(57)【要約】本発明は、特に、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を含めた補体媒介性障害の治療を改善するためのコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを提供する。一部の実施形態では、本発明により提供されるコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨはＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨである。一部の実施形態では、本発明により提供されるコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨはポリシアル酸（ＰＳＡ）コンジュゲートＣ１−ＩＮＨである。本発明は、特に、ＨＡＥを含めた種々の補体媒介性障害を効果的に治療するのに使用可能である、改良型の長時間作用性Ｃ１エステラーゼインヒビターを提供するものである。
2019513724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、
少なくとも１つのグリカン残基を含むＣ１−ＩＮＨタンパク質と、
少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と、を備え、
前記少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が、前記少なくとも１つのグリカン残基に共有結合している、組成物。
【請求項２】
コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、
少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含むＣ１−ＩＮＨタンパク質を備え、
前記少なくとも１つのＰＥＧ部分が、オキシム結合を介して前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している、組成物。
【請求項３】
前記オキシム結合が、前記ＰＥＧ部分と、Ｃ１−ＩＮＨのグリカン残基またはアミン基との間にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記グリカン残基がシアル酸残基またはガラクトース残基である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記グリカン残基がシアル酸残基である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が組換えにより生成されるか、または血漿由来である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、または配列番号３８に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＣ１−ＩＮＨドメインを備える、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が融合タンパク質である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたＦｃドメインを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ１に由来する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングのＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに対応するアミノ酸置換を含む、請求項８または請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたアルブミンドメインを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、約５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して、１分子当たり少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の荷電グリカンを含む、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、約２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の、マンノース、α−ガラクトース、ＮＧＮＡ、またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、
約５％〜約３０％の中性グリカン種、
約１０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、
約３０％〜約５０％のジシアリル化グリカン種、
約１５％〜約３５％のトリシアリル化グリカン種、または
約５％〜約１５％のテトラシアリル化グリカン種、のうちの１つ以上を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、
３０％以下の中性グリカン種、
約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、
約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、
約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び
約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種、を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して、１分子当たり少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して、タンパク質１モル当たり、少なくとも約５モル、６モル、７モル、８モル、９モル、１０モル、１１モル、１２モル、１３モル、１４モル、１５モル、１６モル、１７モル、１８モル、１９モル、２０モル、２１モル、２２モル、２３モル、２４モル、２５モル、２６モル、２７モル、２８モル、２９モル、３０モル、３１モル、３２モル、３３モル、３４モル、３５モル、３６モル、３７モル、３８モル、３９モル、または４０モルのシアル酸を含む、請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の組成物
【請求項２１】
前記ＰＥＧの分子量が、約１ＫＤａ〜５０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約５ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜３０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１０ＫＤａ、または約１ＫＤａ〜５ＫＤａである、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰＥＧの分子量が、約１ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａ、４５ＫＤａ、または５０ＫＤａである、請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨのＰＥＧ／Ｃ１−ＩＮＨの比が、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５である、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨに匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を有する、請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期が、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期の１００％〜５００％の範囲内である、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期が、少なくとも約７０時間、７５時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１０５時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１４５時間、１５０時間、１５５時間、１６０時間、１６５時間、または１７０時間である、請求項１から請求項２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期が、少なくとも約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日である、請求項１から請求項１４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの比活性が、血漿由来ヒトＣ−ＩＮＨの比活性の５０％〜１５０％の範囲内である、請求項１から請求項２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を生成する方法であって、
少なくとも１つのグリカン残基及び／または少なくとも１つのアミン基を備えるＣ１−ＩＮＨタンパク質を供給する工程と、
ＰＥＧ部分を、前記ＰＥＧ部分が前記少なくとも１つのグリカン残基及び／または前記少なくとも１つのアミン基と反応して結合を形成できる条件下で供給し、それによって前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを生成する工程と、を含む、方法。
【請求項３０】
前記ＰＥＧ部分がＰＥＧ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのグリカン残基がシアル酸残基である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのグリカン残基がガラクトース残基である、請求項２９から請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、前記ＰＥＧ部分と反応させる前に、前記少なくとも１つのグリカン残基を酸化させる工程をさらに含む、請求項２９から請求項３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記酸化工程が過ヨウ素酸酸化を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記過ヨウ素酸酸化が、過ヨウ素酸：Ｃ１−ＩＮＨのモル比が約２０：１〜約５０：１の間で実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＥＧに対する過ヨウ素酸のモル比が約２．５〜約４０の間である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＥＧ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比が約２５：１〜１００：１の間である、請求項２９から請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを精製する工程をさらに含む、請求項２９から請求項３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記精製工程が、陰イオン交換、接線流ろ過、透析ろ過、及び透析のうちの１つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２９から請求項３９のうちのいずれか１項に記載の方法によって生成されるコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）。
【請求項４１】
請求項１から請求項２８、及び請求項４０のうちのいずれか１項に記載のコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４２】
前記組成物が液体である、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４１から請求項４３のいずれかに記載の医薬組成物と、
シリンジとを含むキット。
【請求項４５】
前記シリンジに、前記医薬組成物が予め担持されている、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記医薬組成物が凍結乾燥されており、前記キットが再調整用の緩衝溶液をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
補体媒介性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に請求項４１から請求項４７のうちのいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
前記補体媒介性障害が、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーから選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１から請求項２８、及び請求項４０のうちのいずれか１項に記載のコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビターを含む組成物の、補体媒介性障害を治療するための薬剤の製造における使用。
【請求項５０】
前記補体媒介性障害が、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、及び／または多巣性運動ニューロパチーから選択される、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、
少なくとも１つのグリカン残基を含むＣ１−ＩＮＨタンパク質と、
少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分と、を含み、
前記少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、前記少なくとも１つのグリカン残基に共有結合している、組成物。
【請求項５２】
コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物であって、
少なくとも１つのグリカン残基を含むＣ１−ＩＮＨタンパク質と、
少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分と、を含み、
前記少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、オキシム結合またはヒドラゾン結合を介して前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している、組成物。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、オキシム結合を介して前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、ヒドラゾン結合を介して前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記オキシム結合が、前記ＰＳＡ部分と、Ｃ１−ＩＮＨのグリカン残基またはアミン基との間にある、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５６】
前記グリカン残基がシアル酸残基である、請求項５１から請求項５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が組換えにより生成されるか、または血漿由来である、請求項５１から請求項５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、または配列番号３８に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＣ１−ＩＮＨドメインを備える、請求項５１から請求項５７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が融合タンパク質である、請求項５１から請求項５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記融合タンパク質が、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたＦｃドメインを含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ１に由来する、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
前記Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングのＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに対応するアミノ酸置換を含む、請求項５９または請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記融合タンパク質が、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたアルブミンドメインを含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６４】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、約５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項５１から請求項６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＥＧ化前に、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項５１から請求項６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して、１分子当たり少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の荷電グリカンを含む、請求項５１から請求項６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＳＡとコンジュゲートする前に、約２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の、マンノース、α−ガラクトース、ＮＧＮＡ、またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する、請求項５１から請求項６６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＳＡとコンジュゲートする前に、
約５％〜約３０％の中性グリカン種、
約１０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、
約３０％〜約５０％のジシアリル化グリカン種、
約１５％〜約３５％のトリシアリル化グリカン種、または
約５％〜約１５％のテトラシアリル化グリカン種、のうちの１つ以上を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項５１から請求項６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、ＰＳＡとコンジュゲートする前に、
３０％以下の中性グリカン種、
約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、
約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、
約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び
約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種、を含むグリコシル化プロファイルを有する、請求項５１から請求項６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して、１分子当たり少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む、請求項５１から請求項６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記Ｃ１−ＩＮＨタンパク質が、平均して、タンパク質１モル当たり少なくとも約５モル、６モル、７モル、８モル、９モル、１０モル、１１モル、１２モル、１３モル、１４モル、１５モル、１６モル、１７モル、１８モル、１９モル、２０モル、２１モル、２２モル、２３モル、２４モル、２５モル、２６モル、２７モル、２８モル、２９モル、３０モル、３１モル、３２モル、３３モル、３４モル、３５モル、３６モル、３７モル、３８モル、３９モル、または４０モルのシアル酸を含む、請求項５１から請求項６９のいずれか１項に記載の組成物
【請求項７２】
前記ＰＳＡの分子量が、約１ＫＤａ〜５０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約５ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜３０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１０ＫＤａ、または約１ＫＤａ〜５ＫＤａである、請求項５１から請求項７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ＰＳＡの分子量が、約１ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａ、４５ＫＤａ、または５０ＫＤａである、請求項５１から請求項７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨのＰＳＡ／Ｃ１−ＩＮＨの比が、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５である、請求項５１から請求項７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨが、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨに匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を有する、請求項５１から請求項７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期が、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期の１００％〜５００％の範囲内である、請求項５１から請求項７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期が、少なくとも約７０時間、７５時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１０５時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１４５時間、１５０時間、１５５時間、１６０時間、１６５時間、または１７０時間である、請求項５１から請求項７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期が、少なくとも約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日である、請求項５１から請求項７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの比活性が、血漿由来ヒトＣ−ＩＮＨの比活性の５０％〜１５０％の範囲内である、請求項５１から請求項７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を生成する方法であって、
少なくとも１つのグリカン残基及び／または少なくとも１つのアミン基を備えるＣ１−ＩＮＨタンパク質を供給する工程と、
ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分を、前記ＰＳＡ部分が前記少なくとも１つのグリカン残基及び／または前記少なくとも１つのアミン基と反応して結合を形成できる条件下で供給し、それによって前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを生成する工程と、を含む、方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１つのグリカン残基がシアル酸残基である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記方法が、前記ＰＳＡ部分と反応させる前に、前記少なくとも１つのグリカン残基を酸化させる工程をさらに含む、請求項８０から請求項８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記酸化工程が過ヨウ素酸酸化を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記過ヨウ素酸酸化が、過ヨウ素酸：Ｃ１−ＩＮＨのモル比が約２０：１〜約５０：１の間で実施される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＰＳＡに対する過ヨウ素酸のモル比が約２．５〜約４０の間である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ＰＳＡ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比が約２５：１〜１００：１の間である、請求項８０から請求項８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記方法が、前記コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを精製する工程をさらに含む、請求項８０から請求項８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記精製工程が、陰イオン交換、接線流ろ過、透析ろ過、及び透析のうちの１つ以上を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
請求項７８から請求項８６のうちのいずれか１項に記載の方法によって生成されるコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）。
【請求項９０】
請求項５１から請求項７９、及び請求項８９のうちのいずれか１項に記載のコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９１】
前記組成物が液体である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
請求項９０から請求項９２のいずれかに記載の医薬組成物と、シリンジとを含む、キット。
【請求項９４】
前記シリンジに前記医薬組成物が予め担持されている、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
前記医薬組成物が凍結乾燥されており、前記キットが再調整用の緩衝溶液をさらに含む、請求項９３に記載のキット。
【請求項９６】
補体媒介性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に請求項９０から請求項９２のうちのいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９７】
前記補体媒介性障害が、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーから選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
請求項５１から請求項７９、及び請求項８９のうちのいずれか１項に記載のコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビターを含む組成物の、補体媒介性障害を治療するための薬剤の製造における使用。
【請求項９９】
前記補体媒介性障害が、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、及び／または多巣性運動ニューロパチーから選択される、請求項９８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年４月４日に出願された米国仮出願第６２／３１８，００３号に対する優先権及びその利益を主張するものであり、該仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ１−インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）は、Ｃ１エステラーゼインヒビターとしても知られ、セルピンタンパク質スーパーファミリーの最も大きなメンバーである。これは重度にグリコシル化されたセリンプロテイナーゼインヒビターであり、その主な機能は、補体系の自発的活性化を阻害することである。Ｃ１−ＩＮＨは、補体カスケード系を調節し、接触（カリクレイン・キニン）増幅カスケードの調節に重要な役割を果たし、凝固系及び線溶系の調節に関与している。Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖａ，Ｅ．，Ｃ１−Ｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉｓ，１：１１３（２０１３）を参照されたい。
【０００３】
対象におけるＣ１−ＩＮＨの機能不全及び／または欠損は、Ｃ１−ＩＮＨが補体系の活性化を阻害できなくなることから、種々の自己免疫性疾患と関連付けられてきた。こうした疾患の一例は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）であり、これは、予測不可能な反復性の炎症発作によって特徴付けられる稀な障害だが場合によっては生命を脅かす障害である。ＨＡＥ発作の症状として、顔面、口、及び／または気道の腫脹が挙げられ、これらは自然発症的に生じるか、または軽度の外傷によって誘発される。こうした腫脹は、身体の任意の部分にも生じ得る。ＨＡＥは、Ｃ１−インヒビターの血漿レベルが低いことに関連している場合がある一方で、そのタンパク質が正常または基準以上の量で循環しているが機能不全となっている場合もある。炎症の発症に加えて、自己免疫性疾患または紅斑性狼瘡などのさらに重篤であるか、または生命を脅かす症候を引き起こす可能性もある。
【０００４】
ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）は、ヒト血漿由来Ｃ１エステラーゼインヒビターであり、ＨＡＥの急性発作の予防的使用及び治療用に承認されている。ベリナート（登録商標）（同じく血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨ、ＣＳＬベーリング社）は、急性ＨＡＥ発作の治療に適応している。ルコネスト（登録商標）（コネスタットアルファ、Ｐｈａｒｍｉｎｇ  Ｎ．Ｖ．社）は、改変ウサギで発現した組換えＣ１−ＩＮＨであり、急性ＨＡＥ発作の治療にＩＶ投与用として必要とされるものである。ルコネスト（登録商標）は、ヒト血漿由来のＣ１−ＩＮＨと同一のアミノ酸配列を有するが、トランスジェニックウサギで作製される。ルコネストは約２．４時間〜２．７時間という極めて短い半減期を有する。ルコネスト（登録商標）ＦＤＡラベル及び処方情報を参照されたい。
そこで、種々のＣ１エステラーゼ媒介性症候の治療及び予防に適する改良型のＣ１エステラーゼインヒビターが依然として必要となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖａ，Ｅ．，Ｃ１−Ｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉｓ，１：１１３（２０１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特に、ＨＡＥを含めた種々の補体媒介性障害を効果的に治療するのに使用可能である、改良型の長時間作用性Ｃ１エステラーゼインヒビターを提供するものである。
【０００７】
詳細には、本発明は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨに匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を呈示するＣ１エステラーゼインヒビターコンジュゲート（「コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター」とも称される）を提供するものである。本発明は、一つには、ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨ及びポリシアリル化Ｃ１−ＩＮＨが、例えば少なくとも４日といった長い血清半減期を有し得るという驚くべき発見に基づいている。コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの長い血清半減期は、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をもたらし、また好ましい投与レジメン及び投与経路を可能にすると考えられる。例えば、本明細書に記載されるコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、現在承認されているＣ１−ＩＮＨ治療法と比べて少ない頻度で皮下または静脈内に投与することができるが、なおも所望の有効性（例えば、予防）をもたらす。本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１インヒビタータンパク質は、血漿由来のＣ１−ＩＮＨか、または組換えにより産生したＣ１−ＩＮＨを用いて生成されてもよい。したがって、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、費用対効果が高い方法で、血液の供給に依存せずに製造することができる。これらは培養細胞で組換えによって産生することができるため、ヒト血液、ヒト血液成分（例えば、血漿）、または動物乳から精製された産物よりも、産生及び最終産物において均質性が得られる。したがって、本発明は、ＨＡＥ及び他の補体媒介性障害の治療に対してさらに安全で効果的なコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビターを提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質と、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分とを含む、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを提供する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は少なくとも１つのグリカン残基を含み、少なくとも１つのＰＥＧ部分が少なくとも１つのグリカン残基に共有結合している。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ部分は、オキシム結合を介してＣ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している。
【０００９】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ部分は、Ｃ１−ＩＮＨのグリカン残基またはアミン基への共有オキシム結合を形成している。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ部分は、グリカン残基への共有オキシム結合を形成している。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ部分は、Ｃ１−ＩＮＨのアミン基への共有オキシム結合を形成している。
【００１０】
一部の実施形態では、グリカン残基は、Ｃ１−ＩＮＨのシアル酸残基またはガラクトース残基である。一部の実施形態では、グリカン残基はシアル酸残基である。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明に適したＣ１−ＩＮＨタンパク質は、組換えにより生成されるか、または血漿由来である。
【００１２】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、または配列番号３８に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有するＣ１−ＩＮＨドメインを備える。
【００１３】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１に由来する。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングのＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに対応するアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングによるＩｇＧ１のＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、及び／またはＡｓｎ４３４に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたアルブミンドメインを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本発明は、約５０％以下（例えば、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下）の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有するＣ１−ＩＮＨタンパク質を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有するＣ１−ＩＮＨタンパク質を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は、平均して、１分子当たり少なくとも約３０％（例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の荷電グリカンを含むＣ１−ＩＮＨタンパク質を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、または５％未満）の、マンノース、α−ガラクトース、ＮＧＮＡ、またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。
【００１９】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、以下に挙げるもののうちの１つ以上を含むグリコシル化プロファイルを有し、それらは、約５％〜約３０％の中性グリカン種、約１０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約５０％のジシアリル化グリカン種、約１５％〜約３５％のトリシアリル化グリカン種、及び／または約５％〜約１５％のテトラシアリル化グリカン種である。
【００２０】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、３０％以下の中性グリカン種、約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。
【００２１】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、Ｃ１−インヒビターポリペプチドは、平均して、タンパク質１モル当たり、少なくとも約５モル、６モル、７モル、８モル、９モル、１０モル、１１モル、１２モル、１３モル、１４モル、１５モル、１６モル、１７モル、１８モル、１９モル、２０モル、２１モル、２２モル、２３モル、２４モル、２５モル、２６モル、２７モル、２８モル、２９モル、３０モル、３１モル、３２モル、３３モル、３４モル、３５モル、３６モル、３７モル、３８モル、３９モル、または４０モルのシアル酸を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のグリコシル化プロファイルを有するＣ１−ＩＮＨタンパク質は、融合タンパク質である。特定の実施形態では、本明細書に記載のグリコシル化プロファイルを有するＣ１−ＩＮＨタンパク質は、コンジュゲートされていないタンパク質である。
【００２４】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧの分子量は、約１ＫＤａ〜５０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約５ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜３０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１０ＫＤａ、または約１ＫＤａ〜５ＫＤａである。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧの分子量は、約１ＫＤａ以上、２ＫＤａ以上、３ＫＤａ以上、４ＫＤａ以上、５ＫＤａ以上、１０ＫＤａ以上、１５ＫＤａ以上、２０ＫＤａ以上、２５ＫＤａ以上、３０ＫＤａ以上、３５ＫＤａ以上、４０ＫＤａ以上、４５ＫＤａ以上、または５０ＫＤａ以上である。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧは、直鎖構造または分岐構造である。一部の実施形態では、分岐したＰＥＧ部分は、２本、３本、４本、または５本のアーム分岐を有し得る。
【００２５】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、ＰＥＧ／Ｃ１−ＩＮＨの比が、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５である。
【００２６】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質に匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の半減期の１００％〜５００％の範囲内である。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨタンパク質の半減期は、少なくとも約７０時間、７５時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１０５時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１４５時間、１５０時間、１５５時間、１６０時間、１６５時間、または１７０時間である。
【００２７】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期は、少なくとも約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日である。
【００２８】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの比活性は、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質の比活性の５０％〜１５０％の範囲内である。
【００２９】
別の態様では、本発明は、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を生成する方法であって、少なくとも１つのグリカン残基及び／または少なくとも１つのアミン基を備えるＣ１−ＩＮＨタンパク質を供給する工程と、ＰＥＧ部分を、該ＰＥＧ部分が少なくとも１つのグリカン残基及び／または少なくとも１つのアミン基と反応して結合を形成できる条件下で供給し、それによってコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを生成する工程と、を含む方法を提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、ＰＥＧ部分はＰＥＧ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２を含む。一部の特定の実施形態では、少なくとも１つのグリカン残基はシアル酸残基である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのグリカン残基はガラクトース残基である。
【００３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＰＥＧ部分と反応させる前に、少なくとも１つのグリカン残基を酸化させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、酸化工程は過ヨウ素酸酸化の使用を含む。一部の実施形態では、過ヨウ素酸酸化は、過ヨウ素酸：Ｃ１−ＩＮＨのモル比が約２０：１〜約５０：１の間で実施される。一部の実施形態では、ＰＥＧに対する過ヨウ素酸のモル比は約２．５〜約４０の間である。一部の実施形態では、ＰＥＧ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比は２５：１〜１００：１である。
【００３２】
さらなる実施形態では、本方法は、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを精製する工程をさらに含む。一部の実施形態では、精製工程は、陰イオン交換、接線流ろ過、透析ろ過、及び透析のうちの１つ以上を含む。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む医薬組成物は液体である。他の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む医薬組成物は凍結乾燥されている。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む医薬組成物（例えば、液体形態及び凍結乾燥された形態）を備えたキットを提供する。一部の実施形態では、キットはシリンジを含む。一部の実施形態では、シリンジには、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む医薬組成物が予め担持されている。
【００３６】
一部の実施形態では、医薬組成物が凍結乾燥されており、キットは再調整用の緩衝溶液をさらに含む。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、補体媒介性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
関連する態様では、本発明は、補体媒介性障害を治療するための薬剤の製造における、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物の使用を提供する。
【００３９】
一部の実施形態では、補体媒介性障害は、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、及び／または多巣性運動ニューロパチーから選択される。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのグリカン残基を含むＣ１−ＩＮＨタンパク質と、少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分とを備える、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分は、少なくとも１つのグリカン残基に共有結合している。
【００４１】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのグリカン残基を含むＣ１−ＩＮＨタンパク質と、少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分とを備える、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、オキシム結合またはヒドラゾン結合を介してＣ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している。一部の実施形態では、ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、オキシム結合を介してＣ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している。一部の実施形態では、ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分が、オキシム結合を介してＣ１−ＩＮＨタンパク質に共有結合している。一部の実施形態では、オキシム結合は、ＰＳＡ部分と、Ｃ１−ＩＮＨのグリカン残基またはアミン基との間にある。
【００４２】
一部の実施形態では、グリカン残基はシアル酸残基である。
【００４３】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、組換えにより生成されるか、または血漿由来である。
【００４４】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、または配列番号３８に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＣ１−ＩＮＨドメインを備える。
【００４５】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたＦｃドメインを含み得る。一部の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１に由来し得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングのＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに対応するアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメインに直接的または間接的に融合されたアルブミンドメインを含み得る。
【００４６】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ＰＥＧ化前に、約５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。
【００４７】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ＰＥＧ化前に、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。
【００４８】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の荷電グリカンを含む。
【００４９】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ＰＳＡとコンジュゲートする前に、約２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の、マンノース、α−ガラクトース、ＮＧＮＡ、またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。
【００５０】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ＰＳＡとコンジュゲートする前に、以下に挙げるもののうちの１つ以上を含むグリコシル化プロファイルを有し、それらは、約５％〜約３０％の中性グリカン種、約１０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約５０％のジシアリル化グリカン種、約１５％〜約３５％のトリシアリル化グリカン種、または約５％〜約１５％のテトラシアリル化グリカン種である。
【００５１】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、ＰＳＡとコンジュゲートする前に、３０％以下の中性グリカン種、約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。
【００５２】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、タンパク質１モル当たり、少なくとも約５モル、６モル、７モル、８モル、９モル、１０モル、１１モル、１２モル、１３モル、１４モル、１５モル、１６モル、１７モル、１８モル、１９モル、２０モル、２１モル、２２モル、２３モル、２４モル、２５モル、２６モル、２７モル、２８モル、２９モル、３０モル、３１モル、３２モル、３３モル、３４モル、３５モル、３６モル、３７モル、３８モル、３９モル、または４０モルのシアル酸を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、ＰＳＡの分子量は、約１ＫＤａ〜５０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約５ＫＤａ〜４０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜３０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜２０ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１５ＫＤａ、約１ＫＤａ〜１０ＫＤａ、または約１ＫＤａ〜５ＫＤａである。
【００５５】
一部の実施形態では、ＰＳＡの分子量は、約１ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａ、４５ＫＤａ、または５０ＫＤａである。
【００５６】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、ＰＳＡ／Ｃ１−ＩＮＨの比が、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、または約１〜約５である。
【００５７】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨに匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を有する。
【００５８】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期の１００％〜５００％の範囲内である。
【００５９】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期は、少なくとも約７０時間、７５時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１０５時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１４５時間、１５０時間、１５５時間、１６０時間、１６５時間、または１７０時間である。
【００６０】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの半減期は、少なくとも約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日である。
【００６１】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨの比活性は、血漿由来ヒトＣ−ＩＮＨの比活性の５０％〜１５０％の範囲内である。
【００６２】
さらなる態様では、本発明は、コンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を生成する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのグリカン残基及び／または少なくとも１つのアミン基を備えるＣ１−ＩＮＨタンパク質を供給する工程と、ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分を、該ＰＳＡ部分が少なくとも１つのグリカン残基及び／または少なくとも１つのアミン基と反応して結合を形成できる条件下で供給し、それによってコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを生成する工程と、を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのグリカン残基はシアル酸残基である。
【００６３】
一部の実施形態では、本方法は、ＰＳＡ部分と反応させる前に、少なくとも１つのグリカン残基を酸化させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、酸化工程は過ヨウ素酸酸化を含む。一部の実施形態では、過ヨウ素酸酸化は、過ヨウ素酸：Ｃ１−ＩＮＨのモル比が約２０：１〜約５０：１の間で実施され得る。一部の実施形態では、ＰＳＡに対する過ヨウ素酸のモル比は約２．５〜約４０の間であり得る。
【００６４】
一部の実施形態では、ＰＳＡ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比は約２５：１〜１００：１の間である。
【００６５】
一部の実施形態では、本方法は、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを精製する工程をさらに含む。
【００６６】
一部の実施形態では、精製工程は、陰イオン交換、接線流ろ過、透析ろ過、及び透析のうちの１つ以上を含む。
【００６７】
さらに別の態様では、本発明は、上記の態様または実施形態の方法で生成されたコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を提供する。
【００６８】
なおも別の態様では、本発明は、上記の態様または実施形態に記載のコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物の成分は液体である。一部の実施形態では、医薬組成物の成分は凍結乾燥されている。
【００６９】
一態様では、本発明は、上記の態様または実施形態に記載の医薬組成物とシリンジとを含むキットを提供する。一部の実施形態では、シリンジには、医薬組成物が予め担持されている。一部の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥されており、キットは再調整用の緩衝溶液をさらに含む。
【００７０】
別の態様では、本発明は、補体媒介性障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、上記の態様または実施形態に記載の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、補体媒介性障害は、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーから選択される。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は、補体媒介性障害を治療するための薬剤の製造における、上記の態様または実施形態に記載のコンジュゲートされたＣ１エステラーゼインヒビターを含む組成物の使用を提供する。一部の実施形態では、補体媒介性障害は、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、及び／または多巣性運動ニューロパチーから選択される。
【００７２】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明は本発明の実施形態を示すが、単に例示のためであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
【００７４】
【図１】図１はＣ１−ＩＮＨの概略図である。右から左に３つのドメインがあり、それらはシグナルペプチドと、Ｎ末端（Ｎ末端ドメインとも称される）と、セルピンドメインである。Ｎ結合型グリカンはダイヤモンド形の先端部を持つ長い垂直線として表示されており、Ｏ結合型グリカンは短い垂直線として表示されている。
【００７５】
【図２】図２は成熟Ｃ１−ＩＮＨのアミノ酸配列と、ＰＥＧ化される可能性がある部位とを示す。
【００７６】
【図３】図３はアミン媒介性ＰＥＧ化の例を示す化学反応式の概略図である。
【００７７】
【図４】図４Ａはグリカン媒介性アミノキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）ＰＥＧ化の例を示す化学反応式の概略図である。図４Ｂはシアル酸媒介性（ＳＡＭ）アミノキシＰＥＧ化の例を示す化学反応式の概略図である。
【００７８】
【図５】図５はガラクトース媒介性（ＧＡＭ）ＰＥＧ化の例を示す化学反応式の概略図である。
【００７９】
【図６】図６はパネルＡ及びパネルＢは、アミノ基を介するＰＥＧ化とシアル酸を介するＰＥＧ化とを比較した、ＰＥＧ化したＣ１−ＩＮＨ（５ＫＤａまたは４０ＫＤａ）のラットの予備検討の結果を示す。ｒｈＣ１−ＩＮＨとＣＩＮＲＹＺＥは対照薬として供給されている。パネルＣは、５ＫＤａまたは４０ＫＤａのＰＥＧのどちらかでＰＥＧ化されたＣ１−ＩＮＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００８０】
【図７】図７はＰＥＧ化プロセスＡの例の概略図である。
【００８１】
【図８】図８はＰＥＧ化プロセスＢの例の概略図である。
【００８２】
【図９】図９Ａ−９ＥはＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨに好適なＰＥＧ化プロトコルの数例をまとめた概略図である。
【００８３】
【図１０−１】図１０Ａは５ＫＳＡＭ  ＫＨＲ５オクチル担持サンプルのＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧのＩＣ５０を示す。図１０ＢはＴＦＦで遊離ＰＥＧを除去する前及び除去した後のＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧのＩＣ５０を示す。
【図１０−２】同上。
【００８４】
【図１１】図１１は遊離ＰＥＧ及び他の不純物からの例示的な４０ＫＤａＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨ精製物のクロマトグラフィー結果を示す。
【００８５】
【図１２】図１２は遊離ＰＥＧ及び他の不純物からの例示的な２０ＫＤａＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨ精製物のクロマトグラフィー結果を示す。
【００８６】
【図１３】図１３は遊離ＰＥＧ及び他の不純物からの例示的な５ＫＤａＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨ精製物のクロマトグラフィー結果を示す。
【００８７】
【図１４】図１４はＩＶ投与されたＰＥＧ化ｒｈＣ１−ＩＮＨとｒｈＣ１−ＩＮＨとの、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＰＫ試験結果を示す。
【００８８】
【図１５】図１５は種々のＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ負荷量がＮＨＰに投与された場合のＮＨＰのＰＫ試験結果を示す。
【００８９】
【図１６】図１６はＰＥＧ化ｒｈＣ１−ＩＮＨのＩＶ対ＳＣのＮＨＰ試験結果を示す。
【００９０】
【図１７】図１７は５ＫＰＥＧが種々負荷されているＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧサンプルのラットＰＫ力価分析の結果を示す。
【００９１】
【図１８−１】図１８はパネルＡ〜パネルＥは、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧの純度を示す一連のゲルとグラフとを示す。パネルＡ及びパネルＢは、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧサンプル中の遊離ＰＥＧを検出するのに使用された、バリウム−ヨウ素染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。パネルＣ及びパネルＤは、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧサンプル中の遊離ＰＥＧ１Ｋ及び２Ｋを検出するのに使用されたＲＰ−ＨＰＬＣグラフである。パネルＥは、Ｃ１−ＩＮＨサンプルが負荷された２つのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【００９２】
【図１９−１】図１９はパネルＡ〜パネルＣは、ＳＡＭプロセスでコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧサンプルの純度と、ＩＣ５０と、ＰＫデータとを表す一連のグラフ及びゲルを示す。パネルＡは、種々のＣ１−ＩＮＨサンプルのＩＣ５０グラフである。パネルＢは、Ｃ１−ＩＮＨサンプルの純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと、随伴するＣ１−ＩＮＨサンプルのＩＣ５０値とを示す。パネルＣは、ラットが静脈内にＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ及び非ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを与えられている場合の、ラット試験からのＰＫ値を示すグラフである。
【図１９−２】同上。
【００９３】
【図２０−１】図２０はパネルＡ、パネルＢ、及びパネルＣは、Ｃ１−ＩＮＨのＩＣ５０値を表す一連のグラフを示す。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【００９４】
【図２１】図２１はＣ１−ＩＮＨのアミンカップリングＰＥＧ化プロセスの一例を示す概略図である。
【００９５】
【図２２−１】図２２はパネルＡ〜パネルＤは、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧの純度を表す一連のゲルとグラフとを示す。パネルＡは、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧサンプル中の遊離ＰＥＧを検出するのに使用された、バリウム−ヨウ素染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。パネルＢは、遊離ＰＥＧ１Ｋ及び２Ｋを検出するためのＲＰ−ＨＰＬＣグラフである。パネルＣ及びパネルＤは、遊離ＮＨＳ−ＰＥＧ２０Ｋ（パネルＣ）と遊離ＮＨＳ−ＰＥＧ４０Ｋ（パネルＤ）の精製クロマトグラムを示す。
【図２２−２】同上。
【図２２−３】同上。
【００９６】
【図２３−１】図２３はパネルＡ〜パネルＣは、Ｃ１−ＩＮＨサンプルの純度と、ＩＣ５０と、ＰＫデータとを表す一連のグラフ及びゲルを示す。パネルＡは、種々のＣ１−ＩＮＨサンプルのＩＣ５０グラフである。パネルＢは、ラットが静脈内にＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ及び非ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを与えられている場合の、ラット試験からのＰＫ値を示すグラフである。パネルＣは、Ｃ１−ＩＮＨサンプルの純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと、随伴するＣ１−ＩＮＨサンプルのＩＣ５０値とを示す。
【図２３−２】同上。
【００９７】
【図２４−１】図２４はパネルＡ及びパネルＢは、シアル酸媒介性（ＳＡＭ）プロセスで生成されたＣ１−ＩＮＨ−ＰＳＡの純度を表すゲル及びグラフを示す。パネルＡはＳＤＳゲルであり、パネルＢはＣ１−ＩＮＨ−ＰＳＡのＩＣ５０を示すグラフである。
【図２４−２】同上。
【００９８】
【図２５−１】図２５はパネルＡ、パネルＢ、及びパネルＣは、ラットが静脈内にＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＳＡ、ＣＩＮＲＹＺＥ−ＰＥＧ、Ｃ１−ＩＮＨ、またはＣＩＮＲＹＺＥを与えられている場合の、ラット試験からのＰＫ値を表す一連のグラフを示す。
【図２５−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して述べられている。
【０１００】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【０１０１】
およそまたは約：本出願において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は同意語として用いられている。本出願において使用される任意の数字は、約／およそを伴っても伴わなくても、当業者により認識される任意の正常変動を含むことが意図されている。本明細書で使用する場合、関心のある１つ以上の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、いずれかの方向（より大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の値の範囲を指す。
【０１０２】
生物学的利用度：本明細書で使用される場合、用語「生物学的利用度」は、概して、投与された用量のうち対象の血流に到達する割合を意味する。
【０１０３】
生物学的に活性である：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性である」という句は、生物学的系において、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特性を指す。例えば、生物に投与されたときに、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。ペプチドが生物学的活性である特定の実施形態では、該ペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有する該ペプチドの一部分が「生物学的活性」部分と称されるのが典型的である。
【０１０４】
担体または希釈剤：本明細書で使用される場合、「担体」または「希釈剤」という用語は、医薬製剤の調製に有用な薬学的に許容される（例えば、ヒトへの投与に対して安全かつ無毒である）担体または希釈物質を意味する。希釈剤の例には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１０５】
Ｃ１−インヒビターまたはＣ１エステラーゼインヒビターまたはＣ１−ＩＮＨ：本明細書で使用される場合、「Ｃ１−インヒビター」または「Ｃ１エステラーゼインヒビター」または「Ｃ１−ＩＮＨ」という用語は、全て交換可能に使用することができ、別段の指定がない限り、実質上のＣ１−ＩＮＨの生物学的活性を保持する、野生型、天然型、天然に存在する、組換えにより生成された、及び／または修飾型の任意のＣ１−ＩＮＨタンパク質（例えば、１つ以上のアミノ酸変異、欠失、トランケーション、挿入、及び／または融合タンパク質を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質）を意味する。「Ｃ１−インヒビター」または「Ｃ１エステラーゼインヒビター」または「Ｃ１−ＩＮＨ」は融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質はＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとＦｃドメインとを含む。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質はＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとアルブミンドメインとを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質はリンカーをさらに含む。Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、組換え細胞内で組換え発現され得る。特定の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨは、哺乳類細胞で、好ましくはＣＨＯ細胞またはヒト細胞で、好ましくはＨＴ１０８０細胞またはＨＥＫ細胞で発現する。
【０１０６】
コンジュゲート：本明細書で使用される場合、用語「コンジュゲート」は、あるタンパク質に直接的または間接的に共有結合した部分を意味し得る。通例、あるタンパク質がコンジュゲートに結合している場合、そのタンパク質はコンジュゲートされたタンパク質またはタンパク質コンジュゲートと称され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。あるタンパク質がＰＥＧ部分に結合している場合、そのタンパク質はＰＥＧ化タンパク質と称され得る。
【０１０７】
機能的等価物または機能的誘導体：本明細書で使用される場合、「機能的等価物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈では、元来の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物活性（機能的または構造的いずれか）を保持する分子を意味する。機能的誘導体または機能的等価物は、天然の誘導体であり得るか、または合成で調製される。例示的な機能的誘導体として、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するが、タンパク質の生物学的活性が保持されているアミノ酸配列が挙げられる。置換したアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸と類似する化学物理的性質を有する。類似した望ましい化学物理的性質として、電荷、嵩高さ、疎水性、親水性などにおける類似性が挙げられる。
【０１０８】
融合タンパク質：本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」という用語は、２種以上の元来は別々のタンパク質またはそれらの一部分を連結することによって作製されたタンパク質を意味する。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーが各タンパク質の間に存在することになる。
【０１０９】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、タンパク質濃度またはタンパク質活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【０１１０】
遺伝性血管性浮腫またはＨＡＥ：本明細書で使用される場合、「遺伝性血管性浮腫」または「ＨＡＥ」という用語は、予測不可能な反復性の炎症発作によって特徴付けられる血液障害を意味する。ＨＡＥはＣ１−ＩＮＨ欠損と関連しているのが典型的であり、この欠損は、Ｃ１−ＩＮＨが低レベルであることか、またはＣ１−ＩＮＨの活性が損なわれている、もしくは低下していることに起因し得る。症状として、顔面、四肢、生殖器、胃腸管、及び上気道などの身体の任意の部位に生じ得る腫脹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
改善、増加または低減：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などの基準測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【０１１４】
リンカー：本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、融合タンパク質において、天然タンパク質の特定の位置に見られるもの以外のアミノ酸配列を意味し、可撓性を持つか、または２つのタンパク質部分構造の間にα−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計されているのが一般的である。リンカーはスペーサーとも呼ばれる。リンカーまたはスペーサーは、一般的に、それ自体には生物学的機能を持たない。
【０１１５】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介して互いに連結したアミノ酸の連続鎖を意味する。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖について言及するのに使用されるが、当業者が理解するように、この用語は長い鎖に限定されることはなく、ペプチド結合を介して互いに連結した２つのアミノ酸を含めた極めて短い鎖についても言及することができる。当業者に知られるように、ポリペプチドはプロセシング及び／または修飾されてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は交換可能に使用される。
【０１１６】
予防：本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、疾患、障害、及び／または症状の発病に関連して使用される場合、疾患、障害、及び／または症状発症の危険性を低下させることを意味する。後述の「危険性」の定義を参照されたい。
【０１１７】
タンパク質：本明細書で使用される用語「タンパク質」は、個別単位として機能する１つ以上のポリペプチドを意味する。単一のポリペプチドが個別の機能性単位であり、個別の機能性単位を形成するために他のポリペプチドと永続的または一時的に物理的会合することを必要としない場合、用語「ポリペプチド」と用語「タンパク質」は交換可能に用いることができる。個別の機能性単位が相互に物理的会合した２つ以上のポリペプチドで構成される場合、用語「タンパク質」は、物理的に結合し、かつ個別単位として合わせて機能する複数のポリペプチドを意味する。
【０１１８】
危険性：文脈から理解されるとおり、疾患、障害、及び／または症状の「危険性」は、特定の個体が疾患、障害、及び／または症状（例えば、筋ジストロフィー）を発症する可能性を包含する。一部の実施形態では、危険性は割合として表される。一部の実施形態では、危険性は０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％から１００％までである。一部の実施形態では、危険性は、参照試料または参照試料群に関連する危険性と比較した危険性として表される。一部の実施形態では、参照試料または参照試料群は、疾患、障害、症状、及び／または事象（例えば、筋ジストロフィー）の既知の危険性を有している。一部の実施形態では、参照試料または参照試料群は、ある特定の個体と比較可能な個体由来である。一部の実施形態では、相対危険性は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
【０１１９】
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【０１２０】
実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【０１２１】
実質的相同性：本明細書では、「実質的相同性」という句は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者には理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に相同残基を含む場合、一般的に「実質的に相同」であると考えられる。相同残基は同一残基であってもよい。代替的に、相同な残基は、非同一の残基であってもよく、構造的特徴および／または機能的特徴が適切に類似である。例えば、当業者には周知のとおり、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」の側鎖を有するとして分類されるのが典型的である。１つのアミノ酸を同一種の別のアミノ酸で置換することは、多くの場合「相同性」置換と見なされ得る。
【０１２２】
この技術分野でよく知られているように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のそれらの対応する残基が、関連ストレッチの残基にわたって相同である場合、２つの配列は実質的に相同であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは完全なシーケンスである。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基を含む。
【０１２３】
実質的同一性：本明細書では、「実質的同一性」という句は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者には理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含む場合、一般に「実質的に同一」であると考えられる。この技術分野でよく知られているように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のそれらの対応する残基が、関連ストレッチの残基にわたって同一である場合、２つの配列は実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは完全なシーケンスである。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基を含む。
【０１２４】
罹患：疾患、障害、及び／または症状に「罹患」している個体は、その疾患、障害、及び／または症状を持つと診断されているか、またはその疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候を示している。
【０１２５】
感受性を有する：疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状を持つとは診断されていない。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を呈していない場合がある。一部の実施形態では、疾患、障害、症状、または事象（例えば、ＤＭＤ）に感受性を有する個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けることができる：（１）疾患、障害、及び／または症状の発症と関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、及び／または症状の発症と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／または症状と関連するタンパク質の発現及び／または活性の増加及び／または減少；（４）疾患、障害、症状、及び／または事象の発症と関連する習慣及び／または生活様式；（５）移植を受けたか、受ける予定であるか、または移植を必要としていること。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状を発症することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状に感受性を有する個体は、その疾患、障害、及び／または症状を発症することがない。
【０１２６】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは症状に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を治療する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延するのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されるのが典型的であることを理解するであろう。
【０１２７】
治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」または「治療している」は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重症度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、該疾患に関連する病態を発症させる危険性を減らすために、治療が行われる場合もある。
発明を実施するための形態
【０１２８】
本発明は、特に、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を含めた補体媒介性障害の治療を改善するためのコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを提供する。詳細には、本発明により提供されるコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨはＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨである。
【０１２９】
コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨ（例えば、ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨまたはポリシアル酸（ＰＳＡ）コンジュゲートＣ１−ＩＮＨ）は、コンジュゲートされていないが（例えば、非ＰＥＧ化）それ以外の点では同一のＣ１−ＩＮＨよりも長い半減期を有すると考えられる。本発明によると、以下に限定されないが、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨタンパク質または組換え発現Ｃ１−ＩＮＨタンパク質を含めた任意のＣ１−ＩＮＨタンパク質がコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）され得る。一部の実施形態では、コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）され得るＣ１−ＩＮＨタンパク質は融合タンパク質である。以下に説明するように、本発明に従ってコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）した結果によりｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が延びるが、意外なことに、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の良好な生物学的利用度及び／または生物活性は保持される。したがって、本明細書に記載のコンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨによって、例えば、投与頻度を低減し、予防有効性を向上させることで、ＨＡＥ及び他の補体媒介性疾患、障害、または症状の治療を改善することができる。
【０１３０】
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。本明細書で引用される技術の全ての開示は、参照によりその全体が援用される。
【０１３１】
Ｃ１−ＩＮＨタンパク質
本発明を用いて、任意のＣ１−ＩＮＨタンパク質をコンジュゲートすることができる。ヒトＣ１−ＩＮＨは、広範な抑制性及び非抑制性の生物学的活性を有する重要な抗炎症性血漿タンパク質である。ヒトＣ１−ＩＮＨは、配列相同性、そのＣ末端ドメインの構造、及びプロテアーゼ阻害の機序により、血漿プロテアーゼインヒビターの最大クラスであるセルピンスーパーファミリーに属する。このセルピンスーパーファミリーには、抗トロンビン、α１−プロテイナーゼインヒビター、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、及び多種多様な生理学系を調節する構造上類似した多くの他のタンパク質も含まれる。Ｃ１−ＩＮＨは、補体系、キニン生成の接触系、及び固有凝固経路におけるプロテアーゼのインヒビターである。Ｃａｉ，Ｓ．＆Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｅ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：４７８６−４７９１（２００３）。具体的には、Ｃ１−ＩＮＨは、補体系のＣ１ｒ及びＣ１ｓを阻害することが示されている。Ｃ１−ＩＮＨは、凝固第ＸＩ因子及び凝固第ＸＩＩ因子、ならびにカリクレイン、及び凝固系と線溶系の他のセリンプロテアーゼ（例えば、組織型プラスミノーゲン活性化因子及びプラスミンなど）の主要レギュレーターでもある。
【０１３２】
Ｃ１−ＩＮＨの低い血漿含有量またはその機能不全により、補体カスケード及び接触血漿カスケードの両方が活性化され、同様に他の系も影響を受ける恐れがある。Ｃ１−ＩＮＨの血漿含有量が５５μｇ／ｍＬ（正常値の約２５％）未満のレベルに低下すると、Ｃ１の自発的活性化が誘導されることがわかっている。
【０１３３】
Ｃ１−ＩＮＨの構造を示す概略図を図１に示す。シグナルペプチド、Ｎ末端ドメイン、及びセルピンドメインが示されている。Ｃ１−ＩＮＨの２２個のアミノ酸シグナルペプチドは分泌に必要であり、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の残部から切断される。Ｃ１−ＩＮＨは２つのドメインを有しており、それらは、典型的なセルピンドメインである３６５個のアミノ酸を有するＣ末端ドメインと、１１３個のアミノ酸を有するＮ末端ドメインである。このタンパク質は、ドメインを接続する２つのジスルフィド架橋によって安定化されている。これらのジスルフィド架橋は、Ｎ末端ドメインのＣｙｓ１０１とＣ末端（セルピン）ドメインのＣｙｓ４０６とが形成するジスルフィド結合、及びＮ末端ドメインのＣｙｓ１０８とＣ末端ドメインのＣｙｓ１８３とが形成するジスルフィド結合により形成される。セルピンドメインは、Ｃ１−ＩＮＨのプロテアーゼ活性を担っている。Ｐ１−Ｐ１’は、Ａｒｇ４４４−Ｔｈｒ４４５被切断結合を表す。
【０１３４】
グリコシル化タンパク質の重量のうちの２６％超は炭水化物である。グリカンは、ヒトＣ１−ＩＮＨの全体にわたって不均一に分布している。Ｎ末端は重度にグリコシル化されており、３つのＮ結合型（ダイヤモンド形の先端部を持つ長い垂直線として表示）炭水化物基と少なくとも７つのＯ結合型（短い垂直線として表示）炭水化物基とを有する。３つのＮ結合型グリカンは、セルピンドメインのアスパラギン残基であるＡｓｎ２１６、Ａｓｎ２３１、及びＡｓｎ３３０に結合している（ダイヤモンド形の先端部を持つ長い垂直線として表示）。極めて長くかつ重度にグリコシル化されたＮ末端ドメインの機能的役割は依然として不明ではあるが、これは、タンパク質の高次構造安定性、認識、エンドトキシン及びセレクチンに対する親和性、ならびにクリアランスに不可欠である可能性がある。炭水化物部分の固有の不均一性はＣ１−ＩＮＨ全体の不均一性の大きな原因となっており、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの性質を模倣する組換えＣ１−ＩＮＨの産生が困難である理由の１つになっている。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、本発明のコンジュゲーション及び使用に適したＣ１−ＩＮＨタンパク質は、実質上のＣ１−ＩＮＨ生物学的活性を保持する野生型または修飾型のアミノ酸配列（例えば、アミノ酸の変異、欠失、トランケーション、及び／または挿入を有するＣ１−ＩＮＨタンパク質）を備えた、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインを含む。典型的には、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、組換え技術を用いて生成されるが、血漿由来である場合もある。
【０１３６】
一部の実施形態では、本発明に適したＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとして、以下の野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸１〜４７８）（アミノ酸１〜９７を下線引きで表示）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一または相同であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化１】
2019513724.tif 000003
【０１３７】
一部の実施形態では、本発明に適したＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとして、以下の成熟野生型ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸９８〜４７８）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一または相同であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化２】
2019513724.tif 000004
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明に適したＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとして、Ｅ１６５Ｑ変異（変異したアミノ酸を太字にし下線引きで表示）を有するヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸１〜４７８）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一または相同であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化３】
2019513724.tif 000005
【０１３９】
一部の実施形態では、本発明に適したＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとして、Ｅ１６５Ｑ変異（変異したアミノ酸を太字にし下線引きで表示）を有する成熟ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質（アミノ酸９８〜４７８）に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一または相同であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化４】
2019513724.tif 000006
【０１４０】
ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質の相同体または類似体は、当業者に既知のポリペプチド配列変更方法（かかる方法をまとめた参考文献において参照されるものなど）により調製することができる。当業者には理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に相同残基を含む場合、一般的に「実質的に相同」であると考えられる。相同残基は同一残基であってもよい。代替的に、相同な残基は、非同一の残基であってもよく、構造的特徴および／または機能的特徴が適切に類似である。例えば、当業者には周知のとおり、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」の側鎖を有するものとして分類されるのが典型的である。１つのアミノ酸を同じタイプの別のアミノ酸へと置換することは、「相同的」置換と見なされ得ることが多い。一部の実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。一部の実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われる箇所でタンパク質の相対的電荷またはサイズ特性が変更されないアミノ酸置換を意味する。
【０１４１】
この技術分野でよく知られているように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指標を提供する。
【０１４２】
一部の実施形態では、本発明に適したＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインは、トランケートされたＣ１−ＩＮＨタンパク質であり得る。例えば、本発明に適したＣ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとして、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、または配列番号３８のうちのいずれかの一部または断片が挙げられる。
【０１４３】
Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質
一部の実施形態では、本発明に従ってコンジュゲートされ得るＣ１−ＩＮＨタンパク質にはＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質が含まれる。Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨドメイン（Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドとも称される）と他のドメインまたは部分とを含み得るが、これらは通例、例えばＣ１−ＩＮＨタンパク質の半減期、安定性、効力、及び／もしくは送達を増強もしくは増加させることにより、または免疫原性、クリアランス、もしくは毒性を低減もしくは排除することによって、Ｃ１−ＩＮＨの治療効果を促すことができるものである。Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質に好適なドメインまたは部分として、以下に限定されないが、Ｆｃドメイン及びアルブミンドメインが挙げられる。好適な融合ドメインまたは部分（例えば、Ｆｃドメインまたはアルブミンドメイン）は、直接的または間接的に、Ｎ末端、Ｃ末端に、もしくはＣ１−ＩＮＨタンパク質内部に連結されるか、融合されるか、または結合され得る。以下のセクションでは、コンジュゲートされ得るＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質の例を説明する。
【０１４４】
Ｆｃドメイン
一部の実施形態では、好適なＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部を含有する。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンのサブクラスに由来し得る。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する。特に好適なＦｃドメインとして、ヒト抗体またはヒト化抗体に由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、修飾されたヒトＦｃ部分などの修飾型Ｆｃ部分である。
【０１４５】
Ｃ１−インヒビターＦｃ融合タンパク質は、図１に示すように、二量体として存在し得る。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、以下の野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられ得る：
【化５】
2019513724.tif 000007
【０１４７】
一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、補体活性化及び／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性（「エフェクター機能」とも称される）を低減または排除する１つ以上の変異を含み得る。例えば、好適なＦｃドメインは、ＥＵナンバリングによるＩｇＧ１のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）に対応する変異を含み得る。ＬＡＬＡ変異（下線を引いた変異残基）を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの例を以下に示す：
【化６−１】
2019513724.tif 000008
一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、配列番号４に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるが、ＥＵナンバリングによるＩｇＧ１のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）に対応する変異を維持している、アミノ酸配列が挙げられる。
【０１４８】
ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の結合を改良すると血清半減期が延びると考えられる。したがって、一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＦｃＲｎへの結合の改良をもたらす１つ以上のアミノ酸変異を含む。ＦｃＲｎへの結合の改良に影響を及ぼすＦｃドメイン内の様々な変異が当技術分野で知られており、これらを本発明の実施に適合させることができる。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＥＵナンバリングによる、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、及び／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上の位置に１つ以上の変異を含む。
【０１４９】
例えば、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）及び／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）の変異を含有し得る。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）及びＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）の変異を含有し得る。Ｆｃドメインに含まれ得る追加的なアミノ酸置換としては、例えば、米国特許第６，２７７，３７５号、同第８，０１２，４７６号、及び同第８，１６３，８８１号に記載のものが挙げられ、これらの文献は参照により本明細書に援用される。
【０１５０】
一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるが、ＥＵナンバリングによるヒトＩｇＧ１のＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、及び／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上の変異（下記の下線部）を維持している、アミノ酸配列が挙げられる：
【化６−２】
2019513724.tif 000009
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるが、ＥＵナンバリングによる、ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）に対応する変異、ならびにヒトＩｇＧ１のＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、及び／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上の変異（下線を引いた変異残基）を維持している、アミノ酸配列が挙げられる：
【化７】
2019513724.tif 000010
【０１５２】
一部の実施形態では、ＩｇＧ４に由来するＦｃドメインが本発明に使用される。いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、ＩｇＧ４は野生型のＩｇＧ１よりも補体活性化能が低いと報告されている。したがって、本発明の一部の実施形態では、野生型ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインが用いられている。一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインは、ＥＵインデックスによるコアヒンジ領域の配列において、Ｓ２２８Ｐの置換に相当する変異を有するヒトＩｇＧ４由来である。この置換は、Ｋａｂａｔら（１９８７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ．）によればＳ２４１Ｐとも称されている。いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、この置換は、ヒンジ領域のコアの配列を、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２のアイソタイプ抗体の配列と同一にする効果を有し、ＩｇＧ４抗体の相同形態を生成し、したがって、往々にしてヘテロ二量体のＩｇＧ４抗体を生成させる重鎖の解離及び再会合を阻害すると考えられる。さらに、ＩｇＧ４由来のＦｃドメインは、高濃度での安定性のために用いられ得る。
【０１５３】
したがって、一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、以下の野生型ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化８】
2019513724.tif 000011
【０１５４】
一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるが、ＥＵナンバリングのＳ２４１Ｐ置換に対応する変異（下線を引いた変異残基）を維持している、アミノ酸配列が挙げられる：
【化９】
2019513724.tif 000012
【０１５５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃドメインはシグナルペプチドを含み得る。本発明に適したシグナルペプチドの例として、
【化１０】
2019513724.tif 000013
に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる。
【０１５６】
例えば、好適なＦｃドメインは、シグナルペプチドを有しかつＦｃＲｎ受容体への結合を増強する変異を有する（シグナルペプチドと変異残基を下線引きで表示）、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を備え得る：
【化１１】
2019513724.tif 000014
【０１５７】
一部の実施形態では、本発明に適したＦｃドメインとして、シグナルペプチドを有しかつＬＡＬＡとＦｃＲｎ受容体への結合を増強する変異（下線を引いた変異残基）とを有する、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化１２】
2019513724.tif 000015
【０１５８】
Ｃ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合タンパク質の例
特定の実施形態では、好適なＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインとＦｃドメインとを含む。一部の実施形態では、好適なＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインをＦｃドメインに会合させるリンカーを含む。特定の実施形態では、図２に示すように、Ｆｃ部分は完全長（１〜４７８ａａ）ならびに成熟（９８〜４７８）Ｃ１−インヒビターのＮ末端領域に直接融合されてもよい。非限定的な例として、好適なＣ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を有し得る：
【化１３−１】
2019513724.tif 000016
【化１３−２】
2019513724.tif 000017
【０１５９】
一部の実施形態では、好適なＣ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３２、または配列番号３３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１６０】
Ｃ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体または単量体の構成を含めた様々な構成で提供され得ることが考慮される。例えば、好適なホモ二量体構成は、融合パートナー（例えば、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチド＋リンカー）のＣ末端が両方のＦｃポリペプチド鎖のＮ末端に結合するように設計され得る。好適な単量体構成は、融合パートナー（例えば、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチド＋リンカー）のＣ末端が１つのＦｃ二量体に融合するように設計され得る。
【０１６１】
単量体形態は、本明細書において一価形態とも称されるが、特定の用途、及び特定の投与経路（例えば、皮下投与）に使用され得る。単量体構成は、立体障害を減らし、半減期を増加させる、及び／または生物学的利用度を増加させることができる。
【０１６２】
いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、Ｃ１−ＩＮＨが自殺インヒビターであるために、一価形態はＣ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合構築物に特に有用である可能性があると考えられる。Ｃ１−ＩＮＨは自殺インヒビターであるので、二量体のＦｃ融合のうちの１つのＣ１−ＩＮＨ「アーム」の結合によって、別のアームが結合されていない状態であっても、結合Ｃ１−ＩＮＨ融合タンパク質のクリアランス量が増えることになる。
【０１６３】
Ｆｃ融合タンパク質の利点は、単量体であれ二量体であれ、Ｆｃの発現が、Ｃ１−ＩＮＨ単体の発現よりも高レベルで生じると判明したことである。二量体のＣ１−ＩＮＨ−Ｆｃ構築物とＦｃ融合を含まないＣ１−ＩＮＨとの比較を行う活性アッセイによると、同様のＣ１ｑ結合活性を有することが示されていた。リンカーを含めた場合も評価し、Ｃ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合タンパク質がその標的を結合させる性能に影響を与えないことがわかっていた。
【０１６４】
単量体抗体融合タンパク質を作製する方法としては、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１１／０６３３４８号、同第２０１２／０２００９６号、同第２０１３／１３８６４３号、同第２０１４０８７２９９号、Ｄｕｍｏｎｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ：Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２０（３）：１５１−１６０（２００６）、  Ｉｓｈｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｌｄｉｎｇ：Ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｂｙ  Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｆｃ  Ｄｏｍａｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８８：１６５２９−１６５３７（２０１３）に記載された方法が挙げられる。
【０１６５】
一価のＣ１−インヒビターは、Ｆｃ単体を発現するプラスミドと同時トランスフェクトされる、Ｆｃ−Ｃ１を含むプラスミドを用いることによって作製され得る。さらに、一方のＦｃ−Ｃ１生成プロモーターと他方のＦｃ単体生成プロモーターとを有する２つのプロモータープラスミドを用いることによっても作製できるであろう。一価のＦｃはまた、Ｆｃのヒンジ領域の特定のアミノ酸を変異させてＦｃ領域の安定性を付与する、二重特異性技術（例えば、一価Ｃ１の形成を促進させるノブ・アンド・ホール技術または他の安定化変異）を用いて作製することもできるであろう。
【０１６６】
アルブミンドメイン
一部の実施形態では、好適なＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質はアルブミンドメインを含有する。アルブミンは可溶性であり、血清タンパク質の約半分を含む単量体タンパク質である。アルブミンは、主に、ステロイド、脂肪酸、及び甲状腺ホルモンのキャリアタンパク質として機能し、細胞外液量の安定化に役立つものである。アルブミンは、分子量が６６，５００の球状の非グリコシル化血清タンパク質を有する。アルブミンは、Ｎ末端ペプチドを有するプレプロアルブミンとして肝臓で合成され、該ペプチドが除去された後に、新生タンパク質が粗面小胞体から放出される。次に、その産物であるプロアルブミンがゴルジ小胞で切断されて、分泌アルブミンを産生する。
【０１６７】
アルブミンは３つの相同ドメイン（Ｉ〜ＩＩＩ）で構成されており、その各々は２つのサブドメイン（Ａ及びＢ）から構成されている。ヒト血清アルブミンへの主要なリガンド結合領域は、サブドメインＩＩＡ及びＩＩＩＡにおける空洞に位置し、その大部分が疎水性残基及び正荷電残基で形成されており、類似した化学的性質を呈している。ヒト血清アルブミンは５８５個のアミノ酸と、６６，５００Ｄａの分子質量を有する。アミノ酸は３５個のシステインを含み、そのうちの１つを除いて全てが１７個の安定化ジスルフィド結合の形成に関与している。
【０１６８】
アルブミンは１９日の長時間にわたる血清半減期を有するのが典型的である。ＦｃＲｎはアルブミンの長い血清半減期を制御する。ＦｃＲｎは、アルブミンに加えてＩｇＧをも結合させる二重結合受容体であり、細胞内分解から両方のタンパク質を保護するものである。アルブミン分子のＣ末端ドメインは、ＦｃＲｎに結合するために重要であることが判明している。詳細には、ドメインＩＩＩＢがＦｃＲｎに結合するために重要であることが判明している。一部の実施形態では、ドメインＩＩＩＢの欠如、または４６４Ｈｉｓ、５１０Ｈｉｓ、及び５３５Ｈｉｓの変異は、ＦｃＲｎ結合を阻止する。
【０１６９】
本発明のアルブミン融合タンパク質は単量体であるのが典型的である。一部の実施形態では、この特徴は、単量体Ｆｃ融合の実施形態に関して上述した理由から、二量体Ｆｃ融合の実施形態よりも有利であり得る。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明に適したアルブミンポリペプチドとして、以下の野生型ヒト血清アルブミンに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化１４】
2019513724.tif 000018
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明に適したアルブミンポリペプチドとして、以下の野生型ヒト血清アルブミンのＤ３ドメインに対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列が挙げられる：
【化１５】
2019513724.tif 000019
【０１７２】
リンカーまたはスペーサー
Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインは、Ｆｃドメインまたはアルブミンドメインに、直接的または間接的に結合され得る。一部の実施形態では、好適なＣ１−ＩＮＨ融合タンパク質は、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインと、Ｆｃドメインまたはアルブミンドメインとを連結させるリンカーまたはスペーサーを含む。アミノ酸のリンカーまたはスペーサーは、概して、可撓性があるように、またはアルファヘリックスなどの構造を２つのタンパク質部分の間に挿入するように設計されている。リンカーまたはスペーサーは、比較的短くてもよく、または長くてもよい。典型的には、リンカーまたはスペーサーは、例えば、長さ３〜１００（例えば、５〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０）のアミノ酸を有する。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、長さ２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、９５以上、または１００以上のアミノ酸である。長いリンカーは通例、立体障害を減らし得る。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン残基及びセリン残基の混合物を含むことになる。一部の実施形態では、リンカーはさらに、スレオニン残基、プロリン残基、及び／またはアラニン残基を含み得る。したがって、一部の実施形態では、リンカーは、１０〜１００個、１０〜９０個、１０〜８０個、１０〜７０個、１０〜６０個、１０〜５０個、１０〜４０個、１０〜３０個、１０〜２０個、１０〜１５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、または９５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号３７）からなるリンカーではない。
【０１７３】
非限定的な例として、本発明に好適なリンカーまたはスペーサーとしては、以下に限定するものではないが、ＧＧＧリンカーとＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（ＧＧＧＧＳ）２リンカー、配列番号２７）が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＧ及び／または配列番号２７の配列を含む。
【０１７４】
他の好適なリンカーとして、
【化１６】
2019513724.tif 000020
が挙げられる。
【０１７５】
好適なリンカーまたはスペーサーとして、上記の例示的なリンカー、例えば、ＧＧＧリンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（ＧＧＧＧＳ）２リンカー、配列番号２７）、ＧＡＧリンカー（配列番号３４）、ＧＡＧ２リンカー（配列番号３５）、またはＧＡＧ３リンカー（配列番号３６）に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一であるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。一部の実施形態で使用するのに好適なさらなるリンカーは、２０１２年３月２日に出願された米国特許出願公開第２０１２／０２３２０２１号に見い出すことができ、この出願の開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１７６】
通例、リンカーとして、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインが同種リガンド（例えば、Ｃ１ｓなど）のいずれかに結合する性能に実質的に影響を与えるかまたは該性能を実質的に低減させることなく、Ｃ１−ＩＮＨポリペプチドまたはＣ１−ＩＮＨドメインをＦｃドメインまたはアルブミンドメインに会合させるリンカーが挙げられる。
【０１７７】
Ｃ１−ＩＮＨタンパク質のグリコシル化／グリカンマッピング（プロファイル）
本発明によると、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、グリカン残基及び／またはアミン基を介してコンジュゲートされ得る。詳細には、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、例えばシアル酸残基またはガラクトース残基などのグリカン残基でコンジュゲートされ得る。したがって、本発明のコンジュゲーションに適したＣ１−ＩＮＨタンパク質は、特有のグリカンマップ、詳細にはシアル酸含有量で特徴付けられ得る。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのグリコシル化プロファイルと同様のグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのグリコシル化プロファイルとは異なるグリコシル化プロファイルを有する。
【０１７８】
いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、枝分かれ構造という形状や複雑性を伴うグリカン結合を含むグリカンマップは、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス、生物学的利用度、及び／または有効性に影響を及ぼし得ると考えられる。
【０１７９】
グリカンマップは、通例、酵素消化法及びそれに続くクロマトグラフィー分析によって測定され得る。種々の酵素を酵素消化法に用いることができ、酵素には、好適であるグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プロテアーゼ、及びホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、好適な酵素はアルカリホスファターゼである。一部の実施形態では、好適な酵素はノイラミニダーゼである。グリカンはクロマトグラフィー分析によって検出され得る。例えば、グリカンは、パルスアンペロメトリック検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）か、またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出され得る。グリカンマップの各ピークにより表されるグリカンの量は、当該技術分野で既知の方法及び本明細書で開示された方法に従って、グリカンの検量線を用いて計算することができる。
【０１８０】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質はグリカンマップで特徴付けられ得る。各ピーク群に対応するグリカンの相対量は、既定の参照標準での該当ピーク群の面積に対する該各ピーク群の面積に基づいて算出することができる。グリカンマッピング用の種々の参照標準が当該技術分野で知られており、本発明の実施に用いることができる。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、中性、モノシアリル化、ジシアリル化、トリシアリル化、またはテトラシアリル化のＣ１−ＩＮＨタンパク質を示すピーク群から選択される５つ以下のピーク群を含むグリカンマップで特徴付けられ得る。
【０１８１】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、中性グリカン種、モノシアリル化種、ジシアリル化種、トリシアリル化種、及び／またはテトラシアリル化種のうちの少なくとも１種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、中性グリカン種、モノシアリル化種、ジシアリル化種、トリシアリル化種、及びテトラシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約５％〜約３０％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約５％〜約２５％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約１０％〜約２０％の中性グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約８０％（例えば、１分子当たり約８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超）の荷電グリカンを含む。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約１０％〜約３０％のモノシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約３０％〜約５０％のジシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約１５％〜約３５％のトリシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約５％〜約１５％のテトラシアリル化種を含むグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、３０％以下の中性グリカン種、約２０％〜約３０％のモノシアリル化グリカン種、約３０％〜約４０％のジシアリル化グリカン種、約１０％〜約２０％のトリシアリル化グリカン種、及び約５％〜約１０％のテトラシアリル化グリカン種を含むグリコシル化プロファイルを有する。
【０１８２】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのシアリル化プロファイルと同様のシアリル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨのシアリル化プロファイルとは異なるシアリル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、半減期を血漿由来Ｃ１−ＩＮＨの半減期と同様にするかまたは該半減期よりも長くする、シアリル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のシアリル化グリカン残基を含む。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、または２９個のシアリル化グリカン残基を含む。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、平均して、１分子当たり少なくとも約３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個のシアリル化グリカン残基を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の、マンノース、α−ガラクトース、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、約２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の、マンノース、α−ガラクトース、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、またはオリゴマンノース型のグリコシル化のうちの１つ以上を含有する。
【０１８４】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、免疫原性ではないグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨと比べた場合に血清クリアランス速度を増加させないグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨと比べた場合に血清クリアランス速度を減少させるグリコシル化プロファイルを有する。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、コネスタットアルファと比べた場合に血清クリアランス速度を減少させるグリコシル化プロファイルを有する。
【０１８５】
タンパク質のグリコシル化プロファイルを操作する様々な方法が当該技術分野で知られている。これらの方法に加えて、まだ見出されていない他の方法も、本発明により考慮される。本発明のＣ１−ＩＮＨタンパク質及びポリペプチドのグリコシル化プロファイルを操作する方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質またはポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、発現したタンパク質またはポリペプチドの発現後化学修飾により変わる。一部の実施形態では、細胞培養条件は、所望のグリコシル化プロファイルを有するタンパク質を発現させるように操作される。これらの細胞培養条件には、培養の期間、培養培地への添加物、及び／またはグリコシル化を増やすための遺伝子の共発現を含めた、産生及び培養プロセスの制御が含まれる。宿主細胞、及び形質移入された宿主細胞の特異的クローンの選択も、グリコシル化を増大させるために利用されてもよい。グリコシル化を増やすいくつかの方法として、所望のグリコシル化プロファイルを有するタンパク質またはポリペプチドを濃縮する精製プロセスが挙げられる。
【０１８６】
一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質を発現するように操作された細胞は、グリコシル化を改変するように、詳細には、発現したＣ１−ＩＮＨのシアリル化を増加させるようにも操作され得る。例えば、細胞は、グリコシル化経路で異種酵素を発現して（野生型または変異型）、所望のグリコシル化を実現する（例えば、シアリル化を増加させる）ように操作され得る。一部の実施形態では、細胞はまた、内因性酵素を過剰発現して、所望のグリコシル化を実現する（例えば、シアリル化を増加させる）ように操作され得る。一部の実施形態では、細胞は、シアリル化を低減、阻害、もしくは劣化させる内因性酵素の発現を低減させるか、または妨げるように（例えば、アンチセンス構築物を用いて）操作されている。
【０１８７】
本明細書に記載される種々のグリコシル化パターン／グリカンマップ、特にシアリル化プロファイルまたはシアリル化レベルは、Ｃ１−ＩＮＨドメイン単体またはＣ１−ＩＮＨポリペプチド単体に適用可能であるか、または融合タンパク質の状況（例えば、Ｃ１−ＩＮＨ−Ｆｃ融合タンパク質またはＣ１−ＩＮＨ−アルブミン融合タンパク質）で適用可能である。本明細書に記載されるグリコシル化パターン／グリカンマップ、特にシアリル化プロファイルまたはシアリル化レベルを有するＣ１−ＩＮＨタンパク質は、コンジュゲートされる場合もあり、コンジュゲートされない場合もある。所望のシアリル化プロファイルまたはレベルを含めた所望のグリコシル化パターン／グリカンマップは、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を伸ばすことができると考えられる。詳細には、所望のシアリル化プロファイルまたはレベルを含めた所望のグリコシル化パターン／グリカンマップは、Ｆｃ融合またはアルブミン融合と組み合わせると、コンジュゲートされない場合であっても、本出願に記載のＣ１−ＩＮＨタンパク質の望ましいｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を実現することができる。しかしながら、コンジュゲーション（例えばＰＥＧ化）によって、所望のグリコシル化パターンまたはシアリル化レベルを有するＣ１−ＩＮＨタンパク質を含めたＣ１−ＩＮＨタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期がさらに長くなる。
【０１８８】
ＰＥＧ化
本発明によると、ある化学的部分または生物学的部分が、本明細書に記載のＣ１−ＩＮＨタンパク質に、直接的または間接的にコンジュゲートされ得る。詳細には、こうした部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、これには、以下に限定されないが、モノＰＥＧ部分またはポリ（例えば２つ〜４つの）ＰＥＧ部分が含まれる。本明細書で使用される場合、ＰＥＧ部分を、あるタンパク質に直接的または間接的にコンジュゲートするプロセスはＰＥＧ化と称される。ＰＥＧ化は、本明細書に記載されるように、Ｃ１−ＩＮＨの半減期の増加をもたらすことができる。
【０１８９】
ＰＥＧ化は、当該技術分野で既知の任意の好適な反応によって実施され得る。ＰＥＧ化タンパク質を調製する方法には、通例、（ａ）ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と、ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で反応させることと、（ｂ）その反応物を得ることとが含まれ得る。反応条件は、一般的に、既知のパラメータ及び所望の結果に基づいて個別に決定され得る。
【０１９０】
当業者に使用可能な多くのＰＥＧ結合方法があり、例えば、欧州特許第０４０１３８４号、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：１０２８−１０３５（１９９２）、欧州特許第０１５４３１６号、欧州特許第０４０１３８４号、国際公開第９２／１６２２１号、及び国際公開第９５／３４３２６号に記載されている。例えば、本明細書に記載の治療用分子をＰＥＧ化する工程は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。
【表１】
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【０１９１】
一部の実施形態では、コンジュゲーション用のＰＥＧ部分は活性化ＰＥＧである。例えば、好適なＰＥＧ部分はアミノキシ官能基を含み得る。一部の実施形態では、好適なＰＥＧ部分はヒドラジド官能基を含み得る。一部の実施形態では、好適なＰＥＧ部分は、マレイミド官能基またはヨードアセトアミド官能基を含み得る。一部の実施形態では、好適なＰＥＧ部分はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含み得る。したがって、ＰＥＧ部分は、オキシム結合、アミド結合、ヒドラゾン結合、チオエーテル結合、または他の種類の結合を介して、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質にコンジュゲートされ得る。
【０１９２】
一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は直鎖構造または分岐構造を有し得る。例えば、ＰＥＧ部分は、２本、３本、４本、または５本のアーム分岐を有し得る。好適なＰＥＧ−ＮＨＳ部分として、直鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ１Ｋ、直鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ２Ｋ、直鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ５Ｋ、分岐鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ５Ｋ、分岐鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ２０Ｋ、または分岐鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ４０Ｋが挙げられ得る。さらなる例としては、ＰＥＧ−アミノキシ部分として、直鎖または分岐鎖のＰＥＧ−アミノキシ２Ｋ、ＰＥＧ−アミノキシ５Ｋ、ＰＥＧ−アミノキシ５Ｋ、ＰＥＧ−アミノキシ１０Ｋ、ＰＥＧ−アミノキシ２０Ｋ、またはＰＥＧ−アミノキシ４０Ｋが挙げられ得る。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＰＥＧは、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基を介してＣ１−ＩＮＨにコンジュゲートされる。図３を参照されたい。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＰＥＧは、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のガラクトース残基を介してＣ１−ＩＮＨにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のガラクトース残基を酸化した後に、ＰＥＧがそのガラクトース残基にコンジュゲートされる。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＰＥＧは、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のシアル酸残基を介してＣ１−ＩＮＨにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のシアル酸残基を酸化した後に、ＰＥＧがそのシアル酸残基にコンジュゲートされる。
【０１９６】
一部の実施形態では、ＰＥＧは酸化したシアル酸にオキシム結合を介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＰＥＧは酸化したシアル酸にヒドラゾン結合を介してコンジュゲートされる。
【０１９７】
Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、本発明に従って様々なレベルでＰＥＧ化され得る。例えば、ＰＥＧ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比は、約５：１〜１００：１、約１０：１〜１００：１、約１５：１〜１００：１、約２０：１〜１００：１、約２５：１〜１００：１、約３０：１〜１００：１、約４０：１〜１００：１、約５０：１〜１００：１、約１０：１〜９０：１、約１０：１〜８０：１、約１０：１〜７０：１、約１０：１〜６０：１、約１０：１〜５０：１、約１０：１〜４０：１、約１５：１〜３５：１、または約２０：１〜３０：１の範囲になり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比は、少なくとも約１：１、少なくとも約５：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約４５：１、または少なくとも約５０：１であり得る。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＰＥＧ：シアル酸のモル比は、少なくとも約１：１、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：１５、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：２５、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：３５、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：４５、少なくとも約１：５０である。一部の実施形態では、ＰＥＧ：シアル酸のモル比は、約１：１〜１：５０、約１：１〜１：４５、約１：１〜１：４０、約１：１〜１：３５、約１：１〜１：３０、約１：１〜１：２５、約１：１〜１：２０、約１：１〜１：１５、約１：１〜１：１０、または約１：１〜１：５である。
【０１９９】
ポリシアル酸コンジュゲーション
ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、コロミン酸（ＣＡ）とも称され、天然に存在する多糖類である。これは、α（２→８）ケトシド結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、ビシナルジオール基をその非還元末端に含む。また、負に帯電しており、ヒトの身体の天然成分である。
【０２００】
ＰＳＡはＮ−アセチルノイラミン酸のポリマー（通例ホモポリマー）からなる。その第二級アミノ基は通常アセチル基を持つが、代わりにグリコリル基を持つ場合もある。ヒドロキシル基の置換基になり得るものとして、アセチル基、ラクチル基、エチル基、硫酸基、及びリン酸基が挙げられる。
【０２０１】
ＰＳＡ及び修飾型ＰＳＡ（ｍＰＳＡ）は、通例、２，８−グリコシド結合もしくは２，９−グリコシド結合またはこれらの組み合わせ（例えば、交互の２，８−結合と２，９−結合）によって連結されたＮ−アセチルノイラミン酸部分から本質的になる直鎖ポリマーを含む。一部の実施形態では、ＰＳＡとｍＰＳＡのグリコシド結合はα−２，８である。こうしたＰＳＡ及びｍＰＳＡはコロミン酸に由来する。典型的なＰＳＡ及びｍＰＳＡは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも２０個のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、これらは、２個〜３００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは５個〜２００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは１０個〜１００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含み得る。ＰＳＡ及びＣＡは、好ましくは、Ｎ−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。一部の実施形態では、ＰＳＡは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び／または少なくとも９８％のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。
【０２０２】
ＰＳＡがＮ−アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合（例えばｍＰＳＡにおけるように）、これらはポリマー鎖の末端の一方または両方に位置することが好ましい。こうした「他の」部分は、例えば、酸化または還元によって末端Ｎ−アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分であってもよい。
【０２０３】
例えば、国際公開第２００１／０８７９２２号には、非還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によってアルデヒド基に変換されたｍＰＳＡについて記載されている。さらに、国際公開第２００５／０１６９７４には、還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が還元を受けて、該還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位で還元的に開環し、それによりビシナルジオール基が形成され、続いて酸化されて、ビシナルジオール基をアルデヒド基に変換したｍＰＳＡについて記載されている。
【０２０４】
様々なＰＳＡ誘導体が、非還元末端に単一アルデヒド基を含む酸化されたＰＳＡから調製され得る。アミノオキシＰＳＡの調製については、例えば国際公開第２０１２／１６６６２２号に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。末端アミノ基を含むＰＳＡ−ＮＨ２は、ＮＨ４Ｃｌと、ＰＳＡ−ＮＨ２を２−イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させて生じる末端スルフヒドリル基を含むＰＳＡ−ＳＨと、を用いた還元的アミノ化により調製することができ、両方の手順は米国特許第７，６４５，８６０Ｂ２号に記載されている。ＰＳＡヒドラジンは、米国特許第７，８７５，７０８Ｂ２号に従って、酸化したＰＳＡとヒドラジンとの反応によって調製され得る。ＰＳＡヒドラジドは、酸化したＰＳＡとアジピン酸ジヒドラジドとの反応によって調製され得る（国際公開第２０１１／０１２８５０Ａ２号）。
【０２０５】
コロミン酸（ＰＳＡのサブクラス）は、α（２→８）ケトシド結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）のホモポリマーであり、中でも、Ｋ１抗原を持つ大腸菌の特定の株により産生される。コロミン酸は、多くの生理的機能を有する。これらは、薬剤及び化粧品の原材料として重要である。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「シアル酸部分」は、シアル酸モノマーまたはポリマー（「多糖類」）を含み、これらは、水溶液または水性懸濁液に可溶であり、ＰＳＡ−血液凝固タンパク質コンジュゲートを薬学的有効量で投与する際に、哺乳類に副作用などの悪影響をほとんど及ぼさないか、または全く及ぼさないものである。そのポリマーは、一態様では、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個のシアル酸単位を有するとして特徴付けられる。特定の態様では、様々なシアル酸単位が鎖に結合される。
【０２０７】
一部の実施形態では、多糖類化合物のシアル酸部分の親水性が高く、別の実施形態では化合物全体の親水性が高い。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基によって付与され、ヒドロキシル基によっても同様に付与される。糖単位は、アミン基、ヒドロキシル基、もしくは硫酸基、またはそれらの組み合わせなどの他の官能基を含んでもよい。これらの基は、天然に存在する糖化合物に存在してもよく、誘導体の多糖類化合物に導入されてもよい。
【０２０８】
天然に存在するポリマーＰＳＡは、幅広いサイズ分布（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃ−５７６２）と高い多分散性（ＰＤ）とを示す多分散調製物として使用可能である。多糖類は通常、エンドトキシンを共精製するという固有のリスクを持つバクテリアで産生されるため、長いシアル酸ポリマー鎖の精製によって、エンドトキシン含有量が増加する可能性を高める恐れがある。１個〜４個のシアル酸単位を有する短いＰＳＡ分子を合成して調製することもでき（Ｋａｎｇ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２２７−８；Ｒｅｓｓ  ＤＫ  ａｎｄ  Ｌｉｎｈａｒｄｔ  ＲＪ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２００４；１：３１−４６）、したがって、エンドトキシンレベルが高くなるというリスクを最小限にすることができる。一方で、狭いサイズ分布と低い多分散性を有し、エンドトキシンも含まれていないＰＳＡ調製物を、現在では製造することができる。本開示の特定用途の多糖類化合物は、一態様では、バクテリアによって産生されたものである。これらの天然に存在する多糖類の一部は、糖脂質として知られている。一部の実施形態では、多糖類化合物は、末端ガラクトース単位を実質的に含まない。
【０２０９】
一部の実施形態では、ＰＳＡは、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のシアル酸残基を介してＣ１−ＩＮＨにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の１つ以上のシアル酸残基を酸化した後に、ＰＳＡがシアル酸残基にコンジュゲートされる。
【０２１０】
一部の実施形態では、ＰＳＡは酸化したシアル酸にオキシム結合を介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＰＳＡは酸化したシアル酸にヒドラゾン結合を介してコンジュゲートされる。
【０２１１】
Ｃ１−ＩＮＨタンパク質は、本発明に従って様々なレベルでＰＳＡとコンジュゲートされ得る。例えば、ＰＳＡ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比は、約５：１〜１００：１、約１０：１〜１００：１、約１５：１〜１００：１、約２０：１〜１００：１、約２５：１〜１００：１、約３０：１〜１００：１、約４０：１〜１００：１、約５０：１〜１００：１、約１０：１〜９０：１、約１０：１〜８０：１、約１０：１〜７０：１、約１０：１〜６０：１、約１０：１〜５０：１、約１０：１〜４０：１、約１５：１〜３５：１、または約２０：１〜３０：１の範囲になり得る。一部の実施形態では、ＰＳＡ：Ｃ１−ＩＮＨのモル比は、少なくとも約１：１、少なくとも約５：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約４５：１、または少なくとも約５０：１であり得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、ＰＳＡ：シアル酸のモル比は、少なくとも約１：１、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：１５、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：２５、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：３５、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：４５、少なくとも約１：５０である。一部の実施形態では、ＰＳＡ：シアル酸のモル比は、約１：１〜１：５０、約１：１〜１：４５、約１：１〜１：４０、約１：１〜１：３５、約１：１〜１：３０、約１：１〜１：２５、約１：１〜１：２０、約１：１〜１：１５、約１：１〜１：１０、または約１：１〜１：５である。
【０２１３】
延長された半減期
本発明によると、コンジュゲーション（例えば、ＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）によって、Ｃ１−ＩＮＨのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が延びる。コンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨは、コンジュゲートされていない（例えば非ＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲートされていない）Ｃ１−ＩＮＨよりも長い半減期を有するのが一般的である。一部の実施形態では、コンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１−ＩＮＨタンパク質に匹敵するか、またはそれよりも長い半減期を有する。一部の実施形態では、コンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨの半減期は、血漿由来Ｃ１−ＩＮＨタンパク質の半減期の約８０％〜５００％、９０％〜５００％、１００％〜５００％、１１０％〜５００％、１２０％〜５００％、８０％〜４００％、９０％〜３００％、１００％〜３００％、１００％〜２５０％、１００％〜２００％、または１００％〜１５０％の範囲内である。
【０２１４】
一部の実施形態では、コンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨタンパク質の半減期は、少なくとも約７０時間、７５時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１０５時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１４５時間、１５０時間、１５５時間、１６０時間、１６５時間、または１７０時間である。一部の実施形態では、コンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨのｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期は、約２日以上、２．５日以上、３日以上、３．５日以上、４日以上、４．５日以上、５日以上、５．５日以上、６日以上、６．５日以上、７日以上、７．５日以上、８日以上、８．５日以上、９日以上、９．５日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上である。一部の実施形態では、コンジュゲート（例えばＰＥＧ化またはＰＳＡコンジュゲート）されたＣ１−ＩＮＨタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期は、約０．５日〜１４日、０．５日〜１０日、１日〜１０日、１日〜９日、１日〜８日、１日〜７日、１日〜６日、１日〜５日、１日〜４日、１日〜３日、２日〜１０日、２日〜９日、２日〜８日、２日〜７日、２日〜６日、２日〜５日、２日〜４日、２日〜３日、２．５日〜１０日、２．５日〜９日、２．５日〜８日、２．５日〜７日、２．５日〜６日、２．５日〜５日、２．５日〜４日、３日〜１０日、３日〜９日、３日〜８日、３日〜７日、３日〜６日、３日〜５日、３日〜４日、３．５日〜１０日、３．５日〜９日、３．５日〜８日、３．５日〜７日、３．５日〜６日、３．５日〜５日、３．５日〜４日、４日〜１０日、４日〜９日、４日〜８日、４日〜７日、４日〜６日、４日〜５日、４．５日〜１０日、４．５日〜９日、４．５日〜８日、４．５日〜７日、４．５日〜６日、４．５日〜５日、５日〜１０日、５日〜９日、５日〜８日、５日〜７日、５日〜６日、５．５日〜１０日、５．５日〜９日、５．５日〜８日、５．５日〜７日、５．５日〜６日、６日〜１０日、７日〜１０日、８日〜１０日、９日〜１０日、１０日〜１１日、１１日〜１２日、１２日〜１３日、１３日〜１４日の範囲である。
【０２１５】
医薬組成物
本発明は、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨと生理学的に許容される担体とを含有する医薬組成物をさらに提供する。担体とコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨタンパク質は、通例、無菌状態であり、投与様式に適するように製剤化される。
【０２１６】
好適な薬学的に許容される担体として、以下に限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、またはデンプンなど）、糖（マンニトール、スクロース、またはその他など）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、及びこれらの組み合わせが挙げられる。医薬製剤は、必要に応じて、活性化合物と有害な反応を起こさないか、またはそれらの活性を妨げない助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色料、香味料、及び／または芳香剤など）と混合され得る。好ましい実施形態では、静脈内投与に適した水溶性担体が用いられる。
【０２１７】
所望に応じて、好適な医薬組成物または薬剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末であり得る。組成物はまた、従来の結合剤及び担体（トリグリセリドなど）を用いて座薬としても製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【０２１８】
医薬組成物または薬剤は、ヒトに対する投与に適した医薬組成物として、慣行的な手順に従って製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝溶液であるのが典型的である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔薬を含んでもよい。一般的に、成分は、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性作用剤の量を提示するアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器に、別々に、または単位剤形の形態で混合されて供給される。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌医薬品グレードの水、食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入瓶を用いて調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合、注射用の無菌水か、または食塩水のアンプルを供給することができ、投与に先立って成分を混合できるようにする。
【０２１９】
本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、中性形態または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、その他の由来の塩などの遊離アミノ基で形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、その他の由来の塩などの遊離カルボキシル基で形成される塩が挙げられる。
【０２２０】
好ましい製剤は、５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）と、５０ｍＭのソルビトールと、１５０ｍＭのグリシンとを含む。製剤は液体であってもよく、または凍結乾燥され、投与前に元に戻されてもよい。
【０２２１】
投与経路
本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨ（または本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含有する組成物または薬剤）は、任意の適正な経路により投与される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、全身に投与される。全身投与は、静脈内、皮内、頭蓋内、鞘内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内、経口、及び／または経粘膜的投与であり得る。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、皮下に投与される。本明細書で使用される場合、用語「皮下組織」は、皮膚直下の疎性不規則性結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、組成物を、以下に限定されないが、大腿部、腹部、殿部、または肩甲部を含めた領域に注射することによって行われ得る。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、経口投与される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、頭蓋内に投与される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、髄腔内に投与される。所望の場合には、２つ以上の経路を同時に用いることができる。
【０２２２】
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、皮下（すなわち皮膚下）投与により対象に投与される。かかる目的に対して、シリンジを用いて製剤を注射してもよい。しかしながら、注射デバイス（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（商標）デバイス及びＧｅｎｊｅｃｔ（商標）デバイス）、注射ペン（ＧｅｎＰｅｎ（商標）など）、無針デバイス（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（商標）及びＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（商標））、ならびに皮下パッチ送達系といった製剤投与用の他のデバイスが使用可能である。それゆえに、本発明は、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む医薬組成物（例えば、液体形態及び凍結乾燥された形態）と、シリンジなどの注射デバイスと、を備えたキットをさらに提供する。一部の実施形態では、シリンジには、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む医薬組成物が予め担持されている。医薬組成物が凍結乾燥されている場合、キットは再調整用の緩衝溶液をさらに含み得る。
【０２２３】
本発明は、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物の治療有効量の単回投与及び複数回投与を企図している。コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物は、対象の症状（例えば、遺伝性血管性浮腫）の性質、重症度、及び程度に応じて規則的な間隔で投与され得る。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨまたはそれを含有する医薬組成物の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か月に１回）、毎月（月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週、毎日、または連続して）、周期的に投与することができる。
【０２２４】
一部の実施形態では、投与により個体において単に局所的効果を得るだけであるが、他の実施形態では、投与により個体の複数の部位にわたる効果（例えば、全身効果）を得る。投与の結果、通例、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨが１つ以上の標的組織に送達される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、以下に限定されないが、心臓、脳、皮膚、血液、脊髄、横紋筋（例えば、骨格筋）、平滑筋、腎臓、肝臓、肺、及び／または脾臓を含めた１つ以上の標的組織に送達される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは心臓に送達される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは中枢神経系、特に脳及び／または脊髄に送達される。一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、腓腹筋、二頭筋、僧帽筋、三角筋、四頭筋、及び／または横隔膜に送達される。
【０２２５】
剤形及び投与レジメン
一部の実施形態では、組成物は、治療有効量で、及び／または特定の所望の結果（例えば、ＨＡＥなどの補体媒介性慢性疾患の予防）と相関する投与レジメンに従って投与される。
【０２２６】
本発明に従って投与される特定の用量または量は様々であり、例えば、所望の結果の性質及び／もしくは程度、投与経路及び／もしくはタイミングの詳細、ならびに／または１つ以上の特徴（例えば、体重、年齢、個人歴、遺伝的特徴、ライフスタイルパラメータ、心臓障害の重症度、及び／もしくは心臓障害の危険性レベルなど、またはそれらの組み合わせ）に依存する。こうした用量または量は、当業者によって決定され得る。一部の実施形態では、適正な用量または量は、標準的な臨床技術に従って決定される。別の方法として、または加えて、一部の実施形態では、適正な用量または量は、所望のまたは至適な投与用量範囲または量を特定するのに役立つ１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを通して決定される。
【０２２７】
種々の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、基礎疾患または症状を予防する、治療する、調節する、治癒する、防止する、及び／または寛解させる）のに十分な量である。一般に、治療剤（例えば、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨ）の量であって、治療剤を必要とする対象に投与される量は、対象の特徴によって決まる。このような特徴には、対象の状態、疾患重症度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な用量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。特定の一部の実施形態では、適正な投与用量または投与量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル評価系由来の用量反応曲線から外挿することができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、組成物は医薬製剤として提供される。一部の実施形態では、医薬製剤は、ＨＡＥ発作の発症率または危険性を低減させることと相関した投与レジメンに従う投与用の単位用量であるか、または該単位用量を含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む製剤は、単回投与として投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む製剤は、規則的間隔で投与される。本明細書で使用される「間隔」での投与は、治療有効量が周期的（１回限りの投与とは区別される）に投与されることを示している。間隔は、標準的な臨床技術で決定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む製剤は、隔月、毎月、月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または６時間毎に投与される。単一個体に対する投与間隔は、一定の間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて経時的に変動する可能性がある。
【０２３０】
治療上有効な量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療上有効な量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位投与量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品と組み合わせて変化し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度；使用される特定の医薬作用剤の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び／または使用される特定のＣ１−ＩＮＨの排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０２３１】
本明細書で使用される場合、用語「隔月」は２か月に１回（すなわち、２か月毎に一回）の投与を意味し、用語「毎月」は１か月に１回の投与を意味し、用語「３週間毎」は３週間に１回（すなわち３週間毎に１回）の投与を意味し、用語「隔週」は２週間に１回（すなわち、２週間毎に１回）の投与を意味し、用語「毎週」は週に１回の投与を意味し、用語「毎日」は１日に１回の投与を意味する。
【０２３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む製剤は、無期限に規則的間隔で投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨを含む製剤は、決められた期間の間、規則的間隔で投与される。
【０２３３】
任意の特定の対象について、個々の必要性および酵素補充療法の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、特定の投与計画を経時的に調整すべきであり、本明細書に記載の投与量範囲は、単なる例示であって、クレームされた発明の範囲または実施を限定するものではないことが理解されるべきである。
【０２３４】
併用療法
一部の実施形態では、コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨは、補体媒介性疾患の治療に現在用いられている１つ以上の既知の治療剤（例えば、コルチコステロイド）と併用して投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールに従って投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールと比較して変更されたレジメンに従って投与される。一部の実施形態では、こうした変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が異なる（例えば減少または増加）という点で、及び／または投与頻度が異なるという点で（例えば、単位投与間の１つ以上の間隔を長くして低頻度にするか、または間隔を短くして高頻度にしているという点で）、標準的または承認済投与レジメンとは異なっている。
【０２３５】
補体媒介性障害
コンジュゲートされたＣ１−ＩＮＨ及びそれを含有する医薬組成物を使用して、ＨＡＥ及び種々の他の補体媒介性障害を治療することができる。
【０２３６】
一部の実施形態では、本発明で提供されるコンジュゲートされたタンパク質は、補体媒介性障害（例えば、ＮＭＯＳＤ、ＡＭＲ、及びＨＡＥ事象）に関連する急性発作に好適である。これらの発作は長い場合もあり、短い場合もある。一部の実施形態では、疾患または障害は慢性的である。一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は予防的に用いられる。本明細書に開示される組成物及び方法を用いて治療され得る補体媒介性疾患の例として、以下に限定されないが、遺伝性血管性浮腫、抗体関連型拒絶反応、視神経脊髄炎関連疾患、外傷性脳損傷、脊椎損傷、虚血性脳損傷、火傷、中毒性表皮壊死症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチーが挙げられる。
【実施例】
【０２３７】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の実施例において明らかになる。しかしながら、本実施例は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のためであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、本実施例から当業者に明らかになるであろう。
【０２３８】
実施例１．Ｃ１−ＩＮＨのＰＥＧ化
本実施例は、Ｃ１−ＩＮＨタンパク質のＰＥＧ化に適した方法の例を示している。３つの異なるＰＥＧ化戦略を検討した。ＰＥＧ化スキームの例を図３〜図５に示す。これらは、ＰＥＧのシアル酸残基へのコンジュゲーション（シアル酸媒介性（ＳＡＭ）化学作用）、ＰＥＧのガラクトース酸残基へのコンジュゲーション（ガラクトース媒介性（ＧＡＭ）化学作用）、ＰＥＧのアミン媒介性コンジュゲーションとした。
【０２３９】
アミノキシＰＥＧは、さらに安定したオキシム結合を形成するために用いた。ＰＥＧ化を、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＳＨ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｉｔｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ  ２０１３，１５４（３）：１３７３−１３８３に記載された方法に基づいて開発された方法で行った。
【０２４０】
グリコシル化タンパク質にシアル酸残基が露出していると、通例、シアル酸残基がほとんどないかまたは全くないタンパク質に比べて半減期が増加するが、炭水化物鎖に末端ガラクトース残基があると、受容体媒介性クリアランスが生じ、タンパク質の血清半減期を減少させることが知られている。したがって、Ｃ１−ＩＮＨの受容体媒介性クリアランスを阻止するために、まず初めにＧＡＭのＰＥＧコンジュゲーションに注力した。３つのアプローチの全てが有望であると思われたが、驚くべきことに、アミンとＳＡＭのＰＥＧ化は、効力については最小限の許容できる損失でありつつ、最大限のＣ１−ＩＮＨのＰＥＧ化をもたらすことがわかった。ＧＡＭのＰＥＧ化は、比較すると、あまり効果的ではなく、不均一性が高かった。
【０２４１】
最初のｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＫ試験を行い、ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを評価した。具体的には、ラットＰＫ試験において、ＳＡＭの５ＫＤａ及び４０ＫＤａのＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを、アミノＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨと比較した。図６のパネルＡ〜パネルＣを参照されたい。ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを、Ｃ１−ＩＮＨを用いた抗原アッセイで定量して、検量線を作成した。また、サンプルをウェスタンブロットで分析して、分解の可能性を調べた。１ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与と３ｍｇ／ｋｇの投与は、ヒトにおけるＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）の範囲内（２〜３ｍｇ／ｋｇ）とした。これらの試験により、ＰＥＧ化タンパク質は、半減期が３〜４倍増加することがわかったが、これはクリアランスの低減に起因すると考えられる。
【０２４２】
Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧを用いて、さらなる薬物動態試験を、雄のＳＤラットに１ｍｇ／ｋｇを静脈内投与することにより行った。これらのデータを以下の表１に示している。
【表２】
2019513724.tif 000022
表１．雄のスプレーグ・ドーリー（ＳＤ）ラットに静脈内投与されたＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧの薬物動態パラメータ。
【０２４３】
さらに、ＮＨＰ試験において、皮下の生物学的利用度が約３０〜４０％であることが観察され、これは意外にも、コンジュゲートされていない組換えＣ１−ＩＮＨタンパク質に比べて改善されていた。
【０２４４】
したがって、ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨは、半減期を増加させ、かつ治療用途に適するに足る生物学的利用度を有すると考えられる。
【０２４５】
実施例２．ＰＥＧ化プロトコルの例
プロセスＡ
精製したＣ１−ＩＮＨを１００ｍＭ酢酸ナトリウムにｐＨ５．６で透析した。過ヨウ素酸酸化を４℃で３０分間行った。反応をグリセロールを用いて４℃で１５分間クエンチした。酸化されたＣ１−ＩＮＨを酢酸緩衝液に透析した。続いて、その物質を４℃で一晩ＰＥＧ化した後に、グリシンによるクエンチを行った。遊離ＰＥＧを陰イオン交換により除去した。プロセスＡの例示的な概略図を図７に示す。
【０２４６】
プロセスＡにより調製されたＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ４０ＫＤａを、以下の方法を用いてさらに精製した。
【０２４７】
Ｃ１−ＩＮＨにコンジュゲートされた４０ＫＤａのＰＥＧアミンのうちの約１ｍｇを、サンプル希釈緩衝液（ｐＨ７．００で５ｍＭのＮａＰＯ４）を用いて２０倍に希釈した。得られた溶液は、０．７１６ｍＳ／ｃｍの導電率を示した。サンプルを１０ｍＬのＧｉｇａＣａｐ  Ｑ（６５０）カラムＸＫ１６に負荷した。全プロセスを通して流速を１５０ｃｍ／時間とした。カラムをサンプル希釈緩衝液を用いてよく洗浄し、タンパク質を５００ｍＭのＮａＣｌまでの１０カラム容量勾配により溶出した。２ｍＬの画分を採取し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クロマトグラフィーの結果を図１１に示している。次に、ピーク画分をプールし、製剤緩衝液（５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ＝７．１）、１５０ｍＭグリシン、５０ｍＭソルビトール）に透析し、１．０ｍｇ／ｍｌ以上になるまで濃縮し、２８０ｎｍ吸光度で定量した（Ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ）。
【０２４８】
同様の精製をＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ２０ＫＤａ調製物で行った結果を図１２に示し、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ５ＫＤａ調製物で行った結果を図１３に示す。
【０２４９】
全てのサンプルの定量を、Ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ装置で、タンパク質のアミノ酸配列から得られる吸光係数と分子量とを用いて行った。その結果を以下の表２に示している。
【表３】
2019513724.tif 000023
【０２５０】
プロセスＢ
精製したＣ１−ＩＮＨを、ＴＦＦ緩衝液交換を介して１００ｍＭの酢酸ナトリウムにｐＨ５．６で交換した。過ヨウ素酸酸化を室温で３０分間行った。過ヨウ素酸を４０×のモル過剰で供給した。最大４ｍｇ／ｍＬまで、Ｃ１−ＩＮＨが反応に含まれた。反応をグリセロールを用いて室温で１５分間クエンチした。続いて、その物質を室温で一晩ＰＥＧ化した。ＰＥＧを１００×のモル過剰で供給した。最大２ｍｇ／ｍＬまで、Ｃ１−ＩＮＨが反応に含まれた。遊離ＰＥＧをＴＦＦ緩衝液交換により除去した。プロセスＢの例示的な概略図を図８に示す。
【０２５１】
ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨに好適なＰＥＧ化プロトコルの他の例を図９Ａ〜図９Ｅにまとめている。
【０２５２】
ＳＡＭプロセス−ＰＥＧ５Ｋ
このプロセスでは、オクチル充填剤（トリス／硫酸アンモニウム溶液中の約０．９ｍｇ／ｍｌＣ１−ＩＮＨ）の約２００ｍＬを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ、Ｂｉｏｍａｘ  ３０ｋＤａ（ＰＥＳ）ＴＦＦカセットを用いて１０×ダイア容量交換で、１００ｍＭの酢酸ナトリウムにｐＨ５．６で緩衝液交換した。４０μＭのＣ１−ＩＮＨ（３．７ｍｇ／ｍｌ）を１．６ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム（４０×）と共に室温で３０分間、穏やかに攪拌しながら処理した（５０ｍＬ反応液、１００ｍＭ酢酸ナトリウム中、ｐＨ５．６）。反応を１．５％グリセロールを用いて室温で１５分間クエンチした。
【０２５３】
２１．６μＭのＣ１−ＩＮＨ（２ｍｇ／ｍｌ）を２．１６ｍＭの５ｋＤａ−ＰＥＧ（１００×）と共に室温で一晩、穏やかに攪拌しながら処理した（９２．５ｍＬ反応液、１００ｍＭ酢酸ナトリウム中、ｐＨ５．６）。続いて反応を２．１６ｍＭのグリシン（１００×）を用いて室温で１時間クエンチした。
【０２５４】
遊離ＰＥＧのＴＦＦダイアフィルトレーション除去を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ、Ｂｉｏｍａｘ  １００ｋＤａ  ＭＷＣＯ（ＰＥＳ）ＴＦＦカセットを用いて、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭグリシン、及び５０ｍＭソルビトールへの１０×ダイア容量交換でｐＨ７．１にて行った。次に、生成物を、０．２２μｍ、ＰＥＳ、ミリポアステリフリップフィルターを用いてフィルター滅菌した。ＰＥＧ化サンプルのＩＣ５０を図１０のパネルＡ〜パネルＢ、図２０のパネルＡ〜パネルＢに示す。
【０２５５】
各プロセス工程後の収率を以下の表３に示している。
【表４】
2019513724.tif 000024
【０２５６】
ＳＡＭプロセス−ＰＥＧ直鎖２Ｋ、５Ｋ、分岐鎖５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ
ＳＡＭプロセスを同様に用いて、次の種のＰＥＧ：直鎖２Ｋ、直鎖５Ｋ、分岐鎖５Ｋ、分岐鎖１０Ｋ、分岐鎖２０Ｋ、及び分岐鎖４０Ｋを用いてＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧを調製した。
【０２５７】
ＰＥＧ２Ｋ、５Ｋ、及び１０ＫでＰＥＧ化されたＣ１−ＩＮＨを、アミコン遠心フィルター（カットオフ３０Ｋ）で精製した。遊離ＰＥＧを除去するために、ＰＥＧ−アミノキシ２０Ｋまたは４０ＫでＰＥＧ化されたＣ１−ＩＮＨをＡＫＴＡシステムで精製した。Ｃ１−ＩＮＨの特性を図１８のパネルＡ〜パネルＥに示す。ＳＡＭプロセスにより生成したＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧを、純度及び効力についてアッセイし、ＰＫをラットモデルで評価した。これらのデータを図１９のパネルＡ〜パネルＣに示す。ＰＥＧ化サンプルのさらなる特性及びＩＣ５０値を図２４のパネルＡとパネルＢに示している。
【０２５８】
Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ生成のためのＳＡＭのＰＥＧ化条件を以下の表4に示す。
【表５】
2019513724.tif 000025
【０２５９】
アミンカップリングプロセスによるＰＥＧ化
Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧを同様にアミンカップリングプロセスで調製した。アミノカップリングプロセスによるＰＥＧ化の例の略図を図２１に示す。
【０２６０】
ＰＥＧ１Ｋ、直鎖５Ｋ、及び分岐鎖５ＫでＰＥＧ化されたＣ１−ＩＮＨをアミコン遠心フィルターで精製した（カットオフ３０Ｋ）。バリウム−ヨウ素染色を用いてＰＥＧ５Ｋ部分に対する遊離ＰＥＧを検出し、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して遊離ＰＥＧ１Ｋ及び２Ｋを検出した。ＮＨＳ−ＰＥＧ２０Ｋ及び４０ＫでＰＥＧ化されたＣ１−ＩＮＨを、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステムにより精製した。ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨの特性を図２２のパネルＡ〜パネルＤに示す。
【０２６１】
アミンカップリングプロセスにより生成されたＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧを、純度、効力についてアッセイし、ＰＫをラットモデルで評価した。これらのデータを図２３のパネルＡ〜パネルＣに示す。
【０２６２】
アミンカップリングプロセスによるＣ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ生成のためのＰＥＧ化条件を以下の表５に示す。
【表６】
2019513724.tif 000026
【０２６３】
実施例３：ＩＶ投与されたＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨの非ヒト霊長類ＰＫ試験
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（カニクイザル）を２つのグループに分け、組換えヒトＣ１−ＩＮＨ（ｒｈＣ１−ＩＮＨ）を３０ｍｇ／ｋｇで、またはＰＥＧ化ｒｈＣ１−ＩＮＨを５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。試験結果の例を図１４及び表６にまとめている。
【０２６４】
ＮＨＰでは、ＰＥＧ化されたｒｈＣ１−ＩＮＨは、ｒｈＣ１−ＩＮＨに比べて６倍低いクリアランスと、３倍長い終末相半減期とを示した。また、同様の傾向がラット試験で観察されており、クリアランスが４倍低減し、半減期が４倍増加した。
【表７】
2019513724.tif 000027
【０２６５】
Ｃ１−ＩＮＨをＩＶ投与されたＮＨＰのＰＫにＰＥＧの負荷が及ぼす影響
さらなるＰＫ試験をＮＨＰで行った。ＮＨＰに、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧを５×、１０×、２０×、及び４０×の負荷でＩＶ投与した。例示的な結果を図１５に示す。
【０２６６】
実施例４：ＮＨＰのＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨのＩＶ  ＰＫ対ＳＣ  ＰＫ
ＮＨＰを２つのグループに分け、ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与するか、またはＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨを１０ｍｇ／ｋｇで皮下（ＳＣ）投与した。この試験結果を図１６及び表７にまとめている。ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨの機能活性（ＳＡ＝４．８Ｕ／ｍｇ）は、この試験の時間的経過にわたって維持されていた。
【０２６７】
重要なことには、また意外にも、ＮＨＰでは、ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨは８５％の生物学的利用度を示し、半減期はＩＶ投与の半減期と同様であった。これまでに収集した前臨床データによって、週に１回またはそれよりもさらに少ない頻度での投与の可能性が裏付けられる。
【表８】
2019513724.tif 000028
【０２６８】
実施例５：最大化されたＰＫプロファイルに対する極わずかなＰＥＧを評価するための酸化／滴定
用いたＤＴ−１２１５力価アッセイは、ＥＬＩＳＡベースの方法であり、これは、血清サンプルからＰＥＧ−ｒＣ１−ＩＮＨタンパク質を抗ＰＥＧ抗体を用いて捕捉するものである。次に、そのタンパク質を標識化された抗Ｃ１−ＩＮＨタンパク質を用いて検出した。ＰＥＧ−ｒＣ１−ＩＮＨを用いて、検量線を作成した。図１７は、ＤＴ−１２１５力価分析の結果と、サンプルの比活性とを示している。表８及び表９にさらなるデータを示している。
【表９】
2019513724.tif 000029
【表１０】
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【０２６９】
実施例６：ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨの物理的特性
ＰＥＧ化調製物の純度をＳＥＣ及びＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて分析した。０．１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−Ｃ１−ＩＮＨタンパク質のＣＤスペクトルを２５℃で測定した。ＣＤデータをＡＶＩＶソフトウェア及びＣＤＮＮソフトウェアを用いて処理した。ＣＤスペクトル及び二次構造分析によると、タンパク質がＰＥＧ化された場合に、いかなる有意な変化も観察されていない。Ｃ１−ＩＮＨのＣ末端結晶構造（２ＯＡＹ）によると、２７％がヘリックスであり、３０％がベータシートである。
【表１１】
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【０２７０】
ＰＥＧ化Ｃ１−ＩＮＨの融解温度（Ｔｍ）をｎａｎｏＤＳＦにより測定した。ＰＥＧ化はＣ１−ＩＮＨの熱安定性を劇的に変化させることはないことがわかった。４０ＫＤａアミノＰＥＧ化されたＣ−ＩＮＨのＴｍの測定では、他の評価されたコンジュゲートよりも２℃高くなっていた。そのデータを表１１に示している。
【表１２】
2019513724.tif 000032
【０２７１】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて、ＰＥＧ化レベルを特性を明らかにした。アミンのＰＥＧ化率は低く、１つのＣ１−ＩＮＨ当たり約３つのＰＥＧ部分であった。シアル酸を重度にＰＥＧ化して、５ＫＰＥＧ反応物に対して飽和状態にすることが可能である。シアル酸の４０ＫＰＥＧ化は、１分子当たり約９つのＰＥＧに達することになる。異なる過ヨウ素酸濃度でＰＥＧ化レベルを定量した。そのデータを表１２に示している。
【表１３】
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【０２７２】
実施例７：Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＳＡの特性
Ｃ１−ＩＮＨを、シアル酸媒介性（ＳＡＭ）プロセスを用いて、ポリシアル酸（ＰＳＡ）でコンジュゲートした。ＳＡＭプロセスで生成されるＣ１−ＩＮＨ−ＰＳＡの特性について、純度及び効力に対してアッセイした。これらのデータを図２４のパネルＡ〜パネルＢに表示している。このデータが示すのは、遊離ＰＳＡは効力のアッセイそれ自体を妨害することはないが、ここで評価されているＰＳＡ：Ｃ１−ＩＮＨの条件下では、Ｃ１−ＩＮＨ効力が約４〜７倍減少する。
【０２７３】
ＰＫ試験を、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＳＡ、Ｃ１−ＩＮＨ−ＰＥＧ、及びＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）−ＰＥＧを用いてラットで行った。そのデータを図２５のパネルＡ〜パネルＣに示す。
【０２７４】
等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験方法を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１】
2019513724.tif 000034
【図２】
2019513724.tif 000035
【図３】
2019513724.tif 000036
【図４】
2019513724.tif 000037
【図５】
2019513724.tif 000038
【図６】
2019513724.tif 000039
【図７】
2019513724.tif 000040
【図８】
2019513724.tif 000041
【図９】
2019513724.tif 000042
【図１０−１】
2019513724.tif 000043
【図１０−２】
2019513724.tif 000044
【図１１】
2019513724.tif 000045
【図１２】
2019513724.tif 000046
【図１３】
2019513724.tif 000047
【図１４】
2019513724.tif 000048
【図１５】
2019513724.tif 000049
【図１６】
2019513724.tif 000050
【図１７】
2019513724.tif 000051
【図１８−１】
2019513724.tif 000052
【図１８−２】
2019513724.tif 000053
【図１８−３】
2019513724.tif 000054
【図１８−４】
2019513724.tif 000055
【図１９−１】
2019513724.tif 000056
【図１９−２】
2019513724.tif 000057
【図２０−１】
2019513724.tif 000058
【図２０−２】
2019513724.tif 000059
【図２０−３】
2019513724.tif 000060
【図２１】
2019513724.tif 000061
【図２２−１】
2019513724.tif 000062
【図２２−２】
2019513724.tif 000063
【図２２−３】
2019513724.tif 000064
【図２３−１】
2019513724.tif 000065
【図２３−２】
2019513724.tif 000066
【図２４−１】
2019513724.tif 000067
【図２４−２】
2019513724.tif 000068
【図２５−１】
2019513724.tif 000069
【図２５−２】
2019513724.tif 000070
【配列表】
2019513724000001.app
【国際調査報告】
2019513724.tif 000071
2019513724.tif 000072