(57)【要約】  本開示は、複数の標的化核酸ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリ構築法を提供する。標的化ＦＩＳＳＥＱは、ＦＩＳＳＥＱによる「ランダム」又は「ホールオミック（ｗｈｏｌｅ−ｏｍｉｃ）」な検出と比較して、標的種のヌクレオチド配列の検出、同定、定量化及び／又は判定においての感度の増強及び／又はアッセイ時間の短縮など、複数の利点を示し得る。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は細胞マトリックスにおけるハイブリダイゼーション反応を増強するための方法であって、
（ａ）前記細胞又は前記細胞マトリックス、並びに反応混合物を準備すること、
ここで、前記反応混合物は、（ｉ）標的核酸分子、（ｉｉ）前記標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有するプローブ、及び（ｉｉｉ）ポリマー骨格を含むハイブリダイゼーション反応増強剤を含み、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、前記標的核酸分子と前記標的分子の前記標的配列に対する配列相補性を有する前記プローブとの間のハイブリダイゼーション反応の速度を増強し、前記ハイブリダイゼーション増強剤は、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤の不活性化を促進する官能基を含む；並びに、
（ｂ）前記標的核酸分子と前記標的核酸分子の前記標的配列に対する配列相補性を有する前記プローブとの間の前記ハイブリダイゼーション反応を実行するのに十分な条件を、前記反応混合物に適用すること、
ここで、前記ハイブリダイゼーション反応中、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤の非存在下で前記標的核酸分子と前記プローブとの間で実行される別のハイブリダイゼーション反応と比較して、前記標的核酸分子と前記標的分子の前記標的配列に対する配列相補性を有する前記プローブとの間の前記ハイブリダイゼーション反応の前記速度を増強する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ｂ）の後に、前記官能基に、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤を不活性化するのに十分な条件を適用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイゼーション反応増強剤を不活性化することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酵素反応を開始させることをさらに含み、前記酵素反応は、逆転写、ライゲーション、ＤＮＡ重合を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記官能基が水和性基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水和性基が、イオン性基、電解質基又は親水性基である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーション反応増強剤が、前記ポリマー骨格と前記水和性基との間に切断可能なリンカーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記切断可能なリンカーが、α−ヒドロキシ酸、β−ケト酸、ジスルフィド結合、又は他の種類の化学結合を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記官能基が切断可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記官能基の切断を誘起することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記官能基を洗浄除去することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酵素反応を開始させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイゼーション増強剤が、さらに、前記酵素反応を増強するように構成されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素反応が、逆転写、ライゲーション、ＤＮＡ重合を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
イオン性基に中性の電荷を持たせることにより、又は水和性基を弱水和状態にすることにより、前記官能基が選択的に不活性化されるように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞又は前記細胞マトリックスがヒドロゲルに組み込まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応混合物が緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝剤が塩を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝剤が、オフターゲット配列へのプローブの非特異的結合を低減するように構成されたブロッキング剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝剤が、ＤＮＡのアニーリング特性を変化させるように構成された薬剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマー骨格がイオン性ポリマー骨格である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ハイブリダイゼーション増強剤が、ポリイオン性ポリマー、高分子電解質ポリマー、親水性ポリマー又は水和性ポリマーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞の１又は複数の標的核酸分子のｉｎ  ｓｉｔｕ核酸配列検出用又は同定用のプローブセットであって、
前記プローブセットは、複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含む複数のプローブを含み、
前記複数のプローブのうちの１つであるプローブは、（ｉ）前記細胞の前記１又は複数の標的核酸分子のうちの１つである標的核酸分子の標的配列に相補的な前記複数の標的特異的配列のうちの１つである配列；（ｉｉ）前記配列に連結し、前記複数のアダプター配列のうちの１つであるアダプター配列、ここで、前記アダプター配列は増幅反応用のプライマー用の結合部位を含む；及び、（ｉｉｉ）前記アダプター配列に連結し、前記複数のバーコード配列のうちの１つであるバーコード配列、ここで、前記バーコード配列は前記標的配列又は前記標的核酸分子の前記少なくとも前記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、前記複数のバーコード配列は前記複数のプローブの間で異なっている；
を含む、前記プローブセット。
【請求項２４】
前記バーコード配列が、特定の遺伝子に対応する遺伝子バーコードを含み、
前記遺伝子バーコードが、特定の遺伝子の検出を可能にするように構成された、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項２５】
前記バーコード配列が、標的領域に相補的な配列に対応する配列バーコードをさらに含み、
前記配列バーコードが、前記配列の検出を可能にするように構成されている、請求項２４に記載のプローブセット。
【請求項２６】
前記遺伝子バーコードが、前記バーコード配列の第一の配列集合によって規定され、
前記配列バーコードが、前記バーコード配列の残りの配列集合によって規定される、請求項２５に記載のプローブセット。
【請求項２７】
前記複数のバーコード配列が、種々の標的核酸分子の種々の標的配列の同定を可能にする、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項２８】
前記複数のアダプター配列が前記複数のプローブの間で同じである、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項２９】
前記アダプター配列が、前記増幅反応を実行するためのプライマーに相補的である、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項３０】
前記増幅反応がローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応である、請求項２９に記載のプローブセット。
【請求項３１】
前記複数のバーコード配列のうちの１つのバーコード配列が、前記１つの標的領域の所定の配列の同定を可能にする、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項３２】
前記１つのアダプター配列が、前記核酸分子に相補的な１つの配列と前記バーコードとの間に位置する、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項３３】
前記１つのバーコード配列が、前記複数の標的特異的配列のうちの前記１つの配列と前記１つのアダプター配列との間に位置する、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項３４】
前記標的核酸分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）であり、
前記複数の配列のうちの前記１つの配列が、逆転写をプライミングするように構成された、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項３５】
前記複数の標的特異的配列のうちの前記１つ配列が各プローブの３’末端に位置する、請求項３４に記載のプローブセット。
【請求項３６】
前記複数の標的特異的配列のうちの前記１つの配列、前記アダプター配列、及び前記バーコード配列が前記１つのプローブの３’末端から５’末端へ向かって連続して配置されている、請求項３５に記載のプローブセット。
【請求項３７】
前記１つのプローブの５’末端がリン酸化されている、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項３８】
前記１つのプローブを核酸配列にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を生成すること、及び前記ハイブリダイゼーション産物を環状化すること、及び増幅反応を介して前記プローブライブラリを作製すること、を含む、請求項２３に記載の所定のプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕ核酸検出のためのプローブライブラリを作製する方法。
【請求項３９】
ハイブリダイゼーション産物を環状化することが、前記プローブが前記核酸配列にアニールしているときにリガーゼにより環状化することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ハイブリダイゼーション産物を環状化することが、前記核酸配列と独立した追加のスプリントオリゴヌクレオチドを用いてリガーゼにより環状化することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ハイブリダイゼーション産物を環状化することが、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はリガーゼの補助により前記プローブにおけるギャップを充填することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸配列が、リボ核酸（ＲＮＡ）配列又は相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸配列がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数のプローブが直鎖状プローブである、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項４５】
前記複数のプローブが環状プローブである、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項４６】
前記複数のプローブが分子反転プローブを含む、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項４７】
前記複数のプローブがパドロックプローブを含む、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項４８】
前記複数のプローブのうちの前記１つのプローブがプロセシング部位をさらに含む、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項４９】
前記プロセシング部位が追加の増幅領域を含む、請求項４８に記載のプローブセット。
【請求項５０】
前記追加の増幅領域がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を含む、請求項４９に記載のプローブセット。
【請求項５１】
前記プロセシング部位が追加の切断部位を含む、請求項４８に記載のプローブセット。
【請求項５２】
前記追加の切断部位を介して追加の増幅領域を切断除去することを含む、請求項５１に記載の複数のプローブを成熟させる方法。
【請求項５３】
前記複数のプローブのうちの前記１つのプローブが、環状化されるのに十分な長さを有する、請求項２３に記載のプローブセット。
【請求項５４】
前記十分な長さが３５ヌクレオチド長以上である、請求項５３に記載のプローブセット。
【請求項５５】
請求項２３に記載の複数のプローブのうちの前記１つのプローブを核酸配列にハイブリダイズさせること、及び
前記配列を枯渇させること、
を含む、請求項２３に記載の複数のプローブのうちの前記１つのプローブを用いて標的配列を枯渇させる方法。
【請求項５６】
前記枯渇がリボヌクレアーゼＨ消化を介して行われる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記枯渇がＣａｓ９又は他のタンパク質核酸複合体を介して行われる、請求項５５に記載の方法セット。
【請求項５８】
細胞の１又は複数の標的核酸分子をｉｎ  ｓｉｔｕ核酸配列検出又は同定するための方法であって、
（ａ）前記１又は複数の標的核酸分子及び複数のプローブを含む反応混合物を準備することであって、前記複数のプローブは複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含み、前記複数のプローブのうちの１つであるプローブは、（ｉ）前記１又は複数の標的核酸分子のうちの１つである標的核酸分子の標的配列に相補的な前記複数の標的特異的配列のうちの１つである配列；（ｉｉ）前記配列に連結し、前記複数のアダプター配列のうちの１つであるアダプター配列、ここで、前記アダプター配列は前記１つの配列が前記標的配列にハイブリダイズしたときに前記１つのプローブ上で増幅反応を行うためのものである；及び、（ｉｉｉ）前記アダプター配列に連結し、前記複数のバーコード配列のうちの１つであるバーコード配列、ここで、前記バーコード配列は前記標的配列又は前記標的核酸分子の前記少なくとも前記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、前記複数のバーコード配列は前記複数のプローブの間で異なっている、前記バーコード配列、を含む、前記準備すること；
（ｂ）前記反応混合物に、前記１つの配列を前記標的配列にハイブリダイズさせるのに十分な条件を適用すること；並びに
（ｃ）前記バーコードを用いて、前記標的配列又は前記標的核酸分子の前記少なくとも前記一部を検出又は同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項５９】
（ｃ）の前に、前記１つの配列が前記標的配列にハイブリダイズしたときに、前記１つのプローブに対して前記増幅反応を行うことをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的核酸分子がリボ核酸分子であり、
（ｂ）が、前記１つの配列に対して逆転写増幅を行うことで、前記１つのプローブの増幅産物として相補的デオキシリボ核酸分子を得るのに十分な条件を、前記１つの配列に適用することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記バーコード配列が、特定の遺伝子に対応する遺伝子バーコードを含み、
前記遺伝子バーコードが、前記特定の遺伝子の検出を可能にするように構成された、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記バーコード配列が、標的領域に相補的な１つの配列に対応する配列バーコードをさらに含み、
前記配列バーコードが、前記１つの配列の検出を可能にするように構成されている、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記遺伝子バーコードが、前記バーコード配列の第一の配列集合によって規定され、前記配列バーコードが前記バーコード配列の残りの配列集合によって規定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
標的核酸配列検出用の核酸配列ライブラリを作製する方法であって、
一群の標的核酸配列を同定すること；
前記一群の標的核酸配列を標的とする複数の直鎖状プローブを設計すること；
前記複数の直鎖状プローブを前記標的核酸配列にハイブリダイズすること；
前記複数の直鎖状プローブを環状化すること；及び
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）で前記標的核酸配列を検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項６５】
前記プローブが、核酸、ＤＮＡトランスポザーゼ、又はＣａｓ９を含むプローブ複合体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の直鎖状プローブが酵素によって環状化される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記酵素がリガーゼを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
環状化前の前記プローブに塩基を組み込むために、前記酵素が逆転写酵素、ポリメラーゼ、又はその両方をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記複数の環状化プローブを増幅することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記複数の環状化プローブがローリングサークル増幅によって増幅される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数のプローブの各々がアダプター配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数のプローブの各々がバーコード配列をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記複数のプローブがＤＮＡマイクロアレイによって合成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
前記複数のプローブが、クラウディング剤の存在下で標的核酸配列にハイブリダイズされる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
前記配列決定が、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的核酸がリボ核酸又はデオキシリボ核酸を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
前記デオキシ核酸が二本鎖デオキシ核酸である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記二本鎖デオキシ核酸が、熱融解又は酵素消化によって一本鎖デオキシ核酸に変換される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数のプローブが核酸アナログを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８０】
前記核酸アナログがロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
標的核酸配列検出用の核酸配列ライブラリを作製する方法であって、
検出用の一群の標的核酸配列を同定すること；
前記一群の標的核酸配列から配列部分を含む参照配列データベースを作成すること；
前記参照配列データベースから候補配列部分を選択すること；
所定の判定基準に従って前記候補配列部分をスコア付けすることを含む、前記核酸配列ライブラリを計算により設計すること；
前記核酸配列ライブラリを合成すること；
前記核酸配列ライブラリを増幅すること；
前記核酸配列ライブラリを精製すること；及び
前記核酸配列ライブラリを標的核酸配列検出について検証すること、ここで、前記標的核酸配列検出は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）によるものである；
を含む、前記方法。
【請求項８２】
前記核酸配列ライブラリが、前記標的核酸配列の前記候補配列部分に相補的な配列部分を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸配列ライブラリがアダプター配列をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記核酸配列ライブラリがバーコード配列をさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記核酸配列ライブラリが１種又は複数種のタンパク質と複合化される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸配列ライブラリがＤＮＡマイクロアレイ上で合成される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記核酸配列ライブラリが、ガイドＲＮＡをＦＩＳＳＥＱ検出するための複合型ＣＲＩＳＰＲ酵素となるガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡの各々がアダプター配列を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸配列の検証が、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によるものである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
標的核酸配列検出が、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によるものである、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記核酸配列ライブラリが、検出のために前記一群の標的核酸配列にｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリダイズされる、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
前記核酸配列ライブラリと前記一群の標的核酸配列との間のハイブリダイゼーションの酵素適合性増強のためのクラウディング剤が含まれる、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記標的核酸配列にハイブリダイズした核酸配列ライブラリを環状化することをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記核酸配列ライブラリが酵素によって環状化される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記酵素がリガーゼを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記酵素が、逆転写酵素、ポリメラーゼ、又はその両方をさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記核酸配列ライブラリは、スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすると環状化される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記環状化核酸配列ライブラリが、ローリングサークル増幅によって増幅される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
前記標的核酸がリボ核酸又はデオキシリボ核酸を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９９】
前記デオキシ核酸が二本鎖デオキシ核酸である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記二本鎖デオキシ核酸が、熱融解又は酵素消化によって一本鎖デオキシ核酸に変換される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記核酸配列ライブラリが核酸アナログを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記核酸アナログがロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全内容が本明細書に援用される、２０１６年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３８１，９８０号の利益を主張するものである。
【０００２】
政府支援の研究に関する供述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｐ５０ＨＧ００５５５０号及び同第ＲＭ１  ＨＧ００８５２５号、並びに米国立衛生研究所によって授与された助成金第ＤＧＥ１１４４１５２号の基に、政府援助を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定のためのランダムなＲＮＡ配列捕捉は、配列多様性及び空間的な遺伝子発現構成の両方について新規な測定を可能にする。さらに、多くの用途において、ＲＮＡ種の標的サブセットの高感度検出には、途方もない価値があると認識されている。例えば、ヒト疾患の診断、予後、及び治療的指導に臨床的に関連があることが知られている特定の遺伝子の発現を正確に検出することが望まれている。同様に、ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定のためのランダムなＤＮＡ配列捕捉は、ゲノム及びＤＮＡ分子の配列多様性及び空間的構成の両方について新規な測定を可能にする。さらに、多くの用途において、ＤＮＡ遺伝子座又は変異部位の標的サブセットの高感度検出には、途方もない価値があると認識されている。例えば、ヒト疾患の診断、予後、及び治療的指導に臨床的に関連があることが知られている特定のゲノム変異又は遺伝子型の存在を正確に検出することが望まれている。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）による正確且つ効率的な核酸（すなわちＤＮＡ及びＲＮＡ）の検出を可能にする方法の開発が尚も求められている。
【発明の概要】
【０００４】
様々な例で、本開示は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）のための配列ライブラリを提供するための組成物及び方法を提供する。一態様において、本開示は、細胞又は細胞マトリックス内のハイブリダイゼーション反応を増強するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）細胞又は細胞マトリックス、並びに反応混合物を準備すること、
ここで、前記反応混合物は、（ｉ）標的核酸分子、（ｉｉ）標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有するプローブ、及び（ｉｉｉ）ポリマー骨格を含むハイブリダイゼーション反応増強剤を含み、上記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、標的核酸分子と上記標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有する上記プローブとの間のハイブリダイゼーション反応の速度を増強し、上記ハイブリダイゼーション増強剤は、ハイブリダイゼーション反応増強剤の不活性化を促進する官能基を含む；並びに、
（ｂ）標的核酸分子と上記標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有するプローブとの間のハイブリダイゼーション反応を実行するのに十分な条件を、上記反応混合物に適用すること、
ここで、ハイブリダイゼーション反応中、上記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、ハイブリダイゼーション反応増強剤の非存在下で標的核酸分子とプローブとの間で実行される別のハイブリダイゼーション反応と比較して、標的核酸分子と標的分子の標的配列に対する配列相補性を有する上記プローブとの間のハイブリダイゼーション反応の上記速度を増強する、
を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｂ）の後に、上記官能基に、上記ハイブリダイゼーション反応増強剤を不活性化するのに十分な条件を適用することをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ハイブリダイゼーション反応増強剤を不活性化することをさらに含む方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本開示は、酵素反応を開始させることをさらに含む方法を提供し、ここで、酵素反応は逆転写、ライゲーション、ＤＮＡ重合を含む。いくつかの実施形態では、上記官能基は水和性基である。いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する：上記水和性基はイオン性基、電解質基、又は親水性基である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する：ハイブリダイゼーション反応増強剤が、ポリマー骨格と水和性基との間に切断可能なリンカーを含むこと。いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する：切断可能なリンカーが、α−ヒドロキシ酸、β−ケト酸、ジスルフィド結合、又は他の種類の化学結合を含むこと。いくつかの実施形態では、上記官能基は切断可能である。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記官能基の切断を誘起することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記官能基を洗い流すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、酵素反応を開始させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション増強剤は、さらに、酵素反応を増強するように構成されている。いくつかの実施形態では、本開示は、酵素反応が逆転写、ライゲーション、ＤＮＡ重合を含むことを提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する：イオン性基に中性の電荷を持たせることにより、又は上記水和性基を弱水和状態にすることにより、上記官能基が選択的に不活性化されるように構成されている。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞又は細胞マトリックスにおけるハイブリダイゼーション反応を増強するための方法であって、上記細胞又は細胞マトリックスはヒドロゲルに組み込まれている、上記方法を提供する。いくつかの場合で、上記反応混合物は緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記緩衝剤は塩を含む。いくつかの実施形態では、上記緩衝剤は、オフターゲット配列へのプローブの非特異的結合を低減するように構成されたブロッキング剤を含む。いくつかの実施形態では、上記緩衝剤は、ＤＮＡのアニーリング特性を変化させるように構成された薬剤を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、上記ポリマー骨格はイオン性ポリマー骨格である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーション増強剤は、ポリイオン性ポリマー、高分子電解質ポリマー、親水性ポリマー、又は水和性ポリマーを含む。
【００１２】
別の態様では、本開示は、細胞の１又は複数の標的核酸分子のｉｎ  ｓｉｔｕ核酸配列検出又は同定のためのプローブセットを提供する。上記プローブセットは、複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含む複数のプローブを含むことができ、上記複数のプローブのうちの１つであるプローブは、以下を含む：
（ｉ）上記細胞の上記１又は複数の標的核酸分子のうちの１つである標的核酸分子の標的配列に相補的な上記複数の標的特異的配列のうちの１つである配列；
（ｉｉ）上記配列に連結し、上記複数のアダプター配列のうちの１つであるアダプター配列、ここで、上記アダプター配列は増幅反応用のプライマー用の結合部位を含む；及び
（ｉｉｉ）上記アダプター配列に連結し、上記複数のバーコード配列のうちの１つであるバーコード配列、ここで、上記バーコード配列は上記標的配列又は上記標的核酸分子の上記少なくとも上記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、上記複数のバーコード配列は上記複数のプローブの間で異なっている。
【００１３】
いくつかの実施形態では、上記バーコード配列は特定の遺伝子に対応する遺伝子バーコードを含み、上記遺伝子バーコードは特定の遺伝子の検出を可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、上記バーコード配列は標的領域に相補的な配列に対応する配列バーコードをさらに含み、上記配列バーコードは上記配列の検出を可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、上記遺伝子バーコードは上記バーコード配列の第一の配列集合によって規定せられ、上記配列バーコードは上記バーコード配列の残りの配列集合によって規定せられる。いくつかの実施形態では、上記複数のバーコード配列は種々の標的核酸分子の種々の標的配列の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、上記複数のアダプター配列は上記複数のプローブの間で同じである。いくつかの実施形態では、上記アダプター配列は上記増幅反応を実行するためのプライマーに相補的である。いくつかの実施形態では、上記増幅反応はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応である。いくつかの実施形態では、上記複数のバーコード配列のうちの１つのバーコード配列は、上記１つの標的領域の所定の配列の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、上記アダプター配列は上記核酸分子に相補的な上記配列と上記バーコードとの間に位置する。いくつかの実施形態では、上記バーコード配列は上記複数の標的特異的配列のうちの上記配列と上記アダプター配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、上記標的核酸分子はリボ核酸（ＲＮＡ）であり、上記複数の配列のうちの上記１つの配列が、逆転写をプライミングするように構成されている。いくつかの実施形態では、上記複数の標的特異的配列のうちの上記配列は各プローブの３’末端に位置する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、上記複数の標的特異的配列のうちの上記１つの配列、上記アダプター配列、及び上記バーコード配列が、上記１つのプローブの３’末端から５’末端へ向かって連続して配置されている。いくつかの実施形態では、上記１つのプローブの５’末端はリン酸化されている。
【００１５】
本開示はまた、上記１つのプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕ核酸検出のためのプローブライブラリの作製法であって、上記１つのプローブを核酸配列にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を生成すること、及び上記ハイブリダイゼーション産物を環状化すること、及び増幅反応を介して上記プローブライブラリを作製すること、を含む上記方法を提供する。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション産物を環状化することは、上記プローブが上記核酸配列にアニールしているときにリガーゼにより環状化することを含む。いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーション産物を環状化することは、上記核酸配列と独立した追加のスプリントオリゴヌクレオチドを用いてリガーゼにより環状化することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーション産物を環状化することは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はリガーゼの補助により上記プローブにおけるギャップを充填することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記核酸配列は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列又は相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列である。いくつかの実施形態では、上記核酸配列はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、上記複数のプローブは直鎖状プローブである。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブは環状プローブである。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブは分子反転プローブを含む。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブはパドロックプローブを含む。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブのうちの上記１つのプローブはプロセシング部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記プロセシング部位は追加の増幅領域を含む。いくつかの実施形態では、上記追加の増幅領域はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、上記プロセシング部位は追加の切断部位を含む。
【００１９】
本開示はまた、追加の切断部位を介して追加の増幅領域を切断除去することを含む、上記複数のプローブを成熟させる方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、上記複数のプローブのうちの上記１つのプローブは、環状化されるのに十分な長さを有する。いくつかの実施形態では、上記十分な長さは３５ヌクレオチド長以上である。
【００２１】
本開示はまた、上記１つのプローブを用いて標的配列を枯渇させる方法を提供する。上記方法は、上記１つのプローブを核酸配列にハイブリダイズさせること、及び上記配列を枯渇させること、を含み得る。いくつかの実施形態では、上記枯渇はリボヌクレアーゼＨ消化を介して行われる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、上記枯渇はＣａｓ９又は他のタンパク質核酸複合体を介して行われる。
【００２３】
別の態様では、本開示は、細胞の１又は複数の標的核酸分子をｉｎ  ｓｉｔｕ核酸配列検出又は同定するための方法を提供する。上記方法は、
（ａ）上記１又は複数の標的核酸分子及び複数のプローブを含む反応混合物を準備することであって、上記複数のプローブは複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含み、上記複数のプローブのうちの１つであるプローブは、（ｉ）上記１又は複数の標的核酸分子のうちの１つである標的核酸分子の標的配列に相補的な上記複数の標的特異的配列のうちの１つである配列；（ｉｉ）上記配列に連結し、上記複数のアダプター配列のうちの１つであるアダプター配列、ここで、上記アダプター配列は、上記１つの配列が上記標的配列にハイブリダイズしたときに上記１つのプローブ上で増幅反応を行うためのものである；及び、（ｉｉｉ）上記アダプター配列に連結し、上記複数のバーコード配列のうちの１つであるバーコード配列、ここで、上記バーコード配列は上記標的配列又は上記標的核酸分子の上記少なくとも上記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、上記複数のバーコード配列は上記複数のプローブの間で異なっている、上記バーコード配列、を含む、上記準備すること；
（ｂ）上記反応混合物に、上記１つの配列を上記標的配列にハイブリダイズさせるのに十分な条件を適用すること；並びに
（ｃ）上記バーコードを用いて、上記標的配列又は上記標的核酸分子の上記少なくとも上記一部を検出又は同定すること、
を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、上記方法は、（ｃ）の前に、上記１つの配列が上記標的配列にハイブリダイズしたときに、上記１つのプローブに対して上記増幅反応を行うことをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記標的核酸分子はリボ核酸分子であり、（ｂ）は、上記１つの配列に対して逆転写増幅を行うことで、上記１つのプローブの増幅産物として相補的デオキシリボ核酸分子を得るのに十分な条件を、上記１つの配列に適用することをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、上記バーコード配列は、特定の遺伝子に対応する遺伝子バーコードを含み、上記遺伝子バーコードは、上記特定の遺伝子の検出を可能にするように構成されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記バーコード配列は、標的領域に相補的な１つの配列に対応する配列バーコードをさらに含み、上記配列バーコードは上記１つの配列の検出を可能にするように構成されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子バーコードは、上記バーコード配列の第一の配列集合によって規定され、上記配列バーコードは上記バーコード配列の残りの配列集合によって規定される。
【００２９】
別の態様では、本開示は標的核酸配列検出のための核酸配列ライブラリを作製する方法を提供する。上記方法は、一群の標的核酸配列を同定すること；上記一群の標的核酸配列を標的とする複数の直鎖状プローブを設計すること；上記複数の直鎖状プローブを上記標的核酸配列にハイブリダイズすること；上記複数の直鎖状プローブを環状化すること；及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）で上記標的核酸配列を検出すること、を含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、上記プローブは核酸、ＤＮＡトランスポザーゼ、又はＣａｓ９を含むプローブ複合体である。いくつかの実施形態では、上記複数の直鎖状プローブは酵素によって環状化される。いくつかの実施形態では、上記酵素はリガーゼを含む。いくつかの実施形態では、上記酵素は逆転写酵素、ポリメラーゼ、又はその両方をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は上記複数の環状化プローブを増幅することをさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、上記複数の環状化プローブはローリングサークル増幅によって増幅される。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブの各々はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブの各々はバーコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブはＤＮＡマイクロアレイによって合成される。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブはクラウディング剤の存在下で標的核酸配列にハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、上記配列決定は合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）である。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はリボ核酸又はデオキシリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、上記デオキシ核酸は二本鎖デオキシ核酸である。いくつかの実施形態では、上記二本鎖デオキシ核酸は熱融解又は酵素消化によって一本鎖デオキシ核酸に変換される。いくつかの実施形態では、上記複数のプローブは核酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、上記核酸アナログはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００３２】
別の態様では、本開示は、標的核酸配列検出用の候補核酸配列をスコア付けする方法を提供する。上記方法は、プロセッサを利用して、検出用の標的核酸配列を同定すること；プロセッサを利用して、プローブ配列データベースを作成すること、ここで、上記プローブ配列データベースは、上記標的核酸配列の複数の異なるサブ配列を含む；プロセッサを利用して、上記プローブ配列データベースの上記複数の異なるサブ配列を、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）用の所定の判定基準に基づいてスコア付けすること、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、上記複数の候補プローブ配列の各々は所定の長さを有する。いくつかの実施形態では、上記所定の長さは１５ヌクレオチド長以下である。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、グアニン四重鎖の存在に基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、グアニン−シトシン含量に基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、複数の異なるサブ配列の融解温度に基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、エクソンのパイルアップに基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、プローブのヘテロ二量体化のし易さに基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、共通ｋ−ｍｅｒの存在に基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは、熱力学的アプローチに基づく。
【００３４】
いくつかの実施形態では、上記熱力学的アプローチは、短ワードサイズによるＢｌａｓｔアルゴリズムを用いて類似性を見つけること、類似性マトリックスを作成すること、及び、上記類似性マトリックスを用いて上記複数の異なるサブ配列の熱力学的値を算出すること、並びに、クロスハイブリダイゼーションする熱力学的閾値に基づいてサブ配列を除去すること、を含む。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは酵素のミスマッチ感受性プロファイルに基づく。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは下流の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）工程の配列依存性に基づく。いくつかの実施形態では、上記配列依存性はプローブレベルのバーコードを用いて測定される。いくつかの実施形態では、上記スコア付けは５以上の異なる判定基準に基づく。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記プローブ配列データベースから、上記標的核酸配列の上記複数の異なるサブ配列の一部を除外することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるサブ配列の一部は、上記所定の判定基準を満たさないサブ配列を含む。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるサブ配列の一部はグアニン四重鎖を含むサブ配列を含む。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるサブ配列の一部はヘテロ二量体形成を起こし易いサブ配列を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記標的核酸配列検出用の核酸配列ライブラリを合成するために、上記プローブ配列データベースから、上記標的核酸配列の上記複数の異なるサブ配列の一部を選択することをさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記方法は、上記スコア付けに基づいて、核酸配列ライブラリを合成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは、上記所定の判定基準に基づいて選択された上記複数の異なるサブ配列の一部を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、アダプター配列を上記複数の異なるサブ配列の各々に組み入れることをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記アダプター配列はＴ２Ｓ配列決定プライマーを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、バーコードを上記複数の異なるサブ配列の各々に組み入れることをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記割り当ては、バーコードのプールを準備すること、ハミング距離ｈによって一連のｇバーコードを同定すること、を含む。いくつかの実施形態では、上記バーコードプールはｋ−ｍｅｒのプールから生じたものである。いくつかの実施形態では、上記バーコードプールは、ホモポリマー及び４以上のＧＶラン、すなわちグアニン四重鎖、を除外する。いくつかの実施形態では、ハミング距離Ｈによる上記一連のｇバーコードの上記同定は、グラフベースのアルゴリズムを用いて達成される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される上記方法は、核酸配列ライブラリを増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の異なるサブ配列の一部が増幅される。いくつかの実施形態では、上記方法は、核酸配列ライブラリを精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、核酸配列ライブラリを利用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の異なるサブ配列を利用することは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）において複数の異なるサブ配列を利用することを含む。
【００３７】
別の態様では、本開示は、標的核酸配列検出用の核酸配列ライブラリを作製する方法を提供する。上記方法は、検出用の一群の標的核酸配列を同定すること；上記一群の標的核酸配列から配列部分を含む参照配列データベースを作成すること；上記参照配列データベースから候補配列部分を選択すること；上記核酸配列ライブラリを計算により設計することであって、所定の判定基準に従って上記候補配列部分をスコア付けすることを含む、上記設計すること；上記核酸配列ライブラリを合成すること；上記核酸配列ライブラリを増幅すること；上記核酸配列ライブラリを精製すること；及び、上記核酸配列ライブラリを標的核酸配列検出について検証すること、ここで、上記標的核酸配列検出は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）によるものである；を含む。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは、上記標的核酸配列の上記候補配列部分に相補的な配列部分を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリはアダプター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリはバーコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは１種又は複数種のタンパク質と複合化される。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリはＤＮＡマイクロアレイ上で合成される。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは、ガイドＲＮＡをＦＩＳＳＥＱ検出するための複合型ＣＲＩＳＰＲ酵素となるガイドＲＮＡを含み、上記ガイドＲＮＡの各々はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は上記核酸配列を検証することを含み、上記核酸配列のバリデーションは合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によるものである。いくつかの実施形態では、標的核酸配列検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によるものである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは検出のために上記一群の標的核酸配列にｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリと上記一群の標的核酸配列との間のハイブリダイゼーションの酵素適合性増強のためのクラウディング剤が含まれる。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記標的核酸配列にハイブリダイズした核酸配列ライブラリを環状化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは酵素によって環状化される。いくつかの実施形態では、上記酵素はリガーゼを含む。いくつかの実施形態では、上記酵素は逆転写酵素、ポリメラーゼ、又はその両方をさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは、スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすると環状化される。いくつかの実施形態では、上記環状化核酸配列ライブラリはローリングサークル増幅によって増幅される。いくつかの実施形態では、上記標的核酸はリボ核酸又はデオキシリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、上記デオキシ核酸は二本鎖デオキシ核酸である。いくつかの実施形態では、上記二本鎖デオキシ核酸は熱融解又は酵素消化によって一本鎖デオキシ核酸に変換される。いくつかの実施形態では、上記核酸配列ライブラリは核酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、上記核酸アナログはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００４１】
参照による援用
本明細書に記載された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各刊行物、特許、又は特許出願が参照により具体的且つ独立して援用されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【００４２】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理が活用されている例示的な実施形態を記載している以下の発明を実施するための形態、及び添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点のより深い理解が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態に基づいて、（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡ分子にアニールし逆転写をプライムする、３’末端におけるＲＮＡ分子に相補的な配列；（ｂ）ＲＣＡ反応及びシークエンシング反応をプライミングする共通アダプター配列；（ｃ）５’末端における遺伝子レベルバーコード；並びに５’リン酸化、を含む成熟プライマーを示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施形態に基づいて、プライマーの相補的領域が標的ＲＮＡ種にアニールし、逆転写反応をプライムし、ＲＮＡを鋳型とした塩基をｃＤＮＡに組み入れていることを示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施形態に基づいて、直鎖状のＲＣＡ産物において、ｎ個の縦列反復の各々が、バーコードと、それに隣接するＲＮＡを鋳型とした配列とを含有していることを示しており、これにより捕捉特異性の定量化が可能となる。
【図２Ａ】図２Ａは、実施形態に基づいて、マイクロアレイ上で合成されたＦＩＳＳＥＱ用プライマーライブラリの検証の例示的な結果を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施形態に基づいて、プールのかなりの割合が、点線で示される予想サイズと一致するペイロードを含むことを示している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施形態に基づいて、図２Ｂのペイロードの分布のバイオリン図を示しており、ライブラリの大部分の構成員のコピー数が平均で数コピーであることを示している。
【図３Ａ】図３Ａは、実施形態に基づく、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施形態に基づく、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施形態に基づく、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、実施形態に基づく、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。
【図３Ｅ】図３Ｅは、実施形態に基づく、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。
【図３Ｆ】図３Ｆは、実施形態に基づく、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。
【図４Ａ】図４Ａは、実施形態に基づいて、オリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＤＮＡマイクロアレイなど）による、パドロックプローブ又はギャップ充填プローブを製造するための例示的なプローブ設計・成熟戦略を図示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施形態に基づいて、オリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＤＮＡマイクロアレイなど）による、パドロックプローブ又はギャップ充填プローブを製造するための例示的なプローブ設計・成熟戦略を図示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施形態に基づいて、ＤＮＡマイクロアレイなど、オリゴヌクレオチドライブラリ合成による、パドロックプローブ又はギャップ充填プローブの製造のための、例示的なプローブ設計・成熟戦略を図示している。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施形態に基づいて、オリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＤＮＡマイクロアレイなど）による、パドロックプローブ又はギャップ充填プローブを製造するための例示的なプローブ設計・成熟戦略を図示している。
【図４Ｅ】図４Ｅは、実施形態に基づいて、オリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＤＮＡマイクロアレイなど）による、パドロックプローブ又はギャップ充填プローブを製造するための例示的なプローブ設計・成熟戦略を図示している。
【図５】図５は、実施形態に基づく、ヒト乳がん組織生検試料の標的化ＦＩＳＳＥＱの例示的な画像を示している。
【図６】図６は、実施形態に基づいて、図５からの配列決定の例示的な実験データの要約を示している。
【図７】図７は、本明細書で提供される方法を実行するようにプログラムあるいは構成されたコンピュータ制御システムを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
標的化ＦＩＳＳＥＱ
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）とは、マトリックス内の三次元的に配置された標的をｉｎ  ｓｉｔｕで検出又は配列決定する方法であって、検出シグナルが蛍光シグナルであるものと言うことができる。ＦＩＳＳＥＱが採用可能な配列決定法は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、又はハイブリダイゼーションによる配列決定であり得る。ＦＩＳＳＥＱにおいて検出又は配列決定される標的は、目的の生体分子、又は目的の生体分子に結合したプローブであり得る。
【００４５】
生物学的現象に無関係なｃＤＮＡ又はＤＮＡ配列を含有するＲＣＡ産物によって占められるはずであった細胞体積を、目的のＲＮＡ種又はＤＮＡ種のサブセットに再配分できることから、標的化ＦＩＳＳＥＱは、１分子当たりの感度（ｐｅｒ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）をより高める可能性を有し得る。さらに、ＲＮＡ捕捉に関して、ランダムヘキサマーによる逆転写のプライミングはさほど効率的でない場合がある。例えば、Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、Ａｎｄｅｒｓら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍＲＮＡ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０．３（２００４）：５０９−５１５を参照されたい。場合によっては、標的化ＦＩＳＳＥＱは、ランダムＦＩＳＳＥＱの感度の約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約４０倍以上、約８０倍以上、約１２０倍以上、約１６０倍以上、約２００倍以上、約４００倍以上、約１０００倍以上、約５０００倍以上、又はそれ以上の感度を有することがある。例えば、標準的な顕微鏡条件下での回折限界ボクセルの体積とほぼ一致する０．０４μｍ３の細胞内体積をＲＣＡ産物が占めていると仮定した場合、ヒト細胞のおよその平均体積は１００μｍ３（赤血球（ｅｒｉｔｈｒｏｃｙｔｅ））から４，０００，０００μｍ３（卵母細胞）となり、これは、種類に応じて、ヒト細胞１個当たり最大２，５００〜１００，０００，０００個の回折限界ボクセルに相当する。下端において、赤血球、好中球、β細胞、腸細胞、線維芽細胞等の、多くのヒト細胞は、およそ１００，０００個にも満たない回折限界ボクセルしか含まない場合がある。しかし、典型的な哺乳類細胞は、数万の遺伝子種（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に相当する５００，０００個ものｍＲＮＡ分子を含む場合がある。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨは、一般的には、５００分子／細胞のコピー数で発現されると考えられている。１００μｍ３の体積を有し、５００，０００個のｍＲＮＡ分子を含有する赤血球を考えると、ランダムにサンプリングした場合、空間を完全充填するＦＩＳＳＥＱ法であっても、０．５％のｍＲＮＡ分子しか検出できず、すなわち、５００個中平均して約２．５個のＧＡＰＤＨ分子しか検出できない。しかし、一分子ＦＩＳＨの推定感度に匹敵する８０％の分子当たり捕捉（８０％  ｐｅｒ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃａｐｔｕｒｅ）という、最適化された効率を有する標的化ＧＡＰＤＨ  ＦＩＳＳＥＱアッセイでは、５００個中平均約４００個のＧＡＰＤＨ分子を検出し、これは１６０倍の感度向上を表す。１細胞当たりほんの少数のＲＮＡコピー数（例えば、１細胞当たり５分子）でしか発現され得ない、低発現遺伝子（転写因子など）については、非標的化ＦＩＳＳＥＱで検出され得るのは平均して１細胞当たり０分子であるが、その一方で、８０％の分子当たりの（８０％  ｐｅｒ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）効率的な標的化ＦＩＳＳＥＱアッセイでは５個中４個の転写因子ＲＮＡ分子が検出されることとなり、これは、感度の向上にはほぼ限りがないことを表している。さらに、ＲＮＡ捕捉においては、ランダムヘキサマーによる逆転写のプライミングが効率的でない場合がある。他の配列捕捉法及びプローブ設計がより良好な捕捉効率を有する場合がある。ＤＮＡ捕捉においても、分子当たり感度の増強から標的化捕捉が恩恵を受ける場合がある。
【００４６】
また、標的化ＦＩＳＳＥＱは、全トランスクリプトームＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱや全ゲノムＤＮＡ  ＦＩＳＳＥＱよりも実質的により高速なアッセイにも成り得る。場合によっては、標的化ＦＩＳＳＥＱは、全トランスクリプトームＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱや全ゲノムＤＮＡ  ＦＩＳＳＥＱと比べて、約２倍、約３倍、約４倍、約６倍、約８倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、又は約２０倍高速になり得る。一例として、全トランスクリプトームＦＩＳＳＥＱは、高精度のショートリードアラインメントに充分なシーケンスリード長を必要とし得る。すなわち、ゲノム又はトランスクリプトーム参照配列データベースにシーケンスリードをアラインメントするなどしてコンピュータ上で親分子種を決定するのに十分な長さを、シーケンスリードが有する必要があり得る。このようなホールオミック（ｗｈｏｌｅ−ｏｍｉｃ）な適用では、実質的に正確なアラインメントを回収するために、ＲＮＡ−ｓｅｑリードはおよそ２０〜３０塩基長である必要がある場合があるが、ゲノムリードは、より長い（５０〜１００塩基長など）ことが必要である場合がある。バーコード分子標識の標的化ＦＩＳＳＥＱにおいては、Ｎ個の塩基のシーケンスリードと仮定した場合、バーコード標識は４Ｎの複雑さを有する核酸配列であると理解することができるため、分子同定に必要なシーケンスリードをさらに短くすることができる。例えば、５ヌクレオチドのバーコード配列を用いると、１０２４の分子種を同定することができるが（４５＝１０２４）、８ヌクレオチドのバーコードを用いれば、最大６５，５３６の分子種を同定することができ、この数字はヒトゲノム内の個々別々の遺伝子の総数よりも多い。したがって、ヒトトランスクリプトームの各遺伝子を検出するように設計された標的化ＦＩＳＳＥＱアッセイは、４倍近くより高速になる場合があり（８塩基対３０塩基）、ヒトゲノムにおいては、最大で１２倍超より高速になる場合がある（８塩基対１００塩基）。特定のＲＮＡ種を逆転写の標的とする場合、生じ得るｃＤＮＡ配列のスペースがトランスクリプトーム全体のかなりの部分となり得るため、該標的分子を同定するためにより少ない塩基の配列決定が必要となる。特定のＤＮＡ遺伝子座又はヌクレオチドを配列決定又は再配列決定の標的とする場合、捕捉された配列のスペースは、ゲノム配列全体又は細胞ＤＮＡ配列全体のかなりの部分となり得る。標的化ＦＩＳＳＥＱ戦略は、内在性配列ではなく、プローブに含有される分子「バーコード」配列が検出されるため、配列決定サイクル当たりの情報という点から効率的な読み取りといえる。バーコード配列は所定のものであるため、誤り検出訂正機構を持つように設計することもできる。
【００４７】
標的化ＦＩＳＳＥＱは、空間的情報を目的とするあらゆる試料に適用することができる。例えば、試料は、細胞、組織、及び細胞マトリックスを包含する生物試料であり得る。用途に応じて、生物試料は、全血、血清、血漿、粘膜、唾液、頬スワブ、尿、便、細胞、組織、体液又はこれらの組み合わせとすることもできる。
【００４８】
本開示は、種々の標的核酸ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリ構築法を提供する。よって、本開示は可能性のある実施全てを明示的に列挙することはしないが、これらのアプローチの概要は多様に拡張又は組み合わせ可能であることを理解されたい。これらの戦略では、最も手の込んだ方法（例えば、ランダム捕捉プロトコルと非常によく似ているが、特異的逆転写プライマーのプールを用いる、標的化ＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱ法）から、酵素反応を必要とせず、核酸ハイブリダイゼーションのみを必要とする最も単純な方法まで、ｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定用ライブラリを構築するのに必要な酵素反応の数及び種類は異なっていてよい。
【００４９】
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、１又は複数の核酸サブユニット、すなわちヌクレオチド、から構成される分子を示し、「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」と同義的に使用することができる。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）、又はこれらのバリアントから選択される１又は複数のヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチドは、ヌクレオシドと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基とを含んでよい。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボース）、及び１又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは糖がリボースとなったヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチドは糖がデオキシリボースとなったヌクレオチドである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光性のタグ又はマーカー（例えば、フルオロフォア）などの検出可能なタグを含む、例えばデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）（例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）から選択され得る）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、伸長中の核酸鎖に組み入れ可能なあらゆるサブユニットを包含し得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵであってもよく、あるいは、１又は複数の相補的Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵに特異的なあらゆる他のサブユニットであってもよく、あるいは、プリン（すなわち、Ａ若しくはＧ、若しくはそのバリアント）又はピリミジン（すなわち、Ｃ、Ｔ若しくはＵ、若しくはそのバリアント）に相補的なあらゆる他のサブユニットであってもよい。いくつかの例で、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はその誘導体若しくはバリアントである。核酸は、一本鎖型、二本鎖型、三本鎖型、らせん型、ヘアピン型、などであり得る。いくつかの場合で、核酸分子は環状である。核酸は様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約１０ベース、約２０ベース、約３０ベース、約４０ベース、約５０ベース、約１００ベース、約２００ベース、約３００ベース、約４００ベース、約５００ベース、約１キロベース（ｋｂ）、約２ｋｂ、約３ｋｂ、約４ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。核酸分子は、細胞又は組織から単離され得る。本明細書で例示されているように、核酸配列は、単離精製ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含んでもよい。
【００５０】
核酸アナログとしては、限定はされないが、２’−Ｏ−メチル修飾物、末端ホスホロチオエート及び３’末端のコレステロール基を有する２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖類、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）修飾物、２’−フルオロ修飾物、及び２’，４’メチレン修飾物（ＬＮＡ）を挙げることができる。更なる例示的な阻害性核酸としては、修飾オリゴヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル化又は２’−Ｏ−メトキシエチル）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ペプチド複合体、及びＬＮＡ／２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）が挙げられる。例示的な修飾については、例えば、Ｖａｌｏｃｚｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２（２２）：ｅ１７５（２００４）、Ｆａｂｉａｎｉ及びＧａｉｔ、ＲＮＡ  １４：３３６−４６（２００８）；Ｌａｎｆｏｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７（５９６２：１９８−２０１  （２０１０）；Ｅｌｍｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：８９６−９（２００８）；Ｇｅｂｅｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４２（１）：６０９−２１（２０１３）；Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ５（８）：ｅ２０３  （２００７）；及びＥｌｍｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：１１５３−１１６２（２００８）を参照されたい。
【００５１】
修飾ヌクレオチドの更なる例としては、限定はされないが、ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケウオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケウオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ケウオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン等が挙げられる。場合によっては、ヌクレオチドはそのリン酸部分に修飾を含んでいてもよく、例えば三リン酸部分への修飾が挙げられる。このような修飾の例としては、限定はされないが、より長いリン酸鎖（例えば、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分による修飾（例えば、α−チオ三リン酸及びβ−チオ三リン酸）が挙げられる。核酸分子は、塩基部分において（例えば、相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに通常利用できる１若しくは複数の原子において、及び／又は、相補的ヌクレオチドとの水素結合を通常形成できない１若しくは複数の原子において）、糖部分において、又はリン酸骨格において、修飾されていてもよい。核酸分子は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などの、アミン反応性部分の共有結合を可能にするために、アミノアリル（ａｍｉｎｏ  ａｌｌｙ  １）−ｄＵＴＰ（ａａ−ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド（ａｍｉｎｏｈｅｘｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）などの、アミン修飾基を含有していてもよい。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替は、より高い１ｍｍ３当たりビット密度、より高い安全性（偶然又は意図的な天然毒素合成への抵抗性）、光プログラム（ｐｈｏｔｏ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）ポリメラーゼにおけるより簡単な識別、又はより低い二次構造を提供することが可能である。新規合成及び／又は増幅合成用の天然ポリメラーゼ及び変異ポリメラーゼに適合性のそのような代替塩基対は、あらゆる目的において参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｔｚ  Ｋ、Ｍａｌｙｓｈｅｖ  ＤＡ、Ｌａｖｅｒｇｎｅ  Ｔ、Ｗｅｌｔｅ  Ｗ、Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ  Ｋ、Ｄｗｙｅｒ  ＴＪ、Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ  Ｐ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ  ＦＥ、Ｍａｒｘ  Ａ．、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２０１２年７月；８（７）：６１２−４に記載されている。
【００５２】
酵素反応はｉｎ  ｓｉｔｕでの最適化が難しい場合があり、標的分子当たりの捕捉効率の減少の原因と思われるものである。しかし、酵素反応は、ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリで捕捉される情報の量を増加させ得る。例えば、ＲＮＡ編集、選択的スプライシング、又は遺伝子融合による変化を含むＲＮＡ配列の新規検出には、逆転写が必要となる。ＲＮＡを鋳型とする配列を捕捉する、又は塩基ミスマッチ感受性反応を触媒するのにも酵素を用いることなく、核酸ハイブリダイゼーションは単独ではプローブ−標的間相互作用に特異性を与えることに依存し得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列の捕捉特異性を増強するために、Ｃａｓ９又は別の核酸誘導型核酸結合タンパク質のミスマッチ感度が利用され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される標的化ＦＩＳＳＥＱ法は、特定の核酸分子を特異的に捕捉するための、短いオリゴヌクレオチドプローブのプール（又はライブラリ）を含む。本明細書で用いられる「プローブ」という用語は、試料中の生体分子標的に結合可能なオリゴヌクレオチドと言うことができる。プローブは、標的に直接又は間接的に結合できる。プローブは、様々な長さを有することができる。プローブプールを合成するコストを下げるために、いくつかの実施形態では、マイクロアレイＤＮＡ合成プラットフォームを用いて、大規模複合型短（約２００ヌクレオチド長）オリゴヌクレオチドライブラリが作製することが可能である。例えば、Ｋｏｓｕｒｉ、Ｓｒｉｒａｍ、及びＧｅｏｒｇｅ  Ｍ．  Ｃｈｕｒｃｈ．、「Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１．５（２０１４）：４９９−５０７を参照されたい。例示的なプラットフォームとして、アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ）、カスタム・アレイ社（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ）、及びツイスト・バイオサイエンス社（Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が提供するプラットフォームを挙げることができる。マイクロアレイ合成は、固体基板に付着したＤＮＡ又は核酸アナログオリゴヌクレオチドの合成と言ってもよい。商業的供給業者であるツイスト・バイオサイエンス社は、例えば、９，６００個のウェルを含み、ウェル毎に１２１種の別々のオリゴヌクレオチド種が合成され、１アレイ当たり合計１，１６０，０００種のオリゴヌクレオチドが合成されるマイクロアレイを売り物にしている。商業的供給業者であるアジレント社のＯＬＳライブラリは２４４，０００強のオリゴヌクレオチド種を含み、一方、商業的供給業者であるカスタム・アレイ社のＤＮＡマイクロアレイは９４，０００強を合成する。これらのオリゴヌクレオチドライブラリは通常、ライブラリを高度に増幅及びプロセシングするための手法を用いて作製された、一本鎖ＤＮＡプローブから構成される再生可能資源を表すＤＮＡ種溶液中へと、固相基板から遊離せられる。例えば、Ｂｅｌｉｖｅａｕ、Ｂｒｉａｎ  Ｊ．、Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ、及びＣｈａｏ‐ｔｉｎｇ  Ｗｕ、「Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔ  ＦＩＳＨ  ｐｒｏｂｅｓ．」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）：１４−２３；Ｃｈｅｎ、Ｋｏｋ  Ｈａｏら、「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ，  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８．６２３３（２０１５）：ａａａ６０９０）を参照されたい。あるいは、全体において、又は特定のサブプールにおいて、上記オリゴヌクレオチドが上記固相から直接増幅されてもよい。例えば、Ｋｏｓｕｒｉ、Ｓｒｉｒａｍら、「Ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌ��ｔｙ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８．１２（２０１０）：１２９５−１２９９を参照されたい。
【００５４】
マイクロアレイ合成戦略を可能とするために、プローブの増幅とその後のプロセシング及び成熟のための追加の配列を、プローブに加えることができる。コンピュータによるプローブ配列設計と、最終産物のハイスループット配列決定による検証とを容易にするソフトウェアについて、本明細書で論じる。これらの戦略は、プローブプールのＤＮＡアレイ合成に関するセクションで詳細に説明される。
【００５５】
従って、本開示は以下を提供する：標的化ＦＩＳＳＥＱは、生物試料の全トランスクリプトーム又は全ゲノムの一部のヌクレオチド配列を検出、同定、定量化、及び／又は決定するために使用することができる。
【００５６】
様々な実施形態において、本開示は、全トランスクリプトーム又は全ゲノムの一部に対するＦＩＳＳＥＱによる核酸検出を標的とする方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、全トランスクリプトーム又は全ゲノムから標的の一部を選択するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、標的検出用のプローブを設計するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、標的検出用のプローブを合成するための方法を提供する。本開示は以下を提供する：本開示において提供されるＦＩＳＳＥＱによる核酸検出を標的化する、ある新規の方法は、オリゴヌクレオチド「ライブラリ」のＤＮＡマイクロアレイ合成を利用する。いくつかの実施形態において、本開示は、様々なプローブ設計戦略を提供し、これにより様々な構造を有するプローブを得られる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＦＩＳＳＥＱによる標的検出に好適なプローブをもたらす、プローブを成熟させるための方法を提供する。本明細書で使用される「成熟」及び「成熟させる」という用語は、プローブ又はプローブライブラリを、ＦＩＳＳＥＱアッセイで使用されるのに好適なものにするプロセスを示し得る。例えば、いくつかの場合で、ＤＮＡマイクロアレイから合成されたプローブライブラリは、ＦＩＳＳＥＱで使用することに先立ち、さらに増幅されることを必要とする場合がある。これらの場合では、増幅用のオリジナルのプローブライブラリ内の各プローブに増幅用プライマーが組み込まれる場合があるが、この増幅用プライマーは、プローブライブラリを成熟させるために、増幅の後に切断される必要がある。
【００５７】
標的ＦＩＳＳＥＱは、ＦＩＳＳＥＱによる「ランダム」又は「ホールオミック（ｗｈｏｌｅ−ｏｍｉｃ）」な検出と比較して、標的種のヌクレオチド配列の検出、同定、定量化、及び／又は判定においての感度の増強及び／又はアッセイ時間の短縮など、いくつかの利点を示し得る。
【００５８】
標的化ＲＮＡ捕捉
逆転写による捕捉
ランダムプライマーではなく、特異的逆転写（ＲＴ）用プライマーを、ＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱに使用することが可能であり、前述の通り、いくつかの利点を示し得る。しかし、ランダムプライマーではなく特異的逆転写用プライマーを用いるＲＮＡ種の標的化には課題が残っている。例えば、以前の研究では、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡの標的化は可能ではあったが、この転写物はほとんどの内在性遺伝子よりもずっと高いレベルで発現された。例えば、Ｌｅｅ，  Ｊｅ  Ｈｙｕｋら、「Ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｔｕ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３．６１７７（２０１４）：１３６０−１３６３を参照されたい。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡを標的とした逆転写用プライマーのうち、標的部位が、転写物の５’末端から離れたために、ＲＮＡ捕捉の効率が劇的に減少することが観察された。この実験では、アノテーションされた転写開始点直後のｃＤＮＡ配列に相補的な標的化ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用プライマーも使用されたため、逆転写用プライマーの位置依存的な効率の変動は、より長いｃＤＮＡ分子の非効率的な環状化、又はＲＣＡプライミング配列に到達するより前の、早まった逆転写の終結によるものであり得た。他の遺伝子に対して標的化逆転写用プライマーを合理的に設計し、相当数のＲＣＡ産物を作製することは、未だ困難である。ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＲＮＡのアクセシビリティというロジック（例えば、一般にＲＮＡ転写物のどの領域が休止期すなわち高密度のポリソーム複合体と結合するか）も逆転写酵素の配列依存性も完全には理解されていなかったことを考慮に入れると、本開示のＦＩＳＳＥＱのための標的化逆転写に対する１つのアプローチは、逆転写用プライマーにより標的種を大規模にタイリングすることである。いくつかの例では、標的ＲＮＡ種又は標的ＤＮＡ種は、凝集した核酸種全体に対して、部分的に相補的な、又は部分的に実質的に相補的な、複数のプローブを設計することによって、標的化捕捉用プローブにより、大規模にタイリングされる場合がある。そのような例では、ｋ塩基長の標的ＲＮＡ種はｋ個の標的プライマーを有する場合がある。例えば、標的種に対して２０ヌクレオチドの配列相補性又は実質的配列相補性を有する標的化逆転写用プライマーのプールは、１番目の塩基から２０番目の塩基に相補的又は実質的に相補的なプライマー、及び２番目の塩基から２１番目の塩基に相補的又は実質的に相補的な別のプライマー等を含有し、標的種がｋ塩基長である場合、最後のプライマーは、（ｋ−２０）番目の塩基からｋ番目の塩基に相補的又は実質的に相補的なプライマーとなり得る。他の例では、標的化プライマーのプールは、１〜１０、１０〜１００、１００〜１０００、又は１〜ｋのプライマーを含む場合がある。
【００５９】
高速検出を容易にするため、バーコード付加ＦＩＳＳＥＱ戦略を用いることができ、この戦略によって、各ＲＣＡ産物（ＤＮＡナノボール）の分子的アイデンティティ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を検出するために必要なシークエンシングのサイクル数が減少する。いくつかの実施形態では、成熟標的化逆転写用プライマーは、以下の特徴を含み得る：ｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡ分子にアニールし逆転写をプライムする、３’末端におけるＲＮＡ分子に相補的な配列；ＲＣＡ反応及びシークエンシング反応をプライミングする共通アダプター配列；５’末端における遺伝子レベルバーコード；並びに５’リン酸化（図１Ａ〜図１Ｃ）。本明細書で使用される「遺伝子レベルバーコード」という用語は、特定の遺伝子に特異的なバーコード配列を示し得る。いくつかの実施形態では、１又は複数の遺伝子に対して、ユニークなバーコードが使用される場合がある。本明細書で使用される場合、遺伝子レベルバーコード及び遺伝子バーコードという用語は、同義的に使用されている場合がある。
【００６０】
遺伝子レベルバーコードは、様々な長さであり得、例えば、１〜３ヌクレオチド長、３〜５ヌクレオチド長、５〜８ヌクレオチド長、８〜１０ヌクレオチド長、又は１０〜１５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子レベルバーコードは、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、又は２０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子レベルバーコードは、２０ヌクレオチド長よりも長い場合がある。例えば、遺伝子レベルバーコードは、５ヌクレオチド長であるように設計することができ、理論上、最大４５（１０２４）個の遺伝子を同時に標的化することが可能となる。実際には、プローブの設計及び合成に制限があるため（アレイ合成に関するセクションで論じられる）、ｋ塩基のバーコード長さを考えたとき、使用可能なバーコードの数は４ｋ未満となる場合がある。５’末端に遺伝子レベルバーコードを含有する逆転写用プライマーを設計することにより、ライゲーションによる配列決定が、より効率的な５’方向のものとなる場合がある。さらに、配列決定用鋳型上のバーコードの５’塩基は直線状ｃＤＮＡのＲＮＡを鋳型とする最後の塩基と対応していることから（図１Ｃを参照）、バーコードを超えて追加の塩基を配列決定することによって、内在性ｃＤＮＡ配列が得られる場合がある。
【００６１】
ヒトがんについて診断的判定及び予後判定を行うためのＦＩＳＳＥＱの使用を実証するために、臨床的に意義のあるＯｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘを含み、いくつかの一群の遺伝子に対して標的化ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリを合成することができる。例えば、Ｃｒｏｎｉｎ，  Ｍａｕｒｅｅｎら、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ，  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３．６（２００７）：１０８４−１０９１を参照されたい。標的化ＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱデータセットは、コネクトミクス的（ｃｏｎｎｅｃｔｏｍｉｃ）再構築のための細胞の発達プログラミング及び個々の神経連絡の検出を含む、他の応用のために、解析することができる。
【００６２】
逆転写効率は、プライマー配列、ＲＮＡの二次構造、並びに／又はＲＮＡ上のポリソーム及びタンパク質の占有率を含む様々な因子に依存し得る。いくつかの例では、ユニークなプローブバーコード配列が、逆転写用プライマーに連結又は組み込まれていてもよい。ユニークなプローブバーコード配列を各々の逆転写用プライマーに組み込むことによって、各々のプライマーの捕捉効率及び特異性の両方を直接測定するために、そのバーコードを利用することできる。各鋳型分子は、ランダムなバーコードプールからユニークなバーコードを得やすいため、転写されたオリジナル転写物の数は、ユニークバーコードの数をカウントすることによってカウントすることができる。この戦略が経験的にはプライマーのスクリーニング及び逆転写による効率的なｉｎ  ｓｉｔｕＲＮＡ配列捕捉のロジックの研究に有用であり得る一方で、特定のバーコード長さを考えたときに、各プローブへのバーコード付加は同時に検出できる遺伝子の総数を減少させ得る。これは、プライマー設計の際に、最初のｘ塩基を遺伝子レベルバーコードに（理論上、最大４ｘ個の遺伝子）、次のｙ塩基をプローブバーコードに（理論上、１遺伝子当たり最大４ｙ個のプローブ）、該プローブバーコードを遺伝子レベルでは縮重させながら用いることによって、緩和することができる。本明細書で使用される場合、プローブバーコードは、配列レベルバーコード、又は配列バーコードと称される場合もある。いくつかの例で、遺伝子レベルバーコードとプローブは連続していてもよい。所望により、遺伝子バーコードとプローブバーコードは、共通のヌクレオチド塩基を共有していても、していなくてもよい。
【００６３】
一例において、βアクチンのｍＲＮＡ及び１８ＳリボソームＲＮＡを特異的に標的とする初期の逆転写用プライマー最適化ライブラリが設計された。１８Ｓ  ｒＲＮＡを標的とするプローブに関しては、ヘリックス１９でのプライミングが最大の効率を示したが、ヘリックス２２を標的にしても高い効率が得られた。この結果は、ＦＩＳＨに対する１８Ｓ  ｒＲＮＡのアクセシビリティの測定に関するものであった以前の研究と部分的に一致している。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６９．３（２００３）：１７４８−１７５８を参照されたい。プローブバーコードは、様々な長さであり得、例えば、１〜３ヌクレオチド長、３〜５ヌクレオチド長、５〜８ヌクレオチド長、８〜１０ヌクレオチド長、又は１０〜１５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、プローブバーコードは、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、又は２０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、プローブバーコードは、２０ヌクレオチド長よりも長くてもよい。
【００６４】
環状化による捕捉
いくつかの例では、標的を捕捉するプローブは環状化され得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは逆転写後に環状化され得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、当該標的へハイブリダイズした後に環状化するように、標的配列に相補的なプローブの５’末端配列領域及び３’末端配列領域の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、リガーゼを用いて環状化され得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、標的へのハイブリダイゼーションの後、ギャップ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ギャップ領域を充填するために核酸ポリメラーゼを用い、その後リガーゼを用いることにより、標的を捕捉するプローブは環状化され得る。
【００６５】
ＲＣＡを用いて分子プローブを増幅するために、環状鋳型ＤＮＡが必要となる場合がある。様々な方法を用いて、環状プローブは標的ＲＮＡに局在化され得る。例えば、逆転写後のｓｓＤＮＡの環状化は、環状プローブ分子を標的ＲＮＡに局在化させる１つの方法である。パドロックプローブ及び分子反転プローブ（ＭＩＰ）を用いる他の２つの「環状化による捕捉」法は、スプリントライゲーションを選んでｓｓＤＮＡの環状化を避ける場合がある（図３）。両方の種類のプローブ（例えば、パドロックプローブ及び／又はＭＩＰ）は、標的配列に相補的なプローブの５’末端配列領域及び３’末端配列領域の両方を含んでいてよい。ＭＩＰは、鋳型による塩基又は相補的なオリゴヌクレオチドをプローブに組み込む、ポリメラーゼ又はリガーゼによって充填されるギャップを、５’末端と３’末端との間に含んでいてもよい。ＭＩＰは、３’末端が５’末端と出会ったときに、リガーゼによって環状化され得る。例えば、Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ，  Ｐａｕｌら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１．６（２００３）：６７３−６７８を参照されたい。パドロックプローブに関しては、アニーリングの際に５’末端と３’末端とが互いに隣接し、直接ライゲーションされる場合がある。例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｍａｔｓら、「Ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅｓ：  ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５．５１８１（１９９４）：２０８５−２０８８を参照されたい。両方の場合で、ＤＮＡリガーゼは、そのミスマッチ感受性によって、プローブの環状化の際に、特異性で増強し得る。環状化による捕捉は、ＲＮＡを直接標的とすることによっても達成できるし、あるいは、ｃＤＮＡを標的とすることによっても達成できる。
【００６６】
ＲＮＡのスプリントライゲーション
いくつかの実施形態では、プローブは、リガーゼによるスプリントライゲーションを通じてライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、上記リガーゼはＴ４  ＤＮＡリガーゼ又はＳｐｌｉｎｔＲであってよい。
【００６７】
パドロックプローブ及びＭＩＰの両方が、ＲＮＡに直接ハイブリダイズ可能である。環状化による捕捉のためにＲＮＡ分子を直接標的とすることは、ｃＤＮＡ合成を必要としないという利点を有し得る。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ基質に対してのその通常の活性に加えて、ハイブリッドＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖内のニックが入ったＤＮＡのライゲーションを触媒することができる。例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｍａｔｓら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８．７（２０００）：７９１−７９３；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  Ａｌｌｅｎ  Ｔ．ら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９８．２５（２００１）：１４２３８−１４２４３；Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｍａｔｓら、「ＲＮＡ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９．２（２００１）：５７８−５８１を参照されたい。いくつかの例で、ＳｐｌｉｎｔＲ（ＮＥＢ社）などのリガーゼが、さらにより高い効率でこのライゲーションを触媒し得る。例えば、Ｌｏｈｍａｎ，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＪＳら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＮＡ−ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２．３（２０１４）：１８３１−１８４４を参照されたい。ＳｐｌｉｎｔＲは、いくつかの例で、良好なミスマッチ検出特性を示し得る。所望により、ＤＮＡリガーゼの良好なミスマッチ検出特性などの特性を利用することで、ＲＮＡ分子上で直接ＭＩＰを捕捉し、短いオリゴヌクレオチドの中でライゲーションし、ギャップを充填してもよい。いくつかの例で、ＲＮＡを鋳型とする塩基を環状プローブに組み入れるための、逆転写酵素又は逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭＩＰがＲＮＡ標的に対して使用してもよい。例えば、Ｍｏｓｅｒ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．ら、「Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｅｎｚｙｍｅ．」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７．６（２０１２）：ｅ３８３７１を参照されたい。
【００６８】
上記のハイブリッドＲＮＡ：環状ＤＮＡ複合体からＲＣＡ産物を作製するために、ポリメラーゼを用いてもよい。例えば、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、３’末端が環状の鋳型をプライミングするまで３’エクソヌクレオチド（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）活性を介してＲＮＡ分子を消化することよって、ハイブリッドＲＮＡ：環状ＤＮＡ複合体からＲＣＡ産物を合成することができる。しかしながら、このアプローチの以前の実証は、ＲＮＡの３’末端付近の配列に限定されていた。例えば、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ，  Ｍａｇｎｕｓら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｔｕｒｔｌｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｉｍｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ＰＲＩＮＳ．」、ＢＭＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７．１（２００７）：１；Ｌａｇｕｎａｖｉｃｉｕｓ，  Ａｒｕｎａｓら、「Ｄｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：  ３′→  ５′  ＲＮａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ．」、ＲＮＡ  １４．３（２００８）：５０３−５１３を参照されたい。いくつかの例では、ＲＮＡの３’末端は環状鋳型に近接していることが必要である場合があり、ＲＮＡ二次構造の形成が、Ｐｈｉ２９の３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、Ｐｈｉ２９がより長鎖のＲＮＡを分解し、ＲＣＡをプライミングすることを妨げる場合がある。この制限は、例えば、本開示で開示されるように、プローブ上に別々のＲＣＡプライミング領域を導入することによって回避することができる。
【００６９】
ｃＤＮＡのスプリントライゲーション
いくつかの実施形態では、まずＲＮＡ標的が特異的又は非特異的にｃＤＮＡ分子に逆転写された後に、該ｃＤＮＡ分子がプローブによって捕捉され得る。いくつかの例では、プローブは、本明細書に記載のＭＩＰ又はパドロックプローブであってよい。ＤＮＡリガーゼを用いたｄｓＤＮＡのライゲーションが、ハイブリッド二重鎖のライゲーションよりもより高い効率で、且つ／又はより高いミスマッチ感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖ）で起こる場合がある。例えば、Ｌａｇｕｎａｖｉｃｉｕｓ，  Ａｒｕｎａｓら、「Ｄｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：  ３′→  ５′  ＲＮａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ．」、ＲＮＡ  １４．３（２００８）：５０３−５１３；Ｂｕｌｌａｒｄ，  Ｄｅｓｍｏｎｄ  Ｒ．及びＲｉｃｈａｒｄ  Ｐ．  Ｂｏｗａｔｅｒ．、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｉｃｋ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３９８．１（２００６）：１３５−１４４を参照されたい。また、Ｓｒｉｓｋａｎｄａ，  Ｖｅｒｌ及びＳｔｅｗａｒｔ  Ｓｈｕｍａｎ．、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｂｙ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６．１５（１９９８）：３５３６−３５４１も参照されたい。いくつかの例で、ＤＮＡリガーゼを用いたｄｓＤＮＡのライゲーションは、１０以上、１０２以上、１０３以上、１０４以上、１０５以上、１０６以上、１０７以上又はこれらの間のあらゆる値のｋｃａｔ／Ｋｍにおいて起こり得る。ｃＤＮＡに対するＭＩＰ捕捉及び／又はパドロックプローブ捕捉の両方が、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＲＮＡ分子の多重検出に使用できる。例えば、Ｋｅ，  Ｒｏｎｇｑｉｎら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０．９（２０１３）：８５７−８６０；Ｍｉｇｎａｒｄｉ，  Ｍａｒｃｏら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇａｐ−ｆｉｌｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｔｕ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３．２２（２０１５）：ｅ１５１−ｅ１５１を参照されたい。しかしながら、逆転写を使用すると、これらの戦略では捕捉効率が限定され得る（３０％以下の分子当たり捕捉効率）。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｃｈａｔａｒｉｎａら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ７．５（２０１０）：３９５−３９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、プローブの逆転写プライマー領域は、ＬＮＡ塩基などの核酸アナログを含み得る。ｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーション効率���増加させ、下流のパドロックプローブ捕捉のための増幅産物の密度も増加させるため、ＬＮＡ塩基（エキシコン社（Ｅｘｉｑｏｎ））を含有する逆転写プライマーを使用してもよい。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｃｈａｔａｒｉｎａら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ７．５（２０１０）：３９５−３９７；Ｋｅ，  Ｒｏｎｇｑｉｎら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０．９（２０１３）：８５７−８６０を参照されたい。ＬＮＡ含有プライマーは、架橋ＲＮＡ分子へのアニーリングによってｃＤＮＡの局在を維持可能であるように、リボヌクレアーゼＨ耐性を持つように設計することも可能である。例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋ，  Ｊｅｎｓら、「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０．９（２００２）：１９１１−１９１８；Ｋｅ，  Ｒｏｎｇｑｉｎら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０．９（２０１３）：８５７−８６０を参照されたい。ＬＮＡ修飾は、核酸プローブの合成に組み入れることもできるし、あるいは、アレイ合成オリゴヌクレオチドライブラリからのＬＮＡ−ＲＴプライマーの増幅のためのＰＣＲの間に導入することもできる。例えば、Ｖｅｅｄｕ，  Ｒａｋｅｓｈ  Ｎ．、Ｂｉｒｔｅ  Ｖｅｓｔｅｒ、及びＪｅｓｐｅｒ  Ｗｅｎｇｅｌ、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＮＡ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄｓ．」、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８．５（２００７）：４９０−４９２を参照されたい。
【００７０】
標的分子のスプリントライゲーションなし
いくつかの実施形態では、標的核酸ではなく別のオリゴヌクレオチドをライゲーション用スプリントとして用いて、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを標的とする直鎖状の捕捉用プローブをｉｎ  ｓｉｔｕで環状化することが可能であり得る。この戦略は、プローブ−標的間相互作用の特異性を得るためにハイブリダイゼーションのみに依存し得るが、標的分子をスプリントとして用いる場合に発生するいくつかの問題を回避し得る。例えば、プローブとスプリントオリゴヌクレオチドの両方がＤＮＡから構成されている場合、スプリントライゲーション反応が効率的となりやすい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子に環状プローブを直接的にハイブリダイズさせることにより、ｉｎ  ｓｉｔｕでの環状化工程を完全に回避することが可能である。場合により、直鎖状ｓｓＤＮＡと比較して、環状ｓｓＤＮＡの特性が様々であることから、この戦略には潜在的な問題が生じ得る。直鎖状ｓｓＤＮＡは、数ナノメートルほどの持続長を有する、屈曲性の重合体であり得る。例えば、Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｂ．、Ｙｕｊｉａ  Ｃｕｉ、及びＣａｒｌｏｓ  Ｂｕｓｔａｍｅｎｔｅ、「Ｏｖｅｒｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ  Ｂ−ＤＮＡ：  ｔｈｅ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１．５２５０（１９９６）：７９５；Ｔｉｎｌａｎｄ，  Ｂｅｒｎａｒｄら、「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ．」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ    ３０．１９  （１９９７）：  ５７６３−５７６５）を参照されたい。環状ｓｓＤＮＡは有意により長い持続長を有し得る。例えば、Ｒｅｃｈｅｎｄｏｒｆｆ，  Ｋｒｉｓｔｉａｎら、「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｒａｐｈｉｔｅ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｈｙｓｉｃｓ  １３１．ＬＰＭＶ−ＡＲＴＩＣＬＥ−２００９−００２（２００９）：０９５１０３を参照されたい。環状ｓｓＤＮＡは通常、アクリルアミドゲル電気泳動の際に直鎖状分子よりもゆっくりと移動するため、ＦＩＳＳＥＱ用ヒドロゲル中へのプローブの拡散速度が減少する場合がある。いくつかの場合で、あるＤＮＡ分子を別の直鎖状ＤＮＡ分子に環状化することは、これらの分子を位相的に連結し得る。二重鎖ヘリックスターンの数と同じ回数だけ標的鎖の周りを巻き戻っている、塩基対形成に参加していない環状ＤＮＡの領域によって、鎖切断を導入することなく、すなわち、位相的に連結することなく、環状ＤＮＡ分子と直鎖状ＤＮＡ分子とをハイブリダイズすることが可能であり得る。いくつかの実施形態で、環状化プローブの標的へのハイブリダイゼーションが、直鎖状プローブよりも大きな特異性を示すことがあるが、これはおそらくは、ロックされた環状高次構造が生み出す屈曲力又は張力によるものである。例えば、Ｔａｎｇ，  Ｙａｑｉｎら、「Ｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ．」、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ８５（２０１６）：１５１−１５６を参照されたい。しかしながら、これらの分子は、ｍｉＲＮＡの長さが短いために、トポロジーには拘束されない。
【００７２】
いくつかの実施形態において、標的には、複数のプローブが結合することが可能である。ＲＣＡはプローブを大規模に増幅するため、標的外に結合した、又は試料中に非特異的に保持されたあらゆるプローブが、偽陽性の捕捉現象を起こし得る。場合によっては、単一のプローブだけを用いて、増幅されたプローブが標的分子に局在しているかどうかを判定することは困難であり得る。しかしながら、１分子当たりに複数の捕捉用プローブを用いる誤り検出訂正戦略を考案することができる。例えば、完全なバーコード配列を、いくつかのプローブに分配してもよい。同一標的分子に対応する複数のプローブが、空間的に共局在しているオフターゲット結合又は非特異的な保持を起こす可能性は小さい。
【００７３】
核酸に対して結合性又は他の反応性を示すタンパク質の使用
いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、タンパク質成分と核酸成分とを含むプローブ複合体であり得る。タンパク質成分は、プローブの標的上への結合を促進することが可能である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱ法を設計するために、核酸結合タンパク質（Ｃａｓ９など）を使用することができる。いくつかの他の実施形態では、結合以外の核酸の反応（切断又はライゲーションなど）を触媒するタンパク質を、特定のＲＮＡ又はｃＤＮＡ種の検出の対象としてよい。完全にプログラム可能なＲＮＡ結合タンパク質は、核酸標識に連結されている場合がある改変Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメインのコンカテマーを用いて作製することができる（ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、又は核酸タグの結合）。例えば、Ａｄａｍａｌａ，  Ｋａｔａｒｚｙｎａ  Ｐ．、Ｄａｎｉｅｌ  Ａ．  Ｍａｒｔｉｎ−Ａｌａｒｃｏｎ、及びＥｄｗａｒｄ  Ｓ．  Ｂｏｙｄｅｎ、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｕｎｉｔ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１３．１９（２０１６）：Ｅ２５７９−Ｅ２５８８を参照されたい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、核酸によって誘導される核酸結合タンパク質を使用することが可能である。例示的な核酸誘導型核酸結合タンパク質としては、アルゴノート、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、及び／又はＣ２ｃ２を挙げることができる。例えば、Ｂｏｕａｓｋｅｒ，  Ｓａｍｉｒ、及びＭａｒｔｉｎ  Ｊ．  Ｓｉｍａｒｄ、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  ｔｒａｃｉｎｇ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ４６１．７２６５（２００９）：７４３−７４４）；Ｍａｌｉ，  Ｐｒａｓｈａｎｔら、「ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９．６１２１（２０１３）：８２３−８２６；Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ，  Ｂｅｒｎｄら、「Ｃｐｆ１  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．」、Ｃｅｌｌ  １６３．３（２０１５）：７５９−７７１；Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，  Ｏｍａｒ  Ｏ．ら、「Ｃ２ｃ２  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）：ａａｆ５５７３を参照されたい。単一のタンパク質は、特異性を付与するために、ガイド核酸を用いて多種多様な標的を結び付けることが可能であるため、核酸誘導型核酸結合タンパク質（アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）及びＣ２ｃ２など）はさらに大きな柔軟性を提供することが可能である。ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）のイニシエーター、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用の直鎖状若しくは環状のＤＮＡ標識、又は他の種類の検出可能な標識など、バーコード核酸を標的ＲＮＡ分子に局在させるために、これらの親和結合反応を使用することができる。核酸誘導型核酸結合タンパク質の場合、ＲＮＡ又はＤＮＡのガイド鎖を、標的核酸分子の代わりに検出することができる。ガイド核酸分子は、マイクロアレイにより合成及び増幅してもよい。
【００７６】
特定のＲＮＡ又はｃＤＮＡ種に影響を与えるために、核酸の反応を触媒するタンパク質を使用してもよい。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ検出用に特定のＲＮＡ又はｃＤＮＡ種を改変するために、核酸の切断反応及び／又はライゲーション反応を使用してもよい。ＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子は「タグメンテーション（Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」のための鋳型の役割を果たすことが可能であり、タグメンテーションでは、該分子が切断され、その断片の１つに外来性核酸がライゲーションされる。例えば、Ｓｙｅｄ，  Ｆｒａｚ、「Ｓｅｃｏｎｄ‐Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．」、Ｔａｇ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：３１１−３２１を参照されたい。これらの核酸反応は、タンパク質成分及び／又は「ガイド（ｇｕｉｄｅ）」核酸成分を含むプローブ複合体の結合特異性を利用することにより、特定の種を対象とすることができる。いくつかの実施形態では、標的ではない特定のＲＮＡ又はｃＤＮＡ種を、検出のため除去することを目的として、本明細書に記載の戦略を用いて改変することができる。例えば、望まれない標的は、種々のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＨなど）によって消化することができる。いくつかの実施形態では、特定のＲＮＡ又はｃＤＮＡ種を改変してもよい。
【００７７】
検出用の直鎖状のポリメラーゼコロニーの形成
いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、更なる増幅のために、共通のアダプター領域を含む。いくつかの実施形態では、プローブ又は環状化プローブは、ＲＣＡによって増幅することが可能である。いくつかの実施形態では、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）などの直鎖状の増幅産物を作製することが可能である。
【００７８】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の代替として、直鎖状の基質を用いて、直鎖状ポリメラーゼコロニー（「ポロニー」）を形成してもよい。ポロニーは、参照によって本明細書に援用されるＭｉｔｒａ，  Ｒｏｂｉ  Ｄ．ら、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ．」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２０．１（２００３）：５５−６５に記載されている方法で作製される場合がある。ポロニーは、上記のものなどの、酵素、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡにハイブリダイズした核酸プローブ、又は核酸−タンパク質複合体により標的ＲＮＡ若しくは標的ｃＤＮＡ種に局在化した核酸プローブによってｉｎ  ｓｉｔｕで改変されたＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを含んでよい。後に、ポロニーはＦＩＳＳＥＱで検出してもよい。
【００７９】
様々な実施形態のＲＮＡ捕捉を要約すると、本開示は以下を提供する：特定のＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を特異的にプライムするように作用する、ＲＮＡ配列に相補的な配列を含む逆転写用プライマーを含むプローブを合成することによって、逆転写を特定のＲＮＡ種に標的化してもよい。逆転写用プライマーを含むこれらのプローブは、後に、ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリに加工することが可能である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する：ＲＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができ、ここで、プローブの最終産物は環状ＤＮＡ分子となり、この環状ＤＮＡ分子がＦＩＳＳＥＱによる検出のためのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用の鋳型として働く。いくつかの実施形態では、捕捉用プローブは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、相補的なＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列にアニーリングした際にリガーゼによって環状化される直鎖状プローブであり得る。いくつかの実施形態では、捕捉用プローブは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、該プローブがライゲーションされて環状となり得るように、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、又はリガーゼなどにより、直鎖状プローブの「ギャップ」を充填する配列鋳型として、内在性のＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列が使用された後に、環状化される直鎖状プローブであり得る。いくつかの実施形態では、捕捉用プローブは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、標的のＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子とは独立した追加の「スプリント」オリゴヌクレオチドを用いてリガーゼによって環状化される直鎖状プローブであり得る。いくつかの実施形態では、捕捉用プローブは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子にハイブリダイズした環状プローブであり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本開示は、タンパク質成分と核酸成分とを含むプローブ複合体により、ＲＮＡ標的を捕捉する方法を提供する。本開示は以下を提供する：ＲＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができ、ここで、核酸−タンパク質複合体は、タンパク質（改変Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメインのコンカテマーなど）の結合特性を介して、特定のＲＮＡ又はｃＤＮＡ種を対象とし、核酸標識を標的ＲＮＡ又はｃＤＮＡ種に局在化させる。いくつかの実施形態では、プローブ複合体の核酸成分は、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、逆転写とその後のｃＤＮＡのタンパク質への結合、又は核酸とタンパク質との間の他の連結形態によって形成される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体のタンパク質成分は、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成されたＤＮＡ又はｍＲＮＡから発現される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体の核酸成分は、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体の核酸成分及びタンパク質成分の両方が、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成される。例えば、プローブ複合体をｍＲＮＡディスプレイによって標識することが可能であり、ここで、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成されたｍＲＮＡが、タンパク質合成を指示し、核酸標識を構成し得る。
【００８２】
本開示は以下を提供する：タンパク質又は核酸−タンパク質複合体が核酸配列（「ガイド」核酸）を介してとあるＲＮＡ種又はとあるｃＤＮＡ種を対象とする、ＲＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。例示的な核酸誘導型結合タンパク質として、限定はされないが、アルゴノート、Ｃａｓ９、及びＣ２ｃ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は、タンパク質によって（例えば、核酸タグを付けたタンパク質を用いて）、標的のＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象とする。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分が、「ガイド」核酸の標的化部分に付加されるか、又は、「ガイド」核酸を構成する。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は直鎖状ＤＮＡを含んでおり、この直鎖状ＤＮＡはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用の鋳型として環状化される。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は直鎖状ＲＮＡを含んでおり、この直鎖状ＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて特異的に捕捉されるか、又は、ランダム捕捉ＦＩＳＳＥＱ（例えば、Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４）を用いて非特異的に捕捉される。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は環状ＤＮＡを含んでおり、この環状ＤＮＡはＲＣＡを用いて増幅することができる。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分はＤＮＡ又はＲＮＡを含んでおり、このＤＮＡ又はＲＮＡはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）、又はサイクリックハイブリダイゼーション連鎖反応（ＣＨＣＲ）により検出可能な標識として働く。
【００８３】
本開示は以下を提供する：切断、ライゲーション、末端修飾（例えば５’リン酸化）などの修飾、及び保護を含む、１又は複数の核酸反応が、１又は複数のＲＮＡ種又はｃＤＮＡ種を対象とする、ＲＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。いくつかの実施形態では、上記反応は、タンパク質成分及び／又は「ガイド」核酸成分を含む、プローブ複合体の結合特異性により、とあるＲＮＡ種又はとあるｃＤＮＡ種を対象とする。いくつかの実施形態では、上記複合体の１又は複数の成分はＤＮＡマイクロアレイを用いて合成される。いくつかの実施形態では、標的のＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列は、その後、配列決定を介した検出のためのＦＩＳＳＥＱ鋳型へと加工される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する：直線的なポリメラーゼのコロニー（ポロニー）が形成され検出される、ＲＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。
【００８５】
様々な実施形態において、標的分子はｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡ分子から合成されたｃＤＮＡ分子であり、このｃＤＮＡ分子は、とあるＲＮＡ種に相補的な逆転写用プライマーなどの、標的化された逆転写用プライマー、又は、ランダムヘキサマー若しくはポリ（ｄＴ）プライマーなどの、標的化されていない（ランダムな）逆転写用プライマー、を用いて逆転写される場合がある。
【００８６】
様々な実施形態において、核酸プローブ又はプローブ複合体の核酸成分は、ＤＮＡマイクロアレイ合成技術を用いて部分的に又は完全に合成される。いくつかの実施形態では、プローブ又はプローブの核酸成分は、増幅された後、本明細書に記載の方法を用いて機能的なプローブへと「成熟」することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、核酸プローブ又はプローブ複合体の核酸成分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基又は他の核酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、この修飾核酸プローブが、例えば、ＰＣＲによるＬＮＡ若しくは核酸アナログ塩基の組み込みによって、逆転写によって、又は、プローブの酵素的な増幅及び「成熟」の際に、ハイブリダイゼーションの速度、効率、若しくは特異性、又はプローブ−標的分子間相互作用の指示を増強するよう機能し得る。
【００８８】
様々な実施形態において、標的化ＦＩＳＳＥＱ用の複数のプローブが同時に合成及び／又は使用される。
【００８９】
核酸配列を検出するために様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ種の検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）による、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として用いる核酸配列の検出によって可能となる。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ種の検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）による、プローブ又はプローブ複合体の核酸成分に含まれる核酸配列の検出、例えば「バーコード」シークエンシング、によって可能となる。いくつかの他の実施形態では、標的化ＲＮＡ種の検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）  、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として得られた核酸配列、及びプローブ又はプローブ複合体の核酸成分に含まれる核酸配列の両方の検出を含む。
【００９０】
本開示は以下を提供する：分解、末端修飾（例えば２’Ｏ−メチル付加）などの修飾、及び脱保護を含む、１又は複数の核酸反応が、１又は複数のＲＮＡ種又はｃＤＮＡ種を対象とする、ＲＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。いくつかの実施形態では、上記反応は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて合成された核酸成分を含む、プローブ複合体の結合特異性により、とあるＲＮＡ種又はとあるｃＤＮＡ種を対象とする。いくつかの実施形態では、望まれない標的ＲＮＡ配列又は標的ｃＤＮＡ配列は、後のＦＩＳＳＥＱ用ライブラリ及びデータセットで表れないように、後に試料から枯渇される。いくつかの実施形態では、上記特異的な枯渇は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二重鎖のリボヌクレアーゼＨ消化を介して行われる。いくつかの実施形態では、上記特異的な枯渇は、Ｃａｓ９又は他のタンパク質核酸複合体を介して行われる。いくつかの実施形態では、選択的分解の標的とされるＲＮＡ種は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）又は転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素の伸長を遮断するために、オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。いくつかの実施形態では、別のＲＮＡプローブ複合体による望まれない標的ＲＮＡへのアクセスを遮断するために、オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。選択的分解の標的とされる例示的なＲＮＡ種は、ハウスキーピング遺伝子を含み得る。ハウスキーピング遺伝子は、基礎的な細胞機能の維持に必要とされる構成遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、選択的分解の標的とされる望まれない標的ＲＮＡ種は、ある特定のレベルよりも大きな平均ＲＮＡ量で発現される遺伝子を含む。所望により、選択的分解の標的とされる望まれない標的ＲＮＡ種は、１細胞当たり約１００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約２００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約４００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約６００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約８００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約１０００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約１２００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約１４００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約１６００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約１８００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約２０００個以上のＲＮＡ分子、１細胞当たり約１００００個以上のＲＮＡ分子、又はそれ以上（例えば、ｒＲＮＡは１細胞当たり最大１０，０００，０００コピー存在する）、又はこれらの間のあらゆる値、の平均ＲＮＡ量で発現される遺伝子を含む場合がある。
【００９１】
標的化ＤＮＡ捕捉
先の「標的化ＲＮＡ捕捉」のセクションに記載された全ての方法が、ｉｎ  ｓｉｔｕでの特定のＤＮＡ配列の検出に適用され得るが、合理的には「ＲＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」が「ＤＮＡ」で置換され、それに付随して、必要に応じて、検出スキームの関連する酵素成分又はタンパク質成分が、ＤＮＡ基質に対しての対応する反応を触媒する対応する酵素又はタンパク質に置換される。
【００９２】
これらの方法は、核酸プローブ又は核酸−タンパク質プローブ複合体のハイブリダイゼーションを可能にすることを目的とする、ｄｓＤＮＡを変性させてｓｓＤＮＡにする工程など、追加の試料処理工程を伴う場合がある。
【００９３】
環状化による捕捉法は、ＲＣＡを用いて高度に増幅可能である、数十のゲノム塩基に対応する、単一のプローブの検出を可能にする場合がある。典型的には数百ナノメートルという、巨大サイズのＲＣＡ産物は、空間分解能を減少させる場合があるが、超分解能顕微鏡法を用いてイメージングが可能である。場合により、環状化による捕捉は、変異検出及び任意スケールのハプロタイピングのための、一塩基多型の検出を可能にする場合がある。
【００９４】
ＲＮＡの検出に核酸結合タンパク質を用いるための本明細書に記載の方法は、ＤＮＡの検出にも用いることができる。プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質としては、限定はされないが、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、及びＢｕｒｒＨが挙げられる。単一のタンパク質は、特異性を与えるために、ガイド核酸を用いて、多種多様な標的を、結び付けることが可能であるため、場合によっては、アルゴノート、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、及びＣ２ｃ２などの、核酸誘導型核酸結合タンパク質は、より大きな屈曲性を与える場合がある。場合によっては、上記タンパク質は結合のエネルギー地形を変化させる場合があるため（例えば、核酸ハイブリダイゼーション単独と比較した場合）、これらの方法は、より高速な速度論及びより高い配列ミスマッチ感度を有し得る。
【００９５】
最も情報に富んだゲノムＦＩＳＳＥＱ法は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の直接的な類似物であり、配列決定用ライブラリの構築の鋳型としてゲノム配列を用いる。ＮＧＳ用のゲノム配列決定用ライブラリの作製は、断片化工程、末端修復工程、アダプターライゲーション工程、及び／又はＰＣＲ工程を含む場合がある。しかしながら、これらの工程のいくつかは、トランスポザーゼ酵素を用いることで、「タグメンテーション」と呼ばれる１つの反応の中でＤＮＡを断片化し、アダプターをライゲーションすることによって、同時に達成可能である（例えば、イルミナ社のＮｅｘｔｅｒａ法を用いた場合のように）。ＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱ及びゲノムＦＩＳＳＥＱに変更を加えて、既存のＮＧＳ  ＲＮＡ−ｓｅｑプロトコルを適合させることができる。
【００９６】
いくつかの例で、ゲノム断片化の酵素的手段及び／又は化学的手段はＦＩＳＳＥＱに適合可能である。任意であるが、物理的なＤＮＡ断片化法はＦＩＳＳＥＱに適合しない場合がある。これらの物理的方法は音響剪断及び超音波処理を含む場合があり、これらは試料の他の側面にダメージを与える場合がある。いくつかの例で、二酵素ミックス（ニュー・イングランド・バイオラボ社）の、デオキシリボヌクレアーゼＩ又はフラグメンターゼ（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ）が、ＮＧＳ用ライブラリ構築に有効である場合がある。固定された生物標本の中で、ＤＮＡは、いくつかの要因によって自然に断片化されている場合もあり、例えば、低ｐＨのホルマリン及び保存中の環境条件によって形成される脱プリン／脱ピリミジン部位の分解が挙げられる。いくつかの酵素的処理を用いて、ＤＮＡ断片の末端はアダプターライゲーション用に調整することができ、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、及びクレノウラージフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）による平滑末端化及び５’リン酸化、並びにＴａｑポリメラーゼ又はクレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）（エクソ−クレノウフラグメント）による３’ポリアデニル化が挙げられる。
【００９７】
ほとんどのゲノムＮＧＳ用ライブラリとは対照的に、ライブラリを増幅するための調製用ＰＣＲは必要でない場合がある。その結果、検出可能な配列の各々がゲノム断片と１：１対応することで、ＰＣＲクローンの曖昧さをなくすためのユニークな分子識別名又は他の手法の必要性がなくなる場合がある。代わりに、ＲＣＡによる増幅のための配列決定用鋳型は環状化することができる。これらの断片が両末端で既知のアダプター配列により修飾されているならば、これらの分子はスプリントライゲーションを用いて環状化することができる。あるいは、特にＦＩＳＳＥＱ用に調整された新規のアダプターライゲーション・環状化戦略を考案することもできる。例えば、環状化の１つの機構としてヘアピンライゲーションを含むライブラリ構築プロトコルが想定できる。例えば、ヘアピン核酸分子を、ｄｓＤＮＡ断片の各末端で両方の鎖にライゲーションし、その断片をＲＣＡ用の鋳型として環状化するよう働かせてもよい。
【００９８】
イルミナ社のＮｅｘｔｅｒａ法に基づく戦略を使用することができるが、ライブラリ構築を特定のゲノム配列に標的化するためにＤＮＡトランスポザーゼの代わりにＣａｓ９が使用される。これにより、目的の遺伝子座の富化だけでなく、ライブラリ構築のための断片サイズの細かな調整も可能となる場合がある。この方法を用いることで、Ｃａｓ９のヌクレオソームに対する感受性により、クロマチン状態に関するさらなる情報がもたらされる場合もある。メチル化の検出を行うこともできる。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕでのメチル化感受性制限酵素を用いた配列決定（ＭＲＥ−ｓｅｑ）の１つの形態である、ＣｐＧメチル化に対して感受性の制限酵素による断片化を、用いることができる。ＢＳ−ｓｅｑ及びメチルＣ−ｓｅｑをＦＩＳＳＥＱに適用することもでき、亜硫酸水素ナトリウム処理によって非メチル化シトシンがウラシルに変換され、一方でメチル化シトシンは保護され、参照ゲノム配列と比較して変化が検出される。
【００９９】
標的化ＤＮＡ  ＦＩＳＳＥＱを要約すると、種々の実施形態において、本開示は以下を提供する：ＤＮＡ種がｉｎ  ｓｉｔｕで検出可能となる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ  ＦＩＳＳＥＱ用プローブの最終産物は環状ＤＮＡ分子であり、この環状ＤＮＡ分子が、ＦＩＳＳＥＱによる検出のための、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用の鋳型として働く。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的捕捉用プローブは直鎖状プローブであり、この直鎖状プローブは、ＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、相補ＤＮＡ配へのアニーリングの際にリガーゼによって環状化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的捕捉用プローブは直鎖状プローブであり、この直鎖状プローブは、ＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、該プローブがライゲーションされて環状となり得るように、ＤＮＡポリメラーゼ、又はリガーゼなどにより、直鎖状プローブの「ギャップ」を充填する、配列鋳型として、内在性のＤＮＡ配列が使用された後に、環状化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的捕捉用プローブは直鎖状プローブであり、この直鎖状プローブは、ＤＮＡ分子にハイブリダイズされ、標的のＤＮＡ分子とは無関係な追加の「スプリント」オリゴヌクレオチドを用いてリガーゼによって環状化される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的捕捉用プローブは環状プローブであり、この環状プローブがＤＮＡ分子にハイブリダイズされる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、核酸−タンパク質複合体が、改変Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメインのコンカテマーなど、該タンパク質の結合特性を介してとあるＤＮＡ種を対象とし、核酸標識を標的ＤＮＡ種に局在化させる。いくつかの実施形態では、プローブ複合体の核酸成分は、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、逆転写とその後のｃＤＮＡのタンパク質への結合、又は核酸とタンパク質との間の他の連結形態によって形成される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体のタンパク質成分は、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成されたＤＮＡ又はｍＲＮＡから発現される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体の核酸成分は、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体の核酸成分及びタンパク質成分の両方が、ＤＮＡマイクロアレイ技術（例えばｍＲＮＡディスプレイによる該複合体の標識など）を用いて部分的に又は完全に合成される。いくつかの実施形態では、プローブ複合体は、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて部分的に又は完全に合成され、タンパク質合成を共に指示し、プローブの核酸成分を構成するｍＲＮＡで標識され得る。
【０１０１】
本開示は以下を提供する：タンパク質又は核酸−タンパク質複合体が、アルゴノート、Ｃａｓ９、及びＣ２ｃ２などの、核酸配列（「ガイド」核酸）を介してとあるＤＮＡ種を対象とする、ＤＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は、タンパク質によって（例えば、核酸タグを付けたタンパク質を用いて）、標的のＤＮＡを対象とする。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分が、「ガイド」核酸の標的化部分に付加されるか、又は、「ガイド」核酸を構成する。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は直鎖状ＤＮＡを含んでおり、この直鎖状ＤＮＡはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用の鋳型として環状化される。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は直鎖状ＲＮＡを含んでおり、この直鎖状ＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて特異的に捕捉されるか、又は、ランダム捕捉ＦＩＳＳＥＱ（例えば、Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４）を用いて非特異的に捕捉される。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分は環状ＤＮＡを含んでおり、この環状ＤＮＡはＲＣＡを用いて増幅される。いくつかの実施形態では、プローブの核酸成分はＤＮＡ又はＲＮＡを含んでおり、このＤＮＡ又はＲＮＡはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）、又はサイクリックハイブリダイゼーション連鎖反応（ＣＨＣＲ）により検出可能な標識として働く。
【０１０２】
様々な実施形態において、本開示は、試料を複数のプローブ複合体と接触させることにより、ｉｎ  ｓｉｔｕＤＮＡ配列決定用ライブラリ（ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリ）を形成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記プローブ複合体はｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、又は他の核酸を含む。いくつかの実施形態では、上記プローブ複合体はＤＮＡトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、上記プローブ複合体はＣａｓ９又は他の核酸誘導型核酸結合タンパク質を含む。
【０１０３】
本開示は以下を提供する：切断、ライゲーション、末端修飾（例えば５’リン酸化）などの修飾、及び保護を含む、１又は複数の核酸反応が、１又は複数のＤＮＡ種を対象とする、ＤＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。いくつかの実施形態では、上記反応は、タンパク質成分及び／又は「ガイド」核酸成分を含む、プローブ複合体の結合特異性により、とあるＤＮＡ種を対象とする。いくつかの実施形態では、上記複合体の１又は複数の成分はＤＮＡマイクロアレイを用いて合成される。いくつかの実施形態では、標的のＤＮＡ配列は、その後、配列決定を介した検出のためのＦＩＳＳＥＱ鋳型へと加工される。いくつかの実施形態では、直線的なポリメラーゼのコロニー（ポロニー）が形成され、標的ＦＩＳＳＥＱで検出される。
【０１０４】
本明細書で開示されるプローブは、マイクロアレイで合成され得る。いくつかの実施形態では、核酸プローブ又はプローブ複合体の核酸成分は、ＤＮＡマイクロアレイ合成技術を用いて部分的に又は完全に合成される。いくつかの実施形態では、上記合成されたプローブは、本明細書に記載の方法を用いて機能的なプローブへと「成熟」され得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、標的ｄｓＤＮＡは、二重鎖の熱融解及び／又は一方の鎖の酵素消化などにより、一本鎖の（ｓｓＤＮＡ）標的に変換される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、核酸プローブ又はプローブ複合体は１又は複数の核酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、核酸プローブ又はプローブ複合体の核酸成分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基又は他の核酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、この修飾プローブが、ハイブリダイゼーションの速度、効率、若しくは特異性、又はプローブ−標的分子間相互作用の指示を増強するよう機能し得る。ＬＮＡ又は核酸アナログ塩基の組み込みは、例えば、ＰＣＲによって、逆転写によって、又はプローブの酵素的な増幅及び「成熟」の際に行われ得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、複数のプローブが同時に合成及び／又は使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ種の検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）による、ＤＮＡを鋳型として用いる核酸配列の検出によって可能となる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ種の検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）による、プローブ又はプローブ複合体の核酸成分に含まれる核酸配列の検出、例えば「バーコード」シークエンシング、を含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ種の検出は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）による、ＤＮＡを鋳型として得られた核酸配列と、プローブ又はプローブ複合体の核酸成分に含まれる核酸配列との両方の検出を含む。
【０１０８】
本開示は以下を提供する：分解、末端修飾（例えば２’Ｏ−メチル付加）などの修飾、及び脱保護を含む、１又は複数の核酸反応が、１又は複数のＤＮＡ種を対象とする、ＤＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うことができる。いくつかの実施形態では、上記反応は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて合成された核酸成分を含む、プローブ複合体の結合特異性により、とあるＤＮＡ種を対象とする。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、後のＦＩＳＳＥＱ用ライブラリ及びデータセットで表れないように、後に試料から枯渇される。いくつかの実施形態では、上記特異的な枯渇は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二重鎖のリボヌクレアーゼＨ消化を介して行われる。いくつかの実施形態では、上記特異的な枯渇は、Ｃａｓ９又は他のタンパク質核酸複合体を介して行われる。いくつかの実施形態では、選択的分解の標的とされるＤＮＡ種は反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼの伸長又はＤＮＡリガーゼの反応を遮断するために、オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。いくつかの実施形態では、別のプローブ複合体による標的ＤＮＡへのアクセスを遮断するために、オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【０１０９】
捕捉のためのハイブリダイゼーションの強化
標的化ＲＮＡ  ＦＩＳＳＥＱ戦略及び標的化ゲノムＦＩＳＳＥＱ戦略の研究では、生物試料内のプローブと標的分子との間のハイブリダイゼーション反応の速度が許容できないほどに遅い、という問題が生じ得る。例えば、本開示は、細胞又は細胞マトリックス内でハイブリダイゼーション反応を増強するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、捕捉のためのハイブリダイゼーションを増強するために、クラウディング剤が使用される場合がある。いくつかの実施形態では、酵素活性を増強するクラウディング剤を使用することが可能である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、切断後に洗浄除去できる切断可能な荷電基を含む。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、核酸ハイブリダイゼーション後から酵素反応前までに中和できる荷電基を含む。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は分解可能である。
【０１１０】
反応緩衝剤
濃度依存性
まず、大規模多重標的化ＦＩＳＳＥＱのための設計には全て、オリゴヌクレオチドプローブの複合プールの使用が含まれる。しかしながら、ハイブリダイゼーションは二分子間の反応であるため、ハイブリダイゼーションの速度は両分子種の濃度に依存的である場合がある。プローブのプール（ライブラリとしても知られている）を使用する場合、ライブラリの多様性と比例して個々のプローブの濃度は減少する。すなわち、１０００個の遺伝子を同時に標的とすることを試みた場合、各プローブの濃度は、少なくとも１０００倍、もしかするとそれ以上（例えば、１遺伝子当たりに複数のプローブが使用される場合）、減少する場合がある。
【０１１１】
そのため、大規模多重標的化ＦＩＳＳＥＱの実施は、プローブプールの濃度を全体的に増加することによって増強される場合がある。典型的なＲＮＡ  ＦＩＳＨ用プローブ濃度は１〜１５０ｎＭであり得る。例えば、Ｒａｊ，  Ａｒｊｕｎら、「Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｎｇｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ５．１０（２００８）：８７７を参照されたい。複合的プローブライブラリのＩＳＨ用には、上記濃度は上に調節される。例えば、Ｃｈｅｎ，  Ｋｏｋ  Ｈａｏら、「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ，  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８．６２３３（２０１５）：ａａａ６０９０を参照されたい。いくつかの例では、複合プローブライブラリの濃度は、約１０μＭ以上、約２０μＭ以上、約４０μＭ以上、約６０μＭ以上、約８０μＭ以上、約１００μＭ以上、約１２０μＭ以上、約１４０μＭ以上、約１６０μＭ以上、約１８０μＭ以上、約２００μＭ以上、又はこれらの間のあらゆる値の濃度に調節される場合がある。これをさらに調節することも可能である。例えば、上記値は、約２倍、約４倍、約６倍、約８倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１２０倍、約１４０倍、約１６０倍、約１８０倍、約２００倍、又はこれらの間のあらゆる値にさらに調節される場合がある。所望により、上記値は、水中のＤＮＡの溶解限度（約１０ｍＭ）に近くなり得る、１００倍に調節される場合がある。これは、マイクロアレイ合成されたオリゴヌクレオチドライブラリの相対的に安価な酵素的増幅により可能となる。
【０１１２】
酵素適合性が増強されたクラウディング剤
場合によっては、効率的なプローブハイブリダイゼーションの最適条件と下流の酵素反応の最適条件とは、概して、互いに相容れない傾向であり得る。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、クラウディング剤の存在下で効率的となる場合がある。クラウディング剤の一例としては、デキストラン硫酸があり得る。しかしながら、デキストラン硫酸によって酵素が強く阻害される場合がある。例えば、Ｂｏｕｃｈｅ，  Ｊ．  Ｐ．、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ  ｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ．」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１５．１（１９８１）：４２−４５。高度に荷電した、高分子量の重合体であるため、下流の酵素反応、例えば、逆転写、ライゲーション、ＤＮＡ重合、が強く阻害されないポイントまで、デキストラン硫酸を試料から洗浄することは難しい場合がある。しかしながら、クラウディング剤の非存在下では、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの速度が数桁遅くなる場合がある。例えば、Ｗａｈｌ，  Ｇｅｏｆｆｒｅｙ  Ｍ．、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｔｅｒｎ、及びＧｅｏｒｇｅ  Ｒ．  Ｓｔａｒｋ、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌｓ  ｔｏ  ｄｉａｚｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐａｐｅｒ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７６．８（１９７９）：３６８３−３６８７を参照されたい。すなわち、酵素反応を強く阻害しないクラウディング剤が、ＦＩＳＳＥＱで使用可能である。クラウディング剤は、典型的には、高分子量、高結合価の、荷電した重合体であり得る。例えば、クラウディング剤は、ポリアクリル酸、ポリビニルスルホン酸、及びアルギン酸などの重合体であり得る。所望により、クラウディング剤は、デキストラン硫酸と類似した重合体であり得る。いくつかの例では、クラウディング剤の分子間組織化が、クラウディング剤としてのその有効性を判定する要素となる場合がある。
【０１１３】
一例として、デキストラン硫酸は、ハイブリダイゼーションの際にネットワークの形成（高度に局在化したプローブ濃度）を助けることで、アニーリングプロセスを促進すると理解される。アルギン酸のＧ−ブロック（Ｇ−ｂｌｏｃｋ）は、二価の陽イオン（例えば、Ｃａ２＋）との分子間架橋によるヒドロゲルの形成に関与すると考えられている。デキストラン硫酸が、外因的な化学的架橋反応下及びキトサン存在下以外で、ヒドロゲルを形成するかは不明であり、そのどちらも、典型的な核酸ハイブリダイゼーション反応の間には存在しない。いくつかの例では、クラウディング剤は、ヒドロゲルの形成における自己会合性を含む場合がある。あるいは、クラウディング剤は、ヒドロゲルの形成における自己会合性を含まない場合がある。所望による、このヒドロゲル形成における自己会合性の違いが、核酸ＤＮＡハイブリダイゼーション反応の速度の向上における、デキストラン硫酸とアルギン酸との間の違いを説明する場合がある。
【０１１４】
例えば、ポリアクリル酸及びポリビニルスルホン酸は、クラウディング剤として共に効果的に機能する場合があるが、一方、アルギン酸はクラウディング剤として効果的に機能しない場合がある。これは、ＤＮＡのクラウディングにおいてのその有効性を減じる、分子間組織化によるものである場合がある。いくつかの例では、ポリアクリル酸は酵素反応を強く阻害する場合があるが、ポリビニルスルホン酸はそれほどの阻害を示さない場合がある。一例として、ある阻害機構は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、リン酸などの必須金属又は荷電必須補因子、並びに酵素機能に必要な他の金属及び荷電イオン、のキレート化を介したものである場合がある。ポリアクリル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）などのポリイオン塩は、マグネシウムを含有する酵素反応緩衝剤の存在下でナトリウムイオンをマグネシウムイオンと交換し、上記必須補因子の有効濃度を下げる場合がある。別の阻害機構として、酵素に対する結合及び構造的損傷を挙げることができ、例えば、酵素の荷電ドメインとイオン性重合体との間の電荷誘引及び結合であり、これらは、酵素の効果的な反応内隔離を引き起こし、且つ、酵素の構造及び関連機能に必要とされる酵素内の静電気的相互作用すなわち電荷相互作用を破壊する場合ある。あるいは又はさらに、水和性、又は疎水性、電荷、及び構造が、ポリイオン−タンパク質間相互作用の強度に寄与する場合がある。ポリイオン上又はポリイオンネットワーク中のタンパク質吸収が、効果的な酵素濃度の減少に寄与する場合がある。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤として機能できるが、ある程度は分子プログラミング性を有する化合物が使用されてもよい。例えば、クラウディング剤として機能し得るいくつかの重合体を使用することが可能であり、その後、その荷電基を切断除去又は中和することが可能である。これにより、上記化合物はＰＥＧのような中性重合体に変化し、この中性ポリマーが酵素反応の効率を実際に増強する。いくつかの実施形態では、重合体は、クラウディング剤として機能した後に、小さな単量体に特異的に分解され得、試料から容易に洗浄可能である。クラウディング剤の不動態化又は分解の化学特性は、核酸とは独立していること、すなわち、核酸を分解しない又は核酸を不適合性のものにしないこと、が必要である。これらの官能基のいくつかとして、過ヨウ素酸ナトリウムにより切断可能なα−ヒドロキシ酸；熱により切断可能なβ−ケト酸；銀イオンにより切断可能なホスホロチオエート結合；還元により切断しチオールにすることが可能なジスルフィド結合；及び、光処理又は化学的処理により切断され得る他の種類の化学結合が挙げられる。
【０１１６】
酵素適合性の核酸ハイブリダイゼーション速度の増強のためのプログラム可能なポリイオン又は高分子電解質の例としては、イオン価を与える化学基を含むように切断可能なリンカーを介して後に修飾され得る、ＰＥＧ、ＰＶＡ、若しくはＰＡＡなどの重合体、Ｃｙｓ（Ｌｙｓ）ｎＣｙｓの重縮合反応物、又は、クラウディング剤として機能した後に分解され得るように切断可能な結合を含む単量体から形成された重合体が挙げられる。例えば、Ｏｕｐｉｃｋｙ，  Ｄａｖｉｄ、Ａｌａｎ  Ｌ．  Ｐａｒｋｅｒ、及びＬｅｏｎａｒｄ  Ｗ．  Ｓｅｙｍｏｕｒ、「Ｌａｔｅｒａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｓ：  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４．１（２００２）：８−９を参照されたい。イオン価に代わるものとして、これらの重合体は溶液中で水和する非イオン性基を含む場合があり、この非イオン性基も、分子クラウディング及び／又は水の隔離によって核酸ハイブリダイゼーション速度を増強する。
【０１１７】
種々の実施形態において、本開示は、ＦＩＳＳＥＱによる検出のためのＲＮＡ種、ｃＤＮＡ種、及びＤＮＡ種の捕捉を標的とした、多種多様なプローブライブラリのハイブリダイゼーションを増強するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、ハイブリダイゼーション用緩衝液中にクラウディング剤を添加することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＳＣ（塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム緩衝液）などの、多量の（ｈｉｇｈ）塩を含有するハイブリダイゼーション用緩衝液を使用することができる。その塩濃度は、１倍希釈（１Ｘ）、２倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈、又はそれ以上の濃度とすることができる。いくつかの他の実施形態では、塩濃度は、約１倍〜約３倍希釈、約３倍〜約５倍希釈、又は約５倍〜約１０倍希釈とすることができる。いくつかの実施形態では、ブロッキング剤を含有するハイブリダイゼーション用緩衝液を使用することができる。ブロッキング剤は、プローブのオフターゲット配列への非特異的結合を減少することが可能であり、且つ／又は、他の試料成分（例えば、酵母ｔＲＮＡ、サケ精子、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＰＡＮなどの界面活性剤、ＢＳＡなどのペプチド、及びフィコールなどの他の薬剤）との静電的相互作用を防止することによるものである。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション用緩衝液は、ＤＮＡのアニーリング特性（融解温度など）を変化させる薬剤を含有する。アニーリング温度を変化させ得る薬剤の例としては、ホルムアミドが挙げられる。いくつかの実施形態では、高濃度のプローブを使用することが可能である。プローブの濃度の例としては、１〜１５０ｎＭ、１〜１５０μＭ、又は最大１０ｍＭを挙げることができる。いくつかの実施形態では、デキストラン硫酸又はポリアクリル酸などのクラウディング剤を使用することが可能である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤の平均分子量Ｍｎは、１〜１０ｋＤａ、１０〜２０ｋＤａ、１０〜１００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、又は１００〜１０００ｋＤａであり得る。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、単量体占有率が１〜１０％、１０〜３０％、１０〜９９％、又は１００％となる電荷密度を有することが可能である。いくつかの実施形態では、反応中におけるクラウディング剤の重量体積パーセントは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、又はそれ以上であり得る。
【０１１８】
本開示は、例えば、ポリマー骨格及び１又は複数の水和性基を含む、ポリイオン性、高分子電解質、又は親水性且つ強水和性の、重合体である、クラウディング剤を提供する。上記水和性基は、イオン性、電解質、又は親水性（ｈｙｒｏｐｈｙｌｉｃ）であり得る。いくつかの実施形態では、上記水和性基は、例えば、イオン性基に中性の電荷を持たせたり、又は強水和性基を弱水和状態にするなどにより、特異的に不活性化される場合がある。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、上記不活性化の化学特性は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、及び／又は他の種類の生体分子とは実質的に非反応性である。いくつかの実施形態では、不活性化された重合体が酵素反応と適合性となる。
【０１２０】
本開示は、例えば、ポリマー骨格と水和性基との間に切断可能な結合を含む、ポリイオン性、高分子電解質、又は親水性且つ強水和性の、重合体である、クラウディング剤を提供する。いくつかの実施形態では、上記切断可能な結合は、過ヨウ素酸ナトリウムにより切断可能なα−ヒドロキシ酸を含む。いくつかの実施形態では、上記切断可能な結合は、熱により切断可能なβ−ケト酸を含む。いくつかの実施形態では、上記切断可能な結合は、銀イオンにより切断可能なホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、上記切断可能な結合は、還元により切断されてチオールとなることが可能なジスルフィド結合を含む。光処理又は化学的処理によって、他の種類の化学結合が切断される場合もある。
【０１２１】
本開示は、例えば、本明細書で開示されるものが挙げられる、切断可能な結合を、重合体の骨格に沿って含む、ポリイオン性、高分子電解質、又は親水性且つ強水和性の、重合体であるクラウディング剤を提供する。
【０１２２】
本開示は、本明細書で開示されるクラウディング剤のうちの１つを含有するハイブリダイゼーション用緩衝液を用いて、複数のプローブがｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリダイズされる、標的化ＲＮＡ検出又は標的化ＤＮＡ検出のためのクラウディング剤の使用を提供する。
【０１２３】
本開示は、本明細書で開示されるクラウディング剤のうちの１つを含有するハイブリダイゼーション用緩衝液を用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕで複数のプローブをハイブリダイズする工程を含む、ＲＮＡ及びＤＮＡを検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記クラウディング剤に存在する切断可能な基の切断を誘起する工程をさらに含む。
【０１２４】
本開示は、本明細書で開示されるクラウディング剤のうちの１つを含有するハイブリダイゼーション用緩衝液を用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕで複数のプローブをハイブリダイズする工程を含み、且つ、上記水和性基を不活性化する工程をさらに含む、ＲＮＡ及びＤＮＡを検出する方法を提供する。
【０１２５】
プローブプールのＤＮＡアレイ合成
ＤＮＡマイクロアレイ（一般に、アレイ、ＤＮＡチップ、バイオチップ、又はチップとも称される）とは、固体表面に付属した顕微的なＤＮＡスポットの集合を指し得る。例えば、Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．、「ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ｄｅｖｉｃｅｓ，  ｓｙｓｔｅｍｓ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４．１（２００２）：１２９−１５３を参照されたい。場合によっては、アジレント社、カスタム・アレイ社、及びツイスト・バイオサイエンス社によって市販されている、マイクロアレイＤＮＡ合成プラットフォームを用いて、大規模複合型短（およそ２００ヌクレオチド長）オリゴヌクレオチドライブラリを作製することができる。例えば、Ｋｏｓｕｒｉ、Ｓｒｉｒａｍ、及びＧｅｏｒｇｅ  Ｍ．  Ｃｈｕｒｃｈ．、「Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１．５（２０１４）：４９９−５０７を参照されたい。マイクロアレイ合成は、固体基板に付着したＤＮＡ又は核酸アナログオリゴヌクレオチドの合成と言ってもよい。商業的供給業者であるツイスト・バイオサイエンス社は、例えば、９，６００個のウェルを含み、ウェル毎に１２１種の別々のオリゴヌクレオチド種が合成され、１アレイ当たり合計１，１６０，０００種のオリゴヌクレオチドが合成される、マイクロアレイを売り物にしている。商業的供給業者であるアジレント社のＯＬＳライブラリは２４４，０００強のオリゴヌクレオチド種を含み、一方、商業的供給業者であるカスタム・アレイ社のＤＮＡマイクロアレイは９４，０００強を合成する。各ＤＮＡ種は、数ピコモル（１０〜１２モル）のＤＮＡ分子など、微量で合成されてもよい。各々のＤＮＡマイクロアレイ合成技術は、エラー率、オリゴヌクレオチドの長さ、及び、配列の制限（ホモポリマーリピート及び二次構造など）などの特徴の点で異なり得る。これらのオリゴヌクレオチドライブラリは通常、全体において、又は特定のサブプールにおいて、ライブラリを高度に増幅及びプロセシングするための手法を用いて作製する、一本鎖ＤＮＡプローブから構成される再生可能資源を表すＤＮＡ種溶液中へと、固相基板から遊離せられ得る。例えば、Ｂｅｌｉｖｅａｕ，  Ｂｒｉａｎ  Ｊ．、Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ、及びＣｈａｏ‐ｔｉｎｇ  Ｗｕ、「Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔ  ＦＩＳＨ  ｐｒｏｂｅｓ．」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）：１４−２３；Ｃｈｅｎ，  Ｋｏｋ  Ｈａｏら、「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ，  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８．６２３３（２０１５）：ａａａ６０９０）；Ｋｏｓｕｒｉ，  Ｓｒｉｒａｍら、「Ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８．１２（２０１０）：１２９５−１２９９を参照されたい。あるいは、全体において、又は特定のサブプールにおいて、上記オリゴヌクレオチドが上記固相から直接増幅されてもよい。
【０１２６】
コンピュータによる設計
配列がコンピュータツールを用いて手動で又は個別に設計され得る従来のＤＮＡ合成とは異なり、アレイＤＮＡ合成のスケールは、配列の設計及び管理のためのコンピュータパイプラインを用いて設計することが可能である。例えば、Ｒｏｚｅｎ，  Ｓｔｅｖｅ、及びＨｅｌｅｎ  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、「Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９９）：３６５−３８６；Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ，  Ｊｅａｎ‐Ｍａｒｉｅ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒ、及びＥｒｄｏｇａｎ  Ｇｕｌａｒｉ、「ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙ  ２．０：  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１．１２（２００３）：３０５７−３０６２）を参照されたい。これらの方法により、プローブの機能と関連したプローブ設計の側面と、アレイ製造プロセスの特異性と関連したプローブ設計の側面との両方が考慮される場合がある。
【０１２７】
ＤＮＡプローブ
ゲノム配列又は該ゲノム由来のＲＮＡ配列に相補的なプローブを設計することを目的として、染色体配列ファイルをメモリーマッピングし、アノテーションより導かれるインデクシングを与えるために、特注のＧｅｎｏｍｅ  Ｔｏｏｌｓ  Ｐｙｔｈｏｎライブラリを使用することが可能である。このアプローチは、過剰なメモリ使用、ディスクスラッシング、性能ボトルネック、及びメインメモリに完全な染色体データを保存しようとする試みに伴う他の不都合な側面を最小限にしながら、目的の染色体領域の遅延読み込みを可能にする場合がある。ＳＳＤドライブを使用する場合、配列へのアクセスがメモリアクセスのおよそ８０％高速となる場合があるが、インデックスメタデータ及び遅延読み込みされた目的領域のみを含む最小限のメモリフットプリントで済む。アンサンブル社（Ｅｎｓｅｍｂｌｅ）が供給するＧＦＦ／ＧＴＦ  Ｆｉｌｅ  Ｆｏｒｍａｔ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｆｏｒｍａｔ／Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｆｏｒｍａｔ）が、ゲノムアノテーションの保存に使用される場合がある。例えば、Ｋａｗａｊｉ，  Ｈｉｄｅｙａ、及びＹｏｓｈｉｈｉｄｅ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ、「ゲノムアノテーション．」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｄａｔａ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（２００８）：１２５−１３９を参照されたい。遺伝子標的リストの容易な編集を可能にするために、Ｇｅｎｃｏｄｅ又は他の参照アノテーション及び変換テーブルを用いて、ゲノム、トランスクリプトーム、及びタンパク質のアノテーション間のマッピングを行うことが可能である。例えば、Ｈａｒｒｏｗ，  Ｊｅｎｎｉｆｅｒら、「ＧＥＮＣＯＤＥ：  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＥＮＣＯＤＥ．」、Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７．１（２００６）：１を参照されたい。個々のプロジェクト及び共同研究者は実験計画のためにビルド特有のデータセットに頼っているため、アプリケーション毎に構築される適当な参照ゲノムが選択され得る。いくつかの例では、安定なＧＲＣｈ３７アノテーション及び配列アセンブリリリースが用いられ得る。
【０１２８】
ＲＮＡプローブ
ＲＮＡに対するプローブを設計するために、ＲＮＡ種が選択的スプライシングのために多くのアイソフォームで存在するということが考慮される場合がある。特定のエクソン、イントロン、配列ジャンクション（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、発現された多型、又はＲＮＡ編集の部位など、ＲＮＡの特定の配列特徴を検出することに関心がある場合、このアプローチは、ＲＮＡ分子のそのセグメントを特異的に標的とするプローブを設計することに限定される場合がある。これらの場合、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｏｏｌｓライブラリを用いて、このプローブ配列設計論理に束縛された、アノテーションより得られるプローブ配列が作製される場合がある。
【０１２９】
いくつかの例では、ＲＮＡ種のあらゆるアイソフォームを検出することが望ましい場合がる。転写物アイソフォームの全体にわたって本開示のプローブの普遍性を最大にするために、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｏｏｌｓ  ライブラリを用いて、標的ＲＮＡ種のためのエクソン「パイルアップ」が作製される場合がある。概念として、上記パイルアップは、全てのアイソフォームにわたって最もよく見られるエクソン領域を同定するよう意図されている場合がある。実際に、上記パイルアップが単にアレイである場合があり、その範囲は、ゲノムに関して、転写配列の最外側の境界（すなわち、転写物バリアントの５’末端の最初の塩基及びバリアントの３’末端の最後の塩基）によって定義される場合がある。アレイ内の各位置にある値は、全てのアイソフォームの中から、それぞれの位置にエクソン配列を有する、アノテーションされた転写物バリアントの数である場合がある。この方法では、全ての転写物アイソフォームがあらゆる所与の実験で同等に発現されやすいことが、前提である場合がある。発現されたＲＮＡ配列に相補的なプローブの割合を向上させるために、転写物アイソフォームの組織種類特異的発現パターン及び細胞種類特異的発現パターンに関する予備的知識を取り入れることによって、配列設計を改善することが可能である。生物レベルの転写物度数又はアノテーション信頼性に関して、加重エクソンスコアリングを与えるための、アノテーションデータにてこ入れする追加の手段がある場合がある。
【０１３０】
プローブの設計論理
あるアッセイを考えると、プローブ設計のための熱力学的な標的融解温度が決定することが可能である。ゲノム標的又はトランスクリプトーム標的のためにＧｅｎｏｍｅ  Ｔｏｏｌｓによって提供された標的配列は、次に、小さな（１５ヌクレオチドセグメントなどの）候補プローブ配列にチャンク化され得る。遺伝子特異的な逆転写用プライマーについて、プローブの長さは、しばしば、特異性の実施と自己環状化傾向の最小化との間の折衷点であり得る。いくつかの実施形態では、完全「アダプター−バーコード−プローブ」コンストラクトは、自己環状化を最小限に抑えるために、４０ヌクレオチド長の長さしか有しない。いくつかの他の実施形態では、完全「アダプター−バーコード−プローブ」コンストラクトは、１０〜１５ヌクレオチド長、１５〜２０ヌクレオチド長、２０〜２５ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、３０〜３５ヌクレオチド長、３５〜４０ヌクレオチド長、４５〜５０ヌクレオチド長、５０〜５５ヌクレオチド長、５５〜６０ヌクレオチド長、６０〜６５ヌクレオチド長、６５〜７０ヌクレオチド長、７０〜７５ヌクレオチド長、７５〜８０ヌクレオチド長、８０〜８５ヌクレオチド長、８５〜９０ヌクレオチド長、９０〜９５ヌクレオチド長、又は９５〜１００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、完全「アダプター−バーコード−プローブ」コンストラクトは、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、少なくとも４０ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも６０ヌクレオチド長、少なくとも７０ヌクレオチド長、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、又は少なくとも１５００ヌクレオチド長であり得る。最初のチャンク化の後、各候補プローブは、最初の合成及びＦＩＳＳＥＱ試料調製の両方との関連において、その特異性及び効率を予測することを目的としたメトリクスを用いてスコア付けされ得る。例えば、グアニン四重鎖を含有するセグメントを全て除外する。次に、融解温度に基づいてプローブをスコア付けするが、プローブ長も定義済みである場合、融解温度は暗に含まれるＧＣ計量も与える。いくつかの実施形態では、このプローブ長は決定後に固定することが可能であり、これにより、全てのオリゴヌクレオチドを等しい長さとすることによって、アレイ合成が単純化される。（可変長のライブラリのアレイ合成を可能にするために、水増し（ｐａｄｄｉｎｇ）配列をオリゴヌクレオチド末端に加えることが可能である。しかし、このことは、最終的なプローブも長さ分布を有することから、プローブ成熟及び下流の加工を複雑化し、プローブプールを精製するためにサイズ選別を利用できる程度を限定する場合がある）ＲＮＡプローブについては、セグメントは本明細書に記載のエクソンパイルアップを用いてスコア付けすることもできる。
【０１３１】
個体レベル及び集団レベルの両方でプローブ性能を改善する手段として、さらなる設計制約が考慮される場合がある。例えば、プローブのヘテロ二量体化の可能性を減少させるために、プローブがスクリーニングされる場合がある。ヘテロ二量体形成の熱力学的閾値内にある相互に適合性の一群のプローブ配列を見つけることは、困難な計算作業である場合がある。１つのそのようなアプローチは、所与のプローブプール内の全ての対相互作用を記載するグラフデータ構造体を作成した後、ネットワーク除去アルゴリズムを用いて、相互接続性が極小又はゼロの（予測されたヘテロ二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｉｚａｔｉｏｎ）反応がないこと示す）一群のプローブノードを作成することを含み得る。このアプローチは同様の状況で効果的であることが証明されているが（Ｘｕ，  Ｑｉｋａｉら、「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ２４０，０００  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ２５ｍｅｒ  ＤＮＡ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０６．７（２００９）：２２８９−２２９４）、本願の多くの他の制約の存在が許容できる解決策への一致を妨げる場合があるため、本願のためにコンピュータ上で実施不可能である場合がある。ネットワーク除去のためのメトリクスを改善するであろう、逆転写などの下流のＦＩＳＳＥＱ工程の配列依存性のさらなる理解により、この試みは可能となるであろう。
【０１３２】
いくつかの例では、プローブの特異性に関してスクリーニングを行うことが適切である場合がある。非特異的結合についてコンピュータ上でプローブをスクリーニングするために使用される場合がある、いくつかの戦略がある。単純な戦略は共通ｋ−ｍｅｒをプールから除去することであろう。例えば、Ｍｅｌｓｔｅｄ，  Ｐａｌｌ、及びＪｏｎａｔｈａｎ  Ｋ．  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｋ−ｍｅｒｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂｌｏｏｍ  ｆｉｌｔｅｒ．」、ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２．１（２０１１）：１を参照されたい。熱力学的考慮も利用することが可能であり；ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙソフトウェア（Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ，  Ｊｅａｎ‐Ｍａｒｉｅ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒ、及びＥｒｄｏｇａｎ  Ｇｕｌａｒｉ、「ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙ  ２．０：  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１．１２（２００３）：３０５７−３０６２）は、例えば、全ての類似性を見つけるために短ワードサイズでのＢｌａｓｔアルゴリズムを用いる。得られた類似度マトリックスを用いて、標的配列と類似配列との間の全ての起こり得るハイブリダイゼーションの、熱力学的値を算出することができる（Ｔｍ、自由エネルギー、エンタルピー及びエントロピー；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ（Ｚｕｋｅｒ，  Ｍｉｃｈａｅｌ、「Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１．１３（２００３）：３４０６−３４１５；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，  Ｊｏｈｎ、「Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ，  ｄｕｍｂｂｅｌｌ，  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＤＮＡ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５．４（１９９８）：１４６０−１４６５）からの熱力学的パラメータを用いるＭＦＯＬＤを使用）。次に、クロスハイブリダイゼーションの熱力学的閾値を用いて、可能性のある配列が排除することが可能である。酵素ミスマッチ感度プロファイルを介してプローブ特異性を与える際に、プライマーの小領域の役割が考慮され得る。例えば、標的化された逆転写用プライマーの３’末端は、特に、ミスマッチに対して感受性である場合がある。例えば、Ｙｅ，  Ｊｉａｎら、「Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．」、ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １３．１（２０１２）：１を参照されたい。ＭＩＰ及びパドロックプローブを設計するために、リガーゼは、ニックのそれぞれの側の約６塩基以内のミスマッチに対して感受性とすることが可能である。例えば、Ｍｉｔｒａ，  Ｒｏｂｉ  Ｄ．ら、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ．」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２０．１（２００３）：５５−６５を参照されたい。
【０１３３】
さらに、下流のＦＩＳＳＥＱ工程の配列依存性を考慮することが、適切である場合がある。例えば、ＲＮＡ二次構造及びポリソーム複合体又は休止リボソームの存在により、プローブによるＲＮＡへのアクセスが阻害される場合がある。例えば、Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、Ａｎｄｅｒｓら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍＲＮＡ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０．３（２００４）：５０９−５１５を参照されたい。いくつかの例では、ヌクレオソームによって、Ｃａｓ９に対して行われるように、ＤＮＡプローブによるゲノムへのアクセスが阻害される場合がある。例えば、Ｈｏｒｌｂｅｃｋ，  Ｍａｘ  Ａ．ら、「Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ  ｉｍｐｅｄｅ  Ｃａｓ９  ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．」、Ｅｌｉｆｅ  ５（２０１６）：ｅ１２６７７を参照されたい。リガーゼ、ポリメラーゼ、及び逆転写酵素などの酵素は、それ自体が、基質の配列に関して内因的なバイアスを有する場合がある。例えば、Ｈａｆｎｅｒ，  Ｍａｒｋｕｓら、「ＲＮＡ−ｌｉｇａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉａｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉＲＮＡ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｅｐ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」、Ｒｎａ  １７．９（２０１１）：１６９７−１７１２を参照されたい。これらの配列依存性は、プローブレベルのバーコードを用いる実験から直接測定することが可能である。
【０１３４】
バーコードの割り当て
バーコードを割り当てるための２つのアプローチとは、ｋ−ｍｅｒのプールからバーコードをランダムに割り当てること、又は、バーコードをインクリメントするためにイテレータ機能を用いてバーコードを割り当てること、であり得る。しかし、これらの戦略を用いて設計されたバーコードは、誤り訂正能又は誤り検出能が限定されている場合があり、合成するには必ずしも最適とは言えない配列を生み出す場合がある。その代わりに、ｋ−ｍｅｒのプールに由来し、且つホモポリマー及び４以上のＧＣラン並びにグアニン四重鎖を除外した大きなバーコードプールから割り当てを開始することが可能である。このプールから、グラフベースのアルゴリズムを用いて、一連のｇバーコードをハミング距離ｈにより同定することが可能である（Ｃｏｎｗａｙ，  Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｊ．及びＰｒｕｉｔｔ，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ．、「Ｌｉｂｎａｎｏ，  ａ  ｌｏｗ−ｌｅｖｅｌ  ｐｙｔｈｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｉｌｅ  ｉｏ，  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ，  ａｎｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．」、Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ＧｉｔＨｕｂ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ；Ｈａｇｂｅｒｇ，  Ａｒｉｃ  Ａ．ら、「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｄｙｎａｍｉｃｓ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＮｅｔｗｏｒｋＸ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７ｔｈ  Ｐｙｔｈｏｎ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（ＳｃｉＰｙ２００８）１１−１５、パサデナ、カリフォルニア州、米国）。１つのバーコードを別のバーコードとして検出するためには相当な数の配列決定の誤りを必要とし得るため、ハミング距離は、配列決定されたバーコード内の誤りの検出及び訂正を可能にし得る。例えば、イテレータを用いたバーコードのインクリメントは、第一プローブに「ＡＡ」、第二プローブに「ＡＴ」、第三プローブに「ＡＧ」などを割り当てる場合がある。この戦略を用いた場合、このジヌクレオチドバーコードの２番目の塩基における配列決定の誤りは、あるバーコードを、上記一組の中の別の有効なバーコードとして検出させるだろう。バーコード同士がハミング距離で隔てられている場合、配列決定の誤りのほとんどは無効なバーコード配列を生み出し、これが、最も近い有効なバーコード配列に単にマッピングされ得る。また、より高度な誤り訂正では、誤りの偏り及びベースコールの確実性を考慮した探索法も使用され得る。これらのプローブは、ホモポリマー制限を満たし、ホモ二量体及びヘアピンの熱力学的閾値の範囲内とするために、配列の組み合わせも必要とする、「Ｔ２Ｓ」（ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＡ）配列決定用プライマーアニーリング領域などの、プローブの一定のアダプター特徴と、組み合わされ得る。
【０１３５】
プローブプールの選別
標的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子に相補的な配列、Ｔ２Ｓなどのアダプター配列、及びバーコードを含む完全プローブが構築された後、ホモポリマーランを含有するか、又は熱力学的閾値を考慮するとホモ二量体若しくはヘアピンを形成するあらゆるプローブを除去するために、最終スクリーニングを実施し得る。例えば、Ｔｍが３０℃よりも高いホモ二量体又はヘアピンを有するプローブを排除することが可能である。完全プローブ配列の構築時に生じるヘテロ二量体又は非特異的な相互作用も考慮され得る。プローブライブラリを合成する際、マイクロアレイ上の別個のオリゴヌクレオチド特徴の数だけ制限を受け得る。これが起こると、本明細書に記載のスコア化メトリクスを用いて、遺伝子又は標的遺伝子座当たり上位ｎ個のプローブを取得することが可能である。
【０１３６】
サブプールの増幅
マイクロアレイ当たりの多数のオリゴヌクレオチドの特徴を考慮すると、複数のプローブライブラリが単一のチップ上に合成され得る。単一のプローブライブラリを作製することを目的として、成熟及びＦＩＳＳＥＱでの使用のためにプローブ集団の一部を特異的に増幅するために、サブプール増幅が用いられる場合がある。例えば、Ｋｏｓｕｒｉ，Ｓｒｉｒａｍら、「Ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８．１２（２０１０）：１２９５−１２９９を参照されたい。アレイが単一のライブラリのみを含む場合であっても、アレイによって生成される原材料の量はナノグラム規模である場合があるため、追加のＰＣＲプライマー配列が依然として含まれ得る。サブプール増幅の際のペイロード配列からの内部誤プライミング及びクロストークを避けるために、定量的モデリング及び実験によって得られるデータから導き出される探索法を用いて、これらの反応用に、プライマーが自動的に作製される場合がある。この方法は、ライブラリを成熟プローブプールに処理するのに使用される場合がある、ＩＩＳ型制限酵素認識部位などの、プライミング領域内への配列特徴の組み込みを可能とし得る。
【０１３７】
プローブの成熟戦略
マイクロアレイチップからＤＮＡライブラリを収集した後、最初の全体的又はサブプールの増幅を行うことが可能である。ＦＩＳＳＥＱでの使用のために、増幅用プライマー配列を含まない、数マイクログラム、又はさらには数ミリグラムの成熟一本鎖プローブライブラリを作製することが可能である。これを達成するための多くの戦略があり、例えば、インビトロ転写に基づく方法又はＰＣＲに基づく方法が挙げられ、本明細書に記載されている。ＭＩＰの合成及びパドロックプローブの合成のためなどに、プローブをプロセシングするための方法も本明細書で提供される。これらの種類のプローブは、意図的に、プローブの５’末端及び３’末端に可変配列を有する。酵素認識配列の外側である決められた部位での切断のために、ＩＩＳ型制限酵素を使用することが可能である。例えば、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｗａｃｌａｗら、「Ｃｌａｓｓ−ＩＩＳ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ．」、Ｇｅｎｅ  １００（１９９１）：１３−２６を参照されたい。切断の効率は、切断部位を１〜３塩基超えて二重鎖を生成するために、イノシン又はユニバーサル塩基を用いる、可変配列の開始点のすぐ向こう側まで、制限酵素認識配列上に広がるスプリントオリゴヌクレオチドの使用により、増強され得ることが分かる。
【０１３８】
ＩＶＴ
プローブライブラリにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含むことにより、プローブプール全体を高度に豊富な一本鎖ＲＮＡ転写物に直線的に増幅するために用いられるインビトロ転写（ＩＶＴ）が可能となる場合がある。次に、ＲＮＡ分子を一本鎖ｃＤＮＡに効率的に変換するために標的化逆転写を行うことが可能であり、その後、ＲＮＡが分解される。例えば、Ｃｈｅｎ，  Ｋｏｋ  Ｈａｏら、「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ，  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８．６２３３（２０１５）：ａａａ６０９０を参照されたい。この一本鎖ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡにアニーリングし、その二重鎖ＤＮＡ領域が制限酵素による消化の標的となる、スプリント制限などにより、さらに修飾される場合がある。
【０１３９】
ＰＣＲ
別の戦略は、ＰＣＲを用いてライブラリが指数関数的に増幅した後、二重鎖の片方を特異的に消化することであり得る。これを達成するための１つの方法は、１つのプライマー上に５’リン酸を含ませることで、それにより、得られる鎖をλエキソヌクレアーゼにより消化可能とすることであり得る。例えば、Ｂｅｌｉｖｅａｕ，  Ｂｒｉａｎ  Ｊ．ら、「Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔ  ＦＩＳＨ  ｐｒｏｂｅｓ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９．５２（２０１２）：２１３０１−２１３０６を参照されたい。エキソヌクレアーゼ消化の前又は後に、制限酵素を用いて、プローブをさらにプロセシングすることが可能である。
【０１４０】
精製及びバリデーション
上記産物は、ｄＮＴＰ又は他の反応産物を除去するために、また、オリゴヌクレオチドを脱塩するために、エタノール沈殿、ビーズ、又はカラムなどによりさらに精製される場合もある。上記プローブは、正しいサイズの産物のみを選択するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製することも可能である。最終ライブラリが正しい配列を有することを確かめるために、次世代シークエンシングを用いて、ペイロードサイズの分布、合成時及び増幅時の誤り率、並びに配列多様性を測定することが可能である（図２Ａ〜図２Ｃ）。
【０１４１】
本開示は、一群の標的ＲＮＡ配列及び一群の標的ＤＮＡ配列を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ遺伝子座のうちの１又は複数が同定され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列又は構造的バリアントを包含する、ＤＮＡ配列のうちの１又は複数が同定され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ種のうちの１又は複数が同定され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集、スプライシング、配列多様性の発現を含む１又は複数のＲＮＡ配列が同定され得る。
【０１４２】
本開示は以下を提供する：逆転写用プライマー、ＰＣＲ用プライマー、ＭＩＰプローブ及びパドロックプローブ、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、並びに他の種類の標的化プローブの配列用を含む、上記の方法を用いるｉｎ  ｓｉｔｕでの検出に適したプライマー配列を発見するために、参照配列データベースのキュレーション及びマイニングが行われる。
【０１４３】
本開示は以下を提供する：最初の合成及びＦＩＳＳＥＱ試料調製の両方との関連において、その特異性及び効率を予測することを目的としたメトリクスを用いて、候補プローブがスコア付けされる。考慮されるべき例示的なメトリクスとしては、全体的な配列含量、例えばＧＣ含量、及び局所的な配列含量、例えばグアニン四重鎖、ホモポリマーラン、の両方；融解温度、並びに自由エネルギー、エンタルピー及びエントロピーなどの他の熱力学的特性；Ｃａｓ９及びＣ２ｃ２などの、若しくは下流のプロセシングでは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅなどの、プローブ複合体で使用されるタンパク質及び酵素の偏り；二次構造及びホモ二量体形成；マイクロアレイ合成プラットフォームの制限若しくは最適化；二次構造及びｉｎ  ｓｉｔｕでのタンパク質（例えば、ヌクレオソーム及びリボソーム）の占有率を含む、ＲＮＡ若しくはＤＮＡの標的配列特徴；存在することが知られている他の配列に対する核酸ハイブリダイゼーションの特異性；並びに／又は、酵素工程、例えば、逆転写用プライマーの３’末端、若しくはマイクロＲＮＡのシード領域、に対するプローブの一部の配列特異性、が挙げられる。
【０１４４】
本開示は、標的分子の同定のための、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によって検出できる、一連のバーコード配列同定のキュレーションを提供する。いくつかの実施形態では、キュレーションプロセスは以下の特徴を考慮する場合がある：全体的な配列含量、例えばＧＣ含量、及び局所的な配列含量、例えばグアニン四重鎖、ホモポリマーラン、の両方；融解温度、並びに自由エネルギー、エンタルピー及びエントロピーなどの他の熱力学的特性；Ｃａｓ９及びＣ２ｃ２などの、若しくは下流のプロセシングでは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅなどの、プローブ複合体で使用されるタンパク質及び酵素、若しくは配列決定に使用される酵素の偏り；二次構造及びホモ二量体形成；マイクロアレイ合成プラットフォームの制限若しくは最適化；並びに、ハミング距離、並びにＧｏｌａｙなどのアルゴリズムを用いて構築されたパリティビット及びパリティコードなどの、誤り検出訂正の特徴。
【０１４５】
本開示は、上記のようにマイニング及びスコア付けされた標的配列を含む、ＤＮＡマイクロアレイ合成産物のコンピュータによる設計を提供する。本開示はまた、以下のためのものを含む、追加の配列を設計するための方法を提供する：ライブラリのＰＣＲ増幅；全ライブラリのうちの一部のサブプール増幅；プローブ精製；プローブの発現及び成熟を可能にする配列、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、制限酵素部位など；ＦＩＳＳＥＱ又はｉｎ  ｓｉｔｕ検出に関連する配列、例えば、配列決定用アダプター、ＨＣＲ又はＣＨＣＲイニシエーター配列又はアダプター配列、一次、二次、又は追加のｉｎ  ｓｉｔｕプロービング部位；並びに、プローブ及びコグネイトな標的分子の同定に使用されるバーコード配列。
【０１４６】
本開示は、候補配列、及び／又は改変候補配列（例えば、アダプター、並びに後の増幅及びプロセシング、ＦＩＳＳＥＱ、バーコード同定などに必要な他の特徴を追加後の候補配列）から得られたライブラリのキュレーションを提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、相互に適合性の候補配列セットを発見する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、ヘテロ二量体化及びオフ−プライミングを考慮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、配列特徴同士のジャンクション部分（例えば、サブプール増幅用プライマーと、標的核酸との結合に関与するプライマーのセグメントとの間のジャンクション）などの、完全配列の構築時に形成される配列を考慮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、全体的な配列含量、例えばＧＣ含量、及び局所的な配列含量、例えばグアニン四重鎖、ホモポリマーラン、の両方；融解温度、並びに自由エネルギー、エンタルピー及びエントロピーなどの他の熱力学的特性；二次構造及びホモ二量体形成；並びに、マイクロアレイ合成プラットフォームの制限又は最適化、を考慮することを含む。
【０１４７】
本開示は、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡマイクロアレイから遊離したＤＮＡオリゴヌクレオチドから、ｉｎ  ｓｉｔｕでの標的化されたＲＮＡ検出又はＤＮＡ検出のためのプローブライブラリを増幅し成熟させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法はＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＲＮＡ又はＤＮＡの検出のための使用に無関係な又は悪影響を及ぼす、ＰＣＲ及び他のアダプター配列を除去するための、制限酵素による切断などの、酵素的プロセシングを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、プローブの増幅及び／又は成熟の際に、化学修飾、修飾塩基、又は核酸アナログの包含を含む。上記修飾としては、限定はされないが、一級アミン、ビオチン／ストレプトアビジン、チオールを含む、架橋結合のためのケミカルハンドル（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｈａｎｄｌｅ）；ハイブリダイゼーションの速度及び特異性を向上させることが知られている、ロックド核酸（ＬＮＡ）塩基；並びに、オリゴヌクレオチドをとあるヌクレアーゼ処理に対して抵抗性にすることが知られている、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基及びホスホロチオエート結合、が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、５’末端にリン酸を有する相補鎖のλエキソヌクレアーゼ消化、又はＩＶＴなどによるＲＮＡの発現と、その後の該ＲＮＡの逆転写及び分解による一本鎖産物の形成、などにより、一本鎖の最終産物を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ビオチンなどの、精製のためのハンドルを付加することによる精製法、又は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ビーズ使用、若しくはオリゴヌクレオチドを浄化及び精製する当業者に公知の他の方法による精製法を含む、精製法を提供する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、個々のプローブの存在及び存在量における差異の決定を含む、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いて、産物ライブラリをバリデーションする方法を提供する；バーコードがランダムに合成された場合における、バーコードの同定と分子ターゲティングに関連する配列との間の関連性の発見。
【０１４９】
本開示は、ＤＮＡマイクロアレイによって合成されたプローブを用いる、ＲＮＡ種及び／又はＤＮＡ種のｉｎ  ｓｉｔｕ標的化検出のための方法を提供する。
【０１５０】
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び符号は、当該分野においてスタンダードな論文及び教科書、例えば、Ｋｏｍｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ社、ニューヨーク、１９９２年）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、ニューヨーク、１９７５年）；Ｓｔｒａｃｈａｎ及びＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、１９９９年）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９９１年）；Ｇａｉｔ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、オックスフォード、１９８４年）などの用語及び符号に従っている場合がある。
【０１５１】
コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図７は、本明細書に記載されるような、上記プローブライブラリの作製、又は目的の核酸の配列決定、を支援するようにプログラムあるいは構成された、コンピュータシステム７０１を示している。コンピュータシステム７０１は、例えば、目的の標的配列の決定、及び／又は上記プローブのスコア付けなど、本開示の様々な態様を制御することができる。いくつかの態様では、上記コンピュータシステムは、試薬の放出、反応（例えば、増幅反応）の活性化を制御するようにプログラムされていてもよく、且つ／又は、シークエンシング反応を起こしてもよい。コンピュータシステム７０１は、電子デバイスに対して遠位に位置するユーザー又はコンピュータシステムの電子デバイスであり得る。上記電子デバイスは携帯型の電子デバイスであり得る。
【０１５２】
コンピュータシステム７０１は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも言う）７０５を含み、中央処理装置７０５は、シングルコアプロセッサ又はマルチコアプロセッサであり得るか、あるいは、並列処理のために複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム７０１は、メモリ又は記憶域７１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置７１５（例えば、ハードディスク）、１又は複数の他のシステムと通信するための通信インタフェース７２０（例えば、ネットワークアダプター）、並びに、キャッシュメモリ、他のメモリ、データストレージ及び／又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺機器７２５も含む。メモリ７１０、記憶装置７１５、インタフェース７２０及び周辺機器７２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を通じて上記ＣＰＵ７０５と連絡している。記憶装置７１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（又はデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム７０１は、通信インタフェース７２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）７３０に動作可能に結合していることが可能である。ネットワーク７３０は、インターネット、インターネット及び／若しくはエクストラネット、又はインターネットと通信しているイントラネット及び／若しくはエクストラネットであり得る。ネットワーク７３０は、いくつかの場合では、電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワーク７３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１又は複数のコンピュータサーバを含み得る。ネットワーク７３０は、場合によってはコンピュータシステム７０１を用いて、コンピュータシステム７０１に連結されたデバイスがクライアント又はサーバとして振る舞うことを可能にしてよいピアツーピアネットワークを実現し得る。
【０１５３】
ＣＰＵ７０５は、プログラム又はソフトウェアに具体化され得る一連の機械可読命令を実行することが可能である。上記命令は、メモリ７１０などの記憶域に保存されている場合がある。上記命令はＣＰＵ７０５を対象とし得、これにより、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ７０５が後にプログラム又は構成され得る。ＣＰＵ７０５によって実行される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを挙げることができる。
【０１５４】
ＣＰＵ７０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。上記回路には、システム７０１の１又は複数の他の構成要素が含まれていることが可能である。いくつかの場合で、上記回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０１５５】
記憶装置７１５は、ドライバ、ライブラリ、及び保存プログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置７１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザーの好み及びユーザープログラムを記憶することができる。場合によっては、コンピュータシステム７０１は、イントラネット又はインターネットを通じてコンピュータシステム７０１と通信しているリモートサーバ上に位置しているなど、コンピュータシステム７０１の外部にある１又は複数の追加のデータ記憶装置を含み得る。
【０１５６】
コンピュータシステム７０１は、ネットワーク７３０を通じて１又は複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム７０１は、ユーザー（例えば、本開示の上記プローブを作製しているユーザー、又はそのようなプローブを利用しているユーザー）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートＰＣ又はタブレットＰＣ（例えば、アップル（登録商標）社製ｉＰａｄ、サムスン（登録商標）社製Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えばアップル（登録商標）社製ｉＰｈｏｎｅ、アンドロイド対応機種、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、又は携帯情報端末が挙げられる。ユーザーはネットワーク７３０を介してコンピュータシステム７０１にアクセスすることができる。
【０１５７】
本明細書に記載の方法は、コンピュータシステム７０１の電子的記憶場所、例えばメモリ７１０又は電子記憶装置７１５など、に記憶された機械（例えばコンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施され得る。機械実行可能コード又は機械可読コードはソフトウェアの形態で提供され得る。使用の際、上記コードはプロセッサ７０５によって実行され得る。場合によっては、上記コードは、記憶装置７１５から検索され、プロセッサ７０５によるアクセスを容易にするためにメモリ７１０に記憶され得る。状況によっては、電子記憶装置７１５は排除され得、機械実行可能命令はメモリ７１０に記憶される。
【０１５８】
コードは、事前コンパイルされ、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械での使用用に構成され得、あるいは、実行時にコンパイルされ得る。コードは、コードを事前コンパイル方式又はアズコンパイルド（ａｓ−ｃｏｍｐｉｌｅｄ）方式で実行することを可能にするように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
【０１５９】
コンピュータシステム７０１など、本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングに具体化することができる。本技術の様々な態様は、典型的には機械（若しくはプロセッサ）実行可能コード及び／又はある種の機械可読媒体に保持された若しくはその中に具体化された関連データの形態をとる、「製品」又は「製造品」と考えられてもよい。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶装置に記憶され得る。「記憶」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、又は様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのその関連モジュール、のいずれか又はすべてを含み得、これらは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的記憶を提供し得る。ソフトウェアの全部又は一部は、ときに、インターネット又は他の様々な電気通信ネットワークを通じて通信される場合がある。例えば、そのような通信は、あるコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサへの、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのロードを可能にする場合がある。従って、ソフトウェア要素を保持し得る別の種類の媒体は、ローカルデバイス間の物理的インタフェースに亘って、有線及び光地上ネットワークを通じて、並びに、様々なエアリンクに亘って、使用されているような、光波、電波及び電磁波を含む。このような波を保持する物理的要素、例えば有線又は無線リンク、光リンクなどもまた、ソフトウェアを保持する媒体と見なされる場合がある。本明細書で使用される場合、非一時的で有形の「記憶」媒体に限定されていない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与するあらゆる媒体を指す。
【０１６０】
従って、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多くの形態をとる場合がある。不揮発性の記憶媒体としては、例えば、図面に示されるデータベースなどを実装するために使用され得るものなど、任意のコンピュータなどの任意の記憶装置などの光ディスク又は磁気ディスクが挙げられる。揮発性の記憶媒体としては、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形の伝送媒体としては、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む、銅線及び光ファイバ、が挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号の形態、又は、無線（ＲＦ）データ通信及び赤外線（ＩＲ）データ通信時に発生するものなどの、音波若しくは光波の形態を取る場合がある。従って、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば以下が挙げられる：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、あらゆる他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ、あらゆる他の光媒体、パンチカード  紙テープ、孔パターンを有するあらゆる他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、あらゆる他のメモリチップ若しくはカートリッジ、データ若しくは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブル若しくはリンク、又は、コンピュータがプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取ることができるあらゆる他の媒体。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くが、実行のために、１又は複数の命令の１又は複数のシーケンスをプロセッサに搬送することに関与している場合がある。
【０１６１】
コンピュータシステム７０１は、例えば、上記プローブのスコア付けを提供するための、又は上記プローブライブラリを用いた目的の生体分子の検出及び／若しくは配列決定を示すための、ユーザーインターフェース（ＵＩ）７４０を含む、電子ディスプレイ７３５を含むか又はそれと通信していることが可能である。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが挙げられるが、これらに限定はされない。場合によっては、上記コンピュータシステムは、様々な他のデバイスと通信するように構成されている場合があり、且つ、そのようなデバイスを制御するようにプログラムされている場合がある。例えば、上記コンピュータシステムは、様々な光源（例えば、蛍光光源）、及び／又は上記プローブライブラリを利用するためのプラットフォーム若しくは配列決定のために利用されるプラットフォームと通信する場合がある。
【０１６２】
本開示の方法及びシステムは、１又は複数のアルゴリズムによって実現することができる。アルゴリズムは、中央処理装置７０５による実行時にソフトウェアによって実現することができる。アルゴリズムは、例えば、本開示の上記プローブ又はプローブのライブラリを生成するように実行することができる。アルゴリズムは、上記プローブを設計及び／又は生成するための関連パラメータを含む場合がある。場合によっては、アルゴリズムは、目的の生体分子の検出を実施するための関連パラメータを含む場合がある。
【０１６３】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明示していない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び／又は「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、記載された特徴、領域、整数、工程、操作、要素及び／又は構成成分の存在を明示するが、１又は複数の他の特徴、領域、整数、工程、操作、要素、構成成分及び／又はこれらの群の存在又は追加を排除するものではないことが理解される。
【０１６４】
さらに、本明細書では、図に示されているような１つの要素と他の要素との関係を説明するために、「下部（ｌｏｗｅｒ）」又は「底部（ｂｏｔｔｏｍ）」及び「上部（ｕｐｐｅｒ）」又は「頂部（ｔｏｐ）」などの相対語が使用されている場合がある。相対語は、図示されている配向に加えて、要素の異なる配向を包含することが意図されていると理解される。例えば、図の１つの要素が裏返された場合、他の要素の「下（ｌｏｗｅｒ）」側にあると説明された要素は、上記他の要素の「上（ｕｐｐｅｒ）」側に配向されることになるだろう。従って、例示的な「下部（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、図の特定の配向に応じて、「下部（ｌｏｗｅｒ）」及び「上部（ｕｐｐｅｒ）」の両方の配向を包含し得る。同様に、図の１つの要素が裏返された場合、他の要素の「下（ｂｅｌｏｗ）」又は「真下（ｂｅｎｅａｔｈ）」にあると説明された要素は、上記他の要素の「上（ｕｐｐｅｒ）」に配向されることになるだろう。従って、例示的な「下（ｂｅｌｏｗ）」又は「真下（ｂｅｎｅａｔｈ）」という用語は、上（ａｂｏｖｅ）及び下（ｂｅｌｏｗ）の両方の配向を含み得る。
【０１６５】
本明細書では本発明の好ましい実施形態を示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を直ちに思い付くであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。本明細書に記載された実施形態の、多数の異なる組み合わせが可能であり、そのような組み合わせは本開示の一部とみなされる。さらに、本明細書においていずれか１つの実施形態に関連して論じられた全ての特徴は、本明細書における他の実施形態での使用に容易に適合させることができる。添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、及び、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：例示的なプローブ設計
例示的な直鎖状プローブ設計を図１Ａ〜図１Ｃに示す。図１Ａは、成熟プライマーが、（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡ分子にアニールし逆転写をプライムする、３’末端におけるＲＮＡ分子に相補的な配列；（ｂ）ＲＣＡ反応及びシークエンシング反応のプライミングが起こる共通アダプター配列；（ｃ）５’末端における遺伝子レベルバーコード；並びに５’リン酸化を含むことを示している。図１Ｂは、プライマーの相補的領域が標的ＲＮＡ種にアニールし、逆転写反応をプライムして、ＲＮＡを鋳型とした塩基をｃＤＮＡに組み入れていることを示している。図１Ｃは、直鎖状のＲＣＡ産物において、ｎ個の縦列反復の各々が、バーコードと、それに隣接するＲＮＡを鋳型とした配列とを含有していることを示しており、これにより捕捉特異性の定量化が可能となる。
【０１６７】
更なるプローブ設計及び成熟戦略を図４Ａ〜図４Ｅに示す。図４Ａ〜図４Ｅは、ＤＮＡマイクロアレイなど、オリゴヌクレオチドライブラリ合成によるパドロックプローブ又はギャップ充填プローブの製造のための例示的なプローブ設計及び成熟戦略を図示している。図４Ａは、核酸物質の増幅（例えばＰＣＲ又はＩＶＴなど）に使用される場合もある、両端の保存配列を特徴とするプローブ設計の模式図を示している。あるいは、増幅又はサブプール増幅を目的として、赤色ドメインの３’側及び５’側に追加の配列が含まれていてもよい（図示せず）。バーコードドメインは分子同定を目的として含まれている。核酸ハイブリダイゼーション反応を介してプローブを標的分子に方向付けることを目的として、中心の配列は標的配列に実質的に相補的である。図４Ｂは、１）プローブプールが十分な量に増幅された後に、スプリントライゲーション反応が、プローブを環状化することを示している。図４Ｃは、２）非置換型ＤＮＡポリメラーゼなどによる第二鎖合成が、第二鎖合成プライマーの５’末端にあるニックを特徴とする第二相補鎖を生成することを示している。図４Ｄは、３）標的ドメイン（ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内に二重鎖切断を生成するために、ＩＩＳ型制限酵素が用いられることを示している。図４Ｅは、４）電気泳動ゲル精製法などにより、成熟プローブが単離されることを示している。このプロセスはプローブ成熟と呼ばれる場合があり、合成直後の（ａｓ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）核酸プローブをアッセイでの使用に適した形態に変換するために必要とされる増幅工程及びプロセシング工程を包含する。
【０１６８】
実施例２：マイクロアレイ合成されたＦＩＳＳＥＱ用プライマーライブラリのバリデーション
図２Ａは、マイクロアレイ合成されたＦＩＳＳＥＱ用プライマーライブラリのバリデーションの例示的な結果を示している。図２Ａは、このライブラリのペイロード長が０付近に分布していることを示しており、このことは、ライブラリの合成及び／又は増幅が行われたことを示唆している。標的ペイロードサイズは点線で示されている。図２Ｂは、プールのかなりの割合が、点線で示される予想サイズと一致するペイロードを含むことを示している。なお、数塩基長以内のペイロードもかなりの割合で存在しており、このことは、アレイ合成の主なエラーモードである決失を反映している。図２Ｃは、図２Ｂからの、ペイロード分布のバイオリン図を示しており、図２Ｂは、ライブラリの大部分の構成員が平均数コピー数で存在していることを示している。最終的なライブラリから失われている構成員もあり、また、ライブラリの平均レベルの約１０倍で存在している構成員もある。
【０１６９】
実施例３：標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキーム
図３Ａ〜図３Ｆは、例示的な標的化ＦＩＳＳＥＱ捕捉スキームを図示している。図３に示すように、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又はゲノム遺伝子座などの標的核酸分子領域を捕捉するために、ＦＩＳＳＥＱ捕捉用プローブを使用することが可能である。捕捉用プローブは、標的分子配列に実質的に相補的な配列ドメインと、アダプター配列、配列決定用プライマードメイン及びバーコード配列ドメインを含む非相補的テール領域と、を含む。図３Ａは、重合反応の標的化は、標的配列ドメインを介して標的分子を対象としていることを示しており、これは、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、又はＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列の第二鎖合成などの核酸重合反応をプライミングする働きをする。プライマーは、内在性配列を取り込んだポリメラーゼによって伸長され、分子の空間的局在を保持するために、ＦＩＳＳＥＱ  ３Ｄヒドロゲルマトリックスに連結される。最後に、鋳型が、配列決定による検出のために、ローリングサークル増幅などによって環状化及び増幅される。図３Ｂは、予め環状化されたプローブが、標的分子に対してハイブリダイズされた後、配列決定による検出のために、ローリングサークル増幅などによって増幅されることを示している。図３Ｃは、ＦＩＳＳＥＱ用ライブラリ構築の生化学を標的分子に向ける目的で、タンパク質及び核酸捕捉用プローブ複合体が、標的分子の選択を媒介するために使用されていることを示している。ライブラリ構築の生化学には、限定はされないが、切断、ライゲーション及び配列決定、又はコグネイトなバーコード若しくは検出可能な標識の結合を目的とした他の核酸反応が含まれる場合がある。図３Ｄは、標的分子にハイブリダイズした際にプローブの末端同士が直接接触するように設計された「パドロックプローブ」を示している。リガーゼ反応により、上記プローブを環状化するホスホジエステル結合が形成される。最後に、配列決定による検出のために、鋳型が、ローリングサークル増幅などによって環状化及び増幅される。図３Ｅは、プローブが相補性ドメインを介して標的分子にハイブリダイズした後、標的分子に非依存的なライゲーション反応の働きにより該プローブが環状化され、その後、増幅及び配列決定が行われることを示している。図３Ｆは、「ギャップ充填」プローブ（一般に分子反転プローブ、又はＭＩＰとも呼ばれる）の、標的化ＦＩＳＳＥＱにおける使用を示している。上記プローブのハイブリダイゼーション用アームが、３’末端と５’末端との間にギャップを形成しながら標的分子にアニールする。続いて、上記プローブの３’末端によりプライミングされる核酸重合反応が、内在性配列を鋳型とした塩基を取り込みながらプローブを伸長する働きをする。その後、リガーゼにより、上記プローブを環状化するホスホジエステル結合が形成される。最後に、配列決定による検出のために、鋳型が、ローリングサークル増幅などによって環状化及び増幅される。
【０１７０】
実施例４：ＯｎｃｏＴｙｐｅ  Ｄｘパネルの標的化ＦＩＳＳＥＧ
標的化ＦＩＳＳＥＱの作業の流れを示すための一例として、ＯｎｃｏＴｙｐｅ  Ｄｘ遺伝子パネルを使用した。図５は、ヒト乳がん組織生検試料の標的化ＦＩＳＳＥＱの例示的な画像を示している。標的化逆転写用プライマーのプールが、臨床的に関連のあるＯｎｃｏＴｙｐｅ  Ｄｘ遺伝子パネルの遺伝子において、逆転写反応を開始させる。この画像は、３Ｄ  ＦＩＳＳＥＱヒドロゲル内及びオリジナルの組織試料内での分子同定を実証するために３次元回転される１塩基配列決定反応を示している。ＯｎｃｏＴｙｐｅ  Ｄｘ遺伝子の遺伝子発現プロファイルが算出される。図６は、図５から得られる配列決定の例示的な実験データの要約を示している。上部テキストは関連する実験データを含んでいる。左下のパネルは、組織画像上に重ね合わされた分子同定事象の位置を示している。下中央のパネルは、配列決定の質のメトリクスを示す同じ分子を示している。上中央のグラフは、バーコード配列上の各塩基についての配列決定シグナルの分布を示しており、高品質の配列決定データが示されている。右の表は、アッセイに含まれた遺伝子と、結合された配列バーコードとを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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