(57)【要約】  【課題】  本発明の目的は球状体組織マイクロアレイおよびその製造方法を提供することである。  【解決手段】  本発明の球状体組織マイクロアレイは、多孔性型内に包埋された組織球状体のアレイを含むことを特徴とする。本発明の球状体組織マイクロアレイは、ワックスまたは樹脂で含浸され、切片にされてもよく、また、本発明の球状体組織マイクロアレイでは、球状体が規則正しく格子状に位置決めされる。本発明の球状体組織マイクロアレイの製造方法は、鋳型に液状の型材を流し込み、それを凝固させることで多孔性型前駆体を形成するステップ、鋳型から該多孔性型前駆体を取り出すステップ；該多孔性型前駆体の凹部に、さらに液状の型材を注入し、注入した型材が凝固する際の収縮を利用して孔を形成し、多孔性型を得るステップ；該多孔性型の孔内に組織球状体を配置するステップ；該孔内を液状の型材で満たし、型材を凝固させ、孔内に組織球状体を密閉するステップ；を含むことを特徴とする。また、本発明の製造方法の別の態様として、球状体組織マイクロアレイの製造方法であって、鋳型内で液状の型材から多孔性型を形成するステップ；該液状の型材を凝固させるステップ；該鋳型から該多孔性型を取り出すステップ；多孔性型の孔に球状体を入れるステップ；該孔内にさらに該型材料を注入し、球状体を該孔内に密閉するステップを含み、該鋳型がＵ字状凸部を有し、該Ｕ字状凸部がその先端にさらに小さな乳頭状凸部を有しており、該孔が、該乳頭状凸部によって形成されることを特徴とする製造方法がある。
2019513419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性型内に包埋された組織球状体のアレイを含む球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２】
前記多孔性型がアガロースゲルまたは寒天ゲルから形成される請求項１に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項３】
格子状に規則正しく配置された孔を有する請求項１または２に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項４】
前記孔の直径が０．２〜３．０ｍｍである請求項３に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項５】
前記孔の直径が０．５〜１．５ｍｍである請求項４に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項６】
前記穴は、前記孔の直径が約１ｍｍである請求項５に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項７】
前記孔の深さが２〜５ｍｍである請求項３〜６のいずれかに記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項８】
前記孔の深さが３〜４ｍｍである請求項７に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項９】
前記孔の深さが約４ｍｍである請求項８に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１０】
前記多孔性型が１００〜３００個の孔を有する請求項３〜９のいずれに記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１１】
前記多孔性型が、縦に１０行、横に１７列、合計１７０個の孔を有する請求項１０に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１２】
前記多孔性型が９６個の孔を含有する請求項３〜１０のいずれかに記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１３】
前記球状体の中心から水平方向に１００マイクロメートル以下の位置に、隣り合う球状体の中心を位置決めするようにして、前記球状体を正方形状に規則正しく並べることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１４】
１ｃｍ２あたり球状体の密度が１００〜５００個配置された請求項１〜１３のいずれかに記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１５】
前記組織球状体が、人工多能性幹細胞、初代培養細胞、がん組織に由来する細胞株、神経細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞および内皮細胞のうちの１つまたは複数に由来する組織を含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１６】
前記組織球状体が細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ３次元培養物から形成される請求項１〜１５のいずれか一項に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１７】
前記組織球状体の直径が５０〜５００μｍである請求項１〜１６のいずれか一項に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１８】
前記組織球状体の直径が１００〜５００μｍである請求項１７に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項１９】
前記組織球状体の直径が１５０μｍ〜３５０μｍである請求項１８に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２０】
細胞培養用の土台上で培養されて前記組織球状体が、該土台ごと包埋される請求項１〜１９のいずれかに記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２１】
前記土台がポリスチレン（アンバーライト）その他のプラスチック材料から形成されたビーズである請求項２０に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２２】
前記組織球状体がヒト皮膚細胞を含む請求項２０または２１に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２３】
前記組織球状体が組織学的解析のために染色される請求項１〜２２のいずれか一項に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２４】
追加的な構造剤で含浸される請求項１〜２３のいずれか一項に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２５】
パラフィンワックスまたは樹脂で含浸される請求項２４に記載の球状体組織マイクロアレイ。
【請求項２６】
球状体組織マイクロアレイの製造方法であって、
鋳型に液状の型材を流し込み、それを凝固させることで多孔性型前駆体を形成するステップ、
鋳型から該多孔性型前駆体を取り出すステップ；
該多孔性型前駆体の凹部に、さらに液状の型材を注入し、注入した型材が凝固する際の収縮を利用して孔を形成し、多孔性型を得るステップ；
該多孔性型の孔内に組織球状体を配置するステップ；
該孔内を液状の型材で満たし、型材を凝固させ、孔内に組織球状体を密閉するステップ；
を含む製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれかに記載の球状体組織マイクロアレイを製造するための請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記形材が０．５〜４％アガロース水溶液である請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記形材が２％アガロース水溶液である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記形材を６０〜７０℃に加温して前記鋳型に流し込む請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記鋳型が好適な温度にあらかじめ加温される請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記鋳型があらかじめ７０℃加温される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記型材を室温で２０〜４５分間凝固した後、０〜５℃で２０〜４５分間冷却する請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記型材を室温で約３０分間にわたって凝固した後、約４℃で約３０分間冷却する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記多孔性型前駆体を前記鋳型から取り出すために約−２０℃で５〜１５分間冷却する
請求項２６〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記多孔性型前駆体を６０〜７０℃で１０〜３０分間密閉状態で加温した後に、前記多孔性型前駆体の凹部に型材料を注入する請求項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記多孔性型前駆体の凹部に０．１〜１．０％アガロース水溶液を注入する請求項２６〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記多孔性型前駆体の凹部に０．７％のアガロース水溶液を注入する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記多孔性型前駆体の凹部に注入するアガロース水溶液に好適な染料マーカーが添加されている請求項２６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記染料マーカーがブロモフェノールブルーである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記孔が、前記多孔性型の上部１ｍｍ以内の領域に形成される請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組織球状体が、６０〜７０℃に加温して液状にした型材によって前記孔内に密封される請求項２６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記孔内に前記組織球状体を密封した後、０〜５℃で約３０分間することで形材を凝固させる請求項２６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記球状体組織マイクロアレイが追加的な構造剤で含浸される請求項２６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記構造剤がパラフィンワックスまたは樹脂である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記球状体組織アレイが、大気圧以下の圧力下、６０℃約２時間のサイクルで前記パラフィンワックスに含浸される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
球状体組織マイクロアレイの製造方法であって、
鋳型内で液状の型材から多孔性型を形成するステップ；
該液状の型材を凝固させるステップ；
該鋳型から該多孔性型を取り出すステップ；
多孔性型の孔に球状体を入れるステップ；
該孔内にさらに該型材料を注入し、球状体を該孔内に密閉するステップを含み、
該鋳型がＵ字状凸部を有し、該Ｕ字状凸部がその先端にさらに小さな乳頭状凸部を有しており、該孔が、該乳頭状凸部によって形成されることを特徴とする製造方法。
【請求項４８】
前記マイクロアレイを追加的な構造剤で含浸する続くステップをさらに含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記構造剤がパラフィンワックスまたは樹脂である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
添付の図面を参照することで把握される、本願明細書に記載の球状体組織アレイ。
【請求項５１】
添付の図面を参照することで把握される、本願明細書に記載の球状体組織アレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、球状体組織マイクロアレイおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自動化ハイスループット技術とは、同時に複数の実験を大規模に繰り返して実行するために生物科学で使用される技術のことである。当該方法によると、通常、個々に実行される操作を、その操作の質に影響を与えることなく同時に実行することができる。
【０００３】
まず、生物科学におけるアレイ（ａｒｒａｙ）とは、スライドガラスや薄膜といった基板の上に、生物学的材料を規則正しく整列させた状態で固定したものである。そして、基板の上に多数の生物学的材料を固定したものをマイクロアレイと呼ぶ。このマイクロアレイに対してハイスループットスクリーニングを行うことで、大量かつ同時並行に生物学的材料の解析を行うことが可能となる。ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質およびペプチドマイクロアレイ、抗体マイクロアレイならびに組織マイクロアレイといった様々な異なるタイプのマイクロアレイが知られている。
【０００４】
多数（例えば、最大で１０００）の個別の組織サンプルを１つのパラフィンブロックに整列させた、組織マイクロアレイというものが知られている。組織マイクロアレイの登場により、多重組織学的解析が可能となった。従来の組織マイクロアレイの技術では、中空の針を用いて解析したい組織から小さな（＜１ｍｍ）組織サンプルを取り出し、これをパラフィンブロックに規則正しく並べながら挿入してゆき、サンプルを挿入したパラフィンブロックをミクロトームで切片にし、この切片を組織学的に解析していた。当該パラフィンブロックは、多くの切片（例えば、１００〜５００）にスライスされ、これらはそれぞれ独立に解析される。
【０００５】
国際公開第２０１５／０６９７４２号には、規則正しく並べられた仕切りがあらかじめ水で満たされている型が開示されている。水で満たされた仕切りに球状体がピペットで移され、次いで、その仕切りの中にアガロースが注入され、アガロースが凝固したら、型から取り出される。球状体は、アガロースゲルの塊内に包埋されるのではなく、アガロースゲルの底部に保持されていると考えられる。当該先行技術の方法では、型からの取り出し時に、球状体がアガロース部材の底部にきちんと保持された状態のものが、どれほどの収率で得られるのかは不明である。
尚、当該で開示された型は、可塑性物質またはシリコーンから製である。
当該文献には、球状体が切片にされ且つ１枚のスライド上で染色され得るように、球状体が同じ平面上にあることが示されている。しかしながら、当該文献には、球状体の水平方向での位置決め方法が示されておらず、単に球状体が個別の仕切り内に配置されることが開示されているのみである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、改善された球状体組織マイクロアレイおよびそれを製造する方法を提供しようとするものである。本明細書における「球状体」とは、細胞の集塊物、例えばオルガノイドまたは組織様の構造における細胞の球状集塊物を意味する。当該球状体が厳密に球状であるわけではなく、むしろ、ｉｎ  ｖｉｖｏ培養による特性が反映された３次元構造を有することは、当業者にとって当然に理解されることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、多孔性型内に包埋された組織球状体のアレイを含む球状体組織マイクロアレイが提供される。
【０００８】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、ハイスループットによる組織学的検査に好適である。本発明のマイクロアレイでは、組織球状体を規則正しく格子状に整列させるための位置合わせ、位置決めを容易に行うことができ、さらにその状態で組織球状体を包埋することが可能であり、多数の（例えば、何百もの）組織球状体を包埋したものを切片にすることで、多数の球状体を同時に切片にすることが可能である。このようにして得られた多数の球状体は、組織学的解析、例えば染色、トランスクリプトーム／プロテオミクスプロファイリングおよび画像解析のために利用することができる。
また、球状体組織マイクロアレイは、組織学的解析に留まらず、他の分野、例えばオーダーメイド医療における組織検査、および動物実験が許可されづらい化粧品産業での試験にも好適に使用される。
【０００９】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、多孔性型に組織球状体を包埋することにより構成される。多孔性型の材料は任意のものでよく、好ましいくは、アガロースまたは寒天ゲルである。
【００１０】
本発明のマイクロアレイは、多孔性型の孔内に球状体組織が入れられており、さらに孔内の隙間も型材料で埋められており、球状体組織がしっかりと固定されているという特徴を有する。これは、各仕切りが個別に分離され得るタイプのマイクロアレイとは異なる特徴である。つまり、本発明のマイクロアレイでは、多孔性型の一つ一つの孔に球状体組織が入れられ、さらに孔内の隙間も型材料で埋められたブロック状の構造を有する。ゆえに、このブロックをスライスすることで、多数の切片を得ることができる。
【００１１】
本発明とは対照的に、国際公開第２０１５／０６９７４２号には、多孔性型ではなく可塑性物質または他の材料から作製された型が開示されている。一方、本発明では、多孔性型の孔に球状体組織が入れられ、さらに孔内の隙間も型材料で埋められているため、より高い強度がもたらされるので、単位面積当たりにより多くの球状体を配置して解析することが可能になる。
【００１２】
本発明の多孔性型は、規則正しく格子状に整列した孔を有する。
孔の直径は、好ましくは０．２〜３．０ｍｍ、より好ましくは０．５〜１．５ｍｍ、さらに好ましくはおよそ１ｍｍである。孔の深さは、好ましくは２〜５ｍｍ、より好ましくは３〜４ｍｍ、さらに好ましくはおよそ４ｍｍのである。
型一つあたりの孔の個数は、好ましくは１００〜３００個である。例えば、型一つあたり、縦に１０行、横に１７列、合計１７０個の孔を有する。孔の個数は任意でよいが、例えば当業界では９６ウェルプレートが標準的であるため、それに対応するため、９６個の孔を有する型が良く用いられる。
【００１３】
本発明の球状体組織マイクロアレイには、多孔性型内に包埋された組織球状体のアレイも含まれる。
【００１４】
本発明の方法によると、球状体を、球状体どうしの間の距離が極めて均一であるように非常に正確に配置することができる。これは、球状体が配置される孔の底が球状にくぼんだ形態をとるため、各球状体が各仕切りの中心に配置されるからである。これは、一般的なアレイにおける平底の仕切りとは対照的である。
【００１５】
本発明のマイクロアレイにおいて、球状体は、規則正しく整列させた状態で配置される。例えば、球状体の中心が隣の球状体の所定の位置から当該球状体の平均径以下だけ離れるように水平に配置され得る。また、球状体の中心が隣の球状体の所定の位置から当該球状体の平均径の半分以下、若しくは平均径の１０％以下だけ離れていてもよい。
【００１６】
自動化画像解析を可能にするためには、球状体の位置決めを特に正確に行う必要があるが、そのような場合は位置決め用のテンプレートを用いて位置決めを行っても良い。球状体の位置決めは、ロボティクスを利用して自動化により行ってもよい。
【００１７】
各球状体の中心は任意の位置に位置決めすることができ、例えば、所定の位置から水平方向に５００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２００マイクロメートル以下、１００マイクロメートル以下、５０マイクロメートル以下、２０マイクロメートル以下、１０マイクロメートル以下の位置に球状体の中心を位置決めすることができる。
【００１８】
規則正しく整列させた状態（例えば、正方形）で球状体を並べる場合、隣接する球状体間の距離をｘとすると、その標準偏差は、０．５ｘ以下、好ましくは０．２５ｘ以下、より好ましくは０．２ｘ以下、さらに好ましくは０．１ｘ以下、特に好ましくは０．０５ｘ以下、最も好ましくは０．０２ｘ以下である。
【００１９】
本発明のマイクロアレイ上の球状体の密度は、非常に高く、好ましくは１ｃｍ２当たり１００個以上、より好ましくは２００個以上、さらに好ましくは４００個以上、特に好ましくは５００個以上、最大で１０００個である。
【００２０】
本発明の組織球状体には、試験またはアッセイされる任意の組織が含まれる。当該組織は、人工多能性幹細胞、初代培養細胞またはがん組織に由来するもの等の細胞株に由来する。したがって、本発明の組織球状体は、例えば、神経細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、間質細胞（例えば、線維芽細胞およびマクロファージ）、免疫細胞（例えば、リンパ球およびＴ細胞）および内皮細胞（例えば、血管内皮細胞）を含むさまざまな細胞から作製され得る。本発明の組織球状体は、上記の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで３次元的に培養することによって得ることができる。
【００２１】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、様々なサイズの組織球状体を含み得る。本発明の組織球状体の直径は、好ましくは５０〜５００μｍ、より好ましくは１００〜５００μｍ、さらに好ましくは１５０μｍ〜３５０μｍである。
【００２２】
球状体組織マイクロアレイで使用される組織球状体は、ポリスチレンまたは別の好適なプラスチック材料などの好適な材料から形成されたビーズ上で培養されるが、ビーズ上に固定された状態で多孔性型に包埋されてもよい。
【００２３】
ポリスチレンビーズなどの土台上で組織球状体を培養する技術は、例えば、オーダーメイド医療や化粧品産業で使用する皮膚細胞の培養に特に有用である。欧州では、化粧品製造における動物実験が許可されておらず、ヒト皮膚細胞を用いた組織試験のニーズがある。ビーズ上で培養することで、ヒト皮膚細胞は、表皮、真皮および皮下組織が実際の人体における場合と同じように形成されるため、ビーズ上での培養は有用である。ビーズなどの土台なしで培養された場合、ヒト皮膚細胞は、表皮、真皮および皮下組織が実際の人体における組織の形成とは「裏返しに」形成される傾向にあり、このようにして培養されたヒト皮膚球状体は、試験に適さないものであるということが研究によって明らかにされている。
【００２４】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、その構造を更に安定なものにするために、パラフィンワックスまたは樹脂などの追加的な構造剤で含浸され得る。
【００２５】
組織球状体は、組織学的解析、例えば自動化画像解析によるバイオマーカー（生物学的指標分子）の測定のために染色され得る。例えば、細胞応答（バイオマーカー）は、共焦点スキャナーおよび自動化画像解析など、細胞の免疫染色顕微鏡ベースの画像処理によってモニターされ得る。例えば、ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、主要な組織学的染色の１つである。染色は、球状体組織マイクロアレイをミクロトーム等でスライスして切片にした後に行われるのが一般的である。
【００２６】
＜第１の方法＞
本発明によれば、球状体組織マイクロアレイを製造する方法であって、
鋳型に液状の型材を流し込み、それを凝固させることで多孔性型前駆体を形成するステップ、
鋳型から該多孔性型前駆体を取り出すステップ；
該多孔性型前駆体の凹部に、さらに液状の型材を注入し、注入した型材が凝固する際の収縮を利用して孔を形成し、多孔性型を得るステップ；
該多孔性型の孔内に組織球状体を配置するステップ；
該孔内を液状の型材で満たし、型材を凝固させ、孔内に組織球状体を密閉するステップ；
を含む方法が提供される。
【００２７】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、上記した第１の方法で製造されるのが好ましい。
【００２８】
本発明における第１の方法は、上記の通り、鋳型に液状の型材を流し込み、それを凝固させることで多孔性型前駆体を形成するステップを含む。型材料が液状になる温度は、使用される材料に依存する。本発明の型材料としては、アガロースゲルが好ましい。アガロースを好ましくは０．５〜４％、より好ましくは２％の濃度で水溶液にし、６０〜７０℃まで加温し、あらかじめ７０℃に保温しておいた型に注ぐ。尚、鋳型としては、例えば、組織カセットケースを使用することができる。
【００２９】
鋳型に流し込まれた液状の型材は、鋳型内にて凝固させられる。凝固に好適な時間および温度は、使用されている材料に依存する。例えばアガロース水溶液では、室温に２０〜４５分間、好ましくはおよそ３０分間置いた後、０〜５℃（例えば、４℃）で２０〜４５分間（例えば、３０分間）冷却するのが好ましい。
【００３０】
次いで、多孔性型前駆体を鋳型から取り出す。この際、多孔性型前駆体を破損させることなく取り出さなければならず、そのためには、例えば、多孔性型前駆体を冷却して硬化させたうえで鋳型から取り出すのがよい。例えば、アガロースゲルで作成した多孔性型前駆体は、適当な温度（例えば−２０℃）で適当な時間（例えば、５〜１５分間）冷却することにより、鋳型から取り出しやすくなる。
【００３１】
また、鋳型にあらかじめシリコーン、グリセロールもしくはポリテトラフルオロエチレン（テフロン）その他の疎水性材料をスプレー等で塗布することによっても、多孔性型前駆体を鋳型から取り出しやすくなる。
【００３２】
鋳型から取り出した多孔性型前駆体の凹部に、さらに液状の型材を注入し、この型材が凝固する際に収縮するのを利用して、型の表面に孔を形成させる。液状の型材を注入する前に、多孔性型前駆体に閉じ込められた気体やその他の不純物を取り出すために、多孔性型を、適当な時間、（例えば１０〜３０分間、好ましくは２０分間）、適温、（例えば６０〜７０℃）で加熱してもよい。この加熱は、材料の蒸発を防ぐため、密閉された環境において行われるのが好ましい。
多孔性型前駆体の凹部に注入するための液状の型材は、多孔性型前駆体を形成するために使用される材料と同じでも異なっていてもよく、例えば、０．１〜１．０％アガロース水溶液を使用することができ、０．４％または０．７％アガロース水溶液を使用することが好ましく、また、染料マーカー（例えばブロモフェノールブルーまたはクーマシーブルー）で染色されていてもよい。多孔性型前駆体の凹部に注入した型材は、凝固する際、表面張力により凹部に引き寄せられるため、新たな凹部（孔）が形成される。また、凝固に伴い材料自体が収縮することによっても新たな凹部（孔）の形成が促進される。このようにして形成された新たな凹部が、本発明における「孔」である。そして、このようにして「孔」が形成された状態が、本発明における「多孔性型」である。前記孔は、前記多孔性型の上部１ｍｍ以内の領域に形成される。
【００３３】
組織球状体は、多孔性型の表面に形成された孔内に入れられ、そこを更に液状の型材で満たすことによって型内に密閉される。この際のアガロース水溶液の温度は、６０〜７０℃が好適であり、次いで、０〜５℃（例えば、４℃）で適当な時間（例えば３０分間）冷やして凝固させる。
【００３４】
鋳型は、シリコーンまたはポリカーボネートなどの様々な材料から作製され得る。鋳型は、一般に、不活性な材料から作製され得る。また、鋳型には多孔性型の凹部に対応する凸部が形成されている。鋳型の凸部の形状、寸法および凸部の間隔は任意に設定することができる。
【００３５】
本発明における第１の方法では、多孔性型前駆体が鋳型から外された後、さらに液状の型材料を多孔性型前駆体の凹部に注入し、この注入された型材料が凝固の際に凹部に引き寄せられることで、新たな凹部（孔）が形成される。このようにして形成された孔は底が球状にくぼんでいるため、ここに球状体を入れることで、球状体の位置決めを正確に行うことができる。
【００３６】
＜第２の方法＞
上記した方法以外に、球状体を入れるのに好適な孔を形成する方法として、以下の方法が挙げられる。
例えば、Ｕ字状の凸部の先端に、さらに小さな乳頭状の凸部を有する鋳型を用い、凹部の底に、さらに球状にくぼんだ孔を有する多孔性型を作成してもよい（図６参照）。このような形状の型を用いれば、球状体は、凹部の底のくぼみ（孔）に正確に配置される（図６参照）。ここに、さらに型材料（例えば、アガロース）を注入し、凝固させれば、球状体の位置決めを正確に行うことができる。
前述した第１の方法では、多孔性型前駆体の凹部に型材料を追加で注入することで、孔を形成したのに対して、第２の方法では、Ｕ字型の凸部の先端にさらに小さな乳頭状の凸部を有する鋳型を用いることで、孔を形成している。
【００３７】
したがって、本発明によれば、球状体組織マイクロアレイを製造する方法であって、
鋳型内で液状の型材から多孔性型を形成するステップ；
該液状の型材を凝固させるステップ；
該鋳型から該多孔性型を取り出すステップ；
多孔性型の孔に球状体を入れるステップ；
該孔内にさらに該型材料を注入し、球状体を該孔内に密閉するステップを含み、
該鋳型がＵ字状凸部を有し、該Ｕ字状凸部がその先端にさらに小さな乳頭状凸部を有しており、該孔が、該乳頭状凸部によって形成されることを特徴とする
方法が提供される。
【００３８】
前記第１の方法に適用された好ましい態様は、当該第２の方法にも適用される。
【００３９】
本発明の方法では、球状体がアガロース等で構成された多孔性型に包埋されている。つまり、球状体がアガロース等で形成されたマトリクス中に包埋された状態である。これとは対照的に、いくつかの先行技術のアレイにおいては、サンプルは、非多孔性のウェルの底に置かれただけの状態であり、マトリクス中に包埋された状態ではない。
【００４０】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、そのマトリクスを補強するために、適当な条件で、１回または複数回、パラフィンワックスまたは樹脂（例えば、メタクリル酸樹脂）等の追加的な構造剤で含浸され得る。例えば、パラフィンワックスは、大気圧またはより低い圧力（例えば、０．５気圧）下において、６０℃で１時間のサイクルで、アガロースゲルから形成された球状体組織マイクロアレイに含浸され得る。
【００４１】
メタクリル酸ポリマー等の樹脂にアレイを含浸することにより、ガラスブレードやダイヤモンドブレード等を装着したミクロトームでのスライスが容易になり、切片を作製しやすくなる。即ち、樹脂を含浸することにより、ワックスを含浸した場合よりもマトリクスが固くなるため、切片をより薄く（例えば、＜１ｕｍ）スライスすることができるようになる。
また、切片自体もワックスを用いた場合より固くなり、解析の際に切片が歪む可能性も低減され、さらに高精度での解析ができるようになる。
また、マトリクスがより固くなることで、単位面積あたりの球状体の密度を高めることができるようになる。
【００４２】
本発明の球状体組織マイクロアレイは、切片にした状態で解析に使用される。例えば、切片は、ガラス顕微鏡用スライド上に置かれ、画像解析のために組織学的染色材料で染色され得る。
【００４３】
本発明は、マイクロアレイを画像処理のする際に有用である。マイクロアレイの画像処理方法として、サンプルを切片化せずに画像処理を行うホールマウント法というものが知られている。例えば、サンプルが球状体である場合、球状体を切片状にせず、球状体そのものをマイクロアレイにし、画像処理を行う。しかし、ホールマウント法は、切片状にされていない厚みのあるサンプルを用いるため、回析の点において課題があった。また、ホールマウント法では、サンプルに対して熱誘導性エピトープ賦活（ＨＩＥＲ）を適用することができない。
一方、本発明では、球状体が正確に位置決めされ、且つマトリクス中に包埋されることでしっかり固定されているため、薄くて、きれいな（球状体の損傷が少ない）切片を得ることができる。このようにして得られた切片は、その薄さにより、光散乱が回避されているので、より高い解像度で解析することができる。また、球状体の損傷が少ないため、球状体の端から端までを、より正確に解析することができる。
本発明は、炎症細胞マーカーによる肝臓球状体の多重染色およびサイトカインマーカーを使用する薬剤誘発性の肝臓損傷の定量化に好適に適用される。
本発明はまた、腫瘍細胞および正常細胞の両方を含有する混合球状体において腫瘍に対して作用する薬剤をスクリーニングすることにも好適に適用される。当該スクリーニングでは、緑色蛍光（ＧＦ）タグ付きタンパク質等の腫瘍特異的なマーカーを用いて腫瘍細胞を同定し、これに引き続き腫瘍細胞内の薬剤標的を染色する。
【００４４】
ここで、添付の図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１−１】本発明の球状体組織マイクロアレイを製造する方法を示す（Ａ〜Ｂ）。
【図１−２】本発明の球状体組織マイクロアレイを製造する方法を示す（Ｃ〜Ｄ）。
【図２】腫瘍球状体アレイおよびそのサイズを示す（Ａ）。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された、図２の腫瘍球状体アレイの切片のスキャン画像を示す（Ｂ）。図２に示したアレイにおける単一の球状体の拡大高解像度画像を示す（Ｃ）。
【図３】ニューロン球状体アレイおよびそのサイズを示す（Ａ）。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された、図３（Ａ）のニューロン球状体アレイの切片のスキャン画像を示す（Ｂ）。図３（Ａ）に示したアレイにおける単一の球状体の拡大高解像度画像を示す（Ｃ）。
【図４】ポリスチレンビーズ状で培養した球状体組織のマイクロアレイを示す（Ａ）。図４（Ａ）に示した球状体組織マイクロアレイの切片を示す（Ｂ）。
【図５】腫瘍細胞球状体の高解像度画像を示す（Ａ）。腫瘍球状体の高解像度画像を示す（Ｂ）。球状体切片全体の自動化画像解析を示す（Ｃ）。
【図６】本発明の第２の方法により形成された多孔性型の孔の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
図１（Ａ〜Ｄ）を参照して、本発明の球状体組織マイクロアレイを製造するのに好ましい方法を説明する。
【００４７】
本発明の多孔性型は、鋳型に液状の材料を注ぐことによって作製されるのが好ましい。
本発明の多孔性型の材料としては、アガロースゲルまたは寒天ゲルが好ましい。アガロースを好ましくは０．５〜４％、より好ましくは２％の濃度で水溶液にし、６０〜７０℃まで加温し、あらかじめ７０℃に保温しておいた型に注ぐ。尚、鋳型としては、例えば、組織カセットケースを使用することができる。
鋳型に注いだアガロース水溶液を、室温に２０〜４５分間、好ましくはおよそ３０分間置いた後、４℃で３０分間冷却し、ゲル化させ、多孔性型前駆体を得る。
次いで、１０分間−２０℃で冷却し、さらに硬化させる。これにより、鋳型から取り出す際に破損しづらくなる。
続いて、鋳型の底部の各側面の下に２本のマイクロスパチュラ（幅４ｍｍ、奥行き０．５ｍｍ、長さ１０ｃｍ）を挿入し、てこの原理により、鋳型から多孔性型前駆体を取り出す。
【００４８】
次いで、鋳型から取り出した多孔性型前駆体を、密閉されたビニール袋に入れ、７０℃で２０分間、オーブンで加熱する。ビニール袋に入れるのは、ゲルから水が蒸発するのを防ぐためである。
次いで、多孔性型前駆体の凹部に、６０〜７０℃、好ましくは７０℃に加温したクーマシーブルー染料マーカー入りアガロース水溶液（濃度０．１〜１．０％、好ましくは０．４％）のを注入する。注入されたアガロース水溶液が、表面張力下により凹部内に引き寄せられ、またアガロース水溶液が凝固する際に収縮することにより、深さ約１ｍｍの孔が形成される（図１（Ａ）参照）。
【００４９】
上記のようにして形成された孔に、中性緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ）で固定した組織球状体を入れる（図１（Ｂ）参照）。本発明で用いる組織球状体のサイズは、直径５０〜５００μｍ、好ましくは直径１００〜５００μｍ、より好ましくは直径１５０〜３５０μｍである。
本発明で用いる組織球状体は、人工多能性幹細胞、初代細胞またはがん組織由来の細胞株を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３次元培養により培養することで得られる。
尚、中性緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ）は、４ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物、６．５ｇのリン酸水素二ナトリウムおよび脱イオン水から９００ｍｌの緩衝液を調整し、これと純粋なホルムアルデヒド１００ｍｌを混合することにより得られる。
【００５０】
組織球状体は、孔に入れられた後、６０〜７０℃に加温されたアガロース水溶液で孔を満たすことにより密封される（図１（Ｃ）参照）。
次いで、アガロースをゲル化させるために４℃で３０分間冷却し、
続いて、最低でも１〜１０日間、好ましくは５日間にわたって７０％エタノールの溶液に入れて脱水を行う。
【００５１】
次いで、球状体組織マイクロアレイは、組織処理装置により融解パラフィンワックスで含浸される（図１（Ｄ）参照）。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
パラフィン包埋後、球状体組織マイクロアレイは、切片にされ、ガラス顕微鏡用スライド（２５ｍｍ×７５ｍｍ）上に乗せられ、組織学的染色に供される。続いて、必要に応じてマトリックス支援レーザー脱離イメージング質量分析プロテオミクスプロファイリングに供され、最後に自動化画像解析技術により解析される。
【００５４】
本発明の球状体組織マイクロアレイから得られる画像の例を図２〜５に示す。
【００５５】
図１には、アレイに球状体を配置するための方法のうち、前記第１の方法を示す。図６には、前記第２の方法を示す。図６を参照すると、断面図で示される鋳型２０は、凸部２１を有し、該凸部２１は、その先端により小さな乳頭状の凸部２２を有する。このような鋳型を用いて多孔性型を作成すると、凹部２３の底部に、球状体２５を配置するための孔２４が形成される。
【００５６】
本発明の利点の一つとして、マイクロアレイの調整およびそれに続く解析を、球状体の形態を維持したまま行えることが挙げられる。このことは、病理学者による細胞の形態分析により確認されている。
【００５７】
本発明によると、ハイスループット組織診断で使用する球状体組織マイクロアレイ、およびその製造方法が提供される。本発明の球状体組織マイクロアレイによると、組織球状体を規則正しく格子状に位置決めでき、また多くの（例えば、何百個もの）球状体を同時に切片状にすることができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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