(57)【要約】本開示は、異なる遺伝子型およびその変異体を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出および定量するためのオリゴマー、組成物、およびキット、ならびに関連する方法および使用を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ＨＣＶの５’非翻訳領域を標的とし、ＨＣＶの異なる遺伝子型および変異体の実質的に同等の定量を提供するように構成されている。【選択図】図２−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１および第２の増幅オリゴマーを含む組成物またはキットであって、
前記第１の増幅オリゴマーは、配列番号２の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号２のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第２の増幅オリゴマーは、配列番号３の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１および第２の増幅オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、組成物またはキット。
【請求項２】
第３の増幅オリゴマーをさらに含み、前記第３の増幅オリゴマーは、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、ＨＣＶゲノムの７８位の下流に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１に記載の組成物またはキット。
【請求項３】
試料中のＣ型肝炎ウイルス核酸を検出する方法であって、
前記試料を少なくとも第１、第２、および第３の増幅オリゴマーと接触させ、それによって組成物を形成することと、
Ｃ型肝炎ウイルス核酸の存在下で１つ以上のアンプリコンを産生する核酸増幅反応を前記組成物中で実施することと、
前記アンプリコンを検出することと、を含み、
前記第１の増幅オリゴマーは、配列番号２の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号２のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第２の増幅オリゴマーは、配列番号３の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第３の増幅オリゴマーは、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、ＨＣＶゲノムの７８位の下流に特異的にハイブリダイズするように構成され、
前記第１および第２の増幅オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、
前記１つ以上のアンプリコンは、前記Ｃ型肝炎ウイルス核酸の存在下での前記第１および第３の増幅オリゴマーまたは第２および第３の増幅オリゴマーの伸長を通して産生される、方法。
【請求項４】
少なくとも第１および第２の捕獲オリゴマーを含む組成物またはキットであって、前記第１の捕獲オリゴマーは、配列番号５４のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第２の捕獲オリゴマーは、配列番号５５のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１および第２の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、組成物またはキット。
【請求項５】
試料からＣ型肝炎ウイルス核酸を単離する方法であって、
前記試料を少なくとも第１および第２の捕獲オリゴマーと、前記第１および第２の捕獲オリゴマーのＣ型肝炎ウイルス核酸へのアニーリングを許容する条件下で接触させ、それによってＣ型肝炎ウイルス核酸と捕獲オリゴマーとの少なくとも１つの複合体を形成することと、前記少なくとも１つの複合体を単離し、それによって前記複合体を含む組成物を提供することと、を含み、
前記第１の捕獲オリゴマーは、配列番号５４のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第２の捕獲オリゴマーは、配列番号５５のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１および第２の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６】
前記組成物またはキットが、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む初期増幅オリゴマーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項７】
前記組成物またはキットが、配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドおよびＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含むプローブオリゴマーをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項８】
前記初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーが、ＨＣＶ核酸中の少なくとも１つの共通の位置にアニールする、請求項７に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項９】
初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーを含むキットまたは組成物であって、
前記初期増幅オリゴマーは、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、
前記プローブオリゴマーは、配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、
前記初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーはそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、
前記初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーは、ＨＣＶ核酸中の少なくとも１つの共通の位置にアニールする、キットまたは組成物。
【請求項１０】
キットまたは組成物が、
ＨＣＶゲノムの８１位の上流に特異的にハイブリダイズするように構成された、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、
ＨＣＶゲノムの８１位の上流に特異的にハイブリダイズするように構成された、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、前記第１の増幅オリゴマーとは異なる第２の増幅オリゴマーと、
ＨＣＶゲノムの９０位の下流に特異的にハイブリダイズするように構成された、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、初期増幅オリゴマーとは異なる第３の増幅オリゴマーと、のうちの少なくとも１、２、または３つをさらに含む、請求項４もしくは７に記載のキットもしくは組成物、または請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
キットまたは組成物が、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む１つ以上の捕獲オリゴマーをさらに含む、請求項１〜３または６〜１０のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１２】
試料中のＣ型肝炎ウイルス核酸を検出する方法であって、
前記試料を１つ以上の捕獲オリゴマーおよび初期増幅オリゴマーと接触させ、それによって少なくとも１つの捕獲オリゴマーおよび増幅オリゴマーを、存在する場合、ＨＣＶ核酸と会合させことと、
前記ＨＣＶ核酸と会合していない初期増幅オリゴマーを除去することと、
存在する場合、ＨＣＶ核酸と会合した初期増幅オリゴマーを伸長する伸長反応を実施することと、
存在する場合、伸長した初期増幅オリゴマーを鋳型として用いて増幅反応を実施し、それによってアンプリコンを産生することと、
プローブオリゴマーを用いて前記アンプリコンの有無を検出することと、を含み、
前記初期増幅オリゴマーは、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、
前記プローブオリゴマーは、配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、存在する場合、前記アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成され、
前記初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーはそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、
前記初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーは、ＨＣＶ核酸中の少なくとも１つの共通の位置にアニールする、方法。
【請求項１３】
前記増幅反応を実施することが、（ｉ）前記プローブオリゴマーの上流で前記鋳型またはアンプリコンにアニールする前記第１および第２の増幅オリゴマーのうちの少なくとも一方、および（ｉｉ）前記プローブオリゴマーの下流で前記鋳型またはアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された第３の増幅オリゴマーを付加することと、
前記鋳型が存在する場合、前記第１および第２の増幅オリゴマーを伸長させることと、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号２のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項９〜１１または１３のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１５】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項９〜１１または１３〜１４のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１６】
前記第３の増幅オリゴマーが、少なくとも１つのＨＣＶ型において１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０位から選択されるＨＣＶゲノム位置の下流でアニールしない、請求項２〜１５のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＨＣＶ型が、ＨＣＶ型１ａ、１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ、５ａ、および６ａのうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１８】
前記第３の増幅オリゴマーが、ＨＣＶゲノム８０〜１１９位のうちの少なくとも１つを含む部位に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項２〜１７のいずれか一項に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項１９】
前記第３の増幅オリゴマーが、配列番号６または７のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項１８に記載のキット、組成物、または方法。
【請求項２０】
前記第３の増幅オリゴマーが、配列番号３３〜３７のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項１９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２１】
前記第３の増幅オリゴマーが配列番号７のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１９または２０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２２】
前記第３の増幅オリゴマーが配列番号７の配列を含む、請求項２１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２３】
前記第３の増幅オリゴマーが、配列番号４２〜４７のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つの配列を含む、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２４】
前記第３の増幅オリゴマーが配列番号５の配列を含む、請求項２３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２５】
前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号２３〜２７のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項１〜３、６〜８、１０〜１１、または１３〜２４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２６】
前記第１の増幅オリゴマーが配列番号２のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１〜３、６〜８、１０〜１１、または１３〜２５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２７】
前記第１の増幅オリゴマーが配列番号２の配列を含む、請求項２６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２８】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号２８〜３２のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項１〜３、６〜８、１０〜１１、または１３〜２７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２９】
前記第２の増幅オリゴマーが配列番号３のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１〜３、６〜８、１０〜１１、または１３〜２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３０】
前記第２の増幅オリゴマーが配列番号３の配列を含む、請求項２９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３１】
前記第１および第２の増幅オリゴマーが、約８．５：１．５〜約１．５：８．５、約７．５：２．５〜約２．５：７．５、約８：２〜約７：３、約７：３〜約６：４、約６：４〜約５：５、約５：５〜約４：６、約４：６〜約３：７、または約３：７〜約２：８の範囲の相対モル量（第１：第２）で存在する、請求項１〜３、６〜８、１０〜１１、または１３〜３０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３２】
前記第１および第２の増幅オリゴマーが、約６：４〜約１．５：８．５、約４：６〜約６：４、または約４．５：５．５〜約５．５：４．５の範囲の相対モル量（第１：第２）で存在する、請求項３１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３３】
前記初期増幅オリゴマーが、配列番号３３〜４１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４または７〜３２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３４】
前記初期増幅オリゴマーが、配列番号６のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４個の連続したヌクレオチドを含む、請求項４または７〜３３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３５】
前記初期増幅オリゴマーが配列番号６の配列を含む、請求項３４に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３６】
前記初期増幅オリゴマーが、配列番号４２〜４７のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つの配列を含む、請求項４または７〜３５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３７】
前記初期増幅オリゴマーが配列番号４の配列を含む、請求項３６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３８】
前記プローブオリゴマーが、配列番号５０〜５２のうちの少なくとも１つまたは２つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項７〜３７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３９】
前記プローブオリゴマーが、配列番号４８または４９の配列を含む、請求項７〜３８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４０】
前記プローブオリゴマーが、配列番号１２のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７〜３９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４１】
前記プローブオリゴマーが、配列番号１３の少なくとも１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４２】
前記プローブオリゴマーが、その５’末端に第１の自己相補的領域およびその３’末端に第２の自己相補的領域を含む、請求項７〜４１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４３】
前記自己相補的領域がハイブリダイズして、約４〜７個のワトソン−クリック塩基対またはゆらぎ塩基対を形成し得る、請求項４２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４４】
前記自己相補的領域がハイブリダイズして、約５個のワトソン−クリック塩基対またはゆらぎ塩基対を形成し得る、請求項４３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４５】
前記プローブオリゴマーが配列番号１２の配列を含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４６】
前記プローブオリゴマーが、配列番号１３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む、請求項４５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４７】
前記プローブオリゴマーが、非ヌクレオチド検出可能標識を含む、請求項７〜４６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４８】
前記非ヌクレオチド検出可能標識が蛍光標識である、請求項４７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４９】
前記プローブオリゴマーが消光剤を含む、請求項４７または４８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５０】
前記非ヌクレオチド検出可能標識が蛍光標識であり、前記消光剤は、前記プローブが遊離しているときに、前記プローブが標的核酸にアニールされているときよりも大きな程度で蛍光を吸収する、請求項４９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５１】
前記蛍光標識がＦＡＭ、ＨＥＸ、またはアクリジンである、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５２】
前記消光剤がＤＡＢＣＹＬまたはＲＯＸである、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５３】
前記蛍光標識がプローブオリゴマーの５’末端に付着し、前記消光剤がプローブオリゴマーの３’末端に付着するか、または前記蛍光標識がプローブオリゴマーの３’末端に付着し、前記消光剤がプローブオリゴマーの５’末端に付着する、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５４】
前記プローブオリゴマー中の糖のうちの少なくとも約半分、少なくとも約９０％、または全てが、２’−Ｏ−メチル−リボースである、請求項７〜５３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５５】
前記捕獲オリゴマーが、配列番号５４のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕獲オリゴマーを含む、請求項４〜５または１１〜５４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５６】
前記第１の捕獲オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号５７〜５９のうちの少なくとも１つまたは２つを含む、請求項５５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５７】
前記第１の捕獲オリゴマーが配列番号５４の配列を含む、請求項５６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５８】
前記捕獲オリゴマーが、配列番号５５のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕獲オリゴマーを含む、請求項４〜５または１１〜５７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５９】
前記第２の捕獲オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６０〜６２のうちの少なくとも１つまたは２つを含む、請求項５８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６０】
前記第２の捕獲オリゴマーが配列番号５５の配列を含む、請求項５９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６１】
前記捕獲オリゴマーのうちの少なくとも１つが非ヌクレオチド親和性標識をさらに含む、請求項４〜５または１１〜６０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６２】
前記捕獲オリゴマーのうちの少なくとも１つが、非ＨＣＶ配列をさらに含む、請求項４〜５または１１〜６１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６３】
前記第１および第２の捕獲オリゴマーが非ＨＣＶ配列をさらに含む、請求項６０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６４】
捕獲オリゴマーの少なくとも１つまたは２つがポリ−Ｎ配列をさらに含む、請求項６２または６３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６５】
前記ポリ−Ｎ配列が、ポリ−Ａまたはポリ−Ｔ配列である、請求項６４に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６６】
捕獲オリゴマーの少なくとも１つまたは２つが配列番号２１または配列番号２２の配列を含む、請求項６５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６７】
前記第１の捕獲オリゴマーが配列番号１６の配列を含む、請求項６６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６８】
前記第２の捕獲オリゴマーが配列番号１７の配列を含む、請求項６６または６７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６９】
前記キットまたは組成物が、プロモーター−プライマーである少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７０】
前記第３の増幅オリゴマーがプロモーター−プライマーである、請求項２〜３、６〜８、１０〜１１、または１３〜６９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７１】
前記プロモーター−プライマーのうちの１つ以上が、標的ハイブリダイズ配列の５’位に位置するＴ７プロモーターを含む、請求項６９〜７０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７２】
１つ以上のプロモーター−プライマーが配列番号８、９、１０、または１１の配列を含む、請求項７１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７３】
少なくとも１つの増幅オリゴマーが非ヌクレオチド検出可能標識を含む、請求項１〜３または６〜７２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７４】
前記初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーがそれぞれ、ＨＣＶゲノムまたはその相補体における８６〜９５位のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個にアニールする、請求項４または６〜７３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７５】
前記組成物がＨＣＶ核酸をさらに含む、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の組成物または方法。
【請求項７６】
前記組成物またはキットが少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項７６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが好熱性である、請求項７６または７７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが中温性である、請求項７６または７７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８０】
前記組成物またはキットがＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８１】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項８０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８２】
前記組成物またはキットが、Ｍｇ２＋、緩衝液、およびｄＮＴＰのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、またはそれらの各々をさらに含む、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８３】
前記組成物またはキットが、ｒＮＴＰをさらに含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８４】
前記組成物またはキットが、ＨＣＶに特異的にハイブリダイズしない第１の対照増幅オリゴマーおよび第２の対照増幅オリゴマーをさらに含む、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８５】
前記第１の対照増幅オリゴマーが、配列番号１８の配列うちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続したヌクレオチドを含む、請求項８４に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８６】
前記第２の対照増幅オリゴマーが、配列番号５６の配列のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の連続したヌクレオチドを含む、請求項８４または８５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８７】
前記第１の対照増幅オリゴマーまたは前記第２の対照増幅オリゴマーが、プロモーター−プライマーである、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８８】
前記組成物またはキットが、前記第１および第２の対照増幅オリゴマーから産生されるアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの対照プローブオリゴマーをさらに含む、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８９】
前記対照プローブオリゴマーが、配列番号２０の配列のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続したヌクレオチドを含む、請求項８８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９０】
１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の標的ハイブリダイズ配列が、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の方法、組成物、またはオリゴマー。
【請求項９１】
少なくとも１つの増幅オリゴマーが伸長される線形増幅を実施することをさらに含む、請求項１２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記線形増幅の前に、前記増幅オリゴマーがＨＣＶ核酸と捕獲オリゴマーとの複合体と会合し、前記複合体が固体支持体と会合し、前記方法が前記固体支持体を洗浄することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記固体支持体がマイクロビーズの集団である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記集団の前記マイクロビーズが磁性である、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
洗浄ステップに続いて、前記方法が、ＨＣＶ核酸と捕獲オリゴマーとの複合体と会合した増幅オリゴマーに対して反対向きの１つ以上のさらなる増幅オリゴマーを付加することを含む、請求項９１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
１つ以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーがプロモーター−プライマーである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
１つ以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーがプロモーター−プライマーではない、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記１つ以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーが、請求項１、１０、１３、１４、または２５〜２７のいずれか一項に記載の第１の増幅オリゴマーを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記１つ以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーが、請求項１、１０、１３、１５、または２８〜３０のいずれか一項に記載の第２の増幅オリゴマーを含む、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記線形増幅に続いて指数関数的増幅を実施することをさらに含む、請求項９０〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記指数関数的増幅が、請求項２、１０、１３、１６、または１８〜２４のいずれか一項に記載の第３の増幅オリゴマーを伸長させることを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記指数関数的増幅が等温増幅である、請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記等温増幅が転写媒介増幅である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記方法によって産生された少なくとも１つのアンプリコンを定量することをさらに含む、請求項３、６〜８、または１１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記アンプリコンがリアルタイムで定量化される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
プロモーターおよび３’末端標的ハイブリダイズ配列を含む初期増幅オリゴマーであって、前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドおよびＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、初期増幅オリゴマー。
【請求項１０７】
請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の初期増幅オリゴマーである、請求項１０６に記載の初期増幅オリゴマー。
【請求項１０８】
Ｔ７プロモーターを含む、請求項１０７に記載の初期増幅オリゴマー。
【請求項１０９】
配列番号８、９、１０、または１１の配列を含む、請求項１０７に記載の初期増幅オリゴマー。
【請求項１１０】
ＨＣＶゲノム８１〜９２位のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１０６〜１０９のいずれか一項に記載の初期増幅オリゴマー。
【請求項１１１】
ＨＣＶゲノム８１〜８９位のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１１０に記載の初期増幅オリゴマー。
【請求項１１２】
配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドおよびＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含むプローブオリゴマー。
【請求項１１３】
請求項３８〜５４のいずれか一項に記載のプローブオリゴマーである、請求項１１２に記載のプローブオリゴマー。
【請求項１１４】
ＨＣＶゲノム８１〜９２位のうちの少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１１２または１１３に記載のプローブオリゴマー。
【請求項１１５】
ＨＣＶゲノム８１〜９６位のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、または１６個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載のプローブオリゴマー。
【請求項１１６】
請求項１〜２、４、６〜９、または１４〜９０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
請求項１〜２、４、６〜９、または１４〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１８】
水性、凍結型、または凍結乾燥型である、請求項１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
初期増幅オリゴマーの伸長産物をさらに含み、前記伸長産物は請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載の初期増幅オリゴマーの配列と、Ｃ型肝炎核酸配列のうちの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、または２０個のさらなる３’末端ヌクレオチドとを含む、請求項１１７または１１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，１８８号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、Ｃ型肝炎ウイルス核酸の検出および定量化に有用な組成物、キット、および方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は急性および慢性の疾患を引き起こす可能性があり、感染した個体は肝硬変および癌の危険にさらされている。２０１６年７月のＷＨＯのＣ型肝炎ファクトシートによると、世界中で約１億３千万から１億５千万人が感染していると推定され、Ｃ型肝炎関連肝疾患を起因として年間約７０万人が死亡している。ＨＣＶの伝染は輸血や汚染された針や医療機器の使用を含む血液感染性ウイルスの典型的な経路を通して起こる。性感染および母子感染もまた起こることが知られている。
【０００４】
ＨＣＶは、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。その分布は世界的で、７つの遺伝子型と複数の亜型が知られている。抗ウイルス療法はＨＣＶに対して有効であり得るが、信頼性がありかつ高感度の核酸に基づく検出および定量化は、異なる遺伝子型の間の著しい遺伝的不均一性によって複雑化する。例えば、Ｏｈｎｏ  Ｏ，Ｍｉｚｏｋａｍｉ  Ｍ，  Ｗｕ  ＲＲ，Ｓａｌｅｈ  ＭＧ，Ｏｈｂａ  Ｋ，Ｏｒｉｔｏ  Ｅ，Ｍｕｋａｉｄｅ  Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ，Ｌａｕ  ＪＹ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７），“Ｎｅｗ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  （ＨＣＶ）  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  １ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，３ａ，３ｂ，４，５ａ，ａｎｄ  ６ａ，”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（１）：２０１−７，ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２２９５３９を参照されたい。定量化は、例えば抗ウイルス療法の前、最中または後にウイルス量をモニターすることにおいて、または感染の重症度を評価することにおいて有用であり得る。
【０００５】
したがって、遺伝子型に関係なく、ＨＣＶの高感度な検出および定量化が必要とされている。組成物、キット、および方法は、この必要性を満たすために、他の利益を提供するために、または少なくとも公衆に有用な選択を提供するために本明細書に提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、少なくとも第１および第２の増幅オリゴマーを含む組成物またはキットが提供され、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号２のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第２の増幅オリゴマーは、配列番号３の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物またはキットは第３の増幅オリゴマーをさらに含み、第３の増幅オリゴマーはアンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、ＨＣＶゲノム７８位の下流に特異的にハイブリダイズするように構成されている。
【０００７】
いくつかの実施形態において、試料中のＣ型肝炎ウイルス核酸を検出する方法であって、試料を少なくとも第１、第２、および第３の増幅オリゴマーと接触させ、それによって組成物を形成することと、Ｃ型肝炎ウイルス核酸の存在下で１つ以上のアンプリコンを産生する核酸増幅反応を組成物中で実施することと、そしてアンプリコンを検出することと、を含む方法を提供し、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号２の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第２の増幅オリゴマーは、配列番号３の５、７、１２、および１５位のうちの少なくとも１つを含む、配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第３の増幅オリゴマーは、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、ＨＣＶゲノムの７８位の下流に特異的にハイブリダイズするように構成され、
第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、
１つ以上のアンプリコンは、Ｃ型肝炎ウイルス核酸の存在下での第１および第３の増幅オリゴマーまたは第２および第３の増幅オリゴマーの伸長を通して産生される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、少なくとも第１および第２の捕獲オリゴマーを含む組成物またはキットが提供され、第１の捕獲オリゴマーは、配列番号５４のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、
第２の捕獲オリゴマーは、配列番号５５のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第１および第２の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、試料からＣ型肝炎ウイルス核酸を単離する方法であって、試料を少なくとも第１および第２の捕獲オリゴマーと、第１および第２の捕獲オリゴマーのＣ型肝炎ウイルス核酸へのアニーリングを許容する条件下で、接触させ、それによって、Ｃ型肝炎ウイルス核酸と捕獲オリゴマーとの少なくとも１つの複合体を形成することと、少なくとも１つの複合体を単離することにより、複合体を含む組成物を提供することと、を含む、方法を提供し、第１の捕獲オリゴマーは、配列番号５４のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第２の捕獲オリゴマーは、配列番号５５の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含み、第１および第２の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列はそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、組成物またはキットは、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む初期増幅オリゴマーをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドおよびＣ型肝炎ウイルス配列うちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含むプローブオリゴマーをさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーは、ＨＣＶ核酸中の少なくとも１つの共通の位置にアニールする。
【００１３】
いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーを含むキットまたは組成物が提供され、初期増幅オリゴマーは、配列番号６のうち少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、プローブオリゴマーは、配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーはそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーは、ＨＣＶ核酸中の少なくとも１つの共通の位置にアニールする。
【００１４】
いくつかの実施形態では、キットまたは組成物は、ＨＣＶゲノム８１位の上流に特異的にハイブリダイズするように構成された、Ｃ型肝炎ウイルス配列うちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、標的ハイブリダイズ配列を含む第１増幅オリゴマーと、
ＨＣＶゲノム８１位の上流に特異的にハイブリダイズするように構成された、Ｃ型肝炎ウイルス配列の少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む、第１の増幅オリゴマーとは異なる第２の増幅オリゴマーと、
ＨＣＶゲノムの９０位の下流に特異的にハイブリダイズするように構成された、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列の少なくとも約１４の連続したヌクレオチドを含む、初期増幅オリゴマーとは異なる第３の増幅オリゴマーと、のうちの少なくとも１、２、または３つをさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、キットまたは組成物は、アンチセンスＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む１つ以上の捕獲オリゴマーをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、試料中のＣ型肝炎ウイルス核酸を検出する方法であって、試料を１つ以上の捕獲オリゴマーおよび初期増幅オリゴマーと接触させ、それによって少なくとも１つの捕獲オリゴマーおよび増幅オリゴマーをＨＣＶ核酸と会合させることと、存在する場合；ＨＣＶ核酸と会合していない初期増幅オリゴマーを除去することと、存在する場合、ＨＣＶ核酸と会合した初期増幅オリゴマーを伸長する伸長反応を実施することと、存在する場合、伸長した初期増幅オリゴマーを鋳型として用いて増幅反応を実施し、それによってアンプリコンを産生することと、プローブオリゴマーを用いてアンプリコンの有無を検出することと、を含む方法を提供し、初期増幅オリゴマーは、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、プローブオリゴマーは、配列番号１３うちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、存在する場合、アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成され、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーはそれぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含み、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーは、ＨＣＶ核酸中の少なくとも１つの共通の位置にアニールする。
【００１７】
いくつかの実施形態において、増幅反応を実施することが、（ｉ）プローブオリゴマーの上流で鋳型またはアンプリコンにアニールする第１および第２の増幅オリゴマーの少なくとも一方、および（ｉｉ）プローブオリゴマーの下流の鋳型またはアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された第３の増幅オリゴマーを付加することと、鋳型が存在する場合、第１および第２の増幅オリゴマーを伸長させることと、を含む。
【００１８】
プロモーターおよび３’末端標的ハイブリダイズ配列を含む初期増幅オリゴマーが提供され、この標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドおよびＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーはＴ７プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、配列番号８、９、１０、または１１の配列を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、ＨＣＶゲノム８１〜９２位のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、ＨＣＶゲノム位置８１〜８９のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている。
【００２０】
配列番号１３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドおよびＣ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチドを含むプローブオリゴマーが提供される。
【００２１】
いくつかの態様において、プローブオリゴマーは、８１〜９２位のうちの少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの態様において、プローブオリゴマーは、ＨＣＶゲノム８１〜９６位のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、または１６個を含む位置に特異的にハイブリダイズするように構成されている。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは、少なくとも１つのＨＣＶ型において１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０位から選択されるＨＣＶゲノム位置の下流にアニールしない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＨＣＶ型は、ＨＣＶ型１ａ、１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ、５ａ、および６ａのうちの１つ以上を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは、ＨＣＶゲノム８０〜１１９位のうちの少なくとも１つを含む部位に特異的にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは、配列番号６または７のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは、配列番号３３〜３７のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の増幅オリゴマーは、配列番号７のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは、配列番号４２〜４７のうちの少なくとも１、２、３、４または５つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーは配列番号５の配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２３〜２７のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは配列番号２の配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、第２の増幅オリゴマーは、配列番号２８〜３２のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号３のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは配列番号３の配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、第１および第２の増幅オリゴマーは、約８．５：１．５〜約１．５：８．５、約７．５：２．５〜約２．５：７．５、約８：２〜約７：３、約７：３〜約６：４、約６：４〜約５：５、約５：５〜約４：６、約４：６〜約３：７、または約３：７〜約２：８の範囲の相対モル量（第１：第２）で存在する。いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅オリゴマーは、約６：４〜約１．５：８．５、約４：６〜約６：４、または約４．５：５．５〜約５．５：４．５の範囲の相対モル量（第１：第２）で存在する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、配列番号３３〜４１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは配列番号６のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、配列番号４２〜４７のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つの配列を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは配列番号４の配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号５０〜５２のうちの少なくとも１つまたは２つを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号４８または４９の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号１２の少なくとも１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号１３の少なくとも１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの態様において、プローブオリゴマーは、その５’末端に第１の自己相補的領域およびその３’末端に第２の自己相補的領域を含む。いくつかの実施形態では、自己相補的領域はハイブリダイズして、約４〜７個のワトソン−クリックまたはゆらぎ塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、自己相補的領域はハイブリダイズして、約５個のワトソン−クリックまたはゆらぎ塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号１３の配列を含む標的ハイブリダイズ配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは非ヌクレオチド検出可能標識を含む。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド検出可能標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは消光剤を含む。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド検出可能標識は蛍光標識であり、消光剤は、プローブが遊離しているときに、プローブが標的核酸にアニーリングされているときよりも大きい程度で蛍光を吸収する。いくつかの態様において、蛍光標識はＦＡＭ、ＨＥＸ、またはアクリジンである。いくつかの実施形態において、消光剤はＤＡＢＣＹＬまたはＲＯＸである。いくつかの実施形態では、蛍光標識がプローブオリゴマーの５’末端に付着し、消光剤がプローブオリゴマーの３’末端に付着するか、または蛍光標識がプローブの３’末端に付着し、消光剤がプローブオリゴマーの５’末端に付着している。いくつかの態様において、プローブオリゴマー中の糖の少なくとも約半分、少なくとも約９０％、または全てが２’−Ｏ−メチル−リボースである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、配列番号５４の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む第１の捕獲オリゴマーが存在する。いくつかの実施形態において、第１の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５７〜５９のうちの少なくとも１つまたは２つを含む。いくつかの実施形態では、第１の捕獲オリゴマーは配列番号５４の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の捕獲オリゴマーは配列番号１６の配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、配列番号５５のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の連続したヌクレオチドを含む標的ハイブリダイズ配列を含む第２の捕獲オリゴマーが存在する。いくつかの実施形態において、第２の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６０〜６２のうちの少なくとも１つまたは２つを含む。いくつかの実施形態では、第２の捕獲オリゴマーは配列番号５５の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の捕獲オリゴマーは配列番号１７の配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、捕獲オリゴマーのうちの少なくとも１つは非ヌクレオチド親和性標識をさらに含む。いくつかの実施形態では、捕獲オリゴマーのうちの少なくとも１つは非ＨＣＶ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の捕獲オリゴマーは非ＨＣＶ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、捕獲オリゴマーの少なくとも１つまたは２つはさらにポリ−Ｎ配列を含む。いくつかの態様において、ポリ−Ｎ配列はポリ−Ａまたはポリ−Ｔ配列である。いくつかの実施形態では、捕獲オリゴマーの少なくとも１つまたは２つは、配列番号２１または配列番号２２の配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、キットまたは組成物は、プロモーター−プライマーである少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーはプロモーター−プライマーである。いくつかの実施形態では、プロモーター−プライマーのうちの１つ以上は、標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するＴ７プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロモーター−プライマーは、配列番号８、９、１０、または１１の配列を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増幅オリゴマーは非ヌクレオチド検出可能標識を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーはそれぞれ、ＨＣＶゲノムまたはその相補体における８６〜９５位のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個にアニールする。
【００３７】
いくつかの実施形態では、組成物はＨＣＶ核酸をさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは好熱性である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは中温性である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットはＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの態様において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００４０】
いくつかの実施形態において、組成物またはキットは、Ｍｇ２＋、緩衝液、およびｄＮＴＰのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、またはそれらの各々をさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットはさらにｒＮＴＰを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、ＨＣＶに特異的にハイブリダイズしない第１の対照増幅オリゴマーおよび第２の対照増幅オリゴマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の対照増幅オリゴマーは、配列番号１８の配列のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の対照増幅オリゴマーは、配列番号５６の配列のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の対照増幅オリゴマーまたは第２の対照増幅オリゴマーはプロモーター−プライマーである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、第１および第２の対照増幅オリゴマーから産生されたアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの対照プローブオリゴマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、対照プローブオリゴマーは、配列番号２０の配列のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、（例えば、増幅オリゴマー、捕獲オリゴマー、またはプローブオリゴマーの）１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の標的ハイブリダイズ配列は、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの増幅オリゴマーが伸長される線形増幅を実行することをさらに含む。いくつかの実施形態では、線形増幅の前に、増幅オリゴマーはＨＣＶ核酸と捕獲オリゴマーとの複合体と会合し、この複合体は固体支持体と会合し、前記方法は固体支持体を洗浄することを含む。いくつかの態様において、固体支持体はマイクロビーズの集団である。いくつかの実施形態では、集団のマイクロビーズは磁性である。いくつかの実施形態では、洗浄ステップに続いて、本方法は、ＨＣＶ核酸と捕獲オリゴマーとの複合体に会した増幅オリゴマーに対して反対向きの１つ以上のさらなる増幅オリゴマーを付加することを含む。いくつかの実施形態では、１以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーはプロモーター−プライマーである。いくつかの実施形態では、１以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーはプロモーター−プライマーではない。いくつかの実施形態では、１つ以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーが、本明細書に開示されているような第１の増幅オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の反対向きのさらなる増幅オリゴマーは、本明細書に開示されているような第２の増幅オリゴマーを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、方法は、線形増幅に続いて指数関数的増幅を実行することをさらに含む。いくつかの実施形態において、指数関数的増幅は、本明細書に開示されるように第３の増幅オリゴマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、指数関数的増幅は等温増幅である。いくつかの実施形態では、等温増幅は転写媒介増幅である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、方法は、その方法によって産生された少なくとも１つのアンプリコンを定量することをさらに含む。いくつかの態様において、アンプリコンはリアルタイムで定量化される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、組成物は水性、凍結型、または凍結乾燥型である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、組成物は、初期増幅オリゴマーの伸長産物をさらに含み、該伸長産物は請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載の初期増幅オリゴマーの配列と、Ｃ型肝炎核酸配列のうちの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、または２０個のさらなる３’末端ヌクレオチドと、を含む。
【００５０】
セクションの見出しは読者の便宜のために提供されており、本開示の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＨＣＶ配列のアラインメントを示し、増幅およびプローブオリゴマーにより結合された領域を示す。これ以降のアラインメントにおいて、点は参照配列（ここではＨＣＶ  １ａ転写物）との一致を示し、ダッシュはギャップを示し、キャレットは相補的位置を示し、そしてミスマッチはミスマッチ塩基として示される。楕円は、遺伝子型１ａと比較して特定のミスマッチを強調している。左のボックスは、列挙された遺伝子型（１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａ）においてミスマッチが観察されなかった領域を示す。右側のボックスはＧ＋Ｃが豊富な領域を示す。
【図２−１】図２は、３つの濃度での様々なＨＣＶ遺伝子型についての増幅動態を示す。これらの実験において、遺伝子型１ａは３つの濃度について痕跡の明確なグループ分けを示したが、最低濃度（１０２コピー／ｍｌ）では、他の遺伝子型は増幅できず（２ａ）または不均一出現時間を示した（３ｂ、４ｈ、３ａ、５ａ、６ａ）。
【図２−２】図２は、３つの濃度での様々なＨＣＶ遺伝子型についての増幅動態を示す。これらの実験において、遺伝子型１ａは３つの濃度について痕跡の明確なグループ分けを示したが、最低濃度（１０２コピー／ｍｌ）では、他の遺伝子型は増幅できず（２ａ）または不均一出現時間を示した（３ｂ、４ｈ、３ａ、５ａ、６ａ）。
【図２−３】図２は、３つの濃度での様々なＨＣＶ遺伝子型についての増幅動態を示す。これらの実験において、遺伝子型１ａは３つの濃度について痕跡の明確なグループ分けを示したが、最低濃度（１０２コピー／ｍｌ）では、他の遺伝子型は増幅できず（２ａ）または不均一出現時間を示した（３ｂ、４ｈ、３ａ、５ａ、６ａ）。
【図２−４】図２は、３つの濃度での様々なＨＣＶ遺伝子型についての増幅動態を示す。これらの実験において、遺伝子型１ａは３つの濃度について痕跡の明確なグループ分けを示したが、最低濃度（１０２コピー／ｍｌ）では、他の遺伝子型は増幅できず（２ａ）または不均一出現時間を示した（３ｂ、４ｈ、３ａ、５ａ、６ａ）。
【図３】異なるＮＴ７プライマーを用いた遺伝子型１ａおよび３ａについての検量線を示す。
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、異なるＮＴ７プライマー（図４Ａの遺伝子型１ａ配列と一致するＨＣＶ５２〜７８、図４Ｂの遺伝子型３ａ配列と一致するＨＣＶ５２〜７８ｔｇ、または図４ＣのＨＣＶ５２〜７８とＨＣＶ５２〜７８ｔｇの５０：５０混合物）を用いた遺伝子型定量化を示す。矢印は、図４Ａおよび４Ｂにおける遺伝子型１Ａについての曲線を示す。図４Ｃでは、遺伝子型１ａおよび３ａの曲線は実質的に重なっていた。
【図４Ｂ】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、異なるＮＴ７プライマー（図４Ａの遺伝子型１ａ配列と一致するＨＣＶ５２〜７８、図４Ｂの遺伝子型３ａ配列と一致するＨＣＶ５２〜７８ｔｇ、または図４ＣのＨＣＶ５２〜７８とＨＣＶ５２〜７８ｔｇの５０：５０混合物）を用いた遺伝子型定量化を示す。矢印は、図４Ａおよび４Ｂにおける遺伝子型１Ａについての曲線を示す。図４Ｃでは、遺伝子型１ａおよび３ａの曲線は実質的に重なっていた。
【図４Ｃ】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、異なるＮＴ７プライマー（図４Ａの遺伝子型１ａ配列と一致するＨＣＶ５２〜７８、図４Ｂの遺伝子型３ａ配列と一致するＨＣＶ５２〜７８ｔｇ、または図４ＣのＨＣＶ５２〜７８とＨＣＶ５２〜７８ｔｇの５０：５０混合物）を用いた遺伝子型定量化を示す。矢印は、図４Ａおよび４Ｂにおける遺伝子型１Ａについての曲線を示す。図４Ｃでは、遺伝子型１ａおよび３ａの曲線は実質的に重なっていた。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、非Ｔ７プライマー５２〜７８ｔのみ（図５Ａ、矢印は遺伝子型３ａを示す）および５２〜７８ｔｇのみ（図５Ｂ）についての複数のＨＣＶ遺伝子型にわたる結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、非Ｔ７プライマー５２〜７８ｔのみ（図５Ａ、矢印は遺伝子型３ａを示す）および５２〜７８ｔｇのみ（図５Ｂ）についての複数のＨＣＶ遺伝子型にわたる結果を示す。
【図６】様々な遺伝子型を用いた定量アッセイについて、標的との対数差（ＬｏｇＤｉｆｆ）を示す。遺伝子型は、左から右に１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、６ａの順序で提示され、各遺伝子型は１０４（左）および１０７（右）コピー／ｍｌの条件を反映する２本のバーを有する。
【図７−１】図７は、１０２、１０４、および１０７コピー／ｍｌの示された遺伝子型を用いるＨＣＶトーチ６８〜８６対ＨＣＶトーチ８０〜９８  ５ｓｔ  ａの対照比較を示す。矢印は１０２コピー／ｍｌの状態についての痕跡を示す。
【図７−２】図７は、１０２、１０４、および１０７コピー／ｍｌの示された遺伝子型を用いるＨＣＶトーチ６８〜８６対ＨＣＶトーチ８０〜９８  ５ｓｔ  ａの対照比較を示す。矢印は１０２コピー／ｍｌの状態についての痕跡を示す。
【図８】異なるＨＣＶトーチおよびＴ７オリゴマーを用いた検量線を示す。直線の矢印は、遺伝子型３ａ、Ｔ７  ９５〜１１９、トーチ６８〜８６の曲線を示す。曲線の矢印は、遺伝子型１ａ、Ｔ７  ９５〜１１９、トーチ６８〜８６の曲線を示す。
【図９】ＨＣＶトーチ８１〜９６、８１〜９７、および８０〜９８の検量線を示す。
【図１０】最高から最低の曲線の順に図に記載されている、異なるＴ７プライマーを用いた検量線が示されている。
【図１１】ＨＣＶ遺伝子型に対するＴ７プライマーのアラインメントを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、遺伝子型１ａの配列（１２Ａ−Ｄの一番上の行）と一致するかまたはイノシンを含有する（１２Ａ−Ｄのそれぞれの下の２行）、３つのＴ７  ９３〜１１９初期増幅オリゴマーについての遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａを有する３コピーレベルの一連の出現曲線を示す。各プロットは１００、１００００、および１００００００コピー／ｍｌの痕跡を示す。矢印（図１２Ｂ〜図１２Ｄ）は、イノシン塩基をＴ７オリゴマーに使用したときの痕跡の崩壊を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、遺伝子型１ａの配列（１２Ａ−Ｄの一番上の行）と一致するかまたはイノシンを含有する（１２Ａ−Ｄのそれぞれの下の２行）、３つのＴ７  ９３〜１１９初期増幅オリゴマーについての遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａを有する３コピーレベルの一連の出現曲線を示す。各プロットは１００、１００００、および１００００００コピー／ｍｌの痕跡を示す。矢印（図１２Ｂ〜図１２Ｄ）は、イノシン塩基をＴ７オリゴマーに使用したときの痕跡の崩壊を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、遺伝子型１ａの配列（１２Ａ−Ｄの一番上の行）と一致するかまたはイノシンを含有する（１２Ａ−Ｄのそれぞれの下の２行）、３つのＴ７  ９３〜１１９初期増幅オリゴマーについての遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａを有する３コピーレベルの一連の出現曲線を示す。各プロットは１００、１００００、および１００００００コピー／ｍｌの痕跡を示す。矢印（図１２Ｂ〜図１２Ｄ）は、イノシン塩基をＴ７オリゴマーに使用したときの痕跡の崩壊を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、遺伝子型１ａの配列（１２Ａ−Ｄの一番上の行）と一致するかまたはイノシンを含有する（１２Ａ−Ｄのそれぞれの下の２行）、３つのＴ７  ９３〜１１９初期増幅オリゴマーについての遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａを有する３コピーレベルの一連の出現曲線を示す。各プロットは１００、１００００、および１００００００コピー／ｍｌの痕跡を示す。矢印（図１２Ｂ〜図１２Ｄ）は、イノシン塩基をＴ７オリゴマーに使用したときの痕跡の崩壊を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、１０２、１０４、および１０６コピー／ｍｌにおける遺伝子型１ａ、２ｂ、および５ａに対する対照Ｔ７  ９３〜１１９（１３Ａ）、Ｔ７  ８９〜１１９（１３Ｂ）、および８０−１１９（１３Ｃ）プライマーを用いた出現曲線を示し、遺伝子型間でより高い一貫性およびＴ７８９−１１９とＴ７  ８０−１１９の異なる濃度で曲線の分離を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、１０２、１０４、および１０６コピー／ｍｌにおける遺伝子型１ａ、２ｂ、および５ａに対する対照Ｔ７  ９３〜１１９（１３Ａ）、Ｔ７  ８９〜１１９（１３Ｂ）、および８０−１１９（１３Ｃ）プライマーを用いた出現曲線を示し、遺伝子型間でより高い一貫性およびＴ７８９−１１９とＴ７  ８０−１１９の異なる濃度で曲線の分離を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、１０２、１０４、および１０６コピー／ｍｌにおける遺伝子型１ａ、２ｂ、および５ａに対する対照Ｔ７  ９３〜１１９（１３Ａ）、Ｔ７  ８９〜１１９（１３Ｂ）、および８０−１１９（１３Ｃ）プライマーを用いた出現曲線を示し、遺伝子型間でより高い一貫性およびＴ７８９−１１９とＴ７  ８０−１１９の異なる濃度で曲線の分離を示す。
【図１４】Ｔ７  ９３〜１１９、Ｔ７  ８９〜１１９、およびＴ７  ８０〜１１９初期増幅オリゴマーを使用した場合の、２．３、４．３、および６．３ｌｏｇコピー／ｍｌでの、異なるＨＣＶ遺伝子型についての対数差（ＬｏｇＤｉｆｆ）対ＨＣＶ  １ａを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、初期増幅オリゴマーがＴ７  ９３−１１９（１５Ａ）、Ｔ７  ８９−１１９（１５Ｂ）、またはＴ７  ８０−１１９（１５Ｃ）の場合の、遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａの検量線を示す。図１５Ａの矢印は、遺伝子型５ａの曲線を示し、これは、Ｔ７  ９３−１１９を用いた場合には他の遺伝子型の曲線から明らかに区別されたが、より長い初期増幅オリゴマーを用いた場合には他の曲線の間に現れた。
【図１５Ｂ】図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、初期増幅オリゴマーがＴ７  ９３−１１９（１５Ａ）、Ｔ７  ８９−１１９（１５Ｂ）、またはＴ７  ８０−１１９（１５Ｃ）の場合の、遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａの検量線を示す。図１５Ａの矢印は、遺伝子型５ａの曲線を示し、これは、Ｔ７  ９３−１１９を用いた場合には他の遺伝子型の曲線から明らかに区別されたが、より長い初期増幅オリゴマーを用いた場合には他の曲線の間に現れた。
【図１５Ｃ】図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、初期増幅オリゴマーがＴ７  ９３−１１９（１５Ａ）、Ｔ７  ８９−１１９（１５Ｂ）、またはＴ７  ８０−１１９（１５Ｃ）の場合の、遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａの検量線を示す。図１５Ａの矢印は、遺伝子型５ａの曲線を示し、これは、Ｔ７  ９３−１１９を用いた場合には他の遺伝子型の曲線から明らかに区別されたが、より長い初期増幅オリゴマーを用いた場合には他の曲線の間に現れた。
【図１６】異なる標的濃度および初期増幅オリゴマーを使用した場合の、ＨＣＶ  １ａキャリブレータと比較した、様々な遺伝子型についての定量における差異を示す。各遺伝子型について、左から右への９本のバーは、Ａ１  Ａ２  Ａ３  Ｂ１  Ｂ２  Ｂ３  Ｃ１  Ｃ２  Ｃ３として配置され、ここでＡは２００コピー／ｍｌ（ｃ／ｍｌ）、Ｂは２００００ｃ／ｍｌ、Ｃは２Ｍ  ｃ／ｍｌ、１は８０−１１９  Ｔ７ｉｐを用いたもの、２は８９−１１９  Ｔ７ｉｐを用いたもの、および３は８９−１１９  Ｔ７ｉｐを用いたものである（Ｔ７ｉｐ＝Ｔ７初期増幅オリゴマー）。
【図１７】Ｔ７初期増幅オリゴマーと選択されたＨＣＶ遺伝子型とのアラインメントを示す。
【図１８】異なるＴ７初期増幅オリゴマーを用いたＨＣＶ遺伝子型に関するＬｏｇＤｉｆｆデータの特徴付けを示す。遺伝子型と濃度は、左から右に以下のとおりである：１ａ（１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８ｃ／ｍｌ）、２ｂ（１０２、１０４、１０６ｃ／ｍｌ）、３ａ（１０２、１０４、１０６ｃ／ｍｌ）、３ｂ（１０２、１０４、１０６ｃ／ｍｌ）、４ｈ（１０２、１０４、１０６ｃ／ｍｌ）、５ａ（１０２、１０４、１０６ｃ／ｍｌ）、６ａ（１０２、１０４、１０６ｃ／ｍｌ）。各遺伝子型および濃度について、左から右への７つの隣接するバーは、以下のＴ７初期増幅オリゴマーを用いたデータを表す：８１〜１１９、８３〜１１９、８５〜１１９、８７〜１１９、８９〜１１９、９１〜１１９、９３〜１１９。
【図１９】Ｔ７初期増幅オリゴマーについてのＨＣＶ遺伝子型に関する１０Ｋパネルの結果を示す。これは、図１８サブセットのデータからの１０４ｃ／ｍｌデータのみの拡大図であり、遺伝子型およびプライマーは同じ順序である。
【図２０】例示的なオリゴマーセットを用いた、ＨＣＶ  １ａに対する様々な遺伝子型についてのＨＣＶ遺伝子型定量化を示す。
【図２１】ＨＣＶ遺伝子型配列ＨＣＶ  １からＨＣＶ  ６を有するオリゴマーのアラインメントを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａおよび２２Ｂは、初期アッセイ実現可能性オリゴマーシステムで試験した全ての変異体についての対数差（図２３Ａ）および予想される標的から＞０．４ｌｏｇ  ｃ／ｍｌの逸脱を有する変異体の対数差ｃ／ｍｌ（図２３Ｂ）、によるインビトロ転写産物ＨＣＶ変異体試験を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび２２Ｂは、初期アッセイ実現可能性オリゴマーシステムで試験した全ての変異体についての対数差（図２３Ａ）および予想される標的から＞０．４ｌｏｇ  ｃ／ｍｌの逸脱を有する変異体の対数差ｃ／ｍｌ（図２３Ｂ）、によるインビトロ転写産物ＨＣＶ変異体試験を示す。
【図２３】＞０．４ｌｏｇ  ｃ／ｍＬで過少定量化された１３個のＨＣＶ変異体との配列アラインメントを示す。
【図２４】例示的オリゴマーセットの配列アラインメントを示す。
【図２５Ａ−１】図２５Ａおよび２５Ｂは、例示的なオリゴマーセットについての、ＨＣＶ変異体にわたるＩＶＴ変異体検出（標的濃度：１０４ｃ／ｍｌ）（図２６Ａ）および亜型検出（図２６Ｂ）を示す。
【図２５Ａ−２】図２５Ａおよび２５Ｂは、例示的なオリゴマーセットについての、ＨＣＶ変異体にわたるＩＶＴ変異体検出（標的濃度：１０４ｃ／ｍｌ）（図２６Ａ）および亜型検出（図２６Ｂ）を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５Ｂは、例示的なオリゴマーセットについての、ＨＣＶ変異体にわたるＩＶＴ変異体検出（標的濃度：１０４ｃ／ｍｌ）（図２６Ａ）および亜型検出（図２６Ｂ）を示す。
【図２６】アッセイ３０−ｌｅ９ｃ／ｍｌの直線性を示す（３０ｃ／ｍＬ、ｎ＝６０、ｌｅ２−ｌｅ９ｃ／ｍＬ、ｎ＝１２））。
【図２７Ａ】図２７Ａおよび２７Ｂは、１つの標的捕獲オリゴマー（ＴＣＯ）（０２９７；暗いバー）および２つのＴＣＯ（０２９７＋０３２７ｂ；明るいバー）条件についてのＨＣＶ遺伝子型ＩＶＴパーセント陽性の結果を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａおよび２７Ｂは、１つの標的捕獲オリゴマー（ＴＣＯ）（０２９７；暗いバー）および２つのＴＣＯ（０２９７＋０３２７ｂ；明るいバー）条件についてのＨＣＶ遺伝子型ＩＶＴパーセント陽性の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
Ａ．定義
本教示を詳細に説明する前に、本開示は特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それ自体は変化し得ることを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つのオリゴマー」への言及は複数のオリゴマーなどを含む。
【００５３】
本開示で論じられている温度、濃度、時間などの前に暗黙の「約」があり、その結果、ほんのわずかなおよびわずかな逸脱は本明細書の教示の範囲内であることが理解されよう。一般に、用語「約」は、組成物の活性または安定性に有意な影響を及ぼさない、組成物の成分の量のわずかな変動を示す。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定を意図するものではない。前述の一般的な説明および詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。参照により組み入れられるいかなる資料の範囲も本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が支配する。
【００５４】
特に明記しない限り、様々な構成要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙している明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とも企図され、明細書中の様々な構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」と列挙した実施形態もまた、列挙された構成要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」として企図され、そして、明細書中の様々な構成要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ことを列挙された実施形態も、列挙された構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」として企図される（この互換性は請求項におけるこれらの用語の使用には当てはまらない）。
【００５５】
「試料」は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）または核酸または核酸のフラグメントなどのその構成要素を含み得る任意の検体を含む。試料は、ＨＣＶまたはそれに由来する標的核酸を含有する、生きているまたは死んだヒトに由来する任意の組織または材料を含む「生物学的試料」を含み、例えば末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織（例えば肝臓）または他の体液または材料を含む。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊するように処理されてもよく、したがって、標準的な方法を使用して分析用の生物学的サンプルを調製するために使用される酵素、緩衝液、塩、洗剤などをさらに含み得る溶液中に細胞内成分を放出する。また、試料は、試料を濾過装置によってまたは通過させることから、または遠心分離後に、あるいは媒体、マトリックス、または支持体への付着によって得られるものなどの処理済み試料を含み得る。
【００５６】
「核酸」とは、含窒素ヘテロ環塩基または塩基類似体を有する２つ以上の共有結合したヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である多量体化合物であって、前記ヌクレオシドはホスホジエステル結合または他の結合によって互いに結合してポリヌクレオチドを形成するものを指す。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーまたはオリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体を含む。核酸「骨格」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡにおいては、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは例えば２’−メトキシ置換および２’−ハライド置換（例えば２’−Ｆ）のような既知の置換を有する同様の化合物であり得る。窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、イノシン、５−メチルイソシトシン、イソグアニン；例えば、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄ．，１１ｔｈ  ｅｄ．，１９９２；Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３：６１７−２４）であってよく、これはプリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２，６および／または８位に改変または置換置換基を有するプリン塩基、例えば２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、ならびにピラゾロ−化合物、例えば非置換または３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号および国際特許出願公開第ＷＯ９３／１３１２１号を参照されたい）を含む。核酸は、骨格が１つ以上の残基に対して窒素塩基を含まない「無塩基」残基を含み得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られるような従来の糖、塩基、および結合のみを含み得るか、または従来の成分および置換（例えば、２’−メトキシ骨格によって結合される従来の塩基、または従来の塩基および１以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含み得る。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含んでいてよく、ここで１つ以上のヌクレオチドモノマーは糖立体配座を模倣するＲＮＡにロックされた二環式フラノース単位を有し、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補的配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（参照により本明細書に組み込まれるＶｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３２３３−４１，２００４）。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させるための修飾塩基、例えばさらなるヌクレオチドが核酸に付加されるのを阻止するための３’−末端ジデオキシヌクレオチドの付加を含み得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を作製するための合成方法は当該分野で周知であるが、核酸は日常的な技術を用いて天然の供給源から精製することができる。
【００５７】
ある配列が、ＨＣＶのいずれかの遺伝子型、亜型、または単離体と比較して、その配列またはその相補体が生じる、それと少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一である、またはただ一つのミスマッチを含む場合、それは「Ｃ型肝炎ウイルス配列」であり、例えば「Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの１４個の連続したヌクレオチド」とは、ＨＣＶの遺伝子型、亜型、もしくは単離物、またはそれらの相補体の１４個の位置のうち少なくとも１３個、と一致する１４塩基長を指す。配列がＣ型肝炎ウイルス配列として認定されるかどうかを決定する目的のためには、Ｕの存在はＴと同等であると考えられ、その逆もまた同様である。本明細書に開示される例示的オリゴマーの標的ハイブリダイズ領域、本明細書に開示されるインビトロ転写産物のＨＣＶ由来配列、およびその部分配列もまた、Ｃ型肝炎ウイルス配列と見なされる。したがって、Ｃ型肝炎ウイルス配列の例には、配列番号１〜３、６〜７、１３〜１４、２３〜４１、４８、５０〜５２、５４〜６２、および７６〜１０７、配列番号１６６〜２１４および２２１のＨＣＶ配列フラグメントならびに表５の受入番号により示されるＨＣＶ配列、非ＨＣＶ成分（例えば、転写産物中に存在しうるＴＯＰＯまたはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター配列）を除く、配列番号６３〜７４の転写産物配列、配列番号１０８〜１４７のＴ７増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ領域（例えば、配列番号１１のように、Ｔ７プロモーター領域のような非ＨＣＶ配列を除く）、配列番号１６１〜１６５の捕獲オリゴマーの標的ハイブリダイズ領域（例えば、配列番号２１のように、人工領域のような非ＨＣＶ配列を除く）、が含まれる。いくつかの実施形態では、上記のＨＣＶの遺伝子型、亜型、または単離物は、例えば本開示の日付で入手可能な配列データベースまたは刊行物に存在する、既知の遺伝子型、亜型、またはＨＣＶの単離物である。
【００５８】
オリゴマーが、例えば、特定の配列番号「のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチド」および「Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも約１４個の連続したヌクレオチド」を含む場合、同じヌクレオチドを（ｉ）および（ｉｉ）の両方に含めることができ、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス配列のうちの少なくとも１４個の連続したヌクレオチドは、Ｃ型肝炎ウイルス配列の前述の定義と一致する範囲で、特定の配列番号のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのいずれかまたはすべてを含むことができる。同様に、配列番号の各配列が存在する場合、それらが重複するかどうかにかかわらず、「オリゴマーは、少なくとも２つ」（またはそれ以上）の複数の特定の配列番号を含む標的ハイブリダイズ配列を含む。したがって、簡単な例として、ＣＡＴはＣＡとＡＴの両方を含む。
【００５９】
２つの分子が「少なくともＮ個の共通の位置にアニールする」とは、分子が、標的核酸、例えば、ＨＣＶ核酸の同じまたは反対の鎖上にＮ個以上のヌクレオチドだけ重複するハイブリダイゼーション部位を有することを意味する。例えば、位置８１〜９６に特異的にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴマーおよび位置９３〜１１９に特異的にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴマーは、（ｉ）それらが両方とも同じ鎖にアニールするか、または（ｉｉ）一方はセンスまたは（＋）鎖に特異的にハイブリダイズするように構成され、他方はアンチセンスまたは（−）鎖に特異的にハイブリダイズするように構成されているかどうかに係わらす、４つの共通位置（９３、９４、９５、および９６）にアニールする。
【００６０】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は核酸鎖を意味する。本出願を通して、核酸は５’末端から３’末端までで示される。合成核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ（非天然のヌクレオチドまたは類似体がそれらに含まれる場合を含む）は、成長する核酸の５’末端に対して典型的には「３’から５’へ」、すなわちヌクレオチドの付加によって合成される。
【００６１】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素塩基（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見いだされる５炭素糖はリボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は２’−デオキシリボースである。この用語はまた、リボースの２’位にあるメトキシ基（本明細書では「２’−Ｏ−Ｍｅ」または「２’−メトキシ」とも呼ばれる）などのそのようなサブユニットの類似体も含む。本明細書中で使用される場合、「Ｔ」残基を含有するメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を、そしてヌクレオチドの塩基位置にウラシルを有する。
【００６２】
本明細書で使用される「非ヌクレオチド単位」は、ポリマーのハイブリダイゼーションに有意に関与しない単位である。そのような単位は、例えば、ヌクレオチドとのいかなる有意な水素結合にも関与せず、そして構成要素として５つのヌクレオチド塩基またはその類似体のうちの１つを有する単位を除外するであろう。
【００６３】
本明細書で使用される「標的核酸」は、増幅される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書中に記載されるようにＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。標的核酸は、標的配列以外に増幅されていなくてもよい他の配列を含み得る。
【００６４】
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、増幅および／または検出されるべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、増幅プロセス中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体を形成する複合体形成配列（例えば、ＴＭＡ）を含む。標的核酸がもともと一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在するような「標的配列」に相補的な配列も指す。標的核酸がもともと二本鎖である場合、「標的配列」という用語はセンス（＋）鎖とアンチセンス（−）鎖の両方を指す。
【００６５】
「標的ハイブリダイズ配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの部分を指すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成されている。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成されている標的配列の部分に対して１００％相補的であり得るが、必ずしもそうではない。標的ハイブリダイズ配列はまた、標的配列に対して挿入、欠失および／または置換されたヌクレオチド残基を含み得る。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、ＨＣＶの様々な遺伝子型にハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸が種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成するための他の理由が存在することが理解される。
【００６６】
ＨＣＶ核酸の領域に関して本明細書で使用される「配列を標的とする」という用語は、オリゴヌクレオチドが本明細書に記載の増幅および検出を可能にする様式で標的配列にハイブリダイズするプロセスを指す。１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは標的ＨＣＶ核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含まない。別の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは相補的であるが、標的とされたＨＣＶ核酸配列と１、２、３、４、または５つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的な少なくとも１０個〜最大５０個のヌクレオチドを含む。１０、５０およびその間の各整数が含まれるように、少なくとも１０個および５０個もの数が包含範囲であることが理解される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは標的配列に特異的にハイブリダイズする。
【００６７】
用語「するように構成された」は、参照オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を意味する。例えば、標的配列から特定のアンプリコンを生成するように構成された増幅オリゴマーは、標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有し、アンプリコンを生成するための増幅反応に使用することができる。また一例として、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。
【００６８】
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズするように構成された」という用語は、増幅オリゴヌクレオチド、検出プローブ、または他のオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域が、参照ＨＣＶ標的領域の配列を標的とし得るポリヌクレオチド配列を有するように設計されることを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドは、その配列のみを標的化することに限定されず、組成物として、キット中で、またはＨＣＶ標的核酸を標的化するための方法においてむしろ有用である。オリゴヌクレオチドは、試料からのＨＣＶの増幅および検出のためのアッセイの構成要素として機能するように設計されており、したがって試験試料中に通常見られる他の核酸の存在下でＨＣＶを標的とするように設計されている。「に特異的にハイブリダイズする」とは、当技術分野で理解されているように、非標的核酸に対するある少量レベルのハイブリダイゼーションが起こり得るので、排他的にハイブリダイズすることを意味するのではない。むしろ、「特異的にハイブリダイズする」とは、試料中の標的核酸の正確な検出を決定することができるように、オリゴヌクレオチドがアッセイにおいて標的を主としてハイブリダイズするように機能するように構成されていることを意味する。「上流」とは、所与の位置よりも（＋）鎖の５’末端（または（−）鎖の３’末端）に近い位置を指す。「下流」とは、所与の位置よりも（＋）鎖の３’末端（または（−）鎖の５’末端）に近い位置を指す。
【００６９】
標的化ＨＣＶ核酸に関して本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」は、一続きの連続した核酸をいう。特定の実施形態では、このフラグメントは、配列番号１に対応するＨＣＶ  ＲＮＡ由来の連続したヌクレオチドを含み、このフラグメント中の連続したヌクレオチドの数は、配列番号１に対応する全配列についてのそれよりも少ない。
【００７０】
本明細書で使用される「領域」という用語は、核酸の一部分を指し、ここで前記一部分は全核酸よりも小さい。例えば、参照される核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーであるとき、用語「領域」は全オリゴヌクレオチドのより小さいプロモーター部分を指すために使用され得る。同様に、そしてまた単なる例として、核酸がＨＣＶ  ＲＮＡである場合、用語「領域」は、核酸のより小さな領域を指すために使用され得、より小さな領域は本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチドによって標的とされる。。別の非限定的な例として、参照中の核酸がアンプリコンである場合、用語としての領域は、プローブの標的ハイブリダイズ配列によるハイブリダイゼーションのために同定されたより小さなヌクレオチド配列を指すために使用され得る。
【００７１】
互換性のある用語「オリゴマー」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド」は、一般に１，０００ヌクレオチド未満のヌクレオチド（ｎｔ）残基を有する核酸を指し、約５ｎｔの残基の下限および約５００〜９００ｎｔの残基の上限の範囲を有するポリマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２〜１５ｎｔの下限および約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲内にあり、他の実施形態は、約１５〜２０ｎｔの下限および約２２〜１００ｎｔの上限を有するサイズ範囲内にある。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製され得るか、または任意の種々の周知の酵素的方法もしくは化学的方法を使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対するいかなる特定の機能も意味せず、むしろ、それは本明細書に記載されている全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用されている。オリゴヌクレオチドは様々な異なる機能を果たし得る。例えば、それが相補鎖に対して特異的であり、それとハイブリダイズすることが可能であり、そして核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、それはプライマーとして機能し得、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写を可能にする場合、それはプライマーとして機能し、そしてプロモーターを提供し得る（例えば、Ｔ７プライマー）し、そして標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができるならばそれは標的核酸を検出するように機能し得、そしてさらに検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を提供する。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、特定の参照核酸配列「に実質的に対応する」オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列によって参照核酸配列とハイブリダイズするという点で、参照核酸配列と同様のハイブリダイゼーション特性を有するように参照核酸配列と十分に類似することを意味する。当業者は、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が参照配列とは異なり得、なお同じ標的核酸配列にハイブリダイズし得ることを理解するであろう。文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、第２の核酸に対応する第１の核酸は、そのＲＮＡまたはＤＮＡ等価物ならびにそのＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、そしてそれらの相補体を含むことも理解される。核酸からのこの変動は、配列内の同一塩基の割合、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合に関して述べることができる。したがって、特定の実施形態において、これらの塩基同一性または相補性の割合が１００％から約８０％である場合、オリゴヌクレオチドは参照核酸配列に「実質的に対応する」。いくつかの実施形態では、この割合は１００％〜約８５％までである。いくつかの実施形態では、この割合は１００％〜約９０％、例えば１００％〜約９５％である。同様に、核酸または増幅された核酸の領域は、本明細書において参照核酸配列に対応すると言及され得る。当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく、特定の標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために様々な割合の相補性で必要とされ得る、ハイブリダイゼーション条件に対する様々な修正を理解するであろう。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ配列に関する「またはその相補体、またはそのＲＮＡ等価物またはそのＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」という表現は、（参照ＤＮＡ配列に加えて）ＤＮＡ配列の相補体、参照ＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物、参照ＤＮＡ配列の相補体のＲＮＡ等価物、参照ＤＮＡ配列のＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、および参照ＤＮＡ配列の相補体のＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む。同様に、ＲＮＡ配列に関する「またはその相補体、またはそのＤＮＡ等価物またはそのＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」という表現は、（参照ＲＮＡ配列に加えて）ＲＮＡ配列の相補体、参照ＲＮＡ配列のＤＮＡ等価物、参照ＲＮＡ配列の相補体のＤＮＡ等価物、参照ＲＮＡ配列のＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、および参照ＲＮＡ配列の相補体のＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「ブロッキング部分」は、それが核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長され得ないように、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の３’末端を「ブロックする」ために使用される物質である。核酸ポリメラーゼによる伸長を意図していないオリゴマーは、増幅反応においてオリゴマーの酵素媒介伸長を防ぐために３’ＯＨを置換するブロッカー基を含み得る。例えば、増幅中に存在するブロック化増幅オリゴマーおよび／または検出プローブは、官能性３’ＯＨを有さず、その代わりに３’末端またはその近くに位置する１つ以上のブロッキング基を含み得る。いくつかの実施形態において、３’末端付近のブロッキング基は、３’末端の５残基以内であり得、そしてオリゴマーへのポリメラーゼの結合を制限するのに十分に大きい。他の実施形態では、ブロッキング基は３’末端に共有結合している。多くの異なる化学基、例えばアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンが３’末端をブロックするために使用され得る。
【００７５】
「増幅オリゴマー」は、少なくともその３’末端が標的核酸に相補的であり、そして標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、標的核酸とハイブリダイズし、増幅過程においてポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ末端を含む「プライマー」である。いくつかの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチドの５’領域は、標的核酸に対して非相補的であるプロモーター配列（「プロモータープライマー」と称され得る）を含み得る。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、それが３’ブロック化末端を有するため）が、増幅に関与するかまたは増幅を促進するオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの５’領域は、標的核酸に対して非相補的であるプロモーター配列（これは「プロモータープロバイダー」と称され得る）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’プロモーター配列を含むように改変され得、そしてそれ故プロモータープライマーとして機能することを理解するであろう。３’ブロック化末端を組み込むことは、今や標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始するのに役立つ上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しないプロモータープライマーをさらに修飾する。そのような修飾オリゴは、本明細書において「プロモータープロバイダー」オリゴマーと呼ばれる。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲は、長さが約１０〜約７０ｎｔ（プロモーター配列またはポリＡテールを含まない）のものが含まれ、標的核酸配列（またはその相補鎖）の領域に相補的な少なくとも約１０個の連続した塩基、さらには少なくとも１２個の連続した塩基を含むものが含まれる。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは、修飾されたヌクレオチドもしくは類似体、または増幅反応に関与するが標的核酸もしくは鋳型配列に相補的でも含まれてもいないさらなるヌクレオチドを任意に含んでもよい。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さの範囲に言及するとき、その範囲は全ての整数（例えば、長さ１９〜２５の連続したヌクレオチドには、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５が含まれる。）を含むことが理解される。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、核酸に結合しそして特定の部位でＲＮＡの転写を開始するためのシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特定の核酸配列である。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」とは、第１および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨げるように修飾されているオリゴヌクレオチドをいう。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、このハイブリダイズする配列は、プロモーター領域の３’側に位置するが、必ずしも隣接しない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、そして５０ヌクレオチド以上の長さまで伸びてもよい。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、それがＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば逆転写酵素によって伸長され得ないように操作され、いくつかの実施形態において、上記のようにその３’末端にブロッキング部分を含む。本明細書で言及されるように、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供するブロック化プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである。
【００７８】
「終結オリゴヌクレオチド」は、新生核酸のプライマー伸長を「終結させる」ために、標的領域の５’末端付近の標的核酸内の配列に実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、その結果プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結」させ、それによって新生核酸鎖の規定された３’末端を提供する。終結オリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖にとって望ましい３’末端を達成するのに十分な位置で標的核酸とハイブリダイズするように設計されている。終結オリゴヌクレオチドの位置はその設計に応じて柔軟である。終結オリゴヌクレオチドは修飾されていても修飾されていなくてもよい。特定の実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは相補的二本鎖のより高い熱安定性を示した。２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドはまた、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増大させるように機能し、それによって修飾オリゴヌクレオチドの半減期を増大させる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｊｌｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２２２４−９、１９８８を参照されたい）。２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに、本明細書の他の場所に記載されているような他の修飾を利用することができる。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡまたはＬＮＡを含み得る。（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １３：４４−５３，２０００を参照されたい。）本開示の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、その３’末端に伸長を防ぐためのブロッキング部分を含む。終結オリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによる新生核酸鎖のさらなる伸長を終結させるようにオリゴヌクレオチドに結合したタンパク質またはペプチドを含み得る。本開示の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１０塩基の長さであり、そして１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはそれ以上のヌクレオチド長まで伸長し得る。終結オリゴヌクレオチドは、典型的にまたは必然的に３’ブロッキング部分を含むが、「３’−ブロック化」オリゴヌクレオチドは必ずしも終結オリゴヌクレオチドではない。
【００７９】
「増幅」は、標的核酸配列またはその相補体もしくはそのフラグメントの複数のコピーを得るための任意の既知の手順を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と呼ばれることがある。「フラグメント」の増幅は、例えば、標的核酸の内部位置にハイブリダイズし、そこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを使用することによって産生される、完全未満の標的核酸またはその相補体を含む増幅核酸の産生を指す。既知の増幅方法としては、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅が挙げられる。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７８６，６００号を参照されたい）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱サイクリングを使用して、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成するか、またはｃＤＮＡから合成する（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号を参照されたい）。ＬＣＲ増幅は４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２７，９３０号および同第５，５１６，６６３号を参照されたい）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーと、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼを使用し、それによって一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅が起こる（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２２，２５２号、同第５，５４７，８６１号および同第５，６４８，２１１号を参照されたい）。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「線形増幅」とは、反応中の標的核酸の量に直線的に比例する標的核酸の増加を生じるように設計されている増幅機構をいう。例えば、転写関連反応を用いてＤＮＡ標的から複数のＲＮＡコピーを作製することができ、ここでコピー数の増加は線形因子（例えば、鋳型の開始コピー×１００）によって表すことができる。いくつかの実施形態において、多相増幅手順における第１相線形増幅は、第２相増幅反応が始まる前に、標的核酸鎖またはその相補体の開始数を少なくとも１０倍、例えば、少なくとも１００倍、または１０〜１，０００倍増加させる。線形増幅システムの例は、「Ｔ７に基づくＤＮＡの線形増幅」（ＴＬＡＤ、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：Ａｒｔ．Ｎｏ．１９，Ｍａｙ  ９，２００３を参照されたい）である。他の方法は、例えば、米国特許第９，１３９，８７０号から既知であるか、または本明細書に開示されている。したがって、「線形増幅」という用語は、標的核酸配列の指数関数的増幅をもたらさない増幅反応を指す。用語「線形増幅」は、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲの場合のようにＲＮＡ分子の単一ｃＤＮＡ分子への転写のように、核酸鎖の単一コピーを単純に作製する方法を指すものではない。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、用語「指数関数的増幅」とは、反応中の標的核酸の量に幾何学的に比例する標的核酸の増加を生じるように設計されている核酸増幅をいう。例えば、ＰＣＲは、あらゆる元の標的鎖および存在するあらゆる合成鎖に対して１つのＤＮＡ鎖を生成する。同様に、転写関連増幅は、すべての元の標的鎖について、およびその後に合成されるすべての鎖について、複数のＲＮＡ転写物を生成する。増幅は指数関数的である。なぜなら、合成された鎖はその後の増幅ラウンドにおいて鋳型として使用されるからである。増幅反応は、増幅反応がそのような増加を生じるように設計されている限り、指数関数的に増幅すると考えられる量の核酸を実際に産生する必要はない。
【００８２】
「転写関連増幅」または「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）は、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生するためにＲＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅を指す。これらの方法は一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター配列、例えばＴ７プロモーターを含む鋳型相補的オリゴヌクレオチドを使用し、そして任意には１以上の他のオリゴヌクレオチドを含み得る。Ｔ７プロモーター含有オリゴマーが使用される場合、それは「Ｔ７プライマー」または「Ｔ７オリゴマー」と呼ばれることがあり、他のプライマー／オリゴマーは、「非Ｔ７」または「ＮＴ７」プライマー／オリゴマーと呼ばれることがある。ＴＭＡ法および単一プライマー転写関連増幅法は、本明細書に記載のようにＨＣＶ標的配列の検出に使用される増幅法の実施形態である。転写関連増幅のバリエーションは、以前に詳細に開示されたように当該分野において周知である。（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，３９９，４９１号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号および同第７，３７４，８８５号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１３０２号、同第ＷＯ８８／１０３１５号、および同第ＷＯ９５／０３４３０号を参照されたい）。当業者は、開示された組成物がポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅方法において使用され得ることを理解するであろう。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語「リアルタイムＴＭＡ」とは、リアルタイム検出によってモニターされる標的核酸の単一プライマー転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）をいう。
【００８４】
本明細書で使用される「アンプリコン」または「増幅産物」という用語は、標的配列内に含まれる配列に対して相補的または相同な、増幅手順中に生成される核酸分子を指す。アンプリコンの相補的または相同的配列は、本明細書において「標的特異的配列」と呼ばれることがある。本開示の増幅オリゴマーを用いて生成されたアンプリコンは、非標的特異的配列を含み得る。アンプリコンは、二本鎖または一本鎖であり得、そしてＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含み得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写媒介増幅手順の間に二本鎖ＤＮＡから一本鎖アンプリコンを転写する。これらの一本鎖アンプリコンはＲＮＡアンプリコンであり、増幅オリゴマーがどのように構成されているかに応じて、二本鎖複合体のいずれかの鎖であり得る。したがって、アンプリコンは一本鎖ＲＮＡであり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ鎖を合成する。したがって、アンプリコンは、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡハイブリッドであり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはしばしばＲＮａｓｅ活性を含むか、またはＲＮＡ鎖を分解するＲＮａｓｅと共に使用される。従って、アンプリコンは一本鎖ＤＮＡであり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ鎖を合成する。従って、アンプリコンは二本鎖ＤＮＡであり得る。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートからＲＮＡを合成する。従って、アンプリコンは二本鎖ＲＮＡであり得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写とも称される二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成する。したがって、アンプリコンは一本鎖ＲＮＡであり得る。アンプリコンおよびアンプリコンを生成するための方法は当業者に知られている。本明細書における便宜上、ＲＮＡの一本鎖またはＤＮＡの一本鎖は、本開示の増幅オリゴマーの組み合わせによって生成されたアンプリコンを表し得る。そのような表現は、アンプリコンを示される表現に限定することを意味しない。本開示を所有する当業者は、増幅オリゴマーおよびポリメラーゼ酵素を使用して、すべて本開示の精神および範囲内にある多数のタイプのアンプリコンのいずれかを生成するであろう。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、「非標的特異的配列」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で標的配列と安定にハイブリダイズしないオリゴマー配列の領域を指す。非標的特異的配列を有するオリゴマーとしては、プロモータープライマーおよび分子ビーコンが挙げられるが、これらに限定されない。増幅オリゴマーは、標的配列または鋳型配列に相補的ではない配列を含み得、例えば、プライマーの５’領域は、標的核酸に対して非相補的であるプロモーター配列（「プロモータープライマー」と呼ばれる）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’プロモーター配列を含むように改変され得、そしてそれ故プロモータープライマーとして機能することを理解するであろう。同様に、プロモータープライマーは、プロモーター配列の除去、またはプロモーター配列なしの合成によって改変されてもよく、それでもなおプライマーとして機能する。３’ブロック化増幅オリゴマーは、プロモーター配列を提供し、そして重合のための鋳型として機能し得る（「プロモータープロバイダー」と呼ばれる）。したがって、プロモータープライマーなどの増幅オリゴマーメンバーによって生成されるアンプリコンは、標的特異的配列および非標的特異的配列を含むであろう。
【００８６】
「検出プローブ」、「検出オリゴヌクレオチド」、「プローブオリゴマー」、および「検出プローブオリゴマー」は互換的に使用されて、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸中または増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズして標的配列または増幅された核酸の検出を可能にする、核酸オリゴマーを指す。検出は直接的（例えばその標的配列に直接ハイブリダイズしたプローブ）または間接的（例えば中間分子構造を介してその標的に連結したプローブ）のいずれかであり得る。検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体またはそれらの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）であり得、それらは標識されていてもいなくてもよい。検出プローブは、例えば２’−Ｏ−メチル結合などの代替骨格結合をさらに含み得る。検出プローブの「標的配列」は、一般に、標準的な塩基対合によってプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きな核酸配列内のより小さな核酸配列領域を指す。検出プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元立体配座に寄与する他の配列を含み得る（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６００６８４１７号を参照されたい）。
【００８７】
「安定」または「検出に対して安定」とは、反応混合物の温度が核酸二本鎖の融解温度より少なくとも２℃低いことを意味する。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、「標識」とは、検出されるかまたは検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的または間接的に結合した部分または化合物をいう。直接的標識化は、共有結合または非共有相互作用、例えば、水素結合、疎水性およびイオン性相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を介して起こり得る。間接的な標識化は、直接的または間接的に標識化され、検出可能なシグナルを増幅することができる、架橋部分または結合対メンバー、抗体またはさらなるオリゴマーなどの「リンカー」の使用を通じて起こり得る。標識は、例えば放射性核種、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素または酵素基質、反応基、または発色団（例えば、検出可能な色を付与する染料、粒子、またはビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、燐光、または化学発光標識）、またはフルオロフォアのいずれかの検出可能な部分を含む。標識は、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブとは異なる検出可能な変化、例えば不安定性または特異的な分解特性を示す均質アッセイにおいて検出可能であり得る。「均質な検出可能な標識」は、未結合形態の標識または標識プローブから結合したものを物理的に除去することなく検出することができる（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号を参照されたい）。標識は、化学発光化合物、例えば、標準ＡＥを含むアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物および誘導体を含む（例えば、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号を参照されたい）。標識を核酸に付着させそして標識を検出する合成および方法は周知である。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，Ｎ  Ｙ，１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ  １０を参照されたい。また、参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号および同第４，５８１，３３３号を参照されたい）。１つより多い標識、および１つより多くの種類の標識が特定のプローブ上に存在し得るか、または検出は、各プローブが検出可能なシグナルを生じる化合物で標識されているプローブの混合物を使用し得る。（参照によりおのおのが本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照されたい）。
【００８９】
「捕獲プローブ」、「捕獲オリゴヌクレオチド」、「捕獲オリゴマー」、および「捕獲プローブオリゴマー」は、標準的な塩基対合によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、固定化プローブ上の結合パートナーに結合して標的核酸を支持体に捕獲する、核酸オリゴマーを指すために互換的に用いられる。捕獲オリゴマーの一例は、２つの結合領域：通常は同じオリゴマー上の配列結合領域（例えば、標的部位）および固定化プローブ結合領域、を含むが、２つの領域は、１つ以上のリンカーによって互いに結合した２つの異なるオリゴマー上に存在し得る。捕獲オリゴマーの別の実施形態は、標的核酸に非特異的に結合し、それを支持体上の固定化プローブに結合するために、ランダムまたは非ランダムポリ−ＧＵ、ポリ−ＧＴ、またはポリＵ配列を含む標的配列結合領域を使用する。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」、「固定化結合パートナー」、「固定化オリゴマー」、または「固定化核酸」とは、捕獲オリゴマーを支持体に直接または間接的に結合する核酸結合パートナーを指す。支持体に結合した固定化プローブは、試料中の未結合材料からの捕獲プローブ結合標的の分離を容易にする。固定化プローブの一実施形態は、試料中の未結合材料からの結合標的配列の分離を容易にする、支持体に結合したオリゴマーである。支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、または他の組成物でできていてもよい、その一実施形態は磁気的に誘引性の粒子である、既知の材料、例えばマトリックスおよび溶液中で遊離している粒子を含み得る。支持体は、固定化プローブが直接的に（共有結合、キレート化、またはイオン相互作用による）または間接的に（１つ以上のリンカーを介して）結合している単分散磁性球体（例：均一サイズ＋５％）であってもよく、ここでプローブと支持体との間の結合または相互作用はハイブリダイゼーション条件下で安定である。
【００９１】
「相補的」とは、２つの一本鎖核酸の類似領域、または同じ一本鎖核酸の２つの異なる領域のヌクレオチド配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは増幅条件下での安定な二本鎖水素結合領域下で、一本鎖領域が互いにハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成を有することを意味する。互いにハイブリダイズする配列は、標準的な核酸塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕの対合）によって意図する標的配列と完全に相補的または部分的に相補的であり得る。「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基の間の水素結合によって別の配列とハイブリダイズすることができる連続した配列を意味し、これは標準的な塩基対合によって配列中の各位置で相補的であり得、相補的ではない無塩基残基を含む。十分に相補的な連続した配列は、典型的には、オリゴマーが特異的にハイブリダイズすることが意図される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも９０％相補的である。「十分に相補的」な配列は、たとえ配列が完全に相補的でなくても、適切なハイブリダイゼーション条件下で核酸オリゴマーとその標的配列との安定なハイブリダイゼーションを可能にする。ある一本鎖領域のヌクレオチドの連続した配列が、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と一連の「基準の」または「ワトソン−クリック」水素結合塩基対を形成することができる、例えばＡはＵまたはＴとペアになり、ＣはＧとペアになる、場合、ヌクレオチド配列は、「完全に」相補的である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）の§§１．９０〜１．９１，７．３７〜７．５７，９．４７〜９．５１および１１．４７〜１１．５７、特に§§９．５０〜９．５１，１１．１２〜１１．１３，１１．４５〜１１．４７および１１．５５〜１１．５７を参照されたい）。同一性のパーセントの範囲は全ての整数および部分的な数を含むことが理解される。（例えば、少なくとも９０％は９０、９１、９３．５、９７．６８７などを含む）。特定の配列の「相補体」への言及は、文脈がそうでないと示さない限り、一般に完全に相補的な配列を示す。
【００９２】
「ゆらぎ」塩基対とは、ＧとＵまたはＴのいずれかとの対合を指す。
【００９３】
「優先的にハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、プローブがそれらの標的配列またはその複製とハイブリダイズして安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成を最小化することを意味する。したがって、プローブは、非標的配列よりも十分に大きい程度まで標的配列またはその複製にハイブリダイズして、当業者が増幅中に形成された標的配列のＲＮＡ複製物または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に検出または定量することを可能にする。適切なハイブリダイゼーション条件は、当該分野において周知であり、配列組成に基づいて予測され得るか、または日常的な試験方法を使用することによって決定され得る  （例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）の§§１．９０〜１．９１，７．３７〜７．５７，９．４７〜９．５１および１１．４７〜１１．５７，特に§§９．５０〜９．５１，１１．１２〜１１．１３，１１．４５〜１１．４７および１１．５５〜１１．５７を参照されたい）。
【００９４】
「核酸ハイブリッド」、「ハイブリッド」、または「二重鎖」とは、二本鎖の水素結合領域を含む核酸構造を意味し、各鎖は他方に対して相補的であり、そしてこの領域は、限定されるものではないが、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を含む手段によって検出されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で十分に安定である。そのようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含み得る。
【００９５】
「試料調製」は、試料中に存在するＨＣＶ核酸のその後の増幅および／または検出のために試料を処理する任意のステップまたは方法を指す。試料は、標的核酸が少数成分である成分の複合体混合物であり得る。試料調製は、より大きな体積の試料からの空中または水性の粒子の濾過によって、または標準的な微生物学的方法を使用することによる試料からの微生物の単離などによって、より大きな試料体積から微生物または核酸などの成分を濃縮する任意の既知の方法を含み得る。試料調製は、濾過、遠心分離または吸着を用いることによるなどして、細胞内成分を実質的に水性または有機相に放出するための細胞成分の物理的破壊および／または化学的溶解および破片の除去を含み得る。試料調製は、標的核酸を選択的または非特異的に捕獲し、それを他の試料成分から分離する核酸オリゴヌクレオチドの使用を含み得る（例えば、おのおのが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１１０，６７８号および国際特許出願公開第ＷＯ  ２００８／０１６９８８号に記載されるものである。）。
【００９６】
「分離する」または「精製する」ことは、試料の１つ以上の成分を他の試料成分から除去されるかまたは分離することを意味する。試料成分は、通常、一般的には水溶液相内の標的核酸を含むが、これはまた、細胞フラグメント、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸を含み得る。「分離する」または「精製する」ことは、いずれかの精製の程度を示すものではない。典型的には、分離または精製することは、他の試料成分から少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９５％の標的核酸を取り出す。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２もしくはＴ５由来のＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離されるかまたは組換え的に発現される天然に存在する酵素であり得るか、または特定の望ましい特性、例えば熱安定性、または様々な修飾鋳型からのＤＮＡ鎖を認識もしくは合成する能力を有するように操作された改変もしくは「進化」形態であり得る。。全ての既知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは合成を開始するために相補的プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成し得ることが知られている。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは典型的にはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性も有する。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「転写酵素」は、通常二本鎖であるプロモーター配列を有する二本鎖または部分的二本鎖ＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位置から開始して５’から３’方向に合成される。転写酵素の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。全ての既知の逆転写酵素はまた、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを作製する能力を有する。したがって、それらはＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴはまたＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有し得る。プライマーはＲＮＡとＤＮＡの両方の鋳型を用いて合成を開始するために必要である。
【０１００】
「好熱性」は、酵素、例えばポリメラーゼが、約４５℃より高い温度、例えば約５０℃〜９９℃の範囲の温度で最適な活性を示すことを示す。いくつかの実施形態では、好熱性酵素は、６０℃で２０分間インキュベートしたときにその活性の５０％を超える量を失うことはない。いくつかの実施形態では、好熱性酵素は、好熱性生物、例えば、その最適増殖温度が約４５℃以上、例えば約５０℃以上である生物から得られるかまたはそれに由来する。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、「選択的ＲＮＡｓｅ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解するが一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを分解しない酵素である。例示的な選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｈ酵素であり、ＲＮＡｓｅ  Ｈと同じまたは類似の活性を有する酵素もまた使用され得る。選択的ＲＮＡｓｅはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。ほとんどの逆転写酵素は、それらのポリメラーゼ活性に加えてＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含む。しかしながら、関連するポリメラーゼ活性がなくても、他のＲＮＡｓｅ  Ｈ源が利用可能である。分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離をもたらし得る。あるいは、選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡの一部が融解するかまたは酵素がＲＮＡの一部をほどくことを可能にするように、様々な位置で単にＲＮＡを切断することができる。本開示のＲＮＡ標的配列またはＲＮＡ産生物を選択的に分解する他の酵素は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「標準曲線」は、（１）増幅前の量のポリヌクレオチド、および（２）増幅後の量の対応するアンプリコンのいくらかの時間依存のしるしに関する表現である。例えば、標準曲線は、ｘ軸上にプロットされた既知の数の投入鋳型分子、およびｙ軸上にプロットされたあるレベルの検出可能なアンプリコン産生を達成するのに必要な時間値を有するグラフであり得る。標準曲線は、典型的には、既知の数のポリヌクレオチド鋳型を含む対照ポリヌクレオチド標準を用いて作成される。標準曲線は、電子形式で保存することも、グラフで表すこともできる。試験試料中の分析物ポリヌクレオチドの増幅前の量は、当業者によく知られているように、試験試料について得られた測定された時間依存値を標準曲線と比較することによって決定することができる。
【０１０３】
増幅および／または検出システムの文脈において、用語「特異性」は、配列およびアッセイ条件に依存して標的配列と非標的配列とを区別するその能力を説明するシステムの特徴を指すために本明細書中で使用される。核酸増幅に関して、特異性は一般に、副産物の数に対する産生された特定のアンプリコンの数の比（例えば、シグナル対ノイズ比）を指す。検出に関して、特異性とは一般に、標的核酸から生成されたシグナルと非標的核酸から生成されたシグナルとの比を指す。
【０１０４】
用語「感度」は、核酸増幅反応を検出または定量することができる精度を指すために本明細書中で使用される。増幅反応の感度は、一般に、増幅系において確実に検出することができる標的核酸の最小コピー数の尺度であり、そして例えば、使用される検出アッセイ、および増幅反応の特異性、例えば、副産物に対する特異的アンプリコンの比率、に依存するであろう。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、用語「相対光単位」（「ＲＬＵ」）および「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）は、所与の波長または波長帯で試料によって放出される光子の相対数を示す任意の測定単位を表す。ＲＬＵまたはＲＦＵの測定は、測定に使用される検出器の特性によって異なる。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＴＴｉｍｅ」、「出現時間」、および「出現の時間」は交換可能であり、そしてアッセイデータのリアルタイムプロットにおける閾値時間またはシグナルの出現時間を表す。Ｔ  Ｔｉｍｅ値は、アンプリコン産生を示す特定の閾値がリアルタイム増幅反応において通過する時間を推定する。ＴＴｉｍｅおよびＴＴｉｍｅ値を計算し使用するためのアルゴリズムは、Ｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許出願公開第２００６／０２７６９７２号の段落番号［０５１７］〜［０５３８］に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。曲線当てはめ手順が、正規化されバックグラウンド補正されたデータに適用される。曲線当てはめは、所定の下限と上限との間のデータの一部に対してのみ実行される。データに適合する曲線を見つけた後の目的は、曲線またはその投影が所定の閾値と交差する点に対応する時間を推定することである。一実施形態では、正規化データの閾値は０．１１である。上限および下限は、曲線がさまざまな対照データセットに適合する範囲が、与えられた閾値に関連する時間内で最小の変動性を示すように経験的に決定される。例えば、一実施形態では、下限は０．０４であり、上限は０．３６である。曲線は、下限を下回る最初のデータ点から上限を超える最初のデータ点までのデータに適合する。次に、適合の勾配が統計的に有意であるかどうかの決定がなされる。例えば、一次係数のｐ値が０．０５より小さい場合、適合は有意と見なされ、処理が続行される。そうでなければ、処理は停止する。あるいは、データの有効性はＲ２の値によって決定することができる。線形曲線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾きｍと切片ｂが近似曲線に対して決定される。その情報により、ＴＴｉｍｅは次のように決定できる。ＴＴｉｍｅ＝（閾値−ｂ）／ｍ。
【０１０７】
他に示されない限り、以下の表に現れるオリゴマー配列は、小文字がオリゴマーについては２’−Ｏ−メチルＲＮＡを、またはウイルス配列についてはＲＮＡを示し、大文字はＤＮＡを示すという慣例に従う。「（ｃ９）」は−（ＣＨ２）９−リンカーを示す。他に示されない限り、インビトロ転写物（ＩＶＴ）配列はＲＮＡである。
【０１０８】
特に特許請求の範囲における「配列番号Ｘの配列」への言及は、他に示されない限り、対応する配列表の記載の塩基配列を指し、骨格の同一性を必要としない（例えば、ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ、またはＤＮＡ）。さらに、ＴおよびＵ残基は、他に示されない限り、配列表の記載の目的のために交換可能であると考えられるべきであり、例えば、６番目の位置の残基がＴであるかＵであるかにかかわらず、配列は配列番号２と同一であると見なすことができる。
【０１０９】
Ｂ．オリゴマー、組成物、およびキット
本開示は、試料からのＨＣＶを増幅、検出、または定量するのに有用なオリゴマー、組成物、およびキットを提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、増幅オリゴマーが提供される。増幅オリゴマーは、一般に、例えばＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ領域を含む。異なる長さおよび塩基組成のオリゴマーがＨＣＶ核酸を増幅するために使用され得るが、いくつかの実施形態において、本開示におけるオリゴマーは、長さ１０〜６０塩基、長さ１４〜５０塩基、または長さ１５〜４０塩基の標的ハイブリダイズ領域を有する。いくつかの実施形態では、約３０〜５０個、例えば３５〜４５個のヌクレオチドなどの比較的長い標的ハイブリダイズ領域を有する初期増幅オリゴマーが使用され、後の段階で、より短い標的ハイブリダイズ領域を有する増幅オリゴマー、例えば、約１５〜３０ｎｔのような約１４〜３５ヌクレオチドが使用される。
【０１１１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の増幅オリゴマーは、標的ハイブリダイズ配列の５’に位置し、ＨＣＶ標的核酸と非相補的であるプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーである。例えば、ＨＣＶ標的領域の増幅のための本明細書に記載のオリゴマー組み合わせのいくつかの実施形態では、（ｂ）に記載の増幅オリゴマー（例えば、表１に示すアンチセンス標的ハイブリダイズ配列を含むまたはからなる増幅オリゴマー）は、５’プロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーである。特定の実施形態において、プロモーター配列は、例えば、配列番号８に示される配列を有するＴ７プロモーター配列のようなＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である。特定の変形形態では、プロモータープライマーは、配列番号９、配列番号１０、またはいくつかの実施形態では配列番号１１のうちの１つに示されるＴ７プロモーターを含む非ＨＣＶ配列を含む。あるいは、増幅オリゴマーはプロモーター提供者であり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーはプロモータープライマーではなく、またはプロモーター配列を含まない。例えば、ＰＣＲベースのアプローチでは、プライマーは一般にプロモータープライマーではなく、そしてＴＭＡベースのアプローチでは、プロモータープライマーではない少なくとも１つのプライマーが通常使用される（一方、少なくとも１つのプロモータープライマーも使用される）。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、フォワード増幅オリゴマーであり、すなわちそれが（−）鎖ＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成され、その標的ハイブリダイズ配列がＨＣＶの「センス」配列に対応する第１の増幅オリゴマーが提供される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の６５位を、例えば６４〜６６、６３〜６７、６２〜６８、６１〜６９、６０〜７０、５９〜７１、５８〜７２、５７〜７３、５６〜７４、５５〜７５、５４〜７６、５３〜７７、または５２〜７８位を含むいくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号３または２１５に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号７６〜１０７のうちの１つに対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。その配列に関するものを含めて、第１の増幅オリゴマーの様々な実施形態が上記の要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーとは異なるさらなるフォワード増幅オリゴマーである第２の増幅オリゴマーが提供される。実施例に記載されるように、第２のフォワード増幅オリゴマーを使用することは、遺伝子型間の配列変動にもかかわらず、ＨＣＶ核酸の定量の相対精度を改善し得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の６５位、例えば６４〜６６、６３〜６７、６２〜６８、６１〜６９、６０〜７０、５９〜７１、５８〜７２、５７〜７３、５６〜７４、５５〜７５、５４〜７６、５３〜７７、または５２〜７８位を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号３に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号２または２１５に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、配列番号７６〜１０７のうちの１つに対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。その配列に関しても含めて、第２の増幅オリゴマーの様々な実施形態が上記の要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１１７】
１つのフォワード増幅オリゴマーのみが使用される場合、それは本明細書における第１または第２の増幅オリゴマーのいずれかに起因する特徴を有し得ることに留意されたい。この注記は、例えば１つの捕獲オリゴマーのみが使用される場合など、序数詞が使用される他の場合にも準用され、それは本明細書中の第１または第２の捕獲オリゴマーのいずれかに起因する特徴を有し得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、逆増幅オリゴマーである、すなわちそれが（＋）鎖ＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成され、その標的ハイブリダイズ配列がＨＣＶの「アンチセンス」配列に対応する第３の増幅オリゴマーが提供される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の１０６位、例えば１０５〜１０７、１０４〜１０８、１０３〜１０９、１０２〜１１０、１０１〜１１１、１００〜１１２、９９〜１１３、９８〜１１４、９７〜１１５、９６〜１１６、９５〜１１７、９４〜１１８、または９３〜１１９位を含む。いくつかの実施形態において、第３の増幅オリゴマーは、配列番号７に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の増幅オリゴマーは、配列番号２１８もしくは２１９の配列、またはそれに対して最大１もしくは２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の増幅オリゴマーは、配列番号１４７もしくは２２０の配列、またはそれに対して最大１もしくは２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の増幅オリゴマーは、配列番号７５のＮ〜１１９位（ここでＮは８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５である。）の相補体を含む標的ハイブリダイズ配列、またはそれに対して最大１もしくは２までのミスマッチを有する配列、例えば配列番号１１４〜１２８の１つを含む。
【０１２０】
その配列に関するものも含めて、第３の増幅オリゴマーの様々な実施形態が上記の要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１２１】
第３の増幅オリゴマーの存在が必ずしも第１および第２の増幅オリゴマーの両方の存在を意味するわけではないことに注意すべきである。例えば、第１および第３の増幅オリゴマーのみの存在下で指数関数的増幅を実施することが可能である。さらに、線形増幅は、いずれかのフォワード増幅オリゴマーを必要とせずに、第３の増幅オリゴマーの存在下で実施され得る。いくつかの実施形態では、第３の増幅オリゴマーはプロモータープライマーであり、その結果、それは上記で論じられたプロモータープライマーの任意の特徴を有し得る。この注記は、例えば第２の捕獲オリゴマーの存在が必ずしも第１の捕獲オリゴマーの存在を意味するとは限らないなど、序数詞が用いられる他の場合にも準用される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーが提供される。初期増幅オリゴマーは、それらが存在するかまたは使用される限りにおいて、第１、第２、および第３の増幅オリゴマーと異なり得る。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、第３の増幅オリゴマーなどの少なくとも１つの他の増幅オリゴマー、または第１、第２、および第３のＡＯよりも長い標的ハイブリダイズ領域を有する。実施例に記載されるように、長い標的ハイブリダイズ領域を含む初期増幅オリゴマーを使用することは、その後の特定のＨＣＶ遺伝子型の増幅および定量を改善し、それによって全体的な検出および定量性能を改善し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の９９位、例えば９８〜１００、９７〜１０１、９６〜１０２、９５〜１０３、９４〜１０４、９３〜１０５、９２〜１０６、９１〜１０７、９０〜１０８、８９〜１０９、８８〜１１０、８７〜１１１、８６〜１１２、８５〜１１３、８４〜１１４、８３〜１１５、８２〜１１６、８１〜１１７、８０〜１１８、または８０〜１１９位を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、配列番号６に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、配列番号２１８もしくは２１９の配列、またはそれに対して最大１もしくは２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーは、配列番号７５のＮ〜１１９位（ここで、Ｎは７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、もしくは９５である。）の相補体を含む標的ハイブリダイズ配列、またはそれに対して１もしくは２までのミスマッチを有する配列を含む。その配列に関するものも含めて、初期増幅オリゴマーの様々な実施形態が上記の要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプローブオリゴマーが提供される。相補的増幅配列にハイブリダイズする検出プローブのいくつかの実施形態は、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴマー、またはＤＮＡとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせを含むオリゴマー、または改変骨格を用いて合成されたオリゴマー、例えば１つ以上の２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであり得る。増幅されたＨＣＶ配列の検出に使用されるプローブは、非標識で間接的に（例えば、プローブ上の部分への別の結合パートナーの結合によって）検出されてもよく、または様々な検出可能な標識で標識されてもよい。検出プローブオリゴマーは、核酸骨格中の１つ以上の結合に２’−メトキシ骨格を含み得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本開示による検出プローブオリゴマーはさらに標識を含む。特に適切な標識は、検出可能な光シグナルを発する化合物、例えば、均一混合物中で検出され得るフルオロフォアまたは発光（例えば、化学発光）化合物を含む。１つより多い標識、および１つより多くの種類の標識が特定のプローブ上に存在し得るか、または検出は、各プローブが検出可能なシグナルを生じる化合物で標識されているプローブの混合物の使用に頼り得る（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照されたい）。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに付着させることができるが、いくつかの実施形態では、標識は共有結合的に付着させる。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、例えばアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物などの付着された化学発光標識を有し（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号を参照されたい）、これは、典型的な変形において、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに付着される（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、および同第５，６３９，６０４号を参照されたい）。
【０１２６】
本開示による検出プローブオリゴマーは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含み得る。いくつかの用途において、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブは、検出前にハイブリダイズしていないプローブの除去を最初に必要とせずに試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を容易にするために望ましい。そのような検出プローブの具体的な実施形態は、例えば、一般にヘアピンと呼ばれる立体配座のような、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体配座を形成するプローブを含む。特に好適なヘアピンプローブは、「分子トーチ」（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および第６，３６１，９４５号を参照されたい）および「分子ビーコン」（例えば、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、前出、米国特許第５，１１８，８０１および米国特許第５，３１２，７２８号、上記を参照されたい）を含む。さらに他の実施形態では、検出プローブは、分子内結合によって保持される立体配座を実質的に形成しない線状オリゴマーである。
【０１２７】
例として、「分子ビーコン」と呼ばれる構造は、標的相補配列、標的核酸配列の非存在下で閉じた立体配座にプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）を有する核酸分子、およびプローブが閉じた立体配座にあるときに相互作用するラベルペアを含む。標的核酸と標的相補的配列とのハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによってプローブを開放立体配座にシフトさせる。開放型立体配座へのシフトは、例えば、フルオロフォアと消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）であり得る標識対の相互作用の減少により検出可能である。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号に十分に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＨＣＶ特異的核酸配列を検出するのに有用な分子ビーコンは、本明細書に開示されるプローブ（例えば、標的ハイブリダイズ）配列の１つのいずれかの末端にフルオロフォアを含む第１の核酸アームおよび消光剤部分を含む第２の核酸アームを付加することによって作り出され得る。この構成では、本明細書に開示されるＨＣＶ特異的プローブ配列は、得られる分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分として働き、一方、プローブの自己相補的「アーム」はプローブの「ステム」部分を表す。
【０１２８】
本開示と併せて使用され得る自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般に「分子トーチ」と呼ばれる（時には単にトーチと呼ばれる）構造である。これらの自己報告プローブは、結合領域（例えば、−（ＣＨ２）９−リンカー）によって接続され、そして所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の異なる領域（造形された「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含むように設計されている。適切な標的または変性条件に曝されると、分子トーチの２つの相補的領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）が融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復したときに標的結合ドメインが標的配列へのハイブリダイゼーションに利用可能になる。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリダイゼーションを促進するように設計されている。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズするときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズするときには異なるシグナルが生成されるように配置された相互作用標識（例えば、蛍光／消光剤）を含み、それにより、それに関連する実行可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖を検出することができる。分子トーチは、米国特許第６，３６１，９４５号に十分に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
いくつかの実施形態における分子トーチおよび分子ビーコンは、相互作用可能な対の検出可能な標識で標識されている。相互作用可能な対の標識のメンバーである検出可能な標識の例には、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー移動メカニズムによって互いに相互作用するものが含まれる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、熱エネルギーへの変換なくおよび供与体および受容体が動的衝突を起こすことなく、原子間距離よりもかなり長い距離にわたる、発色団間の共鳴相互作用による、吸収部位からその分子または分子系におけるその利用部位へのエネルギー量子の無放射伝達を含む。「供与体」は最初にエネルギーを吸収する部分であり、そして「受容体」はその後エネルギーが伝達される部分である。ＦＲＥＴに加えて、励起エネルギーを供与体から受容体分子に伝達することができる少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー転移プロセスがある。
【０１３０】
２つの標識が十分に接近して保持されて、１つの標識によって発せられたエネルギーが第２の標識によって受け取られるかまたは吸収されることができる場合、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴメカニズムによって２つの標識は互いに「エネルギー伝達関係」にあると言われている。これは、例えば、分子二重標識がステム二本鎖の形成によって閉状態に維持され、そしてプローブの一方のアームに結合した発蛍光団からの蛍光発光が反対側のアーム上の消光部分によって消光される場合である。
【０１３１】
開示された分子トーチおよび分子ビーコンのための例示的な標識部分には、発蛍光団および蛍光消光特性を有する第二の部分（すなわち、「消光剤」）が含まれる。この実施形態では、特性シグナルは特定の波長の蛍光である可能性が高いが、あるいは可視光シグナルでもよい。蛍光が関与する場合、発光の変化は、いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴによるものか、または放射エネルギー移動もしくは非ＦＲＥＴモードによるものである。閉状態の一対の相互作用標識を有する分子ビーコンが適切な周波数の光によって刺激されると、非常に低い可能性がある第１のレベルで蛍光シグナルが生成される。この同じプローブが開放状態にあり、適切な周波数の光によって刺激されると、フルオロフォア部分と消光剤部分とは互いに十分に分離され、それらの間のエネルギー移動は実質的に排除される。その条件下では、消光剤部分は発蛍光団部分からの蛍光を消光することができない。発蛍光団が適切な波長の光エネルギーによって刺激されると、第一のレベルより高い第二のレベルの蛍光シグナルが発生する。２つの蛍光レベル間の差は、検出可能かつ測定可能である。このようにフルオロフォアおよび消光剤部分を使用すると、分子ビーコンは「開放」立体配座において「オン」になるだけであり、プローブが容易に検出可能なシグナルを発することによって標的に結合することを示す。プローブの立体配座状態は、標識部分間の相互作用を調節することによってプローブから発生したシグナルを変える。
【０１３２】
本開示に関連して使用され得る供与体／受容体標識対の例は、ＦＲＥＴを非ＦＲＥＴ対と区別することを試みることなく、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７染料が含まれる。当業者であれば、供与体色素と受容体色素が異なる場合、受容体の増感蛍光の出現または供与体蛍光の消光によってエネルギー移動を検出できることを理解するであろう。供与体種と受容体種が同じ場合、エネルギーは結果として生じる蛍光偏光解消によって検出することができる。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ７染料などの非蛍光受容体は、直接（すなわち、非増感）受容体励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。供与体−受容体対の一方のメンバーとして使用することができる例示的なフルオロフォア部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えば、ＣＹ５）が含まれる。与体−受容体対の他のメンバーとして使用することができる例示的な消光剤部分には、ＤＡＢＣＹＬおよびＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分が含まれる。
【０１３３】
核酸ポリメラーゼによって伸長されることを意図しないオリゴマー、例えばプローブオリゴマーおよび捕獲オリゴマーは、増幅反応においてオリゴマーの酵素媒介伸長を防ぐために３’ＯＨを置換するブロッカー基を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において増幅中に存在するブロック化増幅オリゴマーおよび／または検出プローブは、官能性３’ＯＨを有さず、その代わりに３’末端またはその近くに位置する１つ以上のブロッキング基を含む。３’末端近くのブロッキング基は、いくつかの実施形態では３’末端から５残基以内であり、ポリメラーゼのオリゴマーへの結合を制限するのに十分に大きく、他の実施形態は３’末端に共有結合したブロッキング基を含む。多くの異なる化学基、例えばアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンが３’末端をブロックするために使用され得る。
【０１３４】
長さおよび塩基組成の異なるオリゴヌクレオチドプローブをＨＣＶ核酸の検出に使用することができるが、本開示におけるプローブのいくつかの実施形態は、長さ１０〜６０塩基、または長さ１４〜５０塩基、または長さ１５〜３０塩基である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の８８または８９位、例えば８８〜８９、８７〜９０、８６〜９１、８５〜９２、８４〜９３、８３〜９４、８２〜９５、または８１〜９６位を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号１３に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、プローブオリゴマーは、配列番号２１６の１〜１９位の配列、または配列番号２１７の１〜１９位の配列、またはそれらに対して最大１もしくは２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号１２に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号２１６もしくは２１７の配列、またはそれに対して最大１もしくは２のミスマッチを有する配列を含む。その配列に関するものも含めて、プローブオリゴマーの様々な実施形態が上記の要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの捕獲オリゴマーが提供される。捕獲オリゴマーは、ＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列、例えば１０〜６０塩基長、または１４〜５０塩基長、または１５〜３０塩基長を含む。標的ハイブリダイズ配列は、固定化プローブに結合する配列または部分、例えばビーズなどの固体基質に結合したオリゴマーに共有結合している。
【０１３７】
より具体的な実施形態では、捕獲プローブオリゴマーは、ＨＣＶ標的配列に相補的ではないが固定化結合パートナー（例えば、固定化プローブ）の配列に特異的にハイブリダイズするテール部分（例えば、３’テール）を含み、例えば参照により本明細書に組み込まれる、例えば米国特許第６，１１０，６７８号に既に記載されているように、それにより標的核酸を他の試料成分から分離することを可能にする部分として働く。任意の配列をテール領域に使用することができ、これは一般に長さ約５〜５０ｎｔであり、特定の実施形態は少なくとも約１０ｎｔ、例えば約１０〜４０ｎｔ（例：Ａ１０〜Ａ４０）、例えば約１４〜３３ｎｔ（例：Ａ１４〜Ａ３０またはＴ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーテール（「ポリ−Ｎ配列」）を含み、これは、固体支持体、例えばマトリックスまたは粒子に付着した相補的固定化配列（例えば、ポリ−Ｔ）に結合する。例えば、３’テールを含む捕獲プローブの特定の実施形態では、捕獲プローブは配列番号１６または１７から選択される配列を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、第１の捕獲オリゴマーが提供される。いくつかの実施形態では、第１の捕獲オリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の３０７位、例えば３０６〜３０８、３０５〜３０９、３０４〜３１０、３０３〜３１１、３０２〜３１２、３０１〜３１３、３００〜３１４、２９９〜３１５、または２９８〜３１６位を含む。いくつかの実施形態において、第１の捕獲オリゴマーは、配列番号５４に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の捕獲オリゴマーは、配列番号１６に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の捕獲オリゴマーは、配列番号１６１〜１６５のうちの１つの１〜１９位に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。その配列に関しても含めて、第１の捕獲オリゴマーの様々な実施形態が上記の要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、第１の捕獲オリゴマーとは異なる第２の捕獲オリゴマーが提供される。いくつかの実施形態では、第２の捕獲オリゴマーの標的配列は、配列番号７５などのＨＣＶゲノム核酸の３３５位または３３６位、例えば３３５〜３３６、３３４〜３３７、３３３〜３３８位、３３２〜３３９、３３１〜３４０、３３０〜３４１、３２９〜３４２、３２８〜３４３、または３２７〜３４４位などを含む。いくつかの実施形態において、第２の捕獲オリゴマーは、配列番号５５に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の捕獲オリゴマーは、配列番号１７に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の捕獲オリゴマーは、配列番号１６１〜１６５のうちの１つの１〜１９位に対して最大１または２のミスマッチを有する配列を含む。その配列に関しても含めて、第２の捕獲オリゴマーの様々な実施形態が上記要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１４０】
その配列に関しても含めて、第２の捕獲オリゴマーの様々な実施形態が上記要約に開示されており、それらのいずれも、この節で上述した特徴と実行可能な範囲で組み合わせることができる。
【０１４１】
例えば、条件が増幅に適していることを立証することによって陰性結果が有効であることを確認するために、内部対照オリゴマーを提供することができる。例示的な対照標的捕獲オリゴマーは配列番号１５である。例示的な対照増幅オリゴマーは、配列番号１８および１９である。例示的な対照プローブオリゴマーは配列番号２０である。対照増幅オリゴマーによって増幅することができる対照鋳型も提供することができる。対照テンプレートは既知のプロトコルに従って調製することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７８５，８４４号を参照すれば、これはＨＩＶ−１配列の一部を含むインビトロで合成された転写物および内部対照プローブによって標的化される特有の配列からなる内部対照を記載する。
【０１４２】
本開示の特定の態様では、試料中のＨＣＶの有無を判定するため、またはＨＣＶを定量するために、少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせが提供される。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせは、例えば、配列番号１、７５の配列を有するＨＣＶ標的核酸、表５で言及されるＨＣＶ株、配列番号６３〜７４のいずれかのＨＣＶ由来の配列、または実施例１０に記載のＨＣＶ構築物、の標的領域を増幅するのに適した少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む。そのような実施形態では、少なくとも１つの増幅オリゴマーはセンス配向（「センスＴＨＳ」）の標的ハイブリダイズ配列を含み、少なくとも１つの増幅オリゴマーはアンチセンス配向（「アンチセンスＴＨＳ」）の標的ハイブリダイズ配列を含み、センスＴＨＳおよびアンチセンスＴＨＳはそれぞれ、ＨＣＶ配列内の標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されている。標的ハイブリダイズ配列は、アンチセンスＴＨＳによって標的化されたＨＣＶ配列がセンスＴＨＳによって標的化されたＨＣＶ配列の下流に位置するように選択される（すなわち、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、それらが増幅されるべき標的領域に隣接するように配置される。）。
【０１４３】
オリゴマーは、様々な組み合わせ（例えば、キットまたは組成物）で提供することができ、例えば、２、３、４、５、６、または７個の第１の増幅オリゴマー、第２の増幅オリゴマー、第３の増幅オリゴマー、初期増幅オリゴマー、プローブオリゴマー、第１の捕獲オリゴマー、および第２の捕獲オリゴマー、例えば初期増幅オリゴマーおよび少なくとも１つの捕獲オリゴマー、任意に初期増幅オリゴマーをさらに含む、第１の捕獲オリゴマーおよび第２の捕獲オリゴマー；任意にプローブオリゴマーをさらに含む、第１の増幅オリゴマーおよび第３の増幅オリゴマー；任意にプローブオリゴマーをさらに含む、第１、第２、および第３の増幅オリゴマー；任意にプローブオリゴマーをさらに含む、初期増幅オリゴマー、少なくとも１つの捕獲オリゴマー、第１の増幅オリゴマー、および第３の増幅オリゴマー；任意にプローブオリゴマーをさらに含む、初期増幅オリゴマー、第１の捕獲オリゴマー、第２の捕獲オリゴマー、第１の増幅オリゴマー、および第３の増幅オリゴマー；任意にプローブオリゴマーをさらに含む、初期増幅オリゴマー、少なくとも１つの捕獲オリゴマー、第１の増幅オリゴマー、第２の増幅オリゴマー、および第３の増幅オリゴマー；あるいは、任意にプローブオリゴマーをさらに含む、初期増幅オリゴマー、第１の捕獲オリゴマー、第２の捕獲オリゴマー、第１の増幅オリゴマー、第２の増幅オリゴマー、および第３の増幅オリゴマー、を含む。組み合わせは、対照オリゴマーまたはそれらの組み合わせ、例えば、２つの対照ＡＯ、対照標的捕獲オリゴマー、および／または対照プローブオリゴマーをさらに含み得る。いくつかの態様において、第１および第２のＡＯの両方が存在する。いくつかの実施形態では、初期ＡＯと第３のＡＯの両方が存在する。いくつかの実施形態では、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーの両方が存在し、ここで、初期増幅オリゴマーおよびプローブオリゴマーは、ＨＣＶ核酸中の少なくとも５、１０、または１５の共通位置などの少なくとも１つの共通位置にアニールする。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、組み合わせは、対照オリゴマーを含まず、８、７、６、または５を超える異なるオリゴマーを含まない。そのような実施形態では、誤った組み込み、二重組み込み、省略、またはオリゴマー合成中の他の誤りから生じ得るような、微量（例えば、変異体に最も類似した配列を有するオリゴマーなどの主要なオリゴマー種に対して約１５モル％以下または約１０モル％以下）で存在する変異体は、異なるオリゴマーとは見なされない。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、オリゴマーの組み合わせは、以下の実施例のいずれかに記載されるように、または実施例に記載される個々の反応において提供される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、例えばキットまたは組成物中のオリゴマーの組合せは、少なくとも３、４、５または６つのＨＣＶ遺伝子型（例えば、１ａ型、１ｂ型、２ｂ型、３ａ型、３ｂ型、４ｈ型、５ａ型、６ａ型）の核酸に、任意には試料中に存在すると疑われる他の、非ＨＣＶ核酸（例えば、他の血液媒介病原体）への最小限の交差反応性で、特異的にハイブリダイズするように構成される。特定の変形形態では、本開示の組成物はさらに、前述の種類の５’ＵＴＲとは異なり、例えば少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、．３５、４０、４５、または配列番号１６６〜２１３もしくは２１４の配列を含む全てのＨＣＶ株（例えば表５に列記された菌株）の、ＨＣＶ配列の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせを使用して、１ｌｏｇのＨＣＶ  １ａの範囲内でそのような株を定量することができる。いくつかの実施形態では、オリゴマーの組み合わせを使用して、０．５ｌｏｇのＨＣＶ  １ａの範囲内のそのような株を定量することができる。いくつかの態様では、本開示の組成物は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ＨＩＶ、パルボウイルス、風疹、デング熱２、デング熱３、デング熱４、エプスタイン−バー、および西ナイルウイルスのうちの１以上、またはすべてに対して最小の交差反応性でＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つ以上の、またはすべてのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｐ．ａｃｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに最小限の交差反応性で、ＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成されている。一態様では、本開示の組成物は、これらの生物のうちの１つ以上を検出するための構成要素および方法をさらに含む多重システムの一部である。
【０１４７】
本開示によってまた提供されるのは、試料中のＨＣＶ標的核酸の存在または非存在を決定するため、またはその量を定量するための反応混合物である。本開示による反応混合物は、少なくとも以下のうちの１つ以上を含む：ＨＣＶ標的核酸の増幅のための本明細書に記載のオリゴマーの組み合わせ、ＨＣＶ標的核酸を精製するための本明細書に記載の捕獲プローブオリゴマー、ＨＣＶ増幅産物の有無を判定するための本明細書に記載の検出プローブオリゴマー、ＨＣＶ標的核酸を検出するためのアッセイの感度を離調させるための、本明細書に記載のプローブ保護オリゴマー。いくつかの実施形態では、上記の任意のオリゴマーの組み合わせが反応混合物中に存在する。反応混合物は、例えば捕獲プローブ核酸のアレイなどの多数の任意成分をさらに含んでもよい。増幅反応混合物については、反応混合物は典型的には、例えば緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）などのインビトロ増幅を実施するのに適した他の試薬、および／または酵素（例えば、逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼ）を含み、典型的には試験サンプル成分を含み、その中にＨＣＶ標的核酸が存在してもしなくてもよい。さらに、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含む反応混合物については、反応混合物のための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は共通の標的領域によって連結される（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう。）。
【０１４８】
本開示によってまた提供されるのは、本明細書に記載の方法を実施するためのキットである。本開示によるキットは少なくとも以下のうちの１つ以上を含む：ＨＣＶ標的核酸の増幅のための本明細書に記載の増幅オリゴマーの組み合わせ、ＨＣＶ標的核酸を精製するための本明細書に記載の捕獲プローブオリゴマー、ＨＣＶ増幅産物の有無を判定するための本明細書に記載の検出プローブオリゴマー、およびＨＣＶ標的核酸を検出するためのアッセイの感度を離調させるための、本明細書に記載のプローブ保護オリゴマー。いくつかの実施形態では、上記の任意のオリゴマーの組み合わせがキット中に存在する。キットは、例えば捕獲プローブ核酸のアレイなどのいくつかの任意成分をさらに含み得る。キット中に存在し得る他の試薬には、例えば緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、および／または酵素（例えば、逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼ）などのインビトロ増幅を行うのに適した試薬が含まれる。本明細書に記載のオリゴマーは様々な異なる実施形態で包装することができ、当業者は本開示が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。例えば、キットは、ＨＣＶゲノムの１つの標的領域のみのための増幅オリゴマーを含み得るか、またはそれは複数のＨＣＶ標的領域のための増幅オリゴマーを含み得る。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含むキットについては、キットのための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結される（すなわち、キットは、キットの増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。特定の実施形態において、キットは、本開示による方法を実施するための一組の使用説明書をさらに含み、使用説明書は、添付文書および／またはキットもしくはその構成要素の包装に関連し得る。
【０１４９】
Ｃ．方法および使用
本明細書に開示するいかなる方法も、本方法の目的に差し向けられた本方法に関与する材料の対応する使用の開示としても理解されることになっている。ＨＣＶ配列を含むオリゴマーのうちのいかなるもの、およびこのようなオリゴマーを含むいかなる組み合わせ（例えば、キットおよび組成物）も、ＨＣＶを検出または定量する上での使用のために、およびＨＣＶを検出または定量するための組成物の調製における使用のために、開示されもするものとして理解されることになっている。
【０１５０】
大まかにいえば、方法は、次の構成要素、すなわち、ＨＣＶ核酸が捕獲オリゴマーおよび場合により初期増幅オリゴマーへアニールされた標的捕獲体、標的オリゴマーと会合していない材料を除去するための単離、例えば、洗浄、線形増幅、指数関数的増幅、ならびに指数関数的増幅とともにリアルタイムで実施され得るアンプリコン検出、例えば、アンプリコン定量、のうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態は、上述のステップの各々を包含する。ある特定の実施形態は、線形増幅を伴わない指数関数的増幅を包含する。ある特定の実施形態は、洗浄、単離、および線形増幅を包含する。ある特定の実施形態は、指数関数的増幅およびアンプリコン検出を包含する。ある特定の実施形態は、先に列挙した構成要素のうちのいずれか２つを包含する。ある特定の実施形態は、直上に列挙したいずれか２つの構成要素、例えば、洗浄および線形増幅、または線形増幅および指数関数的増幅を包含する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、増幅は、ＨＣＶ標的核酸に対応するＨＣＶ核酸標的領域を増幅するために核酸試料を少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、先に説明したような少なくとも２つの増幅オリゴマー（例えば、指数関数的増幅のために、センス方向に向けられた１つ以上、およびアンチセンス方向に向けられた１つ以上）を含む、接触させることと、（２）試料中に存在する何らかのＨＣＶ標的核酸が、増幅産物を生成するための鋳型として使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施することと、（３）増幅産物の有無を検出し、それにより試料中のＨＶＣの有無を決定すること、または試料中のＨＣＶ核酸の量を定量することと、を含む。
【０１５２】
本開示に従った検出方法は、当該方法のその後のステップへ供されることになっている試料を得るステップをさらに含むことができる。ある特定の実施形態において、使用することになっている試料「を得ること」は、例えば、当該方法のうちの１つ以上のステップが実施される検査施設または他の場所で試料を受領すること、および／または当該方法のうちの１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、貯蔵施設または他の保管所から）試料を検索することを含む。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、当該方法は、ＨＣＶ標的核酸を試料中の他の成分から、例えば、捕獲ステップの前のような増幅前に精製することをさらに含む。このような精製は、試料中に含有される生体を分離および／もしくは濃縮する方法、または非核酸試料成分、例えば、タンパク質、炭水化物、塩、脂質などを除去もしくは分解する方法を含んでもよい。いくつかの実施形態において、試料中のＤＮＡは、例えば、ＤＮアーゼを用いて、場合により、ＤＮアーゼを除去もしくは失活させること、または分解したＤＮＡを除去することを用いて分解される。
【０１５４】
特定の実施形態において、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕獲して、標的核酸を他の試料構成要素から特異的にまたは非特異的に分離することを含む。非特異的標的捕獲法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他の試料構成要素を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、またはＨＣＶ核酸および他の試料構成要素を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を包含してもよい。
【０１５５】
標的捕獲は典型的には、ハイブリダイズ条件下で、通常、尾部配列：固定したプローブ配列の二本鎖のＴｍよりも高い温度で、ＨＣＶ標的配列に特異的にハイブリダイズする１つ以上の捕獲プローブオリゴマーを含有する液相混合物中で生じる。捕獲プローブ尾部を含む実施形態については、捕獲プローブ尾部が固定プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイズ条件を調整することによって、ＨＣＶ標的：捕獲プローブ複合体を捕獲する。ある特定の実施形態は、常磁性ビーズのような、粒子状固体支持体を用いる。
【０１５６】
単離は捕獲の後に続くことができ、ここで、固体支持体上の複合体は、他の試料構成要素から分離される。単離は、何らかの適切な技術、例えば、ＨＣＶ標的配列と会合した支持体を１回以上（例えば、２回または３回）洗浄して、他の試料構成要素および／または会合していないオリゴマーを除去することによって達成することができる。常磁性ビーズのような粒子状固体支持体を用いる実施形態において、ＨＣＶ−標的と会合した粒子は、洗浄溶液中で懸濁され、いくつかの実施形態において磁力を用いることによって、洗浄溶液から回収されてもよい。取り扱いステップ数を制限するために、ＨＣＶ標的核酸は、支持体上の複合体におけるＨＣＶ標的配列を増幅オリゴマーと単純に混合して、増幅ステップへと進行することによって増幅されることがある。
【０１５７】
線形増幅は、例えば、標的核酸配列を、標的核酸配列の線形増幅を支持し、その指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１つの構成要素を欠失する第１の相の増幅反応混合物と接触させることによって実施することができる。いくつかの実施形態において、第１の相の増幅反応混合物は、逆転写酵素、ポリメラーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される増幅酵素を含む。ポリメラーゼは、典型的にはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、第１の相の増幅反応混合物はさらに、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）ＨまたはＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素のようなＲＮアーゼを含む。いくつかの実施形態において、第１の相の増幅混合物は、ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、第１の相の増幅混合物は、増幅オリゴヌクレオチドも含むことがある。増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼについての５’プロモーター配列、および／またはその酵素的伸長を防止する遮断された３’末端を含むことができる。さらに、第１の相の増幅混合物は、時には、所望の終点を超えた標的核酸配列の酵素的伸長を防止するための遮断性オリゴヌクレオチドを含むことがある。
【０１５９】
先に記載のとおり、第１の相の増幅反応のカギとなる特色は、指数関数的増幅反応を支持するその不能性であり、その理由は、指数関数的増幅に必要とされる１つ以上の構成要素が欠失しているか、および／または指数関数的増幅を阻害する作用因子が存在しているか、および／または反応混合物の温度が指数関数的増幅に対して伝導していない、などである。制限なしで、指数関数的増幅に必要とされる欠失している構成要素および／または阻害因子および／または反応条件は、次の群、すなわち、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリメラーゼについての５’プロモーター配列、非プロモーター増幅オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む増幅オリゴヌクレオチド）、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、切断酵素、ＲＮアーゼ、ホスホリラーゼ、グリコシラーゼなど）、酵素補助因子、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、塩、緩衝液、酵素阻害薬、遮断性オリゴヌクレオチド、ｐＨ、温度、塩濃度およびこれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの場合、欠失する構成要素は、第１の相の反応において存在する指数関数的増幅の阻害因子の効果を逆転させる作用因子のように、間接的に関与し得る。
【０１６０】
ＨＣＶ標的配列を指数関数的に増幅することは、増幅されることになっている標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴマーを用いるインビトロ増幅反応を利用する。いくつかの実施形態において、先に説明したような第１および第２の増幅オリゴマーは、順方向の向きで提供され、第３の増幅オリゴマーは、逆方向の向きで提供される。特定の実施形態において、増幅されることになっている標的領域は、ヌクレオチド位置７９を含む配列番号７５の領域、例えば、約位置７４〜８４、６９〜８９、６４〜９４、５９〜９９、５９〜１０９、または５２〜１１９（増幅産物へと組み込まれるオリゴマー配列を含む）に実質的に相当する。これらの標的領域の増幅に特に適した増幅オリゴマーの組み合わせは、先に説明されている。適切な増幅方法は、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅または転写関連増幅（ＴＭＡ）を含む。
【０１６１】
例えば、ＴＭＡ増幅を使用するいくつかの増幅方法は、次のステップを含む。簡潔には、増幅されることになっている配列を含有する標的核酸は、一本鎖の核酸（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡのようなｓｓＲＮＡ）として提供される。当業者は、代替的に、ＤＮＡがＴＭＡにおいて使用されることができることを認識するであろうし、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の従来の融解は、一本鎖標的核酸を提供するために使用してもよい。プロモータープライマー（例えば、先に説明したようなプロモーターを含む第３の増幅オリゴマー）は、その標的配列において標的核酸へ特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を伸長して、ｃＤＮＡ伸長産物を創出し、ｓｓＲＮＡが元の鋳型であった場合、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を結果的に生じる。ＲＮアーゼは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を消化し、第２のプライマーは、プロモータープライマーの末端から下流のｃＤＮＡ鎖に位置するその標的配列へ特異的に結合する。ＲＴは、第１のｃＤＮＡ鋳型を用いて他のプライマーの３’末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して機能的プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを創出する。次に、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、反応において初期標的鎖の約１００〜１０００増幅コピー（「アンプリコン」）であるＲＮＡ転写産物を生成する。増幅は、他のプライマーがアンプリコンの各々におけるその標的配列へ特異的に結合するときに続行し、ＲＴはアンプリコンＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを創出して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を生成する。反応混合物中のＲＮアーゼは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーは、新たに合成されたＤＮＡにおけるその相補的配列へ特異的に結合する。ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端を伸長して、機能的プロモーターを含有するｄｓＤＮＡを創出し、当該ｄｓＤＮＡへＲＮＡポリメラーゼが結合して、標的鎖と相補的なさらなるアンプリコンを転写する。より多数のアンプリコンコピーを作製する自己触媒周期は、試料中に存在する標的核酸が結果的に約１０億倍増幅する反応の経過中に反復する。増幅産物は、増幅中に、または増幅反応の終了時に、増幅産物中に含有される標的配列へ特異的に結合するプローブを用いることによってリアルタイムで検出され得る。結合したプローブから結果的に生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、方法は、「逆」ＴＭＡ反応を利用する。このような変法において、開始または「順方向」増幅オリゴマーは、標的領域の３’末端の近傍で標的核酸にハイブリダイズするプライミング性オリゴヌクレオチドである。逆転写酵素（ＲＴ）は、標的核酸を鋳型として用いてプライマーの３’末端を伸長することによって、ｃＤＮＡ鎖を合成する。その他のまたは「逆方向」増幅オリゴマーは、合成されたｃＤＮＡ鎖内に含有される標的配列にハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を有するプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第２の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、ＲＴは、ｃＤＮＡ鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を伸長して、標的配列鎖の第２のｃＤＮＡコピーを創出し、それにより機能的プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを創出する。次に、増幅は、前段落においてＲＮＡポリメラーゼを利用するプロモーター配列からの転写の開始について本質的に先に説明したとおり続行する。あるいは、第２の増幅オリゴマーがプロモータープロバイダーである場合、標的領域の５’末端の近傍にある標的配列にハイブリダイズする終止オリゴヌクレオチドは、終止オリゴヌクレオチドの３’末端でプライミング性オリゴマーの伸長を終止するよう典型的に利用され、それにより、プライミング性オリゴマーからの伸長によって合成した初期ｃＤＮＡ鎖について定義された３’末端を提供する。プロモータープロバイダーの標的ハイブリダイズ配列は次に、初期ｃＤＮＡ鎖の定義された３’末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡ鎖の３’末端を、プロモータープロバイダーのプロモーター配列と相補的な配列を付加するよう伸長して、結果的に二本鎖プロモーター配列の形成を生じる。次に、初期ｃＤＮＡ鎖を鋳型として用いて、プロモーター部分を含んでいない、初期ｃＤＮＡ鎖と相補的な複数のＲＮＡ転写産物を、二本鎖プロモーターを認識してそこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて転写する。これらのＲＮＡ転写産物の各々は次に、第１のプライミング性増幅オリゴマーからのさらなる増幅のための鋳型として役立つよう利用可能である。
【０１６３】
検出ステップは、種々の公知の技術のうちのいずれかを用いて実施され、例えば、増幅産物を、標識した検出プローブにハイブリダイズして、標識したプローブから結果的に生じるシグナルを検出することなどによって、増幅した標的配列と特異的に会合したシグナルを検出し得る。検出ステップは、例えば、その核酸塩基配列の全部または一部など、増幅した配列に関するさらなる情報も提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施され得、または標的領域を例えばリアルタイムで増幅することと同時に実施され得る。一実施形態において、検出ステップは、均一な検出、例えば、ハイブリダイズしていないプローブの混合物からの除去なしでの、ハイブリダイズしたプローブの検出を可能にする（例えば、各々が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第５，６３９，６０４号および第５，２８３，１７４号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、核酸は、検出可能な電荷など、物理的変化を結果として生じる表面と会合している。増幅した核酸は、当該核酸をマトリックス中もしくはマトリックス上で濃縮して、核酸もしくは当該核酸と会合した色素（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出することによって、または液相中の核酸と会合した色素の増加を検出することによって検出されてもよい。他の検出方法は、増幅した産物中の配列と特異的にハイブリダイズして、プローブ：生成物複合体の存在を検出するように、または増幅産物と会合した検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによって、構成された核酸検出プローブを用いてもよい（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４２４，４１３号、第５，４５１，５０３号、および第５，８４９，４８１号）。増幅した産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識したプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。特に、増幅した産物は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ中の標的配列またはＨＣＶゲノムＲＮＡ中の配列と相補的な標的配列を含有するであろうし、プローブは、検査した試料中のＨＣＶ核酸の存在を示すために、増幅した産物中に含有される配列へ直接的にまたは間接的に結合するであろう。
【０１６４】
増幅ステップの終了近くまたは終了時に増幅した産物を検出する実施形態において、線形検出プローブは、増幅した産物とのプローブのハイブリダイゼーションを示すためにシグナルを提供するよう使用されてもよい。このような検出の１例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識したプローブを用いる。次に、発光標識を、ハイブリダイズしていないプローブから加水分解する。検出は、ルミノメーターを用いて化学発光によって実施される。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ８９／００２４７６号を参照されたい）。リアルタイム検出を用いる他の実施形態において、検出プローブは、例えば、プローブが、増幅した産物へ結合するときに検出されるレポーター部分で標識された分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブのようなヘアピンプローブであってもよい。このようなプローブは、標的にハイブリダイズする配列と、標的にハイブリダイズしない配列とを含み得る。このようなプローブの種々の形態は、すでに説明されている（例えば、参照により本明細書に各々組み込みまれる米国特許第５，１１８，８０１号、第５，３１２，７２８号、第５，９２５，５１７号、第６，１５０，０９７号、第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号、および第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６００６８４１７Ａ１号および第２００６０１９４２４０Ａ１号を参照されたい）。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、分子トーチ（単にトーチとも時に称する）が検出に使用される。いくつかの実施形態において、トーチは、先に開示したようなプローブオリゴマーである。
【０１６６】
概して、開示された方法は、分析物ポリヌクレオチドの増幅前の量と、分析物アンプリコンの増幅後の量とに関する標準曲線を考慮に入れるステップを包含することができる。
【０１６７】
リアルタイム増幅反応は、反応に入力される分析物ポリヌクレオチドの数と時間の関数として合成される分析物アンプリコンの数との間の定量的な関連性を有利に特色とするので、検査試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの数は、標準曲線を用いて決定することができる。例えば、既知の量のポリヌクレオチド標準曲線を含有する複数の増幅反応は、未知数の分析物ポリヌクレオチドを含有する検査試料を用いて調製された増幅反応と並行して実行することができる。あるいは、標準曲線は、分析手順が実施される各時間の曲線を準備することが不必要であるよう、事前に準備することができる。事前に準備したこのような曲線は、検査機器の記憶装置に電子的に記憶することさえできる。第１の軸上のポリヌクレオチド標準物質の増幅前の量と、第２の軸上の核酸増幅のある特定のレベル（背景シグナルを上回る出現の時間など）をもたらすのに必要とされる時間のいくつかの兆候とを有する標準曲線を次に準備する。検査反応のために測定される分析物アンプリコンの増幅後の量は次に、標準曲線の増幅後の軸上に位置する。曲線の他の軸上の対応する値は、検査反応において存在した分析物ポリヌクレオチドの増幅前の量を表す。したがって、検査試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの分子の数を決定することは、標準曲線を考慮に入れることによって、より詳細には、通常レベルの当業者になじみがあるであろう手順である、検査試料について得られた定量的な結果を標準曲線と比較することによって達成される。
【０１６８】
本明細書に説明する手順は、検査試料中に存在する分析物ポリヌクレオチド（例えば、ＨＣＶ核酸）を定量するために容易に使用することができる。実際に、複数の標準的な対照増幅反応が既知数の分析物ポリヌクレオチド標準物質を用いて開始される場合、および未知数の分析物ポリヌクレオチド分子を含む検査反応が実施される場合、各反応におけるある特定のレベルの増幅をもたらすのに必要とされる時間を測定した後に、検査試料中に存在しなければならなかった分析物ポリヌクレオチド分子の数を決定することはできる。標準的な増幅反応へと入力される分析物ポリヌクレオチド分子の数と、ある特定のレベルの増幅をもたらすのに必要とされる時間との間の関連性は、グラフを用いて簡便に確立される。検査試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの数を決定することは単に、測定された分析物アンプリコンシグナル強度に対応する分析物ポリヌクレオチド分子の数を標準グラフから決定することである。このことは、分析物ポリヌクレオチド標準物質が、検査試料中に含有される分析物ポリヌクレオチドの増幅前の量を定量するために、ポリヌクレオチド増幅反応に関連してどのように用いることができるかを例証する。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、方法または使用は、場合により試料（例えば、他の血液由来の病原体）中にあると疑われる他の非ＨＣＶ核酸との最小限の交差反応性に、少なくとも３、４、５、または６のＨＣＶ遺伝子型（１ａ、１ｂ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａ、６ａ型）の実質的に等価の定量（例えば、１、０．５、または０．２５対数内）を提供することができる。ある特定の変化において、本開示の方法および使用は、上述の型、例えば、配列番号１６６〜２１３または２１４の配列を含む少なくとも１、２，３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または全部のＨＣＶ株（例えば、表５に列挙される株）の５’ＵＴＲから、ＨＣＶ遺伝子型１ａ（例えば、配列番号７５）まで変化するＨＣＶ配列の定量、例えば、実質的に等価の定量（例えば、１、０．５、または０．２５対数内）をさらに可能にする。いくつかの態様において、本開示の方法および使用は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ＨＩＶウイルス、パルボウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス２型、デング熱ウイルス３型、デング熱ウイルス４型、エプスタイン・バーウイルス、西ナイルウイルスのうちの１つ以上または全部との最小限の交差反応性を示す。いくつかの実施形態において、本開示の方法および使用は、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、スタフィロコッカス・ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のうちの１つ以上または全部に対する最小限の交差反応性を示す。一態様において、本開示の方法および使用は、上述のウイルスまたは微生物のうちの１つ以上を検出するための方法で多重になる。概して、最小限の交差反応性は、少なくとも約９５％の特異性、例えば、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％を示すものとして理解される。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例証するよう提供され、本開示の範囲をいかなる方法でも制限するものとして解釈されないことになっている。
【０１７１】
一般的な試薬および方法。別段の記載がない限り、増幅は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を用いた転写媒介増幅を等温で用いて実行した。標準的な転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，４９１号においてＫａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．によって本質的に説明されるように実施した。
二相性ＴＭＡは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１３９，８７０号において本質的に説明される通り実施した。概して、二相性手順において付加された最後のプライマーは、Ｔ７プライマー、または２つの異なるＴ７プライマー配列の組み合わせが使用される短めのＴ７プライマーとした。
【０１７２】
増幅反応は、Ｔ７プライマーおよび非Ｔ７プライマーの反応あたり約５〜１０ｐｍｏｌｅを用いて種々のプライマーの組み合わせについて実施した。
【０１７３】
検出には、５’−蛍光体（例えば、ＦＡＭまたはＲＯＸ）および３’−消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）を含有するプローブオリゴマーとして分子トーチを用いた（ＦＡＭおよびＤＡＢＣＹＬについては「５Ｆ３Ｄ」またはＲＯＸおよびＤＡＢＣＹＬについては「５Ｒ３Ｄ」）。トーチは、参照により組み込まれる米国特許第６，８４９，４１２号において詳細に考察されている。トーチは概して、−（ＣＨ２）９−リンカーを３’末端の近く（例えば、３’末端から５番目のヌクレオチドと６番目のヌクレオチドとの間、または４番目のヌクレオチドと５番目のヌクレオチドとの間）に含有していた。標的捕獲は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０３４，５５４号において本質的に説明されるとおり実施した。
【０１７４】
例示的な内部対照オリゴマーおよび鋳型は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７８５，８４４号において考察されている。
【０１７５】
実施例１−ＨＣＶ遺伝子型および例示的なオリゴマーのためのＨＣＶインビトロ転写産物
ＨＣＶの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を、遺伝子型にわたってＨＣＶを検出するためのアッセイ標的として選択した。この領域の保存された性質は、類似のプライマーおよび検出プローブを用いてＨＣＶの複数の遺伝子型を検出することができる遺伝子検査を可能にすると考えられた。５’−ＵＴＲの長さは、ＨＣＶ遺伝子型間で約９０％の相同性の３４１塩基長である。５’ＵＴＲは、ウイルスＲＮＡ複製に必要とされるが、翻訳に必須ではない。
【０１７６】
ＨＣＶ  １ａインビトロ転写産物（ＩＶＴ）を、９２６塩基の転写長およびＨＣＶ  １ａ  ５’−ＵＴＲ領域を含む８３７塩基対の相配列挿入長を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターを用いて生成した。このＩＶＴおよびその後のＩＶＴについての配列情報は、後述の配列表に示されている。
【０１７７】
ＨＣＶ  ２ｂ  ＩＶＴを元来、ＨＣＶ  ２ｂ  ５’−ＵＴＲの９９８塩基の転写長および約８５０塩基対の配列挿入長を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）へと配置した。
【０１７８】
ＨＣＶ  ３ａ臨床試料から作製した一定分量のＩＶＴストックを用いて、ＩＶＴをｃＤＮＡクローンへと逆転写し、これをＩＶＴ製造に適したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターへと挿入した。プラスミドインサートを配列決定し、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＣＶ  ＤＢ由来の配列と比較し、それにより当該クローンが公知のＨＣＶ  ３ａ遺伝子型配列と一致することを確認した。この新たなプラスミド由来のＩＶＴを、ＨＣＶ  ３ａの５’ＵＴＲ領域の大部分と５’コード領域とを含有する８６１塩基のＩＶＴを結果的に生じるＴ７プロモーターを用いて発生させた。ＩＶＴの３’領域が阻害構造（非表示）を形成していることを示唆する初期の実験に続いて、ＨＣＶ  ３ａＩＶＴがＨＣＶ３ｂ  ＩＶＴとより密接に対合するようＨＣＶ  ３ａＩＶＴから３’オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を除去した。
【０１７９】
ＨＣＶ  ３ａの新たな第２版ＩＶＴ（３ａＶ２）は、標的捕獲オリゴマーＨＣＶ０２９７（−）ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１６）に対する結合部位の直後からＯＲＦ開始位置の近くまでを除去して、結果的に最終長の３５１塩基を有するおよそ４００塩基短いＩＶＴを生じる３’ＩＶＴの終止部を有した。ＨＣＶ  ３ａＶ２の長さおよび領域は、３２２塩基のＨＣＶ３ｂＩＶＴ配列とより類似している。
【０１８０】
５２−７８（＋）非Ｔ７プライマーのちょうど５’の高ＧＣ領域を除去することによって、３ａ  Ｖ２  ＩＶＴとはわずかに異なるさらなる３ａ型第３版（３ａＶ３）を作製した。第Ｖ２版は、ＨＣＶ  ３ａの第Ｖ１版または第Ｖ３版よりもＨＣＶ３ｂ  ＩＶＴに対する良好な増幅および検出性能を示した。
【０１８１】
ＨＣＶ３ｂの５’−ＵＴＲのＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニングプラスミドへと挿入し、転写産物長が４２２塩基であるＳＰ６プロモーターをオフにした。その後、このインサートを３２５塩基対長のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミドへと転移させた。元のインサートは、元のＲＴ−ＰＣＲプライマーによって導入された突然変異を有していた。この突然変異を修正して、ＨＣＶ３ｂ遺伝子型配列についてＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＤＢと対合させた。
【０１８２】
長さ４２２塩基対のＨＣＶ  ４ｈインサート配列を元来、ＳＰ６プロモーターを含有するＴＯＰＯベクター内へと入れた。他のＩＶＴとより一致させるために、Ｔ７プロモーターを用いてインサートを、３２５塩基長のＩＶＴを有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミドへと移動させて、ＩＶＴを発生させた。
【０１８３】
生成した元のＴＯＰＯ  ＨＣＶ  ４ｈＩＶＴは、誤対合にもかかわらず、ＨＣＶ  １ａと比較して過剰定量している。Ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  （ＯＤ），  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ，  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＣＶ４ｈＩＶＴの光学密度（ＯＤ）、分子量、および配列を再確認し、正確であることを認めた。したがって、ＨＣＶ  １ａに対する過剰定量が４ｈＩＶＴ配列に対して本質的であると結論付けられた。この効果は、０．１５対数差未満である（非表示）。
【０１８４】
ＨＣＶ  ５ａ配列を元来、長さ４３５塩基対のＴＯＰＯクローンＩＤ１００００７内に入れ、ＩＶＴはＴ７  ＴＯＰＯプロモーターをオフにさせた。当該配列がＨＣＶ  ３ａ、３ｂ、４ｈおよび６ａと類似のＩＶＴ配列を有するであろうように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターへと移動させた。ＩＶＴのものを再度、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）Ｔ７プロモーターを用いて調製した。結果的に生じるＩＶＴ長のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（＋）プラスミドは、ＨＣＶ  ５ａの５’ＵＴＲ領域を用いて３２５塩基のＩＶＴを発生させる．
【０１８５】
ＨＣＶ  ６ａ配列を元来、４３８塩基対の塩基対長のＴＯＰＯクローンＩＤ１００００８へと入れ、Ｔ７プロモーターを用いて発生させた。Ｔ７プロモーターを用いて当該配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター内へと移動させ、ＩＶＴを発生させた。結果的に生じるＩＶＴ長のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターは、ＨＣＶ  ６ａの５’ＵＴＲ領域を用いて３２８塩基ＩＶＴを発生させる。
【０１８６】
選択されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＶＴ配列と例示的なオリゴマーとのアラインメントを図１に示す。
【０１８７】
実施例２−初期アッセイ設計
ＨＣＶ配列からアラインメントを創出し、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース（２００８）（ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）由来の配列を含む種々のＨＣＶ遺伝子型のうちの配列差を同定した。初期セットのオリゴマーを、５’末端から約塩基５０で開始する、遺伝子型のうちで約９０％相同である領域であるＣ型肝炎ウイルスポリタンパク質前駆体（ＨＣＶ−１）の５’ＵＴＲ領域を標的とするよう設計した。本明細書で説明するプライマー配列は、誤対合を有さないＨＣＶ−１ａ  ｍＲＮＡゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６２３２１）（配列番号７５）と整列させる。
【０１８８】
この元来のＨＣＶオリゴマーセットは、次の特徴を有していた（図１における丸囲み）。トーチ６８〜８６オリゴマーは、ＨＣＶ  ３ａ／ｂ型についての２つの誤対合を有しており、遺伝子型間で大きな違いを有する貧弱な増幅動態を有していた。非Ｔ７  ５０〜６６オリゴマーは、ＨＣＶ  ３ａ型において１つの誤対合を有しており、Ｔ７  ９５−１１９は、ＨＣＶ  ２ｂ、３ａ、および４ｈの各々において１つの誤対合を有している。元来のオリゴマーセットの検査由来の増幅曲線は図２に示しており、このオリゴマーセットを用いた異なるＨＣＶ遺伝子型の定量における差を明確に実証する。例えば、ＣＡＬ０２条件（１０２コピー／ｍｌ）の下で、ＨＣＶ  １ａは、ＣＡＬ０４条件（１０４コピー／ｍｌ）よりも約５分間遅れて増幅し、ＨＣＶ  ２ｂは、意味のある増幅をしなかったが、その他の検査した遺伝子型は、一致していない増幅動態を示した。
【０１８９】
実施例３−ＨＣＶ非Ｔ７プライマー選択
新たなオリゴマー設計を行った。プローブについて図１の左側の四角で囲んだ領域を含む代替的な領域を標的とし、これは、ＨＣＶ遺伝子型全部と対合した。非Ｔ７およびＴ７をこのプローブ領域の周りに設計した。高Ｃ鎖を含有するオリゴマー設計のための貧弱な領域を図１の一番右側の四角で囲んだ領域に示す。この領域におけるオリゴマーまたはこの領域にわたって増幅するオリゴマーは、増幅しなかったかまたは非常に貧弱な増幅を示した。
【０１９０】
非Ｔ７プライマーについての新たな配列を元来の配列と比較した。ＨＣＶ  １ａおよび３ａについてＨＣＶ  ＮＴ７  ５２〜７８と比較した遺伝子型１ａおよび３ａ（緑色および金色）を有する元来のＨＣＶ  ＮＴ７  ５０〜６６オリゴマーを用いた較正曲線は、ＮＴ７  ５２〜７８配列を用いることが、より迅速な出現時間を付与したことと、当該遺伝子型がより類似していることとを示した（図３における４つからなる小文字の群における線）。
【０１９１】
非Ｔ７プライマー設計に影響する配列の誤対合は主として、ＨＣＶ  ３ａ／３ｂ配列にある。ＨＣＶ  ３ａＩＶＴを用いて実施した実験において、標準的な転写媒介増幅（ＴＭＡ）遺伝子型１ａおよび３ａと対合するＨＣＶ５２〜７８  ＮＴ７配列の５０：５０の混合物である新たなトーチおよびＴ７  ＨＣＶ  ９３〜１１９（−）は、いずれかの５２〜７８  ＮＴ７配列単独よりも等しい定量を示した（図４Ａ〜図４Ｃ）。これらのオリゴマーをすべての遺伝子型で再検査した。
【０１９２】
ＨＣＶ遺伝子型をすべて、新たなオリゴマーＨＣＶ非Ｔ７  ５２〜７８ｔ（５’−ＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧ）（配列番号２１５）を含む異なる非Ｔ７プライマーで検査した。ＨＣＶ  ３ａは、ＨＣＶ非Ｔ７  ５２〜７８ｔ（のみ）で定量化された下にある  （図５Ａにおける矢印）のに対し、ＨＣＶ非Ｔ７  ５２〜７８ｔｇ（のみ）は、遺伝子型にわたる定量において類似性を示している（図５Ｂ）。ＨＣＶ  ５ａは、定量がわずかに過小評価されているが、この配列は、Ｔ７領域において２つの誤対合を有している。これらの実験は、ＨＣＶ  ４ｈ、５ａおよび６ａについてのＴＯＰＯ  ＩＶＴ配列を用いた。ＨＣＶ  ＮＴ７  ５２〜７８遺伝子型３ａ配列（「５２〜７８ｔｇ」、５２〜７８−１とも称する）（配列番号２）をオリゴマーセットにおける封入のために選択した。
【０１９３】
図６に示されているのは、二相性ＴＭＡフォーマット（内部対照（ＩＣ）を含む）におけるＨＣＶ非Ｔ７  ５２〜７８ｔｇ（のみ）を含むＨＣＶプライマーセットについての確証的な実験結果である。７つのＨＣＶ遺伝子型を１０ｋコピー／ｍｌで検査し（図６における「０４」項目）、遺伝子型２〜６についての１Ｍコピー／ｍｌ（図６における「０７」項目）を標的に対する対数差として示す。図６における「ＣＡＬ」の登録は、遺伝子型１ａを用いたが、他の項目の遺伝子型は、最後の２文字、例えば、「２Ｂ」によって指示される。本実験についてのＩＶＴは、ＨＣＶ遺伝子型４ｈ、５ａ、および６ａについてのＴＯＰＯプラスミド由来であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＶＴは、ＨＣＶ  １ａ、２ｂ、３ａ（第１版）および３ｂについてのＴＯＰＯプラスミド由来である。
【０１９４】
実施例４−ＨＣＶトーチ選択実験
元来のオリゴマーセットにより、ＨＣＶトーチ６８〜８６は、ＨＣＶ  ３ａおよびＨＣＶ  ３ｂ配列との２つの誤対合を有していた。数個の配列を、完全対合領域において検査し（図１の左側の四角）、いくつかは、配列を有するまたは有さない対合領域の縁部においてＣのものと対合していた。元来のトーチＨＣＶ６８〜８６配列を１つずつ、ＨＣＶ８０〜９８  ５ｓｔ  ａ（＋）（５‘−ＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧＣＧＵＵＡＧＵＡＵ−（ｃ９）−ｇｃｕａｇ（配列番号２１６））と比較し、この比較は、出現曲線がＨＣＶ  ３ａとは劇的に異なっていることを示す（図７）。
【０１９５】
ＨＣＶ  １ａおよびＨＣＶ  ３ａという２つのＩＶＴを用いて検査した３つのトーチについての出現時間較正曲線を図８に示す。元来のオリゴマーセットにより、ＨＣＶ  ３ａの遺伝子型の明確な遅延がある（条件３）（図８における直線矢印で示された上側の較正曲線）。幹部領域の異なる８０〜９８標的結合領域を有する２つのＨＣＶトーチ（トーチ８０〜９８＿５ｓｔ（５’−ｇＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧＣＧＵＵＡＧＵＡＵ−（ｃ９）−ｃｕａｇｃ）（配列番号２１７）および８０〜９８＿５ｓｔ＿ａ）は、６８〜８６についてのＨＣＶ  １ａの較正曲線（曲線矢印で示す）およびＨＣＶ  ３ａの較正曲線（ｃｎｄ３、対照（ｃｎｔ）セット）に対して、ＨＣＶ  １ａおよびＨＣＶ  ３ａについて一緒により近くに動態を移動させる（図８）。
【０１９６】
純粋な系（標的捕獲なし）を有するＨＣＶトーチ８１〜９６および８１〜９７による全ＨＣＶ遺伝子型との実際の対合は、ＨＣＶ  １ａについてＨＣＶトーチ８０〜９８対照と差がないことを示す（図９）。ＨＣＶトーチ８１〜９６を  さらなる使用のために選択したところ、標的結合領域においてＨＣＶトーチ８０〜９８  ５ｓｔ  ａよりも３塩基短い。
【０１９７】
実施例５−ＨＣＶ  Ｔ７プライマーおよび初期増幅オリゴマーの選択
Ｔ７配列を元来のオリゴマーセット、ＨＣＶトーチ６８〜８６、およびＨＣＶ非Ｔ７  ５０〜６６で検査する実験を、標準的なＴＭＡフォーマットを用いた一本鎖ＨＣＶ増幅において実施した。ＨＣＶ  １ａについての較正曲線をＴ７配列における変化を用いて実施し、図１０において示されるＴ７配列による出現時間に対する依存性を明らかにした。Ｔ７  ９９−１１９（５’−
【化１】
2019531747.tif 000003
、配列番号２１８、斜字の標的ハイブリダイズ配列）は、アッセイの終了時に出現時間の５分間の遅延を結果的に生じるＴ７  ９５−１１９に対する標的結合領域から除去された４塩基を有する。Ｔ７  ９９−１１９１（５’−
【化２】
2019531747.tif 000004
、配列番号２１９、斜字の標的ハイブリダイズ配列）は、さらなる遅延を示した。’−
【０１９８】
単体および混合物を検査する、亜型を対合させる一連の標準的なＴ７プライマーをＴＣＲおよびＡＭＰ２において検査した。ＨＣＶ  ５ａ  遺伝子型は常に、完全に対合していない限り、遅延した。しかしながら、５ａと完全に対合したプライマーは、Ｔ７領域の標的結合領域の中心におけるＡＡ誤対合によるように、ＨＣＶ  １ａを遅延させた（データ非表示）。イノシン塩基を有する標準的なＴ７プライマーも、図１１におけるアラインメントの四角によって示されるように、遺伝子型間の増幅を平衡化するよう試みて検査した。７遺伝子型はすべて、二相性ＴＭＡフォーマットにおいて検査した（ＨＣＶ  ４、５、および６遺伝子型についてのＴＯＰＯ  ＩＶＴを用いる）。
【０１９９】
３つのＴ７プライマーを比較する３つのコピーレベルについての一連の出現曲線は、イノシン塩基が図１２Ａ〜図１２Ｄにおける矢印によって示されるように存在したとき、より低い濃度の崩壊を明らかにした。改善が観察されなかったので、プライマーにおけるイノシン塩基を用いたさらなる研究を実施しなかった。
【０２００】
高Ｃ領域において設計されたＴ７プライマーも、トーチと非Ｔ７プライマーとの組み合わせにおいて検査したが、感度レベルは、さらなる研究を正当化しなかった（データ非表示）。
【０２０１】
初期の初回に関する誤対合を除去するための一連のＨＣＶ  Ｔ７初期増幅オリゴマーを検査し、ここで、Ｔ７初期増幅オリゴマーをＴＣＲへ標的捕獲オリゴマー（ＴＣＯ）全部を用いて付加し、最短の標準的なＴ７  ＨＣＶ  ９３−１１９（ＨＣＶ  １ａと対合）をプロモーターＡＭＰ２試薬へ付加した。ＨＣＶ遺伝子型１ａ、２ｂおよび５ａをＴＣＲおよびＡＭＰ２の両方において存在する２つの候補初期増幅オリゴマーＴ７  ８９−１１９およびＴ７  ８０−１１９と対照Ｔ７  ９３−１１９とを用いて初期スクリーニングした。図１３Ａ〜図１３Ｃにおいて呈されるデータについては、ＨＣＶ  １ａについての較正因子は、Ｃａｌ０２＝２．０、Ｃａｌ０４＝４．０およびＣａｌ０６＝６．０対数コピー／ｍｌである。ＨＣＶ遺伝子型２ｂおよび５ａについては、濃度は、ＣＴＲ０１＝２．３、ＣＴＲ０２＝４．３およびＣＴＲ０３＝６．３対数コピー／ｍｌである。出現曲線は、ｃａｌ全部と３つのレベルの対照とを示す。対照条件（Ｔ７  ９３−１１９）（図１３Ａ）は、遺伝子型全部におけるレベルの最小の定義された群を示すのに対し、Ｔ７  ８９−１１９（図１３Ｂ）およびＴ７  ８０−１１９（図１３Ｃ）条件は、別個のレベルを示す（が、Ｔ７  ８９−１１９およびＴ７  ８０−１１９はわずかに異なるレベルを有する）（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。
【０２０２】
各Ｔ７初期増幅オリゴマーについてのＨＣＶ  １ａとのＨＣＶ  ２ｂおよびＨＣＶ  ５ａ対数差を図１４に示しており、ＨＣＶ  ５ａについては最大の差である（ＴＯＰＯプラスミド由来のＩＶＴ）。３つのプライマー全部のＴ７標的結合領域における２つのＡＡ誤対合があるが、長めのＴ７配列８９−１１９および８０−１１９は、増幅の初期についての誤対合を克服する。
【０２０３】
ＨＣＶ  ６遺伝子型全部をＨＣＶ  １ａと比較するために、同じ３つのＴ７初期増幅オリゴマーＨＣＶ  Ｔ７  ９３−１１９、Ｔ７  ８９−１１９、および８０−１１９（全部についての対照およびＡＭＰ２）をＨＣＶ遺伝子型１ａ、２ｂ、３ａ／ｂ、４ｈ、５ａ、および６ａ（ＨＣＶ遺伝子型４〜６についてのＴＯＰＯプラスミドにおける）で検査した。較正因子（先行実験と同じレベル）としてプロットした遺伝子型全部についての比率較正曲線は、長めの初期増幅オリゴマー（Ｔ７  ８９−１１９または８０−１１９）が明確に、ＨＣＶ  ５ａ増幅曲線を他の遺伝子型のものとより類似することを示す（図１５Ａ〜図１５Ｃ）。
【０２０４】
ＨＣＶ  １ａ較正因子に対する遺伝子型についての定量における差としてプロットされるこの同じデータセットは図１６に示されており、ＨＣＶ  Ｔ７  ８９−１１９初期増幅オリゴマーのような長めの初期増幅オリゴマーを用いた改善も例証する（３つからなる各セットにおける中心棒）。
【０２０５】
ＨＣＶ  Ｔ７プライマーの元来の標準的なＴＭＡスクリーニングの間、ＨＣＶ  Ｔ７  ８９−１１９は、内部対照（ＩＣ）プライマー（非表示）とのプライマー相互作用を有すると同定された。この相互作用により、標準的なＴＭＡフォーマットにおけるその使用は回避されたが、ＨＣＶ  Ｔ７  ８９−１１９は、二相性ＴＭＡフォーマットにおいて使用することができる。
【０２０６】
遺伝子型における対数コピー差をさらに特徴づけるために、一連のＴ７初期増幅オリゴマーを設計したので、図１７における対角線近くのアラインメントに示す。
【０２０７】
このシリーズのＴ７初期増幅オリゴマーの一部を、ＨＣＶ  １ａ較正因子およびＨＣＶ遺伝子型１〜６（遺伝子型４〜６についてのＴＯＰＯプラスミド由来のＩＶＴを使用）とともにＡ３ａｍｐ試薬を有する二相性フォーマットにおいて検査した。ＨＣＶ遺伝子型２〜６は全部、３つのレベル、すなわち、１ｍｌあたり１００コピー、１０ｋコピーおよび１Ｍコピーで検査した。また、初期増幅オリゴマーとしてのＴ７  ８９−１１９はとりわけ、同様に実施した。Ｔ７  ８９−１１９は、ＡＭＰ２中にＴ７  ９３−１１９が存在する他のＨＣＶ遺伝子型について、ＨＣＶ  １ａに対する最小の差を与えた（図１８）。
【０２０８】
このデータの部分セットを１ｍｌあたりの１０ｋコピーの条件について図１９に呈し、Ｔ７初期増幅オリゴマーの相対的な性能をより明確に示す。
【０２０９】
実施例６−例示的なＨＣＶオリゴマーセット
上述の結果に一部基づいて、表１に列挙するオリゴマーを含有する例示的なＨＣＶオリゴマーセットを設計した。
【表１】
2019531747.tif 000005
【０２１０】
オリゴマー配列は、異なるＨＣＶ遺伝子型についてのＩＶＴおよび配列と以下の通り整列する。
【０２１１】
２つの誤対合した「Ａ」塩基対は、（＋）５２−７８プライマーに対する１Ａ型ＩＶＴの非Ｔ７結合領域中に存在する。プローブオリゴマー、初期増幅オリゴマー、およびＴ７プライマーは、配列の残部と対合する。１ａ型ＩＶＴは、遺伝子型の残部についてのＩＶＴとの比較についての参照として使用される。
【０２１２】
２つの誤対合した「Ａ」塩基対は、Ｔ７結合領域における５２−７８（＋）プライマーおよび単一の「Ａ」誤対合についての非７結合領域中に存在する。これらの「Ａ」は、配列表における２ｂ  型ＩＶＴについての登録において太字にされている。
【０２１３】
ＨＣＶ  ４ｈは、イニシエーター／Ｔ７領域における非Ｔ７  ５２−７８（＋）領域および単一のＵからＧへの点突然変異における２つの誤対合を特徴とする。トーチおよび標的捕獲オリゴマーは、ＨＣＶ  １ａ遺伝子型配列と対合する。
【０２１４】
ＨＣＶ  ５ａ  ＩＶＴは、非Ｔ７  ５２−７８（＋）領域における２つの「Ａ」の誤対合と、Ｔ７プライマーの中間における２つの並置された「ＡＡ」誤対合を特徴とする。
【０２１５】
初期の実験は、イニシエータープライマーなしで、結果的に、ＨＣＶ５ａ遺伝子型を用いた貧弱な挙動を生じた。ＨＣＶ  １ａ標準に対する過小定量は、Ｔ７プライマー結合領域における二重「ＡＡ」誤対合により、非常に明らかであった。しかしながら、初期増幅オリゴマーが標的捕獲試薬（ＴＣＲ）中にいったん含まれると、ＨＣＶ５ａ  ＩＶＴの挙動は、他のＩＶＴ遺伝子型の挙動に匹敵していた。
【０２１６】
ＨＣＶ  ６ａ  ＩＶＴは、非Ｔ７  ５２−７８（＋）領域における２つの「Ａ」誤対合と、Ｔ７結合ドメインの中間部分における１つの「Ａ」塩基誤対合とを特徴とする。
【０２１７】
実施例７−内部対照オリゴマープライマーの選択
内部対照オリゴマーの組込みは、次のセットのオリゴマー、すなわち、Ｔ７  ９５−１１９、ＮＴ７  ５２−７８、および８０−９８−ａトーチを用いて検査した。
【０２１８】
配列番号１５および１８〜２０によるオリゴマーを内部対照（別名、一般的な内部対照（ＧＩＣ）、ＩＣ）としての使用のために評価した。ＯＥＭプラットフォーム上で標準的なＴＭＡフォーマットを用いて、ＩＣオリゴマーを早期ＨＣＶａｍｐ系へと添加して、何らかのプライマーの相互作用が存在するかどうかを決定した。ＩＣオリゴマーの１つまたは全部を添加することは結果的に、（下方端における１〜２分間の出現時間差の間の）共鳴競合に基づくいくつかの予期される遅延を生じる（データ非表示）。内部対照増幅は、ＨＣＶオリゴマーセットの存在下で成功することも確認した（非表示）。
【０２１９】
実施例８−二相性ＴＭＡ  ＨＣＶ／ＩＣアッセイを用いたＨＣＶ遺伝子型の検出
表２のオリゴマーセットを用いたＨＣＶ遺伝子型２ｂ、３ａ、３ｂ、４ｈ、５ａおよび６ａについてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＶＴのＨＣＶ遺伝子型定量を、ＨＣＶ  １ａ較正因子との定量差としてプロットした（図２０）。ＨＣＶ  １ａ較正因子との□０．２５対数差におけるＨＣＶ遺伝子型の定量を達成した。
【０２２０】
ＴＣＲにおける２つのＴ７増幅オリゴマーＨＣＶ  Ｔ７  ９３−１１９（配列番号５）およびＨＣＶ  Ｔ７  ８０−１１９（配列番号４）を陰性血清で検査し、内部対照増幅についての出現時間に影響しないことを確認した（非表示）。ＨＣＶトーチ配列とより大きく重複するので、トーチ配列を重複させるＴＣＲからのＴ７のキャリオーバーにより、血清を用いた実験における擬陽性があるかどうかを決定するためにも、ＨＣＶ  Ｔ７  ８０−１１９初期増幅オリゴマーを検査した。１つの擬陽性（Ｎ＝１４０、特異性＝９９．３％）は、非常に低濃度で生じたが、添加した血清試料の調製の間の操作側の誤りによることがあり、明らかな分解によりデータを除外した。
【０２２１】
実施例９−ＨＣＶ定量アッセイの要約およびさらなる開発
ＨＣＶ定量アッセイを、特異的標的捕獲およびリアルタイム検出と組み合わせた二相性ＴＭＡを用いて設計および実施した。アッセイは、第１回の伸長および線形増幅のための標的捕獲試薬（ＴＣＲ）における長いＨＣＶ  Ｔ７初期増幅オリゴマーと、増幅試薬における２つのＨＣＶ  ＮＴ７オリゴマーとを用いる。プロモーター試薬における第２のＨＣＶ  Ｔ７は、ＨＣＶ標的の指数関数的増幅に用いられる。ＦＡＭで標識され、Ｄａｂｃｙｌで消光される、プロモーター試薬中のＨＣＶプローブは、リアルタイム蛍光検出に用いられる。
【０２２２】
一般的な内部対照（ＧＩＣ）オリゴマーは、後述の配列表に説明されている通りであった（配列番号１５および１８〜２０）。
【０２２３】
６つのＨＣＶ遺伝子型を検出し、等しく定量するためのアッセイの二相性フォーマットの開発に続いて、オリゴマーセットのさらなる開発は特異的ＨＣＶ配列突然変異を扱い、第２のＨＣＶ  ＴＣＯ（０３２７ｂ）（配列番号１７）の付加は、試料由来の標的捕獲を扱った。注釈付きＨＣＶ配列を提供するＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＣＶ配列データベースを解析ツールとして用いた。
【０２２４】
ＨＣＶ定量に使用するオリゴマーを表２に呈する。
【０２２５】
増幅プライマーを、遺伝子型において約９０％の相同性を有する領域であるＣ型肝炎ウイルスポリタンパク質前駆体（ＨＣＶ−１）の５’ＵＴＲ領域へ向けられる。
【０２２６】
終点Ｐｒｏｃｌｅｉｘ（登録）Ｕｌｔｒｉｏ（登録）アッセイ由来のＨＣＶプライマーもリアルタイムＴＭＡフォーマットにおいて検査した。いずれもさらに進行するよう十分には実施しなかった。
【０２２７】
先に考察するように、比較的早期のＨＣＶオリゴマーセットは、ＨＣＶ遺伝子型に対する誤対合を有していた（図１において楕円で示す）。トーチ６８〜８６は、ＨＣＶ  ３ａ／ｂについて２つの誤対合を有しているが、貧弱な増幅動態を有し、遺伝子間における差は大きかった。非Ｔ７  ５０−６６は、ＨＣＶ  ３ａにおいて１つの誤対合を有しており、Ｔ７  ９５−１１９は、ＨＣＶ  ２ｂ、３ａ、および４ｈの各々において１つの誤対合を有している。オリゴマーの元来のセットは、遺伝子型全部を等しく定量しなかった。
【０２２８】
新たなオリゴマーを、ＨＣＶ遺伝子型全部との完全な対合を有するトーチ配列について代替的な領域および図２１に示すトーチの四角の領域において設計した。非Ｔ７（ＮＴ７）およびＴ７をこのトーチ領域の周りに設計した。
【０２２９】
ＨＣＶ−Ｑｕａｎｔ  Ａｓｓａｙについて選択された予備的オリゴマーを表２に列挙するとともに、アラインメントデータを図２１に列挙した。
【表２】
2019531747.tif 000006
【０２３０】
表２におけるオリゴマーは、複数のＨＣＶ亜型を用いて十分挙動することが認められた。しかしながら、いくつかは、ある特定のＨＣＶ配列に対するオリゴマー結合領域内の誤対合を有することが認められ、このことは貧弱な定量を結果的に生じる可能性があった。ＨＣＶｄＢ．ｏｒｇ、Ｇｅｎｂａｎｋ、およびＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓを含むデータベース源から配列を集めた。これらのデータベースにおける遺伝子型の普及度を以下の表３に報告したが、これは米国の普及度と同様である。
【表３】
2019531747.tif 000007
【０２３１】
本目的は、遺伝子型に関わらず期待された濃度の±０．５対数ｃ／ｍｌ内での定量を提供することとした。ソースデータベースから認められた８５５の配列のうち、表２のオリゴマーセットについての関連領域において８１の独特な配列（完全な対合を含む）があった。誤対合の頻度は、有効な誤対合の下で、以下の表４に示すようなＴ７配列およびトーチ配列において最大であった。ＴＣＯは、高い誤対合普及度も有していた（５％超）が、大半は単一塩基の誤対合で、このことは、挙動に及ぼす最小限の影響よりも多くを有するとは考えられていない。
【表４】
2019531747.tif 000008
【０２３２】
８１の独特な突然変異体配列のうちの５０を次の基準に基づいて合成のために選択した。
１．所与のプライマーまたはオリゴマー配列内での２を超える誤対合。
２．データベースにおいて１回を超えて生じる突然変異体配列全部を構築および検査した。
３．一般的な突然変異。例えば、位置「ｘ」において「ｔ」の代わりに「ｇ」が共通してみられた場合、これらの型の突然変異の部分セットを作製した。この型の単一塩基突然変異は非常に一般的なので、部分セットのみを作製した。
４．欠失および挿入がなされて検査されたことを選択する。
【０２３３】
同定した突然変異を親ＨＣＶクローンへと、特異的突然変異誘発によって組み込んだ（塩基の変更を含有するプライマーを用いたプラスミドのＰＣＲ）。次に、これらの新たな突然変異体クローンのインビトロでの転写産物をオフにした。表５は、合成および検査した突然変異体を列挙する。表５において、「亜型」の欄は、突然変異が初期的に同定された亜型を示し、クローン名は、検査のためのコンストラクトが得られた親クローンの亜型の命名を含む。
【表５−１】
2019531747.tif 000009
【表５−２】
2019531747.tif 000010
【表５−３】
2019531747.tif 000011
【表５−４】
2019531747.tif 000012
【表５−５】
2019531747.tif 000013
【０２３４】
５０のインビトロ転写産物突然変異体を初期アッセイ実現可能性オリゴマーシステムで検査し（表２）、８つの突然変異体を、期待した結果から０．５ｌｏｇ  ｃ／ｍｌを除いて回収した（図２２Ａおよび図２２Ｂ）が、これは集団の約１％を表す（８／８５０）。１３の突然変異体は、０．４ｌｏｇ  ｃ／ｍＬ超ほど過小定量した。
【０２３５】
０．５対数を超える対数差の８個の突然変異体のうちの６個を  Ｔ７およびトーチ領域に、１個をＮＴ７領域に配置し、単一の突然変異体は、Ｔ７、ＮＴ７およびＴＣＯ領域に突然変異を有していた（表６）。
【表６】
2019531747.tif 000014
【０２３６】
図２３は、０．４ｌｏｇ  ｃ／ｍＬ超ほど過小定量した１３の突然変異体を含む配列アラインメントを示す。
【０２３７】
突然変異体ＨＣＶの定量を改善するために、初期オリゴマーセットに対して変更を行った。初期オリゴマーセットに対する選択された改変は、（１）Ｔ７およびトーチ誤対合を取り扱うためにＴ７初期増幅オリゴマーを長くすること、および（２）第２の異なるＮＴ７オリゴマーを加えることとした。スクリーニングされたオリゴマーを表７に列挙する。
【表７−１】
2019531747.tif 000015
【表７−２】
2019531747.tif 000016
【表７−３】
2019531747.tif 000017
【表７−４】
2019531747.tif 000018
【表７−５】
2019531747.tif 000019
【表７−６】
2019531747.tif 000020
【０２３８】
５２−７８−２とも称されるＮＴ７オリゴマーＨＣＶ（＋）５２−７８＿ＮＴ７＿ｍｕｔＴＴＡ＿１（配列番号３）は、ある特定の突然変異の存在下で定量を改善することが認められた。突然変異を扱うためにこのオリゴマーの追加で、オリゴマーセットには２つのＮＴ７プライマー（ＨＣＶ（＋）５２−７８−１（配列番号２）、およびＨＣＶ（＋）５２−７８−２（配列番号３））があった。
【０２３９】
２つのＮＴ７プライマーの比率が変動する亜型３ａ、亜型３ｂ、および亜型１ａのＮＴ７  ＴＴＡＡ突然変異体を含む遺伝子型についての検出結果は、表８にある（標的由来の対数差として付与）（太斜字は、ＮＴ７  Ｔ−Ｔ−Ａ遺伝子型突然変異体について０．５対数差を超えること、または３ａおよび３ｂ遺伝子型について０．２５対数差よりも大きいことを示す）。５２−７８−２  ＮＴ７オリゴマーの７５％または５０％を用いて、結果的に標的の０．５対数以内の検査した配列全部の定量を行った。５２−７８−２  ＮＴ７オリゴマーの２５％を用いて、結果的に標的の０．５対数以内の、Ｔ−Ｔ−Ａ突然変異体以外の検査した配列全部の定量を行った。およそ±１０％のプライマー濃度についての製造耐性が許容され得ることも結論付けられた。５０％の５２−７８−２で、亜型３ａおよび３ｂは、標的の±０．２５対数差以内で定量し、１ａ  ＮＴ７  ＴＴＡ突然変異体は、±０．５ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ内で定量した。
【表８】
2019531747.tif 000021
【０２４０】
Ｔ７およびトーチ突然変異体を扱うために、長めのＴ７初期増幅オリゴマー（ＨＣＶ（−）８０−１１９  Ｔ７）を設計した。Ｔ７配列の長さを長くすることによって、オリゴマーの結合は、Ｔ７における単離された誤対合を克服した。結果として、新たなＴ７初期増幅オリゴマーは、トーチを完全に重複させている。
【０２４１】
Ｔ７初期増幅オリゴマーを標的捕獲試薬中に入れる。Ｔ７初期増幅オリゴマー設計は、トーチ領域を重複させている。したがって、擬陽性の危険性を最小限にするために、遊離Ｔ７初期増幅オリゴマーは、洗浄ステップ中に除去されるべきである。Ｔ７初期増幅オリゴマーを直接、増幅反応へと添加すると、結果的に、擬陽性を生じた（データ非表示）。
【０２４２】
図２４は、エラーに列挙されたオリゴマーに対応するＨＣＶオリゴマーにおけるオリゴヌクレオチドの配列アラインメントである。参照源不明…これらの変更で、ＩＶＴ変異体はすべて、標的とされる濃度の±０．５ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ内で回収し（図２５Ａ）、亜型検出は、期待値の±０．２５ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ以内であった（図２５Ｂ）。試薬製剤中に添加した第２のＨＣＶ  ＴＣＯ（０３２７）についての配列も図２４に示す。
【０２４３】
実施例１０−特異性分析試験
これらのデータは、ＨＣＶ  ０３２７ｂ（−）捕獲オリゴマーが使用されていないことを除き、表２に呈されるようなオリゴマーのセットを用いて発生させた。
【０２４４】
実験室内で調製されたＨＣＶ陰性血清、内部増幅対照（ＩＡＣ）緩衝液、およびより粘度の高い臨床試料を含む臨床的陰性試料を用いて一連の異なる機器でいくつかの特異性を実施した。擬陽性（ＦＰ）は、１００％（９５％信頼区間：９９．７〜１００％）の特異性を結果的に生じる検査した１４６８の陰性において認められなかった（表９）。
【表９】
2019531747.tif 000022
【０２４５】
実施例１１−臨床試料の分析感度および分析
本実施例におけるデータは、ＨＣＶ  ０３２７ｂ（−）捕獲オリゴマーを使用していないことを除き、表２におけるオリゴマーのセットを用いて発生させた。
【０２４６】
以下に呈される試験は、血漿中のウイルス、ＩＡＣ緩衝液中のＩＶＴ、および外殻のあるＲＮＡに類似の人工的なＡｃｒｏＭｅｔｒｉｘ  ＨＣＶ−Ｓウイルスパネルも用いて実施した。ＡｃｒｏＭｅｔｒｉｘ  ＨＣＶ−Ｓパネルは、ＩＵ／ｍＬで較正されたＡｃｒｏｍＭｅｔｒｉｘによるＳｙｎＴｕｒａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号９５０３５０）を用いて組換えＢＶＤＶ（）タンパク質中に埋め込まれたＨＣＶ１ｂの合成配列である。
【０２４７】
予備実験に基づき、ＷＨＯのＨＣＶ第２番目の標準を用いて、ＨＣＶアッセイは、５コピー／ＩＵ変換因子を有する。予備感度試験を、ＩＡＣにおける表１０に指示した。６０ｃ／ｍｌでの陽性率を１００％とした。ＰＲＯＢＩＴ解析を用い、９５％の確率における検出限界は、１９．５８ｃ／ｍｌまたは３．９ＩＵ／ｍｌとした。Ｐｒｏｂｉｔ解析は、Ｒ統計計算ソフトウェアを用いて、二名目誤差分布を有する汎化線形モデルを用いて、応答変数についてのＰｒｏｂｉｔ関数とともに用いることによって実施した。表１０および表１１を参照されたい。
【表１０】
2019531747.tif 000023
【表１１】
2019531747.tif 000024
【０２４８】
血清中のＡｃｒｏｍｅｔｒｉｘパネルを用いた試験も実施した。１２ＩＵ／ｍｌにおける陽性率を１００％とした。ＰＲＯＢＩＴ分析を用いて、９５％確率での検出限界を３．１３ＩＵ／ｍｌとした。表１２および表１３を参照されたい。
【表１２】
2019531747.tif 000025
【表１３】
2019531747.tif 000026
【０２４９】
精度を種々の低コピーレベルパネルを用いて、３つの機器にわたって、３日間、合計６０個の複製物について査定した。誤差の合計は、１２ＩＵ／ｍｌで１ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ未満、または１．７８ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ未満であった。表１４を参照されたい。
【表１４】
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【０２５０】
ＱＣ較正因子の精度を本試験における５つの異なる濃度でも査定した。誤差の合計は、１ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ未満であり、標準偏差ｌｏｇ  ｃ／ｍｌは、２ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ（約２０ＩＵ／ｍｌ）から９ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ（約２ｅ８  ＩＵ／ｍｌ）までで０．２０未満であった。表１５を参照されたい。
【表１５】
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【０２５１】
図２６は、本アッセイが１．４７ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ（約６ＩＵ／ｍｌ）から９ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ（約２ｅ８  ＩＵ／ｍｌ）まで線形であったことを実証している．
【０２５２】
９１の臨床試料についてのＨＣＶウイルス量を実施例１１において説明したアッセイを用いて測定し、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．製およびＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製の市販のＨＣＶアッセイからの結果と比較した。５コピー／ＩＵ変換を先に考察したように測定した。本アッセイの結果はすべて、Ａｂｂｏｔｔの結果（非表示）の１ｌｏｇ  ｃ／ｍｌ内であった。Ｒｏｃｈｅアッセイと比較したとき、２ＨＣＶ亜型の４つの試料は、１対数超の定量を付与した。Ｒｏｃｈｅアッセイは、ＨＣＶ亜型４を過小定量することが公知である。Ｃｈｅｖａｌｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，第４４巻，付録２，２００６年４月号，Ｓ１９５〜Ｓ１９６頁を参照されたい。
【０２５３】
実施例１２−第２の標的捕獲オリゴマーの添加
標的捕獲に関して性能に影響するかどうかについて、第２のＴＣＯであるＨＣＶ  ０３２７ｂ（−）ｄＴ３ｄＡ３０（配列番号１７）を評価した。以下の実験はすべて、別段の記載がない限り、ＨＣＶ  ０３２７ｂ（−）ｄＴ３ｄＡ３０を６ｐｍｏｌ／反応で用いて検査した。
【０２５４】
以下の条件は、第２のＴＣＯの追加の影響を評価して、第２のＴＣＯの至適濃度を決定するために検査した。ＴＣＯ（０２９７）領域および遺伝子型転写産物パネルにおける突然変異を有する６つの突然変異体転写産物をｌｅ４コピー／ｍｌで検査した（ｎ＝５）．６および１２ｐｍｏｌ／反応における第２のＴＣＯ（０３２７ｂ）の追加は、類似の対数コピーおよび精度を有していた。正のパネルはすべて、１００％陽性であり、標的対数コピーの±０．５対数内であった。対照（単一のＴＣＯ系（０２９７のみ））は、初期の実行においてやや高めの対数コピー値を有していたが、異なる日に反復した同じ条件からの結果は、条件の残りと整列した結果を有しており（非表示）、このことは、日に日にわずかな変化を示している。第２のＴＣＯ（０３２７ｂ）は単独で、ＨＣＶおよびＧＩＣについての出現時間を両者についておよそ３分間遅延していた。６ｐｍｏｌ／反応における追加の第２のＴＣＯ（０３２７ｂ）はしたがって、許容され得る濃度である。
【０２５５】
ＷＨＯのＨＣＶパネルを第２のＴＣＯの追加で検査した。本試験は、パネルあたり１５〜４５の範囲の複製物全体による複数の機器に関して完遂した（３回の試行）。検出の先行限界（ＬｏＤ）（９５％陽性）は、３．７６  ＩＵ／ｍＬであると決定された（３つの機器、パネルあたりまたは６回の試行あたりｎ＝３０〜９０）。ＬｏＤは、５．０６ＩＵ／ｍＬまでわずかに増大し、３．７６  ＩＵ／ｍｌという先行値が９５％信頼区間以内であるので（表１６）、実験間の変化があり得る。
【表１６】
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【０２５６】
計算されたＬｏＱ（定量限界）（すなわち、誤さの合計が１に等しい濃度）は、９．７４８ＩＵ／ｍｌであり、単一のＴＣＯを用いたときに類似しており（単一のＴＣＯ  ＴＥ＝９．０２ＩＵ／ｍＬ）、本アッセイのＬｏＤ近くで等価の精度を実証した（表１７）。
【表１７】
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【０２５７】
０２９７  ＴＣＯのみを用いて既に検査した６つのＨＣＶ遺伝子型の同じ臨床標本についてのＬｏＤを、第２のＴＣＯである０３２７ｂ（ＮＢ３＋ＴＣＯ）を用いてＬｏＤ（１２ＩＵ／ｍｌ）の近くで再検査した。臨床標本を、初期の検査から５ＩＵ／ｍｌを超える適切な血漿または血清の希釈物において連続的に希釈した。ＨＣＶ遺伝子型４を例外とする検査した遺伝子型全部について、最低標的濃度での％陽性結果および平均対数コピーは、第２のＴＣＯの追加でより大きかった（表１８）。すなわち、１ＩＵ／ｍｌにおいて、１ｂ、２ａ、３ａ、５ａ、および６ｃの各々は、改善された％陽性を示した（１３、２０、２６、１３、および１３百分率点の上昇）。ＨＣＶ遺伝子型４の標本は、単一のＴＣＯ系と比較して第２のＴＣＯの追加を用いた類似の結果を有していた。すべての百分率陽性の結果は、１２ＩＵ／ｍＬで９５％以上であり、１００ＩＵ／ｍｌにおいて０．２５標準偏差対数コピー以下とした。
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【０２５８】
第２のＴＣＯを含むおよび含まない低濃度での性能をさらに確認するために、遺伝子型ＩＶＴを３０、８および５コピー／ｍｌのパネルで検査した。各パネルを０２９７  ＴＣＯのみ（ｎ＝１０）または０２９７  ＴＣＯおよび０３２７ｂ  ＴＣＯ（ｎ＝２０）を用いて検査した。％陽性結果は、ＨＣＶ遺伝子型２ｂ，  ３ａ，  ３ｂ  ａｎｄ  ４ｈ  について匹敵しており、結果は、遺伝子型５ａおよび６ａについて０２９７および０３２７ｂ  ＴＣＯを遺伝子型５ａおよび６ａについて用いて改善された（図２７Ａ〜図２７Ｂ）。すべての条件は、３０コピー／ｍＬにおいて１００％陽性結果を生じた。平均対数コピー結果は、遺伝子型２ｂ、３ａおよび３ｂについての条件間で匹敵しており、遺伝子型４ｈ、５ａおよび６ａについてやや高かった（非表示）。５ａおよび６ａのような遺伝子型について低濃度で第２のＴＣＯとともに％陽性における上昇傾向は、８および５コピー／ｍｌのパネルのさらに３０個の複製物と、０２９７  ＴＣＯの個別のロットを用いて確認した（非表示）。データは、表１９に要約する。
【表１９】
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【０２５９】
実施例１３−交差反応性、分析特異性、および臨床特異性
ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、パルボウイルス、ルベラ、デング２型、デング３型、デング４型、エプスタイン・バー、および西ナイル）については１０５粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬまたは５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の、微生物（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｐ．ａｃｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）については１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬのＩＡＣ（内部対照緩衝液）へと刺激されたウイルスおよび微生物のパネルに対する微生物交差反応性について含まれた０３２７ｂ  ＴＣＯを用いて検査を行った。陽性結果はＨＣＶ核酸の不在下では得られなかった。ＨＣＶ（２．３対数コピー／ｍｌ）の存在下で、パネルにおけるいかなるウイルスまたは微生物からも有意な干渉はなかった（すなわち、定量は、刺激した試料全部についての対照の０．２５対数以内とした）。
【０２６０】
臨床特異性は、９６１の凍結した未感染標本（４２０の個々のヒト血清および５４１の個々のヒト血漿）を用いて０２９７および０３２７ｂ  ＴＣＯを含むオリゴマーセットを用いて反復した。８個の陽性が検査中に生じ、９９％の特異性および９８．４％の低めの結合（９５％ＣＩ）を先生から与えられた。分析特異性は、情報目的のために、少数のＩＡＣおよび合計ｎ＝１５０での陰性血清試料を用いて反復した。ＩＡＣおよび陰性血清試料について陽性は生じなかった（特異性は１００％であり、低めの結合（９５％ＣＩ）は９８．４％であった）。
【０２６１】
陽性は、同じ試料を用いた１回のＴＣＯのより早期の検査において生じた。陽性の増加が第２のＴＣＯの追加または追加検査時に環境上の混入のような外来源に起因するかどうかを決定するために、１個のＴＣＯを用いておよび２個のＴＣＯを用いて検査を併行反復した。各条件において検査した４１０の臨床陰性標本のうち、２つの陽性は、２つのＴＣＯで生じ、陽性は、対照１のＴＣＯ条件において生じなかった。４０８個のＩＡＣ陰性試料のうち、２つの陽性は、対照１のＴＣＯ条件において生じ、２つのＴＣＯについては何も生じなかった。したがって、１つのＴＣＯ条件と２つのＴＣＯ条件の両方は、類似の結果を有し、これらのデータは第２のＴＣＯの追加が、擬陽性の割合をより高くすることに寄与していないことを確認した。
【０２６２】
配列表
次の表において、小文字はＲＮＡ（ＨＣＶ配列について）または２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（オリゴマー配列および部分配列について）を示し、大文字はＤＮＡを示す。「（ｃ９）」は、−（ＣＨ２）９−リンカーを示す。下線は、異種性融合配列、例えば、プロモーターまたはその部分配列を示す（下線はＴ３Ａ３０配列について非表示）。
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２０−３】
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【表２０−４】
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【表２０−５】
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【表２０−６】
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【表２０−７】
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【表２０−８】
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【表２０−９】
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【表２０−１０】
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【表２０−１１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2019531747.tif 000066
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
2019531747.tif 000070
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
2019531747.tif 000074
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2019531747.tif 000079
【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
2019531747.tif 000083
【図２５Ａ−１】
2019531747.tif 000084
【図２５Ａ−２】
2019531747.tif 000085
【図２５Ｂ】
2019531747.tif 000086
【図２６】
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【図２７Ａ】
2019531747.tif 000088
【図２７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019531747000001.app
【国際調査報告】
2019531747.tif 000090
2019531747.tif 000091
2019531747.tif 000092
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