(57)【要約】  本発明は、ある態様において、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を提供する。疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物の投与方法および調製のためのプロセスも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の疎水性化合物またはその塩の自由単結晶の均一な集団を含む組成物であって、集団中のそれぞれの自由単結晶は、少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する、組成物。
【請求項２】
それぞれの自由単結晶が同じ多形を示す、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
それぞれの自由単結晶が少なくとも約5ミクロンの特徴的な寸法を有する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
それぞれの自由単結晶が少なくとも約50ミクロンの特徴的な寸法を有する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
それぞれの自由単結晶が少なくとも約100ミクロンの特徴的な寸法を有する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
それぞれの自由単結晶が少なくとも約500ミクロンの特徴的な寸法を有する、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
それぞれの自由単結晶が少なくとも約1ミリメートルの特徴的な寸法を有する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
それぞれの自由単結晶が少なくとも約1センチメートルの特徴的な寸法を有する、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
不定形である第1の疎水性化合物をさらに含む、請求項１〜８いずれか記載の組成物。
【請求項１０】
本質的に第1の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団からなる、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
第2の疎水性化合物をさらに含む、請求項１〜８および１０のいずれか記載の組成物。
【請求項１２】
第2の疎水性化合物の少なくともいくつかが不定形である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
第2の疎水性化合物の少なくともいくつかが結晶性である、請求項１１または１２記載の組成物。
【請求項１４】
第2の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団をさらに含む、請求項１〜１０いずれか記載の組成物。
【請求項１５】
自由単結晶のそれぞれが少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
第2の疎水性化合物の自由単結晶が第1の疎水性化合物の自由単結晶と同じ特徴的な寸法を有する、請求項１４または１５記載の組成物。
【請求項１７】
第2の疎水性化合物の自由単結晶が第1の疎水性化合物の自由単結晶とは異なる特徴的な寸法を有する、請求項１４または１５記載の組成物。
【請求項１８】
第1の疎水性化合物および第2の疎水性化合物が同じ多形を示す、請求項１１〜１７いずれか記載の組成物。
【請求項１９】
第1の疎水性化合物および第2の疎水性化合物が異なる多形を示す、請求項１１〜１７いずれか記載の組成物。
【請求項２０】
不定形である第2の疎水性化合物をさらに含む、請求項１３〜１７いずれか記載の組成物。
【請求項２１】
第1の疎水性化合物および第2の疎水性化合物が生物学的に活性である、請求項１１〜２０いずれか記載の組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容され得る担体または賦形剤をさらに含む、前記請求項いずれか記載の組成物。
【請求項２３】
第1の疎水性化合物が、広域スペクトル抗炎症剤、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤、腫瘍成長因子β(TGFβ)を標的化する薬剤およびコロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤からなる群より選択される、請求項１〜２２いずれか記載の組成物。
【請求項２４】
第1の疎水性化合物が、化学式(I)：
【化１】
2019513723.tif 000029
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
第1の疎水性化合物が、化学式(II)：
【化２】
2019513723.tif 000030
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
第1の疎水性化合物が、化学式(III)：
【化３】
2019513723.tif 000031
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２７】
第1の疎水性化合物が、化学式(IV)：
【化４】
2019513723.tif 000032
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２８】
第1の疎水性化合物が、化学式(V)：
【化５】
2019513723.tif 000033
を有する、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２９】
第1の疎水性化合物が、化学式(VI)：
【化６】
2019513723.tif 000034
を有する、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項３０】
第1の疎水性化合物が、化学式(VII)：
【化７】
2019513723.tif 000035
を有する、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項３１】
第1の疎水性化合物が、化学式(VIII)：
【化８】
2019513723.tif 000036
を有する、腫瘍成長因子β(TGFβ)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項３２】
第1の疎水性化合物が、化学式(IX)：
【化９】
2019513723.tif 000037
を有する、広域スペクトル抗炎症剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項３３】
第1の疎水性化合物が、化学式(X)：
【化１０】
2019513723.tif 000038
を有する、広域スペクトル抗炎症剤またはその塩である、請求項２３記載の組成物。
【請求項３４】
第1の疎水性化合物またはその塩が物質に封入される、請求項１〜３３いずれか記載の組成物。
【請求項３５】
第2の疎水性化合物またはその塩が物質に封入される、請求項１１〜３４いずれか記載の組成物。
【請求項３６】
該物質が不活性である、請求項３４または３５記載の組成物。
【請求項３７】
該物質が、ポリマー、ガラス、セラミックまたは金属である、請求項３４、３５または３６記載の組成物。
【請求項３８】
該ポリマーが生体適合性ポリマーである、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
生物学的物質をさらに含む、請求項３４〜３８いずれか記載の組成物。
【請求項４０】
該生物学的物質が生細胞である、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を、その投与を必要とする被験体に送達する方法であって、
該被験体に、第1の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団の有効量を含む組成物を投与する工程、ここで該集団中のそれぞれの自由単結晶は、少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する、
それにより第1の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を該被験体に送達する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
該被験体が、ヒト、非ヒト動物または遺伝子工学により作り変えられた組織である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該被験体が非ヒト動物である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該被験体が遺伝子工学により作り変えられた組織である、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
該被験体がヒトである、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
第2の疎水性化合物の有効量を投与する工程をさらに含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
該被験体が、炎症状態を有するかまたは炎症状態を発症するリスクを有する、請求項４１〜４６いずれか記載の方法。
【請求項４８】
該炎症状態が線維症である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
該有効量が、炎症状態を治療または予防するための治療有効量である、請求項４７または４８記載の方法。
【請求項５０】
該組成物が注射により被験体に投与される、請求項４１〜４９いずれか記載の方法。
【請求項５１】
該組成物が植え込みにより被験体に投与される、請求項４１〜４９いずれか記載の方法。
【請求項５２】
疎水性化合物の持続放出を必要とする被験体において疎水性化合物の持続放出を提供するための方法であって、該被験体に、第1の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を投与する工程、ここで該集団中のそれぞれの自由単結晶が少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する、を含む、方法。
【請求項５３】
該放出が、投与後にある時間遅延される、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該組成物が、不定形である第1の疎水性化合物をさらに含む、請求項４１または５２記載の方法。
【請求項５５】
該組成物が第2の疎水性化合物をさらに含む、請求項５２、５３または５４記載の方法。
【請求項５６】
第2の疎水性化合物の少なくともいくつかが不定形である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
第2の疎水性化合物の少なくともいくつかが結晶性である、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項５８】
a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程；
b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤の量を超えない量の反溶剤を添加する工程；および
c)自由単結晶を回収する工程
を含むプロセスにより作製される、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団。
【請求項５９】
a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程；
b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤の量を超えない量の反溶剤を添加することにより混合物を形成する工程；および
c)自由単結晶を回収する工程
を含む、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を調製するためのプロセス。
【請求項６０】
回収された自由単結晶を、医薬組成物または医療デバイスに製剤化する工程をさらに含む、請求項５９記載のプロセス。
【請求項６１】
該溶液が種晶非添加溶液(unseeded solution)である、請求項５９または６０記載のプロセス。
【請求項６２】
b)における混合物を、c)における回収の前に約4時間未満インキュベートする工程をさらに含む、請求項５９〜６１いずれか記載のプロセス。
【請求項６３】
該プロセスが一定の温度で実施される、請求項５９〜６２いずれか記載のプロセス。
【請求項６４】
該温度が約20℃、約25℃または約30℃である、請求項６３記載のプロセス。
【請求項６５】
該溶液が飽和溶液である、請求項５９〜６４いずれか記載のプロセス。
【請求項６６】
該溶液が過飽和溶液である、請求項５９〜６４いずれか記載のプロセス。
【請求項６７】
該溶液が不飽和溶液である、請求項５９〜６４いずれか記載のプロセス。
【請求項６８】
疎水性化合物が、化学式(I)：
【化１１】
2019513723.tif 000039
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項６９】
疎水性化合物が、化学式(II)：
【化１２】
2019513723.tif 000040
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７０】
疎水性化合物が、化学式(III)：
【化１３】
2019513723.tif 000041
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７１】
疎水性化合物が、化学式(IV)：
【化１４】
2019513723.tif 000042
を有する、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７２】
疎水性化合物が、化学式(V)：
【化１５】
2019513723.tif 000043
を有する、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７３】
疎水性化合物が、化学式(VI): 
【化１６】
2019513723.tif 000044
を有する、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７４】
疎水性化合物が、化学式(VII)：
【化１７】
2019513723.tif 000045
を有する、腫瘍壊死因子α(TNFα)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７５】
疎水性化合物が、化学式(VIII)：
【化１８】
2019513723.tif 000046
を有する、腫瘍成長因子β(TGFβ)を標的化する薬剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７６】
疎水性化合物が、化学式(IX)：
【化１９】
2019513723.tif 000047
を有する、広域スペクトル抗炎症剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７７】
疎水性化合物が、化学式(X)：
【化２０】
2019513723.tif 000048
を有する、広域スペクトル抗炎症剤またはその塩である、請求項５８記載の組成物。
【請求項７８】
18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°および31.08°から選択される2θ角での少なくとも5個の主要粉末x線回析ピークを特徴とする、化学式(I)：
【化２１】
2019513723.tif 000049
で表される化合物の多形。
【請求項７９】
多形が、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°および28.52°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での少なくとも8個の粉末x線回析ピークを特徴とする、請求項７８記載の多形。
【請求項８０】
多形が、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°および31.22°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での少なくとも12個の粉末x線回析ピークを特徴とする、請求項７８〜７９いずれか記載の多形。
【請求項８１】
多形が、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°、31.22°、12.32°、16.34°、18.86°、25.52°、26°、26.24°、29.34°、33.04°および34.04°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での少なくとも20個の粉末x線回析ピークを特徴とする、請求項７８〜８０いずれか記載の多形。
【請求項８２】
多形が、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°および28.52°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での粉末x線回析ピークを特徴とする、請求項７８記載の多形。
【請求項８３】
多形が、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°および31.22°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での粉末x線回析ピークを特徴とする、請求項７８記載の多形。
【請求項８４】
多形が、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°、31.22°、12.32°、16.34°、18.86°、25.52°、26°、26.24°、29.34°、33.04°および34.04°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での粉末x線回析ピークを特徴とする、請求項７８記載の多形。
【請求項８５】
多形が、実質的に図20Cに従う粉末x線回析パターンを特徴とする、請求項７８〜８４いずれか記載の多形。
【請求項８６】
多形が、寸法(aが5.449Åであり、bが9.686Åであり、cが17.653Åである)および角度(αが77.11°であり、βが87.58°であり、γが84.08°である)を有する単位セルを特徴とする、請求項７８〜８５いずれか記載の多形。
【請求項８７】
多形が、約15〜約18A3の非水素原子体積をさらに特徴とする、請求項７８〜８５いずれか記載の多形。
【請求項８８】
該非水素原子体積が16.7A3である、請求項８７記載の多形。
【請求項８９】
請求項５９〜６７いずれか記載のプロセスにより形成される多形。
【請求項９０】
多形が、化学式(I)：
【化２２】
2019513723.tif 000050
で表されるか、または化学式(II)：
【化２３】
2019513723.tif 000051
で表されるか、または化学式(III)：
【化２４】
2019513723.tif 000052
で表されるか、または化学式(IV)：
【化２５】
2019513723.tif 000053
で表されるか、または式(V)：
【化２６】
2019513723.tif 000054
で表されるか、または化学式(VI)：
【化２７】
2019513723.tif 000055
で表されるか、または化学式(VII)：
【化２８】
2019513723.tif 000056
で表されるか、または化学式(VIII)：
【化２９】
2019513723.tif 000057
で表されるか、または化学式(IX)：
【化３０】
2019513723.tif 000058
で表されるか、または化学式(X)：
【化３１】
2019513723.tif 000059
で表される化合物である、請求項８９記載の多形。
【請求項９１】
多形が物質で封入される、請求項７８〜９０いずれか記載の多形。
【請求項９２】
該物質が不活性である、請求項９１記載の多形。
【請求項９３】
該物質が、ポリマー、ガラス、セラミックまたは金属である、請求項９１記載の多形。
【請求項９４】
該ポリマーが生体適合性ポリマーである、請求項９３記載の多形。
【請求項９５】
生物学的物質をさらに含む、請求項９１〜９３いずれか記載の多形。
【請求項９６】
該生物学的物質が生細胞である、請求項９５記載の多形。
【請求項９７】
請求項７８〜９６のいずれか記載の多形、および薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９８】
請求項７８〜９６いずれか記載の多形または請求項９７記載の医薬組成物の有効量を、その送達を必要とする被験体に送達する方法であって、
該被験体に、請求項７８〜９６いずれか記載の多形または請求項９７記載の医薬組成物の有効量を含む組成物を投与する工程、
それにより、請求項７８〜９６いずれか記載の多形または請求項９７記載の医薬組成物の有効量を該被験体に送達する工程
を含む、方法。
【請求項９９】
該被験体が、ヒトまたは非ヒト動物または遺伝子工学により作り変えられた組織である、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
該被験体が非ヒト動物である、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
該被験体が遺伝子工学により作り変えられた組織である、請求項９９記載の方法。
【請求項１０２】
該被験体がヒトである、請求項９９記載の方法。
【請求項１０３】
多形または医薬組成物が注射により被験体に投与される、請求項９８〜１０２いずれか記載の方法。
【請求項１０４】
多形または医薬組成物が植え込みにより投与される、請求項９８〜１０２いずれか記載の方法。
【請求項１０５】
該被験体が炎症状態を有するかまたは炎症状態を発症するリスクを有する、請求項９８〜１０４いずれか記載の方法。
【請求項１０６】
該炎症状態が線維症である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
該有効量が、炎症状態を治療または予防するための治療有効量である、請求項１０５または１０６記載の方法。
【請求項１０８】
炎症状態の治療または予防を必要とする被験体において炎症状態を治療または予防する方法であって、該被験体に、請求項７８〜９６いずれか記載の多形または請求項９７記載の医薬組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０９】
該炎症状態が線維症である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
該多形または医薬組成物が注射により被験体に投与される、請求項１０８〜１０９いずれか記載の方法。
【請求項１１１】
該多形または医薬組成物が植え込みにより被験体に投与される、請求項１０８〜１０９いずれか記載の方法。
【請求項１１２】
該被験体がヒトまたは非ヒト動物または遺伝子工学により作り変えられた組織である、請求項１０８〜１１１いずれか記載の方法。
【請求項１１３】
該多形が、溶剤または反溶剤の分子を含まない結晶格子の存在をさらに特徴とする、請求項８７記載の多形。
【請求項１１４】
該多形が、溶剤または反溶剤の分子が結晶格子中の分子と相互作用しない結晶格子の存在をさらに特徴とする、請求項８７記載の多形。
【請求項１１５】
それぞれの自由単結晶が、集団中の結晶の中位の特徴的な寸法の25%以内にある特徴的な寸法を有する、請求項５８記載の組成物。
【請求項１１６】
それぞれの自由単結晶が、集団中の結晶の中位の特徴的な寸法の20%以内にある特徴的な寸法を有する、請求項５８記載の組成物。
【請求項１１７】
それぞれの自由単結晶が、集団中の結晶の中位の特徴的な寸法の15%以内にある特徴的な寸法を有する、請求項５８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2016年4月4日に出願された米国仮特許出願第62/318,208号の利益を主張し、2016年4月4日に出願された米国仮特許出願第62/317,831号の利益を主張する。上記出願の全教示は参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
ASCIIテキストファイル中の物質の参照による援用
本願は、本明細書と同時に提出されている以下のASCIIテキストファイル：
a)  ファイル名：00502293001SEQUENCELISTING.txt；2017年4月4日に作成、
2KBのサイズ
に含まれる配列表を、参照により援用する。
【背景技術】
【０００３】
背景
結晶化は、複雑な熱力学的および動力学的なプロセスである。重要な因子としては、例えば、過飽和(supersaturation)のレベル、インキュベーション時間、溶剤状態、混合の種類および強度、種晶の濃度およびサイズ、ならびに温度が挙げられる。形態、サイズ分布および多形性(polymorphism)などの結晶の特定の性質は、結晶集団における多様性を生み出し、結晶集団を特定の用途に適したものにする。有機化合物の結晶は、医薬品、半導体、機能性食品(nutraceutical)、診断、農業、テキスタイルおよび化粧品などの多くの分野において重要な用途を有する。これらの分野において、結晶形態の薬剤を調製することは、特に、化学的安定性、制御放出速度、局所送達および再現性などの所望の特性を付与し得る。
【０００４】
疎水性化合物の結晶を調製するための技術は存在しているが、いくつかの方法は、形態、サイズ分布および多形性の重要なパラメーターを制御していない。結果的に、これらの方法により作製される疎水性化合物の結晶は、分散性であるか多形性を示すかまたは不安定であるかのいずれかである。かかる結晶は、ある特殊な用途、例えば制御薬物送達用途に適さない。他の方法は、一定でないサイズの結晶が生じ、これは多くの用途にとって望ましくない。
【０００５】
疎水性化合物の結晶は、しばしば治療剤として使用される。かかる治療的用途について、結晶化プロセスは、厳密な物理的および化学的な仕様を満たすために、厳密な環境制御の下で行わなければならない。結晶性カーペット(carpet)/コーティング、結晶性スラリーおよび準結晶性物質による製剤化は当該分野で公知である。しかしながら、これらの結晶性カーペット/コーティングまたはスラリーは、特定の持続放出用途には一般的に信頼性がない。
【０００６】
したがって、結晶サイズ分布および多形性の重要なパラメーターが制御された結晶化された疎水性化合物の組成物のための必要性がある。かかる組成物を調製および使用するための方法およびプロセスについての必要性もある。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は部分的に、自由単結晶の均一な集団を含む組成物が、多様な技術、自由単結晶のかかる均一な集団を調製するための向上されたプロセスの開発に適用可能である特定の有利な特性を有するという発見に基づくものである。
【０００８】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、本質的に、少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団からなる組成物を提供する。一態様において、結晶化された疎水性化合物の組成物中のそれぞれの自由単結晶は、同じ多形を示す。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、送達が必要な被験体に疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を送達する方法を提供する。該方法は一般的に、被験体に、第1の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団の有効量を投与する工程を含み、ここで該集団中のそれぞれの自由単結晶は、約1マイクロメートルより大きい特徴的な寸法を有する。特定の態様において、本発明の方法は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団をヒト被験体に投与して、線維症などの炎症状態を治療または予防することを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、疎水性化合物の持続放出を必要とする被験体において疎水性化合物の持続放出を提供するための方法を記載し、該方法は、該被験体に、第1の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を投与する工程を含み、ここで該集団中のそれぞれの自由単結晶は、約1マイクロメートルよりも大きい特徴的な寸法を有する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、(a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程、(b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤(anti-solvent)の量を超えない量の反溶剤を添加することにより混合物を形成する工程、および(c)自由単結晶を回収する工程を含むプロセスにより作製された疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明はさらに、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を調製するためのプロセスを提供し、該プロセスは、(a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程、(b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤の量を超えない量の反溶剤を添加することにより混合物を形成する工程、および(c)自由単結晶を回収する工程を含む。
【００１３】
一態様において、本発明は、実質的に図20Cに従う粉末x線回析パターンを特徴とする疎水性化合物の多形を含む組成物を提供する。この態様において、該多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°および31.08°から選択される2θ角における少なくとも5個の主要な粉末x線回析ピークを特徴とする。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、疎水性化合物の多形を調製する方法を提供し、該方法は、(a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程、(b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤の量を超えない量の反溶剤を添加することにより混合物を形成する工程、および(c)自由単結晶多形を回収する工程を含む。
【００１５】
本明細書に記載される組成物、方法およびプロセスは、種々の技術における使用のための化学的安定性、均一性および適合性の増加を含むが限定されない特定の有利な特性を有する疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
米国仮特許出願第62/318,208号(‘208出願)は、本願における図面に対応するカラーの図面を含む。本明細書に提供される図の例示的な記載における色の指示に関して、‘208 出願のこれらの対応する図面および関連のある記載が参照される。
【図１】図1Aは、共封入薬物を有さない植え込まれたデバイス(例えば、糖尿病治療のための封入された島(islet)を有するアルギン酸塩カプセル)の変化する線維症応答および宿主拒絶を示すモデル模式図である。図1Bは、液体分散するかまたは不定形(amorphous)(微粉末)薬物を有する、封入された島を有する植え込まれたアルギン酸塩カプセルの変化する線維症応答および宿主拒絶を示すモデル模式図である。図1Cは、より遅くさらに延長された薬物放出速度が可能な、結晶性薬物を有する、封入された島を有する植え込まれたアルギン酸塩カプセルの変化する線維症応答および宿主拒絶を示すモデル模式図である。
【図２】図2. 複数のスクリーニングされた疎水性薬物候補の化学構造。これらとしては、古典的な広域スペクトル抗炎症剤(例えば、デキサメタゾン、ラパマイシンおよびクルクミン)およびマクロファージ標的化剤(例えば、QNZ、TNFα阻害剤；Ly215799、TGFβ阻害剤；およびGW2580 (GW)、CSF1R阻害剤)が挙げられる。
【図３】図3. 微小不定形(左欄)、小結晶(中央欄)、または大結晶(右欄)として調製された1つの古典的な広域スペクトル抗炎症剤、デキサメタゾン(Dx)、および2つの標的化剤(Ly215799、Ly、TGFβ阻害剤；およびGW2580、CSF1R阻害剤)の代表的な走査電子顕微鏡(SEM)画像。薬物および製剤に応じて、結晶は、1μm〜3mmのサイズの範囲であった(図25にも示す)。
【図４】図4. アルギン酸塩微小球に封入された広域スペクトル抗炎症クルクミンの代表的なマクロスケールの例：結晶性(上)、不定形(中)、または結晶製剤と不定形製剤の両方のハイブリッド(下)。左から右に：拡大の次数が増加。
【図５】図5. アルギン酸塩ヒドロゲルカプセルに封入されたクルクミンの調整可能な放出速度の例。より高い放出は不定形(正方形)により達成され、一方で純粋な結晶クルクミン(ひし形)は初期にはより遅く放出するが、かなり長い時間維持され得る。2つのプロフィール間の差はいくつかのパラメーター、特に結晶サイズおよび結晶度に応じて可変的であることが見出された。結晶製剤と不定形製剤の両方の混合比(三角形)(この場合それぞれ3:1)は、薬物のより高い累積放出量、その後延長された放出を示した。質量バランス分析により該結果は確認された。
【図６】図6. アルギン酸塩球に充填された結晶性クルクミンの遅い表面腐食および長期放出(少なくとも2か月にわたる)を示す代表的な顕微鏡画像。より小さな結晶は3Dアルギン酸塩内の空の空間の背後に残るが(丸および矢印)、より大きな結晶は、より長く表面放出/腐食を示すままである。
【図７】図7. そうでなければ半透明のアルギン酸塩微小球上に白いプラークとして観察される宿主異物応答(免疫細胞接触および線維症)を示す位相差画像。重要なことに、これらの抗炎症剤のいくつかおよびより多くの標的化小分子阻害剤は、C57BL/6マウスの腹腔内(IP)空間への植え込みの2週間後に線維症を予防する向上された有効性を示した。
【図８】図8. アルギン酸塩球から直接分離され、図7において報告された同じ2週間の植え込み試験後に回収された(retrieved)細胞上で実施された定量的FACS分析。プラーク接着および線維症の低減を確認すると、不定形製剤と同様に封入された同じ主要な候補は、マクロファージの存在(左)、およびほとんどの場合において、好中球(右)の存在も低減することが示される。データ：平均±SEM、n=5。統計分析：Bonferroni多重比較補正による一元配置ANOVA、*：p<0.05；**：p<0.001および***：p<0.0001；ns=有意に異ならない。実験は少なくとも2回繰り返した。
【図９】図9. 不定形薬物が充填され、C57BL/6マウスのIP空間において2週間後に回収されたアルギン酸塩マイクロカプセル上に線維症過形成の低減または線維症過形成がないことを示す共焦点顕微鏡検査画像。アルギン酸塩マイクロカプセルは、青色DAPI核染色、マクロファージCD68についての緑色色素マーカーおよびα平滑筋アクチンについての線維症マーカーにより染色された。挿入図は、主要な共焦点パネル中に示されるものと同じ視野での明視野画像を示す。
【図１０】図10. ブランク(薬物なし)、薬物ビヒクル(不定形製剤について)および不定形製剤充填微小球カプセルの、C57BL/6マウスにおける2週間植え込み後の多重化NanoString遺伝子発現分析。
【図１１】図11A. そうでなければ半透明なアルギン酸塩微小球上の黄色っぽい白色プラークとして観察される宿主異物応答(免疫細胞接着および線維症)を示す位相差画像。重要なことに、これらの抗炎症剤のいくつかおよびより多くの標的化された小分子阻害剤は、C57BL/6マウスの腹腔内(IP)空間に植え込まれた1、3および6か月後に線維症を予防するような向上された有効性を示した。注意：薬物結晶は色つきの外観を有するので、結晶性薬物充填アルギン酸塩カプセルの外観はより不透明になる(例えば、クルクミンについて橙色、GWについて白色)。図11B. 植え込まれたアルギン酸塩微小球中に封入された多くの結晶製剤化薬物上の線維症過形成の低減またはそれがないことを示す共焦点顕微鏡画像(青色、DAPI核染色；緑色、マクロファージCD68；および赤色、線維症マーカーα平滑筋アクチン)。挿入図：主要な共焦点パネル中に示されるものと同じ視野の明視野画像。
【図１２】図12. 非ヒト霊長類(NHP)における腹腔内(IP)空間への植え込みの2〜4週間、および3〜6か月後の結晶性CSF1R阻害剤GW2580を封有する0.5および1.5mmの直径のアルギン酸球に対する宿主異物応答(免疫細胞接着および線維症)を示す位相差画像；N=2/群。注意：薬物結晶は色つきの外観を有するので、結晶性薬物充填アルギン酸塩カプセルの外観はより不透明になる(GW2580について白色)。
【図１３Ａ−Ｂ】図13A. アルギン酸塩球から直接分離され、種々の植え込み時間後に回収された細胞に対して行った定量的FACS分析。プラーク接着および線維症の低減を確認することで、主要な候補はマクロファージの存在を低減することが示される。図13B. アルギン酸塩球から直接分離され、種々の植え込み時間の後に回収された細胞に対して行った定量的FACS。プラーク接着および線維症の低減を確認することで、主要な候補は好中球の存在を低減することが示される。
【図１３Ｃ】図13C. 種々の植え込み時間後に回収された図12に記載される0.5mmおよび1.5mmのGWの結晶データ点のアルギン酸塩球から直接分離された細胞に対して行った定量的FACS分析。プラーク接着および線維症の低減を確認することで、空(対照)球と比較してマクロファージの存在が複数の次数の規模で低減する(対数ベース10スケール)。
【図１４】図14. アルギン酸塩微小球中に共封入された島(黄色、丸い細胞集団)および結晶性薬物(GW2580)の代表的な顕微鏡画像。
【図１５】図15. 島封入ブランク(薬物なし)(上段)、不定形(中段)または結晶充填(下段)アルギン酸塩微小球の代表的な画像(島は、左の明視野画像において暗い黒丸として見られる)。(左)明視野画像中で観察される島集団と同じ位置での赤色染色の欠損(中段)および生存能力緑色染色の存在(右欄中に矢印で示される)により示されるように、不定形または結晶製剤化GW2580充填微小球のいずれも島細胞毒性を示さなかった。それぞれの処理について、3枚の画像は全て、同じ視野、焦点および倍率のものである。
【図１６】図16. 結晶GW2580アルギン酸塩カプセルによる延長された正常血糖を示す血糖曲線。薬物製剤ありまたはなしで500 IE(島均等物)島を共封入する約500〜600μmの直径のアルギン酸塩微小球(薬物なし、黒丸；不定形微粉末薬物、黒い正方形；または結晶薬物、黒い三角)。STZ誘導糖尿病C57BL/6マウスにおいて、約40日後に対照(薬物なし)カプセルは、島生存能力および治療効力の欠失を生じる線維症の蓄積のために働かなかった。対照的に、不定形薬物充填カプセルは、ほぼ70日後に正常血糖(200mg/dL未満)維持の消失の遅延を示し、一方で遅い長期放出結晶薬物製剤充填カプセルは、15か月(試料の分析のための実験を終了)を超えて糖尿病マウスにおける治療を保った。マクロファージ調節/阻害が排除/枯渇と同様に良好かつ十分であることを示すことが示されるので、結晶性薬物処理(黒色三角)は、必要な場合は毎週投与される(矢印)マクロファージ枯渇クロドロソーム(クロドロソームs) (Clodro、リポソーム性クロドロネート)と同様に有効である。
【図１７Ａ−Ｃ】図17A. 裸の(封入されない)薬物結晶により可能な長期薬物デポー効果。この試験においてGW2580を使用した。500μmのアルギン酸塩球をC57BL/6マウスのIPに植え込んだ後に、食塩水または裸の製剤化GW2580の結晶を腹腔内に注射した。食塩水を注射した汚い(dirty)対照カプセル(左)とは対照的に、毎日の不定形薬物(3mg/日、2週間で合計45mg)またはかなり少量の薬物結晶(4.5mg、1週間に1回、合計9mg)のみが、線維症を予防でき、かつカプセルをきれいに維持できた。毎週の不定形薬物は有効でなく、バースト放出を達成し得る微粉末は、持続的な薬物放出および延長された抗マクロファージ/抗線維症阻害活性について、同様の貯蔵を提供しなかったことが示唆された。図17B. 物質植え込みの2週間後および最後の裸の結晶注射から1週間の、マウスから洗い流されたIP洗浄液のDIC画像。送達の1週間後に多くの大きな結晶がIP空間中に残り、非封入の裸の結晶薬物によっても長期の薬物放出貯蔵が示された。図17C. 食塩水(対照)または裸のGW2580薬物結晶で処理されたC57BL/6マウスから回収されたアルギン酸塩球上の線維症過形成またはそれがないことを示す蛍光顕微鏡検査(青色、DAPI核染色；緑色、マクロファージCD68；および赤色、線維症マーカーα平滑筋アクチン)。同じ視野の明視野画像も示す。
【図１７Ｄ−Ｇ】図17D. アルギン酸塩球から直接分離された細胞上で行った定量的FACS分析。裸の薬物結晶はマクロファージの存在を低減する(左)。図17E. 食塩水(薬物なし)対照と比較して、裸の結晶性薬物GW2580(SC部位当たり合計0.5または5mg)が共注入された植え込まれた500μmポリスチレン(PS)球の線維症の低減を示す、移植の2週間後に切り出されたSC組織のH&Eおよびマッソン三色染色組織学的切片(スケールバー=1000μm；4X)。図17F. 移植の2週間後に回収されたSC移植ポリスチレン(PS)およびガラス(GL)球から分離された細胞上で実行されたFACS分析。裸の結晶性GW2580は全ての場合においてマクロファージの存在を有意に低減した。データ：平均±SEM、n=5。統計分析：Bonferroni多重比較補正による一元配置ANOVA、*：p<0.05；**：p<0.001および***：p<0.0001；ns=有意に異ならない。実験は少なくとも2回繰り返した。図17G. 図17Eおよび図17Fで報告された実験における組織の近傍の植え込み部位からの薬物抽出分析。分析は裸の形態における結晶製剤薬物の長期放出能力を明らかにする。
【図１８Ａ】図18A. 0(ブランク)、1%、5%または10%結晶GW2580を充填され、かつC57BL/6マウスの皮下(SC)または腹腔内(IP)空間のいずれかへの植え込みの3か月後に回収された、治療されたPDMSディスク上で黄色っぽい白色プラークとして観察される、宿主異物応答(免疫細胞接着および線維症)を示す写真(標識BFで示される上段のパネル)。ブランク(薬物なし)対照ディスと比較して、種々の結晶薬物群において線維症の低減を示す、植え込みの3か月後に切り出されたSCおよびIP組織のH&E(標識H&Eで示される中段のパネル)およびマッソン三色(下段パネル)染色された組織学的切片(スケールバー=1000μm；4X)。
【図１８Ｂ】図18B. SCおよびIP植え込みの3か月後のディスク(1/部位/マウス)から分離されたマクロファージのFACS分析。
【図１８Ｃ】図18C. SC (1%薬物充填-●、5%薬物充填-■、10%薬物充填-▲)またはIP (1%薬物充填-○、5%薬物充填-□、10%薬物充填-△)いずれかの3か月植え込み後の残存薬物レベル(%充填)のHPLC決定。データ：平均±SEM、n=5、統計分析：Bonferroni多重比較補正による一元配置ANOVA、*：p<0.05；**：p<0.001および***：p<0.0001；ns=有意に異ならない。実験は少なくとも2回繰り返した。
【図１９】図19A. 周知の溶剤蒸発法により得られた結晶(左、方法I)および溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法により得られた結晶(右、方法II)の代表的な画像。図19B. 単結晶X線回析(SXRD)により得られた溶剤蒸発により調製された結晶の画像の回析パターンは、結晶双晶化の証拠を示す。図19C. 異なる表面指数、および表面上の点(001または00-1)を有するSXRD中に展開された(mounted)結晶を示す、溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法(方法II)により調製された結晶の投射画像。図19D. SXRDにより決定されたGW2580結晶充填の代表的な画像。画像は、結晶の緻密な構造(高い充填密度)を示し、これは、低い非水素原子体積によっても定量されかつ示される。
【図２０Ａ】図20A. GW2580(式Iの化合物)の単結晶X線回析(SXRD)を特徴とし、溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法(方法II)により調製された多形の結晶格子および関連のある単位セルの代表的な画像。結晶充填は、結晶単位セル内の異なる化学基の間の相互作用(例えば、疎水性、水素結合)および異なる繰り返し単位間の水素結合架橋(半架橋剤)を示す。この観察は、GW2580結晶についての16.7A3の非水素原子体積(結晶統計学上のデータを有する右の表に示される)に相関し、値は、密な充填を有する緻密な構造を示す。
【図２０Ｂ】図20B. GW2580不定形物質および均一な結晶の確認の走査電子顕微鏡(SEM)画像。
【図２０Ｃ】図20C. 溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法(方法II)により調製されたGW2580結晶の粉末X線回析(PXRD)多形プロフィール(左の画像：擬似的 対 右の画像：測定)。データにより単一多形の存在を確認する。実験は2回繰り返した。
【図２１Ａ−Ｂ】図21A. 図19Cに示される表面(001)を示す特定のGW2580結晶上のデータ収集のために使用された原子間力顕微鏡(AFM)における片持ち梁(cantilever)の代表的な画像。図21B. 溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法(方法II)により調製された所定の結晶サイズのGW2580結晶の遅い薬物放出速度を示すプロフィール。これらの結晶による薬物放出は、時間分解インサイチュ原子間力顕微鏡検査(AFM)によりモニタリングされ、放出速度は不飽和リン酸バッファ(PBS)溶液中、37℃で定量した。
【図２１Ｃ】図21C. 調節可能な薬物放出速度を示す加速された放出条件(+SDS)における(溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法(方法II)により調製された)GW2580結晶、すなわち2000μmアルギン酸塩カプセルに封入されるGW2580についてのインビトロ試験。より高い薬物放出は封入された不定形態により達成され(●褐色プロフィール)、一方で純粋な結晶製剤(異なる結晶サイズ範囲、例えば結晶サイズ2：1〜20μmおよび結晶サイズ5：1500〜2000μmに滴定される)は最初により遅く薬物を放出したが、かなり長い時間薬物放出を継続した。2つのプロフィールの間の差は、結晶サイズおよび結晶度を含むいくつかのパラメーター(封入されたアルギン酸塩カプセル中の不定形および結晶性の物質の異なる割合の存在により決定される)により調節可能であることが見出された。平均+/-SD。上パネルは4週間の加速された放出の完全な時間経過を示し、下パネルは最初の7日間の期間にわたる放出プロフィールを示す(上パネルの四角で囲まれた領域中のデータ)。
【図２１Ｄ】図21D. アルギン酸塩カプセルに充填された異なるサイズのGW2580結晶(それぞれ上段：小さい、中段：中位および下段：大きい)からの遅い表面腐食および薬物の長期的な放出を示す代表的な画像。表面腐食の完了後、より小さい結晶は、3Dアルギン酸塩中の背後の空の空間に残るが、より大きな結晶はより長く維持され、両方は制御された表面放出/腐食を示す。
【図２１Ｅ】図21E. アルギン酸塩カプセルに充填されたGW2580結晶からの薬物の遅い表面腐食および長期放出を示す代表的な画像。これらの結晶における表面腐食は、数週間(例えば、1、2、3および4週間)モニタリングされた。実験は少なくとも2〜3回繰り返された。
【図２２Ａ】図22A. ブランク(薬物なし)対照球(sphere)と比較された種々の結晶薬物群における線維症の低減を示す植え込み3か月後に切り出された皮下(SC)組織のH&Eおよびマッソン三色染色された組織学的切片(スケールバー=1000μm；4X)。
【図２２Ｂ−Ｃ】図22B. SC植え込みの3か月後に図22Aに示される球(全ての場合において100μl物質)から分離された応答マクロファージについてのFACS分析。図22C.  SCまたはIPいずれかの植え込み後のLCMS血漿薬物レベル(左Y軸) 対 カプセル薬物レベル(右Y軸)のLCMS決定(使用した薬物：GW2580)。
【図２２Ｄ−Ｅ】図22D. 結晶クルクミン(上)および結晶Ki20227(下)についての回収後のカプセル薬物含有量ならびに1、3および6か月にわたる薬物抽出(SC-●およびIP-○)。図22E. 4〜7日までの多く場合に検出可能な薬物を示さない多くの結晶薬物製剤からの血漿薬物濃度(特定されるように、植え込まれたSC-▲GWプロフィール、□クルクミンプロフィール、黒い◇QNZプロフィール、●LYプロフィールまたはIP-χ GWプロフィール、◇クルクミンプロフィール、△QNZプロフィール、■LYプロフィール、○Dxプロフィール)。実験は少なくとも2〜3回繰り返した。
【図２３】図23A. 図12に示される結晶CSF1R阻害剤GW2580を封入するアルギン酸塩球の薬物抽出分析(HPLC)により、有意な量の薬物が回収されたカプセルの内部に残ることが明らかにされた(1.5mmカプセル：SC-■プロフィールおよびIP-●プロフィール、0.5mmカプセル：SC-□プロフィールおよびIP-○プロフィール)。図23B. ブランク(薬物なし)対照球と比較して、種々の結晶薬物群において低減した線維症を示す、4週間の植え込み後に切り出された腹腔内網または皮下(subcue)組織のH&Eおよびマッソン三色染色された組織学的切片(それぞれスケールバー=1000μm (4X)または400μm (10X))。図23C. ブランク(薬物なし)対照球と比較して、種々の結晶薬物群において低減した線維症を示す、6か月の植え込み後に切り出された腹腔内網または皮下(subcue)組織のH&Eおよびマッソン三色染色された組織学的切片(それぞれスケールバー=1000μm (4X)または400μm (10X))。
【図２４】図24. 不定形および結晶GW2580(GW)群についての、植え込み後それぞれ約400または460日(約1.3年)の時点のSTZ処理したマウスから回収されたカプセルのラットPDX-1および宿主α平滑筋アクチン発現。エラーバー、平均±SEM。処理当たりn=5マウス。全ての実験は少なくとも2または3回行った。統計分析：Bonferroni多重比較補正による一元配置ANOVA、**：p<0.001および***：p<0.0001。
【図２５】図25. 約3mmの結晶サイズを有する溶剤：反溶剤混合物を使用した本発明の方法(例えば、方法II)により得られたGW2580結晶の代表的な画像。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
自由単結晶の均一な集団を含む組成物
本発明の例示態様の記載を以下に続ける；炎症状態(例えば線維症)を治療する方法のさらなる記載は、2017年4月4日に本願と同時に出願された、発明の名称「METHODS OF PREVENTING OR REDUCING A FIBROTIC RESPONSE USING CSF1R INHIBITORS」(HBSR Attorney Docket No. 0050.2291-001)の国際出願番号____において見られ、その内容は、全体において参照により本明細書に援用される。
【００１８】
ある態様において、本発明は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を提供し、ここで該集団中のそれぞれの自由単結晶は少なくとも約1マイクロメートルの特徴的な寸法を有する。本明細書で使用する場合、「集団」は、2以上の結晶の任意の有限数を意味する。一態様において、集団は、統計解析に供される自由単結晶の有限数を含む。
【００１９】
表現「均一な集団」は、集団中のそれぞれの結晶の特徴的な寸法が集団中の結晶の特徴的な中位(median)寸法の25%以内(例えば約1%、約2%、約5%、約10%、約15%、約20%、約24%以内)である結晶の集団をいう。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「特徴的な寸法」は、例えば、顕微鏡検査を含む当該分野で使用される公知の方法により測定され得る結晶の寸法をいう。球状の結晶について、特徴的な寸法は、結晶の直径である。非球状結晶形態について、単結晶の特徴的な寸法は、以下の選択肢(X=Y=Z)、(X≠Y≠Z)、(X=Y、X≠Z)、(X=Z、X≠Y)、(X≠Z、Y=Z))を含む無作為にそれぞれX、YおよびZを割り当てられた結晶の長さ、幅および高さから選択される任意の寸法であり得る。本発明によると、結晶の少なくとも1つの特徴的な寸法(例えば、直径、長さ、幅、高さ)は少なくとも約1μmでなければならない。
【００２１】
表現「自由単結晶(free, single crystal)」は、本明細書で使用する場合、任意の表面に結合しない結晶性物質をいい、試料全体の結晶格子は、連続で、壊れずに、かつ粒子の境界を欠如する。
【００２２】
用語「結晶(crystal)」、「結晶(crystals)」、「結晶性(crystalline)」および「結晶化された(crystallized)」、または句「結晶形態(crystalline form)」は、その構成原子、分子またはイオンが、実質的に均一な繰り返し三次元パターンで配置される物質をいう。該パターンは、例えば、結晶の視覚的同定およびX線回析による同定(例えば、粉末X線回析(PXRD)および単結晶X線回析(SXRD))を含む化学の分野で使用される公知の方法により検出され得る。
【００２３】
本発明の組成物中の結晶は、サイズおよび形状が変化するものであり得る。例えば、均一な集団中の結晶は、限定されないが、球、立方体、棒および六辺形を含む任意の形状であり得る。均一な集団中の結晶は全て、限定されないが、球、立方体、棒および六辺形を含む同じ形状を有し得る。いくつかの態様において、均一な集団中の結晶は、同じ多形(当該分野において「異種同形体(isomorph)」とも称される)を示す。用語「多形(polymorph)」は、本明細書で使用する場合、異なる結晶形態(例えば、単斜晶系、六方晶系、斜方六面体、立方体)で存在するための物質の性質である「多形性(polymorphism)」を示す結晶をいう。多形性結晶は、それらの物理的性質において異なり、同じ多形性を示す同じ化合物の結晶(例えば異種同形結晶)は典型的に、同様の物理的性質(例えば解離速度)を有することが当該分野において公知である。
【００２４】
一態様において、均一な集団は、自由単結晶を含み、ここで該集団中の結晶の全てまたは実質的に大部分(例えば少なくとも約90%)は、単一の多形を示す。異なる態様において、均一な集団は自由単結晶を含み、ここで該集団中の結晶の全て(例えば約100%、約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%)は、単一の多形を示す。別の態様において、均一な集団は、異なる結晶形態(または多形)を示す自由単結晶を含む。
【００２５】
特定の態様において、本発明は、少なくとも2つ(例えば2、3、4、5等)の疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を提供し、ここでそれぞれの集団は、所定の結晶寸法について異なる特徴的な寸法を有する。例えば、図6は、同じ疎水性化合物、クルクミンの自由単結晶の少なくとも2つの異なる均一な集団を含む組成物の代表的な顕微鏡画像を示し、ここでより小さな結晶の集団は、より大きな結晶の集団よりも高い溶解速度を有する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも2つの異なる疎水性化合物を含む組成物を提供し、それぞれは自由単結晶の均一な集団として提供され、ここで2つ以上の集団は、実質的に同じ特徴的な中位寸法(例えば、互いの特徴的な中位寸法の約10%以内)を有する。本発明の特定の態様において、2つ以上の集団は、実質的に同一な特徴的な寸法を有し、同じ多形を示す。さらに別の態様において、2つ以上の集団は、異なる特徴的な寸法を有する。さらなる態様において、2つ以上の集団は、異なる特徴的な寸法を有するが、同じ多形を示す。別の態様において、2つ以上の集団は、異なる特徴的な寸法を有し、異なる多形を示す。
【００２７】
結晶は、限定されないが後述のものを含む任意のサイズのものであり得る。例えば、結晶は、少なくとも約1μm〜約1cmの範囲(例えば約5、約10、約50、約100または約500μm、少なくとも約1、約5、約50、約100または約500mm)内の少なくとも1つの寸法を有し得る。均一な集団中の結晶は全て、限定されないが、約1μm〜約1cmの範囲(例えば少なくとも約5、10、50、100または500μm、少なくとも約1、5、50、100または500mm)内の少なくとも1つの寸法を有するものを含む同じサイズを有し得る。いくつかの態様において、均一な集団中の結晶は全て、限定されないが約1μm〜約1cm(例えば、少なくとも約5、10、50、100または500μm、少なくとも約1、5、50、100または500mm)の範囲の3つの等しい寸法(すなわちX=Y=Z)を有するものを含む同じサイズを有し得る。ある態様において、該結晶は、少なくとも約1cm(例えば、少なくとも約1.5cm、少なくとも約2cm、少なくとも約3cm)である特徴的な寸法を有する。
【００２８】
結晶サイズは、限定されないが、従来の顕微鏡検査、走査電子顕微鏡検査(SEM)、透過電子顕微鏡検査(TEM)、X線回析(XRD)、ラマン分光法、光子相関分光法、示差走査熱量測定(DSC)、動的光散乱法(DLS)を含む当該分野で公知の任意の方法を使用して測定され得る。
【００２９】
「疎水性化合物」は本明細書で使用する場合、米国薬局方(USP)および英国薬局方(BP)溶解度基準(表1)に従って、溶質1部あたりに必要とされる30部の溶剤以上の水性媒体中の溶解度を特徴する有機化合物をいう。
【００３０】
【表１】
2019513723.tif 000002
【００３１】
いくつかの態様において、本発明の疎水性化合物は、約200〜約600ダルトンの範囲の分子量を有する。
【００３２】
本発明の組成物における使用に適切な疎水性化合物としては、限定されないが、無機化合物、有機化合物および有機金属化合物が挙げられる。特定の態様において、疎水性化合物は生物学的に活性および非活性の有機化合物を含む有機化合物である。かかる化合物としては限定されないが、機能性食品、農薬、除草薬、芳香剤、抗凝固薬、色素、化粧品、触媒、矯味矯臭剤、食品、燃料、エマルジョン等が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、生物学的に活性な疎水性化合物は、所望の生物学的標的(例えば生細胞、組織またはタンパク質)に対して所望の効果(例えば治療的または薬学的)を有する化合物である。所望の生物学的標的に対する所望の効果は、インビトロ(例えば固定された細胞)、インビボ(例えばその必要のある被験体中)またはエキソビボ(例えば島細胞などの生細胞)で観察され得る。生物学的に活性な疎水性化合物としては、限定されずに、例えば抗炎症性；抗出血性；抗増殖性；抗好中球減少性；抗脈管形成性；抗骨粗鬆症性；抗鎮痛性；抗寄生性；抗関節炎性；抗喘息性；抗アテローム硬化症性；抗菌性；抗ヒスタミン性；抗凝固性；鎮痛性；抗真菌性；抗感染性；抗菌性；抗片頭痛性；抗有糸分裂性；抗リウマチ性；抗ウイルス性；食欲抑制薬；フィブリン溶解性；免疫調節性(immunomodulatory)；免疫制御性(immunoregulatory)；免疫刺激性；細胞傷害性；および免疫抑制性の化合物、ならびに画像化剤(例えば蛍光剤)；および免疫剤(例えばワクチン)が挙げられる。疎水性化合物はまた、抗癌剤、例えばパクリタキセル、ドキソルビシン(doxirubicin)を含む。
【００３４】
特定の態様において、生物学的に活性な疎水性化合物としては、以下の生物学的分子：腫瘍壊死因子α(TNFα)、腫瘍成長因子β(TGFβ)およびコロニー刺激因子1受容体(CSF1R)の1つ以上を標的化する薬剤が挙げられる。
【００３５】
一態様において、CSF1Rを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化１】
2019513723.tif 000003
を有する5-[[3-メトキシ-4-[(4-メトキシフェニル)メトキシ]フェニル]メチル]-2,4-ピリミジンジアミン(GW2580またはGWとも称される)またはその塩である。
【００３６】
別の態様において、CSF1Rを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化２】
2019513723.tif 000004
を有するN-[4-[(6,7-ジメトキシ-4-キノリニル)オキシ]-2-メトキシフェニル]-N'-[1-(2-チアゾリル)エチル]ウレア(Ki20227とも称される)またはその塩である。
【００３７】
別の態様において、CSF1Rを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化３】
2019513723.tif 000005
を有する4-(3,4-ジメチルアニリノ)-7-(4-(メチルスルホニル)フェニル)キノリン-3-カルボキサミド(cFMS受容体阻害剤IIIとも称される)またはその塩である。
【００３８】
別の態様において、CSF1Rを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化４】
2019513723.tif 000006
を有する4-シアノ-N-(5-(1-(2-(ジメチルアミノ)アセチル)ピペリジン-4-イル)-2',3',4',5'-テトラヒドロ-[1,1'-ビフェニル]-2-イル)-1H-イミダゾール-2-カルボキサミド(JNJ-28312141とも称される)またはその塩である。
【００３９】
別の態様において、TNFαを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化５】
2019513723.tif 000007
を有するN4-(4-フェノキシフェネチル)キナゾリン-4,6-ジアミン(QNZとも称される)またはその塩である。
【００４０】
さらに別の態様において、TNFαを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化６】
2019513723.tif 000008
を有する3-(4-アミノ-1-オキソイソインドリン-2-イル)ピペリジン-2,6-ジオン(レナリドミドまたはCC-5013とも称される)またはその塩である。
【００４１】
一態様において、TNFαを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化７】
2019513723.tif 000009
を有する6,7-ジメチル-3-[[メチル[2-[メチル[[1-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-インドール-3-イル]メチル]アミノ]エチル]アミノ]メチル]-4H-1-ベンゾピラン-4-オン(SPD-304とも称される)またはその塩である。
【００４２】
一態様において、TGFβを標的化する疎水性化合物は、化学式：
【化８】
2019513723.tif 000010
を有する4-(2-(6-メチルピリジン-2-イル)-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル)キノリン-6-カルボキサミド(Ly215799とも称される)またはその塩である。
【００４３】
一態様において、該疎水性化合物は、化学式：
【化９】
2019513723.tif 000011
を有する(1E,6E)-1,7-ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン(クルクミンとも称される)またはその塩である。
【００４４】
さらなる態様において、該疎水性化合物は、化学式：
【化１０】
2019513723.tif 000012
を有する(9-フルオロ-11β,17,21-トリヒドロキシ-16α-メチルプレグナ-1,4-ジエン-3,20-ジオン(デキサメタゾンとも称される)またはその塩である。
【００４５】
本発明の疎水性化合物(例えば、式I〜Xの化合物)は、遊離形態またはその生理学的に無毒性の塩の形態であり得る。これらの塩は、それぞれの化合物を生理学的に許容され得る酸および塩基と反応させることにより得られ得る。かかる塩の例としては、限定されないが、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、フッ化水素、硝酸、硫酸、重硫酸、ピロ硫酸、亜硫酸、重亜硫酸、リン酸、酸性リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、メタリン酸、ピロリン酸、イソニコチン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、カプリル酸、イソ酪酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、スベリン酸、セバシン酸、マンデル酸、クロロ安息香酸、メチル安息香酸、ジニトロ安息香酸、フタル酸、フェニル酢酸、リンゴ酸、パントテン酸、重酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチシン酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、糖酸、蟻酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸およびパモ酸(すなわち、1,1’-メチレン-ビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエン酸))の塩が挙げられる。本発明の特定の化合物は、種々のアミノ酸と薬学的に許容され得る塩を形成し得る。適切な塩基塩としては限定されないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、およびジエタノールアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカインの塩が挙げられる。
【００４６】
いくつかの態様において、疎水性化合物は水溶液に貧可溶性である。本明細書で使用する場合「貧可溶性(poorly soluble)」は、溶質を溶解するために1部の化合物の溶質が30部以上の溶剤を必要とするような化合物の低い水性溶解度をいう。本明細書で使用する場合、用語「水溶液に貧可溶性」および「疎水性」は交換可能に使用される。
【００４７】
当該分野で公知のように、同じ化学組成であるが異なる物理的形態(例えば、結晶性 対 非晶性/不定形)を有する疎水性化合物は、可溶化の速度および化学的安定性を含む異なる性質を示し得る。一般的に、疎水性化合物の結晶形態は、不定形または粉末形態と比較して、向上した化学的安定性を有する。
【００４８】
したがって、本発明はまた、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団および疎水性化合物の不定形態の混合物を含む組成物を包含する。用語「不定形」および「粉末」または句「不定形態」等は、原子および分子が均一かつ繰り返しパターンで組織化されていない任意の非結晶性物質をいう。本発明の1つの特定の態様を図4に示し、ここで抗炎症化合物クルクミンの不定形および結晶性の両方の形態が同じ組成で提供される。図5に示すように、クルクミンの結晶性形態の放出プロフィールは、対応する不定形態のものとは異なる。
【００４９】
一般的に、結晶性形態は典型的に、不定形態よりも徐々により線形の様式で放出される。自由単結晶の不定形態および均一な集団の混合物を有するかかる組成物は、薬剤の制御されたおよび/または延長された放出が望ましい薬学的調製における適用を有する。
【００５０】
ある態様において、本発明は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団と同じ疎水性化合物の不定形態の混合物を含む組成物を提供する。一態様において、結晶性形態における疎水性化合物の量は、その不定形態の量よりも高い。例えば、図5は、クルクミンの結晶性および不定形の両方の形態の混合物を含む組成物を記載し、2つの形態の間の比はそれぞれ3:1である。ある態様において、本発明は、クルクミンの結晶性および不定形の両方の形態の混合物を含む組成物を提供し、2つの形態の間の比はそれぞれ1:1である。別の態様において、結晶性形態における疎水性化合物の量は、その不定形態の量よりも低い。
【００５１】
特定の態様において、該組成物は、自由単結晶の均一な集団と疎水性化合物の不定形態の混合物を含み、結晶性形態における疎水性化合物の量は、約90重量%以下である(例えば、結晶性形態中約10重量%、約20重量%、約30重量%、約40重量%、約50重量%、約60重量%、約70重量%、約85重量%、約90重量%)。疎水性化合物の物理的および化学的安定性は一般的に、化合物の結晶性形態の量の増加に伴い向上する傾向があるので、いくつかの態様において、化合物の結晶性形態の量は少なくとも約90重量%である(例えば約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約85%、約90%)。特定の組成物中で結晶性である疎水性化合物の量は、当該分野で公知の従来の任意の技術、例えば粉末X線回析(PXRD)および単結晶X線回析(SXRD)により決定され得る。
【００５２】
いくつかの態様において、均一な集団中のそれぞれの自由単結晶は封入される。用語「封入(encapsulate)」は一般的に、異なる物質(例えば不活性物質)による1つの物質(例えば化合物、結晶)の取り囲みを記載するために使用される。本明細書で使用する場合、物質は、限定されることなく、不活性(例えば、非反応性)または反応性(例えば、式I〜Xを有する化合物などの化合物)であり得る。結晶の封入に使用される物質の非限定的な例としては、セラミック、ガラス、金属、ポリ乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)コポリマー、ポリマー(例えば生体適合性ポリマー)およびアルギン酸塩ヒドロゲルが挙げられる。
【００５３】
一態様において、本発明は、ポリマー(例えば生体適合性ポリマー)に封入される疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を提供する。特定の態様において、該ポリマーは生体適合性ポリマー(例えば、アルギン酸塩ヒドロゲル)である。他の態様において自由単結晶の均一な集団は、少なくとも1つのさらなる生物学的物質(例えば生細胞または組織)と共に生体適合性ポリマーに封入される。本明細書で使用する場合、生物学的物質は、限定されることなく、細胞、例えば全細胞(例えば島細胞)もしくは細胞の一部(例えばミトコンドリアなどの細胞の小器官)またはそれらの組合せの集団であり得る。本明細書で使用する場合、生物学的物質は、限定されることなく、被験体から得られる組織(例えば膵臓組織)もしくは遺伝子工学により作り変えられた組織またはそれらの組合せを含む組織であり得る。
【００５４】
本発明の第1の多形の態様は、化学式(I)：
【化１１】
2019513723.tif 000013
で表される化合物またはその塩の多形であり；18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°および31.08°から選択される2θ角での少なくとも5個の主要な粉末x線回析ピークを特徴とする。この態様の一局面において、多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°および28.52°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での少なくとも8個の粉末x線回析ピークを特徴とする。さらなる局面において、多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°および31.22°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での少なくとも12個の粉末x線回析ピークを特徴とする。なおさらなる局面において、多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°、31.22°、12.32°、16.34°、18.86°、25.52°、26°、26.24°、29.34°、33.04°および34.04°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での少なくとも20個の粉末x線回析ピークを特徴とする。なおさらなる局面において、多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°および28.52°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での粉末x線回析ピークを特徴とする。なおさらなる局面において、多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°および31.22°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角でのx線回析ピークを特徴とする。なおさらなる局面において、多形は、18.42°、19.46°、19.88°、21.4°、21.64°、22.22°、23.82°、29.64°、31.08°、9.4°、10.28°、15.44°、19.6°、23.4°、25.66°、28.52°、11.68°、17.24°、18.12°、31.22°、12.32°、16.34°、18.86°、25.52°、26°、26.24°、29.34°、33.04°および34.04°の2θ角での粉末x線回析ピークから選択される2θ角での粉末x線回析ピークを特徴とする。
【００５５】
第2の多形の態様において、第1の多形の態様または第1の態様の任意の局面の多形は、実質的に図20Cに従う粉末x線回析(PXRD)パターンを特徴とする。
【００５６】
さらに別の態様において、第1もしくは第2の多形の態様または第1の態様の任意の局面の多形は、寸法(aが5.449Åであり、bが9.686Åであり、cが17.653Åである)および角度(αが77.11°であり、βが87.58°であり、γが84.08°である)を有する単位セルを特徴とする。
【００５７】
第3の多形の態様は、本明細書に記載されるプロセス(例えば方法II)のいずれかにより形成される多形である。
【００５８】
第3の多形の態様の具体的な局面において、多形は、化学式(I)：
【化１２】
2019513723.tif 000014
で表されるか、化学式(II)：
【化１３】
2019513723.tif 000015
で表されるか、化学式(III)：
【化１４】
2019513723.tif 000016
で表されるか、化学式(IV)：
【化１５】
2019513723.tif 000017
で表されるか、化学式(V)：
【化１６】
2019513723.tif 000018
で表されるか、化学式(VI)：
【化１７】
2019513723.tif 000019
で表されるか、化学式(VII)：
【化１８】
2019513723.tif 000020
で表されるか、化学式(VIII)：
【化１９】
2019513723.tif 000021
で表されるか、化学式(IX)：
【化２０】
2019513723.tif 000022
で表されるか、または化学式(X)：
【化２１】
2019513723.tif 000023
で表される、化合物である。
【００５９】
さらなる態様は、上記の多形の態様のいずれかの多形および薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
【００６０】
なおさらなる態様は、炎症状態の治療または予防を必要とする被験体における炎症状態を治療または予防する方法であり、該方法は、該被験体に上記の多形の態様のいずれかの多形または前述の態様の医薬組成物の有効量(例えば治療有効量)を投与する工程を含む。好ましい局面において、炎症状態は線維症である。
【００６１】
使用される装置、湿度、温度、粉末結晶の方向、および粉末X線回析(PXRD)パターンを得ることに含まれる他のパラメーターは、回析パターンの線の見た目、強度および位置においていくつかの変動を引き起こし得ることが当業者に周知であり理解される。(PXRDパターンを示す)本明細書に示される図(図20C)に「実質的に従う」粉末X線回析パターンは、本明細書に示される図のPXRDパターンを提供した同じ多形を示すように当業者に考慮されるPXRDパターンである。したがって、実質的に従うPXRDパターンは、本明細書に示されるものと同一であり得るか、またはより高い確率でどこかが異なるものであり得るかかるPXRDパターンは、本明細書に示される回析パターンの線のそれぞれを必ずしも示すわけではなく、および/またはデータを得ることに関与する条件における違いから生じる線の見た目、強度または位置の移動のわずかな変化を示すことがある。当業者は、結晶性化合物の試料が同じで多形であるかどうか、またはそれらのPXRDパターンの比較により本明細書に開示される多形とは異なる多形であるかどうかを決定し得る。同様に、当業者は、PXRDパターンから得られる所定の解析角(°2θで表される)が本明細書に示される同じ位置の値についてのものであるかどうかを決定し得る。本明細書において特定される任意の2θ角は、実施例区分または図に示される任意の2θ角を除き、特定された値±0.2°を意味することが理解される。例えば、記載される態様または請求項が21.64°の2θ角を特定する場合、これは21.64°±0.2°を意味し、これは21.44°〜21.84°の2θ角であることが理解される。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「主要な粉末x線回析ピーク」は、40%より高い相対強度を有する粉末x線回析パターンにおけるピークをいう。相対強度は、目的のピークのピーク強度 対 図20C(右パネル)に示される2θ範囲内の最大ピークのピーク強度の比として算出される。
【００６３】
当該分野で公知なように、多形は、その単位セルの寸法(a、bおよびc)および角度(α、βおよびγ)を特徴とし得、三次元での反復による最少体積要素は、多形結晶構造を説明する。本明細において特定される任意の単位セル角度は、実施例区分または図に示される任意の単位セルを除き、特定された値±0.1°を意味することが理解される。また、本明細書において特定される任意の単位セル寸法は、実施例区分または図(例えば図20A)に示される任意の単位セル寸法を除き、特定された値±0.01を意味することが理解される。
【００６４】
疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む本発明の組成物は、例えば治療剤の持続放出のための医薬製剤として、種々の適用のために使用され得る(例えば、本願の実施例および図3〜12参照)。治療剤の「持続放出」は、治療剤が、組成物から制御された速度で放出されて、治療的に有益な血液レベルまたは投与部位(例えば植え込み部位)での有益な治療剤のレベルが、延長された時間、例えば1〜24時間；8〜24時間；12〜24時間、1〜2日、2〜4日、4〜10日、10〜100日100〜300日、300〜600日および任意の中間の期間にわたり維持されることを意味する。用語「持続放出」および「制御放出」は交換可能に使用される。あるいは、本発明の組成物は、限定されないが、機能性食品、殺虫剤、除草剤、矯味矯臭化合物、色素、触媒およびその他を含む種々の非医薬持続的放出用途のために使用され得る。本明細書で使用する場合、薬剤(例えば治療剤)の「遅延放出(delayed release)」は、遅延期間に局所的に(例えば投与の点、植え込み部位で)または全身的に(例えば治療剤の血液レベル)測定した場合に、治療剤のレベルがほとんど検出可能でないように、遅延の最初の期間の後のみに組成物から薬剤が放出されることを意味する。遅延期間は、数分、数時間からいくらか(例えば1〜60分、1〜24時間；8〜24時間；12〜24時間、1〜2日、2〜4日、4〜10日、10〜100日 100〜300日、300〜600日および任意の中間の期間)の範囲であり得る。
【００６５】
ある態様において、本明細書に記載される本発明の化合物は、1つ以上の薬学的に許容され得る担体または賦形剤と共に治療的(例えば医薬的)使用のために製剤化される。用語「薬学的に許容され得る担体」は、無毒性の溶剤、分散剤、賦形剤、アジュバントまたは医薬組成物、すなわち患者に投与し得る剤型の形成を可能にするために有効成分と混合される他の物質を意味する。一般的に、薬学的に許容され得る担体または賦形剤は、組成物中の疎水性化合物(1つまたは複数)の安定性および放出速度プロフィールに実質的な効果を有さない量で存在し得る。適切な賦形剤/担体は当該分野で周知であり、その全体において参照により本明細書に援用されるGennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences (18版、Mack Publishing Company, 1990, 特にPart 8参照: Pharmaceutical Preparations and their Manufacture)に記載されるものが挙げられる。治療的使用のために製剤化される本発明の組成物は、その薬学的に許容され得る塩のように使用され得るかまたはその薬学的に許容され得る塩として使用され得る。用語「薬学的に許容され得る塩」は、患者/被験体の治療に適合性である酸付加塩または塩基付加塩のいずれかを意味する。
【００６６】
いくつかの態様において、適切な塩を形成する例示的な無機酸としては、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸ならびに一水素オルトリン酸ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸性金属塩が挙げられる。適切な塩を形成する例示的な有機酸としては、モノ-、ジ-およびトリカルボン酸が挙げられる。かかる酸の例は、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、p-トルエンスルホン酸、ならびにメタンスルホン酸および2-ヒドロキシエタンスルホン酸等の他のスルホン酸である。モノ-またはジ酸塩のいずれかが形成され得、かかる塩は、水和物化、溶媒和化または実質的に無水の形態のいずれかで存在し得る。一般的に、これらの化合物の酸付加塩は、水および種々の親水性有機溶剤により高く可溶性であり、一般的に、それらの遊離塩形態と比較してより高い融点を示す。他の薬学的に許容され得ない塩、例えばシュウ酸塩は、例えば実験室使用のためまたはその後の薬学的に許容され得る酸付加塩への変換のために式I〜Xの化合物と共に使用され得る。
【００６７】
本発明の組成物は、固形または液体形態であり得る。典型的に、それらは錠剤、散剤、サシェ、ビーズ、ペレット、浸透性剤型等の用量単位形態であるが、それらは同様に、種々の適用、すなわち非経口、経口、口内、眼用、鼻腔、皮膚、直腸、および肺の経路における使用のために液体、クリームまたはエアゾール形態であり得る。一態様において、本発明において提供される組成物は封入される。本発明の組成物の封入に使用される物質の非限定的な例としては、セラミック、ガラス、金属、ポリ乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)コポリマー、ポリマー(例えばポリスチレンビーズ)およびアルギン酸ヒドロゲルで構成される物質が挙げられる。特定の態様において、本発明において提供される組成物は、生体適合性ポリマー(例えばアルギン酸塩ヒドロゲル)中に封入される。
【００６８】
本発明の組成物は、異なる投与形式、例えば限定されないが非経口、経口、口内、眼用、鼻腔、皮膚、直腸および肺の経路のために製剤化され得る。一態様において、該組成物は、錠剤、カプセルまたは浸透性剤型などの経口送達形態である。別の態様において、該組成物は、注射による投与に適した形態である。別の態様において、該組成物は植え込みによる投与に適した形態である。
【００６９】
投与の方法
本発明はまた、種々の態様において、被験体(例えば送達を必要とする被験体)に疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を送達するための方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される本発明の組成物を投与する工程を含む。特定の態様において、該組成物は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団の有効量を含み、ここで集団中のそれぞれの自由単結晶は、約1マイクロメートルより大きい特徴的な寸法を有する。
【００７０】
該組成物は、(例えば疾患または状態を予防または治療するため)予防用組成物もしくは治療用組成物として、または代替的に非治療用組成物(例えば機能性食品または化粧品組成物)として被験体に投与され得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「方法」は、所定の仕事を達成するための様式、手段、技術および手順をいい、限定されないが、化学的、薬学的、生物学的、生化学的、医学的、電気的、電気化学的、機械的および電気機械的分野の実施者により公知の様式、手段、技術および手順から、公知であるかまたは容易に開発されるかのいずれかの様式、手段、技術および手順が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「被験体」は、哺乳動物(例えばヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス)をいう。本明細書で使用する場合、「非ヒト動物」は、ヒトでない哺乳動物(例えば非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス)をいう。本明細書で使用する場合、「被験体」はまた、組織(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスから得られた組織、または実験室で遺伝子工学により作り変えられた組織)をいい得る。遺伝子工学により作り変えられた組織の非限定的な例としてはiPS(治療細胞型(例えば島)に分化する人工多能性幹細胞、始原細胞または細胞株から3Dプリンターで作製された(3D printed)組織、因子を送達するためまたは微小環境に影響するために遺伝子的に作り変えられた細胞/組織、始原組織由来の懸濁物中で成長した類器官、および合成成分(例えばナノワイヤ)を組込まれた細胞/組織が挙げられる。特定の態様において、被験体はヒトである。「その必要がある被験体」は、投与される疎水性化合物により治療(例えば向上、緩和、予防)され得る疾患または状態を有するかそれを発症するリスクを有する被験体(例えば患者)をいう。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」または「治療(treatment)」は、臨床的に許容され得る基準に従って医学的状態(例えば局所的な炎症)が改善される(例えば、局所的な炎症の低減または排除)程度にまで医学的状態を中和することを意味する。
【００７４】
ある態様において、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団の有効量が、それを必要とする被験体に投与される。本明細書で定義される場合、「有効量」は、被験体に投与された場合に、投与の条件下で被験体において所望の治療効果を達成するのに十分な疎水性化合物(例えば疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団として投与される)の量、例えば被験体において免疫応答(例えば炎症応答)を阻害(例えば予防、低減、排除)するのに十分な量をいう。本明細書で定義される場合、「治療有効量」は、被験体に投与される場合に、投与の条件下で被験体において所望の治療効果を達成するのに十分な、本明細書に記載される疎水性化合物(例えば疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団として投与される)の最低量、例えば被験体において免疫応答(例えば線維症などの炎症応答)を阻害(例えば予防、低減、排除)するのに十分な量をいう。
【００７５】
特定の態様において、本発明は、安定剤に加えて、生物学的または薬学的に活性な疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を被験体に投与することにより、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を被験体に送達するための方法を提供する。かかる組成物は、重量当たり高い割合の生物学的に活性な疎水性化合物および少ない量の安定化剤を含み、それにより、安定化剤の使用に伴う任意の毒性を低減して、疎水性化合物の治療効力を高める。適切な安定化剤としては、限定されないが、液体の表面張力を低減し得る分子である界面活性剤が挙げられる。界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、非イオン性および両性イオン性であり得る。
【００７６】
一態様において、本発明は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団の有効量を投与することを含む、その必要のある被験体に、組成物を送達するための方法を提供し、ここでその必要のある被験体は、炎症状態を有するかまたは炎症状態を発症するリスクを有するヒトである。特定の態様において、該炎症状態は線維症である。線維症を有する被験体への投与のための適切な疎水性化合物としては、例えばCSF1Rを標的化する疎水性化合物、例えばGW2580、Ki20227、JNJ-28312141およびcFMS受容体阻害剤IIIが挙げられる。
【００７７】
特定の態様において、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物は注射により投与される。別の態様において、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物は植え込みにより投与される。例えば、本明細書に記載される組成物は、注射、表面沈殿され得るか、および/または植え込まれた生体物質または医療デバイスの内部にある薬物デポーから放出され得る。
【００７８】
本発明の組成物の他の可能な投与経路としては、限定されないが、非経口、経口、口内、眼用、鼻腔、皮膚、直腸および肺の経路および/または罹患した組織への局所送達が挙げられる。当業者は、記載される投与経路のいずれか1つが、本発明に開示される被験体への送達方法により完了されることを理解しよう。
【００７９】
一態様において、該方法は、疎水性化合物を、免疫抑制剤と組み合わせて被験体に送達することを含み、ここで該免疫抑制剤は、1)同じ免疫抑制を維持しながら、送達される必要のある疎水性化合物の必要量の低減を可能にし、2)該化合物を植え込まれた物質/デバイスと宿主免疫応答の間に送達および放出して、全身性(全体的)循環の必要性を排除することにより疎水性化合物の作用の特異性をさらに増加させ、3)疎水性化合物の放出速度を有意に拡大させて、それによりコンプライアンスを維持することが困難な反復注射スキームを回避するのに有効な量で提供される。
【００８０】
本発明はまた、被験体(例えばそれを必要とする被験体)において疎水性化合物の放出を持続(例えば、制御、延長、制限)するための方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される本発明の組成物を投与することを含む。特定の態様において、該組成物は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団の有効量を含み、ここで集団中のそれぞれの自由単結晶は、約1マイクロメートルよりも大きな特徴的な寸法を有する。
【００８１】
当該分野で公知のように、結晶形態の疎水性化合物は一般的にその不定形態の化合物よりも安定である。
【００８２】
特定の環境における結晶の安定性を示すパラメーターである結晶の溶解速度は、結晶の表面積に限定されることが当該分野で公知である。そのため、結晶の組成、結晶度、結晶サイズおよび形態(例えば多形性)等を操作することにより物質の放出速度を制御することも可能である。
【００８３】
そのため、疎水性化合物の結晶形態は、遅い、制御された、延長されたおよび/または長期間持続された疎水性化合物の放出に特に有用であり、一方で不定形物質は、疎水性化合物の速い/一気の放出に有用である。したがって、理論に限定されることを望まないが、組成物中の疎水性化合物の結晶形態および不定形態の物質の量を調節することにより被験体に投与される化合物の放出速度を調製することが可能であると考えられる。
【００８４】
したがって、一態様において、本発明は、それぞれ異なる特徴的なサイズの結晶を有する単一の疎水性化合物の自由単結晶の少なくとも2つの異なる均一な集団を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより、疎水性化合物の放出を持続(例えば、制御、延長、制限)するための方法を提供する。例えば、図4は、抗炎症特性を有する疎水性化合物クルクミンの自由単結晶の少なくとも2つの異なる均一な集団を含む組成物の代表的な顕微鏡画像を示し、ここで、より小さい結晶の集団は、より大きな結晶の集団よりも早い速度で結晶中のクルクミンを放出する。該方法の別の態様において、それを必要とする被験体に投与される組成物は、少なくとも2つの異なる疎水性化合物の自由単結晶の少なくとも1つの均一な集団を含む。本発明の他の態様において、それを必要とする被験体に投与することにより疎水性化合物の放出を延長するための方法は、それぞれが異なる特徴的なサイズの結晶を有する少なくとも2つの異なる疎水性化合物の自由単結晶の少なくとも2つの均一な集団の混合物である組成物を含み得、より小さな結晶の集団は、より大きな結晶の集団よりも早い速度で結晶中の疎水性化合物を放出する。本発明のある態様において、それを必要とする被験体に投与することにより疎水性化合物の放出を延長するための方法は、図4に示すように、自由単結晶の均一な集団と疎水性化合物の不定形態の混合物である組成物を含み得る。
【００８５】
いくつかの態様において、約5%〜30%未満(例えば、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%の疎水性化合物は、生理学的条件下で2日後に被験体中で放出され、および/または疎水性化合物の約40〜90%未満(例えば、約約40%、約50%、約60%、約70%、約80%または約90%)は、生理学的条件下で60日後に放出される。いくつかの態様において、疎水性化合物の約80%未満は生理学的条件下で約180日後に放出される。いくつかの態様において、疎水性化合物の約90%未満は生理学的条件下で約240日後に放出される。さらなる態様において、疎水性化合物の約10%未満は、生理学的条件下で2日後に放出される、および/または疎水性化合物の約90%未満は、生理学的条件下で60日後に放出される。
【００８６】
製剤化プロセス
種々の態様において、本発明はまた、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を調製するためのプロセスを提供する。一般的に、該プロセスは、(a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程、(b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ溶剤から化合物を沈澱させる反溶剤の量を超えない量で反溶剤を添加することにより混合物を形成する工程、および(c)自由単結晶を回収する工程を含む。一態様において、(c)における回収の前に、(b)の混合物を約1時間〜約6時間の範囲の時間、インキュベートする。異なる態様において、(c)における回収の前に、(b)の混合物を約6時間未満の間インキュベートする。さらなる態様において、(c)における回収の前に、(b)の混合物を約4時間未満の間インキュベートする。いくつかの態様において、工程(b)は、約0℃〜約60℃の範囲の温度で行う。特定の態様において、工程(b)は、約25℃の一定温度で行う。
【００８７】
用語「溶液」は、溶剤(例えば、液体)中の溶質(例えば、固体)の実質的に均質な混合物をいう。一態様において、(a)の溶液は、疎水性化合物が溶剤に溶解した溶液である。本明細書で使用する場合、用語「溶解」は、固体が溶液になるような固体の可溶化をいう。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「溶剤(solvent)」は、特定の疎水性化合物が可溶性になる液体をいう。溶剤としては限定されないが、有機溶剤が挙げられる。溶剤の非限定的な例としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、エーテル、n-ヘキサン、ブタノン、アニソール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸アセチル、テトラヒドロフラン(THF)、メタノール、エタノール、エタノール+THF、イソプロパノールが挙げられる。いくつかの態様において、有機溶剤は揮発性の溶剤である。本明細書で使用する場合、用語「揮発性」は、常温常圧で容易に蒸発し得る溶剤の性質をいう。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「反溶剤(anti-solvent)」は、疎水性化合物が不溶性であるかまたは疎水性化合物の1部の溶質が溶質を溶解するために30部以上の反溶剤を必要とするように実質的に不溶性である液体をいう。反溶剤としては限定されないが、有機溶剤が挙げられる。反溶剤の非限定的な例としては、水、アニソール、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノール、アセトン、エーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸アセチル、キシレン、ヘキサン、ヘプタン、ヘプタン+水が挙げられる。いくつかの態様において、有機溶剤は揮発性の溶剤である。該プロセスで使用される溶剤および反溶剤は、結晶化されている疎水性化合物の特性に基づいて当業者により選択され得る。典型的に、溶剤および反溶剤は、使用される割合で容易に混和可能である。溶剤:反溶剤の適切な組合せとしては、限定されないが、DMSO:水、アセトン:水、アセトン:ヘプタン、ブタノン:ヘプタン、ブタノン:水、酢酸エチル:ヘキサン、エタノール:酢酸エチル、ブタノン:ヘプタン+水、エタノール+THF:水、エタノール:キシレン、エタノール:アセトニトリル、アニソール/ヘキサン、酢酸エチル:ヘプタン、エタノール:水、酢酸メチル:ヘキサン、メタノール:水および逆の組が挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「回収(harvesting)」は、結晶を収集する(collecting)プロセスをいう。血漿を収集する方法は周知であり、限定されることなく、例えば結晶成長プレートからの手動の回収、レーザーデバイスを使用した自動の回収が挙げられる。
【００９１】
別の態様において、本発明は、疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む医薬組成物または医学的デバイスを調製するためのプロセスを提供し、該プロセスは、(a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程、(b)該溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤の量を超えない量の反溶剤を添加することにより混合物を形成する工程、(c)自由単結晶を回収する工程、および(d)自由単結晶を、疎水性薬剤の自由単結晶の均一な集団を含む医薬組成物または医学的デバイスに製剤化する工程を含む。いくつかの態様において、工程(d)は、該集団と他の物質を混合することを含む。他の物質の例としては、疎水性化合物、ポリマー、金属、薬学的に許容され得る担体または賦形剤が挙げられる。
【００９２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるプロセスにより産生される疎水性化合物の自由単結晶の均一な集団を含む組成物を提供する。一態様において、該プロセスは、(a)溶剤中に本質的に疎水性化合物からなる溶液を提供する工程、(b)該飽和溶液に、自由単結晶の形成を誘導するのに十分でありかつ該化合物を溶剤から沈殿させる反溶剤の量を超えない量の反溶剤を添加する工程；および(c)自由単結晶を回収する工程を含む。用語「飽和溶液」は、本明細書で使用する場合、これ以上の溶質(例えば式I〜Xの疎水性化合物)が溶剤に溶解し得ない溶液をいう。溶液の飽和は、添加される任意のさらなる溶質が固形の沈澱を生じるかまたは気体として放出される場合に達成されることが理解される。用語「不飽和(unsaturated)溶液」または「不飽和(undersaturated)溶液」は、本明細書で使用する場合、溶質(例えば式I〜Xの疎水性化合物)が溶剤に完全に溶解して、さらなる溶質が、物質を残さずにさらに溶解し得る溶液をいう。用語「過飽和(super saturated)溶液」は、本明細書で使用する場合、その結晶化および沈殿の傾向のために飽和溶液よりも多くの溶質(例えば式I〜Xの疎水性化合物)を含む溶液をいう。
【００９３】
http://examples.yourdictionary.com/examples-of-saturated-solution.html#VRUlDV8vgfuYyRIb.99でさらに読み込むことは「限定されないが含む」を意味する。
【００９４】
用語「含む(comprise)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(including)」、「有する(having)」およびそれらの同根語は、「限定されないが含む」を意味する。用語「からなる(consisting of)」は「含み限定される」を意味する。用語「本質的にからなる(consisting essentially of)は、組成物、方法またはプロセスがさらなる成分、工程および/または特徴を、該さらなる成分、工程および/または特徴が特許請求される組成物、方法および/またはプロセスの基本的かつ新規な特徴を大きく変化しない場合にのみ含み得ることを意味する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確にそうではないと示さなければ複数の参照を含む。例えば、用語「化合物(a compound)または「少なくとも1つの化合物(at least one compound)」は、複数の化合物、例えばそれらの混合物を含み得る。
【００９６】
本願を通じて、本発明の種々の態様がある範囲の形式(a range format)で示され得る。ある範囲の記載は単に都合上および簡潔さのためのものであることが理解されるべきであり、本発明の範囲の絶対的な限定として企図されるべきではない。したがって、ある範囲の記載は、具体的に開示されるすべてのあり得る下位の範囲(subranges)およびかかる範囲内の個々の数値を有するものと考えられるべきである。例えば、1〜4などの範囲の記載は、具体的に開示される下位の範囲、例えば、1〜2、1〜3、1〜4、2〜3、2〜4、3〜4等ならびにかかる範囲内の個々の数、例えば1、2、3および4を有するものと考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。本明細書で使用する場合、用語「約」は、±10%をいう。数的範囲が本明細書に示される場合はいつでも、示される範囲内の任意の記載される数(部分的または全体的)を含むことを意味する。
【００９７】
明確化のために別の態様の文脈中に記載される本発明のある特徴は、単一の態様において組み合わせて提供され得ることも理解される。逆に、簡潔さのために単一の態様の文脈において記載される本発明の種々の特徴はまた、別々にもしくは任意の適切な下位の組合せにおいて、または本発明の任意の他の記載される態様において適切なものとして提供され得る。種々の態様の文脈において記載されるある特徴は、該態様がこれらの要素無しでは無効でなければ、これらの態様の必須の特徴とはみなされない。
【実施例】
【００９８】
実施例
広範な疎水性薬物の不定形態および結晶形態を、炎症、線維症および植え込まれた物質の宿主拒絶の予防および治療における潜在的な有効性についてスクリーニングした。不定形薬物よりも低い溶解速度を有する薬物結晶を利用した局所的な制御された薬物の放出は、炎症、線維症および植え込まれた物質の宿主拒絶をより良好に予防および/または治療し得ると仮定した。段階的な様式で薬物を放出し得かつ数か月間の長期的な抗線維症効果を確実にし得る製剤が構想された。
【００９９】
具体的に、炎症、線維症および植え込まれた物質の宿主拒絶の予防および/または治療のための新規の不定形および/または結晶性薬物製剤の有用性を試験するために、一組の小分子をスクリーニングした。本質的なマクロファージ生物学経路に標的化される具体的な免疫調節/阻害剤を含む薬剤のスクリーニングを利用した。しかしながら、いくつかの潜在的な負の副作用を有する免疫細胞(すなわちマクロファージ)の全集団を完全に除去する薬剤を選択する代わりに、マクロファージを阻害および/または調節し得るいくつかの選択的で標的化される薬剤を同定した(図2参照)。広域スペクトル抗炎症剤デキサメタゾン、ラパマイシンおよびクルクミンも試験した(図2)。
【０１００】
結果：
不定形および結晶性の疎水性薬物製剤の調製および比較
図3は、本明細書に記載される本発明のプロセスに従って調製されたデキサメタゾン(Dx)、Ly215 (Ly)またはGW2580 (GW) (図20Bにも示される)の結晶の、それぞれの薬物の不定形粉末製剤と比較した代表的な走査電子顕微鏡(SEM)画像を示す。異なるサイズの結晶を設計して達成した(図3、図20B参照)。
【０１０１】
クルクミンの結晶性および不定形の両方の製剤をアルギン酸塩中に、別々にまたは異なる比の2つの形態の混合物として封入した(図4)。これらの製剤を2か月までの累積放出についてインビトロで追跡した。図5は、結晶および不定形態、ならびにそれぞれ3:1の比の混合物としてのクルクミンについての比較放出プロフィールを示す。不定形クルクミンにより、より速い薬物放出が達成され、一方で結晶クルクミンは初期にはより遅く放出したが、かなり長期間にわたり維持され得たことが見出された。2つのプロフィールの差はいくつかのパラメーター、特に結晶サイズおよび結晶化度に応じて可変的であることが見出された。結晶および不定形の両方の製剤の混合比(この場合、それぞれ3:1)は、クルクミンの速い放出および延長された放出の両方を示した。両方の封入製剤は、その後顕微鏡検査を行い、結晶性物質は、その長期放出プロフィールに寄与すると思われる層による表面放出層を示すことが見出された(図5)。薬物放出は結晶サイズに依存し、より小さな結晶は、結晶体積当たりの表面積の差のためにより大きな結晶よりも速く薬物を放出することも見出された(図6)。
【０１０２】
線維症の予防における不定形疎水性薬物製剤の有効性
抗線維症薬物活性のスクリーニングのために、不定形薬物製剤を500μmのアルギン酸塩カプセル内に封入した。広域スペクトル抗炎症剤クルクミン、デキサメタゾンおよびラパマイシンを、種々の生体物質、例えばポリマーPLGAおよびヒドロゲルアルギン酸塩の線維症の予防のために使用した。伝統的な広域スペクトル抗炎症剤および必須のマクロファージ生物学経路(例えばTNFα、NFκB、p110δ/PI3K、TGFβおよびCSF1R)に標的化される薬剤を含む主要な(lead)薬物候補(例えば式I〜Xの化合物)のパネルを選択した。これらの主要な薬物候補を有するBa+架橋SLG20アルギン酸塩ヒドロゲル球を、異物応答に対するマクロファージ免疫調節の効果を調べるための不定形製剤として調製した。最初に有機溶剤(例えば図7、9のビヒクル)に溶解して、次いでアルギン酸塩水溶液と混合して調製した不定形態中に薬物を封入した。線維症の予防の効果を、腹腔内(IP)空洞中への植え込み後2週間のC57BL/6マウスにおいて評価した。次いで、薬物含有球(500μl/動物)をC57BL/6マウスの腹腔内に14日間植え込んだ。この期間の後、球を回収し、細胞沈殿および線維症について試験した。より早期のデータに基づいて、繊維状カプセル形成には2週間で十分であることが見出され、これは不定形製剤からカプセル中への薬物の大部分の放出に十分であった。
【０１０３】
植え込み後、カプセルを回収して、暗視野位相差および共焦点顕微鏡検査ならびに定量的FACS分析により分析した(図7〜9)。対照試料(ブランクおよびビヒクル)についての位相差画像は、そうでなければ半透明アルギン酸塩微小球上の白色プラークとして観察される宿主異物応答(免疫細胞接着および線維症)を示したが、薬物充填カプセルはより少ない線維症形成を示した(図7)。線維症をほぼ全く有さないものとして主要な化合物を同定した(図7)。DAPI(核マーカー)、F-アクチン(細胞の細胞骨格マーカー)またはマクロファージマーカーCD68、およびα平滑筋アクチン(α-SMA、筋線維芽細胞マーカー)を使用した共焦点画像化を使用して、球上の細胞沈殿を試験した(図9)。主要な候補について、共焦点顕微鏡画像は、不定形薬物を充填したアルギン酸塩マイクロカプセル上の線維症過形成の低下または該過形成がないことを示し、C57BL/6マウスのIP空間中で2週間後に回収した(図9)。
【０１０４】
これらの観察されたデータは、アルギン酸塩球から直接分離し、2週間の植え込み試験後に回収した細胞で行った定量的FACS分析と相関することが見出された。プラーク接着および線維症の低下に加えて、不定形製剤として封入された同じ主要な候補は、マクロファージの存在(図8、左のグラフ)およびほとんどの場合において好中球の存在(図8、右のグラフ)の低下を示した。これらのカプセルとしてはブランクおよびビヒクル対照(薬物なし)ならびに不定形薬物充填微小球カプセルが挙げられた。5%未満の薬物充填を示す回収されたカプセルからの薬物抽出は、充填物(payload)を放出する観察された活性に寄与することが見出された。Nanostring多重化遺伝子発現分析を使用したC57BL/6マウスにおける2週間の植え込み後の宿主媒介性先天性免疫認識の輪郭を描くために遺伝子発現応答についてカプセルを分析した(図10)。線維症関連マクロファージ表現型および相関する線維症応答は、薬物なし(ブランク)およびビヒクル充填対照により誘導されるレベルと比較して、多くの薬物が宿主応答を変化する程度まで阻害するように相関した(図10、グレースケールの図においてより明るい影で示される緑)。同様の標的を有する阻害剤は同様の表現型を誘導し(例えば、A8およびD4；CAL、CCおよびQNZ)、ほとんどは炎症性マクロファージマーカースフィンゴシンキナーゼ1(Sphk1)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、アルギナーゼ1(Arg1)およびインターロイキン1(IL1)の有意な阻害を示した。興味深いことに、CSF1Rを標的化するcFMとGW(GW2580)の両方も、ほぼ同じ遺伝子発現応答を示した。活性化された筋線維芽細胞(α平滑筋アクチン、αSMact)およびさらなる線維症マーカー(コラーゲン1a1、Col1a1)も、線維症対照と比較して、同様の様式で、多くの薬物封入ヒドロゲル植え込み物の表面上で減少した。
【０１０５】
線維症の予防における結晶性疎水性薬物製剤の有効性
不定形製剤のスクリーニングにより同定された主要な化合物(例えば式I〜Xの化合物、特にLY215799、Dx、クルクミン、GW2580、QNZおよびKi20227)を、長期間試験の間、結晶性形態中の封入およびC57BL/6マウスの腹腔内(IP)空間への植え込み後に、長期放出および線維症の予防について試験した。結晶形態の主要な化合物を含む薬物溶出カプセルは、C57BL/6マウスのIP空間から1、3および6か月後に回収し、植え込みの1か月後に、ならび3および6か月後の広範囲の凝集(extensive clumping)において個々の線維症を示したブランク(結晶なし)対照ヒドロゲル球と比較して、位相差画像化(図11A)および共焦点顕微鏡検査(図11B)により線維症がないことを確定した。図11Aは、そうでなければ半透明のアルギン酸塩微小球上の黄色っぽい白色プラークとして観察される宿主異物応答(免疫細胞接着および線維症)を示す代表的な位相差画像を示す。重要なことに、いくつかの抗炎症剤およびより多くの選択的小分子阻害剤は、C57BL/6マウス中IP空間に植え込まれた後の1、3および6か月後に線維症の予防において有効性の向上を示した。6か月の時点で収集されたデータはまた、線維症の予防を示し、完全な結晶は回収されたカプセル内部で有意な量のままであった。また、FACS分析(図13Aおよび13B)は、植え込みの6か月後であってさえ、回収された結晶性薬物充填カプセル群の表面上で、先天性免疫細胞(マクロファージ、左パネル；および好中球、右パネル)の存在の有意な減少を示した。組織学的染色(H&Eおよびマッソン三色)により、多くの結晶性薬物溶出カプセル治療群(図7〜9で同定された異なる薬物候補を有する)は、皮下(SC)植え込みの3か月後に細胞浸潤および線維症性(コラーゲン)沈殿の有意な低下を示すことが決定された(図22A)。回収して分離されたSC組織およびカプセルから採取した細胞のFACS分析により、植え込まれたDECの表面および周囲に、有意に低下したマクロファージレベルが示された(図22B)。線維症なしのカプセルが局所的または全体的な免疫調節のためであるかどうかを決定するために、LC-MSによる試験を通じて血漿薬物濃度をモニタリングし、観察されたレベルは対応する薬物の報告されたIC50(0.5〜10ng/ml)値未満であっただけでなく(図22Cおよび22E)、カプセルがIPまたはSC部位のそれぞれに配置されたかどうかに応じて、植え込み後1〜2週間以内には検出可能ではなく、観察された長期抗線維症効果は全身性の免疫抑制に対して局所的であるためであると思われることが示された。HPLCによる薬物抽出分析によっても、充填された薬物の多くのパーセント(例えば50%より多く)が回収されたカプセル(図22D)、特に皮下埋め込み試料中に残ることが決定された。これらの結果は、線維症予防は、有意に長い時間継続し得ることを示唆する。対照的に、6か月の植え込み後にIP空間から回収されたカプセルは、回収されたカプセル中にわずか2〜40%の充填された薬物が残ったことが同定された。
【０１０６】
GW2580などのこれらの試験において同定された主要な候補を、次いでカプセル(0.5および1.5mm)を腹腔内(IP)および皮下(SC)空間の両方に植え込んだ非ヒト霊長類(NHP)モデルにおいて試験した(図12および13C)。対照の位相差画像により、大規模な宿主異物応答(免疫細胞接着および線維症)が明らかになり、0.5mmの対照カプセルは、IP空間において完全に線維症化され積層される場合には、回復できなかった。対照的に、結晶性GW2580と共に充填されたカプセルの両方のサイズは、有意に高い効率を示し、IPおよびSC空間の両方において2および4週後に線維症の発症を予防した(図12)。回収されたカプセルから残りの薬物を抽出し、HPLCにより定量して、IPおよびSC部位の両方において6か月までの間に1.5mmカプセルにおけるさらなる保存が示され、一方で0.5mmカプセルは、6か月目にSC部位において残存薬物を有しただけであり、IP空間においては3か月目にほとんどまたは全く有さなかった(図23A)。これらの結果は、それぞれの場合に観察される異物応答の程度と相関し、さらにSC部位に対してIP区画におけるより速い放出を示唆した。回収時点後のそれぞれのカプセルの型について(fort)IP空間(洗浄)薬物濃度をLCMSにより追跡して、植え込みの4週後にわずか2〜3ng/mlから検出可能限界(0.5ng/ml)未満まで落ち込むことが見出された。試験の終了時の血漿試料分析も、遅い放出および局所的な送達に寄与し得る検出限界未満の濃度を示した。回収されたカプセル上に存在する任意の細胞を分離して、染色し、FACSにより分析し、残存薬物の全ての場合においてマクロファージ応答の有意な阻害が示された(図13C)。薬物充填アルギン酸塩0.5および1.5mmカプセルの植え込み部位から得られた切り出された組織を、組織学的分析(H&Eおよびマッソン三色染色)により分析し、同じ時間枠にわたり埋め込まれた球の欠損およびコラーゲン沈着が示された(図23B〜23C)。そして0.5mm薬物充填カプセルは3か月目に凝集された(clumped)が、それらは6か月までに網組織の周囲に広く埋め込まれなかった(図12、23Bおよび23C)。これらの結果は、長期間送達および線維症予防についてのかかる結晶性薬物放出戦略の臨床的翻訳(clinical translation)の裏付けを示す。
【０１０７】
主要な薬物候補として同定されたGW2580の結晶および不定形製剤をβ細胞と共に封入し(図14)、STZ誘導糖尿病C57BL/6マウスに導入し、結晶または不定形GW2580を共封入したものと比較して、薬物を有さない従来のサイズの0.5mmマイクロカプセル中のラットの島の生存を評価した。結晶および細胞を充填されたカプセルの死/生画像分析を行った(図15)。結果は、2つの形態不定形および結晶のGW2580は、視覚的に有意な薬物の充填にもかかわらず、共封入されたラットの島に対して無毒性であることを示す。さらに、両方の薬物製剤は、大きく延長された時間におけるグルコース補正(glucose correction)の消失を予防し得た(図16)。薬物製剤(マクロファージ標的化、CSF1R阻害剤GW2580)ありまたはなしで約500 IE(島当量(islet equivalent))の島を共封入した約500μmの直径のアルギン酸塩微小球を実験に使用した。また、200日を超えて試験の間に血糖をモニタリングしたところ(対照、図16、黒丸)、移植後平均して約35日で不首尾になり、一方で不定形(図16、黒四角)および結晶(図16、黒三角)製剤化カプセルは、70日を超えて正常血糖を維持した(2倍向上)か、または15か月もしくは460日を超えてかなり有意であり得る(約13倍向上)かのいずれかであり、この時点で残存カプセルを分析するためにマウスを殺した(terminated)。さらに、クロドロソーム(陽性対照)によるマクロファージ枯渇は、最初に正常血糖を維持した時点で良好であったが、延長された毎週の送達は、移植後約50〜60日で最終的に有意な毒性を生じた(図16、黒いひし形)。治癒は、以前の1.5mmカプセル試験を用いたわずか約4〜6か月から、薬物が充填された従来のサイズの0.5mmのカプセルを代わりに使用して15か月超まで延長され、線維症の予防および島の生存能力の維持における結晶製剤化GW2580の有用性の向上が示唆された。6か月(180日)でより早く採取されたものと比較して、460日後に回収されたカプセル中には有意に大量のGW2580が残り、細胞共封入の場合において、生物学的島からの球状タンパク質の分泌により局所pHまたは他の微小環境化学的性質が変化し、結晶GW2580の溶解が遅くなることにより非常に長い薬物放出が生じることが示唆された。外植された長期不定形および結晶性薬物含有カプセルを、ラットの島機能/生存能力マーカーPdx1、ならびに不定形および結晶GW2580 (GW)群について移植後約430または460(約1.25年)日のそれぞれでの宿主(マウス)α平滑筋アクチン(αSMact)発現について、分析した(図24)。結晶GW2580カプセルは、約30倍高いPdx1発現により示されるような有意に高い島生存能力、ならびに74%低いαSMact発現で示されるようなより低い筋線維芽細胞および線維症を有した(図24)。これらのデータにより、マクロファージ調節/阻害はマクロファージ排除/枯渇と同様に有効であること、および結晶性薬物処理は、毎週投与されるマクロファージ枯渇クロドロソーム(Clodro、リポソーム性クロドロン酸)と同様に有効であることが示される。
【０１０８】
長期の抗線維症効果はまた、裸の(naked)(治療的投与について封入されない、独立した注射可能な)GW2580の薬物結晶により達成された。GW2580の裸の結晶または食塩水のみ(薬物なし対照)を、500μmアルギン酸塩球と共にC57BL/6マウスに2週間、腹腔内に送達した。毎日の不定形薬物(3mg/日、2週間にわたり合計で45mg)またはかなり低重量の薬物結晶(4.5mg、1週間に1回、合計で9mg)を有する透明なアルギン酸塩微小球である、回収されたカプセルの位相差画像のみが、線維症がないことを示した(図17A)。毎週の不定形薬物は効果的ではなく、バースト放出(burst release)を達成し得る微粉末は、延長された抗線維症活性について、残存薬物の同様の貯留層を提供しなかったことが示唆された。さらに、物質植え込みの2週間後、ならびに第2および最後の結晶注射から1週間で、マウスから洗い出されたIP洗浄液の微分干渉画像は、多くの結晶がIP空間に残ることを示し(図17B)、結晶薬物からの長期薬物放出にはポリマー封入が必要ではないことが示された。明視野および蛍光画像を使用して、食塩水(対照)または結晶性GW2580処理群のいずれかから回収されたアルギン酸塩球上の線維症過形成の存在または欠如のそれぞれを強調した(図17C)。FACSにより、非線維症微小球上のマクロファージレベルの有意な減少を確認した(図17D)。GW2580結晶試験(SC部位当たり0.5および5mgの用量)はまた、他の免疫原性物質、セラミックガラス(GL)およびポリマーポリスチレン(PS)を用いて、SC植え込み空間中へも拡大された。H&Eおよびマッソン三色染色により、植え込みの2週間後のSC組織におけるPSを有する結晶GW2580の有意な抗線維症効果を確認した(図17E)。GLにより抗線維症効果も観察されたが、セラミックガラスを通して切片を作製することができなかったので組織学的評価は行うことができなかった。しかしながら、FACS分析を使用して、植え込み2週間後のSC植え込みPSおよびGL 0.5mm球に対するマクロファージの応答の有意な低減を確認した(図17F)。近位の組織の薬物抽出によっても、全ての植え込み群について、再度結晶の遅い放出に寄与する大量の残存薬物を確認した(図17G)。
【０１０９】
GW2580結晶をPDMSと1、5および10% w/wの異なる割合で混合して、9:1 (PDMS:治療試薬)の比で、45℃で一晩固めることにより調製した2.2mmの厚さおよび5mmの直径のディスクを形成して別の試験を行った。これらのディスクをC57BL/6マウスのSCおよびIP空間に植え込んで、次いで回収してC57BL/6マウス(1ディスク/部位/マウス)における植え込みの2週間、4週間および3か月後に分析した。回収されたPDMSディスク上で黄色っぽい白色のプラークとして観察される異物応答は、2および4週間ならびに3か月にて、全ての薬物濃度により用量依存的な様式で低下した。植え込まれたディスクは、線維症の発症の有意な低減を示した(図18A)。切り出されたSCおよびIP組織のH&Eおよびマッソン三色組織学的染色により、ブランク(薬物なし)対照ディスクと比較して、免疫細胞浸潤および線維症の有意な低減が確認された(図18A、中段および下段パネル)。回収されたディスクから分離された応答マクロファージについてのFACS分析により、IPおよびSC植え込みの両方について、全ての時点での細胞数の有意な低減が示された(図18B)。SCまたはIPのいずれかの植え込みの2週間、4週間または3か月後のHPLCにより行った残存薬物レベル(%充填)の決定により、放出がSC空間においてより遅くなったことが確認された(図18C)。また、薬物保持は、同じインキュベーション時間にわたる多孔質ヒドロゲルアルギン酸塩と比較して、ポリマーPDMSにおいてかなり高かった(図18A 対 図22C)。
【０１１０】
いくつかの物理的および化学的な特定を満足するために治療剤の結晶が必要とされたので、結晶化プロセスは厳密な環境制御の下で行わなければならなかった。結晶の特徴化された性質としては、バイオアベイラビリティ、キラル性(化合物分子構造に関連する)、形態、サイズ分布および多形性が挙げられる。別の試験において、全ての薬物結晶は、制御された方法に基づく溶剤:反溶剤脱安定化技術(本明細書において方法IIと称する)を使用して調製し、該プロセス中に添加剤は含まず、完全に純粋な結晶性物質を生じた。これらの高度に緻密な純粋な結晶は、ほとんどの既知の医薬結晶製剤について約18〜約21A3と比較して、約15〜約18A3の範囲の非水素原子体積値を有した。さらに、これらの結晶は、長期放出に有用であり、層ごとの薬物放出機構を示す。図19Aは、本発明に記載される方法(方法II、右パネル)を使用して得られたGW2580結晶、および溶剤蒸発の周知の結晶化方法(方法I、左パネル)により得られた結晶の代表的な画像を示す。溶剤蒸発は、制御が困難であり、再現性が低く、しばしばランダムな結晶形状およびサイズを生じた。この方法(方法I)で得られた結晶の大きな画分は、双晶になった(図19B)。対照的に、溶剤/反溶剤混合物を使用する方法IIは、ほぼ均一な形状およびサイズ範囲を有する高度に緻密な結晶を生じた(GW2580、右パネル)。薬物濃度、溶剤/反溶剤混合物、処理時間、温度および熱力学的バランス等の種々のパラメーターを制御することにより、添加剤を有さない純粋な薬物製剤を調製した。方法IIはまた、種々の寸法(例えば、小さい、大きい)の高度に順序づけられた均一な結晶を生じた。SXRD分析を使用した結晶投射(図19C)は、16.7A3の非水素原子体積を有する高度に緻密な(高い充填密度)GW2580結晶構造を示した(図19D)。プログラムSAINTによりデータ換算を行い、プログラムSADABSにより当量に基づいた半経験的吸収補正(semi-empirical absorption correction based on equivalents)を行なった。構造は、プログラムSHELXTを使用した二重空間方法により解明し、確立された精密化(refinement)技術を使用したSHELXLにより、全てのデータ上のF2に対して精密化した(方法の区分を参照)。方法IIにより得られた全ての化合物(例えば、式I〜Xの化合物)についての結晶格子は、薬物分子間の疎水性相互作用、不活性な内部の水素結合、および疎水性中間相(interphase)(例えば、図20A、左の画像に示されるGW2580結晶格子中に見られる疎水性チャンネル)により密な充填を示した。走査電子顕微鏡(SEM)画像により、均一な結晶画分を有する方法IIにより調製された不定形物質と結晶の間の違いを確認した(図20B)。PXRDによる模擬的粉末パターンと比較して、単一の特有多形を、それぞれの化合物(例えば、式I〜Xの化合物)について同定した(図20B)。
【０１１１】
方法IIにより作製された結晶についての薬物放出の機構を、時間分解インサイチュ原子間力顕微鏡検査(AFM)により試験した。結晶表面からの薬物分子のリアルタイム放出を、生理学的に関連のある環境中でモニタリングした。結晶表面の連続画像を比較して、分子放出の機構を同定し、放出の速度を定量した。結晶を、37℃の不飽和リン酸バッファ(PBS)溶液中に配置した(図21A)。方法IIにより作製された結晶は、優勢な層ごとの薬物放出機構を示す。結晶から放出される薬物分子の全体的な数は、結晶サイズに依存した。例えば、より大きな結晶は、より小さな結晶と比較してより遅い放出を示した(図21B)。AFMの結果は、加速された放出条件下および/またはアルギン酸塩中に封入された場合であっても、不飽和溶液への暴露の際に完全性を保持する結晶のために、巨視的レベルで観察される遅い薬物放出速度と相関する(図21C)。短期間バースト放出製剤(不定形薬物)と比較して、結晶薬物は、おそらくは緻密な構造および調整されたサイズ(高い表面積:体積比)の範囲のために、高度に調整可能な長期間の遅い放出速度を可能にする。加速された放出を使用して、数週間(図21C)または数か月もの(残存薬物抽出結果に基づく外植)経過にわたり、インビトロにおいて、非常に多く調整された製剤による有意に検出可能な累積放出を生じた。放出速度はさらに、結晶薬物単独または不定形画分と組み合わせた混合性剤としてのいずれかを一体化することにより調整され得る。結晶物質は、遅い、延長された長期放出の利点を有するだけでなく、向上された長期の化学的安定性を有する。表面腐食を介する(層ごとの)遅い薬物放出は、小さい、中位のおよび大きな結晶サイズについて観察され(図21D)、これを特により大きな結晶について時間的な様式で視覚的に観察するためには加速された放出条件が必要であった(図21E)。
【０１１２】
結論
スクリーニングにおいて、TNFα、TGFβおよびCSF1Rに対して標的化されるいくつかの薬剤は抗線維症効果を有することが決定された。CSF1受容体を標的化する主要な化合物セット、例えば化合物GW2580 (LC Labs)、Ki20227 (Tocris)およびcFMS「受容体阻害剤III」(EMD Millipore)は、植え込まれた生体物質アルギン酸塩ヒドロゲル、セラミック、ガラス、PDMSおよびポリスチレンビーズの線維症の阻害における有効性を示した。
【０１１３】
抗線維症有効性を有する薬剤の同定に加えて、短期間バースト(不定形薬物として)もしくは長期間遅延放出(結晶性剤として)、または2つのハイブリッドとしてのいずれかについて、制御された放出速度を向上するための新規の化合物製剤化戦略を開発した。デバイス/担体の内部のいずれかに充填される同じ薬物を表面コーティングまたは裸の注射として一体化することにより、治療剤放出速度は、いくつかのパラメーター、例えば限定されないが、結晶度、結晶サイズおよび形態等を調整して、制御、調整および延長され得る。特定の薬剤の局所化された薬物デポーの有効性が、裸の(封入なし)結晶または封入された結晶(単独および共送達される島との組合せの両方)の注射について示された。かかる製剤化戦略は、数日/数週(例えば、不定形製剤により1〜2週)から数週および/または数か月(例えば、結晶製剤により240日)まで延長された薬物放出を可能にする。
【０１１４】
本明細書に記載されるデータは、生体物質および/または医学的デバイスの植え込みと組み合わせて遅く延長された放出を達成するために結晶性抗線維症薬物製剤を変更および最適化(例えば、結晶度および組成、多形性、結晶サイズおよび形態等)することは、異物反応(例えば線維症)の宿主認識および伝播を阻害し得ることを示した。本明細書に記載される方法により作製される結晶(例えばGW2580結晶)は、インビトロおよびインビボにおいて、数か月〜数年にわたる遅い延長された放出のために利用され得る。インサイチュAFMにより試験された放出の機構(例えば表面腐食)により、結晶内の疎水性部分と水素間/水素内結合(XRDにより決定される)の間を過剰に覆うことによる高度に緻密な結晶(例えば、抗充填密度)は、水分子が前述の相互作用の全てを克服して薬物放出を達成することを困難にする可能性があることが示された。したがって、本明細書に記載される様式で調製および製剤化した場合、多くの薬物は、IPおよびSC植え込み部位の両方において線維症を予防するために長期間にわたり(例えば数か月)持続放出および/または遅延放出をなし得た。長期間にわたる持続放出および/または遅延放出はまた、げっ歯類および非ヒト霊長類の両方において検証された。さらに、0.5mmのサイズのアルギン酸塩微小球中の結晶性GW2580(CSF1R小分子阻害剤)は、異物(例えば線維症形成)応答を予防し、糖尿病マウスにおいて1.25年を超えて共封入された島の生存および正常血糖を維持し得る有意な能力を示した。結晶薬物によりかかる延長された期間にマクロファージ応答を調節することは、ヒドロゲルアルギン酸塩、セラミックガラスならびに可塑性ポリスチレンおよびPDMSを含む複数の物質について、有意な抗線維症効果を提供した。独立型の裸の結晶注射における両方の局所的な薬物デポーの有効性が示された。かかる製剤化戦略は、薬物放出を数日/数週(例えば不定形により1〜2)から本明細書に記載される結晶形態について数か月/数年まで大きく延長させる。
【０１１５】
材料および方法
材料/試薬
全てのインビトロ試薬は、そうではないと示されなければLife Technologies (Carlsbad, CA)から入手した。抗体：Alexa Fluor-共役抗マウスCD68、Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)、およびCD11b(下記)はBioLegend Inc. (San Diego, CA)から購入した。霊長類免疫染色について、抗ヒトCD68 Alexa Fluor-共役抗体はSanta Cruz (Dallas, TX)から購入した。同じCD11b(抗マウス/ヒト)抗体(BioLegend)を、霊長類およびマウス染色の両方に使用した。Cy3共役抗マウスα平滑筋アクチン抗体および中位(約500μm)サイズのガラス球(酸洗浄)はSigma Aldrich (St. Louis, MO)から購入した。中位(約400〜約500μm)サイズのポリスチレン球はPhosphorex (Hopkinton, MA)から購入した。本試験に使用した物質の試料採取は、市販供給業者(Charles River, Wilmington, MA)による内毒素試験に供し、結果は、球は<0.05EU/mlの内毒素レベル(検出可能限界未満)を含んだことを示した。全ての溶剤は、Sigma Aldrich, USAから購入した分析等級のものであった。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)もSigma Aldrich, USAから購入した。薬物は種々の供給業者から購入した：ラパマイシンおよびデキサメタゾン(Sigma aldrich)、GW2580 (LC Laboratories)、LY2157299およびQNZ (Cayman chemical company)、クルクミン (Enzo)、KI20227、A83-01およびD4476 (Tocris)、JNJ-28312141 (SYNKINASE)、A83-01およびD4476 (Tocris)、レナリドミド(Lenalidomide) (CC-5013, Selleckchem)、cFMS受容体阻害剤III (Calbiochem)、CAL-101およびレナリドミド/CC-5013 (Selleck Chem)およびcFMS受容体阻害剤III (EMD Millipore)。
【０１１６】
結晶の調製
当業者に周知である結晶化技術(例えば、図19Aにおける方法Iによる)から誘導される溶剤蒸発により成長した全ての結晶を、溶剤(例えば、アセトン、メタノール、エタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、THF、ブタノン、ジクロロメタンおよびクロロホルム)に可溶化させ、次いで溶剤を約0℃〜約40℃(例えば、約0℃、約20℃、約25℃、約30℃、約40℃)の一定温度で蒸発させ、結晶形態を得た。次いで結晶を回収して従来技術(例えば、顕微鏡検査、単結晶および粉末回析技術)により分析した。
【０１１７】
溶剤:反溶剤混合物法(例えば、図19A、19C、19Dおよび20Bの方法IIによる)を使用して成長した全ての結晶は、0.001mg/mL〜5000mg/mLの範囲の疎水性化合物の濃度で一定温度(例えば、約0℃、約20℃、約25℃、約30℃、約40℃)で成長した。種々の溶剤(例えば、DMSO、アセトン、ブタノン、アニソール、酢酸メチル、酢酸エチル、アセチル化(Acetylptimized)酢酸、THF、メタノール、エタノール、エタノール+THF)および反溶剤(例えば、水、アセトニトリル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸アセチル、キシレン、ヘキサン、ヘプタン、ヘプタン+水)混合物を、結晶化実験に使用し得る。特定の態様において、酢酸エチルを溶剤として使用して、ヘキサンを反溶剤として使用した。いくつかの態様において、種々の濃度の疎水性化合物、例えば100mgのクルクミン、100mgのデキサメタゾン、100mgのLy215799、100mgのGW2580および100mgのQNZをそれぞれ最初に5〜150ml(例えば、10ml、30ml、80ml、130ml)の溶剤(例えば、酢酸エチル)に溶解した。いくつかの結晶化実験において、溶剤溶液を0〜15分(例えば、約0分、約1分、約10分)超音波処理して、および/または約20〜80℃(例えば、約25℃、約40℃、約75℃)の範囲で予備加熱して、可溶化を容易にした。これらの溶液のそれぞれに反溶剤(例えば、ヘキサン)を、部分的に、合計100mgの溶解した疎水性化合物当たり、薬物および所望の最終平均結晶サイズに依存して、約0〜160ml(例えば、約20ml、約30ml、約100ml)添加した。該プロセスは分、時間(例えば、約1分、約5分、約10分、約30分、約45分)〜時間(例えば、約1時間、約2時間、約4時間、約6時間、約24時間)、化合物の分子構造に依存して最適化した。最終的な得られた結晶を、1回の調製当たり少なくとも3試料の画像についてSEM分析を含む顕微鏡検査により分析し、それぞれの場合において10回の無作為的なサイズ測定を行った。結晶試料もXRDにより分析した。結晶サイズの制御は、最適化に必要とされる種々の条件、すなわち薬物濃度、溶剤：反溶剤比、スケール、処理時間等に依存する。図3および20Bは、それぞれ本明細書に記載される方法(方法II)により調製されるデキサメタゾン、Ly215799およびGW2580の代表的な単結晶を示す。結晶サイズは20μm〜3mmであり(図25)、図4がこの方法で調製されたクルクミンの代表的な単結晶を示すことを特徴とする。
【０１１８】
不定形物質調製
この試験における薬物について2つの方法で調製した不定形態
無細胞封入プロセス：溶解度に依存して(例えばエタノール、メタノール、アセトン、DMSO)、第1の薬物を有機溶剤(例えばビヒクル)に溶解して不定形物質をポリマー溶液(ヒドロゲル)の内部に調製した。次いで薬物溶液をヒドロゲル水溶液に一度に添加して、混合物1ml当たりの最終的な所望の薬物濃度に合せた(混合物体積の大部分は>=70体積%であり、水性である)。混合することにより2つの溶剤は干渉し、均一に、非常に速く薬物をビヒクル(例えば、DMSO)から押し出し、該薬物は、不定形で混合物内部に細かく分散されて、水溶液/ヒドロゲル/ポリマーマトリックス内部にトラップされる。不定形%収率は、>=90%である(いくつかの場合、自己結晶化のため)。この懸濁物/混合物をさらに封入して、薬物をバースト方式(数日〜数週間の期間)で放出するカプセルを作製した。安定性の制限のための自己結晶化を回避するために、不定形ベースの製剤を、植え込み前に新たに調製する。
【０１１９】
この方法は、均一に混合され得る任意のもの適用され得、混合される溶剤混合物は、第1の溶剤が薬物溶剤であり、第2の溶剤が反溶剤であるものであった(ここでポリマーを溶解するか、またはブランク反溶剤、反溶剤%は最終混合物中に主要である>=70%)。図4は、この方法によりインサイチュでヒドロゲル内部に調製されたクルクミンの代表的な不定形態を示す。
【０１２０】
封入によるプロセス：ホットプレート上に固定されたガラスバイアル(vail) (40〜50℃)にN2またはArを継続的に吹き付け、飽和薬物溶液(薬物+最少体積の溶剤)を滴下様式で添加した。薬物溶液と熱いガラス表面の最初の接触により、溶剤はすぐに蒸発して薬物を有する不定形態が生じる。白色粉末形態の早く作製された不定形薬物をすぐに回収し、封入または投与単独または細胞での封入または単独での封入(方法1と同様に薬物およびヒドロゲルのみ)またはデバイスによる封入に進む。不定形%収率は>=70%である(いくつかの場合は自己結晶化のためであり、蒸発がどの程度速いかは溶剤による)。安定性の制限のための自己結晶化を回避するために、不定形ベースの製剤を植え込み前に新たに調製する。
【０１２１】
アルギン酸塩ヒドロゲル球/アルギン酸塩充填薬物、結晶または不定形の作製
社内でカスタマイズされた電気噴流系：電圧発生器、垂直シリンジポンプ(Harvard Apparatus)およびゲル化水浴槽によりアルギン酸塩ヒドロゲル球を作製した。電圧を、アルギン酸塩を分配するシリンジ針に連結し、ゲル化水浴容器に接地させた。0.9%食塩水(pH約7.4、浸透圧約290mOsm)に溶解した2.0%溶液の市販の滅菌アルギン酸塩(PRONOVA SLG20, NovaMatrix, Sandvika, Norway)により球を作製した。薬物製剤充填カプセルについて、薬物結晶または不定形態(両方不定形法)を溶解したアルギン酸塩に添加してよく混合し、第1の工程後に薬物ありまたはなしのアルギン酸塩を、250mLの滅菌BaCl2ゲル化溶液(20mM BaCl2、250mM D-マンニトール、25mM HEPES、pH約7.4、浸透圧約290mOsm)に架橋させる1。アルギン酸塩ヒドロゲル500μm直径微小球を、25Gの平坦な(blunt)針、5kVの電圧および200μl/分の流速で作製した。ゲル化の直後に、アルギン酸塩球をHEPESバッファ(25mM HEPES、1.2mM MgCl2×6H2O、4.7mM KCl、132mM NaCl2、pH約7.4、約290mOsm)で4回洗浄し、4℃で一晩保存した。植え込みの直前に、球をさらに2回0.9%の食塩水で洗浄した。作製したヒドロゲルの試料を、市販の供給業者(Charles River, Wilmington, MA)によるエンドトキシン試験に供し、結果は、SLG20ヒドロゲルは<0.05EU/mlのエンドトキシンレベル(検出可能限界未満)を含んだことを示した。
【０１２２】
結晶または不定形製剤を充填されたカプセルからのインビトロ薬物放出：
3つの異なる培地、通常食塩水-イソプロピルアルコール(10%)混合物、リン酸塩バッファ(pH7.4)中で、または0.1%w/vまたは03%w/vのいずれかのSDSを有するリン酸緩衝化食塩水(pH7.4)を用いた加速された条件について放出試験を行った。NS+10%のIPAでの放出試験は、37℃で2mlの培地中で行った。1.5mlの放出培地を、新しい培地である放出培地で完全に交換して試料採取を行った。試料採取の時点は6h、1、3、5、7、および次いで60日間の終了まで1週間毎であった。加速された条件(PBS+SDS)における放出について、同じ時点を続け、一方で吸い込み(sink)条件を達成するために20μlの薬物充填カプセルを2mlの放出培地中でインキュベートした。試料中の薬物濃度を、移動相を有するC-18カラム上の逆相HPLCによりまたはUV較正系を使用して測定した。アイソクラシー(isocratic)モードを0.5〜2ml/分の流速およびnmの異なる波形で設定して、20〜50μlの試料をHPLC系(水、LC-モジュール-I)に注射するかまたはUV分析した。0.05〜10μg/mlの濃度範囲において検量線を作成した。作成した検量線を使用して、異なる放出試料中の薬物濃度を計算した。
【０１２３】
ラット島単離、精製および封入
Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)の雄Sprague-Dawleyラット、体重約300グラムを島の回収に使用した。全てのラットは1:20のキシラジン(10mg/kg) 対 ケタミン(150mg/kg)の腹腔内注射により麻酔して、各注射の総量はラットの体重に応じて0.4ml〜0.5mlであった。Lacy and Kostianovskyにより記載されるように単離手術を行った2。簡潔に、胆管にカニューレを挿入し、RPMI 1640培地溶液中の0.15%のLiberase(研究等級、Roche)のインビボ注射により膵臓を膨張させた。縮小する動脈を切断してラットを屠殺し、膨張した膵臓器官を取り出し、全ての手術が終了するまで氷上の50ml円錐チューブ内で保持した。全てのチューブを37℃の水槽に入れて30分間消化し、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(HIFBS)を有する10〜15mlの冷M199培地を添加して軽く振盪することにより停止させた。消化された膵臓を前述と同じM199培地で2回洗浄し、450μmのふるいを通して濾過し、次いでHistopaque 1077 (Sigma)/M199培地勾配中で懸濁し、4℃、1,700RCFで遠心分離した。勾配中に形成された島の層の厚さに応じて、より高純度の島のためにこの工程を繰り返した。最終的に、勾配から島を回収し、連続6回の重力沈降によりさらに単離し、4分間の静置後各上清を廃棄した。精製された島を光学顕微鏡下でアリコートにより手動で計測し、次いで滅菌1Xリン酸緩衝化食塩水中で3回洗浄した。島は次いで、10% HIFBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを有するRPMI 1640中で1回洗浄し、さらなる使用のためにこの培地中で一晩培養した。
【０１２４】
封入の直前に、培養した島を1,400rpmで1分間遠心分離して、Ca非含有Krebs-Henseleit (KH)バッファ(4.7mM KCl、25mM HEPES、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4×7H2O、135mM NaCl、pH約7.4、約290mOsm)で洗浄した。洗浄後、島を再度遠心分離し、全ての上清を吸い取った。次いで島のペレットを、1.0mlアルギン酸塩溶液当たり1,000島の島密度で0.9% NaCl溶液に溶解した2.0%溶液のSLG20アルギン酸塩に再懸濁した。BaCl2ゲル化溶液を使用して球を架橋して、空の球(上述)と同様の手順を使用してそれらのサイズを制御した。架橋の直後、封入された島をHEPESバッファで4回および10% HIFBSを有するRPMI培地1640で2回洗浄し、移植のために37℃で一晩培養した。島が異なるサイズ(50〜400μm)を有し、封入プロセスの間に島の避けられない消失があるので、移植の前に、封入された島の総数を再度計測し、以前に公開された方法(Ricordi, C. et al. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta 18 Diabetol. Lat. 27, 185195 (1990))に基づいて、島の等量(IE、150μmのサイズに標準化)に換算した。
【０１２５】
植え込み/移植手術
全ての動物プロトコルは、MITの動物管理委員会により承認され、全ての手術手順および術後管理はMITのDivision of Comparative Medicine獣医学スタッフにより監督された。免疫コンピテント雄非糖尿病またはSTZ誘導糖尿病のC57BL/6マウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を、酸素中3%イソフルランで麻酔し、腹部の毛を剃り、ベタダイン(betadine)およびイソプロパノールを使用して滅菌した。手術前に、全てのマウスは、0.05mg/kg用量のブプレノルフィンを手術前鎮痛剤として皮下に受け、加えて0.3mLの0.9%食塩水を皮下に受け脱水を防いだ。腹部の正中線に沿って0.5mmの切開を行い、平坦な切開を使用して腹膜線を暴露した。次いでピンセットで腹膜壁をつかみ、白線に沿って0.5〜1mmの切開を行った。球の所望の体積(島を有さない全ての物質、およびラットの島を封入するSLG20球)を滅菌ピペットに充填して、切開を通して腹腔に植え込んだ。次いで、5〜0先細り先端ポリジオキサノン(PDS II)吸収性縫合糸を使用して切開を閉じた。次いで、創傷クリップおよび組織糊(tissue glue)を使用して切開上の皮膚を閉じた。
【０１２６】
非ヒト霊長類(NHP)手順について、ブプレノルフィン(0.01〜0.03mg/kg)を手術前鎮痛剤として投与した。次いで、さらなる鎮静が必要な場合はDCM vet staffに指示されるようにミダゾラムを添加したケタミン(10mg/kg)の筋内(IM)注射を使用してNHPに鎮静剤投与した。体温を維持するために手術の間に、動物を循環温水ブランケット上に維持し、タオルで包んだ。0.5または1.5mmのいずれかの直径(薬物充填)のSLG20球を最小侵襲腹腔鏡検査法により植え込み、4匹の非ヒト霊長類(カニクイザル)の背側(背中)領域に、注射時の生体物質の切断を防ぐために、先端が滑るシリンジを用いて18および12ゲージのカスタム製造された(Harvard Apparatus)滅菌ステンレス鋼針を使用して注射した。実際の物質応答の部位と注射を分離するために、針は、NHPの背中にわずかに触れる程度に針を挿入して、最初の注射部位から約1〜2cm離して滑り込ませた(中に進ませた)。球(0.5および1.5mmの直径)を4匹の非ヒト霊長類の脇腹上の合計4点に注射した：0.5mmおよび1.5mmのそれぞれの直径の球の植え込みのために脇腹の左に2点および右に2点。
【０１２７】
血糖モニタリング
インスリン依存性糖尿病マウスを作製するために、MITへの輸送の前に、健常なC57BL/6マウスを供給業者(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)によりストレプトゾシン(STZ)で処理した。全てのマウスの血糖レベルを移植前に再試験した。非絶食時血糖レベルが2日連続で300mg/dLを超えたマウスのみを糖尿病とみなし、移植に供した。
【０１２８】
血糖レベルは、島含有アルギン酸塩カプセルの移植後1週間に3回モニタリングした。ランセットを使用して尾静脈から小さな血液滴を回収し、市販のグルコメーター(Clarity One, Clarity Diagnostic Test Group, Boca Raton, FL)を使用して試験した。非絶食時血糖レベルが200mg/dL未満のマウスを正常血糖とみなした。全てのマウスが高血糖状態になるまでモニタリングを続け、その時点でマウスを安楽死させ、球を回収した。
【０１２９】
細胞、組織および物質の回収
(封入された島の)植え込みまたは移植後の所望の時点で、図に示されるように、CO2投与、続いて頸椎脱臼によりマウスを安楽死させた。ある例において、腹腔内洗浄を行い、遊離浮遊腹腔内免疫細胞をすすいで回収するために5mlの氷冷PBSを最初に注射した。次いで、ピンセットおよびハサミを使用して、腹部の皮膚および腹膜壁に沿って切開を作製し、腹腔内洗浄体積を、ピペットを用いて、新しい15mlファルコンチューブ(それぞれ5mlのRPMI細胞培養培地で調製)に移した。次いで、洗浄瓶の先端を腹腔内に挿入した。次いでKREBSバッファを使用して、回収のために全物質の球を腹部からペトリ皿に洗い流した。(腹腔内組織に直接線維症がある(fibrosed)場合)全ての球が洗い流されるか手動で回収されることを確実にした後、その後の処理および画像化のために球を50mLの円錐チューブに移した。腹腔内洗浄および球回収の後、残りの線維症腹腔内組織もその後のFACSおよび発現分析のために切り出した。
【０１３０】
非ヒト霊長類腹腔内および皮下回収について、物質が植え込まれた場合と同様に、NHPに再度、手術前鎮痛剤としてブプレノルフィン(0.01〜0.03mg/kg)を投与し、さらなる鎮静が必要な場合にはDCM vet staffに指示されるようにミダゾラムを有するケタミン(10mg/kg)のIM注射を使用して鎮静剤投与した。体温を維持するために、手術の間に、動物を再度循環温水ブランケット上に維持し、タオルで包んだ。次いで8mmの直径の生検パンチを使用して、植え込みの2および4週後に皮膚全体および皮下空間を試料採取した。生検パンチの後、回収部位を、単純な中断パターンの3-0ナイロンおよびVetBond(組織糊)を用いて閉じた。IP回収について、最小侵襲腹腔鏡検査手術も使用した(植え込み手順と同様)。
【０１３１】
回収された物質球の画像化
位相差画像化について、回収された物質を、Krebsバッファを使用して緩やかに洗浄し、Evos Xl顕微鏡(Advanced Microscopy Group)を使用して位相差顕微鏡検査のために35mmペトリ皿に移した。
【０１３２】
回収された物質の明視野画像化について、Krebsバッファを使用して試料を緩やかに洗浄し、Leica Stereoscopic顕微鏡を使用して明視野画像化のために35mmペトリ皿に移した。
【０１３３】
生/死島染色
LIVE/DEAD(登録商標)生存能力/細胞傷害性キット(Life technologies, Carlsbad CA; CA# L-3224)を製造業者の指示書に従って使用して、共封入した薬物製剤有りおよび無しの封入後の島の生存能力を評価した。
【０１３４】
共焦点免疫蛍光法
球に結合した免疫集団を決定するために免疫蛍光画像化を使用した。マウスから物質を回収し、4%パラホルムアルデヒドを使用して4℃で一晩固定した。試料は、次いでKREBSバッファで2回洗浄し、0.1% Triton X100溶液を使用して30分間浸透化させ、その後、1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用して1時間ブロッキングした。次いで、DAPI(500nM)、BSA中特異的マーカープローブ(1:200希釈)からなる免疫染色カクテル溶液中で球を1時間インキュベートした。染色後、球を0.1% Tween 20溶液で3回洗浄し、50%グリセロール溶液中に維持した。次いで球をガラス底ディッシュに移し、5および10X対物レンズを備えたLSM 700点走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Microscopy, Jena Germany)を使用して画像化した。得られた画像は、Photoshop (Adobe Inc. Seattle, WA)を使用して提示について線形に調整した。
【０１３５】
H&Eおよびマッソン三色染色のための組織学的処理
回収された物質を、4%パラホルムアルデヒドを使用して4℃で一晩固定した。固定後、アルギン酸塩球または回収された組織試料を、70%アルコールを使用して洗浄した。次いで物質を4℃カルシウム冷却Histogel (VWR, CA # 60872-486)と混合した。型で固めた後、パラフィン包埋についてブロックを処理し、標準的な組織学的方法に従って切片作製し、染色した。
【０１３６】
FACS分析
製造業者のプロトコルに従って緩やかにMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を使用して、新たに切り出した組織の一細胞懸濁物を調製した。パッシブPEB分離バッファ(1X PBS、pH7.2、0.5% BSAおよび2mM EDTA)中で一細胞懸濁物を調製し、懸濁物を70μmのフィルター(Cat. #22363548, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)に通した。この処理により、球に接着した細胞の大部分(>90%)を取り出した。全ての組織および物質試料由来の一細胞集団を、5mlの1X RBC溶解バッファ(Cat. #00-4333, eBioscience, San Diego, CA, USA)を用いて4℃で5分間赤血球溶解に供した。20mlの滅菌1X PBSを添加して反応を終了させた。残りの細胞を、4℃、300〜400gで遠心分離し、抗体インキュベーションのために最少体積(約50μl)のeBioscience染色バッファ(cat. #00-4222)に再懸濁した。次いで、全ての試料を、4℃で25分、暗所にて、細胞マーカーCD68に特異的な2つの蛍光標識されたモノクローナル抗体(試料当たり1μl(0.5μg)；CD68-Alexa647, Clone FA-11, Cat. #11-5931, BioLegend)、Ly-6G (Gr-1) (試料当たり1μl(0.5μg)；Ly-6G-Alexa-647, Clone RB6-8C5, Cat. #108418, BioLegend)、CD11b(試料当たり1μl(0.2μg)；またはCD11b-Alexa-488, Clone M1/70, Cat. #101217, BioLegend)により共染色した。α平滑筋アクチン(線維症)分析について、さらなる細胞アリコートも1%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1% triton X-100で浸透化させ、その後 Cy3-共役抗マウスαSMアクチン抗体(1:100) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)で染色した。次いで、2mlのeBioscienceフローサイトメトリー染色バッファ(cat. #00-4222, eBioscience)を添加して、試料を4℃で5分間、400〜500gで遠心分離した。吸い取りにより上清を除去し、この洗浄工程を染色バッファで2回以上繰り返した。3回目の洗浄後、それぞれの試料を、500μlのフローサイトメトリー染色バッファに再懸濁し、BD FACSCalibur (cat. #342975), BD Biosciences, San Jose, CA, USA)を使用する実際のFACS分析のために40μmのフィルター(Cat. #22363547, Fisher Scientific)に通した。適切なバックグラウンドおよびレーザー強度設定のために、染色しない単一抗体およびIgG(Alexa-488またはAlexa-647のいずれかで標識される、BioLegend)対照も行った。霊長類細胞染色のために、抗ヒトCD68 Alexa Fluor-647-共役抗体(Clone KP1, Cat. #sc-20060, Santa Cruz, Dallas, TX)を、上述のBioLegend(抗マウス/ヒト)CD11b-AF488抗体と組み合わせて使用した。
【０１３７】
NanoString分析
偽(mock)植え込み(偽(mock))対照のためまたは種々の薬物充填0.5mm直径アルギン酸塩球保有マウス(n=4/群)のためのRNAを、記載のように植え込み後の種々の時点で採取した組織試料から単離した。それぞれのRNAを定量して、適切な濃度(100ng/μl)に希釈し、次いで500ngのそれぞれの試料を、NanoStringの製造業者のプロトコルに従って、発明者らのカスタマイズされた多重遺伝子マウスマクロファージサブタイプパネルによる発現分析のために処理した。RNAレベル(絶対コピー数)をnCounter (NanoString Technologies Inc., Seattle, WA)定量後に得て、群の試料をnSolver分析ソフトウェア(NanoString Technologies Inc., Seattle, WA)を使用して分析した。
【０１３８】
統計分析
データは平均±SEMで表し、1時点当たりおよび1処理群当たりN=5マウスである。ラット試験について、1処理当たりN=3である。これらの試料サイズは以前の文献に基づいて選択した。全ての動物は、予見できなかった病気または罹患率の例を除いて分析に含まれた。動物コホートは無作為的に選択した。試験するものは、行われる実験について盲検ではなかった。qPCRまたはFACSについて、データは、GraphPad Prism 5に示されるように、そうではないと示されなければ、非対称両側t検定、またはBonferroni多重比較補正による一元配置ANOVAのいずれかにより、統計的有意差について解析した；*：p<0.05、**：p<0.001および***：p<0.0001。高出力NanoStringに基づく遺伝子発現解析データは、マクロファージのサブタイプおよび区画に基づく組に分けた。NanoString陽性対照の幾何学的平均を使用してデータを標準化し、バックグラウンドレベルは、陰性対照の平均を使用して確立した。ハウスキーピング遺伝子Tubb5、Hprt1、BactおよびCltcを使用して試料間を標準化した。次いでデータを対数変換した。それぞれのサブタイプ、時間および区画の群について、遺伝子に対するサイズブロッキングの効果のための二元配置ANOVAを行った。Tukeyの正当有意差検定(Honest Significant Difference test)を使用して行ったペアワイズ比較からP値をコンピューター計算し、Bonferroni補正を使用して全体のエラー割合を調整した。
【０１３９】
qPCR分析
切り出しの直後に液体窒素で瞬時に凍結した線維症の球(存在する場合は、組織および免疫過剰成長が接着する)から、製造業者の指示書に従ってTRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、全RNAを単離した。また、完全な組織破砕を確実にすることを補助するために、本発明者らは、Polytronホモジナイザーによる強力な機械的破砕も使用した。したがって、全体的に示される遺伝子発現サインは、回収された物質上および/またはその周囲に存在する全細胞集団に比例し、該集団を示す。High Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(Cat. #4368814; Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用した逆転写の前に、それぞれの試料について20μlの体積中に同じ入力の1μg総RNAを負荷することにより、比較のために、全ての試料を最初に標準化した。16μlの総体積(SYBR GreenおよびPCRプライマーを含む)中のcDNA(4.8μl；1:20希釈)を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してqPCRにより増幅した。Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)を使用して、マウス(5’-GAAATCCACCAAAGCTCACG-3’(配列番号：1)；リバース：5’-CGGGTTCCGCTGTGTAAG-3’(配列番号：2))およびラット(5’-CTCTCGTGCCATGTGAACC-3’(配列番号：3)；リバース：5’-TTCTCTAAATTGGTCCCAGGAA-3’(配列番号：4))Pdx1プライマーを設計し、種ラット(封入された島)またはマウス(宿主)特異性を確実にするためにLaserGeneソフトウェア(DNAStar, Madison, WI, USA)を使用して評価し、マウス(5’-GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTT-3’(配列番号：5)；リバース：5’-CGGAGCCGTTGTCGACGACC-3’(配列番号：6))およびラット(5’-ACCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3’(配列番号：7)；リバース：5’-CGGAGCCGTTGTCGACGACG-3’(配列番号：8))ベータアクチンのそれぞれについて標準化した。試料を95℃で10分間インキュベートし、次いで95℃で15秒および60℃で1分の40サイクルをABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)中で行った。比較CT (ΔΔCT)法を製造業者により記載されるように使用して結果を分析した。比較CT (ΔΔCT)法を使用して結果を分析し、それぞれの試料のβアクチンRNA含有量に対する標準化の後に図の説明に特定される対照細胞試料と比較して、相対RNAレベルとして示した。適切な標準化および複数の回収時点を通しての試料の取り扱いをさらに確実にするために、全ての試料についてのRNAを定量し、逆転写し、並行してqPCRにより分析した。
【０１４０】
LCMSおよび血漿試料
使用したLCポンプはCTC Pal Autosamplerを備えたAgilent 1290 Infinity Binaryポンプである。MSはSciex API6500トリプルクワッド(triple quad)である。試料保存条件：-80℃。試料処理抽出体積：10μL。抽出方法：タンパク質沈殿。例えば、GW2580血漿濃度分析：試料抽出手順：1. 10μLの較正標準、品質対照、ブランクおよび試料を96ウェルプレートに等分した。2. 60μLのIS-SS(内部標準)(アセトニトリル中、100ng/mL QNZ、カルブタミド(carbutamide)、クリシン、カルバマゼピン(carbamazepine)、グラフェニン(glafenine)、デキサメタゾン、グリブリド(glyburide)およびd4AEA)を、二重ブランクを除き全ての試料に添加した。次いで60μLのアセトニトリルを二重ブランクに添加した。3. プレートを覆い、試料を混合し、その後4℃で5分間約3000rpmで遠心分離した。4. 次いで50μLの上清を、液体ハンドラーを使用してきれいな96ウェルプレートに移した。5. 試料を100μLのMilliQ水で希釈し、プレートをもう一度覆い、数分間混合した後、試料を1.00〜2,500ng/mLでLC-MS/MSに注入した。LC条件：Water BEH C18、50x2.1mm、1.7um。実行温度：50℃。移動相A、95:5:0.1 (v:v:v) 水:アセトニトリル:蟻酸(1.2分)。移動相B、50:50:0.1 (v:v:v) メタノール:アセトニトリル:蟻酸(1.3分)。フロー：0.8mL/分。注入体積：2μL。MS条件：MS/MS：API-6500。イオン化方法：電子スプレー。陽/陰イオン：陽。分解：ユニット。供給源温度(℃)：550。遷移(m/z)：化合物ID：GW2580 367.0/245.1 Da. Int Std ID：QNZ 357.0/197.1 Da。データ分析：許容基準±20% (LLOQで±25%)、回帰型、線形(1/(x * x))、許容される曲線範囲1.00〜2,500ng/mL持越し0.00%。
【０１４１】
HPLC
二方向ポンプ(G1312A)、自動サンプラー(G1313A)、脱気および光ダイオード検出器(DAD, G1315A)を備えたAgilent LC 1100 Series (Agilent Technologies, CA, USA)により検量線を得た。LCについての系制御、データ処理およびデータ取得のためにChemstationを使用した。分析用Waters Atlantis T3 C18カラム(5μm、4.6x250mm)によりクロマトグラフ分離を達成した。カラムおよび自動サンプラーの温度を20℃に維持した。
【０１４２】
ジメチルスルホキシド(DMSO)中、10mg/mlの標的濃度でGW2580のストック溶液を調製し、DMSO中で適切な希釈を行い、GW2580の検量線について標準(0.25〜2500μg/ml)を調製した。10μlの標準溶液を注入し、1ml/分の一定流速で水中(A)アセトニトリルおよび(B)0.1%蟻酸を使用して勾配モードにより分析物を溶出した。移動相の勾配条件は以下のとおりである：0分10% A、10分95% A、14分95% A、16分10% A、20分10% A。
【０１４３】
ジメチルスルホキシド(DMSO)中、10mg/mlの標的濃度でクルクミンのストック溶液を調製し、DMSO中で適切な希釈を行って、クルクミンの検量線について標準(0.05〜500μg/ml)を調製した。10μlの標準溶液を注入し、1ml/分の一定流速で水中(A)アセトニトリルおよび(B)0.1%蟻酸を使用して勾配モードにより分析物を溶出した。移動相の勾配条件は以下の通りであった：0分70% A、4分95% A、10分95% A、12分70% A、17分10% A。
【０１４４】
10mg/mlの標的濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)中にQNZのストック溶液を調製し、DMSO中で適切な希釈を行い、QNZの検量線について標準(0.06〜125μg/ml)を調製した。50μlの標準溶液を注入し、1ml/分の一定流速で水中(A)アセトニトリルおよび(B)0.1%蟻酸を使用した勾配モードにより分析物を溶出した。移動相の勾配条件は以下の通りであった：0分20% A、8分95% A、12分95% A、13分20% A、17分20% A。
【０１４５】
10mg/mlの標的濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)中にLY2157299のストック溶液を調製し、DMSO中で適切な希釈を行い、LY2157299の検量線について標準(0.06〜250μg/ml)を調製した。50μlの標準溶液を注入し、1ml/分の一定流速で水中(A)アセトニトリルおよび(B)0.1%蟻酸を使用して勾配モードにより分析物を溶出した。移動相の勾配条件は以下の通りであった：0分10% A、7分60% A、8分95% A、12分95% A、13分10% A、17分10% A。
【０１４６】
10mg/mlの標的濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)中にKI20227のストック溶液を調製し、DMSO中で適切な希釈を行い、KI120227の検量線について標準(0.06〜500μg/ml)を調製した。50μlの標準溶液を注入し、1ml/分の一定流速で水中(A)アセトニトリルおよび(B)0.1%蟻酸を使用して勾配モードにより分析物を溶出した。移動相の勾配条件は以下の通りであった：0分20% A、7分75% A、8分95% A、12分95% A、13分20% A、17分20% A。
【０１４７】
10mg/mlの標的濃度でエタノール中にデキサメタゾンのストック溶液を調製し、エタノール中で適切な希釈を行い、デキサメタゾンの検量線について標準(0.06〜500μg/ml)を調製した。50μlの標準溶液を注入し、1ml/分の一定流速で水中(A)アセトニトリルおよび(B)0.1%蟻酸を使用して勾配モードにより分析物を溶出した。移動相の勾配条件は以下の通りであった：0分50% A、7分80% A、8分95% A、12分95% A、13分50% A、17分50% A。
【０１４８】
単結晶および粉末X線回析(SXRDおよびPXRD)
SXRD - IμSマイクロ供給源からCu Kα放射線(λ=1.54178Å)またはMo Kα放射線(λ=1 0.71073Å)を使用して、Bruker APEX2 CCD検出器に連結されたBruker-AXS X8 Kappa回析機上、100Kで解析データ(φ-およびω-スキャン)を収集した。プログラムSAINT [Bruker (2011). SAINT, Bruker-AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA]によりデータ換算を行い、プログラムSADABS [Krause, L., Herbst-Irmer, R., Sheldrick, G. M. & Stalke, D., J. Appl. Cryst. 2015, 48, 3-10.]により等量に基づいた半経験的吸収補正を行った。プログラムSHELXT [Sheldrick, G. M., Acta Cryst. 2015, A71, 3-8] を使用した双対空間法により構造を解明し、確立された精密化技術 [Mueller, P., Crystallography Reviews 2009, 15, 57-83]を使用して、SHELXL [Sheldrick, G. M., Acta Cryst. 2015, A71, 3-8.]により全てのデータについてF2に対して精密化した。全ての非水素原子は異方的に(anisotropically)精密化した。全ての炭素結合水素原子は、幾何学的に計算された位置に配置し、それらのUisoを、それらが結合する原子のUeqの1.2倍に拘束しながら(メチル基については1.5倍)、ライディングモデル(riding model)を使用して精密化した。窒素または酸素に結合した水素原子配位は、差フーリエ合成から得、次いでこれらの水素原子は、それらのUisoを、窒素のUeqの1.2倍または酸素のUeqの1.5倍のそれぞれに拘束しながら、距離の再拘束(distance restraints)の補助により半自由的に(semi-freely)に精密化した(標的値、O-H距離について0.84(2)ÅおよびN-H距離について0.91(2))。不規則さ(Disorder)は、1〜2および1〜3の距離およびずれ(displacement)パラメーター上の類似性再拘束ならびに異方性ずれパラメーターについての強い(rigid)結合の再拘束の補助により精密化した。
【０１４９】
PXRD - IμSマイクロ供給源からCu Kα放射線(λ=1.54178Å)を使用して、Bruker APEX2 CCD検出器に連結されたBruker-AXS X8 Kappa回析機上、100Kで粉末解析データを収集した。粉末試料はデータ収集の間にその軸の周囲を回転するポリイミドキャピラリー中で維持した。
【０１５０】
環境制御走査電子顕微鏡(ESEM)
結晶形態、構造(topography)およびサイズをESEMにより試験した。試料を導電性炭素紙に置き、スパッタリング蒸着装置(Polarone E5100)を使用して厚さ約10nmまで金でコーティングした。その後、2〜15KVの加速電圧で、走査電子顕微鏡検査(FEI E-SEM Quanta 2000)を使用して結晶を画像化した。それぞれの試験された調製について画像当たり10回のランダム測定を収集するために、それぞれ3枚の画像を有する3つの試料を使用した。
【０１５１】
エクスサイチュ(ex situ)およびインサイチュ原子間力顕微鏡(AFM)
時間分解原子間力顕微鏡検査を使用して、分子レベルでの薬物放出の機構を試験した。空気中および溶液中のエクスサイチュおよびインサイチュ観察のために単結晶を調製して、薬物放出の支配的機構を同定し、結晶多形の間の速度を決定した。Asylum Research (Santa Barbara, CA)のCypher ES環境制御AFMを全ての実験に使用した。Cypher AFMについての密封された液体セルは、harsh 溶剤条件に適合性の物質を用いて特異的に設計される。このAFM は、環境制御、例えばモジュール試料段階(modular sample stage)による正確な温度制御により試料を探査する能力を提供する。この方法において、本発明者は、インサイチュの前のエクスサイチュ測定の際の周囲条件(T=25℃)において薬物放出をモニタリングし得、ここで本発明者は、溶液交換の際にはT=37℃に上昇して維持した。
【０１５２】
AFMのための結晶の結合  AFM測定は、エポキシ基板上に固定された多形1および2結晶を用いて行われた。Ted Pella 15mm金属ディスク上の部分的に硬化されたエポキシ(MasterBond EP21AOLV)の薄層を使用して単結晶を結合させた。エポキシは、静電的に帯電したピペットチップを使用して、結晶の蒸着の前に30分間、60℃で部分的に硬化させた。試料調製の1時間以内に、インサイチュ観察のために全ての結晶を使用した。
【０１５３】
インサイチュAFM画像収集：AFM画像は、32 kHzのタッピング周波数により、Olympus TR800PSAプローブ(窒化ケイ素プローブ、Cr/Auコート5/30、0.15N/mバネ接触)を使用して接触方式で収集した。画像サイズは、画像当たり256スキャンラインを有し2〜5Hzのスキャン速度により1〜10μmの範囲であった。データ分析および画像選択について、高さおよび偏向画像化形式を使用した。高さおよび偏向画像は、二次平面化(2nd order flattening)および画像コントラスト調整により処理した。ローパスなし、中位または2D高速フーリエ変換(FFT)フィルターをAFM画像のいずれかに適用した。
【０１５４】
薬物放出の機構のインサイチュモニタリング：本発明者が実験を行った同日に、単結晶を、上述のようにエポキシを使用してAFM試料パックに結合させた。試料をAFMスキャナ上に置き、これは最初25℃であった。溶液の導入の前に、T=25℃で(001)結晶表面のエクスサイチュ画像を収集した。これらのAFM画像から、結晶について上向きの(001)結晶学的な面上の結晶学的な方向を決定するために、結晶の端を同定した。
【０１５５】
AFM液体セルに試薬等級のリン酸バッファ溶液(PBS)を充填して、AFM液体セルに導入する前に周囲温度に合わせた。導入される際に溶液は十分に不飽和であった。不飽和PBSの導入の際に、温度をT=37℃に設定し、実験の間、一定のインサイチュ温度に維持した。溶液の導入、熱平衡が達成されるまでの加熱およびAFM片持ち梁(cantilever)の先端の表面との連結の間の時間を記録して、t0で示した。AFM画像を連続して収集し、不飽和溶液を交換して一定の不飽和度を維持した。それぞれの結晶表面の異なる領域、例えば基底(001)表面の端および中心を記録した。長時間のインサイチュAFM測定に伴って生じる固有のドリフトのために、本発明者は、より短い時間枠における表面の良く平衡化された画像を示す。これらは完全実験時間の代表的なものであり、ここで本発明者は、>10時間、いくつかの場合はインサイチュAFM観察については長い時間である36時間を超えて表面回転をモニタリングした。全ての画像は接触形式で収集し；本発明者は、接触形式でのスキャンは、それぞれの実験の終わりでのスキャンサイズを増加することおよびスキャンされた全体の面積における均一な変化を観察することにより、表面溶解に影響を有さないことを検証した。
【０１５６】
(001)表面上の負の工程速度νを測定することにより薬物放出の速度を測定した。工程の端の間のずれΔxは、連続AFM高さ形式画像の間に測定した。画像の間の時間を記録したので、式1
【数１】
2019513723.tif 000024
のように工程速度を定量するために使用し得る。
【０１５７】
結晶について、分子の放出の速度と比例するように薬物放出の速度を定量した。分子の放出の速度は、経時的な速度の積分、式2
【数２】
2019513723.tif 000025
(式中、結晶表面についてl=a=0.54nmであり、経時的な分子nの放出速度は式3、
【数３】
2019513723.tif 000026
で示されるようなものである)に比例する。
【０１５８】
それぞれの結晶サイズおよび多形についての20よりも大きい独立した工程を測定した。これから、負の速度およびその後、分子が放出される速度を決定した。エラーバーは、それぞれの結晶表面について放出される分子の全ての数であった。計算された分子の放出速度を合計して、異なる薬物結晶が同等であるように不飽和PBS溶液中の時間の関数として薬物放出の累積速度を示した。
【０１５９】
GW2580の多形の調製
本発明の遅延放出結晶(表面放出)法を使用して、GW2580の多形を調製した： 0.001mg/mL〜5000mg/mLの範囲のGW2580の濃度による溶剤：反溶剤混合法を使用して、一定温度(20〜30℃)で結晶を成長させ、ここで反溶剤は部分的に添加した。溶剤として酢酸エチルを使用し、反溶剤としてヘキサンを使用した。例えば、5mgのGW2580は最初に、2〜80mlの酢酸エチル(例えば3ml、35ml、70ml)に溶解した。いくつかの結晶化実験において、溶剤溶液を15分まで超音波処理しおよび/または20〜80℃の範囲で予め加熱して、溶解を容易にした。該溶液に、部分的に、5mgの溶解したGW2580当たり0〜100mlの範囲に適合するように(例えば約20ml、約30ml、約70ml)、所望の最終的な平均結晶サイズに応じてヘキサンを添加した。次いで、得られた混合物を安定な温度、すなわち20〜30℃でインキュベートした。それぞれの場合に10個のランダムサイズ測定が得られるように、調製当たり少なくとも3試料画像について、SEM分析などの顕微鏡検査法により得られた結晶を分析した。結晶性試料もXRDにより分析した。
【０１６０】
GW2580の多形のSXRDおよびPXRD
SXRD - IμSマイクロ供給源からCu Kα放射線(λ=1.54178Å)またはMo Kα放射線(λ=1 0.71073Å)を使用して、Bruker APEX2 CCD検出器に連結されたBruker-AXS X8 Kappa回析機上、100Kで、回析データ(φ-およびω-スキャン)を収集した。プログラムSAINT (Bruker (2011). SAINT, Bruker-AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA) によりデータ換算を行い、プログラムSADABSにより等量に基づいて半経験的吸収補正を行った。プログラムSHELXTを使用した双対空間法により構造を解明し、良好に確立された精密化技術を使用して、SHELXLにより全てのデータについてF2に対して精密化した。全ての非水素原子は異方的に精密化した。全ての炭素結合水素原子は、幾何学的に計算された位置に配置し、それらのUisoを、それらが結合する原子のUeqの1.2倍に拘束しながら(メチル基については1.5倍)、ライディングモデルを使用して精密化した。窒素または酸素に結合した水素原子の配位は、差フーリエから得、次いでこれらの水素原子は、それらのUisoを、窒素のUeqの1.2倍または酸素のUeqの1.5倍のそれぞれに拘束しながら、距離の再拘束の補助により半自由的に精密化した(標的値、O-H距離について0.84(2)ÅおよびN-H距離について0.91(2))。不規則さは、1〜2および1〜3の距離およびずれパラメーター上の類似性再拘束ならびに異方性ずれパラメーターについての強い結合の再拘束の補助により精密化した。SXRDデータおよびGW2580結晶について得られた統計を図20Aおよび以下の表2に示す。
【０１６１】
【表２】
2019513723.tif 000027
【０１６２】
PXRD - IμSマイクロ供給源からCu Kα放射線(λ=1.54178Å)を使用して、Bruker APEX2 CCD検出器に連結されたBruker-AXS X8 Kappa回析機上、100Kで粉末回析データを収集した。粉末試料はデータ収集の間にその軸の周囲を回転するポリイミドキャピラリー中に維持した。GW2580についてのPXRDパターンを図20Cに示し、対応するピークを以下の表3に列挙する。
【０１６３】
【表３】
2019513723.tif 000028
【図１】
2019513723.tif 000060
【図２】
2019513723.tif 000061
【図３】
2019513723.tif 000062
【図４】
2019513723.tif 000063
【図５】
2019513723.tif 000064
【図６】
2019513723.tif 000065
【図７】
2019513723.tif 000066
【図８】
2019513723.tif 000067
【図９】
2019513723.tif 000068
【図１０】
2019513723.tif 000069
【図１１】
2019513723.tif 000070
【図１２】
2019513723.tif 000071
【図１３Ａ−Ｂ】
2019513723.tif 000072
【図１３Ｃ】
2019513723.tif 000073
【図１４】
2019513723.tif 000074
【図１５】
2019513723.tif 000075
【図１６】
2019513723.tif 000076
【図１７Ａ−Ｃ】
2019513723.tif 000077
【図１７Ｄ−Ｇ】
2019513723.tif 000078
【図１８Ａ】
2019513723.tif 000079
【図１８Ｂ】
2019513723.tif 000080
【図１８Ｃ】
2019513723.tif 000081
【図１９】
2019513723.tif 000082
【図２０Ａ】
2019513723.tif 000083
【図２０Ｂ】
2019513723.tif 000084
【図２０Ｃ】
2019513723.tif 000085
【図２１Ａ−Ｂ】
2019513723.tif 000086
【図２１Ｃ】
2019513723.tif 000087
【図２１Ｄ】
2019513723.tif 000088
【図２１Ｅ】
2019513723.tif 000089
【図２２Ａ】
2019513723.tif 000090
【図２２Ｂ−Ｃ】
2019513723.tif 000091
【図２２Ｄ−Ｅ】
2019513723.tif 000092
【図２３】
2019513723.tif 000093
【図２４】
2019513723.tif 000094
【図２５】
2019513723.tif 000095
【配列表】
2019513723000001.app
【国際調査報告】
2019513723.tif 000096
2019513723.tif 000097
2019513723.tif 000098
2019513723.tif 000099
2019513723.tif 000100
2019513723.tif 000101