(57)【要約】腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を、ヒアルロン酸染色を用いて試料の関連部分の全表面積と比較して評価することによって、ヒアルロン酸染色組織試料をスコアリングするための方法及びシステム。本開示の方法及び発明は、例えば特定の治療を受けるための患者を選択するために使用することができる。【選択図】図３Ａ
2019533149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の腫瘍からの組織試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）含有量をスコアリングすることによって、ＨＡ治療が有効である前記個体を同定する方法であって、
（ａ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｂ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定して、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれ、閾値未満のＨＡスコアは低ＨＡと呼ばれ、高ＨＡスコアがＨＡ治療が有効である個体を示す、得ること
を含む、方法。
【請求項２】
バックグラウンドを上回る任意の強度の染色が、弱い（１＋）ＨＡ染色、中程度（２＋）のＨＡ染色及び強い（３＋）ＨＡ染色を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で決定することが、
（ａ）  （ｉ）全腫瘍表面積にわたって弱い（１＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で；（ｉｉ）全腫瘍表面積にわたって中程度（２＋）のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で；及び（ｉｉｉ）全腫瘍表面積にわたって強い（３＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で、個別に決定すること；並びに
（ｂ）  （ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の合計を計算すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍表面が腫瘍細胞及び関連する間質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍表面が壊死領域を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非腫瘍関連間質が被膜である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
バックグラウンドが、ＨＡの読み取りを妨げない、弱い又は知覚できない非特異的染色を指す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
閾値が５０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＡ治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
患者における腫瘍の成長を阻害する方法であって、
（ａ）
（ｉ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｉｉ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定し、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれる、得ること
によって決定される高ヒアルロン酸（ＨＡ）スコアを用いて、腫瘍を有する患者を同定することと、
（ｂ）  腫瘍の成長を阻害するように腫瘍微小環境を変える抗ＨＡ治療を、腫瘍を有する高ＨＡスコアの患者に施すこと
とを含む、方法。
【請求項１２】
抗ＨＡ治療が、腫瘍に対する他の治療の利用を促進する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＨＡ治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
閾値が５０％である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
患者における腫瘍の腫瘍微小環境を変える方法であって、
（ａ）
（ｉ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｉｉ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定し、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれる、得ること
によって決定される高ヒアルロン酸（ＨＡ）スコアを用いて、腫瘍を有する患者を同定することと、
（ｂ）  腫瘍のＥＣＭ中のＨＡを枯渇させることにより腫瘍微小環境を変える抗ＨＡ治療を、腫瘍を有する高ＨＡスコアの患者に施すこと
とを含む、方法。
【請求項１７】
抗ＨＡ治療が、腫瘍に対する他の治療の利用を促進する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＨＡ治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
閾値が５０％である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
医学的処置に対する腫瘍の受容性を評価する方法であって、
（ａ）  組織試料をＥＣＭバイオマーカー染色することによって、腫瘍の組織試料中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）バイオマーカーを可視化すること；並びに
（ｂ）  バックグラウンドを上回る任意の強度のＥＣＭバイオマーカー染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を決定し、該面積を全腫瘍表面積で割って、ＥＣＭバイオマーカースコアを得ること
を含み、
閾値以上のＥＣＭバイオマーカースコアは、医学的処置が腫瘍の成長を阻害するか、腫瘍の大きさを縮小するか又は腫瘍を排除するというように、腫瘍が医学的処置に対して受容性であることを示す、
方法。
【請求項２２】
ＥＣＭバイオマーカーがヒアルロン酸（ＨＡ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）バイオマーカーの含有量を決定する方法であって、
（ａ）  腫瘍の組織試料をＥＣＭバイオマーカー染色することによって、腫瘍の組織試料中のＥＣＭバイオマーカーを可視化すること；及び
（ｂ）  バックグラウンドを上回る任意の強度のＥＣＭバイオマーカー染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を決定し、該面積を全腫瘍表面積で割って、ECMバイオマーカースコアを得ること
を含み、
閾値以上のＥＣＭスコアは、腫瘍が高いＥＣＭバイオマーカー含有量を有することを示す、
方法。
【請求項２５】
ＥＣＭバイオマーカーがヒアルロン酸（ＨＡ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）  組織化学的にヒアルロン酸（ＨＡ）染色された組織切片のデジタル画像上の、腫瘍表面を含む関心領域（ＲＯＩ）にアノテーションをつけること；
（ｂ）  デジタル画像内の組織化学的なＨＡ染色を検出すること；及び
（ｃ）  式１又は式２：
2019533149.tif 000016
2019533149.tif 000017
［式中、
・  面積（ＥＣＭ染色）は、バックグラウンド染色を上回る、ＨＡの任意の染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；
・  面積（ＥＣＭ  ｗ／１＋）は、１＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；
・  面積（ＥＣＭ  ｗ／２＋）は、２＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；
・  面積（ＥＣＭ  ｗ／３＋）は、３＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；かつ、
・  面積（ＴＳ）は、ＲＯＩ内の腫瘍表面の全表面積である］
に従ってＨＡスコアを決定すること
を含む、方法。
【請求項２８】
組織切片中のＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂのＨＡへの特異的結合を促進する条件下で組織切片をＴＳＧ６とウサギＦｃの組換え融合体（ＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂ）と接触させ、組織切片のＨＡに近接して色素の付着をもたらす条件下で、組織切片に結合したＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂを検出試薬と反応させることによってＨＡ染色が付着する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組織切片が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍の切片である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＲＯＩが腫瘍表面からなる、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
プロセッサ；及び
プロセッサに結合したメモリであって、プロセッサにより実行されると、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を格納するメモリ
を備えるシステム。
【請求項３２】
組織試料のデジタル画像を取得し、該画像をコンピュータ装置に通信するのに適したスキャナ又は顕微鏡を更に備える、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
組織試料の１つ以上の切片を組織化学的にＨＡ染色するようにブログラムされた自動スライド染色機を更に備える、請求項３１又は３２に記載のシステム。
【請求項３４】
試料及び画像のワークフローを追跡するための臨床検査情報システム（ＬＩＳ）を更に備えるシステムであって、ＬＩＳは、組織試料に関する情報を受信及び格納するように構成された中央データベースを含み、情報は、
・  組織切片に対して施される処理工程、
・  組織切片のデジタル画像に対して実行される処理工程、及び
・  組織切片及びデジタル画像の処理履歴
のうちの少なくとも１つを含む、
請求項３１から３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法を含む動作を実行するプロセッサによって実行されるコンピュータ実行可能命令を格納するための、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項３６】
アフィニティー組織化学的なＨＡ染色が施されている、個体の腫瘍からの組織試料のデジタル画像をスコアリングすることによって、ヒアルロン酸（ＨＡ）指向治療が有効な前記個体を同定するためのシステムであり、
プロセッサとプロセッサに結合したメモリとを備える画像解析システムを備えるシステムであって、メモリは、プロセッサにより実行されると：
画像内の腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）面積を同定すること；
画像内の全腫瘍表面積を同定すること；及び
画像内のピクセルを：
ピクセルが腫瘍関連ＥＣＭ面積内にあるかどうか、
ピクセルが、バックグラウンド染色とＨＡ特異的染色との間のカットオフである第１の閾値レベル、任意選択的に、ピクセルのＨＡ染色強度が低下する一組の所定の範囲のうちの１つである第１の閾値レベルを上回る強度を有するかどうか
に従って分類すること；及び
一組のスコアリングルールを画像に適用して、バックグラウンドを上回るＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を全腫瘍表面積で割った関数であるＨＡスコアを計算することであって、第２の閾値を超えるＨＡスコアがＨＡ治療に対する応答の予測である、計算すること
を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を格納する、システム。
【請求項３７】
ＨＡスコアが、式１：
2019533149.tif 000018
［式中、
・  面積（ＥＣＭ）は、バックグラウンドを上回るＨＡスコアを有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり、
・  面積（ＴＳ）は腫瘍表面の全表面積である］
に従って計算される、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
一組の所定のＨＡ染色強度範囲が、（ｉ）低染色強度範囲、（ｉｉ）中染色強度範囲、及び（ｉｉｉ）強染色強度範囲を含み、ＨＡスコアが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のそれぞれを個々に全腫瘍表面積で割った関数である、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３９】
ＨＡスコアが、式３：
2019533149.tif 000019
［式中、
・  面積（ＥＣＭｌｏｗ）が低染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＥＣＭｍｅｄ）が中染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＥＣＭｈｉｇｈ）が強染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＴＳ）が全腫瘍表面積である］
に従って計算される、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
動作が、
ピクセルのＨＡ染色強度に基づいて腫瘍関連ＥＣＭ面積のピクセルを複数の色のうちの１つに変換することによって変換画像を生成することであって、第１の閾値レベルを下回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第１の色を有し、第１の閾値レベルを上回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第２の色を有し、第１の色は第２の色と異なっている、生成すること
を更に含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項４１】
第１の閾値レベルを上回るＨＡ染色強度を有するピクセルが、ピクセルのＨＡ染色強度が低下する一組の所定の範囲のうちの１つに従って分類され、動作が、
ピクセルのＨＡ染色強度に基づいて腫瘍関連ＥＣＭ面積のピクセルを複数の色のうちの１つに変換することによって変換画像を生成することであって、第１の閾値レベルを下回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第１の色を有し、各所定の範囲内のピクセルに、第１の色とは異なり、かつ異なる所定の範囲内のピクセルとも異なる色が割り当てられる、生成すること
を更に含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項４２】
画像解析システムに通信可能に接続された出力装置を更に備える請求項３６から４１のいずれか一項に記載のシステムであって、画像解析システムが画像解析システムからの１つ以上の出力を送るのに適しており、前記出力がＨＡスコア、画像及び変換画像のうちの少なくとも１つを含む、システム。
【請求項４３】
組織試料の組織切片からのデジタル画像を生成するのに適し、かつ、デジタル画像を画像解析システム又は非揮発性記憶媒体に送るのに適しているスキャナを更に備える、請求項３６から４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機と、組織試料の未染色組織切片とを更に含み、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機が、ＨＡ未染色の組織切片を染色するのに適している、請求項３６から４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機がＴＳＧ−６ベースのプローブと、ＴＳＧ−６ベースのプローブと適合性のある一組の特異的検出試薬とを含む、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
ＴＳＧ−６ベースのプローブがＴＳＧ−６−Ｆｃ融合体である、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機が、表１に記載のＴＳＧ６−Ｆｃ融合体と検出試薬との組み合わせを含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
第２の閾値が５０％である、請求項３７又は３９に記載のシステム。
【請求項４９】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項３６から４８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５０】
ＨＡ指向治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、請求項３６から４９のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３９８７８７号（この出願の内容は参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組織試料中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）バイオマーカー（ヒアルロン酸など）をスコアリングするための方法及びシステム、並びに疾患の診断及び／又は予後予測及び／又はＥＣＭ指向療法に対する疾患応答の予測におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くのＥＣＭ成分は、病因に関与している。Ｊａｒｖｅｌａｉｎｅｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．，６１巻，第２版，１９８−２２３頁（２００９）を参照のこと。１つの例は、ヒアルロン酸（ＨＡ）である。ＨＡは、排卵、胚形成、創傷治癒及び炎症性疾患におけるそのさまざまな役割から関心の対象となっている（Meyer and Palmer, 1934, J Biol Chem 107:629-34; Dicker et al., 2014, Acta Biomater 10(4):1558-1570）。ＨＡは近年、腫瘍の微小環境で同定されており、そのことによって、がん療法における魅力的な標的となっている（Kultti et al, 2012, Cancers 4(3):873-903）。ＨＡは多くの固形腫瘍に蓄積し、その結合分子である、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）プロテオグリカン及び糖タンパク質（例えばバーシカン）及び細胞表面受容体（例えばＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ）からなるヒアラドヘリンと活発に相互作用する（Tammi et al., Semin Cancer Biol 18:288-295; Itano and Kimata, 2008, Semin Cancer Biol 18:268-274; Simpson and Lokeshwar, 2008, Front Biosci 13:5664-5680; Toole and Slomiany, 2008, Drug Resist Updat 11:110-121; Maxwell et al., J Cell Sci 121:925-932）。これらの複雑な相互作用は、腫瘍細胞の接着、運動、増殖及び浸潤において役割を果たす（Toole, 2004, Nat Rev Cancer 4:528-539）。更に、腫瘍における異常なＨＡ蓄積が標準的ながん治療の治療効果を妨げるというエビデンスが増えている。
【０００４】
興味深いことにＨＡの酵素枯渇は、腫瘍挙動に大きな影響を及ぼし得る、腫瘍微小環境の再編成を誘発する可能性がある。複数の刊行物が、ペグ化ヒアルロニダーゼＰＨ２０（ＰＥＧＰＨ２０）の静脈投与が組織間質液圧（ｔＩＦＰ）の低下、腫瘍血管の拡大、化学療法剤の送達量増加、腫瘍成長抑制、及び生存率の改善と関連している前臨床試験を記載している（Toole, 2009, Clin Cancer Res 15:7462-7468; Jiang et al, 2012, Anticancer Res 32:1203-1212）。したがって、異常なＨＡ蓄積を示す一部のがん（例えば一部の膵臓腺がん）は、ＨＡ枯渇から利益を得る可能性がある。
【０００５】
予後因子としてＨＡを使用して、腫瘍中のＨＡ含有量を決定する以前の試みは、ＨＡ枯渇から利益を得ると思われる、腫瘍を有する患者を再現可能かつ正確に同定することができていない。
【０００６】
他には例えば、（あまり具体的ではないが）異種で、かつ／又は純度に欠けるＨＡを評価するために、染色を使用するものもある（Jadin et al, 2014, Journal of Histochemistry & Cytochemistry 62(9):672-83; Tengblad A, 1979, Biochim Biophys Acta 578:281-289; Tammi et al, 1988, J Invest Dermatol 90:412-414; Wells et al., 1991, Acta Derm Venereol 71:232- 238; Lindqvist et al, 1992,  Clin Chem 38:127-132; Lin et al, 1997, J Histochem Cytochem 45:1157-1163; Kobayashi et al, 1999, Cell Tissue Res 296:587-597; Sakai Set al, 2000, J Invest Dermatol 114:1184-1187; Baier et al, 2007, Matrix Biol 26:348-358; Clark et al, 2011, Invest Ophthalmol Vis Sci 52:6511-6521参照）。他にも、ＨＡ合成酵素（ＨＡＳ１、２及び３）若しくはＨＡ分解酵素（ＨＹＡＬ１−５及びＰＨ２０）及び／又は最も一般的なＨＡ受容体（ＣＤ４４及びＲＨＡＭＭ）と結合するＨＡを標的としたものもある（Provenzano et al, 2012, Cancer Cell 21:418-429; Jiang et al. 2012, Anticancer Res. 32:1203-1212; Jacobson et al., 2003, Biochem. Biophys. SD (Res) Commun. 305:1017-1023; Wilkinson et al, 2006, J. Cell. Physiol. 2006; Kim et al, 2004, Cancer Res. 64:4569-4576; Udabage et al., 2005, Exp. Cell Res. 310 (205-217参照）。
【０００７】
その他のＨＡ評価方法は明確に定義されておらず、主に定性的なものである。何人かの著者は、明確なスコア又は説得力のある病理組織画像なしに、「高ＨＡ」と「低ＨＡ」腫瘍を挙げている。１＋（低ＨＡ）から３＋（高ＨＡ）までのＨＡ染色強度が、分類のパラメータとして使用された。２＋の中間ＨＡを挙げた刊行物はなかった（Provenzano et al, 2012, Cancer Cell 21:418-429; Kultti et al, 2014, Biomed Res Int. Article ID 817613; Hautmann et al., 2001, Journal of Urology 165:2068-2074; Whatcott et al., 2015, Clin Cancer Res 21(5) 3561-3568; de la Motte and Drazba, 2011, J Histochem and Cytochem 59(3):252-257参照）。
【０００８】
定量的スコアリング方法は主に顕微鏡写真及びデジタル画像分析によって行われ、それがＨＡの評価をより複雑にした。染色スライドの病理学者によるアノテーションにもかかわらず、腫瘍関連ＨＡ発現から非腫瘍関連ＨＡ発現を区別するのにコンピュータ化システムに頼ることは困難であった（Tool, 2009, Clin Cancer Res 15:7492-7468; Provenzano et al, 2012, Cancer Cell 21:418-429; Lokeshwar et al, 2005, Cancer Res. 65:7782-7789; Kultti et al, 2014, Biomed Res Int. Article ID 817613；また、米国特許第８８４６０３４号；米国特許出願公開第２０１４／０３４８８１７号参照）。それらの方法は、臨床転帰データと一致しないだけでなく、病理学者による染色された組織試料の従来のスライドガラス試験によって再現できないことが証明された。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、腫瘍試料中のＨＡ含有量を評価するための方法を発見した。この方法は、腫瘍表面全体との比較で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中のＨＡ含有量を評価することを特徴とする。前述の参考文献の方法はすべて、全ＨＡ染色に関連するようであることに留意されたい。引用した参考文献の中で、ＥＣＭ中のＨＡ含有量に依拠することを示唆したものは一つもない。
【００１０】
本発明をいかなる理論又はメカニズムにも限定することは望まないが、本発明の方法は、腫瘍中のＨＡの作用に最も関連する領域におけるＨＡ含有量を評価すると考えられる。実際ＨＡは、腫瘍のＥＣＭに蓄積し、他のマトリックスタンパク質に架橋することにより、腫瘍に最も有害な影響を及ぼす（Jadin et al, 2014, Journal of Histochemistry & Cytochemistry 62(9):672-83; Kultti et al, 2012, Cancers 4(3), 873-903参照）。
【００１１】
本発明はまた、特定の腫瘍型（例えば膵管腺がん（ＰＤＡ）、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）等）を有し、標準治療法と組み合わせた特定の療法、例えばＨＡ療法（例えばＰＥＧＰＨ２０、Lokeshwar et al, 2005, Cancer Res. 65:7782-7789参照）から恩恵を受け得る患者の同定に資するためのコンパニオン診断を特徴とする。本発明のコンパニオン診断は、ＨＡ含有量を評価するために、前述のＥＣＭに基づくスコアリング方法を利用する。ＰＥＧＰＨ２０効果の予測に関して言えば、ＰＥＧＰＨ２０は腫瘍細胞コンパートメントに対する直接的な作用が確認されていないため、腫瘍細胞におけるＨＡ染色の一貫性のない発現は、腫瘍におけるＨＡのＥＣＭに基づくスコアリング方法に加えると、妨害（distractor）になり得ると考えられる。したがって本発明の方法は、ＰＥＧＰＨ２０に基づくＨＡの酵素的枯渇について最も適切な作用領域におけるＨＡを評価する。
【００１２】
ＥＣＭに基づく本発明のＨＡスコアリング方法は、臨床転帰データによってサポートされている。本発明のスコアリングアルゴリズムに基づいて特定された高ＨＡ患者は、低ＨＡ患者と比較して、標準治療単独からよりもＨＡ標的療法からのより大きな治療利益を示した。
【００１３】
更に、ＥＣＭに基づく本発明のＨＡスコアリング方法は、読影者精度学習及び複数の読影者訓練試験によって、再現可能であり、訓練可能であり、かつ、一般的な病理学の実践に移行可能であることが証明されている。
【００１４】
本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組み合わせは、そのような組み合わせのいずれかに含まれる特徴が、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかとなるように、相互に矛盾しない限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。本発明の更なる利点及び態様は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本開示の特徴及び利点は、添付の図面と関連して提示される以下の詳細な説明を考察することから明らかになるであろう。
【図１】ヒアルロン酸（ＨＡ）を過剰発現している固形腫瘍の例を示す。
【図２】特定の標本に対するＨＡ染色ワークフローの概略図を示す。
【図３Ａ】高ＨＡ含有量を示す、許容可能なＨＡ染色の例を示す。
【図３Ｂ】低ＨＡ含有量を示す、許容可能なＨＡ染色の例を示す。
【図４Ａ】低ＨＡ状態を示す。
【図４Ｂ】高ＨＡ状態を示す。
【図５】本明細書に開示の例示的なＨＡスコアリングシステムを示す。
【図６Ａ】本明細書に開示の画像分析システム上で実施される例示的なワークフローを示し、ここで、オブジェクト識別機能は、ＲＯＩ生成機能が実行される前に画像全体に対して実行される。
【図６Ｂ】本明細書に開示の画像分析システム上で実施される例示的なワークフローを示し、ここで、オブジェクト識別機能は、ＲＯＩ生成機能が実行された後にＲＯＩのみで実行される。
【図７】本明細書に開示のＨＡスコアリングシステムの一部を形成し得る例示的な計算システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、組織試料、例えば腫瘍試料中のＥＣＭ関連分子の含有量を評価又はスコアリングするための方法及びシステムを特徴とする。
【００１７】
Ｉ．定義
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００１８】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 すなわち集団を構成する個々の抗体が、例えば天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製中に生じる、あり得る変異型抗体（このような変異体は通常少量存在するが）を除き、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は例えば、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術あるいはこれらの組み合わせによって作製することができる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」とは、生物学的試料又は生物学的試料が得られる対象を特徴付けるために使用され得る、生物学的試料中に見出される任意の分子又は分子群をいう。バイオマーカーは例えば、分子又は分子群であって、その存在、非存在又は相対的存在量がある特定の病状に特徴的であり；疾患の重症度又は疾患の進行若しくは退行の可能性を示し；かつ／又は特定の病状が特定の治療に応答することを予測する分子又は分子群であり得る。
【００２１】
他の例として、バイオマーカーは、感染病原体（細菌、真菌、ウイルス又は他の微生物等）又はそれらの置換基分子若しくは分子群であり得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「試料」及び「生物学的試料」は、バイオマーカーを含有するか又は含有することが疑われる対象から得られた任意の組成物を指すものとする。この用語は、細胞、組織又は血液の精製又は分離された成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、無細胞部分又は細胞溶解物を含む。試料は、例えば腫瘍又は転移性病変、例えば原発腫瘍又は転移性腫瘍からの、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料とすることができる。試料はまた、既に凍っているか若しくは新鮮な組織から、又は液体試料、例えば血液成分（血漿又は血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、涙、リンパ液、脳脊髄液、スワブから洗い流された材料等からのものであってもよい。試料はまた、細胞株を含む個体から得られた細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の構成要素及び成分を含んでもよい。試料は、個体から直接得られた試料、例えば細胞溶解物又は赤血球が枯渇した血液から部分的に処理することもできる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「細胞試料」とは、インタクトな細胞、例えば病理学的、組織学的、若しくは細胞学的解釈のために採取された細胞培養物、体液試料又は摘出標本を含有する任意の生物学的試料を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「組織試料」とは、試料が得られた対象内に細胞が存在していたときの細胞間の空間関係を保全する細胞試料を指すものとする。「組織試料」は、一次組織試料（すなわち、対象によって生成された細胞及び組織）及び異種移植片（すなわち、対象内に移植された異質細胞試料）の両方を包含するものとする。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「組織化学的検出」とは、組織試料の構造間の空間関係の文脈でバイオマーカー又は他の構造の検出を可能にする様式で、検出試薬を用いて組織試料中のバイオマーカー又は他の構造を標識することを伴うプロセスをいう。例としては、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片のアフィニティー組織化学（affinity histochemistry）（ＡＨＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、クロモジェニックｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、銀ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、並びにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「切片」は、顕微鏡分析に適し、典型的にはミクロトームを使用して切断された組織試料の薄切片を指すものとする。一例として、切片は４−５ミクロンの厚さであり得る。本開示は、４−５ミクロンに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「連続切片」は、１つの組織試料から連続して切断された一連の切片のうちの任意の１つを指すものとする。２つの切片が互いの「連続切片」とみなされるためには、それらは、必ずしも該組織からの連続する切片である必要はないが、一般に、組織学的染色の後に互いに構造が一致し得るように同じ断面関係で同じ組織構造を含んでいなければならない。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「〜に特異的に結合する」又は「〜に特異的」という語句は、生体分子を含む分子の異種集団の存在下における標的の存在を決定づける、標的とバイオマーカー特異的作用剤間の結合などの測定可能で再現可能な相互作用をいう。例えば、ある標的に特異的に結合する結合体は、この標的に対して、他の標的に結合するよりもより高いアフィニティー、アビディティーで、より容易に、かつ／又はより長い期間にわたって結合する抗体である。一実施態様では、無関係な標的への結合体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定して、抗体の標的への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、標的に特異的に結合する結合体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。別の実施態様では、特異的な結合には、必須ではないが排他的結合が含まれる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー特異的作用剤」という用語は、試料中のバイオマーカーの特異的検出ができるようにバイオマーカー又はそのバイオマーカー内の特定の構造に結合する、任意の化合物又は組成物を指すものとする。例には、抗体及びその抗原結合断片、並びに遺伝子操作された特異的結合構造が含まれ、これには、ＡＤＮＥＣＴＩＮ（１０番目のＦＮ３フィブロネクチンベースの足場；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ社）、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＺドメインベースの足場；スウェーデン、ソルナのＡｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ）、ＡＶＩＭＥＲ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体ベースの足場；カリフォルニア州サウザンドオークスのＡｍｇｅｎ）、ｄＡｂ（ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインベースの足場；英国ケンブリッジのＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ＰＬＣ）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質ベースの足場；スイス、チューリッヒのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ（リポカリンベースの足場；ドイツ、フライジングのＰｉｅｒｉｓ  ＡＧ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（ＶＨＨ（ラクダ科のＩｇ）ベースの足場；ベルギー、ヘントのＡｂｌｙｎｘ  Ｎ／Ｖ）、ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹ（トランスフェリンベースの足場；ニューヨーク州ニューヨークのファイザー社）、ＳＭＩＰ（メリーランド州ロックビルのＥｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）及びテトラネクチン（Ｃ型レクチンドメインベース（ＣＴＬＤ）の足場、テトラネクチン；デンマーク、オルフスのＢｏｒｅａｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ）（このような操作された特異的結合構造の説明は、ＷｕｒｃｈらによるＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｔｏ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔａｔｕｓ  ｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．５０２−５０９（２００８）に概説されており、その内容は参照により援用される）；及びバイオマーカーに特異的に結合することができる少なくとも第１のドメイン（例えば、抗体の抗原結合断片、又はバイオマーカーに結合するタンパク質の標的結合部分）と、融合タンパク質への検出試薬の結合を容易にするように適合されている第２の部分（例えばビオチン標識、エピトープタグ、Ｉｇ断片等）とを含む融合タンパク質が含まれる。
【００３０】
組織化学的アッセイ（免疫組織化学及びアフィニティー組織化学を含む）と関連して使用されるときの「検出試薬」は、細胞試料中のバイオマーカーに結合したバイオマーカー特異的作用剤に近接して色素を付着させるために使用される任意の試薬である。非限定的な例には、バイオマーカー特異的抗体に結合することができる二次抗体；かかる二次抗体に結合した酵素；及び蛍光色素又は着色剤の付着を生じさせるためにかかる酵素と反応する化学物質等が含まれる。
【００３１】
名詞として使用されるとき、用語「着色剤」は、明視野顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法等を含む、顕微鏡分析のために細胞試料中の特定の分子又は構造を視覚化するために使用され得る任意の物質を指す。動詞として使用されるとき、用語「染色」は、細胞試料（例えば組織試料、細胞学的試料など）上に着色剤を付着させる任意のプロセスを指すものとする。
【００３２】
用語「個体」、「対象」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用される。個体は、診断前の、診断後だが治療前の、治療中の、又は治療後のものであり得る。本開示の文脈において、個体は典型的には、医療を求めている。
【００３３】
「個体から試料を入手する」という用語は、個体からの生物学的試料が試験のために提供されることを意味する。入手は、個人から直接であっても、個人から試料を直接入手した第三者からであってもよい。
【００３４】
「個体に治療を提供する」という用語は、個体に治療を処方、推奨するか又は利用可能にすることを意味する。治療は、第三者によって実際に個体に施されても（例えば入院患者注射）又は個体自身によって実際に個体に施されてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「腫瘍表面」とは、実質的に浸潤性新生物細胞及び付随する間質から完全に構成される１つ以上の連続した領域によって特徴付けられる組織切片の一部分をいうものとする。
【００３６】
別途定義しない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｌａｃｋｉｅ，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（4th ed.2007)；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，MOLECULAR CLONING，A  LABORATORY  MANUAL，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ(Cold Springs Harbor,N.Y.1989）を参照されたし。「ある／１つの」（「ａ」又は「ａｎ」）」という用語は、「１つ以上」を意味することを意図している。工程又は要素の記載の前にある場合の「含む」（「comprise」、「comprises」及び「comprising」）という用語は、更なる工程又は要素の追加が任意であり、除外されないことを意味することが意図されている。
【００３７】
ＩＩ  組織化学的標識及び検出方法
一実施態様では、本明細書に開示されるスコアリング方法は、組織化学的ＨＡ染色されている細胞試料に対して実施される。
【００３８】
組織化学的染色は、検出可能な作用剤の検出が組織切片全体にわたるバイオマーカーの分布を評価することを可能にするように、目的のバイオマーカーに近接する検出可能な作用剤の付着に依存する技術である。細胞化学的染色は、細胞学的試料が使用されることを除いて、同様である。以後、「組織化学的」という用語が使用される場合、「組織化学的」のみが意図されることが文脈から明らかでない限り、「組織化学的」と「細胞化学的」の双方を意図することが理解されるべきである。
【００３９】
一実施態様では、アフィニティー組織化学技術を用い、組織化学的にＨＡ染色される。アフィニティー組織化学では、検出可能な作用剤は、バイオマーカー特異的作用剤とバイオマーカーの間の特異的結合を促進する条件下で、試料中のバイオマーカー特異的作用剤のバイオマーカーへの結合を介してバイオマーカーに局在する。身体を構成する様々な種類の組織学的組織の固有の性質及び標的バイオマーカーの複雑さのために、アフィニティー組織化学において普遍的な「万能」染色プロトコールは存在しない。むしろ、標的バイオマーカー、試料の種類、検出試薬及び検出スキームはすべて考慮に入れられており、基礎的な組織化学プロトコールは、実験のニーズに合うように修正されている。一般的に、組織化学的染色のワークフローは以下の通りである。
ａ．  （必要なら）抗原賦活化：組織を固定するプロセスによって、バイオマーカーの「マスキング」が生じ得る（すなわち使用されている検出試薬がバイオマーカーに到達しにくくなる）。このため、通常、既にマスクされているバイオマーカーを検出することを可能にする「抗原賦活化法」に試料を供する。多くの抗原賦活化法が当該分野で知られており、通常、複数の抗原賦活化法が同じバイオマーカーに対して使用され得る。Ｓｈｉら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９巻，第８版，９３１-３７頁（２００１）；Ｔａｃｈａ  ＆  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５巻，第４版，２３７-４２頁（２００２）；Ｏ’Ｌｅａｒｙら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  ＆  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８４巻，第５版，２１７-２１頁（２００９）参照；
ｂ．  ブロッキング：組織切片を、例えば酵素、内因性ペルオキシダーゼ、遊離アルデヒド基、免疫グロブリン、及び特異的染色を模倣することができる他の無関係の分子など、非特異的染色の内因性源をブロックするための試薬で処理する。
ｃ．  （必要なら）透過処理：組織切片を透過処理緩衝液とインキュベートして、抗体及び他の染色試薬の組織への浸透を促進する；
ｄ．  バイオマーカー特異的試薬とのインキュベーション；
ｅ．  間接法が使用されている場合は、検出試薬とのインキュベーション。
【００４０】
これらの工程に加えて、残留試薬を除去し、その後の工程からの試薬と相互作用する、ある工程からの残りの試薬の反応性を抑えるために、洗浄工程をこれらの工程の各々の間に実施してもよい。
【００４１】
一実施態様では、ＨＡ特異的試薬は、ＴＮＦ刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）ベースのプローブである。ＴＳＧ−６は、さまざまなサイトカイン及び増殖因子に反応して、多くの異なる種類の細胞及び組織に発現する、壊死因子刺激遺伝子６によってコードされる〜３０ｋＤａの分泌型ＨＡ結合糖タンパク質である（Milner and Day 2003）。ＴＳＧ−６は、炎症及び炎症様過程の間のＨＡ架橋を介した、ＨＡに富む細胞外マトリックスの形成及びリモデリングにおいて重要な役割を果たす（Fulop et al. 2003; Milner et al. 2006; Selbi et al. 2006; Simpson et al. 2009）。ＴＳＧ−６は、１００アミノ酸長のＮ末端ＨＡ結合リンクモジュールとフィブロネクチンに結合するＣ末端ＣＵＢ（補体Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ，Ｕｅｇｆ，Ｂｍｐ１）モジュールから構成されている（Lee et al. 1992; Kohda et al. 1996; Kuznetsova et al. 2008)。 ＨＡに対するＴＳＧ−６  ＨＡ結合リンクモジュールの高いアフィニティー(Kahmann et al. 2000; Lesley et al. 2002) によって、それはＨＡを検出するための均一で特異的な試薬を設計するための出発点となった。本明細書で使用される場合、「ＴＳＧ−６ベースのプローブ」とは、（１）ヒト組織切片中のＨＡへの特異的結合を促進するのに十分な部分のＴＳＧ−６タンパク質を含有し、かつ、（２）組織試料の付着を容易にすることができる少なくとも１つの構造を含む、任意のポリペプチドを指すものとする。
【００４２】
いくつかの実施態様では、検出可能部分は、ＨＡ特異的試薬に直接コンジュゲートし、したがってＨＡ特異的試薬がその標的に結合すると試料に付着する（一般に直接標識法と呼ばれる）。直接標識法は、より直接的に定量化可能であることが多いが、感度が不十分であることが多い。その他の実施態様では、検出可能部分の付着は、ＨＡ特異的試薬と結合した検出試薬の使用によって生じる（一般に間接標識法と呼ばれる）。間接標識法は、ＨＡ特異的試薬に近接して付着させることができる検出可能部分の数を増加させ、したがって、特に色素と組み合わせて用いられる場合、しばしば直接標識法よりも高感度である。
【００４３】
アフィニティー組織化学のための検出スキームは通常、「直接的」及び「間接的」方法に分けられる。直接検出は最速かつ最短のＩＨＣプロトコールであり、選択したフルオロフォアにコンジュゲートした一次抗体のみと組織切片とのインキュベーションを必要とする。直接検出は、強く、高度に発現された組織抗原の検出により適している。直接検出は例えば、二次検出抗体の使用が、一次抗体の宿主種及び組織の組織学的性質に起因して、強い非特異的染色を引き起こし得る場合に選択される技術である。間接検出は通常、直接検出よりも高感度である。間接的検出のより高い感度は、フルオロフォアで標識された２つの二次抗体がその組織標的に結合した単一分子の一次抗体と相互作用する可能性の結果である。間接検出は、異なる色、ストークスシフト、量子収率及び退色耐性のフルオロフォアを有する二次抗体の選択を可能にする。
【００４４】
一実施態様では、ＴＳＧ−６ベースのプローブは、抗体のＦｃ領域（例えばヤギＦｃ、ウサギＦｃ、マウスＦｃ又はラットＦｃ）との融合タンパク質である。ＨＡ特異的検出試薬としての使用のための例示的なＴＳＧ６融合体は、Ｊａｄｉｎら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，６２巻，第９版，６７２-８３頁（２０１４）（その全内容は参照により本明細書に援用される）に開示される。Ｆｃ領域は、従来の二次抗体を検出試薬として使用して色素の付着を促進することを可能にする。特定の実施態様では、ＨＡ特異的検出試薬は、ＴＳＧ６ウサギＦｃ融合体である。ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体は、組織切片中でＨＡと結合している場合、ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体に近接している検出可能部分の付着を媒介することによって、ＨＡの検出を容易にする。
【００４５】
いくつかの実施態様では、間接法はＴＳＧ６−Ｆｃ融合体と共に使用され、組織切片に結合される際に、ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体に局在化される酵素反応を介して検出可能部分が付着する。このような反応に適した酵素はよく知られており、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ及びペルオキシダーゼを含むがこれらに限定されない。明示的に含まれる具体的な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−ラクタマーゼである。酵素は、ＴＳＧ６ベースのＨＡ特異的試薬に直接コンジュゲートしていてもよく、又は標識コンジュゲートを介してＴＳＧ６ベースのＨＡ特異的試薬と間接的に結合していてもよい。本明細書で用いられる場合、「標識コンジュゲート」は、
（ａ）  特異的検出試薬；並びに
（ｂ）  適切な反応条件下で発色基質、シグナル伝達コンジュゲート又は酵素反応性色素と反応して、組織試料上に色素のｉｎ  ｓｉｔｕ生成及び／又は色素の付着を生じさせる、特異的検出試薬にコンジュゲートした酵素
を含む。
【００４６】
非限定的な例として、標識コンジュゲートの特異的検出試薬は、二次検出試薬（例えば、ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体のＦｃ領域に特異的に結合することができる種特異的二次抗体）、三次検出試薬（例えば、ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体に結合した二次抗体に特異的な種特異的三次抗体、ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体に結合したハプテンコンジュゲート二次抗体に特異的な抗ハプテン抗体、又はＴＳＧ６−Ｆｃ融合体に結合したビオチン化二次抗体に結合することができるビオチン結合タンパク質）、又はその他のこのような取り合わせであってもよい。このようにして試料結合ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体に局在化した酵素は、次に検出可能部分を付着させるために複数のスキームで使用され得る。
【００４７】
いくつかの場合、酵素は、発色性化合物／基質と反応する。発色性化合物／基質の具体的で非制限的な例には、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ-ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
【００４８】
いくつかの実施態様では、酵素を金属組織学的検出スキームにおいて使用することができる。金属組織学的検出法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元に不活性な基質と組み合わせて使用することを含む。いくつかの実施態様では、該基質は、酵素によって酸化還元活性剤に変換され、その酸化還元活性剤が金属イオンを還元し、それに検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、２００４年１２月２０日に出願された米国特許出願公開第１１／０１５６４６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号、及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照されたい。尚、これら各々の全内容は、参照により本明細書に援用される）。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に酸化還元酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）を用いて、先と同じく検出可能な沈殿物を形成させることを含む。（例えば、参照により全内容が本明細書に援用される米国特許第６６７０１１３号を参照されたい）。
【００４９】
いくつかの実施態様では、酵素作用は酵素と色素自体との間で起こり、その反応は色素を非結合種から試料への付着種に変換する例えば、ＤＡＢとペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）の反応はＤＡＢを酸化し、それを沈殿させる。
【００５０】
更に他の実施態様では、検出可能部分は、酵素と反応して試料又は他の検出成分に結合することができる反応種を形成するように構成された潜在的反応性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートを介して付着する。このような反応種は、それらの生成に近い、すなわち酵素の近くの試料と反応することができるが、酵素が付着した部位から遠位の部位にはシグナル伝達コンジュゲートが付着しないように非反応種に急速に変わる。潜在的反応性部分の例には、例えば国際公開第２０１５１２４７０３号に記載されているキノンメチド（ＱＭ）アナログと、例えば国際公開第２０１２００３４７６号に記載されているチラミドコンジュゲートが含まれる（これらの各文献は、その全内容が参照により本明細書に援用される）。いくつかの例では、潜在的反応性部分は、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯ、紫色）及びローダミン１１０（ローダミン）等の色素に直接コンジュゲートしている。他の例では、潜在的反応性部分は特異的な結合対の一方のメンバーにコンジュゲートし、色素は該特異的な結合対のもう一方のメンバーに結合している。他の例では、潜在的反応性部分は特異的結合対の一方のメンバーに結合し、酵素は該特異的な結合対のもう一方のメンバーに結合しており、ここで酵素は、（ａ）発色基質と反応性で、色素の生成をもたらし、又は（ｂ）色素と反応性で、色素（ＤＡＢなど）の付着をもたらす。特異的な結合対の例には、
（１）  潜在的反応性部分に結合したビオチン若しくはビオチン誘導体（例えばデスチオビオチン）、及びビオチン結合体（例えばアビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシル化アビジン（ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮなど））、又は色素に、若しくは発色基質と反応性の酵素若しくは色素と反応性の酵素に結合した自身のビオチン結合部位にニトロ化チロシンを有するビオチン結合タンパク質（例えばＣＡＰＴＡＶＩＤＩＮ）（例えば色素がＤＡＢである場合、ビオチン結合タンパク質に結合したペルオキシダーゼ）；
（２）  潜在的反応性部分に結合したハプテン及び、色素に、又は発色基質と反応性若しくは色素と反応性の酵素に結合した抗ハプテン抗体（例えば色素がＤＡＢである場合、ビオチン結合タンパク質に結合したペルオキシダーゼ）
が含まれる。
【００５１】
ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体及び検出試薬の組み合わせの非限定的例は、特に表１に記載のものが含まれる。
2019533149.tif 000003
2019533149.tif 000004
2019533149.tif 000005
2019533149.tif 000006
2019533149.tif 000007
2019533149.tif 000008
2019533149.tif 000009
2019533149.tif 000010
【００５２】
特定の実施態様では、表１に記載の２°Ｆｃ特異的検出試薬は抗体である。別の実施態様では、ＴＳＧ６−Ｆｃ融合体はＴＳＧ６−ウサギＦｃ融合体であり、２°Ｆｃ特異的検出試薬は抗ウサギＩｇ抗体である。
【００５３】
本方法での使用に適した市販の検出試薬又は検出試薬を含むキットの非限定的な例には、ＶＥＮＴＡＮＡ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出システム（ＨＲＰ及びＡＰを含む酵素にコンジュゲートした二次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ  ｉＶＩＥＷ検出システム（ビオチン化抗種二次抗体及びビオチン化抗種二次抗体コンジュゲート酵素）；ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ検出システム（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（ハプテンにコンジュゲートした抗種二次抗体及び酵素多量体にコンジュゲートした抗ハプテン三次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（一次抗体結合部位に付着した酵素の数を増幅するために前述のＶＥＮＴＡＮＡ検出システムのいずれとも一緒に使用することができる、非コンジュゲート二次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ハプテンにコンジュゲートした抗種二次抗体、酵素多量体にコンジュゲートした抗ハプテン三次抗体、及び同じハプテンに結合したチラミドが含まれる。使用時には、二次抗体を試料と接触させて一次抗体に結合させる。その後、試料を抗ハプテン抗体と共にインキュベートし、酵素と二次抗体との結合を生じさせる。その後試料をチラミドと共にインキュベートし、追加のハプテン分子を付着させる。その後試料を抗ハプテン抗体と共に再度インキュベートし、追加の酵素分子を付着させる。次いで試料を検出可能部分と共にインキュベートし、色素付着を生じさせる）；ＶＥＮＴＡＮＡ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＯｍｎｉＭａｐ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＵｌｔｒａＭａｐ抗ハプテン抗体、二次抗体、色素原、フルオロフォア及び色素キット（これらはそれぞれ、ベンタナメディカルシステム社．（アリゾナ州トゥーソン）から入手可能）；ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ及びＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ＩＨＣ検出システム（ＨＲＰ又はＡＰと直接重合して、抗体に対する酵素の比率が高いコンパクトポリマーになる二次抗体）；並びにＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ＋システム（二次抗体にコンジュゲートした酵素標識ポリマー）。
【００５４】
ＩＩＩ．  スコアリング方法
スコアリングシステムの基本的な特徴は、Ｃｒｉｓｓｍａｎらによって提案されており、それには次のものが含まれる：（１）スコアリングシステムは定義可能でなければならない、（２）スコアリングシステムは再現可能でなければならない、（３）スコアリングシステムは意味のある結果を生み出すものでなければならない。また、Ｇｉｂｓｏｎ−Ｃｏｒｌｅｙらは、適切なスコアリングシステム及びデータ評価のためのいくつかの重要な原則を記載したが、それは、評価されたスコアの主観性を低減するための実験材料の「マスク化（Masking）」；組織病変をスコアリングするためのコンテキストの作成を伴う、すべての組織／スライドの徹底的な「検査」；「病変パラメータ」を特定すること（これは後にスコアカテゴリーとして使用可能）であった。このように明確な「スコアリング定義」を使用すると、提示されたデータの理解が深まり、スコアリングシステムの再現性が向上する。可能な限り常に、すべての試料が同じ科学者によって妥当な期間内に採点されることを意味する「解釈の一貫性」を働かせること。
【００５５】
組織病理学者によるＩＨＣマーカー発現の主観的知覚を定量的データに変換するために半定量的スコアリングシステムが広く使用されており、定量的データはその後、統計的分析及び結論の確定のために使用される。スコアリングシステムなしでは、受け取るデータの記述は、「より〜である」又は「より〜でない」といった修飾語を伴う「強い」、「弱い」、「なし」などの形容詞で表現された主観的な知覚によってのみ提供されるにすぎない。各病理学者はスライドを調べる際、この手法を用いるが、スコアリングシステムへの変換なしでは、それらはただ一人の病理学者の評価の主観的な表現にすぎない。主観性を減らすために、研究には少なくとも一人以上の観察者がいることが推奨される。
【００５６】
ほとんどの半定量的スコアリングシステムは通常、別々に定量化され最終的に合計スコアに組み合わされる複数のパラメータを含む。その後、異なる実験群のスコアを統計検定によって比較することができる。パラメータの選択は、実験で使用されるＩＨＣマーカーの発現の形態学的特徴と共に科学的仮説又は疑問に基づいてもよい。標準化されたＩＨＣスコアリングにおける「グローバルスタンダード」はこれまでのところ、テストガイドラインが開発されている３つのマーカー、すなわちＨｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン（ＥＲ）及びプロゲステロン（ＰｇＲ）のみの評価に対して定義されている。多くのＩＨＣマーカーについては、科学者たちが個別のスコアリングシステムを設計する。
【００５７】
本明細書に開示のスコアリング及び染色の方法は、ＥＣＭ成分をスコアリングするために使用することができる。ある実施態様において、ＥＣＭ成分は、ある病態のバイオマーカーである。病態バイオマーカーとして有用な例示的なＥＣＭ成分は、Ｊａｒｖｅｌａｉｎｅｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．，６１巻，第２版，１９８−２２３頁(2009)に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。例示的な実施態様において、ＥＣＭ成分は、例えばコンパニオン診断薬など、ヒト治療のための予測バイオマーカーとして使用される。特定の実施態様において、本開示のスコアリング方法は、ＥＣＭ改変療法（ECM-modifying therapy）に対する応答の予測バイオマーカーとして特定のＥＣＭ成分をスコアリングするために使用され得る。
【００５８】
いくつかの実施態様では、ＥＣＭ関連分子はヒアルロン酸（ＨＡ）である。全固形腫瘍の約２０−３０％が様々な程度でＨＡを過剰発現していると推定される。図１は、異常なＨＡ発現を特徴とする腫瘍の非限定的な例を示す。本開示はまた、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍等におけるＨＡのスコアリングを特徴とする。
【００５９】
特定の実施態様では、本開示のスコアリング方法は、全腫瘍表面と比較して、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中のＨＡ含有量（又は他の適切なＥＣＭバイオマーカー含有量）を評価することを特徴とする。本開示のスコアリング方法は、腫瘍表面（ＴＳ）を特定することを含む。腫瘍表面を特定することは、（例えばＨ＆Ｅスライド上で）腫瘍細胞及び関連する間質を特定することを伴う。臓器被膜領域（organ capsule area）及び線維性仮性被膜領域は腫瘍表面に含まれるべきではなく、壊死領域にも含まれるべきではないことに留意されたい。筋肉、コラーゲン束（collagen bundles）、脂肪組織及び神経等の、腫瘍に取り込まれた非腫瘍関連構造は通常、ＨＡを発現する可能性がある。これらの構造は腫瘍表面の一部と考えられているが、このような非腫瘍関連構造内のＨＡ発現はスコア化されない。本明細書で使用される場合、「腫瘍関連細胞外マトリックス」又は「腫瘍関連ＥＣＭ」とは、腫瘍内に捕捉された非腫瘍関連構造と関連していない、腫瘍表面内のＥＣＭ領域を指すものとする。この方法は、ネガティブコントロールラン（例えば連続切片の染色スライド）が、ＨＡ読み取りを妨げる可能性のある非特異的な中程度又は強いバックグラウンドを示さないことを確認することを更に含み得る。当業者であれば、非特異的バックグラウンドのレベル（例えば、許容可能なかすかな拡散から弱い拡散までと、ＨＡ読み取りを妨げない非特異的バックグラウンド）を決定することができる。この方法は、腫瘍表面全体にわたって（バックグラウンドを上回る任意の強度レベルで）ＨＡ染色された細胞外マトリックスの百分率を推定することを更に含む。
【００６０】
本開示のスコアリング方法は、例えば組織試料をＨＡ染色することによって組織（例えば腫瘍）試料中のＨＡを可視化することと、全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色（例えば、弱い（１＋）ＨＡ染色、中程度（２＋）のＨＡ染色又は強い（３＋）ＨＡ染色）を有する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を百分率で決定して、ＨＡスコアを作成することとを含み得る。式１は上述の方法を表している。
2019533149.tif 000011
式中、面積（ＥＣＭ）は、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり、面積（ＴＳ）は、腫瘍表面の全表面積である。
【００６１】
下記の式２を参照すると、ＨＡスコアは、式１と比較してわずかに異なるように決定され得る。例えば、いくつかの実施態様では、ＨＡスコアは、（１）腫瘍表面の面積にわたってＨＡの弱い（１＋）染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積（百分率）、（２）腫瘍表面の面積にわたって中程度（２＋）のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積（百分率）、及び（３）腫瘍表面の面積にわたって強い（３＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積（百分率）を合計することによって算出される。式２は、この計算を表している。
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式中、
・  面積（１＋のＥＣＭ）は、１＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（２＋のＥＣＭ）は、２＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（３＋のＥＣＭ）は、３＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＴＳ）は、腫瘍表面の全表面積である。
【００６２】
式２が本明細書に記載のシステムで実施される場合、「１＋」、「２＋」、「３＋」のカテゴリーは、ユーザが望む場合、「低」、「中」、「高」のＨＡ染色強度又は他の細区分によって置き換えられ得る。
【００６３】
数学的には式１と式２は同一のＨＡスコアを算出するが、式１と式２を使用して個人（例えば病理学者）がＨＡ含有量をスコア化するプロセスは異なり、例えば、式１では、病理学者は腫瘍関連ＥＣＭでバックグラウンドを上回る任意のＨＡ染色を探す一方、式２では、病理学者はまず、腫瘍関連ＥＣＭで弱いＨＡ染色を探し、その後腫瘍関連ＥＣＭで中程度のＨＡ染色を探し、その後腫瘍関連ＥＣＭで強いＨＡ染色を探す（必ずしもこの順序である必要はないが）。これらのプロセスの微妙な違いにより、一方の式と他方の式で評価した場合、ＨＡスコアがわずかに異なることがある。
【００６４】
図２は、特定の標本に対するワークフローの概略図を示す。非限定的な例として、いくつかの実施態様では、組織試料は患者から採取され、（例えばＮＦＢ又は他の適切な系に）固定され、パラフィンに包埋される。その試料の切片は、顕微鏡スライドに載せられる。１つの切片（又はそれ以上）がＨ＆Ｅで染色される。Ｈ＆Ｅ染色が許容可能な場合、同じ染色ランにおいて、１つの切片はＨＡ染色され、もう１つの切片はネガティブコントロール染色される（例えば、プロテアーゼネガティブ試薬コントロールで染色される）。必要ならば、他の組織コントロール（例えば正常な皮膚、正常な肝臓など）を、患者スライドと同じランで染色して、組織コントロールとして機能させる。組織コントロールが許容可能であり、ネガティブコントロールも許容可能な場合、ＨＡスライドを評価する。ＨＡスライドが許容可能な場合、試料は、本開示によるスコアリング方法を使用して病理学者によって評価される。
【００６５】
組織コントロールの評価の例として、肝臓コントロール組織の許容可能な染色は、肝細胞内のヌルＨＡ含有量及び門脈空間（portal space）における（任意の強度の）任意のＨＡ含有量を示すであろう。いくつかの実施態様において、許容可能でない染色は、肝細胞内の任意のＨＡ含有量及び／又は肝臓組織内の過剰な非特異的バックグラウンド染色を示すであろう。図３Ａは、高いＨＡ含有量を示す、許容可能なＨＡ染色の例を示す。基底上のケラチノサイトには低から中程度のＨＡ含有量があり、皮膚真皮には高ＨＡ染色が存在する。図３Ｂは、低いＨＡ含有量を示す、許容可能なＨＡ染色を示す。門脈空間にはＨＡ含有量があり、肝細胞にはヌルＨＡ染色がある。
【００６６】
試料のＨＡスコアは、特定の閾値と比較され得る。例えば、試料のＨＡスコアが閾値よりも大きい（又は等しい）場合、その試料は高いＨＡスコアを有するといえる。あるいは、試料のＨＡスコアが閾値未満（又は場合によっては閾値に等しい）場合、その試料は低いＨＡスコアを有するといえる。閾値は、臨床データなどの適切なデータを使用して決定され得る。閾値は、バイオマーカー及び／又はがんの種類に応じて異なり得る。いくつかの実施態様において、閾値は５０％である（例えば膵管腺がんの場合）。例えば、特定の腫瘍（例えば膵管腺がん）における５０％又はそれ以上（例えば５０％以上）のスコアは、高ＨＡといえる。いくつかの実施態様において、特定の腫瘍（例えば膵管腺がん）における５０％未満のスコアは、低ＨＡといえる。本開示は、これらの閾値に限定されない。例えば、２５％以上のスコアは高ＨＡ、２５％未満のスコアは低ＨＡとされる。あるいは、７５％以上のスコアを高ＨＡとし、７５％未満のスコアは低ＨＡとすることができる。更に、これらの閾値は、他の腫瘍型については異なり得る。例えば、２５％以上のＨＡスコアは、胃がん又は肺がんなどの腫瘍型については高ＨＡと考えられるが、５０％以上のスコアは、膵臓腫瘍については高ＨＡと考えられる。カットオフ又は閾値は、コホート又は他の適切な手段から獲得されたスコアの技術的評価によって決定され得る。
【００６７】
前述のとおり、腫瘍関連ＥＣＭに基づく、本開示のＨＡスコアリング方法は、臨床転帰データによってサポートされている。本開示のスコアリングアルゴリズムに基づいて同定された高ＨＡ患者は、低ＨＡ患者と比較して、標準治療単独からよりもＨＡ標的療法からのより大きな治療利益を示した（表２参照）。
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【００６８】
更に、ＥＣＭに基づく本開示のＨＡスコアリング方法は、読影者精度学習及び複数の読影者訓練試験によって、再現可能があり、訓練可能であり、かつ、一般的な病理学の実践に移行可能であることが証明されている（表２、表３参照；ＯＰＡ＝全体一致率（Overall Percent Agreement）；ＡＰＡ＝平均陽性一致率（Average Positive Agreement）；ＡＮＡ＝平均陰性一致率（Average Negative Agreement）；［ａ］９５％ＣＩ＝５，０００のブートストラップ試料からのパーセンタイル・ブートストラップ法を用いて計算された両側９５％信頼区間）。
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【００６９】
本開示はまた、特定の療法、例えばＨＡ療法（例えばＰＥＧＰＨ２０）から恩恵を得ることができる、特定の腫瘍型（例えば乳房腫瘍、肺腫瘍（非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む）、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍膵管腺がん（ＰＤＡ）を含む）、胃腸腫瘍、泌尿生殖器腫瘍等）を有する患者の同定に資するための予測診断法を特徴とする。本開示の予測診断法は、ＨＡ含有量を評価するために、前述のＥＣＭに基づくスコアリング方法を利用する。高いＨＡスコアは、ＨＡ療法（例えばＰＥＧＰＨ２０）から恩恵を得ることができる患者、例えば、抗ＨＡ療法から恩恵を得る可能性が高い患者を示し得る。あるいは、低いＨＡスコアは、ＨＡ療法から恩恵を受けない可能性がある患者を示し得る。ＨＡ療法は典型的には、他の抗腫瘍治療実体（例えば化学療法薬、放射線療法又は標的化治療の有効性を改善するために使用され、したがって一般的にそのような抗腫瘍治療実体（therapeutic entity）と共投与されるか、又は他の抗腫瘍治療実体の投与直前に投与される。
【００７０】
ＩＶ   ＨＡスコアリングシステム
一実施態様では、本方法は、手動でスコア化される。別の実施態様では、スコアリング方法は、組織化学的にＨＡ染色された組織切片の１つ以上のデジタル画像からＨＡスコアを計算するように適合されたスコアリングシステムで実施され得る。例示的なＨＡスコアリングシステムを図５に示す。
【００７１】
ＨＡスコアリングシステムは、画像解析システム１００を含む。画像解析システム１００は、例えばデスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレット、スマートフォン、サーバ、特定用途向けコンピュータ装置、又は本明細書に記載の技術及び操作を実行することができる、他の任意の種類の電子装置等、１つ以上のコンピュータ装置を含んでもよい。いくつかの実施態様では、画像解析システム１００は、単一の装置として実装され得る。他の実施態様では、画像解析システム１００は、本明細書で論じた様々な機能を達成する２つ以上の装置の組み合わせとして実装されてもよい。例えば、画像解析システム１００は、１つ以上のローカルエリアネットワーク及び／又はインターネットなどのワイドエリアネットワークを介して互いに通信可能に接続された、１台以上のサーバコンピュータと１台以上のクライアントコンピュータとを含み得る。
【００７２】
図５に示すように、画像解析システム１００は、メモリ１１５、プロセッサ１１６及びディスプレイ１１７を含んでもよい。メモリ１１５は、例えばランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、電気的消去可能プログラム可能読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）などの読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ、ハードドライブ、ＳＳＤ（ソリッドステートドライブ）、光ディスク等、任意の種類の揮発性又は不揮発性メモリの任意の組み合わせを含み得る。簡潔にするために、メモリ１１５を単一の装置として図５に示すが、メモリ１１５は２つ以上の装置にわたって分散させることもできることを理解されたい。
【００７３】
プロセッサ１１６は、例えば中央演算処理装置（ＣＰＵ）、グラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）、特殊目的のシグナル又は画像プロセッサ、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、テンソル・プロセッシング・ユニット（ＴＰＵ）等、任意の種類の１つ以上のプロセッサを含み得る。簡潔にするために、プロセッサ１１６を単一の装置として図５に示すが、プロセッサ１１６は任意の数の装置にわたって分散させることもできることを理解されたい。
【００７４】
ディスプレイ１１７は、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＯＬＥＤ、ＴＦＴ、プラズマ等、任意の適切な技術を用いて実装することができる。いくつかの実装形態では、ディスプレイ１１７は、タッチセンサーディスプレイタッチスクリーン）であってもよい。
【００７５】
図５に示すように、画像解析システム１００はまた、オブジェクト識別子１１０、関心領域（ＲＯＩ）生成器１１１、ユーザインタフェースモジュール１１２及びスコアリングエンジン１１４も含み得る。これらのモジュールはスタンドアローン・モジュールとして図５に示されているが、そうではなく各モジュールを複数のサブモジュールとして実装することもできること、また、いくつかの実施態様では、任意の２つ以上のモジュールを単一のモジュールに組み合わせることも可能なことは、当業者には明らかであろう。更に、いくつかの実施態様では、システム１００は、簡潔にするために図５に示されていない追加のエンジン及びモジュール（例えば入力装置、ネットワーキング及び通信モジュール等）を含み得る。更に、いくつかの実施態様では、図５に示されているブロックのいくつかは、無効にするか省略することができる。以下でより詳細に論じるとおり、システム１００のいくつかの又はすべてのモジュールの機能は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェアで、又はこれらの任意の組み合わせとして実装することができる。本明細書に開示のモジュールを実装するのに有用な、例示的な市販のソフトウェアパッケージには、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＶＩＲＴＵＯＳＯ；ＤｅｆｉｎｉｅｎｓのＴＩＳＳＵＥ  ＳＴＵＤＩＯ、ＤＥＶＥＬＯＰＥＲ  ＸＤ、及びＭＡＧＥ  ＭＩＮＥＲ；並びにＶｉｓｏｐｈａｒｍ  ＢＩＯＴＯＰＩＸ、ＯＮＣＯＴＯＰＩＸ、及びＳＴＥＲＥＯＴＯＰＩＸソフトウェアパッケージが含まれる。
【００７６】
画像を取得した後、画像解析システム１００は、画像をオブジェクト識別子１１０に渡すことができるが、このオブジェクト識別子は、後でスコアリングに使用される画像内の関連オブジェクト及び他の特徴を識別及びマークするための一組のコンピュータ実行可能命令を実行する。オブジェクト識別子１１０は、画像内の様々なオブジェクトを特徴付ける複数の画像特徴及びバイオマーカーの発現を表すピクセルを各画像から抽出する（又は各画像のために生成する）ことができる。抽出された画像特徴は、例えば、Ｈａｒａｌｉｃｋ特徴、バグオブワーズ特徴等のテクスチャー特徴を含み得る。
複数の画像特徴の値は、バイオマーカーの染色パターンを特徴付ける「特徴ベクトル」と以下で呼ぶ、高次元ベクトルに統合してもよい。例えば、Ｍ個の特徴が各オブジェクト及び／又はピクセルについて抽出される場合、各オブジェクト及び／又はピクセルは、Ｍ次元特徴ベクトルによって特徴付けられ得る。オブジェクト識別子１１０の出力は事実上、関心のあるオブジェクト及びピクセルの位置にアノテーションを付け、それらのオブジェクト及びピクセルをオブジェクト又はピクセルを記述する特徴ベクトルと関連付ける画像のマップである。
【００７７】
オブジェクト識別子１１０によって抽出される特徴は、試料（例えば膜、核、細胞、ＥＣＭ等）中のオブジェクトを識別し、試料のＥＣＭをＨＡ陽性、ＨＡ陰性に分類、又は相対強度に基づいて分類するのに十分な特徴又は特徴ベクトルを含み得る。ＨＡは腫瘍関連ＥＣＭに局在する場合にのみスコア化されるため、オブジェクト識別子１１０によって抽出された特徴は、（１）腫瘍関連ＥＣＭに関連するピクセル及び／又は（２）腫瘍関連ＥＣＭに関連するピクセルのＨＡ強度を識別することに関連する特徴を含み得る。例示的な実施態様において、特徴ベクトルは、各ピクセルについてオブジェクト識別子１１０によって生成され、（１）ピクセルがＥＣＭと関連しているかどうか；及び（２）ＨＡ染色チャネル内のピクセル強度がバックグラウンド強度に対応する閾値レベルを上回るか下回るかを含む。別の例示的な実施態様では、オブジェクト識別子１１０によって生成された特徴ベクトルは、（１）ピクセルが腫瘍関連ＥＣＭと関連しているかどうか；及び（２）ＨＡ染色チャネル内のピクセル強度がバックグラウンド強度以下；低い強度（又は強度１＋）；中程度の強度（又は強度２＋）；及び高い強度（又は強度３＋）から選択される所定の範囲内にあるかどうかを含む。画像から抽出され特徴ベクトルに組み込まれる正確な特徴は、適用されている分類関数の種類に依存し、当業者にはよく知られているであろう。
【００７８】
画像解析システム１００はまた、画像をＲＯＩ生成器１１１に渡すことができる。ユーザはＲＯＩ生成器１１１にアクセスして、ＥＣＭスコアが計算されることになる画像のＲＯＩ（複数可）を識別する。オブジェクト識別子１１０が画像全体に適用されない場合、ＲＯＩ生成器１１１によって生成されたＲＯＩ（複数可）は、オブジェクト識別子１１０が実行される画像のサブセットを定義するためにも使用され得る。一実施態様では、ＲＯＩ生成器１１１の出力は、腫瘍表面を含むか、本質的に腫瘍表面からなるか、又は腫瘍表面からなるＲＯＩである。
【００７９】
一実施態様では、ＲＯＩ生成器１１１は、ユーザインタフェースモジュール１１２を介してアクセスすることができる。ＨＡ染色試料（又はＨＡ染色試料の形態学的に染色された連続切片）の画像はユーザインタフェースモジュール１１２のグラフィックユーザインターフェース上に表示され、ＲＯＩとみなされる画像の１つ以上の領域にユーザがアノテーションをつける。この例では、ＲＯＩアノテーションは、複数の形式を取る。例えば、ユーザはＲＯＩを手動で定義することができる（以下、「手動ＯＩアノテーション」という）。他の例では、ＲＯＩ生成器１１１は、ユーザがＲＯＩにアノテーシをつけるのを助ける（「半自動ＲＯＩアノテーシ」という）。例えばユーザは、デジタル画像の１つ以上の領域の輪郭を描き、その後、システムがそれを完全なＲＯＩに自動的に変換する。例えば、所望のＲＯＩが腫瘍表面である場合、ユーザが腫瘍表面の輪郭を描き、次にシステムが、例えばコンピュータビジョン及び機械学習を利用することによって類似の形態学的領域を識別し、それが次にユーザによって承認、拒絶又は修正され得る。他の実施態様では、ＲＯＩ生成器１１１は、（例えばアノテーションなしの画像に組織セグメンテーション機能を適用することによって）ユーザからの直接入力なしにＲＯＩを自動的に提案することができ、ユーザは、それを承認すること、手動ＲＯＩを選んで拒絶すること、又はＲＯＩを編集すること、及び／又はユーザが必要と判断した場合には追加のＲＯＩ領域を付け加えることを選択することができる。ＲＯＩにアノテーションをつけるための他の構成も同様に可能であり、本開示の範囲は、ＲＯＩにアノテーションをつけることができる方法を限定するものとみなされるべきではない。
【００８０】
いくつかの実施態様では、ＲＯＩ生成器１１１は登録機能も含むことができ、それによって一組の連続セクションのうちの１つのセクションにアノテーションが付けられたＲＯＩがその一組の連続セクションの他のセクションに自動的に転送される。この機能は、ＨＡと併せて解析されているバイオマーカーがある場合、又はＨ＆Ｅ染色された連続切片がＨＡ標識切片と共に提供される場合に特に有用である。したがって、例えば形態に基づくＲＯＩは、Ｈ＆Ｅ染色組織切片の画像にアノテーションを付けることができ、アノテーション付けされたＲＯＩは、ＨＡ染色連続切片に自動的に登録される。
【００８１】
オブジェクト識別子１１０とＲＯＩ生成器１１１は、任意の順序で実装することができる。例えば、オブジェクト識別子１１０は、最初に画像全体に適用されてもよい。識別されたオブジェクトの位置及び特徴は、その後ＲＯＩ生成器１１１が実装されるときに記憶され、呼び出され得る。このような構成では、スコアは、ＲＯＩの生成と同時にスコアリングエンジン１１４によって生成され得る。そのワークフローを図６Ａに示す。図６Ａに見られるように、異なるオブジェクトの混合を有する画像が得られる（濃い楕円形と濃い菱形で示す）。オブジェクト識別タスクが実装された後で、画像内のすべての菱形が識別される（白抜きの菱形で示す）。ＲＯＩが画像に付け加えられると（破線で示されている）、ＲＯＩ領域に位置する菱形だけがＲＯＩのメトリック計算に含まれる。その後、スコアリング関数によって使用される特徴メトリックと任意の追加のメトリックを含めて、特徴ベクトルが計算される。あるいは、ＲＯＩ生成器１１１を最初に実装することができる。このワークフローでは、オブジェクト識別子１１０は、ＲＯＩ上にのみ実装されても（計算時間を最小にする）、又はなお画像全体に実装されてもよい（オブジェクト識別子１１０を再実行せずにオンザフライ調整を可能にする）。そのワークフローを図６Ｂに示す。図６Ｂに見られるように、異なるオブジェクトの混合を有する画像が得られる（濃い楕円形と濃い菱形で示す）。ＲＯＩが画像に付け加えられている（破線で示す）が、オブジェクトはまだマークされていない。オブジェクト識別タスクがＲＯＩ上で実装された後で、ＲＯＩ内の全ての菱形が識別され（白抜きの菱形で示す）、ＲＯＩの特徴メトリック計算に含まれる。その後、スコアリング関数によって使用される特徴メトリック（複数可）及び任意の追加のメトリックを含めて、特徴ベクトルが計算される。オブジェクト識別子１１０及びＲＯＩ生成器１１１を同時に実装することも可能である。
【００８２】
オブジェクト識別子１１０及び／又はＲＯＩ生成器１１１が実装された後で、スコアリングエンジン１１４が実装される。スコアリングエンジン１１４は、ＲＯＩの特徴メトリック（複数可）及びＲＯＩ内のオブジェクトの関連メトリック（例えば腫瘍関連ＥＣＭ内のＨＡ陽性ピクセルの面積、複数の範囲（例えば「高」、「中」、「低」又は「１＋」、「２＋」、「３＋」）内のＨＡ強度を有するピクセルを有する腫瘍関連ＥＣＭの面積）を計算する。スコアリング関数によって使用される、算出された特徴メトリック及びＲＯＩから導出された任意の他の変数を含むＲＯＩ特徴ベクトルが集められ、スコアリング関数がＲＯＩ特徴ベクトルに適用される。
【００８３】
図７に示すように、画像解析システムは、様々な機能を実装するためのコンピュータシステム４００を含んでもよく、計算システム４００は、プロセシングリソース４１０と非一時的なコンピュータ可読媒体４２０とを備える。非一時的コンピュータ可読媒体４２０は例えば、次のうちの１つ以上を含む、機能（複数可）を実行するための命令：生体試料画像を取得せよ（４２２）；画像内の関連オブジェクトを識別せよ４２４；画像内にＲＯＩを生成せよ（４２６）；ＥＣＭ空間を識別するのに有用な、ＲＯＩ内のオブジェクトを識別せよ（４２８）；１つ以上のＲＯＩメトリック（例えばバックグラウンドを上回る染色強度を有するＲＯＩの面積又は所定の強度範囲（例えば強度スコア１＋、２＋又は３＋と相関する、デジタル的に測定された強度読み取り値）内の染色強度を有するＲＯＩの面積）を含む、ＲＯＩの特徴ベクトルを生成せよ４３０：特徴ベクトルに基づいてＨＡスコアを計算せよ（４３２）；ＨＡスコアを含むレポートを生成せよ（４３４）を含む。
【００８４】
図５に示すように、いくつかの実施態様では、画像解析システム１００は、画像取得システム１２０に通信可能に接続されてもよい。画像取得システム１２０は、試料の画像を取得し、これらの画像を画像解析システム１００に提供することができる。
【００８５】
画像取得システム１２０は、例えばスライドスキャナを含む、２０倍、４０倍又は他の倍率で染色スライドをスキャンして高解像度のスライド全体のデジタル画像を生成することができる、スライドスキャナなどのスキャニングプラットフォーム１２５を含んでもよい。基本的なレベルでは、典型的なスライドスキャナは、少なくとも（１）対物レンズを備えた顕微鏡、（２）光源（色素に応じて、ハロゲン、発光ダイオード、白色光及び／又はマルチスペクトル光源など）、（３）スライドガラスを動かす（又はスライドの周囲光学系を動かす）ためのロボット、（４）画像取得用の１台以上デジタルカメラ、（５）ロボットを制御し、かつ、デジタルスライドを操作、管理及び表示するためのコンピュータ及び付属のソフトウェアを含む。スライド上の複数の異なるＸＹ位置（また、場合によっては複数のＺ面）のデジタルデータは、カメラの電荷結合素子（ＣＣＤ）によって取得され、画像が結合されて、スキャン面全体の合成画像が作成される。これを実現するための一般的な方法は、以下を含む。
（１）  スライドステージ又は光学系をごくわずかずつ動かして、隣接する正方形とわずかに重なる正方形の画像フレームを取得する、タイルベースのスキャニング。その後、取得された正方形は、自動的に互いにマッチングされて合成画像を構築する；及び
（２）  スライドステージを取得中に１つの軸に沿って動かし、複数の合成画像「ストリップ」を取得する、ラインベースのスキャニング。その後画像ストリップは、互いにマッチングされて、より大きな合成画像を形成する。
【００８６】
各種スキャナ（蛍光と明視野の双方）の詳細な概要は、全内容が参照により援用されるＦａｒａｈａｎら，Ｗｈｏｌｅ  ｓｌｉｄｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｔ’ｌ，７巻，２３-３３頁（２０１５年６月）に見出すことができる。市販のスライドスキャナの例には、３ＤＨｉｓｔｅｃｈ  ＰＡＮＮＯＲＡＭＩＣ  ＳＣＡＮ  ＩＩ；ＤｉｇｉＰａｔｈ  ＰＡＴＨＳＣＯＰＥ；浜松  ＮＡＮＯＺＯＯＭＥＲ  ＲＳ、ＨＴ及びＸＲ；Ｈｕｒｏｎ  ＴＩＳＳＵＥＳＣＯＰＥ  ４０００、４０００ＸＴ及びＨＳ；ライカ  ＳＣＡＮＳＣＯＰＥ  ＡＴ、ＡＴ２、ＣＳ、ＦＬ及びＳＣＮ４００；Ｍｉｋｒｏｓｃａｎ  Ｄ２；オリンパス  ＶＳ１２０−ＳＬ；Ｏｍｎｙｘ  ＶＬ４及びＶＬ１２０；パーキンエルマー  ＬＡＭＩＮＡ；フィリップス  ＵＬＴＲＡ−ＦＡＳＴ  ＳＣＡＮＮＥＲ；サクラファインテック  ＶＩＳＩＯＮＴＥＫ；ユニック  ＰＲＥＣＩＣＥ  ５００及びＰＲＥＣＩＣＥ  ６００ｘ；ＶＥＮＴＡＮＡ  ＩＳＣＡＮ  ＣＯＲＥＯ及びＩＳＣＡＮ  ＨＴ；並びにツァイス  ＡＸＩＯ  ＳＣＡＮ．Ｚ１が含まれる。その他の例示的システム及び特徴は例えば、国際公開第２０１１−０４９６０８号又は２０１４年６月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１４−０１７８１６９号（これらはその全内容が参照により援用される）に見出すことができる。
【００８７】
スキャニングプラットフォーム１２５によって生成された画像は、画像解析システム１００に、又は画像解析システム１００によってアクセス可能なサーバ若しくはデータベースに転送することができる。いくつかの実施態様では、画像は、１つ以上のローカルエリアネットワーク及び／又はワイドエリアネットワークを介して自動的に転送され得る。いくつかの実施態様では、画像解析システム１００は、スキャニングプラットフォーム１２５及び／又は画像取得システム１２０の他のモジュールと統合されるか又は含まれてもよく、その場合画像は、例えばプラットフォーム１２５及びシステム１２０の双方によってアクセス可能なメモリを介して、画像解析システムに転送され得る。いくつかの実施態様では、画像取得システム１２０は画像解析システム１００と通信可能に接続されていなくてもよく、その場合画像は、任意の種類の不揮発性記憶媒体（例えばフラッシュドライブ）に格納することができ、かつ、該媒体から画像解析システム１００へ、又はそれと通信可能に接続されたサーバ若しくはデータベースへダウンロードすることができる。上記の例のいずれにおいても、画像解析システム１００は、生物学的試料の画像を取得することができ、ここで該試料はスライドに固定されており、組織化学的染色プラットフォーム１２３によって染色されており、スライドはスライドスキャナ又は他の種類のスキャニングプラットフォーム１２５によってスキャンされている。しかしながら他の実施態様では、後述の技法が、他の手段によって取得及び／又は染色された生物学的試料の画像にも適用され得ることを理解されたい。
【００８８】
画像取得システム１２０はまた、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機．などの自動組織化学染色プラットフォーム１２３を含み得る。自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機は通常、少なくとも次を含む：染色プロトコールで使用される様々な試薬のリザーバー（バイオマーカー特異的試薬、検出試薬、洗浄液及びその他の付属品を含む）、スライド上へ試薬を分配するための、リザーバーと流体連通している試薬分配装置、そのスライドから使用済み試薬及びその他の廃棄物を除去するための廃棄物除去システム、並びに試薬分配装置及び廃棄物除去システムの動作を調整する制御システム。染色工程を実施することに加えて、多くの自動スライド染色機はまた、スライドベーキング（スライドに試料を接着させるため）、脱ろう（脱パラフィンともいう）、抗原回復、対比染色、脱水及び清澄化、並びにカバーガラス装着（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｉｎｇ）を含めた染色に付随する工程を実施することができる（又はそのような付随的工程を実施する別々のシステムと互換性がある）。全体が参照により本明細書に援用されるＰｒｉｃｈａｒｄのＯｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．，１３８巻，１５７８-１５８２頁（２０１４）には、ｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（バイオケアメディカル，ＷＡＶＥ（Ｃｅｌｅｒｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ダコ  ＯＭＮＩＳ及びダコ  ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ  ＬＩＮＫ  ４８（アジレント・テクノロジー）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（ベンタナメディカルシステム社）、ライカ  ＢＯＮＤ、並びにＬａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）自動スライド染色機を含め、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機の複数の具体例とそれらの様々な特徴が記載されている。更に、ベンタナメディカルシステム社は、自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示している、米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号、第６２９６８０９号、第６３５２８６１号、第６８２７９０１号及び第６９４３０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号（これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される）を含む多数の米国特許の譲受人である。市販の染色装置は通常、次の原理のうちの１つで動作する：（１）スライドが水平に配置され、試薬が、組織試料を含むスライドの表面にパドル（puddle）として分配される開放型個別スライド染色（open individual slide staining）（例えばダコ  ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ  Ｌｉｎｋ  ４８（アジレント・テクノロジー）及びｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（バイオケアメディカル）染色機に実装されている）；（２）試薬を試料上に付着させた不活性流体層で覆うか又はそれを通じて分配する液体オーバーレイ技術（例えばベンタナ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ染色機で実装されている）；（３）スライド表面を別の表面（別のスライド又はカバープレート）の近くに配置して狭い間隙を作り、それを通して毛管力が液体試薬を吸い上げて試料との接触状態を保つキャピラリーギャップ染色（例えばダコ  ＴＥＣＨＭＡＴＥ、ライカ  ＢＯＮＤ、及びダコ  ＯＭＮＩＳ染色機で用いられている染色の原理）。キャピラリーギャップ染色を何回か繰り返しても、間隔内の流体は混ざらない（例えばダコ  ＴＥＣＨＭＡＴＥ及びライカ  ＢＯＮＤで）。ダイナックギャップ染色と呼ばれるキャピラリーギャップ染色の変形では、毛管力を使ってスライドに試料を載せ、その後インキュベーション中に平行表面を互いに対して並進させて試薬を攪拌し、試薬混合を行う（例えばダコ  ＯＭＮＩＳスライド染色機（アジレント）に実装されている）。並進ギャップ染色では、並進可能なヘッドをスライドの上に配置する。ヘッドの下面は、スライドの並進中にスライド上の液体から液体のメニスカスが形成されるのを可能にするのに十分な小ささの第１のギャップ分だけスライドから間隔が空いている。スライドの幅よりも小さい横寸法を有する混合延長部（mixing extension）が、並進可能なヘッドの下面から延びて、混合延長部とスライドとの間の第１のギャップよりも小さい第２のギャップを画定する。ヘッドの並進中、混合延長部の横寸法は、スライド上の液体中に、概ね第２のギャップから第１のギャップに至る方向に横の動きを生じさせるのに十分である。国際公開第２０１１−１３９９７８号参照。最近、スライド上に試薬を付着させるためにインクジェット技術を使用することが提案されている。国際公開第２０１６−１７０００８号参照。この、自動組織化学的染色プラットフォームを列挙したリストは包括的であることを意図しておらず、特異的組織化学的染色を行うための任意の完全又は半自動システムが、自動組織化学的染色プラットフォーム１２３に組み込まれ得る。
【００８９】
画像取得システム１２０もまた、自動Ｈ＆Ｅ染色プラットフォーム１２４を含み得る。Ｈ＆Ｅ染色を実施するための自動システムは通常、２つの染色原理：バッチ染色（「ディップアンドダンク」とも呼ばれる）又は個別スライド染色のうちの１つで動作する。バッチ染色機は一般に、多くのスライドを同時に浸す試薬バット又は槽を使用する。一方、個別スライド染色機は、試薬を各スライドに直接塗布し、同じアリコートの試薬を２枚のスライドで共有することはない。市販のＨ＆Ｅ染色機の例には、ロッシュのベンタナ  ＳＹＭＰＨＯＮＹ（個別スライド染色機）及びベンタナ  ＨＥ  ６００（個別スライド染色機）シリーズＨ＆Ｅ染色機；アジレント・テクノロジーのダコＣｏｖｅｒＳｔａｉｎｅｒ（バッチ染色機）；ヌスロッホのライカバイオシステムズ社のライカ  ＳＴ４０２０  ＳＴ４０２０  Ｓｍａｌｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｔａｉｎｅｒ（バッチ染色機）、ライカ  ＳＴ５０２０  Ｍｕｌｔｉｓｔａｉｎｅｒ（バッチ染色機）、及びライカ  ＳＴ５０１０  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬシリーズ（バッチ染色機）Ｈ＆Ｅ染色機が含まれる。Ｈ＆Ｅ染色機プラットフォーム１２４は典型的には、バイオマーカー染色切片の、形態学的に染色された連続切片が望まれるワークフローで使用される。
【００９０】
ＨＡスコアリングシステムは、臨床検査情報（laboratory information）システム（ＬＩＳ）１３０を更に含み得る。ＬＩＳ  １３０は典型的には、試料に対して、並びに試料由来のスライド及び画像に対して実行される処理を記録及び追跡すること、試料、スライド及び／又は画像に対して特定の処理を実行し、試薬及び／又はスライドに塗布された特定の試薬についての情報（ロットナンバー、有効期限、分配量等）を追跡するようにＨＡスコアリングシステムの異なる構成要素に命令することから選択される１つ以上の機能を実施する。ＬＩＳ  １３０は通常、試料に関する情報を含むデータベースと；試料、スライド及び／又は画像ファイルと関連するラベル（例えばバーコード（１次元バーコード及び２次元バーコードを含む）、無線ＩＤ（ＲＦＩＤ）タグ、試料に付けられた英数字コード等）と；試料又はスライド上の標識を読み取り、かつ／あるいはＬＩＳ  １３０とＨＡスコアリングシステムの他のコンポーネントとの間でスライドに関する情報を通信する通信装置とを少なくとも備える。したがって、通信装置は例えば、試料処理ステーション、自動組織化学染色機１２３、Ｈ＆Ｅ染色プラットフォーム１２４、及びスキャニングプラットフォーム１２５のそれぞれに配置することができる。最初に試料が処理されて切片になると、試料に関する情報（例えば患者ＩＤ、試料タイプ、切片に対して実行される処理）が通信装置に入力され、試料から作製された各切片に対してラベルが作成される。後続の各ステーションにおいて、このラベルが（例えばバーコード若しくはＲＦＩＤタグをスキャンすることによって）通信装置に入力され、該ステーションは、データベースと電子的に通信し、例えば切片に対して特定の処理を実行するように、かつ／又は切片に対して実行される処理を記録するようにステーション又はステーションオペレータに命令する。スキャニングプラットフォーム１２５において、画像が画像解析システム１００に送信されるとき、実行されるべき画像処理ステップをＬＩＳ１３０のデータベースから画像解析システムに送信することができ、かつ／又は画像解析システム１００によって画像に対して実行される画像処理ステップがＬＩＳ１３０のデータベースによって記録されるように、スキャニングプラットフォーム１２５は、各画像を、その画像の元となっている切片又は試料に相関するコンピュータ可読ラベル又はコードで符号化することもできる。本方法及びシステムに有用な市販のＬＩＳシステムには、例えばベンタナ  Ｖａｎｔａｇｅ  Ｗｏｒｋｆｌｏｗシステム（ロッシュ）が含まれる。
【００９１】
Ｖ．   実施例  -  膵管腺がん（ＰＤＡ）におけるヒアルロン酸アッセイ
実施例１は、本開示のスコアリングアッセイの試験を記載する。
【００９２】
本開示のスコアリング方法の試験中、複数の組織試料が、正常なヒト組織試料及び腫瘍組織試料（例えばＰＤＡ、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、及び胃がん等）である細胞株及び異種移植片（ＰＣ３、ＢｘＰＣ３、ＤＵ１４５）から使用された。バイオマーカー特異的試薬としてＴＳＧ６ウサギＦｃ融合タンパク質（ＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂ）と、ベンタナＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットとを使用して、試料をベンタナベンチマーク自動スライド染色システムで染色した。アフィニティー組織化学アッセイを用いて、ＰＥＧＰＨ２０アジュバント療法から恩恵を受けることができるヒアルロン酸（ＨＡ）含有膵管腺がん（ＰＤＡ）患者を、バックグラウンドを上回る任意のＨＡ強度の、高ＨＡと低ＨＡとの間のカットオフである５０％の腫瘍関連ＥＣＭ染色を使用して選択した。
【００９３】
図４Ａは、本開示の方法を用いてスコア化された試料の例である。例えば、ある試料は１０％、ある試料は２０％、ある試料は３０％のスコアを有する。これらの試料は、低ＨＡ状態を有することになる。図４Ｂは、本開示の方法を用いてスコア化された試料の更なる例である。例えば、ある試料は５０％、ある試料は７０％、ある試料は９０％のスコアを有する。これらの試料は、高ＨＡ状態を有することになる。
【００９４】
本明細書に記載されるものの他にも本開示の種々の修正例が、上記説明から当業者には明らかである。そのような修正例も、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本願に引用される各参照文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００９５】
本開示の好ましい実施態様が示され、記載されているが、当業者には、それらに添付の特許請求の範囲を超えない修正がなされてもよいことが容易に明らかである。したがって、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲で列挙される参照番号は、例示であり、特許庁による検討を容易にするためだけのものであり、いかようにも限定するものではない。いくつかの実施態様では、本特許出願において提示されている図面は、角度、寸法の比率などを含め、一定の縮尺で描かれている。いくつかの実施態様では、図面は代表的なものにすぎず、特許請求の範囲は図面の寸法によって限定されない。いくつかの実施態様において、「含む」という語句を使用して本明細書に記載されている本開示の説明は、「からなる」と記載することもできる実施態様を含み、したがって、「からなる」という語句を使用する本開示の一又は複数の実施態様をクレームするための明細書記載要件が満たされる。
【００９６】
以下の請求項で列挙される参照番号は、本特許出願の審査を容易にするためのみのものであって、例示的であり、図面中の対応する参照番号を有する特定の特徴に特許請求の範囲を限定することを決して意図しない。
【図１】
2019533149.tif 000020
【図２】
2019533149.tif 000021
【図３Ａ】
2019533149.tif 000022
【図３Ｂ】
2019533149.tif 000023
【図４Ａ】
2019533149.tif 000024
【図４Ｂ】
2019533149.tif 000025
【図５】
2019533149.tif 000026
【図６Ａ】
2019533149.tif 000027
【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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