(57)【要約】本発明は、ステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体を産生するための組み換え微生物及び方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中で１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生することができる組み換え宿主細胞であって、
（ａ）ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、
（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびに／または
（ｃ）ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む、組み換え宿主細胞。
【請求項２】
（ａ）ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、または配列番号１４１、配列番号１４５、もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、かつ／あるいは
（ｃ）ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号１２１、配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３】
（ａ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ステビオールもしくはそのＣ−１９ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項１または２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４】
（ｅ）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｈ）ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉ）チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｊ）ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項３に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
（ａ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｃ）ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｅ）ＧＧＰＰを合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、もしくは配列番号１１６に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｆ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、もしくは配列番号１２０に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｇ）ｅｎｔ−カウレンを合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｈ）ｅｎｔ−カウレン酸を合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号１１７、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、もしくは配列番号７６に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｉ）チトクロムＰ４５０複合体を還元することができる前記ポリペプチドが、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、かつ／または
（ｋ）ステビオールを合成することができる前記ポリペプチドが、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、もしくは配列番号１１４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項３または４に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
前記組み換え宿主細胞が、
（ａ）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）各々が配列番号２及び／もしくは配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、ならびに
（ｃ）配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項７】
前記組み換え宿主細胞が、
（ａ）ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｄ）配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、または配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに
以下、
（ｅ）配列番号７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するポリペプチドを含むうちの１つ以上を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
前記組み換え宿主細胞が、
（ａ）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、
（ｂ）各々が配列番号２及び／もしくは配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする１つ以上の組み換え遺伝子、ならびに／または
（ｃ）配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含み、
ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする前記遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする前記１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする前記遺伝子が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、過剰発現される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項９】
ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする前記遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする前記１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする前記遺伝子が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または少なくとも２００％過剰発現される、請求項８に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって蓄積されるＵＤＰ−グルコースの量を増加させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって蓄積されるＵＤＰ−グルコースの量を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約２５０％増加させる、請求項１０に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物の量を増加させる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドの量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項１２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１４】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって産生されるＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭの量を増加させる、請求項１２または１３に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって蓄積される前記１つ以上のステビオールグリコシドのうちの１つまたは前記ステビオールグリコシド組成物を減少させる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって蓄積される前記１つ以上のステビオールグリコシドの量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％減少させる、請求項１５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって蓄積されるＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／または１３−ＳＭＧの量を減少させる、請求項１５または１６に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１８】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量を５％未満、２．５％未満、または１％未満増加または減少させる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
前記１つ以上の組み換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、前記細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２５％増加させる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
前記１つ以上のステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、及び／もしくはそれらの異性体であるか、または前記ステビオールグリコシド組成物が、それ（ら）を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２１】
前記組み換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２２】
細胞培養物中で１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生する方法であって、前記遺伝子が発現される条件下で、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を前記細胞培養物中で培養することを含み、前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物が、前記組み換え宿主細胞によって産生される、方法。
【請求項２３】
前記遺伝子が恒常的に発現される、かつ／または前記遺伝子の発現が誘導される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞によって蓄積されるＵＤＰ−グルコースの量が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも少なくとも約１０％増加する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞によって産生されるＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭの量が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも約５％増加する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞によって蓄積されるＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／または１３−ＳＭＧの量が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも約５％減少する、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、約５％未満増加または減少する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量が、前記１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも約５％増加する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組み換え宿主細胞が、発酵槽内、ある温度である期間成長され、前記温度及び期間が、前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物の産生を促進する、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞培養物中に存在するＵＤＰ−グルコースの量が、前記期間全体を通した任意の点で、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約２５０％増加する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を、前記細胞培養物から単離することを更に含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記単離ステップが、
（ａ）前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む前記細胞培養物を提供することと、
（ｂ）前記細胞培養物の液相を前記細胞培養物の固相から分離して、産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ることと、
（ｃ）１つ以上の吸着樹脂を提供することであって、前記吸着樹脂を充填カラム内に提供することを含む、提供することと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記上清を前記１つ以上の吸着樹脂と接触させて、産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部分を得、それにより産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離することと、
あるいは
（ａ）前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む前記細胞培養物を提供することと、
（ｂ）前記細胞培養物の液相を前記細胞培養物の固相から分離して、産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ることと、
（ｃ）１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供することと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記上清を前記１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させて、産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部分を得、それにより産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離することと、
あるいは
（ａ）前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む前記細胞培養物を提供することと、
（ｂ）前記細胞培養物の液相を前記細胞培養物の固相から分離して、産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ることと、
（ｃ）産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を結晶化または抽出し、それにより産生された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離することと、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を、前記細胞培養物から回収することを更に含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
回収された前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物が、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生するための方法であって、
（ａ）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号１１９、もしくは配列番号１４３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、または配列番号１４１、配列番号１４５、もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、及び／あるいは
（ｃ）配列番号１２１、配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチド、ならびに
以下、
（ｄ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、
（ｅ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド、
（ｆ）ステビオールもしくはそのＣ−１９ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、及び／または
（ｇ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドのうちの１つ以上を使用する、組み換え宿主細胞の細胞培養培地中での植物由来もしくは合成のステビオール及び／またはステビオールグリコシドのホールセル生物変換を含み、
前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、前記組み換え宿主細胞内で発現される組み換えポリペプチドであり、それにより前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を産生する、方法。
【請求項３６】
（ｄ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができる前記ポリペプチドが、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、及び／もしくはそれらの異性体であるか、または前記ステビオールグリコシド組成物が、それ（ら）を含む、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を含む細胞培養物であって、前記細胞培養物が、
（ａ）前記組み換え宿主細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む追加の栄養素を更に含み、
前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物が、少なくとも１ｍｇ／リットルの前記細胞培養物の濃度で存在し、
前記細胞培養物が、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物と比較して、前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物について濃縮され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、細胞培養物。
【請求項４０】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を含む細胞培養物であって、前記細胞培養物が、
（ａ）前記組み換え宿主細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む追加の栄養素を更に含み、
ＵＤＰ−グルコースが、前記細胞培養物中に少なくとも１００μＭの濃度で存在し、
前記細胞培養物が、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物と比較して、ＵＧＰ−グルコースについて濃縮され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、細胞培養物。
【請求項４１】
前記細胞培養物中で成長される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞に由来する細胞溶解物であって、
（ａ）前記組み換え宿主細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／もしくはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原、ＹＮＢ、及び／もしくはアミノ酸を含む追加の栄養素を含み、
前記組み換え宿主細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物が、少なくとも１ｍｇ／リットルの前記細胞培養物の濃度で存在する、細胞溶解物。
【請求項４２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドであって、
前記組み換え宿主細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドが、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物とは異なる相対量で存在し、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、１つ以上のステビオールグリコシド。
【請求項４３】
請求項２２〜３８のいずれか１項に記載の方法によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドであって、
前記組み換え宿主細胞によって産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドが、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物とは異なる相対量で存在し、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、１つ以上のステビオールグリコシド。
【請求項４４】
請求項４２または４３に記載の１つ以上のステビオールグリコシドを含む、甘味料組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の甘味料組成物を含む、食品製品。
【請求項４６】
請求項４４に記載の甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、組み換え宿主におけるステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体の組み換え産生に関する。具体的には、本開示は、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース形成に関与する遺伝子を含む組み換え宿主における、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ルブソシド、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、及びレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）を含むステビオールグリコシドの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
甘味料は、食品、飲料、または菓子産業において最も一般的に使用される成分として周知である。甘味料は、生産中に最終食品製品中に組み込まれても、適切に希釈される場合、卓上用甘味料または製菓製パンにおける家庭用の砂糖代替物として単独使用されるためであってもよい。甘味料は、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、及び蜂蜜などの天然甘味料、ならびにアスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースなどの人工甘味料を含む。ステビア抽出物は、多年生低木であるＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａから単離され、抽出され得る天然甘味料である。ステビアは一般に、ステビア抽出物の商業的生産のために南アメリカ及びアジアで育てられている。様々な程度まで精製されるステビア抽出物は、食品中で高強度甘味料として、及びブレンドまたは単独で卓上用甘味料として商業的に使用される。ステビア植物の抽出は一般に、甘味に寄与するステビオールグリコシドを含むが、各ステビオールグリコシドの量は、とりわけ異なる生産バッチ間でしばしば変動する。
【０００３】
ジテルペンステビオール及び様々なステビオールグリコシドを含むいくつかのステビオールグリコシドの化学構造を、図２に示す。ステビア植物の抽出は一般に、甘味に寄与するステビオールグリコシドを含むが、各ステビオールグリコシドの量は、とりわけ異なる生産バッチ間でしばしば変動する。
【０００４】
ステビア植物からのステビオールグリコシドの回収及び精製は、労働集約的かつ非効率的であることがわかっているため、高収率の所望されるステビオールグリコシド（ＲｅｂＭなど）を蓄積し得る組み換え産生系に対する必要性が残存している。商業的用途のための、組み換え宿主におけるステビオールグリコシドの改善された産生に対する必要性もまた残存している。その上、より高い収率のステビオールグリコシド（ＲｅｂＭを含む）の産生のための、組み換え宿主におけるＵＤＰ−グルコース形成の増加に対する必要性が残存している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明が先行技術に対する特定の利点及び進歩を提供するのは、上記の背景に対してである。
【０００６】
本明細書に開示される本発明は、特定の利点または機能性に限定されないものの、本発明は、細胞培養物中で１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生することができる組み換え宿主細胞であって、
（ａ）ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、
（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびに／または
（ｃ）ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む、組み換え宿主細胞を提供する。
【０００７】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、
（ａ）ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドは、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドは、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、または配列番号１４１、配列番号１４５、もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、かつ／あるいは
（ｃ）ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドは、配列番号１２１、配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０００８】
一態様において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、
（ａ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ステビオールもしくはそのＣ−１９ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む。
【０００９】
一態様において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、
（ｅ）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｈ）ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉ）チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｊ）ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む。
【００１０】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、
（ａ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｃ）ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｅ）ＧＧＰＰを合成することができるポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、もしくは配列番号１１６に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｆ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、もしくは配列番号１２０に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｇ）ｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｈ）ｅｎｔ−カウレン酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号１１７、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、もしくは配列番号７６に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
（ｉ）チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドは、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、かつ／または
（ｋ）ステビオールを合成することができるポリペプチドは、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、もしくは配列番号１１４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１１】
一態様において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、
（ａ）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）各々が配列番号２及び／もしくは配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、ならびに
（ｃ）配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
【００１２】
一態様において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、
（ａ）ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｄ）配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに
以下、
（ｅ）配列番号７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｄ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するポリペプチドを含むうちの１つ以上を含む。
【００１３】
一態様において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、
（ａ）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、
（ｂ）各々が配列番号２及び／もしくは配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする１つ以上の組み換え遺伝子、ならびに／または
（ｃ）配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含み、
ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）からウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、過剰発現される。
【００１４】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）からウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または少なくとも２００％過剰発現される。
【００１５】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって蓄積されるＵＤＰ−グルコースの量を増加させる。
【００１６】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって蓄積されるＵＤＰ−グルコースの量を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約２５０％増加させる。
【００１７】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物の量を増加させる。
【００１８】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドの量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。
【００１９】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって産生されるＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭの量を増加させる。
【００２０】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって蓄積される１つ以上のステビオールグリコシドのうちの１つまたはステビオールグリコシド組成物を減少させる。
【００２１】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって蓄積される１つ以上のステビオールグリコシドの量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％減少させる。
【００２２】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって蓄積されるＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／または１３−ＳＭＧの量を減少させる。
【００２３】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量を５％未満、２．５％未満、または１％未満増加または減少させる。
【００２４】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上の組み換え遺伝子の発現は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２５％増加させる。
【００２５】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、１つ以上のステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、及び／もしくはそれらの異性体であるか、またはステビオールグリコシド組成物は、それ（ら）を含む。
【００２６】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞の一態様において、組み換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である。
【００２７】
本発明はまた、細胞培養物中で１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生する方法であって、遺伝子が発現される条件下で、本明細書に開示される組み換え宿主細胞を培養することを含み、１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物は、組み換え宿主細胞によって産生される、方法も提供する。
【００２８】
本明細書に開示される方法の一態様において、遺伝子は恒常的に発現される、かつ／または遺伝子の発現は誘導される。
【００２９】
本明細書に開示される方法の一態様において、細胞によって蓄積されるＵＤＰ−グルコースの量は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも少なくとも約１０％増加する。
【００３０】
本明細書に開示される方法の一態様において、細胞によって産生されるＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭの量は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも約５％増加する。
【００３１】
本明細書に開示される方法の一態様において、細胞によって蓄積されるＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、及び／または１３−ＳＭＧの量は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも約５％減少する。
【００３２】
本明細書に開示される方法の一態様において、細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、約５％未満増加または減少する。
【００３３】
本明細書に開示される方法の一態様において、細胞によって産生される合計ステビオールグリコシドの量は、１つ以上の組み換え遺伝子を欠く対応する宿主細胞と比較して、少なくとも約５％増加する。
【００３４】
本明細書に開示される方法の一態様において、組み換え宿主細胞は、発酵槽内、ある温度である期間成長され、この温度及び期間は、１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物の産生を促進するものである。
【００３５】
本明細書に開示される方法の一態様において、細胞培養物中に存在するＵＤＰ−グルコースの量は、期間全体を通した任意の点で、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約２５０％増加する。
【００３６】
一態様において、本明細書に開示される方法は、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を、細胞培養物から単離することを更に含む。
【００３７】
本明細書に開示される方法の一態様において、単離ステップは、
（ａ）１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む細胞培養物を提供することと、
（ｂ）細胞培養物の液相を細胞培養物の固相から分離して、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ることと、
（ｃ）１つ以上の吸着樹脂を提供することであって、吸着樹脂を充填カラム内に提供することを含む、提供することと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の上清を１つ以上の吸着樹脂と接触させて、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部分を得、それにより産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離することと、
あるいは
（ａ）１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む細胞培養物を提供することと、
（ｂ）細胞培養物の液相を細胞培養物の固相から分離して、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ることと、
（ｃ）１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供することと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の上清を１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させて、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物の少なくとも一部分を得、それにより産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離することと、
あるいは
（ａ）１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む細胞培養物を提供することと、
（ｂ）細胞培養物の液相を細胞培養物の固相から分離して、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を含む上清を得ることと、
（ｃ）産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を結晶化または抽出し、それにより産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離することと、を含む。
【００３８】
一態様において、本明細書に開示される方法は、１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を、細胞培養物から回収することを更に含む。
【００３９】
本明細書に開示される方法の一態様において、回収された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物は、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する。
【００４０】
本発明はまた、１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生するための方法であって、
（ａ）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号１１９、もしくは配列番号１４３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１、配列番号１４５、もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、及び／あるいは
（ｃ）配列番号１２１、配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチド、ならびに
以下、
（ｄ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、
（ｅ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド、
（ｆ）ステビオールもしくはそのＣ−１９ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、及び／または
（ｇ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドのうちの１つ以上を使用する、組み換え宿主細胞の細胞培養培地中での植物由来もしくは合成のステビオール及び／またはステビオールグリコシドのホールセル生物変換を含み、
ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、組み換え宿主細胞内で発現される組み換えポリペプチドであり、それにより１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生する、方法も提供する。
【００４１】
本明細書に開示される方法の一態様において、
（ｄ）ステビオールまたはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号４に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号１１に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に明記されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、または配列番号１６に明記されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４２】
本明細書に開示される方法の一態様において、組み換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である。
【００４３】
本明細書に開示される方法の一態様において、１つ以上のステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、及び／もしくはそれらの異性体であるか、またはステビオールグリコシド組成物は、それ（ら）を含む。
【００４４】
本発明はまた、本明細書に開示される組み換え宿主細胞を含む細胞培養物であって、細胞培養物は、
（ａ）組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む追加の栄養素を更に含み、
１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物は、少なくとも１ｍｇ／リットルの細胞培養物の濃度で存在し、
細胞培養物は、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物と比較して、１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物について濃縮され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、細胞培養物も提供する。
【００４５】
本発明はまた、本明細書に開示される組み換え宿主細胞を含む細胞培養物であって、細胞培養物は、
（ａ）組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む追加の栄養素を更に含み、
ＵＤＰ−グルコースは、細胞培養物中に少なくとも１００μＭの濃度で存在し、
細胞培養物は、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物と比較して、ＵＧＰ−グルコースについて濃縮され、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、細胞培養物も提供する。
【００４６】
本発明はまた、細胞培養物中で成長される、本明細書に開示される組み換え宿主細胞に由来する細胞溶解物であって、
（ａ）組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／もしくはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原、ＹＮＢ、及び／もしくはアミノ酸を含む追加の栄養素を含み、
組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物は、少なくとも１ｍｇ／リットルの細胞培養物の濃度で存在する、細胞溶解物も提供する。
【００４７】
本発明はまた、本明細書に開示される組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドであって、
組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドは、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物とは異なる相対量で存在し、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、１つ以上のステビオールグリコシドも提供する。
【００４８】
本発明はまた、本明細書に開示される方法によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドであって、
組み換え宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドは、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物とは異なる相対量で存在し、植物由来のステビア抽出物と比較して、低減したレベルのステビア植物由来の構成成分を有する、１つ以上のステビオールグリコシドも提供する。
【００４９】
本発明はまた、本明細書に開示される１つ以上のステビオールグリコシドを含む、甘味料組成物も提供する。
【００５０】
本発明はまた、本明細書に開示される甘味料組成物を含む、食品製品も提供する。
【００５１】
本発明はまた、本明細書に開示される甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物も提供する。
【００５２】
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲とまとめて、以下の発明を実施するための形態からより完全に理解されるだろう。特許請求の範囲は、本説明に明記される特徴及び利点の具体的な考察によってではなく、特許請求の範囲中の詳述によって定義されることに留意されたい。
【００５３】
以下の本発明の実施形態についての発明を実施するための形態は、以下の図面と組み合わせて閲読されるときに最良に理解することができ、図面中、同様の構造は、同様の参照数字で示されている。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及びｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドを使用して、ゲラニルゲラニル二リン酸からステビオールを産生するための生化学的経路を示す。
【図２】ステビア抽出物中に見出される化合物のうちのいくつかの好適なＵＧＴ酵素及び化学構造によって触媒される、代表的な一次ステビオールグリコシドのグリコシル化反応を示す。
【図３】ウラシルパーミアーゼ（ＦＵＲ４）、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＦＵＲ１）、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＵＲＡ５）、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ２（ＵＲＡ１０）、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）、ウリジレートキナーゼ（ＵＲＡ６）、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＹＮＫ１）、ホスホグルコムターゼ−１（ＰＧＭ１）、ホスホグルコムターゼ−２（ＰＧＭ２）、及びＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＵＧＰ１）を含む、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する酵素によって触媒される、代表的な反応を示す。例えば、Ｄａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３（２）：５２０−３０を参照されたい。    当業者であれば、図面中の要素は単純性及び明瞭性のために示されており、必ずしも原寸大に描画されていないことを理解するだろう。例えば、図面中の要素のうちのいくつかの寸法は、本発明の実施形態（複数可）についての理解の改善を助けるために、他の要素と比較して、誇張されている可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、これによりあらゆる目的のために参照により明確に組み込まれる。
【００５６】
本発明を詳細に説明する前に、いくつかの用語を定義する。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ（１つの）」、「（１つの）」、及び「その」は、別段文脈が明確に指示しない限り、複数形の参照対象を含む。例えば、「核酸」に対する言及は、１つ以上の核酸を意味する。
【００５７】
「好ましくは」、「一般的に」、及び「典型的に」などの用語は、本明細書では、主張される本発明の範囲を制限するためにも、または特定の特徴が、主張される本発明の構造もしくは機能にとって決定的、必須、もしくは重要であることさえを暗示するためにも利用されないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は単に、本発明の特定の一実施形態において利用されても、利用されなくてもよい代替的または追加的特徴を強調することが意図される。
【００５８】
本発明を説明し、定義するために、「実質的に」という用語は、本明細書では、任意の定量的比較、値、測定、または他の表現に起因し得る、固有の不確実度を表すために利用されることに留意されたい。「実質的に」という用語はまた、本明細書では、問題となる主題の基本的機能に変化をもたらすことなく、定量的表現が述べられる参照基準から変動し得る程度を表すためにも利用される。
【００５９】
当業者にとって周知である方法を使用して、本発明に従って遺伝的表現構築物及び組み換え細胞を構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組み換え技術、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が挙げられる。例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載される技術を参照されたい。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、当業者によって理解される文脈によって、一本鎖または二本鎖の実施形態のいずれにおいても、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む核酸を指すために互換的に使用され得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「組み換え宿主」、及び「組み換え宿主細胞」は、互換的に使用され得る。本明細書で使用される場合、「組み換え宿主」という用語は、そのゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列によって増強されている宿主を指すことが意図される。そのようなＤＮＡ配列としては、天然に存在しない遺伝子、通常ＲＮＡに転写されたりタンパク質に翻訳（発現）されたりしないＤＮＡ配列、及び宿主への導入が望まれる他の遺伝子またはＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、本明細書に記載される組み換え宿主のゲノムは、１つ以上の組み換え遺伝子の安定した導入を通して増強されることが理解されるだろう。一般に、導入されたＤＮＡは、そのＤＮＡのレシピエントである宿主において元々常在しないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離すること、及びそのＤＮＡの１つ以上の追加の複製物を同じ宿主にその後導入すること（例えば、遺伝子の産生物の産生を増強すること、またはある遺伝子の発現パターンを改変すること）は、本開示の範囲内である。場合によっては、導入されたＤＮＡは、例えば、相同組み換えまたは部位特異的変異誘発によって、内在性遺伝子またはＤＮＡ配列を修飾または置換さえするだろう。好適な組み換え宿主は、微生物を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「組み換え遺伝子」という用語は、そのような宿主において同じまたは類似の遺伝子またはＤＮＡ配列が既に存在し得るかどうかに関わらず、レシピエント宿主に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。この文脈において、「導入される」または「増強される」は、人間の手によって導入または増強されることを意味することが当該技術分野において既知である。故に、組み換え遺伝子は、別の種に由来するＤＮＡ配列であっても、同じ種に起源を持つか、または同じ種に存在するＤＮＡ配列であってもよいが、組み換え方法によって宿主に組み込まれて、組み換え宿主を形成している。宿主に導入される組み換え遺伝子は、形質転換される宿主において通常存在するＤＮＡ配列と同一であってもよく、ＤＮＡの１つ以上の追加の複製物を提供して、それによりそのＤＮＡの遺伝子産生物の過剰発現または修飾された発現を可能にするために導入されることが理解されるだろう。いくつかの態様において、該組み換え遺伝子は、ｃＤＮＡによってコードされる。他の実施形態において、組み換え遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発現のために合成及び／またはコドン最適化されている。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「操作された生合成経路」という用語は、本明細書に記載されるように、組み換え宿主において生じる生合成経路を指す。いくつかの態様において、生合成経路の１つ以上のステップは、未修飾の宿主において天然には存在しない。いくつかの実施形態において、ある遺伝子の異種バージョンが、その遺伝子の内在性バージョンを含む宿主に導入される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「内在性」遺伝子という用語は、特定の生物、組織、または細胞に起源を持ち、その内部で産生または合成される遺伝子を指す。いくつかの実施形態において、内在性遺伝子は、酵母遺伝子である。いくつかの実施形態において、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２８８Ｃを含むが、これに限定されない、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに内在性である。いくつかの実施形態において、内在性酵母遺伝子は、過剰発現される。本明細書で使用される場合、「過剰発現」という用語は、野生型生物における遺伝子発現のレベルよりも高いレベルでの、生物における遺伝子の発現を指すために使用される。例えば、Ｐｒｅｌｉｃｈ，２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１９０：８４１−５４を参照されたい。例えば、Ｇｉａｅｖｅｒ＆Ｎｉｓｌｏｗ，２０１４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１９７（２）：４５１−６５を参照されたい。いくつかの態様において、過剰発現は、ＵＳＥＲクローニングシステム使用する組み込みによって実行され得る（例えば、Ｎｏｕｒ−Ｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ６４３：１８５−２００を参照されたい）。本明細書で使用される場合、「欠失」、「欠失された」、「ノックアウト」、及び「ノックアウトされた」という用語は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むが、これに限定されない、ある生物において、もはや発現されないように操作されている内在性遺伝子を指すために互換的に使用され得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「異種配列」及び「異種コード配列」という用語は、組み換え宿主以外の種に由来する配列を説明するために使用される。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり、異種配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の生物に由来する。異種コード配列は、例えば、異種配列を発現する組み換え宿主とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌に由来し得る。いくつかの実施形態において、コード配列は、宿主に天然である配列である。
【００６６】
「選択可能なマーカー」は、宿主細胞の栄養要求性を補完するか、抗菌耐性を提供するか、または色変化をもたらす、任意の数の遺伝子のうちの１つであり得る。その後、遺伝子置換ベクターの直鎖化されたＤＮＡ断片が、当該技術分野において周知である方法（以下を参照されたい）を使用して細胞に導入される。直鎖状断片のゲノムへの組み込み及び遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定することができ、例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット分析によって検証することができる。選択におけるその使用後、選択可能なマーカーは、例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムによって、宿主細胞のゲノムから除去され得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３６：１５３−１７３及び米国第２００６／００１４２６４号を参照されたい）。あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊される遺伝子の一部分を含むような方法で構築されてもよく、その部分は、いかなる内在性遺伝子プロモーター配列も欠き、その遺伝子のコード配列を全くコードしないか、またはその不活性断片をコードする。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「バリアント」及び「変異体」という用語は、特定のタンパク質の野生型配列と比較して、１つ以上のアミノ酸で修飾されているタンパク質配列を説明するために使用される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「不活性断片」という用語は、例えば、その遺伝子の完全長のコード配列から産生されるタンパク質の約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％、または０％）の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。遺伝子のそのような部分は、いかなる既知のプロモーター配列も遺伝子配列に動作可能に連結されないが、終止コドン及び転写終結配列は遺伝子配列のその部分に動作可能に連結されるような方法で、ベクターに挿入される。このベクターはその後、遺伝子配列のその部分において直鎖化され、細胞へと形質転換され得る。その後、単一相同組み換えによって、この直鎖化されたベクターは、その不活性化を有する遺伝子の内在性対応物に組み込まれる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド」という用語は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）（ＣＡＳ番号５８５４３−１６−１）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）（ＣＡＳ番号５８５４３−１７−２）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）（ＣＡＳ番号６３５５０−９９−２）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）（ＣＡＳ番号６３２７９−１３−０）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）（ＣＡＳ番号６３２７９−１４−１）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）（ＣＡＳ番号４３８０４５−８９−７）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）（ＣＡＳ番号１２２０６１６−４４−３）、ルブソシド（ＣＡＳ番号６３８４９−３９−４）、ズルコシドＡ（ＣＡＳ番号６４４３２−０６−０）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）（ＭａｓｓＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ：ＦＵ０００３３２）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、１，２−ステビオシド（ＣＡＳ番号５７８１７−８９−７）、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド（ＭａｓｓＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ：ＦＵ０００２９９）、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、トリ−グリコシル化ステビオールグリコシド、テトラ−グリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタ−グリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサ−グリコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタ−グリコシル化ステビオールグリコシド、及びそれらの異性体を指す。図２を参照されたい。また、Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｗａｌｌｉｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．Ｏｒｇ作製のＳｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ６９ｔｈ  ＪＥＣＦＡ，２００７も参照されたい。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド前駆体」及び「ステビオールグリコシド前駆体化合物」という用語は、ステビオールグリコシド生合成経路における中間体化合物を指すために使用される。ステビオールグリコシド前駆体としては、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリル−二リン酸、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、ｅｎｔ−カウレン酸、及びステビオールが挙げられるが、これらに限定されない。図１を参照されたい。いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド前駆体自体が、ステビオールグリコシド化合物である。例えば、１９−ＳＭＧ、ルブソシド、１，２−ステビオシド、及びＲｅｂＥは、ＲｅｂＭのステビオールグリコシド前駆体である。図２を参照されたい。
【００７１】
また、本明細書で使用される場合、「ステビオール前駆体」及び「ステビオール前駆体化合物」という用語は、ステビオールグリコシド生合成経路における中間体化合物を指すために使用される。ステビオール前駆体はまた、ステビオールグリコシド前駆体であってもよく、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリル−二リン酸、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、及びｅｎｔ−カウレン酸を含むが、これらに限定されない。ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、インビボで（すなわち、組み換え宿主において）、インビトロで（すなわち、酵素的に）、またはホールセル生物変換によって産生され得る。本明細書で使用される場合、「産生する」及び「蓄積する」という用語は、インビボでの、インビトロでの、またはホールセル生物変換による、ステビオールグリコシド及びステビオールグリコシド前駆体の合成を説明するために互換的に使用され得る。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「培養ブロス」、「培養培地」、及び「成長培地」という用語は、細胞の成長を支持する液体または固体を指すために互換的に使用され得る。培養ブロスは、グルコース、フルクトース、スクロース、微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含み得る。微量金属は、Ｍｎ２＋及び／またはＭｇ２＋を含むが、これらに限定されない、二価カチオンであり得る。いくつかの実施形態において、Ｍｎ２＋は、ＭｎＣｌ２二水和物の形態であり、およそ０．０１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、Ｍｇ２＋は、ＭｇＳＯ４七水和物の形態であり、およそ０．０１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。例えば、培養ブロスは、ｉ）およそ０．０２〜０．０３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２二水和物及びおよそ０．５〜３．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物、ｉｉ）およそ０．０３〜０．０６ｇ／ＬのＭｎＣｌ２二水和物及びおよそ０．５〜３．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物、ならびに／またはｉｉｉ）およそ０．０３〜０．１７ｇ／ＬのＭｎＣｌ２二水和物及びおよそ０．５〜７．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物を含み得る。加えて、培養ブロスは、本明細書に記載されるように、組み換え宿主によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドを含み得る。
【００７３】
組み換えステビオールグリコシド産生Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８に記載され、これらの各々の全体が、参照により組み込まれる。ホールセル生物変換によって、及びインビトロで、組み換え宿主においてステビオールグリコシドを産生する方法はまた、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８にも記載される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチド（例えば、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ））をコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ））をコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチド（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））をコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチド（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））をコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチド（例えば、テルペノイド生合成の補助因子として利用される、チトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）もしくはＰ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）をコードする遺伝子、例えば、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ＋への変換中にＮＡＤＰＨからチトクロムＰ４５０複合体へと電子移動することができるポリペプチドなどであるが、これらに限定されない）、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチド（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））をコードする遺伝子、ならびに／またはＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子を含む組み換え宿主が、インビボでステビオールを産生することができる。例えば、図１を参照されたい。当業者であれば、これらの遺伝子のうちの１つ以上は宿主に内在性であってもよいが、但し、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つ（及びいくつかの実施形態において全て）は組み換え宿主に導入された組み換え遺伝子であることを条件とすることを理解するだろう。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２及びＥＵＧＴ１１ポリペプチド）をコードする遺伝子を含む組み換え宿主が、インビボでステビオールグリコシドを産生することができる。当業者であれば、これらの遺伝子のうちの１つ以上は宿主に内在性であってもよいが、但し、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つ（及びいくつかの実施形態において全て）は組み換え宿主に導入された組み換え遺伝子であることを条件とすることを理解するだろう。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、組み換え宿主におけるステビオールグリコシド生合成経路に関与する１つ以上の酵素の発現を通してインビボで産生される。例えば、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２及びＥＵＧＴ１１ポリペプチド）をコードする遺伝子を含む組み換え宿主が、インビボでステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体を産生することができる。例えば、図１及び２を参照されたい。当業者であれば、これらの遺伝子のうちの１つ以上は宿主に内在性であってもよいが、但し、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つ（及びいくつかの実施形態において全て）は組み換え宿主に導入された組み換え遺伝子であることを条件とすることを理解するだろう。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ステビオール産生組み換え微生物は、ステビオールまたはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド、ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、ならびにステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする異種核酸を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ステビオール産生組み換え微生物は、ステビオールまたはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド、ならびにステビオールグリコシドポリペプチドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする異種核酸を含む。
【００７９】
いくつかの態様において、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドは、グルコース分子をウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からステビオール及び／またはステビオールグリコシドへと移動させる。
【００８０】
いくつかの態様において、ＵＤＰ−グルコースは、組み換え宿主におけるＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上の酵素の発現を通してインビボで産生される。例えば、ウラシルを宿主細胞に輸送することができるポリペプチド（例えば、ウラシルパーミアーゼ（ＦＵＲ４））をコードする遺伝子、ウラシルからウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を合成することができるポリペプチド（例えば、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＦＵＲ１））をコードする遺伝子、オロテートもしくはオロト酸からオロチジン一リン酸（ＯＭＰ）を合成することができるポリペプチド（例えば、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＵＲＡ５）及びオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ２（ＵＲＡ１０））をコードする遺伝子、ＯＭＰからＵＭＰを合成することができるポリペプチド（例えば、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３））をコードする遺伝子、ＵＭＰからウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を合成することができるポリペプチド（例えば、ウリジレートキナーゼ（ＵＲＡ６））をコードする遺伝子、ＵＤＰからウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）を合成することができるポリペプチド（すなわち、ヌクレオシド三リン酸からのガンマリン酸の移動を触媒することができるポリペプチド、例えば、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＹＮＫ１））をコードする遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド（例えば、ホスホグルコムターゼ−１（ＰＧＭ１）及びホスホグルコムターゼ−２（ＰＧＭ２））をコードする遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチド（例えば、ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＵＧＰ１）をコードする遺伝子を含む組み換え宿主が、インビボでＵＤＰ−グルコースを産生することができる。例えば、図３を参照されたい。当業者であれば、これらの遺伝子のうちの１つ以上は宿主に内在性であってもよいことを理解するだろう。
【００８１】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え遺伝子である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、宿主に天然であるヌクレオチド配列を含む。他の態様において、組み換え遺伝子は、異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、プロモーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、例えば、ｔＣＹＣ１（配列番号１５４）またはｔＡＤＨ１（配列番号１５５）であるが、これらに限定されない、ターミネーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、プロモーター及びターミネーターは、組み換え遺伝子の高い発現を推進する。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、例えば、ｐＴＥＦ１（配列番号１４８）、ｐＰＧＫ１（配列番号１４９）、ｐＴＤＨ３（配列番号１５０）、ｐＴＥＦ２（配列番号１５１）、ｐＴＰＩ１（配列番号１５２）、またはｐＰＤＣ１（配列番号１５３）であるが、これらに限定されない、強力なプロモーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、組み換え宿主と同じ種に起源を持つか、または同じ種に存在するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも高い、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルをもたらす（すなわち、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドの過剰発現）。
【００８２】
いくつかの態様において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え宿主と同じ種に存在する遺伝子、すなわち、内在性遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の野生型プロモーターは、強力なプロモーターに交換され得る。いくつかの態様において、強力なプロモーターは、内在性遺伝子の高い発現（すなわち、この遺伝子の過剰発現）を推進する。他の実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の野生型エンハンサーは、強力なエンハンサーに交換され得る。いくつかの実施形態において、強力なエンハンサーは、内在性遺伝子の高い発現（すなわち、この遺伝子の過剰発現）を推進する。いくつかの実施形態において、内在性遺伝子の野生型エンハンサー（すなわち、プロモーターに動作可能に連結される）及び野生型プロモーター（すなわち、内在性遺伝子に動作可能に連結される）の両方がそれぞれ、強力なエンハンサー及び強力なプロモーターに交換され、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドの過剰発現をもたらしてもよい（すなわち、野生型エンハンサー及び／またはプロモーターに動作可能に連結される内在性遺伝子の発現レベルと比較して）。強力なエンハンサー及び／またはプロモーターに動作可能に連結される内在性遺伝子は、天然の座位に位置しても、かつ／またはゲノム内の他の場所に位置してもよい。
【００８３】
例えば、いくつかの実施形態において、野生型プロモーターに動作可能に連結される、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む組み換え宿主は、例えば、野生型プロモーター、宿主に天然であるプロモーター、または異種プロモーターに動作可能に連結される、宿主に天然であるヌクレオチド配列を含む、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含む。別の例において、いくつかの実施形態において、野生型プロモーターに動作可能に連結される、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む組み換え宿主は、例えば、野生型プロモーター、宿主に天然であるプロモーター、または異種プロモーターに動作可能に連結される、異種ヌクレオチド配列を含む、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含む。更に別の例において、いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、例えば、宿主に天然である強力なプロモーターまたは異種プロモーターに動作可能に連結される、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む。
【００８４】
当業者であれば、例えば、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子及び内在性遺伝子の発現、ならびにＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現（内在性遺伝子の野生型プロモーター及び／またはエンハンサーは、強力なプロモーター及び／またはエンハンサーに交換される）が各々、野生型プロモーター及びエンハンサーに動作可能に連結される、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を発現しない対応する宿主及び／またはＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする天然遺伝子のみを発現する対応する宿主と比較して、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドの過剰発現をもたらすこと、すなわち、本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、「過剰発現」を含み得ることを理解するだろう。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドは、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルが、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも少なくとも５％高いように過剰発現される。いくつかの実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルは、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または少なくとも２００％高い。
【００８６】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え遺伝子である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、宿主に天然であるヌクレオチド配列を含む。他の態様において、組み換え遺伝子は、異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、プロモーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、例えば、ｔＣＹＣ１（配列番号１５４）またはｔＡＤＨ１（配列番号１５５）であるが、これらに限定されない、ターミネーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、プロモーター及びターミネーターは、組み換え遺伝子の高い発現を推進する。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、例えば、ｐＴＥＦ１（配列番号１４８）、ｐＰＧＫ１（配列番号１４９）、ｐＴＤＨ３（配列番号１５０）、ｐＴＥＦ２（配列番号１５１）、ｐＴＰＩ１（配列番号１５２）、またはｐＰＤＣ１（配列番号１５３）であるが、これらに限定されない、強力なプロモーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、組み換え宿主と同じ種に起源を持つか、または同じ種に存在するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも高い、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベル、すなわち、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドの過剰発現をもたらす。
【００８７】
いくつかの態様において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え宿主と同じ種に存在する遺伝子、すなわち、内在性遺伝子である。いくつかの実施形態において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の野生型プロモーターは、強力なプロモーターに交換され得る。いくつかの態様において、強力なプロモーターは、内在性遺伝子の高い発現（すなわち、この遺伝子の過剰発現）を推進する。他の実施形態において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の野生型エンハンサーは、強力なエンハンサーに交換され得る。いくつかの実施形態において、強力なエンハンサーは、内在性遺伝子の高い発現（すなわち、この遺伝子の過剰発現）を推進する。いくつかの実施形態において、内在性遺伝子の野生型エンハンサー（すなわち、プロモーターに動作可能に連結される）及び野生型プロモーター（すなわち、内在性遺伝子に動作可能に連結される）の両方はそれぞれ、強力なエンハンサー及び強力なプロモーターに交換され、（すなわち、野生型エンハンサー及び／またはプロモーターに動作可能に連結される内在性遺伝子の発現レベルと比較して、）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドの過剰発現をもたらし得る。強力なエンハンサー及び／またはプロモーターに動作可能に連結される内在性遺伝子は、天然の座位に位置しても、かつ／またはゲノム内の他の場所に位置してもよい。
【００８８】
例えば、いくつかの実施形態において、野生型プロモーターに動作可能に連結される、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む組み換え宿主は、例えば、野生型プロモーター、宿主に天然であるプロモーター、または異種プロモーターに動作可能に連結される、宿主に天然であるヌクレオチド配列を含む、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含む。別の例において、いくつかの実施形態において、野生型プロモーターに動作可能に連結される、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む組み換え宿主は、例えば、野生型プロモーター、宿主に天然であるプロモーター、または異種プロモーターに動作可能に連結される、異種ヌクレオチド配列を含む、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含む。更に別の例において、いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、例えば、宿主に天然である強力なプロモーターまたは異種プロモーターに動作可能に連結される、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドは、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルが、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも少なくとも５％高いように過剰発現される。いくつかの実施形態において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルは、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または少なくとも２００％高い。
【００９０】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え遺伝子である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、宿主に天然であるヌクレオチド配列を含む。他の態様において、組み換え遺伝子は、異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、プロモーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、例えば、ｔＣＹＣ１（配列番号１５４）またはｔＡＤＨ１（配列番号１５５）であるが、これらに限定されない、ターミネーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、プロモーター及びターミネーターは、組み換え遺伝子の高い発現を推進する。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、例えば、ｐＴＥＦ１（配列番号１４８）、ｐＰＧＫ１（配列番号１４９）、ｐＴＤＨ３（配列番号１５０）、ｐＴＥＦ２（配列番号１５１）、ｐＴＰＩ１（配列番号１５２）、またはｐＰＤＣ１（配列番号１５３）であるが、これらに限定されない、強力なプロモーターに動作可能に連結される。いくつかの態様において、組み換え遺伝子は、組み換え宿主と同じ種に起源を持つか、または同じ種に存在するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも高い、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベル、すなわち、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドの過剰発現をもたらす。
【００９１】
いくつかの態様において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え宿主と同じ種に存在する遺伝子、すなわち、内在性遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の野生型プロモーターは、強力なプロモーターに交換され得る。いくつかの態様において、強力なプロモーターは、内在性遺伝子の高い発現（すなわち、この遺伝子の過剰発現）を推進する。他の実施形態において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の野生型エンハンサーは、強力なエンハンサーに交換され得る。いくつかの実施形態において、強力なエンハンサーは、内在性遺伝子の高い発現（すなわち、この遺伝子の過剰発現）を推進する。いくつかの実施形態において、内在性遺伝子の野生型エンハンサー（すなわち、プロモーターに動作可能に連結される）及び野生型プロモーター（すなわち、内在性遺伝子に動作可能に連結される）の両方はそれぞれ、強力なエンハンサー及び強力なプロモーターに交換され、（すなわち、野生型エンハンサー及び／またはプロモーターに動作可能に連結される内在性遺伝子の発現レベルと比較して、）ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドの過剰発現をもたらし得る。強力なエンハンサー及び／またはプロモーターに動作可能に連結される内在性遺伝子は、天然の座位に位置しても、かつ／またはゲノム内の他の場所に位置してもよい。
【００９２】
例えば、いくつかの実施形態において、野生型プロモーターに動作可能に連結される、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む組み換え宿主は、例えば、野生型プロモーター、宿主に天然であるプロモーター、または異種プロモーターに動作可能に連結される、宿主に天然であるヌクレオチド配列を含む、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含む。別の例において、いくつかの実施形態において、野生型プロモーターに動作可能に連結される、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む組み換え宿主は、例えば、野生型プロモーター、宿主に天然であるプロモーター、または異種プロモーターに動作可能に連結される、異種ヌクレオチド配列を含む、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含む。更に別の例において、いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、例えば、宿主に天然である強力なプロモーターまたは異種プロモーターに動作可能に連結される、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドを含む組み換え宿主は、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルが、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも少なくとも５％高いように過剰発現される。いくつかの実施形態において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子の合計発現レベルは、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルよりも少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または少なくとも２００％高い。
【００９４】
いくつかの態様において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を含む組み換え宿主は、ウラシルを宿主細胞に輸送することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ウラシルからウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、オロテートもしくはオロト酸からオロチジン一リン酸（ＯＭＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ＯＭＰからＵＭＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、及び／またはＵＭＰからウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に含み得る。いくつかの実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を含む組み換え宿主は、ウラシルを宿主細胞に輸送することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ウラシルからウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、オロテートもしくはオロト酸からオロチジン一リン酸（ＯＭＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ＯＭＰからＵＭＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、及び／またはＵＭＰからウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現し得る。
【００９５】
いくつかの態様において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドは、（配列番号１２２に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９６】
いくつかの態様において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドは、（配列番号１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号２、（配列番号１１８に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１１９、（配列番号１４０に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１４１、（配列番号１４２に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１４３、（配列番号１４４に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１４５、または（配列番号１４６に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９７】
いくつかの態様において、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドは、（配列番号１２０に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号１２１、（配列番号１２４に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１２５、（配列番号１２６に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１２７、（配列番号１２８に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１２９、（配列番号１３０に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１３１、（配列番号１３２に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１３３、（配列番号１３４に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１３５、（配列番号１３６に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１３７、または（配列番号１３８に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、及びグルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする２つ以上の組み換え遺伝子、例えば、第１のアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸を変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子、及び第１のアミノ酸配列とは異なる第２のアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸を変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む。例えば、いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＰＧＭ１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、及びＰＧＭ２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、または配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を含む。特定のそのような実施形態において、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子は、組み換え宿主細胞（例えば、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む、組み換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞）に天然であるヌクレオチド配列を含む。他のそのような実施形態において、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子のうちの１つは、組み換え宿主細胞に天然であるヌクレオチド配列を含む一方で、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子のうちの１つ以上は、異種ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、配列番号１２１に明記にされるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を発現する組み換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞（すなわち、ポリペプチドを過剰発現する組み換え宿主）は、例えば、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、または配列番号１３９に明記にされるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に発現する。別の例において、いくつかの実施形態において、配列番号１１９に明記にされるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を発現する組み換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞（すなわち、ポリペプチドを過剰発現する組み換え宿主）は、例えば、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、または配列番号１４７に明記にされるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を更に発現する。したがって、本明細書で使用される場合、「組み換え遺伝子」という用語は、「１つ以上の組み換え遺伝子」を含み得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路またはステビオールグリコシド生合成経路に関与するポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の２つ以上の複製物を含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、好ましくは、例えば、ＵＤＰ−グルコース生合成経路またはステビオールグリコシド生合成経路に関与するポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の２つの複製物、３つの複製物、４つの複製物、または５つの複製物で形質転換される。例えば、いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子の２つの複製物で形質転換される。当業者であれば、いくつかの実施形態において、細胞複製とは独立して宿主細胞内で組み換え遺伝子が複製され得ること、したがって、組み換え宿主細胞は、例えば、細胞が形質転換された複製物の数よりも多くの組み換え遺伝子の複製物を含み得ることを理解するだろう。したがって、本明細書で使用される場合、「組み換え遺伝子」という用語は、「組み換え遺伝子の１つ以上の複製物」を含み得る。
【０１０１】
いくつかの態様において、組み換え宿主細胞内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドの発現は、細胞によって産生されるＵＤＰ−グルコースの量を増加させる。いくつかの態様において、組み換え宿主細胞内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドの発現は、例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドのグリコシル化に利用可能なＵＤＰ−グルコースのプールを維持するか、または増加すらさせる。いくつかの態様において、組み換え宿主細胞内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドの発現は、ＵＤＰ−グルコースが再生される速度を増加させ、故に、１つ以上のステビオールグリコシドの合成に使用され得るＵＤＰ−グルコースプールを維持するか、または増加すらさせる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主細胞内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、または配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、または配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子の発現は、組み換え遺伝子を欠く対応する宿主と比較して、細胞内ＵＤＰ−グルコース濃度の増加として計算される、細胞によって産生されるＵＤＰ−グルコースの量を少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１２５％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約１７５％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約２２５％、または少なくとも約２５０％、または少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％増加させる。
【０１０３】
特定のそのような実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子のうちの１つ以上は、宿主細胞に天然であるヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞内での、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号２及び／または配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびに配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現（すなわち、ポリペプチドを過剰発現する組み換え宿主を提供すること）は、組み換え遺伝子を欠く対応する宿主と比較して、細胞内ＵＤＰ−グルコース濃度の増加として計算される、細胞によって産生されるＵＤＰ−グルコースの量を少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１２５％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約１７５％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約２２５％、または少なくとも約２５０％、または少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％増加させる。
【０１０４】
いくつかの態様において、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に発現する、ステビオール−グリコシド産生組み換え宿主細胞内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドの発現は、細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドの量を増加させる、かつ／または細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシドの量を減少させる。いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生宿主は、ＦＰＰ及びＩＰＰからＧＧＰＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を更に発現する。
【０１０５】
いくつかの態様において、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチドは、（配列番号１９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号２０に明記されるアミノ酸配列、（配列番号２１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号２２に明記されるアミノ酸配列、（配列番号２３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号２４に明記されるアミノ酸配列、（配列番号２５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号２６に明記されるアミノ酸配列、（配列番号２７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号２８に明記されるアミノ酸配列、（配列番号２９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号３０に明記されるアミノ酸配列、（配列番号３１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号３２に明記されるアミノ酸配列、または（配列番号１１５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１１６に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１０６】
いくつかの態様において、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドは、（配列番号３３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号３４、（配列番号３５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号３６、（配列番号３７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号３８、（配列番号３９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号４０、または（配列番号４１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号４２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドは、葉緑体輸送ペプチドを欠く。いくつかの実施形態において、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１０７】
いくつかの態様において、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドは、（配列番号４３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号４４、（配列番号４５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号４６、（配列番号４７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号４８、（配列番号４９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号５０、または（配列番号５１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号５２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、二機能性ポリペプチドは、（配列番号５３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号５４、（配列番号５５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号５６、または（配列番号５７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号５８に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１０９】
いくつかの態様において、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチドは、（配列番号５９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号６０、（配列番号６１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号６２、（配列番号６３もしくは６４に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１１７、（配列番号６５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号６６、（配列番号６７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号６８、（配列番号６９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号７０、（配列番号７１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号７２、（配列番号７３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号７４、または（配列番号７５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号７６に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１１０】
いくつかの態様において、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドは、（配列番号７７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号７８、（配列番号７９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号８０、（配列番号８１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号８２、（配列番号８３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号８４、（配列番号８５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号８６、（配列番号８７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号８８、（配列番号８９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号９０、または（配列番号９１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号９２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１１１】
いくつかの態様において、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドは、（配列番号９３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ得る）配列番号９４、（配列番号９５もしくは配列番号９６に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号９７、（配列番号９８もしくは配列番号９９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１００、（配列番号１０５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、（配列番号１０７に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１０８、（配列番号１０９に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１１０、（配列番号１１１に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１１２、または（配列番号１１３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１１４に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ステビオールまたはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）をコードする核酸（配列番号７）、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）をコードする核酸（配列番号９）、ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）をコードする核酸（配列番号４）、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチド）をコードする核酸（配列番号１６）を含む。いくつかの態様において、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド）は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１１）またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号１３）であり得る。いくつかの実施形態において、ステビオールまたはステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である。
【０１１３】
いくつかの態様において、ステビオールまたはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号５または配列番号６に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号８に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ、ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号３に明記されるヌクレオチド配列によってコードされ、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１５に明記されるヌクレオチド配列によってコードされる。当業者であれば、これらの遺伝子の発現は特定のステビオールグリコシドを産生するために必要であり得ること、しかしこれらの遺伝子のうちの１つ以上は宿主に内在性であってもよいが、但し、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つ（及びいくつかの実施形態において全て）は組み換え宿主に導入された組み換え遺伝子であることを条件とすることを理解するだろう。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、組み換え遺伝子を欠く対応するステビオールグリコシド産生宿主と比較して、細胞内ステビオールグリコシド濃度の増加として計算される、細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシド、例えば、ルブソシド、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭの量を少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％増加させる。
【０１１５】
例えば、いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生宿主内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、または配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、または配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子の発現は、組み換え遺伝子を欠く対応するステビオールグリコシド産生宿主と比較して、細胞内グリコシド濃度の増加として計算される、細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシド、例えば、ルブソシド、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭの量を少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％増加させる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、組み換え遺伝子を欠く対応するステビオールグリコシド産生宿主と比較して、細胞内ステビオールグリコシド濃度の減少として計算される、細胞によって産生される１つ以上のステビオールグリコシド、例えば、１３−ＳＭＧ及びＲｅｂＤの量を少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％減少させる。
【０１１７】
例えば、いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現、ならびに例えば、配列番号１２７、配列番号１３３、配列番号１２９、配列番号１２５、配列番号１３９、または配列番号１３５に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の更なる発現は、細胞によって産生される１３−ＳＭＧの量を少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７．５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％減少させる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびにＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、組み換え遺伝子を欠く対応するステビオールグリコシド産生宿主と比較して、細胞内ステビオールグリコシド濃度の増加として計算される、ステビオールグリコシドの総量（すなわち、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−、及びヘプタ−グリコシル化ステビオール化合物の総量）を少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７．５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１２．５％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約１７．５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約２７．５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％増加させる。
【０１１９】
例えば、いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現、ならびに例えば、配列番号１３３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１２５、配列番号１３９、または配列番号１３５に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の更なる発現は、組み換え遺伝子を欠く対応するステビオールグリコシド産生宿主と比較して、細胞内ステビオールグリコシド濃度の増加として計算される、ステビオールグリコシドの総量（すなわち、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−、及びヘプタ−グリコシル化ステビオール化合物の総量）を少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７．５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１２．５％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約１７．５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約２７．５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％増加させる。
【０１２０】
いくつかの他の実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主細胞によって産生されるステビオールグリコシドの総量は、宿主内での、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現によって変化しない（すなわち、約５％未満、または約４％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満増加または減少する）。例えば、いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、宿主によって産生されるステビオールグリコシドの総量を約５％未満、例えば、約４％未満、または約３％未満、または約２％未満増加させる。
【０１２１】
当業者であれば、そのような実施形態において、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するに関与するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の発現が、例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドの基質として利用可能なＵＤＰ−グルコースのレベルを増加させることによって、組み換え宿主によって産生されるステビオールグリコシドの相対レベルに影響を与え得ることを理解するだろう。例えば、いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシド産生組み換え宿主内での、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有する、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有する、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の発現は、宿主によって産生されるステビオールグリコシドの総量を約５％未満、例えば、約４％未満、または約３％未満、または約２％未満増加させ、宿主によって産生されるＲｅｂＭの量を少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加させ、かつ宿主によって産生されるＲｅｂＤの量を少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％減少させる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主細胞は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。
【０１２３】
特定の実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする、宿主に天然であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の組み換え遺伝子を含み、すなわち、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチドを過剰発現する。
【０１２４】
特定のそのような実施形態において、組み換え宿主細胞は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞）、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号２及び／もしくは配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞）、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞）を過剰発現する。一例において、組み換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する。
【０１２５】
特定の実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を含む組み換え宿主細胞は、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号４に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を更に含む。特定のそのような実施形態において、組み換え宿主細胞は、ＦＰＰ及びＩＰＰからＧＧＰＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号２０に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号４０に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号５２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号６０もしくは配列番号１１７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、もしくは配列番号９２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号９４に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を更に含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる２つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチド）をコードする２つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる２つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチド）をコードする２つ以上の遺伝子を含む。
【０１２７】
特定のそのような実施形態において、組み換え宿主は、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子、例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／または配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子を含む。一例において、組み換え宿主は、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１１９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号１４５に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。
【０１２８】
特定のそのような実施形態において、組み換え宿主は、ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子、例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／または配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子を含む。一例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号１２５に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号１２９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子及び配列番号１３３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子をコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子及び配列番号１３５に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子及び配列番号１３７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。別の例において、組み換え宿主は、配列番号１２１に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子及び配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはグルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる１つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有する１つ以上のポリペプチド）をコードする１つ以上の遺伝子を更に含む。
【０１２９】
特定のそのような実施形態において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる２つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチド）をコードする２つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる２つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチド）をコードする２つ以上の遺伝子を含む組み換え宿主は、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現する宿主細胞（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１２１、及び／または配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞）である。
【０１３０】
特定の実施形態において、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができる２つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号１１９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、及び／もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチド）をコードする２つ以上の遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができる２つ以上のポリペプチド（例えば、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、及び／もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチド）をコードする２つ以上の遺伝子を含む組み換え宿主細胞は、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号９に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号４に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を更に含む。特定のそのような実施形態において、組み換え宿主細胞は、ＦＰＰ及びＩＰＰからＧＧＰＰを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号２０に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号４０に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号５２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号６０もしくは配列番号１１７に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、もしくは配列番号９２に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子、ならびに／またはｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチド（例えば、配列番号９４に明記されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を更に含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、ホールセル生物変換によって産生される。ホールセル生物変換が生じるために、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞は、細胞内のステビオールグリコシド前駆体を取り込み、修飾し、インビボでの修飾後、ステビオールグリコシドは、細胞内に残存する、かつ／または培養培地に排出される。例えば、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、かつステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基ステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に発現する宿主細胞は、ステビオールを取り込み、細胞内のステビオールをグリコシル化し得、インビボでのグリコシル化後、ステビオールグリコシドは、培養培地に排出され得る。特定のそのような実施形態において、宿主細胞は、ＦＰＰ及びＩＰＰからＧＧＰＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を更に発現し得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生するための方法は、（ａ）ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、（ｂ）グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、ならびに／または（ｃ）ＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドと、以下、（ｄ）ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、（ｅ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチド、（ｆ）ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド、ならびに／または（ｇ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドのうちの１つ以上とを使用する、組み換え宿主細胞の細胞培養培地中での植物由来もしくは合成のステビオール及び／またはステビオールグリコシドのホールセル生物変換を含み、ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、組み換え宿主細胞内で発現される組み換えポリペプチドであり、それにより１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生する。
【０１３３】
本明細書に開示される１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を産生するための方法のいくつかの実施形態において、本明細書に開示される組み換え宿主細胞の細胞培養培地中での植物由来もしくは合成のステビオール及び／またはステビオールグリコシドのホールセル生物変換を含み、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドは、配列番号１２３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドは、配列番号２、配列番号１１９、もしくは配列番号１４３に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、または配列番号１４１、配列番号１４５、もしくは配列番号１４７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、かつ／あるいはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドは、配列番号１２１、配列番号１２７に明記されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、もしくは配列番号１３９に明記されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、または配列番号１３１に明記されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチド、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチド、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドは、それをアンカーモチーフと融合することによって、本明細書に開示される組み換え宿主細胞の表面上に提示され得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、細胞は、修飾される基質を取り込むか、または修飾された産生物を排出するように透過処理される。いくつかの実施形態において、供給原料が宿主に入り、産生物が出るのを補助するために、透過処理剤が添加され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、トルエンなどの溶媒で、またはＴｒｉｔｏｎ−ＸもしくはＴｗｅｅｎなどの洗剤で透過処理される。いくつかの実施形態において、細胞は、界面活性剤、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤で透過処理される。いくつかの実施形態において、細胞は、電気穿孔法または軽微な浸透圧ショックなどの周期性機械的ショックで透過処理される。例えば、培養された微生物の粗溶解物を遠心分離して、上清を得ることができる。その後、結果として得られる上清を、クロマトグラフィーカラム、例えば、Ｃ１８カラムに適用し、水で洗浄して、親水性化合物を除去し、その後対象となる化合物（複数可）をメタノールなどの溶媒で溶出することができる。その後、化合物（複数可）を分取ＨＰＬＣによって更に精製してもよい。また、ＷＯ２００９／１４０３９４も参照されたい。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ステビオール、１つ以上のステビオールグリコシド前駆体、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドは、２つ以上の宿主の共培養によって産生される。いくつかの実施形態において、各々がステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素を発現する１つ以上の宿主は、ステビオール、１つ以上のステビオールグリコシド前駆体、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドを産生する。例えば、ＦＰＰ及びＩＰＰからＧＧＰＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／もしくはｅｎｔ−カウレナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、チトクロムＰ４５０複合体を還元することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成し、ｅｎｔ−コパリル二リン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することができる二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主と、ＵＤＰからＵＴＰを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、グルコース−６−リン酸をグルコース−１−リン酸に変換することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはＵＴＰ及びグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、ステビオールもしくはそのＣ−１３ヒドロキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’をベータ１，３グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ステビオールもしくはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’をベータ１，２グリコシル化することができるポリペプチドをコードする遺伝子を更に発現する宿主とは、１つ以上のステビオールグリコシドを産生する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ステビオールグリコシドは、例えば、１３−ＳＭＧ、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１９−ＳＭＧ、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＩ、ズルコシドＡ、ジ−グリコシル化ステビオール、トリ−グリコシル化ステビオール、テトラ−グリコシル化ステビオール、ペンタ−グリコシル化ステビオール、ヘキサ−グリコシル化ステビオール、ヘプタ−グリコシル化ステビオール、またはそれらの異性体を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、インビボで、インビトロで、またはホールセル生物変換によって産生されるステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物は、低減した量もしくは低減したレベルの、とりわけステビア植物に由来するステビア抽出物以外の植物由来の構成成分を含まないか、または含む。植物由来の構成成分は、異臭に寄与し、色素、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパツレノール及び他のセスキテルペン、ラブダンジテルペン、モノテルペン、デカン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、２−メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β−シトステロール、α−及びβ−アミリン、ルペオール、β−アミリンアセテート、五環トリテルペン、センタウレジン、クエルシチン、エピ−アルファ−カジノール、カリオフィレン及び誘導体、ベータ−ピネン、ベータ−シトステロール、ならびにジベレリンを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で言及される植物由来の構成成分は、非グリコシド化合物である。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」、及び「測定可能な濃度」という用語は、曲線下面積、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭ、またはｍＭで測定されるステビオールグリコシドのレベルを指す。ステビオールグリコシド産生（すなわち、合計上清、及び／または合計細胞内ステビオールグリコシドレベル）は、当業者にとって一般に利用可能な技術によって検出及び／または分析され得、これらの技術は、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外−可視分光法／分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析（ＭＳ）、及び核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）であるが、これらに限定されない。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「検出不能な濃度」という用語は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術によって測定及び／または分析するには低すぎる化合物のレベルを指す。いくつかの実施形態において、「検出不能な濃度」の化合物は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物中には存在しない。
【０１４１】
組み換え微生物を培養物中で一定期間成長させた後（この温度及び期間は、ステビオールグリコシドの産生を促進するものである）、ステビオール及び／または１つ以上のステビオールグリコシドが、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して培養物から回収され得る。ステビオールグリコシドは、本明細書に記載される方法を使用して単離され得る。例えば、発酵後、培養ブロスを４℃、７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞を除去しても、濾過によって細胞を除去してもよい。無細胞溶解物は、例えば、宿主細胞の機械的破壊または酵素的破壊、及び細胞細片を除去するための追加の遠心分離によって得ることができる。乾燥ブロス材料の機械的破壊はまた、超音波処理などによっても実行され得る。溶解または懸濁したブロス材料は、分取クロマトグラフィーなどによって、更なる精製前にミクロンまたはサブミクロンを使用して濾過され得る。発酵培地または無細胞溶解物は、塩などの低分子量化合物を除去するために任意で処理され得、かつ精製前に任意で乾燥され、水と溶媒との混合物中に再溶解され得る。
【０１４２】
上清または無細胞溶解物は、以下のように精製され得る。カラムを、例えば、ＨＰ２０Ｄｉａｉｏｎ樹脂（芳香族型合成吸着剤、Ｓｕｐｅｌｃｏ）または他の好適な非極性吸着もしくは逆相クロマトグラフィー樹脂で充填し得、上清または無細胞溶解物のアリコートをカラム上に充填し、水で洗浄して、親水性構成成分を除去し得る。ステビオールグリコシド産生物が、水中溶媒濃度の段階的な増分増加、または例えば、０％→１００％のメタノール）の勾配によって溶出され得る。その後、通過画分を含む、各画分中のステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸のレベルを、ＬＣ−ＭＳによって分析し得る。その後、画分を組み合わせ、真空蒸発器を使用して体積を低減させ得る。所望される場合、追加のクロマトグラフィーステップ及び結晶化などの追加の精製ステップが利用され得る。例えば、ステビオールグリコシドは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（すなわち、Ｃ１８カラムを使用）、抽出、結晶化、ならびに炭素カラム及び／または脱色ステップに限定されない方法によって単離され得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「または」及び「及び／または」という用語は、組み合わせでの、または互いを除外した、複数の構成成分を説明するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、及び／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、及びｚ」、「（ｘ及びｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙ及びｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。いくつかの実施形態において、「及び／または」は、組み換え細胞が含む外因性核酸を指すために使用され、組み換え細胞は、ある群から選択される１つ以上の外因性核酸を含む。いくつかの実施形態において、「及び／または」は、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体の産生を指すために使用される。いくつかの実施形態において、「及び／または」は、ステビオールグリコシドの産生を指すために使用され、１つ以上のステビオールグリコシドが産生される。いくつかの実施形態において、「及び／または」は、ステビオールグリコシドの産生を指すために使用され、１つ以上のステビオールグリコシドが、以下のステップ、つまり、組み換え微生物の培養、組み換え微生物中での１つ以上のステビオールグリコシドの合成、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドの単離のうちの１つ以上を通して産生される。
【０１４４】
機能的ホモログ
上述のポリペプチドの機能的ホモログはまた、組み換え宿主においてステビオールグリコシドを産生する上での使用にも好適である。機能的ホモログは、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（複数可）のうちの１つ以上を実行するポリペプチドである。機能的ホモログ及び参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであり得、配列類似性は、収束または分岐進化事象によるものであり得る。したがって、機能的ホモログは、文献においてホモログ、オルソログ、またはパラログとして設計されることがある。野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドなどの、天然に存在する機能的ホモログのバリアントは、それら自体が機能的ホモログであり得る。機能的ホモログはまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異誘発を介して、またはコード配列に由来するドメインを異なる天然に存在するポリペプチドに組み合わせること（ドメイン交換）によっても作製され得る。本明細書に記載される機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を修飾するための技術は既知であり、とりわけ指向性進化技術、部位特異的変異誘発技術、及びランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特異的活性を増加させるか、基質特異性を改変するか、発現レベルを改変するか、細胞内位置を改変するか、所望される様式でのポリペプチド−ポリペプチド相互作用を修飾するのに有用であり得る。そのような修飾されたポリペプチドは、機能的ホモログと見なされる。「機能的ホモログ」という用語は、機能的な相同なポリペプチドをコードする核酸に適用されることがある。
【０１４５】
機能的ホモログは、ヌクレオチド及びポリペプチド配列整列の分析によって特定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースについての問い合わせの実行により、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを特定することができる。配列分析は、ＵＧＴアミノ酸配列を参照配列として使用する、非重複データベースのＢＬＡＳＴ、相反ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を伴い得る。場合によっては、アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有する、データベース内のそれらのポリペプチドが、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての好適性についての更なる評価の候補である。アミノ酸配列類似性は、１つの疎水性残基の別の疎水性残基との置換、または１つの極性残基の別の極性残基との置換などの保存的アミノ酸置換を可能にする。所望される場合、そのような候補の手作業の点検を実行して、更に評価される候補の数を狭めてもよい。手作業の点検は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチド中に存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメインを有するようである候補を選択することによって実行され得る。いくつかの実施形態において、核酸及びポリペプチドは、ＢＬＡＳＴの使用によってではなく、発現レベルに基づいて、トランスクリプトームデータから特定される。
【０１４６】
保存された領域は、反復配列であるか、いくつかの二次構造（例えば、らせん体及びベータシート）を形成するか、正電荷もしくは負電荷を持つドメインを確立するか、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域の位置を示すことによって特定され得る。例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上、ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／及びｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／の、様々なタンパク質モチーフ及びドメインのコンセンサス配列を説明するＰｆａｍウェブサイトを参照されたい。Ｐｆａｍデータベースに含まれる情報は、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：３２０−３２２（１９９８）、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８：４０５−４２０（１９９７）、及びＢａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：２６０−２６２（１９９９）に記載される。保存された領域はまた、密接に関連する種に由来する同じまたは関連するポリペプチドの配列を整列させることによっても決定され得る。密接に関連する種は、好ましくは、同じ科に由来する。いくつかの実施形態において、２つの異なる種に由来する配列の整列が、そのようなホモログを特定するのに適切である。
【０１４７】
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を呈するポリペプチドが、保存された領域を特定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存された領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を呈する。いくつかの実施形態において、保存された領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を呈する。
【０１４８】
例えば、組み換え宿主におけるステビオールの産生に好適なポリペプチドは、ＵＧＴの機能的ホモログを含む。
【０１４９】
例えば、ＵＧＴの基質特異性を修飾するための方法は、当業者にとって既知であり、部位特異的／合理的変異誘発アプローチ、ランダム指向性進化アプローチ、及びランダム変異誘発／飽和技術が酵素の活性部位近くで実行される組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｏｓｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７０：３２５−３４７を参照されたい。
【０１５０】
候補配列は、典型的には、参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは、典型的には、参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、もしくは１２０％、またはその間の任意の範囲である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドに対する、任意の候補核酸またはポリペプチドの同一性％は、以下のように決定され得る。核酸またはポリペプチド配列の、それらの全長にわたる整列（網羅的整列）の実行を可能にするコンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（バージョン１．２．１、初期設定パラメータ）を使用して、参照配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列またはアミノ酸配列）を１つ以上の候補配列に整列させる。Ｃｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３４９７−５００。
【０１５１】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、参照配列と１つ以上の候補配列との間の最良のマッチを計算し、同一性、類似性、及び差異が決定され得るようにそれらを整列させる。配列整列を最大化するために、１つ以上の残基のギャップを参照配列、候補配列、または両方に挿入し得る。核酸配列の高速ペアワイズ整列のために、以下の初期設定パラメータ、つまり、ワードサイズ：２、ウインドウサイズ：４、スコア化方法：年齢％、頂点対角の数：４、及びギャップペナルティ：５を使用する。核酸配列の多重整列のために、以下の初期設定パラメータ、つまり、ギャップ開始ペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：５．０、及び重量移行：はいを使用する。タンパク質配列の高速ペアワイズ整列のために、以下のパラメータ、つまり、ワードサイズ：１、ウインドウサイズ：５、スコア化方法：年齢％、頂点対角の数：５、及びギャップペナルティ：３を使用する。タンパク質配列の多重整列のために、以下のパラメータ、つまり、重量マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップ開始ペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ、残基特異的ギャップペナルティ：オンを使用する。ＣｌｕｓｔａｌＷ出力は、配列間の関係を反映する配列整列である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒサイト（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）で、及びワールド・ワイド・ウェブ上、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサイト（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）で実行され得る。
【０１５２】
参照配列に対する候補核酸またはアミノ酸配列の同一性％を決定するために、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを使用して配列を整列させ、整列内の同一のマッチの数を参照配列の長さで除し、結果に１００を乗じる。同一性％値は、小数第２位で四捨五入され得ることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４は、７８．１に四捨五入される一方で、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９は、７８．２に四捨五入される。
【０１５３】
機能的ＵＧＴタンパク質（例えば、ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド）は、酵素によって実行される酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、ＵＧＴタンパク質は、融合タンパク質である。「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「融合構築物」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」、「キメラ構築物」、及び「キメラ酵素」という用語は、異なるタンパク質コードする２つ以上の遺伝子の接合を通して操作されたタンパク質を指すために本明細書で互換的に使用され得る。いくつかの実施形態において、ＵＧＴポリペプチド（例えば、ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド）をコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドのその後の操作（例えば、精製もしくは検出を促進する）、分泌、または局在化を促進するように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置するように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入され得る。コードされたタグの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン−タグ（ＨＩＳタグ）、及びＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。タグの他の例としては、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグが挙げられる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ドメイン交換によって改変されたタンパク質である。本明細書で使用される場合、「ドメイン交換」という用語は、第１のタンパク質のドメインを第２のタンパク質のドメインで置換するプロセスを説明するために使用される。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質のドメイン及び第２のタンパク質のドメインは、機能的に同一であるか、または機能的に類似している。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質のドメインの構造及び／または配列は、第１のタンパク質のドメインの構造及び／または配列とは異なる。いくつかの実施形態において、ＵＧＴポリペプチド（例えば、ステビオールまたはそのＣ−１９カルボキシル基のステビオールグリコシドをグリコシル化することができるポリペプチド）は、ドメイン交換によって改変される。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、循環置換によって改変されたタンパク質であり、これは、その後に他の場所で開放されるタンパク質の終端の共有結合に存する。故に、タンパク質のアミノ酸に変化を引き起こすことなく、配列の順序が改変される。いくつかの実施形態において、標的とされる循環置換は、例えば、非限定的に、元のタンパク質の終端に入るスペーサーを設計することによって産生され得る。スペーサーが定義された後、例えば、非限定的に、ＰＣＲによって鎖状体を産生し、その後鎖状体内の特定の並べ替えを増幅することによる、またはタンパク質の別々の断片を増幅して、それらを異なる順序で入れるように交換することによる、一般に許容される分子生物学技術を通して、並べ替えを生成するためのいくつかの可能性が存在する。並べ替えを生成するステップの後には、断片終端を結合し、ランダムに切り詰め、故にある特有の構築物から並べ替えの収集物を形成することによる、循環遺伝子の作製が続き得る。いくつかの実施形態において、ＤＡＰ１ポリペプチドは、循環置換によって改変される。
【０１５６】
ステビオール及びステビオールグリコシド生合成核酸
本明細書に記載されるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、センス配向でそのポリペプチドの発現に好適な１つ以上の制御領域に動作可能に連結される、そのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物が、多シストロン性ｍＲＮＡから複数の遺伝子産生物を発現することができるため、所望される場合、複数のポリペプチドは、それらの微生物の単一制御領域の調節下で発現され得る。制御領域及びコード配列が、制御領域が配列の転写または翻訳の制御に有効であるように位置するとき、コード配列及び制御領域は、動作可能に連結されるものと見なされる。典型的には、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子の制御領域の１ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。
【０１５７】
多くの場合、本明細書に記載されるポリペプチドのコード配列は、組み換え宿主以外の種において特定され、すなわち、異種核酸である。故に、組み換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核もしくは真核微生物、植物、または動物に由来し得る。しかしながら、場合によっては、コード配列は、宿主に天然である配列であり、その生物に再導入されている。天然配列はしばしば、外因性核酸に連結される非天然配列、例えば、組み換え核酸構築物において天然配列に隣接している非天然制御配列の存在によって、天然に存在する配列とは区別され得る。加えて、安定して形質転換された外因性核酸は、典型的には、天然配列が見出される位置以外の位置で組み込まれる。「制御領域」は、転写または翻訳開始及び速度、ならびに転写または翻訳産生物の安定性及び／または移動性に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。制御領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’未翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。制御領域は、典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。制御領域はまた、エンハンサー配列、上流エレメント、または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの調節エレメントも含み得る。制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳の制御に有効であるように制御領域及びコード配列を位置付けることによって、コード配列に動作可能に連結される。例えば、コード配列及びプロモーター配列を動作可能に連結するために、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの１ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。しかしながら、制御領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドほども上流に、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に位置してもよい。
【０１５８】
含まれる制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導可能性、所望される発現レベル、及び特定の培養段階中の優先的発現を含むが、これらに限定されない、いくつかの因子に依存する。制御領域を適切に選択し、それをコード配列に対して位置付けることによってコード配列の発現を調整することは、当業者にとっては通例事項である。２つ以上の制御領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、及び誘導性エレメントが存在し得ることが理解されるだろう。
【０１５９】
１つ以上の遺伝子は、ステビオール及び／またはステビオールグリコシド産生の別々の態様に有用な「モジュール」で、組み換え核酸構築物中で組み合わされ得る。複数の遺伝子を、モジュール、特に多シストロン性で組み合わせることは、様々な種におけるモジュールの使用を促進する。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスター、またはＵＧＴ遺伝子クラスターは、好適な制御領域の挿入後に、モジュールが幅広い種に導入され得るように、多シストロン性モジュールで組み合わされ得る。別の例として、ＵＧＴ遺伝子クラスターは、各ＵＧＴコード配列が、別個の制御領域に動作可能に連結されて、ＵＧＴモジュールを形成するように組み合わされ得る。そのようなモジュールは、単シストロン性発現が必要であるか、または望ましい種において使用され得る。ステビオールまたはステビオールグリコシド産生に有用な遺伝子に加えて、組み換え構築物はまた、典型的には、複製起源、及び適切な種における構築物の維持のための１つ以上の選択可能なマーカーも含有する。
【０１６０】
遺伝コードの縮重度のため、いくつかの核酸がある特定のポリペプチドをコードし得ること、すなわち、多くのアミノ酸にとって、そのアミノ酸のコドンとしての役割を果たす２つ以上のヌクレオチドトリプレットが存在することが理解されるだろう。故に、所与のポリペプチドのコード配列内のコドンは、特定の宿主における最適な発現が得られるように、その宿主（例えば、微生物）にとって適切なコドンバイアス表を使用して修飾され得る。単離された核酸として、それらの修飾された配列は、精製された分子として存在し得、組み換え核酸構築物のモジュールを構築する上で使用するためにベクターまたはウイルスに組み込まれ得る。
【０１６１】
場合によっては、内在性ポリペプチドの１つ以上の機能を阻害して、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に転用することが望ましい。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシド産生を更に増加させるために、例えば、スクアレンエポキシダーゼを下方制御することによって、酵母株中のステロールの合成を下方制御することが望ましくあり得る。別の例として、特定の内在性遺伝子産生物、例えば、二次代謝物からグルコース部分を除去するグリコヒドラーゼまたは本明細書に考察されるホスファターゼの分解機能を阻害することが望ましくあり得る。そのような場合、ポリペプチドまたは遺伝子産生物を過剰発現する核酸は、株に形質転換される組み換え構築物中に含まれ得る。あるいは、変異誘発を使用して、機能を増加または増強させることが所望される遺伝子内に変異体を生成してもよい。
【０１６２】
宿主微生物
哺乳動物、昆虫、植物、及び藻類細胞を含む組み換え宿主が、産生ステビオールグリコシドのポリペプチドを発現させるために使用され得る。いくつかの原核生物及び真核生物もまた、本明細書に記載される組み換え微生物（例えば、グラム陰性菌、酵母、及び真菌）を構築する上での使用に好適であり得る。ステビオールグリコシド産生株としての使用に選択される種及び株をまず分析して、どの産生遺伝子がその株に内在性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定する。その内在性対応物が株中に存在しない遺伝子は、１つ以上の組み換え構築物中に有利に組み立てられ、それはその後、株へと形質転換されて、欠損する機能（複数可）を供給する。
【０１６３】
典型的には、組み換え微生物は、発酵槽内、ある温度（複数可）である期間成長され、この温度及び期間は、ステビオールグリコシドの産生を促進する。本発明によって提供される、構築され、遺伝子操作された微生物は、とりわけ恒成分培養槽、バッチ、流加培養、半連続発酵（汲出し及び注入など）、連続灌流発酵、ならびに連続灌流細胞培養を含む、従来の発酵プロセスを使用して培養され得る。本方法において使用される特定の微生物に応じて、イソペンテニル生合成遺伝子ならびにテルペンシンターゼ及びシクラーゼ遺伝子などの他の組み換え遺伝子もまた存在し、発現されてもよい。基質及び中間体（例えば、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ＧＧＰＰ、ｅｎｔ−カウレン、及びｅｎｔ−カウレン酸）のレベルは、培養培地から試料を抽出して、発表されている方法に従って分析することによって決定され得る。
【０１６４】
本方法において使用される炭素源は、組み換え宿主細胞によって代謝され得る任意の分子を含むことで、ステビオールグリコシドの成長及び／または産生を促進する。好適な炭素源の例としては、（例えば、糖蜜に見出されるような）スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオース、または他のグルコース包含ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。酵母を宿主として用いる実施形態において、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、及びグルコースなどの炭素源が好適である。炭素源は、培養期間全体を通して宿主生物に提供されても、あるいは、生物は、ある期間別のエネルギー源（例えば、タンパク質）の存在下で成長され、その後流加相中にのみ炭素源が提供されてもよい。
【０１６５】
本明細書で考察される様々な遺伝子及びモジュールは、単一の宿主ではなく、２つ以上の組み換え宿主に存在し得ることが理解されるだろう。複数の組み換え宿主が使用される場合、それらは、混合培養物中で成長されて、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドを蓄積し得る。
【０１６６】
あるいは、２つ以上の宿主は各々、別個の培養培地中で成長され得、第１の培養培地の産生物（例えば、ステビオール）が第２の培養培地に導入されて、その後の中間体または最終産生物（例えば、ＲｅｂＡなど）に変換され得る。その後、第２のまたは最終宿主によって産生される産生物が、回収される。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、培養培地以外の栄養素源を使用して、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長されることもまた理解されるだろう。
【０１６７】
例示的な原核及び真核種を、以下により詳細に説明する。しかしながら、他の種が好適であり得ることが理解されるだろう。例えば、好適な種は、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａなどの属にあるものであり得る。そのような属に由来する例示的な種としては、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｔｉｇｒｉｎｕｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細菌細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細菌細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞などの原核生物であり得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、微生物は、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅであり得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、微生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ菌種、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ種などの藻類細胞であり得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、微生物は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ菌種、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓなどのラン藻細胞であり得る。
【０１７２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌種
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、合成生物学において広く使用されるシャーシ生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして使用され得る。例えば、変異体のライブラリ、プラスミド、代謝についての詳細なコンピュータモデル、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて利用可能な他の情報が存在し、産生物収率を増強するための様々なモジュールの合理的設計を可能にする。組み換え微生物を作製するための方法は、既知である。
【０１７３】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ菌種
Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｓｏｊａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種は、食品製品中で広く使用される微生物であり、組み換え微生物プラットフォームとしても使用され得る。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｔｅｒｒｅｕｓのゲノムでは、ヌクレオチド配列が入手可能であり、流束を増強し、産生物収率を増加させるための内在性経路の合理的設計及び修飾を可能にする。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓでは、代謝モデルならびにトランスクリプトーム研究及びプロテオミクス研究が開発されている。Ａ．ｎｉｇｅｒは、クエン酸及びグルコン酸などのいくつかの食品成分の産業的産生のために培養され、故にＡ．ｎｉｇｅｒなどの種は一般に、ステビオールグリコシドの産生に好適である。
【０１７４】
Ｅ．ｃｏｌｉ
合成生物学において広く使用される別のプラットフォーム生物であるＥ．ｃｏｌｉもまた、組み換え微生物プラットフォームとして使用され得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと同様に、変異体のライブラリ、プラスミド、代謝についての詳細なコンピュータモデル、及びＥ．ｃｏｌｉについて利用可能な他の情報が存在し、産生物収率を増強するための様々なモジュールの合理的設計を可能にする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓについて上述の方法に類似する方法を使用して、組み換えＥ．ｃｏｌｉ微生物を作製することができる。
【０１７５】
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ菌種
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ菌種は、培養物中で大量のイソプレノイドを産生することが既知であるため、それらは有用であり得る。故に、大量のステビオールグリコシドを産生するためのテルペン前駆体は、内在性遺伝子によって既に産生されている。故に、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組み換え遺伝子を含むモジュールは、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要性なく、そのような属に由来する種に導入され得る。
【０１７６】
Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）
Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓは、珍しい生化学的特徴を有する二形性酵母（それは、最大４２℃の温度までパン酵母のように出芽酵母として成長し、この閾値を超えると、繊維状形態で成長する）である。それは、幅広い基質上で成長し得、硝酸同化し得る。それは、天然プラスチックを産生し得る株の生成、または環境試料中のエストロゲンのためのバイオセンサーの開発への適用に成功している。
【０１７７】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、二形性酵母（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓを参照されたい）であり、Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ科に属する。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノム全体が、既知である。Ｙａｒｒｏｗｉａ種は、好気性であり、非病原性であると見なされる。Ｙａｒｒｏｗｉａは、疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用する上で効率的であり、糖で成長し得る。それは、産業用途に高い潜在性を有し、油性微生物である。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｐｔｉｃａは、その乾燥細胞重量のおよそ４０％までの脂質含有量を蓄積し得、脂質蓄積及び再可動化のモデル生物である。例えば、Ｎｉｃａｕｄ，２０１２，Ｙｅａｓｔ２９（１０）：４０９−１８、Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ９１（６）：６９２−６、Ｂａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８４（５）：８４７−６５を参照されたい。
【０１７８】
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ菌種
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａは、単細胞の色素酵母である。油性紅麹、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓは、粗グリセロールから脂質及びカロテノイドを産生することが示されている（Ｓａｅｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６（１）：２１０−８）。Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ株は、改善されたバイオマス及び脂質産生性のための効率的な流加発酵系であることが示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４１：３１２−７）。
【０１７９】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓは、油性酵母であり、脂質産生経路の操作に有用である（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ．３：１１１２、Ａｇｅｉｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９０（４）：１２１９−２７を参照されたい）。
【０１８０】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉは、メチロトローフ酵母である（それはメタノールで成長する）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの他のメチロトローフ種のように、それは、異種タンパク質の産生のための優れたプラットフォームを提供する。複数グラム範囲の分泌される外来性タンパク質の収率が、報告されている。計算的方法、ＩＰＲＯは近年、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉキシロース還元酵素の補助因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへと実験的に切り換えた変異を予想した。例えば、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８２４：３２９−５８、Ｋｈｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１８（１０）：２１２５−３８を参照されたい。
【０１８１】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、メチロトローフ酵母である（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉを参照されたい）。それは、幅広い他の基質で更に成長し得、それは、熱耐性であり、硝酸同化し得る（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓもまた参照されたい）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、及びＣ型肝炎の治療のためのインターフェロンアルファ−２ａの生産、更に様々な技術的酵素の範囲に適用されている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｖｉｒｏｌ  Ｓｉｎ．２９（６）：４０３−９を参照されたい。
【０１８２】
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓは、通常ケフィアの生産に適用される酵母である。それは、いくつかの糖、最も重要なことに乳及び乳清中に存在するラクトースで成長し得る。それは特に、チーズの生産のための、キモシン（通常子ウシの胃内に存在する酵素）の産生への適用に成功している。産生は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽内で生じる。例えば、ｖａｎ  Ｏｏｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．６（３）：３８１−９２を参照されたい。
【０１８３】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチロトローフ酵母である（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを参照されたい）。それは、外来性タンパク質の産生のための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素は、キットとして入手可能であり、それは、タンパク質の産生のために世界的に学界において使用されている。複雑なヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは、ヒトに見出されるものに類似しているが、同一ではない）を産生し得る株は、操作されている。例えば、Ｐｉｉｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（６）：５３２−７を参照されたい。
【０１８４】
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ菌種
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｍｏｓｓｅｓは、懸濁液培養物中で成長した場合、酵母または他の真菌培養物に類似する特徴を有する。この属は、他の種類の細胞内では産生が困難であり得る植物二次代謝物の産生に使用され得る。
【０１８５】
本明細書に開示される組み換え宿主細胞は、植物において成長される植物細胞を含む植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞（酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、もしくはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ種に由来する細胞であるか、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅであるか、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である）を含む真菌細胞、藻類細胞、あるいはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞を含む細菌細胞を含み得ることが理解され得る。
【０１８６】
ステビオールグリコシド組成物
ステビオールグリコシドは、異なる食品系において必ずしも同等の性能を有さない。したがって、選択されるステビオールグリコシド組成物への合成を指向する能力を有することが望ましい。本明細書に記載される組み換え宿主は、特定のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ）について選択的に濃縮され、一貫した味覚プロファイルを有する組成物を産生し得る。本明細書で使用される場合、「濃縮される」という用語は、ステビア植物に由来するステビオールグリコシド組成物（抽出物）と比較して、増加した割合の特定のステビオールグリコシドを有するステビオールグリコシド組成物を説明するために使用される。故に、本明細書に記載される組み換え宿主は、所与の食品製品に所望される甘味プロファイルを満たすように仕立てられ、バッチ間で一貫した割合の各ステビオールグリコシドを有する組成物の産生を促進し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される宿主は、ステビア抽出物に見出される所望されない植物副産物を産生しないか、または低減した量のステビア抽出物に見出される所望されない植物副産物を産生する。故に、本明細書に記載される組み換え宿主によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物に由来する組成物とは区別可能である。
【０１８７】
蓄積される個々のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の量は、約１〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約少なくとも１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様において、個々のステビオールグリコシドの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超えてもよい。蓄積されるステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の組み合わせの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２００〜約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様において、ステビオールグリコシドの組み合わせの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超えてもよい。一般に、より長い培養時間は、より多い量の産生物をもたらすだろう。故に、組み換え微生物は、１日〜７日、１日〜５日、３日〜５日、約３日、約４日、または約５日間培養され得る。
【０１８８】
本明細書で考察される様々な遺伝子及びモジュールは、単一の微生物ではなく、２つ以上の組み換え微生物に存在し得ることが理解されるだろう。複数の組み換え微生物が使用される場合、それらは、混合培養物中で成長されて、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドを産生し得る。例えば、第１の微生物は、ステビオールグリコシド前駆体を産生するための１つ以上の生合成遺伝子を含み得る一方で、第２の微生物は、ステビオールグリコシド生合成遺伝子を含み得る。その後、第２のまたは最終微生物によって産生される産生物が、回収される。いくつかの実施形態において、組み換え微生物は、培養培地以外の栄養素源を使用して、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長されることもまた理解されるだろう。
【０１８９】
あるいは、２つ以上の微生物は各々、別個の培養培地中で成長され得、第１の培養培地の産生物（例えば、ステビオール）が第２の培養培地に導入されて、その後の中間体または最終産生物（ＲｅｂＡなど）に変換され得る。その後、第２のまたは最終微生物によって産生される産生物が、回収される。いくつかの実施形態において、組み換え微生物は、培養培地以外の栄養素源を使用して、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長されることもまた理解されるだろう。
【０１９０】
本明細書に開示される方法によって得られるステビオールグリコシド及び組成物を使用して、食品製品、栄養補助食品、及び甘味料組成物を作製することができる。例えば、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８を参照されたい。
【０１９１】
例えば、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤなどの実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、アイスクリーム、炭酸２、果物ジュース、ヨーグルト、焼成製品、チューインガム、ハード及びソフトキャンディ、ならびにソースなどの食品製品中に含まれてもよい。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドはまた、薬学的製品、医学的製品、栄養補助食品、及び健康補助食品などの非食品製品に含まれてもよい。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドはまた、農業産業及び伴侶動物産業の両方のための動物用飼料製品に含まれてもよい。あるいは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドの混合物は、各々が特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを産生する組み換え微生物を別個に培養し、各微生物からステビオールまたはステビオールグリコシドを実質的に純粋な形態で回収し、その後化合物を組み合わせて、所望される割合で各化合物を含む混合物を得ることによって作製されてもよい。本明細書に記載される組み換え微生物は、現在のステビア産生物と比較して、より正確かつ一貫した混合物を得ることを可能にする。
【０１９２】
別の代替形態において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、他の甘味料、例えば、サッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリトリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムとともに食品製品に組み込まれてもよい。他の甘味料に対するステビオールまたはステビオールグリコシドの重量比は、所望される場合、最終食品製品中での良好な味覚を達成するために変動し得る。例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０１２８３１１を参照されたい。いくつかの実施形態において、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、風味調整剤として風味（例えば、柑橘類）とともに提供されてもよい。
【０１９３】
本明細書に記載される組み換え微生物によって産生される組成物は、食品製品に組み込まれてもよい。例えば、組み換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシド及び食品製品の種類に応じて、乾燥重量に基づいて、約２０ｍｇのステビオールグリコシド／食品製品ｋｇ〜約１８００ｍｇのステビオールグリコシド／食品製品ｋｇの範囲の量で食品製品に組み込まれてもよい。例えば、組み換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品製品が、乾燥重量に基づいて、最大で５００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇを有するように、デザート、冷菓（例えば、アイスクリーム）、乳製品（例えば、ヨーグルト）、または飲料（例えば、炭酸飲料）に組み込まれてもよい。組み換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品製品が、乾燥重量に基づいて、最大で３００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇを有するように、焼成製品（例えば、ビスケット）に組み込まれてもよい。組み換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品製品が、乾燥重量に基づいて、最大で１０００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇを有するように、ソース（例えば、チョコレートシロップ）または野菜製品（例えば、ピクルス）に組み込まれてもよい。組み換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品製品が、乾燥重量に基づいて、最大で１６０ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇを有するように、パンに組み込まれてもよい。組み換え微生物、植物、または植物細胞によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品製品が、乾燥重量に基づいて、最大で１６００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇを有するように、ハードまたはソフトキャンディに組み込まれてもよい。組み換え微生物、植物、または植物細胞によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品製品が、乾燥重量に基づいて、最大で１０００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇを有するように、加工果物製品（例えば、果物ジュース、果物フィリング、ジャム、及びゼリー）に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で産生されるステビオールグリコシド組成物は、薬学的組成物の構成成分である。例えば、Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ６９ｔｈ  ＪＥＣＦＡ，２００７，ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｗａｌｌｉｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．Ｏｒｇ．、ＥＦＳＡ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｄｄｅｄ  ｔｏ  Ｆｏｏｄ（ＡＮＳ），“Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｕｓｅｓ  ａｓ  ａ  ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ，”２０１０，ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ８（４）：１５３７、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ３２３、Ｕ．Ｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ  ３２９、ＷＯ２０１１／０３７９５９、ＷＯ２０１０／１４６４６３、ＷＯ２０１１／０４６４２３、及びＷＯ２０１１／０５６８３４を参照されたい。
【０１９４】
例えば、そのようなステビオールグリコシド組成物は、９０〜９９重量％のＲｅｂＡ及び検出不能な量のステビア植物由来の混入物を有し、乾燥重量に基づいて、２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇで食品製品に組み込まれ得る。
【０１９５】
そのようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＢを有するＲｅｂＢ濃縮組成物であり、産生物中のＲｅｂＢの量が、乾燥重量に基づいて、２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品製品に組み込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＢ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来の混入物を有する。
【０１９６】
そのようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＤを有するＲｅｂＤ濃縮組成物であり、産生物中のＲｅｂＤの量が、乾燥重量に基づいて、２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品製品に組み込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＤ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来の混入物を有する。
【０１９７】
そのようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＥを有するＲｅｂＥ濃縮組成物であり、産生物中のＲｅｂＥの量が、乾燥重量に基づいて、２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品製品に組み込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＥ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来の混入物を有する。
【０１９８】
そのようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＭを有するＲｅｂＭ濃縮組成物であり、産生物中のＲｅｂＭの量が、乾燥重量に基づいて、２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇであるように、食品製品に組み込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＭ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来の混入物を有する。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、卓上用甘味料または「カップ一杯分」製品に組み込まれる。そのような産生物は、典型的には、当業者にとって既知である１つ以上の増量剤（例えば、マルトデキストリン）で適切な甘味レベルまで希釈される。ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭについて濃縮されるステビオールグリコシド組成物は、例えば、卓上用途では、乾燥重量に基づいて、１０，０００〜３０，０００ｍｇのステビオールグリコシド／製品ｋｇでの、小袋内のパッケージであってもよい。いくつかの実施形態において、インビトロで、インビボで、またはホールセル生物変換によって産生されるステビオールグリコシド。
【０２００】
本発明は、以下の実施例において更に説明されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０２０１】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態及びそれらの様々な用途を示す。それらは、説明目的で明記されるに過ぎず、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０２０２】
実施例１：株操作
ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８（これらの各々の全体が、参照により組み込まれる）に記載されるように、ステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を構築した。例えば、ＹＮＫ１ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１２２、配列番号１２３）、ＰＧＭ１ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１、配列番号２）、ＰＧＭ２ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１１８、配列番号１１９）、ＵＧＰ１ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１２０、配列番号１２１）、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１９、配列番号２０）、切断型ＣＤＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号３９、配列番号４０）、ＫＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５１、配列番号５２）、ＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５９、配列番号６０）、ＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号６３、配列番号６４）、ＡＴＲ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９１、配列番号９２）、ＫＡＨｅ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９３、配列番号９４）、ＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号８５、配列番号８６）、ＣＰＲ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号７７、配列番号７８）、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号８、配列番号９）、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５／配列番号６、配列番号７）、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号３、配列番号４）、ＵＧＴ９１ｄ２ｅ−ｂポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１２、配列番号１３）、及びＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６）を含み、発現する酵母株を、ステビオールグリコシドを蓄積するように操作した。
【０２０３】
実施例２：ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＵＧＰ１、及びＹＮＫ１の過剰発現
ＫＡＨポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９６、配列番号９７）及びＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１１７、配列番号６４）を含み、発現するように更に操作した、実施例１に記載されるステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、ｐＴＥＦ１プロモーター（配列番号１４８）及びＣＹＣ１ターミネーター（配列番号１５４）に動作可能に連結される、ＹＮＫ１ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１２２、配列番号１２３）の追加の複製物、ｐＴＥＦ１プロモーター（配列番号１４８）及びＣＹＣ１ターミネーター（配列番号１５４）に動作可能に連結される、ＰＧＭ１ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１、配列番号２）の追加の複製物、ｐＰＧＫ１プロモーター（配列番号１４９）及びｔＡＤＨ１ターミネーター（配列番号１５５）に動作可能に連結される、ＰＧＭ２ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１１８、配列番号１１９）の追加の複製物、ならびにｐＰＧＫ１プロモーター（配列番号１４９）及びｔＡＤＨ１ターミネーター（配列番号１５５）に動作可能に連結される、ＵＧＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１２０、配列番号１２１）の追加の複製物を含むベクターで形質転換した。
【０２０４】
形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株及び対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＫＡＨポリペプチドをコードする組み換え遺伝子及びＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含み、発現するように更に操作した、実施例２に記載されるステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株）の培養物での流加発酵を、グルコース、硫酸アンモニウム、微量金属、ビタミン、塩、及び緩衝液を含む最少培地内、およそ１６時間の成長相で、３０℃、２Ｌの発酵槽内で好気的に実行し、その後、グルコース包含限定供給培地でおよそ１００時間の供給相を続けた。６．０近くのｐＨ及びグルコース制限条件を維持した。（細胞を除去することなく）全培養物試料の抽出を実行し、抽出物をＬＣ−ＵＶによって分析して、ステビオールグリコシドのレベルを決定した。
【０２０５】
ＳＢ−Ｃ１８急速分解高解像度（ＲＲＨＤ）の２．１ｍｍ×３００ｍｍ、１．８μｍ分析カラム（連続した２つの１５０ｍｍのカラム、６５℃のカラム温度）を使用して、可変波長検出器（ＶＷＤ）、サーモスタットカラム区画（ＴＣＣ）、オートサンプラー、オートサンプラー冷却ユニット、及びバイナリポンプを含むＡｇｉｌｅｎｔ１２９０装置で、ＬＣ−ＵＶを実行した。逆相Ｃ１８カラムによってステビオールグリコシドを分離し、その後、２１０ｍｍでのＵＶ吸光度によって検出した。各分析物のピーク面積をＲｅｂＡの標準と比較し、異なるモル吸光率を有する種については補正因子を適用することによって、ステビオールグリコシドの定量化を行った。ＬＣ−ＵＶのために、０．５ｍＬの培養物を沈降させ、上清を除去し、ペレットの湿重量を計算した。ＬＣ−ＵＶ結果を、ペレット湿重量によって正規化した。測定されたＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ、１３−ＳＭＧ、ルブソシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ジ−グリコシル化ステビオール、トリ−グリコシル化ステビオール、テトラ−グリコシル化ステビオール、ペンタ−グリコシル化ステビオール、ヘキサ−グリコシル化ステビオール、及びヘプタ−グリコシル化ステビオールの（ｇ／ＬのＲｅｂＤ当量での）合計として計算した、ステビオールグリコシドの測定されたレベルに基づいて、流加発酵の合計ステビオールグリコシド値を計算した。結果を表１に示す。
【表１】
2019513392.tif 000002
【０２０６】
ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について、対照株と比較して、１３−ＳＭＧ及びＲｅｂＤ蓄積の減少ならびにＲｅｂＡ及びＲｅｂＭ蓄積の増加が観察された。更に、ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ蓄積レベルは、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２の過剰発現時に増加した一方で、実験株によって産生された合計ステビオールグリコシドは、無視できるほどにしか増加しなかった。加えて、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について、対照株と比較して、０．２未満のＲｅｂＤ／ＲｅｂＭ比が観察された。
【０２０７】
実施例３：ＵＧＰ１、ＰＧＭ２活性アッセイ
実施例２に記載されるＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＵＧＰ１、及びＹＮＫ１を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株及び対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（実施例１に記載されるステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株）の培養物での流加発酵を、グルコース、硫酸アンモニウム、微量金属、ビタミン、塩、及び緩衝液を含む最少培地内、およそ１６時間の成長相で、３０℃、２Ｌの発酵槽内で好気的に実行し、その後、グルコース包含限定供給培地でおよそ１００時間の供給相を続けた。６．０近くのｐＨ及びグルコース制限条件を維持した。（細胞を除去することなく）全培養物試料を分析して、ＰＧＭ及びＵＧＰの活性レベルを決定した。
【０２０８】
両方のアッセイについて、凍結した発酵細胞ペレットを、４４のＯＤ６００になるまで、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｙ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。試料を２５℃で３０分間振盪し、その後１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、氷上で保管した。
【０２０９】
ＰＧＭ酵素アッセイは、共役活性アッセイに依存し、ここでは、供給されるグルコース−１−リン酸がまず、細胞溶解物を含有するＰＧＭポリペプチド／ＰＧＭポリペプチドによってグルコース−６−リン酸に変換され、その後、β−ＮＡＤＰ＋消費下、（過剰量の精製された酵素としてアッセイに添加される）グルコース−６−リン酸によってグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによってスホグルコノラクトンに変換される。３４０ｎｍでの吸光度を監視することによって、放出される随伴性β−ＮＡＰＤＨの動態を記録する。
【０２１０】
１８０ｍＭのグリシルグリシン（ｐＨ７．４）（ＮａＯＨ／ＨＣｌで調整）、５．０ｍＭのグルコース−１−リン酸、３．００ｍＭのβ−ＮＡＤＰ＋、０．４ｍＭのＧ１，６−ビスリン酸、３０ｍＭのＭｇＣｌ２、４３ｍＭのＬ−システイン、０．６５Ｕ／ｍｌのＧ６Ｐ−ＤＨ、及び以前に保管していた細胞溶解物を、異なる細胞溶解物／緩衝液濃度（０．５体積％、１体積％、２体積％、及び３体積％）で、３０℃でともに混合した。β−ＮＡＰＤＨの放出の動態を、添加される上清の各濃度について最大１０００秒間にわたって経過観察した。各細胞溶解物／緩衝液濃度のＰＧＭ活性を、ＯＤ３４０対時間の曲線の最大勾配によって定義した。細胞溶解物／緩衝液濃度で補正したＵＧＰ活性を、細胞溶解物／緩衝液濃度の関数としてのＯＤ３４０／秒の曲線の勾配と定義した。特定の株についてこの方法で得られた値は、他の株に由来する値と比較することができ、ＰＧＭ活性の差異を指摘することができる。対照株の増加に対する、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＵＧＰ１、及びＹＮＫ１を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の細胞溶解物の活性の増加を、以下の表３に示す。
【０２１１】
ＵＧＰアッセイは、酵母ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼの共役活性アッセイに依存し、ここでは、供給されるグルコース−１−リン酸がまず、ＵＴＰ消費下、ＵＧＰポリペプチド／ＵＧＰポリペプチド含有細胞溶解物によってＵＤＰ−グルコースに変換され、その後、β−ＮＡＤ＋消費下、（過剰量の精製された酵素としてアッセイに添加される）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼによってＵＤＰ−グルクロン酸及びβ−ＮＡＤＨにＵＤＰ−グルコース変換される。３４０ｎｍでの吸光度の変化を監視することによって、β−ＮＡＤＨの放出の動態を経過観察する。例えば、非限定的に、ＵＤＰ−グルコースの定量化のためのタンデム質量分析に共役した、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（Ｗａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１４２３，ｐｐ．１８３−１８９（２０１６）を参照されたい）を使用する、代替的なＵＧＰアッセイもまた使用することができる。
【０２１２】
１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのβ−ＮＡＤ＋、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＡＴＰ、０．１２ｍｇ／ｍｌのＵＤＰＧ−ＤＨ、５ｍＭ、及び以前に保管していた細胞溶解物を、異なる上清／緩衝液濃度（０．５体積％、１体積％、１．５体積％、及び２体積％）で、３０℃でともに混合した。β−ＮＡＤＨの放出の動態を、各上清／緩衝液濃度について最大１０００秒間にわたって経過観察した。各細胞溶解物／緩衝液濃度のＵＧＰ活性を、ＯＤ３４０対時間の曲線の最大勾配によって定義した。細胞溶解物／緩衝液濃度で補正したＰＧＭ活性を、細胞溶解物／緩衝液濃度の関数としてのＯＤ３４０／秒の曲線の勾配と定義した。特定の株についてこの方法で得られた値は、他の株に由来する値と比較することができ、ＵＧＰ活性の差異を指摘することができる。対照株の増加に対する、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＵＧＰ１、及びＹＮＫ１を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の溶解物の活性の増加を、以下の表２に示す。
【表２】
2019513392.tif 000003
【０２１３】
流加発酵の個々の及び合計ステビオールグリコシド値を、実施例２に従って計算した。結果を表３に示す。
【表３】
2019513392.tif 000004
【０２１４】
ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について、対照株と比較して、ＵＧＰ及びＰＧＭ活性の両方の増加が観察された。表３に示されるように、ＲｅｂＤ及び合計ステビオールグリコシド蓄積は、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２の過剰発現時に増加した。特定の理論に拘束されるものではないが、この結果は、増加するＵＧＰ及びＰＧＭ活性（すなわち、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を発現することによって）が、部分グリコシル化ステビオールグリコシドのより高分子量のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤを含む）への変換を可能にすることを示唆する。
【０２１５】
実施例４：ＬＣ−ＭＳ分析手順（ＵＤＰ−グルコース分析）
陰イオン化モードで動作する、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に共役した、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＡＬオートサンプラーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ＳｅＱｕａｎｔ  ＺＩＣ−ｃＨＩＬＩＣカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、３．０μｍの分析カラム、１００Åの細孔径）を有する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｃｃｅｌａ  ＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ＬＣ−ＭＳ分析を実行した。２つの移動相、つまり、Ａ（０．１％の酢酸アンモニウムを有する水）及びＢ（ＭｅＣＮ）の勾配を使用して、化合物分離を達成した。時間０分で１５％のＡを０．５分まで保持し、時間１５．５０分で５０％のＡまで増加させ、時間１７．５０分まで保持し、時間１７．６０分で１５％のＡまで低減させ、２５．５０分まで１５％のＡで平衡化する勾配を使用することによって、分離を達成した。流量は０．３ｍＬ／分であり、カラムは室温で維持した。１３０〜１４００ｍ／ｚの質量範囲のフルスキャン分析によって、ＵＤＰ−グルコースを監視した。ＵＤＰ−グルコースに対応する５６５．０４４９２〜５６５．０５０５８のＥＩＣ（抽出されたイオンクロマトグラム）を抽出し、確証的な標準に対して比較することによって定量化した。ＵＤＰ−グルコースのｍ／ｚトレース及び保持時間値については、表４を参照されたい。
【表４】
2019513392.tif 000005
【０２１６】
ＵＤＰ−グルコースの細胞内濃度を決定するために、完全発酵ブロスを、異なる発酵段階中の所望される時点で（シリンジを介して）サンプリングした。バイオマス（細胞）を遠心分離によって素早く分離させ、上清を除去した。細胞ペレットを反応停止させ、メタノールと、クロロホルムと、緩衝水溶液との混合物を使用して抽出した。最終細胞内抽出を、ＬＣ−ＭＳ分析前、−８０℃で保管した。
【０２１７】
実施例５：ＵＤＰ−グルコース蓄積定量化
実施例２に記載される、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＵＧＰ１、及びＹＮＫ１を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、ならびに対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＹＮＫ１ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１２２、配列番号１２３）、ＰＧＭ１ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１、配列番号２）、ＰＧＭ２ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１１８、配列番号１１９）、ＵＧＰ１ポリペプチドをコードする天然遺伝子（配列番号１２０、配列番号１２１）、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１９、配列番号２０）、切断型ＣＤＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号３９、配列番号４０）、ＫＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５１、配列番号５２）、ＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５９、配列番号６０）、ＫＡＨｅ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９３、配列番号９４）、ＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号８５、配列番号８６）、ＣＰＲ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号７７、配列番号７８）、ＡＴＲ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９１、配列番号９２）、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５／配列番号６、配列番号７）、及びＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号３、配列番号４）を含み、発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株）の培養物での流加発酵を、グルコース、硫酸アンモニウム、微量金属、ビタミン、塩、及び緩衝液を含む最少培地内、およそ１６時間の成長相で、３０℃、２Ｌの発酵槽内で好気的に実行し、その後、グルコース包含限定供給培地でおよそ１００時間の供給相を続けた。６．０近くのｐＨ及びグルコース制限条件を維持した。（細胞を除去することなく）全培養物試料をＬＣ−ＵＶによって分析して、実施例２に従ってステビオールグリコシドのレベルを決定し、ＬＣ−ＭＳによって分析して、実施例４に従ってＵＤＰ−グルコースの細胞内レベルを分析した。結果を表５〜６に示す。
【表５】
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【表６】
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【０２１８】
ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について、対照株と比較して、最大３００％までのＵＤＰ−グルコース蓄積の増加が観察された。ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ蓄積レベルは、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２の過剰発現時に増加し、この結果は、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭなどのより高い分子量のステビオールグリコシドの産生に対する、ＵＤＰ−グルコース生合成経路遺伝子の発現の有益な効果を更に実証する。
【０２１９】
当業者であれば、ＵＤＰ−グルコースの総量の改善とＵＤＰ−グルコースの再利用との差異を理解するだろう。上記の表６に示されるように、発酵時間にわたる最高値及び最低値を見ると、親株における最低の減少は２．５倍である一方で、ＵＤＰ−グルコースブーストした株（すなわち、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株）における最低の減少は１．９倍である。これは、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２の過剰発現が、ＵＤＰ−グルコースプール及びＵＤＰ−グルコースを増加させることを実証する。実際、正味増加（消費／形成）は、ＵＤＰ−グルコースブーストした株においてより高い。
【０２２０】
特定の理論に拘束されるものではないが、実施例２〜５に観察された結果は、増加するＵＤＰ−グルコースレベル（すなわち、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を発現することによって）が、１３−ＳＭＧ及び他の部分グリコシル化ステビオールグリコシドのより高分子量のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭを含む）への変換を可能にすることを示唆する。更に、例えば、ＲｅｂＭ及び／またはＲｅｂＤの蓄積レベルの増加の大きさと、合計ステビオールグリコシドの蓄積レベルの増加の大きさとの差異は、ＵＤＰ−グルコースレベルの維持及び／または増加が、より高い分子量のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭを含む）のより効率的な産生を可能にする（すなわち、産生されるステビオールグリコシドのプロファイルを、より低い分子量のステビオールグリコシドとは離れたものに変化させることによって）ことを示唆する。
【０２２１】
実施例６：異種ＵＧＰ１及びＰＧＭ２の発現
実施例２に記載される、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、ｐＰＤＣ１プロモーター（配列番号１５３）及びｔＣＹＣ１ターミネーター（配列番号１５４）に動作可能に連結される、ＵＧＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１３２、配列番号１３３）、ならびにｐＴＰＩ１プロモーター（配列番号１５２）及びｔＡＤＨ１ターミネーター（配列番号１５５）に動作可能に連結される、ＰＧＭ２ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１４４、配列番号１４５）を含むベクターで形質転換した。
【０２２２】
形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株及び対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ステビアＫＡＨポリペプチド、ＫＡＨポリペプチドをコードする組み換え遺伝子及びＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含み、発現するように更に操作した、実施例２に記載されるステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株）の培養物での流加発酵を、グルコース、硫酸アンモニウム、微量金属、ビタミン、塩、及び緩衝液を含む最少培地内、およそ１６時間の成長相で、３０℃、２Ｌの発酵槽内で好気的に実行し、その後、グルコース包含限定供給培地でおよそ１００時間の供給相を続けた。６．０近くのｐＨ及びグルコース制限条件を維持した。（細胞を除去することなく）全培養物試料をＬＣ−ＵＶによって分析して、実施例２に記載されるように、ステビオールグリコシドのレベルを決定した。結果を表７に示す。
【表７】
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【０２２３】
ＰＧＭ２及びＵＧＰ１を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について、対照株と比較して、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ蓄積の増加が観察された。更に、実験株によって産生された合計ステビオールグリコシドもまた、増加した。特定の理論に拘束されるものではないが、表７に観察された結果は、増加するＵＤＰ−グルコースレベル（すなわち、ＵＤＰ−グルコース生合成経路に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を発現することによって）が、１３−ＳＭＧ及び他の部分グリコシル化ステビオールグリコシドのより高分子量のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭを含む）への変換を可能にすることを示唆する。
【０２２４】
実施例７：ＬＣ−ＭＳ分析手順（ステビオールグリコシド分析）
陰イオン化モードで動作する、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＴＱＤ三連四重極型質量分析計に共役した、プレカラム（２．１×５ｍｍ、１．７μｍの粒子、１３０Åの細孔径）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍの粒子、１３０Åの細孔径）を有する、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で、ＬＣ−ＭＳ分析を実行した。２つの移動相、つまり、Ａ（０．１％のギ酸を有する水）及びＢ（０．１％のギ酸を有するＭｅＣＮ）の勾配を使用して、０．３〜２．０分間に２０％〜５０％のＢへと増加させ、２．０１分で１００％のＢまで増加させ、１００％のＢを０．６分間保持し、０．６分間再平衡化することによって、化合物分離を達成した。流量は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃に設定した。ＳＩＭ（単一イオン監視）を使用して、ステビオールグリコシドを監視し、確証的な標準に対して比較することによって定量化した。検出されたステビオール前駆体のステビオールグリコシド及びグリコシドのｍ／ｚトレース及び保持時間値については、表１を参照されたい。
【表８】
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【０２２５】
ステビオールグリコシドは、本明細書に記載される方法を使用して単離され得る。例えば、発酵後、培養ブロスを４℃、７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞を除去しても、濾過によって細胞を除去してもよい。無細胞溶解物は、例えば、宿主細胞の機械的破壊または酵素的破壊、及び細胞細片を除去するための追加の遠心分離によって得ることができる。乾燥ブロス材料の機械的破壊はまた、超音波処理などによっても実行され得る。溶解または懸濁したブロス材料は、分取クロマトグラフィーなどによって、更なる精製前にミクロンまたはサブミクロンフィルターを使用して濾過され得る。発酵培地または無細胞溶解物は、塩などの低分子量化合物を除去するために任意で処理され得、かつ精製前に任意で乾燥され、水と溶媒との混合物中に再溶解され得る。上清または無細胞溶解物は、以下のように精製され得る。カラムを、例えば、ＨＰ２０  Ｄｉａｉｏｎ樹脂（芳香族型合成吸着剤、Ｓｕｐｅｌｃｏ）または別の好適な非極性吸着もしくは逆相クロマトグラフィー樹脂で充填し得、上清または無細胞溶解物のアリコートをカラム上に充填し、水で洗浄して、親水性構成成分を除去し得る。ステビオールグリコシド産生物が、水中溶媒濃度の段階的な増分増加、または例えば、０％→１００％のメタノールの勾配によって溶出され得る。その後、通過画分を含む、各画分中のステビオールグリコシド、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸のレベルを、ＬＣ−ＭＳによって分析し得る。その後、画分を組み合わせ、真空蒸発器を使用して体積を低減させ得る。所望される場合、追加のクロマトグラフィーステップ及び結晶化などの追加の精製ステップが利用され得る。
【０２２６】
実施例８：異種ＵＧＰ１の発現
実施例２に記載される、ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現するステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、以下の表９に要約されるように、ｐＴＤＨ３プロモーター（配列番号１５０）及びｔＣＹＣ１ターミネーター（配列番号１５４）に動作可能に連結される、ＵＧＰ１ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含むベクター（配列番号１３２、配列番号１３３）で形質転換した。
【表９】
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【０２２７】
表９に提供される形質転換された株の単一コロニー、及びブランクベクターで形質転換された対照株を、９６ウェルプレート内、５００μＬのＤｅｌｆｔ培地中で、２８０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間成長させた。その後、各株の５０μＬの細胞培養物を第２の９６ウェルプレートに移動させ、４５０μＬの時間内供給（Ｆｅｅｄ−ｉｎ−Ｔｉｍｅ）培地（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ  ＧｍｂＨ，Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中、２８０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４日間成長させた。１００μＬの細胞溶液を１００μＬのＤＭＳＯで抽出し、混合されるまでボルテックスし、８０℃で１０分間インキュベートすることによって、ＬＣ−ＭＳ分析のための試料を調製した。１５，０００ｇ、１０分間の遠心分離によって、結果として得られる抽出物を浄化した。ＬＣ−ＭＳ注入のために、２０μＬの上清を１４０μＬの５０体積％のＤＭＳＯで希釈した。ＬＣ−ＭＳデータを、ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定される、１００μＬの細胞溶液と１００μＬの水との混合物のＯＤ６００に対して正規化した。
【０２２８】
ＬＣ−ＭＳ分析を、実施例７に従って実行した。μＭ／ＯＤ６００での化合物の全培養物蓄積を、ＬＣ−ＭＳによって既知の標準に対して定量化した。結果を以下の表１０に示す。各値は、６つの独立したクローンの平均である。
【表１０】
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【０２２９】
ＵＧＰ１、ＹＮＫ１、ＰＧＭ１、及びＰＧＭ２を過剰発現し、異種ＵＧＰ１を更に発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株について、対照株と比較して、最大約６００％までのステビオールグリコシド蓄積の増加が観察された。ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ蓄積レベルは、異種ＵＧＰ１の発現時に増加し、この結果は、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭなどのより高い分子量のステビオールグリコシドの産生に対する、異種ＵＤＰ−グルコース生合成経路遺伝子の発現の有益な効果を更に実証する。
【０２３０】
本発明を、詳細に、かつその具体的な実施形態を参照することによって説明したが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を逸脱せずに、修正及び変更が可能であることは明らかだろう。より具体的には、本発明のいくつかの態様が、特に有利なものとして本明細書に特定されているものの、本発明は、本発明のこれらの態様に必ずしも限定されないことが企図される。
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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