(57)【要約】  リピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を治療する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法は、更なるリピートＤＮＡの伸長を阻害することが可能であり、いくつかの場合においては、リピートＤＮＡのサイズを低減すること（例えば、リピート数を低減すること）が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のリピートＤＮＡ配列の伸長を阻害する方法であって、細胞をナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させる工程が複数回実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
更に接触させる工程の前に、リピートＤＮＡ配列中のリピート数を決定する工程を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
更に接触させる工程の後に、リピートＤＮＡ配列中のリピート数を決定する工程を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞を、リピートＤＮＡ配列中のリピート数に応じた量のＮＡと接触させる工程を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡが修飾されたＮＡである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
個体のゲノム中のリピートＤＮＡ配列中のリピート数を低減する方法であって、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項９】
ＮＡが、罹患組織に直接投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＡが全身に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与する工程が注射により行われる、請求項８、９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＡが複数回投与される、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
複数用量のＮＡが投与される、請求項８から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
更に投与する工程を複数回繰り返すことを含む、請求項８から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
治療量のＮＡがリピート数に基づく、請求項８から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
治療量のＮＡが約０．０１μＭから約１Ｍである、請求項８から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
更にリピートＤＮＡ配列を有する個体を識別する工程を含む、請求項８から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
更に個体からの１以上の細胞中のリピート数を決定する工程を含む、請求項８から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
更に個体からの１以上の細胞中のリピート数をモニタリングする工程を含む、請求項８から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＡがそのインビボ安定性を増進するように修飾される、請求項８から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＡがリポソーム又は頭蓋内ポンプを通じて送達される、請求項８から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
リピートＤＮＡ配列の伸長によって引き起こされる個体中の疾患を治療または予防する方法であって、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
更にリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を有する個体を識別する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リピートＤＮＡ配列の伸長によって引き起こされる疾患が、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型（ＨＤＬ２）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、フック角膜内皮ジストロフィー２（ＦＥＣＤ２）、統合失調症、双極性障害（ＫＣＮＮ３）、乳がんリスク因子ＡｌＢ１からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＮＡがリピートＤＮＡ配列の伸長の前に投与される、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
投与する工程がリピートＤＮＡ配列の伸長の前に起こる、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＮＡが誕生前に（子宮内で）個体に投与される、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＮＡがリピートＤＮＡ配列の伸長に続いて個体に投与される、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本件開示は一般にリピート伸長に関連する疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
遺伝子特異的ＣＡＧ／ＣＴＧトリヌクレオチド（trinucleotide）リピート伸長は、ハンチントン病（ＨＤ）及び筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）を含む、不安定なリピートによって引き起こされる４０を超える神経変性疾患のうち少なくとも１６についての原因である。罹患組織における進行中のリピート伸長は、発症年齢、重症度及び進行と相関する。劇的なリピート伸長の変異が同じ個体の組織の間で存在し、５０００リピートを超える違いを伴い、最も大きな伸長は心臓、大脳皮質及び線条体に認められる。個体の臨床的に罹患組織中におけるかなり大きな伸長は、疾患の発症、重症度及び進行とともに、進行性の体細胞伸長と更に相関する。最近の研究は、１６のＣＡＧ疾患のうち少なくとも６つ（ＨＤ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ７及びＳＣＡ１７）について、ＤＮＡ修復タンパク質が発症年齢の主な調整役であることを明らかにし（Genetic Modifiers of Huntington’s Disease (GeM-HD) Consortium, 2015, Cell, 162:516-526; Bettencourt 他, 2016, Annals Neurol., in press）、進行性体細胞伸長と発症年齢の間の相関関係を更にサポートした。この関係は、他のリピート不安定性と関連する疾患同様、それぞれ体細胞伸長を示す全ての１６ＣＡＧ疾患について該当しそうである。
従って、体細胞リピート伸長を阻む又は元に戻す方法は、疾患の進行を阻み又は元に戻すために用い得るものであり、治療環境において極めて有益であろう。
【発明の概要】
【０００３】
（概要）
本件開示は、リピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を治療するための方法を提供する。本件開示はまた、リピートＤＮＡの更なる伸長を阻害し、場合によっては伸長したリピートＤＮＡのサイズを低減（例えば、リピート数を低減）する方法を提供する。
１つの態様において、細胞中のリピートＤＮＡ配列の伸長を阻害する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、細胞をナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）に接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、前記接触はインビボで行われる。いくつかの実施形態において、接触工程は、複数回行われる。いくつかの実施形態において、前記方法は更に、接触工程の前に、リピートＤＮＡ配列の中におけるリピート数を決定することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は更に、接触工程の後に、リピートＤＮＡ配列の中におけるリピート数を決定することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、リピートＤＮＡ配列の中のリピート数に応じた量のＮＡと接触させられる。いくつかの実施形態において、ＮＡは修飾されたＮＡである。
【０００４】
別の態様において、個体のゲノム中のリピートＤＮＡ配列の中でリピート数を低減する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロンを個体に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＮＡは罹患組織に直接投与される。いくつかの実施形態において、ＮＡは全身に投与される。いくつかの実施形態において、投与は注射を通じて行われる。
いくつかの実施形態において、ＮＡは複数回投与される。いくつかの実施形態において、複数用量のＮＡが投与される。いくつかの実施形態において、前記方法は更に、複数回投与する工程を繰り返すことを含む。
いくつかの実施形態において、治療量のＮＡはリピート数に基づく。いくつかの実施形態において、治療量のＮＡは約０．０１μＭから約１Ｍである。
いくつかの実施形態において、前記方法は更に、リピートＤＮＡ配列を有する個体を識別することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は更に、個体からの１以上の細胞中のリピート数を決定することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は更に個体からの１以上の細胞におけるリピート数をモニタリングすることを含む。
いくつかの実施形態において、ＮＡはそのインビボ安定性を増進するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＮＡはリポソーム又は頭蓋内ポンプを通じて送達される。
【０００５】
また別の態様において、リピートＤＮＡ配列の伸長によって引き起こされる個体中の疾患を治療または予防する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を個体に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、そのような方法は更にリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を有する個体を識別することを含む。リピートＤＮＡ配列の伸長により引き起こされる代表的な疾患としては、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型（ＨＤＬ２）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、フック角膜内皮ジストロフィー２（ＦＥＣＤ２）、統合失調症、双極性障害（ＫＣＮＮ３）及び乳がんリスク因子ＡｌＢ１が挙げられるがこれらに限られるものではない。
いくつかの実施形態において、ＮＡはリピートＤＮＡ配列の伸長の前に投与される。いくつかの実施形態において、投与工程はリピートＤＮＡ配列の伸長の前に起こる。いくつかの実施形態において、ＮＡは、誕生前に（子宮内で）個体に投与される。いくつかの実施形態において、ＮＡは、リピートＤＮＡ配列の伸長に続いて個体に投与される。
ある態様において、伸長したリピートＤＮＡ配列によって引き起こされる疾患を有する個体を治療する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を該個体に投与することを含む。
【０００６】
また別の態様において、個体中のリピートＤＮＡ配列の中におけるリピート数を低減する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を個体に投与することを含む
また別の態様において、個体中のリピートＤＮＡ配列の伸長を阻害する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を個体に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、前記投与は罹患組織に行われる。いくつかの実施形態において、前記投与は注射を通じて行われる。いくつかの実施形態において、前記投与は全身に行われる。
いくつかの実施形態において、治療量のＮＡの用量は１回よりも多く投与される。いくつかの実施形態において、治療量のＮＡの用量は、リピート数に基づいて用量依存的な方法で投与される。いくつかの実施形態において、治療量のＮＡの用量は約０．０１μＭから約１Ｍである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、投与工程を更に複数回繰り返すことを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、更に、リピートＤＮＡの不安定性によって引き起こされる疾患を有する個体を識別することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、更に、リピート伸長を有する個体を識別することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、個体からの細胞中のリピートサイズを決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、個体からの細胞中のリピートサイズをモニタリングすることを更に含む。
いくつかの実施形態において、ＮＡはそのインビボ安定性を増進するため修飾される。いくつかの実施形態において、ＮＡはリポソーム又は頭蓋内ポンプを通じて送達される。
いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型（ＨＤＬ２）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、フック角膜内皮ジストロフィー２（ＦＥＣＤ２）、統合失調症、双極性障害（ＫＣＮＮ３）または乳がんリスク因子ＡｌＢ１を含む。
【０００８】
別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本件方法及び組成物の属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び物質と類似または同等の方法及び物質は、本件方法及び組成物の実施または試験において用いることが可能であるが、適切な方法及び物質は以下に記載される。加えて、物質、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定することを意図していない。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａはナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）の構造を示す。
【図１Ｂ】図１ＢはＮＡをＮＢＤで標識するために用いられた化学反応を示す。
【図２】図２はＮＡが長いＣＡＧスリップアウトに結合することを示す実験結果である。図２のパネルＡは、２つの複素環、ナフチリジン（赤で示す）及び8-アザキノロン部分（青で示す）を含むＮＡの構造を示す。図２のパネルＢは、ＮＡ−（ＣＡＧ）・（ＣＡＧ）三要素複合体の模式図を示す。（ＣＡＧ）ｎＤＮＡ配列（左）はヘアピン構造に折りたたむことが可能であり、Ｃ−Ｇ塩基対（中央）に隣接するＡ−Ａミスマッチ対を含む。ＮＡ分子は、2-アミノ-1,8-ナフチリジン部分（赤）がグアニンに水素結合し、8-アザキノロン部分（青）がアデニンに水素結合して、ＤＮＡらせんにインタカレーションすることが可能である。図２のパネルＣは、両方の鎖にリピートを伴うゲル精製ＤＮＡ断片に対するＮＡの結合を証明し、該リピートは、両方の鎖が32Ｐで標識されたＣＴＧトラクトの非リピートＤＮＡ上流領域及び下流領域の５９ｂｐ及び５４ｂｐに隣接し、ここでリピートは  、完全二本鎖形状の（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）５０、（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）５０上の房状の短いスリップアウト、（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０からの長い（ＣＡＧ）２０スリップアウト、または（ＣＡＧ）３０・（ＣＴＧ）５０からの長い（ＣＴＧ）２０スリップアウトである。長いスリップアウトが、単一のスリップアウトとして、完全に塩基が対になった（ＣＴＧ）ｎ・（ＣＡＧ）ｎバックボーンから押し出されることについては記載のとおりである（Pearson 他, 2002, Nuc. Acids Res., 30:4534-47）。ＤＮＡを濃度を増やしたＮＡ（０．１５μＭ、０．７５μＭ、７．５μＭ及び５０μＭ）と混合し、４％ポリアクリルアミドゲルで分析した。全てのレーンが同じゲルからであり、それらは明確性のため分離された。ＮＡ−ＤＮＡ複合体をブラケットで示し、遊離ＤＮＡを矢印の頭で示す。線状及び（ＣＴＧ）２０スリップアウトＤＮＡの両方について、ＮＡの結合はなかった（白い矢印の頭）；より高濃度のＮＡにおいて、房状の短いスリップアウトＤＮＡの減少が観察されたが（灰色の矢印の頭）、明確にシフトしたバンドを明らかにすることはできなかった。バンドシフトは（ＣＡＧ）２０スリップアウトＤＮＡ（黒い矢印の頭）において明らかであった。図２のパネルＤは、ＮＡ結合の定量化を示す。線状及び３つのスリップアウト基質について、相対移動を各ＮＡ−ＤＮＡ複合体の移動距離の遊離ＤＮＡの移動距離に対する比率として測定した。移動距離は、ウェルから各バンドの一貫した中心点について測定した。デンシトメトリー分析がＳ−ＤＮＡ基質について行われた。グラフは３つの独立した実験の平均及び対応する標準偏差を示す。図２のパネルＥは、ゲル精製ＤＮＡヘテロ二本鎖断片で、両方の鎖が32Ｐで標識されている（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０からの長い（ＣＡＧ）２０スリップアウトを伴うものが、熱変性され、（内部鎖構造形成を強化し、内部鎖ハイブリダイゼーションを阻害するため）氷でスナップ冷却され、７．５μＭのＮＡの存在下または非存在下でインキュベートされた（左のパネル）。同じＤＮＡがアルカリ処理によって変性され、７．５μＭのＮＡの存在下または非存在下で、リハイブリダイゼーションされた（右のパネル）。その後、ＤＮＡは４％ポリアクリルアミドゲルで解析された。各ＤＮＡ標本を模式的に示す。（ＣＡＧ）５０鎖（両方のパネル）及びヘテロ二本鎖（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０（右のパネル）の両方で形成されたＮＡ−ＤＮＡ複合体をブラケットによって示し、遊離ＤＮＡを矢印の頭で示す。ＮＡはいずれの実験においても、（ＣＴＧ）３０ヘアピン断片と結合しなかった（白い矢印の頭）。とりわけ、ＮＡは、相補鎖のリハイブリダイゼーションを阻害しなかった。
【図３】図３は、特に長いＣＡＧスリップアウトのヒト細胞抽出物（ＨｅＬａ細胞）による修復をＮＡが阻害したことを示す。図４のパネルＡはインビトロ修復アッセイの模式図である。出発ＤＮＡ及び修復生成物はリピート含有断片を放出し、それをＰＡＧＥで分析し、モルレベルでサザンブロッティング及びデンシトメトリーによって評価した。ＮＡの存在下または非存在下での長い（ＣＡＧ）２０スリップアウト（図３のパネルＢ）長い（ＣＴＧ）スリップアウト（図３のパネルＣ）、単一ＣＡＧスリップアウト（図３のパネルＤ）または単一Ｇ−Ｔミスマッチ（図３のパネルＥ）を含む異なるＤＮＡ基質の修復。（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０、（ＣＡＧ）３０・（ＣＴＧ）５０または（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）４９のハイブリッドからスリップＤＮＡ基質を調製した。Ｇ−Ｔミスマッチの修復は、模式的に示されるとおり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトを再構成する。グラフは、レーン中の全てのリピート含有断片に対する修復生成物で修復効率をパーセントで示し、値は、ＮＡ−フリー効率に対して規格化されている。値は３から５つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。ＮＡ含有は長い（ＣＡＧ）２０スリップアウトの修復を阻害するが（図３のパネルＢ）、その他の基質の修復効率には影響しない（図３のパネルＣ、Ｄ及びＥ）。
【図４】図４は、ＮＡ細胞分布、非毒性、及びＨＤ患者細胞中におけるリピート不安定性に対する効果を示す実験結果である。図４のパネルＡは（ＣＡＧ）８５０を伴うＨＴ１０８０細胞モデル中のＮＡの細胞分布を示す。ＮＢＤ標識ＮＡ（緑）が核及び細胞質全体に分布していた。核及び細胞膜はＤＡＰＩ（青）及びCell Light 細胞膜−ＲＦＰ（赤）でそれぞれ染色した。スケールバーは２０μｍを示す。図４のパネルＢは、７２時間ＮＡで処置されたＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞の細胞毒性を示す。細胞生存率をＷＳＴ−１アッセイで推計した。値は３つの独立した測定の平均値±標準偏差を表す。図４のパネルＣは、５０μＭのＮＡで処置された、または処置されなかったＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞の成長曲線を示す。エラーバーは、３つの実験の標準偏差を示す。図４のパネルＤ及びＥは、リピート不安定性が、ＨＤリピートトラクトを通じてｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌ−ＰＣＲ法によって解析されたことを示す（表２を参照）。ヒストグラムは、（ＣＡＧ）１８０を伴うヒトＨＤ初代線維芽細胞ＧＭ０９１９７、または（ＣＡＧ）４３を伴うヒトＨＤ初代線維芽細胞ＧＭ０２１９１を、ＮＡと共にあるいは抜きで４０日間成長させた後のリピート長の分布を示す。リピートアレルの頻度分布を灰色のバーで示す。点線はＣＡＧサイズのピークを示す。アレル長は、１０リピートごとのスパンでビンにグルーピングした。２３０を超えるアレルがグループごとにサイズ分けされた。リピート集団のパーセンテージを、１０リピートスパンのビンにグルーピングされたアレルの数をアレルの総数で割ることによって計算した。３つの独立した実験の要約が示されている（図１０及び１１を参照）。図４のパネルＧ及びＨは、ＨＤ線維芽細胞をＮＡと共にあるいは抜きで４０日間インキュベートした後の平均リピートサイズを示す。*Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。パネルＨは、ＨＤ線維芽細胞中（ＮＡと共にあるいは抜きで４０日間インキュベートした後）のＣＡＳＫ、ＨＴＴ（正常アレル）、及びＭｆｄ１５遺伝子座のリピート−トラクト長を示す（図１２Ａ及び１２Ｃも参照）。長さの変異はこれらの伸長しなかったもののいずれにおいても観察されなかった。
【図５】図５は、増殖から独立して、ｒＣＡＧ転写に依存するＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中で、ＮＡがＣＡＧ収縮を誘発することを示す実験結果である。図５のパネルＡは、模式的転写バブル及びＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞（初代細胞クローン及びＮＡと共にあるいは抜きで３０日間インキュベートした後の細胞）のｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌ−ＰＣＲによるＣＡＧ／ＣＴＧリピート長解析を示す代表的なデータを示す。左のスケールは、分子量マーカー（Ｍ）を同等サイズのＣＡＧ−リピート断片についてのリピート数に変換したものを示す。図５のパネルＢは、ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞におけるリピート長分布を示すヒストグラムである。不安定アレルの頻度分布を灰色のバーで示す。安定アレルの頻度を黒いバーで示す。比較を容易にするため、点線は変化しないＣＡＧサイズを示す。アレル長は５０リピートのスパンでビンにグルーピングする。リピート集団のパーセンテージを、５０リピートスパンのビンにグルーピングされたアレルの数をアレルの総数で割ることによって計算した。５０を超えるアレルが各グループにサイズ分けされた。Ｐ−値をカイ二乗検定によって計算した（表２）。３つの独立した実験の概要を示す（図１０及び１１を参照）。図５のパネルＣは、ＮＡと共にあるいは抜きで３０日間インキュベートした後のＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞の平均リピートサイズの変化を示す。Ｐ−値をスチューデントのｔ検定で計算した。パネルＤは、ＮＡ処置を伴うまたは抜きの非増殖ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞のリピート長分布を、下方に平均リピートサイズの変化とともに示す（図１５Ａ及び１５Ｂも参照）。ＮＡはまだ効果を有しており、その活性が細胞増殖から独立していることを示している。図５のパネルＥは、リピートを転写しない増殖ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞（図１６Ａ）のＮＡと共にあるいは抜きでの３０日後を示す。リピート長分布及び平均リピートサイズ変化が示されている。ＮＡは効果がなく、転写に依存することを示している。図５のパネルＦはＮＡが伸長ＣＡＧトラクトにわたって転写をブロックしないことを示す（図１０Ａ及び１０Ｂも参照）。ＮＡ処置（５０μｍ）された、またはされていないＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中の導入遺伝子（ＣＡＧ−方向における転写）のＲＮＡ転写レベル。定量逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを、TaqMan Gene Expression アッセイを用いて実施した。ＮＡ（５０μＭ）はＣＡＧ−リピート含有転写物の転写に影響しなかった。データは３つの平均±標準偏差である。図５のパネルＧは、ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞（初代クローン及びＮＡと共にあるいは抜きで３０日間インキュベートした後の細胞）中のＣＡＳＫ、ＡＴＸＮ８、及びＭｆｄ１５遺伝子座のリピート−トラクト長を示す。長さの変異は、ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中（ＮＡと共にあるいは抜きで３０日間インキュベートした後）の正常な長さの遺伝子座のこれらのリピートのいずれにおいても観察されなかった（図１２Ａ及び１２Ｃも参照）。
【図６】図６は、Ｒ６／２マウス線条体中でＮＡがＣＡＧ収縮を誘発することを示す実験結果である。図６のパネルＡは、ＣＡＧ長の解析であり、６匹の代表的なＲ６／２マウスで、４週間の間、１回（マウスｉ）、２回（マウスｉｉ及びｉｉｉ）または４回（マウスｉｖ、ｖ、ｖｉ）ＮＡを注入したものの線条体中のＣＡＧリピート長の分布を示す。ＮＡを生理的食塩水に溶解して、左線条体（青）に注入し、右線条体（赤）には生理的食塩水のみを注入した（図２４参照）。ＮＡはＣＡＧ転写遺伝子にわたっての転写に影響しない（図１５Ｂ）。全てのマウスを４回処置し、図２５Ａ−２５Ｈに示す。図６のパネルＢは、記載（Lee 他, 2010, BMC Syst. Biol., 4:29）に従って計算した収縮及び伸長不安定性指数に反映された、１回、２回、または４回のＮＡ注入の効果を示す（図２７も参照）。図６のパネルＣは、記載のとおり計算され、収縮及び伸長の相対的組成に反映された、１回、２回、または４回のＮＡ注入の効果を示す（図２７も参照）。図６のパネルＤは、ＣＡＧ長解析であり、４週間にわたって左線条体にＮＡを４回注入した後の代表的なＲ６／２マウス（マウスｖｉ）からの線条体、前頭皮質、小脳及び尾の中のＣＡＧリピート長の分布を示す。ＤＮＡは左側（青）及び右側（赤）の線条体、前頭皮質、小脳及び尾から、ＮＡ処置前（赤）及び後（緑）に単離された。とりわけ、ＮＡ処置された半分の線条体中のＣＡＧリピートは、尾における遺伝性の長さ（尾の中のＣＡＧ長に基づく前駆アレル長の推計値、この長さは誕生からマウスの生涯を通じて変化しないため；ｅＰＡＬ＝１５９）よりも短かった。リピートサイズ変化は、ＮＡ抜きでの体細胞伸長に対する主要なピークのＮＡ誘発収縮を表す最初の数と遺伝性のアレルに対する収縮を表す第２の数とをブラケットで括る。これらのブラケットは、線条体中の二峰性分布の第二モードにおけるサイズ変化を説明しない（図２５Ａ−２５Ｈも参照）。図６のパネルＥは、Ｄに示された様々な組織の不安定性指数を示し、ここで赤及び青の菱形は、生理的食塩水処置／線条体の右側及びＮＡ−処置／線条体の左側の値をそれぞれ表す（図２５Ａ−２５Ｈ及び図２７Ｂも参照）。図６のパネルＦは、４回注入したＲ６／２マウスからの線条体の両側におけるＭａｐｋａｐ１及びＦｇｄ４遺伝子座のリピート−トラクト長を示す（図１２Ａ及び１２Ｃも参照）。長さの変異は、これら正常な長さのリピートのいずれにおいても観察されなかった。
【図７】図７は、ＮＡ−結合ＣＡＧスリップアウトの高分解能ポリアミドゲル電気泳動分離を示す。（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０からの長い（ＣＡＧ）２０スリップアウトを伴い、両鎖を32Ｐ−標識した１ｐｍｏｌのゲル精製ヘテロ二本鎖ＤＮＡを、濃度を増加させて（０．７５μＭ、７．５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ及び１５００μＭ）ＮＡと混合し、４％ポリアクリルアミドゲル（左のパネル）または８％のポリアミドゲル（右のパネル）上で分析した。ＮＡ−ＤＮＡ複合体をブラケットで示し、遊離ＤＮＡを矢印の頭で示す。相対移動度のシフト（Ｒｍ）を、各ＮＡ−ＤＮＡ複合体の移動距離の遊離ＤＮＡの移動距離に対する比率で測定した（グラフパネル）。移動距離は、ウェルから各バンドの一貫した中心点を定規で測定した。ヒストグラムは、３つの独立した実験の平均と対応する標準偏差を示す。（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０へのＮＡ−結合は、バンドの広がりを引き起こし、これは以前、他のＤＮＡ−結合配位子において観察された（Nielsen 他, 1988, Biochem., 27:67-73; Barcelo 他, 1991, Biochem., 30:4863-73; Carlsson 他, 1995, Nuc. Acids Res., 23:2413-20; Fox 他, 1988, Nuc. Acids Res., 16:2489-507）。
【図８】図８は、１本鎖にリピートなし（左パネル）または（ＣＡＧ）ｎリピートのいずれかを伴い、共通の鎖に32Ｐ−標識したＤＮＡ基質へのＮＡの結合を示す。３、５、１１又は１５ＣＡＧリピートのスリップアウトが単一のスリップアウトとして、完全に塩基が対になったバックボーンから押し出された（トップパネル、ＤＮＡ配列及び構造を参照）。１ｐｍｏｌの各基質を、濃度を増加させて（１５μＭ及び５０μＭ）ＮＡと混合し、４％ポリアクリルアミドゲルで解析した。全てのレーンは同じゲルからであり、それらは明確に分離された。ＮＡ−ＤＮＡ複合体をブラケットにより示し、遊離ＤＮＡを矢印の頭で示す。線状基質については、ＮＡの結合はなく（白い矢印の頭）、ＮＡの濃度が高いほど、短いスリップアウトＤＮＡ（３及び５リピート）のわずかな減少が観察されたが（灰色の矢印の頭）、明確にシフトしたバンドを明らかにすることはできない。バンドシフトは（ＣＡＧ）11及び（ＣＡＧ）15スリップアウトＤＮＡ（黒い矢印の頭）について明らかである。相対移動度シフトを各ＮＡ−ＤＮＡ複合体の移動距離の遊離ＤＮＡの移動距離に対する比率で測定した（グラフパネル）。移動距離はウェルから各バンドの一貫した中心点を測定した。ヒストグラムは、３つの独立した実験の平均とそれに対応する標準偏差を示す。Ｐ−値をスチューデントのｔ検定によって計算した。
【図９】図９は、ＣＡＧ／ＣＴＧトラクトの存在または複製の方向に関わらず、ＮＡが複製効率または複製フォークの進行に影響しないことを示す。ＳＶ４０起源の複製を含有する３つの環状プラスミド及び伸長（ＣＡＧ）７９・（ＣＴＧ）７９リピートトラクト（ｐＤＭ７９ＥＦ及びｐＤＭ７９ＨＦ）またはリピートなし（ｐＫＮ１６）を、ヒトＨｅＬａ細胞抽出物によって複製し、ＮＡ処置無しまたは有り（７．５μＭまたは１５μＭ）で、インビトロで組換えＳＶ４０Ｔ−Ａｇを添加した。ＳＶ４０−ｏｒｉの位置が複製方向及びいずれの鎖がリーディング鎖またはラギング鎖テンプレートとして用いられるかを決定する。ｐＤＭ７９ＨＦはＣＡＧ鎖をラギング鎖テンプレートとして用いる一方、ｐＤＭ７９ＥＦはＣＴＧ鎖をラギング鎖テンプレートとして用いる（ゲルパネルの上の模式図）。複製生成物を精製し、ＢａｍＨｌで線状にした。同じ量の反応物質をまたＢａｍＨｌ及びＤｐｎｌで消化した。Ｄｐｎｌは複製されていない物質及び部分的に複製されている物質を、模式図に示されるように消化する（一番上の図）。完全に複製された物質及び複製されていない物質を分析するために、従前の記載（Panigrahi 他, 2002, J. Biol. Chem., 277:13926-34; Cleary 他, 2002, Nat. Genet., 31(1):37-46; 下の図）のとおり、消化生成物を１％アガロースゲルで電気泳動した。同量の複製されていないプラスミドＤＮＡをＤｐｎｌで消化し、臭化エチジウムで染色して、複製されていないプラスミドＤＮＡの完全な消化を示した（下のパネル）。パネルＩ、臭化エチジウム染色、パネルＩＩ、オートラジオグラフ；マーカー（レーン１）；Ｄｐｎｌ非消化プラスミドＤＮＡ（レーン２）；Ｄｐｎｌ消化非複製プラスミドＤＮＡ（レーン３−４）；複製プラスミドＤＮＡ、Ｄｐｎｌレジスタント（レーン５）。３つの全ての試験されたテンプレートについて、Ｄｐｎｌレジスタント物質においてはＮＡ存在下又は非存在下での複製に違いはなかった（パネルＩＩＩ、ＩＶ及びＶ）。
【図１０】図１０は、３つの独立した実験からの（ＣＡＧ）１８０伸長を伴うＨＤ線維芽細胞におけるリピート不安定性にＮＡが与える効果を独立して解析したものを示す。ＨＤリピートトラクトにわたってＳｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲを用いてリピート不安定性を評価した。ヒストグラムは、ＨＤ初代線維芽細胞をＮＡとともにまたはＮＡ抜きで４０日間インキュベートした後のリピート長の分布を示す。リピートアレルの頻度分布は、灰色のバーで示す。点線はＣＡＧサイズのピークを示す。
【図１１】図１１は、（ＣＡＧ）４３伸長を伴うＨＤ線維芽細胞におけるリピート不安定性にＮＡが与える効果を３つの独立した実験から示す。ＨＤリピートトラクトにわたってＳｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲを用いてリピート不安定性を評価した。ヒストグラムは、ＨＤ初代線維芽細胞をＮＡとともにまたはＮＡ抜きで４０日間インキュベートした後のリピート長の分布を示す。リピートアレルの頻度分布は、灰色のバーで示す。点線はＣＡＧサイズのピークを示す。
【図１２】図１２は、ＨＤ初代線維芽細胞（図１２のパネルＡ）及びＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞（図１２のパネルＢ）中のＣＡＳＫの非伸長ＣＡＧ／ＣＴＧリピート長についての超高感度ｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲを示す代表的なデータである。ｓｐＰＣＲの高感度な変異検出能力をもってしても、ＮＡ処置及び非処置細胞のいずれにおいても長さの変異は観察されなかった。いくつかの反応では何ら生成物が示されず、これは、ｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲで用いられる低ゲノムＤＮＡテンプレート希釈においては典型的である。４０日間ＮＡ処置され、または処置されなかったＨＤ患者線維芽細胞のＴＢＰアレル中の非伸長ＣＡＧトラクトの変動性（図１２のパネルＣ）及びＮＡまたは生理的食塩水を４回注入したＨＤＲ６／２マウス線条体におけるリピート長の変動性（図１２のパネルＤ）。リピート長は、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザで解析した。
【図１３】図１３はＮＡが一般的な変異原ではないことを証明するデータを示す。ＮＡ処置が、ＣＡＧスリップアウト以外の配列に対して一般的な変異原として作用するかどうかを評価するため、一分子リアルタイム環状コンセンサスシークエンシング（ＳＭＲＴ−ＣＣＳ）の高い読み取り正確性及び深度が利用された。一分子シークエンシングは、ＨＰＲＴ１遺伝子（誘発性遺伝的変異のグローバルな効果についての代理指標として広く用いられる）について行われた。一分子シークエンシングは０．５％未満の変異頻度を偽陽性なく検知することができる。図１３のパネルＡは、変異検知のためのＨＰＲＴ１シークエンシングの模式図である。簡潔に述べると、細胞を、ＮＡ（５０μＭ）の添加または生理的食塩水の添加においてのみ異なるが、他は同じ条件下で成長させ、ＤＮＡを単離し、ＨＰＲＴ１エキソン２及び３をＰＣＲ増幅及びシークエンスした。図１３のパネルＢは、ＮＡ処置サンプル及び生理的食塩水処置サンプルの間での配列変異の比較を示すグラフである。我々は、男性ＨＤ患者由来細胞で、ＮＡまたは生理的食塩水処置された、個別Ｘ染色体にリンクしたＨＰＲＴ１アレルの一分子シークエンスのリード（エキソン２及び３、２，８９７ヌクレオチド）を比較することを選択した。この方法で、それぞれのリードは単一細胞を表すであろう。グラフは、ＰａｃＢｉｏ単一分子ロングリードでシークエンスされたＮＡ処置及び生理的食塩水処置細胞の３つの実験的複製の間での相対変異率による配列変異体の分布を示す。２，４０２にのぼる個別ＨＰＲＴ１アレルの比較は、何ら配列の違いを明らかにしなかった。最小限の配列変動はあったものの、この点については、ＮＡ−処置細胞及び生理的食塩水−処置細胞の間で有意な差はなかった（ｐ＝０．１０８３、２サンプル  コルモゴロフ−スミルノフ検定）。パネルＣはＳＭＲＴロングリードシークエンシングが、この適用には理想的であったことを示す。何故ならそれは、アンプリコンの全体の長さを、単一の連続したリード中で、リードを通じて高品質なコンセンサス配列を生成する複数のパスを用いて、シークエンスすることができるためである。したがって、配列の違いが別の複製物について存在しないことは、ＮＡが一般的な変異原として作用しないことの証拠である。
【図１４】図１４は、ｒＣＡＧ転写物を生成するＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０におけるリピート不安定性にＮＡが与える効果についての独立した解析を示す。ヒストグラムは、ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中のリピート長分布を示す。リピート長は、ｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲによって、非処置及びＮＡ処置細胞の両方について、３つの独立した実験において解析した。不安定アレルの頻度分布を灰色のバーで示す。安定アレルの頻度を黒いバーで示す。ＣＡＧ長トラクトの低減は、各実験で、ＮＡ処置細胞において明らかである。比較を円滑化するため、点線は最初の変化していないＣＡＧサイズを示す。Ｐ−値をカイ二乗検定で計算した。
【図１５】図１５は（ＣＡＧ）８５０細胞におけるＮＡの効果が増殖から独立していることを示す。ＮＡの効果を非増殖細胞において試験し、図４と同じ間隔で接触阻害を維持した。図１５のパネルＡは、ＢｒｄＵ−含有媒体中で２４時間後のＢｒｄＵ陽性細胞の割合によって測定した、接触阻害及び血清飢餓による増殖の阻止を示す。図１５のパネルＢは、接触阻害下にあるＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中のリピート長分布を示すヒストグラムを示す。リピート長は、ｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲによって、３つの独立した実験において、非処置及びＮＡ処置細胞の両方について解析された。不安定アレルの頻度分布を灰色のバーで示す。安定アレルの頻度を黒いバーで示す。ＮＡの効果は細胞増殖とは独立していた。ＮＡは、接触阻害細胞において伸長リピートの収縮に向かってシフトを誘発した（ｐ＜０．０５）。比較を円滑にするため、点線は、変化しなかったＣＡＧサイズを示す。Ｐ−値をカイ二乗検定で計算した。
【図１６】図１６は、ＮＡがＨＴＴにわたって転写に影響をしないことを示す。図１６のパネルＡは、ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０及びＨＴ１０８０−非転写（ＣＡＧ）８５０細胞中の導入遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。結果は、ＣＡＧリピートがＨＴ１０８０−非転写細胞に転写されず、単一コピーとしてインテグレートされることを証明する。鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ（１週間）。ＡｔｔＢ−ＰｈｉＣ３１システムが単一コピーインテグレーションに広く用いられる。図１６のパネルＢは、定量リアルタイム逆転写酵素（ｑＲＴ）−ＰＣＲにより決定され、Ｕ６ＲＮＡに規格化され、ＮＡ処置対ＰＢＳ処置Ｒ６／２線条体の比で表現された。データを３つの平均±標準偏差で示す。  ＮＡが誘発したＲ−ループからのＲＮＡ部分の置換は観察されず、Ｒ−ループから離れてＮＡがＲＮＡに競合的に結合するであろうことが予想されよう。ＮＡがＲＮＡリピートに結合するため競合できないことは、これらＲＮＡへの低い結合性のためである可能性がある。ＮＡと、ＲＮＡのあるリピート長であるｒ（ＣＡＧ）９との相互作用に関する研究（Li 他, 2016, Chem. Asian J., 11:1971-1981）。注目すべきことに、ＮＡのＲＮＡ（ＣＡＧ）９への親和性とＤＮＡ（ＣＡＧ）９へのそれは、数倍異なる。更に、ＮＡのｄ（ＣＡＧ）９及びｒ（ＣＡＧ）９に対する結合化学量論は非常に異なっている。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによると、ｄ（ＣＡＧ）９（固定化量は４９７ＲＵであった）及びｒ（ＣＡＧ）９（５２４ＲＵ）について、ｄ（ＣＡＧ）９に結合するＮＡは、ＳＰＲ強度の著しい変化（１４０ＲＵ）を生み出す一方で、ｒ（ＣＡＧ）９についてはわずかな変化（８ＲＵ）しか観察されなかった。エレクトロスプレ−イオン化飛行時間型質量分析計は、ＮＡのｄ（ＣＡＧ）９に対する親和性がｒ（ＣＡＧ）９のそれに対するものよりはるかに高いことを示唆した。ｄ（ＣＡＧ）９及びｒ（ＣＡＧ）９に対するＮＡ−結合の化学量論量が不明であることから、ｄ（ＣＡＧ）９及びｒ（ＣＡＧ）９に対するＮＡー結合の結合定数を正確に測定することは科学的に困難である。これに加えて、これらの全ての実験は、インビトロで行われ、そこには核酸とＮＡのみが緩衝溶液中に存在した。ｒ（ＣＡＧ）９に対するＮＡの結合が、細胞中では著しく効果的ではないということは妥当であるように思われる。ＲＮＡリピートに対するＮＡの強い結合の欠如は、それがＲ−ループからＲＮＡを競合により離すことができないことと整合的である（図１７Ｅ）。
【図１７】図１７は、ＮＡが転写、Ｒ−ループの形成、ＲＮａｓｅによるプロセッシング、またはＲ−ループの生物物理学的安定性に影響を与えないこと示す実験結果である。図１７のパネルＡは、ＮＡ（５０μＭ）で処置された、あるいは処置されていないＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中の導入遺伝子のＲＮＡ転写レベルのグラフである（ＣＡＧ方向に転写）。定量逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを、TaqMan Gene Expressionアッセイを用いて行った。ＮＡ（５０μＭ）は、転写物を含有するＣＡＧ−リピートの転写に影響を与えなかった。データは３つについての平均±標準偏差である。図１７のパネルＢはＲ−ループ形成及びプロセッシングの模式図である。矢印はＮＡが転写、Ｒ−ループ形成、ＲＮａｓｅＡ／Ｈ消化、Ｒ−ループ生物物理学的安定性、またはＲ−ループプロセッシングのいずれかを中断させ得るステップを指しており、それぞれ図１７のパネルＡ、Ｄ、Ｃ及びＥに示されるように試験した。図１７のパネルＣは（ＣＡＧ）７９・（ＣＴＧ）７９リピート含有プラスミドであって、ＮＡ（１２０μＭ）の存在下または非存在下でいずれかの鎖にＴ３またはＴ７ポリメラーゼによってインビトロ転写されたものを示す。反応生成物は、その後全ての一本鎖ＲＮＡを開裂するためＲＮａｓｅＡ（「Ａ」と標識）で処理し、１％アガロースゲルで分析した。ＲＮＡ−フリースーパーコイルＤＮＡを明らかにするために、ＲＮａｓｅＨ（「Ｈ」と標識）によるコントロール処理を行って、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを除いた。転写中にＮＡ（５０μＭ）が存在することはＲ−ループの形成に影響しなかった。図１７のパネルＤは、（ＣＡＧ）７９・（ＣＡＧ）７９の伸長トラクト含有スーパーコイルプラスミドのインビトロ転写が、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写生成物を用いて行われ、ＮＡ（１２０μＭ）の存在下または非存在下でＲＮａｓｅＡ（「Ａ」と標識）またはＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＨ（「Ｈ」と標識）で処理されたことを示す。反応生成物はその後１％アガロースゲルで分析した。ＮＡ（５０μＭ）はｓｓＲＮＡのＲＮａｓｅＡによる開裂にも、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのプロセッシングにも影響しなかった。図１７のパネルＥは、（ＣＡＧ）７９・（ＣＡＧ）７９を伴うスーパーコイルＤＮＡ（レーン１）が、Ｔ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで両鎖上のリピートにわたって転写され、二重Ｒ−ループをもたらしたことを示す。二重Ｒ−ループをＲＮａｓｅＡまたはＨ（「Ａ」または「Ｈ」と標識された）で処理し、ＮＡ（５０μＭ）とともにインキュベートした。反応生成物を１％アガロースゲルで分析した。ＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＨ（「Ｈ」と標識）の両方で処理した二重Ｒ−ループを伴うコントロール反応（レーン５）、及びスーパーコイルプラスミドそれ自身（レーン６）は、ＮＡ（５００μＭ、示されていない）によって変化しなかった。ダイマーまたはモノマー形態のスーパーコイルプラスミドの位置を「ＳＣ」で示す。上方の「ＳＣ」は結合したダイマーを表し、下方の「ＳＣ」はモノマーを表す。パネルＣ、Ｄ及びＥにおいて、ＮＡは、転写反応（パネルＣ）、ＲＮａｓｅＡ／Ｈ反応のみ、ＲＮａｓｅＡ／Ｈクリーンアップに続��場合のみのいずれかに含まれていた。ＮＡは転写、Ｒ−ループ形成、ＲＮａｓｅＡ／ＨによるＲ−ループの消化、またはＲ−ループからＲＮＡの切断を阻害しない。
【図１８】図１８は、ＮＡのＲ−ループ形成、プロセッシング、及び不安定性に与える効果を示す。図１８のパネルＡは、（ＣＡＧ）７９・（ＣＡＧ）７９を伴うスーパーコイルＤＮＡ（レーン１）が、インビトロで両鎖上のリピートにわたって転写され、Ｔ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって二重Ｒ−ループをもたらしたことを示す。二重Ｒ−ループはその後ＲＮａｓｅＡまたはＨ（「Ａ」または「Ｈ」と標識）で処理され、５０μＭのＮＡとともにインキュベートされた。反応生成物はその後１％アガロースゲルで分析された。高濃度のＮＡにおいては、Ｒ−ループスメアが減少した（レーン４）。ＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＨ（「Ｈ」と標識）の両方で処理された二重Ｒ−ループを伴うコントロール反応（レーン５）及びスーパーコイルプラスミドのみ（レーン６）は、より高濃度のＮＡで変化しなかった。ダイマーまたはモノマー形態中のスーパーコイルプラスミドの位置を「ＳＣ」で示す。図１８のパネルＢは、Ｒ−ループ形成、プロセッシング及び解析の模式図である。あらかじめ形成された二重Ｒ−ループを、最終分化（レチノイン酸）ヒトニューロン様細胞抽出物（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）によって、ＮＡ（５０μＭ）の存在下、または非存在下で記載されているとおり処置し、ＤＮＡリピート長を伸長、収縮または安定としてＳＴＲＩＰアッセイによって評価した。図１８のパネルＣは、ＳＴＲＩＰ解析の代表例を示すグラフである。転写生成物を単離し、処置し、先に（ＣＡＧ）７９・（ＣＡＧ）７９長を安定的に維持することが示された大腸菌細胞に形質転換した。個々のバクテリアのコロニーから単離されたプラスミドは、リピート含有断片を放出するため制限酵素で消化し、４％ポリアクリルアミドゲルで分析し、不安定性のスコアをつけた。
【図１９】図１９はＮＡが伸長したＣＡＧトラクトの収縮を誘発し得る可能なメカニズムを示す。図１９のパネルＡは転写に誘発された、ＣＴＧ  ＤＮＡテンプレート鎖とのハイブリッド中のｒ（ＣＡＧ）ｎとのＲ−ループ形成がＣＡＧ鎖を置き換え、ＮＡが結合することを可能とすることを示す。ＮＡは様々な量で結合し、より短い、あるいはより長いヘアピンをつくる。Ｒ−ループで、またはＲＮＡの除去に伴い再アニールされたＤＮＡ鎖上で形成された内部鎖ＤＮＡリピート構造は、不明確なメカニズムによって伸長及び収縮を繰り返すように処置されうる。スリップアウトしたＣＡＧ及びスリップアウトしたＣＴＧリピートは、主にランダムコイル及びヘアピン立体構造中にそれぞれ存在した。Ｒ−ループのプロセッシングに伴うリピート不安定性は、Ｒ−ループからスリップＤＮＡの形成及びそれに引き続く異常な修復を通じて起こることが示されている（Panigrahi 他, 2010, PNAS USA, 107:12593-9）。ｒＣＡＧ−ｄＣＴＧ  Ｒ−ループの形成中に、ＮＡが、変異ｄＣＡＧ鎖上に形成された内部鎖ヘアピンに結合し、それらのヘアピンを図２のパネルＤに示されるように更に伸長させることが可能であり得る。図１９のパネルＢは、同様に、ＮＡが、ＲＮＡの除去に続くＤＮＡ鎖の記載外の再アニールによって形成されたＣＡＧスリップアウトに結合しうることを示す（図１９のパネルＢ）。これらのＮＡ結合構造は、プロセッシングを、伸長を超えて収縮へとシフトしうる。スリップＣＡＧ／ＣＴＧリピートのプロセッシングは複雑であり、未知のヌクレアーゼによる多数のヌクレオチド鎖切断の切れ目（図１９のパネルＢ中の矢印を参照）を含むことが示されている（Hou 他, 2009, Nature Struct. & Mol. Biol., 16:869-75; Pluciennik 他, 2013, PNAS USA, 110:12277-82）。ＮＡはまた一本鎖（ＣＡＧ）１０リピートのギャップに結合することが可能であり、それはＣＴＧスリップアウトの除去の間に起こる可能性がある。（ＣＡＧ）２０スリップアウトの修復をブロックしたそのＮＡは、ヒト及びその他のＤＮＡポリメラーゼが、ＮＡ−結合（ＣＡＧ）１０テンプレートに沿ってプライマーを伸長することができないことと整合する。これらの結果は、転写強化リピート不安定性におけるＮＡの効果が、Ｒ−ループプロセッシングにおけるＮＡ攪乱によって引き起こされた可能性を示唆する。
【図２０】図２０は、ＭｕｔＳβが、（ＣＡＧ）２０の単一スリップアウトを含有する放射標識されたスリップＤＮＡと、室温で、３０分間、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．５、１１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液中において、結合することが可能であったことを示す。この反応にＡＴＰ（＋／−Ｍｇ＋）を添加すると、先に証明されたように、ＭｕｔＳβのＤＮＡへの結合を中断させる。ＮＡの添加は、ＭｕｔＳβとこの基質との結合または解離に何の効果もない。
【図２１】図２１は、スーパーコイルＤＮＡ、線状ＤＮＡ及び転写誘発Ｒ−ループのＦＡＮ１開裂を示す。（ＣＡＧ）７９・（ＣＡＧ）７９リピートを含有するスーパーコイルプラスミドは、ＢａｍＨｌで線状化され、３７℃で１５分間、２００ｎＭのＦＡＮ１とともにインキュベートされた（左パネル、最初の２つのレーン）。同じスーパーコイルプラスミドを直接２００ｎＭのＦＡＮ１で処置した（左パネル、第２の２つのレーン）。同じスーパーコイルプラスミドをインビトロでＴ３ＲＮＡポリメラーゼによってＣＴＧ鎖にわたって転写した（中央パネル）。転写反応生成物をその後ＲＮａｓｅＡで処理し、全ての一本鎖ＲＮＡを開裂させ、またはＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＨの両方で処理し、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを除去した。これらの反応は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ）での抽出、及びエタノール沈殿で精製し、３７℃で１５分間、２００ｎＭのＦＡＮ１とともにインキュベートした（右のパネル）。全ての反応生成物を、１％アガロースゲル上、１ｘＴＢＥ緩衝液中、８０Ｖで３時間流して解析した。続いてゲルを、臭化エチジウム（０．５ｍｇ／ｍｌ）で、紫外光（ＵＶ）下で全核酸が可視化されるように染色した。ＦＡＮ１はスーパーコイル及び線状ＤＮＡ（左パネル）をＤＮＡ含有転写誘発Ｒ−ループ同様に開裂し、スーパーコイル依存ＲＮＡ部分を放出する（右パネル）。モノマーまたは多量体形態のスーパーコイルプラスミドの位置を「ＳＣ」で示す。「ＯＣ」は開環形態を示す。「ＬＮ」は線状化プラスミドを示す。
【図２２】図２２は、ＦＡＮ１開裂が、フラップ−ＤＮＡ基質中のＣＡＧヘアピンの存在によって変化し、この作用がＣＡＧヘアピンに対するＮＡの結合によって阻害されることを示す。フラップ−ＤＮＡ基質（図２２のパネルＤ−Ｆの配列を参照）を模式的にトップパネルに示す：リピートのない５’−フラップＤＮＡ（図２２のパネルＡ）、フラップ中に（ＣＡＧ）２０リピートを伴う５’−フラップＤＮＡ（図２２のパネルＢ）、二本鎖領域中に（ＣＡＧ）２０リピートを伴う５’−フラップＤＮＡ（図２２のパネルＣ）。全てのＤＮＡ構造は、フラップ鎖の５’末端において32Ｐ放射性標識した。１ｐｍｏｌの各基質をＮＡの濃度を増加させて（７．５μＭ、１５μＭ、５０μＭ）インキュベートし、続いて２００ｎＭのＦＡＮ１で処置した。ヌクレアーゼ反応を、未変性８％ポリアクリルアミドゲル上、２００Ｖ、１時間で解析した。消化生成物の量を、デンシメトリー分析で定量した。全てのレーンは同じゲルからで、それらは明確性のために分けられた。ヒストグラムは、３つの独立した実験の平均と対応する標準偏差を示す。ＦＡＮ１消化サイトをマップするため、反応生成物を８％の変性ゲル上で、マクサム−ギルバート法シークエンシング反応とともに分離した。切断箇所を矢印の頭で示す（白から黒へ、消化効率の増加を示す）。異なる消化断片は文字（ａ、ｂ、ｃ）で示す。「ｓ」は開始基質を示す。「ｓ＋ＮＡ」は、ＣＡＧスリップアウトへのＮＡ結合によりシフトした基質を示す。切断箇所は、ＤＮＡの末端、ジャンクション・ポイントまたはリピートユニット数のいずれかに対するヌクレオチドの場所によって示す。図２２のパネルＤ−Ｆ：３つの基質について開裂箇所をマップした；図２２のパネルＤは図２２のパネルＡに対応する；図２２のパネルＥは図２２のパネルＢに対応する；図２２のパネルＦは図２２のパネルＣに対応する。
【図２３】図２３はＮＡがＲＰＡ結合と競合し、ＣＡＧテンプレートに沿ったＤＮＡポリメラーゼδの強化された進行をブロックすることを示す。図２３のパネルＡは、ＲＰＡ（２５０ｎＭ）（レーン２）の、（ＣＡＧ）２０のスリップアウトを含有し両方の鎖が32Ｐ標識されたＤＮＡ基質（トップの模式図）への結合を示す。該基質は、ＮＡ（５０μＭ）とともに１０分間室温で、ＲＰＡ添加前にインキュベートされた。ＮＡはＲＰＡと（ＣＡＧ）２０基質への結合において競合する（レーン３）。ＲＰＡに結合したＤＮＡのパーセンテージがデンシメトリー分析によって定量された。ヒストグラムは、３つの独立した実験の平均及び対応する標準偏差を示す。図２３のパネルＢは、ポリメラーゼ伸長アッセイが先に記載のとおり行われたことを示す。０．１μＭの（ＣＡＧ）１０テンプレートオリゴが、０．１μＭの32Ｐ標識されたプライマーでアニールされ、ＮＡ（５０μＭ）とともにあるいは抜きで３０分間室温でインキュベートされた。２５０ｎＭのＲＰＡ及び／または２０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼδが反応に添加され、１５分間３７℃でインキュベートされた。反応生成物を、６％のシークエンシングゲル上で、マクサム−ギルバート法シークエンシング反応とともに分離した（レーン１）。プライマーのみはレーン２である。ＤＮＡポリメラーゼδのみでは、ＣＡＧトラクトを通じて合成することはできなかった（レーン３）が、その作用は、ＲＰＡの添加により強化された（レーン４）。ＮＡは、ＣＡＧテンプレートに沿ったＤＮＡポリメラーゼδの強化された進行をブロックし（レーン５及び６）、その結果は、ＣＡＧトラクトについてＮＡの結合がＲＰＡに競合することと整合する。図２３のパネルＣは、ポリメラーゼがＮＡ−結合ＣＡＧテンプレートにわたって合成することができないことを通じたＮＡ誘発の収縮につき可能なメカニズムを模式図で示す。
【図２４】図２４は、Ｒ６／２ＨＤマウスのための、ＮＡ及び生理的食塩水の投与計画を示す。
【図２５】図２５は、４回の注入で処置された１０マウスのうちの８マウス（マウスｖｉ−ｘｉ）の線条体、皮質、小脳及び尾についてのＣＡＧリピート長解析及び不安定性指数を示す（図２５のパネルＡ−Ｈ）。その他の２マウスのＣＡＧスキャン（マウスｉｖ及びｖ）を図６Ａに示す。
【図２６】図２６は、生理的食塩水注入、ＮＡを含む生理的食塩水注入、または注入せずに、その後ＨＥ染色を行ったマウス線条体の組織学的研究を示す。
【図２７】図２７は、全てではなくてもほとんどのＮＡ処置線条体中のアレルがリピート収縮を被ったことを示し、ＮＡがほとんどの細胞に影響したことを示している。図２７のパネルＡは、確立された方法を用い、ＣＡＧリピートサイズのＧｅｎｅＳｃａｎトレースから体細胞の「不安定性指数」を定量したものを示す。この計算は、相対的高さの閾値を用いてバックグラウンドを補正し、効率的にデータを規格化し、細胞集団中の細胞あたりの主アレルからの平均ＣＡＧ長変化を表す「不安定性指数」を生成する：より大きい指数はより大きい伸長を反映し、より小さい指数はより低い伸長を反映する。ＮＡで処置されたまたは処置されていない線条体の解析は、１、２及び４投与のＮＡ注入後、不安定性指数が段階的に低減したことを明らかにした（図６Ｂ、図２５Ａ−２５Ｈ）。パネルＢは、ＮＡで４回処置された全ての１０マウスについて、不安定性指数をとりまとめたものを示す。ＮＡで４回処置された線条体中のリピートサイズ分布は、未処置（mock-treated）の線条体とは有意な差があった（マン・ホイットニー、ｐ＝０．０００３５）。相対ピークの高さの補正により、収縮及び伸長指数並びに収縮／伸長ピークの相対的構成の定量が可能となり、記載されているとおり、いずれもがＮＡ処置の後、収縮が増加することを明らかにした。線条体内注入を行った同じマウスからの大脳皮質及び小脳中のＣＡＧトラクトが右側及び左側でＣＡＧ長の不均一性について同一のパターンを示したことから、ＮＡの効果は注入箇所において局所的であった。
【図２８】図２８は、ＮＢＤ−標識ＮＡの構造を確認するためのＮＭＲデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
遺伝子的に不安定な疾患を引き起こすリピートＤＮＡ配列を特に標的とした小分子、またはこれらの配列の結果として形成される構造体は、これらの遺伝子的不安定性をコントロールする潜在力を有する可能性があり、これは、進行する体細胞リピート伸長が疾患の発症及び進行に貢献し得るからである。治療適用のために設計された配位子は、それらの標的に、変異アレルに対する高い特異性で結合しなければならず、全体に対する毒性がほとんど無いから全く無いように伸長を阻止し、または収縮を誘発しなければならない。本件開示はスリップＣＡＧ／ＣＴＧリピート構造に高い特異性で結合するよう設計された小分子（Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43; Hagihara 他, 2006, Nuc. Acids Symp. Ser. (Oxf.), 50:147-8; 及び Hagihara 他, 2011, Chembiochem., 12:1686-9）、及び伸長したリピートの不安定性を修正し、リピート収縮を導くことについて記載している。本件開示は、特にリピート伸長を低減する最初の潜在的な治療について記載している。とりわけ、本明細書において、ＮＡが伸長を阻止することができ、そのことが疾患の発症、進行または重症度を、遅らせまたは阻むとともに、伸長したリピートの収縮を誘発し、遺伝性の長さよりも短くすることすら可能であることについて報告している。
【００１１】
本件開示は、個体中のトリヌクレオチドリピートＤＮＡ配列中のトリヌクレオチドリピート数を低減する方法について記載している。本件開示はまた、個体中のトリヌクレオチドリピートＤＮＡ配列の伸長、または更なる伸長を阻害するために用いることができる方法について記載している。本明細書に記載の方法は、トリヌクレオチドリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を有する個体を治療するために用いることができる。本明細書において用いられる場合、トリヌクレオチドリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を治療することは、伸長の進行を、したがってトリヌクレオチドリピートＤＮＡ配列の伸長と結びついた症状を、阻止または止めることを指すことができる。また、本明細書で用いられる場合、トリヌクレオチドリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を治療することは、疾患の進行を反転させることを指すことができる。例えば、トリヌクレオチドリピートＤＮＡ配列中のトリヌクレオチドリピート数を閾値内にまたはそれよりも下に低減することが可能であれば、その疾患に関連した症状を止める、若しくは予防する、または場合によっては、初期（例えば、細胞及び組織の著しい変性前）の介入であれば反転させることさえ、可能である。
【００１２】
本明細書に記載の方法は、少なくとも１用量の治療量のナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を個体に投与することを含む。ＮＡは、2-アミノ-1,8-ナフチリジン部分と8-アザキノロン部分からなる（例えば、図１Ａを参照）。ＮＡの２つの分子がＤＮＡらせんにインターカレートし、2-アミノ-1,8-ナフチリジン部分がグアニンと水素結合し、8-アザキノロン部分がアデニンと水素結合することが可能であり、結果として２つのシトシンがらせんから突き出し、あるいは押し出される。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本明細書で提示する結果は、変異リピートの転写中、有糸分裂後の細胞内でのＮＡの作用が、伸長した変異性アレルに特異的であり、ＣＡＧスリップアウトの修復を調節することによる仲介であることを示している。
トリヌクレオチドリピート不安定性によって引き起こされる疾患は、当該技術分野で公知であり、現在のその数は数十にのぼる。本明細書に記載されているようにＮＡによって治療することができるトリヌクレオチドリピート不安定性疾患には、ＣＡＧ／ＣＴＧトリヌクレオチドリピートと関連する疾患が含まれる。そのような疾患としては、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型（ＨＤＬ２）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ４、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、フック角膜内皮ジストロフィー２（ＦＥＣＤ２）、統合失調症、双極性障害（ＫＣＮＮ３）、乳がんリスク因子ＡｌＢ１（ＮＣＯＡ３、ＳＲＣ−３、ＡＣＴＲ、ｐＣＩＰ、ＲＡＣ３及びＴＲＡＭ１としても知られている）が挙げられるがこれらに限られるわけではない。トリヌクレオチドリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を有する個体は、典型的には、遺伝子解析（例えば、ＰＣＲ増幅、シークエンシング、制限消化解析、制限断片長多型）を用いてリピートサイズ（例えばトリヌクレオチドリピート数）及び／または伸長領域の存在（例えば伸長）を決定することにより識別される。
【００１３】
ＮＡは、治療（または効果）量を個体に送達するため、薬学的に許容される担体とともに製剤化することができる。特定の製剤及び治療量は、投与経路、ＮＡの適用量及び適用の間隔、治療される個体の性別、年齢及び体重、苦痛の深刻さ並びに当該個体の医師の判断を含む様々な要因に依存する。
所与の組織（骨格筋、心臓、脳領域等）における体細胞伸長の発達タイミングを決定することは、体細胞伸長の発症を阻止する方法、及び／または影響を受けない長さにより近い長さへの収縮を簡単に誘発する方法でＮＡを投与する能力を強化する可能性がある。
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」には、任意の及び全ての賦形剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張性及び吸収遅延剤等、投与と適合するものを含むことを意図している。そのような媒体及び作用剤の薬学的に許容される担体としての使用は、当該技術分野においてよく知られている。いかなる従来の媒体または作用剤についても、化合物と適合しないとされていない限り、その使用が考慮される。
【００１４】
化合物を送達するための薬学的に許容される担体は、当該技術分野で公知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, University of the Sciences in Philadelphia, Ed., 21st Edition, 2005, Lippincott Williams & Wilkins; 及び The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, Eds., 12th Ed., 2001, McGraw-Hill Coを参照のこと。特定の製剤で用いられる薬学的に許容される担体のタイプは、様々な要因によることができ、例えば、化合物の物理学的及び化学的特性、投与経路、及び製造工程のようなものがある。薬学的に許容される担体は当該技術分野で入手可能であり、様々な薬局方でリストアップされているものが挙げられる。例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）、日本薬局方（ＪＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、及び英国薬局方（ＢＰ）；米国食品医薬品局（ＦＤＡ）医薬品評価研究センター（ＣＤＥＲ）出版物（例えば、Inactive Ingredient Guide (1996)); 及び Ash and Ash, Eds. (2002) Handbook of Pharmaceutical Additives, Synapse Information Resources, Inc., Endicott, NY）を参照のこと。
本明細書に記載されるＮＡを含む医薬組成物は、典型的には、意図する投与経路と適合するように製剤化される。適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、局所、経鼻、経肺、眼、経腸及び非経口投与が挙げられる。非経口投与経路としては、静脈内、筋肉内及び皮下投与、更には腹腔内、動脈内、関節内、心臓内、槽内、皮内、病巣内、眼内、胸膜内、髄腔内、子宮内及び脳室内投与が挙げられる。
【００１５】
単に例として、静脈内投与の場合、ＮＡは、例えば、ホスファート、ヒスチジンまたはシトラートを製剤のｐＨを調製するために、等張化剤として例えば塩化ナトリウムやデキストロースを含む生理学的に互換性のある緩衝液を用いた水溶液として製剤化されてもよい。経口投与のために、ＮＡは、液体または固体の剤形で製剤化することが可能であり、また、即放性または放出調節／徐放性製剤として製剤化することも可能である。個体による経口摂取のため適切な形態としては、例えば錠剤、丸剤、硬及び軟シェルカプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁剤及び乳剤が挙げられる。固体経口剤形は、充填剤、崩壊剤、結合剤（乾または湿）、溶解遅延剤、潤滑剤、流動促進剤、抗付着剤、陽イオン交換樹脂、湿潤剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤及び香味剤などの賦形剤を用いて得ることができる。そのような賦形剤の例としては、セルロース誘導体、クエン酸、二カルシウムホスファート、ゼラチン、マグネシウムカルボナート、マグネシウム／ナトリウムラウリルスルファート、マンニトール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、 シリカート、二酸化ケイ素、ナトリウムベンゾアート、ソルビトール、デンプン、ステアリン酸またはその塩、糖（例えば、デキストロース、スクロース、ラクトース）、タルク、トラガントゴム糊、植物油（水素付加したもの）及びワックスが挙げられる。
【００１６】
ＮＡは、例えば、皮膚パッチ、半固形、または液体製剤、例えば、ジェル剤、（ミクロ）乳剤、軟膏剤、溶液剤、（ナノ／ミクロ）懸濁剤、またはフォーム剤を通じて局所投与することが可能である。ＮＡの皮膚及びその下の罹患組織への浸透は、例えば、浸透増強剤；水、有機溶媒、ワックス、オイル、合成または天然ポリマー、界面活性剤、乳化剤を含む親油性、親水性及び疎水性賦形剤の適切な選択及び組合せ；ｐＨ調整により；及び／または錯化剤を用いて調節することができる。
ＮＡは、トリヌクレオチドリピートＤＮＡ不安定性によって引き起こされる疾患を有する個体に治療量を投与することができる。典型的には、ＮＡの治療量または用量とは、体細胞伸長を阻止またはトリヌクレオチドリピートＤＮＡ配列の遺伝によるサイズの低減（例えば、トリヌクレオチドリピート数の低減）のいずれか、そして終局的には、いかなる悪影響ももたらすことなく１以上の症状の低減または改善をもたらすＮＡの量を指す。いくつかの場合、治療量は、存在するリピート数と相関する。ＮＡの毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物中での標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対する治療効果量）によって、決定することが可能である。致死量の治療効果量に対する比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。
【００１７】
治療量のＮＡを１回の用量として投与すること（すなわち、単回投与）、または治療量のＮＡを１回を超える回数の用量として（すなわち、複数回）、または、例えば、ポンプまたはパッチを用いて、ゆっくり、継続的な方法で投与することも可能である。本明細書で用いる場合、治療量のＮＡは、約０．０１μＭから約１Ｍ（例えば、約０．０５μＭから約０．７５Ｍ；約０．１μＭから約０．５Ｍ；約０．５μＭから約０．１Ｍ；約１μＭから約５０ｍＭ；約５０μＭから約１ｍＭ；または約１００μＭから約０．５ｍＭ）のＮＡを指す。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組成物中のＮＡの濃度は、約１％と約５０％の間（例えば、約５％と約４０％の間；約１０％と約３０％の間；約１５％と約２５％の間；または約２０％）であることが可能である。いくつかの場合、ＮＡは、用量依存的な方法で、人の遺伝性のトリヌクレオチドリピート数に応じて、または所与の組織における体細胞伸長の速度に応じて、投与することができる。疾患、症状の重症度、及びトリヌクレオチドリピート数によっては、治療量のＮＡ（例えば、１以上の用量において）は、一週間に１度、一カ月に１度、一年に１度、または必要なだけ多くの、あるいは少ない頻度で（例えば、慢性的に頭蓋ポンプとともに）投与することができることが理解されるであろう。
【００１８】
また、組織特異的伸長がいくつかのトリヌクレオチドリピートの疾患で示されていることから、ＮＡの治療量は、同じ個体内でも、異なりうる組織においては異なることが理解されるであろう。例えば、ＨＤでは、最も伸長（例えば、最大伸長、最速伸長、またはそれらの組合せ）を示す最初の組織としては、線条体、大脳皮質、大脳基底核、中型有棘ニューロン、及びオスの生殖系列が挙げられ；筋緊張性ジストロフィー１型においては、伸長を示す最初の体細胞組織として、脳、心臓及び大脳皮質が挙げられる。ＤＭ１については、例えば、Lopez Castel 他 (2011, Hum. Mol. Genet., 20:1-15) 及びSeriola 他 (2011, Hum. Mol. Genet., 20:176-85)を参照；ハンチントン病については、例えば、De Rooij 他(1995, Hum. Genet., 95:270-4) 及びTelenius 他 (1994, Nat. Genet., 6:409-14)を参照；ＤＲＰＬＡについては、例えば、Aoki 他 (1996, Clin. Genet., 50:199-201)を参照；球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）については、例えば、Tanaka 他 (1996, J. Neurol. Sci., 135:43-50)を参照；ＳＣＡ１及びＳＣＡ３については、例えば、Cancel他 (1998, Hum. Mutat., 11:23-7)を参照；ＳＣＡ７については、例えばYoon他 (2016, Brain, 139(Pt 3):e20)を参照。また、Cleary & Pearson (2003, Cytogenet. Genome Res., 100:25-55), Abeliovich 他 (1993, Am. J. Hum. Genet., 52:1175-81)、Wohrle 他(1995, Hum. Mol. Genet., 4:1147-53)、Peterlin 他(1996, Pflugers Arch., 431(6 Suppl 2):R199-200)、Anvret 他(1993, Hum. Mol. Genet., 2:1397-400)、Thornton 他 (1994, Ann. Neurol., 35:104-7)、及びIshii 他 (1996, Hum. Genet., 98:138-40)も参照のこと。
【００１９】
本明細書に記載された方法はまた、ＮＡを受けた個体をモニタリングする工程も含むことができる。例えば、当該技術分野で日常的な方法（例えば、ＰＣＲ増幅、シークエンシング、制限消化解析、制限断片長多型）を用いて、トリヌクレオチドリピートのサイズを、個体の細胞中でモニターすることができる。モニタリング工程は、所望の頻度で行うことが可能であり、例えば、その個体またはその個体の１以上の組織からの細胞を、ＮＡの投与と同じ頻度（例えば、ＮＡの投与前または後）でモニターすることも、またはその他の望ましい頻度で（例えば、毎週、毎月、または毎年）モニタリングすることもできる。いくつかの場合、モニタリング工程の結果は、治療を必要とする組織、治療量、及び／または個体（または組織）に治療量が送達されるべき適切な頻度を決定する、または決定することを助けることができる。
ＮＡは数多くの方法で、その安定性、組織選択性、取り込みを増加させるように、またはそれらをインビボにおいて組合せるように、修飾することができることを理解されたい。いくつかの場合、ＮＡは、例えば、リポソーム、頭蓋ポンプ、筋肉内拡散、血液脳関門「鍵」、または、投与中にＮＡに安定させ、及び／または罹患細胞及び／または組織への送達中にＮＡに保護を提供する別の製剤を経由して送達することができる。
【００２０】
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、生物化学及び当該技術分野における組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。そのような技術は、文献に十分に説明されている。本発明は更に、以下の実施例によって記述されるが、特許請求の範囲に記載された本件方法及び組成物の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１：ＮＡ−ＣＡＧ／ＣＡＧ複合体の特徴づけ）
以前のＮＡ−ＣＡＧの特徴づけには、ＵＶ−溶解、エレクトロスプレー法飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、等温滴定型カロリメトリー（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、ＳＰＲイメージングアッセイ、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法が用いられていた（Hagihara 他, 2006, Nuc. Acids Symp. Ser. (Oxf.), 50:147-8; Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43; Hagihara 他, 2011, Chem. Bio. Chem., 12:1686-9）。これらの研究は、歪んだ内部鎖ヘアピンの独特なＮＡ−ＣＡＧ・ＣＡＧ構造を明らかにした。ＮＡのナフチリジン及びアザキノロン部分は、相補的な水素結合をグアニン及びアデニンに対してそれぞれ示し、２つのシトシン塩基のＣＡＧヘアピンからのフリップアウトを引き起こす（図２Ａ及び２Ｂ）。各ＮＡ分子／ＣＡＧ−ＣＡＧの親和性は、Ｋaについて１．８×１０6Ｍ-1またはＫdについて０．５６×１０-6Ｍと見積もられた(Hagihara 他, 2006, Nuc. Acids Symp. Ser. (Oxf.), 50:147-8)。ＮＡは（ＣＡＧ）10  ヘアピンの融点を、ＮＡ５０μＭにおいて、４７．１（±０．７）℃から７８．８（±０．１）℃  に増加させ、（ＣＴＧ）10ヘアピンの融点（５４．４（±０．３）℃）を超えた。ｄ（ＣＡＧ）10の大きな構造変化がＣＤ分光法によって示され、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析で確認されたところでは、リピートに対する複数のＮＡ−結合（少なくとも６ＮＡ分子）によって、ＳＰＲ−イメージングアッセイが誘発された。ＮＡ−結合は、（ＣＡＧ）１０−３０の単離された短いオリゴヌクレオチドとともに、より長いリピートについて増加した（Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43）。ＮＡ−ＣＡＧ／ＣＡＧ結合構造が、ＮＭＲ分光法によって決定され、この構造は、蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ）に登録され、アクセッション番号１Ｘ２６が割り当てられた。これらの特徴は、ＮＡのＣＡＧヘアピンに対する際立った選択性を説明する；配列−特異性及びヘアピン−特異性の両方がＣＡＧ／ＣＴＧ伸長アレルを標的としそうである。
【００２２】
（実施例２：ＮＡ合成及び標識）
溶媒及び出発物質は、標準的な供給者から購入し、更なる精製を行うことなく用いた。分析的薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、０．２ｍｍシリカ６０でコートされたＦ２５４指示薬を伴うプレート上で行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーをＷａｋｏゲルＣ−２００シリカゲル上で行った。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、ギルソン社のダイナミックミキサー（モデル８１１Ｃ）によって、ＵＶ検出器を２５４ｎｍにセットし、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩカラム（１５０×２０ｍｍ）を用いて、０．１％ＨＯＡｃ／Ｈ2Ｏ（溶媒Ａ）及びＭｅＣＮ（溶媒Ｂ）の二重溶媒系で実施した。別途記載されていない限り、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、２１±３℃で、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ７００スペクトロメーター上で記録した。化学シフト（δ）が百万分率（ｐｐｍ）で報告された。結合定数（Ｊ）はヘルツで報告された。1Ｈ  ＮＭＲ化学シフトは、ＣＤ3ＯＤ−ｄ４中の残存溶媒ピーク３．３１ｐｐｍに対して参照した。13Ｃ  ＮＭＲ化学シフトは、ＣＤ3ＯＤ−ｄ４について中央溶媒ピーク４９．００ｐｐｍに対して参照した。ＥＳＩ質量スペクトルを、サーモ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計において記録した。
【００２３】
4-アミノ-N-(3-((3-((7-メチル-1,8-ナフチリジン-2-イル)アミノ)-3-オキソプロピル)(3-オキソ-3-(((7-オキソ-7,8-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-2-イル)メチル)アミノ)プロピル)アミノ)プロピル)ブタンアミド (ＮＡ−リンカー)
ＮＡ（４０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）及びtert-ブチル (4-オキソ-4-((3-オキソプロピル)アミノ)ブチル)カルバマート（３４ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）をメタノール中（２ｍＬ）で撹拌した。酢酸を添加し、混合物のｐＨを約６に調節した。続いて、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（３１ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を蒸発させて乾燥し、残渣を、カラムクロマトグラフィーでシリカゲル上クロロホルム：メタノール＝５０：１で溶出することによって精製し、薄い黄色の固体としてＢｏｃ−ＮＡ−リンカー（１５ｍｇ，２５％）を得た。Ｂｏｃ−ＮＡ−リンカー（１５ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１ｍＬ）に、４Ｍ  ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を含有する酢酸エチルを添加し、反応混合物を室温で、０．５時間撹拌した。溶媒を蒸発させて乾燥した。残渣を更にＨＰＬＣで精製し、ＮＡ−リンカー（１１ｍｇ，８６％）が白色固体として得られた。
1H NMR (CD3OD, 700 MHz): δ = 8.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 2H), 7.76-7.60 (m, 2H), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.42 (s, 2H), 3.26 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.01 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.69 (s, 3H), 2.63 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.93 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.76 (t, J = 7.1 Hz, 2H). 13C NMR (CD3OD, 175 MHz): δ = 175.4, 174.1, 173.2, 172.9, 164.4, 162.8, 159.8, 153.7, 153.6, 148.3, 139.5, 138.8, 137.3, 136.6, 121.5, 120.9, 118.3, 115.8, 114.1, 113.1, 51.3, 50.4, 49.4, 44.3, 39.0, 37.2, 34.5, 33.7, 32.4, 26.3, 23.6, 23.0. HRMS (ESI) m/z: [C31H39N9O4+Na]+について計算, 624.3024; 624.3010が得られた。
【００２４】
N-(4-((3-((3-((7-メチル-1,8-ナフチリジン-2-イル)アミノ)-3-オキソプロピル)(3-オキソ-3-(((7-オキソ-7,8-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-2-イル)メチル)アミノ)プロピル)アミノ)プロピル)アミノ)-4-オキソブチル)-6-((7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イル)アミノ)ヘキサンアミド (NA-NBD)
ＮＡ−リンカー（１５ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）及びＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ（スクシンイミジル6-(N-(7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1, 3-ジアゾール-4-イル)アミノ)ヘキサノアート）（１２ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中で撹拌した。続いて、トリエチルアミン（５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。混合物を室温で６時間撹拌した。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーによってシリカゲル上でクロロホルム：メタノール＝２０：１とともに溶出させ、粗生成物を得た。粗生成物を更にＨＰＬＣで精製し、ＮＡ−ＮＢＤ（１３ｍｇ，５９％）が白色固体として得られた。
1H NMR (CD3OD, 700 MHz): δ = 8.41 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.18 (bs, 1H), 8.04 (q, J = 8.3 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.43 (s, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.26 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.14 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.09-2.97 (4H), 2.77 (s, 4H), 2.66 (s, 3H), 2.64 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.18 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.83 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.76-1.70 (4H), 1.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.47-1.37 (2H). 13C NMR (CD3OD, 175 MHz): δ = 174.6, 174.2, 174.1, 173.5, 172.3, 164.4, 162.8, 159.8, 153.7, 153.6, 148.3, 145.1, 144.4, 144.0, 139.5, 138.7, 137.2, 136.6, 121.4, 121.0, 118.3, 115.8, 114.2, 113.1, 98.1, 51.2, 50.0, 49.3, 44.3, 43.1, 38.5, 38.3, 36.9, 35.4, 33.5, 33.0, 32.6, 27.5, 26.1, 25.8, 25.4, 25.1, 23.6. HRMS (ESI) m/z: [C43H51N13O8+Na]+について計算 900.3883;  900.3875が得られた。
これらの反応は図１Ｂに示され、ＮＢＤ−標識されたＮＡの構造はＮＭＲによって確認された（図２８）。
【００２５】
（実施例３：細胞培養）
ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞モデルの構築については先に記載（Sathasivam他, 1997, Hum. Genet., 99:692-5）の通りである。簡潔に説明すると、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ）ヒト線維肉腫細胞に、８００−８５０（ＣＴＧ）・（ＣＡＧ）リピートを含有するプラスミド（ＬＣ１５−Ｒ）（Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43）及びＰｈｉＣ３１インテグラーゼをコードするプラスミドを同時形質移入した。形質移入はNucleofector （ロンザ社、 バーゼル、スイス)によって行い、安定に形質移入されたクローンを、ピューロマイシンによって選択した。ＨＴ１０８０−非転写（ＣＡＧ）850細胞モデルが、ＬＣ１５−Ｒの代わりに、リピートの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを添加することによってｐＬＣ１６から改変されたプラスミドを形質移入することによって確立された。ＨＴ１０８０−非転写（ＣＡＧ）８５０細胞モデルは、（リピートの上流に位置するオリジナルのポリアデニル化シグナルに加えて）リピートの下流の追加的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを挿入することによってｐＬＣ１６から改変されたプラスミドを形質移入することによって確立され、これによってＣＡＧ／ＣＴＧリピートは、転写終結要素によってＬｏｘＰが導入された（floxed）。ＡｔｔＢ−ＰｈｉＣ３１システムはシングルコピーインテグレーションのために幅広く使われてきた。予想通り、このＡｔｔＢ−ＰｈｉＣ３１−媒介インテグレーションは、導入遺伝子の確認されたシングルインテグレ―ションを結果としてもたらし、それは誘導をかけた時にのみ、転写された（図１６Ａ）。ＨＴ１０８０モデル細胞及びＨＤ初代線維芽細胞株、GM09197 (Coriell Biorepository)で１８０ＣＡＧリピートの大きく伸長したアレルと２３リピートの非伸長アレルを伴うもの（Sathasivam 他, 1997, Hum. Genet., 99:6692-5）、ＨＤ初代繊維芽細胞株、GM02191 (Coreill Biorepository) で４３ＣＡＧリピートの伸長したアレルと１９リピートの非伸長アレルを伴うものを、３７℃、二酸化炭素５％で、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補ったダルベッコ改変イーグル培地で、培養した。細胞は、５０μＭのＮＡへの連続的な曝露を伴って、またはＮＡへの曝露抜きで、３０日間（ＨＴ１０８０細胞）または４０日間（線維芽細胞）処置した。非増殖細胞での実験については、ＨＴ１０８０細胞はコンフルエントまで成長させ、その後同じ期間処置した。ＷＳＴ−１アッセイを、製造者の指示（ロッシュ社、バーゼル、スイス）に従って行った。全ての細胞株は、マイコプラズマ抜きで試験された。各実験について、３つの生物学的複製が行われた。
【００２６】
以前行われたように、接触阻害と血清飢餓の下で成長させることによって増殖を阻害した。増殖阻止の程度は、２４時間ＢｒｄＵとともにインキュベートした後の、増殖している、または接触阻害された（及び血清飢餓に置かれた）ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞中のＢｒｄＵ陽性細胞を数えることによって、生細胞中で評価した。ＢｒｄＵ陽性細胞のパーセンテージは、増殖細胞中で９２．６％、接触阻害細胞中で８．１７％であった。少ない割合のＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞が接触阻害及び血清飢餓下においてさえ増殖していたが、その割合は非常に小さかった。３０日（研究が行われた期間）後に１つの細胞に由来する細胞が何個あるかについての計算に基づくと(増殖, 1.926^30 = 348653546.6; 接触阻害, 1.0817^30 = 10.55)、接触阻害細胞における増殖の効果は無視できるものであった。
【００２７】
（実施例４：顕微鏡観察）
ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞を５０μｍのＮＢＤ−標識ＮＡとともに４８時間、Cell Light Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0（ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、ＣＡ）で染色し、その後室温で１５分間、４％のパラホルムアルデヒドとともに固定し、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間、２回、洗浄した。細胞を、ＤＡＰＩを含有するVectashield hard-set mounting media（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、ＣＡ）とともに封入した。オリンパス共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０００Ｄ（オリンパス、東京、日本）を用いて蛍光画像を得た。
【００２８】
（実施例５：リピート長解析）
ＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０クローン及びＨＤ初代線維芽細胞から、Gentra Puregene Cell Kit （キアゲン社、バレンシア、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。伸長した（ＣＴＧ）・（ＣＡＧ）リピートをｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲ（ｓｐ−ＰＣＲ）で大きさに従って仕分け、続いて既述のとおりサザンブロットを行った（Sathasivam 他, 1997, Hum. Genet., 99:692-5）。ＨＴ１０８０モデルについては、ｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲ（ｓｐＰＣＲ）を１．４−１．７ゲノム相当のインプットとともに行った。モデルにおけるリピートサイズの違いは、最大でも、３０００塩基対であり、したがって、非常に保守的に考えれば、本明細書に記載の最適化されたＰＣＲ条件下であってさえ、より短いアレルを増幅する方にバイアスがかかる可能性はある。ＨＤ初代線維芽細胞については、ｓｐ−ＰＣＲ及びサザンブロットを、記述のとおりわずかに修正しつつ行った（Tome 他, 2013, PLoS Genet., 9:e1003280）。簡潔に述べると、表１に列挙したＰＣＲプライマーを用い、ブロットはＤＩＧ−標識（ＣＡＧ）７ロックした核酸プローブでハイブリダイゼーションした（Nakamori 他, 2009, Neuromuscul. Disord., 19:759-62）。少なくとも５０アレル（研究全体で１５０を超えるアレル）を各３つの実験について解析した。各実験のそれぞれの重複について完全なｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲデータセットから編集したリピート解析の概要を表２に示す。図４Ｄ、４Ｅ、１０、１１、５Ｂ、５Ｄ、５Ｅ、１４及び１５Ｂ中のヒストグラムについて、Ｙ軸の「リピート集団の％」は、一定のサイズの一定の長さを伴うリピート生成物を含有するＣＡＧリピートトラクトにわたる、５０超の個々のｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲ反応の集団を決定することによって計算された。細胞クローンは３０日間または４０日間、ＮＡとともに、あるいは抜きで成長させた（例えば、Sathasivam 他, 1997, Hum. Genet., 99:692-5を参照）。とりわけ、リピート長分布のヒストグラムは、少なくとも２つの異なる細胞クローンからのものであった。長さ分布は次のように決定された：ｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲに続いてサザンブロットによってＣＡＧ／ＣＴＧリピート長を解析した。線維芽細胞クローンからのＤＮＡを、平均で、ＰＣＲチューブあたり１つの増幅可能な伸長リピートアレルを生産するため希釈した。リピートトラクトはＰＣＲの２４サイクルによって増幅された。増幅生成物は、電気泳動的に解析され、ＣＡＧリピートオリゴヌクレオチドをプローブしたサザンブロットによって検出され、リピート長はＤＮＡサイズマーカーに相対的に決定された。左のスケールは分子量マーカー（Ｍ）を同等のサイズのＣＡＧ−リピート断片のリピート数に変換したものを示す。比較を円滑化するため、点線は変化しなかったＣＡＧサイズを示す。不安定アレルの分布を灰色のバーで示す（左の垂直軸）。安定アレルの頻度を黒いバーで示す（右の垂直軸）。アレル長はＸ軸に沿って５０リピートのスパンでビンにグループ化される。統計的解析のためカイ二乗検定を行い、既述のとおり各セットの実験において伸長した、変化しなかった及び収縮したアレルの頻度を比較した（Nakamori 他, 2011, Mol. Ther., 19:2222-7）。ＨＴＴ、ＣＡＳＫ、ＡＴＸＮ８、Ｍｆｄ１５、ＴＤＰ並びにマウスのＭａｐｋａｐ１���Ｆｄｇ４及びｔｄｐ遺伝子座のトリヌクレオチド（３塩基）及び２塩基トラクト長を、（表１に列挙の）プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、増幅条件は他に記載のとおりであった（例えば、Kremer 他, 1995, Am. J. Hum. Genet., 57:343-50; Brook 他, 1992, Cell, 69:385; Koob 他, 1999, 21:379-84; Dietmaier 他, 1997, Cancer Res., 57:4749-56; Kabbarah 他, 2003, Mol. Carcinogen., 38:155-9を参照）。リピート長の変動性を非伸長ＣＡＧアレル及びＴＢＰアレルについてＰＣＲ（高分解能ゲル電気泳動）及びAgilent BioAnalyzerによってそれぞれ研究した。ＰＣＲ生成物は、EnhanceITポリマー（Elchrom Scientific社、スイス）を添加した６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、GelRed (Biotium社、ヘイワード、カルフォルニア)で染色し、Typhoon蛍光イメージセンサー(GE ライフサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー)でスキャンした。各実験のそれぞれの重複についての完全なｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲデータセットから編集したリピート解析の概要を表２に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
（実施例６：ｍＲＮＡ定量）
ＮＡを添加してまたは添加せずに７２時間経った後のＨＴ１０８０−（ＣＡＧ）８５０細胞から、RNeasy Plus Microキット（キアゲン社）を用いて、ＲＮＡを採取した。全ＲＮＡにランダムヘキサマーを仕込み、Superscript III （ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、ＣＡ）で逆転写し、続いて、ＲＮａｓｅＨで処理した。TaqMan Gene ExpressionアッセイまたはPrimeTime qPCRアッセイを用いてABI PRISM 7900HT Sequence Detection System （ライフテクノロジーズ社）上で定量逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを行った。プライマー配列を表１に示す。導入遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルを１８Ｓ  ｒＲＮＡで規格化した。結果は、対応のあるｔ−検定を用いて統計的に解析した。導入遺伝子ｍＲＮＡのプライマー配列は、ＣＡＧリピート方向に以下のとおりであった：５′−ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＡＧＧ  −３′（配列番号：２１）及び５′−ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  Ｔ−３′（配列番号：２２）。プローブ配列は、５′−ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＴＧＣ−３′（配列番号：２３）であった。
【００３１】
（実施例７：ＮＡ−ＤＮＡ結合）
バンドシフトアッセイの構造を、既述の方法（Pearson 他, 1997, Hum. Mol. Genet., 6:1117-23; Pearson 他, 2002, Nuc. Acids Res., 30:4534-47; Axford 他, 2013, PLos Genet., 9:e1003866）をわずかに改変した方法により作成した。ヒトＤＭ１ゲノム（ＣＴＧ）ｎ・（ＣＡＧ）ｎリピート（ｎ＝３０または５０）を含有するプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で線状化した。５０リピートのホモ二本鎖スリップ構造（Ｓ−ＤＮＡ）を、Pearson他に記載のとおりアルカリ変性／再生によって形成した（1996, Biochem., 35:5041-53; 1998, Nuc. Acids Res., 26(3):816-23）、長い（ＣＡＧ）２０または（ＣＴＧ）スリップアウトを伴うヘテロ二本鎖ＳＩ−ＤＮＡを、既述のとおり調製した（Pearsons 他, 2002, Nuc. Acids Res., 30:4534-47; Axford 他, 2013, PLos Genet., 9:e1003866）。簡潔に述べると、（ＣＡＧ）５０及び（ＣＴＧ）３０リピートのＤＮＡまたは（ＣＡＧ）３０及び（ＣＴＧ）５０リピートのＤＮＡを等モル量で混合し、その後アルカリ変性／再生によってヘテロ二本鎖化した。断片を含有するリピートは、ＥｃｏＲＩ消化によって放出され、電気泳動的に４％ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ゲル精製した。精製した断片は、両鎖とも充填反応によって、［α−32Ｐ］ｄＮＴＰｓで放射性標識した。各構造の放射能を、チェレンコフ計数を用いて決定し、同等の放射濃度の各構造を、ＮＡ濃度を増加させて３０分間室温で、１Ｘの低張緩衝液とともにインキュベートした。結合生成物を電気泳動的に１ＸＴＢＥ緩衝液中の４％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上で、２００Ｖの低電圧を２．５時間印加して分析した。各ＮＡ分子／ＣＡＧ−ＣＡＧの親和性は、Ｋａについて１．８×１０6Ｍ-1またはＫｄについて０．５６×１０-6Ｍと推計した(Nakatani他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43)。
【００３２】
（実施例８：複製アッセイ）
インビトロ複製のため、テンプレートを、既述のとおり設計した（Panigrahi 他, 2002, J. Biol. Chem., 277:13926-34; Cleary 他, 2002, Nat. Genet., 31(1):37-46）。簡潔に述べると、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ＣＴＧ）７９・（ＣＡＧ）７９断片含有ゲノムクローンを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩにサブクローニングした。ＳＶ４０−ｏｒｉを、平滑末端化した（blunted）Ｘｂａｌ断片として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩのＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩのいずれかのサイトに、ＣＡＧリピートの二方向複製１０３及び９８ｂｐ  ５’及び３’のＳＶ４０オリジンをそれぞれ配置してクローニングした。これらのリピート（ｐＤＭ７９ＥＦ及びｐＤＭ７９ＨＦ）及びＳＶ４０−ｏｒｉを伴う別の基質を含むテンプレート及びリピートなし（ｐＫＮ１６）をインビトロで、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ及びＴ−Ａｎｔｉｇｅｎを添加したＨｅＬａ細胞抽出物によって、詳細Panigrahi他（2002, J. Biol. Chem., 277:13926-34）及びCleary et al.（2002, Nat. Genet., 31(1):37-46）に記載されているように複製した。複製反応はＮＡ抜き、またはＮＡ（７．５μＭ及び１５μＭ）とともに行われた。放射性複製生成物を精製し、ＢａｍＨＩで線状化し、ＤｐｎＩで処置した（詳細については図９を参照）。等量の複製されていないｐＫＮ１６プラスミドＤＮＡを取り出し、ＤｐｎＩで処置し、複製されていないプラスミドＤＮＡの完全な消化を示した。等量の反応生成物を電気泳動的に１５−ｃｍ  １％アガロースゲル上で分析した。ゲルを、ＴＢＥ緩衝液中、１６時間、４Ｖ／ｃｍで流し、乾燥し、コダックフィルムに曝露した。
【００３３】
（実施例９：修復アッセイ）
スリップＤＮＡ構造に対するＮＡの結合がどのように修復に影響するのかを決定するため、一連の環状スリップヘテロ二本鎖基質を、ニックがスリップアウトの５’または３’のいずれかに位置するリピートの過剰とともに作った（図３）。詳細は既述（Panigrahi 他, 2005, Nat. Struct. & Mol. Biol., 12:654-62; Panigrahi 他, 2010, PNAS USA, 107:12593-8）のとおり、一本鎖環状プラスミドをその相補的な異なるリピート長の線状鎖とハイブリダイゼーションすることによって基質を調製し、線状化されたサイトにニックが位置付けられる結果を得た。基質は、過剰リピート数のみにおいて異なる一本鎖スリップアウト、またはニックの位置以外は同じものであった。全ての基質において、スリップアウトは特有のポイントで、ｎが３０、４７、４８、または５０リピートでありうる（ＣＴＧ）ｎ・（ＣＡＧ）ｎの完全な塩基対のバックボーンから押し出された。Ｇ−Ｔがミスマッチな基質を既述（Panigrahi 他, 2005, Nat. Struct. & Mol. Biol., 12:654-62; Panigrahi 他, 2010, PNAS USA, 107:12593-8）のとおり調製した。全てのこれらの基質を、インビトロでＨｅＬａ抽出物によって処置し、その後修復を評価した。修復生成物をサザンブロットで解析し、リピート含有断片について調べ、出発物質と比較し、それによって修復効率の定量的評価がモルレベルで可能となった。各修復アッセイは３回から５回の独立実験において行った。
【００３４】
（実施例１０：Ｒ−ループ形成及びプロセッシング）
収束Ｔ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを伴う伸長（ＣＡＧ）７９・（ＣＴＧ）７９リピートトラクトを帯びたプラスミドについては詳細に既述されている（Panigrahi 他, 2002, J. Biol. Chem., 277:13926-34）。転写反応を既述（Reddy 他, 2014, Nuc. Acids Res., 42:10473-87）のとおり行った。簡潔に述べると、５００ｎｇのテンプレートＤＮＡを１ｘ転写緩衝液（ロッシュ社）及び１ｘウシ血清アルブミン（ＮＥＢ）中で１時間、２０Ｕの適切なＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３またはＴ７＋Ｔ３（ロッシュ社））とＮＡ１２０μＭとともにまたは抜きで混合した。サンプルを精製し、１ｇのＲＮａｓｅＡ（ロッシュ社）のみまたは１ｇのＲＮａｓｅＡ（ロッシュ社）及び１ＵのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（ロッシュ社）のいずれかで、３０分間、室温で、ＮＡ（１２０μＭ）の存在または非存在下で処置した。全てのインビトロ転写反応生成物を、１％アガロースゲル上、１ｘＴＢＥ緩衝液中で流し、８０Ｖを３時間印加して解析した。ゲルは続いて臭化エチジウム（０．５ｍｇ／ｍｌ）で染色し、全ての核酸を紫外光（ＵＶ）で可視化した。
【００３５】
インビトロ転写から調製したＲ−ループテンプレート及びＲＮａｓｅＡ処理したものを、ＮＡとともにインキュベートし、ＨｅＬａまたはＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞の抽出物によって処置した。後者は既述のとおりレチノイン酸で最終分化されていた（Panigrahi 他, 2005, Nat. Struct. & Mol. Biol., 12:654-62）。これらの細胞抽出物は、ＣＡＧ／ＣＴＧリピートによって形成された、機能的、プロセッシングスリップ鎖ＤＮＡであり、複製媒介ＣＡＧ／ＣＴＧ伸長及び収縮を誘発することができる。核酸物質が続いて抽出された。サンプルは、QIAquick enzyme clean-up kitを製造者の指示に従って用いて、個別生成物の解析によるトリヌクレオチドリピートの安定性（ＳＴＲＩＰ）解析のためバクテリアに形質導入する前に更に精製した。ＳＴＲＩＰアッセイについては詳細に記述されている（Panigrahi 他, 2002, J. Biol. Chem., 277:13926-34; Cleary 他, 2002, Nat. Genetics, 31:37-46）。簡潔に述べると、ヒト細胞抽出物プロセッシングの生成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＭｕｔＳ（アジレント社）に形質導入した。それぞれが１つのプロセッシングされたテンプレートを表す個々のバクテリアコロニーを採取し、制限された成長期間（最大６時間、４−６世代）培養した。ミニプレップＤＮＡを、リピート長の変化について、リピート含有断片を４％ポリアクリルアミドゲル上で解析することによって解析した。リピート長の変化の規模を、４％ポリアクリルアミドゲル上でのリピート含有断片の電気泳動的サイズ測定によって、開始長物質及び既知のサイズマーカーのセットに対して相対的に決定した。
【００３６】
出発物質に存在する長さ不均質性（バクテリア中での調製の間の不安定性）及び完全に対になったＤＮＡリピートをＨｅＬａ抽出物に対して曝露することにより招きうる任意の不安定性の基礎レベルを評価するための、細胞抽出物プロセッシングコントロールとして、非転写ＤＮＡテンプレート（Ｔ３またはＴ７プロモーターからの転写なし）をヒト細胞抽出物で処置して、ＳＴＲＩＰに供したものを使用した。これまで発表されてきたように、長さ不均一性のいくつかのレベルは、ＤＮＡテンプレートには予期されるものであり、これは、その不安定な７９リピートユニットの開始長のためであり、内因性ＤＮＡ損傷（潜在的に、一本鎖の切断、酸化的損傷、ヌクレオチドのミスマッチ等が含まれる）のプロセッシングから結果として得られ、ヒト細胞抽出物、開始プラスミドに存在するリピート長不均一性はもちろん、ＳＴＲＩＰ手順の間のバクテリア培養にもよるものである。この開始テンプレートにおけるトラクト長不均一性は、如何なる潜在的Ｒ−ループプロセッシング不安定性もそれを超えなければならないという、トラクト長不安定性のバックグラウンドレベルとしての役割を果たす。バックグラウンドよりも有意に大きい数値のみが報告される。ヒト細胞抽出物によるＲ−ループのプロセッシング生成物の不安定性解析。（Ａ）プロセッシング後の全不安定生成物のパーセンテージ。生成物を、電気泳動的移動に基づき、安定（７９リピートを有する）または不安定（７９リピートよりも少ない、あるいは多いリピートを有する）のいずれかで特徴づけ、プロットした。データは３つの独立したインビトロ転写及びヒト細胞抽出物によるプロセッシング反応に由来し、各Ｒ−ループ形状について解析された１５０の細胞抽出物処置の個別の生成物を表す〜１５０コロニー（１複製あたり〜５０コロニー）を伴う。個々の実験を、その３回の間で互いに比較し、カイ二乗検定を用いて、各実験の間に有意な差がないことを確認し、その後各実験条件ごとのデータを蓄積した。既述のとおり（Reddy 他, 2014, Nuc. Acids Res., 42:10473-87）、Ｒ−ループのプロセッシング生成物を、ＤＮＡコントロールのプロセッシング生成物とカイ二乗検定を用いて比較した。プロセッシングによる収縮及び伸長のパーセンテージ。不安定な生成物を更に、収縮（７９リピート未満）及び伸長（７９リピート超）に分離し、プロットした。収縮及び伸長の分布は、Ｒ−ループ生成物とＤＮＡコントロール生成物の間でカイ二乗検定を用いて比較した。Ｒ−ループプロセッシングの不安定生成物の分布。各プロセッシングの不安定生成物について、既知のサイズマーカーに対する相対的な電気泳動移動位置から、既述のとおりサイズを推計し（Panigrahi 他, 2002, J. Biol. Chem., 277:13926-34）、プロットした。
【００３７】
（実施例１１：ＭｕｔＳβ結合アッセイ）
ＭｕｔＳβはバキュロウィルス感染Ｓｆ９細胞でｈｉｓ−タグされたｈＭＳＨ２及びｈＭＳＨ３を発現しているものから、既述のとおり精製した（Panigrahi 他, 2010, PNAS USA, 107:12593-8）。結合反応を室温で行った。上述のとおり、長い（ＣＡＧ）２０を伴うヘテロ二本鎖ＳＩ−ＤＮＡを調製し、末端標識した。タンパク質をＤＮＡとともに３０分間、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．５、１１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液中で、記載のとおり緩衝液中でＡＴＰとともに、あるいはＡＴＰ抜きでインキュベートした。反応を非変性充填染料（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、４％  グリセロール、ブロモフェノールブルー）とともに４％未変性ポリアクリルアミドゲル上にロードした。ゲルを１ｘＴＢＥ緩衝液で２時間流した。
【００３８】
（実施例１２：ＦＡＮ１ヌクレアーゼアッセイ）
ＦＡＮ１ヌクレアーゼをバキュロウィルス感染Ｓｆ９細胞からＰＡＬＢ２について記載された既述（Buisson 他, 2010, Nat. Struct. Mol. Biol., 17(10):1247-54）のとおり二重−アフィニティ精製戦略を用いて精製した。簡潔に述べると、ＦＡＮ１を、Ｎ−末端でＧＳＴ−タグによりタグ付けし、Ｃ−末端でＦＬＡＧ／Ｈｉｓ１０−タグ付けした。ＧＳＴ−プルダウンに続いて、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ＰｒｏｔｅａｓｅとともにインキュベートすることによってＧＳＴタグを分離し、Ｔａｌｏｎビーズ（ＧＥヘルスケア社）上でアフィニティ精製した。
１ｐｍｏｌの３２Ｐ標識、ゲル精製、ＤＮＡ構造で５’−フラップ及び、リピート無しか、フラップ中または二本鎖領域に（ＣＡＧ）２０スリップアウトを含有するもの（配列について図２２Ｄ−２２Ｆを参照）を室温で１０分間ＮＡ濃度を増加させて処置し、または処置しないで、２００ｎＭのＦＡＮ１とともに３０分間３７℃でインキュベートした。反応は、既述（Liu 他, 2010, Science, 329:693-6）のとおり、１Ｘヌクレアーゼ緩衝液中で１０μｌの反応容量で行われた。ヌクレアーゼ反応は、２０ｍＭのＥＤＴＡを添加することで停止させ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ）で抽出し、続いてエタノール沈殿させることによって精製した。反応生成物を、８％ポリアクリルアミドゲルで２０Ｖ、１時間、流した。ＦＡＮ消化サイトを特定するため、マクサム・ギルバート法シークエンシング（Ｇ＞Ａ及びＴ反応）の32Ｐ標識オリゴが行われた。消化断片は、８％シークエンシングゲルで、２５００Ｖ及び８２Ｗ、７５分間で分離された。
【００３９】
（実施例１３：ポリメラーゼ伸長アッセイ）
ヒトＤＮＡポリメラーゼβ（Ｐｏｌβ）を大腸菌クローンから単離し、イオン交換及びアフィニティクロマトグラフィによって精製した（Chimerx, catalog#1077, Lot#2203007）。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイを用いて決定した。
組換えヒトポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）を、組換えバキュロウィルスベクターを用いて昆虫細胞中で調製し、免疫アフィニティカラムクロマトグラフィーによって、既述（Zhou 他, 2012, PLoS ONE, 7(6):e39156）のとおり精製した。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイを用いて決定した。
組換えＲＰＡ複合体の精製が、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現され、Binz他（2006, Methods Enzymol., 409:11-38）に記載のとおり精製された。
【００４０】
Ｐｏｌδ伸長アッセイを既述（Mason 他, 2010, Biochem., 49:5919-28）のとおり、オリゴ含有（ＣＡＧ）１０リピートを用いて行った。オリゴの配列及びプライマー条件は既述（Hagihara 他, 2011, Chem. Bio. Chem., 12:1686-9）のとおりである。簡潔に述べると、０．１μＭのプライマー及び０．１μＭのオリゴを９５℃で３分間変性させ、室温で３０分間アニールし、ＮＡと３０分間室温でインキュベートした。ＲＰＡ及び／またはＰｏｌδを添加し、０．１  ｍＭのｄＮＴＰｓを１０μｌの反応容量に添加することで反応を開始し、３７℃で１５分間インキュベートした。２０ｍＭのＥＤＴＡを添加することで反応を停止し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ）で抽出し、続いてエタノール沈殿させることによって精製した。ペレットをホルムアルデヒド緩衝液に再懸濁させ、９５℃で１０分間変性させ、６％シークエンシングゲル上で、２０００Ｖ及び９０Ｗで４０分間流した。
【００４１】
（実施例１４−ｒ６／２マウスへの定位的注入）
マウスの取扱い及び実験手順は、動物愛護のための大阪大学ガイドラインに従って行われた。１回の薬剤適用は、異なる６か所への定位的注入、左または右線条体の３つの異なる線条体領域それぞれへの薬剤または生理的食塩水の３注入を含んでいた（図２４の概略記載のとおり）。無菌状況下で、６週齢のＲ６／２マウスに５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、５μｌの生理的食塩水（右側）または５００μＭのＮＡを生理的食塩水に溶解したもの（左側）を線条体の３つの異なるサイトに定位注入した。マウスは４週間続けて、２週間おき、または毎週、１度また２度の注入を受けた。定位的注入は、線条体内の３つのサイトに次の条件で送達された：(前後 (AP) = 0.0 mm、内側−外側(ML) = ブレグマから1.5 mm、背腹(DV) = 硬膜表面下2.5 mm; AP = 1.0 mm, ML = 1.5 mm, DV = 2.5 mm; 及び AP = 0.5 mm, ML = 1.5 mm, DV = 2.5mm)、１０−μｌハミルトンマイクロシリンジを０．５μＬ／ｍｉｎの速度で用いる。投与計画の概要については図２４を参照。各マウスは、脳の両側が生理的食塩水を右線条体に、ＮＡを左線条体に、定位的注入されていたので、内部コントロールを有していた。従って、我々のＮＡ処置のコントロールは、各マウスの線条体の反対側である。左右の線条体の両方についてＨＤのＣＡＧ導入遺伝子及び内因性の長いＣＡＧトラクトにおいてリピート長を評価した。４回処置されたマウスについては、ＮＡ投与前後に尾から、左右の前頭皮質及び左右の小脳と同様にＤＮＡを採取した。
【００４２】
（実施例１５：遺伝子スキャン解析）
最初の注入から４週間で、マウスの脳組織から既述（Nakamori 他, 2009, Neuromuscul. Disord., 19:759-62）のとおりＤＮＡを単離した。既述（Tome 他, 2013, PLoS Genet., 9:e1003280）のとおりＰＣＲを行い、ＰＣＲ生成物のサイズをABI310ジェネティックアナライザーでGENESCAN 3.1 ソフトウェア(ライフテクノロジー社)を用いて測定した。
【００４３】
（実施例１６−不安定性指数計算）
不安定指数計算の手順を既述（Lee 他, 2010, BMC Syst. Biol., 4:29）に従って、また図２７Ａに図示及び概略示されるとおりに行った。
【００４４】
（実施例１７：ＳＭＲＴ−ＣＣＳシークエンシングによるＨＰＲＴ１シークエンス解析
ＤＮＡは３つの独立したＨＤ初代線維芽細胞株ＧＭ０９１９７のＮＡ処置したもの及び３つの独立した非処置コントロール細胞から抽出した．ＨＰＲＴ１エキソン２及び３は、高性能Platinum Taq DNAポリメラーゼ（インビトロゲン社、Ｃａｔ＃１１３０４）及び表１に示されるプライマーを用いて増幅した。増幅生成物は、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシングを用いて、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩ装置上で解析した（図１３Ａを参照）。
【００４５】
具体的には、ＨＰＲＴ１のエキソン２と３に及ぶ〜２．８ｋｂＰＣＲ生成物が、男性ＨＤ患者由来細胞の３つの複製について、ＮＡ処置及び生理的食塩水処置コロニーの両方において、パシフィック・バイオサイエンス社（ＰａｃＢｉｏ）ＲＳＩＩ上でＰ６−Ｃ４ｖ２ケミストリー、３６０分動画、及び複製／処置組合せごと１つのＳＭＲＴ細胞とともにシークエンスされた。もとの細胞コロニーからの個々の分子は、対応するＳＭＲＴ細胞からの単一の長いリードで表された。ＰａｃＢｉｏのＳＭＲＴｂｅｌｌ構築物は、一分子を１回以上１つの長いリード中で、ＳＭＲＴｂｅｌｌインサートの周囲でシークエンシングポリメラーゼが「通過（passes）」する回数に基づいて配列することを可能にした。平均９９，０２３の個別のリードがＳＭＲＴ細胞あたりシークエンスされた。結果として得られた長いリードは、インサート配列を通じて平均〜７通過を含有した。ＳＭＲＴ細胞ごとの平均メジアンインサート長は、２，８７３ｂｐであった。ＰａｃＢｉｏの「インサートのリード（reads of insert）」パイプライン（ＳＭＲＴ解析２．３．０）を用いて、高品質コンセンサス配列が、各長いリードごとに作られ、それは１８を超えるオリジナル分子のコピーを含有し、不完全ＰＣＲ分子（＜２．５ｋｂｐ）または誤って検出されたＰａｃＢｉｏアダプターであって、長すぎるコンセンサス配列（＞３ｋｂｐ）をもたらしたもののいずれかとともにコンセンサス配列を排除した。これらのフィルターに基づいて、平均１，３４３コンセンサス配列が複製／処置の対ごとに、２，４０２配列までの範囲で生成された。コンセンサス配列は、ヒト対照（GRCh38, chrX:134,473,062-134,475,958）の対応する領域に、ＢＬＡＳＲ（ＳＭＲＴ解析2.3.0; パラメーター: -affineAlign -affineOpen 8 -affineExtend 0 -bestn 1 -maxMatch 30 -sdpTupleSize 13−m 5）とともに整列させられ、全ての単塩基対の違いは、完全長アラインメント（２．５−３ｋｂｐ）の配列について、配列とその対照の間で特定された（ミスマッチ、挿入、及び削除）。コンセンサス配列の平均整列同一性（average alignment identity）は９９．６９８％＋／−０．３３２１％で、標準偏差（ＳＤ）が９４．７６７９％から１００％の範囲であった。各複製／処置組合せについて変異率を推計するため、特定の変異体が発生した回数が、ヒト対照（ＧＲＣｈ３８）における特定の位置での高品質ＰａｃＢｉｏコンセンサス配列のリードを、各位置にわたって整列した高品質リードの総数で除して計算した。各複製について、相対変異率を、ＮＡ−処置細胞と生理的食塩水−処置細胞の間で、ＮＡ−処置細胞の変異率から生理的食塩水−処置細胞の変異率を引いて計算し、絶対相対率＞０．５％に基づいて過剰な変異率を特定した。全３複製にわたって特定された１５，２７７変異体のうち、過度の変異率が１４９（１．０％）のＮＡ−処置配列、１０１（０．７％）の生理的食塩水−処置配列について認められた。ヒト対照中で評価された２，８９７位置にわたって、過度な相対変化率が、処置配列の１１３の異なるサイト（３．９％）及びコントロール配列の８４サイト（２．９％）において特定された。変異率については、過度な相対変異率を伴う変異体についてＮＡ−及び生理的食塩水−配列の間で有意な差はなか���た（ｐ＝０．１０８３、２サンプル、コルモゴロフ−スミルノフ検定）（図１３Ｂ）。
【００４６】
（実施例１８：結果）
ＣＡＧ特異的ＤＮＡ結合化合物、ナフチリジン−アザキノロン（ＮＡ）を以前設計した（Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43; Hagihara 他, 2006, Nuc. Acids Symp. Ser. (Oxf.), 50:147-8; Hagihara 他, 2011, Chembiochem., 12:1686-9）。詳細な特徴づけにより、ＮＡが歪んだ内側鎖ＣＡＧヘアピンに結合し、そこでは、ＮＡのナフチリジン及びアザキノロン部分が相補的な水素結合をグアニン及びアデニンに対してそれぞれ示し、二つのシトシン塩基をＣＡＧヘアピンからフリップアウトさせることを明らかにした（図２Ａ及び２Ｂ）。ＮＡは高い親和性をもって結合し、（ＣＡＧ）１０ヘアピンの融点を＞３０℃増加させた（Hagihara 他, 2011, Chembiochem., 12:1686-9）。ＮＡはまた、より長いＣＡＧヘアピンに対して優先的に結合し、最大の結合は（ＣＡＧ）３０に対してであり、続いて（ＣＡＧ）２０、そして（ＣＡＧ）１０に結合した（Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43）。このＮＡのより長いＣＡＧヘアピン構造に対する顕著な選択性は、変異リピート遺伝子座におけるスリップＤＮＡの存在と対になって、伸長アレルを標的とすることを可能とするであろう。
【００４７】
ＮＡが、疾患に関連があり、スリップアウトを伴う、または伴わない（ＣＡＧ）・（ＣＴＧ）二本鎖に対して結合することができるかを決定するため、バンドシフト解析を、リピート不安定性の変異中間体のモデルであるスリップＤＮＡを用いて行った（Pearson 他, 2002, Nuc. Acids Res., 30:4534-47）。これらのインビトロ構造の詳細な生物物理学的特徴は、それらが、ＤＭ１患者中の変異ＤＭ１遺伝子座で特定されたスリップＤＮＡを反映していることを示す（Axford 他, 2013, PLos Genet., 9:e1003866）。ＮＡは、（ＣＡＧ）５０・（ＣＡＧ）５０リピートを含有する完全な二本鎖ＤＮＡ断片には結合せず、高濃度のＮＡは、完全な二本鎖リピートの構造変化を誘発しなかった（図２Ｃ−２Ｄ）。同じ（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）５０分子は誘発することができて、Ｓ−ＤＮＡと呼ばれるクラスター化した短いスリップアウトを含有し、それは不均質な分子の混合物を含み、それぞれ２−６２の短いスリップアウトで、ほとんどがそれぞれ１−５リピートユニットであり、リピートトラクトに沿って両鎖の様々な場所から突き出す（Pearson 他, 1998, Nuc. Acids Res., 26:816-23; Panigrahi 他, 2010, PNAS USA, 107:12593-9）。Ｓ−ＤＮＡは限定された程度ＮＡに結合することが可能であるが、それらの短いスリップアウト及び電気泳動的不均一性は、単シフト種（single-shifted species）の検出を許さない可能性がある。（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０のスリップアウト中の２０ＣＡＧリピートの過剰を伴うスリップヘテロ二本鎖は、広範囲にわたりＮＡによって結合される（図２Ｃ−２Ｄ、図７も参照）。ＮＡ−結合は、バンド拡大（band-broadening）を引き起こし、これは以前他のＤＮＡ−結合配位子について観察されたものである（Neilsen 他, 1988, Biochem., 27:67-73; Carlsson 他, 1995, Nuc. Acids Res., 23:2413-20; Barcelo 他, 1991, Biochem., 30:4863-73; Fox 他, 1988, Nuc. Acids Res., 16:2489-507; Fox & Woolley, 1990, Biochem. Pharmacol., 39:941-8）。ＮＡ存在下で段階的に遅くなるスリップＤＮＡの移動は、ＮＡがヘアピン中の追加的な（ＣＡＧ）・（ＣＡＧ）対に結合することと整合的である（図７；Nakatani 他, 2005, Nat. Chem. Biol., 1:39-43）。対照的に、ＣＴＧリピートの長いスリップアウトを伴うヘテロ二本鎖、（ＣＡＧ）３０・（ＣＴＧ）５０にはＮＡは結合しない（図２Ｃ−２Ｄ、図２Ｃの複数のパネルは全て単一ゲルに由来し、明確さのために分離された）。したがって、ＮＡはＣＡＧに結合するが、ＣＴＧスリップアウトには結合しない。結合は、ＣＡＧスリップＤＮＡ構造について定量的に特異であった（図２Ｄ）。精製されたスリップ（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３０から単離された（ＣＡＧ）５０及び（ＣＴＧ）３０一本鎖（再変性なし）へのＮＡ存在下での変性はまた、ＮＡが一本鎖（ＣＡＧ）５０に特異的に結合することを示した（図２Ｅ、左パネル）。個々の（ＣＡＧ）５０及び（ＣＴＧ）３０一本鎖のＮＡ存在下での再変性は、ＮＡが相補的鎖ハイブリダイゼーションの能力はブロックしなかったが、特異的にスリップアウトＣＡＧ鎖に結合し、ＣＴＧ鎖には結合しなかったことを明らかにした（図２Ｅ、右パネル）。単離された一本鎖（ＣＡＧ）５０トラクトの電気泳動シフトの程度は、わずか２０だけ過剰にＣＡＧリピートのスリップアウトを有するヘテロ二本鎖（ＣＡＧ）５０・（ＣＴＧ）３���のそれよりも大きく、一度一本鎖が与えられたら、全ての５０ＣＡＧリピートが全５０リピートの長いヘアピンに押し込まれ（図２、パネルＥを比較のこと）、それはより多くのＮＡ分子と結合することができる。ＣＴＧヘアピン鎖はＮＡによって結合されない（図２Ｃ−２Ｅ）。結合は、長いＣＡＧスリップアウトの方が短いものよりも有意によかった（図８）。これらの結果及びＮＡの確立した結合モードに基づき、２ＮＡ分子に対し１ＣＡＧ−ＣＡＧの比が、以前推計され、ここで、（ＣＡＧ）２０のスリップアウトは２０ＮＡ分子に結合するであろう。これらの発見はまとめて、疾患に関連するトラクト長の長いＣＡＧリピートスリップアウトに対するＮＡの構造特異性をサポートするが、ＮＡが伸長した完全二本鎖分子からのスリップアウト押出しを誘発するであろうという主張をサポートしない。
【００４８】
ＮＡがスリップＤＮＡのプロセッシングをブロックし、リピート不安定性を修正する可能性が示唆される。ＮＡは、長い（ＣＡＧ）２０スリップアウトを伴うスリップＤＮＡの修復を特異的に阻害するが、（ＣＴＧ）２０スリップアウトを伴うものについては阻害せず（図３Ａ−３Ｃ）、その設計されたＣＡＧヘアピンに対する特異性と整合的である（図２）。ＮＡが（ＣＡＧ）２０スリップアウトの修復をブロックしたことは、ヒト及びその他のＤＮＡポリメラーゼがＮＡ−結合（ＣＡＧ）１０−（ＣＡＧ）２０テンプレートに沿ってプライマーを伸長できないことと整合する。長い（ＣＡＧ）２０スリップアウトの修復は、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）とは独立しており、ＮＡの効果は、ＭＭＲの関与を必要としないことを示している。対照的に、一本鎖リピートスリップアウトでＮＡが結合するには小さすぎるものは、ミスマッチ修復ＭｕｔＳβ（ＭＳＨ２−ＭＳＨ３）複合体を必要とする。ＮＡが結合するには小さすぎる一本鎖余剰ＣＡＧリピートスリップアウトの修復におけるＮＡの効果を評価した。一本鎖リピートＣＡＧまたはＣＴＧスリップアウトの修復は、ＮＡに影響されず、このプロセスにおけるＭｕｔＳβ機能はＮＡに影響されなかったことを示している（図３Ｄ）。
【００４９】
ＣＡＧ／ＣＴＧスリップヘテロ二本鎖に対するＮＡの特異性を探索するため、最も頻繁な塩基―塩基ミスマッチであるＧ−Ｔミスペアの修復におけるＮＡの効果を評価した。このミスペアの修復は、ミスマッチ修復ＭｕｔＳβ複合体（ＭＳＨ２−ＭＳＨ６）に依存する。ＮＡはＧ−Ｔ修復には何ら効果がなく、更に、ＮＡはＭＭＲをブロックせず、ＭＭＲの遺伝的欠如において発生することが知られているゲノムワイドでの変異を引き起こすことはないことを示している（図３Ｅ）。したがって、長いＣＡＧスリップアウトの修復をＮＡが優先してブロックすることは、リピート不安定性を調節する能力を予想させるであろう。
このＮＡの潜在的な治療への使用の問いに答えるものとして、ＮＡが細胞透過性であり、急性細胞毒性を引き起こし、またはヒト細胞の増殖（図２Ｅ−２Ｇ）若しくはＤＮＡ複製（図８）を遅らせることなく、核に入ることができることが決定された。
【００５０】
ＨＤ患者の細胞をＮＡで処置すると、伸長したリピートの収縮が誘発された。ＮＡは細胞透過性で、急性細胞毒性を引き起こしたり、ヒト細胞増殖を遅延したり（図４Ａー４Ｃ）、ＤＮＡ複製を変更したりすることなく（図９）、核に入ることができる。トラクト長が＞２００リピートのものは、脳細胞中に頻繁に認められ、（ＣＡＧ）４０−５０の一般変異が遺伝したＨＤ個体中で体細胞伸長を招く。ＮＡは、ＨＤ患者由来初代線維芽細胞中のハンチントン病の遺伝子座における（ＣＡＧ）１８０・（ＣＴＧ）１８０トラクトの収縮方向へ、リピート集団中に有意なシフトを誘発した。ＮＡは伸長したＨＤリピートの収縮の数を強化し（図４Ｄ；Ｐ＝７．２５Ｅ−０６、図１０、各実験のそれぞれの重複について完全なｓｍａｌｌ−ｐｏｏｌＰＣＲデータセットから編集した、リピート解析は表２に概要を記載する。）、リピートの有意な喪失を招いた（図４Ｆ；Ｐ＝０．０００３）。ＮＡはまた伸長したＨＤリピートの伸長数を低減した（図４Ｄ；Ｐ＝４．３３９Ｅ−０５、図１０、表２）。またＨＤ患者線維芽細胞を、大多数の患者に一般的な変異である４３ＣＡＧリピートの伸長したアレルで処置した。有意な数のＮＡ−処置細胞が伸長したリピートの収縮を招き、ＨＤ病の閾値である３５ユニットを下回る２０リピートの低さくらいまで収縮した（図４Ｅ及び４Ｇ；Ｐ＝３．２８Ｅ−０３、図１１、表２）。ＮＡはまた伸長数を低減した（図４Ｅ；Ｐ＝８．３２Ｅ−０５、図４Ｅ；図１１、表２）。このように、ＮＡは、遺伝し、体細胞において伸長したアレルに共通な、伸長したトラクト長の収縮を誘発することができる。対照的に、ＮＡは非伸長ＨＤリピート、またはストレス条件下で不安定になりがちな既知の他のマイクロサテライトリピートのいずれにも影響せず（図４Ｈ及び図１２）、ＮＡは伸長したＣＡＧ／ＣＴＧリピートに特異的であり、その他のリピートに有害に影響しないであろうこと示唆する。ＮＡのスリップＤＮＡ構造に対する特異性のための追加的なコントロールとして、ＮＡの効果を非常に長い、しかし遺伝子的には不安定ではない、ＮＡ処置ＨＤ患者細胞中のＴＢＰ遺伝子のＣＡＧトラクトで評価した。ＴＢＰ中のリピートの正常範囲は、２５−４１であるが、＞４９リピートに伸びると完全に浸透性の疾患（ＳＣＡ１７）を引き起こし、４２−４８の伸長は、浸透度を低減する方向に導く。ＨＤ患者細胞中で、非変異ＴＢＰ遺伝子は、３８及び３４リピートの長さを有し、ＨＤ病ＣＡＧ長の閾値である３４／３５リピートを上まわり、またはちょうど下回る。重要なことに、ＮＡはＴＢＰリピートが活発に、ＮＡが結合するスリップＤＮＡ構造の形成を導くような不安定性事象を経験している場合にのみ、効果を有することが期待されよう。確立されたｓｐＰＣＲ法を用いたところ、ＮＡはＴＢＰリピートの長さ分布を変化させなかった（図１２Ｃ、表２）。従って、ＮＡは、ＴＢＰ遺伝子の、大きいが変異ではないリピート長に何ら効果がないが（図１２Ｃ、表２）、（ＣＡＧ）４３−１８０の変異ＨＤトラクトには影響したという事実は、活発に不安定性を経験していてスリップＤＮＡを含むと推定されるリピートに対するＮＡの特異性をサポートするものである。非伸長リピートトラクトにＮＡが影響することができないことは、短いトラクトのスリップＤＮＡを形成する能力の低さによる可能性があり、そのことはこれら構造が非伸長遺伝子座において欠如していることと整合する。更に、しばしば変異誘発の代用物として用いられるＨＰＲＴ１遺伝子（エキソン２から３）の２，４０２にのぼる個別アレルの配列解析は、ＮＡ処置された細胞について配列変更を示さず（図１３、パネルＢ参照）、ＮＡが一般的な変異原であることを論駁する。この発見は、ＮＡが塩基−塩基ミスマッチ修復に影響する能力がないことと整合的である（図３Ｅ）。これらの結果はともに、ＮＡは、一般に遺伝し、脳細胞中で頻繁に認められ体細胞伸長を招く伸長したリピート長に特異的であり、ＮＡの効果は、活発に不安定なトラクトに特異的であり、その他のリピートまたは配列に有害な影響をあたえないであろうということを示唆する。
【００５１】
リピート集団において、ｒ（ＣＡＧ）８５０を発現するヒト細胞中の（ＣＡＧ）８５０・（ＣＴＧ）８５０トラクトの収縮方向への有意なシフトをＮＡが誘発した（Nakamori 他, 2011, Human Mol. Genet., 20:580-8) (図５Ａ及び５Ｂ、並びに図１４；Ｐ＝４．７８Ｅ−０５、リピート解析はその概要を表２に示す）。ＮＡは有意にリピートトラクトの平均サイズを短くし、リピートユニット喪失の規模は、７９０リピートにものぼった（図４Ｃ；Ｐ＝６．４４Ｅ−０３）。ＮＡの効果は、細胞増殖及びＤＮＡ複製から独立しており（図５Ｄ、図１５）、ＮＡが細胞増殖（図４Ｃ）または複製進行（図９）に影響しないことと整合する。ＮＡの影響は、リピートにわたっての転写に依存し（図５Ｅ、図１６Ａ−１６Ｃ）、ＮＡは伸長したリピートにわたっての転写を変更しなかった（図５Ｆ）。ＮＡは非伸長ＣＡＧ／ＣＴＧトラクトまたはその他のマイクロサテライトリピートに影響しない（図５Ｇ及び図１２）。これらの結果はともに、ＮＡは、増殖から独立し、リピートにわたっての転写に依存して効果を有することを示唆する。
【００５２】
転写的に誘発されたＲ−ループは、ＣＡＧ／ＣＴＧ不安定性を導くことができる。上述のとおり観察されたリピート不安定性におけるＮＡの転写依存性（図５Ｅ）は、転写、Ｒ−ループ形成、Ｒ−ループの生物物理学的安定性、及び／または不安定性へのＲ−ループのプロセッシングのいずれかにＮＡが影響しうることを示唆するかもしれない。これらの代替手段が試験され、ＮＡが細胞中の伸長リピートの転写レベルを変更しないこと（図５Ｆ、図１６Ａ−１６Ｃ）、あるいはインビトロ転写に影響しないこと（図１７Ｂ）が認められた。ＮＡ（１２０μＭ）は、Ｒ−ループ形成に影響せず（図１７Ｂ）、あらかじめ形成されたＲ−ループのＲＮａｓｅＡまたはＲＮａｓｅＨプロセッシング（図１７Ｃ）に影響しなかった。細胞に用いられたものと同じ濃度（５０μＭ）またはより高い濃度（５００μＭ）のＮＡで、Ｒ−ループはいまだに検出可能であり、このことはＮＡがＲ−ループの生物物理学的安定性に影響しなかったことを示唆する（図１７Ｄ）。しかしながら、ＮＡは、ニューロン様ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の抽出物によるＣＡＧ／ＣＴＧＲ−ループのプロセッシングを変更し、収縮生成物の数を有意に増加させたが、伸長生成物の数についてはそうしなかった（図１８ｃ、ｐ＝０．００２）。これらのモデルシステムからの結果は、ＮＡがリピート収縮のためのＲ−ループプロセッシングを優先的に引き起こすことを示唆する。
【００５３】
ＮＡが伸長したリピートの収縮を強化する妥当なメカニズムは、転写誘発Ｒ−ループから生じたスリップＤＮＡの変型修復を通じたものであり、その経路はその他のレポート（Nakamori 他, 2011, Human Mol. Genet., 20:580-8; Lin 他, 2010, PNAS USA, 107:692-7; Reddy 他, 2014, Nuc. Acids Res., 42:10473-87）同様、本明細書に提示されるデータによってサポートされる。図１９に概要が示されるように、ＣＡＧ転写物を生成するためのＣＴＧ鎖の転写の間、ＨＴＴ遺伝子で起こる場合のように、位置を移したＣＡＧ  ＤＮＡ鎖上にスリップＤＮＡを形成する傾向があり、ＮＡは位置を移したｄＣＡＧ鎖上に形成された内部鎖ヘアピンに結合する可能性があり、更にこれらをより長いヘアピンに伸長する可能性がある（図１９Ａ）。これらのＮＡ−結合スリップＤＮＡは修復を逃れ、収縮を導くであろう。スリップアウトを維持または除去するとき、ヌクレオチド鎖切断の切り目によって（Hou 他, 2009, Nature Struct. Mol. Biol., 16:869-75; Pluciennik 他, 2013, PNAS USA, 110, 12277-82) (図１９Ｂの矢印を参照)、ＮＡ結合（ＣＡＧ）ｎテンプレート上でのＤＮＡ修復合成はブロックされ（Hagihara 他, 2006, Nuc. Acids Symp. Ser. (Oxf.), 50:147-8; Hagihara 他, 2011, Chembiochem., 12:1686-9）、それによって、伸長よりも収縮が選好されるであろう。このモデルは、ＤＮＡ複製がない中でのＮＡ誘発リピート収縮と、転写依存な方法で整合し、そこでＮＡは、リピート構造の修復を攪乱することを通じてその影響を行使する（図３−５）。
【００５４】
リピート不安定性が起こる可能性のある道筋は多数あり、ＮＡが作用するであろう様々な方法（ＤＮＡ複製、転写、後成的変化、ＤＮＡ−損傷等）は、その全てがスリップＤＮＡを含む。ＣＡＧ不安定性におけるＮＡの効果は、増殖／複製とは独立しており（図５Ｄ）、リピートを通じた転写に依存して（図５Ｅ）、転写、Ｒ−ループプロセッシングを通じたスリップＤＮＡの形成、不安定性におけるスリップＤＮＡの関与の見込み、ＣＡＧヘアピンに対するＮＡの特異性（図２）、及びＮＡのＣＡＧ収縮中間物の修復をブロックする能力（図３Ｂ）と相まって、これら全てがこの提案されたモデルをサポートする。
【００５５】
ＤＮＡ修復タンパク質とスリップＤＮＡの相互作用をブロックすることによってＮＡは作用するのであろうか？大きなスリップアウト修復のためのタンパク質は知られていないが、この仮説を試験するため、我々は、４つの候補タンパク質、ＭｕｔＳβ、ＦＡＮ１及びＲＰＡ−ｐｏｌδでＮＡの効果を評価した。多くのマウスモデルが、機能するＡＴＰアーゼを伴うミスマッチ修復ＭｕｔＳβ複合体が、ＣＡＧ／ＣＴＧ伸長に拍車をかけることを証明している。ＮＡが２０過剰リピートの大きなＣＡＧスリップアウトの修復をブロックする一方で、プロセスはＭｕｔＳβとは独立しており、その他はＭｕｔＳβが引き続き伸長を導くスリップＤＮＡの形成に含まれている可能性があることを示唆していた。ＤＮＡに結合するＭｕｔＳβを含むことが予測されるこのプロセスは、ＮＡによって影響される可能性がある。ここで、ＭｕｔＳβは、既存のレポート同様、ＡＴＰによって分離され得る複合体である長いＣＡＧスリップアウトリピートに結合することができることが認められた。ＮＡはＭｕｔＳβのＣＡＧスリップアウトに対する結合をブロックしたり、この複合体のＡＴＰ媒介分離をブロックしたりすることはなかった（図２０）。ＮＡはＭｕｔＳβがスリップアウトに結合することをブロックしないので、また、ＮＡは変性リピート含有ＤＮＡからのスリップアウト形成を許さないわけではないので（図２Ｅ）、ＮＡ単独で、あるいはＭｕｔＳβに強化されて、スリップＤＮＡの形成をブロックするというＮＡの役割をサポートするものではなかった。ＭｕｔＳβは、ＮＡのリピート不安定性に対する作用に関与していたとしても、示唆されるとおり、上流で作用し、転写中にスリップＤＮＡを形成する可能性がある。
【００５６】
最初脳内で特定されたＦＡＮ１／ＫＩＡＡ１０１８／ＭＴＭＲ１５は、ＤＮＡ構造を選好するＤＮＡ修復ヌクレアーゼである。ＦＡＮ１は、ＨＤの発症年齢及び５つの他のＣＡＧ疾患（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ７及びＳＣＡ１７）の修飾因子にかかるいくつかの探索のトップとして最近特定された。ＦＡＮ１が発症年齢を調節する方法は知られていないが、体細胞リピート不安定性を調節することにより行っていると推測されている。何ら前例はないが、ＦＡＮ１のリピートＤＮＡへの作用を試験した。既に証明されたように、ＦＡＮ１はスーパーコイル及び線状ＤＮＡを開裂させること（図２１、左パネル）、ＤＮＡ含有転写誘発Ｒ−ループを開裂させることが可能であり、それによってスーパーコイル依存ＲＮＡ部分を放出する（図２１、右パネル）。ミスアラインしたＤＮＡのアニーリングから、Ｒ−ループからのＲＮＡ喪失に続いて、スリップＤＮＡが発生する可能性がある。ＦＡＮ１開裂は３つの異なるスリップＤＮＡ接合部上にマップされた：コントロール接合部はリピートを欠く；１つはフラップ中にＣＡＧヘアピンを有し；１つは接合部を超えた二本鎖領域にＣＡＧヘアピンを有した（図２２、トップパネル、表１）。他の研究のように、ＦＡＮ１は、５’１本鎖フラップ及びフラップを超えた二本鎖でカットする。コントロール基質については、両サイトにおける開裂は、大体同じである（図２２Ａ及び２２Ｄ）。しかしながら、ＣＡＧ基質については、開裂は二本鎖及びヘアピン領域で低減する（図２２Ｂ−２２Ｃ及び２２Ｅ−２２Ｆ、変性ゲル、矢印の頭を参照）。これは、ＣＡＧヘアピンの存在がＦＡＮ１の作用に影響し得ることを示唆している。反応中に含むＮＡの量を増加させると、二本鎖基質中のＣＡＧ上でのヌクレアーゼ作用が明らかに低減し、とりわけ、ＣＡＧヘアピンに近位及びＣＡＧヘアピン中の開裂に影響している（図２２Ｃ及び２２Ｆ）。本明細書で証明されることは、スリップＣＡＧ基質のＦＡＮ１開裂は、ＣＡＧ不安定性を調節する薬剤として示されてきたＮＡ（図３、５及び６）によって変更することができるということであり、ＮＡがＤＮＡ構造特異的ヌクレアーゼであるＦＡＮ１の作用を調節することができる可能性をサポートする。ＦＡＮ１がＨＤ発症年齢を調節するであろう方法は、将来の研究における焦点である。
【００５７】
複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）は、多くのＤＮＡ修復プロセスにおけるキープレーヤーであり、ヘアピンのような異常なＤＮＡ構造の形成を、一本鎖領域に結合し安定化することを通じて阻害する。ＲＰＡは、難しいＤＮＡテンプレートを通じたＤＮＡポリメラーゼの進行を、構造化されたテンプレートを溶解することによって強化すると報告されてきた。スリップＤＮＡへのＲＰＡの結合及びポリメラーゼデルタ（ｐｏｌδ、ＣＡＧリピート不安定性に関係するポリメラーゼ）による進行の強化におけるＮＡの効果が評価され、修復能力において脳内で活発であった。ＮＡはスリップＣＡＧリピートに対するＲＰＡの相互作用を競合的にブロックした（図２３）。Ｐｏｌδは、ＣＡＧトラクトにわたって合成することができず、このことは、おそらく邪魔なヘアピンを溶解するその能力を通じて、ＲＰＡの添加によって回復された（図２３Ｂ、レーン５−６）。ＮＡは、ＣＡＧテンプレートに沿ってｐｏｌδの強化された進行をブロックし（図２３Ａ、レーン５−６）、ＮＡがＲＰＡに対し競合的にＣＡＧトラクトに結合することと整合的な結果であった（図２３Ａ）。これらの結果は、ポリメラーゼがＮＡ結合ＣＡＧテンプレートを通じて合成できないことを通じたＣＡＧ収縮をＮＡが誘発するメカニズムをサポートする（図２３Ｃ）。この結果は、ＮＡが収縮を誘発し得るプロセスをサポートする（図１９の下半分を参照）。我々のＦＡＮ１、Ｐｏｌδ及びＲＰＡの結果は、ともに、ＮＡがＣＡＧスリップアウトに対する修復タンパク質の相互作用または作用を阻止することによって作用する可能性があるとの概念をサポートする原理証明を提供する。ＮＡがＣＡＧ収縮を誘発するため変更することができる正確なプレーヤー及びステップを特定することは、今後決定されることである。
【００５８】
激しいＣＡＧ伸長を示し、変性に敏感な神経組織において、ＮＡはインビボで効果があるのだろうか。マウスと患者の両方で、最も大きいＣＡＧ伸長及びほとんどの変性は線条体中で起こり（Lopez Castel 他, 2010, Nature Reviews, Mol. Cell. Biol., 11:165-170; Kennedy 他, 2003, Human Mol. Genet., 12:3359-67; Goula 他, 2009, PLoS Genet., 5:e1000749; Larson 他, 2015, Neurobiol. Dis., 76:98-111; Kovalenko 他, 2012, PLoS One, 7:e44273）、中型有棘ニューロンが最も攻撃されやすく、最大のＣＡＧ伸長を招く（Kovalenko 他, 2012, PLoS One, 7:e44273）。従って、線条体に焦点をあて、それぞれ１５０から１６０程度のＣＡＧリピートを遺伝的に受け継ぐハンチントン病Ｒ６／２導入遺伝子マウス中の伸長した（ＣＴＧ）１５０の不安定性に対するＮＡの効果が試験された（Goula 他, 2009, PLoS Genet., 5:e1000749; Larson 他, 2015, Neurobiol. Dis., 76:98-111）。ここで各マウスに、左線条体にＮＡ＋生理的食塩水、または内部コントロールとして右線条体に生理的食塩水のみのいずれかを、４週間の間、注入した（図２４）。ＣＡＧ伸長はこれらのマウスの線条体で早ければ数週間で明らかであり、それはマウスが年を取るに従って継続する（Goula 他, 2009, PLoS Genet., 5:e1000749; Larson 他, 2015, Neurobiol. Dis., 76:98-111）。１つのモデルにおいて、ＣＡＧリピートは、毎月１細胞あたり〜３．５ＣＡＧユニットの割合で、追加的なリピートの広く分布したサイズを得ると定量された（Lee 他, 2011, PLoS One, 6:e23647; Mollersen 他, 2010, PLoS Genet., 6:e1001242）。６週齢Ｒ６／２マウスへの、ＮＡの線条体内注入の繰り返しは、同じマウスの反対側の線条体への生理的食塩水のみの注入に対して相対的に、伸長したリピートの表面上の収縮を導いた（図６Ａ、ＮＡ−処置線条体部分の青いスキャンと生理的食塩水処置線条体部分の赤いスキャンを比較、注入は１回、２回または４回投与を４週間のスパンで行い、その時ＤＮＡを採取した（図２４））。ＮＡの効果は注入サイトに局所的であり、ＮＡ−注入（青いスキャン）の線条体領域のみがリピート収縮を示し、生理的食塩水−注入（赤いスキャン）では示さず、これによって、生理的食塩水を注入した同じマウスの脳の半分は内部コントロールとして供された。何ら処置がなければ、所与のマウスについて、線条体のＣＡＧ長分布は、左及び右半分の間で区別できなかった。（生理的食塩水中の）ＮＡで処置された半分が、生理的食塩水のみで処置された半分よりも短いＣＡＧトラクトを有することは、ＮＡがＣＡＧ長の違いを誘発したという解釈をサポートする（図６Ａ）。
【００５９】
追加的な４週間にわたるＮＡ投与は、継続的な収縮を誘発した（これは、全１３マウス（１匹に１注入、２匹に２注入、及び１０匹に４注入）について非常に再現性が高かった。図２５Ａ−２５Ｈを参照。ＮＡ注入は脳形態を変化させなかった。図２６）。ＮＡの効果は、マウス間での遺伝性のリピート長の違いにも関わらず、マウス間で一貫していた。ＨＤ患者の脳には、二峰性のリピートサイズの分布が存在する。この第２ピークはより大きな伸長であるが、これはほとんどのＣＡＧマウスモデルの線条体において明らかであり、最も脆弱なＨＤ細胞、中型有棘ニューロンからなり、より大きなレベルの伸長したＣＡＧ転写を有するものとして、発見された。興味深いことに、ＮＡは二峰性リピート分布のより大きな伸長により大きな効果を有した（図６Ｄ）。この線条体におけるより大きなサイズの伸長の部分は、ＮＡが結合するのに十分大きな、大きいスリップアウトを含む変異事象によって起こった可能性がある。ＨＤ個体における不安定性解析は、各変異事象において獲得または喪失されたＣＡＧユニットの数は、主として１つのリピートユニットの変化であるが、ＮＡが結合することができるサイズの５−１５リピートユニットの変化を含む可能性があることを示唆する。ＤＭ１患者の脳を含む様々な組織から単離されたＤＭ１遺伝子座におけるスリップＤＮＡが、ピークが〜３０及び＜１０リピートで、前者はＮＡが結合することができるピークである二峰性スリップアウトサイズを示したことは注目に値する。
【００６０】
全てではないにせよほとんどのＮＡ処置線条体中のアレルがリピート収縮を受け、ＮＡがほとんどの細胞に影響を与えたことを示している（図６Ａ、図２５Ａ−Ｈ）。確立された方法を用いて、体細胞「不安定性指数」を定量した：より大きな指数はより大きな伸長を反映し、より低い指数はより低い伸長またはより大きな収縮を反映する（図２７）。収縮に対する伸長ピークの数（図６ｂ）または、収縮に対する伸長ピークの相対的な組成（％）（図６Ｃ）は、それに続く処置とともにより大きくなった。ＮＡで４回処置された線条体中のリピートサイズ分布は、未処置（mock-treated）線条体から著しく異なっていた（マン・ホイットニー、ｐ＝０．０００３４、または対応のあるｔ−検定、ｐ−０．００００１９）。ＮＡの効果は注入したサイトにおいて局所的であり、線条体内注入を行った同じマウスからの小脳及び大脳皮質のＣＡＧトラクトは、右側と左側とでＣＡＧ長不均一性について同一のパターンを示した（図６Ｃ及び６Ｄ、図２５Ａ−２５Ｈ）。
【００６１】
ＮＡが、伸長を阻止するだけでなく収縮を誘発したことは、ＮＡ処置した線条体中のピークリピート長が、マウスの人生を通じて変化しない同じマウスの尾の遺伝的トラクト長よりも短いという事実によってサポートされる（図５Ｄ及び図２５）。重要なことに、所与のマウスについて、ＮＡで処置された線条体の半分におけるリピートサイズ分布は、尾の遺伝による長さに対して相対的に、収縮の方向にシフトした一方で、生理的食塩水で処置した線条体の半分は引き続き伸長を招いた（図６Ｂ−６Ｅ、図２５Ａ−２５Ｈ、生理的食塩水−対ＮＡ処置−対尾ＣＡＧ長の主ピークのデルタは４−７ＣＡＧユニット異なることを参照）。これは、ＮＡの線条体への注入が、伸長したＣＡＧトラクトの収縮を誘発したこと、及びその組織中の伸長バイアスに対抗してそうすることができることをサポートし（自発的な伸長速度が〜５．７５ＣＡＧユニット／月）、この発見は細胞中で観察されたＮＡ誘発収縮と整合的である（図３及び図５）。インビボにおけるＮＡの効果は伸長したリピートに特異的であり、非伸長リピートには何の効果もない（図６Ｅ及び１２Ｄ）。ＮＡの効果は、ＤＮＡ転写よりもむしろゲノム維持を含むものであった可能性が高く、それは６週齢の処置マウスが出生後、マウスの出生６−１７日後に転写ピークがくる「脳成長スパート」を経験したことからもうかがえる。ＣＡＧ−ＲＮＡレベルは、伸長が最大の線条体細胞中で最も大きく、ＮＡがリピートにわたって転写を変更しなかったことから、転写が含まれそうである（図１６Ｃ）。このことは、ＮＡが、細胞増殖とは独立して収縮を誘発することと整合的である（図５Ｅ）。このように、ＮＡは、選択的な神経細胞の脆弱性を示すＨＤ個体中の組織内のほとんどの細胞で、伸長したＣＡＧリピートの収縮を誘発することができた。
【００６２】
これらの約１５０ＣＡＧリピートを有するマウスを４週間の期間にわたってＮＡ処置したことによる発見は、多くのニューロンが、〜０．５リピート喪失／週の収縮を招いていたことを示している。これをＨＤに冒されたヒトに外挿すると、ＮＡのような薬剤を、体細胞ＣＡＧ伸長の急な発症前に適用すると、効果的に伸長をブロックし、遺伝により伸長したアレルより短い長さに収縮することを誘発し、１年にわたる治療によってリピートを５−２５リピート収縮することができるであろう。平均を上回る６０−７０リピートのＨＤアレルについて、これは著しく、疾患の発症と進行を修正することを可能とするであろう。
【００６３】
複数のモデルシステムを用いた様々なアプローチからのデータは、調和のとれた解釈を導いた。例えば、様々な細胞モデル中でのＮＡに強化された収縮は、インビボでの収縮の増加と整合的であり、ＮＡの効果が複製フォークにおいて存在しないこと、複製から独立しているが転写を必要としていることは、全て、転写が起こる細胞または線条体中での増殖の要請欠如と整合的である。加えて、ＮＡがＲ−ループプロセッシングの収縮に影響することは、ＮＡがｒＣＡＧ−ｄＣＴＧ  Ｒ−ループを生成し、ＣＡＧ  ＤＮＡ鎖を移す転写を経験し、ＮＡに結合することを許容する細胞株及び線条体中の不安定性に影響することと整合的である。更に、ＮＡが（短いものではなく）長いＣＡＧスリップアウトに結合してその修復を阻害することは、ＮＡが、大きな跳躍伸長を経験する線条体中のより長いリピートサイズに優先的に影響することと整合的である。
【００６４】
ＣＡＧ／ＣＴＧ不安定性の細胞モデルを用いた過去の研究は、外因的に添加された化合物がリピート不安定性のレベルを修正することができることを証明した（Yang 他, 2003, Am. J. Hum. Genet., 73:1092-105; Gomes-Pereira 他, 2006, Mutat. Res., 598:15-34）。しかしながら、効果的な化合物はＤＮＡ損傷剤（エチルメタンスルホナート、臭化エチジウム、マイトマイシンＣ及びＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）であって伸長リピートへの特異性に欠け、したがって、ゲノム全体にわたって有害突然変異を誘発する。別の研究では、（ＣＡＧ）６アンチセンスオリゴヌクレオチドは（ＣＴＧ）８００の不安定性を低減することが可能であったが、伸長したリピートの収縮は誘発しなかった（Nakamori 他, 2011, Mol. Ther., 19:2222-7）。
【００６５】
ミトコンドリアを標的とする化合物、ＸＪＢ−５−１３１は、未知のプロセスによって、収縮を誘発するのではなくむしろ穏やかにＣＡＧ伸長を抑制することが報告され、この化合物もまた収縮を抑制した。フリドライヒ運動失調症患者中で伸長される二本鎖ＧＡＡリピートを標的とする配列特異的ポリアミドは、ＧＡＡ三重鎖構造の形成を妨げ、ＦＲＤＡ細胞中のＧＡＡリピート伸長を抑制したが、収縮は誘発しなかった。変異アレルをターゲットとするためのＨＤ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９処置は、プロモータ領域、転写開始サイト、及び変異ＨＴＴアレルのＣＡＧ伸長部分にわたる〜４４ｋｂＤＮＡを削除し、その結果、機能性非変異アレルとともにハプロ不全をもたらす。低分子アプローチは、インビボにおけるいくつかの酵素仲介経路のハードル（送達、特異性等）を克服することができるかもしれない。
【００６６】
これらの過去のアプローチとは対照的に、我々の結果は、ＣＡＧリピートを含むＤＮＡスリップ鎖構造に結合するＤＮＡ配位子であるＮＡが、更なる伸長よりむしろ収縮の方にリピート不安定性の動態をシフトすることができることを示す。ＮＡはスリップＤＮＡとＤＮＡ修復タンパク質との相互作用を攪乱することによりスリップＤＮＡの異常修復のサイクルを阻害することで作用する可能性がある。その他の核酸結合化合物であって、有害リピートｒ（ＣＵＧ）ＲＮＡタンパク質相互作用またはＣＡＧ／ＣＴＧ転写を攻撃する方向に効果があることが証明された化合物（Bernat 他, 2015, Neuron, 87:28-46）もまたリピート不安定性に影響する可能性がある。ＮＡの属性−その配列特異性及び構造特異性、その伸長リピートを含有するスリップＤＮＡに対する優遇効果、その罹患脳領域中インビボで収縮を誘発する能力−は、疾患を引き起こす伸長リピートの収縮を誘発し伸長を阻害することによって、ＣＡＧリピート不安定性に影響を与える低分子ＤＮＡ結合化合物の潜在力を示す第１級の例である。このような低分子のヒトの脳への投与は、一度治療において最適化されれば、効果的にその根本的原因を標的として、伸長の変異により引き起こされる全ての下流の効果に対応することであろう。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
本明細書において、数々の異なる態様とともに本件方法及び組成物を記載してきたが、様々な態様についての先の記載は、例示を意図するものであり、本件方法及び組成物の範囲を限定するものではないことが理解されるであろう。その他の態様、有利な点、及び修正は、続く特許請求の範囲の範囲内である。
開示された方法及び組成物の生成物のために、それとともに、またはその調製において用いることが可能である方法及び組成物、または開示された方法及び組成物の生成物が、開示されている。これらの及びその他の物質が本明細書で開示され、これらの方法及び組成物の組合せ、部分集合、相互作用、グループ等が開示されていることが理解される。すなわち、各様々な個々の及び集合的な組合せ、及びこれら組成物及び方法の順列は、明示的に開示されていなくても、そのそれぞれが本明細書において具体的に考慮され、記載されたものである。例えば、もし、特定の本件組成物または特定の方法が開示され、議論され、多数の組成物または方法が議論されれば、組成物及び方法のそれぞれ全ての組合せ及び順列は、そうでないと明示しない限り、考慮されたものである。同様に、任意のこれらの部分集合または組合せもまた、考慮され、開示されたものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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