(57)【要約】  組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンを構築及び生産するための方法及び組成物が提供される。特定の態様では、アデノウイルスに対する既存の免疫を有する対象において高度に反応性の抗HPV及び抗腫瘍免疫応答を生じさせる処置方法における使用のための、標的抗原、例えば、HPV E6及び/又はHPV E7の新規抗原の遺伝子を含むアデノウイルスベクターを用いる組成物及び方法が提供される。【選択図】図２Ｂ
2019517522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製欠損ウイルスベクターを含む組成物であって、前記複製欠損ウイルスベクターは、
a)配列番号8、配列番号9又は配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
b)配列番号12に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
c)配列番号2、配列番号3又は配列番号4に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;
d)配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19又は配列番号7、配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;及び
e)配列番号11又は配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列
のうち1つ以上を含む核酸配列を含む、組成物。
【請求項２】
前記ベクターが、配列番号8に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ベクターが、配列番号9に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記ベクターが、配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記ベクターが、配列番号12に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記ベクターが、配列番号2に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記ベクターが、配列番号3に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記ベクターが、配列番号4に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
前記ベクターが、配列番号5に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ベクターが、配列番号18に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ベクターが、配列番号6に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ベクターが、配列番号19に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ベクターが、配列番号7に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ベクターが、配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ベクターが、配列番号11に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ベクターが、配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ベクターが、E1領域、E2b領域、E3領域、E4領域、又はそれらの組合せ中に、欠失を含む、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ベクターが、E2b領域中に欠失を含む、請求項17〜18のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ベクターが、E1領域、E2b領域及びE3領域中に欠失を含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物又は前記ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はそれらの組合せを含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
前記共刺激分子が、B7、ICAM-1及びLFA-3の組合せを含む、請求項21又は22に記載の組成物。
【請求項２４】
同じ複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
別々の複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも5×1011の複製欠損ウイルスベクターを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
HPV E6及びHPV E7を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
E2b領域中の欠失、及びHPV E6をコードする核酸配列を含む、第1の複製欠損アデノウイルスベクター;並びに
前記E2b領域中の欠失、及びHPV E7をコードする核酸配列を含む、第2の複製欠損アデノウイルスベクター
を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記複製欠損ウイルスベクターが、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
選択マーカーが、lacZタンパク質、チミジンキナーゼ、gpt、GUS若しくはワクシニアK1L宿主範囲タンパク質、又はそれらの組合せである、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
改変型HPV抗原が、改変型HPV E6抗原及び改変型HPV E7抗原の組合せである、請求項1〜30のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
改変型HPV抗原が、非発癌性HPV抗原である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
改変型HPV抗原が、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、又はそれらの組合せに結合する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記核酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、又はそれらの組合せの23〜496位及び502〜795位に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記核酸配列が、配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7又は配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を有する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記核酸配列が、配列番号11又は配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を有する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記複製欠損ウイルスが、1つ以上のさらなる標的抗原又はその免疫学的エピトープをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記1つ以上のさらなる標的抗原が、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生生物抗原、寄生生物抗原、マイトジェン、又はそれらの組合せである、請求項37に記載の組成物。
【請求項３９】
前記1つ以上のさらなる標的抗原が、CEA、葉酸受容体アルファ、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSCA、PSMA、PAP、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、Her2/neu、BRCA1、ブラキュリ、ブラキュリ(TIVS7-2、多型)、ブラキュリ(IVS7 T/C多型)、Tブラキュリ、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、Her2/neu、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、若しくはTEL/AML1、若しくは改変型バリアント、スプライスバリアント、機能的エピトープ、エピトープアゴニスト、又はそれらの組合せである、請求項37〜38のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記1つ以上のさらなる標的抗原が、CEA、ブラキュリ及びMUC1である、請求項37〜39のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
CEAが、配列番号22、若しくは配列番号24に対して、又は配列番号25の1057〜3165位に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項40に記載の組成物。
【請求項４２】
MUC1-cが、配列番号26又は配列番号27に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項40〜41のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
ブラキュリが、配列番号28に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項40〜42のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
少なくとも1×109のウイルス粒子〜少なくとも5×1012のウイルス粒子を含む、請求項1〜43のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
少なくとも1×1011のウイルス粒子を含む、請求項1〜44のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも5×1011のウイルス粒子を含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記複製欠損ウイルスベクターが、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜46のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４９】
請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
【請求項５０】
腫瘍ワクチンを調製する方法であって、請求項48に記載の医薬組成物を調製するステップ又は請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物を調製するステップを含む、方法。
【請求項５１】
それを必要とする対象においてHPV特異的免疫応答を増強する方法であって、治療有効量の請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物又は請求項48に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項５２】
それを必要とする対象においてHPV誘導性癌を予防又は処置する方法であって、治療有効量の請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物又は請求項48に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項５３】
前記投与が、前記対象においてHPV E6又はHPV E7発現細胞を排除する、請求項51〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記投与の前にHPV陽性であると決定された対象においてHPV誘導性癌を予防する方法である、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、HPV16型又はHPV18型癌遺伝子の発現について陽性である、請求項53〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
アジュバントを投与するステップをさらに含み、前記アジュバントが、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、Merckアジュバント65、AS-2、水酸化アルミニウムゲル(alum)、リン酸アルミニウム、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩、アシル化チロシン、アシル化糖、カチオン性又はアニオン性誘導体化多糖、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドA、quil A、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23又はIL-32を含む、請求項51〜55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、HPV陽性であるか、又はHPV E6若しくはHPV E7を発現する、請求項51〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
免疫チェックポイント阻害剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項51〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、又はCD244を標的化する、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1又はPDL1を標的化する、請求項58〜59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗PD-1又は抗PDL1抗体である、請求項58〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
免疫チェックポイント阻害剤が抗PDL1抗体である、請求項58〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
免疫チェックポイント阻害剤がアベルマブである、請求項58〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
それを必要とする対象においてHPV感染症、HPV誘導性癌又はHPV関連疾患を処置するステップをさらに含む、請求項58〜63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象が、HPV感染症、HPV誘導性癌又はHPV関連疾患を有する、請求項58〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記HPV誘導性癌が、HPV誘導性の頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、口腔咽頭・扁桃癌、腟癌、陰茎癌、外陰癌、肛門癌又は子宮頸癌である、請求項64〜65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、子宮頸部、腟、外陰部、頭/頸部、肛門又は陰茎のHPV陽性扁平上皮癌を有する、請求項51〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、Ad5に対する既存の免疫を有する、請求項51〜67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
治療有効量の前記組成物の前記投与が、3週間毎に反復される、請求項51〜68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記医薬組成物が、少なくとも5×1011のアデノウイルスベクターを含む、請求項51〜69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
化学療法、放射線、又はそれらの組合せを前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項51〜70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
投与の経路が、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、腟内、鼻腔内、経口であるか、膀胱内注入によるか、又はスカリフィケーションによる、請求項51〜71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象が、前記投与の後に、細胞性又は体液性応答である増強された免疫応答を有する、請求項51〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象が、B細胞増殖、CD4+ T細胞増殖、CD8+ T細胞増殖、又はそれらの組合せの増強である増強された免疫応答を有する、請求項51〜73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象が、IL-2産生、IFN-γ産生、又はそれらの組合せの増強である増強された免疫応答を有する、請求項51〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象が、抗原提示細胞の増殖、機能、又はそれらの組合せの増強である増強された免疫応答を有する、請求項51〜75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記対象が、以前にアデノウイルスベクターを投与されている、請求項51〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象が、アデノウイルスベクターに対する既存の免疫を有すると決定される、請求項51〜77のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
操作されたナチュラルキラー(NK)細胞の集団を含む医薬組成物を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項51〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記操作されたNK細胞が、KIR(キラー阻害受容体)の発現を本質的に欠くように改変された1つ以上のNK細胞、高親和性CD16バリアントを発現するように改変された1つ以上のNK細胞、及び1つ以上のCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変された1つ以上のNK細胞、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
前記操作されたNK細胞が、KIRの発現を本質的に欠くように改変された1つ以上のNK細胞を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
前記操作されたNK細胞が、高親和性CD16バリアントを発現するように改変された1つ以上のNK細胞を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８３】
前記操作されたNK細胞が、1つ以上のCARを発現するように改変された1つ以上のNK細胞を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８４】
前記CARが、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、PSMA、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her4、BRCA1、ブラキュリ、ブラキュリ(TIVS7-2、多型)、ブラキュリ(IVS7 T/C多型)、Tブラキュリ、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はそれらの任意の組合せに対するCARである、請求項80又は83に記載の方法。
【請求項８５】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、請求項51〜84のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
複製欠損アデノウイルスベクターが細胞中に含まれる、請求項51〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞が樹状細胞(DC)である、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
治療有効量のIL-15又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項51〜87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
治療有効量のIL-15スーパーアゴニスト又はIL-15スーパーアゴニストをコードする核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項51〜88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記IL-15スーパーアゴニストがALT-803である、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
それを必要とする対象においてHPV発現細胞を低減させる方法であって、改変型HPV E6、改変型HPV E7抗原、又はそれらの組合せをコードする核酸配列を含む複製欠損ウイルスベクターを含む組成物の有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項９２】
前記核酸配列が、改変型HPV E6及び改変型HPV E7をコードする、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
前記複製欠損ウイルスベクターが、
a)配列番号8、配列番号9若しくは配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
b)配列番号12に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
c)配列番号2、配列番号3若しくは配列番号4に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;
d)配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7、配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;
e)配列番号11若しくは配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;
f)配列番号13に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
g)配列番号14に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;又は
h)配列番号15に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列
を含む、請求項91〜92のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記投与が、前記対象においてHPV E6又はHPV E7発現細胞を排除する、請求項91〜93のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記投与の前にHPV陽性であると決定された対象においてHPV誘導性癌を予防するステップをさらに含む、請求項91〜94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項91〜95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ベクターが、E1領域、E2b領域、E3領域、E4領域、又はそれらの組合せ中に、欠失を含む、請求項96に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ベクターが、E2b領域中に欠失を含む、請求項96に記載の方法。
【請求項９９】
前記ベクターが、E1領域、E2b領域及びE3領域中に欠失を含む、請求項96に記載の組成物。
【請求項１００】
前記組成物又は前記ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項91〜99のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はそれらの組合せを含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
前記共刺激分子が、B7、ICAM-1及びLFA-3の組合せを含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
前記組成物が、同じ複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む、請求項91〜102のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組成物が、別々の複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む、請求項91〜102のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記組成物が、少なくとも5×1011の複製欠損ウイルスベクターを含む、請求項91〜104のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組成物が、HPV E6及びHPV E7を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項91〜105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記組成物が、
E2b領域中の欠失、及びHPV E6をコードする核酸配列を含む、第1の複製欠損アデノウイルスベクター;並びに
前記E2b領域中の欠失、及びHPV E7をコードする核酸配列を含む、第2の複製欠損アデノウイルスベクター
を含む、請求項91〜106のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記複製欠損ウイルスベクターが、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項91〜107のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記選択マーカーが、lacZタンパク質、チミジンキナーゼ、gpt、GUS若しくはワクシニアK1L宿主範囲タンパク質、又はそれらの組合せである、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
前記改変型HPV E6又はHPV E7抗原が、非発癌性HPV抗原である、請求項91〜109のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記改変型HPV E6又はHPV E7抗原が、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、又はそれらの組合せに結合する、請求項91〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記核酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、又はそれらの組合せの23〜496位及び502〜795位に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を含む、請求項91〜111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記核酸配列が、配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7又は配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を含む、請求項91〜112のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記核酸配列が、配列番号11又は配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を含む、請求項91〜113のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象が、HPV16型又はHPV18型癌遺伝子の発現について陽性である、請求項91〜114のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が、HPV陽性であるか、又はHPV E6若しくはHPV E7を発現すると決定される、請求項91〜114のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対象がHPV感染症を有する、請求項91〜116のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象が、口腔洗浄又はパップスメアによってHPV感染症を有すると決定されている、請求項91〜117のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対象が、Ad5に対する既存の免疫を有する、請求項91〜118のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記投与が、3週間毎に反復される、請求項91〜119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記組成物が、少なくとも5×1011のアデノウイルスベクターを含む、請求項91〜120のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
投与の経路が、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、腟内、鼻腔内、経口であるか、膀胱内注入によるか、又はスカリフィケーションによる、請求項91〜121のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
投与の経路が皮下投与である、請求項91〜121のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記対象が、以前にアデノウイルスベクターを投与されている、請求項91〜123のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記対象が、アデノウイルスベクターに対する既存の免疫を有すると決定される、請求項91〜124のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
治療有効量の前記組成物の前記投与が、1回用量当たり1×109〜5×1012のウイルス粒子を含む、請求項51〜125のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
治療有効量の前記組成物の前記投与が、1回用量当たり少なくとも1×1011のウイルス粒子を含む、請求項51〜126のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
治療有効量の前記組成物の前記投与が、1回用量当たり少なくとも5×1011のウイルス粒子を含む、請求項51〜127のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
治療有効量の前記組成物の前記投与の後に、同じ組成物又は医薬組成物を含む1回以上のブースター免疫化が続く、請求項51〜128のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ブースター免疫化が、1、2又は3カ月毎に施される、請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ブースター免疫化が、3回以上反復される、請求項129又は130に記載の方法。
【請求項１３２】
治療有効量の前記投与が、一次免疫化を1、2又は3週間毎に3回反復し、それに続いてブースター免疫化を1、2又は3カ月毎に3回以上反復することである、請求項51〜131のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる2016年6月3日出願の米国仮特許出願第62/345,592号の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、国立歯科頭蓋顔面研究所(National Institute of Dental and Craniofacial Research:NIDCR)によって授与されたSBIR助成金番号1R43DE021973-01、2R44DE021973-02及び3R44DE021973-03S1に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ワクチンは、有害な物質及び罹患細胞を認識及び破壊するように免疫系をトレーニングすることによって、身体が疾患と闘うのを助ける。ワクチンは、2つの型、予防ワクチン及び処置(治療)ワクチンへと大きくグループ分けできる。予防ワクチンは、特定の疾患の発症を予防するために健康な人に与えられ、一方、免疫療法とも呼ばれる処置ワクチンは、疾患が発達し広がるのを止める助けになるように、又は予防的手段として、疾患を有すると診断された人に与えられる。
【０００４】
ウイルスワクチンは、感染性疾患に対してワクチン接種するため、及び免疫療法によって感染性疾患誘導性癌を処置するために、現在開発されている。これらのウイルスワクチンは、宿主の細胞内の疾患と関連する遺伝子のうちごく一部の発現を誘導することによって機能し、これが次に、感染性因子を含む罹患細胞を同定及び破壊するように宿主の免疫系を増強する。このように、ウイルスワクチンの臨床応答は、高レベルの免疫原性を獲得し、持続性の長期発現を有するワクチンの能力に依存し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、複雑な疾患、例えば、癌、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患又はHPV誘導性癌に対する増強された治療応答のための新規組成物及び方法を見出すことは依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
種々の態様では、本開示は、a)配列番号8、配列番号9又は配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;b)配列番号12に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;c)配列番号2、配列番号3又は配列番号4に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;d)配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19又は配列番号7、配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;及びe)配列番号11又は配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列、のうち1つ以上を含む核酸配列を含む複製欠損ウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【０００７】
一部の態様では、このベクターは、配列番号8に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。他の態様では、このベクターは、配列番号9に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。なお他の態様では、このベクターは、配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０００８】
他の態様では、このベクターは、配列番号12に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。他の態様では、このベクターは、配列番号2に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。なお他の態様では、このベクターは、配列番号3に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。
【０００９】
なお他の態様では、このベクターは、配列番号4に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。一部の態様では、このベクターは、配列番号5に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。一部の態様では、このベクターは、配列番号18に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。一部の態様では、このベクターは、配列番号6に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。他の態様では、このベクターは、配列番号19に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。
【００１０】
一部の態様では、このベクターは、配列番号7に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。他の態様では、このベクターは、配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。一部の態様では、このベクターは、配列番号11に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。一部の態様では、このベクターは、配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。
【００１１】
一部の態様では、このベクターは、アデノウイルスベクターである。さらなる態様では、このベクターは、E1領域、E2b領域、E3領域、E4領域又はそれらの組合せ中において、欠失を含む。さらなる態様では、このベクターは、E2b領域中に欠失を含む。なおさらなる態様では、このベクターは、E1領域、E2b領域及びE3領域中に欠失を含む。
【００１２】
一部の態様では、この組成物又はベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様では、この共刺激分子は、B7、ICAM-1、LFA-3、又はそれらの組合せを含む。さらなる態様では、この共刺激分子は、B7、ICAM-1及びLFA-3の組合せを含む。一部の態様では、この組成物は、同じ複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。一部の態様では、この組成物は、別々の複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。一部の態様では、この組成物は、少なくとも5×1011の複製欠損ウイルスベクターを含む。
【００１３】
一部の態様では、この組成物は、HPV E6及びHPV E7を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、この組成物は、E2b領域中の欠失、及びHPV E6をコードする核酸配列を含む、第1の複製欠損アデノウイルスベクター;並びにE2b領域中の欠失、及びHPV E7をコードする核酸配列を含む、第2の複製欠損アデノウイルスベクターを含む。一部の態様では、この複製欠損ウイルスベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。さらなる態様では、この選択マーカーは、lacZタンパク質、チミジンキナーゼ、gpt、GUS若しくはワクシニアK1L宿主範囲タンパク質、又はそれらの組合せである。一部の態様では、改変型HPV抗原は、改変型HPV E6抗原及び改変型HPV E7抗原の組合せである。
【００１４】
さらなる態様では、この改変型HPV抗原は、非発癌性HPV抗原である。なおさらなる態様では、この改変型HPV抗原は、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、又はそれらの組合せに結合する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、又はそれらの組合せの23〜496位及び502〜795位に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7又は配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を有する。一部の態様では、核酸配列は、配列番号11又は配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を有する。
【００１５】
一部の態様では、この複製欠損ウイルスは、1つ以上のさらなる標的抗原又はその免疫学的エピトープをコードする核酸配列をさらに含む。さらなる態様では、この1つ以上のさらなる標的抗原は、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生生物抗原、寄生生物抗原、マイトジェン、又はそれらの組合せである。一部の態様では、この1つ以上のさらなる標的抗原は、CEA、葉酸受容体アルファ、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSCA、PSMA、PAP、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、Her2/neu、BRCA1、ブラキュリ(Brachyury)、ブラキュリ(TIVS7-2、多型)、ブラキュリ(IVS7 T/C多型)、Tブラキュリ、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、Her2/neu、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、若しくはTEL/AML1、若しくは改変型バリアント、スプライスバリアント、機能的エピトープ、エピトープアゴニスト、又はそれらの組合せである。
【００１６】
一部の態様では、この1つ以上のさらなる標的抗原は、CEA、ブラキュリ及びMUC1である。さらなる態様では、CEAは、配列番号22、配列番号24、又は配列番号25の1057〜3165位に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である配列を含む。一部の態様では、MUC1-cは、配列番号26又は配列番号27に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である配列を含む。一部の態様では、ブラキュリは、配列番号28に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である配列を含む。
【００１７】
一部の態様では、この組成物は、少なくとも1×109のウイルス粒子〜少なくとも5×1012のウイルス粒子を含む。一部の態様では、この組成物は、少なくとも1×1011のウイルス粒子を含む。他の態様では、この組成物は、少なくとも5×1011のウイルス粒子を含む。一部の態様では、この複製欠損ウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む。
【００１８】
種々の態様では、本開示は、上記組成物のいずれか1つ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
種々の態様では、本開示は、上記組成物のいずれか1つを含む宿主細胞を提供する。
【００２０】
種々の態様では、本開示は、腫瘍ワクチンを調製する方法であって、上記任意の医薬組成物を調製するステップ又は上記任意の組成物を調製するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
種々の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてHPV特異的免疫応答を増強する方法であって、治療有効量の上記任意の組成物又は上記任意の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
種々の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてHPV誘導性癌を予防又は処置する方法であって、治療有効量の上記任意の組成物又は上記任意の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、前記投与は、対象においてHPV E6又はHPV E7発現細胞を排除する。一部の態様では、この方法は、前記投与の前にHPV陽性であると決定された対象においてHPV誘導性癌を予防する方法である。一部の態様では、この対象は、HPV16型又はHPV18型癌遺伝子の発現について陽性である。
【００２３】
さらなる態様では、この方法は、アジュバントを投与するステップをさらに含み、このアジュバントは、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、Merckアジュバント65、AS-2、水酸化アルミニウムゲル(alum)、リン酸アルミニウム、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩、アシル化チロシン、アシル化糖、カチオン性又はアニオン性誘導体化多糖、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドA、quil A、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23又はIL-32を含む。一部の態様では、この対象は、HPV陽性であるか、又はHPV E6若しくはHPV E7を発現する。一部の態様では、この方法は、免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、この免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、又はCD244を標的化する。
【００２４】
さらなる態様では、この免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1又はPDL1を標的化する。一部の態様では、この免疫チェックポイント阻害剤は、抗PD-1又は抗PDL1抗体である。一部の態様では、この免疫チェックポイント阻害剤は抗PDL1抗体である。さらなる態様では、この免疫チェックポイント阻害剤はアベルマブである。一部の態様では、この方法は、それを必要とする対象においてHPV感染症、HPV誘導性癌又はHPV関連疾患を処置するステップをさらに含む。一部の態様では、この対象は、HPV感染症、HPV誘導性癌又はHPV関連疾患を有する。一部の態様では、このHPV誘導性癌は、HPV誘導性の頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、口腔咽頭・扁桃癌、腟癌、陰茎癌、外陰癌、肛門癌又は子宮頸癌である。一部の態様では、この対象は、子宮頸部、腟、外陰部、頭/頸部、肛門又は陰茎のHPV陽性扁平上皮癌を有する。
【００２５】
一部の態様では、この対象は、Ad5に対する既存の免疫を有する。一部の態様では、治療有効量の組成物の投与は、3週間毎に反復される。一部の態様では、この医薬組成物は、少なくとも5×1011のアデノウイルスベクターを含む。さらなる態様では、この方法は、化学療法、放射線、又はそれらの組合せを対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、投与の経路は、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、腟内、鼻腔内、経口であるか、膀胱内注入によるか、又はスカリフィケーション(scarification)による。一部の態様では、この対象は、前記投与の後に、増強された免疫応答を有し、この免疫応答は、細胞性又は体液性応答である。一部の態様では、この対象は、増強された免疫応答を有し、この増強は、B細胞増殖、CD4+T細胞増殖、CD8+T細胞増殖、又はそれらの組合せの増強である。
【００２６】
一部の態様では、この対象は、増強された免疫応答を有し、この増強は、IL-2産生、IFN-γ産生、又はそれらの組合せの増強である。さらなる態様では、この対象は、増強された免疫応答を有し、この増強は、抗原提示細胞の増殖、機能、又はそれらの組合せの増強である。一部の態様では、この対象は、以前にアデノウイルスベクターが投与されている。一部の態様では、この対象は、アデノウイルスベクターに対する既存の免疫を有すると決定される。
【００２７】
さらなる態様では、この方法は、操作されたナチュラルキラー(NK)細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、この操作されたNK細胞は、KIR(キラー阻害受容体)の発現を本質的に欠くように改変された1つ以上のNK細胞、高親和性CD16バリアントを発現するように改変された1つ以上のNK細胞、及び1つ以上のCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変された1つ以上のNK細胞、又はそれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、この操作されたNK細胞は、KIRの発現を本質的に欠くように改変された1つ以上のNK細胞を含む。他の態様では、この操作されたNK細胞は、高親和性CD16バリアントを発現するように改変された1つ以上のNK細胞を含む。なお他の態様では、この操作されたNK細胞は、1つ以上のCARを発現するように改変された1つ以上のNK細胞を含む。
【００２８】
一部の態様では、このCARは、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、PSMA、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her4、BRCA1、ブラキュリ、ブラキュリ(TIVS7-2、多型)、ブラキュリ(IVS7 T/C多型)、Tブラキュリ、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はそれらの任意の組合せに対するCARである。
【００２９】
一部の態様では、このアデノウイルスベクターは複製欠損である。一部の態様では、この複製欠損アデノウイルスベクターは細胞中に含まれる。さらなる態様では、この細胞は樹状細胞(DC)である。一部の態様では、この方法は、治療有効量のIL-15又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む。一部の態様では、この方法は、治療有効量のIL-15スーパーアゴニスト又はIL-15スーパーアゴニストをコードする核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む。さらなる態様では、このIL-15スーパーアゴニストはALT-803である。
【００３０】
種々の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてHPV発現細胞を低減させる方法であって、改変型HPV E6、改変型HPV E7抗原、又はそれらの組合せをコードする核酸配列を含む複製欠損ウイルスベクターを含む組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、この核酸配列は、改変型HPV E6及び改変型HPV E7をコードする。一部の態様では、この複製欠損ウイルスベクターは、a)配列番号8、配列番号9若しくは配列番号10に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;b)配列番号12に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;c)配列番号2、配列番号3若しくは配列番号4に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;d)配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7、配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;e)配列番号11若しくは配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を有する核酸配列;f)配列番号13に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;g)配列番号14に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列;又はh)配列番号15に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域を含む核酸配列を含む。
【００３１】
一部の態様では、前記投与は、対象においてHPV E6又はHPV E7発現細胞を排除する。一部の態様では、この方法は、前記投与の前にHPV陽性であると決定された対象においてHPV誘導性癌を予防するステップをさらに含む。一部の態様では、このベクターは、アデノウイルスベクターである。さらなる態様では、このベクターは、E1領域、E2b領域、E3領域、E4領域、又はそれらの組合せ中に、欠失を含む。なおさらなる態様では、このベクターは、E2b領域中に欠失を含む。なおさらなる態様では、このベクターは、E1領域、E2b領域及びE3領域中に欠失を含む。
【００３２】
一部の態様では、この組成物又はベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様では、この共刺激分子は、B7、ICAM-1、LFA-3、又はそれらの組合せを含む。さらなる態様では、この共刺激分子は、B7、ICAM-1及びLFA-3の組合せを含む。なおさらなる態様では、この組成物は、同じ複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。一部の態様では、この組成物は、別々の複製欠損ウイルスベクター中に位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。一部の態様では、この組成物は、少なくとも5×1011の複製欠損ウイルスベクターを含む。
【００３３】
一部の態様では、この組成物は、HPV E6及びHPV E7を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、この組成物は、E2b領域中の欠失、及びHPV E6をコードする核酸配列を含む、第1の複製欠損アデノウイルスベクター;並びにE2b領域中の欠失、及びHPV E7をコードする核酸配列を含む、第2の複製欠損アデノウイルスベクターを含む。一部の態様では、この複製欠損ウイルスベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。
【００３４】
さらなる態様では、この選択マーカーは、lacZタンパク質、チミジンキナーゼ、gpt、GUS若しくはワクシニアK1L宿主範囲タンパク質、又はそれらの組合せである。一部の態様では、この改変型HPV E6又はHPV E7抗原は、非発癌性HPV抗原である。一部の態様では、この改変型HPV E6又はHPV E7抗原は、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、又はそれらの組合せに結合する。さらなる態様では、核酸配列は、配列番号2、配列番号3、配列番号4の23〜496位及び502〜795位に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%若しくは少なくとも99%同一である領域、又はそれらの組合せを含む。
【００３５】
他の態様では、核酸配列は、配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7又は配列番号20に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を含む。他の態様では、核酸配列は、配列番号11又は配列番号21に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%の同一性を含む。一部の態様では、この対象は、HPV16型又はHPV18型癌遺伝子の発現について陽性である。一部の態様では、この対象は、HPV陽性であるか、又はHPV E6若しくはHPV E7を発現すると決定される。一部の態様では、この対象は、HPV感染症を有する。
【００３６】
一部の態様では、この対象は、口腔洗浄又はパップスメアによってHPV感染症を有すると決定されている。一部の態様では、この対象は、Ad5に対する既存の免疫を有する。一部の態様では、前記投与は、3週間毎に反復される。一部の態様では、この組成物は、少なくとも5×1011のアデノウイルスベクターを含む。一部の態様では、投与の経路は、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、腟内、鼻腔内、経口であるか、膀胱内注入によるか、又はスカリフィケーションによる。
【００３７】
一部の態様では、投与の経路は皮下投与である。一部の態様では、この対象は、以前にアデノウイルスベクターが投与されている。一部の態様では、この対象は、アデノウイルスベクターに対する既存の免疫を有すると決定される。一部の態様では、治療有効量の組成物を投与するステップは、1回用量当たり1×109〜5×1012のウイルス粒子を含む。さらなる態様では、治療有効量の組成物を投与するステップは、1回用量当たり少なくとも1×1011のウイルス粒子を含む。なおさらなる態様では、治療有効量の組成物を投与するステップは、1回用量当たり少なくとも5×1011のウイルス粒子を含む。
【００３８】
一部の態様では、治療有効量の組成物の投与に、同じ組成物又は医薬組成物を含む1回以上のブースター免疫化が続く。さらなる態様では、このブースター免疫化は、1、2又は3カ月毎に投与される。一部の態様では、このブースター免疫化は、3回以上反復される。一部の態様では、治療有効量の投与は、一次免疫化を1、2又は3週間毎に3回反復し、それに続いてブースター免疫化を1、2又は3カ月毎に3回以上反復することである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】図1Aは、0日目に2×105の触知不能なHPV E6/E7 TC-1腫瘍細胞を移植し、1、8及び15日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-ヌルウイルス粒子(VP)又は1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VPを投与したC57BL/6マウス(n=5匹/群)の免疫療法からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、体積を、式V=(腫瘍幅2×腫瘍長さ)/2に従って計算した。有意性の分析を、対応のないt検定を使用して実験群とベクター対照群との間で実施した。有意性は、*(p<0.05)及び**(p<0.01)によって示される。
【図１Ｂ】図1Bは、プロットし、マンテル・コックス検定を使用して比較した、図1Aに記載されるマウスの生存曲線を例示する。有意性は、**(p<0.01)によって示される。
【図２Ａ】図2Aは、0日目に2×105の小さい触知可能なHPV E6/E7 TC-1腫瘍細胞を移植し、6、13及び20日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-ヌルVP又は1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VPを投与したC57BL/6マウス(n=4匹/群)の免疫療法からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、体積を、式V=(腫瘍幅2×腫瘍長さ)/2に従って計算した。有意性の分析を、対応のないt検定を使用して実験群とベクター対照群との間で実施した。有意性は、**(p<0.01)によって示される。
【図２Ｂ】図2Bは、プロットし、マンテル・コックス検定を使用して比較した、図2Aに記載されるマウスの生存曲線を例示する。有意性は、**(p<0.01)によって示される。
【図３Ａ】図3Aは、0日目に2×105の大きい樹立されたHPV E6/E7 TC-1腫瘍細胞を移植し、13、20及び27日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-ヌルVP又は1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VPを投与したC57BL/6マウス(n=4匹/群)の免疫療法からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、体積を、式V=(腫瘍幅2×腫瘍長さ)/2に従って計算した。有意性の分析を、対応のないt検定を使用して実験群とベクター対照群との間で実施した。有意性は、**(p<0.01)によって示される。
【図３Ｂ】図3Bは、プロットし、マンテル・コックス検定を使用して比較した、図3Aに記載されるマウスの生存曲線を例示する。有意性は、**(p<0.01)によって示される。
【図４Ａ】図4Aは、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞を接種し、10、17及び24日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-ヌルVP+100μgのアイソタイプ対照ラットIgG抗体による処置を投与したC57BL/6マウス(n=7匹/群)からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、体積を、式V=(腫瘍幅2×長さ)/2に従って計算した。腫瘍成長動態は、各群中の個々のマウスを示す。
【図４Ｂ】図4Bは、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞を接種し、10、17及び24日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-ヌルVP+100μgの抗PD-1抗体による処置を投与したC57BL/6マウス(n=7匹/群)からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。
【図４Ｃ】図4Cは、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞を接種し、10、17及び24日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VP+100μgのアイソタイプ対照ラットIgG抗体による処置を投与したC57BL/6マウス(n=7匹/群)からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。
【図４Ｄ】図4Dは、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞を接種し、10、17及び24日目に1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VP+100μgの抗PD-1抗体による処置を投与したC57BL/6マウス(n=7匹/群)からの腫瘍サイズにおける変化を例示する。
【図５】図5は、図4A〜Dと同様に処置したC57BL/6マウス(n=7匹/群)の生存曲線を例示する。実験は、腫瘍移植後52日目に終了した。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7及び対照抗体で処置したマウスは、両方の群の対照マウス(Ad5[E1-,E2b-]-ヌル及び対照抗体、又はAd5[E1-,E2b-]-ヌル及び抗PD-1抗体)と比較して、有意に(p<0.008)より長い生存を示した。7匹のうち2匹(29%)のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7及び対照抗体処置マウスは、52日目の時点で生き続けた。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+抗PD-1抗体で処置したマウスは、両方の群の対照と比較して、有意に(p<0.0006)より長い生存を示した。7匹のうち4匹(57%)のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7+抗PD-1抗体処置マウスは、52日目の時点で生き続けた。
【図６】図6Aは、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7がTC-1腫瘍中へのCD8+腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の動員を促進することを示す。C57BL/6マウス(n=5匹/群)に、2×105のTC-1腫瘍細胞を移植した。移植の12日後、マウスは、Ad5[E1-,E2b-]-ヌルの空のベクター+対照IgG、Ad5[E1-,E2b-]-ヌル+抗PD-1抗体、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+対照IgG、又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7+抗PD-1抗体による処置を開始した。ワクチンを、毎週皮下投与し、抗PD-1抗体を、3〜4日毎に頭頂間注射により投与し、腫瘍を27日目に分析した。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置は、Treg/CD8+TILの比率を有意に減少させる。有意性の分析を、対応のないt検定を使用して実施した。有意性は、ns(p>0.05)、*(p<0.05)、**(p<0.01)、***(p<0.001)又は****(p<0.0001)によって示される。図6Bは、図6AのTreg/CD8+TILの比率における低減が、Tregの数における低減によって引き起こされないことを示す。図6Cは、図6AのTreg/CD8+TILの比率における低減が、CD8+TILの数における増加を介して引き起こされることを示す。
【図７】図7Aは、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+抗PD-1抗体の組合せ治療が、炎症促進性腫瘍微小環境を促進することを示す。C57BL/6マウス(n=5匹/群)に腫瘍移植し、処置し、腫瘍を、図6A〜Cと同様に分析した。PD-1+CD4+及びCD8+TILの頻度は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7で処置したマウス由来の腫瘍において増加する。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7及び抗PD-1抗体の組合せで処置したマウス由来の腫瘍は、有意に低い頻度のPD-1+CD4+及びCD8+TIL(A)、LAG-3+CD8+TIL(B)、並びに(C)を有する。有意性の分析を、対応のないt検定を使用して実施した。有意性は、ns(p>0.05)、*(p<0.05)、**(p<0.01)又は***(p<0.001)によって示される。図7Bは、図7Aと同様のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7及び抗PD-1抗体の組合せで処置したマウス由来の腫瘍が、有意に低い頻度のLAG-3+CD8+TILを有することを示し、これらのレベルを対照マウス由来の腫瘍とより一致したものにしている。図7Cは、図7Aと同様のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7及び抗PD-1抗体の組合せで処置したマウス由来の腫瘍が、有意に低減された発現レベルのPDL1を有することを示す。
【図８】図8は、1×108、1×109又は1×1010の用量のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VPで14日間隔で3回免疫化し、最終免疫化の14日後に評価したC57BL/6マウス(n=5匹/群)由来の脾細胞のELISpotによって測定される、細胞性免疫(CMI)用量応答を例示する。CMIの最大の誘導は、1×1010VPの用量で達成された。陽性対照脾細胞を、Con Aに曝露させた。
【図９Ａ】図9Aは、1×1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VPで2週間間隔で3回免疫化したC57BL/6マウス(n=5匹/群)の免疫化後のCD8-α+/IFN-γ+脾細胞の活性化を例示する。対照は、1×1010のAd5[E1-,E2b-]-ヌルVPを投与された。最終免疫化の14日後に収集した脾細胞を、フローサイトメトリーによって評価した。陽性対照として、脾細胞を、PMA/イオノマイシンに曝露させた。
【図９Ｂ】図9Bは、図9Aに記載したマウスの免疫化後のCD8-α+/IFN-γ+/TNF-α+脾細胞の活性化を例示する。
【図１０】図10は、HPV-E6/E7発現TC-1腫瘍細胞を移植し(0日目)、10、17及び24日目に1×1010のAd5-ヌルVP+100μgの対照IgG抗体(腹腔内)、1×1010のAd5-ヌルVP+100μgの抗PD-1抗体、1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VP+100μgのマウスIgG抗体又は1×1010のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7 VP+100μgの抗PD-1抗体による免疫療法によって処置したC57Bl/6マウス(n=7匹/群)におけるHPV免疫療法の効果を例示する。抗PD-1による又は抗PD-1によらない免疫療法は、23日目までに、腫瘍成長の有意な阻害を生じた(p<0.05)。全ての対照マウスは、腫瘍量のため、23日目までに終了させた。
【図１１】図11は、フローサイトメトリーによって評価したCMI応答を例示する。C57BL/6マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7で2週間間隔で3回免疫化した。最終免疫化の2週間後、CD8α+脾細胞を、抗原特異的ペプチドプールによる6時間の刺激後のIFNγの細胞内発現についてアッセイした。平均+/-標準偏差をプロットする。
【図１２】図12は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による小さい樹立されたHPV E6/E7発現腫瘍の免疫療法の結果を例示する。C57BL/6マウスに、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞を移植し、矢印によって示されるように、6、13及び20日目に、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(ベクター対照)又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7を投与した。(A)腫瘍サイズを決定し、体積を、式V=(腫瘍幅2×腫瘍長さ)/2に従って計算した。23日目に、ベクター対照群のマウスを安楽死させた。有意性の分析は、この23日の時点の後には実施できなかった。これは破線で示される。有意性の分析を、対応のないt検定を使用して実験群とベクター対照群との間で実施した。有意性は、**(p<0.01)によって示される。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図１３】図13は、樹立されたHPV16-E6Δ/E7Δ発現腫瘍の、化学療法/放射線処置(CRT)と組み合わせた免疫療法を示す。樹立されたHPV16-E6Δ/E7Δ発現腫瘍を、13、20及び27日目のシスプラチン/放射線処置と組み合わせた、7、14及び21日目のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δで処置した。対照腫瘍保有マウスを、シスプラチン/放射線処置と組み合わせたAd-ヌルによる注射によって処置した。
【図１４】図14は、CMI応答に対するCRTの効果を示す。非腫瘍保有マウスを、図4に上記したように処置した。最後の処置の2週間後、マウスを、IFN-γ分泌脾細胞についてELISpotアッセイによって決定されるように、CMI活性について評価した。組合せ治療(Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ+CRT)で処置したマウスにおける増加したCMI応答に留意されたい。
【図１５】図15は、口腔リンス又はパップスメアサンプルによってHPV-16陽性である健康な個体におけるAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの第I/Ib相試験の処置概要を例示する。
【図１６】図16は、HPV-16陽性扁平上皮癌を有する個体におけるAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの第I相試験の研究設計及び処置概要を例示する。
【図１７】図17は、HPV-16陽性扁平上皮癌を有する個体におけるAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの第I相試験の処置及び相関性バイオマーカー概要を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下の節は、ある特定の実施形態の異なる態様をより詳細に記載する。各態様は、明確に逆を示さない限り、任意の他の態様(単数又は複数)と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される特徴の任意の他の特徴と組み合わせてもよい。
【００４１】
特記しない限り、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。種々の態様は、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は、単に簡便さ及び簡潔さのためであることが理解されるべきであり、本発明の範囲に対する融通のきかない限定と解釈すべきではない。従って、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲並びにその範囲内の個々の数値を、明示的に書き出されたかのように具体的に開示したとするべきである。例えば、範囲の記載、例えば、1〜6は、サブ範囲、例えば、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、並びにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、3、4、5及び6を具体的に開示したとするべきである。これは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。範囲が存在する場合、それらの範囲は、範囲の端点値を含む。
【００４２】
本明細書で使用する場合、特記しない限り、冠詞「1つの(a)」は、明示的に他が提供されない限り、1つ以上を意味する。本明細書で使用する場合、特記しない限り、用語、例えば、「含む(contain)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(including)」などは、「含む(comprising)」を意味する。本明細書で使用する場合、特記しない限り、用語「又は」は、接続語又は離接語であり得る。本明細書で使用する場合、特記しない限り、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００４３】
I.アデノウイルスベクター構築物
「アデノウイルス」(Ad)とは、アデノウイルス科の非エンベロープDNAウイルスを指す。これらのウイルスは、ヒト、トリ、ウシ、ブタ及びイヌ種中で見出すことができるがこれらに限定されない。一部の実施形態は、E2b欠失型ウイルスベクター、又は本明細書に記載される他の欠失を含むベクターの基礎として、アデノウイルス科の4つの属(例えば、トリアデノウイルス、マストアデノウイルス、アタデノウイルス及びシアデノウイルス)のいずれか由来の任意のAdの使用を企図する。さらに、いくつかの血清型が、それぞれの種において見出される。Adは、遺伝子変異、欠失又は転位を含むがこれらに限定されない、これらのウイルス血清型のいずれかの遺伝的誘導体にも関する。
【００４４】
「第一世代アデノウイルス」とは、初期領域1(E1)を欠失したAdを指す。さらなる例では、初期領域3(E3)もまた欠失し得る。
【００４５】
「第二世代アデノウイルス」とは、E1、E2、E3の全て又は一部を有し、ある特定の実施形態では、E4 DNA遺伝子配列をウイルスから欠失(除去)したAdを指す。
【００４６】
「E2b欠失型」とは、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を妨げるような方法で変異したDNA配列を指す。従って、ある特定の実施形態では、「E2b欠失型」は、Adゲノムから欠失(除去)した特定のDNA配列に関して使用される。E2b欠失型又は「E2b領域内の欠失を含む」とは、AdゲノムのE2b領域内の少なくとも1つの塩基対の欠失を指す。従って、ある特定の実施形態では、1つよりも多い塩基対が欠失し、さらなる実施形態では、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140又は150塩基対が欠失する。別の実施形態では、欠失は、AdゲノムのE2b領域内の150、160、170、180、190、200、250又は300塩基対よりも多くの欠失である。E2b欠失は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を妨げる欠失であり得、従って、E2b特異的タンパク質のコード部分のエクソン内の欠失、並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態では、E2b欠失は、E2b領域のDNAポリメラーゼ及びプレターミナル(preterminal)タンパク質の一方又は両方の発現及び/又は機能を防げる欠失である。さらなる実施形態では、「E2b欠失型」とは、1つ以上のコードされたタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列中の1つ以上の点変異を指す。そのような変異には、異なる残基で置き換えられて、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列中の変化をもたらす残基が含まれる。
【００４７】
「E1欠失型」とは、少なくとも1つのE1遺伝子産物の発現及び/又は機能を防げるような方法で変異したDNA配列を指す。従って、ある特定の実施形態では、「E1欠失型」は、Adゲノムから欠失(除去)した特定のDNA配列に関して使用される。E1欠失型又は「E1領域内の欠失を含む」とは、AdゲノムのE1領域内の少なくとも1つの塩基対の欠失を指す。従って、ある特定の実施形態では、1つよりも多い塩基対が欠失し、さらなる実施形態では、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140又は150塩基対が欠失する。別の実施形態では、この欠失は、AdゲノムのE1領域内の150、160、170、180、190、200、250又は300塩基対よりも多くの欠失である。E1欠失は、少なくとも1つのE1遺伝子産物の発現及び/又は機能を防げる欠失であり得、従って、E1特異的タンパク質のコード部分のエクソン内の欠失、並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態では、E1欠失は、E1領域のトランス作用性転写調節因子の一方又は両方の発現及び/又は機能を防げる欠失である。さらなる実施形態では、「E1欠失型」とは、1つ以上のコードされたタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列中の1つ以上の点変異を指す。そのような変異には、異なる残基で置き換えられて、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列中の変化をもたらす残基が含まれる。
【００４８】
第一世代アデノウイルスベクターと比較して、ある特定の実施形態は、DNAポリメラーゼ遺伝子(pol)中の欠失及びプレターミナルタンパク質(pTP)の欠失を含む第二世代E2b欠失型アデノウイルスベクターを提供する。E2b欠失型ベクターは、第一世代アデノウイルスベクターの5〜6kbの容量と比較して、最大で13kbの遺伝子運搬容量を有し、種々の標的抗原のいずれかをコードする核酸配列のためのスペースを容易に提供する。E2b欠失型アデノウイルスベクターは、第一世代アデノウイルスベクターと比較して有害反応の低減もまた有する。
【００４９】
「標的抗原」又は「標的タンパク質」とは、免疫応答が指向される分子、例えば、タンパク質を指す。
【００５０】
野生型Adに対する自然免疫応答は複雑であり、アデノウイルスベクターから発現されたAdタンパク質は、重要な役割を果たすようである。具体的には、E2b欠失型ベクター中のプレターミナルタンパク質及びDNAポリメラーゼの欠失は、注射後最初の24〜72時間の間炎症を低減させるようであるが、第一世代アデノウイルスベクターは、この期間の間、炎症を刺激する。さらに、E2b欠失によって生み出されたさらなる複製遮断は、E1、E3欠失単独によって得られるものを十分に超えて、Ad後期遺伝子の発現の10,000分の1の低減もまたもたらすことが報告されている。E2b欠失型アデノウイルスベクターによって産生されるAdタンパク質のレベルの減少は、Ad抗原に対する競合的な望ましくない免疫応答の可能性を効率的に低減させるが、この応答は、Adに免疫化された又は曝露された対象におけるこのプラットフォームの反復使用を防げる。第二世代E2b欠失型ベクターによる炎症応答の誘導の低減は、第一世代アデノウイルスベクターを用いた同一の試みと比較して、抗原提示細胞(即ち、樹状細胞)の感染の間、ベクターが望ましいワクチン抗原を発現する可能性の増加を生じ、抗原競合の可能性を減少させ、望ましい抗原に対するワクチンのより顕著な免疫化を生じる。E2b欠失型アデノウイルスベクターは、第一世代アデノウイルスベクターを使用した以前に記載されたワクチン候補よりも安全で有効かつ多用途の、改善されたAdベースのワクチン候補を提供する。
【００５１】
従って、第一世代E1欠失型アデノウイルスサブタイプ5(Ad5)ベースのベクターは、癌ワクチンとしての使用のための有望なプラットフォームではあるが、天然に存在する又は誘導されたAd特異的中和抗体によって、活性が妨害される。理論に束縛されないが、例えば、後期ウイルスタンパク質発現低下のおかげで、E1領域及びE2b領域(後者はDNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質をコードする)の欠失を有するAd5ベースのベクター(Ad5[E1-,E2b-])は、後期ウイルスタンパク質発現低下のおかげで、Ad免疫宿主において、免疫学的クリアランスを回避し、コードされた腫瘍抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答を誘導し得る。
【００５２】
一部の実施形態は、標的抗原、特に、感染性疾患又は増殖性細胞疾患、例えば癌に付随又は関連する抗原に対する免疫応答を生成する方法及び組成物(例えば、ウイルスベクター)に関する。一部の実施形態は、対象において、標的抗原、特に、細胞増殖疾患、例えば癌と関連する抗原に対する免疫応答を生成する方法及び組成物に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法は、対象において、標的抗原、又は少なくとも1つの標的抗原を含む標的抗原シグネチャーを発現及び/又は提示する細胞に対する免疫応答を生成することに関する。一部の実施形態は、PD-1チェックポイント遮断と組み合わせて、HPV遺伝子E6、HPV遺伝子E7、又はそれらの組合せに対して免疫化するためにウイルス遺伝子送達プラットフォームを使用する、ヒトパピローマウイルス(HPV)に対する免疫療法のための組成物及び方法を提供する。ある特定の実施形態では、これらの組成物及び方法は、免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせてAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7ワクチンを利用する。Ad5[E1-,E2b-]-E6とは、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6を指すことができ、又は逆もまた同様である。Ad5[E1-,E2b-]-E7とは、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7を指すことができ、又は逆もまた同様である。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7とは、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7を指すことができ、又は逆もまた同様である。
【００５３】
一般に、アデノウイルスは、広いトロピズムを有し得、種々の分裂及び非分裂細胞型に感染でき、哺乳動物の身体において、全身的に及びより選択的な粘膜表面を介して使用できるので、臨床的使用にとって魅力的である。さらに、それらが比較的熱安定性であることは、それらの臨床的使用をさらに促進する。アデノウイルスは、線状二本鎖ゲノムを含む正二十面体の非エンベロープカプシドを特徴とするDNAウイルスの科である。一般に、アデノウイルスは、サイズが約30〜35キロ塩基と近似される二本鎖DNAゲノムを含む非エンベロープウイルスとして見出される。ヒトAdのうち、いずれかの新生物疾患と関連するものは存在せず、免疫適格性の対象において比較的軽度の自然治癒性の病気を引き起こすに過ぎない。一部の実施形態では、感染の際に、本明細書に記載されるアデノウイルスベクター中のAdゲノム又は遺伝子は、宿主遺伝子中に組み込まれず、染色体外で処理される。
【００５４】
ウイルスによって発現される第1の遺伝子は、E1遺伝子であり、これは、野生型ゲノム中に存在する他のAd5遺伝子プロモーターからの高レベルの遺伝子発現を開始するように作用する。ウイルスDNA複製及び子孫ビリオンのアセンブリは、感染細胞の核内で生じ、生活環全体は、細胞1つ当たりおよそ104のビリオンのアウトプットを伴って、約36時間かかる。野生型Ad5ゲノムは、およそ36kbであり、それらがDNA複製の前又は後のいずれに発現されるかに依存して、初期及び後期ウイルス機能へと分割される遺伝子をコードする。Ad5に以前に感染した細胞の重複感染は、それが自身のゲノムを複製した後まで、重複感染性ウイルスからの後期遺伝子発現の欠如を生じることが実証されているので、初期/後期の描写は、ほぼ絶対的である。理論に束縛されないが、これは、存在する複製されたゲノムがカプセル封入されるまで、後期遺伝子の発現(主にAd5カプシドタンパク質)を防止する、Ad5主要後期プロモーター(MLP)の複製依存的シス活性化に起因する可能性が高い。本明細書に記載される組成物及び方法は、一部の実施形態では、後の世代のAdベクター/ワクチンの開発における特徴を利用する。アデノウイルスの線状ゲノムには、2つのDNA複製起点(ITR)が一般に隣接し、このゲノムは、RNAポリメラーゼII媒介性転写のための8つのユニットを有する。ゲノムは、5つの初期ユニットE1A、E1B、E2、E3、E4及びE5、ウイルス複製の開始後に遅延を伴って発現される2つのユニット(IX及びIVa2)、並びにL1〜L5へと下位分割される1つの後期ユニット(L)を保有する。一部のアデノウイルスは、ウイルス関連(VA)RNAと呼ばれる1種又は2種のRNAをさらにコードし得る。
【００５５】
ヒト対象において自然及び適応免疫応答を誘導するアデノウイルスが提供される。ウイルスゲノムの決定的な領域の欠失又は挿入によって、それらの予測性を増加させ、望まれない副作用を低減させるように操作された組換えベクターが提供される。一部の態様では、E1A、E1B、E2、E3、E4、E5、IX、IVa2、L1、L2、L3、L4及びL5、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択されるゲノム欠失又は挿入を含むアデノウイルスベクターが提供される。
【００５６】
ある特定の実施形態は、変更されたカプシドを含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。一般に、アデノウイルスのカプシドは、正二十面体の20個の三角形のファセットを主に含み、各正二十面体は、12コピーのヘキソントリマーを含む。さらに、他のいくつかのさらなるマイナーカプシドタンパク質、IIIa、VI、VIII及びIXもまた存在する。
【００５７】
ある特定の実施形態は、1つ以上の変更されたファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。一般に、これもまたトリマーを形成するファイバータンパク質は、12個の頂点において、ペンタマー性ペントンベース中に挿入される。ファイバーは、細いN末端テール、シャフト及びノブドメインから構成され得る。シャフトは、異なる数のβ-ストランドリピートを含み得る。ノブは、1つ以上のループA、B、C、D、E、F、G、H、I又はJを含み得る。ファイバーノブループは、細胞受容体に結合できる。ある特定の実施形態は、癌及び感染性疾患の処置のためのワクチンシステムにおいて使用されるアデノウイルスベクターを提供する。
【００５８】
本開示の方法及び組成物と共に使用され得る適切なアデノウイルスには、本明細書で提供されるヒトサブグループA、B1、B2、C、D、E及びF、又はそれらの決定的なゲノム領域を含む種特異的アデノウイルスが含まれるがこれらに限定されず、これらのサブグループは、免疫学的に別個の血清型へとさらに分類できる。さらに、本開示の方法及び組成物と共に使用され得る適切なアデノウイルスには、霊長類、ウシ、家禽、爬虫類又はカエルから同定された種特異的アデノウイルス又はそれらの決定的なゲノム領域が含まれるがこれらに限定されない。
【００５９】
一部のアデノウイルス血清型は、別個の臓器を優先的に標的化する。血清型、例えば、AdHu1、AdHu2及びAdHu5(亜属C)は一般に、上気道感染をもたらすが、亜属A及びFは、胃腸臓器をもたらす。ある特定の実施形態は、臓器特異的癌又は臓器特異的感染性疾患の処置のために別個の臓器を優先的に標的化する際に使用される組換えアデノウイルスベクターを提供する。一部の適用では、この組換えアデノウイルスベクターは、哺乳動物中の特定の臓器に対するトロピズムを低減させるように変更される。一部の適用では、この組換えアデノウイルスベクターは、哺乳動物中の特定の臓器に対するトロピズムを増加させるように変更される。
【００６０】
アデノウイルスのトロピズムは、宿主細胞受容体に結合するそれらの能力によって決定され得る。一部の例では、宿主細胞結合のプロセスには、ファイバーの遠位ノブドメインの、宿主細胞表面分子への最初の結合と、その後のペントンベース内のRGDモチーフとαVインテグリンとの結合とが関与し得る。ある特定の実施形態は、宿主の特定の細胞型に感染するように遺伝子操作できるように変更されたトロピズムを有する組換えアデノウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態は、細胞特異的癌又は細胞特異的感染性疾患の処置のための、変更されたトロピズムを有する組換えアデノウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態は、サブグループA、B、C、D若しくはF、又はそれらの組合せの1つ以上のアデノウイルス由来の変更されたファイバーノブ、或いはRGD配列の挿入を有する組換えアデノウイルスベクターを提供する。一部の適用では、変更されたファイバーノブを含む組換えアデノウイルスベクターは、1つ以上の特定の細胞型に対する低減されたトロピズムを有するベクターを生じる。一部の適用では、変更されたファイバーノブを含む組換えアデノウイルスベクターは、1つ以上の特定の細胞型に対する増強されたトロピズムを有するベクターを生じる。一部の適用では、変更されたファイバーノブを含む組換えアデノウイルスベクターは、低減された産物特異的B又はT細胞応答を有するベクターを生じる。一部の適用では、変更されたファイバーノブを含む組換えアデノウイルスベクターは、増強された産物特異的B又はT細胞応答を有するベクターを生じる。
【００６１】
ある特定の実施形態は、ウイルス中和抗体の効果を回避するため又は宿主細胞中への形質導入を改善するために、他の分子でコーティングされた組換えアデノウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態は、宿主細胞受容体へのベクターの結合を補助するアダプター分子でコーティングされた組換えアデノウイルスベクターを提供する。例として、アデノウイルスベクターは、コクサッキーAd受容体をCD40Lと接続するアダプター分子でコーティングされ得、樹状細胞の形質導入の増加を生じ、それによって、対象において免疫応答を増強する。他の標的細胞型への結合を増強するために同様に操作された他のアデノウイルスベクターもまた企図される。
【００６２】
第一世代、即ちE1欠失型アデノウイルスベクターAd5[E1-]は、導入遺伝子が遺伝子のE1領域のみを置き換えるように構築される。典型的には、野生型Ad5ゲノムの約90%が、ベクター中に保持される。Ad5[E1-]ベクターは、複製する能力が減少しており、Ad5 E1遺伝子を発現しない細胞の感染後に、感染性ウイルスを産生することができない。組換えAd5[E1-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターの複製及びパッケージングを可能にするヒト細胞(例えば、HEK 293細胞)において増殖される。Ad5 [E1-]ベクターは、いくつかの有益な性状を有する。最も重要なものの1つは、スケールアップ及びcGMP産生が比較的容易なことである。現在、220をはるかに超えるヒト臨床試験がAd5[E1-]ベクターを利用しており、2千人よりも多い対象が、sc(皮下)、im(筋肉内)又はiv(静脈内)でウイルスを与えられている。さらに、Ad5ベクターは組み込まれない。それらのゲノムはエピソーム性のままである。一般に、宿主ゲノム中に組み込まれないベクターについては、挿入変異誘発及び/又は生殖系列伝播のリスクは、あったとしても非常に低い。従来のAd5[E1-]ベクターは、7kbに達する運搬容量を有する。
【００６３】
後期ウイルスタンパク質発現低下のおかげで、E1、並びにDNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質をコードするE2b領域の欠失を伴うAd5ベースのベクター(Ad5[E1-,E2b-])は、Ad免疫宿主において、免疫学的クリアランスを回避する機会を提供し、コードされた腫瘍抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答を誘導する。新たなAd5プラットフォームは、E2b領域中にさらなる欠失を有して、DNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質遺伝子を除去する。Ad5[E1-,E2b-]プラットフォームは、多くの可能な遺伝子を含むことを可能にするのに十分な拡大されたクローニング容量を有する。Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターの7kb容量と比較して、最大で約12kbの遺伝子運搬容量を有し、必要に応じて複数の遺伝子のためのスペースを提供する。一部の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11kbよりも大きい挿入物が、Ad5ベクター、例えば、Ad5[E1-,E2b-]ベクター中に導入される。E2b領域の欠失は、有利な免疫特性をAd5ベクターに付与し、Adウイルスタンパク質に対する免疫応答を最小化しつつ、導入遺伝子抗原を標的化する強力な免疫応答をしばしば惹起する。
【００６４】
一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、野生型免疫原性ポリペプチド又はその断片に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%の同一性を有するポリペプチドをコードする改変型配列を含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、野生型ポリペプチドのサブユニットをコードする改変型配列を含む。これらの組成物及び方法は、一部の実施形態では、配列番号17に対して、少なくとも60%の配列同一性を含むアデノウイルス由来ベクターに関する。
【００６５】
一部の実施形態では、複製欠損アデノウイルスと任意選択で関連するアデノウイルス由来ベクターは、配列番号17又はオルタナティブなコドン置換によって配列番号17から生成された配列に対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.8%又は99.9%の同一性を有する配列を含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されるアデノウイルス由来ベクターは、E2b領域中、任意選択でE1領域中に欠失を有し、この欠失は、本明細書に記載される免疫療法におけるベクターの使用に種々の利点を付与する。
【００６６】
アデノウイルスゲノム内のある特定の領域は、重要な機能を果たし、複製欠損アデノウイルスベクターを構築する場合に実質的に保存される必要があり得る。これらの領域は、それらの全体が参照によって組み込まれるLauerら、J. Gen. Virol., 85, 2615-25 (2004)、Lezaら、J. Virol., p. 3003-13 (1988)及びMirallesら、J. Bio Chem., Vol. 264, No. 18, p. 10763-72 (1983)にさらに記載される。配列番号17の一部分、例えば、配列番号17の少なくとも約100、250、500、1000又はそれより多くの塩基を含む一部分に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.8%、99.9%又は100%の同一性値を有する配列を含む組換え核酸ベクターが、一部の実施形態で使用される。
【００６７】
ある特定の実施形態は、E2b欠失型アデノウイルスベクター、例えば、それらの全体が各々参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,063,622号、同第6,451,596号、同第6,057,158号、同第6,083,750号及び同第8,298,549号に記載されるベクターの使用を企図する。E2b領域中に欠失を有するベクターは、多くの場合、ウイルスタンパク質発現を無能にし、及び/又は複製コンピテントなAd(RCA)を生成する頻度を減少させる。これらのE2b欠失型アデノウイルスベクターの増殖は、欠失型E2b遺伝子産物を発現する細胞株を利用して実施できる。そのようなパッケージング細胞株、例えば、HEK-2p3細胞株に由来するE.C7(以前にはC-7と呼ばれた)は、本明細書で提供される。
【００６８】
さらに、E2b遺伝子産物であるDNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質は、E1遺伝子産物と一緒に、E.C7又は類似の細胞において構成的に発現され得る。Adゲノムから産生細胞株への遺伝子セグメントの移行は、即座の利益を有する:(1)増加した運搬容量;及び(2)RCAを生成するために2回以上の独立した組換え事象を典型的には必要とするRCA生成の可能性の減少。一部の実施形態において使用されるE1、Ad DNAポリメラーゼ及び/又はプレターミナルタンパク質発現細胞株は、混入するヘルパーウイルスを必要とせずに、13kbに達する運搬容量を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能にできる。さらに、ウイルス生活環に重要な遺伝子(例えば、E2b遺伝子)が欠失する場合、他のウイルス遺伝子タンパク質を複製又は発現するAdのさらなる無能化が生じる。これは、感染細胞の免疫認識を減少させ、外来導入遺伝子発現の持続時間を延長させることができる。
【００６９】
E1、DNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質欠失型ベクターは、E1及びE2b領域からそれぞれのタンパク質を発現することが通常できない。さらに、これらは、ウイルス構造タンパク質の大部分の発現の欠如を示し得る。例えば、Adの主要後期プロモーター(MLP)は、後期構造タンパク質L1〜L5の転写を担う。MLPは、Adゲノム複製の前には最小限に活性であるが、高度に毒性のAd後期遺伝子が、ウイルスゲノム複製が生じた後にのみ、MLPから主に転写及び翻訳される。後期遺伝子転写のこのシス依存的活性化は、一般に、例えば、ポリオーマ及びSV-40の増殖において、DNAウイルスの特徴である。DNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質は、Ad複製にとって重要である(E4又はタンパク質IXタンパク質とは異なって)。それらの欠失は、アデノウイルスベクター後期遺伝子発現、及びAPCなどの細胞におけるその発現の毒性効果にとって、非常に有害であり得る。
【００７０】
これらのアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域中に欠失を含み、任意選択でE1領域中に欠失を含み得る。一部の場合には、そのようなベクターは、Adゲノムの任意の他の領域が欠失していない。これらのアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域中に欠失を含み、E1及びE3領域中に欠失を含み得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の領域が欠失していない。これらのアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域中に欠失を含み、E1、E3中に欠失を含み、E4領域の部分的又は完全な除去を含み得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。これらのアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域中に欠失を含み、E1及び/又はE4領域中に欠失を含み得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を含まない。これらのアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2a、E2b及び/又はE4領域中に欠失を含み得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を含まない。これらのアデノウイルスベクターは、E1、及び/又はE2b領域の欠失したDNAポリメラーゼ機能を有し得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。これらのアデノウイルスベクターは、E1、及び/又はE2b領域の欠失したプレターミナルタンパク質機能を有し得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。これらのアデノウイルスベクターは、欠失したE1、DNAポリメラーゼ及び/又はプレターミナルタンパク質機能を有し得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。これらのアデノウイルスベクターは、E2b領域及び/又はE1領域の少なくとも一部分を有し得る。一部の場合には、そのようなベクターは、guttedアデノウイルスベクターではない。これに関して、これらのベクターは、E2b領域のDNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質機能の両方について欠失し得る。これらのアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE1、E2b及び/又は100K領域中に欠失を有し得る。これらのアデノウイルスベクターは、欠失したE1、E2b及び/又はプロテアーゼ機能を有するベクターを含み得る。一部の場合には、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。これらのアデノウイルスベクターは、欠失したE1及び/又はE2b領域を有し得るが、ファイバー遺伝子は、(例えば、Adトロピズムを変更するために)変異又は他の変更によって改変されている。E3又はE4領域からの遺伝子の除去が、言及されたアデノウイルスベクターのいずれかに追加され得る。ある特定の実施形態では、このアデノウイルスベクターは、ガテッド型アデノウイルスベクターであり得る。
【００７１】
「ガテッド型(gutted)」又は「ガットレス(gutless)」とは、全てのウイルスコード領域が欠失したAdベクターを指す。
【００７２】
「ヘルパーアデノウイルス」又は「ヘルパーウイルス」とは、特定の宿主細胞が果たせない(この宿主は、Ad遺伝子産物、例えばE1タンパク質を提供し得る)ウイルス機能を供給できるAdを指す。このウイルスは、第2のウイルス又はヘルパー依存的ウイルス(例えば、ガテッド型若しくはガットレスウイルス、又は特定の領域、例えば、E2b若しくは本明細書に記載される他の領域が欠失したウイルス)において欠如している機能(例えば、タンパク質)をトランスで供給するために使用される。第1の複製インコンピテントなウイルスは、第2のヘルパー依存的ウイルスを「補助(ヘルプ)」し、それによって、細胞における第2のウイルスゲノムの産生を可能にすると言われる。
【００７３】
Adゲノムの他の領域が欠失し得る。Adゲノムの特定の領域中の「欠失」とは、その領域によってコードされる少なくとも1つの遺伝子産物の発現及び/又は機能(例えば、DNAポリメラーゼのE2b機能又はプレターミナルタンパク質機能)を防止するような方法で変異又は除去された特定のDNA配列を指す。欠失は、タンパク質のエクソンコード部分内の欠失並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。特定の領域内の欠失とは、Adゲノムのその領域内の少なくとも1つの塩基対の欠失を指す。1つよりも多い塩基対が欠失し得る。例えば、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140又は150塩基対が、特定の領域から欠失し得る。この欠失は、Adゲノムの特定の領域内の150、160、170、180、190、200、250又は300塩基対よりも多くであり得る。これらの欠失は、この領域によってコードされる遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止できる。例えば、Adゲノムの特定の領域は、1つ以上のコードされたタンパク質が非機能的であるような、1つ以上の点変異を含み得る。そのような変異には、異なる残基で置き換えられて、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列中の変化をもたらす残基が含まれる。Adゲノム中の例示的な欠失又は変異には、E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、L1、L2、L3、L4、L5、TP、POL、IV及びVA領域のうち1つ以上が含まれる。欠失型アデノウイルスベクターは、例えば、組換え技術を使用して作製され得る。
【００７４】
Adベクターは、ある特定の実施形態では、E2b遺伝子産物及び欠失していてもよい必要な遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して、高力価まで首尾よく増殖され得る。E1及びDNAポリメラーゼタンパク質だけでなく、Ad-プレターミナルタンパク質もまた構成的に発現するHEK-293由来細胞が使用され得る。E.C7細胞は、例えば、アデノウイルスベクターの高力価ストックを増殖させるために使用され得る。
【００７５】
自己増殖性アデノウイルスベクターから重要な遺伝子を欠失させるために、標的化された遺伝子によってコードされるタンパク質は、E1タンパク質と一緒に、HEK-293細胞などにおいて最初に共発現され得る。例えば、構成的に共発現された場合に非毒性であるタンパク質(又は誘導性に発現される毒性タンパク質)が、選択的に利用され得る。HEK-293細胞におけるE1及びE4遺伝子の共発現が可能である(例えば、構成的ではなく誘導性のプロモーターを利用する)。E1及びタンパク質IX遺伝子、ビリオン構造タンパク質が共発現され得る。E1、E4及びタンパク質IX遺伝子のさらなる共発現もまた可能である。E1及び100K遺伝子は、E1及びプロテアーゼ遺伝子と同様、トランス補完的細胞株において発現され得る。
【００７６】
高力価のE2b欠失型Ad粒子の増殖に使用するためのE1及びE2b遺伝子産物を共発現する細胞株が使用され得る。有用な細胞株は、およそ140kDaのAd-DNAポリメラーゼ及び/又はおよそ90kDaのプレターミナルタンパク質を構成的に発現する。毒性なしにE1、DNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質の高レベルの構成的共発現を有する細胞株(例えば、E.C7)が、複製欠損アデノウイルスベクターを増殖させる際の使用のために望ましい。これらの細胞株は、E1、DNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質が欠失したアデノウイルスベクターの増殖を可能にする。
【００７７】
組換えAdは、例えば、適切なMOI(例えば、5)のAdベクターウイルスストックを感染させ、37℃で40〜96時間インキュベートされるE.C7細胞を含む組織培養プレートを使用して増殖され得る。感染細胞は、回収され得、10mM Tris-Cl(pH8.0)中に再懸濁され得、超音波処理され得、ウイルスは、2ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離によって精製され得る。ウイルス含有バンドは、カラム上で脱塩され得、スクロース又はグリセロールが添加され得、アリコートは-80℃で貯蔵され得る。ウイルスは、その安定性を増強するように設計された溶液、例えば、A195中に置かれ得る。ストックの力価は、(例えば、溶解後のウイルスのアリコートの260nmでの光学密度の測定によって)測定され得る。組換えE2b欠失型アデノウイルスベクター全体を包含する、線状又は環状のいずれかのプラスミドDNAは、E.C7又は類似の細胞中にトランスフェクトされ得、ウイルス産生の証拠(例えば、細胞変性効果)が存在するまで、37℃でインキュベートされ得る。細胞からの順化培地は、精製前に産生されたウイルスの量を拡大するために、より多くの細胞を感染させるために使用され得る。精製は、例えば、2ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離又は選択的濾過によって達成され得る。ウイルスは、市販の製品又はカスタムクロマトグラフィーカラムを使用するクロマトグラフィーによって精製され得る。
【００７８】
本明細書に記載される組成物は、感染される細胞が、ある特定の数のウイルスに直面するのを確実にするのに十分なウイルスを含み得る。従って、一部の実施形態は、組換えAdのストック、例えば、組換えAdの無RCAストックを提供する。ウイルスストックは、ウイルス遺伝子型並びにそれらを調製するために使用されるプロトコール及び細胞株に大きく依存して、力価がかなり変動し得る。ウイルスストックは、少なくとも約106、107若しくは108ウイルス粒子(VP)/mL、又はそれよりも高い、例えば、少なくとも約109、1010、1011若しくは1012VP/mLの力価を有し得る。
【００７９】
「アデノウイルス5ヌル(Ad5-ヌル)」とは、発現のためのいずれの異種核酸配列も含まない非複製性Adを指す。
【００８０】
「トランスフェクション」とは、真核生物細胞中への外来核酸の導入を指す。トランスフェクションの例示的な手段には、リン酸カルシウム-DNA共沈殿、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び遺伝子銃が含まれる。
【００８１】
「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトされた」とは、外来核酸、DNA又はRNAの、トランスフェクトされた細胞のゲノム中への導入及び組み込みを指す。用語「安定なトランスフェクタント」とは、ゲノムDNA中に安定に組み込まれた外来DNAを有する細胞を指す。
【００８２】
「レポーター遺伝子」は、レポーター分子(例えば、酵素)をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」は、酵素ベースの検出アッセイ(例えば、ELISA、組織化学的アッセイ)、蛍光、放射性及び発光システムが含まれるがこれらに限定されない種々の検出システムのいずれかで検出可能である。大腸菌(E. coli)β-ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子及び他のレポーター遺伝子が使用され得る。
【００８３】
「異種配列」とは、天然にはライゲーションされていない又は天然には異なる位置においてライゲーションされている核酸配列にライゲーションされる又はライゲーションされるように操作される、ヌクレオチド配列を指す。異種核酸は、天然に存在するヌクレオチド配列、又は天然に存在する配列と比較していくらかの改変を含み得る。
【００８４】
「導入遺伝子」とは、対象の細胞又はゲノム中に導入される任意の遺伝子コード領域、天然若しくは異種のいずれかの核酸配列又は融合された同種若しくは異種核酸配列を指す。導入遺伝子は、対象の細胞に導入遺伝子を導入するために使用される任意のウイルスベクター上で運搬され得る。
【００８５】
「免疫応答を生成する」又は「免疫応答を誘導する」とは、1つ以上の免疫細胞(T細胞、B細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球など)の数、又はこれらの免疫細胞のうち1つ以上の活性(CTL活性、HTL活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌プロファイルの変化など)における統計的に有意な変化、例えば、増加又は減少を指す。
【００８６】
II.免疫療法及びワクチンのためのウイルスベクター
組換えウイルスベクターは、タンパク質コード遺伝子又は抗原(例えば、TAA(腫瘍関連抗原)及び/又はIDAA(感染性疾患関連抗原))を発現させるために使用され得る。組換えウイルスベクターベースのワクチン及び免疫療法の利点には、高効率の遺伝子形質導入、標的細胞への遺伝子の高度に特異的な送達、ロバストな免疫応答の誘導、及び増加した細胞性免疫が含まれる。ある特定の実施形態は、ウイルスゲノムの決定的な領域の欠失又は挿入を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で提供されるウイルスベクターは、免疫応答を生成することが望まれる1つ以上の目的の標的抗原、又はそのバリアント、断片若しくは融合物をコードする異種核酸配列を含み得る。
【００８７】
ヒトパピローマウイルス(HPV)ベクターは、抗原を発現させるために使用され得る。例えば、HPVウイルスゲノムの決定的な領域の欠失又は挿入などによって、ゲノム中の癌遺伝子を改変することによって、組換えベクターは、感染の予測性を増加させ、望まれない副作用を低減させるように操作され得る。例示的なHPVベクターは、アデノウイルスベクターとの融合ベクターである。例示的なHPVベクターは、改変型の非発癌性HPV E6及び/又はHPV E7を含むAd5[E1-,E2b-]-HPV抗原ウイルスベクターである。
【００８８】
ヒト及び動物における研究は、Ad5に対する既存の免疫が、Adベースのワクチンの商業的使用に対する阻害因子であり得ることを実証している。圧倒的多数のヒトは、ヒトワクチンのために最も広く使用されるサブタイプであるAd5に対する抗体を有し、研究したヒトの3分の2は、Ad5に対するリンパ増殖性応答を有する。この既存の免疫は、典型的なAd5ワクチンを使用する免疫化又は再免疫化を阻害し得、後のAd5ベクターを使用する第2の抗原に対するワクチンの免疫化を除外し得る。既存の抗ベクター免疫の問題を克服することは、精力的な調査の対象になってきた。代替的ヒト(非Ad5ベースの)Ad5サブタイプ又はさらには非ヒト形態のAd5を使用する調査が試験されてきた。これらのアプローチが初回免疫化において成功した場合であっても、引き続くワクチン接種は、新規Ad5サブタイプに対する免疫応答に起因して、問題になり得る。Ad5免疫化障壁を回避し、最適な免疫応答を誘導する第一世代Ad5[E1-]ベクターの限定的な効力を改善するために、一部の実施形態は、次世代Ad5ベクターベースのワクチンプラットフォームに関する。
【００８９】
種々の実施形態では、Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad免疫の存在下であっても、強力な細胞性免疫(CMI)、並びにベクター発現されるワクチン抗原に対する抗体を誘導する。Ad5[E1-,E2b-]ベクターはまた、Ad5[E1-]ベクターと比較して低減された有害反応、特に、肝毒性及び組織損傷の出現を有する。これらのAd5ベクターの重要な態様は、Ad後期遺伝子の発現が大きく低減されることである。例えば、カプシドファイバータンパク質の産生は、Ad5[E1-]ベクターについてin vivoで検出できたが、ファイバー発現は、Ad5[E1-,E2b-]ベクターワクチンから消失した。野生型Adに対する自然免疫応答は複雑である。Ad5[E1-,E2b-]ベクターから欠失するタンパク質は、一般に、重要な役割を果たす。具体的には、プレターミナルタンパク質又はDNAポリメラーゼの欠失を有するAd5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターと比較して、注射後最初の24〜72時間の間、低減された炎症を示す。種々の実施形態では、Ad5遺伝子発現の欠如は、感染細胞を抗Ad活性から見えなくし、延長された期間にわたって感染細胞が導入遺伝子を発現するのを可能にし、標的に対する免疫を発達させる。
【００９０】
Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、抗原特異的免疫応答の誘導に関して、Ad5[E1-]ベクターよりも安全であるだけでなくAd5[E1-]ベクターよりも優れているようであり、それにより、臨床応答を生じ得るHPV E6及び/又はHPV E7ワクチンを送達するためのプラットフォームとしてかなり適切なものになることが見出された。他の場合には、免疫誘導は、数カ月かかり得る。
【００９１】
一部の実施形態は、樹状細胞を形質導入するAd5[E1-,E2b-]ベクターの能力を増加させること、Ad5[E1-,E2b-]ベクターウイルスタンパク質に対する低減された炎症応答、及び既存のAd免疫の、結果として生じる回避を利用して、ワクチンにおける抗原特異的免疫応答を改善することを企図する。
【００９２】
抗Ad免疫を克服するための試みは、各々、限定的な成功及び得られたワクチンの体内分布を顕著に変更する潜在力を伴って、代替的Ad血清型及び/又はAd5ウイルスカプシドタンパク質における変更の使用を含んできた。従って、完全に新規のアプローチが、既存のAd免疫の標的であることが既知のタンパク質である、E1欠失型Ad5ベクターからのウイルスタンパク質の発現をさらに低減させることによって試みられた。具体的には、初期1(E1)遺伝子領域中の欠失及び初期2b(E2b)遺伝子領域中のさらなる欠失を有する新規組換えAd5プラットフォーム(Ad5[E1-,E2b-])が記載されている。E2b領域(DNAポリメラーゼ及びプレターミナルタンパク質をコードする)の欠失は、減少したウイルスDNA複製及び後期ウイルスタンパク質発現を生じる。このベクタープラットフォームは、癌及び感染性疾患の動物モデルにおいてCMI応答を誘導するために使用され得、より重要なことには、この組換えAd5遺伝子送達プラットフォームは、Ad5免疫の障壁を克服し、既存の及び/又はベクター誘導性のAd免疫の状況において使用され得、従って、ワクチンの複数回の相同な投与を可能にする。特定の実施形態では、一部の実施形態は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む血清型5の複製欠損アデノウイルスベクターに関する。この免疫原性ポリペプチドは、その変異体、天然バリアント又は断片であり得る。
【００９３】
III.抗原標的をコードするポリヌクレオチド及びバリアント
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書で本質的に相互交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コード又はアンチセンス)又は二本鎖であり得、DNA(例えば、ゲノム、cDNA又は合成)又はRNA分子であり得る。RNA分子には、イントロンを含み、一対一の様式でDNA分子と相関するhnRNA分子、及びイントロンを含まないmRNA分子が含まれ得る。さらなるコード又は非コード配列が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド内に存在してもよいがその必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子及び/又は支持体材料に連結されてもよいがその必要はない。単離されたポリヌクレオチドとは、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドが他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離されたDNA分子は、本明細書で使用する場合、無関係のコードDNAの大きい部分、例えば、大きい染色体断片又は他の機能的遺伝子又はポリペプチドコード領域を含まない。これは、元々単離されたままのDNA分子を指し、実験室でセグメントに組換え的に後に付加される遺伝子又はコード領域を排除しない。
【００９４】
当業者に理解されるように、これらのポリヌクレオチドには、本明細書に記載される標的抗原、抗原の断片、ペプチドなどを発現する又はそれを発現するように適応され得る、ゲノム配列、ゲノム外配列及びプラスミドコードされる配列、並びにより小さい操作された遺伝子セグメントが含まれ得る。そのようなセグメントは、天然に単離され得る、又は人の手によって合成的に改変され得る。
【００９５】
典型的には、ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性又は異種標的タンパク質の免疫原性が、天然(native)ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して実質的に減退しないような、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含む。一部の場合には、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入は、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性の増加を生じ得る。本明細書の他の場所に記載されるように、これらのポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアント又はその断片(例えば、エピトープ)をコードでき、ここで、バリアントポリペプチド又はその断片(例えば、エピトープ)が抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する傾向は、天然(native)ポリペプチドと比較して実質的に減退しない。これらのポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアント又はその断片をコードでき、ここで、バリアントポリペプチド又はその断片が抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する傾向は、天然(native)ポリペプチドと比較して実質的に増加する。
【００９６】
用語「バリアント」は、異種起源の相同遺伝子も包含すると理解すべきである。特定の実施形態では、標的抗原のバリアント又は断片は、1つ以上の低減された生物学的活性を有するように改変される。例えば、発癌性タンパク質標的抗原は、タンパク質の発癌活性を低減若しくは排除するために改変され得、又はウイルスタンパク質は、1つ以上の活性若しくはウイルスタンパク質を低減若しくは排除するために改変され得る。改変型HPV E6タンパク質の一例は、L26V変異を有するHPV E6であり、増加した免疫原性を有するバリアントタンパク質を生じる。
【００９７】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、2つの配列は、これら2つの配列中のヌクレオチドの配列が、以下に記載するように、最大の対応を求めてアラインした場合に同じである場合、「同一」である。2つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定及び比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、本明細書で使用する場合、2つの配列を最適にアラインした後に、ある配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る、少なくとも約20個連続する位置、通常、30〜約75、40〜約50個連続する位置のセグメントを指す。比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメーターを使用して、Lasergeneスイートのバイオインフォマティクスソフトウェア中のMegalignプログラムを使用して実施され得る。或いは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith及びWaterman、Add. APL. Math 2:482 (1981)の局所同一性アルゴリズム、Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の同一性アラインメントアルゴリズム、Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズム(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及びTFASTA)のコンピュータによる実施、又は目視検査によって実施され得る。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST及びBLAST 2.0は、ポリヌクレオチドについてパーセント配列同一性を決定するために、例えば、本明細書に記載されるパラメーターと共に使用され得る。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公に入手可能である。例示的な一例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターM(マッチする残基の対についての報酬スコア、通常>0)及びN(ミスマッチする残基についてのペナルティスコア、通常<0)を使用して計算され得る。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される:累積アラインメントスコアが、その最大の達成値から量Xだけ下落する場合;累積スコアが、1つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因してゼロ以下になる場合;又はいずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラムは、デフォルトとして、11のワード長さ(W)、及び10の期待値(E)、及びBLOSUM62スコアリングマトリックスアラインメント、50の(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4並びに両方の鎖の比較を使用する。
【００９８】
「配列同一性の百分率」は、少なくとも20個の位置の比較のウインドウにわたって最適にアラインされた2つの配列を比較することによって決定され得、ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して、20パーセント以下、通常は5〜15パーセント、又は10〜12パーセントの付加又は欠失(即ち、ギャップ)を含み得る。百分率は、同一の核酸塩基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列中の位置の総数によって除算し、結果に100を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
【００９９】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載される目的の特定の抗原又はその断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然(native)遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン用法の差異に起因して変動するポリヌクレオチドが、具体的に企図される。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、一部の実施形態の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの1つ以上の変異、例えば、欠失、付加及び/又は置換の結果として変更された内因性遺伝子である。得られたmRNA及びタンパク質は、変更された構造又は機能を有してもよいがその必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術(例えば、ハイブリダイゼーション、増幅及び/又はデータベース配列比較)を使用して同定され得る。
【０１００】
ある特定の実施形態は、1つ以上の目的の標的抗原又はその断片若しくはバリアントをコードするポリヌクレオチドとも本明細書で言及される核酸配列を提供する。このように、一部の実施形態は、本明細書にさらに記載される任意の供給源由来の標的抗原をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのような発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。望ましい標的抗原ポリペプチドを発現させるために、ポリペプチド又は機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、(例えば、組換え技術を使用して)適切なAdベクター中に挿入され得る。適切なアデノウイルスベクターは、挿入されたコード配列及び任意の望ましいリンカーの転写及び翻訳のために必要なエレメントを含み得る。当業者に周知の方法が、目的のポリペプチドをコードする配列並びに適切な転写及び翻訳制御エレメントを含むこれらのアデノウイルスベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換えが含まれる。
【０１０１】
ポリヌクレオチドは、天然(native)配列(即ち、標的抗原ポリペプチド/タンパク質/エピトープ又はその一部分をコードする内因性配列)を含み得、又はそのような配列のバリアント、断片若しくは誘導体をコードする配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列は、標的抗原タンパク質をコードし得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然(native)ヌクレオチド配列又はバリアントから実質的に変動してもよいが類似のタンパク質抗原をコードする、特定の細胞型における発現のために最適化された新規遺伝子配列を示す。
【０１０２】
他の関連の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、タンパク質(例えば、目的の標的抗原)をコードする天然(native)配列に対して実質的な同一性を有する、例えば、ポリペプチドをコードする天然(native)ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%又はそれより高い配列同一性を含む(例えば、標準的なパラメーターを使用するBLAST分析)。これらの値は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付けなどを考慮して、2つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得る。ポリヌクレオチドは、天然(native)ポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列と比較して、例えば、少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%又はそれより高い配列同一性を含むタンパク質をコードし得る。
【０１０３】
ポリヌクレオチドは、ポリペプチド(例えば、標的タンパク質抗原)をコードする、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、11、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は1000又はそれより多くの連続するヌクレオチド、及びそれらの間の全ての中間の長さを含み得る。「中間の長さ」とは、この文脈では、引用された値の間の任意の長さ、例えば、16、17、18、19など;21、22、23など;30、31、32など;50、51、52、53など;100、101、102、103など;150、151、152、153など;200〜500の全ての整数を含む;500〜1,000などを指す。ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド、例えば、エピトープ又は異種標的タンパク質をコードする天然(native)配列中には見出されないさらなるヌクレオチド分、一方又は両方の末端において伸長され得る。このさらなる配列は、開示された配列のいずれかの末端又は開示された配列の両方の末端における、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20ヌクレオチド又はそれより多くからなり得る。
【０１０４】
これらのポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、それらの全体的な長さがかなり変動し得るように、他のDNA配列、例えば、プロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わされ得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸断片が使用され得、総長さは、好ましくは、意図した組換えDNAプロトコールにおける調製及び使用の容易さによって制限されることが企図される。約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、約500、約200、約100、約50塩基対長など(全ての中間の長さを含む)の総長さを有する例示的なポリヌクレオチドセグメントは、多くの実施形態で有用であることが企図される。
【０１０５】
変異誘発アプローチ、例えば、部位特異的変異誘発が、標的抗原配列を調製するために使用され得る。ポリペプチド配列中の特異的改変は、それらをコードする根底にあるポリヌクレオチドの変異誘発を介して行われ得る。部位特異的変異誘発は、望ましい変異のDNA配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、並びに横断されている欠失接合部の両側に安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズ及び配列複雑度のプライマー配列を提供するのに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して、変異体を作製するために使用され得る。例えば、約14〜約25ヌクレオチドなどの長さを含むプライマーが使用され得、配列の接合部の両側の約5〜約10残基が変更される。ポリヌクレオチドの特性を改善、変更、減少、改変若しくは他の方法で変化させるため、及び/又はコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性若しくは一次配列を変更するために、変異が、選択されたポリヌクレオチド配列において作成され得る。
【０１０６】
ポリヌクレオチド配列の変異誘発は、コードされたポリペプチドの1つ以上の特性、例えば、ポリペプチド中に含まれるエピトープの免疫原性又は標的抗原の発癌性を変更させるために使用され得る。ポリペプチドの免疫原性を試験するためのアッセイには、T細胞細胞傷害性アッセイ(CTL/クロム放出アッセイ)、T細胞増殖アッセイ、細胞内サイトカイン染色、ELISA、ELISpotなどが含まれるがこれらに限定されない。ペプチドの配列バリアント及びそれらをコードするDNA配列を取得するための他の方法が使用され得る。例えば、望ましいペプチド配列をコードする組換えベクターは、配列バリアントを取得するために、変異原性薬剤、例えば、ヒドロキシルアミンで処理され得る。
【０１０７】
本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメント又は断片は、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することによって、容易に調製され得る。断片は、組換え生産のために組換えベクター中に選択された配列を導入することによって、核酸再生産テクノロジー、例えばPCRの適用によって取得され得る。
【０１０８】
種々のベクター/宿主システムが、ポリヌクレオチド配列を含有及び生産するために利用され得る。例示的なシステムには、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド若しくはコスミドDNAベクターで形質転換された細菌;酵母ベクターで形質転換された酵母;ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)が感染した昆虫細胞システム;ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)若しくは細菌ベクター(例えば、Ti又はpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞システム;又は動物細胞システムが含まれる。
【０１０９】
Adベクター中に存在する制御エレメント又は調節配列には、ベクター-エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、並びに5'及び3'非翻訳領域が含まれ得る。そのようなエレメントは、その強さ及び特異性が変動し得る。利用されるベクターシステム及び宿主に依存して、構成的及び誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが使用され得る。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーター及び三要素リーダー配列からなるAd転写/翻訳複合体へとライゲーションされ得る。ウイルスゲノムの非必須のE1又はE3領域中の挿入が、感染宿主細胞においてポリペプチドを発現することが可能な生存ウイルスを取得するために使用され得る。さらに、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。
【０１１０】
特異的開始シグナル(例えば、ATG開始コドン及び隣接配列)もまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の両方の、種々の起源のものであり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞システムに適切なエンハンサーを含むことによって増強され得る。転写又は翻訳のいずれかのための特異的終結配列もまた、選択されたポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために取り込まれ得る。
【０１１１】
ポリヌクレオチドによってコードされた産物(例えば、標的抗原)の発現を検出及び測定するための種々のプロトコールが使用され得る(例えば、産物に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用する)。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光活性化細胞選別(FACS)が含まれる。所与のポリペプチド上の2つの非干渉性エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を利用する2部位のモノクローナルベースのイムノアッセイが、一部の適用のために好ましい場合があるが、競合的結合アッセイを使用してもよい。
【０１１２】
これらのAdベクターは、検出若しくは選択され得る産物、例えば、その産物が、例えば、蛍光、色素生産性若しくは蛍光基質に対する酵素活性などによって検出され得る、又は増殖条件によって選択され得るレポーター遺伝子を含み得る。例示的なレポーター遺伝子には、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒト成長ホルモン(HGH)が含まれる。例示的な選択マーカーには、薬物耐性、例えば、ネオマイシン(G418)、ハイグロマイシンなどが含まれる。
【０１１３】
これらのAdベクターは、プロモーター又は発現制御配列もまた含み得る。プロモーターの選択は、標的化された細胞型及び望ましい制御の程度又は型に一部依存する。適切なプロモーターには、限定なしに、構成的、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、時間特異的又は事象特異的が含まれる。構成的又は非特異的プロモーターの例には、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、CMV初期遺伝子プロモーター、ウシパピローマウイルスプロモーター及びアデノウイルスプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、ウイルスプロモーターに加えて、細胞性プロモーターもまた、受け入れられかつ有用である。特に、いわゆるハウスキーピング遺伝子(例えば、β-アクチン)のための細胞性プロモーターが有用である。ウイルスプロモーターは一般に、細胞性プロモーターよりも強いプロモーターである。誘導性プロモーターもまた使用され得る。これらのプロモーターには、デキサメタゾンによって誘導性のMMTV LTR、重金属によって誘導性のメタロチオネインプロモーター、及びcAMPによって誘導性のcAMP応答エレメントを有するプロモーター、ヒートショックプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターを使用することによって、核酸は、細胞に送達され得、誘導剤の添加まで静止状態のままになる。これは、目的のタンパク質の産生のタイミングのさらなる制御を可能にする。事象、例えば、腫瘍形成能又はウイルス感染の存在などにのみ依存して活性であるか又は上方調節される事象型特異的プロモーター(例えば、HIV LTR)が使用され得る。HIV LTRプロモーターは、ウイルス感染の際に生じるtat遺伝子産物が存在しない限り、不活性である。一部の事象型プロモーターは、組織特異的でもある。好ましい事象型特異的プロモーターには、ウイルス感染の際に活性化されるプロモーターが含まれる。
【０１１４】
プロモーターの例には、α-フェトタンパク質、α-アクチン、myo D、癌胎児性抗原、VEGF受容体;FGF受容体;TEK又はtie 2;tie;ウロキナーゼ受容体;E-セレクチン及びP-セレクチン;VCAM-1;エンドグリン;エンドシアリン(endosialin);αV-β3インテグリン;エンドセリン-1;ICAM-3;E9抗原;フォンビルブランド因子;CD44;CD40;血管内皮カドヘリン;notch 4、高分子量黒色腫関連抗原;前立腺特異的抗原-1、プロバシン、FGF受容体、VEGF受容体、erb B2;erb B3;erb B4;MUC-1;HSP-27;int-1;int-2、CEA、HBEGF受容体;EGF受容体;チロシナーゼ、MAGE、IL-2受容体;前立腺酸性ホスファターゼ、プロバシン、前立腺特異的膜抗原、α-クリスタリン、PDGF受容体、インテグリン受容体、α-アクチン、SM1及びSM2ミオシン重鎖、カルポニン-h1、SM22  α-アンギオテンシン受容体、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、並びにCD4のためのプロモーターが含まれる。
【０１１５】
リプレッサー配列、陰性調節因子又は組織特異的サイレンサーが、ポリヌクレオチドの非特異的発現を低減させるために挿入され得る。複数のリプレッサーエレメントが、プロモーター領域中に挿入され得る。転写の抑制は、リプレッサーエレメントの配向又はプロモーターからの距離から独立している。リプレッサー配列の1つの型は、インスレーター配列である。そのような配列は、転写を阻害し、バックグラウンド転写をサイレンシングできる。陰性調節エレメントは、いくつかの異なる遺伝子のプロモーター領域中に位置し得る。このリプレッサーエレメントは、オボアルブミン遺伝子のプロモーター領域中のNSEと同様、ステロイドなどの因子の非存在下で、転写のリプレッサーとして機能できる。これらの陰性調節エレメントは、輸卵管由来の特異的タンパク質複合体を結合でき、それらはいずれも、ステロイドに対して感受性ではない。3つの異なるエレメントが、オボアルブミン遺伝子のプロモーター中に位置する。これらのエレメントの部分に対応するオリゴヌクレオチドは、TKレポーターのウイルス転写を抑制できる。サイレンサーエレメントの1つは、他の遺伝子におけるサイレンサーと配列同一性を共有する(TCTCTCCNA(配列番号1))。
【０１１６】
望ましい標的抗原の発現を増加させるエレメントが、本明細書に記載されるAdベクターの核酸配列中に取り込まれ得る。例示的なエレメントには、内部リボソーム結合部位(IRES)が含まれる。IRESは、翻訳効率を増加させ得る。同様に、他の配列が発現を増強してもよい。一部の遺伝子について、特に5'末端の配列が、転写及び/又は翻訳を阻害し得る。これらの配列は通常、ヘアピン構造を形成できるパリンドロームである。一部の場合には、送達される核酸中のそのような配列は、欠失する。転写物又は翻訳産物の発現レベルは、どの配列が発現に影響を与えるかを確認又は確定するためにアッセイされ得る。転写物レベルは、ノザンブロットハイブリダイゼーション、RNaseプローブ保護などを含む任意の公知の方法によってアッセイされ得る。タンパク質レベルは、ELISAを含む任意の公知の方法によってアッセイされ得る。
【０１１７】
IV.抗原特異的免疫療法及びワクチン
ある特定の実施形態は、そのようなベクター及び本明細書で提供される他のベクターを利用する、HPV E6、HPV E7、又はそれらの組合せに対する、単一抗原又は組合せ抗原免疫化を提供する。ある特定の実施形態は、HPV誘導性又はHPV関連癌を有する対象における、HPV E6及び/又はHPV E7に対する治療ワクチンを提供する。他の実施形態は、癌なしにHPV陽性であるが、HPV誘導された癌を発達させる高いリスクがある対象における、HPV E6及び/又はHPV E7に対するワクチンを提供する。さらに、種々の実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法は、臨床応答、例えば、変更された疾患進行又は平均余命をもたらし得る。
【０１１８】
樹状細胞(DC)とのAd5ベクターカプシドの相互作用は、Ad5ベクターによってコードされる抗原を提示するDCの傾向を増強し得る、いくつかの有益な応答を誘発し得る。例えば、未成熟DCは、抗原取り込みに特化しているが、T細胞活性化の比較的不効率なエフェクターである。DC成熟化は、T細胞免疫を駆動するDCの能力の増強と同時発生する。一部の場合には、これらの組成物及び方法は、DC成熟化の直接的誘導を生じるAd5感染を利用する。一部の場合には、マウス由来の未成熟骨髄由来DCのAdベクター感染は、DC成熟化と通常関連する細胞表面マーカー(MHC I及びII、CD40、CD80、CD86並びにICAM-1)を上方調節し得、骨髄DC成熟化の際に下方調節されるインテグリンCD11cを下方調節し得る。一部の場合には、Adベクター感染は、DCによるDC成熟化マーカーIL-12の産生を誘発する。理論に束縛されないが、これらの事象はおそらく、NF-κB経路のAd5誘発された活性化に起因し得る。成熟DCは、Adベクターによって効率的に形質導入され得、成熟CD83+ヒトDC(末梢血単球由来)によって実証されるように、より低い感染多重度(MOI)でナイーブT細胞の増殖を刺激するそれらの機能的潜在力を喪失しない。しかし、成熟DCはまた、未成熟のものよりも感染性が低い場合がある。カプシドタンパク質の改変は、AdベクターによるDCの感染を最適化するため、並びに例えば、正常なCAR受容体感染機構を使用するのではなく、CD40L受容体をウイルスベクター受容体として使用して機能的成熟化を増強するための戦略として使用され得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、Ad5[E1-,E2b-]ベクターHPV E6及び/又はHPV E7抗原ワクチンを含む組成物及び方法は、技術的安全性の範囲内で、増加した全生存(OS)の効果を有する。
【０１２０】
一部の実施形態では、これらの抗原標的は、良性腫瘍と関連する。一部の実施形態では、標的化される抗原は、前癌性腫瘍と関連する。
【０１２１】
上述のように、アデノウイルスベクターは、1つ以上の目的の標的タンパク質又は抗原をコードする核酸配列を含む。これに関して、これらのベクターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれより多くの目的の異なる標的抗原をコードする核酸を含み得る。これらの標的抗原は、全長タンパク質であってもよく、その断片(例えば、エピトープ)であってもよい。これらのアデノウイルスベクターは、目的の1つの標的タンパク質由来の複数の断片若しくはエピトープをコードする核酸配列を含み得、又は多数の目的の異なる標的タンパク質由来の1つ以上の断片若しくはエピトープを含み得る。標的抗原は、それに対する免疫応答を生成することが望ましい任意の物質を含み得るが、一般に、この標的抗原はタンパク質である。標的抗原は、全長タンパク質、タンパク質のサブユニット、タンパク質のアイソフォーム、又は免疫応答を誘導するそれらの断片(即ち、免疫原性断片)を含み得る。標的抗原又はその断片は、例えば、標的抗原の1つ以上の生物学的活性を低減させるため、又はその免疫原性を増強するために、改変され得る。この標的抗原又は標的タンパク質は、HPV E6、HPV E7、又はその両方であり得る。
【０１２２】
「免疫原性断片」とは、B細胞及び/又はT細胞表面抗原受容体によって特異的に認識され(即ち、特異的に結合され)、断片に特異的な免疫応答の生成を生じる、ポリペプチドの断片を指す。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、免疫原性断片は、MHCクラスI又はクラスII分子に結合する。免疫原性断片は、そのような結合が当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能である場合、MHCクラスI又はクラスII分子「に結合」し得る。例えば、ポリペプチドがMHCクラスIに結合する能力は、125I標識したβ-2-ミクログロブリン(β-2m)の、MHCクラスI/β2m/ペプチドヘテロトリマー性複合体中への取り込みを促進する能力をモニタリングすることによって、間接的に評価され得る。或いは、当技術分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイを使用してもよい。ポリペプチドの免疫原性断片は、一般に、周知の技術を使用して同定され得る。免疫原性断片を同定するための代表的な技術には、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることが含まれる。特定の標的ポリペプチドの免疫原性断片は、(例えば、ELISA及び/又はT細胞反応性アッセイにおいて)全長標的ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで、そのような抗血清及び/又はT細胞と反応する断片である。言い換えると、免疫原性断片は、全長ポリペプチドの反応性と類似の又はそれよりも高いレベルで、そのようなアッセイ内で反応し得る。そのようなスクリーニングは、当技術分野で公知の方法を使用して実施され得る。
【０１２４】
一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、免疫応答をモジュレートできる1つ以上のタンパク質、それらのバリアント、それらの融合物、又はそれらの断片をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、第二世代E2b欠失型アデノウイルスベクターは、異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、この異種核酸配列は、HPV E6及びHPV E7、それらのバリアント、一部分、又はそれらの任意の組合せである。
【０１２５】
V.HPV抗原標的
標的抗原には、ヒトパピローマウイルス(HPV)と関連するタンパク質、又はそのバリアント若しくは断片、例えば、オンコプロテインE6及び/又はE7もまた含まれ得る。ある特定の実施形態では、このオンコプロテインは、非発癌性バリアント、又は野生型タンパク質と比較して低減された発癌性を有するバリアントを産生するために改変される。例えば、腫瘍サプレッサータンパク質(例えば、p53及びpRb)の結合を担うペプチドの部分は、それがもはや腫瘍サプレッサータンパク質と相互作用しないように、欠失又は改変され得る。ある特定の実施形態では、HPV E6及びHPV E7は、選択されたMHC分子、例えば、HLA-A2、HLA-A3及びHLA-A24に結合するアゴニストエピトープを含むようにさらに改変され得る。例えば、HPV E6及び/又はHPV E7は、1つ以上のアゴニストエピトープを含むように改変され得る。一部の場合には、2つ以上の標的抗原が、免疫化の間に使用され得る。例えば、E6及び/又はE7抗原は、同じベクター、又は組み合わせて使用されるE6及びE7標的抗原をコードする異種ヌクレオチドを含む別々のベクターから発現され得る。例えば、Ad5-E6ベクターは、Ad5-E7ベクターと共に投与され得る。この例では、このAd5-E6ベクター及びAd5-E7ベクターは、同時に投与されてもよく、順次投与されてもよい。
【０１２６】
高リスクヒトパピローマウイルス(HPV)、例えば、HPV16型(HPV-16)は、子宮頸の病因、及びHPV関連頭頸部扁平上皮癌の90%よりも多くと関連する。予防ワクチン、例えば、HPV二価[16及び18型]ワクチン並びに組換え及びHPV四価[6、11、16及び18型]ワクチンは、ウイルスによる感染を予防することによって、HPV関連癌に対する一次防御であり得るが、報告は、それらが、樹立された疾患の積極的な免疫療法のためには有効でないことを示している。HPV初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子は、HPV誘導性癌において高レベルで発現され、初代ヒト上皮細胞の不死化に関与する。従って、これらは、腫瘍特異的免疫療法のための理想的な標的であるが、それは、多くの他の腫瘍関連抗原とは異なり、これらのウイルス抗原が「非自己」であり、従って、自己免疫を誘導する可能性を有しないからである。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、癌を有しないが、HPV誘導性又はHPV関連癌を発達させるリスクがより高いHPV陽性対象において、HPV E6/E7発現細胞を低減、破壊又は排除するために使用され得る、ヒトパピローマウイルス(HPV)に対するワクチンが、本明細書で開示される。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、HPV誘導性又はHPV関連疾患、例えば癌を処置するための、HPV陽性対象におけるワクチン又は免疫療法が開示される。
【０１２９】
本開示のHPVワクチンは、HPV-16遺伝子E6及びE7に対して免疫化するためのウイルス遺伝子送達プラットフォーム(Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7)を使用する。一部の実施形態では、このAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンは、プログラム死-リガンド1(PD-1)遮断と組み合わされ得る。HPV-16 E6及び/又はE7について改変された遺伝子を運搬する遺伝子送達ビヒクル(Ad5[E1-,E2b-])から構成されるワクチンもまた、本明細書で開示される。HPV E6及び/又はE7遺伝子は、HPV及びHPV誘導された腫瘍に対する免疫応答を生じるために必要な抗原性を保持しつつ、それらを非発癌性にするために改変され得る。本明細書でまた開示されるHPV E6及び/又はHPV E7は、選択されたMHC分子、例えば、HLA-A2、HLA-A3及びHLA-A24に結合するアゴニストエピトープを含むようにさらに改変され得る。例えば、HPV E6及び/又はHPV E7は、1つ以上のアゴニストエピトープを含むように改変され得る。改変型遺伝子は、ワクチン(Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7)中に取り込まれ得る。Ad5[E1-,E2b-]-E6ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E7ワクチン又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンは、HPV特異的細胞性免疫(CMI)応答を誘導する能力を保持できる。一部の実施形態では、このAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンは、標準的な臨床的治療と協同して、HPV E6/E7発現腫瘍の免疫媒介性クリアランスを増強できる。一部の実施形態では、このAd5[E1-,E2b-]-E6ワクチンは、標準的な臨床的治療と協同して、HPV E6発現腫瘍の疫媒介性クリアランスを増強できる。一部の実施形態では、このAd5[E1-,E2b-]-E7ワクチンは、標準的な臨床的治療と協同して、HPV E7発現腫瘍の免疫媒介性クリアランスを増強できる。
【０１３０】
ある特定の実施形態は、HPV E6及び/又はHPV E7に対する治療ワクチンを開発する、長く求められている要求を実現し、他のAd5システムで見出される障壁を克服し、Ad5に以前に曝露された人の免疫化を可能にするために、新たなAd5[E1-,E2b-]ベクターシステムを使用する。
【０１３１】
自己腫瘍抗原の低い免疫原性に対処するために、アジュバント及び免疫刺激性サイトカインの共投与を含む種々の進歩した多構成要素ワクチン接種戦略が提供される。一部の実施形態は、目的の抗原を発現するように同時に操作されながら、生得的な炎症促進性シグナルを提供する組換えウイルスベクターに関する。全て広範な安全性プロファイルを維持しつつ、ロバストなT細胞性免疫応答を誘導するためにヒトにおいて反復して使用されてきたアデノウイルス血清型-5(Ad5)ベースの免疫療法薬が、特に目的とされる。
【０１３２】
活性化シグナルと阻害シグナルとの間のバランスは、Tリンパ球と腫瘍細胞との間の相互作用を調節し、ここで、T細胞応答は、T細胞受容体(TCR)による抗原認識を介して開始される。一部の場合には、HPV E6/E7発現腫瘍保有マウスにおいて化学療法/放射線処置と組み合わされる場合、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法処置は、化学療法/放射線単独を受ける対象と比較して、全生存における有意な改善を生じることができる。
【０１３３】
特定の実施形態では、HPV抗原は、非発癌性HPV抗原、又は野生型HPVと比較して低減された発癌性を有する改変型HPV抗原であるように改変される。ある特定の実施形態では、この改変型HPV抗原は、1つ以上のアゴニストエピトープを含むようにさらに改変される。例えば、本明細書で使用される抗原は、配列番号8(E6A1エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号9(E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号10(E6A1+E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号13に示される、又は配列番号8(E6A1エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号9(E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号10(E6A1+E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号13に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する改変型HPV E6抗原、配列番号12(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)、配列番号14に示される、又は配列番号12(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)、配列番号14に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する改変型HPV E7抗原、又はそれらの組合せである。特定の実施形態では、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号2(E6A1エピトープを有するHPV16 E6及びE7A3エピトープを有するE7)、配列番号3(E6A3エピトープを有するHPV16 E6及びE7A3エピトープを有するE7)若しくは配列番号4(E6A1及びE6A3エピトープを有するHPV16 E6並びにE7A3エピトープを有するE7)の23〜496位及び502〜795位に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%同一である領域、又はそれらの組合せを有する。例えば、この核酸配列は、配列番号2、配列番号3又は配列番号4(HPV E6及びE7タンパク質の両方をコードするヌクレオチド配列)に対して少なくとも80%の同一性を有する。さらなる実施形態では、この核酸配列は、配列番号16(HPV E6及びE7を発現するアデノウイルスベクターの予測された配列)の任意の部分又は全長、例えば、配列番号16の1033〜1845位に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%の同一性を有する。ある特定の実施形態では、核酸配列、例えば、配列番号15に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%同一である核酸配列は、改変型HPV E6及び改変型E7抗原を含む融合タンパク質をコードする。
【０１３４】
一部の実施形態では、このHPV抗原は、HPV E6の26、98、106位にアミノ酸の置換を含む改変(例えば、配列番号8、配列番号9又は配列番号10)、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、このHPV抗原は、HPV E7の86位にアミノ酸の置換を含む改変(例えば、配列番号12)を含む。
【０１３５】
一態様では、HPV E6抗原をコードする配列を含む組換え複製欠損ウイルスベクターを含む組成物が提供され、HPV E6抗原をコードする配列は、配列番号5(E6A1エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号18(E6A1エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号6(E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号19(E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号7(E6A1及びE6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号20(E6A1及びE6A3エピトープを有するHPV16 E6)に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、又は配列番号2、配列番号3、配列番号4の23〜496位に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、このHPV E6抗原は、配列番号8、配列番号9又は配列番号10に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。
【０１３６】
一態様では、HPV E7抗原をコードする配列を含む組換え複製欠損ウイルスベクターを含む組成物が提供され、HPV E7抗原をコードする配列は、配列番号11(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)若しくは配列番号21(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、又は配列番号2の502〜795位に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、このHPV E7抗原は、配列番号12に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。
【０１３７】
一態様では、HPV E6/E7をコードする配列を含む組換え複製欠損ウイルスベクターを含む組成物が提供され、HPV E6及びHPV E7抗原をコードする配列は、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、このHPV E6及びHPV E7抗原は、配列番号8、配列番号9、配列番号10又は配列番号12に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。
【０１３８】
標的抗原のさらなる非限定的な例には、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2/neu)、癌胎児性抗原(CEA)、腫瘍ネオ抗原若しくは腫瘍ネオエピトープ、葉酸受容体アルファ、WT1、ブラキュリ(TIVS7-2、多型)、ブラキュリ(IVS7 T/C多型)、Tブラキュリ、T、hTERT、hTRT、iCE、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、HER2/neu、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1-c、MUC1-n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、ヒト上皮増殖因子受容体3(HER3)、アルファ-アクチニン-4、ARTC1、CAR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、ミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARアルファ融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1若しくは-SSX2融合タンパク質、TGF-ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、GAGE-1、2、8、Gage 3、4、5、6、7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、ムチン、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、マンマグロビン-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、IL13Rアルファ2、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトタンパク質、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、p53、PBF、PRAME、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、セセルニン(secernin)1、SOX10、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、又はそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１３９】
一部の態様では、本明細書で使用される腫瘍ネオエピトープは、腫瘍特異的エピトープ、例えば、EQVWGMAVR(配列番号100)又はCQGPEQVWGMAVREL(配列番号101)(FLRT2のR346W変異)、GETVTMPCP(配列番号102)又はNVGETVTMPCPKVFS(配列番号103)(VIPR2のV73M変異)、GLGAQCSEA(配列番号104)又はNNGLGAQCSEAVTLN(配列番号105)(FCRL1のR286C変異)、RKLTTELTI(配列番号106)、LGPERRKLTTELTII(配列番号107)、又はPERRKLTTE(配列番号108)(FAT4のS1613L変異)、MDWVWMDTT(配列番号109)、AVMDWVWMDTTLSLS(配列番号110)、又はVWMDTTLSL(配列番号111)(PIEZO2のT2356M変異)、GKTLNPSQT(配列番号112)、SWFREGKTLNPSQTS(配列番号113)、又はREGKTLNPS(配列番号114)(SIGLEC14のA292T変異)、VRNATSYRC(配列番号115)、LPNVTVRNATSYRCG(配列番号116)、又はNVTVRNATS(配列番号117)(SIGLEC1のD1143N変異)、FAMAQIPSL(配列番号118)、PFAMAQIPSLSLRAV(配列番号119)、又はAQIPSLSLR(配列番号120)(SLC4A11のQ678P変異)である。
【０１４０】
腫瘍関連抗原は、宿主によって通常は発現されない抗原であり得る。腫瘍関連抗原は、宿主によって通常発現される分子の変異型、短縮型、ミスフォールド型又は他の異常な徴候であり得る。腫瘍関連抗原は、通常発現されるが異常に高いレベルで発現される分子と同一であり得る。或いは、腫瘍関連抗原は、異常な状況又は環境で発現され得る。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質若しくはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生物学的分子又はそれらの任意の組合せであり得る。
【０１４１】
VI.CEA抗原標的
本明細書で開示されるものは、同じ又は別々の複製欠損ベクター中に、HPV E6及び/若しくはE7抗原をコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はCEAなどのムチンファミリー抗原をコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はブラキュリをコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はMUC1-cをコードする1つ以上の核酸配列を含むを含む複製欠損ベクターを含む組成物を含む。
【０１４２】
CEAは、ほぼ全ての結腸直腸癌及び膵癌において過剰発現され、一部の肺及び乳癌、並びに珍しい腫瘍、例えば、髄様甲状腺癌によっても発現されるが、胃腸上皮における低レベルの発現を除いて、身体の他の細胞では発現されないので、免疫療法のための魅力的な標的抗原を示す。CEAは、T細胞によってMHC拘束された様式で認識され得るエピトープを含む。
【０１４３】
腫瘍抗原CEAをコードするAd5[E1-,E2b-]-CEA(6D)による複数回の相同(homologous)免疫化は、既存の又は誘導されたAd5中和抗体の存在にもかかわらず、マウスにおいて抗腫瘍活性と共にCEA特異的細胞性免疫(CMI)応答を誘導したことが発見された。本明細書の第I/II相研究では、進行した結腸直腸癌を有する患者のコホートを、増大する用量のAd5[E1-,E2b-]-CEA(6D)で免疫化した。CEA特異的CMI応答が、患者の大部分(61.3%)において、既存のAd5免疫の存在にかからわらず観察された。重要なことに、最小の毒性が存在し、全患者生存(12カ月で48%)は、既存のAd5中和抗体力価にもかかわらず類似であった。これらの結果は、癌患者において、新規Ad5[E1-,E2b-]遺伝子送達プラットフォームが、天然に獲得された及び免疫化誘導されたAd5特異的免疫の両方の状況において、腫瘍抗原CEAに対する有意なCMI応答を生じることを実証している。
【０１４４】
CEA抗原特異的CMIは、例えば、106の末梢血単核球(PBMC)当たり、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000より多く、又はそれより多くのIFN-γスポット形成細胞(SFC)であり得る。一部の実施形態では、この免疫応答は、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、1000、12000、15000よりも大きい、又はそれよりも高い既存の逆Ad5中和抗体力価で、ヒト対象において生じる。この免疫応答は、本明細書に記載される細胞性免疫及び/又は体液性免疫を含み得る。この免疫応答は、当業者に利用可能な範囲内で、本明細書に記載される細胞内サイトカイン染色(ICS)、ELISpot、増殖アッセイ、クロム放出又は等価なアッセイを含む細胞傷害性T細胞アッセイ、及び任意の数のポリメラーゼ鎖反応(PCR)又はRT-PCRベースのアッセイを使用する遺伝子発現分析のうち1つ以上、並びに免疫応答を測定するための当技術分野で公知の任意の他の適切なアッセイによって測定され得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、ポリペプチドの野生型サブユニットに対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%又は99.9%の同一性を有するサブユニットをコードする改変型配列を含む。
【０１４６】
免疫原性ポリペプチドは、変異体CEA又はその断片であり得る。一部の実施形態では、この免疫原性ポリペプチドは、610位においてAsn→Asp置換を有する変異体CEAを含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%又は99.9%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、この免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号22(CEA-CAP1(6D)の核酸配列)又は配列番号24(変異型CAP1(6D)エピトープのアミノ酸配列)の配列を含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、この免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号22若しくは配列番号24に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%若しくは99.9%の同一性を有する配列、又はオルタナティブなコドン置換によって配列番号22若しくは配列番号24から生成される配列を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターによってコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトCEA配列と比較して、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40又はそれよりも多い点変異、例えば、単一のアミノ酸置換又は欠失を含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、この免疫原性ポリペプチドは、例えば、配列番号22又は配列番号24の最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40又はそれよりも多い点変異、例えば、単一のアミノ酸置換又は欠失を含む、配列番号22若しくは配列番号24由来の配列又は改変型バージョンを含む。
【０１４９】
CEA遺伝子ファミリーのメンバーは、配列類似性、発生上の発現パターン及びそれらの生物学的機能に基づいて、以下の3つのサブグループに下位分類される:12の遺伝子(CEACAM1、CEACAM3〜CEACAM8、CEACAM16及びCEACAM18〜CEACAM21)を含むCEA関連細胞接着分子(CEACAM)サブグループ、11の密接に関連した遺伝子(PSG1〜PSG11)を含む妊娠特異的糖タンパク質(PSG)サブグループ、及び11の偽遺伝子(CEACAMP1〜CEACAMP11)のサブグループ。CEACAMサブグループのほとんどのメンバーは、免疫グロブリン可変ドメインに対する構造的相同性を有する単一のN末端V-setドメインと、その後の、A又はBサブタイプの可変数のC2-setドメインとから構成される細胞外Ig様ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインからなる類似の構造を有する。それらの構造の組織化においていくつかの例外を示すCEACAMサブグループの2つのメンバー(CEACAM16及びCEACAM20)が存在する。CEACAM16は、そのN及びC末端において2つのIg様V型ドメインを含み、CEACAM20は、短縮型Ig様V型1ドメインを含む。これらのCEACAM分子は、それらの膜貫通ドメインを介して細胞表面にアンカリングされ得(CEACAM5〜CEACAM8)、又はグリコホスファチジルイノシトール(GPI)脂質部分に直接連結され得る(CEACAM5、CEACAM18〜CEACAM21)。
【０１５０】
CEAファミリーメンバーは、異なる細胞型において発現され、広範な生物学的機能を有する。CEACAMは、ほとんどの上皮細胞上で顕著に見出され、異なる白血球上に存在する。ヒトでは、CEAファミリーの祖先メンバーであるCEACAM1は、上皮及び内皮細胞の頂端側、並びにリンパ系及び骨髄細胞上で発現される。CEACAM1は、出血性(CEACAM1〜CEACAM1)並びに雌雄異型(例えば、CEACAM1〜CEACAM5)相互作用を介して細胞-細胞接着を媒介する。さらに、CEACAM1は、多くの他の生物学的プロセス、例えば、血管新生、細胞遊走及び免疫機能に関与する。CEACAM3及びCEACAM4の発現は、大部分は顆粒球に限定され、これらは、ナイセリア(Neisseria)、モラクセラ(Moraxella)及びヘモフィルス(Haemophilus)種を含むいくつかの細菌病原体の取り込み及び破壊を媒介することができる。
【０１５１】
従って、種々の実施形態では、組成物及び方法は、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21、PSG1、PSG2、PSG3、PSG4、PSG5、PSG6、PSG7、PSG8、PSG9及びPSG11からなる群から選択されるCEAに対する免疫応答を生じさせることに関する。免疫応答は、これらの方法及び組成物を使用して、これらのCEAのうち1つ以上を発現又は過剰発現する細胞、例えば癌細胞に対して生じ得る。一部の実施形態では、そのような癌細胞における1つ以上のCEAの過剰発現は、非癌細胞と比較して、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍を超える、又はそれより高い倍率である。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるCEA抗原は、野生型CEA抗原、又はCEAのCAP1エピトープであるYLSGANLNL(配列番号23)中に少なくとも1つの変異を有する改変型CEA抗原である。この変異は、保存的又は非保存的、置換、付加又は欠失であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるCEA抗原は、変異型CAP1エピトープであるYLSGADLNL(配列番号24)に示されるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、第1の複製欠損ベクター、又はCEAを発現する複製欠損ベクターは、配列番号25(改変型CEA抗原を発現するアデノウイルスベクターの予測された配列)の任意の部分、例えば、配列番号25の1057〜3165位又は全長配列番号25に対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%同一であるヌクレオチド配列を有する。
【０１５３】
VII.ムチンファミリー抗原標的
本明細書で開示されるものは、同じ又は別々の複製欠損ベクター中に、HPV E6及び/若しくはE7抗原をコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はMUC1などのムチンファミリー抗原をコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はブラキュリをコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はCEAをコードする1つ以上の核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む組成物を含む。
【０１５４】
ヒトムチンファミリー(MUC1〜MUC21)は、身体中の上皮表面上の保護的粘膜障壁を形成することにおいて役割を果たす分泌型及び膜貫通ムチンを含む。これらのタンパク質は、呼吸器、胃腸管を裏打ちする上皮、並びに重要な臓器、例えば、乳腺、肝臓、胃、膵臓及び腎臓などの中の裏打ち管を保護することにおいて機能する。
【０１５５】
MUC1(CD227)は、大部分のヒト癌腫及びいくつかの血液悪性腫瘍上で過剰発現されるTAAである。MUC1(GenBank:X80761.1、NCBI:NM_001204285.1)は、ヒト疾患に関与することが公知の多くの重要な細胞経路を活性化する。MUC1は、いくつかのヒト癌において共通して過剰発現される、2つのサブユニットによって形成されるヘテロダイマー性タンパク質である。MUC1は、自己タンパク分解を受けて、2つのサブユニットMUC1n及びMUC1cを生じ、これらは次いで、安定な非共有結合ヘテロダイマーを形成する。
【０１５６】
MUC1のC末端サブユニット(MUC1c)は、58aaの細胞外ドメイン(ED)、28aaの膜貫通ドメイン(TM)及び72aaの細胞質ドメイン(CD)を含み得る。MUC1cはまた、MUC1のダイマー化を可能にし得る「CQC」モチーフもまた含み得、これはまた、細胞に発癌性機能を与え得る。一部の場合には、MUC1は、MUC1cを介した細胞シグナル伝達を誘導することによって、発癌性機能を与えることができる。MUC1cは、EGFR、ErbB2及び他の受容体チロシンキナーゼと相互作用でき、PI3K→AKT及びMEK→ERK細胞経路の活性化に寄与する。核では、MUC1cは、Wnt/β-カテニン、STAT及びNF-κB RelA細胞経路を活性化する。一部の場合には、MUC1は、MUC1nを介した細胞シグナル伝達を誘導することによって、発癌性機能を与えることができる。MUC1のN末端サブユニット(MUC1n)は、グリコシル化され得る可変数の20アミノ酸タンデムリピートを含み得る。MUC1は、腺上皮細胞の表面で通常発現され、癌腫において過剰発現され異常にグリコシル化される。MUC1は、腫瘍免疫療法のための標的として利用できるTAAである。いくつかの臨床試験が、免疫療法ワクチンにおけるMUC1の使用を評価するために、これまで実施されており、現在も実施されている。重要なことに、これらの試験は、MUC1標的化を用いた免疫療法が安全であり、生存利益を提供し得ることを示している。
【０１５７】
しかし、臨床試験は、MUC1が比較的不良な免疫原であることもまた示している。これを克服するために、本発明者らは、MUC1オンコプロテインのC末端領域(MUC1-C又はMUC1c)中のTリンパ球免疫エンハンサーペプチド配列を同定した。天然(native)ペプチド配列と比較して、改変型MUC1-Cのアゴニストは、(a)より低いペプチド濃度でHLA-A2を結合した、(b)HLA-A2に対するより高い結合力を実証した、(c)抗原提示細胞と共に使用した場合、天然(native)ペプチドを使用する場合よりも、T細胞によるより多くのIFN-γの産生を誘導した、及び(d)癌患者由来のMUC1特異的ヒトT細胞株をより効率的に生成することができた。重要なことに、アゴニストエピトープを使用して生成されたT細胞株は、天然(native)エピトープでパルスした標的の溶解について、及びMUC1を発現するHLA-A2ヒト腫瘍細胞の溶解において、天然(native)エピトープを用いて生成されたT細胞株よりも効率的であった。さらに、本発明者らは、MUC1-CのさらなるCD8+細胞傷害性Tリンパ球免疫エンハンサーアゴニスト配列エピトープを同定した。
【０１５８】
ある特定の態様では、免疫エンハンサー能力について改変された強力なMUC1-C(mMUC1-C又はMUC1-C又はMUC1c)が提供される。本開示は、新たなより強力な免疫療法ワクチンを提供するために組換えAd5[E1-,E2b-]プラットフォーム中に取り込まれる免疫エンハンサー能力について改変された強力なMUC1-Cを提供する。例えば、この免疫療法ワクチンは、MUC1発現癌又は感染性疾患を処置するためのAd5[E1-,E2b-]-mMUC1-Cであり得る。
【０１５９】
翻訳後修飾は、身体及びヒト疾患においてタンパク質機能を制御する際に重要な役割を果たす。例えば、上で議論したタンパク分解性切断に加えて、MUC1は、特定のアミノ酸残基において、いくつかの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、パルミトイル化、又はそれらの組合せを有し得る。MUC1のグリコシル化、シアリル化、リン酸化又はパルミトイル化修飾を標的化する免疫療法が、本明細書で提供される。
【０１６０】
MUC1は、高度にグリコシル化され得る(モノ-グリコシル化からペンタ-グリコシル化までの範囲の、各タンデムリピート内のセリン及びスレオニン残基上の、異なる程度のN及びO結合型炭水化物並びにシアル酸)。乳癌において3,4-結合型GlcNAcで差示的にO-グリコシル化される。N-グリコシル化は、分泌形態MUC1/SEC中の高マンノース、酸性複合型及びハイブリッドグリカン、並びに膜貫通形態MUC1/TM.4中の中性複合型からなる。本開示は、MUC1の差示的にO-グリコシル化された形態を標的化する免疫療法を提供する。
【０１６１】
さらに、MUC1は、シアリル化され得る。腎臓及び乳房の癌細胞由来の膜シェディングされた糖タンパク質は、優先的にシアリル化されたコア1構造を有するが、同じ組織由来の分泌形態は、主にコア2構造を示す。O-グリコシル化された内容は、末端フコース及びガラクトース、2-及び3-結合型ガラクトース、3-及び3,6-結合型GalNAc-ol並びに4-結合型GlcNAcの優勢を伴って、これら両方の組織において重複している。本開示は、MUC1の種々のシアリル化形態を標的化する免疫療法を提供する。CQCモチーフ中のシステイン残基上の二重パルミトイル化は、エンドソームから形質膜へ戻ってリサイクルするために必要である。本開示は、MUC1の種々のパルミトイル化形態を標的化する免疫療法を提供する。
【０１６２】
リン酸化は、ヒトの健康にとって重要な特定の細胞シグナル伝達応答を誘導するMUC1の能力に影響を与え得る。本開示は、MUC1の種々のリン酸化形態を標的化する免疫療法を提供する。例えば、MUC1は、C末端ドメイン中のチロシン及びセリン残基上でリン酸化され得る。C末端ドメイン中のチロシン上のリン酸化は、MUC1及びβ-カテニンの核移行を増加させることができる。PKCデルタによるリン酸化は、β-カテニン/CTNNB1へのMUC1の結合を誘導でき、β-カテニン/E-カドヘリン複合体の形成を減少させることができる。MUC1のSrc媒介性リン酸化は、GSK3Bとの相互作用を阻害できる。Tyr-1229上でのMUC1のSrc媒介性及びEGFR媒介性リン酸化は、β-カテニン/CTNNB1への結合を増加させることができる。Ser-1227上でのMUC1のGSK3B媒介性リン酸化は、この相互作用を減少させることができるが、β-カドヘリン/E-カドヘリン複合体の形成を回復させる。MUC1のPDGFR媒介性リン酸化は、MUC1CT及びCTNNB1の核共局在を増加させることができる。本開示は、その細胞シグナル伝達能を調節することが公知の、MUC1、MUC1c及びMUC1nの異なるリン酸化形態を標的化する免疫療法を提供する。
【０１６３】
本開示は、MUC1c細胞質ドメイン及び細胞中でのその機能をモジュレートする免疫療法を提供する。本開示は、MUC1c中のCQCモチーフをモジュレートすることを含む免疫療法を提供する。本開示は、MUC1cの細胞外ドメイン(ED)、膜貫通ドメイン(TM)、細胞質ドメイン(CD)、又はそれらの組合せをモジュレートすることを含む免疫療法を提供する。本開示は、EGFR、ErbB2又は他の受容体チロシンキナーゼを介した細胞シグナル伝達を誘導するMUC1cの能力をモジュレートすることを含む免疫療法を提供する。本開示は、PI3K→AKT、MEK→ERK、Wnt/β-カテニン、STAT、NF-κB RelA細胞経路、又はそれらの組合せを誘導するMUC1cの能力をモジュレートすることを含む免疫療法を提供する。
【０１６４】
一部の実施形態では、このMUC1c免疫療法は、同じ複製欠損ウイルスベクター又は別々の複製欠損ウイルスベクター中のHPV E6及び/若しくはE7、CEA又はブラキュリ免疫療法をさらに含み得る。
【０１６５】
本開示は、MUC1n及びその細胞機能をモジュレートする免疫療法もまた提供する。本開示は、MUC1nのタンデムリピート、MUC1nのタンデムリピート上のグリコシル化部位、又はそれらの組合せを含む免疫療法もまた提供する。一部の実施形態では、このMUC1n免疫療法は、同じ複製欠損ウイルスベクター又は別々の複製欠損ウイルスベクター中のHPV E6及び/若しくはE7、CEA又はブラキュリ免疫療法をさらに含む。
【０１６６】
本開示は、MUC1n、MUC1c、HPV E6及び/若しくはE7、ブラキュリ、CEA、又はそれらの組合せを含むワクチンもまた提供する。本開示は、MUC1c並びにHPV E6及び/若しくはE7、ブラキュリ、CEA、又はそれらの組合せを含むワクチンを提供する。本開示は、MUC1n並びにHPV E6及び/若しくはE7、ブラキュリ、CEA、又はそれらの組合せを標的化するワクチンもまた提供する。一部の実施形態では、この抗原組合せは、本明細書で提供される1つのベクター中に含まれる。一部の実施形態では、この抗原組合せは、本明細書で提供される別々のベクター中に含まれる。
【０１６７】
本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む血清型5の複製欠損アデノウイルスベクターに関する。この免疫原性ポリペプチドは、MUC1のアイソフォーム又はそのサブユニット若しくは断片であり得る。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%又は99.9%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターによってコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトMUC1配列と比較して、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40又はそれより多くの点変異、例えば、単一のアミノ酸置換又は欠失を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、改変型MUC1であり得、配列番号26に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、配列番号26に示されるヌクレオチド配列を有し得る。
【０１６９】
一部の実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、改変型MUC1であり得、配列番号27に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ配列を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、配列番号27に示されるアミノ酸配列を有し得る。
【０１７０】
VIII.ブラキュリ抗原標的
本明細書で開示されるものは、同じ又は別々の複製欠損ベクター中に、HPV E6及び/若しくはE7抗原をコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はMUC1などのムチンファミリー抗原をコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はブラキュリをコードする1つ以上の核酸配列、並びに/又はCEAをコードする1つ以上の核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む組成物を含む。
【０１７１】
本開示は、ブラキュリに対する1つ以上の抗原を含む免疫療法を提供する。ブラキュリ(ヒトでは「T」タンパク質としても公知)は、初期発生の間、主に正常な中胚葉の形成及び分化において重要な役割を果たし、T-ドメインと称される高度に保存されたDNA-結合ドメインを特徴とする、T-ボックスファミリーの転写因子のメンバーである。上皮から間葉系への移行(EMT)は、ブラキュリが決定的な役割を果たす、初代腫瘍から転移状態への進行の間の重要なステップである。ヒト癌腫細胞におけるブラキュリの発現は、間葉系マーカーの上方調節、上皮マーカーの下方調節、並びに細胞遊走及び浸潤における増加を含む、EMTに特徴的な変化を誘導する。逆に、ブラキュリの阻害は、間葉系マーカーの下方調節並びに細胞遊走及び浸潤の喪失を生じ、ヒト腫瘍細胞が転移を形成する能力を減退させた。ブラキュリは、上皮-間葉系移行を媒介し、浸潤を促進するように機能できる。
【０１７２】
本開示は、細胞増殖疾患、例えば癌における上皮-間葉系移行機能に対するブラキュリの効果をモジュレートする免疫療法もまた提供する。本開示は、細胞増殖疾患、例えば癌において浸潤を促進するブラキュリの能力をモジュレートする免疫療法もまた提供する。本開示は、ブラキュリのT-ボックスドメインのDNA結合機能をモジュレートする免疫療法もまた提供する。一部の実施形態では、このブラキュリ免疫療法は、HPV E6及び/若しくはE7、CEA、又はMUC1、MUC1c若しくはMUC1nに対する1つ以上の抗原をさらに含み得る。
【０１７３】
ブラキュリの発現は、ほとんどの正常ヒト組織ではほぼ検出不能であり、ヒト腫瘍に高度に制限され、過剰発現される場合が多く、これが、ブラキュリを免疫療法のための魅力的な標的抗原にしている。ヒトでは、ブラキュリは、T遺伝子(GenBank:AJ001699.1、NCBI:NM_003181.3)によってコードされる。ヒトで見出されるオルタナティブスプライシングによって産生された少なくとも2つの異なるアイソフォームが存在する。各アイソフォームは、いくつかの天然バリアントを有する。
【０１７４】
ブラキュリは免疫原性であり、in vitroで拡大したブラキュリ特異的CD8+T細胞は、ブラキュリ発現腫瘍細胞を溶解できる。ブラキュリのこれらの特徴は、ブラキュリを、免疫療法のための魅力的な腫瘍関連抗原(TAA)にする。ブラキュリタンパク質は、T-ボックス転写因子である。ブラキュリは、T-ボックスと呼ばれるそのN末端中の領域を介して特異的DNAエレメント、ほぼパリンドロームの配列「TCACACCT」に結合して、そのような部位に結合した場合に遺伝子転写を活性化できる。
【０１７５】
本開示は、ブラキュリ、HPV E6及び/若しくはE7、MUC1、CEA、又はそれらの組合せを含むワクチンもまた提供する。一部の実施形態では、この抗原組合せは、本明細書で提供される1つのベクター中に含まれる。一部の実施形態では、この抗原組合せは、本明細書で提供される別々のベクター中に含まれる。
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む血清型5の複製欠損アデノウイルスベクターに関する。この免疫原性ポリペプチドは、ブラキュリのアイソフォーム又はそのサブユニット若しくは断片であり得る。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%又は99.9%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターによってコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトブラキュリ配列と比較して、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40又はそれより多くの点変異、例えば、単一のアミノ酸置換又は欠失を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、本開示のブラキュリ抗原は、配列番号28に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一であるアミノ配列を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のブラキュリ抗原は、配列番号28に示されるアミノ配列を有し得る。
【０１７８】
IX.組合せ治療
ある特定の実施形態は、癌及び感染性疾患の処置及び予防のための組合せ免疫療法及びワクチン組成物を提供する。一部の実施形態は、複雑な疾患、例えば、感染性疾患及び癌に対する治療応答の増強のための組合せマルチ標的化ワクチン、免疫療法及び方法を提供する。この組合せ治療の各構成要素は、HPV感染症の予防又はHPV関連疾患の免疫療法のためのワクチン組成物中に独立して含まれ得る。
【０１７９】
「処置」とは、治療有効用量の本開示のワクチンの対象への投与を指し得る。処置は、医薬組成物で対象に投与され得る。この対象は、処置の時点において疾患状態に罹患していてもよく、この場合、処置は、治療ワクチン接種と呼ばれ得る。この対象はまた、処置の時点において健康であり疾患を有していなくてもよく、この場合、処置は、予防的ワクチン接種と呼ばれ得る。
【０１８０】
「対象」とは、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の型のマカク)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び家禽が含まれるがこれらに限定されない任意の動物を指す。「対象」は、本明細書で、「個体」又は「患者」と相互交換可能に使用され得る。
【０１８１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のワクチン(例えば、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7)は、低用量の化学療法又は低線量の放射線と組み合わされ得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のワクチン(例えば、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7)は、投与される化学療法の用量が、臨床的標準治療よりも低くなるように、化学療法と組み合わされ得る。一部の実施形態では、この化学療法は、シクロホスファミドであり得る。シクロホスファミドは、臨床的標準治療投薬よりも低い用量で投与され得る。例えば、化学療法は、合計8週間にわたって2週間毎に、1〜5日目及び8〜12日目に、1日2回(BID)50mgで投与され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のワクチン(例えば、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7)は、投与される放射線の線量が、臨床的標準治療よりも低くなるように、放射線と組み合わされ得る。例えば、一部の実施形態では、8Gyでの同時発生的な体幹部定位放射線療法(SBRT)が、8、22、36、50日目(4線量にわたって2週間毎)に与えられ得る。放射線は、SBRTを使用して、全ての実行可能な腫瘍部位に投与され得る。
【０１８２】
一部の態様では、本明細書で提供される組合せ免疫療法及びワクチンは、癌の発達と関連する抗原、例えば、腫瘍関連抗原(TAA)、又は特定の感染性疾患に関与することが公知の抗原、例えば、感染性疾患関連抗原(IDAA)に対するマルチ標的化免疫療法アプローチを含み得る。一部の態様では、本明細書で提供される組合せ免疫療法及びワクチンは、癌又は感染性疾患の発達と関連する抗原に対するマルチ標的化抗原シグネチャー免疫療法アプローチを含み得る。これらの組成物及び方法は、種々の実施形態では、本明細書で提供される、疾患の免疫化のためのHPV E6及び/又はHPV E7のバリアントを発現するウイルスベースのベクターを提供する。これらのベクターは、HPV E6及び/又はHPV E7に対する免疫応答を生じさせ得る。
【０１８３】
一部の態様では、このベクターは、少なくとも1つの抗原を含む。一部の態様では、このベクターは、少なくとも2つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチン製剤は、1:1の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:2の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:3の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:4の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:5の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:6の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:7の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:8の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:9の比率のベクター対抗原を含む。一部の態様では、このワクチンは、1:10の比率のベクター対抗原を含む。
【０１８４】
一部の態様では、このワクチンは組合せワクチンであり、このワクチンは、少なくとも単一の抗原を各々が含む少なくとも2つのベクターを含む。
【０１８５】
異なる抗原の混合物が同時に投与される又は対象において同じ又は異なるベクターから発現される場合、これらは互いに競合する可能性がある。結果として、組合せ免疫療法又はワクチン中に異なる濃度及び比率の発現された抗原を含む製剤は、有効かつ持続性の免疫応答が投与後に生じることを確実にするために、評価され、対象又は対象の群に合わせる必要がある。
【０１８６】
複数の抗原を含む組成物は、種々の比率で存在し得る。例えば、1つよりも多いベクターを含む製剤は、種々の比率を有し得る。例えば、免疫療法又はワクチンは、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、2:1、2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、4:1、4:3、4:5、4:6、4:7、4:8、5:1、5:3、5:4、5:6、5:7、5:8、6:1、6:3、6:4、6:5、6:7、6:8、7:1、7:3、7:4、7:5、7:6、7:8、8:1、8:3、8:4、8:5、8:6又は8:7の化学量論で、2つの異なるベクターを有し得る。
【０１８７】
ある特定の実施形態は、TAAに対するマルチ標的化免疫療法を含む組合せ免疫療法を提供する。ある特定の実施形態は、IDAAに対するマルチ標的化免疫療法を含む組合せ免疫療法を提供する。
【０１８８】
一部の実施形態では、これらの組換え核酸ベクターのうち少なくとも1つは、第1の同一性値を含む複製欠損アデノウイルス5ベクターを含む複製欠損アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、E2b領域中に欠失を含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域中に欠失をさらに含む。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも90%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも95%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも99%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、100%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも90%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも95%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも99%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、100%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも90%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも95%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、少なくとも99%である。一部の実施形態では、この第1の同一性値は、100%である。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象においてHPV発現癌を処置する方法であって、HPV抗原又は任意の適切な抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップ;及び免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。この方法は、放射線治療、化学療法、又はそれらの組合せを対象に投与するステップをさらに含み得る。
【０１９０】
A.免疫経路チェックポイントモジュレーター
一部の実施形態では、組合せ治療は、1つ以上の免疫チェックポイントモジュレーター、例えば、免疫チェックポイント阻害剤と共に投与される組成物を含む。一部の実施形態では、この組成物は、標的抗原、例えば、HPV E6、HPV E7、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む複製欠損ベクターを含む。
【０１９１】
活性化シグナルと阻害シグナルとの間のバランスは、Tリンパ球と疾患細胞との間の相互作用を調節し、ここで、T細胞応答は、T細胞受容体(TCR)による抗原認識を介して開始される。阻害経路及びシグナルは、免疫チェックポイントと呼ばれる。正常な状況では、免疫チェックポイントは、自己免疫の制御及び予防において重要な役割を果たし、病原体感染に応答した組織損傷から保護もする。
【０１９２】
ある特定の態様では、癌及び感染性疾患の処置のための免疫チェックポイント阻害経路をモジュレートするウイルスベクターベースのワクチン及び組成物を含む組合せ免疫療法が提供される。一部の実施形態では、モジュレートすることは、遺伝子又はタンパク質の発現又は活性を増加させることである。一部の実施形態では、モジュレートすることは、遺伝子又はタンパク質の発現又は活性を減少させることである。一部の実施形態では、モジュレートすることは、遺伝子又はタンパク質のファミリーに影響を与える。
【０１９３】
一般に、これらの免疫阻害経路は、リガンド-受容体相互作用によって開始される。疾患では、疾患が、対象において免疫耐性を誘導するための機構として、免疫チェックポイント経路を利用できることが、現在明らかである。
【０１９４】
所与の疾患による、対象における免疫耐性又は免疫阻害経路の誘導は、免疫阻害経路のうち1つ以上又はそれらの組合せをモジュレートすることが公知の分子組成物、例えば、siRNA、アンチセンス、小分子、模倣物、組換え形態のリガンド、受容体若しくはタンパク質、又は抗体(これはIg融合タンパク質であり得る)によって遮断され得る。例えば、免疫チェックポイントタンパク質、例えば、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)及びプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)の遮断薬を用いた予備的臨床知見は、抗腫瘍免疫を増強するための有望さを示している。
【０１９５】
罹患細胞は、複数の阻害リガンドを発現でき、疾患浸潤性リンパ球は、複数の阻害受容体を発現するので、免疫チェックポイントタンパク質の二重又は三重の遮断は、抗疾患免疫を増強し得る。本明細書で提供される組合せ免疫療法は、以下の免疫チェックポイントタンパク質又はその断片の1つ以上の分子組成物を含み得る:PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(CD276としても公知)、B7-H4(B7-S1、B7x及びVCTN1としても公知)、BTLA(CD272としても公知)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(CD223としても公知)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(HAVcr2としても公知)、GAL9、A2aR、ADORACD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA及びCD244。
【０１９６】
一部の実施形態では、この免疫経路チェックポイントモジュレーターは、免疫応答を活性化又は強化する。一部の実施形態では、この免疫経路チェックポイントモジュレーターは、免疫応答阻害剤を阻害する。一部の実施形態では、この免疫経路チェックポイントは、免疫応答を阻害する。
【０１９７】
一部の実施形態では、この分子組成物は、siRNAを含む。一部の実施形態では、この分子組成物は、小分子を含む。一部の実施形態では、この分子組成物は、組換え形態のリガンドを含む。一部の実施形態では、この分子組成物は、組換え形態の受容体を含む。一部の実施形態では、この分子組成物は、抗体を含む。一部の実施形態では、この組合せ治療は、1つよりも多い分子組成物及び/又は1つよりも多い型の分子組成物を含む。当業者によって理解されるように、免疫チェックポイント阻害経路のさらに発見されたタンパク質もまた、ある特定の態様に包含されることが想定される。
【０１９８】
一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、CTLA4のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、PD-1のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、PDL1のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、LAG3のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、B7-H3のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、B7-H4のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組合せ免疫療法は、TIM3のモジュレーションのための分子組成物を含む。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(即ち、HAVcr2)、GAL9及びA2aRに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体である。一部の実施形態では、モジュレーションは、発現の増加又は増強である。他の実施形態では、モジュレーションは、発現の減少又は非存在である。
【０１９９】
2つの例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4)及びプログラム細胞死タンパク質-1(PD-1)が含まれる。CTLA-4はT細胞上で排他的に発現され得、この場所で、T細胞活性化の初期段階を調節する。CTLA-4は、T細胞活性を阻害するシグナル伝達を生じ得る共刺激T細胞受容体CD28と相互作用する。TCR抗原認識が生じると、CD28シグナル伝達は、TCRシグナル伝達を増強し得、一部の場合には、T細胞の活性化をもたらし、CTLA-4は、CD28のシグナル伝達活性を阻害する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、抗CTLA-4モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、CTLA-4分子組成物と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。
【０２００】
プログラム死細胞タンパク質リガンド-1(PDL1)は、B7ファミリーのメンバーであり、種々の組織及び細胞型に分布している。PDL1は、PD-1と相互作用して、T細胞活性化及びCTL媒介性溶解を阻害する。PDL1の顕著な発現は、種々のヒト腫瘍上で実証されており、PDL1発現は、腫瘍が宿主の抗腫瘍免疫応答を逃れる重要な機構の1つである。プログラム死-リガンド1(PDL1)及びプログラム細胞死タンパク質-1(PD-1)は、免疫チェックポイントとして相互作用する。この相互作用は、抗腫瘍免疫応答の鈍麻及び引き続く腫瘍進行を生じる、主要な寛容機構であり得る。PD-1は、活性化されたT細胞上に存在し、PD-1の一次リガンドであるPDL1は、腫瘍細胞及び抗原提示細胞(APC)、並びにB細胞を含む他の細胞上で発現される場合が多い。PDL1の顕著な発現は、HPV関連頭頸部癌を含む種々のヒト腫瘍上で実証されている。PDL1は、T細胞上のPD-1と相互作用して、T細胞活性化及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)媒介性溶解を阻害する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、抗PD-1又は抗PDL1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、抗PD-1抗体又は抗PDL1分子組成物と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、抗CTLA-4モノクローナル抗体及び抗PD-1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、抗CTLA-4モノクローナル抗体及びPDL1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。ある特定の実施形態は、増殖性疾患及び癌の処置のための、抗CTLA-4モノクローナル抗体、抗PD-1モノクローナル抗体若しくは抗PDL1モノクローナル抗体、又はそれらの組合せと組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。
【０２０１】
ある特定の実施形態は、癌処置のために臨床開発中の、PDL1/PD-1経路に対するいくつかの抗体と組み合わせた、本明細書で提供される免疫療法を提供する。ある特定の実施形態では、抗PDL1抗体が使用され得る。PDL1の遮断は、PDL2/PD-1経路をインタクトなままにして末梢自己寛容を促進するので、T細胞を標的化する抗PD-1抗体と比較して、腫瘍細胞を標的化する抗PDL1抗体は、自己免疫関連の安全性の問題のより低いリスクを含む、より少ない副作用を有すると予測される。
【０２０２】
この目的のために、完全ヒトIgG1抗PDL1抗体アベルマブ(薬物コードMSB0010718C)が製造されている。アベルマブは、PDL1に選択的に結合し、PD-1とのその相互作用を競合的に遮断する。
【０２０３】
アベルマブはまた、マウスPDL1と交差反応性であり、従って、正常な実験マウスにおいてin vivo薬理学研究を実施することを可能にする。しかし、完全ヒトアベルマブ分子に対する免疫原性に起因して、投薬レジメンは、1週間以内に与えられる3つの用量に限定された。
【０２０４】
アベルマブについての重要な前臨床的薬理学的知見は、以下にまとめられる。アベルマブは、抗原特異的及び抗原非特異的刺激に応答したin vitroでの一次T細胞活性化の機能的増強、並びに単剤治療としてのin vivo腫瘍成長(PDL1発現MC38結腸癌)の顕著な阻害を示した。アベルマブのin vivo効力は、この細胞型が全身的に枯渇した場合の抗腫瘍活性の完全な無効化によって明らかなように、CD8+T細胞によって駆動される。局在的な分割放射線療法とのその組合せは、抗腫瘍免疫記憶の生成と共に、樹立された腫瘍の完全な退縮を生じた。in vitroのヒト腫瘍細胞に対するその抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)が実証された。さらに、ADCC欠損状況でのin vivo研究は、抗腫瘍効力へのADCCの寄与を支持している。アベルマブのさらなる知見には、以下が含まれる:補体依存性細胞傷害性は、in vitroでは観察されなかった。クリニックのための転換適用可能性を有する免疫モニタリングアッセイは、免疫学的作用機構をさらに支持する:蛍光活性化細胞選別(FACS)によって測定される、CD8+PD-1+T細胞及びCD8+エフェクターメモリーT細胞における一貫した増加;ペンタマー染色及び酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイによって測定される、増強された腫瘍抗原特異的CD8+T細胞応答。
【０２０５】
抗腫瘍画像応答が結腸直腸癌においてPD-1-PDL1結合に干渉する薬剤を使用していた可能性が低いことを示す報告にもかかわらず、画像応答が報告されている。さらに、相関が、腫瘍組織上のPDL1発現レベルが画像応答の可能性を予測することを示す複数の臨床試験において実証されている。しかし、PDL1発現は、現在測定されているように、抗腫瘍効力のための決定的な要件ではないことが明らかになっている。結腸直腸腫瘍は、PD-1-PDL1遮断に対して応答する可能性がより高い他の腫瘍と比較して、PDL1をめったに発現しないことが注目されてきた。しかし、IFN-γを産生する強い抗腫瘍T細胞応答がPDL1発現を誘導することが公知である。
【０２０６】
一部の実施形態では、理論に束縛されないが、根底にある免疫応答が、PD-1-PDL1遮断が抗腫瘍効果を有するために必要であることが企図された。理論に束縛されないが、免疫チェックポイント阻害剤の、標準的な治療及びアデノウイルスベクター組成物、例えば、Ad5-E6/E7免疫化とのこの組合せは、PDL1発現を誘導することが可能であり得、それによって、PD-1-PDL1遮断の抗腫瘍活性を増加させることが、さらに企図された。
【０２０７】
一部の実施形態では、PDL1を選択的に結合する他の抗体、例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、BMS-936559、MPDL3280A及びMEDI4736が使用される。
【０２０８】
一部の実施形態は、抗腫瘍効果を増加させることができるPD-1遮断と組み合わせたAd5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫化を提供する。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンによって誘導されるCMI応答は、小さい樹立された腫瘍対大きい樹立された腫瘍を処置する治療潜在力を評価するための抗腫瘍応答の動態を示すと特徴付けられ得る。一部の実施形態は、抗腫瘍効果を増加させることができるPD-1遮断と組み合わせたAd5[E1-,E2b-]-E6免疫化を提供する。Ad5[E1-,E2b-]-E6ワクチンによって誘導されるCMI応答は、小さい樹立された腫瘍対大きい樹立された腫瘍を処置する治療潜在力を評価するために、抗腫瘍応答の動態を示すと特徴付けられ得る。一部の実施形態は、抗腫瘍効果を増加させることができるPD-1遮断と組み合わせたAd5[E1-,E2b-]-E7免疫化を提供する。Ad5[E1-,E2b-]-E7ワクチンによって誘導されるCMI応答は、小さい樹立された腫瘍対大きい樹立された腫瘍を処置する治療潜在力を評価するために、抗腫瘍応答の動態を示すと特徴付けられ得る。
【０２０９】
免疫チェックポイント分子は、T細胞によって発現され得る。免疫チェックポイント分子は、免疫応答を下方調節又は阻害するための「ブレーキ」として効率的に機能できる。免疫チェックポイント分子には、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死1(PD-1、PDCD1又はCD279としても公知、受託番号:NM_005018)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4、CD152としても公知、GenBank受託番号AF414120.1)、LAG3(CD223としても公知、受託番号:NM_002286.5)、Tim3(HAVCR2としても公知、GenBank受託番号:JX049979.1)、BTLA(CD272としても公知、受託番号:NM_181780.3)、BY55(CD160としても公知、GenBank受託番号:CR541888.1)、TIGIT(IVSTM3としても公知、受託番号:NM_173799)、LAIR1(CD305としても公知、GenBank受託番号:CR542051.1)、SIGLECIO(GeneBank受託番号:AY358337.1)、2B4(CD244としても公知、受託番号:NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3が含まれるがこれらに限定されない。例えば、PD-1は、それを必要とする対象を処置するために、アデノウイルスワクチンと組み合わされ得る。表1は、徹底的ではないが、アデノウイルスワクチンの効率を改善するために不活性化され得る例示的な免疫チェックポイント遺伝子を示す。免疫チェックポイント遺伝子は、表1に列挙されたそのような遺伝子、並びに共阻害受容体機能、細胞死、サイトカインシグナル伝達、アルギニントリプトファン飢餓、TCRシグナル伝達、誘導されたT-reg抑制、転写因子制御性の消耗又はアネルギー、及び低酸素媒介性寛容に関与する他の遺伝子から選択され得る。
【０２１０】
【表１】
2019517522.tif 000003
【０２１１】
アデノウイルスベースのワクチン及び免疫経路チェックポイントモジュレーターの組合せは、いずれかの薬剤単独と比較して、処置された対象における癌再発の低減を生じ得る。なお別の実施形態では、アデノウイルスベースのワクチン及び免疫経路チェックポイントモジュレーターの組合せは、いずれかの薬剤単独と比較して、処置された対象における転移又は微小転移の存在又は出現の低減を生じ得る。別の実施形態では、アデノウイルスベースのワクチン及び免疫経路チェックポイントモジュレーターの組合せは、いずれかの薬剤単独と比較して、処置された対象における全生存の改善を生じ得る。一部の場合には、アデノウイルスワクチン及び免疫経路チェックポイントモジュレーターの組合せは、いずれかの薬剤単独と比較して、対象における腫瘍特異的T細胞応答の頻度又は強度を増加させ得る。
【０２１２】
一部の実施形態は、アデノウイルスベクターベースのワクチンの性能を改善するための免疫チェックポイント阻害の使用もまた開示する。この免疫チェックポイント阻害は、ワクチンの時点で投与され得る。この免疫チェックポイント阻害は、ワクチンの後にも投与され得る。免疫チェックポイント阻害は、アデノウイルスワクチン投与と同時に行われ得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50又は60分後に行われ得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24時間後にも行われ得る。一部の場合には、免疫阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6又は7日後に行われ得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の前又は後の任意の時点で行われ得る。
【０２１３】
別の態様では、抗原及び免疫経路チェックポイントモジュレーターを含むワクチンが提供される。一部の実施形態は、対象の細胞上の免疫チェックポイント、例えばPD-1、及びその天然の結合パートナーの下方調節から利益を得る状態を有する対象を処置する方法に関する。
【０２１４】
免疫経路チェックポイントモジュレーターは、任意の抗原をコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスワクチンと組み合わされ得る。例えば、抗原は、HPV E6及び/又はHPV E7であり得る。免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ワクチンと組み合わせた場合に相乗効果を生じ得る。免疫経路チェックポイントモジュレーターはまた、ワクチンと組み合わせた場合に相加効果を生じ得る。
【０２１５】
特定の実施形態では、チェックポイント免疫阻害剤は、任意選択で、化学療法又は任意の他の癌ケア若しくは治療、例えば、VEGF阻害剤、血管新生阻害剤、放射線、他の免疫治療、又は任意の適切な癌ケア若しくは治療と共に、任意の抗原をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと組み合わされ得る。
【０２１６】
B.ナチュラルキラー(NK)細胞
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターベースの組成物又は免疫療法と組み合わせてそれを必要とする対象に投与される、天然(native)又は操作されたNK細胞が提供され得る。
【０２１７】
免疫系は、感染症及び疾患からの保護においてそれ自体の別個の役割を各々が有する免疫細胞の多様なファミリーのタペストリーである。これらの免疫細胞には、身体の第1線の防御としてのナチュラルキラー即ちNK細胞がある。NK細胞は、他の支持分子による事前の曝露又は活性化なしに、異常な細胞、例えば、癌又はウイルス感染細胞を迅速に探索及び破壊する生得的な能力を有する。T細胞などの適応免疫細胞とは対照的に、NK細胞は、第1相臨床試験において細胞ベースの「既製の」処置として利用されており、癌に対する腫瘍死滅能を実証している。
【０２１８】
1.aNK細胞
天然(native)NK細胞に加えて、対象に投与するための、罹患細胞がNK細胞の死滅機能を逃れるために利用する場合が多いキラー阻害受容体(KIR)を発現しないNK細胞が提供され得る。この独自の活性化されたNK細胞即ちaNK細胞は、罹患細胞の選択的な標的化及び死滅を可能にする幅広い活性化受容体を保持しつつ、これらの阻害受容体を欠く。aNK細胞は、より大きいペイロードのグランザイム及びパーフォリン含有顆粒もまた保有し、それによって、はるかに大きいペイロードの致死酵素を複数の標的に送達することが可能になる。
【０２１９】
2.taNK細胞
現在開発中の最も新規の癌治療アプローチには、キメラ抗原受容体(CAR)テクノロジーがある。CARは、免疫エフェクター細胞が特異的表面抗原を示す癌細胞を標的することを可能にするタンパク質である。標的活性化ナチュラルキラー(target-activated Natural Killer)は、aNK細胞が癌上で見出されるタンパク質を標的化するために1つ以上のCARで操作されたプラットフォームであり、次いで、広いスペクトルのCARと一体化される。この戦略は、特に、拡張可能性、品質制御及び一貫性に関して、対象又はドナー供給されるエフェクター細胞、例えば、自己T細胞を使用する他のCARアプローチを超える複数の利点を有する。
【０２２０】
癌細胞死滅の多くは、ADCC(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性)に依存し、その際、エフェクター免疫細胞は、次に標的癌細胞に結合する抗体に結合し、それによって、エフェクター細胞による癌の死滅を促進する。NK細胞は、ADCCのための身体中の重要なエフェクター細胞であり、抗体を結合するために、特殊化した受容体(CD16)を利用する。
【０２２１】
3.haNK細胞
研究は、ヒト集団のおそらく20%のみが、CD16の「高親和性」バリアントを均一に発現することを示しており(haNK細胞)、これは、「低親和性」CD16を有する患者と比較した、より好ましい治療転帰と強く相関する。さらに、多くの癌患者は、化学療法、疾患自体又は他の因子に起因して、著しく弱まった免疫系を有する。
【０２２２】
ある特定の態様では、NK細胞は、高親和性CD16を発現するように改変される(haNK細胞)。このように、haNK細胞は、癌細胞に対する広いスペクトルの抗体の治療効力を強化し得、本明細書に記載される免疫療法又はベクターと組み合わせて使用され得る。
【０２２３】
C.共刺激分子
HPV抗原を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンの使用に加えて、共刺激分子がそのワクチンに取り込まれ得、免疫原性を増加させる。
【０２２４】
免疫応答の開始は、APCによるナイーブT細胞の活性化のために、少なくとも2つのシグナルを必要とする(Damleら、J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinanら、Blood 84:3261-82 (1994); Hellstromら、Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996); Hodgeら、Cancer Res 39:5800-07 (1999))。抗原特異的な第1のシグナルは、ペプチド/主要組織適合複合体(MHC)を介してT細胞受容体(TCR)を通じて送達され、T細胞を細胞周期に入らせる。第2の又は共刺激シグナルが、サイトカイン産生及び増殖のために送達され得る。
【０２２５】
専門の抗原提示細胞(APC)の表面上で通常見出される少なくとも3種の別個の分子が、T細胞活性化にとって重要な第2のシグナルを提供することが可能であると報告されている:B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)及びLFA-3(ヒトCD58)(Damleら、J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinanら、Blood 84: 3261-82 (1994); Wingrenら、Crit Rev Immunol 15: 235-53 (1995); Parraら、Scand. J Immunol 38: 508-14 (1993); Hellstromら、Ann NY Acad Sci 690: 225-30 (1993); Parraら、J Immunol 158: 637-42 (1997); Sperlingら、J Immunol 157: 3909 -17 (1996); Dubeyら、J Immunol 155: 45-57 (1995); Cavalloら、Eur J Immunol 25: 1154 -62 (1995))。
【０２２６】
これらの共刺激分子は、別個のT細胞リガンドを有する。B7-1は、CD28及びCTLA-4分子と相互作用し、ICAM-1は、CD11a/CD18(LFA-1/ベータ-2インテグリン)複合体と相互作用し、LFA-3は、CD2(LFA-2)分子と相互作用する。従って、ある特定の実施形態では、HPV抗原などの標的抗原をコードする1つ以上の核酸を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンと組み合わせた場合に、特異的標的抗原に対する抗腫瘍免疫応答をさらに増加/増強する、それぞれB7-1、ICAM-1及びLFA-3を含む組換えアデノウイルスベクターを有することが望ましい。
【０２２７】
X.免疫学的融合パートナー抗原標的
本明細書に記載されるウイルスベクター又は組成物は、標的抗原、例えば、HPV E6及び/若しくはE7抗原、又は本明細書で開示される任意の標的抗原の免疫原性を増加させることができるタンパク質、又は「免疫学的融合パートナー」をコードする核酸配列をさらに含み得る。これに関して、そのようなタンパク質を含むウイルスベクターによる免疫化後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質に融合された目的の標的抗原を含む融合タンパク質であり得る。さらに、HPV E6及び/又はE7抗原並びに免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、両方の治療部分の組合せが、HPV E6及び/若しくはE7抗原単独又は免疫学的融合パートナー単独をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターのいずれかよりも、免疫応答を相乗的にブーストするように作用するような、免疫応答のブーストを生じ得る。例えば、HPV E6及び/又はE7抗原並びに免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+T細胞の刺激、感染細胞死滅に向かうNK細胞応答の刺激、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞性貪食(ADCP)機構を介した感染細胞死滅に向かう好中球若しくは単球細胞応答の刺激、又はそれらの任意の組合せの相乗的増強を生じ得る。この相乗的ブーストは、それを必要とする対象への投与後に、生存転帰を大きく改善できる。ある特定の実施形態では、HPV E6及び/又はE7抗原並びに免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、対照と比較した、アデノウイルスベクターを投与した対象における、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の標的抗原特異的CTL活性における増加を含む免疫応答の生成を生じ得る。別の実施形態では、免疫応答を生成することは、対照と比較した、HPV E6及び/又はE7抗原並びに免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを投与した対象における、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、標的特異的CTL活性における増加を含む。さらなる実施形態では、免疫応答を生成することは、対照と比較した、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、サイトカイン分泌、例えば、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)又は他のサイトカインを測定するELISpotアッセイによって測定される、標的抗原特異的細胞性免疫活性における増加を含む。さらなる実施形態では、免疫応答を生成することは、適切な対照と比較した、本明細書に記載されるHPV E6及び/又はE7抗原並びに免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを投与した対象における、1.5倍と5倍との間の、標的特異的抗体産生における増加を含む。別の実施形態では、免疫応答を生成することは、対照と比較した、アデノウイルスベクターを投与した対象における、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、標的特異的抗体産生における増加を含む。
【０２２８】
さらなる一例として、標的エピトープ抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+T細胞の刺激、感染細胞死滅に向かうNK細胞応答の刺激、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞性貪食(ADCP)機構を介した感染細胞死滅に向かう好中球若しくは単球細胞応答の刺激、又はそれらの任意の組合せの相乗的増強を生じ得る。この相乗的ブーストは、それを必要とする対象への投与後に、生存転帰を大きく改善できる。ある特定の実施形態では、標的エピトープ抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、対照と比較した、アデノウイルスベクターを投与した対象における、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、標的抗原特異的CTL活性における増加を含む免疫応答の生成を生じ得る。別の実施形態では、免疫応答を生成することは、対照と比較した、標的エピトープ抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを投与した対象における、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、標的特異的CTL活性における増加を含む。さらなる実施形態では、免疫応答を生成することは、対照と比較した、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、サイトカイン分泌、例えば、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)又は他のサイトカインを測定するELISpotアッセイによって測定される、標的抗原特異的細胞性免疫活性における増加を含む。さらなる実施形態では、免疫応答を生成することは、適切な対照と比較した、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを投与した対象における、1.5倍と5倍との間の、標的特異的抗体産生における増加を含む。別の実施形態では、免疫応答を生成することは、対照と比較した、アデノウイルスベクターを投与した対象における、約1.5〜20倍又はそれより高い倍率の、標的特異的抗体産生における増加を含む。
【０２２９】
一実施形態では、そのような免疫学的融合パートナーは、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来Ra12断片など、マイコバクテリウム種(Mycobacterium)の種に由来する。マイコバクテリウム種に由来する免疫学的融合パートナーは、配列番号29〜配列番号37に示される配列のうちいずれか1つであり得る。異種ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列の発現及び/又は免疫原性を増強する際のそれらの使用のためのRa12組成物及び方法は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,009,042号に記載されている。簡潔に述べると、Ra12とは、結核菌MTB32A核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域を指す。MTB32Aは、毒性及び非毒性株の結核菌中の遺伝子によってコードされる32kDaのセリンプロテアーゼである。MTB32Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、記載されている(例えば、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,009,042号、Skeikyら、Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999)を参照のこと)。MTB32Aコード配列のC末端断片は、高レベルで発現され得、精製プロセスを通じて可溶性ポリペプチドとしてとどまる。さらに、Ra12は、それが融合する異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。Ra12融合ポリペプチドは、MTB32Aのアミノ酸残基192〜323に対応する14kDaのC末端断片を含み得る。他のRa12ポリヌクレオチドは、一般に、Ra12ポリペプチドの一部分をコードする、少なくとも約15、30、60、100、200、300又はそれより多くのヌクレオチドを含み得る。Ra12ポリヌクレオチドは、天然(native)配列(即ち、Ra12ポリペプチド又はその一部分をコードする内因性配列)を含んでもよく、そのような配列のバリアントを含んでもよい。Ra12ポリヌクレオチドバリアントは、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が、天然(native)Ra12ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して実質的に減退しないような、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含んでもよい。バリアントは、天然(native)Ra12ポリペプチド又はその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約70%、80%若しくは90%又はそれより高い同一性を有し得る。
【０２３０】
ある特定の態様では、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌インフルエンザB菌(Haemophilus influenzae B)の表面タンパク質であるプロテインDに由来し得る。プロテインDに由来する免疫学的融合パートナーは、配列番号38に示される配列であり得る。一部の場合には、プロテインD誘導体は、タンパク質のおよそ3分の1(例えば、N末端の最初の100〜110アミノ酸)を含む。プロテインD誘導体は、脂質付加されてもよい。ある特定の実施形態内では、リポプロテインD融合パートナーのこの最初の109残基は、ポリペプチドにさらなる外因性T細胞エピトープを提供するためにN末端上に含まれ、大腸菌における発現レベルを増加させ得、発現エンハンサーとして機能し得る。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にし得る。他の融合パートナーには、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、NS1(ヘマグルチニン)が含まれ得る。典型的には、N末端の81アミノ酸が使用されるが、T-ヘルパーエピトープを含む異なる断片を使用してもよい。
【０２３１】
ある特定の態様では、この免疫学的融合パートナーは、LYTAとして公知のタンパク質又はその一部分(特にC末端部分)であり得る。LYTAに由来する免疫学的融合パートナーは、配列番号39に示される配列であり得る。LYTAは、アミダーゼLYTA(LytA遺伝子によってコードされる)として公知のN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中のある特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリン又は一部のコリンアナログ、例えばDEAEに対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現のために有用な大腸菌C-LYTA発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ末端にC-LYTA断片を含むハイブリッドタンパク質の精製が使用され得る。別の実施形態内では、LYTAのリピート部分が融合ポリペプチド中に取り込まれてもよい。リピート部分は、例えば、残基178で始まるC末端領域中に見出すことができる。1つの特定のリピート部分は、残基188〜305を取り込む。
【０２３２】
一部の実施形態では、この標的抗原は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性構成要素」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーに融合される。標的抗原融合物は、IFN-γ、TNFα IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1及びMIFのうち1つ以上に対して実質的な同一性を有するタンパク質を生産し得る。この標的抗原融合物は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1及びMIFのうち1つ以上に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸をコードし得る。一部の実施形態では、この標的抗原融合物は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性構成要素」とも呼ばれる1つ以上の免疫学的融合パートナーをさらに含む。IFN-γの配列は、配列番号40に示される配列であり得るがこれに限定されない。TNFαの配列は、配列番号41に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-2の配列は、配列番号42に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-8の配列は、配列番号43に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-12の配列は、配列番号44に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-18の配列は、配列番号45に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-7の配列は、配列番号46に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-3の配列は、配列番号47に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-4の配列は、配列番号48に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-5の配列は、配列番号49に示される配列であり得るがこれに限定されない��IL-6の配列は、配列番号50に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-9の配列は、配列番号51に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-10の配列は、配列番号52に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-13の配列は、配列番号53に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-15の配列は、配列番号54に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-16の配列は、配列番号81に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-17の配列は、配列番号82に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-23の配列は、配列番号83に示される配列であり得るがこれに限定されない。IL-32の配列は、配列番号84に示される配列であり得るがこれに限定されない。
【０２３３】
一部の実施形態では、この標的抗原は、IFN-γ、TNFα IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性構成要素」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーに連結又は融合される。一部の実施形態では、この標的抗原は、IFN-γ、TNFα IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性構成要素」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーと共に、細胞中で共発現される。
【０２３４】
一部の実施形態では、この標的抗原は、CpG ODN(非限定的な例の配列は、配列番号55に示される)、コレラ毒素(非限定的な例の配列は、配列番号56に示される)、細菌ADPリボシル化外毒素に由来する短縮型Aサブユニットコード領域(非限定的な例の配列は、配列番号57に示される)、細菌ADPリボシル化外毒素に由来する短縮型Bサブユニットコード領域(非限定的な例の配列は、配列番号58に示される)、Hp91(非限定的な例の配列は、配列番号59に示される)、CCL20(非限定的な例の配列は、配列番号60に示される)、CCL3(非限定的な例の配列は、配列番号61に示される)、GM-CSF(非限定的な例の配列は、配列番号62に示される)、G-CSF(非限定的な例の配列は、配列番号63に示される)、LPSペプチド模倣物(非限定的な例の配列は、配列番号64〜配列番号75に示される)、志賀毒素(非限定的な例の配列は、配列番号76に示される)、ジフテリア毒素(非限定的な例の配列は、配列番号77に示される)又はCRM197(非限定的な例の配列は、配列番号80に示される)を含む免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。
【０２３５】
一部の実施形態では、この標的抗原は、IL-15スーパーアゴニストを含む免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。インターロイキン15(IL-15)は、ウイルス感染後に分泌される、天然に存在する炎症性サイトカインである。分泌されたIL-15は、エフェクター免疫細胞上のその同族受容体を介してシグナル伝達することによってその機能を実行し得、従って、エフェクター免疫細胞活性の全体的な増強をもたらし得る。
【０２３６】
IL-15が細胞性免疫応答を刺激し維持する広い能力に基づいて、IL-15は、ある特定の癌を潜在的に治癒できる有望な免疫療法薬物であると考えられる。しかし、IL-15の臨床開発における主要な制限には、標準的な哺乳動物細胞発現システムにおける低い生産収量及び短い血清半減期が含まれ得る。さらに、遊離IL-15サイトカインではなく、同じ細胞によって共発現されるタンパク質を含むIL-15:IL-15Rα複合体が、IL-15βγc受容体を保有する免疫エフェクター細胞の刺激を担い得る。
【０２３７】
これらの欠点に対処するために、IL-15Rβγcを結合する増加した能力及び増強された生物学的活性を有する新規IL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)を同定した。マウス又はヒトのいずれかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を等しいモル濃度のIL-15N72Dに添加することは、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、遊離IL-15サイトカインのものの10分の1より低いIL-15依存性細胞増殖を支持する中央値有効濃度(EC50)を示すような、IL-15の生物活性におけるさらなる増加を提供し得る。
【０２３８】
一部の実施形態では、このIL-15スーパーアゴニストは、新規IL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)であり得る。ある特定の実施形態では、マウス又はヒトのいずれかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を等しいモル濃度のIL-15N72Dに添加することは、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、遊離IL-15サイトカインのものの10分の1より低くなり得るIL-15依存性細胞増殖を支持する中央値有効濃度(EC50)を示すような、IL-15の生物活性におけるさらなる増加を提供し得る。
【０２３９】
従って、一部の実施形態では、本開示は、遊離IL-15サイトカインのIL-15依存性細胞増殖を支持するEC50の、2分の1より低い、3分の1より低い、4分の1より低い、5分の1より低い、6分の1より低い、7分の1より低い、8分の1より低い、9分の1より低い、10分の1より低い、15分の1より低い、20分の1より低い、25分の1より低い、30分の1より低い、35分の1より低い、40分の1より低い、45分の1より低い、50分の1より低い、55分の1より低い、60分の1より低い、65分の1より低い、70分の1より低い、75分の1より低い、80分の1より低い、85分の1より低い、90分の1より低い、95分の1より低い、又は100分の1より低いIL-15依存性細胞増殖を支持するEC50を有するIL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体を提供する。
【０２４０】
一部の実施形態では、このIL-15スーパーアゴニストは、ALT-803としても公知の、2つのIL-15N72D分子と可溶性IL-15Rα/Fc融合タンパク質のダイマーとの、生物学的に活性なタンパク質複合体である。ALT-803の組成物並びにALT-803を生産及び使用する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2015/0374790号に記載されている。N末端にいわゆる「スシ」ドメイン(Su)を含む可溶性IL-15Rα断片は、高親和性サイトカイン結合を担う構造的エレメントの大部分を保有し得ることが公知である。可溶性融合タンパク質は、ヒトIL-15RαSuドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を、Fcドメインを含むヒトIgG1 CH2-CH3領域(232アミノ酸)に連結することによって生成され得る。このIL-15RαSu/IgG1 Fc融合タンパク質は、IgG1ドメインを介したジスルフィド結合によるダイマー形成、及び標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィー法を使用した精製の容易さの利点を有し得る。
【０２４１】
一部の実施形態では、ALT-803は、ダイマー性IL-15Rαスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質に対する高い親和性と関連するヒトIL-15バリアントの2つのタンパク質サブユニットからなる可溶性複合体を有し得る。このIL-15バリアントは、ヘリックスCの72位にAsnからAspへの置換(N72D)を有する成熟ヒトIL-15サイトカイン配列を含む114アミノ酸のポリペプチドである。このヒトIL-15Rスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質は、Fcドメインを含むヒトIgG1 CH2-CH3領域(232アミノ酸)と連結したIL-15Rサブユニットのスシドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を含む。N72D置換は別として、タンパク質配列の全てはヒトである。これらのサブユニットのアミノ酸配列に基づいて、2つのIL-15N72Dポリペプチド(一例のIL-15N72D配列は、配列番号78に示される)及びジスルフィド連結されたホモダイマー性IL-l5RαSu/IgG1 Fcタンパク質(一例のIL-15RαSu/Fcドメインは、配列番号79に示される)を含む複合体の計算された分子量は、92.4kDaである。一部の実施形態では、標的抗原及びALT-803をコードする組換えベクターは、標的抗原をコードすると本明細書に記載される任意の配列を有し得、ALT-803をコードするように、配列番号78、配列番号78、配列番号79及び配列番号79を任意の順序で有し得る。他の実施形態では、IL-15スーパーアゴニスト、例えばALT-803は、標的抗原をコードする組換えベクターによる免疫化の前又は後に、別々の医薬組成物として投与され得る。さらなる実施形態では、IL-15スーパーアゴニスト、例えばALT-803は、タンパク質複合体として、又はタンパク質複合体をコードする組換えベクターとして、別々の医薬組成物中で投与され得る。
【０２４２】
各IL-15N720ポリペプチドは、およそ12.8kDaの計算された分子量を有し、IL-15RαSu/IgG1 Fc融合タンパク質は、およそ33.4kDaの計算された分子量を有する。IL-15N72D及びIL-15RαSu/IgG1 Fcタンパク質は共にグリコシル化され得、サイズ排除クロマトグラフィーによって、およそ114kDaのALT-803の見かけの分子量を生じる。ALT-803について決定された等電点(pI)は、およそ5.6から6.5までの範囲であり得る。従って、この融合タンパク質は、pH7で負に荷電し得る。
【０２４３】
HPV E6及び/又はE7並びにALT-803をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、両方の治療部分の組合せが、いずれかの治療単独よりも、免疫応答を相乗的にブーストするように作用するような、免疫応答のブーストを生じ得る。例えば、HPV E6及び/又はE7抗原並びにALT-803をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+T細胞の刺激、感染細胞死滅に向かうNK細胞応答の刺激、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)又は抗体依存性細胞性貪食(ADCP)機構を介した感染細胞死滅に向かう好中球又は単球細胞応答の刺激の相乗的増強を生じ得る。HPV E6及び/又はE7抗原並びにALT-803をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを用いた組合せ治療は、それを必要とする対象への投与後に、生存転帰を大きく改善するために、上記応答のいずれか1つ又は上記応答の組合せを相乗的にブーストできる。
【０２４４】
本明細書に記載される免疫原性増強剤のいずれも、本明細書に記載される任意の組換えベクターを使用して、同じ組換えベクター中で免疫原性増強剤及び標的抗原を発現させることによって、標的抗原に融合又は連結され得る。
【０２４５】
そのような免疫原性増強剤をコードする核酸配列は、配列番号29〜配列番号84のいずれか1つであり得、表2にまとめられる。
【０２４６】
【表２】
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【０２４７】
一部の実施形態では、標的抗原及び免疫学的融合パートナーの核酸配列は、いずれの核酸によっても分離されない。他の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列が、本明細書に記載される任意の標的抗原をコードする核酸配列と本明細書に記載される任意の免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列との間に挿入され得る。従って、ある特定の実施形態では、標的抗原、リンカー及び免疫学的融合パートナーを含むウイルスベクターによる免疫化後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原とその後のリンカーとを含み、免疫学的融合パートナーで終わる融合タンパク質であり得、こうして、標的抗原を、目的の標的抗原の免疫原性を増加させる免疫学的融合パートナーに、リンカーを介して連結する。一部の実施形態では、リンカー核酸の配列は、約1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長又は約10〜約50核酸長であり得る。一部の実施形態では、これらの核酸配列は、1つ以上のアミノ酸残基をコードし得る。一部の実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、約1〜約50又は約5〜約25アミノ酸残基長であり得る。一部の実施形態では、リンカーの配列は、10アミノ酸未満を含む。一部の実施形態では、このリンカーは、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、又はアラニン及びグリシンの両方を含むリンカーであり得る。
【０２４８】
そのようなリンカーをコードする核酸配列は、配列番号85〜配列番号99のいずれか1つであり得、表3にまとめられる。
【０２４９】
【表３】
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【０２５０】
XI.製剤
一部の実施形態は、単独で又は薬学的に許容される担体若しくは賦形剤と一緒に任意の経路によって投与され得るワクチン接種レジメンを含む医薬組成物を提供し、そのような投与は、単一の投薬量及び複数の投薬量の両方で実施され得る。より特には、この医薬組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハンドキャンディー(hand candy)、粉末、スプレー、水性懸濁物、注射可能な溶液、エリキシル、シロップなどの形態で、種々の薬学的に許容される不活性担体と組み合わされ得る。そのような担体には、固体希釈剤又はフィラー、無菌水性媒体及び種々の非毒性有機溶媒などが含まれる。さらに、そのような経口医薬製剤は、そのような目的のために一般に使用される型の種々の薬剤によって、適切に甘くされ及び/又は風味付けされ得る。至る所で記載される組成物は、医薬品へと製剤化され得、疾患、例えば癌と診断された、それを必要とするヒト又は哺乳動物を処置するために使用され得る。
【０２５１】
投与のために、ウイルスベクターストックは、適切な緩衝液、生理的に許容される担体、賦形剤などと組み合わされ得る。ある特定の実施形態では、適切な数のウイルス粒子(VP)が、適切な緩衝液、例えば、無菌PBS又は食塩水中で投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるベクター組成物は、皮下、非経口、静脈内、筋肉内又はさらには腹腔内投与のために、特定の製剤で提供される。ある特定の実施形態では、遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液中の製剤は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合された水中で調製され得る。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、スクアレンベースの乳濁物、スクアレンベースの水中油乳濁物、油中水乳濁物、水中油乳濁物、非水性乳濁物、パラフィン油中水乳濁物、及びそれらの混合物中で、並びに油中でも調製され得る。他の実施形態では、ウイルスベクターは、嚥下又は坐剤による丸剤形態投与のための特定の製剤で提供され得る。
【０２５２】
注射可能な使用に適切な例示的な医薬形態には、無菌水溶液又は分散物、及び無菌の注射可能な溶液又は分散物の即座の調製のための無菌粉末が含まれる(例えば、米国特許第5,466,468号を参照のこと)。容易な注射可能性(syringability)が存在する範囲の流体形態が好ましい場合がある。製造及び貯蔵の条件下で安定な形態が、一部の実施形態で提供される。種々の実施形態では、形態は、微生物、例えば、細菌、カビ及び真菌の混入作用に対して保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、及び/又は植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び/又は界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサールによって促進され得る。等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが適切であり得る。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０２５３】
一実施形態では、水溶液中での非経口投与のために、この溶液は、必要に応じて適切に緩衝され得、液体希釈剤は、十分な食塩水又はグルコースによって最初に等張にされ得る。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示の教示の下で当業者に公知となろう。例えば、1つの投薬量は、1mLの等張NaCl溶液中に溶解され得、1000mLの皮下点滴療法流体に添加され得るか、又は提案された注入部位で注射され得る(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035-1038頁及び1570-1580頁を参照のこと)。投薬量におけるいくらかの変動が、処置されている対象の状態に依存して生じ得る。
【０２５４】
製剤の担体は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどを含み得る。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的活性成分もまた、組成物中に取り込まれ得る。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、これらのウイルスベクターは、1つ以上の免疫刺激薬、例えば、アジュバントと併せて投与され得る。免疫刺激薬とは、抗原に対する免疫応答(抗体及び/又は細胞性)を増強又は強化する本質的に任意の物質を指す。免疫刺激薬の1つの型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウム又は鉱油、及び免疫応答の刺激因子、例えば、リピドA、百日咳菌(Bortadella pertussis)又は結核菌由来タンパク質を含む。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、以下の市販のアジュバントのいずれかと併せて投与され得る:フロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories);Merckアジュバント65(Merck and Company, Inc.)AS-2(SmithKline Beecham);アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル(alum)又はリン酸アルミニウム;カルシウム、鉄又は亜鉛の塩;アシル化チロシンの不溶性懸濁物;アシル化糖;カチオン性又はアニオン性誘導体化多糖;ポリホスファゼン;生分解性ミクロスフェア;モノホスホリルリピドA並びにquil A。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、アジュバントとしてのサイトカイン、例えば、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23及び/又はIL-32などの増殖因子と併せて投与され得る。
【０２５６】
ある特定の実施形態内では、このアジュバント組成物は、Th1型優位な免疫応答を誘導するアジュバント組成物であり得る。高レベルのTh1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2及びIL-12)は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10)は、体液性免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。本明細書で提供されるワクチンの適用後、対象は、Th1及び/又はTh2型応答を含む免疫応答を支持し得る。応答がTh1型優位である、ある特定の実施形態内では、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルよりも高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを使用して容易に評価され得る。従って、種々の実施形態は、複製欠損ウイルスベクター処置と同時発生的に供給されるサイトカイン、例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13及び/又はIL-15を使用して、標的抗原、例えば、HPV E6及び/又はHPV E7に対する免疫応答を生じさせる治療に関する。一部の実施形態では、サイトカイン又はサイトカインをコードする核酸は、本明細書に記載される複製欠損ウイルスと一緒に投与される。一部の実施形態では、サイトカイン投与は、ウイルスベクター投与の前に又はそれに引き続いて実施される。一部の実施形態では、標的抗原、例えば、HPV E6及び/又はHPV E7に対する免疫応答を生じさせることが可能な複製欠損ウイルスベクターは、サイトカインをコードする配列をさらに含む。
【０２５７】
Th1型優位な応答を惹起するためのある特定の例示的なアジュバントには、例えば、アルミニウム塩と合わせた、モノホスホリルリピドA、例えば、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAの組合せが含まれる。MPL(登録商標)アジュバントは、市販されている(例えば、米国特許第4,436,727号、同第4,877,611号、同第4,866,034号及び同第4,912,094号を参照のこと)。CpG含有オリゴヌクレオチド(CpGジヌクレオチドはメチル化されていない)もまた、Th1優位な応答を誘導する(例えば、WO96/02555、WO99/33488並びに米国特許第6,008,200号及び同第5,856,462号を参照のこと)。免疫刺激DNA配列もまた使用され得る。使用のための別のアジュバントは、サポニン、例えば、Quil A、若しくはQS21及びQS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)を含むその誘導体、エスチン;ジギトニン;又はカスミソウ属(Gypsophila)若しくはキノア(Chenopodium quinoa)サポニンを含む。他の製剤は、アジュバント組合せ、例えば、QS21、QS7、Quil A、β-エスチン又はジギトニンを含む以下の群のうち少なくとも2種の組合せで、1種よりも多いサポニンを含み得る。
【０２５８】
一部の実施形態では、これらの組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び/又は他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。鼻腔内微粒子樹脂及びリゾホスファチジル-グリセロール化合物を使用する薬物の送達が使用され得る(例えば、米国特許第5,725,871号を参照のこと)。同様に、ポリテトラフルオロエチレン(polytetrafluoroetheylene)支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達が使用され得る(例えば、米国特許第5,780,045号を参照のこと)。
【０２５９】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などは、適切な宿主細胞/生物中への組成物の導入のために使用され得る。本明細書に記載される組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア又はナノ粒子などのいずれか中にカプセル化されて、送達のために製剤化され得る。或いは、本明細書に記載される組成物は、そのような担体ビヒクルの表面に、共有結合又は非共有結合のいずれかで結合され得る。リポソームは、種々の培養細胞株及び動物中に、遺伝子、種々の薬物、放射線療法剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを導入するために効率的に使用され得る。さらに、リポソームの使用は、全身的送達後に、自己免疫応答又は許容できない毒性とは関連しないようである。一部の実施形態では、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、多重層同心性二層小胞(即ち、多重層小胞(MLV))を自発的に形成する。
【０２６０】
一部の実施形態では、組成物の薬学的に許容されるナノカプセル製剤が提供される。ナノカプセルは一般に、安定かつ再現性のある方法で化合物を捕捉できる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微細粒子(およそ0.1μmのサイズ)が、in vivoで分解できるポリマーを使用して設計され得る。
【０２６１】
これらの組成物は、一部の実施形態では、化学療法剤(例えば、癌の処置において有用な化学的化合物)を含む、又はそれと共に投与される。開示されたT細胞と組み合わせて使用され得る癌化学療法剤には、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びNavelbine(商標)(ビノレルビン、5'-ノルアンヒドロブラスチン(5'-noranhydroblastine));トポイソメラーゼI阻害剤、例えば、カンプトテシン化合物(例えば、Camptosar(商標)(イリノテカンHCL)、Hycamtin(商標)(トポテカンHCL)、並びにカンプトテシンに由来する他の化合物及びそのアナログ);ポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシド、テニポシド及びミトポドジド(mitopodozide);アルキル化剤、例えば、シスプラチン又はカルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド(trimethylene thiophosphoramide)、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン(belustine)、ウラシルマスタード、クロマファジン(chlomaphazin)及びダカルバジン;代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン(azathioprime)及びプロカルバジン;抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC(mytomycin C)及びダウノマイシン;抗腫瘍抗体;ダカルバジン;アザシチジン;アムサクリン;メルファラン;イホスファミド;並びにミトキサントロンが含まれるがこれらに限定されない。
【０２６２】
本明細書で開示される組成物は、細胞傷害剤/抗新生物剤及び抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与され得る。細胞傷害剤/抗新生物剤は、癌細胞を攻撃し死滅させる薬剤として定義できる。一部の細胞傷害剤/抗新生物剤は、腫瘍細胞中の遺伝子材料をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン及びダカルバジン(dacabazine)であり得る。他の細胞傷害剤/抗新生物剤は、腫瘍細胞に対する代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン(mercaptopuirine)、アザチオプリン及びプロカルバジンであり得る。他の細胞傷害剤/抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC及びダウノマイシンであり得る。これらの化合物について、市販される多数のリポソーム製剤が存在する。なお他の細胞傷害剤/抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)であり得る。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びエトポシドが含まれる。種々の細胞傷害剤/抗新生物剤には、タキソール及びその誘導体、L-アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、VM-26、イホスファミド、ミトキサントロン並びにビンデシンが含まれる。
【０２６３】
抗血管新生剤もまた使用され得る。開示された方法及び組成物での使用のための適切な抗血管新生剤には、ヒト化及びキメラ抗体を含む抗VEGF抗体、抗VEGFアプタマー並びにアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。血管新生の他の阻害剤には、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1(α及びβを含む)、インターロイキン12、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼの組織阻害剤-1及び-2(TIMP-1及び-2)が含まれる。トポイソメラーゼ、例えば、抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼII阻害剤であるラゾキサンを含む小分子もまた使用され得る。
【０２６４】
ある特定の態様では、IL-15を含む医薬組成物は、本明細書で提供される1つ以上の治療、特に、1つ以上の標的抗原、例えば、本明細書に記載されるHPV抗原をコードする核酸配列を含む1つ以上のアデノウイルスベクターと組み合わせて、それを必要とする対象に投与され得る。
【０２６５】
インターロイキン15(IL-15)は、IL-2との構造的類似性を有するサイトカインである。IL-2と同様に、IL-15は、IL-2/IL-15受容体ベータ鎖(CD122)及び共通のガンマ鎖(ガンマ-C、CD132)から構成される複合体に結合し、それを介してシグナル伝達する。IL-15は、ウイルスによる感染後、単核食細胞(及び一部の他の細胞)によって分泌される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞;ウイルス感染細胞を死滅させることがその主要な役割である自然免疫系の細胞、の細胞増殖を誘導する。
【０２６６】
IL-15は、前臨床モデルにおいて、CD8+T細胞の抗腫瘍免疫を増強できる。転移性黒色腫及び腎細胞癌(腎臓癌)を有する患者においてIL-15の安全性、投薬及び抗腫瘍効力を評価するための第I相臨床試験は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)で患者を登録し始めている。本明細書で開示されるIL-15には、その天然(native)形態の機能を維持するように改変されたIL-15の変異体もまた含まれ得る。
【０２６７】
IL-15は、第4染色体の34kb領域4q31によって、マウスでは第8染色体の中心領域によってコードされる、14〜15kDaの糖タンパク質である。ヒトIL-15遺伝子は、9つのエクソン(1〜8及び4A)及び8つのイントロンを含み、そのうち4つ(エクソン5〜8)は、成熟タンパク質をコードする。同じタンパク質をコードするこの遺伝子の2つのオルタナティブスプライシングされた転写物バリアントが報告されている。48アミノ酸の長いシグナルペプチドを有する最初に同定されたアイソフォーム(IL-15 LSP)は、316bpの5'非翻訳領域(UTR)、486bpのコード配列及びC末端の400bpの3'UTR領域からなった。他のアイソフォーム(IL-15 SSP)は、エクソン4A及び5によってコードされる21アミノ酸の短いシグナルペプチドを有する。両方のアイソフォームは、N末端のシグナル配列間で、11アミノ酸を共有する。両方のアイソフォームが同じ成熟タンパク質を産生するが、これらは、細胞内輸送が異なる。IL-15 LSPアイソフォームは、ゴルジ体[GC]、初期エンドソーム及び小胞体(ER)において同定された。これは、特に樹状細胞上で、2つの形態、分泌型及び膜結合型で存在する。他方で、IL-15 SSPアイソフォームは分泌されず、細胞質及び核に制限されるようであり、この場所で、細胞周期の調節において重要な役割を果たす。
【０２６８】
IL-15 mRNAの2つのアイソフォームが、マウスにおいてオルタナティブスプライシングによって生成されることが実証されている。別の3'スプライシング部位を含むオルタナティブなエクソン5を有するアイソフォームは、高い翻訳効率を示した。その産物は、N末端のシグナル配列中の疎水性ドメインを欠く。これは、このアイソフォームに由来するタンパク質が、細胞内に位置することを示唆している。オルタナティブなエクソン5の一体的スプライシング(integral splicing)によって生成される、正常なエクソン5を有する他のアイソフォームは、細胞外に放出され得る。
【０２６９】
IL-15 mRNAは、マスト細胞、癌細胞又は線維芽細胞を含む多くの細胞及び組織において見出すことができ、このサイトカインは、主に樹状細胞、単球及びマクロファージによって、成熟タンパク質として産生される。IL-15 mRNAの広い出現とタンパク質の限定的な産生との間のこの矛盾は、IL-15 mRNAの翻訳を抑制できる、ヒトでは12、マウスでは5の上流開始コドンの存在によって説明され得る。翻訳不活性なmRNAは、細胞内に貯蔵され、特異的シグナルによって誘導され得る。IL-15の発現は、サイトカイン、例えばGM-CSF、二本鎖mRNA、非メチル化CpGオリゴヌクレオチド、Toll様受容体(TLR)を介したリポポリサッカリド(LPS)、インターフェロンガンマ(IFN-γ)によって、又は単球ヘルペスウイルス、結核菌及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の感染後に、刺激され得る。
【０２７０】
XII.調製の方法
一部の実施形態では、組成物及び方法は、ヒト細胞傷害性T細胞(CTL)、例えば、選択されたMHC分子、例えば、HLA-A2、HLA-A3及びHLA-A24に結合するHPV E6及び/又はHPV E7エピトープを認識するものを使用する。ある特定の血清型、例えば、HLA-A2、HLA-A3及びHLA-A24のMHC分子を発現する対象は、本明細書に記載される方法及び組成物を使用する治療のために選択され得る。例えば、ある特定の血清型、例えば、HLA-A2、HLA-A3及びHLA-A24のMHC分子を発現する対象は、本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、HPV E6及び/又はHPV E7に対する免疫応答を生じさせることを含む治療のために選択され得る。
【０２７１】
種々の実施形態では、これらのT細胞は、末梢血単核球を刺激するために目的のエピトープでパルスした抗原提示細胞を使用して、in vitro培養によって生成され得る。さらに、T細胞株は、HPV E6及び/若しくはHPV E7ラテックスビーズ、HPV E6及び/若しくはHPV E7タンパク質パルスしたプラスチック接着性末梢血単核球、又はHPV E6及び/若しくはHPV E7 RNAで感作したDCによる刺激後にも生成され得る。T細胞は、HPV E6及び/又はHPV E7免疫原をコードするワクチンベクターで免疫化された対象からも生成され得る。
【０２７２】
一部の実施形態は、ワクチンHPV E6及び/又はHPV E7で免疫化された癌患者由来のCTLを刺激する能力を有する、HPV E6及び/又はHPV E7のHLA-A2拘束されたエピトープに関する。これらの配列は、T細胞受容体による認識を増強するアミノ酸変化を生じるヘテロクリティック(非アンカー位置)変異を含む。一部の実施形態は、HPV E6の1つ以上の位置(例えば、26、98、106)、HPV E7の1つ以上の位置(例えば、86)、又はそれらの組合せにおいてアミノ酸変化を取り込む。非変異抗原と比較して、アゴニストエピトープの取り込みは、CTLの感作を100〜1000倍増強できる。従って、そのようなバリアント抗原をコードするHPV E6及びHPV E7核酸配列が、一部の実施形態において提供される。
【０２７３】
XIII.HPV関連疾患を処置する方法
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象において免疫応答を増強する方法であって、HPV抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップ;及び免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、この方法は、HPV感染症又はHPV関連疾患、例えば、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、口腔咽頭・扁桃癌、子宮頸癌、陰茎癌、外陰癌又は肛門癌が含まれるがこれらに限定されないHPV関連癌を処置するとさらに定義され得る。
【０２７４】
A.ヒトパピローマウイルス(HPV)関連HNSCC
証拠は、高リスクHPV16による感染が、HPV関連HNSCCの発達及び進行と関連すること、並びにより具体的には、HPV初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子が、癌の発達に寄与することを実証している。米国における頭頸部癌の有病率は、約370,000と推定され、これらのうち25%〜38%は、HPV関連HNSCCである。従って、HPV関連HNSCCの有病率は、92,750〜140,000症例の範囲と推定される。HPV関連HNSCCに関する最近の研究は、米国において約35,000の新たな症例の発生率を推定しており、現在の治療にもかかわらず、年間7,600の癌関連死が予測される。従って、この患者集団のための新たな処置方法を調査する医学的要求は、いまだ満たされていない。HPV関連HNSCCの推定有病率に基づいて、この集団は、FDAによって希少疾病用製品薬物開発のために適格とされており、Etubicsは、HPV関連HNSCCを処置するための新たな免疫療法ワクチン(Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7)の開発のための希少疾病用製品指定を受けている。
【０２７５】
B.HIV及びHPV関連口腔咽頭・扁桃癌
ヒトパピローマウイルス(HPV)は、1年間に世界中で100,000症例もの多くの頭頸部扁平上皮癌(HNSSC)の原因である。これらの大部分は、口腔咽頭・扁桃癌である。米国では、中咽頭HPV感染症の有病率推定は、9.2〜18.6パーセントの範囲である。HPV16型(HPV16)は、口腔癌において見出される最も蔓延したHPVであり、これらの癌の病因に関与する。米国での扁桃腺癌の発生率は、1973年から1995年まで、1年に2〜3%増加した。HIV感染対象は、口腔咽頭・扁桃癌を発達させるリスクが2〜6倍増加する。AIDSの治療における顕著な進歩にもかかわらず、このパンデミックは、世界中で、特に、抗レトロウイルス薬物療法へのアクセスが限定された地域で、壊滅的な罹患率及び死亡率の原因であり続けている。HIVを制御するための強力な組合せ治療及び高度に活性な抗レトロウイルス治療の導入は、HPV関連口腔疾患に対して有益な効果をほとんど有しないようであるので、HPV感染症及び疾患は、劇的には減退していない。従って、HIV及びHIV関連悪性腫瘍に適用できる新たなワクチンを調査することはいまだに必要である。
【０２７６】
ある特定の態様は、HPVの病原的役割に基づいたHIV関連悪性腫瘍のための治療戦略を提供する。使用されるワクチンは、本明細書に記載される新たな組換えアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクタープラットフォーム(Ad5[E1-,E2b-])に基づく。この組換えベクターは、抗原提示細胞の直接的トランスフェクション後に発現される特定の疾患関連抗原遺伝子の挿入を可能にする。重要なことに、この新たなワクチンは、特異的標的抗原に対する強力な細胞性免疫(CMI)応答を刺激するように設計された複数回の相同免疫化レジメンにおいて利用され得、HIV/HPV関連口腔咽頭・扁桃悪性腫瘍との闘いにおける重要な免疫療法剤になる潜在力を有している。
【０２７７】
HPV関連HNSCCを有する患者には、多面的処置が投与され、Ad5[E1-,E2b-]-E6ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E7ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを用いた免疫療法は、この疾患に対する処置の医療設備において重要な役割を果たし得る。
【０２７８】
C.HPV関連子宮頸癌
子宮頸癌は、女性の癌関連死の2番目に多い原因である。発癌性ヒトパピローマウイルス(HPV)は、肛門生殖器癌において重要な病原学的役割を果たし、子宮頸癌の少なくとも70%が、16型(HPV-16)又は18型(HPV-18)と関連することが公知である。HPV-16及び18は、外陰及び腟前癌の大部分が関連するウイルス型でもある。外陰部上皮内新生物は、高リスク型のヒトパピローマウイルス(HPV)によって引き起こされる外陰部皮膚の慢性前悪性障害である。HPV-16は、75%よりも多くの症例に関与する。女性がいずれかのHPV感染症を獲得する生涯リスクは、80%よりも高い。女性の半分は、性活動を開始して3年以内に子宮頸感染を獲得する。HPV感染症の約90%は、6〜24カ月以内に免疫系によって除去される。性的に活発な女性におけるHPV感染症の有病率は、10〜20%であり、若い女性ではさらにいっそう高い。HPV-16/18二価(Cervarix)及びHPV-6/11/16/18四価(Gardasil)ワクチンは、ワクチン接種の時点でHPV陰性である女性においてワクチン型HPV関連生殖器前癌を予防する際に高度に有効である。これらのワクチンは、HPV感染症の予防に高度に有効であるが、ワクチン接種されておらず、HPV感染する、従って、新生物を発達させる高いリスクがある女性の集団が、なおも存在する。最近のメタ分析研究では、以前のワクチン型HPV曝露の証拠を有する女性に与えられた上記HPVワクチンが、3〜4年の時間枠でこれらのHPV型と関連する前悪性病変を予防できるということは示されなかった。それは、HPV関連癌の発達を予防するように設計されたこの新たなアデノウイルスワクチン(Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E6ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E7ワクチン)によるワクチン接種から利益を受けると考えられる女性のこの集団である。
【０２７９】
XIV.HPV陽性対象においてHPV陽性細胞を低減させる方法
ある特定の実施形態では、本開示は、予防の時点で、又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E6ワクチン及び/若しくはAd5[E1-,E2b-]-E7ワクチンを投与する前にHPV陽性であるか又はHPV誘導性癌を発達させるリスクがある対象において、HPV感染症を低減させる又はHPV誘導性癌の発達を予防する方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるHPV-E6/E7ワクチン、HPV-E6ワクチン及び/又はHPV E7ワクチンの投与は、HPV感染細胞を破壊でき、それによって、HPV誘導性癌の発達を予防できる。ある特定の実施形態では、これらの対象は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン、Ad5[E1-,E2b-]-E6ワクチン及び/又はAd5[E1-,E2b-]-E7ワクチンを投与するステップの前に、HPV誘導性若しくはHPV関連癌を有しない、又はHPV誘導性若しくはHPV関連癌を有しないと決定される。
【０２８０】
性行為感染症(STI)のうち、HPVは、最も頻繁に広がったウイルスである。HPV感染症の症状は、気づかれず、疾患状態の認識を伴わない伝播をもたらし得る。HPV感染症は、慢性疾患、例えば、生殖器疣贅及び癌を生じ得る。HPV感染症の割合を低減させることは、予防的ワクチン接種を通じて達成され得る。しかし、一部の場合には、既存のワクチンによるワクチン接種前に、HPV感染が生じ得、癌の発達をもたらし得るHPV癌遺伝子の発現及び増殖を生じ得る。例えば、HPV感染は、感染並びに初期6(E6)及び/又は初期7(E7)癌遺伝子の発現をもたらす、HPV16型若しくはHPV18型、又はそれらの組合せであり得る。HPVに対するワクチン接種は、E6及びE7を含むHPV癌遺伝子の増殖を予防する際に使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫療法、Ad5[E1-,E2b-]-E6免疫療法及び/又はAd5[E1-,E2b-]-E7免疫療法は、HPV陽性対象をワクチン接種するために予防的に投与され得、HPV誘導性又はHPV関連癌の発達を引き起こし得るHPV感染症を低減又は排除し得る。ある特定の態様では、HPV陽性細胞の低減は、タンパク質又は核酸検出のための当技術分野で利用可能な任意の方法、例えばPCRによって、決定され得る。
【０２８１】
XV.投薬量及び投与
本明細書に記載される組成物及び方法は、HPV関連癌を予防するため、又はHPV関連癌若しくは疾患の処置のために、HPV E6/E7発現細胞を低減、破壊又は排除することによるHPV感染症の低減のためのワクチン接種の間の種々の投薬量及び投与レジメンを企図する。対象は、対象において本明細書に記載される標的抗原に対する免疫応答を生じさせることが可能な1つ以上の複製欠損アデノウイルス又はアデノウイルスベクター、例えば、Ad5[E1-,E2B-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7を受けることができる。種々の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、そのような免疫応答をもたらすのに適切な用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×108のウイルス粒子〜約5×1013のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×109〜約5×1012のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×108のウイルス粒子〜約5×108のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約5×108のウイルス粒子〜約1×109のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×109のウイルス粒子〜約5×109のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約5×109のウイルス粒子〜約1×1010のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1010のウイルス粒子〜約5×1010のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約5×1010のウイルス粒子〜約1×1011のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1011のウイルス粒子〜約5×1011のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約5×1011のウイルス粒子〜約1×1012のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1012のウイルス粒子〜約5×1012のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約5×1012のウイルス粒子〜約1×1013のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1013のウイルス粒子〜約5×1013のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×108のウイルス粒子〜約5×1010のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1010のウイルス粒子〜約5×1012のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1011のウイルス粒子〜約5×1013のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×108のウイルス粒子〜約1×1010のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1010のウイルス粒子〜約1×1012のウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり約1×1011のウイルス粒子〜約5×1013のウイルス粒子の用量で投与される。一部の場合には、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、のウイルス粒子(VP)よりも多い若しくはそれと等しい用量又はそれより多くで投与される。一部の場合には、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、のウイルス粒子よりも少ない若しくはそれと等しい用量又はそれより多くで投与される。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、単一の用量で上記用量のいずれかで製剤化又は投与され得る。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化のための単一の用量当たり、1×109〜3×1012、1×109〜1×1011又は5×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の濃度で製剤化及び投与され得る。一部の場合には、この複製欠損アデノウイルスは、免疫化1回当たり10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg又はそれより多くのウイルス粒子の用量で投与される。種々の実施形態では、本明細書に記載される望ましい用量は、適切な体積の製剤化緩衝液、例えば、約0.1〜10mL、0.2〜8mL、0.3〜7mL、0.4〜6mL、0.5〜5mL、0.6〜4mL、0.7〜3mL、0.8〜2mL、0.9〜1.5mL、0.95〜1.2mL又は1.0〜1.1mLの体積中で投与される。当業者は、この体積が、これらの値のいずれかによって境界される任意の範囲(例えば、約0.5mL〜約1.1mL)内に入り得ることを理解する。ウイルス粒子の投与は、送達のための種々の適切な経路を介し得、例えば、注射(例えば、皮内(intradermally)、皮内(intracutaneously)、筋肉内、静脈内又は皮下)によって、鼻腔内で(例えば、吸引によって)、丸剤形態(例えば、嚥下、腟又は直腸送達のための坐剤)で、であり得る。一部の実施形態では、皮下送達が好まれ得、樹状細胞へのより良いアクセスを提供できる。
【０２８２】
対象へのウイルス粒子の投与は、反復してもよい。ウイルス粒子の反復送達は、スケジュールに従ってもよく、或いは、必要に応じて実施してもよい。例えば、標的抗原、例えば、HPV E6及び/又はHPV E7に対する対象の免疫が試験され得、必要に応じてさらなる送達が補充され得る。一部の実施形態では、送達のためのスケジュールは、一定の間隔でのウイルス粒子の投与を含む。スケジュールを用いる期間及び/又は投与前に評価した必要性ベースの投与の期間のうち1つ以上を含む統合送達レジメンが設計され得る。例えば、治療レジメンは、投与、例えば、3週間毎、4週間毎、5週間毎、6週間毎、7週間毎、8週間毎、9週間毎、10週間毎、11週間毎、12週間毎、13週間毎、14週間毎、15週間毎、16週間毎、17週間毎、18週間毎、19週間毎又は20週間毎に1回の皮下投与、次いで、死を含むいずれかの理由のために治療から除外されるまで3カ月毎の別の免疫療法処置を含み得る。別の例のレジメンは、3週間毎、4週間毎、5週間毎、6週間毎、7週間毎、8週間毎、9週間毎、10週間毎、11週間毎、12週間毎、13週間毎、14週間毎、15週間毎、16週間毎、17週間毎、18週間毎、19週間毎又は20週間毎に3回の投与、次いで、3カ月毎の別のセットの3回の免疫療法処置を含む。別の例のレジメンは、第1の頻度での第1の回数の投与を含む第1の期間、第2の頻度での第2の回数の投与を含む第2の期間、第3の頻度での第3の回数の投与を含む第3の期間など、及び任意選択で、必要に応じて未定の回数の投与を含む1つ以上の期間を含む。各期間中の投与の回数は、独立して選択され得、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回又はそれより多くであり得る。各期間中の投与の頻度もまた独立して選択され得、例えば、約毎日、1日おきに、2日おきに、1週間に2回、1週間に1回、1週間おきに1回、3週間毎、毎月、6週間毎、1カ月おきに、2カ月おきに、3カ月おきに、4カ月おきに、5カ月おきに、1年に1回などであり得る。この免疫化レジメンは、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36カ月間又はそれより長い合計期間かかり得る。免疫化間の予定された間隔は、免疫化間の間隔がその間隔の最大で5分の1、4分の1、3分の1又は半分だけ修正されるように改変され得る。例えば、3週間間隔のスケジュールについて、免疫化は、20日と28日との間(3週間-1日〜3週間+7日)に反復され得る。最初の3回の免疫化について、2回目及び/又は3回目の免疫化が遅延される場合、引き続く免疫化はシフトされて、免疫化間の最小量の緩衝を可能にし得る。例えば、3週間間隔のスケジュールについて、免疫化が遅延される場合、引き続く免疫化は、以前の免疫化の17、18、19又は20日後よりも前には生じないように予定され得る。一部の実施形態では、ブースター免疫化が、上記一次ワクチン免疫化のいずれかの後に投与され得る。一部の実施形態では、治療有効量を投与するステップに、一次免疫化と同じ組成物又は医薬組成物を含む1回以上のブースター免疫化が続く。一部の態様では、このブースター免疫化は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは12カ月毎、又はそれより長い期間毎に投与される。一部の態様では、このブースター免疫化は、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは12回又はそれより多く反復される。一部の態様では、治療有効量を投与するステップは、一次免疫化を、1、2又は3週間毎に、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは12回又はそれより多くにわたって反復し、それに続いて、ブースター免疫化を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは12カ月毎、又はそれより長い期間毎に3回以上反復することである。
【０２８３】
組成物、例えば、Ad5[E1-,E2B-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及びAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7ウイルス粒子は、種々の状態で、例えば、室温で、氷上で、又は凍結されて提供され得る。組成物は、適切なサイズの容器、例えば、2mLバイアルのバイアル中で提供され得る。一実施形態では、1.0mLの抽出可能なワクチンを含む2mlバイアルは、5×1011の総ウイルス粒子/mLを含む。温度及び湿度を含む貯蔵条件は変動してもよい。例えば、治療における使用のための組成物は、室温、4℃、-20℃又はより低い温度で貯蔵してもよい。
【０２８４】
一態様では、組成物の投与のためにヒトを選択する方法であって、ヒトのHLAサブタイプを決定するステップ;そのHLAサブタイプがHLAサブタイプの予め選択されたサブグループのうちの1つであると決定される場合に、組成物をそのヒトに投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、HLAサブタイプのこの予め選択されたサブグループは、HLA-A2、HLA-A3及びHLA-A24のうち1つ以上を含む。
【０２８５】
一態様では、癌又は感染性疾患についてヒトを処置する方法であって、組換えウイルスベクターをヒトに投与するステップを含む方法が提供される。
【０２８６】
一態様では、ヒトにおいてHPV E6、HPV E7、又はそれらの組合せに対する免疫応答を生成する方法であって、組成物をヒトに投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、投与するステップは、少なくとも1回反復される。一部の実施形態では、投与するステップは、以前の投与するステップの約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20週間後に反復される。一部の実施形態では、投与するステップは、以前の投与するステップの約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24カ月後に反復される。一部の実施形態では、投与するステップは2回反復される。
【０２８７】
種々の実施形態では、一般的評価が、本明細書に記載される方法及び組成物に従う処置を受けている対象に対して実施される。任意の試験の1つ以上が、必要に応じて、又は例えば、0、3、6週目などに、スケジュールベースで実施され得る。異なるセットの試験が、免疫化なしの時点に対して、免疫化と同時発生的に実施され得る。
【０２８８】
一般的評価は、病歴、ECOGパフォーマンススコア、カルノフスキーパフォーマンスステータス、及び担当医が重みづけした人間ドックのうち1つ以上を含み得る。対象が受けている又は最後の来診以降に受けた任意の他の処置、薬物療法、生物製剤又は血液製剤が記録され得る。対象は、任意の有害反応についてモニタリングするために、ワクチンを投与された後適切な期間、例えば、およそ30分間にわたってクリニックで追跡され得る。各用量のワクチン後の局所的及び全身的反応源性は、選択された時間、例えば、3日間(免疫化の当日及びその後2日間)にわたって毎日評価される。症状を報告するためにダイアリーカードが使用され得、局所的反応源性を測定するために定規が使用され得る。免疫化注射部位が評価され得る。胸部、腹部及び骨盤のCTスキャン又はMRIが実施され得る。
【０２８９】
種々の実施形態では、血液学的及び生化学的評価が、本明細書に記載される方法及び組成物に従う処置を受けている対象に対して実施される。任意の試験の1つ以上が、必要に応じて、又は例えば、0、3、6週目などに、スケジュールベースで実施され得る。異なるセットの試験が、免疫化なしの時点に対して、免疫化と同時発生的に実施され得る。血液学的及び生化学的評価は、化学及び血液学についての血液試験、鑑別を伴うCBC(CBC with differential)、Na、K、Cl、CO2、BUN、クレアチニン、Ca、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、AST、ALT、グルコース並びにANAのうち1つ以上を含み得る。
【０２９０】
種々の実施形態では、生物学的マーカーが、本明細書に記載される方法及び組成物に従う処置を受けている対象に対して評価される。任意の試験の1つ以上が、必要に応じて、又は例えば、0、3、6週目などに、スケジュールベースで実施され得る。異なるセットの試験が、免疫化なしの時点に対して、免疫化と同時発生的に実施され得る。
【０２９１】
生物学的マーカー評価は、適切な体積の血清サンプルから、HPV E6及び/若しくはHPV E7に対する抗体、又はAd5ベクターを測定することのうち1つ以上を含み得、又は、例えば、約5mlのバイオマーカー(例えば、CEA又はCA15-3)が、決定され利用可能な場合には、再検討され得る。
【０２９２】
種々の実施形態では、免疫学的評価が、本明細書に記載される方法及び組成物に従う処置を受けている対象に対して実施される。任意の試験の1つ以上が、必要に応じて、又は例えば、0、3、6週目などに、スケジュールベースで実施され得る。異なるセットの試験が、免疫化なしの時点に対して、免疫化と同時発生的に実施され得る。
【０２９３】
研究の間及び/又は特定の回数の免疫化の後の特定の時点で免疫応答に対する影響があるかどうかを決定するために、例えば約90mLの末梢血が、各免疫化の前及び少なくとも一部の免疫化の後の時点で採血され得る。免疫学的評価は、ELISpot、増殖アッセイ、マルチパラメーターフローサイトメトリー分析及び細胞傷害性アッセイを使用して、HPV E6及び/又はHPV E7に対するT細胞応答について末梢血単核球(PBMC)をアッセイすることのうち1つ以上を含み得る。各採血由来の血清がアーカイブされ、送られ、決定され得る。
【０２９４】
種々の実施形態では、HPV関連疾患の治療的処置の場合、腫瘍評価が、本明細書に記載される方法及び組成物に従う処置を受けている対象に対して実施される。任意の試験の1つ以上が、必要に応じて、又は例えば、処置の前に、0、3、6週目などに、スケジュールベースで実施され得る。異なるセットの試験が、免疫化なしの時点に対して、免疫化と同時発生的に実施され得る。腫瘍評価は、処置の前に、少なくとも一部の免疫化の後の時点で、及び選択された回数、例えば、2、3又は4回の最初の処置の完了の後、及び例えば、処置から除外されるまでおよそ3カ月毎に実施される、胸部、腹部又は骨盤のCT又はMRIスキャンのうち1つ以上を含み得る。
【０２９５】
本明細書に記載される標的抗原、例えば、HPV抗原に対する免疫応答は、免疫応答についての1つ以上の適切な試験、例えば、ELISpot、サイトカインフローサイトメトリー又は抗体応答を使用して、対象のサンプル、例えば、末梢血サンプルから評価され得る。陽性免疫応答は、T細胞応答を測定することによって決定され得る。抗原を含む6つのウェル中のバックグラウンドについて調整したスポットの平均数が、6つの対照ウェル中のスポットの数を10超え、抗原を含む6つのウェルの単一の値と6つの対照ウェルの単一の値との間の差異が、スチューデントt検定を使用してp≦0.05のレベルで統計的に有意である場合、T細胞応答は陽性と考えられ得る。免疫原性アッセイは、各免疫化の前に、及び処置期間の間の予定された時点で実施され得る。例えば、処置のおよそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、20、24、30、36又は48週目における免疫原性アッセイのための時点が、この時点での予定された免疫化なしであっても予定され得る。一部の場合には、対象は、少なくとも最小回数の免疫化、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9回又はそれより多くの免疫化を受ける場合に、免疫応答について評価可能とすることができる。
【０２９６】
一部の実施形態では、この免疫応答は、抗原に対する抗体の生成を含む。一部の実施形態では、この免疫応答は、細胞性免疫(CMI)を含む。一部の実施形態では、HPV E6抗原をコードする配列は、配列番号8、配列番号9又は配列番号10に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、HPV E7抗原をコードする配列は、配列番号12に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、この抗原は、25、15、10、5又はそれ未満のアミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、この組換えウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、この組換えウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルス5ベクターを含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、E2b遺伝子領域中に欠失を含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、E1遺伝子領域中に欠失を含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、E3遺伝子領域中に欠失を含む。一部の実施形態では、この複製欠損アデノウイルスベクターは、E4遺伝子領域中に欠失を含む。一部の実施形態では、この組換えウイルスベクターは、トランスフェクトされた細胞における抗原の過剰発現をもたらす。一部の実施形態では、この組換えウイルスは、ヒトにおいて、基底を少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20又は25倍上回る、抗原を発現する細胞に対する特異的免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、このヒトは、50、75、100、125、150、160、175又は200よりも大きい逆Ad5中和抗体力価を有する。一部の実施形態では、このヒトは、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500又は4767よりも大きい逆Ad5中和抗体力価を有する。一部の実施形態では、この免疫応答は、抗原特異的抗体応答として測定される。
【０２９７】
一部の実施形態では、この免疫応答は、抗原特異的細胞性免疫(CMI)として測定される。一部の実施形態では、この免疫応答は、抗原特異的IFN-γ分泌として測定される。一部の実施形態では、この免疫応答は、抗原特異的IL-2分泌として測定される。一部の実施形態では、抗原に対する免疫応答は、ELISpotアッセイによって測定される。一部の実施形態では、この抗原特異的CMIは、106の末梢血単核球(PBMC)当たり、25、50、75、100、150、200、250又は300よりも多いIFN-γスポット形成細胞(SFC)である。一部の実施形態では、この免疫応答は、HPV E6及び/又はHPV E7抗原パルスされた抗原提示細胞、腫瘍細胞株又は自己腫瘍由来の同種抗原発現細胞のT細胞溶解によって測定される。
【０２９８】
一部の実施形態では、HPV関連疾患の治療的処置の場合、疾患進行又は臨床応答の決定は、測定可能/評価可能な疾患を有する対象において、RECIST 1.1基準に従って行われる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている対象における、完全寛解(CR;標的病変について全ての標的病変の消失、又は全ての非標的病変の消失、及び非標的病変についての腫瘍マーカーレベルの正常化)に影響を与える。一部の実施形態では、これらの方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている対象における、部分寛解(PR;標的病変についてのベースライン合計LDを参照とした、標的病変のLDの合計における少なくとも30%の減少)に影響を与える。
【０２９９】
一部の実施形態では、これらの方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている対象における、安定(SD;標的病変のための処置が開始して以降の最も小さい合計LDを参照とした、PRの資格があるのに十分な収縮も、PDの資格があるのに十分な増加もない)に影響を与える。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている対象における、不完全寛解/安定(SD;1つ以上の非標的病変の持続又は/及び非標的病変についての正常な限界を上回った腫瘍マーカーレベルの維持)に影響を与える。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている対象における、進行性疾患(PD;処置が開始して以降に記録された最も小さい合計LDを参照とした、標的病変のLDの合計における少なくとも20%の増加、或いは標的病変についての1つ以上の新たな病変の出現、又は1つ以上の非標的病変の持続若しくは/及び非標的病変についての正常な限界を上回った腫瘍マーカーレベルの維持)に影響を与える。
【０３００】
XVI.キット
ある特定の実施形態は、HPV感染症及びHPV関連又はHPV誘導性癌と闘うために、対象において免疫応答を生成する組成物、方法及びキットを提供する。ある特定の実施形態は、標的抗原、又は標的抗原を発現若しくは提示する細胞、又は少なくとも1つの標的抗原を含む標的抗原シグネチャーに対する免疫応答を生成する組成物、方法及びキットを提供する。これらの組成物、免疫療法又はワクチンは、キットの形態で供給され得る。これらのキットは、処置レジメン情報を含む、投薬量及び又は投与に関する指示書をさらに含み得る。
【０３０１】
一部の実施形態では、キットは、組合せマルチ標的化癌免疫療法を提供する組成物及び方法を含む。一部の実施形態では、キットは、感染性疾患の組合せマルチ標的化処置のための組成物及び方法を含む。一部の実施形態では、キットは、キット構成要素を投与する際に有用な構成要素、及び構成要素をいかにして調製するかについての指示書をさらに含み得る。一部の実施形態では、このキットは、適切な実験室試験によって処置の前及び後に対象をモニタリングするため、又は結果及び対象データを医療スタッフに連絡するためのソフトウェアをさらに含み得る。
【０３０２】
キットを構成する構成要素は、乾燥又は液体形態であり得る。それらが乾燥形態である場合、キットは、乾燥した材料を可溶化するための溶液を含み得る。このキットは、液体又は乾燥形態のトランスファー因子もまた含み得る。トランスファー因子が乾燥形態である場合、キットは、トランスファー因子を可溶化するための溶液を含む。このキットは、構成要素を混合及び調製するための容器もまた含み得る。このキットは、投与を補助する機器、例えば、針、チュービング、アプリケーター、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器又は任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルもまた含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるキット又は薬物送達システムは、商業的な販売及び配布のための、本明細書で開示される組成物を密封して含むための手段もまた含む。
【０３０３】
一態様では、ヒトにおいて免疫応答を誘導するキットであって、0.8〜1.2mLの範囲の体積の、少なくとも1.0×1011のウイルス粒子を含む治療溶液を含む組成物であって、これらのウイルス粒子が、組換え複製欠損アデノウイルスベクターを含む、組成物;免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物の治療溶液から構成される組成物;及び指示書を含むキットが提供される。
【０３０４】
一部の実施形態では、この治療溶液は、1.0〜5.5×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、トランスフェクトされた細胞において、改変型HPV E6及び/又はHPV E7の過剰発現をもたらすことが可能である。一部の実施形態では、このアデノウイルスベクターは、ヒトにおいてHPV E6及び/又はHPV E7発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導する抗原をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、この免疫経路チェックポイントモジュレーターは、PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、及びCD244からなる群から選択される内因性免疫経路チェックポイントタンパク質又はその断片を標的化する。一部の実施形態では、この分子組成物は、siRNA、アンチセンス、小分子、模倣物、組換え形態のリガンド、組換え形態の受容体、抗体、又はそれらの組合せを含む。
【０３０５】
一部の実施形態では、これらの指示書は、増殖性疾患又は癌の処置のためのものである。一部の実施形態では、このアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルス5ベクターを含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、少なくとも1.0×1011、2.0×1011、3.0×1011、3.5×1011、4.0×1011、4.5×1011、4.8×1011、4.9×1011、4.95×1011又は4.99×1011の、組換え核酸ベクターを含むウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、多くても7.0×1011、6.5×1011、6.0×1011、5.5×1011、5.2×1011、5.1×1011、5.05×1011又は5.01×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、1.0〜7.0×1011又は1.0〜5.5×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、4.5〜5.5×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、4.8〜5.2×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、4.9〜5.1×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、4.95〜5.05×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、この治療溶液は、4.99〜5.01×1011のウイルス粒子を含む。一部の実施形態では、このキットは、免疫原性構成要素をさらに含む。一部の実施形態では、この免疫原性構成要素は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23及びIL-32の群から選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、この免疫原性構成要素は、IL-7、IL-7をコードする核酸、IL-7に対して実質的な同一性を有するタンパク質、及びIL-7に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される。
【実施例】
【０３０６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を示し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示の教示の下で、開示された具体的な実施形態において多くの変化がなされ得、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくなおも同様又は類似の結果を生じることを理解すべきである。
【０３０７】
[実施例1]
HPV E6及び/又はHPV E7を含むAd5ベクターの生産及び評価
この実施例は、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7ベクターの生産及び評価を記述する。HPV E6及びHPV E7は、天然(native)E6及びE7タンパク質の非発癌性バリアントである。
【０３０８】
ウイルス構築
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7を構築及び生産した。簡潔に述べると、導入遺伝子を、相同組換えベースのアプローチを使用してAd5[E1-,E2b-]ベクター中にサブクローニングし、複製欠損ウイルスを、E.C7パッケージング細胞株中で増殖させ、CsCl2精製し、感染力価を、E.C7細胞単層上でのプラーク形成単位(PFU)として決定した。ウイルス粒子(VP)濃度を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)破壊並びに260nm及び280nmにおける分光光度法によって決定した。ベクター対照として、導入遺伝子挿入物を有しないAd5プラットフォーム骨格であるAd5[E1-,E2b-]-ヌルを使用した。
【０３０９】
免疫化及び脾細胞調製
雌性C57BL/6マウス(n=5匹/群)に、異なる用量のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7又はAd5[E1-,E2b-]-ヌルを皮下(SQ)注射した。用量を、25μL注射緩衝液(3%スクロースを含む20mM HEPES)中で投与し、マウスを14日間隔で3回免疫化した。最後の注射の14日後、脾臓及び血清を収集した。マウス由来の血清を、評価まで-20℃で凍結した。脾嚢を破壊し、内容物に穏やかに圧力をかけて70μmナイロン細胞ストレーナーを通過させることによって、脾細胞の懸濁物を生成した。赤血球を、赤血球溶解緩衝液の添加によって溶解させ、溶解後、脾細胞を、R10(L-グルタミン(2mM)、HEPES(20mM)(Corning、Corning、NY)、ペニシリン(100U/ml)及びストレプトマイシン(100μg/mL)並びに10%胎仔ウシ血清を補充したRPMI 1640)中で2回洗浄した。脾細胞を、サイトカイン産生についてELISpot及びフローサイトメトリーによってアッセイした。
【０３１０】
酵素結合免疫吸着Spot(ELISpot)アッセイ
HPV E6及びHPV E7特異的インターフェロン-γ(IFN-γ)分泌T細胞を、上記のように調製した新たに単離されたマウス脾細胞を使用して、ELISpotアッセイによって決定した。ELISpotアッセイを実施した。HPV E6及びHPV E7のコード配列全体にわたって重複するペプチドのプールを、11アミノ酸の重複を有する15マーとして合成した(そして、凍結乾燥したペプチドプールを、DMSO中に溶解した)。脾細胞(2×105細胞)を、2μg/mL/ペプチドの、E6又はE7に由来するプール中の重複する15マーペプチドで刺激した。陽性対照として、細胞を0.06μg/ウェルの濃度のコンカナバリンA(Con A)で刺激した。SIV-Nefに由来する重複する15マー完全ペプチドプール(AIDS Research and Reference Reagent Program、Division of AIDS、NIAID、NIH)を、無関係のペプチド対照として使用した。スポット形成細胞(SFC)の数を、Immunospot ELISpotプレートリーダーを使用して決定した(結果を、106個の脾細胞当たりのSFCの数として報告した)。
【０３１１】
細胞内サイトカイン刺激
脾細胞を、ELISpotアッセイについて上記したように調製した。刺激アッセイを、96ウェルU底プレートにおいて1ウェル当たり106の生脾細胞を使用して実施した。R10培地中の脾細胞を、5%CO2中で37℃で6時間にわたる2μg/mL/ペプチドのHPV E6、HPV E7又はSIV-Nefペプチドプールの添加によって刺激し、タンパク質輸送阻害剤(GolgiStop、BD)を、インキュベーションの開始の2時間後に添加した。次いで、刺激した脾細胞を、リンパ球表面マーカーCD8α及びCD4について染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、IFN-γ及びTNF-αの細胞内蓄積について染色した。マウスCD8α(クローン53-6.7)、CD4(クローンRM4-5)、IFN-γ(クローンXMG1.2)及びTNF-α(クローンMP6-XT22)に対する蛍光コンジュゲート抗体を、BDから購入し、染色を、抗CD16/CD32(クローン2.4G2)の存在下で実施した。フローサイトメトリーを、Accuri C6フローサイトメーター(BD)を使用して実施し、BD Accuri C6ソフトウェアを使用して分析した。
【０３１２】
腫瘍免疫療法
in vivo腫瘍免疫療法研究のために、雌性C57BL/6マウス、8〜10週齢の左側腹部に、2×105のTC-1 HPV E6/E7発現腫瘍細胞をSQ移植した。マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のSQ注射で7日間隔で3回処置した。対照マウスには、同じプロトコールの下で、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌルを注射した。組合せの研究において、マウスに、免疫化と同時に、100μgのラット抗PD-1抗体(クローンRMP1-14)又はアイソタイプラット対照抗体(クローン2A3)をIPで与えた。ラット抗PD-1抗体及びラットIgG2aアイソタイプ対照抗体は、BioXcellから購入した。腫瘍サイズを、2つの反対の寸法(a、b)によって測定し、体積を、式V=(腫瘍幅2×腫瘍長さ)/2に従って計算し、式中、aは短い方の寸法であった。腫瘍が1500mm3に達したとき又は腫瘍が潰瘍化したときに、動物を安楽死させた。
【０３１３】
フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤細胞(TIL)の分析
4つの群の8〜10週齢雌性C57BL/6マウス(n=5匹/群)の左側腹部に、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞をSQ移植した。これらの群のうち2つを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌルベクター対照でSQ免疫化し、他の2つの群を、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンでSQ免疫化した。これらの免疫化を、12日目に開始して7日間隔で2回実施した。免疫化に加えて、1つのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7群及び1つのAd5[E1-,E2b-]-ヌル群中のマウスに、12及び16日目に100μgのラット抗PD-1抗体(クローンRMP1-14)をSQ投与し、19及び23日目に100μgのハムスター抗PD-1抗体(クローンJ43)をSQ投与して、抗PD-1抗体の有効用量を増加させた。これらの免疫経路チェックポイントモジュレーターによる処置について対照とするために、残りのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7及びAd5[E1-,E2b-]-ヌル群中のマウスに、同じ日に、妥当なラット及びハムスター対照IgG抗体を投与した。ハムスター抗PD-1抗体及びアイソタイプ対照は、BioXcellから購入した。27日目に、腫瘍を測定し、切除し、秤量した。腫瘍を刻み、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中のコラゲナーゼIV(1mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(100μg/ml)及びDNase IV(200U/ml)の混合物で、室温で30分間、80rpmで回転させながら消化した。酵素はSigma-Aldrichから購入した。消化後、腫瘍懸濁物を、70μmナイロン細胞ストレーナーを通過させ、遠心分離した。赤血球を、赤血球溶解緩衝液(Sigma-Aldrich)の添加によって除去し、溶解後、腫瘍懸濁物を、1%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)中で2回洗浄し、染色のために蛍光活性化細胞選別(FACS)緩衝液(PBS pH7.2、1%胎仔ウシ血清及び2mM EDTA)中で再懸濁した。CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)及びPDL1(MIH5)に対する蛍光コンジュゲート抗体は、BDから購入した。CD8β(H35-17.2)、CD25(PC61.5)、FoxP3(FJK-16s)、PD-1(RMP1-30)、LAG-3(C9B7W)及びCTLA4(UC10-4B9)に対する蛍光コンジュゲート抗体は、全てeBioscienceから購入した。表面染色を、抗CD16/CD32抗体(クローン2.4G2)を含むFACS緩衝液100μL中で4℃で30分間実施した。染色された細胞を、FACS緩衝液中で洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、(必要に応じて)透過処理緩衝液(eBioscience)中で透過処理し、その後、抗CD16/CD32抗体(クローン2.4G2)を含む透過処理緩衝液100μL中で4℃で60分間にわたって、蛍光コンジュゲート抗FoxP3抗体又は抗CTLA4抗体で染色した。細胞を、透過処理緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中に戻し洗浄し、固定体積の各サンプルを、BD Accuri C6フローサイトメーターを使用するフローサイトメトリーによって分析した。腫瘍細胞を、小さい及び大きい細胞を含む散乱ゲート中のCD45-事象として定義した。CD4+ TILを、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD4+事象として定義した。CD8+TILを、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD8β+事象として定義した。調節性T細胞(Treg)を、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD4+/CD25+/FoxP3+事象として定義した。エフェクターCD4+ T細胞を、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD4+/CD25-/FoxP3-事象として定義した。アイソタイプが一致した対照抗体を使用して、FoxP3、PDL1、PD-1、LAG-3及びCTLA4の陽性発現を決定した。フローサイトメトリーを、Accuri C6フローサイトメーター(BD)を使用して実施し、BD Accuri C6ソフトウェアで分析した。
【０３１４】
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7によって誘導されたHPV E6/E7特異的細胞性免疫応答
マウスにおけるCMI応答の誘導に対する漸増用量のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫化の効果を決定するための研究を実施した。C57BL/6マウスの群(n=5匹/群)を、108、109又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7で14日間隔で3回SQ免疫化した。対照マウスは、108VP、109VP又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(空のベクター対照)を投与された。最後の免疫化の2週間後、脾細胞CMI応答を、ELISpot分析によってIFN-γ分泌細胞について評価した。用量効果が観察され、最も高いCMI応答レベルが、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫化によって得られた。Ad5[E1-,E2b-]-ヌルを注射した対照マウスでは、応答は検出されなかった。
【０３１５】
CD8α+及びCD4+脾細胞集団の両方におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内蓄積もまた、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7で免疫化したマウスにおいて決定した。重複するペプチドプールによる刺激後の細胞内サイトカイン染色(ICS)により、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7で免疫化した全てのマウスから単離されたCD8α+リンパ球におけるE6及びE7抗原特異的IFN-γの蓄積が明らかになった。ペプチド刺激した脾細胞もまた、TNF-αの細胞内蓄積について染色し、E6及びE7の両方に対して特異的な多機能性(IFN-γ+/TNF-α+)CD8α+脾細胞の有意な集団を検出することができた。
【０３１６】
HPV E6/E7発現腫瘍の処置
HPV E6/E7 TC-1腫瘍を保有するマウスにおける免疫療法処置の抗腫瘍効果を調査した。これらの腫瘍細胞は、フローサイトメトリー分析によって評価されるように、PDL1を発現した。PEコンジュゲート抗PDL1で標識した場合、TC-1細胞は、537の中央値蛍光強度(MFI)を有したが、PEコンジュゲートアイソタイプ対照抗体で標識した細胞は、184のMFIを有し、TC-1細胞の表面上の免疫抑制性PDL1の存在を実証した(データ示さず)。2つの群のC57BL/6マウス(n=5匹/群)の右肋骨下領域中に、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞をSQ接種した。1、8及び14日目に、マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(ベクター対照)又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のSQ注射によって処置した。全てのマウスを、腫瘍サイズについてモニタリングし、腫瘍体積を計算した。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7で免疫化したマウスは、12日目から、対照マウスよりも有意に小さい腫瘍を有し(p<0.01)、5匹のマウスのうち完全な腫瘍退縮を示す3匹を含め、実験の残りにわたって有意に小さいままであった(p<0.02)。ベクター対照処置群のマウスにおける腫瘍は、26日目に安楽死のための閾値に達し始め、この群の全てのマウスは33日目までに安楽死させたが、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置群のマウスは、36日目の実験の最後に、小さい腫瘍(<150mm3)の完全腫瘍退縮を示し、全て生存していた。
【０３１７】
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法がより大きい腫瘍に対して有効であるかどうかを決定するために、TC-1腫瘍細胞を、2つの群のC57BL/6マウス(n=4匹/群)に移植し、次いで、腫瘍が小さいが触知可能であった場合、腫瘍移植の後6日間、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による毎週の処置を遅延させた。6日目に処置を開始したマウスは、対照群と類似の腫瘍成長を最初は示したが、16日目から腫瘍退縮が観察された。6日目に処置を開始したマウスにおける腫瘍は、20日目から対照群よりも有意に小さく(p<0.05)、4匹のマウスのうち3匹は、27日目までに完全退縮を有した。6日目に開始したAd5[E1-,E2b-]-E6/E7投与もまた、有意な生存利益をもたらした(p<0.01)。
【０３１８】
最後に、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法が大きい樹立された腫瘍に対して有効であるかどうかを決定するために、TC-1腫瘍細胞を、2つの群のC57BL/6マウス(n=4匹/群)に移植し、次いで、腫瘍が約100mm3となった腫瘍移植の13日後まで、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による毎週の処置を遅延させた。この処置群では、最初の腫瘍成長は、対照群と類似であることが観察されたが、対照群の一部のマウスは、23日目に安楽死基準に達し、さらなる時点における有意性の分析を妨げた。しかし、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置群における腫瘍体積は、ベクター対照群の全てのマウス由来の腫瘍が1500mm3を超え安楽死させた29日目まで安楽死閾値を下回った。これらの結果は、TC-1腫瘍モデルにおいて、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫療法薬が腫瘍成長の強力な阻害剤であり、有意な全生存利益をもたらすことを示している。しかし、腫瘍の完全クリアランスは、処置をより小さい腫瘍で開始したときにのみ観察された。さらに、これらの結果は、腫瘍細胞上の免疫抑制性PDL1の存在にもかかわらず、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法処置が、腫瘍成長の有意な阻害を生じたことを実証している。
【０３１９】
[実施例2]
HPV E6及びHPV E7に対する免疫応答の誘導
この実施例は、HPV E6/E7発現腫瘍の処置のための、HPV E6及びHPV E7に対する免疫応答を誘導するためのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7産物の使用を記述する。
【０３２０】
HPV E6/E7発現腫瘍の処置
以前に、HPV E6/E7 TC-1腫瘍を保有するマウスにおける免疫療法処置の抗腫瘍効果を調査した。これらの腫瘍細胞は、フローサイトメトリー分析によって評価されるように、PDL1を発現した。PEコンジュゲート抗PDL1で標識した場合、TC-1細胞は、537の中央値蛍光強度(MFI)を有したが、PEコンジュゲートアイソタイプ対照抗体で標識した細胞は、184のMFIを有し、TC-1細胞の表面上の免疫抑制性PDL1の存在を実証した。2つの群のC57BL/6マウス(n=5匹/群)の右肋骨下領域中に、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞をSQ接種した。1、8及び14日目に、マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(ベクター対照)又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のSQ注射によって処置した。全てのマウスを、腫瘍サイズについてモニタリングし、腫瘍体積を計算した。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7で免疫化したマウスは、12日目から、対照マウスよりも有意に小さい腫瘍を有し(p<0.01)、5匹のマウスのうち完全な腫瘍退縮を示す3匹を含め、実験の残りにわたって有意に小さいままであった(p<0.02)(図1A)。ベクター対照処置群のマウスにおける腫瘍は、26日目から安楽死のための閾値に達し始め、この群の全てのマウスは33日目までに安楽死させたが、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置群のマウスは、36日目の実験の最後に、小さい腫瘍(<150mm3)の完全腫瘍退縮を示し、全て生存していた(図1B)。
【０３２１】
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法がより大きい腫瘍に対して有効であるかどうかを決定するために、TC-1腫瘍細胞を、2つの群のC57BL/6マウス(n=4匹/群)に移植し、次いで、腫瘍が小さいが触知可能であった場合、腫瘍移植の後6日間、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による毎週の処置を遅延させた。6日目に処置を開始したマウスは、対照群と類似の腫瘍成長を最初は示したが、16日目から、腫瘍退縮が観察された(図2A)。6日目に処置を開始したマウスにおける腫瘍は、20日目から対照群よりも有意に小さく(p<0.05)、4匹のマウスのうち3匹は、27日目までに完全退縮を有した。6日目に開始したAd5[E1-,E2b-]-E6/E7投与もまた、有意な生存利益をもたらした(p<0.01)(図2B)。
【０３２２】
最後に、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法が大きい樹立された腫瘍に対して有効であるかどうかを決定するために、TC-1腫瘍細胞を、2つの群のC57BL/6マウス(n=4匹/群)に移植し、次いで、腫瘍が約100mm3となった腫瘍移植の13日後まで、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による毎週の処置を遅延させた。この処置群では、最初の腫瘍成長は、対照群と類似であることが観察されたが、対照群の一部のマウスは、23日目に安楽死基準に達し、さらなる時点における有意性の分析を妨げた(図3A)。しかし、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置群における腫瘍体積は、ベクター対照群の全てのマウス由来の腫瘍が1500mm3を超え安楽死させた29日目まで安楽死閾値を下回った(図3B)。これらの結果は、TC-1腫瘍モデルにおいて、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫療法薬が腫瘍成長の強力な阻害剤であり、有意な全生存利益をもたらすことを示している。しかし、腫瘍の完全クリアランスは、処置をより小さい腫瘍で開始したときにのみ観察された。さらに、これらの結果は、腫瘍細胞上の免疫抑制性PDL1の存在にもかかわらず、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法処置が、腫瘍成長の有意な阻害を生じたことを実証している。
【０３２３】
免疫チェックポイント阻害との組合せ免疫療法
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7の治療効果を大きい腫瘍の状況で改善できるかどうかを決定するために、抗PD-1抗体を共投与した。4つの群のマウス(n=7匹/群)に、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞を移植し、10日目から、マウスは、SQの1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7+IPの100μgの抗PD-1抗体、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル+100μgの抗PD-1抗体、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7+100μgのラットIgG2aアイソタイプ対照抗体、又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル+100μgのラットIgG2aアイソタイプ対照抗体の毎週の投与を受けた。腫瘍サイズを経時的にモニタリングし、腫瘍サイズが1500mm3を超えた場合又は腫瘍潰瘍化が存在した場合に、マウスを安楽死させた。Ad5[E1-,E2b-]-ヌル+100μgのラットIgG2aアイソタイプ対照抗体を投与された対照マウス(図4A)及びAd5[E1-,E2b-]-ヌル+100μgの抗PD-1抗体で処置したマウス(図4B)は、類似の腫瘍成長パターンを示した。これら2つの群間で、有意な生存利益は観察されなかった。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+ラットIgG2aアイソタイプ対照抗体を投与されたマウスは、対照と比較して、遅延した腫瘍成長パターンを有し、マウスのうち2匹は、腫瘍移植後52日目の時点で、ほぼベースラインのレベルまでの腫瘍退縮を有した(図4C)。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7及び抗PD-1抗体を投与された7匹のマウスのうち4匹は、25日目から腫瘍退縮を有し、これらのうち2匹は、53日目の実験の最後まで、腫瘍クリアランスを生じた(図4D)。
【０３２４】
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+ラットIgG2aアイソタイプ対照抗体で処置したマウス(図5)もまた生存利益を経験し、動物の28.6%が研究の終結時に生存していたが、対照マウス(Ad5[E1-,E2b-]-ヌル+ラットIgG2aアイソタイプ対照抗体)及びAd5[E1-,E2b-]-ヌル+抗PD-1抗体処置マウスの100%が、それぞれ、28日目及び32日目までに終結しなければならなかった(図5)。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7及び抗PD-1抗体の両方で処置したマウスは、最大の処置利益を有し(図5)、対照と比較して、遅延した腫瘍成長、及び生存における有意な改善(P≦0.0006)を実証した。
【０３２５】
マウス抗ラットIgG抗体応答を、ラット抗PD-1抗体による2回目の注射によって誘導し(ELISAによって、エンドポイント抗体力価1:200、データ示さず)、またこれらの応答は、3回目の注射によって劇的に増加した(ELISAによって、エンドポイント抗体力価1:4000〜1:8000、データ示さず)。この抗ラット抗体応答は、抗腫瘍活性が抗PD-1抗体単独による注射後に観察されなかった理由を説明し得る。また、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫療法と組み合わせた抗PD-1抗体の1回目及び場合によっては2回目の注射は、有効であったが、抗PD-1抗体による3回目の注射は、誘導されたマウス抗ラットIgG抗体応答によって効率的に中和された可能性が高い。
【０３２６】
組合せ免疫療法後の腫瘍微小環境
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置マウスにおける遅延した腫瘍成長及び生存に寄与した細胞集団を分析するために、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、フローサイトメトリーによって評価した。4つの群のマウスに、2×105のTC-1細胞を移植し、10日後に、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+PD-1抗体の2回の毎週の免疫化による処置を開始した。「材料及び方法」に記載されるように、27日目に、腫瘍全体を収集し、処理した。腫瘍1mg当たりの浸潤性CD8+T細胞の数は、Ad5[E1-,E2b-]-ヌルを投与された群と比較して、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7処置群において有意に増加した(図6C)。抗PD-1抗体処置は、浸潤性CD8+T細胞の数に対して、ほとんど又は全く影響を有さなかった(図6C)。腫瘍1mg当たりの浸潤性Treg(CD4+CD25+Foxp3+)の数に関して、4つの群のいずれの間でも差異は存在しなかった(図6B)。しかし、CD8+T細胞における増加は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン+抗PD-1抗体処置でマウスを処置した場合、腫瘍微小環境中のTreg:CD8+T細胞比率の減少をもたらした(図6A)。
【０３２７】
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫療法に対する抗PD-1抗体の相乗/相加効果をさらに研究するために、TIL上でのPD-1、LAG-3及びCTLA-4の発現を試験した。腫瘍微小環境内のT細胞上のこれらの共阻害分子の発現は、抗原特異的T細胞の活性化を下方調節することが示されている。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+対照抗体処置による免疫化は、PD-1+及びLAG-3+CD8+TILの画分を有意に増加させたが、CD4+TIL上でのこれらの共阻害分子の発現は、この処置によって影響されなかった。CTLA-4を発現するCD4+及びCD8+TILの百分率は、ワクチン処置によって有意には影響されなかった(データ示さず)。抗PD-1抗体注射をAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン処置と組み合わせることで、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7+対照抗体で処置したマウス由来の腫瘍において見出されたものと比較して、PD-1+CD8+及びCD4+TILの画分に有意な低減が生じた(CD8+TILについてp=0.0083、CD4+TILについてp=0.0016)。さらに、PD-1+CD8+TILの画分は、Ad5[E1-,E2b-]-ヌル処置した対照群において観察された発現のレベルまで減少し、PD-1+CD4+TILの画分は、対照群において観察されたものを下回るまで有意に低減された(p=0.0016、図7A)。さらに、LAG-3+CD8+TILの百分率は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫化を抗PD-1抗体と組み合わせた場合に減少することもまた観察された(p=0.0363、図7B)。ワクチン処置は、腫瘍細胞上のPDL1発現をex vivoで増強できることが以前に示されているので、腫瘍細胞上のPDL1の発現を試験した。ワクチン処置後に、腫瘍細胞上のPDL1の中央値蛍光強度には増大が存在した。しかし、PDL1発現は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7及び抗PD-1抗体の組合せで処置したマウスにおいて低減されたが、このレベルは、Ad5[E1-,E2b-]-ヌル処置した対照マウスにおいて観察されたレベルを上回って、なおも有意に発現された。
【０３２８】
まとめると、このデータは、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7が、用量依存的様式でHPV E6/E7指向性のCMI応答を誘導でき、これが、腫瘍細胞上のPDL1の上方調節を生じることを実証している。腫瘍保有マウスにおける最も高い用量のワクチンによる複数回の相同免疫化は、特に、小さい腫瘍を保有するマウスにおいて、有意な抗腫瘍活性及び増加した生存を生じた。重要なことに、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法を大きい腫瘍を有するマウスにおいて抗PD-1抗体と組み合わせた場合、より高い程度の抗腫瘍活性が達成された。全体として、抗PD-1抗体と組み合わせたAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンによる免疫化は、あまり徹底的/アネルギー性でない表現型を有するCD8+及びCD4+エフェクター集団の増加を生じ、従って、腫瘍微小環境におけるより炎症促進性の状態へのバランスに有利に働く。組合せ処置が大きい腫瘍量での低減と関連したという観察は、抗PD-1抗体と組み合わせたAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法が、HPV関連頭頸部又は子宮頸癌を有する対象の免疫療法の間の臨床的有効性を増加させ得ることを示している。さらに、データは、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを用いた臨床試験が、免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わされるべきであり、依然として優先度が高いことを示唆している。
【０３２９】
[実施例3]
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンの臨床試験
この実施例は、ヒトパピローマウイルス16型(HPV-16)陽性である対象、HPV関連頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を有する対象及びHPV関連子宮頸癌を有する対象における、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンによる免疫化の安全性及び免疫原性の評価を記述する。
【０３３０】
HNSCC患者における現在の介入には、シスプラチン及び放射線又はセツキシマブ及び放射線による治療が含まれる。しかし、最初は応答する又は応答しない多くのHNSCC患者は、最終的に再燃する。ワクチンを、HPVの初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子に対する抗腫瘍T細胞媒介性免疫応答を誘導するように設計する。このワクチンの重要な特徴の1つは、それを化学療法/放射線処置と組み合わせることができることである。
【０３３１】
このワクチンの骨格は、E1、E2b及びE3遺伝子の除去並びに改変型融合非発癌性HPV E6/E7遺伝子の挿入によって改変されたアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。得られた組換え複製欠損ベクターは、ベクター生産のためにトランスで必要とされるE1及びE2b遺伝子機能を供給する新たに操作された専有に係るヒト293ベースの細胞株(E.C7)中でのみ増殖させることができる。
【０３３２】
このプロトコールについては遺伝子導入挿入は提案されない。産物は機能し、エピソーム性のままである。
【０３３３】
ワクチン産物を使用して、対象において安全かつ有効な様式で、HPV E6/E7特異的細胞性免疫応答を誘導する。非盲検用量増大臨床研究を実施して、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン注射の安全性及び免疫原性を評価する。評価する投薬量レベルは、5×1010、1×1011及び5×1011ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンである。対象を、3つのコホートの対象を用いる連続的漸増投薬量レベルに登録し、彼らを用量制限毒性(DLT)についてモニタリングする。各対象に、3週間毎に3回の免疫化のためのSQ注射によって、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを与える。用量増大のためのDLTの評価を、コホート中の全ての対象がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも3週間後に研究来診をした後に行う。
【０３３４】
HPV E6/E7を発現するAd5骨格を、HPV-16+であり、HPV+癌を発達させる高いリスクがある、又はHPV+癌を有する対象の免疫化(ワクチン接種)に使用する。これらの対象は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の型のマカク)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット又は家禽である。
【０３３５】
フローサイトメトリーによって評価する、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン接種後のCMI応答の誘導
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による複数回の相同免疫化後のCMI誘導をフローサイトメトリーによって評価するために、C57Bl/6マウスの群(n=5匹/群)を、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7で2週間間隔で3回SQ免疫化した。最後の免疫化の2週間後、脾細胞を、HPV E6/E7ペプチド又は無関係の抗原に曝露させ、IFN-γ及び/又はTNFα発現T細胞の数について、フローサイトメトリーによって分析した。図11に示されるように、IFN-γ及び/又はTNFα発現T細胞の両方が、最も高い用量のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による複数回の相同免疫化の結果として誘導された。CMI応答がHPV E6及びE7に対して特異的であったこと、並びに無関係の抗原、例えば、SIV-vif又はSIV-nefに対する応答が存在しなかったことが、特異性研究によって明らかになった。
【０３３６】
毒性学
広範な前臨床毒性学研究を実施して、C57Bl/6マウスにおけるSQ注射後のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7の毒性を評価する。毒性エンドポイントを、注射後の種々の時点において評価する。動物に、体重における差異を説明して臨床試験において使用されるものと一致した用量のビヒクル対照又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のいずれかを、1、22及び43日目に最大で3回のSQ注射で投与する。評価は、体重、体重増加、摂食量病理、血液学分析、血液化学分析、及び凝固時間に関する試験に対する影響からなる。
【０３３７】
ワクチン単独による、樹立されたHPV E6/E7発現腫瘍の処置
樹立されたHPV E6/E7発現腫瘍を、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7によってin vivoで処置することの有効性を評価した。C57Bl/6マウスの右肋骨下中に、0日目に106のHPV E6/E7発現腫瘍細胞をSQ移植した。腫瘍は、4〜6日目までに触知可能であった。6、13及び20日目に、マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(空のベクター対照)又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のSQ注射によって処置した。全てのマウスを、腫瘍成長についてモニタリングし、腫瘍体積を計算した。図12に示されるように、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7で免疫化したマウスは、対照マウスよりも有意に小さい腫瘍を有した(p<0.01)。これらの結果は、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ベクタープラットフォームが、HPV E6/E7発現腫瘍を処置するための免疫療法剤として利用される潜在力を有することを実証している。
【０３３８】
ワクチン及び化学療法/放射線処置による、樹立されたHPV E6/E7発現腫瘍の処置
HPV16 E6/E7発現腫瘍を、化学療法/放射線処置と組み合わせたAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δによってin vivoで処置することの有効性を評価した。C57Bl/6マウスに、0日目に106のHPV16 E6/E7発現腫瘍細胞をSQ移植した。樹立されたHPV16-E6Δ/E7Δ発現腫瘍を、13、20及び27日目のシスプラチン/放射線処置と組み合わせた7、14及び21日目の免疫療法によって処置した。対照腫瘍保有マウスを、シスプラチン/放射線処置と組み合わせたAd-ヌル(空のベクター対照)による注射によって処置した。図13に示されるように、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ及び化学療法/放射線を使用する組合せ処置は、処置Ad5[E1-,E2b-]-ヌル及び化学療法/放射線を受けた対照マウスと比較して、生存時間の有意な延長を生じた。これらの結果は、ワクチン免疫療法を化学療法/放射線処置と組み合わせることができること、及びこの組合せが、HPV16 E6/E7発現癌のマウスモデルにおいて生存の有意に長い延長を生じることを示した。
【０３３９】
これらの結果の教示の下で、シスプラチン/放射線処置単独と比較した、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7及びシスプラチン/放射線処置を用いた組合せ免疫化の、免疫応答に対する効果を、マウスモデルにおいて調査した。Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ免疫化+シスプラチン/放射線処置の組合せは、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ単独による免疫化と比較して、より大きいCMI応答の誘導を生じた(図14)。これらの結果は、免疫療法が、より大きい抗腫瘍CMI応答を達成するために、化学療法処置と組み合わせることができることを示している。
【０３４０】
まとめると、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7は、ロバストな免疫応答を誘導する、HPV E6及びHPV E7を標的化する非発癌性ワクチンである。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7は、ELISpot及びフローサイトメトリー研究で評価したマウスにおいて、HPV E6/E7に対する強力なCMIを誘導した。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7は、HPV E6/E7発現癌のマウスモデルにおいて、樹立された腫瘍の進行を有意に阻害した。Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法は、腫瘍保有マウスにおける生存を有意に増加させるために、化学療法/放射線処置と組み合わせることができた。目的は、他のAd5システムで見出される障壁を克服するこの新規Ad5ベクターシステムをさらに開発すること、及び免疫化された(ワクチン接種された)対象において有意なHPV E6/E7指向性免疫応答が誘導されたかどうかを決定するためにこのワクチンを臨床試験することである。この臨床研究の結果は、この新たなAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを使用することの安全性及び免疫原性を確立する。
【０３４１】
[実施例4]
HPV E6及び/又はHPV E7アゴニストエピトープバリアントを含むAd5ベクターの生産及び評価
この実施例は、種々のアゴニストエピトープを含むAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7産物が、類似の様式で構築及び評価されることを示している。これらのベクターは、実施例4〜6で使用される。
【０３４２】
ウイルス構築
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンは、E1、E2b及びE3遺伝子の除去、並びに配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号18、配列番号6、配列番号19、配列番号7、配列番号20、配列番号11及び配列番号21に示されるコード配列を有するアゴニストエピトープバリアントを有する改変型HPV E6及び/又はHPV E7遺伝子の挿入によって改変された、アデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。
【０３４３】
さらに、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンは、E1、E2b及びE3遺伝子の除去、並びに以下の配列:(1)配列番号8(E6A1エピトープを有するHPV16 E6)及び配列番号12(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)、(2)配列番号9(E6A3エピトープを有するHPV16 E6)及び配列番号12(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)、並びに(3)配列番号10(E6A1+E6A3エピトープを有するHPV16 E6)及び配列番号12(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)に示されるHPV抗原をコードする改変型HPV E6及び/又はHPV E7遺伝子の挿入によって改変された、アデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。HPV E6若しくはHPV E7抗原をコードする以下の配列のうちいずれか1つを単独で使用し、又は任意のHPV E6配列を、E6/E7ワクチンを取得するために、任意のHPV E7配列と組み合わせる:配列番号18(E6A1エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号19(E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号20(E6A1及びE6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号21(E7A3エピトープを有するHPV16 E7)、配列番号13(JLを有するHPV16 E6)、配列番号8(NCI E6A1エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号9(NCI E6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号10(E6A1及びE6A3エピトープを有するHPV16 E6)、配列番号14(JLを有するHPV16 E7)、配列番号12(NCI E7A3エピトープを有するHPV16 E7)、配列番号15(HPV E6E7)、配列番号2(E6A1及びE7A3エピトープを有するHPV16 E6E7)、配列番号3(E6A3及びE7A3エピトープを有するHPV16 E6E7)、配列番号4(E6A1、E6A3及びE7A3エピトープを有するHPV16 E6E7)。
【０３４４】
簡潔に述べると、導入遺伝子を、相同組換えベースのアプローチを使用してAd5[E1-,E2b-]ベクター中にサブクローニングし、複製欠損ウイルスを、E.C7パッケージング細胞株中で増殖させ、CsCl2精製し、プラーク形成単位(PFU)として表される感染力価を、E.C7細胞単層上で決定する。ウイルス粒子(VP)濃度を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)破壊並びに260nm及び280nmにおける分光光度法によって決定する。ベクター対照として、導入遺伝子挿入物を有しないAd5プラットフォーム骨格であるAd5[E1-,E2b-]-ヌル(例えば、配列番号14)を使用する。
【０３４５】
免疫化及び脾細胞調製
雌性C57BL/6マウス(n=5匹/群)に、異なる用量のAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7又はAd5[E1-,E2b-]-ヌルを皮下(SQ)注射する。用量を、25μL注射緩衝液(3%スクロースを含む20mM HEPES)中で投与し、マウスを14日間隔で3回免疫化する。最後の注射の14日後、脾臓及び血清を収集する。マウス由来の血清を、評価まで-20℃で凍結する。脾嚢を破壊し、内容物に穏やかに圧力をかけて70μmナイロン細胞ストレーナーを通過させることによって、脾細胞の懸濁物を生成する。赤血球を、赤血球溶解緩衝液の添加によって溶解させ、溶解後、脾細胞を、R10(L-グルタミン(2mM)、HEPES(20mM)(Corning、Corning、NY)、ペニシリン(100U/ml)及びストレプトマイシン(100μg/mL)並びに10%胎仔ウシ血清を補充したRPMI 1640)中で2回洗浄する。脾細胞を、サイトカイン産生についてELISpot及びフローサイトメトリーによってアッセイする。
【０３４６】
酵素結合免疫吸着Spot(ELISpot)アッセイ
HPV E6及びHPV E7特異的インターフェロン-γ(IFN-γ)分泌T細胞を、上記のように調製した新たに単離されたマウス脾細胞を使用して、ELISpotアッセイによって決定する。ELISpotアッセイを実施する。HPV E6及びHPV E7のコード配列全体にわたって重複するペプチドのプールを、11アミノ酸の重複を有する15マーとして合成する(そして、凍結乾燥したペプチドプールを、DMSO中に溶解する)。脾細胞(2×105細胞)を、2μg/mL/ペプチドの、E6又はE7に由来するプール中の重複する15マーペプチドで刺激する。細胞を、陽性対照として0.06μg/ウェルの濃度のコンカナバリンA(Con A)で刺激する。SIV-Nefに由来する重複する15マー完全ペプチドプール(AIDS Research and Reference Reagent Program、Division of AIDS、NIAID、NIH)を、無関係のペプチド対照として使用する。スポット形成細胞(SFC)の数を、Immunospot ELISpotプレートリーダーを使用して決定し、結果を、106個の脾細胞当たりのSFCの数として報告する。
【０３４７】
細胞内サイトカイン刺激
脾細胞を、ELISpotアッセイについて上記したように調製する。刺激アッセイを、96ウェルU底プレートにおいて1ウェル当たり106の生脾細胞を使用して実施する。R10培地中の脾細胞を、5%CO2中で37℃で6時間にわたる2μg/mL/ペプチドのHPV E6、HPV E7又はSIV-Nefペプチドプールの添加によって刺激し、タンパク質輸送阻害剤(GolgiStop、BD)を、インキュベーションの開始の2時間後に添加する。刺激した脾細胞を、リンパ球表面マーカーCD8α及びCD4について染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、IFN-γ及びTNF-αの細胞内蓄積について染色する。マウスCD8α(クローン53-6.7)、CD4(クローンRM4-5)、IFN-γ(クローンXMG1.2)及びTNF-α(クローンMP6-XT22)に対する蛍光コンジュゲート抗体をBDから購入し、染色を、抗CD16/CD32抗体(クローン2.4G2)の存在下で実施する。フローサイトメトリーを、Accuri C6フローサイトメーター(BD)を使用して実施し、BD Accuri C6ソフトウェアを使用して分析する。
【０３４８】
腫瘍免疫療法
in vivo腫瘍免疫療法研究のために、雌性C57BL/6マウス、8〜10週齢の左側腹部に、2×105のTC-1 HPV E6/E7発現腫瘍細胞をSQ移植する。マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のSQ注射で7日間隔で3回処置する。対照マウスには、同じプロトコールの下で、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌルを注射する。組合せの研究において、マウスに、免疫化と同時に、100μgのラット抗PD-1抗体(クローンRMP1-14)又はアイソタイプラット対照抗体(クローン2A3)をIPで与える。ラット抗PD-1抗体及びラットIgG2aアイソタイプ対照抗体は、BioXcellから購入する。腫瘍サイズを、2つの反対の寸法(a、b;例えば、a=腫瘍幅、b=腫瘍長さ)によって測定し、体積を、式V=(a2×b)/2に従って計算し、式中、aは短い方の寸法である。腫瘍が1500mm3に達したとき又は腫瘍が潰瘍化したときに、動物を安楽死させた。
【０３４９】
フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤細胞(TIL)の分析
4つの群の8〜10週齢雌性C57BL/6マウス(n=5匹/群)の左側腹部に、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞をSQ移植する。これらの群のうち2つを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌルベクター対照でSQ免疫化し、他の2つの群を、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンでSQ免疫化する。これらの免疫化を、12日目に開始して7日間隔で2回実施する。免疫化に加えて、1つのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7群、及び1つのAd5[E1-,E2b-]-ヌル群中のマウスに、12及び16日目に100μgのラット抗PD-1抗体(クローンRMP1-14)をSQ投与し、19及び23日目に100μgのハムスター抗PD-1抗体(クローンJ43)をSQ投与して、抗PD-1抗体の有効用量を増加させる。これらの免疫経路チェックポイントモジュレーターによる処置について対照とするために、残りのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7群、及びAd5[E1-,E2b-]-ヌル群中のマウスに、同じ日に、妥当なラット及びハムスター対照IgG抗体を投与する。ハムスター抗PD-1抗体及びアイソタイプ対照は、BioXcellから購入する。27日目に、腫瘍を測定し、切除し、秤量する。腫瘍を刻み、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中のコラゲナーゼIV(1mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(100μg/ml)及びDNase IV(200U/ml)の混合物で、室温で30分間、80rpmで回転させながら消化する。酵素はSigma-Aldrichから購入する。消化後、腫瘍懸濁物を、70μmナイロン細胞ストレーナーを通過させ、遠心分離する。赤血球を、赤血球溶解緩衝液(Sigma-Aldrich)の添加によって除去し、溶解後、腫瘍懸濁物を、1%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)中で2回洗浄し、染色のために蛍光活性化細胞選別(FACS)緩衝液(PBS pH7.2、1%胎仔ウシ血清及び2mM EDTA)中で再懸濁する。CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)及びPDL1(MIH5)に対する蛍光コンジュゲート抗体は、BDから購入する。CD8β(H35-17.2)、CD25(PC61.5)、FoxP3(FJK-16s)、PD-1(RMP1-30)、LAG-3(C9B7W)及びCTLA4(UC10-4B9)に対する蛍光コンジュゲート抗体は、全てeBioscienceから購入した。表面染色を、抗CD16/CD32抗体(クローン2.4G2)を含むFACS緩衝液100μL中で4℃で30分間実施する。染色された細胞を、FACS緩衝液中で洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、(必要に応じて)透過処理緩衝液(eBioscience)中で透過処理し、その後、抗CD16/CD32抗体(クローン2.4G2)を含む透過処理緩衝液100μL中で4℃で60分間にわたって、蛍光コンジュゲート抗FoxP3抗体又は抗CTLA4抗体で染色する。細胞を、透過処理緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中に戻し洗浄し、固定体積の各サンプルを、BD Accuri C6フローサイトメーターを使用するフローサイトメトリーによって分析する。腫瘍細胞を、小さい及び大きい細胞を含む散乱ゲート中のCD45-事象として定義する。CD4+TILを、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD4+事象として定義する。CD8+TILを、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD8β+事象として定義する。調節性T細胞(Treg)を、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD4+/CD25+/FoxP3+事象として定義する。エフェクターCD4+T細胞を、リンパ球散乱ゲート中のCD45+/CD4+/CD25-/FoxP3-事象として定義する。アイソタイプが一致した対照抗体を使用して、FoxP3、PDL1、PD-1、LAG-3及びCTLA4の陽性発現を決定する。フローサイトメトリーを、Accuri C6フローサイトメーター(BD)を使用して実施し、BD Accuri C6ソフトウェアで分析する。
【０３５０】
Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7によって誘導されたHPV E6/E7特異的細胞性免疫応答
マウスにおけるCMI応答の誘導に対する漸増用量のAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫化の効果を決定するための研究を実施する。C57BL/6マウスの群(n=5匹/群)を、108、109又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6/E7で14日間隔で3回SQ免疫化する。対照マウスは、108VP、109VP又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(空のベクター対照)を投与される。最後の免疫化の2週間後、脾細胞CMI応答を、ELISpot分析によってIFN-γ分泌細胞について評価する。CD8α+及びCD4+脾細胞集団の両方におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内蓄積もまた、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7で免疫化したマウスにおいて決定する。
【０３５１】
HPV E6/E7発現腫瘍の処置
HPV E6/E7 TC-1腫瘍を保有するマウスにおける免疫療法処置の抗腫瘍効果を研究する。2つの群のC57BL/6マウス(n=5匹/群)の右肋骨下領域中に、0日目に2×105のTC-1腫瘍細胞をSQ接種する。1、8及び14日目に、マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(ベクター対照)又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7若しくはAd5[E1-,E2b-]-E6/E7のSQ注射によって処置する。全てのマウスを、腫瘍サイズについてモニタリングし、腫瘍体積を計算する。
【０３５２】
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法がより大きい腫瘍に対して有効であるかどうかを決定するために、TC-1腫瘍細胞を、2つの群のC57BL/6マウス(n=4匹/群)に移植し、次いで、腫瘍が小さいが触知可能であると予測される場合、腫瘍移植の後6日間、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による毎週の処置を遅延させる。
【０３５３】
最後に、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による免疫療法が大きい樹立された腫瘍に対して有効であるかどうかを決定するために、TC-1腫瘍細胞を、2つの群のC57BL/6マウス(n=4匹/群)に移植し、次いで、腫瘍が約100mm3であると予測される腫瘍移植の13日後まで、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7による毎週の処置を遅延させる。
【０３５４】
[実施例5]
HPV E6及び/又はHPV E7アゴニストエピトープバリアントに対する免疫応答の誘導
この実施例は、種々のアゴニストエピトープを含むAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7産物を、類似の様式で、免疫療法応答を誘導する能力について評価できることを示している。
【０３５５】
組合せ免疫療法後の腫瘍微小環境
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7処置マウスにおける遅延した腫瘍成長及び生存に寄与する細胞集団を分析するために、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、フローサイトメトリーによって評価する。4つの群のマウスに、2×105のTC-1細胞を移植し、10日後に、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7+抗PD-1抗体の2回の毎週の免疫化による処置を開始した。「材料及び方法」に記載されるように、27日目に、腫瘍全体を収集し、処理する。
【０３５６】
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7免疫療法に対する抗PD-1抗体の相乗/相加効果が存在するかどうかをさらに研究するために、TIL上でのPD-1、LAG-3及びCTLA-4の発現を試験する。
【０３５７】
[実施例6]
HPV E6及び/又はHPV E7アゴニストエピトープバリアントワクチンの臨床試験
この実施例は、ヒトパピローマウイルス16型(HPV-16)陽性である対象、HPV関連頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)を有する対象及びHPV関連子宮頸癌を有する対象における、関連する免疫化の安全性及び免疫原性の評価のための、種々のアゴニストエピトープを含むAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7産物の使用を記述する。
【０３５８】
HNSCC患者における現在の介入には、シスプラチン及び放射線又はセツキシマブ及び放射線による治療が含まれる。しかし、最初は応答する又は応答しない多くのHNSCC患者は、最終的に再燃する。Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを、HPVの初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子に対する抗腫瘍T細胞媒介性免疫応答を誘導するように設計する。Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンの重要な特徴の1つは、それを化学療法/放射線処置と組み合わせることができることである。
【０３５９】
得られた組換え複製欠損ベクターは、ベクター産生のためにトランスで必要とされるE1及びE2b遺伝子機能を供給する新たに操作された専有に係るヒト293ベースの細胞株(E.C7)中で増殖させることができる。
【０３６０】
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン産物を使用して、対象において安全かつ有効な様式で、HPV E6及び/又はHPV E7特異的細胞性免疫応答を誘導する。非盲検用量増大臨床研究を実施して、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン注射の安全性及び免疫原性を評価する。評価する投薬量レベルは、5×1010、1×1011及び5×1011ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7である。対象を、3つのコホートの対象を用いる連続的漸増投薬量レベルに登録し、彼らを用量制限毒性(DLT)についてモニタリングする。各対象に、3週間毎に3回の免疫化のためのSQ注射によって、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを与える。用量増大のためのDLTの評価を、コホート中の全ての対象がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも3週間後に研究来診をした後に行う。
【０３６１】
これらの対象は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の型のマカク)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット又は家禽である。
【０３６２】
フローサイトメトリーによって評価する、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン接種後のCMI応答の誘導
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンによる複数回の相同免疫化後のCMI誘導をフローサイトメトリーによって評価するために、C57Bl/6マウスの群(n=5匹/群)を、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンで、2週間間隔で3回SQ免疫化する。最後の免疫化の2週間後、脾細胞を、HPV E6及び/若しくはHPV E7ペプチド又は無関係の抗原に曝露させ、IFN-γ及び/又はTNFα発現T細胞の数について、フローサイトメトリーによって分析する。
【０３６３】
毒性学
広範な前臨床毒性学研究を実施して、C57Bl/6マウスにおけるSQ注射後のAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7アゴニストエピトープバリアントワクチンの毒性を評価する。毒性エンドポイントを、注射後の種々の時点において評価する。動物に、体重における差異を説明して臨床試験において使用されるものと一致した用量のビヒクル対照又はAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7若しくはAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンのいずれかを、1、22及び43日目に最大で3回のSQ注射で投与する。評価は、体重、体重増加、摂食量病理、血液学分析、血液化学分析、及び凝固時間に関する試験に対する影響からなる。
【０３６４】
ワクチン単独による、樹立されたHPV E6/E7発現腫瘍の処置
樹立されたHPV E6及び/又はHPV E7発現腫瘍を、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンによってin vivoで処置することの有効性を評価する。C57Bl/6マウスの右肋骨下中に、0日目に106のHPV E6及び/又はHPV E7発現腫瘍細胞をSQ移植する。腫瘍は、4〜6日目までに触知可能になると予測される。6、13及び20日目に、マウスを、1010VPのAd5[E1-,E2b-]-ヌル(空のベクター対照)又は1010VPのAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7若しくはAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンのSQ注射によって処置する。全てのマウスを、腫瘍成長についてモニタリングし、腫瘍体積を計算する。
【０３６５】
この臨床研究の結果は、新たなAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7アゴニストエピトープバリアントワクチンを使用することの安全性及び免疫原性を確立する。
【０３６６】
[実施例7]
HPV陽性個体におけるAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンの臨床試験
この実施例は、HPV陽性である対象における、HPV E6及び/又はHPV E7発現細胞を排除又は破壊するための、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンによる免疫化の安全性及び免疫原性の評価を記述する。
【０３６７】
ワクチンを、HPVの初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子に対するT細胞媒介性免疫応答を誘導するように設計する。このワクチンの骨格は、E1、E2b及びE3遺伝子の除去並びに改変型融合非発癌性HPV E6/E7遺伝子の挿入によって改変されたアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。得られた組換え複製欠損ベクターは、ベクター産生のためにトランスで必要とされるE1及びE2b遺伝子機能を供給する新たに操作された専有に係るヒト293ベースの細胞株(E.C7)中でのみ増殖させることができる。
【０３６８】
ワクチン産物を使用して、対象において安全かつ有効な様式で、HPV E6及び/又はHPV E7特異的細胞性免疫応答を誘導する。非盲検用量増大臨床研究を実施して、Ad5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン注射の安全性及び免疫原性を評価する。対象を、3つのコホートの対象を用いる連続的漸増投薬量レベルに登録し、彼らを用量制限毒性(DLT)についてモニタリングする。各対象に、皮下注射によってAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを与える。用量増大のためのDLTの評価を、コホート中の全ての対象がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも3週間後に研究来診をした後に行う。HPV E6/E7を発現するAd5骨格を、HPV陽性である対象の免疫化(ワクチン接種)に使用する。
【０３６９】
HPV陽性であるがHPV関連癌を有しない対象において、HPV E6及び/又はHPV E7発現細胞を排除又は破壊するAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンの効力を評価するための臨床研究もまた実施する。対象を、彼らが皮下注射によってAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを与えられる研究に登録する。対象をモニタリングして、HPV E6及びE7遺伝子に対するワクチン接種に対する一時的細胞性及び体液性応答を評価する。
【０３７０】
HPV陽性対象においてHPV E6及び/又はHPV E7発現細胞を排除又は破壊するために、対象に本開示のAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンをワクチン接種する。これらの対象は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の型のマカク)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット又は家禽である。
【０３７１】
[実施例8]
HPV陽性個体におけるAd5[E1-,E2b-]-E6/E7アゴニストエピトープバリアントワクチンの臨床試験
この実施例は、HPV陽性である対象における、HPV E6/E7発現細胞を排除又は破壊するための、関連する免疫化の安全性及び免疫原性の評価のための、種々のアゴニストエピトープを含むAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7産物の使用を記述する。
【０３７２】
ワクチンを、HPVの初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子に対するT細胞性免疫応答を誘導するように設計する。このワクチンの骨格は、E1、E2b及びE3遺伝子の除去並びに改変型融合非発癌性HPV E6/E7遺伝子の挿入によって改変されたアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。得られた組換え複製欠損ベクターは、ベクター産生のためにトランスで必要とされるE1及びE2b遺伝子機能を供給する新たに操作された専有に係るヒト293ベースの細胞株(E.C7)中でのみ増殖させることができる。
【０３７３】
Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン産物を使用して、HPV陰性である対象において安全かつ有効な様式で、HPV E6及び/又はHPV E7特異的細胞性免疫応答を誘導する。非盲検用量増大臨床研究を実施して、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチン注射の安全性及び免疫原性を評価する。対象を、3つのコホートの対象を用いる連続的漸増投薬量レベルに登録し、彼らを用量制限毒性(DLT)についてモニタリングする。各対象に、3週間毎に3回の免疫化にわたるSQ注射によって、Ad5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを与える。用量増大のためのDLTの評価を、コホート中の全ての対象がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも3週間後に研究来診をした後に行う。
【０３７４】
HPV陽性であるがHPV関連癌を有しない対象において、HPV E6及び/又はHPV E7発現細胞を排除又は破壊するAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンの効力を評価するための臨床研究もまた実施する。対象を、彼らが皮下注射によってAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンを与えられる研究に登録する。対象をモニタリングして、HPV E6及び/又はHPV E7遺伝子に対するワクチン接種に対する一時的細胞性及び体液性応答を評価する。
【０３７５】
HPV陽性対象においてHPV E6及び/又はHPV E7発現細胞を排除又は破壊するために、対象に本開示のAd5[E1-,E2b-]-E6、Ad5[E1-,E2b-]-E7又はAd5[E1-,E2b-]-E6/E7ワクチンをワクチン接種する。対象は、哺乳動物、例えば、ヒト又はマウスである。
【０３７６】
これらの対象は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の型のマカク)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット又は家禽である。
【０３７７】
[実施例9]
HPV-16陽性の健康な個体における、口腔リンス又はパップスメアサンプルによる、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの安全性及び免疫原性を評価するための第I/Ib相研究
この実施例は、HPV-16陽性である健康な個体における、口腔リンス又はパップスメアサンプルによる、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ免疫化の安全性及び免疫原性を評価する第I/Ib相試験を記述する。この研究は、2部で実施する:第1部には、6人の患者の増分設計を使用する用量増大を用い、第2部には、安全性、予備的効力及び免疫原性をさらに評価するための、最大耐用量(MTD)又は最高試験用量(HTD)(及びMTD又はHTD-1)の拡大を用いる。
【０３７８】
第1部では、6人の対象を、各コホートに順次登録する。対象を、用量制限毒性(DLT)について、以下の投薬量で評価する:コホート1: 5×109のウイルス粒子(VP);コホート2: 5×1010VP;及びコホート3: 5×1011VP。
【０３７９】
MTD又はHTDが決定されるときに、用量拡大が行われる。さらに28人の対象を、合計46人の対象になるように、試験の用量拡大構成要素に登録する。
【０３８０】
最大で46人の対象を研究に登録する。用量増大構成要素に、6人の対象を、コホート1で開始して順次登録する。用量拡大構成要素中に(即ち、MTD又はHTDが同定されると)、さらに28人の対象を、さらなる安全性、予備的効力及び免疫原性データを取得するために、MTD/HTDコホートに、合計46人の対象になるように登録する。
【０３８１】
対象組み入れ基準
対象を、以下の基準のうち1つ以上に基づいて、研究への組み入れのために選択する。健康であり、年齢>18を有し、かつ、口腔リンス若しくはパップスメアによって決定されるように、HPV-16陽性として報告されている、並びに/又は白血球(WBC)数≧3000/マイクロリットル、ヘモグロビン≧9g/dL及び血小板≧75,000/マイクロリットルによって判断される適切な血液学的機能を有する個体が、研究への組み入れに適格である。血清クレアチニンレベル<2.0mg/dL、ビリルビン<1.5mg/dL(ビリルビン≦2.0mg/dLを許容するジルベール症候群を除く)、並びに正常上限の≦2.5倍のALT及びASTレベルによって判断される適切な腎及び肝機能を有する個体、並びに出産可能な潜在力がない又は有効な避妊を使用する雌性個体もまた、研究への組み入れのために適格である。
【０３８２】
対象排除基準
対象を、以下の基準のうち1つ以上に基づいて、研究から排除する。自己免疫疾患、活動性肝炎、HIV感染、又は任意の重篤な併発性の慢性若しくは急性の病気を有する個体、妊婦及び授乳婦、並びに/或いは全身的静脈内又は経口コルチコステロイド治療を含む公知の免疫抑制効果を有する任意の薬物療法を現在使用している個体は、研究に不適格である。治験薬物又はデバイスを使用する研究に現在関与している、研究登録前30日以内に任意の生ウイルスワクチンを受けている、及び/又は子宮頸異形成>CIN 1、若しくは悪性腫瘍の懸念がある口腔咽頭病変を有する個体もまた、研究に不適格である。
【０３８３】
研究設計
これは、HPV-16陽性である健康な個体においてAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ]ワクチン産物の投薬、安全性及び免疫原性を試験するために設計した第I/Ib相臨床治験研究である。この研究には、増大する用量のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δワクチンを試験する第I相に、各々6人の患者の最大で3つのコホートを用いる。第Ib相では、さらなる患者、MTDで最大で合計20人及びMTD-1で20人を、試験する。
【０３８４】
第I相
コホート1について、6人の患者が、3週間毎に3回の免疫化にわたって、5×109のウイルス粒子(VP)の用量のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを投与される。各対象についての最初の免疫化が、次の対象から少なくとも1週間分離されて、以前の対象における有害事象のモニタリングを可能にするように、対象の登録をずらす。用量増大のための用量制限毒性(DLT)の評価を、このコホート中の最後の患者がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも2週間後に実施する。≦1/6のDLTが存在する場合、患者は、コホート2への登録を開始する。最初の6人の対象において≧2/6のDLTが存在する場合、開始用量をさらに低下させる可能性を含め、研究を再評価する。
【０３８５】
DLTは、以下の事象のいずれかとして定義される。グレード2以上のアレルギー若しくは即時型過敏反応、グレード2以上の自己免疫毒性(医学的介入を必要としない、白斑、及び甲状腺に関する隔離された実験室異常を除く)、及び/又はグレード2以上の神経学的毒性を示す対象は、DLTを経験したとカテゴライズされる。グレード3若しくは4の主要臓器毒性、グレード3(潰瘍化又は壊死)以上の注射部位反応、及び/又はグレード4の発熱を示す任意の対象もまた、DLTを経験したとカテゴライズされる。
【０３８６】
コホート2について、6人の患者が、3週間毎に3回の免疫化にわたって、5×1010VPの用量のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを投与される。各対象についての最初の免疫化が、次の対象から少なくとも1週間分離されて、以前の対象における有害事象のモニタリングを可能にするように、対象の登録をずらす。用量増大のためのDLTの評価を、このコホート中の最後の患者がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも2週間後に実施する。≦1/6のDLTが存在する場合、患者は、コホート3への登録を開始する。≧2/6がDLTを経験する場合、MTDは、次の最も低い用量(用量レベル#1)(5×109VP)として定義され、患者は、その用量レベルで第1b相への登録を開始する。
【０３８７】
コホート3について、6人の患者が、3週間毎に3回の免疫化にわたって、5×1011VPの用量のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを投与される。各対象についての最初の免疫化が、次の対象から少なくとも1週間分離されて、以前の対象における有害事象のモニタリングを可能にするように、対象の登録をずらす。DLTの評価を、このコホート中の最後の患者がワクチンの最後の用量を投与された少なくとも2週間後に実施する。≦1/6のDLTが存在する場合、HTDは、5×1011VPと定義され、患者は、その用量レベル(用量レベル#3)及び次のより低い用量レベル(用量レベル#2)で第1b相への登録を開始する。≧2/6がDLTを経験する場合、MTDは、次のより低い用量(用量レベル#2)(5×1010VP)として定義され、患者は、その用量レベル(用量レベル#2)及び次のより低い用量レベル(用量レベル#1)で第1b相への登録を開始する。
【０３８８】
用量増大を、表4に示すように実施する。患者内用量増大は許容されない。
【０３８９】
【表４】
2019517522.tif 000012
【０３９０】
第Ib相
開始MTD又はHTDを決定した後、対象は、2つの最高耐用量コホートで、2つの拡大コホートへの登録を開始する。合計20人の対象を、2つの特定の用量レベルの各々に登録し、この20人は、第1相における開始用量増大から6人+第1b相からさらに14人を含む。安全性、免疫原性及び抗ウイルス活性を評価する。
【０３９１】
コホート4について、さらなる患者(N=14)が、3週間毎に3回の免疫化にわたって、MTD/HTD(-1)のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを投与される。(その特定の用量レベルにおける20人の対象のうち)≧4のDLTが存在する場合、このコホートは登録を停止し、次のより低い用量が登録を開始する(このコホートが用量レベル#1であった場合、研究を停止し、再評価する)。
【０３９２】
コホート5について、さらなる患者(N=14)が、3週間毎に3回の免疫化にわたって、MTD/HTDのAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを投与される。(特定の用量レベルにおける20人の対象のうち)≧4のDLTが存在する場合、このコホートは登録を停止し、次のより低い用量がMTDとして定義される。
【０３９３】
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ
治験製品は、HPV16の非発癌性初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子を含む非複製性組換えアデノウイルス血清型(Ad5)であり、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δと呼ぶ。このAd5[E1-,E2b-]ベクターは非複製性であり、そのゲノムは、ヒトゲノム中に組み込まれない。研究薬物は表5に記載される。
【０３９４】
【表５】
2019517522.tif 000013
【０３９５】
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの用量調製及び投与
注射するAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの用量は、1mL当たり5×109VP(コホート1)、1mL当たり5×1010VP(コホート2)又は1mL当たり5×1011VP(コホート3)である。注射前に、適切なバイアルを冷凍庫から取り出し、少なくとも20分間かつ30分間以下にわたって制御された室温(20〜25℃、68〜77°F)で解凍させ、その後2〜8℃(35〜46°F)で維持する。
【０３９６】
各バイアルは、ゴムストッパーで密封され、白いフリップオフシールを有する。製品のエンドユーザーは、親指でキャップの白いプラスチック部分を上下させて、ゴムストッパーを露出させ、次いで、ストッパーを注射針で刺して、液体を引き出す。ゴムストッパーを、アルミニウム圧着シールを用いてバイアルに固定する。
【０３９７】
解凍したバイアルを旋回させ、次いで、無菌的技術を使用して、薬剤師は、1mLシリンジを使用して、適切なバイアルから適切な体積を引き出す。
【０３９８】
このワクチン用量を、1〜1/2インチ、20〜25ゲージの針を使用して、可能な限り直ぐに注射する。ワクチンを即座に注射できない場合、シリンジを薬局に戻し、施設の方針及び手順に従って適切に処分し、処分は、治験製品説明責任記録上に記録しなければならない。
【０３９９】
2〜8℃(35〜46°F)でのバイアル中でのワクチンの貯蔵は、8時間を超えない。ワクチンを一旦解凍したら、再凍結はしない。
【０４００】
5×1011のウイルス粒子の用量調製のために、バイアルから1mLの内容物を引き出し、注射部位をアルコールで準備し、大腿部におけるSC注射による対象への投与を、いずれのさらなる操作もなしに実施する。
【０４０１】
5×1010のウイルス粒子の用量調製のために、0.9%無菌食塩水の5.0mLバイアルから、0.50mLの流体を、1.0mLツベルクリンシリンジを使用して取り出し、4.50mLを残す。次いで、別の1.0mLツベルクリンシリンジを使用して、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δとラベルされたバイアルから0.50mLを取り出し、5mL無菌食塩水バイアル中に残る4.5mLの無菌食塩水中に送達する。希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの5mL溶液を反転させることによって内容物を混合する。1mLの希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを引き出し、注射部位をアルコールで準備し、大腿部におけるSQ注射による対象への投与を実施する。
【０４０２】
5×109のウイルス粒子の用量調製のために、0.9%無菌食塩水の5.0mLバイアルから、0.05mLの流体を、0.50mLツベルクリンシリンジを使用して取り出し、4.95mLを残す。次いで、別の0.50mLツベルクリンシリンジを使用して、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δとラベルされたバイアルから0.05mLを取り出し、5mL無菌食塩水バイアル中に残る4.95mLの無菌食塩水中に送達する。5mLの希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを反転させることによって内容物を混合する。1mLの希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを引き出し、注射部位をアルコールで準備し、大腿部におけるSQ注射による対象への投与を実施する。
【０４０３】
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを、合計3回の注射で、1日目、3週目及び6週目に投与する(図15)。ワクチンの全ての注射を、アルコールによる部位の準備後に、大腿部におけるSC注射によって1mLの体積として与える。いずれかの大腿部を開始注射のために使用する。引き続く注射を、開始注射と同じ大腿部に与え、少なくとも5cm分離する。
【０４０４】
処置期間手順及び評価
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを、合計3回の注射で、1日目、3週目及び6週目に投与する。全ての研究薬物投与処置を、予定した来診日の±7日以内に行う。対象は、研究薬物を最初に投与する研究1日目に登録したものとする。
【０４０５】
出産可能な潜在力がある雌性は、各注射前に尿妊娠試験を受ける。対象は、最初の注射後最低でも30分間及び引き続く注射後30分間にわたってクリニックに残って、バイタルサインの評価及び注射部位反応のモニタリングを可能にする。最初の注射について、バイタルサインを、注射の30分後に評価する。
【０４０６】
対象に、患者日記、定規及び体温計を提供して、部位反応、温度及び有害事象(Ae)をモニタリングする。クリニックのスタッフは、各注射の72時間後に電話で対象と連絡を取り、任意の体質的症状を評価する。
【０４０７】
探索性薬力学的評価
およそ90mLの対象の末梢血を、研究の間の特定の時点で採血する。免疫応答の証拠が6又は9週目の時点で存在する場合、6又は12カ月目にのみ血液を採血する(図15)。対象は、最初の免疫化の6カ月及び12カ月(+/-1カ月)後の時点で、HPV16試験と共に反復パップスメア又は口腔リンスを受ける。
【０４０８】
サンプル分析
ELISpot分析のために、抗原特異的CMI及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)活性を、ELISpotアッセイを使用して評価する。HPV16-E6Δ/E7Δに対するT細胞のCMI活性を、精製されたHPV16-E6Δ/E7ΔペプチドでPBMCを再刺激することによって評価し、IFN-γ分泌性スポット形成細胞(SFC)の数を決定する。HPV16-E6Δ/E7Δに対する細胞のCTL活性を、機能的CTLを測定するための一般に認められた試験であるグランザイムB ELISPOTアッセイを使用して評価する。PBMCを、精製されたHPV16-E6Δ/E7Δペプチドで再刺激し、グランザイムB分泌性スポット形成細胞(SFC)の数を決定する。陰性対照の減算後に106細胞当たり≧50のSFCが検出され、かつSFCが、陰性対照ウェルにおいて観察されたSFCよりも≧2倍高い場合、CMI応答を陽性とする。各コホート中の患者CMI応答を、ベースライン、3回目の免疫化の4週間後、並びに最初の免疫化の6及び12カ月後に決定する。各サンプリングポイントにおける免疫応答(SFCの数)を比較する統計的分析を、スチューデントT検定及び/又はマン・ホイットニー検定(PRISM、Graph Pad)を使用して実施する。
【０４０９】
CD4+及びCD8+T細胞応答を評価するためのフローサイトメトリー分析のために、個々の患者由来のPMBCサンプルを、フローサイトメトリー及び細胞内サイトカイン染色法を使用して、IFN-γ及び/又は腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)発現についてアッセイする。簡潔に述べると、106のPBMC細胞/ウェルを、2.0μg/mlのHPV16-E6Δ/E7Δペプチドプール、2.0μg/mlのSIV nef陰性対照ペプチドプール又は培地単独と共に6時間インキュベートする。タンパク質輸送阻害剤(GolgiStop)を、刺激の最後の4時間にわたって添加する。刺激後、細胞を、CD4及びCD8について染色し、固定し、透過処理し、IFN-γ及びTNF-αについて染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析する。各サンプリングポイントにおける免疫応答(パーセントIFN-γ及び/又はTNF-α発現細胞)を比較する統計的分析を、スチューデントT検定及び/又はマン・ホイットニー検定(PRISM、Graph Pad)を使用して実施する。
【０４１０】
抗体応答:HPV16-E6Δ/E7Δに対する血清IgG抗体(Ab)応答を、精製されたE6及びE7タンパク質を使用する以前に記載された定量的ELISA技術を使用して測定し、Ad5中和抗体(NAb)を決定し、エンドポイントAd5 NAb力価の逆数として報告する。各サンプリングポイント(ベースライン、各免疫化時、3回目の免疫化の3週間後)における免疫応答を比較する統計的分析を、スチューデントT検定及び/又はマン・ホイットニー検定(PRISM、Graph Pad)を使用して実施する。
【０４１１】
検出力の仮定
ELIspot CMI測定について、ベースラインPBMCサンプル(N=20)からの50(±10 SD)のスポット形成細胞(SFC)の最小の活性 対 免疫化の間及び後の時点で採取されたPBMCサンプル(N=10)について100(±25 SD)のSFCまでの最小の増加を仮定すると、検出力は、95%信頼区間について>99%である(両側検定)。
【０４１２】
フローサイトメトリー研究について、ベースラインPBMCサンプル(N=10)からのおよそ0.5%(±0.5 SD)のCD4+若しくはCD8+IFN-γ及び/又はTNF-α発現リンパ球のバックグラウンドレベル 対 免疫化の間及び後の時点で採取されたPBMCサンプル(N=10)についての1.0%(±0.5 SD)のCD4+若しくはCD8+IFN-γ及び/又はTNF-α発現リンパ球のレベルまでの最小の増加を仮定すると、検出力は、95%信頼区間について88.5%である(両側検定)。
【０４１３】
血清HPV16-E6Δ/E7Δ抗体測定について、患者サンプル(N=10)が、ベースライン血清サンプルにおいて10ナノグラムのAbのIgG等価物/ml(±5 SD)の既存の抗体レベルを有し、これらの抗体レベルは免疫化の間及び後の時点で採取された血清サンプルにおいて少なくとも15ナノグラムのAbのIgG等価物/ml(±5 SD)に増加すると仮定すると、検出力は、95%信頼区間について88.5%である(両側検定)。
【０４１４】
Ad5中和抗体(NAb)測定について、患者(N=10)が、200(±100 SD)の逆Ad5 NAb力価レベルを有する既存のAd5免疫を有し、これらのレベルが免疫化の間及び後の時点で採取された血清サンプル(N=10)中で少なくとも400(±100 SD)へのこれらのレベルに増加すると仮定すると、検出力は、95%信頼区間について>99%である(両側検定)。
【０４１５】
安全性分析
DLTを、コホートにおいて持続的に評価する。次の用量レベルへと増大するかどうかの全体的評価を、以前のコホートの最後の対象が最初の注射を受けた少なくとも3週間後に行う。用量レベルで処置した対象のうち<20%(即ち、3人の対象のうち0人、6人の対象のうち≦1人、又は20人の対象のうち≦4人)がDLTを経験する場合、用量レベルは安全と考えられる。安全性を、この研究の用量増大構成要素の各用量レベルにおいて、6人の対象において評価する。この研究の用量拡大構成要素のMTD又はHTDで処置したさらなる対象において、安全性をモニタリングし続ける。対象は、少なくとも1回の注射で処置した場合に、安全性について評価可能と考えられる。DLTを、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの複数の用量の安全性評価を提供するために、9週間の間観察する。
【０４１６】
全体的安全性を、用量コホート内で及び研究集団全体について、処置により発生するAE、重篤な有害事象(SAE)、並びに安全性実験室試験、身体検査及びバイタルサインにおける臨床的に顕著な変化に関して、CTCAEバージョン4.0を使用したグレードによるAEの頻度一覧を使用する記述的分析によって評価する。
【０４１７】
探索性免疫応答分析
陽性免疫応答を有する対象の百分率を、用量コホート及び全体によって評価する。陽性免疫応答は、フローサイトメトリー読み出し(サイトカイン産生又はCD107発現)と共に、ex vivo刺激アッセイにおけるCMI反応性によって定義される。抗原特異的ペプチドチャレンジアッセイは、バックグラウンドを上回る>250の反応性T細胞/細胞百万個の読み出しを要求する。
【０４１８】
免疫応答を、(MTD/HTD)で処置した20人の対象及び(MTD/HTD-1)で処置した20人の対象(用量増大において6人、用量拡大において14人)において評価する。応答の大きさを記載する。対象は、少なくとも3回の注射を受ける場合に、免疫応答について評価可能と考えられる。
【０４１９】
効力分析
陰性HPV-16ウイルスPCR試験を達成する対象の百分率を、用量コホート及び全体によって決定及び評価する。奏効率の95%信頼区間を評価する。
【０４２０】
[実施例10]
HPV-16陽性扁平上皮癌を有する個体における、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの安全性、忍容性を評価するための第I相研究
この実施例は、HPV16型陽性である個体において3回の注射で3週間毎に皮下投与した場合のAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの安全性の評価のための、改変/融合された非発癌性HPV-E6/E7遺伝子をコードするアデノウイルスベクターAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの使用を記述する。さらに、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの薬力学(PD)を、E6及びE7特異的CMI応答についての、凍結保存したPBMCサンプルのELISpot分析によって評価し、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ単独の効力を、全奏効率(ORR)、6カ月病勢コントロール率(DCR)、無増悪生存(PFS)率及び全生存(OS)率を使用して決定する。
【０４２１】
これは、以下の部位のうち1つにおけるHPV-16陽性扁平上皮癌を有する個体についての第I相試験である:子宮頸部、腟、外陰部、頭/頸部、肛門及び陰茎。この研究を、用量増大3+3設計を使用して実施して、安全性及び忍容性を評価する。3〜6人の対象を、用量コホート1で開始して順次登録する。対象を、用量制限毒性(DLT)について評価する:コホート1: 5×1010ウイルス粒子(VP);コホート2: 5×1011VP;必要に応じて、用量脱増大コホート(コホート-1): 5×109VP。
【０４２２】
第1b相研究における用量拡大は、MTD又はHTDが決定された場合に行う。最大で12人の対象をこの研究に登録する。3〜6人の対象を、コホート1で開始して順次登録する。
【０４２３】
研究設計
これは、子宮頸部、腟、外陰部、頭/頸部、肛門、陰茎の組織学的又は細胞学的に確認されたHPV陽性扁平上皮癌を有する対象における第I相試験である。この研究には、標準的な修正版Fibonacciコホート3+3設計の使用を伴う。処置は、表4に概説した通り、DL1で開始する。患者内用量増大は許容されない。
【０４２４】
この用量増大構成要素では、3〜6人の対象を、用量コホート1で開始して順次登録する(表6)。各コホート登録の間、登録間に最低でも7日間が必要である。これにより、次の対象を処置する前の、以前の対象における用量制限毒性(DLT)モニタリングが可能になる。DLTを持続的にモニタリングする。研究設計並びに処置及び相関性バイオマーカーの概略については、それぞれ図16及び図17を参照のこと。
【０４２５】
【表６】
2019517522.tif 000014
【０４２６】
最後の研究処置後の4週間(28日)以内に生じる事象は、DLTについて評価可能である。表7は、どの事象をDLTとするかを詳述する。
【０４２７】
【表７】
2019517522.tif 000015
【０４２８】
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δワクチン
この治験製品は、HPV16の非発癌性初期6(E6)及び初期7(E7)遺伝子を含む非複製性組換えアデノウイルス血清型(Ad5)であり、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δと呼ばれる。この研究薬物は、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの表示を有し、表5に既に記載されている。このAd5[E1-,E2b-]ベクターは、非複製性であり、そのゲノムは、ヒトゲノム中に組み込まれない。
【０４２９】
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの用量調製及び投与
注射するAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの用量は、1mL当たり5×109VP(脱増大コホート-1について)、1mL当たり5×1010VP(コホート1)又は1mL当たり5×1011VP(コホート2)である。注射前に、適切なバイアルを冷凍庫から取り出し、少なくとも20分間かつ30分間以下にわたって制御された室温(20〜25℃、68〜77°F)で解凍させ、その後2〜8℃(35〜46°F)で維持する。
【０４３０】
各バイアルは、ゴムストッパーで密封され、白いフリップオフシールを有する。製品のエンドユーザーは、親指でキャップの白いプラスチック部分を上下させて、ゴムストッパーを露出させ、次いで、ストッパーを注射針で刺して、液体を引き出す。ゴムストッパーを、アルミニウム圧着シールを用いてバイアルに固定する。
【０４３１】
解凍したバイアルを旋回させ、次いで、無菌的技術を使用して、薬剤師は、1mLシリンジを使用して、適切なバイアルから適切な体積を引き出す。
【０４３２】
このワクチン用量を、1〜1/2インチ、20〜25ゲージの針を使用して、可能な限り直ぐに注射する。ワクチンを即座に注射できない場合、シリンジを薬局に戻し、施設の方針及び手順に従って適切に処分し、処分は、治験製品説明責任記録上に記録しなければならない。
【０４３３】
2〜8℃(35〜46°F)でのバイアル中でのワクチンの貯蔵は、8時間を超えない。ワクチンを一旦解凍したら、再凍結はしない。
【０４３４】
5×1011のウイルス粒子の用量調製のために、バイアルから1mLの内容物を引き出し、注射部位をアルコールで準備し、大腿部におけるSQ注射による対象への投与を、いずれのさらなる操作もなしに実施する。
【０４３５】
5×1010のウイルス粒子の用量調製のために、0.9%無菌食塩水の5.0mLバイアルから、0.50mLの流体を、1.0mLツベルクリンシリンジを使用して取り出し、4.50mLを残す。次いで、別の1.0mLツベルクリンシリンジを使用して、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δとラベルされたバイアルから0.50mLを取り出し、5mL無菌食塩水バイアル中に残る4.5mLの無菌食塩水中に送達する。希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δの5mL溶液を反転させることによって内容物を混合する。1mLの希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを引き出し、注射部位をアルコールで準備し、大腿部におけるSQ注射による対象への投与を実施する。
【０４３６】
5×109のウイルス粒子の用量調製のために、0.9%無菌食塩水の5.0mLバイアルから、0.05mLの流体を、0.50mLツベルクリンシリンジを使用して取り出し、4.95mLを残す。次いで、別の0.50mLツベルクリンシリンジを使用して、Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δとラベルされたバイアルから0.05mLを取り出し、5mL無菌食塩水バイアル中に残る4.95mLの無菌食塩水中に送達する。5mLの希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを反転させることによって内容物を混合する。1mLの希釈したAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを引き出し、注射部位をアルコールで準備し、大腿部におけるSQ注射による対象への投与を実施する。
【０４３７】
ワクチンの全ての注射を、アルコールによる部位の準備後に、大腿部におけるSC注射によって1mLの体積として与える。いずれかの大腿部を開始注射のために使用する。引き続く注射を、開始注射と同じ大腿部に与え、少なくとも5cm分離する。
【０４３８】
処置期間手順及び評価
Ad5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δを、3回の注射で、1、21及び43日目に投与する。全ての研究薬物投与処置は、1日目を除き、予定した来診日の±2日以内に行うべきである。対象は、研究薬物を投与する1日目に登録したものとする。
【０４３９】
対象は、最初の注射後最低でも30分間にわたってクリニックに残って、バイタルサインの評価及び注射部位反応のモニタリングを可能にすべきである。最初の注射について、バイタルサインを、注射の30分後に評価しなければならない。
【０４４０】
以下の手順及び評価を、対象のソースレコードにおいて実施及び報告する:指示された身体検査、バイタルサイン及び体重;ECOGパフォーマンスステータスの評価、併用薬物療法の再検討、AE評価、臨床実験室試験(化学:ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素塩、カルシウム、マグネシウム、リン、グルコース、BUN、血清クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、総タンパク質、アルブミン、並びに総及び直接ビリルビン;血液学:鑑別を伴うCBC並びにヘモグロビン及びヘマトクリットと共に血小板;尿検査)、探索性免疫分析のための全血の収集、並びに腫瘍画像化及び評価。腫瘍画像化及び評価を、65日目に実施し、さらに次いで、その後12週間(±7日)毎に、又は臨床的に示された場合にはより早く、実施する。客観的応答を、最初の報告された完全寛解(CR)又は部分寛解(PR)の少なくとも4週間(最低でも28日)後に確認する。標的及び非標的病変を報告及び追跡する。腫瘍応答の評価のために、RECISTバージョン1.1が追跡される。
【０４４１】
探索性薬力学的評価
およそ90mLの対象の末梢血を、研究の間の特定の時点及び/又は特定の注射の後に採血して、免疫応答に対する研究薬物の効果を評価する。採血を、各注射の前、及び3回目の注射(65日目)の後のおよそ3週間の合計4つの時点で実施する。PBMCサンプルのための6つの10mLの緑色蓋ヘパリンナトリウムチューブ及び血清サンプルのための2つの8mL血清分離チューブに採血する。免疫評価を実施し、これには、ELISpotアッセイ、フローサイトメトリーベースのアッセイ及び血清アッセイが含まれる。
【０４４２】
PBMCの分析のために、Ficoll-Hypaque密度勾配分離によって分離した治療前及び治療後のPBMCを、細胞内サイトカイン染色アッセイを使用して、抗原特異的免疫応答について分析する。PBMCを、腫瘍関連抗原HER2をコードする重複する15マーペプチドプールでin vitroで刺激する。対照ペプチドプールは、陰性対照としてのヒト白血球抗原ペプチド及び陽性対照としてのCEFTペプチドミックスの使用を伴う。CEFTは、CMV、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザ及び破傷風毒素のペプチドの混合物である。CD4及びCD8T細胞の刺激後分析には、IFN-γ、IL-2、腫瘍壊死因子及びCD107aの産生を伴う。十分なPBMCが入手可能な場合、他の腫瘍関連抗原に対するT細胞の発生についてのアッセイもまた実施する。
【０４４３】
PBMCを、標準的な免疫細胞型(CD4及びCD8 T細胞、ナチュラルキラー[NK]細胞、調節性T細胞[Treg]、骨髄由来サプレッサー細胞[MDSC]並びに樹状細胞)並びに123の免疫細胞サブセットにおける変化についても評価する。十分なPBMCが入手可能な場合、選択された対象由来のPBMCを、CD4及びCD8 T細胞、NK細胞、Treg並びにMDSCを含む特定の免疫細胞サブセットの機能について分析する。
【０４４４】
ELISpot分析のために、抗原特異的CMI及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)活性を、ELISpotアッセイを使用して評価する。HPV16-E6Δ/E7Δに対するT細胞のCMI活性を、精製されたHPV16-E6Δ/E7ΔペプチドでPBMCを再刺激することによって評価し、IFN-γ分泌性スポット形成細胞(SFC)の数を決定する。HPV16-E6Δ/E7Δに対する細胞のCTL活性を、機能的CTLを測定するための一般に認められた試験であるグランザイムB ELISPOTアッセイを使用して評価する。PBMCを、精製されたHPV16-E6Δ/E7Δペプチドで再刺激し、グランザイムB分泌性スポット形成細胞(SFC)の数を決定する。以前に記載された基準(17、18)を使用して、陰性対照の減算後に106細胞当たり≧50のSFCが検出され、かつSFCが、陰性対照ウェルにおいて観察されたSFCよりも≧2倍高い場合、CMI応答を陽性とする。各コホート中の患者CMI応答を、ベースライン、3回目の免疫化の4週間後、並びに最初の免疫化の6及び12カ月後に決定する。各サンプリングポイントにおける免疫応答(SFCの数)を比較する統計的分析を、スチューデントT検定及び/又はマン・ホイットニー検定(PRISM、Graph Pad)を使用して実施する。
【０４４５】
可溶性因子の分析のために、血清を、以下の可溶性因子について、治療前及び治療後に分析する:可溶性CD27、可溶性CD40リガンド、及びHPV E6に対する抗体、HPV E7に対する抗体、並びに他の腫瘍関連抗原に対する抗体。HPV16-E6及び/又はHPV E7に対する血清IgG抗体(Ab)応答を、精製されたE6及びE7タンパク質を使用する定量的ELISA技術を使用して測定し、Ad5中和抗体(NAb)を決定し、エンドポイントAd5 NAb力価の逆数として報告する。各サンプリングポイント(ベースライン、各免疫化時、3回目の免疫化の3週間後)における免疫応答を比較する統計的分析を、スチューデントT検定及び/又はマン・ホイットニー検定(PRISM、Graph Pad)を使用して実施する。
【０４４６】
探索性ゲノミクス及びプロテオミクス分子分析
探索性ゲノミクス及びプロテオミクス分子プロファイリングを、次世代シークエンシング及び質量分析ベースの定量的プロテオミクスによって、FFPE腫瘍組織及び全血(対象が一致した、腫瘍組織に対する正常コンパレーター)に対して実施する。腫瘍組織及び全血の収集が、この研究のために必要である。腫瘍組織及び全血を、ベースラインで取得する。
【０４４７】
単一のFFPE腫瘍組織ブロックが、腫瘍DNA、腫瘍RNA及び腫瘍タンパク質の抽出のために必要である。全血サンプルが、対象の正常DNAの抽出のために必要である。腫瘍組織及び全血を、CLIA登録された及びCAP認定された/CLIA認証された実験室で処理する。表8は、分子プロファイリングのための収集スケジュールを記載する。
【０４４８】
【表８】
2019517522.tif 000016
【０４４９】
組み入れ基準
対象が本研究への組み入れに適格であるためには、以下の条件のうち1つ以上を満たす必要がある。以下のタイプ:子宮頸部、腟又は外陰部、頭頸部、肛門若しくは陰茎の扁平上皮癌のうちの1つの組織学的若しくは細胞学的に確認されたHPV16陽性悪性腫瘍を有する個体、治癒目的の治療(即ち、外科的切除、化学放射線療法など)によって処置不能な疾患を有する個体、及び/又は白金剤を含むべき、転移/再発状況における治療の少なくとも1つの以前のレジメンで処置した進行性転移性若しくは再発性疾患を有する個体が、研究への組み入れに適格である。研究に適格な対象はまた、試験についての書面によるインフォームドコンセントを提供できなければならず、インフォームドコンセントに署名する日に≧18歳でなければならない。固形腫瘍における応答評価基準(RECIST)1.1によって決定される測定可能な疾患を有する対象もまた、研究への組み入れに適格である。
【０４５０】
さらなる適格性基準には、対象が、最近取得された腫瘍病変のコア又は切除生検(登録の最大で30日前に取得される検体として定義される)からの組織を提供する意思があること、対象が、65日目(+7日)における処置後に反復生検を受ける意思があること、及び対象がECOGパフォーマンススケールで0又は1のパフォーマンスステータスを有する場合に対象が適格であること、が含まれる。研究への組み入れに適格な個体は、白血球(WBC)≧2000/μL、好中球≧1500/μL、血小板≧100×103/μL、ヘモグロビン≧9.0g/dL、クレアチニン血清≧1.5×正常上限(ULN)又はクレアチニンクリアランス(CrCl)≧40mL/分(コッククロフト/ゴールト式を使用する)、AST≦3×ULN、及びALT≦3×ULN、総ビリルビン≦1.5×ULN(総ビリルビン<3.0mg/dLを有し得るジルベール症候群の対象を除く)によって測定されるように、適切な臓器機能を実証する。
【０４５１】
対象が出産可能な潜在力がある雌性である場合、その個体は、研究への組み入れに適格であるために、研究薬物療法の最初の用量を受ける前24時間以内に陰性尿妊娠を有するべきである。尿試験が陽性である場合又は陰性と確認できない場合、血清妊娠試験が必要となる。出産可能な潜在力がある雌性対象は、組み入れに適格であるために、研究薬物療法の最後の用量の後30日間の研究の過程にわたって、受胎調節の2つの方法を使用する若しくは外科的に生殖不能である、又は異性活動を控える意思がなければならない。出産可能な潜在力がある対象は、外科的に生殖不能にされていない対象、又は>1年にわたって月経不在ではない対象である。最後に、研究への組み入れに適格と考えられるために、対象が雄性対象であり、研究治療の最初の用量で開始して、研究治療の最後の用量の後30日間にわたる避妊の適切な方法を使用することに同意する場合、対象は適格である。
【０４５２】
排除基準
以下の場合が、試験から対象を排除するための根拠である。研究処置の開始の4週間以内に任意の他の治験薬剤、化学療法、免疫療法、放射線療法又は分子標的化薬剤を受ける個体は、研究への組み入れに適格ではない。局所的治療によって治癒可能と考えられる疾患を有する対象もまた不適格である。さらなる排除基準には、彼らが研究治療を受けている研究への現在の参加及び/若しくは研究治療への過去の参加、又は処置の最初の用量の4週間以内の治験デバイスの使用が含まれる。
【０４５３】
試験処置の最初の用量の前7日以内に全身的ステロイド治療若しくは任意の他の形態の免疫抑制性治療を受ける免疫不全オラレ(orare)の診断を有する対象、又は活動性TB(バチルス・ツベルクローシス(Bacillus Tuberculosis))の既知の感染歴を有する対象は、臨床試験から排除する。研究1日目の前4週間以内に先行する抗癌モノクローナル抗体(mAb)を与えられた患者、又は4週間よりも前に投与された薬剤に起因する有害事象から回復していない(即ち、≦グレード1又はベースライン)患者もまた、この試験への組み入れに不適格と考えられる。さらに、進行中の若しくは積極的処置を必要とする既知のさらなる悪性腫瘍(例外として、潜在的に治癒的な治療を受けた皮膚の基底細胞癌若しくは皮膚の扁平上皮癌、又は子宮頸上皮内癌が含まれる)、又は既知の活動性中枢神経系(CNS)転移及び/若しくは癌性髄膜炎を有する対象は、試験から排除される。放射線で処置されたCNS転移を有する参加者は、登録の≧4週間前に放射線を完了しており、画像化(IV造影剤を用いた頭部のCT、又はMRI)で確認された進行を有しない限り、適格である。これらの参加者は、コルチコステロイド(登録前少なくとも2週間にわたる≧10mgのプレドニゾン又は等価物)から安定に離れることができなければならない。
【０４５４】
過去2年間に全身的処置(即ち、疾患改変剤、コルチコステロイド又は免疫抑制性薬物の使用による)を必要とした活動性自己免疫疾患を有する対象は、試験から排除される。しかし、補充治療(例えば、副腎又は下垂体不全のためのチロキシン、インスリン又は生理的コルチコステロイド補充治療など)は、全身的処置の一形態とはしない。活動性非感染性間質性肺炎、全身的治療を必要とする活動性感染の既知の病歴を有する若しくはそれらの何らかの証拠を有する対象、又は試験の結果を混乱させ得る任意の状態、治療若しくは実験室異常の履歴若しくは現在の証拠を有する対象は、試験の全持続時間にわたる対象の参加を妨げるか、又は対象の参加にとって得策ではなく、処置している治験責任医師の意見により試験から排除される。試験処置の最後の用量の後120日間の前スクリーニング又はスクリーニング来診で開始する試験の計画時間内に、対象が、協調して試験の要件を妨げる既知の精神医学的若しくは物質乱用障害を有する場合、或いは妊娠中若しくは授乳中である場合、又は妊娠する若しくは子供をもうけることが予測される場合には、対象は排除される。
【０４５５】
最後に、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(HIV 1/2抗体)、既知の活動性B型肝炎(例えば、HBsAg反応性)又はC型肝炎(例えば、HCV RNA[定性的]が検出される)の既知の感染歴を有する対象、又は研究治療の予定した開始の30日以内に生ワクチンを投与された対象は、この臨床試験への組み入れに不適格である。注射用の季節性インフルエンザワクチンは一般に、不活性化インフルエンザワクチンであり、許容されるが、鼻腔内インフルエンザワクチン(例えば、Flu-Mist（登録商標）)は、生弱毒化ワクチンであり、許容されない。
【０４５６】
統計的考察
これは、以前に記載された標準的な修正版Fibonacciコホート3+3設計を使用して、難治性の進行型/転移性HPV+悪性腫瘍(子宮頸部、外陰部、腟、肛門、陰茎及び頭頸部の扁平上皮癌)を有する患者におけるAd5[E1-,E2b-]-HPV16-E6Δ/E7ΔのR2PD及び有害事象プロファイルを決定するために設計した単一群第I相研究である。R2PDは、疾患型に特異的ではなく、全体として推定される。
【０４５７】
サンプルサイズは、各用量増大コホートにおいて必要とされる参加者の数に基づく。DLに基づいて、最低でも9人の参加者かつ最大で12人の参加者を含めることができる。
【０４５８】
安全性分析
DLTを、コホートにおいて持続的に評価する。次の用量レベルへと増大させるかどうかの全体的評価を、以前のコホートの最後の対象が最初の注射を受けた少なくとも3週間後に行う。用量レベルは、用量レベルで処置した対象のうち<33%(即ち、3人の対象のうち0人、6人の対象のうち≦1人、9人の対象のうち≦2人、12人の対象のうち≦3人、15人の対象のうち≦4人、又は18人の対象のうち≦5人)がDLTを経験する場合、安全と考えられる。DLTは上で定義される。安全性を、この研究の用量増大構成要素の各用量レベルにおいて、3人又は6人の対象において評価する。対象は、少なくとも1回の注射で処置した場合に、安全性について評価可能と考えられる。DLTを、このワクチンの複数の用量の安全性評価を提供するために、9週間の間観察する。
【０４５９】
全体的安全性を、用量コホート内で及び研究集団全体について、処置により発生するAE、SAE、並びに安全性実験室試験、身体検査及びバイタルサインにおける臨床的に顕著な変化に関して、CTCAEバージョン4.0を使用したグレードによるAEの頻度一覧を使用する記述的分析によって評価する。
【０４６０】
効力分析
全ての対象を、死亡するまで、65日目の後3カ月毎に進行/生存について追跡する。RECISTバージョン1.1を使用して客観的な確認された完全又は部分的な全体的腫瘍応答を達成する対象の百分率を、用量コホート及び全体によって評価する。奏効率の95%信頼区間を評価する。疾患対照(少なくとも6カ月間持続する確認された応答又はSD)を、類似の様式で分析する。
【０４６１】
全体的応答の持続時間を、用量コホート及び全体によって評価する。全体的応答の持続時間を、CR又はPR(いずれか最初に記録された方)を満たした時間測定基準から、再発又はPDが客観的に報告される(処置を開始して以降に記録された最も小さい測定値を、PDについての参照とする)最初の日付まで、測定する。
【０４６２】
PFSを、カプラン・マイヤー法を使用して、用量コホート及び全体によって評価する。PFSは、最初の処置の日付から、疾患進行又は死亡(任意の原因)のいずれか早く起きる方の日付までの時間として定義する。追跡の最後の時点で疾患進行を有しない又は死亡しなかった対象は、対象が進行なしであった最後の既知の日付で打ち切る。
【０４６３】
OSを、カプラン・マイヤー法を使用して、用量コホート及び全体によって評価する。OSは、最初の処置の日付から死亡(任意の原因)の日付までの時間として定義する。追跡の最後の時点で生存している対象は、生存していた最後の既知の日付で打ち切る。
【０４６４】
[実施例11]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種は3週間間隔で離す。その後、ブースター注射を、2カ月毎に(隔月で)与える。この対象は、任意の動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ヒト又は非ヒト霊長類である。ワクチンの投与の際に、HPV発現癌に対する細胞性及び体液性応答が開始され、癌が排除される。
【０４６５】
[実施例12]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7並びに共刺激分子を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の組合せ処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、共刺激分子と組み合わせて、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種は3週間間隔で離す。その後、隔月でブースター注射を投与する。この共刺激分子は、B7-1、ICAM-1又はLFA-3である。この対象は、任意の動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ヒト又は非ヒト霊長類である。ワクチン及び共刺激分子の投与の際に、HPV発現癌に対する細胞性及び体液性応答が開始され、癌が排除される。
【０４６６】
[実施例13]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7並びにチェックポイント阻害剤を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の組合せ処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、チェックポイント阻害剤と組み合わせて、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種は3週間間隔で離す。その後、隔月でブースター注射を投与する。このチェックポイント阻害剤は、抗PDL1抗体、例えば、アベルマブである。アベルマブを、添付文書ラベルに従い、10mg/kgで投薬及び投与する。この対象は、任意の動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ヒト又は非ヒト霊長類である。ワクチン及びチェックポイント阻害剤の投与の際に、HPV発現癌に対する細胞性及び体液性応答が開始され、癌が排除される。
【０４６７】
[実施例14]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7並びに操作されたNK細胞を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の組合せ処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、共刺激分子と組み合わせて、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種は3週間間隔で離す。その後、隔月でブースター注射を投与する。対象に、操作されたNK細胞、具体的には活性化されたNK細胞(aNK細胞)をさらに投与する。aNK細胞を、処置1回当たり2×109細胞の用量で、-2、12、26及び40日目に注入する。それを必要とする対象は、HPV発現癌細胞、例えば、HPV関連又はHPV誘導性癌を有する。対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト霊長類である。
【０４６８】
[実施例15]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7並びにALT-803を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の組合せ処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、共刺激分子と組み合わせて、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種は3週間間隔で離す。その後、隔月でブースター注射を投与する。対象に、それぞれ、1、2、4、5、7及び8週目に、10μg/kgの用量で、スーパーアゴニスト/スーパーアゴニスト複合体、例えばALT-803もまたSC投与する。それを必要とする対象は、HPV発現癌細胞、例えば、HPV関連又はHPV誘導性癌を有する。対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト動物である。
【０４６９】
[実施例16]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7並びに低用量化学療法を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の組合せ処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、共刺激分子と組み合わせて、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種を、3週間間隔分離する。その後、隔月でブースター注射を投与する。
【０４７０】
対象に、低用量化学療法もまた投与する。この化学療法はシクロホスファミドである。化学療法は、治療投与の臨床的標準よりも低い用量で投与する。例えば、化学療法を、合計8週間にわたって2週間毎に、1〜5日目及び8〜12日目に、1日2回(BID)50mgで投与する。それを必要とする対象は、HPV発現癌、例えば、HPV関連又はHPV誘導性癌を有する。対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト動物である。
【０４７１】
[実施例17]
Ad5[E1-,E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-,E2b-]-HPV E7及び/又はAd5[E1-,E2b-]-HPV E6/E7並びに低線量放射線を用いた、HPV誘導性又はHPV関連癌の組合せ処置
この実施例は、それを必要とする対象における、HPV誘導性又はHPV関連癌中のHPV発現細胞の処置を記述する。E6、E7及び/又はE6/E7をコードするAd5[E1-,E2b-]ベクターを、共刺激分子と組み合わせて、1×109〜5×1011のウイルス粒子(VP)の用量でそれを必要とする対象に皮下投与する。ワクチンを、合計3回投与し、各ワクチン接種は3週間間隔で離す。その後、隔月でブースター注射を投与する。
【０４７２】
対象に、低線量放射線もまた投与する。低線量放射線は、治療投与の臨床的標準よりも低い線量で投与される。8Gyでの同時発生的な体幹部定位放射線療法(SBRT)が、8、22、36、50日目(2週間毎、4回線量)に与えられる。放射線は、SBRTを使用して、全ての実行可能な腫瘍部位に投与される。それを必要とする対象は、HPV発現癌、例えば、HPV関連又はHPV誘導性癌を有する。対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト動物である。
【０４７３】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、そのような実施形態が例のみとして提供されることは、当業者に明らかである。多数のバリエーション、変化及び置換が、本発明から逸脱することなしに、当業者に明らかである。本明細書に記載される発明の実施形態の種々の代替法が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、並びにこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの等価物がそれによってカバーされることが意図される。
【０４７４】
【表９】
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【図１Ａ】
2019517522.tif 000077
【図１Ｂ】
2019517522.tif 000078
【図２Ａ】
2019517522.tif 000079
【図２Ｂ】
2019517522.tif 000080
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019517522.tif 000084
【図４Ｃ】
2019517522.tif 000085
【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
2019517522.tif 000088
【図７】
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【図８】
2019517522.tif 000090
【図９Ａ】
2019517522.tif 000091
【図９Ｂ】
2019517522.tif 000092
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2019517522000001.app
【国際調査報告】
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2019517522.tif 000102
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