(57)【要約】  ここで提供されるのは、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合する抗体またはその抗原結合部分である。また提供されるのは、癌の処置などの治療適用におけるこれらのタンパク質の使用である。さらに提供されるのは、抗体を産生する細胞、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドおよび抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、(１)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または(２)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３と最大５アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３における天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しない特定のアミノ酸におけるものではないものを含む、重鎖定常領域を含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体が抗腫瘍免疫応答を刺激する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
抗体が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
抗体がＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる、請求項１〜３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
抗体がＴ細胞増殖を増加させる、請求項１〜４の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
抗体がＦｃ受容体に結合しない、請求項１〜５の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
抗体が１以上の活性化ＦｃγＲに結合する、請求項１〜５の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
抗体が、Biacoreにより測定して、１００nM以下のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する、請求項１〜７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
抗体が、スキャッチャードにより測定して、１nM以下のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する、請求項１〜８の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、１nM以下のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する、請求項１〜９の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、１０nM以下のＥＣ５０で膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する、請求項１〜１０の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
抗体が多価架橋を必要とせずにＴ細胞活性化を誘発または増強する、請求項１〜１１の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害する、請求項１〜１２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)に結合する、請求項１〜１３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に特異的に結合し、次のものからなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖対である３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜１４の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号１３および１４；
(ｂ)配列番号２６および２７；
(ｃ)配列番号３９および４０；
(ｄ)配列番号５２および５３；
(ｅ)配列番号５２および５４；
(ｆ)配列番号７１および７２；
(ｇ)配列番号８４および８５；
(ｈ)配列番号９７および９８；
(ｉ)配列番号９７および９９；
(ｊ)配列番号１１５および１１６；
(ｋ)配列番号１２８および１２９；
(ｌ)配列番号１２８および１３０；および
(ｍ)配列番号３３５および３３６。
【請求項１６】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、
(ａ)配列番号２０、２１および２２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号２３、２４および２５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ)配列番号３３、３４および３５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３６、３７および３８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｃ)配列番号４６、４７および４８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ)配列番号６２、６３および６４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号６５、６６および６７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ)配列番号６２、６３および６４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号６８、６９および７０をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ)配列番号７８、７９および８０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号８１、８２および８３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ)配列番号９１、９２および９３をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号９４、９５および９６をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ)配列番号１０６、１０７および１０８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１０９、１１０および１１１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ)配列番号１０６、１０７および１０８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１１２、１１３および１１４をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ)配列番号１２２、１２３および１２４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１２５、１２６および１２７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ)配列番号１３８、１３９および１４０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１４１、１４２および１４３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ)配列番号１３８、１３９および１４０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１４４、１４５および１４６をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｍ)列番号３４２〜３４４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３４５〜３４７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、請求項１〜１４の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
抗体が配列番号２０、２１および２２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号２３、２４および２５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
抗体が配列番号３３、３４および３５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３６、３７および３８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
抗体が配列番号４６、４７および４８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域が配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、(１)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または(２)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３と最大５アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３における天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しない特定のアミノ酸においてではないものを含む、重鎖定常領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域が配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、重鎖が(１)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または(２)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３と最大５アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３における天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しない特定のアミノ酸においてではないものを含む、重鎖定常領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)それぞれ配列番号１３および１４；
(ｂ)それぞれ配列番号２６および２７；
(ｃ)それぞれ配列番号３９および４０；
(ｄ)それぞれ配列番号５２および５３；
(ｅ)それぞれ配列番号５２および５４；
(ｆ)それぞれ配列番号７１および７２；
(ｇ)それぞれ配列番号８４および８５；
(ｈ)それぞれ配列番号９７および９８；
(ｉ)それぞれ配列番号９７および９９；
(ｊ)それぞれ配列番号１１５および１１６；
(ｋ)それぞれ配列番号１２８および１２９；
(ｌ)それぞれ配列番号１２８および１３０；および
(ｍ)それぞれ配列番号３３５および３３６。
【請求項２３】
重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２６】
抗体が配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
抗体が配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２８】
抗体が配列番号３９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２９】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)それぞれ配列番号１５および１６；
(ｂ)それぞれ配列番号１７および１９；
(ｃ)それぞれ配列番号１８および１９；
(ｄ)それぞれ配列番号２８および２９；
(ｅ)それぞれ配列番号３０および３２；
(ｆ)それぞれ配列番号３１および３２；
(ｇ)それぞれ配列番号４１および４２；
(ｈ)それぞれ配列番号４３および４５；
(ｉ)それぞれ配列番号４４および４５；
(ｊ)それぞれ配列番号５５および５６；
(ｋ)それぞれ配列番号５５および５７；
(ｌ)それぞれ配列番号５８および６０；
(ｍ)それぞれ配列番号５９および６０；
(ｎ)それぞれ配列番号５８および６１；
(ｏ)それぞれ配列番号５９および６１；
(ｐ)それぞれ配列番号７３および７４；
(ｑ)それぞれ配列番号７５および７７；
(ｒ)それぞれ配列番号７６および７７；
(ｓ)それぞれ配列番号８６および８７；
(ｔ)それぞれ配列番号８８および９０；
(ｕ)それぞれ配列番号８９および９０；
(ｖ)それぞれ配列番号１０２および１０４；
(ｗ)それぞれ配列番号１０３および１０４；
(ｘ)それぞれ配列番号１００および１０１；
(ｙ)それぞれ配列番号１００および３７１；
(ｚ)それぞれ配列番号１０２および１０５；
(ｚａ)それぞれ配列番号１０３および１０５；
(ｚｂ)それぞれ配列番号１１７および１１８；
(ｚｃ)それぞれ配列番号１１９および１２１；
(ｚｄ)それぞれ配列番号１２０および１２１；
(ｚｅ)それぞれ配列番号１３１および１３２；
(ｚｆ)それぞれ配列番号１３４および１３６；
(ｚｇ)それぞれ配列番号１３５および１３６；
(ｚｈ)それぞれ配列番号１３１および１３３；
(ｚｉ)それぞれ配列番号１３４および１３７；
(ｚｊ)それぞれ配列番号１３５および１３７；
(ｚｋ)それぞれ配列番号３３７および３３８；
(ｚｌ)それぞれ配列番号３３９および３４１；および
(ｚｍ)それぞれ配列番号３４０および３４１。
【請求項３０】
重鎖が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３１】
抗体が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３２】
抗体が、配列番号１８に示すアミノ酸配列に包含される可変ドメインおよび配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む重鎖および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３３】
(ａ)請求項２５の抗体とＧＩＴＲ上の同じエピトープに結合するおよび(ｂ)ＦＡＣＳにより測定して請求項２５の抗体の活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を少なくとも９０％する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３４】
抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)に結合する、請求項１５〜３３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
抗体がヒトおよびカニクイザル両方のＧＩＴＲに結合する、請求項１５〜３４の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３６】
抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、請求項１〜３５の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３７】
抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３８】
抗体がエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、請求項３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３９】
抗体またはその抗原結合部分が次の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、請求項３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４０】
抗体またはその抗原結合部分が活性化ＦｃγＲへの結合が増強されたＦｃを含む、請求項３６に記載の抗体。
【請求項４１】
ＣＤＲ領域におけるメチオニン残基が酸化を受けないアミノ酸残基に置換されている、請求項１〜４０の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４２】
抗体またはその抗原結合部分がヒトまたはヒト化抗体である、請求項１５〜４１の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４３】
第二結合特異性を有する分子に結合した、請求項１〜４２の何れかに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
【請求項４４】
請求項１〜４２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項４６】
請求項４５に記載の発現ベクターでトランスフォームされた、細胞。
【請求項４７】
薬剤に結合した請求項１〜４２の何れかに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
【請求項４８】
請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物。
【請求項４９】
請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用指示を含む、キット。
【請求項５０】
抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を製造する方法であって、請求項４６に記載の細胞において該抗体またはその抗原結合部分を発現させ、該細胞から単離することを含む、方法。
【請求項５１】
Ｔ細胞と請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法。
【請求項５２】
エフェクターＴ細胞と請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよびＣＤ３を接触させることを含み、ここで、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞と有効量の請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
【請求項５４】
Ｔ細胞と有効量の請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法。
【請求項５５】
対象に有効量の請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生が増加するように投与することを含む、対象におけるＴ細胞のＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
【請求項５６】
有効量の請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含み、ここで、該抗体またはその抗原結合部分がエフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有し、腫瘍におけるＴ制御性細胞数を減らす、処置を必要とする対象の腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすかまたは枯渇させる方法。
【請求項５７】
請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、対象における免疫応答が刺激されるように投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
【請求項５８】
対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
対象に請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項６０】
処置を必要とする対象に治療有効量の請求項１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、癌を処置するために投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項６１】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
癌が転移癌、難治性癌または再発性癌である、請求項６０または６１の何れかに記載の方法。
【請求項６３】
さらに１以上の付加的治療剤を投与することを含む、請求項５６〜６２の何れかに記載の方法。
【請求項６４】
付加的治療が抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
サンプル中のグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)の存在を検出する方法であって、該サンプルと請求項１〜４２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分を、該抗体またはその抗原結合部分とＧＩＴＲの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、方法。
【請求項６６】
ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプのものではないＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の少なくとも一つを含み、ここで、非ＩｇＧ２ヒンジを有する以外同じ抗ＧＩＴＲ抗体に対して、アゴニスト活性が増強されている、単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【請求項６７】
修飾重鎖定常領域が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域または配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３のアミノ酸配列と最大５アミノ酸異なるかまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域を含む、請求項６６に記載の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【請求項６８】
重鎖が配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２のアミノ酸配列と最大１０アミノ酸異なるまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖を含む、請求項６７に記載の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ２０１５年１１月１９日および２０１６年３月４日出願の米国仮出願６２／２５７,５９９号および６２／３０３,９９０号に基づく優先権を主張する。上記出願の内容を、引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提供されており、引用により本明細書にその全体を包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは２０１７年１１月１７日に作成し、2016-11-15_MXI-547PC_ST25.txtなる名称であり、１,０１１,５５５バイトサイズである。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７およびＧＩＴＲ−Ｄとしても知られる共刺激性分子であるグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)は、元々デキサメサゾンで処置されたマウスＴ細胞株において同定されたＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである(Nocentini et al., PNAS 1997;94:6216-21)。ＴＮＦ受容体ファミリーの他の関連メンバーは、ＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０を含む。ＧＩＴＲ発現はナイーブＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞で低いが、制御性Ｔ細胞で構成的に発現される(Tone et al., PNAS 2003;100:15059-64)。一方で、その発現がエフェクターＴ細胞で誘発されたら、ＧＩＴＲ結合は、その活性化、増殖およびサイトカイン産生を促進する(Watts, Annual Reviews in Immunology 2005;23:23-68)。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)について、Shimizuは、混合培養抑制アッセイを使用して、ＧＩＴＲ結合はその機能を抑制すると報告している(Shimizu et al., Nature Immunology 2002;3:135-42)。しかしながら、Stephans et al (JI 2004 15;173(8):5008-20)によるその後の研究で、Ｔエフェクター(Ｔｅｆｆ)細胞上のＧＩＴＲ結合は、それらをＴｒｅｇ抑制に低感受性とすることを特定し、Ｔｒｅｇ−Ｔｅｆｆ細胞共培養において観察される抑制低下を説明する。ＤＴＡ−１(ラット抗マウスＧＩＴＲ)抗体介在ＧＩＴＲ刺激は、複数の腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を促進する。
【０００４】
ＧＩＴＲのリガンドであるＧＩＴＲ−Ｌは、抗原提示細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞)での発現は低レベルであるが、例えば、ウイルス感染により、これらの細胞が活性化されると、一過性に上方制御される(Suvas et al., J Virol. 2005;79:11935-42)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌などの疾患をターゲティングするための戦略の改善の要望が継続していること考えると、免疫応答、特に、Ｔ細胞応答増強、ＧＩＴＲ活性を調節する新規薬物および方法からの利益が極めて望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要約
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと特異的に結合し、望ましい機能的性質を有する、モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体などの単離抗体である。これらの性質は、ヒトＧＩＴＲへの高親和性結合、サルＧＩＴＲ(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)への結合および抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力である。ここに記載する抗体は、腫瘍担持またはウイルス担持(ウイルス感染)対象におけるような、抗原特異的Ｔ細胞応答刺激およびサンプル中のＧＩＴＲタンパク質検出に使用できる。
【０００７】
ある態様において、ここに提供されるのは、ＧＩＴＲに結合し、(１)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または(２)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３と最大５アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が、配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３における天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しない特定のアミノ酸におけるものではないものを含む、重鎖定常領域を含む、単離抗体またはその抗原結合部分である。ある実施態様において、抗体は、次の性質の少なくとも一つを示す。
(ａ)可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(ｂ)膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(ｃ)膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(ｄ)Ｔ細胞活性化、例えば、抗原特異的Ｔ細胞活性化誘発または増強；
(ｅ)ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(ｆ)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(ｇ)成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体構造エピトープ(配列番号４)に結合；
(ｈ)Ｏ結合およびＮグリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両方への結合；
(ｉ)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；および
(ｊ)抗体２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０の１以上と、ヒトＧＩＴＲへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合。
【０００８】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、抗腫瘍免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞においてサイトカイン産生(例えば、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ)を増加させるおよび／またはＴ細胞増殖を増加させる。
【０００９】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ受容体に結合しない。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、１以上のＦｃγＲ、例えば、活性化または阻害性ＦｃγＲに結合する。
【００１０】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、Biacoreにより測定して１０nM以下のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲと結合し、スキャッチャードにより測定して１nM以下のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲと結合し、ＦＡＣＳにより測定して１nM以下のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲと結合し、ＦＡＣＳにより測定して１０nM以下のＥＣ５０で膜結合カニクイザルＧＩＴＲと結合し、多価架橋を必要とすることなく、Ｔ細胞、例えば、Ｔｅｆｆ細胞活性化を誘発または増強し、ＦＡＣＳにより測定して１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害し、そして／または成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の領域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内で結合する。
【００１１】
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと特異的に結合し、次の
(ａ)配列番号１３および１４；
(ｂ)配列番号２６および２７；
(ｃ)配列番号３９および４０；
(ｄ)配列番号５２および５３；
(ｅ)配列番号５２および５４；
(ｆ)配列番号７１および７２；
(ｇ)配列番号８４および８５；
(ｈ)配列番号９７および９８；
(ｉ)配列番号９７および９９；
(ｊ)配列番号１１５および１１６；
(ｋ)配列番号１２８および１２９；
(ｌ)配列番号１２８および１３０；および
(ｍ)配列番号３３５および３３６
から選択される可変重鎖および可変軽鎖対である３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含み、(１)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または(２)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３と最大５アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３における天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しない特定のアミノ酸におけるものではないものを含む、おいてではないものを含む、重鎖定常領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１２】
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと結合し、
(ａ)配列番号２０、２１および２２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号２３、２４および２５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ)配列番号３３、３４および３５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３６、３７および３８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｃ)配列番号４６、４７および４８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ)配列番号６２、６３および６４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号６５、６６および６７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ)配列番号６２、６３および６４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号６８、６９および７０をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ)配列番号７８、７９および８０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号８１、８２および８３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ)配列番号９１、９２および９３をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号９４、９５および９６をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ)配列番号１０６、１０７および１０８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１０９、１１０および１１１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ)配列番号１０６、１０７および１０８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１１２、１１３および１１４をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ)配列番号１２２、１２３および１２４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１２５、１２６および１２７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ)配列番号１３８、１３９および１４０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１４１、１４２および１４３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ)配列番号１３８、１３９および１４０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１４４、１４５および１４６をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｍ)配列番号３４２、３４３および３４４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３４５、３４６および３４７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および(１)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域または(２)配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３と最大５アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が、配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３に存在しない特定のアミノ酸であって、天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しないものにおけるものを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１３】
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域が配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１４】
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１５】
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと結合し、
(ａ)それぞれ配列番号１３および１４；
(ｂ)それぞれ配列番号２６および２７；
(ｃ)それぞれ配列番号３９および４０；
(ｄ)それぞれ配列番号５２および５３；
(ｅ)それぞれ配列番号５２および５４；
(ｆ)それぞれ配列番号７１および７２；
(ｇ)それぞれ配列番号８４および８５；
(ｈ)それぞれ配列番号９７および９８；
(ｉ)それぞれ配列番号９７および９９；
(ｊ)それぞれ配列番号１１５および１１６；
(ｋ)それぞれ配列番号１２８および１２９；
(ｌ)それぞれ配列番号１２８および１３０；および
(ｍ)それぞれ配列番号３３５および３３６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１６】
ここに提供されるのは、ＧＩＴＲと結合し、
(ａ)それぞれ配列番号１５および１６；
(ｂ)それぞれ配列番号１７および１９；
(ｃ)それぞれ配列番号１８および１９；
(ｄ)それぞれ配列番号２８および２９；
(ｅ)それぞれ配列番号３０および３２；
(ｆ)それぞれ配列番号３１および３２；
(ｇ)それぞれ配列番号４１および４２；
(ｈ)それぞれ配列番号４３および４５；
(ｉ)それぞれ配列番号４４および４５；
(ｊ)それぞれ配列番号５５および５６；
(ｋ)それぞれ配列番号５５および５７；
(ｌ)それぞれ配列番号５８および６０；
(ｍ)それぞれ配列番号５９および６０；
(ｎ)それぞれ配列番号５８および６１；
(ｏ)それぞれ配列番号５９および６１；
(ｐ)それぞれ配列番号７３および７４；
(ｑ)それぞれ配列番号７５および７７；
(ｒ)それぞれ配列番号７６および７７；
(ｓ)それぞれ配列番号８６および８７；
(ｔ)それぞれ配列番号８８および９０；
(ｕ)それぞれ配列番号８９および９０；
(ｖ)それぞれ配列番号１０２および１０４；
(ｗ)それぞれ配列番号１０３および１０４；
(ｘ)それぞれ配列番号１００および１０１；
(ｙ)それぞれ配列番号１００および３７１；
(ｚ)それぞれ配列番号１０２および１０５；
(ｚａ)それぞれ配列番号１０３および１０５；
(ｚｂ)それぞれ配列番号１１７および１１８；
(ｚｃ)それぞれ配列番号１１９および１２１；
(ｚｄ)それぞれ配列番号１２０および１２１；
(ｚｅ)それぞれ配列番号１３１および１３２；
(ｚｆ)それぞれ配列番号１３４および１３６；
(ｚｇ)それぞれ配列番号１３５および１３６；
(ｚｈ)それぞれ配列番号１３１および１３３；
(ｚｉ)それぞれ配列番号１３４および１３７；
(ｚｊ)それぞれ配列番号１３５および１３７；
(ｚｋ)それぞれ配列番号３３７および３３８；
(ｚｌ)それぞれ配列番号３３９および３４１；および
(ｚｍ)それぞれ配列番号３４０および３４１
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１７】
ある実施態様において、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、(ａ)ＧＩＴＲ上の２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および／または６Ｇ１０と同じエピトープに結合し、かつ(ｂ)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および／または６Ｇ１０の活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％阻害する。
【００１８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の領域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内で結合する。ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ヒトおよびカニクイザル両方のＧＩＴＲに結合する。
【００１９】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体またはそのバリアントである。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、例えば、次の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有するエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、活性化ＦｃγＲに結合するか、または、例えば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃに対して、結合が増強したＦｃを含む。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲ領域におけるメチオニン残基は、酸化を受けないアミノ酸残基で置換される。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【００２０】
ここに提供されるのは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプのものではないＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の少なくとも一つを含むＧＩＴＲに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、抗ＧＩＴＲ抗体は、非ＩｇＧ２ヒンジを有する以外同じ抗ＧＩＴＲ抗体に対して、アゴニスト活性が増強される。
【００２１】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域または配列番号２２３〜２２６、２８３〜２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３のアミノ酸配列と最大５アミノ酸異なるかまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域を含む。
【００２２】
ある実施態様において、重鎖は、配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２のアミノ酸配列と最大１０アミノ酸異なるかまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖を含む。
【００２３】
ある実施態様において、軽鎖は、配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１のアミノ酸配列と最大１０アミノ酸異なるかまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖を含む。
【００２４】
ここに提供されるのは、第二結合特異性を有する分子に結合した抗ＧＩＴＲ抗体を含む二重特異性分子である。
【００２５】
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、該核酸分子を含む発現ベクターおよび該発現ベクターで形質転換された細胞である。
【００２６】
ここに提供されるのは、薬剤に結合したここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を含むイムノコンジュゲートである。
【００２７】
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分および担体を含む、組成物である。またここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分および使用指示を含む、キットである。
【００２８】
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体を細胞において発現させ、該細胞から抗体を単離することを含む、抗ＧＩＴＲ抗体を製造する方法である。
【００２９】
ここに提供されるのは、Ｔ細胞と抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法である。
【００３０】
ここに提供されるのは、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞と、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分およびＣＤ３を接触させることを含み、ここで、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法である。
【００３１】
ここに提供されるのは、Ｔ細胞と、有効量の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を接触させることを含む、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖を増加させる方法である。
【００３２】
ここに提供されるのは、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させるために有効量の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、抗ＧＩＴＲ抗体を含む二重特異性分子またはコンジュゲートまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含む組成物を投与することを含む、対象におけるＴ細胞のＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法である。
【００３３】
ここに提供されるのは、腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすために、有効量の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲート(ここで、該抗体またはその抗原結合部分はエフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有する)を投与することを含む、処置を必要とする対象の腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすかまたは枯渇させる方法である。
【００３４】
ここに提供されるのは、有効量の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲートを、対象の免疫応答が刺激されるように対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法である。ある実施態様において、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。
【００３５】
ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲートを、腫瘍の増殖が対象において阻害されるように投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法である。
【００３６】
ここに提供されるのは、癌を処置するために治療有効量の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、抗ＧＩＴＲ抗体を含む二重特異性分子またはコンジュゲートまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含む組成物を処置を必要とする対象に投与することを含む、例えば、免疫療法により癌を処置する方法である。ある実施態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌である。ある実施態様において、癌は、転移癌、難治性癌または再発癌である。
【００３７】
ある実施態様において、ここに記載する方法は、抗ＧＩＴＲ抗体と共に１以上の付加的治療剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体および／またはＰＤ−Ｌ１抗体を投与することをさらに含む。
【００３８】
ここに提供されるのは、サンプルと抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を、該抗体またはその抗原結合部分とＧＩＴＲの間で複合体の形成を可能とする条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプルにおけるＧＩＴＲの存在を検出する方法である。
【００３９】
ここに提供されるのは、癌の処置、対象における免疫応答の増強、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化または共刺激、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖増加、腫瘍におけるＴ制御性細胞の数の減少または枯渇および／または腫瘍細胞の増殖阻害のための、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の使用である。またここに提供されるのは、対象における免疫応答の増強、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化または共刺激、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖増加、腫瘍におけるＴ制御性細胞の数の減少または枯渇および／または腫瘍細胞の増殖阻害のための医薬の製造のための、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の使用である。
【００４０】
本発明の他の特性および利点は、次の詳細な記載および実施例から明らかとなり、これらは限定的と解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、モノクローナル抗体２８Ｆ３(それぞれ配列番号１３および１４)、１８Ｅ１０(それぞれ配列番号３９および４０)および１９Ｄ３(それぞれ配列番号２６および２７)の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。２８Ｆ３のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲに下線を引く。
【００４２】
【図２Ａ】図２Ａは、２８Ｆ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４７)およびアミノ酸配列(配列番号１３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２０)、ＣＤＲ２(配列番号２１)およびＣＤＲ３(配列番号２２)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４３】
【図２Ｂ】図２Ｂは、２８Ｆ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４８)およびアミノ酸配列(配列番号１４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２３)、ＣＤＲ２(配列番号２４)およびＣＤＲ３(配列番号２５)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４４】
【図３Ａ】図３Ａは、１８Ｅ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５８)およびアミノ酸配列(配列番号３９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４６)、ＣＤＲ２(配列番号４７)およびＣＤＲ３(配列番号４８)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４５】
【図３Ｂ】図３Ｂは、１８Ｅ１０ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５９)およびアミノ酸配列(配列番号４０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４９)、ＣＤＲ２(配列番号５０)およびＣＤＲ３(配列番号５１)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４６】
【図４Ａ】図４Ａは、１９Ｄ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５４)およびアミノ酸配列(配列番号２６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３３)、ＣＤＲ２(配列番号３４)およびＣＤＲ３(配列番号３５)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、１９Ｄ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５５)およびアミノ酸配列(配列番号２７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３６)、ＣＤＲ２(配列番号３７)およびＣＤＲ３(配列番号３８)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４８】
【図５Ａ】図５Ａは、３Ｃ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６２)およびアミノ酸配列(配列番号５２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６２)、ＣＤＲ２(配列番号６３)およびＣＤＲ３(配列番号６４)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００４９】
【図５Ｂ】図５Ｂは、３Ｃ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１６３)およびアミノ酸配列(配列番号５３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６５)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６７)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５０】
【図５Ｃ】図５Ｃは、３Ｃ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ２)のヌクレオチド配列(配列番号１６４)およびアミノ酸配列(配列番号５４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６８)、ＣＤＲ２(配列番号６９)およびＣＤＲ３(配列番号７０)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５１】
【図６Ａ】図６Ａは、２Ｇ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６８)およびアミノ酸配列(配列番号７１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７８)、ＣＤＲ２(配列番号７９)およびＣＤＲ３(配列番号８０)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５２】
【図６Ｂ】図６Ｂは、２Ｇ６ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６９)およびアミノ酸配列(配列番号７２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８１)、ＣＤＲ２(配列番号８２)およびＣＤＲ３(配列番号８３)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５３】
【図７Ａ】図７Ａは、８Ａ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１７２)およびアミノ酸配列(配列番号８４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９１)、ＣＤＲ２(配列番号９２)およびＣＤＲ３(配列番号９３)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５４】
【図７Ｂ】図７Ｂは、８Ａ６ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１７３)およびアミノ酸配列(配列番号８５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９４)、ＣＤＲ２(配列番号９５)およびＣＤＲ３(配列番号９６)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５５】
【図８Ａ】図８Ａは、９Ｇ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１７６)およびアミノ酸配列(配列番号９７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１０６)、ＣＤＲ２(配列番号１０７)およびＣＤＲ３(配列番号１０８)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５６】
【図８Ｂ】図８Ｂは、９Ｇ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１７７)およびアミノ酸配列(配列番号９８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１０９)、ＣＤＲ２(配列番号１１０)およびＣＤＲ３(配列番号１１１)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５７】
【図８Ｃ】図８Ｃは、９Ｇ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ２)のヌクレオチド配列(配列番号１７８)およびアミノ酸配列(配列番号９９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１１２)、ＣＤＲ２(配列番号１１３)およびＣＤＲ３(配列番号１１４)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５８】
【図９Ａ】図９Ａは、１４Ｅ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１８２)およびアミノ酸配列(配列番号１１５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１２２)、ＣＤＲ２(配列番号１２３)およびＣＤＲ３(配列番号１２４)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５９】
【図９Ｂ】図９Ｂは、１４Ｅ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１８３)およびアミノ酸配列(配列番号１１６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１２５)、ＣＤＲ２(配列番号１２６)およびＣＤＲ３(配列番号１２７)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００６０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、１９Ｈ８ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１８６)およびアミノ酸配列(配列番号１２８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１３８)、ＣＤＲ２(配列番号１３９)およびＣＤＲ３(配列番号１４０)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００６１】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１９Ｈ８ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１８７)およびアミノ酸配列(配列番号１２９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１４１)、ＣＤＲ２(配列番号１４２)およびＣＤＲ３(配列番号１４３)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００６２】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、１９Ｈ８ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ２)のヌクレオチド配列(配列番号１８８)およびアミノ酸配列(配列番号１３０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１４４)、ＣＤＲ２(配列番号１４５)およびＣＤＲ３(配列番号１４６)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００６３】
【図１１Ａ】図１１Ａは、６Ｇ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号３５３)およびアミノ酸配列(配列番号３３５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３４２)、ＣＤＲ２(配列番号３４３)およびＣＤＲ３(配列番号３４４)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００６４】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、６Ｇ１０ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号３５４)およびアミノ酸配列(配列番号３３６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３４５)、ＣＤＲ２(配列番号３４６)およびＣＤＲ３(配列番号３４７)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００６５】
【図１２】図１２は、２８Ｆ３の重鎖可変領域(配列番号１３)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９３および１９６)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００６６】
【図１３】図１３は、２８Ｆ３の軽鎖可変領域(配列番号１４)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１８およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００６７】
【図１４】図１４は、１８Ｅ１０の重鎖可変領域(配列番号３９)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３、６−１９およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９９および１９７)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００６８】
【図１５】図１５は、１８Ｅ１０の軽鎖可変領域(配列番号４０)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(配列番号２０７および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００６９】
【図１６】図１６は、１９Ｄ３の重鎖可変領域(配列番号２６)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３、３−１６およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、２００および１９８)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７０】
【図１７】図１７は、１９Ｄ３の軽鎖可変領域(配列番号２７)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７１】
【図１８】図１８は、３Ｃ３の重鎖可変領域(配列番号５２)とヒト生殖系列ＶＨ  ４−３４およびＪＨ３アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０１および２０２)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７２】
【図１９Ａ】図１９Ａは、３Ｃ３の軽鎖可変領域(ＶＫ１)(配列番号５３)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７３】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、３Ｃ３の軽鎖可変領域(ＶＫ２)(配列番号５４)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ２０およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０８および２０６)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７４】
【図２０】図２０は、２Ｇ６の重鎖可変領域(配列番号７１)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２および１９７)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７５】
【図２１】図２１は、２Ｇ６の軽鎖可変領域(配列番号７２)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７６】
【図２２】図２２は、８Ａ６の重鎖可変領域(配列番号８４)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９３および１９７)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７７】
【図２３】図２３は、８Ａ６の軽鎖可変領域(配列番号８５)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１８およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７８】
【図２４】図２４は、９Ｇ７の重鎖可変領域(配列番号９７)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−１５、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０３、１９４および１９８)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００７９】
【図２５Ａ】図２５Ａは、９Ｇ７の軽鎖可変領域(ＶＫ１)(配列番号９８)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ａ２７およびＪＫ１アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０９および２１０)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８０】
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、９Ｇ７の軽鎖可変領域(ＶＫ２)(配列番号９９)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ａ２７およびＪＫ５アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０９および２１２)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８１】
【図２６】図２６は、１４Ｅ３の重鎖可変領域(配列番号１１５)とヒト生殖系列ＶＨ  ４−３４およびＪＨ３アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０１および２０２)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８２】
【図２７】図２７は、１４Ｅ３の軽鎖可変領域(配列番号１１６)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１５およびＪＫ１アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２１１)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８３】
【図２８】図２８は、１９Ｈ８の重鎖可変領域(配列番号１２８)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９５および１９６)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８４】
【図２９Ａ】図２９Ａは、１９Ｈ８の軽鎖可変領域(ＶＫ１)(配列番号１２９)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１８およびＪＫ１アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２１１)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８５】
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、１９Ｈ８の軽鎖可変領域(ＶＫ２)(配列番号１３０)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ６およびＪＫ４アミノ酸配列(それぞれ配列番号２１３および２１４)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８６】
【図３０】図３０は、６Ｇ１０の重鎖可変領域(配列番号３３５)とヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９５および１９６)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８７】
【図３１】図３１は、６Ｇ１０の軽鎖可変領域(ＶＫ１)(配列番号３３６)とヒト生殖系列Ｖｋ  Ｌ１８およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２０５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００８８】
【図３２】図３２は、ＦＡＣＳにより評価して、活性化ヒトＴ細胞に対する各種の抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性(nM)を、抗体非存在下、ＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２抗体対照と共に示す。
【００８９】
【図３３】図３３は、ＦＡＣＳにより評価して、活性化カニクイザルＴ細胞に対する各種の抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性(nM)を、抗体非存在下および対照としてのｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２抗体と共に示す。
【００９０】
【図３４−１】図３４Ａおよび３４Ｂは、各種の抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲ−Ｌ)のＧＩＴＲ  ３Ａ９細胞への結合を阻害する能力を、対照としてのｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、抗体非存在下および細胞単独と共に示す。
【００９１】
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、組み換えＧＩＴＲ−Ｌの活性化ヒトＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞への結合を示す。
【００９２】
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、ＧＩＴＲ−Ｌが２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１の活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を部分的に遮断することを示す。固定濃度の０.５μg／mLでの２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１の活性化Ｔ細胞への結合は、０.００２４μg／mLのＩＣ５０で予め結合したＧＩＴＲ−Ｌにより部分的に遮断された。
【００９３】
【図３４Ｅ】図３４Ｅは、２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１が０.６μg／mlのＧＩＴＲ−Ｌの活性化ヒトＴ細胞への結合を遮断しないことを示す。ＧＩＴＲ−ＬをＣＤ４＋Ｔ細胞に、約９０％の飽和である０.６mg／mLで添加したとき、予め結合した２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１は、１００mg／mL〜０.０００５６mg／mLの範囲でＧＩＴＲ−Ｌの遮断は不可能であった。
【００９４】
【図３４Ｆ】図３４Ｆは、２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１が０.０２μg／mlのＧＩＴＲ−Ｌの活性化ヒトＴ細胞への結合を部分的に遮断することを示す。固定濃度の２０ng／mLでのＧＩＴＲ−Ｌの活性化Ｔ細胞への結合は、０.０７５μg／mLのＩＣ５０で予め結合した２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１により部分的に遮断された。
【００９５】
【図３５Ａ】図３５Ａは、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３が天然の、しかし、変性されていない、ヒトＧＩＴＲに結合し、その結合がＮ結合グリコシル化の存在または非存在により影響されないことを示す、ウェスタンブロットを示す。“＋”サインは、Ｎ結合グリコシル化を除去するためにＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理したサンプルを示す。
【００９６】
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ウェスタンブロット解析のためにニトロセルロースに移す前のヒトＧＩＴＲの全形態の存在を示す、クーマシーブルー染色ゲルである。
【００９７】
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｂは、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ(１)、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ(２)、トリプシン(３)、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ(４)またはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ(５)での消化により産生した天然ＧＩＴＲフラグメントへの２８Ｆ３および３Ｃ３抗体の結合を示す。
【００９８】
【図３７】図３７は、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃとトリプシン(“Ｇｌｕ−Ｃとトリプシン”)、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ(“Ａｒｇ−Ｃ”)、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃとトリプシン(“Ｌｙｓ−Ｃとトリプシン”)、トリプシンまたはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮとエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ(“ＡｓｐＮとＧｌｕＣ”)で天然ヒトＧＩＴＲタンパク質を消化することにより産生したヒトＧＩＴＲペプチドフラグメントへの抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３結合のヒートマップ図を示し、２８Ｆ３抗体が結合するエピトープの位置を同定する(枠付加領域)。ヒトＧＩＴＲの成熟細胞外ドメインのアミノ酸配列は濃灰色で示し、それにＣ末端で結合したマウスＦｃの配列を薄灰色で示す。
【００９９】
【図３８Ａ】図３８Ａは、天然ヒトＧＩＴＲのトリプシン消化に由来するペプチドの２８Ｆ３被覆ビーズとのインキュベーション後の素通り画分におけるペプチドを示す。
【０１００】
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、２つの主２８Ｆ３結合ペプチドを示す(アスタリスクにより示す)。
【０１０１】
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、記載する配列を有し、Ｏ結合グリコシル化を欠くＮ末端ペプチドに対応するとしての、図３４Ｂにおける２ピークの最初のもののＬＣ−ＭＳによる同定を示す。
【０１０２】
【図３８Ｄ】図３８Ｄは、記載する配列を有し、Ｔ２０にＯ結合グリコシル化を有するＮ末端ペプチドに対応するとしての、図３４Ｂにおける２ピークの２番目のもののＬＣ−ＭＳによる同定を示す。
【０１０３】
【図３８Ｅ】図３８Ｅは、２８Ｆ３と共にインキュベートした長いペプチドのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎでのインサイチュ消化後残ったＧＩＴＲペプチドを示す。
【０１０４】
【図３９Ａ】図３９Ａは、ＧＩＴＲのＮ末端領域について８６％の配列包括度を達成する、組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃおよび組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃと２８Ｆ３  ＩｇＧ１のタンパク質複合体についての消化性ペプチドの一覧を示す。
【０１０５】
【図３９Ｂ】図３９Ｂは、２８Ｆ３  ＩｇＧ１  ｍＡｂ(“ＧＩＴＲ.６”)の非存在下／存在下でのＨＤＸマススペクトロメトリー(ＭＳ)による重水素取り込みレベルを示す。
【０１０６】
【図３９Ｃ】図３９Ｃは、ＨＤＸ  ＭＳにより決定した、２８Ｆ３により結合される成熟ヒトＧＩＴＲにおける２領域を示す。
【０１０７】
【図４０】図４０は、プレート結合存在下での３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対する各種のアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。
【０１０８】
【図４１Ａ】図４１Ａは、特異的抗原により活性化された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体１８Ｅ１０、１３Ｈ２(２８Ｆ３と同じ)および２８Ｆ３の効果を示す。
【０１０９】
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、特異的抗原により活性化された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体３Ｃ３(“ＧＩＴＲ.３”として示す)、２８Ｆ３、１９Ｄ３および１８Ｅ１０の効果を示す。
【０１１０】
【図４２Ａ】図４２Ａは、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞(すなわち、ＯＫＴ３  ｓｃｆｖを発現するＣＨＯ細胞)で刺激されたＴ細胞による、インターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)分泌に対する各種のアゴニスト抗ＧＩＴＲ  ＨｕＭＡｂ抗体の効果を示す。
【０１１１】
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌に対するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第一ドナー由来である。
【０１１２】
【図４２Ｃ】図４２Ｃは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第一ドナー由来である。
【０１１３】
【図４２Ｄ】図４２Ｄは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第二ドナー由来である。
【０１１４】
【図４２Ｅ】図４２Ｅは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第二ドナー由来である。
【０１１５】
【図４３】図４３は、ＨＥＬ４８−６３ペプチド存在下ＬＫ３５.２細胞で刺激された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３(ＩｇＧ２)、２８Ｆ３−Ｆ(ａｂ’)２フラグメントおよび２８Ｆ３−Ｆａｂの効果を示す。
【０１１６】
【図４４】図４４は、ヒト扁桃検体のモノクローナル抗体２８Ｆ３−ＦＩＴＣを用いる免疫組織化学を示す。
【０１１７】
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｄは、ラット抗マウスＧＩＴＲ抗体、ＤＴＡ−１の各種のアイソタイプの、ＭＣ３８結腸腺癌モデルにおいてこれらアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化により測定した抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図４５Ａ)  対照マウスＩｇＧ１抗体(１０mg／kg)；(図４５Ｂ)  ＤＴＡ−１ラットＩｇＧ２ｂ(１０mg／kg)；(図４５Ｃ)  ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ１(１０mg／kg)；(図４５Ｄ)  ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ２ａ(１０mg／kg)。群あたりの無腫瘍(ＴＦ)マウスの数を、１０マウスの各群について示す。
【０１１８】
【図４６】図４６Ａおよび４６Ｂは、各種のアイソタイプのＤＴＡ−１抗体(１０mg／kg)で処置したマウスの群におけるＭＣ３８腫瘍の平均(図４６Ａ)および中央腫瘍体積(図４６Ｂ)変化を示す。
【０１１９】
【図４７】図４７Ａ〜４７Ｆは、示す各種の抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１)および抗ＣＴＬＡ−４(９Ｄ９)アイソタイプおよび対照抗体で処置したＭＣ３８腫瘍担持マウスからの脾臓(図４７Ａ〜４７Ｃ)および腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)(図４７Ｄ〜４７Ｆ)のフローサイトメトリー解析を示す。(図４７Ａ)  脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ；(図４７Ｂ)  脾臓におけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ；(図４７Ｃ)  脾臓におけるＦｏｘｐ３＋でもあるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ；(図４７Ｄ)  ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ；(図４７Ｅ)  ＴＩＬにおけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ；(図４７Ｆ)  ＴＩＬにおけるＦｏｘｐ３＋でもあるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。
【０１２０】
【図４８】図４８Ａ〜４８Ｆは、凝集を最小化するように再設計した、ラット抗マウスＧＩＴＲ抗体、ＤＴＡ−１の各種のアイソタイプ(“ｍＧＩＴＲ.７”と称する)の、ＭＣ３８モデルにおけるこれらアイソタイプで処置された個々のマウスにおける腫瘍体積の変化により測定した抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図４８Ａ)  対照マウスＩｇＧ１抗体；(図４８Ｂ)  ｍＧＩＴＲ.７  ｍＩｇＧ１；(図４８Ｃ)  ｍＧＩＴＲ.７  ｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ；(図４８Ｄ)  ｍＧＩＴＲ.７  ｍＩｇＧ２ａ；(図４８Ｅ)  ｍＧＩＴＲ.７  ｍＩｇＧ２ｂ；(図４８Ｆ)  ｍＧＩＴＲ.７ラットＩｇＧ２ｂ。群あたりのＴＦマウス数を、９マウスの各群について示す。
【０１２１】
【図４９】図４９Ａおよび４９Ｂは、各種のアイソタイプの再設計ＤＴＡ−１抗体で処置したマウスの群におけるＭＣ３８腫瘍の平均(図４９Ａ)および中央腫瘍体積(図４９Ｂ)変化を示す。
【０１２２】
【図５０】図５０Ａおよび５０Ｂは、ＭＣ３８腫瘍担持マウスからの脾臓(図５０Ａ)およびＴＩＬ(図５０Ｂ)におけるＦｏｘｐ３＋／ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに対する各種のＤＴＡ−１(再設計“ｍＧＩＴＲ”ＤＴＡ−１または最初に設計された“ＤＴＡ−１”抗体)および抗ＣＴＬＡ−４(９Ｄ９)アイソタイプの効果のフローサイトメトリー解析を示す。
【０１２３】
【図５１】図５１Ａ〜５１Ｅは、Ｓａ１Ｎ線維肉腫マウスモデルにおける各種のマウスＤＴＡ−１アイソタイプの、これらアイソタイプで処置された個々のマウスの腫瘍体積の変化により測定した抗腫瘍活性を示す：(図５１Ａ)  対照マウスＩｇＧ１抗体；(図５１Ｂ)  ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ２ａ；(図５１Ｃ)  ＤＴＡ−１ラットＩｇＧ２ｂ；(図５１Ｄ)  ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ１；(図５１Ｅ)  ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ。群あたりのＴＦマウス数を、最大１０マウスまでの各群について示す。
【０１２４】
【図５２】図５２Ａおよび５２Ｂは、各種のアイソタイプのＤＴＡ−１抗体で処置されたマウスの群におけるＳａ１Ｎ腫瘍の平均(図５２Ａ)および中央腫瘍体積(図５２Ｂ)変化を示す。
【０１２５】
【図５３】図５３Ａおよび５３Ｂは、Ｓａ１Ｎ腫瘍担持マウスからの脾臓(図５３Ａ)およびＴＩＬ(図５３Ｂ)におけるＦｏｘｐ３＋／ＣＤ４＋に対する各種のＤＴＡ−１および抗ＣＴＬＡ−４(９Ｄ９)アイソタイプの効果を示す。
【０１２６】
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｄは、ステージ分類ＭＣ３８結腸腺癌モデルを使用する、腫瘍体積に対するラット抗ＧＩＴＲ抗体、ＤＴＡ−１の効果を示す。マウスを、７日、１０日および１４日に(図５４Ａ)  対照ｍＩｇＧ１、(図５４Ｂ)  ｍＩｇＧ＋ＤＴＡ−１、(図５４Ｃ)  ｍＩｇＧ＋ＰＤ−１および(図５４Ｄ)  ＰＤ−１＋ＤＴＡ−１で処置した。群あたりの無腫瘍(ＴＦ)マウスの数を、１０マウスの各群について示す。
【０１２７】
【図５５】図５５Ａおよび５５Ｂは、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞への結合に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３のＶＨ  ＣＤＲ３における変異の各種の組み合わせの効果を示す。
【０１２８】
【図５６】図５６Ａ〜５６Ｆは、プレート結合抗ＣＤ３存在下の３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌レベルに対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３のＶＨ  ＣＤＲ３における変異の各種の組み合わせの効果を示す。
【０１２９】
【図５７】図５７は、活性化Ｔ細胞に対する記載する抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性を示す。試験した抗体は、次の重鎖定常領域の一つを含んだ：ＩｇＧ１定常領域(“抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆ”)、エフェクターレスＩｇＧ１定常領域(“抗ＧＩＴＲ.ｇ１.１ｆ”)、ＩｇＧ２定常領域(“抗ＧＩＴＲ−Ｇ２”)、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１  Ｆｃドメイン(“抗ＧＩＴＲ.Ｇ２.Ｇ１ｆ”)およびＩｇＧ２ヒンジおよびエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃドメイン(“抗ＧＩＴＲ.Ｇ２.Ｇ１.１ｆ”)。
【０１３０】
【図５８】図５８Ａ〜５８Ｃは、各種の重鎖定常領域を有する可溶性抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激されたドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を示す。図５８Ａは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および各種の濃度のＩｇＧ２−ＩｇＧ１定常領域を有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激されたドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を示す。図５８Ｂは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および各種の濃度のＩｇＧ１重鎖定常ドメインまたはＩｇＧ２−ＩｇＧ１ハイブリッド重鎖定常ドメインで刺激されたドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。図５８Ｃは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および各種の濃度の図５５ＡおよびＢにおける抗体のエフェクターレスバージョン(ＩｇＧ１.１)で刺激されたドナーＣＤ４  Ｔ細胞のＩＬ−２分泌を示す。
【０１３１】
【図５９】図５９は、プレート結合抗ＣＤ３存在下、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌に対する記載する抗ＧＩＴＲ抗体の比較を示す。
【０１３２】
【図６０】図６０Ａ〜６０Ｄは、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞の増殖に対する２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の効果を示す。
【０１３３】
【図６１】図６１Ａ〜６１Ｆは、２の異なるドナーからの活性化ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞およびＴｒｅｇ富化細胞のＮＫ細胞誘発溶解に対する２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
【０１３４】
【図６２】図６２Ａ〜６２Ｃは、ＭＣ３８腫瘍の増殖に対する対照ｈＩｇＧ１抗体、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
【０１３５】
【図６３】図６３Ａおよび６３Ｂは、対照ｈＩｇＧ１抗体、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１.１”)で処置したマウスにおけるＭＣ３８腫瘍の平均体積および中央体積をそれぞれ示す。
【０１３６】
【図６４】図６４Ａおよび６４Ｂは、対照ｈＩｇＧ１抗体、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１.１”)で処置したＭＣ３８腫瘍を有するマウスの平均％体重変化および中央％体重変化をそれぞれ示す。
【０１３７】
【図６５】図６５は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＴｒｅｇ細胞枯渇に対する、アイソタイプ対照と比較した、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１”)の効果を示す。
【０１３８】
【図６６】図６６は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージに対する、アイソタイプ対照と比較した、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１”)の効果を示す。
【０１３９】
【図６７】図６７は、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ細胞を共培養したときの、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌に対する可溶性および交差結合２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
【０１４０】
【図６８】図６８は、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ細胞を共培養したときの、Ｔ細胞増殖に対する可溶性および交差結合２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
【０１４１】
【図６９】図６９は、記載する定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す。
【０１４２】
【図７０】図７０は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答を、１：１のｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論を仮定した理論上のＲｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体についての棒を、スライドの下部に色凡例を提供するために示す。
【０１４３】
【図７１】図７１は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答を、１：１のｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論を仮定した理論上のＲｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体についての棒を、スライドの下部に色凡例を提供するために示す。
【０１４４】
【図７２】図７２は、抗ＧＩＴＲ抗体の内部移行経時変化解析を示す。
【０１４５】
【図７３Ａ】図７３Ａは、０時のＧＩＴＲおよび初期エンドソームマーカーＥＥＡ２共局在化解析を示す。
【０１４６】
【図７３Ｂ】図７３Ｂは、３０分および１２０分時点のＧＩＴＲおよび初期エンドソームマーカーＥＥＡ２共局在化解析を示す。
【０１４７】
【図７３Ｃ】図７３Ｃは、総染色に対する共局在化ピクセル強度の比率としてプロットした図７３Ａおよび７３Ｂに示すエンドソーム共局在化の定量化の結果を示す。
【０１４８】
【図７４Ａ】図７４Ａは、記載する抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＮＦｋＢシグナル伝達活性化を示す。
【０１４９】
【図７４Ｂ】図７４Ｂは、記載する抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＮＦｋＢシグナル伝達活性化を示す。
【０１５０】
【図７５】図７５は、記載する抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰ３８活性化を示す。
【０１５１】
【図７６Ａ】図７６Ａは、各種の濃度の記載する定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す。
【０１５２】
【図７６Ｂ】図７６Ｂは、５μg／mlの記載する定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す(図７６Ａと同じ実験)。
【０１５３】
【図７６Ｃ】図７６Ｃは、１.２５μg／mlの記載する定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す(図７６Ａと同じ実験)。
【０１５４】
【図７６Ｄ】図７６Ｄは、０.３１３μg／mlの記載する定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す(図７６Ａと同じ実験)。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
詳細な記載
ここに記載されるのは、ＧＩＴＲに特異的に結合し、それにより下流ＧＩＴＲシグナル伝達を活性可する、単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体(“アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体”)である。ある実施態様において、ここに記載する抗体は特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来し、そして／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造特性を含む。ここに提供されるのは、単離抗体、このような抗体を含むイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子の製造方法、このような抗体を含むように製剤された医薬組成物である。またここに提供されるのは、単独でまたは他の免疫刺激剤(例えば、抗体)および／または癌治療と組み合わせた、該抗体を免疫応答増強のために使用する方法である。従って、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、腫瘍増殖阻害およびウイルス感染処置を含む、広範な治療適用における処置に使用し得る。
【０１５６】
定義
本記載がよりよく理解され得るために、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載をとおして示される。
【０１５７】
ここで使用する用語“グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体”または“ＧＩＴＲ”は、ＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲ−Ｌ)に結合するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである受容体をいう。ＧＩＴＲはまた腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１８(ＴＮＦＲＳＦ１８)、ＡＩＴＲおよびＣＤ３５７とも称される。用語“ＧＩＴＲ”は、細胞により天然に発現されるＧＩＴＲのあらゆるバリアントまたはアイソフォームを含む。従って、ここに記載する抗体は、ヒト以外の種からのＧＩＴＲ(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)と交差反応し得る。あるいは、抗体はヒトＧＩＴＲに特異的であってよく、他の種との如何なる交差反応性も示すことを要しない。ＧＩＴＲまたはそのあらゆるバリアントおよびアイソフォームは、それを天然に発現する細胞または組織から単離しても、当分野で周知のおよび／またはここに記載する技術を使用して組み換えにより産生してもよい。
【０１５８】
ヒトＧＩＴＲの３アイソフォームが同定されており、この全てが、Ｃ末端部分を除き、同じ細胞外ドメインを共有する。バリアント１(Accession No. NP_004186；配列番号１)は２４１アミノ酸からなり、最長転写物を表す。これは、バリアント２と比較して、フレームシフトをもたらす余分のコーディングセグメントを含む。得られたタンパク質(アイソフォーム１)は、アイソフォーム２と比較して、異なる、短いＣ末端を含む。バリアント２(Accession No. NP_683699；配列番号２)は、２５５アミノ酸からなる最長タンパク質(アイソフォーム２)をコードし、可溶性である。バリアント３(Accession No. NP_683700；配列番号３)は、バリアント２と比較して、フレームシフトをもたらす余分のコーディングセグメントを含む。得られたタンパク質(アイソフォーム３)は、アイソフォーム２と比較して、異なる、短いＣ末端を含み、２３４アミノ酸からなる。
【０１５９】
下記は、既知の３種のヒトＧＩＴＲアイソフォーム、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲおよびＧＩＴＲ−Ｌのアミノ酸配列である。
【０１６０】
ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１(Accession No. NP_004186；配列番号１；Accession No. NM_004195.2を有するヌクレオチド配列によりコード)：
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
【０１６１】
ヒトＧＩＴＲアイソフォーム２(Accession No. NP_683699.1；配列番号２；Accession No. NM_148901.1を有するヌクレオチド配列によりコード)：
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCCWRCRRRPKTPEAASSPRKSGASDRQRRRGGWETCGCEPGRPPGPPTAASPSPGAPQAAGALRSALGRALLPWQQKWVQEGGSDQRPGPCSSAAAAGPCRRERETQSWPPSSLAGPDGVGS
【０１６２】
ヒトＧＩＴＲアイソフォーム３(Accession No. NP_683700.1；配列番号３；Accession No. NM_148902.1を有するヌクレオチド配列によりコード)：
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
【０１６３】
アイソフォーム１〜３のシグナル配列は、アミノ酸１〜２５に対応する。それ故に、成熟アイソフォーム１、２および３は、それぞれアミノ酸２６〜２４１、２５５または２３４からなる。成熟ＧＩＴＲの細胞外ドメインは、アミノ酸２６〜１６２からなり、アミノ酸配列
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEP(配列番号４)
を有する。
【０１６４】
カニクイザルＧＩＴＲタンパク質配列(配列番号５)：
MCASGTLCCLALLCAASLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQGEECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPPGWLTIILLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLWV
【０１６５】
ヒトＧＩＴＲ−Ｌタンパク質配列(Accession No. NP_005083.2；配列番号６)：
MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS
【０１６６】
ここで使用する用語“抗体”は、抗体全体およびそのあらゆる抗原結合フラグメント(すなわち、“抗原結合部分”)または一本鎖を含む。“抗体”は、ある実施態様において、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分をいう。各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域を含む。ある天然に存在する抗体において、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３ドメインからなる。ある天然に存在する抗体において、各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略する)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、ＣＬの１ドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置される、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織または免疫系の各種の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。
【０１６７】
抗体は、一般に、１０−５〜１０−１１Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)により示される高親和性で特異的にその同族抗原に結合する。約１０−４Ｍより大きい何らかのＫＤは、一般に非特異的結合を示すと考えられる。ここで使用する抗原と“特異的に結合する”抗体は、該抗原および実質的に同一の抗原に、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ以下のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原に高親和性で結合しない抗体をいう。抗原は、ある抗原と、該抗原と高度な配列同一性を示すならば、例えば、該抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％またはさらにより好ましくは少なくとも９９％配列同一性を示すならば、“実質的に同一”である。例として、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する抗体は、ある霊長類種のＧＩＴＲ抗原(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)とも交差反応性を有してよいが、他の種からのＧＩＴＲ抗原またはＧＩＴＲ以外の抗原と交差反応し得ない。
【０１６８】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れに由来してもよい。ＩｇＧアイソタイプは、ある種ではサブクラスに分割される：ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４およびマウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、数アロタイプで存在でき、これは互いに最大数アミノ酸異なる。“抗体”は、例として、天然に存在し、そして天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体および一本鎖抗体を含む。
【０１６９】
ここで使用する抗体の“抗原結合部分”なる用語は、抗原(例えば、ヒトＧＩＴＲ)に特異的結合する能力を保持する、抗体の１以上のフラグメントをいう。このような“フラグメント”は、例えば約８〜約１５００アミノ酸長、適切には約８〜約７４５アミノ酸長、適切には約８〜約３００、例えば約８〜約２００アミノ酸または約１０〜約５０または１００アミノ酸長である。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより実施され得ることが示されている。抗体、例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント、(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)または(vii)場合により合成リンカーで連結されていてよい２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２ドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ領域とＶＨ領域が対となって一価分子を形成する、単一タンパク質鎖として製造することを可能とする合成リンカーにより、組み換え方法を使用して連結され得る(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として既知；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体も、抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる慣用技術を使用して得て、フラグメントをインタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクト免疫グロブリンの酵素または化学開裂により産生できる。
【０１７０】
“二重特異性”または“二機能性抗体”は、２個の異なる重／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメント結合を含む、多様な方法により産生され得る。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。
【０１７１】
ここで使用する用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体または全抗体が特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物をいう。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、単一結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および任意に定常領域を有する、抗体または抗体組成物をいう。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【０１７２】
ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソミック動物(例えば、マウス)から単離した抗体またはそれから製造したハイブリドーマ、(ｂ)該抗体を発現するようにトランスフォームされた宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかの他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体などの、組み換え手段により製造、発現、作製または単離された全てのヒト抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされるが、例えば、抗体成熟中に起こる、その後の再配列および変異を含む特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する、可変および定常領域を含む。当分野で知られるとおり(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125参照)、可変領域は、外来抗原に特異的な抗体を形成するために再配列される各種の遺伝子によりコードされる、抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、抗体の外来抗原に対する親和性を高めるために、複数の一アミノ酸変化(体性変異または超変異と称する)によりさらに修飾され得る。定常領域は、抗原に対するさらなる応答において変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それ故に、抗原への応答において再配列され、体性変異された軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有し得ないが、実質的に同一または類似である(すなわち、少なくとも８０％同一性を有する)。
【０１７３】
“ヒト”抗体(ＨｕＭＡｂ)は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、該定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ここに記載する抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでよい(例えば、インビトロで無作為または部位特異的変異誘発またはインビボで体性変異により導入された変異)。しかしながら、ここで使用する用語“ヒト抗体”は、マウスなどの他の哺乳動物種由来の生殖系列のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことは意図しない。用語“ヒト”抗体および“完全ヒト”抗体は同義的に使用される。
【０１７４】
“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換される、抗体をいう。抗体のヒト化形態のある実施態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てはヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置換されており、一方、１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全ては変えられない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらが抗体の特定の抗原に結合する能力を消失させない限り、許容される。“ヒト化”抗体は、元の抗体と同程度の抗原特異性を保持する。
【０１７５】
“キメラ抗体”は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体などの、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。
【０１７６】
ここで使用する“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
【０１７７】
“アロタイプ”は、特異的アイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、このバリアントは数アミノ酸異なる(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。ここに記載する抗体は任意のアロタイプであり得る。ここで使用する“ＩｇＧ１ｆ”または“ＩｇＧ１.１ｆ”アイソタイプと称する抗体は、それぞれ、アロタイプ“ｆ”、すなわち、例えば、配列番号７に示すとおり、KabatにおけるＥＵインデックスにより２１４Ｒ、３５６Ｅおよび３５８Ｍを有する、ＩｇＧ１およびエフェクターレスＩｇＧ１.１抗体である(表１５の配列番号７における下線残基参照)。
【０１７８】
用語“抗原を認識する抗体”および“抗原に特異的な抗体”は、ここでは、用語“抗原に特異的に結合する抗体”と相互交換可能に使用する。
【０１７９】
ここで使用する“単離抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体をいうことを意図する(例えば、ＧＩＴＲに特異的に結合する単離抗体は、ＧＩＴＲ以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。ＧＩＴＲのエピトープに特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、様々な種からの他のＧＩＴＲタンパク質と交差反応性を有し得る。
【０１８０】
ここで使用する“ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を阻害する”抗体は、例えば、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を使用する結合アッセイにおいて、当分野で認められている方法、例えば、ここに記載するＦＡＣＳベースの結合アッセイで、約１μg／mL以下、例えば、約０.９μg／mL以下、約０.８５μg／mL以下、約０.８μg／mL以下、約０.７５μg／mL以下、約０.７μg／mL以下、約０.６５μg／mL以下、約０.６μg／mL以下、約０.５５μg／mL以下、約０.５μg／mL以下、約０.４５μg／mL以下、約０.４μg／mL以下、約０.３５μg／mL以下、約０.３μg／mL以下、約０.２５μg／mL以下、約０.２μg／mL以下、約０.１５μg／mL以下または約０.１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を阻害する抗体である。
【０１８１】
“エフェクター機能”は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドの相互作用またはそれ由来の生化学的事象をいう。“エフェクター機能”の例は、Ｃｌｑ結合、補体依存的細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存的細胞貪食活性(ＡＤＣＰ)などのＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合することを必要とする。
【０１８２】
“Ｆｃ受容体”または“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体をいう。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲはＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体のアレルバリアントおよび選択的スプライシングを受けた形を含む。ＦｃγＲファミリーは、３個の活性化(マウスにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトにおけるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１個の阻害性(ＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。各種ヒトＦｃγＲの性質を表１に要約する。先天的エフェクター細胞型の大部分が、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIＢを共発現するのに対し、マウスおよびヒトにおいてナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は１個の活性化Ｆｃ受容体(マウスにおいてＦｃγＲIIIおよびヒトにおいてＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関してマウスＩｇＧ２ａと等価であると考えられる。
【０１８３】
【表１】
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【０１８４】
“Ｆｃ領域”(フラグメント結晶性領域)または“Ｆｃドメイン”または“Ｆｃ”は、宿主組織または免疫系の各種の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む因子への免疫グロブリンの結合に介在する抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)以外の抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２個の重鎖の第二(ＣＨ２)および第三(ＣＨ３)定常ドメインに由来する２個の同一タンパク質フラグメントを含み、ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３個の重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧに関して、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３およびＣγ１とＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリンのＦｃ領域重鎖の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃ２２６またはＰ２３０(またはこれらの２アミノ酸間のアミノ酸)の位置のアミノ酸残基から、重鎖のカルボキシ末端までのストレッチを規定し、ここで、ナンバリングは、KabatにおけるＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、ほぼアミノ酸２３１〜ほぼアミノ酸３４０まで伸び、一方ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧのほぼアミノ酸３４１からほぼアミノ酸４４７まで伸びる。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントを含む天然配列ＦｃまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)であり得る。Ｆｃはまた単離体におけるこの領域もいうことができ、または“Ｆｃ領域を含む結合タンパク質”などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドの文脈では、“Ｆｃ融合タンパク質”(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)ともいう。
【０１８５】
“天然配列Ｆｃ領域”または“天然配列Ｆｃ”は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの各種のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
【０１８６】
“ヒンジ”、“ヒンジドメイン”または“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに繋ぐ重鎖定常領域のドメインをいい、ヒンジの上部、中央部および下部の各部分を含む(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域の間に各種のレベルの柔軟性を提供し、また２重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合の部位も提供する。ここで使用するヒンジは、全ＩｇＧアイソタイプに関してＧｌｕ２１６で始まり、Ｇｌｙ２３７で終わる(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083)。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列を表２および９に示す。
【０１８７】
【表２】
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＊  ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸配列。
【０１８８】
用語“ヒンジ”は、野生型ヒンジ(例えば表１５に示すもの)、ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾ヒンジ)を含む。例えば、用語“ＩｇＧ２ヒンジ”は、表１５に示す野生型ＩｇＧ２ヒンジおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、１、２、３または全４システイン(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)が他のアミノ酸に変えられるＩｇＧ２ヒンジを含む。特異的実施態様において、ＩｇＧ２はＣ２１９Ｓ置換を含む。ある実施態様において、ヒンジは、少なくとも２個のアイソタイプからの配列を含む、ハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、あるアイソタイプからの上部、中央部または下部ヒンジおよび１以上の他のアイソタイプからのヒンジの残部を含み得る。例えば、ヒンジはＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中央部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを含み得る。ヒンジはエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が除去されていてもよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジは、エフェクター機能を提供する。
【０１８９】
用語“ＣＨ１ドメイン”は、可変ドメインを重鎖定常ドメインにおけるヒンジに結合する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ１ドメインはＡ１１８から始まり、Ｖ２１５で終わる。用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメイン(例えばＩｇＧ１については配列番号２７８およびＩｇＧ２については配列番号２７９を有する；表１５)、ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメインまたは修飾ＣＨ１ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメインおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ１ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などの抗体の生物活性を修飾する変異を伴うＣＨ１ドメインを含む。抗体の生物活性に影響するＣＨ１ドメインへの修飾は、ここに提供される。
【０１９０】
用語“ＣＨ２ドメイン”は、ヒンジを重鎖定常ドメインにおけるＣＨ３ドメインに結合させる重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ２ドメインはＰ２３８から始まり、Ｋ３４０で終わる。用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメイン(例えばＩｇＧ１については配列番号２８０およびＩｇＧ２については配列番号２９７を有する；表１５)、ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメインまたは修飾ＣＨ２ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメインおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ２ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などの抗体の生物活性を修飾する変異を有するＣＨ２ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減させる置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。抗体の生物活性に影響するＣＨ２ドメインへの他の修飾は、ここに提供される。
【０１９１】
用語“ＣＨ３ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおけるＣＨ２ドメインに対するＣ末端である重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ３ドメインはＧ３４１から始まり、Ｋ４４７で終わる。用語“ＣＨ３ドメイン”は、野生型ＣＨ３ドメイン(例えばＩｇＧ１については配列番号２８２およびＩｇＧ２については配列番号２９８を有する；表１５)、ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメインまたは修飾ＣＨ３ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ３ドメイン”は、野生型ＣＨ３ドメインおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ３ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などの抗体の生物活性を修飾する変異を有するＣＨ３ドメインを含む。抗体の生物活性に影響するＣＨ３ドメインへの修飾は、ここに提供される。
【０１９２】
“天然配列Ｆｃ領域”または“天然配列Ｆｃ”は、天然で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列をいう。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの各種のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
【０１９３】
用語“エピトープ”または“抗原性決定基”は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、ＧＩＴＲ)の部位をいう。エピトープは、連続アミノ酸(通常直線状エピトープ)またはタンパク質の三次元折りたたみにより並置される非連続アミノ酸(通常立体構造エピトープ)の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは一般に、しかし常にではないが、変性溶媒への暴露後保持され、一方三次元折りたたみにより形成されるエピトープは、一般に変性溶媒での処理により喪失される。エピトープは、一般に、特有の空間的配置の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。どのエピトープがある抗体により結合されるかを決定する方法(すなわち、エピトープマッピング)は当分野で周知であり、例えば、(例えば、ＧＩＴＲ)からの重複または連続ペプチドを、ある抗体(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体)との反応性について試験する、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイを含む。エピトープの空間的配置を決定する方法は、当分野におけるおよびここに記載する技術、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳを含む(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。
【０１９４】
用語“エピトープマッピング”は、抗体−抗原認識のための分子決定基の同定の方法をいう。
【０１９５】
２以上の抗体に関する“同じエピトープに結合”なる用語は、これら抗体が、ある方法により決定して、アミノ酸残基の同じセグメントに結合することをいう。抗体がここに記載する抗体と“ＧＩＴＲ上の同じエピトープ”に結合するか否かを決定する技法は、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線解析および水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)などのエピトープマッピング方法を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異バリエーションへの結合のモニターを含み、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、しばしばエピトープ成分の指標と考えられる。さらに、エピトープマッピングのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用できる。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力を利用する。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合すると予測される。
【０１９６】
“標的に対する結合について他の抗体と競合する”抗体は、他方の抗体の標的への結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体をいう。２抗体が標的への結合について互いに競合するか否か、すなわち、一方の抗体が他方の抗体の標的への結合を阻害するか否かおよび阻害の程度は、既知競合実験を使用して決定し得る。ある実施態様において、抗体は、他方の抗体と競合し、標的への結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が“遮断抗体”(すなわち、標的とまずインキュベートされる冷抗体)であるかにより異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載のとおり実施され得る。競合抗体は、同じエピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープ(例えば、立体障害により証明される)に結合する。
【０１９７】
他の競合的結合アッセイは、固相直接的または間接的ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接的または間接的エンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983))、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)参照)、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)参照)、Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)参照)、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990))および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))を含む。
【０１９８】
ここで使用する用語“特異的結合”、“選択的結合”、“選択的に結合する”および“特異的に結合する”は、既定の抗原上のエピトープに結合する抗体をいう。一般に、抗体は、(ｉ)例えば、検体として既定の抗原、例えば、組み換えヒトＧＩＴＲおよびリガンドとして抗体を使用するＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００装置における表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)テクノロジーまたは抗体の抗原陽性細胞への結合のスキャッチャード解析により決定して、約１０−７Ｍ未満、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低い平衡解離定数(ＫＤ)で結合し、そして(ii)既定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合の親和性より少なくとも２倍大きい親和性で既定の抗原に結合する。従って、“ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する”抗体は、可溶性または細胞結合ヒトＧＩＴＲに、１０−７Ｍ以下、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体である。“カニクイザルＧＩＴＲと交差反応する”抗体は、カニクイザルＧＩＴＲと、１０−７Ｍ以下、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。ある実施態様において、非ヒト種からのＧＩＴＲと交差反応しない抗体は、標準結合アッセイでこれらのタンパク質に対する結合を本質的に検出できないことを示す。
【０１９９】
ここで使用する用語“ｋassoc”または“ｋａ”は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度をいうことを意図し、一方ここで使用する用語“ｋdis”または“ｋｄ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度をいうことを意図する。ここで使用する用語“ＫＤ”は、ｋｄ対ｋａ比(すなわち、ｋｄ／ｋａ)から得て、モル濃度(Ｍ)で表す解離定数をいうことを意図する。抗体のＫＤ値は、当分野で十分確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、好ましくはBiacore(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析の使用による。
【０２００】
ここで使用するＩｇＧ抗体に関する“高親和性”なる用語は、標的抗原に対する１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下およびさらにより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。しかしながら、“高親和性”結合は、他の抗体アイソタイプでは異なり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに関する“高親和性”結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
【０２０１】
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイの文脈における用語“ＥＣ５０”は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間である応答を誘発する抗体またはその抗原結合部分の濃度をいう。
【０２０２】
用語“固定化ＧＩＴＲに結合”は、例えば、細胞の表面に発現されるまたは固体支持体に結合された、ＧＩＴＲに結合するここに記載する抗体の能力をいう。
【０２０３】
ここで使用する用語“交差反応”は、異なる種からのＧＩＴＲに結合するここに記載する抗体の能力をいう。例えば、ヒトＧＩＴＲに結合するここに記載する抗体は、他の種のＧＩＴＲ(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)にも結合し得る。ここで使用する交差反応性は、結合アッセイ(例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ)における精製抗原との特異的反応性またはＧＩＴＲを生理学的に発現する細胞への結合またはその他の機能的相互作用の検出により測定し得る。交差反応性を決定する方法は、例えば、BiacoreTM 2000 SPR装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するBiacoreTM表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)解析またはフローサイトメトリー技法による、ここに記載する標準結合アッセイを含む。
【０２０４】
物体に適用する用語“天然に存在する”は、物体が天然で見出されるという事実を意味する。例えば、天然源から単離でき、研究室で人間により意図的に修飾されていない生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０２０５】
“ポリペプチド”は、少なくとも２個の連続的に結合したアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖の長さに上限はない。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの、しかし、これらに限定されない修飾を含み得る。“タンパク質”は、１以上のポリペプチドを含み得る。
【０２０６】
ここで使用する用語“核酸分子”は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
【０２０７】
また提供されるのは、配列番号１３〜１９１におけるような、ここに、例えば、表１５に示す配列の“保存的配列修飾”、すなわち、該ヌクレオチド配列によりコードされるまたは該アミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合を無効にしないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾である。このような保存的配列修飾は、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、ならびに、ヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失を含む。例えば、修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの当分野で知られる標準技術により、表１５における配列、例えば、配列番号１３〜１９１に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものを含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、抗ＧＩＴＲ抗体における予測非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置き換えられる。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。あるいは、他の実施態様において、例えば飽和変異誘発により抗ＧＩＴＲ抗体コード配列の全体または一部に無作為に変異を導入でき、得られた修飾抗ＧＩＴＲ抗体を、結合活性についてスクリーニングし得る。
【０２０８】
核酸について、用語“実質的相同性”は、２核酸またはその指定配列が、最適にアラインされ、比較されたとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダイズするとき存在する。
【０２０９】
ポリペプチドについて、用語“実質的相同性”は、２ポリペプチドまたはその指定配列が、最適にアラインされ、比較されたとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、アミノ酸の少なくとも約８０％、通常アミノ酸の少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。
【０２１０】
２配列間のパーセント同一性は、２配列の最適アラインメントのために導入が必要であるギャップ数および各ギャップ長を考慮に入れた、これらの配列が共有する同一位置の数の関数(すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００)である。配列の比較および２配列間のパーセント同一性の決定は、下に非限定的例を記載する数学的アルゴリズムを使用して、達成され得る。
【０２１１】
２ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)におけるＧＡＰプログラムを使用して、NWSgapdna.CMPマトリクスおよびギャップ加重４０、５０、６０、７０または８０および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性はまたＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定できる。さらに、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)におけるＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用して、決定できる。
【０２１２】
ここに記載する核酸およびタンパク質配列は、さらに“クエリ配列”として使用して、例えば、関連配列を同定するための公的データベースに対するサーチを実施できる。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２を使用して実施し、ここに記載する核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、ここに記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり、Gapped BLASTを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびGapped BLASTプログラムを利用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用できる。www.ncbi.nlm.nih.gov参照。
【０２１３】
核酸は、細胞全体、細胞ライセートまたは一部精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、染色体の他の部分)またはタンパク質から精製されたとき、“単離される”または“実質的に純粋にされる”。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
【０２１４】
核酸、例えば、ｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するための標準技術により、変異され得る。コード配列について、これらの変異は、所望によりアミノ酸配列に影響し得る。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよびここに記載する他のこのような配列と実質的に相同であるまたはこれに由来するＤＮＡ配列が企図される(ここで、“由来”は、配列が他の配列と同一であるかまたはそこから修飾されることを意味する)。
【０２１５】
ここで使用する用語“ベクター”は、結合されている他の核酸を輸送することができる核酸分子をいうことを意図する。ベクターの一タイプは“プラスミド”であり、これは、付加的ＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの他のタイプはウイルスベクターであり、ここで、付加的ＤＮＡセグメントはウイルスゲノムにライゲートされ得る。あるベクターは、導入される宿主細胞内で自律複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)を、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合させることができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、操作可能に結合する遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、ここでは“組み換え発現ベクター”(または単に“発現ベクター”)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形態であるため、相互交換可能に使用し得る。しかしながら、等価な機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの他の形態の発現ベクターも含む。
【０２１６】
ここで使用する用語“組み換え宿主細胞”(または単に“宿主細胞”)は、細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞をいい、おそらく、組み換え発現ベクターが導入されている細胞である。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことは理解されるべきである。変異または環境的影響により後代にある修飾が生じ得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、なおここで使用する用語“宿主細胞”の範囲内に包含される。
【０２１７】
ここで使用する用語“抗原”は、タンパク質、ペプチドまたはハプテンなどのあらゆる天然または合成免疫原性物質をいう。抗原は、ＧＩＴＲまたはそのフラグメントであり得る。抗原はまた、予防的または治療的免疫応答が望まれる腫瘍抗原、例えば、腫瘍細胞により発現される抗原であってもよい(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせたワクチンにおいて)。抗原は、癌の予防または処置のための腫瘍関連抗原を含む。腫瘍関連抗原の例は、βｈＣＧ、ｇｐ１００またはＰｍｅｌ１７、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、メソテリン、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ−２、メランＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＭＮ(ｇｐ２５０)、イディオタイプ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ａ３、チロシナーゼ、テロメラーゼ、ＳＳＸ２およびＭＵＣ−１抗原および生殖細胞由来腫瘍抗原の配列の全てまたは一部を含む配列を含むが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原はまた血液型抗原、例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、ＬｅＸ、ＬｅＹ、Ｈ−２、Ｂ−１、Ｂ−２抗原も含む。あるいは、１を超える抗原が構築物に包含され得る。例えば、ＭＡＧＥ抗原を、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２などのアジュバントと共にメランＡ、チロシナーゼおよびｇｐ１００などの他の抗原と組み合わせて、抗ＡＰＣ抗体に結合させることができる。
【０２１８】
前記抗原の配列は当分野で周知である。例えば、ＭＡＧＥ−３  ｃＤＮＡ配列の例は、ＵＳ６,２３５,５２５号(Ludwig Institute for Cancer Research)において提供され、ＮＹ−ＥＳＯ−１核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ５,８０４,３８１号およびＵＳ６,０６９,２３３号(Ludwig Institute for Cancer Research)において提供され、メランＡ核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ５,６２０,８８６号およびＵＳ５,８５４,２０３号(Ludwig Institute for Cancer Research)において提供され、ＮＹ−ＢＲ−１核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ６,７７４,２２６号およびＵＳ６,９１１,５２９号(Ludwig Institute for Cancer Research)において提供され、ＮＹ−ＣＯ−５８核酸およびタンパク質配列の例は、ＷＯ０２０９０９８６号(Ludwig Institute for Cancer Research)、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列は、GENBANK(登録商標) Accession No. AAA58637で入手可能であり、そしてヒト癌胎児性抗原様１(ＣＥＡ−１)のヌクレオチド配列(ｍＲＮＡ)は、GENBANK(登録商標) Accession No. NM020219で入手可能である。
【０２１９】
“免疫応答”は、外来因子に対する脊椎動物内の生物学的応答であり、この応答は、生物をこれらの因子およびこれらが原因の疾患から保護する。免疫応答は、脊椎動物体内の侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌または他の異常細胞、または、自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および／または排除をもたらす、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞の何れかまたは肝臓により産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用が介在する。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞の活性化または阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。
【０２２０】
“免疫調節因子”または“イムノレギュレーター”は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る因子、例えば、シグナル伝達経路の成分をいう。免疫応答の“調節”、“制御”または“修飾”は、免疫系の細胞またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性の何らかの改変をいう。このような調節は、各種の細胞型の数の増減、これらの細胞の活性の増減または免疫系内で生じ得るあらゆる他の変化により顕在化し得る免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両方の免疫調節因子が同定されており、そのいくつかは腫瘍微小環境で増強された機能を有し得る。好ましい実施態様において、免疫調節因子はＴ細胞の表面に存在する。“免疫調節性標的”または“免疫制御性標的”は、物質、薬剤、部分、化合物または分子の結合のために標的化され、その活性がこれらの結合により変わる、免疫調節因子である。免疫調節性標的は、例えば、細胞表面の受容体(“免疫調節性受容体”)および受容体リガンド(“免疫調節性リガンド”)を含む。
【０２２１】
“免疫療法”は、免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による、疾患を有するまたは罹患するもしくは再発するリスクのある対象の処置をいう。
【０２２２】
“免疫刺激性治療”または“免疫刺激治療”は、例えば、癌処置のために、対象の免疫応答の増加(誘発または増強)をもたらす治療をいう。
【０２２３】
“内因性免疫応答増強”は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。有効性および効力のこの増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構の克服または内因性宿主免疫応答を増強する機構の刺激により達成され得る。
【０２２４】
“Ｔエフェクター”(“Ｔｅｆｆ”)細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞)ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指示するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞をいうが、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)は含まない。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞を活性化させる。
【０２２５】
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激性受容体アゴニスト活性増強および／または阻害性受容体のアンタゴニスト活性増強に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性(標的細胞で直接的またはＣＤ１０７ａまたはグランザイムの検出を介して間接的に決定)および増殖の変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ５０または活性の最大レベルの増加倍率により反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上増強され得る。
【０２２６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体と比較して、より強力なアゴニスト活性を有する。抗体のアゴニスト活性増強は、例えば、実施例に示すとおり、例えば、抗体と接触しているＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２のレベルの測定により、決定され得る。アゴニスト活性は、エフェクターＴ細胞におけるサイトカイン放出増加または増殖増加により、Ｔｒｅｇへの結合がＴｒｅｇ機能を低減させるならばＴ制御性細胞活性低減によりまたはＴｒｅｇの減少増加により規定して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上増加され得る。例えば、修飾重鎖定常領域を含む抗体で刺激されたＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体で刺激されたＴ細胞のものより少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上高い可能性がある。
【０２２７】
ここで使用する用語“結合”は、２以上の分子の結合をいう。結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。結合はまた遺伝的(すなわち、組み換え的に融合)でもあり得る。このような結合は、化学コンジュゲーションおよび組み換えタンパク質産生などの多種多様な当分野で認識される技術を使用して達成され得る。
【０２２８】
ここで使用する“投与する”は、当業者に知られる各種の方法および送達システムの何れかを使用する、治療剤を含む組成物の対象への物理的導入をいう。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方式をいい、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路などの非経腸ではない経路により、例えば、鼻腔内、経口、経膣、経直腸、舌下または局所に投与できる。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１以上の長期にわたり実施し得る。
【０２２９】
ここで使用する用語“Ｔ細胞介在応答”は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含む、Ｔ細胞が介在する応答をいう。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞毒性および増殖を含む。
【０２３０】
ここで使用する用語“細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答”は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞により介在される。
【０２３１】
ここで使用する用語“阻害”または“遮断”(例えば、ＧＩＴＲ−Ｌの細胞上のＧＩＴＲへの結合の阻害／遮断参照)は相互交換可能に使用し、部分的なおよび完全な阻害／遮断の両方を含む。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合は、例えば、さらにここに記載するとおり決定して、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害される。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を、例えば、さらにここに記載するとおり決定して、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％阻害する。
【０２３２】
ここで使用する腫瘍の“増殖阻害”なる用語は、腫瘍の増殖の何らかの測定可能な減少、例えば、腫瘍の増殖の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％または１００％の阻害をいう。
【０２３３】
ここで使用する“癌”は、体内の異常細胞の無制御の増殖により特徴付けられる広い疾患群をいう。無制御の細胞分裂は、隣接組織に侵入し、リンパ系または血流を介して体の遠位部位に転移し得る、悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
【０２３４】
ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、疾患に付随する症状、合併症、状態または生化学的兆候の進行、進展、重症度または再発の回復、軽減、改善、阻止または遅延または予防を目的として、対象に行うあらゆるタイプの介入または過程または活性剤の投与をいう。処置は、疾患を有する対象または疾患を有していない対象(例えば、予防のため)にであり得る。
【０２３５】
“造血器腫瘍”は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍、ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。リンパ腫の例は、Ｂ細胞リンパ腫(Ｂ細胞血液癌)およびＴ細胞リンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および大部分の非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的例は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫(慢性リンパ性白血病と重複)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的例は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液系腫瘍はまた、二次性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病を含むが、これらに限定されない白血病を含む。血液系腫瘍は、さらに、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない骨髄腫を含む。他の血液学的および／またはＢ細胞またはＴ細胞関連癌は、用語造血器腫瘍に包含される。
【０２３６】
用語“有効用量”または“有効投与量”は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義する。薬物または治療剤の“治療有効量”または“治療有効投与量”は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防により証明される、疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の治療有効量または投与量は、“予防有効量”または“予防有効投与量”も含み、これは、疾患を発症するまたは疾患が再発するリスクのある対象に、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻止する薬物の任意の量である。治療剤が疾患退縮を促進するまたは疾患の発症または再発を阻止する能力は、臨床試験中ヒト対象において、ヒトにおける効果の予測である動物モデル系においてまたはインビトロアッセイにおける薬剤の活性のアッセイによるような、熟練した実務者に知られる多様な方法を使用して評価できる。
【０２３７】
例として、抗癌剤は、対象における癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施態様において、治療有効量の薬物は、癌を排除する点まで、癌退縮を促進する。“癌退縮促進”は、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせた、有効量の薬物の投与が、腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍壊死、少なくとも一つの疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防または患者における疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。さらに、処置に関する“効果的”および“有効性”なる用語は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、薬物が患者における癌退縮を促進する能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与にに起因する、細胞、臓器および／または生物レベル(有害作用)での毒性または他の有害生理作用のレベルをいう。
【０２３８】
腫瘍処置に関する例として、薬物の治療有効量または投与量は、好ましくは未処置対象と比較して、細胞増殖または腫瘍増殖を、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施態様において、薬物の治療有効量または投与量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを使用して評価できる。あるいは、組成物のこの性質は、化合物が細胞増殖を阻害する能力の試験により評価でき、このような阻害は、インビトロで熟練した実施者に知られるアッセイにより測定できる。ここに記載する他の好ましい実施態様において、腫瘍退縮は、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日またはさらにより好ましくは少なくとも約６０日の期間観察され、継続し得る。
【０２３９】
用語“患者”は、予防的または治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【０２４０】
ここで使用する用語“対象”は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに記載する方法および組成物を、癌を有する対象の処置に使用できる。用語“非ヒト動物”は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【０２４１】
ここで使用する用語“ug”および“uM”は、“μg”および“μM”と相互交換可能に使用する。
【０２４２】
ここに記載する各種の態様を次のサブセクションでさらに詳述する。
【０２４３】
Ｉ. 抗ＧＩＴＲ抗体
ここに記載するのは、特定の機能的特性または性質により特徴付けられる抗体、例えば、完全ヒト抗体である。例えば、抗体は、ヒトＧＩＴＲと特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルＧＩＴＲなどの１以上の非ヒト霊長類からのＧＩＴＲと交差反応し得る。
【０２４４】
可溶性および／または膜結合ヒトＧＩＴＲに特異的に結合することに加えて、ここに記載する抗体は、次の機能的性質の１以上を示す。
(ａ)カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(ｂ)免疫応答を刺激または増強；
(ｃ)Ｔ細胞活性化(例えば、サイトカイン分泌および／または増殖の増強により証明される)；
(ｄ)３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞のＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬの結合阻害；
(ｅ)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(ｆ)ヒトＧＩＴＲのＮ末端部分における立体構造エピトープへの結合；
(ｇ)グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲへの結合；および
(ｈ)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強。
【０２４５】
好ましくは、抗ＧＩＴＲ抗体は、高親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−９Ｍ〜１０−７ＭのＫＤでＧＩＴＲと結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、可溶性ヒトＧＩＴＲに、例えば、Biacoreにより決定して、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、活性化ヒトＴ細胞上などの、結合(例えば、細胞膜結合)ヒトＧＩＴＲに、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットにより決定して、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤで結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、活性化ヒトＴ細胞上などの、結合(例えば、細胞膜結合)ヒトＧＩＴＲに、例えば、ＦＡＣＳにより決定して、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、可溶性ヒトＧＩＴＲに、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤでおよび細胞膜結合ヒトＧＩＴＲに１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤまたはＥＣ５０で結合する。
【０２４６】
抗ＧＩＴＲ抗体はカニクイザルＧＩＴＲ、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに、例えば、ＦＡＣＳにより測定して(例えば、実施例に記載のとおり)、例えば、１００nM以下、１０nM以下、１００nM〜０.０１nM、１００nM〜０.１nM、１００nM〜１nMまたは１０nM〜１nMのＥＣ５０で結合できる。
【０２４７】
抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、腫瘍における、例えば、Ｔｅｆｆ細胞の活性化、Ｔｒｅｇ細胞によるＴエフェクター細胞の抑制の限定、腫瘍Ｔｒｅｇ細胞枯渇および／または阻害および／またはＮＫ細胞活性化により、免疫応答を刺激または増強し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、サイトカイン(例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)分泌増強および／または増殖増強により証明されるとおり、Ｔｅｆｆ細胞を活性化または共刺激し得る。ある実施態様において、ＣＤ３刺激も提供される。ある実施態様において、ＧＩＴＲ抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞またはヒトＧＩＴＲを発現するＴ細胞で測定して、５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍以上の倍率で、場合により最大１０倍、３０倍、１００倍までＩＬ−２分泌を増加させる(例えば、実施例においてさらに記載するとおり)。ある実施態様において、ＧＩＴＲ抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞またはヒトＧＩＴＲを発現するＴ細胞で測定して、５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍以上の倍率で、場合により最大１０倍、３０倍、１００倍までＩＦＮ−γ分泌を増加させる(例えば、実施例においてさらに記載するとおり)。
【０２４８】
抗ＧＩＴＲ抗体は、細胞、例えば、ヒトＧＩＴＲを発現する３Ａ９細胞上のヒトＧＩＴＲへのヒトＧＩＴＲＬの結合を、例えば、１０μg／ml以下、１μg／ml以下、０.０１μg／ml〜１０μg／ml、０.１μg／ml〜１０μg／mlまたは０.１μg／ml〜１μg／mlのＥＣ５０で阻害する(実施例５参照)。
【０２４９】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のヒトＧＩＴＲへのヒトＧＩＴＲＬの結合を、最大で部分的にしか阻害しない(実施例５参照)。
【０２５０】
抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、抗体のヒトＧＩＴＲのフラグメント、例えば、ヒトＧＩＴＲの天然(すなわち、非変性)フラグメントへの結合により決定して、エピトープ、例えば、ヒトＧＩＴＲのＮ末端部分における立体構造エピトープ、例えば、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸１〜３９内に位置するエピトープ(実施例９参照)に結合し得る。抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、抗体のヒトＧＩＴＲのフラグメント、例えば、ヒトＧＩＴＲの天然(すなわち、非変性)フラグメントへの結合、続く酵素開裂またはＨＤＸにより決定して、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸１〜２０またはその中に位置するエピトープに結合し得る(それぞれ実施例１１および１２参照)。抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸３〜２０(PTGGPGCGPGRLLLGTGT、配列番号２１７)またはその中のエピトープと結合し得る。抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸３〜２０およびアミノ酸３３〜４０、すなわち、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)またはその中のエピトープと結合し得る。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲと結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、実施例に示すプロトコールを使用する、ＨＤＸにより決定して、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)と結合する。
【０２５１】
抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載するＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のＧＩＴＲへの結合と競合(または結合を阻害)し得る。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のヒトＧＩＴＲへの結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施態様において、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０は、抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲへの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のヒトＧＩＴＲへの結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０は、抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲへの結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する(例えば、双方向に競合)。
【０２５２】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、ＦｃＲ結合の必要がないことにより決定して、多価架橋を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は多価、例えば、二価である。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は一価ではない。Ｆ’(ａｂ)２フラグメントがＴ細胞活性化にＦａｂフラグメントより効果的であることがここに示されている(実施例参照)。
【０２５３】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、アゴニスト活性のためにＦｃ受容体を経て架橋する必要はないが、しかしながら、Ｆｃ受容体への架橋は、Ｆｃ受容体に結合しない同じ抗体と比較して、アゴニスト活性を増強する。
【０２５４】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、次の特性の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２を有する。
(１)例えば、Biacoreにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)Ｔ細胞増殖増強により証明される、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度の存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化誘発または増強；
(６)多価架橋を必要としないＴ細胞活性化の誘発または増強；
(７)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；
(８)例えば、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を用いるアッセイにおいて、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害；
(９)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(１０)成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合；
(１１)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；および
(１２)ヒトＧＩＴＲへの結合について２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０と何れかの方向または双方向で競合。
【０２５５】
抗ＧＩＴＲ抗体はまた、例えば、１０分、３０分または６０分以内にＧＩＴＲの活性化Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への内部移行とその後のシグナル伝達、例えば、ｐ６５  ＮＦ−ｋＢおよびｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化(すなわち、リン酸化)を誘発し得る。
【０２５６】
従って、当分野で知られ、ここに記載する方法により決定したこれらの機能的性質(例えば、生化学的活性、免疫化学的活性、細胞活性、生理学的活性または他の生物学的活性など)の１以上を示す抗体は、該抗体非存在下(例えばまたは無関係な特異性を有する対照抗体が存在するとき)に見られるものと比較して、特定の活性の統計的に有意な差に関連すると理解される。好ましくは、測定パラメータ(例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)の抗ＧＩＴＲ抗体誘発増加は、測定パラメータの少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍の統計的に有意な増加を起こし、ある好ましい実施態様において、ここに記載する抗体は、測定パラメータを、９２％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍を超えて増加させ得る。逆に、測定パラメータ(例えば、腫瘍体積、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲ−Ｌ結合、腫瘍における制御性Ｔ細胞の量)の抗ＧＩＴＲ抗体誘発減少は、測定パラメータの少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の統計的に有意な減少であり、ある好ましい実施態様において、ここに記載する抗体は、測定パラメータを９２％、９４％、９５％、９７％、９８％または９９％を超えて減少させ得る。
【０２５７】
様々な種のＧＩＴＲに対する抗体の結合能を評価するための標準アッセイは当分野で知られ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適当なアッセイは、実施例に詳述する。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)も、Biacore解析などの当分野で知られる標準アッセイにより評価できる。ＧＩＴＲの機能的性質(例えば、リガンド結合、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)に対する抗体の効果を評価するアッセイは、下におよび実施例にさらに詳述する。
【０２５８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は天然抗体ではないまたは天然に存在する抗体ではない。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、翻訳後修飾が多い、少ないまたは異なるなどにより、天然に存在する抗体と異なる翻訳後修飾を有する。
【０２５９】
II. 抗ＧＩＴＲ抗体の例
特定のここに記載する抗体は、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有し、実施例１に記載のとおり単離および構造的特徴付けされた抗体、例えば、モノクローナル抗体ならびにその可変領域またはＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一性(例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一性)を有する抗体である。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６に示す。
【０２６０】
従って、ここに提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２６１】
また提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２６２】
ここに提供されるのは、
(ａ)それぞれ配列番号１３および１４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｂ)それぞれ配列番号２６および２７を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｃ)それぞれ配列番号３９および４０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｄ)それぞれ配列番号５２および５３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｅ)それぞれ配列番号５２および５４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｆ)それぞれ配列番号７１および７２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｇ)それぞれ配列番号８４および８５を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｈ)それぞれ配列番号９７および９８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｉ)それぞれ配列番号９７および９９を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｊ)それぞれ配列番号１１５および１１６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｋ)それぞれ配列番号１２８および１２９を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｌ)それぞれ配列番号１２８および１３０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；または
(ｍ)それぞれ配列番号３３５および３３６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分である。
【０２６３】
抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはこれらの組み合わせを含み得る。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７に示す。ＣＤＲ領域は、Kabatシステムを使用して線引きされる(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。
【０２６４】
これらの抗体の各々がＧＩＴＲに結合し、この抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考慮して、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を“上手く組み合わせ”(すなわち、異なる抗体からのＣＤＲを混ぜて、適合させることができるが、各抗体はＶＨ  ＣＤＲ１、２および３およびＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含まなければならない)、ここに記載する他の抗ＧＩＴＲ結合分子を作製し得る。このように“上手く組み合わせた”抗体のＧＩＴＲ結合を、上記および実施例に記載する結合アッセイを使用して試験できる(例えば、ＥＬＩＳＡ)。好ましくは、ＶＨ  ＣＤＲ配列が上手く組み合わされたとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が上手く組み合わされたとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、好ましくは構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１以上のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０についてここに記載するＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列で置き換えることにより製造できることは、当業者には明らかである。
【０２６５】
ここに提供されるのは、
(ａ)配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
【０２６６】
ある実施態様において、抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
(ａ)配列番号２０〜２２；
(ｂ)配列番号３３〜３５；
(ｃ)配列番号４６〜４８；
(ｄ)配列番号６２〜６４；
(ｅ)配列番号７８〜８０；
(ｆ)配列番号９１〜９３；
(ｇ)配列番号１０６〜１０８；
(ｈ)配列番号１２２〜１２４；
(ｉ)配列番号１３８〜１４０；または
(ｊ)配列番号３４２〜３４４
を含み、ここで、該抗体はヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
【０２６７】
他の実施態様において、抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
(ａ)配列番号２３〜２５；
(ｂ)配列番号３６〜３８；
(ｃ)配列番号４９〜５１；
(ｄ)配列番号６５〜６７；
(ｅ)配列番号６８〜７０；
(ｆ)配列番号８１〜８３；
(ｆ)配列番号９４〜９６；
(ｇ)配列番号１０９〜１１１；
(ｈ)配列番号１１２〜１１４；
(ｉ)配列番号１２５〜１２７；
(ｊ)配列番号１４１〜１４３；
(ｋ)配列番号１４４〜１４６；または
(ｌ)配列番号３４５〜３４７
を含み、ここで、該抗体はヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
【０２６８】
特定の実施態様において、抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２０〜２２を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２３〜２５を含むか；
(ｂ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３３〜３５を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３６〜３８を含むか；
(ｃ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４６〜４８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９〜５１を含むか；
(ｄ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６２〜６４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６５〜６７を含むか；
(ｅ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６２〜６４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６８〜７０を含むか；
(ｆ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７８〜８０を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８１〜８３を含むか；
(ｇ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９１〜９３を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９４〜９６を含むか；
(ｈ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０６〜１０８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０９〜１１１を含むか；
(ｉ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０６〜１０８を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１１２〜１１４を含むか；
(ｊ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１２２〜１２４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１２５〜１２７を含むか；
(ｋ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３８〜１４０を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１４１〜１４３を含むか；
(ｌ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３８〜１４０を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１４４〜１４６を含むか；または
(ｍ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４２〜３４４を含み、そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４５〜３４７を含み、
ここで、該抗体はヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
【０２６９】
ここに記載するＶＨドメインまたはその１以上のＣＤＲは、重鎖、例えば、完全長重鎖形成のために定常ドメインと結合し得る。同様に、ここに記載するＶＬドメインまたはその１以上のＣＤＲは、軽鎖、例えば、完全長軽鎖形成のために定常ドメインと結合し得る。完全長重鎖(無くてもよいＣ末端リシン(Ｋ)以外またはＣ末端グリシンおよびリシン(ＧＫ)以外)および完全長軽鎖を合わせて、完全長抗体を形成する。
【０２７０】
ここに記載するＶＨドメインは、例えば、ここにさらに記載するとおり、天然に存在するかまたは修飾体である、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインに融合させ得る。例えば、ＶＨドメインは、次のヒトＩｇＧ１アミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る：
ASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 
LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE 
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP 
SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG(配列番号７)
【０２７１】
ヒトＩｇＧ１定常ドメインはまたアロタイプバリアントのものであり得る。例えば、ＩｇＧ１のアロタイプバリアントはＲ１０７Ｋ、Ｅ１８９ＤおよびＭ１９１Ｌ(上で下線し、配列番号７に従いナンバリング)を含む。完全長重鎖領域内で、これらのアミノ酸置換はＲ２１４Ｋ、Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌと番号付けされる。
【０２７２】
ここに記載するＶＬドメインを、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインに融合させ得る。例えば、ＶＬドメインは、次のヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列に融合したここに記載するＶＬドメインのアミノ酸配列を含み得る：
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC(配列番号１２)
【０２７３】
ある実施態様において、重鎖定常領域はＣ末端にリシンまたは他のアミノ酸を含み、例えば、重鎖について次の最後のアミノ酸ＬＳＰＧＫ(配列番号２２０)を含む。ある実施態様において、重鎖定常領域はＣ末端で１以上のアミノ酸を欠き、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ(配列番号２７６)またはＬＳＰを有する。
【０２７４】
重鎖および軽鎖の例のアミノ酸配列を表１５に示し、重鎖について配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２に対応し、軽鎖について配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１に対応する。
【０２７５】
表１５に示す重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)の何れか、例えば、配列番号１３〜１９、２６〜３２、４０〜４５、５２〜６１、７１〜７７、８４〜９０、９７〜１０５、１１６〜１２１、１２８〜１３７、２２７〜２７５、３３７〜３４１、３４８〜３５２、３６１、３６２および３７１と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を、所望の特徴、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体の形成に使用し得る。バリアントの例は、例えば、定常ドメインに、アロタイプ変異および／または可変または定常領域に変異、例えば、ここに開示する変異を含むものである。表１５に示す重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)の何れかと最大１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸(置換、付加または欠失により)異なるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を、所望の特徴、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体の形成に使用し得る。
【０２７６】
各種の実施態様において、上記抗体は、次の機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１または全てを示す。
(１)例えば、Biacoreにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)Ｔ細胞増殖増強により証明される、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度の存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化の誘発または増強；
(６)多価架橋を必要としないＴ細胞活性化の誘発または増強；
(７)ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(８)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(９)成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合；
(１０)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；
(１１)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；および
(１２)ヒトＧＩＴＲへの結合について２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０と何れかの方向  または双方向で競合。
【０２７７】
このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。
【０２７８】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、グリコシル化(例えば、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化)および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合する。
【０２７９】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、立体構造エピトープに結合する。
【０２８０】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１、２または３(配列番号４)のアミノ酸残基１〜３９に対応する成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の次の領域
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号２１５)
内のアミノ酸残基に結合する。
【０２８１】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１、２または３(配列番号４)のアミノ酸残基１〜２０に対応する成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の次の領域
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１６)
内のアミノ酸残基に結合する。
【０２８２】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の次の領域
PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)
内のアミノ酸残基と結合する。
【０２８３】
修飾重鎖定常ドメイン
ここでさらに記載するとおり、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４またはこれらの組み合わせおよび／またはその修飾体であり得る。抗ＧＩＴＲ抗体はエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が低減していても失われていてもよい。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、抗体に増強された性質を提供する修飾重鎖定常領域を含む。実施例に示すとおり、ＩｇＧ２ヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体は、非ＩｇＧ２ヒンジを有する以外同じ可変領域を有する抗体と比較して、より強力なアゴニストである。例えば、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、エフェクター機能を有するかまたは有しない抗体は、抗体とインキュベートしたＴ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌増強により測定して、増強されたアゴニスト活性を有する。特異的作用機序に限定されることを望まないが、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＧＩＴＲ抗体は、より大きな抗体／抗原複合体を形成し、より効果的に内部移行し、それによりアゴニスト活性が増加されると仮説立てられる。大複合体の形成は、他のアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４)のヒンジと比較して、ＩｇＧ２ヒンジの高い剛性に起因すると考えられる。実施例においてさらに記載するとおり、アゴニスト活性増強は、抗体の高いまたは低い親和性と相関するように見えない。従って、ここで提供されるのは、修飾重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体であり、ここで、抗ＧＩＴＲ抗体は増強されたアゴニスト活性を有し、修飾重鎖定常領域を有する抗体の親和性は、重鎖定常領域が異なる以外、同じ可変領域を有するのと同程度の親和性でＧＩＴＲに結合する。
【０２８４】
従って、またここに提供されるのは、非ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＧＩＴＲ抗体を提供し、非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジに置き換えることを含む、抗ＧＩＴＲ抗体のアゴニスト活性を増強する方法である。このような修飾により利益を受け得る抗体は、当分野で知られるもの、例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１号に記載の、例えば、抗体６Ｃ８または６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体、ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＪＰ２００８２７８８１４号、ＫＲ２００８０１０５６７４号、ＵＳ２００４００７２５６６号、ＵＳ２００１４７２５６５号、ＵＳ２０１４００６５１５２号またはＷＯ２０１５／０３１６６７号に記載の抗体などのあらゆる抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
【０２８５】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ(“ＩｇＧ２ヒンジ”)およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域はＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも１つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ＩｇＧ２ヒンジは、ＩｇＧ２ヒンジが、非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ抗体と比較して、抗体の活性を増強させる能力を保持する限り、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ(例えば、ERKCCVECPPCPAPPVAG；配列番号２９１)またはそのバリアントであり得る。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジバリアントは、野生型ＩｇＧ２ヒンジと同程度の硬直性または剛性を維持する。ヒンジの硬直性は、例えば、該ヒンジを含む抗体の回転半径を測定または比較するコンピューターモデリング、電子顕微鏡法、核磁気共鳴(ＮＭＲ)などのスペクトロスコピー、Ｘ線結晶学(温度因子)または沈降速度分析超遠心分離(ＡＵＣ)により決定できる。ヒンジは、ヒンジを含む抗体で前の文に記載した試験の何れか一つにより得られた値が、異なるヒンジ、例えば、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体からの値と、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％未満異なるならば、他のヒンジと同程度のまたはそれより高い硬直性を有し得る。当業者は、これらの試験の結果の解釈により、あるヒンジが他のヒンジと少なくとも同程度の硬直性を有するか否かを決定できる。ヒトＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、４システイン残基(すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)の１以上の他のアミノ酸への置換を含む、ＩｇＧ２ヒンジである。システインはセリンに置き換えられ得る。ＩｇＧ２ヒンジの例は、Ｃ２１９Ｘ変異またはＣ２２０Ｘ変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジであり、ここで、Ｘはセリン以外の任意のアミノ酸である。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジはＣ２１９ＸおよびＣ２２０Ｘ置換の両方を含まない。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジはＣ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを含むが、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両方は含まない(例えば、ERKSCVECPPCPAPPVAG；配列番号２９２)。使用し得る他のＩｇＧ２ヒンジバリアントは、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異(これはＣ２１９Ｓ変異と組み合わせてよい)を含むヒトＩｇＧ２ヒンジを含む。ＩｇＧ２ヒンジはまたヒンジの一部が他のアイソタイプであるＩｇＧ２ヒンジ(すなわち、キメラまたはハイブリッドヒンジである)であってよいが、ただし、キメラヒンジの硬直性は、野生型ＩｇＧ２ヒンジと少なくとも同程度でなければならない。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ(表２に定義)がＩｇＧ１アイソタイプのものであり、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジである、ＩｇＧ２ヒンジであり得る。ＩｇＧ２ヒンジにおいて使用し得る付加的ＩｇＧ２ヒンジ変異は、ＳＥ(Ｓ２６７Ｅ)、ＳＥＬＦ(Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ)、ＳＤＩＥ(Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ)、ＳＥＦＦおよびＧＡＳＤＡＬＩＥ(Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)変異を含む。
【０２８６】
“ハイブリッド”または“キメラ”ヒンジは、ヒンジの連続的アミノ酸の半分超が特定のアイソタイプ由来ならば、そのアイソタイプのものと称する。例えば、ＩｇＧ２の上部および中央部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ハイブリッドヒンジと見なす。
【０２８７】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、次の配列
ERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号４４７)；
ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号４４８)；
ERKCSVECPPCPAPPVAG(配列番号４４９)；
ERKXCVECPPCPAPPVAG(配列番号４５０)；
ERKCXVECPPCPAPPVAG(配列番号４５１)；
ERKCCVECPPCPAPPVAGX(配列番号４５２)；
ERKSCVECPPCPAPPVAGX(配列番号４５３)；
ERKCSVECPPCPAPPVAGX(配列番号４５４)；
ERKXCVECPPCPAPPVAGX(配列番号４５５)；
ERKCXVECPPCPAPPVAGX(配列番号４５６)；
ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号４５７)；
ERKSCVECPPCPAPELLGG(配列番号４５８)；
ERKCCSVECPPCPAPELLGG(配列番号４５９)；
ERKXCVECPPCPAPELLGG(配列番号４６０)；
ERKCXVECPPCPAPELLGG(配列番号４６１)；
ERKCCVECPPCPAPELLG(配列番号４６２)；
ERKSCVECPPCPAPELLG(配列番号４６３)；
ERKCCSVECPPCPAPELLG(配列番号４６４)；
ERKXCVECPPCPAPELLG(配列番号４６５)；
ERKCXVECPPCPAPELLG(配列番号４６６)；
ERKCCVECPPCPAP(配列番号４６７)；
ERKSCVECPPCPAP(配列番号４６８)；
ERKCSVECPPCPAP(配列番号４６９)；
ERKXCVECPPCPAP(配列番号４７０)；または
ERKCXVECPPCPAP(配列番号４７１)
〔ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である〕
または、アミノ酸残基ＣＶＥとＣＰＰの間に１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸が挿入されている上記配列の何れかの一つを含むＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、ＴＨＴまたはＧＧＧが挿入される。ある実施態様において、１、１〜２または１〜３アミノ酸がヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入される。例えば、グリシンがヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入され得る。
【０２８８】
ある実施態様において、ヒンジは配列番号４４７、４４８、４４９、４５０または４５１を含み、ここでアミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７(Ｃ末端４アミノ酸“ＰＶＡＧ”(配列番号４７２))の１個、２個、３個または全４個が欠失しているかまたは他のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１ヒンジのＣ末端のアミノ酸(ＥＬＬＧ(配列番号４７３)またはＥＬＬＧＧ(配列番号４７４))で置換されている。ある実施態様において、ヒンジは配列番号４４７、４４８、４４９、４５０または４５１を含み、ここでＶ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７は欠失しているかまたは他のアミノ酸で置換されている。ある実施態様において、ヒンジは配列番号４４７、４４８、４４９、４５０または４５１を含み、ここでＡ２３５およびＧ２３７は欠失しているかまたは他のアミノ酸で置換されている。ある実施態様において、ヒンジは配列番号４４７、４４８、４４９、４５０または４５１を含み、ここでＧ２３７は欠失しているかまたは他のアミノ酸で置換されている。ある実施態様において、ヒンジは配列番号４４７、４４８、４４９、４５０または４５１を含み、ここでＶ２３４およびＡ２３５は欠失しているかまたは他のアミノ酸で置換されている。例えば、上に示すハイブリッドヒンジを得るためのＩｇＧ２におけるＰＶＡＧ(配列番号４７２)のＩｇＧ１ヒンジの対応するアミノ酸、すなわち、(ＥＬＬＧ(配列番号４７３)またはＥＬＬＧＧ(配列番号４７４))での置換は、ＩｇＧ２ヒンジの利点およびＩｇＧ１ヒンジのエフェクター機能を有するヒンジを提供する。
【０２８９】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、上記配列の何れか、例えば、配列番号４４７〜４７１の何れかからなるまたはそれから本質的になるヒンジを含み、ある実施態様において、付加的ヒンジアミノ酸残基を含まない。
【０２９０】
ある実施態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域を含む修飾重鎖定常領域を含み、ここで、ヒンジは１〜１０アミノ酸の欠失を含む。実施例に示すとおり、アミノ酸残基ＳＣＤＫＴＨＴを欠くＩｇＧ１抗体(Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５；配列番号４７５)は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体より効率的に抗体介在ＣＤ７３内部移行をさせた。同様に、ＩｇＧ２抗体の場合、アミノ酸残基ＣＣＶＥを欠くＩｇＧ２抗体(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４；配列番号４７６)は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体より効率的に抗体介在ＣＤ７３内部移行をさせた。従って、ここに提供されるのは、ヒンジがＩｇＧ１抗体について残基Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５およびＩｇＧ２抗体について残基Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４から選択される１、２、３、４、５、６または７アミノ酸残基の欠失を含む、修飾重鎖定常領域である。
【０２９１】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメインであるＣＨ１ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン”または“ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン”)を含む。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインおよび“ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン”)も使用され得る。ＣＨ１ドメインは野生型ＣＨ１ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのバリアントでもよい。ＣＨ１ドメインのバリアントの例は、Ａ１１４ＣおよびＴ１７３Ｃおよび／またはＣ１３１、例えば、Ｃ１３１Ｓを含む。
【０２９２】
ＣＨ１ドメイン、例えば、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインは置換Ｃ１３１Ｓを含んでよく、この置換は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジを有する抗体をＢ形態(または立体構造)とする。
【０２９３】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのものであるＣＨ１ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＨ１ドメインは、例えば、アミノ酸配列
【化１】
2019508013.tif 000004
を有する、野生型ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。ある実施態様において、ＣＨ１ドメインは配列番号４７７のバリアントであり、配列番号４７７と比較して、１〜１０、１〜５、１〜２または１アミノ酸置換または欠失を含む。実施例においてさらに記載するとおり、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントは、ＩｇＧ１抗体と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体の内部移行性質を増強または改変し、該抗体がまたＩｇＧ２ヒンジを含むとき、内部移行がさらに増強または改変されることがここに示されている。ある実施態様において、ＩｇＧ２  ＣＨ１バリアントは、次のアミノ酸残基Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の１以上にアミノ酸置換または欠失を含まず、これらアミノ酸残基は、上記配列番号４７７で太字および下線で示す。例えば、修飾重鎖定常領域は、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の何れも他のアミノ酸で置換されず、またはＣ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の何れも他のアミノ酸で置換されずまたは欠失もしていない、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含み得る。ある実施態様において、Ｃ１３１は他のアミノ酸、例えば、Ｃ１３１Ｓで置換され、この置換は、抗体が立体構造Ｂを採用する引き金になる。修飾重鎖定常領域を有する立体構造Ａおよび立体構造Ｂ両方の抗体が、ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体と比較して活性が増強することがここで示されている。
【０２９４】
ある実施態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３(上記配列番号４７７における斜体および下線残基)を、他のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１における対応するアミノ酸、すなわち、Ｎ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌで置換する。
【０２９５】
ある実施態様において、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの１以上のアミノ酸残基が、ＩｇＧ４における対応するアミノ酸残基で置換される。例えば、Ｎ１９２は、Ｎ１９２Ｓであってよく、Ｆ１９３は、Ｆ１９３Ｌであってよく、Ｃ１３１は、Ｃ１３１Ｋであってよく、および／またはＴ２１４は、Ｔ２１４Ｒであってよい。
【０２９６】
抗体は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントおよびＩｇＧ２ヒンジまたはそのバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み得る。ヒンジおよびＣＨ１ドメインを、ここに記載するＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの何れかと組み合わせ得る。ある実施態様において、ＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジは、次のアミノ酸配列
【化２】
2019508013.tif 000005
またはそれと最大１〜１０アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む。アミノ酸バリアントは、上でヒンジおよびＣＨ１ドメインについて記載したとおりである。
【０２９７】
ある実施態様において、抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび場合によりまたＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは該ヒンジのフラグメントもしくは誘導体および／またはＣＨ１ドメインを含み、該抗体は、形態(立体構造)Ａを採用する(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある実施態様において、抗ＣＤ７３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび場合によりまたＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは該ヒンジのフラグメントもしくは誘導体および／またはＣＨ１ドメインを含み、該抗体は、形態Ｂを採用する(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755参照)。
【０２９８】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメインであるＣＨ２ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン”または“ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン”)を含む。ＣＨ２ドメインはまた野生型ＣＨ２ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのバリアントであり得る。ＣＨ２ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの抗体のＦｃ領域の生物活性を調節するまたは抗体の半減期またはその安定性を調節するバリアントを含む。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは、変異がない同じＣＨ２ドメインと比較して、エフェクター機能が減少している。ＣＨ２ドメインは増強したエフェクター機能を有し得る。ＣＨ２ドメインは、次の変異Ｅ(Ｓ２６７Ｅ)、ＳＥＬＦ(Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ)、ＳＤＩＥ(Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ)、ＳＥＦＦおよびＧＡＳＤＡＬＩＥ(Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)の１以上のおよび／または次のアミノ酸Ｅ２３３、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ｐ２７１Ｌ３２８およびＡ３３０の１以上の変異を含み得る。他の変異は、本明細書の他の箇所にさらに示す。
【０２９９】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメインであるＣＨ３ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ２  ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ３  ＣＨ３ドメイン”または“ＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン”)を含む。ＣＨ３ドメインはまた野生型ＣＨ３ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインのバリアントでもあり得る。ＣＨ３ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの抗体のＦｃ領域の生物活性を調節するまたは抗体の半減期またはその安定性を調節するバリアントを含む。
【０３００】
一般に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのバリアントは、特定のバリアントを含む重鎖定常領域が必要な生物活性を保持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異および／または最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１変異または１〜１０または１〜５変異を含むかまたは対応する野生型ドメイン(それぞれＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン)と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
【０３０１】
表３は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域の例を示し、ここで、各ドメインは、重鎖定常領域に所望の生物活性を提供する野生型ドメインまたはそのバリアントである。表３の空欄セルは、ドメインが存在するかまたは存在せず、存在するならば、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得ることを示す。例えば、表３における重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、またＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインも含んでよく、存在するならば、このＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、重鎖定常領域を含む、抗体である。表３の理解を助ける他の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ３ドメインを含んでも含まなくてもよく、これは、存在するならば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る、重鎖定常領域を含む抗体である。
【０３０２】
【表３】
2019508013.tif 000006
＊  修飾重鎖定常領域
【０３０３】
ある実施態様において、表３に示す重鎖定常領域を含む抗体は、この特定の重鎖定常領域を含まない同じ抗体と比較してまたはＩｇＧ１定常領域を含む同じ抗体と比較して、生物活性が増強される。
【０３０４】
ある実施態様において、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含むＧＩＴＲ抗体の生物活性を改善する方法は、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗ＧＩＴＲ抗体を提供し、非ＩｇＧ２ヒンジおよび非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインをそれぞれＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置換することを含む。修飾重鎖定常領域を含まないＧＩＴＲ抗体の生物活性を改善する方法は、修飾重鎖定常領域を含まない抗ＧＩＴＲ抗体を提供し、その重鎖定常領域を修飾重鎖定常領域で置換することを含み得る。
【０３０５】
抗ＧＩＴＲ可変領域、例えば、ここに記載するものに結合し得る修飾重鎖定常領域の例を表４に提供し、これは、ドメインの各々の特性(identity)を示す。
【表４】
2019508013.tif 000007
【０３０６】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２９１、２９２、２９３、２９４および４４７〜４７１または、(ｉ)配列番号２９１、２９２、２９３、２９４および４４７〜４７１の何れか一つと１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(ii)配列番号２９１、２９２、２９３、２９４または４４７〜４７１の何れか一つと最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(iii)配列番号２９１、２９２、２９３、２９４または４４７〜４７１の何れか一つと１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号２９１、２９２、２９３、２９４または４４７〜４７１の何れか一つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むＩｇＧ２ヒンジなどのそのバリアントの何れか一つを含むＩｇＧ２ヒンジを含む修飾重鎖定常領域を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、そして修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体に増強されたアゴニスト活性を提供する。
【０３０７】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２７８を含むＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたは配列番号２７９を含むＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは配列番号２７８または２７９のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２７８または２７９と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(ii)配列番号２７８または２７９と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(iii)配列番号２７８または２７９と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号２７８または２７９、と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、ここで、抗ＧＩＴＲ修飾重鎖定常領域を含む抗体は、抗ＧＩＴＲ抗体であるが、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域を含む抗ＧＩＴＲ抗体と比較して、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。
【０３０８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２８０または２８１を含むＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたは配列番号２８０または２８１のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を提供し、このバリアントは、(ｉ)配列番号２８０または２８１と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(ii)配列番号２８０または２８１と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(iii)配列番号２８０または２８１と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号２８０または２８１、と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、そして修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のもの「と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体に増強されたアゴニスト活性を提供する。
【０３０９】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２８２を含むＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは配列番号２８２のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２８２と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(ii)配列番号２８２と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる、(iii)配列番号２８２と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号２８２、と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、そして修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、増強されたアゴニスト活性を提供する。
【０３１０】
修飾重鎖定常領域はまた上記ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組み合わせも含み得る。
【０３１１】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３の何れか一つを含む修飾重鎖定常領域または配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３の何れか一つのバリアントを含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３の何れか一つと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失で異なる、(ii)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３の何れか一つと最大１０、９、８、７、６,５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる、(iii)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３の何れか一つと１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３から選択される配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾は、配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３８３〜４４６および４８０〜５４３における、野生型アミノ酸とその位置で異なるアミノ酸で生じず、そして修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、増強されたアゴニスト活性を提供する。
【０３１２】
修飾重鎖定常領域は、(ｉ)野生型重鎖定常領域と比較して、同等な、減少したまたは増加したエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲへの結合)を有し、そして／または(ii)野生型重鎖定常領域と比較して、同等な、短縮されたまたは延長された半減期(またはＦｃＲｎ受容体への結合)を有する。
【０３１３】
III. 特定の生殖系列配列を有する抗体
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
【０３１４】
ここに示すとおり、ヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３遺伝子、ＶＨ  ３−１０遺伝子、ＶＨ  ３−１５遺伝子、ＶＨ  ３−１６、ＶＨ  ＪＨ６ｂ遺伝子、ＶＨ  ６−１９遺伝子、ＶＨ  ４−３４遺伝子および／またはＶＨ  ＪＨ３ｂ遺伝子の産物であるまたはこれに由来する重鎖可変領域を含む、ＧＩＴＲに特異的なヒト抗体は製造されている。従って、ここに提供されるのは、ＶＨ  ３−３３、ＶＨ  ３−１０、ＶＨ  ３−１５、ＶＨ  ３−１６、ＶＨ  ＪＨ６ｂ、ＶＨ  ６−１９、ＶＨ  ４−３４および／またはＶＨ  ＪＨ３ｂからなる群から選択されるヒトＶＨ生殖系列遺伝子の産物であるまたはこれに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【０３１５】
ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ６遺伝子、ＶＫ  Ｌ１８遺伝子、ＶＫ  Ｌ１５遺伝子、ＶＫ  Ｌ２０遺伝子、ＶＫ  Ａ２７遺伝子、ＶＫ  ＪＫ５遺伝子、ＶＫ  ＪＫ４遺伝子、ＶＫ  ＪＫ２遺伝子およびＶＫ  ＪＫ１遺伝子の産物であるまたはこれに由来する軽鎖可変領域を含むＧＩＴＲに特異的なヒト抗体は製造されている。従って、ここに提供されるのは、ＶＫ  Ｌ６、ＶＫ  Ｌ１８、ＶＫ  Ｌ１５、ＶＫ  Ｌ２０、ＶＫ  Ａ２７、ＶＫ  ＪＫ５、ＶＫ  ＪＫ４、ＶＫ  ＪＫ２およびＶＫ  ＪＫ１からなる群から選択されるヒトＶＫ生殖系列遺伝子の産物であるまたはこれに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【０３１６】
ここに記載する好ましい抗体は、図２〜１１に示すとおり、上に挙げたヒト生殖系列ＶＨ遺伝子の何れか一つの産物であるまたはこれに由来する重鎖可変領域を含み、また、上に挙げたヒト生殖系列ＶＫ遺伝子の何れか一つの産物であるまたはこれに由来する軽鎖可変領域を含むものである。
【０３１７】
ここで使用するヒト抗体は、抗体の可変領域が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムにより得られるならば、特定の生殖系列配列の“産物である”またはそれに“由来する”重鎖または軽鎖可変領域を含む。このようなシステムは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫化するかまたはファージ上に提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはそれに“由来する”ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い(すなわち、最大％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはそれに“由来する”ヒト抗体は、例えば、自然に起こる体性変異または部位特異的変異の意図的な導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を有し得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、一般にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト抗体をヒトとして同定させるアミノ酸残基を含む。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９５％またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０を超えるアミノ酸差異を示さない。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、最大で５またはさらには最大で４、３、２または１アミノ酸差異を示し得る。
【０３１８】
IV. 相同抗体
ここに包含されるのは、ここに記載する好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体であり、該抗体は、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の所望の機能的性質を保持する。
【０３１９】
例えば、単離抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでよく、ここで
(ａ)重鎖可変領域は、配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域は、配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｃ)抗体はＧＩＴＲに特異的に結合する、そして
(ｄ)抗体は、次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全てを示す：
(１)例えば、Biacoreにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)Ｔ細胞増殖増強により証明される、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度の存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化の誘発または増強；
(６)多価架橋を必要としないＴ細胞活性化の誘発または増強；
(７)ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(８)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(９)成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合；
(１０)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；
(１１)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；
(１２)２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０とヒトＧＩＴＲへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合する。
【０３２０】
各種の実施態様において、抗体は、上記(１)〜(１２)に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９、１０、１１または全てを示し得る。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０３２１】
単離抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は重鎖および軽鎖を含んでよく、ここで：
(ａ)重鎖は配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含むが、ただし、ある実施態様において、配列がエフェクターレス重鎖のものであるならば、重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されない(すなわち、Ａ２３４、Ｅ２３５、Ａ２３７、Ｓ３３０およびＳ３３１は修飾しない)；
(ｂ)軽鎖は、配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｃ)抗体はＧＩＴＲに特異的に結合する、そして
(ｄ)抗体は、次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全てを示す：
(１)例えば、Biacoreにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)Ｔ細胞増殖増強により証明される、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度の存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化の誘発または増強；
(６)多価架橋を必要としないＴ細胞活性化の誘発または増強；
(７)ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(８)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害
(９)成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合；
(１０)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；
(１１)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；および
(１２)２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０とヒトＧＩＴＲへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合する。
【０３２２】
また提供されるのは、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０の対応するＣＤＲと１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)により異なるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体である。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０における対応する配列と比較して、１個、２個、３個、４個、５個または６個のＣＤＲの各々に、１〜５アミノ酸変化含む。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０におけるＣＤＲと比較して、全ＣＤＲにわたり、合計１〜５アミノ酸変化を含む。
【０３２３】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３のものからなるＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸の１以上は、ここに開示する他の抗ＧＩＴＲ抗体の一つのものである。
【０３２４】
例えば、ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＳＹＧＭＨ(配列番号２０)と比較して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨＣＤＲ１を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る。
ＳＹＧＸＨ(配列番号３７２)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＦである)；
Ｘ１ＹＧＸ２Ｈ(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＮまたはＤであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＦである)；および
Ｘ１ＹＧＸ２Ｘ３(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＮまたはＤであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＦであり、Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、ＨまたはＱである)。
【０３２５】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＶＩＷＹＥＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号２１)と比較して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨＣＤＲ２を含み、次の縮重配列の一つを含み得る。
ＶＩＷＹＸ１ＧＳＮＫＸ２ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号３７３)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＥまたはＡであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＦである)；および
ＶＩＷＹＸ１ＧＳＮＫＸ２ＹＸ３ＤＳＶＫＧ(配列番号３７４)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｅ、Ａ、ＧまたはＤであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＦであり；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、ＡまたはＶである)。
【０３２６】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＧＳＭＶＲＧＤＹＹＹＧＭＤＶ(配列番号２２)と比較して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨＣＤＲ３を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る。
ＧＧＳＸ１ＶＲＧＤＹＹＹＧＭＤＶ(配列番号３７５)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＶ、Ｌ、ＩまたはＡである)。
ＧＧＳＸ１ＶＲＧＸ２ＹＹＹＧＭＤＶ(配列番号３７６)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＶ、Ｌ、ＩまたはＡであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＤまたはＥである。Ｘ１およびＸ２の特定の組み合わせは、実施例に示す)。
ＧＧ(６−７ａａ)ＭＤＶＷＹＹＸ１ＭＤＶＷ(配列番号３７７)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、ＳまたはＶである。ある実施態様において、６−７アミノ酸は、ここに開示する抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨＣＤＲ３配列におけるその位置のアミノ酸に対応する)。
【０３２７】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ(配列番号２３)と比較して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬＣＤＲ１を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る。
ＲＡＳＱＧＩＳＳＸＬＡ(配列番号３７８)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＡまたはＷ(またはＡ、ＷまたはＹ)である)；および
ＲＡＳＱＧ(２−３ａａ)ＳＸ１ＬＡ(配列番号３７９)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｗ、ＹまたはＡであり、２−３アミノ酸は任意のアミノ酸、例えば、ＧＩ、ＳＶＳまたはＳＶＴである)。
【０３２８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＤＡＳＳＬＥＳ(配列番号２４)と比較して１以上のアミノ酸修飾を含む、例えば、次の縮重配列の一つを含み得るＶＬＣＤＲ２を含む。
ＤＡＳＳＬＸＳ(配列番号３８０)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＥまたはＱである)；および
Ｘ１ＡＳＳＸ２Ｘ３Ｘ４(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ａ、ＤまたはＧであり；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、ＬまたはＲであり；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、Ｑ、ＥまたはＡであり；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、ＳまたはＴである)。
【０３２９】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＱＱＦＮＳＹＰＹＴ(配列番号２５)と比較して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬＣＤＲ３を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る。
ＱＱＸＮＳＹＰＹＴ(配列番号３８１)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＹである)；および
ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＰＸ４Ｔ(配列番号３８２)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＹであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＮまたはＧであり；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＳであり；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｗ、Ｉ、ＰまたはＱである)。
【０３３０】
２８Ｆ３、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のものと相同性を有する配列、例えば、それぞれ配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５および配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６のＶＨおよびＶＬ領域またはそれぞれ配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５および３３７および配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７および３３８の重鎖および軽鎖またはＣＤＲを有する抗体は、配列番号１４７、１５４、１５８、１６２、１６８、１７２、１７６、１８２、１８６、３５３および／または配列番号１４８、１５５、１５９、１６３、１６４、１６９、１７３、１７７、１７８、１８３、１８７、１８８、３５４または配列番号１４９、１５１、１５２、１５６、１６０、１６５、１７０、１７４、１７９、１８４、１８９、３５５および／または配列番号１５０、１５３、１５７、１６１、１６６、１７１、１７５、１８０、１８５、１９０、１９１、３５６をコードする核酸分子の変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘発)を行い、次いでここに記載する機能的アッセイを使用するコード化された改変抗体の機能(すなわち、上記(１)〜(１２)に示す機能)保持についての試験によって取得することができる。
【０３３１】
Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、これらのＣＤＲ配列の１以上は、ここに記載する好ましい抗体(例えば、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０)に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾体を含み、ここで、該抗体は、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、単離抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体を含む；
(ｃ)抗体はＧＩＴＲに特異的に結合する、そして
(ｄ)抗体は、次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全てを示す：
(１)例えば、Biacoreにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)Ｔ細胞増殖増強により証明される、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度の存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化の誘発または増強；
(６)多価架橋を必要としないＴ細胞活性化の誘発または増強；
(７)ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(８)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(９)成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合；
(１０)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；
(１１)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；および        
(１２)ヒトＧＩＴＲへの結合について２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０と何れかの方向または双方向で競合。
【０３３２】
好ましい実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体を含む；および軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体を含む。他の好ましい実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体を含む；および軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体を含む。
【０３３３】
各種の実施態様において、抗体は、上の(１)〜(１２)に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９または全てを示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０３３４】
保存的アミノ酸置換はまた、抗体のＣＤＲ以外の部分またはＣＤＲに加えて他の部分にも付し得る。例えば、保存的アミノ酸修飾はフレームワーク領域またはＦｃ領域に付し得る。可変領域または重鎖または軽鎖は、ここに提供する抗ＧＩＴＲ抗体配列と比較して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０保存的アミノ酸置換を含み得る。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、保存的および非保存的アミノ酸修飾の組み合わせを含む。
【０３３５】
VI. ここに記載する抗体とＧＩＴＲ上の同じエピトープに結合するまたはＧＩＴＲへの結合について競合する抗体
また提供されるのは、特定のここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０)とＧＩＴＲへの結合について競合する抗体である。このような競合抗体は、標準ＧＩＴＲ結合アッセイにおける、モノクローナル抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０の１以上のＧＩＴＲへの結合を競合的に阻害するそれらの能力に基づき、同定され得る。例えば、組み換えヒトＧＩＴＲタンパク質をプレートに固定化し、各種の濃度の非標識第一抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識第二抗体を添加し、標識の量を測定する、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用し得る。非標識(第一)抗体(“遮断抗体”とも称する)の濃度増加が、標識(第二)抗体の結合を阻害するならば、第一抗体はプレート上の標的への第二抗体の結合を阻害すると言えるまたは第二抗体の結合と競合すると言える。これに加えてまたはこれとは別に、BIAcore解析を使用して、抗体が競合する能力を評価できる。試験抗体がここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲへの結合を阻害する能力は、試験抗体がＧＩＴＲへの結合について該抗体と競合し得ることを示す。
【０３３６】
従って、ここで提供されるのは、例えば、次の段落に記載するアッセイを使用するような、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定して、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害し、そして／またはその細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害される、抗ＧＩＴＲ抗体である。
【０３３７】
例えば、第一抗体が第二抗体の結合を遮断する(すなわち、“競合する”)か否かを決定する例示的競合実験は、次のとおり、実施し得る。活性化ヒトＴ細胞を次のとおり製造する。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をFicoll勾配を使用してヒト全血から単離し、１０μg／mL  フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ−Ｌ)(USBiol#P3370-30)および２００IU／mL  組み換えＩＬ−２(Peprotech#200-02)で３日間活性化させる。活性化Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液(５％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ)に再懸濁し、９６ウェルプレートのサンプルウェルあたり１０５細胞で播種する。プレートを氷の上に置き、続いて非コンジュゲート第一抗体を０〜５０μg／mLの範囲の濃度(５０μg／mLの最高濃度から出発して３倍タイトレーション)で添加する。無関係のＩｇＧを第一抗体のアイソタイプ対照として使用し、同じ濃度で添加してよい(５０μg／mLの最高濃度から出発して３倍タイトレーション)。５０μg／mL  非標識第二抗体とプレインキュベートしたサンプルを完全遮断(１００％阻害)についての陽性対照として包含させてよく、一次インキュベーションにおける無抗体サンプルを、陰性対照(競合なし；０％阻害)として使用してよい。３０分のインキュベーション後、標識、例えば、ビオチニル化、第二抗体を、洗浄することなく２μg／mL／ウェルの濃度で添加する。サンプルを氷上でさらに３０分インキュベートする。非結合抗体を、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄することにより除去する。細胞結合標識第二抗体を、標識を検出する試薬、例えば、ビオチンの検出のために、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen, catalog#S21388)を使用して検出する。サンプルをFACS Calibur Flow Cytometer(BD, San Jose)上で獲得し、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析する。結果を％阻害として表し得る(すなわち、１００％から、遮断抗体非存在下で得た標識の量で除した各濃度での標識の量を減算)。一般に、その後同じ実験を逆にして、すなわち、第一抗体が第二抗体であり、第二抗体が第一抗体であるようにして行う。ある実施態様において、抗体は、他の抗体の標的、例えばヒトＧＩＴＲまたはその一部への結合を少なくとも部分的に(例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％)または完全に(１００％)遮断し、阻害が一方のまたは他方の抗体が第一抗体であるときに生じるかに無関係である。第一および第二抗体は、これらの抗体が双方向で、すなわち、第一抗体をまず添加する競合実験においておよび第二抗体をまず添加する競合実験において互いに競合するとき、標的への互いの結合を“交差遮断”する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、あるエピトープマッピング技法により決定して、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０)と同じエピトープに結合する。ここにさらに記載するとおり、２８Ｆ３抗体は、ヒトＧＩＴＲ内のQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号２１５)における領域内で結合する。従って、ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のアミノ酸残基１〜３９に対応する、領域QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号２１５)内のアミノ酸残基と結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲの領域QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１６)内のアミノ酸残基と結合する。ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲの領域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内のアミノ酸残基と結合する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、実施例に示すプロトコールを使用する、ＨＤＸにより決定して、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)と結合する。
【０３３８】
ここに記載する抗体と“ＧＩＴＲ上の同じエピトープ”に結合する抗体を決定する技法は、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線解析などの、エピトープマッピング方法を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異バリエーションへの結合をモニターし、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、しばしばエピトープ成分の指標と考えられる。さらに、エピトープマッピングのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用できる。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチド(天然三次元形態または変性形態の何れか)を親和性単離する能力を利用する。次いで、該ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用する抗体に対応するエピトープの規定のためのリードとして考慮される。エピトープマッピングのために、立体構造的不連続エピトープをマッピングすることが示されている、コンピューターによるアルゴリズムも開発されている。
【０３３９】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と結合について競合するまたは同じエピトープに結合する抗体は、当分野で知られる方法を使用して同定され得る。例えば、マウスをここに記載するヒトＧＩＴＲで免疫化し、ハイブリドーマを産生させ、得られたモノクローナル抗体をＧＩＴＲへの結合についてここに記載する抗体と競合する能力についてスクリーニングし得る。マウスをまた抗体が結合するエピトープを含む、ＧＩＴＲの小フラグメントで免疫化してもよい。該エピトープを含むエピトープまたは領域は、例えば、一連のＧＩＴＲにわたる重複ペプチドへの結合についてスクリーニングすることにより、局在化され得る。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994の方法を使用して、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープを、それ故に類似する性質を有する抗体の選択を導き得る。ファージディスプレイを使用して、まず抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖を(好ましくはヒト)軽鎖のレパートリーと対合させてＧＩＴＲ結合抗体を選択し、次いで新規軽鎖を(好ましくはヒト)重鎖のレパートリーと対合させて、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープまたはエピトープ領域を有する(好ましくはヒト)ＧＩＴＲ結合抗体を選択する。あるいはここに記載する抗体のバリアントを、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発により得ることができる。
【０３４０】
ＧＩＴＲにおける、Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085に記載のアラニン走査変異誘発またはアミノ酸残基の点変異誘発のいくつかの他の形態も、抗ＧＩＴＲ抗体の機能的エピトープの決定に使用し得る。しかしながら、変異誘発試験は、抗体−抗原接触に直接参加しないが、ＧＩＴＲの全体的三次元構造に重要であるアミノ酸残基も明らかにするので、この方法を使用して決定した機能的エピトープを確認するための他の方法が必要であり得る。
【０３４１】
特異的抗体により結合されるエピトープまたはエピトープ領域(“エピトープ領域”は、該エピトープを含むまたは該エピトープと重複する領域である)はまた、ＧＩＴＲのフラグメント、例えば、非変性または変性フラグメントを含むペプチドへの抗体の結合の評価によっても決定され得る。ＧＩＴＲ(例えば、ヒトＧＩＴＲ)の配列を包含する一連の重複ペプチドを合成し、例えば直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ(ペプチドを、マイクロタイタープレートのウェルに結合させたＧＩＴＲへの抗体の結合について評価するとき)またはチップで、結合をスクリーニングし得る。このようなペプチドスクリーニング方法は、ある不連続機能的エピトープ、すなわちＧＩＴＲポリペプチド鎖の一次配列に添って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープの一部を検出できない可能性がある。
【０３４２】
エピトープはまた水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)およびタンパク質の迅速光化学酸化(ＦＰＯＰ)などのＭＳベースのタンパク質フットプリンティングによっても同定され得る。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、実施例においてさらに記載し、そしてWei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95に記載されるとおり実施でき、この方法は、引用により本明細書に明示的に包含させる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057に記載されるとおり実施でき、この方法は、引用により本明細書に明示的に包含させる。
【０３４３】
抗ＧＩＴＲ抗体により結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３号)、分子モデリングおよび、遊離のときおよび目的の抗体と複合体で結合したときのＧＩＴＲにおける不安定アミド水素のＨ−Ｄ交換率のＮＭＲ決定を含む核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーなどの構造的方法によっても決定できる(Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891)。
【０３４４】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化を、マイクロバッチ(例えばChayen (1997) Structure 5:1269-1274)、ハンギングドロップ蒸気拡散(例えばMcPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303)、シーディングおよび透析を含む、当分野で知られる方法の何れかを使用して達成し得る(例えばGiege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23)。少なくとも約１mg／mL、好ましくは約１０mg／mL〜約２０mg／mLの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％(ｗ／ｖ)範囲の濃度でポリエチレングリコール１０００〜２０,０００(ＰＥＧ；約１０００〜約２０,０００Daの範囲の平均分子量)、好ましくは約５０００〜約７０００Da、より好ましくは約６０００Daを含む、沈殿剤溶液において最もよく達成できる。約０.５％〜約２０％の範囲の濃度でタンパク質安定化剤、例えばグリセロールを含むのも望ましい可能性がある。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適当な塩も、好ましくは、約１mM〜約１０００mM範囲の濃度で、沈殿剤溶液にあるのが望ましい可能性がある。沈殿剤は、好ましくは約３.０〜約５.０、好ましくは約４.０のｐＨに緩衝化される。沈殿剤溶液において有用な特定の緩衝液は異なり得て、当分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用な緩衝液の例は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸を含むが、これらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃および２６℃を含む広範囲の温度で生長し得る。
【０３４５】
抗体：抗原結晶を、周知のＸ線回折技術を使用して試験でき、Ｘ−ＰＬＯＲ(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；例えばBlundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開２００４／００１４１９４号参照)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)などのコンピューターソフトウェアを使用して、精密化してよく、これらの開示は、全体として引用により本明細書に包含させる。
【０３４６】
抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載する技法などのエピトープマッピング技法により決定して、ここに記載するアミノ酸配列を有する抗ＧＩＴＲ抗体の何れかと同じエピトープに結合し得る。
【０３４７】
VII. 改変および修飾抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
また提供されるのは、出発物質としてここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上の抗体を、修飾抗体の改変のために使用して製造できる改変および修飾抗体であり、この修飾抗体は、出発抗体から変えられた性質を有し得る。抗体は、可変領域(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)の一方または両方の中、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾により改変され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基を修飾することにより改変し得る。
【０３４８】
実施できるあるタイプの可変領域エンジニアリングは、ＣＤＲ移植である。抗体は、標的抗原と、主に６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間でＣＤＲ外の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が抗体−抗原相互作用の大部分を担うため、各種の性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターの構築により、特定の天然に存在する抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
【０３４９】
従って、ここに記載する他の実施態様は、それぞれ配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２、配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３および配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにそれぞれ配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５、配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６および配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む。それ故に、このような抗体はモノクローナル抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含み、さらに、これらの抗体からの各種のフレームワーク配列を含み得る。
【０３５０】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公的参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のための生殖系列ＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖系列配列データベース(インターネット上で、www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ、この各々の内容は、明示的に引用により本明細書に包含させる。
【０３５１】
ここに記載する抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、ここに記載する抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるのと同じ配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較して１以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある例において、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
【０３５２】
ここに記載する改変抗体は、例えば抗体の性質を改善するために、修飾がＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に付されているものを含む。一般にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低減させるために行う。例えば、一つの取り組みは、１以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に“復帰変異”させることである。より具体的に、体性変異を受けている抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基を、抗体フレームワーク配列と該抗体が由来する生殖系列配列の比較により同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、体性変異を、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖系列配列に“復帰変異”させ得る。このような“復帰変異”抗体も、包含されることが意図される。
【０３５３】
他のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内または１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の可能な免疫原性を低減させることを含む。この取り組みは、“脱免疫化”とも称され、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３号にさらに詳述される。
【０３５４】
他のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより目的の抗体の１以上の結合性 (例えば、親和性)を改善することである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発を、変異を導入するために実施でき、抗体結合または興味のある他の機能的性質に対する影響を、ここに記載し、実施例に提供するインビトロまたはインビボアッセイにより評価できる。好ましくは、保存的修飾(上記のとおり)が導入される。変異はアミノ酸置換、付加または欠失でよいが、好ましくは置換である。さらに、一般にＣＤＲ領域内の最大１、２、３、４または５残基が改変される。
【０３５５】
従って、また提供されるのは、(ａ)配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域、(ｂ)配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域、(ｃ)配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域、(ｄ)配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域、(ｅ)配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域および(ｆ)配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域を含む、重鎖および／または軽鎖可変領域を含む、単離抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【０３５６】
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は酸化されることができ、化学分解および結果的な抗体の効力の低減が引き起こされる可能性がある。従って、また提供されるのは、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基が酸化分解を受けないアミノ酸残基で置き換えられている抗ＧＩＴＲ抗体である。ある実施態様において、抗体２８Ｆ３、１８Ｅ１０、１９Ｄ３および６Ｇ１０のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化分解を受けないアミノ酸残基で置き換えられている。
【０３５７】
同様に、特にＣＤＲにおける、脱アミド化部位も、抗ＧＩＴＲ抗体から除去し得る。
【０３５８】
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域は、Ｆｃ、例えば、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、ＩｇＧ１についてＧ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２についてＧ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３についてＧ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)；およびＫについてＫｍ、Ｋｍ１、Ｋｍ２、Ｋｍ３であり得るＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃと結合(例えば、共有結合または縮合)できる(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
【０３５９】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域は１以上の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＩ、ＦｃγIIａまたはＦｃγIIIａ)に結合するＦｃと結合し、それによりＡＤＣＣを刺激し、Ｔ細胞枯渇を引き起こし得る。ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域は、枯渇。を引き起こすＦｃに結合する。実施例においてさらに記載するとおり(実施例１６および１７)、マウスＩｇＧ２ａおよびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ(マウス活性化ＦｃＲへの結合においてマウスＩｇＧ２ａと等価)は、数マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の最大阻害を誘発する。抗ＧＩＴＲ  ｍＧ２ａ、ｍＧ２ｂおよびｒＧ２ｂアイソタイプは末梢においてＴｒｅｇ集団にほとんど影響しないかまたはわずかな増加を誘発するのに対し、腫瘍環境において顕著なＴｒｅｇ枯渇を誘発し、これは腫瘍増殖阻害と相関する。逆に、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプは、腫瘍部位でＣＤ８＋細胞のパーセンテージを増加させ、一方ｍＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂは、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージに影響しないかまたはわずかに増加させた。従って、ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域はヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３  Ｆｃに結合する、すなわち、抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は枯渇性抗体であり、特に、腫瘍微小環境にあるＴｒｅｇ細胞を枯渇させる(そしてそれにより抗腫瘍活性を増大する)が、腫瘍微小環境にあるＴｅｆｆ細胞を顕著に枯渇させず、抗腫瘍効果に介在し、そして／または腫瘍外、例えば、末梢にあるＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を顕著に枯渇させない。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、腫瘍部位でのＴｒｅｇ細胞枯渇または排除と付随するＴｅｆｆ細胞の活性化を刺激する天然に存在するまたは天然に存在しない(例えば、変異を含む)アイソタイプである。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は腫瘍部位でＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比を増加させ、これは、強力な抗腫瘍活性の指標であり、好ましくは腫瘍外、例えば、末梢にあるＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を顕著に枯渇させない。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔｒｅｇの免疫抑制性活性を遮断する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＦｃＲ結合がないまたは低減された、例えば、活性化ＦｃＲへの結合が低減されたＦｃ受容体を有する。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＦｃＲIIｂに結合するまたは結合が増強されたＦｃを有し、これはアゴニズムの増強を提供できる。
【０３６０】
ある実施態様において、内因性免疫応答を増強する抗ＧＩＴＲ抗体の効力は、抗体のＦｃ領域を、該Ｆｃ領域の活性化Ｆｃ受容体への結合が増強されるように選択、設計または修飾することを含む方法により、増強、最適化または最大化される。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体はＴＲＸ−５１８である。
【０３６１】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域は、エフェクターレスまたは大部分がエフェクターレスのＦｃ、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合する。
【０３６２】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域は、例えば、腫瘍環境におけるＴｒｅｇ枯渇を増強するため、天然に存在しないＦｃ領域、例えば、エフェクターレスＦｃまたは１以上の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＩ、ＦｃγIIａまたはＦｃγIIIａ)への結合が増強されたＦｃに結合し得る。
【０３６３】
一般に、ここに記載する可変領域は、一般に血清半減期、補体結合反応、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存的細胞毒性などの抗体の機能的性質の１以上を変えるために、１以上の修飾を含むＦｃに結合させ得る。さらに、ここに記載する抗体は、化学的修飾されていてよく(例えば、１以上の化学部分を抗体に結合させ得る)またはグリコシル化を変えるため、抗体の機能的性質の１以上を変えるため、修飾され得る。これらの実施態様の各々を、下にさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、KabatのＥＵインデックスである。
【０３６４】
Ｆｃ領域は、定常領域のフラグメント、アナログ、バリアント、変異体または誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを含む。適当な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどの他のクラスを含む。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンＣ末端領域と相同である天然に存在するまたは合成により製造されたポリペプチドと定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを、別々にまたは組み合わせで含み得る。
【０３６５】
免疫グロブリンの定常領域は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)結合および補体結合反応を含む多くの重要な抗体機能を担う。ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭとして分類される重鎖定常領域の主要な５クラスがあり、各々、アイソタイプに割り当てられる特徴的エフェクター機能を伴う。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として知られる４サブクラスに分類される。
【０３６６】
Ｉｇ分子は、複数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えばＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３クラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ)、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体への結合のために重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置すると報告されている。抗体の血清半減期は、その抗体がＦｃ受容体(ＦｃＲ)に結合する能力により影響される。
【０３６７】
ある実施態様において、Ｆｃ領域は、バリアントＦｃ領域、例えば、望ましい構造特性および／または生物活性を提供するために、親Ｆｃ配列(例えば、その後バリアントを作製するために修飾される、非修飾Ｆｃポリペプチド)と比較して修飾(例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入による)されているＦｃ配列である。
【０３６８】
例えば、親Ｆｃと比較して、(ａ)抗体依存的細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)が増加または低減している、(ｂ)補体介在細胞毒性(ＣＤＣ)が増加または低減している、(ｃ)Ｃ１ｑに対する親和性が増加または低減しているおよび／または(ｄ)Ｆｃ受容体に対する親和性が増加または低減しているＦｃバリアントを作製するために、Ｆｃ領域に修飾を付し得る。このようなＦｃ領域バリアントは、一般にＦｃ領域に少なくとも１アミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾の組み合わせは、特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、例えばここに同定する特定のＦｃ領域位置の、２個、３個、４個、５個等の置換をその中に含み得る。
【０３６９】
バリアントＦｃ領域はまた、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去されるかまたは他のアミノ酸で置き換えられる配列改変も含んでよい。このような除去は、ここに記載する抗体の産生に使用する宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を避け得る。システイン残基が除去されたときでさえ、一本鎖Ｆｃドメインはなお二量体Ｆｃドメインを形成でき、これは、非共有結合により一体として維持される。他の実施態様において、Ｆｃ領域を修飾して、選択宿主細胞により適合性とし得る。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの大腸菌における消化酵素により認識され得る、典型的天然Ｆｃ領域のＮ末端近辺のＰＡ配列を除去し得る。他の実施態様において、Ｆｃドメイン内のグリコシル化部位の１以上を除去してよい。一般にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解応答を与え得る。このような残基を欠失するかまたは非グリコシル化残基(例えば、アラニン)で置換し得る。他の実施態様において、Ｃ１ｑ結合部位などの補体との相互作用に関与する部位を、Ｆｃ領域から除去し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失または置換してよい。ある実施態様において、Ｆｃ受容体の結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位を除去してよい。他の実施態様において、Ｆｃ領域を修飾して、ＡＤＣＣ部位を除去し得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られ、例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関してMolec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)参照。バリアントＦｃドメインの具体例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号に開示される。
【０３７０】
ある実施態様において、Ｆｃのヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基数が改変、例えば、増加または減少されるように修飾される。この取り組みは、さらに、Bodmer et al.の米国特許５,６７７,４２５号に記載される。Ｆｃのヒンジ領域におけるシステイン残基数は、例えば、軽鎖と重鎖の集合を促進するためまたは抗体の安定性を増加または減少させるために、改変する。ある実施態様において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を短縮するために変異される。より具体的に、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して障害されたブドウ球菌プロテインＡ(ＳｐＡ)結合を有するように、１以上のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジフラグメントにＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この取り組みは、Ward et al.の米国特許６,１６５,７４５号にさらに詳述される。
【０３７１】
さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１アミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることにより改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性が改変され得るエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分である。この取り組みは、両方ともWinter et al.の米国特許５,６２４,８２１号および５,６４８,２６０号にさらに詳述される。
【０３７２】
他の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体のＣ１ｑ結合が改変されるおよび／または補体依存的細胞傷害(ＣＤＣ)が改変または消失するように異なるアミノ酸残基で置き換え得る。この取り組みは、Idusogie et al.の米国特許６,１９４,５５１号にさらに詳述される。
【０３７３】
他の例において、アミノ酸２３１位および２３９位内の１以上のアミノ酸残基が改変され、それにより抗体が補体と結合反応する能力が改変される。この取り組みは、Bodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載される。
【０３７４】
さらに他の例において、Ｆｃ領域を、次の２３４位、２３５位、２３６位、２３８位、２３９位、２４０位、２４１位、２４３位、２４４位、２４５位、２４７位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、２５８位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、２９９位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０９位、３１２位、３１３位、３１５位、３２０位、３２２位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３４０位、３６０位、３７３位、３７６位、３７８位、３８２位、３８８位、３８９位、３９８位、４１４位、４１６位、４１９位、４３０位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位、４３８位または４３９位の１以上のアミノ酸の修飾により、抗体依存的細胞毒性(ＡＤＣＣ)を増加させるおよび／またはＦｃγ受容体に対する親和性を増加させるために修飾され得る。置換の例は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅを含む。バリアントの例は２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強するための他の修飾は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009、Current Opinion in Biotechnology 20：685-691に概説される。
【０３７５】
Ｆｃγ受容体への結合を増加させるＦｃ修飾は、Ｆｃ領域のアミノ酸２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、２５８位、２６５位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７９位、２８０位、２８３位、２８５位、２９８位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３１２位、３１５位、３２４位、３２７位、３２９位、３３０位、３３５位、３３７位、３３３８位、３４０位、３６０位、３７３位、３７６位、３７９位、３８２位、３８８位、３８９位、３９８位、４１４位、４１６位、４１９位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位または４３９位の任意の１以上でのアミノ酸修飾を含み、ここで、Ｆｃ領域における残基のナンバリングはKabatにおけるＥＵインデックスのものである(ＷＯ００／４２０７２号)。
【０３７６】
Ｆｃに付し得る他のＦｃ修飾は、ＦｃγＲおよび／または補体タンパク質への結合を低減または除去し、それによりＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどのＦｃ介在エフェクター機能を減少または除去するためのものである。修飾の例は、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位での置換、挿入および欠失を含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵインデックスに従う。置換の例は、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒを含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵインデックスに従う。Ｆｃバリアントは２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減するための他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖならびに変異もしくは酵素手段によるまたはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物での産生による２９７位のグリコシル化の除去を含む。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009、Current Opinion in Biotechnology 20：685-691に概説される。
【０３７７】
場合により、Ｆｃ領域は、当業者に知られる付加的なおよび／または代替的位置で天然に存在しないアミノ酸残基を含んでよい(例えば、米国特許５,６２４,８２１号、６,２７７,３７５号、６,７３７,０５６号、６,１９４,５５１号、７,３１７,０９１号、８,１０１,７２０号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２号、ＷＯ０１／５８９５７号、ＷＯ０２／０６９１９号、ＷＯ０４／０１６７５０号、ＷＯ０４／０２９２０７号、ＷＯ０４／０３５７５２号、ＷＯ０４／０７４４５５号、ＷＯ０４／０９９２４９号、ＷＯ０４／０６３３５１号、ＷＯ０５／０７０９６３号、ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５号およびＷＯ０６／０２０１１４号参照)。
【０３７８】
阻害性受容体ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を増強するＦｃバリアントも使用され得る。このようなバリアントは、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃｙＲｌｌｂ＋細胞に関連する、免疫調節性活性を有するＦｃ融合タンパク質を提供し得る。ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体と比較して、ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性が選択的に増大される。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を改変する修飾は、ＥＵインデックスに従い２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性を増大するための置換の例は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を増大するための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。
【０３７９】
Ｆｃ領域のそのリガンドに対する親和性および結合性は、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)またはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ))または動態(例えば、BIACORE解析)および間接結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などの他の方法を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様なインビトロアッセイ法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)により決定され得る。これらおよび他の方法は、試験する成分の１以上の標識を利用し、そして／または発色、蛍光、発光または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用い得る。結合親和性および動態の詳細な記載は、抗体免疫原相互作用に焦点を絞ったPaul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。
【０３８０】
ある実施態様において、抗体は、その生物学的半減期を延長するために修飾される。各種の取り組みが可能である。例えば、これは、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性増加により達成し得る。例えば、米国特許６,２７７,３７５号に記載のとおり、次の残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６の１以上が変異され得る。置換の具体例は、次のＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓおよび／またはＴ２５６Ｆの１以上を含む。あるいは、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６号および６,１２１,０２２号に記載のとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。ＦｃＲｎの結合を増加させるおよび／または薬物動態性質を改善する他のバリアントの例は、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、２５９位、３０８位、４２８位および４３４位での置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ(Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。ＦｃＲｎ結合を調節するための他の修飾は、Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671に記載される。ある実施態様において、特定の生物学的特徴を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、ＩｇＧ３からのこれら２アイソタイプが異なる位置でのアミノ酸で置換することにより構築し得る。こうして、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２１、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含む、ハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。ここに記載する他の実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、ＩｇＧ１からのこれら２アイソタイプが異なる位置でのアミノ酸で置換することにより構築し得る。こうして、１以上の置換、例えば、次のアミノ酸置換２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位へのグリシンの挿入をいう)および３２７Ａの１以上を含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。
【０３８１】
さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされており、結合が改善されたバリアントは記載されている(Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604参照)。２５６位、２９０位、２９８位、３３３位、３３４位および３３９位での特異的変異は、ＦｃγＲIIIへの結合を改善することが示された。さらに、次のＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの組み合わせ変異体は、ＦｃγＲIII結合を改善することが示され、これはＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性の増強を示すことが示されている(Shields et al., 2001)。ＦｃγＲIIIａへの結合が強く増強された他のＩｇＧ１バリアントが同定されており、カニクイザルサルにおいてＦｃγＲIIIａに対する親和性の最大増加、ＦｃγＲIIｂ結合減少および強力な細胞毒性活性を示したＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントを含む(Lazar et al., 2006)。アレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)などの抗体への三重変異の導入は、インビトロでの高度に増強されたＡＤＣＣ活性に転換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥバリアントはサルにおいてＢ細胞枯渇の能力の増強を示した(Lazar et al., 2006)。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおけるヒトＦｃγＲIIIａを発現するトランスジェニックマウスにおけるＦｃγＲIIIａへの結合増強と付随するＡＤＣＣ活性増強を示した、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が同定されている(Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011)。使用し得る他のＦｃ変異体は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｌ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６ＬおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。
【０３８２】
ある実施態様において、ＦｃγＲへの結合が減少したＦｃが選択される。ＦｃγＲ結合が減少したＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃの例は、次の３アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む。
【０３８３】
ある実施態様において、補体結合反応が減少したＦｃが選択される。補体結合反応が減少したＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃの例は、次の２アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。
【０３８４】
ある実施態様において、本質的にエフェクター機能がない、すなわち、ＦｃγＲへの結合が減少し、補体結合反応が減少した、Ｆｃが選択される。エフェクターレスであるＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃの例は、次の５変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。これらの変異を含む重鎖の例は表１５に示される。
【０３８５】
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、通常ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それによりＩｇＧ４分子を安定化させる置換Ｓ２２８Ｐを含ませるのが好ましい。
【０３８６】
さらに他の実施態様において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が製造され得る(すなわち、抗体がグリコシル化を欠く)。グリコシル化を、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増加させるために改変できる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位の改変により達成され得る。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を排除し、それによりその部位でのグリコシル化を除去する、１以上のアミノ酸置換をなし得る。このような非グリコシル化は抗体の抗原に対する親和性を増加させ得る。このような取り組みは、Co et al.の米国特許５,７１４,３５０号および６,３５０,８６１号にさらに詳述される。
【０３８７】
定常領域のＮ２９７のグリコシル化を、Ｎ２９７残基を他の残基に置換する、例えば、Ｎ２９７Ａおよび／または隣接アミノ酸、例えば、２９８を変異することにより阻止し、それによりＮ２９７のグリコシル化を低減し得る。
【０３８８】
これに加えてまたはこれとは別に、フコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、グリコシル化のタイプが改変された抗体が製造され得る。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が改変された宿主細胞における抗体の発現を含む。改変グリコシル化機構を有する細胞は文献に記載されており、ここに記載する組み換え抗体を発現し、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する、宿主細胞として使用できる。例えば、Hanai et al.のＥＰ１,１７６,１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が、このような細胞株で発現された抗体が低フコシル化を示すように機能的に破壊された細胞株を記載する。PrestaのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースのＡｓｎ(２９７)結合炭水化物への結合能が減少したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載し、また、この宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化をもたらす(Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740もまた参照)。Umana et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２号は、改変細胞株により発現された抗体が、該抗体のＡＤＣＣ活性を増加させる、二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するように改変された細胞株を記載する(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180もまた参照)。
【０３８９】
ここに記載する抗体の他の修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長するためにペグ化され得る。抗体のペグ化のために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合するようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化を、反応性ＰＥＧ分子(または類似反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により行う。ここで使用する用語“ポリエチレングリコール”は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質の誘導体化に使用されている、ＰＥＧのあらゆる形態を包含することを意図する。ある実施態様において、ペグ化する抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.のＥＰ０１５４３１６号およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４号参照。
【０３９０】
VIII. 抗体物理的性質
ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、改変された抗原結合により、抗体の免疫原性増加または抗体のｐＫ改変をもたらし得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。いくつかの例において、抗ＧＩＴＲ抗体が可変領域グリコシル化を含まないことが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体の選択またはグリコシル化領域内の残基の変異により達成され得る。
【０３９１】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じ得て、ポリペプチド鎖にねじれを生じさせ、その安定性を低減させる(イソアスパラギン酸効果)、イソアスパラギン酸残基の生成に至る。
【０３９２】
各抗体は特有の等電点(ｐＩ)を有し、これは一般に６〜９.５のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体についてのｐＩは、一般に７〜９.５のｐＨ範囲に入り、ＩｇＧ４抗体についてのｐＩは、一般に６〜８のｐＨ範囲に入る。この正常範囲外のｐＩを有する抗体は、若干折り畳み不足で、インビボ条件下で不安定であるとの推論がある。それ故に、抗ＧＩＴＲ抗体がこの正常範囲に入るｐＩ値を含むことが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体の選択または荷電表面残基の変異により達成され得る。
【０３９３】
各抗体は、特徴的融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボでの全体的安定性が高いことが示される(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、ＴＭ１(最初の変性の温度)が６０℃より高い、好ましくは６５℃より高い、さらにより好ましくは７０℃より高いことが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52)または円二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して測定できる。
【０３９４】
好ましい実施態様において、急速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定できる(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)。
【０３９５】
他の好ましい実施態様において、望まれない免疫応答および／または改変されたもしくは不都合な薬物動態の誘発をもたらし得る、凝集効果が最小の抗体が選択される。一般に、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下の凝集の抗体が許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含むいくつかの技術により測定され得る。
【０３９６】
IX. 抗体を改変する方法
上記のとおり、ここに開示するＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはこれに結合する定常領域の修飾により、新規抗ＧＩＴＲ抗体を作ることができる。それ故に、ここに記載する他の態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０の構造特性を使用して、ヒトＧＩＴＲおよびカニクイザルＧＩＴＲへの結合などのここに記載する抗体の少なくとも一つの機能的性質を保持する構造上関連する抗ＧＩＴＲ抗体が作製される。例えば、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０の１以上のＣＤＲ領域またはその変異物を既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み換えにより組み合わせ、上記のとおり、さらなる、組み換えにより改変された、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を作製することができる。他のタイプの修飾は、先のセクションで記載したものを含む。改変方法のための出発物質は、ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上またはそのＣＤＲ領域の１以上である。改変抗体を作製するために、ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上またはそのＣＤＲ領域の１以上を有する抗体を実際に製造する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する“第二世代”配列を作り、次いで、“第二世代”配列を作製し、タンパク質として発現させる。
【０３９７】
従って、ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体の製造方法であって、
(ａ)(ｉ)配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列および(ii)配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し、
(ｂ)重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１アミノ酸残基を改変させて、少なくとも１個の改変抗体配列を作製し、そして
(ｃ)改変抗体配列をタンパク質として発現させる
ことを含む、方法である。
【０３９８】
標準分子生物学技術を使用して、改変抗体配列を製造および発現させ得る。
【０３９９】
好ましくは、改変抗体配列によりコードされる抗体は、
(１)例えば、Biacoreにより測定して、例えば１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)Ｔ細胞増殖増強により証明される、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度の存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化の誘発または増強；
(６)多価架橋を必要としないＴ細胞活性化の誘発または増強；
(７)ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(８)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の、最大でも部分的阻害；
(９)成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合；
(１０)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；
(１１)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；および
(１２)ヒトＧＩＴＲへの結合について２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０と何れかの方向または双方向で競合
を含む、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の機能的性質の１個、数個または全てを保持するものである。
【０４００】
改変抗体は、上の(１)〜(１２)に示す機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１または全てを示し得る。改変抗体の機能的性質は、実施例に示すような(例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ)、当分野で利用可能なおよび／またはここに記載する標準アッセイを使用して評価できる。
【０４０１】
ここに記載する抗体を改変する方法のある実施態様において、変異を、抗ＧＩＴＲ抗体コード配列の全てまたは一部に添って無作為にまたは選択的に導入でき、得られた修飾抗ＧＩＴＲ抗体を、ここに記載する結合活性および／または他の機能的性質についてスクリーニングし得る。変異方法は、文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和変異誘発、合成ライゲーション集合またはこれらの組み合わせを使用する抗体変異の作製およびスクリーニングの方法を記載する。あるいは、Lazar et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９号は、抗体の生理化学的性質の最適化のためにコンピューターによるスクリーニング方法を使用する方法を記載する。
【０４０２】
Ｘ. 核酸分子
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞全体、細胞ライセートまたは一部精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然では単離ＤＮＡと結合している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製されたとき、“単離される”または“実質的に純粋にされる”。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載する核酸は、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０４０３】
ここに記載する核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、さらに下に記載するとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから製造したハイブリドーマ)により発現される抗体について、ハイブリドーマにより作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ技術を使用)により得た抗体について、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収できる。
【０４０４】
好ましいここに記載する核酸分子は、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１４７、１５４、１５８、１６２、１６８、１７２、１７６、１８２、１８６および３５３に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１４８、１５５、１６３、１６４、１６９、１７３、１７７、１７８、１８３、１８７、１８８および３５４に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０の重鎖配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１４９、１５６、１６０、１６５、１７０、１７４、１７９、１８４、１８９および３５５に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０の軽鎖配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１５０、１５７、１６１、１６６、１６７、１７１、１７５、１８１、１８０、１８５、１９０、１９１および３５６に示す。
【０４０５】
２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(同一可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１４７および１４８に示す。２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１５１および１５２に示し、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例は、配列番号１５３に示す。
【０４０６】
シグナルペプチドを伴う２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(同一可変領域)抗体のＶＨおよびＶＬドメインの例は、それぞれ配列番号３５７および３５８に示し、これらをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３５９および３６０に示す。
【０４０７】
シグナルペプチドを伴う２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の重鎖の例をそれぞれ配列番号３６１および３６２に示し、これらをコードするヌクレオチド配列の例を、それぞれ配列番号３６３および３６４に示す。シグナルペプチドを伴う２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の軽鎖の例を配列番号３６５に示し、これをコードするヌクレオチド配列の例を配列番号３６６に示す。
【０４０８】
２８Ｆ３.ＩｇＧ１を製造する方法は、シグナルペプチドを伴う重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、それぞれ配列番号３６３および３６５を含む細胞株において、該重鎖および軽鎖を発現させることを含み得る。２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１を製造する方法は、シグナルペプチドを伴う重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、それぞれ配列番号３６４および３６６を含む細胞株において、該重鎖および軽鎖を発現させることを含み得る。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ここに包含される。
【０４０９】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを標準組み換えＤＮＡ技術によりさらに操作して、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換させ得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーなどの他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合される。この文脈において使用する用語“操作可能に結合”は、２個のＤＮＡフラグメントが、この２個のＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように連結されることを意味することを意図する。
【０４１０】
単離ＤＮＡをコードする単離ＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)にＶＨコード化ＤＮＡを操作可能に結合させることにより、完全長重鎖遺伝子に変換させ得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合させ得る。
【０４１１】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子にＶＬコード化ＤＮＡを操作可能に結合させることにより、完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換させ得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０４１２】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、該ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする他のフラグメントに操作可能に結合させる(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。
【０４１３】
またここに提供されるのは、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０モノクローナル抗体のものと相同であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子である。核酸分子の例は、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする。またここに提供されるのは、例えば、コドン最適化のための、保存的置換(すなわち、核酸分子への翻訳時、得られたアミノ酸配列を変えない置換)を有する核酸分子である。
【０４１４】
XI. 抗体産生
ここに記載するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載される標準体細胞ハイブリダイゼーション技法などの、多様な既知技術を使用して産生される。体細胞ハイブリダイゼーションが、好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生する他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技法も使用できる。
【０４１５】
ハイブリドーマを製造する好ましい動物システムは、マウスシステムである。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて十分に確立された方法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコールおよび技法は当分野で知られる。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合法も知られる。
【０４１６】
ここに記載するキメラまたはヒト化抗体は、上記のとおり製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき、製造できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を使用して目的のマウスハイブリドーマから得て、非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変され得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当分野で知られる方法を使用して、ヒト定常領域に結合させ得る(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７号参照)。ヒト化抗体を製造するために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに挿入できる(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
【０４１７】
ある実施態様において、ここに記載する抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＧＩＴＲに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなく、ヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを使用して、産生され得る。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ここでそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称し、集合的に“ヒトＩｇマウス”とここで称するマウスを含む。
【０４１８】
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と共にコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチングを受け、体性変異して、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する(Lonberg, N. et al. (1994), supra; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546にレビュー)。ＨｕＭＡｂマウスの作製および使用ならびにこのようなマウスにより担持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載され、この全ての内容を、ここに、これらを全体として援用することにより本明細書に明示的に包含させる。さらに、全てLonbergおよびKayの米国特許５,５４５,８０６号、５,５６９,８２５号、５,６２５,１２６号、５,６３３,４２５号、５,７８９,６５０号、５,８７７,３９７号、５,６６１,０１６号、５,８１４,３１８号、５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９号、Surani et al.の米国特許５,５４５,８０７号、全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４号およびＷＯ９９／４５９６２号およびKorman et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号も参照のこと。
【０４１９】
ある実施態様において、ここに記載する抗体を、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスなどの、導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して、産生させる。このようなマウスは、ここでは“ＫＭマウス”と称し、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号に詳述される。
【０４２０】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的トランスジェニック動物システムが当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の産生に使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称する代替的トランスジェニックシステムを使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許５,９３９,５９８号、６,０７５,１８１号、６,１１４,５９８号、６,１５０,５８４号および６,１６２,９６３号に記載される。
【０４２１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的トランスクロモソミック動物システムが当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の産生に使用できる。例えば、“ＴＣマウス”と称するヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を担持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の産生に使用できる。
【０４２２】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＧＩＴＲ抗体産生に関して文献において記載されているさらなるマウスシステムは、(ｉ)標準組み換えＤＮＡ技術を使用して、キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスで産生され、次いで完全ヒト抗体に変換されるように、内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えにより、内因性マウス定常領域に操作可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域に置き換えられているVelocImmune(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)および(ii)マウスが非再配列ヒト重鎖可変領域を含むが、単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域を含む、ＭｅＭｏ(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体産生のためのこれらの使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７号、ＵＳ２０１０／００６９６１４号、ＷＯ２０１１／０７２２０４号、ＷＯ２０１１／０９７６０３号、ＷＯ２０１１／１６３３１１号、ＷＯ２０１１／１６３３１４号、ＷＯ２０１２／１４８８７３号、ＵＳ２０１２／００７０８６１号およびＵＳ２０１２／００７３００４号に記載される。
【０４２３】
ここに記載するヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリースクリーニングのためのファージディスプレイ方法を使用しても産生され得る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９号、５,４０３,４８４号および５,５７１,６９８号、Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８号および５,５８０,７１７号、McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８号および６,１７２,１９７号およびGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３号、６,５２１,４０４号、６,５４４,７３１号、６,５５５,３１３号、６,５８２,９１５号および６,５９３,０８１号参照。
【０４２４】
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が免疫化により生じ得るように再構成されている、ＳＣＩＤマウスを使用しても産生できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６号および５,６９８,７６７号に記載されている。
【０４２５】
免疫化
ＧＩＴＲに対する完全ヒト抗体を産生するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４号に他の抗原について記載されるとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を含むトランスフェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを、ＧＩＴＲ抗原の精製または富化調製物および／またはＧＩＴＲまたはそのフラグメントを発現する細胞で免疫化させ得る。あるいは、マウスを、ヒトＧＩＴＲまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫化し得る。好ましくは、マウスは、最初の注入時６〜１６週齢である。例えば、組み換えＧＩＴＲ抗原の精製または富化調製物(５〜５０μg)を使用して、ＨｕＭＡｂマウスを腹腔内免疫化できる。ＧＩＴＲ抗原の精製または富化調製物を使用する免疫化が抗体を産生させないとき、マウスをまた免疫応答を促進するために、ＧＩＴＲを発現する細胞、例えば、細胞株でも免疫化し得る。細胞株の例は、ＧＩＴＲを過発現する安定なＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞株を含む。
【０４２６】
各種の抗原で蓄積された証拠から、Ribiのアジュバント中の抗原でまず腹腔内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)に免疫化し、その後Ribiのアジュバント中の抗原で隔週ＩＰ／ＳＣ免疫化(最大計１０回)することにより、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスが最良に応答することが示されている。免疫応答を、免疫化プロトコールの間、後眼窩放血により得た血漿サンプルを用いてモニターできる。血漿をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ(下記のとおり)でモニターし、抗ＧＩＴＲヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に使用する。マウスを、屠殺３日前に抗原の静脈内投与によりブーストし、脾臓およびリンパ節を摘出してよい。各免疫化のための２〜３融合が、実施のために必要であることが予測される。６〜２４マウスが、一般に各抗原について免疫化される。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２の両導入遺伝子を、２個の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一マウスで繁殖させ得る(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)。
【０４２７】
ＧＩＴＲに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生
ここに記載するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合させ得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１)と、５０％ＰＥＧを用いて融合させ得る。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約２×１０５で播種し、続いて１０％Fetal Clone血清、１８％“６５３”条件培地、５％オリゲン(ＩＧＥＮ)、４mM  Ｌ−グルタミン、１mM  ピルビン酸ナトリウム、５mM  ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ml  ペニシリン、５０mg／ml  ストレプトマイシン、５０mg／ml  ゲンタマイシンおよび１Ｘ  ＨＡＴ(Sigma)含有選択培地で、２週間インキュベートした。約２週間後、細胞を、ＨＡＴがＨＴに置き換えられた培地で培養してよい。次いで個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡでスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を通常１０〜１４日後観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再スクリーニングし、ヒトＩｇＧについてなお陽性であるならば、該モノクローナル抗体を少なくとも２回限界希釈によりサブクローン化できる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地で少量の抗体を産生できる。
【０４２８】
ヒトモノクローナル抗体精製のために、選択ハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮し、その後プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, N.J.)をし得る。溶出ＩｇＧを、純度を確実にするためにゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認してよい。緩衝液溶液をＰＢＳに交換してよく、濃度を、１.４３透過係数を使用するＯＤ２８０で決定できる。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃で保存してよい。
【０４２９】
ＧＩＴＲに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの産生
抗体を、当分野で周知のとおり、例えば、組み換えＤＮＡ技術と遺伝子導入方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させ得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【０４３０】
例えば、抗体または抗体そのフラグメントを発現させるために、一部または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技術(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、ＤＮＡを該遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に結合するように発現ベクターに挿入させ得る。この場合、用語“操作可能に結合”は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が該抗体遺伝子の転写および翻訳制御の意図する機能を発揮するように、ベクターにライゲートされることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合性であるように選択され得る。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入しても、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子は、標準方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターの相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーション)により発現ベクターに挿入される。ここに記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に結合し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に結合するように、それらを既に所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をコードする発現ベクターに挿入することにより、あらゆる抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を産生できる。
【０４３１】
これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、ベクターにクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドでも、異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)でもよい。
【０４３２】
例示的実施態様において、ヒト抗体重鎖および軽鎖からの次のシグナルペプチドが使用され得る。MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)；MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号３２１)；MEFGLNWVFLVALLRGVQC(配列番号３２７)；MEFGLSWIFLAAILKGVQC(配列番号３２９)；MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号３３３)；MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号３２３)；MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号３２５)；MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号３１７)；MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号３１９)；およびMETPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号３３１)。
【０４３３】
抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖および軽鎖を、これらがクローン化されたハイブリドーマにおける各鎖に結合させた各シグナル配列と共に、発現させ得る。下記は、これらがクローン化されたハイブリドーマに存在する各種の抗ＧＩＴＲ抗体のシグナル配列であり、このシグナル配列を同じ抗体または他の抗体の発現に使用できる：
２８Ｆ３  ＶＨシグナル配列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号３１６)
２８Ｆ３  ＶＬシグナル配列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号３１７)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT(配列番号３１８)
１８Ｅ１０  ＶＨシグナル配列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号３１６)
１８Ｈ１０  ＶＬシグナル配列：
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号３１７)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGAT(配列番号３１８)
１９Ｄ３  ＶＨシグナル配列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号３１６)
１９Ｄ３  ＶＬシグナル配列：
MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号３１９)
ATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号３２０)
３Ｃ３  ＶＨシグナル配列：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号３２１)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号３２２)
３Ｃ３  ＶＬ１シグナル配列：
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号３２３)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号３２４)
３Ｃ３  ＶＬ２シグナル配列：
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号３２５)
ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号３２６)
８Ａ６  ＶＨシグナル配列：
MEFGLNWVFLVALLRGVQC(配列番号３２７)
ATGGAGTTTGGGCTGAACTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号３２８)
８Ａ６  ＶＬシグナル配列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号３１７)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号３１８)
９Ｇ７  ＶＨシグナル配列：
MEFGLSWIFLAAILKGVQC(配列番号３２９)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATTTTCCTTGCTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(配列番号３３０)
９Ｇ７  ＶＬ１およびＶＬ２シグナル配列：
METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号３３１)
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号３３２)
１４Ｅ３  ＶＨシグナル配列：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号３３３)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号３３４)
１４Ｅ３  ＶＬシグナル配列：
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号３２３)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号３２４)
１９Ｈ８ＶＨシグナル配列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号３１６)
１９Ｈ８  ＶＬ１シグナル配列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号３１７)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号３１８)
１９Ｈ８  ＶＬ２シグナル配列：
ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ(配列番号３２５)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号３２６)
６Ｇ１０  ＶＨシグナル配列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号３１６)
６Ｇ１０  ＶＬシグナル配列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号３１７)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号３１８)
【０４３４】
シグナル配列MRAWIFFLLCLAGRALA(配列番号３６７)を、重鎖および軽鎖の発現に使用し得る。
【０４３５】
表１５に提供するものなどの重鎖および軽鎖またはその一部を、ここに提供するシグナル配列に結合させ得る。例えば、配列番号１３、１５、１７または１８を含む、例えば、２８Ｆ３重鎖またはその可変領域を、MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号３１５)またはMRAWIFFLLCLAGRALA(配列番号３６７)を含むまたはこれからなるシグナルペプチドに結合または融合させ得る。例えば、配列番号１４、１６または１９を含む２８Ｆ３軽鎖またはその可変領域を、MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号３１７)またはMRAWIFFLLCLAGRALA(配列番号３６７)を含むまたはこれからなるシグナルペプチドに結合または融合させ得る。
【０４３６】
抗体鎖遺伝子以外に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御性配列を含み得る。用語“制御性配列”は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。このような制御性配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。制御性配列の選択を含む発現ベクターの設計は、トランスフォームする宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどのような因子により得ることは、当業者に認識される。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御性配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御性配列を使用し得る。なおさらに、制御性要素は、ＳＶ４０早期プロモーターからの配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列を含むＳＲαプロモーターシステムのように、各種の源からの配列からなる(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０４３７】
抗体鎖遺伝子および制御性配列以外に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子などのさらなる配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、Axel et al.の米国特許４,３９９,２１６号、４,６３４,６６５号および５,１７９,０１７号参照)。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞において使用)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択用)を含む。
【０４３８】
軽鎖および重鎖発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。用語“トランスフェクション”の各種の形態は、外来性ＤＮＡの原核生物または真核生物宿主細胞への導入に一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。ここに記載する抗体を原核生物または真核生物宿主細胞で発現させることは理論上可能であるが、真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が、このような真核生物細胞および特に哺乳動物細胞が、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を集合させ、分泌する可能性が原核生物細胞より高いため、最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性抗体の高収量での産生に効果的でないと報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
【０４３９】
ここに記載する組み換え抗体の発現のための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のとおりＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用する、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞で使用するために、他の好ましい発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号およびＥＰ３３８,８４１号に開示するＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞を、該宿主細胞での該抗体の発現、または、より好ましくは、該宿主細胞が増殖している培養培地への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、培養することによる。抗体を、標準タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収し得る。
【０４４０】
XII. アッセイ
ここに記載する抗体を、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、ＧＩＴＲへの結合について試験し得る。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μg／mlの精製ＧＩＴＲで被覆し、次いで５％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液で遮断する。抗体希釈物(例えば、ＧＩＴＲ免疫化マウスからの血漿希釈物)を各ウェルに添加し、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)にコンジュゲートした二次試薬(例えば、ヒト抗体について、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)と、１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc, product: ABTS-1000)で展開し、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計により分析する。免疫化マウスからの血清を、さらに、フローサイトメトリーにより、ヒトＧＩＴＲを発現する細胞株に結合するが、ＧＩＴＲを発現しない対照細胞株には結合しないことについてスクリーニングする。簡潔にいうと、抗ＧＩＴＲ抗体の結合を、ＧＩＴＲ発現ＣＨＯ細胞と、抗ＧＩＴＲ抗体を、１：２０希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂで検出する。フローサイトメトリー解析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施する。好ましくは、最高力価を生ずるマウスを融合に使用する。
【０４４１】
上記のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体を、それ故に、ＧＩＴＲ免疫原と陽性反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングできる。ＧＩＴＲに、好ましくは高親和性で、結合する抗体を産生するハイブリドーマを、次いで、サブクローン化し、さらに特徴付けしてよい。親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによる)各ハイブリドーマからの１クローンを、次いで、細胞銀行の作製および抗体精製のために選択し得る。
【０４４２】
抗ＧＩＴＲ抗体を精製するために、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製のための２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮し、その後プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, N.J.)をし得る。溶出ＩｇＧを、純度を確実にするためにゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認してよい。緩衝液溶液をＰＢＳに交換してよく、濃度を、１.４３透過係数を使用するＯＤ２８０で決定できる。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃で保存してよい。
【０４４３】
選択した抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか否かを決定するために、各抗体を、市販試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化できる。ビオチニル化ＭＡｂ結合を、ストレプトアビジン標識プローブで検出できる。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記のとおりＧＩＴＲ被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して実施できる。
【０４４４】
精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンで、一夜、４℃で被覆し得る。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを、１μg／ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼ−コンジュゲートプローブと反応させ得る。プレートを上記のとおり、展開し、分析する。
【０４４５】
ＧＩＴＲを発現する生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を試験するために、実施例に記載のとおり、フローサイトメトリーを使用できる。簡潔にいうと、膜結合ＧＩＴＲを発現する細胞株(標準増殖条件下で増殖)を、各種の濃度のモノクローナル抗体と、０.１％ＢＳＡ中ＰＢＳ中、４℃で１時間混合する。洗浄後、細胞をフルオレセイン標識抗ＩｇＧ抗体と、一次抗体染色と同じ条件下反応させる。サンプルを、単一セル上をゲーティングする光および側方散乱性質を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により分析し、標識抗体の結合を決定する。蛍光顕微鏡を使用するフローサイトメトリーアッセイ以外のアッセイも(これに加えてまたはこの代わりに)使用し得る。細胞を、直前に記載したとおり染色し、蛍光顕微鏡で試験し得る。この方法は、個々の細胞の可視化を可能とするが、抗原の密度により感受性が低いかもしれない。
【０４４６】
抗ＧＩＴＲ抗体を、ウェスタンブロッティングによりＧＩＴＲ抗原との反応性についてさらに試験し得る。簡潔にいうと、ＧＩＴＲを発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し得る。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でブローブする。ＩｇＧ結合を抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出でき、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠で展開させる(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)。
【０４４７】
各種の抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性、交差反応性および結合動態を分析する方法は、当分野で知られる標準アッセイ、例えば、BiacoreTM 2000 SPR装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するBiacoreTM表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)解析を含む。
【０４４８】
ある実施態様において、抗体は、ヒトＧＩＴＲの細胞外領域に特異的に結合する。抗体は、ＧＩＴＲの細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に特異的に結合し得る。特定の実施態様において、抗体は、ＧＩＴＲ上のＧＩＴＲ−Ｌが結合する部位に特異的に結合する。ある実施態様において、抗体は、ヒトＧＩＴＲの細胞外領域およびカニクイザルＧＩＴＲの細胞外領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、ヒトＧＩＴＲに高親和性で結合する。
【０４４９】
XIII イムノコンジュゲート、抗体誘導体および診断
ここに記載する抗体を、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用でき、この目的のために、抗体(またはその結合フラグメント)を、イムノコンジュゲートを形成するために適切な検出可能剤とコンジュゲートさせ得る。診断目的で、適切な薬剤は、全身造影のための放射性同位体、およびサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
【０４５０】
検出可能標識は、コロイド金などの金属ゾルを含む粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチドキレート剤と共に提供されるＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ鎖反応などにより増幅後明らかにされるポリヌクレオチドタグを含む、インビトロ診断の分野で現在使用される各種のタイプの何れでもよい。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１３,７}デカン}−４−イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)などの１,２−ジオキセタン基質ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ(登録商標)または当分野で周知の他の発光基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)などの適当なランタニドのキレートの変換後、化学発光の存在または形成の測定により検出される、酵素アルカリホスファターゼであり得る。検出手段は、選択した標識により決定される。標識またはその反応産物の視認は、標識が粒子であり、適切なレベルで蓄積するときは裸眼で、または分光光度計、ルミノメーター、フルオロメーターなどのような装置を使用して(全て標準的操作による)、達成され得る。
【０４５１】
好ましくは、コンジュゲーションの方法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性の結合、例えば、ペプチド結合(すなわちアミド結合)、スルフィド結合、(立体障害)、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合およびエーテル結合をもたらす。これらの結合はほぼ非免疫原性であり、血清内で合理的な安定性を示す(例えばSenter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244、ＷＯ２００９／０５９２７８号、ＷＯ９５／１７８８６号参照)。
【０４５２】
抗体およびその部分の生化学的性質により、各種のコンジュゲーション戦略が用いられ得る。部分が、５０〜５００アミノ酸の天然に存在するまたは組み換え物であるとき、タンパク質コンジュゲートの合成の化学を説明する教科書に標準法が記載され、当業者はこれに容易に倣い得る(例えばHackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074参照)。ある実施態様において、マレイミド部分と、抗体またはその部分のシステイン残基の反応が利用される。これは、例えば抗体のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントが使用されるとき、特に適するカップリング化学である。あるいは、ある実施態様において、抗体またはその部分のＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質、例えばＦａｂフラグメントのＣ末端修飾は、例えば(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)により実施され得る。
【０４５３】
一般に、部位特異的反応および共有結合カップリングは、天然アミノ酸の、存在する他の官能基の反応性と直交する、反応性を有するアミノ酸への変換に基づく。例えば、希な配列構成内の特定のシステインを、アルデヒドに酵素的に変換し得る(Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427参照)。所望のアミノ酸修飾を、ある配列構成における天然アミノ酸とのある酵素の特異的酵素反応性の利用により得ることが可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136参照; そして、Ｃ−Ｎ結合のプロテアーゼ触媒形成は、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403により使用される)。
【０４５４】
部位特異的反応および共有結合カップリングも、末端アミノ酸と適切な修飾剤の選択的反応により達成され得る。
【０４５５】
Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662参照)を使用して、部位特異的共有結合カップリングを達成できる。
【０４５６】
天然化学ライゲーションはまたＣ末端システイン残基を利用できる(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。
【０４５７】
ＥＰ１０７４５６３号は、負に帯電したアミノ酸のストレッチ内のシステインと、正に帯電したアミノ酸のストレッチに位置するシステインの速い反応に基づくコンジュゲーション方法を記載する。
【０４５８】
部分はまた合成ペプチドまたはペプチド模倣体でもよい。ポリペプチドが化学的に合成されるとき、直交化学反応性を有するアミノ酸を、このような合成中に取り込み得る(例えばde Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295参照)。多種多様な直交官能基が問題となっており、合成ペプチドに導入できるため、このようなペプチドのリンカーへのコンジュゲーションは標準化学である。
【０４５９】
単標識ポリペプチドを得るために、１：１化学量論のコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーにより分離し得る。この方法は、色素標識結合対メンバーおよび荷電リンカーの使用を容易にし得る。この種の標識および高度に負に帯電した結合対メンバーの使用により、モノコンジュゲートポリペプチドを、非標識ポリペプチドおよび１を超えるリンカーを担持するポリペプチドから、電荷および分子量の差異を分離に使用できるため、容易に分離される。標識一価結合剤のように、蛍光色素は、非結合成分から複合体を精製するために有用であり得る。
【０４６０】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体に結合した部分は、結合部分、標識部分および生物学的活性部分からなる群から選択される。
【０４６１】
ここに記載する抗体はまた抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)などのイムノコンジュゲートを形成するために、治療剤にコンジュゲートし得る。適当な治療剤は、代謝拮抗剤、アルキル化薬剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡクロスリンカー、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核排出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および有糸分裂阻害剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくはペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの開裂可能リンカーによりコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号２１９)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許７,０８７,６００号、６,９８９,４５２号および７,１２９,２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０号、ＷＯ０７／０３８６５８号、ＷＯ０７／０５１０８１号、ＷＯ０７／０５９４０４号、ＷＯ０８／０８３３１２号およびＷＯ０８／１０３６９３号、米国特許公開２００６００２４３１７号、２００６０００４０８１号および２００６０２４７２９５号に記載のとおり製造でき、これらの開示を引用により本明細書に包含させる。
【０４６２】
抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載するものは、ヒトＧＩＴＲ、例えば、組織または組織サンプルにおけるヒトＧＩＴＲなどのＧＩＴＲの検出のためにも使用され得る。抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーに使用され得る。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、細胞、例えば、組織中の細胞と、特異的結合が生じるのに適切な時間接触させ、次いで、抗ＧＩＴＲ抗体を検出する試薬、例えば、抗体を添加する。アッセイの例は、実施例に提供する。抗ＧＩＴＲ抗体は完全ヒト抗体であってよく、またはヒト可変領域およびマウス定常領域またはその一部を有する抗体などのキメラ抗体であってよい。サンプル(細胞または組織サンプル)中のＧＩＴＲ、例えば、ヒトＧＩＴＲを検出する方法の例は、(ｉ)サンプルと抗ＧＩＴＲ抗体を、該抗ＧＩＴＲ抗体と、サンプル中のＧＩＴＲの特異的結合を可能にするのに十分な時間接触させ、そして(ii)該サンプルと、抗ＧＩＴＲ抗体、例えば抗ＧＩＴＲ抗体のＦｃ領域と特異的に結合し、それにより該抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲ結合を検出する検出試薬、例えば、抗体と接触させることを含む。洗浄工程が、抗体および／または検出試薬とのインキュベーション後に含まれていてもよい。これらの方法において使用するための抗ＧＩＴＲ抗体は、別の検出剤を使用できるため、標識または検出薬剤と結合している必要はない。
【０４６３】
例えば、単剤療法または組み合わせ治療としての、抗ＧＩＴＲ抗体の他の使用を、ここに、例えば、組み合わせ処置に関するセクションに提供する。
【０４６４】
XIV. 二重特異性分子
ここに記載する抗体を、二重特異性分子の形成のために使用し得る。抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を、少なくとも２個の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生するために、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)で誘導体化するかまたはそれと結合できる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体を、ここに記載するタンパク質(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３に対する抗体)などの組み合わせ処置の標的として使用できる可能性のある、何らかのタンパク質に特異的に結合する抗体またはｓｃＦｖと結合させ得る。ここに記載する抗体は、実際２を超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために、１を超える他の機能的分子で誘導体化するかまたはそれと結合でき、このような多特異的分子も、ここで使用する用語“二重特異性分子”に包含されることが意図される。ここに記載する二重特異性分子を産生するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子がもたらされるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの１以上の他の結合分子と機能的に結合(例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他)させ得る。
【０４６５】
従って、ここに提供されるのは、少なくとも一つのＧＩＴＲに対する第一結合特異性および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む、二重特異性分子である。二重特異性分子が多特異的であるここに記載する実施態様において、該分子は、さらに第三結合特異性を含み得る。
【０４６６】
ある実施態様において、ここに記載する二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも一つの抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)を含むその抗体フラグメントを含む。抗体はまた軽鎖または重鎖二量体またはＦｖなどのその任意の最小フラグメントまたは内容を引用により明示的に本明細書に包含させるLadner et al.の米国特許４,９４６,７７８号に記載の一本鎖構築物であり得る。
【０４６７】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、ここに記載する二重特異性分子において用いられ得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０４６８】
ここに記載する二重特異性分子は、構成物結合特異性を、当分野で知られる方法を使用してコンジュゲートすることにより製造され得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に産生し、互いにコンジュゲートし得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、多様なカップリングまたは架橋剤を共有結合コンジュゲーションのために使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を含む(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載のものを含む。好ましい結合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、何れもPierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
【０４６９】
結合特異性が抗体であるとき、これらは、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートされ得る。特に好ましい実施態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーション前に、奇数の、好ましくは１スルフヒドリル残基を含むように、修飾する。
【０４７０】
あるいは、両結合特異性は同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞内で発現および集合される。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×(ｓｃＦｖ)２、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき、特に有用である。二重特異性抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む、抗体を含み得る。ここに記載する二重特異性分子は、１個の一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２個の結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は少なくとも２個の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を製造する方法は、例えば米国特許５,２６０,２０３号、米国特許５,４５５,０３０号、米国特許４,８８１,１７５号、米国特許５,１３２,４０５号、米国特許５,０９１,５１３号、米国特許５,４７６,７８６号、米国特許５,０１３,６５３号、米国特許５,２５８,４９８号および米国特許５,４８２,８５８号に記載されている。
【０４７１】
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイなどの当分野で認識されている方法を使用して確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に目的の複合体に特異的な標識剤(例えば、抗体)を用いることにより、特に関心のあるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０４７２】
XV. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤した、抗ＧＩＴＲ抗体の一つもしくはこの組み合わせまたはここに記載する他の標的に対する抗体もしくはその抗原結合部分との組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、抗体またはイムノコンジュゲートまたはここに記載する二重特異性分子の１個または組み合わせ(例えば、２種以上)を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の各種のエピトープに結合するまたは相補的活性を有する、抗体の組み合わせ(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)を含み得る。
【０４７３】
ある実施態様において、組成物は、少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／ml、１〜３００mg／mlまたは１００〜３００mg／mlの濃度で抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
【０４７４】
ここに記載する医薬組成物をまた組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせても投与できる。例えば、組み合わせ治療は、少なくとも１つの他の抗癌および／またはＴ細胞刺激性(例えば、活性化)剤と組み合わせて、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を含み得る。組み合わせ治療で使用し得る治療剤の例は、ここに記載する抗体の使用における下のセクションにさらに詳述する。
【０４７５】
ある実施態様において、ここに開示する治療組成物は、癌処置に使用する他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、化学療法薬物、小分子薬物またはある癌に対する免疫応答を刺激する抗体を含み得る。いくつかの例において、治療組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体、抗ＣＤ１３７抗体または抗ＬＡＧ−３抗体の１以上を含み得る。
【０４７６】
ここで使用する“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌薬剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適する。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子を、該化合物を不活化し得る酸および他の天然条件から保護するための物質で被覆してよい。
【０４７７】
ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は、親化合物の所望の生物活性を保持し、望まない毒性学的効果を付与しない塩をいう(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの非毒性無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものを含む。
【０４７８】
ここに記載する医薬組成物は薬学的に許容される抗酸化剤も含んでよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤および(３)クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤を含む。
【０４７９】
ここに記載する医薬組成物において用い得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持により、そして界面活性剤の使用により、維持され得る。
【０４８０】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の存在の防止は、上記滅菌法および各種の抗細菌および抗真菌薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの添加により、確実にし得る。組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を包含させるのが望ましい場合がある。さらに、注射剤形態の吸収延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の添加により、もたらされ得る。
【０４８１】
薬学的に許容される担体は、無菌注射液または懸濁液の即席調製のための無菌水溶液または分散体および無菌粉末を含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られる。何らかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性でない限り、ここに記載する医薬組成物におけるその使用は企図される。医薬組成物は防腐剤を含んでよくまたは防腐剤を欠いてよい。補助的活性化合物を組成物に包含させ得る。
【０４８２】
治療組成物は、一般に製造および保存条件下で、無菌かつ安定でなければならない。組成物を溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適する他の秩序構造として製剤し得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持により、そして界面活性剤の使用により、維持され得る。多くの場合、組成物が等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射剤形態の吸収延長は、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤の添加により、もたらされ得る。
【０４８３】
無菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に取り込ませ、その後精密濾過により滅菌することにより製造され得る。一般に、分散体は、活性化合物を、塩基性分散媒体およびここに挙げる必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込ませることにより製造する。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、予め精密濾過した溶液からの活性成分と何らかの付加的所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
【０４８４】
単一投与形態を製造するために担体物質と合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方式により変わる。単一投与形態を製造するために担体物質と合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセント中、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて活性成分が約０.０１パーセント〜約９９パーセント、活性成分が好ましくは約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０４８５】
投与レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてよく、数分割用量が時間をかけて投与されてよくまたは治療状況の緊急要請により指示されるとおり用量を比例的に減量し、または増量してもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経腸組成物を投与量単位形態で製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置する対象のための単位投与量として適する物理的に分けられた単位をいい、各単位は、必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された既定の量の活性化合物を含む。ここに記載する投与量単位形態の仕様は、(ａ)活性化合物の特有の特徴および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)処置に対する個々の対象の感受性によりこのような活性化合物の製剤分野固有の限度によって、指示され、直接的に依存する。
【０４８６】
抗体投与のために、投与量は約０.０００１〜１００mg／kg、より一般には０.０１〜５または１０mg／kg宿主体重の範囲である。例えば投与量は０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内であり得る。処置レジメの例は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３ヶ月に１回または６ヶ月に１回の投与を伴う。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の好ましい投与レジメンは、静脈内投与による１mg／kg体重または３mg／kg体重を含み、該抗体は、次の投与スケジュール、(ｉ)６回４週毎、次いで３ヶ月毎、(ii)３週毎、(iii)３mg／kg体重１回、続いて１mg／kg体重３週毎の一つを使用して投与される。
【０４８７】
抗ＧＩＴＲ抗体は、均一用量(均一用量レジメン)で投与し得る。
【０４８８】
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、各抗体の投与される投与量は、記載した範囲内に入る。抗体は、通常複数回投与される。単回投与の間隔は、例えば、週、月、３ヶ月毎または年であり得る。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定により指示されるような、不規則でもよい。ある方法において、投与量を、約１〜１０００μg／mlおよびある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するために調製する。
【０４８９】
抗ＧＩＴＲ抗体を、他の抗体の投与レジメンで、他の抗体と共に投与し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体を、ニボルマブ(オプジーボ)などの抗ＰＤ−１抗体と、疾患が進行するまでまたは許容されない毒性が生じるまで２週間毎に６０分にわたるｉ.ｖ.点滴で投与してよい。抗ＧＩＴＲ抗体を、ペンブロリズマブ(キイトルーダ)と、疾患が進行するまでまたは許容されない毒性が生じるまで３週毎に３０分にわたるｉ.ｖ.点滴で投与してよい。
【０４９０】
抗体を持続放出製剤として投与でき、この場合、必要な投与頻度は少ない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により異なる。一般に、ヒト抗体が最長半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防適用の場合、長期にわたり、比較的低投与量が、比較的低頻度で投与される。生涯わたり処置を受け続ける患者がいる。治療的適用において、比較的短い間隔の比較的高投与量が、疾患の進行が減速または停止するまでおよび好ましくは患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで必要である。その後、患者に予防レジメで投与し得る。
【０４９１】
ここに記載する医薬組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物および投与方式で所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量を得るために変わり得る。選択投与量レベルは、用いるここに記載する特定の薬物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および先の病歴および医学分野で周知の類似因を含む、多様な薬物動態因子による。
【０４９２】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の“治療有効投与量”は、好ましくは疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防をもたらす。癌の場合、治療有効用量は、好ましくは生存期間延長および／または癌と関連する身体症状のさらなる悪化の予防をもたらす。癌の症状は、当分野で周知であり、例えば、異常黒子特性、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の外観変化、新規着色皮膚領域、異常黒子、爪の下の黒ずみ、乳房腫瘤、乳首変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力、過度の疲労、食事困難、食欲減退、慢性咳嗽、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨満感、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、寒気、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。
【０４９３】
治療有効用量は、疾患の早期的または前駆的徴候があるときに望まれ得るような癌の予防または発症遅延をし得る。癌の診断に利用される臨床検査は、化学(ＧＩＴＲレベルの測定を含む)、血液学、血清学および放射線学を含む。従って、前記の何れかをモニターする何らかの臨床的または生化学的アッセイを、特定の処置が癌処置のための治療有効用量であるか否かの決定に使用し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択した特定の組成物または投与経路などの因子に基づき、このような量を決定できる。
【０４９４】
ここに記載する組成物を、多様な当分野で知られる方法の１以上を使用して、１以上の投与経路で投与し得る。当業者には認識されるとおり、投与経路および／または方式は、所望の結果により変わる。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常、注射による、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない投与方式を意味する。
【０４９５】
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所のような非経腸ではない経路により投与し得る。
【０４９６】
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて製剤し得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を製造するための多くの方法が特許されているかまたは一般に当業者に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０４９７】
治療組成物を、当分野で知られる医薬デバイスを用いて投与し得る。例えば、好ましい実施態様において、ここに記載する治療組成物は、米国特許５,３９９,１６３号、５,３８３,８５１号、５,３１２,３３５号、５,０６４,４１３号、４,９４１,８８０号、４,７９０,８２４号、または４,５９６,５５６号に開示のデバイス等の無針皮下注射デバイスで投与できる。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と共に使用する周知のインプラントおよびモジュールは、制御速度で薬物を分配するための植込み型微小注入ポンプを開示する米国特許４,４８７,６０３号、皮膚を介して薬物を投与するための治療デバイスを開示する米国特許４,４８６,１９４号、正確な注入速度で薬物を送達する薬物注入ポンプを開示する米国特許４,４４７,２３３号、連続的薬物送達のための変流量植込み型注入装置を開示する米国特許４,４４７,２２４号、多チャンバー区画を有する浸透性薬物送達システムを開示する米国特許４,４３９,１９６および浸透性薬物送達システムを開示する米国特許４,４７５,１９６号を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達システムおよびモジュールが当業者に知られる。
【０４９８】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、インビボでの適切な分布を可能にするために製剤し得る。例えば、血液−脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度親水性化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通過することを確実とするため(例えば、脳腫瘍のために、所望であるならば)、例えば、リポソーム中に製剤され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許４,５２２,８１１号、５,３７４,５４８号および５,３９９,３３１号参照。リポソームは、特異的細胞または臓器に選択的に輸送され、それにより標的薬物送達を増強する、１以上の部分を含む(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。ターゲティング部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許５,４１６,０１６号参照)、マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)、抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)、界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)、ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照のこと。
【０４９９】
XVI. 使用および方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＧＩＴＲシグナル伝達活性化による免疫応答の増強またはＧＩＴＲの検出が関与する、多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。好ましい実施態様において、ここに記載する抗体はヒト抗体である。例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、培養中の細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで、多様な疾患における免疫を増強するために、投与し得る。従って、ここに提供されるのは、対象における免疫応答が修飾されるように、ここに記載する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法である。好ましくは、応答は、増強、刺激または上方制御される。
【０５００】
好ましい対象は、免疫応答の増強が望まれるヒト患者である。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞介在免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)増強により処置可能な障害を有するヒト患者の処置に特に適する。特定の実施態様において、方法は、インビボでの癌処置に特に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を目的の抗原と共に投与でき、または抗原は処置する対象(例えば、腫瘍担持またはウイルス担持対象)に既に存在し得る。ＧＩＴＲに対する抗体を他の薬剤と投与するとき、２剤を別々に投与しても同時に投与してもよい。
【０５０１】
また包含されるのは、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合するモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、該抗体またはその一部とヒトＧＩＴＲの間の複合体形成を可能とする条件下接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＧＩＴＲ抗原の存在を検出するまたはヒトＧＩＴＲ抗原の量を測定する方法である。次いで複合体の形成を検出し、ここで、サンプルと対照サンプルの複合体形成の差異が、サンプルにおけるヒトＧＩＴＲ抗原の指標である。さらに、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、免疫親和性精製によるヒトＧＩＴＲ精製に使用し得る。
【０５０２】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体がＴ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激または共刺激する能力を考慮して、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答の刺激、増強または上方制御のためにここに記載する抗体を使用するインビトロおよびインビボ方法である。ある実施態様において、ＣＤ３刺激もまた提供され(例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との共インキュベーションにより)、この刺激は、抗ＧＩＴＲ抗体での刺激と同時に、前にまたは後に提供される。例えば、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞と、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および場合により抗ＣＤ３抗体を接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法である。抗原特異的Ｔ細胞応答のあらゆる適当な指標が、抗原特異的Ｔ細胞応答の測定のために使用できる。このような適当な指標の非限定的例は、抗体存在下のＴ細胞増殖増加および／または抗体存在下のサイトカイン産生増加を含む。好ましい実施態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２および／またはインターフェロン−γ産生が刺激される。
【０５０３】
抗ＧＩＴＲ抗体により増強または共刺激され得るＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞およびＴ細胞毒性(Ｔｃ)細胞であり得る。
【０５０４】
さらに包含されるのは、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が刺激されるように、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を刺激する方法である。好ましい実施態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は固形腫瘍または液性腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある実施態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある実施態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陽性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はウイルス担持対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０５０５】
さらに提供されるのは、対象における腫瘍の増殖が阻害されるように、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法である。また提供されるのは、ウイルス感染が対象において処置されるように、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置する方法である。
【０５０６】
またここに包含されるのは、対象に治療有効量のここに記載する腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、腫瘍、例えば、癌腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境からＴｒｅｇ細胞を枯渇させる方法である。Ｆｃは、例えば、１以上の活性化Ｆｃ受容体への結合または結合増強などの、エフェクター機能を有するまたはエフェクター機能が増強されたＦｃであり得る。好ましい実施態様において、Ｔｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境におけるＴｅｆｆを顕著に枯渇させまたは阻害せずにおよび腫瘍微小環境外、例えば、末梢におけるＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞の顕著な枯渇または阻害をせずに起こる。ある実施態様において、対象は、例えば、腫瘍微小環境において、Ｔｅｆｆ細胞におけるより高いレベルのＧＩＴＲをＴｒｅｇ細胞に有する。
【０５０７】
ある実施態様において、対象は、アゴニズムを増強する、例えば、阻害性ＦｃＲIIｂに結合するまたは結合が増強されたＦｃを有する抗ＧＩＴＲ抗体で処置される。ある処置は、１以上の活性化ＦｃＲに結合しないまたは結合が低減したＦｃを有する抗ＧＩＴＲ抗体で行われる。抗ＧＩＴＲ抗体は、腫瘍におけるＴｒｅｇおよび／または腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)におけるＴｒｅｇを枯渇させ得る。
【０５０８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、補助治療として対象に与える。抗ＧＩＴＲ抗体での癌を有する対象の処置は、現在の標準治療と比較して長期生存、例えば、長期持続的応答、少なくとも３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の長期生存または少なくとも３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の無再発生存をもたらし得る。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体での癌を有する対象の処置は、癌の再発を予防するかまたは、例えば、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上癌の再発を遅らせる。抗ＧＩＴＲ処置は、第一、第二または第三選択処置として使用し得る。
【０５０９】
好ましい実施態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、顕著に毒性ではない。例えば、ＧＩＴＲ抗体は、例えば、臨床試験における判定で、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１以上に顕著に毒性ではない。ある実施態様において、ＧＩＴＲ抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を顕著に誘発しない。
【０５１０】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲアゴニスト(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体)での対象の処置は、対象の免疫系が対象自体を攻撃する(例えば、自己免疫性応答)または、例えば、アナフィラキシーを起こす程度に免疫系の過剰刺激を引き起こさない。それ故に、抗ＧＩＴＲ抗体は、好ましいことにアナフィラキシーを引き起こさない。
【０５１１】
ある実施態様において、２８Ｆ３のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体での対象の処置は、顕著な炎症性反応、例えば、免疫介在間質性肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎臓機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症または他の免疫介在有害反応を起こさない。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ２８Ｆ３のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体は、他の抗ＧＩＴＲ抗体より炎症性反応、例えば、免疫介在間質性肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎臓機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、アナフィラキシーまたは他の免疫介在有害反応を起こさない。他の免疫介在有害反応は、心臓障害、例えば、心室性不整脈、眼障害、例えば、虹彩毛様体炎、注射に伴う反応、アミラーゼ上昇、リパーゼ上昇、神経系障害、例えば、めまい、末梢および感覚性ニューロパチー、皮膚および皮下組織障害、例えば、発疹、掻痒、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、白斑症または乾癬、呼吸器、胸部および縦隔障害、例えば、咳嗽、疲労、悪心、食欲減退、便秘、関節痛および下痢を含む。
【０５１２】
ある実施態様において、ＧＩＴＲ抗体は、免疫系を刺激する化合物(例えば、腫瘍免疫療法剤)、例えば、ここに記載する化合物またはここに記載する標的を調節する化合物などの他の癌治療との組み合わせで相乗的抗腫瘍効果を提供する。
【０５１３】
これらおよび他のここに記載する方法を、下にさらに詳述する。
【０５１４】
癌
抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲの活性化は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強できる。ここに提供されるのは、対象が処置される、例えば、癌腫瘍の増殖が阻害または低減されるおよび／または腫瘍が退縮するおよび／または長期生存が達成されるように、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗ＧＩＴＲ抗体を、癌腫瘍の増殖阻害のために単独で使用し得る。あるいは、抗ＧＩＴＲ抗体を、下記のとおり、他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて使用し得る。
【０５１５】
従って、ここに提供されるのは、対象に治療有効量のここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１またはその抗原結合部分を投与することを含む、例えば腫瘍細胞増殖阻害により、対象における、癌を処置する方法である。抗体は、ヒト抗ＧＩＴＲ抗体(例えばここに記載するヒト抗ヒトＧＩＴＲ抗体の何れか)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、キメラまたはヒト化抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３または他のここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の配列を含むキメラまたはヒト化抗ＧＩＴＲ抗体であり得る。
【０５１６】
本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、免疫療法に一般に応答性であるおよび免疫療法に一般に応答性ではない癌を含む。癌は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍(液性腫瘍)を伴う癌であり得る。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、扁平上皮非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫、例えば皮膚または眼内悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部癌、精巣癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系の腫瘍(ＣＮＳ)、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ関連または起源腫瘍))および２つの主要な血液細胞系列、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)の何れかに由来する血液系腫瘍、例えば全タイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病、例えば、急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽細胞性白血病(Ｍ１)、骨髄芽細胞性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、弧発性顆粒球性肉腫および緑色腫、リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ  １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(���ＨＬ)、免疫芽細胞性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも称される)およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)、骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも称される)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫、骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍、精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含む中枢および末梢神経の腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、例えば、小細胞および大脳様細胞型のものを含むＴ細胞障害Ｔ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)を含むが、これらに限定されないＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む、他の腫瘍、好ましくはＴ細胞型の大顆粒状リンパ球白血病(ＬＧＬ)、ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫、末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽細胞サブタイプ)、血管中心性(鼻)Ｔ細胞リンパ腫、頭頸部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、急性骨髄リンパ腫、ならびに該癌の任意の組み合わせを含む。ここに記載する方法を、転移癌、切除不能および／または難治性癌(例えば、例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体遮断による先の免疫療法で難治性の癌)および再発性癌の処置にも使用し得る。
【０５１７】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ  Ａｂを、先の処置、例えば、癌免疫療法剤での先の処置に応答が不十分な癌を有する患者または難治性または耐性の、内因的に難治性または耐性(例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストに難治性)または耐性または難治性状態が後天的である癌を有する患者に投与する。例えば、第一治療に応答しないまたは十分に応答しないまたは処置、例えば、抗ＰＤ−１処置後に疾患進行が見られる対象を、抗ＧＩＴＲ抗体単独または他の治療(例えば、抗ＰＤ−１治療)と組み合わせた投与により、処置し得る。
【０５１８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、腫瘍免疫療法剤、例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストを先に受けて(すなわち、処置されて)いない患者に投与する。
【０５１９】
抗ＧＩＴＲ抗体を標準治療処置と共に投与し得る。抗ＧＩＴＲ抗体を、維持治療、例えば、腫瘍の発生または再発の予防を意図する治療として投与し得る。
【０５２０】
抗ＧＩＴＲ抗体を、他の処置、例えば、放射線、手術または化学療法と共に投与し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体補助治療を、微小転移が存在し得るリスクがあるときおよび／または再発のリスクを低減するために投与し得る。
【０５２１】
抗ＧＩＴＲ抗体を、単剤療法としてまたは唯一の免疫刺激性治療として投与し得る。ＧＩＴＲに対する抗体、例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞などの免疫原性剤とも組み合わせ得る(He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む(さらに下に記載)。
【０５２２】
ヒトにおいて、黒色腫などのある腫瘍は、免疫原性であることが示されている。ＧＩＴＲ活性化によりＴ細胞活性化の閾値を下げることにより、宿主における腫瘍応答が活性化され、非免疫原性腫瘍または免疫原性が限定的な腫瘍の処置を可能とし得る。
【０５２３】
抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体をワクチン接種プロトコールと組み合わせ得る。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; see also Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンは自己または同種腫瘍細胞を使用して産生される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されているとき、最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43)。
【０５２４】
各種の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義を導いている(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が生じた細胞に発現される分化抗原であり、例えばメラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。ＧＩＴＲ活性化を、腫瘍に発現される組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと共に、これらのタンパク質に対する免疫応答を産生するために使用できる。これらのタンパク質は、免疫系により通常自己抗原として見なされ、それ故にそれらに寛容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、８５％を超えるヒト癌で発現され、限られた数の体性組織でしか発現されないタンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原は、タンパク質配列を変えるまたは無関係の２配列の融合タンパク質を作る(すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ)体性変異のため、癌細胞で発現される“ネオ抗原”またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプである。
【０５２５】
他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)などのヒト癌と結びつけられているウイルスからのタンパク質であり得る。ＧＩＴＲ活性化と組み合わせて使用され得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞の送達に極めて有効である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
【０５２６】
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答の引き金を引くのに使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエクスビボで産生でき、各種のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を充填できる(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣは、これらの腫瘍抗原を発現するための遺伝的手段により同様に形質導入される。ＤＣはまた免疫化の目的で腫瘍細胞と直接融合され得る(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、より強力な抗腫瘍応答を活性化するためにＧＩＴＲ活性化と効率的に組み合わせ得る。
【０５２７】
ＧＩＴＲ活性化をまた標準癌処置(例えば、手術、放射線および化学療法)とも組み合わせ得る。ＧＩＴＲ活性化は、化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの場合、投与される化学療法剤の用量を減らすことが可能であるかもしれない(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のためのダカルバジンと組み合わせた抗ＧＩＴＲ抗体である。このような組み合わせの他の例は、黒色腫の処置のためにインターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせた抗ＧＩＴＲ抗体である。ＧＩＴＲ活性化と化学療法の組み合わせ使用の後にある科学的原理は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加をもたらすことである。細胞死によりＧＩＴＲ活性化と相乗性の結果となり得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン遮断である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を作る。血管形成阻害剤もＧＩＴＲ活性化と組み合わせ得る。腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給する血管形成の阻害は、腫瘍細胞死に至る。
【０５２８】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的させる二重特異性抗体と組み合わせて使用し得る(例えば、米国特許５,９２２,８４５号および５,８３７,２４３号参照)。二重特異性抗体を、２個の別々の抗原の標的化に使用し得る。例えば抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍の部位に標的化させるために使用されている。このターゲティングは、腫瘍特異的応答をより効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームはＧＩＴＲの活性化により増強され得る。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によりＤＣに直接送達させ得る。
【０５２９】
腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くは、腫瘍に発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中で、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせで使用して、免疫抑制性因子の影響を相殺し、宿主による腫瘍免疫応答を支持し得る。
【０５３０】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体を、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用し得る。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効率的に置き換えることができ(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用できる。ＣＴＬＡ−４(例えば、米国特許５,８１１,０９７号)、ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169)、４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997))およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)などのＴ細胞共刺激性分子に対する抗体の活性化も、Ｔ細胞活性化レベルの増強のために提供され得る。ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤も、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用し得る。
【０５３１】
骨髄移植は、多様な造血起源の腫瘍の処置に現在使用されている。移植片対宿主病がこの処置の結果であるが、治療利益が移植片対腫瘍応答から得られ得る。ＧＩＴＲ活性化を、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性の増加に使用し得る。
【０５３２】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および増大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的処置プロトコールもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法を、ＣＭＶなどの感染因子に対するＴ細胞応答の活性化にも使用し得る。抗ＧＩＴＲ抗体存在下のエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の出現頻度および活性を増加させ得る。
【０５３３】
感染症
ここに記載する方法を、特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置にも使用し得る。従って、ここに記載する他の態様は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法を提供する。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
【０５３４】
上記の腫瘍への適用に類似して、抗体介在ＧＩＴＲ活性化を、単独でまたはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激し得る。この治療適用が特に有用であり得る病原体の例は、現在効果的ワクチンがない病原体または既存のワクチンの効果が完全とは言えない病原体を含む。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、スタフィロコッカス・アウレウス、シュードモナス・エルギノーサを含む。ＧＩＴＲ活性化は、感染の間に提示抗原が改変されるＨＩＶのような因子による確立された感染に対して有用であり得る。これらの新規エピトープは、抗ヒトＧＩＴＲ抗体投与時に外来として認識され、それ故に、強力なＴ細胞応答が誘発される。
【０５３５】
ここに記載する方法により処置可能な感染原因となる病原性ウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
【０５３６】
ここに記載する方法により処置可能な感染原因となる病原性細菌のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス症、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。
【０５３７】
ここに記載する方法により処置可能な感染原因となる病原性真菌のいくつかの例は、カンジダ(アルビカンス、クルーセイ、グラブラータ、トロピカリスなど)、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ケカビ目(ケカビ属、ユミケカビ、クモノスカビ)、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムを含む。
【０５３８】
ここに記載する方法により処置可能な感染原因となる病原性寄生虫のいくつかの例は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、ネグレリア・フォーレリ、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、トリパノソーマ・ブルセイ、トリパノソーマ・クルージ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンディ、ブラジル鉤虫を含む。
【０５３９】
上記方法の全てにおいて、ＧＩＴＲ活性化を、腫瘍抗原の提示を増強させるサイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または二重特異性抗体治療などの免疫療法の他の形態と組み合わせ得る(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123参照)。
【０５４０】
自己免疫性反応
抗ＧＩＴＲ抗体は、自己免疫性応答を誘発および増幅させ得る。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘導は、多くの抗腫瘍応答に抗自己反応性が関与することを明らかにする(an Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。それ故に、疾患処置のために効率的に自己タンパク質に対する免疫応答を産生するためのワクチン接種プロトコールを考案するために、各種の自己タンパク質と組み合わせた抗ＧＩＴＲ抗体の使用を考えることが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳におけるアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適切な蓄積を伴い、アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着を浄化することができる(Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177)。
【０５４１】
アレルギーおよび喘息の処置のためのＩｇＥおよびリウマチ性関節炎のためのＴＮＦｃなど他の自己タンパク質も標的として使用できる。さらに、各種のホルモンに対する抗体応答を、抗ＧＩＴＲ抗体の使用により誘発させ得る。生殖ホルモンに対する中和抗体応答を、避妊に使用し得る。特定の腫瘍の増殖に必要なホルモンおよび他の可溶性因子の中和抗体応答も、可能性のあるワクチン接種標的として考えることができる。
【０５４２】
抗ＧＩＴＲ抗体の使用に関して上記に類似する方法を、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着、ＴＮＦαおよびＩｇＥなどのサイトカインなどの他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者の処置のための治療自己免疫性応答の誘発のために使用し得る。
【０５４３】
ワクチン
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、抗ＧＩＴＲ抗体と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与による抗原特異的免疫応答刺激に使用し得る。従って、ここに提供されるのは、対象に(ｉ)抗原および(ii)抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を、対象における該抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法である。抗体は、ヒト抗ヒトＧＩＴＲ抗体(例えばここに記載するヒト抗ＧＩＴＲ抗体の何れか)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体からの抗原などの上のセクションに記載したものを含む。
【０５４４】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質を、抗ＧＩＴＲ抗体の代わりにまたはこれに加えてワクチンとして使用し得る。
【０５４５】
インビボおよびインビトロでのここに記載する抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異的および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)の適当な投与経路は当分野で周知であり、当業者により選択され得る。例えば、抗体組成物を、注射(例えば、静脈内または皮下)により投与し得る。使用する分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重および抗体組成物の濃度および／または製剤による。
【０５４６】
先に記載のとおり、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、１以上の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒剤または免疫抑制剤と共投与し得る。抗体を、該薬剤と(免疫複合体として)結合してよくまたは該薬剤と別に投与し得る。後者の場合(別々の投与)、抗体を該薬剤の前、後または同時に投与できまたは他の既知治療、例えば、抗癌治療、例えば、放射線と共投与できる。このような治療剤は、数ある中で、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチン、ブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗新生物薬剤を含み、これは、単独では、患者に毒性またはまたは準毒性であるレベルでのみ効果的である。シスプラチンを、１００mg／ml用量で４週に１回静脈内投与し、アドリアマイシンを、６０〜７５mg／ml用量で２１日毎に静脈内投与する。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合フラグメントと化学療法剤の共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果を生じる各種の機構を経て作用する２種の抗癌剤を提供する。このような共投与は、薬物に対する耐性獲得または腫瘍細胞を抗体に対して非反応性とし得る抗原性の変化による問題を解決し得る。
【０５４７】
またここに記載する範囲内にあるのは、ここに記載する抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性または多特異性分子またはイムノコンジュゲート)および使用指示を含むキットである。キットは、さらに少なくとも一つの付加的薬剤または１以上の付加的なここに記載するヒト抗体(例えば、第一ヒト抗体と異なるＧＩＴＲ抗原におけるエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体)を含み得る。キットは、一般にキット構成物の意図する使用を示すラベルを含む。ラベルなる用語は、キット上にまたはキットと共にまたは他の方法でキットに付随するあらゆる文書または記録媒体を含む。
【０５４８】
組み合わせ治療
上に提供する組み合わせ治療に加えて、抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載するものを、例えば、下記のとおり、癌の処置のための組み合わせ治療において使用し得る。
【０５４９】
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体を、免疫応答刺激に、それにより対象における免疫応答のさらなる増強、刺激または上方制御に効果的である１以上の付加的薬剤、例えば、小分子薬物、抗体またはその抗原結合部分と共投与する組み合わせ治療の方法である。実施例に示すとおり、マウスへのアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体とアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体の投与は、腫瘍増殖阻害に相乗効果を有した。
【０５５０】
一般に、例えば、ここに記載する、抗ＧＩＴＲ抗体を、Ｔ細胞などの免疫細胞の(ｉ)刺激性(例えば、共刺激性)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストおよび／または(ii)阻害性シグナルまたは分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストと組み合わせることができ、この何れも抗原特異的Ｔ細胞応答などの免疫応答の増強をもたらす。ある態様において、腫瘍免疫療法剤は、自然免疫に関与する細胞、例えば、ＮＫ細胞の(ｉ)刺激性(共刺激性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストまたは(ii)阻害性(共阻害性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストであり、該腫瘍免疫療法剤は自然免疫を増強する。このような腫瘍免疫療法剤は、しばしば免疫チェックポイントレギュレーター、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント刺激剤と称される。
【０５５１】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである刺激性または阻害性分子を標的とする薬剤と投与する。例えば、ここに記載する、抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、対象に、免疫応答を増加させるためにＩｇＳＦファミリーｔのメンバーを標的とする薬剤と投与し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体を、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含む膜結合リガンドのＢ７ファミリーメンバーを標的とする(または特異的に結合する)またはＢ７ファミリーメンバーに特異的に結合する共刺激性または共阻害性受容体薬剤と投与し得る。
【０５５２】
抗ＧＩＴＲ抗体はまたＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹおよびＮＧＦＲなどのＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーの分子(リガンドまたは受容体)を標的とする薬剤とも投与し得る(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照)。
【０５５３】
Ｔ細胞応答を、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１および次の薬剤の１以上の組み合わせにより刺激し得る。
(１)上記のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３および次のタンパク質ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４の何れかなどのＴ細胞活性化(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)を阻害するタンパク質のアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤)；および／または
(２)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨなどのＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
【０５５４】
上記タンパク質の一つを調節し、癌の処置のために、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載するものと組み合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイＴＭ(イピリムマブ)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ＢＭＳ−６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ＨｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)を含む。
【０５５５】
抗ＧＩＴＲ抗体をピジリズマブ(ＣＴ−０１１)とも投与してよいが、そのＰＤ−１結合についての特異性は疑問視されている。
【０５５６】
癌の処置のためにアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせることができる他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせ得る。
【０５５７】
Ｔ細胞活性化は、また可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、癌を有する対象に、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと共に投与してもよい。
【０５５８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、癌のような増殖性疾患の処置のために、免疫応答を刺激するために、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリーまたはＢ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤または遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制性サイトカイン”)のアンタゴニストおよび／または(ii)ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激性受容体またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと組み合わせて使用し得る。
【０５５９】
組み合わせ治療のためのさらに他の薬剤は、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４号、ＷＯ１１／１０７５５３号、ＷＯ１１／１３１４０７号、ＷＯ１３／８７６９９号、ＷＯ１３／１１９７１６号、ＷＯ１３／１３２０４４号)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９号、ＷＯ１３１６９２６４号、ＷＯ１４／０３６３５７号)を含む、ＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含むが、これらに限定されないマクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤を含む。
【０５６０】
抗ＧＩＴＲ抗体をＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤とも投与し得る。
【０５６１】
抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得る付加的薬剤は、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモドまたは腫瘍細胞の免疫原性を増強させる治療剤(例えば、アントラサイクリン)を含む。
【０５６２】
抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得るさらに他の治療剤は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療剤、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤を含む。
【０５６３】
抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得る他の治療剤は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療剤である。
【０５６４】
抗ＧＩＴＲ抗体と共に使用し得る他のクラスの薬剤は、アデノシンの形成を阻害するまたはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤を含む。
【０５６５】
癌の処置のために、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得る他の治療剤は、Ｔ細胞アネルギーまたは消耗を回復／防止する治療剤および自然免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症を誘発する治療剤を含む。
【０５６６】
抗ＧＩＴＲ抗体を１を超える腫瘍免疫療法剤と組み合わせてよく、例えば、次の１以上の免疫経路の複数要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせてよい。腫瘍抗原提示を増強させる治療剤(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)；例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路の遮断および／またはＴｒｅｇまたは他の免疫抑制性細胞の枯渇または遮断による、負の免疫制御を阻害する治療剤；例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０および／またはＧＩＴＲ経路の刺激および／またはＴ細胞エフェクター機能の刺激により、正の免疫制御を刺激する治療剤；抗腫瘍Ｔ細胞の出現頻度を全身的に増加させる治療剤；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト(例えば、ダクリズマブ)の使用またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇による、腫瘍におけるＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療剤；腫瘍におけるサプレッサー骨髄細胞の機能に影響を与える治療剤；腫瘍細胞の免疫原性を増強させる治療剤(例えば、アントラサイクリン)；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体で修飾された細胞を含む養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入(ＣＡＲ−Ｔ治療)；インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療剤；Ｔ細胞アネルギーまたは消耗を回復／防止する治療剤；自然免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症を誘発する治療剤；免疫刺激性サイトカインの投与；または免疫抑制性サイトカインの遮断。
【０５６７】
ここに記載するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体を、陽性共刺激性受容体結合するアゴニスト薬剤、阻害性受容体によりシグナル伝達を減弱させる遮断剤、アンタゴニストおよび１以上の抗腫瘍Ｔ細胞の出現頻度を全身性に増加させる薬剤、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制経路に打ち勝つ薬剤(例えば、阻害性受容体結合(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)遮断、Ｔｒｅｇ枯渇または阻害(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)の使用またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇による)、ＩＤＯなどの代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは消耗回復／防止)および自然免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症を誘発する薬剤の１以上と共に使用し得る。
【０５６８】
ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、対象がＢＲＡＦ  Ｖ６００変異陽性であるならば、ＢＲＡＦ阻害剤と共に対象に投与する。
【０５６９】
ある実施態様において、他の免疫刺激性抗体と共に投与される抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載する抗体である。ある実施態様において、他の免疫刺激性抗体と共に投与される抗ＧＩＴＲ抗体は、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する抗体、例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１号に記載の、例えば、６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体、ＷＯ２０１１／０２８６８３号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体、ＪＰ２００８２７８８１４号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体、ＷＯ２０１５／０３１６６７号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体またはここに記載するもしくは言及される他の抗ＧＩＴＲ抗体である。
【０５７０】
ここに提供されるのは、例えば腫瘍増殖を阻害するためまたは抗ウイルス応答を刺激するため、対象において免疫応答が刺激されるように、対象にアゴニスト抗ＧＩＴＲ分子、例えば、抗体および抗ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／または抗ＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体などの付加的免疫刺激性抗体の１以上を投与することを含む、対象における免疫応答を増強する方法である。ある実施態様において、対象にアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体が投与される。ある実施態様において、対象にアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体が投与される。ある実施態様において、対象にアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体が投与される。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載する抗体などのヒト抗体である。あるいは、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、ここにさらに記載するキメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂから製造)などであり得る。ある実施態様において、少なくとも一つの付加的免疫刺激性抗体(例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体)はヒト抗体である。あるいは、少なくとも一つの付加的免疫刺激性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から製造)である。
【０５７１】
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＰＤ−１抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両者を治療量以下の用量で投与する。またここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＧＩＴＲ抗体はここに記載する２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体(例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１)または他のここに記載するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体などのヒト配列モノクローナル抗体である。
【０５７２】
ここに記載する方法において使用するための適当なＰＤ−１アンタゴニストは、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体)および多価薬剤を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４などのＦｃ融合タンパク質である。ある実施態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０５７３】
抗ＰＤ−１抗体の例は、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)またはＷＯ２００６／１２１１６８号に記載の抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１の一つのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある実施態様において、抗ＰＤ１抗体はＷＯ２０１２／１４５４９３号に記載のＭＫ−３４７５(ランブロリズマブ)およびＷＯ２０１２／１４５４９３号に記載のＡＭＰ−５１４である。さらに既知ＰＤ−１抗体および他のＰＤ−１阻害剤は、ＷＯ２００９／０１４７０８号、ＷＯ０３／０９９１９６号、ＷＯ２００９／１１４３３５号、ＷＯ２０１１／０６６３８９号、ＷＯ２０１１／１６１６９９号、ＷＯ２０１２／１４５４９３号、米国特許７,６３５,７５７号および８,２１７,１４９号および米国特許公開２００９／０３１７３６８号に記載のものを含む。ＷＯ２０１３／１７３２２３号に開示の抗ＰＤ−１抗体の何れも使用され得る。これらの抗体の一つとＰＤ−１について結合を競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体も組み合わせ処置において使用し得る。ＰＤ−１受容体を標的とする他のアプローチは、ＡＭＰ−２２４と呼ばれる、ＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン(Ｂ７−ＤＣ)からなる組み換えタンパク質である。
【０５７４】
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ−１に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ−１に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＰＤ−１に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
【０５７５】
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両者を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＧＩＴＲ抗体はここに記載する２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体(例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１)または他のここに記載するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体などのヒト配列モノクローナル抗体である。
【０５７６】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＢＭＳ−９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４号および米国特許７,９４３,７４３号では１２Ａ４と称される)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４号および米国特許７,９４３,７４３号に記載の３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６(別名抗Ｂ７−Ｈ１)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(別名ＲＧ７４４６)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(ＷＯ２０１３／７９１７４)またはｒＨｉｇＭ１２Ｂ７である。ＷＯ２０１３／１７３２２３号、ＷＯ２０１１／０６６３８９号、ＷＯ２０１２／１４５４９３号、米国特許７,６３５,７５７号および８,２１７,１４９号および米国公開２００９／１４５４９３号に開示の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の何れも使用され得る。これらの抗体の何れかと競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も組み合わせ処置において使用し得る。
【０５７７】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ−Ｌ１に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
【０５７８】
ここに提供されるのは、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両者を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヤーボイＴＭ(イピリムマブまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号に記載)、トレメリムマブ(以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)、次の刊行物ＷＯ９８／４２７５２号、ＷＯ００／３７５０４号、米国特許６,２０７,１５６号、Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17)；Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505(抗体ＣＰ−６７５２０６)；およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304の何れかに記載のモノクローナルまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示の抗ＣＴＬＡ−４抗体の何れも使用され得る。
【０５７９】
ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＣＴＬＡ−４に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＣＴＬＡ−４に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＣＴＬＡ−４に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
【０５８０】
ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。さらなる実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を治療量以下の用量で投与するまたは両者を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＧＩＴＲ抗体はここに記載する２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２または６Ｇ１０のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などのヒト配列モノクローナル抗体(例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１)または他のここに記載するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例は、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２号、ＷＯ１０／１９５７０号およびＷＯ２０１４／００８２１８号に記載の抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体を含む。ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる他の当分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３号、ＷＯ０８／１３２６０１号およびＷＯ０９／４４２７３号に記載のＩＭＰ７３１およびＩＭＰ−３２１を含む。これらの抗体の何れかと競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体も組み合わせ処置において使用し得る。
【０５８１】
ある実施態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＬＡＧ−３に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＬＡＧ−３に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＬＡＧ−３に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＬＡＧ−３に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
【０５８２】
ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの１以上の第二標的抗原へのここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の追加投与は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強し得る。本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、免疫療法に一般に応答性であるおよび免疫療法に一般に応答性ではない癌を含む。本発明の組み合わせ治療で処置するための癌の代表例はここに挙げる癌を含む。
【０５８３】
ある実施態様において、ここに記載する治療抗体の組み合わせを、薬学的に許容される担体中の一個の組成物として同時にまたは各薬学的に許容される担体中の抗体を個々に含む別組成物として同時に投与し得る。他の実施態様において、治療抗体の組み合わせは逐次的に投与され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＧＩＴＲ抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が最初に投与され、抗ＧＩＴＲ抗体が次または抗ＧＩＴＲ抗体が最初に投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体が次であるなど逐次的に投与され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体は抗ＰＤ−１抗体が最初に投与され、抗ＧＩＴＲ抗体が次または抗ＧＩＴＲ抗体が最初に投与され、抗ＰＤ−１抗体が次であるなど逐次的に投与され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が最初に投与され、抗ＧＩＴＲ抗体が次または抗ＧＩＴＲ抗体が最初に投与され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が次であるなど逐次的に投与され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＧＩＴＲ抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体が最初に投与され、抗ＧＩＴＲ抗体が次にまたは抗ＧＩＴＲ抗体が最初に投与され、抗ＬＡＧ−３抗体の投与が次であるなど逐次的に投与され得る。
【０５８４】
さらに、１回を超えて組み合わせ治療を逐次投与するならば、逐次投与の順番は、各投与時点で逆になっても同じ順番でもよく、逐次投与を同時投与または任意のこれらの組み合わせと組み合わせ得る。例えば、組み合わせ抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は抗ＣＴＬＡ−４抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が二番目である逐次投与であってよく、三回目の投与は抗ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＣＴＬＡ−４抗体が二番目の投与であってよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は抗ＰＤ−１抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が二番目の投与であってよく、三回目の投与は抗ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＰＤ−１抗体が二番目の投与などでよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が二番目の投与であってよく、三回目の投与は抗ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が二番目の投与などでよい。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は抗ＬＡＧ−３抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が二番目の投与であってよく、三回目の投与は抗ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＬＡＧ−３抗体第二が二番目の投与などでよい。他の代表的投与スキームは、抗ＧＩＴＲが最初であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体(および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)が次である逐次の最初の投与を含み、その後の投与は同時であり得る。
【０５８５】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤はアゴニストＣＤ１３７抗体などのＣＤ１３７(４−１ＢＢ)アゴニストである。適当なＣＤ１３７抗体は、例えば、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６(ＷＯ１２／３２４３３号)を含む。
【０５８６】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤はアゴニストＯＸ４０抗体などのＯＸ４０アゴニストである。適当なＯＸ４０抗体は、例えば、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−６４６９またはＭＯＸＲ０９１６(ＲＧ７８８８；ＷＯ０６／０２９８７９号)を含む。
【０５８７】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤アゴニストＣＤ４０抗体などのＣＤ４０アゴニストである。ある実施態様において、腫瘍免疫療法剤は、アンタゴニストＣＤ４０抗体などのＣＤ４０アンタゴニストである。適当なＣＤ４０抗体は、例えば、ルカツムマブ(ＨＣＤ１２２)、ダセツズマブ(ＳＧＮ−４０)、ＣＰ−８７０,８９３またはＣｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４を含む。
【０５８８】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤は、アゴニストＣＤ２７抗体などのＣＤ２７アゴニストである。適当なＣＤ２７抗体は、例えば、バルリルマブ(ＣＤＸ−１１２７)を含む。
【０５８９】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤はＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３)(ＷＯ１１／１０９４００号)である。
【０５９０】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤はリリルマブなどのＫＩＲアンタゴニストである。
【０５９１】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤はＩＤＯアンタゴニストである。適当なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０号、ＷＯ０７／７５５９８号、ＷＯ０８／３６６５３号、ＷＯ０８／３６６４２号)、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０号、ＷＯ０９／１１５６６５２号、ＷＯ１１／５６６５２号、ＷＯ１２／１４２２３７号)またはＦ００１２８７を含む。
【０５９２】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤は、トール様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト(例えば、カルメット・ゲラン桿菌)、ＴＬＲ７アゴニスト(例えば、Hiltonolまたはイミキモド)、ＴＬＲ７／８アゴニスト(例えば、レシキモド)またはＴＬＲ９アゴニスト(例えば、ＣｐＧ７９０９)である。
【０５９３】
ある実施態様において、免疫系の刺激により利益があり得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および腫瘍免疫療法剤を投与することにより処置し、ここで、腫瘍免疫療法剤はＴＧＦ−β阻害剤、例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７またはＩＭＣ−ＴＲ１である。
【０５９４】
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤、例えば、腫瘍免疫療法剤の投与前に逐次的に投与する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤、例えば、腫瘍免疫療法剤と共に投与する。さらにある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤の投与後に逐次的に投与する。２剤の投与は、例えば、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、５日、７日または１週間以上離れた時間に始めてよくまたは第二剤の投与は、第一剤が投与された、例えば、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、５日、７日または１週間以上後に始めてよい。
【０５９５】
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体および第二剤、例えば、腫瘍免疫療法剤を、患者に、同時に投与、例えば、３０分または６０分の時間にわたり、例えば、同時に点滴する。抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤、例えば、腫瘍免疫療法剤と共製剤してもよい。
【０５９６】
場合により、唯一の免疫治療剤としての抗ＧＩＴＲまたは抗ＧＩＴＲ抗体と１以上の付加的免疫療法抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断)の組み合わせを、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞などの免疫原性剤とさらに組み合わせ得る(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞(さらに下に記載)を含む。ＧＩＴＲ活性化および１以上の付加的抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)の組み合わせを、さらに標準癌処置とも組み合わせ得る。例えば、ＧＩＴＲ活性化および１以上の付加的抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)の組み合わせを、化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの場合、本発明の組み合わせと共に投与する他の化学療法剤の用量を減らすことが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のための抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体などの付加的抗体を伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と、さらにダカルバジンを組み合わせた組み合わせである。他の例は、黒色腫の処置のための抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体を伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲ抗体と、インターロイキン−２(ＩＬ−２)を組み合わせた組み合わせである。ＧＩＴＲ活性化およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と化学療法の組み合わせ使用の後にある科学的原理は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加をもたらすことである。細胞死によりＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うまたは伴わないＧＩＴＲ活性化と相乗性の結果となり得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン除去である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を作る。血管形成阻害剤もＧＩＴＲ活性化およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の組み合わせと組み合わせ得る。血管形成の阻害は腫瘍細胞死に至り、後者は腫瘍抗原の宿主抗原提示経路への供給源となる。
【０５９７】
単一免疫治療剤としての抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体またはＧＩＴＲアゴニストとＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組み合わせは、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的させる二重特異性抗体と組み合わせても使用し得る(例えば、米国特許５,９２２,８４５号および５,８３７,２４３号参照)。二重特異性抗体を、２個の別々の抗原の標的化に使用し得る。これらの応答のＴ細胞アームはＧＩＴＲ活性化およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の組み合わせにより増強され得る。
【０５９８】
他の例において、単一免疫治療剤剤としての抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗ＧＩＴＲ抗体と付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３剤の組み合わせを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、リンフォサイド(登録商標)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などの抗新生物抗体と組み合わせて使用し得る。例として、理論に拘束されることを望まないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートした抗癌抗体での処置は、免疫刺激剤、例えば、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体が介在する免疫応答を増強し得る癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)をもたらし得る。例示的実施態様において、過増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の処置は、一緒のまたは逐次のまたは任意のこれらの組み合わせの、抗ＧＩＴＲと、場合により付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体と組み合わせた抗癌剤、例えば、抗体を含み、これは、宿主における抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０５９９】
腫瘍は、極めて多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くは、腫瘍に発現され、免疫抑制的であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中で、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を、抗体などの付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤を伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲ抗体組み合わせで使用して、免疫抑制的因子の影響を相殺し、宿主による腫瘍免疫応答を支持し得る。
【０６００】
宿主免疫応答の活性化に使用される他の薬物、例えば、抗体を、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体などの付加的免疫刺激剤を伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用し得る。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体(Ridge et al., supra)を抗ＧＩＴＲ抗体および場合により付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体と共に使用し得る。Ｔ細胞共刺激性分子に対する他の活性化抗体(Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra)も、Ｔ細胞活性化レベルの増強のために提供され得る。
【０６０１】
上記のとおり、骨髄移植は、多様な造血起源の腫瘍の処置のために現在使用されている。抗ＧＩＴＲ免疫療法単独またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断との組み合わせを、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性の増加に使用し得る。
【０６０２】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および増大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的処置プロトコールもある(Greenberg & Riddell, supra)。これらの方法を、ＣＭＶなどの感染因子に対するＴ細胞応答の活性化にも使用し得る。付加的免疫刺激性治療、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲ存在下のエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の出現頻度および活性を増加させ得る。
【０６０３】
ここに提供されるのは、対象に、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体を伴いまたは伴わずに抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患(例えば、癌)の処置に付随する有害事象を改変する方法である。例えば、ここに記載する方法は、患者への非吸収性ステロイド投与による免疫刺激治療抗体誘発大腸炎または下痢の発生を低減する方法を提供する。ここで使用する“非吸収性ステロイド”は、肝臓での代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるような広範な初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。ここに記載するある実施態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは局所作用性グルココルチコステロイドであり、これは、経口投与後、主に肝臓により、広範に代謝される。ENTOCORT EC(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達の最適化のために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存的経口製剤である。ENTOCORT EC(登録商標)は、米国で回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度クローン病の処置に承認されている。クローン病処置のためのENTOCORT EC(登録商標)の通常の経口投与量は６〜９mg／日である。ENTOCORT EC(登録商標)は吸収前に腸管で放出され、腸粘膜に保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ENTOCORT EC(登録商標)は肝臓のチトクロムＰ４５０システムにより、グルココルチコイド活性がほとんど無い代謝物へと広範に代謝される。それ故に、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低バイオアベイラビリティは、初回通過代謝が広範ではない他のグルココルチコイドと比較して、治療比の改善をもたらす。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドより、視床下部−下垂体抑制が少ないことを含み、有害作用が少ない。しかしながら、ENTOCORT EC(登録商標)の慢性投与は、副腎皮質機能亢進症および副腎抑制などの全身性グルココルチコイド効果をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610参照。
【０６０４】
なおさらなる実施態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせた、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うまたは伴わないＧＩＴＲ活性化(すなわち、免疫刺激治療抗体抗ＧＩＴＲおよび場合により抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)をさらにサリチレートと組み合わせ得る。サリチレートは、例えばスルファサラジン(アザルフィジン(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)、オルサラジン(DIPENTUM(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)、バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)およびメサラミン(アサコール(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標)、Solvay)などの５−ＡＳＡ薬剤を含む。
【０６０５】
ここに記載する方法によって、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴いまたは伴わずに抗ＧＩＴＲと組み合わせて投与されるサリチレートは、免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生を低減させる目的でのサリチレートおよび非吸収性ステロイドのあらゆる重複または逐次投与を含み得る。それ故に、例えば、ここに記載する免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生を減少させる方法は、サリチレートおよび非吸収性を一緒にまたは逐次的に(例えば、サリチレートを非吸収性ステロイドの６時間後投与)または任意のこれらの組み合わせを含む。さらに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同じ経路で(例えば、何れも経口で投与)または別の経路で(例えば、サリチレートを経口投与および非吸収性ステロイドを直腸投与)投与してよく、これは、ｅ抗ＧＩＴＲおよび抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体の投与に使用する経路と異なってよい。
【０６０６】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および組み合わせ抗体治療をまた処置される適応症(例えば、癌)に対する特定の有用性により選択される周知の他の治療と組み合わせて使用してもよい。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の組み合わせを、既知の薬学的に許容される薬剤と逐次的に使用し得る。
【０６０７】
例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および組み合わせ抗体治療を、照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘｃｏｍｂｏ)を使用)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９またはＦ００１２８７)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ−１(骨髄白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質の阻害因子)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃ模倣体、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、抗血管形成因子ターゲティングＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ−阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などの付加的処置と組み合わせて(例えば、同時にまたは別々に)使用し得る。
【０６０８】
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および組み合わせ抗体治療を、さらに１以上の抗増殖性細胞毒性剤と組み合わせて使用し得る。抗増殖性細胞毒性剤として使用し得る化合物は、次のものを含むが、これらに限定されない。
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサンＴＭ)  フォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０６０９】
アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせるための適当な抗増殖性薬剤は、タキサン、パクリタキセル(パクリタキセルはタキソールＴＭとして市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシドＡ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(塩酸タシドチン)、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシレート(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイドイムノコンジュゲート(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１を含むが、これらに限定されず、さらに当分野で知られる他の微小チューブリン安定化剤がある。
【０６１０】
異常に増殖している細胞をここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体での処置と共にまたは処置前に静止状態にさせることが望ましい場合、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスＴＭなどのホルモンおよびステロイド(合成アナログを含む)も患者に投与し得る。ここに記載する方法または組成物を使用するとき、抗模倣体などの臨床の現場で腫瘍増殖または転移の調節に使用される他の薬剤も、必要に応じて投与してよい。
【０６１１】
化学療法剤の安全かつ効果的な投与方法が当業者に知られる。さらに、その投与は標準的文献に記載されている。例えば、多くの化学療法剤の投与は、引用により開示を本明細書に包含させるPhysicians’ Desk Reference(PDR)の例えば１９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)に記載される。
【０６１２】
化学療法剤および／または放射線治療を、当分野で周知の治療プロトコールにより適用し得る。化学療法剤および／または放射線治療の適用は、処置する疾患およびその疾患に対する化学療法剤および／または放射線治療の既知効果により変わり得ることは当業者には明らかである。また、当業者の知識により、治療プロトコール(例えば、投与量および投与回数)は、患者において観察される投与治療剤に対する効果の観点および疾患に対する投与治療剤の観察される応答の観点から変わり得る。
【０６１３】
例示的実施態様
１. ヒトグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次の性質を示す単離抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)可溶性ヒトＧＩＴＲに結合；
(ｂ)膜結合ヒトＧＩＴＲに結合；
(ｃ)膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合；
(ｄ)Ｔ細胞活性化誘発または増強；
(ｅ)ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合阻害；
(ｆ)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合の最大で部分的に阻害；
(ｇ)成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体構造エピトープ(配列番号４)に結合；
(ｈ)Ｏ結合およびＮグリコシル化および非グリコシル化両方のヒトＧＩＴＲに結合；
(ｉ)Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強；および
(ｉ)抗体２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０の１以上とヒトＧＩＴＲへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合。
【０６１４】
２. 抗体が抗腫瘍免疫応答を刺激する、実施態様１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１５】
３. 抗体が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、実施態様１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１６】
４. 抗体ｉがＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１７】
５. 抗体がＴ細胞増殖を増加させる、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１８】
６. 抗体がＦｃ受容体に結合しない、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１９】
７. 抗体が１以上の活性化ＦｃγＲに結合する、実施態様１〜５の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２０】
８. 抗体が、Biacoreにより測定して、１０nM以下のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２１】
９. 抗体が、スキャッチャードにより測定して、１nM以下のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２２】
１０. 抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、１nM以下のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２３】
１１. 抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、１０nM以下のＥＣ５０で膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２４】
１２. 抗体が多価架橋を必要とせずにＴ細胞活性化を誘発または増強する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２５】
１３. 抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２６】
１４. 抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)に結合する、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２７】
１５. グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に特異的に結合し、次のものからなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖対である３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号１３および１４；
(ｂ)配列番号２６および２７；
(ｃ)配列番号３９および４０；
(ｄ)配列番号５２および５３；
(ｅ)配列番号５２および５４；
(ｆ)配列番号７１および７２；
(ｇ)配列番号８４および８５；
(ｈ)配列番号９７および９８；
(ｉ)配列番号９７および９９；
(ｊ)配列番号１１５および１１６；
(ｋ)配列番号１２８および１２９；
(ｌ)配列番号１２８および１３０；および
(ｍ)配列番号３３５および３３６。
【０６２８】
１６. 次のものを含む、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号２０、２１および２２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号２３、２４および２５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ)配列番号３３、３４および３５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３６、３７および３８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｃ)配列番号４６、４７および４８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ)配列番号６２、６３および６４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号６５、６６および６７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ)配列番号６２、６３および６４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号６８、６９および７０をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ)配列番号７８、７９および８０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号８１、８２および８３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ)配列番号９１、９２および９３をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号９４、９５および９６をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ)配列番号１０６、１０７および１０８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１０９、１１０および１１１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ)配列番号１０６、１０７および１０８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１１２、１１３および１１４をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ)配列番号１２２、１２３および１２４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１２５、１２６および１２７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ)配列番号１３８、１３９および１４０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１４１、１４２および１４３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ)配列番号１３８、１３９および１４０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号１４４、１４５および１４６をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｍ)配列番号３４２、３４３および３４４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３４５、３４６および３４７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列。
【０６２９】
１７. 抗体が配列番号２０、２１および２２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号２３、２４および２５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３０】
１８. 抗体が配列番号３３、３４および３５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号３６、３７および３８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３１】
１９. 抗体が配列番号４６、４７および４８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、実施態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３２】
２０. グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６３３】
２１. グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域が配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６３４】
２２. グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)それぞれ配列番号１３および１４；
(ｂ)それぞれ配列番号２６および２７；
(ｃ)それぞれ配列番号３９および４０；
(ｄ)それぞれ配列番号５２および５３；
(ｅ)それぞれ配列番号５２および５４；
(ｆ)それぞれ配列番号７１および７２；
(ｇ)それぞれ配列番号８４および８５；
(ｈ)それぞれ配列番号９７および９８；
(ｉ)それぞれ配列番号９７および９９；
(ｊ)それぞれ配列番号１１５および１１６；
(ｋ)それぞれ配列番号１２８および１２９；
(ｌ)それぞれ配列番号１２８および１３０；および
(ｍ)それぞれ配列番号３３５および３３６。
【０６３５】
２３. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様２２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３６】
２４. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様２３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３７】
２５. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む、実施態様２４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３８】
２６. 抗体が配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３９】
２７. 抗体が配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４０】
２８. 抗体が配列番号３９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４１】
２９. グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)それぞれ配列番号１５および１６；
(ｂ)それぞれ配列番号１７および１９；
(ｃ)それぞれ配列番号１８および１９；
(ｄ)それぞれ配列番号２８および２９；
(ｅ)それぞれ配列番号３０および３２；
(ｆ)それぞれ配列番号３１および３２；
(ｇ)それぞれ配列番号４１および４２；
(ｈ)それぞれ配列番号４３および４５；
(ｉ)それぞれ配列番号４４および４５；
(ｊ)それぞれ配列番号５５および５６；
(ｋ)それぞれ配列番号５５および５７；
(ｌ)それぞれ配列番号５８および６０；
(ｍ)それぞれ配列番号５９および６０；
(ｎ)それぞれ配列番号５８および６１；
(ｏ)それぞれ配列番号５９および６１；
(ｐ)それぞれ配列番号７３および７４；
(ｑ)それぞれ配列番号７５および７７；
(ｒ)それぞれ配列番号７６および７７；
(ｓ)それぞれ配列番号８６および８７；
(ｔ)それぞれ配列番号８８および９０；
(ｕ)それぞれ配列番号８９および９０；
(ｖ)それぞれ配列番号１０２および１０４；
(ｗ)それぞれ配列番号１０３および１０４；
(ｘ)それぞれ配列番号１００および１０１；
(ｙ)それぞれ配列番号１００および３７１；
(ｚ)それぞれ配列番号１０２および１０５；
(ｚａ)それぞれ配列番号１０３および１０５；
(ｚｂ)それぞれ配列番号１１７および１１８；
(ｚｃ)それぞれ配列番号１１９および１２１；
(ｚｄ)それぞれ配列番号１２０および１２１；
(ｚｅ)それぞれ配列番号１３１および１３２；
(ｚｆ)それぞれ配列番号１３４および１３６；
(ｚｇ)それぞれ配列番号１３５および１３６；
(ｚｈ)それぞれ配列番号１３１および１３３；
(ｚｉ)それぞれ配列番号１３４および１３７；
(ｚｊ)それぞれ配列番号１３５および１３７；
(ｚｋ)それぞれ配列番号３３７および３３８；
(ｚｌ)それぞれ配列番号３３９および３４１；および
(ｚｍ)それぞれ配列番号３４０および３４１。
【０６４２】
３０. 重鎖および軽鎖が(ａ)〜(ｚｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖を含む、実施態様２９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４３】
３１. 抗体が配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む重鎖およびが配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施態様３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４４】
３２. 抗体が配列番号１８に示すアミノ酸配列を含む重鎖およびが配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施態様３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４５】
３３. (ａ)実施態様２５の抗体とＧＩＴＲ上の同じエピトープに結合するおよび(ｂ)ＦＡＣＳにより測定して実施態様２５の抗体の活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を少なくとも９０％する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６４６】
３４. 抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１７)およびCRDYPGEE(配列番号２１８)に結合する、実施態様１５〜３３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４７】
３５. 抗体がヒトおよびカニクイザル両方のＧＩＴＲに結合する、実施態様１５〜３４の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４８】
３６. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６４９】
３７. 抗体がＩｇＧ１抗体である、実施態様３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６５０】
３８. 抗体がエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、実施態様３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６５１】
３９. 抗体またはその抗原結合部分が次の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、実施態様３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６５２】
４０. 抗体またはその抗原結合部分が活性化ＦｃγＲへの結合が増強されたＦｃを含む、実施態様３６に記載の抗体。
【０６５３】
４１. ＣＤＲ領域におけるメチオニン残基が酸化を受けないアミノ酸残基に置換されている、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６５４】
４２. 抗体またはその抗原結合部分がヒトまたはヒト化抗体である、実施態様１５〜４１の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６５５】
４３. 第二結合特異性を有する分子に結合した先の実施態様の何れかに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
【０６５６】
４４. 実施態様１〜４２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分に記載の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【０６５７】
４５. 実施態様４４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【０６５８】
４６. 実施態様４５に記載の発現ベクターでトランスフォームされた、細胞。
【０６５９】
４７. 薬剤に結合した実施態様１〜４２の何れかに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
【０６６０】
４８. 実施態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物。
【０６６１】
４９. 実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分または二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用指示を含む、キット。
【０６６２】
５０. 抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を製造する方法であって、実施態様４６に記載の細胞において該抗体またはその抗原結合部分を発現させ、該細胞から単離することを含む、方法。
【０６６３】
５１. Ｔ細胞と実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法。
【０６６４】
５２. エフェクターＴ細胞と実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよびＣＤ３を接触させることを含み、ここで、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法。
【０６６５】
５３. Ｔ細胞と有効量の実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
【０６６６】
５４. Ｔ細胞と有効量の実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法。
【０６６７】
５５. 対象に有効量の実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生が増加するように投与することを含む、対象におけるＴ細胞のＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
【０６６８】
５６. 有効量の実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含み、ここで、該抗体またはその抗原結合部分がエフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有し、腫瘍におけるＴ制御性細胞数を減らす、処置を必要とする対象の腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすかまたは枯渇させる方法。
【０６６９】
５７. 実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、対象における免疫応答が刺激されるように投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
【０６７０】
５８. 対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、実施態様５７に記載の方法。
【０６７１】
５９. 対象に実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【０６７２】
６０. 処置を必要とする対象に治療有効量の実施態様１〜４３および４７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを、癌を処置するために投与することを含む、癌を処置する方法。
【０６７３】
６１. 癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、実施態様６０に記載の方法。
【０６７４】
６２. 癌が転移癌、難治性癌または再発性癌である、実施態様６０または６１に記載の方法。
【０６７５】
６３. さらに１以上の付加的治療剤を投与することを含む、実施態様５６〜６２の何れかに記載の方法。
【０６７６】
６４. 付加的治療が抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体である、実施態様６３に記載の方法。
【０６７７】
６５. サンプル中のグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)の存在を検出する方法であって、該サンプルと実施態様１〜４２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分を、該抗体またはその抗原結合部分とＧＩＴＲの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、方法。
【０６７８】
６６. ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプのものではないＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の少なくとも一つを含み、ここで、非ＩｇＧ２ヒンジを有する以外同じ抗ＧＩＴＲ抗体に対して、アゴニスト活性が増強されている、単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【０６７９】
６７. 修飾重鎖定常領域が配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域または配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０のアミノ酸配列と最大５アミノ酸異なるまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域を含む、実施態様６６に記載の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【０６８０】
６８. 重鎖が配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２のアミノ酸配列と最大１０アミノ酸異なるまたは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖を含む、実施態様６７に記載の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【０６８１】
本発明を、さらなる限定として解釈してはならない次の実施例によりさらに説明する。本明細書をとおして引用する全ての図面および全ての参考文献、Genbank配列、特許および公開特許出願は、引用により本明細書に明示的に包含させる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７号、ＷＯ０９／０７３５３３号、ＷＯ０９／０７３５４６号、ＷＯ０９／０５４８６３号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８号および米国特許公開２０１１／０１５０８９２号の開示を、引用により本明細書に明示的に包含させる。
【実施例】
【０６８２】
実施例１：各種の抗ＧＩＴＲ抗体の産生
ヒト抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体を、Ｈｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２系統のＨｕＭＡｂ(登録商標)トランスジェニックマウス(“ＨｕＭＡｂ”は、Medarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)およびＫＭマウス(ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号に記載のとおり、ＫＭマウス(登録商標)系統はＳＣ２０導入染色体を含む)において産生した。ＨＣ２／ＫＣｏ２７  ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスを、開示全体を本明細書に引用により包含させる、米国特許５,７７０,４２９号および５,５４５,８０６号に記載のとおり産生した。
【０６８３】
７遺伝子型のトランスジェニックマウス(ＫＭ、Ｈｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２)を含む計９４マウスを、各種の免疫化戦略で免疫化した(各種の抗原、各種の用量、期間、投与経路(足蹠(ｆｐ)、腹腔内(ｉｐ)および皮下(ｓｃ)およびアジュバント(ＣＦＡ／ＩＦＡ、Ｒｉｂｉおよび抗体)等)。５４マウスからの３６融合を実施し、スクリーニングした。１５７抗体をこれら３６融合から同定し、さらなる特徴付けは、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０と命名した抗体を含む、特に興味深い抗体の単離に至った。
【０６８４】
ｃＤＮＡ配列決定は、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｄ１０、２Ｇ６、８Ａ６、１４Ｅ３および６Ｇ１０の各々の１個の重鎖および１個の軽鎖ならびに抗体３Ｃ３、９Ｇ７および１９Ｈ８の各々の１個の重鎖および２個の軽鎖(軽鎖１または“Ｌ１”および軽鎖２または“Ｌ２”)を同定した。タンパク質分析により、抗体３Ｃ３および９Ｇ７に付いて単一軽鎖が同定され、Ｎ末端配列決定および分子量決定により、３Ｃ３では軽鎖Ｌ１および９Ｇ７では軽鎖Ｌ２であったことが示された。抗体１９Ｈ８に関して、ハイブリドーマにより発現される抗体の９３％が軽鎖Ｌ１を含み、３％が軽鎖Ｌ２を含んだ。抗体３Ｃ３−１および３Ｃ３−２は、それぞれ軽鎖Ｌ１およびＬ２を有する抗体３Ｃ３に対応する。抗体９Ｇ７−１および９Ｇ７−２は、それぞれ軽鎖Ｌ１およびＬ２を有する抗体９Ｇ７３に対応する。抗体１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２は、それぞれ軽鎖Ｌ１およびＬ２を有する抗体１９Ｈ８に対応する。３抗体の軽鎖の各々のアミノ酸およびヌクレオチド配列は表１５に提供される。
【０６８５】
抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０の可変領域アミノ酸配列およびアイソタイプを図２〜３１に示す。各抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列は表１５に提供されるのアミノ酸配列からなる。２８Ｆ３の重鎖および軽鎖は配列番号１５および１６のアミノ酸配列からなる。１９Ｄ３の重鎖および軽鎖は配列番号２８および２９のアミノ酸配列からなる。１８Ｅ１０の重鎖および軽鎖は配列番号４１および４２のアミノ酸配列からなる。３Ｃ３の重鎖および軽鎖は配列番号５５および５６のアミノ酸配列からなる。２Ｇ６の重鎖および軽鎖は配列番号７３および７４のアミノ酸配列からなる。８Ａ６の重鎖および軽鎖は配列番号８６および８７のアミノ酸配列からなる。９Ｇ７の重鎖および軽鎖は配列番号１００および１０１のアミノ酸配列からなる。１４Ｅ３の重鎖および軽鎖は配列番号１１７および１１８のアミノ酸配列からなる。１９Ｈ８−１の重鎖および軽鎖は配列番号１３１および１３２のアミノ酸配列からなる。１９Ｈ８−２の重鎖および軽鎖は配列番号１３１および１３３のアミノ酸配列からなる。６Ｇ１０の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列３３７および３３８。これらをコードするヌクレオチド配列タンパク質は表１５に提供される。
【０６８６】
実施例２：抗ＧＩＴＲ抗体の活性化ヒトおよびｃｙｎｏ  Ｔ細胞への結合
実施例１いおいて産生したヒトモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を、表面にＧＩＴＲを発現する活性化ヒトおよびｃｙｎｏ  Ｔ細胞への結合について試験した。
ヒトまたはカニクイザルから単離した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、プレート被覆抗ＣＤ３抗体(クローン：ヒトＴ細胞活性化のためにＵＣＨＴ１；クローン：カニクイザルＴ細胞活性化のためにＳＰ３４；両者ともBD Biosciencesから)および可溶性抗ＣＤ２８抗体(クローン：ヒトおよびカニクイザルの両方についてＣＤ２８.２、BD Biosciences)を、４日間(ヒト)／または５日間(カニクイザル)活性化させた。細胞を、フィコエリスリン(ＰＥ)コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体(Jackson ImmunoResearch)を使用する蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)ベースのアッセイにおいてＧＩＴＲ  ｍＡｂ結合について試験した。サンプルを、BD FACS Canto Flow Cytometerで解析した。
【０６８７】
抗ＧＩＴＲ抗体３Ｃ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および２８Ｆ３は、活性化ヒトおよびカニクイザルＴ細胞両方に結合した。図３２に示すとおり、抗体３Ｃ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および２８Ｆ３は、それぞれ０.０４９１６nM、０.３６３３nM、０.１４６１nMおよび０.１９１６nMのＥＣ５０値に示されるとおり、活性化ヒトＴ細胞に強く結合した。同様に、抗体１８Ｅ１０および２８Ｆ３は活性化カニクイザルＴ細胞に結合し、１８Ｅ１０および２８Ｆ３のＥＣ５０値はそれぞれ０.９１３４nMおよび１.０４４nMであった(図３３)。３Ｃ３はカニクイザルＴ細胞に顕著に結合しなかった。
【０６８８】
実施例３：抗ＧＩＴＲ抗体の可溶性ＧＩＴＲへの結合
抗ＧＩＴＲ抗体の可溶性ＧＩＴＲへの結合を、Biacoreにより決定した。抗ＧＩＴＲ抗体をヒトカッパ被覆チップ(約５ＫＲＵ；Southernbiotech cat#2060-01)で捕捉し、組み換えヒトＧＩＴＲ(ｒＨＧＩＴＲ／Ｆｃ：R&D systems, CAT#689-GR)を、５００nM、２５０nM、１２５nM、６２nMおよび３１nM濃度でチップをとおして流した。ｍＡｂ／容積の捕捉濃度は２〜４０μg／mL(１０μL／分で５μL)であった。抗原結合時間は１５μL／分で５分であり、抗原解離時間は６分であり、再生を５０mM  ＨＣｌ／５０mM  ＮａＯＨで行った(１００μL／分で各１２μL)。２８Ｆ３およびいくつかの他の抗ＧＩＴＲ抗体で得られた結果を表５に示す。
【表５】
2019508013.tif 000008
結果は、抗ＧＩＴＲ抗体が可溶性ＧＩＴＲに１.２×１０−８〜３.５  １０−８Ｍ範囲のＫＤで結合することを示す。データを３Ｃ３の２サブクローンについて提供し、ＫＤは１.３３  １０−８〜１.４４  １０−８Ｍの範囲である。
【０６８９】
別のBiacore実験において、２８Ｆ３の可変領域と３つの異なる定常領域を有する抗体の結合特徴を決定した。第一の２８Ｆ３抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域(“ｇ１ｆ”、“ｇ１”または“ＩｇＧ１”または“ＩｇＧ１ｆ”とも称する；配列番号１７を有する重鎖および配列番号１９を有する軽鎖)を有する。接尾辞“ｆ”はアロタイプをいう。第二の抗体は、Ｆｃ領域に３変異を有するエフェクターレスＩｇＧ１定常領域(“ｇ１.１ｆ”、“ｇ１.１”、“ＩｇＧ１.１”および“ＩｇＧ１.１ｆ”とも称し、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａを有する；配列番号１８を有する重鎖および配列番号１９を有する軽鎖)を有し、そして第三の２８Ｆ３抗体は、Ｎ２９７Ａ変異を有するＩｇＧ１定常領域を有する。
Biacore実験を、チップを抗ＣＨ１(Invitrogen Ref# 054500)で被覆した以外、上記のとおり実施した。表６に示す結果は、全３個の抗体が同等な結合特徴を有し、ＫＤは３.９３×１０−８Ｍ〜４.３９×１０−８Ｍの範囲であることを示す。
【表６】
2019508013.tif 000009
【０６９０】
実施例４：活性化ヒトＴ細胞および３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性
活性化ヒトＴ細胞および異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ)での
抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲに対する結合をスキャッチャード解析により決定した。このアッセイを、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(重鎖について配列番号１８および軽鎖について配列番号１９)で４.５９mg／mLで実施した。
活性化ヒトＴ細胞でのスキャッチャード解析を次のとおり実施した。ヒトドナーから得たＴ細胞を培養培地(１０％ＦＢＳ、２mM  Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ)で洗浄し、１μg／mL抗ＣＤ２８(ＣＤ２８.２、BD#555725)および１００Ｕ／mL  ＩＬ−２(Peprotech#200-02)を添加した同じ培養培地に１０６細胞／mLで再懸濁した。各５×１０６細胞を、２０ug抗ＣＤ３(５mL、４μg／mL、一夜、４℃；ＵＣＨＴ−１、BD#555329)で被覆した６ウェルプレートの３ウェルに播種した。細胞を３日間、３７℃でインキュベートし、これらの細胞の半分をスキャッチャード解析に使用した(“３日目”解析)。残りの半分の消費培地を５mLの新鮮培地で置き換え、細胞をさらに１日インキュベートし、次いで、これらの細胞でのスキャッチャード解析(“４日目”解析)に使用した。
スキャッチャード解析について、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１を、IODO-GEN(登録商標)固相ヨウ素化剤(１,３,４,６−テトラクロロ−３ａ−６ａ−ジフェニルグリコウリル；Pierce #28601)を使用して１２５Ｉ−Ｎａ(Perkin Elmer # NEZ033H001MC(１mCi)で放射ヨウ素化した。過剰のアイオダイドを脱塩カラム(Pierce #43243)を使用して除去した。標識抗体のフラクションを回収し、Wizard 1470ガンマカウンター(Perkin-Elmer)で放射活性を解析した。各フラクションの１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１濃度をInvitrogenのQubitTM蛍光光度計で計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射性フラクションの薄層クロマトグラフィー(Pinestar Technology #151-005)により確立した。
【０６９１】
活性化ヒトＴ細胞への放射性ヨウ素化２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１結合を、活性化ヒトＴ細胞と１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１のタイトレーションをインキュベートすることにより示した。非特異的結合を１００倍モル濃度過剰の非標識抗体のタイトレーションの存在下の結合により決定し、総ＣＭＰから減算して特異的結合を計算した。１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１濃度対ＣＰＭの直線状標準曲線を最大nM結合１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の外挿に使用し、それにより細胞あたりの受容体数を計算した。３日目の刺激ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのヒトＧＩＴＲ分子数は約８,４００であり、４日目、約１３,２００であった。スキャッチャード解析の結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１が、３日刺激ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に０.７nMのＫＤでおよび４日刺激ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に０.８７nMのＫＤで特異的に結合することを示す。
３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞への放射性ヨウ素化２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１結合を、３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞と１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１のタイトレーションをインキュベートすることにより示した。非特異的結合を１００倍モル濃度過剰の非標識抗体のタイトレーションの存在下の結合により決定し、総ＣＭＰから減算して特異的結合を計算した。１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１濃度対ＣＰＭの直線状標準曲線を最大nM結合１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の外挿に使用し、それにより細胞あたりの受容体数を計算した。３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞あたりのヒトＧＩＴＲ分子は約１８０,０００であった。スキャッチャード解析の結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１が０.５nMのＫＤで３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞に特異的に結合することを示す。
他の実験において、ヒトおよびｃｙｎｏドナーからの活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の結合を決定した。ヒトおよびｃｙｎｏ  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をヒトおよびｃｙｎｏドナーから単離し、活性化のために抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で処理した。結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８.ＩｇＧ１.１が、それぞれ０.５５nMおよび０.６７nMのＥＣ５０で活性化ヒトＣＤ４＋細胞に同様に結合し、それぞれ０.５６nMおよび０.６５nMのＥＣ５０で活性化ヒトＣＤ８＋細胞に同様に結合することを示す。２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８.ＩｇＧ１.１は、それぞれ１nMおよび０.８６nMのＥＣ５０で活性化ｃｙｎｏ  ＣＤ４＋細胞に結合し、それぞれ１.２６nMおよび０.７４nMのＥＣ５０で活性化ｃｙｎｏ  ＣＤ８＋細胞に同様に結合する。
【０６９２】
実施例５：ヒトモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を阻害する
ＨｕＭＡｂ抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害するか否かを決定するために、異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(ＧＩＴＲ−３Ａ９細胞)を、１０−４μg／mL〜１００μg／mLの濃度範囲のＧＩＴＲ  ｍＡｂとプレインキュベートし、続いて１０ng／mL濃度のＧＩＴＲリガンド(R&D Systems#6987-GL)とインキュベートした。細胞上のＧＩＴＲリガンドの結合を、ＰＥコンジュゲート抗ヘマグルチニン(ＨＡ)タグ抗体を使用するＦＡＣＳベースのアッセイで決定し、サンプルを、BD FACS Canto Flow Cytometerで解析した。図３４Ａおよび３４Ｂに示すとおり、これらの条件下、抗体１９Ｄ３、２８Ｆ３およびＧＩＴＲ.３(３Ｃ３)は全てＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲ−３Ａ９細胞への結合を遮断し、ＥＣ５０値はそれぞれ０.７５４６、０.２７８３および０.０６９３４であった。同様の結果が抗体１９Ｈ８で得られた。
他のセットの実験を各種の条件下で行い、さらに抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲへのＧＩＴＲ−Ｌ結合を阻害する程度を評価した。これらの実験において、１.０６×１０−９〜１００mg／ml濃度の可溶性、組み換えｈＧＩＴＲ−Ｌ三量体を活性化ヒトＴ細胞に添加し、０.０１６ug／mlのＥＣ５０値でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に用量依存的様式で結合した(図３４Ｃ)。実験を次のとおり実施した。１.０６ｅ−９〜１００μg／mL濃度の組み換えｈＧＩＴＲ−Ｌ三量体(R&D Systems Cat. 6987-GL)をＰＨＡ活性化Ｔ細胞に添加した。３０分の一次インキュベーション後、細胞結合ＧＩＴＲ−ＬをＰＥコンジュゲート抗ＨＡタグ(Miltenyi Cat. 120-002-687)を使用して検出した。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)で得て、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析した。
【０６９３】
１.０６×１０−９〜１００ug／ml濃度での活性化Ｔ細胞上へのｒｈＧＩＴＲ−Ｌの前結合は、その後の０.５ug／ml  ２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１(約９０％の飽和)の結合を０.００２４ug／mlのＩＣ５０で阻害した。１００ug／mlでＭＦＩがベースライン(ＩｇＧ対照)にならなかったため、阻害は部分的であった(図３４Ｄ)。実験を次のとおり実施した。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞を、組み換えＧＩＴＲ−Ｌ三量体(R&D Systems 6987-GL)の１００μg／mLから始まる２４点、３倍タイトレーションで、まず３０分処理した。２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１を、その後０.５μg／mLの固定濃度で細胞混合物に添加し、これをさらに３０分のインキュベーションに付した。細胞結合２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１を、ヒトＩｇＧ  Ｆｃに対するＰＥコンジュゲート二次抗体(Jackson ImmunoResearch Cat. 109-116-098)を使用して検出した。無関係のｈＩｇＧ１  Ａｂを２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１のアイソタイプ対照として使用し、一方ＧＩＴＲ−Ｌのプレインキュベーション無しのサンプルを、遮断がないときの２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１結合を示すために包含させた。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)で得て、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析した。
活性化Ｔ細胞を、１.０６×１０−９〜１００ug／ml濃度範囲の２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１で活性化したとき、０.６ug／ml(約９０％飽和)でのＧＩＴＲ−Ｌの結合は影響されなかった(図３４Ｅ)。しかしながら、ＧＩＴＲ−Ｌを、ほぼＥＣ５０である２０ng／mlの低濃度で添加したとき、その結合は、予め結合した２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１により、０.０７６mg／mlのＩＣ５０で部分的に遮断された(図３４Ｆ)。実験を次のとおり実施した。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞を、０.０００５６〜１００μg／mL濃度範囲の２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１とプレインキュベートし、続いて０.６ug／mlまたは２０ng／mL  ＧＩＴＲ−Ｌを添加した。細胞結合ＧＩＴＲ−ＬをＰＥコンジュゲート抗ＨＡタグを用いて検出した。無関係のｈＩｇＧ１を２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１のアイソタイプ対照として包含させ、一次抗体のないサンプルを、遮断がないときのＧＩＴＲ−Ｌの結合を示すために使用した。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)で得て、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析した。
これらのデータは、２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１が、ＧＩＴＲ−ＬによるＧＩＴＲのインビボ結合を一部可能にし得る部分的リガンドブロッカーであることを示す。
【０６９４】
実施例６：全抗ＧＩＴＲ抗体は一つの群にビン分類される
抗体ビニング実験を、次の抗ヒトＧＩＴＲ抗体で実施した。２８Ｆ３、１８Ｅ１０、１９Ｄ３、１４Ｅ３、８Ａ６、９Ｇ７、３Ｃ３および６Ｇ１０。
抗ＧＩＴＲ抗体をSensor Chip CM5チップ(Series S, GE Healthcare CAT# BR-1005-30)表面、フローセル２、フローセル３およびフローセル４(５０００RU)に固定化し、フローセル１を陰性対照として使用した。抗体を、出発濃度で１２０μg／mL(２×)に希釈した。一連の希釈を緩衝液で抗体を１：３濃度で８つの異なる濃度(１２０μg／ml〜０.０μg／ml、２Ｘ)に希釈することにより行い、タイトレーション曲線を得た。各抗体濃度を二分した。濃度シリーズの最初の半分において、各ウェルに４０nM(２×)ＧＩＴＲ抗原(ｒＨＧＩＴＲ／Ｆｃ  CAT# 689-GR)を添加し、最終濃度シリーズ(６０μg／ml〜０.０μg／ml)および２０nMの最終抗原濃度を作った。濃度シリーズの第二の半分において、抗原の代わりに、緩衝液を、抗体を同じ濃度にするために添加し、この半分をブランクとした。複合体を２時間インキュベートした。４０μL複合体を、抗体被覆表面に３０μL／分流速で注入した。Biacore T200装置を使用し、ランニング緩衝液は、ＨＢＥ−ＥＰ、GE Healthcare CAT# BR-1001-88、濾過、脱気、０.０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１５  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.００５％界面活性剤Ｐ２０であった。表面を２５mM  ＮａＯＨ(Order code: BR-1003-58, GE Healthcare)で、１００μL／分で５秒再生した。データを、Microsoft Excelを使用して解析し、抗体の濃度シリーズを対応する応答単位に対してプロットし、タイトレーション曲線を得た。
結果は、全ての試験した抗体が一つの群にビン分類されることを示し、これらが全てヒトＧＩＴＲの細胞外領域の類似する領域に結合することを示す。
【０６９５】
実施例７：抗ＧＩＴＲ抗体は立体構造エピトープに結合する
この実施例は、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３および３Ｃ３が非変性ヒトＧＩＴＲに結合するが、変性ヒトＧＩＴＲに結合せず、該結合はＮまたはＯ結合グリコシル化により影響されないことを示す。
Ｎ結合グリコシル化を有するまたは有しない天然または変性ＧＩＴＲへの抗ＧＩＴＲ抗体の結合を、次のとおり決定した。天然(すなわち、非変性)および変性ヒトＧＩＴＲのサンプルを酵素Ｎ−グリカナーゼＰＮＧａｓｅ  Ｆ存在下または非存在下、３７℃でＰＢＳ中、一夜インキュベートして、Ｎグリコシル化を外した。ＧＩＴＲの変性を、３７℃で５０mM  ジチオスレイトールおよび４Ｍ  塩酸グアニジンによる４５分の還元により行い、続いて１００mM  ヨードアセトアミドで２０分、室温でアルキル化した。Ｎ結合グリコシル化を伴うまたは伴わない天然ヒトＧＩＴＲのサンプルをＳＤＳゲル電気泳動に付し、Ｎ結合グリコシル化を伴うまたは伴わない変性ＧＩＴＲのサンプルを変性ＳＤＳゲル電気泳動に付した。該タンパク質を、ウェスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜に移した。該膜を２８Ｆ３抗体とインキュベートした。結合を抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(ＨＲＰ標識)二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とのインキュベーション、続くフィルムに捕捉された発光検出により検出した。図３５に示す結果は、抗ＧＩＴＲ  Ａｂ  ２８Ｆ３が天然ＧＩＴＲにのみ結合し、変性形態には結合せず、グリコシル化の存在または非存在は結合に影響しないことを示す。抗ＧＩＴＲ抗体３Ｃ３で類似する結果が得られた。
それ故に、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３および３Ｃ３は、立体配座特性を有し、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化に非依存的なエピトープに結合する。
【０６９６】
実施例８：天然ヒトＧＩＴＲペプチドへの２８Ｆ３および３Ｃ３の結合パターン
ヒトＧＩＴＲへの２８Ｆ３および３Ｃ３の結合のパターンを、これらの抗体の天然ヒトＧＩＴＲから産生されたペプチドへの結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析による試験により探索した。実験を次のとおり実施した。まず、天然ヒトＧＩＴＲを、２％ｗ／ｗ比でエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣまたはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎと３７℃でＰＢＳ中、５時間、変性剤非存在下インキュベートすることによりタンパク質分解させた。各消化から２μgの反応混合物全体を、次いで非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、ウェスタンブロット解析のためのニトロセルロースに移した。ウェスタンブロット斑を、次いで２８Ｆ３または３Ｃ３抗体とインキュベートし、結合を抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ標識)コンジュゲート二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とのインキュベーション、続くフィルムに捕捉された発光検出により検出した。図３６に示す結果は、２８Ｆ３と３Ｃ３の結合パターンが異なることを示し、これらの抗体がヒトＧＩＴＲの正確に同じ領域に結合するわけではないことを示唆する。
【０６９７】
実施例９：抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３は、ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメインのＮ末端に結合する
２８Ｆ３が結合するＧＩＴＲ上の領域を、溶液中での各種の非変性ヒトＧＩＴＲのフラグメントへの該抗体の結合を試験することにより決定した。実験を次のとおり実施した。ヒトＧＩＴＲペプチドフラグメントを、ヒトＧＩＴＲと、２％ｗ／ｗ比でエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣまたはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎと３７℃でＰＢＳ中、５時間、変性剤非存在下インキュベートすることにより産生した。次いで、ペプチド混合物を抗ＧＩＴＲ  Ａｂビーズと、ＰＢＳ中、室温で２時間インキュベートした。一部のサンプルを各種の酵素と、ＰＢＳ中１時間インキュベーションすることによるインサイチュ二次開裂に付した。非結合ペプチドを、抗ＧＩＴＲ  ＡｂビーズをＰＢＳで２回洗浄することにより除去した。抗ＧＩＴＲ  Ａｂ  ２８Ｆ３に結合したペプチドを２％ギ酸で溶出し、次いでＬＣ−ＭＳによる配列同定に付した。図３７にヒートマップとして示す結果は、２８Ｆ３が、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のアミノ酸残基１〜３９に対応する次のＮ末端アミノ酸ストレッチQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号２１５)内または短フラグメントQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR(配列番号３７０)内の立体構造エピトープに結合することを示す。
【０６９８】
実施例１０：ヒトＧＩＴＲのＯ結合グリコシル化は、２８Ｆ３の結合を妨害しない
ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメインのＯ結合グリコシル化は知られていないまたは報告されていない。しかしながら、配列番号２１５の残基Ｔ１８およびＴ２０は、Ｏグリコシル化コンセンサス配列を含む。これらの残基は、エピトープ配列で下線を付す：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号２１５)。それ故に、Ｏ結合グリコシル化が２８Ｆ３のヒトＧＩＴＲへの結合に影響するか否かを決定した。
２８Ｆ３の配列番号２１５からなるグリコシル化または非グリコシル化ペプチドへの結合を次のとおり実施した。ヒトＧＩＴＲの部分的グリコシル化および非グリコシル化Ｎ末端ペプチドを、マウスＦｃに結合するインタクト天然ヒトＧＩＴＲ細胞外ドメインのタンパク質分解により産生した。配列番号２１５のアミノ酸残基１〜３９からなる非グリコシル化ＧＩＴＲペプチドも、有機合成により産生した。２８Ｆ３のペプチドへの結合の方法は、先のセクションに記載している(２８Ｆ３被覆ビーズ使用)。図３８Ｂに示すとおり、２個のペプチドは２８Ｆ３被覆ビーズに結合することが判明し、これらは、ＬＣ−ＭＳによりＯ結合グリコシル化がないＮ末端ペプチド(図３８Ａ)および他方は配列番号２１５のＴ１８および／またはＴ２０にＯ結合グリコシル化を有する同じＮ末端ペプチド(図３８Ｄ)であるとして同定された。
それ故に、２８Ｆ３は、アミノ酸Ｔ１８および／またはＴ２０にＯ結合糖を有していてもいなくても、ヒトＧＩＴＲのＮ末端領域に結合する。
【０６９９】
実施例１１：２０量体への抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の結合
先の実施例に記載した実験の一部として、どこのＯ結合グリコシル化も有しない配列番号２１５を有する合成ペプチドを、まず２８Ｆ３被覆ビーズに結合させ、次いでさらにエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎでのインサイチュ消化により開裂させた。アミノ酸配列QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号２１６)からなり、Ｏ結合グリコシル化されていないアミノ酸残基Ｔ１８およびＴ２０を含む残存ペプチドは２８Ｆ３に結合した(図３８Ｅ)。それ故に、２８Ｆ３は、配列番号２１６からなる２０量体に結合する。
【０７００】
実施例１２：ＨＤＸ−ＭＳによるエピトープマッピング
水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)方法は、主鎖アミド水素原子の重水素交換の速度および程度のモニタリングにより、溶液中のタンパク質配置および配座動力学を探索する。ＨＤＸのレベルは、主鎖アミド水素原子およびタンパク質水素結合の溶媒近接性による。ＨＤＸによるタンパク質質量増加は、ＭＳにより厳密に測定できる。この技法を酵素消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造特性が解明され、表面露出ペプチドを内側に折りたたまれているものと分けることが可能となる。一般に、重水素標識およびその後の反応停止実験と、続くオンラインペプシン消化、ペプチド分離およびＭＳ解析を行う。
ＨＤＸ−ＭＳによるＧＩＴＲにおける２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂ(それぞれ配列番号１７および１９からなる重鎖および軽鎖を有する)のエピトープマッピングの前に、非重水素化実験を実施して、組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃの共通消化性ペプチド(R&D Systems、１０μM、アミノ酸置換Ｔ２０Ａを含む)および組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃと２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂのタンパク質複合体(１：２モル濃度比、１０μMおよび２０μM)のリストを作成し、ＧＩＴＲ  Ｎ末端領域について８６％の配列包括度を達成した(図３９Ａ)。この実験において、１０mM  リン酸緩衝液(ｐＨ７.０)を標識工程中使用し、続いて反応停止緩衝液(２００mM  リン酸緩衝液および４Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０.５Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)を添加した。エピトープマッピング実験について、５μLの各サンプル(ＧＩＴＲ／ＦｃまたはＧＩＴＲ／Ｆｃと２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂ(１：２モル濃度比))を、５５μLのＤ２Ｏ緩衝液(１０mM  リン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＤ７.０)で希釈し、室温で標識反応を開始させた。反応を２０秒、１分、１０分、６０分および２４０分の各種の時間実施した。各標識反応時間の最後に、反応を反応停止緩衝液(１：１ｖ／ｖ)添加により停止させ、５０μLの反応停止サンプルを解析のためにWaters HDX-MSシステムに注入した。観察された共通消化性ペプチドを、２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂの非存在下／存在下、重水素取り込みレベルについてモニターした。
【０７０１】
ＧＩＴＲにおける２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂのＨＤＸ−ＭＳ測定から得た図３９Ｂおよび３９Ｃに示す実験データは、２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂが、ＧＩＴＲ  Ｎ末端領域において２ペプチド領域からなる(またはこの領域内の)不連続エピトープを有することを示す。
ペプチド領域１：PTGGPGCGPGRLLLGTGA(配列番号２１７)
ペプチド領域２：CRDYPGEE(配列番号２１８)
相対的重水素取り込みレベルの変化に基づき、２ペプチド領域を領域１＞２とランク付けでき、領域１は重水素取り込みで最も有意に変化し、領域２は統計的有意であった。
【０７０２】
実施例１３：抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔ細胞からＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する
抗ＧＩＴＲ抗体を、該抗体とインキュベートしたＴ細胞により分泌されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量を測定することにより、インビトロでＴ細胞活性を増強する能力について試験した。
異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ)を、存在する１９Ｄ３、１８Ｅ１０および２８Ｆ３抗体の量を増やしながら、抗ＣＤ３モノクローナル抗体被覆プレートで培養した。５×１０４  ３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、１μg／ml抗ＣＤ３抗体(クローン１４５−２Ｃ１１；BD Biosciences)で被覆したプレートで培養し、記載する濃度の抗体で２４時間処理した。図４０に示すとおり、抗体３Ｃ３(ＧＩＴＲ.３)、２８Ｆ３、１９Ｄ３および１８Ｅ１０は、全て、Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を用量依存的様式で増強させた。予想どおり、対照ｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２抗体は３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を増加させなかった。
抗ＧＩＴＲ抗体が刺激性ＣＤ３シグナル存在下３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を増強したことから、該抗体が特異的抗原により活性化された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を増強する能力について試験した。５×１０４  ３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、０.４μM  ＨＥＬ４８−６３ペプチドおよび記載する抗体の存在下、２.５×１０４  ＬＫ３５.２抗原提示細胞と２４時間共培養した。図４１Ａおよび４１Ｂに示すとおり、抗体１８Ｅ１０、１３Ｈ２(２８Ｆ３と同一の抗体)、２８Ｆ３、３Ｃ３および１９Ｄ３は、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を用量依存的様式で増強した。
【０７０３】
さらなる実験において、Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌に対する２８Ｆ３の効果を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)発現ＣＨＯ細胞で刺激したヒトドナーＴ細胞で試験した。ＣＨＯ細胞は、抗ＧＩＴＲ抗体によるアゴニズムを観察可能にさせるために最適以下のの刺激を促進する低レベルのＯＫＴ３を発現した。あるセットの実験において、ドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞をＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および抗ＧＩＴＲ抗体で刺激し、ＩＦＮ−γ分泌を測定して、第二セットの実験において、２ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞(ＣＤ３＋Ｔ細胞のドナーと異なる)を、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および抗ＧＩＴＲ抗体で刺激し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を測定した。実験を次のとおり実施した。汎Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従い汎Ｔ細胞単離キット(Miltenyi#130-091-156)を用いるFicoll勾配(Amersham Bioscience 17-1440-03)で単離したヒトＰＢＭＣから得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞での実験のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣ(ドナー１および２)から、製造業者のプロトコールに従いRosetteSepヒトＣＤ４＋Ｔ細胞富化カクテル(StemCell Technology#15062)を用いて得た。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)を発現するＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−ＯＫＴ３)をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、５０キロラド線量での照射に付した。細胞を採取し、培養培地(１０％ウシ胎児血清、２mM  Ｌ−グルタミン、５５nM  β−メルカプトエタノール、１mM  ピルビン酸ナトリウムおよび１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ−１６４０)に２.５×１０５／mLで再懸濁した。９６ウェルＴＣグレード平底プレート(Costar)のウェルあたり、２.５×１０４  ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞および１×１０５  Ｔ細胞を播種した。細胞を、２０μg／mLから開始するＧＩＴＲ抗体の８点、３倍タイトレーションとインキュベートした。無関係のｈＩｇＧ１をアイソタイプ対照として２０μg／mLで添加した。細胞のみのサンプルを、何ら処理しないベースライン活性を示すために包含させた。各サンプルからの上清を、ＩＬ−２測定(BD opt EIA Human IL- 2 ELISA kit; BD Bioscience#555190)のために２日目(ＣＤ４＋Ｔ細胞でのアッセイのためのみ)およびＩＦＮ−γ測定(BD optEIA human IFN-g ELISA Kit; BD Bioscience#555142)のために３日目に採取した。
【０７０４】
図４２Ｂ〜Ｅに示す結果は、２８Ｆ３が両ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を用量依存的に増加させることを示す。
他の抗ＧＩＴＲ抗体で刺激したドナーＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌も示した。アッセイを上記のとおり実施した。図４２Ａに示すとおり、抗体２８Ｆ３、３Ｃ３、１９Ｄ３および１８Ｅ１０は、全てＣＤ３＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を用量依存的様式で増強し、抗体２８Ｆ３および３Ｃ３が試験した抗体で最大効果を示した。
他の実験において、抗ＧＩＴＲ抗体、特に、２８Ｆ３存在下のＴ細胞増殖が混合リンパ球反応(ＭＬＲ)で示された。
纏めると、これらのデータは、抗体１８Ｅ１０、１９Ｄ３および２８Ｆ３が、Ｔ細胞からのサイトカイン分泌を増強するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体として機能することを示す。
【０７０５】
実施例１４：抗ＧＩＴＲ抗体は、インビトロでＦｃＲ相互作用と無関係にＴ細胞応答を活性化させる
アゴニスト抗ＴＮＦＲ抗体は、インビボ活性のためにＦｃγＲIIＢ共結合が必要であると報告されている(Li et al., Cell Cycle 2012;11:3343-3344)。この要件が抗ＧＩＴＲ抗体にまで拡張されるか否かを決定するために、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、実施例１３に記載のとおりＬＫ３５.２細胞およびＨＥＬ４８−６３ペプチドと共培養し、完全長抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３(ｈＩｇＧ２)、２８Ｆ３のＦ(ａｂ’)２フラグメントまたは２８Ｆ３のＦａｂフラグメントで処理し、ｍＩＬ−２産生について評価した。図４３に示す結果は、完全長２８Ｆ３および２８Ｆ３のＦ(ａｂ’)２フラグメントの両方がｍＩＬ−２産生を増強したが、２８Ｆ３のＦａｂフラグメントの効果は弱く、一価ではなく、二価の結合が抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果に寄与することを示唆する。これらの結果は、纏めて、ＦｃγＲIIＢ共結合はインビトロでのアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体のＴ細胞増強効果に必要ではないが、ＦｃγＲIIＢ受容体の結合はアゴニスト活性を増強し得ることを示唆する。抗ＧＩＴＲ抗体は、アゴニズムを増加させるためにＦｃγＲIIＢ受容体への結合が増大するよう改変され得る。
【０７０６】
実施例１５：抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３は、ヒト扁桃におけるリンパ球を標識する
どの組織がＧＩＴＲを発現するかを決定するために、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３を各種の組織におけるＧＩＴＲの免疫組織化学的検出のために使用した。非リンパ系組織で特異的染色は見られなかった(心臓、肝臓、肺、腎臓、皮膚、末梢神経、甲状腺、精巣、前立腺を含む)。陽性染色はリンパ系(扁桃、脾臓および胸腺を含む)およびリンパ系富(結腸、胃、子宮の粘膜固有層)組織におけるリンパ球および／または単核細胞の散在サブセットでのみ観察された。扁桃における染色を図４４に示す。陽性染色は、濾胞間／傍濾胞領域および胚中心における散乱リンパ球で観察された。単核細胞(上皮の真下)および上皮浸潤リンパ球の散乱クラスターも陽性に染色された。
【０７０７】
実施例１６：ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるバリアント抗ＧＩＴＲアイソタイプの抗腫瘍活性
ＤＴＡ−１は、アゴニストラット抗マウスＧＩＴＲ抗体(Shimizu et al., 2002; eBioscience, San Diego, CA)である。このＩｇＧ２ｂ抗体は、Ｂ１６黒色腫の処置の間ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの両方を調節することが示されている。さらに、ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ両者によるＧＩＴＲ発現が、ＤＴＡ−１の完全な効果に必要であった。Cohen et al. (2010)は、ＤＴＡ−１によるＧＩＴＲライゲーションはＴｒｅｇ抑制活性を全体的に抑止しないが、Ｔｒｅｇ腫瘍浸潤を障害し、抑制の局在的な抑止を暗示する腫瘍内Ｔｒｅｇ内のＦｏｘｐ３発現の喪失に至る。正味の結果は腫瘍内Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の増強ならびに腫瘍内でのＴｅｆｆ活性化および機能の増強である。ＤＴＡ−１は、ＧＩＴＲとＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲＬ)の相互作用を遮断し、可溶性抗体は、インビトロで細胞応答の促進に効果的である。各種の腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の阻害にも有効である(例えば、Turk et al., 2004; Cohen et al., 2010参照)。
【０７０８】
ａ)実験ＭＣ３８  ＃１
各種の抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１)アイソタイプの抗腫瘍活性を、ステージ分類ＭＣ３８結腸腺癌腫瘍モデルで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０６  ＭＣ３８腫瘍細胞を各皮下注射した。７日後、マウスを５処置群に無作為化し、試験抗体を７日目、１０日目および１４日目に、２００μl容積中、用量あたり２００μgで次のとおりＩＰで投与した。群１：マウスＩｇＧ１対照(ＩｇＧ)；群２：抗ＧＩＴＲラットＩｇＧ２ｂ  Ａｂ(ＤＴＡ−ｒＧ２ｂ)；群３：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ１  Ａｂ(ＤＴＡ−ｍＧ１)および群４：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ  ２ａ  Ａｂ(ＤＴＡ−ｍＧ２ａ)。腫瘍および脾臓を１５日目に摘出した。
図４５Ｃは、ＩｇＧ１抗ＧＩＴＲ処置腫瘍は、マウスＩｇＧ１対照処置腫瘍と同等な速度で増殖し(図４５Ａ)、マウスのモニタリングの最後まで１０マウスのいずれも無腫瘍(ＴＦ)とはならなかったことを示す。しかしながら、ＤＴＡ−ｒＧ２ｂ(図４５Ｂ)およびＤＴＡ−ｍＧ２ａ(図４５Ｄ)は腫瘍増殖速度を有意に減少させ、それぞれ１０マウス中３匹および２匹がＴＦとなった。
各種の抗ＧＩＴＲアイソタイプで処置したマウスの群の平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化を、図４６Ａおよび４６Ｂにプロットする。これらのプロットは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗ＧＩＴＲ抗体がＭＣ３８腫瘍増殖で最も強力な阻害性効果を示し、ＩｇＧ２ａアイソタイプがわずかに効力が弱いことを示す、図４５に示す個々のマウスデータを確認する。ＩｇＧ１アイソタイプは腫瘍増殖のわずかな阻害を示し、平均および中央腫瘍体積は、マウスＩｇＧ対照で処置したマウスのものと同等であった。
【０７０９】
ＴＩＬおよび脾臓におけるＭＣ３８  Ｔ細胞サブセットに対する抗ＧＩＴＲアイソタイプの効果も決定した。各種の抗ＧＩＴＲアイソタイプで処置したマウスからのＭＣ３８  ＴＩＬおよび脾臓におけるＴ細胞サブセットの集団を比較した。脾臓において、ＤＴＡ−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｒ２ｂはＣＤ８＋細胞レベルのわずかな減少を引き起こし、一方９Ｄ９−ｍ２ａ(抗ＣＴＬＡ−４抗体)およびＤＴＡ−ｍ１はＣＤ８＋Ｔ細胞レベルを変えなかった(図４７Ａ)。試験したアイソタイプバリアントのいずれも、脾臓におけるＣＤ４＋またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージに顕著な効果を有しなかった(図４７Ｂおよび４７Ｃ)。
ＴＩＬにおいて、９Ｄ９−ｍ２ａは、マウスＩｇＧ１対照両方と比較して、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージの少なくとも２倍増加をもたらした(図４７Ｄ)。マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、ＤＴＡ−ｍ２ａはあまり顕著な効果を示さず、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを約５０％増加させ、一方ＤＴＡ−ｍ１およびＤＴＡ−ｒ２ｂは、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージの増加をもたらさないかまたは最低限度の増加しかなかった(図４７Ｄ)。９Ｄ９−ｍ２ａは、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較してＣＤ４＋細胞のパーセンテージをわずかに増加させ、一方ＤＴＡ−ｍ１はＣＤ４＋を変化させなかった(図４７Ｅ)。対照的に、ＤＴＡ−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｒ２ｂの両方は、マウスＩｇＧ１アイソタイプの両方と比較してＣＤ４＋パーセンテージを４０〜５０％減少させた(図４７Ｅ)。
【０７１０】
最も劇的な効果は、ＴＩＬ間のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルで見られた。ＤＴＡ−ｍ１はＴ細胞のこの集団に効果を有しないが、９Ｄ９−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｍ２ａは、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＤＴＡ−ｍ１と比較してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルの約６倍減少を引き起こした(図４７Ｆ)。これらのデータは、抗ＧＩＴＲのＩｇＧ２ａバリアントが、腫瘍環境で特異的にＴｒｅｇのレベルを減少させることを示す。それ故に、ＩｇＧ２ａ抗ＧＩＴＲアイソタイプは、腫瘍部位でＣＤ８＋Ｔｅｆｆ増加およびＴｒｅｇ減少を誘発し、これは、強固な抗腫瘍活性の指標であるＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比に置き換えられる。ＤＴＡ−ｒ２ｂはまたＩｇＧ１対照と比較してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルの顕著な減少を誘発するが、マウス活性化ＦｃγＲへのラットＩｇＧ２ｂ  Ｆｃ領域の低い結合に一致して、９Ｄ９−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｍ２ａにより誘発される減少ほど明白ではない。これらのデータは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体が枯渇活性のために活性化ＦｃγＲの結合を必要とすることを示す。
ＭＣ３８  ＴＩＬおよび脾臓におけるＴ細胞の各種のサブセット上のＧＩＴＲ発現レベルのフローサイトメトリー測定は、ＧＩＴＲが腫瘍部位でＴｒｅｇ上に最も高度に発現され、その発現レベルは末梢におけるＴｒｅｇまたは腫瘍部位でのＣＤ８＋Ｔｅｆｆより高く、これは、末梢におけるＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔｅｆｆより高い発現となったことを示した。ＧＩＴＲ発現の最低相対レベルは、腫瘍部位のＣＤ４＋Ｔｅｆｆで見られた。これらのデータは、Ｆｃ融合タンパク質の標的が腫瘍部位でのＴｅｆｆ上の標的の発現に比して腫瘍部位でのＴｒｅｇ上で高度に発現され、Ｆｃ融合タンパク質が標的細胞枯渇に介在する活性化ＦｃＲに結合するならば、Ｔ細胞枯渇活性がＴ細胞応答の刺激を助け、それによりＦｃ融合タンパク質の抗腫瘍有効性を増強する機構を示唆する。
【０７１１】
ｂ)実験ＭＣ３８  ＃２
ＤＴＡ−１バリアントで遭遇する凝集のため(ｅ商業的に入手したＤＴＡ−ｒ２ｂの元の形態以外)、新規セットのアイソタイプバリアントを再改変して、凝集しないＤＴＡ−１抗体を得た。観察された凝集は、改変アイソタイプバリアントの軽鎖に不注意に取り込まれていた余分なアミノ酸の痕跡であり、この外来のアミノ酸の除去により問題は軽減された。再改変抗体を、この実験＃２において使用した。再改変抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１；ＧＩＴＲ.７シリーズ)アイソタイプの抗腫瘍活性をステージ分類ＭＣ３８モデルを使用して表かした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０６  ＭＣ３８細胞を各皮下にインプラントした。７日後、マウスを、約１４８mm３／２の同等な平均腫瘍体積を有するように７処置群に無作為化し、試験抗体を、７日目、１０日目および１４日目に、(２００μg用量て投与したｍＩｇＧ対照以外)、用量あたり２００μgで次のとおりＩＰで投与した。群１：マウスＩｇＧ１対照(ｍＩｇＧまたは“アイソタイプ”)；群２：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ１Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ１)；群３：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ１Ｄ２６５Ａアイソタイプ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ１−Ｄ２６５Ａ)；群４：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ２ａ  Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ２ａ)；群５：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ２ｂ  Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ２ｂ)および群６：抗ＧＩＴＲラットＩｇＧ２ｂ  Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｒ２ｂまたはＤＴＡ−１−ｒＧ２ｂ)。腫瘍および脾臓を１５日目に摘出した。
図４８Ｂおよび４８Ｃは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ抗ＧＩＴＲ処置腫瘍が、マウスＩｇＧ１対照で処置した腫瘍と同等の速度で増殖することを示す(図４８Ａ)。各場合、インプラント後３５日のマウスのモニタリングの最後まで、９マウスのいずれもＴＦとならなかった。しかしながら、実験ＭＣ３８  ＃１の結果に類似して、ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ２ａ(図４８Ｄ)は腫瘍増殖の最大阻害を誘発し、９マウス中２匹がＴＦとなった。マウスおよびラット抗ＧＩＴＲ−２ｂ抗体も、同程度腫瘍増殖速度を減少させたが(図４８Ｅおよび４８Ｆ)、ラット２ｂ抗体は１匹のＴＦマウスを生じたのに対し、マウス２ｂ抗体は、インプラント後３５日でＴＦマウスを生じさせなかった。
【０７１２】
平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化を図４９Ａおよび４９Ｂに示す。ＩｇＧ２ａ抗ＧＩＴＲアイソタイプがＭＣ３８腫瘍増殖の最も強力な阻害剤であるが、ＩｇＧ２ｂアイソタイプが腫瘍増殖阻害の有意であるが、低い、効力を示した以外、ＭＣ３８実験１に見られるのと類似する傾向ある。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａアイソタイプは、マウスＩｇＧ対照と比較して腫瘍増殖の低レベル阻害を示した。
処置マウスからのＴＩＬおよび脾臓におけるＴｒｅｇの集団に対する各種の抗ＧＩＴＲアイソタイプの効果を図５０に示す。実験＃１で観察されたとおり、試験したアイソタイプバリアントのいずれも、脾臓におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージに莫大な効果はなく、最強効果は、ラット抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ２ｂアイソタイプでの処置により誘発された４０％未満の増加であり、一方マウス抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ２ｂアイソタイプは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージをわずかに減少させた。試験した他の抗ＧＩＴＲアイソタイプおよび抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２ａ(９Ｄ９−ｍＧ２ａ)抗体は、Ｔｒｅｇのパーセンテージをわずかに増加させた(図５０Ａ)。
【０７１３】
対照的に、ＴＩＬにおいて、アイソタイプ対照と比較して何ら変化させなかったＩｇＧ１アイソタイプ以外、試験した抗体の全てＴｒｅｇのパーセンテージの有意な減少をもたらした。抗ＣＴＬＡ−４抗体９Ｄ９−ｍＧ２ａは、ＩｇＧ１アイソタイプと比較してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルの約４倍減少を引き起こし、抗ＧＩＴＲマウス２ａおよび２ｂアイソタイプならびにラット２ｂアイソタイプは、全てＴｒｅｇのレベルを約２倍減少させ、ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ変異体はわずかに少ない減少を引き起こした(図５０Ｂ)。これらのデータは、抗ＧＩＴＲ  ｍＧ２ａ、ｍＧ２ｂおよびｒＧ２ｂアイソタイプが、腫瘍増殖阻害と相関する、腫瘍環境における顕著なＴｒｅｇ枯渇を誘発することを証明する、実験＃１で見られた効果を確認する。
実験ＭＣ３８  ＃２で得られたデータは実験＃１で得られたデータとほぼ一致し、抗体の凝集が該抗体の活性を過度に妨害しなかったことを示唆する。おそらく、凝集抗体はマウス体内で急速に拡散し、それ故に、抗体凝集はインビボアッセイで顕著な問題ではない可能性がある。
【０７１４】
実施例１７：ステージ分類Ｓａ１Ｎ腫瘍モデルにおけるバリアント抗ＧＩＴＲアイソタイプの抗腫瘍活性
抗ＧＩＴＲの抗腫瘍活性を、Ａ／ＪマウスにおけるＳａ１Ｎ肉腫モデルでも評価した。マウスにインプラントあたり２×１０６  Ｓａ１Ｎ細胞を皮下注射した。７日後、腫瘍体積を決定し、マウスを同等な平均腫瘍体積(約７５mm３／２)となるよう、処置群に無作為化した。実施例１０、実験ＭＣ３８  ＃１において記載したとおり各種のアイソタイプを有するように改変した抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１)抗体を、７日目、１０日目および１２日目に用量あたり２００μgでＩＰで投与した。
腫瘍増殖に対する効果を図５１に示す。ＩｇＧ２ａ抗ＧＩＴＲ抗体での処置は腫瘍増殖を完全に阻害し、全１０マウスはインプラント後約２０日目ＴＦであり(図５１Ｂ)、ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプは同等の効果を有し、１０マウス中９匹が、約２０日目ＴＦであった(図５１Ｃ)。ＩｇＧ１(図５１Ｄ)およびＩｇＧ１Ｄ２６５Ａ(図５１Ｅ)アイソタイプは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照処置腫瘍の非阻害増殖と比較したらある程度腫瘍を阻害したが(図５１Ａ)、これはｍＩｇＧ２ａおよびｒＩｇＧ２ｂアイソタイプで見られる阻害よりはるかに少なかった。図５２Ａおよび５２Ｂに示す平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化は、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａアイソタイプにより示される腫瘍増殖のはるかに低い阻害と比較して、腫瘍増殖に対するｍＩｇＧ２ａおよびｒＩｇＧ２ｂ抗体の実質的に完全な阻害性効果を示した。
纏めると、図５１および５２のデータは、はるかに低い抗腫瘍活性を示すｍＩｇＧ１(およびｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ)アイソタイプとは対照的に、抗ＧＩＴＲ  ｍＩｇＧ２ａおよびｒＩｇＧ２ｂアイソタイプが強力な抗腫瘍活性を示すＭＣ３８腫瘍モデル(実施例１０)で得られたデータを確認する。ｍＩｇＧ１およびＤ２６５Ａバリアント抗体のＳａ１Ｎモデルにおける抗腫瘍活性は、Ｔｒｅｇ枯渇がないＧＩＴＲのアゴニズムの効果に一致する。
【０７１５】
処置マウスからのＳａ１Ｎ  ＴＩＬおよび脾臓におけるＴｒｅｇの集団に対する各種の抗ＧＩＴＲアイソタイプの効果を図５３に示す。試験した抗ＧＩＴＲアイソタイプバリアントの全てが、脾臓におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルの約２０〜４０％の比較的小さな増加を誘発した。最高増加は、マウス抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ２ａアイソタイプでの処置により誘発され、これは、抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２ｂ(９Ｄ９−Ｇ２ｂ)およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ(９Ｄ９−Ｇ１−Ｄ２６５Ａ)抗体での処置と同程度の増加を引き起こした(図５３Ａ)。ＩｇＧ２ｂアイソタイプでＴｒｅｇ枯渇が既に観察されていたため、後者の抗ＣＴＬＡ−４アイソタイプをこのＧＩＴＲ調査における陽性対照として使用した。
末梢におけるＴｒｅｇの効果と対照的に、抗ＧＩＴＲ  ｍ２ａおよびｒ２ｂアイソタイプならびに抗ＣＴＬＡ−４  ２ｂアイソタイプは、全て腫瘍部位のＴｒｅｇのレベルを少なくとも３.５倍減少させた(図５３Ｂ)。ＴＩＬにおいて、抗ＧＩＴＲ  ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ変異体の両方は、Ｔｒｅｇのパーセンテージの約３５％の小さな減少を誘発したのに対し、抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ変異体はＴｒｅｇのパーセンテージを変化させなかった(図５３Ｂ)。それ故に、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて観察されたとおり、抗ＧＩＴＲ  ｍＧ２ａおよびｒＧ２ｂアイソタイプは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ抗体よりはるかに顕著なＴｒｅｇ枯渇を腫瘍環境で誘発し、これは腫瘍増殖阻害と相関すること。
【０７１６】
実施例１８：抗ＧＩＴＲ抗体と抗ＰＤ１アンタゴニスト抗体の組み合わせの相乗的活性
相乗的抗腫瘍効果が、ＤＴＡ−１抗体を、抗腫瘍機構に対する阻害性シグナルを提供する分子であるＰＤ−１と拮抗する抗体と組み合わせることにより得られるか否かを決定するために、ステージ分類ＭＣ３８結腸腺癌モデルを使用して腫瘍体積に対するこれら抗体の組み合わせの効果を評価した。マウスを、７日、１０日および１４日に(Ａ)対照ｍＩｇＧ１、(Ｂ)  ｍＩｇＧ＋ＤＴＡ−１、(Ｃ)  ｍＩｇＧ＋ＰＤ−１(クローン４Ｈ２、ＢＭＳ)および(Ｄ)  ＰＤ−１＋ＤＴＡ−１で処理した。
腫瘍増殖に対する効果を図５４に示す。ＤＴＡ−１抗体または抗ＰＤ−１抗体個々での処置は、ある程度腫瘍増殖を阻害し、各々１０マウス中２匹がＴＦとなった。対照的に、ＤＴＡ−１抗体と抗ＰＤ−１抗体の組み合わせは、３０日までにＴＦマウスの数を実質的に増加させ、１０マウス中７匹がＴＦとなった。予想どおり、対照ｍＩｇＧを投与したマウスでＴＦマウスはいなかった。
これらの結果は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体とアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体の組み合わせが、腫瘍増殖阻害に相乗的に作用することを示唆する。
【０７１７】
実施例１９：結合親和性に対するＣＤＲアミノ酸変異の効果
この実施例は、２８Ｆ３のＶＨ  ＣＤＲ３におけるあるアミノ酸残基を、結合親和性に顕著に影響することなく他のアミノ酸に置換できることを示す。
２８Ｆ３の４８変異体を、ＶＨ  ＣＤＲ３の次のアミノ酸Ｍ１０２、Ｄ１０６およびＭ１１１(ナンバリングは配列番号１３に従う)の１以上を変異させることにより作製し、次３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞への結合およびプレート結合抗ＣＤ３存在下３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞のＩＬ−２分泌の活性を試験した。実験を上記のとおり実施した。
結果を図５５Ａおよび５５Ｂ(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞への結合)、図５６Ａ〜Ｆ(ＩＬ−２分泌)および表７に示す。
【０７１８】
【表７】
2019508013.tif 000010
【表８】
2019508013.tif 000011
結果は、いくつかの変異体が２８Ｆ３と同等な結合および活性を有するが、他の変異は、結合およびＩＬ−２分泌の一方または両方を減少させることを示す。次の変異体は、同等な結合および活性データを有する：Ｍ９８Ｖ；Ｍ９８Ｖ／Ｄ１０６Ｅ；Ｍ９８Ｌ／Ｄ１０６Ｅ；Ｍ９８Ｉ／Ｄ１６０ＥおよびＭ９８Ａ／Ｄ１０６Ｅ。
【０７１９】
実施例２０：ＧＩＴＲ抗体アゴニスト活性に対する定常領域修飾の効果
この実施例は、ＩｇＧ２ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体と比較して、Ｔ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する能力が増加することを示す。
上記ＣＨＯ−ＯＫＴ３および３Ａ９アッセイにおいて、ＩｇＧ２定常領域を有するハイブリドーマ由来抗体が、重鎖定常領域がＩｇＧ１またはエフェクターレスＩｇＧ１(ＩｇＧ１.１)のものにスイッチされた同じ抗体よりも、サイトカイン分泌刺激がより強力であることが観察された。それ故に、ＩｇＧ２定常領域またはヒンジの効果を、これらのアッセイにおいて抗ＧＩＴＲ抗体でさらに試験した。
抗ヒトＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域を、次の重鎖定常領域に結合させた。
【表９】
2019508013.tif 000012
【０７２０】
まず、これらのＧＩＴＲ抗体の結合親和性をＩｇＧ１ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体と比較した。結合親和性を実施例２に記載するとおり決定した。図５７に示すとおり、ＩｇＧ２ヒンジを有する全３ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１.１定常領域を有する２ＧＩＴＲ抗体と、活性化Ｔ細胞に同程度の親和性を示した。
次に、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＧＩＴＲ抗体の能力を、実施例１３に記載するとおり、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞で刺激したＴ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する能力について試験した。図５８Ａおよび５８Ｂに示すとおり、ＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する抗体(“抗ＧＩＴＲ.Ｇ２.ｇ１ｆ”)は、ＩｇＧ１定常領域を有する抗体(“抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆ”)より高い程度でＴ細胞からＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌を誘発した。類似する結果がこれらの定常ドメインのエフェクターレスバージョンで得られた(図５８Ｃ)。
抗ＩｇＧ２ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体でのＴ細胞活性化増加をさらに確認するために、各種の実験構成でＩＬ−２分泌を試験した。この実験において、ＧＩＴＲ抗体が３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞(ヒトＧＩＴＲを異所性に発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株)からのＩＬ−２分泌を誘発する能力を実施例１３に記載のとおり試験した。図５９に示すとおり、ＩｇＧ２ヒンジを有する全抗体(抗ＧＩＴＲ.ｇ２、抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１.１ｆ)は、ＩｇＧ１定常領域含有カウンターパート(抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ.ｇ１.１ｆ”)より高い程度で３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を誘発した。
これらの結果は、纏めて、ＩｇＧ２ヒンジおよびｇ１またはｇ１.１定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体より強力であることを示唆する。ＩｇＧ２ヒンジ含有ＧＩＴＲ抗体の効果改善を説明する可能性のある機構は、ＩｇＧ１ヒンジを含む同じ抗体と比較して、内部移行増加および／または細胞表面でのこれらの抗体の複合体形成増加である。
【０７２１】
実施例２１：抗ＧＩＴＲ抗体誘発増殖は、Ｔｅｆｆ細胞内因性である
ＧＩＴＲはマウスおよびヒト両方の制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞で発現される。文献におけるデータは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体が、Ｔｒｅｇ細胞存在下、マウスＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−  Ｔエフェクター(Ｔｅｆｆ)細胞の増殖を駆動することを示している。さらに、この効果は、Ｔｒｅｇ細胞サプレッサー機能に対する直接効果ではなく、主にＴｅｆｆ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体結合により駆動されることが示唆されている。他の刊行物は、抗ＧＩＴＲ抗体がＴｒｅｇ細胞増殖を駆動し、Ｆｏｘｐ３喪失により特徴付けられるＴｒｅｇ細胞系譜不安定性を誘発し得ることを示す。
Ｔｒｅｇ細胞機能に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を試験するために、Ｔｅｆｆ細胞がＡＰＣおよびタイトレーション数のＴｒｅｇ細胞存在下、抗ＣＤ３および抗マウスＧＩＴＲ  ｍＡｂ  ＤＴＡ−１の各種のアイソタイプで刺激された、マウスＴｒｅｇ細胞抑制アッセイを実施した。結果は、ＤＴＡ−１抗体処置が、アイソタイプ対照と比較して増殖を増加させたことを示す。さらに、ＩｇＧ１、２ａ、２ｂおよび不活性ＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａアイソタイプは、Ｔｅｆｆ細胞増殖の増加に全て効果的であり、それによりＦｃＲ結合がこのシステムにおける抗ＧＩＴＲ抗体機能に必要ではないことを示す。
先の実験から、Ｔｅｆｆ増殖増加がＴｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆ細胞に作用する抗ＧＩＴＲ抗体によるものであるか否か明確ではなかった。この疑問に取り組むため、ヒトＧＩＴＲ“ノック・イン”(ｈｕＧＩＴＲ  ＫＩ)マウスを使用した。これらのマウスにおいて、マウスＧＩＴＲをコードする遺伝子であるＴｎｆｒｓｆ１８をヒトＴＮＦＲＳＦ１８遺伝子に置き換え、ヒトＧＩＴＲを野生型マウスにおけるｍｕＧＩＴＲと同様にに発現させ、ヒトＧＩＴＲはＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ細胞両方で発現され、後者のレベルが高かった。抗ヒトＧＩＴＲ  ｍＡｂ  ２８Ｆ３はｈｕＧＩＴＲ  ＫＩマウスからのＴｅｆｆ細胞の増殖を駆動できることが判明した。２８Ｆ３がマウスＧＩＴＲではなくヒトＧＩＴＲに結合するため、ＧＩＴＲがＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ細胞を差次的に標的とするＴｒｅｇ抑制アッセイシステムの設定が可能であった。このシステムは、２８Ｆ３と、ヒトＩｇＧ１または不活性ＩｇＧ１.１  Ｆｃ領域の間の機能的差異の試験も可能とした。
【０７２２】
ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を、ｈｕＧＩＴＲ  ＫＩおよびＷＴマウスからＣＤ４およびＣＤ２５発現に基づきソートした。ＷＴおよびｈｕＧＩＴＲ  ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を、２８Ｆ３でのＴｒｅｇまたはＴｅｆｆ細胞の単区画ターゲティングを可能にする組み合わせ(ｈｕＧＩＴＲ  ＫＩ  Ｔｅｆｆ細胞と野生型Ｔｒｅｇ細胞など)で混合した。対照として、２８Ｆ３がＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞の両方に結合できるまたはいずれにもできない条件を包含させた。ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ細胞含有培養をＡＰＣおよび２８Ｆ３  ＩｇＧ１、２８Ｆ３  ＩｇＧ１.１またはアイソタイプ対照の存在下、抗ＣＤ３で刺激した。
結果を図６０に示す。予想どおり、２８Ｆ３がＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞の両方に結合できたとき、Ｔｅｆｆ細胞増殖の増加が観察され、この効果は２８Ｆ３がＴｅｆｆ細胞のみに結合できた条件で維持された。対照的に、２８Ｆ３がＴｒｅｇ細胞にしか結合できなかったとき、Ｔｅｆｆ増殖のアイソタイプ対照を超える増加はなかった。アイソタイプに関して、２８Ｆ３が効果を示した条件下で、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１.１  Ｆｃで差異はなかった。これは、Ｆｃ架橋が抗ＧＩＴＲアゴニズムに必要ではないことを示す上記データと一致する。纏めると、このシステムにおいて、抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔｒｅｇ細胞サプレッサー能の阻害を介してではなく、主にＴｅｆｆ細胞機能を調節する能力により作用する。しかしながら、これは、抗ＧＩＴＲ抗体がＴｒｅｇ細胞増殖を駆動するまたはＡＤＣＣまたはＡＤＣＰのためのＴｒｅｇ特異的標的を提供する可能性のため、インビボでのＴｒｅｇ細胞に対するＧＩＴＲシグナル伝達の役割を除外しない。
【０７２３】
実施例２２：抗体依存的細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)
２８Ｆ３.ＩｇＧ１ｆおよび２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆのインビトロＡＤＣＣ活性を、エフェクターとしてＮＫ９２／ＣＤ１６細胞または初代ＮＫ細胞およびＧＩＴＲを発現することが知られる多様な細胞を標的として使用して評価した。
アッセイ３日前、標的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを陰性選択により単離し、Ｔｒｅｇをさらに  ＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ２５陽性選択により単離した。Ｔ細胞サブセットの各々をＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(Miltenyi Biotec)で３日刺激し、ＧＩＴＲの上方制御を誘発した。アッセイ１日前、初代ＮＫ細胞を陰性選択(StemCell Technologies, Inc)により新鮮ＰＢＭＣから単離し、一夜、５００IU／mL組み換えＩＬ−２(R&D Systems)および１uMヒドロコルチゾン(StemCell)添加MyeloCult H5100培地(StemCell)でインキュベートした。アッセイ当日、エフェクター細胞(初代ＮＫ細胞またはＮＫ９２／ＣＤ１６)を、特定のエフェクター対標的比で、１ug／mL  ２８Ｆ３.ＩｇＧ１ｆおよび２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆ存在下、Calcein AM標識活性化Ｔ細胞とインキュベートした。
初代ＮＫ細胞またはＮＫ９２／ＣＤ１６細胞をエフェクターとして使用して、２８Ｆ３.ＩｇＧ１は活性化ＣＤ４＋ＴエフェクターおよびＴｒｅｇ細胞の溶解を誘発したが、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の観察された溶解は少なかった(図６１)。予想どおり、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１は、エフェクターとしてＮＫ９２または初代ＮＫ細胞を使用して、いずれの標的細胞のＡＤＣＣも介在しなかった。それ故に、２８Ｆ３.ＩｇＧ１は活性化ＣＤ４＋ＴエフェクターおよびＴｒｅｇ細胞および程度は少ないが活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解を誘発し、２８Ｆ３.ＩｇＧ１により誘発された溶解レベルは、標的細胞上のＧＩＴＲ発現レベルと比例するように見える。
【０７２４】
実施例２３：ヒトＧＩＴＲノック・インマウスにおける２８Ｆ３.ＩｇＧ１抗体の活性
この実施例は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３ＩｇＧ１.１がヒト免疫系およびヒトＧＩＴＲタンパク質を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８腫瘍に抗腫瘍活性を有し、該抗腫瘍活性が２８Ｆ３.ＩｇＧ１で強まることを示す。
【０７２５】
ヒトＧＩＴＲノック・インマウスの作製：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ヒトＧＩＴＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)をマウスＧＩＴＲ  ＥＣＤの代わりに発現するよう遺伝子操作し、マウス膜貫通および細胞質配列はインタクトのままとした。ヒト／マウスキメラＧＩＴＲの発現は、抗ヒトＧＩＴＲ抗体での抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化脾臓細胞染色により確認した。
ＭＣ３８細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、２mM  Ｌ−グルタミン、４.５ｇ／Ｌ(４５％)  グルコース(１０mL／Ｌ)および１mM  ピルビン酸ナトリウム(１０mL／Ｌ)含有ＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、２日毎に１：１０に分けた。マウスの２コホートを使用し、両コホートについて、各マウスの右脇腹に、０.２mL  ＰＢＳ中７５万ＭＣ３８細胞を１cm３シリンジおよび２５ゲージ半インチ針を使用して皮下にインプラントした。コホート１について、インプラント後７日目、４０マウスを腫瘍体積(Ｌ×Ｗ×Ｈ／２)により各１２〜１３マウスの３群に無作為化した。全群、約１７４mm３／２の平均腫瘍体積を有した。７日目、１０日目および１４日目、媒体対照またはｍＡｂを１０mg／kgで投与した。コホート２について、インプラント後７日目、１０マウスを、腫瘍体積(Ｌ×Ｗ×Ｈ／２)により各５マウスの２群に無作為化した。全群、約６９mm３／２の平均腫瘍体積を有した。７日目、１０日目および１４日目、媒体対照または２８Ｆ３.ＩｇＧ１  ｍＡｂを１０mg／kgで投与した。
マウスに、表９に要約する濃度および日で腹腔内(ＩＰ)投与した。
【表１０】
2019508013.tif 000013
【０７２６】
腫瘍および体重を、調査の終了まで週に２回測定した。腫瘍をFowler Electronic Digital Caliper(モデル62379-531; Fred V. Fowler Co., Newton, MA)で３面測定し、データを、Studylog Systems, Inc.(South San Francisco, CA)のStudyDirectorソフトウェアを使用して電子的に記録した。
この腫瘍調査において、コホート１をインプラント後５２日目に終了した。腫瘍体積および体重の平均、標準偏差(ＳＤ)および中央値の計算にMicrosoft Excelを使用した。平均および中央値を、それぞれ、各処置群の実験動物が１００％および少なくとも６０％残っているとき計算した。コホート２におけるマウスからの腫瘍を、１５日目に摘出した。
結果は、試験中の全マウスが生存していた最終日である、腫瘍インプラント後２２日目に、１０mg／kg用量の２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＭＣ３８異種移植で６７％平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)を示した。腫瘍ＴＧＩを表１０において処置群毎に要約する。処置群毎の腫瘍増殖曲線を図６２Ａ〜６２Ｃに示す。処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を図６３Ａ〜６３Ｂに示す。平均および中央体重変化が２０％未満であったことから、いずれの処置群でも毒性は明白ではなかった。マウス体重および経時的パーセンテージ変化を図６４Ａ〜６４Ｂに示す。
【表１１】
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【０７２７】
結果は、インプラント後２２日目２８Ｆ３.ＩｇＧ１が６７％ＴＧＩを有し、一方２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆが２２％ＴＧＩを有することを示し、両抗体がＭＣ３８腫瘍モデルで腫瘍増殖を減少させたことを示す。さらに、該結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１によるＦｃ結合が、ＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗腫瘍効力を増強することを示唆する。
２８Ｆ３.ＩｇＧ１がＴ細胞集団に有する効果を試験するために、インプラント後１５日目各処置群の５マウスから組織を摘出した。脾臓および腫瘍を、gentleMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi, San Diego, CA)で処理した。単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)を使用してＴ細胞マーカーで染色した。抗体蛍光を、Fortessa(BD Biosciences, San Jose, CA)でのフローサイトメトリーにより検出し、結果をコンピュータープログラム、Flowjo(Flowjo, LLC, Ashland, OR)で解析した。
図６５および６６に示す結果は、アイソタイプ対照と比較した、２８Ｆ３.ＩｇＧ１で処置したマウスにおける枯渇と一致するＴｒｅｇ細胞のパーセンテージ減少を示す(図６５)。逆に、２８Ｆ３.ＩｇＧ１群でＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加はなかった(図６６)。
それ故に、アイソタイプ対照と比較して、２８Ｆ３.ＩｇＧ１で処置したマウスにおける免疫モニタリングは、ＴＧＩにＴｒｅｇ枯渇およびＣＤ８＋Ｔ細胞増加が介在し得ることを示唆する。
【０７２８】
実施例２４：架橋２８Ｆ３.ＩｇＧ１はその効力を増加させる
この実施例は、架橋２８Ｆ３.ＩｇＧ１がＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強し、Ｔ細胞増殖を促進するその効力を増加させることを示す。
Ｔ細胞を、各種の濃度の抗ＧＩＴＲ抗体または対照薬剤の存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞またはＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高と共培養し、インターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)分泌および細胞増殖のレベルを測定した。ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２高細胞株は、親ＣＨＯ−ＯＫＴ３クローンより極めて高レベルのＦｃ受容体ＣＤ３２ａおよびわずかに高いＯＫＴ３発現を有する。
アッセイを次のとおり実施した。レスポンダーＴ細胞を、製造業者のプロトコールに従い、ＣＤ４  Ｔ細胞単離キット(Life technologies, Cat. 113.31D)およびＣＤ２５マイクロビーズ(Miltenyi, Cat. 130-092-983)を用いてFicoll勾配(Amersham Bioscience 17-1440-03)から単離したヒトＰＢＭＣから得た。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)を発現するＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−ＯＫＴ３)または抗ＣＤ３ｓｃＦｖを発現するＣＨＯ細胞およびＣＤ３２ａをＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、５０キロラド線量での照射に付した。細胞を採取し、培養培地(１０％ウシ胎児血清、２mM  Ｌ−グルタミン、５５nM  β−メルカプトエタノール、１mM  ピルビン酸ナトリウムおよび１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ−１６４０)に２.５×１０５／mLで再懸濁した。９６ウェルＴＣグレード平底プレート(Costar)のウェルあたり、２.５×１０４  ＣＨＯ細胞および１×１０５  Ｔ細胞を播種した。細胞を、２０μg／mLから開始するＧＩＴＲ抗体の８点、４倍タイトレーションとインキュベートした。無関係のｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として２０μg／mLで添加した。細胞のみのサンプル、何ら処理しないベースライン活性を示すために包含させた。各サンプルからの上清を、ＩＦＮ−γ測定(BD optEIA human IFN-g ELISA Kit; BD Bioscience#555142)のために３日目に採取した。細胞増殖を、インキュベーションの最後の８時間の３Ｈ−チミジン取り込みにより評価した。図６７および６８に示す結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したものと比較して、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高と共培養したＴ細胞からより多くのＩＦＮ−γが分泌されることを示す(図６７)。予想どおり、ＣＤ３２ａに結合しないエフェクターレス２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆ抗体で有意な差は観察されなかった。さらに、２８Ｆ３.ＩｇＧ１存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したものより多いＴ細胞増殖がＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高と共培養したＴ細胞で観察され、この効果はエフェクターレス２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆ抗体で観察されなかった(図６８)。それ故に、架橋２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強し、Ｔ細胞増殖を促進するその効力を増加させる。この増強効果は、低レベルのＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と増殖させたＴ細胞でも観察された。ＧＩＴＲ.６  ｇ１.１ｆは、可溶性であるときと比べて、交差結合であるとき、高レベルのＩＦＮ−γを示した。これは、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と比較して、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高細胞で発現されるＯＫＴ３レベルがわずかに高いことを反映している可能性がある。交差結合ＧＩＴＲ.６ｇ１ｆで観察された増加は不活性アイソタイプより大きく、架橋の正の利益を示唆する。Ｇ１ｆバージョンは、可溶性抗体が背景を超えるアゴニズムがほとんどない低用量で高レベルのＩＦＮ−γを促進し、同様に架橋の正の役割を示唆する。
それ故に、２８Ｆ３.ＩｇＧ１およびエフェクターレス２８Ｆ３.ＩｇＧ１抗体の両方とも、ＩＦＮ−γ産生を刺激し、Ｔ細胞増殖を刺激するが、しかしながら、架橋２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強し、Ｔ細胞増殖を促進するその効力をさらに増加させる。
【０７２９】
実施例２５：ＩｇＧ２  ＣＨ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＩＴＲ  Ａｂ誘発ＩＬ−２分泌を増強する
この実施例は、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ１ドメインを有する抗体と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体誘発Ｔ細胞活性を増強することを示す。
表１１に示す修飾重鎖定常領域を、抗ＧＩＴＲ抗体の可変領域と結合させた。ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＫＴ３−ｓｃＦｖ発現ＣＨＯ細胞および各種の抗ＧＩＴＲ抗体とインキュベートし、分泌されるＩＬ−２のレベルを測定した。これは、実施例２０に記載のとおり実施した。
【表１２】
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【０７３０】
図６９に示す結果は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジに加えて、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインを有する全抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１よりも、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌刺激により効果的であることを示す。
それ故に、この実施例は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体におけるＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの存在は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含まない同じ抗体と比較して、抗体のアゴニスト活性をさらに増強させることを示す。ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインの両方を有する抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを有するが、ＣＨ１を有しない抗体と比較して、強いアゴニスト効果を有する。さらに、ＩｇＧ２からのＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプからのＣＨ１ドメインを有する抗体より強いアゴニスト活性を有する。ＩｇＧ２からのヒンジおよびＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプからのＣＨ１およびヒンジを有する抗体より強いアゴニスト活性を有する。
【０７３１】
実施例２６：改変定常ドメインを有する抗体に対するＦｃ受容体結合
この実施例は、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗体が、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むとき、ＦｃγＲに結合することを示す。
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用によりＦｃガンマ受容体(ＦｃｇＲ)と結合できる。これらの相互作用は、抗体依存的細胞細胞毒性(ＡＤＣＣ)および抗体依存的細胞貪食活性(ＡＤＣＰ)などのエフェクター機能に介在する。エフェクター機能活性はＩｇＧ１アイソタイプで高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４については、これらのアイソタイプがＦｃｇＲへの親和性が低いため、極めて低いかまたはない。さらに、ＩｇＧ１のエフェクター機能は、ＦｃｇＲ親和性および選択性を改変するための定常領域内のアミノ酸残基の変異により修飾され得る。
抗体のＦｃガンマ受容体(ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ)への結合を、Biacore表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)およびFortebio Biolayer Interferometry(ＢＬＩ)を含むバイオセンサーテクノロジーを使用して試験した。ＳＰＲ試験をBiacore T100装置(GE Healthcare)で２５℃で実施した。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体からのＦａｂフラグメントを約３０００RU密度にＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。各種のｈｉｓタグ付ＦｃｇＲ(７ug／ml)を、１０ul／分で、３０秒の接触時間を使用してＣ末端ｈｉｓタグにより捕捉し、１.０uM抗体の結合を、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)、ｐＨ７.１のランニング緩衝液で評価した。これらの実験に使用いたＦｃｇＲは、ＣＤ６４(ＦｃｇＲＩ)、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｈ１３１)、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｒ１３１)、ＣＤ３２ｂ(ＦｃｇＲIIｂ)、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８(ＦｃｇＲIIIａ−Ｖ１５８)、ＣＤ１６ｂ−ＮＡ１(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ１)およびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ２)を含む。ＢＬＩ実験をFortebio Octet RED装置(Pall, Fortebio)で、２５℃で１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)、ｐＨ７.１で実施した。抗体を、プロテインＡ被覆センサーで非希釈発現上清から捕捉してとり、１μM  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８または０.１μM  ｈＣＤ６４検体の結合が続いた。
【０７３２】
まず、置換Ｓ２６７Ｅ(ＳＥ)およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ(ＳＥＬＦ)ならびに変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの各種の組み合わせ(それぞれＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と称する)を含む修飾ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗体を産生した。これらの抗体の結合を、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ)およびＩｇＧ４.１(ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ)抗体、ならびに全ＦｃｇＲへの結合が減少するように改変されているＩｇＧ１.１ｆ抗体と比較して、Biacore SPRにより試験した。図７０に示す結果は、ＳＥおよびＳＥＬＦについてＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂ結合増加ならびにＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２変異体のＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１を超えるＣＤ３２ｂに対する選択性増加を含む、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ４.１および変異ＩｇＧ１抗体についての予測されるＦｃｇＲ結合性を示す(図７０)。
次のセットの構築物を、そうしなければエフェクター機能陰性であるＩｇＧ２アイソタイプへのエフェクター機能の改変に使用した。この調査に関して、上記変異をＩｇＧ２.３定常領域またはＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹと称するＩｇＧ２.３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドに行った(表１２)。抗体は、小規模で上清に発現させ、Fortebio Octet BioLayer Interferometryバイオセンサーテクノロジーを使用してＦｃｇＲへの結合について試験した。抗体が上清に低濃度で存在したため、実験を、プロテインＡ被覆センサーを使用して抗体ｏを上清から捕捉し、その後、溶液でのＦｃｇＲ検体の結合により実施した。野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む精製および上清対照ＩｇＧ１ｆも比較のために包含させ、これらの対照抗体の各々予測されるＦｃｇＲ結合性を示した(図７１)。ＩｇＧ２.３抗体も予測される結合プロファイルを示し、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１へのみ感知できる結合をした。しかしながら、ＩｇＧ２.３にＳ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ変異を導入するための全変異は、対応する改変ＩｇＧ１  ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性の再現に失敗した(図７１)。対照的に、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ構築物は、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合性を完全に保持し、同時にＩｇＧ２.３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持することが可能であった。さらに、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含む全ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ変異体は、同じ変異を有するＩｇＧ１バージョンｍＡｂと同等なＦｃｇＲ結合性を示した(図７１)。これは、野生型または変異体ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わせたＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を有する抗体のエンジニアリングの成功を示す。
【０７３３】
【表１３】
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【０７３４】
このエンジニアリング戦略を、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｓ２６７Ｅ(ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)でフォーマットした他の抗体、ならびにＩｇＧ２−Ｂ形態バリアント(ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)および他のＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの各種の組み合わせを含むハイブリッド抗体を作製し、これらの抗体の抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ｈｉｓタグ付ＦｃｇＲへの結合をBiacore SPRテクノロジーを使用して試験することによりさらに探索した。Ｏｃｔｅｔ上清データと一致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体が、Ａ形態ＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.３)のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにもかかわらず、それぞれＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅと同等なＦｃｇＲ結合性を有したことを示した(表１３)。ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体を使用してまた類似する同等が得られ、ＩｇＧ１ｆまたは修飾ＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有するＢ形態ＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.５と称されるＣ１３１Ｓ変異含有)のエンジニアリングの成功を示した。ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹまたはＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７定常領域を有するが、可変領域が各種であるいくつかの他の抗体のデータは、このエンジニアリング戦略が可変ドメインと無関係に他の抗体に広く応用可能であることを示す(表１３)。ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合性を示す他の構築物は、ＩｇＧ１−Ｇ２.３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ１デルタＴＨＴであり、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２.３プラスＴＨＴ、ＩｇＧ２.５プラスＴＨＴおよびＩｇＧ２.３プラスＧＧＧ構築物を含む修飾定常領域構築物のいくつかは、ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合性を保持できなかった(表１３)。
【０７３５】
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０７３６】
纏めるとこれらのデータは、ＩｇＧ１におけるヒンジ領域の保存的CPPCPAP(配列番号４７９)モチーフのすぐＣ末端の配列がＦｃｇＲ介在エフェクター機能に寄与し、一方、ＩｇＧ１および修飾ＩｇＧ１のエフェクター機能とＩｇＧ２  ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む抗体の優れた内部移行またはシグナル伝達性質を組み合わせることが可能であるために、抗体のＣＨ１およびヒンジの上部部分はＩｇＧ２または修飾ＩｇＧ２配列に置き換えることが可能であることを示す。
【０７３７】
実施例２７：ＧＩＴＲアゴニスト抗体内部移行は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体で増強される
ＧＩＴＲ発現を誘発するために、細胞を、７２時間、３７℃で２０ng／ml抗ＣＤ３＋１０００ng／ml  ＣＤ２８とインキュベートした。Ｔ細胞活性化の別方法として、大バッチの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を３段階培養プロトコールにより製造した。簡潔にいうと、ＣＤ４＋Ｔ細胞を１μg／ml可溶性ＣＤ２８添加プレート結合ＣＤ３(１.５μg／ml)で、７２時間、３７℃で刺激し、２０ｕ／ml  ＩＬ−２存在下、１４日培養で増大させ、最後に１０μg／ml  ＰＨＡ、２ｕ／ml  ＩＬ−２および１μg／ml  ＣＤ２８を７２時間、３７℃で添加することにより活性化のさらなるラウンドに付した。刺激Ｔ細胞を、３８４ウェルＰＤＬ造影プレートに２時間播種して、細胞を接着させ、１５分、４℃に冷却し、次いでAlexa 488標識ＧＩＴＲ抗体を別々に１時間添加した。プレートを最後にＨＣＳにより造影し、データを細胞あたりの総強度として報告した。
３つの異なるＧＩＴＲ抗体を、上記Ｔ細胞活性化方法を使用して評価している。Ｇ１アイソタイプとしてのＧＩＴＲ.６抗体およびＦｃ受容体に結合できない不活性(ＩｇＧ１.１)アイソタイプ、ならびにＩｇＧ１ヒンジの代わりにＩｇＧ２ヒンジとのキメラである。
ＧＩＴＲ抗体誘発内部移行をＣＤ３刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞で、Alexaクエンチアッセイ形式で評価した。新たに得たＣＤ４陽性Ｔ細胞を上記条件下インキュベートして、ＧＩＴＲ発現を誘発した。刺激後、細胞を新鮮培地に再懸濁し、内部移行アッセイのために次のとおり播種した。細胞を上記抗体とインキュベートし、温培地で洗浄し、３７℃で記載する時間インキュベートして、その後固定および消光した。内部移行抗体を０時に観察された小さな消光不可能なシグナルを超える蛍光の増加として測定し、細胞に最初に結合していた総蛍光“非消光対照”に対して正規化した。図７２に示すとおり、ＧＩＴＲライゲーションは、各抗体試験で３０〜６０分にピークの速い内部移行をもたらすのに対し、対照抗体は、原形質膜への局在化を維持することが判明した。結果は、ＩｇＧ２ヒンジ領域がＧＩＴＲライゲーション誘発内部移行を増強することを示す。
【０７３８】
さらに内部移行および関連動態の詳細な機構を精査するために、抗体エンドサイトーシスおよび初期エンドソーム区画への送達を分析した。この実験において、細胞を、非標識抗体でパルス・チェイス解析した。固定により、細胞を透過性にし、初期エンドソームマーカーＥＥＡ１(Cell Signaling Technology)で染色し、洗浄し、次いでAlexa fluor-488コンジュゲート抗ウサギ二次抗体(ＥＥＡ１)およびAlexa fluor-647コンジュゲート抗ヒト抗体(ＧＩＴＲ)で検出した。プレートを６０倍水浸対物レンズを伴うOpera共焦点システムで造影した。結果は、膜結合抗ＧＩＴＲ抗体染色と細胞内ＥＥＡ１シグナルの明確な分離を示した。培養物を温めたのち、抗体の位置部のクラスタリングが検出され、これはエンドソームタンパク質と共局在するように見えた。エンドソーム共局在化の定量化を、HCS Studio Softwareを使用して実施し、結果を総染色に対する共局在化ピクセル強度の比率としてプロットする(図７３Ａ〜Ｃ)。ＧＩＴＲ抗体と初期エンドソームの共局在は３０分が最も顕著である。この試験した時点で、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆは、ＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆ抗体より高いフラクション共局在化を示した。共局在化結果は、上記Alexa消光方法を使用して観察されたものと相関し、モデルを支持し、Ｇ２ヒンジがＧＩＴＲ内部移行誘発にＧ１を超える潜在的利点を有することを示唆する。
【０７３９】
実施例２８：Ｔ細胞受容体活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲアゴニスト抗体シグナル伝達は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体で増強される
抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体の機構をさらに探索するために、ＮＦｋＢおよびＰ３８シグナル伝達経路などのＴ細胞活性化に関与する数シグナル伝達経路をモニターした。
健常ドナー(Ｍ６５７６)からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレート被覆０.４μg／ml抗ＣＤ３および０.４μg／ml抗ＣＤ２８で活性可した。３日後、細胞を回収し、シグナル伝達活性化のために３８４ウェル造影プレートに播種した。細胞をプレート上で２時間定着させた後、抗ＧＩＴＲ抗体で１５分処理し、シグナル伝達事象をアッセイプレートにホルムアルデヒドを最終１０％まで添加することにより停止させた。細胞を次いでシグナル伝達検出のために透過性とし、ホスホロ−ｐ６５  ＮＦＫＢ抗体で染色した。図７４Ａおよび７４Ｂに示すとおり、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２およびＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆ抗体は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方で、ＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆと比較して高いシグナル伝達応答を有した。内部移行とシグナル伝達経路活性化を結びつける直接的証拠はないが、Ｇ２アイソタイプがＧＩＴＲ.６についてＩｇＧ１と比較して抗体機能的活性の両方の態様を改善するように見えることに注目することは興味深い。
各抗体のシグナル伝達活性を定量するために、各抗体のＥＣ５０およびＥｍａｘの両方を、両パラメータがシグナル伝達事象の完全な程度の捕捉に必須であるため、計算した。ＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆの応答レベルを１００％対照として、選択し、他の全ての抗体をそれに対し正規化した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体により活性化したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方について表１４に示すとおり、効力(ＥＣ５０)および有効性(Ｅｍａｘ％)の両方の観点で、ＧＩＴＲ抗体に対して、ある範囲の活性があった。ＧＩＴＲ.６.Ｇ２、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆおよびＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆは、約１０nM範囲の類似する効力(ＥＣ５０)を示したが、有効性(Ｅｍａｘ)は各種のアイソタイプについてかなり異なり、Ｇ１抗体がＧ２またはキメラアイソタイプほど効率的にシグナル伝達しないことを示唆する。
【０７４０】
【表１７】
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ＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆと比較したＧＩＴＲ.６.Ｇ２およびＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆのシグナル伝達差がＮＦｋＢシグナル伝達のみに限定されるのか他のシグナル伝達事象にもなお同様に当てはまるのかをさらに確認するために、Ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達読み出しを探索した。図７５に示すとおり、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２およびＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆ抗体は、ＣＤ４＋細胞ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化アッセイにおいてＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆ抗体と比較して高いシグナル伝達応答を有した。それ故に、Ｇ１アイソタイプと比較してＧＩＴＲ.６  Ｇ２アイソタイプの良好なシグナル伝達活性は、ＮＦｋＢシグナル伝達のみに限定されるものではない。
【０７４１】
実施例２９：Ｔ細胞におけるＧＩＴＲアゴニズム改善におけるＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジのあるアミノ酸残基の関連性
２８Ｆ３の重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体(ＧＩＴＲ.６)を製造し、上清を４８時間ではなく４０時間で回収する以外、実施例２５に記載のＩＬ−２産生アッセイにおけるとおり試験した。結果を図７６Ａ〜Ｄに示す。
【０７４２】
【表１８】
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【表１９】
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【０７４３】
【表２０】
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【表２１】
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【０７４４】
【表２２】
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【表２３】
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【０７４５】
【表２４】
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【表２５】
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【０７４６】
【表２６】
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【表２７】
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【０７４７】
【表２８】
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【表２９】
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【０７４８】
【表３０】
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【表３１】
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【０７４９】
【表３２】
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【表３３】
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【０７５０】
【表３４】
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【表３５】
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【０７５１】
【表３６】
2019508013.tif 000039
【表３７】
2019508013.tif 000040
【０７５２】
【表３８】
2019508013.tif 000041
【表３９】
2019508013.tif 000042
【０７５３】
【表４０】
2019508013.tif 000043
【表４１】
2019508013.tif 000044
【０７５４】
【表４２】
2019508013.tif 000045
【表４３】
2019508013.tif 000046
【０７５５】
【表４４】
2019508013.tif 000047
【表４５】
2019508013.tif 000048
【０７５６】
【表４６】
2019508013.tif 000049
【表４７】
2019508013.tif 000050
【０７５７】
【表４８】
2019508013.tif 000051
【表４９】
2019508013.tif 000052
【０７５８】
【表５０】
2019508013.tif 000053
【表５１】
2019508013.tif 000054
【０７５９】
【表５２】
2019508013.tif 000055
【表５３】
2019508013.tif 000056
【０７６０】
【表５４】
2019508013.tif 000057
【表５５】
2019508013.tif 000058
【０７６１】
【表５６】
2019508013.tif 000059
【表５７】
2019508013.tif 000060
【０７６２】
【表５８】
2019508013.tif 000061
【表５９】
2019508013.tif 000062
【０７６３】
【表６０】
2019508013.tif 000063
【表６１】
2019508013.tif 000064
【０７６４】
【表６２】
2019508013.tif 000065
【表６３】
2019508013.tif 000066
【０７６５】
【表６４】
2019508013.tif 000067
【表６５】
2019508013.tif 000068
【０７６６】
【表６６】
2019508013.tif 000069
【表６７】
2019508013.tif 000070
【０７６７】
【表６８】
2019508013.tif 000071
【表６９】
2019508013.tif 000072
【０７６８】
【表７０】
2019508013.tif 000073
【表７１】
2019508013.tif 000074
【０７６９】
【表７２】
2019508013.tif 000075
【表７３】
2019508013.tif 000076
【０７７０】
【表７４】
2019508013.tif 000077
【表７５】
2019508013.tif 000078
【０７７１】
【表７６】
2019508013.tif 000079
【表７７】
2019508013.tif 000080
【０７７２】
【表７８】
2019508013.tif 000081
【表７９】
2019508013.tif 000082
【０７７３】
表１５は、成熟可変領域および重鎖および軽鎖の配列および記載があるとき、シグナルペプチドを有する配列を示す。Ｃ末端がＫまたはＧＫで示される重鎖は、ＫまたはＧＫが無くても使用され得る。
【０７７４】
均等物：
当業者は、定常的なものを超える実験を使用することなく、ここに開示する具体的実施態様の多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。このような均等物は、添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2019508013.tif 000083
【図２Ａ】
2019508013.tif 000084
【図２Ｂ】
2019508013.tif 000085
【図３Ａ】
2019508013.tif 000086
【図３Ｂ】
2019508013.tif 000087
【図４Ａ】
2019508013.tif 000088
【図４Ｂ】
2019508013.tif 000089
【図５Ａ】
2019508013.tif 000090
【図５Ｂ】
2019508013.tif 000091
【図５Ｃ】
2019508013.tif 000092
【図６Ａ】
2019508013.tif 000093
【図６Ｂ】
2019508013.tif 000094
【図７Ａ】
2019508013.tif 000095
【図７Ｂ】
2019508013.tif 000096
【図８Ａ】
2019508013.tif 000097
【図８Ｂ】
2019508013.tif 000098
【図８Ｃ】
2019508013.tif 000099
【図９Ａ】
2019508013.tif 000100
【図９Ｂ】
2019508013.tif 000101
【図１０Ａ】
2019508013.tif 000102
【図１０Ｂ】
2019508013.tif 000103
【図１０Ｃ】
2019508013.tif 000104
【図１１Ａ】
2019508013.tif 000105
【図１１Ｂ】
2019508013.tif 000106
【図１２】
2019508013.tif 000107
【図１３】
2019508013.tif 000108
【図１４】
2019508013.tif 000109
【図１５】
2019508013.tif 000110
【図１６】
2019508013.tif 000111
【図１７】
2019508013.tif 000112
【図１８】
2019508013.tif 000113
【図１９Ａ】
2019508013.tif 000114
【図１９Ｂ】
2019508013.tif 000115
【図２０】
2019508013.tif 000116
【図２１】
2019508013.tif 000117
【図２２】
2019508013.tif 000118
【図２３】
2019508013.tif 000119
【図２４】
2019508013.tif 000120
【図２５Ａ】
2019508013.tif 000121
【図２５Ｂ】
2019508013.tif 000122
【図２６】
2019508013.tif 000123
【図２７】
2019508013.tif 000124
【図２８】
2019508013.tif 000125
【図２９Ａ】
2019508013.tif 000126
【図２９Ｂ】
2019508013.tif 000127
【図３０】
2019508013.tif 000128
【図３１】
2019508013.tif 000129
【図３２】
2019508013.tif 000130
【図３３】
2019508013.tif 000131
【図３４−１】
2019508013.tif 000132
【図３４−２】
2019508013.tif 000133
【図３４−３】
2019508013.tif 000134
【図３５Ａ】
2019508013.tif 000135
【図３５Ｂ】
2019508013.tif 000136
【図３６】
2019508013.tif 000137
【図３７】
2019508013.tif 000138
【図３８】
2019508013.tif 000139
【図３９Ａ】
2019508013.tif 000140
【図３９Ｂ】
2019508013.tif 000141
【図３９Ｃ】
2019508013.tif 000142
【図４０】
2019508013.tif 000143
【図４１】
2019508013.tif 000144
【図４２−１】
2019508013.tif 000145
【図４２−２】
2019508013.tif 000146
【図４２−３】
2019508013.tif 000147
【図４３】
2019508013.tif 000148
【図４４】
2019508013.tif 000149
【図４５−１】
2019508013.tif 000150
【図４５−２】
2019508013.tif 000151
【図４６】
2019508013.tif 000152
【図４７−１】
2019508013.tif 000153
【図４７−２】
2019508013.tif 000154
【図４７−３】
2019508013.tif 000155
【図４８−１】
2019508013.tif 000156
【図４８−２】
2019508013.tif 000157
【図４８−３】
2019508013.tif 000158
【図４９】
2019508013.tif 000159
【図５０】
2019508013.tif 000160
【図５１−１】
2019508013.tif 000161
【図５１−２】
2019508013.tif 000162
【図５１−３】
2019508013.tif 000163
【図５２】
2019508013.tif 000164
【図５３】
2019508013.tif 000165
【図５４】
2019508013.tif 000166
【図５５】
2019508013.tif 000167
【図５６−１】
2019508013.tif 000168
【図５６−２】
2019508013.tif 000169
【図５６−３】
2019508013.tif 000170
【図５７】
2019508013.tif 000171
【図５８−１】
2019508013.tif 000172
【図５８−２】
2019508013.tif 000173
【図５９】
2019508013.tif 000174
【図６０−１】
2019508013.tif 000175
【図６０−２】
2019508013.tif 000176
【図６１】
2019508013.tif 000177
【図６２】
2019508013.tif 000178
【図６３】
2019508013.tif 000179
【図６４】
2019508013.tif 000180
【図６５】
2019508013.tif 000181
【図６６】
2019508013.tif 000182
【図６７】
2019508013.tif 000183
【図６８】
2019508013.tif 000184
【図６９】
2019508013.tif 000185
【図７０】
2019508013.tif 000186
【図７１】
2019508013.tif 000187
【図７２】
2019508013.tif 000188
【図７３】
2019508013.tif 000189
【図７４】
2019508013.tif 000190
【図７５】
2019508013.tif 000191
【図７６Ａ】
2019508013.tif 000192
【図７６Ｂ】
2019508013.tif 000193
【図７６Ｃ】
2019508013.tif 000194
【図７６Ｄ】
2019508013.tif 000195
【配列表】
2019508013000001.app
【国際調査報告】
2019508013.tif 000196
2019508013.tif 000197
2019508013.tif 000198
2019508013.tif 000199
2019508013.tif 000200
2019508013.tif 000201
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2019508013.tif 000204