(57)【要約】  本開示は、細菌の保存のための方法および組成物を提供する。
2019532665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を含む組成物。
【請求項２】
凍結防止剤が糖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
糖が二糖である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
二糖がスクロースである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
スクロースが、６．０％〜１０．０％の濃度である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
スクロースが、７．０％〜８．０％の濃度である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
二糖がトレハロースである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
トレハロースが、６．０％〜１０．０％の濃度である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
トレハロースが、７．０％〜８．０％の濃度である、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
栄養素が、酵母エキス、ルリア−ベルターニブロス、または植物ペプトンである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
栄養素が酵母エキスである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
酵母エキスの濃度が、０．５％〜２．０％である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
抗酸化剤が、イヌリン、リボフラビン、またはシステインである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
抗酸化剤がシステインである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
システインの濃度が、０．０１％〜０．５％である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
緩衝液が、ヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
緩衝液が、ヒスチジン緩衝液である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
緩衝液が、約ｐＨ７．０である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
緩衝液が、１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物が還元されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物が、トレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
組成物が、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
組成物が、スクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
組成物が、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が、賦形剤をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
賦形剤が安定化剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
安定化剤が還元剤である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
還元剤がメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
メタ重亜硫酸ナトリウムの濃度が、０．０５％である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物が、細菌をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
細菌が嫌気性細菌である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
嫌気性細菌が偏性嫌気性細菌である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
細菌が、クロストリジウム網に属する１種以上の細菌株を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
細菌が、クロストリジウム科に属する１種以上の細菌株を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
細菌が、クロストリジウム属に属する１種以上の細菌株を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
細菌が、Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus torques、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.からなる群から選択される１種以上の細菌株を含む、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
１種以上の細菌株が、配列番号１〜８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
組成物が、組成物１ｍＬ当たり少なくとも１×１０８コロニー形成単位の細菌を含む、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
組成物が安定化組成物である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
安定化組成物が、ある期間にわたって、細菌のコロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または最大１００％の回収を可能にする組成物である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
期間が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
安定化組成物が、特定の事象の後、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または最大１００％の回収を可能にする、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
特定の事象が、１回以上の凍結融解サイクルまたは凍結乾燥サイクルである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
細菌を保存するための方法であって、方法が、
細菌を、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の組成物に添加すること；および
細菌を含む組成物を、凍結乾燥サイクルに供すること、
を含む、前記方法。
【請求項４５】
凍結乾燥サイクルが、温度勾配速度が０．５℃／分〜３℃／分である１つ以上のステップを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
温度勾配速度が１℃／分である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
温度勾配速度が２．５℃／分である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
細菌を、組成物に添加する前に、感度アッセイにおいて評価することをさらに含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
感度アッセイが、グラム染色または凍結融解アッセイである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４８または４９に記載の方法であって、細菌が感受性であると評価された場合に、
（ｉ）賦形剤を組成物に添加する；および／または
（ｉｉ）凍結乾燥サイクルが、温度勾配速度が２．５℃／分の１つ以上のステップを含む、
前記方法。
【請求項５１】
賦形剤が安定化剤である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
安定化剤が還元剤である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
還元剤がメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
メタ重亜硫酸ナトリウムの濃度が、０．０５％である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供した後に、コロニー形成単位の数を測定することをさらに含む、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
方法が、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供する前に、コロニー形成単位の数を測定することをさらに含む、請求項４４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
方法が、
細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供する前のコロニー形成単位の数と、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供した後のコロニー形成単位の数を比較すること、および
細菌の保存レベルを決定すること、
をさらに含む、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項５８】
方法が、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大１００％の保存をもたらす、請求項４４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物を生成する方法であって、方法が、
凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を組み合わせて混合物を作製すること；および
混合物を還元し、それによって組成物を生成すること、
を含む、前記方法。
【請求項６０】
賦形剤を混合物に添加することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
賦形剤が安定化剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
安定化剤が還元剤である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
還元剤がメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
細菌を混合物に添加することをさらに含む、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
細菌が偏性嫌気性細菌である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
細菌が、クロストリジウム網に属する１種以上の細菌株を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
細菌が、クロストリジウム科に属する１種以上の細菌株を含む、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
細菌が、クロストリジウム属に属する１種以上の細菌株を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
細菌が、Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus torques、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.からなる群から選択される１種以上の細菌株を含む、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細菌が、配列番号１〜８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む１つ以上の細菌株を含む、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
細菌を混合物に添加する前に、細菌を感度アッセイで評価することをさらに含む、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
感度アッセイが、グラム染色または凍結融解アッセイである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
細菌が感受性であると評価された場合、賦形剤が混合物に添加される、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む、組成物。
【請求項７５】
７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む、組成物。
【請求項７６】
７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびクロストリジウム網に属する１種以上の細菌株を含む、組成物。
【請求項７７】
７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびクロストリジウム網に属する１種以上の細菌株を含む、組成物。
【請求項７８】
７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびクロストリジウム網に属する１種以上の細菌株を含む、組成物。
【請求項７９】
７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびクロストリジウム網に属する１種以上の細菌株を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C § 119(e)の下で、２０１６年１０月２８日に出願された米国特許仮出願第62/414489号の利益を主張する；これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、細菌を保存するための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト腸マイクロバイオームは多数の微生物を含む。これらの微生物の多くは嫌気性細菌である。ヒト腸マイクロバイオームに由来する嫌気性細菌を含む組成物は、ヒト疾患の処置において可能性を示している（例えば、Atarashi et al., Nature 500, 232, 2013；Atarashi et al., Cell 163, 1, 2015; Mathewson et al., Nature Immunology 17, 505, 2016を参照）。嫌気性細菌は、それらの酸素に対する感受性のため、保存が困難である。したがって、嫌気性細菌を保存するための改良された組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提供されるのは、細菌を保存するための組成物および方法である。細菌は、治療量の細菌を含む細菌の長期保存を可能にする凍結乾燥（フリーズドライ）により、保存することができる。一側面において、本開示は、細菌組成物の凍結乾燥方法を提供する。一側面において、本開示は、嫌気性細菌株の凍結乾燥を可能にする組成物を提供する。本開示より前には、かかる細菌株を含む組成物は、凍結乾燥によってそれらの生存能力の全部または大部分を失い、かかる細菌株を治療用途に十分な量で保存する選択肢を著しく妨げていた。本明細書に提供される組成物および方法は、凍結乾燥による細菌株の保存を初めて可能にする。本明細書に開示される組成物は、特定の凍結防止剤、栄養素、および／または賦形剤の組み合わせによって、その望ましい保存特性を有すると考えられている。それに加えてまたはその代わりに、温度勾配速度などの凍結乾燥サイクルもまた、本明細書に記載の組成物および方法の有益な保存特性に寄与し得る。
【０００５】
本明細書で提供されるのは、細菌を保存するための組成物および方法である。一側面において、本開示は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を含む組成物を提供する。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、凍結防止剤は糖である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、糖は二糖である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、二糖はスクロースである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、スクロースは、６．０％〜１０．０％のスクロース濃度である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、スクロースは、７．０％〜８．０％の濃度である。
【０００６】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、二糖はトレハロースである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、トレハロースは、６．０％〜１０．０％の濃度である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、トレハロースは、７．０％〜８．０％の濃度である。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、栄養素は、酵母エキス、ルリア−ベルターニブロス、または植物ペプトンである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、栄養素は酵母エキスである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、酵母エキスの濃度は、０．５％〜２．０％である。
【０００７】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、抗酸化剤は、イヌリン、リボフラビン、またはシステインである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、抗酸化剤はシステインである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、システインの濃度は、０．０１％〜０．５％である。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液は、ヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液はヒスチジン緩衝液である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液はｐＨ約７．０である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液は、１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度である。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、還元されている。
【０００８】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、トレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、スクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。
本明細書に記載の組成物のいずれも、賦形剤をさらに含み得る。いくつかの態様において、賦形剤は安定化剤である。いくつかの態様において、安定化剤は還元剤である。いくつかの態様において、還元剤はメタ重亜硫酸ナトリウムである。いくつかの態様において、メタ重亜硫酸ナトリウムは、０．０５％である。
【０００９】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、トレハロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、スクロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、１つ以上の科、網、属および／または種の細菌を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は嫌気性細菌である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、嫌気性細菌は、偏性嫌気性細菌である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、嫌気性細菌は、通性嫌気性細菌である。
【００１０】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム網に属する１以上の細菌株を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム科に属する１以上の細菌株を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属に属する１以上の細菌株を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus torques、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.からなる群から選択される１以上の細菌株を含む。いくつかの態様において、１つ以上の細菌株は、配列番号１〜８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、組成物１ｍＬ当たり少なくとも１×１０８コロニー形成単位の細菌を含む。
【００１１】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は安定化組成物である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、安定化組成物は、ある期間にわたって、細菌のコロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または最大１００％の回収を可能にする。いくつかの態様において、期間は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、安定化組成物は、特定の事象の後、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または最大１００％の回収を可能にする。いくつかの態様において、特定の事象は、１以上の凍結融解サイクルまたは凍結乾燥サイクルである。
【００１２】
一側面において、本開示は、細菌を保存するための方法を提供する。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、細菌を前述の請求項のいずれかに記載の組成物に添加すること、および細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供することを含む。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、０．５℃／分から３℃／分の間の温度勾配速度の１つ以上のステップを含む。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、２．５℃／分の温度勾配速度の１つ以上のステップを含む。いくつかの態様において、組成物は、細菌を組成物に添加する前に、細菌を感度アッセイで評価することをさらに含む。いくつかの態様において、感度アッセイは、グラム染色または凍結融解アッセイである。いくつかの態様において、細菌が感受性であると評価される場合、（ｉ）賦形剤が組成物に添加される；および／または（ｉｉ）凍結乾燥サイクルが、２．５℃／分の温度勾配速度の１つ以上のステップを含む。いくつかの態様において、賦形剤は安定化剤である。いくつかの態様において、安定化剤は還元剤である。いくつかの態様において、還元剤はメタ重亜硫酸ナトリウムである。いくつかの態様において、メタ重亜硫酸ナトリウムは０．０５％である。
【００１３】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法はさらに、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供した後に、コロニー形成単位の数を測定することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法はさらに、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供する前に、コロニー形成単位の数を測定することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法はさらに、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供する前のコロニー形成単位の数と、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供した後のコロニー形成単位の数を比較すること、および、保存のレベルを決定することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大１００％の保存をもたらす。
【００１４】
一側面において、本開示は、本明細書で提供される組成物を生成するための方法を提供する。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を組み合わせることによって混合物を作り出すこと、混合物を還元し、それによって組成物を生成することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、賦形剤を混合物に添加することをさらに含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、賦形剤は安定化剤である。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、安定化剤は還元剤である。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、還元剤はメタ重亜硫酸ナトリウムである。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、細菌を混合物に添加することをさらに含む。
【００１５】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌は偏性嫌気性細菌である。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム網に属する１つ以上の細菌株を含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム科に属する１つ以上の細菌株を含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウム属に属する１つ以上の細菌株を含む。
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌は、Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus torques、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.からなる群から選択される１つ以上の細菌株を含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌は、配列番号１〜８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む１つ以上の細菌株を含む。
【００１６】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法はさらに、細菌を混合物に添加する前に、細菌を感度アッセイで評価することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、感度アッセイは、グラム染色または凍結融解アッセイである。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、細菌が感受性であると評価される場合、賦形剤が混合物に添加される。
一側面において、本開示は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む組成物を提供する。一側面において、本開示は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む組成物を提供する。
【００１７】
一側面において、本開示は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびクロストリジウム網に属する１つ以上の細菌株を含む組成物を提供する。一側面において、本開示は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびクロストリジウム網に属する１つ以上の細菌株を含む組成物を提供する。一側面において、本開示は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびクロストリジウム網に属する１つ以上の細菌株を含む組成物を提供する。一側面において、本開示は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびクロストリジウム網に属する１つ以上の細菌株を含む組成物を提供する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の側面、ならびにその様々な態様は、本発明の図面および詳細な説明を参照することで、より明らかになるであろう。
本発明の各限定は、本発明の様々な態様を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の各限定は、本発明の各側面に含まれ得ることが想定される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載されているかまたは図面に示されている構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付の図面は、一定の縮尺で描かれることを意図されていない。図面は例示的なものにすぎず、本開示を可能にするために必要なものではない。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面でラベル付けされているとは限らない。図面において：
【図１】図１は、実施例に記載の例示実験の概略図を示す。
【図２】図２は、例１に記載の配合物を含む表を示す。
【図３】図３は、例１で生成された代表的な凍結乾燥ケーキの写真を示す。
【図４】図４は、例１で使用された例示配合物を含む表を示す。
【図５】図５は、例３に記載の結果を含む表を示す。
【図６】図６は、例５に記載の凍結乾燥サイクル中の圧力のグラフを示す。
【００２０】
詳細な説明
嫌気性細菌を含む細菌組成物の保存は挑戦的である。細菌は凍結してプレート上または溶液中で再増殖することができるが、この方法の標準化は困難であった。治療目的に使用できる細菌を保存する必要性がある。凍結保存および凍結乾燥などの保存方法は、好気性細菌に関して十分に確立されており、保存方法での好気性細菌の生存および回収に影響する多くの要因が理解されている（Prakash et al. FEMS Microbiol Lett (2013)339:1-9）。しかしながら、嫌気性細菌に使用するための保存方法の開発は、十分ではない。嫌気性細菌を用いたかかる開発および研究は、嫌気性細菌を扱うことの重大な困難性によって妨げられている（Mori et al. "The Challenges of Studying the Anaerobic Microbial World" Microbes Environ. (2014) 29(4) 335-337）。ヒト腸マイクロバイオームから得られた細菌株などの嫌気性細菌が、ヒト疾患の処置において可能性を示していることを考えると、高レベルの細菌回収を可能にする、嫌気性細菌を保存するための改善された方法が必要とされる。
【００２１】
凍結乾燥は、ペプチドおよびタンパク質の保存のための認識された方法であり、再懸濁されて対象に投与されるべき治療用組成物の調製に使用され得る。しかしながら、細菌組成物、特に嫌気性細菌の凍結乾燥は、挑戦的である。本開示は、生存能力を失うことなく嫌気性細菌の凍結乾燥を可能にする組成物を、初めて提供する。本開示はまた、感受性であり保存が困難であると考えられる細菌を、生存能力を実質的に失うことなく保存するための、組成物および方法を提供する。本開示は、二糖、例えばトレハロースおよびスクロースなどの特定の凍結防止剤を含む配合物が、嫌気性細菌の保存を可能にするが、マンニトールおよびソルビトールなどの密接に関連する凍結防止剤はそうではないことを教示する。
【００２２】
さらに、細菌を含有する凍結乾燥組成物を生成するために提案された多くの方法は、動物由来の生成物を含む。例えば、Staab et al.は、１２％スクロースまたは二倍強度スキムミルクを添加した挽肉炭水化物ブロスを使用するフリーズドライ（凍結乾燥）嫌気性細菌を報告している（Staab et al. Cryobiology (1987)24:174-178）。Phillips et al.は、試験した嫌気性ルーメン細菌の多くが、グルコースを添加したウマ血清中での乾燥後も、生存能力を保持したことを実証した（Philips, et al. J. Appl. Bact. (1975)38:319-322）。最後に、Shourekは、大部分の細菌の凍結乾燥のために、ウシ血清またはヒツジ脱繊維血およびラクトースの混合物を推奨する（Shourek, Int. J. Sys. Bacteriol. (1974) 24(3):358-365）。ヒト対象への治療用生成物の投与に重要なことであるが、本明細書に記載の組成物は、動物性生成物または動物由来の生成物を含まない。
【００２３】
本発明は、その適用において、以下の説明に記載されているかまたは図面に示されている構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用されている表現および用語は、説明を目的としており、限定と見なされるべきではない。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含有する」、「含む（involving）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【００２４】
本明細書で提供されるのは、細菌を保存するための組成物および方法である。一側面において、本開示は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、安定化剤などの賦形剤も含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、凍結防止剤は糖である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、糖は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、キトビオース、またはラクツロースなどの二糖である。いくつかの態様において、組成物はマンニトールを含まない。いくつかの態様において、組成物はソルビトールを含まない。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、二糖はスクロースである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、スクロースは、６．０％以上１０．０％以下の濃度であり、例えば、６．０％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、８．０％、８．１％、８．２％、８．３％、８．４％、８．５％、８．６％、８．７％、８．８％、８．９％、９．０％、９．１％、９．２％、９．３％、９．４％、９．５％、９．６％、９．７％、９．８％、９．９％、９．０％、または１０．０％である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、スクロースは、７．０％〜８．０％の濃度、例えば７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、または８．０％である。
【００２５】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、二糖はトレハロースである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、トレハロースは、６．０％以上１０．０％以下の濃度、例えば、６．０％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、８．０％、８．１％、８．２％、８．３％、８．４％、８．５％、８．６％、８．７％、８．８％、８．９％、９．０％、９．１％、９．２％、９．３％、９．４％、９．５％、９．６％、９．７％、９．８％、９．９％、９．０％、または１０．０％である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、トレハロースは、７．０％以上８．０％以下の濃度、例えば、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、または８．０％である。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、栄養素は、酵母エキス、ルリア−ベルターニブロス、または植物ペプトンである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、栄養素は酵母エキスである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、酵母エキスの濃度は、０．５％以上２．０％以下、例えば、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、または２．０％である。いくつかの態様において、組成物は、動物性生成物ではない栄養素を含む。いくつかの態様において、組成物は、動物の血液ではない栄養素を含む。いくつかの態様において、組成物は、栄養素を含まない。
【００２６】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、抗酸化剤は、イヌリン、リボフラビンまたはシステインである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、抗酸化剤はシステインである。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、システインの濃度は、０．０１％以上０．５％以下、例えば０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、０．２０％、０．２１％、０．２２％、０．２３％、０．２４％、０．２５％、０．２６％、０．２７％、０．２８％、０．２９％、０．３０％、０．３１％、０．３２％、０．３３％、０．３４％、０．３５％、０．３６％、０．３７％、０．３８％、０．３９％、０．４０％、０．４１％、０．４２％、０．４３％、０．４４％、０．４５％、０．４６％、０．４７％、０．４８％、０．４９％、または０．５０％である。
いくつかの態様において、システイン以外またはこれに加えての抗酸化剤が、組成物に添加される。システイン以外またはこれに加えて組成物に添加することができる抗酸化剤としては、イヌリン、リボフラビン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、トコフェロール、トコトリエノール、ビタミンＥ、カロチノイド、カロチン、プロビタミンＡ、ビタミンＡ、没食子酸プロピル、三級ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ユビキノール、グルタチオン、チオール、ポリフェノール、カテコール、チリラザド（titilazada）、ＮＸＹ−０５９（ジスフェントンナトリウム、Cerovive）、シュウ酸、フィチン酸、タンニン、オイゲノール、リポ酸、尿酸、コエンザイムＱ、メラトニン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様において、組成物は、抗酸化剤を含まない。
【００２７】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液は、ヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ＴＨＡＭとしても知られる；２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール；トロメタミン；またはトロメタモール）である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液はヒスチジン緩衝液である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液は、ｐＨが約７．０、例えば６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、または７．３である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、緩衝液の濃度は、１０ｍＭ以上５０ｍＭ以下、例えば、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、または５０ｍＭである。いくつかの態様において、組成物は緩衝液を含まない。
【００２８】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は安定化剤である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、安定化剤は、還元剤、キレート剤、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または中性界面活性剤、またはポリマーである。いくつかの態様において、賦形剤は安定化剤である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、安定化剤は、０．０１％以上０．１％以下の濃度で、例えば０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１％で、組成物中に存在する。いくつかの態様において、組成物は賦形剤を含まない。
いくつかの態様において、安定化剤は還元剤である。いくつかの態様において、還元剤はメタ重亜硫酸ナトリウムである。いくつかの態様において、組成物は、メタ重亜硫酸ナトリウムを、０．０１％以上０．１％以下、例えば０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１％含む。いくつかの態様において、組成物は、メタ重亜硫酸ナトリウムを０．０５％含む。
【００２９】
いくつかの態様において、還元剤はアスコルビン酸である。いくつかの態様において、還元剤はクエン酸である。いくつかの態様において、キレート剤はクエン酸である。
いくつかの態様において、安定化剤は酸性アミノ酸である。いくつかの態様において、酸性アミノ酸は、グルタミン酸ナトリウムである。いくつかの態様において、安定化剤は塩基性アミノ酸である。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸はアルギニンである。
いくつかの態様において、安定化剤は、中性界面活性剤である。いくつかの態様において、中性界面活性剤はポロキサマーである。いくつかの態様において、安定化剤はポリマーである。いくつかの態様において、ポリマーは、非イオン性トリブロックコポリマーである。いくつかの態様において、ポリマーはポロキサマーである。いくつかの態様において、ポリマーは、ポリビニルピロリドン（例えば、KOLLIDON（登録商標））である。
【００３０】
いくつかの態様において、賦形剤はポリマーではない。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は還元されている。組成物を還元するための方法は当技術分野で知られており、組成物を嫌気性環境に入れること、および組成物を、嫌気性チャンバー内の混合ガス雰囲気に暴露することを含む。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、スクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、組成物は、細菌株も含む。いくつかの態様において、細菌株は嫌気性細菌株である。
【００３１】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、スクロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。いくつかの態様において、組成物は細菌株も含む。いくつかの態様において、細菌株は嫌気性細菌株である。いくつかの態様において、細菌株はクロストリジウム網に属する。
【００３２】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、トレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、組成物は細菌株も含む。いくつかの態様において、細菌株は嫌気性細菌株である。
【００３３】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、トレハロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。いくつかの態様において、組成物は細菌株も含む。いくつかの態様において、細菌株は嫌気性細菌株である。
【００３４】
一側面において、本明細書で提供される組成物は、細菌の保存を可能にする。組成物は、生存能力の損失を最小限に抑えながら、細菌が凍結乾燥サイクルを通過することを可能にする。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は細菌を含む。いくつかの態様において、組成物は１つ以上の細菌株を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、嫌気性細菌（例えば、偏性嫌気性細菌）である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、嫌気性細菌は偏性嫌気性細菌である。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌はクロストリジウム網に由来する。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌はクロストリジウム科に由来する。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌はクロストリジウム属に由来する。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、またはＸＶＩＩＩに属する。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａまたはＸＶＩＩに属する。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、細菌は、クロストリジウムクラスターＩＶまたはＸＩＶａに属する。
【００３５】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、以下の細菌株のうちの１つ以上を含む：Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Eubacterium fissicatena、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、以下の細菌株のうちの１つ以上を含む：Clostridium bolteae 90A9、Anaerotruncus colihominis DSM17241、Sellimonas intestinalis、Clostridium bacterium UC5.1-1D4、Dorea longicatena CAG:42、Erysipelotrichaceae bacterium 21-3、およびClostridium orbiscindens 1_3_50AFAA。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、以下の細菌株のうちの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８）を含む：Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Eubacterium fissicatena、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.。いくつかの態様において、組成物はClostridium bolteaeを含む。いくつかの態様において、組成物はAnaerotruncus colihominisを含む。いくつかの態様において、組成物はEubacterium fissicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物はClostridium symbiosumを含む。いくつかの態様において、組成物はBlautia productaを含む。いくつかの態様において、組成物はDorea longicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物はErysipelotrichaceae bacteriumを含む。いくつかの態様において、組成物はSubdolinogranulum spp.を含む。
【００３６】
一側面において、本明細書に（例えば実施例に）示されるように、本明細書に提供される組成物および方法は、嫌気性細菌株の安定化および保存を可能にする。一側面において、本明細書に（例えば実施例に）示されるように、本明細書に提供される組成物および方法は、クロストリジウムクラスターＩＶ、ＸＩＶａ、またはＸＶＩＩに属する嫌気性細菌株の安定化および保存を可能にする。一側面において、本明細書に（例えば実施例に）示されるように、本明細書に提供される組成物および方法は、嫌気性細菌株Clostridium bolteae、Anaerotruncus colihominis、Eubacterium fissicatena、Clostridium symbiosum、Blautia producta、Dorea longicatena、Erysipelotrichaceae bacterium、およびSubdolinogranulum spp.の安定化および保存を可能にする。本明細書に開示される組成物の例示的な細菌株はまた、それらの１６ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１〜８）によって同定され得る。それらの配列による細菌の同定はさらに、例示された細菌と同一または非常に類似しているさらなる細菌株の同定を可能にする。例えば、細菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を用いて、全ゲノム配列決定を通して、これらの配列を１６Ｓデータベースと比較することにより、（パーセント同一性に基づいて）最も近い類縁（relative）を同定した（表１）。さらに、全ゲノム配列決定および全ゲノムと全ゲノムデータベースとの比較に基づき、配列番号１〜８により提供される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する細菌株は、以下の細菌種に最も密接に関連している：Clostridium bolteae 90A9、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、Dracourtella massiliensis GD1、Clostridium symbiosum WAL-14163、Clostridium bacterium UC5.1-1D4、Dorea longicatena CAG:42、Erysipelotrichaceae bacterium 21_3、およびClostridium orbiscindens 1_3_50AFAA（例えば表１参照）。したがって、一側面において、表１の各列において、細菌株は非常に類似しているか、および／または同一であることを理解されたい。いくつかの態様において、本開示の文脈において、表１の列内の細菌株の名称は、互換的に使用され得る。
【００３７】
表１：本明細書に開示された組成物の細菌種の例
【表１】
2019532665.tif 000003
【００３８】
いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium bolteaeを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびAnaerotruncus colihominisを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびEubacterium fissicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium symbiosumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびBlautia productaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびDorea longicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびErysipelotrichaceae bacteriumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびSubdolinogranulum spp.を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium bolteaeを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびAnaerotruncus colihominisを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびEubacterium fissicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium symbiosumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびBlautia productaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびDorea longicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびErysipelotrichaceae bacteriumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびSubdolinogranulum spp.を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium bolteaeを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびAnaerotruncus colihominisを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびEubacterium fissicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium symbiosumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびBlautia productaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびDorea longicateraを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびErysipelotrichaceae bacteriumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびSubdrinogranulum spp.を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium bolteaeを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびAnaerotruncus colihominisを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびEubacterium fissicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium symbiosumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびBlautia productaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびDorea longicatenaを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびErysipelotrichaceae bacteriumを含む。いくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびSubdrinogranulum spp.を含む。
【００４２】
本開示の側面は、本明細書に記載の細菌株または種の配列のいずれか１つの核酸配列に対して相同性を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する、細菌株に関する。いくつかの態様において、細菌株は、本明細書に記載のいずれかの株または細菌種に対して、核酸またはアミノ酸配列の特定の領域にわたり、または全配列にわたり、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同性を有する。当業者には、２つ以上の核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における用語「相同性」または「パーセント相同性」とは、２つ以上の配列またはその一部の間の類似性の尺度を指すことが、理解されるであろう。相同性は、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さである配列の領域にわたって、またはより好ましくは１００〜５００または１０００以上のヌクレオチドの長さである領域にわたって、存在し得る。いくつかの態様において、相同性は、１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列、またはその一部の長さにわたって存在する。
【００４３】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つ以上の細菌株を含み、ここで１つ以上の細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または最大１００％の相同性を有する、１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。
【００４４】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号３の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。
【００４５】
追加的に又は代替的に、２つ以上の配列が、配列間の同一性について評価されてもよい。２つ以上の核酸またはアミノ酸配列の文脈における用語「同一の」、およびパーセント「同一性」は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が「実質的に同一」であるとは、比較ウィンドウ上または指定領域で最大の一致が得られるように比較および整列され、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定されるか、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定された場合に、核酸またはアミノ酸配列の特定の領域または配列全体にわたって同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、または９９.９％の配列同一性）場合を指す。任意に、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド長の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の長さにわたって存在する。
【００４６】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つ以上の細菌株を含み、ここで該１つ以上の細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または最大１００％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。
【００４７】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号３の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は１つの細菌株を含み、ここで該細菌株は、配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む。
【００４８】
追加的に又は代替的に、２つ以上の配列が、配列間のアラインメントについて評価されてもよい。２つ以上の核酸またはアミノ酸配列の文脈における用語「アラインメント」またはパーセント「アラインメント」は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が「実質的に整列（アラインメント）されている」とは、比較ウィンドウ上または指定領域で最大の一致が得られるように比較および整列され、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定されるか、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定された場合に、核酸またはアミノ酸配列の特定の領域または配列全体にわたって同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％、または９９.９％同一）場合を指す。任意に、アラインメントは、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド長の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の長さにわたって存在する。
【００４９】
配列比較については、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。比較のために配列をアラインメントさせる方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、以下による：Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:2444の類似方法の検索、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group. Madison. WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)を参照）。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. (1977) 25:3389-3402およびAltschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410に記載されている。
本明細書で使用される「細菌」および「細菌株」という用語は、交換可能であることが理解されるべきである。
【００５０】
いくつかの態様において、細菌株は、単一コロニーから増殖する。いくつかの態様において、細菌株は、精製細菌株である。本明細書で使用される場合、用語「精製された」とは、汚染物質などの１つ以上の成分から分離されたものを含む細菌株または組成物を指す。いくつかの態様において、細菌株は、汚染物質を実質的に含まない。いくつかの態様において、組成物の１つ以上の細菌株は、培養物中または細菌株を含有する試料中に生成されおよび／または存在する１つ以上の他の細菌または細菌株から独立して、精製され得る。いくつかの態様において、細菌株は、試料から単離または精製され、次いで細菌複製に適した条件下、例えば嫌気性培養条件下で培養される。細菌の複製に適した条件下で増殖した細菌は、その後、それが増殖している培養物から単離／精製することができる。
【００５１】
組成物の細菌株は、当技術分野において知られている発酵技術を用いて製造することができる。いくつかの態様において、活性成分は、嫌気性細菌株の急速な増殖を支援することができる、嫌気性発酵槽を使用して製造される。嫌気性発酵槽は、例えば、撹拌槽型反応器または使い捨てウェーブバイオリアクターであり得る。ＢＬ培地およびＥＧ培地などの培地、または動物成分を含まないこれらの培地の類似のバージョンを用いて、細菌種の増殖を支援することができる。細菌産物は、遠心分離および濾過などの伝統的な技術によって、発酵ブロスから精製および濃縮することができる。一般に細菌は、凍結防止剤、栄養素、緩衝液、および抗酸化剤を既に含む組成物中に細菌を導入する前に、ペレット化される。いくつかの態様において、細菌は、凍結防止剤、栄養素、緩衝液、抗酸化剤、および賦形剤（例えば、還元剤）を既に含む組成物中に細菌を導入する前に、ペレット化される。
【００５２】
いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、約１０、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３またはそれ以上の細菌を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、１ミリリットルあたり、約１０、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３またはそれ以上の細菌を含む。いくつかの細菌は生存可能ではない場合があることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、約１０、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３またはそれ以上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の細菌を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、１ミリリットルあたり、約１０、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３またはそれ以上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の細菌を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、本明細書に開示されている組成物は、細菌総数１０〜１０１３、１０２〜１０１３、１０３〜１０１３、１０４〜１０１３、１０５〜１０１３、１０６〜１０１３、１０７〜１０１３、１０８〜１０１３、１０９〜１０１３、１０１０〜１０１３、１０１１〜１０１３、１０１２〜１０１３、１０〜１０１２、１０２〜１０１２、１０３〜１０１２、１０４〜１０１２、１０５〜１０１２、１０６〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２、１０９〜１０１２、１０１０〜１０１２、１０１１〜１０１２、１０〜１０１１、１０２〜１０１１、１０３〜１０１１、１０４〜１０１１、１０５〜１０１１、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０８〜１０１１、１０９〜１０１１、１０１０〜１０１１、１０〜１０１０、１０２〜１０１０、１０３〜１０１０、１０４〜１０１０、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０〜１０９、１０２〜１０９、１０３〜１０９、１０４〜１０９、１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０〜１０８、１０２〜１０８、１０３〜１０８、１０４〜１０８、１０５〜１０８、１０６〜１０８、１０７〜１０８、１０〜１０７、１０２〜１０７、１０３〜１０７、１０４〜１０７、１０５〜１０７、１０６〜１０７、１０〜１０６、１０２〜１０６、１０３〜１０６、１０４〜１０６、１０５〜１０６、１０〜１０５、１０２〜１０５、１０３〜１０５、１０４〜１０５、１０〜１０４、１０２〜１０４、１０３〜１０４、１０〜１０３、１０２〜１０３、または１０〜１０２を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されている組成物は、１ミリリットル当たり細菌総数１０〜１０１３、１０２〜１０１３、１０３〜１０１３、１０４〜１０１３、１０５〜１０１３、１０６〜１０１３、１０７〜１０１３、１０８〜１０１３、１０９〜１０１３、１０１０〜１０１３、１０１１〜１０１３、１０１２〜１０１３、１０〜１０１２、１０２〜１０１２、１０３〜１０１２、１０４〜１０１２、１０５〜１０１２、１０６〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２、１０９〜１０１２、１０１０〜１０１２、１０１１〜１０１２、１０〜１０１１、１０２〜１０１１、１０３〜１０１１、１０４〜１０１１、１０５〜１０１１、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０８〜１０１１、１０９〜１０１１、１０１０〜１０１１、１０〜１０１０、１０２〜１０１０、１０３〜１０１０、１０４〜１０１０、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０〜１０９、１０２〜１０９、１０３〜１０９、１０４〜１０９、１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０〜１０８、１０２〜１０８、１０３〜１０８、１０４〜１０８、１０５〜１０８、１０６〜１０８、１０７〜１０８、１０〜１０７、１０２〜１０７、１０３〜１０７、１０４〜１０７、１０５〜１０７、１０６〜１０７、１０〜１０６、１０２〜１０６、１０３〜１０６、１０４〜１０６、１０５〜１０６、１０〜１０５、１０２〜１０５、１０３〜１０５、１０４〜１０５、１０〜１０４、１０２〜１０４、１０３〜１０４、１０〜１０３、１０２〜１０３、または１０〜１０２を含む。
【００５４】
いくつかの態様において、本明細書に開示されている組成物は、細菌のコロニー形成単位数１０〜１０１３、１０２〜１０１３、１０３〜１０１３、１０４〜１０１３、１０５〜１０１３、１０６〜１０１３、１０７〜１０１３、１０８〜１０１３、１０９〜１０１３、１０１０〜１０１３、１０１１〜１０１３、１０１２〜１０１３、１０〜１０１２、１０２〜１０１２、１０３〜１０１２、１０４〜１０１２、１０５〜１０１２、１０６〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２、１０９〜１０１２、１０１０〜１０１２、１０１１〜１０１２、１０〜１０１１、１０２〜１０１１、１０３〜１０１１、１０４〜１０１１、１０５〜１０１１、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０８〜１０１１、１０９〜１０１１、１０１０〜１０１１、１０〜１０１０、１０２〜１０１０、１０３〜１０１０、１０４〜１０１０、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０〜１０９、１０２〜１０９、１０３〜１０９、１０４〜１０９、１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０〜１０８、１０２〜１０８、１０３〜１０８、１０４〜１０８、１０５〜１０８、１０６〜１０８、１０７〜１０８、１０〜１０７、１０２〜１０７、１０３〜１０７、１０４〜１０７、１０５〜１０７、１０６〜１０７、１０〜１０６、１０２〜１０６、１０３〜１０６、１０４〜１０６、１０５〜１０６、１０〜１０５、１０２〜１０５、１０３〜１０５、１０４〜１０５、１０〜１０４、１０２〜１０４、１０３〜１０４、１０〜１０３、１０２〜１０３、または１０〜１０２を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されている組成物は、１ミリリットル当たりの細菌のコロニー形成単位数１０〜１０１３、１０２〜１０１３、１０３〜１０１３、１０４〜１０１３、１０５〜１０１３、１０６〜１０１３、１０７〜１０１３、１０８〜１０１３、１０９〜１０１３、１０１０〜１０１３、１０１１〜１０１３、１０１２〜１０１３、１０〜１０１２、１０２〜１０１２、１０３〜１０１２、１０４〜１０１２、１０５〜１０１２、１０６〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２、１０９〜１０１２、１０１０〜１０１２、１０１１〜１０１２、１０〜１０１１、１０２〜１０１１、１０３〜１０１１、１０４〜１０１１、１０５〜１０１１、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０８〜１０１１、１０９〜１０１１、１０１０〜１０１１、１０〜１０１０、１０２〜１０１０、１０３〜１０１０、１０４〜１０１０、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０〜１０９、１０２〜１０９、１０３〜１０９、１０４〜１０９、１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０〜１０８、１０２〜１０８、１０３〜１０８、１０４〜１０８、１０５〜１０８、１０６〜１０８、１０７〜１０８、１０〜１０７、１０２〜１０７、１０３〜１０７、１０４〜１０７、１０５〜１０７、１０６〜１０７、１０〜１０６、１０２〜１０６、１０３〜１０６、１０４〜１０６、１０５〜１０６、１０〜１０５、１０２〜１０５、１０３〜１０５、１０４〜１０５、１０〜１０４、１０２〜１０４、１０３〜１０４、１０〜１０３、１０２〜１０３、または１０〜１０２を含む。
【００５５】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、１ミリリットル当たり少なくとも１×１０８コロニー形成単位の細菌を含む。
細菌株を含む組成物は、凍結乾燥して細菌株を保存することができる。いくつかの態様において、組成物または組成物の細菌株は、凍結乾燥されている。細菌を含む組成物などの組成物を凍結乾燥する方法は、当技術分野において知られている。例えば、米国特許第3,261,761号；米国特許第4,205,132号；ＰＣＴ公報WO 2014/029578、WO 2012/098358、WO 2012/076665およびWO 2012/088261を参照；これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。しかしながら、嫌気性細菌などの特定の細菌の凍結乾燥を可能にする条件を見出すことは挑戦的である。例えば、Peiren et al., Appl Microbol Biotechnol (2015) 99: 3559を参照。一側面において、本明細書に提供される安定化および保存の方法は、細菌株、特に嫌気性細菌株の製造を可能にする組成物を生成する能力を許容することが、理解されるべきである。本開示の前には、公表された方法のいずれも、細菌株、特に嫌気性細菌株の製造を可能にするであろう安定化および保存のレベルを提供できなかった。
【００５６】
本開示の側面は、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供することを含む、細菌を保存する方法を提供する。一般に凍結乾燥は、細菌などの材料を保存するための乾燥（dessication）プロセスであり、フリーズドライを含む。材料を凍結し、次いで材料を真空下に置くことによって、材料から水を除去し、その間に氷は昇華する。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、凍結、一次乾燥、および二次乾燥のステップを含む。用語「温度勾配速度」とは、凍結乾燥サイクルのステップ間で、温度が調節される速度を指す。
【００５７】
いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、０．５℃／分〜３℃／分の間の温度勾配速度を有する、１つ以上のステップを含む。いくつかの態様において、温度勾配速度は、０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分、１．０℃／分、１．１℃／分、１．２℃／分、１．３℃／分、１．４℃／分、１．５℃／分、１．６℃／分、１．７℃／分、１．８℃／分、１．９℃／分、２．０℃／分、２．１℃／分、２．２℃／分、２．３℃／分、２．４℃／分、２．５℃／分、２．６℃／分、２．７℃／分、２．８℃／分、２．９℃／分、または３．０℃／分である。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、１．０℃／分の温度勾配速度を有する、１つ以上のステップを含む。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルは、２．５℃／分の温度勾配速度を有する、１つ以上のステップを含む。
【００５８】
いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルの各ステップは、０．５℃／分〜３℃／分の間の温度勾配速度を有する。いくつかの態様において、温度勾配速度は、０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分、１．０℃／分、１．１℃／分、１．２℃／分、１．３℃／分、１．４℃／分、１．５℃／分、１．６℃／分、１．７℃／分、１．８℃／分、１．９℃／分、２．０℃／分、２．１℃／分、２．２℃／分、２．３℃／分、２．４℃／分、２．５℃／分、２．６℃／分、２．７℃／分、２．８℃／分、２．９℃／分、または３．０℃／分である。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルの各ステップは、１．０℃／分の温度勾配速度を有する。いくつかの態様において、凍結乾燥サイクルの各ステップは、２．５℃／分の温度勾配速度を有する。
本明細書で論じられるように、いくつかの態様において、細菌は、例えば感度アッセイにおいて感受性であると決定され得、凍結乾燥における温度勾配速度が増加される。いくつかの態様において、細菌は感受性であると決定され得、凍結乾燥サイクルは、２．５℃／分の温度勾配速度を有する１つ以上のステップを含む。
【００５９】
一側面において、細菌を含む本明細書で提供される組成物は、固体形態である。いくつかの態様において、固体形態は、凍結乾燥ケーキ（「凍結ケーキ」とも呼ばれる）である。本明細書で使用される場合、用語「凍結乾燥ケーキ」および「凍結ケーキ」は、細菌を含む組成物などの組成物の凍結乾燥によって形成される固体組成物を指す。凍結乾燥ケーキの外観は、評価することができる。態様において、無傷のように見え、崩壊しない凍結乾燥ケーキが望ましい。
【００６０】
本開示は固体組成物を包含することが、理解されるべきである。固体組成物は、例えば、本明細書に開示される細菌を含む組成物の１つの凍結乾燥後に、生成され得る。固体形態の組成物は、固体形態を生成するために使用される液体配合物と同じ成分を有するであろう。したがって、例えば、液体組成物が凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を含み、液体組成物が凍結乾燥に供された場合、生成された凍結ケーキは同じ成分を有することになる。各成分の量／パーセンテージの定義は、固体配合物を説明する場合には異なる。指標「ｍＭ」および「ｐＨ」は、固体成分の説明には適さない。しかしながら、同量の液体中における固体配合物の再構成が、同一の組成をもたらすはずであることを理解すべきである。一側面において、本開示は、本明細書に提供される組成物の凍結乾燥によって生成された固体組成物を提供する。
【００６１】
いくつかの態様において、本開示は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、固体組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、緩衝液、および賦形剤（例えば、安定化剤）を含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、固体組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、スクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、固体組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、スクロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、およびメタ重亜硫酸ナトリウムを含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、固体組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、トレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、固体組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、トレハロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、およびメタ重亜硫酸ナトリウムを含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、固体組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、スクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、凍結ケーキを提供する。いくつかの態様において、本開示は、スクロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、およびメタ重亜硫酸ナトリウムを含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、凍結ケーキを提供する。いくつかの態様において、本開示は、トレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、凍結ケーキを提供する。いくつかの態様において、本開示は、トレハロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、およびメタ重亜硫酸ナトリウムを含む液体組成物の凍結乾燥によって生成された細菌を含む、凍結ケーキを提供する。
【００６２】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium bolteaeの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium bolteaeの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６３】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびAnaerotruncus colihominisの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびAnaerotruncus colihominisの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６４】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびEubacterium fissicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびEubacterium fissicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium symbiosumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium symbiosumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６５】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびBlautia productaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびBlautia productaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびDorea longicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびDorea longicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６６】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびErysipelotrichaceae bacteriumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびErysipelotrichaceae bacteriumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびSubdrinogranulum spp.の凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびSubdrinogranulum spp.の凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６７】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium bolteaeの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium bolteaeの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびAnaerotruncus colihominisの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびAnaerotruncus colihominisの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６８】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびEubacterium fissicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびEubacterium fissicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびClostridium symbiosumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびClostridium symbiosumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００６９】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびBlautia productaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびBlautia productaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびDorea longicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびDorea longicatenaの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００７０】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびErysipelotrichaceae bacteriumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびErysipelotrichaceae bacteriumの凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、およびSubdolinogranulum spp.の凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、およびSubdolinogranulum spp.の凍結乾燥によって生成された固体組成物を含む。いくつかの態様において、固体組成物は凍結ケーキである。
【００７１】
いくつかの態様において、本明細書で提供される細菌株を含む固体組成物は、例えば凍結乾燥生成物の再構成による医薬組成物として投与用に製剤化することができる。本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本明細書で提供される固体配合物と１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤との混合または組み合わせから得られる生成物を意味する。
【００７２】
「許容し得る」賦形剤とは、活性成分（例えば、細菌株）と適合性でなければならず、かつそれが投与される対象に有害ではない賦形剤を指す。いくつかの態様において、薬学的に許容し得る賦形剤は、組成物の意図される投与経路に基づいて選択され、例えば経口または経鼻投与用組成物は、直腸投与用組成物とは異なる薬学的に許容し得る賦形剤を含み得る。賦形剤の例には、滅菌水、生理食塩水、溶媒、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、緩和剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、および可溶化剤が含まれる。
【００７３】
一側面において、本開示は、細菌の保存を可能にする組成物を提供する。いくつかの態様において、細菌は嫌気性細菌である。細菌の保存に有用な組成物は、本明細書において安定化組成物とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、細菌（例えば、嫌気性細菌）の保存または細菌の安定化を可能にする組成物とは、その中の細菌の生存能力を促進し、凍結乾燥サイクル後の細菌の回収を可能にする組成物を指す。組成物の安定化または保存の機能性は、２つの特定の時点（例えば、１日目および１００日目）における生存細菌（例えば、コロニー形成単位）の数を比較することによって、評価することができる。いくつかの態様において、組成物の安定化または保存の機能性は、第１の時点での生存細菌（例えば、コロニー形成単位）の数を、第２の時点での生存細菌（例えば、コロニー形成単位）の数と比較することによって、評価される。コロニー形成単位の数が２つの時点でまたはある期間にわたって同一または実質的に同一である場合、その組成物は、完全な安定化組成物である。２時点間またはある期間にわたるコロニー形成単位の数の大幅な減少は、組成物が良好な安定化組成物ではないことを示す。
【００７４】
組成物の安定化機能性はまた、特定の事象（例えば、凍結乾燥または凍結融解事象）の前後の生存細菌（例えば、コロニー形成単位）の数を比較することによって、評価することができる。コロニー形成単位の数が同じかまたは実質的に同じである場合、その組成物は完全な安定化組成物である。特定の事象の前と比較して、特定の事象後のコロニー形成単位の数の大幅な減少は、組成物が良好な安定化組成物ではないことを示している。
【００７５】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、組成物は、安定化組成物である。いくつかの態様において、安定化組成物は、トレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、トレハロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤（例えば、安定化剤）を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．５％のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。
【００７６】
いくつかの態様において、安定化組成物は、スクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、スクロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤（例えば、安定化剤）を含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．０％〜８．０％の濃度のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。いくつかの態様において、安定化組成物は、７．０％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む。
【００７７】
本開示の側面は、感度アッセイにおいて細菌を評価することに関する。いくつかの態様において、細菌は、凍結乾燥用の組成物に細菌を添加する前に、感度アッセイに供される。感度アッセイは、細菌が、例えば酸素の存在または細胞壁／膜ストレスなどのストレスに対して、より感受性であり得るかどうかを決定するために使用され得る。感度アッセイにおける細菌の性能はまた、凍結乾燥サイクルを通して細菌がどのように生き残るか（生存し続けるか）を示すかまたは予測することができる。一般に、感受性である、または他の細菌と比較してより感受性であると決定された細菌を凍結乾燥サイクルに供することは、生存能力のある細菌の回収率の低下をもたらし得る；したがって、いくつかの態様において、細菌が感受性であると決定された場合、賦形剤を組成物に添加することができ、および／または凍結乾燥サイクルの温度勾配速度を上げることができる。いくつかの態様において、感度アッセイは、ストレスに対する細菌の感受性を決定し得る。
【００７８】
いくつかの態様において、細菌の感受性は、別の細菌の感受性または基準値と比較される。いくつかの態様において、感度アッセイにおける細菌の性能は、別の細菌の性能または基準値と比較され得る。感度アッセイの例には、例えば、グラム染色および凍結融解アッセイが含まれる。
【００７９】
グラム染色は、細菌の細胞壁（ペプチドグリカン）構造を評価するために通常使用される方法である。当業者には明らかなように、グラム染色は、細菌を一連のステップに付すことを含む：最初に、細菌を水溶性染料（クリスタルバイオレット）およびヨウ素溶液と接触させ、次に脱色ステップ、最後に、通常はサフラニン（safanin）による対比染色ステップである。クリスタルバイオレットは、細菌細胞壁のペプチドグリカンに結合し、ヨウ素と複合体を形成する。ペプチドグリカンの厚い層を有する細菌は、グラム染色において紫色に見え、グラム陽性（Ｇｒａｍ＋）と呼ばれるのに対し、ペプチドグリカンのより薄い層を有する細菌または外膜で囲まれた細菌は、これらの細胞が対比染色で染色されてクリスタルバイオレットでは染色されないために、グラム染色においてピンクに見える。これらの細胞は、グラム陰性（Ｇｒａｍ−）細菌と呼ばれる。グラム陽性として特徴付けられる（例えば、グラム陽性細菌のペプチドグリカン構造を有することが当技術分野において知られている）が、グラム染色においてグラム陽性に見えない細菌は、感受性であるか、または他の細菌より感受性であると考えられ得る。いくつかの態様において、細菌はグラム染色に供されて、感受性であると決定される。
【００８０】
いくつかの態様において、感度アッセイは凍結融解アッセイである。当業者には明らかであるように、凍結融解アッセイは、細菌を、例えばドライアイス／エタノールバスまたは冷凍庫内で凍結し、次いで細菌を融解することを含む。いくつかの態様において、凍結融解アッセイは、細菌を凍結および融解する１回以上のサイクルを含む。いくつかの態様において、細菌の生存能力は、凍結融解アッセイの後に評価される。凍結融解プロセスは溶解を引き起こし、そのため感受性細菌の生存能力の低下（回収率の低下）を引き起こす可能性がある。いくつかの態様において、凍結融解アッセイにおける細菌の生存能力の低下は、その細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であることを示し得る。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、細菌を感度アッセイにおいて評価することを含む。いくつかの態様において、細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であると決定された場合、感受性の細菌を含有する組成物に、賦形剤が添加される。いくつかの態様において、細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であると決定された場合、感受性の細菌を含有する組成物に、安定化剤が添加される。いくつかの態様において、細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であると決定された場合、感受性の細菌を含有する組成物に、還元剤が添加される。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、還元剤の存在は、組成物中の酸素を除去し、それによって感受性細菌の生存能力を改善することができる。いくつかの態様において、細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であると決定された場合、感受性の細菌を含有する組成物に、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムが添加される。
【００８２】
いくつかの態様において、細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であると決定された場合、感受性の細菌を含有する組成物は、増加した温度勾配速度（例えば、１℃／分より大）を有する凍結乾燥サイクルに供される。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、温度勾配速度を増加させることは、細菌の酸素への潜在的な曝露を減少させ得る。いくつかの態様において、細菌が感受性であるか、または他の細菌より感受性であると決定された場合、感受性の細菌を含有する凍結乾燥組成物は、感受性の細菌を含有する組成物を、２．５℃／分の温度勾配速度の１つ以上のステップを有する凍結乾燥サイクルに供することにより、生成される。
【００８３】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、安定化組成物は、ある期間にわたって、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大１００％までのコロニー形成単位の回収を可能にする組成物である。いくつかの態様において、期間は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間以上である。いくつかの態様において、回収されたコロニー形成単位のパーセンテージまたは保存レベルは、ある期間における第１の時点での細菌（例えば、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数を、第２の時点での細菌（例えば、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数と比較することにより、決定される。例えば、細菌の５０％の回収または５０％の保存は、細菌の半分が、その期間にわたって生存可能なままであったことを示す；細菌の１００％の回収または１００％の保存は、全ての（または実質的に全ての）細菌が、その期間にわたって生存可能なままであったことを示す。
【００８４】
本明細書に提供される組成物のいくつかの態様において、安定化組成物とは、特定の事象の後、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大１００％までの回収を可能にする組成物である。いくつかの態様において、特定の事象は、凍結融解サイクルまたは凍結乾燥サイクルである。いくつかの態様において、回収されたコロニー形成単位のパーセンテージまたは保存レベルは、特定の事象前の細菌（例えば、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数を、特定の事象後の細菌（例えば、細菌株または総細菌）のコロニー形成単位の数と比較することにより、決定される。例えば、細菌の５０％の回収または５０％の保存は、細菌の半分が、特定の事象後に生存可能なままであったことを示す；細菌の１００％の回収または１００％の保存は、全ての（または実質的に全ての）細菌が、特定の事象後に生存可能なままであったことを示す。
【００８５】
一側面において、本開示は、細菌を保存するための方法を提供する。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、細菌を本明細書で提供される組成物のいずれかに添加すること、および細菌が添加された組成物を凍結乾燥サイクルに供することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、細菌を、７．０％〜８．０％の濃度のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む組成物に添加すること、および細菌が添加された組成物を、凍結乾燥サイクルに供することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、細菌を、７．０％〜８．０％の濃度のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む組成物に添加すること、および細菌が添加された組成物を、凍結乾燥サイクルに供することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、細菌を、７．０％〜８．０％の濃度のトレハロース、１％酵母エキス、０．０５％システイン、および２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を含む組成物に添加すること、および細菌が添加された組成物を、凍結乾燥サイクルに供することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、７．０％〜８．０％の濃度のトレハロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、および０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む組成物に添加すること、および細菌が添加された組成物を、凍結乾燥サイクルに供することを含む。
【００８６】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法はさらに、細菌を含む組成物を凍結乾燥サイクルに供した後に、コロニー形成単位の数を測定することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、コロニー形成単位の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大１００％の保存をもたらす。
一側面において、本開示は、本明細書で提供される組成物を生成するための方法を提供する。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、凍結防止剤、栄養素、抗酸化剤、および緩衝液を組み合わせて混合物を作ること、続いて混合物を還元して組成物を生成することを含む。いくつかの態様において、方法はさらに、細菌の添加を含む。
【００８７】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、混合物を作るためのトレハロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を組み合わせて混合物を作ること、続いて混合物を還元して組成物を生成することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、混合物を作るためのトレハロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤を組み合わせて混合物を作ること、続いて混合物を還元して組成物を生成することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、混合物を作るためのスクロース、酵母エキス、システイン、およびヒスチジン緩衝液を組み合わせて混合物を作ること、続いて混合物を還元して組成物を生成することを含む。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、方法は、混合物を作るためのスクロース、酵母エキス、システイン、ヒスチジン緩衝液、および賦形剤を組み合わせて混合物を作ること、続いて混合物を還元して組成物を生成することを含む。
【００８８】
配列番号１  株１  １６ＳリボソームＲＮＡ  Clostridium bolteae
【化１】
2019532665.tif 000004
【００８９】
配列番号２  株２  １６ＳリボソームＲＮＡ  Anaerotruncus colihominis
【化２】
2019532665.tif 000005
【００９０】
配列番号３  株３  １６ＳリボソームＲＮＡ  Ruminococcus torques
【化３】
2019532665.tif 000006
【００９１】
配列番号４  株４  １６ＳリボソームＲＮＡ  Clostridium symbiosum
【化４】
2019532665.tif 000007
【００９２】
配列番号５  株５  １６ＳリボソームＲＮＡ  Blautia producta
【化５】
2019532665.tif 000008
【００９３】
配列番号６  株６  １６ＳリボソームＲＮＡ  Dorea Longicatena
【化６】
2019532665.tif 000009
【００９４】
配列番号７  株７  １６ＳリボソームＲＮＡ  Erysipelotrichaceae bacterium
【化７】
2019532665.tif 000010
【００９５】
配列番号８  株  １６ＳリボソームＲＮＡ  Subdoligranulum spp
【化８】
2019532665.tif 000011
【００９６】
本発明は、その適用において、以下の説明に記載されているかまたは図面に示されている構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用されている表現および用語は説明を目的としており、限定と見なされるべきではない。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含有する」、「含む（involving）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【００９７】
本明細書において別に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法および技術は、一般に当技術分野において知られている従来の方法に従って行われる。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、ウイルス学、細胞または組織培養、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法および技術は、当技術分野でよく知られており一般的に使用されるものである。本開示の方法および技術は一般に、別に指示されない限り、当分野で知られている従来の方法に従って、本明細書を通して引用および議論される種々の一般的およびさらに具体的な参考文献に記載されるようにして、実施される。
【００９８】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、これは決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本明細書を通して引用される全ての参考文献（参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により本明細書に明確に組み込まれる。しかしながら、いかなる参考文献の引用も、その参考文献が先行技術であることの承認を意図するものではない。
【実施例】
【００９９】
例１
概要
様々な凍結乾燥配合物を、嫌気性細菌Dorea longicatenaの凍結乾燥について評価した。実験計画を図１に示す。
【０１００】
細菌培養
Dorea langicatenaの接種物を、単一コロニーから開始し、対数増殖後期に対応する約０．６８のＯＤ６００に到達させ、次いでより大きなフラスコに移した。細菌の４０ｍｌのアリコートをペレット化した。ペレット化した細菌は１．６×１０７ｃｆｕ／ｍｌであった。（ｃｆｕ＝コロニー形成単位）
【０１０１】
凍結乾燥緩衝液の調製
図２および表２に示す配合物を、嫌気性チャンバー内で調製した。マンニトールおよびソルビトールは結晶質であり、一方スクロースおよびトレハロースは非晶質であった。図２に示す配合物成分に加えて、全ての配合物は１％の酵母エキス、および０．０５％のシステインを含んでいた。ヒスチジンおよびトリス塩基緩衝液の濃度は、２０ｍＭであった。配合物を、０．２２マイクロＭのフィルターを通して濾過した。細菌ペレットを含有する１６本の５０ｍｌコニカルチューブを２〜８℃のチャンバーに保存したものが提供された。各チューブ内の細菌数は、１．６×１０７ｃｆｕ／ｍｌであった。ペレットを２０ｍｌの凍結乾燥配合物で２回洗浄し、３９００ｒｐｍで１０分間回転させた。配合物の重量オスモル濃度は、２９２〜３２９ミリオスモルの範囲であった。洗浄したペレットを、２５ｍｌの凍結乾燥緩衝液に再懸濁し、各凍結乾燥配合物について５つのバイアルを調製した。４つのバイアルを凍結乾燥サイクルに使用し、１つのバイアルを対照として−８０℃に保った。バイアルに、直径２０ｍｍのタイプＩエラストマークロロブチルストッパーで部分的に栓をした。１６本の５０ｍｌコニカルチューブのうちの１本を培地で洗浄し、凍結乾燥サイクルの対照として使用した。
【０１０２】
対照として使用した細菌ペレットを、１２ｍｌの細胞培地で２回洗浄し、３９００ｒｐｍで１０分間回転させた。続いて細胞を２５ｍｌの細胞培地で再懸濁し、合計５つのバイアルに充填した：２０ｍｌのバイアルに５ｍｌ充填。４つのバイアルを凍結乾燥し、１つを対照として−８０℃に保った。バイアルに、直径２０ｍｍのタイプＩエラストマークロロブチルストッパーで部分的に栓をした。
表２：例１で用いた配合物
【表２】
2019532665.tif 000012
【０１０３】
凍結乾燥サイクル：
凍結乾燥サイクルを、以下の表３に示す凍結乾燥パラメータを用いて行った。
表３．凍結乾燥サイクル
【表３】
2019532665.tif 000013
【０１０４】
凍結乾燥サイクルが完了すると、窒素を埋め戻して６００，０００ｍＴｏｒｒに到達させ、次いでバイアルに栓をしてバイアル中のＮ２を真空に保った。バイアルに栓をすると、埋め戻しが完了して７６０，０００ｍｔｏｒｒに達した。ガラスバイアル中の凍結乾燥生成物を凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムクリンプキャップで速やかに密封して大気の汚染を防ぎ、バイアルからのＮ２の放出を防いだ。一次および二次乾燥段階の完了は、ピラニ圧力に基づいて決定した。全ての凍結乾燥容器は、生存能力試験前の保存のために、−２０℃で保存した。
試料を４℃に２時間冷却し、−５０℃で２時間凍結した。１６の配合物は異なるＴｇ’を有するため、一次乾燥は−２５℃に設定した。スクロースなどの非晶質の糖は−３２℃の転移を有し、結晶マンニトールは約１５℃の共晶温度を有することが知られている。−２５℃での一次乾燥は、大部分の配合物が凍結乾燥中に転移または共晶温度未満にとどまるように選択された。圧力プロファイルは、ピラニ圧力が約６３時間の凍結乾燥で１００ｍｔｏｒｒに達したことを示唆している。一次乾燥の終了を確実にするために、一次乾燥を７３時間に延長した。結合水を、二次乾燥中に除去した。ピラニ圧力プロファイルに基づいて、二次乾燥は８１時間の凍結乾燥で完了した。凍結乾燥を８８時間まで延長して、結合水の完全な除去を確実にした。
【０１０５】
凍結乾燥サイクルの結果
凍結乾燥配合物の物理的外観を図３に示す。データは、結晶性ソルビトールを含有する配合物および培地を含有する配合物を除いて、他の１３個の配合物のすべてのケーキが、崩壊せず無傷であることを示す。ソルビトールを含有する配合物のケーキは崩壊し、泡立ちと共に上昇した。同様に、培地のみを含む配合物も崩壊した。
ケーキの外観に基づき、この凍結乾燥の実行は、非晶質トレハロースおよびスクロースならびに結晶マンニトールを含有する配合物に対して許容できるように見える。ソルビトールおよび培地を含む配合物のケーキは、凍結乾燥後に崩壊した。
【０１０６】
凍結乾燥試料の生存能力
凍結乾燥ケーキを嫌気性チャンバーに移し、ケーキを、５ｍｌの試料を代表するものとして、開いて５ｍｌの培地に再懸濁した（培地のＨｉＶｅｇ培地に再懸濁）。希釈液を、１０１から１０６〜１０７に調製し、１００μＬの各希釈液をEggerth Gagnonプレートに分配し、滅菌ガラスビーズを用いて広げた。５％のウマ血液が濃縮された還元前のEggerth Gagnonプレート上に、プレーティングを行った。インキュベーションを３７℃で、嫌気性チャンバー内のインキュベーター内で行った。コロニー形成単位は、プレーティング後４８〜７２時間にカウントした。
凍結乾燥実験と評価された試料の生存能力とを合わせた結果を、図４および表４に示す。最良の結果は、緩衝液としてＨｉｓ ｐＨ７．０またはTris ｐＨ７．５、および糖としてスクロースまたはトレハロースを用いて得られる。
表４：配合物実験の結果
【表４】
2019532665.tif 000014
【０１０７】
例２
概要
この研究では、嫌気性細菌Dorea longicatenaの凍結乾燥のための凍結乾燥配合物および成分を評価した。
【０１０８】
細菌培養
Dorea longicatenaの接種物を、４０ｍＬのVegitone培地を含有する５０ｍＬ遠心チューブ内の単一コロニーから開始した。接種物を一晩増殖させ、２本のチューブを用い、１リットルのボトルに７５０ｍＬのVegitoneを開始ＯＤ０．０２５で接種した。これを２０時間増殖させ、ＯＤ０．６８で収穫した。４０ｍＬのアリコートを、１６本の５０ｍＬ遠心チューブに加えた。チューブを３５６０ＲＣＦで１０分間遠心し、上清を捨てた。チューブを密封し、BD EZPakガス発生パウチ（Becton, Dicksinon and Company; Franklin Lakes, NY）を備えたBD EZPak嫌気性容器に入れて、嫌気性環境を確保した。生存能力試験の前に、箱を２〜８℃の冷蔵庫に入れた。
【０１０９】
凍結乾燥用緩衝液の調製および凍結乾燥サイクル
表５に示された配合物を調製して、細菌培養物の凍結乾燥を評価した。試験した各配合物には、１％の酵母エキスおよび０．０５％のＬ−システインを添加した。酵母エキスを添加して、各株に動物を含まない栄養素を供給した。Ｌ−システインは、酸素曝露を軽減するために、還元剤として添加した。
生存能力試験の前に、バイアルを２５ｍＬの培地に再懸濁し、プレーティングして、開始生存能力を決定した。
各試料を、表５に示す配合物緩衝液を使用して２回洗浄した。出発試料を濃縮するために、２５ｍＬの容量を最終再懸濁に使用した。表５に示す各配合物は、別々の２０ｍＬバイアルに５ｍＬのアリコートを加え、次いで１００ｍＴｏｒｒで−２５℃の一次乾燥および１００ｍＴｏｒｒで２０℃の二次乾燥を用いて凍結乾燥した。
【０１１０】
凍結乾燥試料の生存能力
凍結乾燥後、各バイアルを５ｍＬの培地に再懸濁し、ＥＧＨＢ上にプレーティングすることによって、最終生細胞数を決定した（表６）。データは、凍結防止剤としてスクロースまたはトレハロースを含有する配合物中で凍結乾燥した細菌が、回収可能であったことを示している。マンニトールを含む配合物は、回収可能で生存可能な細菌を生じず、凍結乾燥用のみの培地の使用は、不十分な回収をもたらした。ソルビトールを含む配合物は、凍結乾燥ケーキの形成が乏しかった。スクロースとトレハロースの両方で生存能力が得られたので、ヒスチジンを緩衝液として選択した。配合物６および１０をさらに評価した。
【０１１１】
表５：凍結乾燥配合物
【表５】
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【０１１２】
表６：凍結乾燥試料の生存能力
【表６】
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＊配合物は表５に示す配合物に対応する。
＾試料の汚染あり；値の決定不可能。
【０１１３】
例３
概要
選択された数の最適化された凍結乾燥配合物を、８つの異なる嫌気性株の凍結乾燥について評価した。実験計画を図１に示す。
【０１１４】
細菌培養
表７に示す細菌株の各々の接種物を、単一コロニーから開始して表８に示すＯＤに到達させ、次いでより大きいフラスコに移した。細菌の４０ｍｌのアリコートをペレット化した。ペレット化した細菌のｃｆｕを図５に示す。
表７：例３で使用した細菌株
【表７】
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細菌株は、配列相同性／同一性によって識別された、最も近い既知の類縁により識別された。
【０１１５】
表８：例３に使用した細菌株のＯＤ６００
【表８】
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【０１１６】
凍結乾燥緩衝液の調製
２つの凍結乾燥配合物を評価した：
−配合物Ａ：２０ｍＭのヒスチジンｐＨ７．０、１％の酵母エキス、０．０５％のシステインおよび７．５％のトレハロース、重量オスモル濃度３０５ｍＯｓｍｏ／ｋｇ。
−配合物Ｂ：２０ｍＭのヒスチジンｐＨ７．０、１％の酵母エキス、０．０５％のシステインおよび７．０の％スクロース、重量オスモル濃度３１５ｍＯｓｍｏ／ｋｇ。
配合物は、嫌気性チャンバー内で調製した。細菌ペレットを含有する１６本の５０ｍｌコニカルチューブを使用した。各チューブ内の細菌数は株ごとに異なり、１．４×１０７〜２．７５×１０９ｃｆｕ／ｍｌの間で変動した（図５参照）。細菌ペレットを２０ｍｌの凍結乾燥配合物で２回洗浄し、３９００ｒｐｍで１０分間回転させた。配合物の重量オスモル濃度は、３０５〜３１５ミリオスモルの範囲であった。ペレットを、２０ｍｌの凍結乾燥配合物緩衝液に再懸濁し、４つのバイアルにそれぞれ充填した（２０ｍｌ中に５ｍｌ充填）。３つのバイアルを凍結乾燥し、１つのバイアルを対照として−８０℃に保った。バイアルに、直径２０ｍｍのタイプＩエラストマークロロブチルストッパーで部分的に栓をした。
【０１１７】
凍結乾燥サイクル：
凍結乾燥の実行は、下記の表９に示す凍結乾燥パラメータを用いて実施した。
表９：凍結乾燥サイクル
【表９】
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【０１１８】
凍結乾燥サイクルが完了すると、窒素を埋め戻して６００，０００ｍＴｏｒｒに到達させ、次いでバイアルに栓をしてバイアル中のＮ２を真空に保った。バイアルに栓をすると、埋め戻しが完了して７６０，０００ｍｔｏｒｒに達した。ガラスバイアル中の凍結乾燥試料を凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムクリンプキャップで速やかに密封して、大気の汚染を防ぎ、バイアルからのＮ２の放出を防いだ。一次および二次乾燥段階の完了は、設定の貯蔵圧力に達するピラニ圧力に基づいて決定された。全ての凍結乾燥容器を、生存能力試験の前に−２０℃で保存した。
【０１１９】
試料を４℃に１０分間冷却し、−５０℃で２時間凍結した。２つの配合物は異なるＴｇ’を有するため、一次乾燥は−２５℃に設定した。スクロースなどの非晶質糖は−３２℃の転移を有するが、一方トレハロースの転移温度（−２９℃）はスクロースより約３℃高いことが知られている。−２５℃での一次乾燥は、大部分の配合物が凍結乾燥中に転移未満に留まるように選択された。圧力プロファイルは、ピラニ圧力が約５６時間の凍結乾燥で１００ｍｔｏｒｒに達したことを示唆している。一次乾燥を６６時間に延長して、一次乾燥の終了を確実にした。結合水を二次乾燥の間に除去した。ピラニ圧力プロファイルに基づき、二次乾燥は７６時間の凍結乾燥で完了した。
【０１２０】
凍結乾燥サイクルの結果
各凍結乾燥配合物データの物理的外観は、いずれのケーキも崩壊していないことを示した。凍結乾燥ケーキの色は、細菌株によりわずかに異なった。
【０１２１】
凍結乾燥試料の生存能力
凍結乾燥ケーキを嫌気性チャンバーに移し、ケーキを、５ｍｌの試料を代表するものとして、５ｍｌの培地に開けて再懸濁した（ペプトン酵母エキスグルコース培地＋ツイーンに再懸濁）。希釈液を、１０１から１０６から１０７に準備し、１００μＬの各希釈液をEggerth Gagnonプレートに分配し、滅菌ガラスビーズを用いて広げた。５％のウマ血液が濃縮された還元前のEggerth Gagnonプレート上にプレーティングを行った。インキュベーションを３７℃で、嫌気性チャンバー内のインキュベーター内で行った。コロニー形成単位は、プレーティング後４８〜７２時間にカウントした。
凍結乾燥実験の結果および評価された試料の生存能力を、図５および表１０に示す。配合物ＡおよびＢは、細菌株２〜５および７〜８に対して良好な回収能力を提供する。
【０１２２】
凍結乾燥（フリーズドライ）と凍結のみの評価
凍結乾燥サイクルの、配合物ＡおよびＢでの細菌株に対する影響は、試料の凍結乾燥と、試料の凍結のみ（すなわち、試料を−８０℃で凍結するが試料を真空「凍結−融解」にさらさないこと）を比較することにより評価した。凍結融解試料の生存能力は、凍結乾燥サイクルを経た試料の生存能力と同じ方法で評価した。
凍結融解サイクル実験の結果を、図５および表１０に示す。配合物ＡおよびＢは、細菌株２〜５および７〜８に対して良好な安定性を提供する。株１および６をさらに評価した。
表１０：例３の生存能力結果
【表１０】
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【０１２３】
例４
凍結乾燥後の収量を改善するために、細菌株１および６（Clostridium bolteaeおよびDorea longicatena）の凍結乾燥配合物を、追加の賦形剤を用いてさらに評価した（表１１および１２）。株１および６は、それぞれＯＤ２．８３および１．２７で収穫された。培養物を遠心チューブに等分し、３５６０ＲＣＦで１０分間ペレット化した。上清を捨て、試験で使用するまで、ペレットをBD EZPakガス発生パウチを備えたBD EZPak嫌気性容器に入れた。
【０１２４】
生存能力試験の前に、ペレットを、試験する配合物緩衝液を用いて２回洗浄し、最終再懸濁物から５ｍＬをバイアルに等分し、それらを凍結乾燥した。凍結乾燥には、１００ｍＴｏｒｒで−２５℃の一次乾燥を使用し、１００ｍＴｏｒｒで２０℃の二次乾燥を使用した。凍結乾燥サイクルにおいて使用される温度勾配速度は、例１〜３において使用した１．０℃／分と比較して、条件間で２．５℃／分に増加した。
細菌株の生存能力を評価するために、最終凍結乾燥細菌を５ｍＬの培地に再懸濁し、プレーティングして、凍結乾燥後の生細胞数を決定した。配合物中の賦形剤および株１および６の結果を、それぞれ表１１および１２に示す。株１および６の凍結乾燥前の初期生細胞数は、それぞれ２．１４×１０９ＣＦＵ／ｍＬおよび５．１５×１０７ＣＦＵ／ｍＬであった。凍結乾燥後の平均は、２つのバイアルからの結果の平均である。
【０１２５】
表１１：株１の凍結乾燥配合物賦形剤および生存能力
【表１１】
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表１２：株６の凍結乾燥配合物賦形剤および生存能力
【表１２】
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【０１２６】
例５
この研究は、製造用の凍結乾燥プロセスをスケールアップするために使用されるであろう凍結乾燥トレイ（例えば、GORE（登録商標）Lyoguard（登録商標）凍結乾燥トレイ）における、凍結乾燥パラメータを評価するために行われた。例１〜４に記載された以前の研究は、２０ｍＬバイアル中で行われた。株３（Ruminococcus torques）の工学バッチを、別々の凍結乾燥トレイ中の配合物緩衝液のトレイと比較した。
細菌培養物を、７％スのクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のＬ−システイン、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ７．０の配合物緩衝液中にダイアフィルトレーションした１０リットルの発酵槽容量で増殖させた。凍結乾燥トレイを、７５０ｍＬの容量で満たした。凍結乾燥サイクルは、毎分１℃の傾斜速度で行った。凍結乾燥サイクルのデータを図６に示す。圧力プロファイルは、ピラニ圧力が４８時間で７０ｍＴｏｒｒに達したことを示す。結合水が二次乾燥中に除去され、ピラニは５７時間で７０ｍＴｏｒｒに達した。凍結乾燥後の凍結乾燥トレイの外観は、無傷で崩壊していない凍結乾燥ケーキを示し（データは示さず）、サイクルの妥当性を実証した。７０ｍＴｏｒｒおよび−１０℃を使用する一次乾燥ステップと、７０ｍＴｏｒｒおよび２０℃を使用する二次乾燥ステップとが、菌株３の凍結乾燥トレイ中での凍結乾燥に成功した。細菌組成物を凍結乾燥するためのこのスケールアップされた方法は、他の細菌株に適用することができる。
【０１２７】
例６
さらなる研究を行って、配合物中の賦形剤としての０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムおよび２．５℃／分の増加温度勾配を用いて、細菌の回収率を評価した。細菌株２（Anaerotruncus colihominis）の培養物を、１ｍＬのクライオバイアルを備えた５００ｍＬの遠心分離ボトルに接種した。培養物を一晩増殖させ、ＯＤ０．３２５で収穫した。この細菌をスピンダウンし、７％のスクロース、１％の酵母エキス、０．０５％のシステイン、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、および２０ｍＭヒスチジンを含有する凍結乾燥配合物緩衝液で洗浄した。細菌を再度ペレット化し、上清を捨て、ペレットを最終容量１００ｍＬの同じ凍結乾燥配合物緩衝液に再懸濁した。７ｍＬの再懸濁物を２０ｍＬバイアルに等分し、温度保持点の間で２．５℃／分の温度勾配速度を用いて凍結乾燥した。
【０１２８】
凍結乾燥前の株２の生存能力は、６．４×１０８ＣＦＵ／ｍＬと測定された。凍結乾燥後の生存能力は１．９３×１０８ＣＦＵ／ｍＬであり、３０％の生存率をもたらした。これは以前の実行からの改善された収率であったので、株２のために選択された配合物緩衝液は、０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウムを賦形剤として含んでいた。この実行に基づき、株２に対して２．５℃／分の凍結速度が選択され、これは、凍結乾燥中の全ステップ間の温度勾配速度の速度として使用された。
細菌株１〜８のそれぞれについての配合物および凍結乾燥サイクル条件を、表１３に示す。
表１３：凍結乾燥配合物および条件
【表１３】
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＊株の番号付けは表７に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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