(57)【要約】  本開示は細胞増殖を調節する分子を提供する。これらの分子はシアル酸と結合するものを含み、前記は、細胞分裂および/または分化異常、癌および/またはその遊走および/または拡散の治療および/または予防に適用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖および/または細胞活性を調節する方法における使用のための、シアル酸結合分子。
【請求項２】
細胞生存性、細胞遊走、細胞代謝、細胞分化および/または細胞形態/表現型の1つ以上が調節される、請求項1の使用のための、請求項1に記載のシアル酸結合分子。
【請求項３】
異常な細胞の増殖、分化、分裂および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防における使用のための、シアル酸結合分子。
【請求項４】
異常な細胞の増殖、分化、分裂および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、または前記を特徴とする疾患が、細胞分裂および/または分化異常並びに癌から成る群から選択される、請求項3の使用のための、請求項3に記載のシアル酸結合分子。
【請求項５】
癌の治療および/または予防における使用のための、シアル酸結合分子。
【請求項６】
前記癌が、肺癌、子宮頸癌、結腸癌および/または乳癌である、請求項3または4の使用のための、請求項3または4に記載のシアル酸結合分子。
【請求項７】
1つ以上のファミリー40炭水化物結合モジュールを含む、請求項1〜6のいずれか１項の使用のための、請求項1〜6のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項８】
コレラ菌（Vibrio cholerae）NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメインおよび/または肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか１項の使用のための、請求項1〜7のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項９】
前記コレラ菌NanHシアリダーゼが、配列番号:1または2のアミノ酸配列を含む、請求項8の使用のための、請求項8に記載のシアル酸結合分子。
【請求項１０】
前記肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼが、配列番号:3または4のアミノ酸配列を含む、請求項8の使用のための、請求項8に記載のシアル酸結合分子。
【請求項１１】
マルチマーCBMである、請求項1〜10のいずれか１項の使用のための、請求項1〜10のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項１２】
前記マルチマーCBMが、2つ以上のコレラ菌NanHシアリダーゼおよび/または2つ以上の肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼを含む、請求項11の使用のための、請求項11に記載のシアル酸結合分子。
【請求項１３】
前記マルチマーCBMが、2、3、4、5、6、7、8、9または10のコレラ菌NanHシアリダーゼおよび/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼを含む、請求項11または12の使用のための、請求項11または12に記載のシアル酸結合分子。
【請求項１４】
前記マルチマーCBMが、Vc4CBM、Vc2CBMTDおよび/またはSp2CBMTDである、請求項11、12または13のいずれか1項の使用のための、請求項11、12または13のいずれか1項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項１５】
癌の治療および/または予防における使用のためのシアル酸結合分子であって、
（i）コレラ菌NanHシアリダーゼの1つ以上のシアル酸結合ドメインおよび/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼの1つ以上のシアル酸結合ドメイン、
（ii）マルチマーCBM、
（iii）2つ以上のコレラ菌NanHシアリダーゼおよび/または2つ以上の肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼを含むマルチマーCBM、および/または
（iv）Vc4CBM、Vc2CBMTDおよび/またはSp2CBMTD
を含む、前記シアル酸結合分子。
【請求項１６】
細胞増殖および/または細胞活性を調節するin vitro方法であって、細胞または細胞集団をシアル酸結合分子と接触させて細胞増殖および/または細胞活性を調節する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖および/または活性の調節に使用され、さらに癌、その遊走および/または拡散を治療または予防する方法に使用される分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかのレクチン（前記は非免疫起原の糖タンパク質である）は、悪性細胞でアポトーシスを誘発する能力を有し、したがって抗癌特性を示すことはよく知られている。この現象は、部分的にはこれらレクチンと免疫細胞上の特異的なグリカン受容体との相互反応を介して生じる（Yau et al., 2015）。
そのようなレクチンの1つはヤドリギのビスキュミンであり、前記は、α2,6シアリルラクトースでグリコシル化された細胞受容体と結合する毒素である（Muthing et al., 2002）。ビスキュミンは、2つのサブユニット（AおよびB）を含む57kDaのヘテロダイマーである。Aサブユニットは、リボソームを障害し、それによってタンパク質生成を中断させることによってその毒性作用を表し、一方、Bサブユニットはグリカン結合機能を示す。レクチンはピコモルの細胞傷害性をin vitroおよびin vivoで示し、臨床試験の対象者で6μg/kgの推奨用量上限を有する（半減期13分）（Zwierzina et al., 2011）。
細胞の遊走および増殖を妨げる能力（したがって抗癌特性）を示す別の植物レクチンは、イヌエンジュ（Maackia amurensis）の種子のレクチン（またはMASL）である（Ochoa-Alvarez et al., 2012；Astarita et al., 2012）。このレクチンもまたナノモルの有効性（〜300nM）を示して細胞傷害性であり、ポドプラニンの結合を介してその作用を表す。ポドプラニンは、α2,3シアリル化ムチン型トランスメンブレン糖タンパク質であり、前記は多様なヒトの癌で過剰発現される（Kato et al., 2005；Schacht et al., 2005；Shibahara et al., 2006）。
細胞分裂（proliferation）および分化異常（例えば癌を含む）の治療は、それら異常の宿主で十分な耐性を有し治療有効性を有する追加分子の供給を要求する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、シアル酸と結合する分子はまた細胞増殖および/または細胞活性の様相を調節するという発見に基づく。
本明細書を通して、“含む（comprise, comprising and/or comprises）”という用語は、本発明の特徴および実施態様が特有の1つまたは複数の特色を“含む”ことを指すために用いられる。この（これらの）用語はまた、関連する1つまたは複数の特色から“本質的に成る”または前記特色から“成る”特徴および/または実施態様を包含することは理解されるべきである。
第一の特徴では、細胞増殖および/または細胞活性を調節する方法で使用されるシアル酸結合分子が提供される。
第二の特徴では、細胞増殖および/または活性を調節する方法が提供され、前記方法は、細胞をシアル酸結合分子と接触させる工程を含む。当該方法はin vitroでの方法であり得る。
“調節する”という用語は、細胞増殖および/または活性の1つ以上の局面における増加または低下を含む。換言すれば、本明細書に記載するシアル酸結合分子は、細胞増殖および/または活性のある種の局面を阻害することができ、または細胞増殖および/または活性の他の局面を誘発または刺激することができる。
細胞に適用される“増殖”および“活性”という用語は、細胞増殖、細胞生存性、細胞遊走、細胞代謝、細胞分化および/または細胞形態/表現型の1つ以上の関連プロセスおよび/または現象を含むことができる。“増殖”および/または“活性”という用語はさらにまた、ある種の外因性および/または内因性因子または刺激に対する細胞の応答を含むことができ、前記応答は、例えば、免疫系のある種の化合物、サイトカイン、ケモカインおよび1つ以上の環境因子（光、温度、圧、機械的ストレスなど）に対する応答を含む。したがって、本明細書に開示するシアル酸結合分子を用いて細胞応答レベルを調節することができる（阻害、低下または増加をもたらすことができる）。
【０００４】
シアル酸結合分子が（上記に記載された）細胞増殖および活性を調節することが示されたことを考慮すれば、これらシアル酸結合分子について多くの関連する医学的および獣医的適用並びに使用が存在することは理解されよう。例えば、シアル酸結合分子は、異常な細胞増殖および/または異常な細胞活性が要因である疾患の治療および/または予防に適用され得る。
したがって、異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防に使用されるシアル酸結合分子が提供される。
さらにまた、異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防用医薬の製造のためのシアル酸結合分子の使用が提供される。
異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、または前記を特徴とする疾患および/または症状を治療および/または予防する方法もまた提供され、前記方法は、治療的に有効な量のシアル酸結合分子をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、または前記を特徴とする疾患は、例えば、細胞増殖および/または分化の異常（良性または悪性症状と称されるかまたは前記に分類されるものを含む）を含む。例えば、“細胞増殖および/または分化の異常”という用語には、総合的に“癌”と称される疾患および/または症状が含まれ得る。“癌”という用語は以下の形態を含むことができる（ただしそれらに限定されない）：乳癌、骨の癌、脳の癌（グリオーマ）、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、腸/結腸癌。“癌”という用語はまた、総合的に“白血病”（慢性および急性）および粘膜/粘膜関連表面または組織を冒す任意の癌を指す疾患および/または症状を含むことができる。
【０００５】
したがって、本明細書に記載するシアル酸結合分子は癌の治療および/または予防に応用され得る。
したがって、癌の治療および/または予防で使用されるシアル酸結合分子が提供される。
さらにまた、癌の治療および/または予防用医薬の製造のためのシアル酸結合分子の使用が提供される。
癌の治療および/または予防の方法もまた提供され、前記方法は、治療的に有効な量のシアル酸結合分子をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
その必要がある対象動物または本明細書に開示するシアル酸結合分子若しくは前記を含む医薬を実際に投与されるべき対象動物は、以下を罹患する（または罹患している疑われる）任意の対象動物であり得る：（i）細胞増殖および/または分化異常、（ii）癌、（iii）本明細書に記載する任意の他の疾患および/または症状；または（iv）異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、または前記を特徴とする疾患および/または症状。加えて、或いはまた別に、任意の対象動物は以下の素因があるかまたは以下に罹りやすい対象動物であり得る：（i）細胞増殖および/または分化異常、（ii）癌、（iii）本明細書に記載する任意の他の疾患および/または症状；または（iv）異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされる、前記が一因となる、または前記を特徴とする疾患および/または症状。
【０００６】
細胞増殖および/または分化異常、癌、または異常な細胞増殖および/または活性によって引き起こされるかまたは前記が一因となる（または前記を特徴とする）疾患若しくは症状の治療は、これらの疾患の1つ以上の症状を治療、緩和または軽減するために、1つ以上のシアル酸結合分子の使用を必要とし得ることは理解されるべきである。例示すれば、疾患（例えば癌）の症状には、例えば腫瘍および/または細胞塊の存在が含まれ得る。したがって、本明細書に記載するシアル酸結合分子を使用して、腫瘍形成および/またはその転移を調節することができる（例えば停止、遅延、阻害または縮小させることができる）。シアル酸結合分子はまた腫瘍の全体的サイズを減少させるために用いることができる。ある種の腫瘍（大きくおよび/または攻撃性である）は、まず初めにサイズが縮小されている場合にはしばしばより容易に外科的に除去される。典型的には、化学療法および/または放射線療法系治療を用いて腫瘍サイズの縮小が可能であるが、前記のような治療をシアル酸結合分子系治療で置き換えるかまたはシアル酸結合分子系治療で補足することができる。記載したように、シアル酸分子結合活性を示す分子は細胞増殖および/または活性を調節する能力を示し、したがって、理論に拘束されないが、腫瘍のサイズに影響を及ぼすシアル酸結合分子の能力を補強するメカニズムは、当該分子の細胞増殖、分化および/または代謝調節作用に根拠を有するかもしれない。
上記の見地から、腫瘍の治療成功はしたがって、腫瘍サイズが縮小すること、腫瘍転移、腫瘍形成組織内の血管新生および/または組織侵襲が観察されるかまたは検出可能な/検出されるレベルで減少することを特徴とし得る。
【０００７】
したがって、シアル酸結合分子は、その必要がある対象動物で腫瘍の増殖、発達および/または転移を調節する（例えば阻害、制限または軽減する）方法で使用され得る。本明細書に記載するシアル酸結合分子は、腫瘍の増殖、発達および/または転移の調節で使用される組成物として処方されるか、または前記を達成するための医薬の製造で使用され得る。本開示はまた腫瘍の治療で使用されるシアル酸結合分子を提供する。さらにまた、記載されるものは、腫瘍治療用医薬の製造のためのシアル酸結合分子の使用である。さらに、本開示は腫瘍の治療方法を提供し、前記方法は、その必要がある対象動物（または腫瘍形成組織）にシアル酸結合分子を投与する工程を含む。
以前に定義したように、“その必要がある対象動物”という用語は、腫瘍を有すると疑われた、または腫瘍を有すると診断された任意の対象動物、および/または腫瘍の素因があるとおよび/または腫瘍に冒されやすいと識別された対象動物を含むことができる。
したがって、本開示は、細胞増殖および/または活性の調節因子として識別されたシアル酸結合分子のための多様な応用を提供する。与えられるシアル酸結合分子のいずれも、本特許出願の実施例のセクションに記載の多様な実験およびアッセイにより、細胞増殖および/または活性の調節因子として識別することができる。例えば細胞創傷スクラッチアッセイは、与えられた任意の“試験”分子が細胞増殖および/または活性を調節するために必要な能力を示すか否かを決定するために利用できる一例である。
したがって、本発明は、細胞活性調節アッセイ（例えば細胞創傷スクラッチアッセイ）を介して細胞増殖および/または活性を調節する能力を示すそれらシアル酸結合分子に関する。この目的のために、本開示はさらにまた、細胞増殖および/または活性を調節する方法で使用されるシアル酸結合分子、または本明細書に記載する多様な医学的および/または獣医的応用のためのシアル酸結合分子を識別する方法を提供し、前記方法は、細胞増殖および/または活性における試験化合物の効果を告知することができるアッセイに当該試験化合物を付す工程を含む。ここで、当該試験化合物はシアル酸結合化合物であり、当該アッセイが細胞増殖および/または活性の任意の局面で当該化合物が何らかの効果を有すると告知するならば、当該化合物は本明細書に記載のタイプの疾患および/または症状の治療および/または予防で有用であり得る。細胞増殖および/または活性における試験化合物の効果を告知することができるアッセイは、本明細書に記載される細胞創傷スクラッチアッセイであり得る。
【０００８】
本開示は、シアル酸と結合する能力を示す分子および化合物に関する。これらの分子は任意の形態をとることができ、および/または任意のクラスの分子または化合物に属する（例えば、それらはタンパク質、ペプチド、炭水化物、抗体などであり得る）。“シアル酸”という用語はN-またはO-置換ノイラミン酸の全形態を含み、前記の全ての合成形、天然存在および/または改変形を含む。シアル酸は、細胞表面分子、糖タンパク質および糖脂質の成分として見出され得る。きわめてしばしば、シアル酸は、細胞膜および/またはタンパク質に連結された糖鎖の末端（末端領域）に存在する。例えば、人間の上気道のいくつかの細胞はα-2,6-結合シアル酸受容体を含み、上下気道の他の細胞はα-2,3-結合シアル酸受容体を含む。シアル酸ファミリーは、C4、C5、C7、C8およびC9でのアセチル化、グリコリル化、ラクトン化およびメチル化から生じ得る多数（約50）の誘導体を包含する。そのような誘導体の全てが“シアル酸”という用語に含まれるべきである。
さらにまた、GalおよびGalNAcとα(2,3)若しくはα(2,6)結合した、または別のシアル酸とα(2,8)若しくはα(2,9)結合したシアル酸が見いだされる。したがって、本明細書を通して“シアル酸”という用語が用いられるが、当該用語は、その全ての誘導体、アナローグまたは変種（天然に存在するものまたは合成により生成されるもの）を、前記を含むモノマー、ダイマー、トリマー、オリゴマー、ポリマーまたはコンカテマーと同様に包含することを理解することは重要である。
したがって、本開示のシアル酸結合分子（および本明細書に記載の使用されるシアル酸結合分子）は、シアル酸に対する親和性を示す部分を含む（前記シアル酸には、上記記載のシアル酸の全形態および細胞（例えば哺乳動物細胞）表面に存在するシアル酸の任意の形態が含まれる）。シアル酸のこれら多様な形態は総合的に“シアル酸部分”と称することができる。
【０００９】
本開示のシアル酸結合分子はシアル酸に対する親和性を示し、したがってそれらは、1つ以上のシアル酸部分と結合（bind）/連結（couple）、および/または連合（associate）することができる。したがって、“シアル酸結合分子”という用語はさらに、全シアル酸結合分子の任意のフラグメントを包含することができ、前記フラグメントはシアル酸部分と結合、或いは連結または連合する能力を保持する。
使用されるシアル酸結合分子は、ただ1つのシアル酸結合分子を含むことができ（例えばモノマーまたは一価分子）、また別には2つ以上のシアル酸結合分子（2つ以上の分子は同じでも異なっていてもよい）を含むことができる（例えばポリマーまたは多価分子）。
使用されるシアル酸結合分子は、“炭水化物結合モジュール”（CBM）として知られるシアル酸結合分子の1つ以上を含むか、本質的に前記から成るか、または前記から成り得る。使用に適切なCBMはシアル酸に親和性を示す。炭水化物結合モジュールは複数のファミリーに分類され、ファミリー40CBM（CBM40）のメンバーとして分類されるCBMが有用であり得る。ファミリー40CBMは約200残基の分子を含み、しばしばGH33シアリダーゼのN-末端で見出される。それらはまたGH33シアリダーゼのβ-プロペラに挿入されて見出されることがある。
使用される例示的な炭水化物結合モジュールは、コレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM：CBM40）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼに由来する等価（または相同）ドメイン（SpCBM：同様にCBM40）を含むことができる。もちろん、他の生物に存在する類似のまたは相同なシアル酸結合モジュールも“CBM”という用語の範囲内に包含されるべきである。
【００１０】
例示的なコレラ菌NanHシアリダーゼアミノ酸配列はアクセッション番号A5F7A4で寄託され、配列番号:1（781アミノ酸）として下記に再現される。
MRFKNVKKTA LMLAMFGMAT SSNAALFDYN ATGDTEFDSP AKQGWMQDNT NNGSGVLTNA
DGMPAWLVQG IGGRAQWTYS LSTNQHAQAS SFGWRMTTEM KVLSGGMITN YYANGTQRVL
PIISLDSSGN LVVEFEGQTG RTVLATGTAA TEYHKFELVF LPGSNPSASF YFDGKLIRDN
IQPTASKQNM IVWGNGSSNT DGVAAYRDIK FEIQGDVIFR GPDRIPSIVA SSVTPGVVTA
FAEKRVGGGD PGALSNTNDI ITRTSRDGGI TWDTELNLTE QINVSDEFDF SDPRPIYDPS
SNTVLVSYAR WPTDAAQNGD RIKPWMPNGI FYSVYDVASG NWQAPIDVTD QVKERSFQIA
GWGGSELYRR NTSLNSQQDW QSNAKIRIVD GAANQIQVAD GSRKYVVTLS IDESGGLVAN
LNGVSAPIIL QSEHAKVHSF HDYELQYSAL NHTTTLFVDG QQITTWAGEV SQENNIQFGN
ADAQIDGRLH VQKIVLTQQG HNLVEFDAFY LAQQTPEVEK DLEKLGWTKI KTGNTMSLYG
NASVNPGPGH GITLTRQQNI SGSQNGRLIY PAIVLDRFFL NVMSIYSDDG GSNWQTGSTL
PIPFRWKSSS ILETLEPSEA DMVELQNGDL LLTARLDFNQ IVNGVNYSPR QQFLSKDGGI
TWSLLEANNA NVFSNISTGT VDASITRFEQ SDGSHFLLFT NPQGNPAGTN GRQNLGLWFS
FDEGVTWKGP IQLVNGASAY SDIYQLDSEN AIVIVETDNS NMRILRMPIT LLKQKLTLSQ
N
配列番号:1のCBM領域はアミノ酸残基25から216であり、この配列は配列番号:2であり得る。
【００１１】
例示的な肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼアミノ酸配列はアクセッション番号P62575で寄託されてあり、配列番号:3（1035アミノ酸）として下記に再現される。
MSYFRNRDID IERNSMNRSV QERKCRYSIR KLSVGAVSMI VGAVVFGTSP VLAQEGASEQ
PLANETQLSG ESSTLTDTEK SQPSSETELS GNKQEQERKD KQEEKIPRDY YARDLENVET
VIEKEDVETN ASNGQRVDLS SELDKLKKLE NATVHMEFKP DAKAPAFYNL FSVSSATKKD
EYFTMAVYNN TATLEGRGSD GKQFYNNYND APLKVKPGQW NSVTFTVEKP TAELPKGRVR
LYVNGVLSRT SLRSGNFIKD MPDVTHVQIG ATKRANNTVW GSNLQIRNLT VYNRALTPEE
VQKRSQLFKR SDLEKKLPEG AALTEKTDIF ESGRNGKPNK DGIKSYRIPA LLKTDKGTLI
AGADERRLHS SDWGDIGMVI RRSEDNGKTW GDRVTITNLR DNPKASDPSI GSPVNIDMVL
VQDPETKRIF SIYDMFPEGK GIFGMSSQKE EAYKKIDGKT YQILYREGEK GAYTIRENGT
VYTPDGKATD YRVVVDPVKP AYSDKGDLYK GNQLLGNIYF TTNKTSPFRI AKDSYLWMSY
SDDDGKTWSA PQDITPMVKA DWMKFLGVGP GTGIVLRNGP HKGRILIPVY TTNNVSHLNG
SQSSRIIYSD DHGKTWHAGE AVNDNRQVDG QKIHSSTMNN RRAQNTESTV VQLNNGDVKL
FMRGLTGDLQ VATSKDGGVT WEKDIKRYPQ VKDVYVQMSA IHTMHEGKEY IILSNAGGPK
RENGMVHLAR VEENGELTWL KHNPIQKGEF AYNSLQELGN GEYGILYEHT EKGQNAYTLS
FRKFNWDFLS KDLISPTEAK VKRTREMGKG VIGLEFDSEV LVNKAPTLQL ANGKTARFMT
QYDTKTLLFT VDSEDMGQKV TGLAEGAIES MHNLPVSVAG TKLSNGMNGS EAAVHEVPEY
TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTAGEE AAPTVEKPEF
TGGVNGTEPA VHEIAEYKGS DSLVTLTTKE DYTYKAPLAQ QALPETGNKE SDLLASLGLT
AFFLGLFTLG KKREQ
配列番号:3のCBM領域はアミノ酸残基121から305であり、この配列は配列番号:4であり得る。
したがって、本開示の多様な特徴および実施態様でシアル酸結合分子として使用されるCBMは、配列番号:1若しくは2またはそのシアル酸結合フラグメントの配列を有するタンパク質またはペプチドを含むことができる。
【００１２】
有用なシアル酸結合分子は、コレラ菌の（シアリダーゼをコードする）nanH遺伝子（配列番号:1によって提供される）または別の生物に存在する等価または相同遺伝子（例えば、肺炎連鎖球菌の等価/相同nanAシアリダーゼ遺伝子（配列番号:3参照））によってコードされるタンパク質性部分を含むことができる。
使用されるシアル酸結合分子は、配列番号:1および2のコレラ菌シアリダーゼ分子の残基約1、5、10、15、25または30から（すなわち1−30、またはその間の任意のアミノ酸残基から）残基約150、175、200、210、216、220−781（150から781の任意の残基（その間の任意の残基を含む））を含むことができる。例えば、使用されるシアル酸結合分子は、上記配列番号:1の残基25から残基約216に対応する配列を有するペプチドを含むことができる。
さらに別の適切なシアル酸結合分子は、配列番号:3若しくは4の配列またはそのシアル酸結合フラグメントを有するタンパク質またはペプチドを含むことができる。例えば、有用なシアル酸結合分子は、（シアリダーゼをコードする）肺炎連鎖球菌nanA遺伝子のシアル酸結合ドメインによってコードされるタンパク質性部分を含むことができる。例えば使用されるシアル酸結合分子は、配列番号:3および4の肺炎連鎖球菌シアリダーゼ分子の残基約80、90、100、110、120、121から130から（すなわち残基約80から130のいずれか（その間の任意の残基を含む）から）残基約250、275、300、305、310、320−1035（すなわち約250−1035の任意の残基（その間の任意の残基を含む））を含むことができる。例えば、使用されるシアル酸結合分子は、上記配列番号:3の残基121から残基約305に対応する配列を有するペプチドを含むことができる。
【００１３】
使用されるシアル酸結合分子は1つ以上のCBMを含むことができる。例えば、適切なシアル酸結合分子は、ただ1つのCBM、例えばただ1つのVcCBMまたはただ1つのSpCBMを含むことができる。また別には、使用されるシアル酸結合分子は、複数のまたは多数の（すなわち2つ以上の）CBMを含むことができる。複数のCBMを含むシアル酸結合分子は、“多価シアル酸結合分子”または“多価CBM”と称することができる。例えば、多価CBMは、2つ以上のVcCBMまたは2つ以上のSpCBMを含むことができる。多価CBMは異なるCBMの混合物、例えば1つ以上のVcCBMと1つ以上のSpCBMとの混合物を含むことができる。
例えば、多価CBM分子（例えばVc4CBM分子）は、アミノ酸/ペプチドリンカーによって連結される多数のCBMを含む構築物として調製できる。各CBM（例えばVcCBM）は、例えば5、10または15アミノ酸を含むペプチドによって別のものと連結できる。例示すれば、以下のペプチドのいずれか1つ以上を用いて2つ以上のCBMを連結し、多価CBMを生成することができる：
（i）5アミノ酸リンカー：ALNGS、LQALG、GGNSG
（ii）10アミノ酸リンカー：ALNGSGGGSG、LQALGGGGSL
（iii）15アミノ酸リンカー：ALNGSGGGSGGGGSG
したがって、本発明の多様な特徴および実施態様（使用、使用されるシアル酸結合分子、方法および医薬）は、（i）1つ以上のVcCBM、（ii）1つ以上のSpCBM、および（iii）多価CBMから成る群から選択されるシアル酸結合分子を含む、前記から成る、または本質的に前記から成るシアル酸結合分子を活用する。
【００１４】
使用されるシアル酸結合分子はさらにまたオリゴマー化ドメインを含むことができる。適切なオリゴマー化ドメインは、自己連合してマルチマー（例えばトリマー）構造を形成する能力を示す。使用されるオリゴマー化ドメインは、上記に述べたオリゴマー化特性を有する任意の分子またはその任意の機能的フラグメント含むことができる。例えば、1つ以上（例えば2つ）のシアル酸結合分子（例えばCBM）を結合、連結または融合させてオリゴマードメインにすることができる。続いて、生成シアル酸結合分子::オリゴマー化ドメイン“融合物”を、細胞増殖および/または活性の調節のためおよび/または本明細書開示の疾患および/または症状の治療または予防のための分子として、（1つ以上のそのような他の“融合物”と一緒に）用いることができる。
適切なオリゴマー化ドメインは、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のシュードアミニダーゼ（pseudaminidase）から誘導できる。例示的な緑膿菌シュードアミニダーゼ配列のアミノ酸配列はアクセッション番号PAO579で寄託され、配列番号:5（438アミノ酸）として下記に再現される。
MNTYFDIPHR LVGKALYESY YDHFGQMDIL SDGSLYLIYR RATEHVGGSD GRVVFSKLEG
GIWSAPTIVA QAGGQDFRDV AGGTMPSGRI VAASTVYETG EVKVYVSDDS GVTWVHKFTL
ARGGADYNFA HGKSFQVGAR YVIPLYAATG VNYELKWLES SDGGETWGEG STIYSGNTPY
NETSYLPVGD GVILAVARVG SGAGGALRQF ISLDDGGTWT DQGNVTAQNG DSTDILVAPS
LSYIYSEGGT PHVVLLYTNR TTHFCYYRTI LLAKAVAGSS GWTERVPVYS APAASGYTSQ
VVLGGRRILG NLFRETSSTT SGAYQFEVYL GGVPDFESDW FSVSSNSLYT LSHGLQRSPR
RVVVEFARSS SPSTWNIVMP SYFNDGGHKG SGAQVEVGSL NIRLGTGAAV WGTGYFGGID
NSATTRFATG YYRVRAWI
配列番号:5のオリゴマー化ドメインはアミノ酸残基333から438に由来し、この配列は配列番号:6であり得る。
【００１５】
したがって、使用されるオリゴマー化ドメインは、配列番号:5によって提供される緑膿菌シュードアミニダーゼトリマー化ドメイン（PaTD）の残基約250、275、300、310、320、333、340から350（すなわち残基約250から残基約350（その間の任意の残基を含む））から残基約400、410、420、430または438（すなわち残基約400から残基438の任意の残基（その間の任意の残基を含む））を含むことができる。例えば、有用なシアル酸結合分子は、残基333から438を含む配列番号:6のオリゴマー化ドメインを利用することができる。
使用されるシアル酸結合分子は、図1に提示される1つ以上のCBM系分子を含むことができる。例えば、適切なシアル酸結合分子は2つ以上のVcCBMを含む（本質的に前記から成るかまたは前記から成る）ことができ、当該VcCBMは場合によってオリゴマー化ドメイン（例えばPaTDまたはそのオリゴマー化フラグメント）に融合、結合または複合物化（conjugated）される。シアル酸結合分子は、2つの融合（結合）VcCBMを含むか、前記から成るかまたは本質的に前記から成ることができ、当該VcCBMは順にオリゴマー化ドメインに融合される（例えば、図1に示されるVc2CBMTD分子を参照）。
使用される他のシアル酸結合ドメインは2つ以上のSpCBMを含むことができ、前記SpCBMは、場合によってオリゴマー化ドメイン（例えばPaTDまたはそのオリゴマー化フラグメント）に融合、結合または複合物化（conjugated）される。使用されるシアル酸結合分子は、2つの融合（または結合）SpCBMを含むか、前記から成るかまたは本質的に前記から成ることができ、当該SpCBMは順にオリゴマー化ドメインに融合される（例えば、図1に示されるSp2CBMTD分子を参照）。
【００１６】
したがって本開示は以下を提供する:
（i）細胞増殖および/または細胞活性を調節する方法で使用されるCBM、前記方法は細胞とCBMを接触させる工程を含む；
（ii）細胞増殖および/または細胞活性を調節する方法、前記方法は細胞とCBMを接触させる工程を含む。前記方法はin vitroの方法であり得る；
（iii）異常な細胞増殖および/または分裂によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防で使用されるCBM；
（iv）異常な細胞増殖および/または分裂によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防用医薬の製造のためのCBMの使用；
（v）異常な細胞増殖および/または分裂によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状を治療および/または予防する方法、前記方法は治療的に有効な量のシアル酸結合分子をその必要がある対象動物に投与する工程を含む；
（vi）癌の治療および/または予防で使用されるCBM；
（vii）癌の治療および/または予防用医薬の製造のためのCBMの使用；
（viii）癌を治療および/または予防する方法、前記方法は治療的に有効な量のシアル酸結合分子をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
上記の実施態様（i）から（viii）のいずれか1つで、CBMは2つ以上のファミリー40CBMを含む多価CBMであり得る。例えば、上記（i）から（viii）のいずれか1つで、CBMは、2つ以上のVcCBMおよび/またはSpCBMを含む（本質的に前記から成るか、または前記から成る）ことができ、前記VcCBMおよび/またはSpCBMは、場合によってオリゴマー化ドメイン（例えばPaTDまたはそのオリゴマー化フラグメント）に融合、結合または複合物化される。シアル酸結合分子は、2つの融合（または結合）VcCBMまたは2つの融合（または結合）SpBCMを含むか、前記から成るかまたは本質的に前記から成ることができ、それらは順にオリゴマー化ドメインに融合される（例えば、図1に示されるVc2CBMTDおよびSp2CBMTD分子を参照）。
【００１７】
上記の見地から、本開示は以下を提供する:
（i）細胞増殖および/または細胞活性を調節する方法で使用されるコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）、前記方法は、細胞をコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）と接触させる工程を含む；
（ii）細胞増殖および/または活性を調節する方法、前記方法は、細胞をコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）と接触させる工程を含む。前記方法はin vitroの方法を含むことができる；
（iii）異常な細胞増殖および/または分裂によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防で使用される、コレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）；
（iv）異常な細胞増殖および/または分裂によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状の治療および/または予防用医薬の製造のための、コレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）の使用；
（v）異常な細胞増殖および/または分裂によって引き起こされる、前記が一因となる、および/または前記を特徴とする疾患および/または症状を治療および/または予防する方法、前記方法は、治療的に有効な量のコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）をその必要がある対象動物に投与する工程を含む；
（vi）癌の治療および/または予防で使用される、コレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）；
（vii）癌の治療および/または予防用医薬の製造のためのコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）の使用；
（viii）癌を治療および/または予防する方法、前記方法は治療的に有効な量のコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
【００１８】
加えて、本開示は以下を提供する:
（i）腫瘍増殖の調節（方法）で使用される、（本明細書記載の）CBMおよび/またはコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）；
（ii）腫瘍増殖の調節で使用される医薬の製造における、（本明細書記載の）CBMおよび/またはコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）の使用；
（iii）腫瘍増殖を調節する方法、前記方法は、治療的に有効なまたは腫瘍増殖を調節する量の（本明細書記載の）CBMおよび/またはコレラ菌NanHシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（VcCBM）および/または肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（SpCBM）をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
シアル酸と結合する分子、特に細胞結合受容体の部分である分子はさらにまた、いくつかの組織または細胞に他の実在物を標的照準するかまたはデリバリーする目的のために当該他の実在物と複合物化、結合若しくは接合、または連合させることができる分子として適用できる。このタイプの分子は、また別には“治療弾頭”または“複合物”として公知であり得る。理論に拘束されないが、ある種の細胞受容体および膜結合分子におけるシアル酸の存在は、複合物化された異種分子（すなわち当該シアル酸結合分子とは区別されかつ異なる分子）を前記細胞または前記細胞を含む組織にデリバリーする手段としてシアル酸分子を利用することを可能にし得る。したがって、複合物化シアル酸分子は癌の治療で有用であり、シアル酸結合分子（癌細胞および/または腫瘍で発現されるシアル酸に対して親和性を有する）を用いて治療部分および/または細胞傷害性部分を当該癌に向かわせることができる。
【００１９】
例示すれば、本明細書記載のシアル酸結合分子（任意のCBM系分子を含む）を、例えば治療力を有するおよび/または細胞傷害性部分と複合物化させることができる。したがって、本開示はシアル酸結合分子複合物に関する。
シアル酸結合分子複合物は、異種部分と複合物化させた（接合、結合或いは連合させた）本開示のシアル酸結合分子を含むことができる。異種部分は治療力を有するおよび/または細胞傷害性部分を含むことができ、前記部分はシアル酸結合分子の何らかの部分と複合物化させることができる。例えば、異種部分はシアル酸結合分子の一端または両端と複合物化させることができる。異種部分は、追加的に或いはまた別に、シアル酸結合分子の内部部分と複合物化させることができる（または融合させることすら可能である）。しかしながら、異種分子をシアル酸結合分子と複合物化させることはできるが、当該部分は（その複合物化も）、当該シアル酸結合分子のシアル酸結合特性を（実質的に）妨害せず、または停止させず、または減弱させるべきでないことは理解されるであろう。
記載したように、異種部分は、シアル酸を含む細胞または組織を冒す疾患の治療に有用な薬剤であり得る。例えば、薬剤は癌などの治療で使用される化学療法剤であり得る。異種部分は、細胞を死滅させるかまたは細胞でアポトーシスを誘発することができる細胞傷害性部分であり得る。異種部分は、特異的な細胞を特定の組織に補充することができる分子を含むことができる。例えば、異種部分は、例えばT細胞受容体（TCR）であることができ、前記は例えば腫瘍または癌組織にT細胞を補充する手段として用いることができる。
本開示は、本明細書に記載する多様な使用、医薬および方法で使用される組成物を提供することができる。したがって、本明細書記載のシアル酸結合分子はいずれも使用のために処方することができる。便宜上および下記の組成物、処方などに関連して、本明細書記載のシアル酸結合分子および前記を含む任意の複合物（例えばシアル酸結合分子::薬剤複合物/融合物）は、“シアル酸結合分子”という総称内に含まれるべきであることは留意されよう。
【００２０】
1つのシアル酸結合分子（または複数の分子）を、使用のためにおよび治療用組成物または医薬組成物として処方することができる。多様な組成物が本明細書記載の1つ以上のシアル酸結合分子を含むことができ、与えられるいずれの治療も、これら組成物の1つ以上の投与を（一緒に、同時にまたは別々に）要求することができる。
本明細書記載の多様なシアル酸結合分子を、経腸（経口を含む）、非経口および/または局所投与のために処方することができ、正確な処方は投与ルートにより変動し得ることは当業者には理解されるであろう。
本発明の医薬組成物は慣習的に調製することができ、医薬で通例用いられる例えば以下に記載される物質を含むことができる：Remington's The Sciences and Practice of Pharmacy, 22nd Edition（Pharmaceutical Press 2012）；および/またはHandbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition（compiled by Rowe et al, Pharmaceutical Press, 2012）（前記書類及び参考文献の全ての完全な内容は参照により本明細書に含まれる）。
本開示の治療用組成物または医薬組成物（すなわちシアル酸結合分子を含み、本明細書記載の医薬または方法のいずれかで（細胞増殖および/または活性の調節および/または癌治療のための方法または医薬を含む）使用される組成物）は、1つ以上の医薬的に許容できる賦形剤、担体、アジュバントおよび緩衝剤と一緒に処方することができる。組成物は、例えば経口的に（粘膜を含む）、非経口的に、経腸的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、または所望の効果を達成するために有用な任意の他のルートを介して投与することができる。本事例で、所望の効果には細胞の増殖/活性の調節、前記と関連する疾患/症状および/または癌の治療または予防、および/または腫瘍増殖の調節が含まれる。記載したように、選択した投与ルートにしたがって、処方物の厳密な組成は変動し得る。
【００２１】
シアル酸結合分子を含み対象動物に投与される治療用組成物または医薬組成物は、当該化合物および/またはそのシアル酸結合特性を不活化または変性させる可能性がある、酵素、酸および他の天然の化合物/状態（例えば、免疫系の化合物（抗体を含む）、細胞およびプロセスを含む）の作用からシアル酸結合分子を保護する材料で被覆、カプセル化または被包化することができる。
シアル酸結合分子を含む組成物での使用に利用できる多様な標準的および通常的賦形剤はとりわけ、非経口、経腸、経口（粘膜を含む）ルート、およびシアル酸結合分子と有害な反応を生じない他の投与ルートのために適切な医薬的に許容できる有機または無期担体物質である。
シアル酸結合分子が非経口投与用に処方される場合、組成物は無菌的であり得る。
組成物は油系溶液または水溶液、懸濁物および/または乳液を含むことができる。
他の実施態様では、組成物は、インプラントの形態、例えば（溶解性または生物分解性）フィルム、ペッサリーまたはインプラント（座薬を含む）を採用することができる。
シアル酸結合分子を含む医薬調製物は、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、塩（浸透圧に影響を与えるときに使用される）、緩衝剤、および/または活性化合物と有害な反応を生じない他の物質と混合され得る。
本明細書記載のシアル酸結合分子の1つ以上を経口投与用に処方して投与することができる。記載したように、経口投与には粘膜投与が含まれ、粘膜投与自体には鼻内および/または吸入投与が含まれよう。
【００２２】
使用される組成物には固体投薬形が含まれ、前記は経口投与に適切である。これらには、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、および顆粒が含まれ得る。与えられるいずれの固体投薬形においても、シアル酸結合分子（または前記を含む任意の複合物）は少なくとも1つの不活性な医薬的に許容できる賦形剤と一緒に混合され得る。適切な賦形剤の例は当業者には公知であろうが、例えば充填剤、保湿剤、湿潤剤、結合剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、吸着剤、滑沢剤、または前記の混合物が含まれ得る。錠剤、ピルまたはカプセルはさらにまた緩衝剤を含むことができる。固体投薬形（例えば錠剤、糖衣錠、カプセル、ピルおよび/または顆粒）はまた、コーティングおよびシェル（例えば胃腸環境および/または胃酸に対して保護するコーティング）を用いて調製できる。
固体投薬形は乳白剤を含むことができ、腸管の特異的部分でのまたは特異的部分への活性物質（この場合にはシアル酸結合分子または前記を含む複合物）の遅延放出を確保するように処方することができる。
経口投与用の固体組成物はユニット投薬形で処方することができ、各投薬形は適切な用量のシアル酸結合分子（または前記を含む複合物）を含む。任意の既定固体投薬形に含まれるシアル酸結合分子（または前記を含む複合物）の正確な量は、意図される使用に応じて変動するであろう。固体組成物は“ユニット用量”を含むことができ、ユニット用量は、治療期間の過程にわたって所望の効果（例えば細胞増殖および/または活性の調節）を生じるように計算された量のシアル酸結合分子（または前記を含む複合物）を含む。
経口投与用の液体投薬形は、エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルを（記載したように）含むことができる。当該化合物または組成物に加えて、液体投薬形は、当業界で一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水または他の溶媒、安定化剤および乳化剤を含むことができる。
【００２３】
シアル酸結合分子は任意の適切な量で用いることができる。記載したように、シアル酸結合分子は経口投与、粘膜投与または非経口投与のために処方することができ、したがって厳密な処方は意図される投与ルートに左右され得る。任意の既定用量に存在するシアル酸結合分子の量は0.1μg−1000μgの領域に存在し得る。例えば、約0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、1μg、10μg、20μg、25μg、50μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、または900μgの量である。選択量のシアル酸結合分子を、一定体積の医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤および/または緩衝剤中で処方することができる。賦形剤、希釈剤または緩衝剤の体積は約10μLから5mLであり得る。例えば、シアル酸結合分子（CBM）の必要量を、約15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL、200μL、250μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL、2mL、3mLまたは4mLと結合させる（または処方する）ことができる。例えば、100μgの量のシアル酸結合分子を約250μLの賦形剤と結合させて、最終濃度が400μg/mLのシアル酸結合分子濃度を得ることができる。約0.1μg/mL−1mg/mLの濃度の用量を用いることができる。前記は例えば5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mLまたは900μg/mLの用量である。
使用に際して、1用量のシアル酸結合分子（細胞分裂および/または分化異常（例えば癌）の治療および/または予防の部分として投与される）が、何日間または何週間にわたって複数回投与され得る。例えば、最初（または第一）の投与後、1用量のシアル酸結合分子を約（+/-1または2日）3、4、5、6、7、17、21、28および/または35日後に再び投与することができる。任意の既定日に一定用量のシアル酸結合分子を1、2、3または4回以上、細胞分裂および/または分化異常の発達に抗する適切な治療に影響を与えるためにまたは予防を誘発するために最良と考えられる任意のルートによって投与することができる。
本発明は以下の図面を参照することによってこれから詳細に記述されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】多価CBM形の構築ブロックおよびそれらのシアル酸に対する親和性。  a：VcCBM、球体として描かれたα-2,3-シアリルラクトースを含むコレラ菌シアリダーゼの残基25−216（PDB:1w0p）。b：SpCBM、α-2,3-シアリルラクトースを含む肺炎連鎖球菌NanAシアリダーゼの残基121−305（PDB:4c1w）。c：TD（トリマー化ドメイン）、虹色の緑膿菌シュードアミニダーゼの残基333−438（PDB:2w38）；他の2つのモノマーは単色で示される。d：多価形、それらの分子量、原子価、および25℃で表面プラズモン共鳴（SPR）により決定したα-2,3-シアリルラクトースに対する結合親和性（VcCBM、Vc2CBMおよびVc3CBMのKD値は以前に報告されている（Connaris et al., 2009））。タンデムリピートCBMおよびTD融合オリゴマーCBMは5アミノリンカーによって連結される（詳細はConnaris et al., 2014）。
【図２】A549ヒト肺癌細胞におけるCBM用量分析。左パネル：Vc2CBM（上段パネル）およびSp2CBMTD（下段パネル）の10倍連続希釈の一回分用量（すなわちウェル当たり400μgから0.04μg）。右パネルは左パネルと同一であるが、ただし細胞は3日間の間に2回CBMを与えられる。CBMを無血清DMEMで希釈し、細胞と3時間インキュベートした後で除去し、細胞維持のためにDMEM/5％FCSで置き換えた。
【図３】A549ヒト癌細胞での創傷治癒アッセイ。細胞をスクラッチして人工的に創傷をもたらし、その後PBS（A）、無血清DMEM中の100μg/mLのSp2CBMTD（B）、または100μg/mLのVc2CBMTD（C）で処理した。細胞を24時間そのままにし、続いてアクチン染色して細胞骨格を可視化させた。
【図４】（A）50μg/mLのモノマーCBM様ドメイン（TcTs）またはヘキサマーCBM（Vc2CBMTDまたはSp2CBMTD）（前記薬剤は無血清DMEMまたは2mMシアリルラクトース含有無血清DMEM（+Sia）に再懸濁された）で24時間（37℃、5％CO2）処理後のA549ヒト肺癌細胞の代謝活性を示すMTTアッセイの吸収である。（B）処理細胞とPBS単独細胞（コントロール）の24時間後の細胞形態学。
【図５Ａ】mCBM40を用いたヒト肺癌細胞株（A549）のスクラッチアッセイデータ。ヘキサマーVc2CBMTDおよびSp2CBMTDを250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。位相差画像は、PBS、無血清DMEM中のVc2CBMTDまたはSp2CBMTDで細胞を処理してから1時間および72時間後の創傷治癒アッセイを示す。各画像の下の黄色棒線は直径400μmを示す。
【図５Ｂ】mCBM40の非存在下および存在下における72時間後のA549細胞の（ii）創傷治癒パーセンテージおよび（ii）創傷閉鎖の速度を示すグラフである。ダネット多重比較検定をこのデータで実施した。****は統計的有意を示す（p＜0.0001）。
【図６Ａ】mCBM40を用いたヒト子宮頸癌細胞株（HeLa）のスクラッチアッセイデータ。ヘキサマーVc2CBMTDおよびSp2CBMTDを250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。蛍光画像は、PBS、無血清DMEM中のVc2CBMTDまたはSp2CBMTDで細胞を処理してから1時間および72時間後の創傷治癒アッセイを示す。各画像の下の黄色棒線は直径400μmを示す。
【図６Ｂ】mCBM40の非存在下および存在下における72時間後のHeLa細胞の（ii）創傷治癒パーセンテージおよび（ii）創傷閉鎖の速度を示すグラフである。ダネット多重比較検定を当該データで実施した。****は統計的有意を示す（p＜0.0001）。
【図７】100μg（400μg/mL）のSp2CBMTDの存在下および非存在下における肺癌（A549）、乳癌（MDA.MB.231およびMCF-7）および結腸癌（SW480およびSW620）細胞タイプのスクラッチアッセイデータ。（a）100μgのSp2CBMTDの存在下および非存在下における72時間後のA549細胞の創傷閉鎖パーセンテージを示すグラフ。（b）100μgのSp2CBMTDの存在下および非存在下における72時間後のHeLa細胞の創傷閉鎖パーセンテージを示すグラフ。（c）100μgのSp2CBMTDの存在下および非存在下における72時間後のMDA.MB.231細胞の創傷閉鎖パーセンテージを示すグラフ。（d）100μgのSp2CBMTDの存在下および非存在下における72時間後のMCF-7細胞の創傷閉鎖パーセンテージを示すグラフ。（e）100μgのSp2CBMTDの存在下および非存在下における72時間後のSW620細胞の創傷閉鎖パーセンテージを示すグラフ。（f）100μgのSp2CBMTDの存在下および非存在下における72時間後のSW480細胞の創傷閉鎖パーセンテージを示すグラフ。全てのデータをコントロールに対して標準化した。アンペアードｔ検定をデータで実施し、****で強調されるように統計的有意（p）がコントロールとSp2CBMTDとの間で示された（p＝0.0001）。
【図８】ヘキサマーCBM40の存在下および非存在下におけるHeLa細胞の細胞分裂。グラフは時間（h）に対する細胞数を示す。Vc2CBMTDおよびSp2CBMTDを250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。PBSをコントロールとして供した。
【図９Ａ】テトラマーCBM40を用いた肺癌細胞株（A549）および子宮頸癌細胞株（HeLa）のスクラッチアッセイデータ。Vc4CBMを250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。Vc4CBMの非存在下および存在下における72時間後のA549細胞の創傷閉鎖の（i）パーセンテージおよび（ii）速度を示すグラフである。アンペアードｔ検定を全データで実施し、****で強調される統計的有意（p）がコントロールとVc4CBMとの間で示された（p＝0.0001）。
【図９Ｂ】テトラマーCBM40を用いた肺癌細胞株（A549）および子宮頸癌細胞株（HeLa）のスクラッチアッセイデータ。Vc4CBMを250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。B：Vc4CBMの非存在下および存在下における72時間後のHeLa細胞の創傷閉鎖の（i）パーセンテージおよび（ii）速度を示すグラフである。アンペアードｔ検定を全データで実施し、****で強調される統計的有意（p）がコントロールとVc4CBMとの間で示された（p＝0.0001）。
【図１０Ａ】創傷治癒アッセイを用いた、操作マルチマーCBM40の成分部分の72時間後の癌細胞株細胞分裂における効果。モノマー（VcCBM、SpCBM）およびマルチマー（Vc2CBMTDおよびSp2CBMTD）を250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。A459（a）およびHeLa（b）細胞における、PBS、無血清DMEM中のSpCBMまたはVcCBM処理から1時間および72時間後の創傷治癒アッセイを示す画像。各画像の下の黄色棒線は直径400μmを示す。
【図１０Ｂ】創傷治癒アッセイを用いた、操作マルチマーCBM40の成分部分の72時間後の癌細胞株細胞分裂における効果。モノマー（VcCBM、SpCBM）およびマルチマー（Vc2CBMTDおよびSp2CBMTD）を250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。A549およびHeLa細胞株における72時間後のCBM存在下および非存在下の創傷閉鎖のパーセンテージ（i）（ii）および速度（iii）（iv）をそれぞれ示す。ダネット多重比較検定を当該データで実施した。0.0001の統計的有意（p）は****で強調され、0.05のpは*で強調されている。
【図１１Ａ】創傷治癒アッセイを用いた、操作マルチマーCBM40の成分部分の72時間後のA459（A）およびHeLa（B）細胞株の細胞分裂における効果。トリマー化ドメイン（TD）を250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。（a）TD存在下および非存在下の72時間後のA549細胞の創傷閉鎖のパーセンテージを示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、統計的有意（p）はコントロールとTDの間で示されなかった（p＝0.120）。（b）TD存在下および非存在下の72時間後のHeLa細胞の創傷閉鎖のパーセンテージを示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、統計的有意（p）はコントロールとTDの間で示されなかった（p＝0.120）。（c）CBM存在下および非存在下の72時間後のA549細胞の創傷閉鎖の速度を示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、*で強調されるように、0.05のpがコントロールとTDの間で示された（p＝0.0212）。（d）TD存在下および非存在下の72時間後のHeLa細胞の創傷閉鎖の速度を示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、*で強調されるように、0.05のpがコントロールとTDの間で示された（p＝0.0212）。
【図１１Ｂ】創傷治癒アッセイを用いた、操作マルチマーCBM40の成分部分の72時間後のA459（A）およびHeLa（B）細胞株の細胞分裂における効果。トリマー化ドメイン（TD）を250μL体積中の100μg（400μg/mLの濃度を表す）で試験した。（a）TD存在下および非存在下の72時間後のA549細胞の創傷閉鎖のパーセンテージを示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、統計的有意（p）はコントロールとTDの間で示されなかった（p＝0.120）。（b）TD存在下および非存在下の72時間後のHeLa細胞の創傷閉鎖のパーセンテージを示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、統計的有意（p）はコントロールとTDの間で示されなかった（p＝0.120）。（c）CBM存在下および非存在下の72時間後のA549細胞の創傷閉鎖の速度を示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、*で強調されるように、0.05のpがコントロールとTDの間で示された（p＝0.0212）。（d）TD存在下および非存在下の72時間後のHeLa細胞の創傷閉鎖の速度を示すグラフ。アンペアードt検定をデータについて実施し、*で強調されるように、0.05のpがコントロールとTDの間で示された（p＝0.0212）。
【図１２】CBMの存在下および非存在下で72時間後の洗浄と更なる72時間後のA549細胞のスクラッチアッセイプラス洗浄。一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を当該データで実施した。0.0001の統計的有意（p）は****で強調され、0.0002のpは***で強調される。（a）72時間コントロールとの間の0.0001、0.0002および0.05のpはそれぞれ****、***、*で示される。（a）CBMの存在下および非存在下で72時間後および72時間の時点でのCBM洗浄後144時間（洗浄後72時間）におけるA549細胞の創傷閉鎖のパーセンテージを示すグラフ。（b）CBMの存在下および非存在下で72時間後および72時間の時点でのCBM洗浄後144時間（洗浄後72時間）におけるA549細胞の創傷閉鎖の速度を示すグラフ。
【図１３】肺癌細胞株（A549）の走化性アッセイデータ。A549細胞を8.0ｘ105細胞/ウェルで播種した。24時間後に蛍光を測定し、バックグラウンドを修正した。CBMを100μL体積中の100μg（1mg/mLの濃度を表す）で試験した。ダネット多重比較検定を当該データで実施した。0.0001の統計的有意（p）は****で強調される。
【図１４Ａ】Hwangら（1974）から改案した凝集アッセイ。mCBM40（Vc4CBM、Vc2CBMTDおよびSp2CBMTD（いずれも1mg/mL））の非存在下（コントロール）および存在下で5分、30分および1時間のA549細胞における546nmの吸収を示すグラフ。PBS単独のコントロールも加えた。
【図１４Ｂ】Hwangら（1974）から改案した凝集アッセイ。mCBM40（Vc4CBM、Vc2CBMTDおよびSp2CBMTD（いずれも1mg/mL））の非存在下（コントロール）および存在下で1時間および24時間のA549細胞における546nmの吸収を示すグラフ。
【図１４Ｃ】グラフは、氷上で24時間インキュベートした後、mCBM40の非存在下（コントロール）および存在下で20分にわたって546nmにおける10秒毎のA549細胞の吸収を示す。
【図１４Ｄ】グラフは、氷上で24時間インキュベートした後、mCBM40の非存在下（コントロール）および存在下で20分にわたって546nmにおける10秒毎のA549細胞の吸収の速度を示す。
【図１５】カスパーゼ依存アポトーシス。グラフは、4時間、24時間および72時間、CBMの存在下および非存在下でCaspase-Glo(商標)3/7試薬のカスパーゼ切断に続いてルシフェラーゼによって生成された標準化(バックグラウンド修正実施)ルミネセンスシグナルを示す。一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を当該データで実施した。0.05以下の統計有意(p)は*で強調されている。
【図１６】細胞生存率。グラフは、4時間、24時間および72時間、CBMの存在下および非存在下でA549生細胞プロテアーゼによるGF-AFC基質の切断によって生成された標準化(バックグラウンド修正実施)蛍光シグナルを示す。一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を当該データで実施した。0.05以下の統計有意(p)は*で強調されている。
【図１７】CBMの存在下および非存在下における癌細胞株A549の細胞傷害性データ。グラフは、4時間、24時間および72時間、CBMの存在下および非存在下でA549死細胞プロテアーゼによるbis-AAF-R110基質の切断によって生成された標準化(バックグラウンド修正実施)蛍光シグナルを示す。一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を当該データで実施した。0.05以下の統計有意(p)は*で強調されている。
【実施例１】
【００２５】
コンフルエントなA549ヒト肺癌細胞および高濃度のSp2CBMTD（400−800μg）を用いたin vitroのmCBM40用量決定実験では、3日後に細胞増殖または活性はほとんどまたは全く観察されなかった。このことは、培養液（DMEM/5％FCS）の色がそのままであったときに提示された（培養液が利用されるとき色は変化するであろう）(図2参照)。
前記の観察は、我々の操作したシアル酸認識CBMはシアリル化された宿主細胞受容体を標的として狙い撃つ（標的照準する）ことによって、細胞（癌細胞を含む）の分裂および遊走に影響を与えるかもしれないとの仮説をもたらした。
この仮説の更なる支持を得るために、細胞の遊走および分裂を測定する創傷スクラッチアッセイ並びに細胞生存性（MTT）アッセイをA549ヒト肺癌細胞で実施した。これらの細胞はCBMで24時間処理された。結果をPBSのみを与えたコントロール細胞と比較した。
図3で分かるように、CBM処理ウェルでは24時間後にPBSと比較して創傷治癒はほとんどまたは全く観察されなかった。PBS処理細胞は250μmのスクラッチ直径を示し、24時間後に孤立細胞が人工創傷へ遊走した。対照的に、両CBM処理細胞のスクラッチ直径はざっと710μmで、細胞の形態変化はVc2CBMTD処理細胞の細胞死または細胞周期停止と関連するようであった。Sp2CBMTD処理A549細胞による創傷への貧弱な遊走もまた存在した。興味深いことに、Sp2CBMTDに関してフィロポディアの形成が観察された（通常、前記は細胞の運動性と連動する現象である（Mattila and Lappalainen, 2008））。
代謝活性は、PBSのみを与えられた細胞と比較して、無血清（FCS無し）培養液中のVc2CBMTDを与えられた細胞で低下した。Vc2CBMTD処理細胞の細胞形態もまた変化したことが観察され、コントロールと比較したとき細胞の外観はより球形であった（細胞機能停止の徴候）。興味深いことに、細胞の代謝活性および表現型は2mMのシアリルラクトースの添加により回復するように見えた。類似濃度のシアル酸をまたFCSで見出すことができ、このことが、Sp2処理細胞と比較してVc2CBMTD処理細胞が3日後に生存を維持した理由であるかもしれない（Sp2処理細胞は、少なくともアッセイで用いられた高用量のCBMではFCSの存在によって影響を受けないように見える（図2））。また別には、培養液中の遊離シアリルラクトースがVc2CBMTDのグリカン結合部位と競合し、したがってA549細胞の回復および分裂を可能にするということかもしれない。
Sp2CBMTD処理細胞に関しては、代謝活性のわずかな（顕著ではない）低下もまた存在した。しかしながら、顕著さ欠いたのはおそらく細胞に投与された濃度が低いためである。
Vc2処理細胞と比較して、シアリルラクトースの存在下では細胞増殖のわずかな回復が存在したが、これはSp2CBMTDの性質のためである。Sp2CBMTDはまた炎症促進媒介因子を刺激することが知られていて、図2で観察された現象はその免疫調節的役割のためである可能性が高い。Sp2CBMTDは、多数の炎症媒介因子（例えばIFN-γ、VEGF、IP-10、および好中球およびマクロファージの標的照準で重要であることが知られている他のサイトカイン（Govorkova et al., 2015））を増加させることが示されている。前記特色は癌細胞に対する免疫系の標的照準のために理想的であり得る。TcTs処理細胞に関しては、CBM様ドメインは細胞代謝および形態学にほとんど影響をもたなかった。
【実施例２】
【００２６】
癌細胞株の創傷治癒および分裂アッセイ
方法：全てのCBM40タンパク質をConnarisらの記載（Connaris et al., 20141）にしたがって調製したた。以下の癌細胞株（A549（ヒト肺）、HeLa（子宮頸部）、MDA.MB.231およびMCF-7（乳房）並びにSW620およびSW480（結腸））をATCCから購入した。HeLa細胞を除く全ての細胞を10％FBS、DMEM（1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む高グルコース）中で維持し、37℃および5％CO2でインキュベートした。核限定GFPを発現するHeLa細胞（IncuCyte NucLight Greenレンチウイルス試薬（Cat No.4626 Essen Biosciences）を利用）は、0.5μg/mLのピューロマイシンを含む完全培養液で維持された。創傷治癒アッセイのために、24ウェルプレート（Nunc）に細胞（2.5ｘ105細胞/ウェル）を播種し、対応するそれらの維持培養液500μL中で維持し、37℃および5％CO2で24時間インキュベートした。創傷/スクラッチの作成前にウェルを500μLの無血清DMEMにより洗浄した。無菌的な200μLのピペットチップ（Axygen）を用いて、各ウェルの中央に（ウェルの上部から下部に走る）まっすぐな線として創傷/スクラッチを作成した。続いてウェルを500μLの無血清DMEMで洗浄した後で、ざっと希釈した250μLのCBM（同様に無血清DMEMで調製）を添加した。無血清培養液はまたコントロールとしてのウェルにも加えられた。プレートを37℃および5％CO2で10−30分間インキュベートした後、さらに250μLの4％FBS、DMEMを各ウェルに添加し（FBS最終濃度2％）、したがって最終CBM濃度は20−200μg/mLの範囲であった。IncuCyte ZOOM（Essen BioScience）装置を用いて、各ウェルの低速度撮影画像を収集した。これは、72時間の間1時間毎に各ウェルの創傷/スクラッチで3画像を収集するために設定された。データ収集のために、IncuCyte ZOOM 2016ソフトを用いて、各画像について創傷幅を測定し測定値を照合した（手作業で3回の創傷測定を実施した）。細胞分裂アッセイのために、24ウェルプレートで、GFP標識HeLa細胞をmCBM40の存在下または非存在下で72時間にわたって増殖させた。細胞分裂は、IncuCyte ZOOM装置を用い、時間経過における細胞画像の専有領域（コンフルエンスのパーセンテージ）を分析することによってモニターした。細胞分裂はコンフルエンス増加に正比例する。
【００２７】
結果：図5および6は、異なる癌細胞タイプA549およびHeLaに対する種々のヘキサマーmCBM40の効果を測定する創傷治癒アッセイの結果を示す。当該結果は、ヘキサマーCBM40のVc2CBMTDおよびSp2CBMTDは、未処理のままの細胞と比較して両癌タイプで72時間後に有意に創傷閉鎖を阻害することを示している。マルチマーCBMはまた、シアリル化受容体の弁別的発現を示した他の癌タイプでも創傷閉鎖を阻害した。乳癌および結腸癌の両方の細胞増殖が用量依存態様で阻害されることが見いだされた（図7は、乳癌および結腸癌の2つの転移性細胞タイプに対して用いた最高用量のmCBM40の結果を示す）。有効性の相違が、高転移性および低転移性乳癌細胞株MDA.MB.231およびMCF-7の間で観察された。CBMはMDA.MB.231細胞株に対してより強力であった。有効性は、結腸癌細胞株のSW620とSW480とでは異なるグリコシル化プロフィールにもかかわらず大きくは相違しなかった。2つの結腸癌細胞株および軽度乳癌細胞株に対してカバーされる72時間後の創傷パーセンテージは低かった（30％から40％の間）。
創傷治癒の阻害は、図8に示すように（時間経過時に細胞増殖の減少を示すGFP標識HeLa細胞が用いられた）、時間経過中の細胞分裂の欠如のためであった。mCBM40の抗分裂作用はまた、テトラマー型mCBM40、Vc4CBMによりA549およびHeLa細胞の両方で観察された（図9）。
抗分裂作用が操作CBMのマルチマー的性質の結果であるか否かを決定するために、A549およびHeLa細胞株をVcおよびSp系CBM40のモノマー型（VcCBM、SpCBM、各々100μg）で処理し、72時間インキュベートした。続いてデータをそれらのマルチマー型対応物のデータと比較した。図10は、CBM処理後のA549およびHeLa細胞株の創傷治癒アッセイの結果を示す。用いた用量で、マルチマーCBMは創傷閉鎖の速度に対して顕著な効果を示した。
さらにまた、mCBM40の非CBM40成分（すなわちトリマー化ドメイン（TD））もまた、このドメインがスクラッチアッセイで観察された抗分裂作用に寄与し得るか否かを決定するためにスクラッチアッセイで試験した。図11は、TDドメインは、CBMと同じ用量で与えられたとき、A549細胞の細胞増殖または分裂に影響を与えるようには見えないことを示した。なぜならば、創傷閉鎖のパーセンテージおよび速度は、未処理細胞と同一であったからである。
CBMタンパク質の抗分裂活性が創傷/スクラッチアッセイ後に逆転され得るか否かを確立させるために、洗浄実験を試みた。72時間のインキュベーション後に、処理ウェルを0.5mLの2％FBS DMEM（高グルコース、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）で2回洗浄した。続いて同じ培養液（0.5mL）を各ウェルに添加して、さらに72時間インキュベートした。EVOS FL（ThermoFisher Scientific）装置を用いて、0時間および72時間に各ウェルで創傷/スクラッチの3画像を手作業で収集した。画像Jソフトを用いて、各画像について創傷幅を測定し測定値を照合した（画像J測定ツールはEVOS FLのためのスケールバーに対して目盛り修正が実施された）。mCBM40の除去後、細胞が創傷内に向けて遊走および/または分裂するのが明瞭に観察された（図12）。創傷閉鎖の速度およびパーセンテージは、洗浄後に“正常”/コントロールに復帰するのが認められた。洗浄後のVcCBM2TDでの創傷閉鎖の速度は、72時間後のコントロール条件のそれよりもわずかに速くなるのが観察された。これらの観察は、mCBM40はシアリル化細胞表面受容体と相互作用することによって癌細胞との細胞応答を調節できることを示唆する。
【００２８】
遊走アッセイ
方法：ボイデン（Boyden）チャンバーアッセイを選択して、細胞遊走がマルチマーCBM40によって妨害されるか否かを決定した。ボイデンチャンバーアッセイ（8μm、蛍光分析様式）を製造業者の指示に記載されたように調製した（Cell Biolabs CytoSelect 96ウェル細胞遊走アッセイ）。最終CBM濃度は20−200μg/mLの範囲であった。
結果：図13は当該遊走アッセイの結果を示し、前記は、被検CBMはA549細胞の遊走を阻害したことを示している。遊走の欠如は、細胞懸濁物にmCBM40を直接添加したときにmCBM40によってA549細胞が凝集したことに起因するという可能性を排除するために、凝集アッセイもまた分光測定アッセイを用いて実施された（Hwang et al, 19742）。時間経過時のA549細胞の吸収/沈降速度は条件間で大きくは相違しなかった（図14A）。このことはさらにまたより長期間の吸収アッセイおよび吸収速度/動的変化アッセイによって検証された（図14B、CおよびD）。このことは、1mg/mLのmCBM40の存在下ではA549細胞（0.8ｘ106細胞/mL）の凝集は生じないことを示唆している。したがって、A549細胞の走化性の阻害は細胞遊走の直接的阻害に起因し細胞凝集のためではないということができる。
細胞のアポトーシス、生存性および細胞傷害性アッセイ
方法：マルチマーCBMが細胞のアポトーシスを引き起こすか否かを決定するために、プロメガ（Promega）ApoTox-GloTMトリプレックスアッセイを用いた。このアッセイはA549細胞を用いて実施された。実験の24時間前にウェル当たり10,000細胞を播種した。CBMおよびコントロールを最終体積100μLでウェルに添加した。最終CBM濃度は0.1−1mg/mLであった。試験暴露4時間、24時間、48時間および72時間の条件で細胞を培養した（図8）。
結果：48時間後に、Vc2CBMTD（400μg）はカスパーゼ3の活性化に対応するルミネセンスシグナルの上昇（アポトーシスの特徴）を示した。4時間、24時間および48時間の他の条件はいずれも未処理細胞のルミネセンスレベルと同様なレベルを示した（図11）。切断されたAFCの蛍光シグナルは48時間後のCBM条件で低かった（図12）。このことは、基質の透過性の減少、休眠状態および/または細胞周期停止に入る細胞の減少のどちらかに起因し得る。ほとんどの細胞傷害性事象でにおいて、生存率及び細胞傷害性の測定は反比例するであろう。細胞傷害性の増加が存在しない生存率の減少は、膜の完全性の変化を生じることなく正常な細胞の分割を変化させる（すなわち細胞周期を停止させる）化合物/薬剤で認められる。多数のCBMがR110について蛍光レベルの低下を示し、低レベルの細胞傷害性を示した（図13）。この細胞生存性、細胞傷害性およびアポトーシス実験の結果は、mCBM40の存在下で、A549細胞は細胞周期停止または休眠状態にあることを示唆する。
考察
これらの結果は、乳房、結腸、子宮頸部および肺細胞を用いた実験によって示されるように、CBM（Vc4CBM、Vc2CBMTDおよびSp2CBMTD）は創傷治癒（分裂および遊走）に必要な細胞行動を阻害し、多数の癌タイプに対して有効である（ただし非CBM成分（TD）はそうではない）ことを確認する。A549細胞株の凝集は観察されなかった。創傷治癒アッセイで遊走および分裂細胞の両方の阻害が洗浄を介して回復させることができる。プロメガApoTox-GloTMトリプレックスアッセイから得られた結果は、CBMはA549細胞株で細胞周期の停止または休眠を引き起こすことを示唆する。
【００２９】
実施例１のための参考文献
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実施例２のための参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2019532670.tif 000010
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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