(57)【要約】  本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に適した（ベクター）ワクチン、特に新規のプロモーター配列、発現カセットおよびベクターの分野に関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその相補的なヌクレオチド配列を含むプロモーター配列であって、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす、プロモーター配列。
【請求項２】
４ｐｇＧ６００（配列番号１）および４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）ならびにその相補的なヌクレオチド配列、ならびにその機能的および相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるプロモーター配列を含む発現カセットであって、
プロモーター配列が、目的の配列、好ましくは抗原コード配列などの目的の遺伝子、より好ましくは目的の異種および／または外来性配列、目的の遺伝子または目的の抗原コード配列に作動可能に連結されており、
前記プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列が、好ましくは異種プロモーター配列、より好ましくは外来性プロモーター配列である、
発現カセット。
【請求項３】
請求項２に記載の発現カセットを含む、ウイルスベクターなどのベクター。
【請求項４】
プロモーター配列の機能的断片が、７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の配列同一性および／または相同性を有する、請求項１に記載のプロモーター配列および／または請求項２に記載の発現カセットおよび／または請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
プロモーター配列の機能的断片が、５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有し、プロモーター配列の機能的断片が４３０から５５０ヌクレオチド、４３０から５００ヌクレオチド、または４３０から４８０ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項１または４に記載のプロモーター配列および／または請求項２または４に記載の発現カセットおよび／または請求項３または４に記載のベクター。
【請求項６】
プロモーター配列の機能的断片が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％である（またはより高い）、請求項１または４から５に記載のプロモーター配列および／または請求項２または４から５に記載の発現カセットおよび／または請求項３から５に記載のベクター。
【請求項７】
４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片が、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である、請求項１または４から６に記載のプロモーター配列および／または請求項２または４から６に記載の発現カセットおよび／または請求項３から６に記載のベクター。
【請求項８】
プロモーター配列の機能的断片が、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％である（またはより高い）、請求項１または４から７に記載のプロモーター配列および／または請求項２または４から７に記載の発現カセットおよび／または請求項３から７に記載のベクター。
【請求項９】
４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片が、ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である、請求項１または４から８に記載のプロモーター配列および／または請求項２または４から８に記載の発現カセットおよび／または請求項３から８に記載のベクター。
【請求項１０】
ベクターが、１つまたは複数のさらなる制御配列、例えば終結シグナル、ポリアデニル化シグナルまたはＩＲＥＳおよび／または２ａペプチドのような制御エレメントを含む、請求項２および４から９に記載の発現カセットおよび／または請求項３から９に記載のベクター。
【請求項１１】
ベクターが、組換え、および／または異種および／または外来性ベクターである、請求項３から１０に記載のベクター。
【請求項１２】
ベクターが、ウイルスベクターであり、好ましくは、例えばウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）ならびにＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）およびＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１）のような他のバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、ＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス）などのアデノウイルス科（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルスなどのレンチウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択される、請求項３から１１に記載のベクター。
【請求項１３】
ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス科、好ましくはアルファヘルペスウイルス属、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくは前記ベクターがウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）である、請求項３から１２に記載のベクター。
【請求項１４】
ベクター、好ましくはウイルスベクターを産生する方法であって、
ａ．請求項１または４から９に記載のプロモーター配列を用意するステップ、
ｂ．ステップａ）の前記プロモーター配列を、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）またはＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１型）のようなバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、ＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス）などのアデノウイルス科（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルス由来のベクター骨格であって、好ましくはヘルペスウイルスに由来し、より好ましくはＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４であるベクター骨格に組み込むステップ
を含む方法。
【請求項１５】
請求項３から１３に記載のベクターの複製に許容的であることを特徴とする、真核生物の宿主細胞株であって、好ましくは哺乳動物細胞株または昆虫細胞株であり、最も好ましくはＰＫ／ＷＲＬ細胞株、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、Ｓｆプラス細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生物である、真核生物の宿主細胞株。
【請求項１６】
ａ．請求項３から１３に記載のベクターを、請求項１５に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
ｂ．適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
ｃ．任意で前記宿主細胞を回収するステップ
によって特徴づけられる、宿主細胞を調製する方法。
【請求項１７】
プロモーター配列としての、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはそれらの相補的なヌクレオチド配列、またはｐ４３０（配列番号３）もしくはｐ４５５（配列番号４）もしくはそれらの相補的なヌクレオチド配列などのそれらの機能的断片を含む核酸配列の使用であって、前記核酸配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす、使用。
【請求項１８】
請求項３から１３に記載のベクター、宿主細胞、任意でトランスフェクション試薬および指示リーフレットからなるキット。
【請求項１９】
０．０１から０．００１のＭ．Ｏ．Ｉで使用してもよい、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための請求項３から１３に記載のベクターまたは請求項１５に記載の真核生物の宿主細胞株の使用。
【請求項２０】
ａ．請求項２または４から９に記載の発現カセット、および／または
ｂ．請求項３から１３に記載のベクター、および／または
ｃ．請求項２または４から９に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび／または例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の、請求項３から１３に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
ｄ．任意で薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤（好ましくは前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適している）、
を含み、
好ましくは前記免疫原性組成物がウイルスを含む、
免疫原性組成物。
【請求項２１】
ａ．請求項２または４から９に記載の発現カセットおよび／または
ｂ．請求項３から１３に記載のベクター、および／または
ｃ．請求項２または４から９に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび／または例えば改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の、請求項３から１３に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
ｄ．薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤（好ましくは前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適している）、
を含み、
ｅ．前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物。
【請求項２２】
ａ．請求項３から１３に記載のベクターを、請求項１５に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
ｂ．適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
ｃ．感染細胞および／またはベクターおよび／またはウイルス成分を回収するステップ、
ｄ．任意でステップｃ）の回収物を精製するステップ、
ｅ．前記回収物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法。
【請求項２３】
動物において病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を減らすまたは予防する方法で使用するための、または動物において病原体の感染を処置または予防する方法での使用のためのものであり、好ましくは前記動物がブタなどの食物生産動物である、請求項２０に記載の免疫原性組成物または請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記動物において病原体によって引き起こされる臨床疾患に対してブタ、ブタ、またはウシなどの食物生産動物などの動物を免疫する方法であって、請求項２０に記載の免疫原性組成物または請求項２１に記載のワクチンを動物に投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンが感染の臨床徴候を引き起こさないが、前記病原体の病原体型に対して動物を免疫する免疫応答を誘導することができる、方法。
【請求項２５】
ａ）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
ｂ）請求項２０に記載の免疫原性組成物または請求項２１に記載のワクチン、および
ｃ）任意で指示リーフレット
を含む、動物において病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくはブタまたはウシなどの食物生産動物にワクチン接種するための、および／または動物において病原体と関連するまたは病原体によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２１〜１．８２５に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．技術分野
本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に適した（ベクター）ワクチン、特に新規のプロモーター配列、発現カセットおよびベクターの分野に関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ．関連技術の背景および説明
ウマの病原体、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ウマ流産ウイルス、ＥＨＶ−１）は、ヘルペスウイルス目の、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス亜科のバリセロウイルス属に属する。およそ１５０，０００塩基対の二本鎖ＤＮＡゲノムを有する大きなエンベロープウイルスである。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトアルファヘルペスウイルス３型（水痘帯状疱疹ウイルス）、ブタアルファヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス）、ウシアルファヘルペスウイルス１型（感染性気管支炎ウイルス）、およびウマアルファヘルペスウイルス４型（ウマ鼻肺炎ウイルス、ＥＨＶ−４）（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４は風土性であり、世界中のウマに影響を及ぼす。ＥＨＶ−４は、上気道に、大抵は軽度の感染を引き起こすが、ＥＨＶ−１は、株および宿主の免疫状態によって呼吸器症状から流産および致死性の脳脊髄障害の範囲の疾患を含む全身感染を引き起こし得る。ＥＨＶ−１に対して使用許諾を得た２つの改変生ワクチン（ＭＬＶ）がアメリカおよびヨーロッパで現在入手可能であり、それぞれＲｈｉｎｏｍｕｎｅ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＰｒｅｖａｃｃｉｎｏｌ（商標）（ＭＳＤ）である。両方とも、弱毒化のためにブタ上皮細胞において２５６回継代された、古典的に弱毒化したＥＨＶ−１  ＲａｃＨ株を含有する（Ma et al. 2013）。弱毒化のメカニズムは、分子レベルで調査されてきた。Osterrieder et al. (1996)は、ＲａｃＨがｏｒｆ６７の２つのゲノムコピーを欠如し、１つのコピーの回復が毒性を回復させるのに十分であったことを示した。さらに、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするｏｒｆ１のコード配列の９０％より多くを除去する１２８３ｂｐの欠損を持つ。他の変異もまた、弱毒化に影響するが、これまでのところ詳細には調査されていない。これら全てのことから、ＲａｃＨは非常に安全なワクチン株である。ワクチン接種動物における継代による毒性への復帰は、仮に可能だとしてもその可能性が極めて低いからである。
【０００３】
ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ワクチン株ＲａｃＨ（ｐＲａｃＨ−ＳＥ）の全ゲノムを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌人工染色体（ＢＡＣ）は、ベクターワクチン開発のプラットフォームとして公知である。ＥＨＶ−１  ＲａｃＨベースのベクターワクチンは、ブタ、ウシ、およびイヌを含むいくつかの哺乳動物種で免疫性を引き出すことができることが示された（Rosas et al. 2007, Rosas et al. 2008, Trapp et al. 2005, Said et al. 2013）。病原体の抗原タンパク質をコードする遺伝子は、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨによって発現され得る。ＥＨＶ−１−ＲａｃＨゲノムは、大腸菌においてそのＢＡＣ形態で操作し、通常導入遺伝子発現カセットを挿入することによってさらなるタンパク質を発現するように調製することができる（Tischer et al., 2010）。培養した許容細胞においてｐＲａｃＨ−ＳＥ  ＤＮＡをトランスフェクションすると、ＥＨＶ−１複製が細胞の転写因子によって開始される。ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性は、全てのＢＡＣベクター関連配列の欠損およびＥＨＶ−１  ＲａｃＨゲノムのその元々の状態への回復をもたらす。感染性ウイルスが生成され、それはＲａｃＨと区別がつかない。
【０００４】
ｐＲａｃＨ−ＳＥが、例えば導入遺伝子発現カセットの挿入によって、大腸菌中で操作される場合、許容細胞へのトランスフェクション後に再構築されたウイルスは改変を保持し、さらなる遺伝子を発現するであろう。組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨはベクターワクチンとして使用することができる。
しかしながら、さらなる外因性プロモーター無しで発現されるトランスジェニックタンパク質の量は、通常比較的少ない。したがって、そのようなベクター、特に組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨからトランスジェニックタンパク質を発現するために使用され得るさらなるプロモーターに対する、満たされていない要求がある。
【０００５】
野生型ＥＨＶ−１株は、それらのゲノムの長いユニーク断片の一端にｏｒｆ１、ｏｒｆ２、およびｏｒｆ３と呼ばれる３つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を保持する（配列座標  １２９８−３６１４；図２）。Ｏｒｆ１およびｏｒｆ３は、ＤＮＡの１つの鎖に連続して配置されているが、ｏｒｆ２は相補鎖にコードされている。ワクチン株ＲａｃＨは、ｏｒｆ１および２に影響を及ぼす領域内に１２８３ｂｐの欠損があり、これは、これらの遺伝子はウイルス複製に必須ではないことを示している。このため、その部位は導入遺伝子挿入部位となる。ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子１プロモーター−エンハンサー（Boshart et al. 1985）を使用して、導入遺伝子がｏｒｆ１／３挿入部位から効率的に発現されることが報告されている。そのような研究では、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ）を使用して、よりよい発現のために転写を安定化させた（Ma et al. 2012; Said et al. 2013）。ＨＣＭＶがヒトにおいて腫瘍を誘導し得るという証拠はないが、理論的なリスクは除外することができない。ＨＣＭＶ−ＩＥエンハンサーが記載される前（Boshart et l. 1985）、強力なエンハンサーの大半は、サルウイルス４０、ポリオーマウイルス、またはモロニーマウス肉腫ウイルスのような公知の腫瘍ウイルスのゲノムで発見された。極めて強いならびに非組織特異性ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ（マウスサイトメガロウイルス）ＩＥプロモーター−エンハンサーは、様々な研究活動に非常によく適しているが、それらは一般にトランスジェニックベクターワクチンのプロモーターの第一選択とはならないであろう。特に、ワクチン接種動物へのヒトの偶発的暴露のリスクは、監督官庁によってワクチンの認可のハードルとみなされ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
任意のそのような障害を避けるために、本発明は、特にベクターワクチンの文脈の中で、ならびに特にＥＨＶ−１ベクターの文脈の中での導入遺伝子発現のための新しい制御核酸配列／プロモーター配列を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、上記の技術的問題の解決策は請求項に特徴づけられる記載および実施形態によって達成され、その異なる態様内の本発明は請求項に従って実施される。
本発明は、導入遺伝子発現のための新しい制御核酸配列／プロモーター配列、免疫原性組成物、ワクチン、および当技術分野の欠点を克服する関連方法を提供する。
ヘルペスウイルスを含む様々なベクター系での高レベルの導入遺伝子発現を駆動するために広く使用される確立されたプロモーター配列は、ＨＣＭＶ（Boshart et al. 1985; Foecking and Hofstetter 1986）またはマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ；Dorsch-Hasler et al. 1985）の最初期遺伝子のプロモーター配列、または例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターなど、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のような腫瘍ウイルスの強力なプロモーター、ならびに他多数（例えば、Kim et al. 1990）である。そのような強力なプロモーターは、様々な細胞培養系で自律的に機能するため、細胞生物学者に好まれた。ウイルス複製に関して、感染細胞は、ウイルス機能によってウイルス複製機構へと形質転換される。複製の生物学およびヘルペスウイルスの形態形成はよく理解されている。感染後、非常にわずかな遺伝子（α−遺伝子）のみが転写され、最初期タンパク質（ＩＥｐ）へと翻訳される。これらのＩＥｐは、ＤＮＡポリメラーゼおよびその他多くのようなウイルス酵素をコードするβ遺伝子の転写活性化因子である。ウイルスゲノム複製の開始は、ウイルス構造タンパク質をコードするβ−およびγ−遺伝子が転写されているウイルス複製の後期の開始をマークする（Fields, 2013）。しかしながら、改良されたベクターワクチンは、オプションとして上記の自律的な強力なプロモーターが見られず、特に腫瘍ウイルス由来のものは不利な安全性プロファイルを有する。したがって、ＥＨＶ−１  β−およびγ−遺伝子のもののような、ウイルス複製に関して高い活性を有するプロモーターを提供する必要がある。内部相同組換えのリスクが起こることなく、したがって遺伝的不安定性なく、１つのベクター分子に２回同一のＤＮＡ配列を使用することはできないため、本発明は、ＥＨＶ−４の公表されたゲノム配列由来の新しい代替えのプロモーター配列を提供する（ウマアルファヘルペスウイルス４株  ＮＳ８０５６７、完全ゲノム、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＦ０３００２７、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＦ０３００２７．１  ＧＩ：２６０５９５０、１９９８年５月２１日）。ＥＨＶ−１遺伝子との遺伝子の配列同一性は５５〜８４％の範囲内である。
【０００８】
本発明は２つの新しいプロモーター：ｐ４３０およびｐ４５５を提供し、それらは細胞培養において、および動物（ブタおよびマウス）においてもｒＥＨＶ−１−ＲａｃＨ複製の背景で機能的であることが示されている。ウイルス複製サイクル中の２つの新しいプロモーターの活性レベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプロモーター動態実験から推測されるように、非常に類似しているようである。
【０００９】
これらの特性は、類似の効率で並行して２つの異なる抗原を発現するＥＨＶ−１  ＲａｃＨに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチン標的が２つの異なる病原体からなる場合、２つのポリアデニル化配列と組合せた２つの挿入部位における２つの新しいプロモーターの適用は、グッズの費用を著しく削減でき、１つの抗原成分のみを発現するベクターよりもはっきりとした利点を示す。
【００１０】
本発明は２つの新しいプロモーター：４ｐｇＧ６００および４ｐＭＣＰ６００、ならびにより短い長さのそれらの誘導体を提供し、それらは細胞培養において、または細胞培養のｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ複製の背景において、一過的なトランスフェクション後に機能的であることが示される。
さらに、本発明によって提供された新しいプロモーター配列は、イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）のような他のベクター背景においても効果的であることが示される。
重要なことに、ＣＡＧまたはＣＭＶ５プロモーター配列のいずれかがＥ３領域に位置する発現カセットに存在した場合、組換えＣＡｄＶのレスキューは達成されなかった。これは、発現カセットのサイズが観察された実験的なゲノムサイズ制限を超えなかったため、配列特異的であるようである。したがって、本発明の新しいＥＨＶ−４由来プロモーター配列、例えばｐ４３０およびｐ４５５は、導入遺伝子発現を促進するだけでなく、ウイルスレスキューの重要なステップも支持し、したがって、先行技術のプロモーター配列を考えると有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｏｒｆ７０挿入部位の概略図である。ＵＬ＝長いユニーク断片ＵＳ＝短いユニーク断片ＩＲ＝内部逆方向反復ＴＲ＝末端逆方向反復ｇＧ＝糖タンパク質ＧｇｐＩＩ＝糖タンパク質ＩＩｏｒｆ＝オープンリーディングフレームｂｐ＝塩基対
【図２】野生型（ｗｔ）ＥＨＶ−１株ａｂ４と弱毒化ワクチン株ＥＨＶ−１  ＲａｃＨのｏｒｆ１／３領域を比較する概略図である。
【図３】プロモーター動態実験のｑＰＣＲ結果を示す図である。３．ａのグラフは、必須糖タンパク質Ｄをコードするｏｒｆ７２の転写の動態を示す。これらのデータはｍＣｈｅｒｒｙの転写動態のデータをノーマライズするために使用された（３．ｂのグラフ）。
【図４】２つの独立したプロモーター動態実験のｑＰＣＲ結果を示す図である。転写活性と値の正の相関を示す。感染後異なる時間でのｍＣｈｅｒｒｙのｑＰＣＲ結果をノーマライズしたＣｔ値はｔ＝０での相当する平均Ｃｔ値から引かれた。２つの異なる細胞株での２つの実験が示される。
【図５】発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１のＥＨＶ−１  ＲａｃＨのｏｒｆ７０への挿入のためのトランスファープラスミドのプラスミドマップを示す図である。ＯＲＦ６９の３’端  挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ＯＲＦ７０の３’端  挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ｐ４５５  導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターＨ３  導入遺伝子（ＩＡＶ  ヘマグルチニン）７１ｐＡ  ポリアデニル化配列Ｉ−Ｓｃｅ１  Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ  カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物のプロモーターＫａｎａ  カナマイシン耐性ｏｒｆＯＲＩ  プラスミドベクターの複製オリジンＡｐｒ  アンピシリン耐性遺伝子ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ  制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示す
【図６】ｏｒｆ７０挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のゲノムの概略図を示す図である。ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９；ｐ４５５：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば実施例１を参照；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。
【図７】間接免疫蛍光法：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させたＶＥＲＯ細胞の、間接免疫蛍光法を示す図である。感染後２４時間の細胞は、エタノールによって固定され、風乾された。一次抗体としてＨ３に対する市販のモノクローナル抗体および二次抗体としてＦＩＴＣコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧを使用して、Ｈ３は組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた細胞において蛍光顕微鏡によって示された。
【図８】ウェスタンブロット：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３または対照ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥまたはモックを感染させた異なる継代の感染細胞のウェスタンブロットを示す図である。左のブロットは、ＥＨＶ−１のｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７とインキュベートされた。右のレプリカブロットは、Ａ型インフルエンザヘマグルチニンＨ３（ＰＡ５−３４９３０）に対する市販のウサギ高度免疫血清とインキュベートされた。レーンの注釈：１：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３  Ｐ５感染細胞２：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３  Ｐ１０感染細胞３：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３  Ｐ１５感染細胞４：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３  Ｐ２０感染細胞５：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ｍＣ７０感染細胞６：非感染細胞
【図９ａ】ウイルス力価：チャレンジ後ワクチン接種されたまたはワクチン接種されていないブタの肺試料のウイルス負荷量を示すグラフである。Ｉｎａｃｔ＝市販の不活性化ワクチンＥＨＶ＝ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３
【図９ｂ】ウイルス力価：チャレンジ後ワクチン接種されたまたはワクチン接種されていないブタの肺試料のウイルス負荷量を示すグラフである。Ｉｎａｃｔ＝市販の不活性化ワクチンＥＨＶ＝ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３
【図１０】発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨのＥＨＶ−１  ＲａｃＨのｏｒｆ１／３への挿入のためのトランスファープラスミドのプラスミドマップを示す図である。隣接部Ａ  挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列隣接部Ｂ  挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ｐ４３０  導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターＨ１ａｖ  導入遺伝子（ＩＡＶ  ヘマグルチニン）ＢＧＨｐＡ  ポリアデニル化配列Ｉ−Ｓｃｅ１  Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ  カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物のプロモーターＫａｎａ  カナマイシン耐性ｏｒｆＯＲＩ  プラスミドベクターの複製オリジンＡｐｒ  アンピシリン耐性遺伝子ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ  制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示す
【図１１】ｏｒｆ１／３挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖのゲノムの概略図である。Δｏｒｆ１：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム１の残りの部分；ｐ４３０：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば実施例１を参照；Ｈ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；ＢＧＨｐＡ：ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列；ｏｒｆ３：挿入部位の下流のオープンリーディングフレーム３
【図１２】導入遺伝子の発現を示す、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた細胞のウェスタンブロットおよび免疫蛍光法を示す図である。Ｈ１ａｖ＝ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖＳＥ＝ｒＥＨＶ−ＲａｃＨ−ＳＥ（対照）モック＝非感染細胞（対照）
【図１３】２つの挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ｒＥＨＶ−１−ＲａｃＨ−ＳＥ  Ｂ）のゲノムの概略図である。Δｏｒｆ１：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム１の残りの部分；ｐ４３０：新しいプロモーター；Ｈ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；ＢＧＨｐＡ：ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列；ｏｒｆ３：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム３。ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム６９；ｐ４５５：新しいプロモーター；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。
【図１４】ウェスタンブロット：ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−４５５−Ｈ３（Ｂ）、空ベクターｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ（ＳＥ）を感染させた細胞、またはモック感染（ｃｔｒｌ）のウェスタンブロットを示す図である。レプリカブロットは、Ｈ３に対する市販のウサギ高度免疫血清（ＰＡ−３４９３０）（Ｈ３）、Ｈ１に対する市販のウサギ高度免疫血清（ＰＡ−３４９２９）（Ｈ１）、またはＥＨＶ−１  ｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ｇｐＩＩ）のいずれかとインキュベートされた。
【図１５】ＣＡＶ２  ＣＭＶｉｅ  ＣＰＶ  ＶＰ２感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞のフローサイトメトリー分析：感染後７２時間を示す図である。
【図１６】新しいＥＨＶ−４プロモーターを有するｒＣＡＶ−２：感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞のフローサイトメトリー分析：感染後４８時間を示す図である。
【図１７】新しいＥＨＶ−４プロモーターを有するｒＣＡＶ−２：感染Ｅ１Ｂ  ＭＤＣＫ（新しいｒＣＡＶ−２）細胞におけるＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質発現のドットブロット分析を示す図である。一次抗体＝１／５０  抗ＣＰＶ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂ（ＶＭＲＤ）二次抗体＝１／１．０００  ヤギ−抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（ＪＩＲ）  Ａ）元々のドットブロットデータ  Ｂ）ドットブロットから作成された半定量的データ：定量のため、ドットブロットはＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析される（Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York）。画像カラーは、反転されバックグラウンドが引かれ、記録した各ドットの密度を統合する。値は、以下のように＋および−指定に割り当てられる。“＋＋＋＋”＝＞８０００００、“＋＋＋”＝５０００００〜８０００００、“＋＋”＝３０００００〜４９９９９９、“＋”＝１２００００〜２９９９９９、“＋／−“＝８００００〜１１９９９９および“−“=＜８００００。
【図１８】ｒＣＡＶ−２  ｐ４５５  ＲａｂＧを感染させた細胞におけるＲａｂＧ検出を示す図である：発現は元々のｒＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＲａｂＧを感染させた細胞の＜１％で検出される。
【図１９】ｒＣＡＶ−２  ｐ４５５  ＲａｂＧを感染させた細胞におけるＲａｂＧ検出を示す図である：Ａ）感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞におけるＣＰＶ  ＶＰ２発現のＩＦＡ、Ｂ）ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞におけるＲａｂＧ発現のＩＦＡ、Ｃ）ＢＩＶＩ  ２０１１  ＭＤＣＫ細胞におけるＲａｂＧ発現のＩＦＡ−ＲａｂＧおよびＣＡＶ−２の二重染色。
【図２０】チャレンジの前、ならびにチャレンジの１、２、および３日後の群の平均体温を示すグラフである。エラーバー、標準偏差。試験日当たり左から右へ：陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
【図２１】チャレンジ後１および３日の群の平均肺スコアを示すグラフである。エラーバー、標準偏差。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
【図２２】チャレンジの日に回収されたブタＩＡＶ  Ｈ３チャレンジ株Ｒ４５２−１４に対する動物血清の相互血清中和（ＳＮ）力価を示すグラフである。２０、検出限界。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
【図２３】ブタＩＡＶチャレンジ適用後１日または２日で採取したＢＡＬＦからのＩＬ−１βの結果を示すグラフである。各ドットは、１匹の動物当たり決定された値を表す。陰性対照群（Ｎｅｇ．Ｃｔｒ．．）、チャレンジ対照群（Ｃｈａｌｌ．Ｃｔｒ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
【図２４Ａ−Ｂ】２回目のワクチン接種の７日後に再刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔｓの結果を示すグラフである。（Ａ）非ワクチン接種対照群；（Ｂ）不活性化ブタＩＡＶワクチンによる２回ワクチン接種。ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３再刺激により１回だけワクチン接種した動物は、１回目のワクチン接種後７日に相当する。各ドットは、所与の時点および特定の刺激による再刺激後に、１匹の動物当たりに決定された値を表す。再刺激のため、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＨＡ＿Ｖ）のＨ３ワクチン抗原に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ  ＨＡ、チャレンジ株Ｒ４５２−１４（ＨＡ＿ＣＨ）のＨ３に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ  ＨＡ、ＨＡ＿ＶおよびＨＡ＿ＣＨを希釈する培地（ＲＰＭＩ）、空ＥＨＶ−１ベクター  ＲａｃＨ−ＳＥ（ＥＨＶ−１  ｅｍｐｔｙ）、ワクチンＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＥＨＶ−１−Ｈ３）、ブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４（Ｈ３Ｎ２）、Ｒ４５２−１４（ＭＤＣＫ）を増殖するために使用される非感染細胞由来の細胞上澄み液、または組換え発現されたブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）が使用された。
【図２４Ｃ−Ｄ】２回目のワクチン接種の７日後に再刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔｓの結果を示すグラフである。（Ｃ）ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による１回ワクチン接種；（Ｄ）ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による２回ワクチン接種。ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３再刺激により１回だけワクチン接種した動物は、１回目のワクチン接種後７日に相当する。各ドットは、所与の時点および特定の刺激による再刺激後に、１匹の動物当たりに決定された値を表す。再刺激のため、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＨＡ＿Ｖ）のＨ３ワクチン抗原に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ  ＨＡ、チャレンジ株Ｒ４５２−１４（ＨＡ＿ＣＨ）のＨ３に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ  ＨＡ、ＨＡ＿ＶおよびＨＡ＿ＣＨを希釈する培地（ＲＰＭＩ）、空ＥＨＶ−１ベクター  ＲａｃＨ−ＳＥ（ＥＨＶ−１  ｅｍｐｔｙ）、ワクチンＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＥＨＶ−１−Ｈ３）、ブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４（Ｈ３Ｎ２）、Ｒ４５２−１４（ＭＤＣＫ）を増殖するために使用される非感染細胞由来の細胞上澄み液、または組換え発現されたブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）が使用された。
【図２５】トランスファープラスミドｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨの概要マップである。
【図２６】トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１の概要マップである。
【図２７】ｏｒｆ１／３およびｏｒｆ７０挿入領域を拡大した、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ）の線状二本鎖ＤＮＡゲノムを示す図である。
【図２８】ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂ、ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ、ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた、または非感染（ｃｔｒｌ）細胞のウェスタンブロットを示す図である。レプリカブロットは、Ｈ３に対するポリクローナルウサギ高度免疫血清（ＰＡ５−３４９３０）、Ｈ１に対するポリクローナルウサギ高度免疫血清（ＰＡ５−３４９２９）、またはＥＨＶ−１  糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）に対するモノクローナル抗体（Ａｉ２Ｇ７）のいずれかとインキュベートされた。全ての抗体は、全ての感染細胞試料においてＥＨＶ−１  ｇｐＩＩの非常に類似した染色から判断した場合、所望の抗原Ｈ３およびＨ１の発現ならびに異なるウイルスの相当する複製効率を確認する、予測されるパターンを産生した。
【図２９】マウス血清のＡ型インフルエンザウイルスの中和試験の結果を示す図である。*エラーバーは、標準偏差を示す。
【図３０】トランスファープラスミドｐＵ７０−４５５−ＳＢＶＧｃ＿７１Ｋ７１のマップを示す図である。
【図３１Ａ】Ａ）非ワクチン接種対照ウシ（上のパネル）およびＳＢＶのウイルスゲノムの検出のためのｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃにより２回ワクチン接種した動物（下のパネル）の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。個々の動物は、それぞれ非ワクチン接種およびワクチン接種された動物の各群の異なる型の線および印によって同定される。動物１は、黒く塗りつぶされた丸と黒い線として表される（図２７Ｂの黒いバーに相当する）。動物２は、グレーで塗りつぶされた三角とグレーの破線として表される（図２７Ｂのライトグレーのバーに相当する）。動物３は、塗りつぶされていない四角と黒い破線として表される（図２７Ｂの白いバーに相当する）。動物４は、グレーの塗りつぶされたダイヤモンドとグレーの破線として表される（図２７Ｂのダークグレーのバーに相当する）。
【図３１Ｂ】Ｂ）非ワクチン接種対照ウシ（上のパネル）およびｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃにより２回ワクチン接種した動物（下のパネル）の血清中和試験の結果を示すグラフである。個々の動物は、それぞれ非ワクチン接種およびワクチン接種された動物の各群の異なるバーの色／塗りつぶし（黒からライトグレーおよびダークグレーから白まで）によって同定される。動物１は、黒いバーとして表される（図２７Ａの黒い塗りつぶされた円と黒い線に相当）。動物２は、ライトグレーのバーとして表される（図２７Ａのグレーで塗りつぶされた三角とグレーの破線に相当）。動物３は、白いバーとして表される（図２７Ａの塗りつぶされていない四角と黒い破線に相当）。動物４は、ダークグレーのバーとして表される（図２７Ａのグレーで塗りつぶされたダイヤモンドとグレーの破線に相当）。
【図３２】ＥＨＶ中和試験を示すグラフである。それぞれの群における同一の動物の試料から得られた全ての結果は、グレーの同じ影で示される：１つの動物は黒く塗りつぶされたバーによって表され、別の動物はライトグレーで塗りつぶされたバーによって表され、第３の動物は白いバーによって表され、第４の動物はダークグレーのバーによって表される。
【図３３】チャレンジ後１日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。
【図３４】チャレンジ後３日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。
【図３５】チャレンジ後５日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。
【図３６】ワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。試験のため、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現Ｈ３によってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は、グラフの右の凡例に示される。
【図３７】ワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。試験のため、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現Ｈ３によってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は、グラフの右の凡例に示される。
【図３８】インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ）の結果を示すグラフである。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験２８日目（ＳＤ２８）に試験動物から採血された血液から精製された。ＰＢＭＣは、次いで、１（Ｈ３Ｎ２  ＭＯＩ  １）の感染により複数回、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４でまたは１μｇ／ｍｌ（ｒＨ３  １μｇ／ｍｌ）の濃度でワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な組換え発現ブタＩＡＶ  Ｈ３抗原でのいずれかで再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図３９】インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ）の結果を示すグラフである。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験２８日目（ＳＤ２８）に試験動物から採血された血液から精製された。ＰＢＭＣは、次いで、１（Ｈ３Ｎ２  ＭＯＩ  １）の感染により複数回、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４で、または１μｇ／ｍｌ（ｒＨ３  １μｇ／ｍｌ）の濃度でワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な組換え発現ブタＩＡＶ  Ｈ３抗原でのいずれかで再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、先行技術につきものの問題を解決し、当技術の状態の明らかな進歩を提供する。
一般に、本発明は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む、プロモーター配列／制御核酸配列を提供し、前記プロモーター配列は目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。
【００１３】
特定の態様では、機能的断片または誘導体は、５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する。別の態様では、機能的断片または誘導体は、４３０〜５５０ヌクレオチド、４３０〜５００ヌクレオチド、または４３０〜４８０ヌクレオチドの間の長さを有する。好ましくは、機能的断片は配列同一性および／または相同性または７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列同一性を有する。特定の態様では、発現は増大される。
【００１４】
特定の態様では、機能的断片は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である。好ましくは、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片は、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である。別の態様では、配列同一性は（少なくとも）７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。
さらなる特定の態様では、機能的断片は、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％である（またはより高い）。好ましくは、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片は、ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。別の態様では、配列同一性は（少なくとも）７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。
【００１５】
本発明は、ｐ４３０（配列番号３）もしくはｐ４５５（配列番号４）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む、プロモーター配列／制御核酸配列をさらに提供し、前記プロモーター配列は目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。好ましくは、機能的断片は、７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列相同性または配列同一性を有する。特定の態様では、発現が増大される。
【００１６】
本発明は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）および４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）ならびにその相補的なヌクレオチド配列およびその機能的断片および機能的誘導体およびその相補的なヌクレオチド配列、ならびにｐ４３０（配列番号３）およびｐ４５５（配列番号４）ならびにその相補的なヌクレオチド配列およびその機能的断片、およびその機能的誘導体、およびその相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるプロモーター配列／制御核酸配列を含む発現カセットにさらに関し、
プロモーター配列は目的の配列、好ましくは目的の遺伝子または抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および／または外来性配列、目的の遺伝子または抗原コード配列に作動可能に連結しており、
前記プロモーター配列／制御核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列は、好ましくは異種プロモーター配列／制御核酸配列、より好ましくは外来性プロモーター配列／制御核酸配列である。特定の態様では、発現が増大される。
特定の態様では、発現カセットは、組換え、異種および／または外来性発現カセットである。別の特定の態様では、プロモーター配列／制御核酸配列は、組換え、異種および／または外来性プロモーター配列／制御核酸配列である。
本発明は、本発明に記載の発現カセットを含むウイルスベクターまたはウイルス構築物などのベクターにさらに関する。好ましくは、前記ベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）および４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）ならびにその相補的なヌクレオチド配列およびその機能的断片および機能的誘導体およびその相補的なヌクレオチド配列、ならびにｐ４３０（配列番号３）およびｐ４５５（配列番号４）ならびにその相補的なヌクレオチド配列およびその機能的断片、およびその機能的誘導体、およびその相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるプロモーター配列／制御核酸配列を含む発現カセットを含むウイルスベクターまたはウイルス構築物などのベクターに関し、
プロモーター配列は目的の配列、好ましくは目的の遺伝子または抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および／または外来性配列、目的の遺伝子または抗原コード配列に作動可能に連結しており、
前記プロモーター配列／制御核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列は、好ましくは異種プロモーター配列／制御核酸配列、より好ましくは外来性プロモーター配列／制御核酸配列である。特定の態様では、発現が増大される。好ましくは、前記ベクターは免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
【００１８】
本発明は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）および／または４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片または機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列、またはｐ４３０（配列番号３）および／またはｐ４５５（配列番号４）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片、またはその機能的誘導体、またはその相補的なヌクレオチド配列を含む制御核酸／プロモーター配列を含む、ＤＮＡワクチン接種のためのウイルスベクターまたはプラスミドなどの異種（発現）ベクターにさらに関し、前記制御核酸／プロモーター配列は目的の配列、目的の遺伝子、または抗原コード配列の転写または発現をもたらす。特定の態様では、目的の前記配列、目的の遺伝子、または抗原コード配列の転写または発現が増大される。好ましくは、前記ベクターは免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
特定の態様では、ベクターは、組換え、異種および／または外来性ベクターである。別の特定の態様では、プロモーター配列／制御核酸配列は、組換え、異種および／または外来性プロモーター配列／制御核酸配列である。
【００１９】
本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターの特定の態様では、機能的断片または誘導体（プロモーター配列／制御核酸配列の）は、７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列相同性または配列同一性を有する。
【００２０】
本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターの別の特定の態様では、機能的断片または誘導体（プロモーター配列／制御核酸配列の）は、５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する。本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターの別の特定の態様では、機能的断片または誘導体（プロモーター配列／制御核酸配列の）は、４３０〜５５０ヌクレオチド、４３０〜５００ヌクレオチド、または４３０〜４８０ヌクレオチドの間の長さを有する。本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターのさらに別の特定の態様では、機能的断片または誘導体（プロモーター配列／制御核酸配列の）は、７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の配列相同性または配列同一性を有する。
本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターのさらなる特定の態様では、機能的断片または誘導体（プロモーター配列／制御核酸配列の）は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である。好ましくは、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の前記機能的断片は、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である。
【００２１】
本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターのさらなる特定の態様では、機能的断片または誘導体（プロモーター配列／制御核酸配列の）は、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％（またはより高い）である。好ましくは、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の前記機能的断片は、ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。
本発明に記載の発現カセットおよび／または本発明に記載のベクターのさらなる特定の態様では、前記発現カセットおよび／または前記ベクターは１つまたは複数のさらなる制御配列、例えば終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、またはＩＲＥＳおよび／または２ａペプチドのような制御エレメントを含む。
特定の態様では、本発明に記載のベクターは異種および／または外来性ベクターである。
【００２２】
本発明の別の特定の態様では、本発明に記載のベクターは、ウイルスベクター、好ましくは、ヘルペスウイルス科、例えばウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）、およびブタアルファヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス、ＰｒＶ）およびウシアルファヘルペスウイルス１型（ウシヘルペスウイルス１型、ＢＨＶ−１）のような他のバリセロウイルス、ＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス）などのアデノウイルス科（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルスなどのレンチウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択される。より特定の態様では、前記ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス科、好ましくはアルファヘルペスウイルス属、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくは、前記ベクターはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）である。
【００２３】
本発明は、
ａ．本発明に記載のプロモーター配列および／または制御核酸配列を用意するステップ、
ｂ．ステップａ）の前記プロモーター配列を、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ブタアルファヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス、ＰｒＶ）およびウシアルファヘルペスウイルス１型（ウシヘルペスウイルス１型、ＢＨＶ−１）のようなバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、ＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス）などのアデノウイルス科（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルス由来のベクター骨格であって、好ましくはヘルペスウイルスに由来し、より好ましくはＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４であるベクター骨格に組み込むステップ
を含む、ベクター、好ましくはウイルスベクターを産生する方法にさらに関する。
【００２４】
本発明は、本発明に記載のベクターの複製に許容的であることを特徴とする、真核生物の宿主細胞株にさらに関し、好ましくは、前記宿主細胞株は哺乳動物細胞株または昆虫細胞株であり、最も好ましくはＰＫ／ＷＲＬ細胞株、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、Ｓｆプラス細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生物（derivative）である。
【００２５】
本発明は、
ａ．請求項９から１９に記載のベクターを、請求項２１に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
ｂ．適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
によって特徴づけられ、
ｃ．前記宿主細胞を回収するステップ、
によって特徴づけられていてもよい、宿主細胞を調製する方法にさらに関する。
上記に列挙したように、哺乳動物の宿主細胞株は通常、アール塩およびウシ胎仔血清が補足された最小必須培地（ＭＥＭ）などの哺乳動物細胞培養のための培地で浸したプラスチック製の組織培養器中で培養される。哺乳動物細胞株は５％ＣＯ２および湿度およそ８０％を補足した一定の雰囲気下で、３７℃のインキュベーター内で保管される。昆虫細胞株は、昆虫細胞培養培地で浸したプラスチック製の組織培養器中で培養され、インキュベーター内の一定の雰囲気下で、２７℃で保管される。」
【００２６】
本発明は、プロモーター配列としての、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片または機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列の使用にさらに関し、前記核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。特定の態様では、発現が増大される。
本発明は、制御核酸配列としての、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片または機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列の使用にさらに関し、前記核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。特定の態様では、発現が増大される。
【００２７】
本発明は、プロモーター配列としての、ｐ４３０（配列番号３）もしくはｐ４５５（配列番号４）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片または機能的誘導体もしくはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列の使用にさらに関し、前記核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。特定の態様では、発現が増大される。
本発明は、制御核酸配列としての、ｐ４３０（配列番号３）もしくはｐ４５５（配列番号４）またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列の使用にさらに関し、前記核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。特定の態様では、発現が増大される。
本発明は、本発明に記載のベクター、宿主細胞からなり、トランスフェクション試薬および指示リーフレットからなっていてもよいキットにさらに関する。
本発明は、０．０１〜０．００１のＭ．Ｏ．Ｉ．で使用してもよい、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、本発明に記載のベクターまたは本発明に記載の真核生物の宿主細胞株または本発明に記載の真核生物の宿主細胞の使用にさらに関する。
【００２８】
ウイルスベクターの使用のため特別に、哺乳動物の宿主細胞株は通常培養され、細胞株に応じてコンフルエントまたはサブコンフルエントに増殖される。ウイルスベクターは、適当な量の新鮮な培養培地と混合され、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）が０．００１〜０．０１になるように希釈される。細胞培養培地は宿主細胞から除去され、希釈したウイルスベクターを含有する培地で置き換えられる。そのような接種された細胞培養は、細胞株に応じておよそ２〜４日間、３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートされる。細胞内でのウイルスベクターの複製は、細胞変性効果（ＣＰＥ）および最終的な破壊、ならびに細胞の死をもたらす。材料は回収され、−８０℃で保存される。ウイルス力価が決定される。
【００２９】
本発明は、
ａ．本発明に記載の発現カセットおよび／または
ｂ．本発明に記載のベクター、および／または
ｃ．本発明に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび／または例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の、本発明に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、
を含み、ならびに
ｄ．薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤を含んでもよく、好ましくは前記担体が経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適している、
免疫原性組成物にさらに関する。
特定の態様では、前記免疫原性組成物はウイルスを含む。別の特定の態様では、前記免疫原性組成物は感染性ウイルスを含む。
【００３０】
本発明は、
ａ．本発明に記載の発現カセットおよび／または
ｂ．本発明に記載のベクター、および／または
ｃ．本発明に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび／または例えば改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の、本発明に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
ｄ．薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤を含み、好ましくは前記担体が経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適しており、
ｅ．前記ワクチンがアジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物にさらに関する。
【００３１】
本発明は、
ａ．本発明に記載のベクターを、本発明に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
ｂ．適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
ｃ．感染細胞および／またはベクターおよび／またはウイルス成分を回収するステップ
を含み、
ｄ．ステップｃ）の回収物を精製するステップ
を含んでもよく、
ｅ．前記回収物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法にさらに関する。
【００３２】
処置の方法
本発明は、動物において病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を減らすまたは予防する方法での使用のための、または動物において病原体の感染を処置または予防する方法での使用のためのものであり、好ましくは前記動物がブタまたはウシなどの食物生産動物である、本発明に記載の免疫原性組成物または本発明に記載のワクチンにさらに関する。
本発明は、本明細書に記載のように免疫原性組成物またはワクチンを食物生産動物などの動物に投与するステップを含む、食物生産動物などの動物を免疫する方法をさらに提供する。
【００３３】
本発明は、前記動物において病原体によって引き起こされる臨床疾患に対してブタを含む食物生産動物などの動物を免疫する方法にさらに関し、前記方法は本発明に記載の免疫原性組成物または本発明に記載のワクチンを動物に投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンが感染の臨床徴候を引き起こさないが、前記病原体の病原体型に対して動物を免疫する免疫応答を誘導することができる。
特定の態様では、免疫は、家畜において特別なウイルス感染の発生率の減少または特別なウイルス感染によって引き起こされるまたは特別なウイルス感染と関連する臨床徴候の重症度の低減をもたらす。
【００３４】
さらに、本明細書で提供したように免疫原性組成物を必要とする食物生産動物の免疫は、ウイルス感染による食物生産動物の感染の予防をもたらす。さらにより好ましくは、免疫は、有効な、長期持続する、前記ウイルス感染に対する免疫学的応答をもたらす。前記期間は２ヵ月より長く、好ましくは３ヵ月より長く、より好ましくは４ヵ月より長く、より好ましくは５ヵ月より長く、より好ましくは６ヵ月より長く続くことが理解されるであろう。免疫は、免疫された全ての動物／対象に有効ではない場合があることが理解される。しかしながら、家畜の大部分の動物／対象が有効に免疫される期間が必要である。
本発明は、それを必要とする食物生産動物などの動物において、ウイルスによって引き起こされる臨床徴候の処置または予防の方法を提供し、方法は、本明細書に記載のように治療有効量の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与するステップを含む。
好ましくは、臨床徴候は、処置していない（免疫していない）が、特別なブタＡ型インフルエンザウイルスに続いて感染した動物と比較して、少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％低減される。
本発明は、
ａ）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
ｂ）本発明に記載の免疫原性組成物または本発明に記載のワクチン
を含み、
ｃ）指示リーフレット
を含んでもよい、動物において病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくはブタまたはウシなどの食物生産動物にワクチン接種するための、および／または動物において病原体と関連するまたは病原体によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすためのキットにさらに関する。
【００３５】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または（or）」の使用は「および／または（and/or）」を意味する。さらに、用語「含む（including）」ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照。
【００３７】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメーターに限定されず、当然変化し得るものと理解される。本明細書で使用する用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が特に明確に規定しない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（an antigen）」という言及は２つまたはそれ以上の抗原の混合物を含み、「賦形剤（an excipient）」という言及は２つまたはそれ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
【００３８】
分子生物学定義
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成されるまたはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
【００３９】
ベクターおよび発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用する方法は、特に、米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第４，７２２，８４８号、第５，９４２，２３５号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，７７０，２１２号、第５，９４２，２３５号、第３８２，４２５号、ＰＣＴ国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号、Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051(recombinant baculovirus)；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；ＥＰＡ０３７０５７３；米国特許出願第９２０，１９７号、１９８６年１０月１６日出願；欧州特許出願公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５，５９１，４３９号、第５，５５２，１４３号；国際公開第９８／００１６６号；両方とも１９９６年７月３日に出願された、許可された米国特許出願第０８／６７５，５５６号、および第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ  ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；および米国特許第５，５９１，６３９号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号、ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示の方法によるまたは類似してよい。また、国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)；Sanford et al.,米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbachet al. (Intracel)；国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)；Szoka et al.,米国特許第４，３９４，４４８号（生細胞にＤＮＡを挿入する方法）；McCormick et al.,米国特許第５，６７７，１７８号 （細胞変性ウイルスの使用）;および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）；ならびに本明細書で引用した他の文献も参照。
【００４０】
用語「ウイルスベクター」は宿主細胞にそれが入り込むと特定の生物活性、例えばベクターによって運ばれた導入遺伝子の発現をもたらすように、組換えＤＮＡ技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを記載する。特定の態様では、導入遺伝子は抗原である。ウイルスベクターは標的細胞、組織、または生物において複製可能であってもなくてもよい。
【００４１】
ウイルスベクターの生成は、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) or K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))に記載されるように、限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養へのトランスフェクションの標準的な技術を含む、当技術分野で周知の適切な遺伝子工学技術を使用して達成され得る。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。
【００４２】
ウイルスベクターは２つまたはそれ以上の目的のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、目的の第１のタンパク質のコード領域および目的の第２のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、目的の第３または第４のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第３および第４のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。１つのウイルスベクターによってコードされる目的の２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は異なり得る。例えば、２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、またはそれ以上であってよい。
好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４またはＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）またはＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１）のような他のバリセロウイルス由来などのヘルペスウイルスベクターを含む。
【００４３】
本開示の特定の態様に従って、用語「ウイルスベクター」または代わりに「ウイルス構築物」は、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、またはブタアルファヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス、ＰｒＶ）およびウシアルファヘルペスウイルス１型（ウシヘルペスウイルス１型、ＢＨＶ−１）のような他のバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、ＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス、van Regenmortel et al.）などのアデノウイルス科（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルス科、またはポックスウイルス科から選択されるウイルス由来の組換えウイルス構築物を指す。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)。好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１もしくはＥＨＶ−４、またはＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）もしくはＢＨＶ−１（ウシアルファヘルペスウイルス１型）のような他のバリセロウイルスに由来するなど、ヘルペスウイルスベクターを含む。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、ＢＡＣ、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
【００４４】
用語「プラスミド」は、細菌宿主細胞内の細菌染色体とは独立して複製する細胞質のＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、用語「プラスミド」および／または「トランスファープラスミド」は、例えばウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、用語「プラスミド」は、ＤＮＡワクチン接種目的のために有用なプラスミドを特定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
【００４５】
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」または「ＤＮＡ配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片および部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それらは一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してよい。配列は、非コード配列、コード配列、または両方の混合であってよい。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
【００４６】
用語「制御核酸」、「制御エレメント」および「発現調節エレメント」は交換可能に使用され、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に影響し得る核酸分子を指す。これらの用語は、プロモーター、プロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または制御する全てのエレメントに広く使用され、全てのエレメントをカバーする。原核生物における例示的な制御エレメントは、プロモーター、オペレーターシーケンスおよびリボソーム結合部位を含む。真核細胞において使用される制御エレメントは、限定はされないが、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピコルナウイルス２Ａ配列等を含むことができ、コード配列の発現および／または宿主細胞におけるコードポリペプチドの産生を提供および／または制御する。
【００４７】
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの５’の遺伝子に非依存的に翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が単一の転写物から翻訳されるようにする配列を記載する。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための非依存的なリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロニックであり得る、すなわちｍＲＮＡから順に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードする細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞のほとんどのｍＲＮＡは、モノシストロニックであり１つのポリペプチドのみの合成のためにコードする。真核細胞におけるポリシストロニック転写により、翻訳は翻訳開始部位の最も５’側から開始され、最初の終止コドンで終結され、転写物はリボソームから放出され、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物の第２のまたは続くオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロニック転写は、その下流のオープンリーディングフレームの連続的な翻訳を可能にし、同じ転写物によってコードされた２つまたはそれ以上のポリペプチドを産生する。ＩＲＥＳは様々な長さであってよく、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶまたはポリオウイルス（ＰＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）など、さまざまな起源由来であってよい。ベクター構築物における様々なＩＲＥＳ配列およびそれらの使用が記載され、当技術分野で周知されている。下流のコード配列は、下流の遺伝子の発現にネガティブに影響しないであろう任意の距離でＩＲＥＳの３’端に作動可能に連結されている。ＩＲＥＳと下流の遺伝子の始まりの間の最適なまたは許容的な距離は、距離を変化させ、距離の関数として発現を測定することによって容易に決定することができる。
【００４８】
用語「２ａ」または「２ａペプチド」は、短いオリゴペプチド配列を意味し、２ａおよび「２ａ様」と記載され、リボソームスキッピングとして定義されたプロセスによって、翻訳の際にタンパク質間の切断を媒介することができるリンカーとして機能する。そのような２ａおよび「２ａ様」配列（ピコナウイルス科および他のウイルスまたは細胞配列に由来する）は、複数の遺伝子配列を単一の遺伝子に鎖状につなぐために使用され、同じ細胞内でのそれらの共発現を確実にすることができる（Luke and Ryan, 2013参照）。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容し、遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域、遺伝子の転写開始部位の近位に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることが多い。プロモーターの例としては、限定はされないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシおよびヒトを含む）などの動物、トリまたは昆虫由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑圧可能、および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化など、培養条件のいくつかの変化に応じてそれらの調節下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始する（Ptashne, 2014）。当業者に周知のプロモーターの例としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト成長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターが挙げられる。
【００５０】
本発明の文脈で、本明細書で使用する場合、用語プロモーターは、特に機能的断片、例えば、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列を指し、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である。さらに、本発明の文脈で、本明細書で使用する場合、用語プロモーターは、特に機能的断片、例えば、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列を指し、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％である（またはより高い）。最も好ましくは、「プロモーター」は、ｐ４３０（配列番号３）またはｐ４５５（配列番号４）を指す。本発明の文脈で、本明細書でさらに使用する場合、用語プロモーターは、特に、配列同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一または相同であるように、例えばわずかな置換、変異または逆位を有するｐ４３０（配列番号３）もしくはｐ４５５（配列番号４）または４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的誘導体を指す。
【００５１】
用語「ｐ４３０」、「ｇＧ４３０」、および「４３０」は、明細書、図面、シーケンスリスト等を通して同義的および交換可能に使用される。用語「ｐ４５５」、「ＭＣＰ４５５」および「４５５」は、明細書、図面、シーケンスリスト等を通して同義的および交換可能に使用される。
【００５２】
用語「エンハンサー」は、ｃｉｓ位置にあるポリヌクレオチド配列を意味し、プロモーターの活性に作用し、したがって、このプロモーターに機能的に結合した遺伝子またはコード配列の転写を刺激する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は位置および方向に非依存的であり、したがってそれらは、イントロン内またはコード領域内でさえも転写ユニットの前または後に位置することができる。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近くとプロモーターからかなり距離のある位置の両方に位置し得る。プロモーターと物理的および機能的なオーバーラップを有することもできる。当業者は、様々な起源由来の（およびＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託された、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）多くのエンハンサーを把握しており、それらは非依存的なエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして利用可能である（例えば、ＡＴＣＣに寄託され、または市販され、および個々の起源）。多くのプロモーター配列はまた、頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどのエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定された最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの１つの例は、メタロチオネインエンハンサーであり、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
【００５３】
用語「相補的ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの２対の鎖の１つの鎖を記載する。相補的な鎖のヌクレオチド配列は、各アデノシンはチミン（またはＲＮＡの場合はウラシル）、各グアニンはシトシン、逆もまた同様になるように、その対の鎖のヌクレオチド配列を写す。例えば、５’−ＧＣＡＴＡＣ−３’の相補的ヌクレオチド配列は３’−ＣＧＴＡＴＧ−５’、またはＲＮＡの場合は３’−ＣＧＵＡＵＧ−５’である。
【００５４】
用語「遺伝子」、「目的の遺伝子」は、本明細書で使用する場合、同じ意味を有し、目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列の前（５’非コードまたは非翻訳配列）および後（３’非コードまたは非翻訳配列）に制御配列をさらに含んでよい。選択された配列は全長またはトランケート、融合、またはタグ化遺伝子であってよく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片であってよい。ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡは、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からスプライシングされ、したがって、同じポリペプチドまたはＲＮＡをコードするｃＤＮＡには存在しない、非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得ることが通常理解される。それは、天然配列、すなわち自然発生的な形態であってよく、または変異され、または異なる起源由来の配列を含んでもよく、そうでなければ所望のように改変されてもよい。これらの改変は、選択された宿主細胞またはタグ付けにおけるコドン利用を最適化するコドン最適化を含む。さらに、それらは、例えば（潜在性の）スプライスドナー、アクセプター部位および枝分かれ点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、繰り返し配列、二次構造（例えば、ステムループ）、転写因子または他の制御因子の結合部位、制限酵素部位等のｃｉｓ作用性部位の除去または付加を含み、限定はされないが、わずかな例を挙げることができる。選択された配列は、分泌、細胞質、核、膜結合または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「目的のヌクレオチド配列」は、それが必ずしも遺伝子を含まないが、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは部分、例えばｏｒｉ（複製オリジン）を含み得るため、目的の遺伝子よりも、より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、それがコード配列を含むかどうかに非依存的な任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得る。
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「転写」は、細胞でのｍＲＮＡの生合成を記載する。
【００５６】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞内での核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の特定の態様に従って、用語「発現」は、宿主細胞内での異種および／または外因性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する相当するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞内ＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、またはＲＴｑＰＣＲ（逆転写後の定量的ＰＣＲ）によって定量され得る。選択された配列から発現されたタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降によって、タンパク質の生物活性のアッセイによって、またはタンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ解析によって定量され得る。
【００５７】
用語「発現カセット」または「転写ユニット」または「発現ユニット」は、転写される１つまたは複数の遺伝子を含有するベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を定義し、転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列ならびに発現カセット内に含有される制御エレメントを含有するポリヌクレオチド配列が、互いに作動可能に連結されている。それらは、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。１つの特定の態様では、それらは１つの単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子は少なくとも転写的に連結されている。１つより多くのタンパク質または産物は転写され、各転写ユニット（マルチシストロン転写ユニット）から発現される。各転写ユニットは、ユニット内に含有される任意の選択された配列の転写および翻訳に必要な制御エレメントを含むであろう。各転写ユニットは、同じまたは異なる制御エレメントを含有し得る。例えば、各転写ユニットは、同じターミネーターを含有してもよく、ＩＲＥＳエレメントまたはイントロンは、転写ユニット内での遺伝子の機能的な連結に使用され得る。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は１つより多くの転写ユニットを含有し得る。
【００５８】
用語「発現増加」、「力価または生産性増加」または「発現または生産性改善」により、適切な対照との比較、例えば、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質対イントロン含有遺伝子によってコードされるタンパク質による、宿主細胞に導入された異種および／または外因性配列、例えば治療タンパク質をコードする遺伝子の発現、合成または分泌の増加を意味する。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍増加した場合、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍または少なくとも１．５倍または少なくとも２倍または少なくとも３倍増加した場合も、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍〜５倍、好ましくは１．５倍〜５倍、より好ましくは２倍〜５倍、特に好ましくは３倍〜５倍増加した場合も、特別な力価または生産性増加がある。「発現増加」は、そのうえ、より多くの細胞が目的の遺伝子／配列を実際に発現することを意味し得る。例えば、発現増加は、本発明の新しいプロモーターが、他のプロモーターと比較して、ウイルス複製サイクル中により長い期間活性であることを意味し得る。
発現、力価または生産性増加は、本発明に記載の異種ベクターを使用することによって得ることができる。これは、追加の選択可能マーカーとして、１つまたは複数の蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または細胞表面マーカーを含有する組換え宿主細胞のＦＡＣＳアシスト選択などの他の手法と組合せることができる。発現増加を得る他の方法、および使用することができる異なる方法の組合せも、例えばクロマチン構造（例えば、ＬＣＲ、ＵＣＯＥ、ＥＡＳＥ、アイソレーター、Ｓ／ＭＡＲｓ、ＳＴＡＲエレメント）の操作のためのｃｉｓ活性エレメントの使用、（人工）転写因子の使用、内在性または異種および／または外因性遺伝子発現を上方制御するための天然または合成剤による細胞の処置、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性（半減期）の改善、ｍＲＮＡ翻訳の開始の改善、エピソーム性プラスミドの使用による遺伝子用量の増加（複製オリジンとしてウイルス配列の使用に基づく、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＥＢＶ、またはＢＰＶ）、ＤＮＡコンカテマーに基づく増幅促進配列またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅システムの使用に基づく。
【００５９】
「発現増加」を測定するためのアッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのタンパク質測定、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）；抗体ベースの検出方法、例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、または免疫拡散法、およびフローサイトメトリー；ならびに赤血球凝集反応アッセイによる生物活性の測定である。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるｍＲＮＡの定量によって間接的に測定される。ｍＲＮＡは、内因性の標準と比較して、ＲＴｑＰＣＲによって定量される。
【００６０】
用語「ウイルス力価」は、ウイルス調製物の容積当たりの感染ユニットの測定である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して行った試験の特定の割合で効果を示す希釈率として定義される（Reed and Muench, 1938）。特に、１ミリリットル当たりの組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、その希釈率で並行して接種された細胞培養の数の５０％が感染する、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
【００６１】
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核生物のｍＲＮＡの３’端の特異的部位での切断、および切断された３’端での約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）の配列の転写後組込みを引き起こし、したがって、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは切断部位および下流に位置する配列の約１０〜３０ヌクレオチド上流に配列ＡＡＴＡＡＡを含む。ｔｋ  ポリＡ、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ、ＢＧＨ  ポリＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号に記載）またはハムスター増殖ホルモンポリＡ（国際公開第２０１００１０１０７号）など、様々なポリアデニル化エレメントが公知である。
【００６２】
「翻訳制御エレメント」は、発現される各個々のポリペプチドに翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終止コドンおよびポリＡシグナルを含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、いくつかの構築物に含まれてよい。発現を最適化するため、発現される核酸配列の５’−および／または３’−非翻訳領域を除去、付加、または変更し、転写または翻訳のいずれかのレベルで、発現を干渉または減少させ得る、任意の潜在的に余分で不適切な代わりの翻訳開始コドンまたは他の配列を除外することが得策であり得る。コンセンサスリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列）は開始コドンのすぐ上流に挿入され、翻訳、したがって発現を増強することができる。このリボソーム結合部位周辺の増加Ａ／Ｕ含量は、さらにリボソーム結合により効果的である。
【００６３】
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、異なる（ウイルス）種に由来する場合、宿主細胞に対して、「外因性」、「外因性配列」、「外因性遺伝子」、「外因性コード配列」と呼ばれる。したがって、本発明のＥＨＶ−４ベースのプロモーターは、ＥＨＶ−１ウイルスベクターまたはＣＡｄＶウイルスベクターを考慮して外因性である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「外因性」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原はその天然種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、ブタＩＡＶ由来のＨ３抗原は、ＥＨＶ−１ベクターに関して外因性の抗原の１つの例（例３参照）である。ウマではない抗原など、目的の任意のウマではない配列または遺伝子は、したがって、目的の外因性配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
【００６４】
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に対して、「異種、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「導入遺伝子」または「異種タンパク質」と呼ばれる。これは、導入される配列または導入される遺伝子が、宿主細胞の内在性配列または内在性遺伝子と同一である場合でさえも適用する。例えば、異なる部位で、またはＥＨＶ−４野生型ウイルスにおいてよりも改変形態でＥＨＶ−４ウイルスベクターに導入されるＥＨＶ−４プロモーター配列は、定義により、異種配列である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「異種」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原は、その天然亜種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、抗原、例えばＥＨＶ−１を除く任意のウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−３、ＥＨＶ−８由来の抗原など、目的の任意の非ＥＨＶ−１特異的配列または遺伝子は、したがって、目的の異種配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
【００６５】
用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、用語「非天然型」、「異種」および「外因性」と交換可能に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種または外因性ポリヌクレオチド配列のいずれかから発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される場合、用語組換えは、ウイルスゲノムの人工的な操作によって産生されるウイルスを意味する。外因性抗原コード配列など、異種または外因性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。用語組換えウイルスおよび用語非天然型ウイルスは、交換可能に使用される。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外因性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」は、制御エレメントと遺伝子またはそのコード領域の間の接続を記載するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の制御エレメント、例えば、限定はされないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサーの調節下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、制御エレメントと「作動可能に連結される（operably linked to）」または「作動可能に連結される（operatively linked to）」または「作動可能に関連する（operably associated with）」と言われ、遺伝子またはコード領域が制御エレメントによって調節または影響されることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。
【００６７】
さらに、本明細書の範囲内で、用語「機能的連結」、「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらが意図した方法で機能するように配置されることを意味する。例えば、ｃｉｓ位置で連結された遺伝子配列の転写を調節または調整することができる場合、ポロモーター／エンハンサーまたはターミネーターは、コード遺伝子配列に機能的に連結される。通常、必ずしもそうではないが、機能的に連結されたＤＮＡ配列は隣接し、２つのポリペプチドコード領域を合わせる必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、隣接し、リーディングフレームである。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは、通常、上流に位置し、作動可能に連結されたターミネーターは、通常、コード配列の下流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限り、必ずしも隣接していない。このため、それらはコード配列の上流に位置することも、下流に位置することもあり、幾らか距離を隔てていることもある。ポリアデニル化部位は、コード配列を通ってポリアデニル化シグナルまで転写が進行するようにコード配列の３’端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、例えば、適切な制限部位もしくは平滑末端でのライゲーションにより、または融合ＰＣＲ法を使用することにより、当技術分野で公知の組換え方法によって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、適切な制限部位が存在しない場合、従来の実行と一致して使用され得る。
【００６８】
したがって、プロモーター配列の、用語「機能的断片」または「機能的誘導体」は、断片または誘導体が依然としてプロモーター活性が有効であることを意味する。プロモーター活性を評価する方法の機能アッセイは当業者に周知である（Bustin 2000, Nolan et al. 2006）。そのような機能アッセイの例示的な実施形態としては、例えば、プロモーター動態実験が挙げられる。プロモーターまたはその断片がレポーター導入遺伝子の転写を導く発現カセットを有するベクターウイルスを感染させた細胞は、異なる時間インキュベートされる。全ＲＮＡは、感染後の異なる時間で回収された試料から調製される。ＤＮＡｓｅＩ消化によるコンタミネートしたＤＮＡの破壊後、ＲＮＡは逆転写される。ＲＮＡ調製物からのコンタミネートしたＤＮＡの除去の成功を実証するため、１つの複製試料が逆転写酵素（ＲＴ）の添加によって処理され、２つ目の複製はＲＴの添加無しで処理される。生じるｃＤＮＡは精製され、従来のＰＣＲの鋳型として使用される。ＲＴの添加によって処理された試料のみがＰＣＲ産物を産生するはずである。これらのｃＤＮＡは、次いで、レポーター導入遺伝子のプライマーによるｑＰＣＲに、ウイルスベクターの必須遺伝子（内部標準遺伝子）のプライマーによるものと並行して使用することができ、その転写は、感染および複製の効率のための内部標準を提供する。レポーターのｑＰＣＲ値は、内部標準遺伝子のｑＰＣＲ値を使用して、異なる構築物および感染後の時間の間でノーマライズされる。これは、異なるプロモーターおよびその断片のプロモーター活性の解釈を可能にする。
【００６９】
「配列相同性」は、本明細書で使用する場合、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するため、２つまたはそれ以上の配列が最適にアラインされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定する場合には、保存的なアミノ酸置換は一致としてカウントされる。言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有する比較できるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るため、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の参照配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドが一致しなければならず、別のアミノ酸またはヌクレオチドとの保存的な置換を含まなければならない。代わりに、参照配列における、保存的な置換を含まない、全アミノ酸残基またはヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのアミノ酸またはヌクレオチドの数が、参照配列に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも５０、さらにより好ましくは１００、さらにより好ましくは２５０、さらにより好ましくは５００ヌクレオチドのストレッチを含む。
【００７０】
当技術分野で公知のように、「配列同一性」は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、参照配列と、参照配列と比較される所与の配列の間の関係を指す。配列同一性は、配列が最適にアラインされた後に所与の配列を参照配列と比較することによって決定され、そのような配列のストリング間の一致により決定されるように、最も高い程度の配列類似性を産生する。そのようなアライメントにより、配列同一性は、位置ごとに確認され、例えば配列は、その位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、特定の位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、次いで参照配列のヌクレオチドまたは残基の総数によって割られ、％配列同一性を与える。配列同一性は、限定はされないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものを含む公知の方法によって容易に算出することができ、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する一般的に利用可能なコンピュータープログラムでコード化される。そのようなプログラムの例としては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に利用可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、その教示は参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列の間に最高レベルの配列同一性を産生するため、デフォルトのギャップ重み付けを使用して配列を最適にアラインする。例として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチド当たり１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までの点変異を含み得ることを除いて、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列のヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までが欠損または別のヌクレオチドによって置換され、参照配列の総ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのヌクレオチドの数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列、または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかのヌクレオチド中で個々に分散される。同様に、参照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸当たり１５まで、好ましくは１０、９、８、７、６まで、さらにより好ましくは５、４、３、２、１までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照アミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るため、参照配列のアミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までが欠損または別のアミノ酸と置換され、参照配列のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかの残基中で個々に分散される。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、配列同一性を決定する場合、保存的置換は一致として含まれない。
【００７１】
用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適な比較目的のためにアラインされることが本明細書において規定される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列に導入され得る）。相当するアミノ酸またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基が、次いで比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の相当する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の総数（すなわちオーバーラップする位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
【００７２】
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって、または２つの配列の断片にわたって行われ得る。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかしながら、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基の領域にわたって行われ得る。
【００７３】
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータープログラムが利用可能であることを知っている。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数値計算用アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けならびに１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けのいずれかを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。当業者は、これら全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを使用する場合著しくは変更されないことを認識する。
【００７４】
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、「問い合わせ配列」としてさらに使用され、公共のデータベースに対して検索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され、本発明のタンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るため、Altschul et al.  (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。国立バイオテクノロジー情報センターのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照。
【００７５】
ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４／組換えベクター技術の定義
用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する（例えば、ラバ、ケツテイ等）。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
【００７６】
用語「ウマヘルペスウイルスベクター」または「ウマヘルペスウイルス」または「ＥＨＶ」は、ウマに感染するヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。これまでのところ、８つの異なる種のウマヘルペスウイルスが同定され、５つはアルファヘルペスウイルス亜科（ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９）に属し、３つはガンマヘルペスウイルス科に属する。（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)
用語「ＥＨＶ−１」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス１型を意味する。ＥＨＶ−１の非限定的な参照配列は、例えば野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）またはＲａｃＨ（Hubert 1996）。
用語ＥＨＶ−４は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス４型を意味する。
【００７７】
用語「ＣＡｄＶ」または「ＣＡＶ」または「ＣＡＶ２」または「ＣＡＶ−２」は、アデノウイルス科のマストアデノウイルス属のメンバー、イヌアデノウイルス２型を指す。以前は、用語イヌアデノウイルス１型（ＣＡＶ−１またはＣＡＶ１）およびイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２またはＣＡＶ２）が使用され、マストアデノウイルスの２つの異なる種を特定した。しかしながら、より新しい分類学（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)によると、用語イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）は現在、ＣＡＶ−２およびＣＡＶ−１の両方の種を包含する。
用語「ＯＲＦ７０に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス１型オープンリーディングフレーム７０をコードする位置で、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ＯＲＦ７０の５’の８０１塩基対の欠損をもたらし、３’端の残りの４２３ｂｐは無傷なままで残すが、ｏｒｆ７０遺伝子産物糖タンパク質Ｇの発現を無くす。ＥＨＶ−１を含むいくつかのアルファヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇは、感染細胞から分泌され、炎症促進性サイトカインの結合によって免疫調節性タンパク質として機能することが示された。ウイルスベクターでのその発現が無くなると、無傷な糖タンパク質Ｇを発現する野生型ＥＨＶ−１と比較した場合、ウイルス感染の免疫原性を増大させるはずである。
用語「ＯＲＦ１／３に挿入された」は、ワクチン株ＥＨＶ−１  ＲａｃＨの弱毒化手順中の継代での偶発的な欠損によって、ＯＲＦ１の９０％および全ＯＲＦ２を含む１２８３ｂｐの断片が欠失する位置で、ウイルスゲノムにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。この挿入部位は、この位置からの導入遺伝子の発現がウイルスの複製と干渉する可能性が極端に少ないと予測されたため、選択された。
【００７８】
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも１つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。
【００７９】
本明細書で使用する用語「抗原」は、当技術分野で周知であり、免疫原性、すなわち免疫原である物質、ならびに免疫学的不応性、または免疫不応答、すなわち外来物質に対する体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、エピトープを含有するまたは含む、全長タンパク質ならびにそのペプチド断片を意味することが意図される。
用語「食物生産動物」は、例えば、ブタ、ウシ、家禽、魚等、ヒトによる消費のために使用される動物を意味し、好ましくは、食物生産動物はブタおよびウシを意味し、最も好ましくはブタである。用語「食物生産動物」は、ウマなどのウマ科を除外する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、例えば、本明細書に記載のように免疫学的応答を引き出すウイルス表面タンパク質など、ポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部分」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出すタンパク質またはポリペプチドの断片またはトランケートおよび／または置換形態を指す。一般に、そのようなトランケートおよび／または置換形態、または断片は、全長タンパク質からの少なくとも６個の隣接するアミノ酸を含む。そのような断片は、当技術分野で周知のいくつかのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、線状エピトープは、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時合成し、ペプチドが依然として支持体に結合しているうちに、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。そのような技術は公知であり、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715参照。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴によるなどアミノ酸の空間的な構造を決定することにより容易に同定される。上記のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照。合成抗原も、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原の定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998参照。（その教示および内容は全て本明細書に参照により組み込まれる。）
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、動物の免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的活性成分、および可能だが必ずではない活性成分の免疫学的活性を増強する１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。区別すると、ワクチンの免疫学的活性成分は、いわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）でのその元々の形態または弱毒化粒子のいずれかの完全なウイルス粒子、またはいわゆる死菌ワクチン（ＫＶ）での適切な方法によって不活性化された粒子を含み得る。別の形態では、ワクチンの免疫学的活性成分は、生物の適切なエレメント（サブユニットワクチン）を含んでよく、これらのエレメントは、粒子全体を破壊すること、またはそのような粒子を含有する増殖培地のいずれか、および任意選択により所望の構造を産生する続く精製ステップによって、または例えば細菌、昆虫、哺乳動物、もしくは他の種に基づく適切なシステムの使用による適切な操作を含む合成プロセスによって、さらに任意選択により続く単離および精製手順、または適切な医薬組成物（ポリヌクレオチドワクチン接種）を使用する遺伝材料の直接組込みによるワクチンを必要とする動物における合成プロセスの誘導によって生成される。ワクチンは、１つのまたは同時に１つより多くの上記のエレメントを含み得る。本発明の特定の態様内で使用される場合、「ワクチン」は生ワクチンまたは生ウイルスを指し、組換えワクチンとも呼ばれる。本発明の別の特定の態様では、「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む不活性化または死菌ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンまたは死菌（ＫＶ）または不活性化ワクチンであってよい。
用語「感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）」は、どのくらいのウイルス調製物の感染単位、例えばＴＣＩＤ５０が、細胞当たり使用され培養細胞に感染するかを記載する。例えば、０．０１のＭ．Ｏ．Ｉ．は、１つの感染ユニットが接種される培養容器中１００個の細胞全てを意味する。
用語「ＤＮＡワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、適切な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
【００８２】
不活性化の様々な物理的および化学的方法が当技術分野で公知である。用語「不活性化」は、照射（紫外線（ＵＶ）、Ｘ線、電子ビームまたはガンマ照射）、加熱、または化学的に処置され、その免疫原性を保持しながらそのようなウイルスまたは細菌を不活性化または死滅させた、以前は毒性だったまたは非毒性ウイルスまたは細菌を指す。適切な不活性化剤としては、ベータ−プロピオラクトン、バイナリーまたはベータまたはアセチルエチレンイミン、グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）が挙げられる。
【００８３】
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活性化のため、ホルムアルデヒドを、典型的には水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを作製する。メチルアルコールの添加により、活性化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。一実施形態では、３７％ホルムアルデヒド溶液の約０．１〜１％を使用して、ウイルスまたは細菌を不活性化する。材料は不活性化されるが、高用量による副作用が起こるほど多くないことを確実にするように、ホルマリンの量を調節することが重要である。
【００８４】
より詳細には、ウイルスの文脈における用語「不活性化」は、ウイルスがｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれぞれ複製することができないことを意味し、細菌の文脈における用語「不活性化」は、細菌がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できないことを意味する。例えば、用語「不活性化」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで繁殖し、次いでもはや複製できないように化学的または物理的な手段を使用して不活性化されたウイルスを指し得る。別の例では、用語「不活性化」は、繁殖し、次いでワクチンの成分として使用され得るバクテリンを生じるなど、細菌、細菌の断片または成分の懸濁液を生じる、化学的または物理的な手段を使用して不活性化された細菌を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「ＫＶ」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
【００８５】
「医薬組成物」は、それが投与される生物の、または住み着いている生物の、または生物上の生理学、例えば免疫学的機能を改変することができる１つまたは複数の成分から基本的になる。用語は、限定はされないが、抗生物質または駆虫薬、ならびに、例えば、限定はされないが、プロセシング特性、無菌性、安定性、経腸または非経口経路、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または他の適切な経路を介して組成物を投与する可能性、投与後の耐性、または調節性放出特性などの特定の他の目的を達成するために一般に使用される他の構成成分を含む。そのような医薬組成物の１つの非限定的な例は、単に、実証目的のために挙げられ、以下のように調製され得る：感染細胞培養の細胞培養上澄み液は安定剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合され、混合物は続いて他の方法により凍結乾燥または脱水される。ワクチン接種の前に、混合物は次いで、水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または非水性溶液（例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント）中で再水和される。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「薬学的にまたは獣医学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。いくつかの好ましい実施形態、特に本発明での使用のための凍結乾燥免疫原性組成物、安定化剤を含むものは、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイドオイル；アルケンのオリゴマー化から生じるオイル、特にイソブテンまたはデセン；線状アルキル基を含有する酸のまたはアルコールのエステル、より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ−（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ−（カプリル酸／カプリン酸）またはプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルに基づき得る。オイルは乳化剤と組合せて使用され、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（例えば、無水マンニトールオレエート）のエステル、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸の、エトキシル化されていてもよいエステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)参照。例示的なアジュバントは、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書籍の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
【００８８】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルと架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は用語カルボマーで公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したそのようなアクリルポリマーについて記載している米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体がメチルなどの他の置換基を含有し得る。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の名称で販売されている製品（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋されている。それらとしては、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーは、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）であり、これらは無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである。これらのポリマーを水に溶解させることにより酸性溶液が生じ、これを、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、好ましくは生理的なｐＨまで中和する。
【００８９】
さらに適切なアジュバントとしては、多くの他のものもあり、限定はされないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他の方法）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えサイトカインもしくはその類似体または内在性サイトカイン放出の刺激薬が挙げられる。
【００９０】
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、好ましくは用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、より好ましくは用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で、さらにより好ましくは用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加することができると予測される。あるいは、アジュバントは、最終製品の容積で約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、なおさらに好ましくは約７％〜２２％の濃度、および最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってよい。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
【００９１】
「単離された」は、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元々の環境から変更または取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でその用語が用いられる場合、生きている生物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
「弱毒化」は、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、感染の臨床徴候を引き起こさないが標的動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ウイルス、特に請求項のようにＥＨＶ−１  ＲａｃＨウイルスベクターを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないウイルスまたは病原体を感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、用語「低下する／低下した」は、上記で定義された対照群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％、なおより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、なおより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の低下を意味する。したがって、例えば請求項のように弱毒化ウイルスベクターなどの、弱毒化した非病原性病原体、特に請求項のようにＥＨＶ−１（好ましくはＲａｃＨ）ウイルスベクターが、改変生ワクチン（ＭＬＶ）または改変生免疫原性組成物の生成に適している。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、組成物の文脈では、動物において感染または付随する疾患の発生率を低下させるまたはその重症度を軽減する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、用量当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を指す。あるいは、療法の文脈では、用語「有効量」は、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状の重症度または持続時間を低下または好転させるため、疾患または障害の前進を予防するため、疾患または障害の後退を引き起こすため、疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を予防するため、または、別の療法または治療剤による予防もしくは処置を増強もしくは改善するために十分である療法の量を指す。
【００９３】
「免疫応答」または「免疫学的応答」は、限定はされないが、目的の（免疫原性）組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体により媒介される免疫応答の発生を意味する。通常、免疫応答または免疫学的応答は、限定はされないが、以下の作用の１つまたは複数を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的（記憶）応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、および／または疾患の臨床的な重症度が低下する。そのような防御は、症状の数、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の１つまたは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および／またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。
【００９４】
「疾患に対する防御」、「防御免疫」、「機能免疫」、「臨床症状の減少」、「中和抗体および／または血清変換の誘導／産生」、および同様の句は、１つまたはそれ以上の本発明の治療用組成物、またはこれらの組合せの投与によって生じる、疾患または状態に対する部分的または完全な応答を意味し、その結果、疾患または感染に暴露された免疫されていない対象において予測されるものよりも生じる有害作用が少ないことを意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染が減少し得る、遅くなり得る、または場合により完全に予防され得る。本明細書では、感染の完全な予防を意味する場合には、明確に記載される。完全な予防と記載されていない場合、この用語は、部分的な予防を含む。
【００９５】
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低下」または「臨床症状の減少」は、限定はされないが、野生型感染と比較した、群内の感染した対象の数の減少、感染の臨床徴候を示す対象の数の減少もしくは排除、または１または複数の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度の低下を意味する。例えば、病原体負荷量の減少、病原体の排出、病原体の伝染の減少、またはマラリアの任意の症候性の臨床徴候の減少のいずれかを指すべきである。好ましくは、本発明の治療用組成物を受けた１またはそれ以上の対象において、組成物を受けておらず感染する対象と比較して、これらの臨床徴候が少なくとも１０％減少する。より好ましくは、本発明の組成物を受けた対象において臨床徴候が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％減少する。
【００９６】
本明細書では、用語「防御の増大」は、限定はされないが、ワクチン接種された対象の群における感染因子による感染に付随する１つまたは複数の臨床症状が、ワクチン接種されていない対象の対照群に対して統計的に優位に減少することを意味する。用語「統計的に有意な臨床症状の減少」は、限定はされないが、感染因子によるチャレンジ後に、ワクチン接種された対象の群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、さらにより好ましくは５０％、およびさらにより好ましくは７０％低いことを意味する。
「長期にわたる防御」は、少なくとも３週間、より好ましくは少なくとも３ヵ月、なおより好ましくは少なくとも６ヵ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
【００９７】
ウイルスによって誘導される、用語「ウイルス血症の減少」は、限定はされないが、動物の血流に入るウイルスの減少を意味し、ウイルス血症のレベル、すなわち血清ｍＬ当たりのウイルスＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数または血清デシリットル当たりのプラーク形成コロニーの数が、組成物を受けておらず、感染し得る動物と比較して少なくとも５０％、本発明の組成物を受けた動物の血清中で減少する。より好ましくは、ウイルス血症レベルは、本発明の組成物を受けた動物で、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９９９％減少する。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス血症」は、動物、特に哺乳動物、トリ、または昆虫の血流中でウイルス粒子が複製および／または循環する状態として特に理解される。
【００９８】
「安全性」は、ワクチン接種された動物において、ワクチン接種後に、限定はされないが、ウイルスに基づくワクチンの毒性への潜在的な復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に有意な副作用を含む、有害な結果が存在しないことを指す。
用語「ワクチン接種（vaccination）」または「ワクチン接種すること（vaccinating）」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
【００９９】
製剤
組成物を投与する対象は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット、を含む動物であることが好ましく、最も好ましくは、哺乳動物はブタである。
本発明の製剤は、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与の形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
【０１００】
処置の方法
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、１用量、２用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヵ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０（上記のウイルス力価を参照）で投与することができる。本発明の特定の態様では、特に生ウイルス／生ワクチンに関して、投与量は約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０である。
【０１０１】
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与、好ましくは哺乳動物、特にブタに投与するための指示書が添付されていてよい。そのような容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で通知され、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映している。
【０１０２】
シーケンス概要：
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
プロモーター：
配列番号１  ＥＨＶ−４  ６００ｂｐ  デオキシリボ核酸配列  ４ｐｇＧ６００
配列番号２  ＥＨＶ−４  ６００ｂｐ  デオキシリボ核酸配列  ４ｐＭＣＰ６００
配列番号３  ＥＨＶ−４  ４３０ｂｐ  デオキシリボ核酸配列  ｐＧ４３０
配列番号４  ＥＨＶ−４  ４４９ｂｐ  デオキシリボ核酸配列  ｐ４５５
配列番号５  ｏｒｆ７２に特異的なプライマー番号１１３０
配列番号６  ｏｒｆ７２に特異的なプライマー番号１１３１
配列番号７  ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマー番号１０７９
配列番号８  ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマー番号１０８０
【０１０３】
挿入部位：
配列番号９  ｏｒｆ７０挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１０１７
配列番号１０  ｏｒｆ７０挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１０１８
配列番号１１  ｏｒｆ１／３挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１００７
配列番号１２  ｏｒｆ１／３挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１００８
配列番号１３  左（Ｕｐ７０）隣接領域（４１７ｂｐ）
配列番号１４  右（Ｕｐ７１）隣接領域（４３１ｂｐ）
配列番号１５  ヌクレオチド１２７２６４〜１２７６８０に位置する、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）の隣接領域左（ｏｒｆ７０上流）
配列番号１６  ヌクレオチド１２８４８４〜１２８９１３に位置する、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）の隣接領域右（ｏｒｆ７１上流）
配列番号１７  ＲＥＤシステムにおけるトランケートした隣接領域：左（Ｕｐ７０）隣接領域（２８３ｂｐ）＝４１７ｂｐの「クラシカルな」隣接領域の３’の２８３ｂｐと同一
配列番号１８  ＲＥＤシステムにおけるトランケートした隣接領域：右（Ｕｐ７１）隣接領域（１４４ｂｐ）＝４３１ｂｐの「クラシカルな」隣接領域の５’の１４４ｂｐと同一
配列番号１９  野生型ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）ゲノム配列の欠損部分、ヌクレオチド１２７６８１〜１２８４８２
配列番号２０  ＲａｃＨゲノム配列の欠損部分（完全なゲノム配列が公知ではないため、ヌクレオチド番号が入手できない）
【０１０４】
プラスミド／ベクター配列：
配列番号２１  トランスファープラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨのヌクレオチド配列
配列番号２２  トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
配列番号２３  トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
配列番号２４  トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
配列番号２５  トランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
【０１０５】
ヘマグルチニン配列
配列番号２６  ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２））］  ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＲ０１７４６．１  Ｈ１ｐｄｍ
配列番号２７  ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））］  ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＳ５０３０２．２  Ｈ３：
配列番号２８  ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））］ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＲ７６６２３．１  Ｈ１ａｖ：
配列番号２９  ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２））］ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＫ９８４７６．１*  Ｈ１ｈｕ
*アミノ酸５３１（Ｘ、終止コドンは、発明者らによってＩに変更された）に注意されたい
【０１０６】
ＳＢＶ構築物の配列
配列番号３０  ＧＳリンカー配列
配列番号３１  サブクローニングのための制限酵素部位を含む合成ＤＮＡ配列
配列番号３２  ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃを生成するＲＥＤ組換えに使用されるＤＮＡ断片
配列番号３３  ｕｐ７０  Ｆ  プライマー
配列番号３４  ｕｐ７１  Ｒ  プライマー
配列番号３５  ｓｅｑ４５５−Ｆ１  プライマー
配列番号３６  ＳＢＶ  Ｇｃ  Ｆ１  プライマー
配列番号３７  ＳＢＶ  Ｇｃ  Ｒ１  プライマー
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組合せて参照することによってよりよく理解することができる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は本発明の実施において十分に機能することを本発明者らが発見した代表的な技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【０１０８】
（実施例１）
新しいプロモーターの同定および構築
適切なプロモーター配列を同定する戦略は以下の通りであった：２つの公知のｏｒｆの上流のＥＨＶ−４配列の６００ｂｐ断片が、それらをＥＨＶ−１ゲノムのそれぞれの配列断片とアラインすることによってまず分析された。選ばれた遺伝子は主キャプシドタンパク質（ＭＣＰ）をコードするｏｒｆ４２、糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）をコードするｏｒｆ７０であった。主キャプシドタンパク質は、ビリオンの最も豊富な構成成分の１つであり、新しく合成されたウイルスＤＮＡのパッケージングの準備ができるとすぐに細胞核でのキャプシドのアセンブリーに必要とされる。したがって、そのプロモーターは、ウイルス複製サイクルの初期および後期に活性であると予測される。糖タンパク質Ｇに関して、その遺伝子（ｏｒｆ７０）も複製サイクルの初期および後期に活性であることが公知である（Colle et al. 1995, Drummer et al. 1998）。配列同一性は、推定のＭＣＰプロモーターでは８２．２％であり、推定のｇＧプロモーターでは８２．３％であった。これらの違いは、一方では相同組換えを防ぐのに十分大きく、他方ではＥＨＶ−１複製中に転写活性化を可能にするのに十分小さいと考えられた。プロモーター活性を試験するため、６００ｂｐのＤＮＡ断片４ｐｇＧ６００
【化１】
2019533438.tif 000002
および４ｐＭＣＰ６００
【化２】
2019533438.tif 000003
が合成され、自己蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙをコードするレポーター遺伝子の上流にクローニングされた（Shaner et al., 2004）。転写終結シグナルおよびｍＲＮＡ安定化機能として、ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ；Goodwin & Rottman, 1992）が、レポーター遺伝子の３’端のすぐ下流にクローニングされた。
【０１０９】
陽性対照として使用されるように、ＣＭＶプロモーターは市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅され、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の上流にクローニングされ、ここでＢＧＨｐＡもレポーター遺伝子の３’端に付加された。細胞培養は、３つのプラスミド（ｐＢｌｕ−４ｐｇＧｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢｌｕ−４ｐＭＣＰｍＣｈｅｒｒｙ、およびｐＢｌｕ−ＣＭＶｍＣｈｅｒｒｙ）をトランスフェクトされ、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が蛍光顕微鏡によって検査された。ＣＭＶプロモーターの強い活性は、トランフェクション後の異なる時間で明らかであった。４ｐｇＧ６００プロモーターはトランスフェクション後も活性であり、４ｐＭＣＰ６００プロモーターの活性も検出可能であったが、４ｐｇＧ６００プロモーターと比較して弱く、トランスフェクションの３日後のＣＭＶプロモーターと比較した場合でさえ、さらにより弱かった。
【０１１０】
プロモーター活性へのウイルス遺伝子産物の効果を調べるため、ｐＢｌｕ−４ｐｇＧ６００−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｐＢｌｕ−４ｐＭＣＰ６００−ｍＣｈｅｒｒｙのいずれかをトランスフェクトされた細胞培養には、トランスフェクション１日後に緑色蛍光ＥＨＶ−１  ＲａｃＨＩ−ＥＦを重感染させた。ウイルス遺伝子産物は、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨＩ−ＥＦ複製がないよりも著しく高い活性まで、４ｐＭＣＰ６００プロモーターを明らかにトランス活性化した。ウイルス複製がない最初の活性がｐＢｌｕ−４ｐＭＣＰ６００−ｍＣｈｅｒｒｙで観察されたよりも高かったためそれほど劇的ではないにしても、ｐＢｌｕ−４ｐｇＧ６００−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトされ、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨＩ−ＥＦを重感染させた細胞培養においても効果は存在した。さらに、両方の６００ｂｐのプロモーターについて、細胞培養のそれらの活性へのウイルス複製のトランス活性化効果が実証された。
【０１１１】
この効果は、６００ｂｐの配列が、通常活性化エレメントの上流に位置する抑制エレメントを含有する場合に説明され得る。続いて、より短いプロモーターは、ウイルス遺伝子産物の非存在下でより活性であり得る。この両方のＥＨＶ−４プロモーターを試験するため、配列はそれらの元々の長さのおよそ７５％にトランケートされ、再び試験された。
【０１１２】
特に、６００ｂｐのプロモーターは、４３０ｂｐの４ｐｇＧ、新しい名称：ｐ４３０：
【化３】
2019533438.tif 000004
および４４９ｂｐの４ｐＭＣＰ、新しい名称：ｐ４５５：
【化４】
2019533438.tif 000005
にトランケートされた。
短くなったプロモーターを含有するｍＣｈｅｒｒｙレポータープラスミドが細胞培養にトランスフェクトされ、蛍光顕微鏡によって調べられた。ｐ４３０活性は、６００ｂｐバージョン（４ｐｇＧ６００）のものに相当したが、ｐ４５５の活性は４ｐＭＣＰ６００の活性よりも著しく増大された。この結果は、２つのプロモーターの６００ｂｐバージョンを使用するトランスフェクション／重感染実験の結果と一致し、つまり、同じ細胞におけるＥＨＶ−１複製の存在が、４ｐＭＣＰ６００プロモーターのトランス活性化のメカニズムを提供し、その活性を強く増大させるが、４ｐｇＧ６００プロモーターのトランス活性化は見られたが明白ではなかった。
【０１１３】
２つの新しいプロモーターに加えて、新しいポリＡ配列も新しいｏｒｆ７０挿入部位からの発現に必要とされた。エレメントは、７１ｐＡと呼ばれる。そのヌクレオチド配列は合成され、ｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０挿入部位を標的とするｐ４５５を含有するトランスファープラスミドのｍＣｈｅｒｒｙ  ｏｒｆの下流にクローニングされた。
【０１１４】
次いで、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥが生成され、ウイルス複製の背景でのプロモーター活性をアッセイした（表１）。２つのＥＨＶ−４プロモーター（ｐ４３０およびｐ４５５）、ＣＭＶプロモーター、ならびにマウスサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター（ＭＣＭＶ）が使用され、ＢＧＨポリＡシグナルと組合せてｍＣｈｅｒｒｙの発現を導き、ｍＲＮＡの安定性を増大させた。Dorsch-Hasler et al. (1985)に記載されるように、ＭＣＭＶ  ＩＥ１プロモーター（エンハンサー）は合成され、プラスミドベクターにクローニングされ、そこからトランスファープラスミドにサブクローニングされた。さらに、ｐ４５５も、新しいポリＡシグナル７１ｐＡと組合せてｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するｏｒｆ７０の新しい挿入部位にクローニングされた。別の対照として、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨｍＣ７０が実験に含まれた。この組換えウイルスを感染させた細胞は、内在性ｇＧプロモーター（ｅｇＧｐ）の制御下でｍＣｈｅｒｒｙを発現する（表１）。
【表１】
2019533438.tif 000006
【０１１５】
ＶＥＲＯまたはＰＫ／ＷＲＬ細胞は、６つのｍＣｈｅｒｒｙ発現ウイルス全てをｍ．ｏ．ｉ．  １で感染させた。感染細胞は、感染後、０、４、８、および１２時間で回収され、全ＲＮＡが調製された。ＲＮＡ調製物にコンタミネートしているウイルスおよび細胞ゲノムＤＮＡはＤＮＡｓｅ  Ｉ消化によって破壊された。ＲＮＡの完全性およびウイルスＤＮＡの除去は、逆転写酵素の添加有りおよび無しでの逆転写に続いてＥＨＶ−１の基本構造の糖タンパク質Ｄをコードするｏｒｆ７２に特異的なプライマー対（プライマー番号１１３０／１１３１、（ＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧ（配列番号５）／ＣＴＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＧ（配列番号６））によるＰＣＲによって示された。予測される１９６ｂｐのＰＣＲ産物は、逆転写酵素が添加された逆転写された試料（ｃＤＮＡ）、特にｔ１＝感染後４時間、ｔ２＝感染後８時間、およびｔ３＝感染後１２時間で調製された試料からのみ増幅され、ｔ０＝感染後０時間で調製された試料からは増幅されなかった。反応に逆転写酵素が添加されなかった全ての試料は、予測されるいずれのＰＣＲ産物も産生しなかった。したがって、ｑＰＣＲの鋳型として使用される試料（ｃＤＮＡ）はウイルスのゲノムＤＮＡを含有しなかったことが示された。
【０１１６】
添加した酵素による逆転写から得られたｃＤＮＡは、次いで、ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマー対（プライマー番号１０７９／１０８０、（ＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧ（配列番号７）／ＡＣＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧ（配列番号８））およびｏｒｆ７２プライマー対１１３０／１１３１（ＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧ（配列番号５）／ＣＴＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＧ（配列番号６））を使用するｑＰＣＲによって分析された。ｏｒｆ７２  ｑＰＣＲのＣｔ値は、並行する異なるウイルス感染の比較性を評価し、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｑＰＣＲのＣｔ値をノーマライズするために使用された。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙの転写は感染後の時間および異なるウイルスに対して定量された（図３）。
【０１１７】
図３の左のグラフに示すように、ｏｒｆ７２転写物のＣｔ値は、感染後４つの異なる時間での、６つの異なるウイルスでほぼ同一であった。理想的には、６つのウイルス全てが調べた時間で同一の値を出し、１つの線だけが見られる。線がほぼ同一であることから、実験の十分な質が確認され、また感染後１２時間の時点での結果は、感染後８時間と比較した場合の減少が、複製がその最大を通過していない場合にのみ可能である転写物の数のさらなる増加を示すため、妥当である。感染後の各時間の統計的な平均が算出された。特定の時間での各ウイルスの値はその時間で算出された平均によって割られ、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｑＰＣＲのＣｔ値がそれらを直接比較可能にするためにそれによってノーマライズされた因子として使用された。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｑＰＣＲのノーマライズされた視覚的にＣｔ値は図３の右のグラフに示される。線の相違は、異なるウイルス感染細胞で産生されたｍＣｈｅｒｒｙ転写物の数の違いを示す。
【０１１８】
異なる型のグラフに、１つはＶＥＲＯ−ＥＵ細胞（Ｖ）を使用し、１つはＰＫ／ＷＲＬ細胞（Ｐ）を使用する２つの実験を合わせた（図４）。ＲＮＡ調製物の質および経時的なウイルス複製は、上記のように、逆転写酵素有りまたは無しでの逆転写に続いてｏｒｆ７２プライマーによるＰＣＲによって確認された。ｍＣｈｅｒｒｙの得られたｑＰＣＲ  Ｃｔ値は、ｏｒｆ７２のｑＰＣＲ  Ｃｔ値に基づいて上記のようにノーマライズされた。ｔ１＝感染後４時間、ｔ２＝感染後８時間、およびｔ３＝感染後１２時間のノーマライズされたＣｔ値を、ｔ０でのノーマライズされたＣｔ値から引く（ΔノーマライズされたＣｔ）と、転写活性と正の相関を示した。
ＶＥＲＯ（Ｖ）またはＰＫ／ＷＲＬ（Ｐ）細胞での２つの実験は直接比較できないが、ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのより高い発現レベルは、通常感染性ウイルスの１０倍高い力価を生じるＥＨＶ−１複製のためのＰＫ／ＷＲＬ細胞の優れた許容度を最も反映するようである。
ＥＨＶ−由来プロモーターｐ４３０、ｐ４５５およびｅｇＧｐの活性は、使用した細胞株の感染後の各時間でほぼ同じであり、それらの挿入部位または使用したポリＡ（ＢＧＨまたは７１ｐＡ）とは無関係であり、ＣＭＶ−およびＭＣＭＶプロモーターの活性はＰＫ／ＷＲＬ細胞でより高い。ＶＥＲＯ−ＥＵ細胞では、ＭＣＭＶプロモーターのみがより高い活性を持つことが示され、ＣＭＶプロモーターはＥＨＶ−プロモーターよりも優れていなかった。
これらの実験から、ＥＨＶ−４プロモーターｐ４３０およびｐ４５５は、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨ骨格で使用され、ｏｒｆ１／３およびｏｒｆ７０挿入部位の両方から、挿入された導入遺伝子の発現を駆動するのに適していたと結論づけられた。
【０１１９】
（実施例２）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新しいｐ４５５プロモーターの使用
ｐ４５５プロモーター
最初の動物実験のため、ブタ起源Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＢＳ５０３０２．２）由来のインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型が使用された。そのコード配列は合成およびサブクローニングされて、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１を生成し、Ｈ３を新しいｐ４５５プロモーターおよび新しい７１ｐＡポリアデニル化シグナルの調節下に置き、ｏｒｆ７０への挿入のための組換え領域を有するカセットをフレーム調整した（図５）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって（Tischer et al. 2006）、発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１がｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３が生成された（図６）。
【０１２０】
ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法によって分析された（ＩＦＡ、図７）。
【０１２１】
ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７０の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡ（データは示さない）およびウェスタンブロット（図８）によって確認された。感染細胞の細胞膜上のＨ３の三量体の出現は、トリの赤血球（erythrozytes）を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのＴＣＩＤ50／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たないことを示している（データは示さない）。これは、ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３のレスキュー後２０回までの継代（Ｐ２０）によって確認された。Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５、およびＰ２０で、ウイルスは、力価測定、シーケンシング、およびウェスタンブロット（図８）によって、Ｐ１０およびＰ２０で、さらにＩＦＡによって特徴づけられ、ＨＡ発現、ならびにＨＡをコードするインサート、およびプロモーターおよびポリＡ配列の遺伝的安定性が確認された。
【０１２２】
図８に示した２つのブロットは、ＥＨＶ−１糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）を特異的に検出するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（左）またはインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型に対するウサギ由来の市販のポリクローナル抗体（ＰＡ５−３４９３０）（右）のいずれかとインキュベートされたレプリカである。ｇｐＩＩは、予測されたように、組換えＥＨＶ−１を感染させた全ての細胞培養において検出された。全長Ｈ３は、予測されたように、異なる継代のｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた全ての細胞で検出された。Ｈ３−抗血清の特異性は、同じウェスタンブロットで示され、レーンｇＧ４３０ｍＣを参照。ここで、予測されたように、ｇｐＩＩ  ｍａｂのみが反応を起こしたが、抗Ｈ３抗体はそれぞれのレプリカレーンでは結合しなかった。
【０１２３】
モノクローナル抗Ｈ３抗体およびウマ抗ＥＨＶ抗血清を使用するＰ２０を感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光法（ｄＩＦＡ）によって、事実上全てのＥＨＶ−１誘導プラークがＨ３も発現することが確認された（データは示さない）。全ての試験により、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３の安定性が確認された。
【０１２４】
（実施例３）
ｐ４５５プロモーターおよび血清学的応答の評価を使用する動物実験の概念の証明（ＰＯＣ  Ｉ）
試験動物：組入れ基準および実験デザイン
Ａ型インフルエンザ無感作の雌ブタから生まれた１０匹の子ブタの５つの群が、表２に要約したようにＰＯＣ−Ｉ実験に含まれた。
【０１２５】
【表２】
2019533438.tif 000007
【０１２６】
感染量１×１０7  ＴＣＩＤ５０のｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＥＨＶ−１）が、５週齢で１回または２および５週齢で２回のいずれかで適用された。比較のため、市販の不活性化ワクチン（Ｉｎａｃｔ）は２および５週齢で２回適用された。全ての子ブタは、不活性化ワクチン（Ｉｎａｃｔ）の効果を消失させないため、母系由来抗体がなかった。２つの群はワクチン接種されないが、それぞれチャレンジ対照または厳密な陰性対照として寄与する生理的食塩水（ＮａＣｌ）の注入を受けた。２回目のワクチン接種の２１日後、厳密な陰性対照群を除く全ての群は、１×１０7  ＴＣＩＤ50の異種Ａ型インフルエンザ（ＩＶＡ）株（ブタ由来Ｈ３Ｎ２  Ａ型インフルエンザウイルス  Ｒ４５２−１４、ＢＩに所有されるチャレンジ単離株）によってチャレンジされた。非ワクチン接種のチャレンジ対照群（Ｃｈａｌｌ  ｃｔｒｌ）では、全てのブタは、チャレンジ感染後１および３日で肺に高いインフルエンザウイルス力価を有するが、厳密な陰性対照群（ｎｅｇ  ｃｔｒｌ）およびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種された群（ＥＨＶ  ２×）の全てのブタは、両方の日にＩＶＡが陰性であった。不活性化対照ワクチンによって２回ワクチン接種された群（Ｉｎａｃｔ  ２×）では、５匹中１匹の動物がチャレンジ３日後に低いＩＶＡ力価を有した。ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３によるチャレンジの２１日前に１回ワクチン接種された群（ＥＨＶ  １×）では、５匹中２匹の動物が、チャレンジ感染の１日後に肺に低いＩＶＡ力価を有し、５匹中１匹がチャレンジの３日後に肺に低いＩＶＡ力価を有した（図９）。
１×１０7  ＴＣＩＤ５０のｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による２回のワクチン接種は、異種ＩＡＶ、Ｈ３Ｎ２亜型によるチャレンジ感染に対してブタを完全に保護した。
ＥＨＶ−１ベクターＲａｃＨ−ＳＥがブタのワクチン接種に適しており、新しいプロモーター４５５が、ワクチン接種したブタにおいてＩＡＶヘマグルチニンの免疫原性発現の駆動に機能的であることが実証された。
【０１２７】
（実施例４）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新しいｐ４３０プロモーターの使用
ｐ４３０プロモーター
新しく同定されたｐ４３０プロモーターは、Ｈ１Ｎ１ウイルス（（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＲ７６６２３．１）由来の別のインフルエンザヘマグルチニンの発現を駆動するために使用された。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子はトリＩＡＶに由来するため、Ｈ１ａｖと呼ばれる。Ｈ１ａｖは合成、およびトランスファーベクターのｏｒｆ１／３挿入領域にサブクローニングされ、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨを生成した。Ｈ１ａｖの発現は、ｐ４３０プロモーターおよびウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置かれた（図１０）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって（Tischer et al. 2006）、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨはｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ１／３に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖが生成された（図１１）。
【０１２８】
ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖをトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖがレスキューされ、２回プラーク精製された。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用する間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）およびウェスタンブロットによって分析された（図１２）。
ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡおよびウェスタンブロットによって確認された（データは示さない）。Ｈ１ａｖの正確なプロセシングおよび輸送、ならびに感染細胞の細胞膜上の局在は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ５０／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している（データは示さない）。
抗体ＰＡ−３４９２９によって７５ｋＤａの広帯域の移動の特異的検出は、その配列から予測されるように、組換えＨＡ糖タンパク質の予測される出現と一致する。モノクローナル抗体Ｃ１０２による細胞膜の明らかな染色は、予測される細胞内局在に則している（図１２）。
【０１２９】
発現された組換えヘマグルチニンが予測されるようにプロセシングおよび輸送されたかどうか試験するため、ＶＥＲＯ細胞は０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ（親）を感染させ、または非感染のままおいた。感染の２４時間後、生きた感染細胞および非感染細胞は、ＰＢＳ中のトリの赤血球の懸濁液とインキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色によって染色された。トリの赤血球は細胞核を含有するため、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって染色することができ、蛍光顕微鏡によって小さな青いスペックとして現れる。ヘマグルチニンを発現しないｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞と比較して、トリの赤血球の吸着は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖまたはｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のいずれかを感染させた細胞上で著しく増加した（データは示さない）。このことから、真正のインフルエンザウイルス感染によって産生されたかのような様式で、ヘマグルチニンが翻訳され、プロセシングされ、ベクターウイルス感染細胞の細胞膜に輸送されたと結論づけることができる。
感染細胞の赤血球吸着の明確な表現型は、導入遺伝子タンパク質の効果的な発現を示し、ＥＨＶ−１ベクター感染細胞の細胞表面上の機能的ＨＡ三量体の形成を示唆するウェスタンブロットおよび免疫蛍光法による知見を支持する。
【０１３０】
（実施例５）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンにおける並行する２つの挿入部位での２つの新しいプロモーターｐ４５５およびｐ４３０の使用
２つの新しいプロモーターが並行して使用され得ることを示すため、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨは２つの異なるＡ型インフルエンザウイルス亜型の２つの異なるヘマグルチニンを発現するように生成された。
Ｈ３（ＰＡ５−３４９３０）およびＨ１（ＰＡ５−３４９２９）に対する市販のポリクローナル抗体の交差反応性の特異性および欠如は、単一インサートウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３およびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって確かめられた（データは示さない）。
【０１３１】
組換えＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で開始して、トランスファーベクターｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨ（図１０）にアセンブルされた発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨは、２ステップＲＥＤ組換えによってｏｒｆ１／３挿入部位に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を生成した。ＰＫ／ＷＲＬ細胞はｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された（図１３）。
【０１３２】
この組換えウイルスの略称は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂである。発現カセットの正しい挿入は、隣接する配列とともに挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞における導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、データは示さない）ならびに市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図１４）によって分析された。ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復はＩＦＡ（データは示さない）およびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するウェスタンブロット（図１４）によって確かめられた。
図１４に示されるように、導入遺伝子Ｈ３とＨ１ａｖの両方は、二重インサート組換えｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（Ｂ）を感染させた細胞培養中で並行して発現された。導入遺伝子発現は安定であり、ＰＫ／ＷＲＬ細胞の継代１１回まで試験されたウイルス力価を損なわなかった（データは示さない）。
【０１３３】
２つの新しいプロモーターｐ４３０およびｐ４５５は、細胞培養のｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ複製に関しては機能的であることが示された。ウイルス複製サイクル中の活性レベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロモーター動態実験から推測されたものと非常に類似しているようである。これらの特性は、類似の効率で並行して２つの異なる抗原を発現するＥＨＶ−１  ＲａｃＨまたは他のベクタープラットフォームに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチンの標的が２つの異なる病原体からなる場合、２つのポリアデニル化配列と組合せた２つの挿入部位における２つの新しいプロモーターの適用は、グッズの費用を著しく削減することができ、１つの抗原成分のみを発現するベクターに明らかな利点を提示する。
【０１３４】
（実施例６）
新しいｐ４５５およびｐ４３０プロモーターを使用するｒＣＡＶ−２ベクターワクチン
方法
以下のｒＣＡＶ−２を感染させたＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞
１．ＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＢＲＳＶ（抗ＣＡＶ２の陽性対照；抗ＶＰ２の陰性対照）
２．ＣＡＶ−２  ｐ４３０  ＣＰＶ  ＶＰ２（非スプライシング  Ａ１−２−１）
３．ＣＡＶ−２  ｐ４３０  ＣＰＶ  ＶＰ２（Ｇｅｎ  ０．９５  Ｄ１−５−１）
４．ＣＡＶ−２  ｐ４５５  ＣＰＶ  ＶＰ２（Ｇｅｎ０．９５  Ｅ１−８−１）
５．ＣＡＶ−２  ｐ４３０  ＲａｂＧ  （ｎ）
６．ＣＡＶ−２  ｐ４５５  ＲａｂＧ  （ｎ）
免疫蛍光分析（ＩＦＡ）
ＡＩ−ＳＴ２０１５細胞は、感染の７２時間後にＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍにより固定され、抗ＣＰＶ  ＶＰ２−ＦＩＴＣ（ｍＡｂ）、抗ＲａｂＧ−ＦＩＴＣ（ｍＡｂ）および抗ＣＡＶ−２−ＦＩＴＣ（ブタ抗血清）（ＶＭＲＤ）によって染色される。
【０１３５】
フローサイトメトリー（ＦＣ）
ＡＩ−ＳＴ２０１５細胞は、感染の４８および７２時間後にＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍにより固定され、細胞は抗ＣＡＶ−２−ＦＩＴＣ、抗ＣＰＶ  ＶＰ２−ＦＩＴＣ（ＶＭＲＤ）、ＣＰＶに対するブタ高度免疫血清（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）および抗ＲａｂＧ−ＦＩＴＣ（Ｎｏｖｕｓ）によって染色される。
ＣＰＶ  ＶＰ２のドットブロット
感染Ｅ１Ｂ  ＭＤＣＫ（ｒＣＡＶ−２の）細胞由来の澄ませた（６０００×ｇ、５分）組織培養上澄み液／ライセート（凍結／解凍）は、装置への添加前にＰＢＳによって段階希釈され、吸引によってＰＶＤＦに吸着される。次のステップは、ＴＢＳＴ中の５．０％  ＢｉｏＲａｄ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒに３０分暴露され、一次抗体に１．０時間暴露され、ＴＢＳＴで３回洗浄され、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート二次抗体（抗マウスおよび抗ブタ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に１．０時間暴露され、ＴＭＢによって可視化される。定量のため、ドットブロットは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析される（Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York）。画像カラーは、反転されてバックグラウンドを引き、記録された各ドットの密度を統合される。値は、以下のように＋および−表記で割り当てられる：「＋＋＋＋」＝＞８０００００、「＋＋＋」＝５０００００〜８０００００、「＋＋」＝３０００００〜４９９９９９、「＋」＝１２００００〜２９９９９９、「＋／−」＝８００００〜１１９９９９、および「−」＝＜８００００。
【０１３６】
ＣＡＶ−２  ＶＰ２構築物：
ｒＣＡＶ−２ワクチンウイルス感染細胞によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成は、イヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２）ワクチン効率に重要な因子であり得る。ＣＭＶｉｅ−駆動ＣＰＶ  ＶＰ２発現カセットを含有するｒＣＡＶ−２はレスキューされ得るが、ｒＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＣＰＶ  ＶＰ２感染細胞での実質的なＶＰ２発現（ＶＬＰ生成のため）は、従来のＣＭＶｉｅプロモーターを使用して達成できなかった。ＣＭＶ５プロモーターを含有するｒＣＡＶ−２  ＶＰ２ウイルスはレスキューできなかった。
【０１３７】
ＩＦＡ、フローサイトメトリーおよびドットブロットは、ｒＣＡＶ−２感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞におけるＣＰＶ  ＶＰ２のＥＨＶ−４プロモーター駆動発現を評価するために用いられた。ＣＡＶ−２タンパク質発現は、抗ＣＡＶ−２  ＦＩＴＣコンジュゲートブタポリクローナル抗体（ＶＭＲＤ）によってプローブされた。ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質発現は、マウスモノクローナル（ＶＭＲＤ）およびブタ高度免疫血清（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）によってプローブされた。ＣＡＶ−２およびＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質は、ＣＰＶ  ＶＰ２の２つの異なるヌクレオチド変異を有するｒＣＡＶ−２を感染させたＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞のかなりの割合において、ＩＦＡによって容易に可視化され、ＦＣによって検出される（ＤｅｓｐｌおよびＧｅｎ０．９５、感染後４８時間および７２時間）。かなりのＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質が、ドットブロットによって組織培養上澄み液／ライセート（凍結／解凍後）で同定された（アセンブルしたＶＬＰの存在を非常に反映しているようである）。
【０１３８】
感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞におけるＣＰＶ  ＶＰ２発現は、ＩＦＡによって容易に検出された（図１９Ａ参照）。ＣＰＶ  ＶＰ２発現は元々のｒＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＣＰＶ  ＶＰ２を感染させた細胞の３％より少なく検出された（図１５参照）。したがって、新しいＥＨＶ４由来プロモーターｐ４３０およびｐ４５５によって駆動されるＣＰＶ  ＶＰ２発現カセットを有するｒＣＡＶ−２がレスキューされ、感染細胞においてＣＰＶ  ＶＰ２の発現を効果的に駆動できたかどうか決定するために試験された。驚くべきことに、ＣＰＶ  ＶＰ２発現は感染細胞の１４％〜３６％で検出された（図１６参照）。さらに、および元々のｒＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＣＰＶ  ＶＰ２と対照的に（ここで、ドットブロット分析はＣＭＶｉｅ駆動ＣＰＶ  ＶＰ２シグナルがバックグラウンドレベルかまたはそれ以下であることを示した−ＣＡＶ−２、ｒＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＢＲＳＶ  Ｆ感染細胞の上澄み液／ライセートおよび非感染細胞の細胞培養上澄み液／ライセートに匹敵する−データは示さない）、豊富な量のＣＰＶ  ＶＰ２が感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞の上澄み液／ライセートで検出される（図１７参照）。図１７は、ＶＰ２タンパク質が上澄み液中で認識され得ることを示し、したがって、免疫原性に必要な構造（ＶＬＰ）であると予測される。重要なことに、ＣＡＧまたはＣＭＶ５プロモーター配列のいずれかがＥ３領域に位置する発現カセットに存在した場合、組換えＣＡＶ−２のレスキューは達成されなかった。発現カセットのサイズが、観察された実験のゲノムサイズ制限を超えないため、これは配列特異的であるようである。したがって、本発明の新しいＥＨＶ−４由来プロモーター配列、例えばｐ４３０およびｐ４５５は、導入遺伝子の発現を促進するだけでなく、ウイルスレスキューの重要なステップも支持する。
結論として、ＩＦＡ、ＦＣおよびドットブロットは、感染ＡＩ  ＳＴ  ２０１５細胞におけるｒＣＡＶ−２によるＣＰＶ−ＶＰ２導入遺伝子の強いＥＨＶ−４プロモーター駆動発現を実証する。これらの結果は、ＥＨＶ−１以外のベクターにおけるＥＨＶ−４プロモーターの有用性を確認する。
【０１３９】
ｒＣＡＶ−２  ＲａｂＧ（ｎ）構築物：
第２のＣＡＶ−２構築物は、本発明の新しいＥＨＶ−４由来ｐ４５５プロモーターを使用して生成された。感染細胞による発現が従来のＣＭＶｉｅプロモーターを使用して観察されなかったため、ｒＣＡＶ−２  ＲａｂＧ（ｎ）が選択された。
この実験の目的は、ｒＣＡＶ−２  ｐ４５５  ＲａｂＧ（ｎ）−感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞によるＥＨＶ−４プロモーター駆動ＲａｂＧタンパク質発現の測定によって、第２の導入遺伝子、ＲａｂＧ（膜タンパク質）を有するｒＣＡＶ−２に関して新しいＥＨＶ−４プロモーターの活性を確認することであった。
【０１４０】
ＩＦＡおよびフローサイトメトリーは、ｒＣＡＶ−２感染ＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞におけるＲａｂＧのＥＨＶ−４プロモーター駆動発現を評価するために用いられた。ＣＡＶ−２タンパク質発現は、抗ＣＡＶ−２  ＦＩＴＣコンジュゲートブタポリクローナル抗体（ＶＭＲＤ）によってプローブされた。ＲａｂＧタンパク質発現は、マウスモノクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ）によってプローブされた。ＣＡＶ−２およびＲａｂＧタンパク質は、ＲａｂＧ（ｎ）を有するｒＣＡＶ−２を感染させたＡＩ−ＳＴ  ２０１５細胞において、ＩＦＡによって容易に可視化され、ＦＣによって検出される（感染後７２時間で）。
【０１４１】
結果として：ｒＣＡＶ−２  ｐ４５５  ＲａｂＧを感染させた細胞においてＲａｂＧは容易に検出されるが（図１９Ｂおよび図１９Ｃ参照）、発現は、元々のｒＣＡＶ−２  ＣＭＶｉｅ  ＲａｂＧを感染させた細胞の＜２．０％で検出される（図１８参照）。関連のない導入遺伝子を有するｒＣＡＶ−２を感染させた細胞では、最小のシグナルからシグナル無しが見られる（図１９Ｂ参照、抗ＲａｂＧ抗体と関連しないＣＰＶ  ＶＰ２）。図１９Ｃの二重染色で見られるように、多くのＣＡＶ−２陽性細胞がＲａｂＧにも陽性である。
結論として、ＩＦＡおよびＦＣデータは、感染ＡＩ  ＳＴ細胞によるｒＣＡＶ−２によるＲａｂＧ導入遺伝子のＥＨＶ−４プロモーター駆動発現を実証する。これらの結果は、ＥＨＶ−１以外のベクターにおける本発明のＥＨＶ−４プロモーターの有用性をさらに確認する。
【０１４２】
（実施例７）
ブタのための一価のＥＨＶ−１ベクターＡ型インフルエンザウイルスワクチン（Ｈ３ワクチン）の生成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定、およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験
血清型Ｈ３のブタＩＡＶインフルエンザウイルスヘマグルチニン（配列番号２７）（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＢＳ５０３０２．２）が、ブタのワクチン研究のために試験される抗原として選ばれた。ブタＩＡＶに対するこの新しいワクチンは、１つのブタＩＡＶ  ＨＡタンパク質のみを発現するため、例えば、ブタＩＡＶ野外株に感染した動物ではブタＩＡＶタンパク質ＮＰまたはＮＡに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンによってのみワクチン接種された動物では検出されないことによってＤＩＶＡ特性を提供する。そのコード配列は、合成およびサブクローニングされ、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１を生成し、Ｈ３は新しいｐ４５５プロモーター、および新しい７１ｐＡポリアデニル化シグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ７０への挿入のための組換え領域によってカセットがフレームに合わされた（図１および図５）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１がｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３が生成された。
ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された（図６）。
【０１４３】
発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、図７）および市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図８）によって分析された。
【０１４４】
ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡ（データは示さない）およびウェスタンブロット（図８）によって確認された。感染細胞の細胞膜上のＨ３の三量体の出現は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ50／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している（データは示さない）。これは、ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３のレスキュー後２０回までの継代（Ｐ２０）によって確認された。Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５、およびＰ２０で、ウイルスは、力価測定、シーケンシング、およびウェスタンブロット（図８）によって、Ｐ１０およびＰ２０で、さらにＩＦＡによって特徴づけられ、ＨＡ発現、ならびにＨＡをコードするインサート、およびプロモーターおよびポリＡ配列の遺伝的安定性が確認された。
【０１４５】
図８に示した２つのブロットは、ＥＨＶ−１糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）を特異的に検出するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（左）またはインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型に対するウサギ由来の市販のポリクローナル抗体（ＰＡ５−３４９３０）（右）のいずれかとインキュベートされたレプリカである。ｇｐＩＩは、予測されたように、組換えＥＨＶ−１を感染させた全ての細胞培養において検出された。全長Ｈ３は、予測されたように、異なる継代のｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた全ての細胞で検出された。Ｈ３−抗血清の特異性は、Ｈ１亜型ウイルス由来のインフルエンザヘマグルチニンを発現する他の組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞のウェスタンブロットによっても示された、図１４。
モノクローナル抗Ｈ３抗体およびウマ抗ＥＨＶ抗血清を使用するＰ２０を感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光法（ｄＩＦＡ）によって、事実上全てのＥＨＶ−１誘導プラークがＨ３も発現することが確認された（データは示さない）。全ての試験により、組換えＥＨＶ−１  Ｒａｃ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３の安定性を確認した。
【０１４６】
若い子ブタにおいてベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３は、ワクチン接種−チャレンジ試験で試験された。詳細には、ブタＩＡＶに対する母系由来免疫がない（移行抗体がない）子ブタは、２および５週齢で、筋肉内に、１×１０7  ＴＣＩＤ５０の用量でＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３によって２回ワクチン接種され（２回ワクチン接種、２×ＥＨＶ−１）、または５週齢のみで接種された（１回ワクチン接種、１×ＥＨＶ−１）。非ワクチン接種群は陰性対照となり、製造業者の指示（ワクチン接種の時点以外）に従って市販の不活性化ブタＩＡＶワクチンによって２および５週齢でワクチン接種された動物の群は陽性対照となる（殺された）。８週齢では、陰性対照以外の全ての動物が、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（Ｈ３がＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で使用されるＨ３ワクチン抗原とは異種性である、ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４）の１×１０7  ＴＣＩＤ５０の投与量の気管内適用によってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照となったが、非ワクチン接種だがチャレンジされた動物はチャレンジ対照となった。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前およびチャレンジ後、体温が測定され、血液試料は異なる時点で採取された。チャレンジ１日後、群当たり半分の動物が殺され、肺のブタＩＡＶ感染に典型的な病変がスコア化され、それぞれ動物当たり左および右肺につき３つの肺試料が採取され、肺ホモジネートの感染性ブタＩＡＶ力価が決定され、気管支肺胞上皮の洗浄液（ＢＡＬＦ）が採取された。チャレンジ３日後の群当たり、動物の残り半分で同じ手順が実施された。
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後の体温上昇を調べる場合、非ワクチン接種動物はチャレンジ１日後に約１℃の体温上昇を示した。ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンにより２回ワクチン接種した群では、チャレンジ１日後のこの体温上昇は防がれた（図２０）。
【０１４７】
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後１または３日で殺された動物からの肺スコアの評価により、陰性対照はブタＩＡＶ感染に典型的な肺の病変を示さず、チャレンジ対照は平均範囲６〜７％の肺の病変を示し、群平均値に関しては、肺病変スコアはＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンによって２回ワクチン接種された群では１〜４％より少なくなるまで強く減少した（図２１）。
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後１または３日で殺された動物からの平均ブタＩＡＶ肺力価は、陰性対照は肺試料においてブタＩＡＶを示さないが、チャレンジ対照は５より多い（３日目）から７ｌｏｇより多い（１日目）範囲の肺組織ｇ当たりのウイルス力価を示すことを示した。全く対照的に、群平均値は、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した群では、約２ｌｏｇまたはそれより少なくなるまで強く減少し、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した群では、検出できないレベルまで減少した（図２２）。
【０１４８】
ワクチン接種後、ブタＩＡＶ中和抗体の誘導を試験する場合、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した動物からの血清は、最初のワクチン接種後３週間で約１６０の範囲の相互中和価を示し、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した動物からの血清は、２回目のワクチン接種後３週間で約２５６０の範囲の中和価を示したが、非ワクチン接種群からの血清は検出可能なブタＩＡＶ中和抗体レベルを有さなかった（図２２）。
【０１４９】
ブタＩＡＶチャレンジ後１または３日の動物からのＢＡＬＦにおける炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの量を決定する場合、最大９００ｐｇ／ｍｌの１００ｐｇ／ｍｌより多くのＩＬ−１βレベルが、１日目に試験された４頭の動物のうち３頭で検出可能であったが、これらのレベルは、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した動物からのＢＡＬＦにおいて１００〜３００ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βに減少し、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した全ての動物において、０〜１００ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βより少ないレベルまでさらに減少した（図２３）。これは、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンによるワクチン接種が、ブタＩＡＶ感染後に炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの誘導を効果的に防いだことを示す。
【０１５０】
試験２８日目に採取された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および異なる刺激を使用する再刺激を試験する場合、非ワクチン接種動物からのＰＢＭＣの刺激は、使用した刺激に関係なく、７５／１×１０6個より少ないＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示した（図２４Ａ）。不活性化ワクチン（死菌）を２回受けた動物のＰＢＭＣは、組換えブタＩＡＶ核タンパク質ＮＰによって再刺激された場合、約１５０／１×１０6個を示し、ブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４によって再刺激された場合には、約３０００／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示したが、組換えブタＩＡＶ  ＨＡまたはＥＨＶ−１ウイルスが使用された場合にはＰＢＭＣの再刺激は示されなかった（７５／１×１０6個のレベルまたはそれ以下）（図２４Ｂ）。対照的に、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回または２回ワクチン接種した動物も、それらがブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４で再刺激された場合、約２００（１×ＥＨＶ−１）〜３００（２×ＥＨＶ−１）／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示したが、組換えブタＩＡＶ  ＮＰが使用された場合、ＰＢＭＣの再刺激はない（７５／１×１０6個のレベルまたはそれ以下）（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）。ＥＨＶ−１ウイルスが再刺激に使用された場合、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回または２回ワクチン接種された動物は、それぞれ、空のＥＨＶ−１ワクチンＲａｃＨ−ＳＥで再刺激された場合、約３００／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示し、この値はブタＩＡＶ  Ｈ３を発現するＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンが使用された場合、４００／１×１０6個より多くまでさらに増加した（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）。したがって、組換えブタＩＡＶ  ＨＡが再刺激に使用された場合、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回または２回ワクチン接種された動物のみが約１００〜１５０（１×ＥＨＶ−１）から１５０〜２００（２×ＥＨＶ−１）／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示した（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）。
【０１５１】
（実施例８）
ブタのための四価のＥＨＶ−１ベクターＡ型インフルエンザウイルスワクチンの生成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定、およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験
以下に記載したように、記載した本発明では、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１トリ、およびＨ１Ｎ１パンデミックブタＩＡＶ亜型／血清型に由来する記載した４つのブタＩＡＶヘマグルチニン（ＨＡ）抗原が、２つの組換えＥＨＶ−１ベクターウイルスによって発現される。ブタＩＡＶに対するこの新しい四価のワクチンは、ブタＩＡＶ  ＨＡタンパク質のみを発現するため、例えば、ブタＩＡＶ野外株に感染した動物ではブタＩＡＶタンパク質ＮＰまたはＮＡに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンによってのみワクチン接種された動物では検出されないことによってＤＩＶＡ特性を提供する。
新しい四価のブタＩＡＶワクチンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特性決定され、ブタＩＡＶに対するその効果をｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。
【０１５２】
新しく同定されたｐ４３０プロモーターは、ブタＩＡＶ  Ｈ１Ｎ１（（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦＲ７６６２３．１）の発現を駆動するために使用された。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子はトリＩＡＶに由来するため、Ｈ１ａｖと呼ばれる。Ｈ１ａｖは合成され、トランスファーベクターのｏｒｆ１／３挿入領域にサブクローニングされ、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨを生成した。Ｈ１ａｖの発現は、ｐ４３０プロモーターおよびウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ１／３への挿入のための組換え領域によってフレームに合わされた（図１０）。
【０１５３】
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨがｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ１／３に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ）が生成された。ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖをトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ  図１１がレスキューされ、２回プラーク精製された。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）および市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロットによって分析された（図１２）。ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡおよびウェスタンブロットによって確認された（データは示さない）。Ｈ１ａｖの正確なプロセシングおよび輸送、ならびに感染細胞の細胞膜上の局在は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ５０／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している（データは示さない）。
抗体ＰＡ−３４９２９によって７５ｋＤａの広帯域の移動の特異的検出は、その配列から予測されるように、組換えＨＡ糖タンパク質の予測される出現と一致する。モノクローナル抗体Ｃ１０２による細胞膜の明らかな染色は、予測される細胞内局在に則している。
【０１５４】
発現された組換えヘマグルチニンが予測されるようにプロセシングおよび輸送されたかどうか試験するため、ＶＥＲＯ細胞は０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ（親）を感染させ、または非感染のままおいた。感染の２４時間後、生きた感染細胞および非感染細胞は、ＰＢＳ中のトリの赤血球の懸濁液とインキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色によって染色された。トリの赤血球は細胞核を含有するため、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって染色することができ、蛍光顕微鏡によって小さな青いスペックとして現れ、ヘマグルチニンを発現しないｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞と比較して、トリの赤血球の吸着は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖまたはｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のいずれかを感染させた細胞上で著しく増加した（データは示さない）。このことから、真正のインフルエンザウイルス複製によって産生されたかのような様式で、ヘマグルチニンが翻訳され、プロセシングされ、ベクターウイルス感染細胞の細胞膜に輸送されたと結論づけることができる。感染細胞の赤血球吸着の表現型は、導入遺伝子タンパク質の効果的な発現を示し、ＥＨＶ−１ベクター感染細胞の細胞表面上の機能的ＨＡ三量体の形成を示唆するウェスタンブロットおよび免疫蛍光法による知見を支持する（Ｈ１ａｖ、図１２）。
【０１５５】
Ｈ３（ＰＡ５−３４９３０）およびＨ１（ＰＡ５−３４９２９）に対する市販のポリクローナル抗体の交差反応性の特異性および欠如は、単一インサートウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３およびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって確かめられた（データは示さない）。
次に、２つの異なるＡ型インフルエンザウイルスの亜型／血清型の２つの異なるヘマグルチニンを発現する組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥが生成された。
【０１５６】
組換えＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で開始して、トランスファーベクターｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨ（図１０）にアセンブルされた発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨは、２ステップＲＥＤ組換えによってｏｒｆ１／３挿入部位に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を生成した。ＰＫ／ＷＲＬ細胞はｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された。この組換えウイルスの略称はｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂである（図１３）。発現カセットの正しい挿入は、隣接する配列とともに挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。
【０１５７】
感染細胞における導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、データは示さない）ならびに市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図１４）によって分析された。ＥＨＶ−ＩＩ  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復はＩＦＡ（データは示さない）およびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するウェスタンブロットによって確かめられた（図１４）。
導入遺伝子Ｈ３とＨ１ａｖの両方は、二重インサート組換えｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂを感染させた細胞培養中で並行して発現された。導入遺伝子発現は安定であり、ＰＫ／ＷＲＬ細胞の継代１１回まで試験されたウイルス力価を損なわなかった。
２つの挿入部位および２つの新しいプロモーターを有する増強されたＥＨＶ−１ベクターは、２つのインフルエンザウイルスヘマグルチニンを並行して発現することが示された。ＩＦＡによって決定された細胞内局在およびウェスタンブロットによって決定されたＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度は、文献から公知のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞において発現された真正のヘマグルチニンに相当した。
次に、ヘマグルチニンＨ１ｈｕ、配列番号２９（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＫ９８４７６．１）およびＨ１ｐｄｍ、配列番号２６（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＲ０１７４６．１）を発現する、第２の二重インサートｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨが生成された。
【０１５８】
Ｈ１ｈｕのコード配列は合成、およびトランスファーベクターのｏｒｆ１／３挿入領域にサブクローニングされ、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨを生成した。Ｈ１ｈｕの発現は、ｐ４３０プロモーターおよびウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ１／３への挿入のための組換え領域によってフレームに合わされた（図２５）。
Ｈ１ｐｄｍのコード配列は合成およびサブクローニングされ、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１を生成し、Ｈ１ｐｄｍを新しいｐ４５５プロモーターおよび新しい７１ｐＡポリアデニル化シグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ７０への挿入のための組換え領域によってカセットがフレームに合わされた（図２６）。
【０１５９】
続いて、ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨおよびｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１がｐＲａｃＨ−ＳＥに挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕがまず生成された。標的としてこの改変ＢＡＣを使用して、ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１が挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍが生成された。ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍはＰＫ／ＷＲＬ細胞にトランスフェクトされ、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍがレスキューされ、３回プラーク精製された。新しい組換えベクターウイルスの略称はｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ（図２７）。
【０１６０】
感染細胞における導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、データは示さない）ならびに市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図２５）によって分析された。ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復はＩＦＡ（データは示さない）およびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するウェスタンブロットによって確かめられた（図２８）。
組換えｒＥＨＶ−１の遺伝的および表現型安定性は、細胞培養の継代によって示され、５回の継代ごとにウイルス力価を決定した。挿入領域の配列は１０回の継代ごとに、ならびに導入遺伝子の発現はウェスタンブロットによって確認された（データは示さない）。発現忠実度は、メトセル−オーバーレイ下のプラークの二重ＩＦＡによって評価され、抗ＥＨＶ抗体および導入遺伝子特異的抗体によって染色されたプラークがカウントされた（データは示さない）。
【０１６１】
若い子ブタにおいてベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンは、ワクチン接種−チャレンジ試験で試験される。詳細には、ブタＩＡＶに対する母系由来免疫がある（移行抗体が陽性）子ブタは、１および４週齢（２回ワクチン接種、２×ＥＨＶ−１）で、筋肉内に、ワクチン株当たり１×１０7  ＴＣＩＤ５０の用量でｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄによって２回ワクチン接種され、または４週齢のみ（１回ワクチン接種、１×ＥＨＶ−１）で接種される。非ワクチン接種群は陰性対照となる。１１週齢では、陰性対照以外の全ての動物が、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（Ｈ３がｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂで使用されるＨ３ワクチン抗原とは異種性である、ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４）の１×１０6  ＴＣＩＤ５０の投与量の気管内適用によってチャレンジされる。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照となるが、非ワクチン接種だがチャレンジされた動物はチャレンジ対照となる。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前およびチャレンジ後に、体温が測定され、血液試料は異なる時点で採取される。チャレンジの１日後、群当たり半分の動物が殺され、肺のブタＩＡＶ感染に典型的な病変がスコア化され、それぞれ動物当たり左および右肺につき３つの肺試料が採取され、肺ホモジネートの感染性ブタＩＡＶ力価が決定され、気管支肺胞上皮の洗浄液（ＢＡＬＦ）が採取される。チャレンジ３日後の群当たり、動物の残り半分で同じ手順が実施される。試料材料および回収されたデータは、中でも特に、チャレンジ後の体温変化、ブタＩＡＶ感染後の臨床徴候、肺スコア、ブタＩＡＶ肺力価、肺組織の組織学的変化、ブタＩＡＶ血清中和力価、ＢＡＬＦのサイトカインレベル、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔによって測定されるようにＰＢＭＣの再刺激、およびＢ細胞活性化を決定するために分析される。
【０１６２】
（実施例９）
二価のｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨベクターワクチンによってワクチン接種されたマウスにおける２つの抗原に対する中和抗体応答の誘導
発現された導入遺伝子がブタ以外の別の種で免疫原性で有り、抗体の中和が鼻腔内適用による２つの抗原のうちのいずれか１つに対して誘導されることを実証するため、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７−ｐ４５５−Ｈ３、図１３参照）がＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化に使用された。
【０１６３】
詳細には、３〜５週齢の、群当たり５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの３つの群は、それぞれ、４０μｌのｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−４３０−Ｈ１ａｖ−７−４５５−Ｈ３、群１）、または４０μｌの空ベクター（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ、群２、ベクター対照）、または４０μｌの組織培養培地（群３、陰性対照）のいずれかを試験０日および２１日目に鼻腔内接種された。群１および２では、感染性組換えＥＨＶ−１投与量は、それぞれ１×１０5  ＴＣＩＤ５０／４０μｌであった。マウスは、試験０日（最初の接種前）、７日、１４日、２１日（２回目の接種前）、２８日、および３５日に出血された。血清は、血液試料から調製され、−８０℃で凍結保存された。
【０１６４】
ベクターウイルスに対する抗体の検出のための免疫蛍光法
ＡＩ−ＳＴ細胞には、感染の２４時間後に空ベクターＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥ１．２．からレスキューされたウイルスであるｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１２１２を、０．００１の多重感染度（ＭＯＩ）で感染させ、特有のプラークが観察され、細胞は間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）のために処理された。ＰＢＳ中で１：５０に希釈された最終的な血液の３つの群全ての血清（２回目のワクチン接種後１４日で得た）が試験された。陽性対照として、ＥＨＶ−１ワクチン接種したウマの血清が、１：５００希釈で使用された。二次抗体は、マウス血清には、市販のＦＩＴＣコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ、ウマ血清にはＣｙ５コンジュゲートヤギ抗ウマＩｇＧであり、１：２００希釈で使用された。抗体結合は蛍光顕微鏡によって評価された。全てのワクチン接種マウスは、ＩＦＡにおいて、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−感染細胞に反応性の抗体を発生した。非感染細胞には、試験した血清のいずれも結合しなかった。マウスの陰性対照群からの血清は、感染細胞にも非感染細胞にも、特異的な結合を示さなかった。データは以下の表に要約する。
【０１６５】
【表３】
2019533438.tif 000008
これから、マウスの鼻孔へのｒＥＨＶ−１の接種は感染およびウルス複製をもたらし、そのためマウス免疫系が刺激され抗ＥＨＶ−１抗体を産生したと結論づけることができる。
【０１６６】
ウイルス中和試験（ＶＮＴ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））または（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））のいずれかに由来する発現された導入遺伝子に対する保護免疫の誘導を示すため、マウス血清は、それぞれのウイルスに対する中和活性について試験された（Allwinn et al. 2010; Trombetta et al. 2014）。中和試験に使用されるＩＡＶは、２０１４年からドイツでのブタからの単離株、特に、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＲ４５２／２０１４（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＲ１１８１／２０１４（Ｈ１Ｎ１）であった。これらは、ワクチン標的が由来する株とは異種であるため、マウス血清によるこれらのウイルスの任意の中和は、ｒＥＨＶ−１ワクチン接種による保護免疫の広く効果的な誘導を示す。陰性対照血清として、インフルエンザウイルス抗体に陰性であることが示されたブタ由来の血清が使用された。
【０１６７】
Ａ型インフルエンザウイルス中和試験：
９６ウェルプレートでのウイルス中和ならびに逆滴定のためのＭＤＣＫ細胞は、使用前に、３７℃／５％ＣＯ2で２日間インキュベートされた。それぞれのＩＡＶストックＨ３Ｎ２およびＨ１ａｖＮ１は氷上で解凍され、ゲンタマイシンおよび２倍の濃度のトリプシンを含有するＭＥＭ（ＭＥＭ／Ｇｅｎｔａ／２×トリプシン）で希釈された。
試験した血清は、群１（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂ）、群２（空ベクター）、陽性対照（不活性化多価ＩＡＶワクチンによってワクチン接種されたブタ由来の血清および陰性対照の最終血液に由来した。
【０１６８】
血清は熱失活され、それぞれ２回または３回の独立した試験で、１：１６で開始して１：４０９６まで１：２段階希釈された。ＩＡＶは、およそ１００  ＴＣＩＤ５０／中和反応に希釈された。中和反応は３７℃、５％ＣＯ2で２時間インキュベートされた。使用したウイルスの逆滴定は４つ組で行われた。増殖培地は除去され、中和反応または逆滴定のウイルス希釈を添加する前に、ＭＤＣＫ−細胞はゲンタマイシンおよびトリプシンを含有する培地で洗浄された。ＶＮＴおよび滴定プレートは、それぞれ中和反応またはウイルス希釈のＭＤＣＫ細胞への添加後、３７℃／５％  ＣＯ２で１時間インキュベートされた。その後、接種源が除去され、細胞は、ゲンタマイシンおよびトリプシンを含有する新鮮な培地で覆われた。感染５日後に、ＣＰＥはモニターされ、実証された。試験で実際に使用されたウイルス力価はＲｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｎｃｈに従ってＴＣＩＤ５０／ｍｌとして算出され、試験した血清がインフルエンザウイルスに典型的なＣＰＥの誘導を防ぐ希釈率が報告された、以下の表を参照。
【０１６９】
【表４】
2019533438.tif 000009
【０１７０】
【表５】
2019533438.tif 000010
【０１７１】
独立した試験の結果を比較するため、中和能力は相互血清希釈率とそれによって中和されるそれぞれの力価の掛け算によって算出された。３回の試験の平均は、次いで、１００で割られ、１００  ＴＣＩＤ５０の中和を反映した（表３、表４および表５）。データは要約し、図２９にグラフによって示す。
【０１７２】
ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂによってワクチン接種された全てのマウスは、それぞれのＩＡＶ、亜型Ｈ３Ｎ２およびＨ１ａｖＮ１の異種株に対する中和抗体を発生した。したがって、ｐ４５５プロモーター（Ｈ３）の調節下のｏｒｆ７０挿入部位から、および並行してｐ４３０プロモーター（Ｈ１ａｖ）の調節下のｏｒｆ１／３挿入部位から、ＩＡＶのヘマグルチニンを発現するｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥの２倍の鼻孔内適用は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの保護免疫応答を成功裏に刺激した。
ベクターｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥは、２つの異なる導入遺伝子の並行発現のために使用され、鼻孔内ワクチン接種後に免疫応答を刺激することができると結論づけることができる。
【０１７３】
（実施例１０）
ウシのためのＥＨＶ−１ベクターシュマレンベルク（Schmallenberg）ウイルス（ＳＢＶ）ワクチンの生成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験
出現したブニヤウイルスの１つは、シュマレンベルクウイルス（ＳＢＶ）、最初のヨーロッパシンブ血清群ウイルス（オルソブニヤウイルス属）であり、妊娠動物が妊娠期間の危機的状況中に感染する場合、流産、死産、および重度の胎児奇形を引き起こすことがあり、これまで、オルソブニヤウイルス研究のためのモデルウイルスとしてますます使用されている（Bilk et al.,2012）。シンブウイルスは昆虫ベクターによって伝染され、処置選択が利用できないため、ワクチン接種が疾患調節の主要な要素である。ＳＢＶおよびアカバネウイルス（ＡＫＡＶ）またはアイノウイルスなどのさらなるシンブウイルスに対する、不活性化全ウイルスワクチンが入手可能であり、ＳＢＶに対する生弱毒化ワクチンが開発されているが（Anonymous, 2013, 2015; Kraatz et al., 2015; Wernike et al., 2013b）、これらのワクチンのいずれも、野外感染とワクチン接種動物を区別（ＤＩＶＡ原理）できない。最近になって、ＳＢＶ糖タンパク質Ｇｃのアミノ末端の２３４アミノ酸（ａａ）に基づくＤＩＶＡ互換性サブユニットワクチンが、致死性の小動物チャレンジモデルおよびウシで試験された（Wernike et al., 2017）。発現プラスミドとして送達される場合、または哺乳動物細胞培養系で発現される場合、Ｇｃドメインは動物の６６％まで保護を与えるが、関連するＡＫＡＶの相当するドメインに結合するＳＢＶのＧｃドメインによって免疫された全ての動物は完全に保護された（Wernike et al., 2017）。ウシにおけるベクターワクチンとしてのｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥの適用を調べるため、ＳＢＶ−Ｇｃの２３４アミノ末端が、ｏｒｆ７０（ＵＳ４）挿入部位に挿入され、新しいｐ４５５プロモーターおよび７１ｐＡポリＡシグナルの調節下で発現され、ウシのワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
【０１７４】
シュマレンベルクウイルス（ＳＢＶ）糖タンパク質ｃ（Ｇｃ）に由来する抗原を発現する組換えＥＨＶ−１の生成
シュマレンベルクウイルス（ＳＢＶ）糖タンパク質ｃ（Ｇｃ）のコード領域の２３４アミノ酸部分は、ＥＨＶ−１での発現のためにコドン利用が最適化され、感染細胞の細胞膜への効果的な輸送および挿入を達成するためにさらに改変された。この目的のため、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）ヘマグルチニン（ＨＡ）亜型Ｈ１Ｎ２（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＲ０１７４６．１）由来の配列をコードするシグナルペプチドならびにそのＨＡ由来の膜貫通アンカー（ＴＭ）および細胞質Ｃ末端が、それぞれ５’および３’端に結合された。さらに、ＧＳリンカー、ＨＭＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＴ（配列番号３０）がＧｃタンパク質とＨＡ−ＴＭドメインの間に挿入された。ＤＮＡ（配列番号３１）が合成され、ＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥのＲＥＤ媒介組換えによるＥＨＶ−１のｏｒｆ７０（ＵＳ４）への導入遺伝子発現カセットの挿入のためのトランスファーベクター、ｐＵ７０−４５５−７１Ｋ７１のＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位にサブクローニングされた。生じたプラスミドｐＵ７０−４５５−ＳＢＶＧｃ＿７１Ｋ７１（図３０）は、ＸｂａＩで切断され、３０５６ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号３２）を放出し、ｐＲａｃＨ−ＳＥを有する大腸菌Ｋ１２  ＧＳ１７８３へと形質転換された。
【０１７５】
配列番号３１：サブクローニングのための制限酵素部位を含む合成ＤＮＡ配列
【化５】
2019533438.tif 000011
配列番号３２：ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃを生成するＲＥＤ組換えのために使用されるＤＮＡ断片
制限酵素切断部分はアスタリスク（*）によって示す
【化６−１】
2019533438.tif 000012
【化６−２】
2019533438.tif 000013
【０１７６】
組換えｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃ  ＤＮＡが調製され、発現カセットの正確な挿入および配列同一性が、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）を使用する高忠実度ＰＣＲおよびＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングによって確かめられた。使用したプライマーは表６、配列番号３３から配列番号３７を参照。
【表６】
2019533438.tif 000014
【０１７７】
組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃのレスキューおよび特性決定
ＢＡＣ  ＤＮＡは、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−ＳＢＶＧｃの４つの異なるクローンから調製された。ＡＩ−ＳＴ細胞（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ所有のブタ精巣細胞株）は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ、ＳＡＦＣ、Ｃａｔ  １２００３Ｃ−１０００ｍｌ）を含有するＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ、ＳＡＦＣ６２８９２−１０００Ｍ３０５６）中、１０5個の細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｅ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ  ２７７１２、ＵＳＡ；ＲＥＦ  ３５３０４６）に播種された。細胞が６０〜７０％コンフルエントになった時、通常翌日、供給業者の指示に従って、Ｍｉｒｕｓ（商標）ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ、５４５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１  ＵＳＡ）を使用して、２μｇのＢＡＣ  ＤＮＡがトランスフェクトされた。簡潔に言うと、２００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地が、５ｍｌポリスチレンチューブに添加された。ＤＮＡが添加され、混合された。次に、３μｌのブースト試薬が添加され、旋回によって混合された後に同じ容量のトランスフェクション試薬が添加され、旋回によって再び混合された。混合物は、室温で３分間インキュベートされ、次いで細胞培養に直接滴下添加された。細胞は、５日間３７℃／５％  ＣＯ2でインキュベートされた。細胞は培地中でリンスされ、−８０℃での保存のために回収された。レスキューウイルスの１：１０段階希釈はＭＥＭ中で調製され、６ウェルプレート中のコンフルエントなＡＩ−ＳＴ細胞の単層上に置かれた。３７℃／５％ＣＯ2での１時間の吸着後、接種源は除去され、細胞は、０．５％メトセル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｐｈ．Ｅｕｒ．、Ｆｌｕｋａ  ６４６３２−５００Ｇ）および５％ＦＢＳ（ＭＥＭ−Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）を含有する半固体培地でオーバーレイされた。２〜３日間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーション後（継代１）、可能な限り近くのプラークと離れて位置する個々のプラークは１０μｌの容積で吸引され、６ウェルプレートの新しいＡＩ−ＳＴ細胞培養に接種された。感染細胞は、大量のＣＰＥが観察されるまで２〜３日間インキュベートされた（継代２）。細胞は、培地でリンスされ、−８０℃での保存のために回収された。プラーク精製のこの手順は、２回繰り返された。３回プラーク精製されたウイルスを感染させたＡＩ−ＳＴ細胞は、それぞれ間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）またはウェスタンブロットのために処理された。
【０１７８】
感染細胞から調製されたウイルスＤＮＡは、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）を使用する高忠実度ＰＣＲのための鋳型として使用された。得られたＰＣＲ産物は、サンガーシーケンシングによって分析され、挿入領域の理論的な配列との同一性およびＢＡＣの相当するＰＣＲ産物の配列が確認された。
【０１７９】
間接免疫蛍光法
２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｅ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ  ２７７１２、ＵＳＡ；ＲＥＦ  ３５３０４７）中のＡＩ−ＳＴ細胞には、ＭＥＭで段階希釈された３回プラーク精製ウイルスを感染させた。増殖培地は細胞から吸引除去され、細胞は２５０μＬの希釈ウイルス（希釈率１０-2〜１０-7）でオーバーレイされた。細胞は、ウイルスの吸着のため、３７℃／５％ＣＯ2で１時間インキュベートされ、次いで接種源が除去され、細胞は１０００μＬのＭＥＭ−Ｍｅｔｈｏｃｅｌ／ウェルでオーバーレイされ、２日間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートされた。プラーク形成が顕微鏡で観察された場合、細胞はＩＦＡのために処理された。培地は吸引され、細胞は１ｍｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ  ＰＡ４９ＲＦ、ＵＫ、ＤＰＢＳ（１ｘ）ＲＥＦ  １４１９０−１３６）／ウェルで１回洗浄された。ＰＢＳは除去され、細胞は１ｍｌ／ウェルの−２０℃の冷エタノール（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ、Ｓｃｈｏｅｍｐｅｒｌｅｎｓｔｒ．３−５、Ｄ−７６１８５  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ａｒｔ．Ｎｒ．５０５４．１）の添加および室温での３０分間のインキュベーションによって固定された。エタノールは吸引され、細胞は風乾された。室温で１０分間、１ｍｌ／ウェルのＰＢＳによる細胞の再水和後、ＰＢＳで希釈された一次抗体が添加され（１５０μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートされた。一次抗体が除去され、細胞は、二次抗体希釈（１５０μｌ／ウェル）の添加前に、１ｍｌ  ＰＢＳ／ウェルによって２分間、３回洗浄された。光から保護された室温での１時間のインキュベーション後、二次抗体希釈が除去され、細胞は１ｍｌ  ＰＢＳ／ウェルによって２分間、３回洗浄され、蛍光顕微鏡による精査のために５００μｌ  ＰＢＳ／ウェルで最終的にオーバーレイされた。使用した抗体は表７に列挙される。
【０１８０】
【表７】
2019533438.tif 000015
【０１８１】
ウェスタンブロット
１．感染：６ウェルプレート中のＡＩ−ＳＴ細胞のそれぞれコンフルエントな単層の３つのウェルに、解凍したウイルスストックのそれぞれ５０μｌおよび１０μｌを増殖培地に直接添加することによって、２つの異なるプラーク単離株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−４５５−ＳＢＶＧｃ（＃１２１．１３１  Ｐ６および＃１２１．２３２  Ｐ６）およびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１２１２  Ｐ９（親の空ＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥ１．２からレスキューされた）のプラーク単離株をおよそ１のＭ．Ｏ．Ｉ．で感染させた。３つのウェルは、非感染のままにした。感染細胞および非感染細胞は２日間インキュベートされ、次いでウェスタンブロットのために処理された。
【０１８２】
２．ライセートの調製：プロテアーゼ阻害剤カクテルを補足したＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ＋ＰＩ）は以下のように調製された：０．７ｍｌ  １０×ＲＩＰＡ溶解緩衝液  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ＃２０−１８８は６．３ｍｌ  Ｈ2Ｏ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃ＢＰ２４７０−１を添加され、１タブレットのＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃１１  ８３６  １５３  ００１）は７ｍｌの１×ＲＩＰＡ緩衝液に溶解された。
非感染対照は培地にこすり落とされ、３つの反復ウェルからの懸濁液は１５ｍｌ遠心チューブにプールされ、氷上に置かれた。感染細胞は培地にリンスされ、３つの反復ウェルからの懸濁液は１５ｍｌ遠心チューブにプールされ、氷上に置かれた。細胞は、５分間、１０００×ｇ、４℃で遠心分離により沈降された。上澄み液は注意深く吸引され、細胞ペレットはＲＩＰＡ＋ＰＩに再懸濁された（非感染細胞３００μｌ、感染細胞１５０μｌ）。懸濁液は、３０分間氷上でインキュベートされ、１０分ごとにボルテックスされた。懸濁液は、１．５ｍｌマイクロチューブに移され、非溶解物質は、微量遠心機で１０分間、１５０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離によって沈降された。澄んだ上澄み液は新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移され、使用まで−８０℃で保存された。
【０１８３】
３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびナイロンメンブレンへの移行：材料：ＢｉｏＲａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ、４〜２０％、２６ウェル  Ｃａｔ＃＿５６７−８０９５；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｍａｒｋｅｒ、Ｃａｔ＃１６１−０３７４；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ  Ｍａｒｋｅｒ、Ｃａｔ＃１６１−０３７３；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｋｉｔ、Ｍｉｄｉ  ｆｏｒｍａｔ  Ｃａｔ＃１７０−４１５９；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ４ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ  ｎｏ．１６１−０７４７）（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｍａｎｎｓｔｒａｓｓｅ  １６４、Ｄ−８０９３９  Ｍｕｎｃｈｅｎ）；ＴＧＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液（Sambrook et al.）、ブロッキング溶液１：ＰＢＳＴ中５％  ＦＢＳ（Sambrook et al.）；ＰＢＳＴ。試料は、還元剤の添加無しで調製された。試料を氷上で解凍し、１容積の４×Ｌａｍｍｌｉ緩衝液と混合し、９６℃で６分間ボイルし、ゲルにロードするまで室温に保った。ゲルは、２３０ｍＡで３０分間実行され、次いでＢｉｏＲａｄ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏシステムを使用する電気泳動転写のためにアセンブルされた。転写は、２．５Ａ  ２５Ｖ  １０分に設定された。メンブレンは、滅菌蒸留水でリンスされ、４℃で３０分間、２５ｍＬのブロッキング溶液ＰＢＳＴ中５％ＦＢＳとインキュベートされた。
【０１８４】
抗体インキュベーションおよび検出
材料：Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ  ＷｅｓｔｅｒｎＣ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｍａｎｎｓｔｒａｓｓｅ  １６４、Ｄ−８０９３９  Ｍｕｎｃｈｅｎ）Ｃａｔ＃１７０−５０７０
一次抗体：
Ａ：ＳＢＶ−Ｇｃ−タンパク質特異的モノクローナル抗体（Wernike et al., 2015a）１：２０
Ｂ：ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩに対するマウスモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）
二次抗体：ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−０３５−１４６）１：５０００
全てのインキュベーションは、一定の攪拌下、十分な容積で行われた。抗体は５％ＦＢＳ／ＴＢＳＴ中で希釈された。一次抗体は４℃で終夜インキュベートされた。抗体溶液は除去され、ブロットは５〜１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄された。希釈した二次抗体は室温で１時間ブロットとインキュベートされ、除去され、ブロットは５〜１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄された。ブロットは、透明なプラスチックシートプロテクター上に置かれた。ペルオキシドおよびルミノ／エンハンサー溶液は、１ｍｌ＋１ｍｌ（各ブロットにつき全部で２ｍｌ）で混合され、ブロット上にピペッティングされ、３〜５分間インキュベートされた。その後、メンブレンはＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ画像システム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｍａｎｎｓｔｒａｓｓｅ  １６４、Ｄ−８０９３９  Ｍｕｎｃｈｅｎ）に置かれ、シグナルはＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを使用して記録された。
【０１８５】
ウイルス力価測定
ＡＩ−ＳＴ細胞は、感染の１日前に１０％ＦＢＳを補足したＭＥＭ中に２×１０4個の細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｅ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ  ２７７１２、ＵＳＡ；ＲＥＦ  ３５３０７２）に播種された。ウイルスストックは、素早く解凍され、氷上に置かれた。１０個の１：１０段階希釈がＭＥＭ中で、希釈当たり１．２ｍｌ容積で調製された。１００μｌ／ウェルのウイルス希釈物が、希釈当たり縦１列の８ウェルの細胞に添加された。１００μｌ／ウェルのＭＥＭの添加によって、各プレートの縦列１１および１２は培地対照とされた。力価測定は、３回行われ、細胞は５日間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートされた。細胞培養は顕微鏡で検査され、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨの典型的なＣＰＥが観察されたウェルが記録された。力価は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）による方法に従ってＴＣＩＤ５０／ｍｌとして算出された。
【０１８６】
ワクチン接種のために使用された組換えＥＨＶ−１の特性決定
感染細胞における改変ＳＢＶ  Ｇｃ２３４の発現は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃ  １２１．２３２のプラーク単離株のウェスタンブロットおよび二重免疫蛍光法（ＤＩＦＡ）によって示された。ポリクローナルウマ−抗ＥＨＶ−抗血清およびモノクローナル抗ＳＢＶ抗体によるＤＩＦＡは、見かけ上１００％のｒＥＨＶ−１感染細胞で導入遺伝子の発現を確認した。ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃ＿１２１．２３２を感染させた細胞のＤＩＦＡが実施された場合、ウマ抗−ＥＨＶ抗血清（紫）によって染色されたＥＨＶ−１抗原陽性細胞も、ＳＢＶ  Ｇｃに対するモノクローナル抗体に結合した。非還元条件下で実行されたウェスタンブロットは、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃを感染させた細胞における改変ＳＢＶＧｃ２３４の発現を確認した。ＳＢＶ  Ｇｃに対するモノクローナル抗体またはＥＨＶ−１  ｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体によってプローブされた感染細胞または非感染細胞のライセートのウェスタンブロットが実施された。ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩは、全ての感染細胞で発現されたが、ＳＢＶ  ＧｃはｒＥＨＶ−１ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃを感染させた細胞でのみ発現され、空ベクターｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１２１２を感染させた細胞では発現されなかった。いずれのウイルスタンパク質も、モック感染細胞のライセートでは検出されなかった。ＥＨＶ−１のｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体による並行ブロットのインキュベーションにより、トランスフェクション後の組換えウイルスのレスキュー中に自己切除手順によるｏｒｆ７１（ＵＳ５）の回復を確認した。３回プラーク精製した単離株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃ＿１２１．２３２から産生されたＰ７ウイルスストックは、ＡＩ−ＳＴ細胞において１．８５×１０9  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの非常に高い力価に複製され、導入遺伝子の発現はこの細胞株におけるＥＨＶ複製を損なわなかったことを示している。ＴＣＩＤ５０／ｍｌとしてｒＥＨＶ−１ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃ＿１２１．２３２の６回の力価測定の平均は標準偏差１．２８×１０9  ＴＣＩＤ５０／ｍｌで１．８５×１０9  ＴＣＩＤ５０／ｍｌをもたらした。
【０１８７】
動物および実験デザイン
ドイツ家畜品種の４頭のウシは、１０8ＴＣＩＤ50  ｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃによって３週間あけて２回ワクチン接種され、４頭の追加のウシが非ワクチン接種対照とされた。２回目の免疫化の３週間後、全ての動物は、ウシにおいて単独で継代された２×０．５ｍｌのＳＢＶ野生株を皮下に接種された（Wernike et al., 2012）。全試験中、直腸の体温が毎日測定され、動物は獣医によって臨床徴候を調べられた。血清は週間隔で採取され、市販のＮ−ｂａｓｅｄ  ＥＬＩＳＡ（ＩＤ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｃｈｍａｌｌｅｎｂｅｒｇ  ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ、ＩＤ  ｖｅｔ、Ｆｒａｎｃｅ）および先に記載されたようにＳＢＶ単離株ＢＨ８０／１１に対するマイクロ中和試験（Wernike et al., 2013a）によって分析された。評価は、３日後の細胞変性効果のアセスメントによって行われた；全ての試料は四重に試験され、抗体力価はＢｅｈｒｅｎｓ−Ｋａｅｒｂｅｒ法に従ってＮＤ50として算出された。それぞれ免疫化、チャレンジ感染、および研究の終わりの日に採取された血清は、ＥＨＶ株ＲａｃＨに対するマイクロ中和試験によってさらに分析された（ｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃ群および非ワクチン接種対照動物）。
【０１８８】
チャレンジ感染後最初の１０日間、血液試料は毎日さらに採取された。これらの試料から、ウイルスＲＮＡは、製造業者の指示に従って、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｍ４８  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と組合せてＫｉｎｇ  Ｆｉｓｈｅｒ  ９６  Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出され、ＳセグメントベースのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Bilk et al., 2012）によって試験された。
実験手順は、責任のある国家倫理委員会によって審査され、監督官庁（Ｍｅｃｋｌｅｎｂｕｒｇ−Ｖｏｒｐｏｍｍｅｒｎの農業、食品安全性、および水産業州事務所、Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｒｅｆ．ＬＡＬＬＦ  Ｍ−ＶＴＳＤ／７２２１．３−１．１−００４／１２）によって認可された。
【０１８９】
臨床所見およびウイルスＲＮＡ検出
動物は試験全体で関連するＳＢＶ特異的な臨床徴候を示さず、体温は直腸で測定された場合、全ての動物で正常範囲内のままであった。
チャレンジ感染の１日または２日後から開始して、ウイルスＲＮＡは、４日連続で各非ワクチン接種対照動物の血清試料中で検出された。ｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃ群からの全てのワクチン接種動物は、試料採取期間全体を通して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（図３１Ａ）によってウイルスＲＮＡ濃度の低下を示した。ｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃ群の２匹の動物は、試料採取期間全体を通して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（図３１Ａ）によって完全に陰性であった。ｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃによって免疫された２匹の動物では、ＳＢＶゲノムはそれぞれ、３日または５日間、低下したレベルで検出された。
【０１９０】
抗体応答
非ワクチン接種対照動物では、ＳＢＶ特異的抗体は、チャレンジ感染前に血清中和試験によって検出されなかった。感染後１週間または２週間から、向上した高力価の中和抗体が全ての非ワクチン接種動物で検出された（図３１Ｂ）。
【０１９１】
非ワクチン接種対照群とは対照的に、ｒＥＨＶ−ＳＢＶ−Ｇｃによって免疫された４頭のウシのうち２頭で、ＳＢＶ特異的中和抗体はチャレンジ感染の日に検出された。この群の残りの２頭の動物では、ＳＢＶ特異的な中和抗体はチャレンジ感染の前に検出されなかったが、感染後２週間から、中和抗体は存在した（図３１Ｂ）。４頭全てのワクチン接種動物におけるＳＢＶ特異的中和抗体の力価は、チャレンジ対照においてよりも低く、チャレンジウイルスの効率的ではないウイルス複製を示し、したがって、定量的ＲＴ−ＰＣＲデータを支持している。
【０１９２】
ＥＨＶ中和試験
血清の２倍希釈が、１：５で開始してＭＥＭ中で調製された。１００  ＴＣＩＤ５０のＳＢＶを含有する５０μｌのＭＥＭおよび５０μｌの希釈した血清は、９６ウェル細胞培養プレートで２時間インキュベートされた。その後、１００μｌの新しく調製したＢＨＫ細胞の懸濁液（１０％ウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ中）が添加され、培養プレートは、３７℃／５％ＣＯ2で３〜４日間インキュベートされた。細胞変性効果は光学顕微鏡によって評価された。全ての血清は２回ずつ試験され、抗体力価はＢｅｈｒｅｎｓ（未発表）によって改変されたＫａｅｒｂｅｒ（１９３１）に従って、ＮＤ５０として算出された。図３２に示す結果は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−４５５−ＳＢＶＧｃによるウシのワクチン接種が、特定の免疫応答を誘導するのに十分効率的なベクターウイルスの複製をもたらしたことを示す。４頭の動物のうち１頭において、ＥＨＶ−１の非常に低い力価の中和抗体（１：４）が、最初のワクチン接種の３週間後に検出された。２回のワクチン接種後、２回目の適用後３週間で、４頭全てのウシが１：１２８の力価で中和抗体を産生した。この結果から、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨはウシのワクチンベクターとしても機能的であり得ることも結論づけられる。
【０１９３】
（実施例１１）
子ブタでのブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２チャレンジに対するｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンの効果
若い子ブタでのベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、図１３参照）およびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ、図２７参照）からなる四価のブタＩＡＶワクチンが２回目のワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
【０１９４】
この第２の試験では、非ワクチン接種の雌ブタ由来の、ならびにＨ３特異的ＥＬＩＳＡ（図３６）の使用によって、および最初のワクチン接種時にウイルス中和試験（データは示さない）によって、ブタＩＡＶ特異的抗体に血清学的に陰性の試験された子ブタは、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のワクチンによって２回ワクチン接種された。動物は、それぞれ生後１週間（試験日０、ＳＤ０）で初めて、生後４週間（試験日２１、ＳＤ２１）で２回目に、筋肉内、次いで筋肉内（２×ＩＭ）、または最初は鼻腔内、次いで筋肉内（ＩＮ＋ＩＭ）、または２回鼻腔内（２×ＩＮ）のいずれかで、それぞれワクチン株、動物、およびワクチン接種当たり２ｍｌの用量中１×１０7  ＴＣＩＤ５０の用量でワクチン接種された。ある非ワクチン接種群は陰性対照となり、別の非ワクチン接種群は生後１１週間（試験日６９または７０、ＳＤ４２／４３）でチャレンジ対照となり、陰性対照以外の全ての動物は、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４のＨ３は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂで使用されるＨ３ワクチン抗原と異種性である）の２×１０7  ＴＣＩＤ５０の気管内適用用量によってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）となるが、非ワクチン接種であるがチャレンジされた動物はチャレンジ対照（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）となった。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前に、血液試料は異なる時点で採取された。
【０１９５】
チャレンジの１日後、群当たり半分の動物が殺され、動物当たり左および右肺につき３つの肺試料がそれぞれ採取された。次いで、肺ホモジネートグラム当たりの感染性ブタＩＡＶ力価は、それぞれが、左または右肺につきプールされた３つの試料のホモジネートから得られ、それぞれ左または右肺の３つの試料の総質量にノーマライズされた、動物当たりの左および右肺の平均として各動物について決定された。同じ手順が、チャレンジの３日後に、群当たりの動物の残りの半分で実施された。全てのワクチン接種群に関して、群において個々の動物から得られた感染性ブタＩＡＶの力価の中央値は、チャレンジ対照群と比較した場合、チャレンジ後１日目（ＣＨ＋１）に採取された試料では統計的に著しく減少したが、陰性対照群からの全ての動物は、それらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタＩＡＶウイルス力価を示さなかった（図３３）。さらに、全てのワクチン接種群に関して、群の個々の動物から得られた感染性ブタＩＡＶの力価の中央値は、チャレンジ対照群と比較した場合、チャレンジ後３日目（ＣＨ＋３）に採取された試料では統計的に著しく減少したが、陰性対照群からの全ての動物は、それらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタＩＡＶウイルス力価を示さなかった（図３４）。したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれ子ブタにおける異種ブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２株によるチャレンジ後１日および３日でブタＩＡＶ肺負荷を統計的に著しく減少させた。結果として、本明細書に記載のワクチンは、ブタにおけるブタＩＡＶに対して有効である。
【０１９６】
さらに、試験日０（ＳＤ０、最初のワクチン接種前）、試験日２１（ＳＤ２１、２回目のワクチン接種前）、および試験日４２または４３（ＳＤ４２／４３、チャレンジ材料の適用前）に試験動物から採取した血清は、ワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析された。陰性対照群からの血清の平均ＯＤ値は、測定された全ての時点で非常に低い値のみを与えたが、ワクチン接種群からの血清は、２回の筋肉内適用後（２×ＩＭ；ＳＤ２１およびＳＤ４２／４３）、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用後（ＩＮ＋ＩＭ；ＳＤ４２／４３）、および２回の鼻腔内適用後（２×ＩＮ；ＳＤ４２／４３）に、ＯＤ値の強力な増加を実証した；図３６。したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する子ブタの血清学的な免疫応答を引き出した。
【０１９７】
さらに、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、試験日２８（ＳＤ２８）に試験動物から採取された血液から精製された。次いで、ＰＢＭＣは、多重感染度１（Ｈ３Ｎ２  ＭＯＩ  １）でＨ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４、または１μｇ／ｍｌの濃度のワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な、組換え発現されたブタＩＡＶ  Ｈ３抗原（ｒＨ３  １μｇ／ｍｌ）のいずれかによって再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ、得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された（図３８）。チャレンジ対照群（本試験では陰性対照となり、動物はワクチン接種されなかった）からの再刺激されたＰＢＭＣは、いずれかの再刺激後４５より少ない群当たりの平均スポットを示し、ワクチン接種動物からの再刺激されたＰＢＭＣは、それぞれ、いずれかの再刺激後、２回の筋肉内適用後８５より多い、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用（ＩＮ＋ＩＭ）後に１００より多いスポット、および２回の鼻腔内適用（２×ＩＮ）後に１５０より多いスポットの、群当たりの平均スポットを示した（図３８）。したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する、および異種チャレンジウイルス感染に使用されるブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２  Ｒ４５２−１４に対する子ブタの細胞性免疫応答を引き出した。
【０１９８】
したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによる子ブタのワクチン接種は、子ブタにおいて検出可能な血清学的および細胞性免疫応答を誘導し、異種ブタＩＡＶチャレンジ後１および３日で、肺ホモジネート中のブタＩＡＶ負荷を統計的に著しく減少させることによってワクチン効率を実証した。
【０１９９】
（実施例１２）
母系由来抗体を有する子ブタにおけるブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２チャレンジに対するｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンの効果
若い子ブタにおけるベクターワクチンとしてのその特性を調べるために、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンは、第３のワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
【０２００】
この第３の試験では、ブタＩＡＶに対する市販の不活性化ワクチンによって妊娠中に２回ワクチン接種された雌ブタから生まれ、初乳および母乳を与えられた子ブタが使用された。子ブタは、最初のワクチン接種時にＨ３特異的ＥＬＩＳＡの使用によって（図３７）および製造業者の試験勧告に従って市販のブタＩＡＶ特異的抗体ＥＬＩＳＡの使用によって（ＩＤＥＸＸ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（ウイルス抗体試験）（登録商標）；ＩＤＥＸＸ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｍａｉｎｅ  ０４０９２、ＵＳＡ）（データは示さない）、ブタＩＡＶ特異的抗体に血清学的に陽性であると試験され、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のワクチンによって２回ワクチン接種された。動物は、それぞれ生後１週間（試験日０、ＳＤ０）で最初に、生後４週間（試験日２１、ＳＤ２１）で２回目に、筋肉内、次いで筋肉内（２×ＩＭ）、または最初は鼻腔内、次いで筋肉内（ＩＮ＋ＩＭ）、または２回鼻腔内（２×ＩＮ）のいずれかで、それぞれワクチン株、動物、およびワクチン接種当たり２ｍｌ用量中１×１０7  ＴＣＩＤ５０の用量でワクチン接種された。１つの非ワクチン接種群は陰性対照となり、別の非ワクチン接種群はチャレンジ対照となった。生後１１週間（試験日６９または７０、ＳＤ６９／７０）で、陰性対照以外の全ての動物は、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４のＨ３は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂで使用されるＨ３ワクチン抗原と異種性である）の２×１０7  ＴＣＩＤ５０の気管内適用用量によってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）となったが、非ワクチン接種であるがチャレンジされた動物はチャレンジ対照（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）となった。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前に、血液試料は異なる時点で採取された。
【０２０１】
チャレンジの５日後、動物は殺され、動物当たり左および右肺につき３つの肺試料がそれぞれ採取された。次いで、肺ホモジネートグラム当たりの感染性ブタＩＡＶ力価は、それぞれが、左または右肺につきプールされた３つの試料のホモジネートから得られ、それぞれ左または右肺の３つの試料の総質量にノーマライズされた、動物当たりの左および右肺の平均として各動物について決定された。全てのワクチン接種群に関して、群において個々の動物から得られた感染性ブタＩＡＶの力価の中央値は、チャレンジ対照群と比較した場合、チャレンジ後５日目（ＣＨ＋５）に採取された試料では統計的に著しく減少したが、陰性対照群からの全ての動物は、それらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタＩＡＶウイルス力価を示さなかった（図３５）。したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれ子ブタにおける異種ブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２株によるチャレンジ後５日でブタＩＡＶ肺負荷を統計的に著しく減少させた。結果として、本明細書に記載のワクチンは、ブタにおけるブタＩＡＶに対して有効である。
【０２０２】
さらに、試験日０（ＳＤ０、最初のワクチン接種前）、試験日２１（ＳＤ２１、２回目のワクチン接種前）、および試験日３５（ＳＤ３５、２回目のワクチン接種後２週間）に試験動物から採取した血清は、ワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶ  Ｈ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析された。陰性対照群からの血清の平均ＯＤ値は、ＳＤ２１およびＳＤ３５で非常に低い値のみを与えたが、ワクチン接種群からの血清は、２回の筋肉内適用後（２×ＩＭ；ＳＤ３５）、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用後（ＩＮ＋ＩＭ；ＳＤ３５）、および２回の鼻腔内適用後（２×ＩＮ；ＳＤ３５）に、ＯＤ値の強力な増加を実証した；図３７。したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する子ブタの血清学的な免疫応答を引き出した。
【０２０３】
さらに、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、試験日２８（ＳＤ２８）に試験動物から採取された血液から精製された。次いで、ＰＢＭＣは、多重感染度１（Ｈ３Ｎ２  ＭＯＩ  １）でＨ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４、または１μｇ／ｍｌの濃度のワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な、組換え発現されたブタＩＡＶ  Ｈ３抗原（ｒＨ３  １μｇ／ｍｌ）のいずれかによって再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ、得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された（図３９）。チャレンジ対照群（本試験では陰性対照となり、動物はワクチン接種されなかった）からの再刺激されたＰＢＭＣは、いずれかの再刺激後１５より少ない群当たりの平均スポットを示し、ワクチン接種動物からの再刺激されたＰＢＭＣは、それぞれ、いずれかの再刺激後、２回の筋肉内適用後３０より多い、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用（ＩＮ＋ＩＭ）後に５５より多いスポット、および２回の鼻腔内適用（２×ＩＮ）後に６５より多いスポットの群当たりの平均スポットを示した（図３９）。したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する、および異種チャレンジウイルス感染に使用されるブタＩＡＶ  Ｈ３Ｎ２  Ｒ４５２−１４に対する子ブタの細胞性免疫応答を引き出した。
【０２０４】
したがって、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによる子ブタのワクチン接種は、子ブタにおいて検出可能な血清学的および細胞性免疫応答を誘導し、異種ブタＩＡＶチャレンジ後５日で、肺ホモジネート中のブタＩＡＶ負荷を統計的に著しく減少させることによってワクチン効率を実証した。
【０２０５】
本明細書において開示され、特許請求されている組成物および方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および方法ならびに方法のステップまたは一連のステップに、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的にかつ生理的に関連する特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に明らかであるそのような同様の置換および修飾は全て、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【０２０６】
（参考文献）
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ−Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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