(57)【要約】  本発明は、リジン側鎖を修飾されたペプチドを固相ペプチド合成により製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性に修飾されたリジン側鎖を含む単離されたペプチドを製造する方法であって：
（ｉ）  固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的な様式で側鎖に保護された反応性官能基を有する該ペプチドのアミノ酸配列を構築する工程  ［ここで、修飾しようとするリジンの側鎖は、トリチルベースの保護基、特にモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）または４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）により保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に固相樹脂を乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  修飾しようとするリジン側鎖を脱保護するために、乾燥した樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液で数回処理する工程；
（ｉｖ）  樹脂を中和する工程；
（ｖ）  少なくとも１つの活性化９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）結合リンカー部分を、脱保護されたリジン側鎖にカップリングする工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーの末端官能基を脱保護する工程；
（ｖｉｉ）  活性化された親油性部分、特に活性化脂肪酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；及び
（ｉｘ）  樹脂からペプチドを切断する工程
を含む、上記方法。
【請求項２】
単離されたペプチドは、３０と４４との間、特に３８と４０との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、ここで
（ｉ）  野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも６５％であり、かつ／または
（ｉｉ）  野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも７０％であり、かつ／または
（ｉｉｉ）  親油性に修飾されたリジン側鎖は、野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉｉ）において、乾燥した樹脂は、少なくとも７回少なくとも５分間、特に９回少なくとも１０分間、または９回少なくとも１５分間、ＤＣＭ中約１％（体積／体積）ＴＦＡで処理される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；及び
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が、修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較して少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％になるまで、場合により工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
単離されたペプチドは、アミノ酸配列
Ｈ−ｄＳ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ（γＥ−Ｐａｌｍ）−Ｅ−Ｓ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ２  （配列番号１）
を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｘ）の切断は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、トリフルオロ酢酸少なくとも９０％（体積／体積）及びエタンジチオール少なくとも１％（体積／体積）を含む切断カクテルを用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
切断カクテルは、適切なインドール化合物、特に３−メチルインドールをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｘ）の切断は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、トリフルオロ酢酸少なくとも８０％（質量／質量）及び１，２−エタンジチオール少なくとも１％（質量／質量）を含む切断カクテルを用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
切断カクテルは、８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｘ）  切断後のペプチド溶液をろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、ジアルキルエーテル及びヘプタンを含む貧溶媒に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を撹拌する工程
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  沈殿物を洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを乾燥する工程
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｘｉｉ）において、貧溶媒は、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）及びｎ−ヘプタンからなる混合物、特に２５：７５（体積／体積）〜３５：６５（体積／体積）の比のＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンの混合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）  側鎖に保護された反応性官能基を有する配列番号１のペプチドのアミノ酸配列を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的様式で構築する工程［ここで、リジン１４の側鎖はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）により保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に固相樹脂を少なくとも５時間室温で乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  乾燥した樹脂を、位置１４におけるリジン側鎖を脱保護するために、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡの溶液をそれぞれ用いて９回１０分間処理する工程；
（ｉｖ）  溶液のｐＨが≧８のままになるまで、ＤＣＭ中３％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液を用いて樹脂を中和する工程；
（ｖ）  活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕリンカー部分を、脱保護されたリジン側鎖に塩基条件下でカップリングさせる工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンを用いて切断する工程；
（ｖｉｉ）  活性化されたパルミチン酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が少なくとも８５％になるまで工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程；及び
（ｉｘ）  チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、トリフルオロ酢酸少なくとも９０％（体積／体積）及びエタンジチオール少なくとも１％（体積／体積）を含む切断カクテルを使用して、２５℃にて樹脂からペプチドを切断する工程
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）  側鎖に保護された反応性官能基を有する配列番号１のペプチドのアミノ酸配列を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的様式で構築する工程［ここで、リジン１４の側鎖はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）で保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に、固相樹脂を少なくとも５時間室温で乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  位置１４におけるリジン側鎖を脱保護するために、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１％（体積／体積）トロフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液をそれぞれ用いて９回１０分間乾燥した樹脂を処理する工程；
（ｉｖ）  溶液のｐＨが≧８のままになるまで、ＤＣＭ中３％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液を用いて樹脂を中和する工程；
（ｖ）  活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕリンカー部分を塩基性条件下で、脱保護されたリジン側鎖にカップリングさせる工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンを用いて切断する工程；
（ｖｉｉ）  活性化パルミチン酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が少なくとも８５％になるまで工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程；
（ｉｘ）  ９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１，７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテルを使用して、樹脂からペプチドを切断する工程；
（ｘ）  切断後のペプチド溶液を室温でろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を≦３０℃で真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、２５：７５（体積／体積）〜３５：６５（体積／体積）の比のＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンからなる貧溶媒に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を１０〜１５℃で１〜１８時間撹拌する工程；
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  （ｘｖ−ａ）沈殿物を酢酸エチルに再懸濁させること、（ｘｖ−ｂ）得られた懸濁液を３０〜６０分間撹拌すること、及び（ｘｖ−ｃ）酢酸エチルをろ別することにより、沈殿物を４〜５回洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを真空下で乾燥させる工程
を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リジン側鎖を修飾されたペプチドを固相ペプチド合成により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
目的の化合物は、親油性に（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃａｌｌｙ）修飾されたリジン側鎖を含むエキセンディン−４誘導体である。エキセンディン−４（配列番号３）は、アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）（非特許文献１）の唾液腺により産生される３９アミノ酸ペプチドである。エキセンディン−４はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体の活性化因子であるが、これはグルカゴン受容体を有意に活性化しない。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８及び特許文献９に記載されるような、特に位置１４における脂肪酸アシル化残基での修飾は、対応する非アシル化エキセンディン−４誘導体と比較した場合、ＧＬＰ−１受容体だけでなくグルカゴン受容体でも高い活性を有するエキセンディン−４誘導体を生じる。
【０００３】
リラグルチド（配列番号４）は、修飾の中でもとりわけ、脂肪酸が位置２０におけるリジンに連結されて作用の延長された持続期間をもたらす、販売されている化学修飾されたＧＬＰ−１アナログである（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
特許文献１０は、Ｃ末端リジン残基を保有するＧＬＰ−１アナログを開示し、これは式Ｒ１−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−の親油性置換基により修飾されており、Ｒ１はメチル又はカルボキシルであり、そしてｎは８〜２５の整数である。本発明と対照的に、特許文献１０のペプチドは、Ｃ末端リジンから開始して合成され、これは最初の工程において親油性に修飾され；親油性置換基の付加に続いて、所望されるペプチドの残りのアミノ酸がＳＰＰＳを介して加えられる。さらに、乾燥した樹脂を５００ｍｌ  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３０分間膨潤させた後、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）とともに１回インキュベートすることによりＭｔｔ（４−メチルトリチル）リジン保護基が除去される（実施例を参照のこと）。残留ＤＭＦはＤＣＭ中１％ＴＦＡに対して中和効果を有しており、従ってＭｔｔ基の切断を不完全にすることに注意しなければならない。
【０００５】
特許文献１１は様々なアシル化エキセンディン−４化合物に関する。この書面の実施例のセクションにおいて、特許請求される化合物の合成が記載される。特許文献１１によれば、モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）−又はＭｔｔ−保護は、ＤＣＭ中２％ＴＦＡ及び２〜３％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の溶液を使用して除去され、これは本発明に従って使用されるＤＣＭ溶液中のＴＦＡよりも複雑である。さらに、特許文献１１は、アミノ酸配列の構築が完了した後の樹脂の予備乾燥に関して記載していない。
【０００６】
同様に、ペプチド性メラノコルチン受容体修飾因子に関する特許文献１２、並びに野生型ＧＬＰ−１（７−３７）に対して位置２６（Ｋ２６）及び３７（Ｋ３７）におけるリジンでアシル化された二重アシル化ＧＬＰ−１誘導体に関する特許文献１３は、アミノ酸配列の構築後の樹脂の予備乾燥工程に関して記載しておらず、かつ本発明で特許請求されるＭｍｔ−／Ｍｔｔ−保護基の除去のための切断溶液を開示も示唆さえもしていない。両方の出願において、切断溶液はより複雑である。
【０００７】
参照により本明細書に加入される特許文献１４は、エキセンディン−４から誘導されるペプチド性二重ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストに関し、これはアシル化リジンを含有する。この場合もやはり、この書面は、樹脂の予備乾燥もペプチドと親油性部分との間のリンカー部分のカップリングの前の樹脂に結合したペプチドの中和も開示も示唆もしていない。
【０００８】
非天然アミノ酸及び側鎖修飾、例えば、リジンのε−アミノ基又はオルニチンのδ−アミノ基又は２，４−ジアミノ酪酸のγ−アミノ基又は２，３−ジアミノプロピオン酸のβ−アミノ基を含有し得るペプチドの好ましい製造方法は、適切な樹脂上での固相合成である。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、ペプチド類への合成的アクセスのための実績のある方法である（例は：非特許文献４に示される）。
【０００９】
ペプチドの固相合成は、一般的に固体支持体保有リンカーに対するＮ末端保護アミノ酸誘導体で開始される。固体支持体は、ＳＰＰＳにおいて使用される溶媒に対して適合性であり、かつ樹脂上へのそのカルボキシ基とのアミノ酸誘導体のカップリングを可能にするいずれかのポリマーであり得る（例えば、トリチル樹脂、クロロトリチル樹脂、ペプチド酸が望ましい場合はＷａｎｇ樹脂、又はＲｉｎｋ樹脂、Ｆｍｏｃストラテジーを使用することによりペプチドアミドが得られなければならない場合にはＳｉｅｂｅｒ樹脂）。ペプチド合成の間のα−アミノ基の脱保護に使用される条件下でポリマー支持体の安定性が与えられなければならない。
【００１０】
最初のＮ末端を保護されたアミノ酸がリンカー樹脂構築物上にカップリングされた後、Ｎ末端保護基はピペリジン／ジメチルホルムアミド混合物（Ｆｍｏｃストラテジー）のような塩基を用いて切断される。例えば、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）のようなカップリング試薬を、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）又はＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）またはあるいはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ水和物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）のような第三級塩基とともに使用して、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸誘導体と遊離したアミノ基を反応させる。所望のアミノ酸配列が得られるまでこのプロセスを繰り返す。
【００１１】
アミノ酸誘導体の反応性側鎖官能基は、固相ペプチド合成に使用される条件下で安定である適切な保護基で通常ブロックされる。これらは、ペプチドが固相上で構築された後に同じ条件下で樹脂からの所望の生成物の切断に付随して除去される。保護基及びそれらの導入手順は非特許文献５に見出され得る。
【００１２】
それらを修飾するためにＳＰＰＳにおいて選択的に側鎖保護基を除去する可能性もある。このような保護基の除去のための条件は、全ての他の保護基がインタクトなままであるようにしなければならない。リジンはＤＭＦ中のヒドラジン溶液に対して不安定である１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル（ｉｖＤｄｅ）又は１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−エチル（Ｄｄｅ）基で保護され得る（非特許文献６を参照のこと）。Ｎ末端保護基、さらには全ての側鎖保護基が酸に不安定な保護基になると、ｉｖＤｄｅ−又はＤｄｅ−保護基がＤＭＦ中のヒドラジンで切断され得る。リジン側鎖から遊離したアミノ基は、その後例えば他のＦｍｏｃ−アミノ酸又は脂肪鎖で修飾され得る。同じ手順をオルニチン、２，４−ジアミノ酪酸又は２，３−ジアミノプロピオン酸に適用することができる。
【００１３】
トリフルオロ酢酸含有カクテル、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、フェノール、水、チオアニソール及び１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）を含むＫｉｎｇのカクテル（非特許文献７）を使用して、ペプチドは最終的に、全ての側鎖保護基と同時に樹脂から切断され得る。特定の反応時間の後に、樹脂をろ別し、そして粗製ペプチドはエテール中、例えばジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル又はジイソプロピルエーテル中で沈殿させる。沈殿物をろ別しても、遠心分離により溶液から分離してもよい。
【００１４】
必要な場合、粗製ペプチドをＣ１８カラムで分取用クロマトグラフィーにより精製することができる。精製のために、＞９０％又はさらにそれ以上の純度を得るために数回実行することが必要かもしれない。最終の実行は通常は塩化であり、ここで所望の対イオン、例えばアセテートが決定される。フラクションをＨＰＬＣにより分析し、そして規定された基準に従ってプールする。溶媒は例えば、蒸留、凍結乾燥、噴霧乾燥又はそれらの組み合わせにより除去され得る。結果的に精製されたペプチドが得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１８６２４０
【特許文献２】ＷＯ２０１４／０５６８７２
【特許文献３】ＷＯ２０１４／０９６１４５
【特許文献４】ＷＯ２０１４／０９６１４８
【特許文献５】ＷＯ２０１４／０９６１４９
【特許文献６】ＷＯ２０１４／０９６１５０
【特許文献７】ＷＯ２０１５／１５５１３９
【特許文献８】ＷＯ２０１５／１５５１４０
【特許文献９】ＷＯ２０１５／１５５１４１
【特許文献１０】ＥＰ  ２  ４６０  ８２５  Ａ１
【特許文献１１】ＷＯ  ２００８／０２３０５０  Ａ１
【特許文献１２】ＷＯ  ２０１１／１０４３７８  Ａ１
【特許文献１３】ＷＯ  ２０１３／１６７４５４  Ａ１
【特許文献１４】ＷＯ  ２０１５／１５５１４１  Ａ１
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｅｎｇ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６７：７４０２−０５，１９９２
【非特許文献２】Ｄｒｕｃｋｅｒ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｒｅｖ．９，  ２６７−２６８，  ２０１０
【非特許文献３】Ｂｕｓｅ，  Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３７４：３９−４７，  ２００９
【非特許文献４】Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．，  １９８４
【非特許文献５】Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９  ｏｒ  ｉｎ  Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，  Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４
【非特許文献６】Ｃｈｈａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，  １６０３，  １９９８
【非特許文献７】Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６，  ２５５−２６６，  １９９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要旨
リジン側鎖を修飾されたペプチドの固相合成のための新規な方法が本明細書において提供される。これらのペプチドは、特にエキセンディン−４誘導体であり、ここで少なくとも１つのアミノ酸、特に位置１４のメチオニンがリジンで置き換えられ、これがさらに非極性親油性残基（例えば、場合によりリンカーと結合された脂肪酸）で置換される。
【００１８】
驚くべきことに、特定の工程の順序に従うことにより、望ましくない副生成物の量を大いに減少させることができ、所望の生成物をより高い純度で増加した収率で生じるということがわかった。
【００１９】
従って、本発明は、親油性に修飾されたリジン側鎖を含む単離されたペプチドを製造する方法に関し、該方法は：
（ｉ）  固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的な様式で側鎖に保護された反応性官能基を有する該ペプチドのアミノ酸配列を構築する工程  ［ここで、修飾しようとするリジンの側鎖は、トリチルベースの保護基、特にモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）または４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）により保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に固相樹脂を乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  修飾しようとするリジン側鎖を脱保護するために、乾燥した樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液で数回処理する工程；
（ｉｖ）  樹脂を中和する工程；
（ｖ）  少なくとも１つの活性化９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）結合リンカー部分を、脱保護されたリジン側鎖にカップリングする工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーの末端官能基を脱保護する工程；
（ｖｉｉ）  活性化された親油性部分、特に活性化脂肪酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングする工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；及び
（ｉｘ）  樹脂からペプチドを切断する工程
を含む。
【００２０】
特定の実施態様において、単離されたペプチドは、３０と４４との間、特に３８と４０との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、ここで好ましくは、（ｉ）野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも６５％であり、かつ／または（ｉｉ）野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも７０％であり、かつ／または（ｉｉｉ）親油性に修飾されたリジン側鎖は、野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある。特定の好ましい実施態様において、単離されたエキセンディン−４誘導体は、アミノ酸配列Ｈ−ｄＳ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ（γＥ−Ｐａｌｍ）−Ｅ−Ｓ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ２  （配列番号１）を有する。
【００２１】
いくつかの実施態様において、工程（ｉｉｉ）におけるＤＣＭ中ＴＦＡ処理の回数は、工程（ｉｘ）における修飾されたリジン側鎖の収率が少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％になるように調整される。収率は、修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較してパーセントで示される（すなわち、８５％の収率は、ペプチドの８５％が修飾されたリジン側鎖を有し、そしてペプチドの１５％は未修飾リジン側鎖を有するままであることを意味する）。
【００２２】
例えば、工程（ｉｉｉ）において、乾燥した樹脂を、少なくとも７回少なくとも５分間、特に９回少なくとも１０分間、又は９回少なくとも１５分間、ＤＣＭ中約１％（体積／体積）ＴＦＡの溶液で処理し得る。約１．５％（体積／体積）までのＴＦＡを使用することが可能である。しかし、２％（体積／体積）ＴＦＡ及びそれ以上の濃度は、その後切断の選択性が減少するので不利である；特に、≧２％（体積／体積）ＴＦＡを含有する溶液は、例えば目的のリジン側鎖におけるモノメトキシトリチル保護基を切断するだけでなく、例えば他のアミノ酸残基におけるＢｏｃ保護基も切断する。これはこの手順のその後の工程において望ましくない多重アシル化を引き起こし得る。
【００２３】
特定の実施態様において、本発明の方法は：
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；及び
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が、修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較して少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％になるまで、場合により工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程
を更に含む。
【００２４】
特定の実施態様において、脱保護収率を分析する工程は
（ｖｉｉｉ−ａ１）  総反応バッチから樹脂の試験サンプルを取り出し、そして試験サンプルからペプチドを、工程（ｉｘ）と同じ条件下でかつ同じ切断カクテルを用いて切断すること；並びに
（ｖｉｉｉ−ａ２）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量を、修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと、特に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はＨＰＬＣと質量分析との組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ）により比較して決定すること
を含み得る。
【００２５】
特定の実施態様において、工程（ｉｘ）の切断は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まない、少なくとも９０％（体積／体積）のトリフルオロ酢酸及び少なくとも１％（体積／体積）のエタンジチオールを含む切断カクテルを用いて行われる。
【００２６】
特定の実施態様において、切断カクテルは、適切なインドール化合物、特に３−メチルインドールをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施態様において、切断カクテルは、特に９１〜９３％（体積／体積）トリフルオロ酢酸、１〜６％（体積／体積）フェノール及び１〜８％（体積／体積）エタンジチオールからなる。他の実施態様において、切断カクテルは、９６〜９８％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び２〜４％（体積／体積）エタンジチオールからなる。
【００２８】
なおさらなる実施態様において、工程（ｉｘ）の切断は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、少なくとも８０％（質量／質量）のトリフルオロ酢酸及び少なくとも１％（質量／質量）の１，２−エタンジチオールを含む切断カクテルを用いて行われる。
【００２９】
特定の実施態様において、切断カクテルは、８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる。
【００３０】
工程（ｉｘ）の切断は、例えば５〜１５℃、１５〜２２℃及び／又は２２〜３０℃、特に２５℃で行われ得る。樹脂上のペプチド１グラムあたりの切断カクテルの体積は、例えば９．５ｍｌ〜５．５ｍｌ、特に７．０ｍｌ〜６．０ｍｌであり得る。工程（ｉｘ）の切断は、例えば２〜３時間、特に２〜３時間又は２．０〜２．５時間２５℃で又は１〜１．５時間３０℃で、撹拌しながら行われ得る。
【００３１】
工程（ｉｉ）における樹脂の乾燥は、特定の実施態様において、樹脂上のペプチドを少なくとも１回脂肪族アルコールで、及び少なくとも１回ジアルキルエーテルで洗浄した後、不活性ガス、例えば窒素下で室温にて行われ得る。
【００３２】
工程（ｉｖ）における中和は、例えば、有機極性非プロトン性溶媒中の第三級アルキルアミン、例えば、ジクロロメタン中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）又はジクロロメタン中のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）又はジクロロメタン中のトリエチルアミンの１％〜５％溶液とともに少なくとも１０分間少なくとも１回インキュベートし、場合により続いて中和工程後の溶媒のｐＨを決定し、そして樹脂上のペプチドを少なくとも１回上記溶媒で、そして少なくとも１回さらなる極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄することにより行われ得る。
【００３３】
工程（ｖｉ）における脱保護は、特定の実施態様において、樹脂上のペプチドを少なくとも１回少なくとも５分間塩基で処理し、続いて少なくとも１回洗浄する工程により行われ得る。
【００３４】
工程（ｖｉｉｉ）における樹脂の乾燥は、特定の実施態様において、真空下で行われ得、その後樹脂上のペプチドを、特に≦７０ｍｂａｒの真空下で洗浄することにより行われ得る。
【００３５】
いくつかの実施態様によれば、特許請求される方法は：
（ｘ）  切断後のペプチド溶液をろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、ジアルキルエーテル及びヘプタンを含む貧溶媒（ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ）に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を撹拌する工程
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  沈殿物を洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを乾燥する工程
をさらに含む。
【００３６】
工程（ｘ）の後、樹脂フィルターケーキを、いくつかの実施態様において、少なくとも１回、例えば３回、適切なリンス溶液、例えばＴＦＡでリンスし得る。
【００３７】
工程（ｘｉ）において、蒸留は、例えば≦５０ｍｂａｒの真空で≦３０℃の温度にて行われ得る。
【００３８】
さらに、工程（ｘｉｉ）において使用される貧溶媒は、いくつかの実施態様において、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）及びｎ−ヘプタンからなる混合物、特にＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンの２５：７５（体積／体積）〜３５：６５（体積／体積）の比の混合物であり得る。
【００３９】
工程（ｘｉｉｉ）において、沈殿した溶液は、例えば１〜２０時間１０〜１５℃で撹拌され得る。
【００４０】
工程（ｘｖ）において、フィルター上の沈殿物を適切な有機溶媒、例えば酢酸エチルでリンスした後、適切な有機溶媒、例えば酢酸エチル中に沈殿物を再懸濁させ、得られた懸濁液を例えば３０〜６０分間撹拌し、そして有機溶媒をろ別することにより少なくとも１回洗浄し得る。この手順は、いくつかの実施態様によれば、酢酸エチルを用いて１〜５回、特に２〜４回、より特に３〜５回繰り返され得る。
【００４１】
いくつかの実施態様において、湿性ペプチドは、工程（ｘｖｉ）において、例えば２０〜２５℃で、特に≦７０ｍｂａｒの真空で２０〜２５℃にて窒素ストリッピングを用いて真空乾燥される。
【００４２】
いくつかの実施態様において、特許請求される方法は：
（ｉ）  側鎖に保護された反応性官能基を有する配列番号１のペプチドのアミノ酸配列を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的様式で構築する工程［ここで、リジン１４の側鎖はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）により保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に固相樹脂を少なくとも５時間室温で乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  乾燥した樹脂を、位置１４におけるリジン側鎖を脱保護するために、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡの溶液をそれぞれ用いて９回１０分間処理する工程；
（ｉｖ）  溶液のｐＨが≧８のままになるまで、ＤＣＭ中３％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液を用いて樹脂を中和する工程；
（ｖ）  活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕリンカー部分を、脱保護されたリジン側鎖に塩基条件下でカップリングさせる工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンを用いて切断する工程；
（ｖｉｉ）  活性化されたパルミチン酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が少なくとも８５％になるまで工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程；及び
（ｉｘ）  チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、少なくとも９０％（体積／体積）のトリフルオロ酢酸及び少なくとも１％（体積／体積）のエタンジチオールを含む切断カクテルを使用して、２５℃にて樹脂からペプチドを切断する工程
を含む。
【００４３】
いくつかの実施態様において、特許請求される方法は：
（ｉ）  側鎖に保護された反応性官能基を有する配列番号１のペプチドのアミノ酸配列を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的様式で構築する工程［ここで、リジン１４の側鎖はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）で保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に、固相樹脂を少なくとも５時間室温で乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  位置１４におけるリジン側鎖を脱保護するために、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１％（体積／体積）トロフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液をそれぞれ用いて９回１０分間、乾燥した樹脂を処理する工程；
（ｉｖ）  溶液のｐＨが≧８のままになるまで、ＤＣＭ中３％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液を用いて樹脂を中和する工程；
（ｖ）  活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕリンカー部分を塩基性条件下で、脱保護されたリジン側鎖にカップリングさせる工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンを用いて切断する工程；
（ｖｉｉ）  活性化パルミチン酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が少なくとも８５％になるまで工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程；
（ｉｘ）  ９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１．７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテルを使用して、樹脂からペプチドを切断する工程；
（ｘ）  切断後のペプチド溶液を室温でろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を≦３０℃で真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、２５：７５（体積／体積）〜３５：６５（体積／体積）の比のＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンからなる貧溶媒に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を１０〜１５℃で１〜１８時間撹拌する工程；
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  （ｘｖ−ａ）沈殿物を酢酸エチルに再懸濁させること、（ｘｖ−ｂ）得られた懸濁液を３０〜６０分間撹拌すること、及び（ｘｖ−ｃ）酢酸エチルをろ別することにより、沈殿物を４〜５回洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを真空下で乾燥させる工程
を含む。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
上記の親油性に修飾されたリジン側鎖を含む単離されたペプチドを製造する本発明の方法は少なくとも９つの工程を含む。
【００４５】
第一の工程（工程（ｉ））は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を経る目的のペプチドの合成に関する。上述のように、ＳＰＰＳは側鎖に保護された反応性官能基を有するペプチドのアミノ酸配列を段階的様式で構築することを含む。ペプチドは少なくとも１つのリジンを含有し、その側鎖が修飾しようとするものである。この少なくとも１つ（例えば、１、２又は３）のリジン残基の側鎖は、トリチルベースの保護基で保護される。特定の実施態様において、ペプチドは修飾されたリジン側鎖を１つだけ含有する。本出願内の特定の用途のトリチルベースの保護基はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）及び４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）である。特定の好ましい実施態様において、Ｍｍｔのみが、修飾しようとするリジン残基のためのトリチルベースの保護基として使用される。
【００４６】
本発明に従うＳＰＰＳについて、特に、様々なＲｉｎｋ−アミド樹脂、例えば４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂又は４−［（２，４−ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシアセトアミド  メチル樹脂を使用することが可能である。ローディングは、０．１と１ｍｍｏｌ／ｇとの間、特に０．２と０．９ｍｍｏｌ／ｇとの間の範囲に及び得る。特定の実施態様において、ローディングは０．２５と０．６ｍｍｏｌ／ｇとの間の範囲に及ぶ。他の実施態様において、ローディングは０．２と０．４ｍｍｏｌ／ｇとの間の範囲に及ぶ。一般的にはいずれの合成ストラテジーＳＰＰＳを使用することも可能であるが、本発明の状況では、より穏やかな脱保護条件を使用することを可能にする９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ストラテジーが好ましい。適切な塩基、例えば特にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０〜５０％の濃度のピペリジンは脱保護に使用される（すなわち、Ｒｉｎｋアミドの保護されたアミノ基から、又は後の段階で、それぞれのアミノ酸のα−アミノ基からＦｍｏｃ基を除去すること）。各アミノ酸のそれぞれ樹脂又は前のアミノ酸へのカップリングは、例えばカップリング試薬としてＤＭＦ中の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）水和物及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用する標準的な条件に従って行われる。各アミノ酸についてのカップリング時間は異なり得、一般的には２〜２２時間の範囲である。
【００４７】
ＳＰＰＳに使用され、かつその側鎖が修飾されるべきＦｍｏｃ−リジン誘導体は、特にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ又はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨである。
【００４８】
Ｎ末端アミノ酸のα−アミノ基は、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基により保護される。所望のペプチドのＮ末端アミノ酸の付加の後に、樹脂上のペプチドを洗浄する。少なくとも１回かつ１０回までの洗浄工程、特に４、５、６、７、又は８回の洗浄工程、より特に６回の洗浄工程をさらに進行する前に行う。適切な洗浄液は、脂肪族アルコール、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はイソプロパノール（ＩＰＡ）、及び／又はジアルキルエーテル、例えばジエチルエーテル、ｔｅｒｔ．ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）又はジイソブチルエーテルを含む。特定の実施態様において、洗浄はＩＰＡ及びＤＩＰＥを用いて行われる。特に、樹脂上のペプチドは、最初に少なくとも１回ＩＰＡで洗浄され、続いて少なくとも１回ＤＩＰＥで洗浄される。特定の好ましい実施態様において、樹脂上のペプチドは最初に３回ＩＰＡで洗浄され、続いて３回ＤＩＰＥで洗浄される。
【００４９】
洗浄後に、ペプチドを伴う固相樹脂を乾燥する（工程（ｉｉ））。乾燥は不活性ガス雰囲気下、例えば窒素、特に連続窒素流下（窒素ストリッピング）で行われ得る。適切には、乾燥工程（ｉｉ）は、少なくとも１時間、特に少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１６時間及び２０時間まで（例えば、終夜）行われる。いくつかの実施態様において、乾燥工程を２０時間より長く行うことも可能である。特に、乾燥は室温（１８〜２４℃）で行われる。先行技術によれば、樹脂上のペプチドは、樹脂からＭｍｔ−又はＭｔｔ−基が樹脂から切断される前に乾燥するべきではない。ペプチドのＮ末端、この場合はリジンのε−アミノ基の良好なアクセス性を確実にするために、樹脂は合成全体の間十分に膨潤されるべきであると一般的に考えられている。本発明の方法の工程（ｉｉ）に従う乾燥の間、樹脂はかなり収縮し、そして全ての反応性部位がさらなる工程のためになお自由にアクセス可能であることは予測できなかった。さらに、当業者は、さらなる乾燥工程は合成の期間を増加させ、かつより多くの量の溶媒が必要とされ、手順の費用を増加させるようなさらなる不利益を懸念していただろう。しかし驚くべきことに、この中間乾燥工程は有利であり、かつ予測された不利益を大きく上回るということが見出された。例えば、予備乾燥工程は、トリチルベースのリジン保護基のより完全な除去に有益である。
【００５０】
次いで、乾燥されて収縮した樹脂を、修飾しようとする（工程（ｉｉｉ））リジン側鎖を脱保護するためにジクロロメタン（ＤＣＭ）中トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液で数回直接処理してもよいし、例えばＴＦＡ／ＤＣＭ処理前にジクロロメタンで洗浄してもよい。ＴＦＡ／ＤＣＭの適用前に収縮した樹脂を膨潤させる必要のないことに注目することは重要である。本発明者らは、最終ペプチドの合成のこの段階においてアップスケーリング（ｕｐｓｃａｌｉｎｇ）効果、すなわち意図されたリジン修飾を有していない望ましくない副生成物の量が、合成のモルスケールが増加した場合に平均より増加することを見出した。驚くべきことに、このアプスケーリング効果のネガティブな影響を工程（ｉｉｉ）の繰り返し回数に依存して減少させることができた。従って、本発明の特定の好ましい実施態様において、樹脂結合ペプチドは、少なくとも５回、特に７、８、９又は１０回、ＤＣＭ中ＴＦＡの溶液で処理される。各処理の時間は、少なくとも５分、特に少なくとも１０分である。ＤＣＭ中のＴＦＡの濃度は、０．５〜１．５％（体積／体積）の間、特に約１％（体積／体積）、より特に１％（体積／体積）である。これらの濃度の選択は、特に１つより多くのリジン残基を含有するペプチドの合成について特定の有利な効果を有する。ＴＦＡのより高い濃度、例えばＤＣＭ中２％ＴＦＡでは、Ｍｍｔ−又はＭｔｔ−保護基が切断されるだけでなく、リジンに使用される部分的に他の保護基、例えばＢｏｃも、特に数回（例えば、６〜１２回）繰り返しを行った場合に切断され、それによりペプチド鎖中の異なるリジンの望まれない多重アシル化を引き起こす。ＴＦＡ濃度を０．５と１．５％（体積／体積）との間に維持することによりこれを避けることができる。
【００５１】
本発明の文脈において「樹脂結合ペプチド」は、本発明に従うペプチドが共有結合により結合される、固相ペプチド合成に適した樹脂を指す。
【００５２】
特定の好ましい実施態様において、樹脂結合ペプチドは、少なくとも７回少なくとも５分間、特に９回少なくとも１０分間又は９回少なくとも１５分間、ＤＣＭ中約１％（体積／体積）ＴＦＡの溶液で処理される。一実施態様によれば、処理は９回１０分間、ＤＣＭ中１％（体積／体積）ＴＦＡを用いて行われる。
【００５３】
ＤＣＭ中ＴＦＡを用いた処理工程の数は、特に合成のスケールに依存して選択され得る。例えば、１０ｍｍｏｌまでのスケールについては、ＤＣＭ中約１％ＴＦＡを用いた５回の処理が十分である。≧５０ｍｍｏｌのスケールについては、少なくとも５回の処理が行われ得る。≧１００ｍｍｏｌのスケールについては、少なくとも７回の処理が行われ得る。≧５００ｍｍｏｌのスケールについては、少なくとも９回の処理が行われ得る。例として、８００ｍｍｏｌのスケールについては、１０分間ＤＣＭ中１％（体積／体積）ＴＦＡを用いた９回の処理が行われ得る。
【００５４】
ＤＣＭの低い沸点を考えると、処理工程の間の温度はこの沸点より低く設定される。有利には、処理は約０℃、例えば０〜５℃に冷却された樹脂結合ペプチドを用いて開始される。ＴＦＡ／ＤＣＭ処理の間、温度は２５℃まで上昇し得る。例となる実施態様において、第一の処理工程は０と５℃との間の温度範囲で行われ、その後の処理工程は５と１５℃との間の温度で行われ、そして最終処理工程は１５℃２５℃との間の温度で行われる。例えば、ＴＦＡ／ＤＣＭを用いた９回の処理工程が行われる場合、それらのうちの３回は０〜５℃で、３回は５〜１５℃で、そして３回は１５〜２５℃で行われ得る。
【００５５】
ＴＦＡ／ＤＣＭ処理が完了すると、樹脂結合ペプチドを例えばＤＣＭを用いて洗浄し得る。続いて、樹脂結合ペプチドを中和する（工程（ｉｖ））。樹脂結合ペプチドは、≧７のｐＨ、特に≧７．５、より特に≧８．０に達すると十分に中和されたとみなされる。
【００５６】
中和は、有機極性非プロトン性溶媒中１％〜５％第三級アルキルアミンの溶液と共に樹脂結合ペプチドを少なくとも１回インキュベーションすることにより達成される。本出願における使用に適した中和溶液は、ジクロロメタン中ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）又はジクロロメタン中Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）又はジクロロメタン中トリエチルアミンである。特に、ＤＣＭ中ＤＩＰＥＡ２％〜４％、より特に３％（体積／体積）の溶液が使用され得る。
【００５７】
中和は少なくとも１回、特に少なくとも１０分間行われ、場合により続いて中和工程後の溶液混合物のｐＨが決定される。驚くべきことに、特により大きなスケールについて、その後のカップリング反応における良好な収率のために中和が必要であるということが見出された。さらに驚くべきことに、樹脂に存在する残留ＴＦＡは通常中和溶液中の１回インキュベーションで十分に中和されないということが見出された。したがって、最初のインキュベーション後の溶媒混合物のｐＨが酸性過ぎる場合、中和溶液との少なくとも１回のさらなるインキュベーションが行われる。特定の実施態様において、中和溶液との樹脂結合ペプチドの２回より多くのインキュベーションが行われる、例えばＤＣＭ中３％ＤＩＰＥＡとの例えば３回のインキュベーション、特に５回のインキュベーション。いくつかの実施態様において、中和溶液、例えばＤＣＭ中３％ＤＩＰＥＡとの６回のインキュベーションが行われる。
【００５８】
例となる実施態様において、中和は０と２５℃との間の温度範囲で行われる。温度を特定の狭い範囲に維持するか又は徐々に温度を上昇させることが可能である。例えば、１つより多くの中和工程が行われる場合、第一の中和は０と５℃との間の温度で行われ得るが、一方でその後の中和インキュベーションは５と１５℃との間の温度で、又は１５と２５℃との間の温度でも行われる。
【００５９】
中和に続いて、樹脂上のペプチドは、中和において使用された有機極性非プロトン性溶媒（塩基を含まない）で少なくとも１回洗浄され、そして少なくとも１回さらなる極性非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄される。ＤＭＦは、その後のカップリングがＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡの使用を含む場合に特に使用される。さらなる溶媒を用いた洗浄は特に１回より多く、例えば３回行われる。
【００６０】
目的のペプチドの次の合成工程において、少なくとも１つの９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）結合リンカー部分は標準的な手順に従って活性化され、そして脱保護されたリジン側鎖にカップリングされる（工程（ｖ））。
【００６１】
本発明に従う「リンカー部分」は、一般には、一方の末端上の脱保護されたリジンの遊離アミノ側鎖への結合及び他方の末端上の親油性部分の遊離官能基（例えば、脂肪酸のカルボキシ基）への結合に適した官能基を有する線状短鎖分子である。特に、リンカー部分は、アミノ及びカルボキシから独立して選択される末端官能基（すなわち、各末端における１つの官能基）を含有するＣ１−Ｃ１０アルキル鎖であり、ここでアルキル鎖中の炭素原子のうち１つ、２つ又は３つは酸素で置き換えられていてもよい。本発明に従う「リンカー部分」の非限定的な例は、天然及び非天然のアミノ酸、特にすべてのそれらの立体異性体形態の、β−アラニン（β−Ａｌａ）、γ−グルタミン酸（γＥ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アミノ−エトキシ−エトキシ酢酸（ＡＥＥＡｃ）及びε−アミノヘキサン酸（ＥＡＣＡ）である。
【００６２】
リジン側鎖と親油性基との間の完全リンカーは、上記リンカー部分の１つ又はそれ以上、特に１つ、２つ又は３つの同一の又は異なるリンカー部分からなるものであり得る。特定の実施態様において、完全リンカーは、β−Ａｌａ、γＥ、ＧＡＢＡ、ＡＥＥＡｃ及びＥＡＣＡから独立して選択される１つ、２つ又は３つのリンカー部分からなる。完全リンカーの具体例は、β−Ａｌａ、γＥ、ＧＡＢＡ、ＡＥＥＡｃ、ＥＡＣＡ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、γＥ−γＥ、γＥ−γＥ−γＥ、ＡＥＥＡｃ−ＡＥＥＡｃ−γＥ、及びＡＥＥＡｃ−ＡＥＥＡｃ−ＡＥＥＡｃである。特定の好ましい実施態様において、リンカーはγＥである。
【００６３】
親油性部分をカップリングしようとするリンカーの官能基（すなわち、リジン側鎖にカップリングされていない末端官能基）はＦｍｏｃにより保護されている。特定の実施態様において、Ｆｍｏｃ結合リンカー部分はＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕである。例となる実施態様において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕは、ＤＭＦ中３当量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及び６当量のＤＩＰＥＡ又はＤＭＦ中Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及び６当量のＤＩＰＥＡを用いて活性化される。
【００６４】
脱保護されたリジン側鎖を有する樹脂にカップリング混合物を加え、そして十分な時間、例えば３〜４時間インキュベートした。インキュベーションは特に撹拌しながら（例えば、３０〜１００ｒｐｍ）行われる。カップリングの完了後、カップリング混合物を樹脂から除去し、そして樹脂結合ペプチドをカップリングに使用した溶媒、例えばＤＭＦで洗浄する。完成したリンカーが１つより多くのリンカー部分からなる場合、カップリングを最初のリンカー部分の脱保護の後に繰り返す。
【００６５】
その後の工程（ｖｉ）において、工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーの末端官能基を脱保護する。Ｆｍｏｃについての脱保護条件は一般的に当業者に知られている。工程（ｖｉ）における脱保護は、特定の実施態様において、樹脂上のペプチドを少なくとも１回少なくとも５分間塩基で処理し、続いて少なくとも１回の洗浄工程を行うことにより行われる。本発明の特定の実施態様において、Ｆｍｏｃ脱保護は、適切な濃度のピペリジン、例えばＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いた少なくとも１回の処理により行われ得る。特に、脱保護は２回のインキュベーション工程で、例えば５及び２０分、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して行われる。脱保護の完了後に、さらに進める前に溶媒で少なくとも１回樹脂結合ペプチドを洗浄する。
【００６６】
次に、例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）とともにインキュベーションすることにより親油性部分を活性化して、脱保護されたリンカーへのそのカップリングの準備する。特定の実施態様において、使用しようとする親和性部分を当量のＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣとともに例えばＤＭＦ中１０分間インキュベートすることにより活性化を行う。
【００６７】
本発明に従う適切な「親油性部分」は特に脂肪酸である。脂肪酸の中でも、特にパルミチン酸、ステアリン酸及びミリスチン酸は本発明において有利に使用され得る。特定の実施態様において、パルミチン酸は親油性部分として選択される。特定の好ましい実施態様において、パルミチン酸はγＥを介して樹脂結合ペプチドのＬｙｓ（１４）にカップリングされる。
【００６８】
次いで、予め活性化された親油性部分、特に予め活性化された脂肪酸を樹脂結合ペプチドに付加する。リンカーの脱保護された末端官能基への活性化親油性部分のカップリング、すなわち本発明に従う方法の工程（ｖｉｉ）は、少なくとも２時間、特に４〜２２時間進行する。特定の実施態様において、活性化された脂肪酸、例えばパルミチン酸は、リンカーの末端官能基として脱保護されたアミノ基を有する樹脂結合ペプチドに付加され、そしてＨＯＢｔ水和物／ＤＩＣを使用してカップリングされる。特定の好ましい実施態様において、脱保護されたアミノ基を有するリンカーはγＥである。
【００６９】
カップリングの完了後に、カップリング溶液を樹脂から除去し、そして樹脂をカップリング工程の溶媒で少なくとも１回洗浄する。異なる溶媒を用いたさらなる洗浄も同様に行われ得る。特定の実施態様において、樹脂結合ペプチドを、カップリングに使用した溶媒、例えばＤＭＦで少なくとも１回、脂肪族アルコール、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はイソプロパノール（ＩＰＡ）で少なくとも１回、そしてジアルキルエーテル、例えばジエチルエーテル、ｔｅｒｔ．ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）又はジイソブチルエーテルで少なくとも１回で洗浄する。例となる実施態様において、以下の洗浄が行われる：２回ＤＭＦ、３回ＩＰＡ、３回ＤＩＰＥ。さらなる例となる実施態様において、以下の洗浄が行われる：３回ＤＭＦ、３回ＩＰＡ、３回ＤＩＰＥ。
【００７０】
樹脂上の洗浄されたペプチドは、次の工程（工程（ｖｉｉｉ））において乾燥される。樹脂の乾燥は、特定の実施態様において真空下で行われ得る。他の実施態様において、乾燥は不活性ガス下、例えば連続窒素流中で（ストリッピング窒素）行われる。
【００７１】
工程（ｖｉｉｉ）の完了後に、ペプチドは樹脂から切断される準備ができ、これは本発明の方法の工程（ｉｘ）において行われる。
【００７２】
十分なパーセンテージのペプチドが所望の親油性修飾を有することを確実にするために、特定の実施態様では直接切断反応には進まない。むしろ、これらの実施態様において、「工程内管理」が行われる。したがって、これらの実施態様において、樹脂結合ペプチドが本発明の方法の工程（ｖｉｉｉ）において乾燥された後、樹脂結合ペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する（工程（ｖｉｉｉ−ａ））。
【００７３】
特定の実施態様において、脱保護収率の分析は、
（ｖｉｉｉ−ａ１）総反応バッチから樹脂の試験サンプルを取り出し、そして工程（ｉｘ）と同じ条件下でかつ同じ切断カクテルを用いて試験サンプルからペプチドを切断すること；及び
（ｖｉｉｉ−ａ２）修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較して、特に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はＨＰＬＣ及び質量分析の組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ）により、修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量を決定すること
を含み得る。
【００７４】
試験サンプルは総反応バッチと比較して小さい。総反応バッチの０．１％以下のサンプルサイズが通常は十分である。
【００７５】
工程（ｖｉｉｉ−ａ）の分析の結果に依存して、修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が十分になるまで場合により工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す。修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの十分な含有量は、修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較して少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％、又は＞９５％にもなり得、例えば９６、９７、９８又は９９％であり得る。例えば、第一の試験切断が５０％の修飾されたリジン側鎖の含有量を示す場合、再処理（すなわち、工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返すこと）が収率を増加させるために有利である。再処理の後に修飾されたリジン側鎖の含有量が例えば８５％より高い場合、工程（ｉｘ）、すなわち、樹脂からの大部分のペプチドの切断に進むことが可能である。他方で再処理収率が例えば６０％までの修飾されたリジン側鎖の含有量の増加のみである場合、さらなる再処理が示される。再処理と組み合わせてＩＰＣが導入される場合、合成工程が繰り返され得るか、又は生成物の収率及び／若しくは純度を最適化するために調整され得るので、本発明の方法はアップスケーリング効果と無関係になる。
【００７６】
したがって、本発明の特定の好ましい実施態様において、Ｍｍｔ切断はＤＣＭ中１％ＴＦＡを用いて９回少なくとも１０分間行われ、中和はｐＨ制御しながら行われ、そして特により大規模について再処理が適用される。
【００７７】
修飾されたリジン側鎖を有する所望のペプチドの収率及び／又は純度を増加させるための１つの特定の手段は、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）におけるＤＣＭ中ＴＦＡを用いた処理の回数を調整することであるということが見出された。例えば、目的のペプチド中の修飾されたリジン側鎖の含有量が低すぎる場合、ＴＦＡ／ＤＣＭ処理の回数は増加され得る。工程（ｉｉｉ）におけるＤＣＭ中ＴＦＡ処理の回数は、工程（ｉｘ）において修飾されたリジン側鎖の収率が少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％、又は＞９５％にも、例えば９６、９７、９８又は９９％になるように特に調整される。
【００７８】
試験切断により所望の結果が得られると（すなわち、未修飾リジン側鎖を有する最小量の副生成物）、又は試験切断が行われない場合、工程（ｖｉｉｉ）の後にそのまま樹脂からのペプチドの切断が行われる。本発明の状況において、切断は好ましくは特異的に開発された切断カクテルを使用して行われ、これは従来使用されたトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、フェノール、水、チオアニソール及び１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）を含有するＫｉｎｇのカクテル（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、２５５−２６６、１９９０）と比較して有利である。
【００７９】
切断されたペプチドのより良好な収率、より高い含有量及びより良好な純度は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含有しない切断カクテルを使用した場合に達成することができるということが見出された。特に、本発明に従う適切な切断カクテルは、少なくとも９０％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び少なくとも１％（体積／体積）エタンジチオールを含み、かつチオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まない。本発明のさらなる適切な切断カクテルは、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、かつ少なくとも８０％（質量／質量）トリフルオロ酢酸及び少なくとも１％（質量／質量）１，２−エタンジチオールを含む。本発明の状況において、密度に関する計算を、トリフルオロ酢酸について１．５３ｇ／ｃｍ３（２０℃で）及び１，２−エタンジチオールについて１．１２ｇ／ｃｍ３  （２０℃で）の値を用いて行った。例えば、これらの値を使用して、例えば、質量対質量（質量／質量）比を計算するために所定の体積からＴＦＡ又はＥＤＴの質量を計算することができる。
【００８０】
例となる実施態様において、９１〜９３％（体積／体積）トリフルオロ酢酸、１〜６％（体積／体積）フェノール及び１〜８％（体積／体積）エタンジチオールからなる切断カクテルが使用される。他の実施態様において、９６〜９８％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び２〜４％（体積／体積）エタンジチオールからなる切断カクテルが使用される。
【００８１】
本発明に従う特定の例となる切断カクテルは、（ｉ）約９２．２％（体積／体積）トリフルオロ酢酸、約５．１％（体積／体積）フェノール及び約２．７％（体積／体積）エタンジチオールからなる溶液、並びに（ｉｉ）約９７．１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び約２．９％（体積／体積）エタンジチオールからなる溶液である。
【００８２】
さらに、樹脂からのペプチドの切断の間にＲｉｎｋリンカー及びトリプトファン残基の分解産物により形成される特定の望ましくない副生成物の発生を効率的に抑制する助けとなるので、追加のスカベンジャーとしての適切なインドール化合物の使用は、特許請求された方法をさらに改善するということが本発明者らにより見出された。Ｏｇａｗａら（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６（１０）  ３１４４−３１４９  （１９７８））は、Ｚ（ＯＭｅ）−Ｔｒｐ−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨのＴＦＡでの処理の間の副反応を抑制するための３−メチルインドールの使用に言及する。しかし、３−メチルインドールは、アニソール及びＥＤＴ、チオアニソール及びＥＤＴ又はジメチルスルフィド及びＥＤＴと一緒にスカベンジャー系の一部として使用されるだけである。本発明に従う適切なインドール化合物は、上述の望ましくない副生成物を効率的に除去するものである。例えば、適切なインドール化合物は、炭素原子Ｃ３又は窒素原子に低級（Ｃ１−Ｃ３）アルキル又は低級アシル（Ｃ１−Ｃ３）置換基を有するインドール、特にＮ−アセチルインドール及び３−メチルインドール（スカトールとしても知られる）であり得る。特定の実施態様において、３−メチルインドールがインドール化合物として使用される。
【００８３】
したがって、本発明のさらなる適切な切断カクテルは、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、かつ少なくとも９０％（質量／質量）トリフルオロ酢酸、少なくとも１％（質量／質量）１，２−エタンジチオール及び少なくとも０．５％（質量／質量）の適切なインドール化合物、例えば、３−メチルインドールを含む。さらなる例となる実施態様において、８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドール（３−ＭＩ）からなる切断カクテル、特に９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１．７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテルが使用される。
【００８４】
本発明に従うさらなる例となる切断カクテルは、（ｉｉｉ）約９７％（質量／質量）ＴＦＡ、約２％（質量／質量）ＥＤＴ及び約１％  ３−ＭＩからなる溶液、並びに（ｉｖ）約９６．９％（質量／質量）ＴＦＡ、約２．３％（質量／質量）ＥＤＴ及び約０．８％（質量／質量）３−ＭＩからなる溶液である。
【００８５】
樹脂からのペプチドの切断は、比較的広い温度範囲で行われ得る。特に、切断は５〜１５℃、１５〜２２℃及び／又は２２〜３０℃で、特に２５℃で行われ得る。特定の実施態様において、切断は室温（１８〜２４℃）で行われる。インキュベーション時間は好ましくはできるだけ短い。通常は、約４時間、特に室温で４時間のインキュベーションが許容しうる切断を得るために十分である。しかし、本発明の特定の好ましい実施態様において、２５℃での切断反応を行う場合、切断時間は２時間だけに減らすことができ、これはＴＦＡへのペプチドの曝露がかなり減らされるという利点を有する。驚くべきことに、温度の増加にもかかわらず、望ましくない異性体の形成が有意に増加しないということが見出された。例となる実施態様において、切断は２〜３時間、特に２５℃で２〜３時間又は２．０〜２．５時間、撹拌しながら（例えば、３０〜１００ｒｐｍで）行われる。他の実施態様において、切断は３０℃で１〜１．５時間、撹拌しながら（例えば、３０〜１００ｒｐｍで）行われる。
【００８６】
さらに、又はあるいは、樹脂上のペプチド１グラムあたりの切断カクテルの体積は、後の処理及び精製を容易にするように調整され得る。驚くべきことに、切断カクテルの体積を、従来の手順と比較して少なくとも１０％、特に少なくとも２０％及び３０％まで減らすことができるということが見出された。約９ｍｌ／ｇ、例えば９．２ｍｌ／ｇのＫｉｎｇのカクテルの標準的な体積を考慮して、この体積は例となる実施態様では約２４％減らすことができた。定量的スケールで、これは樹脂上のペプチド１グラムあたりの切断カクテルの体積が例えば９．５ｍｌから５．５ｍｌ、特に７．０ｍｌから６．０ｍｌであることを意味する。
【００８７】
特定の実施態様において、本発明の方法の工程（ｉｘ）に従う切断は、
（ａ）９１〜９３％（体積／体積）トリフルオロ酢酸、１〜６％（体積／体積）フェノール及び１〜８％（体積／体積）エタンジチオール、例えば、約９２．２％（体積／体積）ＴＦＡ、約５．１％（体積／体積）フェノール及び約２．７％ＥＤＴからなる切断カクテル、
（ｂ）２５℃の上昇した温度で２．０〜２．５時間のインキュベーション時間、並びに
（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたり切断カクテルの減少した体積、例えば７．０ｍｌ〜６．０ｍｌ
を使用して行われる。
【００８８】
特定の好ましい実施態様において、本発明の方法の工程（ｉｘ）に従う切断は、
（ａ）９１〜９３％（体積／体積）トリフルオロ酢酸、１〜６％（体積／体積）フェノール及び１〜８％（体積／体積）エタンジチオール、例えば、約９２．２％（体積／体積）ＴＦＡ、約５．１％（体積／体積）フェノール及び約２．７％ＥＤＴからなる切断カクテル、
（ｂ）２５℃の上昇した温度で２時間だけのインキュベーション時間、並びに
（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたりの切断カクテルの減少した体積、例えば７．０ｍｌ〜６．０ｍｌ
を使用して行われる。
【００８９】
他の実施態様において、本発明の方法の工程（ｉｘ）に従う切断は、
（ａ）９６〜９８％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び２〜４％（体積／体積）エタンジチオール、例えば、約９７．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び約２．９％（体積／体積）ＥＤＴからなる切断カクテル、
（ｂ）２５℃の上昇した温度で２．０〜２．５時間のインキュベーション時間、並びに
（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたり切断カクテルの減少した体積、例えば７．０ｍｌと６．０ｍｌとの間
を使用して行われる。
【００９０】
他の好ましい実施態様において、本発明の方法の工程（ｉｘ）に従う切断は、
（ａ）９６〜９８％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び２〜４％（体積／体積）エタンジチオール、例えば、約９７．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び約２．９％（体積／体積）ＥＤＴからなる切断カクテル、
（ｂ）２５℃の上昇した温度で２時間のみのインキュベーション時間、並びに
（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたり切断カクテルの減少した体積、例えば７．０ｍｌと６．０ｍｌとの間
を使用して行われる。
【００９１】
さらに他の好ましい実施態様において、本発明の方法の工程（ｉｘ）に従う切断は、
（ａ）８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテル、特に９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１．７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−ＭＩ、例えば、約９７％（質量／質量）ＴＦＡ、約２％（質量／質量）ＥＤＴ及び約１％３−ＭＩからなる切断カクテル、
（ｂ）２５℃の上昇した温度で２〜２．５時間のみのインキュベーション時間、並びに
（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたり切断カクテルの減少した体積、例えば７．０ｍｌと６．０ｍｌとの間
を使用して行われる。
【００９２】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、樹脂からペプチドを切断した後にさらなる工程、すなわち：
（ｘ）  切断後にペプチド溶液をろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、ジアルキルエーテル及びヘプタンを含む貧溶媒に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を撹拌する工程
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  沈殿物を洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを乾燥する工程
を含む。
【００９３】
これらの工程は、目的のペプチドのさらなる精製に役立つ。まず第一に、工程（ｉｘ）の切断生成物のろ過（工程（ｘ））は、固体支持体からの親油性に修飾されたペプチドの分離を可能にする。ろ過は通常室温で行われる。固体支持体から残留ペプチドを完全に回収するために、残留フィルターケーキを少なくとも１回適切なリンス溶液で洗浄する。本発明に従う適切なリンス溶液はトリフルオロ酢酸である。フィルターケーキは１回〜５回、特に３回ＴＦＡでリンスされ得る。
【００９４】
集めたろ液画分（第一のろ過からのろ液及びフィルターケーキのリンスからのろ液）をプールし、そして体積を減らすために工程（ｘｉ）において真空蒸留にかける。幾つかの実施態様において、適用される真空は≦５０ｍｂａｒであり、かつ蒸留温度は≦３０℃である。例となる実施態様において、溶液は約１〜約２．５時間、例えば１．５〜２時間蒸留される。蒸留はペプチド含有溶液の体積を沈殿前の体積の約３分の１に減らす。ペプチドは残留画分中に留まり、蒸留物は主にＴＦＡを含有する。
【００９５】
蒸留の後に、濃縮したペプチド含有溶液を、ジアルキルエーテル及びヘプタンを含む貧溶媒に加える（工程（ｘｉｉ））。いくつかの実施態様において、貧溶媒はジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）及びｎ−ヘプタンからなる混合物である。ＤＩＰＥ対ｎ−ヘプタンの比は、例えば２５：７５〜３５：６５（体積／体積）の範囲であり得る。例となる実施態様において、比ＤＩＰＥ／ｎ−ヘプタンは２５：７５（体積／体積）又は３０：７０（体積／体積）又は３５：６５（体積／体積）である。
【００９６】
濃縮されたペプチド含有溶液が移された溶液を、収率を最大にするために通常は適切な溶媒、例えばＴＦＡで１回リンスする。
【００９７】
特定の実施態様において、貧溶媒は約０〜５℃に予め冷却される。幾つかの実施態様によれば、この予め冷却した貧溶媒に、ペプチド含有溶液を約２０〜約６０分の時間をかけて加える。
【００９８】
貧溶媒は、ペプチド含有溶液から目的のペプチドを沈殿させるために必要とされる。沈殿はジアルキルエーテルだけを使用した場合にも可能である。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、特にｎ−ヘプタンを含有する貧溶媒がその後のろ過に必要とされる時間に有利に影響を及ぼすということを見出した。例えば、２５：７５（体積（体積）〜３５：６５（体積／体積）の範囲のＤＩＰＥ／ｎ−ヘプタン混合物を使用することにより、沈殿後のろ過時間は、貧溶媒としてＤＩＰＥのみの使用と比較して約６０倍まで減らすことができる（実施例を参照のこと）。
【００９９】
ペプチド含有溶液の貧溶媒への添加が完了した後、得られたペプチド懸濁液を、例えば約１０〜１５℃にテンパリングする。その後、沈殿物を熟成させ（工程（ｘｉｉｉ））、すなわち、例えば２０〜３０ｒｐｍ及び例えば１０〜１５℃の温度で特定量の時間撹拌する。例えば、熟成は１〜２０時間、例えば、２〜１８時間又は１０〜２０時間行われる。
【０１００】
熟成工程（ｘｉｉｉ）が完了すると、沈殿した溶液を、主にＤＩＰＥ、ヘプタン及びＴＦＡからなる母液から所望のペプチド、すなわち沈殿物を分離するために、ろ過にかける（工程（ｘｉｖ））。次いでフィルター上の沈殿物を適切な有機溶媒、例えば、酢酸エチルでリンスしてもよい。
【０１０１】
その後、フィルター上の沈殿物を少なくとも１回洗浄する（工程（ｘｖ））。特定の実施態様において、フィルター上の沈殿物を洗浄することは、（ｘｖ−ａ）沈殿物を適切な有機溶媒に再懸濁すること、（ｘｖ−ｂ）得られた懸濁液を撹拌すること、及び（ｘｖ−ｃ）有機溶媒をろ別することを含む。例となる有機溶媒は酢酸エチルである。撹拌は例えば３０〜６０分行われ得る。いくつかの実施態様において、沈殿物を少なくとも２回、又は少なくとも３回洗浄する。特定の実施態様において、沈殿物を１〜５回、特に２〜４回又は３〜５回又は４〜５回酢酸エチルで洗浄する。
【０１０２】
最後の洗浄の洗浄液をろ別した後、沈殿物、すなわち目的の粗製湿性ペプチドを乾燥する。乾燥は真空下で、例えば２０〜２５℃で行われ得る。いくつかの実施態様において、乾燥は≦７０ｍｂａｒの真空下で２０〜２５℃にてかつ窒素ストリッピングで行われる。
【０１０３】
本発明に従う親油性に修飾されたリジン側鎖を含む単離されたペプチドは、特に３０と４４との間、より特に３８と４０との間のアミノ酸長、より特に３９アミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、ここで好ましくは（ｉ）野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも６５％であり、かつ／又は（ｉｉ）野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも７０％であり、かつ／又は（ｉｉｉ）親油性に修飾されたリジン側鎖は野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある。
【０１０４】
説明の目的のために、野生型エキセンディン−４（配列番号３）のアミノ酸位置の割り当ては以下のとおり提供される：
【化１】
2019533666.tif 000002
【０１０５】
野生型（ｗｔ）エキセンディン−４のアミノ酸１〜１３に対応する領域における少なくとも６５％の同一性は、最大４つのアミノ酸が野生型エキセンディン−４と比較して置換されていることを意味する。特に、この領域中の変異に適した位置は位置１、２、３、１０、１２及び１３である。特定の好ましい実施態様において、野生型（ｗｔ）エキセンディン−４のアミノ酸１〜１３に対応する領域は位置２及び３に変異を含有する。特定の好ましい実施態様において、変異はＧｌｙ２Ｄ−Ｓｅｒ（すなわち、位置２におけるグリシンからＤ−セリンへの変異）及びＧｌｕ３Ｇｌｎ（すなわち、位置３におけるグルタミン酸からグルタミンへの変異）である。
【０１０６】
ｗｔエキセンディン−４のアミノ酸２２〜３９に対応する領域における少なくとも７０％の同一性は、最大５つのアミノ酸がｗｔエキセンディン−４と比較して置換されていることを意味する。特に、本発明に従うこの領域における変異に適した位置は、位置２３、２４、２７、２８、２９及び３５である。特定の好ましい実施態様において、野生型（ｗｔ）エキセンディン−４のアミノ酸２２〜３９に対応する領域は位置２８に変異を含有する。特定の好ましい実施態様において、変異はＡｌａ２８Ａｓｎ（すなわち、位置２８におけるアラニンからアスパラギンへの変異）である。
【０１０７】
特定の好ましい実施態様において、単離されたペプチドはエキセンディン−４誘導体であり、そして修飾されたリジン側鎖を１つのみ含有する。この単一の修飾されたリジンは、特に野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４に位置する。
【０１０８】
特定の実施態様において、単離されたペプチドは３９アミノ酸長を有し、野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも６５％であり、野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも７０％であり、そして親油性に修飾されたリジン側鎖は、野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある。
【０１０９】
さらなる実施態様において、単離されたペプチドは３９アミノ酸長を有し、野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも８０％であり（すなわち、２以下の変異を含有する）、野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも９０％であり（すなわち、１以下の変異を含有する）、そして親油性に修飾されたリジン側鎖は、野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある。特定の好ましい実施態様において、本発明の単離されたペプチドは、野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域において正確に２つの変異を含有し、野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域において正確に１つの変異を含有し、そして親油性に修飾されたリジン側鎖は、それぞれ野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある。
【０１１０】
特定の好ましい実施態様において、単離されたペプチドは、アミノ酸配列Ｈ−ｄＳ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ（γＥ−Ｐａｌｍ）−Ｅ−Ｓ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ２  （配列番号１）を有する。本発明の文脈における「γＥ−Ｐａｌｍ」は、（Ｓ）−４−カルボキシ−４−ヘキサデカノイルアミノブチリル部分を表し、そして「ｄＳ」はＤ−Ｓｅｒを表す。
【０１１１】
本発明は以下の実施例により更に説明される。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：Ｒｉｎｋアミド樹脂を使用した固相ペプチド合成
第一の実施例において、配列番号１のアミノ酸配列を、Ｒｉｎｋアミド樹脂及びＦｍｏｃストラテジーを使用してＳＰＰＳにより合成した。
【０１１３】
樹脂のローディング：  固相合成を、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで２回（５分及び２０分）脱保護されたＲｉｎｋアミド樹脂（４−［（２，４−ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシ  アセトアミドメチル樹脂）から始めた。樹脂のローディングは０，２〜０，９ｍｍｏｌ／ｇの範囲であり得る。樹脂をＤＭＦで徹底的に洗浄した。ついでＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを、Ｒｉｎｋ樹脂上の遊離アミノ基上に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸に対して当モル量で使用するカップリング試薬ＤＭＦ中ＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣを使用してカップリングした。カップリング時間は１８〜２２時間の範囲であり得る。この後樹脂を再びＤＭＦで数回洗浄した。
【０１１４】
線状鎖のペプチド構築：第一のＦｍｏｃ−アミノ酸を樹脂上にカップリングした後、Ｆｍｏｃ基を再びＤＭＦ中２０％ピペリジン（５分及び２０分）で除去し、続いてＤＭＦで徹底的に洗浄し、そして再びＤＭＦ中ＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣをカップリング試薬として使用してＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨである次のＦｍｏｃ−アミノ誘導体をカップリングした。繰り返しサイクルにおいて、線状配列は、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨが使用される位置２まで合成された。カップリング時間は２〜２２時間の範囲の範囲に及び、ビルディングブロック及びカップリング試薬の当量は２〜３，５の範囲に及ぶ。位置３７／３６にはジペプチドＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨを使用した。位置１には、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨをカップリングした。カップリング及び脱保護構成、さらには洗浄工程は１０℃〜４０℃の温度範囲で行うことができる。
【０１１５】
以下のＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を適用した：位置３９、３３、３２、１６、１１、８についてＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；位置３８及び３１についてＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；位置３７及び３６についてＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨ；位置３５、１９、１８についてＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；位置３４、３０、２９、４についてＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；位置２７、１７、１２についてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；位置２６、１０についてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；位置２５についてＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；位置２４、１５についてＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；位置２３についてＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；位置２２、６についてＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；位置２１、９についてＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；位置２０、１３、３についてＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；位置１４についてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ又はあるいはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ；位置７、５についてＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；位置２についてＦｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ；位置１についてＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。
【０１１６】
実施例２：Ｌｙｓ（１４）側鎖の修飾
実施例１のペプチドを位置１４においてさらに修飾し、ここで本発明に従って親和性部分が結合される。驚くべきことに、Ｍｍｔ切断に関してアップスケール効果が見出された。
【０１１７】
ＴＦＡ／ＤＣＭを用いた樹脂結合ペプチドの処理：  Ｌｙｓ（１４）の側鎖からのＭｍｔ−基（モノメトキシトリチル）の選択的かつ完全な除去は、この記載における中心的部分のうちの１つである。切断は実験室スケール（８ｍｍｏｌ）でジクロロメタン（ＤＣＭ）中１％ＴＦＡを用いて行われた。Ｍｍｔ−基の除去のために、樹脂をＤＣＭで洗浄し、そしてＤＣＭ中１％ＴＦＡで３回処理した。その後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕを、ＤＭＦ中３当量（ｅｑ）のＨＢＴＵ及び６ｅｑ  ＤＩＰＥＡを使用して３倍過剰で遊離アミノ基上にカップリングした。ＤＭＦで数回洗浄した後、Ｆｍｏｃ基を切断し、樹脂を再び洗浄し、そしてＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣを使用してパルミチン酸をカップリングした。その後Ｋｉｎｇのカクテルを用いてペプチドを樹脂から切断し、そしてＨＰＬＣにより分析した。所望の生成物配列番号１は、４．３％の配列番号２と一緒に見られ、ここでＬｙｓ（１４）の側鎖は欠けていた。
【０１１８】
配列番号２
Ｈ−ｄＳ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｅ−Ｓ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ２
４．３％の配列番号２の存在は、Ｍｍｔ−基の不完全な除去により説明することができる。
【０１１９】
固相合成を、３６ｍｍｏｌスケールで同じプロトコルを用いて繰り返し、そして驚くべきことに、配列番号２の量が１２．６％に増加したことが見出された。すでにパイロットスケール（８００ｍｍｏｌ）での次の合成のために、ＤＣＭ中１％ＴＦＡを用いた５回の処理を適用し、そして２８．７％の配列番号２が検出された。
【０１２０】
これらの予期せぬ結果はアップスケーリング効果に起因する。
【０１２１】
【表１】
2019533666.tif 000003
【０１２２】
Ｍｍｔ基の切断有効性を改善するためにいくつかのさらなる試みを行った。切断工程を７回の処理に増やし、これにより配列番号２のパーセンテージは１５．７％となった（スケール＝８００ｍｍｏｌ）。
【０１２３】
次の試験において、樹脂を乾燥した後ＤＣＭ中１％ＴＦＡで処理した。したがって、樹脂上の線状ペプチドをイソプロパノールで３回そしてジイソプロピルエーテルで３回洗浄し、そして窒素パージ下で＞１６時間乾燥した。その後、樹脂をそのままＤＣＭ中ＴＦＡで７回処理し、続いて１回ＤＣＭで洗浄し、そしてｐＨ＞８になるまでＤＣＭ中３％ＤＩＰＥＡを用いて中和工程を行った。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ及びパルミチン酸のカップリングをすでに記載したように行った。樹脂からのペプチドの切断後に、粗生成物を１２．５％のパーセンテージの配列番号２とともに得た（スケール＝６８０ｍｍｏｌ）。
【０１２４】
さらに、前述のように予備乾燥工程を適用してＭｍｔ基の切断を８回行った。樹脂からのペプチドの切断後に、粗生成物を８．４％のパーセンテージの配列番号２とともに得た（スケール＝６８０ｍｍｏｌ）。
【０１２５】
次に、前述した予備乾燥工程を適用して切断を９回行った。樹脂からペプチドを切断した後、粗生成物を３．６％の配列番号２のパーセンテージで得た（スケール＝６８０ｍｍｏｌ）。
【０１２６】
【表２】
2019533666.tif 000004
【０１２７】
したがって、最も良好な結果は、予備乾燥、ＴＦＡ／ＤＣＭを用いた９回の処理、及びその後の中和の組み合わせで達成された。
【０１２８】
再処理工程：スケールをさらに増加させようとする場合に（すなわち、＞８００ｍｍｏｌに、おそらく４０００〜５０００ｍｍｏｌ）さらなるアップスケーリング効果に依存しないように、再処理工程を確立することができた。従って、配列番号１の樹脂（１ｇ）からの試験切断は実行されて特定量の配列番号２とともに粗製ペプチドを生じる。配列番号２のパーセンテージに依存して、再処理工程が行われ得る。この目的のために、樹脂上の乾燥したペプチドをＤＣＭ中１％ＴＦＡで５回処理し、ＤＣＭ中３％ＤＩＰＥＡでｐＨ＞８に達するまで中和し、ＤＣＭで洗浄し、そしてＤＭＦで数回洗浄した。ついでＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（３  ｅｑ）のカップリングをカップリング試薬ＨＢＴＵ（３  ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（６  ｅｑ）を用いて行った。カップリングが完了した後、Ｆｍｏｃ基を前記のように除去し、そしてパルミチン酸をＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣを使用してカップリングした。
【０１２９】
以下のワークフローは、再処理無しで、Ｍｍｔ切断とその後のカップリングについての主要な手順を示す。
【０１３０】
ａ）  Ｎ末端アミノ酸（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）のカップリング後に、樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２回洗浄する。
ｂ）  樹脂を３回イソプロパノール（ＩＰＡ）及びジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）で洗浄し、樹脂は収縮する。
ｃ）  樹脂を連続窒素気流により数時間、好ましくは終夜乾燥する。
ｄ）  樹脂をＴＦＡ（ＤＣＭ中１％）で９回それぞれ１０分間処理する。
ｅ）  樹脂をＤＣＭで洗浄
ｆ）  ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ中３％）を用いてそれぞれ１０分間樹脂を処理することによる数回の中和工程、洗浄液のｐＨ管理、終点：ｐＨ＞８
ｇ）  ＤＣＭ（１ｘ）そしてＤＭＦ（３ｘ）での洗浄
ｈ）  ３  ｅｑ  ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及びＤＭＦ中６  ｅｑ  ＤＩＰＥＡを用いた３  ｅｑ  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕの活性化。あるいは他の塩基性カップリング条件が使用され得るか、ＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣも使用され得る。カップリング混合物を樹脂に加える。カップリングは３〜４時間進行する。
ｉ）  カップリング混合物を樹脂から除去する。樹脂を２回ＤＭＦで洗浄する。
ｊ）  Ｆｍｏｃ基をピペリジン（ＤＭＦ中２０％）で５分間及び２０分間２回処理することにより切断する
ｋ）  切断溶液を樹脂から洗浄し、そして樹脂を６回ＤＭＦで洗浄する
ｌ）  ３〜３．５  ｅｑのパルミチン酸を、３〜３．５  ｅｑ  ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）及び３〜３．５  ｅｑのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて１０分間ＤＭＦで活性化する。予め活性化した脂肪酸を樹脂に与える。カップリングは４〜２２時間進行する。
ｍ）  カップリング溶液を樹脂から除去する。樹脂を２回ＤＭＦで、３回ＩＰＡでそして３回ＤＩＰＥで洗浄し、そして真空乾燥する。
ｎ）  試験切断が最小量の配列番号２のみを示す場合、樹脂上のペプチドはここで切断されて粗製ペプチドを得る準備ができている。
【０１３１】
以下のスキームは、Ｍｍｔ切断とその後のカップリングについての主要な手順を示す。
【化２】
2019533666.tif 000005
【０１３２】
以下のワークフローは、Ｍｍｔ切断とその後のカップリングについての主要な再処理手順を示す。
【０１３３】
ａ）  乾燥した樹脂を５〜９回ＴＦＡ（ＤＣＭ中１％）でそれぞれ１０分間処理する
ｂ）  樹脂をＤＣＭで洗浄する
ｃ）  樹脂をジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ中３％）でそれぞれ１０分間処理することによる数回の中和工程、洗浄液のｐＨ管理、終点：ｐＨ＞８
ｄ）  ＤＣＭ（１ｘ）及びＤＭＦ（３ｘ）で洗浄
ｅ）  ＤＭＦ中３  ｅｑ  ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及び６  ｅｑ  ＤＩＰＥＡを用いた３  ｅｑ  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕの活性化。あるいは他の塩基性カップリング条件が使用され得るか又はＨＯＢｔ水和物及びＤＩＣも使用され得る。カップリング混合物を樹脂に加える。カップリングは３〜４時間進行する
ｆ）  カップリング混合物を樹脂から除去する。樹脂をＤＭＦで２回洗浄する
ｇ）  Ｆｍｏｃ基をピペリジン（ＤＭＦ中２０％）で５分間及び２０分間２回処理することにより切断する
ｈ）  切断溶液を樹脂から洗浄し、そして樹脂を６回ＤＭＦで洗浄する
ｉ）  ３〜３．５  ｅｑのパルミチン酸を３〜３．５  ｅｑヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）及び３〜３．５  ｅｑジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて１０分間ＤＭＦ中で活性化する。予め活性化された脂肪酸を樹脂に与える。カップリングは４〜２２時間進行する
ｊ）  カップリング溶液を樹脂から除去する。樹脂をＤＭＦで２回、ＩＰＡで３回そしてＤＩＰＥで３回洗浄し、そして真空下で乾燥する
ｋ）  樹脂上のペプチドはここで切断されて粗生成物を得る準備ができている。
場合により再処理手順とともにこの新規なＭｍｔ切断手順の適用は、少量の望ましくない配列番号２を伴う粗製ペプチドへのアクセスを可能にする。
【０１３４】
要約すると、高い率のＬｙｓ（１４）の修飾を達成するために以下の鍵となる工程が取られ得る：予備乾燥した樹脂を用いてＭｍｔ切断を開始し、ＤＣＭ中１％ＴＦＡを９回用いてＭｍｔ切断を行い、ｐＨ制御をしながら中和工程を行い、Ｍｍｔ切断が完了しなかった場合にはより大きなスケールのための再処理手順を適用する。
【０１３５】
実施例３：樹脂からのペプチドの切断
固相合成が終了した後、ペプチドを樹脂から切断しなければならず、そしてまた酸に不安定な側鎖保護基を除去しなければならない。これらの同時に起こる反応は、８２．５％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％水、２．５％  １，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、５％チオアニソール及び５％フェノール（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６、２５５−２６６、１９９０）からなるＫｉｎｇのカクテルを用いて行われ得る。切断は室温（２０℃）で４時間行われる。条件はペプチドごとに、配列番号１についても最適化することができる。しかし、驚くべきことに、他の切断カクテルが以下に詳細に示すように、より良好な結果をもたらすということが見出された。
【０１３６】
第一の実験セットにおいて、樹脂上のペプチドのサンプルを様々な切断カクテルで処理した。１ｇサンプルについて、ＴＦＡ  ８．５ｍｌ、水０．５ｍｌ、ＥＤＴ  ０．２５ｍｌ、チオアニソール０．５ｍｌ及びフェノール０．５ｇを参照として使用した、切断時間４時間、室温。得られたペプチドを、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、遠心分離した。ジイソプロピルエーテルをデカンテーションした。得られたペプチドペレットを酢酸エチルと振盪して再び遠心分離した。さらなるデカンテーション後に、この手順を３回繰り返した。最後にペプチドを真空下で乾燥した。サンプルに対して分析を行った：ＨＰＬＣによるＵＶ−純度（％）、ＨＰＬＣ含有量（％）、樹脂上のペプチドの収量ｇ／ｇ（表３の列１）。段階的様式で、成分を順々に除き、ついで２つ、そして最終的に３つ除いた。次の表（表３）は結果を示す。
【０１３７】
【表３】
2019533666.tif 000006
【０１３８】
最も良好な結果は、チオアニソールが除かれた場合及びＥＤＴが使用された場合に得られた。実験の第二のグループにおいて、３つのカクテルを時間にわたって２０℃で調べた：ＴＦＡ、フェノール、ＥＤＴ、水からなるカクテル１；ＴＦＡ、フェノール、ＥＤＴからなるカクテル２；ＴＦＡ、ＥＤＴからなるカクテル３。表４に結果を示す。
【０１３９】
【表４】
2019533666.tif 000007
【０１４０】
カクテル２及び３の結果は等しく良好である。４時間は樹脂からのペプチドの完全な切断に必要ない。カクテル２及び３についての実験を２５℃で繰り返し、そして表５の結果を得た。
【０１４１】
【表５】
2019533666.tif 000008
【０１４２】
カクテル２及び３を用いた切断は同程度の結果を生じた。切断時間は２５℃で２時間に減らすことができた。
【０１４３】
さらに、カクテルの体積を２０％及び３０％減らすことができるかどうかを調べた。表６は時間にわたる２５℃での結果を示す。
【０１４４】
【表６】
2019533666.tif 000009
【０１４５】
表６に見られるように、有意な差異はない。７０％の体積の切断カクテルの減少の間に、スラリーの粘性のために撹拌は切断反応の間ほとんど維持できなかった。
【０１４６】
確認のために、カクテル２及び３とともにＫｉｎｇのカクテルを用いた切断を、樹脂上ペプチド１０ｇスケールで繰り返した。切断カクテルの体積を、ジイソプロピルエーテル中のペプチドの沈殿の前に蒸留により減らした。
【０１４７】
Ｋｉｎｇのカクテル：フェノール５ｇ、チオアニソール５ｍｌ、ＥＤＴ  ２．６ｍｌ、ＴＦＡ  ７９．２ｍｌ及び水５ｍｌを使用することによりカクテルを混合した。樹脂上ペプチド１０ｇを予め冷却した混合物（１０〜１５℃）に入れた。スラリーを４時間１７〜２３℃で撹拌した。樹脂をろ過し、そしてそれぞれＴＦＡ  １０．１ｍｌで４回洗浄した。合わせた溶液を減圧下で＜３０℃の温度で蒸留して残留体積６０ｍｌとした。この溶液を３０〜６０分以内にジイソプロピルエーテル２７６ｍｌに０〜５℃で入れた。フラスコをＴＦＡ  ３．４ｍｌで洗浄し、これもジイソプロピルエーテルに加えた。得られたスラリーを少なく１０時間１０〜１５℃で撹拌した。沈殿物を遠心分離により単離した。デカンテーションした後、ペレットを酢酸エチル６６，２ｍｌに懸濁し、そして再び遠心分離した。この手順をさらに３回繰り返した。最終的に、粗製ペプチド４．２０ｇを純度５４．９％及び３３．４％の含有量で得た。
【０１４８】
カクテル２：カクテルをフェノール４ｇ、ＥＤＴ  ２ｍｌ及びＴＦＡ  ６８ｍｌを使用して混合した。樹脂上のペプチド１０ｇを予め冷却した混合物（１０℃）に入れた。このスラリーを２時間２５℃で撹拌した。樹脂をろ別し、そしてそれぞれ８ｍｌ  ＴＦＡで４回洗浄した。合わせた溶液を＜３０℃の温度で減圧下で蒸留して残留体積３５ｍｌを得た。この溶液を１０分以内に３℃で２７６ｍｌジイソプロピルエーテルに入れた。フラスコをＴＦＡ  ３．４ｍｌで洗浄し、これもジイソプロピルエーテルに加えた。得られたスラリーを少なくとも１時間１５℃で撹拌した。沈殿物を遠心分離により単離した。デカンテーション後にペレットを酢酸エチル６６．２ｍｌに懸濁し、そして再び遠心分離した。この手順を３回繰り返した。最終的に粗製ペプチド４．８８ｇを６４．２％の純度及び３７．１％の含有量で得た。
【０１４９】
カクテル３：カクテルをＥＤＴ  ２ｍｌ及びＴＦＡ  ６８ｍｌを使用して混合した。樹脂上のペプチド１０ｇを予め冷却した混合物（１０℃）に入れた。このスラリーを２時間２５℃で撹拌した。樹脂をろ別し、そしてそれぞれＴＦＡ  ８ｍｌで４回洗浄した。合わせた溶液を減圧下で＜３０℃の温度で蒸留して残留体積３７ｍｌを得た。この溶液を１０分以内に３℃でジイソプロピルエーテル２７６ｍｌに入れた。フラスコをＴＦＡ  ３．４ｍｌで洗浄し、これもジイソプロピルエーテルに加えた。得られたスラリーを少なくとも１時間１５℃で撹拌した。沈殿物を遠心分離により単離した。デカンテーション後、ペレットを酢酸エチル６６．２ｍｌに懸濁し、再び遠心分離した。この手順を３回以上繰り返した。最終的に、粗製ペプチド５．１０ｇを純度６４．２％及び含有量３６．４％で得た。
【０１５０】
【表７】
2019533666.tif 000010
【０１５１】
表７に示されるように、カクテル２及び３の適用は、Ｋｉｎｇのカクテルの適用と比較して、純度、含有量及び収量の点で非常により良好な結果をもたらすということが見出された。
【０１５２】
カクテル３を使用して、それが最も高い収量及びＨＰＬＣ−ＵＶ純度を生じたという事実（表７）により、樹脂上のペプチド７．６ｋｇを製造スケールで処理した。合計で３．２６ｋｇの配列番号１を純度６８．７％で得た。
【０１５３】
要約すると、以下の鍵となる工程を取ることができた：樹脂からのペプチドの切断のために複雑なＫｉｎｇのカクテルを使用する代わりに、ＴＦＡ及びＥＤＴのみを使用し、切断を２時間２５℃で行い、切断カクテル体積／樹脂上のペプチドｇが減少される。
【０１５４】
実施例４：樹脂からのペプチドの切断
樹脂からのペプチドの切断を最適化するためにさらなる実験を行った。これらの実験で特に注目したのは、望ましくない副生成物の発生を維持することであり、これは、切断工程の間にペプチドのトリプトファン部分とＲｉｎｋ樹脂リンカーからの分解産物との間に許容しうる最小量で形成し得る。以下において、この特定の副生成物は「ＳＰ１」とも呼ばれる。望ましくない副生成物は、目的のペプチド、例えば配列番号１が沈殿するまで（工程（ｘｉｉ））形成し得る。例えば、切断にＫｉｎｇのカクテルを使用した場合、副生成物はＵＶ純度（ＨＰＬＣ）測定に基づいて数％まで蓄積し得る。
【０１５５】
実施例４．１：ＥＤＴの比率の変化
実験の第一のセットにおいて、樹脂上のペプチド（配列番号１）のサンプルをＴＦＡ及びＥＤＴからなる切断カクテルで処理し、ここでＥＤＴの比率を変化させた。切断を２時間２５℃で行い、そして各サンプルを周囲温度でさらに２時間インキュベートした。２時間又は４時間後、サンプルをＨＰＬＣにより分析した。
【０１５６】
【表８】
2019533666.tif 000011
【０１５７】
表８からわかるように、ＥＤＴ比率の増加は、副生成物（ＳＰ１）の形成に対してごくわずかしか影響を及ぼさない。
【０１５８】
実施例４．２：さらなるスカベンジャー化合物の添加
実施例４．１と類似した実験セット行い、ここではＥＤＴの比率を切断カクテルの３．１％（体積／体積）に一定に維持し、そしてチオアニソール又は３−メチルインドールのいずれかをさらなるスカベンジャー化合物として加えた。ＨＰＬＣによるインキュベーション及び分析は実施例４．１に記載されるとおりであった。
【０１５９】
【表９】
2019533666.tif 000012
【０１６０】
【表１０】
2019533666.tif 000013
【０１６１】
上記の切断カクテルの（質量／質量）比は９５．５７％（質量／質量）ＴＦＡ、２．３６％（質量／質量）ＥＤＴ及び２．０７％（質量／質量）３−ＭＩだろう。表９及び１０からわかるように、チオアニソールの添加は副生成物ＳＰ１の発生に対してほとんど効果を有していなかったが、３−メチルインドールの添加により、合計で４時間のインキュベーション時間の後でさえ、副生成物を低いレベルに維持することができた。
【０１６２】
実施例４．３：インドール化合物の比較
実施例４．１と類似したさらなる実験セットにおいて、さらなるインドール化合物、Ｎ−アセチルインドールが、３−メチルインドールの抑制効果と比較して副生成物に対して同様の抑制効果を示すかどうかを分析した。ＥＤＴの比率を切断カクテルの３．１％（体積／体積）に維持し、そしてさらなる化合物無し（対照）、３．１％（体積／体積）Ｎ−アセチルインドール（Ｎ−アセチルインドールは粘性の液体である）又は３．１％（体積／体積）３−メチルインドール（表１０における注釈に記載されるとおりの計算％（体積／体積））のいずれかを加えた。インキュベーション及びＨＰＬＣによる分析を実施例４．１に記載する。
【０１６３】
【表１１】
2019533666.tif 000014
【０１６４】
表１１に示されるように、３−メチルインドール及びＮ−アセチルインドールの両方が、望ましくない副生成物ＳＰ１の形成を低減する際に有効である。
【０１６５】
実施例４．４：３−メチルインドールの比率の変化
実施例４．１と類似したさらなる実験セットにおいて、切断カクテルに加えられる３−メチルインドールの量を変化させて、最も適した濃度を決定した。ＥＤＴの比率を切断カクテルの３．１％（体積／体積）に一定に維持した。インキュベーション及びＨＰＬＣによる分析は実施例４．１に記載されるとおりである。
【０１６６】
【表１２】
2019533666.tif 000015
【０１６７】
表１２からわかるように、０．８％（体積／体積）３−メチルインドールの量は、副生成物の許容できない量の形成を抑制するためにすでに十分である。
【０１６８】
総合すれば、本発明者らは、驚くべきことに、望ましくない副生成物の発生を許容しうる量まで減少させる可能性を見出した。適切なインドール化合物、特にＮ−アセチルインドール又は３−メチルインドールを加えることにより、望ましくない副生成物の量を、粗製の所望の生成物中１．０〜１．３％  ＵＶ純度（ＨＰＬＣ）だけにまで減少させることができた。インドール化合物、例えば３−メチルインドール、さらにはスカベンジャー分子と保護基との付加物は、特に沈殿したペプチド溶液の洗浄の間に所望のペプチドから除去される。
【０１６９】
実施例５：樹脂からの配列番号１の試験切断（キログラムスケール）
樹脂に結合したペプチド６．５〜７．５ｋｇを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）７６．１３ｋｇ、１，２−エタンジチオール１．８ｋｇ、及び３−メチルインドール０．６５６ｋｇの混合物で２〜２．５時間２５℃で処理した。樹脂を濾別し、そしてそれぞれＴＦＡ  １７．５ｋｇで３回処理した。合わせたＴＦＡ相をエバポレートして元の体積の１／３にした。ペプチドの沈殿のために、蒸留残留物をジイソプロピルエーテル及びｎ−ヘプタンの混合物（３０：７０（体積／体積））２０３Ｌ上に０〜５℃で入れた。懸濁液を１０〜２０時間１０〜１５℃で撹拌し、続いてペプチドをろ過により分離した。得られたフィルターケーキをそれぞれ酢酸エチル５０Ｌで５回洗浄した。最終的にフィルター上のペプチドを真空乾燥し、粗製ペプチド２．５〜３．２ｋｇを得た。
【０１７０】
特定の実施態様において、樹脂上の配列番号１  ７．２４ｋｇは、切断そしてさらなる洗浄及び単離工程を以下に列挙されるように受けて、乾燥粗製ペプチド２．５５ｋｇを得た。生成物は白色からわずかに黄色がかった粉末であり、ＨＰＬＣ純度６８．２％及びＲｉｎｋリンカーとトリプトファン残基の望ましくない分解産物の含有量はペプチドの１．２％であった：これらの結果を達成するために、配列番号１  ７．２４ｋｇを、ＴＦＡ  ７３．２ｋｇ、１，２−エタンジチオール  １．７３ｋｇ及び３−メチルインドール０．６３ｋｇの混合物で２．１５時間２３〜２５℃にて処理した。ついで樹脂をろ別し、そしてそれぞれＴＦＡ  １７．４ｋｇで３回洗浄した。合わせたＴＦＡ相（切断混合物及びＴＦＡ洗浄液）を蒸留に移した。≦５０ｍｂａｒ及び≦３０℃の温度で蒸留を行い、１時間以内に体積２９Ｌが得られた。残留物をＤＩＰＥ  ６０．９Ｌ及びｎ−ヘプタン１４２．１Ｌの混合物に０〜５℃で３５分以内に加え、懸濁液を得た。この懸濁液を１０〜１５℃で約１７時間撹拌した。粗製ペプチドを２．５時間以内にろ別し、続いてそれぞれ酢酸エチル４９．４Ｌで粗製ペプチドを洗浄した（酢酸エチルの添加、３０〜６０分撹拌、溶媒の除去）。湿性ペプチドを＞９６時間２０〜２５℃で真空下（＜１００ｍｂａｒ）にて窒素ストリッピングしながら乾燥した。最終的に粗製ペプチド２．５５ｋｇを得た。
【０１７１】
実施例６：ろ過時間に対する切断後のペプチド溶液の濃縮の効果
それぞれ樹脂１０グラムを使用する小バッチ実験において、目的のペプチド（配列番号１）を本明細書に記載されるようにＳＰＰＳにより合成し、そしてＴＦＡ  ６７．８ｍｌ及びＥＤＴ  ２．２６ｍｌを２５℃で２時間使用して樹脂から切断した。
【０１７２】
ペプチド溶液をろ過して樹脂を除去し、次いで沈殿する前に≦８０ｍｂａｒ及び≦３０℃で真空蒸留によりその体積の約３分の１まで濃縮するか、又はそのまま沈殿させた（濃縮せずに）。ジイソプロピルエーテルを貧溶媒として使用した。沈殿物を酢酸エチルで３回洗浄した。沈殿後及びそれぞれの酢酸エチル洗浄後のろ過に必要な時間を記録した。
【０１７３】
【表１３】
2019533666.tif 000016
【０１７４】
濃縮工程が行われる場合、ろ過、特に最初の沈殿後に必要な時間を強く減少させることができるということがわかる。
【０１７５】
実施例７：ＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンの混合物中の粗製ペプチドの沈殿
本発明者らは、驚くべきことに、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）及びｎ−ヘプタンの混合物が、ろ過及びその後の酢酸エチルでの洗浄に必要な時間を強く減少させることができるということを見出した。
【０１７６】
ＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンの比を最適化するために、樹脂１０グラムを使用する小バッチ実験を行った。ペプチドを本明細書に記載されるようにＳＰＰＳにより合成し、そしてＴＦＡ  ６７．２ｍｌ、ＥＤＴ  ２．１ｍｌ及び３−ＭＩ  ０．８６ｇを２５℃で２時間使用して樹脂から切断した。
【０１７７】
ついでペプチド溶液をろ過して樹脂を除去し、そして≦８０ｍｂａｒ及び≦３０℃で真空蒸留してその体積の約３分の１まで濃縮した。続いて、濃縮したペプチド溶液を、ＤＩＰＥのみ又はＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンの混合物のいずれかを用いて沈殿させてろ過した。沈殿物を酢酸エチルで３回洗浄した。沈殿後及び各酢酸エチル洗浄後に必要な時間を記録した。
【０１７８】
【表１４】
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【０１７９】
表１４における結果により示されるように、ろ過時間は混合物中のｎ−ヘプタンの量を増加させるにつれて減少する。しかし、２５：７５より高いＤＩＰＥ：ｎ−ヘプタン比では、プチドがろ過フリット上で「溶融する」ということが観察された。４０：６０より低いＤＩＰＥ：ｎ−ヘプタン比では、時間減少効果はあまり顕著ではない。
【０１８０】
ＨＰＬＣによるサンプルのさらなる分析は、酢酸エチルを用いた第三の洗浄後に、スカベンジャー化合物もスカベンジャーの付加物も、保護基ももはや検出可能ではなかった。
【０１８１】
実施例８：貧溶媒としてＤＩＰＥ／ｎ−ヘプタンを使用した粗製ペプチドの試験精製（実験室スケール）
樹脂上のペプチド２０ｇ（ペプチド：配列番号１）を、切断カクテル（１９８．８ｇ  ＴＦＡ、４．７ｇ  ＥＤＴ、１．７２ｇ  ３−ＭＩ）とともに３時間２５℃でインキュベートすることにより切断した。切断されたペプチドをフリットを通して吸引し、そしてフリット上に残った樹脂をそれぞれＴＦＡ  １６ｍｌで４回洗浄した。
【０１８２】
ろ液をロータリーエバポレーターで３０℃にて濃縮し、そして残留溶液を５６０ｍｌ  ＤＩＰＥ／ｎ−ヘプタン（３０：７０）に加え、これを予め５〜１０℃に冷却した。ペプチドが沈殿し、そしてこれを１時間８℃で誘導した。ついで懸濁液をＤ４−フリット上で吸引し、これには３．６分必要であった。粗生成物を酢酸エチル５２０ｍｌ中に懸濁させ、撹拌し、そして同じＤ４フリットを通して吸引した。この洗浄工程を２回又はそれ以上繰り返した。続いて、粗生成物を真空下で乾燥した。これにより純度６６．６％ｒで粗生成物８．３６ｇが得られた。
【０１８３】
本発明はさらに以下の項目により特徴づけられる。
【０１８４】
１．親油性に修飾されたリジン側鎖を含む単離されたペプチドを製造する方法であって：
（ｉ）  固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的な様式で側鎖に保護された反応性官能基を有する該ペプチドのアミノ酸配列を構築する工程  ［ここで、修飾しようとするリジンの側鎖は、トリチルベースの保護基、特にモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）または４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）により保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に固相樹脂を乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  修飾しようとするリジン側鎖を脱保護するために、乾燥した樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液で数回処理する工程；
（ｉｖ）  樹脂を中和する工程；
（ｖ）  少なくとも１つの活性化９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）結合リンカー部分を、脱保護されたリジン側鎖にカップリングする工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーの末端官能基を脱保護する工程；
（ｖｉｉ）  活性化された親油性部分、特に活性化脂肪酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；及び
（ｉｘ）  樹脂からペプチドを切断する工程
を含む、上記方法。
【０１８５】
２．単離されたペプチドは、３０と４４との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、そしてここで、野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも６５％である、項目１に記載の方法。
【０１８６】
３．単離されたペプチドは、３０と４４との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、そしてここで、野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも７０％である、項目１又は２に記載の方法。
【０１８７】
４．単離されたペプチドは、３０と４４との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、そしてここで親油性に修飾されたリジン側鎖は、野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０１８８】
５．単離されたペプチドは、３０と４４との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、ここで野生型エキセンディンのアミノ酸１〜１３に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも６５％であり、野生型エキセンディンのアミノ酸２２〜３９に対応する領域における野生型エキセンディン−４に対する配列同一性は少なくとも７０％であり、かつ親油性に修飾されたリジン側鎖は、野生型エキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１８９】
６．単離されたペプチドは、３８と４０との間のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０１９０】
７．単離されたペプチドは３９のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体である、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１９１】
８．単離されたペプチドは３９のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、ここで野生型（ｗｔ）エキセンディン−４のアミノ酸１〜１３に対応する領域における配列は２つより多くの変異を含有し、ｗｔエキセンディン−４のアミノ酸２２〜３９に対応する領域は１つより多くの変異を含有し、そしてここで親油性に修飾されたリジン側鎖は、ｗｔエキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【０１９２】
９．単離されたペプチドは３９のアミノ酸長を有するエキセンディン−４誘導体であり、ここでｗｔエキセンディン−４のアミノ酸１〜１３に対応する領域は位置２及び３において変異を含有し、ｗｔエキセンディン−４のアミノ酸２２〜３９に対応する領域は位置２８に変異を含有し、そしてここで親油性に修飾されたリジン側鎖は、ｗｔエキセンディン−４のアミノ酸位置に対して位置１４（Ｌｙｓ（１４））にある、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０１９３】
１０．工程（ｉｉｉ）におけるＤＣＭ中ＴＦＡ処理の回数は、工程（ｉｘ）における修飾されたリジン側鎖の収率が、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％になるように調整される、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０１９４】
１１．工程（ｉｉｉ）において、乾燥した樹脂を、少なくとも７回少なくとも５分間、ＤＣＭ中約１％（体積／体積）ＴＦＡの溶液で処理する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１９５】
１２．工程（ｉｉｉ）において、乾燥した樹脂を、９回少なくとも１０分間、ＤＣＭ中約１％（体積／体積）ＴＦＡの溶液で処理する、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１９６】
１３．工程（ｉｉｉ）において、乾燥した樹脂を、９回少なくとも１５分間、ＤＣＭ中約１％（体積／体積）ＴＦＡの溶液で処理する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１９７】
１４．工程（ｉｖ）において、ペプチドは、ｐＨが≧７、特に≧７，５、より特に≧８．０に達すると十分に中和されたとみなされる、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【０１９８】
１５．工程（ｉｖ）において、ペプチドは＞８．０に達すると十分に中和されたとみなされる、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０１９９】
１６．樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより、工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程（ｖｉｉｉ−ａ）をさらに含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【０２００】
１７．修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が、修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較して、少なくとも８５％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％になるまで、工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程（ｖｉｉｉ−ｂ）をさらに含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【０２０１】
１８．試験サンプルにおいて工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析することが：
（ｖｉｉｉ−ａ１）  樹脂の試験サンプルを総反応バッチから取り出し、そして工程（ｉｘ）と同じ条件下でかつ同じ切断カクテルを用いて試験サンプルからペプチドを切断する工程；及び
（ｖｉｉｉ−ａ２）  修飾されたリジン側鎖を有していないペプチドと比較して、修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量を、特に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は高圧液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ）により決定する工程
を含む、項目１６に記載の方法。
【０２０２】
１９．単離されたペプチドは、アミノ酸配列
Ｈ−ｄＳ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ（γＥ−Ｐａｌｍ）−Ｅ−Ｓ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ２  （配列番号１）
を有する、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【０２０３】
２０．工程（ｉｘ）の切断は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、トリフルオロ酢酸少なくとも９０％（体積／体積）及びエタンジチオール少なくとも１％（体積／体積）を含む切断カクテルを用いて行われる、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【０２０４】
２１．切断カクテルは、適切なインドール化合物、例えばＮ−アセチルインドール又は３−メチルインドール又はそれらの混合物を更に含む、項目２０に記載の方法。
【０２０５】
２２．適切なインドール化合物は３−メチルインドールである、項目２１に記載の方法。
【０２０６】
２３．切断カクテルは、９１〜９３％（体積／体積）トリフルオロ酢酸、１〜６％（体積／体積）フェノール及び１〜８％（体積／体積）エタンジチオールからなるか、又は９６〜９８％（体積／体積）トリフルオロ酢酸及び２〜４％（体積／体積）エタンジチオールからなる、項目２０に記載の方法。
【０２０７】
２４．工程（ｉｘ）の切断は、チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、トリフルオロ酢酸少なくとも８０％（質量／質量）及び１，２−エタンジチオール少なくとも１％（質量／質量）を含む切断カクテルを用いて行われる、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【０２０８】
２５．切断カクテルは、適切なインドール化合物、例えば、Ｎ−アセチルインドール又は３−メチルインドール又はそれらの混合物をさらに含む、項目２４に記載の方法。
【０２０９】
２６．適切なインドール化合物は３−メチルインドールである、項目２５に記載の方法。
【０２１０】
２７．切断カクテルは、８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドール（３−ＭＩ）からなる、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【０２１１】
２８．切断カクテルは、９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１．７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−ＭＩからなる、項目２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【０２１２】
２９．切断カクテルは、約９７％（質量／質量）ＴＦＡ、約２％（質量／質量）ＥＤＴ及び約１％（質量／質量）３−ＭＩからなる、項目２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【０２１３】
３０．切断カクテルは、約９６．９％（質量／質量）ＴＦＡ、約２．３％（質量／質量）ＥＤＴ及び約０．８％（質量／質量）３−ＭＩからなる、項目２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【０２１４】
３１．切断は、５〜１５℃、１５〜２２℃及び／又は２２〜３０℃で、特に２５℃で行われる、項目２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【０２１５】
３２．樹脂上のペプチド１グラムあたりの切断カクテルの体積は、９．５ｍｌ〜５．５ｍｌ、特に７．０ｍｌ〜６．０ｍｌである、項目２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【０２１６】
３３．切断は、２〜３時間、特に２．０〜２．５時間、撹拌しながら行われる、項目２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【０２１７】
３４．切断は、２〜３時間、特に２．０〜２．５時間、２５℃で撹拌しながら行われる、項目２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【０２１８】
３５．切断は、１〜１．５時間３０℃で撹拌しながら行われる、項目２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【０２１９】
３６．（ａ）８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテル、特に９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１．７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−ＭＩ、例えば約９７％（質量／質量）ＴＦＡ、約２％（質量／質量）ＥＤＴ及び約１％３−ＭＩからなる切断カクテル、（ｂ）２５℃の高温で２時間のみのインキュベーション時間、並びに（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたり減少した体積、例えば７．０ｍｌと６．０ｍｌとの間の切断カクテルを使用して切断が行われる、項目２０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【０２２０】
３７．（ａ）８８．２〜９８．３％（質量／質量）トリフルオロ酢酸、１〜４．３％（質量／質量）１，２−エタンジチオール及び０．７〜７．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテル、特に９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１．７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−ＭＩ、例えば約９７％（質量／質量）ＴＦＡ、約２％（質量／質量）ＥＤＴ及び約１％  ３−ＭＩからなる切断カクテル、（ｂ）２５℃の高温で２時間のみのインキュベーション時間、並びに（ｃ）樹脂上のペプチド１グラムあたり減少した体積、例えば７．０ｍｌと６．０ｍｌとの間の減少した体積を使用して切断が行われ、そしてここでペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する、項目２０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【０２２１】
３８．工程（ｉｉ）における樹脂の乾燥は、樹脂上のペプチドを少なくとも１回脂肪族アルコールでそして少なくとも１回ジアルキルエーテルで洗浄した後に、不活性ガス、例えば窒素下で室温にて行われる、項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【０２２２】
３９．脂肪族アルコールはイソプロパノールであり、そしてジアルキルエーテルはジイソプロピルエーテルである、項目３８に記載の方法。
【０２２３】
４０．工程（ｉｖ）における中和は、第三級アルキルアミンの有機極性非プロトン性溶媒中１％〜５％溶液とともに少なくとも１０分間の少なくとも１回のインキュベーション、場合により続いて、中和工程後の溶媒混合物のｐＨの決定、及び樹脂上のペプチドを少なくとも１回該溶媒で、そして少なくとも１回さらなる極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄することにより行われる、項目１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【０２２４】
４１．第三級アルキルアミンはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）又はＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）又はトリエチルアミンであり、そしてここで有機極性非プロトン性溶媒はジクロロメタンである、項目４０に記載の方法。
【０２２５】
４２．続いて、中和工程後の溶媒混合物のｐＨを測定し、そして樹脂上のペプチドを少なくとも１回該溶媒で、そして少なくとも１回さらなる極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する、項目４０又は４１に記載の方法。
【０２２６】
４３．工程（ｖｉ）における脱保護は、樹脂上のペプチドを少なくとも１回少なくとも５分間塩基で処理し、続いて少なくとも１回洗浄する工程により行われる、項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０２２７】
４４．塩基はＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンである、項目４３に記載の方法。
【０２２８】
４５．工程（ｖｉｉｉ）における樹脂の乾燥は、真空下で、特に≦７０ｍｂａｒの真空下で、樹脂上のペプチドを洗浄した後に行われる、項目１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【０２２９】
４６．（ｉ）  側鎖に保護された反応性官能基を有する配列番号１のペプチドのアミノ酸配列を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的様式で構築する工程［ここで、リジン１４の側鎖はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）により保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に固相樹脂を少なくとも５時間室温で乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  乾燥した樹脂を、位置１４におけるリジン側鎖を脱保護するために、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡの溶液をそれぞれ用いて９回１０分間処理する工程；
（ｉｖ）  溶液のｐＨが≧８のままになるまで、ＤＣＭ中３％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液を用いて樹脂を中和する工程；
（ｖ）  活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕリンカー部分を、脱保護されたリジン側鎖に塩基条件下でカップリングさせる工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンを用いて切断する工程；
（ｖｉｉ）  活性化されたパルミチン酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が少なくとも８５％になるまで工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程；及び
（ｉｘ）  チオアニソール及びエチルメチルスルフィドを含まず、トリフルオロ酢酸少なくとも９０％（体積／体積）及びエタンジチオール少なくとも１％（体積／体積）を含む切断カクテルを使用して、２５℃にて樹脂からペプチドを切断する工程
を含む、項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【０２３０】
４７．（ｘ）  切断後のペプチド溶液をろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、ジアルキルエーテル及びヘプタンを含む貧溶媒に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を撹拌する工程
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  沈殿物を洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを乾燥する工程
をさらに含む、項目１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【０２３１】
４８．工程（ｘ）の後に、フィルターケーキを少なくとも１回、例えば３回、適切なリンス溶液、例えばＴＦＡでリンスする、項目１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【０２３２】
４９．工程（ｘｉ）において、≦５０ｍｂａｒの真空で温度≦３０℃にて蒸留を行う、項目１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【０２３３】
５０．工程（ｘｉｉ）において、貧溶媒は、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）及びｎ−ヘプタンからなる混合物、特にＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンの２５：７５（体積／体積）〜３５：６５（体積／体積）の比の混合物である、項目１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【０２３４】
５１．ＤＩＰＥとｎ−ヘプタンとの間の比は３０：７０（体積／体積）である、項目５０に記載の方法。
【０２３５】
５２．工程（ｘｉｉｉ）において、沈殿した溶液は１〜２０時間１０〜１５℃で撹拌される、項目１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【０２３６】
５３．工程（ｘｖ）において、フィルター上の沈殿物を、適切な有機溶媒、例えば酢酸エチルでリンスした後に、適切な有機溶媒、例えば酢酸エチル中に沈殿物を再懸濁し、得られた懸濁液を、例えば３０〜６０分間撹拌し、そして有機溶媒をろ別することにより少なくとも１回洗浄する、項目１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【０２３７】
５４．沈殿物を、１〜５回、特に２〜４回又は３〜５回又は４〜５回、酢酸エチルで洗浄する、項目５３に記載の方法。
【０２３８】
５５．工程（ｘｖｉ）において、湿性ペプチドを真空下で、例えば２０〜２５℃で、特に≦７０ｍｂａｒの真空下で２０〜２５℃にて窒素気流下で（ストリッピング窒素）で乾燥する、項目１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【０２３９】
５６．（ｉ）  側鎖に保護された反応性官能基を有する配列番号１のペプチドのアミノ酸配列を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して段階的様式で構築する工程［ここで、リジン１４の側鎖はモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）で保護される］；
（ｉｉ）  アミノ酸配列の構築が完了した後に、固相樹脂を少なくとも５時間室温で乾燥させる工程；
（ｉｉｉ）  位置１４におけるリジン側鎖を脱保護するために、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１％（体積／体積）トロフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液をそれぞれ用いて９回１０分間乾燥した樹脂を処理する工程；
（ｉｖ）  溶液のｐＨが≧８のままになるまで、ＤＣＭ中３％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液を用いて樹脂を中和する工程；
（ｖ）  活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕリンカー部分を塩基性条件下で、脱保護されたリジン側鎖にカップリングさせる工程；
（ｖｉ）  工程（ｖ）においてリジン側鎖にカップリングされたリンカーのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％（体積／体積）ピペリジンを用いて切断する工程；
（ｖｉｉ）  活性化パルミチン酸を、工程（ｖｉ）のリンカーの脱保護された末端官能基にカップリングさせる工程；
（ｖｉｉｉ）  樹脂を乾燥させる工程；
（ｖｉｉｉ−ａ）  樹脂に結合したペプチドの試験サンプルを切断することにより工程（ｉｉｉ）の脱保護収率を分析する工程；
（ｖｉｉｉ−ｂ）  修飾されたリジン側鎖を含有する切断されたペプチドの含有量が少なくとも８５％になるまで工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ−ａ）を繰り返す工程；
（ｉｘ）  ９６．０〜９７．５％（質量／質量）ＴＦＡ、１，７〜２．６％（質量／質量）ＥＤＴ及び０．７〜１．５％（質量／質量）３−メチルインドールからなる切断カクテルを使用して、樹脂からペプチドを切断する工程；
（ｘ）  切断後のペプチド溶液を室温でろ過する工程；
（ｘｉ）  ろ過したペプチド溶液を≦３０℃で真空蒸留する工程；
（ｘｉｉ）  蒸留からの残留画分を、２５：７５（体積／体積）〜３５：６５（体積／体積）の比のＤＩＰＥ及びｎ−ヘプタンからなる貧溶媒に加える工程；
（ｘｉｉｉ）  沈殿した溶液を１０〜１５℃で１〜１８時間撹拌する工程；
（ｘｉｖ）  沈殿した溶液をろ過する工程；
（ｘｖ）  （ｘｖ−ａ）沈殿物を酢酸エチルに再懸濁させること、（ｘｖ−ｂ）得られた懸濁液を３０〜６０分間撹拌すること、及び（ｘｖ−ｃ）酢酸エチルをろ別することにより、沈殿物を４〜５回洗浄する工程；並びに
（ｘｖｉ）  湿性ペプチドを真空下で乾燥させる工程
を含む、項目１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【配列表】
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【国際調査報告】
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