(57)【要約】  Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）タンパク質と結合する抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。治療用途、例えば、がんの処置における、これらの抗体またはその抗原結合部分の使用もまた、提供される。抗体またはその抗原結合部分を産生する細胞、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖領域をコードするポリヌクレオチド、ならびに抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、さらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）と結合する、単離された抗体（例えば、ヒト抗体）またはその抗原結合部分であって、以下の特性：
（ａ）可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（ｂ）膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（ｃ）Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、ならびに適宜
（ｄ）可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、および
（ｅ）膜カニクイザルＴＩＭ３と結合すること
を示す、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
抗体が、抗腫瘍免疫応答を刺激する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
抗体が、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
抗体が、ＴＩＭ３を発現するＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
抗体が、Ｔ細胞増殖を増大させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
抗体が、Ｆｃ受容体と結合しないか、または抗体が、エフェクター機能を欠く、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、１００ｎＭ以下のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
抗体が、ＴＩＭ３による負の細胞（例えば、Ｔ細胞）シグナル伝達を阻害するアンタゴニスト抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
抗体が、フローサイトメトリーによって測定される場合、０.１または１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
抗体が、スキャッチャード解析によって測定される場合、１ｎＭ以下のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
抗体が、フローサイトメトリーによって測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合するか、または抗体が、スキャッチャード解析によって測定される場合、１ｎＭ以下のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
抗体またはその抗原結合部分が、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、重鎖ＣＤＲ３が、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８または配列番号１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
重鎖ＣＤＲ１が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｙ、Ｘ５およびＸ６を含み、Ｘ１が、Ｓまたは不在であり、Ｘ２が、Ｒまたは不在であり、Ｘ３が、Ｓ、ＲまたはＤであり、Ｘ４が、ＹまたはＨであり、Ｘ５が、ＷまたはＭであり、Ｘ６が、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＨである、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
重鎖ＣＤＲ１が、Ｘ１、Ｙ、Ｙ、ＭおよびＸ２を含み、Ｘ１が、ＳまたはＤであり、Ｘ２が、ＨまたはＳである、請求項１３または１４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
重鎖ＣＤＲ１が、Ｒ、Ｘ１、Ｙ、ＷおよびＸ２を含み、Ｘ１が、ＨまたはＹであり、Ｘ２が、ＮまたはＳである、請求項１３または１４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
重鎖ＣＤＲ２が、Ｘ１、Ｉ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｇ、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｙ、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３およびＸ１４を含み、Ｘ１が、Ｓ、Ｙ、ＩまたはＦであり、Ｘ２が、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＳであり、Ｘ３が、Ｙ、Ｐ、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＧであり、Ｘ５が、Ｆ、ＳまたはＤであり、Ｘ６が、Ｓ、ＴまたはＩであり、Ｘ７が、Ｉまたは不在であり、Ｘ８が、Ｙ、ＮまたはＩであり、Ｘ９が、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＡであり、Ｘ１０が、Ｐ、Ｓ、ＱまたはＤであり、Ｘ１１が、ＳまたはＫであり、Ｘ１２が、Ｌ、ＦまたはＶであり、Ｘ１３が、ＫまたはＱであり、Ｘ１４が、ＳまたはＧである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
重鎖ＣＤＲ２が、Ｙ、Ｉ、Ｈ、Ｙ、Ｘ１、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、Ｎ、Ｘ２、Ｓ、Ｌ、ＫおよびＳを含み、Ｘ１が、ＳまたはＴであり、Ｘ２が、ＳまたはＰである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
重鎖ＣＤＲ２が、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｘ１、Ｘ２、Ｇ、Ｓ、Ｘ３、Ｉ、Ｙ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｓ、Ｖ、ＫおよびＧを含み、Ｘ１が、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ２が、ＧまたはＳであり、Ｘ３が、ＴまたはＩである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
重鎖ＣＤＲ２が、Ｉ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｉ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｆ、ＱおよびＧを含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号６４または配列番号６５を含む、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号６６または配列番号６７を含む、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７１を含む、請求項１３から２２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
抗体またはその抗原結合部分が、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択され、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５からなる群から選択され、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８および配列番号１２９からなる群から選択され、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号６４または配列番号６５を含み、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号６６または配列番号６７を含み、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７１を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
ヒトＴＩＭ３と結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ１）それぞれ配列番号４１、４６、５３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ２）それぞれ配列番号４１、１２２、５３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ３）それぞれ配列番号４１、１２３、５３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ４）それぞれ配列番号４１、１２４、５３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ５）それぞれ配列番号４１、４６、１２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ６）それぞれ配列番号４１、４６、１２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ７）それぞれ配列番号４１、４６、１２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ８）それぞれ配列番号４１、４６、１２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ９）それぞれ配列番号４１、１２２、１２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ａ１０）それぞれ配列番号４１、１２２、１２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ｂ１）それぞれ配列番号４２、４７、５４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ｂ２）それぞれ配列番号４２、１２５、５４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号６４、６６、６９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、
（ｃ）それぞれ配列番号４３、４８および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ配列番号４４、４９および５６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｇ１）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６５、６７および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｇ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、７１を含む、
（ｇ３）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｈ）それぞれ配列番号４５、５１および５８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｉ）それぞれ配列番号４５、５２および５９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２６】
抗体が、それぞれ配列番号４１、４６および５３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
抗体が、それぞれ配列番号４２、４７および５４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２８】
抗体が、それぞれ配列番号４３、４８および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２９】
抗体が、それぞれ配列番号４４、４９および５６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３０】
抗体が、それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３１】
抗体が、それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３２】
抗体が、それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６５、６７および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３３】
抗体が、それぞれ配列番号４５、５１および５８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３４】
抗体が、それぞれ配列番号４５、５２および５９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
ヒトＴＩＭ３と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖可変領域が、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３６】
ヒトＴＩＭ３と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、軽鎖可変領域が、配列番号６０、６１、６２および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３７】
ヒトＴＩＭ３と結合し、ヒトＴＩＭ３との結合について、ＶＨおよびＶＬを含む参照抗体と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ＶＨおよびＶＬが、
（ａ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｅ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｆ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｇ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｈ）配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉ）配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｊ）それぞれ配列番号１２１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｋ）それぞれ配列番号１２０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｌ）それぞれ配列番号１１２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｍ）それぞれ配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｎ）それぞれ配列番号１１４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｏ）それぞれ配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｐ）それぞれ配列番号１１６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｑ）それぞれ配列番号１１７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｒ）それぞれ配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｓ）それぞれ配列番号１１９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに
（ｔ）それぞれ配列番号３６４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択される、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３８】
例えば本明細書において提供される１つまたは方法によって判定される場合、参照抗体と同一のエピトープにおいて、ＴＩＭ３と結合する、請求項３７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３９】
（ａ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｅ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｆ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｇ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｈ）配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉ）配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｊ）それぞれ配列番号１２１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｋ）それぞれ配列番号１２０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｌ）それぞれ配列番号１１２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｍ）それぞれ配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｎ）それぞれ配列番号１１４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｏ）それぞれ配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｐ）それぞれ配列番号１１６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｑ）それぞれ配列番号１１７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｒ）それぞれ配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｓ）それぞれ配列番号１１９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに
（ｔ）それぞれ配列番号３６４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４０】
配列番号３４、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９および配列番号３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４１】
配列番号３５または配列番号１２０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４２】
配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４３】
配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４４】
配列番号３８または配列番号１２１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６１、配列番号６３または配列番号６２記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４５】
配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４６】
配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３７または３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４７】
抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１から４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４８】
抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項４７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４９】
前体が、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、請求項４７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５０】
抗体またはその抗原結合部分が、以下の突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、ならびに適宜Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、請求項４９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５１】
配列番号２６３〜２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５２】
抗体またはその抗原結合部分が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１から５１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５３】
抗体が、
（ａ１）それぞれ配列番号３０１（もしくは３０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２）それぞれ配列番号１（もしくは８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３）それぞれ配列番号１５（もしくは２２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ４）それぞれ配列番号３０３（もしくは３０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ５）それぞれ配列番号７２（もしくは８２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ６）それぞれ配列番号９２（もしくは１０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ７）それぞれ配列番号３０５（もしくは３０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ８）それぞれ配列番号７３（もしくは８３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ９）それぞれ配列番号９３（もしくは１０３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１０）それぞれ配列番号３０７（もしくは３０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１１）それぞれ配列番号７４（もしくは８４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１２）それぞれ配列番号９４（もしくは１０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１３）それぞれ配列番号３０９（もしくは３１０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１４）それぞれ配列番号７５（もしくは８５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１５）それぞれ配列番号９５（もしくは１０５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１６）それぞれ配列番号３１１（もしくは３１２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１７）それぞれ配列番号７６（もしくは８６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１８）それぞれ配列番号９６（もしくは１０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１９）それぞれ配列番号３１３（もしくは３１４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２０）それぞれ配列番号７７（もしくは８７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２１）それぞれ配列番号９７（もしくは１０７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２２）それぞれ配列番号３１５（もしくは３１６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２３）それぞれ配列番号７８（もしくは８８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２４）それぞれ配列番号９８（もしくは１０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２５）それぞれ配列番号３１７（もしくは３１８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２６）それぞれ配列番号７９（もしくは８９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２７）それぞれ配列番号９９（もしくは１０９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２８）それぞれ配列番号３１９（もしくは３２０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２９）それぞれ配列番号３４９（もしくは３５０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３０）それぞれ配列番号３５１（もしくは３５２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３１）それぞれ配列番号３５３（もしくは３５４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ１）それぞれ配列番号３２１（もしくは３２２）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ２）それぞれ配列番号２（もしくは９）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ３）それぞれ配列番号１６（もしくは２３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ４）それぞれ配列番号３２３（もしくは３２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ５）それぞれ配列番号８０（もしくは９０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ６）それぞれ配列番号１００（もしくは１１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ７）それぞれ配列番号３２５（もしくは３２６）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ１）それぞれ配列番号３２７（もしくは３２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ２）それぞれ配列番号３（もしくは１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ３）それぞれ配列番号１７（もしくは２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ４）それぞれ配列番号３２９（もしくは３３０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ１）それぞれ配列番号３３１（もしくは３３２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ２）それぞれ配列番号４（もしくは１１）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ３）それぞれ配列番号１８（もしくは２５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ４）それぞれ配列番号３３３（もしくは３３４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.１）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３２を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.２）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.３）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３１を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ２）それぞれ配列番号５（もしくは１２）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ３）それぞれ配列番号１９（もしくは２６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ４）それぞれ配列番号３３７（もしくは３３８）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ５）それぞれ配列番号８１（もしくは９１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ６）それぞれ配列番号１０１（もしくは１１１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ７）それぞれ配列番号３３９（もしくは３４０）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ１）それぞれ配列番号３４１（もしくは３４２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ２）それぞれ配列番号６（もしくは１３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ３）それぞれ配列番号２０（もしくは２７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ４）それぞれ配列番号３４３（もしくは３４４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ１）それぞれ配列番号３４５（もしくは３４６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ２）それぞれ配列番号７（もしくは４３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ３）それぞれ配列番号２１（もしくは２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、または
（ｇ４）それぞれ配列番号３４７（もしくは３４８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列
を含み、抗体が、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する、請求項１から５２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５４】
抗体またはその抗原結合部分が、以下の特性：
（１）例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個またはすべてと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１つ以上を有する、請求項１から５３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５５】
第２の結合特異性を有する分子に連結された請求項１から５４のいずれか一項に記載の抗体を含む、二重特異性分子。
【請求項５６】
請求項１から５４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項５８】
請求項５７に記載の発現ベクターを用いて形質転換された、細胞。
【請求項５９】
薬剤に連結された請求項１から５４のいずれか一項に記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
【請求項６０】
請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、担体とを含む組成物。
【請求項６１】
請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、使用のための説明書とを含むキット。
【請求項６２】
抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、請求項５８に記載の細胞において、抗体またはその抗原結合部分を発現させることと、細胞から、抗体またはその抗原結合部分を単離することとを含む、方法。
【請求項６３】
抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞を、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【請求項６４】
エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法であって、エフェクターＴ細胞を、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートならびにＣＤ３と接触させ、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激されることを含む、方法。
【請求項６５】
Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させる方法であって、Ｔ細胞を、有効量の、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【請求項６６】
Ｔ細胞の増殖を増大させる方法であって、Ｔ細胞を、有効量の、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【請求項６７】
対象のＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させる方法であって、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生を増大させるために、有効量の、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項６８】
対象においてＴＩＬ活性を刺激する方法であって、対象に、治療有効量の、請求項１から５４のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、方法。
【請求項６９】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、対象において免疫応答が刺激されるように、対象に、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項７０】
対象が、腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が、刺激される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
対象において腫瘍の成長を阻害するか、または腫瘍のサイズを低減するための方法であって、対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項７２】
がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項１から５５および５９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与して、がんを処置することを含む、方法。
【請求項７３】
がんが、膀胱がん、乳がん、子宮がん／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、結腸直腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連のがんからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
がんが、転移性がん、難治性がんまたは再発性がんである、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
１以上の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項６７から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
追加の治療薬が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
サンプルにおけるＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）の存在を検出する方法であって、サンプルを、抗体またはその抗原結合部分とＴＩＭ３との間で複合体の形成を可能にする条件下で、請求項１から５４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分と接触させることと、複合体の形成を検出することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月１４日に出願された米国仮出願第６２／３６２,５４１号および２０１７年２月１５日に出願された同第６２／４５９,４９９号の優先権を主張し、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願とともに出願された、電子的に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表（名称：3338_052PC02_SeqListing.txt、サイズ：７７９,８３７バイト、および作成日：２０１７年７月１０日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られているＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）は、免疫応答の重要な制御因子としての機能を果たす、Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＴＩＭ３は、当初、活性化されたＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞（例えば、１型ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞）において同定され、ガレクチン−９と結合した後に、Ｔ細胞の死または疲弊を誘導することが示されていた。より最近の研究では、ＴＩＭ３の発現が、多くの先天的免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、肥満細胞およびナチュラルキラー細胞）の活性を制御することにも重要であることが示されている。Han G et al., Front Immunol. 4: 449 (2013)を参照のこと。
【０００４】
多くの阻害性受容体（例えば、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４）と同様に、ＴＩＭ３の発現は、がんを含む、多数の種類の慢性疾患と関連付けられている。ＴＩＭ３＋Ｔ細胞は、進行性黒色腫、非小細胞肺がん、または濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者において検出されている。そして、ＴＩＭ３＋制御性Ｔ細胞の存在は、肺がん進行の有効な指標しても示されている。Anderson AC. Cancer Immunol Res. 2: 393-8 (2014)を参照のこと。
【０００５】
ＴＩＭ３のいくつかの潜在的なリガンドが同定されている：ガレクチン−９、ＨＭＧＢ１、セマフォリン−４Ａ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＩＬＴ−４、およびホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒまたはＰＳ）。ＰＳは、重要な細胞膜成分であり、通常、細胞膜の内葉に局在化している。しかしながら、細胞がアポトーシスを受けると、ＰＳは、再分配され、外側の膜に露出される。この再分配は、多数の腫瘍細胞株においても観察されている。Riedl S et al., Biochim Biophys Acta. 1808: 2638-2645 (2011)を参照のこと。ＴＩＭ３のＰＳとの結合は、ファゴサイトーシスおよび交差提示に極めて重要であり得る。Nakayama M et al., Blood. 113: 3821-30 (2009)を参照のこと。
【０００６】
研究により、ＴＩＭ３と阻害性受容体ＰＤ−１との間の緊密な関係性が示されている。例えば、多くの腫瘍特異的Ｔ細胞は、ＰＤ−１およびＴＩＭ３の両方を発現し、これらのＴ細胞は、ＰＤ−１のみまたはＴＩＭ３のみを発現するＴ細胞と比較して、より機能不全であることが示されている。Fourcade J et al., J Exp Med. 207: 2175-2186 (2010)を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＴＩＭ３を標的とする薬剤およびそのような薬剤を使用する方法は、新しいがんの免疫療法を設計し、従来的ながんの免疫療法を改善するために高度に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＴＩＭ３と特異的に結合し、望ましい機能的特性を有する、単離された抗体、例えば、モノクローナル抗体、特に、ヒト（例えば、モノクローナル）抗体が、本明細書において提供される。これらの特性としては、例えば、ヒトＴＩＭ３と高親和性で結合すること、サルＴＩＭ３（例えば、カニクイザルＴＩＭ３）と結合すること、および免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を、例えば、腫瘍担持またはウイルス担持（ウイルス感染）対象において刺激する能力、ならびにサンプルにおけるＴＩＭ３タンパク質を検出することが挙げられる。
【０００９】
一態様では、ＴＩＭ３と結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性：
（ａ）可溶性および／もしくは膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（ｂ）可溶性および／もしくは膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（ｃ）免疫応答を誘導もしくは刺激すること、
（ｄ）Ｔ細胞活性化、例えば、Ｔｈ１細胞活性化（例えば、サイトカイン分泌および／もしくは増殖の増強によって明らかなように）を誘導もしくは刺激すること、
（ｅ）例えば、共培養アッセイ、例えば、実施例に記載されるものにおいて、Ｔ細胞増殖（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）を誘導もしくは刺激すること、
（ｆ）例えば、実施例に記載されるアッセイにおいて判定される場合、Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えば、ヒト腎臓、肺、膵臓もしくは乳がん腫瘍からのＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生を誘導もしくは刺激すること、
（ｇ）例えば、実施例に記載されるアッセイにおいて判定される場合、ヒトＴＩＭ３のＰｔｄＳｅｒとの結合を遮断もしくは阻害すること、
（ｈ）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行もしくは下方制御しないこと、
（ｉ）ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、もしくは（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）と結合すること、
（ｊ）例えば、実施例に記載されるアッセイにおいて判定される場合、本明細書に記載されるＴＩＭ３と結合する抗体（例えば、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、もしくはＴＩＭ３.２からＴＩＭ３.１８のいずれか）のヒトＴＩＭ３との結合と、競合するかまたはそれを交差遮断すること、
（ｋ）ヒトＴＩＭ３と結合するが、配列番号２８６（図２０）において番号付けされる場合、以下のアミノ酸残基：Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０の１つもしくは複数のアミノ酸置換を有するヒトＴＩＭ３とは結合しないこと、
（ｌ）ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）、および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合すること、
（ｍ）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個もしくは全てと相互作用する、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域を有すること、ならびに／または
（ｎ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の少なくとも１つを示す。
【００１０】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、抗腫瘍免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ＴＩＭ３を発現するＴ細胞におけるサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ）を増大させる、および／またはＴ細胞増殖を増大させる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ受容体と結合しない。
【００１１】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合し、スキャッチャード法によって測定される場合、１ｎＭ以下のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合し、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、１００ｎＭ以下のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合し、フローサイトメトリーによって測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合し、フローサイトメトリーによって測定される場合、０.１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合し、フローサイトメトリーによって測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合し、スキャッチャード法によって測定される場合、１ｎＭ以下のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ−３と結合する。
【００１２】
ヒトＴＩＭ３と結合し、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖ＣＤＲ３が、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８および配列番号１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１３】
特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｙ、Ｘ５およびＸ６を含み、ここで、Ｘ１は、Ｓまたは不在であり、Ｘ２は、Ｒまたは不在であり、Ｘ３は、Ｓ、ＲまたはＤであり、Ｘ４は、ＹまたはＨであり、Ｘ５は、ＷまたはＭであり、Ｘ６は、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＨである。他の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、Ｘ１、Ｙ、Ｙ、ＭおよびＸ２を含み、ここで、Ｘ１は、ＳまたはＤであり、Ｘ２は、ＨまたはＳである。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、Ｒ、Ｘ１、Ｙ、ＷおよびＸ２を含み、ここで、Ｘ１は、ＨまたはＹであり、Ｘ２は、ＮまたはＳである。
【００１４】
一実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、Ｘ１、Ｉ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｇ、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｙ、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３およびＸ１４を含み、ここで、Ｘ１は、Ｓ、Ｙ、ＩまたはＦであり、Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＳであり、Ｘ３は、Ｙ、Ｐ、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｆ、ＳまたはＤであり、Ｘ６は、Ｓ、ＴまたはＩであり、Ｘ７は、Ｉまたは不在であり、Ｘ８は、Ｙ、ＮまたはＩであり、Ｘ９は、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＡであり、Ｘ１０は、Ｐ、Ｓ、ＱまたはＤであり、Ｘ１１は、ＳまたはＫであり、Ｘ１２は、Ｌ、ＦまたはＶであり、Ｘ１３は、ＫまたはＱであり、Ｘ１４は、ＳまたはＧである。別の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、Ｙ、Ｉ、Ｈ、Ｙ、Ｘ１、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｙ、Ｎ、Ｘ２、Ｓ、Ｌ、ＫおよびＳを含み、ここで、Ｘ１は、ＳまたはＴであり、Ｘ２は、ＳまたはＰである。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｘ１、Ｘ２、Ｇ、Ｓ、Ｘ３、Ｉ、Ｙ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｓ、Ｖ、ＫおよびＧを含み、ここで、Ｘ１は、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ２は、ＧまたはＳであり、Ｘ３は、ＴまたはＩである。他の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、Ｉ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｉ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｆ、ＱおよびＧを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、配列番号６４もしくは配列番号６５を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６６もしくは配列番号６７を含む軽鎖ＣＤＲ２および／または配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０もしくは配列番号７１を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１６】
ヒトＴＩＭ３と結合し、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択され、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５からなる群から選択され、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８および配列番号１２９からなる群から選択され、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号６４または配列番号６５を含み、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号６６または配列番号６７を含み、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７１を含む、
単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１７】
ヒトＴＩＭ３と結合し、
（ａ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２２、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ３）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２３、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ４）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２４、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ５）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ６）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ７）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ８）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ９）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２２、１２８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ１０）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２２、１２６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ｂ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４２、４７、５４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｂ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４２、１２５、５４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｃ）それぞれ配列番号４３、４８および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ配列番号４４、４９および５６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｇ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６５、６７および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｈ）それぞれ配列番号４５、５１および５８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｉ）それぞれ配列番号４５、５２および５９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、
単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１８】
ヒトＴＩＭ３と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖可変領域が、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、ならびに／または軽鎖可変領域が、配列番号６０、６１、６２および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１９】
ヒトＴＩＭ３と結合し、ヒトＴＩＭ３との結合について、ＶＨおよびＶＬを含む参照抗体と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ＶＨおよびＶＬが、
（ａ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｅ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｆ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｇ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｈ）配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉ）配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｊ）それぞれ配列番号１２１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｋ）それぞれ配列番号１２０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｌ）それぞれ配列番号１１２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｍ）それぞれ配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｎ）それぞれ配列番号１１４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｏ）それぞれ配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｐ）それぞれ配列番号１１６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｑ）それぞれ配列番号１１７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｒ）それぞれ配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｓ）それぞれ配列番号１１９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに
（ｔ）それぞれ配列番号３６４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択される、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００２０】
一実施形態では、単離された抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、参照抗体と同一のエピトープにおいて、ＴＩＭ３と結合する。
【００２１】
他の実施形態では、単離された抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｅ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｆ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｇ）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｈ）配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉ）配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｊ）それぞれ配列番号１２１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｋ）それぞれ配列番号１２０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｌ）それぞれ配列番号１１２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｍ）それぞれ配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｎ）それぞれ配列番号１１４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｏ）それぞれ配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｐ）それぞれ配列番号１１６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｑ）それぞれ配列番号１１７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｒ）それぞれ配列番号１１８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｓ）それぞれ配列番号１１９に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに
（ｔ）それぞれ配列番号３６４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ
からなる群から選択される、ＶＨおよびＶＬを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、以下の突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、ならびに適宜Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む。他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１３０〜１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【００２３】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合し、
（ａ１）それぞれ配列番号３０１（もしくは３０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２）それぞれ配列番号１（もしくは８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３）それぞれ配列番号１５（もしくは２２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ４）それぞれ配列番号３０３（もしくは３０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ５）それぞれ配列番号７２（もしくは８２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ６）それぞれ配列番号９２（もしくは１０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ７）それぞれ配列番号３０５（もしくは３０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ８）それぞれ配列番号７３（もしくは８３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ９）それぞれ配列番号９３（もしくは１０３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１０）それぞれ配列番号３０７（もしくは３０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１１）それぞれ配列番号７４（もしくは８４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１２）それぞれ配列番号９４（もしくは１０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１３）それぞれ配列番号３０９（もしくは３１０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１４）それぞれ配列番号７５（もしくは８５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１５）それぞれ配列番号９５（もしくは１０５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１６）それぞれ配列番号３１１（もしくは３１２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１７）それぞれ配列番号７６（もしくは８６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１８）それぞれ配列番号９６（もしくは１０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１９）それぞれ配列番号３１３（もしくは３１４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２０）それぞれ配列番号７７（もしくは８７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２１）それぞれ配列番号９７（もしくは１０７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２２）それぞれ配列番号３１５（もしくは３１６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２３）それぞれ配列番号７８（もしくは８８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２４）それぞれ配列番号９８（もしくは１０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２５）それぞれ配列番号３１７（もしくは３１８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２６）それぞれ配列番号７９（もしくは８９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２７）それぞれ配列番号９９（もしくは１０９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２８）それぞれ配列番号３１９（もしくは３２０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２９）それぞれ配列番号３４９（もしくは３５０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３０）それぞれ配列番号３５１（もしくは３５２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３１）それぞれ配列番号３５３（もしくは３５４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ１）それぞれ配列番号３２１（もしくは３２２）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ２）それぞれ配列番号２（もしくは９）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ３）それぞれ配列番号１６（もしくは２３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ４）それぞれ配列番号３２３（もしくは３２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ５）それぞれ配列番号８０（もしくは９０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ６）それぞれ配列番号１００（もしくは１１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ７）それぞれ配列番号３２５（もしくは３２６）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ１）それぞれ配列番号３２７（もしくは３２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ２）それぞれ配列番号３（もしくは１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ３）それぞれ配列番号１７（もしくは２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ４）それぞれ配列番号３２９（もしくは３３０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ１）それぞれ配列番号３３１（もしくは３３２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ２）それぞれ配列番号４（もしくは１１）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ３）それぞれ配列番号１８（もしくは２５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ４）それぞれ配列番号３３３（もしくは３３４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１１）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３２を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１２）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１３）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ２）それぞれ配列番号５（もしくは１２）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ３）それぞれ配列番号１９（もしくは２６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ４）それぞれ配列番号３３７（もしくは３３８）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ５）それぞれ配列番号８１（もしくは９１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ６）それぞれ配列番号１０１（もしくは１１１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ７）それぞれ配列番号３３９（もしくは３４０）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ１）それぞれ配列番号３４１（もしくは３４２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ２）それぞれ配列番号６（もしくは１３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ３）それぞれ配列番号２０（もしくは２７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ４）それぞれ配列番号３４３（もしくは３４４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ１）それぞれ配列番号３４５（もしくは３４６）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ２）それぞれ配列番号７（もしくは４３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ３）それぞれ配列番号２１（もしくは２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、または
（ｇ４）それぞれ配列番号３４７（もしくは３４８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列
を含む。
【００２４】
他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性：
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる］の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる］、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる］のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３への結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１つ以上を有する。
【００２５】
第２の結合特異性を有する分子に連結された抗ＴＩＭ３抗体を含む、二重特異性分子が、本明細書において提供される。
【００２６】
抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、核酸分子を含む発現ベクター、ならびに発現ベクターを用いて形質転換された細胞が、本明細書において提供される。
【００２７】
薬剤に連結された、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を含む、イムノコンジュゲートが、本明細書において提供される。
【００２８】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、担体とを含む、組成物が、本明細書において提供される。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、使用のための説明書とを含む、キットもまた、本明細書において提供される。
【００２９】
抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、細胞において、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を発現させることと、細胞から、抗体またはその抗原結合部分を単離することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３０】
抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように（例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞上のＴＩＭ３の負の作用を阻害することによって）、Ｔ細胞を、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３１】
Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞）を活性化または共刺激する方法であって、細胞、例えば、エフェクターＴ細胞を、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲート、ならびにＣＤ３と接触させ、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される（例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞上のＴＩＭ３の負の作用を阻害することによって）ことを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３２】
Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬにおけるＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞またはＴＩＬの増殖を増大させる方法であって、Ｔ細胞を、有効量の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３３】
対象のＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増大させる方法であって、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生を増大させるために、対象に、有効量の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３４】
対象においてＴＩＬ活性を刺激する方法であって、ＴＩＬが、サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γを増殖または分泌するように、対象に、治療有効量の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３５】
対象においてＮＫ細胞（例えば、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性を増大させることによって）および／またはマクロファージもしくは他の抗原提示細胞を刺激するための方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３抗体と接触した抗原提示細胞によるＩＬ−１２分泌を増大させることができる。
【００３６】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、対象において免疫応答が刺激されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が、刺激される。
【００３７】
対象において腫瘍の成長を阻害するか、または腫瘍のサイズを低減するための方法であって、対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３８】
がんを、例えば、免疫療法によって、処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与して、がんを処置することを含む、方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮がん／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、結腸直腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、ウイルス関連のがんおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、転移性がん、難治性がんまたは再発性がんである。いくつかの実施形態では、がんは、冷たいがん（cold tumor）である。
【００３９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗ＴＩＭ３抗体とともに、１以上の追加の治療薬、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体をさらに含む。
【００４０】
サンプルにおけるＴＩＭ３タンパク質の存在を検出する方法であって、サンプルを、抗体またはその抗原結合部分とＴＩＭ３との間で複合体の形成を可能にする条件下で、抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分と接触させることと、複合体の形成を検出することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００４１】
実施形態
実施形態１. ヒトＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）と結合し、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離された抗体（例えば、ヒト抗体）またはその抗原結合部分であって、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択され、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５からなる群から選択され、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８および配列番号１２９からなる群から選択され、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号６４または配列番号６５を含み、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号６６または配列番号６７を含み、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７１を含む、
単離された抗体またはその抗原結合部分。
【００４２】
実施形態２. ヒトＴＩＭ３と結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２２、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ３）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２３、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ４）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２４、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ５）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ６）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ７）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ８）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、４６、１２９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ９）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２２、１２８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ１０）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４１、１２２、１２６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ｂ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４２、４７、５４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｂ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４２、１２５、５４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｃ）それぞれ配列番号４３、４８および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ配列番号４４、４９および５６を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および７１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｇ１）それぞれ配列番号４５、５０および５７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６５、６７および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｇ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、７１を含む、
（ｇ３）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｈ）それぞれ配列番号４５、５１および５８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｉ）それぞれ配列番号４５、５２および５９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ配列番号６４、６６および６９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【００４３】
実施形態３. 重鎖可変領域が、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ならびに／または軽鎖可変領域が、配列番号６０、６１、６２および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【００４４】
実施形態４. 抗体またはその抗原結合部分が、以下の突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、ならびに適宜Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【００４５】
実施形態５. 配列番号２６３〜２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【００４６】
実施形態６. 抗体またはその抗原結合部分が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態１から５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【００４７】
実施形態７. 抗体が、
（ａ１）それぞれ配列番号３０１（もしくは３０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２）それぞれ配列番号１（もしくは８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３）それぞれ配列番号１５（もしくは２２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ４）それぞれ配列番号３０３（もしくは３０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ５）それぞれ配列番号７２（もしくは８２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ６）それぞれ配列番号９２（もしくは１０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ７）それぞれ配列番号３０５（もしくは３０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ８）それぞれ配列番号７３（もしくは８３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ９）それぞれ配列番号９３（もしくは１０３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１０）それぞれ配列番号３０７（もしくは３０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１１）それぞれ配列番号７４（もしくは８４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１２）それぞれ配列番号９４（もしくは１０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１３）それぞれ配列番号３０９（もしくは３１０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１４）それぞれ配列番号７５（もしくは８５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１５）それぞれ配列番号９５（もしくは１０５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１６）それぞれ配列番号３１１（もしくは３１２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１７）それぞれ配列番号７６（もしくは８６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１８）それぞれ配列番号９６（もしくは１０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１９）それぞれ配列番号３１３（もしくは３１４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２０）それぞれ配列番号７７（もしくは８７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２１）それぞれ配列番号９７（もしくは１０７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２２）それぞれ配列番号３１５（もしくは３１６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２３）それぞれ配列番号７８（もしくは８８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２４）それぞれ配列番号９８（もしくは１０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２５）それぞれ配列番号３１７（もしくは３１８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２６）それぞれ配列番号７９（もしくは８９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２７）それぞれ配列番号９９（もしくは１０９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２８）それぞれ配列番号３１９（もしくは３２０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２９）それぞれ配列番号３４９（もしくは３５０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３０）それぞれ配列番号３５１（もしくは３５２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３１）それぞれ配列番号３５３（もしくは３５４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ１）それぞれ配列番号３２１（もしくは３２２）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ２）それぞれ配列番号２（もしくは９）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ３）それぞれ配列番号１６（もしくは２３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ４）それぞれ配列番号３２３（もしくは３２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ５）それぞれ配列番号８０（もしくは９０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ６）それぞれ配列番号１００（もしくは１１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ７）それぞれ配列番号３２５（もしくは３２６）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ１）それぞれ配列番号３２７（もしくは３２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ２）それぞれ配列番号３（もしくは１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ３）それぞれ配列番号１７（もしくは２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ４）それぞれ配列番号３２９（もしくは３３０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ１）それぞれ配列番号３３１（もしくは３３２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ２）それぞれ配列番号４（もしくは１１）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ３）それぞれ配列番号１８（もしくは２５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ４）それぞれ配列番号３３３（もしくは３３４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.１）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３２を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.２）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.３）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３１を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ２）それぞれ配列番号５（もしくは１２）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ３）それぞれ配列番号１９（もしくは２６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ４）それぞれ配列番号３３７（もしくは３３８）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ５）それぞれ配列番号８１（もしくは９１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ６）それぞれ配列番号１０１（もしくは１１１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ７）それぞれ配列番号３３９（もしくは３４０）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ１）それぞれ配列番号３４１（もしくは３４２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ２）それぞれ配列番号６（もしくは１３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ３）それぞれ配列番号２０（もしくは２７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ４）それぞれ配列番号３４３（もしくは３４４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ１）それぞれ配列番号３４５（もしくは３４６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ２）それぞれ配列番号７（もしくは４３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ３）それぞれ配列番号２１（もしくは２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、または
（ｇ４）それぞれ配列番号３４７（もしくは３４８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列
を含み、抗体が、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する、実施形態１から６のいずれか１つに記載の抗体。
【００４８】
実施形態８. 抗体またはその抗原結合部分が、以下の特性：
（１）例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域４９VPVCWGKGACPVFE６２（配列番号３６７）および１１１RIQIPGIMNDEKFNLKL１２７（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１つ以上を有する、実施形態１から７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【００４９】
実施形態９. 第２の結合特異性を有する分子に連結された実施形態１から８のいずれか１つに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
【００５０】
実施形態１０. 実施形態１から８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【００５１】
実施形態１１. 実施形態１０に記載の核酸を用いて形質転換された、細胞。
【００５２】
実施形態１２. 薬剤に連結された実施形態１から８のいずれか１つに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
【００５３】
実施形態１３. 実施形態１から９および１２のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、担体とを含む組成物。
【００５４】
実施形態１４. 実施形態１から９および１２のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、使用のための説明書とを含む、キット。
【００５５】
実施形態１５. 対象における免疫応答の刺激、増大もしくは調節を、それを必要とする対象において行うか、またはがんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、実施形態１から９および１２のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含み、投与の後に、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるか、エフェクターＴ細胞が活性化もしくは共刺激されるか、Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生が増大されるか、Ｔ細胞の数が増大されるか、ＴＩＬ活性が刺激されるか、対象における腫瘍のサイズが低減されるか、対象における腫瘍の成長が阻害されるか、またはこれらの任意の組合せが行われる、方法。
【００５６】
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるが、これらは、限定とみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６７）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＣＤＲ２（配列番号４６）およびＣＤＲ３（配列番号５３）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図１Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６８）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図１Ｃは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７４および２６９）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１６７）およびアミノ酸配列（配列番号３４）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７３および２６８）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。
【００５８】
【図２】図２Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６８）およびアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４２）、ＣＤＲ２（配列番号４７）およびＣＤＲ３（配列番号５４）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図２Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６９）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図２Ｃは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７４および２６９）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１６８）およびアミノ酸配列（配列番号３５）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７３および２６８）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｂ９の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。
【００５９】
【図３】図３Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６９）およびアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４８）およびＣＤＲ３（配列番号５５）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図３Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６９）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図３Ｃは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７４および２６９）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１６９）およびアミノ酸配列（配列番号３６）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７３および２６８）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体８Ｃ４の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。
【００６０】
【図４】図４Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１７０）およびアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４４）、ＣＤＲ２（配列番号４９）およびＣＤＲ３（配列番号５６）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図４Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６８）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図４Ｃは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７２および２６７）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７０）およびアミノ酸配列（配列番号３７）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７３および２６８）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ３の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。
【００６１】
【図５】図５Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１７１）およびアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４５）、ＣＤＲ２（配列番号５０）およびＣＤＲ３（配列番号５７）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図５Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ１の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９５）およびアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６５）、ＣＤＲ２（配列番号６７）およびＣＤＲ３（配列番号７０）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図５Ｃは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ２の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９６）およびアミノ酸配列（配列番号６３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号７１）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図５Ｄは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ３の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６９）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図５Ｅは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７５および２７０）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７１）およびアミノ酸配列（配列番号３８）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７６および２７１）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体９Ｆ６のＶＫ１、ＶＫ２およびＶＫ３の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１９５、１９６および１９４）およびアミノ酸配列（それぞれ配列番号６２、６３および６１）を示す。
【００６２】
【図６】図６Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１７２）およびアミノ酸配列（配列番号３９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４５）、ＣＤＲ２（配列番号５１）およびＣＤＲ３（配列番号５８）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図６Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６８）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図６Ｃは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７５および２７０）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７２）およびアミノ酸配列（配列番号３９）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７３および２６８）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体３Ｇ４の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。
【００６３】
【図７】図７Ａは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１７３）およびアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４５）、ＣＤＲ２（配列番号５２）およびＣＤＲ３（配列番号５９）を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図７Ｂは、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の成熟軽鎖可変（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６４）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６９）を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図７Ｃは、シグナル配列（それぞれ配列番号２７５および２７０）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の重鎖ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７３）およびアミノ酸配列（配列番号４０）、ならびにシグナル配列（それぞれ配列番号２７３および２６８）を有する抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１７Ｃ８の軽鎖ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９４）およびアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。
【００６４】
【図８】図８Ａは、モノクローナル抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８の重鎖可変（ＶＨ）領域の配列アライメントを示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を、枠で囲んで示す。図８Ｂは、抗体のＶＨ領域、ＣＤＲのそれぞれおよびそれらの突然変異体の配列番号を列挙する。
【００６５】
【図９】図９Ａは、モノクローナル抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６＿ＶＫ１、９Ｆ６＿ＶＫ２、９Ｆ６＿ＶＫ３、３Ｇ４および１７Ｃ８の軽鎖可変（ＶＬ）領域の配列アライメントを示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を、枠で囲んで示す。図９Ｂは、抗体のＶＬ領域およびＣＤＲのそれぞれの配列番号を列挙する。
【００６６】
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体ＴＩＭ３.５（１３Ａ３）ならびにその例示的な変異体：ＴＩＭ３.１３（Ｄ１０１Ｅ）、ＴＩＭ３.１４（Ｐ１０２Ｖ）、ＴＩＭ３.１５（Ｐ１０２Ｙ）、ＴＩＭ３.１６（Ｐ１０２Ｌ）、ＴＩＭ３.１７（Ｎ６０Ｑ／Ｐ１０２Ｙ）、ＴＩＭ３.１８（Ｎ６０Ｑ／Ｄ１０１Ｅ）、ＴＩＭ３.１０（Ｎ６０Ｑ）、ＴＩＭ３.１１（Ｎ６０Ｓ）およびＴＩＭ３.１２（Ｎ６０Ａ）の成熟全長重鎖（ＨＣ）の配列アライメントを示す。重鎖のそれぞれのＶＨ領域を、下線で示す。
【００６７】
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体９Ｆ６およびその例示的な変異体ＴＩＭ３.７（Ａ１０８Ｔ）の成熟全長ＨＣの配列アライメントを示す。それぞれの重鎖のＶＨ領域を、下線で示す。
【００６８】
【図１２】図１２は、モノクローナル８Ｂ９およびその例示的な変異体ＴＩＭ３.８（Ｓ６１Ｐ）の成熟全長ＨＣの配列アライメントを示す。それぞれの重鎖のＶＨ領域を、下線で示す。
【００６９】
【図１３】図１３は、ハイブリドーマに由来する抗体（１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８）ならびに組換え（ＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８）抗ヒトＴＩＭ３抗体の全長重鎖および軽鎖、可変領域およびＣＤＲの配列番号を列挙する。重鎖および軽鎖のアイソタイプもまた、示される。「Ｈ.ｎ.」は、ハイブリドーマ名を指す。図１３において参照される重鎖および軽鎖は、そのエレメント、例えば、本明細書において開示される可変領域および定常領域に由来し得る。配列番号が、表の２ページ目または３ページ目で所与の列に表示されていない場合、その前のページの列またはそれよりも前のページの列に提供されている。
【００７０】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、抗ＴＩＭ３抗体の、ヒトＴＩＭ−３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（図１４Ａ）および活性化ヒトＴ細胞（図１４Ｂ）との結合の結合曲線およびＥＣ５０を示す。
【００７１】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、抗ＴＩＭ３抗体の、カニクイザルＴＩＭ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株（図１５Ａ）および活性化カニクイザルＴ細胞（図１５Ｂ）との結合の結合曲線およびＥＣ５０を示す。
【００７２】
【図１６】図１６は、腎細胞がん（ＲＣＣ）において、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）からのＩＦＮ−γ産生を促進することにおける抗ＴＩＭ３活性（種々の抗体濃度での）を示す。それぞれの抗体について、８つのバーは、示される通りの、抗体の様々な濃度を表す。
【００７３】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、肺がんＴＩＬからのＩＦＮ−γ産生を促進することにおける抗ＴＩＭ３活性（種々の抗体濃度での）を示す（図１７Ａ、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ；図１７Ｂ、細胞内ＩＦＮ−γ染色）。図１７Ａでは、それぞれの抗体の個々のバーは、示される通りの、抗体の様々な濃度を表す。図１７Ｂでは、上部のパネルは、ＣＤ４＋細胞を示し、下部のパネルは、ＣＤ８＋細胞を示す。ＴＩＭ３のレベルを、８Ｂ９を用いて測定した（ｘ軸）。
【００７４】
【図１８】図１８は、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞の存在下において、様々な組織から単離されたＴＩＬからのＩＦＮ−γ分泌を促進することにおける、抗ＴＩＭ−３抗体（すなわち、抗体１３Ａ３および３Ｇ４）を示す。
【００７５】
【図１９】図１９は、活性化ヒトＴ細胞におけるＴＩＭ−３抗体の抗ＴＩＭ−３交差遮断を示す。
【００７６】
【図２０】図２０は、抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３および８Ｂ９の、ヒトＴＩＭ３との結合に必要であるアミノ酸残基を示す。シグナル配列および膜貫通ドメインを、下線で示す。
【００７７】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、特定の抗ＴＩＭ３抗体が、ヒトＴＩＭ３とＰＳ−リポソームとの間の相互作用を遮断することを示す。図２１Ａは、「イン・タンデム」遮断アッセイにおけるホスファチジルセリン（ＰＳ）−ｈＴＩＭ３の概略図である。図２１Ｂは、図２１Ａに示されるＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合の、特定の抗ＴＩＭ３抗体によるｈＴＩＭ３−ＦｃのＰＳ−リポソームとの結合の遮断を示す。
【００７８】
【図２２】図２２は、様々な抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ＴＩＭ３.５、ＴＩＭ３.４、ＴＩＭ３.２、ＴＩＭ３.９、９Ｆ６、ＴＩＭ３.８およびＴＩＭ３.６）の機能的活性の概要を示す。結合アッセイ、Ｔ細胞アッセイ、ＴＩＬアッセイおよびＰＳ−ＴＩＭ３遮断アッセイのデータを、提供する。
【００７９】
【図２３】図２３は、配列番号で表される配列の説明とともに、全配列番号の一覧を提供する。
【００８０】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおける、抗ＰＤ１抗体と抗ＴＩＭ３抗体との組合せ投与の抗腫瘍活性を示す。図２４Ａは、（ｉ）対照ＩｇＧ（左上のパネル）、（ｉｉ）ＲＭＴ３−２３抗ＴＩＭ３抗体単独（右上のパネル）、（ｉｉｉ）ＲＭＰ１−１４抗ＰＤ１抗体単独（左下のパネル）ならびに（ｉｖ）ＲＭＴ３−２３抗ＴＩＭ３抗体およびＲＭＰ１−１４抗ＰＤ１抗体の組合せ（右下のパネル）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における、腫瘍移植後の様々な時点での腫瘍体積を示す。図２４Ｂは、（ｉ）ＲＭＴ３−２３抗ＴＩＭ３抗体単独、（ｉｉ）ＡｂＭ抗ＴＩＭ３抗体単独、（ｉｉｉ）ＲＭＰ１−１４抗ＰＤ１抗体単独、（ｉｖ）ＲＭＴ３−２３抗ＴＩＭ３抗体およびＲＭＰ１−１４抗ＰＤ１抗体の組合せ、（ｖ）Ａｂ  Ｍ抗ＴＩＭ３抗体およびＲＭＰ１−１４抗ＰＤ１抗体の組合せならびに（ｖｉ）アイソタイプ対照抗体で処置したマウスにおける、時間の関数（腫瘍移植後の日数）としての平均腫瘍体積を示す。
【００８１】
【図２５】図２５は、水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）を使用して抗ＴＩＭ３抗体（１３Ａ３および３Ｇ４）のエピトープをマッピングするために使用したｈＴＩＭ−３の一般的なペプチドの一覧を示す。それぞれのバーは、消化性ペプチドを示す。丸で囲んだ残基（すなわち、Ｎ９９、Ｔ１４５およびＮ１７２）は、グリコシル化部位を示す。
【００８２】
【図２６】図２６は、ＨＤＸ−ＭＸを使用して同定された抗ＴＩＭ３抗体（１３Ａ３および３Ｇ４）のヒトＴＩＭ−３結合領域を示す。上部のパネルは、１３Ａ３抗ＴＩＭ３抗体の結合領域を示す。下部のパネルは、３Ｇ４抗ＴＩＭ３抗体の結合領域を示す。
【００８３】
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｂは、異所的にヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３を発現するＣＨＯ細胞に対するＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のスキャッチャード解析の結果を示す。図２７Ａは、１２５Ｉ−ＴＩＭ３抗体の標準曲線を示す。図２７Ｂは、ヒト（左のパネル）およびカニクイザル（右のパネル）ＴＩＭ３を発現するＣＨＯ細胞に結合したＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の量を示す。
【００８４】
【図２８】図２８は、２人のドナーに由来する活性化Ｔｈ１細胞に対するＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のスキャッチャード解析の結果を示す（左および右のパネル）。
【００８５】
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３およびＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂが、分極化Ｔｈ１（polarized Th1）／照射ＣＨＯ−ＯＫＴ３の共培養アッセイにおいて、Ｔｈ１  Ｔ細胞の増殖を増強したことを示す。図２９Ａは、様々な濃度のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３、１３Ａ３（「１３Ａ３−ｇ４」）または抗体なしもしくはアイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ１.１およびｈＩｇＧ４）で観察された、Ｔｈ１細胞の増殖を示す。図２９Ｂは、様々な濃度のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂまたは抗体なしもしくはアイソタイプ対照抗体ＩｇＧ１.３で観察された、Ｔｈ１細胞の増殖を示す。
【００８６】
【図３０】図３０は、抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、分極化Ｔｈ１／照射ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＰＤ−Ｌ１の共培養アッセイにおいて、ニボルマブとの組合せで、Ｔｈ１  Ｔ細胞の増殖を増強したことを示す。
【００８７】
【図３１】図３１は、抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、照射されたＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞で刺激した腎細胞がん腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のインターフェロン−γ分泌を増強したことを示す。
【００８８】
【図３２】図３２は、抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、照射ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞で刺激した乳がんＴＩＬのインターフェロン−γ分泌を増強したことを示す。
【００８９】
【図３３】図３３は、ＡｌｌｏＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイにおいて使用したＭ０マクロファージにおけるＣＤ１６３、ＣＤ２０６およびＴＩＭ３の発現を示し、このアッセイの結果は、図３４に示される。
【００９０】
【図３４】図３４は、抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３、アイソタイプ対照の存在下、または抗体の不在下において行われたＡｌｌｏＭＬＲアッセイにおける細胞の増殖を示す。
【００９１】
【図３５】図３５は、結晶構造解析によって判定された、ＴＩＭ３：ＴＩＭ３.１８  Ｆａｂ複合体の構造のリボン図である。Ｆａｂ断片を、薄い灰色で示し、ＴＩＭ３を、濃い灰色で示す。
【００９２】
【図３６】図３６は、結晶構造解析によって判定された、ＴＩＭ３：ＴＩＭ３.１８  Ｆａｂ複合体の構造を示す。Ｆａｂ断片を、リボン図として示す。ＴＩＭ３を、白色の表面で表し、Ｆａｂ接触残基を、濃い灰色で示す。
【００９３】
【図３７】図３７は、抗ＴＩＭ３抗体による内部移行能力を測定するために使用したアッセイの図である。
【００９４】
【図３８】図３８は、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３（左下のパネル）およびその特定の変異体（Ｄ１０１Ｅ−左上のパネル、Ｎ６０Ｑ−右上のパネル）が、受容体（すなわち、ＴＩＭ３）に媒介される内部移行をトリガーしないことを示す。
【００９５】
【図３９】図３９Ａおよび３９Ｂは、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３（図３９Ａ）および３Ｇ４（図３９Ｂ）のエピトープを示すリボン図である。抗体のそれぞれのエピトープのアミノ酸配列を、リボン図の下に提供する。異なるパターンにより、特定のエピトープに対応する抗ＴＩＭ３抗体の特定の領域が同定される。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本明細書において説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示されている。
【００９７】
「１つの（a）」または「１つの（an）」実体という用語は、その実体の１以上を指すことに留意されたく、例えば、「１つのヌクレオチド配列」は、１以上のヌクレオチド配列を表すことが理解される。したがって、「１つの（a）」（または「１つの（an）」）、「１以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において同義的に使用することができる。
【００９８】
さらに、「および／または」は、本明細書において使用されている場合、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれが、互いを伴う場合も伴わない場合もあるという具体的な開示として解釈されるものとする。したがって、用語「および／または」は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」といった語句において使用されるとき、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ（単独）」、ならびに「Ｂ（単独）」を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」といった語句において使用されるとき、以下の態様：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
【００９９】
態様が、「含む（comprising）」という言葉を用いて本明細書に記載されている場合、別途「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載される類似の態様もまた提供されることが理解される。
【０１００】
別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press、The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Pressおよびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に、本開示において使用される用語の多くについての一般的な辞書を提供する。
【０１０１】
単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）に認められた形式で示される。数値範囲は、その範囲を定める数を含む。別途示されない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に、５’から３’の方向で記述される。アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向で記述される。本明細書において提供される見出しは、全体として本明細書への参照によって得ることができる、本開示の様々な態様を制限するものではない。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。
【０１０２】
用語「約」は、およそ、大体、前後、またはその範囲を意味して本明細書において使用される。用語「約」が、数値範囲とともに使用されている場合、この用語は、境界を、記載されている数値の上下に拡大することにより、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、数値を、記述された値の上下、例えば、１０パーセント上または下（高いかまたは低い）に修飾し得る。
【０１０３】
本明細書において、用語「Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３」または「ＴＩＭ３」は、タンパク質のＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン（ＴＩＭ）ファミリーのメンバーである受容体を指す。ＴＩＭ３の主要なリガンドとしては、ホスファチジルセリン（ＴＩＭ３−Ｌ）が挙げられる。ＴＩＭ３はまた、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン受容体３、ＴＩＭ−３、ＴＩＭＤ３、ＴＩＭＤ−３、腎臓損傷分子３、ＫＩＭ−３、およびＣＤ３６６とも称される。用語「ＴＩＭ３」は、細胞によって天然に発現される、ＴＩＭ３の任意の変異体またはアイソフォームを含む。したがって、本明細書に記載される抗体は、ヒト以外の種に由来するＴＩＭ３（例えば、カニクイザルＴＩＭ３）と交差反応し得る。あるいは、抗体は、ヒトＴＩＭ３に特異的であり得、他の種とのいずれの交差反応性も示さない可能性がある。ＴＩＭ３またはその任意の変異体およびアイソフォームは、それらを天然に発現する細胞もしくは組織から単離され得るか、または当技術分野で周知の技術および／もしくは本明細書に記載されるものを使用して組換えにより産生され得るかのいずれであってもよい。
【０１０４】
ヒトＴＩＭ３の２つのアイソフォームが同定されている。アイソフォーム１（受託番号ＮＰ＿１１６１７１、配列番号２８６）は、３０１個のアミノ酸からなり、カノニカル配列を表す。アイソフォーム２（受託番号ＡＡＨ２０８４３、配列番号２８７）は、１４２個のアミノ酸からなり、可溶性である。これは、ＴＩＭ３の膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよび細胞外ドメインの一部をコードするアミノ酸残基１４３〜３０１を欠いている。アミノ酸残基１３２〜１４２もまた、上述のカノニカル配列とは異なる。
【０１０５】
２つの公知のヒトＴＩＭ３アイソフォームのアミノ酸配列を、以下に示す。
（Ａ）ヒトＴＩＭ３アイソフォーム１（受託番号ＮＰ＿１１６１７１；配列番号２８６；受託番号ＮＭ＿０３２７８２.４を有するヌクレオチド配列によってコードされる；配列番号２８８；図２０）。
【化１】
2019533981.tif 000002
（Ｂ）ヒトＴＩＭ３アイソフォーム２（受託番号ＡＡＨ２０８４３；配列番号２８７；受託番号ＢＣ０２０８４３.１を有するヌクレオチド配列によってコードされる；配列番号２８９）。
【化２】
2019533981.tif 000003
【０１０６】
アイソフォーム１および２のシグナル配列は、アミノ酸１〜２１（下線）に対応する。したがって、成熟アイソフォーム１および２は、それぞれアミノ酸２２〜３０１または１４２からなる。成熟ヒトＴＩＭ３の細胞外ドメインは、配列番号２８６のアミノ酸２２〜２０２からなり、アミノ酸配列：
【化３】
2019533981.tif 000004
（配列番号２９０）を有する。
【０１０７】
カニクイザルＴＩＭ３タンパク質は、以下のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）からなる：
【化４】
2019533981.tif 000005
（配列番号３６０）
【０１０８】
「抗体」とは、一実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）および重鎖定常領域（本明細書において、ＣＨと略される）からなる。特定の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体では、重鎖定常領域は、ヒンジと３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。特定の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（本明細書に置いて、ＣＬと略される）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域と散在している超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および伝統的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）との結合を媒介し得る。重鎖は、Ｃ末端リシンを有してもよくまたは有さなくてもよい。本明細書において別途指定されない限り、可変領域のアミノ酸は、カバットの番号付けシステムを使用して番号付けされ、定常領域のアミノ酸は、ＥＵシステムを使用して番号付けされている。
【０１０９】
「ＩｇＧ抗体」、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体は、本明細書において、特定の実施形態では、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有する、すなわち、これは、同一のサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同一の数の重鎖および軽鎖ならびにジスルフィド結合を有する。例えば、抗ＴＩＭ３  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）からなり、ここで、これらの２つの重鎖および軽鎖は、それぞれ天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体において生じるものと同一の数および位置のジスルフィド架橋によって連結されている（抗体が、ジスルフィド架橋を修飾するように突然変異されている場合を除く）。
【０１１０】
抗体は、通常、そのコグネイト抗原と、１０−５〜１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって反映される高親和性で特異的に結合する。約１０−４Ｍより大きい任意のＫＤは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において、抗原と「特異的に結合する」抗体とは、抗原および実質的に同一の抗原と、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、または１０−８Ｍから１０−１０Ｍ以下の間のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない抗体である。抗原は、所与の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合には、例えば、所与の抗原の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を示す場合に、所与の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する抗体は、特定の実施形態では、特定の霊長類種に由来するＴＩＭ３抗原（例えば、カニクイザルＴＩＭ３）との交差反応性を有するが、その他の種に由来するＴＩＭ３抗原と、またはＴＩＭ３以外の抗原とは、交差反応し得ない。
【０１１１】
免疫グロブリンは、それだけには限らないがＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含めた、よく知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分けられる：ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、多くても２、３個のアミノ酸で互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。「抗体」は、例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、ならびに完全合成抗体を含む。
【０１１２】
本明細書において、用語、抗体の「抗原結合部分」は、抗原（例えば、ヒトＴＩＭ３）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片（パパイン切断に由来する断片）または同様の一価の断片、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含むＦ（ａｂ’）２断片（ペプシン切断に由来する断片）または同様の二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）適宜合成リンカーによって接続され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して接続され得る。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。
【０１１３】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と、２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた種々の方法によって生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照のこと。
【０１１４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に同種の抗体の集団に由来する抗体を指す、すなわち、集団内に含まれる個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のある変異体（そのような変異体は、一般に、少量で存在している）を除き、実質的に類似であり、同一のエピトープに結合する（例えば、抗体は、単一の結合特異性および親和性を示す）。「モノクローナル」という修飾語は、抗体が、実質的に同種の抗体集団から得られているという特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるものではない。用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および適宜定常領域を有する、実質的に同種の抗体集団に由来する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および不死化された細胞と融合された軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１１５】
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体またはそれから調製されたハイブリドーマである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用し、生殖系列遺伝子によってコードされる可変および定常領域を含むが、その後の再編成および例えば、抗体成熟の間に起こる突然変異を含む。当技術分野で公知のように（例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと）、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するよう再編成する種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。可変領域は、再配列に加えて、外来抗原に対する抗体の親和性を増大するよう、複数の単一アミノ酸変更（体細胞突然変異または高頻度突然変異とも呼ばれる）によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応じて変化する（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原に応じた、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再編成され、体細胞突然変異された核酸分子は、元の核酸分子との配列同一性を有し得ないが、その代わりに、実質的に同一または同様となる（すなわち、少なくとも８０％の同一性を有する）。
【０１１６】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかし、本明細書において、用語「ヒト抗体」はマウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むよう意図されない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
【０１１７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体のＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリンに由来するアミノ酸で置換されているが、１以上のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたは全てのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入または置換または修飾は、抗体の特定の抗原と結合する能力を抑制しない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体のものと同様の抗原特異性を保持する。
【０１１８】
「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。
【０１１９】
本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体）を指す。
【０１２０】
「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプ群内の天然に存在する変異体を指し、これらの変異体は、２、３個のアミノ酸で異なっている（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、任意のアロタイプのものであり得る。本明細書において、「ＩｇＧ１ｆ」、「ＩｇＧ１.１ｆ」または「ＩｇＧ１.３ｆ」アイソタイプと称される抗体は、それぞれアロタイプ「ｆ」、すなわち、例えば、配列番号３に示されるように、カバットにおけるＥＵ指数による２１４Ｒ、３５６Ｅおよび３５８Ｍを有する、ＩｇＧ１、エフェクターレスＩｇＧ１.１およびエフェクターレスＩｇＧ１.３抗体である。
【０１２１】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
【０１２２】
「単離された抗体」は、本明細書において、他のタンパク質および細胞材料を実質的に含まない抗体を指すことが意図される。
【０１２３】
本明細書において、「ＴＩＭ３−ＬのＴＩＭ３との結合を阻害する」抗体は、ＴＩＭ３のそのリガンド、例えば、ホスファチジルセリンとの結合を、例えば、ヒトＴＩＭ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞またはＴＩＭ３を発現する活性化Ｔ細胞を使用した結合アッセイにおいて、当技術分野において認識されている方法、例えば、本明細書に記載されるＦＡＣＳに基づく結合アッセイで、約１μｇ／ｍＬ以下、例えば、約０.９μｇ／ｍＬ以下、約０.８５μｇ／ｍＬ以下、約０.８μｇ／ｍＬ以下、約０.７５μｇ／ｍＬ以下、約０.７μｇ／ｍＬ以下、約０.６５μｇ／ｍＬ以下、約０.６μｇ／ｍＬ以下、約０.５５μｇ／ｍＬ以下、約０.５μｇ／ｍＬ以下、約０.４５μｇ／ｍＬ以下、約０.４μｇ／ｍＬ以下、約０.３５μｇ／ｍＬ以下、約０.３μｇ／ｍＬ以下、約０.２５μｇ／ｍＬ以下、約０.２μｇ／ｍＬ以下、約０.１５μｇ／ｍＬ以下、約０.１μｇ／ｍＬ以下または約０.０５μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で阻害する、抗体を指すことが意図される。
【０１２４】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドとの相互作用、またはそれにより生じる生化学的事象を指す。例示的「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能ならびに細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるＦｃ領域を必要とする。
【０１２５】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、対立遺伝子変異体およびこれらの受容体の別法としてスプライシングされた形態を含めたＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種の活性化（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１種の阻害性（ＦｃγＲＩＩＢ）受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の特性は、当技術分野で公知である。先天性エフェクター細胞種の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩＢを同時に発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１種の活性化Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩおよびヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体と結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に関してマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられる。
【０１２６】
「Ｆｃ領域」（結晶性断片領域）または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）に位置するＦｃ受容体または古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）との結合を含め、免疫グロブリンと宿主組織または因子との結合を媒介する、抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除いた、抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の定常ドメインに由来する２つの同一なタンパク質断片を含み、ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は、それぞれのポリペプチド鎖に、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２〜４）を含む。ＩｇＧについては、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は、本明細書に定義されるように、多様であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１についてはアミノ酸残基Ｄ２２１から、ＩｇＧ２についてはＶ２２２から、ＩｇＧ３についてはＬ２２１から、ＩｇＧ４についてはＰ２２４から、重鎖のカルボキシ末端までの伸びると定義され、この番号付けは、カバットにおけるＥＵ指数によるものである。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３７からアミノ酸３４０にわたり、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する、すなわち、ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧのアミノ酸３４１から、アミノ酸４４７または４４６（Ｃ末端リシン残基が不在の場合）または４４５（Ｃ末端グリシンおよびリシン残基が不在の場合）にわたる。本明細書において、Ｆｃ領域は、任意のアロタイプ変異体を含む天然の配列のＦｃ、または変異体Ｆｃ（例えば、非天然のＦｃ）であり得る。Ｆｃはまた、「Ｆｃ融合タンパク質」（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とも称される、「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」など、Ｆｃを含むタンパク質ポリペプチドの単離またはその文脈において、この領域を指し得る。
【０１２７】
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。
【０１２８】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、例えば、それを同定するために使用される特定の方法によって定義される場合、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＴＩＭ３）上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸（普通、直鎖エピトープ）またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された非連続アミノ酸（普通、コンホメーションエピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、必ずではないが、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次元フォールディングから形成されるエピトープは、通常、変性溶媒を用いる処理の際に失われる。エピトープは、通常、独特の空間コンホメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体（すなわち、エピトープマッピング）によって結合されるエピトープを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、（例えば、ＴＩＭ３に由来する）重複ペプチドまたは連続ペプチドが、所与の抗体（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）との反応性について試験される、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが挙げられる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法として、当技術分野における技術および本明細書に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶学、抗原変異解析、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳ（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと）が挙げられる。
【０１２９】
用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識の分子決定基の同定のプロセスを指す。
【０１３０】
２種以上の抗体に関して、用語「同一エピトープと結合する」は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基の同一セグメントと結合することを意味する。本明細書に記載される抗体を用いて、抗体が「ＴＩＭ３上の同一エピトープ」と結合するか否かを調べる技術として、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）などのエピトープマッピング方法が挙げられる。その他の方法は、抗体の抗原断片との、または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失が、エピトープ成分の指標と考えられることが多い。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。これらの方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。同一のＶＨおよびＶＬまたは同一のＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同一のエピトープと結合することが予測される。
【０１３１】
「標的との結合について別の抗体と競合する」抗体とは、その他の抗体の標的との結合を阻害する（部分的にまたは完全に）抗体を指す。２種の抗体が、標的との結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、その他の抗体の標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するかは、公知の競合実験、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析などを使用して調べてもよい。特定の実施形態では、抗体は、別の抗体の標的との結合と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合する、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」であるか（すなわち、標的とともに最初にインキュベートされるコールド抗体）に応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施できる。２つの抗体は、一方の抗体が、競合実験において抗原と最初に接触するかまたは他方の抗体が最初に接触するかにかかわらず、互いに、両方の方向で少なくとも５０％遮断する場合に、「交差競合する」。
【０１３２】
２つの抗体が、結合に関して競合または交差競合するかどうかを判定するための競合的結合アッセイには、例えば、フローサイトメトリー、例えば、実施例に記載されるものによる、ＴＩＭ３を発現するＴ細胞との結合についての競合が含まれる。その他の方法として、ＳＰＲ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照のこと）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと）；１−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）；および直接標識化ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）が挙げられる。
【０１３３】
本明細書において、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープとの抗体結合を指す。通常、抗体は、（ｉ）例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組換えヒトＴＩＭ３およびリガンドとして抗体を使用したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術または抗体の抗原陽性細胞との結合のスキャッチャード解析法によって決定される場合に、およそ１０−７Ｍ未満、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、（ｉｉ）所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合に対するその親和性よりも、少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原と結合する。したがって、「ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより小さいＫＤで、可溶性または細胞結合型ヒトＴＩＭ３と結合する抗体を指す。「カニクイザルＴＩＭ３と交差反応する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより低いＫＤでカニクイザルＴＩＭ３と結合する抗体を指す。特定の実施形態では、非ヒト種由来のＴＩＭ３と交差反応しないこのような抗体は、標準結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
【０１３４】
本明細書において、用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」とは、特定の抗体抗原相互作用の会合速度を指すものとするのに対し、本明細書において、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度を指すものとする。用語「ＫＤ」は、本明細書において、解離定数を指すものとし、これはｋａに対するｋｄの割合（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する利用可能な方法は、表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム、またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析法を含む。
【０１３５】
本明細書において、ＩｇＧ抗体に関する用語「高親和性」は、抗体が、標的抗原に対して、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下のＫＤを有することを指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについては変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに関する「高親和性」結合は、抗体が、１０−１０Ｍ以下または１０−８Ｍ以下のＫＤを有することを指す。
【０１３６】
用語、抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロまたはインビボアッセイに関連して「ＥＣ５０」とは、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの間の中間である応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
【０１３７】
用語、本明細書において対象に適用されるような「天然に存在する」とは、対象が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、実験室において人によって意図的に修飾されていない、自然界における供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。
【０１３８】
「ポリペプチド」とは、少なくとも２個の連続して連結しているアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１個または複数のアミノ酸残基は、それだけには限らないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの修飾を含有し得る。「タンパク質」は、１以上のポリペプチドを含み得る。
【０１３９】
用語「核酸分子」とは、本明細書において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであり得る。
【０１４０】
「保存的アミノ酸置換」は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基とのアミノ酸残基の置換を指す。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体中の予想される非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換される。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Brummel et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと）。
【０１４１】
核酸については、用語「実質的な相同性」は、２種の核酸またはその指定された配列は、最適にアラインされ、比較される場合に、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、少なくとも約９０％〜９５％、またはヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９.５％において適当なヌクレオチド挿入または欠失を用いて同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。
【０１４２】
ポリペプチドについては、用語「実質的な相同性」は、２種のポリペプチドまたはその指定された配列が、最適にアラインされ、比較される場合に、アミノ酸の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％〜９５％、またはアミノ酸の少なくとも約９８％〜９９.５％において適当なアミノ酸挿入または欠失を用いて同一であることを示す。
【０１４３】
２種の配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮する。２種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の限定されない例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１４４】
２種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（worldwideweb.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（CABIOS, 4:11-17 (1989)）を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定できる。さらに、２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。
【０１４５】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２.０）を使用して実施され得る。本明細書に記載された核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施できる。本明細書に記載されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長（wordlength）＝３を用いて実施できる。比較目的でギャップ付きアラインメント得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。worldwideweb.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【０１４６】
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸（例えば、染色体のその他の部分）またはタンパク質から精製された場合に「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【０１４７】
核酸、例えば、ｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って突然変異してもよい。コード配列については、これらの突然変異は、所望されるアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書に記載される他のそのような配列と実質的に相同であるか、またはそれらに由来する、ＤＮＡ配列が考慮される（ここで、「由来する」とは、配列が、別の配列と同一であるか、またはそれから修飾されていることを示す）。
【０１４８】
本明細書において、用語「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すものとする。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのその他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
【０１４９】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書において、細胞中に天然に存在しない核酸を含み、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の後代も指すということは理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって後世において起こり得るので、このような後代は実際、親の細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【０１５０】
「免疫応答」とは、当技術分野において理解される通りであり、一般に、外来物質または異常な、例えば、がん性細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答が、これらの物質およびそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１以上の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用によって媒介され、これは、進入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性もしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織との選択的標的化、結合、損傷、破壊および／またはそれらの脊椎動物の身体からの排除をもたらす。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはＴｒｅｇ細胞の活性化もしくは阻害、または免疫系の任意の他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化もしくは阻害が含まれる。
【０１５１】
「免疫調節物質（immunomodulator）」または「免疫制御物質（immunoregulator）」とは、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る物質、例えば、シグナル伝達経路の成分を標的とする物質を指す。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」とは、免疫系の細胞における、またはこのような細胞（例えば、Ｔｈ１細胞などのエフェクターＴ細胞）の活性における任意の変更を指す。このような調節は、免疫系の刺激または抑制を含み、種々の細胞型の数の増大もしくは減少、これらの細胞の活性の増大もしくは減少または免疫系内で起こり得る任意のその他の変化によって示され得る。阻害的および刺激的免疫調節物質の両方とも同定されており、その一部は、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。いくつかの実施形態では、免疫調節物質は、Ｔ細胞の表面上の分子を標的とする。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、作用物質、部分、化合物または分子による結合に対して標的化される分子、例えば細胞表面分子であり、その活性は、物質、作用物質、部分、化合物または分子の結合によって変更される。免疫調節性標的は、例えば、細胞の表面の受容体（「免疫調節性受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節性リガンド」）を含む。
【０１５２】
「免疫療法」とは、免疫系または免疫応答を誘導、増強、抑制またはそれ以外に修飾することを含む方法によって、疾患の再発に苦しむまたは、それを起こすまたは患う危険にある対象の治療を指す。
【０１５３】
「免疫賦活性（immunostimulating）療法」または「免疫賦活性（immunostimulatory）療法」とは、例えば、がんを治療するための、対象における免疫応答の増大（誘導または増強）をもたらす療法を指す。
【０１５４】
「内因性免疫応答を増強する」とは、対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増大することを意味する。この有効性および効力の増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって達成され得る。
【０１５５】
「Ｔエフェクター」（「Ｔｅｆｆ」）細胞とは、細胞がサイトカインを分泌し、その他の免疫細胞を活性化し、指示する、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）ならびにＴヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴｈ１細胞を指すが、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を含まない。本明細書に記載される特定の抗ＴＩＭ３抗体は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞ならびにＴｈ１細胞を活性化する。
【０１５６】
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および／または阻害性受容体の増強されたアンタゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性（標的細胞上で直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出を介して間接的に決定される）および増殖における変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ５０または最大活性レベルの倍増が反映され得る。免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１５７】
本明細書において、用語「連結している」とは、２つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合である場合も、非共有結合である場合もある。連結はまた、遺伝的であり（すなわち、組換えによって融合され）得る。このような連結は、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質生産などの様々な当技術分野において認識される技術を使用して達成され得る。
【０１５８】
本明細書において、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して、治療薬を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の別の投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸性に、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与することは、例えば、１回、複数回および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって実施され得る。
【０１５９】
本明細書において、用語「Ｔ細胞媒介性応答」とは、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）を含めたＴ細胞によって媒介される応答を指す。Ｔ細胞媒介性応答は、例えば、Ｔ細胞細胞傷害性および増殖を含む。
【０１６０】
本明細書において、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞によって誘導される免疫応答を指す。ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって主に媒介される。
【０１６１】
本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」（例えば、ＴＩＭ３−Ｌの、細胞上のＴＩＭ３との結合の阻害／遮断を指す）は、同義的に使用され、部分的および完全阻害／遮断の両方を包含する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、本明細書においてさらに記載されるように判定される場合、ＴＩＭ３−ＬのＴＩＭ３との結合を、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、本明細書においてさらに記載されるように判定される場合、ＴＩＭ３−ＬのＴＩＭ３との結合を、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％阻害する。
【０１６２】
本明細書において、語句「腫瘍の成長を阻害する」には、腫瘍の成長における任意の測定可能な減少、例えば、腫瘍の成長の、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％または１００％の阻害が含まれる。
【０１６３】
本明細書において、「がん」は、身体中での異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患の広い群を指す。未制御細胞分裂は、隣接する組織へ浸潤し、リンパ系または血流によって身体の遠隔部位へ転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
【０１６４】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、本明細書において、症状の進行、発生、重症度もしくは再発、合併症、疾病と関連している状態または生化学的兆候を逆転させ、軽減し、寛解し、阻害し、または減速し、または予防すること、または全般的な生存を増強することを目的とした、対象で実施される任意の種類の介入もしくはプロセスまたは対象へ活性薬剤を投与することを指す。処置は、疾患を有する対象または疾患を有さない対象（例えば、予防のため）のものであってもよい。
【０１６５】
「血液悪性腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節のがんを含む。例示的リンパ腫として、Ｂ細胞リンパ腫（Ｂ細胞血液がん）およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられる。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫の限定されない例として、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫（慢性リンパ性白血病と重複する）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が挙げられる。Ｔ細胞リンパ腫の限定されない例として、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。血液悪性腫瘍としてまた、それだけには限らないが、続発性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病などの白血病も挙げられる。血液悪性腫瘍として、さらにそれだけには限らないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの骨髄腫も挙げられる。その他の血液系および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連がんが、用語血液悪性腫瘍によって包含される。
【０１６６】
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能不全もしくは能力障害の防止によって証明される疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の治療上有効な量または投与量は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて、疾患を発生するか、または疾患の再発を患う危険性にある対象に投与される場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬物の量である、「予防的有効量」または「予防的有効投与量」を含む。治療薬の疾患退縮を促進する能力または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、臨床治験の際にヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、インビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の種々の方法を使用して評価できる。
【０１６７】
例として、抗がん剤は、対象において、がん退縮を促進する薬物である。いくつかの実施形態では、治療上有効な量の薬物は、がんを排除するところまでがん退縮を促進する。「がん退縮を促進すること」とは、有効量の薬物を、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与することが、患者において、腫瘍成長または大きさの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１種の疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能不全もしくは能力障害の防止またはそうでなければ疾患症状の寛解をもたらすことを意味する。さらに、処置に関する用語「有効」および「有効性」には、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方が含まれる。薬理学的有効性とは、薬物の患者においてがん退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、毒性のレベルまたは細胞、臓器および／または生物レベルでのその他の有害な生理学的効果（有害効果）を指す。
【０１６８】
腫瘍の治療の例として、薬物の治療上有効な量または投与量は、未治療の対象と比較して、細胞成長または腫瘍成長を少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％阻害する。いくつかの実施形態では、薬物の治療上有効な量または投与量は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害し、すなわち、細胞成長または腫瘍成長を１００％阻害する。化合物の腫瘍成長を阻害する能力は、以下に記載されるアッセイを使用して評価できる。あるいは、この組成物の特性は、化合物の細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定され得る。本明細書に記載されるその他の実施形態では、腫瘍退縮が観察され得、少なくとも約２０日、少なくとも約４０日、または少なくとも約６０日の期間継続し得る。
【０１６９】
用語「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【０１７０】
本明細書において、用語「対象」には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、がんを有する対象を治療するために使用され得る。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの哺乳動物および非哺乳動物、両生類、爬虫類などを含む。
【０１７１】
本明細書において言及される用語「体重に基づく」用量または投薬とは、患者に投与される用量が、患者の体重に基づいて計算されることを意味する。例えば、体重が６０ｋｇである患者が、３ｍｇ／ｋｇの抗ＴＩＭ３抗体を必要とする場合、投与に適切な量の抗ＴＩＭ３抗体（すなわち、１８０ｍｇ）を計算し、使用することができる。
【０１７２】
本開示の方法に関する用語「固定用量（fixed dose）」の使用は、単一の組成物中の２つ以上の異なる抗体（例えば、抗ＴＩＭ３抗体および第２の抗体、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体）が、互いに、特定の（固定）比で、組成物中に存在することを意味する。いくつかの実施形態では、固定用量は、抗体の重量（例えば、ｍｇ）に基づく。特定の実施形態では、固定用量は、抗体の濃度（例えば、ｍｇ／ｍｌ）に基づく。いくつかの実施形態では、２つの抗体（例えば、抗ＴＩＭ３および抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１）の比は、少なくとも約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２０、約１：１４０、約１：１６０、約１：１８０、約１：２００、約２００：１、約１８０：１、約１６０：１、約１４０：１、約１２０：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１または約２：１の、第１の抗体のｍｇ（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）対第２の抗体のｍｇである。例えば、２：１の比の抗ＴＩＭ３抗体およびＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブは、バイアルまたは注射が、約４８０ｍｇの抗ＴＩＭ３抗体および２４０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、または約２ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体および１ｍｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体を含有し得ることを意味し得る。
【０１７３】
本明細書に記載される方法および投与量に関する用語「一定用量（flat dose）」の使用は、患者の体重または体表面積（ＢＳＡ）に関係なく、患者に投与される用量を意味する。一定用量は、したがって、ｍｇ／ｋｇ用量ではなく、薬剤（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）の絶対量として提供される。例えば、６０ｋｇの人物および１００ｋｇの人物が、同一の用量の抗体（例えば、４８０ｍｇの抗ＴＩＭ３抗体）を受容することになる。
【０１７４】
本明細書において、用語「ｕｇ」および「ｕＭ」は、それぞれ「μｇ」および「μΜ」と同義的に使用される。
【０１７５】
本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【０１７６】
Ｉ. 抗ヒトＴＩＭ３抗体
特定の機能的特徴または特性を特徴とする抗体、例えば、完全ヒト抗体が、本明細書に記載される。例えば、抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合し、より具体的には、ヒトＴＩＭ３の細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能的ドメイン）と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ＴＩＭ３−Ｌが結合するＴＩＭ３上の部位と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、アンタゴニスト抗体である、すなわち、抗体は、細胞、例えば、Ｔ細胞上のＴＩＭ３のＴ細胞阻害活性を阻害または抑制する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１以上の非ヒト霊長類に由来するＴＩＭ３、例えば、カニクイザルＴＩＭ３と交差反応する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ３の細胞外領域およびカニクイザルＴＩＭ３の細胞外領域と特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、高い親和性で、ヒトＴＩＭ３と結合する。
【０１７７】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、以下の機能的特性：
（ａ）可溶性および／もしくは膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（ｂ）可溶性および／もしくは膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（ｃ）免疫応答を誘導もしくは刺激すること、
（ｄ）Ｔ細胞活性化、例えば、Ｔｈ１細胞活性化（例えば、サイトカイン分泌および／もしくは増殖の増強によって明らかなように）を誘導もしくは刺激すること、
（ｅ）例えば、共培養アッセイ、例えば、実施例に記載されるものにおいて、Ｔ細胞増殖（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）を誘導もしくは刺激すること、
（ｆ）例えば、実施例に記載されるアッセイにおいて判定される場合、Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えば、ヒト腎臓、肺、膵臓もしくは乳がん腫瘍からのＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生を誘導もしくは刺激すること、
（ｇ）例えば、実施例に記載されるアッセイにおいて判定される場合、ヒトＴＩＭ３のＰｔｄＳｅｒとの結合を遮断もしくは阻害すること、
（ｈ）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行もしくは下方制御しないこと、
（ｉ）ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（ｉ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｉｉ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｉｉｉ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、もしくは（ｉｖ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）と結合すること、
（ｊ）例えば、実施例に記載されるアッセイにおいて判定される場合、本明細書に記載されるＴＩＭ３と結合する抗体（例えば、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、もしくはＴＩＭ３.２からＴＩＭ３.１８のいずれか）のヒトＴＩＭ３との結合と、競合するかまたはそれを交差遮断すること、
（ｋ）ヒトＴＩＭ３と結合するが、配列番号２８６（図２０）において番号付けされる場合、以下のアミノ酸残基：Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０の１つもしくは複数のアミノ酸置換を有するヒトＴＩＭ３とは結合しないこと、
（ｌ）ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（ｍ）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個もしくは全てと相互作用する、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域を有すること、ならびに／または
（ｎ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１つ以上を示す。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、高い親和性、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、または１０−９Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、ヒトＴＩＭ３と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（例えば、実施例に記載されているように）によって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍ、または１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットによって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、５×１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍ、または１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤで、活性化ヒトＴ細胞上のものなど、結合型（例えば、細胞膜結合型）ヒトＴＩＭ３と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、フローサイトメトリーによって判定される場合、１０μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０.９μｇ／ｍＬ以下、０.８μｇ／ｍＬ以下、０.７μｇ／ｍＬ以下、０.６μｇ／ｍＬ以下、０.５μｇ／ｍＬ以下、０.４μｇ／ｍＬ以下、０.３μｇ／ｍＬ以下、０.２μｇ／ｍＬ以下、０.１μｇ／ｍＬ以下、０.０５μｇ／ｍＬ以下または０.０１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、活性化ヒトＴ細胞上のものなど、結合型（例えば、細胞膜結合型）ヒトＴＩＭ３と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−９Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、カニクイザルＴＩＭ３と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（例えば、実施例に記載される）によって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合する。抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、フローサイトメトリー（例えば、実施例に記載される）によって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１００ｎＭ〜０.０１ｎＭ、１００ｎＭ〜０.１ｎＭ、１００ｎＭ〜１ｎＭまたは１０ｎＭ〜１ｎＭのＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合し得る。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットによって判定される場合、１０−７Ｍ以下��１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、５×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤで、活性化ヒトＴ細胞上のものなど、結合型（例えば、細胞膜結合型）カニクイザルＴＩＭ３と結合する。
【０１７９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、腫瘍において、例えば、Ｔ細胞を活性化することによって、免疫応答を刺激または増強する。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、ＴＩＭ３によって媒介されるＴ細胞阻害性活性の阻害により生じ得る、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）分泌の増強および／または増殖の増強によって明らかなように、細胞を活性化または共刺激し得る。特定の実施形態では、ＴＩＭ３抗体によるＴ細胞活性化または共刺激は、ＣＤ３刺激の存在下において生じる。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞および／またはヒトＴＩＭ３を発現するＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）において測定される場合、ＩＦＮ−γ分泌を、５０％、１００％（すなわち、２倍）、３倍、４倍、５倍またはそれ以上増大させ、最大１０倍、３０倍、１００倍増大させてもよい。
【０１８０】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、細胞、例えば、ＣＨＯ細胞またはヒトＴＩＭ３を発現する活性化Ｔ細胞において、例えば、１０μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０.０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、０.１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌまたは０.１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌのＥＣ５０で、ホスファチジルセリンのヒトＴＩＭ３との結合を阻害する。
【０１８１】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３の細胞外部分、例えば、細胞外領域のＩｇ様ドメイン、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸２２〜２０２内のエピトープ、例えば、コンホメーションエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２８６）のアミノ酸２２〜１２０または成熟ヒトＴＩＭ３（配列番号２９０）の１〜９９内に位置するエピトープと結合する（実施例を参照のこと）。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３のアミノ酸残基３７〜４３（CPVFECG、配列番号２９６；図２０を参照のこと）に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８〜６４からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３のアミノ酸残基９０〜９９（RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２０を参照のこと）に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１〜１２０からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８〜６４（CPVFECG、配列番号２９６）からなる領域からなる領域もしくはその中のエピトープと結合するか、または配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１〜１２０（RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２０を参照のこと）からなる領域もしくはその中のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３のアミノ酸残基５７〜８３（WTSRYWLNGDFR、配列番号２９７；図２０を参照のこと）に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸７８〜８９からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。
【０１８２】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３のものと実質的に同一のエピトープ、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上を含むエピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、３Ｇ４のものと実質的に同一のエピトープ、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上を含むエピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１７Ｃ３のものと実質的に同一のエピトープ、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上を含むエピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９のものと実質的に同一のエピトープ、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上を含むエピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９のものと実質的に同一のエピトープ、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上を含むエピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０１８６】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３との結合について、本明細書に記載されるＣＤＲまたは可変領域、例えば、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、およびＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかのものを含む抗ＴＩＭ３抗体と競合する（またその結合を阻害する）。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかの、ヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。特定の実施形態では、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかの、ヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する（例えば、両方の方向で競合する）。
【０１８７】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、以下の特性：
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３（配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる）のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または全てを有する。
【０１８８】
したがって、当技術分野で公知および本明細書に記載される手法に従って判定されるこれらの機能的特性（例えば、生化学活性、免疫化学活性、細胞活性、生理学活性または他の生物活性など）の１つ以上を示す抗体は、特定の活性において、抗体の不在時（または例えば、無関係な特異性の対照抗体が存在する場合）に見られるものと比べた統計学的に有意な相違を示すことが理解される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体に誘導される、所与のアッセイにおいて測定されるパラメーター（例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生）の増大は、統計学的に有意な、測定されるパラメーターの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％（すなわち、２倍）、３倍、５倍または１０倍の増大を達成し、特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、測定されるパラメーターを、抗体の不在下において行われる同一のアッセイと比べて、例えば、９２％超、９４％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、１００％（すなわち、２倍）、３倍、５倍または１０倍増大させ得る。対照的に、抗ＴＩＭ３抗体に誘導される、所与のアッセイにおいて測定されるパラメーター（例えば、腫瘍体積、ＴＩＭ３−ＬのヒトＴＩＭ３との結合）の減少は、統計学的に有意な、測定されるパラメーターの少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の減少を達成し、特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、測定されるパラメーターを、抗体の不在下において行われる同一のアッセイと比べて、例えば、９２％超、９４％超、９５％超、９７％超、９８％超または９９％超で減少させ得る。
【０１８９】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む、種々の種のＴＩＭ３に対する抗体の結合能力を評価するための標準アッセイは、当技術分野で公知である。好適なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）もまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析などの当技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。ＴＩＭ３の機能的特性（例えば、リガンドの結合、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生）に対する抗体の効果を評価するためのアッセイは、以下および実施例においてさらに詳細に記載されている。
【０１９０】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、天然の抗体ではない、または天然に存在する抗体ではない。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、より多い、より少ないもしくは異なる種類の翻訳後修飾を有するなど、天然に存在する抗体のものとは異なる翻訳後修飾を有する。
【０１９１】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２：Ｔ細胞の共培養実験における抗ＴＩＭ３抗体の交差結合において判定される場合、そのような抗体は、抗ＴＩＭ３単独を上回って活性を増強せず、アゴニスト活性を有さない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、アゴニスト活性を促進することなく、ＴＩＭ３とそのリガンドとの相互作用を遮断する。
【０１９２】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＬＰＳで処置した単球または樹状細胞からのＩＬ−１２産生を増強する。
【０１９３】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＰＤ−１およびＴＩＭ３を共発現する腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を併用処置によって復活させ、したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を回避する。
【０１９４】
ＩＩ. 例示的な抗ＴＩＭ３抗体
本明細書に記載される特定の抗ＴＩＭ３抗体は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかのＣＤＲおよび／または可変領域配列を有し、本明細書に記載されるように単離され構造的に特徴付けられた、抗体、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体および／またはヒト抗体、ならびにそれらの可変領域またはＣＤＲ配列との少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性）を有する抗体である。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４〜４０に記載されている。１３Ａ３、８Ｂ９および９Ｆ６の突然変異バージョンのＶＨアミノ酸配列は、配列番号１１２〜１２１および３６４に記載されている。１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４のＶＬアミノ酸配列は、配列番号６０に記載されている。８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ８のＶＬアミノ酸配列は、配列番号６１に記載されている。９Ｆ６のＶＬアミノ酸配列は、配列番号６１、６２および６３に記載されている。１３Ａ３、８Ｂ９および９Ｆ６の突然変異バージョンのＶＬアミノ酸配列は、対応する非突然変異型抗体のものである。配列番号の同一性の概要は、図１３に提供される。
【０１９５】
したがって、重鎖可変領域が配列番号３４〜４０、１１２〜１２１および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０１９６】
また、軽鎖可変領域が配列番号６０〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、提供される。
【０１９７】
（ａ）それぞれ配列番号３４および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｂ）それぞれ配列番号３５および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｃ）それぞれ配列番号３６および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｄ）それぞれ配列番号３７および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｅ）それぞれ配列番号３８および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｆ）それぞれ配列番号３８および６２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｇ）それぞれ配列番号３８および６３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｈ）それぞれ配列番号３９および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｉ）それぞれ配列番号４０および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｊ）それぞれ配列番号１２１および６３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｋ）それぞれ配列番号１２０および６１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｌ）それぞれ配列番号１１２および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｍ）それぞれ配列番号１１３および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｎ）それぞれ配列番号１１４および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｏ）それぞれ配列番号１１５および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｐ）それぞれ配列番号１１６および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｑ）それぞれ配列番号１１７および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｒ）それぞれ配列番号１１８および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｓ）それぞれ配列番号１１９および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、または
（ｔ）それぞれ配列番号３６４および６０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離された抗ヒトＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０１９８】
抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８、もしくはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれか１つ、またはこれらの組合せの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ３のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１〜４４に記載されている。９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４５に記載されている。突然変異型１３Ａ３抗体（すなわち、ＴＩＭ３.１０〜ＴＩＭ３.１８）のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非突然変異型１３Ａ３抗体、すなわち、配列番号４１のものと同一である。突然変異型８Ｂ９抗体（すなわち、ＴＩＭ３.８）のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非突然変異型８Ｂ９抗体、すなわち、配列番号４２のものと同一である。突然変異型９Ｆ６抗体（すなわち、ＴＩＭ３.７）のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、非突然変異型９Ｆ６抗体、すなわち、配列番号４５のものと同一である。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６〜５２に記載されている。突然変異型１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１２２に記載されている。突然変異型１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１１およびＴＩＭ３.１２のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２３および１２４に記載されている。突然変異型１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１３およびＴＩＭ３.１６のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、非突然変異型１３Ａ３抗体、すなわち、配列番号４６のものである。突然変異型８Ｂ９抗体（すなわち、ＴＩＭ３.８）のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１２５に記載されている。突然変異型９Ｆ６抗体（すなわち、ＴＩＭ３.７）のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、非突然変異型９Ｆ６抗体、すなわち、配列番号４５のものと同一である。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３〜５９に記載されている。
【０１９９】
突然変異型１３Ａ３抗体（すなわち、ＴＩＭ３.１０〜ＴＩＭ３.１２のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非突然変異型１３Ａ３抗体、すなわち、配列番号５３のものである。突然変異型１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１３およびＴＩＭ３.１８のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２６に記載されている。突然変異型１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１５およびＴＩＭ３.１７のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２８に記載されている。突然変異型１３Ａ３抗体ＴＩＭ３.１４およびＴＩＭ３.１６のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２７および１２９に記載されている。突然変異型８Ｂ９抗体（すなわち、ＴＩＭ３.８）のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非突然変異型８Ｂ９抗体、すなわち、配列番号５４のものである。突然変異型９Ｆ６抗体（すなわち、ＴＩＭ３.７）のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、非突然変異型９Ｆ６抗体、すなわち、配列番号５７のものと同一である。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３〜５９に記載されている。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６４に記載されている。９Ｆ６のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６４および６５に記載されている。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６６に記載されている。９Ｆ６のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６６および６７に記載されている。１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６８に記載されている。８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ８のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６９に記載されている。９Ｆ６のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６９、７０および７１に記載されている。突然変異型１３Ａ３、８Ｂ９および９Ｆ６のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列は、対応する非突然変異型抗体のものである。図１３は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体のＣＤＲの配列番号の一覧を提供する。
【０２００】
ＣＤＲ領域は、カバットシステム（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を使用して表記される。カバットシステムは、ＥＵ指数またはＥＵ番号付けシステムと称されるスキームの最も一般的な番号付けシステムであり、シーケンシングされた最初のＩｇＧ（ＥＵ抗体、Edelman et al. 1969）の順次の番号付けに基づく。本明細書において開示されるカバットの番号付けスキームに基づいて、抗体の番号付けを、当技術分野において公知の他のシステム、例えば、Ｃｈｏｔｉａ、ＩＭＧＴ、Ｍａｒｔｉｎ（強化型Ｃｈｏｔｈｉａ）またはＡＨｏ番号付けスキームに変換することができる。
【０２０１】
これらの抗体のそれぞれがヒトＴＩＭ３と結合すること、および抗原結合特異性が、主に、ＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考慮すると、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列、例えば、図１３のものは、本明細書に記載される他の抗ＴＩＭ３結合分子を作製するために、「混合および対応させる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合および対応させることができるが、それぞれの抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有しなければならない）。このような「混合および対応させた」抗体のＴＩＭ３結合は、上記および実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。いくつかの実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合および対応させる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列が、構造的に類似のＣＤＲ配列と置換されている。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合および対応させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列が、構造的に類似のＣＤＲ配列と置換されている。新規なＶＨおよびＶＬ配列を、１以上のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列をモノクローナル抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、およびＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれか１つに関して本明細書に開示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似の配列と置換することによって作製できることが、当業者には容易に明らかであると予想される。
【０２０２】
（ａ）配列番号４１〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４６〜５２および１２２〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５３〜５９および１２６〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号６４〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号６６〜６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、ならびに
（ｆ）配列番号６８〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、単離された抗ヒトＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供され、ここで、抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する。
【０２０３】
一実施形態では、抗ヒトＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、
（ａ）配列番号４１、４６、５３、
（ｂ）配列番号４２、４７、５４、
（ｃ）配列番号４３、４８、５５、
（ｄ）配列番号４４、４９、５６、
（ｅ）配列番号４５、５０、５７、
（ｆ）配列番号４５、５１、５８、
（ｇ）配列番号４５、５２、５９、
（ｈ）配列番号４１、１２２、５３、
（ｉ）配列番号４１、１２３、５３、
（ｊ）配列番号４１、１２４、５３、
（ｋ）配列番号４１、４６、１２６、
（ｌ）配列番号４１、４６、１２７、
（ｍ）配列番号４１、４６、１２８、
（ｎ）配列番号４１、４６、１２９、
（ｏ）配列番号４１、１２２、１２８、または
（ｐ）配列番号４１、１２２、１２６
を含み、ここで、抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、抗ヒトＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、
（ａ）配列番号６４、６６、６８、
（ｂ）配列番号６４、６６、６９、
（ｃ）配列番号６５、６７、７０、または
（ｄ）配列番号６４、６６、７１
を含み、ここで、抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する。
【０２０５】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、４６、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、１２２、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ３）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、１２３、５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ４）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、１２４,５３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ５）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、４６、１２６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ６）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、４６、１２７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ７）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、４６、１２８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ８）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、４６、１２９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ９）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、１２２、１２８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ａ１０）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４１、１２２、１２６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含む、
（ｂ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４２、４７、５４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｂ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４２、１２５、５４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４３、４８、５５を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含む、または
（ｄ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４４、４９、５６を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含み、
（ｅ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含み、
（ｆ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、７１を含み、
（ｇ１）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６５、６７、７０を含み、
（ｇ２）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、７１を含み、
（ｇ３）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５０、５７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含み、
（ｈ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５１、５８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６８を含み、または
（ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、５２、５９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６４、６６、６９を含み、
ここで、抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する。
【０２０６】
本明細書に記載されるＶＨドメインまたはその１つもしくは複数のＣＤＲは、重鎖、例えば、全長重鎖を形成するために、定常ドメインと連結され得る。同様に、本明細書に記載されるＶＬドメインまたはその１つもしくは複数のＣＤＲは、軽鎖、例えば、全長軽鎖を形成するために、定常ドメインと連結され得る。全長重鎖［Ｃ末端リシン（Ｋ）またはＣ末端グリシンおよびリシン（ＧＫ）は、不在であってもよいため、除外する］ならびに全長軽鎖が、組み合わさって、全長抗体が形成される。
【０２０７】
本明細書に記載されるＶＨドメインは、天然に存在するか、または例えば、本明細書にさらに記載されるように修飾されているかのいずれかである、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインに融合され得る。例えば、ＶＨドメインは、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、定常領域、例えば、以下の野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインのアミノ酸配列：
【化５】
2019533981.tif 000006
（配列番号２９１）
または配列番号２９１のアロタイプ変異体のものに融合された、本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得、以下のアミノ酸配列：
【化６】
2019533981.tif 000007
（配列番号２７７、アロタイプ特異的アミノ酸残基は、太字および下線で示す）を有し得る。
【０２０８】
抗ＴＩＭ３抗体のＶＨドメインは、エフェクターレス定常領域、例えば、以下のエフェクターレスヒトＩｇＧ１定常ドメインアミノ酸配列：
【化７】
2019533981.tif 000008
（配列番号２９４、「ＩｇＧ１.１ｆ」、下線で示される置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む）
または
【化８】
2019533981.tif 000009
（配列番号２９５、「ＩｇＧ１.３ｆ」、下線で示される置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む）に融合された、本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【０２０９】
例えば、ＩｇＧ１のアロタイプ変異体は、Ｋ９７Ｒ、Ｄ２３９Ｅおよび／またはＬ２４１Ｍ（上記において下線および太字で示される）を含み、配列番号２７７、２９４および２９５におけるものに従って番号付けされる。全長重鎖領域内、例えば、８Ｃ４（配列番号３）で、ＥＵ番号付けによると、これらのアミノ酸置換は、Ｋ２１４Ｒ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍと番号付けされる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体の定常領域は、配列番号２７７、２９４および２９５における番号付けでアミノ酸Ｌ１１７、Ａ１１８、Ｇ１２０、Ａ２１３およびＰ２１４（上記において下線で示される）、またはＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ａ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０およびＰ３３１に、１以上の突然変異または置換をさらに含み得る。さらなる実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体の定常領域は、配列番号２９１のアミノ酸Ｌ１１７Ａ、Ａ１１８Ｅ、Ｇ１２０Ａ、Ａ２１３ＳおよびＰ２１４Ｓ、またはＥＵ番号付けによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓに、１以上の突然変異または置換を含む。抗ＴＩＭ３抗体の定常領域はまた、配列番号２９１のＬ１１７Ａ、Ａ１１８ＥおよびＧ１２０Ａ、またはＥＵ番号付けによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａに、１以上の突然変異または置換を含んでもよい。
【０２１０】
あるいは、抗ＴＩＭ３抗体のＶＨドメインは、ヒトＩｇＧ４定常領域、例えば、以下のヒトＩｇＧ４アミノ酸配列またはその変異体：
【化９】
2019533981.tif 000010
（配列番号２９２、Ｓ２２８Ｐを含む）に融合した、本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【０２１１】
本明細書に記載されるＶＬドメインは、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインに融合され得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体のＶＬドメインは、以下のヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列：
【化１０】
2019533981.tif 000011
（配列番号２７８）に融合した、本明細書に記載される任意のＶＬドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【０２１２】
特定の実施形態では、重鎖定常領域は、Ｃ末端にリシンまたは別のアミノ酸を含み、例えば、それは、重鎖において、以下の最後のアミノ酸：ＬＳＰＧＫ（配列番号２７９）を含む。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、Ｃ末端における１以上のアミノ酸が欠如しており、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ（配列番号２８０）またはＬＳＰ（配列番号２８１）を有する。
【０２１３】
例示的な重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、重鎖については配列番号１〜２８、７２〜１１１、３０１〜３５４に対応し、軽鎖については配列番号２９〜３０および３２〜３３に対応する。
【０２１４】
（ａ１）それぞれ配列番号３０１（もしくは３０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２）それぞれ配列番号１（もしくは８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３）それぞれ配列番号１５（もしくは２２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ４）それぞれ配列番号３０３（もしくは３０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ５）それぞれ配列番号７２（もしくは８２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ６）それぞれ配列番号９２（もしくは１０２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ７）それぞれ配列番号３０５（もしくは３０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ８）それぞれ配列番号７３（もしくは８３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ９）それぞれ配列番号９３（もしくは１０３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１０）それぞれ配列番号３０７（もしくは３０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１１）それぞれ配列番号７４（もしくは８４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１２）それぞれ配列番号９４（もしくは１０４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１３）それぞれ配列番号３０９（もしくは３１０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１４）それぞれ配列番号７５（もしくは８５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１５）それぞれ配列番号９５（もしくは１０５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１６）それぞれ配列番号３１１（もしくは３１２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１７）それぞれ配列番号７６（もしくは８６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１８）それぞれ配列番号９６（もしくは１０６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ１９）それぞれ配列番号３１３（もしくは３１４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２０）それぞれ配列番号７７（もしくは８７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２１）それぞれ配列番号９７（もしくは１０７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２２）それぞれ配列番号３１５（もしくは３１６）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２３）それぞれ配列番号７８（もしくは８８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２４）それぞれ配列番号９８（もしくは１０８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２５）それぞれ配列番号３１７（もしくは３１８）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２６）それぞれ配列番号７９（もしくは８９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２７）それぞれ配列番号９９（もしくは１０９）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２８）それぞれ配列番号３１９（もしくは３２０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ２９）それぞれ配列番号３４９（もしくは３５０）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３０）それぞれ配列番号３５１（もしくは３５２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ａ３１）それぞれ配列番号３５３（もしくは３５４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ１）それぞれ配列番号３２１（もしくは３２２）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ２）それぞれ配列番号２（もしくは９）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ３）それぞれ配列番号１６（もしくは２３）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ４）それぞれ配列番号３２３（もしくは３２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ５）それぞれ配列番号８０（もしくは９０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ６）それぞれ配列番号１００（もしくは１１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｂ７）それぞれ配列番号３２５（もしくは３２６）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ１）それぞれ配列番号３２７（もしくは３２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ２）それぞれ配列番号３（もしくは１０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ３）それぞれ配列番号１７（もしくは２４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｃ４）それぞれ配列番号３２９（もしくは３３０）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ１）それぞれ配列番号３３１（もしくは３３２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ２）それぞれ配列番号４（もしくは１１）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ３）それぞれ配列番号１８（もしくは２５）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｄ４）それぞれ配列番号３３３（もしくは３３４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.１）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３２を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.２）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ１.３）それぞれ配列番号３３５（もしくは３３６）および３１を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ２）それぞれ配列番号５（もしくは１２）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ３）それぞれ配列番号１９（もしくは２６）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ４）それぞれ配列番号３３７（もしくは３３８）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ５）それぞれ配列番号８１（もしくは９１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ６）それぞれ配列番号１０１（もしくは１１１）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｅ７）それぞれ配列番号３３９（もしくは３４０）および３３を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ１）それぞれ配列番号３４１（もしくは３４２）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ２）それぞれ配列番号６（もしくは１３）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ３）それぞれ配列番号２０（もしくは２７）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｆ４）それぞれ配列番号３４３（もしくは３４４）および２９を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ１）それぞれ配列番号３４５（もしくは３４６）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ２）それぞれ配列番号７（もしくは１４）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、
（ｇ３）それぞれ配列番号２１（もしくは２８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列、または
（ｇ４）それぞれ配列番号３４７（もしくは３４８）および３０を含む重鎖および軽鎖配列
を含む、単離された抗ヒトＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供され、ここで、抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する。
【０２１５】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、本明細書において、例えば、前の段落において記載される重鎖および軽鎖配列の組合せを含み、ここで、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、さらに、２つの重鎖を一緒に連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含み得る。抗体はまた、軽鎖のそれぞれを、重鎖のそれぞれと連結するジスルフィド結合も含み得る。
【０２１６】
本明細書に記載される重鎖または軽鎖（またはそれらの可変領域）のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖、例えば配列番号１〜３３、７２〜１１１、および３０１〜３５４は、所望される特徴、例えば、本明細書にさらに記載されるものを有する抗ヒトＴＩＭ３抗体を形成するために使用され得る。例示的な変異体は、例えば、定常ドメインにアロタイプ変異を含むもの、および／または可変領域もしくは定常領域に突然変異、例えば、本明細書において開示される突然変異を含むものである。本明細書に記載される重鎖または軽鎖（またはそれらの可変領域）のいずれかと多くとも１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が（置換、付加または欠失により）異なるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖は、所望される特徴、例えば、本明細書にさらに記載されるものを有する抗ヒトＴＩＭ３抗体を形成するために使用され得る。
【０２１７】
種々の実施形態では、上記の抗体は、以下の機能的特性：
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上または全てを示す。
【０２１８】
このような抗体には、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体が含まれる。
【０２１９】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、コンホメーションエピトープと結合する。
【０２２０】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：
SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMND（配列番号２９９）内のアミノ酸残基と結合し、これは、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）のアミノ酸残基１〜９９または配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸２２〜１２０に対応する、
【０２２１】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：CPVFECG（配列番号２９６）内のアミノ酸残基と結合し、これは、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）のアミノ酸残基３７〜４３に対応する。
【０２２２】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）内のアミノ酸残基と結合し、これは、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）のアミノ酸残基５７〜８３に対応する。
【０２２３】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：RIQIPGIMND（配列番号２９８）内のアミノ酸残基と結合し、これは、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）のアミノ酸残基９０〜９９に対応する。
【０２２４】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４およびＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８の１以上のものと同一の、野生型および突然変異型ヒトＴＩＭ３との結合パターンを有する。一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：CPVFECG（配列番号２９６）、WTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLAD（配列番号２９７）および／またはRIQIPGIMND（配列番号２９８）内のアミノ酸残基と結合する。
【０２２５】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、（１）49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）または（２）40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６９）、66VVLRTDERDVNY77（配列番号３７０）、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95（配列番号３７１）、110CRIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３７２）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ｈＴＩＭ３のアミノ酸残基４０〜６２および１１１〜１２７の領域と相互作用するが、他の領域、例えば、アミノ酸残基Ｙ４０に対してＮ末端側である領域、アミノ酸残基Ｅ６２とＲ１１１との間に位置する領域、およびアミノ酸残基Ｌ１２７に対してＣ末端側である領域とは有意に相互作用しない。
【０２２６】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる］の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、抗体は、（１）49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）または（２）40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６９）、66VVLRTDERDVNY77（配列番号３７０）、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95（配列番号３７１）、110CRIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３７２）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合する。
【０２２７】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３または１３Ａ３のものと同様の、野生型および突然変異型ヒトＴＩＭ３との結合パターンを有する、すなわち抗体は、
（ｉ）ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、（１）49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合するが、例えば、（ａ）アミノ酸残基４９のＮ末端側に位置する配列を有するペプチド、（ｂ）アミノ酸残基６２と１１１との間に位置する配列［例えば、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95（配列番号３７１）］を有するペプチドおよび（ｃ）アミノ酸残基１２７のＣ末端側に位置する配列を有するペプチドとは有意に結合しない、
（ｉｉ）例えば、酵母表面提示法によって判定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、以下のアミノ酸突然変異：Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）による番号付け］の１つもしくは複数を有するヒトＴＩＭ３と結合することができないかもしくはヒトＴＩＭ３との有意に低減された結合を有する、ならびに／または
（ｉｉｉ）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５、１０、１５、２０個もしくは全てと相互作用する、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域を有する［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる］。
【０２２８】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号７２〜１１１、３０５〜３５４、３２５〜３２６および３３９〜３４０からなる群から選択され、ならびに／または軽鎖は、配列番号２９〜３３からなる群から選択される。
【０２２９】
本明細書においてさらに考察されるように、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、またはそれらの組合せおよび／もしくはそれらの修飾形のものであり得る。抗ＴＩＭ３抗体は、エフェクター機能を有してもよく、または低減されたエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有さなくてもよい。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、増強された特性を抗体に提供する修飾された重鎖定常領域を含む。
【０２３０】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号７２〜１１１および３４９〜３５２からなる群から選択され、ならびに／または軽鎖は、配列番号２９〜３３からなる群から選択される。
【０２３１】
ＩＩＩ. 特定の生殖系列配列を有する抗体
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む。
【０２３２】
本明細書に示されるように、ヒト生殖系列ＶＨ  ４−３９遺伝子、ＶＨ  ４−５９遺伝子、ＶＨ  １−４６遺伝子、ＶＨ  ３−１１遺伝子、ＶＨ  ４−１７遺伝子、ＶＨ  ３−１０遺伝子、ＶＨ  ６−１９遺伝子、ＶＨ  ６−１３遺伝子、ＶＨ  ＪＨ５ｂ遺伝子および／またはＶＨ  ＪＨ６ｂ遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、ＴＩＭ３に特異的なヒト抗体を調製した。したがって、ＶＨ  ４−３９、ＶＨ  ４−５９、ＶＨ  １−４６、ＶＨ  ３−１１、ＶＨ  ４−１７、ＶＨ  ３−１０、ＶＨ  ６−１９、ＶＨ  ６−１３、ＶＨ  ＪＨ５ｂ、ＶＨ  ＪＨ６ｂ、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるヒトＶＨ生殖系列遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０２３３】
ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７遺伝子、ＶＫ  ＪＫ５遺伝子、ＶＫ  ＪＫ４遺伝子、ＶＫ  Ｌ１８遺伝子、および／またはＶＫ  ＪＫ１遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、ＴＩＭ３に特異的なヒト抗体を、調製した。したがって、ＶＫ  Ａ２７、ＶＫ  ＪＫ５、ＶＫ  ＪＫ４、ＶＫ  Ｌ１８、ＶＫ  ＪＫ１およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるヒトＶＫ生殖系列遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０２３４】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、図に示されるように、上記に列挙されたヒト生殖系列ＶＨ遺伝子の１つの産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、上記に列挙されたヒト生殖系列ＶＫ遺伝子の１つの産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域も含むものを含む。
【０２３５】
抗体の可変領域が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合には、本明細書において、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるまたはそれに「由来する」重鎖および軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、対象の抗原を用いて免疫処置することまたは対象の抗原を用いてファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物である」またはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することおよびヒト抗体の配列に対して配列が最も近い（すなわち、最大同一性パーセント）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することなどによって同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物である」またはそれに「由来する」ヒト抗体は、生殖系列配列と比較した場合に、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な誘導によるアミノ酸の相違を含有し得る。しかし、選択されたヒト抗体は、通常、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、その他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合に、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。通常、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から１０個以下のアミノ酸の相違を示す。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、またはさらに４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【０２３６】
ＩＶ. 相同な抗体
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体が、本明細書において包含され、ここで、この抗体は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の所望される機能的特性を保持する。
【０２３７】
例えば、単離された抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得、ここで、
（ａ）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３４〜４０、１１２〜１２１および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号３４〜４０、１１２〜１２１、および３６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含み、ここで、重鎖可変領域は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の１つのＣＤＲ配列を含んでもよく、
（ｂ）軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号６０〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号６０〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の１つのＣＤＲ配列を含んでもよく、
（ｃ）抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合し、
（ｄ）抗体は、以下の機能的特性：
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または全てを示す。
【０２３８】
種々の実施形態では、抗体は、上記の（１）から（１６）として列挙された機能的特性の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０２３９】
単離された抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み得、ここで、
（ａ）重鎖は、配列番号１〜２８、７２〜１１１および３４９〜３５２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号１〜２８、７２〜１１１および３４９〜３５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含むが、ただし、特定の実施形態では、配列が、エフェクターレス重鎖のものである場合、重鎖をエフェクターレスにしている突然変異は、ＩｇＧ１.１定常領域については修飾されず（例えば、Ｒ２１４、Ａ２３４、Ｅ２３５、Ａ２３７、Ｓ３３０およびＳ３３１に対して修飾は行われない）、ＩｇＧ１.３定常領域についてはＲ２１４、Ａ２３４およびＥ２３５に対して修飾は行われないことを条件とし、ここで、重鎖可変領域は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の１つのＣＤＲ配列を含んでもよく、
（ｂ）軽鎖は、配列番号２９〜３１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号２９〜３１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の１つのＣＤＲ配列を含んでもよく、
（ｃ）抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合し、
（ｄ）抗体は、以下の機能的特性：
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３（配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる）のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または全てを示す。
【０２４０】
１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかの対応するＣＤＲとは、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）が異なるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３を含む抗ＴＩＭ３抗体もまた、提供される。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかにおける対応する配列と比べて、ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのそれぞれに、１〜５個のアミノ酸の変更を含む。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８におけるＣＤＲと比べて、全てのＣＤＲにわたり、合計で１〜５個のアミノ酸の変更を含む。
【０２４１】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３のものからなるＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸の１以上は、本明細書に開示されるその他の抗ＴＩＭ３抗体の１つのものである。
【０２４２】
例えば、特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＳＲＳＹＹＷＧ（配列番号４１）と比べて１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨ  ＣＤＲ１を含み、例えば、以下の縮重配列（degenerate sequence）：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＸ５Ｘ６（配列番号２８２）を含み得、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸、例えば、Ｓまたは不在であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸、例えば、Ｒまたは不在であり、Ｘ３は、任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＲまたはＤであり、Ｘ４は、任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＨであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸、例えば、ＷまたはＭであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＨである。
【０２４３】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、SIYYSGFTYYNPSLKS（配列番号４６）と比べて１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨ  ＣＤＲ２を含み、例えば、以下の縮重配列：Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２８３）を含み得、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、Ｙ、ＩまたはＦであり、Ｘ２は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＳであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｐ、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ４は、任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸、例えば、Ｆ、ＳまたはＤであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＴまたはＩであり、Ｘ７は、任意のアミノ酸、例えば、Ｉまたは不在であり、Ｘ８は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、ＮまたはＩであり、Ｘ９は、任意のアミノ酸、例えば、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＡであり、Ｘ１０は、任意のアミノ酸、例えば、Ｐ、Ｓ、ＱまたはＤであり、Ｘ１１は、任意のアミノ酸、例えば、ＳまたはＫであり、Ｘ１２は、任意のアミノ酸、例えば、Ｌ、ＦまたはＶであり、Ｘ１３は、任意のアミノ酸、例えば、ＫまたはＱであり、Ｘ１４は、任意のアミノ酸、例えば、ＳまたはＧである。
【０２４４】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、GGPYGDYAHWFDP（配列番号５３）と比べて１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、例えば、以下の縮重配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＹＧＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号２８４）を含み得、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸、例えば、Ｄ、Ｅまたは不在であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸、例えば、Ｆ、Ｇまたは不在であり、Ｘ３は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙまたは不在であり、Ｘ４は、任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、Ｓまたは不在であり、Ｘ５は、任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、ＴまたはＳであり、Ｘ６は、任意のアミノ酸、例えば、ＧまたはＳであり、Ｘ７は、任意のアミノ酸、例えば、Ｎ、Ｗまたは不在であり、Ｘ８は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｓ、Ｅまたは不在であり、Ｘ９は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙまたは不在であり、Ｘ１０は、任意のアミノ酸、例えば、ＰまたはＹであり、Ｘ１１は、任意のアミノ酸、例えば、Ｄまたは不在であり、Ｘ１２は、任意のアミノ酸、例えば、Ｙまたは不在であり、Ｘ１３は、任意のアミノ酸、例えば、Ａまたは不在であり、Ｘ１４は、任意のアミノ酸、例えば、Ｈまたは不在であり、Ｘ１５は、任意のアミノ酸、例えば、Ｗまたは不在であり、Ｘ１６は、任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＭであり、Ｘ１７は、任意のアミノ酸、例えば、ＤまたはＥであり、Ｘ１８は、任意のアミノ酸、例えば、Ｐ、Ｉ、Ｖ、ＹまたはＬである。
【０２４５】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号５３〜５９および１２６〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【０２４６】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号６４または配列番号６５に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１を含む。
【０２４７】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号６６または配列番号６７に記載されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２を含む。
【０２４８】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、QQYGSSPIT（配列番号６８）と比べて１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含み、例えば、以下の縮重配列：ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｔ（配列番号２８５）を含み得、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＹであり、Ｘ２は、任意のアミノ酸、例えば、ＮまたはＧであり、Ｘ３は、任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＳであり、Ｘ４は、任意のアミノ酸、例えば、Ｐまたは不在であり、Ｘ５は、任意のアミノ酸、例えば、Ｉ、ＲまたはＬである。
【０２４９】
１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかのもの、例えば、それぞれ配列番号３４〜４０、１１２〜１２１もしくは３６４、および配列番号６０〜６３のＶＨおよびＶＬ領域、またはそれぞれ配列番号１〜２８、７２〜１１１、もしくは３４９〜３５２、および配列番号２９〜３３の重鎖および軽鎖、またはＣＤＲと相同性を有する配列を有する抗体は、配列番号１６７〜１７３および／もしくは配列番号１９３〜１９６または配列番号１３４〜１６１および／もしくは配列番号１６２〜１６６をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）、続いて、本明細書に記載される機能性アッセイを使用して、コードされた変更された抗体を保持機能（すなわち、上述の（１）から（１６）に記載される機能）に関して試験することによって、得ることができる。
【０２５０】
Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで、これらのＣＤＲ配列の１以上は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体（例えば、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれか）に基づく指定のアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾形態を含み、抗体は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の所望される機能的特性を保持する。したがって、単離された抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号５３〜５９および１２６〜１２９のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、重鎖可変領域は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の１つのＣＤＲ配列を含んでもよく、
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号６８〜７１のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の１つのＣＤＲ配列を含んでもよく、
（ｃ）抗体は、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合する、ならびに
（ｄ）抗体は、以下の特徴：
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のヒトＴＩＭ３との結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
の１、２、３、４、５、６、７、８、９または全てを示す。
【０２５１】
一実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号４６〜５２および１２２〜１２５のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号６６〜６７のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２５２】
別の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号４１〜４５のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号６４〜６５のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２５３】
種々の実施形態では、抗体は、上記の（１）から（１６）として列挙された機能的特性の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０２５４】
保存的アミノ酸置換は、ＣＤＲ以外の抗体の部分に行われてもよく、またはＣＤＲに加えて行われてもよい。例えば、保存的アミノ酸修飾は、フレームワーク領域またはＦｃ領域に行われてもよい。可変領域または重鎖もしくは軽鎖は、本明細書に提供される抗ＴＩＭ３抗体配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個または１〜５０個の保存的アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、保存的アミノ酸修飾および非保存的アミノ修飾の組合せを含む。
【０２５５】
ＶＩ.同一のエピトープと結合するかまたは結合に関して競合する抗体
ヒトＴＩＭ３との結合について、本明細書に記載される特定の抗ＴＩＭ３抗体の１種または複数（例えば、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４および／またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８）と競合する抗体もまた、本明細書において提供される。このような競合抗体は、標準ＴＩＭ３結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４および／またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８の１つ以上のヒトＴＩＭ３との結合を競合的に阻害するそれらの能力に基づいて、同定することができる。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用でき、これでは、組換えヒトＴＩＭ３タンパク質を、プレート上に固定化し、種々の濃度の非標識試験抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識された参照抗体を添加し、標識の量を測定する。増大する濃度の非標識（第１の）抗体（「遮断抗体」とも呼ばれる）が、標識された（第２の）抗体の結合を阻害する場合には、第１の抗体は、第２の抗体のプレート上の標的との結合を阻害するといわれるか、または第２の抗体の結合と競合するといわれる。さらに、またはあるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を実施して、抗体の競合する能力を評価してもよい。試験抗体の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体のＴＩＭ３との結合を阻害する能力は、試験抗体がヒトＴＩＭ３との結合について抗体と競合し得ることを実証する。
【０２５６】
したがって、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって、例えば、以下の段落に記載されるアッセイを使用して、測定される場合、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の、細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％阻害する、および／または細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のヒトＴＩＭ３とのその結合が、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％阻害される、抗ＴＩＭ３抗体もまた、本明細書において提供される。
【０２５７】
例えば、第１の抗体が、第２の抗体の結合を遮断する（すなわち、「それと競合する」）かどうかを判定するための例示的な競合実験は、実施例に記載されるように、または以下のように、行うことができる：活性化ヒトＴ細胞を、次のように調製する：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を使用してヒト全血から単離し、１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）（ＵＳＢｉｏｌ番号Ｐ３３７０−３０）および２００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ−２（Peprotech番号２００−０２）で、３日間活性化させる。活性化Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）中に再懸濁し、サンプルウェル１つにつき１０５個の細胞で、９６ウェルプレートに播種する。プレートを、氷上に設置した後、コンジュゲートしていない第１の抗体を、０〜５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度（３倍滴定を最も高い濃度５０μｇ／ｍｌから開始）で、添加する。無関係のＩｇＧを、第１の抗体のアイソタイプ対照として使用し、同じ濃度（３倍滴定を最も高い濃度５０μｇ／ｍＬから開始）で添加してもよい。５０μｇ／ｍＬの未標識の第２の抗体とともに予備インキュベートしたサンプルを、競合遮断（１００％阻害）の陽性対照として含めてもよく、一次インキュベート時に抗体を含まないサンプルを、陰性対照（競合なし、０％阻害）として使用してもよい。３０分間のインキュベーションの後に、標識した、例えば、ビオチン標識した第２の抗体を、１ウェル当たり２μｇ／ｍＬの濃度で、洗浄なしで添加する。サンプルを、氷上で、さらに３０分間インキュベートする。未結合の抗体を、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄することによって、除去する。細胞に結合した標識された第２の抗体を、標識を検出する薬剤、例えば、ビオチンを検出するためのＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジン（Invitrogen、カタログ番号Ｓ２１３８８）を用いて検出する。サンプルを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）で取得し、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ,  Ｉｎｃ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で分析する。結果は、阻害％として表すことができる（すなわち、それぞれの濃度における標識の量をブロッキング抗体なしで得られた標識の量で除し、１００％から差し引く）。典型的には、次いで、同じ実験を、逆で行う、すなわち、第１の抗体を第２の抗体にし、第２の抗体を第１の抗体にする。
【０２５８】
特定の実施形態では、抗体は、他の抗体の、標的、例えば、ヒトＴＩＭ３またはその部分との結合を、少なくとも部分的に（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または完全に（１００％）遮断し、これは、阻害が、一方の抗体が第１の抗体である場合に生じるかまたは他方の抗体が第１の抗体である場合に生じるかは関係ない。第１の抗体および第２の抗体は、両方の方向で、すなわち、第１の抗体が最初に添加される競合実験および第２の抗体が最初に添加される競合実験において、互いに競合する場合に、互いの、標的との結合を「交差遮断する」。
【０２５９】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、所与のエピトープマッピング技法によって判定される場合、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体（例えば、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４および／またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８）のものと同じエピトープと結合する。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を用いて「ＴＩＭ３上の同一エピトープ」と結合する抗体を調べる技術として、例えば、エピトープマッピング方法、例えば、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析が挙げられ、これは、エピトープの原子分解を提供する。その他の方法は、抗体の抗原断片または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、この場合、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、エピトープ成分を示すと考えられることが多い（図２０を参照のこと）。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。方法はまた、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、特異的な短いペプチド（天然の三次元形態または変性された形態のいずれか）を親和性単離する能力に頼る可能性がある。そこで、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングのために、コンホメーション的に不連続なエピトープをマッピングするために示されてきた計算アルゴリズムも開発された。
【０２６０】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体との結合について競合するか、またはそれと同じエピトープと結合する抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して同定され得る。例えば、本明細書に記載されるヒトＴＩＭ３を用いてマウスを免疫処置し、ハイブリドーマを産生し、得られたモノクローナル抗体を、ヒトＴＩＭ３との結合について本明細書に記載される抗体と競合する能力についてスクリーニングしてもよい。マウスは、抗体が結合するエピトープを含有するＴＩＭ３の小断片を用いることによっても免疫処置され得る。エピトープまたはエピトープを含む領域は、例えば、ＴＩＭ３に広がる一連の重複するペプチドとの結合についてスクリーニングすることによって位置特定され得る。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994の方法を使用して、同一エピトープを有する、したがって、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体に対して同様の特性を有する抗体の選択を導いてもよい。ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＴＩＭ３抗体の重鎖を、（ヒト）軽鎖のレパートリーと対形成して、ＴＩＭ３結合性抗体を選択し、次いで、新規軽鎖を（ヒト）重鎖のレパートリーと対形成して、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体と同一エピトープまたはエピトープ領域を有する（ヒト）ＴＩＭ３結合性抗体を選択する。あるいは、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発によって、本明細書に記載される抗体の変異体を得ることができる。
【０２６１】
Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085によって記載されるようなアラニンスキャニング突然変異誘発またはＴＩＭ３中のアミノ酸残基の点突然変異誘発のいくつかのその他の形態を使用して、ＴＩＭ３抗体の結合特徴を得ることもできる。
【０２６２】
特定の抗体の結合特徴はまた、抗体の、ＴＩＭ３の断片、例えば、非変性断片または変性断片を含むペプチドとの結合を評価することによって、決定することもできる。ＴＩＭ３（例えば、ヒトＴＩＭ３）の配列を包含する一連の重複するペプチドは、合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ法（ペプチドが、抗体の、マイクロタイタープレートのウェルと結合しているＴＩＭ３との結合を防ぐその能力について評価される）においてまたはチップ上で結合についてスクリーニングしてもよい。
【０２６３】
抗ＴＩＭ３抗体の結合特徴はまた、水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）およびタンパク質の迅速光化学酸化（Fast Photochemical Oxidation of Proteins）（ＦＰＯＰ）などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法によって得ることもできる。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、ＷＯ２０１５／１８７３５およびWei et al.(2014) Drug Discovery Today 19:95で記載されるように実施でき、その方法は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley and Gross (2005) J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057に記載されるように実施でき、その方法は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０２６４】
抗ＴＩＭ３抗体の結合特徴はまた、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリングおよび遊離している場合および対象の抗体との複合体中に結合されている場合には、ＴＩＭ３中の不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含めた核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などの構造的方法によって得ることもできる（Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistry 31:11335-11347、Zinn-Justin et al.(1993) Biochemistry 32:6884-6891）。
【０２６５】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ（例えば、Chayen (1997) Structure 5:1269-1274）、懸滴蒸気拡散（例えば、McPherson (1976) J.Biol.Chem.251:6300-6303）、シーディングおよび透析を含めた当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して達成され得る（例えば、Giege et al.(1994) Acta Crystallogr.D50:339-350;McPherson (1990) Eur.J.Biochem.189:1-23）。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００（ＰＥＧ；約１０００〜約２０,０００Ｄａの範囲の平均分子量）、約５０００〜約７０００Ｄａ、または約６０００Ｄａを含有する沈殿剤溶液中で最良に達成され得る。タンパク質分解防止剤、例えば、グリセロールを約０.５％〜約２０％の範囲の濃度で含むことが望ましいものであり得る。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適した塩はまた、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度の沈殿剤溶液中にあることが望ましいものであり得る。沈殿剤は、約３.０〜約５.０のｐＨに緩衝される。沈殿剤溶液において有用な特定のバッファーは、変わり得、当技術分野で周知である（Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York）。有用なバッファーの例として、それだけには限らないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸が挙げられる。結晶は２℃、４℃、８℃および２６℃を含めた様々な温度で成長させてもよい。
【０２６６】
抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ−ＰＬＯＲ（Yale University、1992、Molecular Simulations、Inc.によって配布された;例えば、Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号を参照のこと）およびＢＵＳＴＥＲ（Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth Enzymol. 276A:361-423; Carter & Sweet, eds.;Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323）、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６７】
抗ＴＩＭ３抗体は、エピトープマッピング技法、例えば、本明細書に記載される技法によって判定される場合、本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する抗ＴＩＭ３抗体のいずれかと同一のエピトープと結合し得る。
【０２６８】
本明細書において記載され、実施例において使用される方法の１つによって判定される、抗ＴＩＭ３抗体と同様の結合特徴を有する、ヒトＴＩＭ３および適宜カニクイザルＴＩＭ３と結合する抗体は、本明細書に包含される。
【０２６９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３の細胞外部分、例えば、細胞外領域のＩｇ様ドメインまたはＩｇＶドメイン、すなわち、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸２２〜１３０内のエピトープ、例えば、コンホメーションエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２８６）のアミノ酸２２〜１２０または成熟ヒトＴＩＭ３（配列番号２９０）の１〜９９内に位置するエピトープと結合する（実施例を参照のこと）。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３のアミノ酸残基３７〜４３（CPVFECG、配列番号２９６；図２０を参照のこと）に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８〜６４からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３のアミノ酸残基９０〜９９（RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２０を参照のこと）に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１〜１２０からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸５８〜６４（CPVFECG、配列番号２９６）からなる領域および配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸１１１〜１２０（RIQIPGIMND、配列番号２９８；図２０を参照のこと）からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、成熟ヒトＴＩＭ３のアミノ酸残基５７〜８３（WTSRYWLNGDFR、配列番号２９７；図２０を参照のこと）に対応する、配列番号２８６を有するヒトＴＩＭ３のアミノ酸７８〜８９からなる領域と結合するか、またはその中のエピトープと結合する。
【０２７０】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３のものと実質的に同一のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１およびＤ１２０の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３およびＤ１２０の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、３Ｇ４のものと実質的に同一のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｄ１０４、Ｇ１１６およびＭ１１８の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１７Ｃ３のものと実質的に同一のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４およびＧ１１６の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｄ１０４およびＧ１１６の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９のものと実質的に同一のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、８Ｂ９のものと実質的に同一のエピトープと結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上を含む、エピトープ（またはヒトＴＩＭ３の領域）と結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７およびＲ８９の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、配列番号２８６（図２０）のアミノ酸残基Ｌ４８、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９およびＤ１０４の１以上が、例えば、非保存的アミノ酸置換において、別のアミノ酸に変更されているヒトＴＩＭ３タンパク質とは、有意に結合しないかまたは有意に低減された結合親和性でしか結合しない。
【０２７４】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３との結合について、本明細書に記載されるＣＤＲまたは可変領域、例えば、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、およびＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかのものを含む抗ＴＩＭ３抗体と競合する（またその結合を阻害する）。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかの、ヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。特定の実施形態では、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかの、ヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかは、抗ＴＩＭ３抗体のヒトＴＩＭ３との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する（例えば、両方の方向で競合する）。
【０２７５】
ＶＩＩ. 遺伝子操作された、および修飾された抗体
修飾された抗体を遺伝子操作するために、出発材料として本明細書において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうち１種または複数を有する抗体を使用して調製され得る、遺伝子操作された、および修飾された抗体もまた提供され、この修飾された抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の、例えば、１以上のＣＤＲ領域内の、および／または１以上のフレームワーク領域内の１個または複数の残基を修飾することによって、遺伝子操作され得る。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能（単数または複数）を変更するために、定常領域（単数または複数）内の残基を修飾することによって遺伝子操作され得る。
【０２７６】
実施され得る１種の可変領域遺伝子操作として、ＣＤＲグラフティングがある。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天然に存在する抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033;Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと）。
【０２７７】
したがって、本明細書において記載される別の実施形態は、それぞれ配列番号４１〜４５、配列番号４６〜５２、１２２〜１２５、および配列番号５３〜５９、１２６〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、ならびに配列番号６４〜６５、配列番号６６〜６７、および配列番号６８〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.１８〜ＴＩＭ３.２のいずれか１つのＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含み、異なるフレームワーク配列をさらに含み得る。
【０２７８】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上でwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseにおいて利用可能）に、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" I. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見出すことができ、それらの各々の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される抗ＴＩＭ３抗体において使用するためのフレームワーク配列は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に同様であるものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域上にグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較した場合に１以上の突然変異を含有するフレームワーク領域上にグラフトされ得る。例えば、特定の場合には、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることが有益であることがわかっている（例えば、Queen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと）。
【０２８０】
本明細書に記載される遺伝子操作された抗ＴＩＭ３抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が行われているもの、例えば、９Ｆ６のアミノ酸１０７に突然変異が行われているものを含む。通常、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるよう行われる。例えば、１つのアプローチとして、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することがある。より詳しくは、体細胞突然変異を起こしている抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列に対して比較することによって同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、体細胞突然変異を生殖系列配列に「復帰突然変異する」ことができる。このような「復帰突然変異された」抗体も包含されるものとする。別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の免疫原性の可能性を低減するために、フレームワーク領域内の、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を突然変異することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Carr et alによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【０２８１】
別の種類の可変領域修飾は、それにより対象の抗体の１以上の結合特性（例えば、親和性）を改善するためにＶＨならびに／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、抗体結合または対象のその他の機能的特性に対して突然変異（単数または複数）および効果を導入でき、本明細書に記載され実施例において提供されるインビトロまたはインビボでのアッセイにおいて評価することができる。いくつかの実施形態では、保存的修飾（上記で論じられるような）が導入される。突然変異は、アミノ酸置換、付加、または欠失であり得る。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。
【０２８２】
したがって、
（ａ）配列番号４１〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４１〜４５と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号４６〜５２および１２２〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４６〜５２および１２２〜１２５と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、
（ｃ）配列番号５３〜５９および１２６〜１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５３〜５９および１２６〜１２９
と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ３領域、
（ｄ）配列番号６４〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６４〜６５と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ１領域、
（ｅ）配列番号６６〜６７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６６〜６７と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、ならびに
（ｆ）配列番号６８〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６８〜７１と比較して、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸配列、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ３領域
を含む、重鎖可変領域を含む、単離された抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体またはその抗原結合部分もまた、提供される。
【０２８３】
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基は、酸化され、その結果、化学的分解の可能性および結果としての抗体の効力の低減をもたらし得る。したがって、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ中の１個または複数のメチオニン残基は、酸化分解を受けないアミノ酸残基と置換されている抗ＴＩＭ３抗体もまた、提供される。一実施形態では、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれかのＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化分解を受けないアミノ酸残基と置換される。
【０２８４】
同様に、抗ＴＩＭ３抗体から、特に、ＣＤＲ中の脱アミド化部位も除去され得る。
【０２８５】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃと連結され得（例えば、共有結合によって連結されるか、または融合される）、これは、例えば、ＩｇＧ１の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１（ａ）、Ｇ１ｍ２（ｘ）、Ｇ１ｍ３（ｆ）、Ｇ１ｍ１７（ｚ）；ＩｇＧ２の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３（ｎ）；ＩｇＧ３の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１（ｇ１）、Ｇ３ｍ２８（ｇ５）、Ｇ３ｍ１１（ｂ０）、Ｇ３ｍ５（ｂ１）、Ｇ３ｍ１３（ｂ３）、Ｇ３ｍ１４（ｂ４）、Ｇ３ｍ１０（ｂ５）、Ｇ３ｍ１５（ｓ）、Ｇ３ｍ１６（ｔ）、Ｇ３ｍ６（ｃ３）、Ｇ３ｍ２４（ｃ５）、Ｇ３ｍ２６（ｕ）、Ｇ３ｍ２７（ｖ）およびＫ：Ｋｍ、Ｋｍ１、Ｋｍ２、Ｋｍ３であり得る（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。
【０２８６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３可変領域は、エフェクターレスまたは大部分がエフェクターレスのＦｃ、例えば、ＩｇＧ１と連結される。
【０２８７】
一般に、本明細書に記載される可変領域は、通常、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性などの、抗体の１以上の機能的特性を変更するために、１以上の修飾を含むＦｃと連結され得る。さらに、本明細書に記載される抗体は、化学的に修飾され得る（例えば、１以上の化学部分は、抗体と結合され得る）か、またはそのグリコシル化を変更するよう、抗体の１以上の機能的特性を変更するよう修飾され得る。これらの実施形態の各々は、以下に詳細に記載される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、カバットのＥＵ指数のものである。
【０２８８】
Ｆｃ領域は、定常領域の断片、類似体、変異体、突然変異体または誘導体を含む、免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを包含する。好適な免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどのその他のクラスが挙げられる。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンＣ末端領域と相同な天然に存在するポリペプチドまたは合成により産生されたポリペプチドとして定義され、これには、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインが、別個または組合せで含まれ得る。
【０２８９】
Ｉｇ分子は、複数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えば、ＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３つのクラスのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体との結合に重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置することが報告されている。抗体の血清半減期は、その抗体がＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する能力によって影響を受ける。
【０２９０】
特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、変異体Ｆｃ領域、例えば、親Ｆｃ配列（例えば、未修飾のＦｃポリペプチドであり、これが、後で修飾されて変異体が生成される）と比べて、望ましい構造的特性および／または生物学的活性を提供するように修飾されている（例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入によって）Ｆｃ配列である。
【０２９１】
一般に、定常領域またはその部分、例えば、ＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の突然変異ならびに／または多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異または１〜１０個もしくは１〜５個の突然変異を含み得るか、あるいは対応する野生型領域またはドメイン（それぞれＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）のものと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、ただし、特定の変異体を含む重鎖定常領域が、必要な生物活性を保持することを条件とする。
【０２９２】
例えば、親のＦｃに対して、（ａ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増大もしくは減少した、（ｂ）補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）が増大もしくは減少した、（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性が増大もしくは減少した、および／または（ｄ）Ｆｃ受容体に対する親和性が増大もしくは減少したＦｃ変異体を作製するために、Ｆｃ領域中に修飾を行ってもよい。このようなＦｃ領域変異体は、一般に、Ｆｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることは、特に望ましいと考えられる。例えば、変異体Ｆｃ領域は、中に、本明細書において同定される特定のＦｃ領域位置の２つ、３つ、４つ、５つなどの置換を含み得る。
【０２９３】
変異体Ｆｃ領域はまた、ジスルフィド結合の形成に関与するアミノ酸が、除去されるかまたはその他のアミノ酸と置換される、配列の変更も含み得る。そのような除去により、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を産生するために使用される宿主細胞に存在するその他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。システイン残基を除去した場合であっても、一本鎖Ｆｃドメインは、依然として、二量体Ｆｃドメインを形成することができ、これは、非共有結合的に一緒に保持される。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、選択された宿主細胞との適合性が高くなるように修飾され得る。例えば、典型的な天然のＦｃ領域のＮ末端の近傍のＰＡ配列を除去してもよく、これは、プロリンイミノペプチダーゼなど、大腸菌における消化酵素によって認識され得る。他の実施形態では、Ｆｃドメイン内の１以上のグリコシル化部位が、除去され得る。典型的にはグリコシル化されている残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解性応答をもたらし得る。そのような残基は、欠失させてもよく、または非グリコシル化残基（例えば、アラニン）と置換してもよい。他の実施形態では、Ｃ１ｑ結合部位など、補体との相互作用に関与する部位が、Ｆｃ領域から除去され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を、欠失または置換してもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体との結合に影響を及ぼす部位、好ましくは、サルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するよう修飾され得る。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野で公知である、例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)を参照のこと。変異体Ｆｃドメインの具体的な例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８に開示されている。
【０２９４】
一実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増大または減少されるように、修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５,６７７,４２５号にさらに記載されている。Ｆｃのヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にするように、または抗体の安定性を増大もしくは減少させるように、変更されている。一実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異される。より具体的には、抗体が、天然のＦｃ−ヒンジドメインのブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合と比べて、損傷されたＳｐＡ結合を有するように、１以上のアミノ酸突然変異が、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６,１６５,７４５号にさらに詳細に記載されている。
【０２９５】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変更するよう、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することによって変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対して低減した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力は保持するよう、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、３２２、３３０、および／または３３１から選択される１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換され得る。それに対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５,６２４,８２１号および同第５,６４８,２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０２９６】
別の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１個または複数のアミノ酸は、抗体が、変更されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基と置き換えられ得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６,１９４,５５１号にさらに詳細に記載されている。
【０２９７】
別の例では、アミノ酸位置２３１〜２３９内の１個または複数のアミノ酸残基が変更され、それによって、抗体が補体と結合する能力を変更する。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【０２９８】
さらに別の実施例では、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９で１個または複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低減するよう、および／またはＦｃγ受容体に対する親和性を低減するよう修飾され得る。例示的置換として、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的変異体として、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが挙げられる。ＦｃγＲおよび補体相互作用を増強するためのその他の修飾として、それだけには限らないが、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌが挙げられる。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
【０２９９】
Ｆｃγ受容体との結合を増大させるＦｃ修飾は、Ｆｃ領域のアミノ酸２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、２５８位、２６５位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７９位、２８０位、２８３位、２８５位、２９８位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３１２位、３１５位、３２４位、３２７位、３２９位、３３０位、３３５位、３３７位、３３８位、３４０位、３６０位、３７３位、３７６位、３７９位、３８２位、３８８位、３８９位、３９８位、４１４位、４１６位、４１９位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位または４３９位のうちの任意の１以上におけるアミノ酸修飾を含み、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、カバット（abat）におけるＥＵ指数のものである（ＷＯ００／４２０７２）。
【０３００】
Ｆｃに対して行われ得るその他のＦｃ修飾は、ＦｃγＲおよび／または補体タンパク質との結合を低減または除去し、それによって、Ｆｃ媒介性エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを低減または除去するためのものである。例示的な修飾としては、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位、３２８位、３３０位および／または３３１位（例えば、３３０位および３３１位）における置換、挿入および欠失が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、番号付けは、ＥＵ指数に従う。例示的な置換としては、２３４Ａ、２３５Ｅ、２３６Ｒ、２３７Ａ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、３３０Ｓおよび３３１Ｓ（例えば、３３０Ｓおよび３３１Ｓ）が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、番号付けは、ＥＵ指数に従う。Ｆｃ変異体は、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃγＲおよび補体の相互作用を低減するためのその他の修飾としては、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖ、ならびに突然変異誘発もしくは酵素的手段またはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物における産生による２９７位におけるグリコシル化の除去が挙げられる。これらおよびその他の修飾は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
【０３０１】
適宜、Ｆｃ領域は、当業者に公知の追加および／または代替的な位置に、非天然のアミノ酸残基を含み得る（例えば、米国特許第５,６２４,８２１号、同第６,２７７,３７５号、同第６,７３７,０５６号、同第６,１９４,５５１号、同第７,３１７,０９１号、同第８,１０１,７２０号、ＰＣＸ特許公開第ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０１／５８９５７、ＷＯ０２／０６９１９、ＷＯ０４／０１６７５０、ＷＯ０４／０２９２０７、ＷＯ０４／０３５７５２、ＷＯ０４／０７４４５５、ＷＯ０４／０９９２４９、ＷＯ０４／０６３３５１、ＷＯ０５／０７０９６３、ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４を参照のこと）。
【０３０２】
阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を増強するＦｃ変異体も使用され得る。このような変異体は、例えば、Ｂ細胞および単球を含めたＦｃγＲＩＩｂ細胞と関連する免疫調節性活性を有するＦｃ融合タンパク質を提供し得る。一実施形態では、Ｆｃ変異体は、１以上の活性化受容体と相対的に、ＦｃγＲＩＩｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を変更するための修飾として、ＥＵ指数に従って、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、３３０、３３１、および３３２からなる群から選択される位置での１以上の修飾が挙げられる。ＦｃγＲＩＩｂ親和性を増強するための例示的置換として、それだけには限らないが、２３４Ａ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ａ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、および３３２Ｅが挙げられる。例示的置換として、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙが挙げられる。ＦｃγＲＩＩｂとの結合を増強するためのその他のＦｃ変異体として、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆが挙げられる。
【０３０３】
Ｆｃ領域のそのリガンドに対する親和性および結合特性は、それだけには限らないが、平衡方法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析）および間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などのその他の方法を含めた、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ法（生化学または免疫学ベースのアッセイ）によって決定され得る。これらおよびその他の方法は、調べられている１種もしくは複数の成分上の標識を利用してもよく、および／またはそれだけには限らないが、クロマトグラフィー、蛍光、発光もしくは同位体標識を含めた種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論の詳細な説明は、抗体免疫原相互作用に焦点を当てる、Paul, W. E., ed., Fundamental immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見出すことができる。
【０３０４】
特定の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増大するよう修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増大することによって行うことができる。例えば、米国特許第６,２７７,３７５号に記載されるように、以下の残基のうちの１個または複数が、突然変異され得る：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。特定の例示的な置換としては、以下の１以上が挙げられる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓおよび／またはＴ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増大させるために、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５,８６９,０４６号および同第６,１２１,０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られたサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更され得る。ＦｃＲｎとの結合を増大し、および／または薬物動態特性を改善するその他の例示的変異体は、位置２５９、３０８、４２８、および４３４での置換を含み、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４１  １、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｘ１が挙げられる。ＦｃＲｎとのＦｃ結合を増大するその他の変異体として、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Hinton et al. 2004、J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216、Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604）、２５２Ｆ、２５２Ｔ２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３１、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524）が挙げられる。ＦｃＲｎ結合を調節するためのその他の修飾は、Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671に記載されている。
【０３０５】
特定の実施形態では、特定の生物学的特徴を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプを、使用することができる。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ１位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ３に由来するアミノ酸と置換することによって構築され得る。このようにして、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が、構築され得る。本明細書に記載されるその他の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ２位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ１に由来するアミノ酸と置換することによって、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体が構築され得る。このようにして、１以上の置換、例えば、以下のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（２３６位でのグリシンの挿入を指す）および３２７Ａのうち１以上を含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が構築され得る。
【０３０６】
さらに、ヒトＩｇＧ１におけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合部位が、マッピングされており、改善された結合を有する変異体が、説明されている（Shields, R.L. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照のこと）。２５６位、２９０位、２９８位、３３３位、３３４位および３３９位における特定の突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩとの結合を改善することが示された。加えて、組合せ突然変異体Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示されており、これらは、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合およびＡＤＣＣ活性を示すことが示されている（Shields et al., 2001）。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ突然変異を有する変異体を含めた、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合が強力に増強されたその他のＩｇＧ１変異体が同定されており、これは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の最大の増大、ＦｃγＲＩＩｂ結合の減少およびカニクイザルにおける強力な細胞傷害性活性を示した（Lazar et al., 2006）。アレムツズマブ（ＣＤ５２特異的）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的）、リツキシマブ（ＣＤ２０特異的）およびセツキシマブ（ＥＧＦＲ特異的）などの抗体中への三重突然変異の導入は、インビトロで大きく増強されたＡＤＣＣ活性に変換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体は、サルにおいてＢ細胞を枯渇させる増強された能力を示した（Lazar et al., 2006）。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳がんのモデルにおいてヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａとの増強された結合および同時に増強されたＡＤＣＣ活性を示した、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ突然変異を含有するＩｇＧ１突然変異体が同定された（Stavenhagen et al., 2007、Nordstrom et al., 2011）。使用することができるその他のＦｃ突然変異体としては、以下のものが挙げられる：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｌ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６ＬおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ。
【０３０７】
特定の実施形態では、ＦｃγＲとの結合が低減されたＦｃが、選択される。ＦｃγＲ結合が低減された例示的なＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の３つのアミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａ。
【０３０８】
特定の実施形態では、補体結合が低減されたＦｃが、選択される。補体結合が低減された例示的なＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の２つのアミノ酸置換を有する：Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。
【０３０９】
特定の実施形態では、本質的にエフェクター機能を有さない、すなわち、ＦｃγＲとの結合が低減され、補体結合が低減されたＦｃが、選択される。エフェクターレスである例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の５つの突然変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。
【０３１０】
ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合、これは、置換Ｓ２２８Ｐを含み得、この置換は、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それによって、ＩｇＧ４分子を安定化させる。
【０３１１】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が、修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を、作製することができる（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増大させるように変更され得る。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによって、その部位におけるグリコシル化を排除する、１以上のアミノ酸置換を行うことができる。そのような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５,７１４,３５０号および同第６,３５０,８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０３１２】
Ｎ２９７における定常領域のグリコシル化は、Ｎ２９７残基を、別の残基、例えば、Ｎ２９７Ａに突然変異すること、および／または隣接するアミノ酸、例えば、２９８を突然変異し、それによって、Ｎ２９７におけるグリコシル化を低減することによって、予防することができる。
【０３１３】
さらに、またはあるいは、変更型のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体、または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造が増大した抗体を、作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、変更されたグリコシル化機序を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって、達成することができる。変更されたグリコシル化機序を有する細胞は、当技術分野において説明されており、本明細書に記載される組換え抗ＴＩＭ３抗体を発現させる宿主細胞として使用して、それによって変更されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、Ｈａｎａｉらによる欧州特許第１,１７６,１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、結果として、そのような細胞株において発現される抗体は、低フコシル化を呈することになる。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースの、Ａｓｎ（２９７）が連結した炭化水素と結合する能力が低下した変異体ＣＨＯ細胞系統、Ｌｅｄ３細胞について記載しており、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化をもたらした（Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。Umana et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１,４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するよう遺伝子操作された細胞系統を記載し、その結果、遺伝子操作された細胞系統において発現された抗体は、二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、これは、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと）。
【０３１４】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体を、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増大するようペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、通常、抗体またはその断片を、１以上のＰＥＧ基が、抗体または抗体断片と結合するようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。いくつかの実施形態では、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（ＣＩＯ〜ＣＩＯ）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、その他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの任意の形態を包含するものとする。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、技術分野で公知であり、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照のこと。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域は、配列番号２６３〜２６６からなる群から選択される。
【０３１６】
ＶＩＩＩ. 抗体物理的特性
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載されるものは、本明細書に記載される特定の抗ＴＩＭ３抗体の物理的特徴、例えば、実施例に記載される特徴のうちのいくつかまたは全てを有する。
【０３１７】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１以上のグリコシル化部位を含有し得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増大または変更された抗原結合による抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Marshall et al (1972) Annu. Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こると知られている。いくつかの場合には、抗ＴＩＭ３抗体は可変領域グリコシル化を含有しない。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによってか、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによって達成され得る。
【０３１８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、その結果、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を低減し得る（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基を生成し得る。
【０３１９】
各抗体は、独特の等電点（ｐｉ）を有し、これは、一般に、６から９.５の間のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐｉは、通常、７〜９.５のｐＨ範囲内に入り、ＩｇＧ４抗体のｐｉは、通常、６〜８のｐＨ範囲内に入る。正常範囲の外側のｐｉを有する抗体は、インビボ条件下で幾分かのアンフォールディングおよび不安定性を有し得るという推測がある。したがって、抗ＴＩＭ３抗体は正常範囲内に入るｐｉ値を含有し得る。これは、正常範囲のｐｉを有する抗体を選択することによってか、または電荷を有する表面残基を突然変異させることによって達成され得る。
【０３２０】
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボで全体的な安定性が大きいことを示す（Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。一般に、ＴＭｉ（最初のアンフォールディングの温度）は、６０℃超、６５℃超、または７０℃超であり得る。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52）または円偏光二色性（Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を使用して測定できる。
【０３２１】
一実施形態では、迅速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32）を使用して測定できる。
【０３２２】
別の実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択され、凝集効果は、不要な免疫応答および／または変更されたか、もしくは不都合な薬物動態特性の誘発につながり得る。一般に、抗体は、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下の凝集を有しても許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含めた、いくつかの技術によって測定できる。
【０３２３】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、上述の節（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）に記載されている構造および特性の組合せを有する。一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、節Ｉおよび／もしくはＶＩに記載されるように、抗体１３Ａ３、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８および９Ｆ６と交差競合し、節ＩＩＩに記載されるように、生殖細胞系配列に由来し、節Ｖに記載されるように保存的突然変異を有し、ならびに／または本明細書の任意の箇所に記載される１以上の機能的特性と組み合わせて、節ＩＶに記載されるように、節ＩおよびＩＩの抗ＴＩＭ３抗体との相同性を有する。
【０３２４】
ＩＸ. 抗体を遺伝子操作する方法
上記のとおり、本明細書に開示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＴＩＭ３抗体を使用して、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列またはそこに結合した定常領域を修飾することによって、新しい抗ＴＩＭ３抗体を作製することができる。したがって、本明細書に記載される別の態様では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の構造的特徴を使用して、ヒトＴＩＭ３およびカニクイザルＴＩＭ３との結合など、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の少なくとも１つの機能的特徴を保持する、構造的に関連する抗ＴＩＭ３抗体を作製する。例えば、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１３Ａ３、もしくはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれか１つの１以上のＣＤＲ領域は、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換えにより組み合わされて、上記のとおり、本明細書に記載される、組換えにより遺伝子操作されたさらなる抗ＴＩＭ３抗体が作製される。他の種類の修飾として、前述の節に記載されているものが挙げられる。遺伝子操作方法の出発材料は、本明細書に提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つもしくは複数またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。遺伝子操作された抗体を作製するために、必ずしも、本明細書に提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つもしくは複数またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質を発現させる）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報は、元の配列に由来する「第２世代」の配列を作製するために出発材料として使用され、次に、この「第２世代」の配列が、調製され、タンパク質として発現される。
【０３２５】
したがって、抗ＴＩＭ３抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４１〜４５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４６〜５２および１２２〜１２５からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに／または配列番号５３〜５９および１２６〜１２９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域抗体配列、ならびに（ｉｉ）配列番号６４および６５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号６６および６７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに／または配列番号６８および７１からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列を提供すること、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも１つの変更された抗体配列を作製すること、ならびに
（ｃ）変更された抗体配列をタンパク質として発現させること
を含む、方法が本明細書において提供される。
【０３２６】
標準分子生物学技術を使用して、変更された抗体配列を調製し、発現することができる。いくつかの実施形態では、変更された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の機能的特性のうちの１種、いくつかまたは全てを保持するものであり、この特性としては、
（１）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、可溶性ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（２）例えば、実施例に記載されるように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、例えば、１００ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１００ｎＭ）のＫＤで、可溶性カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（３）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、１μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（４）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型ヒトＴＩＭ３と結合すること、
（５）例えば、フローサイトメトリーによって測定される場合（例えば、実施例に記載されるように）、例えば、２０μｇ／ｍＬ以下（例えば、０.０１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０で、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（６）例えば、実施例に記載されるように、例えば、スキャッチャード解析によって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下（例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、膜結合型カニクイザルＴＩＭ３と結合すること、
（７）例えば、実施例に記載されるように、（ｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）におけるＩＦＮ−γ産生の増大および／または（ｉｉ）ＴＩＭ３を発現するＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞もしくはＴＩＬ）の増殖の増強によって明らかなように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること（例えば、ＴＩＭ３の阻害性作用を遮断もしくは低減することによって）、
（８）例えば、実施例に記載されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を刺激すること、
（９）例えば、実施例に記載されるように、例えば、ＰＳ−ｈＴＩＭ３「イン・タンデム」遮断アッセイによって測定される場合、ホスファチジルセリンのＴＩＭ３との結合を阻害すること、
（１０）細胞上のＴＩＭ３と結合したときに、細胞表面ＴＩＭ３を内部移行または下方制御しないこと、
（１１）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３細胞外ドメイン（配列番号２９０）の以下の領域：（ａ）CPVFECG（配列番号２９６）、（ｂ）RIQIPGIMND（配列番号２９８）、（ｃ）CPVFECGおよびRIQIPGIMND（それぞれ配列番号２９６および２９８）、ならびに（ｄ）WTSRYWLNGDFR（配列番号２９７）の１つと結合すること、
（１２）例えば、実施例に記載されるように、アミノ酸Ｌ４８、Ｃ５８、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｗ７８、Ｓ８０、Ｒ８１、Ｗ８３、Ｌ８４、Ｇ８６、Ｄ８７、Ｒ８９、Ｄ１０４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｍ１１８およびＤ１２０［配列番号２８６（図２０）において番号付けされる]の１以上が、別のアミノ酸と置換されているヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有すること、
（１３）例えば、実施例に記載されるように、ヒトＴＩＭ３との結合について、１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８、９Ｆ６、８Ｂ９、８Ｃ４またはＴＩＭ３.７、ＴＩＭ３.８、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７およびＴＩＭ３.１８のいずれか１つのＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、
（１４）例えば、実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＴＩＭ３領域49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）および111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）と結合すること、
（１５）Ｘ線結晶構造解析によって判定される場合、ヒトＴＩＭ３の以下のアミノ酸：Ｐ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｔ７０および／もしくはＩ１１２のうちの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個または全てと相互作用する、重鎖および／または軽鎖可変領域を有すること［例えば、実施例に記載され、配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]、ならびに／あるいは
（１６）例えば、実施例に記載されるように、（ａ）アミノ酸Ｃ５８、Ｐ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ１１１、Ｄ１２０、ならびに適宜Ｄ１０４およびＱ１１３［配列番号２８６（図２０）に従って番号付けされる]のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個もしくは９個が、別のアミノ酸と置換されている、ヒトＴＩＭ３に対して、野生型ヒトＴＩＭ３との結合と比べて、低減された結合を有し、（ｂ）実施例に記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）および119NDEKFNLKL127（配列番号３７３）と結合し、ならびに／または（ｃ）例えば、実施例に記載されるように、１３Ａ３もしくはＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の結合と競合するかもしくはそれを交差遮断すること、
が挙げられる。
【０３２７】
変更された抗体は、上記の（１）から（１６）として記載される機能的特性の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。変更された抗体の機能的特性は、当技術分野で利用可能であるおよび／または本明細書に記載される標準アッセイ、例えば実施例に記載されるもの（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）を使用して評価することができる。
【０３２８】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を遺伝子操作する方法の特定の実施形態では、突然変異を、抗ＴＩＭ３抗体コード配列の全てまたは一部に沿って無作為または選択的に導入することができ、得られた修飾された抗ＴＩＭ３抗体を、結合活性および／または本明細書に記載される他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。突然変異の方法は、当技術分野で説明されている。例えば、ShortによるＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはこれらの組合せを使用した抗体突然変異体の作製およびスクリーニング方法について記載している。あるいは、Lazar et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、コンピュータによるスクリーニング方法を使用して抗体の生理化学特性を最適化する方法について記載している。
【０３２９】
Ｘ.核酸分子
本明細書に記載される別の態様は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体をコードする核酸分子に関係する。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸（例えば、その他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界では単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から精製された場合に、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有する場合も、含有しない場合もある。特定の実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０３３０】
本明細書に記載される核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）から得られる抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
【０３３１】
本明細書に記載されるいくつかの核酸分子は、１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４、１７Ｃ８、またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８抗体のいずれかのＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＶＨ配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１６７〜１７３、２４５〜２５４および３５９に記載されている。１３Ａ３、１７Ｃ３および３Ｇ４のＶＬ配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１９３に記載されている。８Ｂ９、８Ｃ４および１７Ｃ８のＶＬ配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１９４に記載されている。９Ｆ６のＶＬ配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１９４〜１９６に記載されている。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８の重鎖配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１３４〜１６１、２０５〜２４４および３５５〜３５８に記載されている。１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８の軽鎖配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１６２〜１６６に記載されている。
【０３３２】
１３Ａ３.ＩｇＧ１.１および１３Ａ３.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１６７および１９３に記載されている。１３Ａ３.ＩｇＧ１.１および１３Ａ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１３４および１４８に記載されており、１３Ａ３.ＩｇＧ１.１および１３Ａ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６２に記載されている。
【０３３３】
８Ｂ９.ＩｇＧ１.１および８Ｂ９.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１６８および１９４に記載されている。８Ｂ９.ＩｇＧ１.１および８Ｂ９.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１３５および１４９に記載されており、８Ｂ９.ＩｇＧ１.１および８Ｂ９.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６３に記載されている。
【０３３４】
８Ｃ４.ＩｇＧ１.１および８Ｃ４.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１６９および１９４に記載されている。８Ｃ４.ＩｇＧ１.１および８Ｃ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１３６および１５０に記載されており、８Ｃ４.ＩｇＧ１.１および８Ｃ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６３に記載されている。
【０３３５】
１７Ｃ３.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ３.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１７０および１９３に記載されている。１７Ｃ３.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１３７および１５１に記載されており、１７Ｃ３.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ３.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６２に記載されている。
【０３３６】
９Ｆ６.ＩｇＧ１.１および９Ｆ６.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１７１および１９７に記載されている。９Ｆ６.ＩｇＧ１.１および９Ｆ６.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１３８および１５２に記載されており、９Ｆ６.ＩｇＧ１.１および９Ｆ６.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６６に記載されている。
【０３３７】
３Ｇ４.ＩｇＧ１.１および３Ｇ４.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１７２および１９３に記載されている。３Ｇ４.ＩｇＧ１.１および３Ｇ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１３９および１５３に記載されており、３Ｇ４.ＩｇＧ１.１および３Ｇ４.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６２に記載されている。
【０３３８】
１７Ｃ８.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ８.ＩｇＧ１.３（同一の可変領域）抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１７３および１９４に記載されている。１７Ｃ８.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ８.ＩｇＧ１.３抗体の成熟重鎖をコードする例示的な核酸は、それぞれ配列番号１４０および１５４に記載されており、１７Ｃ８.ＩｇＧ１.１および１７Ｃ８.ＩｇＧ１.３抗体の成熟軽鎖をコードする例示的な核酸は、配列番号１６３に記載されている。
【０３３９】
上述の例示的な核酸は、配列番号２６７〜２７１および３６１に記載されるシグナルペプチドをさらに含み得る。これらのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２７２〜２７６、３６２および３６３に記載されている。
【０３４０】
本明細書に記載される核酸分子は、特定の配列、例えば、制限酵素認識配列を欠失するように、またはコドンを最適化するように、修飾されていてもよい。
【０３４１】
１３Ａ３  ＩｇＧ１.１、８Ｂ９  ＩｇＧ１.１、８Ｃ４  ＩｇＧ１.１、１７Ｃ３  ＩｇＧ１.１、９Ｆ６  ＩｇＧ１.１、３Ｇ４  ＩｇＧ１.１、１７Ｃ８  ＩｇＧ１.１および／またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８  ＩｇＧ１.１を作製するための方法は、シグナルペプチド、例えば、１３Ａ３  ＩｇＧ１.１については、それぞれ配列番号２６９および２６８を有する重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む細胞株において、重鎖および軽鎖を発現させることを含むことができる。１３Ａ３  ＩｇＧ１.３、８Ｂ９  ＩｇＧ１.３、８Ｃ４  ＩｇＧ１.３、１７Ｃ３  ＩｇＧ１.３、９Ｆ６  ＩｇＧ１.３、３Ｇ４  ＩｇＧ１.３および／または１７Ｃ８  ＩｇＧ１.３を作製するための方法は、シグナルペプチド、例えば、１３Ａ３  ＩｇＧ１.３については、それぞれ配列番号２７４および２７３を有する重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む細胞株において、重鎖および軽鎖を発現させることを含むことができる。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、本明細書に包含される。
【０３４２】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するよう、標準組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と作動可能に連結している。この文脈において使用されるような、用語「作動可能に連結された」は、２種のＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるよう、２種のＤＮＡ断片が接続されることを意味するものとする。
【０３４３】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
【０３４４】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【０３４５】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426;Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照のこと）。
【０３４６】
さらに、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１３Ａ３およびＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８のいずれか１つの抗体のものに相同であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子が、本明細書において提供される。例示的核酸分子は、１７Ｃ３、８Ｂ９、８Ｃ４、３Ｇ４、１７Ｃ８、９Ｆ６、１３Ａ３またはＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８の少なくとも１つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子と少なくとも７０％同一である、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である、ＶＨおよびＶＬ配列をコードする。さらに、例えば、コドン最適化のために、保存的置換（すなわち、核酸分子の翻訳時に得られるアミノ酸配列を変更しない置換）を有する核酸分子が、本明細書において提供される。
【０３４７】
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードする核酸もまた、提供され、この核酸は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０３４８】
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸もまた、提供され、この核酸は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０３４９】
ＸＩ. 抗体作製
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)によって記載される標準体細胞ハイブリダイゼーション技術などの種々の公知の技術を使用して産生できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は好ましいが、原理上、モノクローナル抗体を産生するためのその他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発がん性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
【０３５０】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系として、マウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて十分に確立された手順である。免疫処置プロトコールおよび技術および融合のために免疫処置された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０３５１】
本明細書に記載されるキメラまたはヒト化抗ＴＩＭ３抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、対象のマウスハイブリドーマから得、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよう遺伝子操作できる。例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる（例えば、Cabilly et al.の米国特許第４,８１６,５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ領域を挿入できる（例えば、Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと）。
【０３５２】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなＴＩＭ３に対して向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を保持する、トランスジェニックまたはトランスクロモソミック（transchromosomic）マウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミック（transchromosomic）マウスは、本明細書において、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
【０３５３】
ＨＵＭＡＢマウス（登録商標）（Medarex, Inc.）は、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（miniloci）を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された突然変異とともに含有する（例えば、Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照のこと）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫処置に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖 導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧＫモノクローナルを生成する（Lonberg, N. et al. (1994)、前掲; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説されている）。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスによって保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されている。さらに、全てLonbergおよびKayの米国特許第５,５４５,８０６号；同５,５６９,８２５号；同５,６２５,１２６号；同５,６３３,４２５号；同５,７８９,６５０号；同５,８７７,３９７号；同５,６６１,０１６号；同５,８１４,３１８号；同５,８７４,２９９号；および同５,７７０,４２９号；Surani et al.,の米国特許第５,５４５,８０７号；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ  ９９／４５９６２ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
【０３５４】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスを使用して作製される。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【０３５５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を作製するために使用できる。例えば、Xenomouse（Abgenix、Inc.）と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５,９３９,５９８号；同６,０７５,１８１号；同６,１１４,５９８号；同６、１５０,５８４号および同６,１６２,９６３号に記載されている。
【０３５６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスクロモソミック（transchromosomic）動物系は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を作製するために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体（transchromosome）およびヒト軽鎖導入染色体（tranchromosome）の両方を保持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体（transchromosome）を保持するウシが、当技術分野で記載されており（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を作製するために使用できる。
【０３５７】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＴＩＭ３抗体を作製するための当技術分野において記載されるさらなるマウス系として、（ｉ）内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体（ヒトＶ／マウスＣ）が作製され、次いで、その後、標準組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、VELOCLMMUNE（登録商標）マウス（Regeneron Pharmaceuticals, Inc.）ならびに（ｉｉ）マウスが再編成されていないヒト重鎖可変領域、しかし単一の再変性されたヒト共通軽鎖可変領域を含有するＭＥＭＯ（登録商標）マウス（Merus Biopharmaceuticals, Inc.）が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載されている。
【０３５８】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許第５,２２３,４０９号；同５,４０３,４８４号；および同５,５７１,６９８号；Dower et al.の米国特許第５,４２７,９０８号および同５,５８０,７１７号； McCafferty et al.の米国特許第５,９６９,１０８号および同６,１７２,１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５,８８５,７９３号；同６,５２１,４０４号；同６,５４４,７３１号；同６,５５５,３１３号；同６,５８２,９１５号および同６,５９３,０８１号を参照のこと。
【０３５９】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et alの米国特許第５,４７６,９９６号および同５,６９８,７６７号に記載されている。
【０３６０】
ＸＩ.Ａ. 免疫処置
ＴＩＭ３に対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859;Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス（例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス）を、ＴＩＭ３抗原および／またはＴＩＭ３を発現する細胞もしくはその断片の精製または濃縮された調製物を用いて免疫処置できる。あるいは、マウスをヒトＴＩＭ３またはその断片をコードするＤＮＡを用いて免疫処置できる。いくつかの実施形態では、マウスは、第１の注入の際に６〜１６週齢とする。例えば、ＨｕＭＡｂマウスを腹膜内に免疫処置するために、組換えＴＩＭ３抗原の精製または濃縮された調製物（５〜５０μｇ）を使用できる。ＴＩＭ３抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫処置が抗体をもたらさない事象では、ＴＩＭ３を発現する細胞、例えば、細胞系統を用いてマウスを免疫処置して、免疫応答を促進することもできる。例示的細胞系統として、ＴＩＭ３過剰発現性安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞系統が挙げられる。
【０３６１】
種々の抗原を用いる累積的経験は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる最初に腹膜内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）免疫処置と、それに続く、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる隔週でのＩＰ／ＳＣ免疫処置（最大合計１０）の際に最良に応答することを示した。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿サンプルを用いて、免疫処置プロトコールの過程にわたってモニタリングできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき（以下に記載されるように）、抗ＴＩＭ３ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫処置のために２〜３回の融合が実施されることが必要であり得ると予測される。各抗原について、６から２４匹の間のマウスが、通常免疫処置される。普通、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は両方とも、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）単一マウスに一緒に育種され得る。
【０３６２】
ＸＩ.Ｂ. ＴＩＭ３に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗ＴＩＭ３抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫処置されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、ＰＥＧを用いて、免疫処置マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１）と融合できる。細胞を、平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、選択培地でインキュベートできる。数週間後、細胞を培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、１０〜１４日後に普通に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
【０３６３】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ−セファロース（Pharmacia, Piscataway, N.J.）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１.４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。次いで、モノクローナル抗体をアリコートにし保存できる。
【０３６４】
ＸＩ.Ｃ. ＴＩＭ３に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
抗体を、当技術分野で周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生できる（Morrison, S.(1985) Science 229:1202）。
【０３６５】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすよう、抗体遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって、発現ベクター（単数または複数）中に挿入される。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数または複数）と作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結されるように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。
【０３６６】
さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０３６７】
例示的な実施形態では、ヒト抗体の重鎖および軽鎖に由来する、以下のシグナルペプチドが、使用され得る：MDWTWRVFCLLAVAPGAHS（配列番号２６７）、METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS（配列番号２６９）、MEFGLSWVFLVAIIKGVQC（配列番号２７０）、MDMRVPAQLLGLLLWLPGARC（配列番号２７１）またはMRAWIFFLLCLAGRALA（配列番号３６１）。具体的な実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体のいずれか１つの発現に使用されるシグナル配列は、配列番号３６１である。抗ＴＩＭ３抗体の重鎖および軽鎖は、それらがクローニングされたハイブリドーマにおいて、それぞれの鎖に連結されたそれぞれのシグナル配列を用いて発現させることができる。抗ＴＩＭ３抗体がクローニングされたハイブリドーマに存在する、種々の抗ＴＩＭ３抗体のシグナル配列を、以下に示し、これらのシグナル配列は、同一の抗体または別の抗体を発現させるために使用することができる。
（ｉ）１３Ａ３  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS（配列番号２６９）
（ｉｉ）１３Ａ３  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC（配列番号２７４）
（ｉｉｉ）１３Ａ３  ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｉｖ）１３Ａ３  ＶＬシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
（ｖ）８Ｂ９  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS（配列番号２６９）
（ｖｉ）８Ｂ９  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC（配列番号２７４）
（ｖｉ）８Ｂ９  ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｖｉｉｉ）８Ｂ９  ＶＬシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
（ｉｘ）８Ｃ４  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS（配列番号２６９）
（ｘ）８Ｃ４  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC（配列番号２７４）
（ｘｉ）８Ｃ４  ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｘｉｉ）８Ｃ４  ＶＬシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
（ｘｉｉｉ）１７Ｃ３  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MDWTWRVFCLLAVAPGAHS（配列番号２６７）
（ｘｉｖ）１７Ｃ３  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７２）
（ｘｖ）１７Ｃ３  ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｘｖｉ）１７Ｃ３  ＶＬシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
（ｘｖｉｉ）９Ｆ６  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MEFGLSWVFLVAIIKGVQC（配列番号２７０）
（ｘｖｉｉｉ）９Ｆ６  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７５）
（ｘｉｘ）９Ｆ６  ＶＬ１シグナル配列のアミノ酸配列：MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC（配列番号２７１）
（ｘｘ）９Ｆ６  ＶＬ１シグナル配列の核酸配列：
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT（配列番号２７６）
（ｘｘｉ）９Ｆ６  ＶＬ２およびＶＬ３シグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｘｘｉｉ）９Ｆ６  ＶＬ２およびＶＬ３シグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
（ｘｘｉｉｉ）３Ｇ４  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MEFGLSWVFLVAIIKGVQC（配列番号２７０）
（ｘｘｉｖ）３Ｇ４  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７５）
（ｘｘｖ）３Ｇ４  ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｘｘｖｉ）３Ｇ４  ＶＬシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
（ｘｘｖｉｉ）１７Ｃ８  ＶＨシグナル配列のアミノ酸配列：MEFGLSWVFLVAIIKGVQC（配列番号２７０）
（ｘｘｖｉｉｉ）１７Ｃ８  ＶＨシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７５）
（ｘｘｉｘ）１７Ｃ８  ＶＬシグナル配列のアミノ酸配列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号２６８）
（ｘｘｘ）１７Ｃ８  ＶＬシグナル配列の核酸配列：
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA（配列番号２７３）
【０３６８】
別の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体（例えば、ＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８）の重鎖および軽鎖は、これらの抗体がクローニングされたハイブリドーマに存在するものとは異なるシグナル配列を用いて遺伝子操作されてもよい。そのような配列の例としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない。
（ｉ）重鎖のシグナル配列の核酸配列：
ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCA（配列番号３６２）
（ｉｉ）軽鎖のシグナル配列の核酸配列：
ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGGCCGGGCGCGCCTTGGCC（配列番号３６３）
（ｉｉｉ）重鎖および軽鎖のシグナル配列のアミノ酸配列：MRAWIFFLLCLAGRALA（配列番号３６１）
【０３６９】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得る当業者には明らかである。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲａプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる調節エレメント（Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
【０３７０】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製の起点）などのさらなる配列および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、全てAxel et alによる米国特許第４,３９９,２１６号、同４,６３４,６６５号および同５,１７９,０１７号を参照のこと）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のための）が挙げられる。
【０３７１】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単数または複数）を、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のためによく使用される様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。
【０３７２】
原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高効率の産生にとっては有効ではないと報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。
【０３７３】
本明細書に記載される組換え抗ＴＩＭ３抗体を発現させるための特定の哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞中に導入され、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
【０３７４】
ＸＩＩ. アッセイ
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３との結合について、例えば、標準ＥＬＩＳＡによって試験できる。手短には、マイクロタイタープレートを精製されたＴＩＭ３を用いてコーティングし、次いで、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物（例えば、ＴＩＭ３免疫処置マウスから得た血漿の希釈物）を添加し、インキュベートする。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次試薬（例えば、ヒト抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）とともにインキュベートする。洗浄した後、プレートを発色させ、分光光度計によって分析できる。次いで、免疫処置されたマウスから得た血清を、ＴＩＭ３を発現しない対照細胞株とではなく、ヒトＴＩＭ３を発現する細胞株との結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングできる。手短には、抗ＴＩＭ３抗体の結合を、ＴＩＭ３発現性ＣＨＯ細胞を抗ＴＩＭ３抗体とともにインキュベートすることによって評価できる。細胞を洗浄でき、結合を、抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて検出することができる。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Becton Dickinson, San Jose, CA）を使用してフローサイトメトリー分析を実施できる。最高の力価を発生するマウスが、融合に使用できる。
【０３７５】
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、ひいては、ＴＩＭ３免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングできる。高親和性でＴＩＭ３と結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。細胞バンクを作製するために、抗体精製のために、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによって）各ハイブリドーマから１つのクローンを選択できる。
【０３７６】
抗ＴＩＭ３抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のために選択されたハイブリドーマを成長させることができる。アフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は交換でき、濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、保存できる。
【０３７７】
選択された抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体が独特のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬（Pierce, Rockford, IL）を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＴＩＭ３コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
【０３７８】
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩コーティングできる。１％  ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
【０３７９】
モノクローナル抗体の、ＴＩＭ３を発現する生存細胞との結合を調べるために、実施例に記載されるようにフローサイトメトリーを使用できる。手短には、膜結合性ＴＩＭ３を発現する細胞株（標準成長条件下で成長させた）を、０.１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフルオレセイン標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析して、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、または代わりに）、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて減少した感受性を有し得る。
【０３８０】
抗ＴＩＭ３抗体は、ウエスタンブロッティングによってＴＩＭ３抗原との反応性についてさらに試験できる。手短には、ＴＩＭ３を発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランにトランスファーし、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いてプロービングする。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる（Sigma Chem.Co., St.Louis, MO）。
【０３８１】
種々の抗ＴＩＭ３抗体の結合親和性、交差反応性および結合動態を解析する方法は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）２０００ＳＰＲ機器（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を含む。
【０３８２】
種々のアッセイを使用して、抗ＴＩＭ３抗体の生物学的活性（例えば、異なる抗ＴＩＭ３抗体を比較するために使用することができる）、例えば、本明細書に記載されるものを特徴付けることができる。
（１）Ｔ細胞活性化アッセイ、例えば、ヒトドナーのＰＢＭＣから得られた精製Ｔ細胞を使用するアッセイ。アッセイは、全Ｔ細胞またはその部分集団、例えば、Ｔｈ１細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて行うことができるが、ただし、それらがＴＩＭ３を発現することを条件とする。活性化は、特定のサイトカイン、例えば、インターフェロン−γもしくはＩＬ−２の分泌レベル、またはＴ細胞の増殖レベルを判定することによって測定することができる。特定の作用機序に限定されることを望むものではないが、ＴＩＭ３抗体の、Ｔ細胞上のＴＩＭ３との結合は、ＴＩＭ３のＴＩＭ３リガンド（ＴＩＭ３の推定上のリガンドとしては、ガレクチン−９、ＨＭＧＢ１、セマフォリン−４Ａ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＩＬＴ−４およびホスファチジルセリンが挙げられる）との結合を防止し、それによって、Ｔ細胞におけるＴＩＭ３に媒介されるシグナル伝達を防止し、それによって、ＴＩＭ３によるＴ細胞の負の制御を防止することができる。Ｔｈ１アッセイ、ＴＩＬアッセイおよび混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を含む、例示的なアッセイが、実施例において提供される。
（２）マクロファージ、例えば、Ｍ１またはＭ２マクロファージの刺激を測定するアッセイ、ならびに
（３）ＴＩＭ３陽性骨髄系細胞からの骨髄関連サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５の分泌を測定するアッセイ。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３陽性骨髄系細胞からのＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−２の分泌を刺激する、ならびに／またはＩＬ−１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５の分泌を阻害する。
【０３８３】
一般に、免疫応答を阻害する薬剤の生物学的活性を試験するための任意の方法を使用して、抗ＴＩＭ３抗体の生物学的活性、例えば、ＴＩＭ３に関連する文献（特許および特許出願を含む）に記載されるものを特徴付けることができる。
【０３８４】
ＸＩＩＩ. イムノコンジュゲート、抗体誘導体および診断
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、サンプルの試験およびインビボ撮像を含む診断目的で使用することができ、この目的で、抗体（またはその結合断片）は、適当な検出可能な薬剤とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成することができる。診断目的では、適当な薬剤は、全身撮像のための放射性同位体ならびにサンプルの試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の好適な抗体タグを含む、検出可能な標識である。
【０３８５】
本明細書に記載される任意のＴＩＭ３抗体と連結させることができる検出可能な標識は、コロイド金などの金属ゾルを含む粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳもしくはＮ４型のペプチド性キレート剤とともに提示されるＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびに所与の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応などの増幅後に示されるポリヌクレオチドタグを含め、インビトロ診断の分野において現在使用されている様々な種類のいずれかであり得る。好適な酵素標識として、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどが挙げられる。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、ジナトリウム３−（４−（メトキシスピロ｛１,２−ジオキセタン−３,２’−（５’−クロロ）トリシクロ｛３.３.１.１  ３,７｝デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）などの１,２ジオキセタン基質ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ＳＴＡＲ（登録商標）または当業者に周知の他の発光性基質、例えば、テルビウム（ＩＩＩ）およびユーロピウム（ＩＩＩ）などの好適なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成を測定することによって検出される、酵素アルカリホスファターゼであり得る。検出手段は、選択された標識によって決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適当なレベルで蓄積する場合には、裸眼で、または分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの機器を使用して、達成され得るが、全て標準的な慣例に従う。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーション法は、実質的に（またはほぼ）非免疫原性である結合、例えば、ペプチド（すなわち、アミド）結合、スルフィド結合（立体障害）、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合およびエーテル結合を生じる。これらの結合は、ほぼ非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す（例えば、Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244、ＷＯ２００９／０５９２７８、ＷＯ９５／１７８８６を参照のこと）。
【０３８７】
部分および抗体の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略を用いることができる。部分が、５０〜５００個のアミノ酸の天然に存在するまたは組換えである場合、標準的な手順は、タンパク質コンジュゲートの合成のための化学反応について記載した教則本にあり、当業者であれば容易に従うことができる（例えば、Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074を参照のこと）。一実施形態では、抗体または部分内のマレイミド部分とシステイン残基との反応が使用される。これは、例えば、抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が使用される場合に、特に好適なカップリング化学反応である。あるいは、一実施形態では、抗体または部分のＣ末端へのカップリングが行われる。タンパク質、例えば、Ｆａｂ断片のＣ末端修飾は、記載されるように行われ得る（Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371）。
【０３８８】
一般に、部位特異的反応および共有結合カップリングは、天然のアミノ酸を、存在する他の官能基の反応性に直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列構成内の特定のシステインは、アルデヒドに酵素変換され得る（Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427を参照のこと）。所与の配列構成における特定の酵素の、天然のアミノ酸との特異的酵素反応性を利用することによって、所望されるアミノ酸修飾を得ることもまた可能である（例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126、Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136を参照のこと。プロテアーゼに触媒されるＣ−−Ｎ結合の形成は、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403で使用される）。部位特異的反応および共有結合カップリングはまた、末端アミノ酸の、適当な修飾試薬との選択的反応によっても達成され得る。
【０３８９】
Ｎ末端システインの、ベンゾニトリルとの反応性（Ren. H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662を参照のこと）を使用して、部位特異的共有結合カップリングを達成することができる。
【０３９０】
天然の化学的ライゲーションはまた、Ｃ末端システイン残基に依存し得る（Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96）。
【０３９１】
ＵＳ６４３７０９５は、負に荷電したアミノ酸のストレッチ内のシステインの、正に荷電したアミノ酸のストレッチ内に位置するシステインを用いて早い反応に基づくコンジュゲーション法について記載している。
【０３９２】
部分はまた、合成ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸は、このような合成中に組み込まれ得る（例えば、de Graaf. A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295を参照のこと）。多種多様な直交性官能基が問題となっており、合成ペプチドに導入され得るため、このようなペプチドの、リンカーとのコンジュゲーションは、標準化学反応である。
【０３９３】
単一標識ポリペプチドを得るために、１：１の化学量論のコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーによって分離してもよい。この手順は、色素標識した結合対メンバーおよび荷電リンカーを使用することにより容易となり得る。この種類の標識および高度に負に荷電した結合対メンバーを使用することにより、モノコンジュゲートしたポリペプチドは、非標識ポリペプチドおよび１種を上回るリンカーを有するポリペプチドから容易に分離されるが、これは、電荷および分子量における相違を分離に使用できるためである。蛍光色素は、標識した一価結合剤などの未結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。
【０３９４】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体と結合する部分は、結合部分、標識部分および生物学的に活性な部分からなる群から選択される。
【０３９５】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体はまた、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などのイムノコンジュゲートを形成するように、治療剤とコンジュゲートされ得る。好適な治療剤として、抗代謝剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。他の実施形態では、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号３００）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７,０８７,６００号、同第６,９８９,４５２号および同第７,１２９,２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０、ＷＯ０７／０３８６５８、ＷＯ０７／０５１０８１、ＷＯ０７／０５９４０４、ＷＯ０８／０８３３１２およびＷＯ０８／１０３６９３、米国特許公開第２００６００２４３１７号、同第２００６０００４０８１号および同第２００６０２４７２９５号に記載されるように調製することができる。
【０３９６】
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載されるものはまた、ＴＩＭ３、例えば、ヒトＴＩＭ３、例えば、組織または組織サンプルにおけるヒトＴＩＭ３を検出するためにも使用することができる。抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーにおいて、使用することができる。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体を、特異的な結合が生じるのに適した時間、細胞、例えば、組織における細胞と接触させ、次いで、試薬、例えば、抗ＴＩＭ３抗体を検出する抗体を、添加する。例示的なアッセイは、実施例において提供されている。抗ＴＩＭ３抗体は、完全ヒト抗体であってもよく、またはそれは、キメラ抗体、例えば、ヒト可変領域およびマウス定常領域もしくはその部分を有する抗体であってもよい。サンプル（細胞または組織サンプル）においてＴＩＭ３、例えば、ヒトＴＩＭ３を検出するための例示的な方法は、（ｉ）抗ＴＩＭ３抗体の、サンプルにおけるＴＩＭ３との特異的な結合を可能にするのに十分な時間、サンプルを、抗ＴＩＭ３抗体と接触させること、ならびに（２）サンプルを、検出試薬、例えば、抗ＴＩＭ３抗体、例えば、抗ＴＩＭ３抗体のＦｃ領域と特異的に結合する抗体と接触させて、それによって、抗ＴＩＭ３抗体によって結合されたＴＩＭ３を検出することを含む。洗浄工程が、抗体および／または検出試薬とのインキュベーションの後に含まれてもよい。これらの方法において使用するための抗ＴＩＭ３抗体は、別個の検出剤が使用され得るため、必ずしも標識または検出剤と連結させる必要はない。
【０３９７】
例えば、単剤療法または併用療法としての抗ＴＩＭ３抗体の他の使用は、本明細書の他の箇所、例えば、併用治療に関する節において提供される。
【０３９８】
ＸＩＶ. 二重特異性分子
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、二重特異性分子の形成のために使用され得る。抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化されるか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド）と連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を生成し得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、併用処置の潜在的な標的として使用することができる任意のタンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲまたはＬＡＧ−３に対する抗体）またはｓｃＦｖと連結させてもよい。本明細書に記載される抗体は、実際、誘導されるか、２種以上のその他の機能的分子と連結されて、３種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を生成し得；このような多重特異性分子もまた、本明細書において、用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本明細書に記載される二重特異性分子を作製するために、本明細書に記載される抗体を、二重特異性分子が結果として生じるような別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１以上のその他の結合分子と機能的に連結することができる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による結合または別の方法で）。
【０３９９】
したがって、少なくとも１つのＴＩＭ３に対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が本明細書において提供される。二重特異性分子が多重特異性である本明細書に記載される一実施形態では、分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【０４００】
一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）を含めたその抗体断片を含む。Ladner et al.米国特許第４,９４６,７７８号に記載されるように、抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体またはＦｖもしくは一本鎖コンストラクトなどのその任意の最小断片であり得る。
【０４０１】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記載される二重特異性分子において利用することができるその他の抗体には、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体がある。
【０４０２】
本明細書に記載される二重特異性分子は、当技術分野において公知の方法を使用して、構成要素としての結合特異性をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性を、別個に生成し、次いで、互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性が、タンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合によるコンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５,５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686、Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと）。他の方法としては、Paulus (1985)Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132、Brennan et al. (1985)Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375）に記載されているものが挙げられる。いくつかのコンジュゲーション剤としては、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣがあり、いずれも、Pierce Chemical Co.（Rockford, IL）から入手可能である。
【０４０３】
結合特異性が抗体である場合、これらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に、奇数、好ましくは、１つのスルフヒドロリ残基を含むように修飾される。
【０４０４】
あるいは、両方の結合特異性が、同じベクターにおいてコードされて、同じ宿主細胞において発現され、アセンブリーされてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×（ｓｃＦｖ）２融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。二重特異性抗体は、それぞれの重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含み得る。本明細書に記載される二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合性決定基を含む一本鎖分子であってもよく、または２つの結合性決定基を含む一本鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５,２６０,２０３号、米国特許第５,４５５,０３０号、米国特許第４,８８１,１７５号、米国特許第５,１３２,４０５号、米国特許第５,０９１,５１３号、米国特許第５,４７６,７８６号、米国特許第５,０１３,６５３号、米国特許第５,２５８,４９８号および米国特許第５,４８２,８５８号に記載されている。
【０４０５】
二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定法（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイなどの当技術分野で認識される方法を使用して確認され得る。これらのアッセイは各々、一般に、対象の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に対象とされるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０４０６】
ＸＶ. 組成物
医薬上許容される担体と一緒に製剤化された、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体、または他の標的に対する抗体との組合せ、またはその抗原結合部分（単数または複数）のうちの１種または組合せを含有する組成物、例えば、医薬組成物がさらに提供される。このような組成物は、（例えば、２種以上の異なる）本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子のうち１種または組合せを含み得る。例えば、本明細書に記載される医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または補完的活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性）の組合せを含み得る。
【０４０７】
特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、１〜３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＴＩＭ３抗体を含む。
【０４０８】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、その他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の抗がん剤および／または例えば、Ｔ細胞刺激（例えば、活性化）剤などの免疫調節物質と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療薬の例は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の使用に関する節において以下により詳細に記載される。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される治療用組成物は、がんの治療のために使用されるその他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤として、例えば、所与のがんに対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が挙げられる。いくつかの事例では、治療用組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、またはそれらの併用の１つ以上を含み得る。
【０４１０】
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。いくつかの実施形態では、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、化合物を、酸および化合物を不活性化し得るその他の天然条件作用から保護するために、材料において、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子をコーティングしてもよい。
【０４１１】
本明細書に記載される医薬化合物は、１以上の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、何らかの望ましくない毒物学的影響を付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などといった非毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などといった非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといったアルカリ土類金属に由来するものならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどといった非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【０４１２】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどといった水溶性抗酸化物質、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどといった油溶性抗酸化物質および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などといった金属キレート化剤が挙げられる。
【０４１３】
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどといった）およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０４１４】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌法手順、前掲によって、また種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
【０４１５】
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が考慮される。医薬組成物は、保存剤を含んでもよく、または保存剤を含まなくてもよい。補足活性化合物は、組成物中に組み込まれ得る。
【０４１６】
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物は、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含むことができる。組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射用組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
【０４１７】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込むことと、それに続く、滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および本明細書で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の方法として、その前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
【０４１８】
単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与様式に応じて変わる。単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生産する組成物の量となる。一般に、医薬上許容される担体との組合せにおいて、この量は、１００パーセントのうち、有効成分の約０.０１パーセント〜約９９パーセント、約０.１パーセント〜約７０パーセント、または有効成分の約１パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
【０４１９】
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に低減または増大してもよい。投与の容易性および投与形の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療されている対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生産するよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記載される投与単位形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。
【０４２０】
例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の投与のために、投与量は、約０.０００１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通常は、０.０１〜５ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０.３ｍｇ／体重１ｋｇ、０.３ｍｇ／体重１ｋｇ、０.５ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的治療計画は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３〜６カ月に１回の投与を必要とする。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の例示的な投与計画としては、静脈内投与を介した１ｍｇ／体重１ｋｇまたは３ｍｇ／体重１ｋｇが挙げられ、抗体は、以下の投与スケジュールの１つを使用して与えられる：（ｉ）４週間に１回で、６回の投与、次いで、３カ月に１回、（ｉｉ）３週間に１回、（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重１ｋｇを１回、続いて、１ｍｇ／体重１ｋｇを３週間に１回。
【０４２１】
抗ＴＩＭ３抗体は、一定用量で投与され得る（一定用量計画）。他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、固定用量で、別の抗体とともに投与され得る。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、体重に基づく用量で投与される。
【０４２２】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合には、投与される各抗体の投与量は、示される範囲内に入る。抗体は、通常、複の機会で投与される。単一投与量の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月毎または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則である場合もある。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するよう調整される。
【０４２３】
抗ＴＩＭ３抗体は、他の抗体の投与計画で、別の抗体とともに投与され得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、疾患の進行または許容できないほどの毒性が生じるまで、抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））とともに、６０分間にわたる静脈内注入として、２週間に１回投与され得る。抗ＴＩＭ３抗体は、疾患の進行または許容できないほどの毒性が生じるまで、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））とともに、３０分間にわたる静脈内注入として、３週間に１回投与され得る。抗ＴＩＭ３抗体は、疾患の進行または許容できないほどの毒性が生じるまで、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（商標））とともに、６０分間または３０分間にわたる静脈内注入として、３週間に１回投与され得る。
【０４２４】
抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、治療が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、患者が疾患の症状の部分的または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時には必要である。その後、患者は、予防的投与計画を投与されることがある。
【０４２５】
本明細書に記載される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者とって毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るよう変えてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴および医薬の技術分野において周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に応じて変わる。
【０４２６】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の「治療上有効な投与量」は、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能不全もしくは能力障害の防止をもたらし得る。がんに関連して、治療上有効な用量は、生存、例えば、全生存期間の増大、および／またはがんと関連する身体症状のさらなる増悪の予防をもたらし得る。がんの症状は、当技術分野で周知であり、例えば、普通ではない黒子の特徴、非対称、境界、色および／または直径を含めた黒子の外観の変化、新規に着色した皮膚領域、異常な黒子、爪の下の黒くなった領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、脱力感、過度の疲労、摂食障害、食欲の喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹膜腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。
【０４２７】
疾患の早期または先行する徴候が存在する場合に望まれ得るような治療上有効な用量は、がんの発生を防ぐかまたは遅延し得る。がんの診断において使用される実験室試験は、化学（ＴＩＭ３レベルの測定を含む）、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のうちいずれかをモニタリングする任意の臨床または生化学アッセイを使用して、特定の治療が、がんを治療するための治療上有効な用量であるか否かを調べてもよい。当業者ならば、対象の大きさ、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択された投与経路のような因子に基づいてこのような量を決定できるであろう。
【０４２８】
本明細書に記載される組成物は、当技術分野で公知の１以上の種々の方法を使用して、１以上の投与経路によって投与できる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【０４２９】
あるいは、本明細書に記載される抗体は潜在的に、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸性、舌下にまたは局所になど、非経口ではない経路によって投与できる。
【０４３０】
留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など、活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０４３１】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物は、米国特許第５,３９９,１６３号；同５,３８３,８５１号；同５,３１２,３３５号；同５,０６４,４１３号；同４,９４１,８８０号；同４,７９０,８２４号；または同４,５９６,５５６号に開示される装置などの注射針無し皮下注射装置を用いて投与できる。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体とともに使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として、制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４,４８７,６０３号；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する同４,４８６,１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する同４,４４７,２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋め込み可能注入器具を開示する同４,４４７,２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４３９,１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４７５,１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
【０４３２】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするよう製剤化できる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本明細書に記載される治療用化合物が、ＢＢＢを通過することを確実にするために（所望される場合、例えば、脳のがんについて）、それらを例えば、リポソーム中に製剤化できる。リポソームを作製する方法については、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号；同５,３７４,５４８号；および同５,３９９,３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送され、したがって、標的化された薬物送達を増強する１以上の部分を含み得る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと）。例示的標的化部分として、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５,４１６,０１６号を参照のこと）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
【０４３３】
ＸＶＩ. 使用および方法
本明細書に記載される抗体、抗体組成物および方法は、例えば、例として、ＴＩＭ３（例えば、シグナル伝達）の阻害（もしくはアンタゴナイズ）による免疫応答の増強またはＴＩＭ３の検出に関する、多数のインビトロおよびインビボでの有用性を有する。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト抗体である。例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、インビトロもしくはエキソビボで培養下の細胞に、または種々の疾患において免疫性を増強するために、例えば、インビボでヒト対象に、投与することができる。したがって、対象において免疫応答を修飾する方法であって、対象において免疫応答が修飾されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、応答は、増強、刺激または上方制御される。
【０４３４】
本方法に好適な対象としては、免疫応答の増強が望ましいであろうヒト患者が挙げられる。本方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞に媒介される免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増大させることによって処置することができる障害を有するヒト患者を処置するために、特に好適である。特定の実施形態では、本方法は、インビボでのがんの処置のために特に好適である。免疫性の抗原特異的な増強を達成するために、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を、目的とされる抗原と一緒に投与してもよく、または抗原が、処置されるべき対象においてすでに存在していてもよい（例えば、腫瘍担持対象またはウイルス担持対象）。ＴＩＭ３に対する抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合には、２種は、別個に投与することも、同時に投与することもできる。
【０４３５】
また、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＴＩＭ３と特異的に結合するモノクローナル抗体、例えばヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその部分とヒトＴＩＭ３との複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＴＩＭ３抗原の存在を検出するか、またはヒトＴＩＭ３抗原の量を測定するための方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、この場合、対照サンプルと比較した、サンプル間の複合体形成の相違が、サンプルにおけるヒトＴＩＭ３抗原の存在を示す。さらに、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＴＩＭ３を精製するために使用できる。
【０４３６】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体が、例えば、ＴＩＭ３の負の作用を阻害することによって、Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激または共刺激する能力を踏まえて、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御するインビトロおよびインビボ方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＣＤ３刺激もまた、提供され（例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞とともに共インキュベートすることによって）、この刺激は、抗ＴＩＭ３抗体での刺激と同時、その前または後に提供され得る。例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、前記Ｔ細胞を、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体と接触させ、適宜、抗ＣＤ３抗体と接触させることを含む、方法が、本明細書において提供される。
【０４３７】
抗原特異的Ｔ細胞応答の任意の好適な指標を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定することができる。そのような好適な指標の非限定的な例としては、抗体の存在下におけるＴ細胞増殖の増大および／または抗体の存在下におけるサイトカイン産生の増大が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２および／またはインターフェロン−γ産生が、刺激される。
【０４３８】
抗ＴＩＭ３抗体により増強または共刺激することができるＴ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞（例えば、Ｔｈ１細胞）または細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞であり得る。
【０４３９】
対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）が刺激されるように、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を対象に投与することを含む、対象において免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する方法が、さらに包含される。いくつかの実施形態では、対象は、腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は、固形腫瘍または液性腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。特定の実施形態では、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、非免疫原性である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陰性である。対象は、ウイルス担持対象であってもよく、そのウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０４４０】
対象において腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、方法が、さらに提供される。対象におけるウイルス感染を処置する方法であって、ウイルス感染が、対象において処置されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、方法もまた、提供される。
【０４４１】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、補助療法として対象に提供される。がんを有する対象の、抗ＴＩＭ３抗体による処置は、生存期間の延長、例えば、現在の標準的な治療法と比べて長期永続的な応答、少なくとも３カ月間、６カ月間、９カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、１０年間もしくはそれ以上の長期生存、または少なくとも３カ月間、６カ月間、９カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間もしくは１０年間もしくはそれ以上の再発のない生存期間をもたらし得る。特定の実施形態では、がんを有する対象の、抗ＴＩＭ３抗体での処置は、例えば、３カ月間、６カ月間、９カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間もしくは１０年間またはそれ以上、がんの再発を予防するか、またはがんの再発を遅延させる。抗ＴＩＭ３処置は、第１選択肢、第２選択肢または第３選択肢の処置として使用することができる。
【０４４２】
がんを有する対象の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１での処置は、例えば、疾患の安定、部分的応答、全生存期間の増大、無疾患生存期間の増大、無増悪生存期間の増強をもたらし得る。
【０４４３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、著しく毒性ではない。例えば、ＴＩＭ３抗体は、例えば、臨床試験において判定される場合、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１つ以上に対して、著しく毒性ではない。特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫性または炎症を著しく引き起こすことはない。
【０４４４】
特定の実施形態では、対象の、抗ＴＩＭ３アンタゴニスト（例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体）での処置は、対象の免疫系が、対象自身を攻撃する（例えば、自己免疫応答）か、または例えば、アナフィラキシーを引き起こすほどに、免疫系の過剰刺激をもたらすことはない。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、アナフィラキシーを引き起こさない。
【０４４５】
特定の実施形態では、対象の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体、例えば、１３Ａ３もしくはその変異体（例えば、本明細書に記載される）または本明細書に記載されるその他の抗ＴＩＭ３抗体のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体での処置は、有意な炎症性反応、例えば、免疫媒介性肺炎、免疫媒介性大腸炎、免疫媒介性肝炎、免疫媒介性腎炎もしくは腎不全、免疫媒介性下垂体炎、免疫媒介性甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症またはその他の免疫媒介性悪性反応を引き起こさない。特定の実施形態では、１３Ａ３もしくはその変異体（例えば、本明細書に記載される）のＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＴＩＭ３抗体は、他の抗ＴＩＭ３抗体よりも少ない炎症性反応、例えば、免疫媒介性肺炎、免疫媒介性大腸炎、免疫媒介性肝炎、免疫媒介性腎炎もしくは腎不全、免疫媒介性下垂体炎、免疫媒介性甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、アナフィラキシーまたはその他の免疫媒介性悪性反応を引き起こす。特定の実施形態では、対象の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体、例えば、１３Ａ３もしくはその変異体（例えば、本明細書に記載される）または他の抗ＴＩＭ３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体での処置は、有意な心臓の障害、例えば、心室性不整脈；眼の障害、例えば、虹彩毛様体炎；注入関連反応；アミラーゼの増加,リパーゼの増加；神経系の障害、例えば、めまい、末梢性および感覚性ニューロパチー；皮膚および皮下組織の障害、例えば、発疹、掻痒、剥離性皮膚炎、多形性紅斑、白斑もしくは乾癬；呼吸器、胸部および縦隔の障害、例えば、咳；疲労；吐き気；食欲低下；便秘；関節痛；または下痢を引き起こさない。
【０４４６】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、別のがん療法、例えば、免疫系を刺激する化合物（例えば、免疫−腫瘍学薬剤）、例えば、本明細書に記載される化合物または本明細書に記載される標的を調節する化合物との組合せで、相乗的抗腫瘍作用を提供する。
【０４４７】
キメラまたはヒト化抗体とは対照的に、ヒト抗体を使用することで、より低い抗薬物抗体（ＡＤＡ）レベルがもたらされ得る。したがって、本明細書に記載されるヒト抗ＴＩＭ３抗体、例えば、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、ヒト抗体ではない抗ＴＩＭ３抗体と比べて（例えば、ヒト化またはキメラ抗ＴＩＭ３抗体と比べて）、より低いＡＤＡを有し得る。
【０４４８】
本明細書に記載されるこれらおよびその他の方法は、以下にさらに詳述される。
【０４４９】
ＸＶＩ. がん
抗ＴＩＭ３抗体によるＴＩＭ３の阻害は、がんを有する患者におけるがん性細胞に対する免疫応答を増強し得る。がんを有する対象を処置するための方法であって、対象が処置される、例えば、その結果、がん性腫瘍の成長が阻害もしくは低減される、および／または腫瘍が退縮する、および／または生存期間が延長されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。抗ＴＩＭ３抗体を単独で使用して、がん性腫瘍の成長を阻害することができる。あるいは、抗ＴＩＭ３抗体は、以下に記載されるように、別の薬剤、例えば、別の免疫原性剤、標準がん処置または別の抗体とともに使用することができる。
【０４５０】
したがって、対象において、例えば、腫瘍細胞の成長を阻害することによって、がんを処置する方法であって、対象に、治療上有効な量の、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体、例えば、野生型ＩｇＧ定常領域または低減されたエフェクター機能を有する定常領域、例えば、ＩｇＧ１.１またはＩｇＧ１.３を有するＴＩＭ３.２、ＴＩＭ３.４、ＴＩＭ３.５、ＴＩＭ３.６、９Ｆ６、８Ｂ９、ＴＩＭ３.９、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.７およびＴＩＭ３.８、またはその抗原結合部分を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。抗体は、ヒト抗ＴＩＭ３抗体（例えば、本明細書に記載されるヒト抗ヒトＴＩＭ３抗体のいずれか）であり得る。本開示の抗体を使用して成長を阻害することができるがんには、典型的に免疫療法に応答性であるがんおよび典型的に免疫療法に応答性でないものが含まれる。処置することができるがんにはまた、ＴＩＭ３陽性がんも含まれる。がんは、固形腫瘍または血液の悪性腫瘍（液性腫瘍）を伴うがんであってもよい。治療のためのがんの限定されない例として、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および非扁平ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸がん、腎がん（例えば、明細胞がん）、卵巣がん、肝臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、前立腺がん（例えば、ホルモン難治性前立腺腺がん）、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵臓がん、神経膠芽腫（神経膠芽腫多形）、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん腫および頭頸部がん（またはがん腫）、胃がん（gastric cancer）、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫）、骨がん、皮膚がん、子宮がん、肛門領域のがん、精巣がん、卵管のがん腫、子宮内膜のがん腫、子宮頸部のがん腫、膣のがん腫、外陰部のがん腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、上皮小体腺のがん、副腎のがん、柔組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児の固形腫瘍、尿管のがん、腎盂のがん腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳のがん、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導性がん、ウイルス関連がんまたはウイルス起源のがん（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ関連もしくは起源の腫瘍））および２種の主要な血液細胞系統のいずれか、すなわち、骨髄系細胞株（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する）またはリンパ球系細胞株（Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する）に由来する血液悪性腫瘍、例えば、全ての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３また���Ｍ３変異体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ球系組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ  １＋）大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる）およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（低悪性度骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形がん腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscaroma）および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性がんおよび奇形がん腫を含めたその他の腫瘍、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜種）；血管中心性（鼻腔の）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部のがん、腎がん、直腸がん、甲状腺のがん；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記のがんの任意の組合せが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、転移性がん、切除不能な難治性がん（例えば、遮断性ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体を用いる、例えば、これまでの免疫療法に対して難治性のがん）および／または再発性がんの治療のために使用してもよい。
【０４５１】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、以前の処置、例えば、免疫−腫瘍学薬物もしくは免疫療法薬を用いた以前の処置に対して不適切な応答を示したかもしくはその後進行したがんを有する患者に、または不応性もしくは耐性、本質的に不応性もしくは耐性のいずれかである（例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストに対して不応性である）がんを有する患者に、または耐性もしくは不応性状態が獲得された場合に、投与される。例えば、第１の治療法に対して応答性でないかもしくは十分に応答性でない対象、または処置後、例えば、抗ＰＤ−１での処置後に、疾患の進行が見られる対象を、抗ＴＩＭ３抗体の、単独または別の治療法（例えば、抗ＰＤ−１治療法）と組み合わせた投与によって、処置することができる。
【０４５２】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、これまでに免疫−腫瘍学薬剤、例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストを受容していない（すなわち、それを用いた処置を受けていない）患者に、投与される。
【０４５３】
特定の実施形態では、対象におけるがんを処置する方法は、まず、対象が、ＴＩＭ３陽性である、例えば、ＴＩＭ３を発現する腫瘍細胞またはＴＩＬを有するかどうかを判定すること、ならびに対象がＴＩＭ３陽性がん細胞またはＴＩＬ細胞を有する場合、対象に、例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を投与することを含む。がんを有する対象を、抗ＴＩＭ３抗体で処置する方法は、ＴＩＭ３を発現するがん細胞またはＴＩＬ細胞を有する対象に、治療上有効な量のＴＩＭ３抗体を投与することを含み得る。対象が、抗ＴＩＭ３抗体での処置に応答するかどうかを予測するための方法であって、患者のがんまたはＴＩＬ細胞におけるＴＩＭ３のレベルを判定することを含み、ならびに対象のがんまたはＴＩＬ細胞が、ＴＩＭ３陽性である場合、対象は、ＴＩＭ３抗体での処置に応答する可能性が高い、方法もまた、本明細書において提供される。
【０４５４】
特定の実施形態では、対象におけるがんを処置する方法は、まず、対象が、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１陽性である、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１を発現する腫瘍細胞またはＴＩＬを有するかどうかを判定すること、ならびに対象がＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１陽性がん細胞またはＴＩＬ細胞を有する場合、対象に、例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体（および適宜ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト）を投与することを含む。がんを有する対象を、抗ＴＩＭ３抗体（および適宜ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト）で処置する方法は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を発現するがん細胞またはＴＩＬ細胞を有する対象に、治療上有効な量のＴＩＭ３抗体（および適宜ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１アンタゴニスト）を投与することを含み得る。対象が、抗ＴＩＭ３抗体（および適宜ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト）での処置に応答するかどうかを予測するための方法であって、患者のがんまたはＴＩＬ細胞におけるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１のレベルを判定することを含み、ならびに対象のがんまたはＴＩＬ細胞が、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１陽性である場合、対象は、ＴＩＭ３抗体（および適宜ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト）での処置に応答する可能性が高い、方法もまた、本明細書において提供される。
【０４５５】
抗ＴＩＭ３抗体は、標準治療処置とともに投与され得る。抗ＴＩＭ３抗体は、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を予防することを意図する治療法として、投与されてもよい。
【０４５６】
抗ＴＩＭ３抗体は、別の処置、例えば、放射線、外科手術または化学療法とともに、投与され得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体の補助療法は、微小転移が存在し得る危険性がある場合、および／または再発の危険性を低減するために、投与され得る。
【０４５７】
抗ＴＩＭ３抗体は、単剤療法として投与されてもよく、唯一の免疫刺激療法として投与されてもよい。ＴＩＭ３に対する抗体、例えば、抗ＴＩＭ３抗体はまた、免疫原性剤、例えば、がん性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞ならびに免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞と組み合わせることができる（He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28）。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。（以下にさらに論じられる）。
【０４５８】
ヒトにおいて、黒色腫などの一部の腫瘍は、免疫原性であることが示されている。ＴＩＭ３の阻害を通じてＴ細胞活性化の閾値を低下させることにより、宿主における腫瘍応答が活性化され、非免疫原性腫瘍または限定された免疫原性を有するものの治療が可能となり得る。
【０４５９】
抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせることができる。腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている（Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738を参照のこと; DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition中のRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと）。これらの戦略の１つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であるとわかっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであるとわかっている（Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43）。
【０４６０】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった（Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7）。多くの場合には、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示され得る。これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、ＴＩＭ３阻害は、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物とともに使用できる。これらのタンパク質は、正常には、自己抗原として免疫系によって見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトがんの８５％超において、および限定された数の体細胞組織のみにおいて発現されるタンパク質テロメラーゼを含み得る（Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変更するか、または２種の無関係の配列間の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｃｒ−ａｂｌ）もしくはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプを作製する体細胞突然変異のためにがん細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
【０４６１】
その他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒトがんに関わるウイルスに由来するタンパク質を含み得る。ＴＩＭ３阻害とともに使用できる腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達で高度に効率的である（Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120）。
【０４６２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答をプライムするために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載させることができる（Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。ＤＣはまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝的手段によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫処置を目的として腫瘍細胞と直接融合されている（Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化するよう、ＤＣ免疫処置を、ＴＩＭ３阻害と効率的に組み合わせることができる。
【０４６３】
ＴＩＭ３阻害はまた、標準がん治療（例えば、外科手術、放射線および化学療法）と組み合わせることができる。ＴＩＭ３阻害は、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、投与される化学療法試薬の用量を低減することが可能であり得る（Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの一例として、黒色腫の治療のためのデカルバジン（decarbazine）と組み合わせた抗ＴＩＭ３抗体がある。このような組合せの別の例として、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせた抗ＴＩＭ３抗体がある。ＴＩＭ３阻害および化学療法の組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死による、ＴＩＭ３阻害との相乗作用をもたらし得るその他の併用治療として、放射線照射、手術およびホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、ＴＩＭ３阻害と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
【０４６４】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体はまた、適宜免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）とともに、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用できる（例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同第５,８３７,２４３号を参照のこと）。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体が、腫瘍の部位に対するマクロファージを標的とするために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答を効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＴＩＭ３の阻害によって増大される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達され得る。
【０４６５】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β（Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、ＩＬ−１０（Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド（Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答に有利に働くよう、抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせて使用できる。
【０４６６】
宿主免疫応答性を活性化するその他の抗体を、抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、効率的に、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ（Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478）、抗ＴＩＭ３抗体とともに使用できる。ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５,８１１,０９７）、ＯＸ−４０（Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169）、４−１ＢＢ（Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ（Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266）などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することはまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供し得る。ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤もまた、抗ＴＩＭ３抗体とともに使用してもよい。その他の組合せは、本明細書の別の箇所に提供される。
【０４６７】
骨髄移植は現在、造血起源の種々の腫瘍を処置するために使用されている。この処置の結果として、移植片対宿主病があるが、治療的利点が、移植片対腫瘍の応答から得ることができる。ＴＩＭ３阻害を使用して、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大することができる。
【０４６８】
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および拡大、および腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するのための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含むいくつかの実験治療プロトコールも存在する（Greenberg & RiddellScience 285: 546-51）。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化するよう使用できる。抗ＴＩＭ３の存在下でのエキソビボ活性化は、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大することができる。
【０４６９】
ＸＶＩ. 感染性疾患
本明細書に記載される方法は、特定の毒素または病原体に曝露された患者を治療するためにも使用され得る。したがって、本明細書に記載される別の態様は、対象が感染性疾患について治療されるように、対象に抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象において感染性疾患を治療する方法を提供する。さらに、またはあるいは、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【０４７０】
上述のような腫瘍へのその適用と同様に、抗体媒介性ＴＩＭ３阻害を、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例としては、現在有効なワクチンが存在しない病原体、または従来的なワクチンが、完全な有効性に満たない病原体が挙げられる。これらには、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢおよびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア症、マラリア、リーシュマニア症、黄色ブドウ球菌、シュードモナス・エルギノーザが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＩＭ３阻害は、感染の過程にわたって変更された抗原を提示する、ＨＩＶなどの作用因子による確立された感染症に対して有用であり得る。これらの新規なエピトープは、抗ヒトＴＩＭ３抗体の投与の時点では外来として認識され、したがって、強力なＴ細胞応答を誘起する。
【０４７１】
本明細書に記載される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟疣ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
【０４７２】
本明細書に記載される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例としては、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌（pneumonococci）、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス毒、炭疽菌、疫病、レプトスピラならびにライム病菌が挙げられる。
【０４７３】
本明細書に記載される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例としては、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリスなど）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガーツス、ニガーなど）、ケカビ属（ムコール、アブシジア、リゾプス）、スポロスリックス・シェンキー（Sporothrix schenkii）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）が挙げられる。
【０４７４】
本明細書に記載される方法によって処置可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例としては、エントアメーバ・ヒストリティカ（Entamoeba histolytica）、大腸バランチジウム（Balantidium coli）、ネグレリア・フォーレリ（Naegleriafowleri）、アカントアメーバ種（Acanthamoeba sp.）、ジアルジア・ランブリア（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム種（Cryptosporidium sp.）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、プラスモディウム・ビバックス（Plasmodium vivax）、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、リーシュマニア・ドノバン（Leishmania donovani）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Toxoplasma gondii）およびニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）が挙げられる。
【０４７５】
上記の方法の全てにおいて、ＴＩＭ３阻害を、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法（例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照のこと）などの、例えば本明細書に記載される、その他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。
【０４７６】
ＸＶＩ.Ｃ. 自己免疫反応
抗ＴＩＭ３抗体は、自己免疫応答を誘起し、増幅し得る。実際に、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用した抗腫瘍応答の誘導により、多数の抗腫瘍応答には、抗自己反応性が関与することが明らかとなっている（van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489、Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987、Hurwitz, (2000)上記、Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4）。したがって、疾患の処置に様々な自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成するワクチン接種プロトコールを考え出すために、抗ＴＩＭ３抗体を、これらの自己タンパク質とともに使用することを検討することが可能である。例えば、アルツハイマー病には、脳のアミロイド沈着におけるΑβペプチドの不適切な蓄積が関与し、アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着を取り除くことができる（Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177）。
【０４７７】
アレルギーおよび喘息の処置のためのＩｇＥならびにリウマチ性関節炎のためのＴＮＦ−αなど、他の自己タンパク質もまた、標的として使用することができる。最終的に、種々のホルモンに対する抗体応答を、抗ＴＩＭ３抗体の使用によって誘導することができる。生殖ホルモンに対する抗体応答の中和は、避妊として使用することができる。特定の腫瘍の成長に必要なホルモンおよび他の可溶性因子に対する抗体応答の中和はまた、可能性のあるワクチン接種標的と考えることができる。
【０４７８】
抗ＴＩＭ３抗体の使用に関して上述のものと類似の方法を、他の自己抗原、例えば、アルツハイマー病におけるΑβを含む、アミロイド沈着、サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、およびＩｇＥの不適切な蓄積を有する患者を治療するために、治療的自己免疫応答の誘導に使用することができる。
【０４７９】
ＸＶＩ.Ｄ. ワクチン
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、抗ＴＩＭ３抗体と目的の抗原（例えば、ワクチン）との共投与によって、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用することができる。したがって、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象において抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に、（ｉ）抗原、および（ｉｉ）抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。抗体は、ヒト抗ヒトＴＩＭ３抗体（例えば、本明細書に記載されるヒト抗ＴＩＭ３抗体のいずれか）であり得る。さらに、またはあるいは、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であり得る。そのような抗原の非限定的な例としては、上述の節において考察されたもの、例えば、上述の腫瘍抗原（もしくは腫瘍ワクチン）、または上述のウイルス、細菌もしくはその他の病原体に由来する抗原が挙げられる。
【０４８０】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質が、抗ＴＩＭ３抗体の代わりにまたはそれに加えて、ワクチンとして使用される。
【０４８１】
本明細書に記載される抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびにイムノコンジュゲート）をインビボおよびインビトロで投与する好適な経路は、当技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈内または皮下）によって投与され得る。使用される分子の好適な投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／もしくは製剤に依存するであろう。
【０４８２】
前述のように、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、１つまたはその他の複数の治療剤、例えば、細胞傷害性薬剤、放射線毒性薬剤または免疫抑制剤と共投与され得る。抗体は、薬剤と連結されてもよく（免疫複合体として）、または薬剤とは別個に投与されてもよい。後者の事例（別個の投与）では、抗体は、薬剤の前、後もしくは同時に投与されてもよく、または他の公知の治療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線と共投与されてもよい。そのような治療剤としては、とりわけ、抗新生物剤、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン  硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素が挙げられ、これらは、それ自体では、患者に対して毒性または準毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、１００ｍｇ／ｍｌの用量として、４週間に１回静脈内投与され、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として、２１日に１回静脈内投与される。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片の、化学療法剤との共投与により、異なる機序で作動する２つの抗がん剤が提供され、これによりヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害性作用が生じる。そのような共投与により、腫瘍細胞を抗体に非反応性にするであろう薬物に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性における変化に起因する問題が解決され得る。
【０４８３】
本明細書に記載される抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子またはイムノコンジュゲート）および使用のための説明書を含む、キットもまた、本明細書に記載される範囲内である。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、または１つもしくは複数の追加の本明細書に記載されるヒト抗ＴＩＭ３抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なるＴＩＭ３抗原のエピトープに結合する相補性活性を有するヒト抗体）をさらに含んでもよい。キットは、典型的に、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの上にもしくはキットとともに提供されるかまたはキットに付随する、任意の記述または記録材料を含む。
【０４８４】
ＸＶＩ.Ｅ. 併用療法
上記に提供される併用療法に加えて、抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載されるものはまた、例えば、以下に記載されるように、がんを処置するための併用療法において使用できる。
【０４８５】
抗ＴＩＭ３抗体を、１以上のさらなる薬剤、例えば、免疫応答を刺激するのに有効である小分子薬、抗体またはその抗原結合部分と同時投与し、それによって、対象において免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する併用療法の方法が、本明細書において提供される。
【０４８６】
一般に、例えば、本明細書に記載される、抗ＴＩＭ３抗体は、（ｉ）刺激性（例えば、共刺激性）分子（例えば、受容体もしくはリガンド）のアゴニストならびに／または（ｉｉ）免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上の阻害性シグナルもしくは分子（例えば、受容体もしくはリガンド）のアンタゴニストと組み合わせることができ、これらのいずれも、免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答の増幅をもたらす。特定の態様では、免疫−腫瘍学薬剤は、（ｉ）刺激性（共刺激性を含む）分子（例えば、受容体もしくはリガンド）のアゴニスト、または（ｉｉ）細胞、例えば、Ｔ細胞活性化を阻害するものまたは自然免疫に関与するもの、例えば、ＮＫ細胞上の阻害性（共阻害性を含む）分子（例えば、受容体もしくはリガンド）のアンタゴニストであり、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、自然免疫を増強する。そのような免疫−腫瘍学薬剤は、しばしば、免疫チェックポイント制御因子、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント刺激剤と称される。
【０４８７】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである、刺激性分子または阻害性分子を標的とする薬剤とともに投与される。例えば、抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載されるものは、免疫応答を増大させるために、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤とともに、対象に投与され得る。例えば、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）およびＢ７−Ｈ６を含む、膜結合型リガンドのＢ７ファミリーのメンバー、またはＢ７ファミリーメンバーと特異的に結合する共刺激性もしくは共阻害性受容体もしくはリガンドを標的とする（もしくはそれと特異的に結合する）、薬剤とともに、投与され得る。
【０４８８】
抗ＴＩＭ３抗体はまた、分子のＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバー（リガンドまたは受容体）、例えば、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−ｌＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ  １４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴｐＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンａ／ＴＮＦｐ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦａ、ＬＴｐＲ、リンホトキシンａ１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹならびにＮＧＦＲを標的とする薬剤とともに、投与され得る（例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00: 1を参照のこと）。
【０４８９】
Ｔ細胞応答は、例えば、ＴＩＭ３.２、ＴＩＭ３.４、ＴＩＭ３.５、ＴＩＭ３.６、９Ｆ６、８Ｂ９、ＴＩＭ３.９、ＴＩＭ３.１０、ＴＩＭ３.１１、ＴＩＭ３.１２、ＴＩＭ３.１３、ＴＩＭ３.１４、ＴＩＭ３.１５、ＴＩＭ３.１６、ＴＩＭ３.１７、ＴＩＭ３.１８、ＴＩＭ３.７およびＴＩＭ３.８の可変領域を有する抗ＴＩＭ３抗体と、以下の薬剤の１つ以上との組合せによって、刺激され得る。
（１）ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＧＩＴＲ、およびＬＡＧ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、およびＴＩＭ−４など、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害因子）のアンタゴニスト（阻害剤もしくは遮断剤）、ならびに／または
（２）Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８Ｈなど、Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
【０４９０】
上記のタンパク質の１つを調節し、がんを治療するために抗ＴＩＭ３抗体、例えば、本明細書に記載されるものと組み合わせることができる例示的薬剤として、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（イピリムマブ）またはトレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４に対する）、ガリキシマブ（Ｂ７.１に対する）、ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１に対する）、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１に対する）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＣＴＲＩＱ（登録商標））、ＡＭＰ２２４（Ｂ７ＤＣに対する）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＥＤＩ−５７０（ＩＣＯＳに対する）、ＡＭＧ５５７（Ｂ７Ｈ２に対する）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ−３に対する）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７に対する）、ＰＦ−０５０８２５６６（ＣＤ１３７に対する）、ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７に対する）、抗ＯＸ−４０（Providence Health Services）、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌに対する）、アタシセプト（ＴＡＣＩに対する）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０に対する）、ルカツムマブ（ＣＤ４０に対する）、ダセツズマブ（ＣＤ４０に対する）、ムロモナブ−ＣＤ３（ＣＤ３に対する）、抗ＧＩＴＲ抗体ＭＫ４１６６、ＴＲＸ５１８、Ｍｅｄｉ１８７３、ＩＮＢＲＸ−１１０、ＬＫ２−１４５、ＧＷＮ−３２３、ＧＩＴＲＬ−Ｆｃ、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０４９１】
がんの治療のために抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるその他の分子として、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、抗ＴＩＭ３抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えば、リリルマブ（lirilumab））と組み合わせることができる。
【０４９２】
Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストとともに、例えばがんを有する対象に投与され得る。
【０４９３】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体を、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト（または阻害剤もしくは遮断剤）またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ「免疫抑制サイトカイン」）のアンタゴニストおよび／または（ｉｉ）免疫応答を刺激するための、例えば、がんなどの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
【０４９４】
併用療法のためのさらにその他の薬剤として、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤、それだけには限らないが、ＲＧ７１５５（ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４）またはＦＰＡ−００８（ＷＯ１１／１４０２４９、ＷＯ１３１６９２６４、ＷＯ１４／０３６３５７）を含めたＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストが挙げられる。
【０４９５】
抗ＴＩＭ３抗体はまた、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤とともに投与してもよい。
【０４９６】
抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるさらなる薬剤として、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモド、または腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法（例えば、アントラサイクリン）が挙げられる。
【０４９７】
抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるさらなる他の治療法として、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療法、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤が挙げられる。
【０４９８】
抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができる別の治療法は、インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法である。
【０４９９】
抗ＴＩＭ３抗体とともに使用され得る別のクラスの薬剤として、アデノシンの形成を阻害する薬剤、例えばＣＤ７３阻害剤またはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤が挙げられる。
【０５００】
がんを治療するために抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができる他の治療法として、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞消耗を逆転／防止する治療法ならびに腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療法が挙げられる。
【０５０１】
がんを治療するために抗ＴＩＭ３抗体と組み合わせることができるその他の治療法は、ＩＬ−８を遮断する治療法、例えば、ＨｕＭａｘ−ＩＬ８を用いるものが挙げられる。
【０５０２】
抗ＴＩＭ３抗体は、１種を上回る免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせてもよく、例えば、次の：腫瘍抗原の提示を増強する治療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；例えば、ＣＴＬＡ−４および／もしくはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路を阻害するならびに／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞を枯渇もしくは遮断することによって、負の免疫制御を阻害する治療法；例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０および／もしくはＣＤ４０もしくはＧＩＴＲ経路を刺激するアゴニストならびに／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストを用いて、正の免疫調節を刺激する治療法；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる治療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用してまたはエキソビボでの抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって腫瘍におけるＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療法；腫瘍における抑制骨髄系細胞の機能に影響を及ぼす治療法；腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞（ＣＡＲ−Ｔ療法）を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法；Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞消耗を逆転／防止する治療法；腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療法；免疫刺激サイトカインの投与；あるいは免疫抑制サイトカインの遮断の１つ以上など、免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせてもよい。
【０５０３】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体は、１以上の、陽性共刺激性受容体をライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬、アンタゴニストならびに１以上の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増大する薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路に克服する（例えば阻害性受容体の関与（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用）を遮断しＴｒｅｇを枯渇または阻害し（例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ）を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって）、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転させる／防ぐ）薬剤および先天性免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症の引き金を引く薬剤と一緒に使用できる。
【０５０４】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、対象が、ＢＲＡＦ  Ｖ６００突然変異に関して陽性である場合、ＢＲＡＦ阻害剤と一緒に対象に投与される。
【０５０５】
本明細書に記載される併用療法において使用するための適したＰＤ−１アンタゴニストとして、制限するものではないが、リガンド、抗体（例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体）および多価薬剤が挙げられる。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４などのＦｃ融合タンパク質である。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０５０６】
例示的抗ＰＤ−１抗体として、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１種のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体がある。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＭＫ−３４７５（ランブロリズマブ）；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＡＭＰ−５１４；またはＰＤＲ００１；である。さらに公知のＰＤ−１抗体およびその他のＰＤ−１阻害剤として、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号ならびに米国特許公開第２００９／０３１７３６８号に記載されるものが挙げられる。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ−１抗体のいずれかも使用してもよい。これらの抗体のうち１種と同様に、結合についてＰＤ−１上の同一エピトープと競合する、および／またはＰＤ−１上の同一エピトープと結合する抗ＰＤ−１抗体も、併用治療において使用してもよい。
【０５０７】
いくつかの実施形態では、併用療法に有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号では１２Ａ４と呼ばれる）またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号に記載される３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブおよび抗Ｂ７−Ｈ１としても知られている）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブおよびＲＧ７４４６としても知られている）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブとしても知られている、ＷＯ２０１３／７９１７４）またはｒＨｉｇＭ１２Ｂ７である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号および米国特許公開第２００９／１４５４９３号において開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれも使用してもよい。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も、併用治療において使用してもよい。
【０５０８】
特定の実施形態では、本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体とともに使用することができる。一実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されるイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１）、トレメリムマブ（以前は、チシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６）、モノクローナルまたは以下の刊行物：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６,２０７,１５６；Hurwitz et al. (1998) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145):Abstract No. 2505(抗体CP-675206)；およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304のいずれかに記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体の群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれも、使用してよい。
【０５０９】
他の実施形態では、本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＬＡＧ３アンタゴニストと組み合わせて使用される。抗ＬＡＧ３抗体の例として、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２、ＷＯ１０／１９５７０およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる、その他の当技術分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体として、ＵＳ２０１１／００７０２３、ＷＯ０８／１３２６０１およびＷＯ０９／４４２７３に記載されるＩＭＰ７３１およびＩＭＰ−３２１が挙げられる。ＩＭＰ−３２１もまた、使用され得る。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＬＡＧ−３抗体も、併用治療において使用してもよい。
【０５１０】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ１３７抗体と組み合わせて投与され得る。好適なＣＤ１３７抗体としては、例えば、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６（Ｗ０１２／３２４３３）が挙げられる。
【０５１１】
他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＯＸ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＯＸ４０抗体と組み合わせて投与され得る。好適なＯＸ４０抗体としては、例えば、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−６４６９またはＭＯＸＲ０９１６（ＲＧ７８８８、ＷＯ０６／０２９８７９）が挙げられる。
【０５１２】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、ＣＤ４０アンタゴニスト、例えば、アンタゴニストＣＤ４０抗体である。好適なＣＤ４０抗体として、例えば、ルカツムマブ（ＨＣＤ１２２）、ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０）、ＣＰ−８７０,８９３またはＣｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４が挙げられる。
【０５１３】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＣＤ２７アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ２７抗体と組み合わせて投与され得る。好適なＣＤ２７抗体として、例えば、バルリルマブ（varlilumab）（ＣＤＸ−１１２７）が挙げられる。
【０５１４】
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する抗体、例えば、例として、ＷＯ２００６／１０５０２１に記載される６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＪＰ２００８２７８８１４に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＷＯ２０１５／０３１６６７、ＷＯ２０１５／１８７８３５、ＷＯ２０１５／１８４０９９、ＷＯ２０１６／０５４６３８、ＷＯ２０１６／０５７８４１もしくはＷＯ２０１６／０５７８４６に記載される抗ＧＩＴＲ抗体または本明細書に記載される、もしくは参照される他の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体と一緒に投与される。
【０５１５】
他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する）（ＷＯ１１／１０９４００）と組み合わせて投与される。
【０５１６】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＫＩＲアンタゴニスト、例えば、リリルマブと組み合わせて投与される。
【０５１７】
他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＩＤＯアンタゴニストと組み合わせて投与される。好適なＩＤＯアンタゴニストとして、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０（ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２）、インドキシモド（indoximod）、ＮＬＧ−９１９（ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７）またはＦ００１２８７が挙げられる。
【０５１８】
さらに他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト（例えば、カルメット・ゲラン桿菌（Bacillus Calmette-Guerin））；ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ヒルトノール（Hiltonol）またはイミキモド）；ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、レシキモド）；またはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ７９０９）と組み合わせて投与される。
【０５１９】
一実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＧＦ−β阻害剤、例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７またはＩＭＣ−ＴＲ１と組み合わせて投与される。
【０５２０】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体および組合せ療法を、治療されている適応症（例えば、がん）に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤（単数または複数）と逐次使用してもよい。
【０５２１】
例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体および組合せ療法は、放射線照射および／または化学療法、（例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル（タキソール）、ドキソルビシン、５−ＦＵまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ（６Ｘ  ｃｏｍｂｏ）を使用する）、１以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２）、１以上のＢｃｌ−２阻害剤（例えば、ＢＨ３Ｉ−２’（ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤）、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ１）阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９、またはＦ００１２８７）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール誘導体）、ＡＢＴ−２６３（小分子）、ＧＸ−１５−０７０（オバトクラックス（obatoclax））またはＭＣＬ−１（骨髄系白血病細胞分化タンパク質−１）アンタゴニスト）、ｉＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）アンタゴニスト（例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド（Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15）、ＩＳＩＳ２３７２２（ＬＹ２１８１３０８）またはＡＥＧ−３５１５６（ＧＥＭ−６４０））、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤（例えば、アバスチン）、合成トリテルペノイド（Hyer et al, Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと）、ｃ−ＦＬＩＰ（細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質）モジュレーター（例えば、ＰＰＡＲｙ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００）、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド（Lenalildomide）、ＧＳＫ３Ｐ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて（例えば、同時または別個に）使用できる。
【０５２２】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体および組合せ療法は、１以上の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
【０５２３】
アルキル化剤（制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
【０５２４】
代謝拮抗剤（制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカププリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０５２５】
当技術分野で公知のその他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、抗ＴＩＭ３抗体、制限するものではないが、タキサン、パクリタキセル（パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬＴＭとして市販されている）、ドセタキセル、ディスコデルモリド（ＤＤＭ）、ジクチオスタチン（ＤＣＴ）、ペロルシド（Peloruside）Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢＩＯ、ディスコデルモリド（discoderomolide）、パツピロン（patupilone）（ＥＰＯ−９０６）、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ（ディスコデルモリド（discoderomolide））、ＴＺＴ−１０２７（ソブリドチン）、ＩＬＸ−６５１（タシドチン塩酸塩（tasidotin hydrochloride）)、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩（Eribulin mesylate）（Ｅ−７３８９）、ヘミアステリン（ＨＴＩ−２８６）、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート（ＤＭ−１）、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２（イスピネシブ（ispinesib））、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７β−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５（１０）−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−（＋）−ディスコデルモリドおよびクリプトチロン（cryptothilone）１と組み合わせるための適した抗増殖性薬剤。
【０５２６】
本明細書に記載される抗ＴＩＭ３抗体を用いる治療とともに、またはそれに先立って異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ZOLADEXTM（登録商標）などのホルモンおよびステロイド（合成類似体を含む）も、患者に投与できる。本明細書に記載される方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
【０５２７】
特定の実施形態では、本明細書において論じられる抗ＴＩＭ３抗体および第２の薬剤の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の抗ＴＩＭ３抗体および第２の薬剤を有する別個の組成物として同時に、投与できる。別の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体および第２の薬剤の組合せは、逐次的に投与され得る。２つの薬剤の投与は、例えば、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、５日間、７日間、または１週間もしくは数週間離れた時点で開始してもよく、または第２の薬剤の投与は、例えば、第１の薬剤を投与した３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、３日後、５日後、７日後、または１週間後もしくは数週間後に開始してもよい。
【０５２８】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体および／または第２の薬剤と組み合わせることができる抗新生物抗体としては、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、リンホサイド（Lymphocide）（登録商標）（エプルツズマブ（eprtuzumab））、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）およびタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）またはこれらの任意の組合せが挙げられる。他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体との併用療法に有用な第２の抗体は、抗体薬物コンジュゲートであり得る。
【０５２９】
他の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、単独または別の薬剤と組み合わせて、造血起源の様々な腫瘍を処置するために、骨髄移植と同時にまたは逐次的に使用される。
【０５３０】
抗ＴＩＭ３抗体を、第２の薬剤を伴って、または伴わずに対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患（例えば、がん）の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。例えば、本明細書に記載される方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。本明細書に記載される一実施形態では、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ENTOCORT EC（登録商標）（Astra-Zeneca）は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。なおもさらなる実施形態では、非吸収性ステロイドを伴う抗ＴＩＭ３抗体を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸として、例えば、スルファサラジン（AZULFIDINE（登録商標）、Pharmacia & UpJohn）；オルサラジン（DJPENTUM（登録商標）、Pharmacia & UpJohn）；バルサラジド（COLAZAL（登録商標）、Salix Pharmaceuticals, Inc.）；およびメサラミン（ASACOL（登録商標）、Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA（登録商標）、Shire US；CANASA（登録商標）、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA（登録商標）、Solvay）などの５−ＡＳＡ薬剤が挙げられる。
【０５３１】
【表１−１】
2019533981.tif 000012
【表１−２】
2019533981.tif 000013
【０５３２】
【表１−３】
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【表１−４】
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【０５３３】
【表１−５】
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【表１−６】
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【０５３４】
【表１−７】
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【表１−８】
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【０５３５】
【表１−９】
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【表１−１０】
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【０５３６】
【表１−１１】
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【表１−１２】
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【０５３７】
【表１−１３】
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【表１−１４】
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【０５３８】
【表１−１５】
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【表１−１６】
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【０５３９】
【表１−１７】
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【表１−１８】
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【０５４０】
【表１−１９】
2019533981.tif 000030
【表１−２０】
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【０５４１】
【表１−２１】
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【表１−２２】
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【０５４２】
【表１−２３】
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【表１−２４】
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【０５４３】
【表１−２５】
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【表１−２６】
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【０５４４】
【表１−２７】
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【表１−２８】
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【０５４５】
【表１−２９】
2019533981.tif 000040
【表１−３０】
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【０５４６】
【表１−３１】
2019533981.tif 000042
【表１−３２】
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【０５４７】
【表１−３３】
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【表１−３４】
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【０５４８】
【表１−３５】
2019533981.tif 000046
【表１−３６】
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【０５４９】
【表１−３７】
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【表１−３８】
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【０５５０】
【表１−３９】
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【表１−４０】
2019533981.tif 000051
【０５５１】
本開示の実施には、別途示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来的な技法が用いられ、これらは、当業者の技能の範囲内である。そのような技法は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)、D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II、Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis、Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195、Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization、Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation、Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)、Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)、Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning、the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)、Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155、Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)、Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV、Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); )、Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照のこと。
【０５５２】
上記に引用された参考文献の全て、ならびに本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５５３】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるものである。
【実施例】
【０５５４】
実施例１：ヒト抗ＴＩＭ３抗体の同定
ヒトＩｇＧトランスジェニック（ＫＭ）マウスを、ヒトＴＩＭ−３をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３ヒト細胞の原形質膜画分を用いて免疫処置した。免疫処置した全てのマウスからのリンパ節細胞を、ＳＰ２／０融合パートナーと融合させた。ハイブリドーマ上清を、まず、ハイスループットアッセイを使用して、ヒトＩｇＧ抗体の存在に関してスクリーニングした。次いで、抗原特異性を、ヒトＴＩＭ−３をトランスフェクトした細胞においてＦＡＣＳ結合によって判定した。簡単に述べると、４７回の融合を行い、３９３５個のＩｇＧ陽性クローンを同定し、そのうちの４４８個が、ＥＬＩＳＡによって、ｈＴＩＭ３陽性であると同定され、このうち１２６個が、ｈＴＩＭ３  ＦＡＣＳによって陽性であることが見出された。これらのうち、１１７個のクローン（または抗体）を、次のものを含む様々な方法によってさらに分析した：（１）Ｂｉａｃｏｒｅによって行われるエピトープビニング、（２）ＥＣ５０を判定するための、ＴＩＭ３の、ＴＩＭ−３をトランスフェクトした細胞株（２９３−ＴＩＭ３）との結合、（３）Ｔｈ１アッセイ（以下にさらに記載される）および（４）ＴＩＬアッセイ（以下にさらに記載される）。１１７個のうち、完全ヒト抗ヒトＴＩＭ３抗体を発現する７個のハイブリドーマ：１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８を、望ましい特徴を有するとして選択した。これらのハイブリドーマによって産生された抗体の可変ドメインのアミノ酸およびそれらをコードするヌクレオチド配列を、図１〜７に提供し、ＣＤＲ、可変領域ならびに重鎖および軽鎖、ならびにそれらのアイソタイプの配列番号を、図１３に提供する（ハイブリドーマ名の行を参照のこと）。ハイブリドーマおよびそれによって分泌される抗体は、同じ名称を有する（例えば、１３Ａ３）。
【０５５５】
抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８のＣＤＲおよび／または可変ドメインを含む抗体はまた、宿主細胞において組換えで発現させた。組換え抗体は、本明細書では、「ＴＩＭ３.２」から「ＴＩＭ３.１８」という名称で称される。これらの組換え抗体のいずれかに、それらの名称「ＴＩＭ３.２」から「ＴＩＭ３.１８」で言及する場合、特定の定常領域には言及されない、すなわち、抗体ＴＩＭ３.２〜ＴＩＭ３.１８は、任意の所望される定常領域、例えば、図１３に示されるものを有し得る。
【０５５６】
ＣＤＲおよび可変ドメインは、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１定常領域（アロタイプ「ｆ」）の状況で発現させ（「ＩｇＧ１.１ｆ」）、また、ＩｇＧ１.３ｆ、すなわち、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａを含むエフェクターレスＩｇＧ１定常領域（アロタイプ「ｆ」）の状況で発現させた。すなわち、これは、ＩｇＧ１.１ｆとは、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓの置換を有さないことのみが異なる。ＣＤＲおよび可変領域はまた、ＩｇＧ４、例えば、ＩｇＧ４Ｐ（すなわち、「Ｓ２２８Ｐ」置換を有するＩｇＧ４）の状況で使用してもよい。これらの抗体の特定のＣＤＲおよびフレームワーク領域はまた、突然変異されている。具体的には、１３Ａ３および８Ｂ９のＶＨＣＤＲ２、１３Ａ３のＶＨＣＤＲ３、ならびにＶＨＦＲ４が、突然変異されている。産生されたＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆ抗体ならびに作製することができるその他の抗体の一覧は、図１３、表１および配列表に提供されている。組換えで発現された抗体には、以下の実施例に記載されるもの、ならびにＩｇＧ１.１ｆ抗体として発現された抗体３Ｇ４、８Ｃ４、９Ｆ６、８Ｂ９、１７Ｃ８、５Ｄ６が含まれる。
【０５５７】
抗体１３Ａ３、８Ｂ９、８Ｃ４、１７Ｃ３、９Ｆ６、３Ｇ４および１７Ｃ８の重鎖および軽鎖可変領域の配列アライメントは、それぞれ図８Ａおよび９Ａに提供されている。ＶＨおよびＶＬ領域の配列表記は、それぞれ図８Ｂおよび９Ｂに提供されている。野生型および突然変異型１３Ａ３  ＶＨ鎖の配列アライメントは、図１０に提供されている。野生型および突然変異型９Ｆ６  ＶＨ鎖の配列アライメントは、図１１に提供されている。野生型および突然変異型８Ｂ９  ＶＨ鎖の配列アライメントは、図１２に提供されている。
【０５５８】
実施例２：ヒト抗ＴＩＭ３抗体の特徴付け
選択された抗ＴＩＭ３抗体を、ＴＩＭ３を発現する細胞との結合に関してアッセイした。図１４Ａは、フローサイトメトリーによって判定した場合の、種々の抗ＴＩＭ３抗体の、ヒトＴＩＭ３をトランスフェクトした細胞との結合（図１４Ａ）、および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ヒトＴ細胞との結合（図１４Ｂ）を示す。抗体はまた、カニクイザルＴＩＭ３をトランスフェクトした細胞（図１５Ａ）および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化Ｔカニクイザル細胞（図１５Ｂ）を使用することによって、カニクイザルＴＩＭ３との結合に関しても試験した。図１５Ａは、１３Ａ３が、カニクイザルＴＩＭ３をトランスフェクトした細胞株については最も良好な結合ＥＣ５０を有し、これが、活性化カニクイザルＴ細胞と反応性である唯一の抗ＴＩＭ３抗体であることを示す。
【０５５９】
実施例３：表面プラズモン共鳴によって判定される、ＴＩＭ３抗体の、ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３に対する結合親和性
抗ＴＩＭ３  １３Ａ３  Ｆａｂ断片の、ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ３に対する動態および親和性を、以下にさらに記載されるように、３７℃、０.０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ  ｐＨ７.４において、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器で判定した。使用したヒトＴＩＭ３タンパク質は、マウスＦｃに連結されたヒトＴＩＭ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなり、したがって、二量体ｈＴＩＭ３  ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質（「ｈＴＩＭ３−ｍＦｃ」）を形成していた。この融合タンパク質は、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から発現させ、プロテインＡ親和性、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、培地から精製した。使用した組換えカニクイザルＴＩＭ３タンパク質は、カニクイザルＴＩＭ３の細胞外ドメイン、続いて、リンカーおよび親和性タグからなり、したがって、単量体カニクイザルＴＩＭ３  ＥＣＤタンパク質（「カニクイザルＴＩＭ３−ＭｙｃＨｉｓＡｖｉ」）を形成していた。この融合タンパク質は、一過的にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞（Life Tech）から発現させ、このタンパク質を、親和性タグを使用して（６ｘ  Ｈｉｓ）、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって、培地から単離し、精製した。
【０５６０】
ｈＴＩＭ３−ｍＦｃのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【化１１】
2019533981.tif 000052
（配列番号３７５）
【０５６１】
カニクイザルＴＩＭ３−ＭｙｃＨｉｓＡｖｉのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【化１２】
2019533981.tif 000053
（配列番号３７６）
【０５６２】
ヒスチジン尾部に連結された１３Ａ３およびＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のＦａｂを、使用した。１３Ａ３重鎖（ＨＣ）Ｆａｂ  ６ｘＨｉｓのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【化１３】
2019533981.tif 000054
（配列番号３６５）
【０５６３】
１３Ａ３重鎖（ＨＣ）Ｎ６０Ｑ  Ｄ１０１Ｅ  Ｆａｂ  ６ｘＨｉｓのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【化１４】
2019533981.tif 000055
（配列番号３６６）
【０５６４】
組換え１３Ａ３およびＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂを、Ｅｘｐｉ２９３（Life Tech）の一過的トランスフェクションを使用して作製した。発現されたＦａｂは、重鎖可変領域、続いて、ｈＩｇＧ１のＣＨ１、および軽鎖可変領域、続いて、ｈＫａｐｐａのＣＬドメインを含んだ。発現されたＦａｂは、培地に分泌され、親和性タグ（６ｘ  Ｈｉｓ）を使用して、精製した。
【０５６５】
抗マウス抗体捕捉チップを、Biacoreマウス抗体用捕捉キット（カタログ番号ＢＲ−１００８−３８）を使用して、Biacore CM4シリーズＳチップ（GE Healthcare Life Sciencesカタログ番号ＢＲ−１００５−３４）に準備した。ヒトＴＩＭ３−マウスＦｃ融合タンパク質を、フローセル２および３に、２つの異なる表面密度で捕捉した。カニクイザルＴＩＭ３−マウスＦｃ融合タンパク質を、フローセル４に捕捉した。フローセル１（ブランク捕捉表面）は、参照としての機能を果たした。組換えで発現させたＨｉｓタグ化抗体Ｆａｂ断片を、検体として、上方濃度１.０μＭおよび下方濃度４.１ｎＭで、３倍の６回希釈系列において、全ての表面に流した。結果として得られたセンサグラムを、二重参照し（フローセル１および緩衝液ブランクを使用して）、質量移動を伴う１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。フローセル２および３からのデータを、全体に当てはめた。
【０５６６】
複合体の形成（Ｋａ）および解離（ＫＤ）の速度、ならびに全体的な解離定数（ＫＤ）を、表２に提供する。
【０５６７】
【表２】
2019533981.tif 000056
【０５６８】
１３Ａ３を用いた実験は、ＴＩＭ３.１８を用いた実験と同日には行わなかった。
【０５６９】
実施例４：スキャッチャード解析によるヒトおよびカニクイザルへのＴＩＭ３抗体の結合親和性
ＴＩＭ３.１８ＩｇＧＩ.３抗体を、IODO-GEN（登録商標）固相ヨウ素化試薬（１,３,４,６−テトラクロロ−３ａ−６ａ−ジフェニルグリコウリル、Pierceカタログ２８６０１）を使用して、１２５Ｉ−Ｎａ（１ｍＣｉ、PerkinElmerカタログＮＥＺ０３３Ｈ００１ＭＣ）で放射ヨウ素標識した。過剰なヨウ素を、脱塩カラム（Pierceカタログ４３２４３）を使用して、除去した。標識した抗体の画分を採取し、Wizard 1470ガンマカウンター（PerkinElmer）で放射活性について分析した。各画分における１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧＩ.３抗体濃度を、InvitrogenのQubitフルオロメーターを用いて計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射活性画分（Pinestar Technologyカタログ１５１−００５）の薄層クロマトグラフィーによって確立した。
【０５７０】
放射ヨウ素標識したＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の、ヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３を発現するＣＨＯ細胞との結合を、ヒトまたはカニクイザルＴＩＭ３を発現するＣＨＯ細胞を、１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の未標識抗体の滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、ＣＰＭの合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の濃度の線形標準曲線を使用して、特異的活性、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
【０５７１】
結果を、図２７Ａおよび２７Ｂに示す。１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体の標準曲線（図２７Ａ）は、１ｎＭの１２５Ｉ標識化抗体が、８１１１９.３ｃｐｍに等しいことを示す。細胞１個当たりの受容体数は、以下の等式によって計算される：（Ｂｍａｘ）×（アボガドロ数）×（アッセイ体積）／１ウェル当たりの細胞数。結果は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体が、ＣＨＯ細胞上の過剰発現したヒトＴＩＭ３（細胞１個当たり４１４,７２０個の受容体を有する）に対して、０.２６〜０.４８ｎＭの親和性を有し、過剰発現したカニクイザルＴＩＭ３（細胞１個当たり２３５,９４４個の受容体を有する）に対して、０.３６〜０.４８ｎＭの親和性を有することを示す。
【０５７２】
２人のドナーに由来する活性化ヒトＴｈ１細胞（細胞５０,０００個／ウェル）において１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３抗体を用いて行った同様の分析により、ドナー間で細胞１個当たりの受容体数がほぼ４倍異なるにもかかわらず、０.１２５〜０.１６４ｎＭの親和性が得られた（図２８）。放射ヨウ素標識したＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の、ヒトＴＩＭ３との結合を、活性化初代ヒトＴｈ１細胞（本明細書の他の実施例に記載されるように調製）を、１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の未標識抗体の滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、ＣＰＭの合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の濃度の線形標準曲線を使用して、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
【０５７３】
実施例５：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の、ヒトＴＩＭ１、ヒトＴＩＭ４およびマウスＴＩＭ３との交差反応性の欠如
遺伝子バンク全体に対してＴＩＭ−３  ＩｇＶドメインをｂｌａｓｔ検索すると、最も高い相同性の分子は、ＴＩＭ１およびＴＩＭ４（４５％同一性）であった。ヒトＴＩＭ１またはＴＩＭ４をトランスフェクトした細胞株を使用したフローサイトメトリーによるＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の選択的なプロファイリングでは、ＴＩＭ１またはＴＩＭ４に対する交差反応性は示されなかった。マウスＴＩＭ３をトランスフェクトした細胞におけるフローサイトメトリーによって、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、マウスＴＩＭ−３をトランスフェクトした細胞と交差反応性ではないこともまた、示された。
【０５７４】
実施例６：腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によるＩＦＮ−γ産生は、抗ＴＩＭ３抗体によって増強される
抗ＴＩＭ３抗体をさらに特徴付け、インビボで有意なＴ細胞刺激活性を有する可能性が高いものを同定するために、特定のＴ細胞アッセイを開発した。アッセイは、新しい腫瘍組織から単離され、ＣＤ３を発現する照射したＣＨＯ細胞（「ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞」）の存在下においてインキュベートした、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から分泌されるＩＦＮ−γの量を、ＴＩＭ３抗体の存在下または不在下（または対照）において、測定する。特定の作用機序に限定されることを望むものではないが、所与の抗ＴＩＭ３抗体の存在下におけるＩＦＮ−γの分泌は、その抗体が、ＴＩＬ上のＴＩＭ３によって通常提供される負のシグナル伝達を阻害し、ＴＩＬの活性化（すなわち、ＩＦＮ−γ産生）を刺激することを示す。
【０５７５】
腎細胞がん患者に由来する新しい腫瘍組織［腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む］を、酵素消化（Miltenyi、カタログ番号１３０−０９５−９２９）による単一細胞懸濁液に調製した。細胞生存率は、ＦＡＣＳによって判定した場合、８０％を上回っていた。１.５  １０５個の細胞を、２.５  １０４個の照射した（１時間２０分間で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator, RS-2000 Biological System）ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とともに、ＩＬ−２含有培地［ＩＬ−２（Peprotech、カタログ番号２００−０２）、２０ＩＵ／ｍｌ］において、アイソタイプ対照抗体または異なる濃度の抗ＴＩＭ３抗体のいずれかの存在下で、５日間共培養した。培養の５日目に、細胞上清を収集し、ＩＦＮ−γレベルを、ＥＬＩＳＡ（BD Opteia  ｈＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ、カタログ番号５５５１５２）によって評価した。図１６に示される結果は、抗ＴＩＭ３抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８および９Ｆ６が、腎細胞がんＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生を刺激することを示す。
【０５７６】
肺がん患者に由来する新しい腫瘍組織を、Miltenyi酵素消化キット（Miltenyi、カタログ番号１３０−０９５−９２９）を用いて消化させた。単一細胞懸濁液を、照射した（１時間２０分間で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System）ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とともに、ＩＬ−２含有培地［ＩＬ−２（Peprotech、カタログ番号２００−０２）、２０ＩＵ／ｍｌ］において、アイソタイプ対照抗体または異なる濃度の抗ＴＩＭ３抗体の存在下で、５日間共培養した。培養の５日目に、細胞上清を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ（BD Opteia  ｈＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ、カタログ番号５５５１５２）のために収集した。図１７Ａに示される結果は、試験した抗ＴＩＭ３抗体（すなわち、１３Ａ３および３Ｇ４）が、肺がんＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生を刺激することを示す。
【０５７７】
さらに、ＩＬ−２の存在下においてアイソタイプ対照抗体または抗ＴＩＭ３抗体で処置した、肺がん腫瘍組織からの細胞懸濁液と照射した（１時間２０分で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System）ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞との共培養の３.５日目に、細胞を、BD GolgiStopとともに一晩インキュベートした。続いて、細胞を、まず、細胞表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＩＭ３およびＰＤ１で染色し、次いで、BD Cytofix/Cytopermキットによる固定化および透過処理を行った後、細胞内ＩＦＮ−γ染色を行った。図１７Ｂに示される結果は、細胞内ＩＦＮ−γ発現細胞の割合が、抗ＴＩＭ３抗体で処置した場合、ＣＤ８＋細胞（下のパネル）において増大されることを示す。
【０５７８】
図１８は、抗ＴＩＭ−３抗体クローン１３Ａ３または３Ｇ４に応じた複数回の腫瘍ＴＩＬ実験（本実施例において上述のように実施した）から得られたプールされたデータを示す（すなわち、図におけるそれぞれの点は、１３Ａ３または３Ｇ４のいずれかで処置した１つの患者腫瘍サンプルに由来するＴＩＬを表す）。いくつかの腎細胞がん（ＲＣＣ）および肺がんＴＩＬは、ＩＦＮ−γ産生の促進において抗ＴＩＭ−３抗体に応答したが、甲状腺腫瘍に由来する単一ＴＩＬ調製物はそれができなかった。
【０５７９】
実施例７：ＦＡＣＳに基づく抗ＴＩＭ３抗体の交差遮断
全ヒトＴ細胞を、Miltenyi  Ｔ細胞精製キットを使用して、ＰＢＭＣから単離し、プレート結合型抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３、eBioscience、カタログ番号１６−００３７−８５）および可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８クローンＣＤ２８.２、BD Biosciences、カタログ番号５５５７２５）を用いて、４日間活性化させた。ＴＩＭ３は、ＦＡＣＳによって判定した場合、Ｔ細胞の８０％超に発現していた。Ｔ細胞を、種々の抗ＴＩＭ３抗体とともに、３０分間インキュベートした後、選択されたビオチン標識化抗ＴＩＭ３抗体とともに、３０分間インキュベートし、ＰＥコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出した。図１９に示される結果は、抗体１３Ａ３、３Ｇ４、１７Ｃ３、１７Ｃ８および９Ｆ６が、同一のビニング群（群Ｉ）である、すなわち、互いに交差競合するが、一方で、抗体８Ｂ９および８Ｃ４は、別個のビニング群（群ＩＩ）である、すなわち、群Ｉの抗体とは交差競合しないが、互いには交差競合することを示す。ビニング群Ｉの抗体は、生物学的活性を有することが示されたが（実施例を参照のこと）、一方で、ビニング群ＩＩのものは、それよりも弱い活性を有した。群Ｉまたは群ＩＩのいずれとも交差競合しなかった２つの抗ＴＩＭ３抗体は、いずれの生物学的活性も有すると見られなかった。ビニング群Ｉの抗体はまた、ＴＩＭ３のＰＳとの結合を妨害したものであった（本明細書においてさらに記載される）。
【０５８０】
実施例８：酵母表面提示法によるエピトープマッピング
ヒトＴＩＭ３（ＮＭ＿０３２７８２）の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列、すなわち、
SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIG（配列番号２９０）
を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位へのライゲーションによって、酵母提示プラスミドＰＤＶ００２３にクローニングした。Agilent TechnologiesからのGeneMorph II Random Mutagenesisキットを使用して、低い割合のランダム突然変異誘発を、この配列に行って、ＴＩＭ３をコードする領域全体に単一点突然変異を生成した。９.８×１０６個のクローンのライブラリーを、ＶＷＫ１８ｇａｌ出芽酵母細胞において生成した。２×１０８個のライブラリー細胞を、継代させ、抗体標識および細胞分取のために誘導した。約２×１０７個の誘導された細胞を、１００ｎＭの一次標的抗ヒトＴＩＭ３抗体および１００ｎＭの抗ｃＭｙｃ（９Ｅ１０）抗体とともに、２５℃で１時間、インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、蛍光標識化したヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥおよびヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａ６３３二次抗体で、４℃で４５分間検出を行って、細胞表面に結合した一次抗体を検出した。標識化された細胞を、BD FACSARIA II機器で、酵母培養培地中に分取した。抗Ｍｙｃ抗体で正に標識化され、抗ヒトＴＩＭ３で負に標識化された細胞を、収集した。ＡＰＣ＋／ＰＥ−の細胞集団を増殖させ、継代し、２回目の同一な標識化および分取のために誘導し、所望される集団を濃縮させた。酵母プラスミドＤＮＡを、約２  １０７個の未選択ライブラリーに由来する細胞および２回ともの選択し分取された細胞から、精製した。それぞれの細胞集団について、ＴＩＭ３標的配列を、回収し、ヒトＴＩＭ３配列に隣接するベクター特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって酵母プラスミドＤＮＡから精製した。標的配列のＰＣＲ産物を、IlluminaからのIllumina Sequencing用のNextera XT DNA Libraryキットを使用して、ＮＧＳライブラリー調製に供した。調製されたライブラリーを、IlluminaからのＭｉＳｅｑプラットフォームにおける３００サイクル／フローセルでのハイスループットシーケンシングのために、EA/Q2 Solutionsに送った。それぞれのライブラリーの５０〜１００万個の配列リードを、野生型ＴＩＭ３配列と比較し、配列に沿ってそれぞれの位置における突然変異について、表を作成した。選択した場合と未選択のライブラリーとの間での、それぞれの残基位置における突然変異頻度の差異を、計算し、抗体結合に重要な残基を判定するために使用した。高い突然変異頻度を有する位置を、マウスＴＩＭ３の公知の結晶構造（ＰＤＢ：２ＯＹＰおよびＰＤＢ：３ＢＩＢ）に基づいて、ヒトＴＩＭ３構造モデルを使用して、表面露出に関して試験した。高い突然変異頻度の表面に露出した残基は、エピトープの一部と考えられるが、一方で、高い突然変異頻度の包埋した残基は、偽陽性と考えられる。偽陽性残基は、通常、タンパク質の局所的または中心的のいずれかのフォールディングを破壊し、抗体のその表面エピトープとの結合を間接的に変更するものである。
【０５８１】
図２０は、使用した抗体のそれぞれについて、ヒトＴＩＭ３におけるエピトープの一部と判定された残基を示す。加えて、Ｄ１０４は、全てのマッピングにおいて、正の突然変異スコアを示し、Ｒ８１に対する構造的塩架橋であり得る。８Ｂ９のエピトープについては、Ｌ８４が、高い突然変異頻度を示すが、エピトープ残基を補助する構造に包埋されていると見られる。Ｑ１１３は、１３Ａ３について、低いが陽性のスコアを示す。これは、エピトープ領域の構造的補助の役割を果たす可能性が高いが、いくらかの表面露出を有する。
【０５８２】
実施例９：ＴＩＭ３抗体のＴＩＭ３−ＰｔｄＳｅｒ相互作用の遮断
図２１Ａに示される「タンデム遮断アッセイ」を使用して、抗ＴＩＭ３抗体が、ヒトＴＩＭ３とホスファチジルセリン（「ＰｔＳｅｒ」または「ＰＳ」）との間の相互作用を阻害するかどうかを判定した。ＰＳは、水溶性ではないため、ＰＳ−リポソームを、アッセイのために作製した。簡単に述べると、脂質を、メタノール／クロロホルムと混合し、次いで、クロロホルムを、窒素流および真空下において、一晩蒸発させた。続いて、脂質を、マイクロチップを用いて超音波処理し、脂質を完全に分散させて、リポソームを作製した。これらを、さらに、１０回よりも多く押出器を通過させて、確実に均一なサイズになるようにした。
【０５８３】
ＰＳリポソームを、クロロホルム中に懸濁したＰＳ［Ｌ−α−ホスファチジルセリン（脳、ブタ）Avanti Polar Lipidsカタログ番号８４００３２Ｃ］を用いて生成する。ＰＳストックを、まず、クロロホルム中に希釈して必要な量にし、クロロホルムを、液体が見えなくなるまで窒素流下において蒸発させる。微量のクロロホルムを除去するために、乾燥させたＰＳを、真空下に一晩おく。乾燥させたＰＳを、次いで、ボルテックスおよび短時間の超音波処理により、溶液が混濁するまでＰＢＳ中に懸濁する。サイズが定まったＰＳリポソームを作製するために、１００ｎｍのフィルターを備える押出器を使用する。懸濁したＰＳを、押出器に充填し、少なくとも１０回、フィルターを通過させる。この時点で、ＰＳリポソームを、必要とされる濃度までＰＢＳ中に希釈する。
【０５８４】
「タンデムブロッキングアッセイ」において、ＴＩＭ３（ＥＣＤ）−Ｆｃを、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーで捕捉し、抗ＴＩＭ３抗体およびＰＳ−リポソームを、ＴＩＭ３タンパク質に結合させる。抗ＴＩＭ３が、ＰＳの結合を遮断する領域に結合する場合、ＰＳ−リポソームは、結合を示さない。
【０５８５】
図２１Ｂに示される結果は、抗体３Ｇ４、１３Ａ３、１７Ｃ３および１７Ｃ８が、ＰｔＳｅｒのヒトＴＩＭ３との結合を阻害するが、２つの他の抗ＴＩＭ３抗体、すなわち、ＡｂＡおよびＡｂＢは、ＰｔＳｅｒのヒトＴＩＭ３との結合を阻害しないことを示す。実施例においてさらに記載されるように、ＰｔＳｅｒ結合を阻害する抗体は、最も強力な機能的活性を有するものでもある（Ｔｈ１およびＴＩＬアッセイにおいて判定される場合）。
【０５８６】
実施例１０：ＴＩＭ３抗体のＨＤＸ−ＭＳエピトープマッピング
水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）を利用して、抗体１３Ａ３および３Ｇ４と結合するｈＴＩＭ−３のエピトープを調べた。
【０５８７】
ＨＤＸ−ＭＳにより、骨格アミドの水素原子の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることによって、溶液中のタンパク質のコンホメーションおよびコンホメーション動態を調べる［１、２］。ＨＤＸのレベルは、骨格アミドの水素原子の溶媒接触可能性およびタンパク質の水素結合に依存する。ＨＤＸ時のタンパク質の質量増大を、ＭＳによって正確に測定することができる。この技術を酵素消化と組み合わせた場合、ペプチドレベルでの構造特性を分解することができ、表面に露出しているペプチドを、内部に折り畳まれているもの、またはタンパク質−タンパク質複合体の接合部で封鎖されているものと、区別することが可能となる。通常、重水素標識および続いて反応停止処理の実験を行い、続いて、酵素消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を行った。
【０５８８】
エピトープマッピング実験の前に、非重水素化実験を行って、組換えヒトＴＩＭ−３［（ｈＴＩＭ３−ＥＣＤ（２２−２００）Ｈｉｓ−タグ化（図２５を参照のこと）、１０μＭ、Sino Biological Inc.］の一般的なペプチドならびにｈＴＩＭ−３と抗体１３Ａ３および３Ｇ４のＦａｂとのタンパク質複合体（１：１のモル比）の一覧を生成した。サンプルを、Waters Enzymate BEHペプシン酵素カラム（２.１×３０ｍｍ）に注入し、２００℃で３分間消化させた。クロマトグラフィー要素を全て収容したＵＰＬＣシステムの冷却チャンバを、測定の全時間の間、０.０±０.１℃で保持した。注入したペプチドを、１００μＬ／分で３分間、トラップし、脱塩した後、６５μＬ／分で５〜４０％のアセトニトリル−水の勾配によって、６分間で分離した。分離カラムは、１.０ｍｍ×５０.０ｍｍのACQUITY UPLC BEH C18カラム（Waters）であった。消化性ペプチドの同定は、Waters HDX-MSシステムにおいてProteinLynx Global SERVER 2.5（Waters）を使用して、厳密な質量分析およびＭＳＥの組合せによって達成した。
【０５８９】
ＨＤＸ−ＭＳ実験では、５μＬのそれぞれのサンプル（ｈＴＩＭ−３または抗体１３Ａ３もしくは３Ｇ４のＦａｂを有するｈＴＩＭ−３）を、５５μＬのＤ２Ｏ緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＨ７.０）中に希釈して、標識反応を開始した。反応は、異なる期間：１分間、１０分間および２４０分間行った。各標識反応期間の終わりに、反応停止緩衝液（４Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０.４Ｍ  ＴＣＥＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ）を添加することによって、反応を停止させた。５０μＬの反応停止処理したサンプルを、非重水素化実験におけるものと同一の条件を使用して、オンラインで消化させた。全ての比較実験は、同一の実験条件下で行った。全ての実験は、２連に行った。結果として得られた相対的な重水素レベルを、ソフトウェアプログラムDynamX 3.0（商標）（Waters）の使用により、交換時間に対してプロットした。
【０５９０】
図２５に示されるように、ｈＴＩＭ−３の９７.３％の配列カバレッジが、ＨＤＸ−ＭＳ実験において得られた。図２６に示されるように、抗体１３Ａ３および３Ｇ４のＦａｂと結合した場合に、ｈＴＩＭ−３のＨＤＸ−ＭＳデータ分析により、以下の不連続なエピトープが同定された：
ｍＡｂ  １３Ａ３：49VPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６７）、111RIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３６８）およびその断片119NDEKFNLKL127、ならびに
ｍＡｂ  ３Ｇ４：40YTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFE62（配列番号３６９）、66VVLRTDERDVNY77（配列番号３７０）、78WTSRYWLNGDFRKGDVSL95（配列番号３７１）および110CRIQIPGIMNDEKFNLKL127（配列番号３７２）。
【０５９１】
図２６は、本実施例に記載されるＨＤＸ−ＭＳプロトコールを使用して判定した場合に、抗体１３Ａ３および３Ｇ４が結合するＨＤＸ−ＭＳペプチドを示す。
【０５９２】
したがって、抗体１３Ａ３は、ｈＴＩＭ３のアミノ酸残基４９〜６２および１１１〜１２７の領域と相互作用するが、他の領域、例えば、アミノ酸残基Ｙ４０またはＶ４９に対してＮ末端側である領域、アミノ酸残基Ｅ６２とＲ１１１との間に位置する領域、およびアミノ酸残基Ｌ１２７に対してＣ末端側である領域とは有意に相互作用しない。１３Ａ３は、ＴＩＭ−３  ＩｇＶドメインのホスファチジルセリン結合ループと結合する。
【０５９３】
実施例１１：ヒト組織交差反応性におけるＴＩＭ３.１８による標的を定めたＩＨＣ染色
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を、ヒトおよびカニクイザルの脾臓の凍結切片において、１３Ａ３を用いて行った。いずれの種でも、１３Ａ３（０.５μｇ／ｍＬ）により、静脈洞様血管の内皮が染色された。予測した通り、カニクイザルＴＩＭ−３と交差反応しない抗体３Ｇ４は、ヒト脾臓は染色したが、カニクイザル脾臓は染色しなかった。
【０５９４】
予備的な組織交差反応性分析において、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３を、大脳、小脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、ＰＢＭＣスミア、脾臓、扁桃腺、胸腺、皮膚、結腸、小腸、胃、膵臓、末梢神経、下垂体、甲状腺、前立腺、および胎盤（それぞれ１人のドナー）を含む、２０種類の正常なヒト組織に由来する凍結切片またはスミアに適用した。特異的染色が、ＰＢＭＣ、脾臓および扁桃腺の単核細胞（ＭＮＣ）ならびに胸腺の上皮網状細胞またはマクロファージのサブセットにおいて、観察された。最も顕著な染色は、マクロファージ／ＤＣ様細胞におけるものであり、これは、組織特異的マクロファージ（例えば、肝臓におけるクッパー細胞、皮膚における真皮マクロファージ／ＤＣおよび胎盤におけるホーフバウワー細胞）を含め、試験した全ての組織において観察された。器官レベルでは、最も強力な染色は、脾臓において見出された。ＭＮＣの小さなサブセット以外では、強力な染色は、赤脾髄における脾臓内皮細胞において非常に頻繁に見られた。加えて、陽性染色は、腎皮質における皮質尿細管上皮細胞の小さなサブセットにおいて観察された。
【０５９５】
実施例１２：マウスにおける抗ＴＩＭ３およびＰＤ−１抗体の組合せの抗腫瘍活性
ラット抗マウスＴＩＭ−３（ＲＭＴ３  ２３）およびＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）の市販の抗体（Ｂｉｏ−Ｘ−Ｃｅｌｌ）を、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおいて評価した。実験の設計は、インビボでの研究Ngiow et al. (2011) Cancer Res. 71:3540においてこれまでに説明されているものと同様であった。ＴＩＭ−３は、この腫瘍モデルでは比較的後期（１５日目）に発現されるため、腫瘍成長が最小限となり、ＴＩＭ−３発現の時間が得られるように、少量の腫瘍細胞（２×１０５個）を、それぞれのマウスの側腹部に移植した。８日目に、腫瘍が容易にわかるようになったときに、マウスを、１０匹ずつのマウスで４つの処置群に、平均腫瘍体積は４０ｍｍ３でランダム化した。ＲＭＴ３−２３（抗ＴＩＭ−３抗体）およびＲＭＰ１−１４（抗ＰＤ−１抗体）を、単剤または組合せの薬剤（それぞれの抗体の１回の注射当たり２５０μｇ）のいずれかとして、腹腔内注射によって投与し、アイソタイプ対照は、１回の注射当たり５００μｇで投与した。それぞれの研究動物は、それぞれの注射で、２５０μｇの１種類の抗体または５００μｇの２種類の抗体の組合せを、合計３回の用量で受容させた。腫瘍サイズを、２週間に１回評価した。単剤または組合せの試験物品を受容したそれぞれの群のマウスは、抗腫瘍活性を示し、抗ＰＤ−１単剤療法群の１０匹のマウスのうち２匹、ならびに組合せ抗ＰＤ−１および抗ＴＩＭ−３群の１０匹のマウスのうち６匹は、研究の終了時に、腫瘍なしのままであった（図２４Ａ）。同一の設計のこれまでのＣＴ２６研究で、同様の結果が得られており、抗ＰＤ−１単剤療法群の１０匹のマウスのうち３匹、ならびに組合せ抗ＰＤ−１および抗ＴＩＭ−３群の１０匹のマウスのうち７匹が、腫瘍なしであった。単剤として投与した抗ＴＩＭ−３による抗腫瘍活性は、ほとんどなかったか、またはまったくなかった。
【０５９６】
ＲＭＴ３−２３の活性化マウスＴ細胞との結合のＥＣ５０値は、１.７ｎＭであり、これは、ＴＩＭ３.１８のヒトＴＩＭ−３との結合のＥＣ５０よりも１７倍弱いことに、留意すべきである。ＲＭＴ３−２３を交差遮断する別のラット抗マウスＴＩＭ−３抗体（Ａｂ  Ｍ）は、活性化マウスＴ細胞との結合について、０.１ｎＭのＥＣ５０を有するが、これは、ＴＩＭ３.１８のＥＣ５０と同等である。ＲＭＴ３−２３と同様に、Ａｂ  Ｍは、マウスＴＩＭ−３のＰＳ−結合ループにマッピングする。ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、ｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ（Ｆｃ不活性アイソタイプ）重鎖定常領域を有するこの抗体を使用することにより、これが、抗ＰＤ−１に対する抗腫瘍応答を増強したことが示された（図２４Ｂ）。
【０５９７】
実施例１３：ＴＩＭ３抗体（全長またはＦａｂ）遮断によるＴｈ１細胞増殖アッセイ
抗ＴＩＭ３抗体をさらに特徴付けるために、インビトロで分極化したＴｈ１細胞を使用する特定のＴ細胞増殖アッセイを開発した。分極化Ｔｈ１細胞を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を反復的に再刺激することによって得た。これらの細胞を、次いで、抗ＴＩＭ３抗体（または対照）の存在下において、照射した（成長を停止させた）ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とともにインキュベートし、Ｔｈ１細胞増殖を測定した。
【０５９８】
ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、以下のように、Ｔｈ１メモリー様Ｔ細胞に分極化させた。ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、MiltenyiからのナイーブＣＤ４  Ｔ細胞単離キットを使用して、ＰＢＭＣから精製した。細胞を、細胞３.６×１０５個／ｍｌで、ビーズ１に対して細胞１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングした（それぞれ８０％／２０％）ビーズ、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２、１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２および１００００ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−４抗体の存在下において、ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ中で３〜４日間、培養した。インキュベーションの後に、細胞を、チューブに収集し、ビーズを、磁石を用いて除去し、細胞を、培養のために新しいフラスコに戻した。組換えヒトＩＬ−２を添加して、最終濃度４ｎｇ／ｍｌにし、細胞を、さらに３日間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、１×ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳで洗浄した。細胞を計数し、細胞４.１×１０５個／ｍｌで、ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、ビーズ１に対して細胞１の比率で、ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングした（それぞれ８０％／２０％）ビーズ、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２、１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２および１００００ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−４抗体の存在下において、３〜４日間培養した。インキュベーションの後に、細胞を、チューブに収集し、ビーズを、磁石を用いて除去し、細胞を、培養のために新しいフラスコに戻した。組換えヒトＩＬ−２を添加して、最終濃度４ｎｇ／ｍｌにし、細胞を、さらに２〜３日間インキュベートした。次いで、分極化したＴｈ１細胞を、採取し、３回洗浄した。アッセイ構築の日に、分極化したＴｈ１細胞を、完全培地中に再懸濁した。
【０５９９】
以下の試薬を使用した。
Dynabeads M-450 Epoxy、Dynal Biotech ASA 140.11
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８.５、Teknova 0214-250
機能グレードの抗ｈＣＤ３クローンＵＣＨＴ−１、eBioscience 16-0038-85
機能グレードの抗ｈＣＤ２８クローンＣＤ２８.２、eBioscience 16-0289-85
組換えヒトＩＬ−２、PeproTech, Inc. 200-02
組換えヒトＩＬ−１２、PeproTech, Inc. 200-12
抗ヒトＩＬ−４、eBioscience  １６−７０４８−８５
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＥＭ、Mediatech, Inc. 10-016-CM
ウシ胎児血清（熱不活性化）、Hyclone SH30071.03
【０６００】
ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコ中で成長させ、照射した（１時間２０分で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System）。アネキシンＶ染色によって確認した場合、照射したＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞により、Ｔ細胞刺激およびホスファチジルセリン（phophatidylserine）（ＰＳ）の露出がもたらされた。
【０６０１】
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３またはアイソタイプ対照を、２０μｇ／ｍＬから４倍連続希釈によって滴定し、それぞれの条件を３連に構築した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂを、５３μｇ／ｍＬから、これも４倍連続希釈によって滴定した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂ断片は、結晶構造解析実験において使用されたものと同一であった（実施例を参照のこと）。
【０６０２】
培養物を、平底ＴＣ処理９６ウェルプレート（Costar）に、０.１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８.２、BD Biosciences、カタログ番号５５５７２５）の存在下において、ウェルごとに２００μＬの完全培地中の１×１０５個の分極化したＴｈ１細胞および２.５×１０４個の照射したＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞（ＣＨＯ：Ｔ細胞の比、１：４）を配置し、３７℃および５％ＣＯ２で、３日間インキュベートした。次いで、プレートを、ウェルごとに、１μＣｉのトリチウム化チミジン（Perkin Elmer、カタログ番号ＮＥＴ０２７００１ＭＣ）で、１６時間パルス処理した後、細胞を、増殖を評価するためのトリチウム化チミジンの組込みの分析のために、フィルタープレート（Perkin Elmer）に採取した。
【０６０３】
図２９Ａおよび２９Ｂに示される結果は、抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、ＣＨＯ−ＯＫＴ３／Ｔｈ１共培養細胞アッセイにおいて、用量依存的様式で、Ｔｈ１細胞増殖を増大させたことを示した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の全体的な活性は、その親抗体１３Ａ３（ＩｇＧ４アイソタイプ）のものと同等である（図２９Ａ）。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂ断片もまた、ＣＨＯ−ＯＫＴ３／Ｔｈ１細胞アッセイにおいて、増殖の用量依存性誘導（図２９Ｂ）を示した。
【０６０４】
したがって、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３（全長およびＦａｂの両方）が、照射したＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞との共培養物において、用量依存的様式で、Ｔｈ１細胞活性を強化した。Ｆａｂ断片による活性の存在により、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、アンタゴニスト抗体として機能すること、およびＴＩＭ−３が、Ｔ細胞機能の阻害性受容体であることが示された。Ｆｃ架橋は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３生物学的アッセイには必要なかった。
【０６０５】
実施例１４：ＴＩＭ  ３およびＰＤ  １の共遮断によるＴｈ１細胞増殖アッセイ
このアッセイは、抗ＣＤ２８の存在下における、ヒトＰＤ−Ｌ１（ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＰＤ−Ｌ１）をトランスフェクトした照射した（成長を停止させたもの、１時間２０分で、６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System）ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とＴｈ１細胞との間で、ＣＨＯ：Ｔ細胞の比１：４での共培養であった。ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＰＤ−Ｌ１細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコにおいて成長させ、照射した。分極化したＴｈ１細胞を、本明細書の他の実施例に記載されるように、調製した。アッセイ構築の日に、分極化したＴｈ１細胞を、完全培地中に再懸濁した。
【０６０６】
抗ＰＤ−１抗体ニボルマブを、１０μｇ／ｍＬから１０倍連続希釈によって滴定し、それぞれの条件を３連に構築した。ＴＩＭ−３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３またはアイソタイプ対照を、２０μｇ／ｍＬでスパイクした。
【０６０７】
培養物を、平底ＴＣ処理９６ウェルプレート（Costar）に、［０.１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８.２、BD Biosciences、カタログ番号５５５７２５）の存在下において、ウェルごとに２００μＬの完全培地中の１×１０５個のＴｈ１細胞および２.５×１０４個のＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＰＤ−Ｌ１細胞を配置し、３７℃および５％ＣＯ２で、３日間インキュベートした。次いで、プレートを、ウェルごとに、１μＣｉのトリチウム化チミジン（Perkin Elmer、カタログ番号ＮＥＴ０２７００１ＭＣ）で、１６時間パルス処理した後、細胞を、増殖を評価するためのトリチウム化チミジンの組込みの分析のために、フィルタープレート（Perkin Elmer）に採取した。
【０６０８】
図３０に示される結果は、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブが、用量依存的様式で、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＰＤ−Ｌ１で刺激した細胞により刺激されたＴｈ１  Ｔ細胞の増殖を増大させたこと、ならびに増殖が、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３との組合せで大幅に増強されたことを示す。ＴＩＭ−３およびＰＤ−１経路の共遮断により、このアッセイにおいて相加効果が示された。
【０６０９】
実施例１５：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３遮断による腫瘍浸潤リンパ球ＩＦＮ−γ放出アッセイ
このアッセイについては、新しい腫瘍組織を、外科手術により摘出されたヒト腎細胞がんサンプルまたは乳がんサンプルから得た。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、酵素的解離キット（Miltenyi、カタログ１３０−０９５−９２９）を使用して単離した。ＴＩＬに、２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２（組換えヒトＩＬ−２、Peprotech、カタログ２００−０２）を補充し、照射した（成長を停止させたもの、１時間２０分で６７,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System）ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞とともに、ＣＨＯ：Ｔの比１：６で、共培養した。ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞株を、アッセイ構築の日に、振盪フラスコにおいて成長させ、照射した。
【０６１０】
ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３またはアイソタイプ対照を、２０μｇ／ｍＬから４倍連続希釈によって滴定し、それぞれの条件を３連に構築した。培養物を、平底ＴＣ処理９６ウェルプレート（Costar）に、ＩＭＤＭ＋５％ＦＢＳおよび５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ番号１００−５１２）中、ウェルごとに２００μＬの１.５×１０５個のＴ細胞および２.５×１０４個の照射したＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞を配置し、３７℃および５％ＣＯ２で、５日間インキュベートした。上清を、ＥＬＩＳＡ（BD Opteia  ｈＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ、カタログ５５５１５２）によって、ＩＦＮ−γ測定のために、それぞれのサンプルから採取した。
【０６１１】
腎細胞がんＴＩＬについては、図３１に示され、乳がんＴＩＬについては、図３２に示される結果は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、ＣＨＯ−ＯＫＴ３／ＴＩＬ共培養アッセイにおいて、用量依存的様式で、ＩＦＮ−γ産生を増大させたことを示し、腎細胞がんＴＩＬアッセイにおける陰性対照でのより高い濃度のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の比べて最大４倍の増大であった。
【０６１２】
実施例１６：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、Ｍ０：Ｔ同種ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＦＮ−γ分泌を促進する
健常なドナーから単離されたＣＤ１４＋単球を、Ｍ−ＣＳＦを含有する培養培地において、Ｍ０期に分化させた。培養後６日目に、ＦＡＣＳ染色によると、有意なマクロファージ集団が、ＣＤ１６３＋およびＣＤ２０６＋を細胞表面上に発現しており、抑制性マクロファージのシグネチャーと一致した。抗ＴＩＭ−３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、ＴＩＭ−３は、Ｍ０マクロファージに発現されることが示された（図３３）。次いで、これらのＭ０マクロファージに、照射を行い（７分間で５,０００ＲＡＤ、Rad Source Irradiator、RS-2000 Biological System）、同種ドナーの全Ｔ細胞とともに共培養し、共培養後６日目に、混合細胞を、Ｔ細胞増殖を評価するために、３Ｈ−チミジンで一晩パルス処理した。
【０６１３】
図３４に示される結果は、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、アイソタイプ対照と比較して、Ｔ細胞増殖を増大させたことを示す。
【０６１４】
実施例１７：ｈＴＩＭ３と相互作用するＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３  Ｆａｂの結晶構造
ｈＴＩＭ３  ＩｇＶ領域を、以下のように、ＴＩＭ３.１８のＦａｂ断片とともに共結晶化した。使用した配列は、以下の通りであった。
ｈＴｉｍ３＿ＩｇＶ：
【化１５】
2019533981.tif 000057
（配列番号３７７；ＴＩＭ３配列に下線を引いてある）
Ｔｉｍ３.１８＿Ｆａｂ：
【化１６】
2019533981.tif 000058
（配列番号３６６）
Ｔｉｍ３.１８＿カッパ：
【化１７】
2019533981.tif 000059
（配列番号２９）
【０６１５】
発現および精製。ヒスチジンタグ化ｈＴｉｍ３  ＩｇＶドメインを、ｐＥＴ４７ｂベクターを用いて、大腸菌（ＢＬ２１  ＤＥ３）において発現させた。精製およびリフォールディングは、ｍＴｉｍ３について、以下の公開されているプロトコールに従って行った（DeKruyff et al. J. Immunology 2010）。Ｔｉｍ３.１８  Ｆａｂを、ＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させ、重鎖のＣ末端Ｈｉｓタグにより精製した。
【０６１６】
複合体の結晶化および構造の判定。Ｔｉｍ３.１８  Ｆａｂを有するｈＴｉｍ３  ＩｇＶドメインの結晶構造を、１.５Åに分解した。Ｆａｂ：抗原複合体を、まず、Hampton Researchからの種々のスクリーニングで結晶化条件に関してスクリーニングし、結晶クラスターを、６.５〜５.５の範囲のｐＨで、ＰＥＧ  ３３５０の条件下で観察した。結晶の成長条件を、単結晶の成長を可能にするようにさらに最適化した。単結晶を、グリセロールを凍結保護剤として用いて採取し、液体窒素中で瞬間凍結させた。データの収集を、ＡＰＳにおいて、ＩＭＣＡ−ＣＡＴでPilatus-6M検出器を使用して行った。回折画像を、Global Phasingソフトウェアで処理し、Ｔｉｍ３.１８のＦａｂモデルを使用してフェージングした。ＣＣＰ４スイート、Coot、Phenix、およびGlobal Phasingスイートのソフトウェアを使用して、複数回の精査を行った。
【０６１７】
分解されたｈＴｉｍ３  ＩｇＶドメインは、公開されているｈＴｉｍ３構造（ＰＤＢ：５Ｆ７１、worldwideweb.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?pdbId=5F71）、ならびにＰＳとの複合体において分解されたｍＴｉｍ３構造（ＰＤＢ：３ＫＡＡ、worldwideweb.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3kaa、Rosemarie et al. (2010) J Immunol 184:1918）のものと十分に一致する。ｈＴｉｍ３におけるＰＳ結合ポケットは、これらの構造的アライメントにより推測した。加えて、ＰＳ結合ポケットの位置は、ヒトおよびマウスにおいて、ＴＩＭメンバー間で保存されている（Freemen et al. (2010) Immunol Rev. 235: 172）。
【０６１８】
ｈＴｉｍ３タンパク質におけるＴＩＭ３.１８の接触残基は、ｈＴＩＭ３：ＴＩＭ３.１８  Ｆａｂ結晶構造とｈＴＩＭ３構造単独との間の接触可能性表面積の差を計算することによって、同定した（「表面包埋法」）。ＴＩＭ３.１８  Ｆａｂと複合体を形成したときに包埋された表面積を示すｈＴＩＭ３残基を、接触残基の一部であるとして定義した。タンパク質の溶媒接触可能表面は、プローブスフェア（半径１.４−Åの溶媒分子を表す）の中心の遺伝子座として定義されるが、これは、それが、タンパク質のファンデルワールス表面上を転がるためである。溶媒接触可能表面積は、プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（http://www.ccp4.ac.uk/newsletters/newsletter38/03_surfarea.html）において実装されるように、それぞれの原子の周りに拡張したスフェア上に表面点を生成し（原子およびプローブの半径の和と等しい原子中心からの距離で）、隣接する原子と会合した等価のスフェア内にあるものを排除することによって、によって計算した。
【０６１９】
図３５および３６に示される結果は、上述の表面包埋法によって同定した場合、以下のアミノ酸が、接触残基であることを提供する：Ｐ２９、Ｖ３０、Ｃ３１、Ｐ３８、Ｖ３９、Ｆ４０、Ｅ４１、Ｃ４２、Ｇ４３、Ｎ４４、Ｖ４５、Ｖ４６、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｔ４９、Ｄ５０、Ｅ５１、Ｄ５３、Ｒ９０、Ｑ９２、Ｇ９５、Ｉ９６、Ｍ９７、Ｄ９９（成熟ｈＴＩＭ３細胞外ドメインである配列番号２９０による番号付け）またはＰ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｔ７０、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０（シグナルペプチドを有するｈＴＩＭ３である配列番号２８６（図２０）による番号付け）。これらの結果は、ヒトＴＩＭ３上のＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の接触残基が、ヒトＴＩＭ３上のＰＳ結合ポケットと重複することを示す。具体的には、ＴＩＭ３.１８の重鎖ＣＤＲ２が、ＰＳ結合ポケットを占有する。ＰＳ結合ループとのさらなる接触は、重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３によって行われる。ここで生成された構造データにより、ＰＳ遮断アッセイにおいて得られた結果が確認される（実施例を参照のこと）。
【０６２０】
結晶構造解析の結果はまた、ｈＴＩＭ３の以下のアミノ酸残基が、ＴＩＭ３.１８  Ｆａｂのアミノ酸残基の原子の５Å以内に位置する原子を有することを示す（「５Å距離法」）：Ｐ２９、Ｖ３０、Ｃ３１、Ｐ３８、Ｖ３９、Ｆ４０、Ｅ４１、Ｃ４２、Ｇ４３、Ｎ４４、Ｖ４５、Ｖ４６、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｄ５０、Ｅ５１、Ｄ５３、Ｒ９０、Ｉ９１、Ｑ９２、Ｇ９５、Ｉ９６、Ｍ９７、Ｄ９９（成熟ｈＴＩＭ３細胞外ドメインである配列番号２９０による番号付け）またはＰ５０、Ｖ５１、Ｃ５２、Ｐ５９、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｇ６４、Ｎ６５、Ｖ６６、Ｖ６７、Ｌ６８、Ｒ６９、Ｄ７１、Ｅ７２、Ｄ７４、Ｒ１１１、Ｉ１１２、Ｑ１１３、Ｇ１１６、Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０（シグナルペプチドを有するｈＴＩＭ３である配列番号２８６（図２０）による番号付け）。ＦａｂおよびｈＴＩＭ３タンパク質の相互作用する具体的な残基を、表３に記載する。
【０６２１】
表３. Ｆａｂ残基と相互作用するヒトＴＩＭ３残基の一覧
【表３】
2019533981.tif 000060
【０６２２】
両方の方法によって同定されたアミノ酸残基の比較により、表面包埋法によってのみ同定された残基Ｔ４９および「５Å距離法」によってのみ同定された残基Ｉ９１を除き、残基が、本質的には同じであることが示される。
【０６２３】
実施例１８：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の追加の特徴
ＣＨＯ細胞において発現されるＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の生物学的特徴を、表４に提供する。
【表４】
2019533981.tif 000061
【０６２４】
単一のＮグリコシル化部位が、重鎖のＮ２９７において確認され、グリカンプロファイルは、ＣＨＯにより発現されたＩｇＧ１モノクローナル抗体のグリカンプロファイルと一致した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４とは結合せず、これが、任意のＦｃ−ＦｃＲ媒介性エフェクター機能に対して不活性であることを示唆する。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、良好な熱安定性（Ｔｍ１＝６８.１℃、Ｔｍ２＝８０.３℃、Ｔｍ３＝８２.６℃）および熱可逆性（７４℃で９５.６％、８０℃で２５.５％）を有し、これにより、この分子が、熱ストレス下において構造的完全性を保持し、ストレスが解放された場合には強力なリフォールディング特性を有することが示唆される。
【０６２５】
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の安定性特徴を、表５に提供する。
【表５】
2019533981.tif 000062
【０６２６】
物理的な安定性の問題は、５０ｍｇ／ｍＬにおいて凍結−解凍ストレス（６サイクル）中に観察されなかった。５０ｍｇ／ｍＬでの強制分解研究を、４℃、２５℃および４０℃で構築した。ＣＤＲ領域における化学修飾は、試験したいずれの条件下においても、１２週間にわたって観察されなかった。
【０６２７】
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３の潜在的な免疫原性の危険性を、コンピュータ方法によって評価した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のコンピュータによるｉＤＡＢ分析では、このｍＡｂのＣＤＲに、ＨＬＡ結合配列の可能性がほとんど示されず、ヒト免疫応答の誘導の危険性が低いことが示された。
【０６２８】
実施例１９：サルにおけるＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３のＰＫ／ＰＤ
単回用量のＰＫ／ＰＤおよび寛容性研究において、全てのサルを、２.５ｍｇのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＮｅｆおよびＧａｇタンパク質を発現するキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）ベクターおよび非増殖性組換えアデノウイルス−５（Ａｄ５）ベクター（３×１０９個のそれぞれのベクター）を用いて、筋肉内に免疫処置した。免疫処置の後に、サルに、０（ビヒクル）、０.５、１０または２５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝３匹／群、性別混合）の用量で、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３を静脈内投与した。血清サンプルを、薬物動態（ＰＫ）および抗薬物抗体（ＡＤＡ）の評価のために、最大４２日間採取し、血液サンプルを、受容体占有率の評価のために、最大４２日間採取した。追加の血清サンプルを、可溶性ＴＩＭ−３のレベルを含む、その他の試験的エンドポイントのために、保管した。
【０６２９】
ＡＵＣ０−１６８ｈは、０.５〜２５ｍｇ／ｋｇで、用量に比例した。ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、約２週間のＴ１／２および０.１８ｍＬ／ｈ／ｋｇの総血清クリアランスを示した。定常状態での分布量は、６８〜８４ｍＬ／ｋｇの範囲に及び、ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３が、主として、細胞外空間に存在することを示唆した（表６）。
【表６】
2019533981.tif 000063
*外挿したAUCは、20%のカットオフを上回り、21%から55%の範囲に及んだ。
【０６３０】
カニクイザルにおけるＰＫおよび相対成長率に基づいて、概算されたヒト総血清クリアランスは、０.１０ｍＬ／ｈ／ｋｇであり、８８ｍＬ／ｋｇのＶｓｓである。結果として、概算されたヒト半減期は、約２６日である。
【０６３１】
実施例２０：予備的なサイトカイン放出アッセイ
ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３での処置が、サイトカイン放出症候群の危険性を及ぼすかどうかを判定するために、１６人のヒトドナーに由来する全血を、溶液中、２０μｇ／ｍＬのＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３または陽性対照とともにインキュベートした。７５種類の血清サイトカインおよびケモカインのパネルを、それぞれのドナーについて試験した。Ｔ細胞に由来するサイトカインまたはケモカインの放出の増強の根拠は認められず、サイトカイン放出症候群の危険性は低いことが示唆された。数人のドナーからの全血アッセイでは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびＧ−ＣＳＦの上昇があり、ＴＩＭ−３の遮断が、単球またはマクロファージに由来するサイトカインの産生を増大するという上記に提示された証拠と一致した。
【０６３２】
実施例２１：ＴＩＭ３.１８.ＩｇＧ１.３は、受容体の下方制御または内部移行を引き起こさない
１３Ａ３が、細胞膜上のヒトＴＩＭ３と結合した場合に、それを下方制御または内部移行するかどうかを判定するために、図３７に示される蛍光消光研究を行った。３時間の処置の後の結果は、図３８に示されるが、１３Ａ３抗体も変異体Ｄ１０１ＥまたはＮ６０Ｑも、活性化ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞において、細胞内ＴＩＭ３抗体の用量依存性蓄積を引き起こさなかったことを示し、抗体が、内部移行されないことが示唆された。
【０６３３】
下方制御の可能性を判定するために、活性化ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を、様々な量の１３Ａ３、１３Ａ３.Ｄ１０１.Ｉｇ１.１ｆ、１３Ａ３.Ｄ１０１Ｅ／Ｎ６０Ｑ.ＩｇＧ１.１ｆもしくは対照抗体の存在下において、または抗体なしで、２時間インキュベートし、細胞表面上のＴＩＭ３の量を、判定した。結果は、抗ＴＩＭ３抗体とのインキュベーションが、細胞表面ＴＩＭ３を下方制御しなかったことを示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２４−７】
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【図２４−８】
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【図２４−９】
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【図２４−１０】
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【図２４−１１】
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【図２４−１２】
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【図２４−１３】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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