(57)【要約】1個または複数個のB細胞をEL4-B5細胞と共にインキュベートする段階を含む、該1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、該EL4-B5細胞が、細胞600,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られている／該EL4-B5細胞の培養物に由来する、方法が本明細書において報告される。2019513368.tif 000034
2019513368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
- 細胞600,000個／ml〜細胞1,500,000個／mlの細胞密度までEL4-B5細胞を培養する段階、および
- 1個または複数個のB細胞を、前段階で得られた該EL4-B5細胞の一定分量と共にインキュベートする段階
を含む、該1個または複数個のB細胞を共培養するための方法。
【請求項２】
前記EL4-B5細胞の培養が、細胞650,000個／ml〜細胞1,450,000個／mlの細胞密度までである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記EL4-B5細胞の培養が、細胞1,000,000個超／ml〜細胞1,500,000個／mlの細胞密度までである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記EL4-B5の培養が、細胞650,000個／ml〜細胞825,000個／mlの細胞密度までである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
前記EL4-B5細胞の培養が、細胞1,400,000個／ml〜細胞1,500,000個／mlの細胞密度までである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベートする段階がさらに、フィーダー混合物の存在下である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィーダー混合物が、
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および／またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 該腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記フィーダー混合物が、IL-1βと、TNF-αと、IL-10と、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4、およびIL-6より選択される1つまたは複数とを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記培養する段階の後かつ前記インキュベーションする段階の前に、前記EL4-B5細胞にγ線を照射する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
1個のB細胞の共培養のためである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記1個のB細胞が単一の置かれたB細胞である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベートする段階が5〜14日間である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を含み、それによって抗体を生成する、該抗体を生成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
B細胞を、ある特定の細胞密度のEL4-B5細胞の培養物から得られたEL4-B5フィーダー細胞と共培養するための方法、単一B細胞によって分泌されるモノクローナル抗体の少なくとも可変ドメインのアミノ酸配列を得る方法、および抗体を生成するための方法が本明細書において報告される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るためには、KoehlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術が広く用いられている。しかし、ハイブリドーマ技術では、免疫化実験動物から採取されたB細胞のごく一部のみが融合および増殖され得るにすぎない。B細胞の供給源は一般的に、免疫化実験動物の脾臓などの臓器である。
【０００３】
Zublerらは、1984年に、モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るための異なるアプローチを開発し始めた（例えば、Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363（非特許文献1）、J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183（非特許文献2）を参照されたい）。そこでは、免疫化実験動物の血液からB細胞を採取し、フィーダー混合物を構成するサイトカインの存在下でこれをマウスEL-4 B5フィーダー細胞と共培養する。この方法論では、共培養の10〜12日後に、最大で50 ng/mlまでの抗体を得ることができる。
【０００４】
Weitkamp, J-H.ら (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237（非特許文献3）) は、蛍光ウイルス様粒子を用いて選択された単一の抗原特異的B細胞からの、ロタウイルスに対する組換えヒトモノクローナル抗体の作製を報告している。複数の同族抗原に対する複数の単離された抗体を生成する方法は、US 2006/0051348（特許文献1）において報告されている。WO 2008/144763（特許文献2）およびWO 2008/045140（特許文献3）では、IL-6に対する抗体およびその使用、ならびに抗原特異的B細胞のクローン集団を得るための培養法がそれぞれ報告されている。抗原特異的B細胞のクローン集団を得るための培養法は、US 2007/0269868（特許文献4）において報告されている。Masriら (Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106（非特許文献4）) は、炭疽毒素に対する単一のヒトリンパ球から得られた機能的Fab断片の大腸菌 (E. coli) におけるクローニングおよび発現を報告している。免疫グロブリンライブラリーを調製するための方法は、WO 2007/031550（特許文献5）において報告されている。
【０００５】
WO 2011/147903（特許文献6）において、単一B細胞培養法が報告されている。
【０００６】
WO 2013/076139（特許文献7）において、CD40L発現哺乳動物細胞およびその使用が報告されている。
【０００７】
WO 2013/092716（特許文献8）において、同起源の抗体可変領域遺伝子セグメントをクローニングおよび発現させるための迅速な方法が報告されている。
【０００８】
US 7,807,415（特許文献9）において、安定した不死化Bリンパ球を生成するための方法が報告されている。EP 0 488 470（特許文献10）において、抗体の生成法が報告されている。
【０００９】
Seeber, S.らは、末梢血由来のウサギB細胞を用いて機能的組換えモノクローナル抗体を作製するための堅牢なハイスループットプラットホームを報告した (PLOS One 9 (2014) e86184/-14（非特許文献5）)。
【００１０】
US 2007/065919（特許文献11）では、安定したBリンパ球を生成する方法が報告されている。
【００１１】
WO 2012/178150（特許文献12）では、抗原特異的抗体産生細胞株およびモノクローナル抗体を作製するための方法が報告されている。
【００１２】
Kwekkeboom, J.らは、マウス胸腺腫細胞株によるヒトBリンパ球活性化に基づいたヒトモノクローナル抗体の作製のための効率的な手順を報告した (J. Immunol. Meth. 160 (1993) 117-127（非特許文献6）)。
【００１３】
Weber, M.らは、ヒト抗Scl-70自己抗体断片の単離の成功のための、EL4-B5ベースのB細胞刺激とファージディスプレイ技術の組み合わせを報告した(J. Immunol. Meth. 278 (2003) 249-259（非特許文献7）)。
【００１４】
Dohmen, S.E.らは、抗原で選択された単一B細胞からの組換えIg分子の生成、および抗D抗体によるIg遺伝子セグメントの制限的使用について報告した (J. Immunol. Meth. 298 (2005) 9-20（非特許文献8）)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】US 2006/0051348
【特許文献２】WO 2008/144763
【特許文献３】WO 2008/045140
【特許文献４】US 2007/0269868
【特許文献５】WO 2007/031550
【特許文献６】WO 2011/147903
【特許文献７】WO 2013/076139
【特許文献８】WO 2013/092716
【特許文献９】US 7,807,415
【特許文献１０】EP 0 488 470
【特許文献１１】US 2007/065919
【特許文献１２】WO 2012/178150
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Zublerら、Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363
【非特許文献２】Zublerら、J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183
【非特許文献３】Weitkamp, J-H.ら、J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237
【非特許文献４】Masriら、Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106
【非特許文献５】Seeber, S.ら、PLOS One 9 (2014) e86184/-14
【非特許文献６】Kwekkeboom, J.ら、J. Immunol. Meth. 160 (1993) 117-127
【非特許文献７】Weber, M.ら、J. Immunol. Meth. 278 (2003) 249-259
【非特許文献８】Dohmen, S.E.ら、J. Immunol. Meth. 298 (2005) 9-20
【発明の概要】
【００１７】
任意の供給源のものであってよい単一の置かれたB細胞を、適切な共培養培地中でフィーダー細胞と共培養するための方法が本明細書において報告される。
【００１８】
本発明は、少なくとも一部は、共培養において使用されるEL4-B5フィーダー細胞が、細胞500,000個超／ml、特に細胞600,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの範囲の細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られ得る、すなわちEL4-B5細胞は該細胞密度まで培養されたものであるという知見に基づく。
【００１９】
本発明はさらに、少なくとも一部は、全体的に見て、全IgG陽性ウェル中の抗原結合かつIgG陽性ウェルの頻度が、EL-4-B5細胞の回収時のEL-4-B5培養物密度に依存して増加する、すなわちEL-4-B5細胞回収時により高い細胞密度を有するEL4-B5培養物から得られたEL-4-B5細胞が、B細胞共培養において用いられる場合に、先に言及された頻度の増加が得られ得るという知見に基づく。この効果は、細胞1,500,000個／mlまでの細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られたEL4-B5細胞が共培養において用いられた場合に観察された。換言すると、EL-4-B5細胞を最大で細胞1,500,000個／mlまでの最終細胞密度まで培養した場合に、以前と同様の濃度のEL-4-B5細胞を共培養において使用すると、抗原結合かつIgG陽性ウェルの頻度の増加が生じる。
【００２０】
本明細書において報告される個々の局面は、
(i) 単離されたB細胞またはB細胞クローンが、標的に特異的に結合する抗体を産生する、B細胞の集団からのB細胞またはB細胞クローンの単離、
(ii) 単一の置かれたB細胞の共培養、および
(iii) 抗体の生成
のための方法である。
【００２１】
前記方法に付随して、対応する使用もまた包含および開示される。
【００２２】
本明細書において報告される1つの局面は、
- 1個または複数個のB細胞をEL4-B5細胞と共にインキュベートする段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、EL4-B5細胞が、細胞600,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの（最終）細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られている／該EL4-B5細胞の培養物に由来する、方法である。
【００２３】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞650,000個／mlから細胞1,450,000個／mlまでの（最終）細胞密度を有する。
【００２４】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞650,000個／mlから細胞825,000個／mlまでの（最終）細胞密度を有する。
【００２５】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞1,400,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの（最終）細胞密度を有する。
【００２６】
本明細書において報告される1つの局面は、
- 細胞約600,000個／ml〜細胞約1,500,000個／mlの細胞密度までEL4-B5細胞を培養する段階、および
- 1個または複数個のB細胞を、前段階のEL4-B5細胞の培養物の／前段階のEL4-B5細胞の培養物からの、すなわち細胞約600,000個／ml〜細胞約1,500,000個／mlの細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物からのEL4-B5細胞の一定分量と共にインキュベートする段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法である。
【００２７】
1つの態様において、前記EL4-B5細胞の培養は、細胞約650,000個／ml〜細胞約1,450,000個／mlの（最終）細胞密度までである。
【００２８】
1つの態様において、前記EL4-B5細胞の培養は、細胞約650,000個／ml〜細胞約825,000個／mlの（最終）細胞密度までである。
【００２９】
1つの態様において、前記EL4-B5細胞の培養は、細胞約1,400,000個／ml〜細胞約1,500,000個／mlの（最終）細胞密度までである。
【００３０】
すべての局面の1つの態様では、1個または複数個のB細胞に添加する前に、EL4-B5細胞にγ線を照射する。γ線の線量は致死量以下の線量である。1つの態様では、EL4-B5の培養物が細胞約600,000個／ml〜細胞約1,500,000個／mlの細胞密度を有する時点で該EL4-B5細胞を回収し、回収物における細胞密度を細胞約1×106個／mlの細胞密度に調整し、細胞密度を調整したEL4-B5細胞懸濁液に50 Gyの線量のγ線を照射し、照射したEL4-B5細胞の各一定分量を1個または複数個のB細胞に添加する。1つの態様において、一定分量は、B細胞1個当たり約104〜105個のEL-4-B5細胞である。
【００３１】
すべての局面の1つの態様では、1個または複数個のB細胞を、B細胞1個当たり約104〜105個のEL4-B5細胞と共にインキュベートする。すべての局面の1つの態様では、1個または複数個のB細胞を、B細胞1個当たり約1×104〜約5×104個のEL4-B5細胞と共にインキュベートする。すべての局面の1つの態様では、1個または複数個のB細胞を、B細胞1個当たり約2×104個のEL4-B5細胞と共にインキュベートする。したがって、1個または複数個のB細胞に添加されるEL4-B5細胞の培養物の一定分量は、B細胞1個当たり約104〜105個、または約1×104〜約5×104個、または約2×104個のEL4-B5細胞である。
【００３２】
すべての局面の1つの態様において、インキュベートする段階はさらに、フィーダー混合物の存在下である。
【００３３】
1つの態様において、フィーダー混合物は、
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および／またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む。
【００３４】
1つの態様において、フィーダー混合物は、黄色ブドウ球菌株Cowan細胞 (SAC) および胸腺細胞培養上清を含む。
【００３５】
すべての局面の1つの態様において、前記方法は1個のB細胞の共培養のためである。1つの好ましい態様において、1個のB細胞は単一の置かれたB細胞である。
【００３６】
すべての局面の1つの態様において、インキュベートする段階は5〜14日間である。
【００３７】
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される共培養方法を含み、それによって抗体を生成する、抗体を生成するための方法である。
【００３８】
本明細書において報告されるすべての局面（方法および使用）は、
- （単一の置かれた各）B細胞またはB細胞（のプール）を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と共に（個々に）共培養／インキュベートする段階
を含む。
【００３９】
共培養の結果は、B細胞クローン、すなわち、単一B細胞の子孫であるB細胞の集団である。
【００４０】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、共培養する段階の前に以下の段階を含む：
- 1〜3種類または1〜4種類の蛍光色素／フルオロフォアで標識されたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階。
【００４１】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、共培養する段階の前に以下の段階を含む：
- 異なるB細胞表面抗原にそれぞれが特異的に結合する1〜4種類の抗体と接触させたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階であって、各抗体が、異なる蛍光色素にコンジュゲートされているが、1〜4種類の蛍光色素でのみ標識されている、段階。
【００４２】
標識化は、1つの態様において、B細胞集団を（連続してまたは同時に）1〜4種類の蛍光標識抗体と接触させることによる。それによって、標識B細胞集団が得られる。蛍光標識抗体の各々は、異なるB細胞表面マーカー／標識に結合する。
【００４３】
置く段階は、標識されたB細胞調製物をフローサイトメーターに導入し、かつ1〜4種類の蛍光標識で標識された細胞を単一細胞として置くことによる。セルソーターにおいて細胞を選別するために用いられるより多くの蛍光色素と共に細胞をインキュベートすることが可能であるため、細胞を特定の表面マーカーの存在、および（任意で）同時に他の表面マーカーの非存在について選択することができる。
【００４４】
標識化および単一細胞デポジション（single cell deposition）は、意図される特徴を有する抗体を産生する可能性が低いB細胞を枯渇させることによりB細胞集団の複雑さを減少させるために行われる。標識抗体は、B細胞の表面上に提示された特定のポリペプチドに結合し、したがって陽性選択標識を提供する。同様に、B細胞と共にインキュベートされた標識抗体の数と比較して、少ない数の蛍光色素でしか標識されない細胞、例えば2種類のうち1種類（すなわち、2種類の蛍光標識抗体とのインキュベーションが行われたが、そのうちの1種類のみがB細胞に結合する）または3種類のうち2種類の蛍光標識を有する細胞などを選択することも可能である。B細胞集団の個々のB細胞に対する蛍光標識抗体の結合／非結合に基づき、マイクロ流体選別装置を用いて標的B細胞を同定および分離することが可能である。選別と同時に、標識の量を決定することもできる。
【００４５】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、単一細胞を置くこと／単一細胞デポジションの前に、B細胞の集団を共培養培地中でインキュベートする段階を含む。1つの態様において、インキュベーションする段階は約37℃である。1つの態様において、インキュベーションする段階は0.5〜2時間である。1つの態様において、インキュベーションする段階は約1時間である。1つの好ましい態様において、インキュベーションする段階は約37℃で約1時間である。
【００４６】
1つの態様において、本明細書において報告される方法は、置く段階の後かつ共培養する段階の前に、単一細胞として置かれたB細胞を遠心分離する段階を含む。1つの態様において、遠心分離する段階は約1分〜約30分間である。1つの態様において、遠心分離する段階は約5分間である。1つの態様において、遠心分離する段階は約100×g〜約1,000×gである。1つの態様において、遠心分離する段階は約300×gである。1つの好ましい態様において、遠心分離する段階は約300×gで約5分間である。
【００４７】
1つの態様において、B細胞（クローン）を選択する／得るための方法は、以下の段階を含む：
(a) （任意で、B細胞集団を、2〜4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより）B細胞の集団のB細胞を1〜4種類の蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) 1〜4種類の蛍光色素で標識された（および任意で、他の蛍光色素で標識されていない）B細胞の集団のB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞と共に遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と（個々に）共培養する段階、
(f) 段階(e)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階。
【００４８】
1つの態様において、標的に特異的に結合する抗体を生成するための方法は、以下の段階を含む：
(a) （任意で、B細胞集団を、2〜4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより）B細胞の集団のB細胞を1〜4種類の蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) 1〜4種類の蛍光色素で標識された（および任意で、他の蛍光色素で標識されていない）B細胞の集団のB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞と共に遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と（個々に）共培養する段階、
(f) 抗体を分泌する段階(e)のB細胞クローンを選択する段階、
(g) (i) 段階(f)において選択されたB細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る段階、
(ii) B細胞クローンがヒトB細胞クローンではない場合、可変ドメインをヒト化し、各コード核酸を提供する段階、および
(iii) 1つまたは複数の核酸を1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(h) 段階(g)の1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトした細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
【００４９】
1つの態様において、抗体を生成するための方法は、以下の段階を含む：
(a) （任意で、B細胞集団を、2〜4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2〜4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより）B細胞の集団のB細胞を1〜4種類の蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) 1〜4種類の蛍光色素で標識された（および任意で、他の蛍光色素で標識されていない）B細胞の集団のB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞と共に遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と（個々に）共培養する段階、
(f) 個々のB細胞の培養液中に分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
(g) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、B細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る（およびそれによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る）段階、
(h) B細胞が非ヒトB細胞である場合、可変軽鎖および重鎖ドメインをヒト化し、ヒト化可変ドメインをコードする核酸を提供する段階、
(i) モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、（ヒトまたはヒト化）抗体の発現用の1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(j) 発現ベクターを細胞に導入する段階、
(k) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
【００５０】
1つの態様において、B細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る段階は、以下の段階を含む：
- 抗体産生B細胞クローンからの全RNAの抽出、
- 抽出されたポリA+ mRNAの一本鎖cDNA合成／逆転写の実施、
- 1組の種特異的プライマーを用いてPCRの実施、
- 任意で、PCRプライマーの除去／PCR産物の精製、
- 任意で、PCR産物の配列決定。
【００５１】
1つの態様において、モノクローナル抗体可変軽鎖および／または重鎖可変ドメインをコードする核酸を、（ヒトまたはヒト化）抗体の発現用の発現ベクターに導入する段階は、以下の段階を含む：
- 可変軽鎖および重鎖可変ドメインのT4ポリメラーゼインキュベーション、
- 発現ベクターの線状化および増幅、
- 増幅された発現ベクターのT4ポリメラーゼインキュベーション、
- 増幅された発現ベクター中への、可変ドメインをコードする核酸の配列およびライゲーション非依存的クローニング、ならびに
- ベクターで形質転換された大腸菌細胞のプールからのベクターの調製。
【００５２】
すべての局面の1つの態様において、前記方法は、標識する段階の直前に、以下の段階を含む：
- B細胞の集団を、固体表面上に固定化されている（標的）抗原と共にインキュベートし、固定化抗原に結合しているB細胞（のみ）を回収する段階。
【００５３】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団は非ヒト動物B細胞集団である。1つの態様において、B細胞集団はマウスB細胞集団またはハムスターB細胞集団またはウサギB細胞集団である。1つの好ましい態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団である。
【００５４】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団は、免疫化の4日後に非ヒト動物の血液から採取される。1つの態様において、B細胞の集団は、免疫化の4日後から最長13日後までに非ヒト動物の血液から採取される。
【００５５】
1つの態様において、B細胞集団はヒトB細胞集団である。
【００５６】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団は密度勾配遠心分離によって血液から採取される。
【００５７】
すべての局面の1つの態様において、B細胞は成熟B細胞である。
【００５８】
すべての局面の1つの態様において、単一細胞はマルチウェルプレートのウェル中に（個々に）置かれる。
【００５９】
すべての局面の1つの態様において、フィーダー混合物は天然胸腺細胞培養上清 (TSN) または合成フィーダー混合物である。1つの態様において、胸腺細胞培養上清は若年動物の胸腺の胸腺細胞から得られる。
【００６０】
すべての局面の1つの特定の態様において、フィーダー混合物は合成フィーダー混合物である。1つの態様において、合成フィーダー混合物は、
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびに／または
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および／もしくはインターロイキン-10 (IL-10) 、ならびに／または
(iii) 黄色ブドウ球菌株Cowan細胞 (SAC)、ならびに／または
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、ならびに／または
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、ならびに／または
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、ならびに／または
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)
を含む。
【００６１】
すべての局面の1つの態様において、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞である。
【００６２】
1つの態様において、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物は、IL-1βと、TNF-αと、IL-10と、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4、およびIL-6より選択される1つまたは複数とを含む。
【００６３】
1つの態様において、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物はIL-1β、TNF-α、IL-10、SAC、およびIL-2を含む。
【００６４】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物は胸腺細胞培養上清である。
【００６５】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物は、IL-1β、TNF-α、ならびにIL-2、IL-6、およびIL-10のうちの任意の2つからなる。
【００６６】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物はIL-1β、TNF-α、IL-6、およびIL-10からなる。
【００６７】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物は、IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC、およびIL-2またはIL-6を含む。
【００６８】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、フィーダー細胞はマウスEL-4 B5細胞であり、フィーダー混合物は、IL-1β、TNF-α、IL-21、ならびにIL-2、IL-10、およびIL-6のうちの少なくとも1つを含む。
【００６９】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、フィーダー細胞はウサギCD40L発現CHO細胞である。1つの態様において、フィーダー混合物はIL-2およびIL-21ならびに任意でIL-6を含む。
【００７０】
すべての局面の1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００７１】
すべての局面の1つの態様において、置かれる細胞は1種類または4種類の蛍光色素で標識され、インキュベーションは2〜4種類の蛍光標識抗体を伴う。
【００７２】
すべての局面の1つの態様において、B細胞の集団のB細胞の標識化は、（全）B細胞集団の細胞の0.1%〜2.5%の標識化をもたらす。
【００７３】
すべての局面の1つの態様において、標識化はB細胞表面IgGのものである。
【００７４】
すべての局面の1つの好ましい態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗IgM抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面IgMのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面IgMについて陰性の細胞のものである（IgG+IgM--B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００７５】
すべての局面の1つの好ましい態様において、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗IgM抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面IgMのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつ細胞表面IgMについて陰性の細胞のものであり（IgG+IgM--B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）、この場合、B細胞の集団は、固体表面上に固定化されている（標的）抗原と共にインキュベートされ、かつ固定化抗原に結合しているB細胞（のみ）が回収されて蛍光標識抗体とのインキュベーションに供される。
【００７６】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGのものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性の細胞のものである（IgG+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００７７】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面CD138について陽性の細胞のものである（CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００７８】
すべての局面の1つの態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは蛍光標識抗IgG抗体および蛍光標識抗CD138抗体を伴い（標識化は細胞表面IgGおよび細胞表面CD138のものである）、選択は細胞表面IgGについて陽性でかつまた細胞表面CD138についても陽性の細胞のものである（IgG+CD138+-B細胞の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００７９】
すべての局面の1つの好ましい態様において、B細胞集団はウサギB細胞集団であり、インキュベーションは、蛍光標識抗IgG抗体、蛍光標識抗IgM抗体、および任意で、ヒトトランスジェニックウサギの場合には蛍光標識抗ヒトIgG軽鎖抗体を伴い（標識化は、細胞表面IgG、細胞表面IgM、および任意で細胞表面ヒトIgG軽鎖のものである）、選択は、細胞表面IgGについて陽性、細胞表面IgMについて陰性、かつ任意で細胞表面ヒトIgG軽鎖について陽性の細胞のものである（IgG+IgM--B細胞（任意でIgG+IgM-huIgGLC+-B細胞）の単一細胞デポジションをもたらす）。
【００８０】
すべての局面の1つの態様において、共培養は、10% (v/v) FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む1% (w/v) の200 mMグルタミン溶液、2% (v/v) の100 mMピルビン酸ナトリウム溶液、ならびに1% (v/v) の1 M 2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン)-エタンスルホンサン (HEPES) 緩衝液を補充したRPMI 1640培地を含む共培養培地中においてである。1つの態様において、共培養培地は0.05 mM β-メルカプトエタノールをさらに含む。
【００８１】
1つの態様において、動物は実験動物である。1つの態様において、実験動物はマウス、ハムスター、およびウサギより選択される。1つの態様において、実験動物はウサギである。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】IgG陽性ウェル当たりの抗原特異的IgG陽性ウェルの平均頻度を示す。
【図２】IgG陽性ウェル当たりの抗原特異的IgG陽性ウェルの平均頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
定義
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で用いられる場合の「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の1：1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は一般的に、解離定数 (kd) によって表すことができる。親和性は、本明細書において記載されるものを含めた、当技術分野で公知の通常の方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的および例示的態様を以下に記載する。
【００８４】
本出願の中で用いられる「アミノ酸」という用語は、核酸によって直接または前駆体の形でコードされ得るカルボキシα-アミノ酸の群を意味する。個々のアミノ酸は、3つのヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットによってコードされる。各アミノ酸は、少なくとも1つのコドンによってコードされる。これは「遺伝暗号の縮重」として公知である。本出願の中で用いられる「アミノ酸」という用語は、アラニン（3文字表記：ala、1文字表記：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リジン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、スレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、およびバリン（val、V）を含む、天然に存在するカルボキシα-アミノ酸を意味する。
【００８５】
本明細書における「抗体」という用語は、天然に存在するそれらの構造変種を含めた、天然に存在する抗体を意味するために用いられる。
【００８６】
例えば、天然（ヒト、マウス、ラット、ウサギ）IgG抗体は、約150,000ダルトンの分子量を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。天然IgG抗体は、鎖間および鎖内ジスルフィド結合を含む2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖から構成され、結果として4本の鎖はすべて互いに共有結合している。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも称される可変領域 (VH)、続いて3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）を有し、この場合、第1定常ドメインと第2定常ドメインの間には可動性のヒンジ領域が位置している。抗体の重鎖は、それらの配列およびドメイン構造に応じて、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMと称される5つのタイプのうちの1つに割り当てられ得る（抗体の「クラス」）。これらのうちのいくつかはさらに、サブタイプ（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも称される可変領域 (VL)、続いて定常軽鎖定常ドメイン (CL) を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、カッパ (κ) およびラムダ (λ) と称される2つのタイプのうちの1つに割り当てられ得る。
【００８７】
例えば、天然（ラクダ科の動物、すなわち、ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマを含むラクダ科、ラクダ亜目由来）の重鎖のみの抗体（VHH抗体）は、従来のIgG重鎖において見出される古典的なCH1ドメインを含まず、したがって抗体のヒンジ-CH2-CH3ドメインに直接融合されたVHHドメインとして発現される。例えばラマ由来VHH抗体からの可変領域配列は、ヒトVH3ファミリーの可変ドメインにおける配列に類似している (Schroeder et al., Int. Immunol. 2 (1989) 41-50)。IgGタイプの抗体と比較して、L. ラマVHHドメインにおけるCDR3ドメインアミノ酸配列は、重鎖および軽鎖を含む古典的なIgGタイプ抗体の大部分のCDR3ドメインよりも平均して長い。古典的なIgG抗体と同様に、VHH抗体におけるCDRの位置も、当技術分野で周知の方法によって決定することができる（例えば、US 5,637,677を参照されたい）。残基11、37、44、45、および47は、鎖界面の形成に重要である（例えば、WO 99/42077を参照されたい）。
【００８８】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体（IgG/VHH＝4本の鎖／2本の鎖）が結合するのと同じ抗原に結合する、インタクトな抗体の一部のみを含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；直線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、scFv）；単一ドメイン抗体；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
「細胞」という用語は、プラスミドの増殖のために用いられる原核細胞、および核酸の発現のために用いられる真核細胞の両方を含む。1つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、任意で、CHO K1細胞（例えば、ATCC CCL-61もしくはDSM ACC 110)、またはCHO DG44細胞（CHO-DHFR[-]、例えばDSM ACC 126としても公知である)、またはCHO XL99細胞、CHO-T 細胞（例えば、Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963を参照されたい)、またはCHO-S細胞、またはSuper-CHO細胞 (Pak, S.C.O., et al. Cytotechnol. 22 (1996) 139-146)、またはBHK細胞、またはNS0細胞、またはSp2/0細胞、またはHEK 293細胞、またはHEK 293 EBNA細胞、またはPER.C6（登録商標）細胞、またはCOS細胞である。これらの細胞が無血清培地中または懸濁液中での増殖に適合しない場合には、本方法における使用の前に適合化を行うことができる。本明細書で用いられる場合、「細胞」という表現は、対象細胞およびその子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、および移行または継代培養の回数に関係なくそれらに由来する培養物を含む。意図的または偶発的な変異のために、すべての子孫のDNA内容物が正確に同一でなくてもよいこともまた理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変種子孫が含まれる。
【００９０】
「クローン」という用語は、単一のB細胞から生じる／起こる、分裂しかつ抗体を分泌するB細胞の集団を意味する。したがって、B細胞クローンは、B細胞の均一な集団であり、モノクローナル抗体を産生する。
【００９１】
「同族の抗体可変ドメイン対」という用語は、単一の抗体分泌B細胞（クローン）から得られた、すなわち免疫原性分子との接触により哺乳動物の免疫応答の際に対として生成された、またはディスプレイアプローチの際に無作為に組み立てられた1対の抗体可変ドメインを意味する。
【００９２】
「実験動物」という用語は、非ヒト動物を意味する。1つの態様において、実験動物は、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ラマ、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、サメ、およびハ虫類より選択される。1つの態様において、実験動物はウサギである。
【００９３】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、細胞内で起こる転写および/または翻訳ならびに分泌過程を指す。細胞における関心対象の核酸配列の転写レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、関心対象の配列から転写されたmRNAは、qPCRもしくはRT-PCRによって、またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) を参照されたい）。核酸によってコードされるポリペプチドは、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることによって、またはポリペプチドを認識して結合する免疫グロブリンを用いる、ウェスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイなどの、そのような活性に依存しないアッセイを用いることによって、定量することができる（Sambrook, et al., (1989)、前記を参照されたい）。
【００９４】
当業者にとって、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するため、およびその逆のための手順および方法は周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列、および同様に、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴決定される。
【００９５】
「発現カセット」は、少なくとも含まれる核酸を細胞において発現させるための、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの必要な調節エレメントを含む構築物を意味する。
【００９６】
発現は、一過性発現または安定発現のいずれかとして行われ得る。抗体は一般的に、それを産生する細胞によって培養液中に分泌される。したがって、非成熟抗体鎖は、抗体を細胞壁を通って細胞外培地に輸送／分泌するのに必要なN末端伸長（シグナル配列としても公知である）を含む。一般的に、抗体の組換え産生のためのシグナル配列は、分泌型ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来し得る。異種シグナル配列が用いられる場合、それは、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものでなければならない。例えば酵母における分泌の場合、発現されるべき異種遺伝子の天然シグナル配列は、分泌型遺伝子に由来する相同酵母シグナル配列、例えば、酵母インベルターゼシグナル配列、α因子リーダー（サッカロマイセス属 (Saccharomyces)、クリベロマイセス属 (Kluyveromyces)、ピキア属 (Pichia)、およびハンゼヌラ属 (Hansenula) α因子リーダーを含む、2番目のものはUS 5,010,182に記載されている）、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC. アルビカンス (C. albicans) グルコアミラーゼシグナル配列 (EP 0 362 179) などによって置換され得る。哺乳動物細胞では、天然シグナル配列は満足のいくものであるが、同一種または近縁種の他の分泌型ポリペプチドに由来するシグナル配列などの、他の哺乳動物シグナル配列、およびウイルス分泌シグナル配列、例えば単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列が適切である場合がある。そのようなプレセグメントをコードするDNA断片は、抗体鎖をコードするDNA断片にインフレームで連結される、すなわち機能的に連結される。
【００９７】
「発現機構」という用語は、核酸または遺伝子の転写段階（すなわち、「遺伝子発現機構」とも称される）から始まり、核酸によってコードされるポリペプチドの翻訳後修飾までの遺伝子発現の段階に関与する細胞の酵素、補因子等の総和を意味する。発現機構は、例えば、DNAのプレmRNAへの転写、成熟mRNAへのプレmRNAのスプライシング、mRNAのポリペプチドへの翻訳、およびポリペプチドの翻訳後修飾の段階を含む。
【００９８】
「発現プラスミド」または「発現ベクター」とは、含まれる構造遺伝子を宿主細胞において発現させるために必要なすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的に、発現プラスミド／ベクターは、複製開始点および選択マーカーを含む、例えば大腸菌用の原核生物プラスミド増殖単位、真核細胞選択マーカー、ならびに各々がプロモーター、構造遺伝子、任意で転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、関心対象の構造遺伝子を発現させるための1つまたは複数の発現カセットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結される」と称される。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントおよびコアプロモーターは機能的に連結されている。
【００９９】
「フィーダー混合物」という用語は、増殖因子、サイトカイン、ならびに／またはB細胞の活性化および／もしくは生存ならびに／または抗体分泌を促進するさらなるタンパク質などの様々な添加物の組み合わせを意味する。フィーダー混合物は、例えば、サイトカインの規定されていない組み合わせである胸腺細胞の培養上清 (TSN) から得られた、天然フィーダー混合物であってよい。あるいは、フィーダー混合物は、増殖因子、サイトカイン、ならびに／またはB細胞の活性化および／もしくは生存ならびに／または抗体分泌を促進するさらなるタンパク質などの、組換えによって産生されたまたは化学的に合成された様々な添加物の規定された組み合わせである合成フィーダー混合物であってもよい。
【０１００】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に用いられ、そのような細胞の子孫も含め、外因性の核酸が導入されている細胞を指す。宿主細胞は、初代形質転換細胞、および継代回数に関係なくそれらに由来する子孫を含む、「形質転換体」または「トランスフェクタント」および「形質転換細胞」および「トランスフェクトした細胞」を含む。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、本明細書中に含まれる。
【０１０１】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【０１０２】
「個体」または「対象」は脊椎動物である。1つの態様において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、個体または対象はヒトである。他の態様において、個体または対象はウサギである。
【０１０３】
「標識化」という用語は、特異的に結合しかつ標識された抗表面マーカー抗体の細胞に対する結合／非結合によって決定され得る、表面マーカーの有無を決定するための過程を意味する。したがって、表面マーカーの存在は、例えば蛍光標識の場合には蛍光の出現によって決定され、表面マーカーの非存在は、特異的に結合しかつ標識された各抗表面マーカー抗体と細胞とのまたは細胞の集団とのインキュベーション後の蛍光の非存在によって決定される。
【０１０４】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、単一細胞クローンによって産生された実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば自然に生じる変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる可能性のある、一般的に少量で存在する変種抗体を除いて、同一でありかつ／または同じエピトープと結合する。典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られたという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含むトランスジェニック動物を用いる方法を含むがこれに限定されない種々の手法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法およびその他の例示的な方法は、本明細書において記載される。
【０１０５】
「核酸」および「核酸配列」という用語は、個々のヌクレオチド（塩基とも称される）a、c、g、およびt（またはRNAではu）からなるポリマー分子、例えば、DNA、RNA、またはその改変物を意味する。このポリヌクレオチド分子は、天然に存在するポリヌクレオチド分子もしくは合成ポリヌクレオチド分子、または1つもしくは複数の天然に存在するポリヌクレオチド分子と1つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせであってよい。この定義には、1つまたは複数のヌクレオチドが変化した（例えば、変異誘発による）、欠失した、または付加された、天然に存在するポリヌクレオチド分子もまた包含される。核酸は単離されてもよく、または別の核酸、例えば、発現カセット、プラスミド／ベクター、もしくは宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴決定される。
【０１０６】
「機能的に連結された」とは2つまたはそれ以上の成分の並置を指し、このように記載される成分は、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、連結されている配列の転写を制御または調節するようにシスで作用する場合に、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、しかし必ずしもそうとは限らないが、「機能的に連結された」DNA配列は連続しており、分泌リーダーとポリペプチドなどの2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、連続しかつ（リーディング）フレーム内にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは一般的にコード配列の上流に位置するが、必ずしもそれと連続しているとは限らない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合に、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置してよく、またプロモーターとかなり離れて位置してよい。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列まで進むように、コード配列の下流末端に位置する場合に、コード配列に機能的に連結されている。翻訳終止コドンは、翻訳がコード配列を通って終始コドンまで進み、そこで終結されるように、コード配列の下流末端（3'末端）に位置する場合に、エクソン核酸配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野で公知の組換え法によって、例えば、PCR方法論を用いて、および／または簡便な制限部位での連結によって達成される。簡便な制限部位が存在しない場合には、慣行に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
【０１０７】
「構造遺伝子」は、シグナル配列を有しない遺伝子の領域、すなわちコード領域を意味する。
【０１０８】
「特異的に結合する」という用語およびその文法的同等物は、抗体がその標的に10-7 Mまたはそれ未満、1つの態様においては10-8 M〜10-13 M、さらなる態様においては10-9 M〜10-13 Mの解離定数 (KD) で結合することを意味する。本用語はさらに、抗体が、存在するその他の生体分子に特異的に結合しないこと、すなわち抗体が他の生体分子に10-6 Mまたはそれ以上、1つの態様においては10-6 M〜1 Mの解離定数 (KD) で結合することを示すために用いられる。
【０１０９】
「トランスフェクションプラスミド／ベクター」とは、トランスフェクションプラスミド／ベクター中に含まれるコード核酸／構造遺伝子を宿主細胞において発現させるために必要なすべてのエレメントを提供する核酸（核酸分子としても表される）である。トランスフェクションプラスミド／ベクターは、例えば大腸菌用の原核生物プラスミド増殖単位を含み、これは、原核生物複製開始点、および原核生物選択薬剤に対する耐性を付与する核酸を含み、トランスフェクションプラスミド／ベクターは、真核生物選択薬剤に対する耐性を付与する1つまたは複数の核酸、および関心対象のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸をさらに含む。選択薬剤に対する耐性を付与する核酸および関心対象のポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ発現カセット内に配置され、それによって各発現カセットは、プロモーター、コード核酸、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結される」と称される。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントおよびコアプロモーターは機能的に連結されている。
【０１１０】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体のその抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖の領域を指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む（例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するには、単一のVHまたはVLドメインで十分な場合がある。さらに、特定の抗原と結合する抗体に由来するVHまたはVLドメインを用いて、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして、その抗原と結合する抗体を単離することができる（例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clarkson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい）。
【０１１１】
「若齢動物」という用語は、性成熟が起こる前の動物を意味する。若齢ハムスターは、例えば、6週齢未満、特に4週齢未満のハムスターである。若齢マウスは、例えば、8週齢未満、特に5週齢未満のマウスである。
【０１１２】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、B細胞との共培養において使用されるEL4-B5フィーダー細胞が採取される際の培養物の細胞密度が、B細胞およびEL-4-B5フィーダー細胞の共培養において得られる、抗原特異的抗体を分泌するB細胞クローンの頻度（すなわち、相対数）に影響を及ぼすという知見に基づく。当技術分野では、単独EL-4 B5培養物における細胞1,000,000個／mlというEL4-B5細胞の最大細胞密度を超えてはならないといと教示しているため、この知見は驚くべきことである。これが事実とは異なること、およびさらにより高い細胞密度を使用することができ、それによってEL4-B5細胞のより効率的な生成が可能になること、すなわち、共培養において用いられるEL4-B5細胞の数を変更することなく、より高い細胞密度が使用され得るという理由で、培養物の数が減少することが見出された。
【０１１３】
本発明は、少なくとも一部は、共培養において用いられるEL-4 B5細胞が、用いられるEL-4-B5細胞の回収時に、公表されているよりも高い（すなわち、細胞500,000個／mlよりも高い）EL-4 B5細胞密度を有する培養物から得られた場合に、全体的に見て、全IgG陽性ウェル中の抗原結合かつIgG陽性ウェルの頻度が増加するという知見に基づく。この効果は、細胞1,500,000個／mlの細胞密度まで観察された。
【０１１４】
免疫化
治療用抗体の作製については、非ヒト動物を治療標的で免疫化して（単独で、または免疫原性刺激と組み合わせて）免疫応答を誘発するか、またはファージディスプレイライブラリーなどの合成アプローチを使用するかのいずれかである。トランスジェニック動物（すなわち、ヒト免疫系を有する）またはヒトファージディプレイライブラリーが用いられる場合には、ヒト抗体が得られる。そうでなければ、非ヒト動物抗体が得られ、これはその後ヒト化される。潜在的な治療用抗体を得るための稀な可能性は、疾患から回収されたヒトの血液によるものである。
【０１１５】
多くの場合、抗体に基づく治療法を評価するための動物モデルとして、マウス、ウサギ、ハムスター、およびラットなどの非ヒト動物が用いられる。したがって、通常は、非ヒト動物抗原およびヒト抗原に結合する交差反応性抗体を提供することが必要である。
【０１１６】
本明細書において報告される方法では、任意の供給源、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、またはウサギから採取されたB細胞を用いることができる。B細胞の供給源に応じて、フィーダー細胞およびフィーダー混合物が調整／選択される。
【０１１７】
ウサギB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞、またはウサギCD40Lを発現する、CHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞などの哺乳動物細胞のいずれかである。1つの態様において、ウサギは、ニュージーランドホワイト (NZW) ウサギ、ツィンマーマンウサギ (ZIKA)、Alicia変異株ウサギ、basilea変異株ウサギ、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックウサギ、rbIgMノックアウトウサギ、およびそれらの交雑種より選択される。
【０１１８】
ヒトB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞、またはヒトCD40Lを発現する、CHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞などの哺乳動物細胞のいずれかである。
【０１１９】
マウスB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞、またはマウスCD40Lを発現する、CHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞などの哺乳動物細胞のいずれかである。1つの態様において、マウスはNMRIマウスまたはbalb/cマウスである。
【０１２０】
ハムスターB細胞の場合、フィーダー細胞は、EL4-B5細胞であるか、または、ハムスターCD40Lを発現する哺乳動物細胞、例えばCHO細胞もしくはBHK細胞もしくはHEK細胞である。1つの態様において、ハムスターは、アルメニアンハムスター（タビキヌゲネズミ (Cricetulus migratorius)）、チャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ (Cricetulus griseus)）、およびシリアンハムスター（ゴールデンハムスター (Mesocricetus auratus)）より選択される。好ましい態様において、ハムスターはアルメニアハムスターである。
【０１２１】
B細胞の供給源および単離
血液は、高度な多様性の抗体産生B細胞を提供する。そこから採取されたB細胞クローンは、CDR内にほとんど同一ではないまたは重複しないアミノ酸配列を有する抗体を分泌し、よって高度な多様性を示す。
【０１２２】
1つの態様において、例えば血液に由来するB細胞は、免疫化の4日後から非ヒト動物の免疫化または最も近い追加免疫の最長14日後までに採取される。この期間により、本明細書において報告される方法における高い適応性が可能になる。この期間中に、最も親和性の高い抗体を提供するB細胞が脾臓から血液に移動する可能性が高い（例えば、Paus, D., et al., JEM 203 (2006) 1081-1091；Smith, K.G.S., et al., The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006；Wrammert, J., et al., Nature 453 (2008) 667-672を参照されたい）。
【０１２３】
例えば非ヒト動物の血液由来またはヒト血液由来のB細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって採取することができる。例えば、密度勾配遠心分離 (DGC) または赤血球溶解（溶解）を用いることができる。密度勾配遠心分離は低張溶解と比較して、より高い全収率、すなわちB細胞クローン数を提供する。加えて、密度勾配遠心分離によって採取された細胞からは、共培養段階においてより多数の細胞が分裂し、増殖する。また、分泌された抗体の濃度は、異なる方法で採取された細胞と比較してより高い。したがって、1つの態様において、B細胞の集団の提供は密度勾配遠心分離による。
【０１２４】
あるいは、B細胞は、脾臓、またはリンパ節もしくはパイエル板のようなその他の二次免疫器官から採取することもできる。
【０１２５】
共培養前の選択段階
抗原と特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮することができる。したがって、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、B細胞集団は末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮される。
【０１２６】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、PBMCからマクロファージを枯渇させる。このことは、共培養段階のために、ウサギ起源のB細胞にとって特に有利である。
【０１２７】
マクロファージは、細胞培養プレートの表面への接着によってPBMCから枯渇させることができる（プレインキュベーション段階を参照されたい）。
【０１２８】
単一細胞を置く前にB細胞の集団を共培養培地中でインキュベートすることにより、非ヒト動物の血液からB細胞の集団を単離し、任意で濃縮した直後に単一細胞を置く場合と比較して、単一細胞を置いた後に得られる抗体分泌細胞の総数が増加し得る（1つの態様において、非ヒト動物はウサギである）。具体的には、インキュベーションは、例えば細胞培養インキュベーターを用いた、EL-4 B5培地中で約37℃で約1時間である。
【０１２９】
本明細書において報告される方法の1つの態様において、細胞はタンパク質免疫化動物に由来し、標識化の前にそこからマクロファージを枯渇させる。
【０１３０】
抗原と結合する抗体を産生しない細胞、または同様に抗原に結合する抗体を産生する細胞を、パニングアプローチを用いてそれぞれ減少させるまたは濃縮することができる。そこでは、各抗原が表面に結合して提示され、それに結合する細胞は、結合した細胞がさらに処理される場合には細胞集団内で選択的に濃縮されるか、または溶液中に残存する細胞がさらに処理される場合には細胞集団内で減少する。
【０１３１】
本明細書において報告される方法は、1つの態様において、単一細胞を置く前に、特異的および／または非交差反応性抗体を産生するB細胞が細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別／ゲーティングに基づいて選択される選択段階を含む。1つの態様において、成熟B細胞が選別／濃縮／選択される。異なる非ヒト動物種からB細胞を選択するためには、異なる細胞表面マーカーを用いることができる。
【０１３２】
非標的細胞集団および非特異的結合リンパ球を標識することにより、これらの細胞を選択的に枯渇させることが可能である。この枯渇段階では、部分的な枯渇が達成され得るにすぎない。枯渇は定量的でないにもかかわらず、これにより、残存細胞のその後の蛍光標識化における妨害細胞の数が減少するか、またはさらには排除される。標識化を用いる蛍光活性化細胞選別により成熟B細胞（記憶B細胞、親和性成熟形質芽球、および形質細胞）を単一細胞として置くことによって、共培養段階においてより多くの数のIgG+ウェル／細胞クローンを得ることができる。
【０１３３】
異なる細胞集団は、CD3+細胞（T細胞）、CD19+細胞（B細胞）、IgM+細胞（成熟ナイーブB細胞）、IgG+細胞（成熟B細胞）、CD38+細胞（例えば、形質芽球）、およびIgG+CD38+細胞（前形質細胞）などの異なる表面マーカーを用いることによって標識することができる。
【０１３４】
記憶B細胞、形質芽球、および形質細胞などの成熟IgG+ B細胞を選択するための免疫蛍光標識化が使用可能である。B細胞の選択または濃縮のためには、細胞を単一標識するか、または二重標識するか、または三重標識するかのいずれかである。
【０１３５】
（表）マウス (A〜J)、ハムスター (K)、およびウサギ (L〜N) のB成熟細胞を決定するための免疫蛍光標識化
2019513368.tif 000003
【０１３６】
1つの態様において、前記方法は、B細胞集団からマクロファージを枯渇させ、標的抗原と特異的に結合する抗体を分泌するB細胞集団のB細胞を濃縮する段階を含む。
【０１３７】
単一細胞を置くこと
本明細書において報告される方法は、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く段階を含む。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、単一細胞として置く段階は蛍光活性化細胞選別 (FACS) による。FACSで単一細胞を置く段階に必要な標識化のために用いられる表面マーカーは、本明細書において概説されるような特異的マーカー組み合わせであってよい。
【０１３８】
単一細胞を置く段階の後かつ共培養前のさらなる遠心分離段階は、抗体分泌細胞の数および分泌されるIgGの量を増加させ得る。
【０１３９】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、方法は、共培養の前に、単一の置かれた細胞を遠心分離する段階を含む。1つの好ましい態様において、遠心分離する段階は300×gで5分間である。
【０１４０】
共培養
単一の置かれたB細胞を、フィーダー混合物の存在下でマウスEL-4-B5フィーダー細胞と共培養する。
【０１４１】
上記に概説されるように、適切な免疫蛍光標識化によって、共培養段階における収率（IgG+ウェル/細胞クローンの数およびIgG濃度）の増加、ならびにまたPBMCからの成熟IgG+ B細胞の濃縮または単離が達成され得る。
【０１４２】
実験用非ヒト動物の血液から採取されたB細胞に対して用いられる免疫蛍光標識化はまた、マウス、ハムスター、およびウサギなどの実験用非ヒト動物の脾臓およびその他の免疫器官から採取されたB細胞の標識化に用いることもできる。ウサギ血液由来B細胞については、マクロファージの枯渇後に0.2%のIgG+細胞が見出された。マクロファージの枯渇後に、ウサギ由来のパイエル板は0.4%のIgG+細胞を示し、脾臓は0.3%のIgG+細胞を示した。
【０１４３】
本明細書において報告される方法により、共培養の約7日後に、すなわち5日、6日、7日、または8日後に、特に7日または8日後に、約30 ng/mlから最大で15μg/mlまでまたはそれ以上の抗体濃度が得られ得る（平均値約500 ng/ml）。例えば結合特異性に関して、より詳細に抗体を特徴決定するために、それによって提供される抗体量を用いて、多数の異なる解析を行うことができる。スクリーニング／選択過程のこの初期段階における抗体の特徴決定の改善により、行うべき必要な核酸単離および配列決定反応の回数を減らすことが可能である。加えて、B細胞クローンは、縮重PCRプライマーの使用を可能にする一定量の、モノクローナル軽鎖および重鎖可変領域をコードするmRNAを提供し、それによって高度に特異的なプライマーの必要性がなくなる。また、必要なPCRサイクル数も減少する。したがって、1つの態様において、逆転写PCRは、軽鎖および重鎖可変ドメイン用の縮重PCRプライマーを用いて行われる。
【０１４４】
いくつかのさらなる段階が先行しておよびまた後続して、フィーダー細胞との共培養段階を行うことができる。
【０１４５】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、フィーダー混合物は胸腺細胞培養上清である。特定の態様において、胸腺細胞培養上清は各非ヒト動物の胸腺の胸腺細胞から得られる。
【０１４６】
培養胸腺細胞の上清（胸腺細胞培養上清（thymocyte cultivation supernatant - TSN））に由来するフィーダー混合物の起源に起因して、かなりのバッチ間変動が生じる場合がある。
【０１４７】
この変動性を克服するために、合成成分からなる合成フィーダー混合物を用いることができる。
【０１４８】
Tucci, A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784により、IL-1β（インターロイキン-1β）、TNF-α（腫瘍壊死因子α）、IL-2（インターロイキン-2）、およびIL-10（インターロイキン-10）からなる合成フィーダー混合物が公知である。
【０１４９】
合成フィーダー混合物用のB細胞種特異的添加物は、各B細胞クローンによる分泌抗体の量の増加をもたらし得る。同時に、高産生細胞はより多くのmRNAを含み、次にこれにより、例えば重複非特異的プライマーセットを用いたコード核酸の逆転写および配列決定が容易になる。 
【０１５０】
SAC（黄色ブドウ球菌株Cowan細胞、単一のSACロットを使用した）の添加により、共培養後の抗体分泌B細胞の数および上清中の平均IgG濃度を増加させることができる。共培養におけるSACの添加については、SAC濃度の低下および上昇により、分泌抗体の量が減少するため、濃度範囲が規定され得る。
【０１５１】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、マウスB細胞の共培養のための合成フィーダー混合物は、IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、およびBAFFを含む。1つの態様において、BAFFは5 ng/mlの濃度で添加される。
【０１５２】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、ハムスターB細胞の共培養のための合成フィーダー混合物は、IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、IL-6、およびSACを含む。1つの態様において、IL-6は10 ng/mlの濃度で添加される。1つの態様において、SACは1:75,000比で添加される。
【０１５３】
EL-4 B5フィーダー細胞の存在下において、マウス、ハムスター、およびウサギB細胞の共培養には少なくともIL-1βおよびTNFαが必要である。マウス細胞の共培養には、IL-2およびIL-10を省略することができる。ハムスターB細胞は、IL-2またはIL-10のいずれかの非存在下で培養することができる。ウサギB細胞は、IL-2またはIL-10またはIL-6のいずれかの非存在下で培養することができる。
【０１５４】
1つの態様において、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-10、およびIL-21は、組換えマウスIL-1β、マウスTNF-α、マウスIL-2、マウスIL-10、およびマウスIL-21である。
【０１５５】
1つの態様において、BAFFは5 ng/mlの濃度で添加される。
【０１５６】
1つの態様において、IL-6は10 ng/mlの濃度で添加される。
【０１５７】
1つの態様において、SACは1:75,000比で添加される。
【０１５８】
共培養は、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、丸底を有するウェルを備えたポリスチレンマルチウェルプレート中においてである。ウェルの作業容積は、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、50μl〜250μlである。1つの態様において、ウェルは、ポリマープラスチック樹脂と両親媒性分子の混合物から調製された非繊維性基材で少なくとも部分的にコーティングされ、両親媒性分子は親水性部分および疎水性領域を含み、疎水性領域は該基材内に固定され、親水性部分は該基材上に露出している。1つの態様において、両親媒性分子は、エトキシ化アルキルアミン、ポリ（エチレンイミン）、オクチルデカミン、またはそれらの混合物より選択される（例えばEP 1 860 181を参照されたい）。
【０１５９】
共培養した細胞の特徴決定
共培養後の分泌されたIgGの（定性的および定量的）測定には、一般的に、ELISAなどの当業者に公知のすべての方法を用いることができる。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、ELISAが用いられる。
【０１６０】
特徴決定の結果に応じて、B細胞クローンを得ること、すなわち選択することができる。「クローン」という用語は、単一のB細胞から生じる／起こる、分裂しかつ抗体を分泌するB細胞の集団を意味する。したがって、B細胞クローンはモノクローナル抗体を産生する。
【０１６１】
mRNAの単離、クローニング、および配列決定
B細胞から全mRNAを単離し、cDNAに転写することができる。特異的プライマーを用いて、同族のVH領域およびVL領域コード核酸を増幅することができる。同一の配列はほとんど得られない。前記方法は、同一抗原に結合する高度に多様な抗体を提供する。
【０１６２】
VHコード核酸を増幅するために用いられるプライマーは、NMRIマウス、アルメニアンハムスター、Balb/cマウス、ならびにシリアンハムスター、およびウサギに由来する細胞から得られたcDNAに用いることができる。
【０１６３】
本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、アミノ酸配列は増幅されたVHコード核酸から導かれ、正確な開始点および終点は、EVQL/QVQL（SEQ ID NO: 40および41）〜VSS（VH領域）(SEQ ID NO: 42) ならびにDIVM/DIQM（SEQ ID NO: 43および44）〜KLEIK（VL領域）(SEQ ID NO: 45) のアミノ酸配列を位置づけることによって同定される。
【０１６４】
本明細書において、以下の段階を含む、抗体を生成するための方法もまた報告される：
(a) （実験用非ヒト動物の血液から採取された）（成熟）B細胞の集団を提供する段階、
(b) B細胞の集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素で（1つの態様においては、1〜4種類または2〜4種類の蛍光色素で）染色する段階、
(c) 個々の容器（1つの態様においては、容器はマルチウェルプレートのウェルである）に、染色されたB細胞の集団の単一細胞を置く段階、
(d) 置かれた個々のB細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物（1つの態様においてフィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様においてフィーダー混合物は天然TSNであり、1つの態様においてフィーダー混合物は合成フィーダー混合物である）の存在下で培養する段階、
(e) 個々のB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
(f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る段階、
(g) モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、抗体発現用の発現カセットに導入する段階、
(h) 該核酸を細胞に導入する段階、
(i) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
【０１６５】
1つの態様において、非ヒト動物は、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類より選択される。
【０１６６】
本明細書において報告される方法
本発明は、少なくとも一部は、細胞500,000個超／ml、特に細胞600,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの範囲の（最終）細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られたEL4-B5フィーダー細胞を、B細胞との共培養において使用することが有利であるという知見に基づく。
【０１６７】
本明細書において報告される1つの局面は、
- 1個または複数個のB細胞をEL4-B5細胞と共にインキュベートする段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、EL4-B5細胞が、細胞600,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られている／該EL4-B5細胞の培養物に由来する、方法である。
【０１６８】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞650,000個／mlから細胞1,450,000個／mlまでの細胞密度を有する。
【０１６９】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞650,000個／mlから細胞825,000個／mlまでの細胞密度を有する。
【０１７０】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞700,000個／mlから細胞775,000個／mlまでの細胞密度を有する。
【０１７１】
1つの態様において、EL4-B5細胞の培養物は、細胞1,400,000個／mlから細胞1,500,000個／mlまでの細胞密度を有する。
【０１７２】
前記方法を、異なる結合特異性を有する抗体を発現する2つのB細胞調製物を用いて、以下に例証する。
【０１７３】
1つ目の例では、ヒトCDCP1で免疫化されたウサギから採取されたB細胞を使用した。
【０１７４】
免疫化ウサギから採取されたB細胞を、マルチウェルプレートのウェル中に単一細胞として置いた（それぞれ96ウェルプレート3枚について；それぞれのEL4-B5細胞密度につき252ウェル）。単一の置かれた各細胞を、50グレイで照射した50,000個のEL4-B5細胞と共に、TSNおよびSACの存在下において7日間共培養した。
【０１７５】
IgG陽性ウェル、すなわち共培養上清中でIgGが検出され得たウェルの平均頻度は、EL4-B5細胞が採取された際の培養物の細胞密度にかかわらず同等であった（以下の表を参照されたい）。
【０１７６】
（表）
2019513368.tif 000004
【０１７７】
平均産生能もまた、EL4-B5細胞が採取された際の培養物の細胞密度にかかわらず同等であった（以下の表を参照されたい）。
【０１７８】
（表）
2019513368.tif 000005
【０１７９】
全ウェルに対する、抗原特異的IgG陽性ウェル、すなわち標的抗原に特異的に結合するIgGが産生されたウェルの平均頻度は、EL4-B5細胞が採取された際の培養物の低細胞密度および高細胞密度に関してのみ同等であった（以下の表を参照されたい）。
【０１８０】
（表）
2019513368.tif 000006
【０１８１】
IgG陽性ウェルに対する、抗原特異的IgG陽性ウェル、すなわち標的抗原に特異的に結合するIgGが産生されたウェルの平均頻度は、EL4-B5細胞が採取された際の培養物の高細胞密度に関してのみ同等であった（以下の表および図1を参照されたい）。
【０１８２】
（表）
2019513368.tif 000007
【０１８３】
2つ目の例では、ヒト血清アルブミンで免疫化されたウサギから採取されたB細胞を使用した。
【０１８４】
免疫化ウサギから採取されたB細胞を、マルチウェルプレートのウェル中に単一細胞として置いた（それぞれ96ウェルプレート2枚について；それぞれのEL4-B5細胞密度につき168ウェル）。単一の置かれた各細胞を、50グレイで照射した50,000個のEL4-B5細胞と共に、TSNおよびSACの存在下において7日間共培養した。
【０１８５】
IgG陽性ウェル、すなわち共培養上清中でIgGが検出され得たウェルの平均頻度は、EL4-B5細胞が採取された際の培養物における細胞1,450,000個／mlの細胞密度まで同等であった（以下の表を参照されたい）。
【０１８６】
（表）
2019513368.tif 000008
【０１８７】
平均産生能もまた、EL4-B5細胞が採取された際の培養物における細胞1,450,000個／mlの細胞密度まで同等であった（以下の表を参照されたい）。
【０１８８】
（表）
2019513368.tif 000009
【０１８９】
全ウェルに対する、抗原特異的IgG陽性ウェル、すなわち標的抗原に特異的に結合するIgGが産生されたウェルの平均頻度は、EL4-B5細胞が採取された際の培養物における細胞1,450,000個／mlの細胞密度まで同等であった（以下の表を参照されたい）。
【０１９０】
（表）
2019513368.tif 000010
【０１９１】
IgG陽性ウェルに対する、抗原特異的IgG陽性ウェル、すなわち標的抗原に特異的に結合するIgGが産生されたウェルの平均頻度は、EL4-B5細胞が採取された際の培養物における細胞約700,000個／mlおよび細胞約1,450,000個／mlの細胞密度において増加した（以下の表および図2を参照されたい）。
【０１９２】
（表）
2019513368.tif 000011
【０１９３】
以下の実施例および配列は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載の手順において変更がなされ得ることが理解される。
【実施例】
【０１９４】
材料および方法
組換えDNA法
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) に記載されているような標準方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
【０１９５】
培地および緩衝液
ELISA用のブロッキング緩衝液は、1×PBSおよび1% BSAを含む。
【０１９６】
ELISA用のコーティング緩衝液は4.29 g Na2CO3* 10 H2Oおよび2.93 g NaHCO3を含み、最終量1リットルまで水を添加し、2 N HClでpH 9.6に調整する。
【０１９７】
RNA単離用のエタノール溶液は、70%エタノールまたは80%エタノールを含む。
【０１９８】
免疫蛍光染色用のFACS緩衝液は、1×PBSおよび0.1% BSAを含む。
【０１９９】
ELISA用のIMDM緩衝液は、1×PBS、5% IMDM、および0.5% BSAを含む。
【０２００】
ELISA用のインキュベーション緩衝液1は、1×PBS、0.5% CroteinCを含む。
【０２０１】
ELISA用のインキュベーション緩衝液2は、1×PBS、0.5% CroteinC、および0.02% Tween 20を含む。
【０２０２】
ELISA用のインキュベーション緩衝液3は、1×PBS、0.1% BSAを含む。
【０２０３】
ELISA用のインキュベーション緩衝液4は、1×PBS、0.5% BSA、0.05% Tween、PBS (10×)、0.01 M KH2PO4、0.1 M Na2HPO4、1.37 M NaCl、0.027 M KCl、pH 7.0を含む。
【０２０４】
PCR緩衝液は、500 mM KCl、15 mM MgCl2、100 mM Tris/HCl、pH 9.0を含む。
【０２０５】
ELISA用の洗浄緩衝液1は、1×PBS、0.05% Tween 20を含む。
【０２０６】
ELISA用の洗浄緩衝液2は、1×PBS、0.1% Tween 20を含む。
【０２０７】
ELISA用の洗浄緩衝液3は、水、0.9% NaCl、0.05% Tween 20を含む。
【０２０８】
EL-4 B5培地は、10% FCS（Hyclone、Logan, UT, USA）、2 mMグルタミン、1%ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA、Pasching, Austria）、2 mMピルビン酸ナトリウム、10 mM HEPES（PAN Biotech、Aidenbach, Germany）、および0.05 mM β-メルカプトエタノール（Gibco、Paisley, Scotland）が補充されたRPMI 1640（PAN Biotech、Aidenbach, Germany）を含む。
【０２０９】
動物の管理および免疫化
実験動物は、ドイツ動物保護法 (TierSCHG) に従って、および各欧州指針に従って維持した。
【０２１０】
最初は、抗原を完全フロイントアジュバント (CFA) と共に適用した。さらなる適用は、不完全フロイントアジュバント (IFA) と共に行った。抗原含有乳濁液を皮下に適用し、該乳濁液は、受け取る実験動物の体重に応じて50〜100μgの量の抗原を含んだ。
【０２１１】
免疫化には、NZWウサギ (Charles River Laboratories International, Inc.) を使用した。抗原を1 mg/mlの濃度でK3PO4緩衝液pH 7.0に溶解し、安定した乳濁液が作製されるまで完全フロイントアジュバント (CFA) と混合した (1:1)。ウサギに2 mlの乳濁液を皮内 (i.d.) 注射し、その後1週間間隔でそれぞれ1 mlを2度目には筋肉内 (i.m.) 注射および3度目には皮下 (s.c.) 注射した。2週間後に4度目の1 mlのi.m.注射を行い、続いて4週間間隔で1 mlの2回のさらなるs.c.注射を行った。
【０２１２】
免疫化の期間中に、抗原特異的アッセイを用いて血清抗体価を測定した。抗体価が1:10000のIC50を有する時点で、免疫化動物の血液または脾臓を取り出した。抗原特異的B細胞の再活性化のため、血液または脾臓を取り出す3日前に、30μg〜50μgの抗原を実験動物の静脈内に適用した。
【０２１３】
器官、血液、およびマクロファージの取り出し
マウス由来およびハムスター由来の血液は、眼球後静脈の穿刺によって採取した。ウサギ由来の血液は、耳静脈、またはより大量の場合には耳動脈の穿刺によって採取した。3度目、4度目、5度目、および6度目の免疫化の4〜6日後にウサギから全血 (10 ml) を回収し、FACSによる単一細胞選別に使用した。
【０２１４】
マクロファージは、細胞培養プラスチックへの付着により、採取された血液から単離した。マウスおよびハムスターからは、この方法により各動物から約3*105個のマクロファージが得られ得る。
【０２１５】
より大量のマウスまたはハムスターマクロファージが必要である場合には、腹腔マクロファージを単離した。このためには、動物は少なくとも3ヵ月齢でなくてはならない。腹腔マクロファージの取り出しのため、動物を屠殺し、37℃のEL-4 B5培地5 mlを直ちに腹腔内に注入した。動物の腹部を5分間もんだ後、細胞を含む溶液を取り出した。
【０２１６】
EDTAを含有する全血を1×PBSで2倍に希釈した後に、lympholyte mammal (Cedarlane Laboratories) またはFicoll Paque Plus（GE Healthcare、カタログ番号17-1440-03）によって密度遠心分離を行ったが、これはウサギPBMCを単離するために行った。PBMCを2回洗浄した後に、抗体で染色した。
【０２１７】
密度勾配遠心分離
末梢血単核細胞 (PBMC) の単離は、製造業者の説明書A（Lympholyte（登録商標）-mammal、Cedarlane）に従ってLympholyte（登録商標）を用いて密度勾配分離により行った。
【０２１８】
採血した血液をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で2:1に希釈した。遠心分離バイアル中に同量の密度分離培地を提供し、希釈した血液をバイアルの壁を介して注意深く添加した。バイアルを、ブレーキをかけずに800×gで20分間遠心分離した。白い中間層からリンパ球を採取した。取り出した細胞にPBS 10 mlを補充し、800×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、かつペレットを再懸濁し、洗浄し、遠心分離した。最終ペレットをPBSに再懸濁した。
【０２１９】
赤血球の低張溶解
低張溶解による赤血球の破壊のため、塩化アンモニウム溶液（BD Lyse（商標））を水で1:10に希釈し、全血に対して1:16の比で添加した。赤血球を溶解するため、この混合物を暗所で15分間インキュベートした。無傷細胞から細胞残屑を分離するため、溶液を800×10で10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをPBSに再懸濁し、再度洗浄し、遠心分離し、かつペレットをPBSに再懸濁した。実施例8。
【０２２０】
マクロファージの枯渇
滅菌した6ウェルプレート（細胞培養等級）を使用して、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させた。ウェルをKLH（キーホールリンペットヘモシアニン）、またはストレプトアビジンおよび対照ペプチドのいずれかでコーティングした。各ウェルを3 ml〜（最大）4 mlの培地、および免疫化ウサギ由来の最大で6×106個までの末梢血単核細胞で満たし、インキュベーター内で37℃で60〜90分間結合させた。その後、リンパ球含有上清を遠心分離バイアルに移し、かつ800×gで10分間遠心分離した。ペレットをPBSに再懸濁した。
【０２２１】
抗原特異的B細胞の濃縮
各抗原を、最終濃度2μg/mlまでコーティング緩衝液で希釈した。この溶液3 mlを6ウェルマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。使用する前に上清を除去し、ウェルをPBSで2回洗浄した。B細胞溶液を細胞2×106個/mlの細胞密度に調整し、3 mlを6ウェルマルチウェルプレートの各ウェルに添加した（培地3〜4 ml当たり最大で細胞6×106個まで）。プレートを37℃で60〜90分間インキュベートした。上清を除去し、ウェルを1×PBSで1〜4回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。付着性の抗原特異的B細胞を回収するため、1 mlのトリプシン／EDTA溶液をマルチウェルプレートのウェルに添加し、37℃で10〜15分インキュベートした。培地を添加することによりインキュベーションを停止し、上清を遠心分離バイアルに移した。ウェルをPBSで2回洗浄し、この上清を他の上清と混合した。細胞を800×gで10分間遠心分離してペレット化した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。任意で、ペレットをPBSに再懸濁した。
【０２２２】
B細胞とEL-4 B5細胞の共培養
(a) 共培養は、丸底を有する96ウェルマルチウェルプレート中で行った。EL-4 B5培地中にEL-4 B5細胞（細胞1.6×106個／15.2 ml）およびサイトカインを含む基礎溶液を調製した。200μlの基礎溶液をマルチウェルプレートの各ウェルに添加した。各ウェルに対して、蛍光活性化細胞選別により単一B細胞を添加した。B細胞の添加後、プレートを300×gで5分間遠心分離した。プレートを37℃で7日間インキュベートした。
【０２２３】
(b) 単一選別したB細胞を96ウェルプレート中で、Pansorbin細胞 (1:20000)（Calbiochem (Merck)、Darmstadt, Deutschland）、5%ウサギ胸腺細胞上清、およびγ照射したEL-4-B5マウス胸腺腫細胞（2×104個／ウェル）を加えた210μl／ウェルEL-4 B5培地を用いて、インキュベーター内の5% CO2の雰囲気中で37℃で7日間培養した。スクリーニングのためにB細胞培養上清を取り出し、細胞は可変領域遺伝子クローニングのために直ちに回収するか、または100μl RLT緩衝液（Qiagen、Hilden, Germany）中で-80℃で凍結した。
【０２２４】
ヒトB細胞をこれに応じて培養した。
【０２２５】
T細胞の培養
それぞれ3〜4週齢のマウスおよびハムスターまたは4〜5週齢のウサギの胸腺からT細胞を単離した。細胞を遠心分離し、直ちに培養するか、または細胞3×107個の一定分量で凍結した。胸腺細胞は、175 cm2培養フラスコ中で、細胞5×105個／EL-4 B5培地1 mlの最小細胞密度で播種し、37℃で48時間インキュベートした。
【０２２６】
マクロファージの培養
それぞれ少なくとも3ヵ月齢のマウスおよびハムスターの腹腔からマクロファージを単離した。マウスもしくはハムスター由来の腹腔マクロファージ、またはウサギ由来の血液単核細胞を、175 cm2培養フラスコ中細胞少なくとも1×105個／mlの細胞密度で、EL-4 B5培地中で37℃にて1.5時間培養した。その後、培地を取り出し、温めたEL-4 B5培地で洗浄することにより付着したマクロファージから付着しなかった細胞を取り出し、続いて35 ml培地中で48時間培養した。
【０２２７】
T細胞とマクロファージの共培養
T細胞およびマクロファージを別々のフラスコ中で48時間培養した。両方の細胞集団を混合する前に、T細胞を800×gで10分間遠心分離した。上清を破棄し、細胞ペレットを培地10 mlに再懸濁した。T細胞を細胞5×105個／mlの最小細胞密度に調整し、培地1 ml当たり10 pgホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA) および5 ngまたは50 ngフィトヘマグルチニンM (PHA-M) を添加した。マクロファージから培養液を取り出し、マクロファージを含むフラスコにT細胞懸濁液を添加した。36時間の共培養後に培養液を取り出し、これをTSN溶液と命名した。残存細胞を取り出すため、TSN溶液を0.22μmフィルターを通して濾過した。TSN溶液を4 mlの一定分量で-80℃で凍結した。
【０２２８】
免疫蛍光染色
プロトコール1：
染色しようとする細胞の数に応じて、細胞をそれぞれ100μl培地（細胞106個未満）または200μl培地（細胞106個超）中に提供した。蛍光標識抗体を実験動物の5%血清およびFACS緩衝液で、それぞれ100μlまたは200μlの最終量に希釈した。反応混合物をローラーラック上で、暗所で4℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を300×gで5分間、2回洗浄した。ペレットをPBS 400μlに再懸濁し、70μmふるいを通して濾過した。濾過した溶液をFACSバイアルに移し、FACS実験の直前に、死細胞をヨウ化プロピジウム (6.25μg/ml) の添加により染色した。標識抗体がビオチンで標識されている場合には、該抗体はストレプトアビジン標識Alexa Fluor（登録商標）647（抗体197）を用いて第2段階で検出した。
【０２２９】
プロトコール2：
単一細胞選別のために使用した抗ウサギ IgG FITCは、AbD Serotec（STAR121F、Dusseldorf, Germany）から入手した。
【０２３０】
表面染色のために、細胞を、PBSで最適に希釈した抗ウサギIgG FITC抗体と共に、回転させながら暗所で4℃にて30分間インキュベートした。遠心分離後に、上清を吸引によって除去した。PBMCを2サイクルの遠心分離に供し、氷冷PBSで洗浄した。最後に、PBMCを氷冷PBSに再懸濁し、直ちにFACS解析に供した。FACS解析の前に5μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen、San Diego, CA, USA）を添加して、死細胞と生細胞を区別した。他の実験では、染色細胞をFACSによって単一で置いた。
【０２３１】
コンピュータおよびFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences、USA）を備えたBecton Dickinson FACSAriaを用いて、データを収集し解析した。
【０２３２】
増殖アッセイ
(a) Cell Titer Glo (CTG) 生存アッセイ
CTG生存アッセイ（Promega；#G7571）は、製造業者の説明書に従って使用した。
【０２３３】
(b) 3Hチミジンアッセイ
6日間インキュベートした後、3H-チミジンを添加し（0.5μCi/ウェル）、さらに16時間インキュベートした。細胞増殖中の3H-チミジンの取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウンター (Wallac) を用いて決定した。
【０２３４】
(c) 顕微鏡解析
顕微鏡画像を取得するために、高解像度カメラ (Leica DFC290 HD) と組み合わせたLeicaの位相差顕微鏡 (Leica DM IL) を使用した。
【０２３５】
(d) CFSE標識によるB細胞活性化の解析
単離されたB細胞を、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄した。1×107個までの細胞をタンパク質不含PBS 1mlに再懸濁し、最終濃度2.5μMのCFSE（#C34554、Invitrogen/Molecular Probes）と共に37℃で3〜10分間インキュベートした。過剰量のFCS補充培地を添加することにより、CFSE負荷を停止した。FCS含有培地で大規模に洗浄した後、B細胞を共培養実験において使用した。CFSE希釈の結果としてのCD19+ゲート化 (B)細胞の増殖を、表示の時点後にフローサイトメトリー解析（FL-1チャネル）によって確認した。
【０２３６】
IgGの定量化
7日間の共培養後に、共培養を行った96ウェルマルチウェルプレートを300×gで5分間遠心分離した。上清150μlを取り出し、2枚目の96ウェルマルチウェルプレート中でPBSで2:1の比に希釈した。
【０２３７】
抗体は50 ng/mlの濃度で使用した。5分間のインキュベーション時間後にODが1または1超である場合には、0.8〜108 ng/ml IgGの希釈系列を試験した。
【０２３８】
抗原特異的IgGの検出
単一で置かれかつ共培養されたB細胞により産生された抗体、または免疫化実験動物から採取されたB細胞から産生された抗体を、特異的抗原結合に関して特徴決定することができる。ELISAを室温で行い、個々の段階の間にELISA溶液を20×gの振盪機上でインキュベートした。第1段階では、抗原を96ウェルマルチウェルプレートのウェルに結合させた。抗原がタンパク質である場合には、それをコーティング緩衝液で希釈し、プレートに直接適用した。ペプチド抗原は、特異的結合対であるビオチン／ストレプトアビジンを介して結合させた。マルチウェルプレートのウェルは、製造業者によって可溶性CroteinC (CrC) で既にコーティングされていてよい。そうでない場合には、抗原の固定化後に、ウェルをブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした。それぞれウェル1個当たり100μlの抗原溶液（予めコーティングされたマルチウェルプレート）またはブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした後、非結合の抗原またはブロッキング緩衝液を洗浄緩衝液での洗浄により除去した。希釈したB細胞上清をウェル1個当たり100μlの量で添加し、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄した。その後、検出抗体をウェル1個当たり100μlの量で添加した。該抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合していてもよいし、またはビオチンで標識されていてもよい。検出抗体は、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートにより決定した。インキュベーション後、マルチウェルプレートを洗浄し、その後3,3',5,5'テトラメチルベンジジン (TMB) を含む基質溶液をウェル1個当たり50μl添加し、表Xに示される期間インキュベートした。硫酸50μlの添加により酵素反応を停止し、光度計（Rainbow Thermo ELISAリーダー）およびXread plusソフトウェアにより450 nmおよび680 nmの吸光度を測定した。
【０２３９】
リボ核酸 (RNA) の単離
最初に、RNAを単離すべき細胞を遠心分離によってペレット化した。10μl/ml β-メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液100μlの添加により、細胞ペレットを溶解した。ピペットで複数回混合することにより、細胞を再懸濁した。溶液をマルチウェルプレートのウェルに移した。プレートに200×gで手短にショックを与え、これを-20℃で凍結した。
【０２４０】
RNAの単離は、製造業者の説明書に従ってRNeasy（登録商標）キット（Quagen、Hilden, Germany）を用いて行った。
【０２４１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
プロトコール1：
逆転写は20μlの量で行った。各反応について、逆転写酵素を用いておよび用いずに対照を実施した。1反応当たり1μl dNTP（それぞれ10 mM）、0.4μlオリゴ(dT)12-18 (0.2μg)、および0.6μlランダムヘキサマー (0.03μg) を予め混合し、H2O中のRNA 8.5μlに添加した。反応混合物を65℃で5分間インキュベートし、その後直接氷に移した。その後、2μl RT緩衝液 (10×)、4μl MgCl2 (25 mM)、2μl DTT (0.1 M)、および1μl RNAse Out（商標）（40単位）を予め混合し、氷冷反応混合物に添加した。室温での2分間のインキュベーション時間の後、0.5μl Superscript（商標）II逆転写酵素（25単位）を添加した。反応混合物を室温で10分間インキュベートした。翻訳は42℃で50分間行った。翻訳後、70℃で15分間のインキュベーションにより、逆転写酵素を不活化した。cDNAを-20℃で保存した。
【０２４２】
プロコトール2：
製造業者の説明書に従ってSuper Script III第一鎖合成SuperMix (Invitrogen) を使用して、mRNAの逆転写によりcDNAを作製した。第一段階において、単離されたmRNA 6μlをアニーリング緩衝液1μlおよびオリゴdT 1μl (50μM) と混合し、65℃で5分間インキュベートし、その後直ちに氷上に約1分間置いた。続いて、なお氷上で、2×第一鎖反応ミックス10μlおよびSuperScript（商標）III／RNaseOUT（商標）酵素ミックスを添加した。混合後、反応物を50℃で50分間インキュベートした。85℃で5分間インキュベートすることにより、反応を停止した。停止後、反応混合物を氷上に置いた。
【０２４３】
ポリメラーゼ連鎖反応
プロコトール1：
ポリメラーゼ連鎖反応は、製造業者の説明書に従ってTaq PCR Coreキット（Qiagen、Hilden, Germany）を用いて行った。PCRは20μlの量で行った。試料を95℃のMastercyler（登録商標）に移した。
【０２４４】
プロコトール2：
ポリメラーゼ連鎖反応は、製造元業者の説明書に従ってAccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen) を用いて行った。軽鎖および重鎖可変領域を個別の反応において増幅した。標的抗体発現ベクターに対して25 bpの重複を有するPCRプライマー（0.2μM／反応）を使用した。PCR後、PCR反応混合物8μlを48ウェルeGel (Invitrogen) での解析のために使用した。
【０２４５】
配列決定
DNA配列は、SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany) において実施された二本鎖配列決定により決定した。
【０２４６】
DNAおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データ管理
配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図解のために、GCG（Genetics Computer Group、Madison, Wisconsin）のソフトウェアパッケージバリアント10.2およびInfomaxのVector NTI Advanceスイートバリアント8.0を使用した。
【０２４７】
遺伝子合成
cDNAをコードする所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH (Regensburg, Germany) によって調製された。発現構築物クローニングを容易にするために、下記のように、遺伝子セグメントには特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。
【０２４８】
抗原上でのパニング
(a) プレートのコーティング
ビオチン／ストレプトアビジン： 滅菌したストレプトアビジンコーティング6ウェルプレート（細胞培養等級）を、PBS中の0.5〜1 (2) μg/mlの濃度のビオチン化抗原と共に室温で1時間インキュベートした。プレートは、使用する前に滅菌したPBSで3回洗浄した。
【０２４９】
タンパク質の共有結合： 滅菌した細胞培養6ウェルプレートを、炭酸緩衝液（0.1 M炭酸水素ナトリウム、34 mM炭酸水素二ナトリウム、pH 9.55）中の2μg/mlタンパク質で、4℃で一晩コーティングした。プレートは、使用する前に滅菌したPBSで3回洗浄した。
【０２５０】
(b) 抗原上でのB細胞のパニング
各抗原でコーティングされた6ウェル組織培養プレートに、培地4 ml当たり6×106個までの細胞を播種し、インキュベーター内で37℃で1時間結合させた。ウェルを1×PBSで1〜2回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。残存する付着細胞を、インキュベーター内で37℃で10分間にわたりトリプシンによって剥離し、次いで培地で2回洗浄した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。
【０２５１】
プラスミドDNAの調製
抗体重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするPCR産物をクローニングするためのレシピエントとして使用されるべきプラスミドDNAを、最初に制限酵素消化によって線状化した。続いて、線状化プラスミドDNAを分取アガロース電気泳動によって精製し、ゲル (QIAquick Gel Extraction Kit / Qiagen) から抽出した。この精製プラスミドDNAを、クローニングされるべきPCR産物と（20〜25 bpだけ）重複するプライマーを用いるPCRプロトコールに鋳型として加えた。PCRは、AccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen) を用いて行った。
【０２５２】
クローニング
Haun, R.S., et al. (BioTechniques 13 (1992) 515-518) およびLi, M.Z., et al. (Nature Methods 4 (2007) 251-256) によって記載される「部位およびライゲーション非依存的クローニング」法 (SLIC) を用いて、PCR産物を発現ベクタ中にクローニングした。精製ベクターおよびインサートの両方を、dNTPの非存在下でDNA 1μg当たりT4 DNAポリメラーゼ（Roche Applied Sciences、Mannheim, Germany）0.5 Uによって25℃で45分間処理して、適合するオーバーハングを生成した。反応容積の1/10の10 mM dCTP溶液 (Invitrogen) を添加することによって、反応を停止した。T4処理したベクターおよびインサートDNA断片を1:2 (w/w)のプラスミド：インサート比（例えば、100 ng:200 ng）で組み合わせ、RecAProtein (New England Biolabs) および10×RecA緩衝液を添加することにより37℃で30分間組換えを行った。続いて、作製された重鎖および軽鎖発現プラスミドの各5μlを使用して、標準的な化学的形質転換プロトコールを用いて、MultiShot Strip Well TOP 10 Chemically Competent E.coli cell (Invitrogen) を形質転換した。再生後（形質転換大腸菌細胞を37℃で45分間振盪する）、形質転換混合物全体を、ウェル1個当たり2 mlのアンピシリン補充LB培地を含むDWP 96（深型ウェルプレート）に移した。細胞を振盪機内で37℃で20時間インキュベートした。次の段階で、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするプラスミドDNAを、NucleoSpin 96 Plasmid Mini Kit (Macherey&Nagel) を用いて精製し、選択された制限酵素で消化し、48ウェルeGel (Invitrogen) において解析した。並行して、貯蔵のためにグリセロール保存液を調製した。
【０２５３】
真核細胞における組換え抗体のトランスフェクションおよび発現
8% CO2を含む雰囲気中、HEK293細胞をF17培地 (Gibco) 中で37℃にて、120 rpmで振盪させながら増殖させた。トランスフェクションの前日に細胞を分割し、細胞0.7〜0.8×106個／mlの密度で播種した。トランスフェクション当日、容積2 ml中のHEK293細胞1〜1.5×106個にHCプラスミド0.5μg＋LCプラスミド0.5μgをトランスフェクトし、48ウェル深型ウェルプレートにおいて293不含培地 (Novagen) 1μlおよびOptiMEM（登録商標）培地 (Gibco) 80μlに懸濁した。培養物を、37℃および8% CO2において180 rpmで7日間インキュベートした。7日後、培養上清を回収して濾過し、抗体含有量および特異性について解析した。
【０２５４】
プライマー
(a) ウサギ抗体を発現するB細胞のB細胞PCR用のプライマー
プライマーセット1：
LCプライマー
2019513368.tif 000012
HCプライマー
2019513368.tif 000013
プライマーセット2：
LCプライマー
2019513368.tif 000014
HCプライマー
2019513368.tif 000015
重鎖発現プラスミド骨格の増幅用のプライマー：
2019513368.tif 000016
2019513368.tif 000017
κ軽鎖発現プラスミド骨格の増幅用のプライマー：
2019513368.tif 000018
【０２５５】
(b) ヒト抗体を発現するウサギB細胞（トランスジェニックウサギに由来）のB細胞PCR用のプライマー
重鎖可変ドメインの増幅用のプライマー
HC-UP
2019513368.tif 000019
軽鎖可変ドメインの増幅用のプライマー
2019513368.tif 000020
【０２５６】
(c) 重鎖プラスミド骨格の増幅用のプライマー：
2019513368.tif 000021
【０２５７】
(d) κ軽鎖プラスミド骨格の増幅用のプライマー：
2019513368.tif 000022
【０２５８】
(e) ヒトドナー由来のB細胞のB細胞PCR用のプライマー
重鎖可変ドメインの増幅用のプライマー
2019513368.tif 000023
κ軽鎖可変ドメインの増幅用のプライマー
2019513368.tif 000024
λ軽鎖可変ドメインの増幅用のプライマー
2019513368.tif 000025
【０２５９】
(f) ヒト免疫グロブリン発現プラスミドの増幅用のプライマー
重鎖発現プラスミド骨格の増幅：
2019513368.tif 000026
κ軽鎖発現プラスミド骨格の増幅：
2019513368.tif 000027
λ軽鎖発現プラスミド骨格の増幅：
2019513368.tif 000028
【０２６０】
サイトカイン
Zublerミックス： 2 ng/mlマウスIL-1β、50 ng/mlマウスIL-2、10 ng/mlマウスIL-10、および2 ng/mlマウスTNFα（最終濃度）
規定されたサイトカインカクテルを確立するために試験したサイトカイン(特に定めのない限り最終濃度として示した)：
2019513368.tif 000029
【０２６１】
ウサギB細胞培地
2019513368.tif 000030
【０２６２】
ウサギB細胞培地への添加物
2019513368.tif 000031
【０２６３】
96er Uプレート    #3799          Corning
【０２６４】
抗体の表現型決定／選別
2019513368.tif 000032
【０２６５】
その他
2019513368.tif 000033
【０２６６】
実施例1
EL-4 B5細胞の培養
凍結EL-4 B5細胞を37℃の水浴中で迅速に融解し、EL-4 B5培地10 mlで希釈した。300×gで10分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを培地1 mlに再懸濁した。
【０２６７】
EL-4 B5細胞をT175培養フラスコ中に細胞8×10個／mlの細胞密度で接種した。細胞密度を1日おきに測定し、細胞8×104個／mlに調整した。細胞はおよそ18時間の倍加時間を有する。その後、細胞を細胞3×104個〜4×105個／mlの細胞数で播種して、細胞2275×105個／mlまでの異なる最終細胞密度に到達させた。
【０２６８】
細胞を回収し、50 Gyでのγ照射の前に細胞1×106個／mlの細胞密度に調整した
【０２６９】
実施例2
B細胞とEL-4 B5細胞の共培養
単一選別したB細胞を96ウェルプレート中で、Pansorbin細胞 (1:100000)（Calbiochem (Merck)、Darmstadt, Deutschland）、5%ウサギ胸腺細胞上清、およびγ照射したEL-4-B5マウス胸腺腫細胞（5×104個/ウェル）を加えた200μl／ウェルEL-4 B5培地を用いて、インキュベーター内の5% CO2の雰囲気中で37℃で7日間培養した。スクリーニングのためにB細胞培養上清を取り出し、細胞は可変領域遺伝子クローニングのために直ちに回収するか、または100μl RLT緩衝液（Qiagen、Hilden, Germany）中で-80℃で凍結した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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