(57)【要約】本発明は、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入と、同じ抗原を標的とする腫瘍溶解性ウイルスワクチンを含む、がんを治療するための方法を記載する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象においてがんを治療するための併用療法であって、（ｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％又は少なくとも約７０％がセントラルメモリー表現型を示し、前記がんによって発現される腫瘍抗原に特異的である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を含む養子細胞療法（ＡＣＴ）を前記対象に投与するステップと、（ｉｉ）続いて、前記腫瘍抗原を発現する複製型腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）ワクチン、好ましくは腫瘍溶解性ラブドウイルス又はワクシニアウイルスを前記対象に投与するステップを含む、併用療法。
【請求項２】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が、ＩＬ−２１組成物、腫瘍抗原及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、対象に対して組織適合性の表現型を有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、より好ましくは自己由来ＰＢＭＣのｅｘ  ｖｉｖｏ培養を行って、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮及びプログラムし、続いて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２を含む急速拡大プロトコル（ＲＥＰ）を行うことにより調製される、請求項１に記載の併用療法。
【請求項３】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が、腫瘍抗原、ＡＰＣ、並びにＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンを含むかそれらから本質的になる組成物の存在下で、好ましくは約１〜３週間、又は少なくとも約１週間、又は少なくとも約２週間、又は少なくとも約３週間、ＰＢＭＣ又はＴＩＬのｅｘ  ｖｉｖｏ培養を行い、任意選択で、続いて、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンを含むか又はそれらから本質的になる組成物中、腫瘍抗原及びＡＰＣの非存在下で、好ましくは約１週間、ＰＢＭＣ又はＴＩＬをｅｘ  ｖｉｖｏ培養を実施して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮及びプログラムすることにより調製される、請求項１に記載の併用療法。
【請求項４】
ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンを含むか又はそれらから本質的になる前記組成物がＩＬ２を含まない、請求項３に記載の併用療法。
【請求項５】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が、腫瘍抗原に特異的な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＣＡＲでＰＢＭＣを形質導入し、形質導入されたＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで培養することによって産生される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項６】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が、ＣＤ２５枯渇ＰＢＭＣのｅｘ  ｖｉｖｏ培養によって産生される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項７】
ＩＬ２１及びＩＬ１５が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ラパマイシンが、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項８】
抗原特異的Ｔ細胞の濃縮及びプログラミングのためのＰＢＭＣ又はＴＩＬのｅｘ  ｖｉｖｏ培養に続いて、好ましくは抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ２を含む組成物中で、好ましくは少なくとも１週間から少なくとも４週間、培養細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大を行い、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養後に、Ｔ細胞の精製ステップ（例えばセルソーティング）は実施されない、請求項２〜７のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項９】
前記対象がＩＬ−２を投与されない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１０】
前記複製型腫瘍溶解性ウイルスが、ラブドウイルス、好ましくはベシシクロウイルスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１１】
前記ラブドウイルスが、組換え又は野性型マラバウイルス、好ましくはマラバＭＧ１又は組換え若しくは野性型ＶＳＶ、好ましくはＶＳＶデルタ５１である、請求項１０に記載の併用療法。
【請求項１２】
前記ラブドウイルスが、前記対象に血管内投与、好ましくは静脈内投与される、請求項１０又は１１に記載の併用療法。
【請求項１３】
前記複製型腫瘍溶解性ウイルスが、野生型又は組換えワクシニアウイルスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１４】
前記ワクシニアウイルスが、好ましくはチミジンキナーゼ欠失及び／又はワクシニア増殖因子遺伝子欠失を有する、Ｗｙｅｔｈ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ又はＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株である、請求項１３に記載の併用療法。
【請求項１５】
前記ワクシニアウイルスが、血管内投与、腫瘍内投与若しくは筋肉内投与、又は腹腔内投与される、請求項１３又は１４に記載の併用療法。
【請求項１６】
前記ＯＶが、ＡＣＴ療法の約１時間〜約３１日後、好ましくは約１日〜約４週間後、より好ましくは約１日〜約３週間後、約１日〜約２週間後、約１２時間〜約４８時間後、約２０時間〜２８時間後、又は約２４時間後に対象に投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１７】
前記対象が、ＡＣＴを受ける前にリンパ球枯渇を受けていない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１８】
前記腫瘍抗原が、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、Ｈｅｒ２、ドパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、ＧＰ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥタンパク質、ＢＡＧＥタンパク質、ＧＡＧＥタンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＷＴ−１、サバイビン、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、サイクリンＡ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｍｅｌｏｅ、Ｌｅｎｇｓｉｎ、カリクレイン４、ＩＧＦ２Ｂ３、グリピカン−３、ＨＰＶ  Ｅ６及びＨＰＶ  Ｅ７からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１９】
前記がんが、黒色腫、肉腫、リンパ腫、癌腫、脳腫瘍（例えば神経膠腫）、乳がん、肝臓がん、肺がん、腎臓がん、膵臓がん、食道がん、胃がん、結腸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、前立腺がん及び白血病からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２０】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２１】
前記がんが転移である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２２】
前記腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２３】
前記腫瘍抗原が自己抗原である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２４】
前記ＯＶが、ＡＣＴの投与後に複数回前記対象に投与される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２５】
前記対象が少なくとも第１の併用療法及び第２の併用療法を投与され、前記腫瘍抗原が第１の併用療法及び第２の併用療法に対して同じである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２６】
前記対象が少なくとも第１の併用療法及び第２の併用療法を投与され、前記腫瘍抗原が第１の併用療法及び第２の併用療法に対して同じではない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２７】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が前記対象にとって自己由来である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２８】
前記対象がヒトである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２９】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２〜２８のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項３０】
前記腫瘍抗原及び抗原提示細胞が、腫瘍抗原ペプチドが担持された抗原提示細胞の形態で存在する、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項３１】
腫瘍抗原ペプチドが担持された前記抗原提示細胞が、（ｉ）前記対象由来の接着性ＰＢＭＣを、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに培養して自己由来樹状細胞を得て、続いて任意選択で、ＴＮＦα、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＰＧＥ−２、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦで前記樹状細胞を刺激すること、（ｉｉ）前記樹状細胞を腫瘍抗原ペプチドでパルスすること、（ｉｉｉ）腫瘍抗原ペプチドが担持された前記樹状細胞を照射することにより得られる、請求項３０に記載の併用療法。
【請求項３２】
前記腫瘍抗原が、前記対象由来の腫瘍材料の形態で前記組成物中に存在する、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項３３】
セントラルメモリー表現型を有する腫瘍抗原特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、（ｉ）腫瘍抗原、ＡＰＣ、並びにＩＬ１５、ＩＬ２１及びラパマイシンを含むか又はそれらから本質的になり、ＩＬ２を含まない組成物の存在下で、ヒトから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をｅｘ  ｖｉｖｏ培養して、セントラルメモリー表現型を有する腫瘍抗原特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップと、（ｉｉ）得られた前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を、好ましくは抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２を含む培養培地中で拡大させるステップを含む、方法。
【請求項３４】
ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）の間に、Ｔ細胞精製ステップ（例えばセルソーティング）を含まない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＢＭＣが、がんを有するヒトから得られる、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＢＭＣがｅｘ  ｖｉｖｏ培養される前に、前記ＰＢＭＣからＣＤ２５＋細胞が枯渇される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
（ｉ）ヒトがん対象から得たＰＢＭＣ又はＴＩＬに、前記がんによって発現される腫瘍抗原に特異的な組換えＴＣＲ又はＣＡＲを形質導入するステップと、（ｉｉ）前記腫瘍抗原、ＡＰＣ、並びにＩＬ１５、ＩＬ２１及びラパマイシンを含むか又はそれらから本質的になり、ＩＬ２を含まない組成物の存在下、培養培地中で、形質導入された前記ＰＢＭＣ又はＴＩＬを培養して、セントラルメモリー表現型を有するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップ、及び（ｉｉ）得られた前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を培養物中、好ましくは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２の存在下で拡大させるステップを含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
得られた前記ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
[0001]本出願は、２０１６年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／３５４５０６号の優先権を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み入れる。
［発明の分野］
【０００２】
[0002]本発明は、がんを治療するための併用免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]がん及び従来のがん療法は、現在、精神的／身体的苦痛、生命の喪失及び医療費の増加の点で、著しい社会経済的負担を強いている。従来の療法はいくつかの有益な臨床成果を示しているが、患者の生活の質をしばしば低下させる有害な副作用がある［１］。副作用がほとんどなく有害でない、より効果的ながん療法が必要とされている。
【０００４】
[0004]腫瘍性悪性病変は免疫系によって効果的に排除することができ、また免疫療法ががんに対する有望な代替治療形態であることは十分に理解されている［２］。
【０００５】
[0005]免疫細胞、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異性のあるＴ細胞は、腫瘍を破壊する可能性を有する。そのような細胞は、天然の腫瘍細胞ターンオーバーの結果として、又は治療用ワクチンの投与により、がん患者において誘導され得る。残念なことに、これらの細胞は、腫瘍に浸潤した際に効果が消失することが多く、枯渇表現型及び／又は機能障害性表現型をしばしば示し、腫瘍誘導性局所免疫抑制により腫瘍の軽減又は破壊に必要な細胞傷害性機能を欠失する［３〜５］。したがって、免疫抑制性腫瘍環境は、従来のがん免疫療法によって誘導される応答を鈍化する深刻な障害をとどめている。
【０００６】
[0006]チェックポイント阻害剤に基づいた療法は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抑制性シグナル伝達を緩和し、内因性抗腫瘍応答を活性化するために使用されてきた［６、７］。チェックポイント阻害剤は臨床試験において効果を示したが、治療を受けたすべての対象において応答が観察されているわけではない［８］。チェックポイント阻害剤による療法は、先在のＴＡＡ特異的Ｔ細胞の活性化に依存するが、一部の患者においては、療法で誘導された再活性化後に腫瘍の完全退縮をもたらすのに十分な先在のＴＡＡ特異的Ｔ細胞が存在しない［９、１０］。
【０００７】
[0007]ＴＡＡ特異的Ｔ細胞の養子細胞移入（ＡＣＴ）は、悪性病変を治療するためのチェックポイント阻害剤療法に対する優れた代替法である（［１１］に総説あり）。ＡＣＴは、がん患者から単離されｅｘ  ｖｉｖｏで増殖された腫瘍応答性Ｔ細胞を用いて実施される。これらの細胞は、腫瘍によって強いられていた免疫抑制性環境から取り出されると、活性化され、多数にまで増殖され、その後患者に移し戻される。本質的には、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養は、細胞溶解活性がほとんどないか全くない少数の機能障害性Ｔ細胞を、同族腫瘍細胞に効果的に向かわせ破壊することができる数十億の完全機能性Ｔ細胞に変換する。ＡＣＴ用のリンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＴＩＬを含む数多くの供給源に由来する。ＡＣＴは、ＴＡＡをその天然受容体を介して認識するリンパ球を利用することができるという点、又はリンパ球が、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子による形質導入によって改変され得るという点で融通性がある［１２、１３］。
【０００８】
[0008]臨床上の証明によれば、Ｂ細胞リンパ腫などの非固形がんにおけるＡＣＴの良好な抗腫瘍効果が明らかになっている。実際、ヒトパピローマウイルス応答性Ｔ細胞の注入がＨＰＶ陽性転移性子宮頸がんの退縮を誘導できることも示されている［１４］。この方策は非ウイルス性腫瘍関連抗原を標的とするように拡大されつつあるが、腫瘍浸潤及び固形腫瘍の退縮を増強するためには依然として改善が求められている。
【０００９】
[0009]ＡＣＴに関するこれまでの研究からは、ＡＣＴの治癒可能性では、すべての悪性細胞を死滅させるためには、移入細胞が十分な量及び長期持続性で腫瘍に浸潤することが必要であることがわかっている。臨床上の証明によれば、これらの必要条件は、複製能を維持する最小分化表現型を有する（数十億個の）高用量の養子移入細胞によって達成され得ることが示唆されている［１５］。しかし、これらの２つのゴールは相反する。高用量のＴ細胞の産生には、Ｔ細胞の最終分化及び複製老化ももたらす膨大なｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大が必要である［１６］。実際、従来のＡＣＴ療法は最終分化エフェクターＴ細胞を使用し、患者に対する放射線療法又は化学療法による治療前にリンパ球集団を枯渇させることが要求され、それで注入する必要のある何十億もの細胞の良好な生着が可能となる［１７、１８］。さらに、ＩＬ２治療では、注入細胞の持続性及び活性化を維持することが必要である［１９］。
【００１０】
[0010]最近の研究からは、分化が低い細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞などは、生着細胞の持続性及び臨床成果の点から、ＡＣＴにおいてより良好な成功を示すことが明らかとなっている［１５、２０］。ＰＢＭＣ試料由来のＴＡＡ特異的セントラルメモリーＴ細胞培養物を産生する方法が公開されているが［２１］、このプロトコルは、抗原特異的細胞の濃縮に、労力及び資源集約的な臨床グレードのセルソーターを必要とする（米国特許出願公開第２０１５／００２３９３８号も参照されたい）。本発明は、大型ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大の抗原特異的セントラルメモリーＴ細胞を産生する方法、及び抗原を発現する腫瘍細胞に向けられる抗原特異的セントラルメモリーＴ細胞からの攻撃性細胞溶解応答を誘発するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提供する。併用において、これらの方法は、セルソーターの使用又は対象の内因性Ｔ細胞集団の枯渇を必要としないがん治療向けの適応型細胞療法を構成し、したがって、既存の療法に対して大幅な改善を示す。
【発明の概要】
【００１１】
[0011]養子細胞移入及びその後の腫瘍溶解性ウイルスワクチンの投与を含む、哺乳動物（例えばヒト）におけるがんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療するための併用療法であって、（ｉ）対象への腫瘍抗原特異的セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞の養子細胞移入、続いて、（ｉｉ）がんの破壊及び除去を誘導するための、養子細胞移入（ＡＣＴ）Ｔ細胞によって標的とされる同一抗原を発現する組換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）ワクチンを用いる対象へのワクチン接種を含む、併用療法を提供する。好ましい態様では、ＡＣＴ  Ｔ細胞は、腫瘍抗原に特異的な１つ又は複数の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されている。いくつかの実施形態では、ＡＣＴ  Ｔ細胞は、治療しようとする対象に由来する自己Ｔ細胞である。併用療法は、対象が免疫枯渇されるステップを含まないのが好ましい。
【００１２】
[0012]本明細書に記載の方法は、哺乳動物のがんを治療するのに有用である。本明細書で使用される場合の用語「がん」とは、限定するものではないが、黒色腫、肉腫、リンパ腫、癌腫、脳腫瘍（例えば神経膠腫）、乳がん、肝臓がん、肺がん、腎臓がん、膵臓がん、食道がん、胃がん、結腸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、前立腺がん及び白血病を含む任意のがんを包含する。いくつかの態様では、がんは固形腫瘍である。他の態様では、がんは転移である。
【００１３】
[0013]本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」とは、ヒト並びに非ヒト哺乳動物を意味し、また用語「養子細胞移入」とは、末梢血試料又は腫瘍試料のいずれかから抽出されたリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ培養によって産生される細胞産物の注入を包含することを意味する。
【００１４】
[0014]一実施形態では、腫瘍抗原特異的セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を産生する方法であって、腫瘍抗原、樹状細胞などの抗原提示細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの存在下で、好ましくはＩＬ２の非存在下で、ＰＢＭＣ由来のリンパ球又はＴＩＬを培養することを含むｅｘ  ｖｉｖｏ細胞培養のステップを含む方法を提供する。ＣＤ２５＋細胞（制御性Ｔ細胞並びに活性化Ｔ細胞及びＢ細胞）は、培養前にＰＢＭＣから除去されるのが好ましい。腫瘍抗原は、例えば、哺乳動物において免疫応答を引き起こす腫瘍細胞で産生される物質である腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は自己抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍に特有であって、正常細胞では発現されないか正常細胞では極めて少量が発現される腫瘍特異的抗原である（例えばネオ抗原）。
【００１５】
[0015]関連する実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比較してがん細胞において高い発現を有する組織特異的腫瘍抗原であり、その非限定的な例としては、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５及びＴＲＰ−２タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、腫瘍抗原は、がん及び精巣では発現されるが、他の正常組織では発現されないか又は極めて少量が発現される腫瘍特異的共通抗原（がん−精巣抗原又はＣＴ抗原）であり、それらの非限定的な例としては、ＢＡＧＥ、ＣＡＭＥＬ、ＭＡＧＥ−Ａ１及びＮＹ−ＥＳＯ−１が挙げられる。他の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞においてのみ発現される腫瘍特異的固有抗原（ネオ抗原）であり、それらの非限定的な例としては、ＣＤＫ４、カテニン、カスパーゼ−８、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＭＡＲＴ−２、ＯＳ−９、ｐ１４ＡＲＦ、ＧＡＳ７、ＧＡＰＤＨ、ＳＩＲＴ２、ＧＰＮＭＢ、ＳＮＲＰ１１６、ＲＢＡＦ６００、ＳＮＲＰＤ１、ＰＲＤＸ５、ＣＬＰＰ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＥＦ２、ＡＣＴＮ４、ＭＥ１、ＮＦ−ＹＣ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＳＰ７０−２及びＫＩＡＡ１４４０が挙げられる。他の実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比較してがん細胞において過剰発現される過剰発現腫瘍抗原である。腫瘍関連抗原の例としては、腫瘍胎児性抗原、例えばアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）、表面糖タンパク質、例えばＣＡ１２５、がん遺伝子、例えばＨｅｒ２、黒色腫関連抗原、例えばドパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、ＧＰ１００及びＭＡＲＴ１、がん−精巣抗原、例えばＭＡＧＥタンパク質及びＮＹ−ＥＳＯ１、ウイルス性がん遺伝子、例えばＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７、胚組織又は胚体外組織に通常限定される腫瘍において異所的発現されるタンパク質、例えばＰＬＡＣ１が挙げられる。当業者には理解されるように、１つ又は複数の抗原はある特定のがんの治療における使用に特に適し得るので、抗原は、本方法を使用して治療されるがんの種類に基づいて選択することができる。例えば、黒色腫の治療に関しては、黒色腫関連抗原、例えばＤＣＴなどを使用することができる。
【００１６】
[0016]いくつかの好ましい態様では、腫瘍抗原（例えばＴＡＡ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するために、本方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養細胞（例えば、対象から得られた自己由来ＰＢＭＣ又は対象に対して組織適合性の表現型を有するＰＢＭＣ）を遺伝的に改変して、１つ又は複数の組換えＴＣＲ（複数可）又はＣＡＲ（複数可）を発現させ、腫瘍抗原特異性を付与するステップを包含する。形質導入細胞は、腫瘍抗原、樹状細胞などの抗原提示細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養される。ＣＡＲは、抗体由来の細胞外単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、抗原認識部分及び細胞内Ｔ細胞活性化ドメインとともに含んでなる融合タンパク質である。組換えＴＣＲはα鎖及びβ鎖を含み、例えばＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体を認識し得る。細胞は、選択したＴＣＲ／ＣＡＲの発現をサポートする導入遺伝子カセットを担持するベクター、例えばレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターで形質導入され得る。導入遺伝子カセットをベクターに導入する方法は、当業者には周知である。一般に、ベクターはＴＣＲ／ＣＡＲを発現するように改変される。この点に関して、選択したＴＣＲ／ＣＡＲをコードする核酸配列は、十分に確立された組換え技術を使用して、選択したベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ又はＣＡＲは、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥファミリーのメンバー（例えばＭＡＧＥ−Ａ３）に特異的である。本明細書に記載の方法によって産生される腫瘍抗原（例えばＴＡＡ）特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、例えば、拡大（例えば抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２を用いた急速拡大）前に、テトラマー標識及び臨床グレードのソーターを使用する精製（又はさらなる濃縮）を必要としないので有利である。したがって、好ましい実施形態では、養子細胞移入のための方法であって、（ｉ）がんを有する対象から得られたＰＢＭＣ又はＴＩＬを、腫瘍抗原を担持した抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば自己樹状細胞）、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの存在下で、好ましくはＩＬ２の非存在下で培養して、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を作製するステップと、（ｉｉ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２を用いて、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させるステップと、（ｉｉｉ）それらの細胞を対象に再導入するステップを含み、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）の間に、テトラマー＋細胞のソーティングなどのＴ細胞を精製する（又はさらに濃縮する）ステップの実施を含まない、方法を提供する。
【００１７】
[0017]好ましい実施形態では、ＰＢＭＣ由来のリンパ球又はＴＩＬは、腫瘍抗原、ＡＰＣ、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの存在下で、約１〜約４週間、例えば約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、又はその間の任意の範囲の間、腫瘍抗原、樹状細胞などの抗原提示細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの存在下で、好ましくはＩＬ２の非存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養され、その後、約１週間〜約２週間、約１週間又は約２週間、腫瘍抗原及び抗原提示細胞の非存在下、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下で培養され得る。特に好ましい実施形態では、ＰＢＭＣ由来のリンパ球は、腫瘍抗原ペプチドが担持された樹状細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下で約２週間、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下、腫瘍抗原ペプチドが担持された樹状細胞の非存在下で約１週間、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養される。本明細書に記載の方法によって産生される腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、リンパ球枯渇を必要とすることなく、また対象へのＩＬ−２投与を必要とすることなく、哺乳動物に導入することができるので有利である。したがって、いくつかの実施形態では、養子細胞移入のための方法であって、（ｉ）ＰＢＭＣ由来のリンパ球又はＴＩＬを、腫瘍抗原、樹状細胞などの抗原提示細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養するステップと、（ｉｉ）化学療法手段又は放射線学的手段により哺乳動物の既存のリンパ球を破壊することなく（リンパ球枯渇又はリンパ球除去）、対象にＩＬ−２を投与することなく、得られた腫瘍抗原（例えばＴＡＡ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
[0018]本明細書に記載の併用療法によれば、腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入後に、対象に投与される。腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入は、本明細書に記載の方法、及びその内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１５／００２３９３８号に記載の方法を含めた任意の適切な方法によって達成することができる。
【００１９】
[0019]いくつかの実施形態では、併用療法は、（ｉ）腫瘍を有する対象由来のＴＩＬを、腫瘍抗原ペプチドを担持した抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＩＬ２１の存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、培養細胞を拡大し、対象に細胞を再導入するステップと、（ｉｉ）対象に同じ腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む。
【００２０】
[0020]他の実施形態では、併用療法は、（ｉ）腫瘍を有する対象由来のＴＩＬを、腫瘍抗原ペプチドを担持したＡＰＣ及びＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、培養細胞を拡大し、対象に細胞を再導入するステップと、（ｉｉ）対象に同じ腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む。
【００２１】
[0021]他の実施形態では、併用療法は、（ｉ）対象由来のＰＢＭＣを、腫瘍抗原ペプチドを担持したＡＰＣ及びＩＬ２１の存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、培養細胞を拡大し、対象に細胞を再導入するステップと、（ｉｉ）対象に同じ腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む。
【００２２】
[0022]他の実施形態では、併用療法は、（ｉ）対象由来のＰＢＭＣを、腫瘍抗原ペプチドを担持したＡＰＣ及びＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、培養細胞を拡大し、対象に細胞を再導入するステップと、（ｉｉ）対象に同じ腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む。
【００２３】
[0023]関連する実施形態では、ＰＢＭＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養の前に、腫瘍抗原に特異的な組換えＴＣＲ又はＣＡＲで形質導入される。
【００２４】
[0024]いくつかの実施形態では、腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が移入された約８〜７２時間後に、哺乳動物に投与される。好ましい実施形態では、腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が移入された約１２〜４８時間後、約２０〜２８時間後、又は約２４時間後に対象に投与される。
【００２５】
[0025]腫瘍抗原を発現する任意の複製能力のある腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載の併用療法によって投与され得る。いくつかの好ましい実施形態では、複製型腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に対するウイルスの選択性を高める１つ又は複数の遺伝的改変を好ましくは含む、ラブドウイルス、例えばＶＳＶ又はマラバラブドウイルス（Ｍａｒａｂａ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）である。
【００２６】
[0026]複製型腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、多数の経路のうちの１つ又は複数の経路によって投与することができる。いくつかの実施形態では、複製型腫瘍溶解性ウイルスはラブドウイルスであり、静脈内経路によって哺乳動物に投与される。他の実施形態では、複製型腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）であり、哺乳動物に静脈内（ＩＶ）投与、筋肉内（ＩＭ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与又は腫瘍内（ＩＴ）投与される。当業者には理解されるように、複製型腫瘍溶解性ウイルス（例えばラブドウイルス又はワクシニアウイルス）は、適切な担体、例えば食塩水又は他の薬学的に適切な緩衝液中で投与される。
【００２７】
[0027]本発明の実施形態は、下記に列挙したそれぞれの図面に対する以下の説明によってより詳細に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＩＬ１５、１Ｌ２１、及びラパマイシンとともにｅｘ  ｖｉｖｏ培養されたＰ１４又は２４Ｈ９Ｒ  ＣＤ８＋Ｔ細胞のセントラルメモリー表現型（ＣＤ４４＋及びＣＤ６２Ｌ＋）の獲得を示す図である。開始後の提示した日のＰ１４マウス（上図）又は２４Ｈ９Ｒマウス（下図）由来のＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のＣＤ４４の発現増加を示す（Ａ）。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養の過程で観察される細胞数の増加を示す（Ｂ）。
【図２】ＩＬ１５、ＩＬ２１及びラパマイシンの組合せ使用が、併用療法において最適な抗腫瘍効果を有するＴｃｍ細胞を産生するためにｅｘ  ｖｉｖｏ培養中に必要とされることを示す図である。提示した組合せのＩＬ１５、ＩＬ２１及びラパマイシンとともに７日間ｅｘ  ｖｉｖｏ培養した後のＰ１４  ＣＤ８Ｔ細胞の拡大倍率（Ａ）並びにＣＤ６２Ｌ（Ｂ）及びＣＤ４４（Ｃ）の発現レベルを示す。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している。提示した組合せのＩＬ１５、ＩＬ２１及びラパマイシンにより培養したＰ１４細胞を注入した後、ＶＳＶ−ｇｐ３３で治療したマウスに関する腫瘍体積の結果を示す（Ｄ〜Ｇ）。感染５、１２及び２１日後の応答は、ｇｐ３３３３−４１ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す（Ｈ）。腫瘍終点のカットオフである１０００ｍｍ３未満の腫瘍サイズを維持する図Ｄ〜図Ｇのマウスのパーセントを示す（Ｉ）。
【図３】２４Ｈ９Ｒ  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶ−ｈＤＣＴ併用療法は、強固な抗原特異的Ｔ細胞応答及びＢ１６Ｆ１０腫瘍の退縮を誘導することを示す図である。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している（Ａ）。感染５、１２及び２１日後の応答は、ＤＣＴ１８０−１８８ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す（Ｂ）。
【図４】ＤＵＣ１８  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶ−Ｅｒｋ９Ｍ併用療法が、強固な抗原特異的Ｔ細胞応答及びＣＭＳ５腫瘍の退縮を誘導することを示す図である。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している（Ａ）。感染５、１２及び２１日後の応答は、Ｅｒｋ９Ｍ１３６−１４４ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す（Ｂ）。Ｔｃｍ＋ＯＶ−Ｅｒｋ９Ｍ療法を使用して既に治癒され、ＣＭＳ５細胞を再チャレンジしたマウスの腫瘍体積を、ノギスを使用して測定し、提示したチャレンジ後の各日にｍｍ３として表した（Ｃ）。
【図５】Ｐ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶ−ｇｐ３３併用療法は、強固な抗原特異的Ｔ細胞応答及びＢ１６−ｇｐ３３腫瘍の退縮を誘導することを示す図である。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している。ＶａｃＶ−ｇｐ３３、ＶＳＶ−ｇｐ３３及びＭＲＢ−ｇｐ３３注射の結果を示す（Ａ）。感染５及び１２日後の応答は、ｇｐ３３３３−４１ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す（Ｂ）。
【図６】ウイルスをＩＶ、ＩＴ、ＩＰ、及びＩＭ注射経路で投与した場合のＰ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶ追加免疫の腫瘍退縮効果を示す図である。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している。
【図７】ＩＶ、ＩＴ、ＩＰ、及びＩＭ注射により投与された場合のＰ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のレベルを示す図である。感染５及び１２日後の応答は、ｇｐ３３３３−４１ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す。
【図８】自己免疫性糖尿病は、Ｐ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＶＳＶ−ｇｐ３３治療と同様の腫瘍退縮速度及びピークＴ細胞応答レベルを示すにもかかわらず、Ｐ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３併用療法によって誘発されないことを示す図である。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している（Ａ）。感染５、１２及び２１日後の応答は、ｇｐ３３ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す（Ｂ）。血糖値は血糖計でモニターし、感染後の各表示日（ｄｐｉ）のｍｍｏｌ／Ｌとして表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している（Ｃ）。
【図９】膵臓ベータ細胞破壊は、Ｐ１４  Ｔｃｍ＋ＶＳＶ−ｇｐ３３で治療したＲＩＰｇｐマウスにおいて誘導されたが、Ｐ１４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３で治療したＲＩＰｇｐマウスにおいては、免疫細胞浸潤の証拠があったにもかかわらず、誘導されなかったことを示す図である。ヘマトキシリン及びエオシン（Ａ）又はインスリン免疫組織化学（Ｂ）で染色した１及び５ｄｐｉに採取した膵臓組織切片を示す。
【図１０】ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンによるプログラムされたＴ細胞の拡大は、セルソーティングなしで、高レベルのｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生することを示す図である。同一供給源由来のＰＢＭＣからのアリコートされたヒトＴ細胞を、樹状細胞、ＩＬ２１、ＩＬ７、及びＩＬ２との共培養（Ａ及びＢ）、又は樹状細胞ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンと共培養（Ｃ）することを含むＹｅｅの方法によって２週間培養した。２週間のそのような濃縮／プログラミング後、各共培養物中の細胞を、ｐｐ６５テトラマー染色を使用してソーティングし抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ａｂ及びＩＬ２により拡大させるか（Ａ）、又は事前ソーティングなく抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ａｂ及びＩＬ２により直接的に拡大させた（Ｂ及びＣ）。１週間及び２週間の拡大後、各培養物中の所望のｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的レベルを決定した。
【図１１】リンパ球枯渇は、効果的ＡＣＴ＋ＯＶ応答を樹立するために必要ではないことを示す図である。樹立されたＣＭＳ５腫瘍は、宿主リンパ球を除去することなく、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＤＵＣ１８トランスジェニックＴ細胞＋Ｍａｌａｂａ−Ｅｒｋ９Ｍによって治癒され得る（Ａ）。しかし、内因性リンパ球を欠いているＢａｌｂ／ｃ−ＮＲＧマウスは、腫瘍を完全に取り除くことはできず、部分的な腫瘍クリアランスの初期段階のみを経て再発する（Ｂ）。
【図１２】シクロホスファミドリンパ球枯渇は、Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶ療法の抗腫瘍効果にとって好ましくないことを示す図である。低用量（５０ｍｇ／ｋｇ）高用量（１５０ｍｇ／ｋｇ）でのシクロホスファミド治療を介した、宿主リンパ球の事前除去の有無下での樹立されたＢ１６−ｇｐ３３腫瘍のＰ１４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３による併用治療を示す（Ａ）。腫瘍体積はノギスを使用して測定し、感染後の各表示日（ｄｐｉ）にｍｍ３として表し、０ｄｐｉは腫瘍溶解性ウイルス注射日を表している。感染５、１２及び２１日後の応答は、ｇｐ３３ペプチドで刺激した際にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する末梢循環中のＣＤ８＋Ｔ細胞の％として表す（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
[0040]特に指示のない限り、この節及び他の節に記載されている定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように適切な本明細書に記載の本出願のすべての実施形態及び態様に適用されるものとする。
【００３０】
[0041]本出願の範囲の理解において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその派生語は、本明細書で使用される場合、明示した特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップの存在を指定するオープンエンドの用語であるものとするが、他の明示されていない特徴、要素、構成要素、群、整数及び／又はステップの存在を除外するものではない。また前述のことは、類似の意味を有する単語、例えば用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの派生語にも適用される。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及びその派生語は、本明細書で使用される場合、明示した特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップの存在を指定するクローズド用語であるものとするが、他の明示されていない特徴、要素、構成要素、群、整数及び／又はステップの存在を除外するものではない。用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、本明細書で使用される場合、明示された特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップ、並びに特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップの基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものの存在を指定するものとする。
【００３１】
[0042]「併用療法」が本明細書に記載のＡＣＴ方法によって産生される腫瘍抗原特異的セントラルメモリーＴ細胞集団と、１つ又は複数の同じ腫瘍抗原を発現する複製型腫瘍溶解性ウイルスの対象への順次投与を意図することは理解されよう。本明細書に記載のＡＣＴ方法によって産生されるメモリーＴ細胞集団及び同じ腫瘍抗原（複数可）を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、治療薬が協同作用、例えば相乗作用を示すことを可能にする時間間隔内で投与される。好ましい実施形態では、メモリーＴ細胞集団及び腫瘍溶解性ウイルスは、それぞれの約１時間〜約７２時間以内（例えば約１、２、３、６、１２、２４、４８又は７２時間以内）、約１日〜約４週間以内（例えば約１、２、３又は４週間以内）、約１週〜約３週間以内、又はそれらの間の任意の範囲内に投与される。関連する実施形態では、メモリーＴ細胞集団及び腫瘍溶解性ウイルスは、相互の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１日以内に投与される。
【００３２】
[0043]本明細書で使用される場合の「実質的に」、「約」及び「およそ」などの程度に関する用語は、結果が有意に変化しないような修飾用語のしかるべき量の偏差を意味する。これらの程度に関する用語は、この偏差が修飾した単語の意味を否定しない限り、修飾用語の少なくとも±５％の偏差を含むものとして解釈されたい。
【００３３】
[0044]本出願において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「Ｔ細胞（ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ）」を含む実施形態は、１つの物質又は２つ以上の追加の物質を含む特定の態様を指示するものと理解されたい。
【００３４】
[0045]「追加の」又は「第２の」構成要素、例えば、追加の又は第２のサイトカインなどを含む実施形態では、第２の構成要素は、本明細書で使用される場合、他の構成要素又は第１の構成要素と化学的に異なる。「第３の」構成要素は、他の第１の構成要素及び第２の構成要素とは異なり、またさらに列挙された構成要素又は「追加の」構成要素も同様に異なる。
【００３５】
[0046]用語「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、列挙された項目が個別に又は組み合わせて存在するか使用されることを意味する。実際、この用語は、列挙された項目の「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」が使用されているか存在していることを意味する。
【００３６】
詳細な説明
Ｔ細胞
[0047]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法は、本明細書に記載の方法によって産生される腫瘍抗原特異的セントラルメモリーＴ細胞の養子移入を利用する。驚いたことに、それにより、ＡＰＣ、腫瘍抗原、並びにＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンを含むか又はそれらから本質的になる組成物の存在下でＴ細胞（例えばナイーブＴ細胞）を培養すると、ＩＬ２１、ＩＬ１５又はラパマイシン単独と比較して、セントラルメモリー表現型を提示するＴ細胞が実質的に濃縮された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団が得られ、これをｅｘ  ｖｉｖｏで拡大し、患者に導入することができ、続いてがんを相乗的に治療するために同じ抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスを患者に投与することができるが、これにはコストのかかるセルソーティング技術を必要とすることなく、Ｔ細胞の導入前に患者にリンパ球枯渇レジメンを実施する必要なく、また患者にＩＬ２を投与する必要がないことが見出された。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１及びＩＬ１５は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌで存在する。関連する実施形態では、ラパマイシンは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌで存在する。
【００３７】
[0048]ＡＰＣは、例えば自己樹状細胞であってもよく、これは、接着性ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦ（例えば約８００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（例えば約５００Ｕ／ｍｌ）とともに約５日間培養し、それらを樹状細胞へ分化させることにより得ることができる。得られた樹状細胞は、５日目に、ＴＮＦａ（例えば約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１ｂ（例えば約２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば約１０００Ｕ／ｍｌ）、ＰＧＥ−２（例えば約１０００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（例えば約５００Ｕ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（例えば約８００Ｕ／ｍｌ）を添加することによってシミュレートされ、さらに２日間培養され得る。７日目に、樹状細胞はペプチド腫瘍抗原４０μｇ／ｍｌで約２時間パルスされ、本明細書に記載の方法に従って腫瘍抗原ペプチドが担持されたＡＰＣとして使用するために照射され得る。
【００３８】
[0049]いくつかの実施形態では、ＡＰＣ、腫瘍抗原、並びにＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下でナイーブＴ細胞を培養することによって、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又は少なくとも８０％又はそれ以上がセントラルメモリー表現型を提示する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団が得られる。一実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴ方法により得られるセントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４４＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ１２７＋表現型を示す。
【００３９】
[0050]本明細書に記載のＡＣＴ方法により使用するためのＴ細胞は、血液、リンパ系組織（例えば脾臓）、又は腫瘍（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＣＴ方法により使用するためのＴ細胞は、治療するがんを有する対象に対して組織適合性の表現型を有するＰＢＭＣから産生される。関連する実施形態では、ＰＢＭＣは、治療するがんを有する対象に対して自己由来である。
【００４０】
[0051]好ましい一実施形態では、本併用による養子細胞移入で使用するためのＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団は、（例えば１〜４週間、好ましくは約３週間）、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシン、がんによって発現される腫瘍抗原及び抗原提示細胞の存在下で、ヒトがんの対象から得られるＰＢＭＣを培養し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２によりＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団を拡大し、その細胞を患者に再導入し、続いて（例えば２４時間間隔で）同じ腫瘍抗原をコードする導入遺伝子を発現するように操作された複製型腫瘍溶解性ウイルス（例えば腫瘍溶解性ラブドウイルス）を投与することによって得られる。
【００４１】
[0052]関連する実施形態では、本併用による養子細胞移入において使用するためのＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団は、ヒト対象のがんによって発現される腫瘍抗原に特異的な組換えＴＣＲ又はＣＡＲを対象から得られるＰＢＭＣに形質導入し、（例えば１〜４週間、好ましくは約３週間）、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシン、抗原提示細胞及び腫瘍抗原の存在下で、遺伝的に改変された細胞を培養し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２によりＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団を拡大し、その細胞を患者に再導入し、続いて（例えば２４時間間隔で）同じ腫瘍抗原をコードする導入遺伝子を発現するように操作された複製型腫瘍溶解性ウイルス（例えば腫瘍溶解性ラブドウイルス）を投与することによって得られる。
【００４２】
[0053]別の実施形態では、本併用による養子細胞移入において使用するためのＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団は、（例えば１〜４週間、好ましくは約３週間）、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシン、がんによって発現される腫瘍抗原及び抗原提示細胞の存在下で、ヒトがんの対象から得られる腫瘍浸潤リンパ球を培養し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２によりＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団を拡大し、その細胞を患者に再導入し、続いて（例えば２４時間間隔で）同じ腫瘍抗原をコードする導入遺伝子を発現するように操作された複製型腫瘍溶解性ウイルス（例えば腫瘍溶解性ラブドウイルス）を投与することによって得られる。
【００４３】
[0054]関連する実施形態では、本併用による養子細胞移入において使用するためのＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団は、（例えば１〜４週間、好ましくは約３週間）、ヒト対象のがんによって発現される腫瘍抗原に特異的な組換えＴＣＲ又はＣＡＲを対象から得られた腫瘍浸潤リンパ球に形質導入し、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシン、抗原提示細胞及び腫瘍抗原の存在下で、遺伝的に改変された細胞を培養し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体並びにＩＬ２によりＣＤ８＋ヒトＴ細胞集団を拡大し、その細胞を患者に再導入し、続いて（例えば２４時間間隔で）同じ腫瘍抗原をコードする導入遺伝子を発現するように操作された複製型腫瘍溶解性ウイルス（例えば腫瘍溶解性ラブドウイルス）を投与することによって得られる。
【００４４】
腫瘍溶解性ウイルス
[0055]併用の腫瘍抗原を発現する複製コンピテント腫瘍溶解性ウイルスは、天然に存在する（例えば「フィールド起源」）か、改変された任意の複製コンピテント腫瘍溶解性ウイルスを含む。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原の発現に加えて、例えば、がん細胞に対するウイルスの選択性を増大するように改変され得る。
【００４５】
[0056]本発明による複製コンピテント腫瘍溶解性ウイルスとしては、限定するものではないが、ミオウイルス科（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（ｐｏｄｐｖｉｒｉｄａｅ）、テシウイルス科（ｔｅｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィコドナウイルス科（ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アドノウイルス科（ａｄｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポーバウイルス科（ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ジェミニウイルス科（ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、シクトウイルス科（ｃｙｃｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビルナウイルス科（ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルソミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、セキウイルス科（ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ）、コモウイルス科（ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポチウイルス科（ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ノダウイルス科（ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ）、テトラウイルス科（ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、トンブスウイルス科（ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、グラビウイルス科（ｇｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、及びバルナウイルス科（ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）の科のメンバーである腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。
【００４６】
[0057]本発明の実施において使用するための複製コンピテント腫瘍溶解性ウイルスの特定の例としては、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＶ）、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＶａｃＶ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｖｉｒｕｓ）及びパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【００４７】
[0058]いくつかの好ましい実施形態では、併用による腫瘍抗原を発現する複製コンピテント腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ラブドウイルスである。
【００４８】
[0059]典型的なラブドウイルスは、このウイルス科で最も研究されている、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。ラブドウイルスは、非セグメント（−）センスＲＮＡゲノムを有する弾丸形ウイルス科である。ラブドウイルス科としては、限定するものではないが、次のものが挙げられる：アラジャスウイルス（Ａｒａｊａｓ  ｖｉｒｕｓ）、チャンディプラウイルス（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＦ１２８８６８／ｇｉ：４５８３４３６、ＡＪ８１００８３／ｇｉ：５７８３３８９１、ＡＹ８７１８００／ｇｉ：６２８６１４７０、ＡＹ８７１７９９／ｇｉ：６２８６１４６８、ＡＹ８７１７９８／ｇｉ：６２８６１４６６、ＡＹ８７１７９７／ｇｉ：６２８６１４６４、ＡＹ８７１７９６／ｇｉ：６２８６１４６２、ＡＹ８７１７９５／ｇｉ：６２８６１４６０、ＡＹ８７１７９４／ｇｉ：６２８６１４５９、ＡＹ８７１７９３／ｇｉ：６２８６１４５７、ＡＹ８７１７９２／ｇｉ：６２８６１４５５、ＡＹ８７１７９１／ｇｉ：６２８６１４５３）、球菌ウイルス（Ｃｏｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＦ０４５５５６／ｇｉ：２８６５６５８）、イスファハンウイルス（Ｉｓｆａｈａｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＪ８１００８４／ｇｉ：５７８３４０３８）、マラバウイルス（Ｍａｒａｂａ  ｖｉｒｕｓ）（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８４８１０２３号の配列番号１〜６；ＨＱ６６００７６．１）、カラジャスウイルス（Ｃａｒａｊａｓ  ｖｉｒｕｓ）（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８４８１０２３号の配列番号７〜１２；ＡＹ３３５１８５／ｇｉ：３３５７８０３７）、ピリーウイルス（Ｐｉｒｙ  ｖｉｒｕｓ）（Ｄ２６１７５／ｇｉ：４４２４８０、Ｚ１５０９３／ｇｉ：６１４０５）、水疱性口内炎アラゴアスウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ａｌａｇｏａｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＢｅＡｎ  １５７５７５ウイルス、ボテケウイルス（Ｂｏｔｅｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、カルチャキウイルス（Ｃａｌｃｈａｑｕｉ  ｖｉｒｕｓ）、エルウイルスアメリカン（Ｅｅｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）、グレイロッジウイルス（Ｇｒａｙ  Ｌｏｄｇｅ  ｖｉｒｕｓ）、ジュロナウイルス（Ｊｕｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ）、クラマスウイルス（Ｋｌａｍａｔｈ  ｖｉｒｕｓ）、クワッタウイルス（Ｋｗａｔｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ラホヤウイルス（Ｌａ  Ｊｏｙａ  ｖｉｒｕｓ）、マルペススプリングウイルス（Ｍａｌｐａｉｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、マウントエルゴンコムモリウイルス（Ｍｏｕｎｔ  Ｅｌｇｏｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＤＱ４５７１０３／ｇｉ：９１９８４８０５）、ペリネットウイルス（Ｐｅｒｉｎｅｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６５２／ｇｉ：７１８４２３８１）、ツパイウイルス（Ｔｕｐａｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＮＣ＿００７０２０／ｇｉ：６６５０８４２７）、バイアグランデウイルス（Ｂａｈｉａ  Ｇｒａｎｄｅ  ｖｉｒｕｓ）（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８４８１０２３号の配列番号１３〜１８；ＫＭ２０５０１８．１）、ミュアスプリングスウイルス（Ｍｕｉｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＫＭ２０４９９０．１）、リードランチウイルス（Ｒｅｅｄ  Ｒａｎｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、ハートパーク��イルス（Ｈａｒｔ  Ｐａｒｋ  ｖｉｒｕｓ）、フランダースウイルス（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＦ５２３１９９／ｇｉ：２５１４０６３５、ＡＦ５２３１９７／ｇｉ：２５１４０６３４、ＡＦ５２３１９６／ｇｉ：２５１４０６３３、ＡＦ５２３１９５／ｇｉ：２５１４０６３２、ＡＦ５２３１９４／ｇｉ：２５１４０６３１、ＡＨ０１２１７９／ｇｉ：２５１４０６３０）、カメセウイルス（Ｋａｍｅｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、モスケイロウイルス（Ｍｏｓｑｕｅｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、モスリルウイルス（Ｍｏｓｓｕｒｉｌ  ｖｉｒｕｓ）、バルールウイルス（Ｂａｒｕｒ  ｖｉｒｕｓ）、フクオカウイルス（Ｆｕｋｕｏｋａ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６５１／ｇｉ：７１８４２３７９）、カーンキャニオンウイルス（Ｋｅｒｎ  Ｃａｎｙｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、コルビソンウイルス（Ｎｋｏｌｂｉｓｓｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、ルダンテックウイルス（Ｌｅ  Ｄａｎｔｅｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６５０／ｇｉ：７１８４２３７７）、キューラリバウイルス（Ｋｅｕｒａｌｉｂａ  ｖｉｒｕｓ）、コネチカットウイルス（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  ｖｉｒｕｓ）、ニューミントウイルス（Ｎｅｗ  Ｍｉｎｔｏ  ｖｉｒｕｓ）、ソーグラスウイルス（Ｓａｗｇｒａｓｓ  ｖｉｒｕｓ）、チャコウイルス（Ｃｈａｃｏ  ｖｉｒｕｓ）、セナマドレイラウイルス（Ｓｅｎａ  Ｍａｄｕｒｅｉｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ティンボウイルス（Ｔｉｍｂｏ  ｖｉｒｕｓ）、アルムピウォーウイルス（Ａｌｍｐｉｗａｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６４５／ｇｉ：７１８４２３６７）、アルアックウイルス（Ａｒｕａｃ  ｖｉｒｕｓ）、バンゴランウイルス（Ｂａｎｇｏｒａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ビンボウイルス（Ｂｉｍｂｏ  ｖｉｒｕｓ）、ビベンアームウイルス（Ｂｉｖｅｎｓ  Ａｒｍ  ｖｉｒｕｓ）、ブルークラブウイルス（Ｂｌｕｅ  ｃｒａｂ  ｖｉｒｕｓ）、チャールビルウイルス（Ｃｈａｒｌｅｖｉｌｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、コースタルプレーンズウイルス（Ｃｏａｓｔａｌ  Ｐｌａｉｎｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＤａｋＡｒＫ  ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｖｉｒｕｓ）、ガルバウイルス（Ｇａｒｂａ  ｖｉｒｕｓ）、ゴッサスウイルス（Ｇｏｓｓａｓ  ｖｉｒｕｓ）、ハンプティドゥーウイルス（Ｈｕｍｐｔｙ  Ｄｏｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６４３／ｇｉ：７１８４２３６３）、ジョインジャカカウイルス（Ｊｏｉｎｊａｋａｋａ  ｖｉｒｕｓ）、カンナマンガラムウイルス（Ｋａｎｎａｍａｎｇａｌａｍ  ｖｉｒｕｓ）、コロンゴウイルス（Ｋｏｌｏｎｇｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＤＱ４５７１００／ｇｉ：９１９８４７９９  核タンパク質（Ｎ）ｍＲＮＡ、部分的ｃｄｓ）；コールピンヤウイルス（Ｋｏｏｌｐｉｎｙａｈ  ｖｉｒｕｓ）、コトンコンウイルス（Ｋｏｔｏｎｋｏｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＤＱ４５７０９９／ｇｉ：９１９８４７９７、ＡＹ８５４６３８／ｇｉ：７１８４２３５４）；ランジアウイルス（Ｌａｎｄｊｉａ  ｖｉｒｕｓ）、マニトバウイルス（Ｍａｎｉｔｏｂａ  ｖｉｒｕｓ）、マルコウイルス（Ｍａｒｃｏ  ｖｉｒｕｓ）、ナソールウイルス（Ｎａｓｏｕｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ナバロウイルス（Ｎａｖａｒｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、ヌガインガンウイルス（Ｎｇａｉｎｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４��４９／ｇｉ：７１８４２３７５）、オークベールウイルス（Ｏａｋ−Ｖａｌｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６７０／ｇｉ：７１８４２４１７）、オボジャングウイルス（Ｏｂｏｄｈｉａｎｇ  ｖｉｒｕｓ）（ＤＱ４５７０９８／ｇｉ｜９１９８４７９５）、オイタウイルス（Ｏｉｔａ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＢ１１６３８６／ｇｉ：４６０２００２７）、ウアンゴウイルス（Ｏｕａｎｇｏ  ｖｉｒｕｓ）、パリークリークウイルス（Ｐａｒｒｙ  Ｃｒｅｅｋ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６４７／ｇｉ：７１８４２３７１）、リオグランデシクリッドウイルス（Ｒｉｏ  Ｇｒａｎｄｅ  ｃｉｃｈｌｉｄ  ｖｉｒｕｓ）、サンジンバウイルス（Ｓａｎｄｊｉｍｂａ  ｖｉｒｕｓ）（ＤＱ４５７１０２／ｇｉ｜９１９８４８０３）、シグマウイルス（Ｓｉｇｍａ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＨ００４２０９／ｇｉ：１６８０５４５、ＡＨ００４２０８／ｇｉ：１６８０５４４、ＡＨ００４２０６／ｇｉ：１６８０５４２）、スリプルウイルス（Ｓｒｉｐｕｒ  ｖｉｒｕｓ）、スウィートウォーターブランチウイルス（Ｓｗｅｅｔｗａｔｅｒ  Ｂｒａｎｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、チブロガルガンウイルス（Ｔｉｂｒｏｇａｒｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６４６／ｇｉ：７１８４２３６９）、キシブレマウイルス（Ｘｉｂｕｒｅｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ヤタウイルス（Ｙａｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、アデレードリバーウイルス（Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（Ｕ１０３６３／ｇｉ：６００１５１、ＡＦ２３４９９８／ｇｉ：１０４４３７４７、ＡＦ２３４５３４／ｇｉ：９９７１７８５、ＡＹ８５４６３５／ｇｉ：７１８４２３４８）、ベリマーウイルス（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６３６／ｇｉ：７１８４２３５０］）、キンバリーウイルス（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＹ８５４６３７／ｇｉ：７１８４２３５２）、又はウシ一過性熱ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｅｐｈｅｍｅｒａｌ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＮＣ＿００２５２６／ｇｉ：１００８６５６１）。これらのラブドウイルス又はそれらの変異体のいずれかは、併用により使用するために腫瘍抗原を発現するように操作されていてもよい。
【００４９】
[0060]いくつかの好ましい実施形態では、併用の腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性のラブドウイルスは、野性型又は組換えベシクロウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、例えば、それらの変異体を含む野性型又は組換えのＶＳＶ、チャンディプラ、マラバ、カラジャスである。他の実施形態では、腫瘍溶解性ラブドウイルスは、野性型又は組換え非ベシクロウイルス、例えば、変異体を含めたミュアスプリングス、ファーミントン、又はバイアグランデウイルスである。
【００５０】
[0061]特に好ましい実施形態では、併用の腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、例えば腫瘍選択性を増強するように任意選択で遺伝的に改変された野性型マラバ株ラブドウイルス又はその変異体である。マラバウイルスは、例えば、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９０４５７２９号の第２欄、２４〜４２行に記載されているように、Ｇタンパク質のアミノ酸２４２及び／又はＭタンパク質のアミノ酸１２３に置換を含有するマラバウイルスであってもよい。特に好ましい実施形態では、マラバウイルスは、Ｂｒｕｎら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１８（８）：１４４０〜１４４９（２０１０）に記載されているように、マラバＭＧ１である。マラバＭＧ１は、がん細胞ではウイルスの高毒性を付与するが、正常細胞では弱化される、Ｇタンパク質変異（Ｑ２４２Ｒ）及びＭタンパク質変異（Ｌ１２３Ｗ）を含有する遺伝的に改変されたマラバ株ラブドウイルスである。
【００５１】
[0062]別の好ましい実施形態では、併用の腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ラブドウイルスは、例えば腫瘍選択性を増強するように任意選択で遺伝的に改変されたＶＳＶ株又はその変異体である。特に好ましい実施形態では、ＶＳＶは、その全内容は参照により本明細書に組み込まれるＳｔｏｊｄｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．，４（４）：２６３〜７５（２００３）に記載されているように、Ｍタンパク質の５１位にメチオニンの欠失を含む。
【００５２】
[0063]併用の腫瘍抗原を発現する複製型腫瘍溶解性ラブドウイルスは、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４又はそれ以上のウイルス粒子（ｖｐ）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）の１回又は複数回用量として、好ましくは、本明細書に記載の方法によるＡＣＴ治療後の対象に、注射、潅流などを含む血管内（静脈内及び／又は動脈内）投与によって、全身投与することができる。好ましい実施形態では、腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ラブドウイルスは、１０５〜１０１４ｐｆｕ、１０６〜１０１２ｐｆｕ、１０８〜１０１４ｐｆｕ又は１０８〜１０１２ｐｆｕの１回又は複数回用量として、本明細書に記載の方法によるＡＣＴ治療後の対象に血管内投与される。
【００５３】
[0064]いくつかの好ましい実施形態では、併用の腫瘍抗原を発現する複製コンピテント腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。
【００５４】
[0065]好ましい実施形態では、併用の腫瘍抗原を発現する複製型腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）又はワイス（Ｗｙｅｔｈ）株である。ウエスタンリザーブワクシニア株のゲノムは配列決定されている（アクセッション番号ＡＹ２４３３１２）。
【００５５】
[0066]腫瘍抗原を発現する複製型の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ウイルスのがん選択性を増大するために、１つ又は複数の機能遺伝子を欠損するように操作され得る。いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を欠損するように操作される。別の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）を欠損するように操作され得る。別の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＦＧ及びＴＫ活性の両方を欠損するように操作され得る。他の態様では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｅ３Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｂ１８Ｒ又はＢ８Ｒなどの宿主インターフェロン（ＩＦＮ）応答の回避に関与する１つ又は複数の遺伝子を欠損するように操作され得る。いくつかの好ましい実施形態では、複製型の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ウエスタンリザーブ、コペンハーゲン、リスター又はワイス株であり、ＴＫ機能遺伝子を欠損している。他の実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｂ１８Ｒ及び／又はＢ８Ｒ機能遺伝子を欠損しているウエスタンリザーブ、コペンハーゲン、リスター又はワイス株である。
【００５６】
[0067]併用の腫瘍抗原を発現する複製型の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、例えば、本明細書に記載の方法によるＡＣＴ療法後に、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、頭蓋内、皮下又は鼻腔内投与を介して、１×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、５×１０５ｐｆｕ、少なくとも１×１０６ｐｆｕ、５×１０６又は約５×１０６ｐｆｕ、１×１０７、少なくとも１×１０７ｐｆｕ、１×１０８又は約１×１０８ｐｆｕ、少なくとも１×１０８ｐｆｕ、約又は少なくとも５×１０８ｐｆｕ、１×１０９又は少なくとも１×１０９ｐｆｕ、５×１０９又は少なくとも５×１０９ｐｆｕ、１×１０１０ｐｆｕ又は少なくとも１×１０１０ｐｆｕ、５×１０１０又は少なくとも５×１０１０ｐｆｕ、１×１０１１又は少なくとも１×１０１１、１×１０１２又は少なくとも１×１０１２、１×１０１３又は少なくとも１×１０１３ｐｆｕの１回用量又は複数回用量として、対象に局所投与又は全身投与することができる。例えば、ウイルスは、約１０７〜１０１３ｐｆｕの間、約１０８〜１０１３ｐｆｕの間、約１０９〜１０１２ｐｆｕの間、約１０８〜１０１２の間、又は１０９〜１０１０ｐｆｕの間の用量で投与することができる。
【００５７】
[0068]腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスの単回用量は、０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０又は２４時間にわたって、それらの間にあるすべての値を含めて、対象又は腫瘍に投与される量を意味することが企図される。用量は経時的に拡散されてもよいし、個別の注射により拡散されてもよい。典型的には、複数回投与は、例えば、腫瘍の近傍において、或いは静脈内投与の場合には対象の血流又はリンパ系の特定の注入口など、同じ一般的な標的領域に投与される。ある特定の態様では、ウイルス用量は、単一の針に複数のポートを提供する針、又は注射器に連結された複数のプロング、又はそれらの組合せを含む注射器具によって送達される。腫瘍溶解性ウイルスの単回用量が投与されてもよく、又は複数回投与が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週又はそれ以上の週を含み得る治療期間にわたって投与されてもよい。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、１、２、３、４、５、６カ月又はそれ以上の期間にわたって隔日、毎週、隔週、３週毎に投与され得る。
【００５８】
[0069]当業者には理解されるように、腫瘍抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスは、通常、薬学的に許容される担体、例えば生理食塩水又は他の適切な緩衝液とともに、医薬組成物の一部として投与される。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。医薬活性物質に対するそのような媒体及び薬剤の使用は、当分野においては周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が考えられる。また補充の活性成分も組成物に組み入れることができる。
【００５９】
腫瘍抗原
[0070]併用の腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載のＡＣＴ方法によって産生されるＴ細胞によって標的とされる同じ抗原を発現する。腫瘍溶解性ウイルスによって発現され得る適切な抗原としては、限定するものではないが、がん胎児性抗原、例えばアルファフェトプロテイン（ＡＬＦ）及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）、表面糖タンパク質、例えばＣＡ１２５、がん遺伝子、例えばＨｅｒ２、メラノーマ関連抗原、例えばドパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、ＧＰ１００及びＭＡＲＴ−１、がん精巣抗原、例えばＭＡＧＥタンパク質及びＮＹ−ＥＳＯ−１、ウイルス性がん遺伝子、例えばＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７、並びに胚又は胚体外組織に通常限定される腫瘍において異所的に発現されるタンパク質、例えばＰＬＡＣ１、或いは腫瘍関連抗原の変異体が挙げられる。腫瘍関連抗原の「変異体」は、（ａ）腫瘍関連抗原タンパク質由来の少なくとも１つの腫瘍関連抗原エピトープを含み、（ｂ）腫瘍関連抗原タンパク質に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である、タンパク質を意味する。十分に容認された抗原エピトープをまとめているデータベースは、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ  Ｖ、Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｎ、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  Ｂによって「Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：２０１３年最新版」で提供されている。Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ２０１３  １３：１５は、オンラインによりｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅで入手可能である。
【００６０】
[0071]いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通性上皮抗原、又はがん精巣抗原１を発現する。
【００６１】
[0072]他の実施形態では、本発明は、腫瘍抗原を同定する方法であって、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシン並びに抗原提示細胞（例えば樹状細胞）を含むか又はそれらから本質的になる組成物の存在下で、対象から単離した腫瘍材料とＰＢＭＣとを共培養するステップと；培養物からＴ細胞集団を単離するステップと；個々のＴ細胞をＴ細胞集団からクローニングするステップと；抗原特異性についてＴ細胞クローンを特性決定するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍材料は、全ＲＮＡ、溶解腫瘍細胞又はアポトーシス小体を含む。本明細書に記載のＡＣＴ方法を使用して、本方法によって同定された抗原に特異的なセントラルメモリーＴ細胞の集団を産生し、同じ抗原を発現するように操作された腫瘍溶解性ウイルスと併用して、相乗的ながん治療を提供することができる。
【００６２】
がん
[0073]本明細書に記載の併用によって治療されるがんとしては、限定するものではないが、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性前骨髄球、骨髄単球性単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫及び辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真性赤血球増加症、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、及び癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸直腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、上咽頭癌、食道癌、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん及び非扁平上皮非小細胞肺がんを含む）、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、神経芽細胞腫；口腔がん（例えば唇、舌、口及び咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん；呼吸器系がん、肉腫、皮膚がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、及び泌尿器系がんが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、治療されるがんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん（例えばホルモン抵抗性転移性乳がん）、頭頸部がん（例えば頭頸部扁平上皮がん）、転移性結腸直腸がん、ホルモン感受性又はホルモン抵抗性前立腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肝細胞がん、腎細胞がん、軟部組織肉腫及び小細胞肺がんから選択される。
【００６３】
[0074]一態様では、併用で治療される対象は、１つ若しくは複数の化学療法剤による治療に対して難治性及び／又は１つ若しくは複数の抗体による治療に対して難治性であるがんを有するヒトである。
【実施例】
【００６４】
[0075]以下の実施例により本発明の範囲を説明する。実施例の特定の要素は単なる説明目的のためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、同等の方法を開発し本発明の範囲内にある類似の材料を利用することができる。
【００６５】
実験方法及び手順
細胞株
[0076]すべての細胞を５％のＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃にて維持した。Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＢ１６ｇｐ３３細胞（ＬＣＭＶ  ｇｐ３３エピトープに対応するミニ遺伝子を発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０細胞である）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５ｍｌのピルビン酸ナトリウム、５ｍｌの非必須アミノ酸、５ｍｌのビタミン溶液、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＭＥＭ／Ｆ１１中で維持した。ｇｐ３３ミニ遺伝子の発現は、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて維持した。すべての細胞培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ニューヨーク州）である。ＣＭＳ５細胞は、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で維持した。
【００６６】
動物
[0077]Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入し、特定病原体に感染していない設備に収容した。ＤＵＣ１８マウスは、Ｅｒｋ９Ｍ（１３６〜１４４）変異された同系ＣＭＳ５線維肉腫拒絶抗原に特異的なＴ細胞受容体を発現するように操作されたトランスジェニックマウスであり、Ｌｙｓｅ  Ｎｏｒｉａｎ氏（アイオワ大学、アイオワ州）から寄贈された。２４Ｈ９Ｒマウスは、ＤＣＴ／ＴＲＰ−２１８０〜１８８のＨ−２Ｋｂ制限エピトープを認識するＴＣＲ導入遺伝子を保持するトランスジェニックマウス系統であり、Ａｒｔｈｕｒ  Ｈｕｒｗｉｔｚ博士（ＮＩＨ、フレデリック、メリーランド州）から寄贈された。Ｐ１４マウスは、ｇｐ３３ペプチドに対するＴＣＲを担持するトランスジェニックマウス系統（Ｂ６．Ｃｇ−ＴｃｒａｔｍｌＭｏｍＴｇ（ＴｃｒＬＣＭＶ）３２７Ｓｄｚ）であるが、これはＴａｃｏｎｉｃ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ジャーマンタウン、ニューヨーク州）から購入した。Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｉｎｓ２−ＧＰ）３４−２０Ｏｌｄｓトランスジェニックマウス（ＲＩＰｇｐマウスと呼ばれる）は、Ｐａｍｅｌａ  Ｏｈａｓｈｉ氏（ＵＨＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、トロント、カナダ）から寄贈されたものであり、マクマスター大学の中央動物施設で飼育した。ＮＲＧマウス（Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ファーミントン、コネチカット州）から購入した。すべての動物実験は、カナダの審議会の動物飼育ガイドラインに準拠し、マクマスター大学の動物研究倫理委員会によって承認された。
【００６７】
皮膚腫瘍動物モデル
[0078]６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６又はＲＩＰｇｐマウスに、２×１０５個のＢ１６−ｇｐ３３若しくはＢ１６Ｆ１０細胞又は１０６個のＣＭＳ５細胞を皮内投与した。ＡＣＴ及びその後のＯＶワクチン接種は、（腫瘍が直径約５ｍｍに達した場合）腫瘍移植の５〜７日後に投与された。腫瘍増殖を毎日モニターし、一日おきにノギスで測定した。腫瘍体積は、幅×長さ×深さとして算出した。腫瘍の終了点は、少なくとも二次元で＞１０ｍｍ又は一次元で＞２０ｍｍと定義した。必要とされた場合、血糖値は、Ｃｏｎｔｏｕｒ  ｎｅｘｔ  ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ａｓｃｅｎｓｉａ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ）を使用してモニターした。血糖が＞１４ｍｍｏｌ／Ｌを示した動物は、糖尿病であると考えられた。
【００６８】
ウイルス
[0079]ＶＳＶ−ｇｐ３３［２２］ベクター及びＶａｃＶ−ｇｐ３３［２３］ベクターは、それぞれ、組換え水疱性口内炎ウイルス及びワクシニアウイルスであり、これらはリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス糖タンパク質の優性ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを発現する（それぞれ、ＬＣＭＶ−ｇｐ３３−４１及びＬＣＭＶ−ｇｐ６１−８０）。ＭＲＢ−ＧＰは、その天然糖タンパク質がＬＣＭＶの糖タンパク質と遺伝的に置き換えられた偽型の組換えマラバウイルスである。ＶＳＶ−ｈＤＣＴ及びＭＲＢ−ｈＤＣＴは、それぞれ、組換え水疱性口内炎ウイルス及びマラバウイルスであり、これらは完全長のヒトドーパクロームトートメラーゼ（ＤＣＴ）を発現する［２４］。ＶａｃＶ−ｈＤＣＴは、ｈＤＣＴを発現するように操作された、組換えのチミジンキナーゼ及びワクシニア成長因子二重欠失ワクシニアウイルスである。Ａｄ−ｈＤＣＴは、完全長のヒトメラノーマ抗原ＤＣＴをコードするヒト血清型５をベースとした複製欠損アデノウイルス（Ｅ１／Ｅ３欠失）である［２４］。ＶＳＶ−Ｅｒｋ９Ｍ及びＭＲＢ−Ｅｒｋ９Ｍは、それぞれ、組換えの水疱性口内炎ウイルス及びマラバウイルスであり、これらは、ＣＭＳ５細胞株において発現されるＥＲＫの変異型に対して優性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを発現する。ＶＳＶ−ｇｐ３３及びＶＳＶ−ｈＤＣＴは、既に記載されているようにして［２５］、基質タンパク質の５１位のメチオニン残基の欠失を介してＩ型ＩＦＮ応答を阻害するそれらの能力を無効にするように改変された。またＭＲＢ−ｈＤＣＴ及びＭＲＢ−Ｅｒｋ９Ｍは、既に記載されているようにして［２６］、基質中の残基及び糖タンパク質中の残基の変異を介してＩ型ＩＦＮ応答を阻害するそれらの能力を無効にするように改変された。
【００６９】
ペプチド
[0080]ＬＣＭＶ−ＧＰのＨ−２Ｄｂ−制限ペプチド（ｇｐ３３−４１；ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ（配列番号１））、ＤＣＴのＨ−２Ｋｂ−制限ペプチド（ＤＣＴ１８０−１８８  ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号２））、及び変異体ＥＲＫのＨ−２Ｋｄ−制限ペプチド（Ｅｒｋ９Ｍ１３６−１４４；ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号３））は、Ｂｉｏｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（プレザントン、カリフォルニア州）から購入した。ペプチドは蒸留水に溶解し、−２０℃で保存した。
【００７０】
Ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔｃｍ培養及びＡＣＴ＋ワクチン接種プロトコル
[0081]脾細胞は、従来の方法によってＴＣＲトランスジェニックマウスから単離した。脾細胞（多数のＡＰＣを含有）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２１、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５、２０ｎｇ／ｍＬのラパマイシン、及び０．１μｇ／ｍＬの同族抗原ペプチドを補充したＲＰＭＩ培地に３００万／ｍＬの密度で播種した。最初の播種後の４日間、最初の培地及びペプチド非含有の補充物を使用して、培養物を５倍容量に拡大した。細胞を３日後に回収し、洗浄し、注射用ＰＢＳに懸濁した。マウスに、２００μＬのＰＢＳ中の１０６個Ｔｃｍ細胞を静脈内（ＩＶ）注射し、２４時間後、２×１０８ｐｆｕのＶＳＶ−ｇｐ３３、ＶＳＶ−ＤＣＴ及びＭＲＢ−ＤＣＴ、１×１０８ｐｆｕのＶａｃＶ−ｇｐ３３及びＶａｃＶ−ＤＣＴ、５×１０８ｐｆｕのＶＳＶ−ｅｒｋ９ｍ及びＭＲＢ−ｅｒｋ９ｍを（特に指示のない限り）２００μＬのＰＢＳ中でＩＶ注射した。リンパ球枯渇治療は、指示のある場合、Ｔｃｍ細胞を注入する３日前に、２０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＰＸ）をＩＰ注射することによって実施した。
【００７１】
Ｔｃｍ表面マーカーに対するフロー染色
[0082]ｅｘ  ｖｉｖｏ培養細胞を回収し、ペレット化し、Ｆｃブロックで処理した。次いで、細胞をＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１２７の表面発現について染色した。データは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミシソーガ、オンタリオ州、カナダ）でＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、アシュランド、オレゴン州）を用いて解析した。
【００７２】
抗原特異的Ｔ細胞応答の検出
[0083]末梢血単核細胞は、眼窩骨膜洞血液試料から得た。赤血球は、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解した。単核細胞をｇｐ３３ペプチド（１μｇ／ｍＬ）で３７℃にて５時間刺激し、インキュベーションの最後の４時間、ブレフェルジンＡ（Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ、１μｇ／ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。細胞をＦｃブロックで処理し、ＣＤ８の表面発現について染色した。続いて細胞を固定し、透過処理し（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、細胞内インターフェロン−γについて染色した。データは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、アシュランド、オレゴン州）で解析した。
【００７３】
組織病理学的染色及び免疫組織化学的染色
[0084]組織を１０％ホルマリンに２４時間固定した後、７０％エタノールで脱水した。固定した組織をパラフィンに包埋し、５μｍで切片化した。切片は、ヘマトキシリン及びエオシンで染色するか、免疫組織化学（ＩＨＣ）によりインスリン発現について調べた。ＩＨＣについては、切片を３％の過酸化水素で１５分間室温にて処理し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中の５％ＢＳＡ及び２％ヤギ血清で４５分間ブロックし、続いてアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）で処理した。スライドを、ウサギ抗マウスインスリン抗体（ａｂｅａｍ；ａｂ１８１５４７）と４℃で一晩インキュベートし、続いてビオチン化抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）とインキュベートした。スライドを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）及びＩｍｍＰＡＣＴ  ＡＭＥＣ  Ｒｅｄペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）による連続処理を使用して展開した後、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンで対比染色し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してマウントした。
【００７４】
実施例１
ＴＡＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養はセントラルメモリー表現型を誘導する
[0085]ｅｘ  ｖｉｖｏ系Ｔ細胞培養は、一般に、共通のガンマ鎖（ＩＬ２Ｒγ又はＣＤ１３２）を介してシグナル伝達するサイトカインを利用する。一般的なガンマ鎖ファミリーのサイトカインとしては、限定するものではないが、ＩＬ２、ＩＬ１５、及びＩＬ２１が挙げられる［２７］。ＣＤ１３２は主としてリンパ球で発現され、この受容体を介したシグナル伝達はＣＤ８＋Ｔ細胞及び他のリンパ球サブタイプの増殖及び成熟を促進する［２７］。ＩＬ２はＣＤ８  Ｔ細胞の速やかな増殖及びエフェクター分化を誘導することが知られているが［２８〜３０］が、ＩＬ１５及びＩＬ２１は恒常性増殖を緩やかに推進し、ＣＤ８＋Ｔ細胞をセントラルメモリー分化状態に傾かせることが知られている［３０〜３２］。したがって、本発明者らは、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養系においてＩＬ１５及びＩＬ２１補充を利用した。さらに、本発明者らは、一般的に使用されているｍＴＯＲ阻害剤のラパマイシンも使用した。ｍＴＯＲ経路の制御は、ウイルスワクチン系において、Ｔ細胞の生存をサポートし、メモリーＴ細胞分化を誘導することが明らかにされている［３３、３４］。ラパマイシンによる短期間のｉｎ  ｖｉｖｏ治療は、メモリーＴ細胞分化を増大し、ワクチン誘導Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強することができる［３５］。その結果、本発明者らのＴ細胞培養プロトコルにおいてＩＬ１５、ＩＬ２１、及びラパマイシンを併用すると、Ｔ細胞の拡大と、セントラルメモリー表現型及び機能性の獲得が可能になる。
【００７５】
[0086]Ｔｃｍ培養を樹立するため、脾細胞をＰＩ４又は２４Ｈ９Ｒマウスから抽出し、０．１μｇ／ｍＬのｇｐ３３又はＤＣＴペプチド、２０ｎｇ／ｍＬのラパマイシン、及びそれぞれ１０ｎｇ／ＬのＩＬ１５及びＩＬ２１の存在下で、７日間培養した。開始３日後に、ペプチド非存在下、２０ｎｇ／ｍＬのラパマイシン及びそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５及びＩＬ２１を補充した標準Ｔ細胞培地（Ｌ−グルタミン、抗生物質及びベタメルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地）で培養容量を５倍に拡大した。培養前、Ｐ１４  ＣＤ８  Ｔ細胞（図１Ａ、０日目）はＣＤ４４陰性であったが、古典的なナイーブＴ細胞表現型のＣＤ６２Ｌについては陽性であった。７日間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養後の回収の際（図１Ａ、７日目）、細胞は依然としてＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの両方の発現が高レベルのセントラルメモリー表現型を示した。Ｔｃｍ表現型を獲得することに加えて、培養細胞は、細胞数から算出された総細胞収率に基づき、７日間で約２０倍に拡大するＰ１４及び２４Ｈ９Ｒベース培養の両方で強固な増殖を示した（図１Ｂ）。ＩＬ−１５と併用した腫瘍抗原刺激は、Ｔ細胞の増殖を促進する。ＩＬ−２１及びラパマイシンはセントラルメモリー分化を誘導し、それらがエフェクターＴ細胞にならないようにＴ細胞の増殖を抑制する。
【００７６】
実施例２
ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンの特定の併用は、併用療法において最適な抗腫瘍効果を有する抗原特異的セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導分化に必要とされる。
[0087]ラパマイシン、ＩＬ１５、及びＩＬ２１の特定の併用は、本明細書に記載の併用療法において最適な抗腫瘍効果を有する抗原特異的セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養、拡大及び分化に必要とされる。これらの各成分及び全部は、そのようなＴｃｍ細胞を産生するのに必要とされ、１つ又は複数のこれらの成分の非存在下で産生される細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入及びＯＶワクチン接種後、最適下限のＴ細胞増殖及び／又は抗腫瘍効果の低下がある。
【００７７】
[0088]ＩＬ１５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大及びセントラルメモリー分化を促進する培養プロトコルにおいて必要とされる。ＩＬ１５の非存在下で培養された細胞は、完全な併用（図２Ａの１Ｌ１５／ＩＬ２１／Ｒａｐａ）で増殖させた細胞と比較して、増殖低下及びｅｘ  ｖｉｖｏ培養からの細胞収率の減少を示した（図２ＡのＩＬ２１／Ｒａｐａ）。さらに、このようにして培養された細胞は、図２Ｂ及び図Ｃにおける完全な併用で増殖された細胞によって例示されるセントラルメモリー表現型よりもナイーブに向かって傾いた改変表現型を示した（図２ＣにおけるＣＤ４４レベルの低下）。注入及びＶＳＶ−ｇｐ３３刺激の際、ＩＬ１５の非存在下で増殖させた細胞は、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答の程度がわずかに低下し（図２Ｈ）、腫瘍を完全退縮させること、又は生存期間を延長させることはできなかった（図２Ｅ及び図２Ｉ）。
【００７８】
[0089]ＩＬ２１は、培養細胞を、最適な抗原特異的細胞溶解機能を有する良質のセントラルメモリー表現型にプログラミングするのに不可欠な役割を果たす。ＩＬ２１の非存在下（ＩＬ１５／Ｒａｐａ）で培養された細胞は、完全な併用で培養した細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に匹敵する正常な発現レベルのＣＤ６２Ｌ（図２Ｂ）及びＣＤ４４（図２Ｃ）を有した。注入及びＶＳＶ−ｇｐ３３による刺激の後、ＩＬ２１の非存在下で増殖した細胞は、完全な併用で培養した細胞に匹敵する程度のｉｎ  ｖｉｖｏ応答を生じた。ともかく、ＩＬ２１の非存在下で増殖させた細胞で処置したマウスの腫瘍退縮（図２Ｆ）及び生存率（図２Ｉ）は、完全な併用で増殖させた細胞と比較して劣っていた。
【００７９】
[0090]ラパマイシンは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対して阻害機能を示し、それはＴｃｍ表現型の獲得に干渉しない。代わりに、本明細書に記載の培養レジメンにおけるラパマイシンの役割は、細胞溶解機能及びＯＶ刺激後の抗腫瘍効果の点で細胞品質を増強することである。ラパマイシンの非存在下で産生された細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで同等の増殖を示すが（図２ＡのＩＬ１５／ＩＬ２１群）、完全な併用で増殖した細胞と比較して、セントラルメモリーＴ細胞マーカータンパク質ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４の発現に変化を示す（それぞれ、図２Ａ及び図２Ｂ）。これらの細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現の低下は、それらが真のセントラルメモリー分化状態を獲得していないことを示唆している。実際、ラパマイシンの非存在下で増殖した細胞は、ＯＶ刺激の５日後にｉｎ  ｖｉｖｏで増殖の増強を示した（図２Ｈ）。これは生存が短く、感染後１２日及び２１日で、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のレベルが完全な併用で増殖した細胞に匹敵するレベルまで低下した。まとめると、これらの結果は、ラパマイシンの非存在下で増殖した細胞はエフェクターメモリー表現型を取り入れ（３０）、ＶＳＶ−ｇｐ３３刺激後にｉｎ  ｖｉｖｏで送達される死滅シグナルに対してより感受性が強いことを示唆している。結局のところ、これらの細胞は抗腫瘍効果を損なっており、生存率の低下につながる（図２Ｉ）完全な腫瘍退縮の欠如を示している（図２Ｇ）。
【００８０】
実施例３
ｅｘ  ｖｉｖｏ培養したメモリーＴ細胞の移入は、抗腫瘍活性の獲得にＯＶワクチン追加免疫を必要とする
[0091]セントラルメモリーＣＤ８  Ｔ細胞はリンパ節に存在し、それらの同族ペプチドとの提示を介して刺激されるまでは不活性のままである。抗原特異的刺激の際、Ｔｃｍ細胞は速やかに分裂し、エフェクター細胞に分化し、強固な全身性細胞溶解応答を起こす。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養で産生されたＴｃｍ細胞の抗原特異的細胞溶解機能を、移入された細胞により標的化された抗原を発現する腫瘍を担持するマウスへの養子移行と、それに続く同じ抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスワクチンによる活性化によって試験した。本発明者らは、３種のＴＣＲトランスジェニックマウス系統（２４Ｈ９Ｒ、ＤＵＣ１８及びＰ１４マウス）を試験したが、これらは真の自己抗原、ネオ抗原及びウイルス抗原（それぞれ、Ｂ１６Ｆ１０細胞のＤＣＴ、ＤＵＣ１８細胞、及びＢ１６−ｇｐ３３細胞のＥｒｋ９Ｍ）を提示する一般的に使用される腫瘍細胞株モデルで発現される抗原を標的とする。培養されたＴｃｍ細胞は、Ｔ細胞の抗原性標的を発現する腫瘍を担持するマウスに養子移入された。Ｔｃｍ細胞単独の移入は、有意な全身性抗原特異的応答を誘導することができず、抗腫瘍効果は示さなかった（図３、図４及び図５のＴｃｍ群）。これはＴｃｍ細胞の予測された特徴であり、最小レベルのペプチドに遭遇するリンパ器官に隔離されているためである。抗原提示はＴｃｍ細胞の活性化及びエフェクター応答の発生にとって必要条件であるので、本発明者らは、本発明者らのＴｃｍ  ＡＣＴを、同族ペプチドを発現する腫瘍溶解性ウイルスワクチンベクターと併用した。本発明者らは、水疱性口内炎ウイルスベクター、マラバウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクターを使用することを選択したが、その理由は腫瘍溶解性ウイルスであり、過去にワクチンベクターとして使用されていたからである。これらのウイルスは強力な腫瘍溶解活性を有しており、このことはそれらががん細胞に優先的に感染し溶解するのでＣＤ８媒介性腫瘍破壊を相乗的に増強することができることを意味する。移入されたＴ細胞のペプチド特異性と相互に関連するこれらのウイルスベクターに導入遺伝子カセットを包含することにより、腫瘍溶解ワクチンが産生され、リンパ節へのペプチドの送達と、既に投与されたＴｃｍ  ＡＣＴ細胞の活性化を可能にする。Ｔｃｍ  ＡＣＴは、ＶＳＶ、ＭＲＢ（図３Ａ、図４Ａ及び図５Ａ）、並びにＶａｃＶワクチン接種（図３Ａ及び図５Ａ）と組み合わせた場合に、速やかにかつ完全に腫瘍退縮を誘導した。併用療法で誘導されたＣＤ８  Ｔ細胞応答は、ＶＳＶ及びマラバについては感染の５日後（図３Ｂ、図４Ｂ及び図５Ｂ）、ＶａｃＶについては感染の１２日後（図３Ｂ及び図５Ｂ）に顕著であり、約１０〜３０％のＩＦＮγ＋ＣＤ８  Ｔ細胞の平均ピーク応答であった。ＶＳＶ−ｇｐ３３及びＶａｃＶ−ｇｐ３３の両ワクチン接種単独では、ｇｐ３３ペプチドに対する有意な応答を誘導するにもかかわらず（図５Ｂ）、ｇｐ３３モデルにおいて完全な腫瘍退縮を誘導することができなかったので（図５Ａ）、腫瘍溶解性ワクチンのＡＣＴとの併用が必要である。腫瘍増殖において遅延が観察され、最終的には、腫瘍は腫瘍溶解性ワクチンによってもたらされる免疫攻撃及び増殖阻害を弱めた。これは、腫瘍増殖が��生している抗腫瘍免疫応答を上回ることによる可能性がある。或いは、腫瘍の免疫抑制作用は、腫瘍溶解性ワクチン単独によって誘導されるｇｐ３３特異的細胞を機能不全にしている可能性がある。これらのデータは、Ｔｃｍ  ＡＣＴと腫瘍溶解性ワクチン療法との併用により、いずれかの治療単独では不可能である完全な免疫媒介性の腫瘍退縮を誘導することを示唆している。
【００８１】
[0092]Ｔｃｍ  ＡＣＴと併用した非腫瘍溶解性アデノウイルスワクチンベクター（図３のＡｄ−ｈＤＣＴ）の使用は、感染の１２日後、約１０％のＩＦＮγ＋ＣＤ８  Ｔ細胞のピーク応答で移入したＴｃｍ細胞の有意な拡大及び活性化を誘導したにもかかわらず（図３Ｂ）、腫瘍増殖を制御できなかった（図３Ａ）。このことから、腫瘍溶解性ウイルスワクチンベクター（ＶＳＶ、ＭＲＢ、及びＶａｃＶなど）がＡＣＴ  Ｔｃｍの活性化に理想的に適しており、この併用療法における完全及び腫瘍応答に必要であることが示唆される。
【００８２】
[0093]併用療法の抗腫瘍特性は、腫瘍を完全に退行させることができただけでなく、少なくとも６０日間存続し、その後の抗原適合腫瘍細胞の生着及び増殖を抑制した。６０日前にＤＵＣ１８Ｔｃｍ及びＶＳＶ−Ｅｒｋ９Ｍとの併用治療によりＣＭＳ５腫瘍を治療し治癒させたＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣＭＳ５腫瘍細胞の皮内注射により再攻撃した。ナイーブ対照マウスでは速やかな腫瘍増殖が観察されたが、以前に治癒したマウスでは確認されず（図４Ｃ）、併用療法によって誘発される応答が持続し、標的抗原を発現するあらゆる新しい腫瘍細胞の増殖を抑制することが明らかであった。
【００８３】
実施例４
ＯＶ媒介性Ｐ１４  Ｔｃｍ活性化の注射経路依存
[0094]理想的には、腫瘍溶解性ワクチンベクターは、同時的に、直接ウイルス感染を介して腫瘍減量を引き起こし、ＴＡＡ特異的細胞溶解性Ｔ細胞を刺激する。したがって、ウイルス注射の経路は、腫瘍溶解性ワクチン免疫療法を設計する場合に重要課題であるが、それはワクチンが、これら２つの目的を達成するために、腫瘍及びリンパ系器官に効果的に播種されなければならないからである。さらに、ウイルスの安全性プロファイル、ウイルスの自然なトロピズム、及び注射後に複製し拡大するその能力が併用療法を設計する場合に考慮されなければならない。したがって、本発明者らは、腫瘍溶解ワクチンが異なる経路で投与された場合に腫瘍を排除する本発明者らの併用療法の能力について試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０５個のＢ１６−ｇｐ３３細胞を皮内移植した７日後に１×１０６個のＰ１４  Ｔｃｍ細胞を注射し、続いて２４時間後に、２×１０８ｐｆｕのＶＳＶ−ｇｐ３３又は７．５×１０７ｐｆｕのＶａｃＶ−ｇｐ３３のいずれかを静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、腫瘍内（ＩＴ）又は筋肉内（ＩＭ）注射した。腫瘍体積をモニターし、それを図５にｍｍ３として示す。ラブドウイルスベクター（ＶＳＶｇｐ３３）は、ＩＶ投与した場合にのみ有効な腫瘍退縮を誘導し、他の経路によって投与した場合には部分的な腫瘍退縮しか示さなかった（図６、パネルの左欄）。ｇｐ３３特異的エフェクターＴ細胞応答の誘導を、使用したすべての注射経路について測定したところ、腫瘍退縮で観察されたように、ＩＶ注射経路のみがＰ１４  Ｔｃｍ＋ＶＳＶ−ｇｐ３３治療マウスにおいて有意な応答を生じた（図７Ａ）。対照的に、ワクシニア系の腫瘍溶解性接種は、より高い適応性を示した。ワクシニアワクチンがＰ１４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３併用療法の状況においてどの経路で投与されたかにかかわらず、腫瘍の完全退縮が再発の存在なく観察され（図６、パネルの右欄）、有意なｇｐ３３特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答が誘導された（図７Ｂ）。したがって、本発明者らの併用療法におけるＶＳＶ投与は、ＩＶ投与の場合に有効な腫瘍根絶応答を生じるが、ＶａｃＶ投与は適応性があり、ＩＶ、ＩＴ、ＩＰ及びＩＭ投与の場合に有効な治療成果をもたらす。
【００８４】
実施例５
Ｐ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴのＯＶ媒介性活性化は、正常組織に対する共有の抗原特異的自己免疫損傷なく、腫瘍退縮を引き起こす
[0095]がん性細胞は変異され、宿主由来の細胞を調節不全にする。その結果、がん細胞の抗原性標的（ＴＡＡ）の多くは、正常細胞でも発現され得る自己抗原である。ＴＡＡ標的を慎重に選択することにより、がん免疫療法によって誘発される正常組織に対する抗原特異的付帯的損傷を最小限にすることができるが、予期せぬペプチド交差反応性及び正常組織破壊が他のＡＣＴベースの療法で観察された［３６、３７］。このため、併用療法によって誘発される完全腫瘍退縮と並行する正常組織の抗原特異的破壊を評価した。
【００８５】
[0096]Ｂ１６−ｇｐ３３腫瘍を担持するＲＩＰｇｐマウスを使用し、Ｐ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴ療法及びＯＶ療法の併用によって誘発される抗原特異的自己免疫を決定した。ＲＩＰｇｐマウスは、ｇｐ３３ペプチドを含有するＬＣＭＶ糖タンパク質を膵臓ベータ細胞において選択的に発現するトランスジェニック系統である。したがって、これらのマウスにおけるｇｐ３３に対する細胞溶解性免疫応答は、腫瘍及び膵臓ベータ細胞の両方で破壊を引き起こし、それぞれ腫瘍退縮及び糖尿病を引き起こす可能性がある。ＲＩＰ−ｇｐマウスに、１×１０５個のＢ１６−ｇｐ３３細胞を皮内移植した７日後に１×１０６個のＰ１４  Ｔｃｍ細胞を注射し、続いて２４時間後に２×１０８ｐｆｕのＶＳＶ−ｇｐ３３又は７．５×１０７ｐｆｕのＶａｃＶ−ｇｐ３３のいずれかを静脈内注射した。いずれかのウイルスによる治療後の腫瘍退縮をモニターした。腫瘍体積は、感染後５日目に両ウイルス治療において約１００ｍｍ３でピークに達し、その後は着実に減少した（図８Ａ）。ＶＳＶ−ｇｐ３３誘導腫瘍退縮の速度は、ＶａｃＶ−ｇｐ３３の速度よりもわずかに速かったが、最終的には、ＰＩ４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３で治療した腫瘍は完全に退縮し再発せず、Ｐ１４  Ｔｃｍ＋ＶＳＶ−ｇｐ３３で治療した腫瘍では再発前の完全退縮はなかった（図８Ａ）。
【００８６】
[0097]糖尿病誘導を検出するために、治療したマウスの血糖値を、血糖計を使用してモニターした。これらの実験において、糖尿病は１４ｍｍｏｌ／Ｌを超える血糖として定義した（図８Ｃで点線として提示）。糖尿病は、感染５日後にＶＳＶ−ｇｐ３３治療マウスにおいて誘導されたが（図８Ｃ）、これはこの療法によって誘導されるピーク免疫応答と相関する。膵島構造の破壊が、ＶＳＶ−ｇｐ３３による治療の５日後に、マウスから得たヘマトキシリン及びエオシン染色膵臓組織において観察された（図９Ａ）。同じ組織で実施されたインスリンタンパク質に関する免疫組織化学的調査により膵島のインスリン陽性細胞の数に劇的な減少があることが明らかになったが（図９Ｂ）、これはインスリン産生ベータ細胞がこれらのマウスにおいて破壊されたことを示唆している。ｇｐ３３ペプチドはＲＩＰ−ｇｐマウスのベータ細胞で特異的に発現されるので、ＶＳＶと組み合わせた場合にＰ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴが正常組織の抗原特異的損傷を誘導したと思われる。対照的に、Ｐ１４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶｇｐ３３併用療法で治療したマウスは、同等ピークのｇｐ３３特異的Ｔ細胞応答を示すにもかかわらず（図８Ｂ）、治療後のどの時点での糖尿病にはならなかった（図８Ｃ）。これらのマウス由来の膵臓組織は、感染５日後に膵島の拡大を示したが（図８Ａ）、これはインスリン陰性細胞の膵島への有意な浸潤による（図９Ｂ）。インスリン陽性細胞が依然として膵島において高い数値で観察されたが、浸潤細胞はたとえあったとしても、有効なベータ細胞ｇｐ３３特異的細胞溶解活性を示さなかったと思われる。ＶａｃＶ−ｇｐ３３及びＶＳＶ−ｇｐ３３の両方が同等ピークのｇｐ３３特異的応答を誘導したが、腫瘍溶解性ワクチン間の自己免疫損傷の差は、誘導された応答の大きさに、むしろ刺激されたＴ細胞の質に、起因し得ない。したがって、試験したいずれかの腫瘍溶解ワクチンとＰ１４  Ｔｃｍ  ＡＣＴとの併用は腫瘍退縮を誘導することが可能であるが、ＶＳＶ−ｇｐ３３が正常組織の付帯的抗原特異的損傷を誘導するのに対し、ＶａｃＶ−ｇｐ３３は同じ系で誘導はしない。
【００８７】
実施例６
抗原提示細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１５、及びラパマイシンによるヒトＴ細胞のプログラミングは、抗原特異的Ｔｃｍ細胞を選択的に濃縮する
[0098]ヒト抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を濃縮し、抗原パルスした自己樹状細胞、ＩＬ２１、ＩＬ１７、及びＩＬ２の存在下でセントラルメモリー表現型に「プログラム化」（誘導型分化）することができる［２１］。最初のプログラミング後に、（典型的にはテトラマー染色により）望ましいタイプのＴ細胞について集団を精製するセルソーティングステップと、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体及びＩＬ２の存在下でＴ細胞を培養することによってこの精製された集団を拡大するステップ（ＲＥＰと呼ばれる急速拡大プロトコル）が続く。この方法は所望のＴ細胞を非常に高レベルで産生することができるが、それには時間がかかるとともに高価な設備が必要である。対照的に、抗原、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンの存在下でリンパ球を樹状細胞と共培養することによるプログラミング／濃縮は、元のＴ細胞集団に存在するＴｃｍ細胞を選択的に濃縮するが、その後の拡大（ＲＥＰ）前にセルソーティングが必要ではない。
【００８８】
[0099]これを証明するため、米国特許出願公開第２０１５／００２３９３８号に記載されている方法（第１週に３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１、次いで第２週に１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を添加）、又は本明細書に記載のＩＬ２１、ＩＬ１５、ラパマイシン法のいずれかに従って、同じ供給源由来のアリコートしたヒトＰＢＭＣを、ｐｐ６５（ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来免疫優性ペプチド）でパルスした樹状細胞（ＤＣ）と共培養し、ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮しプログラム化した。簡単に説明すると、ＣＤ２５枯渇化ＰＭＢＣを、２週間、照射したペプチド担持ＤＣ並びにＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンと共培養し、１週間、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンのみ（ペプチド担持ＤＣなし）と共培養し（フェーズＩとして定義：濃縮及びプログラミング）、続いて、介在するソーティングステップなしに、２週間、ＩＬ２及びＣＤ３／ＣＤ２８抗体で拡大させた（フェーズＩＩとして定義：急速拡大又はＲＥＰ）。米国特許出願公開第２０１５／００２３９３８号に記載されている濃縮／プログラミング方法は、１週間の拡大後に＞９９％の抗原特異的Ｔ細胞を有するＴ細胞集団を産生することができ、濃縮したプログラム化細胞をＲＥＰ前にセルソーターでソーティングした場合は、２週間の拡大後に約９５％に低下する（図１０Ａ）。セルソーティングしない同方法は、１週間の拡大後に約２２％の抗原特異的Ｔ細胞を有するＴ細胞集団を産生し、これは２週間の拡大後に＜１２％に低下する（図１０Ｂ）。対照的に、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンを利用する本明細書に記載の方法は、１週間の拡大後に約６６％の抗原特異的Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を生じ、２週間の拡大後に＞８２％に上昇する（図１０Ｃ）。したがって、ＩＬ２１、ＩＬ１５、ラパマイシンのプログラミング／濃縮ステップは、セントラルメモリーＴ細胞が高度に濃縮されているＴ細胞の集団を産生するだけでなく、これらの細胞は、ＲＥＰの過程で抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ａｂ及びＩＬ２への長期曝露のストレスに対してより良好に耐え得る。
【００８９】
[00100]これらの結果をまとめると、治療有効量のヒトＴｃｍ細胞を、セルソーティングに関する時間と費用を必要とすることなく、ＡＣＴ用に調製することができることが示されている。さらに、これらの結果は、細胞がプログラム化され、ＩＬ２１、ＩＬ１５及びラパマイシンで濃縮された場合、効力の低い多数のＴ細胞間の抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ａｂ媒介性拡大に固有のトレードオフが効力のより高いＴｃｍ細胞に有利にシフトされることを示唆している。
【００９０】
実施例７
ＡＣＴ＋ＯＶ併用療法による腫瘍根絶は事前のリンパ球枯渇を必要としない
[00101]併用ＡＣＴ＋ＯＶ療法の腫瘍根絶の能力に対する事前リンパ球枯渇の効果をＢＡＬＢ／ｃ（野生型として）及びＢＡＬＢ／ｃ−ＮＲＧマウスを使用して試験した。ここで、ＢＡＬＢ／ｃ−ＮＲＧマウスは、Ｒａｇ１ＫＯ（Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ）及びＩＬ２ＲγｃＫＯ（Ｉｌ２ｒｇｔｍＷｊｌ）ノックアウト変異により内因性リンパ球を全く欠損している。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃ−ＮＲＧマウスの両方にＣＭＳ５細胞を注射し、腫瘍を６日間成長させた。次いで、マウスに指示したＤＵＣ１８  Ｔｃｍ  ＡＣＴ細胞を注射し、続いて１日後に、指示した組換えマラバウイルス構築物を注射し、対象マウスの腫瘍体積を５〜６週間経過観察した。
【００９１】
[00102]予想した通り、未治療のＢＡＬＢ／ｃマウス、並びにＡＣＴ単独又はＯＶ治療単独のみを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスは腫瘍の制御を示さず、腫瘍体積は速やかに増大した（図１１Ａ、それぞれ、Ｔｃｍ及びＭＲＢ−Ｅｒｋ９ｍ）。さらに、ＤＵＣ１８  Ｔｃｍ  ＡＣＴ及びＯＶ治療を組換えＭａｒａｂａ−ＧＦＰ構築物とともに含む併用療法もまた、これらのマウスにおける腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった（図１１Ａ、Ｔｃｍ＋ＭＲＢ−ＧＦＰ）。対照的に、ＤＵＣ１８  Ｔｃｍ  ＡＣＴ及びＯＶ治療を組換えＭａｒａｂａ−Ｅｒｋ９Ｍとともに用いる併用療法は完全に腫瘍を根絶した。このことはＴｃｍと特異的抗原を発現するＯＶベクターの両方が完全な腫瘍根絶に必要であることを示唆している。
【００９２】
[00103]驚いたことに、ＢＡＬＢ／ｃ−ＮＲＧマウスは若干違った挙動をした。この場合、ＤＵＣ１８  Ｔｃｍ  ＡＣＴ及びＯＶ  Ｍａｒａｂａ−Ｅｒｋ９Ｍ治療の同一併用は一過性の腫瘍退縮を生じただけであり、２〜３週間後に腫瘍が再発した（図１１Ｂ）。理論の束縛を受けるものではないが、これは、内因性Ｔ細胞が、完全な腫瘍根絶に対しては移入した（ＡＣＴ）Ｔ細胞とともに作用することが必要であること、又は他の腫瘍抗原を標的とする内在性Ｔ細胞が関与するエピトープ拡散を介して抗原欠失変異体の拒絶を媒介することが必要であることを示している可能性がある。
【００９３】
[00104]化学誘導したリンパ球枯渇前処理のＴｃｍ＋ＡＣＴに対する結果をＣ５７ＢＬ／６マウスでも試験した。Ｂ１６−ｇｐ３３腫瘍を有するマウスを、ＣＰＸ処置によって誘導した事前リンパ球枯渇の有無下で、Ｐ１４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３により治療した。ＣＰＸ前処置の非存在下でＰ１４  Ｔｃｍ＋ＶａｃＶ−ｇｐ３３により治療したマウスは、感染１２日後に完全な腫瘍退縮（図１２Ａ）と、約１２％ＩＦＮγ＋ＣＤ８  Ｔ細胞応答のピーク応答を示した。対照として、マウスを低用量（５０ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（１５０ｍｇ／ｋｇ）のＣＰＸで前処置したが、その場合は腫瘍を完全に退縮させることはできず、最終的には腫瘍再発のため死亡した（図１２Ａ）。ＣＰＸ処置マウスにおいて腫瘍制御が欠如していることは、これらのマウスを薬物で処置していないマウスと比較した場合に同等又はそれ以上の程度の応答を示したことから、ｇｐ３３特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答の程度と相関はない（図１２Ｂ）。したがって、化学的リンパ球枯渇は、併用療法によって誘導される抗腫瘍効果を増強しない。実際、ＣＰＸ処置は、Ｔｃｍ  ＡＣＴ＋ＯＶ併用療法によって誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の抗腫瘍活性に対して有害な影響があるように思われる。
【００９４】
[00105]これらの結果は、本明細書に記載のＡＣＴ＋ＯＶ治療の併用が、事前処理のリンパ球枯渇又はリンパ球除去を回避することができることを証明するだけでなく、リンパ球枯渇／リンパ球除去が療法の全体的有効性にとって有害となり得ることを証明している。
【００９５】
[00106]本発明の異なる実施形態が上記の実施例によって示されている。当業者は、本発明の範囲内及び定義した特許請求の範囲内にある上記の方法の代替物を開発することができる。
【００９６】
[00107]すべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許又は特許出願のそれぞれが参照によりその全体が組み込まれたように具体的及び個別に示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願における用語が参照により本明細書に組み込まれる文書内で異なって定義されている場合、本明細書に提供される定義がその用語の定義として取り扱われる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2019524667000001.app
【国際調査報告】
2019524667.tif 000015
2019524667.tif 000016
2019524667.tif 000017
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