(57)【要約】  本発明は、微生物の抗菌剤感受性を迅速に決定するための方法及びキットに、一部で関する。この方法及びキットは、微生物の表面に特異的又は非特異的に結合するシグナル伝達剤を使用する。好ましくは、シグナル伝達剤は、ユウロピウム配位錯体などの増幅基を有する。
2019508062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法であって、
微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤及び微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤の存在下にて、微生物の液体懸濁液をインキュベートすること、
シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、並びに
１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法であって、
微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤の存在下にて、微生物の液体懸濁液をインキュベートすること、
微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を添加すること、
シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、及び
１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定すること
を含む方法。
【請求項３】
シグナル伝達剤の添加が、インキュベーション工程の前又はインキュベーション工程の間に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
シグナル伝達剤の添加がインキュベーション工程の後に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法であって、
微生物の増殖を促進する条件下で、１つ以上の抗菌剤をそれぞれ含有する複数のチャンバを含むカートリッジ内で微生物の液体懸濁液をインキュベートすること、
微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を複数のチャンバに添加すること、
非結合シグナル伝達剤を除去すること、及び
１つ以上の対照と比較して複数のチャンバにおけるシグナル伝達レベルを決定し、これにより１つ以上の抗菌剤に対する微生物の感受性を決定すること
を含む方法。
【請求項６】
カートリッジが、抗菌剤を含まない又は微生物が感受性でない１つ以上の抗菌剤を含まない、１つ以上の対照チャンバをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
カートリッジが、少なくとも２、４、６、８、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６又はそれ以上のチャンバを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
微生物の表面への結合が非特異的である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
非特異的結合が非共有結合相互作用を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非特異的結合が共有結合を形成することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
シグナル伝達剤が、微生物の表面に結合することができる化学基及び／又は生化学基を含み、前記表面が、膜、壁、タンパク質、細胞小器官、サッカリド、脂質、細胞エンベロープ及び／又は核酸の１つ以上を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
シグナル伝達剤が、微生物の表面の生体分子に結合することができる化学基及び／又は生化学基を含み、前記表面生体分子が、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポーリン、β−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、脂質Ａ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質、並びにこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
シグナル伝達剤が、シグナル増幅剤と、微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法であって、
微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤及びシグナル増幅剤と微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含むシグナル伝達剤の存在下で微生物をインキュベートすること、
シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、並びに
１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定すること
を含む方法。
【請求項１５】
微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法であって、
微生物の増殖を促進する条件下で抗菌剤の存在下にて微生物をインキュベートすること、
シグナル増幅剤と微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含むシグナル伝達剤を添加すること、
シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、及び
１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定すること
を含む方法。
【請求項１６】
シグナル伝達剤の添加が、インキュベーション工程の前、インキュベーション工程の開始時又はインキュベーション工程の間に行われる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
シグナル伝達剤がインキュベーション工程の後に添加される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
微生物を液体懸濁液中でインキュベートする、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
液体懸濁液が、生物学的試料から増殖させた微生物単離物を液体培地に接種することによって調製される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
微生物の液体懸濁液が、未処理生物学的試料から調製される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
未処理生物学的試料が培養工程を経ていない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
微生物の液体懸濁液が、培養又は処理された生物学的試料から調製される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
生物学的試料が、血液、脳脊髄液、尿、便、膣試料、痰、気管支肺胞洗浄液、咽喉、鼻／創傷スワブ、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
方法が、インキュベーションの前又はインキュベーション中に固体表面上で微生物を捕捉する工程を含まない、請求項１〜２３のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
方法が、インキュベーション工程中又はインキュベーション工程後に固体表面上で微生物を増殖させる工程を含まない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
インキュベーションが、微生物の液体懸濁液を撹拌することを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
微生物の液体懸濁液が、インキュベーションの間、機械撹拌、超音波撹拌及び／又は磁気撹拌によって連続的又は不連続的に撹拌される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
インキュベーションが３１〜３７℃で行われる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
シグナル伝達剤が、リンカー基Ｌを含む化学化合物であり、ここで、
Ｌが、化学若しくは生化学増幅剤である増幅基１０４と共有結合を形成するか、又は
Ｌが、化学若しくは生化学増幅剤である増幅基１０４と共有結合を形成することができるか、又は
Ｌが、化学若しくは生化学増幅剤である増幅基１０４と１つ以上の非共有結合相互作用を形成するか、又は
Ｌが、化学若しくは生化学増幅剤である増幅基１０４と１つ以上の非共有結合相互作用を形成することができる、
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記リンカー基Ｌが、
微生物の表面と共有結合又は非共有結合相互作用を形成することができる化学的部分１０１、
化学的部分１０１及び化学的部分１０３に共有結合しているスペーサー部分１０２、並びに
化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４と共有結合を形成している又は形成することができる化学的部分１０３
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リンカー基Ｌが、
微生物の表面と共有結合又は非共有結合相互作用を形成することができる化学的部分１０１、
化学的部分１０１及び化学的部分１０３に共有結合しているスペーサー部分１０２、並びに
化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４と非共有結合相互作用を形成している又は形成することができる化学的部分１０３
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
化学的部分１０１が、微生物の表面と共有結合を形成することができる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記共有結合を、カップリングを促進する１つ以上の作用物質の存在下で形成することができる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
カップリングを促進する前記１つ以上の作用物質が、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＣＭＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ウッドワード試薬、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、アクリレート、アミド、イミド、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート、イソチオシアネート、有機酸、モノマー、ポリマー、シラン、シリケート、ＮＨＳ、スルホ−ＮＨＳ、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
化学的部分１０１が、微生物の表面と非共有結合相互作用を形成することができる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記非共有結合相互作用が、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、π−π相互作用若しくは水素結合、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
化学的部分１０１が求核性官能基を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記求核性官能基が、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ又はチオールである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記求核性官能基が、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮＨ２又は−ＯＮＨ２である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
化学的部分１０１が求電子性官能基を含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記求電子性官能基が、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、トシレートエステル、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、イミドエステル、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、カーボネート、ハロアセチル、クロロトリアジン、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アジリジン、アクリロイル誘導体、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、塩化アセチル又は無水酢酸を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記求電子性官能基が、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、
【化１】
2019508062.tif 000038
を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
スペーサー部分１０２が疎水性である、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
スペーサー部分１０２が親水性である、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
スペーサー部分１０２が、オリゴマー若しくはポリマーであり、ペプチド結合に由来するか又は無機結合からなる、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
スペーサー部分１０２が、
【化２】
2019508062.tif 000039
である反復基を含み、ここで、
ｎ、ｍ、ｏ、ｐ及びｑの各々が独立して１〜３００の整数である、
請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
スペーサー部分１０２が
【化３】
2019508062.tif 000040
である、請求項３０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
化学的部分１０３が求核性基を含む、請求項３０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
化学的部分１０３が求電子性基を含む、請求項３０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
化学的部分１０３が、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド又はビオチニルである基を含む、請求項３０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
化学的部分１０３が、
【化４】
2019508062.tif 000041
である基を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
化学的部分１０３が、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである基を含む化学構造から形成される、請求項３０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド又はビオチニルである前記の基が、増幅基１０４と共有結合を形成している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド又はビオチニルである前記の基が、増幅基１０４と非共有結合を形成している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
化学的部分１０３が、
【化５】
2019508062.tif 000042
である基を含む化学構造から形成される、請求項５３又は５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
リンカー基Ｌが、以下の構造：
【化６】
2019508062.tif 000043
［ここで、
Ｘが、
【化７】
2019508062.tif 000044
であり、
Ｒが、
【化８】
2019508062.tif 000045
であり、
Ｙが、
【化９】
2019508062.tif 000046
であり、
ｊ及びｋの各々が独立して０〜１００の整数であり、並びに
ｎ、ｍ、ｏ、ｐ及びｑの各々が独立して１〜１００の整数である］
を有するか又はこの構造から形成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５７】
Ｘが、微生物の表面と共有結合若しくは非共有結合相互作用を形成しているか若しくは形成することができ、
及び／又は
Ｙが、化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４と共有結合を形成しているか又は形成することができる、
請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
増幅基１０４が、触媒、フルオロフォア又は比色色素を含む、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
指示薬が、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロシウムからなる群より選択される１つ以上のランタニドである、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
１つ以上の増幅剤が、酵素、触媒及びナノ粒子からなる群より選択される、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
増幅基１０４が、ケミルミノフォア、量子ドット、酵素、鉄配位触媒、ユウロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体、サマリウム配位錯体、テルビウム配位錯体又はジスプロシウム配位錯体を含む、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
増幅基１０４がユウロピウム配位錯体を含む、請求項２９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
増幅基１０４が、
【化１０】
2019508062.tif 000047
2019508062.tif 000048
2019508062.tif 000049
である構造を含むユウロピウム配位錯体を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
シグナル伝達剤が、
【化１１】
2019508062.tif 000050
2019508062.tif 000051
2019508062.tif 000052
からなる群より選択される構造を含むか又はこの構造から形成される、請求項２９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
シグナル伝達剤が、
抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然糖ポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマー
の化学的部分と、
ランタニド配位錯体、ビオチン、抗体及び／又は酵素
とを含む構造を含むか又はこの構造から形成される、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
シグナル伝達剤が、
抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、バクテリオファージ、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然糖ポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマー
の化学的部分と、
ランタニド配位錯体及び／又は酵素とストレプトアビジン及び／又は抗体及び／又はアプタマーを含む増幅基１０４
とを含む構造を含むか又はこの構造から形成される、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
化学的部分が、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
化学的部分が、合成及び／又は天然リガンド及び／又はペプチドを含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
リガンド及び／又はペプチドが、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リジン及びこれらの組み合わせから選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
化学的部分が、合成及び／又は天然ポリマー及び／又は糖ポリマーを含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
天然及び／又は合成ポリマーが、直鎖又は分岐であり、並びにアミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］及びこれらの組み合わせから選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
天然及び／又は合成ポリマー及び／又は糖ポリマーが、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、第四級アミン、ピリジニウムトリブロミド、ヒスチジン、リジン、システイン、アルギニン、スルホニウム、ホスホニウム、又はコブロックポリマー、グラフトポリマー及び交互ポリマーを含むがこれらに限定されない、これらの組み合わせを含むがこれらに限定されない部分を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
化学的部分が、マンノース結合レクチン、他のレクチン、アネキシン及びこれらの組み合わせから選択される糖タンパク質を含む、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ユウロピウム配位錯体が、
【化１２】
2019508062.tif 000053
2019508062.tif 000054
である構造を含む、請求項６１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
１つ以上の対照が、他の点では同一条件であるが、抗菌剤を含まない条件下又は微生物が感受性でない１つ以上の抗菌剤を含む条件下で、微生物から測定された陽性対照を含む、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
１つ以上の対照が、他の点では同一条件であるが、栄養素を含まない条件下で、微生物から測定された対照を含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
１つ以上の対照が、他の点では同一条件であるが、微生物の増殖を阻害することが公知の１つ以上の毒素を含む条件下で、微生物から測定された対照を含む、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
微生物が、細菌、真菌、原生動物及び／又は古細菌である、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
細菌が、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、エーリキア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルドネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリア属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ノカルジア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
真菌が、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、イサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ブラストミセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、コクシジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒストプラスマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ニューモシスティス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、スタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、エキセロヒラム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、白癬、ムコールミセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
インキュベーションを約２０分〜約７２時間続ける、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
インキュベーションを約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間又は１２時間続ける、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
インキュベーションを１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満又は２時間未満続ける、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
微生物の抗菌剤感受性が、１８時間未満、１４時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満又は２時間未満で決定される、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
微生物を分離することが、遠心分離、磁気分離、ろ過、電気泳動、誘電泳動、沈殿、凝集又はこれらの組み合わせによって実施される、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
遠心分離のｇ力が５００×ｇを超える、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
磁気分離が、微生物に結合する１つ以上の結合部分と会合した磁気ビーズを提供し、これにより非結合シグナル伝達剤から前記微生物を分離することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
磁気ビーズに会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤と会合した化学的部分又はシグナル伝達剤の化学的部分と同一である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
磁気ビーズに会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤と会合した化学的部分又はシグナル伝達剤の化学的部分と異なる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤と同時に微生物に結合する、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤による結合の前に微生物に結合する、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤による結合の後に微生物に結合する、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分が、微生物を沈殿させる１つ以上のポリマーと会合する、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
微生物を沈殿させる１つ以上のポリマーがカチオン性である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
微生物を沈殿させる１つ以上のポリマーがポリ（エチレングリコール）である、請求項９３又は９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
磁気ビーズが２０ｎｍ〜２０ミクロンの範囲の直径を有する、請求項８７〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
ろ過が、０．４５ミクロン以下、好ましくは０．２ミクロン以下の細孔を含むフィルタを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
シグナルレベルを決定する前に、０回、１回又は２回の洗浄を実施する、請求項１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
シグナル伝達剤の添加の前に、０回、１回、又は２回の洗浄を実施する、請求項１〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
シグナルレベルを決定する前に、シグナルレベルを増強する展開溶液を添加する、請求項１〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
シグナルが光及び／又は電気シグナルである、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
光シグナルが、蛍光、時間分解蛍光、吸収及び／又は発光である、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
シグナルレベルを決定することが、無傷の微生物に関連するシグナルレベルを測定することを含む、請求項１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
シグナルレベルを決定することが、無傷の微生物に関連しないシグナルレベルを測定することを含む、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
微生物が１つ以上の抗菌剤に耐性、中等度耐性若しくは感受性であるかどうかを決定する工程、及び／又は無傷の微生物に関連するシグナルレベルに基づいて１つ以上の抗菌剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定する工程をさらに含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
複数の抗菌剤を並行して試験する、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
微生物の同定が、微生物が得られた生物学的試料から及び／又は微生物が得られた生物学的試料に由来する培養物から実施される、請求項１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
微生物の同定が、表現型解析及び／又は遺伝子解析を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
遺伝子解析が、微生物に関連することが公知の１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を検出することを含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
表現型解析が、微生物に関連することが公知の１つ以上のタンパク質を検出することを含む、請求項１０８又は請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
表現型解析が微生物の可視化を含む、請求項１０８又は請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
複数の抗菌剤感受性試験を並行して実施する、請求項１〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
自動化されている、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
微生物が生物学的試料から得られる及び／又は生物学的試料に由来する培養物から誘導される、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
生物学的試料が、微生物の感染を有することが疑われる被験体から得られる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
被験体に、微生物が感受性である少なくとも１つの抗菌剤を含む治療薬を投与する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
少なくとも１つの抗菌剤を、微生物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）以上で投与する、請求項１１５又は請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
少なくとも１つの抗菌剤が、アミカシン、アミノグリコシド、アミノグリコシドアモキシシリン、アミノグリコシド類、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラネート、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、抗毒素、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、β−ラクタム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロール、セフラドキシル、セファレキシン、セファロチン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、シクロセリン、ダルババンシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、フルクロキサシリン、フルオロキノロン、フルオロキノロン類、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド系抗生物質、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルミシン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ポシゾリド、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、ラデゾリド、ラキシバクマブ、リファブチン、リファンピシン、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、シルバースルファジアジン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、スピラマイシン、ストレプトグラミン類、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファアセトアミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルファイソオキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テジゾリド、テイコプラニン、テイキソバクチン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チカルシリン／クラブラネート、チカルシリン／クラブラン酸、チゲサイクリン、���ゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トブラマイシン、トレゾリド、トリメトプリム（Ｂｓ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン及びバンコマイシン又はこれらのジェネリック医薬品又はこれらの変種からなる群より選択される、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
微生物の抗菌剤感受性を決定するためのキットであって、
関心対象の微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤、
微生物を含む試料をインキュベートするための溶液、及び
シグナル伝達剤からシグナルを生成するための１つ以上の試薬
を含むキット。
【請求項１２０】
シグナル伝達剤が、微生物に直接又は間接的に結合することができる１つ以上の結合部分と会合している、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
１つ以上の結合部分が、抗体、レクチン、天然及び／若しくは合成ペプチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然糖ポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマーから選択される、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
１つ以上の結合部分が、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２３】
１つ以上の結合部分が、合成リガンド及び／又は天然リガンド及び／又はペプチドを含む、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２４】
リガンド及び／又はペプチドが、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リジン及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１２３に記載のキット。
【請求項１２５】
１つ以上の結合部分が、合成ポリマー及び／又は天然ポリマー及び／又は糖ポリマーを含む、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２６】
天然及び／又は合成ポリマーが、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１２５に記載のキット。
【請求項１２７】
天然及び／又は合成ポリマー及び／又は糖ポリマーが、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、又はコブロックポリマー、グラフトポリマー及び交互ポリマーを含むがこれらに限定されない、これらの組み合わせを含むがこれらに限定されない部分を含む、請求項１２５に記載のキット。
【請求項１２８】
１つ以上の結合部分が、マンノース結合レクチン、他のレクチン、アネキシン及びこれらの組み合わせから選択される糖タンパク質を含む、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２９】
１つ以上の結合部分が２つ以上の結合部分を含む、請求項１２０〜１２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３０】
１つ以上の結合部分が、微生物表面上に存在する１つ以上の生体分子に直接又は間接的に結合する、請求項１２０〜１２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３１】
表面生体分子が、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポーリン、β−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、脂質Ａ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質、並びにこれらの組み合わせから選択される、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３２】
結合部分がナノ粒子である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１３３】
結合部分がバクテリオファージである、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１３４】
１つ以上の結合部分が、１つ以上の生体分子に特異的に結合する、請求項１２０〜１３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３５】
１つ以上の結合部分が、１つ以上の種特異的生体分子に結合する、請求項１３４に記載のキット。
【請求項１３６】
１つ以上の結合部分が微生物に非特異的に結合する、請求項１２０〜１３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３７】
非特異的結合が非共有結合相互作用を含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
非特異的結合が共有結合を形成することを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
上清から微生物を磁気的に分離するための磁気ビーズをさらに含む、請求項１１９〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４０】
磁気ビーズが、微生物に結合する１つ以上の結合部分と会合している、請求項１３９に記載のキット。
【請求項１４１】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤と会合しているものと同一である、請求項１４０に記載のキット。
【請求項１４２】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分が、シグナル伝達剤と会合しているものと異なる、請求項１４０に記載のキット。
【請求項１４３】
磁気ビーズが２０ｎｍ〜２０ミクロンの範囲の直径を有する、請求項１３９〜１４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４４】
結合部分と関心対象の微生物との間の結合を増強するための１つ以上のイオン又は小分子をさらに含む、請求項１１９〜１４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４５】
溶液が０．１５Ｍ未満の塩を含む、請求項１１９〜１４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４６】
キットが微生物結合剤をさらに含み、及び結合部分が前記微生物結合剤を介して間接的に微生物に結合する、請求項１１９〜１４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４７】
結合部分が、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン若しくはアビジンであるか又はストレプトアビジン、ニュートラアビジン若しくはアビジンにコンジュゲートされており、及び微生物結合剤がビオチン化されている、請求項１４６に記載のキット。
【請求項１４８】
結合部分が、種特異的Ｆｃドメインに結合する抗体であり、及び微生物結合剤が、前記種特異的Ｆｃドメインを有する微生物に結合することができる抗体である、請求項１４６又は請求項１４７に記載のキット。
【請求項１４９】
シグナル伝達剤が、ケミルミノフォア、触媒又は酵素の１つ以上を含む、請求項１１９〜１４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５０】
酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ及びこれらの組み合わせの少なくとも１つである又は少なくとも１つを含む、請求項１４９に記載のキット。
【請求項１５１】
触媒が有機金属化合物を含む、請求項１４９に記載のキット。
【請求項１５２】
シグナル伝達剤がナノ粒子の形態で提供される、請求項１４９〜１５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５３】
シグナル伝達剤がナノ粒子内に封入されている、請求項１４９〜１５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５４】
ナノ粒子が解離性である、請求項１５２又は請求項１５３に記載のキット。
【請求項１５５】
解離性ナノ粒子が金属酸化物を含む、請求項１５４に記載のキット。
【請求項１５６】
金属酸化物が、酸化鉄、酸化セシウム及び／若しくは酸化セリウムであるか、又は酸化鉄、酸化セシウム及び／若しくは酸化セリウムを含む、請求項１５５に記載のキット。
【請求項１５７】
測定可能なシグナルを生成するための展開試薬をさらに含む、請求項１１９〜１５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５８】
１つ以上の試薬が、触媒反応のための試薬及び前記触媒反応を停止させる試薬を含む、請求項１１９〜１５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５９】
シグナルを測定するための装置をさらに含む、請求項１１９〜１５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６０】
シグナルが光学的及び／又は電気的である、請求項１５９に記載のキット。
【請求項１６１】
光学的測定が、蛍光、時間分解蛍光、吸収及び／又は発光である、請求項１６０に記載のキット。
【請求項１６２】
マルチウェルプレートをさらに含む、請求項１１９〜１６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６３】
マルチウェルプレートが、２４ウェル、９６ウェル、１９２ウェル又は３８４ウェルプレートである、請求項１６２に記載のキット。
【請求項１６４】
請求項１〜１１８のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示をさらに含む、請求項１１９〜１６３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／２８１，６９８号、２０１６年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／２９８，８２１号、２０１６年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３２６，５４５号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，３７６号、２０１６年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／３７０，５７９号及び２０１６年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３８３，１９８号の優先権及び利益を主張するものである。上記特許出願の内容は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗菌剤耐性微生物感染は、感染した患者の罹患率、死亡率及び医療費の増加を含む臨床転帰不良に関連する。米国でのこのような施設におけるこれらの生物の有病率は、過去３０年間に着実に増加している。微生物の表現型抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、医師に適切な治療レジメンの情報を与えるために重要である。現在の方法を使用すると、ＡＳＴ測定は、典型的には少なくとも８時間を必要とし、多くの臨床微生物学研究室でのシフト作業のために一晩の工程となる。現在のＡＳＴ法からの決定を待つ間に、患者はしばしば広域スペクトルの抗菌剤を投与され、これは、しばしば患者の健康に重大な有害作用を及ぼし、及び／又は抗菌剤耐性流行病の増加に寄与する。さらに、正確な抗菌治療情報を得るまでのこの時間遅延は、患者の入院期間を延長させ、これにより患者への費用及び不便さを増大させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、微生物感染の抗菌剤感受性を迅速に決定する方法に対する必要性が存在する。本明細書に記載の方法は、既存のアッセイハードウェア構成要素と互換性があるので、費用効率の高い方法でこの必要性に対処するという点でさらに有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、微生物感染の抗生物質感受性の迅速な決定を可能にする。本発明は、１２時間未満、具体的には４時間未満で、正確で迅速な抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）の決定を提供する非特異的な表面結合アッセイの驚くべき発見に、一部で基づく。本発明（「高速ＡＳＴ」）は、複数の抗菌剤を用いて複数の微生物に関して試験した場合にＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の参照法を用いて得られた結果と一致する、正確な結果を提供する；しかしながら、本発明は、結果を得るのにＣＬＳＩ法よりも有意に短い時間しかかからない。さらに、本発明は、１つ以上の抗菌剤に耐性である臨床的に関連する微生物株に対する抗菌剤のＭＩＣと、抗菌剤に感受性である同じ微生物株に対する抗菌剤のＭＩＣとを正確に区別する。さらに、本発明は、特異的ではなく非特異的に（例えば化学的に保存された基又は微生物上の生化学的に保存された結合部位を介して）微生物に結合するシグナル伝達剤（例えばユウロピウム化合物）を含み得、これにより本発明の一般化を任意の微生物に拡大し、特定の感染性微生物を最初に同定する必要なしに適切な処置を開始することを可能にする。また、本発明は、例えば微生物の希薄な培養物から、又は患者の生物学的試料を介して、微生物が低い濃度で迅速に検出され得るシグナル増幅を可能にする。さらに、本発明は、化学的部分としてユウロピウム製剤を使用することができ、これにより本発明の方法のダイナミックレンジを拡大し、様々な微生物試料からのより正確な測定を可能にする。最後に、本発明は既存の機器と互換性があり、これにより現在の臨床検査室での迅速な採用を可能にする。したがって、本発明は、標準的な方法と比較して大幅に低減された量の時間と費用で、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤を特定の投与量で提供することができる。したがって、本発明は、患者の転帰を改善し、病院の費用を低減し、抗菌剤耐性微生物のさらなる進化を減少させるのに役立つ；したがって、本発明は、ＡＳＴ分野における重要なブレイクスルーである。
【０００５】
本発明の一態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤及び微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤の存在下で微生物の液体懸濁液をインキュベートする工程、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離する工程、並びに１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定する工程を含む。
【０００６】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤の存在下に微生物の液体懸濁液をインキュベートする工程、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を添加する工程、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離する工程、及び１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定する工程を含む。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で、１つ以上の抗菌剤をそれぞれ含有する複数のチャンバを含むカートリッジ内で微生物の液体懸濁液をインキュベートする工程、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を複数のチャンバに添加する工程、非結合シグナル伝達剤を除去する工程、及び１つ以上の対照と比較して複数のチャンバにおけるシグナルレベルを決定する工程を含む。
【０００８】
本発明の一態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤及びシグナル増幅剤と微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含むシグナル伝達剤の存在下で微生物をインキュベートすること、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、並びに１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定することを含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で抗菌剤の存在下にて微生物をインキュベートすること、シグナル増幅剤と微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含むシグナル伝達剤を添加すること、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、及び１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定することを含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するためのキットである。このキットは、関心対象の無傷（ｉｎｔａｃｔ）の微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤、微生物を含む試料をインキュベートするための溶液、及びシグナル伝達剤からシグナルを生成するための１つ以上の試薬を含む。
【００１１】
本明細書に記載される任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。本開示はこれらの詳細な説明と共に記載されているが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示するものであり、限定することを意図しない。他の態様、利点及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
【００１２】
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用されるすべての米国特許及び公開又は未公開米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用されるすべての公開外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他の公開されている参考文献、資料、原稿及び科学文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本発明の他の特徴及び利点は、図面並びに以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。
【００１４】
上記及びさらなる特徴は、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明からより明確に理解される。しかしながら、図面は説明のためだけのものであり、限定のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一般化された工程を示す概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の態様（「高速ＡＳＴ」）の主要な特徴を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の態様（「高速ＡＳＴ」）の主要な特徴を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の態様（「高速ＡＳＴ」）の主要な特徴を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の態様（「高速ＡＳＴ」）の主要な特徴を示すグラフである。
【図３】図３は、現在使用されている抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システムと本発明の態様において必要とされる工程とを比較する概略図である。
【図４】図４は、現在使用されているＡＳＴシステム（すなわちＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＶｉｔｅｋ２）を使用して結果を得るのに必要な時間遅延を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明（「高速ＡＳＴ」技術）及び標準的な一晩増殖とそれに続く６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）読み取りを用いた、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ株２９２１３）に対するクリンダマイシンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）測定の比較を示すグラフである。「高速ＡＳＴ」について示されているデータは、検出溶液とのインキュベーションの開始後５分の時点からのものであり、４つのウェルの平均及び標準偏差を表し、抗菌剤を含まない対照と比較した各アッセイタイプの値を示す。
【図６】図６は、本発明（「高速ＡＳＴ」技術）及び標準的な一晩増殖とそれに続く６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）読み取りを用いた、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ株２７８５３）に対するセフタジジムのＭＩＣ測定の比較を示すグラフである。示されているデータは、４つのウェルの平均及び標準偏差を表し、抗菌剤を含まない対照と比較した各アッセイタイプの値を示す。
【図７】図７は、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の２つの株：感受性株（ＡＴＣＣ株２７８５３）及び耐性株（ＡＴＣＣ株ＢＡＡ−２１０８）についての本発明（「高速ＡＳＴ」）を用いたＭＩＣ測定の比較を示すグラフである。示されているデータは４つのウェルの平均を表し、抗菌剤を含まない対照と比較した各アッセイの値を示す。
【図８】図８は、実施例２からのデータを要約した表である。これは、標準的な一晩のＯＤ６００手順のＭＩＣコールと「高速ＡＳＴ」技術によるＭＩＣコールとを比較する。示されているデータは、４つのウェルの平均を表し、抗菌剤を含まない対照と比較した各アッセイタイプの値を示す。
【図９】図９は、本発明（「高速ＡＳＴ」増幅技術）及び６００ｎｍでの標準光学密度技術（ＯＤ６００）の２つの技術についての生光シグナル対スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）の比較を示すグラフである。
【図１０】図１０は、７種の病原性細菌種についての、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の参照法と比較した本発明（「高速ＡＳＴ」法）のＭＩＣ結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例４で使用した細菌、抗菌剤及びシグナル伝達剤／化学的部分を同定する表である。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｃは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（図１２Ａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（図１２Ｂ）についての代表的なＳｅｎｓｉＴｉｔｒｅ（Ｒ）結果を示す表である。本発明を使用した、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｎｉｎ）のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）実験については、この抗菌剤には２つのウェルしか与えられなかったので、データは提示していない。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜図１２Ｃは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（図１２Ａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（図１２Ｂ）についての代表的なＳｅｎｓｉＴｉｔｒｅ（Ｒ）結果を示す表である。本発明を使用した、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｎｉｎ）のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）実験については、この抗菌剤には２つのウェルしか与えられなかったので、データは提示していない。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜図１２Ｃは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（図１２Ａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（図１２Ｂ）についての代表的なＳｅｎｓｉＴｉｔｒｅ（Ｒ）結果を示す表である。本発明を使用した、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｎｉｎ）のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）実験については、この抗菌剤には２つのウェルしか与えられなかったので、データは提示していない。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）臨床株に対する抗菌剤オキサシリン（図１３Ａ）、バンコマイシン（図１３Ｂ）及びレボフロキサシン（図１３Ｃ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）臨床株に対する抗菌剤オキサシリン（図１３Ａ）、バンコマイシン（図１３Ｂ）及びレボフロキサシン（図１３Ｃ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）臨床株に対する抗菌剤オキサシリン（図１３Ａ）、バンコマイシン（図１３Ｂ）及びレボフロキサシン（図１３Ｃ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株に対する抗菌剤アンピシリン（図１４Ａ）、シプロフロキサシン（図１４Ｂ）、イミペネム（図１４Ｃ）及びゲンタマイシン（図１４Ｄ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株に対する抗菌剤アンピシリン（図１４Ａ）、シプロフロキサシン（図１４Ｂ）、イミペネム（図１４Ｃ）及びゲンタマイシン（図１４Ｄ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株に対する抗菌剤アンピシリン（図１４Ａ）、シプロフロキサシン（図１４Ｂ）、イミペネム（図１４Ｃ）及びゲンタマイシン（図１４Ｄ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株に対する抗菌剤アンピシリン（図１４Ａ）、シプロフロキサシン（図１４Ｂ）、イミペネム（図１４Ｃ）及びゲンタマイシン（図１４Ｄ）についての本発明及びＣＬＳＩ参照法によって得られたＭＩＣ結果の比較を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明（「高速ＡＳＴ」）が、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の同じ臨床種に対し、１ヶ月間にわたって、ＣＬＳＩ標準参照法によって得られたのと同様のＭＩＣ結果を一貫して生じることを示すグラフである。
【図１６】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図１７】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図１８】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図１９】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図２０】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図２１】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図２２】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図２３】図１６〜図２３は、化学的に感受性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（「ＱＣ  ２５９２２」）及び臨床的に関連する抗菌剤耐性株（「臨床」）についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、イミペネム（図１６）、アンピシリン（図１７）、セフタジジム（図１８）、ゲンタマイシン（図１９）、レボフロキサシン（図２０）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）、シプロフロキサシン（図２２）及びセトリアキソン（図２３）である。
【図２４】図２４〜図２６は、化学的に感受性のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（「ＱＣ株２９２１３」）株についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、バンコマイシン（図２４）、ペニシリン（図２５）及びテイコプラニン（図２６）である。
【図２５】図２４〜図２６は、化学的に感受性のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（「ＱＣ株２９２１３」）株についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、バンコマイシン（図２４）、ペニシリン（図２５）及びテイコプラニン（図２６）である。
【図２６】図２４〜図２６は、化学的に感受性のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（「ＱＣ株２９２１３」）株についての、複数の抗菌剤に対する感受性を比較したグラフである。使用した抗菌剤は、バンコマイシン（図２４）、ペニシリン（図２５）及びテイコプラニン（図２６）である。
【図２７】図２７は、本発明の方法を臨床試料に直接使用し、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋａｗａｙ（一晩増殖の前に継代培養工程を実施する）で得られた臨床結果と比較したＭＩＣ結果を示すグラフである。
【図２８】図２８は、本発明の方法を臨床試料に直接使用し、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＭｉｃｒｏＳｃａｎ  Ｗａｌｋａｗａｙ（一晩増殖の前に継代培養工程を実施する）で得られた臨床結果と比較したＭＩＣ結果を示すグラフである。
【図２９】図２９は、グラム陽性菌溶液の検出された蛍光（ユウロピウムを含むシグナル伝達剤及びグラム陽性菌に特異的に結合する小麦胚芽凝集素の使用を介して）を、溶液中の細菌の濃度と比較して示すグラフである。
【図３０】図３０は、グラム陰性菌溶液の検出された蛍光（ユウロピウムを含むシグナル伝達剤及びグラム陰性菌に特異的に結合するポリミキシンＢの使用を介して）を、溶液中の細菌の濃度と比較して示すグラフである。
【図３１】図３１は、抗体結合ユウロピウム製剤をシグナル伝達剤として用いた場合に得られたＭＩＣ値を、抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をシグナル伝達剤として使用した場合に得られたＭＩＣ値と比較したグラフである。この臨床Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株に対するＳＸＴのＭＩＣは、ＣＬＳＩ一晩法により≦０．５μｇ／ｍｌであった。
【図３２】図３２は、細菌表面に非特異的に結合する２つのユウロピウム製剤に関して、特定の細菌濃度について得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示すグラフである。
【図３３】図３３は、細菌表面に非特異的に結合する２つのユウロピウム製剤に関して、２つの細菌種の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３４】図３４は、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関して、様々な細菌種の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３５】図３５は、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関して、様々な細菌種の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３６Ａ】図３６Ａは、グルタルアルデヒドを含む種々の洗浄を用いた場合に、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関して様々な細菌種の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、グルタルアルデヒドを含む種々の洗浄を用いた場合に、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関して様々な細菌種の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、グルタルアルデヒドを含む種々の洗浄を用いた場合に、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関して様々な細菌種の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３７】図３７は、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン、続いてストレプトアビジン−ユウロピウム（Ｅｕ−ＳＡｖ）を含む２段階工程を使用して、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関してＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３８】図３８は、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、続いてＥｕ−ＳＡｖを含む２段階工程を使用して、細菌表面に非特異的に結合するユウロピウム製剤に関してＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の細菌濃度について得られたＲＦＵを示すグラフである。
【図３９】図３９は、糸状増殖が微生物の抗菌剤感受性の体積測定に基づく決定に及ぼす交絡作用を説明する概略図である。糸状増殖に入る感受性細菌は、体積増加のために偽耐性に見えることがある。
【図４０】図４０は、ＡＳＴ測定における糸状微生物の干渉を最小化する方法を例示する概略図である。
【図４１】図４１は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ＭＩＣよりかなり上の濃度）で処理した及び処理していないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアンピシリン耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）についての、蛍光ナノ粒子を含むシグナル伝達剤を用いたアッセイの結果を示すグラフである。
【図４２】図４２は、様々なアンピシリン濃度での、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）についての蛍光ナノ粒子を含むシグナル伝達剤を用いたアッセイの結果を示すグラフである。エラーバーは３回の反復の標準偏差を示す。
【図４３】図４３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で官能基化された磁気ビーズが無傷の細菌に結合し、細菌を溶液から単離することができる能力を示すグラフである。
【図４４】図４４は、様々な量の抗菌剤を含む溶液から、官能基化された磁気ビーズによって単離された無傷の細菌の数を示すグラフである。
【図４５】様々な量の抗菌剤（ここでは、バンコマイシン「ＶＡＮ」）を含む溶液から、遠心分離によって及び官能基化された磁気ビーズによって単離された無傷の細菌の数を比較するグラフを含む。この臨床Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株に対するＶＡＮのＭＩＣは、ＣＬＳＩ一晩法により８μｇ／ｍｌであった。
【図４６Ａ】図４６Ａは、テトラアミノ有機金属配位子（ＴＡＭＬ（Ｒ））ナノ標識の設計及び性能を示す。図４６Ａは、ナノ標識の成分を示す概略図である。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、テトラアミノ有機金属配位子（ＴＡＭＬ（Ｒ））ナノ標識の設計及び性能を示す。図４６Ｂは、ＨＲＰ及びＴＡＭＬ（挿入図）の触媒比較を示すグラフである；破線は、ＨＲＰについては０．９９７、ＴＡＭＬについては０．９８７のＲ２での各データセットの線形最良適合である。図４６Ｂ及び図４６Ｃにおいて、シグナルをゼロ濃度で「１」に正規化し、誤差を伝搬し、エラーバーは±１標準偏差を表す。実験を３回重複して反復し、同様の結果を得た。
【図４６Ｃ】図４６Ｃは、テトラアミノ有機金属配位子（ＴＡＭＬ（Ｒ））ナノ標識の設計及び性能を示す。図４６Ｃは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡイムノアッセイのＴＡＭＬナノ標識対ＨＲＰの比較を示すグラフである。図４６Ｂ及び図４６Ｃにおいて、シグナルをゼロ濃度で「１」に正規化し、誤差を伝搬し、エラーバーは±１標準偏差を表す。実験を３回重複して反復し、同様の結果を得た。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本発明がより容易に理解されるために、いくつかの用語を最初に以下で定義する。以下の用語及び他の用語についての追加の定義は、本明細書全体を通して説明される。
【００１７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００１８】
特に明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は包括的であると理解され、「又は」と「及び」の両方を包含する。
【００１９】
本明細書で使用される「例えば」及び「すなわち」という用語は、単に例示の目的で使用され、限定を意図されず、明細書で明示的に列挙された項目のみを指すと解釈されるべきではない。
【００２０】
「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、「複数の」等の用語は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００又はこれ以上、及びこの間の任意の数を含むがこれらに限定されないと理解される。
【００２１】
逆に、「以下」という用語は、記述される値よりも小さい各々の値を含む。例えば、「１００ヌクレオチド以下」は、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１及び０個のヌクレオチドを含む。
【００２２】
「複数」、「少なくとも２つ」、「２つ以上」、「少なくとも２番目」等の用語は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００又はこれ以上、及びこの間の任意の数を含むがこれらに限定されないと理解される。
【００２３】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述される要素、整数若しくは工程、又は要素、整数又は若しくは工程の群を包含することを意味するが、任意の他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除することを意味しないことが理解される。
【００２４】
特に明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差以内であると理解される。「約」は、記述される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％又は０．００１％以内であると理解することができる。文脈から特に明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、「約」という用語によって修飾される。
【００２５】
表面は、細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜若しくは細胞被膜の外面；細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜若しくは細胞被膜の内面であり得るか；又は細胞壁、細胞エンベロープ、形質膜若しくは細胞被膜内に存在し得る。表面は、繊毛（ｃｉｌｉｕｍ）、線毛（ｐｉｌｕｓ）及びべん毛を含むがこれらに限定されない、細胞外に突出している細胞の構造体を含み得る。表面は、細胞小器官を含み得る。表面は、膜貫通タンパク質、細胞壁タンパク質、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外関連多糖、細胞内関連多糖、細胞外脂質、細胞内脂質、膜脂質、細胞壁脂質、タンパク質、多糖及び／又は細胞エンベロープに不可欠であるか若しくは関連する脂質を含み得る。表面は、核酸を含み得る。
【００２６】
表面は、シグナル伝達剤が結合又は会合する生体分子を含み得る。例示的な生体分子には、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポーリン、β−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、脂質Ａ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【００２７】
増殖は、微生物の増殖におけるように、数の増殖、長さの増加、体積の増加、並びに／又は微生物の核酸及び／若しくはタンパク質含量の増加を含む。
【００２８】
対照は、微生物が感受性でない抗菌剤を含み得る。例として、アッセイがグラム陽性菌の感受性を決定するために使用される場合は、対照（及び試験インキュベーション）は、グラム陰性菌を標的とする１つ以上の抗菌剤を含み得、アッセイが真核微生物の感受性を決定するために使用される場合は、対照（及び試験インキュベーション）は、１つ以上の抗菌抗微生物剤を含み得る。
【００２９】
対照は、他の点では同一条件であるが、抗菌剤を含まない条件下又は微生物が感受性でない１つ以上の抗菌剤を含む条件下で微生物から測定された陽性対照であり得る。
【００３０】
対照は、他の点では同一条件であるが、栄養素を含まない条件下で微生物から測定され得る。
【００３１】
対照は、他の点では同一条件であるが、微生物の増殖を阻害することが公知の１つ以上の毒素を含む条件下で微生物から測定され得る。
【００３２】
対照は、歴史的な（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）対照であり得る。ここで、試験インキュベーションは、対照インキュベーションが行われた後に実施され得る。
【００３３】
又は、対照は、試験インキュベーションを含むカートリッジとは別個のカートリッジ内で実施され得る。
【００３４】
「処理される」とは、生物学的試料から微生物を単離する工程、生物学的試料から得られる微生物の濃度を増加させる工程、及び／又は、例えば微生物の増殖を促進する条件下で微生物を培養することによって、生物学的試料から得られる微生物の数を増加させる工程を意味する。
【００３５】
本発明の化合物は、本明細書で一般的に記載される化合物を含み、本明細書で開示されるクラス、サブクラス及び種によってさらに説明される。本明細書で使用される場合、特に指示されない限り、以下の定義が適用される。本発明の目的のために、化学元素は、元素の周期表、ＣＡＳ版、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版に従って同定される。さらに、有機化学の一般原則は、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９及び「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１に記載されており、これらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本明細書で使用される「複素環」、「ヘテロシクリル」又は「複素環式」という用語は、１つ以上の環員が独立して選択されるヘテロ原子である非芳香族、単環式、二環式又は三環式環系を意味する。いくつかの実施形態では、「複素環」、「ヘテロシクリル」又は「複素環式」基は、１つ以上の環員が酸素、硫黄、窒素又はリンから独立して選択されるヘテロ原子である３〜１４個の環員を有し、系の各環は３〜７個の環員を含む。
【００３７】
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン及びケイ素（窒素、硫黄、リン又はケイ素の任意の酸化形態、任意の塩基性窒素の四級化形態又は複素環式環の置換可能な窒素、例えばＮ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）、ＮＨ（ピロリジニルにおけるような）又はＮＲ＋（Ｎ置換ピロリジニルにおけるような）を含む）の１つ以上を指す。
【００３８】
本明細書で使用される「アルコキシ」又は「チオアルキル」という用語は、先に定義されたような、酸素原子を介して（「アルコキシ」）又は硫黄原子を介して（「チオアルキル」）結合されたアルキル基を指す。
【００３９】
「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」、「ハロ脂肪族」及び「ハロアルコキシ」という用語は、場合によって、１つ以上のハロゲン原子で置換されたアルキル、アルケニル又はアルコキシを意味する。この用語は、−ＣＦ３及び−ＣＦ２ＣＦ３などのペルフルオロアルキル基を含む。
【００４０】
「ハロゲン」、「ハロ」及び「ハル」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味する。
【００４１】
単独又はより大きな部分、例えば「アラルキル」、「アラルコキシ」又は「アリールオキシアルキル」の一部として使用される「アリール」及び「アル」という用語は、１〜３個の芳香環を含む任意に置換されたＣ６−１４の芳香族炭化水素部分を指す。例えば、アリール基は、Ｃ６−１０アリール基（すなわちフェニル及びナフチル）である。アリール基には、任意に置換されたフェニル、ナフチル又はアントラセニルが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「アリール」及び「アル」という用語はまた、アリール環が１つ以上の脂環式環に縮合して、テトラヒドロナフチル、インデニル又はインダニル環などの任意に置換された環状構造を形成する基も含む。「アリール」という用語は、「アリール基」、「アリール環」及び「芳香環」という用語と交換可能に使用され得る。
【００４２】
本発明の化合物は、治療のための遊離形態で、又は適切な場合は、薬学的に許容される塩として存在し得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「芳香族」という用語は、以下及び本明細書で一般的に記述されるアリール及びヘテロアリール基を含む。
【００４４】
本明細書で使用される「脂肪族」又は「脂肪族基」という用語は、完全に飽和しているか又は１つ以上の不飽和単位を含む任意に置換された直鎖又は分岐Ｃ１−１２炭化水素を意味する。例えば、適切な脂肪族基には、任意に置換された直鎖又は分岐アルキル、アルケニル及びアルキニル基が含まれる。特に指定されない限り、様々な実施形態において、脂肪族基は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３又は１〜２個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の「脂肪族」基が２価であり得ることは当業者に明らかである。
【００４５】
単独で又はより大きな部分の一部として使用される「アルキル」という用語は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３又は１〜２個の炭素原子を有する、飽和の、任意に置換された直鎖又は分岐鎖炭化水素基を指す。
【００４６】
単独で又はより大きな部分の一部として使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの二重結合を有し、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４又は２〜３個の炭素原子を有する任意に置換された直鎖又は分岐鎖炭化水素基を指す。
【００４７】
単独で又はより大きな部分の一部として使用される「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの三重結合を有し、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４又は２〜３個の炭素原子を有する任意に置換された直鎖又は分岐鎖炭化水素基を指す。
【００４８】
特に明記されない限り、本明細書に示される構造はまた、構造のすべての異性体（例えばエナンチオマー、ジアステレオマー及び幾何（又は立体配座））形態、例えば各不斉中心のＲ及びＳ立体配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体、並びに（Ｚ）及び（Ｅ）立体配座異性体を含むことが意図されている。したがって、本発明の化合物の単一立体化学異性体並びにエナンチオマー、ジアステレオマー及び幾何（又は立体配座）混合物は、本発明の範囲内である。特に明記されない限り、本発明の化合物のすべての互変異性体は、本発明の範囲内である。さらに、特に明記されない限り、本明細書に示される構造は、１つ以上の同位体濃縮原子が存在することにおいてのみ異なる化合物を含むことも意図されている。例えば、重水素又はトリチウムによる水素の置換、又は１３Ｃ若しくは１４Ｃ濃縮炭素による炭素の置換が存在する本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。このような化合物は、非限定的な例として、生物学的アッセイにおける分析ツール又はプローブとして有用である：
【００４９】
開示される化合物が少なくとも１つのキラル中心を有する場合、本発明は、対応する光学異性体を含まない阻害剤の１つのエナンチオマー、阻害剤のラセミ混合物及び対応する光学異性体と比較して１つのエナンチオマーが濃縮された混合物を包含することが理解されるべきである。混合物が、光学異性体と比較して１つのエナンチオマーが濃縮されている場合、混合物は、例えば少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、９９％又は９９．５％のエナンチオマー過剰率を含む。
【００５０】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び学術用語は、本出願が属する技術分野の当業者によって一般的に理解され、本出願が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有し、このような技術は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。紛争の場合は、定義を含む本明細書が支配する。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、微生物感染の抗生物質感受性の迅速な決定を可能にする。本発明は、一部には、１２時間未満、具体的には４時間未満で、正確で迅速な抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）の決定を提供する非特異的な表面結合アッセイの驚くべき発見に基づく。本発明（「高速ＡＳＴ」）は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の参照法を用いて、複数の抗菌剤を用いて複数の微生物に関して試験した場合に得られた結果と一致する、正確な結果を提供する；しかしながら、本発明は、結果を得るのにＣＬＳＩ法よりも有意に短い時間しかかからない。さらに、本発明は、１つ以上の抗菌剤に耐性である臨床的に関連する微生物株に対する抗菌剤のＭＩＣと、抗菌剤に感受性である同じ微生物株に対する抗菌剤のＭＩＣとを正確に区別する。さらに、本発明は、特異的ではなく非特異的に（例えば化学的に保存された基又は微生物上の生化学的に保存された結合部位を介して）微生物に結合するシグナル伝達剤（例えばユウロピウム化合物）を含み得、これにより本発明の一般化を任意の微生物に拡大し、特定の感染性微生物を最初に同定する必要なしに適切な処置を開始することを可能にする。また、本発明は、例えば微生物の希薄な培養物から、又は患者の生物学的試料を介して、微生物がより低い濃度で迅速に検出され得るシグナル増幅を可能にする。さらに、本発明は、化学的部分としてユウロピウム製剤を使用することができ、これにより本発明の方法のダイナミックレンジを拡大し、様々な微生物試料からのより正確な測定を可能にする。最後に、本発明は既存の機器と互換性があり、これにより現在の臨床検査室での迅速な採用を可能にする。したがって、本発明は、標準的な方法と比較して大幅に低減された量の時間と費用で、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤を特定の投与量で提供することができる。したがって、本発明は、患者の転帰を改善し、病院の費用を低減し、抗菌剤耐性微生物のさらなる進化を減少させるのに役立つ；したがって、本発明は、ＡＳＴ分野における重要なブレイクスルーである。
【００５２】
本発明の態様は、微生物表面を化学的に増幅することにより、正確で低コストの表現型ＡＳＴ結果を提供する。この新規アプローチは、現在使用されている方法に比べて２つの主要な進歩を提供する：１）当業者に周知のように、糸状増殖状態に関する現在のプラットフォームの限界を克服する、相対表面積を決定することによる微生物増殖の定量化；及び２）標準的な光学検出装置を用いて１×１０３〜１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ範囲の最適感受性での微生物増幅。
【００５３】
本明細書で（例えば実施例において）開示されるように、本発明は、６種全部（エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種）（「ＥＳＫＡＰＥ」）の病原体を含む広範囲の微生物種について、ゴールドスタンダードと同等の結果を提供することが示されている。本発明の一般性ゆえに、新しい微生物種株及び診断試験に容易に及び安価に適合させることができるという点で本発明は柔軟性がある。
【００５４】
本発明は、８時間未満、好ましくは５時間未満で、標準的な微生物コロニー単離物から又は直接陽性血液試料から、低コストの表現型ＡＳＴを提供する。これは、標準的な臨床微生物学研究室の同じシフトでの表現型ＡＳＴ結果を可能にする。以下の実施例は、微生物表面の化学的増幅が、４時間未満で正確な最小阻害濃度（ＭＩＣ）及びブレークポイントコールを生じることを実証する。これは、現在の待機時間を２０時間以上短縮し、現在ＦＤＡ治験に近づいている直接陽性血液培養ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ同定、並びに既にＦＤＡクリアランスを取得した直接陽性血液培養マルチプレックスＰＣＲ同定プラットフォームに匹敵する。この設計は、本発明（「高速ＡＳＴ」プラットフォーム）が従来の速度対コストのトレードオフを打破することを可能にする。本発明は、標準的なマイクロプレート形式（例えば６、１２、２４、４８、９６、３８４又は１５３６ウェルを有する）及び従来の光検出器の両方と適合性である。
【００５５】
速度と精度を備えた、侵入する病原体の同定及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、最も有効な治療薬の時宜を得た投与を可能にする。このような治療は、感染を改善し、入院患者の滞在期間を短縮し、患者が、抗菌剤耐性の世界的蔓延をもたらす広域スペクトルの抗菌剤を投与される時間を低減する。対照的に、微生物の同定及び感受性結果についての現在受け入れられている３０時間以上の待機時間は、広域スペクトル抗菌剤の過剰使用及び患者の必要以上に長い入院を余儀なくさせる。この理由から、Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ｃｏｍｂａｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａは、最近、抗生物質耐性菌の検出のための迅速な診断の開発と使用をその主要目標の１つとした。
【００５６】
より迅速で正確なＡＳＴ決定を生じる本発明は、患者１人当たり２，０００ドルを超える実際の費用便益を提供し得る。これらの価値ポイントには、より容易に定量化できる点（入院期間の短縮及び高額な治療の低減）並びにより無形で価値を測るのが難しい点（患者の死亡率及び抗菌薬適正使用の改善による社会的影響）が含まれる。規制機関が、より厳密な抗菌薬適正使用支援プログラムを採用していない病院にコストを負担させることを始めたため、抗菌薬適正使用支援の価値のような、これらの無形の価値の一部がより定量化されるようになり得る。２０１４年９月にカリフォルニア州上院法案第１３１１号が署名されて法律として成立し連邦政府及び専門機関によって制定されたガイドラインに従って、抗菌薬適正使用支援方針を採用し実施すること、及び適正使用支援に関連する特定の訓練を受けた少なくとも１名の医師又は薬剤師を含む、医師が監督する多専門分野にわたる抗菌薬適正使用支援委員会を設置することが、病院にさらに要求された。２０１６年６月に、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＭＳ）は、今後２年間に経済的インセンティブが導入されることを期待する多くの産業専門家と共に、病院における抗菌薬適正使用支援を促進するという提案された役割を使用した。本発明は、より良い抗菌薬適正使用支援という政府及び医療産業の目標を前進させる。
【００５７】
本発明の態様の一般化された工程を図１に示す。図１の画像は、異なる工程段階を含む態様を示す；しかしながら、本発明の態様は自動化され得る。
【００５８】
図２Ａ〜図２Ｄは、本発明の態様の特徴を示す。図２Ａは、３つの代表的な病原体に対する検出感度範囲を示す。点線はゼロ濃度のシグナルレベルを示す。図２Ｂは、本発明で使用し得る「Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ」（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ−Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）自動高速ＡＳＴプロトタイププラットフォームを示す。図２Ｃは、カチオン性ナノ標識及びポリマーと相互作用するアニオン性細菌を示す概略図である。生じる中性錯体の溶解度低下は、磁気ビーズの結合を可能にする。図２Ｄは、高増殖対照及び「ｆｒｏｚｅｎ−ｉｎ−ｔｉｍｅ（ＦＩＴ）」対照と比較した静菌性（クリンダマイシン）及び殺菌性（ペニシリン）抗菌剤の結果を示す、ＳｅｎｓｉＴｉｔｒｅ（Ｒ）グラム陽性パネル（ＧＰＡＬＬ３Ｆ）を用いたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）についてのデータを示す。
【００５９】
当業者に公知のように、ＡＳＴプラットフォームは、試験される各抗菌剤について最小阻害濃度（ＭＩＣ）結果及び／又は定性的感受性結果（ＱＳＲ）をもたらし得る。ＭＩＣは、微生物増殖を阻害し、医師に投薬情報を提供する抗菌剤の最小濃度であることが一般的に知られている。ＱＳＲも医師に同様の投薬情報を提供し得るが、数値としてのＭＩＣは提供しないことがある。ＡＳＴアッセイは、主として、得られた各生物学的試料について複数の抗菌剤を並行して試験するように構成されている。ＭＩＣ又はＱＳＲの結果を得るためには、各抗菌剤について希釈系列が必要である。したがって、ＣＬＳＩによる「微量液体希釈法」と呼ばれる液体ベースのＡＳＴでは、アッセイは、異なる濃度の異なる抗菌剤の並行試験を可能にする、カートリッジ及び／又はマイクロプレートで一般的に実施される。
【００６０】
ＡＳＴ測定結果を得るため長い時間は、医師に不完全な情報を与えることになる。これらの長い時間は、しばしば、抗菌効果又は死滅動態の速度の同定を妨げる。この追加情報は、治療情報を与えるために重要であり得る。治療開始後６時間以上（一般に１２時間以上）まで決定されない現在のＡＳＴは、多くの場合、抗菌効果の速度の差を識別する能力を失う：微生物を直ちに死滅させる抗菌剤は、４時間以内に死滅させたものと１２時間後に死滅させたものとが同じに見える。
【００６１】
表１は、２時間のインキュベーション後の細菌の数への種々の処理の効果を推定する。３０分の倍加時間を仮定すると、未処理対照は１６倍増加するはずである。ＭＩＣより上の「強力な」抗菌剤（例えば細菌に対して効果を有するものと定義される）による処理群は、微生物の最小限の増殖及び、殺菌性抗菌剤の場合は、微生物の死滅をもたらすはずである。したがって、出発濃度よりも少ない細菌が予想される。ＭＩＣ未満の「強力な」抗菌剤による処理群は、抗菌剤なしの対照と同等又はこれより少ない微生物増殖をもたらすはずである。この場合細菌を死滅させるのに２時間以上を要するものと定義される（例えば静菌性抗菌剤の場合のように）、遅効性抗菌剤は、出発濃度と１６倍増加との間でシグナルを生じる。
【００６２】
【表１】
2019508062.tif 000003
【００６３】
５ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌの細菌の出発濃度は、微量液体希釈技術についての、Ｍａｒｉｅ  Ｂ．Ｃｏｙｌｅを調整編集者とするアメリカ微生物学会のＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｃ）２００５に示されている。各ウェルは約１００μＬを含むので、１ウェルにつき約５×１０４個の細菌が存在する。標準的な蛍光色素は、約０．１ｎＭ濃度で定量可能になり始め、これは約１．２×１０１０分子に相当する。したがって、３０分の倍加時間の細菌が２時間後に可視であるためには、個々の細菌を１．５×１０４の蛍光分子で標識しなければならない。蛍光バックグラウンドや非特異的結合などの実際的な考慮事項は、この数を数桁増加させ得る。標準的な光検出器との互換性を可能にするために、より低濃度で検出可能なシグナルを生成する化学及び／又は生化学増幅剤を使用することが有利であり得る。
【００６４】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明は、一部には、微量液体希釈法の原理に基づく。評価する培養物を、最も好ましくは１〜１０×１０５ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、ＭＩＣが抗菌剤の適切なパネルについて決定できるように、異なる濃度の異なる抗菌剤を含むウェルに導入する。次いで、細菌を増殖させるために、プレートを適切な温度、最も好ましくは３１〜３７℃のインキュベータに、適切な条件下で、最も好ましくは好気的条件下で、導入する。この時間に、微生物は増殖することができる。
【００６５】
ブイヨンは、カチオン調整ミューラーヒントンブロスであってもよく、溶解ウマ血液などの微生物増殖のため及び／又は高塩化ナトリウム濃度などの抗菌効果を測定するために有利であることが当業者に公知である追加の補助剤を含有してもよい。この増殖期間中、マイクロプレートを撹拌してもよく、これは、各ウェル中の栄養素及び／若しくはガス交換及び／若しくは抗菌剤を分散させるため、並びに／又はバイオフィルム形成を減少させるために有利であり得る。
【００６６】
ＡＳＴ開始の０〜８時間（最も好ましくは０〜４時間）以内に、公知の量のシグナル伝達剤を各ウェルに添加する。試薬（シグナル発生剤を含む）の添加は、自動化された機器若しくは半自動化された機器によって実施してもよく、又は手動で実施してもよい。
【００６７】
シグナル伝達剤（「粘着性ａｍｐ」と称され得る）は、微生物に結合することができる部分（例えば微生物表面に結合する抗体及び／若しくはレクチン、荷電した部分及び／又は微生物表面に非特異的に結合する機能性部分）並びにシグナルを提供する又はシグナルの生成に寄与することができる化学的部分（例えば酵素ケミルミノフォア及びランタニドキレート）を含む。例示的な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、シグナル発生剤は、１つ以上の「微生物受容体」に結合した１つ以上の化学的部分（すなわち「シグナル発生剤」）を含み得る。シグナル発生剤には、１つ以上の触媒（酵素、金属酸化物ナノ粒子、有機金属触媒、シグナル増幅用に設計されたナノ粒子（本出願が優先権を主張し、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願に記載されているものなど）、シグナル生成要素を含むバクテリオファージ、フルオロフォア（有機フルオロフォア、ユウロピウム若しくはルテニウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、パラジウム（ＩＩ）、白金（ＩＩ）含有有機金属を含む）、及び／又は比色色素（例えば有機「染料」を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ナノ粒子、デンドリマー並びに／又は酵素、フルオロフォア及び／若しくは有機金属分子を有する他のナノスケール構造体などの、上記の組み合わせを使用し得る。
【００６９】
シグナル伝達剤を微生物に接触させる前に、シグナル伝達剤が微生物に最初に接触する間に、又はシグナル伝達剤が微生物に接触した後に、化学的部分をシグナル伝達剤に結合させ得る。
【００７０】
微生物を含むＡＳＴ希釈液にシグナル伝達剤を添加する場合、シグナル伝達剤受容体（例えば微生物に特異的又は非特異的に結合することができる部分）は、微生物表面と会合する。したがって、例えば無傷の微生物が多いほど、これらの細菌と会合するより多数のシグナル伝達剤が溶液中に存在する。この結果として、無傷の細菌の数と、無傷の細菌によって結合されないものによって定義される、溶液中に「遊離」しているシグナル伝達剤の数との間には、逆の相関がある。例えば抗菌剤処理に応答して微生物が溶解する場合、遊離シグナル伝達剤は可溶性微生物成分に結合し得ることに留意されたい。
【００７１】
微生物表面と会合する及び／又は微生物表面にインターカレートするシグナル伝達剤の数は、微生物の表面積に比例する。微生物の表面積は真に耐性の微生物と強く関連する。特に、ＭＩＣ及びサブＭＩＣ未満の濃度の抗菌剤に応答して膨潤又は伸長する微生物（例えばフィラメント形成細菌）の場合、代謝及び／又は体積同定は、６時間未満のものと定義される、「迅速な」ＡＳＴの時点について誤った感受性プロフィールを与えることが公知である。この制限を克服するために、本発明は、微生物表面積（体積ではなく）を測定可能なシグナル、最も好ましくは光シグナルに変換する。本発明の方法は、６時間未満で微生物の耐性プロフィールを正確に決定することができる。
【００７２】
微生物と会合した及び／又は微生物にインターカレートしたシグナル伝達剤を遊離シグナル伝達剤から分離するために、１つ以上の分離及び／又は競合的結合工程を実施することが必要であり得る。このような工程には、遠心分離（例えばｇ力＞５００×ｇで）、ろ過（例えば０．４５ミクロン以下、好ましくは０．２ミクロン以下の細孔を有するフィルタによって）、電気泳動及び／又は磁気捕捉が含まれるが、これらに限定されない；このような工程は当業者に周知である。
【００７３】
シグナル伝達剤の結合を促進する及び／又はバックグラウンドを低減するために、シグナル伝達剤を添加する前に、インキュベーションの間微生物が懸濁されていた液体から微生物を分離することがさらに有利であり得る。このような分離には、遠心分離、ろ過、電気泳動及び／又は磁気捕捉が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７４】
これらのデータを処理群にわたって比較すると、現在使用されているＡＳＴ測定と同様の工程を用いて、微生物の耐性プロフィールを決定し得る。さらに、これらのデータは、抗菌効果の速度又は死滅動態の決定を可能にし得る。
【００７５】
シグナル伝達剤は、ＡＳＴインキュベーション期間全体にわたって存在するように、微生物及び／又は抗菌剤と共に添加され得る。この合計時間は、２４時間までであり得るが、好ましくは８時間以内、より好ましくは５時間以内である。又は、シグナル伝達剤は、所定のインキュベーション期間後に微生物及び抗菌剤に添加され得る。この期間は、２４時間までであり得るが、好ましくは８時間以内、より好ましくは４時間以内である。
【００７６】
シグナル伝達剤は、壁及び／又は膜を含む微生物表面と会合する及び／又は微生物表面にインターカレートするように設計される。会合のために設計されたシグナル伝達剤は、１つ以上の抗体、レクチン、他のタンパク質、１つ以上の荷電した化学基を有する小分子、１つ以上の機能的化学基を有する小分子、ファージ、糖タンパク質、ペプチド、アプタマー、荷電小分子、固定電荷を有する小分子、荷電ポリマー、固定電荷を有する荷電ポリマー、疎水性小分子、荷電ペプチド、固定電荷を有する荷電ペプチド、交互の親水性領域と疎水性領域を有するペプチド、及び／又は有機金属錯体であってもよく若しくは有機金属錯体でなくてもよい小分子配位子を含むがこれらに限定されない結合部分を含む。微生物会合のために設計された分子は、当業者に周知である。シグナル伝達剤は、微生物に結合したままでもよく、及び／又はインターナライズされてもよく、したがってすべての会合が含まれる。インターカレーションのために設計されたシグナル伝達剤は、疎水性小分子、疎水性ペプチド、及び／又は交互の疎水性領域と親水性領域を有するペプチドを含み得るが、これらに限定されない。微生物のインターカレーションのために設計された分子は、当業者に周知である。シグナル伝達剤は、さらに、１つ以上の種類の微生物に特異的であり得る。シグナル伝達剤は複数の受容体を有し得る。これらは、結合を強化し得る及び／又は細菌を「凝集させる」のにさらに役立ち得る、２つ以上の微生物への同時結合を可能にし得る。シグナル伝達剤の添加の前に又は添加と同時に、溶液のｐＨを調整することが有利であり得る。これは、微生物とシグナル伝達剤との間の電荷−電荷相互作用を増強するために有益であり得る。微生物のアニオン電荷は、溶液のｐＨを中性より上（より塩基性）に滴定することによって増加させ得る。したがって、１以上の固定されたカチオン電荷を有する部分を利用することが有益であり得る。
【００７７】
シグナル伝達剤が、微生物に特異的に結合し得るか（例えば微生物種又は微生物株に特異的に結合する抗体）、又は微生物に非特異的に結合し得る（例えば一般的な共有結合又は非共有結合の形成及び当技術分野で公知の別の非特異的化学会合によって）ことは注目すべきである。
【００７８】
シグナル伝達剤は、天然の微生物表面に結合することが好ましい。
【００７９】
又は、シグナル伝達剤と会合することができる化学物質及び／又は生化学物質を、インキュベーション中に化学物質及び／又は生化学物質が微生物に取り込まれるように、増殖の間微生物が懸濁される液体に添加し得る。これは、微生物とのシグナル伝達剤の会合を増強するのに役立ち得る。代替実施形態では、シグナル伝達剤自体が、インキュベーションの間微生物が懸濁される液体中に存在してもよく、増殖中に微生物に取り込まれてもよい。
【００８０】
好ましくは、シグナル伝達剤は、それぞれの無傷微生物からのシグナルが、各微生物と会合したシグナル伝達剤の数を超えて増幅され得るように、増幅シグナル発生剤を含む。例えば、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、シグナルを＞１×１０４倍増幅できることが公知である。したがって、１００個のＨＲＰ分子が各微生物表面に結合している場合、１０６の増幅が達成され得る。これは、さもなければ区別できない微生物濃度の識別を可能にすることにより、ＡＳＴ測定が行われ得る速度を増加させ得る。ユウロピウム製剤の使用は、同様にシグナル増幅を提供する。
【００８１】
又は、シグナル伝達剤は、細胞膜などの疎水性領域へのインターカレーションの際に蛍光発光を大きく増加させるように設計された「膜色素」として当業者に公知の光学色素前駆体を含み得る。これらのシグナル伝達剤を用いて設計されたアッセイは、光学的に容易に測定されるのに十分なシグナルを生成するために、微生物をより小さな体積に濃縮し、平面に近づけることを必要とし得る。干渉種は、近赤外フルオロフォアの使用を必要とし得る。
【００８２】
可能性のある分離技術には、ろ過（例えば０．４５ミクロン以下、好ましくは０．２ミクロン以下の細孔を有するフィルタによって）、遠心分離（例えばｇ力＞５００ｘｇ）、電気泳動、誘電泳動及び磁気捕捉が含まれるが、これらに限定されない。これらの技術は、フィルタに固着し、遠心分離機でペレット化され、並びに／又は電気泳動的及び／若しくは磁気的に分離される、微生物と会合したシグナル伝達剤を、溶液中に遊離しているシグナル伝達剤から分離するために使用される。遊離シグナル伝達剤は、フィルタを通過し（「ろ液」）、遠心分離又は磁気分離後に溶液中に残存し（「上清」）、及び／又は電気泳動的に別々に泳動する。遠心分離は、標準、密度勾配又は分画遠心分離であり得る。磁気分離は、微生物と会合又は結合するように特異的に標的化された１つ以上の磁性粒子の添加を必要とし得る。これらは、シグナル伝達剤の添加の前に又は同時に添加され得る。
【００８３】
このような分離技術はまた、抗菌剤処理に応答して形態を変化させ、測定を混乱させ得る微生物をも単離し得る。このような微生物の一例は、抗菌剤処理に応答して最初に伸長する糸状菌である。この増殖形態は当業者に公知である。本明細書に記載の分離技術を使用して、アッセイから糸状菌を単離し、除外することは、得られる結果の精度を高める。
【００８４】
微生物の分離は、微生物種との粒子の会合によって増強され得る。例えば、磁気分離の場合、磁気ビーズは微生物と（特異的又は非特異的に）会合し得る。磁気ビーズ表面上に存在する部分は、微生物の、シグナル伝達剤と同じ表面（若しくはこの生体分子）又は異なる表面（若しくはこの生体分子）に結合し得る。磁気ビーズは、シグナル伝達剤と同じ及び／又は異なる部分を有し得る。例えば、シグナル伝達剤がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に結合する抗体を含む場合、磁気ビーズは同じ抗体で官能基化され得る。他の例では、シグナル伝達剤は、微生物に結合するモチーフを含み得、磁気ビーズは、微生物に非特異的に結合するように官能基化される。
【００８５】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分は、シグナル伝達剤と会合した化学的部分又はシグナル伝達剤の化学的部分と同一であってもよく又は異なっていてもよい。
【００８６】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分は、微生物とシグナル伝達剤の結合の前、結合と同時、又は結合後に微生物に結合し得る。
【００８７】
磁気ビーズと会合した１つ以上の結合部分は、微生物を沈殿させる１つ以上のポリマーと会合し得る。微生物を沈殿させる１つ以上のポリマーは、カチオン性であり得る。微生物を沈殿させる１つ以上のポリマーは、ポリ（エチレングリコール）であり得る。
【００８８】
磁気ビーズは、当業者に公知のように、２０ｎｍ〜２０ミクロンのサイズ範囲であり得る。
【００８９】
分離後、微生物分離後に残存するシグナル伝達剤の数及び／又は微生物分離中に除去されたシグナル伝達剤（「遊離」シグナル伝達剤）の数を測定するための１つ以上のアッセイを実施し得る。遊離シグナル伝達剤のアッセイを実施すると、微生物濃度に反比例するシグナルが得られる。この場合、微生物と会合するシグナル伝達剤は、微生物によって結合され得るか又はインターナライズされ得る。又は、微生物と会合したシグナル伝達剤についてアッセイを実施し得る。この場合、微生物が特異的に溶解されない限り、結合シグナル伝達剤のみがシグナルに寄与する。
【００９０】
分離効率を最大にするために、すなわち残存する遊離シグナル伝達剤の数を最小限に抑えるために、１回以上の洗浄工程を実施し得る。これらは、ろ過、磁気捕捉若しくは電気泳動の場合のように連続的あってもよく、及び／又は遠心分離若しくは磁気捕捉の場合のように不連続的であってもよい。
【００９１】
代替実施形態では、シグナル伝達剤は洗浄を必要としないと考えられる。これは、「膜色素」シグナル伝達剤を使用する場合に当てはまり得る。微生物膜にインターカレートされていない分子は、インターカレートされた種よりも有意に低い光学活性を有するので、したがって洗浄を必要としないと考えられる。
【００９２】
シグナル伝達剤を微生物に添加する前に、１回以上の洗浄を実施し得る。これらの洗浄は、例えば、インキュベーションの間微生物が懸濁された液体中に存在する干渉種を除去し得る。
【００９３】
実施形態では、洗浄は実施しない。
【００９４】
シグナルの展開は、「展開液」の添加を必要とし得る。触媒を含むシグナル伝達剤の場合、展開液は、光学的及び／又は電気的に活性なシグナル伝達分子に変換され得る１つ以上のシグナル前駆体を含み得る。ナノ粒子内などの、カプセル化された分子を含むシグナル伝達剤の場合、展開液は、カプセル化された種を放出するための１つ以上の試薬を含み得る。展開液の添加後の所定の時間に、比色及び／又は電気化学的シグナルを測定し得る。このようなシグナルには、吸光度、蛍光、時間分解蛍光、化学発光、電気化学発光、電流測定、ボルタンメトリ、インピーダンス及び／又はインピーダンス分光法が含まれるが、これらに限定されない。次に、現在のＡＳＴプロトコルと同様に、データを比較してＡＳＴ及びＭＩＣを決定し得る。
【００９５】
実施形態では、シグナルレベルを決定することは、無傷の微生物と会合したシグナルレベルを測定することを含む。代替的又は追加的に、シグナルレベルを決定することは、無傷の微生物に会合していないシグナルレベルを測定することを含む。
【００９６】
これらの工程は、培養物、継代培養物、陽性血液培養物、試料から直接実施され得る。微生物を濃縮する及び／又は潜在的な干渉種を除去する処理は、ＡＳＴの前又はシグナル伝達剤の添加前に実施し得る。
【００９７】
シグナル伝達剤はまた、勾配拡散などのＡＳＴ測定のためのプレートベースの方法と共に使用し得る。これらは、微生物をプレートに添加するのと同時に又は設定されたインキュベーション期間後に添加し得る。これらの場合、光及び／又は電気シグナルについての空間情報が重要である。このアプローチでは、空間情報を保持するために、無傷の微生物に結合したシグナル伝達剤のアッセイが好ましいと考えられる。この場合、遊離シグナル伝達剤を除去するために、展開液の添加前に１回以上の洗浄工程を実施し得る。
【００９８】
実施形態では、洗浄は実施しない。
【００９９】
又は、シグナル伝達剤は、細菌によって取り込まれるように設計することができ、これは、例えばバクテリオファージの使用によって達成され得る。このような方法では、遊離シグナル伝達剤についてのアッセイを実施する。
【０１００】
又は、ニトロセルロース紙で標準的であるようなブロット転写アプローチを用いて細菌又は遊離シグナル伝達剤を転写し、次いで、ブロットした紙に関して空間アッセイを実施し得る。
【０１０１】
シグナル伝達剤が結合の際にシグナルを生成する場合、分離工程は必要ないと考えられる。又は、シグナル伝達剤が結合の際に特定の展開液成分に感受性又は耐性になる場合は、分離工程を含まない方法を達成し得る。
【０１０２】
最終的なＭＩＣ及び／又はＱＳＲ出力データは、本明細書に記載のアッセイによって生成されたデータから直接ユーザーによって解釈され得る。又は、これらのデータは、ＭＩＣ及び／又はＱＳＲを生成するための１つ以上のアルゴリズムによって処理されてもよい。報告されたＭＩＣ及び／又はＱＳＲ値は、本明細書に記載されるアッセイの１つ以上から導かれ得るか、又は代謝色素指示薬アッセイ、ｐＨ指示薬アッセイ、核酸アッセイ及びＡＴＰアッセイを含むがこれらに限定されない、微生物増殖についての１つ以上の公知のアッセイと共に、本明細書に記載されるアッセイの１つ以上から導かれ得る。
【０１０３】
本発明の方法
本発明の一態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で、抗菌剤及び微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤の存在下に微生物の液体懸濁液をインキュベートする工程、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離する工程、並びに１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定する工程を含む。
【０１０４】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で抗菌剤の存在下に微生物の液体懸濁液をインキュベートする工程、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を添加する工程、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離する工程、１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定する工程を含む。実施形態では、シグナル伝達剤の添加は、インキュベーション工程の前若しくは工程の間に行われるか、又はインキュベーション工程の後にシグナル伝達剤の添加が行われる。
【０１０５】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で、１つ以上の抗菌剤をそれぞれ含有する複数のチャンバを含むカートリッジ内で微生物の液体懸濁液をインキュベートする工程、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を複数のチャンバに添加する工程、非結合シグナル伝達剤を除去する工程、及び１つ以上の対照と比較して複数のチャンバにおけるシグナルレベルを決定し、これにより１つ以上の抗菌剤に対する微生物の感受性を決定する工程を含む。実施形態では、カートリッジは、抗菌剤を含まない又は微生物が感受性でない１つ以上の抗菌剤を含まない１つ以上の対照チャンバ（例えば少なくとも２、４、６、８、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６又はこれ以上のチャンバ）をさらに含む。
【０１０６】
上記の態様の実施形態では、微生物の表面への結合は非特異的であり、例えば非共有結合相互作用を含み、共有結合を形成することによる。
【０１０７】
上記態様の実施形態では、シグナル伝達剤は、微生物の表面に結合することができる化学基及び／又は生化学基を含んでもよく、表面は、膜、壁、タンパク質、細胞小器官、糖類、脂質、細胞エンベロープ及び／又は核酸の１つ以上を含む。
【０１０８】
上記態様の実施形態では、シグナル伝達剤は、微生物の表面の生体分子に結合することができる化学基及び／又は生化学基を含んでもよく、表面生体分子は、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポーリン、β−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、脂質Ａ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質、並びにこれらの組み合わせから選択される。
【０１０９】
上記態様の実施形態では、シグナル伝達剤は、シグナル増幅剤及び微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分を含み得る。
【０１１０】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で抗菌剤及びシグナル増幅剤と微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含むシグナル伝達剤の存在下にて微生物をインキュベートすること、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、並びに１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定することを含む。
【０１１１】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するための方法である。この方法は、微生物の増殖を促進する条件下で抗菌剤の存在下にて微生物をインキュベートすること、シグナル増幅剤と微生物の表面に非特異的に結合することができる１つ以上の化学的部分とを含むシグナル伝達剤を添加すること、シグナル伝達剤によって結合された微生物を非結合シグナル伝達剤から分離すること、及び１つ以上の対照と比較して微生物に関連するシグナルレベルを決定し、これにより微生物の抗菌剤感受性を決定することを含む。実施形態では、シグナル伝達剤は、インキュベーション工程の開始前、開始時又は工程の間、好ましくはインキュベーション工程の間に生じる。実施形態では、微生物を液体懸濁液中でインキュベートする。
【０１１２】
上記態様の実施形態では、液体懸濁液は、生物学的試料から増殖させた微生物単離物を液体培地に接種することによって調製し得る。
【０１１３】
上記態様の実施形態では、微生物の液体懸濁液は、未処理生物学的試料、例えば培養工程を経ていない未処理生物学的試料から調製し得る。
【０１１４】
上記態様の実施形態では、微生物の液体懸濁液は、培養又は処理された生物学的試料から調製され得る。
【０１１５】
上記態様の実施形態では、生物学的試料は、血液、脳脊髄液、尿、便、膣試料、痰、気管支肺胞洗浄液、咽喉、鼻／創傷スワブ、及びこれらの組み合わせから選択される。
【０１１６】
上記態様の実施形態では、この方法は、インキュベーション前又はインキュベーション中に固体表面上で微生物を捕捉する工程を含まない。
【０１１７】
上記態様の実施形態では、この方法は、インキュベーション工程中又は工程後に固体表面上で微生物を増殖させる工程を含まない。
【０１１８】
上記態様の実施形態では、インキュベーションは、微生物の液体懸濁液を撹拌することを含み得る。
【０１１９】
上記態様の実施形態では、微生物の液体懸濁液は、インキュベーションの間、機械、超音波及び／又は磁気撹拌によって連続的又は不連続的に撹拌され得る。
【０１２０】
上記態様の実施形態では、インキュベーションは３１〜３７℃で行われる。本発明と現在使用されているＡＳＴシステムとの比較
本発明は、一部には現在使用されているＡＳＴ法よりも有意に短い時間で正確なＡＳＴ結果を提供するため、現在使用されているＡＳＴ法より優れている。
【０１２１】
現在臨床で使用されている３つの自動ＡＳＴシステムは、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＶｉｔｅｋ２、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＰｈｏｅｎｉｘ及びＢｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒのＭｉｃｒｏＳｃａｎである。現在使用されているＡＳＴシステムと本発明における工程の比較を図３に示す。本発明で述べる方法は、少なくとも２つの様式で実施され得る。最初の様式は標準的な分離株用であり、現在の検査室のワークフローに変更はない。２番目は、陽性血液培養物から直接の様式である。
【０１２２】
標準的な単離物処理に関して、本発明は既存の臨床検査室ワークフローと適合性であり、したがって変更を必要としない。図３の「工程８」に示すように、コロニー単離（工程６）及び微生物濃度の標準化（工程７）後に現在の感受性（ＡＳＴ）試験を実施する。このワークフローでは、本発明は現在のシステムを「工程８」で置き換える。本発明によるＡＳＴ結果は、医療従事者のシフト内（＜５時間）に入手可能であるので、有用性は、患者が最適化された治療を受ける（工程９）速度を実際上最大１日まで高め得る。自動化は、「工程７」及び、潜在的に、ワークフローのさらなる工程を含むように設計され得る。このような自動化は当業者に公知である。図３は、血液試料についてのワークフローを示すことに留意されたい。尿やスワブなどの多くの試料タイプは、プレートに直接画線接種し得る（工程４）。この場合、工程６でグラム染色を実施し得る。
【０１２３】
血液検査のために、現在使用されているＡＳＴシステムは、得られた血液培養物が検出可能に陽性になること（１０時間以上かかる）、続いて継代培養工程（少なくとも１２時間）、次いでＡＳＴ試験（最低８時間を要する）を必要とする：これは、病原体に応じて合計４８時間を要し、しばしば実際には３日以上かかる。ほとんどのワークフローでは、生物の同定は継代培養工程後に行われ、ますます質量分析によって実施されるようになりつつある。臨床医又は薬剤師が適切な標的化抗菌剤を処方するためには同定とＡＳＴ結果の両方が必要であるので、ＡＳＴ結果へのこの遅延は、広域スペクトル抗菌剤の治療期間を直接延長する。さらに、待機は、しばしば、多くの臨床微生物学研究室で一般的なワンシフト操作によってさらに延長される。
【０１２４】
又は、本発明は、陽性血液培養物から直接使用され得る。採血及びインキュベーション／培養の標準的な工程１及び工程２の後、培養物が陽性であれば、培養物の瓶は直ちに微生物単離（工程３）へと移動し、次いで自動化システム（工程４）に進む。本発明は完全に自動化することができ、技術者は、微生物希釈液を含む標準カートリッジをシステムに装填し、次いで４時間の「高速ＡＳＴ」法を開始するだけでよい。次いで、検査技師は、最小阻害濃度（「ＭＩＣ」）のＡＳＴについて同じ標準的な表現型結果を受け取る。しかし、合理化された方法は、ＡＳＴの時間を理論的には２４時間以上、潜在的には実際上２日間短縮し、検査室のワークフローを簡略化する。
【０１２５】
現在使用されているＡＳＴシステムは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の微量液体希釈法の変形を実施する。細菌を複数のウェルに並行して接種する。各々のウェルは、公知濃度の１つの（又はこれ以上の）抗菌剤及び栄養ブロスを含む。細菌が対数増殖期にあることを確実にするためにウェルに５×１０５ＣＦＵ／ｍｌで接種する。これは抗菌剤に対する正確な応答を検出するために重要である。次いで、微生物検出を視覚的に実施する。
【０１２６】
表現型ＡＳＴ試験の緩やかな速度は、一部には、検出可能な光シグナルを生成するために微生物増殖に依存することによる。細菌は、約１×１０８ＣＦＵ／ｍｌの濃度より低い光学密度測定によっては定量化することができないので、ＣＬＳＩ出発濃度は最低８倍の倍加時間では目に見えない。最も緩やかに増殖するウェルにおける微生物増殖を全く増殖しないウェルから識別することは最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定にとって極めて重要であるので、有意により長い時間が必要である。当業者に公知のように、いくつかの既存のプラットフォームは、インキュベーションの間微生物が懸濁される液体中に代謝プローブを含めることによってこれらの増殖の問題を克服する。しかし、これらのプローブを含めると、糸状増殖などの増殖形態を見逃すことがあり、結果の精度に影響を及ぼし得る。
【０１２７】
ＡＳＴ特異的な工程が開始された後、現在使用されているＡＳＴシステムは、依然として、典型的には単純な高感受性細菌の結果を報告するのに８時間以上を要し、複雑な耐性プロフィール又は緩やかな増殖動態を有する病原体については１０時間以上を要する；図４参照。
【０１２８】
さらに、現在使用されている自動化ＡＳＴシステムには、６時間未満で正確な結果を報告するのを妨げる２つの欠点：１）非常に重大なエラーである、真に耐性の菌株に対する不正確な「感受性」コール；及び２）重大なエラーである、真に感受性の菌株に対する不正確な「耐性」コール、がある。実際に、これらの問題により、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ及びＢＤは、Ｖｉｔｅｋ２（Ｒ）及びＰｈｏｅｎｉｘ（Ｒ）について当初の４時間という速度の謳い文句を改訂することが必要になった。
【０１２９】
非常に重大なエラーの存在は、抗菌剤耐性を達成する際に微生物が消費する代謝エネルギーによって部分的に説明される。耐性微生物は、抗菌剤に応答してエネルギー消費を変化させることがあり、ＭＩＣ付近の代謝プローブの結果を混乱させ得る。これらはまた、増殖培地中の酸化還元指示薬などの添加剤の存在によっても生じ得る。重大なエラーの頻発は、主として特定の細菌の糸状増殖に起因する。この増殖形式は、グラム陰性菌における、特にβ−ラクタムなどの細胞壁作用性抗菌剤に対する共通の抗菌剤応答である。糸状菌は自らの内部の内容物を複製し続けるが、分離はしない。したがって、再び、代謝プローブは誤ったＭＩＣ付近の結果を与えることになる。糸状菌の除去は、ＡＳＴ法の重大なエラーを有意に減少させることが示された。
【０１３０】
本発明で使用される相対微生物表面積の測定は、ＡＳＴの代謝プローブの落とし穴を克服する。第一に、相対的表面積は代謝活性のシフトによって交絡されないので、高速ＡＳＴは迅速で正確な耐性コールを可能にする。第二に、表面積測定は過剰な耐性コールを防止する。現在使用されているＡＳＴシステムの代謝プローブで得られる体積測定とは対照的に、表面積測定は、真の耐性と糸状増殖との間の正確な区別を可能にする。図３９の概略図に示されるように、耐性及び感受性糸状菌の体積は区別することが困難である。しかし、分離の欠如は、真に耐性の細菌のものよりも有意に低い糸状表面積を生じる。したがって、各細菌の表面積を増幅することにより、本発明は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料について４時間のβ−ラクタム（アンピシリン）ＭＩＣを正確にコールすることができる（以下の実施例参照）。図３９に示すように、伸長と「真の」耐性との間の表面積の差は２／３に近く、これは増幅されたシグナルで検出され得る。
【０１３１】
患者
本明細書で使用される場合、「患者」という用語（交換可能に「宿主」又は「被験体」とも称される）は、本明細書で論じられるような生物学的試料又は標本の１つ以上の供給源として働くことができる任意の宿主を指す。特定の態様では、ドナーは、任意の動物種（及び好ましくは、ヒトなどの哺乳動物種）を表すことが意図されている、脊椎動物である。特定の実施形態では、「患者」とは、家畜、牧畜又は移住動物又は鳥類、外来種又は動物学的標本、並びにコンパニオン動物、ペット及び獣医師の世話を受けている任意の動物を含むがこれらに限定されない、ヒト及び非ヒト霊長動物、鳥類、爬虫類、両生類、ウシ、イヌ、ヤギ、キャビティ、カラス、エピン、ウマ、ネコ、ヤギ、ラピン、ウサギ、オオカミ、ヒツジ、ブタ、ラシン、キツネ等を含むがこれらに限定されない任意の動物宿主を指す。
【０１３２】
生物学的試料
生物学的試料は、微生物、例えば細菌及び真菌細胞を含む任意の試料である。
【０１３３】
典型的な生物学的試料には、全血、血漿、血清、痰、尿、便、白血球、赤血球、軟膜、涙、粘液、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、脊髄又は脳脊髄液、腹膜滲出液、胸水、滲出液、穿刺液、上皮スミア、生検材料、骨髄試料、嚢胞又は膿瘍からの液体、滑液、硝子体液又は房水、眼洗浄又は吸引液、気管支肺胞洗浄液、気管支洗浄液又は肺洗浄液、肺吸引液、並びに肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓等を含むがこれらに限定されない器官及び組織、スワブ（創傷スワブ、口腔スワブ、咽喉スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブ等を含むがこれらに限定されない）、並びにこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。また、細菌培養物又は細菌単離物、真菌培養物又は真菌単離物も含まれる。当業者はまた、上記の例示的な生物学的試料のいずれかから得られた単離物、抽出物又は物質も本発明の範囲内であることを理解する。
【０１３４】
生物学的試料から得られた微生物は、当技術分野において日常的に行われるように培養され得るか、さもなければ処理され得る。
【０１３５】
例示的微生物
本明細書で使用される場合、感染は、微生物起源の任意の感染性因子、例えば細菌、真菌細胞、古細菌及び原生動物を含むことが意図されている。好ましい例では、感染因子は細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌及び非定型細菌である。「抗菌剤耐性微生物」という用語は、１つ以上の異なる抗菌剤、すなわち抗菌薬、抗真菌薬、抗古細菌薬及び抗原生動物薬に耐性である微生物（例えば細菌、真菌、古細菌及び原生動物）である。
【０１３６】
微生物（例えば微生物の液体懸濁液）は、１つの株の微生物を含み得る。微生物は、１つの種の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の株の微生物を含み得る。微生物は、１つの目の微生物を含み得る。微生物は、１つの綱の微生物を含み得る。微生物は、１つの科の微生物を含み得る。微生物は、１つの界の微生物を含み得る。
【０１３７】
微生物（例えば微生物の液体懸濁液）は、２つ以上の株の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の種の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の属の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の目の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の綱の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の科の微生物を含み得る。微生物は、２つ以上の界の微生物を含み得る。
【０１３８】
微生物は細菌であり得る。細菌の例には、アセトバクター・アウランティウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・ビチューメン（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｔｕｍｅｎ）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、アクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ビネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）としても公知である）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌ��ａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリマトバクテリウム・グラヌロマティス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（以前はクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と呼ばれていた）、クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（以前はクラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）と呼ばれていた）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（以前はクロストリジウム・ウェルチ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ）と呼ばれていた）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コキセラ・ブルネッチ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、エールリヒア・シャフェエンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エールリヒア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラツス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガルドネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パータシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヘモフィルス・バギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア・モノサイトゲネシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、メタノバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、ミクロバクテリウム・マルチフォルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ���ｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプラムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコバクテリア属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ノカルジア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ・ツラレンシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロッモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）（以前はバクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）と呼ばれていた）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、シ
ュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・シタッシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッチア・クインターナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）、リケッチア・トラコマエ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロシャリメア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロシア・デントカリオーサ（Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、スピリルム・ボルタンス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｖｏｌｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ステノトロフォモナス・マルトフィラ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ステノトロフォモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス。クリセツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティオール（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅ��ｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｍｍａ）、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ヴィリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ウォールバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
微生物は真菌であってもよい。真菌の例には、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ブラストミセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コクシジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エキセロヒラム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、フザリウム属（ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒストプラスマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、イサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ムコールミセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）、ニューモシスティス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、白癬、セドスポリウム（ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）及びスタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
微生物は原生動物であってもよい。原生動物の例には、エンタモエバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、プラスモジウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）が含まれ、これらに限定されない。
【０１４１】
例示的な抗菌剤
微生物が細菌である場合、例示的な抗菌剤には、アミカシン、アミノグリコシド、アミノグリコシドアモキシシリン、アミノグリコシド類、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブランネート、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、抗毒素、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、β−ラクタム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロール、セフラドキシル、セファレキシン、セファロチン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、シクロセリン、ダルババンシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、フルクロキサシリン、フルオロキノロン、フルオロキノロン類、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド系抗生物質、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルミシン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、プラテンシマイシン、ポミキシンＢ、ポシゾリド、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、ラデゾリド、ラキシバクマブ、リファブチン、リファンピシン、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、シルバースルファジアジン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、スピラマイシン、ストレプトグラミン類、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファアセトアミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルファイソオキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テジゾリド、テイコプラニン、テイキソバクチン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チカルシリン／クラブランネート、チカルシリン／クラブラン���、チゲサイクリン、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トブラマイシン、トレゾリド、トリメトプリム（Ｂｓ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、バンコマイシン及びこれらのジェネリック医薬品又はこれらの変種が含まれる。
【０１４２】
微生物との相互作用が微生物表面上の負電荷に影響を及ぼし、微生物表面上の負電荷によって影響を受ける抗菌剤には、以下が含まれる：細胞表面に結合すると、脂質膜成分と架橋するＭｇ２＋イオンを置換し、これによって外膜を破壊し、薬剤吸収を増強するポリカチオン性アミノグリコシド；やはり微生物細胞への結合が膜の負電荷に依存性であるため膜の負電荷を減少させることによって突然変異及びプラスミド媒介性耐性が生じるカチオン性ポリミキシン（コリスチン及びポリミキシンＢ）；並びに宿主の自然免疫応答のカチオン性抗菌ペプチドに類似し、膜破壊の作用機構のためにＣａ２＋及びホスファチジルグリセロールを必要とするリポペプチドであって、やはり耐性が細胞表面電荷の変化を含み得る、ダプトマイシン。
【０１４３】
微生物が真菌である場合、例示的な抗菌剤には、５−フルオロシトシン、アバファンジン、アルバコナゾール、アリルアミン、アムホテリシンＢ、アンコボン、アニドゥラファンギン、アゾール、ペルーバルサム、安息香酸、ビフォナゾール、ブトコナゾール、カンジシジン、カスポファンギン、シクロピロクス、クロトリマゾール、クレセンバ、クリスタルバイオレット、ジフルカン、エキノカンジン、エコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フェンチコナゾール、フィリピン、フルコナゾール、フルシトシン、グリフルビンＶ、グリセオフルビン、グリス−ＰＥＧ、ハロプロギン、ハマイシン、イミダゾール、イサブコナゾール、イサブコナゾニウム、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ラミシール、ルリコナゾール、ミカファンギン、ミコナゾール、ナタマイシン、ノキサフィル、ナイスタチン、オモコナゾール、オンメル、オラビグ、オキシコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、リモシジン、セルタコナゾール、スポラノックス、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チアゾール、チオカルバメート抗真菌剤、チコナゾール、トルナフテート、トリアゾール、ウンデシレン酸、ブイフェンド、ボリコナゾール及びこれらのジェネリック医薬品又はこれらの変種が含まれる。
【０１４４】
微生物が原生動物である場合、例示的な抗菌剤には、８−アミノキノリン、アセタール、アメーバゾア（ａｍｏｅｂｏｚｏａ）に対する作用薬、アイラントン、アモジアキン、アムホテリシンＢ、アムプロリウム、抗トリコモナス薬、アプラスモマイシン、アルスチノール、アルテリン酸、アルテメテル、アルテメテル／ルメファントリン、アルテミシニン、アルテモチル、アルテロラン、アルテスネート、アルテスネート／アモジアキン、アトバコン、アトバコン／プログアニル、アザニダゾール、アジスロマイシン、ベンズニダゾール、ブロキシキノリン、ブパルバコン、カルバルゾン、カルニダゾール、アセトキノン、アズバキノン、アズニダゾール、アジスロマイシン、ベンズイミダゾール、ブロキシキノリン、ブパルバコン、カルバゾーネ、カルニダゾール、キニオホン、クロロキン、クロルプログアニル、クロルプログアニル／ダプソン、クロルプログアニル／ダプソン／アルテスネート、クロルキナルドール、クロムアルベオレート駆虫薬、キンコナ、シパルガミン、クラズリル、クレファミド、クリオキノール、抗コクシジウム薬、コジネオプシン、コトリファジド、クリプトレピン、シクログアニル、デヒドロエメチン、ジフェタルゾン、ジヒドロアルテミシニン、ジロキサニド、ジミナゼン、ジスルフィラム、ドキシサイクリン、エフロルニチン、ＥＬＱ−３００、エメチン、エトファミド、エクスカバタ（Ｅｘｃａｖａｔａ）駆虫薬、フマギリン、フラゾリドン、グリコビアルゾール、ＧＮＦ６７０２、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、イミドカーブ、イプロニダゾール、ジェスイット（Ｊｅｓｕｉｔ）の樹皮、ＫＡＦ１５６、ルメファントリン、マヅラミシン、メフロキン、メガゾール、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロル、メパクリン、メトロニダゾール、ミルテフォシン、ニイロレニンＢ、ニカルバジン、ニフルチモックス、ニモラゾール、ニタルソン、ニチジン、ニトロフラル、オリバシン、オルニダゾール、オロイジン、パマキン、パロモマイシン、ペンタミジン、五価アンチモン薬、ファンキノン、フェナミジン、ピペラキン、プリマキン、プログアニル、プロジェクト５２３、プロペニダゾール、ピリメタミン、ピロナリジン、キンファミド、キニン、ロニダゾール、スケジューラ・ロマーナ、ＳＣＹＸ−７１５８、セクニダゾール、セマピモド、スチボグルコン酸ナトリウム、スピロインドロン、スルファドキシン、スルファドキシン−ピリメタミン、スルファレン、スラミン、タフェノキン、テクロザン、テノニトロゾール、チルブロキノール、チニダゾール、トリメトレキセート、抗トリパノソーマ薬、ワールブルグのチンキ剤、及びこれらのジェネリック医薬品又はこれらの変種が含まれる。
【０１４５】
抗菌剤は、本明細書で列挙した薬剤と同様の機構によって作用する薬剤であり得る。
【０１４６】
当技術分野で公知の他の抗菌剤を、本発明において使用し得る。
【０１４７】
液体懸濁液
微生物の液体懸濁液は、機械、超音波及び／又は磁気撹拌を用いて撹拌され得る。機械撹拌の例には、振とう又は揺動並びに／又は撹拌棒、撹拌パドル、撹拌翼及び／若しくは撹拌プロペラ若しくは羽根車の使用が含まれる。
【０１４８】
微生物の分離は、遠心分離（例えばｇ力＞５００×ｇ）、磁気分離、ろ過（例えば０．４５ミクロン以下、好ましくは０．２ミクロン以下の細孔を有するフィルタによって）、電気泳動、誘電泳動、沈殿、凝集又はこれらの任意の組み合わせによって実施される。
【０１４９】
液体は、カチオン調整ミューラーヒントンブロスなどの増殖培地を含み得る。この培地は、微生物の増殖及び安定性を促進するための当業者に公知の１つ以上の添加剤を含み得る。種々の抗菌剤に加えて、種々の試験ウェルは、特定の抗菌剤についてのＡＳＴ精度を改善することが公知である１つ以上の添加剤を含み得る。例えば、オキサシリンを含む試験物に追加の塩化ナトリウムを添加してもよく、ダプトマイシンを含む試験物に追加のカルシウムを添加してもよい。
【０１５０】
カートリッジ
カートリッジの種類は限定されない。カートリッジは、微生物の液体懸濁液を保持し、増殖させることができる容器である。カートリッジの非限定的な例には、培養フラスコ、培養皿、ペトリ皿、バイオアッセイ皿、培養管、試験管、微量遠心管、瓶、マイクロウェルプレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マイクロプレートが含まれる。カートリッジは、１つのチャンバを含み得る。カートリッジは複数のチャンバを含んでもよく、各々のチャンバは、液体懸濁液を別の空間から物理的に隔離して保持することができる空間であり、チャンバの一例は、マルチウェルプレートのウェルである。カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６又はこれ以上のチャンバ及びこの間の任意の数のチャンバを含み得る。
【０１５１】
光学装置
シグナルを検出することができる多くの様々な特徴を有する任意の光学装置（例えば顕微鏡、マイクロプレートリーダー）は、本発明において有用である。例えば、広域スペクトルランプ（例えばキセノン）、狭域スペクトルランプ、レーザー、ＬＥＤ、多光子、共焦点又は全反射照明を励起のために使用することができる。カメラ（単一若しくは複数）、単一のフォトダイオード若しくはフォトダイオードのアレイ（１Ｄ若しくは２Ｄ）、アバランシェフォトダイオード、ＣＭＯＳ若しくはＣＣＤセンサ、固体光電子増倍管（例えばシリコン光電子増倍管）、及び／又はフィルタ若しくは回折格子に基づくスペクトル分解（１つ以上のスペクトル分解された発光波長）を有する光電子増倍管（単一又は複数）が検出側で可能である。
【０１５２】
キット
本発明において本明細書で使用される「キット」及び「システム」という用語は、複数のシグナル伝達剤と１つ以上の他の種類の要素又は成分（例えば他の種類の生化学試薬、シグナル検出試薬、対照（すなわち陽性及び陰性対照、例えば化学的に感受性／耐性の微生物）、分離手段（例えばフィルタ及び磁気ビーズ）、容器、商業的販売目的のパッケージングなどのパッケージ、微生物懸濁液を培養、処理又は含有することができる基質／カートリッジ、電子ハードウェア部品、及び非一時的なプロセッサ可読媒体に記録されたソフトウェア）との組み合わせなどの事物を指すことが意図されている。
【０１５３】
本発明の別の態様は、微生物の抗菌剤感受性を決定するためのキットである。このキットは、関心対象の無傷の微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤、微生物を含む試料をインキュベートするための溶液、及びシグナル伝達剤からシグナルを生成するための１つ以上の試薬を含む。
【０１５４】
実施形態では、シグナル伝達剤は、関心対象の無傷の微生物に直接又は間接的に結合することができる１つ以上の結合部分と会合している。
【０１５５】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、抗体、レクチン、天然及び／若しくは合成ペプチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然糖ポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマーから選択される。
【０１５６】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体であり得る。
【０１５７】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、合成及び／又は天然リガンド及び／又はペプチドであり得る。リガンド及び／又はペプチドは、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リジン及びこれらの組み合わせから選択され得る。
【０１５８】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、合成及び／又は天然ポリマー及び／又は糖ポリマーであり得る。天然及び／又は合成ポリマーは、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］及びこれらの組み合わせであり得る。天然及び／又は合成ポリマー及び／又は糖ポリマーは、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、又はコブロックポリマー、グラフトポリマー及び交互ポリマーを含むがこれらに限定されない、これらの組み合わせを含むがこれらに限定されない部分を含み得る。
【０１５９】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、マンノース結合レクチン、他のレクチン、アネキシン及びこれらの組み合わせから選択される糖タンパク質を含み得る。
【０１６０】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、２つ以上の結合部分を含み得る。
【０１６１】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、微生物表面上に存在する１つ以上の生体分子に直接又は間接的に結合し得る。例示的な生体分子には、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポーリン、β−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、脂質Ａ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【０１６２】
実施形態では、結合部分はナノ粒子である。
【０１６３】
実施形態では、結合部分はバクテリオファージである。
【０１６４】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、１つ以上の生体分子に特異的に結合し得る。
【０１６５】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、１つ以上の種特異的生体分子に結合し得る。
【０１６６】
実施形態では、１つ以上の結合部分は、例えば非共有結合相互作用によって及び共有結合を形成することによって、非特異的に微生物に結合し得る。
【０１６７】
実施形態では、キットは、上清から微生物を磁気的に分離する磁気ビーズをさらに含む。
【０１６８】
実施形態では、磁気ビーズは、微生物に結合する１つ以上の結合部分と会合している。磁気ビーズと会合している１つ以上の結合部分は、シグナル伝達剤と会合しているものと同一であってもよい。磁気ビーズに会合している１つ以上の結合部分は、シグナル伝達剤に会合しているものとは異なっていてもよい。
【０１６９】
実施形態では、磁気ビーズは、２０ｎｍ〜２０ミクロンの範囲の直径を有する。
【０１７０】
実施形態では、キットは、結合部分と微生物との間の結合を増強するための１つ以上のイオン又は小分子をさらに含む。
【０１７１】
実施形態では、溶液は＜０．１５Ｍの塩を含む。
【０１７２】
実施形態では、キットは、微生物結合剤をさらに含み、結合部分は、微生物結合剤を介して間接的に微生物に結合する。結合部分は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン又はアビジンにコンジュゲートしていてもよく、微生物結合剤はビオチン化されていてもよい。結合部分は、種特異的Ｆｃドメインに結合する抗体であってもよく、微生物結合剤は、種特異的Ｆｃドメインを有する微生物に結合することができる抗体であってもよい。
【０１７３】
実施形態では、シグナル伝達剤は、ケミルミノフォア、触媒又は酵素の１つ以上を含み得る。酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ及びこれらの組み合わせの少なくとも１つであり得る。触媒は、有機金属化合物であり得る。
【０１７４】
実施形態では、シグナル伝達剤はナノ粒子の形態で提供され、例えば、シグナル伝達剤はナノ粒子内に封入される。ナノ粒子は解離性であり得、これは、金属酸化物を含んでもよく、金属酸化物は、酸化鉄、酸化セシウム及び／又は酸化セリウムであってもよく又はこれらを含んでもよい。
【０１７５】
実施形態では、シグナルレベルを決定する前に、０回、１回又は２回の洗浄を実施する。
【０１７６】
実施形態では、シグナル伝達剤の添加の前に０回、１回又は２回の洗浄を実施する。
【０１７７】
実施形態では、キットは、測定可能なシグナルを生成するための展開剤試薬をさらに含む。
【０１７８】
実施形態では、１つ以上の試薬は、触媒反応のための試薬及び触媒反応を停止させる試薬を含む。
【０１７９】
実施形態では、キットは、シグナル、例えば光及び／又は電気シグナルを測定するための装置をさらに含む。光学測定は、蛍光、時間分解蛍光、吸収及び／又は発光であり得る。
【０１８０】
実施形態では、キットは、マルチウェルプレート、例えば２４ウェル、９６ウェル、１９２ウェル又は３８４ウェルプレートをさらに含む。
【０１８１】
実施形態では、キットは、本明細書に開示される方法を実施するのにキットを使用するための説明書をさらに含む。キットは、本明細書に記載の１つ以上の方法の前又は後に行われる工程を実施するための説明書をさらに含み得る。
【０１８２】
一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の方法を実施するために必要な試薬又は本明細書に記載の１つ以上の方法の前又は後の工程を実施するために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１８３】
治療法
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」等の用語は、これに関連する障害及び／又は症状を軽減又は改善することを指す。除外されるわけではないが、障害又は状態を治療することは、これに関連する障害、状態又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解される。治療することは、医療専門家又は診断学者が所望の作用経過又は治療レジメン、例えば処方について被験体にアドバイスすることを含み得る。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」等の用語は、障害又は状態を有していないが、発症する危険性がある又は発症しやすい被験体において障害又は状態を発症する可能性を低減することを指す。
【０１８５】
「治療する方法」という用語は、管理する方法を含み、感染性微生物又は感染に関連して使用される場合は、感染性微生物の有害な作用からの改善、排除、軽減、予防又は他の緩和若しくは管理を含む。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「薬物」、「薬剤」、「治療薬」、「活性剤」、「治療化合物」、「組成物」又は「化合物」という用語は、交換可能に使用され、疾患、疾病、状態又は身体機能の障害を治療又は予防するために使用できる任意の化学的実体、薬剤、薬物、生物学的製剤、植物製剤等を指す。薬剤は、公知の治療化合物及び潜在的な治療化合物の両方を含み得る。薬剤は、当業者に公知のスクリーニングを用いてスクリーニングすることによって治療的であると決定され得る。「公知の治療化合物」、「薬物」又は「薬剤」は、このような治療において有効であることが示されている（例えば動物試験又はヒトへの投与に関する事前の経験を通して）治療化合物を指す。「治療レジメン」は、本明細書で開示される「薬物」、「薬剤」、「治療薬」、「活性剤」、「治療化合物」、「組成物」若しくは「化合物」を含む治療及び／又は被験体による行動変容を含む治療及び／又は外科的手段を含む治療に関する。
【０１８７】
抗菌剤、例えば抗生物質は、微生物を死滅させるか又は微生物の増殖を阻害することができる作用物質である。
【０１８８】
シグナル伝達剤及び化学的結合
実施形態では、本発明は、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤を特徴とする。実施形態では、前記結合は非特異的である。実施形態では、前記結合は特異的である。
【０１８９】
実施形態では、シグナル伝達剤は、本明細書に記載の方法のインキュベーション工程の間存在する。実施形態では、シグナル伝達剤は、本明細書に記載の方法のインキュベーション工程の後に存在する。
【０１９０】
実施形態では、結合は、共有結合の形成を含む。実施形態では、シグナル伝達剤は微生物の表面に結合することができ、前記結合は、共有結合の形成を含む。実施形態では、本明細書に記載の方法は、微生物表面上の基と本明細書に記載のシグナル伝達剤との間での共有結合の形成（例えば本明細書に記載の求電子性基又は求核性基などの反応性基を介して）をもたらす。実施形態では、シグナル伝達剤は、微生物の表面への共有結合を形成している。
【０１９１】
実施形態では、結合は、非共有結合相互作用の形成を含む。実施形態では、シグナル伝達剤は微生物の表面に結合することができ、前記結合は、非共有結合相互作用の形成を含む。実施形態では、本明細書に記載の方法は、微生物表面上の基と本明細書に記載のシグナル伝達剤との間での非共有結合相互作用の形成（例えば本明細書に記載の求電子性基又は求核性基などの反応性基を介して）をもたらす。実施形態では、シグナル伝達剤は、微生物の表面と非共有結合相互作用を形成している。
【０１９２】
実施形態では、非共有結合相互作用は、イオン性相互作用、イオン−イオン相互作用、双極子−双極子相互作用、イオン−双極子相互作用、静電的相互作用、ロンドン分散、ファンデルワールス相互作用、水素結合、π−π相互作用、疎水性相互作用又はこれらの任意の組み合わせを含む。実施形態では、非共有結合相互作用は、イオン性相互作用、イオン−イオン相互作用、双極子−双極子相互作用、イオン−双極子相互作用、静電的相互作用、ロンドン分散、ファンデルワールス相互作用、水素結合、π−π相互作用、疎水性相互作用又はこれらの任意の組み合わせである。
【０１９３】
実施形態では、非共有結合相互作用は、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、π−π相互作用若しくは水素結合、又はこれらの任意の組み合わせを含む。実施形態では、非共有結合相互作用は、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合若しくはπ−π相互作用、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９４】
実施形態では、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤は、微生物の膜、壁、タンパク質、細胞小器官、サッカリド、脂質、細胞エンベロープ若しくは核酸、又はこれらの任意の組み合わせに結合することができる基（例えば化学基又は生化学基）を含む。実施形態では、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤は、微生物の膜、壁、タンパク質、細胞小器官、サッカリド、脂質、細胞エンベロープ若しくは核酸、又はこれらの任意の組み合わせに結合することができる化学基（例えば求核性基又は求電子性基）を含む。実施形態では、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤は、微生物の膜、壁、タンパク質、細胞小器官、サッカリド、脂質、細胞エンベロープ若しくは核酸、又はこれらの任意の組み合わせに結合することができる生化学基を含む。
【０１９５】
実施形態では、表面は、シグナル伝達剤が結合又は会合する生体分子を含み得る。例示的な生体分子には、ペプチドグリカン、ムレイン、マンノプロテイン、ポーリン、β−グルカン、キチン、糖タンパク質、多糖、リポ多糖、リポオリゴ糖、リポタンパク質、内毒素、リポテイコ酸、テイコ酸、脂質Ａ、炭水化物結合ドメイン、流出ポンプ、他の細胞壁及び／又は細胞膜関連タンパク質、他のアニオン性リン脂質、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【０１９６】
実施形態では、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤は、微生物の膜、壁、タンパク質、細胞小器官、サッカリド、脂質、細胞エンベロープ若しくは核酸、又はこれらの任意の組み合わせに結合することができる生化学基を含む。
【０１９７】
実施形態では、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤は、微生物の膜、壁、タンパク質、細胞小器官、サッカリド、脂質、細胞エンベロープ若しくは核酸、又はこれらの任意の組み合わせに結合することができる化学基（例えば求核性又は求電子性官能基）を含む。実施形態では、前記化学基は、求核性官能基である。実施形態では、前記化学基は、求電子性官能基である。
【０１９８】
実施形態では、シグナル伝達剤は、生化学的シグナル伝達剤である。実施形態では、生化学的シグナル伝達剤は、抗体、リガンド、タンパク質、アプタマー、ｓｓ−ＤＮＡ、ｓｓ−ＲＮＡ又はｓｓ−ＰＮＡなどの生体分子を含む。
【０１９９】
実施形態では、シグナル伝達剤は、化学的シグナル伝達剤である。実施形態では、化学的シグナル伝達剤は、化学化合物（例えば合成化学化合物）である。実施形態では、化学的シグナル伝達剤は、抗体、リガンド、タンパク質、アプタマー、ｓｓ−ＤＮＡ、ｓｓ−ＲＮＡ又はｓｓ−ＰＮＡなどの生体分子を含まない。
【０２００】
実施形態では、微生物の表面に結合することができるシグナル伝達剤は、
リンカー基Ｌ；及び
増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）
を含む。
【０２０１】
実施形態では、増幅基は、化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４である。実施形態では、増幅基１０４は化学増幅剤である。実施形態では、増幅基１０４は生化学増幅剤である。
【０２０２】
実施形態では、シグナル伝達剤は化学化合物である。実施形態では、化学化合物は、本明細書に記載のもののような化学増幅基を含む。
【０２０３】
実施形態では、リンカー基Ｌは、抗体の保存された（Ｆｃ）領域を含む。
【０２０４】
実施形態では、リンカー基Ｌは、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）と共有結合を形成することができる。
【０２０５】
実施形態では、リンカー基Ｌは、シグナル増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）と共有結合を形成する。
【０２０６】
実施形態では、リンカー基Ｌは、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）に対して１つ以上の非共有結合相互作用を形成することができる。
【０２０７】
実施形態では、リンカー基Ｌは、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）に対して１つ以上の非共有結合相互作用を形成する。
【０２０８】
実施形態では、リンカー基Ｌは、微生物表面に結合することができる基（例えば化学基又は生化学基）を含む。実施形態では、リンカー基Ｌは、微生物表面に結合する基（例えば化学基又は生化学基）を含む。
【０２０９】
実施形態では、リンカー基Ｌは、微生物の表面と共有結合を形成することができる基（例えば化学基又は生化学基）を含む。実施形態では、リンカー基Ｌは、微生物の表面と共有結合を形成する基（例えば化学基又は生化学基）を含む。
【０２１０】
実施形態では、リンカー基Ｌは、微生物の表面と１つ以上の非共有結合相互作用を形成することができる基（例えば化学基又は生化学基）を含む。実施形態では、リンカー基Ｌは、微生物の表面と１つ以上の非共有結合相互作用を形成する基（例えば化学基又は生化学基）を含む。
【０２１１】
実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０１を含み、前記化学的部分は、微生物の表面と非共有結合相互作用を形成することができる。実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０１を含み、前記化学的部分は、微生物の表面と共有結合を形成することができる。実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０１を含み、前記化学的部分は、微生物の表面と非共有結合相互作用を形成する。実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０１を含み、前記化学的部分は、微生物の表面と共有結合を形成する。
【０２１２】
実施形態では、リンカー基Ｌは、スペーサー部分１０２を含む。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０１及び／又は化学的部分１０３に共有結合している。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０１に共有結合している。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０３に共有結合している。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０１及び化学的部分１０３に共有結合している。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０１及び／又は化学的部分１０３と非共有結合相互作用を形成する。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０１と非共有結合相互作用を形成する。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０３と非共有結合相互作用を形成する。実施形態では、スペーサー部分１０２は、化学的部分１０１及び化学的部分１０３と非共有結合相互作用を形成する。
【０２１３】
実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０３を含み、前記化学的部分は、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）と共有結合を形成することができる。実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０３を含み、前記化学的部分は、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）と共有結合を形成している。実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０３を含み、前記化学的部分は、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）と非共有結合相互作用を形成することができる。実施形態では、リンカー基Ｌは化学的部分１０３を含み、前記化学的部分は、増幅基（例えば化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４）と非共有結合相互作用を形成している。
【０２１４】
実施形態では、シグナル伝達剤は、
微生物の表面と共有結合又は非共有結合相互作用を形成することができる化学的部分１０１、
化学的部分１０１及び化学的部分１０３に共有結合しているスペーサー部分１０２、並びに
化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４と共有結合を形成している又は形成することができる化学的部分１０３
を含むリンカー基Ｌを含む化学化合物である。
【０２１５】
実施形態では、シグナル伝達剤は、
微生物の表面と共有結合又は非共有結合相互作用を形成することができる化学的部分１０１、
化学的部分１０１及び化学的部分１０３に共有結合しているスペーサー部分１０２、並びに
化学又は生化学増幅剤である増幅基１０４と非共有結合相互作用を形成している又は形成することができる化学的部分１０３
を含むリンカー基Ｌを含む化学化合物である。
【０２１６】
実施形態では、リンカー基は、１つの化学的部分１０１を含む。実施形態では、リンカー基は、２つ以上の化学的部分１０１（例えばリンカー基は１、２、３、４、５又は６個の化学的部分１０１を含む）を含む。
【０２１７】
実施形態では、リンカー基は、１つのスペーサー部分１０２を含む。実施形態では、リンカー基は、２つ以上のスペーサー部分１０２（例えばリンカー基は１、２、３、４、５又は６個のスペーサー部分１０２を含む）を含む。
【０２１８】
実施形態では、リンカー基は、１つの化学的部分１０３を含む。実施形態では、リンカー基は、２つ以上の化学的部分１０３（例えばリンカー基は１、２、３、４、５又は６個の化学的部分１０３を含む）を含む。
【０２１９】
実施形態では、リンカー基は、１つの化学的部分１０１、１つのスペーサー部分１０２及び１つの化学的部分１０３を含む。実施形態では、リンカー基は、１つの化学的部分１０１、１つのスペーサー部分１０２及び１つの化学的部分１０３からなる。
【０２２０】
実施形態では、リンカー基は、部分構造（Ｉ）：
−１０１−１０２−１０３−、（Ｉ）
［ここで、
「１０１」は化学的部分１０１を表し、
「１０２」はスペーサー部分１０２を表し；及び
「１０３」は化学的部分１０３を表す］
の構造を有する。
【０２２１】
実施形態では、化学的部分１０１は、微生物の表面と共有結合を形成することができる。
【０２２２】
実施形態では、化学的部分１０１は、カップリングを促進する１つ以上の作用物質（本明細書ではカップリング剤とも称される）の存在下で微生物の表面と共有結合を形成することができる。
【０２２３】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メチル−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ウッドワード試薬、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）若しくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２２４】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、アルデヒド、アクリレート、アミド、イミド、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート、イソチオシアネート、有機酸、モノマー、ポリマー、シラン若しくはシリケート、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２２５】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、カルボジイミド、ホスホニウム塩若しくはアンモニウム塩、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２２６】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、グルタルアルデヒド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカーボネート（ＥＤＣ）、（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート）（ＨＡＴＵ）、（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＨＢＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、（Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ブロモ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）、７−アザ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタート−Ｏ２）−トリ−（１−ピロリジニル）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾ［ｄ］トリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｎ−［（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド（ＨＤＭＣ）、１−［１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノ］−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、２−（１−オキシ−ピリジン−２−イル）−１，１，３，３−テトラメチルイソチオウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＯＴＴ）、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−プロパンホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、トリホスゲン、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、［（６−ニトロベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ］トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＯＰ）、［［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾール−１−イル］オキシ］トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＦＯＰ）、［［４−ニトロ−６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾール−１−イル］オキシ］トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＦＯＰ）、［（６−ニトロベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＮＯＰ）、１−β−ナフタレンスルホニルオキシベンゾトリアゾール（ＮＳＢｔ）、１−β−ナフタレンスルホニルオキシ−６−ニトロベンゾトリアゾール（Ｎ−ＮＳＢｔ）、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、ビス（テトラメチレン）フルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＴＦＦＨ）、１，３−ジメチル−２−フルオロ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（ＤＦＩＨ）、塩化シアヌル（ＣＣ）若しくは２，４−ジクロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン（ＤＣＭＴ）、及び２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２２７】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、ＥＤＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＮＨＳ、ＤＣＣ、ＨＯＢＴ若しくはＰｙＢＯＰ、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２２８】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＣＭＣ、ＤＩＣ若しくはＨＡＴＵ、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２２９】
実施形態では、カップリングを促進する作用物質には、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド若しくはパラホルムアルデヒド、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２３０】
実施形態では、化学的部分１０１は、微生物の表面と非共有結合的相互作用（例えば本明細書に記載される任意の非共有結合相互作用）を形成することができる。実施形態では、非共有結合相互作用は、イオン性、イオン−イオン、双極子−双極子、イオン−双極子、静電的、ロンドン分散、ファンデルワールス、水素結合若しくはπ−π相互作用、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２３１】
実施形態では、化学的部分１０１は、微生物の表面と非共有結合相互作用を形成することができ、前記非共有結合相互作用は、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、π−π相互作用若しくは水素結合、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２３２】
実施形態では、化学的部分１０１は、求核性官能基を含む。実施形態では、化学的部分１０１は、求核性官能基から形成される基を含む。
【０２３３】
実施形態では、求核性官能基は、アミノ、アミド、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシ又はチオである。実施形態では、求核性官能基は、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ又はチオである。実施形態では、求核性官能基は、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシ又はチオを含む。実施形態では、求核性官能基は、カルボキサミド、Ｎ−ヒドロキシカルボキサミド、カルボキシルヒドラジド又はグアニジノである。
【０２３４】
実施形態では、求核性官能基は、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨである。実施形態では、求核性官能基は、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮＨ２又は−ＯＮＨ２である。
【０２３５】
実施形態では、化学的部分１０１は、求電子性官能基を含む。
【０２３６】
実施形態では、化学的部分１０１は、求電子性官能基から形成される基を含む。
【０２３７】
実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物（例えば塩化アセチル）又はカルボン酸無水物（例えば無水酢酸）を含む。
【０２３８】
実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、トシレートエステル、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、イミドエステル、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、カーボネート、ハロアセチル、クロロトリアジン、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アジリジン又はアクリロイル誘導体を含む。実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、トシレートエステル、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、イミドエステル、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、カーボネート、ハロアセチル、クロロトリアジン、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アジリジン又はアクリロイル誘導体である。
【０２３９】
実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド又はヒドロキシスクシンイミド基を含む。
【０２４０】
実施形態では、求電子性官能基は、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、
【０２４１】
【化１】
2019508062.tif 000004
を含む。
【０２４２】
実施形態では、求電子性官能基は、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、
【０２４３】
【化２】
2019508062.tif 000005
である。
【０２４４】
実施形態では、化学的部分１０１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ヘテロアリール、ハロアルキル、ヒドロキシ、カルボニル、ハロゲン化アシル、アルコキシカルボニルオキシ、カルボキシ、ハロケトン、アルコキシ、アルコキシオール（ヘミアセタール又はヘミケタール）、ジアルコキシ（例えばケタール又はアセタール）、トリアルコキシ（オルトエーテル）、カルバモイル、アミノ、アンモニオ、イミノ、イミド、スクシンアミド、マレイミド、ヒドロキシスクシンアミド、ビオチン、Ｄ−ビオチン、アジド、アゾ、シアネート、イソシアナト、ニトロキシ、シアノ、イソシアノ、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、オキシム、スルファニル、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアナト、イソチオシアナト、チオイル、ホスフェート又はボロネートである基を含む。
【０２４５】
実施形態では、スペーサー部分１０２は疎水性である。実施形態では、スペーサー部分１０２は親水性である。
【０２４６】
実施形態では、スペーサー部分１０２はペプチド性（例えばペプチド結合に由来する）である。
【０２４７】
実施形態では、スペーサー部分１０２は無機結合を含む。実施形態では、スペーサー部分１０２は、有機結合を含む。実施形態では、スペーサー部分１０２は、有機結合のみを含む。
【０２４８】
実施形態では、スペーサー部分１０２はオリゴマー性である。実施形態では、スペーサー部分１０２はポリマー性である。実施形態では、スペーサー部分１０２は、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレングリコール（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、イミノエチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）、ビニルアルコール（−ＣＨ２ＣＨＯＨ−）ｘ、乳酸（−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、アクリル酸（−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＯ２Ｈ）−）、メタクリル酸（−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）（ＣＯ２Ｈ）−）又はメチルメタクリレート（−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）（ＣＯ２ＣＨ３）−）のセグメント（例えば１〜約３００、１〜約２００、１〜約１００、１〜約５０、１〜約２５若しくは１〜約１０又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のセグメント）を含む。
【０２４９】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２５０】
【化３】
2019508062.tif 000006
であるセグメントを含む。
【０２５１】
実施形態では、ｎ、ｍ、ｐ及びｑは、独立して、１〜約３００（例えば１〜約２００、１〜約１００、１〜約５０、１〜約２５又は１〜約１０）の整数である。実施形態では、ｎ、ｍ、ｐ及びｑの各々は、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０２５２】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２５３】
【化４】
2019508062.tif 000007
を含む。実施形態では、Ｒ’は、独立して、水素又はＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル若しくはＣ２−Ｃ１２アルキニルである基である。実施形態では、ｏは、１〜約３００（例えば１〜約２００、１〜約１００、１〜約５０、１〜約２５又は１〜約１０）の整数である。実施形態では、ｏは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０２５４】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２５５】
【化５】
2019508062.tif 000008
を含む。実施形態では、Ｒは、独立して、水素又はＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル若しくはＣ２−Ｃ１２アルキニルである基である。実施形態では、ｒは、１〜約３００（例えば１〜約２００、１〜約１００、１〜約５０、１〜約２５又は１〜約１０）の整数である。実施形態では、ｒは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０２５６】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２５７】
【化６】
2019508062.tif 000009
を含む。実施形態では、Ｒは、独立して、水素又はＣ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル若しくはＣ２−Ｃ１２アルキニルである基である。いくつかの実施形態では、ｓは、１〜約３００（例えば１〜約２００、１〜約１００、１〜約５０、１〜約２５又は１〜約１０）の整数である。実施形態では、ｓは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０２５８】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２５９】
【化７】
2019508062.tif 000010
を含む。実施形態では、ｔは、１〜約３００（例えば１〜約２００、１〜約１００、１〜約５０、１〜約２５又は１〜約１０）の整数である。実施形態では、ｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０２６０】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２６１】
【化８】
2019508062.tif 000011
を含む。
【０２６２】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、アルキル、アルコキシ、エステル、アクリル、アミノ、ヒドロキシル若しくはアシルヒドラジン官能基、又はこれらの任意の組み合わせを含む反復基を含むポリマーである。
【０２６３】
実施形態では、スペーサー部分１０２は、
【０２６４】
【化９】
2019508062.tif 000012
であり、ここで、ｎ、ｍ、ｐ及びｑは、本明細書で定義される通りである。
【０２６５】
実施形態では、ｎ、ｍ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ又はｔの各々は、独立して、１〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０又は１〜１０の整数である。
【０２６６】
実施形態では、化学的部分１０３は、求核性官能基である基を含む。
【０２６７】
実施形態では、化学的部分１０３は、求核性官能基から形成される基を含む。
【０２６８】
実施形態では、求核性官能基は、アミノ、アミド、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシ又はチオである。実施形態では、求核性官能基は、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ又はチオである。
【０２６９】
実施形態では、求核性官能基は、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシ又はチオを含む。実施形態では、求核性官能基は、カルボキサミド、Ｎ−ヒドロキシカルボキサミド、カルボキシルヒドラジド又はグアニジノである。
【０２７０】
実施形態では、求核性官能基は、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨである。実施形態では、求核性官能基は、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＣＯＮＨＮＨ２又は−ＯＮＨ２である。
【０２７１】
実施形態では、化学的部分１０３は、求電子性官能基である基を含む。
【０２７２】
実施形態では、化学的部分１０３は、求電子性官能基から形成される基を含む。
【０２７３】
実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物（例えば塩化アセチル）又はカルボン酸無水物（例えば無水酢酸）を含む。
【０２７４】
実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、トシレートエステル、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、イミドエステル、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、カーボネート、ハロアセチル、クロロトリアジン、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アジリジン又はアクリロイル誘導体を含む。実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、トシレートエステル、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、イミドエステル、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、カーボネート、ハロアセチル、クロロトリアジン、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アジリジン又はアクリロイル誘導体である。
【０２７５】
実施形態では、求電子性官能基は、アルデヒド、α−ハロケトン、マレイミド、スクシンイミド又はヒドロキシスクシンイミド基を含む。
【０２７６】
実施形態では、求電子性官能基は、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、
【０２７７】
【化１０】
2019508062.tif 000013
を含む。
【０２７８】
実施形態では、求電子性官能基は、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、
【０２７９】
【化１１】
2019508062.tif 000014
を含む。
【０２８０】
実施形態では、化学的部分１０３は、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである化学構造を含む。実施形態では、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである前記基は、増幅基（例えば増幅基１０４）と共有結合を形成することができる。実施形態では、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである前記基は、増幅基（例えば増幅基１０４）と非共有結合相互作用を形成することができる。
【０２８１】
実施形態では、化学的部分１０３は、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである基を含む化学構造から形成される。実施形態では、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである前記基は、増幅基（例えば増幅基１０４）と共有結合を形成している。実施形態では、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド、ビオチニル、無水物、クロロトリアジン、エポキシド、イソシアネート又はイソチオシアネートである前記基は、増幅基（例えば増幅基１０４）と非共有結合相互作用を形成している。
【０２８２】
実施形態では、化学的部分１０３は、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド又はビオチニルである基を含む。
【０２８３】
実施形態では、化学的部分１０３は、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド又はビオチニル官能基を含む。
【０２８４】
実施形態では、化学的部分１０３は、
【０２８５】
【化１２】
2019508062.tif 000015
を含む。
【０２８６】
実施形態では、化学的部分１０３は、カルボニル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、アミノ、チオール、マレイミド、スクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミド又はビオチニル官能基である基を含む化学構造から形成される基を含む。
【０２８７】
実施形態では、リンカー基Ｌは、部分構造（ＩＩ）：
【０２８８】
【化１３】
2019508062.tif 000016
［ここで、
Ｘは、化学的部分１０１（例えば本明細書に記載の任意の化学的部分１０１）を表し、
Ｒは、スペーサー部分１０２（例えば本明細書に記載の任意のスペーサー部分１０２）を表し、
Ｙは、化学的部分１０３（例えば本明細書に記載の任意の化学的部分１０３）を表し、並びに
ｊ及びｋの各々は、独立して、０〜１００の整数である］
の構造を有する。
【０２８９】
実施形態では、Ｘは、
【０２９０】
【化１４】
2019508062.tif 000017
である。
【０２９１】
実施例では、Ｒは、
【０２９２】
【化１５】
2019508062.tif 000018
であり、ここで、ｎ、ｍ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ又はｔの各々は、本明細書に記載の通り（例えば１〜約３００の整数）である。
【０２９３】
実施形態では、Ｙは、
【０２９４】
【化１６】
2019508062.tif 000019
である。
【０２９５】
実施形態では、Ｘは微生物の表面と共有結合を形成することができる。実施形態では、Ｘは微生物の表面と共有結合を形成する。
【０２９６】
実施形態では、Ｘは、微生物の表面と１つ以上の非共有結合相互作用を形成することができる。実施形態では、Ｘは、微生物の表面と１つ以上の非共有結合相互作用を形成する。
【０２９７】
実施形態では、Ｙは、増幅基１０４（例えば化学又は生化学増幅剤）と共有結合を形成することができる。実施形態では、Ｙは、増幅基１０４（例えば化学又は生化学増幅剤）などの増幅基と共有結合を形成する。
【０２９８】
実施形態では、Ｙは、増幅基１０４（例えば化学又は生化学増幅剤）に対して１つ以上の非共有結合相互作用を形成することができる。実施形態では、Ｙは、増幅基１０４（例えば化学又は生化学増幅剤）などの増幅基に対して１つ以上の非共有結合相互作用を形成する。
【０２９９】
実施形態では、リンカー基Ｌは、
【０３００】
【化１７】
2019508062.tif 000020
2019508062.tif 000021
ＷＧＡ−ビオチン、ポリミキシンＢ−ビオチン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ビオチン化モノクローナル抗体、ビオチン化ポリクローナル抗体、ユウロピウムキレート−抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体、並びに抗体変異体（例えばＦａｂ：抗原結合フラグメント（一方の腕）；Ｆ（ａｂ’）２：ヒンジ領域を含む抗原結合フラグメント（両方の腕）；Ｆａｂ’：ヒンジ領域を含む抗原結合フラグメント（一方の腕）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変フラグメント；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体一本鎖可変フラグメント；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二重特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体及びＢｉＴＥ：二重特異性Ｔ細胞誘導体）である。
【０３０１】
例示的な増幅基には、例えば国際公開ＷＯ２０１６／０１５０２７号及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９号に記載されているものが含まれ、これらの各々は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０２】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、触媒、フルオロフォア又は比色色素を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、触媒、フルオロフォア又は比色色素である。
【０３０３】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、酵素、触媒又はナノ粒子を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、酵素、触媒又はナノ粒子である。
【０３０４】
実施形態では、化学増幅基は、触媒、フルオロフォア、ナノ粒子又は比色色素を含む。実施形態では、化学増幅基は、触媒、フルオロフォア、ナノ粒子又は比色色素である。
【０３０５】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は触媒を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は触媒である。
【０３０６】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はフルオロフォアを含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はフルオロフォアである。例示的なフルオロフォアには、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９号の表１に記載されているものが含まれる。
【０３０７】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は比色色素を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は比色色素である。
【０３０８】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は酵素を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は酵素である。
【０３０９】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はナノ粒子を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はナノ粒子である。
【０３１０】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はランタニドを含む。
【０３１１】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム又はジスプロシウムであるランタニドを含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、ユウロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロシウムからなる群より選択されるランタニドを含む。
【０３１２】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は有機フルオロフォアを含む。
【０３１３】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、配位錯体であるフルオロフォアを含む。
【０３１４】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はユウロピウム配位錯体を含む。実施形態では、配位錯体はユウロピウム配位錯体である。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はルテニウム配位錯体を含む。実施形態では、配位錯体はルテニウム配位錯体である。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はレニウム配位錯体を含む。実施形態では、配位錯体はレニウム配位錯体である。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はパラジウム配位錯体を含む。実施形態では、配位錯体はパラジウム配位錯体である。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は白金配位錯体を含む。実施形態では、配位錯体は白金配位錯体である。
【０３１５】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は、ケミルミノフォア、量子ドット、酵素、鉄配位触媒、ユウロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体、サマリウム配位錯体、テルビウム配位錯体又はジスプロシウム配位錯体を含む。
【０３１６】
実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はケミルミノフォアを含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は量子ドットを含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は酵素を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は鉄配位触媒を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はユウロピウム配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はルテニウム配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はレニウム配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はパラジウム配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）は白金配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はサマリウム配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はテルビウム配位錯体を含む。実施形態では、増幅基（例えば増幅基１０４）はジスプロシウム配位錯体を含む。
【０３１７】
実施形態では、増幅基１０４は、
【０３１８】
【化１８】
2019508062.tif 000022
である部分を含む。
【０３１９】
実施形態では、増幅基１０４は、
【０３２０】
【化１９】
2019508062.tif 000023
2019508062.tif 000024
2019508062.tif 000025
である部分を含む。
【０３２１】
実施形態では、増幅基１０４は、触媒又は酵素である。実施形態では、増幅基は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ又はβ−ラクタマーゼである。
【０３２２】
実施形態では、増幅基１０４はホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【０３２３】
実施形態では、増幅基１０４は、フルオロフォア又は比色色素である。
【０３２４】
適切なフルオロフォア及び比色色素は当業者に周知であり、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｒ）Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１ｔｈ  Ｅｄ．（２０１０）及びＧｏｍｅｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，ａｎｄ  Ｌｉｍａ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（２００５）ｐｐ  ４５−８０に記載されており、これらは全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なフルオロフォアには、例えば国際公開ＷＯ２０１６／０１５０２７号及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９号に記載されているものも含まれ、これらの各々は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２５】
適切なフルオロフォア又は比色色素の例には、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール、シアニン、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＳＹＴＯ、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシローダミン６Ｇ、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジン、アレクサフルオル、アリザリン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ボディピー、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カテコールアミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミン、モノブロモビマン、オレゴングリーン、フィコエリトリン、ＳＹＴＯ、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チオフラビン、Ｘ−ローダミンＣ又はテトラメチルローダミンイソチオシアネートが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２６】
実施形態では、増幅基１０４は、有機金属化合物、遷移金属錯体又は配位錯体である。例示的な例は、ＥＰ０１８０４９２、ＥＰ０３２１３５３、ＥＰ０５３９４３５、ＥＰ０５３９４７７、ＥＰ０５６９４９６、ＥＰ１３９６７５、ＥＰ６４４８４、ＵＳ４，２８３，３８２、ＵＳ４，５６５，７９０、ＵＳ４，７１９，１８２、ＵＳ４，７３５，９０７、ＵＳ４，８０８，５４１、ＵＳ４，９２７，９２３、ＵＳ５，１６２，５０８、ＵＳ５，２２０，０１２、ＵＳ５，３２４，８２５、ＵＳ５，３４６，９９６、ＵＳ５，３７３，０９３、ＵＳ５，４３２，１０１、ＵＳ５，４５７，１８５、ＵＳ５，５１２，４９３、ＵＳ５，５２７，６８４、ＵＳ５，５３４，６２２、ＵＳ５，６２７，０７４、ＵＳ５，６９６，２４０、ＵＳ６，１００，３９４、ＵＳ６，３４０，７４４、ＵＳ６，５２４，７２７、ＵＳ６，７１７，３５４、ＵＳ７，０６７，３２０、ＵＳ７，３６４，５９７、ＵＳ７，３９３，５９９、ＵＳ７，４５６，０２３、ＵＳ７，４６５，７４７、ＵＳ７，６２５，９３０、ＵＳ７，８５４，９１９、ＵＳ７，９１０，０８８、ＵＳ７，９５５，８５９、ＵＳ７，９６８，９０４、ＵＳ８，００７，９２６、ＵＳ８，０１２，６０９、ＵＳ８，０１７，２５４、ＵＳ８，０１８，１４５、ＵＳ８，０４８，６５９、ＵＳ８，０６７，１００、ＵＳ８，１２９，８９７、ＵＳ８，１７４，００１、ＵＳ８，１８３，５８６、ＵＳ８，１９３，１７４、ＵＳ８，２２１，７１９、ＵＳ８，２８８，７６３、ＵＳ８，３６２，６９１、ＵＳ８，３８３，２４９、ＵＳ８，４９２，７８３、ＵＳ８，６３２，７５３、ＵＳ８，６６３，６０３、ＵＳ８，７２２，８８１、ＵＳ８，７５４，２０６、ＵＳ８，８９０，４０２、ＵＳ８，９６９，８６２、ＵＳ９，０１２，０３４、ＵＳ９，０５６，１３８、ＵＳ９，１１８，０２８、ＵＳ９，１３３，２０５、ＵＳ９，１８７，６９０、ＵＳ９，１９３，７４６、ＵＳ９，３１２，４９６、ＵＳ９，３３７，４３２、ＵＳ９，３４３，６８５、ＵＳ９，３９１，２８８及びＵＳ９，５３７，１０７に記載されているが、これらに限定されず、これらは全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的な有機金属化合物、遷移金属錯体又は配位錯体には、例えば国際公開ＷＯ２０１６／０１５０２７号及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９号に記載されているものも含まれ、これらの各々は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２７】
実施形態では、増幅基１０４はランタニド配位錯体である。
【０３２８】
実施形態では、ランタニド配位錯体は、ランタニド（例えばＥｕ又はＴｂ）と四座配位子との間の錯体である。
【０３２９】
実施形態では、ランタニド配位錯体は、ランタニド（例えばＥｕ又はＴｂ）とクリプテート配位子との間の錯体である。
【０３３０】
実施形態では、増幅基１０４は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）又は白金（Ｐｔ）の配位錯体である。
【０３３１】
実施形態では、増幅基１０４は、原子番号５７のランタンから原子番号７１のルテチウムまでの１５元素の群（ランタニド）と、原子番号２１のスカンジウム及び原子番号３９のイットリウムの２つの追加元素とからなる１７元素を集合的に指す、希土類金属の配位錯体である。希土類金属の具体的な例には、ユウロピウム、テルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、スカンジウム及びイットリウムが含まれ、ユウロピウム及びテルビウムが好ましく、ユウロピウムがより好ましい。
【０３３２】
実施形態では、増幅基１０４は、ランタニド（例えばユウロピウム又はテルビウム）とジエチレントリアミン四酢酸又はクリプテート配位子との配位錯体である。
【０３３３】
実施形態では、増幅基１０４は、ランタニド（例えばユウロピウム又はテルビウム）とジエチレントリアミン四酢酸との配位錯体である。
【０３３４】
実施形態では、増幅基１０４は、ランタニド（例えばユウロピウム又はテルビウム）とクリプテート配位子との配位錯体である。
【０３３５】
実施形態では、シグナル伝達剤（例えば化学的シグナル伝達剤）は、
【０３３６】
【化２０】
2019508062.tif 000026
2019508062.tif 000027
2019508062.tif 000028
2019508062.tif 000029
を含むか又はこれから形成される。
【０３３７】
実施形態では、シグナル伝達剤は、造影剤を形成するために１つ以上の常磁性金属キレートを含み得る。好ましい常磁性金属イオンは、原子番号２１〜２９、４２、４４又は５７〜８３を有する。これには、１つ、より好ましくは５つ以上の不対電子及び少なくとも１．７ボーア磁子の磁気モーメントを有する遷移金属又はランタニド系列のイオンが含まれる。好ましい常磁性金属には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、マンガン（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ユウロピウム（ＩＩＩ）及びイッテルビウム（ＩＩＩ）が含まれる。さらに、本発明のシグナル伝達剤は、１つ以上の超常磁性粒子も含み得る。
【０３３８】
実施形態では、シグナル伝達剤は、蛍光化合物と共に又は蛍光化合物の一部として金属錯体に含まれる１つ以上の金属を含み得る：金属錯体には、中心金属としてＡｌ、Ｚｎ、Ｂｅ等；Ｔｂ、Ｅｕ若しくはＤｙなどの希土類金属；又はＰｔ若しくはＩｒなどの遷移金属を有し、配位子としてオキサジアゾール、チアジアゾール、フェニルピリジン、フェニルベンゾイミダゾール若しくはキノリン構造を有する金属錯体、例えばアルミニウムキノリノール錯体、ベンゾキノリノールベリリウム錯体、ベンゾオキサゾール亜鉛錯体、ベンゾチアゾール亜鉛錯体、アゾメチル亜鉛錯体、ポルフィリン亜鉛錯体及びユウロピウム錯体などが含まれる。
【０３３９】
実施形態では、シグナル伝達剤は、高いルミネセンス量子効率及び長いルミネセンス減衰時間（＞１００ナノ秒）を特徴とする発光団（供与体）を含み得る。好ましい発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類（特にユウロピウム及びランタン）のカチオン性有機金属錯体である。これらの有機金属錯体の有機部分は、例えばポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリン又は他の複素環式化合物の群からの配位子で構成され得る。
【０３４０】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、抗体（例えばモノクローナル若しくはポリクローナル抗体）、修飾抗体（例えばビオチン化モノクローナル抗体、ビオチン化ポリクローナル抗体、ユウロピウムキレート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体）、抗体変異体（例えばＦａｂ：抗原結合フラグメント（一方の腕）；Ｆ（ａｂ’）２：ヒンジ領域を含む抗原結合フラグメント（両方の腕）；Ｆａｂ’：ヒンジ領域を含む抗原結合フラグメント（一方の腕）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変フラグメント；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体一本鎖可変フラグメント；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二重特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体及びＢｉＴＥ：二重特異性Ｔ細胞誘導体）、ＷＧＡ−ビオチン、ポリミキシンＢ−ビオチン、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然糖ポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマーを含む。
【０３４１】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、任意の本明細書に記載される種類の抗体、修飾抗体若しくは抗体フラグメント、又は当技術分野で公知の種類の抗体、修飾抗体若しくは抗体フラグメントを指す。したがって、「抗体を含むシグナル伝達剤」は、例として、未修飾モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント及び三官能性抗体を含むシグナル伝達剤を含む。
【０３４２】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、ランタニド配位錯体、ビオチン、抗体及び／又は酵素を含む。
【０３４３】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／若しくは天然リガンド、合成及び／若しくは天然ポリマー、合成及び／若しくは天然糖ポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／若しくはポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／若しくはポリマー、荷電小分子、他のタンパク質、バクテリオファージ並びに／又はアプタマーを含む構造を含む又は前記構造から形成される。
【０３４４】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、ランタニド配位錯体及び／又は酵素とストレプトアビジン及び／又は抗体及び／又はアプタマーを含む増幅基１０４を含む。
【０３４５】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む結合部分を含む。
【０３４６】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、修飾抗体を含む結合部分を含む。例示的な修飾抗体には、ビオチン化モノクローナル抗体、ビオチン化ポリクローナル抗体、ユウロピウムキレート−抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体が含まれる。
【０３４７】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、抗体変異体を含む結合部分を含む。例示的な抗体変異体には、Ｆａｂ：抗原結合フラグメント（一方の腕）；Ｆ（ａｂ’）２：ヒンジ領域を含む抗原結合フラグメント（両方の腕）；Ｆａｂ’：ヒンジ領域を含む抗原結合フラグメント（一方の腕）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変フラグメント；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体一本鎖可変フラグメント；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二重特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体及びＢｉＴＥ：二重特異性Ｔ細胞誘導体が含まれる。
【０３４８】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含む。
【０３４９】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、合成及び／又は天然リガンド及び／又はペプチドを含む結合部分を含む。
【０３５０】
実施形態では、リガンド及び／又はペプチドは、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リジン及びこれらの組み合わせから選択される。
【０３５１】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、合成及び／又は天然ポリマー及び／又は糖ポリマーを含む結合部分を含む。
【０３５２】
実施形態では、天然及び／又は合成ポリマーは、直鎖又は分岐であり、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］及びこれらの組み合わせから選択される。
【０３５３】
実施形態では、天然及び／又は合成ポリマー及び／又は糖ポリマーは、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、第四級アミン、ピリジニウムトリブロミド、ヒスチジン、リジン、システイン、アルギニン、スルホニウム、ホスホニウム、又はコブロックポリマー、グラフトポリマー及び交互ポリマーを含むがこれらに限定されない、これらの組み合わせを含むがこれらに限定されない部分を含む。
【０３５４】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、マンノース結合レクチン、他のレクチン、アネキシン及びこれらの組み合わせから選択される糖タンパク質を含む結合部分を含む。
【０３５５】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、
抗体；及び
ユウロピウム配位錯体
を含む。
【０３５６】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（２Ｋ）、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（４Ｋ）、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含むリンカー基Ｌを含む。
【０３５７】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、
【０３５８】
【化２１】
2019508062.tif 000030
を含むユウロピウム錯体を含む。
【０３５９】
実施形態では、微生物表面に結合することができるシグナル伝達剤は、
【０３６０】
【化２２】
2019508062.tif 000031
2019508062.tif 000032
を含むユウロピウム錯体を含む。
【０３６１】
以下の実施例において及び本明細書及び図面を通して開示されるように、本発明は、少なくとも：
・１２の細菌種の７５株（グラム陰性桿菌によるβ−ラクタムを含む）について重大な／非常に重大なエラーを伴わずに、ここで開示される方法とＣＬＳＩ標準法との間で＞８９．９％のＭＩＣ一致（±１希釈）；
・直接陽性血液培養についてのここで開示される方法とＣＬＳＩ標準血液培養試料処理との間で同等のＭＩＣ；
・グラム陽性及び陰性種の２×１０３ＣＦＵ／ｍｌまでの検出；
・シグナル伝達剤による微生物の非特異的結合；
・ユウロピウム製剤の使用；
・データ出力を伴う半自動化装置の使用
を提供する。
【０３６２】
本発明に関連するさらなる教示は、ＥＰ１３９６７５；ＥＰ６４４８４；ＵＳ２０１３／０２１７０６３；ＵＳ２０１４／０２７８１３６；ＵＳ２０１４／０３２３３４０；ＵＳ２０１４／０３６３８１７；ＵＳ２０１５／００６４７０３；ＵＳ２０１５／０３３７３５１；ＵＳ２０１６／００１０１３８；ＵＳ３，７９８，３２０；ＵＳ４，５６５，７９０；ＵＳ４，６４７，５３６；ＵＳ４，８０８，５４１；ＵＳ４，９２７，９２３；ＵＳ５，４５７，１８５；ＵＳ５，４８９，４０１；ＵＳ５，５１２，４９３；ＵＳ５，５２７，６８４；ＵＳ５，６２７，０７４；ＵＳ５，６６５，５５４；ＵＳ５，６９５，９４６；ＵＳ６，２８４，４７０；ＵＳ６，３８５，２７２；ＵＳ６，８４４，０２８；ＵＳ７，３４１，８４１；ＵＳ７，６２９，０２９；ＵＳ７，８６８，１４４；ＵＳ８，１７８，６０２；ＵＳ８，８９５，２５５；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４２５８９；及びＷＯ／２０１６０１５０２７の１つ以上に記載されており、これらの各々は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６３】
上記の態様及び実施形態のいずれもが、以下の実施例を含む、図面、発明の概要及び／又は詳細な説明に開示されている任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０３６４】
本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下で述べる。本明細書で言及されるすべての公表文献、特許出願、特許及び他の参考文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される参考文献は、特許請求される本発明の先行技術であるとは認められない。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０３６５】
［実施例１］
本発明は、抗菌剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）の迅速で正確な決定を提供する。
【０３６６】
この実施例では、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）又はシュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する抗菌剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を迅速に決定するための本発明を、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又はＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の一晩のインキュベーションを必要とする標準的な方法と比較した。
【０３６７】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２９２１３株）の培養物を、ミューラーヒントン（ＭＨ）ブロスを用いて激しく振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。同時に、２つの滅菌９６ウェルマイクロプレートを、３２μｇ／ｍｌ〜０．１２５μｇ／ｍｌのクリンダマイシンの段階希釈液及びクリンダマイシンなしの対照を用いて、すべてＭＨブロス中で調製した。次いで、一晩培養物からのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）濃度を、６００ｎｍでの光学密度読み取りのためにマクファーランド標準技術を用いて５×１０５ＣＦＵ／ｍｌに設定した。本明細書で開示される発明（例えば「高速ＡＳＴ」技術）を使用して抗菌剤の感受性を決定するために、調製した抗菌剤希釈液を、各ウェルがそれぞれ２００μＬを含むマイクロプレートに接種し、３７℃で３．５時間インキュベートするか、又はＯＤ６００対照については３７℃で一晩（＞１２時間）インキュベートした。「高速ＡＳＴ」マイクロプレートを振とうインキュベータから４時間後に取り出し、ポリクローナルウサギ抗Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを各ウェルに添加した。次いで、結合を可能にするためにプレートを室温で２０分間振とうし、この後、残存する無傷の細菌をペレット化するために、マイクロプレートを４，０００×ｇで遠心分離した。次いで、ＭＨブロスを吸引し、滅菌ブロスを合計３回の洗浄のために添加した。最後の吸引の後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び過酸化水素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）からなる安定化された展開溶液を添加し、マイクロプレートリーダー（Ｖｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて６５０ｎｍ及び４５０ｎｍでの光学密度を１０分間観測した。一晩のインキュベーション後、ＯＤ６００対照のマイクロプレートをインキュベータから取り出し、６００ｎｍでの光学密度を直接読み取った（Ｖｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。最後に、図５に示すように、データからＣＬＳＩ標準法によってＭＩＣを決定した。両方の技術によって決定されたＭＩＣは同じである：０．１２５μｇ／ｍｌ。
【０３６８】
同様に、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ株２７８５３）の培養物を、ＭＨブロスを用いて激しく振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。同時に、２つの滅菌９６ウェルマイクロプレートを、３２μｇ／ｍｌ〜０．１２５μｇ／ｍｌのセフタジジムの段階希釈液及びセフタジジムなしの対照を用いて、すべてＭＨブロス中で調製した。次いで、一晩培養物からのＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）濃度を、６００ｎｍでの光学密度読み取りのためにマクファーランド標準技術を用いて５×１０５ＣＦＵ／ｍｌに設定した。本明細書で開示される発明を使用して抗菌剤の感受性を決定するために、調製した抗菌剤希釈液を、各ウェルがそれぞれ２００μＬを含むマイクロプレートに接種し、３７℃で３．５時間インキュベートするか、又はＯＤ６００対照については３７℃で一晩（＞１２時間）インキュベートした。「高速ＡＳＴ」マイクロプレートを振とうインキュベータから４時間後に取り出し、ポリクローナルウサギ抗Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗体（Ａｂｃａｍ）のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートの溶液を各ウェルに添加した。次いで、結合を可能にするためにプレートを室温で２０分間振とうし、この後、残存する無傷の細菌をペレット化するために、マイクロプレートを４，０００×ｇで遠心分離した。次いで、ＭＨブロスを吸引し、滅菌ブロスを合計３回の洗浄のために添加した。最後の吸引の後、３，３’，５，５’−ＴＭＢ及び過酸化水素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）からなる安定化された展開溶液を添加し、マイクロプレートリーダー（Ｖｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて６５０ｎｍ及び４５０ｎｍでの光学密度を１０分間観測した。図６に示すデータは、検出溶液とのインキュベーションの開始後５分の時点から描画されている。一晩のインキュベーション後、ＯＤ６００対照のマイクロプレートをインキュベータから取り出し、６００ｎｍでの光学密度を直接読み取った（Ｖｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。最後に、図６に示すように、データからＣＬＳＩ標準法によってＭＩＣを決定した。両方の技術によって決定されたＭＩＣは同じである：４μｇ／ｍｌ。
【０３６９】
ＭＩＣを決定する上での本発明の正確さは、データの下方領域の勾配（図５及び図６）が本発明と一晩の培養物とでほぼ同一であることで明らかに実証される。
【０３７０】
これらのデータは、本発明が、細菌培養物の一晩のインキュベーションを必要とする標準的な方法と少なくとも同程度に正確な抗菌剤のＭＩＣを正確に決定できることを示す。
【０３７１】
［実施例２］
本発明は、抗菌剤耐性細菌に対する抗菌剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）の迅速で正確な決定を提供する。
【０３７２】
この実施例では、本発明を使用して、それぞれ抗菌剤耐性であるＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対するＭＩＣを、抗菌剤感受性であるＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対するＭＩＣと比較した。
【０３７３】
感受性Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株、ＡＴＣＣ  ２７８５３のＭＩＣを実施例１で述べたように決定したが、重要な違いは、イミペネムを抗菌剤として使用した（３２μｇ／ｍｌ〜０．１２５μｇ／ｍｌの段階希釈を使用した）ことであった。耐性Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２１０８のＭＩＣも同様に決定した。両方の菌株に同じ９６ウェルマイクロプレートを使用し、４８ウェルを各々の菌株に割り当てた。この実験を３回繰り返して同様の結果を得、得られたデータを図７に示す。感受性株に対するＭＩＣは２μｇ／ｍｌであり、耐性株のＭＩＣは３２μｇ／ｍｌである。
【０３７４】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）については、抗菌剤としてメチシリンを使用し、耐性株ＡＴＣＣ  ４３３００を使用したことを除き、実施例１で上述したのと同じ手順を使用した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）については、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）感受性（２５９２２）株及び耐性（３５２１８）株を使用し、抗菌剤としてアンピシリンを使用し、及びシグナル伝達剤が細菌に結合することを可能にする化学的部分としてポリクローナルウサギ抗Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体（Ａｂｃａｍ）のＨＲＰコンジュゲートを使用したことを除き、Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）について上述したのと同じ手順を用いた。検出溶液との５分間のインキュベーション後の「高速ＡＳＴ」値をＯＤ６００の一晩対照と比較し、データを図８にまとめている。
【０３７５】
これらのデータは、本発明が、抗菌剤に耐性である細菌株及び抗菌剤に感受性である同じ細菌の株について、抗菌剤のＭＩＣを正確に区別できることを示す。
【０３７６】
［実施例３］
本発明は、標準法に必要とされるよりも２００倍濃縮されていない微生物濃度で検出可能なシグナルを提供する。
【０３７７】
この実施例では、本発明において検出可能なシグナルを提供するのに必要な微生物濃度を、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の一晩のインキュベーションを必要とする標準的な方法と比較した。
【０３７８】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を実施例１で述べたように一晩培養した。一晩コロニーの段階希釈を９６ウェルマイクロプレート中で行い、吸光度を６００ｎｍで読み取った。これらの値をマクファーランド標準と比較して、細菌濃度をＣＦＵ／ｍｌとして得た。曲線の定量化可能な領域を図９に示す（ＯＤ６００）；実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。同様の希釈系列のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、実施例２で述べたように、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）特異的シグナル伝達剤で２０分間処理した。実施例２の手順に従って、微生物を遠心分離し、３回洗浄して、検出溶液を添加した。
【０３７９】
図９において、得られた吸光度を、マクファーランド標準法で決定したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）濃度と比較して示す。「高速ＡＳＴ」シグナルは、矢印で示すように、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の標準ＡＳＴ実験の出発細菌濃度（すなわち５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）から可視である。対照的に、光シグナルは〜１０８ＣＦＵ／ｍｌまで正確な定量化ができない。
【０３８０】
これらのデータは、本発明が、標準的な方法に必要とされる濃度よりも２００倍低い微生物培養濃度で、検出可能で利用可能なシグナルを提供できることを示す。
【０３８１】
［実施例４］
本発明は、病原菌の複数の種及び株にわたってＣＬＳＩ参照法から得られるものと同様のＭＩＣ値を、ＣＬＳＩ法に必要な時間よりも有意に短い時間で提供する。
【０３８２】
この実施例では、複数の病原性細菌に対する抗菌剤のＭＩＣを迅速に決定するための本発明を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の方法と比較した。
【０３８３】
図１０に示すように、３．５時間のインキュベーション後に６つの細菌のＭＩＣ決定を得たが、ＣＬＳＩ  ＡＳＴ参照法の決定は、１６時間のインキュベーション後（アンピシリン処理培養物の場合）又は２４時間のインキュベーション後（オキサシリン処理培養物の場合）に得られた。薬剤、シグナル伝達剤／化学的部分（「抗体−ＨＲＰコンジュゲート」）及び細菌株を図１１に列挙する。シグナル伝達剤／化学的部分に関して、Ｓ．エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）試験には小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）ＨＲＰコンジュゲートを使用し、「高速ＡＳＴ」アッセイは上記実施例２の手順に従う。すべての臨床単離物は同定されていない試料であり、使用前に少なくとも２回継代培養した。以下の細菌種：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ニューモニエ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．クロカエ（Ｅ．ｃｌｏｃａｅ）及びＡ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）を含むがこれらに限定されない、合計８７の個々の試料を試験した。この実施例で試験した細菌種（Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を除く）が、合わせると、多くの臨床検査室で陽性血液培養物の＞９０％を占めることは注目に値する。したがって、本発明は、ヒト感染症に対する明らかな臨床的関連性を有する。本発明とＣＬＳＩ法との間でＭＩＣ値は極めて類似しているが、本発明は３時間半のインキュベーションを必要とし、一方ＣＬＳＩ法は１６時間又は２４時間のインキュベーションを必要とする。
【０３８４】
これらのデータは、本発明が、少なくともＣＬＳＩ法と同程度に正確な抗菌剤のＭＩＣを正確に決定することができるが、ＭＩＣを決定するのに有意に短い時間しか要さないことを示す；したがって、本発明は、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤及び特定の投与量が提供されるまでの時間を大幅に短縮する。
【０３８５】
［実施例５］
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）試料に関して、広範囲の抗菌剤にわたって、本発明はＣＬＳＩ参照法から得られたものと同様のＭＩＣ値を有意に短い時間で提供する。
【０３８６】
この実施例では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（グラム陽性細菌）又はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ニューモニエ）（グラム陰性菌）を処理する場合に、本発明を用いて複数の抗菌剤のＭＩＣを迅速に決定し、ＣＬＳＩ法によって得られたＭＩＣ値と比較した。
【０３８７】
実施例２で上述した本発明の方法において、市販の全面乾燥抗菌プレートＳｅｎｓｉＴｉｔｒｅ（Ｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、４時間目に細菌生存率を評価した。代表的なＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ニューモニエ）の結果を図１２Ａ〜図１２Ｃに示す。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関するエリスロマイシン実験並びにＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ニューモニエ）に関するテトラサイクリン及びイミペネム実験を除き、本発明の「高速ＡＳＴ」から得られたＭＩＣ値とＣＬＳＩ法で得られた結果との間には優れた一致があった；しかし、ＦＤＡによれば、本発明とＣＬＳＩ結果との間の食い違いは「軽微なエラー」である；図１２Ｃ参照。
【０３８８】
これらのデータは、本発明が、２つの異なる細菌種について、少なくともＣＬＳＩ法と同程度に正確な複数の抗菌剤のＭＩＣを正確に決定することができるが、ＭＩＣを決定するのに有意に短い時間しか要さないことを示す；したがって、本発明は、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤及び特定の投与量が提供されるまでの時間を大幅に短縮する。
【０３８９】
［実施例６］
本発明は、複数のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株を使用し多種多様な抗菌剤にわたってＣＬＳＩ参照法から得られたものと同様のＭＩＣ値を、有意に短い時間で提供する。
【０３９０】
この実施例では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（グラム陽性細菌）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（グラム陰性菌）を処理する場合に、本発明を用いて複数の抗菌剤のＭＩＣを迅速に決定し、ＣＬＳＩ法によって得られたＭＩＣ値と比較した。
【０３９１】
実施例５におけるように、これらの実験を行うためにＳｅｎｓｉｔｉｔｒｅ（Ｒ）プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの指示に従って、接種物５０μＬを各ウェルに添加したことを除き、実施例２で述べたのと同じ手順を使用した。ＣＬＳＩ参照法を２４時間（オキサシリン及びバンコマイシン）並びに１８時間（レボフロキサシン）実施し、本発明（「高速ＡＳＴ」法）を用いたすべての実験は４時間（３時間半のインキュベーションを含む）で実施した。結果を図１３Ａ〜図１３Ｃ及び図１４Ａ〜図１４Ｄに示す。図１３Ａ〜図１３Ｃ及び図１４Ａ〜図１４Ｄの黒い線は、各抗菌剤についてのＣＬＳＩのブレークポイントを示す。基本的一致「ＥＡ」及び明確な一致「ＣＡ」は、ＦＤＡにより、「自動ＡＳＴシステムのためのクラスＩＩガイダンス資料（Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＡＳＴ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」の中で定義されている。さらに、結果の一貫性を判定するために、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の１つの臨床種について、上述したように複数の「高速ＡＳＴ」アッセイ及びＣＬＳＩ標準参照アッセイを１ヶ月間にわたって実施した；図１５参照。
【０３９２】
これらのデータは、本発明（「高速ＡＳＴ」手順）が、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株に関して複数の抗菌剤で試験した場合、ＣＬＳＩ参照法と一致する結果を提供するが、ＭＩＣを決定するのに有意に短い時間しか要さないことを示す；したがって、本発明は、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤及び特定の投与量が提供されるまでの時間を大幅に短縮する。
【０３９３】
［実施例７］
本発明は、抗菌剤耐性細菌に対する複数の抗菌剤のＭＩＣの迅速で正確な決定を提供する。
【０３９４】
この実施例では、本発明を用いて、抗菌剤耐性であるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する複数の抗菌剤のＭＩＣを、抗菌剤感受性であるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のＭＩＣと比較した。
【０３９５】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＱＣ株、ＡＴＣＣ  ２５９２２）及び臨床耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（「臨床」）の両方を、ミューラーヒントン（ＭＨ）ブロス中標準的な滅菌条件下で、振とうしながら３７℃で一晩培養した。次いで、一晩培養物からのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）濃度を、６００ｎｍでの光学濃度の読み取りのためにマクファーランド標準技術を用いて５×１０５ＣＦＵ／ｍｌに設定した。同時に、２つの滅菌９６ウェルマイクロプレートを、指定の抗菌剤（下記参照）及び抗菌剤なし（生理食塩水）対照の段階希釈液を用いて、すべてＭＨブロス中で調製した。本発明（「高速ＡＳＴ」技術）を用いた測定のために、調製した抗菌剤希釈液を、各ウェルがそれぞれ２００μＬを含むマイクロプレートに接種し、３７℃で３時間４５分間インキュベートした。「高速ＡＳＴ」マイクロプレートを振とうインキュベータから３時間４５分後に取り出し、ペレット化するために２５００ｇで２．５分間遠心分離した。次いで、ＭＨブロスを吸引し、両方のマイクロプレートの各ウェルに水１００μＬを添加した。次に、化学的部分（ここではユウロピウム−クリプテート製剤）１０μＬを各ウェルに添加し（２０ｎｇ／ウェルになるように）、５％グルタルアルデヒド（シグナル伝達剤として）１０μＬを各ウェルに添加した。次いで、２つのマイクロプレートを３００ｒｐｍで３０分間振とうした。この後、両方のプレートを２５００ｇで２．５分間遠心分離してペレット化した。溶液を吸引し、ＰＢＳ−トゥイーン２００μＬの洗浄液を各ウェルに添加し、続いて遠心分離してペレット化した。溶液の吸引後、ＰＢＳ−トゥイーン２００μＬの２回目の同じ洗浄を実施し、続いて最終的な遠心分離を行ってペレット化した。次いで、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いてプレートを読み取った。この工程を、以下の抗菌製剤を用いて実施した：８μｇ／ｍｌ〜０．１２μｇ／ｍｌの希釈濃度のイミペネム（図１６）；３２μｇ／ｍｌ〜０．２５μｇ／ｍｌの希釈濃度のアンピシリン（図１７）；３２μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍｌの希釈濃度のセフタジジム（図１８）；１６μｇ／ｍｌ〜０．０６μｇ／ｍｌの希釈濃度のゲンタマイシン（図１９）；８μｇ／ｍｌ〜０．０６μｇ／ｍｌの希釈濃度のレボフロキサシン（図２０）；３２μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの希釈濃度のトリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）（図２１）；４μｇ／ｍｌ〜０．０１５μｇ／ｍｌの希釈濃度のシプロフロキサシン（図２２）及び６４μｇ／ｍｌ〜０．１２μｇ／ｍｌの希釈濃度のセトリアキソン（図２３）。
【０３９６】
図１６〜図２３に見られるように、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＱＣ株、ＡＴＣＣ  ２５９２２）及び臨床耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（「臨床」）は、イミペネム、セフタジジム、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン及びセトリアキソンについては同様のＭＩＣを有していたが、アンピシリン及びトリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）に関しては、２つの株は類似しないＭＩＣを有していた。したがって、このデータは、臨床耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、アンピシリン及びトリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）に対して耐性であることを示す。したがって、患者がこの株（又は類似の株）による感染を呈する場合、アンピシリン及びトリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）は投与すべきではない；代わりに、イミペネム、セフタジジム、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン及びセトリアキソンを投与すべきである。
【０３９７】
これらのデータは、本発明が、１つ以上の抗菌剤に耐性である細菌の臨床的に関連する株に対する抗菌剤のＭＩＣと、抗菌剤に感受性である同じ細菌の株に対する抗菌剤のＭＩＣとを正確に区別できることを示す；したがって、本発明は、標準的な方法と比較して大幅に短縮された時間量で、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤及び特定の投与量を提供することができる。
【０３９８】
［実施例８］
本発明は、抗菌剤感受性細菌に対する複数の抗菌剤のＭＩＣの迅速で正確な決定を提供する。
【０３９９】
この実施例では、本発明を用いて、抗菌剤感受性であるＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株に対する複数の抗菌剤のＭＩＣを決定した。
【０４００】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＱＣ株２９２１３）を、ミューラーヒントン（ＭＨ）ブロス中、標準的な滅菌条件下で振とうしながら３７℃で一晩培養した。次いで、一晩培養物からのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）濃度を、６００ｎｍでの光学密度読み取りのためにマクファーランド標準技術を用いて５×１０５ＣＦＵ／ｍｌに設定した。同時に、２つの滅菌９６ウェルマイクロプレートを、指定の抗菌剤（下記参照）及び抗菌剤なし（生理食塩水）対照の段階希釈液を用いて、すべてＭＨブロス中で調製した。
【０４０１】
本発明（「高速ＡＳＴ」技術）を用いた測定のために、調製した抗菌剤希釈液を、各ウェルがそれぞれ１００μＬを含むマイクロプレートに接種し、３７℃で３時間４５分間インキュベートした。「高速ＡＳＴ」マイクロプレートを振とうインキュベータから３時間４５分後に取り出し、ペレット化するために２５００ｘｇで２．５分間遠心分離した。次いで、ＭＨブロスを吸引し、２５ｍＭ  ＰＢＳ  １００μＬを両方のマイクロプレートの各ウェルに添加した。次に、化学的部分（ここではユウロピウム−クリプテート製剤）１０μＬを各ウェルに添加し（２０ｎｇ／ウェルになるように）、０．００５％グルタルアルデヒド（シグナル伝達剤として）１０μＬを各ウェルに添加した。次いで、２つのマイクロプレートを３００ｒｐｍで３０分間振とうした。この後、両方のプレートを２５００ｘｇで２．５分間遠心分離してペレット化した。溶液を吸引し、ＰＢＳ−トゥイーン２００μＬの洗浄液を各ウェルに添加し、続いて遠心分離してペレット化した。溶液の吸引後、ＰＢＳ−トゥイーン２００μＬの２回目の同じ洗浄を実施し、続いて最終的な遠心分離を行ってペレット化した。ＰＢＳ−トゥイーン２００μＬを各ウェルに添加した。次いで、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いてプレートを読み取った。この工程を、以下の抗菌製剤を用いて実施した：３２μｇ／ｍｌ〜０．２５μｇ／ｍｌの希釈濃度のバンコマイシン（図２４）；８μｇ／ｍｌ〜０．０６２５μｇ／ｍｌの希釈濃度のペニシリン（図２５）及び１６μｇ／ｍｌ〜０．０１２５μｇ／ｍｌの希釈濃度のテイコプラニン（図２６）。
【０４０２】
図２４〜図２６に見られるように、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＱＣ株２９２１３）に関して、本発明は、標準的なＣＬＳＩ参照方法から得られたものと同様のＭＩＣを決定した：バンコマイシン：０．５〜２μｇ／ｍｌ；ペニシリン：０．２５〜２μｇ／ｍｌ及びテイコプラニン：０．２５〜１μｇ／ｍｌ。
【０４０３】
これらのデータは、本発明が複数の抗菌剤のＭＩＣを正確に決定できることを示す；したがって、本発明は、標準的な方法と比較して大幅に短縮された時間量で、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤及び特定の投与量を提供することができる。
【０４０４】
［実施例９］
本発明は、継代培養及び一晩増殖インキュベーションを必要とせずに、血液培養試料から直接、抗菌剤のＭＩＣの迅速で正確な決定を提供する。
【０４０５】
この実施例では、血液培養試料から直接、抗菌剤のＭＩＣを迅速に決定するために本発明を使用した。
【０４０６】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の各々について１つの臨床試料を得た。単離物を寒天斜面上で輸送し、継代培養して、−８０℃で保存した。試料を冷凍庫から取り出し、室温に温め、５％ヒツジ血液トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）ペトリ皿（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上に画線接種した。ペトリ皿を３５℃のインキュベータに一晩入れた。単一コロニーを採取し、画線接種工程を新しいプレート上で繰り返し、続いて２回目の３５℃での一晩インキュベーションを行った。合計３〜５コロニーを採取し、滅菌生理食塩水（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１ｍＬ中に分散させ、６００ｎｍでの光学密度測定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ２）によって濃度を決定した。試料を、蓋付きフラスコにおいて、滅菌カチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＭＨＢ、Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）４０ｍＬ中で２ＣＦＵ／ｍｌに２段階で希釈した。
【０４０７】
ＢＤ  ＢＡＣＴＥＣ（Ｒ）血液培養システムの性能を模倣するために、フラスコを３５℃で一晩振とうインキュベータに入れた。フラスコを１０時間後に４℃に置き、この時点でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の濃度は〜１×１０８ＣＦＵ／ｍｌであると測定された。これは、ＢＤ  ＢＡＣＴＥＣ及びｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔなどの市販の血液培養システムが陽性血液培養物と記録するのに近い濃度である。１０時間のインキュベーション時間は、血液培養試料を５％ヒツジ血液ＴＳＡペトリ皿上に画線接種し、これらを３５℃で一晩インキュベートして、コロニー数を測定することによって決定した。
【０４０８】
この「陽性」血液培養物をＴＳＡプレート上に画線接種し、３５℃で一晩インキュベートすることによって継代培養「対照」試料を採取した。次いで、先に述べたように、標準的なＣＬＳＩ微量液体希釈参照法を実施した。
【０４０９】
次いで、ＳｅｐｓｉＴｙｐｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）プロトコルに従って、遠心分離に基づく分離を行った。簡単に述べると、溶解緩衝液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）１ｍＬを、１×１０８ＣＦＵ／ｍｌのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むＭＨＢブロス５ｍＬに添加した。混合物を６つの微量遠心管に分取し、１０秒間ボルテックスして、次いで１３，０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を取り出して廃棄し、洗浄緩衝液（Ｂｒｕｋｅｒ）１ｍＬを各々の管に添加して、管を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。再び上清を取り出して廃棄した。各ペレットを、ピペットを上下させることによって滅菌生理食塩水５００μＬに再懸濁した。溶液を混合し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂａｃｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏ（ＴＭ）細菌細胞生存率キットを用いて細菌濃度を測定した。
【０４１０】
試料を約５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度でＭＨＢに希釈した。次に、「高速ＡＳＴ」アッセイ（実施例２で述べたように）を実施し、ＭＩＣ測定を比較した。臨床試料に関する「高速ＡＳＴ」法は、継代培養を必要とする標準的な方法と同様のＭＩＣ値を提供した；図２７及び図２８参照。
【０４１１】
これらのデータは、本発明（「高速ＡＳＴ」手順）が臨床試料に直接使用された場合、一晩増殖の前に継代培養工程を必要とする標準的なＭＩＣ決定方法と一致する結果を提供することを示す；したがって、本発明は、患者に適切な治療レジメン、すなわち特定の抗菌剤及び特定の投与量が提供されるまでの時間を大幅に短縮する。
【０４１２】
［実施例１０］
ユウロピウムにコンジュゲートしたストレプトアビジンは、グラム陽性菌に特異的に結合するビオチン化小麦胚芽凝集素に結合する。
【０４１３】
この実施例では、ユウロピウムを、グラム陽性菌に特異的に結合する小麦胚芽凝集素を含むシグナル伝達剤中の化学的部分として使用した。
【０４１４】
細菌（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中、１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ビオチン化小麦胚芽凝集素（Ｓｉｇｍａ）２μｇを添加し、選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を１５分間インキュベートした。次いで、市販のストレプトアビジン−ユウロピウム（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒからの）を０．４μｇ／ｍｌのウェル当たり最終濃度になるように添加した。さらに１５分間インキュベートした後、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。未反応レポーターを完全に除去するために、この洗浄手順をさらに２回繰り返した。最後に、吸引したウェルに、読み取り緩衝液を添加した後、デルフィア増強溶液を添加した。次いで、プレートを１５分間インキュベートしてユウロピウムを増強させた後、図２９に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いてユウロピウムを測定した。
【０４１５】
これらのデータは、シグナル伝達剤中の化学的部分としてのユウロピウムの使用が、溶液中の細菌濃度を正確に定量化できることを示す。
【０４１６】
［実施例１１］
ユウロピウムにコンジュゲートしたストレプトアビジンは、グラム陰性菌に特異的に結合するビオチン化ポリミキシンＢに結合する。
【０４１７】
この実施例では、ユウロピウムを、グラム陰性菌に特異的に結合するポリミキシンＢを含むシグナル伝達剤中の化学的部分として使用した。
【０４１８】
細菌（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中、１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ビオチン化ポリミキシン（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を最終希釈１：２００になるように添加し、選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を１５分間インキュベートした。次いで、市販のストレプトアビジン−ユウロピウム（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒからの）を０．４μｇ／ｍｌのウェル当たり最終濃度になるように添加した。さらに１５分間インキュベートした後、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。未反応レポーターを完全に除去するために、この洗浄手順をさらに２回繰り返した。最後に、吸引したウェルに、読み取り緩衝液を添加した後、デルフィア増強溶液を添加した。次いで、プレートを１５分間インキュベートしてユウロピウムを増強させた後、図３０に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いてユウロピウムを測定した。
【０４１９】
これらのデータは、シグナル伝達剤中の化学的部分としてのユウロピウムの使用が、溶液中の細菌濃度を正確に定量化できることを示す。
【０４２０】
［実施例１２］
ユウロピウム検出器は、より大きなシグナル範囲のＭＩＣデータ、したがって、より正確なＭＩＣデータを提供する。
【０４２１】
この実施例は、シグナル伝達剤中の化学的部分（細菌に特異的に結合する抗体を含む）として、ユウロピウムとＨＲＰのＭＩＣを正確に決定する能力を比較した。
【０４２２】
カチオン調整ミューラーヒントンブロスと適切な抗菌剤希釈液を含む９６ウェルプレートを用いて、コロニーを生理食塩水に希釈して０．５のマクファーランド値に達するように細菌を調製し、これを分光光度計を用いて検証した。これを生理食塩水で１：２０に希釈し、接種物１０μｌを各ウェルに添加した。細菌抗菌剤試験プレートを、１５０ｒｐｍで振とうしながら３５℃で３時間４５分間インキュベートした。このインキュベーション後、カチオン性磁気ビーズ及び抗Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はユウロピウムのいずれかにコンジュゲートさせた；Ｃｉｓｂｉｏ  Ａｓｓａｙｓによって実施されたカスタムコンジュゲーション）を各ウェルに添加し、２０分間インキュベートした。自動プレート洗浄機を用いて磁気ビーズを捕捉し、各ウェルの内容物をＰＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）で３回洗浄した。次いで、時間分解蛍光（ユウロピウム）を用いてウェルを直接画像化するか、又はＴＭＢを添加し、１５分間インキュベートした後、１Ｍ硫酸の添加によって反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を各ウェルについて測定した。
【０４２３】
図３１に示すように、化学的部分としてユウロピウムを使用することにより、ＨＲＰを化学的部分として用いて測定したＭＩＣよりも正確にＳＸＴのＭＩＣが決定された。
【０４２４】
これらのデータは、シグナル伝達剤中の化学的部分としてのユウロピウムの使用が、抗菌剤のＭＩＣを正確に決定できることを示す。
【０４２５】
［実施例１３］
細菌を非特異的に標識するユウロピウム製剤の実施形態は、細菌を検出し、細菌濃度を定量化するのに有効である。
【０４２６】
この実施例では、ユウロピウム製剤は細菌に非特異的に結合する。
【０４２７】
細菌（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液（ユウロピウムクリプテート−ジアミン）又はｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ（ユウロピウムＮ１−アミノ）中、１ｅ５〜１ｅ９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ユウロピウムクリプテート−ジアミン（化合物（３）；Ｃｉｓｂｉｏ）又はユウロピウムＮ１−アミノ（化合物（６）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を６６ｎｇ／ウェルで添加し、次いでＥＤＣ／ＮＨＳ（０．１及び０．３ｍｇ／ｍｌ）又はグルタルアルデヒド（０．５％最終濃度）を指示通りに添加した。
【０４２８】
【化２３】
2019508062.tif 000033
【０４２９】
選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を３０分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。未反応のレポーターを完全に除去するために、この洗浄手順をさらに１回（Ｅｕ−クリプテート−ジアミン）又は２回（ユウロピウムＮ１−アミノ）繰り返した。ユウロピウム−クリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３２に示すように、、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。最後に、ユウロピウムＮ１−アミノで処理した吸引ウェルに、読み取り緩衝液を添加した後、デルフィア増強溶液を添加した。次いで、プレートを１５分間インキュベートしてユウロピウムを増強させた後、図３２に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いてユウロピウムを測定した。
【０４３０】
これらのデータは、ユウロピウム製剤が、細菌に非特異的に結合する場合、溶液中の細菌濃度を正確に定量化できることを示す。
【０４３１】
［実施例１４］
ユウロピウムは、細菌濃度を定量化する場合、細菌を非特異的に標識するためにイソチオシアネートを介してアミンに又はＮＨ２を介してカルボン酸に結合することができる。
【０４３２】
この実施例では、ユウロピウム製剤は細菌に非特異的に結合する。
【０４３３】
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液（ユウロピウムクリプテート−ジアミン；化合物（３））又はｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ（ユウロピウムＩＴＣ；化合物（４））中１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ユウロピウムクリプテート−ジアミン（Ｃｉｓｂｉｏ）又はユウロピウムＩＴＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を６６ｎｇ／ウェルで添加し、次にユウロピウムクリプテートを含むウェルにＥＤＣ／ＮＨＳ（０．１及び０．３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
【０４３４】
【化２４】
2019508062.tif 000034
【０４３５】
選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を３０分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。未反応のレポーターを完全に除去するために、この洗浄手順をさらに１回（ユウロピウムクリプテート−ジアミン）又は２回（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）繰り返した。ユウロピウムクリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３３に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。最後に、Ｅｕ−Ｎ１で処理した吸引ウェルに、読み取り緩衝液を添加した後、デルフィア増強溶液を添加した。次いで、プレートを１５分間インキュベートしてユウロピウムを増強させた後、図３３に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いてユウロピウムを測定した。
【０４３６】
これらのデータは、ユウロピウム製剤が、細菌に非特異的に結合する場合、溶液中の細菌濃度を正確に定量化できることを示す。
【０４３７】
［実施例１５］
グルタルアルデヒドは、ユウロピウム−クリプテートを細菌表面に非特異的に連結するために使用することができる。
【０４３８】
この実施例では、ユウロピウム製剤は、グルタルアルデヒドを含む細菌に非特異的に結合する。
【０４３９】
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ）を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ユウロピウムクリプテート−ジアミン（化合物（３）；Ｃｉｓｂｉｏ）を６６ｎｇ／ウェルで添加し、次いでユウロピウムクリプテートを含むウェルにグルタルアルデヒドの５％溶液を添加した。
【０４４０】
【化２５】
2019508062.tif 000035
【０４４１】
選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を３０分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。未反応のレポーターを完全に除去するためにこの洗浄手順を１回繰り返しした。ユウロピウムクリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３４に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。
【０４４２】
これらのデータは、ユウロピウム製剤が、細菌に非特異的に結合する場合、溶液中の細菌濃度を正確に定量化できることを示す。
【０４４３】
［実施例１６］
ＥＤＣ／ＮＨＳは、ユウロピウム−クリプテートを細菌表面に非特異的に結合するために使用できる。
【０４４４】
この実施例では、ユウロピウム製剤は、ＥＤＣ／ＮＨＳを含む細菌に非特異的に結合する。
【０４４５】
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ユウロピウムクリプテート−ジアミン（化合物（３）；Ｃｉｓｂｉｏ）を６６ｎｇ／ウェルで添加し、次いでユウロピウムクリプテートを含むウェルにＥＤＣ／ＮＨＳ（０．１及び０．３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
【０４４６】
【化２６】
2019508062.tif 000036
【０４４７】
選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を３０分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。未反応のレポーターを完全に除去するためにこの洗浄手順を１回繰り返しした。ユウロピウムクリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３５に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。
【０４４８】
これらのデータは、ユウロピウム製剤が、細菌に非特異的に結合する場合、溶液中の細菌濃度を正確に定量化できることを示す。
【０４４９】
［実施例１７］
非特異的にクリプテート標識した細菌へのグルタルアルデヒド洗浄サイクルの影響。
【０４５０】
この実施例では、グルタルアルデヒドを含む種々の洗浄を用いてユウロピウム製剤を細菌に非特異的に結合させる。
【０４５１】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、ユウロピウムクリプテート−ジアミン（化合物（３）；Ｃｉｓｂｉｏ）を６６ｎｇ／ウェルで添加し、次いでユウロピウムクリプテートを含むウェルにグルタルアルデヒドの５％溶液を添加した。
【０４５２】
【化２７】
2019508062.tif 000037
【０４５３】
選択したレポーターによるウェル内の細菌の外側の標識化を促進するために、反応溶液を３０分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。複数の洗浄が全体的なデータ品質に及ぼす影響を調べるために、この洗浄手順を２回繰り返した。ユウロピウムクリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３６Ａ〜図３６Ｃに示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。
【０４５４】
これらのデータは、ユウロピウム製剤を、グルタルアルデヒドを含む種々の洗浄を用いて細菌に非特異的に結合させ得ることを示す。
【０４５５】
［実施例１８］
ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチンとこれに続くストレプトアビジン−ユウロピウム（Ｅｕ−ＳＡｖ）を用いた２段階標識化工程は、細菌を非特異的に標識することができる。
【０４５６】
この実施例では、２段階工程を用いてユウロピウム製剤を細菌に非特異的に結合させる。
【０４５７】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、アミン−ＰＥＧ−ビオチン（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）を１ｍｇ／ウェルで添加し、次にアミン−ＰＥＧ−ビオチンを含むウェルにＥＤＣ／ＮＨＳ（０．１及び０．３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。ビオチン種によるウェル内の細菌の外側の官能基化を促進するために、反応溶液を１５分間インキュベートした。各反応ウェルに、ストレプトアビジン−ユウロピウム（Ｅｕ−ＳＡｖ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を４００ｎｇ／ウェルで添加した。ビオチンとストレプトアビジンとの間の結合を促進するために、反応溶液を１５分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。複数の洗浄が全体的なデータ品質に及ぼす影響を調べるために、この洗浄手順を２回繰り返した。Ｅｕ−ＳＡｖを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３７に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。
【０４５８】
これらのデータは、ユウロピウム製剤を、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチンとこれに続くＥｕ−ＳＡｖを含む２段階工程を用いて細菌に非特異的に結合させ得ることを示す。
【０４５９】
［実施例１９］
ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンとこれに続くＥｕ−ＳＡｖによる２段階細菌標識化工程は、細菌を非特異的に標識することができる。
【０４６０】
この実施例では、別の２段階工程を用いてユウロピウム製剤を細菌に非特異的に結合させる。
【０４６１】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ｐＨ６のＭＥＳ緩衝液中１×１０５〜１×１０９の範囲の濃度で９６ウェルプレートに接種した。細菌を含む各ウェル及び対応する対照ウェルに、アミン−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を１ｍｇ／ウェルで添加し、次にアミン−ＰＥＧ−ビオチンを含むウェルにＥＤＣ／ＮＨＳ（０．１及び０．３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。ビオチン種によるウェル内の細菌の外側の官能基化を促進するために、反応溶液を１５分間インキュベートした。各反応ウェルに、ストレプトアビジン−ユウロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を４００ｎｇ／ウェルで添加した。ビオチンとストレプトアビジンとの間の結合を促進するために、反応溶液を１５分間インキュベートした。次いで、上清中の非結合レポーターを残しつつプレートの底部の細菌をペレット化するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３を使用して２５００ｘｇの速度で２．５分間遠心分離した。次いで、洗浄緩衝液を添加する前に、ＢｉｏＴｅｋ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏ  Ｘプレート洗浄機を用いてプレートを吸引し、上清及び未反応のレポーターを除去した。複数の洗浄が全体的なデータ品質に及ぼす影響を調べるために、この洗浄手順を２回繰り返した。ユウロピウムクリプテート−ジアミンを含むウェルを読み取り緩衝液中で再構成し、図３８に示すように、ＢｉｏＴｅｋ  Ｈ１プレートリーダーで時間分解蛍光を用いて読み取った。
【０４６２】
これらのデータは、ユウロピウム製剤を、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンとこれに続くＥｕ−ＳＡｖを含む２段階工程を用いて細菌に非特異的に結合させ得ることを示す。
【０４６３】
［実施例２０］
糸状菌を、＞０．２ミクロン〜＜１０ミクロンのサイズ範囲の細孔を有するフィルタシステムを用いて溶液から単離することができる；これにより、より正確な化学的感受性データが提供される。
【０４６４】
この実施例は、抗菌剤処理に応答して糸状増殖を受けた細菌を排除するためのろ過を用いた実施形態を示す。
【０４６５】
特に、グラム陰性桿菌は、細胞壁作用性抗菌剤（β−ラクタムなど）の亜阻害濃度に応答して糸状増殖を最初に受ける。これらは最終的には阻害されるが、代謝的「体積」アプローチは、糸状増殖を受けた細菌から抗菌剤耐性細菌を区別することは極めて困難である。考慮されない場合、このような糸状増殖は、細菌を実際よりも耐性であると不適切に同定する。「体積」アプローチを用いて抗菌剤耐性を決定することの難しさは図３９に認められる。
【０４６６】
これを避けるために、一実施形態では、インキュベーション期間の最後に、各微量液体希釈液を、１つ以上の所定の細孔径を含むフィルタに充填する（図４０参照）。細孔径は、複数の「正常」細菌がフィルタを通過することができるように選択されるが、特定の長さよりも大きい糸状菌は捕捉される。細孔径は、＞０．２ミクロン及び＜１０ミクロンであり得る。
【０４６７】
このフィルタは、９６、３８４又は１５８６ウェルプレートなどの並行試料処理用に設計し得る。図４０に示すように、ＡＳＴ工程の間にフィルタを適用し得る。
【０４６８】
この実施例は、基本的に体積測定である従来の代謝アプローチとは対照的に、表面積によって無傷の細菌の存在を決定する迅速なＡＳＴプラットフォームを設計することの重要な利点をさらに示す。
【０４６９】
［実施例２１］
蛍光ナノ粒子を含むシグナル伝達剤を調製し、使用するための方法。
【０４７０】
この実施例では、蛍光ナノ粒子を含むシグナル伝達剤を調製し、使用する方法を述べる。
【０４７１】
最初に、透明ガラスシンチレーションバイアルにフルオレセインジラウレート（ＦＬ−ＤＬ）２０ｍｇを秤量し、エタノール１０００ｍｇを添加した。次いで、ボルテックスによってＦＬ−ＤＬをバイアル中で溶解した。この後、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２ｋ−アミン（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）１０ｍｇをこの混合物に添加し、ボルテックスによって溶解した。別途に、脱イオン水４０ｇをビーカーに秤量し、撹拌棒を加えた。次いで、ビーカーをマグネチックスターラ上に置き、２００ＲＰＭで撹拌した。次に、エタノール溶液をビーカーに滴下し、この後の溶液をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓホモジナイザーに導入して、６０００ｐｓｉで１回処理した。次いで、得られた混合物に脱イオン水２００ｇを添加し、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を用いてナノ粒子を精製し、２０ｍＬまで約１２倍濃縮して、次いでガラスシンチレーションバイアルに収集した。この収集したナノ粒子製剤を０．２μｍフィルタでろ過し、ナノ粒子のサイズ及び濃度を、平均サイズ読み取り１０２ｎｍでＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって決定した。
【０４７２】
フルオロフォア含有ナノ粒子を、正に荷電した小分子で官能基化し、本発明に有用なシグナル伝達剤を形成した。
【０４７３】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ１１３０３）及びアンピシリン耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ３９９３６）の両方を、ＬＢブロス中、標準的な滅菌条件下に３７℃で培養した。６００ｎｍでの吸光度（マクファーランド）を測定することによって濃度を決定し、５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度を希釈によって設定した。次いで、アンピシリンを滅菌水に秤量し、滅菌３ｍＬ微量遠心管に適切な濃度で添加した。これらのアンピシリンで被覆された滅菌微量遠心管に、細菌及び８×１０８ナノ粒子／ｍｌの濃度のナノ粒子の両方を添加した。次いで、管に蓋をして、連続振とうしながら３７℃で１．５時間置いた後、これらを開放し、それぞれ０．２μｍフィルタに通した。次に、各ろ液１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに添加し、展開溶液（エタノール中５％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド）１５０μＬを各ウェルに添加した。５分後、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４９０ｎｍ励起／５３０ｎｍ発光で読み取った。
【０４７４】
図４１は、上記で調製したナノ粒子を含むシグナル伝達剤を用いたアッセイの結果を示す。ここで、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びアンピシリン耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＭＩＣより十分高い濃度である１００μｇ／ｍｌのアンピシリンで処理した及びアンピシリンなしで処理した。無傷の細菌を０．２μｍフィルタでのろ過によって除去した後、無傷の細菌と結合していない遊離シグナル伝達剤のアッセイを実施した。アンピシリンを含まない対照群は、アンピシリンで処理したアンピシリン耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）群と同様に、低い蛍光シグナルを示す。ＭＩＣより上のアンピシリンで処理したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、蛍光の有意の増加を示し、この抗菌剤の有効性を示す。
【０４７５】
図４２は、様々なアンピシリン濃度についてのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアッセイの結果を示す。アンピシリン濃度がＭＩＣより下の約１５μｇ／ｍｌである場合、蛍光シグナルは低く、この値で上昇し、この範囲内の抗菌剤の有効性を示す。
【０４７６】
［実施例２２］
本発明は、無傷の細菌を単離するために磁気ビーズを用いて実施することができる。
【０４７７】
この実施例では、無傷の細菌に結合することができる作用物質と結合した磁気ビーズを用いて、無傷の細菌を溶液から単離する。
【０４７８】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に反応性の磁気ビーズを、製造者の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従ってＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル活性化１ミクロン磁気ビーズから調製した。簡単に述べると、供給されたビーズを磁気的に捕捉し、保存溶液を吸引した。次いで、ビーズを氷冷０．１Ｍ塩酸で洗浄し、続いてポリクローナルヤギ抗リポ多糖（ＬＰＳ）抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  Ｉｎｃ．）を添加した。反応物を２時間振とうし、最初の３０分間は、製造者の指示に従って５分ごとにボルテックスした。次いでビーズを十分に洗浄し、使用時まで４℃でリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）中に保存した。
【０４７９】
シグナル伝達剤は、微生物に結合することができる部分（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に結合する抗体）及びシグナルを提供する又はシグナルの生成に寄与することができる化学的部分（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））を含む。
【０４８０】
抗ＬＰＳ磁気ビーズ及び抗Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナル伝達剤を、ＭＨブロス中のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のマクファーランド標準測定希釈系列に同時に添加した。反応を２０分間進行させ、続いて９６ウェルマイクロプレート磁気スタンド（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で磁気ビーズを捕捉した。ウェルを３回洗浄し、続いて実施例１で述べた検出溶液を添加した。４５０ｎｍ及び６５０ｎｍでの光学密度を１０分間読み取った。５分目の値を図４３にプロットする。
【０４８１】
次いで、シグナル伝達剤及び官能基化磁気ビーズの添加によって実施例１の手順を使用した。しかし、ここでは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株はＡＴＣＣ１２６００であり、３つの抗菌剤：セフタジジム、オキサシリン及びバンコマイシンを使用した。
【０４８２】
インキュベーション期間後、０．５μｍサイズの固定カチオン電荷を有する磁気ビーズ（ＣｈｅｍｉＣｅｌｌ  Ｆｌｕｉｄｍａｇ）をシグナル伝達剤と同時に添加した。ホウ酸塩緩衝液５０μＬの添加によってｐＨを〜８．４に調整した。マイクロプレートをオービタルシェーカーで２０分間撹拌した。次いで、マイクロプレートを、２４個のネオジムＮ５２磁性物質を含む磁気捕捉プレート上に置いた。次いで、ＭＨブロスを吸引し、０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳを添加して合計３回洗浄した。最後の吸引後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び過酸化水素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）からなる安定化された展開溶液を添加し、６５０ｎｍ及び４５０ｎｍでの光学密度をマイクロプレートリーダー（Ｖｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で１０分間観測した。図４４に示すデータは、検出溶液とのインキュベーションの開始後５分の時点から描画されている。予想されたように、細菌細胞の溶解を引き起こす抗菌剤の量が増加すると、無傷の細菌の数が減少する。
【０４８３】
これらのデータは、官能基化された磁性粒子が、無傷の細菌を捕捉することができ、抗菌剤処理後に無傷細菌の定量化を可能にし得る（シグナル伝達剤に結合した場合）ことを示す。このような磁気捕捉を、本発明における使用のために無傷の細菌を収集するために、他の分離技術と共に又は他の分離技術の代わりに使用し得る。
【０４８４】
［実施例２３］
官能基化された磁気ビーズによる無傷細菌の単離と比較した場合、細菌溶液の遠心分離は無傷細菌のより正確な計数を提供する。
【０４８５】
この実施例では、官能基化磁気ビーズを用いて無傷の細菌を単離する方法（実施例２１＋に記載）を、遠心分離を用いて無傷の細菌を単離する方法と比較する。
【０４８６】
官能基化された磁気ビーズを用いた無傷細菌の捕捉を上述したように実施した。遠心分離データのために、２５００×ｇで２．５分間の遠心分離、手作業での吸引及びＰＢＳ−トゥイーンの添加の工程によって細菌を３回洗浄した。磁気ビーズは、遠心分離洗浄には使用しなかった。細菌を様々な濃度のバンコマイシン（「ＶＡＮ」）で処理した。
【０４８７】
図４５は、遠心分離が、官能基化された磁気ビーズによる単離よりもはるかに高く、より正確な細菌数及びＭＩＣを提供することを示す。
【０４８８】
これらのデータは、無傷の細菌を単離するための細菌培養物の遠心分離が、官能基化された磁性粒子を用いる方法よりも優れていることを示す。遠心分離を用いた単離を、本発明における使用のために無傷の細菌を収集するために、他の分離技術（例えば磁気単離）と共に又は他の分離技術の代わりに使用し得る。
【０４８９】
［実施例２４］
ＴＡＭＬナノ粒子増幅剤による化学増幅は、標準的な光学検出装置を用いて１×１０３〜１×１０８ＣＦＵ／ｍｌの範囲で、最適感受性でのシグナル伝達を可能にする。
【０４９０】
この実施例では、テトラアミノ有機金属配位子（ＴＡＭＬ（Ｒ））触媒を含むシグナル伝達剤を調製し、使用する方法を述べる。
【０４９１】
薬物送達からの最先端のナノ粒子製剤技術及び環境に優しい化学からの小分子触媒に適合する、独自のナノ粒子増幅剤を用いて化学増幅が可能となる。各々の「ナノ標識」は、特定の配位子で官能基化されたポリマーシェルによって保護された＞６×１０４の高密度に充填された鉄含有テトラアミノ有機金属配位子（ＴＡＭＬ（Ｒ））触媒を含む（図４６）。各ＴＡＭＬ分子は、ゴールドスタンダードのイムノアッセイ酵素標識であるホースラディッシュペルオキシダーゼのモル活性の５倍以内のモル活性を有する（図４６Ｂ）。特異的結合後、ナノ標識は、内容物を溶液中に放出するように化学的に誘発され、光シグナルの均一な触媒作用を可能にする。結合事象当たりの高い数の触媒は、標準的な酵素イムノアッセイに比べてわずか２００個の無傷細菌の定量化（図４６Ａ）及び１００倍の感受性増強（図４６Ｃ）を可能にする。新しい検出技術の開発の必要性を取り除くことに加えて、標準的な光学的検出は、ＳｅｎｓｉＴｉｔｒｅプレートなどの標準的な乾燥抗菌パネルマイクロプレートとの適合性を可能にする。
【図１】
2019508062.tif 000055
【図２Ａ】
2019508062.tif 000056
【図２Ｂ】
2019508062.tif 000057
【図２Ｃ】
2019508062.tif 000058
【図２Ｄ】
2019508062.tif 000059
【図３】
2019508062.tif 000060
【図４】
2019508062.tif 000061
【図５】
2019508062.tif 000062
【図６】
2019508062.tif 000063
【図７】
2019508062.tif 000064
【図８】
2019508062.tif 000065
【図９】
2019508062.tif 000066
【図１０】
2019508062.tif 000067
【図１１】
2019508062.tif 000068
【図１２Ａ】
2019508062.tif 000069
【図１２Ｂ】
2019508062.tif 000070
【図１２Ｃ】
2019508062.tif 000071
【図１３Ａ】
2019508062.tif 000072
【図１３Ｂ】
2019508062.tif 000073
【図１３Ｃ】
2019508062.tif 000074
【図１４Ａ】
2019508062.tif 000075
【図１４Ｂ】
2019508062.tif 000076
【図１４Ｃ】
2019508062.tif 000077
【図１４Ｄ】
2019508062.tif 000078
【図１５】
2019508062.tif 000079
【図１６】
2019508062.tif 000080
【図１７】
2019508062.tif 000081
【図１８】
2019508062.tif 000082
【図１９】
2019508062.tif 000083
【図２０】
2019508062.tif 000084
【図２１】
2019508062.tif 000085
【図２２】
2019508062.tif 000086
【図２３】
2019508062.tif 000087
【図２４】
2019508062.tif 000088
【図２５】
2019508062.tif 000089
【図２６】
2019508062.tif 000090
【図２７】
2019508062.tif 000091
【図２８】
2019508062.tif 000092
【図２９】
2019508062.tif 000093
【図３０】
2019508062.tif 000094
【図３１】
2019508062.tif 000095
【図３２】
2019508062.tif 000096
【図３３】
2019508062.tif 000097
【図３４】
2019508062.tif 000098
【図３５】
2019508062.tif 000099
【図３６Ａ】
2019508062.tif 000100
【図３６Ｂ】
2019508062.tif 000101
【図３６Ｃ】
2019508062.tif 000102
【図３７】
2019508062.tif 000103
【図３８】
2019508062.tif 000104
【図３９】
2019508062.tif 000105
【図４０】
2019508062.tif 000106
【図４１】
2019508062.tif 000107
【図４２】
2019508062.tif 000108
【図４３】
2019508062.tif 000109
【図４４】
2019508062.tif 000110
【図４５】
2019508062.tif 000111
【図４６Ａ】
2019508062.tif 000112
【図４６Ｂ】
2019508062.tif 000113
【図４６Ｃ】
2019508062.tif 000114
【国際調査報告】
2019508062.tif 000115
2019508062.tif 000116
2019508062.tif 000117
2019508062.tif 000118
2019508062.tif 000119
2019508062.tif 000120
2019508062.tif 000121