(57)【要約】  本開示は、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）を拡大し、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）を、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞）へと分化させるための方法と、例えば、難聴および平衡感覚障害を処置するための候補治療用化合物を同定するための、内耳支持細胞および内耳有毛細胞の使用とに関する。加えて、本明細書で記載される方法は、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および分化の増大から利益を得る難聴および平衡感覚障害を有する対象の処置において使用することができる。
2019508033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
拡大された内耳支持細胞の集団を作製する方法であって、内耳支持細胞の集団を、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化剤；
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｆ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；
（ｇ）表Ｆに明示されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；
（ｈ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｊ）表Ｉに明示されたｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ
を含み、
前記１つまたは複数の薬剤が、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項２】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤が、Ｄｅｌｔａ様タンパク質活性化剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質活性化剤、Ｎｏｔｃｈ活性化剤、および／またはγ−セクレターゼ活性化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の薬剤が、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記拡大された内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
内耳支持細胞の集団の、内耳有毛細胞の集団への分化を促進する方法であって、内耳支持細胞の集団を、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｆ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｇ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｈ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；
（ｉ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および
（ｊ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ
を含み、
前記１つまたは複数の薬剤が、内耳有毛細胞の集団への分化を促進するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数の薬剤が、
（ａ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｃ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｄ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｅ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤が、Ｄｅｌｔａ様タンパク質阻害剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、および／またはγ−セクレターゼ阻害剤である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記内耳有毛細胞の集団が、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞の集団である、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の集団が、Ａｔｏｈ１＋蝸牛有毛細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の集団が、Ａｔｏｈ１＋前庭有毛細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストまたは表Ｋに明示されたレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニストである、請求項１から７および９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＡＲアゴニストが、ＲＡＲαアゴニスト、ＲＡＲβアゴニスト、および／またはＲＡＲγアゴニストである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＸＲアゴニストが、ＲＸＲαアゴニスト、ＲＸＲβアゴニスト、および／またはＲＸＲγアゴニストである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性化剤、リポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）活性化剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）活性化剤、アキシン阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）阻害剤、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）阻害剤、Ｇｒｏｕｃｈｏ阻害剤、および／またはＷｎｔ阻害性タンパク質（ＷＩＦ）阻害剤である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢＭＰシグナル伝達阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ活性化剤、Ｃｈｏｒｄｉｎ活性化剤、ＢＭＰ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ１／５／８阻害剤、ＳＭＡＤ２／３阻害剤、および／またはＳＭＡＤ４阻害剤である、請求項１から７および９から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤＫ活性化剤が、ｐ２７Ｋｉｐ１阻害剤および／または網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）阻害剤である、請求項１から７および９から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｅ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤が、Ａｔｏｈ１活性化剤である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＤＡＣクラスＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤、および／または汎ＨＤＡＣ阻害剤である、請求項１、２、および４から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤が、ＳＩＲＴ１阻害剤および／またはＳＩＲＴ２阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質分解阻害剤が、プロテアソーム阻害剤またはユビキチンリガーゼ阻害剤である、請求項１、２、および４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤が、Ａｋｔ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、および／またはＰＤＫ１阻害剤である、請求項１、２、４から７、および９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換え核酸分子、ならびにＡｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換え核酸分子を含み、前記第１のレポーター遺伝子が、前記第２のレポーター遺伝子と異なる、ヒト細胞。
【請求項２８】
前記内耳支持細胞マーカーが、Ｌｇｒ５である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記内耳有毛細胞マーカーが、Ａｔｏｈ１である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３０】
前記内耳支持細胞マーカーが、Ｌｇｒ５であり、前記内耳有毛細胞マーカーが、Ａｔｏｈ１である、請求項２８または２９に記載の細胞。
【請求項３１】
内耳支持細胞マーカーの前記調節エレメントが、Ｌｇｒ５プロモーターである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
内耳有毛細胞マーカーの前記調節エレメントが、Ａｔｏｈ１エンハンサーである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
前記Ａｔｏｈ１エンハンサーが、ＳＶ４０プロモーターまたはグロビンプロモーターに作動可能に連結された、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記第１のレポーター遺伝子が、第１の蛍光タンパク質をコードし、前記第２のレポーター遺伝子が、第２の蛍光タンパク質をコードし、前記第１の蛍光タンパク質が、前記第２の蛍光タンパク質と異なる、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
マウスのゲノムへと安定的に組み込まれた２つ以上の組換え核酸分子を有するトランスジェニックマウスであって、Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第１のレポーター遺伝子を含む少なくとも第１の組換え核酸分子、ならびにＡｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換え核酸分子を含み、前記第１のレポーター遺伝子が、前記第２のレポーター遺伝子と異なる、トランスジェニックマウス。
【請求項３６】
前記内耳支持細胞マーカーが、Ｌｇｒ５である、請求項３５に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３７】
前記内耳有毛細胞マーカーが、Ａｔｏｈ１である、請求項３５に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３８】
前記内耳支持細胞マーカーが、Ｌｇｒ５であり、前記内耳有毛細胞マーカーが、Ａｔｏｈ１である、請求項３６または３７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３９】
内耳支持細胞マーカーの前記調節エレメントが、Ｌｇｒ５プロモーターである、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４０】
内耳有毛細胞マーカーの前記調節エレメントが、Ａｔｏｈ１エンハンサーである、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４１】
前記Ａｔｏｈ１エンハンサーが、ＳＶ４０プロモーターまたはグロビンプロモーターに作動可能に連結された、請求項４０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４２】
前記第１のレポーター遺伝子が、第１の蛍光タンパク質をコードし、前記第２のレポーター遺伝子が、第２の蛍光タンパク質をコードし、前記第１の蛍光タンパク質が、前記第２の蛍光タンパク質と異なる、請求項３５から４１のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４３】
請求項３５から４２のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスから単離された細胞であって、前記第１の組換え核酸分子および前記第２の組換え核酸分子を含む細胞。
【請求項４４】
前記トランスジェニックマウスの内耳から単離される、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）内耳支持細胞の集団を、請求項３５から４２のいずれか一項に記載のマウスから単離するステップ；
（ｂ）前記内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップ；
（ｃ）被験化合物を、前記拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；
（ｄ）前記被験化合物の存在下での、前記拡大された内耳支持細胞の集団内の前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子の前記発現レベルを検出するステップ；ならびに
（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、前記第１のレポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における前記第１のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させ、かつ／または前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項４６】
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、１つまたは複数の成長因子、好ましくは、表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および／またはインスリン様成長因子（ＩＧＦ１）の存在下における培地、好ましくは、ＤＭＥＭおよびＦ１２培地の混合物、好ましくは１：１の混合物を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｆ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、または表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
（ｇ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｈ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｊ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、表１に明示された１つまたは複数の薬剤を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、Ｎ２、Ｂ２７、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＶＰＡを補充した培地、好ましくは、ＤＭＥＭおよびＦ１２の１：１の混合物を含む、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記候補薬剤が、低分子、化合物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、および後成的修飾剤からなる群から選択される、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
最初にコルチ器を切開するステップと、感覚上皮を単離するステップと、単一細胞の懸濁液を創出するステップとを含む方法により、前記内耳支持細胞の集団を前記マウスの蝸牛から単離する、請求項４５から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１のレポーター遺伝子が、第１の蛍光タンパク質をコードし、前記第２のレポーター遺伝子が、第２の蛍光タンパク質をコードし、前記第１の蛍光タンパク質が、前記第２の蛍光タンパク質と異なる、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルが、タンパク質の発現レベルである、請求項４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下でレポーター遺伝子を含む組換え核酸分子を安定的に組み込んだ内耳支持細胞の集団を用意するステップ；
（ｂ）前記内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであり、前記条件が、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤、
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤、
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤、
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤、
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤、
（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、
（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤、
（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤、
（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤、および
（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、ステップ；
（ｃ）被験化合物を、前記拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；
（ｄ）前記被験化合物の存在下での、前記拡大された内耳支持細胞の集団内の前記レポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに
（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、前記レポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における前記レポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項５７】
蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）Ａｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下でレポーター遺伝子を含む組換え核酸分子を安定的に組み込んだ内耳支持細胞の集団を用意するステップ；
（ｂ）前記内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであり、前記条件が、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤、
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤、
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤、
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤、
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤、
（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、
（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤、
（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤、
（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤、および
（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、ステップ；
（ｃ）被験化合物を、前記拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；
（ｄ）前記被験化合物の存在下での、前記拡大された内耳細胞の集団内の前記レポーター遺伝子の前記発現レベルを検出するステップ；ならびに
（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、前記レポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における前記レポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項５８】
前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記拡大された内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である、請求項５６から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記内耳支持細胞の集団を、ヒトから単離する、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記内耳支持細胞の集団を、マウスから単離する、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項５６から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、それを必要とする前記対象へと、
（ａ）治療有効量の、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；
（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または
（ｂ）治療有効量の、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｉｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤
のうちの一方または両方を投与するステップを含む方法。
【請求項６７】
それを必要とする前記対象へと、
（ａ）治療有効量の、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または
（ｂ）治療有効量の、
（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤
のうちの一方または両方を投与するステップを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つまたは複数の薬剤を、全身投与するか、または前記対象の耳へと投与する、好ましくは、前記対象の中耳へと経鼓膜投与する、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤を、前記内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の前に投与する、請求項６６から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の内耳支持細胞を、任意選択でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；
（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）任意選択で、前記拡大された内耳支持細胞の集団を、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；
（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および
（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；ならびに
（ｃ）前記内耳有毛細胞を、前記対象の耳（任意選択で、内耳）へと投与するステップ
を含む方法。
【請求項７１】
難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の内耳支持細胞を、任意選択でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；
（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；ならびに
（ｂ）前記拡大された内耳支持細胞の集団を、前記対象の耳（好ましくは、内耳）へと、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；
（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および
（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の投与と組み合わせて、好ましくは、これと同時にまたはこの前に投与するステップ
を含む方法。
【請求項７２】
（ａ）前記内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤が、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択され；
（ｂ）前記内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤が、
（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、請求項６６から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである、請求項６６から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記内耳支持細胞が、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞である、請求項６６から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記内耳有毛細胞が、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞である、請求項６６から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象が、平衡感覚障害を有する、請求項６６から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記対象が、難聴を有する、請求項６６から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記難聴が、感覚神経的難聴である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記難聴が、遺伝性欠損もしくは先天性欠損、外傷、老化、または化学物質誘導性中毒性難聴の結果である、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象が、ヒトである、請求項６６から７９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年１月２９日出願の米国仮出願第６２／２８８，９５８号明細書の利益を主張する。前出の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書では、哺乳動物の内耳の感覚上皮からの内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）を拡大し分化させるための方法と、例えば、難聴または平衡感覚障害を処置するための候補治療用化合物を同定するための、拡大された細胞の使用とが記載される。加えて、本明細書で記載される方法は、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖の増大と、その内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞）への分化とから利益を得る、難聴または平衡感覚障害の処置において使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
聴力機能障害は、ＷＨＯにより、世界人口のうちの５％以上（３２００万人の小児を含む、３億６０００万人）に影響を及ぼすと推定されている、健康面での大きな課題である。音を検出しそれらの信号を聴覚神経を介して脳へと伝送する感覚有毛細胞は、損傷を受けやすい。喪失の後、有毛細胞は、置き換わることがなく１、２、したがって、出生後の生涯の開始においても少ない細胞の数（耳１つ当たり１５，０００個）は、年齢と共に減少の一途をたどり、細胞の置きかえがなければ、難聴の後天性形態の有病率が高まる。実際、騒音への曝露、耳毒性薬物、ウイルス／細菌感染、および老化により典型的に引き起こされる、有毛細胞および聴覚神経の損傷は、難聴の全症例のうちの８０％を超える症例の原因となっている３。聴力機能障害に加えて、感覚有毛細胞の損傷または喪失は、平衡感覚機能障害、および平衡感覚機能障害に関連する疾患、例えば良性発作性頭位めまい（ＢＰＰＶ）も引き起こしうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、少なくとも部分的に、哺乳動物の内耳の感覚上皮からの内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞、例えばＬｇｒ５＋蝸牛支持細胞またはＬｇｒ５＋前庭支持細胞）を拡大するための方法と、例えば、難聴または平衡感覚障害を処置するための候補治療用化合物を同定するために拡大された細胞の使用との発見に基づく。加えて、本明細書では、スクリーニングした化合物を、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖の増大、および／または内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞）の数の増大から利益を得る、難聴または平衡感覚障害の処置において使用するための方法が記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様では、本発明は、拡大された内耳支持細胞の集団を作製する方法を特色とする。方法は、内耳支持細胞の集団を、（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｃ）表Ｂに明示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤；（ｄ）表Ｃに明示されたサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化剤；（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｆ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｇ）表Ｆに明示されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；（ｈ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｊ）表Ｉに明示されたｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と接触させるステップを含み、この場合、１つまたは複数の薬剤は、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な量で存在する。
【０００６】
本発明の第１の態様についての一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤は、Ｄｅｌｔａ様タンパク質活性化剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質活性化剤、Ｎｏｔｃｈ活性化剤、および／またはγ−セクレターゼ活性化剤である。
【０００７】
本発明の第１の態様についての一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤からなる群から選択される。
【０００８】
本発明の第１の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団は、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である。一部の実施形態では、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団は、拡大されたＬｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団である。一部の実施形態では、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団は、拡大されたＬｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である。
【０００９】
第２の態様では、本発明は、内耳支持細胞の集団の、内耳有毛細胞の集団への分化を促進する方法を特色とする。方法は、内耳支持細胞の集団を、（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｆ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｇ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｈ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および（ｊ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と接触させるステップを含み、この場合、１つまたは複数の薬剤は、内耳有毛細胞の集団への分化を促進するのに十分な量で存在する。
【００１０】
本発明の第２の態様についての一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、（ａ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｂ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｃ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｄ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および（ｅ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の第２の態様についての一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤は、Ｄｅｌｔａ様タンパク質阻害剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、および／またはγ−セクレターゼ阻害剤である。
【００１２】
本発明の第２の態様についての一部の実施形態では、内耳有毛細胞の集団は、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の集団である。一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の集団は、Ａｔｏｈ１＋蝸牛有毛細胞の集団である。一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の集団は、Ａｔｏｈ１＋前庭有毛細胞の集団である。
【００１３】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤は、表Ｋに明示されたレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、および／または表Ｋに明示されたレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニストである。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストは、ＲＡＲαアゴニスト、ＲＡＲβアゴニスト、および／またはＲＡＲγアゴニストである。一部の実施形態では、ＲＸＲアゴニストは、ＲＸＲαアゴニスト、ＲＸＲβアゴニスト、および／またはＲＸＲγアゴニストである。
【００１４】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性化剤、リポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）活性化剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）活性化剤、アキシン阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）阻害剤、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）阻害剤、Ｇｒｏｕｃｈｏ阻害剤、および／またはＷｎｔ阻害性タンパク質（ＷＩＦ）阻害剤である。
【００１５】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎ活性化剤、Ｃｈｏｒｄｉｎ活性化剤、ＢＭＰ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ１／５／８阻害剤、ＳＭＡＤ２／３阻害剤、および／またはＳＭＡＤ４阻害剤である。
【００１６】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、ＣＤＫ活性化剤は、ｐ２７Ｋｉｐ１阻害剤および／または網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）阻害剤である。
【００１７】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、Ｅ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤は、Ａｔｏｈ１活性化剤である。
【００１８】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣクラスＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤、および／または汎ＨＤＡＣ阻害剤である。一部の実施形態では、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤は、ＳＩＲＴ１阻害剤および／またはＳＩＲＴ２阻害剤である。
【００１９】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、タンパク質分解阻害剤は、プロテアソーム阻害剤またはユビキチンリガーゼ阻害剤である。
【００２０】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤は、Ａｋｔ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、および／またはＰＤＫ１阻害剤である。
【００２１】
本発明の第１の態様および第２の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞の集団は、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である。一部の実施形態では、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団は、Ｌｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団である。一部の実施形態では、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団は、Ｌｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、マウスのゲノムへと安定的に組み込まれた、２つ以上の組換え核酸分子を有するトランスジェニックマウスを特色とする。２つ以上の組換え核酸分子は、Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第１のレポーター遺伝子を含む少なくとも第１の組換え核酸分子、ならびにＡｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換え核酸分子を含み、この場合、第１のレポーター遺伝子は、第２のレポーター遺伝子と異なる。
【００２３】
本発明の第３の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞マーカーは、Ｌｇｒ５である。
【００２４】
本発明の第３の態様についての一部の実施形態では、内耳有毛細胞マーカーは、Ａｔｏｈ１である。
【００２５】
本発明の第３の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞マーカーは、Ｌｇｒ５であり、内耳有毛細胞マーカーは、Ａｔｏｈ１である。
【００２６】
本発明の第３の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞マーカーの調節エレメントは、Ｌｇｒ５プロモーターである。
【００２７】
本発明の第３の態様についての一部の実施形態では、内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントは、Ａｔｏｈ１エンハンサーである。一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１エンハンサーは、プロモーターエレメント、例えば、ＳＶ４０プロモーターまたはグロビンプロモーターに作動可能に連結される。
【００２８】
本発明の第３の態様についての一部の実施形態では、第１のレポーター遺伝子は、第１の蛍光タンパク質をコードし、第２のレポーター遺伝子は、第２の蛍光タンパク質をコードし、第１の蛍光タンパク質は、第２の蛍光タンパク質と異なる。
【００２９】
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様のトランスジェニックマウスから単離された細胞を特色とする。細胞は、第１の組換え核酸分子および第２の組換え核酸分子を含む。
【００３０】
本発明の第４の態様についての一部の実施形態では、細胞は、トランスジェニックマウスの内耳から単離される。
【００３１】
本発明の第５の態様では、本発明は、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する、難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、（ａ）内耳支持細胞の集団を、請求項２９から３６のいずれか一項に記載のマウスから単離するステップ；（ｂ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップ；（ｃ）被験化合物を、拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；（ｄ）被験化合物の存在下での、拡大された内耳支持細胞の集団内の第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、第１のレポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における第１のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させ、かつ／または第２のレポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における第２のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップを含む方法を特色とする。
【００３２】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件は、１つまたは複数の成長因子、例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および／またはインスリン様成長因子（ＩＧＦ１）の存在下における培地、例えば、ＤＭＥＭおよびＦ１２培地の混合物、例えば１：１の混合物を含む。一部の実施形態では、内耳支持細胞の集団を、２日間以上の日数、例えば、２日間〜１０日間の間、例えば、２日間〜５日間の間にわたり培養する。
【００３３】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件は、（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｆ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、または表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；（ｇ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｈ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｊ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤をさらに含む。
【００３４】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤は、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである。
【００３５】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件は、表１に明示された、１つまたは複数の薬剤を含む。
【００３６】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件は、Ｎ２、Ｂ２７、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＶＰＡを補充した培地、例えば、ＤＭＥＭおよびＦ１２の１：１の混合物を含む。
【００３７】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、候補薬剤は、低分子、化合物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、および後成的修飾剤からなる群から選択される。
【００３８】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、最初にコルチ器を切開するステップと、感覚上皮を単離するステップと、単一細胞の懸濁液を創出するステップとを含む方法により、内耳支持細胞の集団をマウスの蝸牛から単離する。本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞の集団を、マウスの内耳の前庭から単離する。
【００３９】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞の集団は、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である。
【００４０】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、第１のレポーター遺伝子は、第１の蛍光タンパク質をコードし、第２のレポーター遺伝子は、第２の蛍光タンパク質をコードし、第１の蛍光タンパク質は、第２の蛍光タンパク質と異なる。
【００４１】
本発明の第５の態様についての一部の実施形態では、第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の発現レベルは、タンパク質の発現レベルである。
【００４２】
第６の態様では、本発明は、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、（ａ）Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下でレポーター遺伝子を含む組換え核酸分子を安定的に組み込んだ内耳支持細胞の集団を用意するステップ；（ｂ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであり、条件が、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤、（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤、（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤、（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤、（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤、（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤、（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示された タンパク質分解阻害剤、（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤、および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、ステップ；（ｃ）被験化合物を、拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；（ｄ）被験化合物の存在下での、拡大された内耳支持細胞の集団内のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、レポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下におけるレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップを含む方法を特色とする。
【００４３】
第７の態様では、本発明は、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、（ａ）Ａｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下でレポーター遺伝子を含む組換え核酸分子を安定的に組み込んだ内耳支持細胞の集団を用意するステップ；（ｂ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであり、条件が、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤、（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤、（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤、（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤、（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤、（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤、（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示された タンパク質分解阻害剤、（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤、および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、ステップ；（ｃ）被験化合物を、拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；（ｄ）被験化合物の存在下での、拡大された内耳細胞の集団内のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、レポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下におけるレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップを含む方法を特色とする。
【００４４】
本発明の第６の態様および第７の態様についての一部の実施形態では、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤は、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである。
【００４５】
本発明の第６の態様および第７の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件は、（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む。
【００４６】
本発明の第６の態様および第７の態様についての一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団は、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団である。一部の実施形態では、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団は、拡大されたＬｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団である。一部の実施形態では、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団は、拡大されたＬｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である。
【００４７】
本発明の第６の態様および第７の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞の集団を、ヒトから単離する。一部の実施形態では、内耳支持細胞の集団を、マウスから単離する。
【００４８】
本発明の第６の態様および第７の態様についての一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。
【００４９】
第８の態様では、本発明は、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、（ａ）治療有効量の、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または（ｂ）治療有効量の、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤のうちの一方または両方を投与するステップを含む方法を特色とする。
【００５０】
本発明の第８の態様についての一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象へと、（ａ）治療有効量の、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または（ｂ）治療有効量の、（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤のうちの一方または両方を投与するステップを含む。
【００５１】
本発明の第８の態様についての一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤を、全身投与する。本発明の第８の態様についての一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤を、例えば対象の耳へと、局所投与する、例えば、対象の中耳へと経鼓膜投与する。
【００５２】
本発明の第８の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤を、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の前に投与する。
【００５３】
第９の態様では、本発明は、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、（ａ）１つまたは複数の内耳支持細胞を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；（ｂ）任意選択で、拡大された内耳支持細胞の集団を、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤および（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；ならびに（ｃ）内耳有毛細胞を、対象の耳（例えば、内耳）へと投与するステップを含む方法を特色とする。
【００５４】
第１０の態様では、本発明は、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、（ａ）１つまたは複数の内耳支持細胞を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；ならびに（ｂ）拡大された内耳支持細胞の集団を、対象の耳（例えば、内耳）へと、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の投与と組み合わせて、例えば、これと同時にまたはこの前に投与するステップを含む方法を特色とする。
【００５５】
本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、（ａ）内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤は、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤からなる群から選択され、（ｂ）内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤は、（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される。
【００５６】
本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤は、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである。
【００５７】
本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、内耳支持細胞は、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞である。
【００５８】
本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、内耳有毛細胞は、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞である。
【００５９】
本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、対象は、平衡感覚障害を有する。本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、対象は、難聴（例えば、感覚神経的難聴）を有する。一部の実施形態では、難聴は、遺伝性欠損もしくは先天性欠損、外傷（例えば、物理的外傷または騒音関連の傷害による外傷）、老化、または化学物質誘導性中毒性難聴の結果である。一部の実施形態では、難聴は、感染（例えば、ウイルス感染または細菌感染）の結果である。
【００６０】
本発明の第８の態様、第９の態様、および第１０の態様についての一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００６１】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書では、本発明における使用のための方法および材料について記載するが、当技術分野では、他の適切な方法および材料も公知であり、これらもまた使用することができる。材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。齟齬が生じる場合は、定義を含む本明細書に従う。
【００６２】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００６３】
定義
本明細書で使用される内耳支持細胞の「拡大された集団」という用語は、集団内の内耳支持細胞の数量が、本明細書で記載される１つまたは複数の薬剤（例えば、レチノイド受容体シグナル伝達の活性化、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性化、Ｅ  ｂｏｘ依存性転写の活性化、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害、タンパク質分解の阻害、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達の阻害、およびｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化などの１つまたは複数の活性を呈示する、１つまたは複数の薬剤）を投与する前における内耳支持細胞の数を超える（例えば、少なくとも１０％超える、少なくとも２０％超える、少なくとも３０％超える）ような、少なくとも１を超える内耳支持細胞を含む細胞の集団を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「内耳支持細胞」という用語は、有毛細胞（例えば、蝸牛支持細胞および前庭支持細胞）間に存在し、有毛細胞が機能することを可能とする上皮内の環境を維持し、音の刺激時および頭部の運動時における感覚器官の構造的完全性を支持することなど、多様な機能のセットを果たす非感覚細胞を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「内耳有毛細胞」という用語は、内耳の骨迷路の蝸牛または前庭のコルチ器内に存在する感覚細胞を指す。内耳有毛細胞は、音波を、電気信号として、脳へと伝送する一因となる。蝸牛の内耳有毛細胞への損傷は、聴覚感度の低下または難聴を結果としてもたらしうる。前庭の内耳有毛細胞への損傷は、平衡感覚機能障害または平衡感覚障害を結果としてもたらしうる。
【００６６】
本明細書で使用される「レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤」とは、１つまたは複数のレチノイド受容体（例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、およびＲＸＲγ）に結合し、これを活性化させ、これにより、活性化レチノイド受容体が結合する標的遺伝子の転写活性に影響を及ぼす化合物を指す。レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤は、汎レチノイド受容体活性化剤の場合もあり、１つまたは複数のレチノイド受容体に対する選択性を呈示する場合もある。レチノイド受容体シグナル伝達の活性化剤の例は、表Ｋに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用される「Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤」とは、カノニカルのＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを指す。この経路のアゴニストは、Ｗｎｔタンパク質または哺乳動物細胞の核内のβ−カテニンの濃度の増大を促進するような形で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよびリポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）の共受容体タンパク質（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性化剤、ＬＲＰ５／６活性化剤）に直接結合する他の化合物をさらに含む。代替的に、β−カテニン／Ｗｎｔ経路アゴニストは、Ｗｎｔタンパク質に結合し、これが、内因性Ｗｎｔ共受容体と相互作用することから隔離する、１つまたは複数の分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）（例えば、ｓＦＲＰ阻害剤）またはＷｎｔ阻害剤性タンパク質（ＷＩＦ）（例えば、ＷＩＦ阻害剤）を阻害することにより機能しうる。Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤の例はまた、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）活性化剤、アキシン阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）阻害剤、およびＧｒｏｕｃｈｏ阻害剤も含むがこれらに限定されない。ＧＳＫ−３βは、アキシン、ＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）、およびβ−カテニンと複合体を形成して、プロテアソームによる下流の分解のために、β−カテニンを準備するキナーゼである。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）は、活性化Ｎｏｔｃｈ受容体から、下流のエフェクターへと、シグナルを受け渡す細胞内タンパク質である。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）は、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄにより動員され、β−カテニンの構成的破壊を防止する。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）は、ＬＲＰ５／６共受容体タンパク質を隔絶させ、これにより、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するように作用する分泌型タンパク質である。Ｇｒｏｕｃｈｏは、核内のＴＬＥと複合体を形成して、遺伝子発現を抑制するタンパク質である。β−カテニンは、核に進入すると、Ｇｒｏｕｃｈｏ／ＴＬＥ複合体を破壊して、遺伝子発現を活性化させる。Ｗｎｔ活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる低分子化合物を指す。
【００６８】
β−カテニン／Ｗｎｔ経路アゴニストの活性を決定するのに使用しうる例示的な方法は、限定されるものではないが、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子の制御下で、レポーター遺伝子の発現をモニタリングすることのほか、米国特許出願公開第２０１４／００４４７６３号明細書に記載されているＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイを含む。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の例は、表Ａに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される「骨形成性タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤」とは、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストを指す。ＢＭＰは、リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、ＢＭＰシグナル伝達のモジュレーターを、本発明の方法と共に使用して、例えば、内耳支持細胞を拡大するか、または内耳支持細胞を、内耳有毛細胞へと分化させることができる。ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達経路に関与するタンパク質を阻害する、任意のタンパク質または低分子化合物を含む。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤の例は、Ｎｏｇｇｉｎ活性化剤、Ｃｈｏｒｄｉｎ活性化剤、ＢＭＰ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ１／５／８阻害剤、ＳＭＡＤ２／３阻害剤、およびＳＭＡＤ４阻害剤を含むがこれらに限定されない。ＮｏｇｇｉｎおよびＣｈｏｒｄｉｎは、ＢＭＰの、ＢＭＰ受容体への結合を阻害するアンタゴニストである。ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰからのシグナルを伝達する。活性化ＢＭＰ受容体は、転写因子であるＳＭＡＤ１／５／８を動員し、リン酸化する。リン酸化ＳＭＡＤ１／５／８は、ＳＭＡＤ４と相互作用して、核へと移行して、遺伝子発現を調節する複合体を形成する。ＢＭＰ受容体は、アクチビンまたはアクチビン様リガンドからのシグナルを伝達する。活性化ＢＭＰ受容体は、転写因子であるＳＭＡＤ２／３を動員し、リン酸化する。リン酸化ＳＭＡＤ２／３は、ＳＭＡＤ４と相互作用して、核へと移行して、遺伝子発現を調節する複合体を形成する。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤の例は、表Ｂに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される「サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化剤」とは、ＣＤＫのアゴニストを指す。ＣＤＫは、細胞周期の調節に関与する、セローム／トレオニンキナーゼのファミリーである。ＣＤＫは、調節性タンパク質であるサイクリンに結合して、活性化キナーゼを形成する。ＣＤＫ活性化剤は、ＣＤＫと相互作用して、その活性を増大させる、タンパク質または低分子化合物の場合もあり、ＣＤＫと相互作用するタンパク質と相互作用して、ＣＤＫの活性を間接的に増大させる、タンパク質または低分子化合物の場合もある。ＣＤＫ活性化剤は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ｐ２７Ｋｉｐ１阻害剤）または網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）阻害剤の阻害剤でありうる。タンパク質であるｐ２７Ｋｉｐ１は、サイクリン−ＣＤＫ２複合体およびサイクリン−ＣＤＫ４複合体と相互作用する細胞周期調節性タンパク質であり、細胞周期の進行を、Ｇ１で阻害する。Ｒｂは、これもまた、細胞周期の進行を、Ｇ１で阻害する、腫瘍抑制タンパク質である。
【００７１】
本明細書で使用される「Ｅ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤」とは、Ｅ  ｂｏｘに結合して、Ｅ  ｂｏｘの下流の遺伝子の発現を活性化させる、タンパク質（例えば、転写因子）化合物を指す。Ｅ  ｂｏｘとは、遺伝子発現を調節するタンパク質結合性部位として作用するＤＮＡ応答エレメントである、エンハンサーｂｏｘを指す。転写因子は、Ｅ  ｂｏｘに結合して、遺伝子の転写を誘発する。Ｅ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤の例は、Ａｔｏｈ１の発現を上方調節するＡｔｏｈ１活性化剤である。Ａｔｏｈ１は、耳内の神経感覚の発生の調節に関与する、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。
【００７２】
本明細書で使用される「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤」とは、Ｎｏｔｃｈ経路機能の活性化を促進するタンパク質または低分子化合物を指す。本明細書で使用される「Ｎｏｔｃｈ経路機能」という用語は、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインの核移行、ＲＢＰ−Ｊκまたはそのショウジョウバエ（Drosophila）属の相同体であるＳｕ（Ｈ）（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓ）の核移行；Ｅ（ｓｐｌ）（Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｓｐｌｉｔ）複合体のｂＨＬＨ遺伝子、例えば、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄの活性化；ＨＥＳ−１遺伝子またはＫＢＦ２（また、ＣＢＦ１とも称する）遺伝子の活性化；ショウジョウバエ（Drosophila）属の神経芽細胞のセグリゲーションの阻害；およびＮｏｔｃｈの、Ｄｅｌｔａタンパク質、Ｊａｇｇｅｄ／Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｄｅｌｔｅｘ、もしくはＲＢＰ−Ｊκ／Ｓｕ（Ｈ）（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓ）、またはこれらの相同体もしくは類似体への結合を含むがこれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路により媒介される機能を指す。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達によりもたらされる、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のカスケードおよび表現型については、例えば、それらの各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる、Kopan et al., Cell 137:216-233 (2009) and Jarriault, et al., Mol. Cell. Biol. 18:7423-7431 (1998)に記載されている。
【００７３】
Ｎｏｔｃｈアゴニストの例については、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３６９９７３号明細書、および米国特許第７，３９９，６３３号明細書に記載されており、それらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＮｏｔｃｈアゴニストは、限定するものではないが、Ｎｏｔｃｈタンパク質、ならびにその類似体、誘導体、および断片；Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を伝搬する他のタンパク質、ならびにその類似体、誘導体、および断片；Ｎｏｔｃｈ受容体活性を刺激する活性化抗体、およびアゴニスト活性を保持するその抗原結合性断片；Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を強化するタンパク質をコードする核酸；ならびに、Ｎｏｔｃｈ経路活性を促進するように、Ｎｏｔｃｈタンパク質もしくはＮｏｔｃｈ経路内の他のタンパク質に結合するか、またはこれらと他の形で相互作用する、これらのタンパク質、誘導体、および類似体を含む。このようなアゴニストは、Ｎｏｔｃｈタンパク質およびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを含有するその誘導体、前出をコードするＮｏｔｃｈ核酸、ならびにＮｏｔｃｈリガンドのＮｏｔｃｈ相互作用ドメインに接触するタンパク質（例えば、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅの細胞外ドメイン）を含むがこれらに限定されない。
【００７４】
他のＮｏｔｃｈアゴニストは、Ｄｅｌｔａ様タンパク質活性化剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質活性化剤、Ｎｏｔｃｈ活性化剤、およびγ−セクレターゼ活性化剤を含むがこれらに限定されない。Ｄｅｌｔａ様タンパク質およびＪａｇｇｅｄタンパク質は、隣接細胞上のＮｏｔｃｈ受容体と相互作用して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化させる膜貫通タンパク質である。ガンマ−セクレターゼとは、Ｎｏｔｃｈ受容体発現細胞の細胞膜の内部小葉内のＮｏｔｃｈ受容体の一部を切断する酵素である。γ−セクレターゼによる切断は、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインを放出し、次いで、これが、核へと移行して、遺伝子発現を調節する。Ｎｏｔｃｈ活性化剤とは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化させる低分子化合物を指す。他のＮｏｔｃｈアゴニストは、ＲＢＰＪκ／Ｓｕ（Ｈ）（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓ）またはＤｅｌｔｅｘを含むがこれらに限定されない。加えて、Ｆｒｉｎｇｅは、例えば、Ｄｅｌｔａタンパク質と共に、Ｎｏｔｃｈ活性を増強するのに使用されうる。これらのタンパク質、これらの断片、および誘導体を、組換えにより発現させ、単離することもでき、化学合成することもできる。
【００７５】
本明細書で使用される「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤」とは、Ｎｏｔｃｈ経路機能を阻害する、タンパク質または低分子化合物を指す。「Ｎｏｔｃｈ経路機能」という用語については、上記で記載した。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化に関与する、１つまたは複数のタンパク質の活性を阻害しうる。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に関与する、１つまたは複数のタンパク質の活性を活性化させうる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤は、Ｄｅｌｔａ様タンパク質阻害剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、および／またはγ−セクレターゼ阻害剤を含むがこれらに限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤の例は、表Ｊに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される「ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤」とは、１つまたは複数のＨＤＡＣに結合し、これを阻害し、これにより、ＨＤＡＣの酵素活性に影響を及ぼす化合物を指す。ＨＤＡＣとは、ヒストンのＮ末端におけるリシン残基のε−アミノ基からの、アセチル基の除去を触媒する酵素のファミリーのうちのいずれか１つを指す。文脈によりそうでないことが指し示されない限りにおいて、「ヒストン」という用語は、任意の種に由来する、ＨＩ、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、およびＨ５を含む、任意のヒストンタンパク質を指すことを意図する。ヒトＨＤＡＣタンパク質は、４つのクラスに分けられる。クラスＩは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、およびＨＤＡＣ８を含み；クラスＩＩは、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、およびＨＤＡＣ９を含み；クラスＩＩＩは、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７を含み；クラスＩＶは、ＨＤＡＣ１１を含む。ＨＤＡＣ阻害剤は、汎ＨＤＡＣ阻害剤の場合もあり、１つまたは複数のＨＤＡＣに対する選択性を呈示する場合もある。ＨＤＡＣ阻害剤の例は、表Ｆに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用される「タンパク質分解阻害剤」とは、タンパク質分解経路、例えば、ユビキチン−プロテアソーム分解経路を阻害する化合物を指す。タンパク質分解阻害剤は、タンパク質分解経路、例えば、ユビキチン−プロテアソーム分解経路に関与するタンパク質のうちの１つまたは複数の活性を阻害しうる。例えば、タンパク質分解阻害剤は、プロテアソームを阻害する低分子化合物（例えば、プロテアソーム阻害剤）、すなわち、プロテアソームの１９Ｓまたは２０Ｓを阻害する低分子化合物、またはユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を阻害する低分子化合物、ユビキチンコンジュゲート酵素（Ｅ２）を阻害する低分子化合物、および／もしくはユビキチンリガーゼ（Ｅ３）を阻害する低分子化合物（例えば、ユビキチンリガーゼ阻害剤）でありうる。ユビキチン−プロテアソーム分解経路では、タンパク質は、共因子であるユビキチンへの連結によって、プロテアソームによる分解のためにマーキングされる。Ｅ１はまず、ユビキチンとチオエステル結合を形成する。この反応は、後続の、ユビキチンの、Ｅ２への結合を可能とし、Ｅ２が、Ｅ１に置き換わる。最後に、Ｅ３リガーゼが、ユビキチンのカルボキシ末端と、基質タンパク質上のリシン残基との、イソペプチド結合を形成する。多数のＥ３リガーゼは、各々が、基質タンパク質のサブセットだけを修飾するという意味で、特異性をもたらす。さらなる特異性は、リン酸化を含むがこれに限定されない、基質タンパク質の翻訳後修飾によりにより達成される。タンパク質分解阻害剤の例は、表Ｇに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
本明細書で使用される「ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤」とは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達に関与する、１つまたは複数のタンパク質を阻害する化合物を指す。Ａｋｔとは、代謝、成長、増殖、生存、転写、およびタンパク質の合成など、多様な細胞の機能を調節するセリン／トレオニンキナーゼ（また、タンパク質キナーゼＢまたはＰＫＢとしても公知である）である。Ａｋｔシグナル伝達カスケードは、受容体チロシンキナーゼ、インテグリン、Ｂ細胞受容体およびＴ細胞受容体、サイトカイン受容体、Ｇタンパク質共役受容体、およびホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）による、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）三リン酸（ＰＩＰ３）の産生を誘導する、他の刺激により活性化する。これらの脂質は、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを擁するタンパク質であって、Ａｋｔおよびその上流の活性化剤であるＰＤＫ１を含むタンパク質の形質膜ドッキング部位として用いられる。膜では、ＰＤＫ１は、Ａｋｔをリン酸化し、Ａｋｔの部分的な活性化をもたらす。ＡｋｔのｍＴＯＲＣ２によるリン酸化は、完全な酵素活性を刺激する。ＤＮＡ−ＰＫを含む、ＰＩ３Ｋ関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）ファミリーのメンバーもまた、Ａｋｔをリン酸化しうる。Ａｋｔは、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）およびＰＨドメインロイシンリッチリピート含有タンパク質ホスファターゼ（ＰＨＬＰＰ１／２）により脱リン酸化される。加えて、腫瘍抑制因子であるＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、ＰＩＰ３を脱リン酸化することにより、Ａｋｔ活性を阻害する。Ａｋｔには、３つの高度に類縁のアイソフォーム（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３）が存在し、これらは、コンセンサスのリン酸化モチーフであるＲｘＲｘｘＳ／Ｔを含有する基質をリン酸化する。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達の阻害剤の例は、Ａｋｔを阻害する化合物（すなわち、Ａｋｔの活性化を阻害する化合物）、ＰＩ３Ｋを阻害する化合物、ＰＫＣを阻害する化合物、およびＰＤＫ１を阻害する化合物を含むがこれらに限定されない。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤の例は、表Ｈに列挙された化合物を含むがこれらに限定されない。
【００７９】
本明細書で使用される「ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化剤」とは、ＣＲＥＢに結合し、これを活性化させる化合物、またはＣＲＥＢの活性化に関与するタンパク質に結合し、これを活性化させる化合物を指す。一部の実施形態では、ＣＲＥＢ活性化剤は、ＣＲＥＢの濃度を増大させうる。ＣＲＥＢは、ＤＮＡ結合性タンパク質のロイシンジッパーファミリーの転写因子である。ＣＲＥＢは、ホモ二量体として、ｃＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）に結合し、これにより、下流の遺伝子の転写を増大または減少させる。ＣＲＥＢの活性化に関与するタンパク質の例は、ＰＫＡおよびＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼを含むがこれらに限定されない。ＣＲＥＢにより転写が調節される遺伝子は、ｃ−ｆｏｓ、ＢＤＮＦ、チロシンヒドロキシラーゼ、神経ペプチド（例えば、アソマトスタチン、エンケファリン、ＶＧＦ、コルチコトロピン放出ホルモン）、および哺乳動物の概日時計に関与する遺伝子（例えば、ＰＥＲ１、ＰＥＲ２）を含むがこれらに限定されない。ＣＲＥＢの例は、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ２、ＣＲＥＢ３、ＣＲＥＢ５、ＣＲＥＢ３様タンパク質１（ＣＲＥＢ３Ｌ１）、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢ３Ｌ３、およびＣＲＥＢ３Ｌ４を含むがこれらに限定されない。ＣＲＥＢ活性化剤の例は、ＡＣ１０２（表Ｉを参照されたい）である。
【００８０】
本明細書で使用される「平衡感覚障害」という用語は、例えば立位にあるかまたは歩行しているときに、対象に不安定であると感じさせる、対象の前庭系または前庭機能の不足を指す。耳と関連する平衡感覚障害はまた、めまい（クラクラ感）および悪心も引き起こす。平衡感覚障害と類縁の（すなわち、平衡感覚障害により引き起こされるか、または平衡感覚障害を引き起こす）疾患および障害は、良性発作性頭位めまい（ＢＰＰＶ）、迷路炎（例えば、前庭神経炎、蝸牛神経炎）、外傷（すなわち、耳または頭蓋への損傷、耳または頭蓋への手術により引き起こされる損傷）、メニエール病、外リンパ瘻、上半規管裂隙症候群、および両側前庭障害を含むがこれらに限定されない。平衡感覚障害はまた、投薬、ストレス、不安、および老化によっても引き起こされうる。
【００８１】
特許または出願のファイルは、有色で作製された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を伴うこの特許または特許出願公開の写しは、申請し、必要な費用を支払えば、特許庁により交付される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】Ｌｇｒ５＋細胞を、増殖に影響を及ぼす薬物についてスクリーニングするための日程表を示す図である。
【図２】Ｌｇｒ５＋細胞を、分化に影響を及ぼす薬物についてスクリーニングするための日程表を示す図である。
【図３】Ｌｇｒ５−ＧＦＰ細胞の増殖に影響を及ぼす薬物についてのスクリーニングに由来する、Ｌｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞のパーセントについて描示するグラフを示す図である。化合物の凡例（ＷＪＭ＝ＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸）については、表１を参照されたい。
【図４】Ｌｇｒ５−ＧＦＰ細胞の増殖に影響を及ぼす薬物についてのスクリーニングに由来する、Ｌｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞の数を描示するグラフを示す図である。化合物の凡例（ＷＪＭ＝ＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸）については、表１を参照されたい。
【図５】Ａｔｏｈ１−ＧＦＰ＋細胞の分化に影響を及ぼす薬物についてのスクリーニングに由来する、Ａｔｏｈ１−ＧＦＰ＋細胞のパーセントについて描示するグラフを示す図である。化合物の凡例（ＷＪＭ＝ＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸）については、表１を参照されたい。
【図６】トランスジェニックマウスの作出における使用のためのプラスミドであって、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質がＡｔｏｈ１エンハンサーの制御下にあるプラスミドについての概略的例示を示す図である。
【図７】具体的なスクリーニング化合物である、化合物Ａ（国際公開第２００９／１００４３８号パンフレットを参照されたい）、化合物Ｂ（国際公開第２００９／１００４３８号パンフレットを参照されたい）、化合物Ｃ（国際公開第２００９／１００４３８号パンフレットを参照されたい）、およびＢＩ８６２２（出典：Peter et al., EMBO Mol Med. 2014 Dec; 6(12): 1525-1541）の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
有毛細胞は、振動に誘導される変位を組み合わせる頂端部不動毛束を介して、音をイオンチャネルの開閉へと変換する。集団の高割合で生じる、蝸牛有毛細胞の損傷および死滅は、有毛細胞の置換機構の欠如による広範な難聴の原因である。そして、前庭有毛細胞の損傷および死滅は、平衡感覚障害または機能障害を結果としてもたらしうる。
【００８４】
上皮幹細胞マーカーであるＬｇｒ５は近年、有毛細胞を取り囲む、内耳の支持細胞（例えば、蝸牛支持細胞）内で発現することが示されており、Ｌｇｒ５発現細胞は、通常は有糸分裂後における蝸牛感覚上皮内のＷｎｔにより刺激されると、増殖するように誘導されうるであろう。実際、Ｌｇｒ５を発現させた支持細胞が、繁殖により、新たなＬｇｒ５陽性細胞をもたらし、かつ、Ｌｇｒ５陰性である有毛細胞をもたらしたのに対し、この受容体を発現させなかった支持細胞は、有毛細胞をもたらさなかったことは、前駆細胞の役割と符合する。Ｗｎｔの上方調節がまた、有毛細胞の分化も増大させることは、有毛細胞の分化の最大の調節因子である、上流の転写因子Ａｔｏｈ１の調節におけるその役割と符合する。Ｗｎｔシグナル伝達に応答する、この分裂能と、有毛細胞へと分化させる効力との組合せは、Ｌｇｒ５細胞が、蝸牛上皮の前駆細胞として作用していることを示唆した。Ｌｇｒ５＋細胞は、限定的ながら、損傷の後で、自発的に再生する能力を示したが、Ｗｎｔ刺激に応答して分裂および分化し、かつ、Ｎｏｔｃｈ阻害に応答して、分化形質転換するそれらの能力は、限定的なものであり、新生仔動物だけで観察された。
【００８５】
これらのデータは、Ｌｇｒ５＋細胞の、内耳（例えば、蝸牛）前駆細胞としての役割を裏付け、蝸牛核（cochlear sphere）としての繁殖により、ある程度の細胞の拡大を達成しえたが、異質な細胞集団は、他のシグナル伝達経路が、幹細胞の拡大および有毛細胞の分化に関与しうることも示唆した。さらに、自発的な再生能は、生後１週目以後に失われ、これらの前駆細胞の遺伝子発現の変化は、成体マウス蝸牛における、核形成能の喪失を結果としてもたらした。有毛細胞を置きかえる努力を、支持細胞の、有毛細胞への分化形質転換へと集中したが、機能的な蝸牛または前庭の再生は、これらの細胞を分裂させ、かつ、有毛細胞へと分化させる、両方の刺激を要請するであろう。本明細書では、スクリーニングを援用することにより、本発明者らは、内耳支持細胞（例えば、蝸牛または前庭の、Ｌｇｒ５発現内耳支持細胞）の増殖および／または分化を促進する、経路および低分子を同定した。これらの拡大された内耳細胞は、例えば、哺乳動物における難聴を処置するのに使用しうる化合物を同定するために使用することができる。内耳支持細胞マーカーおよび有毛細胞マーカーについてのレポーター遺伝子（例えば、それぞれ、Ｌｇｒ５レポーター遺伝子およびＡｔｏｈ１レポーター遺伝子）を含むトランスジェニック動物から拡大された内耳細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳細胞）は、特に、有用である。
【００８６】
内耳支持細胞の増殖および／または分化を促進する化合物
内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進する化合物の例は、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤（例えば、表Ｋを参照されたい）；表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；表Ｂに明示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤；表Ｃに明示されたサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化剤；表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；表Ｆに明示されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および表Ｉに明示されたｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化剤を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞）への分化を促進する化合物の例は、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤（例えば、表Ｋを参照されたい）；表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖を支持もしくは促進し、かつ／または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する多数の化合物を、表１に明示する。
【００８９】
本明細書では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖を支持または促進する多数の化合物が記載され、ＴＴＮＰＢ、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、１−アザケンパウロン、ＢＩＯ、ＷＡＹ−３１６６０６、ＬＤＮ−１９３１８９、およびアルスターパウロンのうちの１つまたは複数を含む。
【００９０】
本明細書では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する多数の化合物が記載され、ボリノスタット、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、１−アザケンパウロン、ＢＩＯ、ＷＡＹ−２６２６１１、ＮＰ０３１１１２、ＭＧ−１３２、ＩＭ−１２、トリコスタチンＡ、ＨＬＹ７８、およびＰＦ０３０８４０１４のうちの１つまたは複数を含む。
【００９１】
本発明の一部の実施形態では、表Ａ〜Ｋ中に列挙された化合物の誘導体もまた、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および／もしくは拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進するのに使用することができる。表Ａ〜Ｋ中に列挙された化合物の誘導体は、親化合物とは構造が異なるが、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する能力は保持する低分子である。化合物の誘導体は、ある特定の他の分子またはタンパク質とのその相互作用を、親化合物と比べて変化させうる。化合物の誘導体はまた、塩、付加物、または親化合物の他の変異体も含みうる。本発明の一部の実施形態では、本明細書で記載される、任意の化合物の誘導体（例えば、表Ａ〜Ｋ中に列挙された化合物のうちの、任意の１つの化合物）を、親化合物の代わりに使用することができる。一部の実施形態では、表Ａ〜ＩおよびＫ中に列挙された化合物の任意の誘導体を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製する方法において使用することができる。一部の実施形態では、表Ａ〜ＤおよびＦ〜Ｋ中に列挙された化合物の任意の誘導体を、内耳支持細胞の集団の、内耳有毛細胞の集団への分化を促進する方法において使用することができる。
【００９２】
【表１−１】
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【００９３】
【表１−２】
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【００９４】
【表２】
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【００９５】
【表３】
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【００９６】
【表４】
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【００９７】
【表５】
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【００９８】
【表６−１】
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【００９９】
【表６−２】
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【０１００】
【表６−３】
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【０１０１】
【表７−１】
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【０１０２】
【表７−２】
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【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
【表１０−１】
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【０１０６】
【表１０−２】
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【０１０７】
【表１１−１】
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【０１０８】
【表１１−２】
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【０１０９】
【表１１−３】
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【０１１０】
一部の実施形態では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進するのに使用される、１つまたは複数の薬剤は、以下の経路、タンパク質、およびＤＮＡ応答エレメント：レチノイド受容体シグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ＣＤＫシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、タンパク質分解経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、および／またはＥ  ｂｏｘ  ＤＮＡ応答エレメントのうちの２つ以上の（例えば、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の）ものをターゲティングする薬剤の組合せを含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進するのに使用される、１つまたは複数の薬剤は、薬剤の組合せ（例えば、各々が、表Ａ〜Ｋに明示された化合物から選択され、互いと異なる、２つの薬剤の組合せ；各々が、表Ａ〜Ｋに明示された化合物から選択され、互いと異なる、３つの薬剤の組合せ；各々が、表Ａ〜Ｋに明示された化合物から選択され、互いと異なる、４つの薬剤の組合せ；および各々が、表Ａ〜Ｋに明示された化合物から選択され、互いと異なる、５つの薬剤の組合せ）を含む。
【０１１２】
各々が、表Ａ〜Ｋに明示された化合物から選択される、２つの薬剤の組合せを使用して、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する場合、組み合わされた２つの薬剤は、表Ｌに列挙された組合せに基づき選択することができる。
【０１１３】
【表１２】
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【０１１４】
代替的に、本発明はまた、レチノイド受容体シグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ＣＤＫシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、タンパク質分解経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路、および／またはｃＡＭＰ依存性経路に関与する、１つまたは複数のタンパク質を使用して、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進するように、これらの経路を下方調節または上方調節する方法も想定する。
【０１１５】
方法についての一部の実施形態では、ＲＡＲおよび／またはＲＸＲを使用して、レチノイド受容体シグナル伝達経路を上方調節することができる。
【０１１６】
方法についての一部の実施形態では、ＲＳＰＯ、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ３ａ、および／またはＷｎｔ５ａを使用して、Ｗｎｔシグナル伝達経路を上方調節することができる。
【０１１７】
方法についての一部の実施形態では、Ｎｏｇｇｉｎ および／または Ｃｈｏｒｄｉｎを使用して、ＢＭＰシグナル伝達経路を下方調節することができる。
【０１１８】
方法についての一部の実施形態では、ＣＤＫおよび／またはサイクリンを使用して、ＣＤＫシグナル伝達経路を上方調節することができる。
【０１１９】
方法についての一部の実施形態では、Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ−２ペプチドおよび／またはＮｏｔｃｈ受容体を使用して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を上方調節することができる。
【０１２０】
方法についての一部の実施形態では、ユビキチンのレベルを低下させて、タンパク質分解経路を下方調節することができる。
【０１２１】
方法についての一部の実施形態では、Ａｋｔ、ＰＩ３−キナーゼ、および／またはＰＤＫ１のレベルを低下させて、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路を下方調節することができる。
【０１２２】
方法についての一部の実施形態では、ＣＲＥＢタンパク質のレベルを上昇させて、ｃＡＭＰ依存性経路を上方調節することができる。
【０１２３】
方法についての一部の実施形態では、Ｅ  ｂｏｘ  ＤＮＡ応答エレメントに結合する、１つまたは複数の転写因子のレベルを上昇させて、Ｅ  ｂｏｘ依存性転写を上方調節することができる。
【０１２４】
方法についての一部の実施形態では、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のレベルを低下させて、ＨＤＡＣ 活性を下方調節することができる。
【０１２５】
代替的に、本発明はまた、１つまたは複数の成長因子を使用して、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進するか、または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進するために、以下の経路：レチノイド受容体シグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路、ＣＤＫシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、タンパク質分解経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路、および／またはｃＡＭＰ依存性経路のうちの１つまたは複数を下方調節または上方調節する方法も想定する。
【０１２６】
方法についての一部の実施形態では、成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および／またはインスリン様成長因子（ＩＧＦ１）を含むがこれらに限定されない。
【０１２７】
トランスジェニック動物および使用法
一態様では、本発明は、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、もしくは４つ、またはそれ以上の）組換え核酸分子を、それらのゲノムへと安定的に組み込んだ、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。２つ以上の組換え核酸分子は、Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇ（例えば、Ｌｇｒ５）からなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第１のレポーター遺伝子（例えば、蛍光マーカー）を含む少なくとも第１の組換え核酸分子、ならびにＡｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３（例えば、Ａｔｏｈ１）からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換え核酸分子を含み、この場合、第１のレポーター遺伝子は、第２のレポーター遺伝子と異なる。
【０１２８】
本発明はまた、多様な遺伝子操作技術を使用して、細胞またはトランスジェニック動物において、１つまたは複数のレポーターを発生させることも想定する。一部の実施形態では、多様な遺伝子操作法を使用して、細胞またはトランスジェニック動物において、２つ以上のレポーターを発生させることができる。遺伝子操作法の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する技術、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘＰ組換え系を使用する技法、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ組換え系を使用する技法、Ｆｌｐ−ＦＲＴ組換え系を使用する技法、およびＲＭＣＥ（リコンビナーゼ媒介型カセット交換）系を使用する技法を含むがこれらに限定されない。
【０１２９】
一部の実施形態では、内耳支持細胞マーカーは、Ｌｇｒ５であり、内耳有毛細胞マーカーは、Ａｔｏｈ１である。一部の実施形態では、内耳支持細胞マーカーの調節エレメントは、Ｌｇｒ５プロモーターである。一部の実施形態では、内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントは、Ａｔｏｈ１エンハンサーである。一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１エンハンサーは、ＳＶ４０プロモーターまたはグロビンプロモーターに作動可能に連結される。
【０１３０】
一部の実施形態では、第１のレポーター遺伝子は、第１の蛍光タンパク質をコードし、第２のレポーター遺伝子は、第２の蛍光タンパク質をコードし、第１の蛍光タンパク質は、第２の蛍光タンパク質と異なる。
【０１３１】
一部の実施形態では、Ｌｇｒ５の発現は、第１の蛍光マーカー（Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子）の発現を結果としてもたらす。一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１の発現は、第２の蛍光マーカー（Ａｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子）の発現を結果としてもたらす。好ましい実施形態では、その体細胞および生殖細胞の全てにおいて、Ｌｇｒ５レポータータンパク質およびＡｔｏｈ１レポータータンパク質のトランス遺伝子を含有するマウスを得る。第１のマーカーと、第２のマーカーとは、互いから識別可能であるものとする。一部の実施形態では、第１のマーカーおよび第２のマーカーは、細胞内で、緑色蛍光および赤色蛍光を生成する。本明細書では、蛍光マーカーを例示するが、他のマーカー（レポーター遺伝子）もまた、使用することができ、適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む。当技術分野では、他の多数の例も公知である。一部の実施形態では、マーカーのうちの１つは、緑色蛍光タンパク質またはその誘導体、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｔａｇ−ＲＦＰなど）、発光レポーター（ラネラ（Ranella）属、ホタルなど）であるルシフェラーゼ、色原体（ベータ−Ｇａｌなど）などである。例えば、Pollock et al., Trends in Cell Biology 9:57 (1999)を参照されたい。有用な蛍光タンパク質はまた、蛍光発光する能力を保持する、これらのタンパク質の突然変異体およびスペクトル変異体も含む。例えば、Shaner et al., Nat. Biotech. 22:1567 (2004), Tag-RFP (Shaner, N. C. et al., 2008 Nature Methods, 5(6), 545-551)を参照されたい。記載される方法で使用しうる他の蛍光のタンパク質は、ＡｃＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｍＣｙａｎ、ｃｏｐＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＤｓＲｅｄ２、ＡｍＣｙａｎ１、ＡＱ１４３、ＡｓＲｅｄ２、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣＦＰ、ＣＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥｏｓＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＥＣＦＰ、ｍＥｍｅｒａｌｄ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴｅａｌ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＷａｓａｂｉ、ＰｈｉＹＦＰ、ＲｅＡｓＨ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ｔ−ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＪＲｅｄ、Ｋａｔｕｓｋａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＡｐｐｌｅ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｔｏｐａｚ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌを含むがこれらに限定されず、これらの全ては当技術分野で公知であり、例えば、文献に記載されているか、またはそうでなければ市販されている。
【０１３２】
「トランスジェニック動物」とは、哺乳動物、一般に、ラットまたはマウスなどの齧歯動物などの非ヒト動物であり、動物の細胞のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載されるトランス遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生動物などを含む。「トランス遺伝子」とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムへと組み込まれ、したがって、成熟動物のゲノム内にとどまり、これにより、トランスジェニック動物の、１つまたは複数の細胞型内または組織内でコードされる遺伝子産物の発現を方向付ける外因性ＤＮＡである。遺伝子の挿入を含むノックイン動物は、トランスジェニック動物の定義に含まれる。
【０１３３】
本明細書で使用される「Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子」または「Ａｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子」とは、Ｌｇｒ５またはＡｔｏｈ１を発現させる細胞内のレポータータンパク質の発現を結果としてもたらすように、Ｌｇｒ５プロモーターまたはＡｔｏｈ１プロモーターの下流に挿入されるレポータータンパク質のコード配列を特色とする構築物を指す。プロモーターは、レポータータンパク質の発現を駆動し、転写は、ポリアデニル化シグナルにより停止させる。トランス遺伝子は一般に、トランスジェニック動物の細胞のゲノムへと組み込まれるか、またはこの中で生じる。したがって、本明細書で記載されるＬｇｒ５／Ａｔｏｈ１トランスジェニック動物とは、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子の、少なくとも１つのコピーと、Ａｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子の、少なくとも１つのコピーとを、動物の細胞、例えば、動物の発生の前における、動物の胚細胞へと導入したトランスジェニック動物である。Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子と、Ａｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子とを、それらの細胞の一部または（好ましくは）全部において保有するトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、または他の哺乳動物）の系列を作製することができる。このようなトランスジェニック動物を作出するための、当技術分野で公知の方法を、例えば、下記で記載される通りに使用する。
【０１３４】
トランスジェニック動物を作製するための、当技術分野で公知の方法を使用して、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子またはＡｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子を保有する動物、例えば、マウスを作出することができる（例えば、それらの両方が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、Barker et al., Nature. 2007 Oct 25;449(7165):1003；およびLumpkin et al., Gene Expr Patterns. 2003 Aug;3(4):389を参照されたい）。このような動物を交配させて、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子、およびＡｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子の両方に対してホモ接合性である後代、すなわち、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子と、Ａｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子とをゲノムへと組み込んだ後代を作製することができる。
【０１３５】
例えば、一実施形態では、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子またはＡｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子をコードする配列を含む、適切なベクターを、細胞、例えば、受精した卵母細胞または胚性幹細胞へと導入する。次いで、このような細胞を使用して、前記配列を、それらのゲノムへと導入した、非ヒトトランスジェニック動物を創出することができる。次いで、これらの動物を、例えば、特異的な細胞内もしくは組織内、または発生の特異的な時点において、レポータータンパク質の発現をオンにする、Ｌｇｒ５プロモーターまたはＡｔｏｈ１プロモーターの制御下で、リコンビナーゼを発現させる、他のトランスジェニック動物と交配させることができる。
【０１３６】
当技術分野では、多能性幹細胞または卵母細胞の胚操作および電気穿孔またはマイクロインジェクションを介して、トランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作出するための方法が公知であり、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号明細書および同第４，８７０，００９号明細書、米国特許第４，８７３，１９１号明細書、米国シリアルナンバー第１０／００６，６１１号、”Transgenic Mouse Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology),” Hofker and van Deursen, Editors (Humana Press, Totowa, N.J., 2002)、および“Manipulating the Mouse Embryo,” Nagy et al., Editors (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2002)に記載されており、これらは、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。トランスジェニックマウスを創出するのに使用される方法と類似の方法は、他のトランスジェニック動物を作製するためにも使用することができる。
【０１３７】
一般に、本方法では、本明細書で記載されるトランスジェニックマウスを、本明細書で記載された通りに作製されたベクターを、受精させたマウス卵母細胞（例えば、Ｌｇｒ５レポーター遺伝子をノックインされたマウスに由来する卵母細胞；Barker et al., Nature. 2007 Oct 25;449(7165):1003を参照されたい）の前核へと注入することにより作製し、例えば、“Transgenic Mouse Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology),” Hofker and van Deursen, Editors (Humana Press, Totowa, N.J., 2002)；米国特許第４，７３６，８６６号明細書および同第４，８７０，００９号明細書、米国特許第４，８７３，１９１号明細書および同第６，７９１，００６号明細書、ならびにHogan, “Manipulating the Mouse Embryo,” Nagy et al., Editors (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2002)に記載されているような標準的なトランスジェニック技法を使用して、全ての細胞内でＬｇｒ５レポーター遺伝子およびＡｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスを作出するために使用する。レポーター遺伝子は、全ての細胞内、例えばプラスミド上で、維持および発現させることもでき、標準的な分子技術を使用して、ゲノムへと安定的に組み込むこともできる。
【０１３８】
Ｌｇｒ５／Ａｔｏｈ１トランスジェニック創始動物は、そのゲノム内の、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子、およびＡｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子の存在に基づき、例えば、動物の組織内または細胞内の、レポーター配列またはタンパク質の存在または発現を検出することにより同定することができる。次いで、トランスジェニック創始動物を使用して、トランス遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子と、Ａｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子とを保有するトランスジェニック動物を、他のトランス遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物へと、さらに繁殖させることもできる。
【０１３９】
ベクター
本明細書で記載されるマウスは、ベクター、例えば、本明細書で記載される、Ｌｇｒ５レポーターのトランス遺伝子またはＡｔｏｈ１レポーターのトランス遺伝子をコードする核酸を含有する発現ベクターを使用して作製することができる。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指し、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターを含みうる。ベクターは、自律的な複製が可能な場合もあり、宿主ＤＮＡへと組み込まれる場合もある。ウイルスベクターは、例えば、複製欠損性のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含む。
【０１４０】
ベクターは、Ｌｇｒ５レポータータンパク質またはＡｔｏｈ１レポータータンパク質をコードする核酸を、宿主細胞内の核酸の発現に適する形態で含みうる。好ましくは、組換え発現ベクターは、発現させる核酸配列へと作動的に連結された１つまたは複数の調節配列を含む。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を方向付ける配列のほか、組織特異的な調節配列および／または誘導配列を含む。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうる。本発明の発現ベクターを、宿主細胞へと導入して、これにより、本明細書で記載される核酸によりコードされる、Ｌｇｒ５レポーターおよびＡｔｏｈ１レポーターを作製することができる。
【０１４１】
本明細書で記載される組換え発現ベクターは、原核細胞内または真核細胞内の、Ｌｇｒ５レポータータンパク質およびＡｔｏｈ１レポータータンパク質の発現のためにデザインすることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌（E. coli）内、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する）内、酵母細胞内、または哺乳動物細胞内で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Goeddel, “Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185,” Academic Press, San Diego, CA (1990)において、さらに論じられている。代替的に、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写および翻訳することができる。
【０１４２】
一部の実施形態では、実施例５で記載されるＡｔｏｈ１エンハンサーを使用して、レポーター遺伝子の発現を駆動する。
【０１４３】
細胞
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される核酸分子、例えば、組換え発現ベクター内で、Ｌｇｒ５レポータータンパク質もしくはＡｔｏｈ１レポータータンパク質をコードする核酸分子、または宿主細胞ゲノムの特異的な部位への相同組換えを可能とする配列を含有する核酸分子を含む単離細胞を提供する。本明細書では、「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語を、互換的に使用する。このような用語は、核酸分子（例えば、本明細書で記載されるベクター）と接触させた特定の対象細胞を指すだけではなく、それらもまた核酸分子を含有する、このような細胞の後継または潜在的な後継も指す。ある特定の改変は、突然変異または環境的影響のために、後続の世代においても生じうるため、このような後継は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、これらもまた、核酸分子を含有する限りにおいて、なお、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【０１４４】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞でありうる。例えば、細胞は、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨＥＫ、またはＣＯＳ細胞など）でありうる。当業者には、他の適切な宿主細胞も公知である。ベクターが、組換え細胞から作製されうるウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである場合、細胞は、ウイルスベクターを産生する細胞でありうる。
【０１４５】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション法を介して、宿主細胞へと導入することができる。本明細書で使用された、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を、宿主細胞へと導入するための、当技術分野で認知された様々な技法であって、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む技法を指すことを意図する。一部の実施形態では、単純に、ネイキッドＤＮＡを、細胞へと適用する。ベクターがウイルスベクターである場合、公知の感染プロトコールを使用することができる。
【０１４６】
例えば、レトロウイルスベクターは、例えばRobertson et al., Nature 323:445-448 (1986)に記載されている通りに使用することができる。レトロウイルスは一般に、フランキング配列の再配列を伴わずに、宿主ゲノムへと組み込まれるが、ＤＮＡを、マイクロインジェクションまたは他の方法により導入する場合、常にこれが当てはまるわけではない。
【０１４７】
本発明の細胞はまた、本明細書で記載されるトランスジェニック動物から得られる細胞、例えば、核酸分子を含有するそれらの動物の組織に由来する細胞も含む。
【０１４８】
配列の同一性
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較を目的として、配列をアライメントする（例えば、最適なアライメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に、ギャップを導入することができ、相同でない配列は、比較を目的として無視することができる）。比較を目的としてアライメントされる基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態では、少なくとも９０％、９５％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されている場合、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れるときに、配列により共有される、同一な位置の数の関数である。
【０１４９】
２つの配列の間の配列の比較、および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。本方法のためには、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、デフォルトのパラメータ、すなわち、ギャップペナルティーを１２とし、ギャップ伸長ペナルティーを４とし、フレームシフトギャップペナルティーを５とする、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２スコアリング行列を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネットのgcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）によるアルゴリズムを使用して決定する。
【０１５０】
当技術分野では、本方法で有用なトランス遺伝子を構築するための方法が公知であり、例えば、Sambrook and Russell, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Labman edition (January 15, 2001); and Ausubel et al., Eds., “Short Protocols in Molecular Biology,”Current Protocols; 5 edition (November 5, 2002)を参照されたい。一部の実施形態では、市販のベクターを、本明細書で記載される核酸分子、例えば、ｐＣ４Ｍ−Ｆｖ２Ｅ（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手可能である）の構築において使用することができる。
【０１５１】
スクリーニング法
本明細書には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、無機高分子もしくは無機低分子または有機高分子もしくは有機低分子である被験化合物（例えば、表Ａ〜Ｋに列挙された化合物）などの被験化合物をスクリーニングするための方法であって、蝸牛有毛細胞（例えば、内耳内の蝸牛有毛細胞）の喪失と関連する難聴の処置において有用な薬剤を同定する方法が含まれる。
【０１５２】
本開示は、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、（ａ）内耳支持細胞の集団（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）を、本明細書で記載されるトランスジェニックマウスから単離するステップ；（ｂ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップ；（ｃ）被験化合物を、拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；（ｄ）被験化合物の存在下での、拡大された内耳支持細胞の集団内の第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、第１のレポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における第１のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させ、かつ／または第２のレポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下における第２のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップを含む方法を提示する。
【０１５３】
一部の実施形態では、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件は、表１に明示された、１つまたは複数の薬剤を含む。
【０１５４】
本開示はまた、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、（ａ）Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下でレポーター遺伝子を含む組換え核酸分子を安定的に組み込んだ内耳支持細胞の集団を用意するステップ；（ｂ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであり、条件が、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤、（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤、（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤、（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤、（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤、（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤、（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示された タンパク質分解阻害剤、（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤、および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、ステップ；（ｃ）被験化合物を、拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；（ｄ）被験化合物の存在下での、拡大された内耳支持細胞の集団内のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、レポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下におけるレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップを含む方法も提示する。
【０１５５】
本開示はまた、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、（ａ）Ａｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下でレポーター遺伝子を含む組換え核酸分子を安定的に組み込んだ内耳支持細胞の集団を用意するステップ；（ｂ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであり、条件が、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤、（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤、（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤、（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤、（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤、（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤、（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示された タンパク質分解阻害剤、（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤、および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤を含む、ステップ；（ｃ）被験化合物を、拡大された内耳支持細胞の集団へと投与するステップ；（ｄ）被験化合物の存在下での、拡大された内耳細胞の集団内のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに（ｅ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、レポーター遺伝子の発現レベルを、その非存在下におけるレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップを含む方法も提示する。
【０１５６】
本開示はまた、有毛細胞を使用して、オトトキシンについてスクリーニングする方法も提示する。本開示はまた、オトトキシンにより引き起こされる有毛細胞の損傷に対する保護特性を呈示する、１つまたは複数の化合物（例えば、表Ａ〜Ｋに列挙された化合物）を同定する方法も提示する。一部の実施形態では、オトトキシンは、抗新生物剤、サリチル酸塩、キニン、およびアミノグリコシド抗生剤を含む治療用薬物、食品中または医薬品中の共雑物、ならびに環境汚染物質または産業汚染物質を含む。本開示はまた、有毛細胞を使用して、シナプス接続を同定する方法も提示する。一部の実施形態では、これらの方法で使用される有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）を、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）から単離することができる。一部の実施形態では、これらの方法で使用される有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）を、記載される通り、本明細書で提示される方法により、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）から分化させることができる。
【０１５７】
本明細書で使用される「低分子」とは、分子量約３，０００ドルトン未満の有機低分子または無機低分子を指す。一般に、本発明に有用な低分子は、３，０００ドルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する。低分子は、例えば、少なくとも約１００Ｄａ〜約３，０００Ｄａ（例えば、約１００〜約３，０００Ｄａ、約１００〜約２５００Ｄａ、約１００〜約２，０００Ｄａ、約１００〜約１，７５０Ｄａ、約１００〜約１，５００Ｄａ、約１００〜約１，２５０Ｄａ、約１００〜約１，０００Ｄａ、約１００〜約７５０Ｄａ、約１００〜約５００Ｄａ、約２００〜約１５００、約５００〜約１０００、約３００〜約１０００Ｄａ、または約１００〜約２５０Ｄａの間）でありうる。
【０１５８】
被験化合物（例えば、表Ａ〜Ｋおよび表１に列挙された化合物）は、例えば、天然の産物またはコンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーでありうる。電荷、芳香族性、水素結合、可撓性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、および剛性など、様々な機能を網羅するように、多様な分子のセットを使用するものとする。当技術分野では、例えば、Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998)により例示されている通り、低分子を合成するのに適するコンビナトリアル技術が公知であり、「スプリットおよびプール」合成法または「パラレル」合成法、固相法および液相法、ならびにコード法（例えば、Czarnik, Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60-6 (1997)を参照されたい）などを含む。加えて、多数の低分子ライブラリーも市販されている。多数の適切な低分子被験化合物は、米国特許第６，５０３，７１３号明細書において列挙されており、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
本発明の方法を使用してスクリーニングされるライブラリーは、様々な種類の被験化合物（例えば、表Ａ〜Ｋおよび表１に列挙された化合物）を含みうる。所与のライブラリーは、構造的に類縁または非類縁の被験化合物のセットを含みうる。一部の実施形態では、被験化合物は、ペプチドまたはペプチド模倣分子である。一部の実施形態では、被験化合物は、核酸である。
【０１６０】
一部の実施形態では、被験化合物およびそのライブラリーは、例えば、当技術分野で公知の方法または本明細書で記載される方法を使用して、第１の被験化合物、例えば、標的ポリペプチドの公知の天然結合性パートナーと構造的に類似する第１の被験化合物、または標的ポリペプチドに結合することが可能であるものとして同定されている第１の低分子の構造を体系的に変更し、この構造を、結果として得られる生物学的活性、例えば、構造−活性関係の研究と相関させることにより得ることができる。当業者が察知する通り、このような構造−活性関係を創出するための、様々な標準的な方法が存在する。したがって、ある場合には、作業は、大部分、経験的でありうるが、他の場合には、内因性ポリペプチドまたはその一部についての三次元構造を、１つまたは複数の低分子化合物の合理的なデザインの出発点として使用しうる。例えば、一実施形態では、例えば、本明細書で記載される方法を使用して、一般的な低分子ライブラリーをスクリーニングする。
【０１６１】
一部の実施形態では、被験化合物（例えば、表Ａ〜Ｋおよび表１に列挙された化合物）を、被験試料、例えば、細胞または生存組織もしくは生存器官、例えば眼へと適用し、被験化合物の１つまたは複数の効果を評価する。例えば、培養細胞内または初代細胞内で、支持細胞マーカー（例えば、Ｌｇｒ５）および／または有毛細胞マーカー（例えば、Ａｔｏｈ１）の発現を増大させる被験化合物の能力について評価する。
【０１６２】
一部の実施形態では、被験試料は、本明細書で記載される障害のｉｎ  ｖｉｖｏモデルであるか、またはこれに由来しうる（例えば、これから採取された試料）。例えば、動物モデル、例えばラットなどの齧歯動物を使用することができる。
【０１６３】
当技術分野では、これらの効果の各々について評価するための方法が公知である。例えば、タンパク質の発現をモジュレートする能力は、例えば定量的ＰＣＲ法またはイムノアッセイ法を使用して、遺伝子レベルで評価することもでき、またはタンパク質レベルで評価することもできる。一部の実施形態では、当技術分野では、ハイスループット法、例えば、タンパク質チップまたは遺伝子チップが公知であり（例えば、Ch. 12, Genomics, in Griffiths et al., Eds. Modern genetic Analysis, 1999, W. H. Freeman and Company; Ekins and Chu, Trends in Biotechnology, 1999, 17:217-218; MacBeath and Schreiber, Science 2000, 289(5485):1760-1763; Simpson, Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003を参照されたい）、支持細胞マーカー（例えば、Ｌｇｒ５）および／または有毛細胞マーカー（例えば、Ａｔｏｈ１）の発現に対する効果を検出するのに使用することができる。
【０１６４】
本明細書で記載される方法によりスクリーニングされ、Ｌｇｒ５および／またはＡｔｏｈ１の発現を増大させることが決定された被験化合物（例えば、表Ａ〜Ｋおよび表１に列挙された化合物）は、候補化合物と考えることができる。例えば、障害についてのｉｎ  ｖｉｖｏモデル、例えば難聴についての動物モデルにおいてスクリーニングされ、障害、例えば障害の１つもしくは複数の症状または有毛細胞の数に対して、望ましい効果を及ぼすことが決定された候補化合物は、候補治療剤と考えることができる。候補治療剤は、臨床状況においてスクリーニングされると、治療剤となる。候補化合物、候補治療剤、および治療剤は、任意選択で、最適化および／または誘導体化し、かつ、生理学的に許容される賦形剤と共に製剤化して、医薬組成物を形成しうる。
【０１６５】
したがって、第１のスクリーニングにおいて、「ヒット」（例えば、Ｌｇｒ５および／またはＡｔｏｈ１の発現を増大させる被験化合物）として同定された被験化合物を選択し、例えば、結合アフィニティー、アビディティー、特異性、または他のパラメータを最適化するように、合理的デザインを使用して、体系的に変更することができる。このような最適化もまた、本明細書で記載される方法を使用してスクリーニングすることができる。したがって、一実施形態では、本発明は、当技術分野で公知の方法、および／または本明細書で記載される方法を使用して、化合物の第１のライブラリーをスクリーニングすることと、このライブラリー内で、１つまたは複数のヒットを同定することと、これらのヒットを、体系的な構造的変更下に置いて、ヒットと構造的に類縁の化合物の第２のライブラリーを創出することと、本明細書で記載される方法を使用して、第２のライブラリーをスクリーニングすることとを含む。
【０１６６】
ヒットとして同定された被験化合物は、本明細書で記載される蝸牛有毛細胞（例えば、内耳内の蝸牛有毛細胞）の喪失と関連する障害、例えば難聴の処置において有用な、候補治療用化合物と考えることができる。「ヒット」の構造を決定するために有用な様々な技法を、本明細書で記載される方法、例えば、ＮＭＲ、質量分析計、電子捕捉検出器を装備したガスクロマトグラフィー、蛍光分光法、および吸光分光法において使用することができる。したがって、本発明はまた、本明細書で記載される方法、ならびに本明細書で記載される障害を処置するか、防止するか、またはその発生もしくは進行を遅延させるときに、それらを投与および使用するための方法により「ヒット」として同定される化合物も含む。
【０１６７】
候補治療用化合物として同定された被験化合物は、本明細書で記載される蝸牛有毛細胞（例えば、内耳内の蝸牛有毛細胞）の喪失と関連する障害についての動物モデルへの投与により、さらにスクリーニングすることもできる。動物を、障害の変化、例えば、障害のパラメータ、例えば臨床転帰と関連するパラメータの改善についてモニタリングすることができる。一部の実施形態では、パラメータは、聴能であり、改善は、聴応答の改善であろう。一部の実施形態では、対象は、ヒト、例えば、難聴を伴うヒトであり、パラメータは、聴力の改善である。
【０１６８】
処置法
一部の実施形態では、本開示は、それぞれ、蝸牛有毛細胞（例えば、内耳内の蝸牛有毛細胞）または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害（すなわち、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および分化の増大から利益を得る状態）を処置するための、新規の治療戦略を提示する。一部の実施形態では、このような戦略は、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖の増大、および／または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化の増大を促進し、これにより、標的細胞の、内耳の成熟細胞、例えば聴覚有毛細胞への拡大および分化を促進しうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法および組成物は、実質的な細胞増殖の促進を伴わずに、標的細胞（例えば、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞））の、内耳の成熟細胞、例えば聴覚有毛細胞（例えば、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞））への分化またはそれに向かった分化を促進する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法および組成物は、実質的な細胞増殖の促進を伴わずに、標的細胞（例えば、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞））の増殖を促進する。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明は、例えば、１つまたは複数の細胞（例えば、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞））の、耳の感覚細胞、例えば有毛細胞（例えば、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞））として機能することが可能な、１つまたは複数の細胞への分化（例えば、完全な分化または部分的な分化）を促進することにより、聴覚機能障害、聴覚消失、および前庭障害など、耳内の細胞の喪失の結果として生じる有毛細胞の喪失および任意の障害を処置するのに使用することができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、難聴は、蝸牛の損傷または機能不全、例えば有毛細胞の喪失を結果としてもたらす、感覚上皮の喪失または感覚上皮への損傷から生じうる感覚神経的難聴である。
【０１７１】
一部の実施形態では、難聴は、任意の理由による場合もあり、任意の種類の事象の結果としての場合もある。例えば、遺伝性欠損または先天性欠損のため、例えば、ヒト対象は、出生時から耳が不自由である場合もあり、遺伝性欠損または先天性欠損による聴力が徐々に失われた結果として、耳が不自由であるまたは聞こえにくい場合もある。別の例では、難聴は、耳の構造に対する物理的外傷、または突発的な騒音もしくは長時間にわたる騒音への曝露など、外傷性事象の結果でありうる。例えば、長時間にわたるコンサート会場、空港の滑走路、および建築現場への曝露は、内耳損傷および後続の難聴を引き起こしうる。
【０１７２】
一部の実施形態では、難聴は、化学物質に誘導される中毒性難聴に起因する場合があり、この場合、オトトキシンは、抗新生物剤、サリチル酸塩、キニン、およびアミノグリコシド抗生剤を含む治療用薬物、食品中または医薬品中の共雑物、ならびに環境汚染物質または産業汚染物質を含む。一部の実施形態では、難聴は、老化から生じうる。
【０１７３】
一部の実施形態では、本開示は、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）治療有効量の、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または
（ｂ）治療有効量の、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤を、対象、例えば、対象の耳へと投与して、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖、および／または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化（直接的治療）を促進する、
方法を提示する。
【０１７４】
一部の実施形態では、本開示は、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）治療有効量の、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または
（ｂ）治療有効量の、（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤を、対象、例えば、対象の耳へと投与して、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖、および／または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する、
方法を提示する。
【０１７５】
難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法についての一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤を、全身投与するか、または対象の耳へと投与する、例えば、対象の中耳へと経鼓膜投与する。一部の実施形態では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤を、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の前に投与する。
【０１７６】
本開示はまた、
（ａ）１つまたは複数の内耳支持細胞を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）任意選択で、拡大された内耳支持細胞の集団を、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；ならびに
（ｃ）内耳有毛細胞を、対象の耳（例えば、内耳）へと投与するステップ
により、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法も提示する。
【０１７７】
本開示はまた、
（ａ）１つまたは複数の内耳支持細胞を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および（ｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；ならびに
（ｂ）拡大された内耳支持細胞の集団を、対象の耳（例えば、内耳）へと、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；（ｉｘ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および（ｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の投与と組み合わせて、例えば、これと同時にまたはこの前に投与するステップ
により、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法も提示する。
【０１７８】
本明細書で記載される、難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法についての一部の実施形態では、（ａ）内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤は、（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤からなる群から選択され、（ｂ）内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤は、（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤からなる群から選択される。
【０１７９】
一部の実施形態では、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤は、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストである。一部の実施形態では、内耳支持細胞は、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞である。一部の実施形態では、内耳有毛細胞は、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞である。
【０１８０】
本明細書で記載される対象を処置する方法についての一部の実施形態では、対象は、平衡感覚障害を有する。本明細書で記載される対象を処置する方法についての一部の実施形態では、対象は、難聴（例えば、感覚神経的難聴）を有する。一部の実施形態では、難聴は、遺伝性欠損もしくは先天性欠損、外傷、老化、または化学物質誘導性中毒性難聴の結果である。
【０１８１】
本明細書で記載される対象を処置する方法についての一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１８２】
一般に、本明細書で記載される化合物および方法を使用して、耳内の有毛細胞の成長（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の成長）をもたらし、かつ／または耳内（例えば、内耳内、中耳内、および／もしくは外耳内）の有毛細胞の数を増大させることができる。例えば、耳内の有毛細胞の数は、処置前の有毛細胞の数と比較して、約２、３、４、６、８、もしくは１０倍、またはこれを超えて増大させることができる。この新たな有毛細胞の成長は、対象の聴く能力の、少なくとも部分的な改善を、効果的に回復または確立しうる。例えば、薬剤の投与は、難聴を、約５、１０、１５、２０、４０、６０、８０、１００％、またはこれを超えて改善しうる。
【０１８３】
内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖を支持もしくは促進し、かつ／または内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する多数の化合物を、表１に明示する。
【０１８４】
本明細書では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖を支持または促進する多数の化合物が記載され、ＴＴＮＰＢ、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、１−アザケンパウロン、ＢＩＯ、ＷＡＹ−３１６６０６、ＬＤＮ−１９３１８９、およびアルスターパウロンのうちの１つまたは複数を含む。
【０１８５】
本明細書では、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞）への分化を促進する多数の化合物が記載され、ボリノスタット、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、１−アザケンパウロン、ＢＩＯ、ＷＡＹ−２６２６１１、ＮＰ０３１１１２、ＭＧ−１３２、ＩＭ−１２、トリコスタチンＡ、ＨＬＹ７８、およびＰＦ０３０８４０１４のうちの１つまたは複数を含む。
【０１８６】
内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および拡大を促進する化合物の他の例は、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤（例えば、表Ｋを参照されたい）；表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；表Ｂに明示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤；表Ｃに明示されたサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化剤；表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；表Ｆに明示されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および表Ｉに明示されたｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化剤を含むがこれらに限定されない。
【０１８７】
内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の、内耳有毛細胞（例えば、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞）への分化を促進する化合物の他の例は、レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤（例えば、表Ｋを参照されたい）；表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【０１８８】
適切な場合は、処置の後、ヒトを、内耳障害と関連する聴力または他の症状の改善について試験することができる。聴力を測定するための方法は周知であり、純音聴力検査、気導、および骨伝導試験を含む。これらの検査は、ヒトが聴取可能な音量（強度）および音高（周波数）の限界を測定する。ヒトにおける聴覚試験は、行動観察聴力検査（７カ月までの乳児）、ＶＲＡ（ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｕｄｉｏｍｅｔｒｙ）（７カ月〜３歳の小児）、および３歳を超える小児のための遊戯聴力検査を含む。耳音響放射試験を使用して、蝸牛有毛細胞の機能について調べることができ、蝸電図は、蝸牛、および脳への神経経路のうちの第１の部分の機能についての情報をもたらす。一部の実施形態では、処置は、改変を伴うかまたは伴わずに持続することもでき、中止することもできる。
【０１８９】
医薬組成物
一部の実施形態では、本明細書で記載される、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および／または分化を促進するための１つまたは複数の化合物は、医薬組成物として製剤化することができる。本明細書で記載される１つまたは複数の化合物を含有する医薬組成物は、意図される投与法に従い製剤化することができる。
【０１９０】
本明細書で記載される、内耳支持細胞（例えば、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞）の増殖および／または分化を促進するための１つまたは複数の化合物は、対象へと直接投与するための医薬組成物として製剤化することができる。１つまたは複数の化合物を含有する医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、局部的投与または全身投与、例えば、滴下剤（例えば、点耳剤）もしくは耳への注射、送気（耳への送気など）による投与、静脈内投与、局所投与、または経口投与のために製剤化することができる。
【０１９１】
投与についての医薬組成物の性質は、投与方式に依存し、当業者がたやすく決定しうる。一部の実施形態では、医薬組成物は、滅菌または滅菌可能である。本発明で特色とされる治療用組成物は、それらのうちの多くが当業者に公知である、担体または賦形剤を含有しうる。使用しうる賦形剤は、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、ポリペプチド（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、水、およびグリセロールを含む。本発明で特色とされる核酸、ポリペプチド、低分子、および他のモジュレーター化合物は、任意の標準的な投与経路により投与することができる。例えば、投与は、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、または経口投与でありうる。
【０１９２】
医薬組成物は、対応する投与経路に従い、多様な手法で製剤化することができる。例えば、液体溶液は、耳への滴下による投与、注射、または内服のために作製することができ；ゲルまたは粉末は、内服または局所適用のために作製することができる。このような製剤を作製するための方法は、周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ndEd., Allen, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2012において見出すことができる。
【０１９３】
化合物のうちの１つまたは複数は、例えば、医薬組成物として、例えば内耳へと、注射によりまたは外科留置を介して、直接的および／または局所的に投与することができる。医薬組成物の量を、有効量として記載することもでき、細胞ベースの組成物の量を、治療有効量として記載することもできる。ある期間にわたる適用が推奨されまたは望ましい場合は、本発明の組成物を、持続放出製剤中または植込み用デバイス（例えば、ポンプ）内に入れることができる。
【０１９４】
代替的に、または加えて、医薬組成物は、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、全身非経口投与のために製剤化することができる。このような製剤は、保存剤を添加した単位剤形、例えば、アンプルまたは複数回投与用容器により提示することができる。組成物は、油性媒体中または水性媒体中の、懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含有しうる。代替的に、有効成分は、使用の前における、適切な媒体、例えば滅菌発熱物質非含有水による構成のための粉末形態でもありうる。
【０１９５】
前出で記載した製剤に加えて、組成物はまた、デポ調製物としても製剤化することができる。このような長時間作用型製剤は、植込み（例えば、皮下）により投与することができる。したがって、例えば、組成物は、適切なポリマー性材料もしくは疎水性材料もしくはイオン交換樹脂とともに（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）、または難溶性誘導体、例えば難溶性塩として、製剤化することができる。
【０１９６】
全身経口投与のために製剤化された医薬組成物は、従来の手段により、結合剤（例えば、あらかじめゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶質セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または保湿剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など、薬学的に許容される賦形剤と共に調製された錠剤またはカプセルの形態を取りうる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取る場合もあり、使用の前に、水または他の適切な媒体による構成のための、乾燥生成物として提示される場合もある。このような液体調製物は、従来の手段により、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および保存剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）など、薬学的に許容される添加剤と共に調製することができる。調製物はまた、適切な場合、緩衝塩、芳香剤、着色剤、および甘味剤も含有しうる。経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出をもたらすように、適切に製剤化することができる。
【０１９７】
一部の実施形態では、本明細書で記載される医薬組成物は、上記で記載した方法のうちのいずれかに従い製剤化される化合物のうちの１つまたは複数、および本明細書で記載される方法により得られる１つまたは複数の細胞を含みうる。
【実施例】
【０１９８】
本発明を、以下の実施例においてさらに記載するが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０１９９】
［実施例１］
増殖および分化を促進する薬剤についての薬物スクリーニング
２つのマウス株を使用して、Ｌｇｒ５発現細胞の増殖または分化を促進する薬剤についてのスクリーニングを開発した。各株は、Ｌｇｒ５発現細胞またはＡｔｏｈ１発現有毛細胞のいずれかを検出するための蛍光マーカーを含有した。Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲマウスを使用して、Ｌｇｒ５＋細胞の増殖についてモニタリングした（Barker, N. et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgf5. Nature 449, 1003-1007 (2007)）。次いで、この株を、Ｒｏｓａ２６−ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏレポーターマウス（Madisen, L. et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci 13, 133-140 (2010)）と交配させて、分化Ｌｇｒ５発現細胞から生じた細胞の系統追跡を可能とするマウス系列を創出した。Ａｔｏｈ１−ｎＧＦＰマウスを使用して、分化有毛細胞を同定した（Lumpkin, E.A. et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns 3, 389-395 (2003)）。
【０２００】
Ｌｇｒ５−ＧＦＰ＋レポーターマウスおよびＡｔｏｈ１−ＧＦＰ＋レポーターマウスの両方に由来するＬｇｒ５＋細胞は、以下の通りに得た。新生仔マウス（生後１〜３日目）に由来する蝸牛をＨＢＳＳ中で切り出し、コルチ器を血管条および蝸牛軸から分離した。次いで、コルチ器をＣｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で１時間にわたり処理して、蝸牛上皮を、基底をなす間葉から分離した。次いで、上皮を回収し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、３７℃で１５〜２０分間にわたり処理した。機械的破砕により得られた単一細胞を濾過し（４０μｍ）、３Ｄ培養のために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁させた。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞外マトリックスタンパク質に富む腫瘍であるエリザベス−ホルム−スワーム（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出されて再構成された基底膜調製物であり、約６０％のラミニン、３０％のコラーゲンＩＶ、および８％のエンタクチンである。結果として得られた細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＩＧＦ１（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；ＬＣ  Ｌａｂｓ）、ＶＰＡ（１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、ｐＶｃ（１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、および６１６４５２（２μＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む低分子を補充した、ＤＭＥＭとＦ１２との、１：１の混合物を使用して、２４ウェルプレート内、ウェル１つ当たり蝸牛１つの濃度で、５日間にわたり個別に培養した。培地は、隔日で交換した。
【０２０１】
次いで、Ｌｇｒ５＋細胞の増殖の程度を評価するために、２００μｌの細胞解離溶液を、Ｌｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞の各ウェルへと添加し、４５分間にわたりインキュベートし、次いで、ＴｒｙｐｌｅＥを添加し２０分間にわたりインキュベートした。次いで、遠心分離のために、細胞培養物を、１５ｍｌのファルコンチューブへと移した。次いで、上清を除去し、細胞培養物を、マトリゲル中に再度再懸濁させた。細胞を、９６ウェルプレートへと、ウェル１つ当たりの細胞約５０００個で分配した。次いで、Ｌｇｒ５−ＧＦＰ＋培養物を、ナノモル〜マイクロモルの濃度、例えば、０．００１、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、または１００μＭの候補薬物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、さらに５日間にわたり処理した（図１を参照されたい）。この時点で、ＦＡＣＳを使用して、Ｌｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞を分取し、蛍光を測定した（図３および４を参照されたい）。
【０２０２】
Ｌｇｒ５＋細胞の、有毛細胞への分化の程度を評価するために、Ａｔｏｈ１−ｎＧＦＰ細胞を、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ｐＶｃ、ＶＰＡ、およびＣＨＩＲ９９０２１を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（上記と同様に、ＤＭＥＭとＦ１２との１：１の混合物）であって、Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＩＧＦ１（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、ＶＰＡ（１ｍＭ）、ｐＶｃ（１００μｇ／ｍｌ）、および６１６４５２（２μＭ）を含む低分子を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、さらに２日間（合計７日間）にわたり培養した。培地は、隔日で交換した。４−ヒドロキシタモキシフェン（２０ｎｇ／ｍｌ）を、０日目に、系統追跡研究のために、培養物へと添加した（図２を参照されたい）。インキュベーションの７日後、２００μｌの細胞解離溶液を、各ウェルへと添加し、４５分間にわたりインキュベートし、次いで、ＴｒｙｐｌｅＥを添加し、２０分間にわたりインキュベートした。次いで、遠心分離のために、細胞培養物を、１５ｍｌのファルコンチューブへと移した。次いで、上清を除去し、細胞培養物を、マトリゲル中に再度再懸濁させた。細胞を、９６ウェルプレートへと、ウェル１つ当たりの細胞約５０００個で分配した。次いで、細胞を、候補薬物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で処理した。候補薬物を伴い、１０日間にわたりインキュベートした後で、細胞をＦＡＣＳにより分取し、Ａｔｏｈ１−ｎＧＦＰ細胞の蛍光レベルを測定した（図５を参照されたい）。Ｗｎｔ経路のＧＳＫ−３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１と、Ｎｏｔｃｈ経路のγ−セクレターゼ阻害剤であるＬＹ４１１５７５とを、このスクリーニングのための陽性対照として使用した（国際特許公開第２０１４１５９３５６号パンフレットおよび図５を参照されたい）。このスクリーニング法を使用して、薬物、化合物、遺伝子、および成長因子をスクリーニングした（表１を参照されたい）。
【０２０３】
【表１３−１】
2019508033.tif 000022
【０２０４】
【表１３−２】
2019508033.tif 000023
【０２０５】
図３〜５に示される結果は、スクリーニングされた多数の化合物が、増殖または分化を効果的に誘導することが可能であることを示した。表２および３に、それぞれ、増殖および分化について上位の化合物を列挙する。
【０２０６】
【表１４】
2019508033.tif 000024
【０２０７】
【表１５】
2019508033.tif 000025
【０２０８】
［実施例２］
蝸牛有毛細胞の喪失と関連する難聴の処置のための薬剤についての薬物スクリーニング
マウスのゲノムへと安定的に組み込まれた２つの蛍光レポーターを含有する、新規のトランスジェニックマウス（Ｌｇｒ５／Ａｔｏｈ１レポーターマウス）を作製する。Ｌｇｒ５／Ａｔｏｈ１レポーターマウスは、Ｌｇｒ５プロモーター（Barker et al., supra）の制御下にあるＧＦＰを有するトランスジェニックマウスに由来する卵母細胞から出発し、Ａｔｏｈ１のエンハンサーおよびプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーターまたはグロビン最小プロモーター）の制御下にあるｍＣｈｅｒｒｙを含むプラスミドを添加することにより作製する（図６を参照されたい）。
【０２０９】
これらの構築物中で使用されるＡｔｏｈ１エンハンサーの配列は、以下の通りである。
【０２１０】
【化１】
2019508033.tif 000026
【０２１１】
Ａｔｏｈ１−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドの配列は、以下の通りである。
【０２１２】
【化２−１】
2019508033.tif 000027
【０２１３】
【化２−２】
2019508033.tif 000028
【０２１４】
【化２−３】
2019508033.tif 000029
【０２１５】
このマウスに由来する幹細胞を内耳から単離し、マトリゲル中に懸濁させ、２４ウェルプレート内の、ＥＦＧ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ｐＶｃ、およびＶＰＡＣＨＩＲを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、最長５日間にわたり培養した。５日間の後、２００μｌの細胞解離溶液を各ウェルへと添加し、４５分間にわたりインキュベートし、次いで、ＴｒｙｐｌｅＥを添加し、２０分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞培養物を、遠心分離のために１５ｍｌのファルコンチューブへと移す。次いで、上清を除去し、細胞培養物をマトリゲル中に再度再懸濁させた。細胞を、９６ウェルプレートへと、ウェル１つ当たりの細胞約５０００個で分配した。
【０２１６】
次いで、細胞培養物を、候補薬物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、さらに５〜７日間にわたり処理した。この時点で、細胞をＦＡＣＳにより分取し、両方のマーカーの蛍光を測定する。トランスジェニックマウス細胞内の両方のマーカーの蛍光を、非処理トランスジェニック対照細胞と比較して増大させる候補薬物を、蝸牛有毛細胞（例えば、内耳内の蝸牛有毛細胞）の喪失と関連する難聴を処置するための候補薬剤として選択する。このスクリーニング法を使用して、薬物、化合物、遺伝子、または成長因子をスクリーニングする。
【０２１７】
（参考文献）
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12.     Mizutari, K. et al. Notch inhibition induces cochlear hair cell regeneration and recovery of hearing after acoustic trauma. Neuron 77, 58-69 (2013).
【０２１８】
他の実施形態
本発明について、その詳細な説明と共に説明してきたが、前出の説明は、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲により規定される。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
2019508033.tif 000030
【図２】
2019508033.tif 000031
【図３】
2019508033.tif 000032
【図４】
2019508033.tif 000033
【図５】
2019508033.tif 000034
【図６】
2019508033.tif 000035
【図７】
2019508033.tif 000036
【配列表】
2019508033000001.app
【国際調査報告】
2019508033.tif 000037
2019508033.tif 000038
2019508033.tif 000039