(57)【要約】  一般式Ｉで示される置換三環式複素環化合物又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ、上記構造を含む医薬組成物及びそれらの用途を提供する。置換三環式複素環化合物及び本明細書に開示の化合物を含む医薬組成物は、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症の治療に使用できる。また、このような化合物及び本明細書に開示の化合物を含む医薬組成物は、任意の異常キナーゼ活性に起因、関連又は随伴する病症の予防又は治療にも使用できる。【化１】2019524658.tif 000096【選択図】なし
2019524658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2019524658.tif 000083
（式中、
ＶはＣＨ又はＮであり、
ＷはＮ又はＯであり、
Ｒ１は存在せず、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−５アルキル−Ｃ１−１０ヘテロアリール、又はＣ１−５アルキル−Ｃ６−１４アリール（ここで、前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−５アルキル−Ｃ１−１０ヘテロアリール及びＣ１−５アルキル−Ｃ６−１４アリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル及びＣ２−７ヘテロシクロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）であり、
Ｘ１は結合、ＣＯ又は−（ＣＨ２）ｎ−であり、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１４アリール又はＣ１−１０ヘテロアリールであり、Ｒ２及びＲ３はそれらに結合している炭素原子とともに、Ｃ３−Ｃ１０炭素環又は３〜１０員複素環を形成してもよく（ここで、前記−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０炭素環及び３〜１０員複素環はそれぞれ独立に、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）、
Ｚは結合、ＮＲ２、−（ＣＨ２）ｎ−又は−（ＣＲ２Ｒ３）−（ここで、前記ＮＲ２、−（ＣＨ２）ｎ−及び−（ＣＲ２Ｒ３）−はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、−Ｈ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ３-７−シクロアルキル、Ｃ２−７−ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール又はＣ１−１０−ヘテロアリール（ここで、前記Ｃ１−６−アルキル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ｃ２−７−ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール及びＣ１−１０−ヘテロアリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、及び−ＣＯ２Ｈから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）から選択される。）で示される化合物又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ。
【請求項２】
Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ１−３アルキル−Ｃ１−７ヘテロアリール、又はＣ１−３アルキル−Ｃ６−１０アリール（ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ１−３アルキル−Ｃ１−７ヘテロアリール、及びＣ１−３アルキル−Ｃ６−１０−アリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、及びＣ３−７ヘテロシクロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１はＣＯ、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、又は−（ＣＨ２）３−である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１０アリール又はＣ３−８ヘテロアリールであり、Ｒ２及びＲ３はそれらに結合している炭素原子とともに、Ｃ３−Ｃ８炭素環又は３〜８員複素環を形成してもよい（ここで、前記−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８炭素環及び３〜８員複素環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、
【化２】
2019524658.tif 000084
又は
【化３】
2019524658.tif 000085
（ここで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３及びＱ４はそれぞれ独立にＣ又はＮであり、且つＱ１、Ｑ２、Ｑ３及びＱ４はそれぞれ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよく、
Ｑ５、Ｑ６及びＱ７はそれぞれ独立にＣ、Ｎ、Ｏ又はＳであり、且つＱ５、Ｑ６及びＱ７はそれぞれ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよい。）である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚは結合、ＮＲ２、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＲ２Ｒ３）−であり、ここで、前記ＮＲ２、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−及び−（ＣＲ２Ｒ３）−はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、−Ｈ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ３−５シクロアルキル、Ｃ３−５ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−８アリール又はＣ３−８ヘテロアリール（ここで、前記Ｃ１−３アルキル、Ｃ３−５シクロアルキル、Ｃ３−５ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−８アリール及びＣ３−８ヘテロアリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、及び−ＣＯ２Ｈから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１は、
【化４】
2019524658.tif 000086
から選択され、
好ましくは、Ｒ１は、
【化５】
2019524658.tif 000087
から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、ベンゼン環、５〜６員複素芳香環、Ｃ６−１０アリール又はＣ３−８ヘテロアリールであり、Ｒ２及びＲ３はそれらに結合している炭素原子とともに、Ｃ３−Ｃ６炭素環又は３〜６員複素環を形成してもよい（ここで、前記ベンゼン環、５〜６員複素芳香環、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ６炭素環及び３〜６員複素環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、−ＣＦ３、及びＣ１−３ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。）請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｙは、
【化６】
2019524658.tif 000088
から選択され、
好ましくは、Ｙは、
【化７】
2019524658.tif 000089
から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物は、以下のいずれかの構造を有するもの、又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグであり、
【化８】
2019524658.tif 000090
【化９】
2019524658.tif 000091
【化１０】
2019524658.tif 000092
【化１１】
2019524658.tif 000093
好ましくは、前記化合物は、以下のいずれかの構造を有するもの、又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグである請求項１に記載の化合物。
【化１２】
2019524658.tif 000094
【化１３】
2019524658.tif 000095
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組合せをさらに含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
第二治療薬をさらに含む請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症を治療するための医薬の調製における用途。
【請求項１６】
前記神経変性疾患はパーキンソン病である請求項１５に記載の用途。
【請求項１７】
癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症を治療する方法であって、被験者に治療有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記神経変性疾患はパーキンソン病である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症の治療における使用。
【請求項２０】
前記神経変性疾患はパーキンソン病である請求項１９に記載の前記化合物又は医薬組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の、任意の異常キナーゼ活性に起因、関連又は随伴する病症を予防又は治療するための医薬の調製における用途。
【請求項２２】
前記キナーゼはＬＲＲＫである請求項２１に記載の用途。
【請求項２３】
前記キナーゼはＬＲＲＫ２である請求項２２に記載の用途。
【請求項２４】
任意の異常キナーゼ活性に起因、関連又は随伴する病症を予防又は治療する方法であって、被験者に治療有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記キナーゼはＬＲＲＫである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記キナーゼはＬＲＲＫ２である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の、任意の異常キナーゼ活性に起因、関連又は随伴する病症を予防又は治療における使用。
【請求項２８】
前記キナーゼはＬＲＲＫである請求項２７に記載の化合物又は医薬組成物の使用。
【請求項２９】
前記キナーゼはＬＲＲＫ２である請求項２８に記載の化合物又は医薬組成物の使用。
【請求項３０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の、キナーゼを阻害できる別の候補化合物を同定するための試験における用途。
【請求項３１】
前記キナーゼはＬＲＲＫである請求項３０に記載の用途。
【請求項３２】
前記キナーゼはＬＲＲＫ２である請求項３１に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は２０１６年６月１５日に国家知識産権局に提出した出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８５８１１の国際特許出願の優先権及び権益を主張し、その全内容は引用により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は製薬の技術分野に属し、より具体的には化合物、それを含む組成物、及び両者の癌、神経変性疾患による病症の治療における用途に関する。特に、本明細書は１種以上のキナーゼ、特にＬＲＲＫ、さらに特にＬＲＲＫ２を阻害できる置換三環式複素環化合物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は２番目に罹患しやすい神経変性疾患であり、高齢者の１−２％に影響を及んでいる［１］。ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は非家族性ＰＤの２４個の部位に２８種の関連する遺伝的リスク変異体を有する［２］。そのうち、ＬＲＲＫ２（Ｐａｒｋ８）における突然変異も遺伝的であることが見出され、家族性ＰＤ及び非家族性ＰＤの両方において発病メカニズムを駆動する共有分子経路（最も一般的な疾患の原因も含み）が確定される［３，４］。ＰＤ病原性ＬＲＲＫ２突然変異マップは主にキナーゼ（Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ）とＲＯＣ−ＣＯＲドメイン（Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｙ１６９９Ｃ）に関連しているため、これらの酵素活性が発病メカニズムについて非常に重要であることを示している［５］。病原性突然変異の頻度は全体的に２％程度で珍しいが［６，７］、特定の人種の４０％と高い患者から、該キナーゼを２〜３倍活性化する、かかる最も一般的な突然変異Ｇ２０１９Ｓが見られる［８−１３］。病原性突然変異の他、ＬＲＲＫ２中の一般的な遺伝的変異性は散発性ＰＤの危険要素である［１４−１６］。
【０００４】
２００４年、ＬＲＲＫ２はＰＡＲＫ８遺伝子座に関連するＰＤ遺伝を担う遺伝子として同定され［１７，１８］、それは５１個のエクソンからなり、比較的に大きな（２６８  ｋＤａ）タンパク質を生成させることが判明される。続いて、家族性ＰＤから単離された散発性ＰＤにも見られる優性突然変異、及び散発性ＰＤ発症の生涯リスクを増大させるＬＲＲＫ２遺伝子座での多型等のＬＲＲＫ２一次構造中の多くの変異体が同定されている［２０−２２］。
【０００５】
ＬＲＲＫ２はコアが２種の酵素機能を含むマルチドメインタンパク質である。Ｒｏｃドメインと呼ばれるもののＣ−末端（ＣＯＲ）で終結するスペーサードメインの複合タンパク質（ＲＯＣ）のＲａｓからなるＧＴＰ酵素ドメインに、セリン／トレオニンキナーゼに属するキナーゼドメインが続く。このような酵素コアはＬＲＲＫ２のＮ末端の、プリオンタンパク質、アンキリン及びロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを含むタンパク質−タンパク質相互作用ドメインによって囲まれている［２３］。ＬＲＲＫ２のＣ末端はタンパク質の折り畳みに必要であると考えられるＷＤ４０ドメインを含み、それによってＬＲＲＫ２機能及びキナーゼ活性を制御する［２４］。興味深いこととして、これまでに記載されている主要な病原性突然変異はＬＲＲＫ２の酵素コア内で生じていることから、ＬＲＲＫ２活性の改変がＰＤの発症及び進行に大きな影響を与えることを示す。
【０００６】
現在まで、４０種近くの単一アミノ酸置換突然変異は常染色体優性ＰＤと関連している［２５，２６］。  ヨーロッパの家族性ＰＤの約６％及び散発性ＰＤの症例の３％を占めるＬＲＲＫ２の最も一般的な突然変異型はＳｅｒ残基に対するＧｌｙ２０１９のアミノ酸置換を含む。Ｇｌｙ２０１９は保存されたＤＹＧ−Ｍｇ２＋−結合モチーフ内に位置し、キナーゼドメインのサブドメイン−ＶＩＩ中にある［２５］。最新の報道によれば、このような突然変異はＬＲＲＫ２の自己リン酸化を強化し、及びミエリン塩基性タンパク質を２−３倍リン酸化する能力を高める［８，１２，２７］。細胞株と初代ニューロン培養においてＧ２０１９Ｓ−ＬＲＲＫ２が過剰発現されると、酸化ストレスの非存在下と存在下での細胞毒性、及び封入体の形成が観察される［２７，２８］。これらの結果及びＬＲＲＫ２キナーゼ活性の遺伝的不活性化から、このような毒性表現型への防御効果が示され、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の変化がＬＲＲＫ２−ＰＤの神経毒性及び病因メカニズムに潜在的に関与していることを示唆する。
【０００７】
ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓパーキンソン病患者に由来する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は神経突起伸長及びロテノンに対する感受性の増加の欠陥を示すことが見出されており、Ｇ２０１９Ｓ突然変異を遺伝的修正する又はＬＲＲＫ２キナーゼ活性を有する小分子阻害剤を用いて細胞を治療することにより改善できる［２９］。ｉＰＳＣにおけるＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓ突然変異に関連するミトコンドリア損傷の増加もＧ２０１９Ｓ突然変異の遺伝的修正によってブロックされている［３０］。
【０００８】
別の証拠によると、ＬＲＲＫ２機能及び機能不全がオートファジーリソソーム経路に関連付けられている［３１］。ＬＲＲＫ２タンパク質はシャペロン介在性オートファジーにおける欠陥を引き起こし、細胞がα−シヌクレインを分解する能力に悪影響を及ぼす［３２］。ほかの細胞モデルでは、選択的ＬＲＲＫ２阻害剤はマクロファージの貪食を刺激できることが明らかになる［３３］。これらのデータから分かるように、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性を有する小分子阻害剤は、ＧＢＡ突然変異に関連するパーキンソン病［３４］、ほかのα−シヌクレイン病、タウオパチー、アルツハイマー病［３５］及びほかの神経変性疾患［３６］やゴーシェ病［３７］等を含む、異常オートファジー／リソソーム分解経路によって引き起こされる細胞タンパク質分解欠陥を特徴とする疾患を効果的に治療できる。また、正常被験者の線維芽細胞に比べて、Ｃ型Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ（ＮＰＣ）病患者の線維芽細胞にもＬＲＲＫ２  ｍＲＮＡのレベルが明らかに上昇していることが観察され、異常なＬＲＲＫ２機能はリソソーム疾患に有効である可能性があることを示す［３８］。この観察結果から分かるように、ＬＲＲＫ２阻害剤はＮＰＣの治療に有効である可能性がある。
【０００９】
ＰＤに関連するＧ２０１９Ｓ突然変異型のＬＲＲＫ２がチューブリン関連Ｔａｕタンパク質のリン酸化を強化することがさらに報道されており［３９］、且つＬＲＲＫ２がＴａｕとα−シヌクレインの病因の上流で作用する疾患モデル［４０］が提案されている。これをサポートするために、トランスジェニックマウスモデルでは、ＬＲＲＫ２発現は、増加した不溶性Ｔａｕ凝集と増加したＴａｕリン酸化に関連している［４１］。報道によれば、ＰＤ病原性変異タンパク質ＬＲＲＫ２  Ｒ１４４１  Ｇの過剰発現はトランスジェニックマウスモデルにおけるパーキンソン病の病症及びＴａｕ過剰リン酸化を引き起こす［４２］。従って、これらのデータから分かるように、キナーゼ触媒活性を有するＬＲＲＫ２阻害剤は、たとえば嗜銀顆粒性認知症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、及び１７番染色体に関連する遺伝性前頭側頭型認知症やパーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）のようなＴａｕ過剰リン酸化を特徴とするタウオパチーを治療できる［４３］。また、ＬＲＲＫ２阻害剤はたとえば薬物嗜癖に関連する禁断病症／再発のようなドーパミンレベルの低下を特徴とするほかの疾患を治療できる効能を有してもよい［４４］。
【発明の概要】
【００１０】
一態様によれば、本明細書は一般式（Ｉ）の化合物又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグを提供する。
【化１】
2019524658.tif 000003
式中、
ＶはＣＨ又はＮであり、
ＷはＮ又はＯであり、
Ｒ１は存在せず、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−５アルキル−Ｃ１−１０ヘテロアリール、又はＣ１−５アルキル−Ｃ６−１４アリールであり、ここで、前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−５アルキル−Ｃ１−１０ヘテロアリール及びＣ１−５アルキル−Ｃ６−１４アリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル及びＣ２−７ヘテロシクロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよく、
Ｘ１は結合、ＣＯ又は−（ＣＨ２）ｎ−であり、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１４アリール又はＣ１−１０ヘテロアリールであり、Ｒ２及びＲ３はそれらに結合している炭素原子とともにＣ３−Ｃ１０炭素環又は３〜１０員複素環を形成してもよく、ここで、前記−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１０炭素環及び３〜１０員複素環はそれぞれ独立に、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよく、
Ｚは結合、ＮＲ２、−（ＣＨ２）ｎ−又は−（ＣＲ２Ｒ３）−であり、ここで、前記ＮＲ２、−（ＣＨ２）ｎ−及び−（ＣＲ２Ｒ３）−はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよく、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３-７シクロアルキル、Ｃ２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール又はＣ１−１０ヘテロアリールから選択され、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール及びＣ１−１０ヘテロアリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、及び−ＣＯ２Ｈから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ１−３アルキル−Ｃ１−７ヘテロアリール、又はＣ１−３アルキル−Ｃ６−１０アリールであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ１−３アルキル−Ｃ１−７ヘテロアリール、及びＣ１−３アルキル−Ｃ６−１０アリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、及びＣ３−７ヘテロシクロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＣＯ、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、又は−（ＣＨ２）３−である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１０アリール又はＣ３−８ヘテロアリールであり、Ｒ２及びＲ３はそれらに結合している炭素原子とともにＣ３−Ｃ８炭素環又は３〜８員複素環を形成してもよく、ここで、前記−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８炭素環及び３〜８員複素環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、
【化２】
2019524658.tif 000004
又は
【化３】
2019524658.tif 000005
であり、
ここで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３及びＱ４はそれぞれ独立にＣ又はＮであり、且つＱ１、Ｑ２、Ｑ３及びＱ４はそれぞれ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよく、
ここで、Ｑ５、Ｑ６及びＱ７はそれぞれ独立にＣ、Ｎ、Ｏ又はＳであり、且つＱ５、Ｑ６及びＱ７はそれぞれ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｚは結合、ＮＲ２、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−又は−（ＣＲ２Ｒ３）−であり、ここで、前記ＮＲ２、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−及び−（ＣＲ２Ｒ３）−はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、−Ｈ、Ｃ１−３−アルキル、Ｃ３−５シクロアルキル、Ｃ３−５ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−８アリール又はＣ３−８ヘテロアリールから選択され、ここで、前記Ｃ１−３アルキル、Ｃ３−５シクロアルキル、Ｃ３−５ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−８アリール及びＣ３−８ヘテロアリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、及び−ＣＯ２Ｈから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、
【化４】
2019524658.tif 000006
から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は好ましくは、
【化５】
2019524658.tif 000007
から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＲ２Ｒ３）−、ベンゼン環、５〜６員複素芳香環、Ｃ６−１０アリール又はＣ３−８ヘテロアリールであり、Ｒ２及びＲ３はそれらに結合している炭素原子とともにＣ３−Ｃ６炭素環又は３〜６員複素環を形成してもよく、ここで、前記ベンゼン環、５〜６員複素芳香環、Ｃ６−１０アリール、Ｃ３−８ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ６炭素環及び３〜６員複素環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、−ＣＦ３、及びＣ１−３ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｙは、
【化６】
2019524658.tif 000008
から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｙは好ましくは、
【化７】
2019524658.tif 000009
から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書は以下のいずれかの構造を有する化合物、又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグを提供する。
【化８】
2019524658.tif 000010
【化９】
2019524658.tif 000011
【化１０】
2019524658.tif 000012
【化１１】
2019524658.tif 000013
【００２３】
いくつかの実施形態では、本明細書は、好ましくは以下のいずれかの構造を有する化合物、又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグを提供する。
【化１２】
2019524658.tif 000014
【化１３】
2019524658.tif 000015
【００２４】
別の態様によれば、本明細書は、本明細書に開示されている化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組合せをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物は、第二治療薬をさらに含む。
【００２７】
別の態様によれば、本明細書は、本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物の、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症を治療するための医薬の調製における用途を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００２９】
別の態様によれば、本明細書は、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症を治療する方法を提供し、被験者に治療有効量の本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物を投与することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００３１】
別の態様によれば、本明細書は、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症の治療に使用される本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００３３】
別の態様によれば、本明細書は、本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物の、任意の異常キナーゼ活性に起因する、関連する又は随伴する病症を予防又は治療するための医薬の調製における用途を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００３６】
別の態様によれば、本明細書は、任意の異常キナーゼ活性に起因する、関連する又は随伴する病症を予防又は治療する方法を提供し、被験者に治療有効量の本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物を投与することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００３９】
別の態様によれば、本明細書は、任意の異常キナーゼ活性に起因する、関連する又は随伴する病症の予防又は治療に使用される、本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００４２】
別の態様によれば、本明細書は、本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物の、キナーゼを阻害できるほかの候補化合物を同定するための試験における用途を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００４５】
別の態様によれば、本明細書は一般式ＩＩの化合物、又はその立体異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、代謝産物、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグを提供する。
【化１４】
2019524658.tif 000016
式中、ＶはＣＨ又はＮであり、
ＷはＮ又はＯであり、
Ｒ１は存在せず、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−５アルキル−Ｃ１−１０−ヘテロアリール、又はＣ１−５−アルキル−Ｃ６−１４−アリールであり、ここで、前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ１−１０ヘテロアリール、Ｃ１−５アルキル−Ｃ１−１０−ヘテロアリール及びＣ１−５−アルキル−Ｃ６−１４−アリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ２−７ヘテロシクロアルキル、アミド類、スルファニルアミド類及びスルホン類から選択される１個以上の置換基により置換されていてもよく、
Ｘ１は結合、ＣＯ、又は−（ＣＨ２）ｎ−であり、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−であり、
Ｚは結合、Ｎ、又は−（ＣＨ２）ｎ−であり、
Ｒ４はそれぞれ独立に、存在せず、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、又はＣ１−６ハロアルキルであり、２つのＲ４はそれらに結合しているＹとともにＣ３−Ｃ１０炭素環又は３〜１０員複素環を形成してもよく、ここで、前記Ｃ３−Ｃ１０炭素環及び３〜１０員複素環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよく、
Ｒ５は存在せず、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルであり、Ｒ４及びＲ５はそれらに結合しているＹ−Ｚとともにベンゼン環、Ｃ３−Ｃ１０炭素環、３〜１０員複素環又は５〜１０員複素芳香環を形成してもよく、ここで、前記ベンゼン環、Ｃ３−Ｃ１０炭素環、３〜１０員複素環及び５〜１０員複素芳香環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよく、
ｋは０、１、２、３又は４であり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、
いくつかの実施形態では、Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−８ヘテロアリール、Ｃ１−３アルキル−Ｃ１−８−ヘテロアリール、又はＣ１−３−アルキル−Ｃ６−１０−アリールであり、ここで、前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−８ヘテロアリール、Ｃ１−３アルキル−Ｃ１−８−ヘテロアリール、及びＣ１−３−アルキル−Ｃ６−１０−アリールはそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、及びＣ３−７ヘテロシクロアルキルから選択される１種以上の置換基により置換されていてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＣＯ、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、又は−（ＣＨ２）３−である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ｙは−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、又は−（ＣＨ２）３−である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｚは結合、Ｎ、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、又は−（ＣＨ２）３−である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、Ｒ４はそれぞれ独立に、存在せず、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−３アルキル、又はＣ１−３ハロアルキルであり、Ｙに結合している２つのＲ４はＹとともにＣ３−Ｃ７炭素環又は３〜７員複素環を形成してもよく、ここで、前記Ｃ３−Ｃ７炭素環及び３〜７員複素環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、及びＣ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、Ｒ５は存在せず、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−３アルキル、又はＣ１−６ハロアルキルであり、Ｒ４及びＲ５はそれらに結合しているＹ−Ｚとともにベンゼン環、Ｃ３−Ｃ７炭素環、３〜７員複素環又は５〜７員複素芳香環を形成してもよく、ここで、前記ベンゼン環、Ｃ３−Ｃ７炭素環、３〜７員複素環及び５〜７員複素芳香環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルから選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、
【化１５】
2019524658.tif 000017
から選択される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、Ｒ５は存在せず、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、Ｃ１−３アルキル、又はＣ１−３ハロアルキルであり、Ｒ４及びＲ５はそれらに結合しているＹ−Ｚとともにベンゼン環又はピラゾール環を形成してもよく、ここで、前記ベンゼン環及びピラゾール環はそれぞれ独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、及び−ＣＦ３から選択される１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００５３】
別の態様によれば、本明細書は、本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組合せをさらに含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物は、第二治療薬をさらに含む。
【００５６】
別の態様によれば、本明細書は、一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物の、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症を治療するための医薬の調製における用途を提供する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００５８】
別の態様によれば、本明細書は、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による疾患を治療する方法を提供し、被験者に治療有効量の一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００６０】
別の態様によれば、本明細書は、癌及び神経変性疾患のうちの少なくとも１種による病症の治療に使用される、一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００６２】
別の態様によれば、本明細書は、一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物の、任意の異常キナーゼ活性に起因する、関連する又は随伴する病症を予防又は治療するための医薬の調製における用途を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００６５】
別の態様によれば、本明細書は、任意の異常キナーゼ活性に起因する、関連する又は随伴する病症を予防又は治療する方法を提供し、被験者に治療有効量の一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００６８】
別の態様によれば、本明細書は、任意の異常キナーゼ活性に起因する、関連する又は随伴する病症の予防又は治療に使用される、一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【００７１】
別の態様によれば、本明細書は、キナーゼを阻害できるほかの候補化合物を同定するための試験における、一般式ＩＩの化合物又は本明細書に開示されている一般式ＩＩの化合物を含む医薬組成物の用途を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、キナーゼはＬＲＲＫ２である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
定義及び公知の用語
本発明に引用されるすべての参考文献はその全内容が引用により本明細書に取り込まれ、且つ引用した参考文献が本発明に一致しない場合、本開示に準じる。また、本明細書に使用されるすべての用語及び語句は当業者が周知する一般的な意味を有する。それにも関わらず、本発明の用語及び語句をさらに詳細に説明する必要がある。言及された用語及び語句は周知する意味に一致しない場合、本開示に準じる。検討する用語は単独に出現するか組合せの形態で出現するかに関わらず、本明細書に使用される通常の用語の下記定義を適用できる。
【００７５】
例えば、本明細書に使用される冠詞「１個（ａ）」、「１種（ａｎ）」及び「該（ｔｈｅ）」は、特に断らない限り又はコンテキストと矛盾しない限り、「少なくとも１個」又は「１個以上」を含むことを意味する。従って、本明細書に使用される冠詞とは、１個又は１個より多い（すなわち、少なくとも１個）対象を意味する。例として、「成分」とは１個以上の成分を含み、従って１個超の成分も考慮でき、且つ説明される実施形態において採用又は使用できる。
【００７６】
本明細書に記載するように、本明細書に開示されている化合物は、通常下に例示する、又は本発明の特定のクラス、サブクラス及び種によって例示される１個以上の置換基により置換されてもよい。
【００７７】
用語「ハロゲン」とはフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）又はヨウ素（Ｉ）である。
【００７８】
用語「アルキル」とは、１−１０個の炭素原子を含有する飽和直鎖状又は分岐状の一価炭化水素基である。特に断らない限り、アルキル基は１−１０個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、アルキル基は１−８個の炭素原子を含有し、ほかの実施形態では、アルキル基は１−６個の炭素原子を含有し、さらにほかの実施形態では、アルキル基は１−４個の炭素原子を含有し、またほかの実施形態では、アルキル基は１−３個の炭素原子を含有する。アルキル基は本明細書に説明された１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００７９】
アルキル基の例として、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、ｎ−プロピル（ｎ−Ｐｒ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、イソプロピル（ｉ−Ｐｒ、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、ｎ−ブチル（ｎ−Ｂｕ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、ｓｅｃ−ブチル（ｓ−Ｂｕ、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ、−Ｃ（ＣＨ３）３）、ｎ−ペンチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、ｎ−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
用語「シクロアルキル」とは、３−１０個の炭素原子を有する一価又は多価の飽和環であり、例えば単環、二環又は三環の環系である。そして二環又は三環の環系は縮合環、架橋環及びスピロ環を含んでもよい。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基は３−８個の炭素原子を含有する。ほかの実施形態では、シクロアルキル基は３−６個の炭素原子を含有する。シクロアルキル基（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ）は本明細書に説明された１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００８１】
用語「アリール」とは、計６−１２個の環員、好ましくは６−１０個の環員、さらに好ましくは６個の環員を有する一価又は多価の単環、二環又は三環炭素環系であり、且つ該系の少なくとも１個の環は芳香族である。アリール基は、通常、アリール基の芳香環によって親分子に結合されるが、これに限定されない。用語「アリール」及び「芳香環」は本明細書では互換的に使用できる。アリール基の例として、フェニル、ナフチル、アントラセン等が挙げられる。アリール基（ａｒｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ）は本明細書に説明された１個以上の置換基により置換されていてもよい。
【００８２】
用語「ヘテロアリール」とは、計５−１０個の環員を有する一価又は多価の単環、二環又は三環の環系であり、且つ該系の少なくとも１個の環は芳香族であり、且つ少なくとも１個の環は１個以上のヘテロ原子を含有する。ヘテロアリール基は通常、ヘテロアリール基の芳香環によって親分子に結合されるが、これに限定されない。用語「ヘテロアリール」及び「複素芳香環」又は「複素芳香族化合物」は本明細書では互換的に使用できる。ヘテロアリール基は本明細書に開示されている１個以上の置換基により置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、５〜１０員ヘテロアリール基は、それぞれ独立にＯ、Ｓ及びＮから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を含有し、いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロアリールは単環系であり、且つそれぞれ独立にＯ、Ｓ及びＮから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を含有する。
【００８３】
ヘテロアリール環の例として、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル等及びそれらのベンゾ誘導体、たとえばベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンズイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾール等、又はピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル等及びそれらのベンゾ誘導体、たとえばキノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
「ヘテロシクロアルキル」とは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１個以上のヘテロ原子を含有する環状脂肪族基であり、環において１個以上の−（ＣＯ）−基で中断されてもよく、及び／又は環において１個以上の二重結合を含有してもよい。或いは、ヘテロシクロアルキル基はＣ４−７−ヘテロシクロアルキル、より好ましくはＣ４−６−ヘテロシクロアルキルである。好ましくは、ヘテロシクロアルキル基は、ピペラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル及びテトラヒドロピラニルを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明に係る化合物についての説明
【００８６】
治療応用
【００８７】
本発明の別の態様は、医薬における上記化合物の使用に関する。
【００８８】
本発明の別の態様は、癌又は神経変性疾患の治療における上記化合物の使用に関する。
【００８９】
別の態様は、神経変性疾患を治療又は予防するための医薬の調製における上記化合物の用途に関する。好ましくは、神経変性疾患はパーキンソン病である。
【００９０】
別の態様は、増殖性疾患、たとえば癌を治療又は予防するための医薬の調製における上記化合物の用途に関する。
【００９１】
好ましくは、１種以上のキナーゼ、好ましくはＬＲＲＫ、より好ましくはＬＲＲＫ２を阻害できる量の該化合物を投与する。
【００９２】
さらに別の態様は、キナーゼ、より好ましくはＬＲＲＫ、さらにより好ましくはＬＲＲＫ２である生物学的標的に対する任意の異常活性に起因する、関連する又は随伴する病症を予防又は治療するための医薬の調製における、本発明に係る化合物の用途に関する。
【００９３】
好ましくは、該病症はパーキンソン病である。
【００９４】
本発明の別の態様は、プロテインキナーゼ関連の疾患又は病症を治療する方法に関する。本発明の該態様に係る方法は、治療有効量の上記本発明に係る化合物のみ、又はより好ましくはたとえば後述する薬学的に許容される担体と混合してなる医薬組成物を対象となる被験者に投与することによって実現される。
【００９５】
本発明のさらに別の態様は、プロテインキナーゼの阻害によって軽減される病症を有する哺乳動物を治療する方法に関し、該方法は、治療有効量の本発明に係る化合物を哺乳動物に投与することを含む。
【００９６】
好ましくは、病症は、プロテインキナーゼＬＲＲＫ、より好ましくはＬＲＲＫ２の阻害によって軽減される。
【００９７】
好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９８】
用語「方法」とは、所定のタスクを達成するための方式、手段、技術及び手順であり、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学分野の当業者に知られている方式、手段、技術及び手順、又は当業者に知られている方式、手段、技術及び手順から開発しやすい方式、手段、技術及び手順を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
本明細書に使用される用語「投与」とは、直接的に、すなわちプロテインキナーゼ自体と相互作用することによって、又は間接的に、プロテインキナーゼの触媒活性が依存するほかの分子と相互作用することによって、プロテインキナーゼの酵素活性に影響を及ぼすように、本発明に係る化合物をプロテインキナーゼと組み合わせる方法である。本明細書に使用されるように、インビトロ（すなわち試験管内）、又はインビボ（すなわち生体の細胞又は組織内）で投与される。
【０１００】
本明細書では、用語「治療」は、疾患又は病症の進行を排除し、実質的に阻害し、緩和し又は逆転し、疾患又は病症の臨床症状を実質的に改善し、又は疾患又は病症の臨床症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０１０１】
本明細書では、用語「予防」とは、最初の場所で、生物が病症又は疾患を患うのを阻止する方法である。
【０１０２】
用語「治療有効量」とは、治療対象の疾患又は病症の１種以上の症状をある程度緩和できる量の化合物を投与することである。
【０１０３】
本発明に使用される任意の化合物について、治療有効量（本明細書では治療有効用量とも呼ばれる）は細胞培養アッセイから最初に推定される。例えば、ある用量は、細胞培養物で決定されるＩＣ５０又はＩＣ１００を含む血中濃度範囲を達成するための動物モデルにおいて製剤化され得る。これらの情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用できる。初期用量はまた、インビボデータから推定され得る。これらの初期ガイドラインを用いて、当業者はヒトにおける有効用量を決定することができる。
【０１０４】
また、本明細書に記載の化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手段によって、例えば、ＬＤ５０及びＥＤ５０を決定することによって決定できる。毒性と治療効果との用量比は、治療的指標であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表現できる。高い治療的指標を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のために毒性でない用量範囲を策定する点で使用できる。これらの化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか又はまったくないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。用量は、採用された投薬剤形及び利用された投与経路によってこの範囲内で変動できる。正確な製剤化、投与経路及び用量は、患者の状態に応じて個々の医師によって選択できる（例えば、Ｆｉｎｇｌ等，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１章，第１頁参照）。
【０１０５】
用量及び間隔は、治療効果を維持するために十分である活性化合物の血漿レベルを提供するように個別に調整できる。経口投与用の通常の患者の用量は、約１−２０００ｍｇ／ｋｇ／日、一般的には、約２−１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５−７００ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約１０−５００ｍｇ／ｋｇ／日である。好ましくは、治療上有効な血清レベルは、毎日複数回投与することによって達成される。局所投与又は選択的取り込みの場合には、薬物の有効局所濃度は血漿濃度に関連しない可能性がある。当業者は過度な実験をすることなく治療上有効な局所用量を最適化できる。
【０１０６】
本明細書に使用されるように、「キナーゼ関連の疾患又は病症」とは、本明細書で定義された不適切なキナーゼ活性又はキナーゼの過剰活性を特徴とする疾患又は病症である。不適切な活性とは、（ｉ）通常前記キナーゼを発現しない細胞におけるキナーゼ発現、（ｉｉ）望ましくない細胞増殖、分化及び／又は成長を引き起こすキナーゼ発現の増加、又は（ｉｉｉ）細胞増殖、分化及び／又は成長の望ましくない減少を引き起こすキナーゼ発現の低減である。キナーゼの過剰活性とは、特定のキナーゼをコードする遺伝子の増幅又は特定のキナーゼ活性レベルの産生であり、細胞増殖、分化及び／又は成長機能障害に関連する可能性がある（すなわち、キナーゼのレベルの増加に伴って、１個以上の細胞機能障害の症状の重症度が増加する）。過剰活性は、リガンド結合に関与するキナーゼの断片欠失のような突然変異によるリガンド非依存性又は構成的活性化の結果であってもよい。
【０１０７】
本明細書に記載の化合物は、好ましくはパーキンソン病のような癌及び神経変性疾患を含む疾患又は病症を予防することに使用できる。
【０１０８】
従って、本発明は、ＬＲＲＫ２阻害が望ましい疾患を治療するための医薬の調製における、本明細書で定義された化合物の用途をさらに提供する。これらの疾患はパーキンソン病を含む。
【０１０９】
医薬組成物
本発明の用途に応じて、本明細書に記載の化合物又はその生理学的に許容される塩、エステル又はほかの生理学的機能性誘導体は医薬製剤として提供でき、該医薬製剤は化合物又はその生理学的に許容される塩、エステル又はほかの生理学的機能性誘導体、及び１種以上の薬学的に許容される担体、及び任意のほかの治療及び／又は予防成分を含む。担体は製剤の他の成分と相溶性があり、且つその被投与者に有害ではないものとする。医薬組成物はヒト及び獣医におけるヒト又は動物の用途に用いられる。
【０１１０】
本明細書に記載の様々な形態の医薬組成物に用いられる適切な賦形剤の例は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第２版，（１９９４）、Ａ  Ｗａｄｅ及びＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒ編」に記載されている。
【０１１１】
治療用途用の許容される担体又は希釈剤は製薬分野において周知されており、且つたとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編１９８５）に記載されている。
【０１１２】
適切な担体の例として、ラクトース、澱粉、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。適切な希釈剤の例として、エタノール、グリセロール及び水が挙げられる。
【０１１３】
薬物担体、賦形剤又は希釈剤は、意図する投与方法及び標準的な薬務に応じて選択できる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤である任意の適切な接着剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、緩衝剤、矯味剤、界面活性剤、増粘剤、防腐剤（酸化防止剤を含む）等、及び製剤を意図する被投与者の血液と等張にするために含まれる物質を含んでもよく、又は付加的に含んでもよい。
【０１１４】
適切な接着剤の例として、澱粉、ゼラチン、天然糖類（たとえば、グルコース、無水ラクトース、遊離ラクトース、β−ラクトース）、コーン甘味料、天然及び合成ゴム（たとえば、アカシア、トラガカントゴム）又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１１５】
適切な潤滑剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【０１１６】
医薬組成物に防腐剤、安定剤、染料及び矯味剤を提供してもよい。防腐剤の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤を使用してもよい。
【０１１７】
医薬製剤は経口投与、局所投与（皮膚投与、口腔投与、及び舌下投与を含む）、直腸投与又は非経口投与（皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、及び静脈内投与を含む）、鼻腔内投与及び経肺投与（たとえば、吸入による）を含む。製剤は適切な場合に、便宜には、個別投与単位で提供してもよく、製薬分野では周知するいずれかの方法によって調製してもよい。すべての方法は、活性化合物を液体担体又は微粉固体担体、又はその両方と組み合わせる工程を含み、続いて、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形する。
【０１１８】
担体が固体である経口投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、例えばそれぞれ所定量の活性化合物を含有する丸剤、カプセル剤又は錠剤の単位用量剤形とする。プレス又はモールド成形によって、任意に１種以上の補助成分とともに錠剤を調製してもよい。適切な機械で自由流動状態（たとえば、粉末又は顆粒）の活性化合物をプレスし、接着剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑物質、界面活性剤又は分散剤のいずれかと混合してプレスされた錠剤を調製してもよい。活性化合物と不活性液体希釈剤をモールド成形して、モールドされた錠剤を調製してもよい。錠剤をコーティングしてもよく、コーティングしない場合、記号を印刷してもよい。活性化合物を単独に、又は１種以上の補助成分と混合してカプセルシェルに充填し、次に通常の手段で密封してカプセル剤を調製してもよい。カシェ剤はカプセル剤と類似し、活性化合物をいずれかの補助成分とともにライスペーパー内に密封する。活性化合物を分散性顆粒として製剤化してもよく、たとえば投与前に水中に懸濁させ、又は食品に振りかける。顆粒を、たとえば小袋に包装してもよい。担体が液体である経口投与に適した製剤は、水性又は非水性液体の形態の溶液又は懸濁液として、又は水中油型エマルジョンとして提供されてもよい。
【０１１９】
経口投与用の製剤は制御放出剤形、たとえば錠剤を含み、活性化合物が適切な制御放出マトリックス内に製剤化され、又は活性化合物に適切な制御放出膜がコーティングされる。このような製剤は特に予防的使用に便利である。
【０１２０】
直腸投与に適した医薬製剤（担体は固体である）は、最も好ましくは、単位用量座薬の形態で提供される。適切な担体はココアバター及び本分野で一般的に使用されるほかの材料を含む。活性化合物を、軟化又は溶融した担体と混合し、次に金型内で冷却し成形することにより座薬を簡単に形成できる。非経口投与に適した医薬製剤は水性又は油性溶媒中の活性化合物の無菌溶液又は懸濁液を含む。
【０１２１】
注射用製剤はボーラス注射（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又は連続注射に適している。このような製剤は、単位用量又は複数回用量容器に都合よく提供され、製剤を導入した後、使用に必要となるまで容器を密封する。或いは、活性化合物は粉末の形態とし、使用前、適切な溶媒、例えば無菌のパイロジェンフリー水で形成してもよい。
【０１２２】
活性化合物を持続性製剤に製剤化してもよく、筋肉内注射又は埋め込み、たとえば皮下又は筋肉内投与によって投薬する。持続性製剤はたとえば適切な重合体又は疎水性材料又はイオン交換樹脂を含む。このような持続性製剤は予防的使用に特に便利である。
【０１２３】
口腔を介した経肺投与に適した製剤は提供され、活性化合物を含有する所望の直径が０．５−７ミクロンの範囲にある顆粒を被投与者の気管支樹に送達する。
【０１２４】
このような製剤は、たとえばゼラチンに適した穿刺可能なカプセルに都合よく存在し、吸入装置に用いられる微細粉末の形態としてもよく、或いは活性化合物、適切な液体又はガス推進薬及びたとえば界面活性剤及び／又は固体希釈剤のような任意のほかの成分を含む自己推進製剤としてもよい。適切な液体推進薬はプロパン及びクロロフルオロカーボンを含み、且つ適切なガス推進薬は二酸化炭素を含む。活性化合物が溶液又は懸濁液の液滴の形態で分配された自己推進製剤を使用してもよい。
【０１２５】
このような自己推進製剤は本分野で公知の自己推進製剤と類似し、既存の方法によって調製できる。適切には、それらは、所要の噴霧特性を有する手動操作又は自動機能の弁を提供する容器中に存在し、その利点について、該弁を操作するごとに、固定体積、たとえば２５−１００マイクロリットル送達する。
【０１２６】
また、活性化合物は、アトマイザー又は噴霧器に使用される溶液又は懸濁液の形態としてもよく、それにより加速気流又は超音波撹拌によって吸入用の微細な液滴ミストを発生させる。
【０１２７】
鼻腔内投与に適した製剤は通常上記経肺投与と類似する製剤を含む。製剤を分配する時、このような製剤は、鼻腔内での保持を可能にするために、１０−２００ミクロン範囲の粒径を有することが望ましく、これは適切な粒度の粉末を適宜使用する又は適切な弁を選択することによって実現できる。ほかの適切な製剤は、鼻に近い容器から鼻腔を通して急速吸入により投与される粒径が２０−５００ミクロンの粗粉末、及び０．２−５％ｗ／ｖの水性又は油性溶液又は懸濁液中の活性化合物を含有する点鼻薬を含む。
【０１２８】
薬学的に許容される担体は当業者に周知であり、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液又は０．８％の飽和食塩水を含むが、これらに限定されない。また、これらの薬学的に許容される担体は水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（たとえば、オリーブオイル）及び注射用有機エステル（たとえば、オレイン酸エチル）が挙げられる。水性担体は水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含み、飽和食塩水と緩衝媒体を含む。非経口溶媒は塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、グルコース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ）又は固定油を含む。たとえば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガス等の防腐剤及びほかの添加剤も存在し得る。
【０１２９】
たとえばゲル、クリーム剤又は軟膏剤のような局所投与に適した製剤を提供してもよい。このような製剤は、たとえば創傷又は潰瘍に適用でき、創傷又は潰瘍の表面に直接塗り、又は被治療領域の上方に適用される適切な支持体、たとえば包帯、ガーゼ、メッシュ等に担持させる。
【０１３０】
たとえば、創傷又は潰瘍のような被治療部位に直接スプレー又は噴霧する液体又は粉末製剤をさらに提供してもよい。或いは、たとえば包帯、ガーゼ、メッシュ等の担体に製剤をスプレー又は噴霧して被治療部位にセットする。
【０１３１】
本発明の別の態様によれば、前記医薬又は獣医組成物を調製するための方法を提供し、活性化合物と担体をたとえば混合によって組み合わせることを含む。
【０１３２】
通常、活性剤を、液体担体又は微粉化した固体担体又はその両方と均一かつ密接に組み合わせることにより、次に必要に応じて、製品を成形して製剤を調製する。本発明は医薬組成物を調製するための方法に関し、式（Ｉ）の化合物を薬学的又は獣医学的に許容される担体又は溶媒と結合する又は組み合わせることを含む。
【０１３３】
塩／エステル
本発明に係る化合物は塩又はエステル、特に薬学的及び獣医学的に許容される塩又はエステルとして存在し得る。
【０１３４】
本発明に係る化合物の薬学的に許容される塩は、適切な酸付加塩又は塩基塩を含む。適切な薬物塩についての総説はＢｅｒｇｅら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、６６，１９９（１９７７）に記載されている。たとえば、鉱酸、例えばハロゲン化水素酸（たとえば、塩酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸）、硫酸、リン酸硫酸塩、硫酸水素塩、ヘミ硫酸塩、チオシアン酸塩、過硫酸塩及びスルホン酸のような強無機酸；１−４個の炭素原子を有する非置換又は置換の（たとえば、ハロゲンによる）アルカンカルボン酸、例えば酢酸のような強有機カルボン酸；蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はテトラフタル酸のような飽和又は不飽和ジカルボン酸；アスコルビン酸、エタノール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸のようなヒドロキシカルボン酸；アスパラギン酸又はグルタミン酸のようなアミノ酸；安息香酸；又は非置換又は置換の（たとえば、ハロゲンによる）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリール−スルホン酸、例えばメタン−ｐ−トルエンスルホン酸のような有機スルホン酸を使用して、塩を形成する。薬学的又は獣医学的に許容されない塩は依然として有用な中間体であり得る。
【０１３５】
好適な塩は、たとえば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、パントテン酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタン酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロールリン酸塩、蓚酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、ニコチン酸塩、パルミテート、ペクチン酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、ラクトース酸塩、ｐｉｖｏｌａｔｅ、樟脳酸塩、ウンデカン酸塩及びコハク酸塩を含み、有機スルホン酸として、例えばメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸塩及びｐ−トルエンスルホン酸塩が挙げられ、無機酸として、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硫酸水素、ヘミ硫酸、チオシアン酸、過硫酸、リン酸及びスルホン酸が挙げられる。
【０１３６】
エステル化される官能基に応じて、有機酸又はアルコール／水酸化物を使用してエステルを形成する。有機酸として、１−１２個の炭素原子を有する非置換又は置換の（たとえば、ハロゲンによる）アルカンカルボン酸、例えば酢酸のようなカルボン酸；蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はテトラフタル酸のような飽和又は不飽和ジカルボン酸；アスコルビン酸、エタノール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸のようなヒドロキシカルボン酸；アスパラギン酸又はグルタミン酸のようなアミノ酸；安息香酸；又は、非置換又は置換の（たとえば、ハロゲンによる）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリール−スルホン酸、例えばメタン−ｐ−トルエンスルホン酸のような有機スルホン酸を使用する。適切な水酸化物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムのような無機水酸化物を含む。アルコールは１−１２個の炭素原子を有する非置換又は置換の（たとえば、ハロゲンによる）アルカノールを含む。
【０１３７】
鏡像異性体／互変異性体
以上検討した本発明のすべての態様において、適切な場合には、本発明は本発明に係る化合物のすべての鏡像異性体、非鏡像異性体及び互変異性体を含む。当業者は光学的性質（１個以上のキラル炭素原子）又は互変異性特徴を有する化合物を同定すべきである。本分野で周知する方法によって対応する鏡像異性体及び／又は互変異性体を分離／調製できる。
【０１３８】
鏡像異性体はそのキラル中心の絶対立体配置を特徴とし、Ｃａｈｎ、Ｉｎｇｏｌｄ及びＰｒｅｌｏｇのＲ−とＳ−順位規則によって記述される。これらの慣例は本分野において周知である（たとえば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，第３版，Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５参照）。
【０１３９】
キラル中心を含む本発明に係る化合物はラセミ混合物、鏡像異性体に富んだ混合物として使用でき、又は公知の技術によってラセミ混合物を分離でき、且つ個々の鏡像異性体を単独に使用できる。
【０１４０】
立体異性体及び幾何異性体
いくつかの本発明に係る化合物は立体異性体及び／又は幾何異性体として存在し得て、たとえば、それらは１個以上の非対称及び／又は幾何中心を有するため、２種以上の立体異性及び／又は幾何学的形態で存在し得る。本発明はすべての阻害剤を使用する個々の立体異性体と幾何異性体及びその混合物を考慮に入れている。特許請求の範囲に使用される用語は適切な機能活性を保持できる（必ずしも同一程度ではないにも関わらず）形態を含む。
【０１４１】
本発明は、薬剤又はその薬学的に許容される塩のすべての適切な同位体変種をさらに含む。本発明の薬剤又はその薬学的に許容される塩の同位体変種は、少なくとも１個の原子が同じ原子番号を有するが通常自然に見られる原子量と異なる原子量を有する原子によって置換されるものであると定義される。該薬剤及びその薬学的に許容される塩に取り込むことができる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体が挙げられ、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌが挙げられる。薬剤及び薬学的に許容される塩のいくつかの同位体変種、たとえば３Ｈ又は１４Ｃのような放射性同位体が取り込まれた同位体変種は、薬物及び／又は基質組織分布研究に有用である。トリチウム標識された同位体、すなわち３Ｈ、及び炭素−１４、すなわち１４Ｃ同位体は、それらの調製の容易さ及び検出可能性のため、特に好適である。また、ジュウテリウム（すなわち２Ｈ）のような同位体での置換は、より大きいな代謝安定性により生じる治療上の利点、たとえばインビボ半減期の増大又は必要用量の減少をもたらすことができ、従って場合によっては好適であり得る。たとえば、本発明はいずれかの水素原子がジュウテリウム原子に置換された一般式（Ｉ）の化合物を含む。通常、適切な試薬の適切な同位体変種を使用して、通常の方法によって本発明の薬剤及び本発明の薬学的に許容される塩の同位体変種を調製できる。
【０１４２】
プロドラッグ
本発明はプロドラッグの形態とする本発明に係る化合物、すなわちインビボで一般式（Ｉ）の活性親薬物の共有結合を放出する化合物をさらに含む。このようなプロドラッグは通常、１個以上の適切な基が修飾されており、ヒト又は哺乳動物の被験者に投与されると、該修飾が逆転され得る本発明に係る化合物である。インビボでの逆転を容易にするように第二薬剤をこのプロドラッグとともに投与することがあるにも関わらず、通常、該逆転はこのような被験者に天然に存在する酵素によって行われる。このような修飾の例として、エステル（たとえば、上記いずれか１種）が挙げられ、エステラーゼ等によってこのような逆転を行う。ほかのこのようなシステムは当業者にはよく知られている。
【０１４３】
溶媒和物
本発明は、本発明に係る化合物の溶媒和物の形態をさらに含む。特許請求の範囲に使用される用語はこれらの形態を含む。
【０１４４】
多結晶型
本発明はさらに、本発明に係る化合物の種々の結晶形態、多結晶形態及び水和形態の本発明に係る化合物に関する。製薬業界では、このような化合物の合成調製に使用される溶媒の精製及び／又は分離の方法をやや変えることによって、これらの形態のいずれかで化学化合物を分離できることが決定されている。
【０１４５】
投与
本発明の医薬組成物は、直腸、鼻腔内、支気管内、局所（口腔及び舌下を含む）、膣内又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び皮内を含む）、腹腔内又は髄腔内投与に適用できる。好ましくは、製剤は経口投与用の製剤である。製剤は単位剤形で、すなわち単位用量又は単位用量の複数の単位又はサブ単位を含む個別部分の形態で都合よく提供されてもよい。例として、製剤は錠剤及び徐放カプセルの形態であり得、且つ薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。
【０１４６】
本発明の経口投与用の製剤は、それぞれ所定量の活性剤を含有するカプセル剤、ゲル剤、滴剤、カシェ剤、丸剤又は錠剤のような個別単位；粉末又は顆粒；水性液体又は非水性液体中の活性剤の溶液、エマルジョン又は懸濁液；又は水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョン；又はボーラス注射等とする。好ましくは、これらの組成物は、１用量あたり１−２５０ｍｇ、より好ましくは１０−１００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１４７】
経口投与用の組成物（たとえば、錠剤及びカプセル剤）について、用語「許容される担体」は、一般的な賦形剤、たとえば接着剤、たとえばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース及び澱粉のような溶媒；コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸のような充填剤及び担体；並びにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及びほかのステアリン酸金属塩、グリセリンステアリン酸、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、油及びコロイダルシリカのような潤滑剤を含む。矯味剤として、ペパーミント、ウィンターグリーンオイル、チェリーフレーバー等を使用できる。必要に応じて、剤形を容易に識別できるように着色剤を添加する必要がある。錠剤は本分野で周知の方法によってコーティングされてもよい。
【０１４８】
プレス又はモールド成形によって、任意に１種以上の補助成分とともに錠剤を調製してもよい。適切な機械で自由流動形態（たとえば、粉末又は顆粒）の活性剤をプレスし、接着剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑物質、防腐剤、界面活性剤又は分散剤のいずれかと混合してプレスされた錠剤を調製してもよい。不活性液体希釈剤で湿潤した粉末化合物の混合物を適切な機械でモールド成形してモールドされた錠剤を調製してもよい。錠剤にコーティング又はエンボスを行ってもよく行わなくてもよく、且つ調製して活性剤の徐放又は制御放出を実現する。
【０１４９】
経口投与用のほかの製剤は、通常スクロースとアカシア又はトラガカントゴム中の活性剤である矯味マトリックスを含有する錠剤、ゼラチン及びグリセロール、又はスクロース及びアカシア中の活性剤のような不活性マトリックスを含有する軟錠剤、及び適切な液体担体中の活性剤を含有する含嗽薬を含む。
【０１５０】
ほかの投与形態として、静脈内、動脈内、髄腔内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内注射でき、無菌又は滅菌可能な溶液で調製された溶液又はエマルジョンが挙げられる。注射剤形は通常、１回の投与あたり１０−１０００ｍｇ、好ましくは１０−２５０ｍｇの活性成分を含有する。
【０１５１】
本発明の医薬組成物はさらに、アナルプラグ、膣座薬、懸濁液、エマルジョン、ローション、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、スプレー剤、溶液又は展着剤の形態としてもよい。
【０１５２】
経皮投与の別の方法は皮膚パッチ剤を使用することである。たとえば、活性成分を、ポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性エマルジョンからなるクリーム剤に配合する。活性成分を１−１０重量％の濃度で、ホワイトワックス又は白色軟質パラフィン、及び必要に応じた安定剤と防腐剤からなる軟膏剤に配合してもよい。
【０１５３】
用量
当業者は、過度の実験をすることなく、被験者に投与される本発明の組成物のいずれかの適切な用量を容易に決定できる。通常、医師は、使用される特定の化合物の活性、該化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、通常の健康状態、性別、飲食、投与方式及び時間、排泄率、薬物組合せ、特定の症状の深刻度及び治療を受ける個体の様々な要素に応じて、個々の患者に最も適切な実際の用量を決定する。本明細書に開示されている用量は平均症状の例である。勿論、場合によっては、より高い又はより低い用量範囲が有用であり、且つこの用量範囲は本発明の範囲内に含まれる。
【０１５４】
本発明によれば、有効量の一般式（Ｉ）の化合物を投与して、特定の症状又は疾患に関連するキナーゼを阻害する。勿論、化合物の投与タイプに応じて、用量を更に変更する。たとえば、好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物を非経口投与して、急性治療の「有効量」を達成する。筋肉内ボーラス注射も有用であるが、５％グルコース水溶液又は生理飽和食塩水中の化合物又は適切な賦形剤を有する類似の製剤の静脈内注入が最も効果的である。通常、非経口用量は約０．０１−約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１−２０ｍｇ／ｋｇであり、このようにして血漿中の薬物の濃度をキナーゼを効果的に阻害できる濃度に維持する。１日あたり化合物をあるレベルで１−４回投与して、約０．４−約４００ｍｇ／ｋｇ／日の総日用量を達成してもよい。当業者は薬剤の血液レベルと治療効果を有する所要濃度とを比べて、それにより治療上有効な本発明に係る化合物の正確量、及び該化合物の最適投与経路を容易に決定できる。
【０１５５】
本明細書に開示されている１種以上の治療適応症を治療できる薬物濃度で、本発明に係る化合物を患者に経口投与してもよい。通常、患者の症状と一致する方式によって、約０．１−約５０ｍｇ／ｋｇの経口投与用量で、該化合物を含む医薬組成物を投与する。経口投与量は好ましくは約０．５−約２０ｍｇ／ｋｇである。
【０１５６】
本発明に従って本発明に係る化合物を投与する場合、許容されない毒物学的作用が生じることがないと予想できる。様々なバイオアッセイ法のいずれかによって、良好なバイオアベイラビリティを有し得る本発明に係る化合物をテストして、所定の薬理学的効果に必要な化合物の濃度を決定するようにしてもよい。
【０１５７】
組合せ
特に好適な実施形態では、１種以上の本発明に係る化合物と１種以上のほかの活性剤（たとえば、市販される従来の薬物）とを組み合わせて投与する。この場合、本発明に係る化合物と１種以上のほかの活性剤を連続的に、同時に又は順次投与できる。
【０１５８】
通常、薬物は組合せ使用すると、より効果的である。特に、組合せ治療は、主要な毒性、作用メカニズム及び薬剤耐性メカニズムの重複を回避するために望ましい。また、最大耐用量及びこのような用量の間の最小時間間隔で大部分の薬物を投与することが望ましい。組合せ化学療法薬物の主要な利点は、生化学的相互作用によって付加的又は可能な相乗作用を促進し、さらに薬剤耐性の出現を減少させることができることである。
【０１５９】
化合物、及び特定の病症の治療に有用であると既知又は推定される薬剤の阻害活性を研究試験して有益な組合せを提案する。該方法はこのような薬剤の投与順序、すなわち化合物の送達前、同時又は送達後についての決定にも用いられる。このような投与方式は本明細書に同定されたすべての活性剤の特徴であり得る。
【０１６０】
試験
本発明の別の態様は、１種以上のキナーゼ、より好ましくはＬＲＲＫ、さらにより好ましくはＬＲＲＫ２を阻害できるほかの候補化合物を同定するための試験における上記化合物の用途に関する。
【０１６１】
好ましくは、該試験は競合結合試験である。
【０１６２】
より好ましくは、競合結合試験は本発明に係る化合物をキナーゼ、好ましくはＬＲＲＫ、より好ましくはＬＲＲＫ２及び候補化合物に接触させ、本発明に係る化合物とキナーゼとの間の相互作用の変化を検出することを含む。
【０１６３】
好ましくは、本発明に係る化合物の従来のＳＡＲ修飾によって候補化合物を調製する。
【０１６４】
本明細書に使用されるように、用語「従来のＳＡＲ修飾」とは、化学的誘導体化によって所定の化合物を変更する本分野での周知の標準的な方法である。
【０１６５】
従って、一態様によれば、同定された化合物は、ほかの化合物を開発するモデル（たとえば、テンプレート）として使用できる。このようなテストに使用される化合物は溶液中で遊離したもの、固体担体に固定されたもの、細胞の表面に担持されたもの又は細胞内に位置するものであってもよい。化合物と被験薬剤との間の活性消失又は結合複合物の形成を測定できる。
【０１６６】
本発明の試験はスクリーニングすることができ、したがって、大量の薬剤を試験できる。一態様によれば、本発明のアッセイ方法はハイスループットスクリーニングである。
【０１６７】
本発明は、競合薬スクリーニング試験を使用することをさらに考慮し、化合物に結合できる中和抗体と化合物結合にするための試験化合物が特異的に競合する。
【０１６８】
ＷＯ  ８４／０３５６４に詳細に記載される方法に基づき物質が適切な結合親和性を有する試薬にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を行うスクリーニング用の別の技術を提供する。
【０１６９】
本発明の測定方法は、試験化合物の小規模スクリーニング及び大規模スクリーニング及び定量的試験に適用できると予想される。
【０１７０】
好ましくは、競合結合試験は、キナーゼの既知の基質の存在下で本発明に係る化合物を前記キナーゼに接触させ、前記キナーゼと前記既知の基質との間の相互作用の変化を検出することを含む。
【０１７１】
本発明の別の態様は、リガンドとキナーゼの結合を検出する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）キナーゼの既知の基質の存在下で、リガンドを前記キナーゼに接触させる工程と、
（ｉｉ）前記キナーゼと前記既知の基質との間の相互作用の変化を検出する工程と、を含み、
ここで、前記リガンドは本発明に係る化合物である。
【０１７２】
本発明の一態様は、
（ａ）上記測定方法を行う工程と、
（ｂ）リガンド結合ドメインに結合可能な１種以上のリガンドを同定する工程と、
（ｃ）所定量の前記１種以上のリガンドを調製する工程と、を含む方法に関する。
【０１７３】
本発明の別の態様は、
（ａ）上記測定方法を行う工程と、
（ｂ）リガンド結合ドメインに結合可能な１種以上のリガンドを同定する工程と、
（ｃ）前記１種以上のリガンドを含む医薬組成物を調製する工程と、を含む方法を提供する。
【０１７４】
本発明の別の態様は、
（ａ）上記測定方法を行う工程と、
（ｂ）リガンド結合ドメインに結合可能な１種以上のリガンドを同定する工程と、
（ｃ）リガンド結合ドメインに結合可能な前記１種以上のリガンドを修飾する工程と、
（ｄ）このような上記測定方法を行う工程と、
（ｅ）任意的に前記１種以上のリガンドを含む医薬組成物を調製する工程と、を含む方法を提供する。
【０１７５】
本発明はさらに、上記方法によって同定されたリガンドに関する。
【０１７６】
本発明の別の態様は、上記方法によって同定されたリガンドを含む医薬組成物に関する。
【０１７７】
本発明の別の態様は、１種以上の病症を治療するための医薬組成物の調製における、上記方法によって同定されたリガンドの用途に関する。
【０１７８】
上記方法は１種以上のキナーゼの阻害剤として使用できるリガンドをスクリーニングすることに使用できる。
【０１７９】
一般式（Ｉ）の化合物は実験室用ツールとしても治療薬としても有用である。実験室では、本発明のいくつかの化合物は、疾患の状況の決定又は進行中に、既知の又は新規に発見されたキナーゼが決定的な又は少なくとも重要な生化学的機能の発生をもたらすかどうかという通常「ターゲット検証」と呼ばれる方法を確立することに使用できる。
【０１８０】
公知の合成方法
以下の実施例を参照して本発明を説明する。なお、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではなく、これらの実施例は本発明を実施する方法を提案するためのものに過ぎない。
【０１８１】
明細書を通して、以下の略語が使用されている。
ＡｃＯＨ        酢酸
ＡｌＣｌ３        塩化アルミニウム
ＢＨ３            ボラン
Ｂｎ              ベンジル
ＢｕＯＨ        ｎ−ブタノール
ＣｕＩ            ヨウ化第一銅
ＤＣＭ          ジクロロメタン
ＤＭＦ          Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＤＩＥＡ、ＤＩＰＥＡ        Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＥＡ              酢酸エチル
ＥＤＣＩ          １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＨ          エタノール
ＥｔＯＡｃ        酢酸エチル
Ｅｔ３Ｎ            トリエチルアミン
ＨＡＴＵ      ２−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＨＯＢＴ        ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｉ２                ヨウ素
ＩＰＡ            イソプロパノール
ＫＯＡｃ        酢酸カリウム
ＫＯＨ        水酸化カリウム
Ｋ３ＰＯ４      リン酸カリウム
ＬｉＡｌＨ４      水素化アルミニウムリチウム
ＬｉＣｌ          塩化リチウム
ＬＣＭＳ      高速液体クロマトグラフィー−質量分析
ＭｅＯＨ      メタノール
ＭｅＣＮ      アセトニトリル
ＭｅＩ          ヨウ化メチル
ＭｓＣｌ        塩化メタンスルホニル
Ｎａ２ＣＯ３      炭酸ナトリウム
ＮａＨＣＯ３    炭酸水素ナトリウム
Ｎａ２Ｓ２Ｏ３    チオ硫酸ナトリウム
ＮａＯＨ        水酸化ナトリウム
ＮａＢＨ４        水素化ホウ素ナトリウム
（ｎ−Ｂｕ）４ＮＩ        ヨウ化テトラブチルアンモニウム
ｎ−ＢｕＬｉ        ｎ−ブチルリチウム
ＮＨ３            アンモニア
ＮＨ４Ｃｌ          塩化アンモニウム
ＮＩＳ            Ｎ−ヨードスクシンイミド
ＮＭＲ          核磁気共鳴
ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ    分取高速液体クロマトグラフィー
ｐｒｅｐ−ＴＬＣ      分取薄層クロマトグラフィー
ＰＭＢ          ｐ−メトキシベンジル
ＰＭＢＣｌ      ｐ−メトキシベンジルクロリド
ＰＰｈ３            トリフェニルホスフィン
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２      １，１'−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４          テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
Ｐｄ（ＯＡｃ）２        酢酸パラジウム（ＩＩ）
ＰＥ                    石油エーテル
ｒｔ                      室温
Ｓｐｈｏｓ                ２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２'，６'−ジメトキシビフェニル
ｔ−ＢｕＯＫ              カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド
ｔ−ＢｕＯＮａ            ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド
ＴＥＡ                  トリエチルアミン
ＴＬＣ                  薄層クロマトグラフィー
ＴＨＦ                  テトラヒドロフラン
ＴＦＡ                  トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ                    トリチル
ＵＶ                    紫外線
【０１８２】
スキーム１
【化１６】
2019524658.tif 000018
【０１８３】
工程１
工程１では、式Ａを式Ｂに転化し、ここで、Ｘはハロゲン、好ましくは臭素又はヨウ素であり、且つＬＧは脱離基、例えばスクシンイミドである。
【０１８４】
反応は、適切なハロゲン化剤、たとえばヨウ素又はＮ−ブロモスクシンイミドの存在下で、適切な溶媒中で行われ、場合によってはアルカリ、たとえば水酸化カリウムの存在下で行われる。
【０１８５】
典型的な条件（Ｘ＝Ｉ）として、１，４−ジオキサン中の１当量の式Ａ、２当量のＩ２、３．７当量のＫＯＨを７５℃で４時間反応させた。
【０１８６】
工程２
工程２では、式Ｂを式Ｃに転化し、
ここで、ＰＧは保護基と定義され、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−、ベンジルオキシカルボニル−、ベンジル−、４−メトキシベンジル−、２，４−ジメトキシベンジル−又はトリチル−を含むが、これらに限定されるものではなく、ＬＧは脱離基と定義され、たとえばハロゲン又は炭酸ｔｅｒｔ−ブチルである。
【０１８７】
該反応は保護基でピラゾールＮＨをキャッピングすることを含む。当業者であれば、多くの保護基はこの目的に使用できると理解できる（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．及びＷｕｔｓ，Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．第４版（２００６）参照）。技術者は、さらにＮ１又はＮ２で保護基を導入し、且つ該比率はＰＧの性質又は展開の正確な反応条件に応じて変動し得ると理解できる。反応条件は保護基の性質に依存する。
【０１８８】
典型的な条件（ＰＧ＝４−メトキシベンジル）として、室温でＤＭＦ中の１当量の４−メトキシベンジルクロリド、１当量の式Ｂ、２当量の水酸化カリウムを一晩撹拌した。
【０１８９】
工程３
工程３では、式Ｃを式Ｄに転化し、ここで、Ｘはハロゲン、基Ｒ１は、当業者に公知の標準的な条件を用いて合成方法の後続段階で操作できる官能基を任意に含み得る。
【０１９０】
該反応は、場合によってはプロトン酸（Ｂｒｏｎｓｔｅｄ  ａｃｉｄ）の存在下で、式Ｃ中のクロロ基を適切な溶媒中のアミノ基と求核置換させることを含む。該反応は通常、熱的手段又はマイクロ波照射による加熱を必要とする。
【０１９１】
典型的な条件として、ｎ−ブタノール中の２．５当量のアミン、１当量の式Ｃを密封反応器中で１８０℃に５時間加熱した。
【０１９２】
工程４
工程４では、式Ｄを式Ｅに転化する。Ｘはハロゲン、好ましくはヨウ素である。該反応は、適切な遷移金属触媒と適切なアルカリ（好ましくはトリエチルアミン）及び任意の付加的添加剤（たとえば、ヨウ化テトラブチルアンモニウム）の存在下で、置換されたビニルエステルと式Ｄがクロスカップリングするに関する。当業者は、通常、このような転化を「Ｈｅｃｋ反応」と呼称する。
【０１９３】
典型的な条件として、ＤＭＦ中の１当量の式Ｄ、１０当量のビニルエステル、２当量のヨウ化テトラブチルアンモニウム、０．２当量のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２、ＤＭＦ：水：トリエチルアミン（６．２５：１：１）を７０℃に一晩加熱した。
【０１９４】
工程５
工程５では、式Ｅを式Ｆに転化する。該反応は、適切な遷移金属触媒の存在下で、適切な溶媒中で水素源を用いて二重結合を対応する飽和化合物に水素化することを含む。プロトン酸（たとえば、ＨＣｌ又は酢酸）を添加して該反応を促進することが必要とする又は望ましい場合がある。当業者は、多くの異なる金属触媒をこのような反応に使用でき、且つ圧力下でこれらの反応を行うことが必要とする又は望ましい場合があると理解できる。
【０１９５】
典型的な条件として、水素雰囲気下でパラジウム炭素を用いて式Ｅを処理した。
【０１９６】
工程６
工程６では、式Ｆを式Ｇに転化する。該反応は、適切なアルカリ、たとえば水酸化ナトリウムの存在下で、適切な溶媒中でエステルを加水分解して対応するカルボン酸を生成することを含む。
【０１９７】
典型的な条件として、メタノール中で水酸化ナトリウム水溶液を用いて式Ｆを処理した。
【０１９８】
工程７
工程７では、式Ｇを式Ｈに転化する。該反応は、アミド結合形成反応条件下で分子内環化してラクタムを形成することを含む。当業者であれば、このような反応は多くの異なるアミド結合形成反応条件を用いることができると理解できる。
【０１９９】
典型的な条件として、トリエチルアミンの存在下で、ジクロロメタン中でＨＡＴＵを用いて式Ｇを処理した。
【０２００】
工程８
工程８では、式Ｈを一般式Ｉに転化する。反応は、ピラゾールから保護基を除去することを含み、正確な条件は保護基の性質に依存するに関する（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．及びＷｕｔｓ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第４版．（２００６）。
【０２０１】
典型的な条件（ＰＧは４−メトキシベンジルである）として、７０℃でトリフルオロ酢酸を用いて式Ｈを一晩処理した。
【０２０２】
工程９
工程９では、式Ｈを式Ｊに転化する。該反応は、還元剤、たとえばボランを用いてアミドを対応するアミンに還元することを含む。当業者であれば、多くの異なる還元剤はこのような反応に使用できると理解できる。
【０２０３】
工程１０
工程１０では、式Ｊを式Ｋに転化する。反応は、ピラゾールから保護基を除去することを含み、且つ正確な条件は保護基の性質に依存する（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．及びＷｕｔｓ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．第４版．（２００６）。
【０２０４】
典型的な条件（ＰＧは４−メトキシベンジルである）として、７０℃でトリフルオロ酢酸を用いて式Ｊを一晩処理した。
【０２０５】
スキーム２
【化１７】
2019524658.tif 000019
【０２０６】
工程１１
工程１１では、式Ｄを式Ｌに転化し、ここで、ＸとＰＧは上記定義された通りである。該反応は、遷移金属触媒の存在下で、適切な溶媒中で式Ｄ中のハロゲン化物とアリール又はヘテロアリールホウ酸又はエステルとがクロスカップリングをするに関する。反応は、通常、熱的手段又はマイクロ波加熱によって上げられた温度で行われる。通常、反応混合物に無機塩基（たとえば、炭酸ナトリウム）を添加する。当業者は、このような転化を「Ｓｕｚｕｋｉカップリング」と呼称する。
【０２０７】
典型的な条件として、１，４−ジオキサン中の１当量の式Ｄ、０．０９当量のＰｄ（ｄｐｐｆ）２Ｃｌ２、１．５当量のホウ酸（又はホウ酸エステル）、３．５当量の２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を９０℃で１８時間反応させた。
【０２０８】
工程１２
工程１２では、式Ｌを式Ｍに転化する。該反応は、適切なアルカリ、たとえば水酸化ナトリウムの存在下で、適切な溶媒中で水を用いてエステルを加水分解して、対応するカルボン酸を生成することを含む。
【０２０９】
典型的な条件として、メタノール中で水酸化ナトリウム水溶液を用いて式Ｌを処理した。
【０２１０】
工程１３
工程１３では、式Ｍを式Ｎに転化する。該反応は、アミド結合形成反応条件下で分子内環化してラクタムを形成するに関する。当業者であれば、このような反応は多くの異なるアミド結合形成反応条件を用いることができると理解できる。
【０２１１】
典型的な条件として、トリエチルアミンの存在下で、ジクロロメタン中でＨＡＴＵを用いて式Ｍを処理した。
【０２１２】
工程１４
工程１４では、式Ｎを式Ｏに転化する。該反応は、ピラゾールから保護基を除去し、且つ正確な条件は保護基の性質に依存するに関する（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．及びＷｕｔｓ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第４版（２００６）。
【０２１３】
典型的な条件（ＰＧは４−メトキシベンジルである）として、７０℃でトリクロロ酢酸を用いて式Ｎを一晩処理した。
【０２１４】
工程１５
工程１５では、式Ｎを式Ｐに転化する。該反応は、還元剤、たとえばボランを用いてアミドを対応するアミンに還元することを含む。当業者であれば、多くの異なる還元剤はこのような反応に使用できると理解できる。
【０２１５】
工程１６
工程１６では、式Ｐを式Ｑに転化する。該反応は、ピラゾールから保護基を除去することを含み、且つ正確な条件は保護基の性質に依存する（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．及びＷｕｔｓ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．第４版．（２００６）。
【０２１６】
典型的な条件（ＰＧは４−メトキシベンジルである）として、７０℃でトリフルオロ酢酸を用いて式Ｐを一晩処理した。
【０２１７】
以下の非限定的な実施例によって本発明を更に説明する。
【０２１８】
実施例
【０２１９】
化合物を合成する公知の手順
【０２２０】
クロマトグラフィー法
Ａｇｅｌａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の装置を用いて、高速液体クロマトグラフィー法を行い、多波長ＵＶ検出器によって監視する。分離用の典型的な移動相はＰＥ／ＥＡ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ又は水／ＭｅＣＮである。当業者であれば、具体的な化合物の条件を変更することが必要とする又は望ましい場合があり、たとえば、開始又は終了時に溶媒組成、溶媒又は緩衝液、運転時間、流速及び／又はカラムを変更すると理解できる。
【０２２１】
分析方法
特に断らない限り、室温で、前記溶媒中でＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ  ４００スペクトロメータを用いて１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを行う。すべての場合において、ＮＭＲデータは提案された構造と一致した。主ピークを指定するための一般的な略語を用いて、ｐｐｍ（１００万分の１）で特定の化学シフト（δ）を与え、たとえば、ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｄｄ、二重線の二重線；ｂｒ、幅広線である。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ／６４６０  ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ＬＣＭＳを用いて質量スペクトルを記録する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いる場合、それはシリカゲルＴＬＣである。
【０２２２】
化合物の調製
出発原料の調製についての記載がない限り、これらの出発原料は市販されているもの、文献で知られているもの、又は当業者が標準的な手順に従って入手しやすいものである。上記実施例又は中間体と類似するものことで化合物を調製すると記載する場合、当業者であれば、各特定の反応の反応時間、試薬の当量数及び温度を変更でき、且つ異なる後処理又は精製技術を採用することが必要とする又は望ましい場合があると理解できる。
【０２２３】
実施例１
【化１８】
2019524658.tif 000020
【０２２４】
工程１
４−クロロ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン（中間体１）の合成
【化１９】
2019524658.tif 000021
【０２２５】
室温で、ヨウ素（１９ｇ、７６ｍｍｏｌ）を、４−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン（５．８ｇ、３８ｍｍｏｌ、ＷＯ  ２０１０１０６３３３Ａ１とＷＯ  ２０１２０３８７４３Ａ１に基づき合成される）とＫＯＨ（８ｇ、１４２ｍｍｏｌ）とを１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）に溶解させた混合物に添加した。反応混合物を７５℃で４時間撹拌した後、室温に冷却した。溶液を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液）で希釈し、濾過して沈殿物を乾燥させ、黄色固体（４．１ｇ）を得た。濾液を３日間静置し、濾過して沈殿物を得て、別の生成物を３．５５ｇ生成した。通算収率（７．６５ｇ、７２％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ｐｐｍ  ７．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １４．２２  （ｓ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２８０  ［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２２６】
工程２
１−（４−メトキシベンジル）−４−クロロ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン（中間体２）の合成
【化２０】
2019524658.tif 000022
【０２２７】
室温で、４−メトキシベンジルクロリド（０．５ｍＬ、３．６ｍｍｏｌ）を、中間体１（１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）とＫＯＨ（０．３ｇ、５．４ｍｍｏｌ）とをＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた混合物に添加した。得た混合物を室温で２．５時間撹拌した後、減圧濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解させて水で洗浄し、有機相を乾燥させて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて残留物を精製し、０−３０％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出して、位置異性体Ｎ１：Ｎ２の混合物固体（Ｎ１：Ｎ２＝９：１、１．３ｇ、９３％）を得た。主要なＮ１異性体：１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．５７  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４００  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２２８】
工程３
１−（４−メトキシベンジル）−３−ヨード−Ｎ−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−４−アミン（中間体３）の合成
【化２１】
2019524658.tif 000023
【０２２９】
メチルアミン（６ｍＬ、４０％水溶液）を、中間体２（１．０ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）をｎ−ＢｕＯＨ（６ｍＬ）に溶解させた溶液に添加した。混合物を密封反応釜中で１７０℃に加熱し、５時間撹拌しながら反応させた後、減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを用いて残留物を精製し、０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭで溶出して、白色固体（０．８４ｇ、８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２４  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．４３  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．９４  （ｍ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  １３．２８  （ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３９５  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２３０】
工程４
（Ｅ）−３−（４−（メチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）メチルアクリレート（中間体４）の合成
【化２２】
2019524658.tif 000024
【０２３１】
室温で、アルゴン雰囲気において、メチルアクリレート（１．３０ｇ、１５．０８ｍｍｏｌ）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２２０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、中間体３（５９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）とヨウ化テトラブチルアンモニウム（１．１１ｇ、３．０２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／水／トリエチルアミン（２６ｍＬ／２．８ｍＬ／２．８ｍＬ）に溶解させた混合物に添加し、得た混合物を密封反応釜において７０℃で一晩加熱し、次に減圧濃縮し、粗残留物をＥｔＯＡｃに溶解させ、飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させ、濾過し、減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−６０％酢酸エチル／石油エーテルで勾配溶出し、褐色ゴム状固体（８０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ２．９３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７５  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．４９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．９２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  ＨＺ，  ２Ｈ），  ７．８３  （  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １７．６  Ｈｚ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３５３  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２３２】
工程５
３−（４−（メチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）プロピオン酸メチル（中間体５）の合成
【化２３】
2019524658.tif 000025
【０２３３】
１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）と酢酸（２ｍＬ）を、中間体４（３１７ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１０ｍｌ）とメタノール（１０ｍＬ）に溶解させた溶液に添加した。得た混合物をＨ２雰囲気において室温で一晩撹拌した後、珪藻土で濾過した。ＥｔＯＡｃでケーキを２回洗浄し、濾液を合併し、減圧濃縮し、白色固体（９０％）を得た。残留物を更に精製せずに次の反応に投入した。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３５５  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２３４】
工程６
３−（４−（メチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−プロピオン酸（中間体６）の合成
【化２４】
2019524658.tif 000026
【０２３５】
室温で、ＮａＯＨ（１６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を、中間体５（２８３ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）と水（３ｍＬ）に溶解させた溶液に添加した。得た混合物を４０℃で４時間撹拌した後、酢酸でｐＨ＝４に調整し、減圧濃縮後、フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３０％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出し、黄色固体（６８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ：  ２．６８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．９１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ３．２１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ５．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １２．２０  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３４１  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２３６】
工程７
６−メチル−２−（４−メトキシベンジル）−２，６，８，９−テトラヒドロ−７Ｈ−１，２，５，６−テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン−７−オン（中間体７）の合成
【化２５】
2019524658.tif 000027
【０２３７】
アルゴン雰囲気下で、ＨＯＢｔ（２．０６ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１．９７ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）を、中間体６（４．３１ｇ、１２．６７ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶解させた溶液に添加した。混合物を０℃に冷却した後、ＥＤＣＩ（２．９２ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で０．５時間撹拌した後、反応混合物をゆっくり室温に自然昇温させて一晩撹拌し、続いて水（１００ｍＬ）で急冷した。減圧濃縮して大部分のＴＨＦを除去し、残留物をＥｔＯＡｃと水の間で分液した。飽和食塩水（１００ｍＬ）で有機層を洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し（ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出した）、白色固体（７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ：  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３２３  ［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２３８】
工程８
６−メチル−２，６，８，９−テトラヒドロ−７Ｈ−１，２，５，６−テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン−７−オン（実施例１）の合成
【化２６】
2019524658.tif 000028
【０２３９】
中間体７をＴＦＡ（１５０ｍｇ、５ｍＬ）に溶解させ、密封反応釜において９０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、混合物を減圧濃縮し、残留物をＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合溶媒（１：１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３で中和し、濾過し、洗浄して減圧濃縮した。その後、フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３０％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出し、次に逆相Ｃ−１８カラムで精製し、５−６０％ＭｅＣＮ／水で勾配溶出し、白色固体の生成物（７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ２．９４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．１３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４９  （ｓ，  ３Ｈ），  ７．１８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１４  （ｓ，  １Ｈ），  １３．３０  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２０３  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２４０】
実施例２−１４
工程３ではメチルアミンのかわりに適切なアミンを使用する以外、実施例１と同様に実施例２−１４を調製した。
【化２７】
2019524658.tif 000029
【０２４１】
【表１】
2019524658.tif 000030
【表２】
2019524658.tif 000031
【０２４２】
実施例１５
工程４ではメチルアクリレートのかわりにメチルメタクリレートを使用する以外、実施例１４と同様に実施例１５を調製した。
【０２４３】
【表３】
2019524658.tif 000032
【０２４４】
実施例１６
【化２８】
2019524658.tif 000033
【０２４５】
６−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−１，２，５，６−テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン（実施例１６）の合成
【化２９】
2019524658.tif 000034
【０２４６】
０℃で、ＢＨ３（１Ｍ、５ｍＬのＴＨＦ中）を実施例１の中間体７（３２８ｍｇ、１０ｍＬの無水ＴＨＦ中、１．０２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。アルゴン雰囲気において室温で１６時間撹拌した後、メタノール（１０ｍＬ）を添加して反応混合物を急冷して、そして減圧濃縮した。粗中間生成物８をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、密封反応釜において９０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、混合物を減圧濃縮してＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３で中和し、濾過して減圧濃縮した。その後、フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３０％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出し、次に逆相Ｃ−１８カラムで精製し、５−６０％ＭｅＣＮ／水で勾配溶出し、黄色固体（二段階収率１５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ２．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．６６  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １３．０７  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  １８９  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２４７】
実施例１７−２９
以下のように、中間体７のかわりに、適切な中間体を使用する以外、実施例１６と同様に実施例１７−２９を調製し、該中間体は、工程３（実施例１）ではメチルアミンのかわりに適切なアミンを用いて調製された。
【化３０】
2019524658.tif 000035
【０２４８】
【表４】
2019524658.tif 000036
【０２４９】
実施例３０
以下のように、中間体７のかわりに適切な中間体を使用する以外、実施例１６と同様に実施例３０を調製し、該中間体は工程３（実施例１）ではメチルアミンのかわりに適切なアミンを使用し、工程４（実施例１）ではメチルアクリレートのかわりにメチルメタクリレートを使用して調製された。
【化３１】
2019524658.tif 000037
【０２５０】
【表５】
2019524658.tif 000038
【０２５１】
実施例３１
【化３２】
2019524658.tif 000039
【０２５２】
工程１
２−（４−（メチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）安息香酸メチル（中間体９）の合成
【化３３】
2019524658.tif 000040
【０２５３】
アルゴンを用いて、中間体３（１．８ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）、（２−（メトキシカルボニル）フェニル）ボロン酸（１．２３ｇ、６．８５ｍｍｏｌ）とＫ３ＰＯ４（１．９４ｇ、９．１３ｍｍｏｌ）をトルエン（５０ｍＬ）に溶解させた混合物を脱酸処理した後、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（１０３ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を密封反応釜に移して９５℃に加熱して１６時間連続的に反応させた。濃縮後、残留物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）と水（１５０ｍＬ）の間で分液した。水（１００ｍＬ×２）で有機層を洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−６５％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、淡黄色泡状固体（１．４４ｇ、７８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ２．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ３．４４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７０（ｓ，  ３Ｈ），  ５．１１  （ｍ，  １Ｈ），  ５．４６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．９０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４０３［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５４】
工程２
２−（４−（エチルアミノ）−１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）安息香酸（中間体１０）の合成
【化３４】
2019524658.tif 000041
【０２５５】
室温で、ＮａＯＨ（７００ｍｇ、１７．７８ｍｍｏｌ）を、中間体９（１．４４ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）と水（５ｍＬ）に溶解させた溶液に添加した。得た混合物を４５℃で４時間撹拌し、酢酸で混合物のｐＨ値を４に調整した。減圧濃縮後、フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３０％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出し、白色固体（１．３ｇ、９３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ３．００  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．６２（ｓ，  ２Ｈ），  ６．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ７．３８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｍ，  ３Ｈ），  ８．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  １３．２０  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３８９  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５６】
工程３
１１−（４−メトキシベンジル）−４−メチル−４，１１−ジヒドロ−５Ｈ−３，４，１０，１１−テトラアザジベンゾ［ｃｄ，ｈ］アズレン−５−オン（中間体１１）の合成
【化３５】
2019524658.tif 000042
【０２５７】
アルゴン雰囲気において、Ｅｔ３Ｎ（１．０２ｇ、１０．０５ｍｍｏｌ）を、中間体１０（１．３ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）とＨＡＴＵ（１．９ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解させた混合物に添加した。室温で１６時間撹拌した後、反応混合物を減圧濃縮し、且つフラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３０％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、白色固体（１．１１ｇ、９０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ３．６４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｍ，  ２Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３７１  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２５８】
工程４
４−メチル−４，１１−ジヒドロ−５Ｈ−３，４，１０，１１−テトラアザジベンゾ［ｃｄ，ｈ］アズレン−５−オン（実施例３１）の合成
【化３６】
2019524658.tif 000043
【０２５９】
中間体１１（５０ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（３ｍＬ）に溶解させた溶液を９０℃に加熱して６時間連続的に反応させ、次に減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−３０％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出し、白色固体（４５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ３．６６  （ｓ，  ３Ｈ），  ７．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  １３．７３  （ｓ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２５１  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２６０】
実施例３２−４４
以下のように、中間体３のかわりに適切な中間体を使用する以外、実施例３１と同様に実施例３２−４４を調製し、該中間体は工程３（実施例１）ではメチルアミンのかわりに適切なアミンを使用して調製された。
【化３７】
2019524658.tif 000044
【０２６１】
【表６】
2019524658.tif 000045
【０２６２】
実施例４５
【化３８】
2019524658.tif 000046
【０２６３】
４−メチル−５，１１−ジヒドロ−４Ｈ−３，４，１０，１１−テトラアザジベンゾ［ｃｄ，ｈ］アズレン（実施例４５）の合成
【化３９】
2019524658.tif 000047
【０２６４】
０℃で、アルゴン雰囲気において、ＢＨ３（１．６Ｍ、ＴＨＦ中、４ｍＬ）を実施例３１の中間体１１（２６０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）の溶液に添加した。混合物を室温で３時間撹拌した後、メタノール（６ｍＬ）を添加して急冷して減圧濃縮した。粗生成物１２をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、密封反応釜において９０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、混合物を減圧濃縮し、残留物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３で中和し、濾過して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３５％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出し、次に逆相Ｃ−１８カラムで精製し、５−７０％ＭｅＣＮ／水で勾配溶出し、灰白色固体（二段階収率３６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ３．３３  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．８６  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．０６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  １２．６８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２３７  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２６５】
実施例４６−５８
下記スキームに従って、実施例４５と同様に実施例４６−５８を調製した。
【化４０】
2019524658.tif 000048
【０２６６】
【表７】
2019524658.tif 000049
【０２６７】
実施例５９、６０
工程１（実施例３１）では２−（メトキシカルボニル）フェニルボロン酸のかわりに適切なフェニルボロン酸を使用し、且つ工程３（実施例１）ではメチルアミンのかわりにテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−アミンを使用する以外、下記スキームに従って、実施例４４と同様に実施例５９、６０を調製した。
【化４１】
2019524658.tif 000050
【０２６８】
【表８】
2019524658.tif 000051
【０２６９】
実施例６１、６２
中間体１１（実施例４５）のかわりに適切な中間体を使用する以外、下記スキームに従って、実施例５８と同様に実施例６１、６２を調製し、該中間体は工程１（実施例３１）では２−（メトキシカルボニル）フェニルボロン酸のかわりに適切なフェニルボロン酸を使用し、工程３（実施例１）ではメチルアミンのかわりにテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−アミンを使用して調製された。
【化４２】
2019524658.tif 000052
【０２７０】
【表９】
2019524658.tif 000053
【０２７１】
実施例６５
【化４３】
2019524658.tif 000054
【０２７２】
工程１
４−ヨード−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（中間体１６）の合成
【化４４】
2019524658.tif 000055
【０２７３】
４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（８．０ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１２．４２ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）及びＴｒｔＣｌ（１０．０６ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（２００ｍＬ）に溶解させた混合物を９０℃に加熱して１５時間連続的に反応させた。室温に冷却した後、濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）でケーキを洗浄し、合併した濾液を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−１５％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、白色結晶固体（１０．０ｇ、６７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．２８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．２７  （ｍ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０２  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．２９−７．５０  （ｍ，  ９  Ｈ），  ７．５６  （ｓ，  １Ｈ）。
【０２７４】
工程２
４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（中間体１７）の合成
【化４５】
2019524658.tif 000056
【０２７５】
アルゴン雰囲気において、中間体１６（２．１ｇ、４．１３ｍｍｏｌ）と２−イソプロポキシ−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（２．３１ｇ、１２．４０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を−７５℃に冷却し、次にｎ−ＢｕＬｉ（７．７５ｍＬ、１２．４０ｍｍｏｌ、ノルマルヘキサン溶液、１．６Ｍ）を滴下し、滴下中に反応温度を−７０℃以下に維持し、滴下終了後、−７５℃で１時間撹拌し、水を添加して反応混合物を急冷し、次に混合物を水とＥｔＯＡｃの間で分液した。それぞれ飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）及び飽和食塩水（１００ｍＬ）で有機層を洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４を用いる）させて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０−３０％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、白色固体（０．５ｇ、２４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ：  １．２３  （ｓ，  １２Ｈ），  １．２８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．２４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０４  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３９  （ｍ，  ９Ｈ），  ７．４７  （ｓ，  １Ｈ）．
【０２７６】
工程３
４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（中間体１８）の合成
【化４６】
2019524658.tif 000057
【０２７７】
アルゴン雰囲気において、中間体３ａ（３．２５ｇ、７．０ｍｍｏｌ、工程３ではメチルアミンのかわりにテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−アミンを使用して、実施例１の中間体３と同様に調製された）と中間体１７（３．９２ｇ、７．７ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（６．８５ｇ、２１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２の無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を反応釜に密封した。混合物を９０℃で１６時間撹拌して室温に冷却し、２００ｍＬ飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を反応混合物に添加した。酢酸エチルで（３×１５０ｍＬ）抽出した後、１５０ｍＬ飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液で、合併した有機層を洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０％−８０％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、白色固体（３．０ｇ、６０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  ０．６７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．１５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７２  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ５．４６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１６  （ｍ，  ８Ｈ），  ７．４２  （ｍ，  １０Ｈ），  ７．７５  （ｍ，  ２Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ７１９  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２７８】
工程４
４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（中間体１９）の合成
【化４７】
2019524658.tif 000058
【０２７９】
５０℃で、中間体１８（３．０ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）とＮａＯＨ（０．８７ｇ、２１．７１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ、１６ｍＬ）に溶解させた混合物を６０時間撹拌して室温に冷却した。混合物中のＴＨＦを減圧除去し、ＨＣｌ（１Ｎ）で混合物のｐＨ値を３に調整した。ＤＣＭ（１００ｍＬ×３）で混合物を抽出し、有機層を合併し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４を用いる）させて濃縮し、粗生成物（２．５ｇ）を得て、該粗生成物を精製せずに次の反応に使用する。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ６９１  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２８０】
工程５
５−（４−メトキシベンジル）−９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−２−トリチル−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン−１０（２Ｈ）−オン（中間体２０）の合成
【化４８】
2019524658.tif 000059
【０２８１】
室温で、中間体１９（２．５ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２．０６ｇ、５．４３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡをＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解させた混合物を１６時間撹拌した後、混合物を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、０％−８０％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、白色固体（３．０ｇ、６０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．５１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．６７  （ｍ，  １Ｈ），  ６．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１８  （ｍ，  ８Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  １０Ｈ），  ７．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ６７３  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２８２】
工程６
９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン−１０（２Ｈ）−オン（実施例６５）の合成
【化４９】
2019524658.tif 000060
【０２８３】
中間体２０（５０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（３ｍＬ）の混合物を密封反応器において９０℃で１６時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、且つ逆相Ｃ−１８カラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、５％−６０％アセトニトリル／水で勾配溶出し、白色固体（１２ｍｇ、６０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．８１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  １３．４１  （ｓ，  １Ｈ），  １４．０１  （ｓ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３１１  ［Ｍ＋Ｈ］＋．。
【０２８４】
実施例６６及び６７
【化５０】
2019524658.tif 000061
【０２８５】
工程１
５−（４−メトキシベンジル）−９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−２−トリチル−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン−１０（２Ｈ）−オン（中間体２１）の合成
【化５１】
2019524658.tif 000062
【０２８６】
室温で、実施例６５での中間体２０（１．０ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ（２２ｍＬ、１０：１、ｖ／ｖ）溶液を３時間撹拌した。反応混合物を５０ｍＬ飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液で急冷し、混合物中のＣＨ２Ｃｌ２を減圧除去した。濾過して混合物中の固体を収集し、ケーキを水（２０ｍＬ×３）で洗浄し、白色固体（０．４２ｇ、６６％）を得て、該白色固体を更に精製せずに次の反応に使用する。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４３１  ［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０２８７】
工程２
５−（４−メトキシベンジル）−２−メチル−９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン−１０（２Ｈ）−オン（中間体２２）及び５−（４−メトキシベンジル）−１−メチル−９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン−１０（１Ｈ）−オン（中間体２３）の合成
【化５２】
2019524658.tif 000063
【０２８８】
室温で、密封反応釜において、ＣＨ３Ｉ（１４５ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を、中間体２１（２２０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）とＣｓ２ＣＯ３（３３３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた混合物に添加した。６０℃で５時間撹拌した後、混合物を室温に冷却し、２０ｍＬ飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液に注入して、次にＥＡ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合併した有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ×３）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧濃縮して、中間体２２及び２３の混合物の粗生成物（２００ｍｇ、白色固体）を得て、更に精製せずに次の反応に使用する。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４４５  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２８９】
工程３
２−メチル−９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン−１０（２Ｈ）−オン（実施例６６）及び１−メチル−９−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−５，９−ジヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタジエン［ｈ］アズレン−１０（１Ｈ）−オン（実施例６７）の合成
【化５３】
2019524658.tif 000064
【０２９０】
９０℃で、密封反応釜中の中間体２２及び２３（２００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）とＴＦＡ（５ｍＬ）の混合物を１６時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、逆相Ｃ−１８カラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーで残留物を精製し、５％−５０％アセトニトリル／水で勾配溶出し、２０ｍｇの最終生成物６６と４２ｍｇの最終生成物６７を得た。
【０２９１】
化合物６６：  １Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．６３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１３  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．７１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９７  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  １３．４１  （ｓ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３２５  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２９２】
化合物６７：  １Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９５  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．６３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３５  （ｓ，  １Ｈ），  １３．３７  （ｓ，  １Ｈ）．  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３２５  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２９３】
実施例６８
ピラゾールボロネートの合成
【化５４】
2019524658.tif 000065
【０２９４】
工程１
４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（２５）の合成
【０２９５】
室温で、ＮＩＳ（２２．５ｇ、１００ｍｍｏｌ）を１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（１０．０ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を２４時間撹拌した。次にＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で反応物を急冷し、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ×３）で混合物を抽出した。合併した有機相を飽和食塩水（５０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧濃縮した。クロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：５、ｖ／ｖ）で残留物を精製し、生成物４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（１５．５ｇ、８２％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２６７  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２９６】
工程２
４−ヨード−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（２６）及び４−ヨード−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（２７）の合成
【０２９７】
２−ヨードプロパン（１２．９ｇ、７５．９ｍｍｏｌ）とＫ２ＣＯ３（１６．０ｇ、１１６ｍｍｏｌ）を４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（１５．５３ｇ、５８．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を６０℃に加熱して３時間連続的に反応させた。次に水（３００ｍＬ）で反応を急冷し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ×３）で混合物を抽出した。合併した有機相を飽和食塩水（２００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機相を減圧濃縮した。順相カラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１、ｖ／ｖ）で残留物を精製し、４−ヨード−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（中間体２６）（９．４ｇ、５２％）を得て、ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３０９  ［Ｍ＋Ｈ］＋、且つＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝８：１（ｖ／ｖ）で溶出し、４−ヨード−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（中間体２７）（６．１ｇ、３３％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３０９  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２９８】
工程３
１−イソプロピル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（２８）の合成
【０２９９】
４，４，４'，４'，５，５，５'，５'−オクタメチル−２，２'−ビ（１，３，２−ジオキサボロラン）（３．５６ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（２．７ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）２Ｃｌ２（３００ｍｇ）を４−ヨード−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（２．１４ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を１００℃に加熱して２時間連続的に反応させた。次にＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で反応を急冷し、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ×３）で混合物を抽出した。次に合併した有機相を飽和食塩水（４０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１、ｖ／ｖ）で残留物を精製し、生成物である１−イソプロピル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（１．０ｇ、９３％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３０９  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３００】
工程４
１−イソプロピル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（２９）の合成
【０３０１】
４−ヨード−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸エチル（４．５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）と２−イソプロポキシ−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（８．１５ｇ、４３．８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を−７５℃に冷却した後、ｎ−ＢｕＬｉ（１７．５ｍＬ、ノルマルヘキサン溶液、１．６Ｎ、４３．８ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を−７５℃で２時間撹拌した後、２００ｍＬ飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加して反応を急冷し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で混合物を抽出し、合併した有機層を５０ｍＬ飽和食塩水で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４を用いる）させて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで残留物（黄色油状物）を精製し、０−４０％ＥｔＯＡｃ／ＰＥで勾配溶出し、淡黄色油状物（２．０ｇ、４４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．２０−１．５０  （ｍ，  ２１Ｈ），  ４．２５  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５１−４．６５  （ｍ，  １  Ｈ），  ８．１８  （ｓ，  １  Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３０９  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３０２】
２８及び２９と同様に、工程２ではヨウ化メチル又はヨウ化エチルを使用して下記ピラゾールボロネートを調製してもよい。
【化５５】
2019524658.tif 000066
【０３０３】
実施例６８の合成
【化５６】
2019524658.tif 000067
【０３０４】
工程１
３−ヨード−１−（４−メトキシベンジル）−Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−４−アミン（３０）の合成
【０３０５】
１３０℃で、５０ｍＬ丸底フラスコ中の４−クロロ−３−ヨード−１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン（３．０ｇ、７．５ｍｍｏｌ）、１−メチルピペリジン−４−アミン（２．５７ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（３．８７ｇ、３０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩撹拌した。その後、反応物を減圧濃縮し、順相カラムクロマトグラフィーで残留物を精製し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨで勾配溶出し、褐色固体である３−ヨード−１−（４−メトキシベンジル）−Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−４−アミン（２．７ｇ、７５％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４７８  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３０６】
工程２
１−イソプロピル−４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（３１）の合成
【０３０７】
Ｎ２雰囲気において、３−ヨード−１−（４−メトキシベンジル）−Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−４−アミン（４６４ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、１−イソプロピル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（３００ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（８０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）及び２Ｎ  Ｎａ２ＣＯ３（１ｍＬ、２ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）溶液を９０℃に加熱して一晩撹拌した。その後、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で混合物を希釈し、水（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機相を濾過して濾液を濃縮し、残留物を得て、該残留物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１（ｖ／ｖ）で溶出し、黄色油状物である１−イソプロピル−４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（３００ｍｇ、５８％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ５３２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３０８】
工程３
（１−イソプロピル−４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メタノール（３２）の合成
【０３０９】
０ｏＣで、ＬｉＡｌＨ４（１８２ｍｇ、４．７９ｍｍｏｌ）を１−イソプロピル−４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸エチル（５１０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に複回に分けて添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。その後、水（５ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で反応を急冷した。懸濁液を濾過し、有機相を分離して飽和食塩水（１５ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機相を濾過し、濾液を減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝６／１（ｖ／ｖ）で溶出して残留物を精製し、白色固体である（１−イソプロピル−４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メタノール（３００ｍｇ、６４％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４９０  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３１０】
工程４
１−イソプロピル−５−（４−メトキシベンジル）−９−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１，５，９，１０−テトラヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン（３３）の合成
【０３１１】
０℃で、Ｎ２雰囲気において、塩化メタンスルホニル（１４４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を（１−イソプロピル−４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メタノール（３００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（１８５ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に一滴ずつ添加した。その後、反応を室温で０．５時間撹拌し、ＴＬＣは出発原料の消失を示し、その後、ｔ−ＢｕＯＫ（２０６ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応をＮ２雰囲気下で６０℃に加熱して１時間撹拌した後、水（１０ｍＬ）で反応を急冷してＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出し、飽和食塩水（３０ｍＬ）で有機相を洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機相を濾過し、濾液を濃縮し、残留物を得て、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝６／１（ｖ／ｖ）で溶出したシリカゲルクロマトグラフィーを用いて該残留物を精製し、無色油状物である１−イソプロピル−５−（４−メトキシベンジル）−９−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１，５，９，１０−テトラヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン（２００ｍｇ、６９％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４７２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３１２】
工程５
１−イソプロピル−９−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１，５，９，１０−テトラヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン（実施例６８）の合成
【０３１３】
７０℃で、１−イソプロピル−５−（４−メトキシベンジル）−９−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１，５，９，１０−テトラヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン（２００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させた混合物を一晩撹拌し、減圧濃縮し、得た残留物を分取ＨＰＬＣで精製し、収集した溶出液を合併し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ＝８に調整し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で有機相を乾燥させて濾過し、濾液を減圧濃縮し、白色固体である１−イソプロピル−９−（１−メチルピペリジン−４−イル）−１，５，９，１０−テトラヒドロ−１，２，４，５，８，９−ヘキサアザベンゾ［ｃｄ］シクロペンタ［ｈ］アズレン（１１０ｍｇ、７４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．６３−１．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．９１−２．１２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２２−２．３２  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ４．９３−４．９６（ｍ，  １Ｈ），  ６．７、９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７８−７．８１  （ｍ，  ２Ｈ），  １２．９５  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３５２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３１４】
実施例６９−８８
実施例６８と同様に、工程１では適切なアミンを使用し、及び工程２では適切なピラゾールボロネートを使用して実施例６９−８８を調製した。実施例６９及び７６において、適切なピラゾールボロネートは実施例６５の工程２中の中間体１７である。
【０３１５】
【表１０】
2019524658.tif 000068
【表１１】
2019524658.tif 000069
【表１２】
2019524658.tif 000070
【表１３】
2019524658.tif 000071
【０３１６】
実施例８９
【化５７】
2019524658.tif 000072
【０３１７】
工程１
４−ヨード−６−（トリフルオロメチル）ニコチン酸（３４）の合成
【０３１８】
３０００ｍＬの三口丸底フラスコにおいて、窒素ガス雰囲気下で、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（３４．５ｇ、１４１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）溶液を−７８℃に降温させて保温し、ｎ−ＢｕＬｉ（９８ｍＬ、２．４Ｍヘキサン溶液）を添加して０．５時間撹拌しながら反応させた後、６−トリフルオロメチルニコチン酸（１５ｇ、７８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を一滴ずつ滴下し、−７８℃で混合物を２．５時間撹拌した。その後、Ｉ２（２９．３ｇ、１１７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液をゆっくり添加し、同様に−７８℃で１時間撹拌しながら反応させた。その後、１００ｍＬ飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加して反応を急冷し、１Ｎ  ＨＣｌで反応液のｐＨ値を４〜５に調整した後、ＤＣＭ（４００ｍＬ×３）で混合物を抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して減圧濃縮し、残留物を得て、順相シリカゲルカラム（ＰＥ／ＥＡ／ＡｃＯＨ、１：１０：０．０１、ｖ／ｖ／ｖ）で精製し、黄色固体化合物３４（１０ｇ、４０％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）−：  ３１６  ［Ｍ−Ｈ］−。
【０３１９】
工程２
４−ヨード−６−（トリフルオロメチル）ニコチン酸メチル（３５）の合成
【０３２０】
室温で、中間体３４（１０ｇ、３１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（８．７ｇ、６３ｍｍｏｌ）及びＭｅＩ（５．３７ｇ、３７．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解させた混合物を一晩撹拌した。その後、反応混合物にＨ２Ｏ（３００ｍＬ）を添加した。混合物を濾過して水（２０ｍＬ）でケーキを洗浄し、空気中で乾燥させ、黄色固体化合物３５（１０ｇ、粗製品）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３３２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３２１】
工程３
４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）−６−（トリフルオロメチル）ニコチン酸メチル（３６）の合成
【０３２２】
Ｎ２雰囲気において、中間体３５（１０．０ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコール）ジボロン（１１．５ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（５．９ｇ、６０．４ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）２Ｃｌ２（３．３１ｇ、４．５３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）に混合し、９５℃に昇温させて保温しながら１８時間を連続的に撹拌した。その後、降温させて濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）と水（８０ｍＬ）の間で分液した。水（２００ｍＬ×２）で有機層を洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して減圧濃縮した。順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ、ｖ／ｖ、２０：１−１０：１梯度）で残留物を精製し、黄色固体の生成物（２．２ｇ）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２５０  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３２３】
工程４
４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−６−（トリフルオロメチル）ニコチン酸（３７）の合成
【０３２４】
Ｎ２を用いて、化合物３ａ（１．２３ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）、中間体３６（２．２ｇ、６．６ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（７３３ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン／Ｈ２Ｏ（４：１、ｖ／ｖ、２０ｍＬ）溶液を脱気した。その後、上記溶液にＰＰｈ３（１７５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＰＰｈ３）４（１８５ｍｇ）を添加した。窒素ガス雰囲気下で、混合物を１００℃で１８時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残留物を得て、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、ｖ／ｖ、５：１−２：１勾配溶出）、黄色固体の化合物３７（１．０ｇ、６９％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ５２８  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３２５】
工程５
（４−（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）−６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）メタノール（３８）の合成
【０３２６】
０℃で、中間体３７（１ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、ＡｌＣｌ３（２３４ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）及びＬｉＡｌＨ４（２６１ｍｇ、７．８６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させた混合物を１時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（０．２６ｍＬ）、１５％ＮａＯＨ（水溶液、０．２６ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．８ｍＬ）を混合物に順に添加した。混合物を濾過して濾液を減圧濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで残留物を精製し（ＰＥ／ＥＡ、ｖ／ｖ、５：１−２：１勾配溶出）、黄色油状物の生成物（２４０ｍｇ、２４．６％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ５１４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３２７】
工程６
１１−（４−メトキシベンジル）−４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−（トリフルオロメチル）−５，１１−ジヒドロ−４Ｈ−３，４，７，１０，１１−ペンタアザジベンゾ［ｃｄ，ｈ］アズレン（３９）の合成
【０３２８】
０℃で、ＭｓＣｌ（１１２ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）を中間体３８（２５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（１９８ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に一滴ずつ滴下した。０℃で０．５時間撹拌した後、ｔ−ＢｕＯＫ（２１９ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、５５℃で１．５時間撹拌しながら反応させ、減圧濃縮して残留物を得て、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで残留物を精製し（ＰＥ／ＥＡ、１：１、ｖ／ｖ）、黄色固体の化合物３９（２３０ｍｇ、９５％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４９６  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３２９】
工程７
４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−８−（トリフルオロメチル）−５，１１−ジヒドロ−４Ｈ−３，４，７，１０，１１−ペンタアザジベンゾ［ｃｄ，ｈ］アズレン（実施例８９）の合成
【０３３０】
化合物３９（２３０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をマイクロ波反応管においてＴＦＡ（３ｍＬ）に溶解させた後、１０５℃にマイクロ波支援加熱して１時間撹拌しながら反応させて、その後減圧濃縮し、残留物を分取ＨＰＬＣで精製し、白色固体（５５ｍｇ、３３．１％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１８  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １１．５，  ７．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  １１．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．１，  ３．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  １０．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８９  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．２４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２７  （ｓ，  １Ｈ），  ９．１９  （ｓ，  １Ｈ），  １４．７０  （ｓ，  １Ｈ）；  １９Ｆ−ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  −６６．７２，  −７４．４１；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３７６  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３３１】
実施例９０−９２
工程１では適切なピリジンを使用して、実施例８９と同様に実施例９０−９２を調製した。
【０３３２】
【表１４】
2019524658.tif 000073
【０３３３】
実施例９３
【化５８】
2019524658.tif 000074
【０３３４】
工程１
２−（（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）（メチル）アミノ）エタノール（４０）の合成
【０３３５】
１００℃で、３−ヨード−１−（４−メトキシベンジル）−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−４−アミン（１．５ｇ、３．２３ｍｍｏｌ）、２−（メチルアミノ）エタノール（１．９８ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅（１２３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、Ｌ−プロリン（１５０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）及びｔ−ＢｕＯＫ（６２１ｍｇ、６．４６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１５ｍＬ）に溶解させた混合物を一晩撹拌した。その後、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で混合物を希釈し、水（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ×１）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、混合物を濾過して濾液を濃縮し、残留物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝２／１（ｖ／ｖ）で溶出し、無色油状物である２−（（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）（メチル）アミノ）エタノール（７６０ｍｇ、５７％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４１２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３３６】
工程２
２−（（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）（メチル）アミノ）メタンスルホン酸エチル（４１）の合成
【０３３７】
０℃で、Ｎ２雰囲気において、塩化メタンスルホニル（４２９ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を２−（（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）（メチル）アミノ）エタノール（７６０ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（５６０ｍｇ、５．５５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７６ｍＬ）溶液に一滴ずつ滴下した後、室温で混合物を０．５時間撹拌した。水（１０ｍＬ）で反応を急冷し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×２）で抽出し、合併した有機相を飽和食塩水（２０ｍＬ×１）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、有機相を濾過して濾液を濃縮し、残留物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝３：１（ｖ／ｖ）で溶出し、無色油状物である２−（（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）（メチル）アミノ）メタンスルホン酸エチル（４８９ｍｇ、５４％）を得た。ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ４９０  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３３８】
工程３
２−（４−メトキシベンジル）−９−メチル−６−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−１，２，５，６，９−ペンタアザベンゾ［ｃｄ］アズレン（４２）の合成
【０３３９】
ｔ−ＢｕＯＫ（３１２ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）を２−（（１−（４−メトキシベンジル）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３−イル）（メチル）アミノ）メタンスルホン酸エチル（４５５ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に添加した。Ｎ２雰囲気下で、反応物を６０℃に加熱して１時間反応させた。その後、水（１０ｍＬ）で反応を急冷し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出し、飽和食塩水（３０ｍＬ）で有機相を洗浄し、且つＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、有機相を濾過し、濾液を減圧濃縮し、残留物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１／１（ｖ／ｖ）で溶出し、油状物である２−（４−メトキシベンジル）−９−メチル−６−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−１，２，５，６，９−ペンタアザベンゾ［ｃｄ］アズレン（１６７ｍｇ、４６％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ｐｐｍ  １．５７−１．６６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０４  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．２４  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ）；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ３９４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３４０】
工程４
９−メチル−６−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−１，２，５，６，９−ペンタアザベンゾ［ｃｄ］アズレン（実施例９３）の合成
【０３４１】
Ｎ２雰囲気下で、２−（４−メトキシベンジル）−９−メチル−６−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−１，２，５，６，９−ペンタアザベンゾ［ｃｄ］アズレン（１５０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のＴＦＡ（７．５ｍＬ）溶液を７０℃に加熱して８時間反応させた後、減圧濃縮してＴＦＡを除去し、残留物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に溶解させ、ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ×２）、飽和食塩水（２０ｍＬ×１）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して濾液を濃縮し、残留物を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１１／１、ｖ／ｖ）で精製し、白色固体である９−メチル−６−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−１，２，５，６，９−ペンタアザベンゾ［ｃｄ］アズレン（７５ｍｇ、７２％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  １．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０２（ｓ，  ３Ｈ），  ３．４４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７８（ｍ，  ２Ｈ），  ３．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３３（ｍ，  １Ｈ），  ６．８４（ｓ，  １Ｈ），  ７．５５（ｓ，  １Ｈ），  １２．３５  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  １２．９８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）；１９Ｆ−ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ｐｐｍ  −７４．４１；  ｍ／ｚ  （ＥＳＩ）＋：  ２７４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３４２】
実施例９４
工程１では２−（メチルアミノ）エタノールのかわりに２−（エチルアミノ）エタノールを使用する以外、実施例９３と同様に実施例９４を調製した。
【０３４３】
【表１５】
2019524658.tif 000075
【０３４４】
以下の方法によって、実施例のＬＲＲＫ２阻害、及びＪＡＫ２などのほかのキナーゼに対する選択性を測定する。
【０３４５】
材料及び方法
【０３４６】
材料
Ａｄａｐｔａ（登録商標）キナーゼアッセイ法（ＬＲＲＫ２＿ＩＣ５０アッセイ）において、キナーゼ反応緩衝液は５×キナーゼ緩衝液Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＶ５２１３）と２ｍＭ  ＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ２３２５）を含有する。キナーゼＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓタンパク質（ＰＶ４８８１）とＥＲＭ（ＬＲＲＫｔｉｄｅ、ＰＶ５０９３）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手される。Ａｄａｐｔａ（登録商標）ユニバーサルキナーゼアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＶ５０９９）の成分は、Ａｄａｐｔａ（登録商標）Ｅｕ−抗−ＡＤＰ抗体（ＰＶ５０９７；４μｇ）、１０μＭ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７  ＡＤＰトレーサー（ＰＶ５０９８；２００  ｐｍｏｌ）、ＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（ＰＶ３５７４；１００ｍｌ）、キナーゼ急冷緩衝液（Ｐ２８２５；１ｍｌ）、１０ｍＭ  ＡＴＰ（ＰＶ３２２７；５００μｌ）、及び１０ｍＭ  ＡＤＰ（ＰＶ５０９６；５００μｌ）を含む。ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１（１２３４４８０−８４−２、ＨＹ−１０８７５）はＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓから入手される。
【０３４７】
ＬＡＮＣＥ（登録商標）キナーゼアッセイ法（ＪＡＫ２＿ＩＣ５０選択性アッセイ）において、ＪＡＫ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＶ４２８８）、ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ７６９９−１ｇ）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）、ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４３８１５）、ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ＵＬｉｇｈｔ（登録商標）−ＪＡＫ−１ペプチド（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＴＲＦ０１２１）、ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ１０２４抗ホスホチロシン（ＰＴ６６）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ００６９）、ＬＡＮＣＥＴＭアッセイ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＣＲ９７−１００）、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（ＰｈａｒｍａＢｌｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｎｊｉｎｇ），Ｉｎｃ，カタログ番号ＰＢＮ２０１１５８６−０１）；装置：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｂｒａｖｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ）；消耗品：３８４ウェル中間プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８１２８０）、３８４ウェルアッセイプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００７２９９）。
【０３４８】
ショウジョウバエモデルにおいて、抗ＬＲＲＫ２（ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ９３５）抗体［ＵＤＤ２  １０（１２）］（ａｂ１３３４５０）はＡｂｃａｍから入手される。ｄｄｃ−ＧＡＬ４は蘇州大学医学部から入手される。
【０３４９】
Ａｄａｐｔａ（登録商標）キナーゼアッセイ方法
Ａｄａｐｔａ（登録商標）ユニバーサルキナーゼアッセイ法は、ＡＤＰを検出するための均一系蛍光免疫測定法である。ＡＴＰ枯渇アッセイ法とは逆で、Ａｄａｐｔａ（登録商標）アッセイ法はＡＤＰ形成に非常に敏感であり、ほとんどのシグナルは最初の１０−２０％のＡＴＰがＡＤＰに転化される時に変化することができる。それにより、Ａｄａｐｔａ（登録商標）ユニバーサルキナーゼアッセイ法は低活性キナーゼに非常に適する。
【０３５０】
室温（〜２１℃）ですべての測定を行い、且つ使用条件下で該測定は時間及び酵素濃度と線形関係を示している。５×キナーゼ緩衝液Ｓ原液（上記列挙されたもの）で１×キナーゼ反応緩衝液溶液を調製し、８ｍｌ  Ｈ２Ｏに２ｍｌ  ５×原液を添加することにより１０ｍｌの１×キナーゼ反応緩衝液を調製する。２０μｌの１Ｍ  ＤＴＴをこの１×キナーゼ反応緩衝液に添加する。
【０３５１】
低容量３８４ウェルプレートにおいて１０μｌ体積でキナーゼ反応を行う。通常、Ｇｒｅｉｎｅｒプレート（カタログ＃３６７４＃、低容量、白壁、７８４０７５）を使用する。テストされていないほかの未処理アッセイプレートも適切である場合がある。このようなアッセイにおいて、基質濃度は１００μＭであり、且つ１×キナーゼ反応緩衝液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５及び２ｍＭ  ＤＴＴ、並びに特定のキナーゼに必要なほかの添加剤のいずれかから形成される。キナーゼ反応を室温で１時間行った後、５μｌのＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液中のキナーゼ急冷緩衝液（ＥＤＴＡ；３０ｍＭ）、Ｅｕ標識抗体（６ｎＭ）及びトレーサー（１８．９ｎＭ）の製剤を添加する。アッセイウェル中の抗体の最終濃度は２ｎＭ、トレーサーは６．３ｎＭ、ＥＤＴＡは１０ｍＭである。プレートを室温で少なくとも３０分間平衡化した後、Ａｄａｐｔａ（登録商標）  ＴＲ−ＦＲＥＴ用に構成されたプレートリーダーで読み取る。
【０３５２】
ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーによって、Ａｄａｐｔａ（登録商標）用の適切なフィルター及び機器を用いて、本明細書で提供されたデータを設定する。ウェルにおいて１％ＤＭＳＯ（最終）で試験化合物をスクリーニングする。８点滴定について、出発濃度から５回連続希釈する。
【０３５３】
ＬＡＮＣＥ（登録商標）キナーゼ選択性試験方法
該測定法は、酵素触媒工程、及びＨＴＲＦ試薬で行われる検出工程の２つの工程を含む。工程１では、酵素触媒工程期間に、基質ビオチンを目的キナーゼとともにインキュベートする。ＡＴＰを添加して反応を開始する。工程２では、検出試薬でリン酸化基質を捕獲し、得たＴＲ−ＦＲＥＴがリン酸化レベルに比例する。
【０３５４】
化合物の調製について、試験化合物を３０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液に溶解させ、室温でこの溶液を窒素カバーに長期間保存し、３倍係数、計１１種の濃度で、ＤＭＳＯ中の３０ｍＭ化合物を希釈し、１μｌ化合物を吸引して、その後キナーゼ緩衝液で該化合物を２５倍に希釈する。均一に混合し、室温で３０分間平衡化する。
【０３５５】
キナーゼ反応について、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｒａｖｏによって、２．５μｌキナーゼ緩衝液（４ｘ）中の化合物をアッセイプレートに移す。プレートを回転させ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ電子マルチチャンネルピペットを用いて、５μｌ酵素混合物をアッセイプレートに移す。プレートを回転させ、室温（２３℃）でアッセイプレートを２０分間インキュベートし、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐを用いて、ＡＴＰを含有したキナーゼ緩衝液２．５μｌをアッセイプレートに投入する。プレートを回転させて密封し、室温（２３℃）でアッセイプレートを９０分間インキュベートする。
【０３５６】
反応の停止について、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ電子マルチチャンネルピペットを用いて、１０μｌ検出試薬（２ｎＭ  ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ１０２４抗ホスホチロシン）をアッセイプレートに移す。プレートを回転させて密封し、室温（２３℃）でアッセイプレートを６０分間インキュベートする。
【０３５７】
検出及び読み取りについて、励起波長は３４０ｎｍ、一次発光波長は６１５ｎｍ、二次発光波長は６６５ｎｍ（それぞれＣｒｙｐｔａｔｅとＵｌｉｇｈｔに用いられる）である。ＥｎＶｉｓｉｏｎを用いてプレートを読み取り、２つの波長の示度を得て、６６５ｎｍ／６１５ｎｍの比を計算する。
【０３５８】
ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ  Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて、ＩＣ５０推計値を取得する。
【０３５９】
ショウジョウバエモデルのスクリーニング方法
ショウジョウバエモデルはインビボで例を評価するために用いられる。１９９３年にＡｎｄｒｅａ  Ｂｒａｎｄ及びＮｏｒｂｅｒｔ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎによって開発されたＧＡＬ４／ＵＡＳシステム［４５］はドーパミン（ＤＡ）ニューロンにおいてＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓを発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製するために用いられる。該システムは、酵母転写活性化タンパク質ＧＡＬ４をコードするＧＡＬ４遺伝子、及びＧＡＬ４と特異的結合して遺伝子転写を活性化するエンハンサーＵＡＳ（上流活性化配列）の２つの部分を有する。該システムはＵＡＳと特異的結合した酵母ＧＡＬ４転写因子を利用する。ＵＡＳ−野生型−ＬＲＲＫ２とＵＡＳ−Ｇ２０１９Ｓ−ＬＲＲＫ２の遺伝子組換えをドーパデカルボキシラーゼ（ｄｄｃ）−ＧＡＬ４ドライバー［４６］と組み合わせて、ＤＡニューロンにおいてＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓを発現する。１０μＭのＧＷ５０７４は陽性対照に用いられる。陰性対照群はＤＭＳＯ対照である（すべての化合物は１：１０００でＤＭＳＯに希釈溶解した）。１２時間明／１２時間暗サイクルでは、ショウジョウバエを２５℃に維持する。ＧＷ５０７４は陽性対照として用いられる［４７］。
【０３６０】
生存率
新しく閉じられた２０匹の雌のショウジョウバエを収集し、食品バイアルに入れる。１日おきにショウジョウバエを新鮮な食品バイアルに移し、この時、死亡を記録する。
【０３６１】
ショウジョウバエの生存曲線に基づき、５０％生存期間パラメータはショウジョウバの半分が生存する期間を示し、且つ異なる群の生存率を比較することに用いられる。各群の４個の独立実験に基づき、平均５０％生存期間と標準誤差を計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ６．０ソフトウェアによってデータを分析する。
【０３６２】
クライミングアッセイ（Ｃｌｉｍｂｉｎｇ  Ａｓｓａｙ）
負の走地性測定はショウジョウバエの運動能力を分析することに用いられる。各バイアルの２０匹のショウジョウバエ（１群あたり４匹のバイアル）に週１回クライミングアッセイを行う。
【０３６３】
測定対象のショウジョウバエを垂直プラスチック管（高さ１５ｃｍ、直径１．５ｃｍ）に移す。室温で３０分間静置した後、ショウジョウバエを管の底までやさしく叩き、１０秒以内に試験線まで又はその上までクライミングできるショウジョウバエの数を計数し、且つ百分率を計算する。
【０３６４】
各バイアルの３回の独立実験に基づきクライミング能力を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ６．０ソフトウェアによってデータを分析する。
【０３６５】
６週目に行われたキナーゼアッセイ
氷上でショウジョウバエ成虫の頭部を均質化し、ＡＴＰとＤＴＴを有するキナーゼ反応緩衝液中で脳溶解物のキナーゼ反応を行う。
【０３６６】
その後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって、溶解物を電気泳動させて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す。室温で、５％脱脂乳を有するＴＢＳＴ中で該膜を１時間密閉した後、４℃で抗ＬＲＲＫ２  ｐＳｅｒ９３５抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３３４５０）と抗Ｆｌａｇ抗体中で一晩インキュベートする。
【０３６７】
ＨＲＰ結合二次抗体とＥＣＬ検出試薬を用いてタンパク質を検出する。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって免疫ブロットの光学密度を分析し、リン酸化ＬＲＲＫ２タンパク質のＦｌａｇタンパク質に対する比を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ６．０ソフトウェアによってデータを分析する。
【０３６８】
キナーゼ選択性試験方法
【０３６９】
１．ＭＫＫ１試験
これは二段階アッセイ法であり、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ  ＡＴＰを含有する体積２５．５μｌ中で、不活性ＭＡＰＫ（０．０６ｍｇ／ｍｌ）がＭＫＫ１（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）によって活性化された。室温で３０分間インキュベートした後、第１回の反応溶液から、（最終濃度）２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．６６ｍｇ／ｍｌミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する第２反応混合物２０μｌに溶液５μｌを移し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７０】
２．ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２試験。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＭＡＰＫ／ＥＲＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７１】
３．ＪＮＫ１ａ１／ＳＡＰＫ１ｃ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、ＡＴＦ２（３μＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＡＴＦ２（活性化転写因子）に対するＪＮＫ１ａ１／ＳＡＰＫ１ｃ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７２】
４．ＳＡＰＫ  ２ａ／ｐ３８試験。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＳＡＰＫ  ２ａ／ｐ３８（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７３】
５．ＳＡＰＫ  ２ｂ／ｐ３８β２試験。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＳＡＰＫ  ２ｂ／ｐ３８β２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７４】
６．ＳＡＰＫ  ３／ｐ３８  ｇ試験。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＳＡＰＫ  ３／ｐ３８  ｇ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７５】
７．ＳＡＰＫ  ４／ｐ３８∂試験。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＳＡＰＫ  ４／ｐ３８ｄ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７６】
８．ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ試験。
５０ｍＭ  Ｎａ−ｂ−グリセロールリン酸塩  ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡに対するＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で４０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７７】
９．ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２試験。
５０ｍＭ  Ｎａ−ｂ−グリセロールリン酸塩  ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡに対するＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７８】
１０．ＭＳＫ１試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、修飾されたＣｒｏｓｓｔｉｄｅペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧＫＫに対するＭＳＫ１（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３７９】
１１．ＰＲＡＫ試験。
５０ｍＭ  ｂ−グリセロールリン酸ナトリウム  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＬＲＲＴＬＳＶＡに対するＰＲＡＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  ｂ−グリセロールリン酸ナトリウム  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８０】
１２．ＰＫＡ試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｋｅｍｐｔｉｄｅ（ＬＲＲＡＳＬＧ）に対するＰＫＡ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８１】
１３．ＰＫＣａ試験。
ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒｉｎｅ）、ＤＡＧ（０．１ｍｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌ）及び０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で、ヒストンＨ１に対するＰＫＣａ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に希釈した）を測定した。該測定は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で行われ、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８２】
ＰｔｄＳｅｒ／ＤＡＧの調製について、ＭｅＯＨ／クロロホルム（１：２）中のＰｔｄＳｅｒ原料＝１０ｍｇ／ｍｌである。所要量乾燥させた。適切な体積の１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４に再懸濁させた。遠心処理して短時間超音波処理した。（２×１０−１５秒、間隔１０−１５秒）。ＭｅＯＨ／クロロホルム（１：２）中のＤＡＧ原料＝１０ｍｇ／ｍｌである。所要量乾燥させる。超音波処理済みのＰｔｄＳｅｒ溶液を添加した。遠心処理及び超音波処理を行った。
【０３８３】
１４．ＰＤＫ１試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％％ｂ−メルカプトエタノール、１００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＰＤＫｔｉｄｅ（ＫＴＦＣＧＴＰＥＹＬＡＰＥＶＲＲＥＰＲＩＬＳＥＥＥＱ−ＥＭＦＲＤＦＤＹＩＡＤＷＣ）に対するＰＤＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８４】
１５．ΔＰＨ−ＰＫＢａ−Ｓ４７３Ｄ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、修飾されたＣｒｏｓｓｔｉｄｅペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧＫＫに対するΔＰＨ−ＰＫＢａ−Ｓ４７３Ｄ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８５】
１６．ＳＧＫ試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、修飾されたＣｒｏｓｓｔｉｄｅペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧＫＫに対するＳＧＫ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８６】
１７．Ｓ６Ｋ１／Ｐ７０  Ｓ６Ｋ試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＲＮＲＴＬＴＶ）に対するＳ６Ｋ１／Ｐ７０  Ｓ６Ｋ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８７】
１８．ＧＳＫ３ｂ試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μＭリン酸化ＧＳ２ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、リン酸化ＧＳ２ペプチド（ＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱＳ（ＰＯ４）ＥＤＥＥＥ）に対するＧＳＫ３ｂ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８８】
１９．ＲＯＣＫ−ＩＩ  （ＲＯＫａ）試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、３０μＭ  Ｌｏｎｇ  Ｓ６基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｌｏｎｇ  Ｓ６基質ペプチド（ＫＥＡＫＥＫＲＱＥＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＧＧＳＱＫ）に対するＲＯＣＫ−ＩＩ  （ＲＯＫａ）（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３８９】
２０．ＡＭＰＫ試験。
５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｂｒｉｊ３５、０．４ｍＭ  ＳＡＭＳペプチド、０．１９６ｍＭ  ＡＭＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＳＡＭＳ基質ペプチド（ＨＭＲＳＡＭＳＧＬＨＬＶＫＲＲ）に対するＡＭＰＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｂｒｉｊ３５に希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９０】
２１．ＣＨＫ１試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００μＭ  ＣＨＫｔｉｄｅ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＣＨＫｔｉｄｅ基質ペプチド（ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ）に対するＣＨＫ１（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、５％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９１】
２２．ＣＫ２試験。
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、ＣＫＩＩペプチド（０．１６５ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＣＫＩＩペプチド（ＲＲＲＤＤＤＳＤＤＤ）に対するＣＫ２（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９２】
２３．ＰＢＫ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．６、５０ｍＭｂ−グリセロールリン酸ナトリウム、０．０４ｍＭ  ＣａＣｌ２、リン酸化ｂペプチド（０．１９６ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、リン酸化ｂペプチド（ＫＲＫＱＩＳＶＲＧＬ）に対するＰＢＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭｂ−グリセロールリン酸ナトリウム  ｐＨ７．０、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で１５分間インキュベートする。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９３】
２４．ＬＣＫ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３Ｖｏ４、Ｃｄｃ２ペプチド（０．２５ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｃｄｃ２ペプチド（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）に対するＬＣＫ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で１５分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９４】
２５．ＣＳＫ試験。
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｃｄｃ２ペプチド（０．２５ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｃｄｃ２ペプチド（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）に対するＣＳＫ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９５】
２６．ＣＤＫ２／サイクリンＡ試験。
５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｂｒｉｊ３５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ヒストンＨ１（１ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ヒストンＨ１に対するＣＤＫ２／サイクリンＡ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｂｒｉｊ３５、１００ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９６】
２７．ＤＹＲＫ  １Ａ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、３５０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｗｏｏｄｔｉｄｅに対するＤＹＲＫ  １Ａ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９７】
２８．ＣＫ１試験。
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、ＣＫＩペプチド（０．５ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＣＫＩペプチド（ＲＲＫＤＬＨＤＤＥＥＤＥＡＭＳＩＴＡ）に対するＣＫ１（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９８】
２９．ＮＥＫ６試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、ＮＥＫ６ペプチド（０．３ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＮＥＫ６ペプチド（ＦＬＡＫＳＦＧＳＰＮＲＡＹＫＫ）に対するＮＥＫ６（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０３９９】
３０．ＮＥＫ２ａ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ  ＮＥＫ２ａペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＮＥＫ２ａペプチド（ＲＦＲＲＳＲＲＭＩ）に対する５−２０ｍＵのＮＥＫ２ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４００】
３１．ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ／ＲＳＫ２試験。
５０ｍＭ  ｂ−グリセロールリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ）に対するＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０１】
３２．ＩＫＫｂ試験。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥＹ）に対する５−２０ｍＵのＩＫＫｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０２】
３３．ｓｍＭＬＣＫ試験
５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０μＭカルモジュリン、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＲＰＱＲＡＴＳＮＶＦＡ）に対する５−２０ｍＵのｓｍＭＬＣＫ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０３】
３４．ＰＲＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３０μＭ  Ｌｏｎｇ  Ｓ６ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｌｏｎｇ  Ｓ６ペプチド（ＫＥＡＫＥＫＲＱＥＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＧＧＳＱＫ）に対する５−２０ｍＵのＰＲＫ２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０４】
３５．ＭＮＫ２α試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ｅＩＦ４Ｅ）に対する５−２０ｍＵのＭＮＫ２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０５】
３６．ＣＡＭＫ−１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３μＭカルモジュリン、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＹＬＲＲＲＬＳＤＳＮＦ）に対する５−２０ｍＵのＣＡＭＫ−１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０６】
３７．ＰＩＭ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３μＭカルモジュリン、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＳＲＨＳＳＹＰＡＧＴ）に対する５−２０ｍＵのＰＩＭ２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０７】
３８．ＮＥＫ７試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、基質ペプチド（０．３ｍＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＦＬＡＫＳＦＧＳＰＮＲＡＹＫＫ）に対するＮＥＫ７（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止し、且つオルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０８】
３９．ＪＮＫ３α１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、ＡＴＦ２（３μＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＡＴＦ２（活性化転写因子）に対するＪＮＫ３  α１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４０９】
４０．ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ）に対する５−２０ｍＵのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１０】
４１．ＥＲＫ８試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＥＲＫ８（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１１】
４２．ＭＮＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ｅＩＦ４Ｅ）に対する５−２０ｍＵのＭＮＫ１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１２】
４３．ＳＲＰＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ）に対する５−２０ｍＵのＳＲＰＫ１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１３】
４４．ΔＰＨ−ＰＫＢβ（Ｓ４７４Ｄ）試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、修飾されたＣｒｏｓｓｔｉｄｅペプチド（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧＫＫ）に対するΔＰＨ−ＰＫＢ  β−Ｓ４７４Ｄ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１４】
４５．Ａｕｒｏｒａ  Ｂ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧ）に対するＡｕｒｏｒａ  Ｂ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１５】
４６．ＣＨＫ２試験
８ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００μＭ  ＣＨＫｔｉｄｅ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＣＨＫｔｉｄｅ基質ペプチド（ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ）に対するＣＨＫ２（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、５％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１６】
４７．Ｓｒｃ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）に対するＳｒｃ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１７】
４８．ＥＦ２Ｋ試験
５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．６、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３μＭカルモジュリン、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＫＫＦＧＥＳＫＴＫＴＫＥＦＬ）に対するＥＦ２Ｋ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ６．６、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１８】
４９．ＭＡＲＫ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＣＨＫｔｉｄｅ基質（ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ）に対するＭＡＲＫ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４１９】
５０．ＭＳＴ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＭＳＴ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１００μＭバナジウム酸塩に希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２０】
５１．ＰＫＤ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ）に対するＰＫＤ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２１】
５２．ＰＬＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、１０μＭバナジウム酸塩、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＩＳＤＥＬＭＤＡＴＦＡＤＱＥＡＫＫＫ）に対するＰＬＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１００μＭバナジウム酸塩に希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２２】
５３．ＤＹＲＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、３５０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｗｏｏｄｔｉｄｅ（ＫＫＩＳＧＲＬＳＰＩＭＴＥＱ）に対するＤＹＲＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２３】
５４．ＪＮＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ｂ−メルカプトエタノール、ＡＴＦ２（３μＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＡＴＦ２（活性化転写因子）に対するＪＮＫ２  １（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２４】
５５．ＤＹＲＫ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、３５０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、Ｗｏｏｄｔｉｄｅ（ＫＫＩＳＧＲＬＳＰＩＭＴＥＱ）に対するＤＹＲＫ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２５】
５６．ＨＩＰＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＨＩＰＫ２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２６】
５７．ＨＩＰＫ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＨＩＰＫ３（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２７】
５８．ＰＡＫ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ）に対するＰＡＫ４（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２８】
５９．ＰＡＫ５（ＰＡＫ７）試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ）に対するＰＡＫ５（ＰＡＫ７）（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４２９】
６０．ＰＡＫ６試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ）に対するＰＡＫ６（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３０】
６１．ＣＡＭＫＫａ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３μＭカルモジュリン、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＡＫＰＫＧＮＫＤＹＨＬＱＴＣＣＧＳＬＡＹＲＲＲ）に対する５−２０ｍＵのＣＡＭＫＫａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３１】
６２．ＣＡＭＫＫｂ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３μＭカルモジュリン、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＤＧＥＦＬＲＴＳＣＧＳＰＮＹＡＡＲＲＲ）に対する５−２０ｍＵのＣＡＭＫＫｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３２】
６３．ＰＩＭ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＳＲＨＳＳＹＰＡＧＴ）に対するＰＩＭ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３３】
６４．ＰＩＭ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＳＲＨＳＳＹＰＡＧＴ）に対するＰＩＭ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３４】
６５．ＰＬＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、１０μＭバナジウム酸塩、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＩＳＤＥＬＭＤＡＴＦＡＤＱＥＡＫＫＫ）に対するＰＬＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１００μＭバナジウム酸塩に希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３５】
６６．ＢＲＳＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ）に対するＢＲＳＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３６】
６７．ＭＥＬＫ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、２００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ）に対するＭＥＬＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３７】
６８．ＰＫＣζ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、１０μＭバナジウム酸塩、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＥＲＭＲＰＲＫＲＱＧＳＶＲＲＲＶ）に対するＰＫＣζ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１００μＭバナジウム酸塩に希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３８】
６９．Ａｕｒｏｒａ  Ｃ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．０５％ｂ−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧ）に対するＡｕｒｏｒａ  Ｃ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４３９】
７０．ＥＲＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＥＲＫ１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ｂ−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４０】
７１．ＦＧＦ−Ｒ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＦＧＦ−Ｒ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４１】
７２．ＩＲＲ試験
５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＩＲＲ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４２】
７３．ＥＰＨ−Ａ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＥＰＨ−Ａ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４３】
７４．ＭＳＴ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＭＳＴ４（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４４】
７５．ＳＹＫ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＳＹＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４５】
７６．ＹＥＳ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＹＥＳ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４６】
７７．ＩＧＦ−１Ｒ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ）に対するＩＧＦ−１Ｒ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４７】
７８．ＶＥＧ−ＦＲ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ）に対するＶＥＧ−ＦＲ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４８】
７９．ＢＴＫ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）に対するＢＴＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４４９】
８０．ＩＲ−ＨＩＳ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＳＲＧＤＹＭＴＭＱＩＧ）に対するＩＲ−ＨＩＳ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５０】
８１．ＥＰＨ−Ｂ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＥＰＨ−Ｂ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５１】
８２．ＴＢＫ１（ＤＵ１２５６９）試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥ）に対するＴＢＫ１（ＤＵ１２５６９）（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５２】
８３．ＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ（ＤＵ１４２３１）試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−ｇ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対する５−２０ｍＵのＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ（ＤＵ１４２３１）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した。オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭで測定液をＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５３】
８４．ＧＣＫ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＧＣＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５４】
８５．ＩＲＡＫ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＩＲＡＫ４（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５５】
８６．ＮＵＡＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＡＬＮＲＴＳＳＤＳＡＬＨＲＲＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＡＬＮＲＴＳＳＤＳＡＬＨＲＲＲに対するＮＵＡＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５６】
８７．ＭＬＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＭＬＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５７】
８８．ＭＩＮＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＭＩＮＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５８】
８９．ＭＬＫ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＭＬＫ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４５９】
９０．ＬＫＢ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＬＳＮＬＹＨＱＧＫＦＬＱＴＦＣＧＳＰＬＹＲＲＲに対するＬＫＢ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６０】
９１．ＨＥＲ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒに対するＨＥＲ４（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６１】
９２．ＴＴＫ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲに対するＴＴＫ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６２】
９３．ＲＩＰＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＲＩＰＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６３】
９４．Ａｕｒｏｒａ  Ａ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧＬＲＲＬＳＬＧに対するＡｕｒｏｒａ  Ａ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６４】
９５．ＰＡＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧに対するＰＡＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６５】
９６．ＢＲＳＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧに対するＢＲＳＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６６】
９７．ＨＩＰＫ３試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＨＩＰＫ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６７】
９８．ＨＩＰＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＨＩＰＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６８】
９９．ＪＮＫ３α１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、ＡＴＦ２（３μＭ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５００−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＡＴＦ２（活性化転写因子）に対するＪＮＫ３（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％  β−メルカプトエタノールに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４６９】
１００．ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３試験
５０ｍＭ  β−グリセロールリン酸ナトリウムｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡに対するＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（５−２０ｍＵ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、５％グリセロール、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７０】
１０１．ＭＡＲＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲに対するＭＡＲＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７１】
１０２．ＭＡＲＫ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲに対するＭＡＲＫ４（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７２】
１０３．ＥＰＨ−Ｂ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＥＰＨ−Ｂ４（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７３】
１０４．ＪＡＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０５％  β−メルカプトエタノール、１００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＰＤＫｔｉｄｅ（ＫＴＦＣＧＴＰＥＹＬＡＰＥＶＲＲＥＰＲＩＬＳＥＥＥＱ−ＥＭＦＲＤＦＤＹＩＡＤＷＣ）に対するＪＡＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０５％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７４】
１０５．ＥＰＨ−Ａ４試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＥＰＨ−Ａ４（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７５】
１０６．ＴＡＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、３００μＭ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ）に対するＴＡＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７６】
１０７．ＴｒｋＡ試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＴｒｋＡ（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７７】
１０８．ＭＥＫＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＰ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＭＢＰに対するＭＥＫＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７８】
１０９．ＭＡＲＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲに対するＭＡＲＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４７９】
１１０．ＣＬＫ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．３ｍＭペプチド、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＲＮＲＹＲＤＶＳＰＦＤＨＳＲ）に対するＣＬＫ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４８０】
１１１．ＤＡＰＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．３ｍＭペプチド、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ）に対するＤＡＰＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４８１】
１１２．ＥＰＨ−Ｂ２試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ基質ペプチド、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、基質ペプチド（ポリＧｌｕｔ  Ｔｙｒ）に対するＥＰＨ−Ｂ２（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４８２】
１１３．ＴＳＳＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０２ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲに対するＴＳＳＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４８３】
１１４．ＴＥＳＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌアクチン２、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．０５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、アクチン２に対するＴＥＳＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ＭＭ  ＤＴＴに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４８４】
１１５．ＴＴＢＫ１試験
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３ｍＭ  ＲＲＫＤＬＨＤＤＥＥＤＥＡＭＳＩＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．００５ｍＭ［３３Ｐ−γ−ＡＴＰ］（５０−１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する最終体積２５．５μｌ中で、ＲＲＫＤＬＨＤＤＥＥＤＥＡＭＳＩＴＡに対するＴＴＢＫ１（５−２０ｍＵ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴに希釈した）を測定し、室温で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ（３％）オルトリン酸５μｌを添加して測定を停止した後、オルトリン酸の洗浄緩衝液５０ｍＭでＰ８１  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートに収集した。
【０４８５】
ＬＲＲＫ２効果
下記表は本発明の実施例によるＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓ阻害のＩＣ５０値を示している。
【０４８６】
【表１６】
2019524658.tif 000076
【０４８７】
ＪＡＫ２選択性
下記表は本発明の実施例のＪＡＫ２  ＩＣ５０値を示している。
【０４８８】
【表１７】
2019524658.tif 000077
【０４８９】
ショウジョウバエモデルの効果
【０４９０】
生存率
下記表は本発明の実施例の生存率を示している。
【０４９１】
【表１８】
2019524658.tif 000078
【０４９２】
＊＊はＤＭＳＯ陰性対照と比較してＰ＜０．０１における有意差が観測されたことを示している。
＊はＤＭＳＯ陰性対照と比較してＰ＜０．０５における有意差が観測されたことを示している。
【０４９３】
クライミングアッセイ
下記表は本発明の実施例のクライミングアッセイを示している。
【０４９４】
【表１９】
2019524658.tif 000079
【０４９５】
＊＊はＤＭＳＯ陰性対照と比較してＰ＜０．０１における有意差が観測されたことを示している。
＊はＤＭＳＯ陰性対照と比較してＰ＜０．０５における有意差が観測されたことを示している。
【０４９６】
６週目に行われたキナーゼアッセイ
下記表は本発明の実施例のキナーゼ測定結果を示している。
【０４９７】
【表２０】
2019524658.tif 000080
【０４９８】
＊はＤＭＳＯ陰性対照と比較してＰ＜０．０５における有意差が観測されたことを示している。
【０４９９】
キナーゼ選択性データ
代表化合物のキナーゼ選択性データは下記表に示されている。１μＭ阻害剤の濃度における各特異的キナーゼの阻害百分率の値で表される。
【０５００】
【表２１】
2019524658.tif 000081
【表２２】
2019524658.tif 000082
【０５０１】
本発明の範囲及び精神を逸脱せず場合、当業者は、本発明の態様に種々の変更や変形を行うことができる。具体的な好適実施形態を参照して本発明を説明したが、保護請求する本発明は、それらの具体的な実施形態を限定するものではないと理解できる。実際には、本発明の実施形態への種々の変更は当業者にとって明らかであり、且つ特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０５０２】
参考文献
１．  Ｌｅｅｓ  ＡＪ，  Ｈａｒｄｙ  Ｊ，  Ｒｅｖｅｓｚ  Ｔ  （２００９）  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３７３：  ２０５５−２０６６．
２．  Ｎａｌｌｓ  ＭＡ，  Ｐａｎｋｒａｔｚ  Ｎ，  Ｌｉｌｌ  ＣＭ，  Ｄｏ  ＣＢ，  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＤＧ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｉｘ  ｎｅｗ  ｒｉｓｋ  ｌｏｃｉ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４６：  ９８９−９９３．
３．  Ｓｉｍｏｎ−Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｊ，  Ｓｃｈｕｌｔｅ  Ｃ，  Ｂｒａｓ  ＪＭ，  Ｓｈａｒｍａ  Ｍ，  Ｇｉｂｂｓ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１：  １３０８−１３１２．
４．  Ｓａｔａｋｅ  Ｗ，  Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｙ，  Ｍｉｚｕｔａ  Ｉ，  Ｈｉｒｏｔａ  Ｙ，  Ｉｔｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｔ  ｆｏｕｒ  ｌｏｃｉ  ａｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１：  １３０３−１３０７．
５．  Ｒｕｄｅｎｋｏ  ＩＮ，  Ｃｏｏｋｓｏｎ  ＭＲ  （２０１４）  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １１：  ７３８−７５０．
６．  Ｆｏｎｚｏ  Ａ，  Ｗｕ−Ｃｈｏｕ  Ｙ−Ｈ，  Ｌｕ  Ｃ−Ｓ，  Ｄｏｅｓｅｌａａｒ  Ｍ，  Ｓｉｍｏｎｓ  ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＬＲＲＫ２  ｇｅｎｅ，  Ｇｌｙ２３８５Ａｒｇ，  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：  １３３−１３８．
７．  Ｆａｒｒｅｒ  ＭＪ，  Ｓｔｏｎｅ  ＪＴ，  Ｌｉｎ  ＣＨ，  Ｄａｃｈｓｅｌ  ＪＣ，  Ｈｕｌｉｈａｎ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｌｒｒｋ２  Ｇ２３８５Ｒ  ｉｓ  ａｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｓｉａ．  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  Ｒｅｌａｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  １３：  ８９−９２．
８．  Ｗｅｓｔ  ＡＢ，  Ｍｏｏｒｅ  ＤＪ，  Ｂｉｓｋｕｐ  Ｓ，  Ｂｕｇａｙｅｎｋｏ  Ａ，  Ｓｍｉｔｈ  ＷＷ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｃｏｖｅｒ：  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ａｕｇｍｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０２：  １６８４２−１６８４７．
９．  Ｋｈａｎ  ＮＬ，  Ｊａｉｎ  Ｓ，  Ｌｙｎｃｈ  ＪＭ，  Ｐａｖｅｓｅ  Ｎ，  Ａｂｏｕ−Ｓｌｅｉｍａｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ＬＲＲＫ２  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｄａｒｄａｒｉｎ  （ＰＡＲＫ８）  ｃａｕｓｅ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ，  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ，  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄａｔａ．  Ｂｒａｉｎ．
１０．  Ｋａｃｈｅｒｇｕｓ  Ｊ，  Ｍａｔａ  ＩＦ，  Ｈｕｌｉｈａｎ  Ｍ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＪＰ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＬＲＲＫ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｆｏｕｎｄｅｒ  ａｃｒｏｓｓ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７６：  ６７２−６８０．
１１．  Ｏｚｅｌｉｕｓ  ＬＪ，  Ｓｅｎｔｈｉｌ  Ｇ，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ−Ｐｕｌｌｍａｎ  Ｒ，  Ｏｈｍａｎｎ  Ｅ，  Ｄｅｌｉｇｔｉｓｃｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓ  ａｓ  ａ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  Ｊｅｗｓ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５４：  ４２４−４２５．
１２．  Ｊａｌｅｅｌ  Ｍ，  Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＲＪ，  Ｄｅａｋ  Ｍ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ，  Ｇｉｌｌａｒｄｏｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  ＬＲＲＫ２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｍｏｅｓｉｎ  ａｔ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−５５８：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｗ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４０５：  ３０７−３１７．
１３．  Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｌ，  Ｇｉｂｓｏｎ  ＲＡ，  Ｗａｒｒｅｎ  Ｌ，  Ａｍｏｕｒｉ  Ｒ，  Ｌｙｏｎｓ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｌｒｒｋ２  Ｇ２０１９Ｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｎｉｓｉａｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｕｃａｓｉａｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２２：  ５５−６１．
１４．  Ｔａｎ，  Ｅ．  Ｋ．  （２００６）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ｖａｒｉａｎｔ  （ＬＲＲＫ２  Ｇｌｙ２３８５Ａｒｇ）  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎｎ  Ａｃａｄ  Ｍｅｄ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ．  ３５：  ８４０−８４２．
１５．  Ｒｏｓｓ  ＯＡ，  Ｗｕ  Ｙ−Ｒ，  Ｌｅｅ  Ｍ−Ｃ，  Ｆｕｎａｙａｍａ  Ｍ，  Ｃｈｅｎ  Ｍ−Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｒｒｋ２  Ｒ１６２８Ｐ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６４：  ８８−９２．
１６．  Ｒｏｓｓ  ＯＡ，  Ｓｏｔｏ−Ｏｒｔｏｌａｚａ  ＡＩ，  Ｈｅｃｋｍａｎ  ＭＧ，  Ａａｓｌｙ  ＪＯ，  Ａｂａｈｕｎｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２  ｅｘｏｎｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １０：  ８９８−９０８．
１７．  Ｐａｉｓaｎ−Ｒｕ??ｚ  Ｃ，  Ｊａｉｎ  Ｓ，  Ｅｖａｎｓ  ＥＷ，  Ｇｉｌｋｓ  ＷＰ，  Ｓｉｍoｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  Ｃａｕｓｅ  ＰＡＲＫ８−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ４４：  ５９５−６００．
１８．  Ｚｉｍｐｒｉｃｈ  Ａ，  Ｂｉｓｋｕｐ  Ｓ，  Ｌｅｉｔｎｅｒ  Ｐ，  Ｌｉｃｈｔｎｅｒ  Ｐ，  Ｆａｒｒｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＬＲＲＫ２  Ｃａｕｓｅ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ−Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  Ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ４４：  ６０１−６０７．
１９．  Ａｇａｌｌｉｕ  Ｉ，  Ｓａｎ  Ｌｕｃｉａｎｏ  Ｍ，  Ｍｉｒｅｌｍａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｈｉｇｈｅｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｌｒｒｋ２  ｇ２０１９ｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ａ  ｐｏｏｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７２：  ５８−６５．
２０．  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ＡＢ，  Ｆａｒｒｅｒ  ＭＪ，  Ｂｏｎｉｆａｔｉ  Ｖ  （２０１３）  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２８：  １４−２３．
２１．  Ｊｏｓｔｉｎｓ  Ｌ，  Ｒｉｐｋｅ  Ｓ，  Ｗｅｅｒｓｍａ  ＲＫ，  Ｄｕｅｒｒ  ＲＨ，  ＭｃＧｏｖｅｒｎ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｈａｖｅ  ｓｈａｐｅｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９１：  １１９−１２４．
２２．  Ｍａｒｃｉｎｅｋ  Ｐ，  Ｊｈａ  ＡＮ，  Ｓｈｉｎｄｅ  Ｖ，  Ｓｕｎｄａｒａｍｏｏｒｔｈｙ  Ａ，  Ｒａｊｋｕｍａｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＬＲＲＫ２  ａｎｄ  ＲＩＰＫ２  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＯＤ  ２−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ  ｉｎ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ８：  ｅ７３１０３．
２３．  Ｍａｒiｎ  Ｉ  （２００６）  Ｔｈｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ＬＲＲＫ２：  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２３：  ２４２３−２４３３．
２４．  Ｒｕｄｅｎｋｏ  ＩＮ，  Ｋａｇａｎｏｖｉｃｈ  Ａ，  Ｈａｕｓｅｒ  ＤＮ，  Ｂｅｙｌｉｎａ  Ａ，  Ｃｈｉａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｔｈｅ  Ｇ２３８５Ｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４４６：  ９９−１１１．
２５．  Ｍａｔａ  ＩＦ，  Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ  ＷＪ，  Ｆａｒｒｅｒ  ＭＪ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＪＰ，  Ｇａｌｌｏ  ＫＡ  （２００６）  ＬＲＲＫ２  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２９：  ２８６−２９３．
２６．  Ｔａｙｌｏｒ  ＪＰ，  Ｍａｔａ  ＩＦ，  Ｆａｒｒｅｒ  ＭＪ  （２００６）  ＬＲＲＫ２：  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ，  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ？  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２：  ７６−８２．
２７．  Ｇｒｅｇｇｉｏ  Ｅ，  Ｊａｉｎ  Ｓ，  Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ  Ａ，  Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ  Ｒ，  Ｌｅｗｉｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＲＲＫ２／ｄａｒｄａｒｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ２３：  ３２９−３４１．
２８．  Ｈｅｏ  ＨＹ，  Ｐａｒｋ  Ｊ−Ｍ，  Ｋｉｍ  Ｃ−Ｈ，  Ｈａｎ  ＢＳ，  Ｋｉｍ  Ｋ−Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＬＲＲＫ２  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｖｉａ  ｉｔｓ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１６：  ６４９−６５６．
２９．  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｐ，  Ｓｃｈｍｉｄ  Ｂ，  Ｂｕｒｂｕｌｌａ  Ｌｅｎａ  Ｆ，  Ｓｃｈoｎｄｏｒｆ  Ｄａｖｉｄ  Ｃ，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＬＲＲＫ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣｓ  Ｌｉｎｋｓ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＥＲＫ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２：  ３５４−３６７．
３０．  Ｓａｎｄｅｒｓ  ＬＨ，  Ｌａｇａｎｉeｒｅ  Ｊ，  Ｃｏｏｐｅｒ  Ｏ，  Ｍａｋ  ＳＫ，  Ｖｕ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  ＬＲＲＫ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ６２：  ３８１−３８６．
３１．  Ｍａｎｚｏｎｉ  Ｃ，  Ｌｅｗｉｓ  ＰＡ  （２０１３）  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ／ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ａ  ｓｈａｒｅｄ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７：  ３４２４−３４２９．
３２．  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ＳＪ，  Ｋｕｏ  Ｓ−Ｈ，  Ｔａｓｓｅｔ  Ｉ，  Ａｒｉａｓ  Ｅ，  Ｋｏｇａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２  ｗｉｔｈ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：  ３９４−４０６．
３３．  Ｍａｎｚｏｎｉ  Ｃ，  Ｍａｍａｉｓ  Ａ，  Ｄｉｈａｎｉｃｈ  Ｓ，  Ａｂｅｔｉ  Ｒ，  Ｓｏｕｔａｒ  ＭＰＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８３３：  ２９００−２９１０．
３４．  Ｓｗａｎ  Ｍ，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ−Ｐｕｌｌｍａｎ  Ｒ  （２０１３）  Ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  β−Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １３：  １−１０．
３５．  Ｌｉ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｌｅ  Ｗ  （２０１０）  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ７：  ２６５−２７１．
３６．  Ｎｉｘｏｎ  ＲＡ  （２０１３）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９：  ９８３−９９７．
３７．  Ｗｅｓｔｂｒｏｅｋ  Ｗ，  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ＡＭ，  Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ  Ｅ  （２０１１）  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７：  ４８５−４９３．
３８．  Ｒｅｄｄｙ  ＪＶ，  Ｇａｎｌｅｙ  ＩＧ，  Ｐｆｅｆｆｅｒ  ＳＲ  （２００６）  Ｃｌｕｅｓ  ｔｏ  Ｎｅｕｒｏ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｔｙｐｅ  Ｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  １：  ｅ１９．−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｓｅｔ  Ｓ１
３９．  Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｆ，  Ｙａｂａｔａ  Ｔ，  Ｏｈｔａ  Ｅ，  Ｍａｅｋａｗａ  Ｔ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  ＬＲＲＫ２  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  Ｔｕｂｕｌｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔａｕ  ｂｕｔ  Ｎｏｔ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：  ＬＲＲＫ２−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔａｕ−Ｔｕｂｕｌｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｉｔｅ  Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ７：  ｅ３０８３４．
４０．  Ｔａｙｍａｎｓ  Ｊ−Ｍ，  Ｃｏｏｋｓｏｎ  ＭＲ  （２０１０）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：  Ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｔｒｉａｎｇｌｅ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２，  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，  ａｎｄ  ｔａｕ．  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ３２：  ２２７−２３５．
４１．  Ｂａｉｌｅｙ  ＲＭ，  Ｃｏｖｙ  ＪＰ，  Ｍｅｌｒｏｓｅ  ＨＬ，  Ｒｏｕｓｓｅａｕ  Ｌ，  Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＬＲＲＫ２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｕ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ  １２６：  ８０９−８２７．
４２．  Ｌｉ  Ｙ，  Ｌｉｕ  Ｗ，  Ｏｏ  ＴＦ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｔａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｍｕｔａｎｔ  ＬＲＲＫ２Ｒ１４４１  ｇ  ＢＡＣ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ  ｃａｒｄｉｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２：  ８２６−８２８．
４３．  Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ，  Ｊａｋｅｓ  Ｒ  （２００５）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １７３９：  ２４０−２５０．
４４．  Ｒｏｔｈｍａｎ  ＲＢ，  Ｂｌｏｕｇｈ  ＢＥ，  Ｂａｕｍａｎｎ  ＭＨ  （２００８）  Ｄｏｐａｍｉｎｅ／ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅｒｓ  ａｓ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｎｔ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎｓ．  Ｉｎ：  Ｇｉｕｓｅｐｐｅ  Ｄｉ  Ｇｉｏｖａｎｎ  ＶＤＭ，  Ｅｎｎｉｏ  Ｅ，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．  ｐｐ．  ３８５−４０６．
４５．  Ｂｒａｎｄ  ＡＨ，  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ  Ｎ  （１９９３）  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：  ４０１−４１５．
４６．  Ｌｉｕ  Ｚ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｙｕ  Ｙ，  Ｌｉ  Ｘ，  Ｗａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＬＲＲＫ２−ｌｉｎｋｅｄ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５：  ２６９３−２６９８．
４７．  Ｌｉｕ  Ｚ，  Ｈａｍａｍｉｃｈｉ  Ｓ，  Ｄａｅ  Ｌｅｅ  Ｂ，  Ｙａｎｇ  Ｄ，  Ｒａｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２  ｋｉｎａｓｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ａｎｄ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：  ３９３３−３９４２．  
【国際調査報告】
2019524658.tif 000097
2019524658.tif 000098
2019524658.tif 000099