ酸残基１８４〜２３３；
領域４：配列番号５６のアミノ酸残基２５３〜２６８；
領域５：配列番号５６のアミノ酸残基２７０〜２８９；
領域６：配列番号５６のアミノ酸残基３６２〜３７２；および
領域７：配列番号５６のアミノ酸残基５１２の後、すなわちＣ末端の末端
からなる群から選択される領域内で、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス（ＭＡＲＡＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号５６）に挿入されている。
【０２０９】
別の実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）、Ｃｏｃａｌウイルス（ＣＯＣＶ）、インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス（ＩＳＦＶ）、ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）、ピリ（Ｐｉｒｙ）ウイルス（ＰＩＲＹＶ）、ソウギョのラブドウイルス、ＢｅＡｎ  １５７５７５ウイルス（ＢｅＡｎ  １５７５７５）、ボテケ（Ｂｏｔｅｋｅ）ウイルス（ＢＴＫＶ）、カルチャキ（Ｃａｌｃｈａｑｕｉ）ウイルス（ＣＱＩＶ）、ウナギウイルスアメリカン（Ｅｅｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）（ＥＶＡ）、グレーロッジ（Ｇｒａｙ  Ｌｏｄｇｅ）ウイルス（ＧＬＯＶ）、ユロナ（Ｊｕｒｏｎａ）ウイルス（ＪＵＲＶ）、クラマス（Ｋｌａｍａｔｈ）ウイルス（ＫＬＡＶ）、クワッタ（Ｋｗａｔｔａ）ウイルス（ＫＷＡＶ）、ラホイヤ（Ｌａ  Ｊｏｙａ）ウイルス（ＬＪＶ）、マルパイススプリング（Ｍａｌｐａｉｓ  Ｓｐｒｉｎｇ）ウイルス（ＭＳＰＶ）、マウントエルゴンコウモリウイルス（ＭＥＢＶ）、ペリネト（Ｐｅｒｉｎｅｔ）ウイルス（ＰＥＲＶ）、パイクフライのラブドウイルス（ＰＦＲＶ）、ポートン（Ｐｏｒｔｏｎ）ウイルス（ＰＯＲＶ）、ラジ（Ｒａｄｉ）ウイルス（ＲＡＤＩＶ）、コイ春季ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣＶ）、ツパイ（Ｔｕｐａｉａ）ウイルス（ＴＵＰＶ）、潰瘍性疾患のラブドウイルス（ＵＤＲＶ）、およびヤグボグダノバク（Ｙｕｇ  Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃ）ウイルス（ＹＢＶ）などのベジクロウイルス属に分類されたまたは暫定的に分類されたウイルス株由来のＶＳＶ−Ｇに挿入されている。少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、当業者により容易に選択される位置に挿入されている。
【０２１０】
本明細書中以下で使用する場合、または他の意味を表さない限り、異種性ペプチドが挿入される位置は、挿入部位の直後のアミノ酸残基により定義されている。言い換えると、挿入位置１８は、アミノ酸残基１７と１８との間の領域に対応している。
【０２１１】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６６位、３６７位、３６８位、３６９位、３７０位、３７１位、３７２位、３７３位、およびＣ末端の末端、ならびにそれらの組み合わせを含むまたはこれからなる群から選択されるＶＳＶ−Ｇのアミノ酸位置で、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）に挿入されている。
【０２１２】
一実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、１８位、５１位、５５位、１９１位、１９６位、２１７位、３６８位、およびＣ末端の末端、ならびにそれらの組み合わせを含むまたはこれからなる群から選択されるＶＳＶ−Ｇのアミノ酸位置で、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）に挿入されている。
【０２１３】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の１８位および／または１９１位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。言い換えると、好ましい実施形態では、異種性ペプチドをコードする核酸配列は、発現し、改変されたＶＳＶ−Ｇが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の１８位および／または１９１位で挿入された異種性ペプチドを含むようにＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列に挿入されている。
【０２１４】
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントは、ＶＳＶ−ＧのＣ末端の末端で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。
【０２１５】
特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の１８位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の５１位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の５５位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の１９１位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の１９６位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の２１７位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１に関してＶＳＶ−Ｇのアミノ酸の３６８位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。特定の実施形態では、１超の異種性ペプチドまたはそのフラグメントが、ＶＳＶ−ＧのＣ末端の末端で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されている。
【０２１６】
少なくとも１つの異種性ペプチドまたはそのフラグメントを挿入できる水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）由来のＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）以外のＶＳＶ−Ｇにおけるアミノ酸の位置を決定するための技術は、当該分野で周知である。
【０２１７】
一実施形態では、複数の異種性ペプチドが、たとえばＶＳＶ−Ｇにおいて１超の部位で、好ましくは２以上の部位で、ＶＳＶ−Ｇに挿入されていてもよい。一実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、同じ異種性ペプチドの複数のコピーを含む。別の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、異なる異種性ペプチドの１つのコピーを含む。さらなる別の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、異なる異種性ペプチドの１つ以上のコピーを含む。
【０２１８】
２．ポリヌクレオチド
本発明の第２の態様は、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチド、または核酸配列に関する。
【０２１９】
「コード配列」または改変されたＶＳＶ−Ｇを「コードする」配列は、発現する際に改変されたＶＳＶ−Ｇの産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわちヌクレオチド配列は、改変されたＶＳＶ−Ｇのアミノ酸配列をコードしている。一実施形態では、コード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）および終止コドンを含む。
【０２２０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、単離されたポリヌクレオチドまたは単離された核酸配列である。
【０２２１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は、当業者に周知である従来の方法によって得ることができる。通常、上記ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、またはウイルスベクターなどの適切なベクターに含まれていてもよい。
【０２２２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡ分子である。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は、ＲＮＡ分子である。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は、ｍＲＮＡ分子である。
【０２２３】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸のコドン使用頻度のバイアスを最適化する。本明細書中使用する場合、用語「コドン使用頻度のバイアス」は、所定の生物、組織、または細胞内のアミノ酸をコードする特定のコドンが高頻度で優先的に使用されること（他の同義のコドンとは対照的）を表す。コドン使用頻度のバイアスは、たとえば同じアミノ酸をコードする他のコドンと比較した、特定の生物、組織、または細胞のゲノムで特定のコドンが使用される比率の定量的測定値として表され得る。コドン使用頻度のバイアスを決定するための様々な方法は、当業者に公知である。一部の実施形態では、コドン使用頻度のバイアスは、ＣＡＩ（Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）法により決定することができ、この方法は、基本的に、既定の組の高度に発現される遺伝子のコドン使用頻度に対する遺伝子のコドン使用頻度の距離の測定である（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ，  １９８７．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：１２８１−９５）。コドン使用バイアスを決定するための代替方法として、ＭＩＬＣ（長さおよび組成の影響を受けない測定）（Ｓｕｐｅｋ  ａｎｄ  Ｖｌａｈｏｖｉｃｅｋ，  ２００５．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ６：１８２）および相対的同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）（観察された特定のコドンの使用頻度を、そのアミノ酸に関してすべての同義コドンが等しく使用される場合に予想される頻度で除算したもの）（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：５１２５−４３）が挙げられる。１に近いＲＳＣＵ値は、特定のコドンに関するバイアスがないことを表しており、１．０から逸脱した値は、コドン利用のバイアスを反映している。
【０２２４】
一実施形態では、１つ以上の選択した異種性ペプチド、好ましくは抗原が樹状細胞の表面に有効量で提示されるように、１つ以上のポリペプチドを、樹状細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで挿入する。「有効量」は、提示が、樹状細胞に免疫応答を誘発することができるために十分であることを意味する。
【０２２５】
核酸の操作に関する技術は周知である。このような技術を適用するために有用な試薬、たとえば制限酵素などは、当該分野で広く公知であり、多くのベンダーから市販されている。
【０２２６】
樹状細胞での提示に望ましい異種性ペプチド、好ましくは抗原をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、高レベルの発現が起こり得る組み換え発現ベクターである。
【０２２７】
一実施形態では、ベクターはまた、選択されたクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子、共刺激分子および他の免疫調節性分子、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２タンパク質を含むＡＢＣトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列も含み得る。一実施形態では、ベクターはまた、挿入した核酸を有する樹状細胞の選択を可能にする少なくとも１つの正のマーカーを含み得る。
【０２２８】
樹状細胞へのトランスフェクション後の目的のポリヌクレオチドの発現は、イムノアッセイまたは生物学アッセイにより確認され得る。たとえば、細胞に導入したポリヌクレオチドの発現は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）もしくはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）などの当該分野で周知のアッセイを使用して、目的の抗原に特異的な標識抗体の細胞への結合を検出することにより、または単純に染色（たとえばβ−ｇａｌを用いる）および細胞数を決定することにより、確認され得る。
【０２２９】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞の増殖の変化の測定、標的細胞の殺滅、四量体染色、リンホカインなどの特定の制御因子の分泌、特定の免疫調節性分子のｍＲＮＡの発現、またはこれらの組み合わせを含む様々な既知の方法により、検出され得る。
【０２３０】
３．ベクター
よって、本発明のさらなる目的は、本発明のポリヌクレオチドが、転写の制御に適切な要素（特にプロモーター、エンハンサー、および任意選択でターミネーター）、ならびに任意選択で翻訳の制御に適切な要素に会合しているベクターまたはプラスミドに関する。
【０２３１】
本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドが挿入されている組み換えベクターに関する。これら組み換えベクターは、たとえば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。
【０２３２】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、宿主を形質転換させ、本発明のポリヌクレオチドの発現（たとえば転写および翻訳）を促進させるために、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できる媒体を意味する。
【０２３３】
本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドを挿入および発現できる限り、動物細胞に関するいずれの発現ベクターを使用してもよい。適切なベクターの例として、限定するものではないが、ｐＶＡＸ２、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１  β  ｄ２−４などが挙げられる。
【０２３４】
プラスミドの他の例として、複製開始点を含む複製プラスミドまたは組み込みプラスミド、たとえばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。
【０２３５】
一実施形態では、本ベクターは、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。たとえば、栄養要求株の補完、毒素−抗毒素システム、オペレーター−リプレッサータイトレーション、ＲＮＡマーカー、または増殖に必須の遺伝子の過剰発現のいずれかに基づき、選択を行う。また、当初のベクターからの抗生物質耐性遺伝子の除去を可能にするミニサークルまたは他のいずれかの方法を使用することができる（Ｖａｎｄｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １９（１１）：１９４２−４９）。
【０２３６】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドワクチン投与に特に最適化されている発現ベクターの中にライゲートされている。エレメントとして、限定するものではないが、転写プロモーター、免疫原性エピトープ、免疫促進性または免疫調節性遺伝子（ユビキチンなど）をコードする追加的なシストロン、それら自身のプロモーター、転写ターミネーター、細菌の複製起源、抗生物質耐性遺伝子または別の選択マーカー、および自然免疫を刺激するＣｐＧ配列が挙げられ、これらすべては当業者に周知である。任意に、本ベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよい。
【０２３７】
一実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を特定の組織の種類に限定するために組織特異的なプロモーターまたはエンハーサーを含む。
【０２３８】
たとえば、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーエレメントは、本ポリヌクレオチドの発現を特定の組織の種類に限定するために、望ましいであろう。筋細胞は、分裂しない最終分化細胞である。染色体に外来性ＤＮＡを組み込むためには、細胞分裂およびタンパク質の合成の両方を必要とすると思われる。よって、筋細胞などの非分裂細胞にタンパク質発現を限定することが、好ましいであろう。
【０２３９】
さらなる例として、ケラチノサイト特異的プロモーター、メラノサイト特異的プロモーター、および真皮乳頭に特異的なプロモーター、たとえばケラチン（皮膚基底層のケラチン５（Ｋ５）およびケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター；皮膚基底上層のケラチン１（Ｋ１）およびケラチン１０（Ｋ１０）プロモーターを含む）、ロリクリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼＩ、Ｅ−カドヘリン、エラスチン、フィラグリン、α１  コラーゲン、コーニフィンβ、ｍＣＣ１０、またはメラノコルチン１受容体（ＭＣＲ１）プロモーターが、挙げられる。
【０２４０】
一実施形態では、組織または細胞に特異的なプロモーターを使用して、改変されたＶＳＶ−Ｇの発現を抗原提示細胞に標的化してもよい。
【０２４１】
他の真核生物転写プロモーターの例として、限定するものではないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが挙げられる。
【０２４２】
適切なベクターとして、真核生物のプロモーターと作動可能に結合している、本発明のポリヌクレオチドをコードするいずれかのプラスミドＤＮＡコンストラクトが挙げられる。このようなベクターの例として、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．）から市販されているｐＣＭＶシリーズの発現ベクター；またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．）によるｐｃＤＮＡもしくはｐＲＥＰシリーズの発現ベクターが挙げられる。
【０２４３】
別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターとして、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびＡＡＶウイルスのベクターが挙げられる。このような組み換えウイルスは、当該分野で公知の技術により、たとえばパッケージング細胞をトランスフェクトすることにより、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いた一時的なトランスフェクションにより、産生させることが可能である。典型的なウイルスパッケージング細胞の例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組み換えウイルスの産生に関する詳細なプロトコルは、たとえば国際特許公開公報第１９９５０１４７８５号、国際特許公開公報第１９９６０２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、および国際特許公開公報第１９９４０１９４７８号で見出すことができる。
【０２４４】
４．宿主細胞／樹状細胞
また、本発明の別の目的は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチドによって遺伝的に形質転換された原核生物または真核生物の宿主細胞である。
【０２４５】
用語「形質転換」は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的に導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質を産生するように、宿主細胞に対する「外来性の」（すなわち外的または細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡ配列（プラスミド、およびウイルスベクターを含む）の導入を意味する。導入したＤＮＡまたはＲＮＡを受け取っておよび発現する宿主細胞は、「形質転換されている」。
【０２４６】
好ましくは、タンパク質、特には本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇを発現および産生させるために、真核生物細胞、特に哺乳類細胞、より具体的にはヒト細胞が、選択される。
【０２４７】
誘導体の正しい翻訳後修飾を処理する能力のため、通常、ＣＨＯ、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＨＥＫ２９３などの細胞株が使用され得る。
【０２４８】
本発明に係る発現ベクターの構築、および宿主細胞の形質転換は、従来の分子生物学の技術を使用して実行することができる。本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇは、たとえば、本発明に係る遺伝的に形質転換した細胞を培養し、上記細胞により発現した誘導体を、培養物から回収することにより、得ることができる。次に、これらを必要に応じて、それ自体が当業者に公知である従来の手法により、たとえば分画沈殿、特に硫酸アンモニウム沈殿、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製してもよい。
【０２４９】
特に、組み換えタンパク質を調製および精製するための従来の方法を、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇを産生させるために使用してもよい。
【０２５０】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクトした樹状細胞、すなわち本発明に係る１つ以上のポリヌクレオチドが挿入されている樹状細胞に関する。
【０２５１】
本発明の別の目的は、本発明に係る核酸配列またはベクターをトランスフェクトした樹状細胞集団である。
【０２５２】
５．組成物
また本発明は、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を含む、これから本質的になる、またはこれからなる組成物に関する。
【０２５３】
本明細書中使用する場合、「から本質的になる」との表現は、それが指す組成物が、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞以外の他のいずれかの活性成分、すなわち生理的または治療上の応答の原因となる成分を全く含まないことを意味する。
【０２５４】
さらに本発明は、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、またはこれから本質的になる、またはこれからなる医薬組成物に関する。本明細書中使用する場合、用語「医薬組成物」は、獣医学用の組成物を含む。
【０２５５】
また本発明は、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を含む、またはこれから本質的になる、またはこれからなる免疫原性組成物に関する。
【０２５６】
６．ワクチン
また本発明は、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含むベクター、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列をコードする核酸配列によって遺伝的に形質転換した宿主細胞、または本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇを含むワクチンに関する。
【０２５７】
一実施形態では、本発明のワクチンは、予防ワクチンである。
【０２５８】
「予防ワクチン」とは、ワクチンが、疾患の決定的な臨床兆候、診断、または同定の前に投与されることを意味する。この実施形態によれば、ワクチンは、疾患を予防するために投与される。
【０２５９】
ワクチンが有効ではあるが免疫応答が短期間であると思われる場合、予防ワクチンをまた、ブースターワクチンとして使用するように設計してもよい。このようなブースターワクチンは、保護期間を延長することを意図して、過去にワクチン接種を受けている個体に提供される。
【０２６０】
別の実施形態では、本ワクチンは、治療用ワクチンであり、すなわち、疾患の最初の臨床兆候、診断、または同定の後に投与される。この実施形態によれば、ワクチンは、疾患を治療するために投与される。
【０２６１】
６．１．ポリヌクレオチドワクチン
一実施形態では、ワクチンはポリヌクレオチドワクチンである。
【０２６２】
ポリヌクレオチドによる免疫は、「遺伝的免疫」、「ＲＮＡ免疫」、または「ＤＮＡ免疫」とも呼ばれる。
【０２６３】
よって、一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチド、または本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする核酸配列を含む。
【０２６４】
一実施形態では、本発明のワクチンは、ＤＮＡベースのワクチンである。よって一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−ＧをコードするＤＮＡ分子を含む。
【０２６５】
別の実施形態では、本発明のワクチンは、ＲＮＡベースのワクチンである。よって一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−ＧをコードするＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を含む。
【０２６６】
一実施形態では、本発明のワクチンは、１超の改変されたＶＳＶ−Ｇを発現する。よって一実施形態では、本発明のワクチンは、２つ以上の改変されたＶＳＶ−Ｇを発現する。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、異なる２つ以上の改変されたＶＳＶ−Ｇを発現する。
【０２６７】
この実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドワクチンは、２つの異なる改変されたＶＳＶ−Ｇをコードする２つのポリヌクレオチドまたは２つの核酸配列を含んでもよい。さらにこの実施形態では、本発明のタンパク質ワクチンは、２つの異なる改変されたＶＳＶ−Ｇを含んでもよい。
【０２６８】
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、第１の改変されたＶＳＶ−Ｇおよび第２の改変されたＶＳＶ−Ｇを発現し、第１の改変されたＶＳＶ−Ｇは、ＣＤ８Ｔ細胞のエピトープを含み、第２の改変されたＶＳＶ−Ｇは、ＣＤ４Ｔ細胞のエピトープを含む。
【０２６９】
本発明はさらに、
（ａ）第１の異種性ペプチドもしくは１超の異種性ペプチドの第１の組み合わせ、またはそれらの核酸配列を含む、第１の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンと、
（ｂ）第２の異種性ペプチドもしくは１超の異種性ペプチドの第２の組み合わせ、またはそれらの核酸配列を含む、第２の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンと
の組み合わせであって、前記第１の異種性ペプチドもしくは１超の異種性ペプチドの組み合わせ、またはそれらの核酸配列と、前記第２の異種性ペプチドもしくは１超の異種性ペプチドの組み合わせ、またはそれらの核酸配列が、異なっている、
組合せに関する。
【０２７０】
一実施形態では、前記第１の異種性ペプチドまたはその核酸配列はＣＤ８Ｔ細胞エピトープであり、前記第２の異種性ペプチドまたはその核酸配列はＣＤ４Ｔ細胞エピトープである。
【０２７１】
一実施形態では、前記第１および／または第２の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンは、ユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたはその核酸配列をさらに含み得る。
【０２７２】
６．２．タンパク質ワクチン
別の実施形態では、本発明のワクチンはタンパク質ワクチンである。よって一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇを含む。別の実施形態では、本発明のワクチンは、２つ以上の改変されたＶＳＶ−Ｇを含む。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、異なる２つ以上の改変されたＶＳＶ−Ｇを含む。
【０２７３】
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、第１の改変されたＶＳＶ−Ｇおよび第２の改変されたＶＳＶ−Ｇを含み、第１の改変されたＶＳＶ−Ｇは、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含み、第２の改変されたＶＳＶ−Ｇは、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含む。
【０２７４】
一実施形態では、本発明のワクチンは、本ペプチドに対する強力かつ長期間持続する免疫応答を誘導するために、プライムブースト戦略で使用する。同じ抗原性構築物の繰り返し注射に基づくプライミングおよびブースティングワクチン接種プロトコルは、周知であり、強力なＣＴＬ反応をもたらす。一般的に、第１の用量は、保護免疫を生じなくてもよく、免疫系を単に「プライミング」する。保護免疫応答は、第２または第３の用量の後に発達する。
【０２７５】
一実施形態では、本発明のワクチンは、同じワクチンを対象に複数回用量で投与する、従来のプライムブースト戦略で使用する。好ましい実施形態では、本ワクチンを、１回以上の接種に使用する。これらのブーストは、従来の技術に従って行われ、投与スケジュール、投与経路、アジュバントの選択、用量、および別のワクチン、治療、または同種のワクチンと共に投与する場合の可能性がある順序の観点から、経験的にさらに最適化することができる。
【０２７６】
別の実施形態では、本発明のワクチンは、異種抗原および自己抗原もしくはそのフラグメントを含む改変されたＶＳＶ−Ｇ、または異種抗原および自己抗原もしくはそのフラグメントを含む改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドの代替の投与を使用するプライムブースト法に使用する。具体的には、本発明では、最初に、対象を、外来起源の抗原またはそのフラグメント（「異種抗原」）をコードするワクチンによって処置するか、またはプライミングする。その後、次に、対象を、異種抗原に対応しているが、自己起源である抗原またはそのフラグメント（「自己抗原」）をコードする別のワクチンによって処置する。このように、抗原に対する免疫応答がブーストされる。ブースティングステップを、１回以上繰り返してもよい。
【０２７７】
６．３．賦形剤
一実施形態では、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体または賦形剤、たとえば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組み合わせなどと共に製剤化されている。一実施形態では、ワクチンはまた、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、アジュバントなどの補助物質を含んでもよい。
【０２７８】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドワクチンに使用するための賦形剤は、陽イオン性ポリマーまたは非イオン性ポリマーなどのポリマー（限定するものではないが、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、直鎖状または分枝状のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む）である。別の実施形態では、ポリマーは、ブロックコポリマー、たとえばＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーを形成することができる。本明細書中で使用する場合、用語「ポリプレックス」は、ポリマー−ポリヌクレオチド、またはコポリマー−ポリヌクレオチド複合体を表す。
【０２７９】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドワクチンは、陽イオン性脂質と共に製剤化されている。任意選択で、脂質を、マンノシル化（ｍａｎｎｏｌｙｓａｔｅ）することができる。本明細書で使用する場合、用語「リポプレックス」は、脂質−ポリヌクレオチドまたはリポソーム−ポリヌクレオチドの複合体を表す。
【０２８０】
一実施形態では、リポプレックスは、ポリマーまたはコポリマーとさらに複合体を形成して三次複合体を形成する。これらの三次複合体は、目的の細胞に対するポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達およびトランスフェクションを増強し、これにより免疫応答を促進する。
【０２８１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドワクチンに使用するための担体は、ナノ粒子である。これらは、限定するものではないが、ナノエマルジョン、デンドリマー、ナノゴールド、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、薬物−担体コンジュゲート、抗体−薬物複合体、および磁性ナノ粒子を含む。
【０２８２】
６．４．アジュバント
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドワクチンは、本発明のポリヌクレオチドワクチンの免疫原性を増大させ得る少なくとも１つのアジュバントと共に製剤化されている。アジュバントを含まないポリヌクレオチドワクチンの投与と比較して、本発明のポリヌクレオチドワクチンの免疫応答を増大し得る入手可能なアジュバントを利用することは、当業者の範囲内にある。
【０２８３】
一部の実施形態では、アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＨＩＶ−１のｇａｇ、皮膚Ｔ細胞誘引性のケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮で発現するケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなり、シグナル配列を欠失させ、任意にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子として、限定するものではないが、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＩＰ−ｌｏｃ、ＭＩＰ−Ｉ  ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−Ｉ、ＶＬＡ−Ｉ、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−Ｉ、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−Ｉ、Ａｐ−Ｉ、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫのリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０のリガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、それらの機能的なフラグメントおよび組み合わせをコードする遺伝子が挙げられる。
【０２８４】
一部の好ましい実施形態では、アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２８、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＩＰ−Ｉａ、ＭＩＰ−Ｉｐ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫのリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０のリガンド、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、それらの機能的なフラグメントおよび組み合わせからなる群から選択される。
【０２８５】
一部の好ましい実施形態では、アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、それらの機能的なフラグメントおよび組み合わせからなる群から選択される。
【０２８６】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドワクチンに使用するためのアジュバントは、たとえばリン酸アルミニウムベースのアジュバントのうちの１つ以上の形態、またはリン酸カルシウムのうちの１つ以上の形態などの、無機質ベースの化合物である。
【０２８７】
別の実施形態では、アジュバントは、サポニン、モノホスホリルリピドＡ、またはポリヌクレオチドワクチンの免疫原性を増大させるために使用できる他の化合物である。
【０２８８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドワクチンは、本発明のポリヌクレオチドワクチンの免疫原性を増大させ得る少なくとも１つの遺伝子アジュバントと共に製剤化されている。アジュバントを含まないポリヌクレオチドワクチンの投与と比較して、本発明のポリヌクレオチドワクチンの免疫応答を増大し得る入手可能な遺伝子アジュバントを利用することは、当業者の範囲内にある。
【０２８９】
本明細書中で使用する場合、遺伝子アジュバントは、プラスミドベクターによりコードされる免疫調節分子を表す。これらは自然免疫系を刺激して、適切な樹状細胞の成熟を引き起こし、これにより、強力で特異的な長期間持続する適応免疫応答をもたらす。免疫調節分子として、サイトカイン、ケモカイン、または免疫刺激分子、たとえば、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストまたはインターフェロン制御因子を含む。
【０２９０】
一実施形態では、遺伝子アジュバントは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされていない。別の実施形態では、遺伝子アジュバントは、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドまたはベクターによりコードされている。この実施形態によれば、遺伝子アジュバントは、自身のプロモーターの制御下であり得るか、または遺伝子アジュバントは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によりそれから隔てられた本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇと同じプロモーターの制御下であり得る。
【０２９１】
一部の実施形態では、遺伝子アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＨＩＶ−１  ｇａｇ、皮膚Ｔ細胞誘引性のケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮で発現するケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなり、シグナル配列を欠失させ、任意にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子として、限定するものではないが、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＩＰ−ｌｏｃ、ＭＩＰ−Ｉ  ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−Ｉ、ＶＬＡ−Ｉ、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−Ｉ、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−Ｉ、Ａｐ−Ｉ、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫのリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０のリガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、それらの機能的なフラグメントおよび組み合わせをコードする遺伝子が挙げられる。
【０２９２】
一部の好ましい実施形態では、遺伝子アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２８、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＩＰ−Ｉａ、ＭＩＰ−Ｉｐ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫのリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０のリガンド、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、それらの機能的なフラグメントおよび組み合わせからなる群から選択される。
【０２９３】
一部の好ましい実施形態では、遺伝子アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、それらの機能的なフラグメントおよび組み合わせからなる群から選択される。
【０２９４】
他のアジュバントの例として、限定するものではないが、ＤＮＡでコーティングまたはＲＮＡでコーティングした金のビーズを使用したパーティクルガン法；サイトカイン、ケモカイン、または共刺激分子を発現するプラスミドＤＮＡとポリヌクレオチドワクチンの同時投与が挙げられる。
【０２９５】
７．使用
本発明のさらなる目的は、疾患もしくは症状の予防もしくは治療に使用するため、または疾患もしくは症状を予防もしくは治療することに使用するための、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンに関する。
【０２９６】
一実施形態では、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンは、癌もしくは感染性疾患の予防もしくは治療に使用するため、または癌もしくは感染性疾患を予防もしくは治療することにするためである。
【０２９７】
特定の実施形態では、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンは、対象における腫瘍の成長の長期間の阻害を提供するために、使用される。
【０２９８】
本発明の一実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクトした樹状細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化する。Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットは、様々なリンパ組織から入手することができる。このような組織の例として、限定するものではないが、脾臓、リンパ節、および末梢血が挙げられる。
【０２９９】
細胞は、混合Ｔ細胞集団としてまたは精製Ｔ細胞のサブセットとして、トランスフェクトした樹状細胞と共培養することができる。たとえば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を早期に除去すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の混合培養におけるＣＤ４＋細胞の過剰増殖を防止し得るため、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原をトランスフェクトした樹状細胞と共に培養することが望ましいであろう。Ｔ細胞の精製は、限定するものではないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、およびＣＤ８に対する抗体の使用を含む、正の選択または負の選択により達成され得る。他方で、細胞傷害性免疫応答およびＴｈ免疫応答の両方を包含する特異的応答を誘発する場合には、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団を使用することが望ましいであろう。
【０３００】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化した後、Ｔ細胞は本発明の樹状細胞により発現される選択された抗原に対する免疫応答を誘導または増強するために十分な用量で投与されてもよい。
【０３０１】
８．投与／用量
一実施形態では、本発明の組成物またはワクチンは、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。
【０３０２】
Ｅｘ  ｖｉｖｏでの投与は、対象の体外で調節ステップの一部を行うこと、たとえば改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、またはワクチンが細胞に負荷される条件下で、対象から採取した細胞、好ましくは樹状細胞集団に本発明の組成物を投与し、細胞を対象に戻すことを表す。
【０３０３】
一実施形態では、本発明の組成物またはワクチンは、任意の適切な投与形式により、対象に投与されてもよく、または対象に戻されてもよい。
【０３０４】
一実施形態では、投与は、全身性、粘膜性、および／または標的部位の位置の近位（たとえば腫瘍近く）で行われる。
【０３０５】
好ましい投与経路は、予防もしくは治療すべき症状の種類、使用する抗原、および／または標的の細胞集団もしくは組織に応じて、当業者に明らかである。
【０３０６】
好ましい投与方法として、限定するものではないが、エレクトロポレーションまたはソノポレーションが挙げられる。エレクトロポレーションによる投与は、細胞に永続的な損傷をもたらすことなく、細胞膜に一時的な孔を作製するためにパルス電場の適用を含む。ソノポレーションによる投与は、細胞に永続的な損傷をもたらすことなく、細胞膜に一時的な孔を作製するためにパルス超音波周波数の適用を含む。これにより、外来の分子の導入が可能となる。電気パルスおよび／超音波周波数を調節することにより、核酸分子は、このプロセスの間に作製された細胞内の通路または孔を通ることができる。
【０３０７】
他の好ましい投与方法として、限定するものではないが、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）投与、冠血管内投与、動脈内投与（たとえば頸動脈内への投与）、皮下投与、皮内投与、経皮送達、腫瘍内投与、腫瘍周囲投与、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（たとえばエアロゾル）、頭蓋内、脊髄内、眼内、耳、鼻腔内、経口、肺投与、カテーテルの含浸、および組織内への直接注射が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、様々な投与経路のうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。
【０３０８】
特に好ましい投与経路として、限定するものではないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、静脈内、腹腔内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、皮内、節内、筋肉内、経皮、吸入（ｉｎｈａｌｅｄ）、鼻腔内、経口、眼内、関節内、頭蓋内、および脊髄内が挙げられる。
【０３０９】
非経口送達として、限定するものではないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、腫瘍内、腫瘍周囲、皮内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、肺内、静脈内、皮下、心房（ａｔｒｉａｌ）カテーテル、および静脈（ｖｅｎａｌ）カテーテルの経路が挙げられる。
【０３１０】
耳への送達として、限定するものではないが、点耳薬が挙げられ、鼻腔内送達として、点鼻薬または鼻腔内注射を挙げることができ、眼内送達として、点眼薬を挙げることができる。
【０３１１】
エアロゾル（吸入）はまた、当該分野で標準的な方法を使用して行うことができる（たとえば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １８９：１１２７７−１１２８１参照）。たとえば、一実施形態では、本発明の組成物またはワクチンは、適切な吸入装置またはネブライザーを使用する噴霧送達に適した組成物へと製剤化することができる。
【０３１２】
経口送達として、限定するものではないが、口を介して摂取することができる固体および液体が挙げられ、酵母媒体を含む組成物は、たとえば錠剤またはカプセルとして経口送達用に容易に調製でき、食品および飲料の中に入れることができることから、これは、粘膜免疫の発達に有用である。
【０３１３】
粘膜免疫を調節する他の投与経路は、ウイルス性感染症、上皮癌、免疫抑制性障害、および上皮領域に影響を与える他の疾患の治療に有用である。このような経路として、気管支、皮内、筋肉内、鼻腔内、他の吸入（ｉｎｈａｌａｔｏｒｙ）、直腸、皮下、局所、経皮、膣、および尿道経路が挙げられる。
【０３１４】
一実施形態では、本組成物またはワクチンは、筋肉内注射、皮内注射、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはｂｉｏｊｅｃｔｏｒにより対象に投与されてもよい。より好ましい実施形態では、本組成物またはワクチンを、エレクトロポレーション、好ましくは筋肉内または皮内へのエレクトロポレーションにより投与する。
【０３１５】
エレクトロポレーションは、パルス電流を使用して細胞膜に孔をあけ（透過処理と呼ばれるプロセス）、注入したポリヌクレオチドを、組織に存在する細胞および免疫細胞により取り込ませる。
【０３１６】
一実施形態では、本ポリヌクレオチドは、リポプレックス（陽イオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体）、ポリプレックス（陽イオン性ポリマー−ＤＮＡ複合体）、またはタンパク質−ＤＮＡ複合体として製剤化されている。
【０３１７】
一実施形態では、本発明の組成物またはワクチンは、症状が現れる前に投与され、すなわち、本発明の組成物またはワクチンは、予防のために投与する。
【０３１８】
一実施形態では、本発明の組成物またはワクチンは、症状が現れた後に投与され、すなわち本発明の組成物またはワクチンは、治療のために投与する。
【０３１９】
本発明によれば、有効な投与プロトコル（すなわち有効な方法での組成物またはワクチンの投与）は、疾患もしくは症状を有する対象または疾患もしくは症状を罹患するリスクのある対象において免疫応答の誘発をもたらし、好ましくはこれにより対象が当該疾患から保護される、適切な用量パラメータおよび投与形式を含む。
【０３２０】
有効な用量パラメータは、特定の疾患に関する分野で標準的な方法を使用して、決定することができる。このような方法として、限定するものではないが、生存率、副作用（すなわち毒性）、および疾患の進行または退行の決定が挙げられる。
【０３２１】
特に、癌を治療する場合の本発明の治療用組成物の用量パラメータの有効性は、奏効率を評価することにより決定することができる。このような奏効率は、部分的または完全な寛解を伴い応答する、患者集団における治療した患者のパーセンテージを表す。寛解は、たとえば、腫瘍の大きさを測定し、または組織試料中の癌細胞の存在に関して顕微鏡によって調べることにより決定することができる。
【０３２２】
本発明によれば、適切な単回用量の大きさは、適切な期間にわたり１回以上投与する場合に、対象に抗原特異的な免疫応答を誘発することができる用量である。用量は、治療する疾患または症状に応じて変化し得る。癌の治療では、たとえば、治療上有効量は、治療する癌が原発性腫瘍であるか、または転移型の癌であるかに応じて変化し得る。当業者は、対象の体格および投与経路に基づき、投与のための予防上または治療上の有効量を容易に決定することができる。
【０３２３】
一実施形態では、本発明の組成物またはワクチンの予防上または治療上有効量は、本組成物またはワクチンを投与する対象の体重１ｋｇあたり約０．５ｐｇ〜約５ｍｇである。好ましい実施形態では、本発明の組成物またはワクチンの予防上または治療上有効量は、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、好ましくは約１μｇ〜約１００μｇ／対象の体重１ｋｇ、好ましくは約１０μｇ〜約７５μｇ／対象の体重１ｋｇ、好ましくは約５０μｇ／対象の体重１ｋｇである。
【０３２４】
対象にＴ細胞または樹状細胞を投与する場合、これらの細胞を、非経口的に（たとえば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、および皮下投与を含む）（アジュバントを伴いまたは伴わずに）投与してもよい。あるいはこれらの細胞を、腫瘍または感染した組織への直接注射により、局所的に投与してもよい。
【０３２５】
アジュバントは、いずれかの公知の薬学的に許容される担体を含む。薬学的な担体として使用するための非経口のビヒクルとして、限定するものではないが、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、および乳酸加リンガー溶液が挙げられる。必要に応じて、抗菌剤などの他の補助剤を添加してもよい。
【０３２６】
例として、Ｔ細胞は、約１０８〜１０９個の細胞／体表面積１ｍ２の用量で、静脈内注入により投与され得る（たとえばＲｉｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２５７：２３８−２４１参照）。注入は、所望の間隔で、たとえば毎月繰り返すことができる。レシピエントを、Ｔ細胞の注入の間および注入の後に、何らかの有害作用のエビデンスに関してモニタリングする。
【０３２７】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、樹状細胞を得た対象と同じ対象から得る。
【０３２８】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、対象から得て、Ｔ細胞を刺激するために使用される樹状細胞は、ＨＬＡの一致する健常なドナー（たとえば兄弟姉妹）から得る、またこの逆もあり得る。
【０３２９】
さらなる別の実施形態では、Ｔ細胞および樹状細胞の両方を、ＨＬＡが一致する健常なドナーから得る。この実施形態は、たとえば対象が、放射線照射および／または化学療法剤ですでに治療されており、十分なまたは有効な樹状細胞またはＴ細胞を提供できない可能性のある後期の癌患者である場合に、特に好適である。
【０３３０】
本発明の別の実施形態では、対象から単離した樹状細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、トランスフェクトし、Ｔ細胞の活性化を含む免疫応答を刺激するために対象に戻すように投与する。よって、樹状細胞は、ワクチンおよび／または免疫治療剤を構成している。
【０３３１】
例として、抗原を提示する樹状細胞を、静脈内注入を介して、たとえば約１０５〜１０８個の細胞の用量で投与する。一実施形態では、抗原を提示する樹状細胞は、投与あたり約０．５×１０６〜約４０×１０７個の樹状細胞、好ましくは投与あたり約１×１０６〜約２０×１０７個の細胞、より好ましくは投与あたり約１０×１０６〜約１×１０７個の樹状細胞の用量で投与する。
【０３３２】
一実施形態では、注入は、対象の免疫応答に基づき望ましい間隔で繰り返すことができる。
【０３３３】
本発明のワクチンを、プライムブースト戦略で使用する場合、ワクチンの「ブースター」は、好ましくは、本ペプチド、好ましくは抗原に対する免疫応答が弱まった場合に投与されるか、または特定のペプチド、好ましくは抗原に対する免疫応答を提供するため、もしくは特定のペプチド、好ましくは抗原に対するメモリー応答を誘導するために必要に応じて投与される。ブースターは、最初の投与から約１週間〜数年後に投与することができる。一実施形態では、投与スケジュールは、対象の体重１ｋｇあたり約０．５ｐｇ〜約５ｍｇのワクチンを、約１ケ月〜約６ケ月の期間にわたり、約１回から約４回投与するスケジュールである。
【０３３４】
対象に投与される投与の数は、疾患の度合いおよび上記対象の治療に対する応答に応じて変化することは、当業者に明らかである。たとえば、大きな腫瘍は、それより小さな腫瘍よりも多くの用量を必要とし得て、慢性疾患は、急性疾患よりも多くの用量を必要とし得る。しかしながら、場合によって、大きな腫瘍を有する対象がそれより小さな腫瘍を有する対象よりも本組成物またはワクチンに対して好ましく応答する場合、大きな腫瘍を有する対象は、それより小さな腫瘍を有する患者よりも少ない用量を必要とし得る。よって、適切な投与の数が、所定の疾患を治療するために必要とされる任意の数を含むことは、当業者の範囲内である。
【０３３５】
９．疾患
９．１．癌
一実施形態では、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンによって予防または治療され得る疾患または症状は、癌である。
【０３３６】
本明細書中で使用する場合、用語「癌」は、限定するものではないが、固形腫瘍および血液由来の腫瘍を含む。用語癌は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液、および血管の疾患を含む。
【０３３７】
一実施形態では、癌は、原発癌である。別の実施形態では、癌は転移癌である。転移癌は、身体の癌の原発性の起点から別の部分に拡散した癌であり、「後期の癌」または「進行期の癌」とも呼ばれている。一部の実施形態では、進行期の癌は、ステージ３および４の癌を含む。癌は、癌の成長の度合いおよび全身への広がりの度合いに応じたステージにランク付けされており；ステージは重症度に対応している。所定の癌のステージを決定することは、医師が治療推奨を作製し、患者に何が起こり得るか（進行）についての可能性のあるアウトカムのシナリオを形成し、他の医師と有効にコミュニケーションを行うために役立つ。
【０３３８】
癌の例として、限定するものではないが、メラノーマ、扁平上皮癌、乳癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、脳癌、血管肉腫、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａｓ）、マスト細胞腫瘍、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃腸癌、腎細胞癌、造血器新生物、およびそれらの転移癌が、挙げられる。
【０３３９】
特定の実施形態では、癌は、メラノーマ、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肺癌、およびその他を含む、またはこれからなる群から選択される。
【０３４０】
好ましくは、癌を有する対象、すなわち動物またはヒトの組織における腫瘍抗原の発現は、癌の軽減、癌に関連する腫瘍の低減、癌に関連する腫瘍の排除、転移性癌の予防、癌の予防、および癌に対するエフェクター細胞の免疫の刺激の群から選択される結果をもたらす。
【０３４１】
９．２．感染性疾患
一実施形態では、本発明に係る改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンで予防または治療され得る疾患または症状は、感染性疾患である。
【０３４２】
一実施形態では、感染性疾患は、ウイルス性感染症、細菌感染症、真菌感染症、および寄生生物感染症からなる群から選択される。
【０３４３】
感染性ウイルスの例として、限定するものではないが、レトロウイルス科（たとえば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、またはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれている；および他の単離物、たとえばＨＩＶ−ＬＰ）；ピコルナウイルス科（たとえばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトのコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株）；トガウイルス科（たとえば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（たとえばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（たとえば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（たとえばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（たとえばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（たとえばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばハンタンウイルス、ブニヤ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（たとえばレオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｒｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（たとえばアフリカ豚コレラウイルス）；ならびに分類されていないウイルス（たとえば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損型のサテライトと考えられている）、非Ａ非Ｂ型肝炎の作用物質（クラス１−内部で伝染する；クラス２−非経口的に伝染する（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連のウイルス、およびアストロウイルス）が挙げられる。
【０３４４】
感染性細菌の例として、限定するものではないが、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａｉ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム属（たとえば結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍ．  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、レンサ球菌（緑色群）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ウシレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、レンサ球菌（嫌気性種）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属菌、エンテロコッカス属菌、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属菌、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｏｍｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｃｏｄａ）、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリホルム（Ｓｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ、およびアクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｅｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）が、挙げられる。
【０３４５】
感染性真菌の例として、限定するものではないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられる。他の感染性生物（すなわち原性生物）として、限定するものではないが、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。
【０３４６】
１０．対象
一実施形態では、対象は、疾患または症状、好ましくは癌または感染性疾患を罹患しやすい、または罹患する疑いがある。
【０３４７】
一実施形態では、対象は、疾患または症状、好ましくは癌または感染性疾患を発症するリスクがある。
【０３４８】
癌を発症するリスクの例として、限定するものではないが、年齢、アルコール、癌を引き起こす物質への曝露、慢性炎症、食事、ホルモン、家族性癌の素因、遺伝性癌の素因、免疫抑制、感染病原体、肥満、放射線への曝露、太陽光への曝露、タバコなどが、挙げられる。
【０３４９】
感染性疾患を発症するリスクの例として、限定するものではないが、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物への曝露（たとえば間接的な接触、昆虫刺咬、または食物汚染による）；特定の種類の癌またはＨＩＶの罹患；ステロイドの摂取；埋め込まれた医療装置；栄養障害；極端な年齢などが挙げられる。
【０３５０】
別の実施形態では、対象は、疾患または症状、好ましくは癌または感染性疾患に罹患している。
【０３５１】
一実施形態では、対象は、当該疾患または症状に関して過去に別の治療を受けていない。
【０３５２】
別の実施形態では、対象は、当該疾患または症状に関する１つ、２つ、またはそれ以上の他の治療を過去に受けている。一実施形態では、対象は、当該疾患または症状に関する１つ以上の他の治療を過去に受けているが、これら治療に対して応答していないかまたは適切に応答しておらず、このことは、これら治療により誘導される治療効果がないかまたは当該治療効果が非常に低いことを意味している。
【０３５３】
一実施形態では、対象は、動物、好ましくはヒトである。
【０３５４】
さらなる実施形態では、上記哺乳類は、飼育動物である。本明細書中で使用する場合、用語「飼育動物」は、飼いならされた（野生とは反対の）状態で生きて繁殖するように飼育されている任意の様々な動物を表す。飼育動物として、限定するものではないが、畜牛（乳牛を含む）、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、および医療の受診を待機している、または医療を受診している、または医療の対象であった／医療の対象である／医療の対象となるであろう他のいずれかの哺乳類、または疾患の発症に関してモニタリングされている他のいずれかの哺乳類が、挙げられる。
【０３５５】
別の実施形態では、上記哺乳類は、霊長類である。本明細書中で使用する場合、用語「霊長類」は、キツネザル、ブッシュベイビー、ロリス、メガネザル、サル、類人猿などの非ヒトの霊長類；およびヒトの霊長類、すなわちヒトを含む。
【０３５６】
一実施形態では、本発明の対象は若年である。本明細書中で使用する場合、用語「若年の」は、対象がヒトである場合、対象が、最大２０歳、最大１５歳、または最大１０歳であることを意味し、または対象が非ヒトの動物である場合には種に準じた同等の年齢を有することを意味する。
【０３５７】
一実施形態では、対象は小児である。本明細書中使用する場合、用語「小児」は、出生から思春期の期間の間のヒト（人間）を表す。「思春期」は、ホルモンの変化により性的特徴および身体的特徴が人間を成熟させる期間を意味する。特定の実施形態では、本発明の小児は、最大１４歳（これを含む）の人間とみなされている
【０３５８】
一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。
【０３５９】
１１．方法
本発明の別の目的は、疾患または症状を予防および／または治療するための方法であって、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンをその必要のある対象に投与することを含む、方法である。
【０３６０】
特定の実施形態では、本発明の方法は、その必要がある対象の癌を予防および／または治療するための方法であって、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを上記対象に投与することを含む、方法である。
【０３６１】
別の実施形態では、本発明の方法は、その必要がある対象の感染性疾患を予防および／または治療するための方法であって、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを上記対象に投与することを含む、方法である。
【０３６２】
一実施形態では、本方法は、症状が現れる前に、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを投与することを含む。この実施形態によれば、本方法は予防のための方法であり得る。
【０３６３】
別の実施形態では、本方法は、最初の症状が現れた後に、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを投与することを含む。この実施形態によれば、本方法は治療のための方法であり得る。
【０３６４】
一実施形態では、本発明の方法は、本方法の有効性を高めるために他の予防上および／または治療上の手法と組み合わせられている。たとえば、癌の治療では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを、対象から腫瘍を外科的に切除した後に、投与してもよい。
【０３６５】
別の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを、別の治療用分子、たとえば化学療法剤、抗血管新生剤、チェックポイント阻害抗体、もしくは免疫抑制を低減する他の分子と組み合わせて投与してもよく、または別の抗腫瘍治療、たとえば放射線療法、ホルモン療法、標的化治療、もしくは免疫治療と組み合わせて投与してもよい。
【０３６６】
特定の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを、抗体と組み合わせて投与する。同時投与され得る抗体の例として、限定するものではないが、抗ＰＤ−１抗体（たとえばニボルマブ、ピディリズマブ、およびＭＫ−３４７５）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、およびＭＰＤＬ３３２８０Ａ）、抗ＣＴＬＡ４抗体（たとえばイピリムマブおよびトレメリムマブ）、抗ＯＸ４０抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、およびそれらの組み合わせが、挙げられる。
【０３６７】
特定の実施形態では、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンを、刺激因子と組み合わせて投与する。同時投与され得る刺激因子の例として、限定するものではないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（たとえばサルグラモスチムまたはモルグラモスチム）が挙げられる。
【０３６８】
本発明の別の目的は、保護免疫応答を対象に誘導するための方法であって、本発明の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、細胞、またはワクチンをその必要がある対象に投与することを含む、方法である。
【０３６９】
一実施形態では、本発明の方法は、癌に対する保護免疫応答を対象に誘導するための方法である。別の実施形態では、本発明の方法は、病原体に対する保護免疫応答を対象に誘導するための方法である。
【０３７０】
１１．１．個別化治療
また本発明は、その必要がある対象（すなわちヒトまたは非ヒトの動物）の疾患または症状、好ましくは癌を治療するための個別化治療であって、本明細書中上述の改変されたＶＳＶ−Ｇ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、またはワクチンを投与することを含む、個別化方法に関する。
【０３７１】
一実施形態では、その必要がある対象の癌を治療するための個別化治療は、
ａ）対象由来の腫瘍の試料を準備するステップと、
ｂ）少なくとも１つのネオアンチゲンを同定するステップと、
ｃ）ＶＳＶ−Ｇに挿入された少なくとも１つのネオアンチゲンを含む組成物を調製するステップと、
ｄ）組成物を対象に投与するステップと
を含む。
【０３７２】
一実施形態では、その必要がある対象の癌を治療するための個別化治療は、
ａ）対象由来の腫瘍の試料を準備するステップと、
ｂ）少なくとも１つのネオアンチゲンを同定するステップと、
ｃ）少なくとも１つのネオアンチゲンをコードするポリヌクレオチドが挿入されている改変されたＶＳＶ−Ｇをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を調製するステップと、
ｄ）上記組成物を対象に投与するステップと
を含む。
【０３７３】
すべての細胞種または組織を利用して、本明細書中記載のシークエンシング法に使用するための核酸試料を得てもよい。好ましい実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡの試料は、対象に由来する腫瘍、または体液、たとえば既知の技術（たとえば静脈穿刺）により得られた血液、唾液、汗、尿、糞便、嘔吐物（ｖｏｍｉｔ）、母乳、および精液の試料から得る。あるいは、乾燥試料（たとえば毛髪または皮膚）について核酸試験を行うことができる。
【０３７４】
ネオアンチゲンを同定するための方法は、当業者に周知である。
【０３７５】
たとえば、対象由来の腫瘍の試料および正常な組織を、全エクソーム解析およびＲＮＡ−Ｓｅｑに供して、発現した非同義の体細胞性変異を同定してもよい。これら変異を、候補抗原のリストに優先順位をつけるためにエピトープ予測アルゴリズム（たとえばＩＥＤＢ、ＥｐｉＢｏｔ、ＥｐｉＴｏｏｌＫｉｔなど）に送ってもよく、および／または、同じ対象の血液または腫瘍から単離した変異体のネオアンチゲン特異的自己Ｔ細胞の同定および拡大のために使用するミニ遺伝子として発現させてもよい。
【０３７６】
好ましくは、いずれかの適切な合成時解読プラットフォームを使用して変異を同定することができる。４つの主な合成時解読プラットフォーム：Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ製のＨｉＳｅｑ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製のＳＯＬｉＤシステム、およびＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムが、現在入手可能である。合成時解読プラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより説明されている。これらのプラットフォームの各々を、本発明の方法で使用することができる。
【０３７７】
個体のＤＮＡまたはＲＮＡの特定の変異またはアレルの存在を検出するための様々な方法が、利用可能である。
【０３７８】
このような方法の例として、限定するものではないが、動的なアレルに特異的なハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、および様々なＤＮＡ「チップ」技術、たとえばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップが、挙げられる。これらの方法は、通常ＰＣＲによる標的遺伝的領域の増幅を必要とする。
【０３７９】
ＰＣＲを必要としない例は、侵襲性の切断後の質量分析、または固定した鋳型プローブ、およびローリングサークル増幅法による小さなシグナル分子の作製に基づく方法を含む。
【０３８０】
あるいは、ＭＨＣクラスＩエピトープ結合性のアルゴリズムによりネオアンチゲンを形成すると予測される発現した変異を確認し、ネオアンチゲンワクチンを作製するために使用してもよい。
【０３８１】
腫瘍特異的なネオアンチゲンをまた、ＭＨＣ多量体を使用して同定し、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞応答を同定してもよい。たとえば、患者の試料におけるネオアンチゲン特異的Ｔ細胞応答のハイスループット解析を、ＭＨＣ四量体ベースのスクリーニング技術を使用して行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０３８２】
【図１】図１は、抗腫瘍活性に関するｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８の予防用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊Ｐ＜０．０１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）
【図２】図２は、抗腫瘍活性に関するＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８の治療用の腫瘍内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）
【図３】図３は、予防用の筋肉内免疫に関する、挿入したエピトープ配列周辺への制限部位の付加の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊Ｐ＜０．０１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）
【図４】図４は、抗腫瘍活性に関するｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４の予防用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）
【図５−１】図５は、抗腫瘍活性に関するｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４の治療用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）および（Ｃ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。（Ｂ）および（Ｄ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。生存曲線は、マンテル・コックス検定で比較した。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（それぞれ、ｎ＝１０およびｎ＝６）。
【図５−２】図５は、抗腫瘍活性に関するｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４の治療用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）および（Ｃ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。（Ｂ）および（Ｄ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。生存曲線は、マンテル・コックス検定で比較した。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（それぞれ、ｎ＝１０およびｎ＝６）。
【図６】図６は、細胞傷害性Ｔ細胞応答に関する、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８とｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４の同時送達の効果を示すグラフである。ＯＶＡ標的細胞殺滅のパーセンテージを比較し、アスタリスクは有意差を表している（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝５）（スチューデントｔ検定）。
【図７】図７は、ｐＴＯＰ１に挿入されたＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープによるＯＴＩＩ増殖アッセイおよび免疫の効果を示すグラフである。細胞分裂のパーセンテージを、スチューデントｔ検定により比較した（＊＊＊ｐ＜０．００１）（ｎ＝５）。
【図８】図８は、ｐＴＯＰ１に挿入されたＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープによるＯＴＩ増殖アッセイおよび免疫の効果を示す一連のグラフである。このグラフは、細胞分裂のパーセンテージを示している。アスタリスクは有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝５）（スチューデントｔ検定）。
【図９】図９は、免疫化チェックポイント阻害（ＩＣＢ）治療と併用したｐＴＯＰ１の治療用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、曲線間の有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【図１０】図１０は、抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１＿ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【図１１】図１１は、抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊Ｐ＜０．０１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【図１２】図１２は、抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果を示すグラフである。これは、チャレンジ後の生存率のモニタリングを表す。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【図１３】図１３は、抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿ＡＨ１Ａ５＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【図１４】図１４は、抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果を示す一連のグラフである。（Ａ）チャレンジ後の腫瘍の成長の経過観察。腫瘍の大きさは、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ（ｍｍ３）として計算した。（Ｂ）チャレンジ後の生存率のモニタリング。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【図１５】図１５は、抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１＿ｇｐ１００＿ＬＰ（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果を示すグラフである。これは、チャレンジ後の生存率のモニタリングを表す。アスタリスクは、未処置のマウスと比較した有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）（ｎ＝６）（生存曲線の比較、マンテル・コックス検定）。
【発明を実施するための形態】
【０３８３】
実施例
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。
【０３８４】
材料および方法
材料
プラスミド
ＶＳＶ−Ｇ（ｐＴＯＰ）、ＶＳＶ−Ｇ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（ｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８）、およびＶＳＶ−Ｇ−ＲＳ（制限部位、ｐＴＯＰ１を有する）のコドン最適化遺伝子配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒを使用して設計し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳ）の標準的な遺伝子合成を使用して得た。これらの配列を、付着末端クローニングを使用してｐＶＡＸ２ベクターにサブクローニングした。ｐＶＡＸ２ベクターは、プロモーターがｐＣＭＶβプラスミドプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）に置換されたｐＶＡＸ１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）からなる。プラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖｅｎｌｏ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を製造元のプロトコルに従って使用して調製した。プラスミドの希釈を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（１×）（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳ）で行った。精製したプラスミドの質を吸光度の比率（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）、および０．５％アガロースゲル電気泳動により評価した。ＤＮＡの濃度を、２６０ｎｍでの吸光度により決定した。プラスミドを、−２０℃で保存した。
【０３８５】
ｐＶＡＸ２にクローニングしたＶＳＶ−Ｇ配列
水疱性口内炎インディアナウイルスの糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号１、配列番号１０によりコードされる）。
プラスミドの命名：ｐＶＡＸ２−ＶＳＶＧ（ｐＴＯＰ）
ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＫＦＴＩＶＦＰＨＮＱＫＧＮＷＫＮＶＰＳＮＹＨＹＣＰＳＳＳＤＬＮＷＨＮＤＬＩＧＴＡＩＱＶＫＭＰＫＳＨＫＡＩＱＡＤＧＷＭＣＨＡＳＫＷＶＴＴＣＤＦＲＷＹＧＰＫＹＩＴＱＳＩＲＳＦＴＰＳＶＥＱＣＫＥＳＩＥＱＴＫＱＧＴＷＬＮＰＧＦＰＰＱＳＣＧＹＡＴＶＴＤＡＥＡＶＩＶＱＶＴＰＨＨＶＬＶＤＥＹＴＧＥＷＶＤＳＱＦＩＮＧＫＣＳＮＹＩＣＰＴＶＨＮＳＴＴＷＨＳＤＹＫＶＫＧＬＣＤＳＮＬＩＳＭＤＩＴＦＦＳＥＤＧＥＬＳＳＬＧＫＥＧＴＧＦＲＳＮＹＦＡＹＥＴＧＧＫＡＣＫＭＱＹＣＫＨＷＧＶＲＬＰＳＧＶＷＦＥＭＡＤＫＤＬＦＡＡＡＲＦＰＥＣＰＥＧＳＳＩＳＡＰＳＱＴＳＶＤＶＳＬＩＱＤＶＥＲＩＬＤＹＳＬＣＱＥＴＷＳＫＩＲＡＧＬＰＩＳＰＶＤＬＳＹＬＡＰＫＮＰＧＴＧＰＡＦＴＩＩＮＧＴＬＫＹＦＥＴＲＹＩＲＶＤＩＡＡＰＩＬＳＲＭＶＧＭＩＳＧＴＴＴＥＲＥＬＷＤＤＷＡＰＹＥＤＶＥＩＧＰＮＧＶＬＲＴＳＳＧＹＫＦＰＬＹＭＩＧＨＧＭＬＤＳＤＬＨＬＳＳＫＡＱＶＦＥＨＰＨＩＱＤＡＡＳＱＬＰＤＤＥＳＬＦＦＧＤＴＧＬＳＫＮＰＩＥＬＶＥＧＷＦＳＳＷＫＳＳＩＡＳＦＦＦＩＩＧＬＩＩＧＬＦＬＶＬＲＶＧＩＨＬＣＩＫＬＫＨＴＫＫＲＱＩＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ
【０３８６】
１９１位でＳＩＩＮＦＥＫＬ配列（ＯＶＡ＿ＣＤ８、配列番号１１）を含むＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）（配列番号８）
プラスミドの命名：ｐＶＡＸ２−ＶＳＶＧ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（ｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８）
【化１】
2019531090.tif 000004
（太字の下線は、ＯＶＡ＿ＣＤ８配列、配列番号１１である）
【０３８７】
１９１位で制限部位（ＲＳ）を含むＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）（配列番号９）
プラスミドの命名：ｐＶＡＸ２−ＶＳＶＧ−ＲＳ（ｐＴＯＰ１）
【化２】
2019531090.tif 000005
（太字の下線は、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位である）
【０３８８】
ｐＴＯＰ１におけるペプチドの挿入
ＶＳＶ−Ｇ（配列番号１）の１９１位でのエピトープをｐＴＯＰ１ベクターに挿入するために、付着末端クローニングを使用した。ｐＶＡＸ２−ＶＳＶＧ−ＲＳを、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用して開環し、２つの相補的で重複するリン酸化オリゴヌクレオチドを組み込んだ。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）またはＩＤＴ−ＤＮＡ（Ｌｅｕｖｅｎ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）から注文したオリゴヌクレオチドの配列を変えることにより、複数のプラスミドを得た。ｐＴＯＰ１の１８位におけるペプチド挿入に関して、ｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメントと共にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．）を、製造元の指示に従って使用した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、１８位でのペプチドの修飾を容易にするために付加した。次にプラスミドを精製し、特徴づけ、本明細書の上記で説明するように保存した。
【表３】
2019531090.tif 000006
【表４】
2019531090.tif 000007
2019531090.tif 000008
コンストラクトのリスト
【表５】
2019531090.tif 000009
2019531090.tif 000010
2019531090.tif 000011
2019531090.tif 000012
【０３８９】
細胞培養
Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ、オボアルブミンを安定して発現するＣ５７ＢＬ／６マウス由来のメラノーマ細胞株を、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含むＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳ）で培養した。
【０３９０】
Ｂ１６Ｆ１０、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のメラノーマ細胞株を、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含むＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳ）培地で培養した。
【０３９１】
ＣＴ２６、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来の結腸癌細胞株を、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含み、Ｌ−グルタミン酸塩およびピルビン酸塩を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳ）で培養した。
【０３９２】
Ｐ８１５、ＤＢＡ／２マウス由来のマスト細胞腫細胞株を、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳ）で培養した。
【０３９３】
動物
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、およびＤＢＡ／２雌性マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ，  ＦＲ）から得て、最小限の疾患研究用施設に収容し、食餌および水を自由に与えた。
【０３９４】
腫瘍の移植およびエレクトロポレーションのため、マウスに、１０ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび１ｍｇ／ｍｌのキシラジン溶液１５０μｌを腹腔内（ｉｐ）注射することにより麻酔をかけた。本出願人らの実験プロトコルは、ルーヴァン・カトリック大学の医療部門の動物のケアおよび使用に関する倫理委員会により承認された（ＵＣＬ／ＭＤ／２０１１／００７およびＵＣＬ／ＭＤ／２０１６／００１）。
【０３９５】
方法
免疫
げっ歯類用のシェーバー（ＡｇｎＴｈｏ’ｓ，  Ｌｉｄｉｎｇｏ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して体毛を除去した後に、ＰＢＳ３０μＬで希釈した、１μｇまたは５０μｇのプラスミドを、左脚の頭側の脛骨筋（ｔｉｂｉａｌ  ｃｒａｎｉａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）に注射した。注射の直後に、この脚を、４ｍｍ間隔のプレート電極（ＢＴＸ  Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）の間に置き、８つの矩形波の電気パルス（８０Ｖ、２０ｍｓ、２Ｈｚ）を、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＢＴＸ；  ｂｏｔｈ  ｆｒｏｍ  ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｌｅｕｖｅｎ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）により送達した。皮膚との電気的接触を確保するために、伝導性のゲルを使用した（Ａｑｕａｓｏｎｉｃ  １００；  Ｐａｒｋｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）。
【０３９６】
予防用ワクチン接種の実験に関して、２回のブースト（すなわち第２および第３のワクチン投与）を、プライミングから２週間後および４週間後に、同様に行った。
【０３９７】
治療用ワクチン接種の実験に関して、治療を、腫瘍細胞の注射から２日後に開始し、２回のブーストを、毎週送達した。
【０３９８】
あるいは、腫瘍の大きさが３０〜５０ｍｍ３の大きさに達した際に、プラスミドを腫瘍に注入し、エレクトロポレーションを行った。次に、この処置を２日後に繰り返した。
【０３９９】
ＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩの増殖試験では、プラスミドを、耳に注射し、２ｍｍ間隔の電極を適用し、１０個の矩形波の電気パルス（１００Ｖ、２０ｍｓ、１Ｈｚ）を送達した。
【０４００】
腫瘍の移植
１００μＬのＰＢＳで希釈した１×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞またはＢ１６Ｆ１０細胞を、各Ｃ５７ＢＬ／６の右側腹部に皮下注射した。
【０４０１】
１００μＬのＰＢＳで希釈した１×１０６個のＣＴ２６細胞を、各ＢＡＬＢ／Ｃの右側腹部に皮下注射した。
【０４０２】
１００μＬのＰＢＳで希釈した１×１０６個のＰ８１５細胞を、各ＤＢＡ／２の右側腹部に皮下注射した。
【０４０３】
腫瘍細胞は、治療用および予防用のＤＮＡ免疫試験に関してそれぞれ、最初のプラスミド投与の２日前、または最後の投与から２週間後に移植した。腫瘍の大きさを、電子工学的なデジタルノギスを用いて１週間に３回測定した。腫瘍の体積を、長さ×幅×高さとして計算した（ｍｍ３）。腫瘍の体積が１５００ｍｍ３に達した際、またはマウスの状態が不良で、まもなく死亡すると予測される場合に、マウスを屠殺した。
【０４０４】
免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）抗体の投与
ＩＣＢの投与のために、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の移植後３日目、６日目、および９日目に、ＰＢＳ２００μｌ中の、１００μｇのＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗マウス  ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）クローン９Ｄ９および１００μｇのＩｎＶｉｖｏＭＡｂ  抗マウス  ＰＤ−１（ＣＤ２７９）クローン２９Ｆ．１Ａ１２（両方ともＢｉｏＸｃｅｌｌ（ＣＴ，  ＵＳ）製）を腹腔内注射によりマウスに投与した。
【０４０５】
ＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩの増殖
Ｔ細胞を、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キットＩＩマウス用（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、トランスジェニックＯＴＩマウスおよびＯＴＩＩマウスの脾臓およびリンパ節から単離した。その後、Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、５０×１０６個の細胞／ｍｌを、５μＭのＣＦＳＥと３７℃で７分間インキュベートすることにより、標識した。この反応を、氷冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）＋１０％の血清を添加することによりブロックした。２×１０６個のＯＴ−１細胞またはＯＴ−ＩＩ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。これらを、プラスミド注射およびエレクトロポレーションにより２日後に処置した。マウスを４日後に屠殺して、単細胞浮遊液調製のため排液リンパ節を収集した。フローサイトメトリーによる測定を、ａｑｕａ  ｌｉｖｅ  ｄｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＣＤ１９  ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｄｅｘｔｒａｍｅｒ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ  Ｈ−２ｋｂ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｄｅｘ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）での染色後に行った。
【０４０６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの殺滅アッセイ
未処置のマウスの脾細胞に、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは無関係のペプチド（４０ｍＬのＰＢＳ中４０μｇ）を、３７℃で１時間パルスした。その後、これらのパルスした脾細胞を洗浄し、高濃度（５μＭ、ｈｉ）または低濃度（０．５μＭ、ｌｏｗ）のＣＦＳＥによってそれぞれ染色した。２つの脾細胞集団を、１：１の比で混合し、１０７個の脾細胞を、免疫したマウスに、最後のブースター免疫から２週間後に静脈内注射した。移入から２日後に、宿主のマウスの脾臓を単離し、自家蛍光マクロファージを排除するためにα−Ｆ４／８０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）によって染色した後、フローサイトメトリーにより解析した。抗原特異的殺滅のパーセンテージを、以下の式を使用して決定した。
【数１】
2019531090.tif 000013
【０４０７】
実施例１：抗腫瘍活性に関するｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果
Ｂ１６メラノーマは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の自然発生的なメラノーマである。最も一般的に使用される多様体はＢ１６Ｆ１０であり、侵襲性が高く、静脈内（ｉｖ）注射を行うと、皮下原発部位から肺に転移すると共に肺に定着する。
【０４０８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミド（１μｇ）によって、２週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。最後のワクチン接種から２週間後に、マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。このＢ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞株は、ニワトリのオボアルブミンを安定して発現するＢ１６Ｆ１０メラノーマ由来の安定したトランスフェクタントである。
【０４０９】
腫瘍の成長およびマウスの生存を、３か月間にわたり評価した。
【０４１０】
Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞の接種は、急速に増殖する腫瘍を誘導し、未処置のマウスを死亡させた。しかしながら、腫瘍モデルのＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる予防用の免疫により、腫瘍の成長が遅延し、マウスの生存が改善した（図１）。
【０４１１】
実施例２：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）の治療用の腫瘍内免疫の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。腫瘍が３０〜５０ｍｍ３に達した際に、マウスを、ｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミド、ｐＴＯＰ対照プラスミド（挿入ペプチドを有さない配列番号１のＶＳＶ−Ｇを発現）、または空のｐＶＡＸ２（ｐＥｍｐｔｙ）プラスミド（それぞれ５０μｇ）を用いて、２日間隔で２回免疫した。
【０４１２】
腫瘍モデルのＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの腫瘍内エレクトロポレーションによる治療用の免疫により、腫瘍の成長が遅延した（図２）。
【０４１３】
実施例３：ワクチンの有効性に関する、挿入したエピトープ配列周辺での制限部位付加の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｐＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドまたはｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミド（それぞれ１μｇ）によって、２週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。最後のワクチン投与から２週間後に、マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。腫瘍の成長およびマウスの生存を評価した。
【０４１４】
ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位の付加は、挿入したエピトープ周辺にアミノ酸ＴＳおよびＥＦを導入する。この結果は、Ｔ細胞のエピトープ周辺にこれらアミノ酸を付加しても、ワクチンの有効性が変化しないことを示した（図３）。
【０４１５】
実施例４：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果
ＶＳＶ−ＧにおけるＣＤ８Ｔ細胞エピトープの挿入は、抗腫瘍の有効性を観察するために必要である。ｐＴＯＰおよびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）の送達後では抗腫瘍効果は認められない。ＯＶＡ＿ＣＤ８細胞およびＯＶＡ＿ＣＤ４Ｔ細胞エピトープをそれぞれ含む２つのｐＴＯＰ１プラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる予防用の免疫により、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）単独と比較して、腫瘍チャレンジに対する保護が改善する。ヘルパーエピトープを、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープと同時送達すると、腫瘍の成長が遅延し、マウスの生存が改善される（図４）。
【０４１６】
実施例５：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。２日後に、マウスを、１μｇのｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）単独、または１μｇのｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）と組み合わせた１μｇのｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）によって、１週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。腫瘍の成長およびマウスの生存を評価した。
【０４１７】
ＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞エピトープをそれぞれ含む２つのｐＴＯＰ１プラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる治療用の免疫により、腫瘍チャレンジに対する保護が改善する。２つの別々の実験を行った。第１に、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）による治療用の免疫は、チャレンジに対する保護を改善する傾向がある（しかしながら、この効果は有意ではない）ことが示された。第２に、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）を組み合わせると、マウスの生存および腫瘍の成長の遅延を顕著に改善した（図５）。
【０４１８】
実施例６：細胞傷害性Ｔ細胞応答に関する、ＴＯＰ−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）とｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）の同時送達の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１μｇのｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドの単独、または１μｇのｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）プラスミドとの組み合わせによって、２週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。抗原特異的殺滅のパーセンテージを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞傷害性アッセイにより分析した。免疫したマウスに、２つの標識脾細胞集団：ＭＨＣ−Ｉ  ＯＶＡペプチドパルス標的細胞およびＭＨＣ−Ｉとは無関係のペプチドパルス細胞集団を養子移入した。移植から２日後に、標的細胞の特異的殺滅を、２つの集団の相対的減少を比較することにより得た。
【０４１９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの殺滅アッセイは、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）の同時送達が、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）単独の送達と比較して、ワクチン抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を改善することを例証した（図６）。
【０４２０】
実施例７：ＯＴ−ＩＩの増殖アッセイ
ＣＤ４＋Ｔ細胞応答に関する、ｐＴＯＰ１に挿入したＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープの免疫の効果を、ＯＴ−ＩＩ細胞を使用して例証した。Ｔ細胞を、トランスジェニックＯＴ−ＩＩマウスの脾臓およびリンパ節から単離し、ＣＦＳＥによって標識し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。２日後に、マウスを、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）１μｇまたはｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）１μｇによって免疫した。マウスを、４日後に屠殺し、標識したＴ細胞の増殖を評価した。
【０４２１】
ＶＳＶ−ＧにおけるＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープの挿入は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導したが、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープは、ヘルパー応答を誘導できない（図７）。
【０４２２】
実施例８：ＯＴ−Ｉ増殖アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関する、ｐＴＯＰ１に挿入したＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープによる免疫の効果を、ＯＴ−Ｉ細胞を使用して例証した。Ｔ細胞を、トランスジェニックＯＴ−Ｉマウスの脾臓およびリンパ節から単離し、ＣＦＳＥによって標識し、レシピエントのＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。２日後に、マウスを、ＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）（１μｇ）またはｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）（１μｇ）のエレクトロポレーションにより免疫した。４日後にマウスを屠殺し、標識したＴ細胞の増殖を評価した。
【０４２３】
ＶＳＶ−ＧにおけるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの挿入は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導したが、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を誘導できない（図８）。
【０４２４】
実施例９：免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）療法と併用したｐＴＯＰ１免疫の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。２日後に、マウスを、１週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。チャレンジ後３日目、６日目、および９日目に、ＩＣＢ治療を行った。マウスに、
（１）ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）（１μｇ）およびｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１９１）（１μｇ）プラスミドの両方
（２）抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体のカクテル［ＩＣＢ群］、または
（３）２つのプラスミド（それぞれ１μｇ）および抗体カクテルの組み合わせ［併用の群］
のいずれかを投与した。
【０４２５】
腫瘍の成長およびマウスの生存を、チャレンジ後に評価した。
【０４２６】
ｐＴＯＰ１の有効性は、免疫チェックポイント阻害療法との組み合わせにより、さらに高められた。これらの結果は、併用治療が、治療単独と比較して相乗効果を有することを例証した。実際に、併用治療後に観察される生存、腫瘍の成長、および腫瘍体積は、別々の治療後に得た効果の合計よりも良好である（図９）。
【０４２７】
実施例１０：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。２日後に、マウスを、１μｇのｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドまたは１μｇのｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）プラスミドによって、１週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。腫瘍の成長およびマウスの生存を評価した。
【０４２８】
ｐＴＯＰ１−ＯＶＡ＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドまたはｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）の筋肉内エレクトロポレーションによる治療用の免疫は、腫瘍の成長を有意に遅らせることができた。２つのワクチンの間に統計学的な差は存在しなかった（図１０）。
【０４２９】
実施例１１：抗腫瘍活性に関するｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果
ＤＢＡ／２マウスを、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）プラスミド（１μｇ）によって、２週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。最後のワクチン接種から２週間後に、マウスに、Ｐ８１５細胞をチャレンジした。腫瘍の成長およびマウスの生存を、２ケ月間評価した。
【０４３０】
Ｐ８１５細胞の接種は、急速に増殖する腫瘍を誘導し、未処置のマウスを死亡させた。しかしながら、腫瘍モデルのＣＤ８Ｔ細胞エピトープおよびユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含むＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる予防用の免疫は、腫瘍の成長を遅らせ、マウスの生存を改善した（図１１）。
【０４３１】
実施例１２：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果
ＤＢＡ／２マウスに、Ｐ８１５細胞をチャレンジした。２日後に、マウスを、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）プラスミド（１μｇ）の１週間後および２週間後に１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。マウスの生存を、２カ月間評価した。
【０４３２】
ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿Ｐ１Ａ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる治療用の免疫は、腫瘍の成長を有意に遅らせることができた（図１２）。
【０４３３】
実施例１３：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿ＡＨ１Ａ５＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿ＡＨ１Ａ５＿ＣＤ８（１９１）プラスミド（１μｇ）によって、２週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。最後のワクチン接種から２週間後に、マウスにＣＴ２６細胞をチャレンジした。腫瘍の成長およびマウスの生存を、２週間評価した。
【０４３４】
ＣＴ２６細胞の接種は、急速に増殖する腫瘍を誘導し、未処置のマウスを死亡させた。しかしながら、腫瘍モデルのＣＤ８Ｔ細胞エピトープおよびユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含むＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる予防用の免疫は、腫瘍の成長を遅らせた（図１３）。
【０４３５】
実施例１４：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）の予防用の筋肉内免疫の効果
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ｐＴＯＰ１−ＰＡＤＲＥ（１８）＿ＴＲＰ２＿ＣＤ８（１９１）プラスミド（１μｇ）によって、２週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。最後のワクチン投与から２週間後に、マウスにＢ１６Ｆ１０細胞をチャレンジした。腫瘍の成長およびマウスの生存を、２カ月間評価した。
【０４３６】
Ｂ１６Ｆ１０細胞の接種は、急速に増殖する腫瘍を誘導し、未処置のマウスを死亡させた。しかしながら、腫瘍モデルのＣＤ８Ｔ細胞エピトープおよびユニバーサルな抗原性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープを含むＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドの筋肉内エレクトロポレーションによる予防用の免疫は、腫瘍の成長を遅らせ、マウスの生存を改善した（図１４）。
【０４３７】
実施例１５：抗腫瘍活性に関する、ｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）およびｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＬＰ（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）の治療用の筋肉内免疫の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ細胞をチャレンジした。２日後に、マウスを、１μｇのｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドまたは１μｇのｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＬＰ（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドによって、１週間間隔での１回のプライムおよび２回のブーストのレジメンで免疫した。腫瘍の成長およびマウスの生存を、評価した。
【０４３８】
ｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＣＤ４（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）プラスミドまたはｐＴＯＰ１−ｇｐ１００＿ＬＰ（１８）＿ＯＶＡ＿ＣＤ８（１９１）の筋肉内エレクトロポレーションによる治療用の免疫は、腫瘍の成長を有意に遅らせることができた。２つのワクチンの間に統計学的な差は存在しなかった（図１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月20日(2019.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019531090000001.app
【国際調査報告】
2019531090.tif 000030