(57)【要約】本発明は、細胞透過効率が顕著に優れ、セラムや血清が存在する環境でも１時間内に１００％のすべての細胞内に透過する特性があり、安定した構造を有し、カーゴを損傷することなくその機能を維持したままで細胞内に運ぶことができる細胞透過ペプチドに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチド。
【請求項２】
前記細胞透過性ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項３】
前記細胞透過性ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項４】
前記細胞透過性ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記細胞透過ペプチドと、そのＮ−末端またはＣ−末端に融合したカーゴを含む組換えカーゴ。
【請求項６】
前記カーゴは、配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ５３Ｃペプチドである請求項５に記載の組換えカーゴ。
【請求項７】
前記組換えカーゴは、配列番号６のアミノ酸配列を含む請求項６に記載の組換えカーゴ。
【請求項８】
前記カーゴは、配列番号８のアミノ酸配列を含むペプチドである請求項５に記載の組換えカーゴ。
【請求項９】
前記組換えカーゴは、配列番号９のアミノ酸配列を含む請求項５に記載の組換えカーゴ。
【請求項１０】
請求項５に記載の前記組換えカーゴを含む細胞透過用組成物。
【請求項１１】
請求項５に記載の前記組換えカーゴを含む組換え発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来のタンパク質内で発見した細胞透過ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を透過できる性質を持つペプチドである、細胞膜透過能を有するペプチド（cell-penetrating peptide；ＣＰＰ）は、通常３０個以下のアミノ酸で構成されており、二重脂質膜を自由に通過する性質を有することが知られている。ＣＰＰは、ＰＴＤ（protein-transduction domains）、ＭＴＳ（membrane-translocating sequences）とも呼ばれるが、輸送対象体に結合された形態または混合された形態で細胞膜を通過し、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの運搬対象を細胞内にだけでなく、細胞質、細胞内小器官、核の中にまで運ぶことができる。
【０００３】
高等動物の細胞膜は、リン脂質二重層（phospholipid bilayer）で構成されており、この脂質二重層（lipid bilayer）が持っている疎水性により、殆どのペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、リポソームなどが細胞内に移動することは殆ど不可能である。このため、細胞膜は、ペプチドやタンパク質、あるいは化合物製剤の薬物や遺伝子治療剤を細胞内に移動させるのに障害物になっていると言える。これを克服するために、陽イオン性脂質（cationic lipid）またはＰＥＩ（polyethyleneimine）を用いるか、若しくはウイルスベクター（viral vector）または電気穿孔法（electroporation）を用いる方法などが多用されている。
【０００４】
しかし、これらの方法は、低い効率、適用可能な細胞の制限、細胞内の毒性などから限界がある。この限界を克服するために、最近では細胞透過ペプチドを使用する試みが盛んに行われている。
【０００５】
ＣＰＰは、細胞膜に反応してエンドサイトーシス（endocytosis）または直接細胞膜を透過できる性質を持っているオリゴペプチドであり、細胞膜を透過できる電気化学的及び物理化学的な特性を有する。
【０００６】
ＣＰＰは、輸送タンパク質（translocatory protein）の一部であり、代表的には、ヒト繊維芽細胞成長因子（human fibroblast growth factor）４のシグナルペプチド（signal sequence）に存在する疎水性部分（hydrophobic region）であるＭＴＳ（membrane translocating sequence）と、ＨＩＶのウイルスタンパク質（viral protein）の一つであるＴａｔタンパク質のＴａｔ−ＰＴＤ（basic amino acid domain）が挙げられる。
【０００７】
その他にも、多くのＣＰＰが報告されて商業化されているが、細胞膜を通過して物質を細胞内に移動する程度が細胞特異的なものが多く、その効果も高くない。特に、セラム（serum）や血清が存在する環境では、細胞膜を通過する透過効率が半分程度に減少する。このため、機能性タンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡを細胞内に運ぶのに細胞特異性がなく、且つセラムの存在下でもその効率が高いＣＰＰの開発が求められている。
【０００８】
ＣＰＰの開発による利点は、細胞分化、細胞特性の維持、または組織及び器官の機能調節に必要な様々な形態の調節物質を効率的に細胞内に導入できることである。特に、アクティブ期間が非常に限られているタンパク質を細胞内に容易に移動させることで、所期の目的を、予想される危険性なしに処置できる非常に有用な媒介物である。さらに、組換えの形態、または対象物と混合された形態で細胞内に対象物をトランスフェクション（transfection）できる利点がある。しかし、理論的に又はいくつかの実験により証明されているが、前述のように、従来のＣＰＰが持つ限界が問題になっている。つまり、細胞特異的に物質の移動効率が異なることと、遺伝子組換えに用いられている他の方法に比べて効率が落ちる問題がある。最近では、このような問題点を克服でき、且つ副作用のない伝達媒介物に関する研究が盛んに行われている。
【０００９】
したがって、従来知られている細胞透過ペプチドよりもその効率に優れた細胞透過能の良い候補を確保して融合タンパク質に適用すること、及びそのアミノ酸配列について技術的優位を確保することは非常に重要であると言える。
【００１０】
本発明者は、細胞分化、細胞特性の維持、または組織及び器官の機能調節に必要な様々な形態の調節物質を効率よく伝達できる伝達媒介物を見つけるために、新規なＣＰＰを見つけ、それによって、従来の伝達物質が持つ問題点を克服できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細胞透過効率に優れた細胞透過ペプチドを提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は、前記細胞透過ペプチドを含む組換えカーゴを提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、前記組換えカーゴを含む細胞透過用組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明は、前記細胞透過ペプチドまたは組換えカーゴを含む遺伝子コンストラクト、及びそれを含む発現ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
１．配列番号１のアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチド。
【００１６】
２．前記項目１において、前記細胞透過ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド。
【００１７】
３．前記項目１において、前記細胞透過ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド。
【００１８】
４．前記項目１において、前記細胞透過ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド。
【００１９】
５．前記項目１〜４のいずれか一項に記載の前記細胞透過ペプチドと、そのＮ−末端またはＣ−末端に融合したカーゴとを含む組換えカーゴ。
【００２０】
６．前記項目５において、前記カーゴは、配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ５３Ｃペプチドである組換えカーゴ。
【００２１】
７．前記項目６において、前記組換えカーゴは、配列番号６のアミノ酸配列を含む組換えカーゴ。
【００２２】
８．前記項目５において、前記カーゴは、配列番号８のアミノ酸配列を含むペプチドである組換えカーゴ。
【００２３】
９．前記項目５において、前記組換えカーゴは、配列番号９のアミノ酸配列を含む組換えカーゴ。
【００２４】
１０．前記項目５に記載の前記組換えカーゴを含む細胞透過用組成物。
【００２５】
１１．前記項目５に記載の前記組換えカーゴを含む組換え発現ベクター。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る細胞透過ペプチドは、血液のようにセラムや血清が存在する環境でも１時間内に１００％のすべての細胞内へ透過する特性があり、ＳＤＳのような界面活性剤を加えた場合にも、その構造が変性しない程度の安定な構造を持っている。これにより、機能性物質を、細胞及び物質の損傷なしにその機能を維持したままで、細胞質または核質および生体内の各臓器に運ぶことができるとともに、血管内投与のほか、身体の局部部位に適用して副作用を最小限に抑えることができる。
【００２７】
本発明の細胞透過ペプチドと融合されたカーゴを含む組換えカーゴは、細胞内伝達効率が非常に優れている。これにより、カーゴの種類を多様に選択し、様々な薬物の伝達などに活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、人体由来の中間葉幹細胞（Mesenchymal stem cell、ＭＳＣ）で、Ａｒａ−２７細胞透過ペプチドが濃度に比例して細胞膜透過効率が増加していることを示すものである。グラフのＹ軸は、蛍光強度（Fluorescence intensity）を示すものであり、単位細胞当たり導入されるペプチドの量を確認できる指標である。指標が対照群（No treatment）よりも高い値を有するほど、単位細胞当たりにより多くのペプチドを細胞内に導入できることを示す。対照群やＴａｔ−ＰＴＤに比べてＡｒａ−２７の方が、濃度に比例して細胞内へのペプチドの導入量が増加していることを示している。
【図２】図２は、人体由来のＭＳＣで、Ａｒａ−２７細胞透過ペプチドが１時間以内に蛍光顕微鏡によって肉眼確認できる程度に、多量のペプチドが細胞膜を透過して細胞内に導入されていることを示すものである。１０％Ｓｅｒｕｍが含まれた培地で、１μＭの濃度で３０分間処理した後、ヘパリン洗浄法（Heparin washing method）を用いて細胞表面に付着している蛍光ペプチドを除去し、トリプシン（Trypsin）を処理して細胞を剥がした後、蛍光顕微鏡で撮影した写真である。Ｔａｔ−ＰＴＤは、細胞内に導入されていることが非常に少ないのに対し、Ａｒａ−２９の場合は、すべての細胞に導入されていることが確認できた。
【図３】図３は、Ａｒａ−２７（５μＭ）が細胞透過してから１８時間経過後、細胞内の転座（translocation）を示す共焦点蛍光顕微鏡（confocal microscope）の写真である。一日経過しても、細胞透過したペプチドが安定的に細胞内に存在していることを確認できる。細胞内に存在することをより明確に示すために、トリプシン（trypsin）で底に付着している細胞を剥がし、さらにメンブランマーカー（membrane marker）と共に免疫蛍光実験を行った。ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍａｒｋｅｒの内側にＦＩＴＣ蛍光が観察されることから、ペプチドが細胞内に存在していることが分かる。また、細胞質のみならず、核の内部にも一部ペプチドが存在していることが分かる。
【図４】図４は、ＧＦＰ蛍光タンパク質をレポータータンパク質（reporter protein）として使用して、Ｔａｔ（図４の右側）及びＴａｔ−Ａｒａ−２７（図４の左側）の細胞内への移動効果を確認した結果である。
【図５】図５は、ＧＦＰ蛍光タンパク質をｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎとして使用して、Ｔａｔ（図５の右側）及びＴａｔ−Ａｒａ−２７（図５の左側）の細胞内への移動効果を確認した結果である。
【図６】図６は、繊維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３でのＡｒａ−２７、Ａｒａ−２０、Ｒ８−Ａｒａ−１９、Ａｒａ−８の細胞透過ペプチドの細胞透過効率を比較したものである。
【図７】図７は、ｐ５３Ｃ、Ｔａｔ−ａｒａ−１９及びＩＣＴ−５３ペプチドの細胞透過効率を比較したものである。
【図８】図８は、ＩＣＴ−５３ペプチドが大腸菌で安定的に大量発現することを確認した結果である。
【図９】図９は、ＩＣＴ−５３ペプチドの抗癌効果を示すものである。
【図１０】図１０は、ＩＣＴ−５３ペプチドの抗癌効果を示すものである。
【図１１】図１１は、ＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドが大腸菌で安定的に大量発現することを確認した結果である。
【図１２】図１２は、ＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドを処理した細胞群で精製したＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドの成長促進効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
タンパク質やペプチドは、細胞膜を透過して細胞内に伝達されることが難しいため、遺伝子の形で幹細胞に導入され、細胞治療剤としての役割を果たしてきた。
【００３０】
そこで、本発明者は、幹細胞に導入せず、ペプチド自体としても優れた細胞透過能を有する新規なペプチドを発見し、本発明を完成した。
【００３１】
本発明の細胞透過ペプチドは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）由来のペプチドであり、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本明細書で使用される用語「細胞透過ペプチド（Cell Penetrating Peptide、ＣＰＰ）」は、イン・ビトロ（in vitro）及び／又はイン・ビボ（in vivo）でカーゴ（cargo）を細胞内に移動できるペプチドを意味する。
【００３３】
本発明者は、シロイヌナズナ由来のいくつかのペプチドを分離し、その中の一部のペプチドが、セラムや血清が存在する環境でも優れた細胞透過能を有すること、及びこれらのペプチドが共通して配列番号１のアミノ酸配列を有することを確認した。つまり、配列番号１のアミノ酸配列が、細胞透過能に影響を与える部分に該当するものと判断される。
【００３４】
したがって、本発明の細胞透過ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むものであれば、その具体的な配列は特に限定されず、配列番号１のアミノ酸配列のみからなるものであってもよく、Ｎ−末端、Ｃ−末端または両末端に一部の配列が追加されたものであってもよい。
【００３５】
一部の配列が追加されたものの具体例としては、Ｎ−末端に一部の配列が追加された配列番号２のアミノ酸配列、Ｎ−末端に一部の配列が追加された配列番号３のアミノ酸配列、Ｎ−末端に一部の配列が追加された配列番号４のアミノ酸配列などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の細胞透過ペプチドは、前記配列のほか、当分野で公知の他のタンパク質または他のタンパク質伝達ドメインと結合することもできる。例えば、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）に由来したＴＡＴ（trans-activating transcriptional activator）；ショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメイン（Antennapedia Homeodomain）であるＡｎｔｐ（Antennapediaまたはpenetratin）ペプチド；マウスの転写因子のＭｐｈ−１（Mutator phenotype protein 1）、ＨＳＶ−１（Herpes simplex virus）のＶＰ２２（viral protein 22）；ニシンプロタミンのＨＰ４（human protamine P4）；トランスポータン（Transportan）、ＭＡＰ（Model amphipathic peptide）、ＴＰ１０（Transportan-10）、ＣＴＰ（Cardiac targeting peptide）、Ｋ５−ＦＧＦ（K5-fibroblast growth factor、AAVALLPAVLLALLP）、ＨＡＰ−１（Huntingtin-associated protein 1、SFHQFARATLAS）、２９３Ｐ−１（SNNNVRPIHIWP）、ＣＡＤＹ（cysteamidation PTD、Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-Cya）、ＰＦ６（PepFect6、Stearyl-AGYLLGK(εNH)INLKALAALAKKIL-NH2）、ＲＸＲ（arginine rich peptide）、ポリアルギニン（poly−arginine、Rn(n=6〜12)）、ポリリシン（poly-lysine）、またはそれらの変形ペプチド（例えば、ＴＡＴタンパク質の４７−５７アミノ酸残基を変形したペプチドなど）などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００３７】
本発明の細胞透過ペプチドは、優れた細胞透過能を示すので、カーゴと結合してカーゴを細胞内に効率よく運ぶことができる。
【００３８】
これにより、本発明は、前記細胞透過ペプチドを含む組換えカーゴを提供する。
【００３９】
本発明の組換えカーゴは、前述した細胞透過ペプチドおよび前記細胞透過ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合したカーゴを含む。
【００４０】
本明細書で使用される用語「カーゴ（cargo）」は、本発明の細胞透過ペプチドと結合して細胞内に移動できる物質をすべて含むものであり、例えば、細胞透過効率を高めようとするすべての物質、具体的には、薬物、化粧品または健康食品の有効物質、より具体的には、一般的な経路によっては細胞内への移動が容易でない物質、さらに具体的には、タンパク質、核酸、ペプチド、ミネラル、ブドウ糖を含む糖、ナノ粒子、生物学的製剤、ウイルス、造影物質またはその他の化学物質を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本明細書で使用される用語「薬物」は、病気、傷または特定の症状を緩和、予防、治療または診断するための物質を含む幅広い概念である。前記具現例において、細胞透過性ペプチドによって細胞内に伝達される薬物は、リポソーム、ミセル、ナノ粒子、磁性粒子または量子ドットのような薬物伝達体をさらに含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達タンパク質（又はペプチド）、抗体、またはワクチンを含むことができるが、これらに限定されるものではない。前記核酸は、自然発生的または人工的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。核酸分子は、一つ以上であってもよいが、同じタイプの（例えば、同じヌクレオチド配列を有する）核酸分子であってもよく、異なるタイプの核酸分子であってもよい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｄｅｃｏｙ ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＰＮＡ、アンチセンスオリゴマー（antosense oligomer）、プラスミド（plasmid）及びその他の変形された核酸のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本明細書で使用される用語「造影物質」は、医学的な画像撮影（imaging）で生体内の構造または流体の造影のために使用するすべての物質を意味する。前記造影物質は、放射線非透過造影物質（radiopaque contrast agent）、常磁性造影物質（paramagnetic contrast agent）、超常磁性造影物質（superparamagnetic contrast agent）、ＣＴ（computed tomography）造影物質またはその他の造影物質を含むことができるが、これらに限定されるものではない。例えば、放射線非透過造影物質（Ｘ線画像用）は、無機ヨウ素化合物および有機ヨウ素化合物（例えば、ジアトリゾアート）、放射線非透過金属及びその塩（例えば、銀、金、白金など）、および、その他の放射線非透過化合物（例えば、カルシウム塩、硫酸バリウムなどのバリウム塩、タンタルおよび酸化タンタル）を含むことができる。常磁性造影物質（ＭＲ画像用）は、ガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸（gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid、Ｇｄ−ＤＴＰＡ）及びその誘導体、およびその他のガドリニウム、マンガン、鉄、ジスプロシウム（dysprosium）、銅、ユーロピウム（europium）、エルビウム（erbium）、クロム、ニッケル及びコバルト複合体、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，−Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（Ｄ０３Ａ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１０−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、ヒドロキシベンジルエチレン−ジアミンジ酢酸（ＨＢＥＤ）を含むことができる。超常磁性造影物質（ＭＲ画像用）は、磁鉄鉱（magnetite）、超常磁性酸化鉄（super-paramagnetic iron oxide、ＳＰＩＯ）、超小超常磁性酸化鉄（ultrasmall superparamagnetic iron oxide、ＵＳＰＩＯ）、及び単結晶性（monocrystailine）酸化鉄を含むことができる。他の適切な造影物質は、ヨウ化及び非ヨウ化（non-iodinated）、イオン性及び非イオン性のＣＴ造影物質、およびスピン−標識（spin-label）のような造影物質、またはその他の診断活性剤（diagnostically effective agent）を含むことができる。また、前記造影物質は、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを含むことができる。細胞で発現する場合には、容易に検出できるタンパク質をコードするマーカー遺伝子を含むことができる。放射性核種（radionuclide）、蛍光物質（fluor）、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤などの様々な標識を用いることができる。
【００４４】
カーゴがペプチドである場合の具体例として、カーゴは、配列番号５のアミノ酸配列からなる抗癌タンパク質ｐ５３Ｃであってもよく、組換えカーゴは、前記ｐ５３Ｃが前述の細胞透過ペプチド配列のＮ−末端またはＣ−末端に結合したアミノ酸配列を有することができる。より具体的には、配列番号４のアミノ酸配列のＮ−末端にｐ５３Ｃが結合した配列番号６のアミノ酸配列を含むものであってもよい。本明細書ではこれをＩＣＴ−５３と称する。また、ＩＣＴ−５３には、精製を容易にするためにＮ−末端またはＣ−末端にＨｉｓタグを付着することができるが、Ｈｉｓタグが付着されたＮ−末端に付着されたペプチドの例としては、配列番号７のアミノ酸配列を含むことができる。
【００４５】
カーゴがペプチドである場合の他の具体例として、カーゴは、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の配列番号８のアミノ酸配列からなる一部の配列であってもよい。組換えカーゴは、前記配列が前述の細胞透過ペプチド配列のＮ−末端またはＣ−末端に結合したアミノ酸配列を有することができる。より具体的には、配列番号４のアミノ酸配列のＣ−末端に配列番号８のアミノ酸配列が結合した配列番号９のアミノ酸配列を含むものであってもよい。本明細書ではこれをＩＣＴ−Ｍｙｃと称する。また、ＩＣＴ−Ｍｙｃには、精製を容易にするためにＮ−末端またはＣ−末端にＨｉｓタグを付着することができるが、Ｈｉｓタグが付着されたＮ−末端に付着されたペプチドの例としては、配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。
【００４６】
また、本発明の組換えカーゴは、生体内でより優れた特異性を示すように、特定の細胞、組織、臓器の受容体と選択的に結合するリガンド、リンカーなどをさらに含むことができる。
【００４７】
また、本発明は、前記組換えカーゴを含む細胞透過用組成物を提供することができる。本発明の組成物は、細胞透過ペプチドに融合されるカーゴの種類、機能等によって様々な効果を示すことができる。
【００４８】
例えば、カーゴが抗癌機能を有するペプチドである場合には、細胞透過用組成物は、抗癌剤として活用でき、細胞成長促進機能を有するペプチドである場合には、細胞成長促進剤として活用できる。このように、その効果は結合されるカーゴの種類に応じて異なるので、カーゴの種類が制限されないのと同じようにその役割も制限されない。
【００４９】
また、本発明は、前記細胞透過ペプチドまたは組換えカーゴをコードする遺伝子コンストラクト、及びそれを含む発現ベクターを提供する。
【００５０】
本発明の遺伝子コンストラクト、そして発現ベクターを用いて、細胞透過ペプチドを繰り返し量産することができる。
【００５１】
さらに、特に、細胞内に導入するカーゴがタンパク質である場合には、前記の遺伝子コンストラクトが含まれている発現ベクターのマルチクローニング部位（multi−cloning site、ＭＣＳ）に前記カーゴタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、細胞膜透過ドメインと前記カーゴタンパク質が融合した組換えカーゴタンパク質を量産することができる。前記ベクターによって量産した組換えカーゴタンパク質は、野生型（wild type）のカーゴタンパク質と比較して、より高効率で細胞内に導入することができる。
【００５２】
また、本発明は、細胞内へのカーゴの伝達方法を提供する。
【００５３】
本発明のカーゴの伝達方法は、前記組換えカーゴを細胞と接触させるステップを含む。
【００５４】
組換えカーゴと細胞との接触は、イン・ビトロ（in vitro）またはイン・ビボ（in vivo）で行うことができる。前記接触がイン・ビトロ（in vitro）で行われる場合には、試験管内の細胞に組換えカーゴが含まれた培地を処理して細胞を培養させる過程により、前記接触が行われる。前記接触がイン・ビボ（in vivo）で行われる場合には、前記組換えカーゴは、筋肉内（intramuscular）、腹膜内（intraperitoneal）、静脈内（intravein）、経口（oral）、鼻内（nasal）、皮下（subcutaneous）、皮内（intradermal）、粘膜（mucosal）または吸入（inhale）などの経路を介して生体内に注入（injection）され、生体内で細胞と組換えカーゴとの接触が行われる。
【００５５】
組換えカーゴと細胞との接触によって、前記組換えカーゴが細胞内に導入される。前記組換えカーゴの導入量は、処理される組換えカーゴの濃度が高ければ高いほど、また組換えカーゴが処理される時間が長ければ長いほど増加する。
【００５６】
本発明の方法は、人間または人間以外の様々な動物に制限なく適用することができる。
【００５７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００５８】
実施例
（１）セラム及び血清が存在する環境でも細胞膜透過効率が顕著に高い細胞透過ペプチドの合成、並びに細胞透過効率の測定
本発明の細胞透過ペプチドの透過効率を確認するために、よく知られている細胞透過ペプチドであるＴａｔ−ＰＴＤ（配列番号１２）を対照群として含めて実験を行った。
【００５９】
各細胞透過ペプチドの細胞透過効率を調べるために、各ペプチドに蛍光を発するＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate、蛍光物質）を付着して、その透過効率を調べた。
【００６０】
細胞透過効率を測定するために、細胞膜表面に付着している可能性のある各細胞透過ペプチドを除去するために、ケプラングループ（Keplan group）で用いたヘパリン＆トリプシン洗浄法（Heparin ＆ Trypsin washing method）を採用した［Kaplan IM、Wadia JS、Dowdy SF（2005）Cationic TAT peptide transduction domainenters cells by macropinocytosis．J Controlled release 102：247-253］。要約すると、後述する実験で細胞を育てる培地に１μＭの濃度で各細胞透過ペプチドを入れて、３０分間インキュベーションを行った後、ヘパリン（Heparin）を用いて細胞を３回洗浄し、トリプシン（Trypsin）によって細胞を剥がしてＦＡＣＳ分析を行った。
【００６１】
中間葉幹細胞（ＭＳＣ）で配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド（Ａｒａ−２７）の濃度別に細胞内に流入される量を調べた。
【００６２】
Ａｒａ−２７は、１時間の間に単位細胞当たり流入されるペプチドの量が濃度に比例して増加する特性があったが、Ｔａｔ−ＰＴＤは、５μＭの濃度でも単位細胞当たり流入されるペプチドの量が顕著に低いことが分かった（図１）。また、Ｔａｔ−ＰＴＤとは異なり、光学顕微鏡により肉眼でも確認できるほどの高い蛍光強度を示した（図２）。
【００６３】
また、Ａｒａ−２７細胞透過ペプチドが実際に細胞内の核の中や細胞質内に存在するかどうかを調べるために、Ａｒａ−２７処理後、共焦点顕微鏡（confocal microscopy）を使用して分析を行った。人体由来の中間葉幹細胞（ｈｕｍａｎ ＭＳＣ）を６−ウェルプレート（well plate）に１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ細胞培養培地に入れた。培養してから３時間後に、２μＭ濃度のＡｒａ−２７ペプチドを培地に添加した。Ａｒａ−２７ペプチド処理して１８時間経過した後に顕微鏡で確認した結果、ほとんどのＡｒａ−２７ペプチドが細胞質内に存在していることが確認できた。実際に細胞膜の内側に存在しているかを調べるために、ｍｅｍｂａｒｎｅ ｍａｒｋｅｒ（ＦＭ−６４）を用いた。試薬を細胞膜に容易に挿入させるために、トリプシン（trypsin）で細胞をはがした後、試薬を処理後に分析したことろ、ペプチドが細胞膜の内側の細胞質部分に殆ど存在していることが確認できた。また、核の中にも一部のペプチドが存在していることを確認した（図３）。
【００６４】
Ａｒａ−２７細胞透過ペプチドが、他の物質を細胞内に導入する役割を果たすかを再確認するために、ＧＦＰ蛍光タンパク質をｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎとして使用して、細胞内への移動の効果を確認する実験を行った。Ｔａｔ−Ａｒａ−１９にＧＦＰ（配列番号１３）が融合して発現できるように遺伝子を合成（Ｔａｔ−Ａｒａ１９−ＧＦＰ）（配列番号１４）し、対照群としては、Ｔａｔ−ＰＴＤにＧＦＰが融合して発現できるように遺伝子を合成（Ｔａｔ−ＧＦＰ）（配列番号１５）し、ｐＥＴ１１ベクター（ｐＥＴ−１１ｄ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）で発現をした。両タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓタグレジンを用いて精製した。この両タンパク質の細胞透過度を調べるために、皮膚幹細胞を使用した。図４〜６に示すように、１時間の間処理したとき、Ｔａｔ−ＧＦＰの場合は、５μＭの高濃度でも細胞内に蛍光を発しないのに対して、Ｔａｔ−Ａｒａ１９−ＧＦＰの場合は、１μＭの濃度でも細胞に蛍光を発することが明らかに観察され、２μＭの濃度では、より明るい蛍光強度を示した。これは、単位細胞当たり導入できるＴａｔ−Ａｒａ１９−ＧＦＰの分子数は、濃度に比例して増加することを意味する（図４、５）。これらの結果から、Ａｒａ−２７細胞透過ペプチドは、目的とする物質を細胞内に伝達できる素材として使用できるだけでなく、単位細胞当たりに、時間が経過するほど、そして濃度に比例して、より多くの分子が一つの細胞内に流入されて、効果的に細胞内で機能的な特性を示すことができることが分かる。
【００６５】
次に、繊維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３におけるＡｒａ−２７と配列番号１（Ａｒａ−２０）、配列番号３（Ｒ８−Ａｒａ−１９）、配列番号１１（Ａｒａ−８）の実施例の細胞透過ペプチドの細胞透過効率を比較してみた。Ａｒａ−２７は、セラムが存在する環境下で１μＭの濃度で３０分にも細胞内に透過される効率が９０％以上になる、非常に高効率の細胞透過性ペプチドであることが分かった。残りの細胞透過ペプチドの中で、ある場合には、より高い細胞膜透過効率を示した。これとは逆に、Ｔａｔ−ＰＴＤは、非常に低いレベルの透過効率を示した（図６）。また、実施例の細胞透過ペプチドは、セラムの存在有無にかかわらず、非常に高い透過効率を示した。
【００６６】
（２）細胞透過ペプチドと融合したｐ５３Ｃペプチドの抗癌効果
ｐ５３Ｃペプチド（配列番号５）は、抗癌効果を有するｐ５３タンパク質のＣ−末端部位のペプチドであり、この部分だけが細胞内で遺伝子発現をしたときに抗癌効果が奏されることがいくつかの論文に報告されている。これに基づいて、配列番号４（Ｔａｔ−Ａｒａ−１９）の細胞透過ペプチドにｐ５３Ｃペプチドを融合したペプチド（配列番号６、ＩＣＴ−５３）の細胞透過能および抗癌効果を調べる実験を行った。
【００６７】
２２個のアミノ酸配列を有するｐ５３ＣとＴａｔ−Ａｒａ−１９、そしてＴａｔ−Ａｒａ−１９にｐ５３Ｃを融合したペプチドＩＣＴ−５３を合成し、Ｃ−末端にＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate、蛍光物質）を付けて蛍光を発するようにした。これらのペプチドを用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞株を対象として、１μＭの濃度で１時間の間の細胞透過効率を調べたところ、ｐ５３Ｃは細胞内に透過せず、Ｔａｔ−Ａｒａ−１９とＩＣＴ−５３が高効率で細胞内に自動流入されることを確認した（図７）。この実験もまた、セラムが存在する状況での透過効率を調べたものである。
【００６８】
一方、前記のように細胞透過効率の高い細胞透過性の抗癌ペプチドを微生物で大量生産する方法を開発するために、ｐＥＴ１１というＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにＩＣＴ−５３をコードする遺伝子を挿入して発現ベクターを作製した。精製を容易にするために、タンパク質にヒスチジン（Histidine）が６個付いたＨｉｓタグと精製後Ｈｉｓタグとの分離のために、トロンビン切断部位（thrombin cleavage site）を入れて共に発現できるように製作した（配列番号７）。ＩＣＴ−５３の細胞透過性の抗癌ペプチドの発現有無を確認するために、発現菌株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株に形質転換（transformation）して発現菌株を選抜した。菌を培養してＯＤ ０．５程度に育ったとき、ＩＰＴＧ ０．５ｍＭの濃度で誘導（induction）をし、３７℃で６時間培養した。ＩＣＴ−５３を発現する大腸菌体を超音波破砕法（sonication）を用いて細胞壁を破砕した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、８ｋＤａ程度の位置で大量発現したタンパク質バンドを確認することができた。これは、ＩＣＴ−５３ペプチドが大腸菌で安定的に大量発現することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したものである（図８）。また、Ｈｉｓタグが存在するため、Ｎｉ−ＮＴＡ 樹脂（resin）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）を用いて精製し、癌細胞株を用いて抗癌効果を調べる実験を行った。
【００６９】
精製されたＩＣＴ−５３ペプチドの抗癌効果を調べるために、骨髄癌細胞であるＵ２ＯＳ癌細胞株に濃度別に処理をした。
【００７０】
ＩＣＴ−５３ペプチドを処理した細胞群で細胞が死んでいくことを確認した（図９）。精製したＩＣＴ−５３ペプチドを濃度別に処理したときにも、濃度に比例して抗癌効果が奏されることを確認した。特に、７．５μＭの濃度では、約７０％程度、癌の成長を阻害することを確認した（図１０）。
【００７１】
（３）Ａｒａ−２７由来のペプチドと融合したｃ−Ｍｙｃペプチドの細胞成長促進効果
また他の適用例として、細胞成長を促進させる効果があるｃ−ＭｙｃペプチドとＡｒａ−２７を融合したとき、細胞透過による細胞成長促進効果が奏されるかどうかについて実験を行った。
【００７２】
細胞透過効率が高い細胞透過性の再生ペプチドを微生物で大量生産する方法を開発するために、ｐＥＴ１１というＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにＩＣＴ−Ｍｙｃをコードする遺伝子を挿入して発現ベクターを作製した。精製を容易にするために、タンパク質にヒスチジン（Histidine）が６個付いたＨｉｓタグと精製後Ｈｉｓタグとの分離のために、ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅを入れて共に発現できるように製作した（配列番号１０）。ＩＣＴ−Ｍｙｃの細胞透過性の再生ペプチドの発現有無を確認するために、発現菌株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎして発現菌株を選抜した。菌を培養してＯＤ ０．５程度に育ったとき、ＩＰＴＧ ０．５ｍＭの濃度でｉｎｄｕｃｔｉｏｎをし、２０℃で１８時間培養した。ＩＣＴ−Ｍｙｃを発現する大腸菌体を超音波破砕法（sonication）を用いて細胞壁を破砕した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、１７ｋＤａ程度の位置で発現したタンパク質バンドを確認することができた。これは、ＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドが大腸菌で安定的に大量発現することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したものである（図１１）。また、Ｈｉｓタグが存在するため、Ｎｉ−ＮＴＡ ｒｅｓｉｎを用いたアフィニティー・クロマトグラフィー（affinity chromatography）を用いて精製し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を用いて細胞成長促進効果を調べる実験を行った。
【００７３】
精製されたＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドの再生促進効果を調べるために、繊維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞株に濃度別に処理をした。
【００７４】
ＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドを処理した細胞群で精製したＩＣＴ−Ｍｙｃペプチドを濃度別に処理したとき、濃度に比例して成長促進効果が奏されることを確認した。特に、７．５μＭの濃度では、約６０％程度、成長促進を誘導することを確認した（図１２）。
【００７５】
本発明で提示するアミノ酸配列は、Ａｒａ−２７由来のペプチドであって、細胞内に導入させる能力が高い細胞透過ペプチドであり、Ｔａｔ−ＰＴＤペプチドよりも顕著に高い細胞透過効率を示し、細胞透過効率のみならず、実際の機能的な特性を有する目的タンパク質やペプチドまたは遺伝子を細胞内に伝達して、機能的特性を有することができる。これにより、多くの機能性に優れた素材を対象とした新薬開発が可能なだけでなく、優れた機能性を保有する他の有望なタンパク質を対象として、細胞透過が可能なタンパク質を開発できると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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