(57)【要約】  この発明は、肺癌、特にステージ３ａ肺腺癌及び肺扁平上皮癌における一塩基バリアントを検出する方法を提供する。核酸のクローン性集団を含む反応混合物及び固相等である、さらなる方法及び組成物を提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺の扁平上皮癌に存在する一塩基バリアント（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔ）を決定する方法であって、
肺の扁平上皮癌が疑われる個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を行うことによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌に関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、前記一組のアンプリコンを生成することと、
前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである前記セグメントの配列を決定することによって、扁平上皮癌中に存在する一塩基バリアントを決定することとを含む、方法。
【請求項２】
前記扁平上皮癌は、ステージ１ａ、１ｂ又は２ａの扁平上皮癌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記扁平上皮癌は、ステージ１ａ又は１ｂの扁平上皮癌である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記個体は外科手術を受けていない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記個体は生検を受けていない、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記個体に化合物を投与することをさらに含むものであって、前記化合物は、決定された一塩基バリアントのうちの１つ又は複数を有する肺扁平上皮癌の治療に特に有効であることがわかっている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
配列の決定から、前記一塩基バリアントのそれぞれに関して、バリアントアレル頻度（ｖａｒｉａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を決定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記バリアントアレル頻度の決定に基づいて、肺癌の治療計画を決める、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記一塩基バリアントのうちのひとつであって、決定されたその他の一塩基バリアントの少なくとも１／２よりも可変アレル頻度が高い、前記一塩基バリアントのうちのひとつを有する肺の扁平上皮癌の治療に特に有効であることがわかっている化合物を、前記個体に投与することをさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
核酸は、前記個体の腫瘍から単離されたものであり、一塩基バリアントは、血液又はそのフラクションの前記サンプルに関して、前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントの配列を決定する前に、前記一組の一塩基バリアント遺伝子座に対して腫瘍中で特定される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
肺癌が疑われる個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから、前記個体に対する肺癌の診断を裏付ける方法であって、前記方法は、
前記サンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を実行することによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌に関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、前記一組のアンプリコンを生成することと、
前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである前記セグメントの配列を決定することによって、１つまたは複数の一塩基バリアントが、複数の一塩基バリアント遺伝子座中に存在するか否かを決定することとを含み、
ａ）  一塩基バリアントが存在しないということが、ステージ１ａ、２ａ又は２ｂの腺癌の診断を裏付け、
ｂ）  一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌、又は、ステージ２ｂもしくは３ａの腺癌の診断を裏付け、又は、
ｃ）  １０以上の一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌又はステージ２ｂまたは３の腺癌の診断を裏付ける、方法。
【請求項１２】
前記方法は、非観血的方法によって肺癌の病変のステージを決定することをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
肺癌が疑われる個体からの血液又はそのフラクションのサンプル中において肺扁平上皮癌を検出する方法であって、前記方法は、
前記サンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を実行することによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌に関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、前記一組のアンプリコンを生成することと、
前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである前記セグメントの配列を決定することによって、複数の一塩基バリアント遺伝子座から１つ又は複数の一塩基バリアント遺伝子座が存在するか否かを決定することとを含むものであって、前記複数の一塩基バリアント遺伝子座のいずれかに関して、前記サンプル中に前記一塩基バリアント遺伝子が存在するということが、扁平上皮癌が存在することの示唆である、方法。
【請求項１４】
個体中において肺の扁平上皮癌を検出する方法であって、前記方法は、複数の一塩基バリアント遺伝子座の高スループットなＤＮＡシークエンシングを実行することによって、前記個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから、肺扁平上皮癌に関連することがわかっている複数の一塩基バリアント遺伝子座中に一塩基バリアント遺伝子が存在するか否かを決定することを含むものであって、前記複数の一塩基バリアント遺伝子座のいずれかに関して、前記サンプル中に前記一塩基バリアントが存在するということが、肺の扁平上皮癌が存在することの示唆である、方法。
【請求項１５】
個体の肺腫瘍中においてクローン性一塩基バリアントを検出する方法であって、前記方法は、
サンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を実行することによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌に関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、前記一組のアンプリコンを生成することと、
前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうちの少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである前記セグメントの配列を決定することと、
一連のアンプリコンの複数のコピーの配列に基づいて、ＳＮＶ遺伝子座のそれぞれに関して、バリアントアレル頻度を決定することとを含むものであって、複数の一塩基バリアント遺伝子座のうちの他の一塩基バリアントと比較してアレル頻度が比較的高いということが、腫瘍中のクローン性一塩基バリアントの示唆である、方法。
【請求項１６】
前記他の一塩基バリアントではなく、１つ又は複数のクローン性一塩基バリアントを標的とする化合物を個体に投与することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
バリアントアレル頻度が１．０％を超えるということが、クローン性一塩基バリアントの示唆である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
核酸を、肺癌を患う個体からの血液循環遊離核酸から単離するか否かを決定する方法であって、前記方法は、
前記肺癌が腺癌であるか扁平上皮癌であるかを決定することを含むものであって、前記肺癌が扁平上皮癌であれば、個体から血液循環遊離核酸を単離する、方法。
【請求項１９】
前記肺癌のステージを決定することをさらに含むものであって、前記肺癌が扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌であれば、前記個体から血液循環遊離核酸を単離する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記肺癌が扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌であれば、前記個体から血液循環遊離核酸を単離する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記肺癌が、あるステージの扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌であれば、前記個体の肺腫瘍から核酸を単離しない、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
扁平上皮癌が疑われる個体からの血液又はそのフラクションのサンプルにおいて、肺扁平上皮癌中に一塩基バリアントが存在するかを決定する方法であって、前記方法は、
ａ．  ポリメラーゼと、ヌクレオチド三リン酸塩と、前記サンプルから生成した核酸ライブラリからの核酸断片と、一塩基バリアント遺伝子座の１５０塩基対の範囲内でそれぞれ結合する一組のプライマー又は一塩基バリアント遺伝子座を含む１６０塩基対以下の領域にそれぞれ跨る一組のプライマー対とを組み合わせることによって、増幅反応混合物を形成することであって、前記一塩基バリアント遺伝子座は、扁平上皮癌に関連することがわかっているものであることと、
ｂ．  前記増幅反応混合物を増幅条件に供して、肺癌と関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうち少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座を含む一組のアンプリコンを生成させることと、
ｃ．  前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである前記セグメントの配列を決定することによって、扁平上皮癌中に存在する一塩基バリアントを決定することとを含む。
【請求項２３】
前記扁平上皮癌は、ステージ１ａ、１ｂ又は２ａの扁平上皮癌である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記扁平上皮癌は、ステージ１ａ又は１ｂの扁平上皮癌である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記個体は外科手術を受けていない、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記個体は生検を受けていない、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記個体に化合物を投与することをさらに含むものであって、前記化合物は、決定された一塩基バリアントのうちの１つ又は複数を有する肺扁平上皮癌の治療に特に有効であることがわかっている、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
配列の決定から、前記一塩基バリアントのそれぞれに関して、バリアントアレル頻度を決定することをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
バリアントアレル頻度の決定に基づいて、肺癌の治療計画を立てることをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記一塩基バリアントのうちのひとつであって、決定されたその他の一塩基バリアントの少なくとも１／２よりも可変アレル頻度が高い、前記一塩基バリアントのうちのひとつを有する肺の扁平上皮癌の治療に特に有効であることがわかっている化合物を、前記個体に投与することをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
核酸は、前記個体の腫瘍から単離されたものであり、一塩基バリアントは、血液又はそのフラクションの前記サンプルに関して、前記一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントの配列を決定する前に、前記一組の一塩基バリアント遺伝子座に対して腫瘍中で特定される、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
組成物は、ユニバーサルアダプター（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｄａｐｔｅｒ）を含む血液循環腫瘍核酸断片を含むものであって、前記血液循環腫瘍核酸は、肺の扁平上皮癌の腫瘍に由来するものである、組成物。
【請求項３３】
ユニバーサルアダプターを含む血液循環腫瘍核酸の断片を含む組成物であって、前記血液循環腫瘍核酸は、肺の扁平上皮癌を患う個体の血液又はそのフラクションのサンプルに由来する、組成物。
【請求項３４】
核酸の複数のクローン性集団を含む固相であって、前記クローン性集団が、血液循環遊離核酸のサンプルから生じたアンプリコンを含み、前記血液循環腫瘍核酸は肺の扁平上皮癌腫瘍に由来するものである、固相。
【請求項３５】
核酸の複数のクローン性集団を含む固相であって、前記クローン性集団が、肺の扁平上皮癌を患う個体からの血液又はそのフラクションのサンプルからの血液循環遊離核酸のサンプルから生じた核酸断片を含むものである、固相。
【請求項３６】
様々なクローン性集団中の前記核酸断片が、同一のユニバーサルアダプターを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
核酸のクローン性集団は、２人以上の個体からの一組のサンプルからの核酸断片に由来する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸断片は、前記一組のサンプル中のあるサンプルに対応する一連の分子バーコードのうちのひとつを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも５つのＳＮＶを検出するものであり、前記少なくとも５つのＳＮＶが存在することが、扁平上皮癌を示唆している、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
一塩基バリアントがサンプル中に存在するか否かを決定することが、一組の一塩基バリアント遺伝子座のそれぞれにおけるアレルの決定毎に、前記遺伝子座に関するリード深度（ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｒｅａｄ）に少なくとも一部基づいて、信頼度の値を特定することを含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
一塩基バリアントのコールは、一塩基バリアントの存在に対する信頼度の値が９０％を超える場合になされる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
一塩基バリアントのコールは、一塩基バリアントの存在に対する信頼度の値が９５％を超える場合になされる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
一組の一塩基バリアント遺伝子座が、肺癌に関するＴＣＧＡ及びＣＯＳＭＩＣのデータセットにおいて特定された一塩基バリアント遺伝子座の全てを含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
一組の一塩基バリアント部位が、肺扁平上皮癌に関するＴＣＧＡ及びＣＯＳＭＩＣのデータセットに特定された一塩基バリアント部位の全てを含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法は、少なくとも１，０００である、一組の一塩基バリアント遺伝子座に対するリード深度で実行される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
一組の一塩基バリアント遺伝子座が、肺癌に関連することがわかっている２５から１０００の一塩基バリアント遺伝子座を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
一塩基バリアント遺伝子座の多重増幅反応の増幅反応毎に、１サイクル当たりの効率及びエラー率を決定するものであり、前記効率及びエラー率を用いて、一組の単一バリアント（ｓｉｎｇｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ）遺伝子座における一塩基バリアントが、サンプル中に存在するか否かを決定する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
増幅反応がＰＣＲ反応であり、またアニーリング温度が、一組のプライマーのうちの少なくとも５０％のプライマーの融解温度よりも１から１５°Ｃ高い、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
増幅反応がＰＣＲ反応であり、前記ＰＣＲ反応におけるアニーリングステップの長さが１５から１２０分である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
増幅反応がＰＣＲ反応であり、前記ＰＣＲ反応におけるアニーリングステップの長さが１５から１２０分である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
増幅反応におけるプライマーの濃度が、１から１０ｎＭである、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
一組のプライマー中のプライマーが、プライマーダイマーの形成が最小化されるように設計されている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
増幅反応がＰＣＲ反応であり、またアニーリング温度が、一組のプライマーのうち少なくとも５０％のプライマーの融解温度よりも１から１５℃高く、前記ＰＣＲ反応におけるアニーリングステップの長さが、１５から１２０分であり、前記増幅反応におけるプライマーの濃度は１から１０ｎＭであり、一組のプライマー中のプライマーが、プライマーダイマーの形成が最小化されるように設計されている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
多重増幅反応は、制限されたプライマー条件下で実行する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年４月１５日出願の米国仮出願第６２／３２３，５８９号の利益を請求し、その全体を参照することによりここに組み入れるものとする。
【０００２】
開示の発明は、概して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅方法を用いて核酸の変異及び融合を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌に関連する変異の検出は、診断前、診断の際、疾患の病期分類、又は治効の監視のいずれであっても、従来、固体腫瘍生検サンプルに依存していた。かかるサンプリングは、侵襲性が高く、転移又は手術の合併症をもたらすおそれのある危険性がないというものではない。癌に関連する変異を検出するために、より良好で低侵襲性である方法が要望されている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書の一実施形態では、肺の扁平上皮癌に存在する一塩基バリアント（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔ）を決定する方法を提供する。この実施形態の該方法は、肺の扁平上皮癌が疑われる個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を行うことによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌に関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、該一組のアンプリコンを生成することと、
【０００５】
この一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである該セグメントの配列を決定することによって、扁平上皮癌中に存在する上記一塩基バリアントを決定することとを含む。
【０００６】
他の実施形態においては、肺癌が疑われる個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから、該個体に対する肺癌の診断を裏付ける方法を本明細書において提供する。該方法は、上記サンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を実行することによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌に関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、該一組のアンプリコンを生成することと、
【０００７】
この一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである該セグメントの配列を決定することによって、１つまたは複数の一塩基バリアントが、複数の一塩基バリアント遺伝子座中に存在するか否かを決定することとを含む。説明的な実施形態によれば、
【０００８】
一塩基バリアントが存在しないということが、ステージ１ａ、２ａ又は２ｂの腺癌の診断を裏付け、
一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌、又は、ステージ２ｂもしくは３ａの腺癌の診断を裏付け、及び／又は、
５、１０、１５又はそれ以上の一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌、又は、ステージ２ｂもしくは３の腺癌の診断を裏付ける。
【０００９】
或る実施形態においては、５、１０又は１５又はそれ以上の一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌、又は、ステージ３の腺癌の診断を裏付ける。
【００１０】
この方法の実施形態のうちいずれかの説明的な実施例においては、増幅ステップを含むものであって、増幅反応はＰＣＲ反応であり、アニーリング温度は一組のプライマーのうち少なくとも５０、６０、７０、８５、８０、９０、９５又は１００％のプライマーの融解温度よりも１から１５℃高く、ＰＣＲ反応におけるアニーリングステップの長さは、１５から６０分であり、増幅反応におけるプライマー濃度は１から１０ｎＭの間であり、該一組のプライマー中のプライマーは、プライマーダイマーの形成を最小化するように設計されていることを含む実施形態を本明細書において提供する。
【００１１】
この発明の方法の実施形態のいずれかにおいては、ある増幅法を用いてＳＮＶの存在を決定又は検出することを含み、一組の一塩基バリアント遺伝子座の多重増幅反応のうちの増幅反応毎に、１サイクル当たりの効率及びエラー率を決定することが可能であり、該効率及びエラー率を用いて、一組の単一バリアント（ｓｉｎｇｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ）遺伝子座において一塩基バリアントがサンプル中に存在するか否かを決定することが可能である。これら例示的な実施形態の一部においては、信頼度を決定し、信頼度９０％、９５％又は９８％等であるカットオフの信頼度の値を超えると、ＳＮＶコールがなされる。
【００１２】
他の実施形態においては、発明的な組成物及び固相が本明細書で提供される。
【００１３】
他の実施形態ならびに開示される実施形態の特徴及び効果は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
この特許又は出願ファイルには、カラーで示した少なくともひとつの図面が含まれる。この特許又は特許出願のカラー図面を伴う公開公報の写しは、請求及び必要な料金の支払いにより特許庁より提供されることとなる。
【００１５】
ここに開示する実施形態は、添付の図面を参照しながらさらに説明されるものであり、同じ構造は、複数の図面にわたって同じ符合で表される。示される図面は必ずしも縮尺通りではなく、ここに開示する実施形態の原則の説明について、通常の配置をする代わりに強調して示される。
【００１６】
【図１】図１は、ワークフロー図である。
【図２】図２は、上図が１サンプル当たりのＳＮＶ数であり、下図がドライバカテゴリで分類した、作業したアッセイである。
【図３】図３は、測定したｃｆＤＮＡ濃度であり、各データポイントは、ある血漿サンプルを意味する。
【図４−１】図４は、予め決定した組織ＶＡＦ測定値（ｘ軸）とここで用いたｍＰＣＲ−ＮＧＳ（ｙ軸）との間で良好な相関を示しているサンプルである。各サンプルは、それぞれ四角内に示され、ＶＡＦデータポイントは、組織の小区分ごとに色分けされている。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図５−１】図５は、予め決定した組織ＶＡＦ測定値（ｘ軸）とここで用いたｍＰＣＲ−ＮＧＳ（ｙ軸）との間で貧しい相関を示しているサンプルである。各サンプルは、それぞれ四角内に示され、ＶＡＦデータポイントは、組織の小区分ごとに色分けされている。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図６Ａ】図６Ａは、結果であるコールの関数としてのリード深度のヒストグラムであり、上図は、予想した血漿ＳＮＶが検出されなかったアッセイであり、下図は、予想した血漿ＳＮＶが検出されたアッセイである。
【図６Ｂ】同上。
【図７】図７は、組織型ごとの血漿中で検出されたＳＮＶ数である。
【図８】図８は、腫瘍ステージごとの血漿中でのＳＮＶ検出（左）及びサンプル検出（右）である。
【図９】図９は、腫瘍ステージ及びＳＮＶのクロナリティーの関数としての血漿のＶＡＦである。
【図１０】図１０は、ｃｆＤＮＡ入力量の関数としての、各サンプルからの血漿中で検出されたＳＮＶ数である。
【図１１】図１１は、平均腫瘍ＶＡＦの関数としての血漿のＶＡＦであり、平均腫瘍ＶＡＦは、各腫瘍からの解析した全腫瘍小区分にわたって計算した。
【図１２−１】図１２は、検出した各ＳＮＶのクローン比率（赤から青）と変異バリアントアレル頻度（ＭｕｔＶＡＦ（ｍｕｔａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ））とを示している。各サンプルから検出した合計のＳＮＶは、１つの縦列内に配置し、サンプルは、腫瘍ステージ（ｐＴＮＭｓｔａｇｅ）ごとに分類している。ＳＮＶが検出されなかったサンプルも含まれている。クローン比率は、ＳＮＶが観察された腫瘍の小区分数と、その腫瘍からの解析した合計小区分数との間の比率として規定している。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【図１３】図１３は、クローン状態（クローン性を青、サブクローン性を赤）と、検出された各ＳＮＶの変異バリアントアレル頻度（ＭｕｔＶＡＦ）とを示している。各サンプルから検出した合計のＳＮＶは、１つの縦列内に配置し、サンプルは、腫瘍ステージ（ｐＴＮＭｓｔａｇｅ）ごとに分類している。ＳＮＶが検出されなかったサンプルも含まれている。クローン状態は、腫瘍組織からの全エクソームシークエンシングデータを用いてＰｙＣｌｏｎｅＣｌｕｓｔｅｒ（ＰｙＣｌｏｎｅクラスタ）により決定した。
【図１４】図１４は、クローン状態（クローン性を青、サブクローン性を赤）と、検出した各ＳＮＶの変異バリアントアレル頻度（ＭｕｔＶＡＦ）とを示しており、上図はクローン性ＳＮＶのみを示しており、下図はサブクローン性ＳＮＶのみを示している。各サンプルから検出した合計のＳＮＶは、１つの縦列内に配置し、サンプルは、腫瘍ステージ（ｐＴＮＭｓｔａｇｅ）ごとに分類している。ＳＮＶが検出されなかったサンプルも含まれている。クローン状態は、腫瘍組織からの全エクソームシークエンシングデータを用いてＰｙＣｌｏｎｅＣｌｕｓｔｅｒ（ＰｙＣｌｏｎｅクラスタ）により決定した。
【図１５】図１５は、組織型及び腫瘍サイズの関数として、血漿中で検出したＳＮＶ数を示している。組織型及び腫瘍ステージは、病理報告によって決定した。各データポイントはサイズごとに色分けし、赤が最大腫瘍サイズを示し、青が最小腫瘍サイズを示している。
【図１６−１】図１６は、全サンプル中の、ＤＮＡ濃度、ライブラリ調製（ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐ）へのゲノムコピー当量（ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｐｙ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、血漿の溶血程度及びｃＤＮＡプロファイルを示す、ｃｆＤＮＡ解析表である。
【図１６−２】同上。
【図１７−１】図１７は、サンプル毎に血漿中で検出したＳＮＶの表である。
【図１７−２】同上。
【図１８】図１８は、血漿中で検出した他のＳＮＶの表である。
【図１９−１】図１９は、実施例１における実験用の遺伝子に基づくアッセイカウントの表である。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図１９−４】同上。
【図１９−５】同上。
【図１９−６】同上。
【図２０−１】図２０は、実施例１の実験で解析したサンプルに関する情報と、実施例１で提供する実験で生じたデータの表である。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２０−４】同上。
【図２０−５】同上。
【図２０−６】同上。
【図２０−７】同上。
【図２０−８】同上。
【図２０−９】同上。
【図２０−１０】同上。
【図２０−１１】同上。
【図２０−１２】同上。
【図２０−１３】同上。
【図２０−１４】同上。
【図２０−１５】同上。
【図２０−１６】同上。
【図２０−１７】同上。
【図２０−１８】同上。
【図２０−１９】同上。
【図２０−２０】同上。
【図２０−２１】同上。
【図２０−２２】同上。
【図２０−２３】同上。
【図２０−２４】同上。
【図２０−２５】同上。
【図２０−２６】同上。
【図２０−２７】同上。
【図２０−２８】同上。
【図２０−２９】同上。
【図２０−３０】同上。
【図２０−３１】同上。
【図２０−３２】同上。
【図２０−３３】同上。
【図２０−３４】同上。
【図２０−３５】同上。
【図２０−３６】同上。
【図２０−３７】同上。
【図２０−３８】同上。
【図２０−３９】同上。
【図２０−４０】同上。
【図２０−４１】同上。
【図２０−４２】同上。
【図２０−４３】同上。
【図２０−４４】同上。
【図２０−４５】同上。
【図２０−４６】同上。
【図２０−４７】同上。
【図２０−４８】同上。
【図２０−４９】同上。
【図２０−５０】同上。
【図２０−５１】同上。
【図２０−５２】同上。
【図２０−５３】同上。
【図２０−５４】同上。
【図２０−５５】同上。
【図２０−５６】同上。
【図２０−５７】同上。
【図２０−５８】同上。
【図２０−５９】同上。
【図２０−６０】同上。
【図２０−６１】同上。
【図２０−６２】同上。
【図２０−６３】同上。
【図２０−６４】同上。
【図２０−６５】同上。
【図２０−６６】同上。
【図２０−６７】同上。
【図２０−６８】同上。
【図２０−６９】同上。
【図２０−７０】同上。
【図２０−７１】同上。
【図２０−７２】同上。
【図２０−７３】同上。
【図２０−７４】同上。
【図２０−７５】同上。
【図２０−７６】同上。
【図２０−７７】同上。
【図２０−７８】同上。
【図２０−７９】同上。
【図２０−８０】同上。
【図２０−８１】同上。
【図２０−８２】同上。
【図２０−８３】同上。
【図２０−８４】同上。
【図２０−８５】同上。
【図２０−８６】同上。
【図２０−８７】同上。
【図２０−８８】同上。
【図２０−８９】同上。
【図２０−９０】同上。
【図２０−９１】同上。
【図２０−９２】同上。
【図２０−９３】同上。
【図２０−９４】同上。
【図２０−９５】同上。
【図２０−９６】同上。
【図２０−９７】同上。
【図２０−９８】同上。
【図２０−９９】同上。
【図２０−１００】同上。
【図２０−１０１】同上。
【図２０−１０２】同上。
【図２０−１０３】同上。
【図２０−１０４】同上。
【図２０−１０５】同上。
【図２０−１０６】同上。
【図２０−１０７】同上。
【図２０−１０８】同上。
【図２０−１０９】同上。
【図２０−１１０】同上。
【図２０−１１１】同上。
【図２０−１１２】同上。
【図２０−１１３】同上。
【図２０−１１４】同上。
【図２０−１１５】同上。
【図２０−１１６】同上。
【図２０−１１７】同上。
【図２０−１１８】同上。
【図２０−１１９】同上。
【図２０−１２０】同上。
【図２０−１２１】同上。
【図２０−１２２】同上。
【図２０−１２３】同上。
【図２０−１２４】同上。
【図２０−１２５】同上。
【図２０−１２６】同上。
【図２０−１２７】同上。
【図２０−１２８】同上。
【図２０−１２９】同上。
【図２０−１３０】同上。
【図２０−１３１】同上。
【図２０−１３２】同上。
【図２０−１３３】同上。
【図２０−１３４】同上。
【図２０−１３５】同上。
【図２０−１３６】同上。
【図２１】図２１は、再発時（ＬＴＸ１０３）の、血漿サンプルに関する、検出したアッセイとそれらのバックグラウンドのアレル断片の一例である。
【００１７】
上記に特定した図は、提示するために提供されるのであって限定するためではない。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書では、肺癌の検出、診断、病期分類、スクリーニング、治療及び管理を向上させる方法及び組成物を提供する。本明細書で提供する方法は、説明的な実施形態においては、循環する流体中の、特に血液循環腫瘍ＤＮＡの、一塩基バリアント変異体（ＳＮＶ）を解析する。該方法は、必要とされていた複数回試験ではなく、全てが有効であれば腫瘍サンプルを利用する一回の試験で、腫瘍中で発見される大部分の変異体、クローン性変異のみならずサブクローン性変異を特定するという利点を提供する。この方法及び組成物は、それのみで有用であり得る、又は、肺癌を検出、診断、病期分類、スクリーニング、治療及び管理する他の方法と併用したときに有用であり得、例えばこれら他の方法の結果に対する裏付けとなり、さらなる信頼性及び／又は最終的な結果を提供する。
【００１９】
したがって、一実施形態においては、本明細書で提供するｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローを用いて、扁平上皮癌を有する又は扁平上皮癌が疑われる個体等であるある個体からのｃｔＤＮＡサンプル中に存在する一塩基バリアントを決定することによって、肺扁平上皮癌中に存在する一塩基バリアントを決定する方法を、本明細書において提供する。
【００２０】
他の実施形態においては、本明細書で提供するｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローを用いてｃｔＤＮＡサンプル中に存在する一塩基バリアントを決定することによって、サンプル中に存在する一塩基バリアントを決定することを含むものである、癌が疑われる個体等であるある個体からの血液又はそのフラクションのサンプルにおいて肺扁平上皮癌を検出する方法を提供する。複数の一塩基遺伝子座において、サンプル中に、ＳＮＶが、範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０又は５０存在するということが、扁平上皮癌が存在していることの示唆である。
【００２１】
他の実施形態においては、個体の肺腫瘍中においてクローン性一塩基バリアントを検出する方法を本明細書において提供する。該方法は、本明細書で提供するｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローを実行することと、一連のアンプリコンの複数のコピーの配列に基づいて、ＳＮＶ遺伝子座のそれぞれに関してバリアントアレル頻度を決定することとを含む。複数の一塩基バリアント遺伝子座の他の一塩基バリアントと比べてアレル頻度が比較的高いということが、腫瘍中におけるクローン性一塩基バリアントの示唆である。バリアントアレル頻度は、シークエンシング分野で周知である。この実施形態の裏付けを、例えば図１２から１４で提供している。
【００２２】
或る実施形態においては、この方法は、治療計画、治療法を決定することと、及び／又は、１つ又は複数のクローン性一塩基バリアントを標的とする化合物を個体に投与することとをさらに含む。或る実施例においては、サブクローン性ＳＮＶ及び／又は他のクローン性ＳＮＶは治療法で標的とされない。或る治療法及び関連する変異が、この明細書の他の部分で提供されるが、この分野で公知である。したがって、或る実施例においては、該方法は、個体に化合物を投与することをさらに含むものであって、該化合物は、決定された一塩基バリアントのうちの１つ又は複数を有する肺扁平上皮癌の治療に特に有効であることがわかっているものである。
【００２３】
この実施形態の或る態様においては、バリアントアレル頻度が０．２５％、０．５％、０．７５％、１．０％、５％又は１０％を超えるということが、クローン性一塩基バリアントの示唆である。これらカットオフは、図２０の表の形式内のデータで裏付けられている。
【００２４】
この実施形態の或る実施例においては、扁平上皮癌は、ステージ１ａ、１ｂ又は２ａの扁平上皮癌である。この実施形態の或る実施例においては、扁平上皮癌は、ステージ１ａ又は１ｂの扁平上皮癌である。この実施形態の或る実施例においては、個体は外科手術を受けていない。この実施形態の或る実施例においては、個体は生検を受けていない。
【００２５】
この実施形態の一部の実施例においては、直接腫瘍試験等の他の試験が、試験中の任意のＳＮＶに関して、ある試験中のＳＮＶであって、決定されたその他の一塩基バリアントの少なくとも１／４、１／３、１／２又は３／４よりも可変アレル頻度が高い該ある試験中のＳＮＶが、クローン性ＳＮＶであるということを示唆していれば、クローン性ＳＮＶであると特定される又はさらに特定される。
【００２６】
一部の実施形態においては、ｃｔＤＮＡ中においてＳＮＶを検出する本明細書の方法を、腫瘍からのＤＮＡの直接的な解析に代えて用いることが可能である。本明細書で提供する結果が、クローン性ＳＮＶである可能性がかなり高いＳＮＶはより高いＶＡＦを有する、ということを実証している（例えば図１２〜１４を参照のこと）。
【００２７】
本明細書で提供する方法の実施形態のいずれについての或る実施例においては、ある個体からのｃｔＤＮＡに標的増幅を実行する前に、該個体からのある腫瘍中で発見されるＳＮＶに対してデータを提供する。したがってこれら実施形態においては、ＳＮＶの増幅／シークエンシング反応を、個体からの１つ又は複数の腫瘍サンプルに対して実行する。この方法では、本明細書で提供するｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシング反応は、それがクローン性及びサブクローン性の変異の液体生検を提供することを理由に、やはり有利である。また、本明細書で提供するように、肺癌を患う個体において、あるＳＮＶに関して、該個体からのｃｔＤＮＡサンプル中で例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％ＶＡＦ以上である高い割合のＶＡＦが確定するものであれば、クローン性変異であることがより明確に特定可能である。
【００２８】
或る実施形態においては、本明細書で提供する方法を用いて、肺癌を患う個体からの血液循環遊離核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）からｃｔＤＮＡを単離して解析するか否かを決定することが可能である。はじめに、肺癌が腺癌であるか扁平上皮癌であるかを決定する。肺癌が扁平上皮癌であれば、個体から血液循環遊離核酸を単離する。該方法は、一部の実施例において、肺癌のステージを決定することをさらに含むものであって、肺癌が扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌であれば、個体から血液循環遊離核酸を単離する。図１５及び図２０の表で提供する結果が、扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌で、ＳＮＶが広くいきわたっていることを実証している。しかし早期のステージのＡＤＣでは、ＳＮＶはそれほど広くいきわたっていない。したがって、ステージ１ａ、１ｂのＳＮＶ及び／又は２ａのＡＤＣである患者が試験を免れることで、健康管理上の重要な救済を実現することが可能である。
【００２９】
実施例においては、肺癌が扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌であれば、個体から血液循環遊離核酸を単離する。また、一部の実施例においては、
【００３０】
肺癌が、あるステージの扁平上皮癌又はステージ３ａの腺癌であれば、個体の肺腫瘍から核酸を単離しない。
【００３１】
一部の方法においては、発明的な組成物及び／又は固相が本明細書において提供される。Ｆ１。組成物は、ユニバーサルアダプター（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｄａｐｔｅｒ）を含む血液循環腫瘍核酸断片を含むものであって、該血液循環腫瘍核酸は、肺の扁平上皮癌の腫瘍に由来するものである。
【００３２】
一部の実施形態においては、ユニバーサルアダプターを含む血液循環腫瘍核酸の断片を含む発明的な組成物を、本明細書において提供するものであって、該血液循環腫瘍核酸は、肺の扁平上皮癌を患う個体の血液又はそのフラクションのサンプルに由来する。実施例１で提示する結果が、ｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシング試験法の驚くべき利点を実証している。これら方法は典型的に、ユニバーサルアダプターを含むｃｔＤＮＡ断片を形成することを含む。また、かかる方法は典型的に、固相の形成、特に核酸の複数のクローン性集団を含む、高スループットなシークエンシング用の固相を形成することを含むものであって、該クローン性集団は、ｃｔＤＮＡである血液循環遊離核酸のサンプルから生じたアンプリコンを含む。本明細書で提供する驚くべき結果に基づいた説明的な実施形態においては、該ｃｔＤＮＡは、肺の扁平上皮癌の腫瘍に由来するものである。
【００３３】
同様に、この発明のある実施形態として、核酸の複数のクローン性集団を含む固相を本明細書で提供するものであって、該クローン性集団は、肺の扁平上皮癌を患う個体からの血液又はそのフラクションのサンプルからの血液循環遊離核酸のサンプルから生じた核酸断片を含む。
【００３４】
或る実施形態においては、様々なクローン性集団中の核酸断片が、同一のユニバーサルアダプターを含む。こうした組成物は典型的に、実施例１で実行するとおりの本発明の方法において高スループットなシークエンシング反応中に形成される。
【００３５】
核酸のクローン性集団は、２人以上の個体からの一組のサンプルからの核酸断片に由来し得る。これら実施形態においては、核酸断片は、一組のサンプル中のあるサンプルに対応する一連の分子バーコードのうちのひとつを含む。
【００３６】
詳細な解析法は、本明細書の解析セクションでＳＮＶ法１及びＳＮＶ法２として本明細書で提供する。本明細書で提供する方法はいずれも、本明細書で提供する解析ステップをさらに含むことが可能である。したがって或る実施例においては、一塩基バリアントがサンプル中に存在するか否かを決定する方法が、一組の一塩基バリアント遺伝子座のそれぞれにおけるアレルの決定毎に信頼度の値を特定することを含み、それは該遺伝子座に関するリード深度に少なくとも一部基づくことが可能である。信頼度限界は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％又は９９％に設定することが可能である。信頼度限界は、異なるタイプの変異に対しては異なるレベルを設定することが可能である。
【００３７】
該方法は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１，０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００又は１００万である、一組の一塩基バリアント遺伝子座に対するリード深度で実行可能である。図２０は、実施例１において良好に解析された、ＳＮＶ遺伝子座に対するリード深度のデータを提供している。
【００３８】
或る実施形態においては、本明細書における実施形態のいずれの方法が、一塩基バリアント遺伝子座の多重増幅反応の増幅反応毎に決定される、１サイクル当たりの効率及び／又はエラー率を決定することを含む。その後、該効率及びエラー率を用いて、一組の単一のバリアント遺伝子座における一塩基バリアントが、サンプル中に存在するか否かを決定することが可能である。或る実施形態においては、解析方法において提供するＳＮＶ法２で提供されるさらに詳細な解析ステップも同様に含むことが可能である。
【００３９】
説明的な実施形態においては、本明細書の方法のうちいずれかの、一組の一塩基バリアント遺伝子座が、肺癌もしくは肺の腺癌及び／又は特に肺の扁平上皮癌に関するＴＣＧＡ及びＣＯＳＭＩＣのデータセットにおいて特定された一塩基バリアント遺伝子座の全てを含む。
【００４０】
本明細書の方法のうちのいずれかの或る実施形態において、一組の一塩基バリアント遺伝子座は、肺癌、肺ＡＤＣ及び／又は特に肺ＳＣＣと関連することがわかっている一塩基バリアント遺伝子座を、範囲の下限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００又は１０，０００含み、範囲の上限で５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００及び２５，０００含む。
【００４１】
本明細書のｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローを含むＳＮＶを検出する方法のうちのいずれかにおいては、多重ＰＣＲのための改善された増幅パラメータを用いることが可能である。例えば、増幅反応がＰＣＲ反応であり、またアニーリング温度が、一組のプライマーのうちの少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、０６、７０、７５、８０、９０、９５又は１００％のプライマーに関する融解温度よりも、範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０°Ｃから範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５°Ｃの間の温度である。
【００４２】
或る実施形態においては、増幅反応がＰＣＲ反応であり、またＰＣＲ反応におけるアニーリングステップの長さが、範囲の下限で１０、１５、２０、３０、４５及び６０分から範囲の上限で１５、２０、３０、４５、６０、１２０、１８０又は２４０分の間の長さである。或る実施形態においては、ＰＣＲ反応等の増幅の際のプライマー濃度が、１から１０ｎＭの間である。また、例示的な実施形態においては、一組のプライマー中のプライマーは、プライマーダイマーの形成が最小化されるように設計されている。
【００４３】
したがって、増幅ステップを含む本明細書における方法のいずれかについての実施例においては、増幅反応がＰＣＲ反応であり、またアニーリング温度が、一組のプライマーのうち少なくとも９０％のプライマーの融解温度よりも１から１０℃の間の温度高く、ＰＣＲ反応におけるアニーリングステップの長さが、１５から６０分の間であり、増幅反応におけるプライマー濃度は１から１０ｎＭの間であり、一組のプライマー中のプライマーは、プライマーダイマーの形成が最小化されるように設計されている。この実施例のさらなる態様においては、多重増幅反応は、制限されたプライマー条件下で実行する。
【００４４】
他の実施形態においては、個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから、肺癌が疑われる個体等であるある個体に対して肺癌の診断を裏付ける方法を本明細書で提供するものであって、それは本明細書で提供するようなｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローを実行して、１つ又は複数の一塩基バリアントが複数の一塩基バリアント遺伝子座中に存在するか否かを決定することを含む。この実施形態において、以下の要素、声明、ガイドライン又は規則を適用する：
【００４５】
一塩基バリアントが存在しないということが、ステージ１ａ、１ｂ又は２ａの腺癌の診断を裏付け、
【００４６】
一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌、又は、ステージ２ｂもしくは３ａの腺癌の診断を裏付け、及び／又は、
【００４７】
１０以上の一塩基バリアントが存在するということが、扁平上皮癌又はステージ２ｂ又は３の腺癌の診断を裏付ける。
【００４８】
上記要素、声明、ガイドライン又は規則は、実施例１の結果により裏付けられる（例えば、図２０の表データを参照）。これら結果は、ＡＤＣ腫瘍で、特にステージ２ｂ及び３ａのＡＤＣ腫瘍で、特にあらゆるステージのＳＣＣ腫瘍で、発見されたＳＮＶを特定する有益な方法として、個体からの肺のＡＤＣサンプル及びＳＣＣサンプルについての、ｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローを用いて解析を特定している（例えば、図１５及び図２０を参照）。
【００４９】
或る実施例においては、この実施形態は、非観血的方法によって肺癌の病変のステージを決定することをさらに含む。例えば、非観血的方法によって腫瘍サイズを決定することが可能である。
【００５０】
或る実施形態においては、本明細書のＳＮＶを検出する方法を用いて治療レジメンを行うことが可能である。ＡＤＣ及びＳＣＣに関連する特定の変異を標的とする治療法が、利用可能であり、開発中である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ．  １４：５３５−５５１  （２０１４））。例えば、治療の選択には、Ｌ８５８Ｒ又はＴ７９０ＭにおけるＥＧＦＲ変異の検出が有益であり得る。エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＺＫ９２９１、ＣＯ−１６８６及びＨＭ６１７１３は、米国又は治験で現在承認されている治療であり、これらは特定のＥＧＦＲ変異を標的としている。他の例では、ＫＲＡＳ中のＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ又はＧ１２Ｖの変異を利用して、個体に対してセルメチニブとドセタキセルとを組み合わせた治療を行うことが可能である。他の例として、ＢＲＡＦにおけるＶ６００Ｅ変異を利用して、対象に対してベムラフェニブ、ダブラフェニブ及びトラメチニブによる治療を行うことが可能である。
【００５１】
或る説明的な実施形態においては、本発明の方法で解析されるサンプルは、血液サンプル又はそのフラクションである。或る実施形態においては、本明細書で提供する方法は、ＤＮＡ断片の、特に血液循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）中で発見した腫瘍のＤＮＡ断片の増幅に特に適している。こうした断片は、典型的には、長さを約１６０ヌクレオチドとする。
【００５２】
例えばｃｆＮＡである無細胞核酸（ｃｆＮＡ）は、アポトーシス、壊死、自家融解及びネクロプトーシス等である種々の細胞死の形態を介して循環系に放出され得るということがこの技術分野で知られている。ｃｆＤＮＡは断片化されており、該断片のサイズ分布は１５０〜３５０ｂｐから＞１００００ｂｐまで様々である（Ｋａｌｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ７；２１（４１）：１１６３６−１１６５３を参照）。例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血漿ＤＮＡ断片のサイズ分布は、カウント数（ｃｏｕｎｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）のピークが約１６６ｂｐである長さ１００〜２２０ｂｐの範囲に及ぶものであって、また長さ１５０〜１８０ｂｐの断片において腫瘍ＤＮＡ濃度が最も高かった（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：Ｅ１３１７−Ｅ１３２５を参照）。
【００５３】
説明的な実施形態においては、血液循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、細胞片及び血小板を遠心分離で除去後、ＥＤＴＡ−２Ｎａチューブを用いて血液から単離した。血漿サンプルは、例えばＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、独国ヒルデン）を用いてＤＮＡを抽出するまで、−８０℃で保存することが可能である（例えばＨａｍａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；１１２：３５２−３５６）。Ｈａｍａｋａｖａらは、全サンプルのうち抽出した無細胞ＤＮＡの濃度の中央値が血漿１ｍｌ当たり４３．１ｎｇ（９．５〜１３３８ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ）であり、変異断片は０．００１〜７７．８％の範囲に及び、中央値は０．９０％であると報告した。
【００５４】
或る説明的な実施形態においては、サンプルは腫瘍である。この分野では、本明細書で教示する、腫瘍から核酸を単離する方法、かかるＤＮＡサンプルから核酸ライブラリを作成する方法が知られている。さらに本明細書で教示から、当業者には、ｃｔＤＮＡサンプルに加えてＤＮＡが浮遊する他の液体サンプル等である他のサンプルから、本明細書の方法に適した核酸ライブラリを作成する方法がわかるであろう。
【００５５】
或る実施形態における本発明の方法は、典型的に、サンプルから核酸ライブラリを生成及び増幅するステップ（すなわちライブラリ調製）を含む。ライブラリ調製ステップ中のサンプルからの核酸は、ライブラリタグ、すなわちライゲーションアダプタタグ（ＬＴ）ともしばしば称される、付随するライゲーションアダプタを有することが可能であり、該ライゲーションアダプタは、次にユニバーサル増幅が続くユニバーサルプライミング配列を含む。これは、ある実施形態においては、断片化の後でシークエンシングライブラリを作成するように設計された標準プロトコルを用いて行われ得る。ある実施形態においては、ＤＮＡサンプルは平滑末端であり得、その場合Ａが３’末端に付加され得る。Ｔオーバーハングを含むＹアダプタが付加され、連結され得る。一部の実施形態においては、Ａ又はＴオーバーハング以外の他の粘着末端を用いることが可能である。一部の実施形態においては、例えばループライゲーションアダプタである他のアダプタが付加され得る。一部の実施形態においては、該アダプタは、ＰＣＲ増幅のために設計されたタグを有してもよい。
【００５６】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡサンプル中でＳＮＶを検出する方法を含む。こうした方法は、説明的な実施形態においては、増幅ステップ及びシークエンシングステップ（本明細書においては「ｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフロー」と称することもある）を含む。ある例示的な実施例においては、ｃｔＤＮＡの増幅／シークエンシングワークフローが、例えば扁平上皮癌である肺癌が疑われる個体等であるある個体からの血液又はそのフラクションのサンプルから単離した核酸に対して多重増幅反応を行うことによって、一組のアンプリコンであって、その各アンプリコンが、肺癌と関連することがわかっているＳＮＶ遺伝子座等の一組の一塩基バリアント遺伝子座のうちの少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座に跨っているものである、該一組のアンプリコンを生成させることと、
【００５７】
該一組のアンプリコンの各アンプリコンのうち少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである該セグメントの配列を決定することとを含むことが可能である。このようにして、この例示的な方法は、サンプル中に存在する一塩基バリアントを決定する。
【００５８】
例示的なｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンスワークフローは、より詳細には、ポリメラーゼと、ヌクレオチド三リン酸塩と、サンプルから生成した核酸ライブラリからの核酸断片と、それぞれが一塩基バリアント遺伝子座から有効な距離で結合している一組のプライマー又はそれぞれが一塩基バリアント遺伝子座を含む有効な範囲に跨る一組のプライマーペアとを組み合わせることによって、増幅反応混合物を形成することを含むことが可能である。この一塩基バリアント遺伝子座は、例示的な実施形態においては、例えば肺腺癌及び／又は特に説明的な実施形態においては扁平上皮癌である、肺癌と関連することがわかっている遺伝子座である。そして、上記増幅反応混合物を増幅条件に供して、好ましくは肺癌と関連することがわかっている一組の一塩基バリアント遺伝子座のうち少なくともひとつの一塩基バリアント遺伝子座を含む一組のアンプリコンを生成させることと、
【００５９】
該一組のアンプリコンの各アンプリコンのうちの少なくともひとつのセグメントであって、一塩基バリアント遺伝子座を含むものである該セグメントの配列を決定することとを含む。
【００６０】
プライマーの結合の有効な距離は、ＳＮＶ遺伝子座のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５又は１５０塩基対の範囲内とすることが可能である。一対のプライマーが跨る有効な範囲は、典型的にはあるＳＮＶを含み、典型的には１６０塩基対以下であり、また１５０、１４０、１３０、１２５、１００、７５、５０又は２５塩基対以下とすることが可能である。他の実施形態においては、一対のプライマーが跨る有効な範囲は、あるＳＮＶ遺伝子座から、範囲の下限で２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０又は１５０ヌクレオチド、範囲の上限で２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０又は１５０、１６０、１７０、１７５又は２００ヌクレオチドとする。
【００６１】
この発明の方法で用いる、ｃｔＤＮＡのＳＮＶの増幅／シークエンシングワークフローに用いてＳＮＶを検出することが可能である増幅方法に関するさらなる詳細は、この明細書の他のセクションで提供する。
【００６２】
ＳＮＶコール解析
本明細書で提供する方法を実施する間に、タイルド（ｔｉｌｅｄ）多重ＰＣＲによって形成したアンプリコンに対して、核酸シークエンシングデータを生成する。本明細書の実施例１に説明するように、このデータを解析して、標的遺伝子中にＳＮＶ等の変異が存在するか否かを特定の信頼度限界の範囲内で決定するために用いる及び／又は適用することが可能である、アルゴリズム設計ツールを利用可能である。
【００６３】
シークエンシングのリードを、インハウスツールを用いて逆多重化し、ｈｇ１９ゲノムに対して、ＰＥＡＲでマージしたリードを用いるシングルエンドモードで、Ｂｕｒｒｏｗｓ−ＷｈｅｅｌｅｒアラインメントソフトウェアであるＢｗａ  ｍｅｍ関数（ＢＷＡ、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｉ  Ｈ．ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ  Ｒ．（２０１０）Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｅｐｕｂ．［ＰＭＩＤ：２００８０５０５］を参照）でマッピングすることが可能である。増幅の統計のＱＣ（クオリティーコントロール）は、合計リード数、マッピングしたリード数、標的上にマッピングしたリード数及び計数したリード数を解析することによって実行可能である。
【００６４】
或る実施形態においては、核酸シークエンシングデータ検出からＳＮＶを検出する任意の解析方法を、ＳＮＶを検出するステップ又はＳＮＶが存在するか否かを決定するステップを含むこの発明による発明方法のうちの方法と共に用いることが可能である。説明的な或る実施形態においては、以下のＳＮＶ法１を利用したこの発明の方法を用いている。他のさらなる説明的な実施形態においては、ＳＮＶを検出するステップ又はＳＮＶ遺伝子座においてＳＮＶが存在するか否かを決定するステップを含むこの発明の方法は、以下のＳＮＶ法２を利用している。
【００６５】
ＳＮＶ法１：この実施形態に関して、ラン特有の人工産物を説明するために同一のシークエンシングランで配列した正常な血漿サンプルを用いて、バックグラウンドエラーモデルを構築する。或る実施形態においては、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０又は２５０以上である正常な血漿サンプルを、同一のシークエンシングランで解析する。説明的な或る実施形態においては、２０、２５、４０又は５０の正常な血漿サンプルを、同一のシークエンシングランで解析する。正常中央値のバリアントアレル頻度が、あるカットオフよりも高い雑音位置は、除外するものとする。或る実施形態においては、このカットオフは、例えば＞０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、１％、２％、５％又は１０％である。説明的な或る実施形態においては、正常中央値のバリアントアレル頻度が０．５％よりも高い雑音位置を、除外するものとする。異常値のサンプルは、雑音及び汚染の原因となるためモデルから繰り返し除去した。或る実施形態においては、５、６、７、８、９又は１０を超えるＺスコアをもつサンプルを、データ解析から除去している。全てのゲノム遺伝子座の塩基置換毎に、エラーの平均及び標準偏差で重み付けしたリード深度を計算する。少なくとも５つのバリアントのリードと、例えばバックグラウンドエラーモデルに対してＺスコア１０とを含む、腫瘍の又は無細胞血漿のサンプル位置を、候補変異としてコールすることが可能である。
【００６６】
ＳＮＶ法２：この実施形態のため、血漿ｃｔＤＮＡデータを用いて、一塩基バリアント（ＳＮＶ）を決定する。ＰＣＲ工程は、確率論的な工程としてモデル化され、訓練セットを用いてパラメータを概算して、個別の試験セットに対して最終的なＳＮＶコールを行う。多重ＰＣＲサイクルを横断するエラーの伝播を決定し、バックグラウンドエラーの平均及び変動を計算するが、説明的な実施形態においては、バックグラウンドエラーは、真の変異とは区別される。
【００６７】
以下のパラメータを、塩基毎に概算する。
【００６８】
ｐ＝効率（各サイクルにおいて各リードが複製される蓋然性）
【００６９】
ｐｅ＝ｅ型変異に対する１サイクル当たりのエラー率（ｅ型のエラーが発生する蓋然性）
【００７０】
Ｘ０＝最初の分子数
【００７１】
ＰＣＲ工程の過程にわたってリードが複製されるにつれて、より多くのエラーが発生する。このため、本来のリードからの分離度をもって、リードのエラープロファイルを決定する。発生するまでにｋ回の複製を続けた場合のリードを、第ｋ世代と称する。
【００７２】
ここで、塩基毎に以下の変数を規定するものとする。
【００７３】
Ｘｉｊ＝ＰＣＲサイクルｊにおいて生成した第ｉ世代のリード数
【００７４】
Ｙｉｊ＝サイクルｊの最後における第ｉ世代の合計リード数
【００７５】
Ｘｉｊｅ＝ＰＣＲサイクルｊにおいて生成した、変異ｅを含む第ｉ世代のリード数
【００７６】
さらに、ＰＣＲ工程の開始時に変異ｅを含む他のｆｅＸ０分子があれば、正常な分子Ｘ０に加える（ゆえにｆｅ／（１＋ｆｅ）は、最初の混合物中の変異分子の断片となる）。
【００７７】
サイクルｊ−１における第ｉ−１世代の合計リード数を考慮して、サイクルｊにおいて生成した第ｉ世代のリード数は、サンプルサイズＹｉ−１，ｊ−１と蓋然性のパラメータｐとによる二項分布を有する。ゆえに、Ｅ（Ｘｉｊ，｜Ｙｉ−１，ｊ−１，ｐ）＝ｐＹｉ−１，ｊ−１であり、Ｖａｒ（Ｘｉｊ，｜Ｙｉ−１，ｊ−１，ｐ）＝ｐ（１−ｐ）Ｙｉ−１，ｊ−１である。
【００７８】
【数１】
2019517781.tif 000003
という式もある。ゆえに、帰納、シミュレーション又は同様の方法によって、Ｅ（Ｘｉｊ，）を決定することが可能である。同様に、分布ｐを用いて、Ｖａｒ（Ｘｉｊ）＝Ｅ（Ｖａｒ（Ｘｉｊ，｜ｐ））＋Ｖａｒ（Ｅ（Ｘｉｊ，｜ｐ））を決定することが可能である。
【００７９】
最終的に、Ｅ（Ｘｉｊｅ｜Ｙｉ−１，ｊ−１，ｐｅ）＝ｐｅＹｉ−１，ｊ−１及びＶａｒ（Ｘｉｊｅ｜Ｙｉ−１，ｊ−１，ｐ）＝ｐｅ（１−ｐｅ）Ｙｉ−１，ｊ−１となり、これらを用いてＥ（Ｘｉｊｅ）及びＶａｒ（Ｘｉｊｅ）を計算することが可能である。
【００８０】
或る実施形態においては、ＳＮＶ法２を以下のとおり実行する：
【００８１】
ａ）訓練データセットを用いて、ＰＣＲ効率と１サイクル当たりのエラー率とを概算すること、
【００８２】
ｂ）ステップ（ａ）で概算した効率の分布を用いて、各塩基における試験データセットに関して開始の分子数を概算すること、
【００８３】
ｃ）必要であれば、ステップ（ｂ）で概算した開始の分子数を用いて、試験データセットに関して効率の概算を更新すること、
【００８４】
ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で概算した試験データセットとパラメータとを用いて、合計分子数、バックグラウンドエラー分子及び真の変異分子（真の変異分子の最初の割合からなる探索空間に関して）の平均値及び変動を概算すること、
【００８５】
ｅ）合計分子中における合計エラー分子数（バックグラウンドエラーと真の変異）に対してある分布を当てはめて、上記探索空間における真の変異の割合毎に尤度を計算すること、及び、
【００８６】
ｆ）ステップ（ｅ）からのデータを用いて、最も可能性のある真の変異の割合を決定して信頼度を計算すること。
【００８７】
信頼度のカットオフを用いて、あるＳＮＶ遺伝子座におけるあるＳＮＶを特定することが可能である。例えばあるＳＮＶをコールするために、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である信頼度のカットオフを用いることが可能である。
【００８８】
例示的なＳＮＶ法２のアルゴリズム
訓練セットを用いて、効率と、１サイクル当たりのエラー率とを概算することで、アルゴリズムを開始する。ここでｎは、ＰＣＲサイクルの合計数を示す。
【００８９】
各塩基ｂにおけるリードＲｂの数は、（１＋ｐｂ）ｎＸ０で近似することが可能であり、ここでｐｂは塩基ｂにおける効率である。そして（Ｒｂ／Ｘ０）１／ｎを用いて、１＋ｐｂを近似することが可能である。その後、全訓練サンプルにわたってｐｂの平均及び標準偏差を決定して、塩基毎に確率分布（例えば正規分布、ベータ分布又は同様の分布）のパラメータを概算することが可能である。
【００９０】
同様に、各塩基ｂにおけるエラーｅのリードＲｂｅの数を用いて、
【数２】
2019517781.tif 000004
を概算することが可能である。全訓練サンプルにわたってエラー率の平均及び標準偏差を決定した後、その確率分布（例えば正規分布、ベータ分布又は同様の分布）を近似するが、これがもつパラメータは、この平均及び標準偏差の値を用いて概算されるものである。
【００９１】
次に、試験データに関して、各塩基における最初の開始コピーを
【数３】
2019517781.tif 000005
として概算するが、ここでｆ（．）は、訓練セットからの概算分布である。
もつパラメータは、この平均及び標準偏差の値を用いて概算されるものである。
【数４】
2019517781.tif 000006
ここにおいて、ｆ（．）は、訓練セットからの概算分布である。
【００９２】
このように、確率論的な工程で用いるパラメータを概算した。その後、これら概算値を用いて、各サイクルで形成される分子の平均及び変動を概算することが可能である（なおこれは、正常分子、エラー分子及び変異分子のそれぞれに個別に行う）。
【００９３】
最後に、確率論的方法（例えば最尤法又は同様の方法）を用いて、エラー、変異及び正常な分子についての分布が最良に適する、最良のｆｅ値を決定することが可能である。より詳細には、最終的なリード中の種々のｆｅ値に関して、エラー分子の合計分子数に対する予想比率を概算し、これら値のそれぞれに対して我々のデータの尤度を決定し、その後最高尤度を含む値を選択する。
【００９４】
プライマーテールにより、ユニバーサルにタグ付けしたライブラリからの断片化ＤＮＡの検出を改善することができる。ライブラリタグ及びプライマーテールが相同配列を含有する場合、ハイブリダイゼーションが改善され得（例えば融解温度（Ｔｍ）が低下する）、プライマー標的配列の一部のみがサンプルＤＮＡ断片中にあれば、プライマーを伸長させることが可能である。一部の実施形態においては、１３以上の標的特異的塩基対を用いてよい。一部の実施形態においては、１０〜１２の標的特異的塩基対を用いてよい。一部の実施形態においては、８〜９の標的特異的塩基対を用いてよい。一部の実施形態においては、６〜７の標的特異的塩基対を用いてよい。
【００９５】
一実施形態においては、ライブラリは、上記サンプルから、サンプル中のＤＮＡ断片の末端又はサンプルから単離したＤＮＡから生成したＤＮＡ断片の末端に対して、アダプタを連結させることによって生成する。その後、例えば以下の例示的なプロトコルに従って、ＰＣＲを用いてこの断片を増幅させることが可能である：
【００９６】
９５°Ｃで２分、［９５°Ｃで２０秒、５５°Ｃで２０秒、６８°Ｃで２０秒］を１５回、６８°Ｃで２分、４°Ｃで保持。
【００９７】
例えばクローン性増幅である配列増幅及びサブ配列シークエンシングのための、ユニバーサルプライマーの結合部位を含む核酸のライブラリ生成用のキット及び方法がこの技術分野で多数公知である。アダプタ連結の促進に有用であるように、ライブラリの調製及び増幅は末端の修復及びアデニル化（すなわちＡテーリング）を含むみ得る。小さい核酸断片、特に血液循環遊離ＤＮＡからライブラリを調製することに特に適したキットが、本明細書で提供する方法の実施に有用であり得る。例えばＢｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より市販されているＮＥＸＴｆｌｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅキット又はＮａｔｅｒａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット（カリフォルニア州サン・カルロス、Ｎａｔｅｒａ社（Ｎａｔｅｒａ，Ｉｎｃ．）より市販）がある。しかしながら、通常こうしたキットを変形させて、本明細書で提供する方法の増幅及びシークエンシングのステップのために誂えたアダプタを含むようにするものである。アダプタのライゲーションは、ＡＧＩＬＥＮＴ  ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴキット（カリフォルニア州、アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））で見られるライゲーションキット等の市販のキットを用いて実行することが可能である。
【００９８】
その後、本発明の方法のために、サンプルから、特に血液循環遊離ＤＮＡサンプルから単離したＤＮＡから生成した核酸ライブラリの標的領域を増幅する。この増幅に関して、範囲の下限で５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００又は５０，０００から、範囲の上限で１５、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００又は１００，０００の間のプライマーを含むことが可能である、一連のプライマー又はプライマー対がそれぞれ、一連のプライマー結合部位のうちのひとつに結合する。
【００９９】
プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｕｎｔｅｒｇｒａｓｓｅｒ  Ａ，Ｃｕｔｃｕｔａｃｈｅ  Ｉ，Ｋｏｒｅｓｓａａｒ  Ｔ，Ｙｅ  Ｊ，Ｆａｉｒｃｌｏｔｈ  ＢＣ，Ｒｅｍｍ  Ｍ，Ｒｏｚｅｎ  ＳＧ（２０１２）“Ｐｒｉｍｅｒ３−ｎｅｗ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（１５）：ｅ１１５及びＫｏｒｅｓｓａａｒ  Ｔ，Ｒｅｍｍ  Ｍ（２００７）“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ３．”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３（１０）：１２８９−９１）、ソースコードはｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能である）で生成可能である。プライマーの特異性は、ＢＬＡＳＴで評価して、以下の既存のプライマー設計パイプライン判定基準に加えることが可能である：
【０１００】
プライマーの特異性は、ｎｃｂｉ−ｂｌａｓｔ−２．２．２９＋パッケージからのＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて決定することが可能である。タスクオプション“ｂｌａｓｔｎ−ｓｈｏｒｔ”を用いて、ｈｇ１９ヒトゲノムに対してプライマーをマッピングすることが可能である。プライマーの設計は、プライマーがこのゲノムに対して１００ヒット未満であり、かつ、トップヒットが該ゲノムの領域に結合する標的相補的プライマーであって他のヒットよりも少なくとも２スコア高いものであった場合（スコアはＢＬＡＳＴｎプログラムによって規定されている）に、「特異的」として決定することが可能である。これは、このゲノムに対して唯一ヒットし、このゲノム全体にわたってその他の多くにヒットさせないためになされ得る。
【０１０１】
最後に選択したプライマーを、検証用のベッドファイル及びカバレッジマップを用いて、ＩＧＶ（Ｊａｍｅｓ  Ｔ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｌｇａ  Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ，Ｗｅｎｄｙ  Ｗｉｎｃｋｌｅｒ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｇｕｔｔｍａｎ，Ｅｒｉｃ  Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ，Ｇａｄ  Ｇｅｔｚ，Ｊｉｌｌ  Ｐ．Ｍｅｓｉｒｏｖ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，２４−２６（２０１１））と、ＵＣＳＣブラウザ（Ｋｅｎｔ  ＷＪ，Ｓｕｇｎｅｔ  ＣＷ，Ｆｕｒｅｙ  ＴＳ，Ｒｏｓｋｉｎ  ＫＭ，Ｐｒｉｎｇｌｅ  ＴＨ，Ｚａｈｌｅｒ  ＡＭ，Ｈａｕｓｓｌｅｒ  Ｄ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒ  ａｔ  ＵＣＳＣ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００２  Ｊｕｎ；１２（６）：９９６−１００６）とにおいて可視化することが可能である。
【０１０２】
或る実施形態においては、本発明の方法は、増幅反応混合物を形成することを含む。この反応混合物は典型的に、ポリメラーゼと、ヌクレオチド三リン酸塩と、サンプルから生成した核酸ライブラリからの核酸断片と、ＳＮＶを含有する標的領域に対して特異的な一組の順方向プライマー及び逆方向プライマーとを組み合わせることによって形成される。本明細書で提供するこの反応混合物は、説明的な実施形態においては、この発明の独立した態様でそれぞれが形成される。
【０１０３】
本発明で有用な増幅反応混合物は、核酸の増幅のための、特にＰＣＲ増幅のためのこの技術分野で公知の構成要素を含む。例えば、反応混合物は典型的に、ヌクレオチド三リン酸塩と、ポリメラーゼと、マグネシウムとを含む。本発明で有用なポリメラーゼは、増幅反応に用いることが可能であり、特にＰＣＲ反応に有用である任意のポリメラーゼを含むことが可能である。或る実施形態においては、ホットスタートＴａｑポリメラーゼが特に有用である。本明細書で提供する方法の実施に有用である増幅反応混合物としては、例えばＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（カリフォルニア州カールスバッド、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））等が市販されている。
【０１０４】
ＰＣＲの増幅条件（例えば温度サイクル）は、この技術分野において周知である。本明細書で提供する方法としては、ライブラリからの標的核酸等である、標的核酸の増幅をもたらす任意のＰＣＲサイクル条件を含み得る。非限定的な例示的サイクル条件を、本明細書の実施例セクションで提供している。
【０１０５】
ＰＣＲを行う場合に可能なワークフローが多数存在し、本明細書で開示する方法に対して典型的である一部のワークフローを本明細書で提供している。本明細書で概要を示したステップは、他の可能性のあるステップを除外することを意図するものではなく、また本明細書に記載したステップのいずれもが、適切に作業するために上記方法に必須であるということを意図するものでもない。大量のパラメータのバリエーション又は他の変形が文献で公知であるが、この発明の要素に影響することなくそれらがなされてよいものである。
【０１０６】
本明細書で提供する方法の或る実施形態においては、アウタープライマー標的アンプリコン等である、アンプリコンの少なくとも一部分の配列が、例示的な実施形態においては、アンプリコンの全配列が、決定される。アンプリコンの配列の決定方法は、この技術分野で公知である。こうした配列の決定に、この技術分野で公知である任意のシークエンシング方法、例えばＳａｎｇｅｒシークエンシングを用いることが可能である。説明的な実施形態においては、限定するものではないが、ＭＹＳＥＱ（イルミナ社（ＩＬＬＵＭＩＮＡ））、ＨＩＳＥＱ（イルミナ社）、ＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ（ライフテクノロジーズ社）、ＧＥＮＯＭＥ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ  ＩＬＸ（イルミナ社）、ＧＳ  ＦＬＥＸ＋（ＲＯＣＨＥ  ４５４社）で用いられるシークエンシング技術等である高スループットな次世代シークエンシング技術（本明細書においては超並列シークエンシング技術とも称する）を、本明細書で提供する方法によって生じたアンプリコンを配列するために用いることが可能である。
【０１０７】
高スループットな遺伝子シークエンサーは、個体からの特定のサンプルを特定するようにバーコーディングすること（すなわち、別個の核酸配列でサンプルをタグ付けすること）を用いることが可能であり、それによってＤＮＡシークエンサーのシングルランで複数のサンプルを同時に解析可能となる。ライブラリ調製（又は他の関心の核酸調製）においてゲノムの所与の領域を配列した回数（リード数）が、関心のゲノム内でのその配列のコピー数（又はｃＤＮＡ含有調製の場合には発現レベル）に比例することとなる。こうした定量的な決定では、増幅効率にバイアスを考慮に入れることが可能である。
【０１０８】
標的遺伝子
本発明の標的遺伝子は、例示的な実施形態においては癌関連遺伝子であり、多くの説明的な実施形態においては肺癌関連遺伝子である。癌関連遺伝子（例えば、肺癌関連遺伝子又は肺ＳＣＣ関連遺伝子又は肺ＡＤＣ関連遺伝子）は、癌（例えば、それぞれ肺癌又は肺ＳＣＣ又は肺ＡＤＣ）毎に異なる危険性又は癌毎に異なる予後に関連する遺伝子を指す。癌を促進する例示的な癌関連の遺伝子には、癌遺伝子、細胞の増殖や湿潤又は転移を高める遺伝子、アポトーシスを抑制する遺伝子、及び、血管新生促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子が含まれる。癌を抑制する癌関連遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子、細胞の増殖や湿潤又は転移を抑制する遺伝子、アポトーシスを促進する遺伝子、及び、抗血管新生（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子が含まれるが、これに限定されない。
【０１０９】
変異検出方法の一実施形態では、標的となる遺伝子の領域を選択することから開始する。公知の変異を含む領域を用いて、ｍＰＣＲ−ＮＧＳのためのプライマーを増殖させて、増幅して変異を検出する。
【０１１０】
本明細書で提供する方法を用いて、あらゆるタイプの変異、特に癌に関連することがわかっている変異を可視的に検出することが可能であり、最も詳細には、本明細書で提供する方法は、肺癌、特に腺癌及び扁平上皮癌に関連する変異、特にＳＮＶに向けられるものである。例示的なＳＮＶは、以下の遺伝子のうちの１つ又は複数中に存在し得る：種々の肺癌サンプル中において、変異している、コピー数が増加している又は他の遺伝子と融合している、及びその組み合わせであるものとして特定された、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＲＯＳ１、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、ＨＥＲ２、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＫＲＡＳ、ＮＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＥＫ１、ＮＯＴＣＨ１、ＭＬＬ２、ＥＺＨ２、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＫＥＡＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＲＧ１、ＴＰ５３、ＬＫＢ１及びＰＴＥＮ（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ：ａ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１４  Ａｕｇ  １４（８）：５３５−５５１）。他の実施例においては、遺伝子の一覧は上記に列記したものであって、ＳＮＶは引用したＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の参照文献等で報告されている。他の実施形態においては、ＳＮＶは、本明細書の表１９で見られる遺伝子のうちのひとつにおいて発見したＳＮＶを含み得る。表１９に列記した遺伝子中のＳＮＶを、実施例１の実験で解析した。これら遺伝子中のＳＮＶは、実施例１のｃｔＤＮＡサンプルに一致する腫瘍サンプル中で検出した。一部の実施形態においては、本明細書で提供する方法において解析されるＳＮＶは、この段落より前に列記した遺伝子のいずれか又は上記に列記していない表１９内の遺伝子のいずれかを含み得る。標的薬療法を行うために、特定の遺伝子中のある特定のＳＮＶの特異性を決定することを用いる方法を、本明細書で提供する。
【０１１１】
増幅（例えばＰＣＲ）反応混合物：
或る実施形態においては、本発明の方法は、増幅反応混合物を形成することを含む。この反応混合物は典型的に、ポリメラーゼと、ヌクレオチド三リン酸塩と、サンプルから生成した核酸ライブラリからの核酸断片と、一連の標的特異的な順方向アウタープライマーと、単鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）逆方向アウターユニバーサルプライマーとを組み合わせることによって形成する。他の説明的な実施形態では、反応混合物は、標的特異的な順方向アウタープライマーの代わりである標的特異的な順方向インナープライマーと、核酸ライブラリからの核酸断片の代わりである、アウタープライマーを用いた第一のＰＣＲ反応からのアンプリコンとを含む。本明細書で提供するこの反応混合物は、説明的な実施形態においては、この発明の独立した態様でそれぞれが形成される。説明的な実施形態においては、この反応混合物はＰＣＲ反応混合物である。ＰＣＲ反応混合物は典型的に、マグネシウムを含む。
【０１１２】
一部の実施形態においては、この反応混合物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マグネシウム、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態においては、ＴＭＡＣの濃度を、２０から７０ｍＭの間（両端の値を含める）とする。いずれの特定の理論と結びつける意図はないが、ＴＭＡＣが、ＤＮＡに結合し、二本鎖を安定させ、プライマー特異性を増加させ及び／又は様々なプライマーの融解温度を均一化させるということがわかっている。一部の実施形態においては、ＴＭＡＣが、様々な標的に対する増幅産物の量の均一性を増加させる。一部の実施形態においては、マグネシウム（塩化マグネシウムからのマグネシウム等）の濃度を１から８ｍＭの間とする。
【０１１３】
大量の標的の多重ＰＣＲ用の大量のプライマーが、多量のマグネシウムをキレート化し得る（プライマー中の２つのリン酸塩が１つのマグネシウムをキレート化する）。例えば、プライマーからのリン酸塩濃度が約９ｍＭであるように十分なプライマーを用いると、該プライマーは、有効なマグネシウム濃度を約４．５ｍＭだけ減少させ得る。一部の実施形態においては、高濃度のマグネシウムが、非標的遺伝子座の増幅等であるＰＣＲエラーを引き起こすことがあるため、ポリメラーゼに対する補助因子として利用可能なマグネシウムの量を減少させるためにＥＤＴＡを用いる。一部の実施形態においては、ＥＤＴＡの濃度が、利用可能なマグネシウムの量を１から５ｍＭの間（例えば３から５ｍＭの間）まで減少させる。
【０１１４】
一部の実施形態においては、ｐＨが７．５から８．５の間とし、例えば７．５から８、８から８．３、又は８．３から８．５の間（両端の値を含める）等である。一部の実施形態においては、Ｔｒｉｓバッファーを、例えば１０から１００ｍＭの間の濃度で、例えば１０から２５ｍＭ、２５から５０ｍＭ、５０から７５ｍＭ又は２５から７５ｍＭの間（両端の値を含める）等の濃度で用いる。一部の実施形態においては、これら濃度のＴｒｉｓバッファーはいずれも、７．５から８．５の間のｐＨで用いる。一部の実施形態においては、ＫＣｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４の組み合わせを用いるものであり、例えば５０から１５０ｍＭの間のＫＣｌ及び１０から９０ｍＭの間の（ＮＨ４）２ＳＯ４等（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、ＫＣｌの濃度は、０から３０ｍＭの間、５０から１００ｍＭの間又は１００から１５０ｍＭの間（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１０から５０ｍＭ、５０から９０ｍＭ、１０から２０ｍＭ、２０から４０ｍＭ、４０から６０ｍＭ、又は６０から８０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の間（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、アンモニウム［ＮＨ４＋］の濃度は、０から１６０ｍＭの間であり、例えば０から５０、５０から１００、又は１００から１６０ｍＭの間等（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、カリウムとアンモニウムとの濃度の合計（［Ｋ＋］＋［ＮＨ４＋］）は、０から１６０ｍＭの間であり、例えば０から２５、２５から５０の間、５０から１５０、５０から７５、７５から１００、１００から１２５、又は１２５から１６０ｍＭの間等（両端の値を含める）である。［Ｋ＋］＋［ＮＨ４＋］が１２０ｍＭである例示的なバッファーは、ＫＣｌが２０ｍＭ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４が５０ｍＭである。一部の実施形態においては、該バッファーは、ｐＨが７．２から８のＴｒｉｓバッファーを２５から７５ｍＭ、ＫＣｌを０から５０ｍＭ、硫酸アンモニウムを１０から８０ｍＭ及びマグネシウムを３から６ｍＭを含む（両端の値を含める）。一部の実施形態においては、該バッファーは、ｐＨが７から８．５のＴｒｉｓバッファーを２５から７５ｍＭ、ＭｇＣｌ２を３から６ｍＭ、ＫＣｌを１０から５０ｍＭ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４を２０から８０ｍＭを含む（両端の値を含める）。一部の実施形態においては、１００から２００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのポリメラーゼを用いる。一部の実施形態においては、ｐＨ８．１の最終容量２０ｕｌ中の、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＣｌ２、ライブラリ中の各プライマー７．５ｎＭ、５０ｍＭのＴＭＡＣ及び７ｕｌのＤＮＡテンプレートを用いる。
【０１１５】
一部の実施形態においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えばＰＥＧ８，０００）又はグリセロール等のクラウディング試薬（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いる。一部の実施形態においては、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ８，０００）の量は、０．１から２０％であり、０．５から１５％、１から１０％、２から８％又は４から８％の間（両端の値を含める）等である。一部の実施形態においては、グリセロールの量は、０．１から２０％の間であり、０．５から１５％、１から１０％、２から８％又は４から８％の間（両端の値を含める）等である。一部の実施形態においては、クラウディング試薬により、用いられるポリメラーゼ濃度の低濃度化及び／又はアニーリング時間の短縮化が可能となる。一部の実施形態においては、クラウディング試薬が、ＤＯＲの均一性を改善し及び／又は脱落（未検出のアレル）を低減する。一部の実施形態のポリメラーゼは、プルーフリーディング活性をもつポリメラーゼ、プルーフリーディング活性のない（又はごくわずかな）ポリメラーゼ、又は、プルーフリーディング活性をもつポリメラーゼとプルーフリーディング活性のない（又はごくわずかな）ポリメラーゼとの混合物を用いる。一部の実施形態においては、ホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）ポリメラーゼ、非ホットスタート（ｎｏｎ−ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）ポリメラーゼ、又は、ホットスタートポリメラーゼと非ホットスタートポリメラーゼとの混合物を用いる。一部の実施形態においては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる（例えば、キアゲン社のカタログＮｏ．２０３２０３を参照）。一部の実施形態においては、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いる。一部の実施形態においては、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼであって、反応混合物中に過剰なテンプレートが存在する場合に、及び、長い産物を増幅する場合に有効なＰＣＲ増幅を提供するハイフィデリティポリメラーゼを用いる（カリフォルニア州マウンテンビュー、タカラクロンテック社（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。一部の実施形態においては、ＫＡＰＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ又はＫＡＰＡ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、これらはシングルサブユニットの、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである好熱性バクテリア、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）に基づく。ＫＡＰＡ  Ｔａｑ及びＫＡＰＡ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、５′−３′ポリメラーゼと５′−３′エキソヌクレアーゼ活性とを有するが、３′から５′へのエキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性は有さない（例えば、ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社カタログＮｏ．ＢＫ１０００を参照）。一部の実施形態においては、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いるものであり、それは超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）からの高度に熱安定なＤＮＡポリメラーゼである。酵素が、５’→３’の向きで、二重鎖ＤＮＡにヌクレオチドのテンプレート依存性重合を触媒する。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼもまた、ポリメラーゼに対してヌクレオチド取り込みエラーを修正可能にさせる３’→５’のエキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を示す。それは、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を有さない（例えば、サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）カタログＮｏ．ＥＰ０５０１を参照）。一部の実施形態においては、Ｋｌｅｎｔａｑ１を用いるものであり、それはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ−ｆｒａｇｍｅｎｔ）アナログであるであり、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有さない（例えば、ミズーリ州セントルイス、ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社カタログＮｏ．１００を参照）。一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、ＰＨＵＳＩＯＮ  ＤＮＡポリメラーゼであり、例えばＰＨＵＳＩＯＮハイフィデリティ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３０Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．））又はＰＨＵＳＩＯＮホットスタートフレックス（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３５Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社）等である。一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであり、例えばＱ５（登録商標）ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９１Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社）又はＱ５（登録商標）ホットスタートハイフィデリティ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９３Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社）等である。一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０２０３Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社）である。
【０１１６】
一部の実施形態においては、５から６００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（反応容量１ｍＬ当たりのユニット数）の間のポリメラーゼであり、５から１００、１００から２００、２００から３００、３００から４００、４００から５００又は５００から６００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬの間（両端の値を含める）等であるポリメラーゼを用いる。
【０１１７】
ＰＣＲ法
一部の実施形態においては、ホットスタートＰＣＲを用いて、ＰＣＲサーモサイクルを行う前に重合を軽減又は防止する。例示的なホットスタートＰＣＲ法は、反応混合物が高温に達するまで、最初のＤＮＡポリメラーゼを抑制すること、又は、反応成分の反応を物理的に分離することを含む。一部の実施形態においては、マグネシウムの緩やかな放出を利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、活性のためにマグネシウムイオンを要するため、マグネシウムは、化学物質と結合させておくことで反応から化学的に分離し、高温でのみ溶液中に放出させる。一部の実施形態においては、抑制剤の非共有結合性の結合を利用する。この方法においては、ペプチド、抗体又はアプタマーが、低温で酵素に非共有結合的に結合し、その活性を抑制する。上昇した温度でのインキュベーション後、抑制剤が放出されて、反応が開始する。一部の実施形態においては、低温ではほとんど活性をもたない改変ＤＮＡポリメラーゼ等の、低温感受性のＴａｑポリメラーゼを利用する。一部の実施形態においては、化学的な改変を利用する。この方法においては、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位内のアミノ酸の側鎖に、ある分子が共有結合している。この分子は、上昇した温度で反応混合物をインキュベーションすることによって、酵素から放出される。分子が放出されると、酵素が活性化する。
【０１１８】
一部の実施形態においては、テンプレートの核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡのサンプル等）に対する量は、２０から５，０００ｎｇの間であり、２０から２００、２００から４００、４００から６００、６００から１，０００、１，０００から１，５００又は２，０００から３，０００ｎｇの間等（両端の値を含める）である。
【０１１９】
一部の実施形態においては、キアゲン社のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲキットを利用する（キアゲン社カタログＮｏ．２０６１４３）。１００×５０μｌの多重ＰＣＲ反応に関しては、キットには、２×ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（最終濃度が３ｍＭのＭｇＣｌ２を与える、３×０．８５ｍｌ）、５×Ｑ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×２．０ｍｌ）及びＲＮａｓｅフリー水（２×１．７ｍｌ）が含まれる。ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＭＭ）は、ＫＣｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４の組み合わせのみならず、ＰＣＲ添加剤、テンプレートにおけるプライマーの局所濃度を増加させるＦａｃｔｏｒ  ＭＰを含有する。Ｆａｃｔｏｒ  ＭＰは、特に結合したプライマー同士を安定化させ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって有効なプライマー伸長が可能になる。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの改変形態であり、室温ではポリメラーゼ活性を有さない。一部の実施形態においては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、任意の既存のサーモサイクルプログラムに組み込むことが可能な９５°Ｃでの１５分間のインキュベーションにより活性化される。
【０１２０】
一部の実施形態においては、１×ＱＩＡＧＥＮ  ＭＭ最終濃度（推奨濃度）、ライブラリ中の各プライマーを７．５ｎＭ、ＴＭＡＣを５０ｍＭ、及び、２０ｕｌ最終容量中でＤＮＡテンプレート７ｕｌを用いる。一部の実施形態においては、ＰＣＲサーモサイクル条件は、９５°Ｃで１０分（ホットスタート）、９６°Ｃで３０分間を２０サイクル、６５°Ｃで１５分間及び７２°Ｃで３０秒間、次いで７２°Ｃで２分間（最終伸長）、その後４°Ｃでの保持を含む。
【０１２１】
一部の実施形態においては、２×ＱＩＡＧＥＮ  ＭＭ最終濃度（推奨濃度の２倍）、ライブラリ中の各プライマーを２ｎＭ、ＴＭＡＣを７０ｍＭ、及び、２０ｕｌ合計容量中でＤＮＡテンプレート７ｕｌを用いる。一部の実施形態においては、４ｍＭまでのＥＤＴＡも含む。一部の実施形態においては、ＰＣＲサーモサイクル条件は、９５°Ｃで１０分間（ホットスタート）、９６°Ｃで３０秒間を２５サイクル、６５°Ｃで２０、２５、３０、４５、６０、１２０又は１８０分間及び任意に７２°Ｃで３０秒間、次いで７２°Ｃで２分間（最終伸長）、その後４°Ｃでの保持を含む。
【０１２２】
他の例示的な条件のセットは、セミネスト（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲのアプローチを含む。第一のＰＣＲ反応では、２×ＱＩＡＧＥＮ  ＭＭ最終濃度、ライブラリ中の各プライマーを１．８７５ｎＭ（順方向及び逆方向のアウタープライマー）、及び、ＤＮＡテンプレートを含む、２０ｕｌの反応容量を用いる。サーモサイクル用パラメータには、９５°Ｃで１０分間と、９６°Ｃで３０秒間、６５°Ｃで１分間、５８°Ｃで６分間、６０°Ｃで８分間、６５°Ｃで４分間及び７２°Ｃで３０秒間を２５サイクルと、その後７２°Ｃで２分間とを含み、その後４°Ｃで保持する。次に、１：２００で希釈した、得られた産物２ｕｌを、第二のＰＣＲ反応の入力として用いる。この反応では、１×ＱＩＡＧＥＮ  ＭＭ最終濃度、順方向インナープライマーをそれぞれ２０ｎＭ及び１ｕＭの逆方向プライマータグを含む、１０ｕｌの反応容量を用いる。サーモサイクル用パラメータは、９５°Ｃで１０分間と、９５°Ｃで３０秒間、６５°Ｃで１分間、６０°Ｃで５分間、６５°Ｃで５分間及び７２°Ｃで３０秒間を１５サイクルと、その後７２°Ｃで２分間とを含み、その後４°Ｃで保持する。アニーリング温度は、本明細書で述べているように、任意に、プライマーの一部又はプライマーの全ての融解温度より高くすることが可能である（その全体を参照することによって本明細書に組み入れるものとする２０１５年１０月２０日出願の米国特許出願第１４／９１８，５４４号を参照）。
【０１２３】
融解温度（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチド（プライマー等）ＤＮＡ二重鎖の２分の１（５０％）と、その完全な補体とが解離して、単鎖ＤＮＡになる温度である。アニーリング温度（ＴＡ）は、ＰＣＲプロトコルが走査する温度である。従来の方法では、用いるプライマーの最低Ｔｍよりも通常５°Ｃ低いものであり、これにより可能性のある全ての二重鎖がほとんど形成される（本質的に全てのプライマー分子がテンプレート核酸と結合するように）。これは高効率であるが、低温では、より非特異的な反応となることが必至である。ＴＡが低過ぎることによるひとつの結果として、内部での一塩基の不一致又は部分的なアニーリングが許容されることがあるため、プライマーが、真の標的以外の配列に対してアニールされ得ることがある。本発明の一部の実施形態においては、ＴＡはＴｍよりも高いものであり、ある瞬間では、標的のごく一部のみが、アニールされたプライマーを有する（約１〜５％のみ等）。これらが伸長すれば、それらがプライマー及び標的のアニーリング及び解離の平衡状態から脱し（伸長でＴｍが直ぐに７０°Ｃを超えるまでに上昇するため）、標的のうち新たな約１〜５％がプライマーを有する。これにより、反応を長時間のアニーリングとすることにより、１サイクル当たり約１００％のコピーされた標的を得ることが可能である。
【０１２４】
種々の実施形態においては、アニーリング温度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３°Ｃから、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１５°Ｃの間であり、少なくとも２５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５又は１００％の不一致のプライマーの融解温度（経験的に測定又は計算したＴｍ等）よりも高いものである。種々の実施形態においては、アニーリング温度は、１から１５°Ｃの間（１から１０、１から５、１から３、３から５、５から１０、５から８、８から１０、１０から１２又は１２から１５°Ｃの間等（両端の値を含める））であり、非同一のプライマーのうち少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００のプライマーの融解温度（経験的に測定又は計算したＴｍ等）か又は不一致のプライマーの全ての融解温度（経験的に測定又は計算したＴｍ等）よりも高いものである。種々の実施形態においては、アニーリング温度は、１から１５°Ｃの間（１から１０、１から５、１から３、３から５、３から８、５から１０、５から８、８から１０、１０から１２又は１２から１５°Ｃの間等（両端の値を含める））であり、不一致のプライマーのうち少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％の融解温度（経験的に測定又は計算したＴｍ等）か又は不一致のプライマーの全ての融解温度（経験的に測定又は計算したＴｍ等）よりも高いものであり、アニーリングステップの長さ（１ＰＣＲサイクル当たり）は、５から１８０分の間であり、１５から１２０分、１５から６０分、１５から４５分又は２０から６０分の間等（両端の値を含める）である。
【０１２５】
例示的な多重ＰＣＲ法
種々の実施形態においては、長いアニーリング時間（本明細書で述べるとおりであり実施例１２に例示する）及び／又は低プライマー濃度を用いる。実際には、或る実施形態においては、制限したプライマーの濃度及び／又は条件を用いる。種々の実施形態においては、アニーリングステップの長さは、範囲の下限で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は６０分から、範囲の上限で２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、１２０又は１８０分の間である。種々の実施形態においては、アニーリングステップの長さ（１ＰＣＲサイクル当たり）は３０から１８０分の間である。例えば、アニーリングステップを３０から６０分の間とすることが可能であり、各プライマーの濃度を２０、１５、１０又は５ｎＭ未満とすることが可能である。他の実施形態においては、プライマー濃度は、範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５ｎＭから、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５及び５０である。
【０１２６】
高濃度の多重化においては、溶液中の大量のプライマーが原因で、溶液が粘稠となり得る。溶液が粘稠過ぎる場合は、プライマーがテンプレートＤＮＡに結合するのにそれでも十分な量までプライマー濃度を減少させることが可能である。種々の実施形態においては、１，０００から１００，０００の様々なプライマーを用いて、各プライマーの濃度を２０ｎＭ未満とし、例えば１０ｎＭ未満、又は１から１０ｎＭの間（両端の値を含める）等とする。
【０１２７】
以下の実施例は、本明細書で提供する実施形態の使用方法の完全な開示及び説明を当業者にもたらすように定期するものであり、開示の範囲を限定するものでもなく、また以下の実施例が全てであったり又は行った実験のみであるということを示すことを意図しているものでもない。使用する数字（例えば量、温度等）に関して精度を保証するような努力しているが、一部の実験的な誤差や偏差を考慮に入れるべきである。別に示さない限り、部分は容量部であり、温度は摂氏℃である。実施例を説明することを意図した本質的な態様を変更することなく、説明した方法において変形させることが可能であるということを理解されたい。
【実施例】
【０１２８】
実施例１  肺癌患者からの血液循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）中の一塩基バリアント（ＳＮＶ）の解析
事前の予備実験により、癌患者の血漿中における癌関連の点変異の良好な検出を実証した。その実験では、４つの肺癌腫瘍の変異プロファイルを、全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）又はＡｍｐｌｉｓｅｑ（カリフォルニア州カールスバッド、ライフテクノロジーズ社）で決定し、それら変異のサブセットを、多重ＰＣＲ次世代シークエンシング（ｍＰＣＲ−ＮＧＳ）法によって対応する血漿サンプル中において良好に検出した。この実験では、ＴＲＡＣＥＲｘと呼ばれるｍＰＣＲ−ＮＧＳ法を用いて、癌患者の血漿中における癌特異的変異を検出して経時的に追跡して、治療にわたって疾患進行を監視する際の該方法の有用性を評価した。全体的なプロジェクト設計を図１に示している。プロジェクトの第一段階は、５０人の未治療肺癌患者の血漿中におけるベースライン変異プロファイルを決定することとした。５０人の患者から、腫瘍のいくつかの領域（腫瘍当たり２〜７領域）からの精製したゲノムＤＮＡサンプル、精製した生殖系ＤＮＡサンプル、及び、無処置の血漿サンプルを得た。この腫瘍の領域の全ての変異プロファイルをＷＥＳ及びＡｍｐｌｉＳｅｑによって先に決定し、患者毎に変異のサブセットをｍＰＣＲ−ＮＧＳで解析した。それら変異は、ドライバ変異及びパッセンジャー変異の両方と、クローン性変異及びサブクローン性変異の両方とを含んでいた。これらデータに基づいて、多重ＰＣＲアッセイを設計し、プライマープール（プライマーは、アイオワ州コーラルビルのＩＤＴ社より取得した）を調製し、プライマープールにＱＣ（クオリティーコントロール）を行い、プール毎にｍＰＣＲプロトコルを最適化した。血漿ｃｆＤＮＡを精製し、定量し、ライブラリに変換した。その後このライブラリを、ｍＰＣＲに対する入力として用いて、産物を配列して解析した。同様のプロトコルを、腫瘍からのゲノムＤＮＡと、対応する正常サンプルとに適用した。
【０１２９】
サンプルの説明
サンプル  はじめの５０人のＴＲＡＣＥＲｘ患者のそれぞれに関して、腫瘍切開前かつあらゆる治療より先に得た４〜５ｍｌの血漿を単離した。血漿サンプルは、２ｍｌチューブに分注し、ドライアイス上に載せて冷凍させた。７つまでの腫瘍小区分、影響するリンパ節（可能であれば）及び白血球フラクション（相当する正常のものとも称する）のそれぞれからの精製ゲノムＤＮＡを精製し、１０ｎｇ／μｌで正規化した、各サンプルからの５００ｎｇの精製ＤＮＡを解析した。精製ＤＮＡサンプルはドライアイス上に載せて冷凍させた。
【０１３０】
ＳＮＶ情報  各腫瘍小区分についての、一塩基バリアント（ＳＮＶ）とコピー数多型（ＣＮＶ）とを含む変異プロファイルを、ＷＥＳを用いてＴＲＡＣＥＲｘで決定した。各腫瘍の完全変異プロファイルを用いて、クローン構造を検出し、各腫瘍の系統樹を再構成した。ＰｙＣｌｏｎｅ（ＰｙＣｌｏｎｅは、癌中のクローン性集団構造の統計的推測である。Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，３９６−３９８（２０１４））を用いて、クローン構造を検出した。ＰｙＣｌｏｎｅにより、ＳＮＶサブクローンのリストが特定され、それらの癌細胞断片を計算する。それはまた、クローン性かサブクローン性かのいずれかとしてＳＮＶを分類する。各ＳＮＶのドライバのカテゴリを決定し、ドライバカテゴリ（１〜４とし、１はドライバ変異の可能性が最も高く、４はドライバ変異の可能性が最も低い）として提供した。各患者に関して、全てのドライバカテゴリに跨り、かつ、クローン性変異及びサブクローン性変異を含んでいる１０８までのＳＮＶを解析した。ＰｙＣｌｏｎｅのクローン性／サブクローン性のクラスタ情報に加えて、各腫瘍小区分中の各ＳＮＶの検出したアレル断片、リンパ節及び対応する正常なＤＮＡのサンプルを比較した。
【０１３１】
さらなる情報  各患者に関して、以下の情報が利用可能である：腫瘍サイズ（ｍｍ）、腫瘍位置（肺葉）、腫瘍ステージ、腫瘍病理タイプ、影響を受けるリンパ節数、脈管侵襲状態及び収集した病院での匿名の情報。
【０１３２】
アッセイの設計及びプロトコルの最適化
アッセイの設計  Ｎａｔｅｒａ社の標準アッセイ設計パイプラインを用いて、全ての所与のＳＮＶに対して、Ｒｉｇｈｔ  ＰＣＲプライマー及びＬｅｆｔ  ＰＣＲプライマーを設計した。あるＳＮＶを標的とする一対のＲｉｇｈｔ  ＰＣＲプライマー及びＬｅｆｔ  ＰＣＲプライマーを、その特定のＳＮＶに対するアッセイとして規定する。なお、それらが近接していれば、ひとつのアッセイに関して、１以上の標的ＳＮＶをカバーすることが可能である。アッセイの対の全てに対して、プライマーダイマーを形成する蓋然性を計算した。各腫瘍中のＳＮＶアレル断片データを用いて、Ｌｉｃｈｅｅ（Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｃａｌａｂｌｅ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｓａｍｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｐｏｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｍａｙ  ６；１６：９１）により系統樹を再構成した。サンプル毎にアッセイのリストを選別して、ドライバ１及び２のＳＮＶをカバーするアッセイに高い優先度を与えながら、プライマーダイマーを形成することが予測されるプライマーを除外する。残りのアッセイを用いて、バランスのとれた５つのプールを構築する。共にプールされたアッセイは全て適合性があったが、これは１つのプール内でプライマーダイマーを形成することが予測されるプライマーが存在しないことを意味する。各ステップにおいて、ドライバ１及び２のＳＮＶをカバーするアッセイが最高の優先度を有するようにアッセイを選択したため、患者毎の、ブランチ当たりの選択ＳＮＶ数が、再構成した系統樹からのそのブランチの合計ＳＮＶ数に比例した。より詳細には、再構成した系統樹内のブランチからＳＮＶを均一にサンプリングすることを試みたことで、選択したアッセイが、再構成した系統樹の良好なカバレッジを提供することを確認した。最終的な設計は、９７２のアッセイからなり、５つのプールに平等に分布し、各サンプルに対して１５〜２０のアッセイを含有した。ドライバカテゴリ毎の１サンプル当たりのＳＮＶ数及びアッセイ数を、図２に示している。ＳＮＶが発見された遺伝子及び遺伝子毎のアッセイしたＳＮＶ数を、図１９に示している。
【０１３３】
プールのＱＣ（クオリティーコントロール）及び最適化  ９７２のプライマー対を個別のウェルに取得し（アイオワ州コーラルビル、ＩＤＴ社）、脱塩し、１００μＭに正規化した。アッセイをプール用スキームに従ってプールし、各プールは組み合わせたＱＣ（クオリティーコントロール）／最適化実験で用いた。最適化実験に関しては、いくつかのＰＣＲパラメータを変化させて、シークエンス性能における効果のみならず脱落アッセイ数を配列データから評価した。標的のリード、リード深度の均一性及びエラー率の最良の割合が得られるＰＣＲ条件を決定した。プライマーダイマーの大部分に関与していたプライマーを特定し、各プールから除去した（プライマー毎に除去し、その対応する対のもう一方もまた除去した）。このステップに従って、合計９０８のアッセイが続き、５つのプールに均一に分布した。
【０１３４】
サンプル調製
ＤＮＡの抽出及びＱＣ（クオリティーコントロール）  各患者からの血漿の分注全てをｃｆＤＮＡ抽出の前にプールして、プールした血漿サンプルそれぞれの溶血の程度を可視的に評価した（溶血なし、軽度の溶血又は重篤な溶血）。５ｍｌの血漿に最適化したプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＮＡキット（カリフォルニア州バレンシア）  を用いてｃｆＤＮＡを抽出した。全てのｃｆＤＮＡサンプルは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙのチップ（カリフォルニア州サンタクララ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行った。同じＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙのランをまた用いて、予め定量した純粋ｃｆＤＮＡサンプルから調製した検量線上でのモノヌクレオソームのピーク高さの内挿によって、ｃｆＤＮＡサンプルを定量した。これは、ｃｆＤＮＡが、チップ上で高度なサイズマーカーと重複する無処置のＤＮＡ断片を含有することがあることを理由に必要であり、信頼できないモノヌクレオソームのピークを定量する。精製ゲノムＤＮＡサンプル（腫瘍小区分、リンパ節及び白血球からの）の代表的なサブセットを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（デラウェア州ウィルミントン）を用いて定量した。定量した全てのサンプルは、予想範囲内（約１０ｎｇ／μｌ）であった。
【０１３５】
ｃｆＤＮＡライブラリの調製  各血漿サンプルからの全ｃｆＤＮＡ量を、Ｎａｔｅｒａライブラリ調製キットと以下のキットの指示とを用いたＬｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへの入力として用いた。極めて大量のｃｆＤＮＡを含む２つのサンプルに関しては、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへの入力量を、約５０，０００ゲノム当量（１６５ｎｇ）に制限した。ライブラリを増幅してプラトーに達するようにし、その後製造元のプロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅビーズ（カリフォルニア州ブレア、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で精製した。精製したライブラリに、ＬａｂＣｈｉｐ上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行った。
【０１３６】
ｃｆＤＮＡの多重ＰＣＲ及びシークエンシング  各血漿サンプルからのライブラリ材料を、関連するアッセイのプールと最適化した血漿ｍＰＣＲプロトコルとを用いた多重ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）への入力として用いた。該プロトコルでは、アニーリング時間を１５分、プライマーのＴｍを超えるものである６０℃又は６２．５℃の温度を利用した。プライマーのＴｍは、理論的計算によって５３から５９℃とした。プライマー濃度は１０ｎＭを用いた。ｍＰＣＲ産物は、個別のＰＣＲステップにおいてバーコーディングし、バーコーディングしたＰＣＲ産物をアッセイのプール用情報（上記セクションを参照）に従って５つのプールにプールした。該プールは、製造元のプロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅビーズを用いて精製し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップ（カリフォルニア州サンタクララ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行い、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅキット（マサチューセッツ州ウォルサム、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて定量した。各プールは、１０の癌患者の血漿サンプルと２０の陰性対照（推定される健常な被験者から抽出したｃｆＤＮＡ  から調製したもの）とから、上記に開示したとおりに調製したライブラリを含有するものとした。この陰性対照サンプルは、必要な制御的な手順に従って得た。各プールは、５０サイクル、シングルインデックスのペアエンドリードで、独立したＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｒａｐｉｄラン（カリフォルニア州サンディエゴ、イルミナ社）で配列した。
【０１３７】
ｇＤＮＡの多重ＰＣＲ及びシークエンシング  ゲノムＤＮＡサンプルを、関連するアッセイのプールと最適化したゲノムｍＰＣＲプロトコルとを用いた類似のｍＰＣＲへの入力として用いた。ｍＰＣＲ産物は、個別のＰＣＲステップにおいてバーコーディングし、バーコーディングした産物の全てを１つのプールに組み合わせた。このプールは、製造元のプロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅビーズを用いて精製し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップ上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行い、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅキットを用いて定量した。プールは、５０サイクル、シングルインデックスのシングルエンドリードで、シングルＨｉＳｅｑ２５００  Ｒａｐｉｄランで配列した。
【０１３８】
結果
図２０は、この実験において解析したサンプルに関する詳細な解析結果と詳細な情報を示した表である。
【０１３９】
ｃｆＤＮＡの抽出及び解析  ５０の血漿サンプル（図３）に関するｃｆＤＮＡ濃度の分布は、５ｍｌの血漿に基づく予想した分布に従っていた（中央値が血漿１ｍｌ当たり２，２００ゲノムコピー当量）。ｃｆＤＮＡ濃度、溶血程度（可視的に概算したもの）及びｃｆＤＮＡサイズプロファイル（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ追跡から可視的に概算したもの）の質的な評価を、図１６に表形式で示している。
【０１４０】
ｃｆＤＮＡの解析  精製ｃｆＤＮＡ濃度、血漿の溶血程度及びｃｆＤＮＡプロファイルを図１６に示している。ｃｆＤＮＡ濃度は、モノヌクレオソームのピークのみを指すものであり、検量線を用いてモノヌクレオソームのピーク高さから決定した。ゲノムコピー当量は、３．３ｐｇ／ゲノムの変換因子を用いて計算し、４０μｌの精製ｃｆＤＮＡをＬｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへの入力として用いたものであり、緑色で強調するサンプルに関してはライブラリ調製への入力を５０，０００ゲノム当量に制限した。ｃｆＤＮＡサイズのプロファイルは以下のとおりである：１：ｃｆＤＮＡの大部分は、モノヌクレオソームのピーク内にある、２：ｃｆＤＮＡの大部分は、モノヌクレオソームのピーク内にあるが、他のサイズも確認される、３：無処置のＤＮＡの大きいピーク（＞１，０００ｂｐ）がモノヌクレオソームのピークと共に確認され、一部はより大きい分子量のピークである。溶血は、血漿の色に基づいて可視的に概算した。０：溶血なし（黄色血漿）、１：軽度の溶血（薄桃色血漿）、２：重篤な溶血（鮮桃色又は赤色の血漿）。
【０１４１】
腫瘍小区分注のＶＡＦ解析  腫瘍小区分のそれぞれからの配列データを解析して、各腫瘍小区分、リンパ節及び対応する正常サンプル中の各ＳＮＶのバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を決定した。このデータを、全ゲノムシークエンシング又はエクソームシークエンシング等の様々な試験法を用いた、ある異なる試験サイトから独立して提供される対応するデータと比較した。サンプルの大部分に関しては、各腫瘍小区分からの予め決定した組織ＶＡＦ値が、新規に導いた組織ＶＡＦ値と十分一致した（図４）。しかしながら、有意な不一致が確認されたサンプルが、大量に存在した（図５）。以下の３種類の不一致が観察された：（ｉ）１又は２つの小区分に関して、先の解析において全てのＶＡＦが０であるか又は０に近いが、ｍＰＣＲ−ＮＧＳ解析においてゼロではない（かつ同じサンプルの他の小区分中で確認されるＶＡＦの範囲に及ぶ）  （例：ＬＴＸ０４１、  ＬＴＸ１１１）、（ｉｉ）いくつかのアッセイに関して、ｍＰＣＲ−ＮＧＳ解析においてＶＡＦが０であるが、先の解析においてはゼロではなく（かつ同じサンプルの他の小区分中で確認されるＶＡＦの範囲に及ぶ）、この不一致モードで小区分によるクラスタリングは確認されなかった（例：ＬＴＸ０９３、ＬＴＸ０７４）、（ｉｉｉ）いくつかのアッセイ又は領域に関して、失敗したアッセイはないが、２つの解析で得られたＶＡＦ間の一致性が全体的に乏しかった（例：ＬＴＸ０６３、ＬＴＸ０５９）。
【０１４２】
また、ＴＲＡＣＥＲｘのＳＮＶコールで報告されなかった組織サンプルから、１６の体細胞性ＳＮＶも特定した。同様に、これら新規の体細胞性ＳＮＶのうち、それらの対応する血漿ｃｆＤＮＡにおいて７つをコールした。図１８のリストを参照されたい。
【０１４３】
１つのサンプル（Ｕ＿ＬＴＸ２０６、１９アッセイを含む）は、シークエンシングに失敗したので解析から除去した。９１１のＳＮＶをカバーする８８９アッセイを解析した。１，０００未満のリード深度を含むアッセイは失敗とみなし、それらの対応するＳＮＶは「コールしない」としてマークした。合計２１が「コールしない」ＳＮＶとして解析から除去され、合計８９０のＳＮＶを解析した。
【０１４４】
各ランは、ひとつのアッセイプールに属し、１０の癌サンプル及び２０の対照サンプルを含有するものとした。あるプール中においてアッセイがカバーしている一組のＳＮＶを、関連するランの標的ＳＮＶとみなす。癌サンプルの特定の位置においてＳＮＶコールを行うために、はじめにその位置に対するバックグラウンドエラーモデルを構築した。このエラーモデルは、２０の陰性サンプルと、提供された情報に基づいてその位置においてＳＮＶを含有していることが予期されない残りの癌サンプル（８又は９）とに基づいて構築した。ＶＡＦ＞２０％である位置は、バックグラウンドエラーモデルから除外した。対応する血漿サンプル中のその変異に対する信頼度が我々の信頼度の閾値９５から９８％を超えていれば、陽性血漿ＳＮＶコールを行うものとした。
【０１４５】
事前の予備実験と同様に、血漿中の全体的なＳＮＶ検出率は３５．５％（８９０のうち３１０）である。アルゴリズムにより最高信頼度の真陽性コールを行った一方で、偽陽性コール数は許容可能な数（＜０．２５％）であった。高信頼度で検出されたＳＮＶに対する平均変異アレル頻度は、０．８７５％であり、０．０１１％から１３．９３％の範囲に及ぶ。あるサンプル中に存在することが予期されるＳＮＶの少なくともひとつが、信頼性をもって血漿中で検出される場合には、そのサンプルを「血漿中で検出されるもの」とみなした。この定義を用いれば、全体的な血漿中のサンプル検出率は６９％（４９サンプルのうち３４）であり、またそれらに関して、血漿中で検出された平均ＳＮＶ数は９．１（１から１９の範囲に及ぶ）であった。サンプル毎の血漿中で検出されたＳＮＶ数を、図１７に表形式で示している。
【０１４６】
血漿中で検出されなかったＳＮＶの解析  血漿中での予期したＳＮＶが＞６０％（９１１のうち５８０）での検出されるという失敗が、ｍＰＣＲ−ＮＧＳ法での一部の失敗に対立するものとして、ｃｆＤＮＡサンプル中にそれら変異が存在することの証拠が不十分であるという事実に起因するという結論については、いくつかの証拠が裏付けとなる。すなわち、リード深度（ＤＯＲ（ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｒｅａｄ））分布が、予期した血漿ＳＮＶが検出されたアッセイと、予期したＳＮＶが検出されなかったアッセイとで類似しているということがある（図６ａ）（予期したＳＮＶが検出されたアッセイの平均ＤＯＲは４５，５５１であるのに対し、検出されなかったアッセイの平均ＤＯＲは４５，１３３）。このことは、偽陰性ＳＮＶコールに対応するアッセイが、真陽性コールのアッセイと同程度に効率的であることを示唆している。さらに、標的ＳＮＶの位置において高ＤＯＲであるにもかかわらず、変異リード数はほぼ無視できるものであるということがある。実際に、その３６％が０変異リードであり、その７５％が５変異リード以上であり、また残る２５％の偽陰性コールはＶＡＦ＜０．１％である。
【０１４７】
血漿中のＳＮＶ検出に影響する因子
血漿ＳＮＶの検出能に影響を及ぼすいくつかの因子について評価した。ｃｆＤＮＡ量及び腫瘍病期分類の情報、腫瘍サイズ、ならびに腫瘍小区分中のＳＮＶ頻度を、別個の位置において決定した。
【０１４８】
組織型  血漿中で特定の腫瘍が検出されたか否かの最も重要な予測子としては、以下の組織型であるようにみられた：この実験では、扁平上皮癌（ＳＱＣＣ）腫瘍の１００％が血漿中で検出された一方で、腺癌（ＡＤＣ）腫瘍は５０％のみ（１５／２９）が血漿中で検出された（図７）。さらに、サンプル毎の検出された平均ＳＮＶ数は、ＳＱＣＣで１２．７（中央値＝１３）、ＡＤＣで２．６（中央値＝１）であった。このコホートには１種類の癌肉腫の腫瘍、１種類の腺扁平上皮癌腫瘍のみが存在するものであったため、この時点でそれら腫瘍タイプについて、血漿中でのそれらの全般的な検出能に関する結論を導くことができるものではなかった。
【０１４９】
腫瘍のステージ及びサイズ  腫瘍のステージ及びサイズは、対応する血漿サンプル中で検出されるＳＮＶ数に影響を及ぼす、特定した最重要因子の一部であった（図８）。ステージ１ａの腫瘍は、少なくともひとつのＳＮＶを検出する見込みが最低であっただけでなく、血漿中でのＳＮＶ検出の成功率も最低であった。ステージ１ａの腫瘍から検出したＳＮＶのＶＡＦ分布もまた、残りの腫瘍のものよりも低かった（図９）。腫瘍のサイズとステージとは相関しているため、類似の傾向が腫瘍サイズで確認された。これはアッセイの失敗又は感度限界（以下を参照のこと）に起因するものではなかったため、こうした腫瘍が、この実験で用いる血漿容量において検出可能であるような量の血漿中に存在するｃｆＤＮＡを有しない傾向があるということが、最も確かな説明である。ｃｔＤＮＡ中で検出されるＳＮＶ数に対する腫瘍のステージ及びサイズの効果は、ＡＤＣサンプルとＳＱＣＣサンプルとで異なった。ＡＤＣサンプルではこれら因子により依存しており、ＳＣＣサンプルのｃｔＤＮＡ中で検出されたよりも、ｃｔＤＮＡ中で検出されたＳＮＶがかなり少ないという全般的な傾向をもっていた。実際には、ステージにかかわらず、全てのＳＱＣＣサンプルのｃｔＤＮＡ中で、ＳＮＶが検出された。すなわち、ＳＣＣサンプルのうちのひとつのｃｔＤＮＡ中で３つのＳＮＶが検出され、残りのＳＣＣサンプルのｃｔＤＮＡ中で少なくとも５つのＳＮＶが検出された（図１５）。実際には、ＳＣＣサンプルのｃｔＤＮＡ中で、３から１９のＳＮＶが検出された。ステージ１ａであった６つのＡＤＣサンプル中では、ｃｔＤＮＡサンプルのうちのひとつにおいてのみあるＳＮＶが検出され、そのサンプル中ではひとつのＳＮＶのみが検出された。ステージ１ａのＡＤＣサンプルでは、ｃｔＤＮＡ中で１以上のＳＮＶが検出されたサンプルはなかった。ステージ１ｂのＡＤＣサンプルでは、２つのサンプル中であるが全てのサンプルにおいて５つ未満のＳＮＶが特定されたが、ステージ１ｂのＡＤＣサンプルのうちのひとつにおいては７つのＳＮＶが特定され、ステージ１ｂのサンプルのうちのひとつにおいては１８つのＳＮＶが特定された。
【０１５０】
腫瘍のＶＡＦ及びクロナリティー  （変異が検出されたある腫瘍の小区分数）／（解析したその腫瘍の合計小区分数）として、クロナリティー比を変異毎に計算した。解析した腫瘍の全区分で観察された変異は「クローン性（ｃｌｏｎａｌ）」とし、その他の全てを「サブクローン性（ｓｕｂ−ｃｌｏｎａｌ）」とした。血漿中で検出されたＳＮＶのＶＡＦは、変異の「クロナリティー（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）」と関連し、よりクローン性である変異は、血漿ＶＡＦの最高値に関与し（図９及び１２）、同様に複数の腫瘍小区分中に存在するＳＮＶは、対応する血漿サンプル中において、より高い血漿ＶＡＦに関与する傾向がある。クロナリティー比に加えて、各ＳＮＶのクローン状態を、腫瘍組織からのＷＥＳデータに基づいてＰｙＣｌｏｎｅＣｌｕｓｔｅｒ（ＰｙＣｌｏｎｅクラスタ）によって分類した。クローン性ＳＮＶは、より高いＶＡＦを有する傾向があった（図１３及び１４）。
【０１５１】
ｃｆＤＮＡの入力と腫瘍ＶＡＦ  ｃｆＤＮＡ量と血漿サンプル中で検出されるＳＮＶ数と該ＳＮＶの割合との間に、相関はなかった。血漿中で検出されるＳＮＶ数は、ｃｆＤＮＡの入力量から予測されないが、高い入力（＞２５，０００コピー）を含むサンプルは全て、血漿中で検出される少なくともひとつのＳＮＶを有した（図１０）。血漿ＳＮＶのＶＡＦはまた、腫瘍ＳＮＶのＶＡＦ（図１１）と相関する。
【０１５２】
多変量解析  我々の変異検出の予測に用いることが可能である変数を決定するために、回帰分析を行った。より詳細には、０／１の応答変数（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）を用いて、存在する又は存在しないと呼称する変異の注釈とした。以下の独立の変数を我々のモデルに含むようにした：
１．  腫瘍ＶＡＦ
２．  ＰｙＣｌｏｎｅクラスタ（分類変数）
３．  癌のステージ（分類変数）
４．  腫瘍サイズ
５．  入力ＤＮＡ量
６．  病理上のタイプ（分類変数）
７．  影響を受ける肺葉数
８．  脈管侵襲（分類変数）
９．  影響を受ける肺葉
ロジスティック回帰分析により、以下の変数が、変異の検出と統計学的に有意に関連するということが示された（ｐ値＜５％で）：
１．  腫瘍ＶＡＦ（ｐ＝４．３ｅ−６）
２．  ＰｙＣｌｏｎｅクラスタ（ｐ＝１．６ｅ−４）
３．  腫瘍サイズ（ｐ＝３．５ｅ−４）
４．  病理上のタイプ（ｐ＝８．３ｅ−３０）  
【０１５３】
結論  この実施例において、肺癌患者からの血漿サンプル中において肺癌関連ＳＮＶが良好に検出されることを実証した。このサンプルコホート用に誂えた従来の多重ＰＣＲパネルを用いると、バリアントアレル断片を含むＳＮＶが検出されるのは、０．０１％程度の低さであった。この試験でのＳＮＶは、その３５％が血漿サンプル中で検出され、解析したサンプルのうち６７％が、検出された少なくともひとつの血漿ＳＮＶを有した。さらにここでは、血漿ＳＮＶの良好な検出に寄与する因子の一部を特定した。これらには、腫瘍タイプ、腫瘍ステージ、腫瘍サイズ、腫瘍中のＳＮＶアレル頻度、及び、より程度は低いが解析されたｃｆＤＮＡ量が含まれる。血漿中において全てのＳＮＶが検出されるとは限らないということ、全てのサンプルが血漿中で検出可能なＳＮＶを有するとは限らないことという発見が、アッセイ又はプロトコルの限界に起因しているように思われなかったものであるが、それはそれらアッセイが機能的であり（それらのシークエンシングのリード深度で証明されるとおり）、かつ、それらの検出の限界は、ＳＮＶがｃｆＤＮＡサンプル中に存在するのであればあらゆるＳＮＶを検出するのに十分であったからである。むしろ、それらＳＮＶ検出の失敗は、それらがサンプル中に存在しないという事実に起因している可能性が高かった。低度の腫瘍及び小腫瘍からのサンプルは、血液循環腫瘍ＤＮＡの量が制限されている傾向が強かった。同様に、腫瘍中に低アレル頻度で存在していたＳＮＶは、血漿中に存在している可能性が低かった。しかしながら、高度の腫瘍及び比較的大きいサイズの腫瘍であっても、血漿中で検出されないＳＮＶを有することがある。他の生物学的な理由がこのことに関与しており（例えばｃｔＤＮＡ量が腫瘍から脱落している等）、サンプル毎により多くのＳＮＶを解析することが一部の０．４ｍＭのｄＮＴＰを検出する機会を増加させることとなるという可能性がある（図１２−３Ｃを参照）。
【０１５４】
当業者は、ここに開示した発明の範囲及び趣旨の範囲内で、多数の変形及び他の実施形態を創出することが可能である。実際には、開示した発明の本質的な態様を変えることなく、当業者によって、記載の材料、方法、図面、実施例及び実施形態において変形がなされ得る。開示した実施形態はいずれも、開示したその他の実施形態と組み合わせて用いることが可能である。
【０１５５】
開示した実施形態、実施例及び実験は、この開示の範囲を限定する意図はなく、また以下の実験が実行した実験の全てである又は以下の実験が実行した唯一の実験であるということを表す意図もない。使用する数字（例えば量、温度等）に関して精度を保証するような努力がなされているが、一部の実験的な誤差や偏差を考慮に入れるべきである。実施例を説明することを意図した本質的な態様を変更することなく、説明した方法において変形させることが可能であるということを理解されたい。
【０１５６】
実施例２  血漿中の腫瘍の変異を追跡する特注の多重ＰＣＲプロトコル
【０１５７】
Ｎａｔｅｒａ社の特注の多重ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）プロトコルは、腫瘍組織サンプルから特定した一組の患者特有の変異を追跡することによって血漿ｃｔＤＮＡレベルを概算するように設計している。患者特有のある変異プロファイルを考慮して、対応する患者の時系列での血漿サンプルに適用することが可能である専用のｍＰＣＲパネルを設計した。
【０１５８】
ＳＮＶ標的  腫瘍小区分毎に一塩基バリアント（ＳＮＶ）を含んだ変異プロファイルを、腫瘍シークエンシングの解析に基づいて決定した。各腫瘍の完全変異プロファイルを用いて、各腫瘍の系統樹を再構成した。ＰｙＣｌｏｎｅ（Ｒｏｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＰｙＣｌｏｎｅ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｌｏｎａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：３９６−３９８）を用いて、ＳＮＶのクラスタを特定し、それらの癌細胞断片を計算した。これを用いて、ＳＮＶをクローン性又はサブクローン性のいずれかとして分類した。各ＳＮＶのドライバカテゴリを決定した（１〜４とし、１はドライバ変異の可能性が最も高く、４はドライバ変異の可能性が最も低い）。
【０１５９】
アッセイの設計  Ｎａｔｅｒａ社の標準アッセイ設計パイプラインを用いて、全ての所与のＳＮＶに対して、以下のパラメータを含むＰＣＲプライマーを設計した：
・  最適融解温度［Ｔｍ］５６°Ｃ、許容範囲５３°Ｃ〜５９°Ｃ
・  アンプリコン長、５０〜７０ｂｐ
・  ＧＣ含有量、３０〜７０％
【０１６０】
我々は、あるＳＮＶを標的とする一対のＲｉｇｈｔ  ＰＣＲプライマー及びＬｅｆｔ  ＰＣＲプライマーを、その特定のＳＮＶに対するアッセイと称する。標的ＳＮＶが近接していれば、ひとつのアッセイで、１以上の標的ＳＮＶをカバーすることが可能である。アッセイの対の全てに対して、熱力学的アプローチを用いて、プライマーダイマーを形成する蓋然性を計算し（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  ＪＲ（１９９８）“Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ，  ｄｕｍｂｂｅｌｌ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＤＮＡ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９５：１４６０−６５）、プライマー対のジョイントのハイブリダイゼーション構造について安定性を概算した。アッセイは、同一プール内でプライマーダイマーを形成する蓋然性が高いプライマーの数を最小化するように、共にプールした。患者毎に、１）ドライバＳＮＶをカバーするアッセイが最高優先度を有するように、かつ、２）系統樹の均一なサンプリングがあるように、アッセイを優先順位付けした。
【０１６１】
プールのＱＣ（クオリティーコントロール）及び最適化  プライマーは、個別のウェルにＩＤＴ社から注文し、脱塩し、１００ｕＭに正規化した。アッセイをプール用スキームに従ってＮａｔｅｒａにおいてプールして、アッセイプールを形成するものとし、各プライマーは水中で２５０ｎＭとした。各プールは、組み合わせたＱＣ（クオリティーコントロール）／最適化実験で用いた。最適化実験に関して、ＰＣＲパラメータ（プライマー濃度及びアニーリング温度）を変化させて、オンターゲットリードの割合と、リード深度の均一性（８０パーセンタイル／２０パーセンタイルの比として測定した）と、脱落アッセイ（＜１，０００リードであるアッセイとして定義した）の数とにおける効果を、シークエンシングデータから評価した。最良であるオンターゲットリードの割合、リード深度の均一性及び最低脱落アッセイ数が得られるＰＣＲ条件を決定した。全てのプールで、１０ｎＭのプライマー、６０°Ｃ又は６２．５°Ｃのアニーリング温度が最適条件であった。
【０１６２】
プライマーダイマーの大部分に関与していたプライマーを特定し、各プールから除去した（プライマー毎に除去し、その対応する対のもう一方もまた除去した）。
【０１６３】
ＤＮＡの抽出及びＱＣ（クオリティーコントロール）  各患者からの血漿の分注をｃｆＤＮＡ抽出の前にプールして、プールした血漿サンプルそれぞれの溶血程度を可視的に評価して示した（溶血なし、軽度の溶血又は重篤な溶血）。５ｍｌの血漿に最適化したプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＮＡキットを用いて、ＮａｔｅｒａにおいてｃｆＤＮＡを抽出した。全てのｃｆＤＮＡサンプルについて、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップ上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行った。同じＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙのランをまた用いて、予め定量した純粋なｃｆＤＮＡサンプルから調製した検量線上でのモノヌクレオソームのピーク高さの内挿によって、ｃｆＤＮＡサンプルを定量した。これは、ｃｆＤＮＡが、チップ上で高度なサイズマーカーと重複する無処置のＤＮＡ断片を含有することがあることを理由に必要であり、信頼できないモノヌクレオソームのピークを定量する。
【０１６４】
ゲノムＤＮＡサンプル（腫瘍小区分、リンパ節及び白血球からの）を、Ｎａｎｏｄｒｏｐで定量した。
【０１６５】
ｃｆＤＮＡライブラリの調製  各血漿サンプルからの全ｃｆＤＮＡ量を、Ｎａｔｅｒａライブラリ調製キットと以下のキットの指示とを用いたＬｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへの入力として用いた。極めて大量のｃｆＤＮＡを含む２つのサンプルに関しては、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐへの入力量を、約５０，０００ゲノム当量（１６５ｎｇ）に制限した。簡単には、モノヌクレオソーム長及びポリヌクレオソーム長の断片中に存在する、血漿から抽出した４０ｕｌのＤＮＡは、修復されてＡテール状の末端であって、Ｎａｔｅｒａ社の従来のアダプタが連結している。１５サイクルの間、ライブラリを増幅してプラトーに達するようにし、その後製造元のプロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅビーズで精製した。精製したライブラリに、ＬａｂＣｈｉｐ上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行った。
【０１６６】
ｃｆＤＮＡの多重ＰＣＲ及びシークエンシング  各血漿サンプルからのライブラリ物質を、関連のアッセイプールと、最適化した血漿ｍＰＣＲプロトコルとを用いた多重ＰＣＲへの入力として用いた。ＰＣＲ組成物は、合計反応容量１０ｕＬ中において、１×インハウスＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、１０ｎＭのプライマー、３ｕＬのｃｆＤＮＡライブラリ（約６００ｎｇのＤＮＡに相当する）とした。サーモサイクル条件としては、９５°Ｃで１０分、（９５°Ｃで３０秒、６０°Ｃ又は６２．５°Ｃで１５分、７２°Ｃで３０秒）を１０サイクル、７２°Ｃを２分とし、４°Ｃで保持した。
【０１６７】
ｍＰＣＲ産物は、個別のＰＣＲステップにおいてバーコーディングし、バーコーディングしたＰＣＲ産物をアッセイのプール用情報に従ってプールした。
【０１６８】
このプールは、製造元のプロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅビーズで精製し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップ上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行い、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅキットで定量した。各プールは、１０の癌血漿ライブラリ及び２０の陰性対照（健常な被験者から抽出したｃｆＤＮＡから調製した）のバーコーディングしたｍＰＣＲ産物を含有した。この陰性対照サンプルは、必要な制御的な手順に従って得た。各プールは、５０サイクル、シングルインデックスのペアエンドリードで、それぞれのＨｉＳｅｑ２５００  Ｒａｐｉｄランで配列した。
【０１６９】
ゲノムＤＮＡの多重ＰＣＲ及びシークエンシング  ゲノムＤＮＡサンプル（ｇＤＮＡ）を、関連するアッセイのプールと最適化したゲノムｍＰＣＲプロトコルとにより、類似のｍＰＣＲへの入力として用いて、５０ｎｇのｇＤＮＡを入力として用いた。ｍＰＣＲ産物は、個別のＰＣＲステップにおいてバーコーディングし、バーコーディングした産物の全てを１つのプールに組み合わせた。このプールは、製造元のプロトコルに従ってＡｍｐｕｒｅビーズを用いて精製し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ１０００チップ上でＱＣ（クオリティーコントロール）を行い、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅキットを用いて定量した。プールは、５０サイクル、シングルインデックスのシングルエンドリードで、シングルＨｉＳｅｑ２５００  Ｒａｐｉｄランで配列した。
【０１７０】
バイオインフォマティクスパイプライン  ペアエンドリードは、ｈｇ１９参照ゲノムに対してＮｏｖｏａｌｉｇｎのバージョン２．０８．０２でマッピングし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Ｌｉ  Ｈ．＊，Ｈａｎｄｓａｋｅｒ  Ｂ．＊，Ｗｙｓｏｋｅｒ  Ａ．，Ｆｅｎｎｅｌｌ  Ｔ．，Ｒｕａｎ  Ｊ．，Ｈｏｍｅｒ  Ｎ．，Ｍａｒｔｈ  Ｇ．，Ａｂｅｃａｓｉｓ  Ｇ．，Ｄｕｒｂｉｎ  Ｒ．ａｎｄ  １０００  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄａｔａ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｕｂｇｒｏｕｐ（２００９）Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｍａｐ（ＳＡＭ）ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５，２０７８−９）を用いて選別してインデックス化した。全てのペアエンドリードを、Ｐｅａｒ（Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｋ．Ｋｏｂｅｒｔ，Ｔ．Ｆｌｏｕｒｉ，Ａ．Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ．ＰＥＡＲ：Ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  ｒｅＡｄ  ｍｅｒｇｅＲ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（５）：６１４−６２０，２０１４）を用いてマージした（デフォルトのパラメータを使用する）。全アンプリコンが７０塩基長未満であるため、イルミナ社のＨｉＳｅｑ  ２５００で生成した５０ｂｐのペアのリードと共に、全てのオンターゲットリードを、重複の最小値を３０ｂｐとしてマージした。未再構成のリードは、オフターゲットであるため、このステップにおいて除去した。アンプリコンは、標的ＳＮＶの位置が重複領域内に位置するように設計した。順方向リード及び逆方向リードに一致しなかった塩基又は２０未満のＰｈｒｅｄクオリティースコアを有する塩基は、配列ステップにおけるシークエンシングエラーを最小限にするために除外した。マージしたリードのうち、３０より高いマッピングクオリティーを有し、かつ、プライマーの配列下で不一致が多くともひとつであったものを、オンターゲットとして標識した。１０００リード未満の標的は、失敗と考えてその後の解析から除去した。合計リード数、マッピングしたリード、オンターゲットリード、失敗した標的数及び平均エラー率を含んだ、サンプル当たりの統計の多岐にわたるリストをチェックするインハウスＪａｖａプログラムを用いて、クオリティーコントロール（ＱＣ）を行った。９０％未満でマップされたリード及び３以上の失敗した標的を含むサンプルは通過させず、再配列が必要であるものとした。
【０１７１】
統計的モデル  ＰＣＲ工程は、一組の２９の対照血漿サンプルを用いてエラーパラメータを概算することと、標的癌サンプルに対して最終ＳＮＶコールを行うこととである、確率論的な工程としてモデル化した。標的ＳＮＶ毎に、対照サンプルからの以下のパラメータを概算することによって、標的特異的なバックグラウンドエラーモデルを構築した。
・  ＰＣＲ効率
【数５】
2019517781.tif 000007
：あるＰＣＲサイクルにおいて各分子が複製される蓋然性
・  エラー率
【数６】
2019517781.tif 000008
：変異タイプｅに関する１サイクル当たりのエラー率（例えば、変異アレルＧに対する野生型アレルＡ）
・  最初の分子数（〔Ｘ０〕）
【数７】
2019517781.tif 000009
【０１７２】
標的特異的なエラー伝播モデルを用いて、エラー分子の分布を特徴付けた。ＰＣＲ工程の過程にわたって分子が複製されるにつれて、よりエラーが発生する。サイクル
【数８】
2019517781.tif 000010
においてあるエラーが発生し、系内に
【数９】
2019517781.tif 000011
の野生型分子が存在する場合、そのエラー分子は、次のサイクルで蓋然性
【数１０】
2019517781.tif 000012
と共に複製されて、二項過程
【数１１】
2019517781.tif 000013
に従って、野生型バックグラウンド分子から新しいエラー分子が生じる。再起的関係を用いて、図２１に示すように、
【数１２】
2019517781.tif 000014
回のＰＣＲサイクルの後で、合計分子数
【数１３】
2019517781.tif 000015
及びエラー分子数
【数１４】
2019517781.tif 000016
の平均及び変動を計算した。
【０１７３】
アルゴリズムのステップは、
ａ．  正常対照サンプルを用いて、ＰＣＲ効率と１サイクル当たりのエラー率とを概算するステップ、
ｂ．  効率の概算値を用いて、試験セットにおける開始分子数を計算するステップ、
ｃ．  この開始コピー数と、訓練セットからの先の効率の分布とを用いて、試験サンプルにおけるＰＣＲ効率を概算するステップ、
ｄ．  ０から１の間である（我々は上限として０．１５を用いた）、可能性のある真の変異断片の値θの範囲に関して、最終段落に記載したエラー伝播モデルと、ステップａ〜ｃにおいて概算したパラメータとを用いて、合計分子数、バックグラウンドエラー分子ならびに真の変異分子に関する平均及び変動を概算するステップ、
ｅ．  ステップｄで概算した平均及び変動を用いて、可能性のある真の変異断片毎に尤度Ｌ（θ）を計算して、この尤度を最大化するθの値を選択して（
【数１５】
2019517781.tif 000017
で示す）、信頼度スコア（
【数１６】
2019517781.tif 000018
として）を計算するステップ、
ｆ．  該信頼度スコアが、トランジションで≧≧９５％、及び、トランスバージョンで≧９８％であれば、変異コールを行うステップである。
【図１】
2019517781.tif 000019
【図２】
2019517781.tif 000020
【図３】
2019517781.tif 000021
【図４−１】
2019517781.tif 000022
【図４−２】
2019517781.tif 000023
【図４−３】
2019517781.tif 000024
【図５−１】
2019517781.tif 000025
【図５−２】
2019517781.tif 000026
【図５−３】
2019517781.tif 000027
【図６Ａ】
2019517781.tif 000028
【図６Ｂ】
2019517781.tif 000029
【図７】
2019517781.tif 000030
【図８】
2019517781.tif 000031
【図９】
2019517781.tif 000032
【図１０】
2019517781.tif 000033
【図１１】
2019517781.tif 000034
【図１２−１】
2019517781.tif 000035
【図１２−２】
2019517781.tif 000036
【図１２−３】
2019517781.tif 000037
【図１２−４】
2019517781.tif 000038
【図１２−５】
2019517781.tif 000039
【図１３】
2019517781.tif 000040
【図１４】
2019517781.tif 000041
【図１５】
2019517781.tif 000042
【図１６−１】
2019517781.tif 000043
【図１６−２】
2019517781.tif 000044
【図１７−１】
2019517781.tif 000045
【図１７−２】
2019517781.tif 000046
【図１８】
2019517781.tif 000047
【図１９−１】
2019517781.tif 000048
【図１９−２】
2019517781.tif 000049
【図１９−３】
2019517781.tif 000050
【図１９−４】
2019517781.tif 000051
【図１９−５】
2019517781.tif 000052
【図１９−６】
2019517781.tif 000053
【図２０−１】
2019517781.tif 000054
【図２０−２】
2019517781.tif 000055
【図２０−３】
2019517781.tif 000056
【図２０−４】
2019517781.tif 000057
【図２０−５】
2019517781.tif 000058
【図２０−６】
2019517781.tif 000059
【図２０−７】
2019517781.tif 000060
【図２０−８】
2019517781.tif 000061
【図２０−９】
2019517781.tif 000062
【図２０−１０】
2019517781.tif 000063
【図２０−１１】
2019517781.tif 000064
【図２０−１２】
2019517781.tif 000065
【図２０−１３】
2019517781.tif 000066
【図２０−１４】
2019517781.tif 000067
【図２０−１５】
2019517781.tif 000068
【図２０−１６】
2019517781.tif 000069
【図２０−１７】
2019517781.tif 000070
【図２０−１８】
2019517781.tif 000071
【図２０−１９】
2019517781.tif 000072
【図２０−２０】
2019517781.tif 000073
【図２０−２１】
2019517781.tif 000074
【図２０−２２】
2019517781.tif 000075
【図２０−２３】
2019517781.tif 000076
【図２０−２４】
2019517781.tif 000077
【図２０−２５】
2019517781.tif 000078
【図２０−２６】
2019517781.tif 000079
【図２０−２７】
2019517781.tif 000080
【図２０−２８】
2019517781.tif 000081
【図２０−２９】
2019517781.tif 000082
【図２０−３０】
2019517781.tif 000083
【図２０−３１】
2019517781.tif 000084
【図２０−３２】
2019517781.tif 000085
【図２０−３３】
2019517781.tif 000086
【図２０−３４】
2019517781.tif 000087
【図２０−３５】
2019517781.tif 000088
【図２０−３６】
2019517781.tif 000089
【図２０−３７】
2019517781.tif 000090
【図２０−３８】
2019517781.tif 000091
【図２０−３９】
2019517781.tif 000092
【図２０−４０】
2019517781.tif 000093
【図２０−４１】
2019517781.tif 000094
【図２０−４２】
2019517781.tif 000095
【図２０−４３】
2019517781.tif 000096
【図２０−４４】
2019517781.tif 000097
【図２０−４５】
2019517781.tif 000098
【図２０−４６】
2019517781.tif 000099
【図２０−４７】
2019517781.tif 000100
【図２０−４８】
2019517781.tif 000101
【図２０−４９】
2019517781.tif 000102
【図２０−５０】
2019517781.tif 000103
【図２０−５１】
2019517781.tif 000104
【図２０−５２】
2019517781.tif 000105
【図２０−５３】
2019517781.tif 000106
【図２０−５４】
2019517781.tif 000107
【図２０−５５】
2019517781.tif 000108
【図２０−５６】
2019517781.tif 000109
【図２０−５７】
2019517781.tif 000110
【図２０−５８】
2019517781.tif 000111
【図２０−５９】
2019517781.tif 000112
【図２０−６０】
2019517781.tif 000113
【図２０−６１】
2019517781.tif 000114
【図２０−６２】
2019517781.tif 000115
【図２０−６３】
2019517781.tif 000116
【図２０−６４】
2019517781.tif 000117
【図２０−６５】
2019517781.tif 000118
【図２０−６６】
2019517781.tif 000119
【図２０−６７】
2019517781.tif 000120
【図２０−６８】
2019517781.tif 000121
【図２０−６９】
2019517781.tif 000122
【図２０−７０】
2019517781.tif 000123
【図２０−７１】
2019517781.tif 000124
【図２０−７２】
2019517781.tif 000125
【図２０−７３】
2019517781.tif 000126
【図２０−７４】
2019517781.tif 000127
【図２０−７５】
2019517781.tif 000128
【図２０−７６】
2019517781.tif 000129
【図２０−７７】
2019517781.tif 000130
【図２０−７８】
2019517781.tif 000131
【図２０−７９】
2019517781.tif 000132
【図２０−８０】
2019517781.tif 000133
【図２０−８１】
2019517781.tif 000134
【図２０−８２】
2019517781.tif 000135
【図２０−８３】
2019517781.tif 000136
【図２０−８４】
2019517781.tif 000137
【図２０−８５】
2019517781.tif 000138
【図２０−８６】
2019517781.tif 000139
【図２０−８７】
2019517781.tif 000140
【図２０−８８】
2019517781.tif 000141
【図２０−８９】
2019517781.tif 000142
【図２０−９０】
2019517781.tif 000143
【図２０−９１】
2019517781.tif 000144
【図２０−９２】
2019517781.tif 000145
【図２０−９３】
2019517781.tif 000146
【図２０−９４】
2019517781.tif 000147
【図２０−９５】
2019517781.tif 000148
【図２０−９６】
2019517781.tif 000149
【図２０−９７】
2019517781.tif 000150
【図２０−９８】
2019517781.tif 000151
【図２０−９９】
2019517781.tif 000152
【図２０−１００】
2019517781.tif 000153
【図２０−１０１】
2019517781.tif 000154
【図２０−１０２】
2019517781.tif 000155
【図２０−１０３】
2019517781.tif 000156
【図２０−１０４】
2019517781.tif 000157
【図２０−１０５】
2019517781.tif 000158
【図２０−１０６】
2019517781.tif 000159
【図２０−１０７】
2019517781.tif 000160
【図２０−１０８】
2019517781.tif 000161
【図２０−１０９】
2019517781.tif 000162
【図２０−１１０】
2019517781.tif 000163
【図２０−１１１】
2019517781.tif 000164
【図２０−１１２】
2019517781.tif 000165
【図２０−１１３】
2019517781.tif 000166
【図２０−１１４】
2019517781.tif 000167
【図２０−１１５】
2019517781.tif 000168
【図２０−１１６】
2019517781.tif 000169
【図２０−１１７】
2019517781.tif 000170
【図２０−１１８】
2019517781.tif 000171
【図２０−１１９】
2019517781.tif 000172
【図２０−１２０】
2019517781.tif 000173
【図２０−１２１】
2019517781.tif 000174
【図２０−１２２】
2019517781.tif 000175
【図２０−１２３】
2019517781.tif 000176
【図２０−１２４】
2019517781.tif 000177
【図２０−１２５】
2019517781.tif 000178
【図２０−１２６】
2019517781.tif 000179
【図２０−１２７】
2019517781.tif 000180
【図２０−１２８】
2019517781.tif 000181
【図２０−１２９】
2019517781.tif 000182
【図２０−１３０】
2019517781.tif 000183
【図２０−１３１】
2019517781.tif 000184
【図２０−１３２】
2019517781.tif 000185
【図２０−１３３】
2019517781.tif 000186
【図２０−１３４】
2019517781.tif 000187
【図２０−１３５】
2019517781.tif 000188
【図２０−１３６】
2019517781.tif 000189
【図２１】
2019517781.tif 000190
【国際調査報告】
2019517781.tif 000191
2019517781.tif 000192
2019517781.tif 000193
2019517781.tif 000194
2019517781.tif 000195
2019517781.tif 000196
2019517781.tif 000197