(57)【要約】本発明は、特に癌の治療又は予防における、免疫調節剤としてのＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーに関する。オープンコンフォーマーは、第１及び第２の単量体を含み又はからなり、かつ各単量体はＭＨＣ−Ｉａ分子由来のＨＬＡ重鎖を含む。オープンコンフォーマーは、タンパク質安定化ポリペプチド配列及び任意にアミノ酸リンカーをさらに含む。本発明のさらなる態様は、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーと免疫チェックポイント阻害剤とを含む併用薬剤を提供する。さらに、本発明は、特にＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、及び１０ＰＴＰＲＪなどの多様な免疫調節受容体との相互作用が免疫応答を調節する疾患、及びＴｒｅｇのネガティブ調節が治療的戦略である疾患、例えば感染症において、免疫調節剤としてのＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーがＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、薬剤として使用するための、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項２】
前記単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、第１の単量体又は第１及び第２の単量体を含み、かつ他の単量体と独立する各単量体はＨＬＡ重鎖であり又は含み、ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ではないことを条件とする、請求項１に記載の薬剤として使用するための、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項３】
癌の治療又は予防における使用のための、請求項１又は２に記載の単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項４】
特に感染症の治療において、より特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、はしか、ヘルペス及び黄熱病の治療において、免疫調節剤として使用するための、請求項１又は２に記載の単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項５】
オープンコンフォーマーが、Ａ２５、Ｂ５８、Ｃ０８、Ａ３０、Ｂ５３、及びＣ１２から選択される１つ又は２つのＨＬＡ重鎖を含む、又は、から本質的になる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、特に癌の治療又は予防において、又は免疫調整剤としての、薬剤として使用するための単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項６】
融合ＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーがＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーであって、前記融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは第１の単量体又は第１及び第２の単量体を含み、又は本質的になり、
ａ．前記第１の単量体、又は他の単量体と独立する前記第１及び第２の単量体のそれぞれは、ＨＬＡ重鎖を含み、かつ
ｂ．前記第１の単量体、又は前記第１及び第２の単量体のそれぞれは、Ｆｃポリペプチド配列に共有結合的に連結される、
前記融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項７】
アミノ酸リンカーがＨＬＡ重鎖とＦｃポリペプチド配列とを連結する、請求項６に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項８】
第１の単量体と第２の単量体とが同一である、請求項６又は７に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項９】
融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーが、ペプチドエピトープ断片をさらに含み、特に第１及び／又は第２の単量体がペプチドエピトープ断片をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１０】
ＨＬＡ重鎖は、ＨＬＡアルファ１、２及び３ドメインのみからなる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１１】
ＨＬＡ重鎖は膜貫通ドメインを含み、かつ細胞内ドメインを含まない、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１２】
ＨＬＡ重鎖は、Ａ２５、Ｂ５８、Ｃ０８、Ａ３０、Ｂ５３、及びＣ１２から選択される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１３】
Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）のいずれか１つから選択される重鎖定常領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１４】
アミノ酸リンカーが、１〜５０個、特に５〜４０個、さらに特に１０〜３０個、なおさらに特に１５〜２５個のアミノ酸を含み、ＨＬＡ重鎖を１本の単一ポリペプチド鎖としてＦｃドメインに連結する、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１５】
薬剤として使用するための、特に、
ａ．癌の治療又は予防において、又は
ｂ．免疫調節剤として、特に感染症の治療、より特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、はしか、ヘルペス及び黄熱病の治療において
の使用のための、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー。
【請求項１６】
癌の治療又は予防における使用のための、又は免疫調節剤としての使用のための、特に感染症の治療における使用のための核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーをコードする、前記核酸分子。
【請求項１７】
癌の治療又は予防における使用のための、又は免疫調整剤として使用のための、特に感染症の治療における使用のための、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下で、請求項１６に記載の核酸分子を含むウイルス、特にアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はレンチウイルス。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸分子を含むインビトロで遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１９】
併用薬剤であって、
ａ．請求項１〜１４のいずれか一項で特定されるとおりの単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー、及び
ｂ．チェックポイント調節剤であって、
ｉ．チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）、特に前記ＣＰＩは：
‐  ＣＴＬＡ４とＢ７−１（ｃｄ８０）及び／又はＢ７−２（ｃｄ８６）のいずれかとの相互作用の阻害剤、より特にＣＴＬＡ−４又はｃｄ８０又はｃｄ８６へのポリペプチドリガンド；
‐  ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２のいずれかとの相互作用の阻害剤、より特にＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２へのポリペプチドリガンド；及び、
‐  特に抗体である、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ−３）の阻害性ポリペプチドリガンド；
から選択される前記チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）；及び
ｉｉ．チェックポイントアゴニスト剤、特に腫瘍壊死因子受容体４−１ＢＢに結合し、かつ活性化するように選択されたチェックポイントアゴニスト抗体、特に４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体、
から選択される前記チェックポイント調節剤、を含み、
特に前記チェックポイント調節剤は、抗体、抗体断片、及び抗体様分子から選択されるポリペプチドであり、かつポリペプチドはＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ及び４−１ＢＢＬから選択されるチェックポイントメディエータに対して、選択的に反応性である、
前記併用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、癌の予防又は治療における使用のための、及び免疫調節剤としての使用のための、古典的なＭＨＣクラスＩａ（ＭＨＣ−Ｉａ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、古典的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質ファミリーに属する。ＨＬＡ複合体は、免疫系が、ウイルスや細菌などの外来の侵入物質によって作られたタンパク質から身体自身のタンパク質を区別する働きがある。ヒトは、古典的（ＭＨＣ−Ｉａ）ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ、並びに非古典的（ＭＨＣ−Ｉｂ）ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−Ｈ分子を含むＭＨＣクラスＩ分子を有する。両カテゴリーは、それらのペプチド結合、提示及び誘導Ｔ細胞応答のメカニズムにおいて類似している。古典的ＭＨＣ−Ｉａの最も顕著な特徴はそれらの高い多型性であるが、非古典的ＭＨＣ−Ｉｂは通常非多型でありそしてそれらのＭＨＣ−Ｉａの対応物よりもより制限された発現パターンを示す傾向がある。
【０００３】
ＨＬＡ命名法では、遺伝子座の特定の名前（例えば、ＨＬＡ−Ａ）によって与えられ、続いて、対立遺伝子ファミリーの血清学的抗原（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２）、及びＤＮＡ配列が決定されている数及び順序で割り当てられた対立遺伝子サブタイプが与えられる（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）。コード配列内の同義ヌクレオチド置換（サイレント又は非コード置換とも呼ばれる）によってのみ異なる対立遺伝子は、３番目の数字セットの使用によって区別される（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１）。イントロン内、又はエクソンとイントロンに隣接する５’又は３’の非翻訳領域内の配列多型によってのみ異なる対立遺伝子は、４番目の数字セットの使用によって区別される（例えばＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０２Ｌ）（図１）。
【０００４】
ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子のリストを表１に提供する。対立遺サブタイプの完全なリストについては、ｈｔｔｐ：／／ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ／ａｌｌｅｌｅｓ／ｃｌａｓｓ１．ｈｔｍｌを参照。
【０００５】
古典的ＭＨＣ−Ｉａ分子の主な機能は適応免疫応答の一部としてペプチドを提示することである。ＭＨＣ−Ｉａ分子は、自己タンパク質、ウイルス又はバクテリアに由来するβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）及び小ペプチドと非共有結合的に会合する３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）を有する膜結合重鎖を含む三量体構造である。α１及びα２ドメインは高度に多型性であり、そしてペプチド結合溝を生じさせるプラットフォームを形成する。保存されたα３ドメインに並置されているのは、膜貫通ドメインとそれに続く細胞内細胞質尾部である。
【０００６】
免疫応答を開始するには、ＭＨＣ−Ｉａ分子は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上のＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）の提示によって認識される特定のペプチドを提示するが、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）に存在するＮＫ細胞受容体は、個々のペプチドではなくペプチドモチーフを認識する。正常な生理学的条件下では、ＭＨＣ−Ｉａ分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞へのペプチドを提示することを担当するヘテロ三量体複合体として存在するが、ＭＨＣ−Ｉａ分子はβ２−ミクログロブリン及びペプチドを欠く遊離重鎖として細胞にも存在し得、オープンコンフォーマーと呼ぶことができる（Ａｒｏｓａら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７  ３月；２８（３）：１１５−２３）（図２）。ＨＬＡ−オープンコンフォーマーとＴ細胞受容体及びＮＫ細胞受容体との相互作用はペプチドとは無関係であり、その機能は未知である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｒｏｓａら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７  ３月；２８（３）：１１５−２３
【非特許文献２】Ｒａｉｎｅら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００６；  ４５：１３３８−１３４４
【非特許文献３】Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２０１５  ８月；１４（８）：５６１−８４
【非特許文献４】Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１２、４月：１２、２９８−３０６
【非特許文献５】Ｇｉｒａｌｄｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４，２７：８−１５
【非特許文献６】Ｂｅｃｈｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６，３９：１７−１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
オープンコンフォーマーは、細胞の細胞表面で発現することができ、β２ｍ及びペプチドを含まないＨＬＡ分子の線状エピトープを認識する抗体（例えば、ＬＡ４５、Ｌ３１、ＨＣＡ２及びＨＣ−１０）を用いて検出することができる。これらの抗体は、様々な自己免疫患者及び健康な個人においてオープンコンフォーマーの存在を検出するために使用されてきた（Ｒａｉｎｅら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００６；  ４５：１３３８−１３４４）。患者及び細胞株におけるそれらの存在にかかわらず、作用様式は少しも知られていない。オープンコンフォーマーは主に強直性脊椎炎（ＡＳ）＋ＨＬＡ−Ｂ２７患者において多く評価され、ＨＬＡ−Ｂ２７オープンコンフォーマーが自己免疫を誘導すると仮定されてきたが、他の自己免疫患者におけるそれらの作用はまだ取り組まれていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において、本発明者らは、オープンコンフォーマー（β２ｍを含まない重鎖）として存在する分子の古典的ＭＨＣ−Ｉａ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ）ファミリーが、癌の治療におけるそれらの免疫調節特性及び使用のために有用な治療薬であることを初めて開示する。
【００１０】
癌は、制御されていない及び破壊的な成長を受けている身体の異常細胞によって特徴付けられる疾患群である。癌細胞は体の周りに広がり、転移して腫瘍を形成する；この成長パターンは悪性と呼ばれる。癌は、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法及び免疫療法によって治療することができる。治療の選択は、癌の種類、癌の段階（その広がり具合）、年齢、健康状態、及び追加の個人的特徴に依存する。癌のための単独治療はなく、患者はしばしば療法と緩和ケアの併用を受ける。
【００１１】
癌免疫療法は、患者自身の免疫系を誘導して腫瘍と戦うように設計された多様な治療戦略を指し、多様な突然変異の蓄積を含む癌の進行を免疫系によって監視するという見識に基づいている。免疫療法は、免疫系の特定の細胞成分の活性を刺激するか、又は癌細胞によって産生される免疫応答を抑制するシグナルを相殺する（Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２０１５  ８月；１４（８）：５６１−８４）。
【００１２】
免疫細胞の異なる型が癌に対する免疫応答に関与している。白血球（免疫組織）の画分内で最も有名な細胞は：Ｔ細胞（細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ−細胞、ＴヘルパーＣＤ４＋細胞−Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７表現型）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、マクロファージ（炎症促進性Ｍ１型及び腫瘍促進性Ｍ２型）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及び樹状細胞（ＤＣ）である。これらの免疫細胞は、腫瘍の中心、浸潤マージン（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍａｒｇｉｎ）又は隣接する三次リンパ様構造に位置し得る（Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１２、４月：１２、２９８−３０６）。
【００１３】
免疫微小環境の密度及び組成は、患者と腫瘍の間で異質である。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１表現型細胞及びＭ１型マクロファージの浸潤は、多くの場合、免疫療法への良好な臨床的結果及び良好な応答につながることが多いが、一般にＭ２表現型マクロファージ及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）による腫瘍浸潤は腫瘍進行を促進することが現在十分に確立されている。他のリンパ球及び骨髄系細胞集団の臨床的影響は一貫性が低く、腫瘍の種類及び段階に依存するようである。Ｔｈ１７及びＮＫ細胞の存在、及び腫瘍浸潤物におけるＴｒｅｇ細胞の不存在／減少は、いくつかの癌適応症における良好な結果と相関する（Ｇｉｒａｌｄｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４，２７：８−１５）。白血球浸潤と臨床的結果の間の均衡の一般的概要を概説する（Ｂｅｃｈｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６，３９：１７−１３）。
【００１４】
全体として、Ｍ１型マクロファージ、細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞、及びＴｈ１細胞の浸潤に有利な腫瘍の免疫構成を調節し、及び／又はＭＤＳＣ及びＭ２型マクロファージの浸潤を減少させることは、ここで検討されるＨＬＡオープンコンフォーマータンパク質の使用を伴う癌を治療するための期待が高い治療手段となる。
【００１５】
用語と定義
アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端へ与えられる。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ−アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版  ｐ．２１）。
【００１６】
本明細書中で使用される用語「オープンコンフォーマー（ｏｐｅｎ  ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）」とは、単量体又は二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）のいずれかとして、β２−ミクログロブリンに会合しない単離されたＨＬＡ重鎖分子をいう。本明細書中に開示されるオープンコンフォーマーの特定の実施形態は、ＨＬＡ重鎖が安定化ポリペプチド領域、特に結晶性断片免疫グロブリンドメインに共有結合的に連結される融合タンパク質単量体又は二量体である。
【００１７】
本明細書中で使用される用語「配列同一性」及び「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの整列した配列を比較することによって決定される値を指す。比較のために配列のアラインメントを求める方法は当技術分野で周知である。比較のための配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似検索法による検索によって、又はＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されないこれらアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって達成され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。アミノ酸配列の比較の一例は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムであり：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲での最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１；拡張：１；構成調整：条件付き構成スコアマトリクス調整；のデフォルト設定を使用する。このような核酸配列の比較の一例は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムであり：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；クエリ範囲での最大一致：０；一致／不一致スコア：１．−２；ギャップコスト：リニア；のデフォルト設定を使用する。特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、それぞれタンパク質及び核酸の比較の上記既定のパラメーターを用いてＢＬＡＳＴプログラム群（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を使用して得られた値を指す。
【００１８】
本明細書中で使用される用語「主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）」は、生物学及び免疫学の分野で知られている意味で使用される；それはタンパク質のエピトープとも呼ばれる特定の断片（ペプチド）を提示する細胞表面分子を指す。ＭＨＣ分子の２つの主要クラス：クラスＩ及びクラスＩＩが存在する。ＭＨＣクラスＩ内で、その多型を基に２つの群を区別することができる：ａ）対応する多型ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ遺伝子を有する古典的（ＭＨＣ−Ｉａ）、及びｂ）対応するより多型性の低いＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ及びＨＬＡ−Ｈ遺伝子を有する非古典的（ＭＨＣ−Ｉｂ）。
【００１９】
ＭＨＣクラスＩ重鎖分子は、通常、非ＭＨＣ分子β２−ミクログロブリンのユニットに連結されたアルファ鎖として生じる（すなわち、オープン型ではない場合）。アルファ鎖は、Ｎ末端からＣ−末端への方向に、シグナルペプチド、３つの細胞外ドメイン（Ｎ末端にα１を有するα１〜３）、膜貫通ドメイン及びＣ末端細胞質尾部を含む。表示又は提示されるペプチドは、α１／α２ドメインの中央領域のペプチド結合溝によって保持される。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「β２−ミクログロブリンドメイン」は、細胞生物学及び生化学の分野で知られている意味で使用される；これは、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体分子の一部である非ＭＨＣ分子を指す。換言すれば、それはＭＨＣクラスＩヘテロ二量体のβ鎖を構成する。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）」は、細胞生物学及び生化学の分野で知られている意味で使用される；それは、ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子座を指す。３つの主要な古典的ＭＨＣ−Ｉａ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃであり、これらの遺伝子の全ては様々な対立遺伝子数を有する（表１）。密接に関連する対立遺伝子は、特定の対立遺伝子のサブグループに群別される。例えば、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ命名委員会により対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ５７は、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１：０１〜ＨＬＡ−Ｂ＊５７：８２と標識された、一つ以上のアミノ酸に変化した１００以上の密接に関連する対立遺伝子を有する。すべての既知のＨＬＡ遺伝子及びそれらのそれぞれの対立遺伝子の完全配列又は部分配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）のような専門データベースで当業者に利用可能である。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、細胞生物学及び免疫学の分野で知られている意味で使用される；それは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）のいずれかの抗原結合断片又はその一本鎖及び、関連又は誘導された構築物に限定されないが、これらを含むすべての抗体を指す。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを構成する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「抗体様分子」は、高い親和性／ｋｄ≦１０Ｅ−８ｍｏｌ／Ｌで別の分子又は標的に特異的に結合することができる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同様にその標的に結合する。用語「抗体様分子」は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（モレキュラーパートナーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）、チューリッヒ）、アルマジロリピートタンパク質に由来するポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質に由来するポリペプチド、及びテトラリコペプチドリピートタンパク質に由来するポリペプチドのように、リピートタンパク質を包含する。
【００２４】
用語「抗体様分子」は、プロテインＡドメインに由来するポリペプチド、フィブロネクチンドメインＦＮ３に由来するポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメインに由来するポリペプチド、リポカリンに由来するポリペプチド、ジンクフィンガーに由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）に由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）に由来するポリペプチド、ＰＤＺドメインに由来するポリペプチド、γ−クリスタリンに由来するポリペプチド、ユビキチンに由来するポリペプチド、システインノットポリペプチドに由来するポリペプチド、及びノッティンに由来するポリペプチドをさらに包含する。
【００２５】
用語「プロテインＡドメイン由来ポリペプチド」は、プロテインＡの誘導体であり、免疫グロブリンのＦｃドメイン及びＦａｂ領域に特異的に結合することができる分子を指す。
【００２６】
用語「アルマジロリピートタンパク質」は、少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成するαヘリックスの対によって特徴付けられる。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「結晶化可能断片（Ｆｃ）領域」は、細胞生物学及び免疫学の分野で知られている意味で使用される；それは、ジスルフィド結合によって共有結合的に連結されたＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの同一の重鎖断片を含む抗体の画分を指す。
【００２８】
本明細書の文脈において、用語「二量体」は、２つのサブユニットからなるユニットを指す。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「ホモ二量体」は、同じクラスのサブユニットの同一又は非常に類似したメンバーである２つのサブユニットからなる二量体を意味する。ホモ二量体の一例は、ＨＬＡ対立遺伝子のリストから独立して選択された２つのサブユニットからなる二量体であろう。特定の実施形態では、ホモ二量体は、２つの同一のＨＬＡ対立遺伝子からなる。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸リンカー」は、一本鎖ポリペプチドを生成するために、２つのポリペプチドを連結するため使用される可変長のポリペプチドをいう。本明細書で特定される本発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをＦｃドメインと連結するポリペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号００１）である。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「チェックポイント阻害剤」又は「チェックポイント阻害抗体」は、当該分野において免疫チェックポイント機構として知られているものの一部にあるとおり、Ｔ細胞活性化後にＴ細胞阻害をもたらすシグナルカスケードを破壊することができる薬剤、特に（非アゴニスト）抗体（又は抗体様分子）を包含することを意味する。チェックポイント阻害剤又はチェックポイント阻害抗体の非限定的な例には、ＣＴＬＡ−４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１６４１０）、ＰＤ−１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１５１１６）、ＰＤ−Ｌ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＮＺＱ７）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ５ＺＰＲ３）、Ｔｉｍ−３、Ｇａｌ９、ＶＩＳＴＡ、Ｌａｇ３に対する抗体を含む。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「チェックポイントアゴニスト剤」又は「チェックポイントアゴニスト抗体」は、当該分野において免疫チェックポイント機構として知られているものの一部にあるとおり、Ｔ細胞活性化に至るシグナルカスケードに従事することができる、特に抗体（又は抗体様分子）であるが、これに限定されない薬剤を包含することを意味する。Ｔ細胞活性化を刺激することが知られている受容体の非限定的な例には、ＣＤ１２２及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ０７０１１）が含まれる。「チェックポイントアゴニスト剤」又は「チェックポイントアゴニスト抗体」という用語は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（Ｏ×４０）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８に対するアゴニスト抗体を包含する。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「（免疫）チェックポイント調節剤」は、チェックポイント阻害剤、チェックポイント阻害抗体、チェックポイントアゴニスト剤及びチェックポイントアゴニスト抗体を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＭＨＣクラスＩ分子の命名法を示す。
【図２】図２は、ＨＬＡヘテロ三量体及びＨＬＡオープンコンフォーマー（遊離重鎖）の概略図を示す。両方の形態が抗原提示細胞（ＡＰＣ細胞）の細胞表面に存在し得る。本発明者らは、オープンコンフォーマーと免疫調節性受容体（ＫＩＲ、ＬＩＬ、ＰＴＰＲＪなど）との相互作用は親和性が異なり、したがって抗腫瘍免疫に有利な免疫応答を誘導するように改変されることを提案する。
【図３ＡＢ】図３はＨＬＡ−Ｆｃ及びβ２ｍＤＮＡカセットの概略図及びＣＨＯ細胞からのＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子の発現を示す。Ａ）ヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクターカセットに挿入されたＭＨＣ−Ｉａ重鎖（ＨＬＡ重鎖）のアルファ１、２及び３ドメイン；及び別のベクターカセットに挿入されたヒトβ２ミクログロブリン。Ｂ）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞でのトランスフェクションは、ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の細胞外生産のために、１：１の比率でＨＬＡ−Ｆｃベクター＋β２ｍベクターの両方を使用して行う。標準的な抗体精製の手順を用いて上清を回収し、ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃを精製した。β２ｍをＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ複合体から除去し、その後のＨＬＡ−Ｆｃ単量体をリフォールディングしてＨＬＡ２−Ｆｃホモ二量体を形成する。
【図４ＡＢＣ】図４は、ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ複合体からのβ２ｍの分離及びＳＥＣによるＨＬＡ２−Ｆｃの精製及びリフォールディングを示す。Ａ）尿素−トリス−ＢＭＥ変性緩衝液中のＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子のクロマトグラフィーヒストグラムプロットは、ＳＥＣによるセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１００ＨＲカラムを用いたβ２ｍからのＨＬＡ−Ｆｃ遊離重鎖の解離を示す。Ｂ）及びＣ）クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、ＳＥＣの前後のβ２ｍの存在を示す。Ｂ）はＳＥＣ中で分離される前のＨＬＡ−Ｂ２ｍ−Ｆｃ分子を示し、そしてＣ）はＳＥＣ後に回収され、そしてリフォールディングされたＨＬＡ２−Ｆｃ分子を示す。
【図５ＡＢＣＤ】図５は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により白血球集団の異なる免疫調節受容体に対するＨＬＡ２−Ｆｃ（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ及びＣ１２２−Ｆｃ）の相互作用を示す。Ａ）ヒトＫＩＲ３ＤＬ１、Ｂ）ヒトＫＩＲ３ＤＬ２、及びＣ）ヒトＫＩＲ３ＤＬ３は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の亜集団において発現される。Ｄ）ＬＩＬＲＢ１、及びＥ）ＬＩＬＲＢ２は主に骨髄細胞で発現され、Ｆ）ＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢに対するマウスのホモログ）及びＧ）ＰＴＰＲＪ（白血球上ではＭＤＳＣ細胞及び活性化Ｔ細胞で優先的に発現される）
【図５ＥＦＧ】図５は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により白血球集団の異なる免疫調節受容体に対するＨＬＡ２−Ｆｃ（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ及びＣ１２２−Ｆｃ）の相互作用を示す。Ａ）ヒトＫＩＲ３ＤＬ１、Ｂ）ヒトＫＩＲ３ＤＬ２、及びＣ）ヒトＫＩＲ３ＤＬ３は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の亜集団において発現される。Ｄ）ＬＩＬＲＢ１、及びＥ）ＬＩＬＲＢ２は主に骨髄細胞で発現され、Ｆ）ＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢに対するマウスのホモログ）及びＧ）ＰＴＰＲＪ（白血球上ではＭＤＳＣ細胞及び活性化Ｔ細胞で優先的に発現される）
【図６Ａ】図６は、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ、及びＣ１２２−Ｆｃ）がｉＴｒｅｇへのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の変換を常に遮断することを示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との用量依存的な様式でのＨＬＡ２−Ｆｃのインキュベーションは、ｉＴｒｅｇへの変換を阻止する。Ａ〜Ｂ）ＨＬＡ２−Ｆｃ分子は、ｉＴｒｅｇの分化に最適な培養条件（１０μｇ／ｍＬ）でＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇの分化マーカー）の発現を阻止し、コントロールＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子、アイソタイプ、ＴＧＦβ及びＩＬ−２を補充した培地及び補充なしの培地は、ｉＴｒｅｇ変換においてＨＬＡ２−Ｆｃの特異的な影響を実証する。
【図６Ｂ】図６は、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ、及びＣ１２２−Ｆｃ）がｉＴｒｅｇへのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の変換を常に遮断することを示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との用量依存的な様式でのＨＬＡ２−Ｆｃのインキュベーションは、ｉＴｒｅｇへの変換を阻止する。Ａ〜Ｂ）ＨＬＡ２−Ｆｃ分子は、ｉＴｒｅｇの分化に最適な培養条件（１０μｇ／ｍＬ）でＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇの分化マーカー）の発現を阻止し、コントロールＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子、アイソタイプ、ＴＧＦβ及びＩＬ−２を補充した培地及び補充なしの培地は、ｉＴｒｅｇ変換においてＨＬＡ２−Ｆｃの特異的な影響を実証する。
【図７ＡＢ】図７は、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ、及びＣ１２２−Ｆｃ）がＴ細胞リンパ腫を抑制することを示す。Ａ〜Ｅ）ＨＬＡ２−Ｆｃ分子又はコントロールＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子の存在下で細胞の増殖を測定するための抑制アッセイ。ＨＬＡ２−Ｆｃは、ヒト（Ｊｕｒｋａｔ）及びマウス（ＥＧ．７）のリンパ腫細胞株を用量依存的様式で抑制し（μｇ／２００μＬ）、Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞リンパ腫；ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、神経芽細胞腫；及びＬ５４０、ヒトホジキンリンパ腫などのその他の細胞株を評価したが、抑制は最適な培養条件ではＨＬＡ２−Ｆｃ分子から観察されたものではなかった。Ｌ４２８、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ１２３６、ヒトホジキンリンパ腫；ＩＭＲ−５、神経芽細胞腫；及びＭ１３０４２８、黒色腫などの他の細胞株も試験したが抑制は観察されなかった。
【図７ＣＤ】図７は、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ、及びＣ１２２−Ｆｃ）がＴ細胞リンパ腫を抑制することを示す。Ａ〜Ｅ）ＨＬＡ２−Ｆｃ分子又はコントロールＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子の存在下で細胞の増殖を測定するための抑制アッセイ。ＨＬＡ２−Ｆｃは、ヒト（Ｊｕｒｋａｔ）及びマウス（ＥＧ．７）のリンパ腫細胞株を用量依存的様式で抑制し（μｇ／２００μＬ）、Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞リンパ腫；ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、神経芽細胞腫；及びＬ５４０、ヒトホジキンリンパ腫などのその他の細胞株を評価したが、抑制は最適な培養条件ではＨＬＡ２−Ｆｃ分子から観察されたものではなかった。Ｌ４２８、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ１２３６、ヒトホジキンリンパ腫；ＩＭＲ−５、神経芽細胞腫；及びＭ１３０４２８、黒色腫などの他の細胞株も試験したが抑制は観察されなかった。
【図７Ｅ】図７は、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ、及びＣ１２２−Ｆｃ）がＴ細胞リンパ腫を抑制することを示す。Ａ〜Ｅ）ＨＬＡ２−Ｆｃ分子又はコントロールＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ分子の存在下で細胞の増殖を測定するための抑制アッセイ。ＨＬＡ２−Ｆｃは、ヒト（Ｊｕｒｋａｔ）及びマウス（ＥＧ．７）のリンパ腫細胞株を用量依存的様式で抑制し（μｇ／２００μＬ）、Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞リンパ腫；ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、神経芽細胞腫；及びＬ５４０、ヒトホジキンリンパ腫などのその他の細胞株を評価したが、抑制は最適な培養条件ではＨＬＡ２−Ｆｃ分子から観察されたものではなかった。Ｌ４２８、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ１２３６、ヒトホジキンリンパ腫；ＩＭＲ−５、神経芽細胞腫；及びＭ１３０４２８、黒色腫などの他の細胞株も試験したが抑制は観察されなかった。
【図８ＡＢＣＤ】図８は、単独療法として、又はＰＤ−１抗体との併用療法としてＨＬＡ２−Ｆｃ（Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、及びＣ０８２−Ｆｃ）は、Ｃ３８マウス同系結腸癌モデルにおける腫瘍のサイズを縮小することができることを示す。Ａ）結腸癌細胞（Ｃ３８）の注射時点及び化合物注射の実験設計。Ｂ）Ａ３０２−Ｆｃ処置群の平均腫瘍体積の平均（Ｍｅａｎ  ａｖｅｒａｇｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）ｍｍ３（ｎ＝５）。Ｃ）Ｂ５８２−Ｆｃ処置群（ｎ＝５）の平均腫瘍体積の平均。Ｄ）Ｃ０８２−Ｆｃ処置群（ｎ＝５）の平均腫瘍体積の平均。細胞の注入時点及び物質の注入の実験設計は以下の通りであった：ビヒクルＰＢＳ  Ｑ３Ｄ×６、アイソタイプ（１０ｍｇ／Ｋｇ）Ｑ３Ｄ×６；ＨＬＡ２−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）Ｑ３Ｄ×６；ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×２（２００μｇ）；及びＨＬＡ２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄ×６及びｂｉｗｋ×２）。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により解析し、続いてボンフェローニポストホック（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）分析、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、により分析した。ｎ．ｓ．＝有意ではない。Ｑ＝注入間の日数。Ｄｘ＝注入回数。ｂｉｗｋ＝週に２回。
【図９ＡＢ】図９は、ＣＴＬＡ４又はＰＤ−１抗体との併用においてＨＬＡ２−Ｆｃ（Ｂ２７２−Ｆｃ及びＢ５７２−Ｆｃ）がＭＣ３８−ＯＶＡ又はＣ３８マウス同系結腸癌モデルにおいて腫瘍のサイズを縮小することを示す。Ａ）Ｂ２７２−Ｆｃ処置群（ｎ＝６）の平均腫瘍体積の平均ｍｍ３。Ｂ）Ｂ５７２−Ｆｃ処置群の平均腫瘍体積の平均ｍｍ３（ｎ＝６）。細胞の注入時点及び物質の注入の実験計画は以下の通りであった：ビヒクルＰＢＳ  Ｑ３Ｄｘ６、アイソタイプ（１０ｍｇ／Ｋｇ）Ｑ３Ｄｘ６；ＨＬＡ２−Ｆｃ（１０ｍｇ／Ｋｇ）Ｑ３Ｄｘ６；ＣＴＬＡ−４  Ｑ３Ｄ×２（ｄ１＝１００μｇ；ｄ４＝５０μｇ）、ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×２（２００μｇ）；ＨＬＡ２−Ｆｃ＋ＣＴＬＡ−４（それぞれＱ３Ｄｘ６及びＱ３Ｄｘ２）、及びＨＬＡ２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄｘ６及びｂｉｗｋ×２）。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析により解析し、続いてボンフェローニポストホック分析、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１により分析した。ｎ．ｓ．＝有意ではない。Ｑ＝注入間の日数。Ｄｘ＝注入回数。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図１０ＡＢ】図１０は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用におけるＡ２５２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ａ２５２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３での平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ａ２５２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）をｂｉｗｋ×２回注入；Ａ２５２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＡ２５２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（各５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析により解析し、続いてボンフェローニポストホック分析＊ｐ＜０．０５により分析した。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図１１ＡＢＣ】図１１は、フローサイトメトリーによるＡ２５２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図１０における実験の継続）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、続いてダネットポストホック（Ｄｕｎｎｅｔ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）分析＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１によって分析した。
【図１２ＡＢＣ】図１２は、フローサイトメトリーによるＡ２５２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫組織図を示す（図１０における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。＊＊＊ｐ＜０．００１によって分析した。
【図１３ＡＢ】図１３は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用におけるＡ３０２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ａ３０２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３での平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ａ３０２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ａ３０２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＡ３０２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析する。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図１４ＡＢＣ】図１４は、フローサイトメトリーによるＡ３０２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図１３における実験の続き）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析し：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図１５ＡＢＣ】図１５は、フローサイトメトリーによるＡ３０２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図１３における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図１６ＡＢ】図１６は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用におけるＢ２７２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ｂ２７２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３での平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった；アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ｂ２７２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ｂ２７２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＢ２７２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析した。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図１７ＡＢＣ】図１７は、フローサイトメトリーによるＢ２７２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図１６における実験の継続）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を表すボックスプロットとして表し、並びに各群は一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図１８ＡＢＣ】図１８は、フローサイトメトリーによるＢ２７２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図１６における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図１９ＡＢ】図１９は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用においてＢ５３２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ｂ５３２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３での平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ｂ５３２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ｂ５３２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＢ５３２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析する。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図２０ＡＢＣ】図２０は、フローサイトメトリーによるＢ５３２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図１９における実験の継続）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図２１ＡＢＣ】図２１は、フローサイトメトリーによるＢ５３２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図１９における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図２２ＡＢ】図２２は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用におけるＢ５７２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ｂ５７２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３での平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ｂ５７２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ｂ５７２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＢ５７２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析する。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図２３ＡＢＣ】図２３は、フローサイトメトリーによるＢ５７２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図２２における実験の継続）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図２４ＡＢＣ】図２４は、フローサイトメトリーによるＢ５７２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図２２における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図２５ＡＢ】図２５は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用においてＢ５８２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ｂ５８２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３における平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ｂ５８２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ｂ５８２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＢ５８２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析する。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図２６ＡＢＣ】図２６は、フローサイトメトリーによるＢ５８２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図２５における実験の継続）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図２７ＡＢＣ】図２７は、フローサイトメトリーによるＢ５８２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図２５における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図２８ＡＢ】図２８は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体の併用においてＣ０８２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ｃ０８２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３においての平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＣＯ８２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ｃ０８２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＣ０８２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析する。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図２９ＡＢＣ】図２９は、フローサイトメトリーによる、Ｃ０８２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図２８における実験の継続）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図３０ＡＢＣ】図３０は、フローサイトメトリーによる、Ｃ０８２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大型腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図２８における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図３１ＡＢ】図３１は、膵臓Ｐａｎ０２同系マウスモデルの大きな腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体との併用におけるＣ１２２−Ｆｃのインビボ試験を示す。Ａ）Ｃ１２２−Ｆｃ処置動物のｍｍ３での平均腫瘍体積の平均（ｎ＝６）。Ｂ）コントロールと比較した処置マウス群の％Δ腫瘍阻害。物質の注入時点の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；Ｃ１２２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２注入；Ｃ１２２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１抗体（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；及びＣ１２２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれ５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析、続いてボンフェローニポストホック分析によって分析する。Δ腫瘍阻害は、アイソタイプと比較した、治療の開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療の終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの％の腫瘍の成長を表すΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算される。ｂｉｗｋ＝週に２回
【図３２ＡＢＣ】図３２は、フローサイトメトリーによるＣ１２２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有するＰａｎ０２膵臓癌マウスからの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析の免疫構成を示す（図３１における実験の続き）。腫瘍に浸潤している関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）顆粒球、マクロファージ、マクロファージＭ１型、マクロファージＭ２型、及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。Ｃ）Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【図３３ＡＢＣ】図３３は、フローサイトメトリーによるＣ１２２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１で処置された大きな腫瘍を有する処置されたＰａｎ０２膵臓癌マウスからの血液白血球分析の免疫構成を示す（図３１における実験の継続）。血液中に存在する関連白血球を分析：Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。Ｂ）Ｔｈ１細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ＋）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）。Ｃ）単球、顆粒球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｇ−ＭＤＳＣ）、及び単球−骨髄由来免疫抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）。白血球％は、試料の最大値及び最小値を示すボックスプロットとして表し、各群を一元配置分散分析、続いてダネットポストホック分析＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１によって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー（ＨＬＡ−オープンコンフォーマー）を提供する。ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーには、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーが含まれる。表１に、既知のＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子のリストを示す。本発明は、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７対立遺伝子を含むＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーを含まない。
【００３６】
本発明の一態様によれば、単離されたＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーがＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーが提供される。
【００３７】
特定の実施形態では、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、第１の単量体、又は第１及び第２の単量体を含み、かつ他の単量体と独立する各単量体は、ＨＬＡ重鎖を含む。
【００３８】
本発明の第１の態様の代替によれば、単離されたＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマーが提供される。
【００３９】
本発明の第１の様態の他の代替によれば、単離されたＨＬＡ−ＢオープンコンフォーマーがＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、単離されたＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーが提供される。
【００４０】
本発明の第１の様態のさらに別の代替によれば、単離されたＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーが提供される。
【００４１】
本発明の第１の様態のさらに別の代替によれば、単離されたＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマー及びＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーが提供される。
【００４２】
本発明の第２の態様によれば、単離されたＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーはＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーが：
‐  薬剤としての使用のために、
‐  特に癌の治療又は予防に使用するために、
若しくは、
‐  特に免疫調節剤としての使用のために、
‐  特に感染症の治療のために、
‐  さらに特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス（それぞれＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、はしかウイルス、ヘルペスウイルス及び／又は黄熱病ウイルスの予防、治療又は療法のために、
提供される。
【００４３】
本発明の第２の態様の代替によれば、単離されたＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマーは：
‐  薬剤としての使用のために、
‐  特に癌の治療又は予防に使用するために、
若しくは、
‐  特に免疫調節剤としての使用のために、
‐  特に感染症の治療のために、
‐  さらに特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス（それぞれＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、はしかウイルス、ヘルペスウイルス及び／又は黄熱病ウイルスの予防、治療又は療法のために、
提供される。
【００４４】
本発明の第２の態様の別の代替によれば、単離されたＨＬＡ−ＢオープンコンフォーマーはＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、単離されたＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーが：
‐  薬剤としての使用のために、
‐  特に癌の治療又は予防に使用するために、
若しくは、
‐  特に免疫調節剤としての使用のために、
‐  特に感染症の治療のために、
‐  さらに特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス（それぞれＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、はしかウイルス、ヘルペスウイルス及び／又は黄熱病ウイルスの予防、治療又は療法のために、
提供される。
【００４５】
本発明の第２の態様のさらなる別の代替によれば、単離されたＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーは：
‐  薬剤としての使用のために、
‐  特に癌の治療又は予防に使用するために、
若しくは、
‐  特に免疫調節剤としての使用のために、
‐  特に感染症の治療のために、
‐  さらに特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス（それぞれＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、はしかウイルス、ヘルペスウイルス及び／又は黄熱病ウイルスの予防、治療又は療法のために、
提供される。
【００４６】
免疫調節剤としての機能は感染症などの白血球反応の改変を必要とする疾患の治療に特に有用である。本発明によって好ましくは治療できる感染症には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、はしか、ヘルペス及び黄熱病が含まれる。
【００４７】
本発明の第２の態様の特定の実施形態において、又は本発明の第２の態様のいかなる上述の代替の実施形態において、癌は大腸癌又は膵臓癌である。
【００４８】
本発明の第３の態様は、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーに関する。融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、第１のＨＬＡ重鎖単量体又は第１及び第２のＨＬＡ重鎖単量体又を含む、又は、から本質的になる。これらの他のものと独立するＨＬＡ重鎖単量体のそれぞれは、ＨＬＡ重鎖を含む、又は、から本質的になる。融合ＭＨＣオープンコンフォーマーは、Ｆｃポリペプチド配列をさらに含む。特定の実施形態において、ＨＬＡ単量体配列は融合ＭＨＣオープンコンフォーマーのＮ末端に配置し、かつＦｃ構築物はＣ末端に向かって位置する。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーはＨＬＡ重鎖とＦｃ断片を結合する。
【００４９】
融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、インビボでポリペプチドを代謝的に安定化することが知られているポリペプチドドメインをさらに含む。そのような安定化ドメインの一例は、免疫グロブリンのＦｃ（結晶化可能断片）ドメイン、特にγ免疫グロブリンのＦｃポリペプチドドメインである。ＨＬＡ重鎖及び安定化ドメインは、任意にアミノ酸リンカーによって連結されていてもよい。ＨＬＡ鎖及び免疫グロブリンＦｃ断片を含むオープンコンフォーマー融合タンパク質は、以後、ＨＬＡ−Ｆｃオープンコンフォーマー又はＨＬＡ２−Ｆｃと称する。
【００５０】
融合タンパク質中のＦｃドメインの存在は、哺乳動物系（プロテインＡ又はＧ精製）における溶解性、安定性、結合活性、半減期、及び技術的観点からの費用効果の高い産生及び精製の増大を促進する。
【００５１】
本発明の第３の態様の代替によれば、ＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマーが提供され、ＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマーは、第一の単量体又は第１及び第２の単量体を含み、かつ他の単量体と独立する各単量体は、Ｆｃポリペプチド配列、及び任意に、ＨＬＡ重鎖とＦｃ断片とを連結するアミノ酸リンカーをさらに含むＨＬＡ重鎖を含む。
【００５２】
本発明の第３の態様の別の代替によれば、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーは、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーを提供され、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーは、第１の単量体又は第１及び第２の単量体を含み、かつ他の単量体と独立する各単量体は、Ｆｃポリペプチド配列、及び任意に、ＨＬＡ重鎖とＦｃ断片とを連結するアミノ酸リンカーをさらに含むＨＬＡ重鎖を含む。
【００５３】
本発明の第３の態様のさらに別の代替によれば、ＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーが提供され、ＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーは、第１の単量体又は第１及び第２の単量体を含み、かつ他の単量体と独立する各単量体は、Ｆｃポリペプチド配列、及び任意に、ＨＬＡ重鎖とＦｃ断片とを連結するアミノ酸リンカーをさらに含むＨＬＡ重鎖を含む。
【００５４】
本発明の代替の態様によれば、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー単量体（すなわち、第２のＨＬＡ重鎖ポリペプチドに結合しておらず、かつβ２−ミクログロブリンにより結合しないＨＬＡ重鎖）は、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー単量体は、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とし、癌の治療又は予防における使用のために、又は免疫調節剤としての使用のために提供される。この態様の特定の実施形態では、ＭＨＣ−Ｉａ単量体は、ペプチドエピトープ断片をさらに含む。
【００５５】
この態様は、以下の項目で要約することができる：
項目１：薬剤として使用するための、特に癌の治療又は予防に使用するため又は免疫調節剤としての使用のための、会合β２−ミクログロブリンを本質的に含まない、ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子由来の単離された単一ＨＬＡ重鎖ポリペプチド単量体。
項目２：単量体がペプチドエピトープ断片をさらに含む、項目１に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するための、ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子由来の単離された単一ＨＬＡ重鎖ポリペプチド単量体。
項目３：ＨＬＡ重鎖がＨＬＡアルファ１、２及び３ドメインのみからなる、項目１又は２に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するための、ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子由来の単離された単一ＨＬＡ重鎖ポリペプチド単量体。
項目４：ＨＬＡ重鎖が膜貫通ドメインを含み、かつ細胞内ドメイン（細胞質尾部）を含まない、前記項目のいずれか１項に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するための、ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子由来の単離された単一ＨＬＡ重鎖ポリペプチド単量体。
項目５：併用薬剤であって、：
ａ．項目１〜４のいずれか一項に特定されるとおり、ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子由来の単離された単一ＨＬＡ重鎖ポリペプチド単量体と、
ｂ．チェックポイント阻害剤、特にチェックポイント阻害抗体及び／又はチェックポイントアゴニスト剤、特にチェックポイントアゴニスト抗体、
とを含む前記併用薬剤。
項目６：項目５に記載の併用薬剤であって、前記チェックポイント阻害剤が、ＣＤ８０又はＣＤ８６とのＣＴＬＡ４相互作用の阻害剤、及びＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害剤、特にＣＴＬＡ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１のいずれか一つに対する抗体、さらに特にヒトＣＴＬＡ４、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体から選択され、及び／又は前記チェックポイントアゴニスト剤はアゴニスト抗体又は４−１ＢＢ及び／又は４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４１２７３）に対するリガンドから選択される、前記併用薬剤。
【００５６】
本発明のこの代替の態様の特定の実施形態において、癌は結腸癌又は膵臓癌である。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、ＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーがＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマータンパク質は免疫調節剤として提供される。理論に縛られることを望まずに、本発明者らは特に、白血球に存在する様々な免疫調節受容体に結合し、かつＴ細胞リンパ腫細胞の増殖を改変する、その能力が特に有用であると考える。さらに制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のネガティブモジュレーターとしてＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、癌及び感染症のようなＴｒｅｇが防御免疫の発達を害するヒトの疾患における使用のために特に適している（Ｂｏｅｈｍｅｒら、前出）。
【００５８】
本発明のこの他の態様の代替によれば、ＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマーは免疫調節剤としに提供される。
【００５９】
本発明のこの他の態様の別の代替によれば、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーは、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７のオープンコンフォーマーでないことを条件とする、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーが、免疫調節剤として提供される。
【００６０】
本発明のこの他の態様のさらなる別の代替によれば、ＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーは免疫調節剤として提供される。
【００６１】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、ＨＬＡ重鎖は膜貫通ドメインを含み、かつ細胞内ドメイン（細胞質尾部）を含まない。
【００６２】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、上記のＨＬＡ対立遺伝子から独立して選択される２つのサブユニットからなる。特定の実施形態において、ホモ二量体は２つの同一のＨＬＡ対立遺伝子からなる。
【００６３】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、２つの同一のＨＬＡポリペプチド鎖を含む。特定の実施形態では、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、２つの異なるＨＬＡポリペプチド鎖を含む。
【００６４】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、ペプチドエピトープ断片をさらに含む。
【００６５】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、ペプチドエピトープ断片は、ＨＬＡペプチド鎖の抗原提示ドメイン内のポリペプチドに非共有結合的に結合される。
【００６６】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、第１及び／又は第２の単量体はペプチドエピトープ断片をさらに含む。
【００６７】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、細胞外ＨＬＡ−アルファ１、ＨＬＡ−アルファ２及びＨＬＡ−アルファ３ドメインのみを含む。これらの実施形態において、ＨＬＡ重鎖の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、組換え細胞におけるその細胞外発現を可能にするために、本発明の治療用ポリペプチドに含まれない。当業者であれば、注釈付きのＨＬＡ配列とのペアワイズ配列アライメントにより、以前に未知のＨＬＡ配列であっても、それぞれのドメインを容易に同定することができる。
【００６８】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーはＦｃドメインを含む。特定の特別な実施形態では、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）の重鎖定常領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【００６９】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、安定化ドメイン、特にＦｃドメインをＨＬＡポリペプチドに連結するアミノ酸リンカーを含む。特定の特別な実施形態では、アミノ酸リンカーは、一つの単一ポリペプチド鎖としてＨＬＡ重鎖をＦｃドメインに連結する１〜５０個のアミノ酸、特に５〜４０個のアミノ酸、さらに特に１０〜３０個のアミノ酸、なおさらに特に１５〜２５個のアミノ酸を含む。
【００７０】
本発明のいずれか一つの態様の特定の実施形態において、単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、特に注射用に調合された非経口剤形として提供される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤又はアゴニスト剤は、特に注射用に調合された非経口剤形として提供される。特定の実施形態では、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーと免疫チェックポイント阻害剤又はアゴニスト剤の両方が同じ投与形態で存在する。
【００７１】
本発明の第３の態様の特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは薬剤として使用するためのものである。
【００７２】
本発明の第３の態様の特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、癌、特に結腸癌又は膵臓癌の治療又は予防に使用するためのものである。
【００７３】
本発明の第３の態様の特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは免疫調節剤としての使用、特に調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のネガティブモジュレーターとしての使用のためのものである。特定の実施形態では、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは感染症の治療に使用するためのものである。特定の実施形態において、融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染、はしか、ヘルペス及び黄熱病の治療に使用するためのものである。
【００７４】
本発明の第４の態様によれば、本発明の上記態様に記載のＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー単量体、特にＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードする核酸分子が、癌の治療又は療法における使用のために、又は免疫調節剤としての使用のために、特に感染症の治療において、提供される。核酸分子からのインビボでのオープンコンフォーマーの発現は、二量体化の後に、本発明の融合タンパク質ポリペプチドをもたらす。患者の体内でそれらをコードする核酸から薬学的に活性なポリペプチドを発現させるという概念は周知であり、患者に大きな利益を与えることができる。
【００７５】
本発明の第４の態様の代替によれば、癌の治療又は療法においての使用のための、又は免疫調節剤としての使用のための、特に感染症の治療においての使用のための、ＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマー単量体をコードする核酸が提供される。
【００７６】
本発明の第４の態様の別の代替によれば、ＨＬＡ−ＢオープンコンフォーマーがＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーではないことを条件とする、癌の治療又は療法においての使用のための、又は免疫調節剤としての使用のための、特に感染症の治療においての使用のための、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマー単量体をコードする核酸が提供される。
【００７７】
本発明の第４の態様のさらなる別の代替によれば、癌の治療又は療法においての使用のための、又は免疫調節剤としての使用のための、特に感染症の治療においての使用のための、ＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマー単量体をコードする核酸が提供される。
【００７８】
本発明の第４の態様の特定の実施形態又は任意の上述のその代替において、癌は結腸癌又は膵臓癌である。
【００７９】
特定の実施形態では、核酸分子は、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー単量体、特にペプチドエピトープ断片を含むＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー単量体、特に、細胞外ＨＬＡアルファ１、２及び３ドメインのみを含むＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＬＡオープンコンフォーマー単量体、特に細胞外ＨＬＡアルファ１、２及び３ドメインのみを含むＦｃオープンコンフォーマー単量体及びペプチドエピトープ断片をコードする。
【００８０】
特定の実施形態では、核酸分子は、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー単量体、特にアミノ酸リンカー及び／又はＦｃ（結晶化可能な断片）ドメインを含むＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードし、癌、特に結腸癌又は膵臓癌においての治療又は療法において使用される。
【００８１】
本発明の代替の態様によれば、本発明の第４の態様（及び代替の態様）に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターは、癌、特に結腸癌又は膵臓癌の治療又は療法における使用のために提供される。
【００８２】
特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーターを含むプラスミドである。プロモーターは、本発明の核酸分子に作動可能に連結される。
【００８３】
本発明の第５の態様によれば、本発明の第４の態様（及び代替の様態）に記載の核酸分子を含むウイルスは、癌、特に結腸癌又は膵臓癌の治療又は療法における使用のために、又は免疫調節剤として、特に感染症の治療における使用のために、提供される。核酸分子は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下にある。特定の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はレンチウイルスである。
【００８４】
本発明の第６の態様によれば、本発明の第４の態様（及び代替の態様）に記載の核酸分子を含むインビトロで遺伝子改変された宿主細胞が提供される。
【００８５】
本発明の別の態様は、癌、特に結腸癌又は膵臓癌の治療又は予防のための薬剤の製造において、本発明の第１及び第２の態様（及びそれらの代替）に記載の単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーホモ二量体又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーホモ二量体の使用を提供する。
【００８６】
本発明のさらなる別の態様によれば、本発明は、本発明の第１及び第２の態様（及びそれらの代替の態様）に記載のＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーを、それを必要とする患者に投与することを含む、癌、特に結腸癌又は膵臓癌の治療方法を提供する。
【００８７】
本発明の第７の態様によれば、併用薬剤が提供され、併用薬剤は：
−  本発明の上記態様又は実施形態のいずれか一つに記載の単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー、又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー、及び、
−  免疫チェックポイント調節剤であって、
○  免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）であって：
・  Ｂ７−１（ＣＤ８０）及び／又はＢ７−２（ＣＤ８６）との細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２としても知られている）相互作用の阻害剤、特に例えば抗体のようなＣＴＬＡ−４又はｃｄ８０又はｃｄ８６に対するポリペプチドリガンド、
・  プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても知られている）とそのリガンドＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４としても知られる；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ９ＮＺＱ７）及び／又はＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３としても知られる；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ９ＢＱ５１）との相互作用の阻害剤。特に、例えば抗体のような、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対するポリペプチドリガンド、及び
・  特に抗体のような、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ−３）の阻害性ポリペプチドリガンド、
から選択される前記免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）、及び
○  チェックポイントアゴニスト剤、特に、腫瘍壊死因子受容体４−１ＢＢ（ＣＤ１３７又はＴＮＦＲＳＦ９としても知られている）に結合して活性化するように選択されたチェックポイントアゴニスト抗体、
から選択される前記免疫チェックポイント調節剤、
とを含む。
【００８８】
本発明の第７の態様の代替によれば、併用薬剤内に含まれる単離されたＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー又は融合ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、ＨＬＡ−Ａオープンコンフォーマー、ＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマー（但しＨＬＡ−Ｂオープンコンフォーマーは、ＨＬＡ−Ｂ２７又はＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーでないことを条件とする）又はＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマーから選択される。
【００８９】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用の阻害剤である。
【００９０】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）；ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９）である。
【００９１】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）とその受容体ＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、臨床的に利用可能な抗体薬であるニボルマブ（ブリストル・マイヤーズ  スクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＣＡＳ番号９４６４１４−９４−４）、ペンブロリズマブ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃ．）；ＣＡＳ番号１３７４８５３−９１−４）、ピジリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０−４２−３）、アテゾリズマブ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ）；ＣＡＳ番号１３８０７２３−４４−３）、及びアベルマブ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）；ＣＡＳ番号１５３７０３２−８２−８）から選択される。
【００９２】
特定の実施形態では、免疫チェックポイントアゴニスト剤は、現在臨床試験中の４−１ＢＢに対する完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であるウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）である。
【００９３】
特定の実施形態において、チェックポイント調節剤は、抗体、抗体断片、及び抗体様分子から選択されるポリペプチドであり、そしてこのポリペプチドは、チェックポイントメディエータに対して選択的に反応性である。特定の実施形態において、チェックポイントメディエータは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ及び４−１ＢＢＬから選択される。
【００９４】
さらなる別の態様において、本発明は、組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを産生するための方法に関する。この方法を以下の項目に概要する：
項目Ａ：組換えバイオテクノロジーの方法により、ヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
ａ．発現段階：
ｉ．細胞、特に真核細胞、さらに特に哺乳類細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下でＨＬＡ重鎖の少なくともα１鎖、α２鎖及びα３鎖をコードするＨＬＡコード核酸配列、及び
ｉｉ．前記細胞（項目１のａと同じ細胞）において作動可能なプロモーター配列の制御下で、ヒトＨＬＡβ２ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ６１７６９）をコードするβ２−ミクログロブリンコード核酸配列を、哺乳動物細胞（「産生細胞株」）において同時発現させる；
ｂ．精製工程：得られたＨＬＡ−重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を哺乳動物細胞（産生細胞株）から精製し；
ｃ．解離工程：精製されたＨＬＡ−重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を適切な条件下で解離させ、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをβ２−ミクログロブリンポリペプチドから分離し；
ｄ．リフォールディング段階：分離されたＨＬＡ重鎖ポリペプチドを、リフォールディング（生理的に活性なＨＬＡオープンコンフォーマー分子に見られるそれらの天然の三次タンパク質構造へ）することを誘導する条件下でインキュベートする。
項目ＡＡ：ヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドがＢ２７重鎖でもＢ５７重鎖でもないということを条件とする項目Ａ。
項目Ｂ：項目Ａ又は項目ＡＡに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列が、コードされたポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、α１鎖、α２鎖、α３鎖と安定化配列とを含む。
項目Ｃ：項目Ｂに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、安定化配列が、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリン定常断片（Ｆｃ）、特に免疫グロブリンＧ定常断片、さらに特にＩｇＧ４Ｆｃから選択される。
項目Ｄ：上記項目のいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列及びβ２ミクログロブリンコード核酸配列が、同一の核酸ベクター分子（特に、ＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。
項目Ｅ：上記項目Ａ〜Ｃのいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列及びβ２ミクログロブリンコード核酸配列が異なる核酸ベクター分子（特に、異なるＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。
項目Ｆ：項目Ｅの方法であって、ＨＬＡコード核酸配列を含む核酸ベクターが、β２−ミクログロブリンコード核酸配列、特に約３重過剰に含む核酸ベクターに対して、約１〜５重過剰、特に１．５〜５重過剰に存在する。
項目Ｇ：前記項目のいずれかに記載の方法であって、ＨＬＡコード核酸配列が安定化配列としての免疫グロブリンＦｃ断片を含み、精製工程は、プロテインＡへ連結された表面に組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを吸着させることによって行われる。
項目Ｈ：上記項目のいずれかに記載の方法であって、解離工程は、酸性条件下、特に約ｐＨ  ２での処理により、かつ還元条件下での透析により行われる。
項目Ｉ：前記項目のいずれかに記載の方法であって、リフォールディング工程が、中性条件下での処理により行われる。
【００９５】
本明細書で特定されるＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーをより具体的に指摘すると、その方法は以下の項目に要約することができる：
項目Ａ’：組換えバイオテクノロジーの方法により、ヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドを製造する方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
ａ．発現段階：
ｉ．細胞、特に真核細胞、さらに特に哺乳動物細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下でＨＬＡ重鎖の少なくともアルファ１鎖、アルファ２鎖及びアルファ３鎖をコードするＨＬＡ重鎖コード核酸配列、及び
ｉｉ．前記細胞（項目１のａと同じ細胞）において作動可能なプロモーター配列の制御下で、ヒトＨＬＡβ２ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ６１７６９）をコードするβ２−ミクログロブリンコード核酸配列を、哺乳動物細胞（「産生細胞株」）において同時発現させる；
ｂ．精製工程：得られたＨＬＡ重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を哺乳動物細胞（産生細胞株）から精製し；
ｃ．解離工程：精製されたＨＬＡ重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を適切な条件下で解離させ、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをβ２−ミクログロブリンポリペプチドから分離し；
ｄ．リフォールディング段階：分離されたＨＬＡ重鎖ポリペプチドは、リフォールディング（生理学的に活性なＨＬＡオープンコンフォーマー分子に見られるそれらの天然の三次タンパク質構造へ）することを誘導する条件下でインキュベートする。
項目ＡＡ’：ヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドがＢ２７重鎖でもＢ５７重鎖でもないということを条件とする項目Ａ’。
項目Ｂ’：項目Ａ’又は項目ＡＡ’に記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列が、コードされたポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、アルファ１鎖、アルファ２鎖、アルファ３鎖と安定化配列とを含む。
項目Ｃ’：項目Ｂ’に記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、安定化配列が、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリン定常断片（Ｆｃ）、特に免疫グロブリンＧ定常断片、さらに特にＩｇＧ４Ｆｃから選択される。
項目Ｄ’：上記項目のいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列及びβ２ミクログロブリンコード核酸配列が同一の核酸ベクター分子（特に、ＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。
項目Ｅ’：上記項目Ａ’〜Ｃ’のいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列及びβ２−ミクログロブリンコード核酸配列が異なる核酸ベクター分子（特に、異なるＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。
項目Ｆ’：項目Ｅ’の方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列を含む核酸ベクターが、β２−ミクログロブリンコード核酸配列、特に約３重過剰に含む核酸ベクターに対して、約１〜５重過剰、特に１．５〜５倍過剰に存在する。
項目Ｇ’：前記項目のいずれかに記載の方法であって、ＨＬＡコード核酸配列が安定化配列として免疫グロブリンＦｃ断片を含み、精製工程は、プロテインＡへ連結された表面に組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを吸着させることによって行われる。
項目Ｈ’：前記項目のいずれかに記載の方法であって、解離工程は、酸性条件下、特に約ｐＨ  ２での処理により、かつ還元条件下での透析により行われる。
項目Ｉ’：前記項目のいずれかに記載の方法であって、リフォールディング工程が、中性条件下での処理により行われる。
【００９６】
単一の分離可能な特徴のそのような代替、例えば、対立遺伝子又はコード配列などは、本明細書において「実施形態」として示される箇所すべてにおいて、そのような代替は、本明細書に開示される発明の別個の実施形態を形成するために自由に組み合わせられ得る。
【００９７】
本発明は、以下の実施例及び図によりさらに説明され、これにより、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９８】
驚くべきことに、本発明者らは、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーが、それらのコントロールＭＨＣ−Ｉａヘテロ三量体よりも独特の結合又はより強い親和性で、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ及びＭＤＳＣ細胞に存在する種々の免疫調節細胞表面受容体と相互作用することを見出した。ＨＬＡクラスＩ−ａオープンコンフォーマーは、癌及び感染症の場合のように、白血球が防御免疫の発達を害する疾患を標的とするための治療薬として使用することができる。
【００９９】
さらに、本発明者らは、チェックポイント調節剤を用いた単独療法又は併用療法のアプローチとしてのＨＬＡ２−Ｆｃの注入による新規のインビボ作用様式を発見した。ＨＬＡ２−Ｆｃ療法の単独又は併用療法では、マクロファージＭ１／Ｍ２比の浸潤の増加、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、及びＭＤＳＣの減少によって決定されるとおり、多様な白血球セットの腫瘍への浸潤を調節することができる。
【０１００】
さらに本発明者らは、全身的血液分析によりＨＬＡ２−Ｆｃ療法が、ＮＫＴ細胞及びある場合にはＴｈ１細胞の増殖を増加させることを観察し、前臨床及び臨床設定における治療効果のために使用できるバイオマーカーの存在を示している。興味深いことに、本発明者らはまた、４−１ＢＢによる単独療法が動物の血液中のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇの増殖を全身的に増加させることを観察し、４−１ＢＢによる免疫系の過剰活性化の潜在的副作用を示している。ＨＬＡ２−Ｆｃ＋４−１ＢＢの多様な併用は、血中ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｔｒｅｇ、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を有意に減少させ、アゴニスト抗体による治療を受けた患者の血液上の望ましくないリンパ球の増殖の場合のポジティブな併用アプローチを示す。
【０１０１】
全体として、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーの作用様式は、特にＦｃ免疫グロブリン断片を含む融合タンパク質として存在する場合、単独、又はアンタゴニスト／アゴニスト抗体との併用のアプローチにおいて免疫調節剤として疑いなく関連性があり、かつ癌の治療におけるその翻訳のために有用であり得る。
【０１０２】
ＨＬＡオープンコンフォーマーは、癌及び感染症の場合のように、免疫調節が治療的アプローチである疾患を標的とするための治療薬として使用することができる。
【０１０３】
インビトロ試験
ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、それらのＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃコントロール対応物とは独特の結合又は異なる親和性で、多様な型の白血球に発現している免疫調節受容体に結合する。
【０１０４】
本発明者らは、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーが酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって特定の免疫調節受容体と相互作用するかどうかを決定した。結果は、ＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーがＫＩＲ３ＤＬ２、及びＰＴＰＲＪ（ＨＬＡ−Ｃ−β２ｍ−Ｆｃを除く）に対して独自に相互作用し、かつＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、及びＰｉｒｂ免疫調節受容体に対して、それらのＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃコントロール対応物とは異なる親和性を示すことを示した（図５Ａ〜Ｇ）。このデータは、それらがオープンコンフォーマーとして存在する場合、ＭＨＣ古典的対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ）（ＭＨＣ−Ｉａ）が免疫調節受容体に対して類似の結合パターンを有することを初めて示す。
【０１０５】
ＭＨＣ−ＩａオープンコンフォーマーはマウスＣＤ４＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの変換を阻止する
ｉＴｒｅｇ変換についてのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＭＨＣ−Ｉａ分子の影響を、ｉＴｒｅｇ変換に最適な培養条件でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートした、１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ２−Ｆｃ（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ及びＣ１２２−Ｆｃ）、ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃコントロール（Ａ２５−β２ｍ−Ｆｃ、Ａ３０−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ２７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５３−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５８−β２ｍ−Ｆｃ、Ｃ０８−β２ｍ−Ｆｃ及びＣ１２−β２ｍ−Ｆｃ）、アイソタイプ、及びＰＢＳで分析した。ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、ＦｏｘＰ３の誘導（図６）、つまりナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの変換を常に下方調節することを実証した。
【０１０６】
ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは白血病Ｔ細胞の増殖を阻害する。
本発明者らは、異なる腫瘍細胞株における増殖の遮断を伴うＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ及びＣ１２２−Ｆｃ）の効果を測定した。結果、ＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーは、コントロール対応物のＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ（図７）又はアイソタイプＩｇＧ４（データは提供しない）と比較して、リンパ腫Ｔ細胞株の増殖を常に調節することが示され、標的療法としてのリンパ腫の治療の潜在的適用を示している。
【０１０７】
インビボ試験
癌治療のための免疫調節治療分子としてのＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーの概念のインビボ実証は、有効な前臨床同系マウスＣ３８及びＭＣ３８−ＯＶＡ結腸癌モデル（図８及び９）を用いて、並びに膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスモデルにおいて実証された。（図１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８及び３１）。
【０１０８】
ＣＨＯ細胞におけるヒトＦｃ融合タンパク質としてのＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマーの産生
治療上の観点からの有効な戦略とは、溶解性、安定性、結合活性、半減期の増加、及び哺乳動物系での技術的観点、費用対効果の高い生産及び精製のために安定な型（Ｆｃ融合）においてＭＨＣ−Ｉａオープンコンフォーマー分子を産生することである。ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ複合体は、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ａ３０、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−Ｂ５７、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−Ｃ０８及びＨＬＡ−Ｃ１２のアルファ１、２及び３ドメインを、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクターカセット（図３Ａ）に、ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の細胞外産生に必要なヒト−β２ｍベクターと共に挿入することにより産生される（図３Ａ、Ｂ）。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞におけるトランスフェクションは、ＨＬＡ−Ｆｃベクター＋β２ｍベクターの両方を１：１の比率で用いて行った。上清を回収し、標準的な抗体精製手順（組換えタンパク質精製ハンドブック（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、原則及び方法、２００９．ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１８−１１４２−７５）を用いてＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃを精製した。ＨＬＡ−Ｆｃ遊離重鎖からのβ２ｍの分離は、ＳＥＣ（図４Ａ）又は透析法（データは示さず）により変性状態を利用し行った。リフォールディング緩衝液において希釈法を用いてＨＬＡ２−Ｆｃのリフォールディングを評価し、ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ  ｐａｇｅ）（図４Ｂ，Ｃ）又はウエスタンブロットにより分析した（データは示さず）。
【０１０９】
マウス同系結腸癌モデルにおけるＣＴＬＡ４及びＰＤ−１抗体とＨＬＡ２−Ｆｃの前臨床併用療法試験
免疫調節治療分子としてＨＬＡ２−Ｆｃ（Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ及びＣ０８２−Ｆｃ）を用いたインビボ概念実証試験は、Ｃ３８及びＭＣ３８−ＯＶＡマウス結腸癌腫モデルにおいて、単独療法として、又はマウスＣＴＬＡ４又はマウスＰＤ−１抗体との併用療法として実証された。
【０１１０】
確立された手順に従って、同系マウスの脇腹にＣ３８又はＭＣ３８−ＯＶＡ断片腫瘍を皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３（腫瘍の移植後１〜２週間）に達すると、マウスを腫瘍体積に従って区分した。Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ及びＣ０８２−Ｆｃを３日ごとに６回（Ｑ３Ｄ×６）腹腔内注射し、ＣＴＬＡ４を２回（Ｑ３Ｄ×２）、ＰＤ−１は週２回（ｂｉｗｋ×２）の４回注射した（図８Ａ）。
【０１１１】
選択されたＨＬＡ２−Ｆｃは、同種Ｃ３８及びＭＣ３８−ＯＶＡ結腸癌マウスモデル（図８及び９）において、単剤療法として（Ｃ０８２−Ｆｃ）（図８Ｄ）又はチェックポイント抗体との併用において、例えば、ＰＤ−１＋Ａ３０２−Ｆｃ（図８Ｂ）、Ｂ５８２−Ｆｃ（図８Ｃ）、Ｂ５７２−Ｆｃ（図９Ｂ）及びＣＴＬＡ４＋Ｂ２７２−Ｆｃ（図９Ａ）などのどちらかとして、抗腫瘍反応を相乗及び増強することができる。
【０１１２】
マウス同系膵臓癌モデルの大腫瘍におけるＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体とのＨＬＡ２−Ｆｃの前臨床併用療法試験
膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスモデルについては、確立された手順に従ってＰａｎ０２細胞を同系マウスの右側腹部にそれぞれ１×１０５で注射した。腫瘍が３００ｍｍ３に達したら（細胞注射後約３週間）、マウスをそれらの腫瘍体積に従って統計的に分布させた。大きな腫瘍は小さな腫瘍よりも処置が困難であるが、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のさらなる分析には有用であることを言及する。さらに、大きな腫瘍は、免疫調節剤による介入が患者の大きなサイズの腫瘍において行われる臨床的設定により近い。
【０１１３】
膵臓（Ｐａｎ０２）データは、ＰＤ−１抗体とのＨＬＡ２−Ｆｃの併用が、Ａ２５２−Ｆｃ（図１０Ａ〜Ｂ）、Ｂ２７２−Ｆｃ（図１６Ａ〜Ｂ）、Ｃ０８２−Ｆｃ（図２８Ａ〜Ｂ）及びＣ１２２−Ｆｃ（図３１Ａ〜Ｂ）との併用において、大きなＰａｎ０２腫瘍を有意に減らすことができることを示したのに対し、ＰＤ−１単独療法は治療効果を示さなかった。ＰＤ−１との他のＨＬＡ２−Ｆｃの併用は統計的有意性を示さなかったが、％Δ腫瘍阻害がＢ５７２−Ｆｃの併用において観察された（図２２）。さらに、４−１ＢＢ抗体とＨＬＡ２−Ｆｃの併用療法は、腫瘍サイズを有意に減少させることが実証され、又はいくつかのＨＬＡ２−Ｆｃ併用療法（Ａ３０２−Ｆｃ及びＣ０８２−Ｆｃを除く）はアイソタイプと比較した場合、実証された。最も著しい腫瘍縮小（ｐ＜０．０１）は、Ｂ５３２−Ｆｃ（図１９Ａ〜Ｂ）、Ｂ５７２−Ｆｃ（図２２Ａ〜Ｂ）、及びＢ５８２−Ｆｃ（図２５Ａ〜Ｂ）で観察された。４−１ＢＢ単独療法は、アイソタイプコントロールと比較した場合、有意差はなかった。Ｃ０８２−Ｆｃによる単独療法（図２８Ａ−Ｂ）は、アイソタイプと比較して有意な腫瘍の減少を示した（ｐ＜０．０１）。
【０１１４】
膵臓（Ｐａｎ０２）マウスの腫瘍免疫構成は、Ａ２５２−Ｆｃ（図１１Ａ〜Ｃ）、Ａ３０２−Ｆｃ（１４Ａ〜Ｃ）、Ｂ２７２−Ｆｃ（１７Ａ〜Ｃ）、Ｂ５３２−Ｆｃ（２０Ａ〜Ｃ）、Ｂ５７２−Ｆｃ（２３Ａ〜Ｃ）、Ｂ５８２−Ｆｃ（２６Ａ〜Ｃ）、Ｃ０８２−Ｆｃ（２９Ａ〜Ｃ及びＣ１２２−Ｆｃ（３２Ａ〜Ｃ）において観察されるとおり、多様な各ＨＬＡ２−Ｆｃを用いて、マクロファージＭ１／Ｍ２比の浸潤、増加したＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＭＤＳＣの減少で観察されるように、多様な組の腫瘍浸潤白血球に対するＨＬＡ２−Ｆｃ療法の影響を示した。血液由来の白血球の全身分析は、いくつかの場合、Ａ２５２−Ｆｃ（図１２Ａ〜Ｃ）、Ａ３０２−Ｆｃ（１５Ａ〜Ｃ）、Ｂ２７２−Ｆｃ（１８Ａ〜Ｃ）、Ｂ５３２−Ｆｃ（２１Ａ〜Ｃ）、Ｂ５７２−Ｆｃ（２４Ａ〜Ｃ）、Ｂ５８２−Ｆｃ（２７Ａ〜Ｃ）、Ｃ０８２−Ｆｃ（３０Ａ〜Ｃ）、及びＣ１２２−Ｆｃ（３３Ａ〜Ｃ）について、ＮＫＴ細胞及びＴｈ１細胞におけるそれらのコントロール単剤療法対応物と比較した場合、ほんのわずかしか変化を示さなかった。
【０１１５】
結論
本発明は、β２ｍを有さない重鎖（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃオープンコンフォーマー及びそれらの対応するＨＬＡ２−Ｆｃ融合タンパク質）として産生される場合の古典的なＭＨＣ−Ｉａ分子のファミリーが、それらのコントロールＨＬＡ−β２ｍ対応物とは異なる免疫調節特性を有することを初めて実証する。非限定的な例として、ＨＬＡ対立遺伝子の多様なセットを使用して、本発明者らは、オープンコンフォーマーとして存在する場合は常にＭＨＣ−Ｉａ分子が腫瘍微小環境及び血中に存在する白血球の調節によって実証されるとおりの独特な特性を有する免疫調節剤であることを実証するデータを提供する。さらに、その使用は調節剤だけでなく、結腸癌及び膵臓癌の前臨床癌マウスモデルにおいて単独療法として又はチェックポイント阻害剤抗体（例えばＣＴＬＡ４及びＰＤ−１）及びチェックポイントアゴニスト抗体（例えば４−１ＢＢ）との併用療法として実証されるような癌治療用の治療薬としての使用にも用いられる。
【０１１６】
多様な白血球（例えばＮＫ、ＮＫＴ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ及びＭＤＳＣ）に分布する、多様な免疫調節受容体（ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＬ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＴＰＲＪ、及びＰｉｒｂ）とＨＬＡ２−Ｆｃとの相互作用は、該分子のマルチタスク性がＨＬＡオープンコンフォーマーを用いて免疫系を調節する新しい方法を切り開くことを実証する。
【０１１７】
さらに、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子は、インビトロでナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの変換を遮断することが実証されており、作動様式は、ＨＬＡ２−ＦｃがｉＴｒｅｇの分化及び機能に影響を及ぼす免疫調節分子として作用することであることが指摘されている。標的ｉＴｒｅｇは、感染症や癌などの多様な治療的表示のためのひとつの戦略である。
【０１１８】
全体として、アンタゴニスト／アゴニスト抗体を用いた併用のアプローチとしてのＨＬＡ２−Ｆｃの作用様式は、癌の治療において疑いなく関連性があり、癌免疫療法における現在の臨床的必要性と相関する。
【０１１９】
ＨＬＡ２−Ｆｃ分子は、新規クラスの免疫調節薬として出現している。インビトロ及びインビボのデータは、ＨＬＡ２−Ｆｃ分子が抗腫瘍免疫の活性化のためのスイッチオンメカニズムとして作用するというメカニズムを示している。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、多様な免疫調節受容体とのＨＬＡ２−Ｆｃオープンコンフォーマーの相互作用は、ＮＫ、Ｔ細胞、マクロファージ及びＭＤＳＣに存在し、かつＴｒｅｇの機能的調節が相乗的に関与し、免疫応答を悪化させると仮定する。
【０１２０】
材料及び方法
細胞株
Ｃ３８及びＭＣ３８−ＯＶＡ結腸癌マウス細胞株を用いてインビボ実験を行った。
【０１２１】
使用されたインビトロ実験細胞株は：ＥＬ４、マウスＴ細胞リンパ腫；ＥＧ．７、マウスＴ細胞リンパ腫；Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＴ細胞リンパ腫；Ｌ４２８、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ５４０、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ１２３６、ヒトホジキンリンパ腫；Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞リンパ腫；ＩＭＲ−５、神経芽細胞腫；ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、神経芽細胞腫；及びＭ１３０４２８、メラノーマである。
【０１２２】
抗体
ｉＴｒｅｇ変換実験のためのリンパ球集団は：ＣＤ４（ＦＩＴＣ−ＢＤ  バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＦｏｘＰ３＋（ｅｆｌｕｏｒ  ４５０−  ｅバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＣＤ３（ＰＥ−Ｃｙ７−  ｅバイオサイエンス）、ＣＤ４５（ＰｅｒＣＰ−  ｅバイオサイエンス）で染色した。
【０１２３】
腫瘍浸潤リンパ球の分析は以下の抗体を用いて実施した：ＣＤ４５（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、クローン３０−Ｆ１１）；ＣＤ３（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、クローン１４５−２Ｃ１１）；ＣＤ４（バイオレジェンド、クローンＧＫ１．５）；ＣＤ８（ＢＤバイオサイエンス、クローン５３−６．７）、ＣＤ２５（バイオレジェンド、クローンＰＣ６１）、ＦｏｘＰ３（イーバイオサイエンス、クローンＦＪＫ−１６ｓ）、ＣＤ３３５（バイオレジェンド、クローン２９Ａ１．４）、Ｆ４／８０（バイオレジェンド、クローンＢＭ８）、ＣＤ１１ｂ（バイオレジェンド、クローンＭ１／７０）、Ｇｒ−１（ＢＤバイオサイエンス、クローンＲＢ６−８Ｃ５）、ＭＨＣＩＩ  ＩＡ／ＩＥ（ＢＤバイオサイエンス、クローン２Ｇ９）、ＣＤ２０６（バイオレジェンド、クローンＣ０６８Ｃ２）及びＬ／Ｄ染色（イーバイオサイエンス）。
【０１２４】
血液白血球の分析は以下の抗体を用いて実施した：ＣＤ４５（バイオレジェンド、クローン３０−Ｆ１１）；ＣＤ３（ＢＤバイオサイエンス、クローン１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（バイオレジェンド、クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８（ＢＤバイオサイエンス、クローンＦＪＫ−１６ｓ）、ＦｏｘＰ３（ｅバイオサイエンス、クローンＦＪＫ−１６ｓ）、Ｔ−Ｂｅｔ（ＢＤバイオサイエンス、クローン４Ｂ１０）、ＣＤ３３５（バイオレジェンド、クローン２９Ａ１．４）、Ｆ４／８０（バイオレジェンド、クローンＢＭ８）、ＣＤ１１５（バイオレジェンド、クローンＭ１／７０）、ＣＤ１１ｂ（バイオレジェンド、クローンＭ１／７０）、Ｌｙ６Ｇ（バイオレジェンド、クローン１Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ（バイオレジェンド、クローンＨＫ１．４）及びＬ／Ｄ染色（ｅバイオサイエンス）。
【０１２５】
チェックポイント阻害抗体ＣＴＬＡ４クローン９Ｈ１０、ＰＤ−１クローンＲＭＰ１−１４、及びアゴニスト抗体４−１ＢＢクローン３Ｈ３は、バイオエックスセル社（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏ．）から入手した。
【０１２６】
ＭＨＣ−Ｉａ対立遺伝子のβ２ｍ遊離重鎖へ結合するＨＣ１０  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ａ）は、Ｈｉｄｄｅ  Ｐｌｏｅｇｈ博士（マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）、マサチューセッツ州）からの贈与であった。
【０１２７】
ＨＬＡ２−Ｆｃの生産、精製及びリフォールディング
ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ（Ａ２５−β２ｍ−Ｆｃ、Ａ３０−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ２７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５３−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５８−β２ｍ−Ｆｃ、Ｃ０８−β２ｍ−Ｆｃ及びＣ１２−β２ｍ−Ｆｃ）の組換え生産は、ＨＬＡのアルファ１、２及び３ドメインをヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクター（インビボゲン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ））に挿入し、そしてヒトβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）を別のベクターに挿入することによって達成した。組換えＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃの産生は、ＨＬＡ−Ｆｃ−ベクターとβ２ｍ−ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へ同時トランスフェクションすることによって行った。ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃの生産はＥｖｉｔｒｉａ  ＡＧに外部委託した。
【０１２８】
ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ構築物の精製は、抗体精製のための従来の手順を用いて実施した。ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ複合体からβ２ｍを除去するための変性工程を追加して、ＨＬＡ２−Ｆｃの産生を行った。
【０１２９】
簡潔には、ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の捕捉ステップは、上清をプロテインＧカラム（アマシャム  ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に流した後に行った（５ｍＬ／分）。中間精製工程は、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン、ｐＨ  ２．０）を用いてプロテインＧ−カラムから選択されたＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃを溶出し、そして８Ｍの尿素、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０において画分を回収することにより実施した。第一の精製工程は、ＡＫＴＡシステム（ＧＥ  ライフサイエンス）を使用してスーパーデックス２００プレップグレード又はセファクリルＳ−１００ＨＲ（ＧＥ  ライフサイエンス（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ））を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、又は５０ＫＤａの細孔サイズ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））の膜を使用した透析のどちらかによりＨＬＡ−Ｆｃ単量体画分をβ２ｍから分離することであった。両方の手順から回収したＨＬＡ−Ｆｃ単量体を、１００倍体積のリフォールディング緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５、５００ｍＭのＬ−アルギニン、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５ｍＭのＮａＣｌ、１％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）中、それぞれ８時間間隔で３回、ＨＬＡ−Ｆｃ単量体を振動させた後、希釈法によりリフォールディングした。ＳＥＣによる第二の精製工程では、さらなる不純物を除去し、そしてＨＬＡ２−Ｆｃタンパク質の新たに回収された画分を希釈緩衝液（ＰＢＳ、１％シスクロース及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）にバッファー交換することを行った。ＨＬＡ２−Ｆｃタンパク質（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ２５２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆ、Ｃ１２２−Ｆｃ）の精製溶液を、０．２μｍ膜（ミリポア）を用いて濾過滅菌した。
【０１３０】
画分ＨＬＡ−β２ｍ−Ｆｃ複合体及びＨＬＡ２−Ｆｃを、勾配４〜２０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＨＣ１０（ＨＬＡ遊離重鎖に特異的）抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。β２ｍウエスタンブロットを、変性条件（１０ｍＭ  ＤＴＴ）の有無にかかわらず実施した（データは示さず）。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
競合ＥＬＩＳＡアッセイは、クリエイティブバイオマート（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ）から購入した１０μｇ／ｍＬの選択された白血球受容体（ヒトＫＩＲ３ＤＬ１、ヒトＫＩＲ３ＤＬ２、ヒトＫＩＲ３ＤＬ３、ヒトＬＩＬＲＢ１、ヒトＬＩＬＲＢ２、ヒトＰＴＰＲＪ及びマウスＰｉｒｂ）で被覆したマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、スイス）９６ウェルプレートを用いて行った。受容体を４℃で終夜インキュベートし、５％粉乳−ＴＢＳで２時間ブロックした。ＨＬＡ２−Ｆｃ選択された構築物（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆ及びＣ１２２−Ｆｃ）及びそれらのコントロール（Ａ２５−β２ｍ−Ｆｃ、Ａ３０−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ２７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５３−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５８−β２ｍ−Ｆｃ、Ｃ０８−β２ｍ−Ｆｃ及びＣ１２−β２ｍ−Ｆｃ）、並びにアイソタイプＩｇＧ４を１０μｇ／ｍＬ、室温にて２時間で添加した。ヒトＦｃに対するＨＲＰ結合抗体を検出器として使用した。
【０１３２】
白血球のフローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ  ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  バイオサイエンス）を用いて行い、データはＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．４を用いて分析した。
【０１３３】
Ｔｒｅｇの生成
マウスＣＤ４＋Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３の発現を誘導するために、Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞から脾臓細胞を採取し、そして精製して（マウスナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット  イージーセプ（Ｅａｓｙ  Ｓｅｐ））ＣＤ４＋Ｔナイーブ細胞を得た。次いで、細胞を、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂ（ｅバイオサイエンス）、可溶性２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８ｍＡｂ（バイオレジェンド）、１０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄシステム）及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄシステム）で被膜された９６ウェルプレートにおいて１０５細胞／２００μＬ／ウェルで９６時間培養した。
【０１３４】
ＨＬＡ２−Ｆｃ存在下でのｉＴｒｅｇ変換
ｉＴｒｅｇ変換に最適な培養条件のマウスナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、用量濃度（５μｇ／２００μＬ）のＨＬＡ２−Ｆｃ（Ａ２５２−Ｆｃ、Ａ３０２−Ｆｃ、Ｂ２７２−Ｆｃ、Ｂ５３２−Ｆｃ、Ｂ５７２−Ｆｃ、Ｂ５８２−Ｆｃ、Ｃ０８２−Ｆｃ及びＣ１２２−Ｆｃ）、コントロール（Ａ２５−β２ｍ−Ｆｃ、Ａ３０−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ２７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５３−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ５８−β２ｍ−Ｆｃ、Ｃ０８−β２ｍ−Ｆｃ及びＣ１２−β２ｍ−Ｆｃ）、アイソタイプＩｇＧ４、分化因子を含まない培地及びＰＢＳの存在下で７２時間インキュベートした。ｉＴｒｅｇ変換はフローサイトメトリーにより測定した。
【０１３５】
増殖アッセイ
細胞を１日間、異なる濃度（２５、１０、及び５μｇ／ウェル）の試薬を添加した後、５×１０５細胞／ウェルの密度で円形９６ウェルプレートに播種した。マニュアルの指示（細胞増殖キットＩＩ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って、ＸＴＴ増殖アッセイを実施した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて４５０ｎｍでのウェルの吸光度で結果を得た。
【０１３６】
インビボ治療
Ｃ３８又はＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍断片を６週目に同系雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射した。Ｐａｎ０２細胞株を６週目に同系マウスＣ５７ＢＬ／６の右脇腹に１×１０５で注射した。それらの個々の腫瘍体積サイズに従い区分し、そしてそれらの間に統計的差異を示さない群に分けた。Ｃ３８及びＭＣ３８−ＯＶＡについては、腫瘍が±６０ｍｍ３に達したときに実験的治療を開始した。膵臓Ｐａｎ０２については、実験治療は３００ｍｍ３の大きさの腫瘍において開始した。キャリパーを用いて腫瘍直径を測定し、式Ｄ／２×ｄ２に従って体積を計算した。ここで、Ｄ及びｄはそれぞれｍｍ単位の腫瘍の最長及び最短直径である。
【０１３７】
物質注入の実験計画は、結腸（Ｃ３８及びＭＣ３８）について以下のように確立された：ビヒクル（ＰＢＳ  ２００μＬ）Ｑ３Ｄ×６；アイソタイプ（１０ｍｇ／Ｋｇ）Ｑ３Ｄ×６；ＨＬＡ２−Ｆｃ（１０ｍｇ／Ｋｇ）Ｑ３Ｄ×６；抗ＣＴＬＡ４  Ｑ３Ｄ×２（１回目の注入１００μｇ及び２回目の注入５０μｇ）；ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×２（２００μｇ）；ＨＬＡ２−Ｆｃ＋ＣＴＬＡ−４（それぞれＱ３Ｄ×６及びＱ３Ｄ×２）；ＨＬＡ２−Ｆ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄ×６及びｂｉｗｋ×２）。膵臓（ＰａｎＯ２）については、物質注入の実験計画は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＨＬＡ２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＰＤ−１（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；４−１ＢＢ（１ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×２；ＨＬＡ２−Ｆｃ＋ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×２；及びＨＬＡ２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ  ｂｉｗｋ×２。
【０１３８】
％Δ阻害は、ΔＴ／ΔＣ腫瘍成長率から計算され、これはコントロールと比較し、治療開始時（例えば３００ｍｍ３）から治療終了時体積（例えば１０００ｍｍ３）までの腫瘍の成長を％単位で以下の式を用いて表す：平均％Δ阻害＝（平均（Ｃ）−平均（Ｃ０））−（平均（Ｔ）−平均（Ｔ０））／（平均（Ｃ）−平均（Ｃ０））*１００％。Ｔ＝治療群の値、Ｔ０−治療群の初期値、Ｃ−コントロール群の値、Ｃ０−コントロール群の初期値。
【０１３９】
腫瘍浸潤リンパ球の分析には、以下のゲーティング戦略が使用された：全白血球に対してＣＤ４５＋；全Ｔ細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋；ＣＤ４Ｔヘルパー細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４＋；ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ８＋；Ｔｒｅｇ細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＦｏｘＰ３＋  ＣＤ２５＋；ＭＤＳＣに対してＣＤ４５＋  ＣＤ３−  ＣＤ１１＋  Ｇｒ−１＋；マクロファージに対してＣＤ４５＋  ＣＤ３−  ＣＤ１１＋  Ｆ４／８０＋；Ｍ１型マクロファージに対してＣＤ４５＋  ＣＤ３−  ＣＤ１１＋  Ｆ４／８０＋  ＭＨＣＩＩ＋；Ｍ２型マクロファージに対してＣＤ４５＋  ＣＤ３−  ＣＤ１１＋  Ｆ４／８０＋  ＣＤ２０６＋；ＮＫ細胞に対してＣＤ４５＋  Ｇｒ−１−  Ｆ４／８０−  ＣＤ３３５＋；及びＮＫＴ細胞に対してＣＤ４５＋  Ｇｒ−１−  Ｆ４／８０−  ＣＤ３３５＋  ＣＤ３＋。
【０１４０】
血液白血球の分析には、以下のゲーティング戦略が使用された：全白血球に対してＣＤ４５＋；Ｔ細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋；Ｔヘルパー細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４＋；ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ８＋；Ｔｒｅｇ細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＦｏｘＰ３＋；Ｔｈ１細胞に対してＣＤ４５＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  Ｔ−Ｂｅｔ＋；Ｇ−ＭＤＳＣ及びＭ−ＭＤＳＣに対してＣＤ４５＋  ＣＤ３−  ＣＤ１１＋  Ｌｙ６Ｃ＋  Ｌｙ６Ｇ＋；ＮＫ細胞に対してＣＤ４５＋  Ｌｙ６Ｃ−  Ｌｙ６Ｇ−  ＣＤ３３５＋；及びＮＫＴ細胞に対してＣＤ４５＋  Ｌｙ６Ｃ−  Ｌｙ６Ｇ−  ＣＤ３３５＋  ＣＤ３＋。
【０１４１】
フローサイトメトリー用の腫瘍及び血液試料の調製は、ｅバイオサイエンス（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／ｐｄｆ／ｂｅｓｔ−ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｃｅｌｌ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ−ｆｏｒ−ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ｐｄｆ、２０１７年２月２１日にアクセス）によって記載されている手順を使用して行った。
【０１４２】
【表１】
2019531707.tif 000002
【０１４３】
【表２】
2019531707.tif 000003
2019531707.tif 000004
【図１】
2019531707.tif 000005
【図２】
2019531707.tif 000006
【図３ＡＢ】
2019531707.tif 000007
【図４ＡＢＣ】
2019531707.tif 000008
【図５ＡＢＣＤ】
2019531707.tif 000009
【図５ＥＦＧ】
2019531707.tif 000010
【図６Ａ】
2019531707.tif 000011
【図６Ｂ】
2019531707.tif 000012
【図７ＡＢ】
2019531707.tif 000013
【図７ＣＤ】
2019531707.tif 000014
【図７Ｅ】
2019531707.tif 000015
【図８ＡＢＣＤ】
2019531707.tif 000016
【図９ＡＢ】
2019531707.tif 000017
【図１０ＡＢ】
2019531707.tif 000018
【図１１ＡＢＣ】
2019531707.tif 000019
【図１２ＡＢＣ】
2019531707.tif 000020
【図１３ＡＢ】
2019531707.tif 000021
【図１４ＡＢＣ】
2019531707.tif 000022
【図１５ＡＢＣ】
2019531707.tif 000023
【図１６ＡＢ】
2019531707.tif 000024
【図１７ＡＢＣ】
2019531707.tif 000025
【図１８ＡＢＣ】
2019531707.tif 000026
【図１９ＡＢ】
2019531707.tif 000027
【図２０ＡＢＣ】
2019531707.tif 000028
【図２１ＡＢＣ】
2019531707.tif 000029
【図２２ＡＢ】
2019531707.tif 000030
【図２３ＡＢＣ】
2019531707.tif 000031
【図２４ＡＢＣ】
2019531707.tif 000032
【図２５ＡＢ】
2019531707.tif 000033
【図２６ＡＢＣ】
2019531707.tif 000034
【図２７ＡＢＣ】
2019531707.tif 000035
【図２８ＡＢ】
2019531707.tif 000036
【図２９ＡＢＣ】
2019531707.tif 000037
【図３０ＡＢＣ】
2019531707.tif 000038
【図３１ＡＢ】
2019531707.tif 000039
【図３２ＡＢＣ】
2019531707.tif 000040
【図３３ＡＢＣ】
2019531707.tif 000041
【配列表】
2019531707000001.app
【国際調査報告】
2019531707.tif 000042
2019531707.tif 000043
2019531707.tif 000044
2019531707.tif 000045
2019531707.tif 000046