(57)【要約】  本発明は、生きている動物の生物体内の放射性元素のバイオアベイラビリティを、前記放射性元素による前記生物体の汚染の後に予測するための方法に関するものであり、前記方法は：（ａ）前記生きている動物体内の汚染部位を模擬するゲルであって、かつその中で前記放射性元素が均一に分布している該ゲルを製造すること：ｂ）前記工程（ａ）で製造されたゲルを、前記生きている動物体内の汚染の領域と接触する生物学的流体を模擬する溶液と接触させること、次いで混合物を攪拌すること；およびｃ）所与の時間ｔにおいて、前記溶液中の前記放射性元素の量を測定することであって、前記測定が前記生きている動物の生体内の前記放射性元素のバイオアベイラビリティの予測を可能にすること、の工程を含む。本発明はまた、所与の放射性元素に関係してキレート特性を示す分子を同定するため、および／または分子のキレート特性を特徴づけるための、かかる方法の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている動物体内の放射性元素のバイオアベイラビリティを、前記放射性元素によるこの身体の汚染の後に予測するための方法であって：
ａ）前記放射性元素がその中で均一に分布しているゲルを調製することであって、前記ゲルが前記生きている動物体内の汚染部位を模擬していること；
ｂ）前記工程（ａ）で調製されたゲルを、前記生きている動物体内の汚染部位と接触する生物学的流体を模擬する溶液と接触して配置すること、次いで全体を攪拌下に置くこと；および
ｃ）時間ｔにおいて、前記溶液中の前記放射性元素の量を測定することであって、前記測定が前記生きている動物体内の前記放射性元素のバイオアベイラビリティの予測を可能にすること、
の工程を含む該方法。
【請求項２】
前記放射性元素がアクチニドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲルが、工程前記（ａ）において、コロイド特性を有する少なくとも１種の化合物、ゲル溶液と称される溶液、および少なくとも１種の放射性元素から調製されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
コロイド特性を有する前記化合物が、特に、アガロース、スクロース、セファロース、キトサン、キサンタン、カラギーナン、デキストラン、寒天、アルギン酸塩、またはそれらの混合物からなる群より選択される多糖であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
コロイド特性を有する化合物（ｇで表した重量）／ゲル溶液（ｍｌで表した体積）の割合が１と５％との間、典型的には２と４％との間であることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲル溶液が、水溶液、例えば生理食塩水であって、任意で、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酒石酸ナトリウム（Ｎａ２Ｃ４Ｈ４Ｏ６）、乳酸ナトリウム（Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）ＣＯＯＮａ）、ピルビン酸ナトリウム（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、およびクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）からなる群より選択される少なくとも１種の有機または無機塩によって完成される該生理食塩水であることを特徴とする、請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲルが、ペプシン、レシチン、グリシン、グルコース、リゾチーム、アルブミン、タウロコール酸ナトリウム、マレイン酸、トランスフェリン、フェリチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グルコサミン、フィブロネクチン、ラミニン、ムチン、ケラチン、コラーゲン、コンドロイチン、オステオポンチン、ヒドロキシアパタイト、およびグルタミン酸からなる群より選択される１種以上の化合物を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、放射性元素が、コロイド特性を有する少なくとも１種の化合物を含有するゲル溶液へ、懸濁液または溶液の形態で添加されることを特徴とする、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）の溶液が、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酒石酸ナトリウム（Ｎａ２Ｃ４Ｈ４Ｏ６）、乳酸ナトリウム（Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）ＣＯＯＮａ）、ピルビン酸ナトリウム（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、およびクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）からなる群より選択される１種以上の有機または無機塩を含む水溶液であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲル溶液と、工程（ｂ）で用いる前記溶液とが、１種以上の同じかまたは異なる塩を含むことを特徴とする、請求項３から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）の溶液が、ペプシン、レシチン、グリシン、グルコース、リゾチーム、アルブミン、タウロコール酸ナトリウム、マレイン酸、トランスフェリン、フェリチン、およびフィブリンからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）の溶液が、約３７℃の温度を有する撹拌機を備えたインキュベータにおいて調製され、コントロールされた雰囲気の組成が５％ＣＯ２を含む湿った空気であることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
所与の放射性元素に対しキレート特性を有する分子を同定するための、および／または分子のキレート特性を特徴づけるための、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
放射性元素に対しキレート特性を有する分子を同定するための方法であって：
ｉ）請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記放射性元素のバイオアベイラビリティを測定することであって、これにおいて生物学的流体を模擬する溶液がキレート特性を示す可能性のある分子を含むこと；
ｉｉ）工程（ｉ）と同じ条件下で請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記放射性元素のバイオアベイラビリティを測定することであって、生物学的流体を模擬する溶液がキレート特性を示す可能性のある前記分子を含まないこと；および
ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたバイオアベイラビリティを、工程（ｉｉ）で得られたものと比較することであって、工程（ｉ）で得られたバイオアベイラビリティが工程（ｉｉ）で得られたものよりも高い場合には、工程（ｉ）で試験された分子が前記放射性元素に対するキレート特性を有することを示すものであること、
の工程を含む、該方法。
【請求項１５】
前記工程（ｉ）および（ｉｉ）において、汚染部位を模擬するゲルの組成、このゲル中に最初に含まれていた放射性元素のタイプおよび量、生物学的流体を模擬する溶液の組成、溶液中に含まれる放射性元素を測定するための技術、およびこの測定が実施される時間ｔに関して同じ条件が使用され、異なるのは、生物学的流体を模擬する溶液中の試験されるべき分子の存在または不在のみであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性元素による、汚染の一般的な分野、特にヒトの汚染を対象とする。
【０００２】
より具体的には、本発明は汚染後の、アクチニドなどの放射性元素のバイオアベイラビリティを予測するための方法を提案する。この方法は、放射性元素の保持部位にも相当する汚染部位を模擬する静的区画と、汚染部位に接触しかつ、その中で放射性元素が溶解してその除去のために運ばれ得る生物学的液体を模擬する動的区画とを用いる。
【０００３】
本発明はまた、放射性元素をキレート可能な分子を同定するため、および／または前記分子のキレート特性を特徴づけるための、前記方法の使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
アクチニドなどの放射性元素によるヒトの汚染は、核燃料サイクルに関連した産業活動：ウランの採掘、ウランの化学的精製および転換、同位体分離、核燃料の生産、使用済み核燃料の再処理およびリサイクリング、原子力発電所の修復および解体、または核廃棄物もしくは核物質の貯蔵、の間に起こり得る。それはまた、任意の核関連分野で作業するかまたは放射性元素の使用を伴う研究所においても起こり得る。この汚染は、吸入、摂取、損傷によって、および／または接触によって起こり得る。
【０００５】
かかる汚染後の、体内の放射性元素の挙動を評価できることは、身体に対するそれらの効果およびそれらのハザードレベルを制限するために利用可能な手段を評価するために、可能でなければならない。そうするためには、それらの可溶性が考慮されねばならない：可溶性化合物は身体により迅速に除去されるのに対し、不溶性または難溶性にすぎない化合物は長時間体内に残留することになる。
【０００６】
この目的のため、アクチニド用に使用されかつＡｎｓｏｂｏｒｌｏら、１９９９［非特許文献１］により記載された様々なインビトロの溶解法が存在する。概略的には、これらの方法は、試験されるべき化合物を膜上に付着させることに基づく。可溶化された分画は、緩衝液の存在下で膜をインキュベートした後に膜を通してこの緩衝液を濾過することにより回収される。別の技術は、緩衝液中での粒子のインキュベーションと、それに続く溶解された分画から粒子を分離するための遠心分離に基づく。別の系は、２つの膜の間で粒子を捕捉し、可溶化された分画は系の外側の区画において収集される。しかしながら、これらの技術はいずれも、充分な信頼性または再現性があることが証明されていない。
【０００７】
さらに挙げることができる１つの技術は、充分に定義された拡散ゲルを通した金属種の拡散の原理と、イオン交換膜上でのそれらの蓄積に基づく。ＤａｖｉｓｏｎおよびＺｈａｎｇ、１９９４［非特許文献２］によって最初に記載されたこの技術は、「薄膜拡散勾配」（ＤＧＴ）と称される。それは特に、天然の水、沈殿物、および土壌中の、不安定な金属を検査するために用いられる。
【０００８】
加えて、主としてナノメートル形態の金属粒子の、生物学的液体を模擬する培地中での溶解試験が文献において記載されている。しかしながら、これらの試験は、静的条件下で行われており、それ故、生体において遭遇する条件からは多くが取り除かれ、かつ本質的には粒子／溶解された元素の分離に基づく。
【０００９】
医薬品分野では、放射性元素による汚染の分野とは明らかに異なり、アガロースゲルなどのヒドロゲルが、薬物拡散を研究するために既に使用されている。例えば、Ｋｌｏｓｅら、２００９［非特許文献３］は、薬学的薬剤の拡散を評価するためのインビトロの方法を記載している。この方法は、０．１％−０．６％アガロースゲル中での医薬化合物の拡散の研究に基づいている。より具体的には、アガロースゲルがひとたび固化すれば、ゲルの中央に穴が開けられてリザーバーが形成され、その中に、特性評価されるべき化合物を含む溶液が配置される。ゲルの試料は、リザーバーから種々の距離で採取され、採取された試料中の化合物の量が評価される。Ｈｏａｎｇ  Ｔｈｉら、２０１０［非特許文献４］は、医薬化合物の拡散を調べるための、このアガロースゲル使用の原理を再現している。ＣｈａｉｂｖａおよびＷａｌｋｅｒ、２００７［非特許文献５］は、薬学的薬剤のインビトロの放出を評価するための様々な方法を比較しており、用いたゲルは２０−３０％アガロースゲルである。また医薬品分野で既知でありかつ使用されているのは、所与の生物学的区画を模擬できる組成物である［非特許文献６］。
【００１０】
生理学の領域では、放射性元素による汚染の領域とは明らかに異なり、インビボの測定は、結腸における吸収能、主として水および電解質（Ｎａ＋、Ｋ＋）の動きについて行われた。アガロースは、流体およびイオンの拡散を可能にするという利点を有する［非特許文献７］。
【００１１】
最後に、放射性元素および特にプルトニウム（Ｐｕ）などのアクチニドの取扱いが技術的性質の難点を示すことが指摘されるべきである。Ｐｕ同位体の非常に強い比放射能（＞１０９Ｂｑ／ｇ）のため、粒子の懸濁液から放射能に関して再現性のあるサンプリングを行うことは事実上不可能である。試料間の再現性は、より可溶性の化合物の方がより良好である。加えてＰｕの、任意の表面上への、および主としてプラスチック上への強い吸着の故に、再現性であるためにはサンプリングが非常に短時間で行われねばならない。
【００１２】
結果として、アクチニドなどの放射性元素を用いる試験は、試料の調製後非常に速やかに行われねばならず、このことが信頼性に関する不確定性を生じ得る。言い換えれば、同位体の比放射能とそれらの表面上への強い吸着との故に、アクチニドなどの放射性元素に関して信頼できる再現性のある試験を行うことは非常に難しい。
【００１３】
それ故、ヒトの汚染後の放射性元素のインビボのバイオアベイラビリティを予測または測定するための、放射性元素に固有の特異性および制約を考慮しかつ先行技術において公知の方法の欠点をもたない、インビトロの方法が真に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ａｎｓｏｂｏｒｌｏら、“Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ”（利用可能なインビトロの溶解試験の総説および批評的分析）、「Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｈｙｓｉｃｓ」、１９９９年、第７７巻、ｐ．６３８−６４５．
【非特許文献２】Ｄａｖｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ、“Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｗａｔｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｇｅｌｓ”（薄膜ゲルを用いた天然水中の微量成分のインシトゥのスペシエーション測定）、「Ｎａｔｕｒｅ」、１９９４年、第３６７巻、ｐ．５４６−５４８．
【非特許文献３】Ｋｌｏｓｅら、“Ｔｏｗａｒｄｓ  ｍｏｒｅ  ｒｅａｌｉｓｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（生分解性微粒子のためのより現実的なインビトロの放出測定技術に向けて）、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２００９年、第２６巻、ｐ．６９１−６９９．
【非特許文献４】Ｈｏａｎｇ  Ｔｈｉら、“Ｂｏｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｕｌｋ”（シクロデキストリンで修飾された骨移植体：バルクでの薬物放出の研究）、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」、２０１０年、第４００巻、ｐ．７４−８５．
【非特許文献５】Ｃｈａｉｂｖａ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ、“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”（ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７非経口製剤からのオキシトシン放出の評価のためのインビトロの放出法の比較）、「Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、２００７年、第１４巻、ｐ．１５−２５．
【非特許文献６】Ｍａｒｑｕｅｓら、“Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ”（溶解試験において適用の可能性のある模擬生物学的流体）、「Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、２０１１年、第１８巻、ｐ．１５−２８．
【非特許文献７】Ｚａｍｍｉｔら、“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  Ｎａ＋ｆｌｕｘ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｏｌｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”（インビボのラット結腸における流体およびＮａ＋の流動に対する変化する管腔の流体力学的抵抗の影響）、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」、１９９４年、第４７７巻、ｐ．５３９−５４８．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の方法は、この必要に応え、さらに別の利点を提供する。本発明者らは、放射性元素の挙動およびそれ故インビボのバイオアベイラビリティを、この放射性元素による生物の汚染の後に予測できるようにする方法であって、前記方法が迅速であり、実施が比較的容易であり、放出された放射性元素の測定以外には何ら特別な器具を必要としない、該方法を開発した。この方法が無細胞性であること、すなわちその実施のために何ら細胞または細胞培養の使用を必要としないことが注目されるべきである。
【００１６】
本発明者らは、２つの基本的な要素を含む方法を提案しており、それらは、（１）バイオアベイラビリティを測定することが所望されている放射性元素を含有する汚染部位（静的区画）を模擬するゲルと、および（２）該ゲルと接触しかつその中に放射性元素が放出され得る液体であって、前記液体が攪拌に供されかつ汚染部位と接触する動的区画を模擬している、該液体とである。
【００１７】
既に説明したように、本発明の方法は、放射性元素が汚染部位を去る能力を評価できるようにする。ゲル中に取込まれた検査放射性元素が動的区画へ移らない場合、このことはそれが汚染部位に留まっており、かつそれ故不溶性であり、および／またはその中に捕捉されており、それ故、潜在的に危険であることを意味する。
【００１８】
本発明を実施する場合、検査されるべき放射性元素を含む所与の組成を有する単一のゲル溶液を調製すること、および次にそれを分画することにより、「量」特に、それが粒子形態である場合を含めて、検討中の放射性元素の質量および放射能の面で、非常に高い再現性を保証することが可能である。加えて、この調製は可溶性、適度に可溶性、またはさらに不溶性の化合物について使用できる。
【００１９】
本発明の方法では、静的区画および／または動的区画の組成物が容易に交換可能であり、それにより、種々の生物学的条件を模擬する非常に多くの組成物を試験することだけでなく、質量、保持区画の組成、およびｐＨなどの、試験されるべき放射性元素の溶解／バイオアベイラビリティに対する多数のパラメータの影響を評価することも可能にする。これらの特性は、本発明の方法が同じ条件下にある非常に多数の試料を同時に（数百）処理する可能性を与えるという事実に関連して、前記方法がハイスループット技術と称され得ることを意味している。
【００２０】
最後に、本発明の方法は、比較的少ない、典型的にはそれぞれ１ｍｌおよび５ｍｌよりも少ない、ゲル（静的区画）またはこのゲルと接触する液体（動的区画）の体積を使用しており、小規模の予測試験ができるようにする。
【００２１】
より具体的には、本発明は生きている動物体内の放射性元素のバイオアベイラビリティを、前記放射性元素によるこの身体の汚染の後に予測するための方法であって：
ａ）前記放射性元素がその中で均一に分布しているゲルを調製することであって、前記ゲルが前記生きている動物体内の汚染部位を模擬していること；
ｂ）前記工程（ａ）で調製されたゲルを、前記生きている動物体内の汚染部位と接触する生物学的流体を模擬する溶液と接触して配置すること、次いで全体を攪拌させておくこと；および
ｃ）時間ｔにおいて、前記溶液中の前記放射性元素の量を測定することであって、前記測定が前記生きている動物体内の前記放射性元素のバイオアベイラビリティの予測を可能にすること、
の工程を含む該方法に関する。
【００２２】
「生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）」および「生物学的液体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｉｑｕｉｄ）」という表現は、本明細書では区別なく使用される。
【００２３】
本発明においては、用語「バイオアベイラビリティ」は、汚染時に身体が暴露された放射性元素の全量に比較した、測定時間ｔにおける生体中の有効作用をもつ放射性元素の割合を示す。インビトロでは、このバイオアベイラビリティは、工程（ａ）で調製されたゲルから時間ｔにおいて溶液中に放出された放射性元素の、このゲルが調製されたときその中に最初に配置された放射性元素の全量に比較した割合として表すことができる。それ故、時間ｔにおける放射性元素のバイオアベイラビリティは、以下の式（Ｉ）：
バイオアベイラビリティ（ｔにおける）＝（ｔにおける溶液中の量）／（最初の全量）×１００    （Ｉ）
に従って計算される。
【００２４】
「生体」により、任意の生きている動物体、および特にヒトが意味される。
【００２５】
本発明は、生体を汚染する恐れのある任意の天然または人工の放射性元素に適合する。本明細書では用語「放射性元素（ｒａｄｉｏｅｌｅｍｅｎｔ）」および「放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ）」が区別なく使用されることが明記される。１つの特定の実施形態では、前記放射性元素はアクチニドである。それについてバイオアベイラビリティを予測することが所望され得るアクチニドのさらに特定の例としては、ウラン、プルトニウム、トリウム、アメリシウム、キュリウム、ネプツニウム、またはそれらの任意の混合物が挙げられる。本発明では、調べる放射性元素は、可溶性か否かにかかわらず、様々な化学形態、および特に酸化物、硝酸塩、フッ化物、または金属の、および／または固体の形態であってよい。
【００２６】
既に示したように、本発明の方法はゲルを使用する。ゲルは一般に、少なくとも２つの構成要素から形成される：溶液（以降ゲル溶液と称される）、これは、溶液全体を通した３次元のネットまたは３次元のネットワークを形成する第２の化合物によって「捕捉された」液体である。この３次元のネットワークは、マトリックス、すなわち固体連続相を形成できるコロイド特性を有する化合物から構成される。典型的には、ゲルは柔らかい材料であり、溶液により膨潤し、かつ大きな変形を受けることができる。
【００２７】
本発明では、一般にゲルを調製するために特に生物学において用いられる、コロイド特性を有する全ての化合物が本発明において使用可能である。有利には、コロイド特性を有するこれらの化合物は、有機性のものである：それらは一般に高分子であって、典型的には、低分子量の分子から、事実上または設計によって派生した多数の反復単位から本質的に形成された構造をもつ、比較的高い分子量の分子である。
【００２８】
例えば、コロイド特性を有する化合物として、多糖類および特にアガロース、スクロース、セファロース、キトサン、キサンタン、カラギーナン、デキストラン、寒天、アルギン酸塩、またはそれらの混合物の１種などの、高分子を使用することが可能である。カラギーナンとアガロースとの混合物などの２種の異なる多糖、およびさらに２種超の混合物を使用することは事実上可能である。例として、架橋剤の存在下でアクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の重合により形成されるポリアクリルアミドゲルまたはその誘導体が挙げられる。
【００２９】
有利には、本発明の方法で用いたゲルを調製する場合、コロイド特性を有する化合物／ゲル溶液（ｇで表した重量／ｍｌで表した体積）の割合は、０．０１と０．０５との間、典型的には０．０２と０．０４との間である。例えば、アガロース／ゲル溶液比が２．５％、すなわち０．２５ｇアガロース／１０ｍｌゲル溶液であるアガロースゲルを調製可能である。
【００３０】
本発明で用いたゲルは、放射性元素により汚染された部位を模擬する特性を有する。「模擬する」という概念は、ゲルが、汚染部位または汚染部位に含まれかつその中に放射性元素が保持され得る要素（組織または細胞）の１つを表すモデルであることを意味する。このモデルは、特にｐＨ、イオン、タンパク質、および脂質濃度に関し、汚染部位要素のものに匹敵するかまたは類似する物理化学的特性を有し、かつ任意で、汚染部位または前記要素に特徴的な１種以上の成分化合物を有するが、しかし細胞がないことによってゲルは汚染部位とは異なる。ゲル溶液および／またはゲルの３次元ネットワーク中に保持された付加的な化合物が、ゲルにその模擬性を提供する。
【００３１】
それ故、本発明の方法で用いたゲル溶液は、典型的には水溶液、例えば、蒸留水と８から９ｇ．Ｌ−１の濃度に希釈された塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）とからなり、任意選択的に１種以上の塩、および特に１種以上の有機または無機塩によって完成する生理食塩水である。これらの塩、および特にこれらの有機または無機塩は、溶液のイオン濃度およびｐＨを修正するために使用される。前記有機または無機塩の例としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酒石酸ナトリウム（Ｎａ２Ｃ４Ｈ４Ｏ６）、乳酸ナトリウム（Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）ＣＯＯＮａ）、ピルビン酸ナトリウム（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、およびクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）が挙げられる。
【００３２】
模擬される汚染部位は、放射性元素の吸入または摂取後に、或いはそれらの存在下での接触または損傷後に、汚染される恐れがある人体の要素または区画であり得る。それ故汚染部位は、肺粘膜、頬粘膜、胃粘膜、角膜、真皮、肝臓（汚染放射性元素の除去プロセス後の）、筋肉、軟骨、骨、滑膜（または滑液）、胃液、肺粘液またはサーファクタント、および食細胞に含まれるファゴリソソーム（または食空胞）であってもよい。
【００３３】
例えば損傷による汚染後の放射性元素のバイオアベイラビリティを調べるためには、それぞれが要素または区画：全てかかる損傷時に汚染される恐れがある筋肉、軟骨、骨、滑膜（または滑液）を模擬し、しかしまた損傷部位に向けて循環するマクロファージの補充後のファゴリソソームも模擬する、いくつかのゲルを用いて、本発明の方法が実施可能であることは明らかである。
【００３４】
既に説明したように、ゲルは模擬汚染部位または模擬汚染部位に存在する要素の１つに特徴的な、１種以上の成分化合物を有し得る。このまたはこれらの化合物は、殆どが糖たんぱく質およびグリコサミノグリカンのファミリーに属する。このまたはこれらの化合物は、特に、ペプシン、レシチン、グリシン、グルコース、リゾチーム、アルブミン、タウロコール酸ナトリウム、マレイン酸、トランスフェリン、フェリチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グルコサミン、フィブロネクチン、ラミニン、ムチン、ケラチン、コラーゲン、コンドロイチン、オステオポンチン、ヒドロキシアパタイト、およびグルタミン酸からなる群より選択される。当業者は、彼らの知識に照らして、模擬汚染部位の関数として、ゲル中に使用されるべき適当な化合物および量を選択できる。特に、彼らは、以下の実験のセクションにおいて提供され、かつ滑液、軟骨、単純な（ＥＣＭ１）またはより複雑な（ＥＣＭ２）細胞外マトリックスゲルを参照し得る。ＥＣＭ２は、コラーゲンを含むが、グルコサミン（全ての単糖類のビルディングブロック）およびヒアルロン酸などの他の化合物も含んでおり、グリコサミノグリカンはこのマトリックスの大部分の化合物である。これら２つのゲルは、異なる組織を表すものではない。
【００３５】
本発明の方法の工程（ａ）では、ゲルが調製され、これにおいて検査されるべき放射性元素は均一に分布される。「均一に分布」により、２つの同等な、独立して選ばれたゲルの体積中の放射性元素の量が実質的に同じとなることが意味される。均一な分布の概念は、放射性元素の貯蔵所を形成する窪みなどの所与のゲル部位に放射性元素が集まった場合の反対である。
【００３６】
ゲルの調製工程は、用いる化合物に依存し、かつ対応する分野において公知である。それは一般に、コロイド特性を有する化合物を溶液中に入れること、続いてゲルを形成することにより実施される。ゲルは自発的に形成し得る。多糖などの化学化合物では、コロイド特性を有する化合物を含有する溶液を加熱し、次いで冷却することが必要である。加熱は、溶液中の化合物の分散を確保し、かつ異なる化合物の間に存在する弱い結合のいくらかを切断させ、そのことが次に、それら自体を再編成して３次元のネットワークを形成できるようにする。ゲル化は、溶液の冷却時に起こる。例えば、ポリアクリルアミドゲルについては、ゲルの形成には架橋剤およびアクリルアミドの使用が必要である。
【００３７】
有利には、その中で放射性元素が均一に分布しているゲルは、単一工程で調製し得る。この目的のためには、ゲルを調製する際に放射性元素を直接添加することが望ましい。この場合方法は、コロイド特性を有する少なくとも１種の化合物と、既に定義されたような溶液（ゲル溶液）と、および少なくとも１種の放射性元素とから、ゲルを調製する工程を含むこととなる。
【００３８】
既に説明したように、本発明は可溶性の放射性元素、ならびに可溶性ではないかまたは難溶性にすぎない放射性元素に適用される。それ故、固体放射性元素を溶液中に入れることが、溶液（可溶性放射性元素の完全な溶解）または懸濁液（難溶性または可溶性がない放射性元素）をもたらす。
【００３９】
１つの特定の実施形態では、溶液形態の放射性元素は、コロイド特性を有する少なくとも１種の化合物がそれに添加された既に定義されたようなゲル溶液中に取込まれる。この実施形態は、典型的には可溶性または適度に可溶性の放射性元素に適用される。例えば、既知の放射能（Ｂｑ）の放射性元素がガラスバイアル中に配置される。ホットプレート上での蒸発の後、ゲル溶液へ添加されることになる溶液中に放射性元素が取込まれる。この標本は、参考として使用可能な厳密な濃度の溶液を提供し、該溶液の放射能および採取する体積がコントロールされる。
【００４０】
変形として、放射性元素はコロイド特性を有する少なくとも１種の化合物を含有するゲル溶液へ、懸濁液の形態で添加される。この変形は、特に金属酸化物などの不溶性または難溶性の放射性元素に適用される。典型的には、放射性元素の懸濁液はグローブボックス内で調製され、所望の放射能を含有する懸濁液の体積が、アガロース溶液などのコロイド特性を有する少なくとも１種の化合物を既に含有するゲル溶液に直接添加される。この変形においては、ゲル溶液に添加される懸濁液の体積は、ゲル溶液の体積の１％以下である。
【００４１】
ゲルを調製する場合、既に定義されたような１種以上の特徴的な成分化合物を添加することが可能である。後者は、放射性元素の添加の前、後、または最中にゲル溶液へ、および／またはコロイド特性を有する化合物の添加の前、後、または最中にゲル溶液へ添加し得る。
【００４２】
選択された形態学をゲルに付与することが有利である；この形態学は、しばしば前記ゲルを調製する際に付与される。この目的のため、使用者がゲルに付与することを希望する形状に対応する特別な型を使用することが可能である。その調製後に、ブレードなどの器具を用いて、ゲルを形作ることも可能である。本発明では典型的には、ゲル溶液、コロイド特性を有する少なくとも１種の化合物、放射性元素、および任意で少なくとも１種の特徴的な成分化合物を含有する組成物が、いかなる固化にも先立ち、生物学またはバイオテクノロジーにおいて通常使用されるマルチウェルプレートのウェルへ注入される。例えば、５００と７００μｌの間の体積の組成物が、１２ウェルプレートの３．９ｃｍ２などのウェル内へ配置される。
【００４３】
均一に分布した放射性元素を含むゲルが、本発明の方法の工程（ａ）に従ってひとたび調製されれば、直後に工程（ｂ）を実施でき、或いは反対にそれを遅らせてもよい。その実施に先立ち、工程（ａ）で調製されたゲルを密閉ラッピング内に保存して、ゲルの乾燥および特性変化を防止できる。典型的には、それは４℃において、３６時間を超えず、かつ特に２４時間を超えない時間にわたり保存可能である。
【００４４】
本発明の方法の工程（ｂ）においては、放射性元素を含有しかつ汚染部位を模擬するゲルは、前記生体中の前記汚染部位と接触している生物学的流体を模擬する溶液と接触して配置される。
【００４５】
「汚染部位と接触している生物学的流体」により、それによって既に定義されたような汚染部位が液体交換、栄養交換、および／または老廃物交換などのインビボ交換を行う、生物学的流体が意味される。この生物学的流体は、インビボの連続流体を汚染部位と接触させ得る、すなわち、それは汚染部位を灌注する。変形として、この生物学的流体はインビボで汚染部位に近接して、循環、通過、または流動する流体である。かかる生物学的流体の例としては、血液、リンパ、唾液、涙、前眼房（眼の）の眼房水、間質液、および汗が挙げられる。加えて、所与の汚染部位について、いくつかの異なる生物学的流体がそれと接触していてもよい。例えば、頬粘膜に接触した生物学的流体の摂取による、かつそれにより汚染物質が除去され得る汚染については、この粘膜を灌注する血液または唾液のいずれかでよい。
【００４６】
本発明の方法の工程（ｂ）は、前記生物学的流体を模擬する溶液を使用する。汚染部位を模擬するゲルについて上文で定義された全てのものが、必要な変更を加えて、汚染部位と接触する生物学的流体を模擬する溶液に適用される。この溶液はそれ故、ｐＨ、粘度、イオン、タンパク質、および脂質濃度の面で、模擬生物学的流体のものに匹敵または類似する物理化学的特性を示し、かつ任意で、この流体の１種以上の特徴的な成分化合物を含み得るが、しかし該溶液は、細胞がないために生物学的流体とは異なる。
【００４７】
有利には、工程（ｂ）の溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酒石酸ナトリウム（Ｎａ２Ｃ４Ｈ４Ｏ６）、乳酸ナトリウム（Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）ＣＯＯＮａ）、ピルビン酸ナトリウム（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、およびクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）により形成される群から選択される、１種以上の有機または有機塩を含む水溶液である。
【００４８】
工程（ｂ）の溶液へさらに特定的に加えることができる成分化合物の例としては、ペプシン、レシチン、グリシン、グルコース、リゾチーム、アルブミン、タウロコール酸ナトリウム、マレイン酸、トランスフェリン、フェリチン、およびフィブリンが挙げられる。
【００４９】
当業者には、様々な溶液が生体の生物学的流体を模擬するために使用可能であることが公知である。例えば、Ｍａｒｑｕｅｓら、２０１１年［非特許文献６］は、本発明において使用可能なこれらのいくつかの溶液の組成を記載している。具体的な例としては、ウシ胎児血清を１０％添加した培地（ＲＰＭＩ１６４０またはＭＥＭタイプ）、およびギャンブル液が、それぞれ血液および肺液を模擬するために使用できる。
【００５０】
ゲルおよび接触する溶液に依存して、ゲル溶液の組成と、工程（ｂ）で用いる溶液のそれとは、同じかまたは異なっていてもよい。例えば、ゲル溶液と、工程（ｂ）で用いる溶液とは、１種以上の同じかまたは異なる塩を含む。
【００５１】
本方法の工程（ｂ）における溶液とゲルとの接触は、ゲルが溶液中に配置されるか、またはゲルに溶液を塗布することを可能にする、任意の通常の技術を用いて実施され得る。例えば、ゲルがマルチウェルプレートのウェル中で調製される場合、生物学的流体を模擬する溶液は、ピペットを用いてゲルが溶液で覆われるようにゲル上に分布される。例えば、２と３ｍｌの間の体積の溶液が、ウェル、例えばゲルを含有する１２ウェルプレートの３．９ｃｍ２ウェルへ添加される。
【００５２】
加えて、工程（ｂ）において、かつ汚染部位とそれに接触する生物学的流体との間にインビボで存在する条件、および特にこの接触の動的モードを模擬するため、汚染部位を模擬するゲルおよびこの生物学的流体を模擬する溶液は、攪拌下に置かれる。それ故、工程（ｂ）について既に用いた用語「全体」は、溶液と接触して配置されたゲルに相当する。有利には、この攪拌は比較的低速度で行われる。本発明においては「比較的低速度」により、２５０ｒｐｍ以下、特に２ｒｐｍ以上、および特に５と１５０ｒｐｍの間の回転速度が意味される。より特定的には、その中で少なくとも１つのウェルが既に定義されたような溶液で覆われたゲルを含有するマルチウェルプレートが、５ｒｐｍの回転速度を有しかつインキュベータ内に配置された、撹拌機上に配置される。
【００５３】
同様に、工程（ｂ）における接触および攪拌は、生体内で遭遇するものと、特に温度および周囲雰囲気に関して類似した条件下に行われる。有利には、工程（ｂ）は、細胞培養のために通常使用されるインキュベータ、すなわち、約３７℃（すなわち３７℃±５℃および特に３７℃±３℃）の温度を有する撹拌機を備えたインキュベータにおいて実施され、コントロールされた雰囲気の組成は、５％ＣＯ２を含む湿った空気である。工程（ｂ）を無菌条件下に実施して、ゲル内に分散された放射性元素の挙動の研究が、豊富な溶液中でできるようにすること、すなわち長時間にわたる細菌または真菌の汚染に適合させることも可能である。
【００５４】
本発明の方法において研究される放射性元素に依存して、ゲルと接触している溶液中に含有される放射性元素の量を時間ｔにおいて測定するために使用可能な技術を、創造力を示すことなく決定することは、当業者の届く範囲内にあり、これは本発明の方法の工程（ｃ）に相当する。なされる選択は、特に、放射性元素により放出される放射線のタイプの関数となる。かかる測定のために使用可能な技術を説明するための例としては、特にガス検出器を用いる分光測定技術、ゲルマニウム、テルル化カドミウム、およびシリコンなどの半導体、シンチレータとしてヨウ化ナトリウム、ヨウ化セシウム、またはゲルマニウム酸ビスマスを用いる無機シンチレーション検出器、有機液体シンチレーション検出器、または有機固体シンチレーション検出器が挙げられる。
【００５５】
また、この測定工程に先立つこの溶液の可能な処理条件は、調べる放射性元素だけでなく、選択される測定技術にも依存する。当業者は、何ら創造力を用いることなく、放射性元素に対し、かつ測定技術に対し、最高に適するものを選択できる。このことはまた、特に、以下の実験のセクションにおいて示されるように、用いるべき放射性元素の全量を決定するための、ゲルの可能な処理条件にも適用される。
【００５６】
測定時間ｔが、工程（ｂ）において溶液とゲルが接触して配置される時間として定義されるｔ０に対して評価されることに注目されるべきである。
【００５７】
本発明はまた、所与の放射性元素に対しキレート特性を有する分子を同定するための、および／または分子のキレート特性を特徴づけるための、既に定義されたような方法の使用にも関する。
【００５８】
本発明において「キレート特性」という概念は、天然または合成の分子がアクチニドなどの放射性元素と結合しかつ安定な錯体を形成する能力を意味する。前記錯体の形成は、放射性元素を捕捉すること、および放射性元素の正常な反応性を阻止することにより望ましくない相互作用を防止することを可能にする。前記分子は、「キレート剤」とも、また放射性元素の体外除去、すなわち自然の経路（尿中および糞中経路）により生体の外側への放射性元素の排出を引き起こすその能力のために「体外除去剤」とも称される。
【００５９】
本発明の方法は、様々な汚染部位またはそれと接触する生物学的流体を模擬する、非常に多数の組成物を試験できることなどの、キレート分子の同定および特性評価のために特に適合したいくつかの利点および特異性を提供する。加えて、この方法が比較的少ない体積のゲルまたは接触溶液について実施できるという事実は、少量の試験分子しか必要とされないことを意味している。
【００６０】
それ故、本発明は放射性元素に対しキレート特性を有する分子を同定するための方法であって：
ｉ）既に定義されたような方法を適用して、前記放射性元素のバイオアベイラビリティを測定することであって、これにおいて生物学的流体を模擬する溶液がキレート特性を示す可能性のある分子を含むこと；
ｉｉ）工程（ｉ）と同じ条件下で既に定義されたような方法を適用して、前記放射性元素のバイオアベイラビリティを測定することであって、生物学的流体を模擬する溶液がキレート特性を示す可能性のある前記分子を含まないこと；および
ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたバイオアベイラビリティを、工程（ｉｉ）で得られたものと比較することであって、これにより、工程（ｉ）で得られたバイオアベイラビリティが工程（ｉｉ）で得られたものよりも高い場合には、工程（ｉ）で試験された分子が前記放射性元素に対するキレート特性を有することを示すものであること、
の工程を含む、該方法に関する。
【００６１】
前記方法のためには、工程（ｉ）および（ｉｉ）において、汚染部位を模擬するゲルの組成、このゲル中に最初に含まれていた放射性元素のタイプおよび量、生物学的流体を模擬する溶液の組成、溶液中に含まる放射性元素の測定技術、およびこの測定が実施される時間ｔに関して同じ条件が使用され、異なるのは、生物学的流体を模擬する溶液中の試験されるべき分子の存在または不在のみである。加えて、種々の量の試験されるべき分子の存在下で工程（ｉ）を実施することにより、用量応答作用を得ることが可能である。
【００６２】
同等の戦略を用いて：
−それぞれが同じ量の所与の放射性元素を含有するよう調製された同じ組成のゲルを用いて本発明の方法を実施することにより、種々の放射性元素に対する所与の分子のキレート特性を比較すること；
−１種の同じ放射性元素に対してキレート特性を有する少なくとも２種の分子を比較することであって、各分子について得られた放射性元素のバイオアベイラビリティの比較が、相互の関連においてそれらのキレート特性を分類可能なようにすること；
−様々な組成のゲルの使用によって得られた放射性元素のバイオアベイラビリティを比較することにより、所与の放射性元素に対する所与の分子のキレート特性を、この放射性元素によって汚染された部位の関数として比較すること；
−同じ組成のゲルと接触した様々な組成の溶液を用いた場合に得られる放射性元素のバイオアベイラビリティを比較することにより、所与の放射性元素に対する所与の分子のキレート特性を、該分子がこの放射性元素により汚染された部位へそれによって到達する生物学的流体の関数として比較すること；および
−種々の濃度のキレート分子を試験すること、
が可能である。
【００６３】
本発明の他の特徴および利点は、例証を目的として示された以下の非限定的な例を添付の図面を参照して読むことで、当業者にはさらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】２名の異なる作業者により実施された異なる実験後に得られるような、本発明の方法を実施した際に回収されたエバンスブルー（Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ）の量を例示する図である。
【図２】本発明の方法を実施することにより回収された、ＭＯＸの、硝酸塩状のＰｕの、および硝酸塩状のＡｍの、全α放射能を示す図である。
【図３】本発明の方法を実施した場合の、損傷後の種々の汚染部位を模擬するゲルから回収された、Ｐｕの全α放射能を示す図である。
【図４】キレート分子（ＤＴＰＡおよび３，４−ＬＩＨＯＰＯ）を含むかまたは含まない異なる培地と接触するゲルに対し、本発明の方法を実施した場合に回収された、Ｐｕの全α活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
Ｉ．本発明の方法の繰り返し精度および再現性
Ｉ．１．操作プロトコル
２５０ｍｇのアガロース（Ｔｙｐｅ  ＩＩＡ；中電気浸透度（Ｍｅｄｉｕｍ  ＥＥＯ））を、ビーカー内で１０ｍｌの生理食塩水（８．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．３７ｇ／Ｌ  ＫＣｌ）に添加する。この混合物を計量し、電子レンジ中で加熱する（１７０Ｗ×３０ｓ×２；１７０Ｗ×２０ｓ×１）。２分間冷却した後、ビーカーを再度計量して、体積を生理食塩水で最初の体積の値に調整する。
【００６６】
１００μｌのエバンスブルー（水中０．２％）を、穏やかに混合しながらアガロースに添加する。約５−１０分間の冷却後、エバンスブルーを含有する７００μｌのアガロース溶液を、ピペッティングを促進するために円錐形チップがカットされたＧｉｌｓｏｎ  Ｐ１０００ピペットを用いて培養プレート（１２ウェルプレート）のウェルに分配する。
【００６７】
３ｍｌの生理食塩水をゲルに添加する。プレートを、５％ＣＯ２の存在下の加湿雰囲気中で、３７℃で２時間にわたり低速攪拌下に（５ｒｐｍ）インキュベートする。インキュベート開始の２時間後に、各ウェルから培地を採取して、エバンスブルーのパーセントを６１０ｎｍにおける分光測定により測定する。ゲルをホルムアミド中に溶解して光学密度を測定する。試料中のエバンスブルーの濃度を、濃度を増していく着色剤の範囲から計算する。
【００６８】
Ｉ．２．結果
８つの実験を同じ条件下で数日間にわたり、かつ２名の作業者により実験あたり３から１２個の試料を用いて実施した（図１）。得られたデータは、変動係数約８．６％で１名の同じ作業者による繰り返し精度を、また変動係数約８．５％で２名の作業者間の再現性を示す。
【００６９】
ＩＩ．アクチニドの溶解
ＩＩ．１．操作プロトコル
アクチニドの溶液および懸濁液を、以下のように調製する：
ＭＯＸ：２５ｍｇのＭＯＸ（混合酸化物（Ｍｉｘｅｄ  Ｏｘｉｄｅ）すなわち、ウランおよびプルトニウム酸化物の混合物）を５ｍｌの無水エタノール中に入れ、激しくボルテックスする。この懸濁液５００μｌを、０．９％ＮａＣｌ中で１：４に希釈する。アリコートを採取し、全α放射能を液体シンチレーションにより測定する。
【００７０】
Ｐｕ：約４−５ｋＢｑの、２Ｎ硝酸中のプルトニウム溶液（Ｐｕ）（全放射能の％としての同位体組成：１２．４％２３９Ｐｕ、８５．６％２３８Ｐｕ、および１．８％２４１Ａｍ）のアリコートを、ホットプレート（１００℃）上に置かれたガラス液体シンチレーションバイアル内に完全に蒸発するまで配置する。次にＰｕを１００μｌの水またはＮａＣｌ／ＫＣｌ緩衝液中に採取する。全放射能を液体シンチレーションにより測定する。
【００７１】
Ａｍ：約４−５ｋＢｑの、２Ｎ硝酸中のアメリシウム溶液（Ａｍ）のアリコートを、ホットプレート（１００℃）上に置かれたガラス液体シンチレーションバイアル内に完全に蒸発するまで配置する。次にＡｍを１００μｌの水中に採取する。全放射能を液体シンチレーションにより測定する。
【００７２】
２．５％アガロース溶液は、生理食塩水（８．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．３７ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、ｐＨ５．６）中で、０．３７５ｇのアガロース（低融点、Ａ１１−ＥＥＯ、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））をビーカー内で１５ｍｌの生理食塩水に添加することにより調製する。溶液を出力２５０Ｗの電子レンジ内で３０秒間加熱し、ホモジナイズし、次いで３０秒間加熱し、再度ホモジナイズし、そして２０秒間加熱する。溶液の半透明性を確認した後、必要に応じて体積を１５ｍｌに再調整する。
【００７３】
５から１０分間にわたり室温に冷却した後、１００−１５０μｌ中の約１００ｋＢｑのＭＯＸ、４−５ｋＢｑのＰｕまたはＡｍを、１５ｍｌのアガロース溶液に添加する。混合物を慎重にホモジナイズする。７００μｌの混合物を１２ウェル培養プレートの３．９ｃｍ２ウェル内に、その末端部分のチップが切り取られている自動Ｐ１０００ピペットを用いて配置する。培養プレートを非常に弱い攪拌下に置いて、アガロース溶液をウェルの底に均一に分配する。プレートを次に、濃縮を防ぐための蓋なしで、１０−１５分間室温に置いて、ゲルの完全な固化を達成する。
【００７４】
それぞれの条件を少なくとも３回実施する（３つの同等のウェル）。
【００７５】
この工程において、プレートをビニルフィルムで密封して、後の使用のために＋４℃で貯蔵するか（１−３日）、または直ちに使用してもよい。
【００７６】
３ｍｌの生理食塩水を各ウェルに添加する。培養プレートを次に、３７℃の細胞培養インキュベータ内で、低速攪拌下（５ｒｐｍ）で、５％ＣＯ２を用いた加湿雰囲気中に配置する。
【００７７】
インキュベーション開始の２時間後、各ウェルの緩衝液を採取し、液体シンチレーションバイアルに入れる。１５ｍｌのシンチレータ（Ｕｌｔｉｍａｇｏｌｄ）を添加し、全α放射能を液体シンチレーション（パッカード（Ｐｕｃｋａｒｄ）カウンタ）により測定する。３ｍｌの緩衝液を各ウェルに添加し、プレートをインキュベータ内に戻し入れる。インキュベーション開始の２４時間および４８時間後に、同様の方法で上清を収集する。
【００７８】
４８時間において、金属製スパチュラを用いて培養プレートからゲルを非常に慎重に回収し、乾燥を防ぐため、および検出器による直接計数のため、パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）Ｍ（登録商標）タイプのフィルムでラップされたペトリ皿に入れてもよい。変形として、慎重に収集したゲルを直接液体シンチレーションバイアル内に配置する。２ｍｌの２Ｎ硝酸をバイアルに添加する。これらは、ホットプレート上に（１００℃）完全に蒸発するまで配置される。次に１ｍｌのＨ２Ｏ２（３０％）を添加する。完全に蒸発した後、１ｍｌの２Ｎ硝酸を、続いて１５ｍｌのシンチレーション液を添加する。各試料、すなわち既に収集された上清およびゲル、の放射能を測定する。
【００７９】
ＩＩ．２．結果
２時間、２４時間、および４８時間において上清中で測定された、各ウェルの放射能が、ゲルの放射能に加えられる。この値は、各ウェルの１００％、すなわちウェル内に置かれた初期放射能を形成する。結果は次に、上清中で測定された放射能／初期放射能として表され、かつ図２に示される。２４時間における放射能が、２時間における上清の放射能と２４時間における上清の放射能との和に等しいこと、および４８時間における放射能が、２時間における上清の放射能と２４時間における上清の放射能とおよび４８時間における上清の放射能との和に等しいことに注目されるべきである。
【００８０】
初期放射能に比較して、上清に含有されるＭＯＸに由来する放射能は、硝酸塩状のＰｕまたはＡｍに由来するよりも少ない。後者は、それ故、ＭＯＸよりもアガロースゲル中に保持されにくい：ＰｕおよびＡｍはそれ故、硝酸塩の形態にある場合には、ＭＯＸ中に含有される場合よりもよりバイオアベイラブルである。
【００８１】
ＩＩＩ．プルトニウム保持区画の同定
ＩＩＩ．１．操作プロトコル
Ｐｕ溶液を、上記の項目ＩＩ．１に記載したのと同じ方法で調製し、次いで模擬生理学的区画の関数として、組成を変えた緩衝液中で調製されたアガロース溶液に添加する。ＮａＣｌ／ＫＣｌ中で調製されたアガロースの溶液を、参考として用いる。
【００８２】
滑液（ＳＹＮ）を模擬するため：８．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．３７ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ヒアルロン酸の溶液を用いてアガロースゲルを調製する。
【００８３】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ−１）を模擬するため：８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４の溶液を用いてアガロースゲルを、上記の項目ＩＩ．１に記載したように調製する。室温で５から１０分間冷却した後、コラーゲン（タイプＩ、ラット尾由来）を添加して最終濃度０．５ｇ／Ｌを得る。ｐＨは、酢酸を用いて７に調整する。
【００８４】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ−２）を模擬するため：８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ヒアルロン酸、１．１ｇ／Ｌ  グルコサミンの溶液を用いてアガロースゲルを調製する。室温で５から１０分間冷却した後、コラーゲン（タイプＩ、ラット尾由来）を添加して最終濃度０．５ｇ／Ｌを得る。ｐＨは、酢酸を用いて７に調整する。
【００８５】
軟骨（ＣＨＯＮ）を模擬するため：８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｇ／Ｌ  コンドロイチンの溶液を用いてアガロースゲルを調製する。
【００８６】
ホモジナイゼーションの後、１００−１５０μｌ中の４−５ｋＢｑのＰｕを、種々のアガロース溶液の各々に添加する。実験の残りの部分は、上記の項目ＩＩ．１に記載したものと同様である。
【００８７】
ＩＩＩ．２．結果
上記の項目ＩＩのプロトコルに示したように、２時間、２４時間、および４８時間において上清中に測定された各ウェルの放射能が、ゲルの放射能に加えられる。この値は、各ウェルの１００％、すなわちウェル内に置かれた初期放射能を形成する。結果はそれ故、上清中で測定された放射能／初期放射能として表され、かつ図３に示される。
【００８８】
模擬区画から、２つのタイプの挙動：（１）Ｐｕがその中に保持される区画、すなわち滑液および細胞外マトリックスであって、ＥＣＭ−１およびＥＣＭ−２に対応する２つの曲線が並置されるもの、および（２）Ｐｕまたは参考アガロースのいずれもを保持しない区画、すなわち軟骨、があることになる。それ故Ｐｕは、軟骨におけるよりも滑液および細胞外マトリックスにおいて、バイオアベイラビリティが低いように見える。
【００８９】
ＩＶ．プルトニウムキレート分子の効率の評価
ＩＶ．１．操作プロトコル
Ｐｕ溶液およびアガロース溶液を、上記の項目ＩＩ．１に記載されたのと同じ方法で調製する。Ｐｕ含有ゲルの調製は、上記の項目ＩＩ．１に記載されたように実施する。
【００９０】
アガロースゲルのインキュベーションは、試験されるべきキレート分子の関数としての、組成の異なる緩衝液中で行われる。ＮａＣｌ／ＫＣｌ緩衝液中でのインキュベーションを、参考として用いる。ジエチレントリアミン五酢酸（Ｃａ−ＤＴＰＡ、軍の中央薬局（Ｐｈａｒｍａｃｉｅ  ｃｅｎｔｒａｌｅ  ｄｅｓ  ａｒｍｅｅｓ））の溶液をＮａＣｌ／ＫＣｌ中で希釈して、１０μＭの濃度を得る。３，４−ＬＩＨＯＰＯの溶液を、最終濃度１０μＭで調製する。実験の残りの部分は、上記の項目ＩＩ．１に記載したものと同様である。
【００９１】
ＩＶ．２．結果
上記の項目ＩＩのプロトコルにおいて示したように、２時間、２４時間、および４８時間において上清中に測定された各ウェルの放射能が、ゲルの放射能に加えられる。この値は、各ウェルの１００％、すなわちウェル内に置かれた初期放射能を形成する。結果はそれ故、上清中で測定された放射能／初期放射能として表され、かつ図４に示される。
【００９２】
Ｃａ−ＤＴＰＡおよび３，４−ＬＩＨＯＰＯの性質を考慮すれば予想されるように、アガロースゲルにおけるＰｕの保持は少なく、それ故Ｐｕは、このゲルの周囲の培地がキレート分子を含む場合には、それらを欠く培地に比較して、よりバイオアベイラブルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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