(57)【要約】本発明は、配列決定セル中の核酸から経時的に測定されるシグナル値を処理するための方法を提供する。シグナル値はヒストグラムの作成に使用でき、そのヒストグラムから、異なる状態（例えばそれぞれ異なるヌクレオチドに対応する）についての確率関数が決定される。確率関数（例えば混合分布モデルを用いて決定されるような）のそれぞれは、特定のヌクレオチドに対応するシグナルの出力確率を割り当てることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定セルを使用する方法であって、前記方法が：
−配列決定セルのための第一の時間間隔にわたって核酸から測定された第一の組のシグナル値を得ること、ここで第一の組のシグナル値は配列決定セルの４つのセル状態のそれぞれの測定値を含み、４つのセル状態は異なる種類のヌクレオチドに対応するものである；
−第一の組のシグナル値の第一のヒストグラムを作成すること、ここで第一のヒストグラムは複数のカウントを記憶するデータ構造であり、各カウントはビン内のシグナル値の数に対応するものであり、第一のヒストグラムの各ビンは異なる数値に対応するものである；
ここで、４つのセル状態の各セル状態に対して：
−そのセル状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる確率関数を決定すること、ここで確率関数は第一のヒストグラムのビンに対する複数のカウントを使用して決定されるものである；
−核酸の４つのヌクレオチド状態間のペアワイズ遷移確率を提供する遷移行列を決定すること、ここで４つのヌクレオチド状態は異なる種類のヌクレオチドに対応するものである；
−Ｔ個の時間ステップにわたるトレリス線図を作成すること、ここで各時間ステップは第一の組のシグナル値の１つのシグナル値に対応するものであり、所与の時間ステップにおけるトレリス線図は４つのヌクレオチド状態を含むものであり、そのそれぞれが対応するセル状態の確率関数を用いて決定された出力確率を有するものであり、ある時間ステップでのヌクレオチド状態はペアワイズ遷移確率に従って次の時間ステップでのヌクレオチド状態に結びつけられるものである；および、
−各時間ステップにおけるヌクレオチド状態を識別するために、出力確率およびペアワイズ遷移確率に基づいてトレリス線図を通る最適経路を決定すること；
を含み、
−Ｔ個の時間ステップにおけるヌクレオチド状態を用いて核酸の配列を含む塩基を決定すること；ならびに、
−核酸の配列を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
配列決定セルがナノポアをさらに含み、配列決定セル全体に印加される電圧を有し、そして４つのセル状態がナノポアのポア状態に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電圧が、参照電圧に対して第一の部分と第二の部分とを有する交流シグナルを含み、第一の組のシグナル値が交流シグナルの第一の部分の間に測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列決定セルが核酸を配列決定するためのポリメラーゼを含み、ヌクレオチド状態がポリメラーゼの結合状態に対応し、第一の組のシグナル値がナノポアを通り抜けるヌクレオチドに結合されたタグ分子がないことに対応する配列決定セルの第五のセル状態に対する測定値であることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチド状態が、セル状態のサブ状態およびポリメラーゼの結合状態を含むシステム状態に対応し、システム状態はポリメラーゼに対する非結合状態とポア状態についての通り抜け状態との組合せを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、
−他の配列決定セルについての他の核酸から測定された他の組のシグナル値を得ることを含み、
そして、他の配列決定セルのそれぞれに対して：
−別の組のシグナル値から別のヒストグラムを作成すること、
−第一のヒストグラムを用いて配列決定セルに固有の確率関数を決定すること、および
−配列決定セルに固有の確率関数を用いて、配列決定セルにおける核酸の配列を含む塩基を決定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一のヒストグラムを用いる確率関数の決定が、各確率関数を第一のヒストグラムのピークにフィッティングさせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
トレリス線図を通る最適経路が、ビタビ復号を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらに、
第二の時間間隔に対応する第二の確率関数を決定することを含み、
確率関数と第二の確率関数は時間依存性確率関数のセットを形成し、ここで第二の確率関数は、確率関数と、配列決定セルについての第二の時間間隔にわたって核酸から測定された第二の組のシグナル値から決定された第二のヒストグラムとを用いて決定され、核酸の配列を含む塩基は時間依存性確率関数のセットを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定セルが核酸を配列決定するためのポリメラーゼを含み、第一の組のシグナル値は配列決定セルの５つの結合状態のそれぞれの測定値を含み、４つの結合状態は異なる種類のヌクレオチドに対応し、第五の結合状態はヌクレオチドがポリメラーゼの活性部位にないことに対応し、４つの結合状態はまとめて結合状態に対応し、第五の結合状態は非結合状態に対応する請求項１に記載の方法であって、前記方法がさらに、
−第一の組のシグナル値のそれぞれを第一の分類手順を用いて結合状態または非結合状態に対応するとして分類すること、ここで第一の分類手順は２状態分類子である；および、
−サブセットのシグナル値を結合状態に対応するとして識別すること、ここでトレリス線図を用いてサブセットのシグナル値に対応するヌクレオチド状態が決定される、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
配列決定セルが核酸を配列決定するためにナノポアに結合されたポリメラーゼを含み、そして第一の組のシグナル値を得ることが配列決定セル全体に電圧を印加することを含み、
ここで前記電圧は参照電圧に対して第一の部分と第二の部分とを有する交流シグナルを含み、
ここで第一の組のシグナル値の少なくとも一部が、タグ分子が配列決定セルのナノポアを通り抜ける時に交流シグナルの第一の部分の間に測定され、前記タグ分子は特定のヌクレオチドに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
配列決定セルを使用する方法であって、前記方法が：
−配列決定セルについての第一の時間間隔にわたって核酸から測定された第一の組のシグナル値を得ること、ここで第一の組のシグナル値は配列決定セルの４つのセル状態のそれぞれの測定値を含み、４つのセル状態は異なる種類のヌクレオチドに対応するものである；
−第一の組のシグナル値の第一のヒストグラムを作成すること、ここで第一のヒストグラムは複数のカウントを記憶するデータ構造であり、各カウントはビン内のシグナル値の数に対応するものであり、第一のヒストグラムの各ビンは異なる数値に対応するものである；
ここで、４つのセル状態の各セル状態に対して：
−そのセル状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる初期確率関数を決定すること；および、
−初期確率関数と第一のヒストグラムを使用して、そのセル状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる第一の確率関数を決定すること、ここで前記第一の確率関数は第一の時間間隔に対応するものである；
−第二の時間間隔に対応する第二の確率関数を決定すること、ここで第一の確率関数と第二の確率関数は時間依存性確率関数のセットを形成し、第二の確率関数は、第一の確率関数と、配列決定セルについての第二の時間間隔にわたって核酸から測定された第二の組のシグナル値から決定された第二のヒストグラムとを用いて決定されるものである； 
−時間依存性確率関数のセットを用いて核酸の配列を含む塩基を決定すること；および、
−核酸の配列を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
初期確率関数が、一つまたは複数の他の配列決定セルから測定されたシグナル値を用いて決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
初期確率関数が、第一の時間間隔より早い時間間隔から測定されたシグナル値を用いて決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
初期確率関数が、核酸の配列決定における第一の時間間隔と他の時間間隔とを含むより長い時間間隔にわたって測定されたシグナル値を用いて決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
第一の確率関数が、ベイズ統計を用いて事後分布として第二の確率関数を決定するために、事前分布として使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
時間依存性確率関数のセットを使用する塩基の決定が、
−核酸の４つのヌクレオチド状態間のペアワイズ遷移確率を提供する遷移行列を決定すること、ここで４つのヌクレオチド状態は核酸の異なるヌクレオチドに対応するものである；
−Ｔ個の時間ステップにわたるトレリス線図を作成すること、ここで各時間ステップは第一の組のシグナル値の１つのシグナル値に対応するものであり、所与の時間ステップにおけるトレリス線図は４つのヌクレオチド状態を含むものであり、そのそれぞれが対応するセル状態の時間依存性確率関数を用いて決定された出力確率を有し、そして所与の時間ステップに対応するものであり、ある時間ステップでのヌクレオチド状態はペアワイズ遷移確率に従って次の時間ステップでのヌクレオチド状態に結びつけられるものである；および、
−各時間ステップにおける塩基呼出を識別するために、出力確率およびペアワイズ遷移確率に基づいてトレリス線図を通る最適経路を決定すること；
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
配列決定セルを使用する方法であって、前記方法が：
−ポリメラーゼを含む配列決定セルについての第一の時間間隔にわたって核酸から測定された第一の組のシグナル値を得ること、ここで第一の組のシグナル値は配列決定セルの５つの結合状態のそれぞれの測定値を含み、４つの結合状態は異なる種類のヌクレオチドに対応し、第五の結合状態はヌクレオチドがポリメラーゼの活性部位にないことに対応し、４つの結合状態はまとめて結合状態に対応し、第五の結合状態は非結合状態に対応するものである；
−Ｔ個の時間ステップにおける第一の組のシグナル値のそれぞれを第一の分類手順を用いて結合状態または非結合状態に対応するとして分類すること、ここで第一の分類手順は２状態分類子である；
−サブセットのシグナル値を結合状態に対応するとして識別すること；
−サブセットのシグナル値のそれぞれを第二の分類手順を用いて４つの結合状態の一つに対応するとして分類し、Ｎ個の結合状態を得ること、ここで第二の分類手順は少なくとも４つの結合状態間を分類する；
−Ｎ個の結合状態を用いて核酸の配列を含む塩基を決定すること；および、
−核酸の配列を提供すること、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
第一の分類手順を使用することが、
−サブセットのシグナル値のヒストグラムを作成すること、ここでヒストグラムは複数のカウントを記憶するデータ構造であり、各カウントはビン内のシグナル値の数に対応するものであり、ヒストグラムの各ビンは異なる数値に対応するものである；
ここで、結合状態および非結合状態の各状態に対して：
−その状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる確率関数を決定すること、ここで確率関数はヒストグラムのビンに対する複数のカウントを使用して決定されるものである；
−非結合状態と結合状態間の遷移確率を決定すること；
−Ｔ個の時間ステップにわたるトレリス線図を作成すること、ここで所与の時間ステップにおけるトレリス線図は結合状態および非結合状態を含むものであり、ある時間ステップでの状態は遷移確率に従って次の時間ステップでの状態に結びつけられるものである；および、
−各時間ステップにおける結合状態または非結合状態を存在するとして識別するために、出力確率および遷移確率に基づいてトレリス線図を通る最適経路を決定すること；
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第二の分類手順が４状態分類子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
第二の分類手順を使用することが、
−サブセットのシグナル値のヒストグラムを作成すること、ここでヒストグラムは複数のカウントを記憶するデータ構造であり、各カウントはビン内のシグナル値の数に対応するものであり、ヒストグラムの各ビンは異なる数値に対応するものである；
ここで、結合状態の各結合状態に対して：
−その結合状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる確率関数を決定すること、ここで確率関数はヒストグラムのビンに対する複数のカウントを使用して決定されるものである；
−核酸の４つの結合状態間のペアワイズ遷移確率を提供する遷移行列を決定すること；
−複数の時間ステップにわたるトレリス線図を作成すること、ここで各時間ステップはサブセットのシグナル値の１つのシグナル値に対応するものであり、所与の時間ステップにおけるトレリス線図は４つの結合状態を含むものであり、ある時間ステップでの結合状態はペアワイズ遷移確率に従って次の時間ステップでの結合状態に結びつけられるものである；および、
−各時間ステップにおける結合状態を識別するために、出力確率およびペアワイズ遷移確率に基づいてトレリス線図を通る最適経路を決定すること；
を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
内径が１ナノメートルのオーダーのポアサイズを有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定に有望であることが示されている。導電性流体に浸漬されたナノポアに電位が印加されると、ナノポアを横切るイオン伝導に起因する微小なイオン電流が存在しうる。電流の大きさは、ポアサイズおよびナノポア中の分子が何であるかに影響される。その分子が特定のヌクレオチドに付けられた特定のタグであれば、それによって核酸の特定の位置におけるヌクレオチドの検出が可能となる。ナノポアを含む回路中の電圧またはその他のシグナルは、分子の抵抗を測定する手段として（例えば積分キャパシタで）測定できるので、どの分子がナノポア中にあるかを検出することが可能となる。
【０００２】
ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定に使用することができる。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成された多数のセンサーセルを組み込むことができる。例えば、１００万セルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含みうる。
【０００３】
測定されるシグナルは、製造ばらつきのために、チップごとにおよび同じチップのセルごとに変動しうる。従って、正しい分子（セル中の特定の核酸またはその他のポリマー中の正しいヌクレオチドでありうるまたはそれに対応しうる）を決定するのは困難でありうる。さらに、測定シグナル中の他の時間依存的非理想性も不正確さを招きうる。また、これらの回路は、脂質二重層、ナノポアなどの生化学的回路素子を使用しているため、電気的特性の変動は従来の半導体回路よりかなり高いものになりうる。さらに、配列決定プロセスは確率的性質のものであるので、変動はナノポアを使用しない配列決定装置を含め、様々なシステムを問わず生じうる。
【０００４】
そこで、配列決定プロセスの正確性および安定性を改良するために、改良された特性化技術が求められている。
【発明の概要】
【０００５】
様々な態様において、配列決定セル中の核酸の配列の測定に関連した方法、技術およびシステムを提供する。前記配列決定セル中とは、配列決定セルのアレイ（例えばチップ上のナノポアのアレイ）中でありうる。
【０００６】
一態様に従って、配列決定セル中の核酸からのシグナル値が経時的に測定される。シグナル値はヒストグラムの作成に使用でき、そのヒストグラムから、異なる状態（例えば、それぞれ異なるヌクレオチドに対応する）についての確率関数が決定される。各確率関数（例えば混合分布モデルを用いて決定される）は、特定のヌクレオチドに対応するシグナルの出力確率を割り当てることができる。状態間の遷移確率および出力確率を用いて、ある時間にわたる状態の組の最も可能性の高い組を決定できるので、それによって核酸の配列の塩基（ヌクレオチド）の測定が提供される。ヒストグラムおよび確率関数は配列決定セルに固有のものでありうるので、その特定の配列決定セルについての核酸の配列決定における正確性が向上する。ヒストグラムから決定された確率関数の使用は、測定された特定のデータに出力確率を合わせることによって正確性を高めることもできる。
【０００７】
別の態様に従って、配列決定セル中の核酸からのシグナル値が経時的に測定される。シグナル値はヒストグラムの作成に使用でき、そのヒストグラムから、異なる状態（例えば、それぞれ異なるヌクレオチドに対応する）についての確率関数が決定される。各確率関数（例えば混合分布モデルを用いて決定される）は、特定のヌクレオチドに対応するシグナルの出力確率を割り当てることができる。確率関数は、さらに、例えば更新手順の一部として、初期確率関数を用いて決定することもできる。このようにして、確率関数は、核酸の配列決定の間、何回も更新できる。これらの時間依存性確率関数は、最も可能性の高い状態に対して使用できるので、それによって核酸の配列の塩基（ヌクレオチド）の測定が提供される。時間依存性確率関数は、物理的配列決定セルの性質におけるドリフトを計算することにより、正確性を高めることができる。
【０００８】
別の態様に従って、配列決定セル中の核酸からのシグナル値が経時的に測定される。シグナル値は、異なるヌクレオチド結合状態(binding state)（まとめて結合状態(bound state)）および非結合状態(unbound state)を含む、ポリメラーゼの異なる結合状態に対応しうる。２状態分類子(2-states classifier)は、様々な時間ステップにおけるシグナル値を結合状態または非結合状態に対応するとして分類することができる。結合状態に対応するシグナルのサブセットは、第二の分類子を用いてさらに分析し、様々なヌクレオチド結合状態間を区別することができる。最も可能性の高いヌクレオチド結合状態を用いて、核酸の配列の塩基（ヌクレオチド）の測定を提供することができる。
【０００９】
従って、本発明は、上記および以下に開示された技術的特徴のすべてを特徴とする、配列決定セルの使用法およびそれによる核酸の配列決定法を提供する。本発明はまた、開示された方法のいずれかの操作を実行するための、コンピュータシステムを制御するための複数の命令を記憶しているコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品も包含する。本発明はまた、上に開示されたコンピュータ製品を含むシステムおよび機器；およびコンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するための一つまたは複数のプロセッサも包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の態様に従って、ナノポアセルのアレイを有するナノポアセンサーチップの態様の上面図である。
【図２】図２は、本発明の態様に従って、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特徴付けするために使用できるナノセンサーチップ中のナノポアセルの態様を示す。
【図３】図３は、本発明の態様に従って、ナノポアベースの合成による配列決定（Ｎａｎｏ−ＳＢＳ）技術を用いて、ヌクレオチドの配列決定を実施するナノポアセルの態様を示す。
【図４】図４は、本発明の態様に従って、ナノポアセル中の電気回路の態様を示す。
【図５】図５は、本発明の態様に従って、ＡＣサイクルの明期間（部分）および暗期間（部分）中にナノポアセルから捕捉されたデータ点の例を示す。
【図６】図６は、本発明の態様に従って、タグ付きヌクレオチドを用いる核酸の配列決定プロセスの態様を示す。
【図７】図７は、本発明の態様に従って、配列決定セルおよび対応するデータ層の簡略図を示す（鋳型（配列番号１）；酵素（配列番号２）；ポアデータ（配列番号３））。
【図８】図８は、本発明の態様に従って、パルスで構成される酵素層の例を示す。
【図９】図９は、本発明の態様に従って、通り抜け状態(threaded state)にある図７の配列決定セルおよびある層のサンプルデータの簡略図を示す（鋳型（配列番号１）；酵素（配列番号２）；ポアデータ（配列番号３））。
【図１０】図１０は、本発明の態様に従って、鋳型核酸の配列決定中に配列決定セルの物理的状態を再構築するための方法１０００を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、本発明の態様に従って、開チャンネル（ＯＣ）値の分率によって測定された、正規化シグナル値のプロットおよび異なる正規化値における測定値のヒストグラムを示す。
【図１２】図１２は、本発明の態様に従って、５つの状態を含むＨＭＭの例を示す。
【図１３】図１３は、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて隠れ状態を決定するための時間トレース１３００を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ペアワイズ遷移確率の遷移行列の例を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、結合状態間のゼロでない確率を有するペアワイズ遷移確率の遷移行列の例を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、各５つの状態について異なる範囲にある観測パラメーターの確率を含む出力テーブルの例を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明の態様に従って、５つの状態のそれぞれ（Ｓ０〜Ｓ４）についての出力確率関数の例を示す。
【図１６】図１６は、本発明の態様に従って、４つのポア状態についての確率関数の例を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、本発明の態様に従って、５つの時間ステップにおける４つの状態についての観測テーブルを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、本発明の態様に従って、４つの状態と５つの時間ステップについてのトレリス線図の例を示す。
【図１８】図１８は、本発明の態様に従って、核酸を配列決定するための時間依存性確率関数を決定するために、配列決定セルを使用する方法のフローチャートを示す。
【図１９】図１９は、本発明の態様に従って、２状態分類子と第二の分類子を用いて核酸を配列決定するために、配列決定セルを使用する方法のフローチャートを示す。
【図２０】図２０は、本発明の態様に従って、シグナルトレース、拡大トレース、正規化シグナル値、およびヒストグラムの例を示す。
【図２１】図２１は、本発明の態様に従って、正規化シグナル値、中間図、および最高ズーム図を示す。
【図２２】図２２は、本発明の態様に従って、高ズーム図および上３つの最も可能性の高い隠れ状態を示す。
【図２３】図２３は、本発明の態様によるシステムおよび方法で使用可能なコンピュータシステムの例のブロック図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語
特に明記されない限り、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されているのと類似または等価の方法、装置、および材料が、開示技術の実施に使用できる。下記の用語は、頻繁に使用されている一定の用語の理解を促進するために提供されるのであって、本開示の範囲を制限するものではない。本明細書中で使用されている略語は、化学および生物学的分野の範囲内における慣用の意味を有する。
【００１２】
“核酸”は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーのことでありうる。該用語は、合成、天然、および非天然の、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、公知ヌクレオチド類似体または修飾主鎖残基または連結を含有する核酸を包含しうる。そのような類似体の例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイト、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などでありうるが、これらに限定されない。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列のほか、その保存修飾変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成できる（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用できる。
【００１３】
“鋳型”という用語は、ＤＮＡ合成のためにＤＮＡヌクレオチドの相補鎖に複製される一本鎖核酸分子のことでありうる。場合によって、鋳型は、ｍＲＮＡの合成中に複製されるＤＮＡの配列を言うこともある。
【００１４】
“プライマー”という用語は、ＤＮＡ合成の開始点を提供する短い核酸配列のことでありうる。ＤＮＡ合成を触媒する酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製のためにプライマーに新しいヌクレオチドを付加することができる。
【００１５】
“ポリメラーゼ”は、ポリヌクレオチドの鋳型依存性合成(template-directed synthesis)を実施する酵素のことでありうる。該用語は、全長ポリペプチドおよびポリメラーゼ活性を有するドメインの両方を包含する。ＤＮＡポリメラーゼは当業者には周知であり、ピュロコックス・フリオスス(Pyrococcus furiosus)、テルモコックス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、およびテルモトガ・マリティメ(Thermotoga maritime)から単離または誘導されたＤＮＡポリメラーゼまたはその修飾形などであるが、これらに限定されない。それらは、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼおよび逆転写酵素などのＲＮＡ依存性ポリメラーゼの両方を含む。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの少なくとも５つのファミリーが知られているが、大部分は、Ａ、ＢおよびＣのファミリーに入る。様々なファミリー間で配列の類似性はほとんどまたは全くない。ほとんどのファミリーＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ、３'から５'へのエキソヌクレアーゼ活性および５'から３'へのエキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素機能を含有できる一本鎖タンパク質である。ファミリーＢポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼと３'から５'へのエキソヌクレアーゼ活性を有する単一の触媒ドメインのほか、補助因子を有する。ファミリーＣポリメラーゼは、典型的には、重合および３'から５'へのエキソヌクレアーゼ活性を有するマルチサブユニットタンパク質である。大腸菌(E. coli)で、３種類のＤＮＡポリメラーゼが見出されている。ＤＮＡポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、II（ファミリーＢ）およびIII（ファミリーＣ）である。真核細胞では、３種類の異なるファミリーＢポリメラーゼ、すなわちＤＮＡポリメラーゼα、δ、およびεが核複製に関与し、ファミリーＡポリメラーゼのポリメラーゼγがミトコンドリアＤＮＡ複製に使用されている。ＤＮＡポリメラーゼのその他の種類はファージポリメラーゼなどである。同様に、ＲＮＡポリメラーゼは、典型的には、真核細胞のＲＮＡポリメラーゼＩ、II、およびIII、ならびに細菌のＲＮＡポリメラーゼのほか、ファージおよびウィルスポリメラーゼを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性でありうる。
【００１６】
“ナノポア”は、膜に形成されているまたは別の方法で提供されているポア、チャンネルまたは通路のことを言う。膜は、有機膜、例えば脂質二重層、または合成膜、例えばポリマー材料から形成された膜でありうる。ナノポアは、検知回路または検知回路に接続された電極、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路に隣接してまたはその近傍に配置できる。一部の例において、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍのオーダーの特徴的な幅または直径を有する。一部の実施において、ナノポアはタンパク質でありうる。
【００１７】
“ヌクレオチド”という用語は、天然のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーを指すほか、文脈上明白に他の場合を指示していない限り、ヌクレオチドが使用される特定の状況（例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に等価であるその関連構造変異体（誘導体および類似体を含む）も指すと理解されうる。
【００１８】
“タグ”という用語は、原子または分子、または原子もしくは分子の集合体でありうる検出可能部分のことでありうる。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電気的（例えば、誘導的、容量的）シグネチャーを提供でき、そのシグネチャーがナノポアの助けを借りて検出されうる。典型的には、ヌクレオチドがタグに結合されている場合、それは“タグ付きヌクレオチド”と呼ばれる。タグは、ヌクレオチドにホスフェート部分を介して付けることができる。
【００１９】
“明期間(bright period)”という用語は、一般的に、タグ付きヌクレオチドのタグがＡＣシグナルを通じて印加された電界によってナノポアに押し込まれる期間のことでありうる。“暗期間(dark period)”という用語は、一般的に、タグ付きヌクレオチドのタグがＡＣシグナルを通じて印加された電界によってナノポアから押し出される期間のことでありうる。ＡＣサイクルは明期間と暗期間を含みうる。異なる態様において、ナノポアセルを明期間（または暗期間）にするためにナノポアセルに印加される電圧シグナルの極性は異なりうる。明期間および暗期間は、参照電圧に対する交流シグナルの異なる部分に対応しうる。
【００２０】
“シグナル値”という用語は、配列決定セルから出力される配列決定シグナルの値のことでありうる。一定の態様によれば、配列決定シグナルは、一つまたは複数の配列決定セルの回路中の一点から測定および／または出力される電気シグナルでありうる。例えば、シグナル値は電圧または電流でありうる（またはそれらを表す）。シグナル値は、電圧および／または電流の直接測定の結果を表すこともおよび／または間接測定を表すこともある。例えば、シグナル値は、電圧または電流が特定値に到達するのにかかる測定時間でもよい。シグナル値は、ナノポアの抵抗率に相関し、そこからナノポア（通り抜けおよび／または非通り抜け）の抵抗率および／またはコンダクタンスを誘導できる任意の測定可能な量を表しうる。別の例として、シグナル値は、例えばポリメラーゼで触媒されて核酸になるヌクレオチドに付けられた発蛍光団からの光強度に対応することもある。
【００２１】
“ヒストグラム”という用語は、特定数の間隔（ビン）それぞれについて、いくつかのシグナル値のカウントを記憶するデータ構造でありうる。各ビンは、シグナル値の離散値（例えば、ＡＤＣの分解能によって決定される）または間隔内の可能なシグナル値の範囲に対応しうる。
【００２２】
“ヌクレオチド状態”とは、所与の時間における核酸の状態のことでありうる。核酸がナノポアを通過するとき、ヌクレオチド状態は、その時点でナノポアを通過していると判定されたヌクレオチドに対応しうる。従って、４つのヌクレオチド状態がありうる。ポリメラーゼが使用される場合、ヌクレオチド状態は、４つのヌクレオチドの４つの結合状態およびポリメラーゼの活性部位にヌクレオチドがない第五の状態を含みうる結合状態に対応しうる。
【００２３】
詳細な説明
態様により、例えば配列決定プロセスの確率的性質を考慮し、核酸の配列の測定における改良された正確性が提供できる。一部の態様では、所与の配列決定セルに特別な時間ベースの測定（例えばヒストグラムの形成）を使用して、特定期間にわたって測定された塩基の配列を決定するための特注モデルを生成することができる。該モデルは、それぞれが異なる状態（例えばナノポアの異なる状態）に対応する確率関数を含みうる。そのような確率関数は、その特定セルについて得られた測定のヒストグラムにフィットさせることができるので、確率関数をその特定セルに合わせることにより、増大した正確性を提供できる。確率関数は、核酸の配列決定操作の間中更新できるので、配列決定セルの物理的性質のドリフトを考慮に入れることができる。
【００２４】
一部の態様において、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、そのような確率関数を、最も可能性の高いヌクレオチド状態を経時的に決定するための出力確率として使用することができる。その他の利益（例えば計算効率に関する）は、ポリメラーゼの結合状態および非結合状態の間の２状態分類（例えばヌクレオチドがポリメラーゼの活性部位にあるか否か）を実施することにより、ポリメラーゼを使用する配列決定セルについて得られる。結合領域をさらに第二の分類子によって分析して、異なる結合ヌクレオチドに対応する状態間を区別することができる。
【００２５】
導入部において、態様で使用されうる様々な生物学的プロセスおよび電気装置について記載する。次に、例示的配列決定セルの異なる物理層および対応するデータ層について記載する。配列決定セルから測定されたシグナル値を再構築して、核酸の配列を測定するためのパイプラインを提供する。一つまたは複数の隠れマルコフモデルの使用についてさらに記載する。態様では品質スコアも提供されうる。これを使用すれば、例えば確率関数のモデルの生成に使用するための特別なシグナル値を選択できる。時間依存性確率関数と２段階の分類の使用についても記載する。
【００２６】
Ｉ．ナノポアベースの配列決定チップ
図１は、ナノポアセル１５０のアレイ１４０を有するナノポアセンサーチップ１００の態様を示す上面図である。各ナノポアセル１５０は、ナノポアセンサーチップ１００のシリコン基板上に集積された制御回路を含む。一部の態様において、側壁１３６がアレイ１４０に含まれてナノポアセル１５０のグループを分離し、各グループが特徴付けのための異なるサンプルを受け入れるようにすることもできる。各ナノポアセルは、核酸を配列決定するために使用できる。一部の態様において、ナノポアセンサーチップ１００は、カバープレート１３０を含んでもよい。一部の態様において、ナノポアセンサーチップ１００は、コンピュータプロセッサなどの他の回路とのインターフェースのために複数のピン１１０を含むこともできる。
【００２７】
一部の態様において、ナノポアセンサーチップ１００は、例えば、マルチチップ・モジュール（ＭＣＭ）またはシステム・イン・パッケージ（ＳｉＰ）のように、同じパッケージ内に複数のチップを含むこともできる。チップは、例えば、メモリー、プロセッサ、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、データ変換装置、高速Ｉ／Ｏインターフェースなどを含みうる。
【００２８】
一部の態様において、ナノポアセンサーチップ１００は、ナノチップワークステーション１２０に接続（例えばドッキング）されてもよい。そのワークステーションには、本明細書中に開示されたプロセスの様々な態様を実施（例えば自動的に実施）するための各種コンポーネントが含まれうる。例えば、脂質懸濁液またはその他の膜構造懸濁液、被検体溶液、および／またはその他の液体、懸濁液もしくは固体を送達するためのピペットなどの被検体送達機構、ロボットアーム、コンピュータプロセッサ、および／またはメモリーなどである。複数のポリヌクレオチドがナノポアセル１５０のアレイ１４０上で検出できる。一部の態様において、各ナノポアセル１５０は個別にアドレス可能でありうる。
【００２９】
ＩＩ．ナノポア配列決定セル
ナノポアセンサーチップ１００のナノポアセル１５０は、多様な方法で実施することができる。例えば、一部の態様において、異なるサイズおよび／または化学構造のタグを、配列決定される核酸分子の異なるヌクレオチドに付けることができる。一部の態様において、配列決定される核酸分子の鋳型に対する相補鎖は、異なるポリマータグ付きヌクレオチドを鋳型とハイブリダイズすることによって合成することができる。一部の実施において、核酸分子と付着タグは、どちらもナノポアを通って移動できるので、ナノポアを通るイオン電流は、ヌクレオチドに付けられたタグの特定のサイズおよび／または構造のために、ナノポア内にあるヌクレオチドを示すことができる。一部の実施においては、タグだけがナノポア内に移動できる。ナノポア中の異なるタグを検出するための多数の異なる方法もあるであろう。
【００３０】
Ａ．ナノポア配列決定セル構造
図２に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの特徴付けに使用できる図１のナノポアセンサーチップ１００中のナノポアセル１５０のような、ナノポアセンサーチップ中のナノポアセル２００の態様を示す。ナノポアセル２００は、誘電体層２０１および２０４から形成されたウェル２０５；ウェル２０５上に形成された脂質二重層２１４などの膜；および脂質二重層２１４上にあって脂質二重層２１４によりウェル２０５から分離されているサンプルチャンバ２１５を含みうる。ウェル２０５は、一定容量の電解質２０６を含有でき、サンプルチャンバ２１５は、ナノポアを含有するバルク電解質２０８、例えば可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）、および目的の被検体（例えば、配列決定される核酸分子）を保持できる。
【００３１】
ナノポアセル２００は、ウェル２０５の底部に作用電極２０２と、サンプルチャンバ２１５に配置された対電極２１０を含みうる。シグナル源２２８は、作用電極２０２と対電極２１０の間に電圧シグナルを印加できる。単一のナノポア（例えばＰＮＴＭＣ）が電圧シグナルによって生じた電気穿孔プロセスによって脂質二重層２１４内に挿入でき、それによって脂質二重層２１４にナノポア２１６が形成される。アレイ内の個々の膜（例えば脂質二重層２１４またはその他の膜構造）は、互いに化学的にも電気的にも接続されることはできない。従って、アレイ中の各ナノポアセルは独立した配列決定マシンとなり、ナノポアに会合した単一ポリマー分子に特有のデータを生ずることができる。ナノポアは、目的の被検体に対して動作し、ナノポアがなければ不透過性の脂質二重層を通るイオン電流を調節する役割を果たす。
【００３２】
図２に示されているように、ナノポアセル２００は、シリコン基板などの基板２３０上に形成されうる。誘電体層２０１は基板２３０上に形成できる。誘電体層２０１を形成するために使用される誘電材料は、例えば、ガラス、酸化物、窒化物などでありうる。電気刺激を制御するためおよびナノポアセル２００から検出されたシグナルを処理するための電気回路２２２は、基板２３０上および／または誘電体層２０１内に形成できる。例えば、複数のパターン化金属層（例えば金属１〜金属６）が誘電体層２０１内に形成され、複数の能動デバイス（例えばトランジスタ）が基板２３０上に製作されうる。一部の態様において、シグナル源２２８は電気回路２２２の一部として含まれる。電気回路２２２は、例えば、増幅器、積分器、アナログ・デジタル変換器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および／または各種のその他コンポーネントを含みうる。電気回路２２２はさらに、メモリー２２６に接続されたプロセッサ２２４に接続することもできる。ここでプロセッサ２２４は、配列決定データを分析し、アレイ中で配列決定されたポリマー分子の配列を決定することができる。
【００３３】
作用電極２０２は誘電体層２０１上に形成でき、ウェル２０５の底部の少なくとも一部を形成しうる。一部の態様において、作用電極２０２は金属電極である。非ファラデー伝導の場合、作用電極２０２は、腐食および酸化に対して抵抗性の金属またはその他の材料、例えば、白金、金、窒化チタン、およびグラファイトなどから製造されうる。例えば、作用電極２０２は、電気めっきされた白金を有する白金電極でありうる。別の例では、作用電極２０２は、窒化チタン（ＴｉＮ）作用電極でありうる。作用電極２０２は多孔質であることにより、その表面積および結果として作用電極２０２に関連するキャパシタンスが増大しうる。ナノポアセルの作用電極は、別のナノポアセルの作用電極から独立しうるので、作用電極は、本開示においてはセル電極と呼ばれることもある。
【００３４】
誘電体層２０４は、誘電体層２０１の上方に形成できる。誘電体層２０４は、ウェル２０５を囲む壁を形成する。誘電体層２０４の形成に使用される誘電材料は、例えば、ガラス、酸化物、一窒化ケイ素（ＳｉＮ）、ポリイミド、またはその他の適切な疎水性絶縁材料などでありうる。誘電体層２０４の上面はシラン処理されうる。シラン処理により、誘電体層２０４の上面の上に疎水性層２２０が形成できる。一部の態様において、疎水性層２２０は約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【００３５】
誘電体層２０４の壁によって形成されたウェル２０５は、作用電極２０２上に一定容量の電解質２０６を含む。一定容量の電解質２０６は緩衝化でき、下記の一つまたは複数を含みうる。すなわち、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）である。一部の態様において、一定容量の電解質２０６は、約３ミクロン（μｍ）の厚さを有する。
【００３６】
また、図２に示されているように、誘電体層２０４の上部に膜が形成でき、ウェル２０５全体に及ぶ。一部の態様において、膜は疎水性層２２０の上部に形成された脂質単分子層２１８を含みうる。膜がウェル２０５の開口部に到達すると、脂質単分子層２１８は脂質二重層２１４に移行でき、それがウェル２０５の開口部全体に及ぶ。脂質二重層は、例えば、ジフィタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３５０］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル；ＧＭ１  ガングリオシド、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはこれらの任意の組合せから選ばれるリン脂質を含みうるまたは該リン脂質からなりうる。
【００３７】
示されているように、脂質二重層２１４は、例えば単一ＰＮＴＭＣによって形成された単一ナノポア２１６を埋め込んでいる。上記のように、ナノポア２１６は、電気穿孔により単一ＰＮＴＭＣを脂質二重層２１４に挿入することによって形成できる。ナノポア２１６は、目的の被検体の少なくとも一部および／または小イオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−）を脂質二重層２１４の両側間に通せるほどの大きさでありうる。
【００３８】
サンプルチャンバ２１５は、脂質二重層２１４の上方にあり、特徴付けのための目的被検体の溶液を保持できる。該溶液は、バルク電解質２０８を含有する水溶液であり、最適イオン濃度に緩衝化され、ナノポア２１６を開口させておくために最適ｐＨに維持されうる。ナノポア２１６は、脂質二重層２１４を横断し、バルク電解質２０８から作用電極２０２へのイオン流のための唯一の経路を提供している。ナノポア（例えばＰＮＴＭＣ）および目的被検体のほかに、バルク電解質２０８は、一つまたは複数の下記をさらに含みうる。すなわち、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）である。
【００３９】
対電極２１０は電気化学ポテンシャルセンサーでありうる。一部の態様において、対電極２１０は、複数のナノポアセル間で共有できるので、共通電極と呼ぶことができる。一部の場合、共通電位および共通電極は全ナノポアセルに共通であっても、または特定のグループ内の少なくとも全ナノポアセルに共通であってもよい。共通電極は、ナノポア２１６と接触しているバルク電解質２０８に共通電位を印加するように構成できる。対電極２１０と作用電極２０２は、脂質二重層２１４を横切る電気刺激（例えば電圧バイアス）を提供するためにシグナル源２２８に接続でき、脂質二重層２１４の電気的特徴（例えば、抵抗、キャパシタンス、およびイオン電流）を検知するために使用することができる。一部の態様において、ナノポアセル２００は参照電極２１２も含みうる。
【００４０】
一部の態様において、ナノポアセルの創作中、較正の一部として様々なチェックを行うことができる。ナノポアセルが創作されたら、例えば所望通りの性能を有するナノポアセル（例えばセル中に１個のナノポア）を識別するために、更なる較正ステップを実施することができる。そのような較正チェックは、物理的チェック、電圧較正、開チャンネル較正、および単一ナノポアを有するセルの識別などを含みうる。
【００４１】
Ｂ．ナノポア配列決定セルの検出シグナル
ナノポアセンサーチップ１００中のナノポアセル１５０のような、ナノポアセンサーチップ中のナノポアセルは、合成による単一分子ナノポアベースの配列決定（Ｎａｎｏ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にしうる。
【００４２】
図３に、Ｎａｎｏ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチドの配列決定を実施するナノポアセル３００の態様を示す。Ｎａｎｏ−ＳＢＳ技術では、配列決定される鋳型（例えばヌクレオチド酸分子または別の目的被検体）とプライマーを、ナノポアセル３００のサンプルチャンバ中のバルク電解質３０８に導入できる。例として、鋳型３３２は円形のこともまたは線形のこともある。核酸プライマーは鋳型３３２の一部にハイブリダイズされており、それに４種類の異なるポリマータグ付きヌクレオチド３３８を加えることができる。
【００４３】
一部の態様において、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ３３４）を、鋳型３３２に対する相補鎖の合成に使用するためにナノポア３１６に会合させることができる。例えば、ポリメラーゼ３３４はナノポア３１６に共有結合されうる。ポリメラーゼ３３４は、一本鎖核酸分子を鋳型として用いて、プライマー上へのヌクレオチド３３８の取込みを触媒できる。ヌクレオチド３３８はタグ種（“タグ”）を含むことができ、ヌクレオチドは４つの異なる種類、すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣの一つである。タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼ３３４に正しく結合されると、タグは、脂質二重層３１４および／またはナノポア３１６を挟んで印加された電圧によって生じた電界の存在下で生じた力などの電気的力により、ナノポアに引き込まれる（装填される）。タグの尾部はナノポア３１６の胴部(barrel)に位置しうる。ナノポア３１６の胴部に保持されたタグは、タグの異なる化学構造および／またはサイズのために、特有のイオン性遮断シグナル３４０を生じうる。それによって、タグが結合している付加塩基が電子的に同定される。
【００４４】
本明細書において、“装填”または“通り抜け”タグは、相当程度の時間、例えば０．１ミリ秒（ｍｓ）〜１０，０００ミリ秒の間、ナノポア内またはナノポアの近傍に位置するおよび／または留まるものでありうる。一部の場合、タグは、ヌクレオチドから放出される前にナノポアに装填される。一部の場合、ヌクレオチドの取込み事象時に放出された後、ナノポアを通過する（および／またはナノポアによって検出される）装填タグの確率は適切に高い、例えば９０％〜９９％である。
【００４５】
一部の態様において、ポリメラーゼ３３４がナノポア３１６に接続される前、ナノポア３１６のコンダクタンスは高く、例えば３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）くらいであろう。タグがナノポアに装填されると、タグの異なる化学構造および／またはサイズのために、特有のコンダクタンスシグナル（例えばシグナル３４０）が生じる。例えば、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳ、または１２０ｐＳで、それぞれ４種類のタグ付きヌクレオチドの一つに対応している。次いで、ポリメラーゼは異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを伸長中の核酸分子に取り込むことができ、タグ分子を放出する。
【００４６】
場合により、タグ付きヌクレオチドの一部は、核酸分子（鋳型）の現在位置と適合しない（相補塩基）ことがある。核酸分子と塩基対を作らないタグ付きヌクレオチドもナノポアを通過しうる。これらの不対ヌクレオチドは、正しく対になったヌクレオチドがポリメラーゼと会合している時間スケールよりも短い時間スケール以内にポリメラーゼによって拒絶されうる。不対ヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポアを迅速に通過し、短時間（例えば１０ｍｓ未満）の間検出できるが、対になったヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポアに装填され、長時間（例えば少なくとも１０ｍｓ）の間検出できる。従って、不対ヌクレオチドは、下流のプロセッサによって、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも一部は基づいて識別されうる。
【００４７】
装填（通り抜け）タグを含むナノポアのコンダクタンス（または等価的に抵抗）は、ナノポアを通過する電流によって測定できるので、それによってタグ種、従って現在位置におけるヌクレオチドの同定が提供される。一部の態様においては、直流（ＤＣ）シグナルがナノポアセルに印加できる（例えば、ナノポアを通過するタグの方向が逆転しないように）。しかしながら、直流を使用して長時間ナノポアセンサーを運転すると、電極の組成を変化させ、ナノポアを挟むイオン濃度を不均衡にし、そしてナノポアセルの寿命に影響を及ぼしかねないその他の望まざる影響がもたらされうる。交流（ＡＣ）波形の印加は、エレクトロマイグレーションを低減して、これらの望ましくない影響を回避し、以下に記載の一定の利点も有しうる。タグ付きヌクレオチドを利用する本明細書中に記載の核酸配列決定法は、印加ＡＣ電圧に完全に適合性があるので、ＡＣ波形を使用してこれらの利点を達成することができる。
【００４８】
ＡＣ検出サイクル中に電極を再充電できる能力は、犠牲電極、通電反応中に分子特性が変化する電極（例えば銀を含む電極）、または通電反応中に分子特性が変化する電極が使用される場合、有益でありうる。直流シグナルが使用されると、電極は検出サイクル中に枯渇しうる。再充電は、電極が枯渇限界に達する、例えば完全枯渇するのを防止できる。電極の枯渇は、電極が小さい場合（例えば、電極が１平方ミリメートルあたり少なくとも５００個の電極を有する電極のアレイを提供できるほど小さい場合）に問題となりうる。電極の寿命は、一部の場合、電極の幅に対応する、および少なくとも一部は依存する。
【００４９】
ナノポアを通過するイオン電流を測定するための適切な条件は当該技術分野で公知であり、実例が本明細書に提供されている。測定は、膜およびポアを挟んで印加される電圧を用いて実施できる。一部の態様において、使用される電圧は、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶの範囲でありうる。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、および０ｍＶから選ばれる下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、および＋４００ｍＶから独立に選ばれる上限とを有する範囲である。使用される電圧は、さらに好ましくは１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲であり得、最も好ましくは１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲でありうる。増大させた印加電位を用いてナノポアによる異なるヌクレオチド間の区別を大きくすることも可能である。ＡＣ波形およびタグ付きヌクレオチドを用いる核酸の配列決定は、２０１３年１１月６日出願の米国特許公開第２０１４／０１３４６１６号、発明の名称「タグを用いる核酸の配列決定」に記載されており、前記公開特許は引用によってその全文を本明細書に援用する。ＵＳ２０１４／０１３４６１６に記載のタグ付きヌクレオチドに加え、配列決定は、糖または非環式部分を欠くヌクレオチド類似体、例えば５個の共通核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミンの（Ｓ）−グリセロールヌクレオシドトリホスフェート（ｇＮＴＰ）を用いて実施することもできる（Ｈｏｒｈｏｔａら，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，８：５３４５−５３４７［２００６］）。
【００５０】
Ｃ．ナノポア配列決定セルの電気回路
図４に、ナノポアセル２００のようなナノポアセル中の電気回路４００（図２の電気回路２２２の部分を含みうる）の態様を示す。上記のように、一部の態様において、電気回路４００は、ナノポアセンサーチップ中の複数のナノポアセルまたは全ナノポアセル間で共有できる、従って共通電極とも呼べる対電極４１０を含む。共通電極は、電圧源ＶＬＩＱ４２０に接続することにより、ナノポアセル中の脂質二重層（例えば脂質二重層２１４）と接触しているバルク電解質（例えばバルク電解質２０８）に共通電位を印加するように構成できる。一部の態様においては、ＡＣ非ファラデーモードを利用して電圧ＶＬＩＱをＡＣシグナル（例えば矩形波）で変調し、それをナノポアセル中の脂質二重層と接触しているバルク電解質に印加することができる。一部の態様において、ＶＬＩＱは±２００〜２５０ｍＶの振幅および例えば２５〜４００Ｈｚの周波数を有する矩形波である。対電極４１０と脂質二重層（例えば脂質二重層２１４）間のバルク電解質は、例えば１００μＦ以上の大型キャパシタ（図示せず）によってモデル化することができる。
【００５１】
図４に、作用電極４０２（例えば作用電極２０２）および脂質二重層（例えば脂質二重層２１４）の電気的特性を表す電気モデル４２２も示す。電気モデル４２２は、脂質二重層に関連するキャパシタンスをモデル化したキャパシタ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ）およびナノポアに関連する可変抵抗（ナノポア中の特定タグの存在に基づいて変化できる）をモデル化した抵抗器４２８（ＲＰＯＲＥ）を含む。電気モデル４２２は、二重層キャパシタンス（ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ）を有し、作用電極４０２およびウェル２０５の電気的特性を表すキャパシタ４２４も含む。作用電極４０２は、他のナノポアセル中の作用電極からは独立に異なる電位を印加するように構成できる。
【００５２】
パスデバイス(pass device)４０６は、脂質二重層および作用電極を電気回路４００に接続または前記回路から切断するために使用できるスイッチである。パスデバイス４０６は、ナノポアセル中の脂質二重層に印加される電圧刺激を有効または無効にするために制御ライン４０７によって制御できる。脂質が堆積して脂質二重層を形成する前、二つの電極間のインピーダンスは、ナノポアセルのウェルが密封されていないために非常に低いので、短絡状態を回避するためにパスデバイス４０６を開放したままにしておくことができる。パスデバイス４０６は、脂質溶媒がナノポアセルに堆積してナノポアセルのウェルを密封したら、閉じることができる。
【００５３】
電気回路４００は、オンチップ積分キャパシタ４０８（ｎｃａｐ）をさらに含むことができる。積分キャパシタ４０８は、積分キャパシタ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５に接続されるようにリセットシグナル４０３を用いてスイッチ４０１を閉じることにより予備充電できる。一部の態様において、電圧源ＶＰＲＥ４０５は、例えば９００ｍＶの大きさを有する一定の参照電圧を提供する。スイッチ４０１が閉じられると、積分キャパシタ４０８は電圧源ＶＰＲＥ４０５の参照電圧レベルにまで予備充電できる。
【００５４】
積分キャパシタ４０８が予備充電された後、積分キャパシタ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５から切断されるようにリセットシグナル４０３を用いてスイッチ４０１を開放する。この時点で、電圧源ＶＬＩＱのレベルに応じて、対電極４１０の電位は作用電極４０２（および積分キャパシタ４０８）の電位より高いレベルにあるか、またはその逆でありうる。例えば、電圧源ＶＬＩＱからの矩形波の正相にある間（例えば、ＡＣ電圧源シグナルサイクルの明または暗期間）、対電極４１０の電位は、作用電極４０２の電位より高いレベルにある。電圧源ＶＬＩＱからの矩形波の負相にある間（例えば、ＡＣ電圧源シグナルサイクルの暗または明期間）、対電極４１０の電位は、作用電極４０２の電位より低いレベルにある。従って、一部の態様において、積分キャパシタ４０８は、対電極４１０と作用電極４０２間の電位差のために、明期間中、電圧源ＶＰＲＥ４０５の予備充電電圧レベルからより高いレベルにさらに充電され、暗期間中、低いレベルに放電されうる。他の態様においては、充電および放電はそれぞれ暗期間および明期間に起こりうる。
【００５５】
積分キャパシタ４０８は、アナログ・デジタル変換器（ＡＤＣ）４３５のサンプリング速度（１ｋＨｚ、５ｋＨｚ、１０ｋＨｚ、１００ｋＨｚ以上でありうる）に応じて、一定期間充電または放電できる。例えば、１ｋＨｚのサンプリング速度の場合、積分キャパシタ４０８は約１ｍｓのあいだ充電／放電された後、電圧レベルは積分期間の終了時にＡＤＣによってサンプリングされ変換されうる。特定の電圧レベルはナノポア中の特定のタグ種に対応し、ひいては鋳型上の現在位置におけるヌクレオチドに対応する。
【００５６】
ＡＤＣ４３５によってサンプリングされた後、積分キャパシタ４０８は、積分キャパシタ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５に再度接続されるようにリセットシグナル４０３を用いてスイッチ４０１を閉じることにより、再度充電できる。積分キャパシタ４０８の予備充電、積分キャパシタ４０８が充電または放電するための一定期間の待機、およびＡＤＣ４３５による積分キャパシタの電圧レベルのサンプリングおよび変換の工程は、配列決定プロセスの間を通して周期的に繰り返すことができる。
【００５７】
デジタルプロセッサ４３０は、ＡＤＣ出力データを、例えば正規化、データバッファリング、データフィルタリング、データ圧縮、データ整理、事象抽出、またはナノポアセルのアレイからのＡＤＣ出力データを様々なデータフレームにアセンブルするために処理することができる。一部の態様において、デジタルプロセッサ４３０は、塩基決定などの更なる下流処理を実施することができる。デジタルプロセッサ４３０は、ハードウェアとして（例えば、ＧＰＵ、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどにおける）またはハードウェアとソフトウェアの組合せとして実装することができる。
【００５８】
従って、ナノポアに印加される電圧シグナルを用いれば、ナノポアの特定の状態を検出することができる。可能性あるナノポアの状態の一つは、タグ付きポリホスフェートがナノポアの胴部に不在のときの開チャンネル状態である（本明細書においては、ナノポアの非通り抜け状態とも呼ばれる）。可能性あるナノポアの別の４つの状態は、４つの異なる種類のタグ付きポリホスフェートヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ）の一つがナノポアの胴部に保持されているときの状態にそれぞれ対応する。可能性あるナノポアのさらに別の状態は、脂質二重層が破裂している場合である。
【００５９】
一定期間の後、積分キャパシタ４０８上での電圧レベルを測定すると、ナノポアの異なる状態によって異なる電圧レベルの測定値がもたらされうる。これは、積分キャパシタ４０８上での電圧減衰（放電による減少または充電による増加）の速度（すなわち、時間プロットに対する積分キャパシタ４０８上の電圧の傾きの険しさ）が、ナノポアの抵抗（例えば抵抗器ＲＰＯＲＥ４２８の抵抗）に依存するためである。さらに詳しくは、異なる状態のナノポアに関連する抵抗は分子（タグ）の異なる化学構造のために異なるので、電圧減衰の異なる対応速度が観測でき、ナノポアの異なる状態の識別に使用することができる。電圧減衰曲線は、ＲＣ時定数τ＝ＲＣを有する指数曲線でありうる。式中、Ｒはナノポアに関連する抵抗（すなわちＲＰＯＲＥ４２８）であり、ＣはＲと並列な膜に関連するキャパシタンス（すなわちキャパシタ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））である。ナノポアセルの時定数は、例えば、約２００〜５００ｍｓでありうる。減衰曲線は、二重層の詳細な実施要領のために、正確には指数曲線に適合しないかもしれないが、減衰曲線は指数曲線に類似し得、単調であるので、タグの検出が可能となる。
【００６０】
一部の態様において、開チャンネル状態のナノポアに関連する抵抗は、１００ＭΩ〜２０ＧΩの範囲でありうる。一部の態様において、タグがナノポアの胴内にある状態のナノポアに関連する抵抗は、２００ＭΩ〜４０ＧΩの範囲内でありうる。他の態様において、積分キャパシタ４０８は、ＡＤＣ４３５に至る電圧が電気モデル４２２における電圧減衰のためになお変動するであろうから、省略されてもよい。
【００６１】
積分キャパシタ４０８上での電圧減衰速度は様々な方法で決定できる。上で説明したように、電圧減衰速度は、一定期間の間の電圧減衰を測定することによって決定できる。例えば、積分キャパシタ４０８上の電圧は、時間ｔ１でＡＤＣ４３５によってまず測定でき、次いで時間ｔ２で電圧をＡＤＣ４３５により再度測定する。積分キャパシタ４０８上の電圧対時間曲線の傾きが急であれば電圧差は大きく、電圧曲線の傾きが緩やかであれば電圧差は小さい。従って、電圧差は、積分キャパシタ４０８上での電圧の減衰速度、ひいてはナノポアセルの状態を決定するための計測量として使用することができる。
【００６２】
他の態様において、電圧減衰の速度は、選択された電圧減衰量に必要な時間を測定することによって決定することもできる。例えば、電圧が第一の電圧レベルＶ１から第二の電圧レベルＶ２に降下または上昇するのに必要な時間を測定すればよい。電圧対時間曲線の傾きが急であれば所要時間は短く、電圧対時間曲線の傾きが緩やかであれば所要時間は長くなる。従って、測定された所要時間は、積分キャパシタｎｃａｐ４０８上での電圧の減衰速度、ひいてはナノポアセルの状態を決定するための計測量として使用することができる。当業者であれば、例えば電流測定技術を含め、ナノポアの抵抗を測定するために使用できる様々な回路は分かるであろう。
【００６３】
一部の態様において、電気回路４００は、チップ上に製作されたパスデバイス（例えばバスデバイス４０６）および余分のキャパシタ（例えば積分キャパシタ４０８（ｎｃａｐ））を含まなくてもよい。それによってナノポアベースの配列決定チップのサイズの縮小が容易になる。膜（脂質二重層）の薄さのために、膜に関連するキャパシタンス（例えばキャパシタ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））だけで、追加のオンチップキャパシタンスを必要とせずとも、必要なＲＣ時定数を生成するのに十分でありうる。そこで、キャパシタ４２６を積分キャパシタとして使用し、電圧シグナルＶＰＲＥによって予備充電し、その後電圧シグナルＶＬＩＱによって放電または充電すればよい。電気回路のチップ上にさもなければ製作される余分のキャパシタおよびパスデバイスの排除は、ナノポア配列決定チップの単一ナノポアセルの実装面積を著しく縮小できるので、ナノポア配列決定チップがより多くのセルを含む（例えばナノポア配列決定チップ中に数百万のセルを有する）ようにスケーリングすることが容易になる。
【００６４】
Ｄ．ナノポアセルにおけるデータサンプリング
核酸の配列決定を実施するためには、タグ付きヌクレオチドが核酸に付加されている間に積分キャパシタ（例えば積分キャパシタ４０８（ｎｃａｐ）またはキャパシタ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））の電圧レベルをサンプリングし、ＡＤＣ（例えばＡＤＣ４３５）によって変換すればよい。ヌクレオチドのタグは、例えば印加電圧がＶＰＲＥよりＶＬＩＱが低いような場合、対電極および作用電極を通じて印加されるナノポア全体の電界によってナノポアの胴部に押し込まれうる。
【００６５】
１．通り抜け(Threading)
通り抜け事象は、タグ付きヌクレオチドが鋳型（例えば核酸フラグメント）に結合し、タグがナノポアの胴部に入りそして出るときのことである。これは通り抜け事象中に何回も起こりうる。タグがナノポアの胴部にある場合、ナノポアの抵抗は高くなり、ナノポアを流れる電流は少なくなりうる。
【００６６】
配列決定中、タグは、一部のＡＣサイクル中にナノポア内にないこともある（開チャンネル状態と呼ばれる）。その場合、ナノポアの抵抗は低くなるため、電流は最大となる。タグがナノポアの胴部に誘引されると、ナノポアは明モードになる。タグがナノポアの胴部から押し出されると、ナノポアは暗モードになる。
【００６７】
２．明および暗期間
ＡＣサイクル中、積分キャパシタ上の電圧はＡＤＣによって何回もサンプリングされうる。例えば、一態様において、ＡＣ電圧シグナルはシステム全体に例えば約１００Ｈｚで印加され、ＡＤＣの取得速度はセルあたり約２０００Ｈｚでありうる。従って、ＡＣサイクル（ＡＣ波形のサイクル）あたり捕捉される約２０のデータ点（電圧測定値）がありうる。ＡＣ波形の１サイクルに対応するデータ点はセットと呼ぶことができる。ＡＣサイクルに対するデータ点のセットには、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低い場合に捕捉されるサブセットがありうる。これはタグがナノポアの胴部に押し込まれている明モード（期間）に対応しうる。別のサブセットは、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより高い場合に印加電界によってタグがナノポアの胴部から押し出された暗モード（期間）に対応しうる。
【００６８】
３．測定電圧
各データ点について、スイッチ４０１が開放されている場合、積分キャパシタ（例えば積分キャパシタ４０８（ｎｃａｐ）またはキャパシタ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））の電圧は、ＶＬＩＱによる充電／放電の結果、例えばＶＬＩＱがＶＰＲＥより高い場合、ＶＰＲＥからＶＬＩＱへの増加として、またはＶＬＩＱがＶＰＲＥより低い場合、ＶＰＲＥからＶＬＩＱへの減少として、減衰様式で変化する。最終電圧値は、作用電極が充電するとＶＬＩＱから逸脱しうる。積分キャパシタ上の電圧レベルの変化速度は、ナノポアを含みうる、ひいてはナノポア内の分子（例えばタグ付きヌクレオチドのタグ）を含みうる二重層の抵抗の値に支配されうる。電圧レベルはスイッチ４０１の開放後、所定の時間に測定できる。
【００６９】
スイッチ４０１は、データ取得速度で操作できる。スイッチ４０１は、二つのデータ取得の合間、典型的にはＡＤＣによる測定の直後に比較的短時間閉鎖できる。スイッチは、ＶＬＩＱの各ＡＣサイクルの各サブ期間（明または暗）の間、多数のデータ点の収集を可能にする。スイッチ４０１が開放されたままであると、積分キャパシタ上の電圧レベル、従ってＡＤＣの出力値は完全に減衰し、そこにとどまる。代わりに、スイッチ４０１が閉じられた場合、積分キャパシタは再度予備充電され（ＶＰＲＥへ）、別の測定の準備が整う。従って、スイッチ４０１は、各ＡＣサイクルの各サブ期間（明または暗）について、多数のデータ点の収集を可能にする。そのような多数の測定は、固定されたＡＤＣでより高い分解能を可能にしうる（例えば、より多数の測定のために、平均すれば８ビット〜１４ビット）。多数の測定は、ナノポアに入り込む分子に関する動力学的情報も提供できる。タイミング情報は、通り抜けがどのくらいの時間起こるのかの決定を可能にしうる。これは、核酸鎖に付加された複数のヌクレオチドが配列決定されているかどうかを決定するための一助としても使用できる。
【００７０】
図５に、ＡＣサイクルの明期間および暗期間中にナノポアセルから捕捉されるデータ点の例を示す。図５では、説明の目的のためにデータ点の変化が誇張されている。作用電極または積分キャパシタに印加された電圧（ＶＰＲＥ）は、例えば９００ｍＶなど、一定レベルである。ナノポアセルの対電極に印加された電圧シグナル５１０（ＶＬＩＱ）は、方形波として示されたＡＣシグナルで、デューティサイクルは任意の適切な値、例えば５０％以下、例えば約４０％でありうる。
【００７１】
明期間５２０の間、対電極に印加された電圧シグナル５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加された電圧ＶＰＲＥより低い結果、タグは、作用電極と対電極に印加された異なる電圧レベルによって生じた電界により、ナノポアの胴部に押し込まれうる（例えば、タグ上の電荷および／またはイオン流のため）。スイッチ４０１が開放されると、ＡＤＣの前のノードにおける（例えば積分キャパシタにおける）電圧は低下する。電圧データ点が捕捉された後（例えば特定期間の後）、スイッチ４０１は閉じられ、測定ノードにおける電圧は増加して再度にＶＰＲＥ戻る。このプロセスは多数の電圧データ点を測定するために繰り返すことができる。このようにして、多数のデータ点が明期間中に捕捉できる。
【００７２】
図５に示されているように、ＶＬＩＱシグナルの符号の変化後、明期間における第一のデータ点５２２（ファーストポイントデルタ（ＦＰＤ）とも呼ばれる）は、その後のデータ点５２４よりも低くなりうる。これは、ナノポア中にタグがなく（開チャンネル）、低抵抗および高放電速度を有するためでありうる。一部の場合において、第一のデータ点５２２は、図５に示されているように、ＶＬＩＱレベルを超えることがある。これは、シグナルをオンチップキャパシタに結合している二重層のキャパシタンスが原因でありうる。データ点５２４は、通り抜け事象が発生した後、すなわちタグがナノポアの胴部に押し込まれた後に捕捉されうるもので、そこでは、ナノポアの抵抗、従って積分キャパシタの放電速度は、ナノポアの胴部に押し込まれたタグの特定の種類に依存する。データ点５２４は、以下に記載するように、ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ４２４に蓄積された電荷のために各測定ごとにわずかに減少しうる。
【００７３】
暗期間５３０の間、対電極に印加された電圧シグナル５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加された電圧（ＶＰＲＥ）より高い結果、どのタグもナノポアの胴部から押し出されることになる。スイッチ４０１が開放されると、測定ノードにおける電圧は、電圧シグナル５１０（ＶＬＩＱ）の電圧レベルがＶＰＲＥより高いため、増加する。電圧データ点が捕捉された後（例えば特定期間の後）、スイッチ４０１は閉じられ、測定ノードにおける電圧は減少して再度にＶＰＲＥ戻る。このプロセスは多数の電圧データ点を測定するために繰り返すことができる。このようにして、暗期間中に、ファーストポイントデルタ５３２およびその後のデータ点５３４を含め、多数のデータ点が捕捉されうる。上記のように、暗期間中はどのヌクレオチドタグもナノポアから押し出されるので、正規化に使用する以外は、任意のヌクレオチドタグに関して最小限の情報しか得られない。
【００７４】
図５はまた、明期間５４０の間、対電極に印加された電圧シグナル５１０（ＶＬＩＱ）が作用電極に印加された電圧（ＶＰＲＥ）より低くても、通り抜け事象が起こらないこと（開チャンネル）も示している。従って、ナノポアの抵抗は低く、積分キャパシタの放電速度は高い。その結果、第一のデータ点５４２およびその後のデータ点５４４を含め、捕捉されたデータ点は低い電圧レベルを示している。
【００７５】
明または暗期間中に測定された電圧は、ナノポアの定抵抗の各測定ごと（例えば、所与のＡＣサイクルの明モード中、１個のタグがナノポアにある間になされる）にほぼ同じであると予想できるが、これは二重層キャパシタ４２４（ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ）で電荷が蓄積している場合には、その限りではない。この電荷蓄積は、ナノポアセルの時定数をより長くすることになりうる。その結果、電圧レベルはシフトし、それによって測定値はサイクル中の各データ点ごとに減少することになろう。従って、サイクル内で、データ点は図５に示されているようにデータ点ごとに多少変化しうる。
【００７６】
測定に関する更なる詳細は、例えば、米国特許公開第２０１６／０１７８５７７号、発明の名称「電圧刺激の変動を伴うナノポアベースの配列決定(Nanopore-Based Sequencing With Varying Voltage Stimulus)」、米国特許公開第２０１６／０１７８５５４号、発明の名称「電圧刺激の変動を伴うナノポアベースの配列決定」、米国特許出願第１５／０８５，７００号、発明の名称「電気刺激に対する二重層の応答の測定を用いる非破壊的二重層モニタリング(Non-Destructive Bilayer Monitoring Using Measurement Of Bilayer Response To Electrical Stimulus)」、および米国特許出願第１５／０８５，７１３号、発明の名称「二重層形成の電気的増強(Electrical Enhancement Of Bilayer Formation)」に見出すことができ、これらの開示内容はあらゆる目的のために引用によってそれらの全文を援用する。
【００７７】
４．正規化および塩基呼出
ナノポアセンサーチップの使用可能な各ナノポアについては、核酸の配列決定をするために実動モード(production mode)を実施することができる。配列決定中に捕捉されたＡＤＣ出力データは、より高い正確性を提供するために正規化することができる。正規化は、サイクル形状、ゲインドリフト、電荷注入オフセット、およびベースラインシフトなどのオフセット効果に対処できる。一部の実施において、通り抜け事象に対応する明期間サイクルのシグナル値は、そのサイクルについて単一のシグナル値（例えば平均）が得られるようにまたはサイクル内減衰（一種のサイクル形状効果）を低減するために測定シグナルに対して調整が行えるように、平坦化することができる。ゲインドリフトは、一般的に、シグナル全体を拡大縮小し、数百から数千秒のオーダーで変化させる。例として、ゲインドリフトは、溶液（ポア抵抗）の変化または二重層キャパシタンスの変化によって誘発されうる。ベースラインシフトは、〜１００ｍｓの時間スケールで発生し、作用電極における電圧オフセットに関連する。ベースラインシフトは、明期間から暗期間への配列決定セル中の電荷バランスを維持する必要性の結果、通り抜けによる有効整流比の変化によって推進されうる。
【００７８】
正規化後、態様において、通り抜けチャンネルについての電圧のクラスター（群）を決定できる。各クラスターは、異なるタグ種、ひいては異なるヌクレオチドに対応する。クラスターを用いて、所与のヌクレオチドに対応する所与の電圧の確率を決定することができる。別の例としては、クラスターを用いて、異なるヌクレオチド（塩基）間を区別するためのカットオフ電圧を決定することができる。
【００７９】
シグナル測定に基づいて核酸の塩基を決定する例示的方法を以下に提供する。例では説明のために電圧測定を使用しているが、例示的技術は、電流測定などのその他のシグナル測定にも等しく適用できる。
【００８０】
III．配列決定セルの状態
鋳型核酸の配列が所望されるが、配列の特定の塩基は、測定から推測される必要がある。システムの様々な物理的特性が、そのような決定を実施するのを困難にしうる。シグナルの測定（例えばＡＤＣ層）から鋳型核酸（鋳型層）の配列を決定するプロセスにおいて、様々なデータ層は異なるレベルの推測に対応しうる。様々なデータ層は、鋳型層、酵素層、ポア層、および単一層を含む。様々なデータ層を議論する前に、ヌクレオチドの取込みおよびタグの通り抜けの様々な状態について説明する。
【００８１】
Ａ．合成によるナノポアベースの配列決定
図６に、本発明の態様に従って、タグ付きヌクレオチドを用いる核酸配列決定のためのプロセス６００の態様を示す。ステージＡは、そのようなタグ付きヌクレオチドを用いてヌクレオチドの配列決定を実施しようとしている配列決定セルを示す。ナノポア６０１が膜６０２に形成されている。酵素６０３（例えばＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ）がナノポアに会合している。一部の場合、ポリメラーゼ６０３はナノポア６０１に共有結合されている。ポリメラーゼ６０３は、配列決定される核酸分子６０４と会合している。一部の態様において、核酸分子６０４は円形である。一部の場合、核酸分子６０４は線形である。一部の態様において、核酸プライマー６０５は核酸分子６０４の部分にハイブリダイズされている。ポリメラーゼ６０３は、１本鎖核酸分子６０４を鋳型として用いて、プライマー６０５上へのヌクレオチド６０６の取込みを触媒する。ヌクレオチド６０６はタグ種（“タグ”）６０７を含む。
【００８２】
ステージＡでは、タグ付きヌクレオチド（４つの異なる種類：Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣの一つ）はポリメラーゼに会合していない。ステージＡは、ヌクレオチドの非結合状態（何のヌクレオチドもポリメラーゼ６０３または核酸６０４に結合されていないため）および任意のタグの非通り抜け状態（何のタグもポア６０１内にないため）に対応している。ステージＢでは、タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼに会合している。ステージＢは、ヌクレオチド６０６の結合状態、しかしタグ６０７の非通り抜け状態に対応している。
【００８３】
ステージＣでは、ポリメラーゼはナノポアにドッキングし、タグはナノポアに入り込む。タグは、ドッキング中、膜および／またはナノポアに印加された電圧によって生じた電界の存在下で発生した力などの電気的力により、ナノポアに引き込まれる。“通り抜け”タグは、相当程度の時間、例えば０．１ミリ秒〜１０，０００ミリ秒の間、ナノポアの内部または近傍に位置するおよび／または留まるものでありうる。ステージＣは、ヌクレオチドの結合状態およびタグの非通り抜け状態に対応する。
【００８４】
ステージＤでは、放出されたタグがナノポアを通過する。会合したタグ付きヌクレオチドの一部は、核酸分子と塩基対を形成しない。これらの不対ヌクレオチドは、典型的には、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと会合したままの時間スケールよりも短い時間スケール以内にポリメラーゼによって拒絶される。不対ヌクレオチドはポリメラーゼと一時的に会合するだけなので、図６に示されたプロセス６００は、典型的にはステージＤより先に進まない。例えば、不対ヌクレオチドは、ステージＢまたはプロセスがステージＣに入った直後にポリメラーゼによって拒絶される。
【００８５】
様々な態様において、ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前、ナノポアのコンダクタンスは〜３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）でありうる。他の例として、ステージＣでは、ナノポアのコンダクタンスは、４種類のタグ付きヌクレオチドの一つにそれぞれ対応して、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳ、または１２０ｐＳでありうる。ポリメラーゼは異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを伸長中の核酸分子に取り込み、タグ分子を放出する。特に、タグがナノポアに保持されていると、タグの異なる化学構造のために特有のシグナルが生成し、それによって付加された塩基が電子的に識別される。サイクル（すなわちステージＡからＥ）を繰り返すことにより、核酸分子の配列決定が可能となる。
【００８６】
一部の場合、伸長中の核酸分子に取り込まれないタグ付きヌクレオチドも、図６のステージＦに見られるようにナノポアを通過する。ステージＦは、非結合ヌクレオチドおよび通り抜けタグに対応する。取り込まれなかったヌクレオチドは、場合によってはナノポアによって検出できるが、態様では、取り込まれたヌクレオチドと取り込まれなかったヌクレオチドは、例えばヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に基づいて区別できる。取り込まれなかったヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポアを迅速に通過するので、短時間（例えば１０ｍｓ未満）検出されるが、取り込まれたヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポアに入り込むので、長時間（例えば少なくとも１０ｍｓ）検出される。
【００８７】
Ｂ．データ層
図７に、本発明の態様に従って、配列決定セル７００および対応データ層の簡略図を示す。鋳型核酸分子７０４が、膜７１４内のナノポア７０１を用いて、酵素７０３による合成によって配列決定されているところが示されている。図７は、ヌクレオチド７０６を鋳型核酸分子７０４に触媒するプロセスにおける酵素７０３を示している。従って、酵素７０３は、塩基Ｔに対応する結合状態にある。タグ７０７は、ナノポア７０１に入り込んでいないので、非通り抜け状態にある。ＡＤＣ７３５は、非通り抜け状態（図示）および通り抜け状態のナノポア７０１の抵抗を測定して（例えば電圧または電流の測定により）、タグ７０７を識別することができる。これによってヌクレオチド７０６の識別が提供されることにより、鋳型核酸分子７０４の配列中の１個の塩基が得られる。
【００８８】
シグナル値の測定（例えば、ＡＤＣ７３５によって測定される電圧値）はシグナル層に対応する。ナノポア７０１における様々なタグの通り抜け事象はポア層に対応する。これは測定されたシグナル値を用いて決定できる。通り抜け事象は、シグナル層の測定シグナル値に基づいて特定塩基に対応すると識別できる。ある時間間隔にわたって識別された通り抜け事象を用いて、その時間間隔中にどのヌクレオチドが結合されたかを決定することができる。結合されたと識別されたヌクレオチドを用いて、どのヌクレオチドが実際鋳型核酸分子７０４に触媒されたかを識別することができる。様々な物理的プロセスは、正確な鋳型層を得るのに困難をもたらしうる。その例を以下に記載する。
【００８９】
１．鋳型層
鋳型核酸分子７０４の配列は鋳型層の塩基に対応する。鋳型核酸分子７０４の配列は、鋳型核酸分子７０４に触媒されたヌクレオチドの触媒状態に対応するはずである。図７に、ＧＡＧＴＴＴＴＡＴＣＧＣＴＴＣＣ（配列番号１）の配列例を示す。この配列は、測定シグナル値を用いてコンピュータシステムによって実施された塩基呼出手順の所望出力である。しかし、以下に説明するように、配列は直接測定されるわけではない。従って、鋳型層は隠れ層と見なすことができる。鋳型層は、それが実際の物理的分子に対応しているので、物理的状態の最高レベルの情報と見なすことができ、誤差ゼロと見なすことができる。
【００９０】
２．酵素層
酵素層は、自由流動しているヌクレオチドと酵素７０３に関連する活性部位との結合事象の配列である。図７に、酵素層の例ＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＣ−ＣＴＴＣＣ（配列番号２）を示す。酵素層も直接測定されないので、隠れ層と見なすことができる。
【００９１】
酵素層は、鋳型層の活性部位に対応する相補ヌクレオチドの結合事象で構成されるはずである。しかし、酵素７０３が適合塩基を見つけ、その後ヌクレオチドが触媒される前に放すことは可能である。ヌクレオチド（例えばＡ）は、ヌクレオチドが活性部位から解離する前に比較的長時間結合されうる。ヌクレオチドが離れ落ちた後、ＤＮＡポリメラーゼは別のヌクレオチドが活性部位に結合されるのを待つ。
【００９２】
一時的結合の間も測定は実施される。ヌクレオチドの一時的結合とヌクレオチドの永久的触媒作用との間の相違を識別することは困難でありうる。従って、同じ種類の別のヌクレオチドが活性部位に最終的に触媒された場合、ただ１個のＡがあるだけか、または複数のＡが並んでいるのか決定するのは困難でありうる。従って、エラーモードは挿入に関連しうる。図７で、鋳型層に関連して見られるように、赤い塩基は挿入に対応する。これは２位における結合で見られ（塩基Ａに対応する）、そこでは、塩基Ａを有するヌクレオチドは触媒されず、離れ落ちた。塩基Ａを有する別のヌクレオチドは、酵素層の３位に示されているように、結合され最終的に触媒される。
【００９３】
従って、２個のＡが二つの連続した位置にあるのか、またはただ１個のＡが一つの位置にあるのか決定するのは困難でありうる。ゆえに、単一の結合事象が二つの別個の結合事象として誤呼出されることも、または二つの結合事象が一つの結合事象として誤呼出されることもある。一部の態様において、正確な鋳型層が提供されるように、挿入エラーを識別することができる。
【００９４】
図８に、本発明の態様に従って、パルス、例えば８１０ａ〜８１０ｃで構成される酵素層８００の例を示す。パルス８１０ａ〜８１０ｃは、短い持続時間を有する複数の通り抜け事象から決定できる。異なるパルスは異なる塩基ごとに異なる高さを有しうる。示されているように、三つの顕著なパルス８１０ａ〜８１０ｃがある。第一のパルス８１０ａは比較的長いが、パルス８１０ａが一つの結合事象に対応しているかどうかは不明である。その理由の一部は、上記のＡＣモードで動作している場合、一つの連続パルスはないからである。代わりに、図９に示されているような、一連のより短いパルスがある。
【００９５】
３．ポア層
通り抜け事象に対応するポア層は、理想化された酵素−タグ結合事象の下に示されている。図７に、ポア層の例：ＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−ＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号３）を示す。ポア層も直接測定されないので、隠れ層と見なすことができる。
【００９６】
示されているように、同じ塩基の一連の通り抜け事象があり、これは酵素層の一つの結合状態に対応している。“−”で示されているように、通り抜け事象がないＡＣシグナルのサイクルがありうる。ゆえに、情報の内容は、二つの結合事象があるのかまたは一つの長い結合事象なのか、そして両方の結合事象とも触媒作用をもたらし、従って鋳型ＤＮＡ鎖上の各位置に対応しているのかを決定するのが困難でありうるので、劣化しうる。
【００９７】
酵素層は、ポア層の３４〜３９の位置に対応する７位にもエラーを示している。そこではＡが短時間結合され、触媒されなかった。このエラーの結果、酵素層はＴの代わりにＡを有することになる。そのようなエラーは、触媒されなかったＡが、ただ２個の触媒されたＴで、３個の触媒されたＴではないと識別される前にＴの通り抜け事象が起こることに起因しうる。
【００９８】
４．シグナル層（例えばＡＤＣ層）
シグナル層は、電圧がＡＤＣ７３５によって測定されると示される。これはスイッチが開放された後（例えばスイッチ４０１）、特定時間の後に行われた電圧測定値に対応する。電圧測定値は、積分キャパシタ４０８（ｎｃａｐ）における電圧に対応しうる。他のシグナル値も使用できる。
【００９９】
シグナル層は観測層である。これらの電圧測定値から、態様は、そのサンプリング中のポアの抵抗を推測することができる。ただし、ノイズは起こりうるので、それによって隠れデータ層にエラーが生じうる。ＡＤＣは、測定される実際のシグナルで、隠れデータ層はそれから推測される。
【０１００】
この例のシグナル層の測定データでは、開チャンネル明モードおよび開チャンネル暗モードに対応する二つのバンドが上部と底部に示されている。明チャンネルにおける窪み(dip)は結合事象に対応する。ポア層におけるそれぞれの通り抜け事象は、シグナル層の別のサイクルに対応しうる（その中で通り抜けシグナルが測定された）。このシグナル層の例は、上記ＡＣシグナルの多数のサイクルに対応する測定値を示している。
【０１０１】
Ｃ．データ層の再構築
図９に、本発明の態様に従って、通り抜け状態にある図７の配列決定セル７００と、ある層のサンプルデータの簡略図を示す。図９は、シグナル層９１０を観測層として示している。図９は、結合状態にあるヌクレオチド７０６と、通り抜け状態にあるタグ７０７を有する配列決定セル７００を示している。タグ７０７のこのような通り抜けは、ナノポア７０１の抵抗を増大させるので、測定ＡＤＣ値は低下する。
【０１０２】
シグナル層９１０は、配列決定セル７００に印加されたおよそ１７サイクルのＡＣシグナルにわたるＡＤＣ値のクローズアップを示す。あるサイクルについての通り抜けＡＤＣ値はクラスターとして見ることができ（例えば通り抜けクラスター９１５）、何の通り抜けも示していないサイクル（例えば非通り抜けクラスター９１７）とは区別できる。所与のサイクルについての通り抜けクラスターのＡＤＣ値は、通り抜け事象に対応しうる。従って、一部の態様において、１サイクルあたり最大で一つの通り抜け事象があり得、ＡＤＣ値の通り抜けクラスターは、酵素層の単一の結合事象９３０に対応できる。他の態様においては、各シグナル値を塩基呼出手順（例えばＨＭＭ）のための観測値として使用することができる。
【０１０３】
ＡＤＣ値は、例えば、米国特許出願第１５／６３２，１９０号、発明の名称「ナノポア配列決定セルの形成および較正(Formation And Calibration Of Nanopore Sequencing Cells)」（引用によってその全文を援用する）に開示されているように、正規化できる。そのような正規化は、配列決定セルの変化のため（例えば膜７１４の厚さの変化または配列決定セル７００における電荷の蓄積のため）に生じうる測定値の経時的なシフトに対処できる。正規化後、同じタグについての複数サイクルにわたる通り抜け事象のＡＤＣ値は、ほぼ同じ値を提供するはずである。正規化は、同じ高さを有する通り抜け事象９２０に見ることができる。通り抜け事象９２０は、ポアデータ層の再構築を示している、通り抜け事象９２０は、これらの例表示が１対１の対応を示していなくても、ＡＤＣ値における通り抜けクラスターを反映している。正規化されたＡＤＣ値のクラスターは、例えば、異なるタグまたはタグなしの異なるポア状態に対応して分類することができる。そのような分類は、異なる分類（状態）に対して確率を割り当てることができる混合分布モデルを用いて実施できる。
【０１０４】
示されているように、明期間９１１の間に暗期間９１２があり、通り抜けはその中で起こりうるので、通り抜け事象は一連のより短いパルスを形成する。示されているように、パルスは、通り抜けの開始に異なる遅延が生じる結果、異なる幅を有する。ＡＣ波形が暗モードから明モードに切り替わる際、ヌクレオチド７０６に付けられたタグ７０７は、直ちにナノポア７０１に入り込まないかもしれない。ナノポア７０１の狭窄内には強い電界があるので、タグ７０７はすぐに引き込まれることができる。しかし、タグはランダムな動きで放散することもあるので、直ちにまたは所与のサイクル中にポア付近のこの強い電界と相互作用しないかもしれない。たとえ明確に定義された通り抜け速度があるとしても、明モードの開始後、通り抜けは必ずしも全く同時に起こるわけではない。ナノポア７０１の外へのタグの拒絶は、タグが既に電界と相互作用しているので同時に起こる。
【０１０５】
図９において、パルスがない一つのスペース９２５がある。これは、一つのサイクルの明モードで通り抜けが起こらない場合に発生しうる。従って、物理的状態の情報は、二つの結合事象があるのかまたはただ一つの長い結合事象なのかを決定するのが困難となりうるので、劣化しうる。また、両方の結合事象が触媒作用をもたらしたかどうか、従って鋳型核酸７０４上の各位置に対応しているのかを決定するのも困難となりうる。
【０１０６】
一連の通り抜け事象９２０は、結合事象９３０を形成するために再構築できる。この再構築プロセスは、どの通り抜けパルスを互いに組み合わせて（すなわち統合して）、酵素層の結合事象を形成するかを決定する。一部の態様において、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて、どの通り抜けパルスが特定のヌクレオチドの結合事象に対応するかを決定することができる。次いで、結合事象から、例えば合意形成手順を通じて、鋳型層が再構築できる。
【０１０７】
IV．再構築パイプライン
一つまたは複数の隠れ層（例えば、ポア層、酵素層、および鋳型層）を再構築するためのプロセスは、塩基呼出パイプライン（ハードウェアおよび／またはソフトウェアを含みうる）において進めることができる。そのような塩基呼出パイプラインは、コンピュータシステム、例えば図１のナノチップワークステーション１２０、図２のプロセッサ２２４、および／または図４のデジタルプロセッサ４３０を用いて実行できる。
【０１０８】
図１０は、本発明の態様に従って、鋳型核酸の配列決定中の配列決定セルの物理的状態を再構築するための方法１０００を示すフローチャートである。方法１０００は、ナノポア、ポリメラーゼ、またはその両方の組合せを用いて、例えば上記のタグを使用して測定されたシグナル値を使用できる。態様は、核酸がナノポアを通過するナノポア配列決定法に適用できる。態様は、例えば、全ヌクレオチドが同時に配列決定セル中に存在する場合に起こりうるような、ヌクレオチド取込みステップ間の明確な分離が存在しない非ナノポア技術と共に使用することもできる。
【０１０９】
ブロック１０１０で、配列決定セルに対して較正チェックが実施される。較正チェックは、配列決定チップ上の配列決定セルのすべてまたは一部に対して実施されうる。配列決定の開始前、配列決定セルの創作中に様々なチェックが実施できる。配列決定セルが創作されたら、所望通りの性能を発揮する配列決定セル（例えばセル中に１個のナノポア）を識別するために更なる較正ステップを実施することができる。そのような較正チェックは、物理的チェック、電圧較正、開チャンネル較正、および単一ナノポアを有するウェルの識別を含みうる。そのような較正の更なる詳細は、米国特許出願第１５／６３２，１９０号、発明の名称「ナノポア配列決定セルの形成および較正」に記載されている。チップの使用可能なセルが識別されたら、使用可能セルごとに一つずつ、核酸の配列決定をするための実動モードを実行できる。
【０１１０】
ブロック１０２０で、配列決定セルに対して配列決定モードが開始される。配列決定モードは、タグ付きヌクレオチドを配列決定セルに供給することによって開始できる。一部の態様において、電気シグナル値が測定できるようにＡＣまたはＤＣシグナルなどの電圧が配列決定セルに印加できる。他の態様では、例えば、ヌクレオチドに付けた発蛍光団からの光シグナルを測定してもよい。
【０１１１】
ブロック１０３０で、例えば第一の組のシグナル値として、シグナル値が測定される。シグナル値の例を本明細書に記載する。シグナル値は、ヌクレオチドに付けられたタグのものだけに限定されなくてよい。ＡＣシグナルの各サイクルについて一つまたは複数のシグナル値が測定できる。これらの測定シグナル値は、本明細書中に記載のようにシグナル層に一致する。第一の組のシグナル値は、配列決定セルの４つのセル状態（例えばポア状態）のそれぞれに対する測定値を含み、４つのセル状態は、異なるタグがポアを通り抜ける場合に起こりうるような、核酸の異なるヌクレオチドに対応する。その他のポア状態（例えば、開チャンネル状態、部分通り抜け状態、または非結合通り抜け状態）も使用できる。核酸がナノポアを通過する場合、開チャンネル状態は不要であろう。ナノポアを使用しない態様では、セル状態は、核酸に結合されているヌクレオチドの代理として測定された発光状態または電気的状態に対応されてもよい。
【０１１２】
ブロック１０４０で、シグナル値は任意に正規化されてもよい。正規化は、物理的な配列決定セルにおける揺らぎ（例えば、膜７１４の物理的構造または電流電荷の分布および配列決定セル）に対処できる結果、同じタグ種の測定値は類似のシグナル値を提供するので、より高い正確性を提供できる。正規化は、サイクル形状、ゲインドリフト、電荷注入オフセット、およびベースラインシフトなどのオフセット効果に対処できる。明期間における正規化シグナル値は、名目上０から１（１よりわずかに大きい値も可能）のスケールに置くことができる。ここで、１は開チャンネルのシグナル値（すなわちポア内にタグがない）に対応し、１未満の値は様々な通り抜け値に対応する。
【０１１３】
一部の態様において、すべてのシグナル値は、正規化を実施する前に、配列決定セルについて測定される。他の態様においては、シグナル値の測定中に少なくとも一部の正規化が実施できる。例えば、一定数のシグナル値が測定された後、第一の組の測定値を用いて正規化手順が開始でき、いくつかの新規シグナル値は測定が終了する前に正規化される。
【０１１４】
ブロック１０５０で、シグナル値のセットからヒストグラムが作成される。シグナル値は正規化できるが、配列決定セルの動作が時間を経ても十分に安定であれば、正規化されなくてもよい。ヒストグラムは複数のカウントを記憶するデータ構造を形成しうる。例えば、ＡＤＣ値（例えば０−２５５または０−５１１）が測定される回数をカウントでき、各ＡＤＣ値はヒストグラムのビンに対応しうる。従って、各カウントは、ビン内のシグナル値の数に対応しうる。別個の離散値のほかに、ビンは値の範囲にも対応しうる。いずれの実施においても、ヒストグラムの各ビンは異なる数値に対応しうる。
【０１１５】
図１１に、本発明の態様に従って、正規化されたシグナル値のプロット１１００と、開チャンネル（ＯＣ）値の分率によって測定された、異なる正規化値における測定のヒストグラム１１５０を示す。プロット１１００の縦軸は正規化された電圧を示すが、その電圧は任意の所与の時間（横軸）における開チャンネル電圧の推定値で割ったものである。正規化された電圧はＯＣ分率として表される。他の正規化および非正規化シグナル値も使用できる。電圧値は、所与のサイクルについてのメジアン値または平均値、または個別の値に対応するＡＤＣ値（例えばＡＤＣ４３５によって測定された）でありうる。
【０１１６】
ヒストグラム１１５０は、特定の値を有するシグナル値（この例ではＯＣ分率）の数を示す。示されているように、縦軸はＯＣ分率に対応する（プロット１１００と同じ）。立てて見ると、横軸がＯＣ分率値に対応することになる。他方の軸は、特定の数値（例えば範囲または具体的数字）を有する測定シグナル値の数のカウントに対応する。示されているように、最大ピーク（シグナル値の大部分）は１付近にある（ＯＣ値に対応する）。他の小さいピークは異なる塩基：Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧに対応する。シグナル値のこれらのクラスターを用いて、例えば混合分布モデルをヒストグラムにフィッティングさせることにより、塩基呼出を決定することができる。ピークがよく分離しているので、置換エラーは低いはずである。
【０１１７】
ブロック１０６０で、出力確率が、ヒストグラムに基づいて特定塩基に対応する正規化（または非正規化）シグナル値に割り当てられる。４つのセル状態の各セル状態について、確率関数は、そのセル状態にあることの確率を異なる数値に割り当てることができる。確率関数は、ヒストグラムのビンに対する複数のカウントを使用して決定できる。様々な種類の確率関数が、例えば、カットオフ値、ヒストグラムのピークに対応するシグナル値、または混合分布モデルに基づいて決定できる。確率関数が決定されたら、特定のセル状態に対応する（例えばＣに対応する）、所与の時間に測定された特定のシグナル値の確率が、そのセル状態に対応する確率関数を用いて決定できる。各シグナル値に対して４つの確率が決定できる。各確率関数は１つの確率を提供する。
【０１１８】
例えば、シグナル値のクラスターは、例えばヒストグラムのピークとして、ヒストグラムで確認できる。そのクラスターを用いて異なる塩基間を区別するためのカットオフ値を決定することができる。カットオフ値は、クラスターの間にあるように決定でき、例えば、ある範囲の正規化シグナル値をある塩基に割り当てることを可能にする。そのような例では、塩基（例えばＡ）が０．５〜０．６の正規化シグナル値に対応するとすれば、その範囲内に入る正規化シグナル値に１００％の確率が割り当てられる。他の態様では、所与の塩基に対して中央値が決定でき（例えば、カットオフ値によって設定された範囲の中央）、塩基に対応するシグナル値の確率は、シグナル値が中央値から遠く離れるほど低下する。
【０１１９】
一部の態様において、正規化シグナル値から混合分布モデルを決定することができる。混合分布モデルは、異なる塩基に対する４つの確率（混合）関数と、おそらくは開チャンネルに対する１つの確率関数（実施に開チャンネルが関与する場合）を有しうる。所与のセル状態（塩基）に対する関数は、ヒストグラムのピーク（例えば、最も一般的なシグナル値またはクラスターの重心にあるピーク）に適合する分布を形成できる。様々な態様において、各関数は別個のピークに独立に適合させることも（例えば別個最適化手順）または関数は集合的最適化手順の一部として集合的に適合させることもできる。
【０１２０】
混合分布関数は様々な形態のものでありうる。例えばガウス分布：
【数１】
2019531536.tif 000002
［式中、αはそのピークにおける関数の高さであり、μはピークの中心（例えばシグナル値のクラスターの重心、平均、メジアン、またはモードまたはその塩基についての予測値）であり、ｃは標準偏差である］。別の例は、ラプラス関数：
【数２】
2019531536.tif 000003
［式中、μはガウスの場合と同じである］を用いるラプラス混合分布モデルである。各関数下面積は１に制約できる。指数関数的に減衰する関数を有する様々な関数が使用できる。混合分布関数の高さ、位置、または幅について更に多くのパラメーターを有する更に複雑な関数も使用することができる。
【０１２１】
混合分布関数のパラメーター（例えば幅）は、基礎となるヒストグラムのシグナル値を最も良く近似するために、混合分布関数の最適パラメーターを識別するフィッティング（最適化）手順の一部として決定することができる。様々な実施において、期待値最大化手順、モーメントマッチング、スペクトル法、またはマルコフ連鎖モンテカルロが、混合分布関数のヒストグラムへのフィッティングを最適化するために使用することができる。
【０１２２】
ナノポアを用いる態様において、確率の割り当ては、ポア層を決定するための機構を提供でき、各ポア状態（４つの通り抜け状態および１つの非通り抜け状態）の確率は混合分布関数を用いて決定される。一部の実施において、混合分布モデルが各配列決定セルの測定シグナル値に適用できる。他の実施においては、シグナル値が同じチップのセル全体、またはチップごとに安定していることもある。そうすると、同じ混合分布モデルがチップのセル全体またはチップ全体に使用できる。混合分布モデルが特定の配列決定セルに対して決定される態様においては、初期の混合分布モデルは、他のセルまたは他のチップで行われた測定に基づいて決定できる。この初期混合分布モデルは、その後、最適化によってより良好な初期推定値が得られるように、最適化（フィッティング）手順の一部として更新することができる。
【０１２３】
ブロック１０７０で、ヌクレオチド状態（例えば、ポリメラーゼが使用される場合、結合状態）が、割り当てられた確率を用いて隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）で決定される。割り当てられた確率は、ＨＭＭの出力値として使用できる。混合分布モデルの各混合関数（分布）は、ＨＭＭの隠れ結合状態に対応しうるので、それによって酵素層の結合状態が提供される。合成が使用されない態様の場合（例えば核酸がナノポアを通って移動する）、ヌクレオチド状態は結合状態に対応しないであろう。塩基呼出は、ポア状態と酵素状態の１対１対応がある場合、確率関数のみ（例えば最も高い確率を有するものを取って）から生成できるが、ＨＭＭは高い正確性を提供することができる。
【０１２４】
図１２に、本発明の態様に従って、５つの状態を含むＨＭＭの例を示す。示されているように、状態０は結合タグなしに対応する。状態１は、酵素と核酸の間の活性部位に結合された塩基“Ａ”に対応する。状態２は活性部位に結合された塩基“Ｃ”に対応する。状態３は活性部位の塩基“Ｔ”に対応する。状態４は活性部位の塩基“Ｇ”に対応する。配列決定セル１２００は状態０で示されている。５つの状態が示されているが、より多くの状態（例えば非結合であるが通り抜け状態に対応する）を使用することもできる。
【０１２５】
状態を示す測定観測量（すなわちシグナル値）の確率は、円内の値によって表される。例えば、Ａが結合している場合の測定シグナルは、ポア内の結合Ａタグ（ＰＡによって表されている）のほか、任意の非結合（遊離）タグ（Ａ＋Ｃ＋Ｔ＋Ｇによって表されている）の測定値を含みうる。他の状態についても同様の構成が示されている。状態０の場合、Ｐはポア内にタグが検出されない確率を表している。
【０１２６】
状態０と他の結合状態と間の時間経過の遷移速度は、状態０と対応する状態間の矢印で示されている。Ｋｏｎ＿Ａ＝活性部位に入るヌクレオチド（タグ）Ａの結合速度。活性部位からのヌクレオチド放出速度は、Ｋｒｅｌｅａｓｅ＿Ａ  ＝Ｋｃａｔ＿Ａ  ＋  Ｋｏｆｆ＿Ａで、“触媒作用”速度（鋳型核酸上にとどまるヌクレオチド）と“オフ”速度（活性部位から離れ落ちるヌクレオチド）の合計である。遷移速度は様々な方法で決定（推定）できる。遷移速度は、例えば、同じポアの種類、タグの種類、および電解質溶液を用いて、実験ごとに安定していることが多い。
【０１２７】
塩基呼出手順は、一つまたは複数のセルの測定から実施できる。塩基呼出の決定後、状態の順序対(ordered pair)間の遷移の時間および頻度を用いて遷移速度を決定することができる。一実施において、遷移速度は、経時的な指数関数的減衰を定義するので、異なる時間で観測された遷移の頻度から決定できる。他の態様において、例えば、既知ゲノムのサンプル（例えば細菌）を配列決定し、出力を既知ゲノムと比較することによって、遷移行列(transition matrix)の様々な値を探し、最適な値の組を見つけることができる。一部の態様において、遷移行列は、所与の配列決定セルについて、おそらくは経時的に、例えば確率関数を経時的に更新するのと同様に更新することができる。これについては以下でさらに詳細に説明する。
【０１２８】
これらの遷移速度（例えば、遷移行列のペアワイズ遷移確率を提供する）を、割り当てられた確率（例えば出力確率）と組み合わせて使用すれば、最も可能性のある結合状態の系列を経時的な道筋として決定することができる。ＨＭＭは、ランダムではあるが、特定の統計的分布に従って挙動する確率プロセスをモデル化するためのフレームワークを提供できる。均一および／または不均一ＨＭＭは、塩基呼出プロセスの様々な部分に対して使用することができる。ＨＭＭの運用に関する更なる詳細は後述する。
【０１２９】
ブロック１０８０で、鋳型核酸の塩基がヌクレオチド状態から決定される。例えば、問題のサンプルからの核酸がチップ上で配列決定でき、ヌクレオチド状態の予備配列が互いに比較され、一致した塩基を決定することができる。そのようなプロセスは、例えばデ・ノボ・アセンブリ(de novo assembly)および／または参照ゲノムとの比較による予備配列のアセンブリを含みうる。一部の実施において、単一の予備配列の参照ゲノムとの比較は、それ自体、鋳型層の塩基の最終配列の決定の一部として使用することができる。塩基の配列を得るためにヌクレオチド状態に対する補正の確認において、様々なその他の技術（例えば発見的問題解決(heuristics)）も使用することができる。
【０１３０】
ブロック１０９０で、鋳型核酸の配列が提供される。例として、配列は、ユーザーに表示できる、後で閲覧するためにデータベースに保存できる、または更なる処理のために他のモジュールに提供できる。例えば、チップ上の核酸の全部または一部の配列（例えば同じサンプル由来）を分析して、コピー数の変動、一つまたは複数の参照ゲノムと比較した配列の変動（例えば、一塩基多型、体細胞突然変異、新規突然変異など）、転座などの変動を検出することができる。
【０１３１】
Ｖ．隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）の実施
様々な態様において、一つまたは複数のＨＭＭをパイプラインの様々な時点で使用することができる。例えば、ＨＭＭの隠れ配列は、経時的な結合状態（事象）の配列でありうる。この隠れ配列の決定は、ＡＣモードの使用によってさらに困難になりうる。ＤＣモードでは、結合事象があるたびに、タグは多少の遅れの後通り抜ける。一連のパルスがあり、それぞれ結合事象に対応し、連続的な結合事象が異なる塩基に対するものである場合、おそらく異なるシグナルレベルを有する。しかし、ＡＣモードが使用されると、そのようなパルスは、例えばＡＣシグナルの明期間のようなより小さい観測に分断されてしまう。
【０１３２】
結合事象の決定は、以下の例に示されているように、さらに複雑でありうる。ナノポアは、Ａがポリメラーゼの活性部位に結合されている状態にあり、対応するタグが２回並んで通り抜けると、２回の短いＡパルスが見られる。次に、通り抜けではなく次のＡＣ明期間の時に、Ａタグが通り抜け事象に失敗すると、先の通り抜けサイクルと後の通り抜けサイクルとの間にギャップが生じる。２組の通り抜けサイクル（間にギャップあり）が単一のＡに対応しているのかまたは２個のＡに対応しているのか決定することは困難でありうる。非通り抜け明期間の間、その最中にポアに捕捉されたＧの遊離タグ（付着Ｇは結合されていない）が存在することも可能である。このように、複数のタグの種類が単一の結合事象に混在することもありうる。ＨＭＭを用いる態様は、そのような問題に対処するために使用できる。
【０１３３】
Ａ．ＨＭＭの時系列
図１３に、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて隠れ状態を決定するための時間トレース１３００を示す。この例では、隠れ状態は、ポリメラーゼ（結合）状態またはポア（通り抜け）状態に対応しうる。トレース１３００は、いくつかの離散した時間ステップ１３１０（例えば、タイムスタンプまたは時間インデックスによって識別される）を含む。例として、各時間ステップは、異なる測定シグナル値（すなわち連続した測定シグナルは同じ明期間からのものでありうる）に対応しうるか、またはＡＣサイクル（例えば明期間あたり１点、これは通り抜け事象に対応すると識別されたシグナル値から決定できる）に対応しうる。様々な実施において、単一の値は、所与の明期間の通り抜けシグナル値の平均またはメジアンとして決定できる。明期間の通り抜けシグナル値は、開チャンネルと通り抜けチャンネル間を区別するカットオフ値（重み付きのハードカットオフまたはソフトカットオフ）に基づいて、非通り抜けシグナル（例えば、通り抜けが即時でない場合の明期間の開始時に起こりうるような）から区別することができる。
【０１３４】
変数Ｓは、隠れ状態１３２０、例えば、隠れ状態が結合状態の場合、１つの非結合状態と異なる塩基に対する４つの結合状態、または隠れ状態がポア状態の場合、１つの開チャンネル状態と４つの通り抜け状態を含む５つの状態に対応する。変数Ｙは、観測１３３０、例えば電圧または電流によって測定できるようなポア抵抗値に対応する。
【０１３５】
これらの特定の時間ステップにおいて、システムは任意の時点において、これら５つの状態の一つにある。隠れ状態は、例えば、塩基がポリメラーゼの活性部位に結合されているのかまたはタグがポアを通り抜けているのかどうか、決して実際に直接観測されない。これらの観測は、システムがあるその状態に依存するが、観測値とシステムの状態との間には必ずしも１対１の対応はしていない。単一のシグナル値は、特定の結合状態に直接対応するとは限らない（例えば、ＡＣモードが使用されている場合、結合状態が開チャンネル値および通り抜け値を含みうるように、または非結合タグがポアに入るように）。状態のそのような時系列は、特定の状態に対応する時間ステップにおける観測値の出力確率と、時間ｔにおける状態から時間ｔ＋１における状態への遷移確率に基づいて決定できる。将来の状態の確率は、現在の状態のみに依存し、それより前の状態には依存しないので、プロセスを無記憶にすることができる。
【０１３６】
様々な態様において、複数の隠れ層（例えば上記のデータ層）がありうるが、これらは別のＨＭＭによって別個に決定されてもまたは１つのＨＭＭによる決定のために一つの隠れ層に凝縮されてもよい。複数の隠れ層が関与する一例において、一つのＨＭＭが経時的な隠れポア状態を決定するために使用でき、ＨＭＭは結合状態を決定するための観測値としてポア状態を使用できる。別の例として、第一のＨＭＭ（または他のフィルタリング手順）は、測定シグナル値を用いて結合状態と非結合状態間を区別でき、第二のＨＭＭは、結合状態に対応する時間間隔中に得られた測定シグナル値を用いて、どの塩基が異なる時間に結合されたかを決定できる。フィルタリング手順は探索スペースを削減できるので、ＨＭＭだけが４つの結合状態間を区別するために必要である。そのようなフィルタリング手順は後のセクションでさらに詳細に説明する。
【０１３７】
Ｂ．状態の定義
ＨＭＭプロセスの最初の部分で、可能性ある様々な状態について記載している。前述のように、一部の態様において、４種類の塩基に対する４つの結合状態（おそらくは１つの集合的結合状態に対応する）と１つの非結合状態に対応する５つの酵素状態がある。ポア状態に対しては様々な状態が定義できる。例えば、フィルタリング手順を用いて結合状態および非結合状態に対応する時間を識別する場合、通り抜けおよび非通り抜け（開チャンネル）の２つの状態が定義できる。この場合、二つの確率関数が決定できる（例えば混合分布モデルについて）。一つは通り抜け確率関数であり、一つは非通り抜け確率関数である。通り抜け状態を異なるタグごとに４つの通り抜け状態に分ける場合、５つのポア状態が定義できる。
【０１３８】
一部の態様において、ポリメラーゼ状態およびポア状態は一つのＨＭＭを用いて決定できるので、より多くの隠れ状態が一つの隠れ層に存在しうる。例えば、非結合ヌクレオチドに付けられたタグ（非結合タグと呼ばれる）は、ナノポアを通過できるので、結合されていないタグの種類、例えば非結合Ｇタグに特有のシグナルを発生する。状態の組合せ、例えばＡタグは結合されているが通り抜けておらず非結合Ｇタグが通り抜けているという状態もありうる。
【０１３９】
そのような組合せ状態は、システム状態と呼ぶことができる。システム状態は、結合ヌクレオチドなしおよび通り抜けタグなし、結合ヌクレオチドなしおよび通り抜け遊離タグあり、結合ヌクレオチドなしおよび通り抜けタグなしであるがバックグラウンド構造あり（例えば、ポリメラーゼ構造がポアの近くにあってポア抵抗を変化させている）を含みうる。従って、６つの可能なポア状態に対応する非結合ポリメラーゼについて６つのシステム状態がありうる。すなわち、非通り抜け、通り抜けた異なるタグについて４つ、およびバックグラウンドに対して１つである。結合ポリメラーゼ状態のそれぞれは、６つのシステム状態に対応できるので、そのような例においては３０のシステム状態が提供される。実際のポリメラーゼ状態は、ポリメラーゼ状態を得るために決定されたシステム状態から抽出することができる。
【０１４０】
可能性ある他の状態は、部分結合状態を含む。これは、ナノポアを部分的に通り抜けている特定タグに対応する。これらの部分結合状態は、部分積分状態と呼ぶこともできる。なぜならば、ＡＤＣ（例えばＡＤＣ４３５）前のキャパシタ（例えばキャパシタ４０８）における蓄積電荷の量が、タグが測定サイクルのごく一部の間しかポア内になかったので、想定される量の一部に過ぎないからである。例えば、ポア／タグの組合せは、タグが全時間ポア内にある場合、一定の抵抗を有することになる。タグが積分時間（例えば、スイッチ４０１の開放と、ＡＤＣ４３５による測定の間）を通じて途中までしか通り抜けなかった場合、異なる量の電荷が蓄積することになる結果、ポア／タグの組合せの抵抗について異なる測定値が得られる。このような部分積分状態は、いつ通り抜けが起こるかに依存しうる。そのような部分状態は、電流または光強度などのその他のシグナルを測定する態様についても定義できる。
【０１４１】
そのような多数のシステム状態は、ＣＰＵ時間および記憶装置に関して計算コストが高くつくことになりかねない。というのも、計算要件は状態数の２乗に比例して拡大するからである。一部の態様では、問題をポア状態に分解し（例えば混合分布モデルを用いる）、次いでポリメラーゼ状態に対してＨＭＭを使用することによって、そのような計算量を低減することができる。前述のように、態様は、二つのＨＭＭ、すなわち結合状態を非結合状態から識別する第一のＨＭＭと、結合状態についての異なる塩基間を差別化する第二のＨＭＭを使用することにより、増大した計算効率をさらに提供する。
【０１４２】
Ｃ．遷移確率
状態が定義されたら、状態間の遷移確率が決定できる。そのようなペアワイズ遷移確率は遷移行列を形成する。遷移行列は正方行列である。従って、３０の状態があると、遷移行列は３０×３０の行列となる。遷移行列は、これらの状態間の遷移の統計知識に基づいて、一つの状態から次の状態へ移動する配列決定セルの経時的な確率を記述する。
【０１４３】
行列内の値は物理的測定値から決定できる。一つの測定値は通り抜け速度である。一部の態様において、新規データがあると、他のパラメーターに依存しないパラメーター（例えば遷移または出力確率）は、観測を通じて直接フィットさせることができる。次に、そのような今較正されたパラメーターを、遷移確率を決定するためのより複雑なモデルに入力することができる。別のパラメーターは、結合事象の擬似持続時間(suspected duration)で、これは対応する遷移確率に影響する。一部の実施において、持続時間は新しいデータセットごとにリセットされない。推定関数(estimator function)はより正確になり、新しい測定を実施することができる。一部の態様は、推定と再推定のループが多くの実験にわたって行われるサイクルを有しうる。ＨＭＭ中の各パラメーターは多少異なって処理することができる。一部のパラメーターは較正に長時間を要しうるが、他のパラメーターはより安定でありうる。
【０１４４】
図１４Ａに、ペアワイズ遷移確率の遷移行列の例を示す。５つの状態が示されており、例えば１つの非結合状態および４種類の塩基に対する４つの結合状態に対応している。行は開始状態に対応し、列は終了状態に対応している。任意の所与の行の合計は１である。遷移確率は、図１２に描かれた状態図を反映している。ブランクの行列要素は０である。ゼロであるかまたは極端に低い遷移は、特定の遷移をするための確率がなしであるかまたは非常に小さい確率であることを表す。
【０１４５】
対角要素が最も高い。セルがＳ１の状態にある場合、セルは次のサイクルでＳ１にとどまる可能性が最も高い。従って、遷移行列の対角値は１に近くなりうる。例えば、所与の明期間における現在のポリメラーゼ状態がＡが結合されていることであれば、次の明期間も結合されたＡを有する可能性が高い（例えば、Ａの対応タグが再度通り抜ける）。一般に、ポリメラーゼがどのような状態でも、状態は観測時間より長く続くので、次の状態も同じである可能性が最も高い。遷移行列の非対角項は、一つの状態から別の状態への遷移を提供する。様々な状態（例えば本明細書中に記載のような）のいずれも遷移行列に含めることができる。
【０１４６】
追加の状態の中には、他の状態のあるサブセットからしか到達し得ないものもある。そのような制限は遷移行列にコード化できる。例えば、システムは、状態Ｓ３に到達する前に、状態Ｓ０（非結合）からＳ１にしか到達できない。従って、Ｓ０は、二つの他の状態の間にあるので、その経路における遷移状態と見なすことができる。そのような制限および遷移は、システムに関するある種の物理的性質を知ることができるので、重要な情報を提供できる。一部の態様において、二つの結合状態間の遷移はゼロでない確率を有しうる。図１４Ｂに、結合状態間のゼロでない確率を有するペアワイズ遷移確率の遷移行列の例を示す。
【０１４７】
Ｄ．出力確率
出力テーブルまたは関数は、所与の状態についての観測パラメーターに関する情報を提供する。例えば、各状態は、一般的に、観測パラメーター、例えばナノポアにある特定のタグに関連する電圧または電流について、特定範囲の値を有しうる。
【０１４８】
１．テーブル
図１５Ａに、各５つの状態について異なる範囲にある観測パラメーターの確率を含む出力テーブルの例を示す。行は５つの状態Ｓ０〜Ｓ４に対応する。例えば、１つの非結合状態および４つの結合状態に対応している。列Ｙ０〜Ｙ４は異なる範囲のシグナル値（例えば正規化されたシグナル値について）に対応する。例えば、Ｙ０は（＞０．９）に対応し；Ｙ１は（０．９−０．６７）に対応し；Ｙ２は（０．４５−０．６７）に対応し；Ｙ３は（０．２３−０．４５）に対応し；そしてＹ４は（０．０−０．２３）に対応する。５つの範囲が示されているが、追加の範囲も使用できる。範囲は、所与の状態にある確率がゼロで無視される範囲間の値と重なり合わない。
【０１４９】
所与の範囲（例えばＹ２）内のシグナルに関する任意の数値は、出力テーブルの所与の列に対応する。この列は、その範囲内で測定されたシグナルについて５つの状態のそれぞれにある確率を提供する。Ｓ１の場合、Ｙ１を観測する可能性が最も高いが、他の範囲からの値を観測することも不可能ではない。従って、範囲内の各数値に別の確率を割り当てる代わりに、そのシグナル値に割り当てられている一つの確率に対するハードカットオフがある。シグナル値をこのように離散化すると一定量の情報が失われうるが、テーブルの使用はより効率的であろう。
【０１５０】
バウム・ウェルチアルゴリズムを用いると、遷移行列および出力行列を決定できるほか、解くこともできる。しかしながら、そのような技術は計算コストが高い。代わりに、態様では確率関数を使用することができる。
【０１５１】
２．出力確率関数
出力関数（例えば確率密度関数、ＰＤＦ）は、同じ範囲内の観測パラメーターのすべての値を同じ発生確率を有するとして扱うのとは対照的に、連続関数として確率を提供できる。ＰＤＦは、観測パラメーターの所与の値についてそれぞれの状態にある確率を提供することができる。
【０１５２】
図１５Ｂに、本発明に態様に従って、５つの状態（Ｓ０〜Ｓ４）のそれぞれについて、出力確率関数の例を示す。各関数の縦軸は確率であり、横軸は観測パラメーターの値（シグナル値）である。例えば、横軸は、図１１のＯＣ分率であり得る。横軸は左側の約１から始まり、右側に向かって０まで伸びている。
【０１５３】
図１１と一致して、開チャンネル状態は１．０に近いシグナル値を有する可能性が最も高い。異なるタグのポア状態のそれぞれは、異なる数値にピークを有している。一部の態様において、通り抜けポア状態のそれぞれは、例えば部分通り抜けまたは緩徐な通り抜けのために、開チャンネル値の近くにゼロでないある確率を有しうる。それによって、明期間に開チャンネルの測定値を含ませている。
【０１５４】
３．ヒストグラムを用いる確率関数の決定
一部の態様において、ピークおよび／または谷の検出技術を実施すれば、ピークの位置を決定することができる。例えば、Ｄａｖｉｅｓの谷検出法が、例えば、谷が負の方向でピークに変換でき、逆さ谷(inverted valley)の間の分離をピークと識別できる場合、使用できる。当業者には分かる通り、様々なピークおよび／または谷検出技術が使用できる。ヒストグラムは、例えばカーネル密度推定（ＫＤＥ）を用いてビニングアーチファクト(binning artifacts)を平滑化することができるので、ピーク検出をより容易に実施することが可能となる。
【０１５５】
一部の実施において、ピーク検出は、有利なことに、データ形状、ピーク数などに関する仮定を持たなくてよい。そのような仮定がなければ、所与の実行について所与の配列決定セルのすべてのシグナル値が必要になりうる。すべてのデータを要求することはオフラインと呼ばれ、スループットを遅らせうる。ピーク検出は、十分に形成されていないかまたは非常にまばらなデータに対してよく機能しうる。そのような検出は、存在するはずのピークの数（例えば５つのポア状態に対応する５つのピーク）を特定することによって支援することができる。従って、５つの最高ピークの位置を使用して、出力確率関数を決定することができる。
【０１５６】
確率関数は、ピークの位置に基づいて決定することができる。例えば、同じ幅を有する同じ確率関数は各ピークを中心にすることができる。別の例として、各確率関数は、ピーク付近のデータだけに独立にフィットさせることができるので、各ポア状態に対する確率関数の幅（例えば半値幅）の決定が可能となる。
【０１５７】
更なる実施において、特定数の確率関数はヒストグラム（または平滑化ヒストグラム）にフィットさせることができる。確率関数は混合分布モデルの一部であり得、各確率関数は混合要素で、それぞれは異なるポア状態に対応している。従って、すべての異なる確率関数は、混合分布モデルの異なる要素から来ているとして扱うことができる。一態様において、ラプラス混合分布モデルが使用され、より多くのシグナル値が得られるとオンラインで更新できる。混合分布モデル（または他のＰＤＦ）のパラメーターの初期値は、同様のポアおよびタグを用いる他の配列決定セルの測定値に基づいて決定することができる。このようにして最適化手順は確率関数をより効率的にフィットさせることができる。そのようなパラメーターは、ＰＤＦのピークの位置およびＰＤＦの幅を含みうる。
【０１５８】
図１６に、本発明の態様に従って、４つのポア状態についての確率関数（ＰＤＦ）の例を示す。各ポア状態は出力関数を有し、それぞれ異なるＯＣ分率値（正規化されたシグナル値の例である）にピークを有する。分かるように、確率関数はヒストグラムにフィットし、確率関数の高さはヒストグラムのピークに対応し、確率関数の幅はピーク付近のビンカウントの広がりに対応している。
【０１５９】
ＰＤＦ１６１０は状態１に対応している。ＯＣ分率が約０．３の場合、ナノポアは状態１にある可能性が最も高い。同様に、ＯＣ分率〜０．５５は状態２の可能性が最も高いことを示唆する等々である。出力ＰＤＦはオーバーラップして、異なる結合タグ（状態）間の何らかのクロストークに至ることがあるかもしれないが、ピークは一般的に分離している。
【０１６０】
従って、所与のシグナル値について、各状態のＰＤＦを使用すれば、その所与のシグナル値がその状態にある確率を提供することができる。シグナル値がＰＤＦのピークにあれば、対応する状態は高い確率を有することになる。ＰＤＦがシグナル値をカバーするテールを有する場合、確率は小さくなるが、それでも有限である。従って、測定されたシグナルを使用してすべての状態の確率をＰＤＦに基づいて決定することができる。
【０１６１】
一部の態様において、異なる確率関数が異なる時間間隔に対して決定できる。シグナル値のピークは時間経過と共にドリフトしうる。従って、異なるセットの確率関数を使用すれば、異なる時間ステップにおける出力確率を決定することができる。
【０１６２】
Ｅ．復号 − 隠れ状態の最適配列の決定
状態が定義され、遷移確率および出力確率関数が決定されたら、隠れ状態を復号して鋳型核酸に結合された塩基を決定することができる。一部の態様において、遷移確率および出力確率関数は、隠れ状態が復号される前に、所与のセルについて配列決定の実行全体にわたって完全に決定されうる。
【０１６３】
複数の復号が異なる観測パラメーターと共に使用できる。例えば、一つのモデルでは各シグナル値が使用され、別のモデルではＡＣサイクルの所与の明期間についての単一の統計（要約）値が使用される。要約値を使用すればより速く実行できるが、個別のＡＤＣ値を使用すれば、例えば上記のようなより多くの様々な状態など、状態におけるより多くの記述が可能になる。
【０１６４】
１．観測テーブル
ＰＤＦおよび各時間ステップにおける測定シグナル値を用いて、観測テーブルが作成できる。各時間ステップについて、測定シグナル値を用いて各状態（例えば酵素状態）の確率を決定することができる。
【０１６５】
図１７Ａに、本発明の態様に従って、５つの時間ステップにおける４つの状態についての観測テーブルを示す。４つの状態はＳ１〜Ｓ４であり、５つの時間ステップはＴ１〜Ｔ５である。より多くの状態およびより多くの時間ステップが使用できる。観測テーブル中の値は、各時間ステップにおける測定シグナル値に基づいて決定された、各状態の異なる確率に対応している。
【０１６６】
例として、観測１の場合（すなわち時間ステップＴ１）、シグナル値を用いて各状態に対する対応確率（Ｐ１１、Ｐ２１、Ｐ３１、およびＰ４１）をそれぞれのＰＤＦに基づいて決定することができる。同じことが、それぞれ異なる時間ステップに対応している各測定シグナル値について実施できる。時間ステップの数は、セル中の所与の核酸の測定の一部またはすべてでありうる。例えば、測定のあるセグメントはチャンク（ひとかたまり）として一緒に復号でき、核酸の別の部分の測定の別のセグメントは異なるチャンクとして復号できる。
【０１６７】
図１６の例において、ポア状態と酵素状態の１対１対応があるので、確率関数と酵素状態も１対１対応がある。他の実施において、酵素状態より多いポア状態があることもある。例えば、非結合タグまたはバックグラウンド構造を含むポア状態である。この場合、それより多い確率関数が所与の酵素状態に対応しうる。従って、所与の時間ステップにおける所与の状態の確率（例えばＰ１１）は、複数の確率関数から決定される確率値の合計として決定できる。例えば、非結合酵素状態は、ポアを通り抜ける非結合タグに対応する確率関数からの寄与を有しうる。酵素状態とポア状態を組み合わせたシステム状態を使用する他の態様では、非結合タグを有する状態が使用できるが、確率関数は一つのシステム状態に対応する。
【０１６８】
一部の態様において、観測テーブルは出力テーブルから作成できる（例えば観測されたパラメーターの離散レベルが使用されている場合）。観測テーブルが作成されたら、連続および離散ＨＭＭは同じように処理できる。
【０１６９】
２．トレリス線図を通る最適経路
遷移行列および観測テーブルを使用してトレリス線図（グラフ）を作成することができ、トレリスを通る最適経路は結合事象を提供する。トレリス線図を通る最適経路は、システムは無記憶であるというマルコフ性に基づいて決定できる。どの時点でも、その時間の状態を決定する際、前の列だけが考慮されうる。それより前の列は考慮されない。トレリス線図では、一つの時間ステップにおけるヌクレオチド状態は、ペアワイズ遷移確率に従って、次の時間ステップにおけるヌクレオチド状態に結びつけることができる。
【０１７０】
図１７Ｂに、本発明の態様に従って、４つの状態と５つの時間ステップのトレリス線図の例を示す。４つの状態Ｓ１〜Ｓ４のそれぞれが数字１〜４の２進値によって表されて示されている。列は、観測テーブルにおけるのと同様、時間ステップに対応している。赤い矢印は最適経路に対応している。最適であることにより、経路は、一つの時間ステップから別の時間ステップへの各遷移の最も高い確率を有しうる。トレリス線図の第一の列は、初期条件を特定するための時間＝０における状態の確率Ｐ（Ｓ０）と言うことができる。確率Ｐ（Ｓｔ＋１｜Ｓｔ）は、例えば図１４Ａの遷移行列に特定されているような遷移動力学を特定する。確率Ｐ（Ｙｔ｜Ｓｔ）は、出力確率関数によって定義されているようなセンサーモデルを特定する。
【０１７１】
矢印１７０５のそれぞれは、観測テーブルおよび遷移行列からの対応値を組み合わせることによって決定された関連値を有する。例えば、遷移１７１０の尤度は、（Ｓ１，Ｓ１）に対応する遷移行列要素およびＰ１２の値に基づいて決定できる。従って、状態がＴ１においてＳ１（すなわち００）と仮定すると、遷移１７１０の尤度は、遷移行列要素およびＰＤＦ確率に基づいて決定できる。これらの尤度は、最適経路を決定するために復号（例えばビタビ復号）によって使用できる。
【０１７２】
トレリス線図決定の一部として、システムが単一時点ごとにいずれかの状態にあった尤度を決定することができる。尤度は、特定の遷移が許可されているかおよびまたは可能性が高いかどうかということ、および実際の測定シグナル値（これは、システムが観測テーブルで決定される所与の状態にあった確率を提供するために使用される）に依存しうる。一態様において、遷移の尤度は、遷移行列からの対応値と観測テーブルからの対応値をかけることによって決定できる。計算は対数空間で実施できる。
【０１７３】
Ｔ１における状態は、何も結合されていない状態０と仮定できることが多い。次に、Ｔ２への最適経路を決定する一部として、Ｓ０からＳ１への遷移は不可能であるかまたは確率が低いことが分かる。そこで、次のベストの推測は、Ｓ０からＳ２への遷移でありうる。これは可能であり高い遷移速度を有しうる。Ｔ２においてＳ１にある観測確率は状態２にあるより高いであろうが、遷移確率の差がＳ２の選択につながる。
【０１７４】
トレリス線図を通る前進パス(forward pass)は、システムが任意の時点で任意の状態にある尤度を決定するために実施できる。一つの態様では、時点ごとに最大確率を取ることができる。さらに、フォワード・バックワード・アルゴリズムの一部として、同じ経路が得られるかを決定するためにトレースバック(trace back)を実施することもできる。最適経路の決定において、一部の態様では次の状態を決定するために現在の状態だけが使用できる。
【０１７５】
各時間ステップにおいて、結果の状態は、結合状態だけが使用される場合、結合事象に対応しうる。他の状態が使用される場合（例えば、部分結合状態および非結合状態）、トレリス線図を検索して結合状態を抽出できる。一部の態様において、二つの非結合状態間に複数の結合状態が存在する場合、それらの結合状態をさらに解析して、複数の塩基が実際に存在しているかどうかまたはそれらが単一ヌクレオチドの取込みに対応しているかどうかを決定することができる。
【０１７６】
非結合状態が存在する場合、更なる情報も決定できる。例えば、通り抜け時間が決定できる。これは、状態が結合および非通り抜け（例えば開チャンネル状態）から結合および通り抜けに進んだ場合を解析することによって実施できる。トレリス上の結果を見ることにより、それらの場合すべての通り抜け時間が決定できる。あるいは、塩基呼出を決定するために、所与の時間に何が結合されているかのみを決定することもできる。
【０１７７】
一部の態様において、トレリス上の最適経路は、どの状態がシステムに対して定義されているかに応じて、ポアデータ層および酵素データ層（結合事象）を提供できる。層の異なる組合せおよび異なる組合せに由来するすべての状態は、システム状態、すなわち酵素層状態およびポア層状態の組合せと呼ぶことができる。システム状態は、それら二つの層のすべての組合せを記述でき、そのどちらも、そのように定義された場合、一つのトレリスから読み出すことができる。
【０１７８】
Ｆ．塩基呼出の決定
塩基呼出を決定するための一態様において、すべての結合事象を塩基呼出と見なすことができる。そのような手順は、配列決定セルがつっかえず(stutter)、例えば、ヌクレオチドは取り込まれたが触媒されず、同じ種類の新しいヌクレオチドが取り込まれて、後で触媒されれば、正確でありうる。例えば、結合事象があるたびに、触媒される前に離れ落ちる機会が５０％あると仮定する。結合事象のリストが分析できれば、塩基呼出の数を減らすことができる。例えば、同じ塩基について二つ以上の連続結合事象があるたびに、その数は半分にすることができる。二つ以上の場合とは対照的に、ヌクレオチドについて時には一つの結合事象しか並んでいないことに対処するために修正を行うことができる。
【０１７９】
一部の実施において、時間的に隣接しているが非結合状態によって分離されている二つの結合状態（同じ塩基に対応する）を統合するかどうかを決断する場合、ヌクレオチドが全時間結合されている場合に通り抜け事象を失敗する可能性がどのくらいであるかを決定することができる。これは、時間的に互いに非常に近接した同じ状態に対して二つの結合状態を二つが見出す可能性がどのくらいあるかということとバランスを取ることができる。配列決定セルの運転において、結合事象間の待機時間は、タグ付きヌクレオチドを希釈して、結合事象間に多くの待機時間があるように十分に大きく設計することができる。しかしながら、結合事象間が長くなるほど、スループットはそれだけ遅くなる。
【０１８０】
VI．品質スコア
一部の態様において、塩基の品質スコアが提供できる。品質スコアは、単一分子観測に固有の確率的挙動を反映したものでありうる。塩基呼出の品質は時間または読み出し長さに伴って劣化することはないであろうが、所与の鋳型核酸上の異なる時点でランダムになされる異なる塩基呼出については異なる品質スコアがあるかもしれない。塩基呼出の品質スコアが高いほど、塩基呼出が正しいことの信頼度が大きいことを示しうる。例えば、ＰＤＦのピークに近いシグナル値は、ＰＤＦのピークから遠いシグナル値よりも、高い品質スコアを有する塩基呼出をもたらすことができる。ベースコーラー(basecaller)（例えばＨＭＭを使用する）の出力の一つは、そのような品質スコアでありうる。
【０１８１】
一部の態様において、品質スコアは以下のように計算できる。
【数３】
2019531536.tif 000004
Ｐ（ｏｂｓ｜ｓｔａｔｅｉ）は確率関数から決定でき、そして
Ｐ（ｓｔａｔｅｉ）は遷移確率から決定できる。
【０１８２】
品質スコアＱは、酵素状態が４種類の塩基間で正しく呼び出された可能性がどのくらいであるかということと、該当する場合非結合状態の可能性についての尺度を提供する。Ｑ値は特定の範囲内に特定することができ、例えばＱ値が高いほど、より大きい正確性の信頼度を提供する。一部の側面において、Ｑスコアの成分は、例えば、一つの結合事象を小さいパルスに分割するＡＣモードに起因する、同じシグナルレベルの結合事象またはポア事象の統合における信頼度を含みうる。
【０１８３】
ＨＭＭを用いる品質スコアの決定の一例として、隠れたスペースを通る異なる準最適経路がある（例えばトレリス線図）。相対確率は重み付けをして、情報的意味の品質、すなわち塩基呼出がいかに確実であるかを提供することができる。
【０１８４】
例えば、復号は、複数のサイクルにわたって同様の値を有するタグの一連の通り抜けシグナルを、単一の結合ヌクレオチドに対応すると識別することができる。Ｑスコアが生成される場合、他の準最適経路を考慮に入れて、測定されたシグナル値はまだ生み出されうるのかどうか、そしてもしそうなら、その組み合わされた経路と測定シグナル値の確率は何であるかを決定することができる。確率は、その所与のセットの観測に対して隠れ状態のすべてについて計算することができる。品質スコアは、可能な状態間の相対的分離を提供できる。別の状態の確率がわずかに小さかった場合、品質スコアは相対的に低くなるであろう。
【０１８５】
一部の態様において、正規化手順からの情報を品質スコアの決定に使用することができる。例えば、不確実性の推定は、ＯＣ分率を決定するために使用される現在の開チャンネル電圧を推定するために使用されるカルマンフィルタから得ることができる。不確実性を用いてＱスコアを調整することができる。不確実性は、正規化がいかに良く機能したかと見なすことができる。
【０１８６】
VII．出力ＰＤＦの更新（時間依存性混合分布モデル）
前述のように、混合分布モデル（または他のＰＤＦ）のパラメーターの初期値は、同様のポアおよびタグを使用する他の配列決定セルからの測定値に基づいて決定できる。ＰＤＦは最近の測定に基づいて更新でき、ポアごとに決定できる。一部の状態のＰＤＦは実験ごとに非常に安定していることがある。そのような状態は特徴付けでき、出力関数の形状が決定できる。他の状態は、時間経過と共に変化しうるおよび／またはポアごとに異なりうる。
【０１８７】
従って、態様において、ＰＤＦの初期パラメーター、例えば、ピークの位置、各ＰＤＦの幅、および各ＰＤＦの指数関数的減衰速度が決定できる。次に、一組のシグナル値を測定し、それを使用してヒストグラムを決定し、それを使用してＰＤＦのパラメーターを更新できる。実際の測定値に基づいてリアルタイムでＰＤＦを更新することは、センサー（例えばポア）ごとに塩基呼出手順を調整することを可能にするので、有用である。このように、確率関数は、所与のセルにおける核酸の配列決定のために経時的に調整できる。
【０１８８】
一部の態様において、ＰＤＦはベイズ統計を用いて更新することもできる。初期のＰＤＦは事前分布として扱うことができ、更新されたＰＤＦは、所与のポアについて測定されたシグナル値を用いて、事後分布として決定することができる。一部の実施において、第一の組の測定シグナル値は、セルに対する所与の実行で核酸について測定されたシグナル値の一部にすぎない。後の組のシグナル値を用いて、核酸の後の部分についての配列決定時間にわたってＰＤＦを更新することができる。このようにして、時間依存性ＰＤＦ（例えば時間依存性混合分布モデル）を得ることができる。
【０１８９】
事後分布の決定に当たって、初期の塩基呼出は事前分布を用いて決定できる（例えば、ＨＭＭ、予期されるクラスターを分離するカットオフ値、または事前分布から最も高い確率を有する塩基を用いて）。特定塩基に対する塩基呼出を使用して、その塩基の事前分布を用いてその塩基に対応する事後分布を決定することができる。これは、すべてまたは複数の事後分布を同時に決定するのとは対照的である。一部の実施においては、特定の塩基に明らかに対応するシグナル値だけ（例えば、２番目に高い別の塩基の確率と比較しうる閾値より高い出力確率を有する）を使用して、所与の期間の事後確率が決定される。シグナル値は、シグナル値に対応する塩基呼出の品質スコアに基づいて選択できる。さらにまたはあるいは、一定のシグナル値だけ（例えば、閾値を超える品質スコアを有する塩基呼出の）を使用して事前分布が決定される。
【０１９０】
他の態様において、ＰＤＦの更新は、所与のセルについての第一の組の測定値を使用するだけよいが、最適化手順のための初期値は、他の配列決定セルおよび／または配列決定チップから得られた値で開始させる。そのような制約が最適化手順に加えられるのは、新しいパラメーターが初期値からあまりに著しく逸脱しないようにするためである。初期値から著しくは変化しないパラメーターの個別の値のほかに、制約はパラメーターの相対値にも課すことができる（例えば、ＰＤＦの２つのピークの位置間の距離は特定範囲内にあるように制限できる）。そのような状況では、ＰＤＦの更新は、一組のピークの位置のシフト（値の上げまたは下げ）でありうる。新しい測定値がＰＤＦのパラメーターを著しく変化させる（または制約に達する）ようであれば、所与の配列決定セルに問題があるのかもしれない。例えば、二つのＰＤＦのピーク位置が近くなりすぎるような場合である。そのような問題はそのセルのデータの廃棄をもたらすことになろう。
【０１９１】
他のセルおよび／またはチップからの初期パラメーター値を使用することに加えてまたはその代わりに、ＰＤＦの決定に使用される初期ヒストグラムの決定に初期の組のシグナル値が使用できる。例えば、セルの配列決定実行のシグナル値の３分の１をＰＤＦのパラメーター値の決定に使用することができる。
【０１９２】
Ａ．時間依存性ＰＤＦの決定法
図１８に、本発明の態様に従って、核酸の配列決定をするために、配列決定セルを使用して時間依存性確率関数を決定する方法１８００のフローチャートを示す。方法１８００の側面は、方法１０００と同様に実施できる。
【０１９３】
ブロック１８１０で、配列決定セルについての第一の時間間隔にわたって核酸から測定された第一の組のシグナル値を得る。第一の組のシグナル値は、配列決定セルの４つのセル状態（例えばポア状態）のそれぞれの測定値を含み、その４つのセル状態は異なる種類のヌクレオチドに対応する。一部の実施においては（例えばポリメラーゼが関与する）、５つのセル状態が使用できる。例えば、第五のセル状態はヌクレオチドが現在活性部位にないことに対応する。シグナル値は、図１０のブロック１０３０に記載されているようにセルで測定され続ける。
【０１９４】
第一の組のシグナル値は、プロセッサ、例えば図２のプロセッサ２２４でシグナル値を受け取ることによって得られる。受け取ったシグナル値は電気回路２２２からのものである。一部の実施において、取得は、配列決定セルを用いてシグナル値を測定することを含みうる。第一の組のシグナル値は、例えば図１０のブロック１０４０に記載されているように正規化することができる。
【０１９５】
ブロック１８２０で、第一のヒストグラムが第一の組のシグナル値から作成される。ブロック１８２０は図１０のブロック１０５０と同様に実施できる。例えば、第一のヒストグラムは複数のカウントを記憶するデータ構造であり、各カウントはヒストグラムのビン内のシグナル値の数に対応する。第一のヒストグラムの各ビンは、例えば図１１に関して記載されたように、異なる数値に対応しうる。
【０１９６】
ブロック１８３０および１８４０は、４つのセル状態の各セル状態に対して実施できる。より多くのセル状態が使用される場合、ブロック１８３０および１８４０はそれらのセル状態に対しても実施できる。
【０１９７】
ブロック１８３０で、セル状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる初期確率関数が得られる。初期確率関数の例は上に記載されている。例えば、初期確率関数は、一つまたは複数の他の配列決定セルから測定されたシグナル値を用いて決定できる。例えば、他のセルからのシグナル値を用いてヒストグラムを作成でき、それに初期確率関数をフィットさせることができる（おそらく初期確率関数のすべては一緒に決定される）。別の例として、初期確率関数は、第一の時間間隔より早い時間間隔から測定されたシグナル値を用いて決定することもできる。
【０１９８】
さらに別の例として、初期確率関数は、核酸の配列決定における第一の時間間隔と他の時間間隔とを含むより長い時間間隔にわたって測定されたシグナル値を用いて決定することもできる。例えば、より長い時間間隔は、そのセルの配列決定実行全体にわたることができる。より長い時間間隔から使用されるシグナル値は、一定のシグナル値だけ、例えば重心からの閾値シグナル距離によって定義できるようなタイトなクラスターにあるシグナル値だけを含みうる。より長い時間間隔中の全シグナル値にわたるベースコーラー（例えばＨＭＭまたは単にカットオフ値を使用する）による初回パス(first pass)は、品質スコアと共に初期塩基呼出を提供できる。というのも、所与のセル状態（例えば特定の通り抜けタグに対応するポア状態）についての初期確率関数を決定するために、高い品質スコアを有する塩基呼出に対応するシグナル値を選ぶことができるからである。このようにして、初期確率関数は、特定のヌクレオチドの結合状態を高度に示すシグナル値に対応しているので、より狭い幅とより正確なピーク位置を有することができる。
【０１９９】
ブロック１８４０で、初期確率関数と第一のヒストグラムを用いて、第一の時間間隔に対応する第一の確率関数を決定する。第一の確率関数は、セル状態にあることの出力確率を異なる数値に割り当てる。第一の確率関数を決定するための技術例は上に記載した。例えば、ベイズ手順は初期確率関数を事前分布として使用することができ、第一のヒストグラムは、第一の確率関数を事後分布として提供する新しい測定値である。
【０２００】
ブロック１８５０で、第二の時間間隔に対応する第二の確率関数を決定する。第二の確率関数は４つのセル状態に対応する。第一の確率関数と第二の確率関数（おそらくは他の時間間隔についての他の確率関数も一緒に）は、時間依存性確率関数のセットを形成できる。この時間依存性確率関数のセットは、ＨＭＭ塩基呼出手順の一部として観測テーブルを作成する際に高い正確性を提供することができる。
【０２０１】
時間間隔は様々な長さでありうる。例えば、各１つのＡＣサイクルの長さ、または多数のＡＣサイクルの長さなど。異なる時間間隔は、時間（またはデータ）のチャンク（ひとかたまり）に対応し得、数百秒の長さでありうるが、それより大きくても小さくてもよい。より小さいチャンクが使用される場合、時間依存性確率関数はより頻繁に更新できるが、更新あたりの調整量が大きいチャンクが使用される場合よりも少なくなるように、事前分布により重みを与えることができる。確率分布における経時的な変動は比較的緩やかであり得、例えば、１時間の間に１０％、１５％、または３０％ドリフトしうる。変化は徐々であるので、確率関数と特定のセル状態との対応の追跡を失うことなく確率関数を更新させることが可能である。
【０２０２】
第二の確率関数は、第一の確率関数と第二のヒストグラム（配列決定セルについての第二の時間間隔にわたって核酸から測定された第二の組のシグナル値から決定される）を用いて決定できる。第二の確率関数は第一の確率関数と同様に決定できるが、第一の確率関数はここでは初期確率関数として働く。
【０２０３】
ブロック１８６０で、核酸の配列を含む塩基が時間依存性確率関数のセットを用いて決定される。塩基は様々な方法で決定できる。例えば、所与の時間ステップについて最も高い確率を有するセル状態に対応する塩基を塩基呼出として取る。別の態様では、ＨＭＭが使用されてもよい。従って、図１０のブロック１０７０が使用できる。ブロック１０８０の側面も使用できる。
【０２０４】
ブロック１８７０で、核酸の配列が提供される。ブロック１８７０はブロック１０９０と同様に実施できる。
【０２０５】
Ｂ．ＨＭＭを用いた２パス
前述のように、初期確率関数は、配列決定実行全体のシグナル値を用いて決定することができる。これらの初期確率関数は時間非依存性ＰＤＦとして決定できる。ベースコーラー（例えばＨＭＭを使用する）を、例えば方法１０００の態様に記載されているのと同様に実施して、初期塩基呼出を決定することができる。時間非依存性ＰＤＦを用いるそのようなベースコーラーの初回パスは、特定のタグ／塩基を高度に示す（例えば関連塩基呼出に対するより高い確率および／または品質スコア）明白なシグナル値を識別できる。これらの高品質シグナル値は時間依存性ＰＤＦに対する更新を決定するために使用でき、それによって時間依存性ＰＤＦの決定からのノイズが削減される。
【０２０６】
次に、ベースコーラーは、時間ステップにわたる２回目のパスにおいて時間依存性ＰＤＦを使用することができる。新しい観測テーブルが作成でき、新しいトレリス線図が得られる。そのような２パス法の実施は、限界塩基呼出(marginal basecall)の正確性を向上できる。改良は、時間非依存性ＰＤＦに優る時間依存性ＰＤＦの高い正確性によるものでありうる。そのような改良は、所与の時間ステップに対する特定の機能性シグナル値が特定のタグ／塩基に起因しうるがゆえにも起こりうる。従って、所与の時間間隔についてＰＤＦのヒストグラムへのフィッティングは、多くのシグナル値が特定のセル状態（例えばポア状態）、ゆえに特定のＰＤＦに帰属できるので、より正確になりうる。
【０２０７】
従って、一部の態様において、核酸の初期塩基呼出の初期配列は、初期確率関数を用いて決定できる。品質スコアは初期塩基呼出のそれぞれについて決定できる。第一の組のシグナル値は、対応する初期塩基呼出の品質スコアに基づいて、第一の時間間隔内のすべてのシグナル値から選ぶことができる。結合状態の塩基呼出は、シグナル値を含む期間をカバーする結合状態に基づいてシグナル値に対応できる。
【０２０８】
Ｃ．非結合タグの確率関数
追加のポア状態の出力ＰＤＦは、例えば非結合タグが各ＰＤＦで表されている場合、変動しうる。例えば、非結合ＧタグのＰＤＦは、結合ＧのＰＤＦとは異なる位置にピークを有する形状を有しうる。部分積分状態の場合、タグが非通り抜け状態から通り抜け状態に進むので、ＰＤＦは開チャンネルからピークに至るまでより均一な分布を有しうる。従って、部分積分状態は、二つの状態、例えば開チャンネルとＡとの間をつなぐであろう別個のＰＤＦを有しうる。
【０２０９】
そのような追加の状態（例えばシステム状態と定義される）は、時間依存性遷移を可能にできるが、より多くのポア状態を単一のＰＤＦに含める（例えば、すべての非結合状態を別個のＰＤＦとは対照的に単一のＰＤＦとして表す）ほど、時間依存性側面について分かることが少なくなる。例えば、部分積分状態が続く長さとか、他の状態と比較した部分状態の順序など。従って、非結合および／または部分状態の情報を別個のＰＤＦに入れることは可能であるが、状態の数が増大するために計算量が増大する。
【０２１０】
VIII．２状態分類子を用いる初期分類
ポリメラーゼを使用する態様において、ポリメラーゼは、４種類のヌクレオチドの一つと結合状態かまたは活性部位にヌクレオチドがない非結合状態でありうる。同じ手順（例えば本明細書中に記載のような）で全５つの結合状態を分類する代わりに、一部の態様では、測定されたシグナル値を結合状態または非結合状態に対応するとして分類する初期分類子を使用することができる。そのような２状態分類子は２つの隠れ状態を有するＨＭＭでありうるが、他の２状態分類子も使用できる。
【０２１１】
次に、結合状態に対応する時間ステップはさらに４状態分類子を用いて解析することができる。４状態分類子は、区別する状態が少ないために、より効率的に動作できる結果、少ないメモリー要件と速い計算速度がもたらされる。２状態分類子によって識別された結合領域におけるシグナル値だけが使用される場合、より正確なＰＤＦから高い正確性も得られる。
【０２１２】
初期２状態分類子は、結合状態に対応する時間ステップを識別できる。２状態分類子は、ただ一つの結合状態が存在するというだけで、どの種類の結合状態が結合状態に対応しているか（例えばどのタグがポアにあるか）を区別する必要はない。初期２状態分類子が結合状態に対応するシグナル値を識別した後、そのシグナル値を用いて４つのＰＤＦ（すなわち各ヌクレオチドに一つずつ）を決定することができる。ＰＤＦは、結合状態に対応するシグナル値のヒストグラムに混合分布モデルをフィッティングさせることによって決定できる。
【０２１３】
Ａ．第一の分類子（２状態分類子）
第一の分類子は、正規化または非正規化シグナル値に対して動作できる。タグおよびポアを用いる態様において、２状態分類子は、シグナル値が開チャンネル状態または通り抜け状態（タグがポア内にある）に対応しているかどうかを決定できる。正規化されたシグナル値の例として（例えばＯＣ分率）、非結合状態のピークはおよそ１．０でありうるので、１．０より十分低い任意の値（例えば０．９未満）は結合状態に対応する。
【０２１４】
この２状態分類子のより高性能版では、２つのＰＤＦ（一つは結合状態、もう一つは非結合状態）がありうる。これは通り抜け状態と非通り抜け状態に等しいと見なすことができる。２状態分類子は、ポアを使用する態様において、ポア状態間を分類すると見なすことができる。ＰＤＦをＨＭＭと併せて使用すれば、どの状態がどの時間ステップに対応しているかを決定することができる。
【０２１５】
非結合状態は、例えば、バックグラウンド、ノイズ帯域、または遊離タグに対応する様々なサブ状態を含みうる。遊離タグが、一つの時間ステップの間にシグナル値に短い変化を、それが開チャンネル値に戻る前にもたらしたとしても、２状態分類子は、一つのシグナル値の一過性の性質のために、非結合状態がまだ存在すると決定することができる。従って、２状態分類子（復号）は、非結合状態の決定に際して開チャンネルシグナルがどのくらいの長さ持続するかを見ることができ、結合状態の決定に際して通り抜けシグナルがどのくらいの長さ持続するかを見ることができる。ＨＭＭの実施の場合、遷移行列は結合事象がいかにあるべきかについての情報を含有することができる。
【０２１６】
一例として、観測テーブルは０または１のベクトルとして表すことができる。０は一つの状態に対応し、１は他の状態に対応する。０は０％の確率および１は１００％の確率と見ることができるが、他の確率値も使用できる。１が結合状態に対応している場合、結合状態を認識するために、ベクトルを解析して、十分長い１のグループが存在しているかどうかを決定することができる。散発的な０しかなくても、結合状態はまだ認識できる。同様に、０のグループの中に数少ない１が散見される場合、一連の時間ステップは非結合状態に対応していると識別することができる。
【０２１７】
２状態分類子は、シグナル値を、時間的に近い他のシグナル値に対して分析する示差フィルタと見ることができる。そのような示差フィルタは、出力ＰＤＦを構築する前に、バックグラウンドである可能性が最も高いデータを除去するのに有用でありうる。
【０２１８】
Ｂ．二つの分類子を使用する方法
図１９に、本発明の態様に従って、２状態分類子と第二の分類子を用いて核酸の配列を決定するために配列決定セルを使用する方法１９００のフローチャートを示す。方法１９００の側面は、方法１０００および／または方法１８００と同様に実施できる。
【０２１９】
ブロック１９１０で、第一の組のシグナル値を得る。これらのシグナル値は、ポリメラーゼを含む配列決定セルについての第一の時間間隔にわたって核酸から測定される。第一の組のシグナル値は、配列決定セルの５つの結合状態のそれぞれについての測定値を含みうる。４つの結合状態は異なる種類のヌクレオチドに対応し、第五の結合状態はポリメラーゼの活性部位にヌクレオチドがないことに対応する。４つの結合状態はまとめて結合状態に対応し、第五の結合状態は非結合状態でありうる。ブロック１９１０はブロック１８１０と同様に実施できる。
【０２２０】
ブロック１９２０で、Ｔ個の時間ステップにおける第一の組のシグナル値のそれぞれは、第一の分類手順を用いて、結合状態または非結合状態に対応するとして分類される。第一の分類手順は２状態分類子でありうる。２状態分類子は本明細書中に記載のように動作できる。
【０２２１】
ブロック１９３０で、サブセットのシグナル値は、結合状態に対応するとして識別される。サブセットは、結合状態に対応すると識別される相互に重なり合わない領域に対応しうる。一部の実施において、結合状態に対応すると識別された領域内のすべてのシグナル値はサブセットに含めることができる。そのように相互に重なり合わない領域は、方法１９００の後の段階で独立に分析（例えば並行して）またはまとめて分析できる。一態様において、サブセットのシグナル値は、結合領域のヒストグラムを決定するために使用でき、そのヒストグラムを使用して、異なるタグ／ヌクレオチドについての各ＰＤＦを決定できる。
【０２２２】
ブロック１９４０で、サブセットのシグナル値のそれぞれは、Ｎ個の結合状態を得るために第二の分類手順を用いて、４つの結合状態の一つに対応するとして分類される。第二の分類手順は少なくとも４つの結合状態間を分類できる。一部の態様において、第二の分類手順は、より多くの結合状態（例えば部分通り抜け状態を含む）間を分類できる。第二の分類手順は、例えば、識別された結合領域内に非結合状態が存在しないことを確認するために、非結合状態も含むことができる。
【０２２３】
第二の分類子は、結合状態に対応すると識別された領域で動作できる。そのような領域だけに焦点を当てることは、例えばヒストグラムは非結合状態に対応するシグナル値を何も含むことができないので、ＰＤＦの推定値を改良することができる。混合分布モデルは、このより特定的なデータにより正確にフィットさせることができる。従って、一部の態様において、一つまたは複数の追加のトレリス線図が作成でき、それぞれは結合状態を有する一つまたは複数の時間ステップの別の結合領域に対応する。次いで、トレリス線図を通る一つまたは複数の追加の最適経路が、出力確率およびペアワイズ遷移確率に基づいて決定できる。
【０２２４】
ブロック１９５０で、核酸の配列を含む塩基がＮ個の結合状態を用いて決定される。ブロック１９５０は、方法１８００のブロック１８６０と同様に実施できる。
ブロック１９６０で、核酸の配列が提供される。ブロック１９６０は、方法１８００のブロック１８７０と同様に実施できる。
【０２２５】
IX．実施例およびリスト復号
図２０に、本発明の態様に従って、シグナルトレース２０１０、拡大トレース２０２０、正規化シグナル値２０３０、およびヒストグラム２０４０の例を示す。シグナルトレース２０１０についての本実施例で、ＨＭＭ復号は、最も可能性の高い結合状態の配列を、ＡＴＡＧＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＣＧ（配列番号４）と識別している。拡大トレース２０２０は、開チャンネルおよび暗チャンネルの二つの暗バンドを示している。正規化シグナル値２０３０（暗チャンネル除去）は、正規化の結果、拡大トレース２０２０よりも平坦なデータを示している。ヒストグラム２０４０は、正規化シグナル値２０３０のプロットに表された時間間隔におけるシグナル値の組に対応している。
【０２２６】
図２１に、本発明の態様に従って、正規化シグナル値２０３０、中間図２１４０、および高ズーム図２１５０を示す。中間図２１４０は、個別の事象を見るためのズームレベルを示している。バーは個別の結合事象を示し、特定の種類の結合事象が二つ以上あるであろう領域をおそらくは示している。例えば、バー２１４２は、復号がＡについて１つの結合状態を識別していることを示しているが、Ａについて実際には３つの結合状態がありうることを示す３つの小さいバーがある。次のバーのバー２１４５との間のギャップは、その間に通り抜けポア状態がなかったことを示している。バー２１４７は、何も結合されなかった時間の後、Ｇ結合事象が検出されることを示す。高ズーム図２１５０は、最後の２つのＡ結合事象と、Ｇ結合事象を示す。
【０２２７】
図２２に、本発明の態様に従って、高ズーム図２１５０と、最も可能性の高い上３つの隠れ状態２２１０〜２２３０を示す。上３つの状態から分かるように、いくつのＡ結合事象が発生したかはっきりしない。一部の態様において、これらの配列のそれぞれの確率は、例えば、最も可能性の高い呼出だけでなく追加の準最適呼出も決定するビタビの修正版であるリスト復号を用いて決定できる。例えば、Ｋ個の最も可能性の高い隠れ状態が決定できる。異なる配列のそのような確率は、下流のゲノム解析の後半段階に回すことができる。
【０２２８】
Ｘ．コンピュータシステム
本明細書中に記載されたコンピュータシステムはいずれも、任意の適切な数のサブシステムを利用できる。そのようなサブシステムの例は図２３のコンピュータシステム１０に示されている。一部の態様において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムはコンピュータ装置のコンポーネントでありうる。他の態様では、コンピュータシステムは複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部コンポーネントを有するサブシステムでありうる。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話およびその他のモバイル機器を含みうる。
【０２２９】
図２３に示されたサブシステムはシステムバス７５によって相互接続されている。プリンタ７４、キーボード７８、記憶装置７９、モニタ７６（ディスプレイアダプタ８２に連結されている）、およびその他などの追加のサブシステムを示す。周辺機器および入出力（Ｉ／Ｏ）装置（Ｉ／Ｏコントローラ７１に連結されている）は、当該技術分野で公知の任意の数の手段、例えば入出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えばＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））によってコンピュータシステムに接続できる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、イーサネット（登録商標）、Ｗｉ−Ｆｉなど）を用いて、コンピュータシステム１０を、インターネットなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナに接続することができる。システムバス７５を介した相互接続は、中央処理装置７３が、各サブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶装置７９（例えばハードドライブなどの固定ディスク、または光ディスク）からの複数の命令の実行ならびにサブシステム間の情報の交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶装置７９は、コンピュータ可読媒体を体現しうる。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計などのデータ収集装置８５である。本明細書中に記載のデータはいずれも、一つのコンポーネントから別のコンポーネントに出力でき、そしてユーザーに出力できる。
【０２３０】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１によって、内部インターフェースによって、または一つのコンポーネントから別のコンポーネントへと接続および取り外しできるリムーバブル記憶装置を介して一緒に接続された複数の同じコンポーネントまたはサブシステムを含むこともできる。一部の態様において、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワークを通して通信できる。そのような場合、一つのコンピュータはクライアントで、別のコンピュータはサーバーと見なすことができ、それぞれ同じコンピュータシステムの一部でありうる。クライアントおよびサーバーはそれぞれ、複数のシステム、サブシステム、またはコンポーネントを含むことができる。
【０２３１】
態様の側面は、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路またはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）を用いて、および／またはコンピュータソフトウェアを一般にプログラム可能なプロセッサと共にモジュール方式または統合的に用いて、制御ロジックの形態で実施できる。本明細書において、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、または単一回路基板上のまたはネットワーク化された多重処理ユニット、ならびに専用ハードウェアを含みうる。本明細書中に提供された開示および教示に基づいて、当業者は、ハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアの組合せを用いて、本発明の態様を実施するための他の方式および／または方法を承知および理解するであろう。
【０２３２】
本願に記載されているソフトウェアコンポーネントまたは機能のいずれも、任意の適切なコンピュータ言語、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔ、またはスクリプト言語、例えば、ＰｅｒｌまたはＰｙｔｈｏｎを用い、例えば慣用技術またはオブジェクト指向技術を用いて、プロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実施できる。ソフトウェアコードは、記憶および／または伝送のためにコンピュータ可読媒体上に一連の命令またはコマンドとして保存できる。適切な固定（非一時的）コンピュータ可読媒体は、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリー・メモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体、例えばハードドライブまたはフロッピーディスク、または光媒体、例えばコンパクトディスク（ＣＤ）またはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）、フラッシュメモリなどを含みうる。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶または伝送装置の任意の組合せでありうる。
【０２３３】
そのようなプログラムは、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線、光、および／または無線ネットワークを介した伝送に適応されたキャリアシグナルを用いてコード化および伝送することもできる。従って、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムでコード化されたデータシグナルを用いて作成することができる。プログラムコードでコード化されたコンピュータ可読媒体は、互換性があるデバイスと共にパッケージ化されても、または他のデバイスとは別に提供されてもよい（例えば、インターネットダウンロードを介して）。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、または全コンピュータシステム）上または内部にあっても、またはシステムもしくはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上または内部にあってもよい。コンピュータシステムは、本明細書中に記載のいずれかの結果をユーザーに提供するためのモニタ、プリンタ、またはその他の適切なディスプレイを含みうる。
【０２３４】
本明細書中に記載の方法はいずれも、ステップを実施するために構成されうる一つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて、全体的にまたは部分的に実施できる。従って、態様は、本明細書中に記載の方法のいずれかのステップを実施するために構成されたコンピュータシステム（おそらくはそれぞれのステップまたはそれぞれのステップ群を実施する異なるコンポーネントと共に）に向けることができる。番号付けされたステップとして示されているが、本明細書における方法のステップは、同時にまたは異なる時にまたは異なる順序で実施できる。さらに、これらのステップの一部は、他の方法の他のステップの一部と共に使用することもできる。また、ステップのすべてまたは一部は任意選択でありうる。さらに、いずれかの方法のいずれかのステップは、これらのステップを実施するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、または他の手段を用いて実施できる。
【０２３５】
“ａ”、“ａｎ”または“ｔｈｅ”の記述は、それに反することが明記されていない限り、“一つまたは複数”を意味するものとする。“または”の使用は、それに反することが明記されていない限り、“包括的なまたは”を意味し、“排他的なまたは”を意味しないものとする。“第一の”構成要素への言及は、第二の構成要素が提供されることを必ずしも要求しない。さらに、“第一”または“第二”の構成要素への言及は、特に明記されない限り、言及された構成要素を特定の位置に限定するものではない。
【符号の説明】
【０２３６】
１０  コンピュータシステム
７５  システムバス
１００  ナノポアセンサーチップ
１１０  ピン
１３０  カバープレート
１３６  側壁
１４０  アレイ
１５０  ナノポアセル
２００  ナノポアセル
３００  ナノポアセル
３４０  遮断シグナル
４００  電気回路
４０１  スイッチ
４０８  積分キャパシタ
４２２  電気モデル
５１０  電圧シグナル
５２２  データ点
６００  核酸配列決定のプロセス
６０１  ナノポア
６０３  酵素
６０４  核酸分子
６０５  プライマー
６０６  ヌクレオチド
６０７  タグ
７００  配列決定セル
７０１  ナノポア
７０３  酵素
７０４  核酸分子
７０６  ヌクレオチド
７０７  タグ
７１４  膜
８００  酵素層
８１０  パルス
１１００  正規化されたシグナル値のプロット
１１５０  ヒストグラム
１２００  配列決定セル
１３００  時間トレース
２０１０  シグナルトレース
２０２０  拡大トレース
２０３０  正規化シグナル値
２０４０  ヒストグラム
２１４０  中間図
２１５０  高ズーム図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
2019531536.tif 000025
【図１９】
2019531536.tif 000026
【図２０】
2019531536.tif 000027
【図２１】
2019531536.tif 000028
【図２２】
2019531536.tif 000029
【図２３】
2019531536.tif 000030
【配列表】
2019531536000001.app
【国際調査報告】
2019531536.tif 000031
2019531536.tif 000032
2019531536.tif 000033