(57)【要約】  本開示は、遺伝子編集方法において改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有する修飾シングルガイドＲＮＡおよびデュアルガイドＲＮＡに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、５’末端修飾と、
ａ．上部ステム領域、
ｂ．ヘアピン１領域、および
ｃ．ヘアピン２領域のうちの１つまたは複数中の１つまたは複数の修飾と、を含み、
前記５’末端修飾が、５’終端の５’末端における最初の７個のヌクレオチドの中に少なくとも２つのホスホロチオエート（ＰＳ）連結を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項２】
少なくとも１つの修飾が２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３】
少なくとも１つの修飾が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１または請求項２に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４】
少なくとも１つの修飾がヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項５】
前記上部ステム領域中に１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項６】
ＵＳ１〜ＵＳ１２において修飾を含む、請求項５に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７】
前記ヘアピン１領域中に１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項８】
Ｈ１−１において修飾を含む、請求項７に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項９】
前記ヘアピン２領域中に１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１０】
Ｈ２−１において修飾を含む、請求項９に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１１】
Ｈ１−１〜Ｈ１−１２において修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１２】
Ｈ２−１〜Ｈ２−１５において修飾を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１３】
前記上部ステム領域、前記ヘアピン１領域、および前記ヘアピン２領域のそれぞれの中に１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１４】
ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間に修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１５】
修飾を含む下部ステム領域をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１６】
修飾を含む３’終端領域をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１７】
前記３’終端中に３’末端修飾をさらに含む、請求項１６に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１８】
前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つが修飾されている、請求項１７に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１９】
前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つが２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、または２’−Ｏ−ｍｏｅで修飾されている、請求項１７に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２０】
前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの１つまたは複数の間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２１】
修飾を含むバルジ領域をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２２】
修飾を含むネクサス領域をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２３】
少なくとも、前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチド、および前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２４】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチド、および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２５】
前記末端修飾が２’−Ｏ−Ｍｅを含む、請求項２４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２６】
前記末端修飾が２’−Ｆを含む、請求項２４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２７】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２８】
前記５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび前記３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、および／または２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２９】
ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３０】
前記バルジ領域中の前記ヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３１】
前記バルジ領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５０％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３２】
前記上部ステム領域中の前記ヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３３】
前記ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３４】
ネクサス領域中のＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が修飾されている、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３５】
前記ネクサス領域中の前記修飾が２’−Ｏ−Ｍｅおよび２’Ｆから選択される、請求項３３または請求項３４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３６】
Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８がＰＳ結合で連結されている、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３７】
前記ヘアピン１領域中の前記ヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３８】
前記ヘアピン２領域中の前記ヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３９】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを以下の位置：
ａ．５’ 終端の５’末端における最初の３ヌクレオチドと、
ｂ．下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２と、
ｃ．バルジ領域中のＢ１および／またはＢ２と；
ｄ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、
ｅ．ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８と、
ｆ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｇ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドと、において含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項４０】
Ｂ３〜Ｂ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項３９に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４１】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項３９に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４２】
ＬＳ９およびＬＳ１０が、例えば、２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されている、先行する請求項１〜４１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４３】
Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が、例えば、２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されている、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４４】
Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５が２’−Ｆで修飾されている、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４５】
前記３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドが２’−Ｆで修飾されている、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４６】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを以下の位置：
ａ．下部ステム領域中のＬＳ９およびＬＳ１０と、
ｂ．ネクサス領域中のＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、
ｃ．ヘアピン２領域中のＨ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５と、において含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項４７】
３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項４６に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４８】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項４６または請求項４７に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４９】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドの３つにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項５０】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５１】
ＬＳ１および／またはＬＳ６において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項５０に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項５２】
ヘアピン１とヘアピン２との間に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項５０または請求項５１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項５３】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１〜ＬＳ６における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５４】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ２〜ＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５５】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５６】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５７】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における２’−Ｏ−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５８】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項５９】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項６０】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’個の端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ２−１〜Ｈ２−８における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−９〜Ｈ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端の３’末端における最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項６１】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、およびＨ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、およびＨ１−１１における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２；およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１；Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後から２つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｉ．３’終端の３’末端における最後から３つ目、および最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項６２】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項５０〜６１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項６３】
前記５’終端の前記５’末端における最初の７個のヌクレオチド内に少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合をさらに含む、請求項５０〜６１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項６４】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５と、
ｂ．ＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１；Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項６５】
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項６４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項６６】
ａ．３’終端の３’末端における最後および最後から３つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．３’終端の３’末端における最後から２つ目および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、をさらに含む、請求項６４または請求項６５に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項６７】
表４の修飾を含む、配列番号２２８〜３３２のうちのいずれかを含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項６８】
表４の修飾を含む、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれかを含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項６９】
配列番号２４０を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項７０】
表４の修飾を含む配列番号２４０を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項７１】
表４の修飾を含む配列番号２４２を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項７２】
表４に描写されるように、配列番号２４２の修飾を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項７３】
配列番号３５８を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項７４】
配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、表４における参照配列識別子のヌクレオチドに対応するｓｇＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が、表４における参照配列識別子に示される修飾と同一または同等である、ｓｇＲＮＡ。
【請求項７５】
前記５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項６６〜７４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７５】
前記ヘアピン１領域中の前記ヌクレオチドを連結する少なくとも３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１〜７４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７６】
前記ヘアピン２領域中の前記ヌクレオチドを連結する少なくとも３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１〜７５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７７】
前記上部ステム領域中の前記ヌクレオチドを連結する少なくとも３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１〜７６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７８】
Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項１〜７７のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７９】
上部ステム領域中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項８０】
以下のヌクレオチド：ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、およびＵＳ１２のうちの１、２、３、または４、５、６、７、８、９、１０、または１１個において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項８１】
ヘアピン１領域およびヘアピン２領域中のヌクレオチドの５０％またはそれより多くにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項８２】
上部ステム領域中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、かつヘアピン１領域およびヘアピン２領域中のヌクレオチドの５０％またはそれより多くにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項８３】
Ｈ２−１またはＨ２−２に始まり３’終端の最後のヌクレオチドまでの各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含むまたはそれからなる、ガイドＲＮＡ。
【請求項８４】
ＬＳ１および／またはＬＳ６において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含みまたはそれからなり、かつＬＳ２〜ＬＳ５において修飾を含まない、ガイドＲＮＡ。
【請求項８５】
ＬＳ８、ＬＳ９、ＬＳ１０、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２のうちの２つまたはそれより多くにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項８６】
少なくともＬＳ８およびＬＳ１０が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項８５に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項８７】
ネクサス領域中の前記ヌクレオチドの５０％またはそれより多くにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾をさらに含む、請求項７９〜８６のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項８８】
前記ネクサス領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項８７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項８９】
ネクサス領域中のヌクレオチドの最大５０％において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項９０】
ネクサス領域中の４つまたはそれより多くのヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項９１】
前記ネクサス領域中のヌクレオチドＮ２〜Ｎ６のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項９０に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９２】
ネクサス領域中の１０個またはそれより多くのヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項９３】
少なくともＮ２〜Ｎ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項９２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９４】
バルジ領域中のヌクレオチドの５０％またはそれより多くにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項９５】
前記バルジ領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項９４に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９６】
Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項９４に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９７】
バルジ領域中の３つまたはそれより多くのヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項９８】
Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項９７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９９】
請求項１〜９８のいずれか１項に記載の前記ガイドＲＮＡの前記修飾パターンを有する配列番号３５７の前記ヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項１００】
請求項１〜９９のいずれか１項に記載の前記ガイドＲＮＡの前記修飾パターンを有する配列番号３５６の前記ヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡ。
【請求項１０１】
前記５’終端領域の前記５’末端における最初の３個、４個、または５個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾をさらに含む、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０２】
前記３’終端領域の前記３’末端における最後の３個、最後の４個、または最後の５個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾をさらに含む、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０３】
前記３’終端領域の前記３’末端における最後のヌクレオチドが修飾されていない、請求項１０２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０４】
前記３’終端領域の前記３’末端における最後から２つ目および最後から３つ目のヌクレオチドのみが修飾されている、請求項１０２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０５】
前記３’終端領域中の最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドのみが修飾されている、請求項１０２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０６】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個、４個、または５個のヌクレオチドの間にＰＳ結合をさらに含む、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０７】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されている、請求項１０６に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０８】
前記３’終端の前記３’末端における最後の３個、４個、または５個のヌクレオチドの間にＰＳ結合をさらに含む、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１０９】
前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されている、請求項１０８に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１０】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個または４個のヌクレオチド、および前記３’終端の前記３’末端における最後の３個または４個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１１】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個または４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記３’終端の前記３’末端における最後の３個または４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１２】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個または４個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、かつＰＳ結合により連結されており、また前記３’終端の前記３’末端における最後の３個または４個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、かつＰＳ結合により連結されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１３】
ヌクレオチドＬＳ８、ＬＳ９、ＬＳ１０、ＬＳ１１、およびＬＳ１２のうちの少なくとも２つが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１４】
少なくともＬＳ８およびＬＳ１０が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１５】
前記ネクサス領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５０％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１６】
前記ネクサス領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１１５に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１７】
少なくともＮ２〜Ｎ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１１５に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１８】
前記ネクサス領域中の前記ヌクレオチドのうちの少なくとも１０個が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１１９】
少なくともＮ２〜Ｎ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１１５に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２０】
前記バルジ領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５０％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２１】
前記バルジ領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１２０に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２２】
Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１２１に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２３】
前記バルジ領域中の前記ヌクレオチドのうちの少なくとも３つが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項７９〜１００のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２４】
Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１２３に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２５】
ｓｇＲＮＡである、請求項７９〜１２４のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２６】
ｄｇＲＮＡである、請求項７９〜１２５のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２７】
前記ヘアピン１領域および前記ヘアピン２領域中の前記ヌクレオチドの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が２’−ＯＭｅで修飾されている、請求項８１または８２に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２８】
Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項７９〜１２７のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項１２９】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の個のヌクレオチドと、
ｂ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、
ｃ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、
ｆ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、ｓｇＲＮＡ。
【請求項１３０】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結するＰＳ結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結するＰＳ結合をさらに含む、請求項１２９に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１３１】
表４に描写される配列番号３５０、３５１、３５２、または３５３に示される修飾パターンを有する、ｓｇＲＮＡ。
【請求項１３２】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個、４個、５個、または７個のヌクレオチドと、
ｂ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、
ｃ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、
ｆ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、ｓｇＲＮＡ。
【請求項１３３】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個、４個、５個、または７個のヌクレオチドと、
ｂ．ヌクレオチドＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１およびＵＳ１２のそれぞれと、
ｃ．ヌクレオチドＨ１−１、Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ１−１１、およびＨ１−１２のそれぞれと、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドと、
ｅ．ヌクレオチドＨ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５のそれぞれと、
ｆ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、ｓｇＲＮＡ。
【請求項１３４】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結するＰＳ結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結するＰＳ結合をさらに含む、請求項１２９〜１３３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１３５】
表４に示されるような配列番号３５０、３５１、３５２、または３５３の修飾パターンを有する、ｓｇＲＮＡ。
【請求項１３６】
Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項１２９〜１３５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１３７】
ｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、
以下の領域、すなわち、
ａ．５’終端の５’末端における最初の５個のヌクレオチドと、
ｂ．下部ステム領域と、
ｃ．バルジ領域と、
ｄ．上部ステム領域；および
ｅ．前記ｃｒＲＮＡの３’末端における最後の５個のヌクレオチドと、のうちの１つまたは複数の領域内に１つまたは複数の修飾を含む、ｃｒＲＮＡ。
【請求項１３８】
５’末端修飾をさらに含み、前記５’末端修飾が前記５’終端の前記５’末端における最初の７個のヌクレオチド内に１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む、請求項１３６に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１３９】
５’末端修飾をさらに含み、前記５’末端修飾が前記５’終端の前記５’末端における最初の７個のヌクレオチド内に少なくとも２つのホスホロチオエート連結を含む、請求項１３６に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４０】
少なくとも１つの修飾が２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３７〜１３９のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４１】
少なくとも１つの修飾が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３７〜１４０のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４２】
少なくとも１つの修飾がヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項１３７〜１４１のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４３】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、請求項１３７〜１４２のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４４】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチド、および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている、請求項１３７〜１４３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４５】
前記修飾が２’−Ｏ−Ｍｅを含む、請求項１４３に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４６】
前記修飾が２’−Ｆを含む、請求項１４３に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４７】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、請求項１３７〜１４６のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４８】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｆ修飾を含む、請求項１３７〜１４６のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１４９】
ＬＳ１およびＬＳ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１３７〜１４８のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５０】
上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１３７〜１４９のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５１】
ｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、
ａ．下部ステム領域中のＬＳ１およびＬＳ６と、
ｂ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｃｒＲＮＡ。
【請求項１５２】
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１５１に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５３】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１５１または請求項１５２に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５４】
ＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６が２’−Ｆで修飾されている、請求項１３７〜１５３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５５】
前記バルジ領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｆで修飾されている、請求項１３７〜１５４のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５６】
ｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、
ａ．下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６と、
ｂ．バルジ領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、ｃｒＲＮＡ。
【請求項１５７】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１３７〜１５６のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５８】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１３７〜１５７のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１５９】
表４の修飾を含む配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つを含む、ｃｒＲＮＡ。
【請求項１６０】
表４の修飾を含む配列番号１９〜３１、５３〜７３、１０４〜１３０、および１６１〜１８７のうちのいずれか１つを含む、ｃｒＲＮＡ。
【請求項１６１】
配列番号１９〜３１、５３〜７３、１０４〜１３０、および１６１〜１８７のうちのいずれか１つに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、表４中の参照配列識別子のヌクレオチドに対応するｃｒＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が表４における前記参照配列識別子に示される前記修飾と同一または同等である、ｃｒＲＮＡ。
【請求項１６２】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１５９〜１６１のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１６３】
ｔｒＲＮＡと組み合わさった前記ｃｒＲＮＡがＳ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項１３７〜１６２のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項１６４】
ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）であって、
以下の領域：
ａ．５’終端の５’末端における最初の５個のヌクレオチドと、
ｂ．上部ステム領域と、
ｃ．バルジ領域と、
ｄ．下部ステム領域と、
ｅ．ネクサス領域と、
ｆ．ヘアピン１領域と、
ｇ．ヘアピン２領域と、
ｈ．３’終端の３’末端における最後の５個のヌクレオチドと、のうちの１つまたは複数の領域内に１つまたは複数の修飾を含む、ｔｒＲＮＡ。
【請求項１６５】
少なくとも１つの修飾が２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１６４に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１６６】
少なくとも１つの修飾が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１６４または請求項１６５に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１６７】
少なくとも１つの修飾がヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項１６４〜１６６のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１６８】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチド、および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている、請求項１６４〜１６７のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１６９】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、請求項１６４〜１６８のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７０】
前記修飾が２’−Ｏ−Ｍｅを含む、請求項１６９に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７１】
前記修飾が２’−Ｆを含む、請求項１６９に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７２】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、請求項１６４〜１７１のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７３】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｆ修飾を含む、請求項１６４〜１７１のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７４】
前記上部ステム領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１６４〜１７３のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７５】
前記バルジ領域内のＢ１およびＢ２が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１６４〜１７４のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７６】
前記ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１６４〜１７５のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７７】
前記ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１６４〜１７６のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７８】
前記ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１６４〜１７７のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１７９】
ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）であって、
ａ．上部ステム中の各ヌクレオチドと、
ｂ．バルジ領域内のＢ１および／またはＢ２と、
ｃ．ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８と、
ｄ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｔｒＲＮＡ。
【請求項１８０】
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１７９に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８１】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含む、請求項１７９または請求項１８０に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８２】
Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が２’−Ｆで修飾されている、請求項１６４〜１８１のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８３】
ＬＳ１、ＬＳ３、およびＬＳ５が２’−Ｆで修飾されており、かつＬＳ２、ＬＳ４、およびＬＳ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、請求項１６４〜１８２のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８４】
前記５’終端の前記５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および前記３’終端の前記３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１６４〜１８３のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８５】
前記５’終端の前記５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ前記３’終端の前記３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１６４〜１８４のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８６】
表４の修飾を含む配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つを含む、ｔｒＲＮＡ。
【請求項１８７】
配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、表４中の参照配列識別子のヌクレオチドに対応するｔｒＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が表４における参照配列識別子に示される前記修飾と同一または同等である、ｔｒＲＮＡ。
【請求項１８８】
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、請求項１８６〜１８７のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１８９】
ｃｒＲＮＡと組み合わさった前記ｔｒＲＮＡがＳ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項１６４〜１８８のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項１９０】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むデュアルガイドであって、前記ｃｒＲＮＡが表４に描写される配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つを含み、かつ前記ｔｒＲＮＡが表４に描写される配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸を含む、デュアルガイド。
【請求項１９１】
請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡおよび請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡを含む、デュアルガイド。
【請求項１９２】
請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを含む、デュアルガイド。
【請求項１９３】
非修飾ｃｒＲＮＡおよび請求項１３７〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡを含む、デュアルガイド。
【請求項１９４】
Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項１９０〜１９３のいずれか１項に記載のデュアルガイド。
【請求項１９５】
請求項１〜７８および１２９〜１３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡを含む、ＬＮＰ組成物。
【請求項１９６】
請求項１〜１９３のいずれか１項に記載の前記ＲＮＡを含むまたはそれからなるｇＲＮＡを含む、ＬＮＰ組成物。
【請求項１９７】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合した請求項１〜７８および１２９〜１３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡを含む、組成物。
【請求項１９８】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合した請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡを含む、組成物。
【請求項１９９】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合した請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２００】
請求項１〜７８および１２９〜１３６のいずれか１項に記載の前記ｓｇＲＮＡ、請求項７９〜１２８のいずれか１項に記載の前記ｇＲＮＡ、請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載の前記ｃｒＲＮＡ、請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載の前記ｔｒＲＮＡ、請求項１９０〜１９４のいずれか１項に記載の前記ｄｇＲＮＡ、または請求項１９５〜１９９のいずれか１項に記載の前記組成物を含み、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをさらに含む、組成物。
【請求項２０１】
前記ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項２００に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項２０１に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記Ｃａｓ９がＳ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９である、請求項２０２に記載の組成物。
【請求項２０４】
前記ヌクレアーゼがニッカーゼである、請求項２００〜２０３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０５】
前記ヌクレアーゼが改変されている、請求項２００〜２０４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記改変されているヌクレアーゼが核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２０７】
前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項２００〜２０６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０８】
請求項１〜７８および１２９〜１３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項７９〜１２８のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ、請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ、請求項１９０〜１９４のいずれか１項に記載のｄｇＲＮＡ、または請求項１９５〜２０７のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬製剤。
【請求項２０９】
標的ＤＮＡを改変する方法であって、
Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸と、以下：
ａ．請求項１〜７８および１２９〜１３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ；
ｂ．請求項７９〜１２８のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ；
ｃ．請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ；
ｄ．請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ；
ｅ．請求項１９０〜１９４のいずれか１項に記載のｄｇＲＮＡ；
ｆ．請求項１９５〜２０７のいずれか１項に記載の組成物；または
ｇ．請求項２０８に記載の医薬製剤のうちのいずれか１つまたは複数と、を細胞に送達することを含む、方法。
【請求項２１０】
遺伝子中の挿入または欠失を結果としてもたらす、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記細胞に鋳型を送達することをさらに含み、前記鋳型の少なくとも一部が、Ｃａｓタンパク質により誘導される二本鎖切断部位においてまたはその近くにおいて標的ＤＮＡの中へと組み込まれる、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１２】
疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するための、請求項１〜７８および１２９〜１３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２１３】
疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するための、請求項７３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項２１４】
疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するための、請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡ。
【請求項２１５】
疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するために、請求項１６４〜１８９のいずれか１項に記載のｔｒＲＮＡと組み合わせた、請求項１３７〜１６３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項２１６】
疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するための、請求項２０８に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、該配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１７年１２月７日に作成され、０１１５５−０００４−００ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔという名称であり、１１８，８７７バイトのサイズである。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／４３１，７５６号の優先権の利益を主張し、該仮出願は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００３】
本開示は、外因性遺伝因子を認識しかつ切断する原核性免疫系の一部であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する遺伝子編集の分野に関する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＤＮＡの部位特異的切断を誘導するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と称される単一のヌクレアーゼに依拠する。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される短鎖ＲＮＡ分子により特定のＤＮＡ配列にガイドされる。ガイドＲＮＡは、ｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても公知）およびｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内に含有される場合があり、またはデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の２つの別々のＲＮＡ分子中に含有される場合がある。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と称される。
【０００４】
オリゴヌクレオチド、特にＲＮＡは、時としてエンドヌクレアーゼ切断またはエキソヌクレアーゼ切断により細胞中および血清中で分解される場合がある。そのような分解を防止し、ｇＲＮＡの安定性を改善し、かつ遺伝子編集効率を増進させるための改善された方法および組成物が、特に治療応用のために望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一部の実施形態では、修飾ガイドＲＮＡを含む治療用ゲノム編集ツールが提供される。本明細書に記載される修飾ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の安定性を改善し、かつ標的ＤＮＡを切断するＣａｓ９（例えば、ＳｐｙＣａｓ９および同等物）の活性を改善し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｄｇＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡである。
【０００６】
本明細書に記載されるガイドＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、Ｇ−Ｃ置換、ならびにヌクレオチドおよびその同等物間の逆位脱塩基連結を含んでもよい。本発明の実施形態は以下を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’末端修飾ならびに上部ステム領域；ヘアピン１領域；およびヘアピン２領域のうちの１つまたは複数中に１つまたは複数の修飾を含んで包含され、５’末端修飾は、５’終端の５’末端における最初の７個のヌクレオチドの中に少なくとも２つのホスホロチオエート連結を含む。一部の事例では、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドである。
【０００８】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＵＳ１〜ＵＳ１２において修飾を含み、かつ／またはＨ１−１において修飾を含み、かつ／またはＨ２−１の中に修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２および／またはＨ２−１〜Ｈ２−１５において修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、上方ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のそれぞれの中に１つまたは複数の修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間に修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、下部ステム領域中に修飾を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端および／または３’終端において修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端の中の３’末端修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つにおいて修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の中の５’末端修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つで修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端の中に３’末端修飾を含み、かつ５’終端の中に５’末端修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つにおいて、および５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つにおいて修飾を含む。一部の事例では、これらの修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、またはヌクレオチドを連結するホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つおよび／または５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つの間にＰＳ結合を含む。一部の事例では、ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載される１つより多くの修飾、例えばＰＳ結合および２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有する５’終端および３’終端を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、バルジ領域中に修飾を含む。一部の実施形態では、バルジ領域中のヌクレオチドの５０％は修飾されており、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
【００１１】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ネクサス領域中に修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ネクサス領域中のＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８において修飾を含み、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。一部の事例では、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８はＰＳ結合により連結されている。
【００１２】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、少なくとも、修飾された５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端の３’末端における最後の３個のヌクレオチドを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端および／または５’終端において修飾を含む。一部の事例では、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている。一部の実施形態では、５’および３’修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅを含む。一部の実施形態では、５’および３’修飾は２’−Ｆを含む。一部の実施形態では、５’および／または３’修飾は、ヌクレオチドを連結するＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、５’および／または３’修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、およびヌクレオチドを連結するＰＳ結合のうちの１つまたは複数を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおいて修飾を含む。一部の事例では、これらの修飾は、連結するＰＳ結合（すなわち、最初の４個のヌクレオチドおよび最後の４個のヌクレオチドを連結するＰＳ結合）である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端の３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾をさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおいて修飾を含み、修飾は少なくとも、４個のヌクレオチドを連結するＰＳ結合であり、さらに、５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端の３’末端における最後の３個のヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、または２’−Ｆ修飾を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、修飾ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２を含み、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
【００１７】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、バルジ領域中のヌクレオチドのそれぞれにおいて修飾を含み、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
【００１８】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれにおいて修飾を含み、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
【００１９】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン１領域中のヌクレオチドのそれぞれにおいて修飾を含み、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
【００２０】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン２領域中のヌクレオチドのそれぞれにおいて修飾を含み、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
【００２１】
一部の実施形態では、以下の位置：
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドと、
ｂ．下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２と、
ｃ．バルジ領域中のＢ１および／またはＢ２と、
ｄ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、
ｅ．ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８と、
ｆ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｇ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡが包含される。
一部の実施形態では、Ｂ３〜Ｂ６は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の事例では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＬＳ９およびＬＳ１０において２’−Ｆ修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８において２’Ｆ修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５において２’Ｆ修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端の３’末端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおいて２’Ｆ修飾を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、以下の位置：
ａ．下部ステム領域中のＬＳ９およびＬＳ１０と、
ｂ．ネクサス領域中のＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、
ｃ．ヘアピン２領域中のＨ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５と、において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡが包含される。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、また３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドの３つにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１および／またはＬＳ６における任意選択の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の任意選択の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００２４】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端の５’末端における最初の個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１〜ＬＳ６における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’終末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００２５】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ２〜ＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００２６】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、
かつ任意選択で、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００２７】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、
かつ任意選択で、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００２８】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における２’−Ｏ−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００２９】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００３０】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００３１】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ２−１〜Ｈ２−８における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−９〜Ｈ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００３２】
一部の実施形態では、
ａ．５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、およびＨ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド；と、
ｄ．Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、およびＨ１−１１における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２；およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１；Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後から２つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｉ．３’終端の３’末端における最後から３つ目および最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含み、
かつ任意選択で、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００３３】
一部の実施形態では、
ａ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５と、
ｂ．ＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１；Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、を含み、かつ任意選択で、
５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含み、かつ任意選択で、
ｃ．３’終端の３’末端における最後および最後から３つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド；および／または
ｄ．３’終端の３’末端における最後から２つ目、最後から４つ目、および／または最後のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含んで、ｓｇＲＮＡが包含される。
【００３４】
一部の実施形態では、表４の修飾を含む配列番号２２８〜３５３のうちのいずれかの核酸を含んでｓｇＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、表４の修飾を含む配列番号２２８〜３３２のうちのいずれかを含んでｓｇＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、表４の修飾を含む配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれかを含んでｓｇＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、配列番号２４０を含んでｓｇＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、表４の修飾を含む配列番号２４０を含んでｓｇＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、配列番号２４２を含んでｓｇＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、配列番号３５８を含んでｓｇＲＮＡが包含される。追加の実施形態では、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、表４における参照配列識別子のヌクレオチドに対応するｓｇＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が表４における参照配列識別子に示される修飾と同一または同等であるｓｇＲＮＡは、任意選択で、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン１領域中のヌクレオチドを連結する少なくとも３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン２領域中のヌクレオチドを連結する少なくとも３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、上部ステム領域中のヌクレオチドを連結する少なくとも３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９とリボ核タンパク質複合体を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡ（ＴＲ０００００２）と共に修飾ｃｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウストランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の次世代配列（ＮＧＳ）によって測定された編集パーセントを示す。
【図２】図２は、非修飾ｃｒＲＮＡ（ＣＲ０００６８６）およびＣａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図３】図３は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡならびに親配列においては見られないＧ−Ｃペアリングを有するｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図４】図４は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。標準偏差が値の後に示されている。
【図５】図５は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｓｇＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図６】図６は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡ（ＴＲ０００００２）を用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。星印は、技術的理由によりこの実験において活性を示さなかったデュアルガイドを表す。このデュアルガイドは図９に表す実験において再び試験され、該試験において編集活性を示した。
【図７】図７は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に非修飾ｃｒＲＮＡ（ＣＲ０００６８６）および修飾ｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図８】図８は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡならびに親配列においては見られないＧ−ＣペアリングまたはＧ−Ｕミスマッチを有するｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡペアリングを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図９】図９は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡおよび修飾ｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。標準偏差が値の後に示されている。
【図１０】図１０は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｓｇＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲ遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図１１】図１１は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｓｇＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウス第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）遺伝子のＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲのＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のＦＶＩＩのＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｔｒＲＮＡおよび非修飾ｃｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のマウスＴＴＲのＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に修飾ｔｒＲＮＡおよび非修飾ｃｒＲＮＡを用いたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のトランスフェクション後のＦＶＩＩのＮＧＳによって測定された編集パーセントを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中のインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−アルファ）レベルを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中のインターロイキン６（ＩＬ−６）レベルを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）レベルを示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）レベルを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１５Ａは肝臓における総編集パーセンテージを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１５Ｂは血清ＴＴＲレベルを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１５Ｃは図１５Ａの結果の平均および標準偏差を示す。
【図１５Ｄ】図１５ＤはＧ０００２０９  ｓｇＲＮＡ（配列番号２２８）への修飾を要約する。太字のヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されている。
【図１５Ｅ】図１５ＥはＧ０００２６７  ｓｇＲＮＡ（配列番号２３４）への修飾を要約する。太字のヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されている。
【図１６Ａ】図１６Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中のインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−アルファ）レベルを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）レベルを示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中のインターロイキン６（ＩＬ−６）レベルを示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）レベルを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１７Ａは肝臓における総編集パーセンテージを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１７Ｂは図１７Ａの結果の平均および標準偏差を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１７Ｃは血清ＴＴＲレベルを示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１７Ｄは図１７Ｂの結果の平均および標準偏差を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１８Ａは肝臓における総編集のパーセンテージを示す。ＭＰＫ＝ミリグラム／キログラム；ＢＬＯＤ＝検出レベル未満である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１８Ｂは肝臓の編集データを要約する。ＭＰＫ＝ミリグラム／キログラム；ＢＬＯＤ＝検出レベル未満である。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図１８Ｃは血清ＴＴＲレベルを示す。ＭＰＫ＝ミリグラム／キログラム；ＢＬＯＤ＝検出レベル未満である。
【図１９Ａ】図１９Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中のインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−アルファ）レベルを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）レベルを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中のインターロイキン６（ＩＬ−６）レベルを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の血清中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）レベルを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のＦＶＩＩ遺伝子座の肝臓における編集を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のＴＴＲ遺伝子座の肝臓における編集を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、注釈したｓｇＲＮＡ（配列番号３４１）の図式を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、注釈なしのｄｇＲＮＡ  ＣＲ０００６８６（配列番号１）およびＴＲ０００００２（配列番号１８８）の図式を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、注釈したｄｇＲＮＡ  ＣＲ０００６８６（配列番号１）およびＴＲ０００００２（配列番号１８８）の図式を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図２２Ａは肝臓におけるＴＴＲ遺伝子座の総編集のパーセンテージを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図２２Ｂは肝臓の編集データを要約する。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図２２Ｃは血清ＴＴＲレベルを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図２３Ａは肝臓におけるＴＴＲ遺伝子座の総編集のパーセンテージを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図２３Ｂは肝臓の編集データを要約する。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後のｉｎ  ｖｉｖｏの結果を示す。図２３Ｃは血清ＴＴＲレベルを示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後の初代マウス肝細胞における編集を示す。図２４ＡはＴＴＲ遺伝子座の総編集の編集パーセンテージを示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後の初代マウス肝細胞における編集を示す。図２４Ｂは、ＥＣ５０を算出するために使用したｍＲＮＡ用量の関数として編集パーセンテージの正規化された変換を示す。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの投与後の初代マウス肝細胞における編集を示す。図２４Ｃは試験したＬＮＰに対するＥＣ５０値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
遺伝子編集方法において使用するためのデュアルガイドＲＮＡおよびシングルガイドＲＮＡを含む修飾ガイドＲＮＡが本明細書で提供される。修飾ガイドは、それらの非修飾対応物と比較してより安定であり、かつ改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す。操作および試験したガイドＲＮＡの配列を表４に示す。
【表１】
2019536464.tif 000002
2019536464.tif 000003
2019536464.tif 000004
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【００３７】
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、総称的にｓｇＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても公知）、またはｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡとしても公知）のいずれかを指すために本明細書で交換可能に使用される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子上に会合していてよく（シングルガイドＲＮＡ［ｓｇＲＮＡ］）、または２つの別々のＲＮＡ分子中にあってもよい（デュアルガイドＲＮＡ［ｄｇＲＮＡ］）。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は各種類を指す。
【００３８】
ｔｒＲＮＡ配列は天然に存在するものであってよく、またはｔｒＲＮＡ配列は天然に存在する配列と比較して修飾またはバリエーションを含んでもよい。
【００３９】
本明細書で使用される「編集効率」または「編集パーセンテージ」または「編集パーセント」は、Ｃａｓ  ＲＮＰによる切断後の配列リードの総数に対する対象の標的領域へのヌクレオチドの挿入または欠失を有する配列リードの総数である。
【００４０】
本明細書で使用される「ヘアピン」は、核酸鎖がフォールディングして同じ鎖の別の区分と塩基対を形成した時に作られる核酸のループを表す。ヘアピンは、ループまたはＵ字形を含む構造を形成する場合がある。一部の実施形態では、ヘアピンはＲＮＡループを含んでもよい。ヘアピンは、結合して一緒になった単一の核酸分子中で、分子のフォールディングまたはリンクリング（wrinkling）と共に、２つの相補的配列により形成することができる。一部の実施形態では、ヘアピンはステムまたはステムループ構造を含む。
【００４１】
本明細書で使用される「領域」は、核酸の保存された群を表す。領域はまた、「モジュール」または「ドメイン」と称される場合もある。ｇＲＮＡの領域は特定の機能を行う場合があり、例えば、Briner AE et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014)に記載されるように、ＲＮＰのエンドヌクレアーゼ活性を方向付ける。ｇＲＮＡの領域は表１〜３に記載される。
【００４２】
本明細書で使用される「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、例えば、Ｃａｓタンパク質などのヌクレアーゼと一緒になったｇＲＮＡを表す。一部の実施形態では、ＲＮＰはＣａｓ９およびｇＲＮＡを含む。
【００４３】
本明細書で使用される「ステムループ」は、対形成していない核酸のループで終わる塩基対を形成した「ステム」を形成するヌクレオチドの二次構造を表す。ステムは、同じ核酸鎖の２つの領域の配列が反対方向に読まれた時に少なくとも部分的に相補的である場合に形成される場合がある。本明細書で使用される「ループ」は、ステムをキャップする場合がある塩基対形成していない（すなわち、相補的でない）ヌクレオチドの領域を表す。「テトラループ」は４個のヌクレオチドのループを表す。本明細書で使用される場合、ｓｇＲＮＡの上部ステムはテトラループを含んでもよい。
【００４４】
ｄｇＲＮＡを伴うある特定の実施形態では、本明細書で使用される「ステム」領域は、ｃｒＲＮＡのある特定の領域とｔｒＲＮＡのある特定の領域（例えば、各ＲＮＡの下部ステム領域と上部ステム領域）との間に塩基対を形成した領域を形成するヌクレオチドの二次構造を表す。ｄｇＲＮＡの「ステム」領域は、当該技術分野において「フラッグポール」領域と称されてもよい。
【００４５】
本明細書で使用される「治療」は、対象における疾患のための治療的な任意の投与または塗布を包含し、また疾患を抑制し、その進行を阻み、疾患の１つもしくは複数の症状を緩和し、疾患を治癒し、または疾患の１つもしくは複数の症状の再発を予防することを含む。
【００４６】
１．修飾の種類
Ａ．２’−Ｏ−メチル修飾
修飾された糖は、相補鎖にとってのオリゴヌクレオチド結合親和性、デュプレックス形成、およびヌクレアーゼとの相互作用に影響する物理的性質である、ヌクレオチドの糖環のパッカリングを制御すると考えられている。したがって、糖環上の置換は、これらの糖の確認およびパッカリングを変化させることができる。例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾は、オリゴヌクレオチドの結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させることができるが、実施例に示されるように、オリゴヌクレオチド中の所与の位置における任意の修飾の効果は経験的に決定される必要がある。
【００４７】
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを表すために使用される場合がある。
【００４８】
２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとしてのリボヌクレオチドの修飾は以下の通りに描写することができる：
【化１】
2019536464.tif 000028
【００４９】
Ｂ．２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）であってもよい。２’−Ｏ−ｍｏｅリボヌクレオチドとしてのリボヌクレオチドの修飾は以下の通りに描写することができる：
【化２】
2019536464.tif 000029
【００５０】
「ｍｏｅＡ」、「ｍｏｅＣ」、「ｍｏｅＵ」、または「ｍｏｅＧ」という用語は、２’−Ｏ−ｍｏｅで修飾されたヌクレオチドを表すために使用される場合がある。
【００５１】
Ｃ．２’−フルオロ修飾
ヌクレオチドの糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾はハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチドの糖環上の２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチドの結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
【００５２】
本出願において、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’−Ｆで置換されたヌクレオチドを表すために使用される場合がある。
【００５３】
２’−Ｆの置換は以下の通りに描写することができる：
【化３】
2019536464.tif 000030
【００５４】
Ｄ．ホスホロチオエート修飾
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合は、ホスホジエステル連結中、例えばヌクレオチド塩基間の結合中の１つの非架橋性リン酸酸素を硫黄が置換している結合を指す。オリゴヌクレオチドを生成するためにホスホロチオエートが使用される場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ−オリゴと称される場合もある。
【００５５】
「＊」はＰＳ修飾を描写するために使用される場合がある。本出願において、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語は、次（例えば、３’）のヌクレオチドにＰＳ結合で連結されたヌクレオチドを表すために使用される場合がある。
【００５６】
本出願では、「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」という用語は、２’−Ｏ−Ｍｅで置換され、かつ次（例えば、３’）のヌクレオチドにＰＳ結合で連結されたヌクレオチドを表すために使用される場合がある。同様に、「ｆＡ＊」、「ｆＣ＊」、「ｆＵ＊」または「ｆＧ＊」という用語は、２’−Ｆで置換され、かつ次（例えば、３’）のヌクレオチドにＰＳ結合で連結されたヌクレオチドを表すために使用される場合がある。ＰＳ連結または結合の同等物は、本明細書に記載される実施形態に包含される。
【００５７】
以下の図解は、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生成する、Ｓ−による非架橋性リン酸酸素への置換を示す：
【化４】
2019536464.tif 000031
【００５８】
Ｅ．Ｇ−Ｃ置換
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾を含まない配列置換により修飾されている。一部の実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、親ｇＲＮＡ配列においては見られない（例えば、下部ステム領域および／または上部ステム領域中の）Ｇ−Ｃペアリングを用いて操作されている。一部の実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、親ｇＲＮＡ配列においては見られないＧ−Ｕミスマッチ（「ＧＵウォブル」またはミスマッチペアリング）により操作されている。
【００５９】
Ｆ．逆位脱塩基修飾
脱塩基ヌクレオチドは、窒素塩基を欠くヌクレオチドを指す。下記の図は、塩基を欠いた脱塩基（脱プリン塩基としても公知）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する：
【化５】
2019536464.tif 000032
【００６０】
逆位塩基は、通常の５’から３’への連結から逆転した連結（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）を有する塩基を指す。例えば：
【化６】
2019536464.tif 000033
【００６１】
脱塩基ヌクレオチドは、逆位連結により結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への連結を介して終端部の５’ヌクレオチドへと結合される場合があり、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への連結を介して終端部の３’ヌクレオチドへと結合される場合がある。終端部の５’または３’のいずれかのヌクレオチドにおける逆位脱塩基ヌクレオチドも、逆位脱塩基末端キャップと呼ばれる場合がある。本出願において、「ｉｎｖｄ」という用語は、逆位脱塩基ヌクレオチド連結を指し示す。
【００６２】
上記修飾およびそれらの同等物は、本明細書に記載される実施形態の範囲内に包含される。
【００６３】
２．ガイドＲＮＡ組成物
ガイドＲＮＡを含む組成物が包含される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡとして１つのＲＮＡ分子上にｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｄｇＲＮＡとして２つのＲＮＡ分子上にｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む。ｄｇＲＮＡにおいて、２つのＲＮＡ分子は塩基対形成を介して会合してもよい。
【００６４】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは５’終端領域を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは５’終端領域を含まない。一部の実施形態では、５’終端領域は、ｓｇＲＮＡについて（但し、本明細書においては全てのガイドＲＮＡに適用可能である）Briner AE et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014)に記載される「スペーサー」領域を含む。一部の実施形態では、５’終端領域は５’末端修飾を含む。スペーサー領域を有するまたは有しない５’終端領域は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、および／またはｄｇＲＮＡと会合していてもよい。スペーサー領域は、時として本明細書においておよびその他により、「ガイド領域」、「ガイドドメイン」または「標的化ドメイン」とも称される。本明細書で使用される「標的配列」は、ガイド領域／ドメインが切断のためにヌクレアーゼをそれに対して方向付ける核酸の配列を指す。一部の実施形態では、ｓｐｙＣａｓ９タンパク質は、スペーサー領域中に存在するヌクレオチドにより標的核酸分子の標的配列にガイド領域／ドメインにより方向付けられてもよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはスペーサー領域を含まない。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡは、表４に示される配列のうちのいずれかを含むまたはそれからなる。しかしながら、配列がガイド／スペーサー領域を示す場合、組成物はこの領域を含んでもよく、または含まなくてもよいことを認識するべきであることに留意されたい。さらに、表４に示され、表４において配列番号により特定される配列のうちのいずれかの修飾を含むガイドＲＮＡが包含される。すなわち、ヌクレオチドは同じであってもよく、または異なっていてもよいが、示される修飾パターンは表４のガイド配列の修飾パターンと同じであってもよく、または類似であってもよい。修飾パターンは、ｇＲＮＡの修飾の相対位置および同一性またはｇＲＮＡの領域（例えば、５’終端領域、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、３’終端領域）を含む。一部の実施形態では、修飾パターンは、表４の配列欄に示される配列のうちのいずれか１つの修飾、または該配列の１つもしくは複数の領域にわたる修飾の少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％を含有する。一部の実施形態では、修飾パターンは、表４の配列欄に示される配列のうちのいずれか１つの修飾パターンに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、表４に示される配列の１つまたは複数の領域、例えば、５’終端領域、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、および／または３’終端領域にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。例えば、一部の実施形態では、修飾パターンが５’終端領域にわたる配列の修飾パターンに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンが下部ステムにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンがバルジにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンが上部ステムにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンがネクサスにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンがヘアピン１にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンがヘアピン２にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンが３’終端にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一であるガイドＲＮＡが包含される。一部の実施形態では、修飾パターンは、０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドにおける、表４の配列、またはそのような配列の領域（例えば、５’終端、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’終端）の修飾パターンとは異なる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドにおける表４の配列の修飾とは異なる修飾を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドにおける表４の配列の領域（例えば、５’終端、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’終端）の修飾とは異なる修飾を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡはヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、または５’末端修飾および３’末端修飾を含む。一部の実施形態では、５’末端修飾はヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合と、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドのうちの１つまたは複数と、を含む。末端修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾を含んでもよい。同等の末端修飾もまた本明細書に記載される実施形態に包含される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの１つまたは複数の領域の修飾と組み合わせて末端修飾を含む。
【００６８】
Ａ．ｓｇＲＮＡの組成物
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼを標的ＤＮＡ配列に方向付けるｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは１つのＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）上に会合していてもよい。
【００６９】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号２２８〜３３２に記載される配列のうちのいずれか１つを含むまたはそれからなるｓｇＲＮＡを含む。
【００７０】
一部の実施形態では、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９の修飾配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９の修飾配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡであって、標的配列に相補的であり、かつＣａｓ９をその切断のための標的に方向付ける５’「スペーサー」配列（「ガイド配列」）をさらに含むｓｇＲＮＡが包含される。一部の事例では、本発明は、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一であるｓｇＲＮＡを含む。
【００７１】
１．ｓｇＲＮＡのドメイン
Briner AE et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014)には、標的化に関与する「スペーサー」ドメイン、「下部ステム」、「バルジ」、「上部ステム」（テトラループを含む場合がある）、「ネクサス」、ならびに「ヘアピン１」ドメインおよび「ヘアピン２」ドメインなどのｓｇＲＮＡの機能性ドメイン（本明細書において「ドメイン」と称される）が記載されている。Briner et al.、第３３４頁、図１Ａを参照のこと。
【００７２】
表１および図２１Ａは、本明細書で使用されるｓｇＲＮＡのドメインの説明を提供する。表１において、領域間の「ｎ」は、可変数のヌクレオチド、例えば、０から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多くのヌクレオチドを表す。一部の実施形態では、ｎは０に等しい。一部の実施形態では、ｎは１に等しい。
【表２】
2019536464.tif 000034
【００７３】
ａ）５’終端領域
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、表１に示されるように５’終端においてヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡの５’終端は、Ｃａｓタンパク質を標的ヌクレオチド配列へと方向付けるように機能するスペーサーまたはガイド領域を含む。一部の実施形態では、５’終端はスペーサーまたはガイド領域を含まない。一部の実施形態では、５’終端は、Ｃａｓタンパク質を標的ヌクレオチド領域へと方向付けるように機能しないスペーサーおよび追加のヌクレオチドを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、ガイド領域は、ｓｇＲＮＡの５’末端において最初の１〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイド領域は２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイド領域は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、もしくは２５個またはそれより多くのヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド領域は１７個のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド領域は１８個のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド領域は１９個のヌクレオチドを含んでもよい。
【００７５】
一部の実施形態では、ガイド領域の選択は、編集のための対象の遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。例えば、一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、対象の遺伝子の標的配列に相補的なガイド領域を含む。
【００７６】
一部の実施形態では、対象の遺伝子中の標的配列はｓｇＲＮＡのガイド領域に相補的であってもよい。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域と対象の遺伝子中のその対応する標的配列との相補性または同一性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってもよい。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は１００％相補的または同一であってもよい。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は少なくとも１つのミスマッチを含有してもよい。例えば、ｓｇＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的配列は、標的配列の全長が少なくとも約１７個、１８個、１９個、２０個またはそれより多くの塩基対である場合、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のミスマッチを含有してよい。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は、ガイド配列が少なくとも約１７個、１８個、１９個、２０個またはそれより多くのヌクレオチドを含む場合、１〜６個のミスマッチを含有してよい。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は、ガイド配列が約２０個のヌクレオチドを含む場合、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のミスマッチを含有してよい。５’終端は、ガイド領域とは考えられない（すなわち、Ｃａｓ９タンパク質を標的核酸に方向付けるように機能しない）ヌクレオチドを含んでもよい。
【００７７】
ｂ）下部ステム
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、直線的に見た時にバルジおよび上部ステム領域により分離された下部ステム（ＬＳ）領域を含む。表１を参照のこと。
【００７８】
一部の実施形態では、下部ステム領域は、１〜１２個のヌクレオチドを含み、例えば、一実施形態では、下部ステム領域はＬＳ１〜ＬＳ１２を含む。一部の実施形態では、下部ステム領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、下部ステム領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。下部ステム領域が表１および図２１Ａの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチド含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持されるべきである。
【００７９】
一部の実施形態では、下部ステム領域は、反対方向に読まれた時に核酸配列が相補的なヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、下部ステムの核酸配列における相補性は、ｓｇＲＮＡ中のステムの二次構造に繋がる（例えば、該領域は互いに塩基対形成する場合がある）。一部の実施形態では、下部ステム領域は、反対方向に読まれた時に互いに完全には相補的でなくてもよい。
【００８０】
ｃ）バルジ
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、６個のヌクレオチドＢ１〜Ｂ６を含むバルジ領域を含む。直線的に見た時に、バルジ領域は２つの領域に分離される。表１を参照のこと。一部の実施形態では、バルジ領域は６個のヌクレオチドを含み、最初の２個のヌクレオチドには上部ステム領域が後続し、上部ステム領域にはバルジの最後の４個のヌクレオチドが後続する。一部の実施形態では、バルジ領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、バルジ領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。バルジ領域が表１および図２１Ａの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持されるべきである。
【００８１】
一部の実施形態では、バルジの存在は、ｓｇＲＮＡ中の上部ステムモジュールと下部ステムモジュールとの間の方向性キンクを結果としてもたらす。
【００８２】
ｄ）上部ステム
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１２個のヌクレオチドを含む上部ステム領域を含む。一部の実施形態では、上部ステム領域はループ配列を含む。一部の事例では、ループはテトラループ（４個のヌクレオチドからなるループ）である。
【００８３】
一部の実施形態では、上部ステム領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、上部ステム領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。上部ステム領域が表１および図２１Ａの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持されるべきである。
【００８４】
一部の実施形態では、上部ステム領域は、反対方向に読まれた時に核酸配列が相補的なヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、上部ステムの核酸配列における相補性は、ｓｇＲＮＡ中のステムの二次構造に繋がる（例えば、該領域は互いに塩基対形成する場合がある）。一部の実施形態では、上部ステム領域は、反対方向に読まれた時に互いに完全には相補的でなくてもよい。
【００８５】
ｅ）ネクサス
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、下部ステム領域とヘアピン１領域との間に位置するネクサス領域を含む。一部の実施形態では、ネクサスは１８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ネクサス領域は、表１および図２１Ａに示されるように、ヌクレオチドＮ１からＮ１８を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、ネクサス領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ネクサス領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも多いヌクレオチドを含む。ネクサス領域が表１および図２１Ａの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持されるべきである。
【００８７】
一部の実施形態では、ネクサス領域は、反対方向に読まれた時に核酸配列が相補的なヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、核酸配列における相補性は、ｓｇＲＮＡ中のステムおよび／またはステムループの二次構造に繋がる（例えば、ネクサス領域中のある特定のヌクレオチドは互いに塩基対形成する場合がある）。一部の実施形態では、ネクサス領域は、反対方向に読まれた時に互いに完全には相補的でなくてもよい。
【００８８】
ｆ）ヘアピン
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは１つまたは複数のヘアピン領域を含む。一部の実施形態では、ヘアピン領域はネクサス領域の下流（例えば、３’）にある。一部の実施形態では、ネクサス領域のすぐ下流のヌクレオチドの領域は「ヘアピン１」または「Ｈ１」と称される。一部の実施形態では、ヘアピン１の３’のヌクレオチドの領域は「ヘアピン２」または「Ｈ２」と称される。一部の実施形態では、ヘアピン領域はヘアピン１およびヘアピン２を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡはヘアピン１またはヘアピン２のみを含む。
【００８９】
一部の実施形態では、ヘアピン１領域は、ネクサス領域のすぐ下流の１２個の核酸を含む。一部の実施形態では、ヘアピン１領域は、表１および図２１Ａに示されるように、ヌクレオチドＨ１−１からＨ１−１２を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、ヘアピン２領域は、ヘアピン１領域の下流の１５個の核酸を含む。一部の実施形態では、ヘアピン２領域は、表１および図２１Ａに示されるように、ヌクレオチドＨ２−１からＨ２−１５を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドがヘアピン１領域とヘアピン２領域との間に存在する。ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の１つまたは複数のヌクレオチドは、修飾されていてもよく、または非修飾であってもよい。一部の実施形態では、ヘアピン１およびヘアピン２は、１個のヌクレオチドにより分離されている。一部の実施形態では、ヘアピン領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヘアピン領域は、表１および図２１Ａに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。ヘアピン領域が表１および図２１Ａの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持されるべきである。
【００９２】
一部の実施形態では、ヘアピン領域は、反対方向に読まれた時に核酸配列が相補的なヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ヘアピン領域は、反対方向に読まれた時に互いに完全には相補的でなくてもよい（例えば、ヘアピンのトップまたはループは、対形成していないヌクレオチドを含む）。
【００９３】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヌクレオチド「ｎ」でのヘアピン１の置換を含み、「ｎ」は、１と、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、および２との間の整数である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのヘアピン１領域は２ヌクレオチドにより置換される。
【００９４】
ｇ）３’終端領域
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域（複数可）の後にヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、例えば、ヘアピンの二次構造と会合しない１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個もしくは２０個またはそれより多くのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１個、２個、３個、または４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１個、２個、または３個のヌクレオチドを含む。
【００９５】
２．ｓｇＲＮＡの修飾
一部の実施形態では、本発明は、以下の領域：５’終端におけるヌクレオチド；下部ステム領域；バルジ領域；上部ステム領域；ネクサス領域；ヘアピン１領域；ヘアピン２領域；および３’ 終端におけるヌクレオチドのうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾を含むｓｇＲＮＡを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾はヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、その５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、または４つにおいて修飾を含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の３個または４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の３個または４個のヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドと３’終端における最後の４個のヌクレオチドとはホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｆを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−ｍｏｅを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、または４つにおいて修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、または４つにおいて修飾を含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドはＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドはＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドは２’−Ｆ修飾を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されているｓｇＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのバルジ領域中のヌクレオチドのそれぞれは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡの上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのヘアピン１領域中のヌクレオチドのそれぞれは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのヘアピン２領域中のヌクレオチドのそれぞれは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。
【０１０１】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、以下のヌクレオチド：５’終端における最初の３個のヌクレオチド；ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２；バルジ領域中のＢ１およびＢ２；ｓｇＲＮＡの上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれ；ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８；ヘアピン１領域中のヌクレオチドのそれぞれ；ヘアピン２領域中のヌクレオチドのそれぞれ；および３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸、および３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＳ９およびＬＳ１０は２’−Ｆで修飾されている。一部の実施形態では、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は２’−Ｆで修飾されている。一部の実施形態では、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、ＨＳ−１４、およびＨ２−１５は２’−Ｆで修飾されている。一部の実施形態では、３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドは２’−Ｆで修飾されている。
【０１０３】
一部の実施形態では、以下のヌクレオチド：下部ステム領域中のＬＳ９およびＬＳ１０；ネクサス領域中のＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８；ならびにヘアピン２領域中のＨ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、ＨＳ−１４、およびＨ２−１５において２’−Ｆ修飾核酸を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含み、かつ３’終端における最後の４個のヌクレオチドのうちの３つにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ１〜ＬＳ６における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ２〜ＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における２’−Ｏ−Ｆ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１〜Ｈ２−８における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−９〜Ｈ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、およびＨ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、およびＨ１−１１における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後から２つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後から３つ目、および最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、ヌクレオチドＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、かつＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１；Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４において２’−Ｆ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が本明細書に開示される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’終端における最後および最後から３つ目のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ３’終端における最後から２つ目および最後から３つ目のヌクレオチドにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、配列番号２２８〜２３２のうちのいずれか１つの核酸を含むｓｇＲＮＡが本明細書に開示される。一部の実施形態では、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つの核酸を含むｓｇＲＮＡが本明細書に開示される。一部の実施形態では、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｓｇＲＮＡが本明細書に開示される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、５’末端修飾と、上部ステム領域；ヘアピン１領域；およびヘアピン２領域のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の修飾と、を含むｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’終端の最初の７個のヌクレオチド内に少なくとも２つのホスホロチオエート連結を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、５’末端修飾と、上部ステム領域；ヘアピン１領域；およびヘアピン２領域のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の修飾と、を含むｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ＲＮＡの５’末端において１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のホスホロチオエート結合（phorphorothioate bonds）は、５’終端のヌクレオチドを連結する。
【０１１７】
一部の実施形態では、５’末端修飾と、上部ステム領域；ヘアピン１領域；およびヘアピン２領域の１つまたは複数において１つまたは複数の修飾と、を含むｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’終端の最初の７個のヌクレオチド内に１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、配列番号２２８〜３３２の修飾ｓｇＲＮＡ配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡが提供される。
【０１１９】
一部の実施形態では、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９の修飾ｓｇＲＮＡ配列のうちのいずれか１つを含むまたはそれからなるｓｇＲＮＡが提供される。
【０１２０】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９の修飾配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを含み、ｓｇＲＮＡは、標的配列に少なくとも部分的に相補的であり、かつＣａｓ９をその標的に切断のために方向付ける５’スペーサー配列をさらに含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つのヌクレオチドに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有するヌクレオチドを含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｓｇＲＮＡを含む。すなわち、ヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、およびＧは、配列に示されるものと比較して９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％異なっていてもよいが、修飾は変更しないままである。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明は、以下の領域：５’終端におけるヌクレオチド；下部ステム領域；バルジ領域；上部ステム領域；ネクサス領域；ヘアピン１領域；ヘアピン２領域；および３’終端におけるヌクレオチドのうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾を含むｓｇＲＮＡを含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾はヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、修飾は逆位脱塩基ヌクレオチドを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、５’終端中の最初の３個のヌクレオチドと、下部ステム中のＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２と、バルジ領域中のＢ１およびＢ２と、上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれと、ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、ヘアピン１領域中のヌクレオチドのそれぞれと、ヘアピン１とヘアピン２との間の１個のヌクレオチドと、ヘアピン２領域中のヌクレオチドのそれぞれと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含んで、ｓｇＲＮＡが提供される。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドの間の３つのＰＳ結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドの間の３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、５’終端中の最初の３個のヌクレオチドと、下部ステム中のＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２と、バルジ領域中のＢ１〜Ｂ６と、上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれと、ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、ヘアピン１領域中のヌクレオチドのそれぞれと、ヘアピン１とヘアピン２との間の１個のヌクレオチドと、ヘアピン２領域中のヌクレオチドのそれぞれと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含んで、ｓｇＲＮＡが提供される。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドの間の３つのＰＳ結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドの間の３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、下部ステム中のＬＳ９およびＬＳ１０と、ネクサス領域中の１５〜Ｎ１８と、ヘアピン２領域中のＨ２−９〜ＨＳ−１５と、３’終端領域中の最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドと、において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含んで、ｓｇＲＮＡが提供される。
【０１２７】
一部の実施形態では、下部ステム中の各ヌクレオチドと、ネクサス領域中の１５〜Ｎ１８と、ヘアピン２領域中のＨ２−９〜ＨＳ−１５と、３’終端領域中の最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドと、において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含んで、ｓｇＲＮＡが提供される。
【０１２８】
一部の実施形態では、ＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、Ｈ２−１５と、３’終端における最後および最後から３つ目のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含み、かつＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、Ｈ２−１４と、３’終端における最後から２つ目および最後から４つ目のヌクレオチドと、において２’−Ｆ修飾を含んで、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。
【０１２９】
以下の実施形態のそれぞれが包含される：
実施形態０１．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、以下の領域：
ａ．５’終端と、
ｂ．下部ステム領域と、
ｃ．バルジ領域と、
ｄ．上部ステム領域と、
ｅ．ネクサス領域と、
ｆ．ヘアピン１領域と、
ｇ．ヘアピン２領域と、
ｈ．３’終端と、のうちの１つまたは複数において１つまたは複数の修飾を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態０２．
修飾が２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１のｓｇＲＮＡ。
実施形態０３．
修飾が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１のｓｇＲＮＡ。
実施形態０４．
修飾がヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態１のｓｇＲＮＡ。
実施形態０５．
５’終端における最初の３個または４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の３個または４個のヌクレオチドが修飾されている、実施形態１〜３のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態０６．
５’終端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の４個のヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている、実施形態１〜５のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態０７．
修飾が２’−Ｏ−Ｍｅを含む、実施形態５のｓｇＲＮＡ。
実施形態０８．
修飾が２’−Ｆを含む、実施形態５のｓｇＲＮＡ。
実施形態０９．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、実施形態１〜７のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１０．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜８のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１１．
ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１〜１０のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１２．
バルジ領域中のヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１〜１１のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１３．
上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１〜１２のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１４．
ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１〜１３のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１５．
ヘアピン１領域中のヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１〜１４のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１６．
ヘアピン２領域中のヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１〜１５のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態１７．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、以下のヌクレオチド：
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドと、
ｂ．下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２領域と、
ｃ．バルジ領域中のＢ１およびＢ２と、
ｄ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、
ｅ．ネクサス領域中のＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、
ｆ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｇ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾核酸を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態１８．
Ｂ３〜Ｂ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態１７のｓｇＲＮＡ。
実施形態１９．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態１７のｓｇＲＮＡ。
実施形態２０．
ＬＳ９およびＬＳ１０が２’−Ｆで修飾されている、実施形態１〜１０のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態２１．
Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が２’−Ｆで修飾されている、実施形態１〜１０および２０のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態２２．
Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５が２’−Ｆで修飾されている、実施形態１〜１０および２０〜２１のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態２３．
３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドが２’−Ｆで修飾されている、実施形態１〜１０および２１〜２２のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態２４．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、以下の位置：
ａ．下部ステム領域中のＬＳ９およびＬＳ１０と、
ｂ．ネクサス領域中のＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、
ｃ．ヘアピン２領域中のＨ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５と、において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
実施形態２５．
３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態２４のｓｇＲＮＡ。
実施形態２６．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態２４または２５のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態２７．
５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、かつ３’終端における最後の４個のヌクレオチドの３つにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態２４〜２６のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態２８．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態２９．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態２８のｓｇＲＮＡ。
実施形態３０．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１〜ＬＳ６における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態３１．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態３０のｓｇＲＮＡ。
実施形態３２．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ２〜ＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
実施形態３３．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態３２のｓｇＲＮＡ。
実施形態３４．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態３５．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態３４のｓｇＲＮＡ。
実施形態３６．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態３７．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態３６のｓｇＲＮＡ。
実施形態３８．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における２’−Ｏ−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態３９．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態３２のｓｇＲＮＡ。
実施形態４０．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、 
ｇ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態４１．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態４０のｓｇＲＮＡ。
実施形態４２．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態４３．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態４３のｓｇＲＮＡ。
実施形態４４．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．Ｈ２−１〜Ｈ２−８における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−９〜Ｈ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．３’終端における最後から２つ目、最後から３つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態４５．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態４４のｓｇＲＮＡ。
実施形態４６．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｃ．Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、およびＨ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｄ．Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、およびＨ１−１１における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｆ．Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２；およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｇ．Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１；Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｈ．３’終端における最後から２つ目、および最後から４つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、
ｉ．３’終端における最後から３つ目、および最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態４７．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態４６のｓｇＲＮＡ。
実施形態４８．
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、
ａ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５と、
ｂ．ＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態４９．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態４８のｓｇＲＮＡ。
実施形態５０．
ａ．３’終端における最後および最後から３つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、
ｂ．３’終端における最後から２つ目および最後から３つ目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、をさらに含む、実施形態４８〜４９のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
実施形態５１．
配列番号２２８〜３３２のうちのいずれか１つの核酸を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態５２．
配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つの核酸を含む、ｓｇＲＮＡ。
実施形態５３．
配列番号２３５〜２４０、２６５〜２８５、および３０９〜３２９のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｓｇＲＮＡ。
実施形態５４．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態５１〜５３のいずれか１つのｓｇＲＮＡ。
【０１３０】
Ｂ．ｄｇＲＮＡの組成物
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼを標的ＤＮＡ配列に方向付けるｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは会合しているが、２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）上にある。
【０１３１】
表２および図２１Ｃは、本明細書で使用されるｃｒＲＮＡのドメインの説明を提供する。５’終端領域は、ｃｒＲＮＡの５’終端においてまたはその近くにスペーサー領域を含む場合があり、かつＣａｓ９を、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ中の標的領域に方向付けるように機能する場合がある。表２では、領域間の「ｎ」は、可変の数、例えば、０個から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多くのヌクレオチドを表す。一部の実施形態では、ｎは０に等しい。本明細書に記載される任意のｄｇＲＮＡは、任意のドメイン間の「ｎ」を含み得る。
【０１３２】
表３および図２１Ｃは、本明細書で使用されるｔｒＲＮＡのドメインの説明を提供する。表３では、領域間の「ｎ」は、可変の数、例えば、０個から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多くのヌクレオチドを表す。一部の実施形態では、ｎは０に等しい。本明細書に記載される任意のｄｇＲＮＡは、任意のドメイン間の「ｎ」を含み得る。
【０１３３】
１．ｄｇＲＮＡのドメイン
Briner 2014に記載される通り、ｄｇＲＮＡは、標的化に関与するスペーサードメイン、下部ステムドメイン、バルジドメイン、上部ステムドメイン、ネクサスドメイン、およびヘアピンドメインなどが挙げられる、本明細書において「ドメイン」と称される特定の機能性ドメインに基づいて開発することができる。ｄｇＲＮＡにおいて、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡの一部の構成成分を含み、かつ、ｔｒＲＮＡはｇＲＮＡの一部の構成成分を含む。
【０１３４】
ｃｒＲＮＡの領域を表２および図２１Ｃに提供する。ｔｒＲＮＡの領域を表３および図２１Ｃに提供する。図２１Ｃは例示的なｄｇＲＮＡの図式を示す。
【表３】
2019536464.tif 000035
【表４】
2019536464.tif 000036
【０１３５】
ａ）５’終端領域
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、表２〜３および図２１Ｃに示されるように、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの５’終端においてヌクレオチドを含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの５’終端は、Ｃａｓタンパク質を標的ヌクレオチド配列に方向付けるように機能するスペーサーまたはガイド領域を含む。一部の実施形態では、５’終端はスペーサーまたはガイド領域を含まない。一部の実施形態では、５’終端は、Ｃａｓタンパク質を標的ヌクレオチド領域に方向付けるように機能しないスペーサーおよび追加のヌクレオチドを含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、ガイド領域は、ｃｒＲＮＡの５’末端において最初の１〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイド領域は２０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイド領域は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、もしくは２５個またはそれより多くのヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド領域は１７個のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド領域は１８個のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド領域は１９個のヌクレオチドを含んでもよい。
【０１３８】
一部の実施形態では、ガイド領域の選択は、編集のための対象の遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。例えば、一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、対象の遺伝子の標的配列に相補的なガイド領域を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、対象の遺伝子中の標的配列は、ｃｒＲＮＡのガイド領域に対して相補的であってもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのガイド領域と対象の遺伝子中のその対応する標的配列との相補性または同一性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は１００％相補的または同一であってもよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は少なくとも１つのミスマッチを含有してもよい。例えば、ｃｒＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は、標的配列の全長が少なくとも約１７個、１８個、１９個、２０個またはそれより多くの塩基対である場合、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のミスマッチを含有してもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は、ガイド配列が少なくとも約１７個、１８個、１９個、２０個またはそれより多くのヌクレオチドを含む場合、１〜６個のミスマッチを含有してよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのガイド領域および対象の遺伝子の標的領域は、ガイド配列が約２０個のヌクレオチドを含む場合、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のミスマッチを含有してよい。
【０１４０】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは５’終端を含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、ｄｇＲＮＡの上部ステムを部分的に形成する５’終端を含む。ｔｒＲＮＡの５’終端は標的遺伝子の領域に対して相補的ではない。
【０１４１】
ｂ）下部ステム
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは下部ステム（ＬＳ）領域を含む。下部ステム領域は、図２１Ｃに描写されるように会合するｃｒＲＮＡ下部ステム領域およびｔｒＲＮＡ下部ステム領域を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの下部ステム領域はｔｒＲＮＡの下部ステム領域に対して少なくとも部分的に相補的である。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの下部ステム領域はｔｒＲＮＡの下部ステム領域に対して全体的に相補的である。
【０１４２】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの下部ステム領域はそれぞれ６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの下部ステム領域はそれぞれ、表２および表３ならびに図２１Ｃに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、下部ステム領域は、表２および表３ならびに図２１Ｃに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。下部ステム領域が表２および表３ならびに図２１Ｃの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの下部ステム中のヌクレオチドの数は、ｔｒＲＮＡの下部ステム中のヌクレオチドの数とは異なる。
【０１４３】
ｃ）バルジ
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡはバルジ（Ｂ）領域を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは１つのバルジ領域を含み、かつｔｒＲＮＡは１つのバルジ領域を含む。一部の実施形態では、各バルジ領域は１〜４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのバルジ領域は２個のヌクレオチドを含み、かつ、ｔｒＲＮＡのバルジ領域は４個のヌクレオチドを含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのバルジ領域は、ｃｒＲＮＡの下部ステム領域と上部ステム領域との間に位置する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのバルジ領域は２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのバルジ領域は、表２および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＢ１およびＢ２を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのバルジ領域は、ｔｒＲＮＡの上部ステム領域と下部ステム領域との間に位置する。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのバルジ領域は４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのバルジ領域は、表３および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＢ１からＢ４を含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、バルジの存在は、ｄｇＲＮＡ中の上部ステムモジュールと下部ステムモジュールとの間の方向性キンクを結果としてもたらす。ｃｒＲＮＡのバルジおよびｔｒＲＮＡのバルジは部分的に相補的であってもよい。ｃｒＲＮＡのバルジおよびｔｒＲＮＡのバルジは相補性を有しなくてもよい。
【０１４７】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡのバルジ領域は、表２および表３ならびに図２１Ｃに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。バルジ領域が表２および表３ならびに図２１Ｃの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのバルジ中のヌクレオチドの数は、ｔｒＲＮＡのバルジ中のヌクレオチドの数とは異なる。
【０１４８】
ｄ）上部ステム
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは上部ステム（ＵＳ）領域を含む。上部ステム領域は、図２１Ｃに描写されるように会合するｃｒＲＮＡ上部ステム領域およびｔｒＲＮＡ上部ステム領域を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの上部ステム領域は、ｔｒＲＮＡの上部ステム領域に対して少なくとも部分的に相補的である。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの上部ステム領域は、ｔｒＲＮＡの上部ステム領域に対して全体的に相補的である。
【０１４９】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの上部ステム領域は１４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡの上部ステム領域は１１個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの上部ステム領域はそれぞれ、表２および表３ならびに図２１Ｃに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの上部ステム領域は、表２および表３ならびに図２１Ｃに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。上部ステム領域が表２および表３ならびに図２１Ｃの図式に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持される。
【０１５０】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの上部ステムは、表２および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＵＳ１からＵＳ１４を含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡの上部ステムは、表３および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＵＳ１からＵＳ１１を含む。
【０１５２】
ｅ）ネクサス
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡはネクサス領域を含むｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ネクサスは、ｔｒＲＮＡの下部ステム領域とヘアピン１領域との間にある。一部の実施形態では、ネクサスは、ｔｒＲＮＡの下部ステムのすぐ下流に位置する。一部の実施形態では、ネクサスは１８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのネクサス領域は、表３および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＮ１〜Ｎ１８を含む。一部の実施形態では、ネクサスは、表３および図２１Ｃに示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのネクサス領域は、表３および図２１Ｃに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。ネクサス領域が表３および図２１Ｃに示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持される。
【０１５３】
一部の実施形態では、ネクサス領域は、反対方向に読まれた時に核酸配列が相補的なヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、核酸配列中の相補性は、ｓｇＲＮＡ中のステムおよび／またはステムループの二次構造に繋がる（例えば、ネクサス領域中のある特定のヌクレオチドは互いに塩基対形成する場合がある）。一部の実施形態では、ネクサス領域は、反対方向に読まれた時に互いに完全には相補的でなくてもよい。
【０１５４】
ｆ）ヘアピン
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン領域はネクサス領域の下流にある。一部の実施形態では、ネクサス領域のすぐ下流のヌクレオチドの領域は「ヘアピン１」と称される。一部の実施形態では、ヘアピン１領域のすぐ下流のヌクレオチドの領域は「ヘアピン２」と称される。一部の実施形態では、ヘアピン領域はヘアピン１およびヘアピン２を含む。一部の事例では、ヘアピン１およびヘアピン２は、１つまたは複数のヌクレオチド「ｎ」により分離されている。一部の実施形態では、ｎ＝１である。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡはヘアピン１またはヘアピン２のみを含む。
【０１５５】
２個のヌクレオチドによるｔｒＲＮＡのヘアピン１領域の置換は、Ｃａｓ  ＲＮＰの編集活性を可能とすることが示されている（米国特許公開第２０１５０３７６５８６号、図１６を参照のこと）。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡはヌクレオチド「ｎ」によるヘアピン１の置換を含み、「ｎ」は、１と５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、および２との間の整数である。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン１領域は２個のヌクレオチドにより置換されている。
【０１５６】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン１は、ネクサス領域のすぐ下流の１２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン１領域は、表３および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＨ１−１からＨ１−１２を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、非ヘアピンヌクレオチドがｔｒＲＮＡのヘアピン１領域とヘアピン２領域との間に存在する。一部の実施形態では、１〜２個の非ヘアピンヌクレオチドがヘアピン１とヘアピン２との間に存在する。
【０１５８】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン２はヘアピン１の後（３’）に１５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン２領域は、表３および図２１Ｃに示されるように、ヌクレオチドＨ２−１からＨ２−１５を含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン２領域は、表３に示されるように、ヌクレオチドＨ２−１からＨ２−１５を含み、かつ、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」は１または２である。
【０１５９】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン領域は、表３および図２１Ｃに示されるよりも多くのヌクレオチドを含む。ヘアピン領域が表３および図２１Ｃに示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかなように、修飾パターンは維持される。
【０１６０】
一部の実施形態では、ヘアピン領域は、反対方向に読まれた時に核酸配列が相補的なヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ヘアピン領域は、反対方向に読まれた時に互いに完全には相補的でなくてもよい（例えば、ヘアピンのトップまたはループは対形成していないヌクレオチドを含む）。
【０１６１】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡはヌクレオチド「ｎ」によるヘアピン１の置換を含み、「ｎ」は、１と５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、および２との間の整数である。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡのヘアピン１領域は２ヌクレオチドにより置換されている。
【０１６２】
ｇ）３’終端
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ヘアピン領域（複数可）の後（３’）に追加のヌクレオチドを含む３’終端領域を含むｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個もしくは２０個またはそれより多くのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１個、２個、３個、または４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’終端領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１個、２個、または３個のヌクレオチドを含む。
【０１６３】
２．ｄｇＲＮＡの修飾
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは非修飾ｃｒＲＮＡおよび修飾ｔｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は修飾を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドまたはｄｇＲＮＡ）となる。表２、表３、および図２１Ｃを参照のこと。
【０１６５】
一部の実施形態では、本発明は、ａ）配列番号１〜１８７のｃｒＲＮＡ配列のうちのいずれか１つ；およびｂ）配列番号１８８〜２２７に記載されるｔｒＲＮＡ配列のうちのいずれか１つを含むまたはそれからなるｄｇＲＮＡを含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、１〜１８７の修飾ｃｒＲＮＡ配列のうちのいずれか１つを含むｄｇＲＮＡが提供される。
【０１６７】
一部の実施形態では、１８８〜２２７の修飾ｔｒＲＮＡ配列のうちのいずれか１つを含むｄｇＲＮＡが提供される。
【０１６８】
一部の実施形態では、配列番号１９〜３１、５３〜７３、および１０４〜１３０の修飾ｃｒＲＮＡ配列のうちのいずれか１つを含むｄｇＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１９〜３１、５３〜７３、および１０４〜１３０の修飾配列のうちのいずれか１つを含むｄｇＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡは、標的配列に少なくとも部分的に相補的であり、かつ切断のためにＣａｓ９をその標的に方向付ける５’スペーサー配列をさらに含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１８７に記載される配列のうちのいずれか１つを含むｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１９〜３１、５３〜７３、および１０４〜１３０に記載される配列のうちのいずれか１つを含むまたはそれからなるｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１９〜３１、５３〜７３、および１０４〜１３０に記載される配列のうちのいずれか１つおよびスペーサー領域を含むｃｒＲＮＡを含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号：１８８〜２７７に記載される配列のうちのいずれか１つを含むまたはそれからなるｔｒＲＮＡを含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つのヌクレオチドに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有するヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含み、修飾パターンは参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である。すなわち、ヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、およびＧは、配列に示されるものと比較して９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％異なっていてもよいが、修飾は変更しないままである。
【０１７２】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１８８〜２７７のうちのいずれか１つのヌクレオチドに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有するヌクレオチドを含むｔｒＲＮＡを含み、修飾パターンは参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である。すなわち、ヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、およびＧは、配列に示されるものと比較して９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％異なっていてもよいが、各ヌクレオチド上の修飾は変更しないままである。
【０１７３】
３．修飾を有するｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、およびｄｇＲＮＡ
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’終端、下部ステム、バルジ、上部ステム、および３’終端のうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｆを含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、修飾は、１つまたは複数のヌクレオチドを連結するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、修飾は、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合である。
【０１７７】
一部の実施形態では、修飾は逆位脱塩基ヌクレオチドを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、上部ステム中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのＵＳ−１からＵＳ−１４はそれぞれ２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのＬＳ１およびＬＳ６は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのＬＳ５は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。
【０１７９】
一部の実施形態では、上部ステム中のヌクレオチドのそれぞれ、ならびに下部ステム中のＬＳ１およびＬＳ６において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、上部ステム中のヌクレオチドのそれぞれ、下部ステム中のＬＳ１、ＬＳ５、およびＬＳ６において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本発明は、下部ステム中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、バルジ領域中のＢ１およびＢ２のそれぞれにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、本発明は、下部ステム中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６において、ならびにバルジ領域中のＢ１およびＢ２のそれぞれにおいて２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、下部ステム領域中のヌクレオチドＬＳ１およびＬＳ６；バルジ領域中の核酸のそれぞれ；および上部ステム領域中の核酸のそれぞれにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのＬＳ５ヌクレオチドも２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡのＬＳ２、ＬＳ３、およびＬＳ４は修飾されていない。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６、ならびにバルジ領域中のヌクレオチドのそれぞれにおいて２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６、ならびにＢ２およびバルジ領域中のＢ２において２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、下部ステム領域中のＬＳ１〜ＬＳ６、およびバルジ領域中のヌクレオチドのそれぞれにおいて２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本発明は、以下の領域：５’終端、上部ステム領域；バルジ領域；下部ステム領域；ネクサス領域；ヘアピン１領域；ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の介在領域；ヘアピン２領域；および３’終端領域のうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むｔｒＲＮＡを含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅを含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、修飾は２’−Ｆを含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、修飾は、１つまたは複数のヌクレオチドを連結するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、修飾は、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合である。
【０１８８】
一部の実施形態では、修飾は逆位脱塩基ヌクレオチドを含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、上部ステム中の各核酸；バルジ領域中のＢ１およびＢ２；下部ステム領域中のＬＳ１およびＬＳ２；ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８；ヘアピン１領域中の各ヌクレオチド；ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の１個のヌクレオチド；およびヘアピン２領域中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、上部ステム中の各核酸；バルジ領域中の各ヌクレオチド；下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ２、ＬＳ５、およびＬＳ６；ネクサス領域中のＮ３〜Ｎ５、Ｎ１０〜Ｎ１８；ヘアピン１領域中の各ヌクレオチド；ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の１個のヌクレオチド；およびヘアピン２領域中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、ネクサス領域中のＮ１５からＮ１８において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、下部ステム領域中のＬＳ４およびＬＳ５、ならびにネクサス領域中のＮ１３〜Ｎ１８において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’および／または３’終端領域中、例えば、５’および／または３’末端修飾中に、１つまたは複数の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、下部ステム中のＬＳ１、ＬＳ３、およびＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、下部ステム中のＬＳ２、ＬＳ４、およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドと、を含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、以下の領域：５’終端における最初の５個のヌクレオチド；下部ステム領域；バルジ領域；上部ステム領域；および３’終端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾を含むｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が本明細書に開示される。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾はヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の４個のヌクレオチドはホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｆを含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドはＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドはＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドは２’−Ｆ修飾を含む。一部の実施形態では、ＬＳ１およびＬＳ６は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。
【０１９５】
一部の実施形態では、本発明は、以下のヌクレオチド：下部ステム領域中のＬＳ１およびＬＳ６；および上部ステム領域中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾核酸を含むｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸と、３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸と、をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６は２’−Ｆで修飾されている。一部の実施形態では、バルジ領域中の各ヌクレオチドは２’−Ｆで修飾されている。
【０１９６】
一部の実施形態では、以下のヌクレオチド：下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６と、バルジ領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｆ修飾核酸を含むｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が本明細書に開示される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸、および３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸を含むｃｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、配列番号１９〜３１、５３〜７３、１０４〜１３０、および１６１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸を含むｃｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、配列番号１９〜３１、５３〜７３、１０４〜１３０、および１６１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｃｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０１９８】
以下の領域：５’終端における最初の５個のヌクレオチド；上部ステム領域；バルジ領域；下部ステム領域；ネクサス領域；ヘアピン１領域；ヘアピン２領域；および３’終端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾を含むｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）も包含される。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾はヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の４個のヌクレオチドはホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている。一部の実施形態では、５’終端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端における最後の３個のヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅを含む。一部の実施形態では、修飾は２’−Ｆを含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドはＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。一部の実施形態では、５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドはＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドは２’−Ｆ修飾を含む。一部の実施形態では、上部ステム領域中の各ヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、バルジ領域内のＢ１およびＢ２は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。
【０１９９】
一部の実施形態では、本発明は、以下のヌクレオチド：上部ステム中の各ヌクレオチド；バルジ領域内のＢ１およびＢ２；ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８；ヘアピン１領域中の各ヌクレオチド；およびヘアピン２領域中の各ヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾核酸を含むｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸と、をさらに含む。一部の実施形態では、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は２’−Ｆで修飾されている。一部の実施形態では、ＬＳ１、ＬＳ３、およびＬＳ５は２’−Ｆで修飾されており、かつＬＳ２、ＬＳ４、およびＬＳ６は２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸と、３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸と、をさらに含む。
【０２００】
一部の実施形態では、配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸を含むｔｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｔｒＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む。
【０２０１】
一部の事例では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むデュアルガイドが提供され、ｃｒＲＮＡは配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸を含み、かつ、ｔｒＲＮＡは配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸を含む。
【０２０２】
本明細書に開示されるｃｒＲＮＡおよび本明細書に開示されるｔｒＲＮＡを含むデュアルガイドが包含され、本明細書に開示されるｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを含むデュアルガイドも包含される。一部の実施形態では、非修飾ｃｒＲＮＡおよび本明細書に開示される修飾ｔｒＲＮＡを含むデュアルガイドが提供される。
【０２０３】
一部の実施形態では、以下が包含される：
実施形態５５．
ｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、以下の領域：
ａ．５’終端における最初の５個のヌクレオチドと、
ｂ．下部ステム領域と、
ｃ．バルジ領域と、
ｄ．上部ステム領域と、
ｅ．３’終端における最後の５個のヌクレオチドと、のうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾を含む、ｃｒＲＮＡ。
実施形態５６．
修飾が２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態５５のｃｒＲＮＡ。
実施形態５７．
修飾が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態５５のｃｒＲＮＡ。
実施形態５８．
修飾がヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態５５のｃｒＲＮＡ。
実施形態５９．
５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、実施形態５５〜５８のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態６０．
５’終端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の４個のヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている、実施形態５５〜５８のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態６１．
修飾が２’−Ｏ−Ｍｅを含む、実施形態５９のｃｒＲＮＡ。
実施形態６２．
修飾が２’−Ｆを含む、実施形態５９のｃｒＲＮＡ。
実施形態６３．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３ヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個の個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、実施形態５５〜６２のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態６４．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｆ修飾を含む、実施形態５５〜６２のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態６５．
ＬＳ１およびＬＳ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態５５〜６０のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態６６．
上部ステム領域中のヌクレオチドのそれぞれが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態５５〜６０および６５のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態６７．
ｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、
ａ．下部ステム領域中のＬＳ１およびＬＳ６と、
ｂ．上部ステム領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｃｒＲＮＡ。
実施形態６８．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態６７のｃｒＲＮＡ。
実施形態６９．
５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態６７または６８のｃｒＲＮＡ。
実施形態７０．
ＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６が２’−Ｆで修飾されている、実施形態５５〜６０のいずれかのｃｒＲＮＡ。
実施形態７１．
バルジ領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｆで修飾されている、実施形態５５〜６０および７０のいずれかのｃｒＲＮＡ。
実施形態７２．
ｃｒｉｓｐｒ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、
ａ．下部ステム領域中のＬＳ１、ＬＳ２、およびＬＳ６と、
ｂ．バルジ領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、ｃｒＲＮＡ。
実施形態７３．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態７０〜７２のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態７４．
５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、をさらに含む、実施形態７２または７３のｃｒＲＮＡ。
実施形態７５．
配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸を含むｃｒＲＮＡ。
実施形態７６．
配列番号１９〜３１、５３〜７３、１０４〜１３０、および１６１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸を含むｃｒＲＮＡ。
実施形態７７．
配列番号１９〜３１、５３〜７３、１０４〜１３０、および１６１〜１８７のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｃｒＲＮＡ。
実施形態７８．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態７５〜７７のいずれか１つのｃｒＲＮＡ。
実施形態７９．
ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）であって、
以下の領域：
ａ．５’終端における最初の５個のヌクレオチドと、
ｂ．上部ステム領域と、
ｃ．バルジ領域と、
ｄ．下部ステム領域と、
ｅ．ネクサス領域と、
ｆ．ヘアピン１領域と、
ｇ．ヘアピン２領域と、
ｈ．３’終端における最後の５個のヌクレオチドと、のうちの１つまたは複数内に１つまたは複数の修飾を含む、ｔｒＲＮＡ。
実施形態８０．
修飾が２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態７９のｔｒＲＮＡ。
実施形態８１．
修飾が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態７９のｔｒＲＮＡ。
実施形態８２．
修飾がヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態７９のｔｒＲＮＡ。
実施形態８３．
５’終端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端における最後の４個のヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている、実施形態７９〜８２のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態８４．
５’終端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、実施形態７９〜８２のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態８５．
修飾が２’−Ｏ−Ｍｅを含む、実施形態８４のｔｒＲＮＡ。
実施形態８６．
修飾が２’−Ｆを含む、実施形態８４のｔｒＲＮＡ。
実施形態８７．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む、実施形態７９〜８６のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態８８．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の４個のヌクレオチドがＰＳ結合により連結されており、かつ５’終端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’終端における最後の３個のヌクレオチドが２’−Ｆ修飾を含む、実施形態７９〜８６のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態８９．
上部ステム領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態７９〜８４のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態９０．
バルジ領域内のＢ１およびＢ２が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態７９〜８４および８９のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態９１．
ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態７９〜８４および８９〜９０のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態９２．
ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態７９〜８４および８９〜９１のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態９３．
ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、実施形態７９〜８４および８９〜９２のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態９４．
ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）であって、
ａ．上部ステム中の各ヌクレオチドと、
ｂ．バルジ領域内のＢ１およびＢ２と、
ｃ．ネクサス領域中のＮ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８と、
ｄ．ヘアピン１領域中の各ヌクレオチドと、
ｅ．ヘアピン２領域中の各ヌクレオチドと、において２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｔｒＲＮＡ。
実施形態９５．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態９４のｔｒＲＮＡ。
実施形態９６．
５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと、３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸と、をさらに含む、実施形態９４または９５のｃｒＲＮＡ。
実施形態９７．
Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が２’−Ｆで修飾されている、実施形態７９〜８４のいずれかのｔｒＲＮＡ。
実施形態９８．
ＬＳ１、ＬＳ３、およびＬＳ５が２’−Ｆで修飾されており、かつ、ＬＳ２、ＬＳ４、およびＬＳ６が２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されている、
実施形態７９〜８４および９７のいずれかのｔｒＲＮＡ。
実施形態９９．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態８７〜９８のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態１００．
５’終端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および３’終端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態９８または９９のｔｒＲＮＡ。
実施形態１０１．
配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸を含む、ｔｒＲＮＡ。
実施形態１０２．
配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸に対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含み、修飾パターンが参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である、ｔｒＲＮＡ。
実施形態１０３．
５’終端における最初の４個のヌクレオチドを連結する３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合および３’終端における最後の４個のヌクレオチドを連結する３つのＰＳ結合をさらに含む、実施形態１０１〜１０２のいずれか１つのｔｒＲＮＡ。
実施形態１０４．
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むデュアルガイドであって、ｃｒＲＮＡが配列番号１〜１８７のうちのいずれか１つのヌクレオチドを含み、かつ、ｔｒＲＮＡが配列番号１８８〜２２７のうちのいずれか１つの核酸を含む、デュアルガイド。
実施形態１０５．
実施形態５５〜７８のうちのいずれか１つのｃｒＲＮＡおよび実施形態７９〜１０３のうちのいずれか１つのｔｒＲＮＡを含む、デュアルガイド。
実施形態１０６．
実施形態５５〜７８のうちのいずれか１つのｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを含む、デュアルガイド。
実施形態１０７．
非修飾ｃｒＲＮＡおよび実施形態７９〜１０３のうちのいずれか１つのｔｒＲＮＡを含む、デュアルガイド。
【０２０４】
Ｃ．終端部ヌクレオチドの修飾
一部の実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡのいずれかの５’または３’終端のヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方などの、ガイドＲＮＡの３’終端領域中の終端部（すなわち、最後）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの３’終端領域中の終端部（すなわち、最後）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドは１つより多くの修飾を含む。一部の実施形態では、３’終端領域における終端部（すなわち、最後）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは修飾されている。一部の実施形態では、３’終端領域中の終端部（すなわち、最後）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つは修飾されている。一部の実施形態では、３’終端領域中の終端部（すなわち、最後）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも３つは修飾されている。一部の実施形態で、修飾はＰＳ連結を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、５’終端領域の５’末端は修飾されており、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方の最初の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの３’終端領域中の最初の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドは１つより多くの修飾を含む。一部の実施形態では、５’末端における終端部（すなわち、最初）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは修飾されている。一部の実施形態では、５’末端における終端部の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つは修飾されている。一部の実施形態では、５’末端における終端部の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも３つは修飾されている。一部の実施形態で、修飾はＰＳ連結を含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方の５’終端および３’終端（例えば、末端）の両方は修飾されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方の５’終端のみが修飾されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方の３’終端のみが修飾されている。
【０２０７】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端における最初の７つのヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つにおいて修飾を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端における終端部の７つヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つにおいて修飾を含む。一部の実施形態では、５’末端における最初の４つのヌクレオチドのうちの２つ、３つ、もしくは４つおよび／または３’末端における終端部の４つのヌクレオチドのうちの２つ、３つ、もしくは４つは修飾されている。一部の実施形態では、５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの２つ、３つ、または４つは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合により連結されている。
【０２０８】
一部の実施形態では、５’終端および／または３’終端の修飾は、ヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）または２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾を含む。一部の実施形態では、修飾は、ヌクレオチドへの２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾を含む。一部の実施形態では、修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）連結を含む。一部の実施形態では、修飾は逆位脱塩基ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）連結、および逆位脱塩基ヌクレオチドから選択される１つより多くの修飾を含む。一部の実施形態では、同等の修飾が包含される。
【０２０９】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は、５’終端における最初の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドの間に１つまたは複数のホスホロチオエート（ＰＳ）連結を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は、３’終端における最後の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドの間に１つまたは複数のＰＳ連結を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は、５’終端および３’終端の両方において最後の１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のヌクレオチドの間に１つまたは複数のＰＳ連結を含む。一部の実施形態では、ＰＳ連結に加えて、５’および３’終端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【０２１０】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は、５’および３’終端における修飾ヌクレオチド、ならびに表１〜３および図２１Ａまたは図２１Ｃに記載される１つまたは複数の他の領域中の修飾ヌクレオチドを含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は、５’または３’末端においてではない修飾ヌクレオチドを含む。修飾の特定のパターンを以下および表４に記載する。
【０２１２】
３．ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の送達
一部の実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡに加えて、本明細書で提供される組成物はヌクレアーゼをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質と一緒になったｇＲＮＡはＣａｓ  ＲＮＰと呼ばれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものである。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣａｓ９タンパク質、例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＳ．ピオゲネス（S. Pyogenes）に由来しないが、Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９と同じように機能し、Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９に特異的なｇＲＮＡは非Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９をその標的部位に方向付ける。一部の実施形態では、Ｃａｓは標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を誘導する。Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９タンパク質の同等物は本明細書に記載される実施形態に包含される。
【０２１３】
Ｃａｓ９は、その改変物および変異型を包含する。不活性な、ＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかの１つの触媒ドメインを有するＣａｓ９の改変バージョンは「ニッカーゼ」と称される。ニッカーゼは標的ＤＮＡ上の１鎖のみを切断し、したがって一本鎖切断を作り出す。一本鎖切断は「ニック」としても知られている場合もある。一部の実施形態では、組成物および方法はニッカーゼを含む。一部の実施形態では、組成物および方法は、標的ＤＮＡ中に二本鎖切断ではなくニックを誘導するニッカーゼＣａｓ９を含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つの機能的なヌクレアーゼドメインのみを含有するように改変されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを変異させまたは完全もしくは部分的に欠失させてその核酸切断活性を低減させるように改変されてもよい。一部の実施形態では、低減した活性を有するＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。一部の実施形態では、不活性ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。一部の実施形態では、低減した活性を有するＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。一部の実施形態では、不活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。
【０２１５】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または変化させるために置換される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中にアミノ酸置換を含んでもよい。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中の例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン中にアミノ酸置換を含んでもよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン中の例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（Ｓ．ピオゲネス（S. Pyogenes）のＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。
【０２１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＰ複合体は、ニッカーゼ、および標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖にそれぞれ相補的な一対のガイドＲＮＡを含む。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列に方向付け、標的配列の反対鎖上にニックを生成すること（すなわち、二重ニック形成）により二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。一部の実施形態では、二重ニック形成の使用は、特異性を改善し、かつオフターゲット効果を低減させ得る。一部の実施形態では、ニッカーゼＣａｓは、ＤＮＡの反対鎖を標的化する２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用されて、標的ＤＮＡ中に二重ニックを生成する。一部の実施形態では、ニッカーゼＣａｓは、近接するように選択された２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用されて、標的ＤＮＡ中に二重ニックを生成する。
【０２１７】
一部の実施形態では、タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の部分により置換されたキメラＣａｓタンパク質が使用される。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、異なるヌクレアーゼ、例えば、Ｆｏｋ１からのドメインにより置換されてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は改変されたヌクレアーゼであってもよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、異種機能性ドメインに連結した触媒不活性なＣａｓ９を含む融合タンパク質を含む（例えば、国際特許公開公報第２０１４１５２４３２号を参照のこと）。一部の実施形態では、触媒不活性なＣａｓ９はＳ．ピオゲネス（S. Pyogenes）からのものである。一部の実施形態では、触媒不活性なＣａｓ９は、Ｃａｓ９を不活化する変異を含む。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、遺伝子発現、ヒストン、またはＤＮＡを修飾するドメインである。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメインである。
【０２１９】
Ａ．ＰＡＭ
一部の実施形態では、標的配列はＰＡＭに隣接してもよい。一部の実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端の１個、２個、３個、または４個のヌクレオチドに隣接するまたはそれらのヌクレオチドの中にあってもよい。ＰＡＭの長さおよび配列は、使用されるＣａｓタンパク質に依存する場合がある。例えば、ＰＡＭは、Ran et al., Nature 520: 186-191 (2015)（参照により本明細書に組み込まれる）の図１に開示されるものを含む、特定のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログのコンセンサス配列または特定のＰＡＭ配列から選択されてもよい。一部の実施形態では、ＰＡＭは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のヌクレオチドの長さを含んでもよい。非限定的な例示的なＰＡＭ配列としては、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＴＴＮ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、およびＮＮＮＮＧＡＴＴ（式中、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＲはＡまたはＧのいずれかとして定義される）が挙げられる。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧであってもよい。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧＮＧであってもよい。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＮＡＡＡＡＷであってもよい。
【０２２０】
Ｂ．修飾ｇＲＮＡの送達
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）はヌクレオチドおよびタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびＲＮＰの送達のために使用されてもよい。一部の実施形態では、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、またはタンパク質と共に核酸を送達する。
【０２２１】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つを対象に送達する方法であって、ｇＲＮＡがＬＮＰと会合している、方法を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとも会合している。
【０２２２】
一部の実施形態では、本発明は、開示されるｇＲＮＡのいずれか１つおよびＬＮＰを含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約４．５のＲＮＡリン酸に対するカチオン性脂質アミンのモル比（Ｎ：Ｐ）を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡと会合しているＬＮＰは、疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するためのものである。
【０２２５】
エレクトロポレーションはカーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達のために任意のエレクトロポレーションの方法論を使用してもよい。一部の実施形態では、エレクトロポレーションは、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つおよびＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを送達するために使用されてもよい。
【０２２６】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つをｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に送達する方法であって、ｇＲＮＡがＬＮＰと会合している、またはＬＮＰと会合していない、方法を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰまたはｇＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとも会合している。
【０２２７】
４．遺伝子モジュレーションの方法
一部の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と共に本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを含む医薬製剤を含む。一部の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と共に本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つおよびＬＮＰを含む医薬製剤を含む。一部の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と共に本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つ、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびＬＮＰを含む医薬製剤を含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、疾患または障害を治療するための薬剤の調製において使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡまたは医薬製剤のうちのいずれか１つを投与することを含む、ヒト患者を治療する方法を含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、本発明は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓ  ｍＲＮＡおよび本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つまたは複数を投与または送達することを含む、標的ＤＮＡを改変する方法または使用を含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、本発明は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓ  ｍＲＮＡおよび本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つまたは複数を投与または送達することを含む、標的遺伝子のモジュレーションのための方法または使用を含む。一部の実施形態では、モジュレーションは標的遺伝子の編集である。一部の実施形態では、モジュレーションは、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の変化である。
【０２３０】
一部の実施形態では、方法または使用は遺伝子編集を結果としてもたらす。一部の実施形態では、方法または使用は標的遺伝子内の二本鎖切断を結果としてもたらす。一部の実施形態では、方法または使用は、ＤＳＢの非相同末端結合の間のインデル変異の形成を結果としてもたらす。一部の実施形態では、方法または使用は、標的遺伝子中のヌクレオチドの挿入または欠失を結果としてもたらす。一部の実施形態では、標的遺伝子中のヌクレオチドの挿入または欠失は、非機能的タンパク質を結果としてもたらすフレームシフト変異または未熟な終止コドンに繋がる。一部の実施形態では、標的遺伝子中のヌクレオチドの挿入または欠失は標的遺伝子発現のノックダウンまたは除去に繋がる。一部の実施形態では、方法または使用はＤＳＢの相同組換え修復を含む。一部の実施形態では、方法または使用は、細胞に鋳型を送達することをさらに含み、鋳型の少なくとも一部分は、Ｃａｓタンパク質により誘導される二本鎖切断部位においてまたはその近くにおいて標的ＤＮＡの中へと組み込まれる。
【０２３１】
一部の実施形態では、方法または使用は遺伝子モジュレーションを結果としてもたらす。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーションは、遺伝子発現の増加もしくは減少、ＤＮＡのメチル化状態の変化、またはヒストンサブユニットの修飾である。一部の実施形態では、方法または使用は、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の増加または減少を結果としてもたらす。
【０２３２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれかは、疾患または障害を治療するための薬剤の調製において有用である場合がある。
【０２３３】
Ａ．遺伝子モジュレーションの測定
修飾ｇＲＮＡの有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができる。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡの１つまたは複数を含み、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と共に細胞に提供された時に遺伝子モジュレーションを結果としてもたらす。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて測定することができる。
【０２３４】
１．Ｃａｓの有効性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定
一部の実施形態では、修飾ｓｇＲＮＡを含むＣａｓＲＮＰの活性は、非修飾ｓｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性と比較される。
【０２３５】
一部の実施形態では、修飾ｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性は、非修飾ｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性と比較される。
【０２３６】
一部の実施形態では、修飾ｃｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性は、非修飾ｃｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性と比較される。
【０２３７】
一部の実施形態では、修飾ｃｒＲＮＡおよび修飾ｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性は、非修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの活性と比較される。
【０２３８】
一部の実施形態では、標的タンパク質の発現の増加または減少におけるｇＲＮＡの有効性は、標的タンパク質の量を測定することにより決定される。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを含み、ｇＲＮＡは、標的化された遺伝子から生成されるタンパク質の量を増加または減少させる。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを対象に投与することを含む、タンパク質発現をモジュレ―トする方法を含み、ｇＲＮＡは、標的タンパク質をコードする遺伝子へとＣａｓ９を方向付け、かつ、標的タンパク質の発現は、Ｃａｓ９をその遺伝子に標的化しないｇＲＮＡ対照と比較して増加または減少する。
【０２３９】
一部の実施形態では、特定のｇＲＮＡを用いた編集の有効性は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡのいずれか）の送達後のゲノム中の標的位置において存在する編集により決定される。一部の実施形態では、特定のｇＲＮＡを用いた編集の有効性は次世代シークエンシングにより測定される。一部の実施形態では、対象の標的領域の編集パーセンテージが決定される。一部の実施形態では、配列リードの総数に対する対象の標的領域へのヌクレオチドの挿入または欠失を有する配列リードの総数がｇＲＮＡおよびＣａｓ９の送達後に測定される。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡのうちのいずれか１つを細胞に投与または送達することを含む、遺伝子編集の有効性を増加させる方法を含み、遺伝子編集のパーセンテージは、同様に修飾されていない対照ｇＲＮＡと比較して増加する。
【０２４０】
一部の実施形態では、特定のｇＲＮＡを用いた編集の効率は、遺伝子編集の成功により導入されたヌクレオチドの挿入または欠失の存在により測定される。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡのいずれか１つを細胞に投与または送達することを含む、遺伝子中のヌクレオチドの挿入または欠失を作り出す方法を含み、ヌクレオチドは、同様に修飾されていない対照ｇＲＮＡと比較して挿入または欠失される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの活性は、生化学的アッセイにおいて試験される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの活性は、無細胞切断アッセイにおいて試験される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの活性は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞において試験される。
【０２４１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡまたは修飾ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡは、非修飾ｓｇＲＮＡまたは非修飾ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡと比較して類似の、より大きい、または低減した活性を示す。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ならびに修飾ｓｇＲＮＡまたは修飾ｃｒＲＮＡおよび／もしくはｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡは、非修飾ｓｇＲＮＡまたは非修飾ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡと比較して増進した活性を示す。
【０２４２】
２．Ｃａｓの有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ測定
一部の実施形態では、修飾ｇＲＮＡの活性は、修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に測定される。
【０２４３】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡまたは組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性は、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の投与後の組織（例えば、肝臓組織）から抽出されたＤＮＡにおいて測定された編集の有効性により決定される。
【０２４４】
３．免疫系活性化のｉｎ  ｖｉｖｏ測定
本明細書に開示されるｇＲＮＡの修飾は、ｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ投与に対する対象の免疫応答を低減させる場合がある。一部の実施形態では、対象の免疫応答の活性化は、（例えば、ＬＮＰ中に配合された）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質と共にｓｇＲＮＡまたはｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含むｄｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のサイトカイン（複数可）の血清濃度により測定される。一部の実施形態では、サイトカインは、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）である。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを含む、ｇＲＮＡの送達に対する対象の免疫応答を低減させる方法を含み、ｇＲＮＡは、投与後に対象の免疫系による低減された応答を生成する。一部の実施形態では、本発明は、同様に修飾されていない対照ｇＲＮＡと比較して投与後に対象の免疫系の活性化を低減させる方法を含む。
【０２４５】
一部の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）と共にＣａｓ  ＲＮＰまたはＣａｓ９  ｍＲＮＡの投与は、非修飾ｓｇＲＮＡの投与と比較して免疫サイトカインのより低い血清濃度（複数可）を生成する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを投与することを含む、免疫サイトカインの対象の血清濃度を低減させる方法を含み、ｇＲＮＡは、同様に修飾されていない対照ｇＲＮＡと比較して対象の血清中の免疫サイトカインのより低い濃度を生成する。
【０２４６】
本記述および例示的な実施形態は、限定するものと解してはならない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、別に指し示さない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される量、パーセンテージ、または割合、および他の数値を表す全ての数は、全ての場合に、既にそうではないと修飾されていない限り、「約」という用語により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、そうでないことを指し示さない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値的パラメーターは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得るおおよそのものである。少なくとも、そして請求項の範囲に対する均等論の適用を制限する試みではなく、各数値的パラメーターは少なくとも、報告される有効数字の桁数に照らして、および通常の端数処理技法を適用することにより解釈されるべきである。
【０２４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」ならびに任意の単語のあらゆる単数形での使用は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことが留意される。本明細書で使用される場合、「含む」という用語およびその文法的変形は非限定的であることを意図し、リスト中の事項の記載は、リストした事項への代替または追加とすることができる他の同様の事項を除外しない。
【実施例】
【０２４８】
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を説明するために提供するものであり、いかなる意味でも本開示の範囲を限定するものと解してはならない。
【０２４９】
実施例１−材料および方法
Ａ．合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
デュアル（ｄｇＲＮＡ、すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ）およびシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）の両方のフォーマットで、販売業者により表４に提供される修飾ヌクレオチドおよび連結を用いてｇＲＮＡを化学合成した。
【０２５０】
Ｂ．Ｃａｓ９  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）
線状化プラスミドＤＮＡ鋳型およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりＮ１−メチルシュードＵを含有するキャップ化およびポリアデニル化Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを生成した。Ｔ７プロモーターおよび１００ヌクレオチド（ｎｔ）ポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有するプラスミドＤＮＡをＸｂａＩにより線状化し、それを商業的な製造者から得た。Ｃａｓ９の修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応物を３７℃で４時間、以下の条件：５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド；各２ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＮ１−メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスリボヌクレアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．  ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；および１×反応緩衝液、でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．０１Ｕ／μＬの最終濃度となるように加え、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などのシリカ結合カラムまたはＬｉＣｌの後にＮａＯＡｃを含むＥｔＯＨを使用する沈殿ステップを含む標準的なプロトコールを使用して酵素およびヌクレオチドからＣａｓ９  ｍＲＮＡを精製した。２６０ｎｍでの吸光度を測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）することにより転写物濃度を決定し、Ｂｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動により転写物を分析した。
【０２５１】
Ｃ．Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのトランスフェクション
１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中でマウス細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａを培養し、トランスフェクションの２４時間前に９６ウェルプレート中に１５，０００細胞／ウェルの密度でプレートした。トランスフェクションの日に、培地を細胞から吸引し、新鮮な培地で置き換えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１：５０（ｖ／ｖ）に希釈した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびシングルガイドＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に別々に希釈した。デュアルガイドフォーマットについては、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを一緒にＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に１：１のモル比で希釈した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を別々に、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、２つのリポプレックスを生成させた。５分間のインキュベーション後、１００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡ／ウェルおよび０．４μＬの総リポフェクション試薬の最終濃度となるようにリポプレックスを細胞に連続的に加えた。各実験について、２５ｎＭおよび２．５ｎＭ、１６．７ｎＭおよび１．６７ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭ、８．３ｎＭおよび０．８３ｎＭ、および３ｎＭおよび０．３ｎＭを含む２つの用量レベルでガイドを試験した。デュアルガイドについては、この濃度は、等モル量のｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ、例えば、２５ｎＭの総デュアルガイドを生成する２５ｎＭのｃｒＲＮＡおよび２５ｎＭのｔｒＲＮＡを含む。トランスフェクションの２４時間後に細胞を溶解させ、溶解液を直接的にＰＣＲ反応に使用してＮＧＳにより編集について解析した。
【０２５２】
１ｘＮＬＳを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ（配列番号３５９）：
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG
【０２５３】
２ｘＮＬＳおよびＨＡタグを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ（配列番号３６０）：
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCUCGGCUUACCCAUACGACGUGCCUGACUACGCCUCGCUCGGAUCGGGCUCCCCCAAAAAGAAACGGAAGGUGGACGGAUCCCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGGACUCCGGAUGAGAAUUAUGCAGUCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG
【０２５４】
Ｄ．初代肝細胞
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）（Ｇｉｂｃｏ）を製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、プロトコール１１．２８．２０１２）にしたがって培養した。簡潔に述べれば、細胞を解凍し、添加物を含む肝細胞解凍培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号ＣＭ７０００）中に再懸濁した後、１００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を添加物パックを加えた肝細胞プレーティング培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、商品番号Ａ１２１７６０１およびＣＭ３０００）中に再懸濁した。細胞を計数し、Ｂｉｏ−ｃｏａｔコラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、商品番号８７７２７２）に１５，０００細胞／ウェルの密度でプレートし、３７℃および５％のＣＯ２雰囲気で５時間インキュベートして単層を形成させた。５時間後、プレーティング培地を除去し、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡに加えて３％のマウス血清を配合したＬＮＰ含有する補充した肝細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、商品番号Ａ１２１７６０１およびＣＭ４０００）で置き換えた。ＬＮＰは、ウェル当たり１００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび約３０ｎＭのガイドＲＮＡの開始用量レベルから希釈し、ウェル当たり０．１ｎｇのｍＲＮＡおよび０．０３ｎＭのガイドまで連続希釈を実行した。細胞を３７℃および５％のＣＯ２雰囲気で約４８時間インキュベートした後、本明細書に記載される細胞溶解およびＮＧＳ解析を行った。
【０２５５】
Ｅ．脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）の配合
約４．５のＲＮＡリン酸に対するカチオン性脂質アミンのモル比（Ｎ：Ｐ）でＬＮＰを配合した。以下のモル比で脂質ナノ粒子成分を１００％のエタノール中に溶解させた：４５モル％（１２．７ｍＭ）のカチオン性脂質（例えば、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも呼ばれる（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート）；４４モル％（１２．４ｍＭ）のヘルパー脂質（例えば、コレステロール）；９モル％（２．５３ｍＭ）の中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）；および２モル％（０．５６３ｍＭ）のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）。２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ４．５でＲＮＡカーゴを調製し、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度とした。
【０２５６】
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを製造者のプロトコールにしたがって使用して脂質およびＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によりＬＮＰを形成させた。流速差を使用して混合の間、２：１の水性溶媒対有機溶媒の比を維持した。
【０２５７】
ＬＮＰ配合手順Ａ：混合後、ＬＮＰを回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、約１：１）中に希釈した後、１０ｋＤａ  Ｓｌｉｄｅ−ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ  Ｇ２  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して緩やかに撹拌しながら４℃で終夜、残りの緩衝液をＰＢＳ（試料体積の１００倍過剰）中に交換した。１０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用してＬＮＰを濃縮（４℃、４０００ｇでの遠心分離）して所望の濃度を達成した。次に、結果として得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。結果として得られた濾液を２〜８℃で貯蔵した。
【０２５８】
ＬＮＰ配合手順Ｂ：混合後、ＬＮＰを回収し、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス中に希釈した後（約１：１）、１０ｋＤａ  Ｓｌｉｄｅ−ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ  Ｇ２  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して緩やかに撹拌しながら４℃で終夜、ＬＮＰをｐＨ７．５ｎの５０ｍＭのトリス（試料体積の１００倍過剰）中に交換した。１０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用してＬＮＰを濃縮（４℃、４０００ｇでの遠心分離）して所望の濃度の２倍を達成した。これらの濃縮されたＬＮＰをｐＨ７．５にて５０ｍＭのトリス、９０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のスクロース（２Ｘ  ＴＳＳ）と１：１で混合した。次に、結果として得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。結果として得られた濾液を−８０℃で貯蔵した。
【０２５９】
ＬＮＰ配合手順Ｃ：２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム中、ｐＨ５でＲＮＡカーゴを調製し、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度とした。混合後、ＬＮＰを３：１の比で水中に回収した。ＬＮＰを室温で１時間インキュベートし、水と１：１で混合した。次にそれらを、製造者のプロトコールを使用してＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で１Ｘ  ＴＳＳ（５０ｍＭのトリス、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％のスクロース、ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。１０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用してＬＮＰを濃縮（４℃、４０００ｇでの遠心分離）して所望の濃度を達成した。次に、結果として得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。結果として得られた濾液を−８０℃で貯蔵した。
【０２６０】
Ｆ．次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）およびオンターゲット切断効率の解析
ゲノム中の標的位置での編集の効率を定量的に決定するために、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集により導入された挿入および欠失の存在を同定した。
【０２６１】
標的部位（例えば、ＴＴＲ、ＦＶＩＩ）周辺のＰＣＲプライマーを設計し、対象のゲノム区画を増幅した。プライマー配列を以下の表５に提供する。
【表５】
2019536464.tif 000037
シークエンシングのために必要な化学物質を加えるために製造者のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にしたがって追加のＰＣＲを行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔでアンプリコンをシークエンシングした。低いクオリティスコアを有するものを除去した後、リードをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対してアライメントした。リードを含有する結果として得られたファイルを参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、対象の標的領域と重なり合ったリードを選択し、挿入、置換、または欠失を含有するリードの数に対する野生型リードの数を算出した。
【０２６２】
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集パーセント」）は、野生型を含む配列リードの総数に対する、挿入または欠失を有する配列リードの総数として定義される。
【０２６３】
Ｇ．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＮＰ送達
６〜１０週齢の範囲のＣＤ−１雌マウスを各試験において使用した。動物を計量し、グループの平均重量に基づいて投与溶液を調製するために体重にしたがってグループ化した。動物当たり０．２ｍＬの体積（体重１キログラム当たり約１０ｍＬ）で側尾静脈を介してＬＮＰを投与した。有害効果について投与の約６時間後に動物を観察した。投与の２４時間後に体重を測定し、イソフルラン（isoflourane）麻酔下での心臓穿刺を介する失血により様々な時点において動物を安楽死させた。血液を血清セパレーターチューブ中または本明細書に記載される血漿用の緩衝化クエン酸ナトリウムを含有するチューブ中に採取した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの編集を伴う研究について、ＤＮＡ抽出および解析のために各動物の中葉から肝臓組織を採取した。
【０２６４】
Ｈ．サイトカイン誘導解析
この解析のために、尾静脈に切り込みを入れることによりおよそ５０〜１００μＬの血液を血清サイトカイン測定のために採取した。血液を室温で約２時間凝血させ、次いで１０００×ｇで１０分間遠心分離させた後、血清を採取した。ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−アルファ、およびＭＣＰ−１を測定するＬｕｍｉｎｅｘベースの磁気ビーズマルチプレックスアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｕｓ、商品番号Ｅｘｐ０４０−０００００−８０１）を採取した試料におけるサイトカイン分析のために使用した。キットの試薬および標準物質を製造者のプロトコールに指示される通りに調製した。２５μＬの希釈した抗体でコーティングした磁気ビーズを含有するウェルに２５μＬのマウス血清を加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした後、洗浄した。希釈したビオチン抗体（５０μＬ）をビーズに加え、室温で１時間インキュベートした。ビーズを再び洗浄した後、５０μＬの希釈したストレプトアビジン−ＰＥを各ウェルに加え、３０分間インキュベートした。ビーズをもう一度洗浄した後、１００μＬの洗浄緩衝液中に懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取った。５パラメーターロジスティック曲線フィットを使用して標準曲線から算出されたサイトカイン濃度を用いてＢｉｏｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖｅｒ．６．１解析パッケージを使用してデータを解析した。
【０２６５】
Ｉ．ゲノムＤＮＡの単離
ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究のために、ビーズベースの抽出キットＭａｇＭＡＸ−９６  ＤＮＡ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓａｍｐｌｅ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、商品番号４４１３０２０）を、溶解緩衝液（１０ｍｇの組織当たりおよそ４００μＬ）中で組織をホモジナイズすることを含む製造者のプロトコールにしたがって使用して、１０ｍｇの組織からゲノムＤＮＡを抽出した。本明細書に記載されるように、ＰＣＲおよびその後のＮＧＳ解析のために、全てのＤＮＡ試料を１００ｎｇ／μＬの濃度に正規化した。
【０２６６】
Ｊ．トランスサイレチン（ＴＴＲ）のＥＬＩＳＡ分析
血液を採取し、血清を指し示された通りに単離した。Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、商品番号ＯＫＩＡ００１１１）を使用して総ＴＴＲ血清レベルを決定した。キットの試薬および標準物質を製造者のプロトコールにしたがって調製した。１×のアッセイ希釈剤を用いてマウス血清を１０，０００倍の最終希釈まで希釈した。２回の逐次的な５０倍希釈を実行することによりこれを行い、２５００倍の希釈を結果として得た。１０，０００倍の総試料希釈のために最終の４倍希釈ステップを実行した。両方の標準曲線希釈液（各１００μＬ）および希釈した血清試料を、捕捉用抗体を予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした後、洗浄した。酵素−抗体コンジュゲート（ウェル当たり１００μＬ）を２０分間のインキュベーションのために加えた。未結合の抗体コンジュゲートを除去し、プレートを再び洗浄した後、発色基質溶液を加えた。プレートを１０分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液、例えば、硫酸（およそ０．３Ｍ）を加えた。４５０ｎｍの吸光度においてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーでプレートを読み取った。４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用してＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアｖｅｒ．６．４．２により標準曲線から血清ＴＴＲレベルを算出した。最終の血清値をアッセイ希釈について調整した。
【０２６７】
実施例２−修飾ｇＲＮＡの操作およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
表４に示されるように、デュアルガイドフォーマット（ｄｇＲＮＡ）で修飾ｇＲＮＡを設計した。その結果、修飾ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方を設計および化学合成して、ｄｇＲＮＡを形成する修飾および非修飾の構成成分を対形成させた。これらのペアリングを図に指し示す濃度でＮｅｕｒｏ２Ａ細胞へとトランスフェクトし、実施例１に記載されるようにＮＧＳにより編集効率（例えば、編集パーセント）を測定した。
【０２６８】
マウスＴＴＲ遺伝子を標的化する表４のある特定の修飾ｃｒＲＮＡをＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡ（ＴＲ０００００２）と共にトランスフェクトした。試験したガイドは配列番号１〜１８を含んだ。図１に示されるように、（非修飾ｔｒＲＮＡと共に）修飾ｃｒＲＮＡの一部は、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、他の修飾ｃｒＲＮＡは活性を減少させた。
【０２６９】
並行して、表４の修飾ｔｒＲＮＡをマウスＴＴＲ遺伝子の同じ配列を標的化する非修飾ｃｒＲＮＡ（ＣＲ０００６８６）と一緒にＣａｓ９  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした。試験したガイドは配列番号１８８〜２００、および２０４を含んだ。図２に示されるように、（非修飾ｃｒＲＮＡと共に）修飾ｔｒＲＮＡの多くは、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、修飾ｔｒＲＮＡの一部は活性を減少させた。
【０２７０】
化学修飾ヌクレオチドの置換に加えて、試験したｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡのペアリングの一部も配列置換により操作して、例えば、親配列においては見られないＧ−Ｃ対形成を結果としてもたらした。試験したガイドは配列番号１５および２０１；１６および２０２；１および１８８を含んだ。図３に示されるように、１つのそのようなペアリング（配列番号１６および２０２）は、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を結果としてもたらしたが、ペアリングの２つは活性を減少させた。
【０２７１】
次に、表４の修飾ｃｒＲＮＡおよび修飾ｔｒＲＮＡのペアリングを試験した。図４に示されるように、修飾ｔｒＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡのペアリングの一部は、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、ペアリングの一部は活性を減少させた。図４では、列の見出しは実験で使用した異なるｔｒＲＮＡを表し、行の見出しは使用した異なるｃｒＲＮＡを表す。実験で使用した組合せを判定するためには、列を行にマッチさせる。ＴＲ０００００２およびＣＲ０００６８６は非修飾対照である（右下の欄を参照のこと）。
【０２７２】
ｄｇＲＮＡの設計に基づいて、表４および図１５Ｄに描写されるように、修飾ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの一部の態様を特徴として、対応するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を操作した。配列番号２２８〜２３４のこれらのｓｇＲＮＡもＮｅｕｒｏ２Ａ細胞において試験し、図５に示されるように、修飾ｓｇＲＮＡのそれぞれは、５’および３’末端修飾のみを含有する対照（Ｇ００００２０９；配列番号２２８）と同等の活性を示した。
【０２７３】
表４および図６に描写される追加のｄｇＲＮＡガイドについて類似のセットの実験を実行した。試験したガイドは配列番号３２〜４７、および１を含んだ。これもまたマウスＴＴＲ遺伝子を標的化する修飾ｃｒＲＮＡをＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡ（ＴＲ０００００２）と共にトランスフェクトした。図６に示されるように、非修飾ｔｒＲＮＡと共に）修飾ｃｒＲＮＡの一部は、非修飾対照（ＣＲ０００６８６）と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、他の修飾ｃｒＲＮＡは活性を減少させた。
【０２７４】
並行して、図７に示されるように、表４の修飾ｔｒＲＮＡをマウスＴＴＲ遺伝子の同じ配列を標的化する非修飾ｃｒＲＮＡ（ＣＲ０００６８６）と一緒にＣａｓ９  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした。試験したガイドは配列番号２０５〜２２２、および１を含んだ。図７に示されるように、（非修飾ｃｒＲＮＡと共に）修飾ｔｒＲＮＡの多くは、非修飾対照（ＴＲ０００００２）と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、修飾ｔｒＲＮＡの一部は活性を減少させた。
【０２７５】
化学修飾ヌクレオチドの置換に加えて、表４からの試験したｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡのペアリングの一部も配列置換により操作して、例えば、親配列においては見られないＧ−Ｃ対形成またはＧ−Ｕミスマッチ（「ＧＵウォブル」）を結果としてもたらした。図８に示されるように、修飾およびペアリングの一部は、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、一部（例えば、「ＧＵウォブル」またはミスマッチペアリング）は活性を減少させた。図８は、配列番号４８〜５２、および１に示されるｃｒＲＮＡガイドと共に配列番号２２３〜２２７および１８８に示されるｔｒＲＮＡガイドを使用した結果を示す。
【０２７６】
次に、表４からの修飾ｃｒＲＮＡおよび修飾ｔｒＲＮＡの選択したペアリングを図９に示されるように試験した。修飾ｔｒＲＮＡと共に修飾ｃｒＲＮＡのペアリングの一部は、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、ペアリングの一部は活性を減少させた。図９では、列の見出しは実験において使用した異なるｔｒＲＮＡを表し、行の見出しは使用した異なるｃｒＲＮＡを表す。実験において使用した組合せを判定するためには、列を行にマッチさせる。非修飾対照はＴＲ０００００２、およびＣＲ０００６８６である。
【０２７７】
表４からの修飾ｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ）の一部は純粋に生化学的なアッセイ（すなわち、無細胞切断アッセイ）においても試験した。興味深いことに、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞において概ね不活性であった修飾ｇＲＮＡの多くは生化学的アッセイにおいて活性であり、そのような生化学的アッセイは細胞中の修飾ｇＲＮＡの活性が予測されない可能性があることを指し示す（データ示さず）。
【０２７８】
実施例３．他の標的に対する修飾ｇＲＮＡのさらなる試験
ある特定の修飾がｇＲＮＡの活性に影響することが確立されたので、（１）同じ遺伝子中の別々の配列を標的化した時、または（２）異なる遺伝子中の配列を標的化した時にこれらの修飾が活性に影響することになるかどうかを次に試験した。その結果、マウスＴＴＲ遺伝子中の別の配列だけでなくマウス第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）遺伝子中の配列も標的化するｇＲＮＡを操作し、実施例２において試験したある特定の修飾パターンを有するように合成した（表４を参照のこと）。これらのｇＲＮＡを図に指し示す濃度でＮｅｕｒｏ２Ａ細胞へとトランスフェクトし、実施例１に記載されるようにＮＧＳにより編集効率（例えば、編集パーセント）を測定した。
【０２７９】
マウスＴＴＲ遺伝子（実施例２において標的化したものとは異なる配列）またはマウスＦＶＩＩ遺伝子のいずれかを標的化する表４の修飾ｃｒＲＮＡをＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび非修飾ｔｒＲＮＡ（ＴＲ０００００２）と共にトランスフェクトした。試験したガイドは図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるものを含んだ。（非修飾ｔｒＲＮＡと共に）修飾ｃｒＲＮＡの一部は、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、他の修飾ｃｒＲＮＡは活性を減少させた。
【０２８０】
並行して、表４からの修飾ｔｒＲＮＡを、マウスＴＴＲ遺伝子の同じ配列（ＣＲ０００７０５；実施例２において標的化したものとは異なる配列）またはマウスＦＶＩＩ遺伝子（ＣＲ０００６５７）の同じ配列を標的化する非修飾ｃｒＲＮＡと一緒にＣａｓ９  ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした。図１３Ａおよび図１３Ｂに示されるように、（非修飾ｃｒＲＮＡと共に）修飾ｔｒＲＮＡの多くは、非修飾対照と比較して類似のまたは増進した活性を付与したが、修飾ｔｒＲＮＡの一部は活性を減少させた。このデータは、ある特定の修飾パターンは異なる配列にわたって類似の効果を有する傾向があったことを示す。
【０２８１】
上記されるｄｇＲＮＡの設計に基づいて、修飾ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの一部の態様を特徴として、対応するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を操作した。表４を参照のこと。これらのｓｇＲＮＡもＮｅｕｒｏ２Ａ細胞において試験した。結果を図１０（マウスＴＴＲ）および図１１（マウスＦＶＩＩ）に示す。一部の修飾パターンは、異なる遺伝子を標的化した時でさえ類似の効果を結果としてもたらすことをこれらの実験は示す。
【０２８２】
実施例４．ｉｎ  ｖｉｖｏでの修飾ｇＲＮＡの試験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の後、修飾がｉｎ  ｖｉｖｏでの編集のために何らかの利益を付与するかどうかを決定するために６つの別々の研究において修飾ｓｇＲＮＡを動物に送達した。
【０２８３】
実施例１に記載されるように、化学修飾ｓｇＲＮＡ（ＴＴＲまたはＦＶＩＩを標的化する）と共にＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを含んでＬＮＰを配合した。ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡの比は、ＲＮＡ成分の質量基準でおよそ１：１であった。別に指し示さない限り、本実施例に記載される研究において使用したＣａｓ９  ｍＲＮＡは配列番号３６０の配列を有し、上述のＬＮＰ配合手順Ａを使用してＬＮＰを配合した。
【０２８４】
１つの実験では、２ｍｇ／ｋｇの単回投与のＬＮＰをマウス（群当たりｎ＝５）に投与し、投与の４時間後に血清サイトカイン分析のために血液を採取した。投与の７日後の解剖において、肝臓および血液をそれぞれ編集効率のＮＧＳ測定および血清ＴＴＲの分析のために採取した。この実験におけるｓｇＲＮＡのそれぞれはＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的化し、ｓｇＲＮＡ間の唯一の差異はそれぞれに対して行った修飾であった（図１４Ａ〜Ｄおよび１５Ａ〜Ｅ；表４、配列番号２２８〜２３４を参照のこと）。Ｇ０００２０９（２ロットを試験した）は、修飾のより少ない対照として機能し、ｓｇＲＮＡの５’終端および３’終端の両方のそれぞれにおける３つの終端部ヌクレオチドにおいて、およびそれらの間で２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホロチオエート連結のみを有した（図１５Ｄを参照のこと）。
【０２８５】
図１４Ａ〜Ｄに示す結果は、より重度に修飾したｓｇＲＮＡは、修飾がより少ないＧ０００２０９対照と比較して、アッセイした各サイトカインについてより低い応答を誘導する傾向があったことを示す。より重度に修飾したｓｇＲＮＡはまた、修飾がより少ない対照（Ｇ０００２０９ロット）についての約４４〜４７％と比較して、より重度に修飾したｓｇＲＮＡのうちの２つ（例えば、Ｇ０００２６３およびＧ０００２６７）について約６０％に達する編集パーセントを有して、処置した動物の肝臓においてより高い編集効率を付与した（図１５Ａ）。重要なことに、血清のＴＴＲレベルのノックダウンは、修飾がより少ない対照と同等またはそれより有意に高かったので、編集効率は表現型の変化と相関した（例えば、図１５Ａ〜１５ＢにおいてＧ０００２０９ロットに対してＧ０００２６３およびＧ０００２６７を参照のこと）。末端修飾Ｇ０００２０９と高度修飾Ｇ０００２６７との差異を図１５Ｄおよび図１５Ｅに要約する（２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを太字で示し、＊はホスホロチオエート連結を表す）。
【０２８６】
別のｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、マウスＴＴＲ遺伝子中の別々の配列を標的化する３つのｓｇＲＮＡを試験した。２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与のＬＮＰをマウス（群当たりｎ＝５）に投与した。投与の４時間後に血清サイトカイン分析のために血液を採取した。投与の７日後の解剖において、肝臓および血液をそれぞれ編集効率のＮＧＳ測定および血清ＴＴＲの分析のために採取した。この研究において、ｓｇＲＮＡのそれぞれは、１つのｓｇＲＮＡは完全に非修飾で（Ｇ０００２０１（配列番号２４３））、別のｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’終端および３’終端の両方のそれぞれにおける３つの終端部ヌクレオチドにおいて、およびそれらの間に２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホロチオエート連結を伴う末端修飾のみを有して（Ｇ０００２１１（配列番号２４１））、３つ目のｓｇＲＮＡは、先行するｉｎ  ｖｉｖｏ研究におけるＧ０００２６７と同じ修飾パターンを有して（Ｇ０００２８２（配列番号２４２））、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列（先行するｉｎ  ｖｉｖｏ研究において標的化したものとは異なる配列）を標的化した。
【０２８７】
図１６Ａ〜１６Ｄに示されるように、ｓｇＲＮＡのそれぞれは、試験したサイトカインのそれぞれについて用量依存的な様式で類似の応答を結果としてもたらした。編集効率について、非修飾ｓｇＲＮＡ（Ｇ０００２０１（配列番号２４３））はｉｎ  ｖｉｖｏでは編集をほとんど付与しなかったが、重度に修飾したｓｇＲＮＡ（Ｇ０００２８２（配列番号２４２））は、２ｍｇ／ｋｇの用量で約６０％に達するレベルを付与し、これは修飾がより少ないｓｇＲＮＡ（Ｇ０００２１１（配列番号２４１））で達成されたレベルより著しく高かった（図１７ＡおよびＢ）。先行するｉｎ  ｖｉｖｏ研究と同様、編集のレベルは血清ＴＴＲのノックダウンの量と相関した（図１７ＣおよびＤ）。
【０２８８】
マウスＴＴＲ遺伝子中のさらに異なるＴＴＲ配列を標的化する（２つの先行するｉｎ  ｖｉｖｏ研究において標的化したものとは異なる配列を標的化する）別のセットの３つのｓｇＲＮＡを用いて、第２のｉｎ  ｖｉｖｏ研究と類似の研究を次に実行した。マウス（群当たりｎ＝５）に２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与のＬＮＰを投与した。投与の４時間後に血清サイトカイン分析のために血液を採取した。投与の７日後の解剖において、肝臓および血液をそれぞれ編集効率のＮＧＳ測定および血清ＴＴＲの分析のために採取した。この研究において、ｓｇＲＮＡのそれぞれは、１つのｓｇＲＮＡは完全に非修飾（Ｇ０００２８５；（配列番号３３２））で、別のｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’終端および３’終端の両方のそれぞれにおける３つの終端部ヌクレオチドにおいて、およびそれらの間に２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホロチオエート連結を伴う末端修飾のみを有して（Ｇ０００２６９（配列番号３３０））、３つ目のｓｇＲＮＡは、先行する２つのｉｎ  ｖｉｖｏ研究におけるＧ０００２６７およびＧ０００２８２と同じ修飾パターンを有して（Ｇ０００２８３（配列番号３３１））、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列（先行する２つのｉｎ  ｖｉｖｏ研究において標的化したものとは異なる配列）を標的化した。
【０２８９】
本研究では、非修飾ｓｇＲＮＡ（Ｇ０００２８５（配列番号３３２））はｉｎ  ｖｉｖｏでの編集をほとんど付与しなかったが、重度に修飾したｓｇＲＮＡ（Ｇ０００２８３（配列番号３３１））は、２ｍｇ／ｋｇの用量で約６０％に達するレベルを付与し、これは修飾がより少ないｓｇＲＮＡ（Ｇ０００２６９（配列番号３３０））で達成されたレベルより著しく高かった（図１８Ａ〜１８Ｂ）。先行するｉｎ  ｖｉｖｏ研究と同様、編集のレベルは血清ＴＴＲのノックダウンの量と相関した（図１８Ｃ）。
【０２９０】
第４のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ｇＲＮＡに対する修飾の効果を別の遺伝子（ＦＶＩＩ）について評価した。研究内比較のために、第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究において試験したｓｇＲＮＡのうちの２つを含めた（Ｇ０００２０９およびＧ０００２６７）。マウス（群当たりｎ＝５）に２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与のＬＮＰを投与し、投与の４時間後に血清サイトカイン分析のために血液を採取した。投与の６日後の解剖において、肝臓を編集効率のＮＧＳ測定のために採取した。この研究では、ｓｇＲＮＡのそれぞれはＴＴＲまたはＦＶＩＩ遺伝子中の同じ配列を標的化し、それぞれのために１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端の両方のそれぞれにおける３つの終端部ヌクレオチドにおいて、およびそれらの間に２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホロチオエート連結の両方を有する末端修飾のみを有し（ＦＶＩＩについてＧ０００２０８（配列番号２８６）、ＴＴＲについてＧ０００２０９）、２つ目のｓｇＲＮＡは、先行するｉｎ  ｖｉｖｏ研究におけるＧ０００２６７、Ｇ０００２８２、およびＧ０００２８３と同じ修飾パターンを有し（ＦＶＩＩについてＧ０００３７３（配列番号２８７）；ＴＴＲについてＧ０００２６７（配列番号２３４））。
【０２９１】
図１９Ａ〜１９Ｄに示されるように、ｓｇＲＮＡのそれぞれは、試験したサイトカインのそれぞれについて用量依存的な様式で類似の応答を結果としてもたらした。編集効率について、ＦＶＩＩを標的化するより重度に修飾されたｓｇＲＮＡ（Ｇ０００３７３（配列番号２８７））は、試験した用量のそれぞれにわたって、修飾がより少ないバージョン（Ｇ０００２０８（配列番号２８６））と比較して編集効率の増加を有した（図１８Ａ）。これらの結果は、ＴＴＲを標的化するｓｇＲＮＡについても観察された（図２０Ａ〜２０Ｂ）。
【０２９２】
別のｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、Ｇ０００２８２と同じマウスＴＴＲ遺伝子中の配列を標的化する１０個の追加のｓｇＲＮＡを試験した。比較目的のためにＧ０００２８２も研究に含めた。マウス（群当たりｎ＝５）に１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの単回投与のＬＮＰを投与した。この研究において使用したＬＮＰは、上述のＬＮＰ配合手順Ｂを使用して配合した。投与の７日後の解剖において、肝臓および血液をそれぞれ編集効率のＮＧＳ測定および血清ＴＴＲの分析のために採取した。この研究において、ｓｇＲＮＡのそれぞれはＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的化した。試験した各ｓｇＲＮＡの修飾パターンは様々であり、ｓｇＲＮＡの５’終端、３’終端、ヘアピン１、ヘアピン２、ネクサス、下部ステム、バルジ、および上部ステム中に２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、およびＰＳ修飾を含んだ。編集％（図２２Ａ）、編集の平均および標準偏差（図２２Ｂ）、ならびに血清ＴＴＲレベル（図２２Ｃ）を含むこの研究の結果を図２２Ａ〜２２Ｃに示す。本明細書に記載される方法にしたがって、これらの同じｓｇＲＮＡを初代マウス肝細胞において試験した。編集％（図２４Ａ）、用量応答曲線（図２４Ｂ）、およびＥＣ５０値（図２４Ｃ）を含むこの用量応答ＴＴＲ編集研究の結果を図２４Ａ〜２４Ｃに示す。
【０２９３】
別のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、マウスＴＴＲ遺伝子中のＧ０００２８２と同じ配列を標的化する１３個の追加のｓｇＲＮＡを試験した。比較目的のためにＧ０００２８２も研究に含めた。マウス（群当たりｎ＝５）に１ｍｇ／ｋｇの単回投与のＬＮＰを投与した。この研究において使用したＬＮＰは、上述のＬＮＰ配合手順Ｃを使用して配合した。この研究において使用したＣａｓ９  ｍＲＮＡは配列番号３５９の配列を有した。投与の４時間後に血清サイトカイン分析のために血液を採取した。投与の７日後の解剖において、肝臓および血液をそれぞれ編集効率のＮＧＳ測定および血清ＴＴＲの分析のために採取した。この研究において、ｓｇＲＮＡのそれぞれはＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的化した。試験したｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’終端、３’終端、ヘアピン１、ヘアピン２、および上部ステム中に追加の２’−ＯＭｅおよびＰＳ修飾を含んだ。編集％（図２３Ａ）、編集の平均％（図２３Ｂ）、および血清ＴＴＲレベル（図２３Ｃ）を含むこの研究の結果を図２３Ａ〜２３Ｃに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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