(57)【要約】治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が開示される。医薬組成物は局所投与のために調剤される。これらの医薬組成物を使用してアトピー性皮膚炎を処置する方法がさらに開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物であって、
ａ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子はインビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害し；
ｂ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激し；
ｃ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発し；および
ｄ）グラム陰性菌は、免疫適格性の被験体の皮膚に投与された時に非病原性であり、
ここで医薬組成物は皮膚への局所適用のために調剤される、医薬組成物。
【請求項２】
グラム陰性菌の成長に必要な栄養素をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
クリーム、ゲル、膏薬、発泡体または軟膏として調剤されることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
グラム陰性菌はシュードモナス属を含むことを特徴とする、請求項１−３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項５】
シュードモナス属は緑膿菌であることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項６】
グラム陰性菌はロゼオモナス属を含むことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ロゼオモナス属はロゼオモナス・ミュコーサであることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
グラム陰性菌は、シュードモナス・ルテオラ、シュードモナス・オリジハビタンス、パンテア・セプティカ、およびモラクセラ・オスロエンシスの１つ以上を含むことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
グラム陰性菌は単一の属からであることを特徴とする、請求項１−８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
グラム陰性菌は単一の種であることを特徴とする、請求項１−８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
グラム陰性菌は単一の株であることを特徴とする、請求項４−８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
グラム陰性菌は、健康な被験体の皮膚から精製される、または健康な被験体の皮膚から増殖されることを特徴とする、請求項１−１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
サイトカインはインターロイキン（ＩＬ）−６であることを特徴とする、請求項１−１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒトケラチノサイトを刺激する工程は、ＩＬ−１βをコードするｍＲＮＡ、ディフェンシンベータ４をコードするｍＲＮＡ、Ｃｙｐ２７ｂ１をコードするｍＲＮＡ、および／またはビタミンＤ受容体をコードするｍＲＮＡ、の生成を誘導する工程を含むことを特徴とする、請求項１−１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１−１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む包帯。
【請求項１６】
被験体の皮膚へのあらかじめ決められた用量の組成物の送達のための、請求項１−１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む単位用量ディスペンサー。
【請求項１７】
請求項１−１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を含むスプレーボトル。
【請求項１８】
アトピー性皮膚炎の処置のための、またはアトピー性皮膚炎を有する被験体のマイクロバイオームを変化させるための、請求項１−１４のいずれか１つに記載の医薬組成物、または請求項１５に記載の包帯、請求項１６に記載の単位用量ディスペンサー、または請求項１７に記載のスプレーボトルの使用。
【請求項１９】
アトピー性皮膚炎を処置する方法であって、被験体の皮膚に治療上有効な量の請求項１−１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与する工程であって、それによってアトピー性皮膚炎を処置する工程、を含む方法。
【請求項２０】
アトピー性皮膚炎を有する被験体の皮膚内の微生物叢の相対存在量を変化させる方法であって、被験体の皮膚に治療上有効な量の請求項１−１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与する工程であって、それによって被験体の皮膚内の微生物叢の相対存在量を変化させる工程、を含む方法。
【請求項２１】
被験体はヒトであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験体は免疫無防備状態ではないことを特徴とする、請求項１９−２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
被験体の皮膚は無傷であることを特徴とする、請求項１９−２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
アトピー性皮膚炎を処置するためのキットであって、該キットは：
ａ）治療上有効な量の生菌のグラム陰性菌を含む容器であって、ここで
ｉ）グラム陰性菌、グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子は、インビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害し；
ｉｉ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激し；
ｉｉｉ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発し；および
ｉｖ）グラム陰性菌は、被験体の皮膚に投与された時に非病原性である
容器；
ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む容器；および
ｃ）薬学的に許容可能な担体中の、治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌を皮膚に局所的に適用するための説明書、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本件は、２０１６年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３２４，７６２号の利益を主張し、該仮出願は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、皮膚病学の分野に関し、特にアトピー性皮膚炎を処置するための生菌のグラム陰性菌の局所適用の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アトピー性皮膚炎を記載するためにしばしば使用される用語「湿疹（ｅｃｚｅｍａ）」は古代ギリシャで造語され、そして「沸騰させて除去すること（ｔｏ  ｂｏｉｌ  ｏｕｔ）」としておおざっぱに翻訳された。しかしながら、現代科学は、宿主と環境要因の両方がこの疾患の原因になることを認識している。疾病の特徴には、バリア機能の低下、先天免疫活性の低下、および黄色ブドウ球菌に感染しやすいことが含まれる。素因となる宿主要因は、ＳＴＡＴ３、フィラグリン、およびＡＤ様表現型に関連する他の遺伝子における単一遺伝子変異によって示唆される（Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｙ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ３５，１６１−１８３（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｅｐｕｂ  Ｆｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｉａｃ．２０１４．０９．００８））。宿主の遺伝子的影響は、ステロイド外用薬またはカルシニューリン阻害剤によって治療的に調整され得る（Ｂｏｇｕｎｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｌｅｕｎｇ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３２，５１１−５１２  ｅ５１５（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ａｕｇ（１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１３．０６．０３０））。黄色ブドウ球菌はＡＤ発病の原因となり、および抗生物質によって緩和可能である（Ｂｏｇｕｎｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｌｅｕｎｇ，ｓｕｐｒａ；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２，７５６−７６６）。皮膚マイクロバイオームは、健康な対照とＡＤを伴う患者との間で大幅に異なり、および症状は共生多様性の喪失に関係することが、最近の研究によって明らかになっている（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，８５０−８５９（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｍａｙ（１０．１１０１／ｇｒ．１３１０２９．１１１））。この腸内菌共生バランス失調を治療的に標的とし、およびアトピー性皮膚炎を処置するための方法が依然として求められる。
【発明の概要】
【０００４】
健康な被験体の皮膚由来の培養可能なグラム陰性菌（ＣＧＮ）は、先天免疫の活性化、バリア機能の増強、および黄色ブドウ球菌の制御に関係していたことが、本明細書に開示される。これらのグラム陰性菌は、この疾病を有する被験体のアトピー性皮膚炎を処置するために有用である。
【０００５】
いくつかの実施形態では、治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が開示され、ここでａ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子はインビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する）；ｂ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する；ｃ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する；およびｄ）グラム陰性菌は、被験体の皮膚に投与された時に非病原性である。医薬組成物は局所投与用に調剤される。
【０００６】
これらの医薬組成物を使用して局所的な皮膚炎を処置する方法がさらに開示される。
【０００７】
本発明の前記および他の特徴と利点が、添付の図を参照して行われるいくつかの実施形態についての以下の詳細な説明から、より明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ＣＧＮ単離菌は、健康な志願者とＡＤを有する患者との間で、存在と黄色ブドウ球菌阻害の点で異なる。図１Ａは、ＨＶ（ｎ＝２６）およびＡＤ（ｎ＝１７）の被験体から産出されたＣＧＮ単離菌を有する個体の割合である。多数のＣＧＮ単離菌を有する個体を単離菌ごとに数え、ＨＶでは合計１００％より多かった：詳細については表１を参照。
【図１Ｂ】ＣＧＮ単離菌は、健康な志願者とＡＤを有する患者との間で、存在と黄色ブドウ球菌阻害の点で異なる。ＨＶおよびＡＤ患者から単離された黄色ブドウ球菌の８つの株を、ＣＧＮ上澄みまたは対照培地のいずれかの存在下で育てた。各データポイントは、培地対照と比較した、１つのＣＧＮ単離菌からの上澄みの黄色ブドウ球菌成長に対する効果を表す（ＨＶ単離菌＝９、ＡＤ単離菌＝７）。形は、参加者の自己由来の黄色ブドウ球菌、またはＨＶまたはＡＤ患者からの１つの黄色ブドウ球菌の単離菌のいずれかである、黄色ブドウ球菌の供給源を表す。＊シンボルのあるデータポイントは、続くヒトチャレンジおよびマウスモデル実験のために選択された、１つのＨＶ由来および１つのＡＤ由来のＣＧＮ単離菌を表す。データは代替的にＣＧＮ種によって提示される、図４を参照。示されたデータは、３つ以上の独立した実験の組み合わせであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。ＳＡ＝黄色ブドウ球菌、ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、Ｐａ＝緑膿菌。有意性はスチューデントのｔ検定（Ｂ）によって判定された。
【図１Ｃ】ＣＧＮ単離菌は、健康な志願者とＡＤを有する患者との間で、存在と黄色ブドウ球菌阻害の点で異なる。健康なマウスの耳に、１０日間、ＨＶまたはＡＤ患者からの黄色ブドウ球菌（株ＳＡＡＳ９）およびＲ．ミュコーサ（Ｒｍ）、またはＨＶからの緑膿菌を共接種した。１２日目に耳をホモジナイズし、および階段希釈によってＣＦＵごとに平板培養した。成長ｖｓ希釈（ＣＧＮ未添加）対照の増減率を示す。示されたデータは、２つの独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。ＳＡ＝黄色ブドウ球菌、ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、Ｐａ＝緑膿菌。有意性はボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された。
【図１Ｄ】ＣＧＮ単離菌は、健康な志願者とＡＤを有する患者との間で、存在と黄色ブドウ球菌阻害の点で異なる。図１Ｄは、図１Ｃと同じマウスから採取されたＣＧＮ  ＣＦＵ産出物である。示されたデータは、２つの独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。ＳＡ＝黄色ブドウ球菌、ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、Ｐａ＝緑膿菌。有意性はボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された。
【図２Ａ】ＨＶ由来のＣＧＮは先天免疫およびバリア機能を高める。図２Ａは、健康な対照に対するインビボでのヒト水疱チャレンジに関するサイトカイン分析であり、食塩水の対照ウェル（点線）と比較した、健康な対照由来のＲ．ミュコーサの代表的な株と、ＡＤを伴う患者から単離されたものに対するサイトカイン応答を示す、Ｎ＝７。示されたデータは、７つの独立した実験の組み合わせであり、および平均と個々の参加者として示される。ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、ＦＬＧ＝フィラグリン、ＩＬ−＝インターロイキン、ＴＥＷＬ＝経皮水分損失。ボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された希釈対照からの有意性（またはその示唆）。
【図２Ｂ】ＨＶ由来のＣＧＮは先天免疫およびバリア機能を高める。図２Ｂは、図２Ａに示されるデータのペア分析であり、同じヒト被験体において、ＨＶ供給Ｒ．ミュコーサに接触させた水疱ウェルでのサイトカイン生成は、ＡＤ供給Ｒ．ミュコーサに十分に接触させた水泡でのサイトカイン生成よりも少ないことを示している。示されたデータは、７つの独立した実験の組み合わせであり、および平均と個々の参加者として示される。ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、ＦＬＧ＝フィラグリン、ＩＬ−＝インターロイキン、ＴＥＷＬ＝経皮水分損失。ボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された希釈対照からの有意性（またはその示唆）。
【図２Ｃ】ＨＶ由来のＣＧＮは先天免疫およびバリア機能を高める。マウスの耳に、ＨＶまたはＡＤのいずれか由来の１ｅ７ＣＦＵ  Ｒ．ミュコーサを３日間毎日、接種した。５日目の、ＧＡＰＤＨに標準化されたＩＬ−１βおよびフィラグリンごとのｍＲＮＡの存在量、および未処置マウスとの比較が示される。各群につきＮ＝４−５のマウス。示されたデータは、２つ以上の独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、ＦＬＧ＝フィラグリン、ＩＬ−＝インターロイキン、ＴＥＷＬ＝経皮水分損失。ボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された希釈対照からの有意性（またはその示唆）。
【図２Ｄ】ＨＶ由来のＣＧＮは先天免疫およびバリア機能を高める。０日目に、マウスの背中を剃り、および毛を化学的に除去した。次にＴＥＷＬを、ＨＶまたはＡＤのいずれか由来の１ｅ７  ＣＦＵ  Ｒ．ミュコーサの毎日の適用後に測定した。各群につきＮ＝４−５のマウス。示されたデータは、２つ以上の独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。ＨＶ＝健康な志願者、ＡＤ＝アトピー性皮膚炎、ＣＧＮ＝培養可能なグラム陰性菌、Ｒｍ＝ロゼオモナス・ミュコーサ、ＦＬＧ＝フィラグリン、ＩＬ−＝インターロイキン、ＴＥＷＬ＝経皮水分損失。ボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された希釈対照からの有意性（またはその示唆）。
【図３Ａ】ＨＶ由来のＣＧＮは、ＡＤ様皮膚炎のＭＣ９０３マウスモデルにおける結果を改善する。ＭＣ９０３適用に先立ち２日間、マウスの両方の耳に毎日、ＨＶまたはＡＤ患者由来のＲ．ミュコーサ（Ｒｍ）、またはＨＶからの緑膿菌（Ｐａ）、または黄色ブドウ球菌のＳＡＡＳ９株を接種した。次に、１３日間毎日、細菌をＭＣ９０３と共に適用した。１４日目の各耳の厚みが示される；各群につきＮ＝４−８のマウス。
【図３Ｂ】ＨＶ由来のＣＧＮは、ＡＤ様皮膚炎のＭＣ９０３マウスモデルにおける結果を改善する。ＭＣ９０３適用に先立ち２日間、マウスの両方の耳に毎日、ＨＶまたはＡＤ患者由来のＲ．ミュコーサ（Ｒｍ）、またはＨＶからの緑膿菌（Ｐａ）、または黄色ブドウ球菌のＳＡＡＳ９株を接種させた。次に、１３日間毎日、細菌をＭＣ９０３と共に適用した。１４日目の血清の全ＩｇＥレベルが示される；各群につきＮ＝４−８のマウス。
【図３Ｃ】ＨＶ由来のＣＧＮは、ＡＤ様皮膚炎のＭＣ９０３マウスモデルにおける結果を改善する。ＡＤ様皮膚炎を誘発するために、１４日間マウスをＭＣ９０３で処置した。１３日目から、ＨＶまたはＡＤ患者由来の１ｅ６ＣＦＵ  の生きたＲ．ミュコーサ（ＨＶＣＧＮおよびＡＤＣＧＮ）、３ｅ６ＣＦＵの自己由来Ｒ．ミュコーサからの上澄みで再懸濁された同じＨＶからの死んでいる１ｅ６ＣＦＵのＲ．ミュコーサ（死んだ混合物）、または１ｅ７ＣＦＵのＨＶ  Ｒ．ミュコーサからの上澄み（Ｓｕｐ）で、マウスを３日間毎日処置した。２１日目における、目に見える赤み（Ｄ）および耳の厚み（Ｃ）が示される；各群につきＮ＝３−５のマウス。示されたデータは、３つの独立した実験の代表的なものであり、平均＋平均値の標準誤差として示される。有意性はＡＮＯＶＡによって判定された。
【図３Ｄ】ＨＶ由来のＣＧＮは、ＡＤ様皮膚炎のＭＣ９０３マウスモデルにおける結果を改善する。ＡＤ様皮膚炎を誘発するために、１４日間マウスをＭＣ９０３で処置した。１３日目から、ＨＶまたはＡＤ患者由来の１ｅ６  ＣＦＵ  の生きたＲ．ミュコーサ（ＨＶＣＧＮおよびＡＤＣＧＮ）、３ｅ６  ＣＦＵの自己由来Ｒ．ミュコーサからの上澄みで再懸濁された同じＨＶからの死んでいる１ｅ６  ＣＦＵのＲ．ミュコーサ（死んだ混合物）、または１ｅ７  ＣＦＵのＨＶ  Ｒ．ミュコーサからの上澄み（Ｓｕｐ）で、マウスを３日間毎日処置した。２１日目における、目に見える赤み（Ｄ）および耳の厚み（Ｃ）が示される；各群につきＮ＝３−５のマウス。示されたデータは、３つの独立した実験の代表的なものであり、平均＋平均値の標準誤差として示される。有意性はＡＮＯＶＡによって判定された。
【図４】図１Ｂからのデータの種分析。ＨＶおよびＡＤ患者から単離された８つの黄色ブドウ球菌株を、ＣＧＮ上澄みまたは対照培地のいずれかの存在下において育てた。各データポイントは、培地対照（ＨＶ単離菌＝９、ＡＤ単離菌＝７）と比較し、１つのＣＧＮ単離菌からの上澄みの黄色ブドウ球菌成長に対する効果を表す。Ｒ．ミュコーサ単離菌間の有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。
【図５Ａ】吸引水疱プロトコル。３Ｄ印刷された水疱誘発デバイスの画像。
【図５Ｂ】吸引水疱プロトコル。吸引の２時間後の水疱結果。
【図５Ｃ】吸引水疱プロトコル。裸にされた水疱領域に置かれたチャレンジチャンバー、単離菌はピペットによって各チャレンジキャップの中心に入れられた。
【図６Ａ】サイトカインおよび抗菌性ペプチドの反応に対するＣＧＮの影響。インビボでのヒト水疱チャレンジ（補助的方法を参照）に関するサイトカイン分析、Ｎ＝５。示されたデータは５つの独立した実験の組み合わせであり、および平均と個々の参加者（Ａ）として示される。
【図６Ｂ】サイトカインおよび抗菌性ペプチドの反応に対するＣＧＮの影響。インビボでのヒト水疱チャレンジ（補助的方法を参照）に関する抗菌性ペプチド、Ｎ＝５。示されたデータは５つの独立した実験の組み合わせであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。
【図７Ａ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図７Ｂ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図７Ｃ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図７Ｄ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図７Ｅ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図７Ｆ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図７Ｇ】ＣＧＮは初代ヒトケラチノサイトを刺激する。初代ヒト包皮ケラチノサイトを培養して集密させた。１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌をウェルごとに加えた。２４時間後にｍＲＮＡをＫＣから採取し、およびＰＣＲによって分析した。データは３つの独立した実験を代表するものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示され、個々のドットは別個の単離菌で培養されたＫＣを表す。有意性はスチューデントのｔ検定によって判定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＞０．０１。
【図８Ａ】ＨＶ−Ｒ．ミュコーサによって生成された脂質は、黄色ブドウ球菌の成長を阻害する。図１Ｂで行なわれるように、黄色ブドウ球菌（株ＵＳＡ３００）阻害を評価する前に、Ｒ．ミュコーサおよび緑膿菌からの上澄みに硫安塩析を行なった。データは３つの独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。有意性はボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された。＊＝ｐ＜０．０５。
【図８Ｂ】ＨＶ−Ｒ．ミュコーサによって生成された脂質は、黄色ブドウ球菌の成長を阻害する。３つの黄色ブドウ球菌の単離菌を、図１Ｂで評価された阻害（対希釈（０））を有するリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはカルディオリピンの存在下または欠如下で培養した。データは３つの独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。有意性はボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された。＊＝ｐ＜０．０５。
【図８Ｃ】ＨＶ−Ｒ．ミュコーサによって生成された脂質は、黄色ブドウ球菌の成長を阻害する。ヒト包皮ケラチノサイトを、ＬＰＣの存在下または欠如下で培養し、および評価した。データは３つの独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。有意性はボンフェローニ補正を用いたＡＮＯＶＡによって判定された。＊＝ｐ＜０．０５。
【図９】ＭＣ９０３チャレンジ中に、ＣＧＮはマウスのフィラグリン反応に影響を与える。示されるように、マウスはグラム陰性単離菌の接種と共にＭＣ９０３処置を受けた。１４日目にｍＲＮＡを耳から採取し、およびＰＣＲで分析した。示されたデータは３つの独立した実験の代表的なものであり、および平均＋平均値の標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡによって算出された、ＭＣ９０３との有意差が示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
健康な対照由来の共生生物は、アトピー性皮膚炎を伴う患者から採取された同一の種と比較して、免疫活性、バリア機能、および抗菌プロフィールの点で異なっていることが、本明細書に開示される。したがって、アトピー性皮膚炎を伴う患者を処置するための生きたバイオ治療（ｌｉｖｅ−ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）アプローチが提供される。
【００１０】
アトピー性皮膚炎の処置に使用することができる、局所投与のために調剤された医薬組成物が本明細書に開示される。これらの医薬組成物は、治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌および薬学的に許容可能な担体を含み、ここでａ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子はインビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する；ｂ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する；ｃ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する；およびｄ）グラム陰性菌は、被験体の皮膚に投与された時に非病原性である。特定の非限定的な例では、グラム陰性菌はリゾホスファチジルコリンを産出する。
【００１１】
グラム陰性菌はいかなる種からでもよい。したがって、特定の例では、グラム陰性菌がシュードモナス属である場合、グラム陰性菌は緑膿菌、シュードモナス・ルテオラ（ｌｕｔｅｏｌａ）またはシュードモナス・オリジハビタンス（ｏｒｂｙｈａｂｉｔａｎｓ）であり得る。他の例では、グラム陰性菌がパンテア属である場合、グラム陰性菌はパンテア・セプティカ（ｓｅｐｔｉｃａ）であり得る。さらなる例では、グラム陰性菌がモラクセラ属である場合、グラム陰性菌はモラクセラ・オスロエンシスであり得る。さらなる例では、グラム陰性菌がロゼオモナス属である場合、グラム陰性菌はロゼオモナス・ミュコーサであり得る。医薬組成物に含まれるグラム陰性菌は、単一の株、単一の種または単一の属からであり得る。代替的に、グラム陰性菌の株、種および／または属の組み合わせを、開示された方法において使用することができる。
【００１２】
＜用語＞
分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），“Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，”ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見つけることができる。
【００１３】
本開示の様々な実施形態の論評を促すために、以下に特定の用語の説明が提供される。
【００１４】
アトピー性皮膚炎：皮膚を冒す慢性疾患。アトピー性皮膚炎では、皮膚が非常にかゆくなる。ひっかくことによって、赤み、腫れ、ひび割れ、透明液の滲出がもたらされ、および最終的にはかさぶたができてはがれる。ほとんどの場合、増悪の期間に続いて寛解の期間がある。どれほどの人がアトピー性皮膚炎に冒されているかを正確に特定するのは難しいが、乳児と幼児の推定２０％は該疾患の症状を経験する。これらの幼児のおよそ６０％は、成年期にアトピー性皮膚炎の１つ以上の症状を有し続ける。したがって、アメリカでは１５００万人以上が、該疾患の症状を有している。「病変領域」はアトピー性皮膚炎に冒された皮膚の領域である。一般的に、病変は皮膚の乾燥（乾皮症）、赤み、水疱、痂皮、または任意の組み合わせに特徴づけられる。非病変領域は、アトピー性皮膚炎または他のいかなる皮膚病状にも冒されていない。
【００１５】
動物：生きている多細胞の脊椎生物、例えば哺乳動物と鳥を含むカテゴリー。哺乳動物の用語は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」はヒトおよび動物の被験体の両方を含む。
【００１６】
抗生物質：細菌、真菌または他の任意の微生物を殺す、または実質的にそれらの成長を遅らせる化合物または物質。「抗菌性」とは、細菌を殺す、または実質的にその成長を遅らせる化合物または物質である。抗菌性抗生物質は通常、その作用機序、化学構造、または作用スペクトルに基づいて分類される。大部分は細菌の機能または成長プロセスを標的とする。細菌の細胞壁を標的とするもの（例えばペニシリンとセファロスポリン）、または細胞膜を標的とするもの（例えばポリミキシン）、または必須の細菌酵素を標的とするもの（例えばキノロンとスルホンアミド）は、殺菌性である。タンパク質合成を標的とするもの（例えばアミノグリコシド、マクロライドおよびテトラサイクリン）は、一般的に静菌性である。さらなる分類はそれらの標的特異性に基づく。
【００１７】
「狭域」の抗菌性抗生物質は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの特定の種類の細菌を標的とする。「広域抗生物質」は多数の異なる種類の細菌に影響を与える。抗菌剤には、環状リポペプチド（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン（チゲサイクリンなど）、およびオキサゾリジノン（リネゾリドなど）がさらに含まれる。
【００１８】
局所用抗生物質は、皮膚または目などの体表面に適用される抗生物質である。局所用抗生物質は、しばしば軟膏またはクリームとして調剤され、およびマクロライド系抗生物質（エリスロマイシンなど）、サルファ剤抗生物質（スルファセタミドなど）、環状ペプチド（バシトラシン、ポリミキシンなど）、プソイドモン酸（ムピロシンなど）、アミノグリコシド（ネオマイシンなど）、またはキノロン（シプロフロキサシンまたはオフロキサシンなど）などの活性薬剤、ニトロイミダゾール（メトロニダゾールなど）、または薬物の組み合わせ（バシトラシン／ポリミキシンまたはネオマイシン／ポリミキシンＢ／バシトラシン）を含む。
【００１９】
共生：生物が同じ環境で生きることができ、および他方に影響（有害または有益のいずれか）を与えずに一方が他方から恩恵を受けることができる場合、生物は共生である。皮膚微生物叢の細菌は、ヒトなどの宿主と共生すると考えられる。皮膚微生物叢に存在する共生菌の種の数は、例えば存在する細菌種を特定するために１６ＳリボソームＲＮＡを使用して、検出することができる。
【００２０】
上皮細胞：皮膚などの上皮を形成する、密集して詰まった細胞。上皮にはいくつかの種類があり、単層扁平上皮、単層立方上皮、単層円柱上皮、偽重層上皮、重層扁平（非角化）上皮、重層立方上皮、および移行上皮が含まれる。
【００２１】
グラム陰性菌：複数の外側細胞膜、内側細胞膜、薄いペプチドグリカン層、およびリポ多糖（ＬＰＳ）を含む外膜を有する細菌。ポリンは外膜に存在し、およびグラム陰性菌は、細菌の識別のためのグラム染色法で使用されるクリスタルバイオレット染色に染まらない。外膜と細胞質部分の間に、ペリプラスムで満たされた空間がある。Ｓ層は、外膜に直接付属する。テイコイル酸またはリポタイコ酸は存在しない。ほとんどのグラム陰性菌（しかし全てでない）は胞子を形成しない。典型的なグラム陰性菌は、例えばＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＮＤＯＴＯＸＩＮＳ，１：１８７−２１４，ｅｄｓ．Ｒ．Ｐｒｏｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）に報告されたように、限定されないが、ヒトにおける敗血症および敗血症性ショックに最も一般的に関連するものを含む。ＨＳＰ６０（ＧｒｏＥＬ）タンパク質中のＣＳＩ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｎｄｅｌ）は、グラム陰性菌のすべての従来の門（例えばプロテオバクテリア門、アクウィフェクス門、クラミジア門、バクテロイデス門、クロロビウム門、シアノバクテリア門、フィブロバクター門、ウェルコミクロビウム門、プランクトミケス門、スピロヘータ門、およびアシドバクテリウム門）を識別する。グラム陰性菌は、限定されないが、大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス属の種、シュードモナス属、サルモネラ菌およびロゼオモナス属の種を含む。ＣＧＮは、皮膚に見られるグラム陰性菌である。「構成分子」は、グラム陰性菌に存在する、またはグラム陰性菌によって分泌される分子を意味する。したがって、構成分子は可溶化液または上澄みに存在し得る。特定の非限定的な例では、上澄みに含まれるものなどのグラム陰性菌の構成分子は、インビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する。
【００２２】
グラム陽性菌：細菌の鑑別のためのグラム染色法においてクリスタルバイオレット染色に染まる細菌。これらの細菌は、その膜内のＬＰＳ分子に対し重量で勝るペプチドグリカンに特徴付けられ、グラム陰性種に関して記載されたものと類似の、細菌感染に特徴的な疾患病因および症状を誘発し得る。
【００２３】
異種：別個の遺伝子源または種から始まること。異種のポリペプチドは、異なる細胞または組織の種類、または受容者とは異なる種からのものであり、および通常はそのポリペプチドを発現しない細胞へとクローン化される。
【００２４】
宿主細胞：ベクターの増殖、およびそのＤＮＡ発現が可能な細胞。細胞は原核生物または真核生物のものでもよい。細胞はヒト細胞などの哺乳動物のものであり得る。該用語はさらに、被験体の宿主細胞の子孫を含む。複製中に変異が起こり得るため、全ての子孫が親の細胞と同一ではないかもしれないことが理解される。しかしながら、用語「宿主細胞」が使用される場合、そのような子孫が包含される。
【００２５】
マイクロバイオーム：人体内および人体上で生きている微生物群の遺伝物質であって、持続可能かつ一時的であり、真核生物、古細菌、細菌、およびウイルス（細菌ウイルス［すなわちファージ］を含む）を含み、ここで「遺伝物質」には、ゲノムＤＮＡ、ミクロＲＮＡおよびリボソームＲＮＡなどのＲＮＡ、エピゲノム、プラスミド、および他の全ての種類の遺伝子情報が含まれる。
【００２６】
免疫適格性：体液性（Ｂ細胞）免疫不全、Ｔ細胞欠損症または補体欠損症などの免疫不全のないヒトなどの被験体。免疫適格性の被験体は、細菌感染に対して免疫反応をしかけることができる。「免疫適格」は、抗原または細菌にさらされた後に正常な免疫反応を生み出すための体の能力である。
【００２７】
単離された、または精製された：グラム陰性菌などの「単離された」または「精製された」細胞は、細菌などの細胞が生じる環境中の他の細胞または種から分離または精製されている。したがって用語「単離された」は、単一細胞クローン化および培養などの標準的な精製法によって精製された細菌を含む。該用語はさらに、組み換え法によって調製された、または自然発生源から単離された細菌を包含する。単離（または精製）されたグラム陰性菌は一般的に、グラム陽性菌などの他の細菌から取り出される。単離されたグラム陰性菌は単一の属、種、および／または株であり得る。本明細書で使用されるように用語「実質的に精製された」は、細菌の属、種、株または複数の菌株の混合物（例えばグラム陰性菌）を指し、それはサンプル内で実質的に増殖させられ、そうすると他の種類の細菌（例えばグラム陽性菌）は激減させられる。サンプルは、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはより多くの望ましい細菌の属、種、株であり、または約３０％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはより少ない望ましくないまたは他の細菌の属、種または株であるように、菌株または対象株の混合物用に実質的に精製され、または増殖され得る。
【００２８】
疾患の阻害または処置：アトピー性皮膚炎などの疾患の阻害は、疾患の全発症を阻害することを指す。いくつかの例では、疾患の阻害は、症状の低減または病変サイズの減少を指す。「処置」は、皮膚の赤み、腫れ、ひび割れ、透明液の「滲出」、および最終的にかさぶたができてはがれることなどの、疾患の徴候または症状を改善する治療的介入を指す。
【００２９】
インターロイキン（ＩＬ）−６：炎症促進性のサイトカインおよび抗炎症性のマイオカインとして作用するＩＬ。ＩＬ−６は、リガンド結合ＩＬ−６Ｒα鎖（ＣＤ１２６）、およびシグナル伝達要素ｇｐ１３０（ＣＤ１３０とも呼ばれる）から成る細胞表面Ｉ型サイトカイン受容体の複合体を介してシグナルを送る。ＣＤ１３０は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子、オンコスタチンＭ、ＩＬ−１１およびカルジオトロフィン−１を含むいくつかのサイトカインに関する一般的なシグナル伝達者であり、およびほとんどの組織にほぼ遍在して発現する。対照的に、ＣＤ１２６の発現は特定の組織に限定される。ＩＬ−６がその受容体と相互に作用するように、それはｇｐ１３０とＩＬ−６Ｒタンパク質による複合体の形成を引き起こし、したがって受容体を活性化させる。典型的なアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの受け入れ番号Ｎｏ．Ｐ０５２３１（ヒト）およびＰ０８５０５（マウス）、および（対応するタンパク質配列と共に）ＩＬ−６をコードする典型的なｍＲＮＡ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受け入れ番号Ｎｏ．ＮＭ＿０００６００．４（ヒト）、２０１６年１月５日、およびＮＭ＿０３１１６８．２（マウス）、２０１５年１０月２６日に提供され、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
哺乳動物：この用語は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」はヒトおよび動物の被験体の両方を含む。
【００３１】
核酸：一本鎖または二本鎖のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体であり、および他で限定されない限り、自然に生じるヌクレオチドに類似の方法で核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む。
【００３２】
製薬剤：被験体に適切に投与された時に望ましい治療的または予防的効果を誘発することができる、グラム陰性菌などの細菌、化合物、核酸分子、または組成物。一実施形態では、製薬剤はグラム陰性菌である。
【００３３】
薬学的に許容可能な担体：本発明に有用である薬学的に許容可能な担体はありふれたものである。“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）には、本明細書に開示されるグラム陰性菌の薬剤送達に適した組成物と処方が記載されている。
【００３４】
一般的に、担体の性質は、使用される投与の特定の方法に依存する。例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性のブドウ糖、またはグリセリンなどの薬学的および生理的に許容可能な流体を賦形剤として含む注射可能な流体を含む。固形組成物（例えば粉剤、丸剤、錠剤、またはカプセル形状）の場合、従来の非毒性の固形担体として、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムの医薬品グレードをあげることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝薬などの軽微な量の非毒性の補助剤、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含み得る。許容可能な担体はさらに、局所投与用などのクリーム剤および軟膏剤を含む。
【００３５】
シュードモナス属：１９１の記載された種を含むシュードモナダセエ科に属する、グラム陰性で好気性のガンマプロテオバクテリア綱の属。属の構成員は、かなりの程度の代謝の多様性を実証し、従って広範囲の生態的地位をコロニー化することができる。この属の構成員は１６ＳリボソームＲＮＡ分析を使用して判定することができる。一般的に、属の構成員は、１つ以上の極性の鞭毛を有する桿菌の好気性の芽胞非形成であり、および陽性のオキシダーゼおよびカタラーゼのテストを示す。
【００３６】
ロゼオモナス属：プロテオバクテリア門およびアセトバクター科に割り当てられた、好気性でグラム陰性の桿菌の細菌の属。特定の非限定的な例では、細菌は、細菌からの１６Ｓ  ｒＲＮＡの核酸配列を評価することによって、ロゼオモナス属に属すると判定され得る。ロゼオモナス属は、種に応じて、丸々とした球菌、球桿菌、または短桿菌として現われ得る。ほとんどの株は、マッコンキー寒天培地上で成長し、および成長は２５℃と３０℃と３５℃、およびその間の温度で起こる。ほとんどの株はさらに、４２℃で成長する。薄いピンクの成長色素が生成される；“ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ（登録商標）ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，”Ｖｏｌｕｍｅ  Ｔｗｏ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｅｒｉａ，Ｐａｒｔ  ３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，２０１６年７月２５日、８８−８９頁を参照されたい、Ｇｏｏｇｌｅ  ｂｏｏｋｓよりオンラインで利用可能。
【００３７】
治療上の有効量：アトピー性皮膚炎を処置するのに十分な用量。一実施形態では、治療上の有効量は、病変サイズの減少に十分なグラム陰性菌の量である。
【００３８】
局所適用：局所的に適用される薬剤は、体全体ではなく特定の領域にのみ適用される。特定の例では、組成物は病変内などの皮膚に適用される。例えば、医薬組成物は医薬品製剤中で病変に適用することができる。
【００３９】
形質導入された：形質導入された細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書において使用されるように、形質導入という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入し得る全ての技術を含み、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、および電気穿孔とリポフェクションと粒子銃加速による裸のＤＮＡの導入、を含む。
【００４０】
ベクター：宿主細胞に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を生み出す核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはさらに、１つ以上の選択可能な標識遺伝子、および当技術分野において既知の他の遺伝要素を含み得る。ベクターは、グラム陰性およびグラム陽性の菌細胞における発現のためのプラスミドを含む、プラスミドベクターを含む。典型的なベクターには、グラム陰性菌における発現のためのものがあげられる。
【００４１】
別段の説明のない限り、本明細書で使用される技術的かつ科学的な用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者によって通常、理解されるのと同じ意味を有する。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明らかに示されない限り、複数の指示物を含んでいる。同様に、単語「または（ｏｒ）」は、文脈により明らかに示されない限り、「および（ａｎｄ）」を含むように意図される。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、全ての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、および全ての分子量または分子量の数値は、おおよその数値であり、および説明のために提供されることが、さらに理解される。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書において言及される全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む特許明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定を意図したものではない。
【００４２】
＜グラム陰性菌＞
単離されたまたは実質的に精製されたグラム陰性菌、および無傷のヒト皮膚由来のグラム陰性菌またはそのようなグラム陰性菌から増殖したグラム陰性菌の組み合わせ、を含む医薬組成物が提供される。これらのグラム陰性菌は、健康な微生物叢の機能を有意義に提供する、またはアトピー性皮膚炎を有する被験体に投与された時に固有のマイクロバイオームに対する増強を触媒する能力がある。特に、アトピー性皮膚炎の症状を処置する、予防する、遅らせる、または低減する組成物が提供される。
【００４３】
これらの組成物は、皮膚の病理学的な疾病を有さない健康な被験体などの、アトピー性皮膚炎のない被験体から単離されたグラム陰性菌を含み得る。いくつかの実施形態では、被験体は病理学的な疾病、例えば皮膚および／または内臓の病理学的な疾病、を有さない。被験体は免疫適格性で有り得る。グラム陰性菌は、被験体の皮膚から直接単離することができ、または細菌の培養のための標準的な技術を用いてインビトロで増殖させることができる。しかしながら、以下に論じられるように、グラム陰性菌は他の供給源から得ることができる。グラム陰性菌は、プロテオバクテリア、スピロヘータ科、腸内細菌、多形性紡錘菌、またはＳｅｌｅｎｏｍａｏｎａｄａｌｅｓであり得る。グラム陰性菌は、双球菌、球桿菌、球菌、または桿菌であり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、単離されたまたは実質的に精製された生菌のグラム陰性菌および薬学的に許容可能な担体を含む、局所投与のために調剤された組成物が開示され、ａ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子は、インビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する；ｂ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する；ｃ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する；およびｄ）グラム陰性菌は、免疫適格性の被験体の皮膚に投与された時に非病原性である。「構成分子」は、グラム陰性菌に存在する、またはグラム陰性菌によって分泌される分子を意味する。特定の非限定的な例では、グラム陰性菌によって分泌された分子を含む上澄みは、インビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する。
【００４５】
本明細書で提供されるのは、特定の属、種、株、および株または種の組み合わせであって、健康な被験体などのアトピー性皮膚炎を伴わない被験体のヒト皮膚微生物叢内で元々は発見されたものである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、これらの種／株は、インビトロアッセイで皮膚病原体の複製速度を大幅に減じることができる。これらの種／株は、そのような病原菌の成長、複製および発病度に影響を与える安全かつ効果的な手段を提供することができる。いくつかの実施形態では、細菌組成物は、病原性の細菌を排除する能力を備えている。
【００４７】
典型的な細菌組成物は黄色ブドウ球菌などの特定の病原体の成長速度を減じることが、実証されている。皮膚内の黄色ブドウ球菌を永続的に減じる能力を備えたグラム陰性菌は、ヒト微生物叢内の構成要素に関する生態的防除因子（ＥＣＦ）を推定するための方法を使用して特定することができる。ＥＣＦは、インビトロアッセイを使用して、所与の共生株または株の組み合わせの、所与の病原体（例えば黄色ブドウ球菌）に対する拮抗活性を評価することにより判定され、加えられた共生株の様々な濃度における生態的防除の観測レベルをもたらす。共生株または株の組み合わせに関するＥＣＦは、抗生物質の評価に使用される長期にわたる最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）評価に多少類似している。ＥＣＦは、共生株および株の組み合わせが皮膚病原体に拮抗する能力に関する、相対的な潜在能力の評価とランキングを可能にする。共生株または株の組み合わせのＥＣＦは、インビトロアッセイにおける標的病原体（例えば黄色ブドウ球菌）の所与の阻害率（例えば少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）を仲介することができる組成物の濃度を評価することで、算出することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する。グラム陰性菌は、インビボおよび／またはインビトロでケラチノサイトを刺激し得る。グラム陰性菌は、ＩＬ−１βをコードするｍＲＮＡ、ディフェンシンベータ４をコードするｍＲＮＡ、Ｃｙｐ２７ｂ１をコードするｍＲＮＡ、ビタミンＤ受容体をコードするｍＲＮＡ、オクルディンをコードするｍＲＮＡ、クローディン１をコードするｍＲＮＡ、および／またはフィラグリンをコードするｍＲＮＡの産生などの、免疫媒介物または上皮性関門機能に含まれる分子のｍＲＮＡの転写を高めることにより、ケラチノサイトを刺激する。
【００４９】
さらなる実施形態では、グラム陰性菌は、ヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する。ヒト細胞には、限定されないが、繊維芽細胞およびケラチノサイトなどの皮膚の細胞が含まれる。サイトカインには、限定されないが、ＩＬ−６およびＩＬ−１βなどのインターロイキン（ＩＬ）が含まれる。
【００５０】
さらに他の実施形態では、グラム陰性菌はリゾホスファチジルコリンを産出する。
【００５１】
さらなる実施形態では、グラム陰性菌は、免疫適格性の被験体などの被験体の皮膚に投与された時に、非病原性である。一般的に、グラム陰性菌は、無傷のヒト皮膚に投与された時、いかなる感染も引き起こさない。したがって、処置後には何の病因も観察されない。
【００５２】
本開示の組成物に含まれる生菌のグラム陰性菌は、任意の属であり得る。いくつかの実施形態では、グラム陰性菌はシュードモナス属である。さらなる実施形態では、グラム陰性菌はパンテア属またはモラクセラ属である。他の実施形態では、グラム陰性菌はロゼオモナス属である。
【００５３】
単一の属のみからの細菌を医薬組成物に含んでもよい。代替的に、属の組み合わせを医薬組成物に含んでもよく、本開示の方法に有用である。したがって組成物は、例えば１、２、３、４、または５属のグラム陰性菌を含み得る。１つの特定の非制限的な例では、組成物は、生菌のロゼオモナス属を含む。別の特定の非制限的な例では、組成物は生菌のシュードモナス属を含む。さらに別の特定の非制限的な例では、組成物は生菌のロゼオモナス属および生菌のシュードモナス属を含む。
【００５４】
生菌のグラム陰性菌はいかなる種からでもよい。したがって、特定の例では、グラム陰性菌がシュードモナス属である場合、グラム陰性菌は緑膿菌、シュードモナス・ルテオラ（ｌｕｔｅｏｌａ）またはシュードモナス・オリジハビタンス（ｏｒｂｙｈａｂｉｔａｎｓ）であり得る。他の例では、グラム陰性菌がパンテア属である場合、グラム陰性菌はパンテア・セプティカ（ｓｅｐｔｉｃａ）であり得る。さらなる例では、グラム陰性菌がモラクセラ属である場合、グラム陰性菌はモラクセラ・オスロエンシスであり得る。さらなる例では、グラム陰性菌がロゼオモナス属である場合、グラム陰性菌はロゼオモナス・エリラタ（ａｅｒｉｌａｔａ）、ロゼオモナス・エロフィラ（ａｅｒｏｐｈｉｌａ）、ロゼオモナス・エスツアリイ（ａｅｓｔｕａｒｉｉ）、ロゼオモナス・アルカリテラアエ（ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ）、ロゼオモナス・アクアティク（ａｑｕａｔｉｃ）、ロゼオモナス・サービカリス（ｃｅｒｖｉｃａｌｉｓ）、ロゼオモナス・ファウリアエ（ｆａｕｒｉａｅ）、ロゼオモナス・フリジダクエ（ｆｒｉｇｉｄａｑｕａｅ）、ロゼオモナス・ジラーディイ、ロゼオモナス・ラクス、ロゼオモナス・ルディプエリティアエ（ｌｕｄｉｐｕｅｒｉｔｉａｅ）、ロゼオモナス・ミュコーサ、ロゼオモナス・ペクーニアエ（ｐｅｃｕｎｉａｅ）、ロゼオモナス・リゾスフェラエ（ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、ロゼオモナス・リグィロシ（ｒｉｇｕｉｌｏｃｉ）、ロゼオモナス・ロゼア（ｒｏｓｅａ）、ロゼオモナス・ソーリ（ｓｏｌｉ）、ロゼオモナス・スタグニ（ｓｔａｇｎｉ）、ロゼオモナス・テラエ、またはロゼオモナス・ヴィナセア（ｖｉｎａｃｅａ）であり得る。１つの特定の非限定的な例では、グラム陰性菌はロゼオモナス・ミュコーサである。
【００５５】
単一種のグラム陰性菌が医薬組成物に含まれ得る。代替的に、種を組み合わせたグラム陰性菌が医薬組成物に含まれ得、本開示の方法に有用である。したがって組成物は、１、２、３、４、または５種のグラム陰性菌を含み得る。１つの特定の非制限的な例では、組成物は生菌のロゼオモナス・ミュコーサを含む。別の特定の非制限的な例では、組成物は生菌の緑膿菌を含む。さらに別の特定の非制限的な例では、組成物は生菌のロゼオモナス・ミュコーサと生菌の緑膿菌を含む。
【００５６】
有用な生菌のグラム陰性菌は、単一の株からのものであり得る。代替的に、グラム陰性菌は多数の株からのものであり得る。単一株のグラム陰性菌、または株を組み合わせたグラム陰性菌を本開示の組成物に含んでもよく、本開示の方法に有用である。したがって、組成物は、１、２、３、４、または５種のグラム陰性菌を含み得る。１つの特定の非制限的な例では、組成物は、単一株の生菌のロゼオモナス・ミュコーサを含む。さらに特定の非限定的な例では、組成物は、２、３、４、または５株の生菌のロゼオモナス・ミュコーサを含む。別の特定の非制限的な例では、組成物は単一株の緑膿菌を含む。さらに特定の非限定的な例では、組成物は、２、３、４、または５株の生菌の緑膿菌を含む。さらに別の特定の非制限的な例では、組成物は、１株の生菌のロゼオモナス・ミュコーサおよび１株の生菌の緑膿菌を含む。他の特定の非限定的な例では、組成物は、２、３、４、または５株の生菌のロゼオモナス・ミュコーサおよび２、３、４、または５株の生菌の緑膿菌を含む。
【００５７】
したがって、医薬組成物は２種類のグラム陰性菌（「二組」または「二対」）または２つより多い種類のグラム陰性菌を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、属、種および／または株などの操作的分類単位（ＯＴＵ）により定義されるような、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または少なくとも４０、少なくとも５０、または５０より多くの種類のグラム陰性菌を含み得る。一般的に、属、種または株は、個々にまたは組み合わせにより以下の特性を有する：ａ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子は、インビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する；ｂ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する；ｃ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する；およびｄ）グラム陰性菌は、被験体の皮膚に投与された時に非病原性である。
【００５８】
特定の実施形態では、グラム陰性菌は、プラスミド形態などの異種の核酸で形質転換される。発現ベクターは、対象のタンパク質をコードすることができる。外因性のＤＮＡは、電気穿孔またはリン酸カルシウムを媒介としたトランスフェクションなどの標準的な技術を用いて、筋細胞に導入され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、異種の核酸がプラスミドに含まれる。核酸カセット内の核酸を転写することができ、および必要であればトランスフェクトされた細胞において翻訳することができるように、プラスミドは一般的に、他の必要な遺伝要素と共に、位置的および順序的に配向された多数の遺伝要素を含む。プラスミドは、１つ以上の異種の核酸が挿入され得る、プラスミドベクター、コスミドまたはファージミドに由来するＤＮＡである核酸を含む。異種の核酸は、対象のタンパク質をコードすることができ、それはグラム陰性菌の発現のためのプロモーターに作用可能に連結され得る。
【００６０】
プラスミドは一般的に１つ以上の特有の制限部位を含んでいる。加えて、プラスミドは、薬物耐性などの、選択可能かつ容易に検出される、宿主生物上のいくつかの十分に規定された表現型を付与することができる。したがって、プラスミドは発現カセットを含むことができ、ポリペプチドがコードされる。発現は、挿入された遺伝子、核酸配列、またはプラスミドを伴う核酸カセットの効果的な転写を含む。
【００６１】
一実施形態では、環状のプラスミドが細菌細胞内に運ばれると、それは、正常な細菌のゲノムとは異なり、および非選択的な条件下での細菌細胞生存に必須ではない細胞質ＤＮＡ分子を、自主的に複製することができる。本明細書で使用される用語「持続的な発現」は、エピゾームの（染色体外）複製および／または細胞内の遺伝物質の保全を可能にする遺伝要素を伴う、細胞への遺伝子の導入を指す。これは、宿主細胞の染色体に新しい遺伝物質を組込むことなく、細胞の明確に安定した形質転換をもたらすことができる。
【００６２】
プラスミドはさらに、標的細胞の染色体に遺伝物質を導入することができ、そこでプラスミドが統合し、およびその細胞における遺伝物質の恒久的な構成分子になる。安定した導入後の遺伝子発現は、細胞および複製によって生じるその子孫の特性を恒久的に変更し、安定した形質転換に導き得る。
【００６３】
＜投与用の細菌組成物を調製する方法＞
細菌組成物を製造するための方法は、３つの主たる処理工程を含み、１つ以上の混合工程と組み合わせてもよい。工程は、生物バンキング、生物生成、および保存である。
【００６４】
バンキングに関し、細菌組成物に含まれる株は、（１）限定されないがヒトの皮膚、またはバンキングされた在庫から採取されたものなどの試料から直接単離される、（２）随意に、生菌のバイオマスを生じさせるために成長を支持する栄養寒天培地またはブロスで培養される、および（３）随意に、長期保管されている多数のアリコートに保存されているバイオマスでもよい。
【００６５】
グラム陰性菌は、ヒト被験体の皮膚から単離され得る。通常、ヒト被験体はアトピー性皮膚炎または他のいかなる皮膚疾病も有さない。したがって、被験体は健康であり得、これは他のいかなる病的な症状も有さないことを意味する。被験体は免疫適格性であり得る。しかしながら、グラム陰性菌は、商用供給源または環境上のサンプルなどの他の供給源から単離可能であり、本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる。本明細書に記載されるように、以下の条件であれば、グラム陰性菌は有用である：ａ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子は、インビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する；ｂ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する；ｃ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する；およびｄ）グラム陰性菌は、被験体の皮膚に投与された時に非病原性である。その後、グラム陰性菌は増殖し得る。
【００６６】
培養工程を用いる実施形態では、寒天培地またはブロスは、成長を可能にする必要要素および特定の因子を供給する栄養素を含んでもよい。非限定的な例は、０．５ｇ／Ｌのブドウ糖、０．５ｇ／Ｌの酵母エキス、０．５ｇ／Ｌのプロテオースペプトン、０．５ｇ／Ｌのカザミノ酸、０．３ｇ／Ｌのリン酸二カリウム、５０ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．３ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムから構成される培地である。様々な微生物培地および変化形体が、当技術分野で知られている（例えば、Ｒ．Ｍ．Ａｔｌａｓ，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ”（２０１０）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。培養の開始時または培養中に培地を加えてもよく、または培養を通して断続的／連続的に培地を注いでもよい。種／株は単独で培養されてもよく、または細菌の種／株を含む全集合として培養されてもよい。一例として、培養物が培養から流れ出るのを防ぐために、第１の株は、いずれかの細胞の最大成長速度より遅い希釈速度で、混合連続培養において第２の株と共に培養されてもよい。
【００６７】
培養は、バイオマスを構築するのに十分な時間、好ましい条件下でインキュベートされる。ヒト使用のための細菌組成物の場合、しばしば約３２−３７℃、ｐＨ、および正常なヒトの生態的地位に類似する数値を有する他のパラメータである。環境は能動的に制御され得る。
【００６８】
培養物が十分なバイオマスを生成すると、それはバンキングのために保存され得る。凍結（凍結防止剤の添加など）、乾燥、および／または浸透圧衝撃（浸透圧保護剤の添加など）から保護する化学的環境に生物を置き、均一なバンクを作るために多数の（随意に同一の）容器へと分配し、そして随意に保存のために培養物を処理する。容器は、通常は不浸透性であり、および環境からの隔離を保証するクロージャーを有する。凍結保存は、極めて低い温度（例えば約−７０℃以下）で液体を凍結することによって行うことができる。乾燥保存は、蒸発（噴霧乾燥または冷却乾燥の場合）または昇華（例えば凍結乾燥、スプレー凍結乾燥の場合）によって培養物から水を除去する。水の除去は、より高い温度での、細菌組成物の長期保存の安定性を改善する。株および／または種は、個々に培養および保存することができ、または種／株はバンキングのために混合することができる。
【００６９】
１つの非限定的な例では、凍結保存のために、細菌培養物を遠心分離によって採取して培地から細胞をペレット化し、上澄みを注ぎ出し、および１５％のグリセリンを含む新しいブロスと取り替えてもよい。その後、培養物を１ｍＬのクライオチューブに等分し、密封し、長期生存を保持するために−８０℃または−７０℃に置いてもよい。この手順は、冷凍保存からの回収に際して許容可能な生存性を達成する。
【００７０】
生物生成は、バンキングに類似する工程を用いて行ってもよく、培地組成および培養条件が含まれる。生成は、特に臨床開発または営業生産のために、大規模な実施により行なわれ得る。より規模が大きい場合、最終的な培養に先立って、細菌の継代培養をいくらか行なってもよい。培養の終了時に、投与用の剤形へと製剤するために培養物を採取する。これには、濃縮、望ましくない培地成分の除去、および／または細菌組成物を保存しおよび選択された経路を介した投与に好ましくする化学的環境への導入、が含まれ得る。１つの非制限的な例では、細菌組成物を、水中で１５％のスクロースから成る保存培地を用いて１０１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度に培養してもよい。
【００７１】
＜局所製剤および処置法＞
開示される単離されたまたは実質的に精製されたグラム陰性菌を含む医薬組成物が提供され、該医薬組成物は局所投与用に調剤される。これらの組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み、随意に追加の化合物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最終産物を生成するために、さらなる活性および／または不活性の物質を含み、最終産物は単回投与ユニットまたは多回投与方式であり得る。
【００７２】
アトピー性皮膚炎を有する任意の被験体を、本明細書に開示される方法を使用して処置することができる。被験体はヒトであり得る。いくつかの実施形態では、被験体は小児であり、すなわち１１歳、１０歳、９歳、８歳、７歳、６歳、５歳、４歳、３歳、２歳、１歳またはそれ未満の被験体などである。被験体は、１歳未満の乳児などの被験体でもよい。他の実施形態では、被験体は成人であり、すなわち１８歳の被験体、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、または６０歳を超える被験体などである。被験体は、６５歳、７０歳、７５歳、または８０歳を超える被験体などの高齢者でもよい。被験体は免疫無防備状態であり得る、または完全な免疫系（免疫適格性）を有し得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の緩衝剤、防腐剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑剤、分散増強剤、および／または着色剤を含み得る。適切な緩衝剤の非限定的な例には、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および重炭酸カルシウムがあげられる。適切な保存剤の非限定的な例には、αトコフェロールとアスコビル酸塩などの酸化防止剤、パラベン、クロロブタノールおよびフェノールがあげられる。適切な結合剤の非限定的な例には、スクロース、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、多価アルコール、糖類、オリゴ糖、およびそれらの組み合わせがあげられる。適切な滑沢剤の非限定的な例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水添植物油、ステロテックス（ｓｔｅｒｏｔｅｘ）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、滑石、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽油があげられる。ｐＨ緩衝剤をもし使用するのであれば、それは組成物の水性成分に溶解された時に、５〜７の範囲のｐＨ（例えば約ｐＨ５．５）を提供し得る。
【００７４】
医薬組成物は、細菌の成長を持続させるためなどの、他の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は栄養素を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの炭水化物を含む。「炭水化物」は、糖または糖の重合体を指す。用語「糖類」、「多糖類」、「炭水化物」および「オリゴ糖」は、区別なく使用されてもよい。ほとんどの炭水化物は、多くの水酸基を伴うアルデヒドまたはケトンであり、水酸基は通常は分子の各炭素原子上にある。炭水化物は一般的に、分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖または多糖類であり得る。最も基本的な炭水化物は、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロースおよびフルクトースなどの単糖類である。二糖類は、２つの結合された単糖類である。典型的な二糖類として、スクロース、マルトース、セロビオースおよびラクトースがあげられる。典型的には、オリゴ糖は３から６の単糖類ユニット（例えばラフィノース、スタキオース）を含み、および多糖類は６以上の単糖類ユニットを含む。典型的な多糖類として、デンプン、グリコゲンおよびセルロースがあげられる。炭水化物は、水酸基が取り除かれた２’−デオキシリボース、水酸基がフッ素置換された２’−フルオロリボースなどの修飾された糖類ユニット、またはＮ−アセチルグルコサミン、窒素を含むグルコースの形態（例えば、２’−フルオロリボース、デオキシリボースおよびヘキソース）を含んでもよい。炭水化物は、様々な形態、例えば配座異性体、環状形態、非環状形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、異性体、で存在し得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの脂質を含む。「脂質」には、脂肪、油脂、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、遊離脂肪酸を含む任意の形態の脂肪酸が含まれる。脂肪、油脂および脂肪酸は、飽和、不飽和（シスまたはトランス）、または部分的に不飽和（シスまたはトランス）である。いくつかの実施形態では、脂質は、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、アラキジン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰＡ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）、およびテトラコサン酸（２４：０）、から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの追加のミネラルまたはミネラル源を含む。ミネラルの例には、以下が制限なく含まれる：塩化物、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウムおよびセレン。前記のミネラルの適切な形状として、可溶性ミネラル塩、難溶性ミネラル塩、不溶性ミネラル塩、キレートミネラル、ミネラル複合体、カルボニルミネラルなどの非反応性ミネラル、還元型ミネラル、およびそれらの組み合わせがあげられる。
【００７７】
さらなる実施形態では、組成物は少なくとも１つの追加のビタミンを含む。少なくとも１つのビタミンは脂溶性または水溶性のビタミンであり得る。適切なビタミンには、限定されないが、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸およびビオチンがあげられる。前記のビタミンの適切な形状として、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンと同じまたは類似の作用を有する化合物、およびビタミンの代謝産物があげられる。
【００７８】
他の様々な添加物を組成物に含んでもよい。これらには、限定されないが、酸化防止剤、収れん剤、香料、保存剤、皮膚軟化剤、顔料、染料、湿潤剤、噴射剤、日焼け止め剤、およびその存在が少なくとも薬学的に望まれ得る他のクラスの物質が含まれる。随意の添加物の非限定的な例は以下の通りである：ソルビン酸塩などの保存剤；イソプロパノールおよびプロピレングリコールなどの溶剤；メントールおよびエタノールなどの収れん剤；ポリアルキレンメチルグルコシドなどの皮膚軟化剤；グリセリンなどの湿潤剤；ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ＰＥＧ−１００、ポリグルセリル−３ヒドロキシラウリルエーテル、およびポリソルベート６０などの乳化剤；ソルビトール、およびポリエチレングリコールなどの他のポリヒドロキシアルコール；メトキシけい皮酸オクチル（Ｐａｒｓｏｌ  ＭＣＸとして市販で入手可能）、およびブチルメトキシベンゾイルメタン（Ｐａｒｓｏｌ  １７８９の商品名で利用可能）などの日焼け止め剤；アスコルビン酸（ビタミンＣ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、ε−トコフェロール、ζι−トコフェロール、Ｚ＾−トコフェロール、η−トコフェロール、およびレチノール（ビタミンＡ）などの酸化防止剤；芳香油、セラミド、必須脂肪酸、鉱油、植物油（例えば大豆油、ヤシ油、シアバターの液体分、ヒマワリ油）、動物油（例えばスクアラン）、合成潤滑油、シリコン油またはワックス（例えばシクロメチコンおよびジメチコーン）、フッ素油（一般的にペルフルオロポリエーテル）、脂肪アルコール（例えばセチルアルコール）、およびワックス（例えば密蝋、カルナウバ蝋およびパラフィン蝋）；皮膚感触調節剤；濃厚剤と、膨潤粘土および架橋結合カルボキシポリアルキレンなどの構造体。
【００７９】
他の添加物には、皮膚（特に角皮層内の皮膚の上層）を整え、およびその含水量の低下を遅らせることによって皮膚を柔らかく保ち、および／または皮膚を保護する物質が含まれる。そのようなコンディショナーおよび保湿剤には、例として、ピロリジンカルボン酸およびアミノ酸；２，４，４’−トリクロロ−２−ヒドロキシジフェニルエーテル（トリクロサン）および安息香酸などの有機抗菌剤があげられる。さらなる添加物として、アセチルサリチル酸およびグリシレチン酸などの抗炎症剤；レチン酸などの抗脂漏薬；ニコチン酸などの血管拡張剤；コウジ酸などのメラニン形成阻害剤；およびそれらの合剤があげられる。
【００８０】
他の実施形態では、組成物は、αヒドロキシ酸、αケト酸、高分子ヒドロキシ酸、保湿剤、コラーゲン、魚介エキス、およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）および／またはα−トコフェロール（ビタミンＥ）などの酸化防止剤を含み得る。日焼け止め剤をさらに含んでもよい。付加的に、酵素、薬草、植物抽出物、腺、または動物エキスなどの成分を組成物に添加してもよい。これらの様々な添加物の量は、化粧品の分野で従来から使用されているものであり、例えば、局所製剤の全重量の約０．０１％から約２０％の範囲にある。
【００８１】
組成物はさらに、保管時の腐敗を防ぐために、つまり酵母やカビなどの微生物の成長を阻害するために、抗菌剤を含み得る。適切な抗菌剤は典型的に、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステルとプロピルエステル（つまり、メチルパラベンとプロピルパラベン）、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、イミド尿素、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００８２】
組成物はさらに、投与される化学物質または組成物の他の構成要素に起因する皮膚の炎症または皮膚障害の可能性を最小化する、またはなくすために、炎症を緩和する添加物を含み得る。適切な炎症緩和添加物には、例えば：α−トコフェロール；モノアミンオキシダーゼ阻害薬、特に２−フェニル−１−エタノールなどのフェニルアルコール；グリセリン；サリチル酸；アスコビル酸；モネンシンなどのイオノフォア；両親媒性アミン；塩化アンモニウム；ｎ−アセチルシステイン；カプサイシン；およびクロロキンが含まれる。炎症緩和添加物が存在する場合、それは炎症または皮膚障害を緩和するのに効果的な濃度で組成物に組み込まれ得、典型的には製剤の約２０重量％を超えない、より典型的には約５重量％を超えない。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明の製剤に組み込まれ得る、したがって活性薬剤と共に局所的に適用され得る、さらなる適切な薬理学的活性薬剤には、限定されないが以下が含まれる：着色または無着色の顔のシミ、角化上皮およびしわを改善または取り除く薬剤；局所麻酔薬および鎮痛剤；コルチコステロイド；レチノイド；およびホルモン。局所用の薬理学的活性薬剤のいくつかの例には、アシクロビル、アンホテリシン、クロルヘキシジン、クロトリマゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ミコナゾール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、フェニトイン、パラアミノ安息香酸エステル、オクチノキサート、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、ジオキシベンゾン、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ジンクピリチオン、ジフェンヒドラミン、プラモキシン、リドカイン、プロカイン、クロタミトン、ヒドロキノンおよびそのモノメチルおよびベンジルエーテル、ナプロキセン、イブプロフェン、クロモリン、レチノール、レチニルパルミテート、酢酸レチニル、コールタール、グリセオフルビン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン２１−酢酸、ヒドロコルチゾン１７−吉草酸、ヒドロコルチゾン１７−酪酸、プロゲステロン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ミノキシジル、ジピリダモール、ジフェニルヒダントイン、過酸化ベンゾイル、５−フルオロウラシル、タクロリムス、およびステロイド外用薬であって、アルクロメタゾン、アムシノニド、ベタメタゾン、クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、ジフロラゾン、フルオシノニド、フルドロキシコルチド、ハロベタゾール、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、および／またはトリアムシノロンなどのステロイド外用薬。
【００８４】
皮膚への送達用に調剤されたクリーム剤および軟膏などの局所製剤が考慮されるが、送達システムには徐放性、遅延放出性または持効性の送達システムが含まれ得る。そのようなシステムは、組成物の連続投与を回避することができ、被験体および医師にとっての利便性を高めることができる。多くの種類の放出性の送達システムが当技術分野において利用可能であり、および当業者に既知である。特定の例として、限定されないが以下が挙げられる：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号；４，６６７，０１４号；４，７４８，０３４号；５，２３９，６６０号；および６，２１８，３７１号に記載されたものなどの侵食性システム；および（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号および３，８５４，４８０号に記載されたものなどの、活性成分が重合体から制御された速度で浸透する拡散性システム。
【００８５】
送達システムには、コラーゲン、フィブリン、または基底膜抽出物などの細胞膜抽出物を含むことができ、例えば組成物は皮膚への投与用に調剤される。適切な基底膜抽出物には、約６０−８５重量％のラミニン、５−３０重量％のコラーゲンＩＶ、１−１０重量％のニドゲン、１−１０重量％のヘパラン硫酸プロテオグリカンおよび１−５％のエンタクチンが部分的に包含される。生物学的活性重合性抽出物が含まれる（米国特許第４，８２９，０００号を参照、これは参照により本明細書に組み込まれ、ＢＭＥ組成物およびこれらの組成物の製造方法を開示している）。ＢＭＥは、培養されると、上皮細胞を含む様々な細胞型の正常な成長と分化を支持することができる。基底膜抽出物は当技術分野において既知であり、および市販で入手可能である。
【００８６】
皮膚の処置のために、治療上の有効量の組成物が、冒された領域に局所的に投与され得る。本明細書に開示される薬学的組成物は、アトピー性皮膚炎の処置のための少なくともグラム陰性菌の使用を促進する。そのような組成物は、限定されないがヒト被験体などの任意の適切な被験体への有効成分の送達に適しており、および既知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって、製造することができる。上記のように、薬学的組成物は、１つ以上の薬理学的に（例えば生理的にまたは薬学的に）許容可能な担体を使用し、および薬学的に利用可能な調合剤への活性化合物の処理を促進する随意の補助剤を使用し、従来の方法で調剤することができる。
【００８７】
組成物は、グラム陰性菌の単回（単位）用量を含み得る。典型的な量は、１０６−１０１０、例えば１０５−１０７ｃｆｕ、例えば１０６ｃｆｕなどの、１０５−１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）である。いくつかの実施形態では、グラム陰性菌の適切な用量は、１０４〜１０１２ｃｆｕの範囲、例えば１０４〜１０１０、１０４〜１０８、１０６〜１０１２、１０６〜１０１０、または１０６〜１０８ｃｆｕの１つであり得る。他の実施形態では、組成物は、少なくとも約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．５重量％、約２．０重量％、約３．０重量％、約４．０重量％、約５．０重量％、約６．０重量％、約７．０重量％、約８．０重量％、約９．０重量％、約１０．０重量％、約１１．０重量％、約１２．０重量％、約１３．０重量％、約１４．０重量％、約１５．０重量％、約１６．０重量％、約１７．０重量％、約１８．０重量％、約１９．０重量％、約２０．０重量％、約２５．０重量％、約３０．０重量％、約３５．０重量％、約４０．０重量％、約４５．０重量％、約５０．０重量％、の細菌を含む。他の実施形態では、組成物は、少なくとも約０．０１％〜約３０％、約０．０１％〜約２０％、約０．０１％〜約５％、約０．１％〜約３０％、約０．１％〜約２０％、約０．１％〜約１５％、約０．１％〜約１０％、約０．１％〜約５％、約０．２％〜約５％、約０．３％〜約５％、約０．４％〜約５％、約０．５％〜約５％、約１％〜約１０％、約５％、の重量％のグラム陰性菌を含み得る。
【００８８】
組成物は、病変領域および円形病変領域などの皮膚に、または病変の形成を防ぐために無傷の皮膚の領域（非病変領域）に、適用され得る。組成物は病変サイズを減少させるために使用することができる。組成物は毎日適用することができる。組成物は、１日につき１、２、３、４、または５回、適用することができる。組成物は一日おきに、または１週間に１、２、３、４、５、６または７回適用することができる。組成物は週１回適用することができる。１つの特定の非限定的な例では、１０６ｃｆｕを皮膚に、１週間に２回または３回、適用する。組成物は、投与のための単位服用量として調剤され得る。
【００８９】
クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、スプレーおよび無菌溶液注射剤または懸濁剤などの局所用の医薬組成物を製造する方法は、当技術分野において周知である。局所用の医薬組成物を調製する適切な方法は、例えば、国際公開第９５／１０９９９号、国際公開第２０１２１５０２６９号、米国特許第６，９７４，５８５号、および国際公開第２００６／０４８７４７号に記載されており、参照によりこれらすべてが本明細書に組み込まれる。組成物は水性担体を含み、およびスプレーとして皮膚に適用することができる。
【００９０】
随意に、組成物は薬学的に許容可能な粘性強化剤および／または薄膜形成剤を含み得る。粘性強化剤は、製剤が適用部位を超えて広がるのを防ぐために、製剤の粘性を高める。バルサムモミ（Ｂａｌｓａｍ  Ｆｉｒ）（Ｏｌｅｇｏｎ）は、グラム陰性菌と共に使用される薬学的に許容可能な粘性強化剤の例である。
【００９１】
薄膜形成剤は、乾燥すると、適用部位上に保護膜を形成する。薄膜は、有効成分の除去を阻止し、および処置されている部位にそれを接触させたままにしておく。本発明での使用に適した薄膜形成剤の例は、弾性コロジオン、ＵＳＰである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，”１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）の１５３０頁に記載されるように、コロジオン剤は、ピロキシリン（ニトロセルロース）を含むエチルエーテル／エタノール溶液であり、それは蒸発するとピロキシリンの薄膜を残す。薄膜形成剤は、担体として付加的に作用し得る。乾燥して薄膜を形成する溶液は、時に塗布剤と呼ばれる。医薬製剤の技術分野において周知のクリーム剤は、粘稠液または半固体の乳剤であり、水中油型または油中水型のいずれかである。
【００９２】
クリーム基材は水洗い可能であり、および油相と乳化剤と水相を含んでいる。油相は「内」相とも呼ばれるが、一般的に、ワセリン、およびセチルまたはステアリルアルコールなどの脂肪族アルコールで構成される。水相は、必然ではないが通常は量の点で油相にまさり、および一般的に湿潤剤を含む。クリーム製剤内の乳化剤は一般的に非イオン、陰イオン、カチオンまたは両性界面活性剤である。
【００９３】
ローション剤は、摩擦なしに皮膚表面に適用される調合剤であり、典型的に液体または半流動体の調合剤であり、活性薬剤を含む粒子が水またはアルコールの基剤にある。ローション剤は通常、固形物の懸濁剤であり、および好ましくは水中油型の液体の油乳剤を含む。ローション剤は、より多くの流体組成物を容易に適用できるため、身体の広い領域を処置するために使用することができる。一般的に、ローション剤中の不溶物がきれいに分離されている必要がある。
【００９４】
ローション剤は典型的に、十分な分散を生み出すための懸濁剤、および皮膚に接する活性薬剤を局限して保持するのに有用な化合物、例えばメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどを含む。
【００９５】
溶液は、溶解された物質の分子が溶剤の間に分散するように、液体に１つ以上の化学物質（溶質）を溶解させることによって調製された均一混合物である。該溶液は、溶質の緩衝、安定化、または保存のために、他の薬学的または美容的に許容可能な化学製品を含んでもよい。局所用の溶液を調製するのに使用される溶剤の一般的な例は、エタノール、水、プロピレングリコールまたは他の許容可能な賦形剤である。これらは、皮膚に噴霧する、皮膚に塗る、または溶液で包帯を湿らせるなどの任意の方法で適用され得る。
【００９６】
ゲル剤は、半固体の懸濁型システムである。単相のゲル剤は、担体液全体にわたって実質的に均一に分配された有機高分子を含み、それは典型的に水性であり、さらに好ましくはアルコールおよび随意に油脂を含む。いくつかの有用な「有機高分子」、特にゲル化剤は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）として市販されている重合体の「カルボマー」ファミリー、例えばカルボキシポリアルキレンなどの、架橋アクリル酸重合体である。さらに有用なのは、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体およびポリビニルアルコールなどの親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメチルセルロースなどのセルロースポリマー；トラガントおよびキサンタンガムなどのガム；アルギン酸ナトリウム；およびゼラチンである。均一のゲルを調製するために、アルコールまたはグリセリンなどの分散剤を添加してもよく、またはゲル化剤を粉砕、機械的混合、かくはん、またはそれらの組み合わせによって分散させてもよい。これらのゲル剤は本明細書に開示される方法に有用である。
【００９７】
軟膏剤もまた、本開示の方法に使用することができる。軟膏剤は、典型的にはワセリンまたは他の石油派生物に基づく半固形製剤である。当業者によって理解されるであろうように、使用される特定の軟膏基剤は、多数の望ましい特性、例えば軟化など、を提供するものである。軟膏基剤は一般的に不活性で、安定しており、非刺激性および非感作性である。軟膏基剤は４つのクラスに分類される：油脂性基剤；乳化性基剤；乳剤性基剤；および水溶性基剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５），１３９９−１４０４頁を参照）。油脂性軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得た油脂、および石油から得た半固体の炭化水素が含まれる。吸収性軟膏基剤としても知られる乳化性軟膏基剤は、ほとんどまたは全く水を含まず、および例えば、ヒドロキシステアリン硫酸（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、脱水ラノリンおよび親水ワセリンを含む。乳剤性軟膏基剤は、油中水型（Ｗ／Ｏ）乳剤または水中油型（Ｏ／Ｗ）乳剤のいずれかであり、および例えば、アセチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ラノリンおよびステアリン酸を含む。水溶性軟膏基剤は、様々な分子量のポリエチレングリコールから調製される。
【００９８】
パスタ剤は、活性薬剤が適切な基剤中に懸濁されている半固体の剤形であり、および有用である。基剤の性質に応じて、パスタ剤は、脂肪性パスタ剤または単相の水性ゲル剤から作られたものに分けられる。脂肪性パスタ剤の基剤は、一般的にワセリンまたは親水ワセリンなどである。単相の水性ゲル剤から作られたパスタ剤は、一般的に基剤としてカルボキシメチルセルロースなどを組み込む。
【００９９】
局所用組成物は、クリーム、ローション、スプレー、溶液、ゲル、軟膏、パスタ剤、膏薬、塗布剤、生体付着性剤、包帯、スプレー、または懸濁液などの、体表面への適用に適した任意の形状であり得、および／またはリポソーム、ミセル、および／またはミクロスフェアを含むように調製されてもよい。局所用組成物は、体表面への適用時およびその後に、体表面から蒸発する水分を製剤内に保つように、閉塞性の被覆層と組み合わせて使用され得る。
【０１００】
クリーム、ローション、ゲル、軟膏、パスタ剤などは、冒された表面に広げられてもよい。溶液は同じ方法で適用されてもよいが、より典型的には滴瓶、綿棒、噴霧器などで適用され、および冒された領域に注意深く適用される。組成物は、例えば軟膏などの局所用の調合剤、またはドレッシングか包帯の一部として、標的位置に直接適用され得る。組成物は、皮膚への投与のための任意のデバイスによる投与用に、単位用量として調剤することができる。単位用量は、担体、例えば少なくとも１日以上などの所望の期間、皮膚に付着することができる粘着性の担体中の、活性薬剤の蓄積でもよい。
【０１０１】
医薬組成物はアトピー性皮膚炎の処置に有用である。したがって、いくつかの実施形態では、局所適用は結果として病変サイズの減少、病変の数の減少、および／または症状の低減をもたらす。これらの医薬組成物の適用は、処置される被験体の皮膚内の黄色ブドウ球菌を減らすことができる。医薬組成物の適用は、経皮水分損失によって測定される皮膚のバリア機能の向上を提供することができる。
【０１０２】
アトピー性皮膚炎が再発として生じ、および寛解の期間があり得る。局所適用は再発を減らすことができ、その結果、アトピー性皮膚炎のさらなる事象の数、強度または頻度が減少する。局所適用は、事象間の時間の長さなどの寛解の時間を増やすことができる。いくつかの実施形態では、アトピー性皮膚炎の追加の事象は、適用後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２週間は起こらないだろう。さらなる実施形態では、アトピー性皮膚炎の追加の事象は、局所適用後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２か月間は起こらないだろう。
【０１０３】
該方法は、被験体の皮膚の微生物叢を測定する工程を含み得る。具体的には、被験体の皮膚内のバクテリア分類群が処置後に変化したことを判定するために、診断アッセイを行うことが可能である。したがって、いくつかの実施形態では、細菌の門、細菌のクラス、細菌の目、細菌の科、細菌の属および／または細菌の種が、アトピー性皮膚炎を伴う被験体の皮膚において変化したかを判定する。一実施形態では、黄色ブドウ球菌の量が処置後に被験体の皮膚内で変化したかを判定する。
【０１０４】
サンプル中の微生物叢を特定するそのような方法は、皮膚サンプルなどのサンプルを提供する工程、およびサンプル中の少なくとも１つの微生物叢を検出する工程を含み得る。該方法の一実施形態は、サンプル中に存在する少なくとも１つの微生物叢から、主体の分子指標（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を含む核酸サンプルを調製する工程、および主体の分子指標を検出する工程を含み得る。例えば、該方法は、ＤＮＡサンプルの調製により少なくとも１つの核酸サンプルを調製する工程を含み得る。主体の分子指標は、ｒＲＮＡ遺伝子（例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）などの多形性ポリヌクレオチドであり得る。主体の分子指標は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子などの多形性ポリヌクレオチド、またはそれらの一部または部分列を判定することによって、検出され得る。主体の分子指標を検出するためのさらなる実施形態はさらに、選択的なプライマーを伴うＰＣＲ、選択的なプライマーを伴う量的ＰＣＲ、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、およびそれらの組み合わせを含み得る。例えば、多形性ポリヌクレオチドは、特定のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出することができる。そのような例では、特定のプローブは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子などの多形性の標的核酸にハイブリダイズする。随意に、複数の特定のプローブ、例えばその各々が細菌を識別する複数の特定のプローブを含む少なくとも１つの配列に、核酸をハイブリダイズさせることができる。主体の分子指標の検出はさらに、多形性の標的タンパク質、例えば微生物叢を識別する多形性の標的タンパク質に結合するタンパク質プローブ（抗体など）を使用して、行われ得る（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１７３，９１０号を参照）。
【０１０５】
黄色ブドウ球菌などの１つ以上の細菌の相対的存在量は、被験体からのサンプル中で測定することができる。本明細書において使用されるように、用語「相対的存在量」は、定義された位置またはコミュニティー内の他の生物に対する、生物の共通性または珍奇性を指す。例えば、相対的存在量は、一般的にはサンプル中の生物の全存在と比較した、特定の生物の存在を測定することによって、判定することができる。
【０１０６】
細菌の相対的存在量は、直接または間接的に測定することができる。直接測定は培養に基づく方法を含み得る。間接測定は、全サンプルに関して生物または生物の群に特異的な、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列などの、主体の分子指標の普及度を比較することを含み得る。
【０１０７】
一実施形態では、黄色ブドウ球菌および／または任意の種類のグラム陰性菌などの微生物叢の相対存在量は、個々の被験体の皮膚内において、被験体の微生物叢プロフィールを得るために、個体からのサンプル中の１つ以上の特定の細菌の比率を測定することにより算出され得る。相対的存在量は、サンプル中に存在する細菌の全存在量から導き出すことができる。本明細書において使用されるように、「全存在量」は一般的に、サンプル中の全細菌を指す。したがって「微生物叢プロフィール」は、被験体または被験体の皮膚サンプル中の１つ以上の微生物叢の相対的存在量の、グラフなどの表現を指す。
【０１０８】
＜キット＞
開示される治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌は、キットのコンポーネントとして提供され得る。精製された生菌のグラム陰性菌は、増殖培地で凍結乾燥された形態で、または凍結した細胞として、提供され得る。したがってキットは、治療上有効な量の精製された生菌のグラム陰性菌を含む容器を含み得、ここでｉ）グラム陰性菌の可溶化液および／または構成分子はインビトロアッセイで黄色ブドウ球菌の成長を阻害する；ｉｉ）グラム陰性菌はヒトケラチノサイトを刺激する；ｉｉｉ）グラム陰性菌はヒト細胞からのサイトカイン発現を誘発する；およびｉｖ）グラム陰性菌は、被験体の皮膚に投与された時に非病原性である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、キットは、グラム陰性菌（任意の形態）を含む１つの容器、およびグラム陰性菌の懸濁のための薬学的に許容可能な担体を含む１つの容器などの、医薬組成物の生成に必要なコンポーネントを含み得る。薬学的に許容可能な担体は、例えば緩衝生理食塩水またはスクロース溶液であり得る。他の実施形態では、キットは、グラム陰性菌を含む容器、および薬学的に許容可能な担体を含む第２の容器、および薬学的に許容可能な担体を測定するための、限定されないがシリンジなどのデバイス、を含み得る。さらに別の実施形態では、キットは、薬学的に許容可能な担体中で懸濁されたグラム陰性菌の局所適用のための、限定されないがスプレーノズルまたは包帯などのデバイスを含むことができる。
【０１１０】
随意に、そのようなキットは、包装、説明書、および追加の緩衝剤または他の治療成分などの他の様々な試薬、をさらに含む。キットは、容器、および容器上にまたは容器に関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は典型的に、アトピー性皮膚炎の処置に効果的なグラム陰性菌を含む組成物を収容する。いくつかの実施形態では、容器は、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアルであり得る）。
【０１１１】
ラベルまたは添付文書は、アトピー性皮膚炎などの特定の疾病の処置に組成物を使用することを示す。ラベルまたは添付文書は典型的に、使用説明書をさらに含む。添付文書は典型的には、そのような治療薬の使用に関する指示、用法、用量、投与、禁忌および／または警告に関する情報を含んだ治療薬のコマーシャルパッケージに慣習的に含まれる説明書、を含む。いくつかの非限定的な例では、説明書は、グラム陰性菌を含むバイアルに添加するための薬学的に容認可能な担体の量についての情報、薬学的に許容可能な担体中にグラム陰性菌を懸濁するための説明書、および皮膚への局所適用のための説明書を含む。適用は、皮膚へのスプレー、あるいは皮膚を綿棒で拭く、または皮膚に適用するための包帯上に懸濁剤を導入することによって可能である。
【０１１２】
説明書は、電子的形態（コンピューターディスケットまたはコンパクトディスクなど）に書き込まれてもよく、または視覚的なもの（ビデオファイルなど）でもよい。キットはさらに、皮膚への適用のためのスプレーチップ、包帯または綿棒などの、キットがその用途用に設計されている特定用途を促す追加のコンポーネントを含んでもよい。キットは付加的に、緩衝剤、および特定の方法の実施に慣例的に使用される他の試薬を含んでもよい。キットおよび適切な内容物は当業者に周知である。
【０１１３】
ここで本開示は以下の非限定的な実施例によって例証される。
【実施例】
【０１１４】
ヒト皮膚から採取された異なる共生グラム陰性（ＣＧＮ）菌への接触後の免疫学的結果が異なるかどうかを評価するために、試験を行なった。これらの試験のために、ＣＧＮ菌を、健康な対照およびアトピー性皮膚炎（ＡＤ）を有する患者から集めた。様々な細胞および培養ベースのモデルを使用して、それらの免疫原性を評価した。ＣＧＮの代表的な株を選択し、およびそれらの影響をＡＤのＭＣ９０３マウスモデルで評価した。ＡＤを有する患者ではなく健康なヒト志願者から採取したＣＧＮ菌は、バリア機能の向上、先天免疫活性化、および黄色ブドウ球菌の制御に関係することがわかった。健康な対照からのＣＧＮを用いたＡＤの処置は、マウスモデルの結果を改善した。
【０１１５】
＜実施例１＞
＜材料および方法＞
グラム陰性菌の採取および特定：無菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で湿らせた２つのＦｌｏｑＳｗａｂｓ（Ｃｏｐａｎ，Ｂｒｅｓｃｉａ，Ｉｔａｌｙ）を、１５−３０秒間、被験体の（肘前窩の）皮膚に活発にこすりつけた。１つの綿棒を、グラム陽性菌と真菌類の成長を阻害するために、バンコマイシン（３００ｕｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（５ｕｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む２ｍＬの無菌のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に１５ｍＬの円錐管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に入れた。残りの綿棒を、類似する濃度のバンコマイシンおよびアンホテリシンＢと共に、２ｍＬのＲ２Ａ（Ｒｅａｓｏｎｅｒ’ｓ  ２Ａ）ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を含む１５ｍＬの円錐管に入れた。適所に綿棒を置いたチューブを次に、各チューブからの１００ｕＬをＲ２Ａ寒天プレート（Ｒｅｍｅｌ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）上に平板培養する前に、４８−７２時間、一定の振動で３２℃においてインキュベートした。次に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用した質量分析法によって、種属同定用に群体を採取した。前記の方法（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５２，”２８０４−２８１２（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｅｐｕｂ  Ａｕｇ（１０．１１２８／ＪＣＭ．００６９４−１４））、器具の設定と較正（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５１，”８２８−８３４（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｍａｒ（１０．１１２８／ＪＣＭ．０２８５２−１２）；Ｙｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，”（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）（Ｓｅｐ  ２）（１０．１１２８／ＪＣＭ．０１６４３−１５））を使用して、ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの微生物学ラボによって、ＢｉｏＴｙｐｅｒ（ｖ３．１，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのための細菌タンパク質抽出が行われた。バイオタイパー識別は、ＮＩＨによって開発されたいくつかのデータベースにより提供される付加質量スペクトルプロフィールによって補足された（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ｓｕｐｒａ；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４８，”３４８２−３４８６（２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｏｃｔ（１０．１１２８／ＪＣＭ．００６８７−０９；Ｍｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，”８０４−８１１（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ａｕｇ（１０．１０３８／ｎｉ．２６３７））。図１に報告された１０個の健康な対照のＲ．ミュコーサ株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって特定されたＲ．ミュコーサ単離菌で観察された特有の群体形態、ＵＶ光反応およびグラム染色特性にもっぱら基づいて、特定した。続く試験に使用されるすべてのＲ．ミュコーサ単離菌を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって確認した。書面のインフォームドコンセントを、この試験の全ての参加者ごとに得た。
【０１１６】
インビトロの黄色ブドウ球菌阻害アッセイ：グラム陰性単離菌を、５ｍＬのＲ２Ａで８−１０日間、上記のように培養した。細菌を１２分間、５０００ｇにペレット化した。上澄みを採取し、凍結し、次に凍結乾燥した（Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ２．５，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）。凍結乾燥した産物、および細菌なしで同時にインキュベートと凍結乾燥をしたＲ２Ａの対照を、１ｍＬのトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）に懸濁させた。５ｍＬのＴＳＢで培養した黄色ブドウ球菌株を一晩培養した物を、１：１００で新しい培地に希釈し、次に、この新たに希釈された１００ｍｃＬの培養物を、ＣＧＮ上澄みまたは凍結乾燥されたＲ２Ａの対照を含む１００ｍｃＬのＴＳＢと合わせた。サンプルを３７℃において、一定のかくはん下で３時間インキュベートした。階段希釈を行い、および平板培養をした；翌日、群体を数え、および数えることができたすべてのプレートを平均した。黄色ブドウ球菌の成長に対する影響のパーセントを、ＣＧＮ上澄みに接触させた培養物におけるＣＦＵの数を、Ｒ２Ａのみに接触させた培養物のＣＦＵの数で割ることによって算出した。
【０１１７】
水疱の誘発および細菌チャレンジ：８つのウェル吸引チャンバーを設計し（Ａｍｍｎｒａ  Ｃｒｅａｔｉｏｎｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ブロンズに３Ｄ印刷した（Ｓｈａｐｅｗａｙｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。これを、エタノール殺菌した参加者の前腕の手掌側に置き、およびマイクロダーマブレーション装置（Ｋｅｎｄａｌ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＨＢ−ＳＦ０２）を使用して、２時間、３０ｍｍＨｇ未満の吸引下に置いた。デバイスの除去後、結果として生じた上皮の水疱の頂部を除去した。８つのチャレンジチャンバーを設計し（Ａｍｍｎｒａ  Ｃｒｅａｔｉｏｎｓ）、ブロンズ（Ｓｈａｐｅｗａｙｓ）に３Ｄ印刷した（図４Ｃ）。一致する８つのウェル鋳型（Ａｍｍｎｒａ  Ｃｒｅａｔｉｏｎｓ）を使用して、１０ｍｍのパンチ生検（Ａｃｕ−Ｐｕｎｃｈ，Ａｃｕ−ｄｅｒｍ；Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ，ＦＬ）を、１つの４”×４”のデュオダーム（Ｄｕｏｄｅｒｍ）ドレッシング（ＣｏｎｖａＴｅｃ；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）に刻んだ。露出した水疱上に配置する前に、ダーマボンド（Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ）接着剤（Ｅｔｈｉｃｏｎ；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）をチャレンジチャンバーの縁に塗った。無菌食塩水（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ）または無菌食塩水中で懸濁された２ｅ７ＣＦＵの被照射細菌いずれかを１ｍＬ用いて、各ウェルを満たした。翌朝、水疱液をピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）で取り除いた。採取されたサンプルを７分間、３５０ｇを遠心分離機にかけ、上澄みを取り除き、およびバッチ分析のために凍結した。
【０１１８】
サイトカインおよび抗菌ペプチドの検出：標準ヒトｒｅｇ３ｇａｍｍａ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）または水疱液サンプル（０．９％のＮａＣｌに希釈された１００−１２．５％）を一晩、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。翌日、ウェルを５回、ＰＢＳで洗浄し、および１時間、３％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。ウェルをもう一度、ＰＢＳで洗浄した。多クローンの、タンパク質Ａ−精製されたウサギ抗マウスｒｅｇ３ｇａｍｍａ（１３．２ｍｇ／ｍｌ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈのＪ．Ｋｏｌｌｓからの贈り物）を、１：１０００の稀釈で１％のＢＳＡ／ＰＢＳに加え、およびＲＴで９０分間インキュベートした。抗ウサギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）とＴＭＢ基質（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加え、およびプレートを５−１０分間、ＲＴでインキュベートした。反応を止めるために２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えた；プレートを４５０ｎｍで読み取った。ＬＬ−３７（Ｈｙｃｕｌｔ；Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）およびヒトベータ−ディフェンシン３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、商用ＥＬＩＳＡキットで測定した。サイトカインレベルを、メーカー説明書に従いＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（ＢＩＯ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で判定した。
【０１１９】
ケラチノサイト培養物：初代包皮ケラチノサイト（ＫＣ）培養物を採取し、および以前に記載されたように刺激した（Ｍｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，”８０４−８１１（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｕｇ（１０．１０３８／ｎｉ．２６３７））。１ｅ７ＣＦＵの生きた共生グラム陰性菌をＫＣ培地に加えた。ｍＲＮＡを、ΔΔＣＴ法によるＰＣＲ解析のために、２４時間後に抽出した。
【０１２０】
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）から購入した。８〜１４週齢のマウスを使用した。雄と雌両方のマウスで実験を行ったが、年齢と性別は各実験内で一致していた。
【０１２１】
経皮水分損失（ＴＥＷＬ）の測定：マウスの毛をそり、および毛を化学的に除去した（Ｎａｉｒ）。翌日から、およそ１ｅ７ＣＦＵの生きた細菌を毎日、むき出しの領域に置いた。接種の直前に、ＴＥＷＬを、メーカーの説明書に従いＶａｐｏＭｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ；Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）で毎日測定した。
【０１２２】
ＭＣ９０３および耳接種：以前に記載されたように、ＡＤのＭＣ９０３マウスモデルを行った（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３５，”７８１−７９１  ｅ７８３（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｍａｒ（１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１４．０９．０１５））。予防試験として、１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌を無菌のＰＢＳに懸濁し、および１０ｍｃＬ量をマウスの耳に滴らせた。ＭＣ９０３の２日前に接種を開始し、およびＭＣ９０３との接触の間も継続した。まずＭＣ９０３を配置し、細菌単離菌の配置に先立って２−５分間、エタノールを蒸発させた。耳の厚さを１４日目に測定した。以前に記載されたようにｍＲＮＡ単離およびＰＣＲを行った（Ｍｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ｓｕｐｒａ）。黄色ブドウ球菌の共接種を使用する実験では、１ｅ６ＣＦＵの黄色ブドウ球菌のＳＡＡＳ９株を、グラム陰性単離菌の接種の直前に耳の上に滴らせた。１４日間毎日マウスをＭＣ９０３に接触させ、および１３−１５日目に１ｅ７ＣＦＵのグラム陰性菌を接種させることにより、処置試験を行った。２１日目に耳の厚さを測定し、および写真を撮った。
【０１２３】
血清の全ＩｇＥ分析：血清を、ＭＣ９０３処置の１４日目に採取した。商用のキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を使用して、以前に記載されたように全ＩｇＥを判定した（Ｍｙｌｅｓ，“Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  １３，”６１（２０１４）１０．１１８６／１４７５−２８９１−１３−６１））。
【０１２４】
統計：Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、多数のサンプルを比較するために、両側独立ｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して平均値を比較した。ＮＳ＝有意ではない、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【０１２５】
試験の認可：全ての動物実験は、認可されたＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅの手続きの下で行なわれた。全てのヒトサンプルの採取および処理は、ＩＲＢに認可された治験のもとで行われ、および全ての被験体がサンプル採取に完全な同意を与えた。全ての参加者は、研究プロトコルに書面による同意を与え、および血液採取に先立って治験審査委員会（ＩＲＢ）の同意を得た。
【０１２６】
＜実施例２：皮膚の共生グラム陰性微生物叢は、健康な対照とＡＤを伴う患者との間で異なる＞
遺伝子ベースのマイクロバイオーム特定は、ＡＤ患者と健康な対照との間での、グラム陰性皮膚バイオームにおける有意差を明らかにした（４）。培地、抗生物質および温度の適切な選択を経たグラム陰性皮膚細菌叢の培養のための方法は、ＣＧＮ種の機能特性および比較を可能にした。２６人の健康な志願者と比較して、１７人のＡＤ患者の皮膚上に存在する培養可能な細菌に有意差を見出した（図１Ａ；表１）。
【０１２７】
【表１】
2019513769.tif 000002
【０１２８】
図１には、参加者に関する年齢、性別、人種およびＳＣＯＲＡＤが含まれる。スチューデントのｔ検定（年齢、ＳＣＯＲＡＤ）またはカイ二乗検定（性別、人種）によって有意性を判定した。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ＮＳ＝有意ではない。
【０１２９】
健康な志願者（ＨＶ）で特定された主なグラム陰性種は、ロゼオモナス・ミュコーサであった。ＡＤ患者のおよそ半数は、培養可能なグラム陰性菌を持たず、ＤＮＡに基づいた分析と一貫している（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，”８５０−８５９（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｙ（１０．１１０１／ｇｒ．１３１０２９．１１１））。
【０１３０】
＜実施例３：健康な志願者からのＣＧＮは黄色ブドウ球菌の成長を阻害する＞
異常増殖および黄色ブドウ球菌への感染は共に、ＡＤに特徴的な免疫の不均衡および不十分なバリア機能の要因であると共に、それらの結果でもある。黄色ブドウ球菌は直接、アレルギーの肥満細胞（Ｓｃｈｌｉｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２５，”３９−４９（２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（ＥｐｕｂＪａｎ）（１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２００９．１０．０３９）；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎａｔｕｒｅ  ５０３，”３９７−４０１（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）（Ｎｏｖ  ２１）（１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２６５５））、およびＴ細胞（Ｂｒａｕｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３４，”２１１４−２１２１（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ａｕｇ（１０．１０３８／ｊｉｄ．２０１４．４３））を活性化することができる。抗生物質による処置は、黄色ブドウ球菌量を減らし、および症状を改善することができるが、根本的な病理を正常化することはない（Ｂｏｇｕｎｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｌｅｕｎｇ，“Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３２，”５１１−５１２  ｅ５１５（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ａｕｇ（１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１３．０６．０３０））。黄色ブドウ球菌へのＣＧＮ株の影響を評価するために、黄色ブドウ球菌の多数の単離菌を、ＣＧＮの培養から得た上澄みの存在下で育てた。平均では、ＨＶ−ＣＧＮからの上澄みは、ほぼ５０％まで黄色ブドウ球菌を阻害した（図１Ｂ；図４）。対照的に、ＡＤ−ＣＧＮは、より変動しやすい効果を有し、およびほとんどの株は阻害に失敗した（図１Ｂ；図４）。阻害性ＣＧＮ上澄みからの黄色ブドウ球菌の新しい培地への再接種は、正常な成長を可能にし、殺菌作用ではなく静菌作用を示唆した。このインビトロ分析と一貫して、マウスの耳上へのＣＧＮと黄色ブドウ球菌の共接種は、さらに黄色ブドウ球菌の産出を減らした（図１Ｃ）。この阻害は、脂質リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の生成に関係し、および市販で購入したＬＰＣ（図８Ｂ）を使用して反復され、本発明の細菌特有の特徴が可能性のある臨床的有益性に関係していることを示した。
【０１３１】
＜実施例４：健康な志願者からのＣＧＮは、ヒトにおける先天免疫を誘導する＞
これらの細菌に対するインビボでのヒト皮膚の免疫反応を測定するために、吸引水疱を健康な志願者（図５Ａ）の前腕上に引き起こし、および以前に記載されたのと同様に上皮の水疱の頂部を除去した（図５Ｂ）（Ｆｏｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｄａｈｌｇｒｅｎ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４１２，”３３３−３４６（２００７）１０．１００７／９７８−１−５９７４５−４６７−４＿２２）。チャレンジチャンバー（図５Ｃ）を使用し、黄色ブドウ球菌阻害の違いに基づいて選択された、ＨＶまたはＡＤのいずれかに由来する致死的に照射されたＲ．ミュコーサ単離菌に、皮膚の水疱基部を接触させた（図１Ｂ）。
【０１３２】
２０−２４時間の刺激の後、ＩＬ−６に関する水疱サイトカインレベル（図２Ａ−２Ｂ）は、ＡＤを伴う患者由来のものと比較して（図２Ａ−２Ｂ）、ＨＶのＲ．ミュコーサに呼応して有意により高かった。インターロイキン（ＩＬ）−１７、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）またはＩＬ−４（図２Ａ）などの従来のＴｈ（Ｔ−ヘルパー）サイトカインのレベルに差異はなく、および他の多くのサイトカイン（図６Ａ）または抗菌性ペプチド（図６Ｂ）のレベルにおける有意差はなかった；しかしながら、適応性のあるＴ細胞サイトカインをさらに、より遅い時間点で測定すべきである。ヒト包皮由来の初代ケラチノサイト（ＫＣ）の、生きたＣＧＮの多数の単離菌へのインビトロでの感染は、異なる単離菌がＫＣ先天免疫マーカーに有する効果の変動性を示し、しかしＡＤ−ＣＧＮと比較して、ＨＶ−ＣＧＮはディフェンシンベータ４ＡのｍＲＮＡの存在量（図７Ａ）、および上流の修飾因子を増強した（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，”１３−２２  （２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｊａｎ−Ｆｅｂ（１０．１１１１／ｊ．１５２９−８０１９．２００９．０１２８７．ｘ）；Ｓｃｈａｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １７，”６３３−６３９（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ａｕｇ（１０．１１１１／ｊ．１６００−０６２５．２００８．００７６８．ｘ））。ＣＹＰ２７ｂ１（ビタミンＤ転換酵素；図７Ｂ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）（図７Ｃ）、および抗菌ペプチドカテリシジン（図７Ｄ）。ＩＬ−１βまたはＩＬ−６に関して転写レベルに差異はなかった（図７Ｅ−７Ｆ）。ＣＤ１４、ＩＬ−８、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、トール様受容体（ＴＬＲ）２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９または胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）ｍＲＮＡの存在量にもまた差異はなく、および黄色ブドウ球菌を阻害し、かつＫＣを活性化する単離菌の能力に明白な相関はなかった。
【０１３３】
＜実施例５：健康な志願者からのＣＧＮは、マウスにおけるバリア機能を保全する＞
ＡＤにおけるバリア機能の損失は、経皮水分損失（ＴＥＷＬ）に起因する肌の乾燥とかゆみ（Ｂｏｇｕｎｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２５，”４−１３；ｑｕｉｚ１４−１５（２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｊａｎ（１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２００９．１１．０２７））、および抗原への皮膚感作（Ｐｙｕｎ，“Ａｌｌｅｒｇｙ，ａｓｔｈｍａ＆ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，”１０１−１０５（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｍａｒ（１０．４１６８／ａａｉｒ．２０１５．７．２．１０１））を引き起こす。患者のサブセットでは、このバリア欠損は、タイトジャンクション構成タンパク質フィラグリンの機能不全に関係する（Ｂａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，”（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ａｐｒ（１０．４１７２／２１５５−９８９９．１０００２０２））。ヒト水疱試験で使用される代表的なＨＶ−ＣＧＮ単離菌の、健康なマウスの耳への局所適用は、ＡＤ−ＣＧＮ単離菌（図２Ｃ）と比較して、耳の紅斑または厚さの顕著な変化を伴うことなくフィラグリンの転写レベルを増強した。ＡＤ−ＣＧＮの適用はＴＥＷＬを増強し、一方でＨＶ−ＣＧＮは何の効果もなかった（図２Ｄ）。総合すると、健康な状態に関係するＣＧＮの株は、ビタミンＤの活性化、先天免疫の刺激およびバリア機能の保全に関する、潜在的に有益な免疫効果を誘発することを、これらのデータは示唆している。
【０１３４】
＜実施例６：健康な志願者からのＣＧＮは、ＡＤのマウスモデルにおける結果を改善する＞
ＭＣ９０３、ビタミンＤ類似体は、マウスの耳に適用された時にＡＤ様皮膚炎を誘発する（２２）。ＨＶ供給Ｒ．ミュコーサ単離菌の同時適用は、耳の厚さにより測定されるように、ＭＣ９０３誘発皮膚炎の発症を防いだ（図３Ａ）。対照的に、ＡＤ供給Ｒ．ミュコーサ単離菌は、ＫＣ活性化（図７）および黄色ブドウ球菌阻害（図１Ｂ）に対するＨＶ供給緑膿菌の影響にもかかわらず、ＨＶ供給緑膿菌のように（図３Ａ）疾患発症を防ぐことはできなかった。ＡＤ供給Ｒ．ミュコーサの適用は、血清ＩｇＥ誘発を高めたが、ＨＶ供給Ｒ．ミュコーサは有意な影響を全く示さなかった（図３Ｂ）。健康なマウスの耳への接種と一貫して、フィラグリンの転写レベルは、ＡＤ供給Ｒ．ミュコーサに接触させたＭＣ９０３処置マウスにおいて有意により低かった（図９）。
【０１３５】
ＣＧＮの治療上の潜在力を試験するために、ＡＤ様皮膚炎をＭＣ９０３で誘発し、次に３日間毎日ＣＧＮを接種した。ＨＶ−Ｒ．ミュコーサを用いた処置は、耳の厚みおよび目に見える赤みの減少に関係した（図３Ｃ−３Ｄ）。生きたバイオ治療が必要であるか、または表面因子および分泌因子が単独で同様の結果をもたらすかを評価するために、上澄みで懸濁された致死的に照射されたＨＶ−ＣＧＮの等価なＣＦＵ濃縮物を適用した。この「死んだ混合物」および上澄みは単独でいかなる有益性ももたらすことはなく、および各々が耳の厚みを増加させた（図３Ｃ−３Ｄ）。
【０１３６】
ゲノムワイド関連解析（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２５，”１６−２９  ｅ１１−１１；ｑｕｉｚ  ３０−１１（２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｊａｎ（１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２００９．１１．００８））、および黄色ブドウ球菌の特性評価が、ＡＤの病因を解明しているが、多くの原因の根本が謎のままである。宿主応答および黄色ブドウ球菌の集落形成を標的とする現在の治療アプローチは、ＡＤ症状を有意に改善することができるが、成功した場合であっても、これらの処置は治癒的ではなく、および患者とその家族にかなりの感情的な犠牲を求める（２４）。本明細書に開示される試験は、ＡＤで報告された腸内菌共生バランス失調が単に関連する結果であるだけでなく、病理の要因であり得ることを証明する。健康な対照から単離されたＲ．ミュコーサの株は、ＡＤの多くの特徴に影響を与えることができ、バリア機能を改善し、先天免疫の活性化を増強し、および黄色ブドウ球菌の成長を制限した。他のグラム陰性菌は類似の効果を提供することができた。
【０１３７】
グラム陰性Ｖ．フィリフォルミス可溶化液をスキンクリームに加えることで、ＡＤ処置における有益性がもたらされる場合もある（Ｇｕｅｎｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １５９，”１３５７−１３６３（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ（Ｅｐｕｂ）Ｄｅｃ（１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１３３．２００８．０８８３６．ｘ））。しかしながら、死んだＲ．ミュコーサの有効性の欠如は、生きた共生生物のいない単離された分泌産物および／または表面産物の使用が有益性をもたらさないかもしれないことを示唆する。理論によって制限されることなく、宿主共生動物の動的な相互作用がＲ．ミュコーサの臨床的有用性に求められる場合もあり、および集落形成の可能性は、限定的な再適用の利点およびさらなる生理学的薬物動態を提供する。
【０１３８】
本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態の観点から、例示された実施形態は本発明の単なる例であり、および本発明の範囲を制限すると考えられるべきでないことを、認識すべきである。むしろ本発明の範囲は以下の請求項によって規定される。したがって、本発明はすべて、これらの請求項の範囲および趣旨内にあることを主張する。
【図１Ａ】
2019513769.tif 000003
【図１Ｂ】
2019513769.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2019513769.tif 000009
【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2019513769.tif 000011
【図３Ｂ】
2019513769.tif 000012
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2019513769.tif 000014
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019513769.tif 000017
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2019513769.tif 000019
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2019513769.tif 000022
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2019513769.tif 000024
【図７Ｅ】
2019513769.tif 000025
【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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