(57)【要約】本出願は、新規の蛍光色素および蛍光標識としてのそれらの使用に関する。当該化合物は、核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド用蛍光標識として使用され得る。【選択図】図１
2019531255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物またはそのメソメリー型であって、
【化１】
2019531255.tif 000104
式中、各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ１’が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’が、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ５およびＲ６が、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒが、−ＯＲ７または−ＮＲ８Ｒ９から選択され、
Ｒ７が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ１０が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍが、０〜４から選択される整数であり、
ｎが、０〜４から選択される整数であり、ただし、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、各ｍおよびｎが０であり、Ｒが−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨである場合、ＸはＯ、Ｓ、またはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、各ｍおよびｎが０であり、Ｒが−ＯＨである場合、ＸはＳまたはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５がメチルであり、ｎが０であり、Ｒが−ＯＨまたは−ＯＥｔである場合、ＸはＳ、ＮＲ１０、またはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５が−Ｓ（Ｏ２）Ｅｔであり、ｎが０であり、Ｒが−ＯＨまたは−ＯＥｔである場合、ＸはＳ、ＮＲ１０、またはＳｅから選択される、化合物。
【請求項２】
ＸがＳまたはＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが−ＯＲ７である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ７がＨまたはアルキルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒが−ＮＲ８Ｒ９である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
各Ｒ８およびＲ９がＨである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ８がＨであり、Ｒ９がアルキルまたは置換型アルキルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ８およびＲ９の両方がアルキルまたは置換型アルキルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
前記置換型アルキルが、カルボキシルまたはスルホニルヒドロキシドで置換されているアルキルから選択される、請求項７または８に記載の化合物。
【請求項１０】
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２の少なくとも１つがアルキルである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
各Ｒ３およびＲ４がアルキルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
各Ｒ３およびＲ４がメチルまたはエチルから選択される、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ３がＨであり、Ｒ４がアルキルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリルを形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ４がＨまたはアルキルから選択される、請求項１５または１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１’およびＲ２のうちの少なくとも一方がＨである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリルを形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ３がＨまたはアルキルから選択される、請求項１９または２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１’およびＲ１のうちの少なくとも一方がＨである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリルを形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記へテロシクリルが１つのヘテロ原子を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記ヘテロシクリルが１以上のアルキルで置換されている、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
ｍが０である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
ｍが１であり、Ｒ５がハロ、スルホ、アミノスルホニル、またはスルホニルハライドから選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
ｎが０である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
【化２−１】
2019531255.tif 000105
【化２−２】
2019531255.tif 000106
またはそれらのメソメリー異性体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項３１】
前記化合物が、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、Ｒが−ＯＲ７であり、Ｒ７が置換型アルキルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項３２】
前記化合物が、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、Ｒが−ＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８またはＲ９の少なくとも一方が置換型アルキルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項３３】
約６０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲のストークスシフトを有する式（Ｖ）の蛍光化合物であって、
【化３】
2019531255.tif 000107
式中、各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’が、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
ＲＨｅｔが、１以上のＲ５で置換されていてもよいヘテロアリールであり、
各Ｒ５およびＲ６が、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒが、−ＯＲ７または−ＮＲ８Ｒ９から選択され、
Ｙが、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｒ７が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｎが、０〜４の整数である、蛍光化合物。
【請求項３４】
ＲＨｅｔが、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリールから選択される、請求項３３に記載の蛍光化合物。
【請求項３５】
ＲＨｅｔが、置換されていてもよい９員のヘテロアリールから選択される、請求項３３または３４に記載の蛍光化合物。
【請求項３６】
ＲＨｅｔが、構造
【化４】
2019531255.tif 000108
を有する置換されていてもよい２−ベンゾチアゾリル、または構造
【化５】
2019531255.tif 000109
を有する置換されていてもよい２−ベンゾオキサゾリルである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の蛍光化合物。
【請求項３７】
ＹがＯである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の蛍光化合物。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記化合物が、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、Ｒが−ＯＲ７であり、Ｒ７が置換型アルキルである、請求項３８に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記化合物が、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、Ｒが−ＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８またはＲ９の少なくとも一方が置換型アルキルである、請求項３８に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記化合物が、リンカー部分を介して、前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのピリミジン塩基のＣ５位または７−デアザプリン塩基のＣ７位に結合している、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合している３’−ＯＨブロッキング基をさらに含んでなる、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
１以上のヌクレオチドを含んでなるキットであって、１以上のヌクレオチドが請求項３８〜４２に記載の標識ヌクレオチドである、前記キット。
【請求項４４】
２以上の標識ヌクレオチドを含んでなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記２つの標識ヌクレオチドが単一レーザーを用いて励起される、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
第３および第４のヌクレオチドをさらに含んでなり、前記第２、第３、および第４のヌクレオチドの各々が異なる化合物で標識されており、前記各化合物が異なる吸収極大を有し、前記各化合物が他の化合物と区別可能である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
シークエンシングアッセイにおいて請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを取り込むことを含んでなるシークエンシング方法。
【請求項４８】
前記ヌクレオチドの検出をさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記シークエンシングアッセイを自動化シークエンシング機器で行い、前記自動化シークエンシング機器が異なる波長で作動する２つの光源を含んでなる、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
式（Ｉａ）の化合物を製造する方法であって、
式（ＩＩａ）
【化６】
2019531255.tif 000110
または（ＩＩｂ）
【化７】
2019531255.tif 000111
の化合物と式（ＩＩＩ）
【化８】
2019531255.tif 000112
の化合物を反応させて、
【化９】
2019531255.tif 000113
を形成することを含んでなり、
式中、各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ１’が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’が、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ５およびＲ６が、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ１０が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ”が、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍが、０〜４から選択される整数であり、
ｎが、０〜４から選択される整数である、方法。
【請求項５１】
式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法であって、
カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に変換することと、
【化１０】
2019531255.tif 000114
式（Ｉａ’）の化合物を式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることと、
【化１１】
2019531255.tif 000115
を含んでなり、
前記式（Ｉａ）の化合物を請求項５０に従って製造し、
Ｒ７が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権出願の参照による援用】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月３０日に出願された、New Fluorescent Dyes and Their Uses as Biomarkersと題する米国仮出願第６２／４０２６３５号の利益を主張し、その開示をその全体で参照により本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本出願は、蛍光色素として使用するための新規のベンゾピラン誘導体に関する。当該化合物は、蛍光標識として、特に核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド標識用に使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
蛍光標識を利用する核酸の非放射性検出は、分子生物学における重要な技術である。組み換えＤＮＡ技術で用いられる多くの手順は、以前は、３２Ｐなどで放射性標識されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に大きく依存していた。放射性化合物は、核酸および他の目的の分子の高感度の検出を可能にする。しかしながら、費用、限られた貯蔵寿命、より重要なことである安全性への配慮など、放射性同位元素の使用には重大な制限がある。放射性標識を不要とすることは、環境への影響を低減し、試薬廃棄などに関連するコストを削減しながら、安全性を高める。非放射性蛍光検出に適した方法には、非限定的な例として、自動化ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション方法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物のリアルタイム検出、およびイムノアッセイが含まれる。
【０００４】
多くのアプリケーションにとって、複数の空間的に重なり合う被検物の独立した検出を達成するために、複数のスペクトル的に区別可能な蛍光標識を使用することが望ましい。このような多重方法では、反応容器の数を減らして実験プロトコルを単純化し、特定用途向け試薬キットの製造を容易にし得る。マルチカラー自動化ＤＮＡシークエンシングなどにおいて、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーンにおける複数の核酸塩基の分析を可能にし、それによってシングルカラーの方法よりもスループットを増加させ、レーン間の電気泳動移動度のばらつきに関連する不正確性を減少させる。
【０００５】
しかしながら、多重蛍光検出は問題を含む可能性があり、蛍光標識の選択を制約する多くの重要な因子がある。第一に、吸収および発光スペクトルが適切にスペクトル分離される色素化合物を見つけることは困難である。さらに、いくつかの蛍光色素が一緒に使用される場合、異なるスペクトル領域では色素の吸収帯は通常遠く離れているため、同時励起は困難であり得る。多くの励起方法は高出力レーザーを使用し、そのため、色素はこのようなレーザー励起に耐えるのに充分な光安定性を有しなければならない。分子生物学的方法において特に重要な最後の検討事項は、蛍光色素が、例えばＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、ならびにリガーゼ酵素などの使用される化学試薬と適合性でなければならないということである。
【０００６】
シークエンシング技術が進歩するにつれて、上記の制約の全てを満たし、固相シークエンシングおよび同種のものなどのハイスループット分子法に特に適している他の蛍光色素化合物、それらの核酸コンジュゲート、および色素セットに対する必要性が生じてきている。
【０００７】
特許文献１は、蛍光標識としての使用に適したローダミン化合物群を記載している。当該広報に記載されている化合物は、固相核酸シークエンシングプロトコルにおける使用に適している。固相核酸シークエンシングの技術およびスループットの進歩は、蛍光標識の分子設計に対して、特に蛍光試薬と特定の塩基配列との間の相互作用において、さらなる開発および改良をもたらした。
【０００８】
改良された蛍光特性（ストークスシフト、蛍光強度、蛍光極大の位置、および蛍光バンドの形状など）を有する蛍光色素分子は、核酸シークエンシングの速度および精度を改良することができる。ストークスシフトは、生物学的アプリケーションでの蛍光シグナルの同定における重要な要素である。例えば、吸収極大および蛍光極大が互いに非常に近い（すなわち、ストークスシフトが小さい）フルオロホアを使用する場合、励起バンドおよび発光バンドが大きく重なり合うため、発光の検出は励起光と区別することが困難であり得る。対照的に、大きなストークスシフトを有するフルオロホアは、励起波長と発光波長との間が大きく離れているために区別が容易である。あるフルオロホアの発光波長が同じサンプル中の別のフルオロホアと重なり合い、それゆえに励起する可能性があるため、ストークスシフトは多重蛍光アプリケーションでは特に重要である。また、測定が水ベースの生物学的緩衝液中で、かつ／または高温で行われる場合に、ほとんどの色素の蛍光はそのような条件では著しく低いので、蛍光シグナル強度は特に重要である。さらに、色素が結合している塩基の性質も、蛍光極大、蛍光強度、および他の分光色素の特性に影響を与える。蛍光色素と核酸塩基との間の配列特異的相互作用は、蛍光色素の特定の設計によって調整することができる。蛍光色素の構造の最適化は、蛍光色素の蛍光特性を改良し、ヌクレオチドの取り込みの効率も改良し、シークエンシングエラーのレベルを低減し、核酸シークエンシングにおける試薬の使用量を削減し、それにより核酸シークエンシングのコストを低減することができる。
【０００９】
本明細書に記載されているのは、新規のベンゾピラン誘導体、および生体分子標識としての、特に核酸シークエンシングに使用されるヌクレオチド用標識としてのそれらの使用である。生体分子コンジュゲートとして製造した場合に当該色素のストークスシフトが大きくなること、ならびに新規の蛍光化合物を使用して得られるシークエンシングの読み取りの長さ、強度、および質において、改良が見られ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開第２００７／１３５３６８号広報
【発明の概要】
【００１１】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（Ｉ）の新規のベンゾピラン誘導体またはそれらのメソメリー型に関し、
【化１】
2019531255.tif 000003
式中、各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ１’は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ５およびＲ６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒは、−ＯＲ７または−ＮＲ８Ｒ９から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍは、０〜４から選択される整数であり、
ｎは、０〜４から選択される整数であり、ただし、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、各ｍおよびｎが０であり、Ｒが−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨである場合、ＸはＯ、Ｓ、またはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２はＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、各ｍおよびｎが０であり、Ｒが−ＯＨである場合、ＸはＳまたはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２はＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５がメチルであり、ｎが０であり、Ｒが−ＯＨまたは−ＯＥｔである場合、ＸはＳ、ＮＲ１０、またはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２はＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５が−Ｓ（Ｏ２）Ｅｔであり、ｎが０であり、Ｒが−ＯＨまたは−ＯＥｔである場合、ＸはＳ、ＮＲ１０、またはＳｅから選択される。
【００１２】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲のストークスシフトを有する式（Ｖ）の蛍光化合物に関し、
【化２】
2019531255.tif 000004
式中、各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
ＲＨｅｔは、１以上のＲ５で置換されていてもよいヘテロアリールであり、
各Ｒ５およびＲ６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒは、−ＯＲ７または−ＮＲ８Ｒ９から選択され、
Ｙは、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｎは、０〜４の整数である。
【００１３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（Ｉ）または（Ｖ）の化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
【００１４】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、１以上のヌクレオチドを含むキットであって、１以上のヌクレオチドが本明細書に記載の蛍光色素で標識されたヌクレオチドである、前記キットに関する。
【００１５】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、シークエンシングアッセイにおいて本明細書に記載の標識ヌクレオチドを取り込むことと、前記標識ヌクレオチドを検出することとを含むシークエンシング方法に関する。
【００１６】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、式（ＩＩａ）
【化３】
2019531255.tif 000005
または式（ＩＩｂ）
【化４】
2019531255.tif 000006
の化合物と式（ＩＩＩ）
【化５】
2019531255.tif 000007
の化合物を反応させて、
【化６】
2019531255.tif 000008
を形成することを含み、不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘ、ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されており、Ｒ”は、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される。
【００１７】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ’）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、式（ＩＩａ）
【化７】
2019531255.tif 000009
または式（ＩＩｂ）
【化８】
2019531255.tif 000010
の化合物と式（ＩＩＩａ）
【化９】
2019531255.tif 000011
の化合物を反応させて、
【化１０】
2019531255.tif 000012
を形成することを含み、不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ”、Ｘ、ｍ、およびｎは、上記で定義されている。
【００１８】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ’）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に変換することを含み、
【化１１】
2019531255.tif 000013
不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｘ、ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。
【００１９】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に変換することと、
【化１２】
2019531255.tif 000014
式（Ｉａ’）の化合物を式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることとを含み、
【化１３】
2019531255.tif 000015
不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｘ、ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。
【００２０】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、式（ＩＩａ）
【化１４】
2019531255.tif 000016
または式（ＩＩｂ）
【化１５】
2019531255.tif 000017
の化合物と式（ＩＩＩｂ）
【化１６】
2019531255.tif 000018
の化合物を反応させて、
【化１７】
2019531255.tif 000019
を形成することを含み、不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ”、Ｘ、ｍ、およびｎは、上記で定義されている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】吸収が同じスペクトル領域にある市販の色素と比較した、本明細書に記載のベンゾピラン蛍光色素の蛍光スペクトルを示す折れ線グラフである。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、本明細書に記載の新規の蛍光新規色素で標識されたＣ−ヌクレオチドのシークエンシング分析への有用性を示す（黒色表示の）プロットである。
【図３】本明細書に記載の新規の蛍光色素が青色（４６０ｎｍ）または緑色（５３０ｎｍ）の光で励起されたときの、当該色素で標識されたＣ−ヌクレオチドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図４】２つの異なる温度における、市販の色素と比較した、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたＣ−ヌクレオチドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本明細書に記載の実施形態は、蛍光色素として使用するための式（Ｉ）または（Ｖ）の構造の新規のベンゾピラン誘導体に関する。当該新規の蛍光色素は、大きいストークスシフトを有し、蛍光標識として、特に核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド標識用に使用され得る。当該蛍光色素の製造方法および当該色素を利用するダウンストリームのシークエンシングアプリケーションも例示される。
【００２３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（Ｉ）の新規のベンゾピラン誘導体またはそれらのメソメリー型に関し、
【化１８】
2019531255.tif 000020
式中、各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ１’は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ５およびＲ６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒは、−ＯＲ７または−ＮＲ８Ｒ９から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍは、０〜４から選択される整数であり、
ｎは、０〜４から選択される整数であり、ただし、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、各ｍおよびｎが０であり、Ｒが−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨである場合、ＸはＯ、Ｓ、またはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、各ｍおよびｎが０であり、Ｒが−ＯＨである場合、ＸはＳまたはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５がメチルであり、ｎが０であり、Ｒが−ＯＨまたは−ＯＥｔである場合、ＸはＳ、ＮＲ１０、またはＳｅから選択され、
各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５が−Ｓ（Ｏ２）Ｅｔであり、ｎが０であり、Ｒが−ＯＨまたは−ＯＥｔである場合、ＸはＳ、ＮＲ１０、またはＳｅから選択される。
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２がＨであり、各Ｒ３およびＲ４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ５がＣｌである場合、ＸはＳ、Ｏ、またはＳｅから選択され、好ましくはＯである。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、本明細書に開示されている置換されていてもよいアリールは、置換されていてもよいＣ６〜１０アリール、例えばフェニルである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている置換されていてもよいヘテロアリールは、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、より好ましくは、置換されていてもよい５〜６員のヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている置換されていてもよいカルボシクリルは、置換されていてもよい３〜７員のカルボシクリル、特に３〜７員のシクロアルキルである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている置換されていてもよいヘテロシクリルは、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、より好ましくは、５〜６員のヘテロシクリルである。
【００２５】
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは−ＯＲ７であり、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ’）によっても表される。
【化１９】
2019531255.tif 000021
【００２６】
一実施形態において、Ｒ７はＨであり、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）によっても表される。
【化２０】
2019531255.tif 000022
【００２７】
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは−ＮＲ８Ｒ９であり、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）によっても表される。
【化２１】
2019531255.tif 000023
【００２８】
一実施形態において、各Ｒ８およびＲ９はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ８はＨであり、Ｒ９は置換型アルキルである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ８およびＲ９の両方とも置換型アルキルである。いくつかのこのような実施形態において、置換型アルキルは、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホ（−ＳＯ３Ｈ）、またはスルホネート（−ＳＯ３−）で置換されているアルキルから選択される。いくつかの他の実施形態において、置換型アルキルは、Ｃ−アミド基で置換されているアルキルから選択される。
【００２９】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２のうちの１つ以上は、アルキルである。
【００３０】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ３およびＲ４はアルキルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ３および／またはＲ４は、メチルまたはエチルから選択されることができる。いくつかの他の実施形態において、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４はエチルである。
【００３１】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態において、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、構造
【化２２】
2019531255.tif 000024
を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、
【化２３】
2019531255.tif 000025
は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ４は、Ｈまたはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ４はエチルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ１’およびＲ２のうちの少なくとも一方は、Ｈである。一実施形態において、Ｒ１’およびＲ２の両方がＨである。
【００３２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態において、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、構造
【化２４】
2019531255.tif 000026
を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、
【化２５】
2019531255.tif 000027
は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ３は、Ｈまたはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ３はエチルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ１’およびＲ１のうちの少なくとも一方は、Ｈである。一実施形態において、Ｒ１’およびＲ１の両方がＨである。
【００３３】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの別の実施形態において、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、構造
【化２６】
2019531255.tif 000028
を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、
【化２７】
2019531255.tif 000029
は、単結合または二重結合を表す。一実施形態において、Ｒ１’はＨである。
【００３４】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ１／Ｒ３および／またはＲ２／Ｒ４により形成される３〜７員のヘテロシクリル環は、非置換型である。いくつかの他の実施形態において、当該３〜７員のヘテロシクリルは、１以上のアルキル、例えばメチルで置換されている。
【００３５】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、ｍは０である。いくつかの他の実施形態において、ｍは１である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ５は、スルホ、スルホニルハライド、例えばスルホニルクロリド、またはアミノスルホニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ５はハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ５は塩素である。
【００３６】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）のいくつかの実施形態において、ｎは０である。
【００３７】
本明細書に開示されている式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物の実施形態のいずれか一つにおいて、ＸはＳ（硫黄）であることができる。本明細書に開示されている式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物の実施形態のいずれか一つにおいて、ＸはＯ（酸素）であることができる。いくつかのこのような実施形態において、式、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、および（Ｉｂ）の化合物は、それぞれ、式（Ｉｃ）、（Ｉｃ’）、および（Ｉｄ）によっても表されることができる。
【化２８】
2019531255.tif 000030
【００３８】
いくつかの特定の実施形態において、式（Ｉ）の例示的な化合物には、以下：
【化２９−１】
2019531255.tif 000031
【化２９−２】
2019531255.tif 000032
【化２９−３】
2019531255.tif 000033
またはそれらのメソメリー型が含まれる。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、当該化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは−ＯＲ７であり、Ｒ７は置換型アルキルである。
【００４０】
いくつかの別の実施形態において、当該化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは−ＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８またはＲ９の少なくとも一方は、生体分子への結合に使用され得る１以上の官能基を含んでなり、例えば、Ｒ８またはＲ９の一方は、１以上のカルボキシル基を含んでなる置換型アルキルである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、１以上のメソメリー型（Ｉ−Ａ）、（Ｉ−Ｂ）、または（Ｉ−Ｃ）で存在する。
【化３０】
2019531255.tif 000034
【００４２】
本明細書に開示されているいくつかの実施形態は、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲のストークスシフトを有する式（Ｖ）の蛍光化合物に関し、
【化３１】
2019531255.tif 000035
【００４３】
式中、各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
各Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される環または環系を形成し、
ＲＨｅｔは、１以上のＲ５で置換されていてもよいヘテロアリールであり、
各Ｒ５およびＲ６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒは、−ＯＲ７または−ＮＲ８Ｒ９から選択され、
Ｙは、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ８およびＲ９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｎは、０〜４の整数である。
【００４４】
式（Ｖ）のいくつかの実施形態において、ＲＨｅｔは、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリールから選択される。いくつかのこのような実施形態において、ＲＨｅｔは、置換されていてもよい９員のヘテロアリールから選択され、例えば置換されていてもよいベンゾチアゾールである。一実施形態において、ＲＨｅｔは置換されていてもよい２−ベンゾチアゾリル：
【化３２】
2019531255.tif 000036
である。一実施形態において、ＲＨｅｔは、構造
【化３３】
2019531255.tif 000037
を有する置換されていてもよい２−ベンゾオキサゾリルである。いくつかのこのような実施形態において、ＲＨｅｔは、スルホ、スルホニルハライド、またはアミノスルホニルから選択される１以上の置換基で置換されている。いくつかのこのような実施形態において、ＲＨｅｔは、１以上のハロゲンで置換されている。いくつかのこのような実施形態において、ＲＨｅｔは、塩素で置換されている。
【００４５】
いくつかの実施形態において、Ｒは−ＯＲ７であり、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖａ）：
【化３４】
2019531255.tif 000038
によっても表される。一実施形態において、Ｒ７はＨである。別の実施形態において、Ｒ７は置換型アルキルである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、Ｒは−ＮＲ８Ｒ９であり、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖｂ）：
【化３５】
2019531255.tif 000039
によっても表される。一実施形態において、各Ｒ８およびＲ９はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ８はＨであり、Ｒ９は置換型アルキルである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ８およびＲ９の両方とも置換型アルキルである。いくつかのこのような実施形態において、置換型アルキルは、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、またはスルホ（−ＳＯ３Ｈ）、またはスルホネート（−ＳＯ３−）で置換されているアルキルから選択される。いくつかの他の実施形態において、置換型アルキルは、Ｃ−アミド基で置換されているアルキルから選択される。
【００４７】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、ＹはＯである。
【００４８】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ２のうちの１つ以上は、アルキルである。
【００４９】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ３およびＲ４はアルキルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ３および／またはＲ４は、メチルまたはエチルから選択されることができる。いくつかの他の実施形態において、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はアルキルである。
【００５０】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態において、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、構造
【化３６】
2019531255.tif 000040
を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、
【化３７】
2019531255.tif 000041
は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ４は、Ｈまたはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ４はエチルである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ１’およびＲ２のうちの少なくとも一方は、Ｈである。一実施形態において、Ｒ１’およびＲ２の両方がＨである。
【００５１】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態において、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、構造
【化３８】
2019531255.tif 000042
を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、
【化３９】
2019531255.tif 000043
は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ３は、Ｈまたはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ３はエチルである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ１’およびＲ１の少なくとも一方は、Ｈである。一実施形態において、Ｒ１’およびＲ１の両方がＨである。
【００５２】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの別の実施形態において、Ｒ１およびＲ３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ２およびＲ４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３〜７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、構造
【化４０】
2019531255.tif 000044
を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、
【化４１】
2019531255.tif 000045
は、単結合または二重結合を表す。一実施形態において、Ｒ１’はＨである。
【００５３】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ１／Ｒ３および／またはＲ２／Ｒ４により形成される３〜７員のヘテロシクリル環は、非置換型である。いくつかの他の実施形態において、当該３〜７員のヘテロシクリルは、１以上のアルキル、例えばメチルで置換されている。
【００５４】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、ｎは０である。
【００５５】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）のいくつかの特定の実施形態において、式（Ｖ）の例示的な化合物には、本明細書に開示されている化合物Ｉ−１〜Ｉ−１５が含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の蛍光化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは−ＯＲ７であり、Ｒ７は置換型アルキルである。
【００５７】
いくつかの別の実施形態において、式（Ｖ）の蛍光化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは−ＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８またはＲ９の少なくとも一方は、置換型アルキルである。
定義
【００５８】
本明細書で使用されている節の見出しは、編成目的のためにすぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５９】
別段の定めがない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。用語「含む（including）」、ならびに「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含んでいた（included）」などの他の語形の使用は限定的なものではない。用語「有する（having）」、ならびに「有する（have）」、「有する（has）」、および「有していた（had）」などの他の語形の使用は限定的なものではない。本明細書で使用される場合、請求項の移行句であろうと本体部であろうと、用語「含んでなる（comprise(s)）」および「含んでなる（comprising）」は、開放的な意味を有するものと解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含む」という句と同義的に解釈されるべきである。例えば、方法との関連で使用されている場合、用語「含んでなる（comprising）」は、方法が少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、または装置との関連で使用されている場合、用語「含んでなる（comprising）」は、化合物、組成物、または装置が少なくとも列挙された特徴または構成要素を含むが、追加の特徴または構成要素も含み得ることを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、一般的な有機物の略語を以下のように定義する。
Ａｃ  アセチル
Ａｃ２Ｏ  無水酢酸
ａｑ．  水性
ＢＯＣまたはＢｏｃ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ  （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｃａｔ．  触媒
℃  摂氏度の温度
ｄＡＴＰ  デオキシアデノシントリホスフェート
ｄＣＴＰ  デオキシシチジントリホスフェート
ｄＧＴＰ  デオキシグアノシントリホスフェート
ｄＴＴＰ  デオキシチミジントリホスフェート
ｄｄＮＴＰ  ジデオキシヌクレオチド
ＤＣＭ  メチレンクロリド
ＤＭＡ  ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
Ｅｔ  エチル
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ｆｆＮ  充分に機能性のヌクレオチドコンジュゲート
ｆｆＣ  充分に機能性のシチジンコンジュゲート
ｇ  グラム
ｈまたはｈｒ  時間
ＩＰＡ  イソプロピルアルコール
ＬＣＭＳ  液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
ｍＬ  ミリリットル
ＰＧ  保護基
Ｐｈ  フェニル
ｐｐｔ  沈殿
ＰｙＢＯＰ  （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｒｔ  室温
ＳＢＳ  合成によるシークエンシング
ＴＥＡ  トリエチルアミン
ＴＥＡＢ  テトラエチルアンモニウムビカーボネート
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
Ｔｅｒｔ，ｔ  三級
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
ＴＳＴＵ  Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
μＬ  マイクロリットル
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「共有結合（covalently attached）」または「共有結合（covalently bonded）」は、原子間の電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合ポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相互作用による表面への付着と比較して、基体の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合しているポリマーは、共有結合とは別の手段によって結合していることもできることが理解されよう。
【００６２】
本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、元素周期表の第７列の放射線安定原子のうちのいずれか一つ、例えばフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し得る（「１〜２０」などの数値範囲は、本明細書中に記載されているときはいつでも、所定の範囲の各整数を指す；「１〜２０個の炭素原子」は、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、２０個以下の炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が指定されていない場合の用語「アルキル」の記載も包含する）。アルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する中サイズのアルキルでもあり得る。アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルでもあり得る。アルキル基は、「Ｃ１〜４アルキル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ１〜６アルキル」は、アルキル鎖中に１〜６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、式−ＯＲを指し、ここで、Ｒは上記に定義されているアルキルであり、例えば、「Ｃ１〜９アルコキシ」として、限定はされないが、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１以上の二重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の記載も包含する。アルケニル基は、２〜９個の炭素原子を有する中サイズのアルケニルでもあり得る。アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を有する低級アルケニルでもあり得る。アルケニル基は、「Ｃ２〜６アルケニル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ２〜６アルケニル」は、アルケニル鎖中に２〜６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルケニル鎖は、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、プロペン−３−イル、ブテン−１−イル、ブテン−２−イル、ブテン−３−イル、ブテン−４−イル、１−メチル−プロペン−１−イル、２−メチル−プロペン−１−イル、１−エチル−エテン−１−イル、２−メチル−プロペン−３−イル、ブタ−１，３−ジエニル、ブタ−１，２，−ジエニル、およびブタ−１，２−ジエン−４−イルからなる群から選択される。典型的なアルケニル基として、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、１以上の三重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の記載も包含する。アルキル基は、２〜９個の炭素原子を有する中サイズのアルキニルでもあり得る。アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を有する低級アルキニルでもあり得る。アルキニル基は、「Ｃ２〜６アルキニル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ２〜６アルキニル」は、アルキニル鎖中に２〜６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキニル鎖は、エチニル、プロピン−１−イル、プロピン−２−イル、ブチン−１−イル、ブチン−３−イル、ブチン−４−イル、および２−ブチニルからなる群から選択される。典型的なアルキニル基として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、主鎖中に１以上のヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素、例えば、限定はされないが、窒素、酸素、および硫黄を含有する直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアルキル」の記載も包含する。ヘテロアルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する中サイズのヘテロアルキルでもあり得る。ヘテロアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する低級ヘテロアルキルでもあり得る。ヘテロアルキル基は、「Ｃ１〜６ヘテロアルキル」または同様の表記として示され得る。ヘテロアルキル基は、１以上のヘテロ原子を含有し得る。ただの例示として、「Ｃ１〜６ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖中に１〜６個の炭素原子があり、さらに骨格鎖中に１個以上のヘテロ原子があることを示す。
【００６８】
用語「芳香族」は、共役パイ電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香族基（例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む。当該用語は、環系全体が芳香族であるという条件の下に、単環式または縮合環多環式（すなわち、隣接する原子の対を共有する環）基を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２以上の縮合環）を指す。アリールが環系である場合、当該系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６〜１８個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アリール」の記載も包含する。いくつかの実施形態において、アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ６〜１０アルキル」、「Ｃ６またはＣ１０アリール」、または同様の表記として示され得る。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、アルキレン基を介して置換基として結合しているアリール基であり、例えば「Ｃ７〜１４アラルキル」などとしては、限定はされないが、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられる。いくつかの場合において、アルキレン基は、低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１〜６アルキレン基）である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環骨格中に１以上のヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素、例えば、限定はされないが、窒素、酸素、および硫黄を含有する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、当該系中の全ての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、５〜１８の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリール」の記載も包含する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、５〜１０の環員数または５〜７の環員数を有する。ヘテロアリール基は、「５〜７員のヘテロアリール」、「５〜１０員のヘテロアリール」、または同様の表記として示され得る。ヘテロアリール環の例として、限定はされないが、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル（isoquinlinyl）、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが挙げられる。
【００７２】
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、アルキレン基を介して置換基として結合しているヘテロアリール基である。例としては、２−チエニルメチル、３−チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、アルキレン基は、低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１〜６アルキレン基）である。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格中に炭素原子のみを含有する非芳香族環式環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２以上の環が、縮合、架橋、またはスピロ結合様式で共に結合していてもよい。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件の下に、任意の飽和度を有し得る。したがって、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は、３〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「カルボシクリル」の記載も包含する。カルボシクリル基は、３〜１０個の炭素原子を有する中サイズのカルボシクリルでもあり得る。カルボシクリル基は、３〜６個の炭素原子を有するカルボシクリルでもあり得る。カルボシクリル基は、「Ｃ３〜６カルボシクリル」または同様の表記として示され得る。カルボシクリル環の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３−ジヒドロ−インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全飽和カルボシクリル環または環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に１以上のヘテロ原子を含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、縮合、架橋、またはスピロ結合様式で共に結合していてもよい。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件の下に、任意の飽和度を有し得る。ヘテロ原子は、環系中の非芳香族環または芳香族環のいずれに存在していてもよい。ヘテロシクリル基は、３〜２０の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の記載も包含する。ヘテロシクリル基は、３〜１０の環員数を有する中サイズのヘテロシクリルでもあり得る。ヘテロシクリル基は、３〜６の環員数を有するヘテロシクリルでもあり得る。ヘテロシクリル基は、「３〜６員のヘテロシクリル」または同様の表記として示され得る。好ましい６員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、１〜３のＯ、Ｎ、またはＳから選択され、好ましい５員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１〜２のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例として、限定はされないが、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジオニル（pyrrolidionyl）、４−ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３−ジオキシニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキシニル、１，４−ジオキサニル、１，３−オキサチアニル、１，４−オキサチイニル、１，４−オキサチアニル、２Ｈ−１，２−オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジニル、１，３−ジオキソリル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオリル、１，３−ジチオラニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３−オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ−１，４−チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられる。
【００７６】
「Ｏ−カルボキシ」基は、「−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００７７】
「Ｃ−カルボキシ」基は、「−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例として、カルボキシル（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が挙げられる。
【００７８】
「シアノ」基は、「−ＣＮ」基を指す。
【００７９】
「スルホニル」基は、「−ＳＯ２Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８０】
「スルホニルヒドロキシド」または「スルホ」基は、「−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨ」基を指す。
【００８１】
「スルフィノ」基は、「−Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ」基を指す。
【００８２】
「スルホネート」基は、−ＳＯ３−を指す。
【００８３】
「スルホニルハライド」基は、「−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｘ」基を指し、ここでＸはハライドである。
【００８４】
「Ｓ−スルホンアミド」基は、「−ＳＯ２ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８５】
「Ｎ−スルホンアミド」基は、「−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲｂは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８６】
「Ｃ−アミド」基は、「−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８７】
「Ｎ−アミド」基は、「−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８８】
「アミノ」基は、「−ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜７カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例として、遊離アミノ（すなわち−ＮＨ２）が挙げられる。
【００８９】
「アミノアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアミノ基を指す。
【００９０】
「アミノスルホニル」基は、「−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ２」基を指す。
【００９１】
「アルコキシアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアルコキシ基を指し、例えば、「Ｃ２〜８アルコキシアルキル」などである。
【００９２】
本明細書で使用される場合、置換基は、１個以上の水素原子が他の原子または基で交換されている非置換型親基に由来する。特段の定めがない限り、基を「置換型」と見なす場合、当該基が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７カルボシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、Ｃ３〜Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、３〜１０員ヘテロシクリル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、３〜１０員ヘテロシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、５〜１０員ヘテロアリール（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、５〜１０員ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１つ以上の置換基で置換されていることを意味する。基が「置換されていてもよい」と記載されている場合は常に、当該基は上記の置換基で置換されていることができる。
【００９３】
当業者が理解しているように、化合物が正または負に帯電した置換基、例えばＳＯ３−を含む場合、当該化合物が全体として中性であるように、当該化合物は、負または正に帯電した対イオンも含み得る。
【００９４】
特定のラジカル命名法は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを含み得ることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残部への２つの結合点を必要とする場合、当該置換基はジラジカルであると理解される。例えば、２つの結合点を必要とするアルキルとして識別される置換基には、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−などのジラジカルが含まれる。他のラジカル命名法は、ラジカルが「アルキレン」または「アルケニレン」などのジラジカルであることを明確に示している。
【００９５】
２つの「隣接する」Ｒ基が「それらが結合している原子と共に」環を形成すると記載されている場合、原子、介在結合、および２つのＲ基の集合単位が、記載の環であることを意味する。例えば、以下の構造が存在し、
【化４２】
2019531255.tif 000046
Ｒ１およびＲ２が、水素およびアルキルからなる群から選択されるものとして定義されるか、またはＲ１およびＲ２が、それらが結合している原子と共にアリールまたはカルボシクリルを形成する場合、Ｒ１およびＲ２が水素またはアルキルから選択され得ること、またはその代わりに、部分構造が構造：
【化４３】
2019531255.tif 000047
を有し、Ａが、描かれている二重結合を含むアリール環またはカルボシクリルであることを意味する。
標識ヌクレオチド
【００９６】
本明細書に記載の色素化合物は、基体部分への結合に適している。基体部分は、本明細書に記載の蛍光色素をコンジュゲートすることができる実質的にあらゆる分子または物質であり得、非限定的な例としては、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、リガンド、粒子、固体表面、有機および無機ポリマー、ならびにそれらの組み合わせまたは集合体、例えば、染色体、核、生細胞などが含まれ得る。疎水性引力、イオン性引力、および共有結合を含む様々な手段によって、当該色素を任意のリンカーによりコンジュゲートすることができる。具体的には、当該色素は共有結合によって基体にコンジュゲートしている。より具体的には、当該共有結合は、リンカー基による。いくつかの場合において、このような標識ヌクレオチドは、「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。
【００９７】
本明細書に記載の長いストークスシフトを有する新規の蛍光色素の特に有用な用途は、生体分子、例えば、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの標識化用途である。本出願のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の新規の蛍光化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
【００９８】
生体分子への結合は、式（Ｉ）または（Ｖ）の化合物の−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ部分を介し得る。いくつかの実施形態において、Ｒは−ＯＲ７であり、Ｒ７は、生体分子のアミノ基への結合に使用され得る置換型アルキルである。一実施形態において、−Ｃ（Ｏ）Ｒ部分は、さらなるアミド／ペプチド結合形成に最も適した活性化エステル残基であり得る。本明細書で使用される用語「活性化エステル」は、穏やかな条件下で、例えばアミノ基を含む化合物と反応することができるカルボキシ基誘導体を指す。活性化エステルの非限定的な例としては、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、およびスクシンイミドエステルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの他の実施形態において、Ｒは−ＮＲ８Ｒ９であり、Ｒ８またはＲ９の少なくとも一方は、生体分子への結合に使用され得る１つ以上の官能基を含み、例えばＲ８またはＲ９の一方は、１つ以上のカルボキシルを含んでなる置換型アルキルである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、色素化合物は、核酸塩基を介してオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに共有結合していてもよい。例えば、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、リンカー部分を介してピリミジン塩基のＣ５位、または７−デアザプリン塩基のＣ７位に結合した標識を有し得る。標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合している３’−ＯＨブロッキング基も有し得る。
リンカー
【０１００】
本明細書に開示されている色素化合物は、当該化合物と他の分子との共有結合のための置換基位置の一つに反応性リンカー基を含み得る。反応性連結基は、共有結合を形成することができる部分である。特定の実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を除去する必要があることを暗示することを意図したものではない。切断後にリンカーの一部が色素および／または基体部分に結合したままであることを確実にするリンカー上の位置に切断部位を配置することができる。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光により切断可能なリンカー、還元条件下で切断可能（例えば、ジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化的条件下で切断可能、セーフティー−キャッチリンカーの使用により切断可能、および除去機構により切断可能であり得る。色素化合物を基体部分に結合させるための切断可能なリンカーの使用は、標識を必要に応じて検出後に除去し、ダウンストリーム工程でのいかなる干渉シグナルをも回避することを確実にできるようにする。
【０１０１】
リンカー基の非限定的な例として、ヌクレオチドの塩基と、例えば本明細書に記載の新規の蛍光化合物などの標識とを結合する、ＰＣＴ国際公開第２００４／０１８４９３号広報（参照により本明細書に援用される）に開示されているリンカー基が挙げられる。これらのリンカーは、遷移金属および少なくとも部分的に水溶性のリガンドから形成された、水溶性ホスフィンまたは水溶性遷移金属触媒を使用して切断され得る。水溶液中では、後者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。使用され得る他の好適なリンカーとしては、ＰＣＴ国際公開第２００４／０１８４９３号広報および国際公開第２００７／０２０４５７号広報（両方とも参照により本明細書に援用される）に開示されているリンカーが挙げられる。ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することにより、蛍光色素（フルオロホア）とグアニン塩基との間のリンカーの長さを変えること、特に増大させることによって、当分野で公知の他の結合を介してグアニン塩基に結合している同じフルオロホアと比較して、蛍光強度を増加させることが可能であることが発見された。リンカーの設計、特にリンカーの長さの増大は、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドに取り込まれたときに、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロホアの明るさの改良も可能にする。したがって、国際公開第２００７／０２０４５７号広報に記載されているように、色素がグアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要とする分析方法において使用するためのものである場合、リンカーが式−（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ−のスペーサー基を含んでなると有利であり、ここで、ｎは、２〜５０の整数である。
【０１０２】
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識されていてもよい。当業者が理解しているように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１つ以上のリン酸基からなる。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖はデオキシリボース、すなわちリボースに存在する１つのヒドロキシル基を欠く糖である。窒素塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンは、シトシン（Ｃ）および、チミン（Ｔ）またはＲＮＡではウラシル（Ｕ）である。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、エステル化は糖のＣ−３またはＣ−５に結合したヒドロキシル基で起こる。ヌクレオチドは、通常モノ、ジ、またはトリホスフェートである。
【０１０３】
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部分を欠いている。ヌクレオシド類似体の一例は、標識が塩基に結合しており、糖分子に結合したリン酸基がないものである。
【０１０４】
塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ワトソン−クリック塩基対合を経るというヌクレオチドまたはヌクレオシドの性質を変えない誘導体および類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、そのコア構造が親化合物のコア構造と同じであるか、または近似しているが、例えば異なる、または追加の側鎖基などの化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味し、そのため、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを他の分子に連結させることが可能である。例えば、塩基はデアザプリンであり得る。誘導体は当然ワトソン−クリック対合を経ることができる。「誘導体」および「類似体」は、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体も意味する。このような誘導体および類似体は、例えば、Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)およびUhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990で論じられている。ヌクレオチド類似体は、修飾ホスホジエステル結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル−ホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合などを含んでなることもできる。
【０１０５】
ワトソン−クリック塩基対合がなおも行われ得るという条件の下に、リンカーを介して核酸塩基上の任意の位置に色素を結合させ得る。具体的な核酸塩基標識部位として、ピリミジン塩基のＣ５位または７−デアザプリン塩基のＣ７位が挙げられる。上記のように、リンカー基を用いて、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させ得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、標識ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に取り込み可能かつ酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、核酸複製酵素によるヌクレオチドの全体的な結合および認識を化合物が著しく妨害しないように、ヌクレオチドを化合物に結合させるのに充分な長さであり得る。したがって、リンカーは、スペーサー単位を含んでなることもできる。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌクレオチド塩基を離れさせる。
【０１０７】
本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式：
【化４４】
2019531255.tif 000048
を有し得、
式中、Ｄｙｅは、色素化合物であり、Ｂは、核酸塩基、例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンなどであり、Ｌは、存在してもしなくてもよい任意のリンカー基である。Ｒ’は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した−Ｏ−、またはブロッキング基により保護された−Ｏ−であることができる。Ｒ”は、Ｈ、ＯＨ、ホスホルアミダイト、または３'−ＯＨブロッキング基であることができ、Ｒ”’は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ”がホスホルアミダイトである場合、Ｒ’は、自動合成条件下でのその後のモノマーカップリングを可能にする酸切断可能なヒドロキシル保護基である。
【０１０８】
いくつかの場合において、ブロッキング基は、色素化合物とは別個であり、独立している、すなわち、色素化合物に結合していない。あるいは、色素は、３’−ＯＨブロッキング基の全部または一部を含んでなり得る。したがって、Ｒ”は、色素化合物を含んでなっても含んでならなくてもよい３’−ＯＨブロッキング基であることができる。他の代替的な実施形態において、ペントース糖の３’炭素上にブロッキング基は存在せず、塩基に結合した色素（または色素およびリンカーの構築物）は、例えば、３’部位以外の点からの他のヌクレオチドの取り込みに対するブロックとして作用するのに充分なサイズまたは構造であることができる。したがって、ブロックは、立体障害によるものあることができるか、またはサイズ、電荷、および構造の組み合わせによるものであることができる。
【０１０９】
ブロッキング基の使用は、修飾ヌクレオチドが取り込まれたときに伸長を停止することなどによって、重合を制御することを可能にする。ブロッキング効果が、例えば非限定的な例として化学的条件の変更により、または化学的ブロックの除去により、可逆的である場合、伸長を特定の時点で停止させ、その後続けさせることができる。３’−ＯＨブロッキング基の非限定的な例として、参照により本明細書に援用される国際公開第２００４／０１８４９７号および国際公開第２０１４／１３９５９６号に開示されているものが挙げられる。例えば、ブロッキング基は、アジドメチル（−ＣＨ２Ｎ３）もしくは置換型アジドメチル（例えば、−ＣＨ（ＣＨＦ２）Ｎ３もしくはＣＨ（ＣＨ２Ｆ）Ｎ３）、またはアリルであり得る。
【０１１０】
特定の実施形態において、リンカーおよびブロッキング基は、両方とも存在し、実質的に同様の条件下で両方とも切断可能な別個の部分である。したがって、色素化合物とブロッキング基の両方を除去するために単一の処理のみが必要とされるので、脱保護工程およびデブロッキング工程は、より効率的であり得る。
【０１１１】
本開示は、本明細書に記載の色素化合物を取り込んでいるポリヌクレオチドを包含することも目的とする。当該ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合したデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからそれぞれなるＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本出願に係る色素化合物で標識された１以上のヌクレオチドが存在するという条件の下に、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の標識ヌクレオチド以外の天然ヌクレオチド、非天然（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなり得る。ポリヌクレオチドは、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾も含み得る。１以上の標識ヌクレオチドを含んでなるリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造体も企図されている。
【０１１２】
本明細書に記載の標識ヌクレオチドの非限定的な例として、以下が挙げられる。
【化４５−１】
2019531255.tif 000049
【化４５−２】
2019531255.tif 000050
キット
【０１１３】
本明細書で開示されているいくつかの実施形態は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドを含むキットである。当該キットは、通常、色素で標識された１以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを１以上の他の成分と共に含む。他の成分は、他の修飾または未修飾のヌクレオチドまたはヌクレオシドであり得る。例えば、色素で標識されたヌクレオチドは、非標識もしくは天然のヌクレオチド、および／もしくは蛍光標識されたヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わされて供給され得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別々の個々の成分として、またはヌクレオチド混合物として提供され得る。いくつかの実施形態において、キットは、１以上のヌクレオチドを含んでなり、１以上のヌクレオチドが、本明細書に記載の新規の蛍光化合物で標識されたヌクレオチドである。キットは、２以上の標識ヌクレオチドを含んでなり得る。ヌクレオチドは２以上の蛍光標識で標識されていてもよい。レーザーであり得る単一の励起源を使用して、２以上の標識を励起し得る。
【０１１４】
キットは、４つの標識ヌクレオチドを含み得、ここで４つのヌクレオチドうちの第１のヌクレオチドは、本明細書に開示されている化合物で標識されており、第２、第３、および第４のヌクレオチドは、それぞれ異なる化合物で標識されており、各化合物は異なる蛍光極大を有し、各化合物は他の３つの化合物と区別可能である。キットは、２以上の化合物が同様の吸収極大を有するが異なるストークスシフトを有するようなものであり得る。
【０１１５】
本明細書に記載の蛍光色素化合物、標識ヌクレオチド、またはキットは、シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、またはタンパク質結合アッセイに使用され得る。使用は、自動化シークエンシング機器での使用であり得る。シークエンシング機器は、異なる波長で作動する２つのレーザーを含み得る。
【０１１６】
キットが色素化合物で標識された複数の、特に２つ、さらには４つのヌクレオチドを含んでなる場合、異なるヌクレオチドは、異なる色素化合物で標識されていてもよく、または１つはダークであり、色素化合物を有しなくてもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識されている場合、前記色素化合物がスペクトル的に区別可能な蛍光色素であることがキットの特徴である。本明細書で使用される場合、用語「スペクトル的に区別可能な蛍光色素」は、１つのサンプル中に２以上の蛍光色素が存在する場合、蛍光検出装置（例えば、市販のキャピラリーベースのＤＮＡシークエンシングプラットフォーム）が区別できる波長で蛍光エネルギーを発する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識された２つのヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、いくつかの実施形態では、スペクトル的に区別可能な蛍光色素を、同じ波長で、例えば同じレーザーなどによって、励起することができる。蛍光色素化合物で標識された４つのヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、いくつかの実施形態では、スペクトル的に区別可能な蛍光色素のうちの２つを、両方とも、１つの波長で励起することができ、他の２つの同じスペクトル的に区別可能な色素を、両方とも、別の波長で励起することができる。具体的な励起波長は、約４６０ｎｍである。
【０１１７】
一実施形態において、キットは、本明細書に記載の化合物で標識されたヌクレオチドおよび第２の色素で標識された第２のヌクレオチドを含んでなり、色素は１０ｎｍ以上、具体的には２０ｎｍ〜５０ｎｍの吸収極大の差を有する。より具体的には、２つの色素化合物は１５〜４０ｎｍの間または２０〜４０ｎｍの間のストークスシフトを有する。本明細書で使用される場合、用語「ストークスシフト」は、同一の電子遷移の吸収スペクトルと発光スペクトルのバンド極大の位置の間の差である。
【０１１８】
他の実施形態において、前記キットは、蛍光色素で標識された２つの他のヌクレオチドをさらに含んでなり、前記色素は、同じレーザーによって約４６０ｎｍ〜約５４０ｎｍで励起される。
【０１１９】
代替的実施形態において、キットは、同じ塩基が２つの異なる化合物で標識されているヌクレオチドを含み得る。第１のヌクレオチドは、本明細書に記載の化合物で標識されていることがあり得る。第２のヌクレオチドは、スペクトル的に異なる化合物、例えば６００ｎｍを超える波長で吸収する「赤色」色素で標識されていることがあり得る。第３のヌクレオチドは、本明細書に記載の蛍光色素化合物とスペクトル的に異なる化合物との混合物として標識されていることがあり得、第４のヌクレオチドは「ダーク」であり、標識を含まないことがあり得る。したがって、簡単に言えば、ヌクレオチド１〜４は、「緑色」、「赤色」、「赤色／緑色」、およびダークで標識されていることがあり得る。機器類をさらに単純化するために、単一のレーザーで励起される２つの色素で４つのヌクレオチドを標識することができ、したがって、ヌクレオチド１〜４の標識は、「緑色１」、「緑色２」、「緑色１／緑色２」、およびダークであり得る。
【０１２０】
他の実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの取り込みを触媒することができるポリメラーゼ酵素を含み得る。当該キットに含まれる他の成分には、緩衝液などが含まれ得る。本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたヌクレオチド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキット中に提供され得る。このような実施形態では、好適な希釈緩衝液も含まれ得る。
シークエンシング方法
【０１２１】
本明細書に記載の新規の蛍光色素を含んでなるヌクレオチド（またはヌクレオシド）は、単独でも、またはより大きな分子構造もしくはコンジュゲートに組み込まれているか、もしくはこれらと会合していても、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した蛍光標識の検出を必要とする分析方法に使用され得る。本出願のいくつかの実施形態は、（ａ）本明細書に記載の１以上の標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込むことと、（ｂ）前記修飾ヌクレオチドに結合した新規の蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することとを含むシークエンシング方法に関する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、１以上の標識ヌクレオチドは、合成工程においてポリメラーゼ酵素の作用によってポリヌクレオチドに取り込まれる。しかしながら、標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込む他の方法、例えば化学的オリゴヌクレオチド合成または標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドの連結は除外されない。したがって、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに「取り込む」という用語は、化学的方法および酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含する。
【０１２３】
当該方法の全ての実施形態において、標識ヌクレオチドが取り込まれているポリヌクレオチド鎖を鋳型鎖にアニールさせる間に、または２つの鎖を分離する変性工程の後に、検出工程を実施し得る。さらなる工程、例えば化学的もしくは酵素的反応工程または精製工程が、合成工程と検出工程との間に含まれ得る。特に、標識ヌクレオチドを取り込んでいる標的鎖を、単離または精製し、次いでさらに処理するか、またはその後の分析に使用し得る。例として、合成工程において本明細書に記載の修飾ヌクレオチドで標識された標的ポリヌクレオチドを、その後、標識プローブまたはプライマーとして使用し得る。他の実施形態において、合成工程（ａ）の生成物を、さらなる反応工程に付してもよく、所望により、これらの後続工程の生成物を精製または単離する。
【０１２４】
合成工程の好適な条件は、標準的な分子生物学的技術に精通している者に周知であろう。一実施形態において、合成工程は、好適なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的な伸長標的鎖を形成する、本開示に係る修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的プライマー伸長反応に類似し得る。他の実施形態において、合成工程は、それ自体、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピー由来のアニーリングした相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を産生する増幅反応の一部を形成し得る。他の例示的な「合成」工程としては、ニックトランスレーション、鎖置換型重合、ランダムプライムドＤＮＡラベリングなどが挙げられる。合成工程で使用されるポリメラーゼ酵素は、本開示に係る修飾ヌクレオチドの取り込みを触媒することができなければならない。その他の点では、ポリメラーゼの詳細な性質は特に限定されないが、合成反応の条件に依存し得る。例として、合成反応がサーモサイクリングを用いて行われる場合、熱安定性ポリメラーゼが必要とされるが、熱安定性ポリメラーゼは、標準的なプライマー伸長反応では必須ではない場合がある。本開示に係る修飾ヌクレオチドを取り込むことができる好適な熱安定性ポリメラーゼには、国際公開第２００５／０２４０１０号または国際公開第２００６／１２０４３３号に記載されているものが含まれる。３７℃などの低温で行われる合成反応では、ポリメラーゼ酵素は、必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性などの多数の要因に依存するであろう。
【０１２５】
特定の非限定的な実施形態において、本出願に係る長いストークスシフトを有する新規の蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸シークエンシング、再シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、一塩基多型スコアリング、ポリヌクレオチドに取り込まれたときの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出を伴う他のアプリケーション、または本出願に係る蛍光色素を含んでなる修飾ヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用を必要とする他のアプリケーションの方法で使用され得る。
【０１２６】
特定の実施形態において、本出願は、ポリヌクレオチド「合成によるシークエンシング」反応における、本明細書に記載の色素化合物を含んでなる修飾ヌクレオチドの使用を提供する。合成によるシークエンシングは、通常、配列決定される鋳型核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成するために、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、５’から３’の方向に１つ以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを伸長しているポリヌクレオチド鎖に順次付加することを伴う。１つ以上の付加されたヌクレオチド中に存在する塩基の同一性は、検出または「画像化」工程において決定される。付加された塩基の同一性は、各ヌクレオチド取り込み工程の後に決定され得る。次いで、鋳型の配列は、従来のワトソン−クリック塩基対合規則を使用して推測され得る。一塩基の同一性の決定のための本開示に係る色素で標識された修飾ヌクレオチドの使用は、例えば一塩基多型のスコアリングにおいて有用であり得、このような一塩基伸長反応は、本出願の範囲内である。
【０１２７】
ある実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドの配列は、取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出により、配列決定される鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への１以上のヌクレオチドの取り込みを検出することによって決定される。鋳型ポリヌクレオチドのシークエンシングは、好適な（または、ヘアピンの一部としてプライマーを含むヘアピン構築物として作製された）プライマーでプライミングされ、新生鎖は、ポリメラーゼ触媒反応において、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加により段階的様式で伸長される。
【０１２８】
特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の各々は、特有のフルオロホアで標識されていてもよく、制御されない重合を防ぐために３’位にブロッキング基も含んでなる。あるいは、４つのヌクレオチドのうちの１つは、非標識（ダーク）であり得る。ポリメラーゼ酵素は、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを取り込ませ、ブロッキング基は、ヌクレオチドのさらなる取り込みを防ぐ。取り込まれていないヌクレオチドを除去し、取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグナルを、レーザー励起を用いる電荷結合素子および好適な発光フィルターなどの好適な手段によって、光学的に「読み取る」。次いで、３’ブロッキング基および蛍光色素化合物を、特に同じ化学的方法または酵素的方法によって、除去（脱保護）して、さらなるヌクレオチドの取り込みのために新生鎖を露出させる。典型的には、取り込まれたヌクレオチドの同一性は、各取り込み工程の後に決定されるであろうが、これは、絶対に必須というわけではない。同様に、米国特許第５，３０２，５０９号は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドをシークエンシングする方法を開示している。当該方法は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での、固定化ポリヌクレオチドに相補的な伸長鎖への蛍光標識された３'−ブロック化ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴの取り込みに依拠している。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を取り込むが、３’−ブロッキング基により、さらなる付加は防止される。次いで、取り込まれたヌクレオチドの標識を測定し、化学的切断によってブロッキング基を除去して、さらなる重合を起こさせることができる。合成によるシークエンシング反応で配列決定される核酸鋳型は、配列決定することが望まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。シークエンシング反応用の核酸鋳型は、典型的には、シークエンシング反応においてさらなるヌクレオチドを付加するためのプライマーまたは開始点として機能する遊離３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含んでなるだろう。配列決定される鋳型の領域は、相補鎖上のこの遊離３’ヒドロキシル基をオーバーハングするであろう。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は、一本鎖であり得るが、シークエンシング反応の開始のために遊離３’ＯＨ基を与えるように、配列決定される鋳型鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」という条件の下に、二本鎖であることができる。このような実施形態では、シークエンシングは、鎖置換により進行し得る。特定の実施形態において、遊離３’ヒドロキシル基を有するプライマーを、配列決定される鋳型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として添加し得る。あるいは、配列決定されるプライマーおよび鋳型鎖はそれぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成し得る。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に結合させ得る方法は、ＰＣＴ国際公開第２００１／０５７２４８号広報および国際公開第２００５／０４７３０１号広報に開示されている。ヌクレオチドが遊離３'−ヒドロキシル基に連続的に付加さ���、結果として、５’から３’方向のポリヌクレオチド鎖の合成が起こる。付加された塩基の性質を、必須ではないが特に各ヌクレオチド付加の後に、測定し、それにより、核酸鋳型についての配列情報を与え得る。このこととの関連における核酸鎖（またはポリヌクレオチド）へのヌクレオチドの「取り込み」という用語は、ヌクレオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介した、核酸鎖の遊離３’ヒドロキシル基へのヌクレオチドの結合を指す。
【０１２９】
配列決定される核酸鋳型は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはさらにはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子であり得る。核酸鋳型は、シークエンシング反応における鋳型のコピーを妨げないという条件の下に、天然および／または非天然のヌクレオチドならびに天然または非天然の骨格結合を含んでなり得る。
【０１３０】
特定の実施形態において、配列決定される核酸鋳型を、当分野において公知の好適な連結方法によって、例えば共有結合によって、固体支持体に結合し得る。特定の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドを、固体支持体（例えば、シリカ系支持体）に直接結合し得る。しかしながら、他の実施形態において、固体支持体の表面を、鋳型ポリヌクレオチドの直接的な共有結合を可能にするように、またはそれ自体が非共有結合的に固体支持体に結合し得るヒドロゲルもしくは高分子電解質多層により鋳型ポリヌクレオチドを固定化するように、修飾し得る。
【０１３１】
ポリヌクレオチドがシリカ系支持体に直接結合しているアレイには、ＰＣＴ国際公開第２０００／００６７７０号広報に開示されているものなどがあり、このアレイでは、ポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ基との反応によって、ガラス支持体上に固定化されている。また、ＰＣＴ国際公開第２００５／０４７３０１号広報は、硫黄系求核剤と固体支持体との反応により、ＳＭＡの作製における使用等のため、固体支持体に結合させたポリヌクレオチドのアレイを開示している。固体支持鋳型ポリヌクレオチドのさらに他の例には、鋳型ポリヌクレオチドがシリカ系または他の固体支持体上に支持されたヒドロゲルに結合している場合がある。ＰＣＴ国際公開第００／３１１４８号広報、国際公開第０１／０１１４３号広報、国際公開第０２／１２５６６号広報、国際公開第０３／０１４３９２号広報、国際公開第００／５３８１２号広報、および米国特許第６，４６５，１７８号に記載されているように、シリカ系支持体は、典型的には、ヒドロゲルおよびヒドロゲルアレイを支持するために使用される。
【０１３２】
鋳型ポリヌクレオチドが固定化され得る具体的な表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、先行技術に記載されており、そのうちのいくつかは上記で論じられている。本出願において使用され得る具体的なヒドロゲルとしては、国際公開第２００５／０６５８１４号および米国公開第２０１４／００７９９２３号に記載されているものが挙げられる。一実施形態において、ヒドロゲルは、ＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド））である。
【０１３３】
ＤＮＡ鋳型分子は、例えば米国特許第６，１７２，２１８号に記載されているように、シークエンシングのためにビーズまたは微粒子に結合させることができる。各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含むビーズライブラリーの作製の他の例は、Margulies et al., Nature 437, 376-380 (2005)；Shendure et al., Science. 309(5741):1728-1732 (2005)で見ることができる。記載されているヌクレオチドを用いるこのようなビーズのアレイのシークエンシングは、本出願の範囲内である。
【０１３４】
配列決定される鋳型は、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成し得、この場合、アレイは任意の利便性のある形態をとり得る。したがって、本開示の方法は、単分子アレイ、クラスターアレイ、およびビーズアレイを含む、あらゆる種類の「高密度」アレイに適用可能である。本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、固体支持体上に核酸分子を固定化することによって形成された実質的にあらゆる種類のアレイ、より詳細には、あらゆる種類の高密度アレイ上の鋳型のシークエンシングに使用され得る。しかしながら、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドは、クラスターアレイのシークエンシングにおいて特に有利である。
【０１３５】
マルチポリヌクレオチドまたはクラスターアレイにおいて、アレイ上の別個の領域は、複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含んでなる。用語「クラスターアレイ」は、アレイ上の別個の領域または部位が、光学的手段により個々に解像することができない複数のポリヌクレオチド分子を含んでなるアレイを指す。アレイの形成方法に応じて、アレイ上の各部位は、１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピー、またはさらには少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、２つの相補的核酸鎖の複数のコピー）を含んでなり得る。マルチポリヌクレオチドまたは核酸分子のクラスターアレイは、当分野において公知の技術を使用して作製され得る。例として、国際公開第９８／４４１５１号および国際公開第００／１８９５７号は両方とも、固定化核酸分子のクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、鋳型および増幅産物の両方が固体支持体上に固定化されたままとなる、核酸の増幅方法を記載している。これらの方法に従って作製されたクラスターアレイ上に存在する核酸分子は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドを使用してシークエンシングするための好適な鋳型である。
【０１３６】
本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型のシークエンシングにおいても有用である。本明細書で使用される用語「単一分子アレイ」または「ＳＭＡ」は、固体支持体上に配置（または配列）されたポリヌクレオチド分子の集団を指し、１つのポリヌクレオチドと集団の他の全てとの間隔は、ポリヌクレオチドの個々の解像を達成することが可能であるようになっている。したがって、固体支持体の表面上に固定化された標的核酸分子は、当然、光学的手段によって解像可能である。これは、使用される特定のイメージングデバイスの解像可能な領域内に、それぞれが１つのポリヌクレオチドを表す１以上の別個のシグナルが存在しなければならないことを意味する。
【０１３７】
これは、アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、１００ｎｍ以上、より具体的には２５０ｎｍ以上、さらにより具体的には３００ｎｍ以上、なおいっそう具体的には３５０ｎｍ以上である場合に達成され得る。したがって、各分子は個々に解像可能であり、単一分子の蛍光点として検出可能であり、前記単一分子の蛍光点からの蛍光も単一段階のフォトブリーチングを示す。
【０１３８】
用語「個々に解像」および「個々の解像」は、視覚化したときに、アレイ上の１つの分子をその隣接分子と区別することが可能であることを明示するために本明細書において使用される。アレイ上の個々の分子間の間隔は、ある程度、個々の分子を解像するために使用される具体的な技術によって決められるであろう。単一分子アレイの一般的特徴は、ＰＣＴ国際公開第２０００／００６７７０号広報および国際公開第２００１／０５７２４８号広報を参照することによって理解されよう。本開示の修飾ヌクレオチドの一つの用途は、合成によるシークエンシング反応におけるものであるが、当該標識ヌクレオチドの有用性は、当該方法に限定されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とするシークエンシング方法に有利に使用され得る。
【０１３９】
特に、本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、自動化蛍光シークエンシングプロトコル、特にサンガーと共同研究者の鎖停止配列決定法に基づく蛍光色素−ターミネーターサイクルシークエンシングに使用され得る。当該方法は、通常、プライマー伸長シークエンシング反応において蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを取り込むために酵素およびサイクルシークエンシングを使用する。いわゆるサンガー配列決定法、および関連プロトコル（サンガー型）は、標識ジデオキシヌクレオチドを用いるランダム化鎖停止に依拠する。
【０１４０】
したがって、本開示は、３’位および２’位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである本明細書に記載の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドも包含し、当該修飾ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型配列決定法などにおける使用に好適である。
製造方法
【０１４１】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、式（ＩＩａ）
【化４６】
2019531255.tif 000051
または式（ＩＩｂ）
【化４７】
2019531255.tif 000052
の化合物と式（ＩＩＩ）
【化４８】
2019531255.tif 000053
の化合物を反応させて、
【化４９】
2019531255.tif 000054
を形成することを含み、不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘ、ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されており、Ｒ”は、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール；置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される。
【０１４２】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ’）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、式（ＩＩａ）
【化５０】
2019531255.tif 000055
または式（ＩＩｂ）
【化５１】
2019531255.tif 000056
の化合物と式（ＩＩＩａ）
【化５２】
2019531255.tif 000057
の化合物を反応させて、
【化５３】
2019531255.tif 000058
を形成することを含み、不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ”、Ｘ、ｍ、およびｎは、上記で定義されている。
【０１４３】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ’）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に変換することを含み、
【化５４】
2019531255.tif 000059
不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｘ、ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。
【０１４４】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に変換することと、
【化５５】
2019531255.tif 000060
式（Ｉａ’）の化合物を式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることとを含み、
【化５６】
2019531255.tif 000061
不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｘ、ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。
【０１４５】
本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法に関し、前記方法は、式（ＩＩａ）
【化５７】
2019531255.tif 000062
または式（ＩＩｂ）
【化５８】
2019531255.tif 000063
の化合物と式（ＩＩＩｂ）
【化５９】
2019531255.tif 000064
の化合物を反応させて、
【化６０】
2019531255.tif 000065
を形成することを含み、不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ”、Ｘ、ｍ、およびｎは、上記で定義されている。
【０１４６】
式（Ｉａ）の化合物の製造は、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の出発物質を式（ＩＩＩ）の中間化合物と、好ましくは有機溶媒中１対１のモル比で、触媒を用いて、または触媒を用いずに、反応させることによって達成することができる。有機触媒（例えば、トリフルオロ酢酸またはメタンスルホン酸）および無機触媒（例えば、リン酸または硫酸）の両方を使用し得る。いくつかの実施形態において、製造は、溶媒なしで、または溶媒として触媒を使用して達成し得る。
【０１４７】
式（Ｉａ’）または（Ｉｂ）の化合物の製造は、有機溶媒中の式（Ｉａ）の出発物質を、例えばカルボジイミド、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム塩、ＢＯＰ、またはＰｙＢＯＰを活性化試薬として用いて、室温で最初に酸活性化し、続いてカップリング工程のための適当なヒドロキシ誘導体ＨＯＲ７または式（ＩＶ）のアミンとの反応により、達成することができる。
【０１４８】
式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物は、式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物の製造において上述したのと同様の合成スキームに従って製造し得る。
【０１４９】
式（Ｉ）の化合物は、いくつかの有機反応において、例えば新規の色素合成用の出発材料として求電子性芳香族置換反応において使用され得る。例えば、スルホン化反応によるいくつかのシアニン色素分子の修飾が当該誘導体の蛍光特性を改良し得ることは、これまでにAlan S. Waggoner (Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2):105-111；米国特許公開第２０１５／０２７４９７６号も参照)によって実証されている。
【０１５０】
化合物（Ｉ）のスルホン化は、三酸化硫黄との反応によって、三酸化硫黄誘導体または溶液との反応によって、例えば硫酸中で達成することができる。
【化６１】
2019531255.tif 000066
【０１５１】
化合物（Ｉ）のスルホクロル化は、クロロスルホン酸との反応によって達成することができる。
【化６２】
2019531255.tif 000067
【０１５２】
スルホン酸基またはクロロスルホン酸基を含む式（Ｉ）の化合物は、例えば、アンモニア、式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることによって、さらに修飾することができ、
【化６３】
2019531255.tif 000068
不確定要素Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｘ、ｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。
【実施例】
【０１５３】
他の実施形態を、特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の実施例において、さらに詳細に開示する。
式（Ｉａ）の化合物の合成の一般的な手順
【化６４】
2019531255.tif 000069
【０１５４】
エチルベンゾチアゾリル−２酢酸（２．２ｇ，０．０１ｍｏｌ）とヒドロキシベンゾイル安息香酸の適当な誘導体（０．０１１ｍｏｌ）との混合物を濃硫酸（５ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、反応が完了するまで、例えば８０〜１２０℃で１〜２時間加熱した。反応混合物を氷（約５０ｇ）に注ぎ入れ、生成物を濾過し、水で洗浄した。多くの場合、最終生成物はさらなる精製を必要としない。
式（Ｉａ’）の化合物の合成の一般的な手順
【化６５】
2019531255.tif 000070
【０１５５】
式（Ｉａ）の化合物（０．００１ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した。この溶液にカルボジイミド（０．００１２ｍｏｌ）または他の活性化試薬を加えた。この反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで適当なヒドロキシ誘導体Ｒ７ＯＨを加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで濾過し、氷（約５０ｇ）に注ぎ入れた。生成物を濾別し、水で洗浄した。収率：５５〜７５％。多くの場合、最終生成物はさらなる精製を必要としない。
式（Ｉｂ）の化合物の合成の一般的な手順
【化６６】
2019531255.tif 000071
【０１５６】
式（Ｉａ）の化合物（０．００１ｍｏｌ）を好適な無水有機溶媒（ＤＭＦ，１．５ｍＬ）に溶解した。この溶液にＴＳＴＵ、ＢＯＰ、またはＰｙＢＯＰを活性化試薬として加えた。この反応混合物を室温で約２０分間撹拌し、次いで適当なアミンＮＨＲ８Ｒ９を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液でクエンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：６５〜７５％。
実施例１
２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−９−エチル−２−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ］キノリン−４−イル］安息香酸（化合物Ｉ−３）
【０１５７】
【化６７】
2019531255.tif 000072
【０１５８】
硫酸（２ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで約０〜５℃に冷却し、０．３２５ｇ（１．０ｍｍｏｌ，１当量）の２−（１−エチル−７−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−カルボニル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．３ｇ（１．４ｍｍｏｌ，１．４当量）の２−（ベンゾチアゾール−２−イル）酢酸エチルを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、１００℃で撹拌しながら１．５時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。
【０１５９】
反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約１００ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、次いで濾液を風乾した。収率：０．３５ｇ（０．７３ｍｍｏｌ，７３％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値482.13.実測値： (-) 481 (M-1), (+) 483 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.71 (s, 1H), 8.11 - 8.02 (m, 1H), 7.96 (dd, J = 7.4, 1.6 Hz, 1H), 7.56 (tt, J = 7.5, 5.8 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.39 - 7.25 (m, 2H), 7.16 (dd, J = 6.6, 2.1 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 3.48 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.65 - 2.55 (m, 2H), 1.79 (q, J= 6.3 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
実施例２
２−［１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１，１，７，７−テトラメチル−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル］安息香酸（化合物Ｉ−５）
【０１６０】
【化６８】
2019531255.tif 000073
【０１６１】
０．７５ｇ（１．９０ｍｍｏｌ，１当量）の２−（８−ヒドロキシ−１，１，７，７−テトラメチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−カルボニル）安息香酸と０．４４ｇ（１．９９ｍｍｏｌ，１．０４当量）の２−（ベンゾチアゾール−２−イル）酢酸エチルとの混合物を、室温（約２０℃）で濃硫酸（７ｍＬ）に攪拌しながら加えた。この反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、１２０℃で撹拌しながら２．５時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約５０ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：０．５８ｇ（１．０５ｍｍｏｌ，５５％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値550.19.実測値： (-) 549 (M-1).
実施例３
２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（エチルアミノ）−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル］安息香酸（化合物Ｉ−８）
【０１６２】
【化６９】
2019531255.tif 000074
【０１６３】
硫酸（５ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで約０〜５℃に冷却し、０．７ｇ（２．３４ｍｍｏｌ，１当量）の２−（４−（エチルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−メチルベンゾイル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．７ｇ（３．１６ｍｍｏｌ，１．３５当量）の２−（ベンゾチアゾール−２−イル）酢酸エチルを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、９５℃で撹拌しながら１時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。
【０１６４】
反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約１００ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：１．０１ｇ（２．２２ｍｍｏｌ，９５％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値456.11.実測値： (-) 455 (M-1), (+) 457 (M+1). 1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 8.19 - 8.12 (m, 1H), 7.92 - 7.78 (m, 1H), 7.64 (dd, J = 8.3, 1.1 Hz, 1H), 7.61 - 7.48 (m, 2H), 7.43 - 7.36 (m, 1H), 7.36 - 7.26 (m, 1H), 7.21 - 7.14 (m, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.56 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 3.41 - 3.34 (m, 2H), 2.03 (s, 3H), 1.38 - 1.27 (m, 3H).
実施例４−１
２−［１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−イミノ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル］安息香酸（化合物Ｉ−４Ａ）
【０１６５】
【化７０】
2019531255.tif 000075
【０１６６】
硫酸（１０ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで１ｇ（２．９６ｍｍｏｌ，１当量）の２−（８−ヒドロキシ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−カルボニル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．５７ｇ（３．２６ｍｍｏｌ，１．１当量）の２−（ベンゾチアゾール−２−イル）アセトニトリルを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、８０℃で撹拌しながら１．５時間加熱し、９０℃で１時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。
【０１６７】
反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約１００ｇ）の混合物に注ぎ入れた。０．５時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：０．８ｇ（１．６２ｍｍｏｌ，５５％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値493.15.実測値： (-) 492 (M-1), (+) 494 (M+1).
実施例４−２
２−［１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル］安息香酸（化合物Ｉ−４）．
【０１６８】
【化７１】
2019531255.tif 000076
【０１６９】
前の工程（実施例４−１）からのイミン（Ｉ−４Ａ）および水（２５ｍｌ）の懸濁液を８０℃で５時間撹拌した。この時間が終わったとき、出発材料の赤色はほとんど消失し、非常に強い蛍光が発生した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、生成物を濾別し、水で洗浄し、風乾した。収率：０．７７ｇ（１．５６ｍｍｏｌ，９６％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値494.13。実測値： (-) 493 (M-1), (+) 495 (M+1).
実施例５
２−［１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル］安息香酸（化合物Ｉ−４）
【０１７０】
【化７２】
2019531255.tif 000077
【０１７１】
硫酸（１０ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで１ｇ（２．９６ｍｍｏｌ，１当量）の２−（８−ヒドロキシ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−カルボニル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．５７ｇ（３．２６ｍｍｏｌ，１．１当量）の２−シアノメチルベンゾチアゾールを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、９５℃で撹拌しながら２時間加熱した。反応混合物を放置して室温（約２０℃）に冷却し、次いで水と砕氷（約７５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。この混合物を室温で一晩撹拌し、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。最終生成物をさらに精製することなく使用した。収率：１．０９ｇ（２．２１ｍｍｏｌ，７５％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値494.13.実測値： (-) 493 (M-1), (+) 495 (M+1).
実施例６
２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジメチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル］安息香酸（化合物Ｉ−２）
【０１７２】
【化７３】
2019531255.tif 000078
【０１７３】
０．２８５ｇ（１．０ｍｍｏｌ，１当量）の２−［４−（ジメチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］安息香酸と０．２４３ｇ（１．１ｍｍｏｌ，１．１当量）の２−（ベンゾチアゾール−２−イル）酢酸エチルとの混合物を、室温（約２０℃）で硫酸（５ｍＬ）に攪拌しながら加えた。この反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、１００℃で撹拌しながら４時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）に一晩置き、次いで、水−砕氷（約１００ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：０．４２９ｇ（０．９６ｍｍｏｌ，９７％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  442.10。実測値： (-) 441 (M-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.70 (s, 1H), 8.14 - 8.04 (m, 1H), 8.04 - 7.94 (m, 1H), 7.58 (h, J = 6.5 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 - 7.29 (m, 2H), 7.19 (dd, J = 7.2, 1.7 Hz, 1H), 6.78 - 6.63 (m, 3H), 3.07 (s, 6H).
実施例７−１
２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル］安息香酸（化合物Ｉ−１）．
【０１７４】
【化７４】
2019531255.tif 000079
【０１７５】
硫酸（８ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで０．２５ｇ（０．８ｍｍｏｌ，１当量）の２−［４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．１４ｇ（０．８ｍｍｏｌ，１当量）の２−シアノメチルベンゾチアゾールを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、９５℃で撹拌しながら２時間加熱した。この反応混合物を氷−冷水（約７５ｇ）に注ぎ入れた。この段階で、対応するイミン中間体（Ｉ−１Ａ）が形成され、濾過により単離し得る。水中、または水の存在下での、特に酸性条件下での有機溶媒中、イミン中間体のさらなる加水分解を達成し得る。
【化７５】
2019531255.tif 000080
【０１７６】
この混合物を室温で一晩撹拌し、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：０．３３ｇ（０．７ｍｍｏｌ，８８％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値470.13.実測値： (-) 469 (M-1), (+) 471 (M+1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.71 (s, 1H), 8.08 (dt, J = 7.6, 1.7 Hz, 1H), 8.03 - 7.92 (m, 1H), 7.64 - 7.52 (m, 2H), 7.45 - 7.39 (m, 1H), 7.39 - 7.27 (m, 2H), 7.19 (dd, J= 6.9, 2.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 6.69 - 6.61 (m, 2H), 3.47 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.23 - 1.05 (m, 6H).
実施例７−２
２−（７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−３−（６−スルホベンゾチアゾール−２−イル）−２Ｈ−クロメン−４−イル）安息香酸（化合物Ｉ−１３）．
【０１７７】
【化７６】
2019531255.tif 000081
【０１７８】
２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル］安息香酸（化合物Ｉ−１）（１．３ｇ，２．７６ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れ、高真空中で乾燥し、次いでアセトン−ドライアイス浴で冷却した。発煙硫酸（２０％，５．８ｍＬ，２７ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下した。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで５０℃で１時間加熱し、出発物質を溶解した。反応混合物を冷まし、無水エーテルを慎重に加えた。灰白色の吸湿性沈殿を濾別し、濾液を再度エーテルで、次にＥｔＯＨで微細化した。淡紅色の沈殿を採取した。収率  １．２１ｇ（８０％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  550.09.実測値： (-) 549 (M-1), (+) 551 (M+1). 1H NMR (400 MHz, TFA) δ 8.85 - 8.78 (m, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.57 - 8.45 (m, 2H), 8.26 - 8.15 (m, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.67 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.63 - 7.56 (m, 1H), 7.45 (dd, J = 8.8, 4.5 Hz, 1H), 3.94 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 6H). ＨＰＬＣおよびＮＭＲスペクトル分析によると、この生成物は主に１つの異性体からなる。
実施例７−３
２−（７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−３−（６−クロロスルホニルベンゾチアゾール−２−イル）−２Ｈ−クロメン−４−イル）安息香酸（化合物Ｉ−１４）．
【０１７９】
【化７７】
2019531255.tif 000082
【０１８０】
クロロスルホン酸（５ｍｌ，７５ｍｍｏｌ）を氷浴で冷却し、色素Ｉ−１（１．２ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）を５分間かけて少しずつ撹拌しながら注意深く加えた。まとめた混合物を室温（約２０℃）で１．５時間撹拌し、次いで、９５〜１００℃で６時間加熱した。室温に冷却した後、混合物を非常にゆっくりと約２０ｍｌの氷／水混合物に加えた。赤色の固体が分離し、これを素早く濾別し、冷水（２×３０ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥した。収率１．２ｇ（８３％，２．１１ｍｍｏｌ）。この化合物をさらに精製することなく次の工程に使用した。
実施例７−４
２−（７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−３−（６−アミノスルホニルベンゾチアゾール−２−イル）−２Ｈ−クロメン−４−イル）安息香酸（化合物Ｉ−１５）．
【０１８１】
【化７８】
2019531255.tif 000083
【０１８２】
２−（７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−３−（６−クロロスルホニルベンゾチアゾール−２−イル）−２Ｈ−クロメン−４−イル）安息香酸（Ｉ−１４）（１．２ｇ，２．１１ｍｍｏｌ）を、氷浴で冷却したアンモニア溶液（５ｍｌ，２５％）に、５分間かけて少しずつ撹拌しながら注意深く加えた。反応混合物を室温（約２０℃）で１時間撹拌し、溶媒を真空中で室温で留去した。化合物をフラッシュカラム（シリカゲル，溶離液としてＤＣＭ−ＭｅＯＨ）によって精製した。収率０．３４ｇ（３０％，０．６２ｍｍｏｌ）。この化合物は少量の他の異性体を含有し、この化合物をさらに精製することなく次の工程に使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値549.10.実測値： (-) 548 (M-1), (+) 550 (M+1). 1H NMR (400 MHz, TFA) δ 8.83-8.73 (m, 1H), 8.62 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.57 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 8.42 (dd, J = 8.9, 1.8 Hz, 1H), 8.24-8.13 (m, 2H), 7.82 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.64-7.52 (m, 2H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
実施例８
４−ニトロフェニル２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル］ベンゾエート（化合物Ｉ−１Ｂ）
【０１８３】
【化７９】
2019531255.tif 000084
【０１８４】
無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に、９４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ，１当量）の２−［３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル］安息香酸（Ｉ−１，ＮＲ４４０）を溶解した。この溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（６２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。この反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いでｐ−ニトロフェノール（３３ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，１．２当量）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いでジシクロヘキシル尿素を濾別した。溶媒を室温で真空中で留去し、油状残渣を氷（約５ｇ）に注ぎ入れた。黄色の固体生成物を濾別し、水で洗浄した。収率：７９ｍｇ（６７％，０．１３４ｍｍｏｌ）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  591.15.実測値： (-) 590 (M-1), (+) 592 (M+1).
実施例９
トリエチルアンモニオ３−（２−（１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル）−Ｎ−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブチル）ベンズアミド）プロパン−１−スルホネート（化合物１−９Ａ’）
【０１８５】
【化８０】
2019531255.tif 000085
【０１８６】
化合物Ｉ−４（１５０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，１当量）を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、活性化試薬として過剰のトリエチルアミン（１ｍＬ）および［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムテトラフルオロボレート（１４０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ，１．２当量）を加えた。この反応混合物を室温で約２０分間撹拌し、次いで、３−（（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン−１−スルホン酸（１４０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ，１．６当量）を加えた。反応の進行をＴＬＣ（アセトニトリル−水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。
【０１８７】
反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液でクエンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：１８０ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ，６９％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  757.25.実測値：対応するプロトン化アニオン化合物Ｉ−９Ａ：
【化８１】
2019531255.tif 000086
について(-) 756 (M-1), (+) 758 (M+1)
実施例１０
トリエチルアンモニオ４−（２−（１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル）−Ｎ−（３−スルホナトプロピル）ベンズアミド）ブタノエート（化合物Ｉ−９’）
【０１８８】
【化８２】
2019531255.tif 000087
【０１８９】
溶媒の蒸発後の前の工程からの化合物Ｉ−９Ａ’（１８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温に一晩置いた。脱保護反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル−水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。ＤＣＭを留去した。残渣をアセトニトリルに溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加えた。黄色沈殿を濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  701.19。実測値：対応するプロトン化アニオン化合物Ｉ−９：
【化８３】
2019531255.tif 000088
について(-) 700 (M-1)
実施例１１
トリエチルアンモニオ３−（２−（３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）−Ｎ−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブチル）ベンズアミド）プロパン−１−スルホネート，（化合物Ｉ−６Ａ’）
【０１９０】
【化８４】
2019531255.tif 000089
２−（３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）安息香酸（化合物Ｉ−１）（９４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ，１当量）を無水ＤＭＡ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に過剰のＮ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（１ｍＬ）を加えた。この溶液に、活性化試薬として［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムテトラフルオロボレート（８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ，１．０４当量）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。
【０１９１】
反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル−水，１０％）によってモニタリングした。次に３−（（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン−１−スルホン酸（７０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ，１．２５当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液（３ｍＬ）でクエンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：１１３ｍｇ（０．１３６ｍｍｏｌ，６８％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  733.25.実測値：対応するプロトン化アニオン化合物Ｉ−６Ａ：
【化８５】
2019531255.tif 000090
について(-) 732 (M-1)
実施例１２ 
トリエチルアンモニオ４−（２−（３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）−Ｎ−（３−スルホナトプロピル）ベンズアミド）ブタノエート，（化合物１−６’）
【０１９２】
【化８６】
2019531255.tif 000091
溶媒の蒸発後の前の工程からの化合物Ｉ−６Ａ’（１８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温に撹拌しながら一晩置いた。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル−水，１０％）によってモニタリングした。溶媒を留去し、残渣をアセトニトリルに溶解し、トリエチルアミン（１．８ｍＬ）を加えた。アセトニトリルおよび過剰のトリエチルアミンを留去した。フラスコ中の残渣に無水ジエチルエーテルを加え、生成物を黄色の結晶性沈殿として形成させ、濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  677.19.実測値：酸Ｉ−６：
【化８７】
2019531255.tif 000092
について(-)676(M-1)
実施例１３
ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−（１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル）ベンズアミド）ブタノエート（Ｉ−１０Ａ）
【０１９３】
【化８８】
2019531255.tif 000093
化合物Ｉ−４（９７ｍｇ，０．１９６ｍｍｏｌ，１当量）を蒸留したばかりの無水ＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、活性化試薬として過剰のＮ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（０．２５３ｍｇ，１．９６１ｍｍｏｌ，１０当量）および［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムテトラフルオロボレート（１１３ｍｇ，０．２９４ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。反応混合物を室温で約２０分間撹拌し、次いで、ｔｅｒｔ−ブチル４−アミノブタノエートハイドロクロライド（５８ｍｇ，０．２９４ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。反応の進行をＴＬＣ（アセトニトリル−水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。
【０１９４】
反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液でクエンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：１０５ｍｇ（０．１６５ｍｍｏｌ，８４％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値635.25.実測値： (-) 634 (M-1), (+) 636 (M+1).
実施例１４
４−（２−（１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル）ベンズアミド）ブタン酸（化合物Ｉ−１０）
【０１９５】
【化８９】
2019531255.tif 000094
溶媒の蒸発後の前の工程からの化合物Ｉ−１０Ａ（６４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（３．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温に一晩置いた。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル−水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。溶媒を留去した。残渣をアセトニトリルに溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加えた。アセトニトリルおよび過剰のトリエチルアミンを留去した。フラスコ内の残渣を真空中で一晩乾燥させ、次いで石油エステル（２５ｍｌ）と共に１時間超音波処理した。黄色沈殿を濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  579.18.実測値： (-) 578 (M-1), (+) 580 (M+1).
実施例１５
４−（２−（１０−（ベンゾチアゾール−２−イル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イル）ベンズアミド）ブタン酸（化合物Ｉ−７）
【０１９６】
【化９０】
2019531255.tif 000095
化合物１−１Ｂ（１８０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，１当量）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ジメチルアミノピリジン（５６ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。この反応混合物に４−アミノブタン酸（４７ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ，１．５当量）を加え、この反応混合物を室温に一晩置いた。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル−水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。溶媒を室温で真空中で留去した。残渣を水（２５ｍｌ）で希釈し、生成物を黄色沈殿として形成させ、濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値  555.18.実測値： (-) 554 (M-1), (+) 556 (M+1).
実施例１６
２−（３−（５−クロロベンゾオキサゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）安息香酸（化合物Ｉ−１６）
【０１９７】
【化９１】
2019531255.tif 000096
０．３１３ｇ（１．０ｍｍｏｌ，１当量）の２−［４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］安息香酸と０．２６３ｇ（１．１ｍｍｏｌ，１．１当量）の２−（５−クロロベンゾオキサゾール−２−イル）酢酸エチルとの混合物を、室温（約２０℃）で硫酸（５ｍＬ）に攪拌しながら加えた。この反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、１００℃で撹拌しながら４時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてＤＣＭ−ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）に一晩置き、次いで、水−砕氷（約１００ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性反応（ｐＨ約７）になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：０．４５３ｇ（０．９３ｍｍｏｌ，９３％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値488.11.実測値： (-) 487 (M-1).
実施例１７
充分に機能性のヌクレオチドコンジュゲートの合成の一般的な手順
【０１９８】
新規の色素−ヌクレオチドコンジュゲートを、化合物（Ｉ）または化合物（Ｖ−Ｏ）から、適当なヌクレオチド誘導体と結合させることにより合成した。
【化９２】
2019531255.tif 000097
【０１９９】
無水ＤＭＡ（２．５ｍＬ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（２０ｍｇ，６０μｍｏｌ）、およびヒューニッヒ塩基（０．０５ｍＬ）を適当な色素の乾燥サンプル（５０μｍｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で撹拌した。ＴＬＣ（アセトニトリル−水，１０％）によれば、活性化は通常２０〜３０分で完了した。活性化が完了した後、ＤＭＡ（０．７５ｍＬ）と水（０．３０ｍＬ）との混合物中のトリエチルアンモニウム塩（５５μｍｏｌ）としてのｐｐｐＣ−ＬＮ３の溶液を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を氷浴で約４℃に冷却し、次いで０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（５ｍＬ）の水溶液を加え、混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を０．０５Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液中の約２５ｇのＤＥＡＥ  Sephadex樹脂懸濁液を含むカラムに加え、ＴＥＡＢ（０．１Ｍから１Ｍまでの濃度勾配）で洗浄した。着色画分を採取し、蒸発させ、次いで再び水と共蒸発させて、さらにＴＥＡＢを除去し、減圧乾燥した。次いで、残渣をＴＥＡＢ  ０．１Ｍに再溶解した。この溶液を０．２ｎｍ孔径のシリンジフィルターを通して濾過した。生成物を、アセトニトリル−０．１Ｍ  ＴＥＡＢを含むＣ１８逆相カラムを使用するＨＰＬＣによって精製した。収率：６０〜７５％。
【０２００】
上記の一般的な手順を用いて、以下のヌクレオチドコンジュゲートを作製した。
【０２０１】
【化９３】
2019531255.tif 000098
【化９４】
2019531255.tif 000099
実施例１８
【０２０２】
本実施例では、本明細書に記載の様々な蛍光色素および対応するヌクレオチドコンジュゲートのスペクトル特性を試験し、市販の色素と比較した。
【０２０３】
テーブル１Ａは、エタノール溶液中の吸収が同じスペクトル領域にあるいくつかの例示的な市販の色素と比較した、本明細書に記載の新規の蛍光色素のスペクトル特性を示す。本出願の新規の蛍光色素の各々は、Star440sxと比較してより長いストークスシフトを有することを観察することができる。
【０２０４】
【表１】
2019531255.tif 000100
【０２０５】
さらに、色素Ｉ−１のスペクトル特性をメタノール溶液中のスルホン化色素Ｉ−１３およびＩ−１５と比較し、結果をテーブル１Ｂにまとめた。これらのデータは、スルホン化誘導体Ｉ−１３およびＩ−１５が、対応する非置換型類似体Ｉ−１と比較した場合に、溶液中で２〜５倍強い蛍光を有することを実証している。これらの結果は、スルホン化色素をバイオマーカーとして使用できる可能性を実証している。
【０２０６】
【表２】
2019531255.tif 000101
【０２０７】
図１は、同じスペクトル領域に吸収を有する市販の色素Star440sx（Universal Scanning Mixture中の溶液；色素は４６０ｎｍで励起された）と比較した本出願の新規の蛍光色素の蛍光スペクトルを示す。より大きいストークスシフトに起因して、これらの新規に開発された色素は、４６０ｎｍでの励起光とより良好に分離して、検出領域においてより多くのシグナルを与えることができる。
【０２０８】
テーブル２は、同じスペクトル領域に吸収を有する市販の色素で標識した適当なヌクレオチドと比較した、新規の色素で標識したＣ−ヌクレオチドの相対的蛍光強度を示す。本明細書に記載の新規の蛍光色素は、それらのより強い蛍光およびより大きなストークスシフトに起因して、４６０ｎｍの光で励起したときに５７０ｎｍ（検出領域）で６０〜４００％多いシグナルを与えることができることが示されている。
【０２０９】
【表３】
2019531255.tif 000102
【０２１０】
テーブル３は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたＣ−ヌクレオチドの溶液中のスペクトル特性を示しており、これは、本出願の蛍光色素で標識されたヌクレオチドの大部分が、同じスペクトル領域の市販の色素と比較して、より長いストークスシフトを有するというテーブル１の観察と一致する。
【０２１１】
【表４】
2019531255.tif 000103
【０２１２】
図２は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたＣ−ヌクレオチド（黒色で示されている）のシークエンシング分析への有用性を示す。このシークエンシング例では、２チャンネル検出法を使用した。本明細書に記載の２チャンネル法に関して、その開示がその全体で参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号に記載の方法およびシステムを利用して、核酸をシークエンシングすることができる。２チャンネル検出では、第１のチャンネルで検出される第１のヌクレオチド型、第２のチャンネルで検出される第２のヌクレオチド型、第１と第２のチャンネル両方で検出される第３のヌクレオチド型、およびどちらのチャネルにおいても検出されないか、または極僅かにしか検出されない、標識を欠く第４のヌクレオチド型を提供することによって、核酸をシークエンシングすることができる。
【０２１３】
図２Ａおよび２Ｂの各々において、「Ｇ」ヌクレオチドは、非標識であり、左下の雲として示されている。右上の雲として示されている、２つの標識された「Ａ」ヌクレオチドの混合物があり、一方は０．５μＭのクマリン誘導体色素で標識されおり、他方は１．５μＭのベンゾピラン誘導体Ｉ−６で標識されている。ＮＲ５５０Ｓ０色素で標識された「Ｔ」ヌクレオチドからのシグナルは、左上の雲によって示されており、標識された「Ｃ」ヌクレオチドシグナルは、右下の雲によって示されている。Ｘ軸は一方のチャンネルの信号強度を示し、Ｙ軸は他方のチャンネルの信号強度を示す。図２Ａおよび図２Ｂにおいて、ｆｆＣは、それぞれＩ−６およびＩ−１で標識されている。実験の設定：機器：Ｍ１５サイクル数：Ｃ−Ｉ−６はＣ５，Ｃ−Ｉ−１はＣ９，シークエンシングライブラリー：標準PhiX。色素Ｉ−６およびＩ−１で標識された充分に機能性のＣ−ヌクレオチドコンジュゲートが充分なシグナル強度およびより良好な雲の分離を与えたことが示されている。
【０２１４】
図３は、青色（４６０ｎｍ）または緑色（５３０ｎｍ）の光で励起されたときの、様々な蛍光色素で標識されたＣ−ヌクレオチドの相対的蛍光強度を示す。この棒グラフは、示されている色素を取り込んだクラスターの未処理の強度を示す。各測定は手動でＥｘ４６０ｎｍで行い、６０℃で１秒間露光した。MTS [MiSeq R&D (Test) Software]をM15で使用して画像を撮り、画像解析ツールFirecrestを使用して強度データを抽出した。
【０２１５】
結果は、同じスペクトル領域の長いストークスの市販の色素と比較したときに、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたｆｆＣが最大３００％明るいシグナルを与えたことを示す。
【０２１６】
図４は、２つの異なる温度（２２℃の室温および６０℃の高温）で青色（４６０ｎｍ）光で励起されたときの、市販および新規の蛍光色素Ｉ−６で標識されたコンジュゲート化Ｃ−ヌクレオチドの相対輝度を示す。新規の蛍光色素Ｉ−６で標識されたｆｆＣは、両方の温度で、一部のスペクトル領域について、市販の長いストークスの色素Star440lsで標識されたｆｆＣと比較して、より明るいシグナルを与えた。
【０２１７】
本明細書で使用される見出しおよび小見出しは、読みやすくするためだけのものであり、本開示の範囲を定義または限定することが意図されたものではない。上記の本出願は、方法および材料における改変、ならびに製造方法および機器における変更をしやすい化合物および方法に関する。このような改変は、本開示を検討することにより、または本明細書に開示されているアプリケーションを実施することにより、当業者に明らかになるであろう。したがって、本開示が本明細書に開示されている具体的な実施形態に限定されることではなく、本開示の真の範囲および精神に入る全ての改変および代替を包含することが意図されている。
【図１】
2019531255.tif 000116
【図２Ａ】
2019531255.tif 000117
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2019531255.tif 000122
2019531255.tif 000123
2019531255.tif 000124
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