(57)【要約】核酸を配列決定する方法が提供される。（１）核酸の漸進的酵素消化によって単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成し、（２）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、少なくとも１つの単一ヌクレオシド三リン酸を、（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位と、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位と、該捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域とを含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチド隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、対応する第１のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド使用プローブを作製し、（３）前記第１の使用プローブの第１のオリゴヌクレオチド鎖を第１のニッキング部位で第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして個々の第１のオリゴヌクレオチド成分を作製し、（４）前記使用プローブの相補鎖から工程（３）で生成した前記第１のオリゴヌクレオチド成分を分離し、（５）リガーゼの存在下で、少なくとも１つの分離された前記第１のオリゴヌクレオチド成分を、（ｃ）第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含み、実質的に検出不可能な状態のフルオロフォアを有する相補的第４のオリゴヌクレオチド、および任意に、（ｄ）前記第４のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドを含む、対応する第２のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第２の使用プローブを作製し、（６）前記第２の使用プローブの第４のオリゴヌクレオチド鎖を第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、個々の第４のオリゴヌクレオチド成分を作製し、それらの少なくともいくつかは、検出可能な状態のフルオロフォアと、少なくとも部分的に前記第４のオリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖の第６のオリゴヌクレオチドとを有し、（７）工程（６）で放出されたフルオロフォアを検出する工程により特徴づけられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を配列決定する方法であって、
（１）核酸の漸進的酵素消化により単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成し、
（２）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、少なくとも１つの単一ヌクレオシド三リン酸を、
（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位と、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位と、該捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域とを含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチド隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
を含む、対応する第１のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド使用プローブを作製し、
（３）前記第１の使用プローブの第１のオリゴヌクレオチド鎖を第１のニッキング部位で第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして個々の第１のオリゴヌクレオチド成分を作製し、
（４）前記使用プローブの相補鎖から工程（３）で生成した前記第１のオリゴヌクレオチド成分を分離し、
（５）リガーゼの存在下で、少なくとも１つの分離された前記第１のオリゴヌクレオチド成分を、
（ｃ）第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含み、実質的に検出不可能な状態のフルオロフォアを有する相補的な第４のオリゴヌクレオチドと、任意に、
（ｄ）前記第４のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドと、
を含む、対応する第２のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第２の使用プローブを作製し、
（６）前記第２の使用プローブの第４のオリゴヌクレオチド鎖を第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、個々の第４のオリゴヌクレオチド成分を作製し、それらの少なくともいくつかは、検出可能な状態のフルオロフォアと、少なくとも部分的に前記第４のオリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖の第６のオリゴヌクレオチドとを有し、
（７）工程（６）で放出された前記フルオロフォアを検出する工程により特徴づけられる、方法。
【請求項２】
工程（３）および（４）が第１のサイクルで繰り返されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（６）で生成された前記第６のオリゴヌクレオチドを前記第４のオリゴヌクレオチドのさらなる分子と反応させ、その後、工程（６）を繰り返して第２のサイクルを作り出すことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第４のオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの消光剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドリンカー領域によって連結されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の使用プローブの相補鎖が閉ループを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のニッキング部位が前記捕捉部位を含むオリゴヌクレオチド領域であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１および第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼが同一であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼがいずれかまたは両方が従来の制限エンドヌクレアーゼであり、ニッキングされたものに対して相補的な前記第１および／または第２の使用プローブの鎖はヌクレオチド鎖切断に対する抵抗性を付与されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
最大４つの異なる第２のプローブ型が用いられ、それぞれの前記第４のオリゴヌクレオチドが、異なるフルオロフォアおよび異なる第１のオリゴヌクレオチド成分に相補的な領域を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
最大４つの異なる１次プローブ型が用いられ、それぞれの前記第１のオリゴヌクレオチドが、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの特徴的な核酸塩基の１つ、および、任意に、実質的に検出不可能な状態での異なるフルオロフォアに対して選択的な捕捉部位を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（１）が対応する微小液滴中に各単一ヌクレオシド三リン酸を含有することをさらに含み、工程（２）〜（７）が各微小液滴中で行われるかまたは各微小液滴に対して行われる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（１）第１のプローブであって、
（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位、および前記第１の捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域を含む、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
を含む、第１のプローブと、
（２）第２のプローブであって、
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な一本鎖の領域を有し、かつ、第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含む、実質的に検出不可能な状態でフルオロフォアを有する少なくとも部分的に一本鎖の第４のオリゴヌクレオチドと、任意に、
（ｄ）前記第４のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドと、
を含む、第２のプローブと、
を含むことを特徴とする多成分生物学的プローブシステム。
【請求項１４】
１以上のポリメラーゼ、リガーゼ、並びに前記第１および第２のプローブが使用されたとき、前記第１および第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位をニッキングすることができる少なくとも１つのニッキング制限エンドヌクレアーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の多成分生物学的プローブシステム。
【請求項１５】
単一ヌクレオシド三リン酸を分析する方法であって、
（１）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、単一のヌクレオシド三リン酸を、
（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位、および該捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域を含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチド隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
を含む、対応する第１のプローブと反応させることにより、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド使用プローブを作製し、
（２）前記第１の使用プローブの第１のオリゴヌクレオチド鎖を第１のニッキング部位で第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、個々の第１のオリゴヌクレオチド成分を作製し、
（３）前記使用プローブの相補鎖から工程（２）で生成した前記第１のオリゴヌクレオチド成分を分離し、
（４）リガーゼの存在下で、少なくとも１つの分離された前記第１のオリゴヌクレオチド成分を、
（ｃ）第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含み、実質的に検出不可能な状態でフルオロフォアを有する相補的な第４のオリゴヌクレオチドと、任意に、
（ｄ）前記第４のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドと
を含む、対応する第２のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の２次使用プローブをを作製し、
（５）前記第２の使用プローブの第４のオリゴヌクレオチド鎖を第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、少なくともその一部が検出可能な状態でフルオロフォアを有する個々の第４のオリゴヌクレオチド成分を作製し、それらの少なくともいくつかは、検出可能な状態のフルオロフォアと、少なくとも部分的に前記第４のオリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖の第６のオリゴヌクレオチドとを有し、
（６）工程（５）で放出された前記フルオロフォアを検出する工程により特徴づけられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一ヌクレオチドを検出および特徴付けるための方法および関連する生物学的プローブシステムに関する。それはＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定における使用に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
遺伝物質の次世代シーケンシングは、シーケンシングの単価がますます速くなるシーケンシング機の市場投入に合わせて低下しているため、すでに生物科学全般、特に医学に大きな影響を与えている。
【０００３】
我々の以前の出願である国際公開第２０１４／０５３８５３号、国際公開第２０１４／０５３８５４号、国際公開第２０１４／１６７３２３号、国際公開第２０１４／１６７３２４号および国際公開第２０１４／１１１７２３号では、単一のヌクレオチドの規則正しいストリーム（流れ）、好ましくは単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを発生させることができ、そのそれぞれは微小液滴ストリーム中の対応する液滴に一つずつ捕獲することができる、ポリヌクレオチド分析物の漸進的消化を含む新しい配列決定方法を記載している。その後、各液滴を化学的および／または酵素的に操作して、それが元々含まれていた特定の単一ヌクレオチドを明らかにすることができる。一実施形態では、これらの化学的および／または酵素的操作は、分析物が構成される単一ヌクレオチド型のうちの１つを選択的に捕捉することができるようになっている１つまたは複数の二成分オリゴヌクレオチドプローブ型の使用を伴う方法を含む。典型的には、そのようなプローブ型のそれぞれにおいて、２つのオリゴヌクレオチド成分のうちの一方は特徴的なフルオロフォアを含み、プローブの未使用状態では、これらのフルオロフォアの蛍光発光能力は、自己消光によりまたは近接した消光剤が存在するために消滅したままである。使用時に、プローブがその対応する単一ヌクレオチドを捕捉すると、それはその後のエキソヌクレオリシス（exonucleolysis）を受けやすくし、それによって消光剤からフルオロフォアを遊離させ、および／または互いにそれらが自由に蛍光を発することを可能にする。これにより、各液滴中に存在する元の単一ヌクレオチドは、分光学的手段によって間接的に推論することができる。
【０００４】
この方法の変形例は、国際公開第２０１４０５３８５号、および国際公開第２０１６０１２７８９号を含む我々の係属中の他の出願に記載されており、後者は三成分プローブシステムの使用を含む。
具体的には、国際公開第２０１６０１２７８９号には、
（１）核酸の漸進的酵素消化により単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成し、（２）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、少なくとも１つの単一ヌクレオシド三リン酸を、（ａ）例えば、検出不可能な状態の特徴的なフルオロフォアで標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、対応するプローブシステムと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖のオリゴヌクレオチド使用プローブを作製し、（３）使用プローブを二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で消化して、検出可能な状態のフルオロフォアと、少なくとも部分的に第１のオリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖の第４のオリゴヌクレオチドとを得て、（４）第４のオリゴヌクレオチドを他の第１のオリゴヌクレオチドと反応させて、使用プローブに対応する実質的に二本鎖のオリゴヌクレオチド生成物を生成し、（５）サイクルにおいて工程（３）および（４）を繰り返し、（６）工程（３）の各繰り返しにおいて放出されたフルオロフォアを検出することにより特徴づけられる方法が記載される。この方法は、サイクル中に工程（３）および（４）を繰り返すことによって蛍光シグナルを強く増大させることができ、それによって全体的な感度、したがってヌクレオチド検出の信頼性を向上させることができるという利点を有する。一実施形態において、第２および第３のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド捕捉後に、それらがエキソヌクレオリシスに対して有利に耐性である閉ループ一本鎖オリゴヌクレオチド成分を形成するように連結される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
他の先行技術に関しては、Nature Reviews Genetics 7(8) 632-644 (2006)のＦａｎらがジェノタイピング、コピー数測定、シークエンシングおよびヘテロ接合性の喪失検出、対立遺伝子特異的発現およびメチル化のための高度にパラレルなゲノムアッセイを可能にした方法およびプラットフォーム開発の一般的な概説を提供している。このレビューの図２ａは、分析物の一塩基多型（ＳＮＰ）部位の上流および下流にアニールする３’および５’末端を持つ環状プローブの使用を概略的に示しており、これにより、その後ＳＮＰの相補体であるヌクレオチドで埋められたギャップを残して、その後、放出後に増幅され得る完全な環状プローブを形成する。しかしながら、我々の方法とは異なり、充填プロセス中に捕捉されるヌクレオチドは、分析物自体から直接得られない。
【０００６】
国際公開第０３０８０８６１号は、核酸分析物が、ヌクレオチドが放出されるにつれてヌクレオチドに直接付着するヌクレオチド特異的反応性標識の存在下で進行性ピロリン酸分解に付される方法を開示している。これが我々が採用する方法とは全く異なるだけでなく、実際には、標識されたヌクレオチドが続いて調べられるときに測定される蛍光シグナルはおそらく関連するバックグラウンドノイズより高い信頼できる同定を可能にするには弱すぎるようである。
【０００７】
最後に、国際公開第９４１８２１８号は、分析物が進行性エキソヌクレオリシスに供されて、単一ヌクレオチド二リン酸または一リン酸のストリームを生成し、次いで検出される前に蛍光増強マトリックスに組み込まれるＤＮＡ配列決定方法を教示している。これは、ここで説明したものとはまったく異なるアプローチであるだけでなく、生成されたいずれの信号も信頼性の高い方法で検出および識別するには弱すぎる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここで、我々は、我々が前述した液滴ベースのシーケンサーと共に使用するのに適しているさらに強い蛍光シグナルを生成する改良された方法を発明した。したがって、本発明によれば、
（１）核酸の漸進的酵素消化により単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成し、
（２）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、少なくとも１つの単一ヌクレオシド三リン酸を、
（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位と、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位と、該捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域とを含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチド隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
を含む、対応する第１のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド使用プローブを作製し、
（３）前記第１の使用プローブの第１のオリゴヌクレオチド鎖を第１のニッキング部位で第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして個々の第１のオリゴヌクレオチド成分を作製し、
（４）前記使用プローブの相補鎖から工程（３）で生成した前記第１のオリゴヌクレオチド成分を分離し、
（５）リガーゼの存在下で、少なくとも１つの分離された前記第１のオリゴヌクレオチド成分を、
（ｃ）第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含み、実質的に検出不可能な状態のフルオロフォアを有する相補的第４のオリゴヌクレオチド、および任意に、
（ｄ）前記第４のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドと
を含む、対応する第２のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第２の使用プローブを作製し、
（６）前記第２の使用プローブの第４のオリゴヌクレオチド鎖を第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、個々の第４のオリゴヌクレオチド成分を作製し、それらの少なくともいくつかは、検出可能な状態のフルオロフォアと、少なくとも部分的に前記第４のオリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖の第６のオリゴヌクレオチドとを有し、
（７）工程（６）で放出された前記フルオロフォアを検出する
工程により特徴づけられる、核酸を配列決定する方法が提供される。
【０００９】
１つの好ましい実施形態では、工程（４）で生成された相補鎖を第１のオリゴヌクレオチドのさらなる分子と反応させ、工程（３）および（４）を下記のように第１のサイクルで反復して、工程（７）で検出のために解放されるフルオロフォアの数を有意に増加させる。別の実施形態では、工程（６）で生成された第６のオリゴヌクレオチドを第４のオリゴヌクレオチドのさらなる分子と反応させ、その後工程（６）を繰り返して第２のサイクルを作り出す。好ましくは、本発明の方法は、第１および第２のサイクルの両方を用いた反復を含む。
【００１０】
本発明の方法の工程（１）は、漸進的酵素消化によって核酸分析物から単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成することを含む。一実施形態では、これは、分析物の進行性エキソヌクレアーゼ分解、続いて得られた単一ヌクレオシド一リン酸に対するキナーゼの作用によって達成することができる（例えば、Bao and Ryu, Biotechnology and Bioengineering DOI 10.1002/bit (May 2007)を参照）。別の実施形態では、工程（１）は、進行性ピロリン酸分解によって分析物から直接単一ヌクレオシド三リン酸のストリームを生成することを含む。この工程で使用される分析物は適切には二本鎖ポリヌクレオチドであり、その長さは原則として無制限であり得、例えば、ヒト遺伝子または染色体断片に見いだされる最大数百万のヌクレオチド対を含む。しかしながら、典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも５０、好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド対の長さであり、適切にはそれは５００を超え、１０００を超え、そして多くの場合数千のヌクレオチド対長である。分析物それ自体は、好ましくは天然起源のＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、植物、動物、細菌またはウイルスに由来する）であるが、本方法は、合成的に生成されたＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはその核酸塩基が天然では一般的に見られない、すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）以外の核酸塩基であるヌクレオチドの全体的または部分的に構成される他の核酸を配列決定するためにも使用できる。このような核酸塩基の例には、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプズウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ウィブトキソシン、ウィブトシン、シュードウリジン、クエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンおよび２−Ｏ−メチルウリジンが含まれる。ＤＮＡの場合、生成される単一ヌクレオシド三リン酸はデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、一方、ＲＮＡの場合、それらはリボヌクレオシド三リン酸である。
【００１１】
方法の一実施形態では、工程（１）は、分析物を基板に付着させる第１のサブステップをさらに含む。典型的には、この基板は、マイクロ流体表面、マイクロビーズまたは透過膜を含み、例えば、ガラス製または非分解性ポリマー製のものが挙げられる。好ましくは、基材は、分析物を受容するように特に適合された表面をさらに含む。分析物をそのような表面に付着させることができる多くの方法があり、そのいずれも原則的にこのサブ工程で使用することができる。例えば、一つの方法はエポキシシラン、アミノヒドロカルビルシランまたはメルカプトシランのような官能化シランでガラス表面を下塗りすることを含む。そのようにして生成された反応部位は、末端アミン、スクシニルまたはチオール基を含むように修飾された分析物の誘導体で処理することができる。
【００１２】
工程（１）の別の実施形態では、分析物はピロリン酸分解されて、その順序が分析物の配列の順序に対応する単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成する。そのような加ピロリン酸分解は、２０〜９０℃の範囲の温度で、例えば、適切なポリメラーゼを含む反応媒体の存在下で実施することができる。好ましくは、単一のヌクレオシド三リン酸が遊離するにつれて反応域から連続的に除去されるように、連続流の条件下で行われる。最も好ましくは、加ピロリン酸分解は、酵素および他の典型的な添加剤を含有する水性緩衝媒体を分析物が結合している表面上に連続的に流動させることによって行われる。
【００１３】
さらに別の実施形態では、使用される酵素は、分析物の進行性の３’−５’ピロリン酸分解を引き起こし、高適合度で妥当な反応速度でヌクレオシド三リン酸のストリームを生じさせることができるものである。好ましくは、この分解速度は可能な限り速く、そして一実施態様では毎秒１から５０ヌクレオシド三リン酸の範囲である。
【００１４】
ポリヌクレオチドの消化に適用される加ピロリン酸分解反応に関するさらなる情報は、例えば、J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028でみることができる。適切には、加ピロリン酸分解消化は、ピロリン酸アニオンおよびマグネシウムカチオンをさらに含む媒体の存在下で行われ、好ましくはミリモル濃度である。
【００１５】
本発明の方法の工程（２）において、ストリーム中の少なくとも１つの単一ヌクレオシド三リン酸、好ましくは各単一ヌクレオシド三リン酸を、ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で第１のプローブと反応させて、実質的に二本鎖の第１の使用プローブを生成する。好ましくは、この工程を実施する前に、工程（１）の生成物をピロホスファターゼで処理して、残留ピロリン酸をリン酸アニオンに加水分解する。
【００１６】
有利に使用することができるポリメラーゼの例には、原核生物ｐｏｌ  １酵素、または大腸菌（例えば、クレノウフラグメントポリメラーゼ）、テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）（例えば、Ｔａｑ  Ｐｏｌ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・カルドベックス（Bacillus caldovelox）、およびバチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）のような細菌から得られる酵素誘導体が含まれるが、これらに限定されない。原則として、任意の適切なリガーゼをこの工程で使用することができる。
【００１７】
工程（２）で使用される各第１のプローブは、適切には、
（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位、ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位、および捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域を含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、および
（ｂ）隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。一実施形態では、第２および第３のオリゴヌクレオチドは別々の実体であり、別の実施形態では、それらはリンカー領域によって互いに結合している。この後者の場合および一実施形態では、リンカー領域は第２および第３のオリゴヌクレオチドの末端を連結する。リンカー領域は、原則として、任意の二価の基であり得るが、便利には別のオリゴヌクレオチド領域である。一実施形態では、このオリゴヌクレオチドリンカー領域は、第１のオリゴヌクレオチドと実質的にハイブリダイズすることができない。
【００１８】
第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドは、工程（２）において、第２および第３のオリゴヌクレオチドが、捕捉部位の両側に並置された第１のオリゴヌクレオチドの３’側および５’側隣接領域にそれぞれハイブリダイズするように選択される。捕捉部位は、その核酸塩基が、検出されるべきヌクレオシド三リン酸によって担持されるものと相補的である単一のヌクレオチドを含む。これは、３成分の第１のプローブをその特定のヌクレオシド三リン酸に対して高度に選択的にする。例えば、分析物がＤＮＡに由来し、第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドからなる場合、それが含むヌクレオチドがチミン核酸塩基を有する場合、捕捉部位はデオキシアデノシン三リン酸に対して高度に選択的である。したがって、本発明の有用な一実施形態では、ステップ（２）は、複数の第１のプローブタイプからなるプローブシステムの存在下で実施することができ、例えば、それぞれが１、２、３または４つの第１のプローブ型であり、それらはそれぞれ異なる隣接領域および求められる様々な異なる核酸塩基に特徴的な異なる捕捉部位を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む。
【００１９】
典型的には、第１のオリゴヌクレオチドは、１５０ヌクレオチド長まで、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド長である。一実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの相補的３’側隣接領域よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。別の実施形態では、この時点でヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐために、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチド上の反対側のヌクレオチドとの間に１ヌクレオチドミスマッチがある。同様に、一実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの相補的５’側隣接領域よりも少なくとも１ヌクレオチド長く、一方、別の実施形態では、この時点で単一のヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐために、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と第１のオリゴヌクレオチドにおけるその反対側のヌクレオチドとの間に単一ヌクレオチドのミスマッチがある。
【００２０】
好ましい一実施形態では、第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、それ自体が捕捉部位を含む第１のオリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチド領域を含む。一つ以上の第１のプローブ型が使用される別の実施形態では、必要とされる一つの第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼのみが使用されるように、各第１のオリゴヌクレオチドはそれにもかかわらず共通の第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。したがって、これを達成するために、認識部位は、場合によっては、ＲＮＡまたはＤＮＡのそれぞれの典型的なヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む配列からなることが好ましい。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、本明細書で定義される第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼは、第１の使用プローブの両方の鎖を切断することができる従来の制限エンドヌクレアーゼであり、ニッキング部位の領域で第１のプローブの使用中に形成される鎖は、例えば、第２および／または第３のオリゴヌクレオチドに１つ以上のヌクレオチド鎖切断ブロッキング部位を含めることにより、ヌクレオチド鎖切断に対して耐性となる。一実施形態では、これらのブロッキング基は、ホスホロチオエート結合および当該分野で一般的に使用される他の骨格修飾、Ｃ３スペーサー、リン酸基などから選択され得る。
【００２２】
工程（２）は、ストリーム中の各単一ヌクレオシド三リン酸を２０〜８０℃の範囲の温度で上記の酵素および１種以上の第１のプローブ型と接触させることにより適切に実施される。
【００２３】
本発明の方法の工程（２）の生成物は、上記の通り、構成鎖がそれぞれ第１のオリゴヌクレオチド、並びに、第２のオリゴヌクレオチド、単一のヌクレオシド三リン酸に由来するヌクレオチド、および最後に第３のオリゴヌクレオチドからなる相補的オリゴヌクレオチドである、実質的に二本鎖の第１の使用プローブである。第２および第３のオリゴヌクレオチドが以前にリンカー領域によってともに結合されている場合、この相補的オリゴヌクレオチドが閉ループ鎖を含むことは容易に明らかであろう。
【００２４】
工程（３）では、第１の使用プローブは、２０〜１００℃の範囲の温度で第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼで処理される。このステップでは、第１のオリゴヌクレオチドに由来する第１の使用プローブの鎖が２つの個々のオリゴヌクレオチド成分に切断され、その後、これらは工程（４）で、プローブの相補鎖からデハイブリダイズ（de-hybridise）され、これにより、こられは互いに分離される。工程（４）は、ニッキングされた使用プローブを３０〜１００℃の範囲の温度に加熱することによって達成することができるが、最も好ましくは工程（３）で使用されるのと同じ温度で達成される。
【００２５】
工程（５）では、分離されたオリゴヌクレオチド成分の少なくとも１つをリガーゼおよび対応する第２のプローブの存在下で反応させて、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第２の使用プローブを作製する。一実施形態では、この第２のプローブは、検出不可能な状態でフルオロフォアを有する部分的に二本鎖の第４のオリゴヌクレオチド、第２の制限酵素ニッキング部位であり、少なくとも部分的には関連する分離されたオリゴヌクレオチド成分の配列相補体である一本鎖領域からなる。別の実施形態では、この第４のオリゴヌクレオチドは、その構造的特徴に関するさらなる情報について読者が向けられている我々の出願ＷＯ２０１４１６７３２３に記載されているように、ｊ字形である。さらに別の実施形態では、第２のプローブは２つの成分：（ｃ）少なくとも部分的に、工程（３）で作成された分離されたオリゴヌクレオチド成分の１つの配列である一本鎖領域からなり、一本鎖の第４のオリゴヌクレオチド（第２の制限エンドヌクレアーゼ認識部位および検出不可能な状態のフルオロフォアを含む）であって、（ｄ）第４のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列相補体である一本鎖領域から少なくとも部分的に構成される一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドを含む。
【００２６】
１つより多い第２のプローブ型が使用される１つの好ましい実施形態では、それでもなお各第４オリゴヌクレオチドは共通の第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましく、そのため１つの第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼのみが必要とされる。
【００２７】
一つの好ましい実施形態では、第１および第２の制限エンドヌクレアーゼ認識部位は同じであり、共通の第１および第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼを本方法において使用することを可能にする。
【００２８】
それ自身の独特のタイプのフルオロフォアで標識された領域を備え、そしてこれらのフルオロフォアが第２のプローブが未使用状態にあるとき実質的に検出できないようにアレンジされていることが第４のオリゴヌクレオチドの特徴である。好ましくは、それらは、それらが検出されるように設計されている波長において本質的に非蛍光性であるようにアレンジされる。したがって、フルオロフォアは、電磁スペクトルの広い範囲にわたって一般的な低レベルのバックグラウンド蛍光を示すこととしてもよいが、典型的には、蛍光の強度が最大である1つまたは少数の特定の波長または波長エンベロープである。本質的に蛍光が生じず、フルオロフォアが特徴的に検出されるのは、これらの最大値のうちの１つ以上である。この特許の文脈では、「本質的に蛍光を発しない」という用語または同等の用語によって、関連する特徴的な波長または波長エンベロープで第４のオリゴヌクレオチドに結合したフルオロフォアの総数の蛍光強度が同数の遊離フルオロフォアの対応する蛍光強度の、２５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．１％未満であることを意味する。
【００２９】
原則として、第４のオリゴヌクレオチドが未使用の状態でフルオロフォアが本質的に蛍光を発しないようにするために、任意の方法を使用することができる。一実施形態では、これは、それらを消光剤に近接して配置することによって達成される。別の方法では、消光剤が必要とされないようにそれらが互いに十分に消光する傾向があるように、複数のフルオロフォアを互いに近接して配置することによって達成される。この特許の文脈において、フルオロフォア間またはフルオロフォアと消光剤との間の「近接」を構成するものは、使用される特定のフルオロフォアおよび消光剤、そしておそらく第４のオリゴヌクレオチドの構造的特徴に依存するであろう。したがって、この用語はこれらの様々な要素の特定の構造的配置よりもむしろ要求される結果を参照して解釈されるべきであることが意図されている。しかしながら、例示のみを目的として、隣接するフルオロフォアまたは隣接するフルオロフォアと消光剤とが特徴的なフェルスター距離（典型的には５ｎｍ未満）に対応する距離だけ離れている場合、一般に十分なクエンチングが達成されることが指摘される。
【００３０】
フルオロフォア自体に関しては、それらは、原則として、キサンテン部分、例えば、フルオレセイン、ローダミンおよびそれらの誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢなど；クマリン部分（例えば、ヒドロキシ‐、メチル‐、およびアミノクマリン）ならびにシアニン部分、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７、を含むがこれに限定されない、当技術分野で従来使用されているもののいずれかから選択することができる。具体例としては、以下の一般的に使用される染料：アレクサ染料、シアニン染料、アトテック染料、およびローダミン染料から誘導されるフルオロフォアが挙げられる。また、例としては、Atto 633（ATTO-TEC GmbH）、Texas Red（商標）、Atto 740（ATTO-TEC GmbH）、Rose Bengal、Alexa Fluor（商標）750 C5‐マレイミド（Invitrogen）、Alexa Fluor（商標）532 C2‐マレイミド（Invitrogen）およびローダミンレッドＣ２−マレイミドおよびローダミングリーン、ならびにQuasar 570のようなホスホロマダイト染料が挙げられる。あるいは、LI-COR Biosciencesによって供給されるもののような量子ドットまたは近赤外染料を使用することができる。フルオロフォアは、典型的には当該分野で公知の化学的方法を用いて核酸塩基を介して第４のオリゴヌクレオチドに結合される。
【００３１】
適切な消光剤としては、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムによって作用するものが挙げられる。上記のフルオロフォアと関連して使用することができる市販の消光剤の例としては、ＤＤＱ‐１、ダブシル、エクリプス、アイオワブラックＦＱおよびＲＱ、ＩＲダイ‐ＱＣ１、ＢＨＱ‐０、ＢＨＱ‐１、‐２および‐３およびＱＳＹ‐７および‐２１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの隣接領域の少なくとも１つはまた、第１のオリゴヌクレオチドがその未使用状態において実質的に非蛍光性であるように配置された上記のフルオロフォアをさらに含む。別の実施形態では、隣接領域の少なくとも１つは消光剤をさらに含む。
【００３３】
本発明の方法の工程（５）の生成物は、第４のオリゴヌクレオチド、関連オリゴヌクレオチド成分および任意に第５のオリゴヌクレオチドからなる実質的に二本鎖の第２の使用プローブである。
【００３４】
一実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドまたは第１のオリゴヌクレオチド成分は、第４のオリゴヌクレオチドの相補的３’側隣接領域よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。別の例では、この時点でヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐために、第４のオリゴヌクレオチドの３’末端と第５のオリゴヌクレオチドまたは第１のオリゴヌクレオチド成分の反対側のヌクレオチドとの間に単一ヌクレオチドミスマッチがある。同様に、一実施形態では、第５のオリゴヌクレオチドまたは第１のオリゴヌクレオチド成分は、第４のオリゴヌクレオチドの相補的５’側隣接領域よりも少なくとも１ヌクレオチド長く、一方、別の実施形態では、この時点で単一のヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐために、第５のオリゴヌクレオチドまたは第１のオリゴヌクレオチド成分の３’末端と第４のオリゴヌクレオチドの反対側のヌクレオチドとの間に単一ヌクレオチドミスマッチがある。
【００３５】
その後、工程（６）において、第２の使用プローブを第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼで処理して、個々の第４のオリゴヌクレオチド成分を作製する。上記で説明したように、この第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼは、第１および第２のニッキング部位が同じである場合、第１のものと同一であり得る。また、第２の使用プローブの関連鎖が上記のようにヌクレオチド鎖切断に対して耐性にされている場合、第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼは上記のような従来の制限エンドヌクレアーゼであり得ると考えられる。
【００３６】
このニッキングが起こった後、第４のオリゴヌクレオチド成分は、使用された第２の使用プローブのニックのない相補鎖（以下、第６のオリゴヌクレオチドと呼ぶ）から分離され、その時点で、これらの成分上のフルオロフォアは互いにまたは消光剤から分離され、そして検出可能になる。従って、第２の使用プローブのヌクレオチド鎖切断が進行するにつれて、観察者は蛍光シグナルの発生を見る。そしてこの蛍光の特性は、最初に第１のプローブによって捕捉された単一のヌクレオシド三リン酸の性質を間接的に反映する。
【００３７】
当然のことながら、工程（３）および（４）は、工程（４）の後にさらなる第１のオリゴヌクレオチドを第１の使用プローブの相補鎖にアニーリングさせることによって第１のサイクルで繰り返すことができ、したがって、高濃度の関連する分離された第１のオリゴヌクレオチド成分、それによって対応する高濃度の第２の使用プローブを作製することを可能にする。また別の実施形態では、工程（６）で生成された第６のオリゴヌクレオチドをさらなる分子の第４のオリゴヌクレオチドと反応させ、その後工程（６）を繰り返して第２のサイクルを作り出すことができる。したがって、第１および第２のサイクルの両方が同時に繰り返されると、倍増効果が得られる。これにより、蛍光シグナルを非常に迅速に高強度まで増大させることができ、その検出および同定を容易にする。
【００３８】
その後、工程（７）において、工程（６）で遊離したフルオロフォアを検出し、そして単一のヌクレオシド三リン酸に結合した核酸塩基の性質を推論によって決定する。工程（１）で生成された順序付けられたストリーム中の全ての単一ヌクレオシド三リン酸について本発明の方法を体系的に実行することによって、元の核酸分析物の配列に特徴的なデータを生成し分析することができる。これを行う方法は当技術分野において周知であり、例えば、反応媒体をレーザーからの光および様々なフルオロフォアの特徴的な蛍光波長または波長エンベロープに対して調整された光検出器または同等の装置を用いて検出されるあらゆる発生した蛍光により調べることができる。これにより、光検出器は、既知のアルゴリズムを使用してコンピュータ内で処理され分析され得る特徴的な電気信号を生成する。
【００３９】
特に好ましい一実施形態では、本発明の方法は、その少なくとも一部が単一のヌクレオシド三リン酸を含有する微小液滴のストリームの中で全体的または部分的に行われ、適切には順序付けのあるストリームである。このような方法は、例えば、順序付けを維持するのを助けるために、工程（１）で生成されたヌクレオシド三リン酸を、炭化水素またはシリコーン油のような不混和性担体溶媒中に維持される水性微小液滴の対応するストリームに一つずつ挿入することによって開始し得る。あるいは、これは、例えば、反応媒体を適切な寸法の微小液滴ヘッドから溶媒の流動ストリームに出現させることによって、消化（ピロリン酸分解）ゾーンの下流に微小液滴を直接作製することによって達成することができる。あるいは、工程（１）からの反応媒体の小アリコートを、溶媒中に懸濁させた既存の水性微小液滴のストリームに規則的かつ連続的に注入することができる。この後者のアプローチが採用される場合、各微小液滴は、工程（２）〜（６）を達成するのに必要な酵素および他の任意の試薬（例えば緩衝液）と共に、第１および第２のプローブの種々の成分を既に含有し得る。さらに別のアプローチでは、前の実施形態で作成された微小液滴を、その後、そのような既存の微小液滴のストリームと合体させて、同様の結果を達成することができる。これらの微小液滴法では、次いで工程（７）は、微小液滴を貯蔵領域に送達すること、および各微小液滴を調査して遊離したフルオロフォアを同定することを含むことが好ましい。その後、各微小液滴から得られた結果は、元の核酸分析物の配列に特徴的な一連のデータにまとめられる。
【００４０】
所与の微小液滴が２つ以上のヌクレオシド三リン酸を含有する危険性を回避するために、各充填微小液滴が平均して１〜２０、好ましくは２〜１０の空の微小液滴によって分離されるような速度で、工程（１）において各ヌクレオシド三リン酸を放出することが好ましい。その後、溶媒中の充填されたおよび充填されていない微小液滴のストリームを流速、適切には微小流体流路に沿って一定の速度で、それらが別々の状態に維持され、互いに合体する機会がないような方法で流す。適切には、使用される微小液滴は、１００ミクロン未満、好ましくは５０ミクロン未満、より好ましくは２０ミクロン未満、さらにより好ましくは１５ミクロン未満の有限直径を有する。最も好ましくは、それらの全ての直径は、２〜２０ミクロンの範囲である。一実施形態では、システム全体を通る微小液滴の流速は、毎秒５０〜３０００微小液滴の範囲、好ましくは毎秒１００〜２０００である。
【００４１】
本発明の第２の態様において、（１）（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位、および該捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域を含む第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含む第１のプローブと、（２）（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドのと少なくとも部分的に相補的な一本鎖領域を有し、かつ第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含む、実質的に検出不可能な状態のフルオロフォアを有する少なくとも部分的に一本鎖の第４のオリゴヌクレオチドと、（ｄ）任意に、第４のオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドと、を含む第２のプローブと、を含むことを特徴とする多成分生物学的プローブシステムが提供される。
【００４２】
一実施形態では、第２および第３のオリゴヌクレオチドはリンカー領域、例えば、オリゴヌクレオチド領域によって連結されている。別の態様において、第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位は捕捉部位を含むオリゴヌクレオチド領域である。別の実施形態では、第１および第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位は同じである。さらに別の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドは、（１）部分的に二本鎖、すなわちＪ字形、または（２）一本鎖であり、そして第５のオリゴヌクレオチドと共に使用される。
【００４３】
適切には、第１のプローブは、それらの隣接領域の配列および捕捉領域に特徴的なヌクレオチドが異なる１〜４の異なる第１のオリゴヌクレオチド型を含む。別の実施形態では、第２のプローブは、それらが有するフルオロフォアおよびそれらの配列が異なる１〜４の異なる第４のオリゴヌクレオチド型を含む。
【００４４】
好ましくは、プローブシステムは、第１のプローブおよび第２のプローブが使用されると、リガーゼ、ポリメラーゼ、ならびに第１および第２のニッキング部位をニッキングすることができる第１および第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼの少なくとも一方をさらに含む。
【００４５】
本発明の方法、第１および第２のプローブならびにプローブシステムと共に使用できる適切なニッキング制限エンドヌクレアーゼの詳細は、http：//rebase.neb.comに関連するデータベースに見出すことができる。
【００４６】
上記の配列決定方法で使用される検出方法はまた、生物学的試料またはそれに由来する分析物中の単一ヌクレオシド三リン酸の分析、特徴付けまたは定量化にも一般的に適用可能であると考えられる。したがって、本発明の第３の態様では、単一ヌクレオシド三リン酸を分析する方法であって、
（１）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、単一のヌクレオシド三リン酸を、
（ａ）第１の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位、および該捕捉部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド隣接領域を含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチド隣接領域にハイブリダイズすることができる第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
を含む、対応する第１のプローブと反応させることにより、少なくとも１つの実質的に二本鎖の第１のオリゴヌクレオチド使用プローブを作製し、
（２）前記第１の使用プローブの第１のオリゴヌクレオチド鎖を第１のニッキング部位で第１のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、個々の第１のオリゴヌクレオチド成分を作製し、
（３）前記使用プローブの相補鎖から工程（２）で生成した前記第１のオリゴヌクレオチド成分を分離し、
（４）リガーゼの存在下で、少なくとも１つの分離された前記第１のオリゴヌクレオチド成分を、
（ｃ）第２の制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含み、実質的に検出不可能な状態でフルオロフォアを有する相補的な第４のオリゴヌクレオチドと、任意に、
（ｄ）前記第４のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドと
を含む、対応する第２のプローブと反応させることによって、少なくとも１つの実質的に二本鎖の２次使用プローブをを作製し、
（５）前記第２の使用プローブの第４のオリゴヌクレオチド鎖を第２のニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングして、少なくともその一部が検出可能な状態でフルオロフォアを有する個々の第４のオリゴヌクレオチド成分を作製し、それらの少なくともいくつかは、検出可能な状態のフルオロフォアと、少なくとも部分的に前記第４のオリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖の第６のオリゴヌクレオチドとを有し、
（６）工程（５）で放出された前記フルオロフォアを検出する工程により特徴づけられる、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、反応のｄＮＴＰ成分の存在下および非存在下での経時的な蛍光強度の増加をモニターし、結果を示すグラフである。
【図２】図２は、各々が単一ヌクレオチド塩基を含む微小液滴が上述のような種類のプローブシステムと反応するように作られている微小流体配列決定装置を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
そのような方法では、使用される様々な工程の性質および生物学的プローブは適切には上記の通りである。一実施形態では、単一のヌクレオシド三リン酸は、加ピロリン酸分解によって前駆体の二本鎖ＤＮＡ分析物から誘導されるであろう。他の実施形態では、例えば、キナーゼを用いて前駆体単一ヌクレオシド一リン酸または単一ヌクレオシド二リン酸から生成されるであろう（例えば、Biotechnology and Bioengineering by Bao and Ryu(DOI 10.1002/bit.21498)を参照されたい。）。
【００４９】
本発明を、以下の実施例を参照して説明する。
実施例１−プローブシステムの準備と使用
以下のヌクレオチド配列を有する一本鎖の第１のオリゴヌクレオチド１を調製した。
５’−ＡＣＣＴＡＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣ−３’
式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、ＤＮＡの関連する特徴的なヌクレオチド塩基を有するヌクレオチドを表す。さらに、５’末端から１３番目の塩基に、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物中のデオキシチミジン三リン酸ヌクレオチド（ｄＴＴＰ）の捕捉に選択的な捕捉領域（Ａヌクレオチド）、および、ニッキング制限エンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｓｒＤＩの認識配列、「ＮＮＣＡＴＴＧＣ」を含む。
【００５０】
第１のオリゴヌクレオチドの３’隣接領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド領域を含む、別の一本鎖オリゴヌクレオチド２、および、３’末端に１塩基ミスマッチを有する第１のオリゴヌクレオチドの５’隣接領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド領域および５’リン酸基を含む一本鎖オリゴヌクレオチド３もまた調製した。それらは以下のヌクレオチド配列：
オリゴヌクレオチド２：５’−ＡＴＡＴＧＧＣＡＡ−３’
オリゴヌクレオチド３：５’−ＰＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＧＡ−３’
を有し、ここで、Ｐは５’リン酸基を表す。
【００５１】
また、以下のヌクレオチド配列：
５’−ＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＣＴＸＧＣＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＱＡＧＧＴＴＣＡＣＧＡＴＡ−３’
を有する一本鎖の第４のオリゴヌクレオチドを調製し、
式中、Ｘは、従来のアミン付着化学を用いてＡｔｔｏ５９４染料で標識されたデオキシチミジンヌクレオチド（Ｔ）を表し、Ｑは、ＢＨＱ−２クエンチャー（消光剤）で標識されたデオキシチミジンヌクレオチドを表す。それはさらに、第１のオリゴヌクレオチドの５’隣接領域に相補的な３’領域、およびニッキング制限エンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｓｒＤＩの認識配列、「ＮＮＣＡＴＴＧＣ」を含む。
【００５２】
以下のヌクレオチド配列：
５’−ＰＧＴＴＡＧＣＡＡＧＡ−３’
を有する一本鎖の第５のオリゴヌクレオチドもまた調製され、これは第４のオリゴヌクレオチドの５’領域に実質的に相補的である。
【００５３】
次いでプローブシステムを含む反応混合物を調製した。それは以下の配合物：
２０μＬ  ５ｘバッファー  ｐＨ７．９
１０μＬ  オリゴヌクレオチド１、１０００ｎＭ
３μＬ    オリゴヌクレオチド２、１００ｎＭ
５μＬ    オリゴヌクレオチド３、１００ｎＭ
１０μＬ  オリゴヌクレオチド４、１０００ｎＭ
５μＬ    オリゴヌクレオチド５、１００ｎＭ
１０μＬ  スペルミン溶液、１０ｍＭ
１０Ｕ    Ｎｂ．ＢｓｒＤＩニッキングエンドヌクレアーゼ
（例えば、New England Biolabs Inc.）
８０Ｕ    Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ
５．８Ｕ  Ｂｓｔラージフラグメントポリメラーゼ
６．７Ｕ  熱安定性無機ピロホスファターゼ
２．５μＬ  ｄＮＴＰの混合物、１ｎＭ
１００μＬまでの水
から誘導されたものに対応する組成を有し、
５×緩衝液は以下：
２５μＬ  トリズマアセテート、１Ｍ、ｐＨ７．９
５０μＬ  水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ  酢酸カリウム水溶液、１Ｍ
５０μＬ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤（１０％）
５００μｇＢＳＡ
１ｍＬまで水
の混合物を含んでいた。
【００５４】
次いで、ｄＴＴＰの捕捉およびオリゴヌクレオチド２のオリゴヌクレオチド３へのライゲーションによる第１の使用プローブの形成を、混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後温度をさらに１５分間５６℃に上昇させることによって実施し、第１のオリゴヌクレオチドの反復ニッキングを可能にする。次いで、温度をさらに３０分間３７℃に下げて、得られた第１のオリゴヌクレオチド成分を第４のオリゴヌクレオチドに対して第５のオリゴヌクレオチドに連結して、完成した第２のプローブを形成した。次いで、温度を９０分間５６℃に上げて、第４のオリゴヌクレオチドの反復ニッキングを可能にした。エンドヌクレアーゼ分解のサイクルが生じるとともに、反応混合物が光学的に励起され、得られたＡｔｔｏ５９４色素の特徴的な蛍光を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（BMG Labtech社製）を用いて検出した。
【００５５】
反応のｄＮＴＰ成分の存在下および非存在下での経時的な蛍光強度の増加をモニターし、結果を図１にグラフで示した。これから、プローブシステムがｄＴＴＰを効率的に捕捉し、そして本発明の方法の周期的性質が蛍光シグナルの急速な成長をもたらすことが理解され得る。反対に、反応混合物中にｄＮＴＰが存在しない比較実験では、オリゴヌクレオチド４上のＡｔｔｏ５９４色素は有意な程度には蛍光を示さなかった。
【００５６】
実施例２‐プローブシステムを用いた液滴マイクロ流体法
図２は、各々が単一ヌクレオチド塩基を含む微小液滴が上述のような種類のプローブシステムと反応するように作られている微小流体配列決定装置を概略的に示す。
【００５７】
ヒトＤＮＡ由来の１００ヌクレオチド塩基ポリヌクレオチド分析物の進行性加ピロリン酸分解によって得られた単一ヌクレオチド三リン酸のストリームを含む水性媒体１を、ＰＤＭＳポリマーから製造された直径１０ミクロンのマイクロ流体チューブを通して流す。加ピロリン酸分解反応自体は、水性緩衝化（ｐＨ７．５）反応媒体の流れを７２℃で通過させることによって行われ、分析物が予めスクシニル架橋によって付着されているガラスマイクロビーズ上に、Ｔａｑ  Ｐｏｌおよび１リットル当たり２ミリモル濃度のピロリン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムの濃度を有する溶液を含む。マイクロビーズの下流にある１中の単一ヌクレオチドの順序は、分析物の配列に対応する。１は液滴ヘッド２から第１のチャンバ３内に出現し、そこで第１のチャンバ３は不混和性の軽質シリコーンオイル４の１つ以上のストリーム（流れ）と接触する。これらのストリームの速度は、乱流混合を回避し、それぞれ直径約８ミクロンの油中に懸濁した水性球状液滴５を生成するように選択される。典型的には、隣接する充填液滴の間に平均１０個の空の液滴が存在するように速度が調整される。次に、５の流れが、同じ直径の第２のマイクロ流体チューブに沿って第２のチャンバ６へと運ばれ、その中に５ミクロンの水性球状液滴７の第２の流れも第２の液滴ヘッド８によって供給される。液滴５および７を連続的に合体させて、直径約９ミクロンの拡大水性液滴９を形成する。７のそれぞれは、５のそれぞれに存在するあらゆる残留ピロリン酸アニオンを破壊するために無機ピロホスファターゼを含有する。
【００５８】
次に、９のストリームがマイクロ流体チューブを介して同じ速度で第３のチャンバ１０へと運ばれ、そこでこれらの液滴は対応する液滴ヘッド１２を通ってそこに供給される５ミクロンの水性球状液滴１１の第３の流れと接触する。９のそれぞれがチャンバー６と１０の間を移動するのにかかる時間は約２分である。
【００５９】
次に液滴９と１１を１０で合体させて液滴１３（直径約１０ミクロン）を生成する。１１のそれぞれは、中温性リガーゼ、好熱性ポリメラーゼ、ニッキング制限エンドヌクレアーゼＮｂ．ＢｓｒＤＩ（例えば、New England Biolabs Inc.）、実施例１に記載したものと同様の４組の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む第１のプローブ、および異なるフルオロフォアで標識された４つの異なる第４の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび４つの相補的な第５のオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブを含む。あるいは、これらの成分を一連の合体工程（図示せず）で添加してもよく、ここでは、それぞれ１種以上のこれらの成分を含有する異なる液滴型１１を９または前の合体から生じる液滴と合体させて、最終的に１３を得る。
【００６０】
このようにして形成された合体した微小液滴１３のストリームを次に３７℃で３０分間、続いて５６℃で１５分間、続いて３７℃で３０分間、続いて５６℃で９０分間インキュベートする。この時間の終わりに１３が検出システム１４に転送される。
【００６１】
検出システム（図示せず）は通常、各液滴がレーザからの入射光で調べられる検出ウィンドウを含む。次いで、この光の作用により、各小滴中に放出されたフルオロフォアが、もともと第１のプローブに組み込まれていた単一ヌクレオチド塩基に特徴的な方法で蛍光を発する（または小滴が最初に空の場合は本質的に全く起こらない）。次いで、この蛍光の存在または非存在は、上記の４つのオリゴヌクレオチドセットに関連した４つのフルオロフォアの４つの特徴的な波長で検出される。したがって、液滴が順番に調べられると、元のポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列が事実上読み取られる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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