(57)【要約】本発明は、四量体二重特異性抗体分子、ならびにその産生方法、その使用、及び四量体二重特異性抗体分子をコードする核酸分子に関する。【選択図】図１
2019533675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗原に対する第１の結合部位と第２の抗原に対する第２の結合部位とを含む二重特異性ｓｃＦｖ断片の二量体である四価抗体分子であって、前記２つの結合部位が、リンカードメインを介して共に結合している、前記四価抗体分子。
【請求項２】
前記ｓｃＦｖ断片がタンデムｓｃＦｖである、請求項１に記載の四価抗体分子。
【請求項３】
前記リンカードメインが免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の四価抗体分子。
【請求項４】
前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域である、請求項３に記載の四価抗体分子。
【請求項５】
前記免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列が、フレキシブルリンカーアミノ酸配列に隣接している、請求項３または請求項４に記載の四価抗体分子。
【請求項６】
前記フレキシブルリンカーアミノ酸配列が、アミノ酸配列
2019533675.tif 000020
を含む、請求項５に記載の四価抗体分子。
【請求項７】
前記リンカードメインが、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部を含む、請求項１または請求項２に記載の四価抗体分子。
【請求項８】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項７に記載の四価抗体分子。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部がＣＨ２ドメインである、請求項７または請求項８に記載の四価抗体分子。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインが免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列のＣ末端に連結している、請求項７〜９のいずれか１項に記載の四価抗体分子。
【請求項１１】
前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域である、請求項１０に記載の四価抗体分子。
【請求項１２】
前記リンカードメインが、一方の末端または両方の末端にフレキシブルリンカーアミノ酸配列を含む、請求項９または請求項１０に記載の四価抗体分子。
【請求項１３】
各々のフレキシブルリンカーアミノ酸配列が、独立して、アミノ酸配列
2019533675.tif 000021
を含む、請求項１２に記載の四価抗体分子。
【請求項１４】
以下をコードする核酸分子を含む、核酸コンストラクト：
第１の抗原に特異的に結合することのできる抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
第２の抗原に特異的に結合することのできる抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、ならびに
リンカードメイン。
【請求項１５】
前記リンカードメインが免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１６】
前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域である、請求項１５に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１７】
前記リンカードメインが、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１８】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１７に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部がＣＨ２ドメインである、請求項１７または請求項１８に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２０】
前記Ｆｃドメインが前記ヒンジ領域のＣ末端に連結している、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２１】
前記リンカードメインが、一方の末端または両方の末端にフレキシブルリンカーアミノ酸配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２２】
各々のフレキシブルリンカーアミノ酸配列が、独立して、アミノ酸配列
2019533675.tif 000022
を含む、請求項２１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２５】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、濾胞性Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、請求項１に記載の四価抗体分子を含む細胞外ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２７】
前記膜貫通ドメインが、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するストーク領域をさらに含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
【請求項２８】
前記膜貫通ドメインがＣＤ２８を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
【請求項２９】
前記膜貫通ドメインと前記細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置する１つ以上の追加の共刺激分子をさらに含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
【請求項３０】
前記共刺激分子が、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０である、請求項２９に記載のＣＡＲ。
【請求項３１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ鎖を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
【請求項３２】
その細胞表面膜上に、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を発現し、それを担持する、遺伝子改変された細胞。
【請求項３３】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項３２に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋である、請求項３３に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３５】
ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との混合した集団を含む、請求項３４に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の四価抗体分子を投与する段階を含む、疾患または障害を治療するための方法。
【請求項３７】
前記疾患または障害がＣＮＳ関連疾患または障害である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＮＳ関連疾患または障害がＣＮＳがんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＮＳがんが膠芽細胞腫（ＧＢＭ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＮＳ関連疾患または障害が神経変性疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記四価抗体分子が、ＣＮＳ輸送受容体を認識し、及び／またはそれにより結合される、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＮＳ輸送受容体が、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ９８ｈｃ、またはインスリン受容体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記四価抗体分子が、血液脳関門を通過する輸送を増強する、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によりその内容の全てが本明細書に組み込まれる、２０１６年１０月１４日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／４０８，２７１の利益及び優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、四量体二重特異性抗体分子、その産生方法及びシステムに関する。
【０００３】
政府の利害
本発明は、［］によって与えられた［］の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる結合特異性を有する抗体または抗体様分子である。ＢｓＡｂは生物医学、特に腫瘍に対する免疫療法において広範な用途を有する。現在、免疫療法研究の焦点は、腫瘍細胞を殺傷するためにＢｓＡｂの細胞媒介性細胞傷害をいかに利用するかという点にある。ＢｓＡｂは、腫瘍細胞及びエフェクター細胞を同時に標的としつつ、エフェクター細胞による腫瘍細胞の破壊を引き起こすように設計することができる。
【０００５】
ＢｓＡｂは、化学工学、細胞工学、及び遺伝子工学などの方法によって調製できる。遺伝子工学の利点は、抗体を容易に改変することができることであり、ダイアボディ、タンデムＳｃＦｖ、及び単鎖ダイアボディ、ならびにそれらの誘導体を含む、二重特異性抗体断片の多くの異なる形態の設計及び産生をもたらす。それらのＢｓＡｂはＩｇＧ  Ｆｃドメインを有さないので、その小さいサイズのゆえに腫瘍への浸透が増強されるが、インビボにおいて顕著に短い半減期を有し、また、抗体の定常領域に関連するＡＤＣＣ効果をも欠く。
【０００６】
安定性と治療可能性を改善するために、重鎖においてヘテロ二量体化を促進し、Ｆｃ含有ＩｇＧ様二重特異性抗体をより高い収率で産生するための組換え遺伝子改変がなされた。ヘテロ二量体化のための抗体ＣＨ３鎖を設計するために、いくつかの合理的設計戦略、すなわちジスルフィド結合、塩橋、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）が用いられてきた。並置された位置にノブとホールを作り出すための基本は、ノブとホールとの相互作用がヘテロ二量体形成に有利に働き、一方でノブ−ノブの相互作用及びホール−ホールの相互作用は好ましい相互作用を欠如しているためホモ二量体形成を妨げることである。このノブイントゥーホールによるアプローチは、重鎖ホモ二量体化の問題を解決するが、２つの異なる抗体由来の軽鎖と重鎖との誤対合に関する問題には対処しなかった。２つの異なる抗体について同一の軽鎖を認識することは可能であるものの、共通の軽鎖を共有し得る２つの抗体の配列を用いるＢｓＡｂ構築の可能性は非常に限定されている。
【０００７】
調製がより容易で、より優れた臨床的安定性及び有効性を有し、かつ／または全身毒性が低減された、より優れたＢｓＡｂを提供する必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、調製がより容易で、より優れた臨床的安定性及び有効性を有し、かつ／または全身毒性が低減された、より優れたｔＢｓＡｂを提供する。
【０００９】
本発明の一態様は、四価抗体分子に関する。四価抗体は、第１の抗原に対する第１の結合部位と第２の抗原に対する第２の結合部位とを含む二重特異性ｓｃＦｖ断片の二量体であってもよい。２つの結合部位は、リンカードメインを介して共に結合していてもよい。実施形態において、ｓｃＦｖ断片は、タンデムｓｃＦｖであり、リンカードメインは免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のヒンジ領域）のアミノ酸配列を含む。実施形態において、免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列には、フレキシブルリンカーアミノ酸配列、例えば、アミノ酸配列
2019533675.tif 000003
を有するものが隣接していてもよい。実施形態において、リンカードメインは、免疫グロブリンＦｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃドメインの少なくとも一部を含む。免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部は、ＣＨ２ドメインであってよい。Ｆｃドメインは、免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のヒンジ領域）のアミノ酸配列のＣ末端に連結していてもよい。リンカードメインは、一方の末端または両方の末端において、フレキシブルリンカーアミノ酸配列
2019533675.tif 000004
を含んでいてもよい。
【００１０】
別の態様では、本発明は、核酸コンストラクトに関する。コンストラクトは、第１の抗原に特異的に結合することのできる抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、第２の抗原に特異的に結合することのできる抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、ならびにリンカードメインをコードする核酸分子を含んでいてもよい。実施形態において、リンカードメインは免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のヒンジ領域）のアミノ酸配列である。実施形態において、リンカードメインは、免疫グロブリンＦｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃドメインの少なくとも一部である。免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部は、ＣＨ２ドメインであってよい。Ｆｃドメインは、免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のヒンジ領域）のアミノ酸配列のＣ末端に連結していてもよい。リンカードメインは、一方の末端または両方の末端において、フレキシブルリンカーアミノ酸配列
2019533675.tif 000005
を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、上述の態様の核酸コンストラクトを含むベクターである。
【００１２】
本発明の別の態様は、上述の態様のベクターを含む宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、濾胞性Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）である。
【００１３】
本発明の一態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、上述の態様または実施形態の任意の四価抗体分子を含む細胞外ドメインとを含んでもよい。実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するストーク領域をさらに含み、及び／または膜貫通ドメインはＣＤ２８を含む。実施形態において、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータ鎖との間に位置する１つ以上の追加の共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、及びＯＸ４０）をさらに含む。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、遺伝子改変された細胞である。遺伝子改変された細胞は、その細胞表面膜に、上述の態様または実施形態のキメラ抗原受容体を発現し、それを担持する。実施形態において、細胞はＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋）またはＮＫ細胞である。細胞は、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８細胞＋との混合した集団を含んでもよい。
【００１５】
本発明の態様は、疾患または障害を治療する方法である。方法は、上述の態様または実施形態の四価抗体分子を投与する段階を含み得る。実施形態において、疾患または障害は、ＣＮＳ関連疾患または障害、例えば、ＣＮＳがんまたは神経変性疾患である。ＣＮＳがんは膠芽細胞腫（ＧＢＭ）であってもよい。神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはハンチントン病であってもよい。実施形態において、四価抗体分子は、ＣＮＳ輸送受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ９８ｈｃ、及びインスリン受容体を認識し、及び／またはそれらにより結合される。この態様、及び上述の任意の態様または実施形態において、四価抗体分子は、血液脳関門を通過する輸送を増強する。
【００１６】
上述の態様または実施形態はいずれも、任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を本発明の実施において使用することができるが、好適な方法及び物質を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が優位となるであろう。さらに、本明細書において記載される物質、方法、及び例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【００１８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになり、それらに包含されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）の設計及び形成を示す図である。
【図２】ｐｃＤＮＡ３．１＼１  ｓｃＦｖ−ヒンジ−ｓｃＦｖ発現ベクターの概略図である。
【図３】図３Ａは、ＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩを用いて消化され、四量体発現ベクターに挿入された合成四量体リンカーを示すＳＤＳゲルである。図３Ｂは本発明によるｔＢｓＡｂの精製を示すＳＤＳゲルである。
【図４】図４Ａは、ｔＢｓＡｂの抗体結合親和性の検出方法を示す図である。図４Ｂ〜図４Ｃは、プレートをＣＣＲ４−Ｆｃ（Ｂ）またはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（Ｃ）によってコーティングし、次いで四価二重特異性抗体（抗ＣＣＲ４かつ抗ＰＤ−Ｌ１）及び対照の抗体と共にインキュベートしたときのデータを示すグラフである。結果は、この四価抗体が、用量依存的にＣＣＲ４−ＦｃとＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの両方に結合することができることを示した。
【図５】抗ＣＡＩＸ−ＰＤ−Ｌ１二重特異性ｍＡｂがＣＡＩＸ−Ｆｃ融合タンパク質に結合することを示すグラフである。
【図６】抗ＣＡＩＸ−ＰＤ−Ｌ１二重特異性ｍＡｂがＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質に結合することを示すグラフである。
【図７】図７Ａは、二重特異性ｍＡｂの結合を最適化するために、いかにリンカーの長さを変更することができるかを示す図である。図７Ｂは、ｔＢｓＡｂ配列の概略図である。
【図８】図８Ａは、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂの結合である。ｔＢｓＡｂは、Ｔ細胞のＧＩＴＲタンパク質及び腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１に結合する。図８Ｂは、ヒンジ領域のシステイン残基間での鎖間ジスルフィド結合形成を介して達成されるｔＢｓＡｂのフォーマットの概略図である。
【図９】図９Ａは、結合してｔＢｓＡｂを形成する２つのｓｃＦｖの基本的な構造である。図９Ｂは、ＧＩＴＲ及びＰＤ−Ｌ１に対する二重特異性二量体ｔａＦｖである。各々のＶＨ及びＶＬの対は、１５残基のリンカーによって結合してｓｃＦｖを形成する。２つのｓｃＦｖは、リンカー−ヒンジ−リンカー（５５残基）によって結合する。ヒンジ領域は２つのシステイン残基を有し、２つのｔａＦｖの酸化条件下でのジスルフィド架橋を介する対形成を可能にする。
【図１０】図１０Ａは、タンデムｓｃＦｖの基本構造である。図１０Ｂは、追加のＣＨ２ドメインを有する、ＧＩＴＲ及びＰＤーＬ１に対する三機能性ｔＢｓＡｂである。各々のＶＨ及びＶＬの対は、１５残基のリンカーによって結合する。２つのｓｃＦｖは、リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−リンカードメインによって結合する。ヒンジ領域は２つのシステイン残基を有し、２つのタンデムｓｃＦｖの酸化条件下でのジスルフィド架橋を介する対形成を可能にする。ＣＨ２ドメインのＮ末端は、Ｆｃ−γまたはＣ１ｑに結合することができる。生じるフォーマットは、三機能性ｔＢｓＡｂである。
【図１１】αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂの作用機序である。図１１Ａで腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１タンパク質を過剰発現する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用は、有効なＴ細胞活性化を阻害し、免疫抑制及び適応免疫耐性を促進する。図１１ＢでαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂは、免疫応答を増強し得る。αＰＤ−Ｌ１アームは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断し、それによってＴ細胞枯渇を阻害し、Ｔｒｅｇ抑制を無効にする。αＧＩＴＲアームは、共刺激性ＧＩＴＲ受容体に対するアゴニストとして作用し、Ｔ細胞活性化及び増殖を増強するＧＩＴＲ発現の上方制御をもたらす。
【図１２】αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１クローニングプロセスの概略図である。ドナーベクターとｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ＶＨＧＩＴＲ−ＶＬＧＩＴＲ遺伝子を単離し、続いて互いに連結した。最終的なプラスミドは、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１クローンをもたらした。
【図１３】対照プラスミド（１）のクローニングプロセスの概略図である。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターと発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ＶＨＦ１０−ＶＬＦ１０遺伝子を単離し、その後、ｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに連結した。最終的なプラスミドは、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１クローンをもたらした。
【図１４】対照プラスミド（２）及び（３）のクローニングプロセスの概略図である。単離したＦ１０  ＶＨ及びＶＬのＤＮＡと受容ベクターｐｃＤＮＡ３．４をＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、その後互いに連結した。最終的なプラスミドは、最終的なαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１クローンをもたらした。
【図１５】ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１コンストラクトのクローニング戦略の概略図である。部位特異的変異導入によって、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに導入した。その後、単離したＣＨ２断片と発現ベクターを消化して、互いに連結し、最終的にＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１のコンストラクトをもたらした。
【図１６】受容ｐｃＤＮＡ３．４ベクター、６つのＶＨＧＩＴＲ−ＶＬＧＩＴＲインサート、１つのＶＨＦ１０−ＶＬＦ１０インサートの制限酵素解析（ＲＥＡ）である。臭化エチジウム染色した、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動したＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。全てのプラスミドは、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。レーン１：７．５ｋｂの消化した受容ｐｃＤＮＡ３．４ベクターを示す。５００〜１０００ｂｐの下部のバンドは、以前に使用されたｓｃＦｖインサート（Ｍａｒａｓｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのもの）である。レーン２〜６：下部のバンドは、８００ｂｐのＶＨＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬＧＩＴＲインサートを表す。８ｋｂで集まるより大きいバンドは、二重消化された派生ベクターである。レーン７：８００ｂｐのＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０インサートは、５００〜１０００ｂｐで集まる下部のバンドに可視化される。レーンの「ｂｐ」は、１ｋｂのＤＮＡラダー（ＮＥＢ）を表す。
【図１７】ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０  ｃＤＮＡ及び受容ｐｃＤＮＡ３．４発現（それぞれ、ＶＨＧＩＴＲ１−ＶＬＧＩＴＲ１またはＶＨＧＩＴＲ１０−ＶＬＧＩＴＲ１０）のＲＥＡである。臭化エチジウム染色した、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動したＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。受容発現ベクター及びインサートはＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化された。レーン１：ＰＣＲによって単離されたＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０（ｓｃＦｖ）断片を表す、８００ｂｐに集まる単一のバンドを示す。レーン２及び３：上部の２つのバンドは、ＶＨＧＩＴＲ１−ＶＬＧＩＴＲ１（レーン２）及びＶＨＧＩＴＲ１０−ＶＬＧＩＴＲ１０（レーン３）を含むｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターを可視化する。両方とも７５００ｂｐを含み、正しいレベルのラダーで検出できる。レーン２及び３の、５００〜１０００ｂｐで集まる下部のバンドは、消化されてそのベクターから分離されたＶＨＰＤ−Ｌ１−ＶＬＰＤ−Ｌ１断片を表す。レーンの「ｂｐ」は、１ｋｂのＤＮＡラダー（ＮＥＢ）に対応する。
【図１８】精製されたｔＢｓＡｂの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析である。クマシーブルー染色された、ＭＥＳ緩衝液で電気泳動されたタンパク質のＳＤＳゲルを示す。３〜５μｇのタンパク質試料が負荷され、還元条件下（Ａ）及び非還元条件下（Ｂ）でゲルにおいて分離された。レーン１〜８：非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、各々のタンパク質において２つの主要なバンドを明らかにした。上部のバンドは８０ｋＤａ〜１１５ｋＤａの見かけの分子量を有し、下部は７０〜８０ｋＤａの分子量のバンドである。非還元下のＳＤＳーゲル解析において、いくつかの弱いが高分子量のバンド（＞１８０ｋＤａ）が観察できる。還元条件下（１０％ＤＴＴ、７０℃１０分間）のＳＤＳ−ゲル解析は、７０〜８０ｋＤａの見かけの分子量を有する単一のバンドのみを示した。レーン９：非還元条件下において、１４０ｋＤａをわずかに超える見かけの分子量を有する単一のバンドを示す。還元条件下の２つのバンドの可視化は、分離した重鎖及び軽鎖（５０ｋＤａ及び２５ｋＤａ）を示し、αＧＩＴＲ  ＩｇＧの正しい発現を強調する。レーンのｋＤａは、対応する条件下（ＭＥＳ緩衝液で泳動する４〜１２％のゲル濃度）のベンチマークの予め染色されたタンパク質ラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を表す。
【図１９−１】受動的に固定化されたＰＤ−Ｌ１抗原に対して試験したαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ及びαＰＤ−Ｌ１のｍＡｂのＥＬＩＳＡ吸光度値である。各濃度範囲のαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１（０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、横軸）を、ＰＤ−Ｌ１抗原のＥＬＩＳＡに供した。結果は、４５０ｎｍにおける吸光度の平均及び標準偏差（縦軸）を示す。各試料を各濃度において三つ組で試験した。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図１９−２】受動的に固定化されたＰＤ−Ｌ１抗原に対して試験したαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ及びαＰＤ−Ｌ１のｍＡｂのＥＬＩＳＡ吸光度値である。各濃度範囲のαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１（０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、横軸）を、ＰＤ−Ｌ１抗原のＥＬＩＳＡに供した。結果は、４５０ｎｍにおける吸光度の平均及び標準偏差（縦軸）を示す。各試料を各濃度において三つ組で試験した。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図２０】αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体の、アセトン−メタノールで固定したＧＩＴＲ＋発現ＣＦ２細胞に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、３．３ｍｇ／ｍＬ〜０．００４６ｍｇ／ｍＬの範囲の１：３連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図２１】αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体の、８％のパラホルムアルデヒドで固定したＧＩＴＲ＋発現ＣＦ２細胞に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、３．３ｍｇ／ｍＬ〜０．００４６ｍｇ／ｍＬの範囲の１：３連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図２２】αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及び市販のαＧＩＴＲ１０のｍＡｂ抗体の、８％のパラホルムアルデヒドで固定したＧＩＴＲ＋発現ＣＦ２細胞に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、５ｍｇ／ｍＬ〜０．０７８ｍｇ／ｍＬの範囲の１：２連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０，０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図２３Ａ】ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞で試験した蛍光活性化αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ（抗Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  ４８８（ＡＰＣ）コンジュゲートされた）のフローサイトメトリー解析である。
【図２３Ｂ】ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞で試験した蛍光活性化αＧＩＴＲ１０  ＩｇＧ  Ａｂ（抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＦＩＴＣにコンジュゲートされた）のフローサイトメトリー解析である。水平の線は蛍光強度シグナルを示し、垂直軸は細胞数を示す。各個々の画像は、一定の細胞数を有する異なる濃度のαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１を表す。
【図２４Ａ】ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞で試験した蛍光活性化αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ（抗Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  ４８８（ＡＰＣ）コンジュゲートされた）のフローサイトメトリー解析である。各個別の画像は一定の細胞数を有する異なる濃度のαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１を表す。水平の線は蛍光強度シグナルを示し、垂直軸は細胞数を示す。各個別の画像は一定の細胞数を有する異なる濃度のαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧを表す。
【図２４Ｂ】ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞で試験した蛍光活性化αＧＩＴＲ１０  ＩｇＧ  Ａｂ（抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＦＩＴＣにコンジュゲートされた）のフローサイトメトリー解析である。水平の線は蛍光強度シグナルを示し、垂直軸は細胞数を示す。各個別の画像は一定の細胞数を有する異なる濃度のαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧを表す。
【図２５】１６個のクローンの制限酵素解析（ＲＥＡ）である。臭化エチジウム染色した、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動したＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。全てのプラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。レーン番号１０に２つのバンドが示される：６ｋｂ〜８ｋｂに集まるバンドは、消化された受容ｐｃＤＮＡ３．４ベクター（７．５ｋｂ）を表す。５００〜１０００ｂｐの下部のバンドは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で単離された断片が、予想される理論上のサイズ８００ｂｐに近いことを示している。レーンの「ｂｐ」は、１ｋｂのＤＮＡラダーを表す。
【図２６】クローン１０（ＨｉｎｄＩＩＩを有するＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１）及びＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有さない）のＲＥＡである。臭化エチジウム染色した、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動したＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。両方のプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩのみで（レーン１）、ＮｏｔＩのみで（レーン２）、及びＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで同時に（レーン３）消化された。単一の酵素でのクローン番号１０の消化（レーン１及び２）は、８０００ｂｐ付近に集まる１本のバンドをもたらした。両方の酵素によるクローン番号１０の消化（レーン３）は、２つの断片を生じ、そのうちのより小さなサイズのバンドは５００ｂｐ未満に集まる。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位のみによるαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１の消化（レーン１）は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを明らかにした。
【図２７】ベクターＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む）及びＣＨ２断片の制限酵素消化解析である。臭化エチジウム染色した、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動したＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。レーン１：ＨｉｎｄＩＩＩによるαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１の単一の消化。レーン２：ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたＣＨ２断片は、ラダーの５００ｂｐのマーク未満に集まるバンドをもたらした。レーンの「ｂｐ」は、１ｋｂのＤＮＡラダーに対応する。
【図２８】ＣＨ２を有する精製したαＧＩＴＲ１０ーαＰＤ−Ｌ１であるＢｓＡｂの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析である。クマシーブルー染色された、ＭＥＳ緩衝液で電気泳動されたタンパク質のＳＤＳゲルを示す。３〜５μｇのタンパク質試料が負荷され、還元条件下（Ｒ）及び非還元条件下（ＮＲ）でゲルにおいて分離された。非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、各々のタンパク質において２つの主要なバンドを明らかにした。上部のバンドは約１４０ｋＤａの見かけの分子を有し、下部のバンドは８０ｋＤａの分子量を有し、二量体（１５０ｋＤａ）及び単量体（７５ｋＤａ）のＢｓＡｂの理論上のサイズと相関する。還元条件下（１０％ＤＴＴ、７０℃１０分間）でのＳＤＳ−ゲル解析は、約８０ｋＤａの見かけの分子量を有する１本のバンドのみを示し、ヒンジ領域におけるそのジスルフィド架橋によって還元され得るｔＢｓＡｂの正しい発現を裏付ける。レーンの「ｋＤａ」は、対応する条件下（ＭＥＳ緩衝液で泳動する４〜１２％のゲル濃度）のベンチマークの予め染色されたタンパク質ラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を表す。
【図２９】ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧ抗体の、８％のパラホルムアルデヒドで固定したＧＩＴＲ＋発現ＣＦ２細胞に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、５ｍｇ／ｍＬ〜０．１６ｍｇ／ｍＬの範囲の１：２連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０，０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図３０】ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体のＡＤＣＣ活性である。ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のＡＤＣＣ活性を様々な濃度で測定した。全ての抗体を、２０ｍｇ／ｍＬの最高濃度から０．０２ｍｇ／ｍＬまで連続希釈し（１：２）、ウェルあたり２０，０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。エフェクター細胞（ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２）対標的細胞（Ｗｉｌｓ−２）の比は５：１であった。αＧＩＴＲ  ＩｇＧは陽性対照を表し、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１は陰性対照である。縦軸は、発光読み出しにより定量したエフェクター細胞中のルシフェラーゼ活性の生の値を表す。各試料を各濃度において三つ組で試験し、平均標準偏差を括弧内に示す。ＲＰＭＩ培地中のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞のバックグラウンドを、得られた値から引いた。
【図３１】ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、マウス補体を介するＣＤＣ活性を媒介した。αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のｔＢｓＡｂ及び対照のαＧＩＴＲのｍＡｂ（陽性）、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１（陰性）の連続希釈によって得たＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞の溶解の割合はＣＤＣアッセイによって決定した。全ての抗体を、２０ｍｇ／ｍＬの最高濃度から０．２ｍｇ／ｍＬまで連続希釈し（１：１０）、ウェルあたり１０，０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。縦軸は溶解の割合を表す。それは、完全に溶解したＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞からのシグナル強度に対する、得られた試料のシグナルの比として計算される。各試料を各濃度において三つ組で試験し、平均標準偏差を括弧内に示す。ＲＰＭＩ培地中のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞のバックグラウンドを、得られた値から引いた。各々のバーは、三つ組の試料から取得した単純な平均を表す（標準偏差は括弧によって示される）。
【図３２】αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体の、８％のパラホルムアルデヒドで固定したＣＦ２細胞（ＧＩＴＲ発現を有さない）に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、３．３ｍｇ／ｍＬ〜０．００４６ｍｇ／ｍＬの範囲の１：３連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０００個のＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図３３】αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧ抗体の、８％のパラホルムアルデヒドで固定したＣＦ２細胞（ＧＩＴＲ発現を有さない）に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、５ｍｇ／ｍＬ〜０．０７８ｍｇ／ｍＬの範囲の１：２連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０，０００個のＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図３４】ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧ抗体の、８％のパラホルムアルデヒドで固定したＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞に対する結合を試験する、細胞に基づくＥＬＩＳＡである。Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、陰性対照を表す。全ての抗体を、５ｍｇ／ｍＬ〜０．１６ｍｇ／ｍＬの範囲の１：２連続希釈物を用いて試験した。全ての抗体を、１ウェルあたり１０，０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。各々のバーは、三つ組の試料から取得した平均を表す（偏差はバーによって示される）。一次抗体を添加したウェルの平均シグナルから一次抗体の非存在下でインキュベートしたウェルの平均シグナルを差し引くことにより、生シグナル強度をバックグラウンドシグナルについて補正した。
【図３５】蛍光活性化αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１抗体のフローサイトメトリー解析のための対照の設定である。レーン１〜６は、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞のための対照の設定を示す。レーン７〜９は、ＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞のための対照の設定を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、各受容体に対する２つの結合部位を含む二重特異性抗体（すなわち四価二重特異性抗体または「ｔＢｓＡｂ」）、それを産生するシステム及び方法に関する。
【００２１】
治療薬としての二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の臨床開発は、従来の方法では十分な量及び質で物質を調製することが困難であるということによって妨げられてきた。近年、抗体断片として、及び全長ＩｇＧ様分子としての両方の、ＢｓＡｂの効率的な産生のために、様々な組換え方法が開発されてきた。これらの組換え抗体分子は、ほとんどの場合、それらの標的抗原の各々に対して一価である２種の抗原結合能を有する。本発明は、ｓｃＦＶ二重特異性抗体を遺伝子工学的に操作し、そしてその２つを融合することによって、その標的抗原の各々に対して２つの抗原結合部位を有する新規の四価ＢｓＡｂ（ｔＢｓＡｂ）の産生のための効率的なアプローチを提供する。
【００２２】
二重特異性／二価抗体と比較して、ｔＢｓＡｂはその両方の標的抗原に対してより効率的に結合し、そして受容体へのリガンド結合を遮断することにおいてより有効である。さらに、哺乳動物細胞におけるｔＢｓＡｂの発現は、より高レベルの産生及びより良好な抗体活性をもたらした。重要なことに、ｔＢｓＡｂは一価の二重特異性抗体と比較してより高い安定性とより長い半減期を示す。一価二重特異性抗体の１つの欠点は、数週間連続低用量での投与を必要とする、それらの小さいサイズと、それゆえに短い血清半減期である。対照的に、本発明のｔＢｓＡｂのより長い半減期は、この課題を解決し、したがって、臨床応用により好適である。ｔＢｓＡｂについてのこの設計及び発現は、任意の抗原特異性の対に適用可能であるはずである。
【００２３】
好ましくは、ｔＢｓＡｂは、ＢＭＣＡ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ１、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、インフルエンザ、フラビウイルス、または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）に対して特異的である。
【００２４】
本発明によるｔＢｓＡｂを構築するのに有用な例示的な抗体は、例えば以下に開示される抗体を含み、それらの内容は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる：ＷＯ／２００５／０６０５２０、ＷＯ／２００６／０８９１４１、ＷＯ／２００７／０６５０２７、ＷＯ／２００９／０８６５１４、ＷＯ／２００９／０７９２５９、ＷＯ／２０１１／１５３３８０、ＷＯ／２０１４／０５５８９７、ＷＯ２０１５／１４３１９４、ＷＯ２０１５／１６４８６５、ＷＯ２０１３／１６６５００、ＷＯ２０１４／１４４０６１、ＷＯ２０１６／０５７４８８、ＷＯ２０１６／０５４６３８、ＷＯ／２０１６／１６４８３５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２６２３２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５００９３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５０３２７、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４３５０４。
【００２５】
ＰＤＬ１（６８）
例示的な抗ＰＤＬ１抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９９を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１９を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３９を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００２６】
例示的な抗ＰＤＬ１抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７１を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８８を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９２を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９６を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５００を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０４を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０８を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１２を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１６を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２０を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２４を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２８を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３２を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３６を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４０を有するＶＬポリペプチド配列を有する抗体を含む。
【００２７】
他の実施形態では、抗ＰＤＬ１抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４１、１５５４、１５６９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１５８４、１５９９、１６１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４３、１５５６、１５７１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５８６、１６００、１６１２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４４、１５５７、１５７２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５８７、１６０１、１６１３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４５、１５５８、１５７３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５８８、１６０２、１６１４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４６、１５５９、１５７４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５８９、１６０３、１６１５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４７、１５６０、１５７５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９０、１６０４、１６１６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４８、１５６１、１５７６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９１、１６０５、１６１７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４１、１５６２、１５７７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９２、１５９９、１６１８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４９、１５６３、１５７８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９３、１６０６、１６１９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５５０、１５６４、１５７９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９４、１６０７、１６２０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５５１、１５６５、１５８０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９５、１５９９、１６２１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５４２、１５６６、１５８１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９６、１５９９、１６２２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５５２、１５６７、１５８２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９７、１６０８、１６２３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または１５５３、１５６８、１５８３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び１５９８、１６０９、１６２４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００２８】
ＳＡＲＳ（２６）
例示的なＳＡＲＳ中和抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２６を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２８を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３０を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３９を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４０を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４２を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４４を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３６を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４６を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００２９】
ＣＸＣＲ４（３３）
例示的な抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７９を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８１を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８３を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８５を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８６を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００３０】
他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０３、８０４、８０５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８０６、８０７、８０８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれ８０９、８１０、８１１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８１２、８１３、８１４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれ８１５、８１６、８１７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８１８、８１９、８２０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれ８２７、８２８、８２９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８３０、８３１、８３２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれ８３３、８３４、８３５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８３６、８３７、８３８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれ８３９、８４０、８４１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８４２、８４３、８４４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００３１】
炭酸脱水酵素ＩＸ（４０）
例示的な抗ＣＡ  ＩＸ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６９を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７１を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７３を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７５を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７７を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７９を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８１を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８３を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８５を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８７を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８８を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００３２】
他の実施形態では、抗ＣＡ  ＩＸ抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０３、８０４、８０５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ８０６、８０７、８０８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９０５、９０６、９５２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３５、９４３、９５３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３５、９０６、９５４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１０、９１６、９２３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３６、９４４、９５５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３６、９４４、９５６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１１、９１７、９２４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３７、９４５、９５７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３５、９４６、９５８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３８、９４６、９５９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９０５、９４６、９６０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１８、９２５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３７、９４７、９５５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１８、９２６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３７、９４５、９５７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１２、９１９、９２７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３７、９４３、９６１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１８、９２８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３７、９０６、９６０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１８、９２８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３７、９０６、９６０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１３、９２０、９２９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３９、９４８、９６２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１８、９３０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３５、９４４、９５５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９２１、９３１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３５、９４４、９５５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１２、９１９、９３２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９４０、９４９、９６３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または８９９、９１５、９０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９３５、９４３、９６０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１４、９２２、９３３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９４１、９５０、９６４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または９１２、９１８、９３４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及び９４２、９５１、９６５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００３３】
ＣＣ−ケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）（０４８）
例示的なＣＣ−ケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７２を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００３４】
例示的なＣＣＲ４抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７１を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００３５】
他の実施形態では、ＣＣＲ４抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７３、９７４、９７５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ９７６、９７７、９７８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００３６】
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）（８５）
例示的な抗中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７９を有するＶＬヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９２を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９９を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０３を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００３７】
例示的な抗中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７８のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８２のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８６のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９０のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９４のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９８のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７００を有するＶＬアミノ酸配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０２のＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０４を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００３８】
他の実施形態では、抗中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗体は、７０５、７０６、及び７０７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７２２、７２３、及び７２４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、７０８、７０９、及び７１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７２５、７２６、及び７２７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、７１１、７１２、及び７１３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７２８、７２９、及び７３０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、７１１、７３５、及び７１５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７３１、７３２、及び７３３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、７１１、７３５、及び７１６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７３７、７３８、及び７３９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、７１７、７１８、及び７１９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７３６、７４２、及び７４３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、７１４、７２０、及び７２１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに７４０、７２９、及び７４１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００３９】
ＧＩＴＲ（９３）
例示的な抗ヒトＧＩＴＲ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７９を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９８を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０３を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００４０】
例示的な抗ヒトＧＩＴＲ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６８を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７８を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８０を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８４を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９６を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４００を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０４を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００４１】
他の実施形態では、抗ヒトＧＩＴＲ抗体は、それぞれ１４０５、１４０６、及び１４０７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびにｌ４０８、１４０９、及び１４１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４１１、１４１２、及び１４１３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１４１４、１４１５、及び１４１６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４１７、１４１８、及び１４１９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１４２０、１４２１、及び１４２２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４２３、１４２４、及び１４２５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびにｌ４２６、１４２７、及び１４２８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４２９、１４３０、及び１４３１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１４３２、１４３３、及び１４３４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４３５、１４３６、及び１４３７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびにｌ４３８、１４３９、及び１４４０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４４１、１４４２、及び１４４３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１４４４、１４４５、及び１４４６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４４７、１４４８、及び１４４９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１４５０、１４５１、及び１４５２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４５３、１４５４、及び１４５５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびにｌ４５６、１４５７、及び１４５８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、それぞれ１４５９、１４６０、及び１４６１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１４６２、１４６３、及び１４６４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１４６５、１４６６、及び１４６７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびにｌ４６８、１４６９、及び１４７０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００４２】
フラビウイルス（７３）
例示的な抗西ナイルウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（ＷＮＥ）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２４を有するＶＨアミノ酸配列を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２６を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００４３】
例示的な抗西ナイルウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（ＷＮＥ）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２７を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００４４】
他の実施形態では、抗西ナイルウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（ＷＮＥ）抗体は、それぞれ１２４４、１２４５、及び１２４６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２４７、１２４８、及び１２４９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００４５】
ＣＣＲ４（６５）
例示的な抗ＣＣ−ケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９２を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４３を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５９を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００４６】
例示的な抗ＣＣ−ケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４４を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６０を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００４７】
他の実施形態では、抗ＣＣ−ケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）抗体は、それぞれ１２０３、１２０８、及び１２１１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２０７、１２０９、及び１２１６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１２０４、１２０８、及び１２１２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２０７、１２０９、及び１２１７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１２０４、１２０８、及び１２１３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２０７、１２０９、及び１２１７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１２０５、１２０８、及び１２１４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２０７、１２０９、及び１２１８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１２０６、１２０８、及び１２１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２０７、１２０９、及び１２２０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１２０２、１２０８、及び１２１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１２０７、１２０９、及び１２１９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００４８】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９（５７）
例示的な抗ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５５を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５５を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００４９】
例示的な抗ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５６を有するＶＬアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５６を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００５０】
他の実施形態では、抗ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９抗体は、それぞれ１１５７、１１５８、及び１１５９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１１６０、１１６１、及び１１６２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００５１】
インフルエンザ（４９）
例示的な抗インフルエンザ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８３を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８９を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９９を有するＶＫヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００５を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００７を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１１を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１５を有するＶＬヌクレオチド配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１９を有するＶＫヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２０を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２２を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００５２】
例示的な抗インフルエンザ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９６を有するＶＫアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０００を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１４を有するＶＫアミノ酸配列、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１８を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００５３】
他の実施形態では、抗インフルエンザ抗体は、１０２３、１０３１、及び１０３９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０４７、１０５９、及び１０７１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２３、１０３２、及び１０４０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０４８、１０６０、及び１０７２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２５、１０３２、及び１０４０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５７、１０６９、及び１０８１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２６、１０３３、及び１０４１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０４９、１０６１、及び１０７３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２６、１０３３、及び１０４１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５４、１０６６、及び１０７８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２７、１０３４、及び１０４２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５０、１０６２、及び１０７４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２７、１０３４、及び１０４２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５６、１０６８、及び１０８０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２８、１０３５、及び１０４３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５１、１０６３、及び１０６５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２８、１０３６、及び１０４４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５２、１０６４、及び１０７６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、１０２９、１０３７、及び１０４５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５３、１０６５、及び１０７７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、１０３０、１０３８、及び１０４６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖ならびに１０５８、１０７０、及び１０８２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００５４】
インフルエンザ（７８）
例示的な抗インフルエンザ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９８を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４００を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０２を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４２を有するＶＬヌ��レオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６８を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８６を���するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９０を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９１を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９２を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９３を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９４を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９５を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９６を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９８を有するＶＬヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９９を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６００を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００５５】
例示的な抗インフルエンザ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７２を有するＶＬポリペプチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７６を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７７を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７８を有するＶＬヌクレオチド配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５００を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２０を有するＶＬアミノ��配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５０を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５１を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５２を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５３を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５４を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５６を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５７を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５８を有するＶＬアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５９を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６０を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００５６】
他の実施形態では、抗インフルエンザ抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３７、７３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１０９、１４５、１８１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２、３８、７４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１０、１４６、１８２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３、３９、７５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１１、１４７、１８３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ４、４０、７６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１２、１４８、１８４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ５、４１、７７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１３、１４９、１８５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ６、４２、７８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１４、１５０、１８６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ７、４３、７９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１５、１５１、１８７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ８、４４、８０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１６、１５２、１８８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ９、４５、８１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１７、１５３、１８９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１０、４６、８２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１８、１５４、１９０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１１、４７、８３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１１９、１５５、１９１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１２、４８、８４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２０、１５６、１９２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１３、４９、８５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２１、１５７、１９３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１４、５０、８６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２２、１５８、１９４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１５、５１、８７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２３、１５９、１９５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１６、５２、８８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２４、１６０、１９６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１７、５３、８９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２５、１６１、１９７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１８、５４、９０のアミノ酸��列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２６、１６２、１９８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ１９、５５、９１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２７、１６３、１９９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２０、５６、９２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２８、１６４、２００のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２１、５７、９３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１２９、１６５、２０１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２、５８、９４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３０、１６６、２０２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３、５９、９５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３１、１６７、２０３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４、６０、９６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３２、１６８、２０４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２５、６１、９５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３３、１６９、２０５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２６、６２、９６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３４、１７０、２０６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２７、６３、９７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３５、１７１、２０７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２８、６４、９８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３６、１７２、２０８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２９、６５、９９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３７、１７３、２０９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３０、６６、１００のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３８、１７４、２１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３１、６７、１０１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１３９、１７５、２１１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３２、６８、１０２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１４０、１７６、２１２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３３、６９、１０３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１４１、１７７、２１３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３４、７０、１０４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１４２、１７８、２１４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３５、７１、１０５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１４３、１７９、２１��のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ３６、７２、１０６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ１４４、１８０、２１６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２１７、２４７、２７７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３０７、３３７、３６７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２１８、２４８、２７８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３０８、３３８、３６８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２１９、２４９、２７９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３０９、３３９、３６９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２０、２５０、２８０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１０、３４０、３７０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２１、２５１、２８１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１１、３４１、３７１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２２、２５２、２８２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１２、３４２、３７２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２３、２５３、２８３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１３、３４３、３７３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２４、２５４、２８４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１４、３４４、３７４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２５、２５５、２８５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１５、３４５、３７５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２６、２５６、２８６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１６、３４６、３７６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２７、２５７、２８７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１７、３４７、３７７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２８、２５８、２８８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１８、３４８、３７８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２２９、２５９、２８９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３１９、３４９、３７９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３０、２６０、２９０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２０、３５０、３８０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３１、２６１、２９１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２１、３５１、３８１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３２、２６２、２９２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ��２２、３５２、３８２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３３、２６３、２９３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２３、３５３、３８３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３４、２７３、２９４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２４、３５４、３８４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３５、２７４、２９５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２５、３５５、３８５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３６、２７５、２９６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２６、３５６、３８６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３７、２７６、２９７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２７、３５７、３８７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３７、２７７、２９８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２８、３５８、３８８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３８、２７８、２９９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３２９、３５９、３８９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２３９、２７９、３００のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３０、３６０、３９０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４０、２８０、３０１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３１、３６１、３９１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４１、２８１、３０２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３２、３６２、３９２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４２、２８２、３０３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３３、３６３、３９３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４３、２８３、３０４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３４、３６４、３９４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４４、２８４、３０５
のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３５、３６５、３９５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、または、それぞれ２４５、２８５、３０６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれ３３６、３６６、３９６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００５７】
他の抗インフルエンザ抗体は、以下の表１に示されるアミノ酸または核酸の配列を有するものを含む。
【００５８】
（表１Ａ）抗体３Ｉ１４可変領域核酸配列
2019533675.tif 000006
【００５９】
（表１Ｂ）抗体３Ｉ１４可変領域アミノ酸配列
2019533675.tif 000007
【００６０】
（表１Ｃ）抗体３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎ可変領域核酸配列
2019533675.tif 000008
【００６１】
（表１Ｃ）抗体３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎ可変領域アミノ酸配列
2019533675.tif 000009
【００６２】
３Ｉ１４及び３Ｉ１４ＶＬＤ９４Ｎインフルエンザ中和抗体の重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列を以下の表２に示す。
【００６３】
（表２）
2019533675.tif 000010
【００６４】
ＣＣ−ケモカイン受容体４  ＣＣＲ４（９４）
例示的なＣＣＲ４抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７８を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７９を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８０を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８１を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８３を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８５を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８６を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８７を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８８を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８９を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００６５】
例示的な抗ＣＣＲ４抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９１を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９３を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９５を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９７を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９９を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７００を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０１を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００６６】
他の実施形態では、抗インフルエンザ抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０２、１７０３、１７０４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０５、１７０６、１７０７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０８、１７０９、１７１０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１１、１７１２、１７１３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１４、１７１５、１７１６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１７、１７１８、１７１９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２０、１７２１、１７２２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２３、１７２４、１７２５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２６、１７２７、１７２８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２９、１７３０、１７３１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３２、１７３３、１７３４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３５、１７３６、１７３７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３８、１７３９、１７４０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４１、１７４２、１７４３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００６７】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子（ＶＨ１−６９）（１３３）
例示的な抗ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４５を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４８を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４９を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５３を有するＶＬヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
例示的な抗ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４７を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５１を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５５を有するＶＬアミノ酸配列を含む。
【００６９】
他の実施形態では、抗ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１−６９抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５６、１７５７、１７５８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５９、１７６０、１７６１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００７０】
ジカウイルス抗体（１４０）
ジカウイルスを標的とし中和する例示的な抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６３を有するＶＬヌクレオチド配列を有する抗体を含む。
【００７１】
ジカウイルスを標的とし中和する例示的な抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６５を有するＶＬアミノ酸配列を有する抗体を含む。
【００７２】
他の実施形態では、ジカウイルスを標的とし中和する例示的な抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６６、１７６７、１７６８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６９、１７７０、１７７１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００７３】
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）（１４１）
例示的な抗グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７３を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７５を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７６を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７７を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７８を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７９を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８０を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８１を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８３を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８５を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８６を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８７を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８８を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８９を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９０を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９１を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９２を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９３を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９４を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９５を有するＶＬヌクレオチド配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９６を有するＶＨヌクレオチド配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９７を有するＶＬヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
例示的な抗グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９９を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８００を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０１を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０３を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０５を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０７を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０９を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１１を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１３を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１４を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１５を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１６を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１７を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１８を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１９を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２０を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２１を有するＶＬアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２２を有するＶＨアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２３を有するＶＬアミノ酸配列を含む。
【００７５】
他の実施形態では、抗グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）抗体は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２４、１８２５、１８２６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２７、１８２８、１８２９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３０、１８３１、１８３２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３３、１８３４、１８３５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３６、１８３７、１８３８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３９、１８４０、１８４１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４２、１８４３、１８４４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４５、１８４６、１８４７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４８、１８４９、１８５０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５１、１８５２、１８５３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５４、１８５５、１８５６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５７、１８５８、１８５９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６０、１８６１、１８６２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６３、１８６４、１８６５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６６、１８６７、１８６８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６９、１８７０、１８７１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７２、１８７３、１８７４のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７５、１８７６、１８７７のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７８、１８７９、１８８０のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８１、１８８２、１８８３のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８４、１８８５、１８８６のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８７、１８８８、１８８９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９０、１８９１、１８９２のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９３、１８９４、１８９５のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９６、１８９７、１８９８のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖及びそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９９���１９００、１９０１のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する。
【００７６】
四価抗体は、第１の抗原に対する第１の結合部位と第２の抗原に対する第２の結合部位とを有する二重特異性ｓｃＦｖ断片の二量体である。ｓｃＦｖは、好ましくはタンデムｓｃＦｖである。２つの結合部位の可変ドメインは、リンカードメインを介して共に結合している。好ましい実施形態では、リンカードメインは免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含む。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域である。例示的なヒンジ領域のアミノ酸配列は、
2019533675.tif 000011
を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部をさらに含む。免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインである。免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部は、ヒンジ領域のＣ末端に連結している。免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部によって、例えば、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインアミノ酸配列、ＣＨ３ドメインアミノ酸配列、ＣＨ４ドメインアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを意味する。
【００７８】
免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＣＨ２ドメイン）の少なくとも一部を組み入れることは、第３の機能性結合部位（すなわち、Ｆｃエフェクター機能）を提供し、三機能性二重特異性抗体をもたらす。したがって、エフェクター機能に関する少なくとも一部を改変して、例えばｔＢｓＡｂの有効性を増強するようにすることが好ましくあり得る。例えば、アミノ酸の置換、挿入または欠失を、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部に導入して、改善された取り込み能力及び／または増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有するｔＢｓＡｂを生成することができる。代替的に、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部をグリコシル化して、ｔＢｓＡｂの安定性及び可溶性を改善する。例えば、免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部は、アミノ酸位置２９７のアスパラギンに対応するアミノ酸においてグリコシル化されている。グリコシル化は安定性にとって重要であるが、ＣＨ２炭水化物の脱フコシル化もまたＦｃγＲへの結合親和性を増大させそしてＡＤＣＣのさらなる増強をもたらし得る。
【００７９】
ある特定の実施形態において、本発明のｔＢｓＡｂは、抗体の抗原非依存性エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を変化させるアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含み得る。そのような抗体は、これらの置換を欠く抗体と比較したとき、ＦｃＲｎへの増加したまたは減少した結合を示し、したがって、それぞれ血清中で増加したまたは減少した半減期を有する。ＦｃＲｎに対する親和性が改善されたＦｃバリアントは、より長い血清半減期を有すると予想され、そしてそのような分子は、投与される抗体の長い半減期が望まれる哺乳動物の治療方法において、例えば慢性疾患または障害を治療するために、有用な用途を有する。対照的に、減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃバリアントは、より短い半減期を有すると予想され、そしてそのような分子はまた、例えば、短い循環時間が有利であり得る哺乳動物への投与、例えば、インビボ診断イメージングのため、または長期間の循環中に存在するときに開始抗体が毒性の副作用を有する状況にも有用である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有する。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵナンバリングに従う）からなる。ＦｃＲｎ結合活性を改変した例示的なアミノ酸置換は、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ０５／０４７３２７号に開示され、これは参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、以下の置換：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、及びＳ３０４Ｄ（ＥＵナンバリング）の１つ以上を有するＦｃドメインを含む。
【００８０】
好ましくは、Ｆｃドメインの少なくとも一部は、ＣＨ２ドメインアミノ酸配列である。例示的なＣＨ２ドメインアミノ酸配列は、
2019533675.tif 000012
を含む。
【００８１】
他の態様において、免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列または免疫グロブリンヒンジ領域Ｆｃドメインのアミノ酸配列には、フレキシブルリンカーアミノ酸配列が隣接している。フレキシブルリンカーアミノ酸配列は、例えば、
2019533675.tif 000013
を含む。
【００８２】
複数反復（例えば４以上）を付加することによるリンカーの拡大は、単量体ｓｃＦｖを優勢に生じ、したがって、それはエピトープへの接近可能性を高めることができる。リンカーの長さ及び組成は、標的タンパク質上のエピトープのトポグラフィーを考慮に入れて、安定性及び機能的活性を最適化するために選択され得る。
【００８３】
以下をコードする核酸分子を含む核酸コンストラクトもまた本発明に含まれる：第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域、第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域、ならびにリンカードメイン。
【００８４】
なおさらなる態様において、本発明は、本発明のｔＢｓＡｂを細胞表面膜に発現及び担持する遺伝子改変された細胞を提供する。細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、濾胞性Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋である。細胞は、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８細胞＋との混合した集団である。細胞は、ｔＢｓＡｂを発現して分泌するようにさらに改変される。
【００８５】
ベクターは、本発明による核酸コンストラクトを含み、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞は本発明のベクターを発現する。
【００８６】
キメラ抗原受容体
本発明のｔＢｓＡｂは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するのに使用できる。ＣＡＲは、一般的に、本発明のｔＢｓＡｂを含む少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも１つの膜貫通ポリペプチドと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む膜貫通ポリペプチドとを含む。
【００８７】
好ましい実施形態では、上記膜貫通ドメインは、上記細胞外リガンド結合ドメインと上記膜貫通ドメインとの間に、ストーク領域をさらに含む。本明細書で使用される用語「ストーク領域」は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するよう機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの柔軟性及び接近可能性を提供するのに使用される。ストーク領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、そして最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部からなどの天然に存在する分子の全部もしくは一部に由来し得る。代替的に、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成のストーク配列であってもよい。好ましい実施形態では、上記ストーク領域はヒトＣＤ８α鎖の一部である。
【００８８】
本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達を担い、免疫細胞の活性化及び免疫応答をもたらす。換言すると、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を果たすように指示するタンパク質の部分を指す。
【００８９】
シグナル伝達ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、抗原依存性の一次活性化を開始するもの、及び抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすものを含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体活性化チロシンモチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼのための結合部位として働く、様々な受容体の細胞質内尾部に見られる明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例には、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、またはＦｃイプシロンＲＩベータもしくはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含み得る。別の好ましい実施形態では、シグナル伝達は、例えば、４−１ＢＢまたはＯＸ４０などの、ＣＤ２８及び／または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）によって提供される共刺激と共にＣＤ３ゼータによってもたらされる。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは２、３、４、またはそれ以上の共刺激分子をタンデムに含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００９１】
「共刺激リガンド」とは、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドを負荷したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／Ｄ３複合体の結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、シグナルをもたらし、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンフォトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、リガンドであってＣＤ８３に特異的に結合するものなどであるがこれらに限定されないものと特異的に結合する抗体を包含する。
【００９２】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定されないが、増殖などの細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びリガンドであってＣＤ８３に特異的に結合するものなどが含まれる。別の特定の実施形態では、上記シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ関連因子２（ＴＲＡＦ２）結合モチーフ、すなわち共刺激ＴＮＦＲメンバーファミリーの細胞質内尾部である。共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの細胞質尾部は、主要な保存モチーフ（Ｐ／Ｓ／Ａ）Ｘ（Ｑ／Ｅ）Ｅ）またはマイナーモチーフ（ＰＸＱＸＸＤ）からなるＴＲＡＦ２結合モチーフを含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である。ＴＲＡＦタンパク質は、受容体の三量化に応答して、多くのＴＮＦＲの細胞内尾部に動員される。
【００９３】
適切な膜貫通ポリペプチドの際立った特徴は、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面において発現し、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指令するために共に相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含む本発明のＣＡＲの異なる膜貫通ポリペプチドは、共に相互作用して、標的リガンドとの結合後のシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得るが、キメラに最もよく適合する特定の膜貫通ドメイン、例えば、自己凝集を促進するか、または時期尚早の枯渇につながり得る標的結合の非存在下でのＣＡＲＴ細胞基礎活性化の増加を促進するものが好ましい。
【００９４】
本明細書で使用される用語「一部」は、より短いペプチドである、分子の任意のサブセットを指す。代替的に、ポリペプチドのアミノ酸配列機能的バリアントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおける変異によって調製することができる。そのようなバリアントまたは機能的バリアントは、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせはまた、最終的なコンストラクトに到達するためになされ得るが、但し、最終的なコンストラクトは、所望の活性、特に特異的な抗標的細胞免疫活性を示すことを条件とする。宿主細胞内での本発明のＣＡＲの機能性は、特定の標的の結合時に上記ＣＡＲのシグナル伝達能力を実証するのに適したアッセイにおいて検出可能である。そのようなアッセイは当業者に利用可能である。例えば、このアッセイは、カルシウムイオン放出の増加、細胞内チロシンリン酸化、イノシトールリン酸代謝回転、または結果として影響を受けたインターロイキン（ＩＬ）２、インターフェロンγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４産生の測定を含むアッセイなどの、標的の結合に起因するシグナル伝達経路の検出を可能にする。
【００９５】
使用方法
本発明によるｔＢｓＡｂ、ｔＢｓＡｂを発現する細胞、またはＣＡＲは、がん、ウイルス感染、または自己免疫疾患の治療を必要とする患者において治療を行うために使用できる。別の実施形態では、本発明によるｔＢｓＡｂ、ｔＢｓＡｂを発現する細胞、またはＣＡＲは、がん、ウイルス感染、または自己免疫疾患の治療を必要とする患者におけるその治療のための医薬の作製に使用できる。
【００９６】
上記治療は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは自家免疫療法の一部または同種異系免疫療法の治療の一部であってもよい。自家性とは、ｔＢｓＡｂまたはｔＢｓＡｂを発現する細胞を産生するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、ｔＢｓＡｂまたはｔＢｓＡｂを発現する細胞を産生するために使用される細胞または細胞の集団が、患者に由来するのではなくドナーに由来することを意味する。
【００９７】
治療は、がん、ウイルス感染、自己免疫疾患、または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と診断された患者を治療するために使用することができる。治療され得るがんには、血管新生化されていない、またはまだ実質的に血管新生化されていない腫瘍、ならびに血管新生化腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（白血病及びリンパ腫などの血液腫瘍など）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明のＣＡＲで治療すべきがんの種類としては、がん腫、芽細胞腫及び肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性疾患、良性及び悪性の腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、がん腫、及び黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／がん及び小児の腫瘍／がんもまた含まれる。
【００９８】
上記治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、及び放射線療法の群から選択される、がんに対する１つ以上の療法と組み合わせた治療であり得る。
【００９９】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３やＣＡＭ  ＰＡＴＨなどの抗体と組み合わせて（例えば、その前に、同時に、またはその後に）患者に投与される。
【０１００】
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の実体は、その実体の１つ以上を指し、例えば、「二重特異性抗体」は、１つ以上の二重特異性抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用され得る。
【０１０１】
本明細書において使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」及び複数形の「ポリペプチド」を包含し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結した単量体（アミノ酸）からなる分子を指すことを意図する。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、２つ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すのに使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりに、または任意のこれらの用語と交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。それは化学合成によることを含む任意の方法で生成することができる。
【０１０２】
細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関連して本明細書において使用されるとき、用語「単離した」は、巨大分子の天然の供給源に存在しているそれぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。本明細書で使用されるとき、用語「単離された」はまた、組換えＤＮＡ技術によって製造されるときには細胞物質、ウイルス物質、もしくは培地を実質的に含まない、または化学的に合成されるときには化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然には存在せず、そして天然の状態では見出されないであろう核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すために本明細書において使用される。単離されたポリペプチドは、精製ポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
【０１０３】
本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する用語「組換え」は、天然には存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図し、その非限定的な例は、通常共に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作り出され得る。
【０１０４】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列の類似性を指す。相同性は、比較の目的でアラインメントさせることができる各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められているとき、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致の位置または相同の位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」の配列は、本開示の配列の１つと、４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【０１０５】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対する「配列同一性」のある特定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）を有し、アラインメントされるとき、その塩基（またはアミノ酸）の割合は、２つの配列の比較において同一であることを意味する。このアラインメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを用いて決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメーターがアラインメントのために使用される。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴである。特に、プログラムはＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメーターを使用する：遺伝子コード＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予測＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記載＝５０配列、ソート＝ハイスコアによる、データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉに見出され、２００８年５月２１日に最後にアクセスされた。生物学的に等価なポリヌクレオチドは、上記の特定の相同性パーセントを有し、そして同一または類似の生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【０１０６】
用語「等価の核酸またはポリヌクレオチド」は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列との、ある特定の相同性または配列同一性の程度を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その相補体とまたはその相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様において、核酸の相同体は核酸またはその相補体とハイブリダイズすることができる。同様に、「等価のポリペプチド」とは、基準ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの態様において、等価の配列は、基準配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば塩橋）を保持している。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施することができる。一般に、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は約４０℃で、約１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で実施される。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、典型的には約５０℃で、約６×ＳＳＣ中で実施され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般に、約６０℃で、約１×ＳＳＣ中で実施される。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知の「生理的条件」下で実施することができる。生理条件の非限定的な例は、細胞において通常見られる温度、イオン強度、ｐＨ、及びＭｇ２＋の濃度である。
【０１０８】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列からなる。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表示は、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースに入力することができ、機能的ゲノム学及び相同性検索などのバイオインフォマティクス用途に使用することができる。「多型」という用語は、遺伝子またはその一部の１を超える形態の共存を指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は単一ヌクレオチドであり得、その同一性は異なる対立遺伝子において異なる。
【０１０９】
用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造をとり得、公知であれ未知であれ任意の機能をなし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような、修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。他に特定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々を包含する。
【０１１０】
用語「コードする」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、その天然の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されるときに、ポリペプチド及び／またはその断片のｍＲＮＡを産生するように転写及び／または翻訳することができる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、核酸の相補体であり、それからコード配列を推定することができる。
【０１１１】
本明細書で使用されるとき、用語「検出可能な標識」は、検出される組成物、例えば「標識された」組成物を生成するために抗体などのポリヌクレオチドまたはタンパク質に直接または間接的にコンジュゲートする直接または間接に検出可能な化合物または組成物を意味する。この用語はまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの、挿入された配列の発現時にシグナルを提供するであろうポリヌクレオチドにコンジュゲートした配列も含む。標識はそれ自体検出可能であり得（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。標識は小規模検出に適しているか、またはハイスループットスクリーニングにさらに適している可能性がある。したがって、適切な標識としては、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、染料、及び酵素を含むタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。標識は単純に検出されてもよく、または定量化されてもよい。単純に検出される応答は一般に単に存在が確認される応答を含むのに対して、定量化される応答は一般に強度、偏光、及び／または他の特性などの定量化可能な（例えば数値として報告可能な）値を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイにおいて、検出可能な応答は、実際に結合に関与するアッセイの構成要素に関連する発光団またはフルオロフォアを使用して直接的に、または別の（例えばレポーターまたは指示薬）構成要素に関連する発光団またはフルオロフォアを間接的に使用して生じ得る。
【０１１２】
本明細書において使用されるとき、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」とは、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体及び任意の抗原結合断片またはその単鎖であり得る。したがって、用語「抗体」は、抗原に結合する生物活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのような例には、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１３】
本明細書で使用されるとき、「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部である。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷な抗体によって認識されるのと同一の抗原と結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、シュピーゲルマー、及びダイアボディを含む。用語「抗体断片」はまた、複合体を形成するために特定の抗原に結合することによって抗体のように作用する任意の合成タンパク質または遺伝子改変されたタンパク質を含む。
【０１１４】
「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、この領域は、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと結合している。このリンカーは柔軟性のためにグリシンに富んでいてもよく、同様に溶解度のためにセリンまたはトレオニンに富んでいてもよく、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と結合でき、またはその逆であることもできる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
【０１１５】
「タンデムｓｃＦｖ」は、短いリンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖからなり、これにより、２つの別々の抗原結合単位の自由な回転が可能になり、したがって柔軟な構造がもたらされる。
【０１１６】
抗体という用語は、生化学的に区別することができる様々な広いクラスのポリペプチドを包含する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、ガンマ１〜ガンマ４）と共に分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特性決定されており、機能的な特殊化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変型は、本開示を考慮すると当業者には容易に識別可能であり、したがって本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは明らかに本開示の範囲内であり、以下の考察は概してＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、及び分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４本の鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって「Ｙ」配置に連結されており、ここで、軽鎖は、「Ｙ」の出入り口から始まり可変領域を通って続く重鎖を囲む。
【０１１７】
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むがこれらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類、（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
【０１１８】
軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。各々の重鎖クラスはカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝的に改変された宿主細胞によって産生されるとき、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「テール」部分は共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐した末端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで伸びている。
【０１１９】
軽鎖と重鎖の両方が構造的及び機能的な相同性の領域に分割される。用語「定常」及び「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽（ＶＫ）鎖と重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識及び特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＫ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である：ＣＨ３及びＣＫドメインは、実際には、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【０１２０】
上述のように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＫドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖及びＶＫ鎖の各々の３つのＣＤＲ、すなわちＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３）によって定義される。いくつかの例では、例えばラクダ科動物種に由来するか、またはラクダ科動物免疫グロブリンに基づいて改変された特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は、軽鎖を含まず、重鎖のみからなり得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照。
【０１２１】
天然の抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその三次元配置をとるとき、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置するアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン中の残りのアミノ酸は、より少ない分子間変動を示している。フレームワーク領域は主にβシート構造を採用し、ＣＤＲはβシート構造を連結するループであって、いくつかの場合ではβシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有相互作用によって正しい向きにＣＤＲを配置することをもたらす足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、その同族エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それらが正確に定義されているので（参照により全ての内容が本明細書に組み込まれる、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照）、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について当業者によって容易に同定できる。
【０１２２】
当該技術分野で使用及び／または許容される用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、そうでないと明示的に述べられていない限り、そのような意味の全てを含むことを意図する。具体的な例は、重鎖と軽鎖のポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続な抗原結合部位を記載する用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって、及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、これらは参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義は、互いに比較したときの、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体のＣＤＲまたはそのバリアントを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され使用される用語の範囲内にあることが意図されている。上に引用した参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表に示されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変動するであろう。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
【０１２３】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えたいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔナンバリング」のシステムをあらゆる可変ドメイン配列に明白に割り当てることができる。本明細書において使用されるとき、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に示されるナンバリングシステムを指す。
【０１２４】
上述の表に加えて、Ｋａｂａｔナンバーシステムは、以下のようにＣＤＲ領域を記載する：ＣＤＲ−Ｈ１は約アミノ酸３１（すなわち、最初のシステイン残基の約９残基後）で始まり、約５〜７アミノ酸を含み、そして次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の終わりから１５番目の残基で始まり、約１６〜１９個のアミノ酸を含み、そして次のアルギニンまたはリジン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の終わりの後の約３３番目のアミノ酸残基で始まり、３〜２５個のアミノ酸を含み、そして、配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ−Ｌ１は、約残基２４（すなわち、システイン残基に続く）で始まり、約１０〜１７残基を含み、そして次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の末端の後の約１６番目の残基から始まり、約７残基を含む。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の末端の後（すなわち、システイン残基の後）の約３３番目の残基から始まり、約７〜１１個の残基を含み、Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇに関する配列で終わり、式中Ｘは任意のアミノ酸である。
【０１２５】
本明細書で開示される抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源がコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメ由来）であり得る。
【０１２６】
本明細書中で使用されるとき、用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央、及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示における使用のための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示における使用のための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いていてもよい。上述のように、当業者であれば、重鎖定常領域は、それらが天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることを理解するであろう。
【０１２７】
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ分子由来のＣＨ１ドメイン及びＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、部分的にＩｇＧ分子由来の、及び部分的にＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ分子由来の、及び部分的にＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含み得る。
【０１２８】
本明細書中で使用されるとき、用語「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインの少なくとも一方を含む。
【０１２９】
「軽鎖−重鎖対」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成することができる軽鎖及び重鎖の集合を指す。
【０１３０】
上述のように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で使用されるとき、用語「ＶＨドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、そして用語「ＣＨ１ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、そして免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
【０１３１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、標準的なナンバリングスキームを用いて抗体の残基約２４４から残基３６０まで延伸する重鎖分子の部分を含む（Ｋａｂａｔナンバリングシステムで残基２４４から３６０、及びＥＵナンバリングシステムで残基２３１から３４０、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）を参照。ＣＨ２ドメインは別のドメインと密接に対になっていないという点で独特である。むしろ、２つのＮ結合型分岐鎖炭水化物鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入されている。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端まで延伸し、約１０８残基を含むこともまた十分に実証されている。
【０１３２】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５残基を含み、そして柔軟であり、したがって、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動作することを可能にする。ヒンジ領域は、３つの異なるドメイン：上部、中央、及び下部ヒンジドメインに分割することができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４０８３（１９９８））。
【０１３３】
本明細書で使用されるとき、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第二のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。最も天然に存在するＩｇＧ分子では、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して、２３９及び２４２（ＥＵナンバリングシステムで位置２２６または２２９）に対応する位置でＣＨ１及びＣＫ領域はジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０１３４】
本明細書中で使用されるとき、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位は、第１の種から得られるか、またはそれに由来し、定常領域（無傷、部分的、または本開示に従って改変され得る）は、第２の種から得られる任意の抗体を意味する。ある特定の実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト起源（例えば、マウスまたは霊長類）であり、定常領域はヒトである。
【０１３５】
本明細書中で使用されるとき、「ヒト化パーセント」は、ヒト化ドメインと生殖細胞系列ドメインとの間のフレームワークアミノ酸差異（すなわち、非ＣＤＲ差異）の数を決定し、次いでその数をアミノ酸の全数から差し引き、それをアミノ酸の全数で割り、１００をかけることによって計算される。
【０１３６】
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間にある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義によると、抗体は、それがランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にその抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープを妨げる相対的親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなされ得るか、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【０１３７】
本明細書において使用されるとき、用語「治療する」及び「治療」は、治療的治療と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指し、その目的は、がんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは望ましい臨床結果には、病状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または緩徐化、病態の寛解または好転、及び検出可能か検出不能かにかかわらず緩解（部分的または全体的）が含まれるがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して延長された生存期間を意味することもできる。治療の必要のあるものは、状態もしくは障害をすでに有するもの、及び状態もしくは障害を有する傾向にあるもの、または状態もしくは障害を予防すべきものを含む。
【０１３８】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、スポーツ動物、またはペット動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ウシなど）を含む。
【０１３９】
本明細書で使用されるとき、「治療を必要とする患者に対する」または「治療を必要とする対象」などの語句は、例えば、検出のため、診断手順のため、及び／または治療のために使用される本開示の抗体または組成物の投与から恩恵を受ける、哺乳動物対象などの対象を含む。
【０１４０】
本開示は、がん療法に適用できる二重特異性抗体の開発を記載する。この目的を達成するために、ＧＩＴＲタンパク質及びＰＤ−Ｌ１タンパク質に対する２種の特異性を有する２つの四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）が作り出された。これらのコンストラクトの利点は、それらが、Ｔ細胞を活性化し、制御性Ｔ細胞の抑制を無効にすることによって抗腫瘍応答を増強することである。抗ＣＣＲ４−抗ＰＤＬ１  ｔＢｓＡｂ（図３及び４）ならびに抗ＣＡＩＸ−抗ＰＤＬ１（図５及び６）もまた記載されている。
【０１４１】
ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター中の２つの異なるフォーマットのタンデムｓｃＦｖ断片二量体化単位が本明細書に記載される。第１のコンストラクトにおいて、タンデムｓｃＦｖは、異なる親抗体に由来する２つのｓｃＦｖを含む。αＧＩＴＲのｓｃＦｖ及びαＰＤ−Ｌ１のｓｃＦｖは、２つのフレキシブルリンカー間のＩｇＧ１ヒンジ領域によってタンデムに結合している。第１のコンストラクトは、ＶＨ  ＧＩＴＲ１０−リンカー−ＶＬ  ＧＩＴＲ１０−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨ  ＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬ  ＰＤ−Ｌ１の構造を有し、その配列はＤＮＡシーケンシングによって確認された。２番目のフォーマットは最初のフォーマットと同等に構成されている。さらに、それは、ヒンジと１つのリンカー領域との間に導入された追加のドメイン、例えばＣＨ２ドメインを含む。第２のコンストラクトは、ＶＨ  ＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬ  ＧＩＴＲ−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−リンカー−ＶＨ  ＰＤ−Ｌ１−リンカーＶＬ  ＰＤ−Ｌ１の構造を有する。第１のコンストラクトと対照的に、第２のコンストラクトはＦｃドメインを含み、三機能性ｔＢｓＡｂをもたらす可能性がある。
【０１４２】
両方のｔＢｓＡｂは、ＨＥＫ細胞での一過性トランスフェクションにより成功裏に発現し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。
【０１４３】
精製されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価され、示された結果は、還元条件下でｔＢｓＡｂの全てのタンパク質プロファイルが１つの単一のバンドを示し、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）の理論値と正確に一致する：αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔａＦｖについて６５ｋＤａ、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔａＦｖについて７５ｋＤａ。非還元条件下において、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１（１３０ｋＤａ）及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１（１５０ｋＤａ）のｔＢｓＡｂの予想された分子量は、見かけの分子量と一致する（図１８を参照）。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーは、新規に設計されたｔＢｓＡｂの生物活性を実証した。ＥＬＩＳＡにおいて、産生されたＢｓＡｂのαＰＤ−Ｌ１アームの保持された生物活性は、インビトロにおいて保存され、αＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂと同様の結合活性を示した。αＧＩＴＲーαＰＤ−Ｌ１抗体が結合しないＣＣＲ４がシグナルを全く示さなかったので、ｔＢｓＡｂの非特異的結合は、除外されていた。さらに、両方の産生されたＢｓＡｂ（αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１）について、αＧＩＴＲアームのＧＩＴＲタンパク質に対する同様の結合活性が観察された。αＧＩＴＲーαＰＤ−Ｌ１抗体が、ＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞に対する結合特異性を全く示さなかったので、同様に、非特異的結合はこのアームから除外されていた。αＧＩＴＲ  ＩｇＧを各々のＢｓＡｂと比較するとき、αＧＩＴＲ  ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡ実験においてより高い結合を示したが、これは、ｔＢｓＡｂのより低い親和性を示唆した。それにもかかわらず、抗原結合部位の空間的配置及びｔＢｓＡｂの抗原表面分布の二価性に応じてアビディティを増加させることができ、これは弱い結合を補償することができる。
【０１４５】
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞によって試験したαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１のフローサイトメトリー解析は、新規のｔＢｓＡｂが細胞上に発現するときにその天然の立体構造においてＧＩＴＲタンパク質を認識することを示唆している。ＧＩＴＲ  ｍＡｂと比較したαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂの同様の結合親和性が観察された。したがって、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー分析は、インビボの場合と同様に、細胞上に発現するときに対応する抗原を特異的に認識するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１の能力を実証した。これらの特性決定研究は、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１の類似の結合挙動を示した。
【０１４６】
ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１の重要な態様は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する機能にある。これらの機能は、破壊のために腫瘍細胞を標的とするときのｔＢｓＡｂの有益な効果をさらにもたらす。
【０１４７】
標的細胞としてＧＩＴＲ＋  ＣＦ２を、エフェクター細胞としてＷＩＬ２−Ｓを用いる（Ｅ／Ｔ＝５：１）ＡＤＣＣ解析において、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１は、驚くべき結果を示した。αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体について、ルシフェラーゼ活性の生のシグナルは、高い抗体濃度で低下し、標的細胞及びエフェクター細胞のみについてのシグナルよりも実質的に低かった（図３０を参照）。
【０１４８】
本明細書に記載された方法は、１つのクローニングステップのみを含むｔＢｓＡｂの生成を可能にする。ｔＢｓＡｂは、わずか約１５０ｋＤａのみの小サイズの分子で、ＧＩＴＲタンパク質及びＰＤ−Ｌ１抗原に対する２種の親和性を保持する。そのようなｔＢｓＡｂは、効果的ながん療法にとって極めて重要であろう。
【実施例】
【０１４９】
実施例１：αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）のクローニング
クローニング戦略
フレキシブルリンカーによって結合した、異なる親抗体を起源とする２つの組換え単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むプラスミドをクローニングすることを目的とした。ｓｃＦｖの一方がＧＩＴＲタンパク質に対するものであり、他方がＰＤ−Ｌ１に対するものである。そのようなプラスミドは、リンカー−ヒンジ−リンカードメインによって共有結合する２つのｓｃＦｖを産生し、四量体二重特異性抗体（αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂ）をもたらす。
【０１５０】
哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４プラスミドは、コンストラクト（ＶＨＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１）の基礎であった。ｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターの基礎的な構造は、Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグに融合したＶＨＸ−リンカー−ＶＬＸ−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１遺伝子を予め含んだ（図１２）。
【０１５１】
制限酵素消化及びライゲーション
６つのαＧＩＴＲ  ｓｃＦｖ遺伝子配列をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに個別にクローニングした。６つのＶＨＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ遺伝子配列は、ＶＨＧＩＴＲＬ１−ＶＬＧＩＴＲＬ１、ＶＨＧＩＴＲＬ１０−ＶＬＧＩＴＲＬ１０、ＶＨＧＩＴＲＬ１１−ＶＬＧＩＴＲＬ１１、ＶＨＧＩＴＲＬ１４−ＶＬＧＩＴＲＬ１４、ＶＨＧＩＴＲＬ１５−ＶＬＧＩＴＲＬ１５、及びＶＨＧＩＴＲＬ１７−ＶＬＧＩＴＲＬ１７とラベルされた。全ての６つのαＧＩＴＲ遺伝子配列は、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位が隣接し、対応するドナープラスミドから消化によって単離された（表１）。同様に、ｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターもまた、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限酵素によって消化された。消化されたベクター及び断片は、１％アガロースゲルで解析され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製された。ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ消化からの突出末端インサートを、Ｔ４  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて５倍モル比で、対応するベクターｐｃＤＮＡ３．４に連結した。ライゲーション反応あたり、５０ナノグラムの受容ベクターを使用した。ライゲーション生成物は、ＶＨＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１の最終構造をもたらした（図１２）。
【０１５２】
それぞれ対照抗体を生成する３つのさらなるクローンを構築した。ＶＨＦ１０−ＶＬＦ１０結合ドメインはＧＩＴＲタンパク質とＰＤ−Ｌ１タンパク質とのいずれにも結合親和性を有さないので、Ｆ１０遺伝子を「対照アーム」として選択した。したがって、このドメインは陰性対照として定義された。Ｆ１０は、インフルエンザＨＡタンパク質に対する評価された抗体である。同一の抗体フォーマットを保つために、その遺伝子配列は、それぞれＶＨＧＩＴＲ１−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１またはＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１のいずれかのみを置き換える。３つの対照プラスミドは以下の配列の順番を示す：
（１）ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１（Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１）
（２）ＶＨＧＩＴＲ１−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０（αＧＩＴＲ１−Ｆ１０）
（３）ＶＨＧＩＴＲ１０−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１０−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０（αＧＩＴＲ１０−Ｆ１０）。
【０１５３】
プラスミド（１）の構築
ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０遺伝子を、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩのＲＥによる消化を介してｐｃＤＮＡ３．１ベクターから単離した。発現ベクターに関して、同一のｐｃＤＮＡ３．４ベクターを使用した（図１３）。それは、所望の挿入部位にＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位を含み、したがって、対応する制限酵素によって消化された。最終的なプラスミドは、両方の消化生成物を互いに連結することによって得られた。ライゲーションは、１６℃で一晩、Ｔ４  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて実施された。
【０１５４】
プラスミド（２）及び（３）の構築の手順
上述のコンストラクトにおいてαＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを置き換えることを目的として、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩ制限部位とＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０断片の５’末端及び３’末端とをそれぞれ導入するためにフォワード及びリバースプライマーを設計して合成した。ＰＣＲ増幅の後、ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０を含むＰＣＲ産物とｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターをＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩで消化し、以前に構築した発現プラスミド、ＶＨＧＩＴＲ１−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１及びＶＨＧＩＴＲ１０−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１０−リンカー−ヒンジ−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１においてＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤーＬ１をコードするＤＮＡ断片を置き換えるのに使用した。消化した発現ベクター及びインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲル精製（１％アガロース）し、続いて、Ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ（５分間、室温にて）によって互いに連結した。この手順はプラスミド（２）及び（３）をもたらした（図１４）。
【０１５５】
対照プラスミドコンストラクトの構築のためのプライマー設計
上述のように、対照プラスミド（２）及び（３）について、ＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０を単離するための２つのプライマーを設計した。フォワードプライマー（５’−３’）は、ＤＮＡの相補鎖の３’末端に結合するよう設計され、リバースプライマー（３’−５’）は、ＤＮＡの主鎖の３’末端に結合するように設計され、逆相補的であった。プライマーは約２０ｂｐ長であり、最適融解温度は６２〜６５℃であり、±１℃を超えて逸脱しない。フォワードプライマー（ＢｓｉＷＩ制限部位（番号１）を含む）及びリバースプライマー（ＢａｍＨＩ制限部位（番号２）を含む）は、Ｇｅｎｅｗｉｚによって合成された。ＰＣＲ反応のために、熱サイクルにおいて、１００ｎｇのＤＮＡテンプレート（ｐｃＤＮＡ３．１）を使用した。ＰＣＲ生成物は、製造者のプロトコールに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって精製し、１％アガロースゲルで解析した。
【０１５６】
実施例２：ＣＨ２ドメインを含むαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）のクローニング
クローニング戦略
この実施例の目的は、以前に構築されたプラスミドにＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインを導入し、ＶＨＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１の基本構造をもたらすことであった。ＣＨ２の付加は、エフェクター機能を付与し、三機能性ｔＢｓＡｂをもたらす。
【０１５７】
αＧＩＴＲ１０−αＰＤＬ１を含むｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターは、新規のプラスミド構築のために使用されるテンプレートとして機能した。新規の制限部位ＨｉｎｄＩＩＩは、ＩｇＧ１ヒンジ領域とリンカー（ＧＧＧＧＳ）６との間での部位特異的変異導入によって導入された。この新規に構築された制限部位は、ＩｇＧ１定常ＣＨ２ドメインのためのクローニング部位として機能した（図１５を参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、いくつかの理由から選択された。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、プラスミドにおいて唯一であり、そのゲノム配列は、その隣接コード領域とは類似しない。にもかかわらず、ＨｉｎｄＩＩＩは、変異導入効率をおそらく減少させる比較的長い長さ（６ヌクレオチド）というようないくつかの欠点を特徴とする。
【０１５８】
ＩｇＧ１プラスミドを、ＣＨ２ドメインを単離するためのテンプレートとして使用した。ＣＨ２配列を、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩを含むプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ｐｃＤＮＡ３．４発現ベクター（ＶＨＧＩＴＲ１０−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１０−リンカー−ヒンジ−ＨｉｎｄＩＩＩ＊−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１）及び増幅したＣＨ２断片を、対応する制限酵素で消化した。消化したベクターと断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲル精製（１％アガロース）した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化からの突出末端インサートを、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて２０倍インサートでベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に連結し、新規のプラスミド、ＶＨＧＩＴＲ１０−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ１０−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１を構築した。
【０１５９】
部位特異的変異導入
ＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１ベクターの変異導入は、製造者のプロトコールに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｌｉｇｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて達成された。各々がベクターの反対側の鎖に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。両方のプライマーは、所望の変異としてＨｉｎｄＩＩＩを含んだ。
【０１６０】
プライマーは、７〜１０塩基が隣接するプライマー中央にＨｉｎｄＩＩＩ変異を示すよう設計された。オリゴヌクレオチドプライマーは、熱サイクルの間のＰｆｕＵｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる伸長のために使用された。このアプローチは、互い違いのニックを含む変異プラスミドの生成を可能にした。次の熱サイクルの間、生成物は、ＤｐｎＩによって処理され、メチル化及びヘミメチル化ＤＮＡを含む親ＤＮＡテンプレートを消化した。対照として、４．５ｋｐのｐＷｈｉｔｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを使用して、変異プラスミドを試験した。ｐＷｈｉｔｅｓｃｒｉｐｔプラスミドは、グルタミンコドンがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩのβーガラクトシダーゼ遺伝子中に現れる位置において終止コドン（ＴＡＡ）をコードし、通常ＩＰＴＧ及びＸｇａｌを含むＬＢ−アンピシリン寒天プレート上のコロニーの青色を消す。しかしながら、オリゴヌクレオチド対照プライマーが、ｐＷｈｉｔｅｓｃｒｉｐｔの４．５ｋｂ対照プラスミドに点変異を作り出すと、終止コドンのＴ残基をＣに戻し、それによってＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含む培地上の青色の表現型をもたらす。サイクリング後、２μＬのＤｐｎＩ制限酵素を添加し（３７℃、５分間）、親ｄｓＤＮＡを消化した。次いで、変異導入プラスミドをＸＬ１０Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換し、そして８０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ及び２０ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ−アンピシリン寒天プレート上に広げた（３７℃、＞１６時間）。次の日、１６個のクローンをＬＢ−アンピシリンプレートから選び、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化して、変異導入に成功したクローンを同定した。陽性クローン１０番（ＨｉｎｄＩＩＩを有するＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１）を別の消化に供し、それを元のプラスミドＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１（ＨｉｎｄＩＩＩなし）と比較した。各々の試料をＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩによって個別に消化し、ならびにＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ−ＨＦで一緒に同時に消化し、全部で６つの消化物をもたらした（以下の表１を参照）。
【０１６１】
（表１）全部で６つの制限酵素消化物についてのパラメーター及び体積
2019533675.tif 000014
６つの試料は、３７℃で２時間インキュベートし、１％アガロースゲルで解析した。
【０１６２】
番号１０の陽性変異クローンを含む細菌を１２０ｍＬのＹＴ培地中３７℃で一晩増幅し、続いてＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む正しいコンストラクトは、シーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ（登録商標）、事前に設計されたプライマーを用いて）によって確認された。グリセロールストックを調製し、そして−８０℃で保存した。ＨｉｎｄＩＩＩドメインを含む受容プラスミド及びＣＨ２断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて互いに連結した。本明細書に記載のプロトコールに従って、ライゲーション生成物をヒートパルスによりＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換した。正しいプラスミドはシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ（登録商標））によって検証した。
【０１６３】
形質転換
ライゲーション生成物をヒートパルスによりＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換した。これらの細胞を氷上でゆっくりと溶解した。各形質転換について、４５μＬの細胞を２μＬのＢ−メルカプトエタノール及び１．５μＬの対象のＤＮＡと混合した。形質転換反応物を３０分間インキュベートし、続いて４２℃の水浴中で４０秒間ヒートパルスした。０．５  ｍＬのＳ．Ｏ．Ｃ．Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を各チューブに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。形質転換反応物をＬＢ−アンピシリンプレート上で３７℃において一晩増殖させた。
【０１６４】
１つのライゲーション試料につきいくつかのコロニーを個別に選び、そして１．５ｍＬの２−ＹＴ培地中で８時間増殖させた。選択したコロニーのプラスミドは、製造者によって指定されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて精製した。正しいプラスミドをシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ（登録商標））によって検証した。陽性クローンの細菌を１２０ｍＬのＹＴ培地（３７℃、２４０ｒｐｍ）中で一晩増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて（製造業者のプロトコールに従って）精製した。グリセロールストックは、４００μＬのグリセロール及び６００μＬの培養物を低温チューブバイアルに添加することによって調製し、次いで−８０℃で保存した。
【０１６５】
細胞培養及びトランスフェクション
タンパク質発現のために、２９３Ｆヒト細胞株２９３ＦをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）より、２９３Ｔ接着細胞株をＡＴＣＣ細胞バンクより入手した。細胞に基づくＥＬＩＳＡアッセイを目的として、細胞表面上にＧＩＴＲを発現するためにＭａｒａｓｃｏ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにおいてＣＦ２ーＧＩＴＲ細胞株を生成した。
【０１６６】
タンパク質発現のための懸濁状態の２９３Ｆ細胞
２９３Ｆ細胞（ヒト胚腎臓細胞、ＨＥＫ細胞に由来する）の懸濁培養物を、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））及び２９３フリースタイル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））中に３７℃において５％ＣＯ２で維持した。細胞は、継続した増殖のために、対数増殖期で継代し、新鮮な培地により最適な密度（２００，０００細胞／ｍＬ）に希釈した。
【０１６７】
２９３Ｔ及びＣＦ２−ＧＩＴＲ接着細胞
接着性の２９３ＴまたはＣＦ２−ＧＩＴＲ細胞は、７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）ならびに１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））及び１％ＳＰ（ピルビン酸ナトリウム）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を補充したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））中に３７℃において５％ＣＯ２で維持した。継続した増殖のために、細胞は８０〜１００％コンフルエントで継代し、新鮮な培地により最適な播種密度（２×１０６細胞）に希釈した。
【０１６８】
トランスフェクション
四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）（αＧＩＴＲ１−αＰＤ−１Ｌ１、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１１−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１４−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１５−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１７−αＰＤＬ１、及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１（ＣＨ２を有する））ならびに対照抗体（αＧＩＴＲ１−Ｆ１０、αＧＩＴＲ１０−Ｆ１０、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ  ＩｇＧ）の産生のために、２９３Ｆ細胞または２９３Ｔ細胞を、対応するプラスミドでトランスフェクトした。
【０１６９】
２９３Ｆ  ＨＥＫ細胞でのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介一過性トランスフェクション
トランスフェクションの１日前に、細胞を、３００ｍＬの全体積中６×１０５細胞／ｍＬの最終濃度に継代した。トランスフェクションの日に、細胞密度は１．０×１０６〜１．４×１０６細胞／ｍＬであった。対応するプラスミドをトランスフェクションのために調製した。トランスフェクション複合体の全体の電荷は、トランスフェクション試薬対ＤＮＡの比によって決定される。ＤＮＡ骨格中のホスフェートによって寄与された負電荷は、トランスフェクション試薬の正電荷によって相殺される。これは、良好な複合体形成を可能にし、そして負に荷電した細胞膜によって、ＤＮＡに付与された静電反発力の中和を可能にした。プラスミド：ＰＥＩの１：１の比は、ポリマーのＤＮＡに対する完全な結合を可能にし、そしてカーゴを保護するための完全な縮合が起こったが、過剰のＰＥＩは、アニオン性細胞表面の阻害効果を克服するために重要である。細胞１００万個ごとに、１μｇのプラスミド及び３μｇのＰＥＩをトランスフェクションに使用し、それぞれを別個に１５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（低血清培地）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））に希釈した。希釈したＰＥＩをプラスミドに添加し、室温で２０分間インキュベートした。中和効率は、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体への曝露時間とともに増加するが、脂質試薬に対して過度に長時間曝露することは有毒になる可能性がある。ＰＥＩ／プラスミド複合体を２９３Ｆ懸濁細胞（１×１０６細胞／ｍＬ、フラスコ当たり３００ｍＬ）に注ぎ入れ、３７℃において１４０ｒｐｍで６日間インキュベートした。
【０１７０】
２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞でのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介一過性トランスフェクション
ＰＥＩ細胞を用いた２９３Ｔ  ＨＥＫのトランスフェクションは、２９３Ｆ懸濁ＨＥＫ細胞について上述したものと同一だが少し変更を加えたプロトコールに従った。トランスフェクションは、組織培養皿（２００ｍｍ）に１０％ＦＢＳを補充した希釈したＤＭＥＭ培地中に８０％コンフルエントで増殖している２９３Ｔ細胞に対して行った。４０μｇのＤＮＡに対して、２００μｇのＰＥＩを使用し（１：５の比率）、それぞれを別々に１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（低血清培地）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））中で別々に希釈した。希釈したＰＥＩをプラスミドに添加し、室温で２０分間保存した。細胞の解離及び死を防ぐためにＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を皿に静かに滴下した。次いで細胞を３７℃で２日間インキュベートした。
【０１７１】
実施例３：タンパク質精製
二重特異性抗体のＮｉ−ＮＴＡ精製
２９３  ＨＥＫ細胞の懸濁物を採取し、４℃において５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した。Ｎ末端６×Ｈｉｓタグを介して二重特異性抗体を精製するために、ろ過した上清（０．２２μｍのＰＥＶ、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））を、１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）と共に２時間（２４０ｒｐｍ、室温）インキュベートした。上清を１５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ重力流カラムに２回通した。洗浄後、ビーズを含むカラムを４カラム用量のＮｉ−ＮＴＡ洗浄緩衝液（０．０２Ｍのイミダゾール、０．３ＭのＮａＣｌ、１ＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０））で洗浄し、タンパク質を１３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ溶離緩衝液（０．５Ｍのイミダゾール、０．３ＮａＣｌ、０．０２Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０））でゆっくり溶離した。溶離したタンパク質の緩衝液を、遠心フィルターユニット１００，０００ＭＷ（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標））を用いてＰＢＳ緩衝液に交換した。ｔＢｓＡｂの収率は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００を用いて測定した。
【０１７２】
αＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体のプロテインＡ精製
αＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体を２９３  ＨＥＫ細胞の懸濁液から採取し、４℃において、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した。Ｆｃドメインを介してαＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体を精製するために、ろ過した上清を１ｍＬのプロテインＡ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に２時間インキュベートし（室温、振とう）、次いで１５ｍＬの重力流カラム（Ｂｉｏｒａｄ）に２回通過させ、続いて洗浄のために１０ｍＬのＰＢＳを通した。αＧＩＴＲ  ＩｇＧを２ｍｌのＴＥＡ（１００ｎＭ）で溶離し、２００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、（ｐＨ＝７））を溶離液に添加してＴＥＡを中和した。追加の２ｍＬのＰＢＳをカラムに添加し、溶離したタンパク質と共にチューブに集めた。
【０１７３】
実施例４：タンパク質特性決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を用いて、ＮｕＰＡＧＥ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）テクニカルガイド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってタンパク質の純度を検証した。ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（４〜１２％）（Ｎｏｖｅｘ）をＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液中で使用し、全タンパク質量は３μｇ〜５μｇであった。タンパク質試料を、ドデシル硫酸塩を含む４×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）と混合してタンパク質を変性させた。還元条件下において、タンパク質試料を１００℃で１０分間さらに煮沸した。次いで試料をＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液中でＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌに負荷した。ゲルをＸｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ中、２００Ｖで３５分間泳動した後、ｓｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｎｏｖｅｘ）を用いたクマシーＧ−２５０染色で処理した。
【０１７４】
受動的に吸着した可溶性ＰＤ−Ｌ１抗原に対するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１の直接ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））を、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１ウサギＦｃ抗原及びＣＣＲ４タンパク質（陰性対照）１００μＬで室温において一晩コーティングした。次の日に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％ＢＳＡ）によって室温で２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。様々な濃度で１×ＰＢＳ中に調製した一次抗体、αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１１−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１４−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１５−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１７−αＰＤ−Ｌ１、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡＢ、及び市販の抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をウェルに添加し（１００μＬ）、室温で２時間インキュベートした。試験された抗体の最高濃度は１μｇ／ｍＬであり、次いで１×１０５μｇ／ｍＬ希釈まで１０倍で連続希釈した。各々の試料を、全ての濃度において三つ組で実施した。いくつかの対照を設定し、以下の表に列挙する（表２）。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。二次抗体（６×Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ、ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の溶液を１×ＰＢＳで希釈した（１：２０００及び１：５０００）。二次抗体（１００μＬ）を各ウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。最後に、各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。９６ウェルプレートを１００μＬのＴＢＭ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させ、発色後、１００μＬのリン酸停止溶液（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。終点ＯＤデータをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓを用いて４５０ｎｍで記録し、そしてＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ５．２．１ソフトウェアを用いて解析した。
【０１７５】
（表２）受動的に吸着したＰＤ−１抗原に対するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１の直接ＥＬＩＳＡのための、試験試料及び対照に関する実験的概観
2019533675.tif 000015
【０１７６】
ＧＩＴＲ＋ＣＦ２に対するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの、細胞に基づくＥＬＩＳＡ
細胞に基づくＥＬＩＳＡのために、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対する結合能の維持についてαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１、及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体を試験した。全部で４つのＥＬＩＳＡ実験が設定された。
【０１７７】
細胞に基づく第１のＥＬＩＳＡで、αＧＩＴＲ１−Ｆ１０及びαＧＩＴＲ１０−Ｆ１０の四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）が解析された。ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞及びＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞（陰性対照）の播種について、ウェルあたり１，０００個の細胞が２００μＬの１％ＤＭＥＭ培地に添加され、一晩インキュベートして接着させた。次の日に、細胞を１００μＬのアセトン−メタノール溶液（１：１比）で固定し、室温で２０分間インキュベートした。アセトン−メタノール溶液をプレートから吸引し、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄した。全般的なアッセイ手順及び発色は、２．６．２章に述べたＥＬＩＳＡのプロトコールに従って実施された。一次抗体、αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１が様々な濃度で試験された。ｔＢｓＡｂを１×インキュベーション緩衝液中で３分の１に段階希釈し、３．３３ｍｇ／ｍＬの最高濃度と０．０４１１ｍｇ／ｍＬの最低濃度であった。いくつかの対照が設定され、以下の表に列挙される（表３）。
【０１７８】
（表３）ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対するαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１の、細胞に基づくＥＬＩＳＡのための、試験試料及び対照に関する実験的概観
2019533675.tif 000016
【０１７９】
細胞に基づくＥＬＩＳＡ（図２０）の結果を評価した後、細胞を８％パラホルムアルデヒドによって固定したことを除いて上述のものと同一の手順を用いて、細胞に基づく第２のＥＬＩＳＡ実験を繰り返した。
【０１８０】
細胞に基づく第３のＥＬＩＳＡを実施して、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂを市販のヒトαＧＩＴＲ  ｍＡｂと比較した。ＧＩＴＲ＋ＣＦ２細胞及びＧＩＴＲ−ＣＦ２細胞（陰性対照）の播種について、ウェルあたり１０，０００個の細胞が２００μＬの１％のＤＭＥＭ培地に添加され、一晩インキュベートして接着させた。次の日に、細胞を１００μＬの８％パラホルムアルデヒドによって固定し、室温で２０分間インキュベートした。パラホルムアルデヒド溶液をプレートから吸引して、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄した。全般的なアッセイ手順及び発色は、本明細書に述べたＥＬＩＳＡのプロトコールに従って実施された。一次抗体、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０  ｍＡｂが様々な濃度で試験された。抗体を１×インキュベーション緩衝液中で連続希釈し（１：２）、５ｍｇ／ｍＬの最高濃度と０．０７８ｍｇ／ｍＬの最低濃度であった。いくつかの対照を設定し、以下の表に列挙する（表４）。
【０１８１】
（表４）ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ  ｍＡｂの、細胞に基づくＥＬＩＳＡのための、試験試料及び対照に関する実験的概観
2019533675.tif 000017
【０１８２】
第４のＥＬＩＳＡを実施して、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂを市販のαＧＩＴＲ  ｍＡｂと比較した。アッセイ手順は第３のＥＬＩＳＡ（上述）と同一であった。
【０１８３】
αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１についてのフローサイトメトリー解析
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対するαＧＩＴＲの生物活性は、蛍光標識細胞分取ＦＡＣＳ解析によって解析された。ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞及びＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞を７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）で、およそ８０％コンフルエントに到達するまで増殖させた。ＰＢＳ中０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む１：１０希釈トリプシンを添加することによってそれらを解離し、そして再懸濁し、次いでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で９６ウェル丸底プレートに添加した。次のステップで、αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１を様々な濃度において、４℃で１時間添加した。試験された抗体の最高濃度は１００μｇ／ｍＬであり、次いで０．０５μｇ／ｍＬ希釈まで２倍で連続希釈した。一次抗体はＨｉｓタグ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）によって検出した。二次抗体はＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に希釈して、各々のウェルに３０分間添加した。次いで細胞をＰＢＳ緩衝液によって３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。全部で１０，０００事象がＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって解析された。結果は、ＦｌｏｗＪｏ  １０．１ソフトウェアによって解析された。いくつかの対照が実施され、以下の表に列挙する。（表５）
【０１８４】
（表５）ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞及びＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞に対するαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１α及びＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１の、ＦＡＣＳ解析のための、対照試料に関する実験的概観
2019533675.tif 000018
【０１８５】
実施例５：機能試験
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対する、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤＬ１の、ＡＤＣＣアッセイ
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対する、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１の抗体依存性細胞傷害を、ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ（ＷＩＬ２−Ｓ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて解析し、製造者のプロトコールに従って実施した。目的は、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１をＡＤＣＣについて試験することであった。アッセイは、Ｆｃγ受容体及び応答エレメント駆動型ルシフェラーゼ遺伝子を有するＡＤＣＣレポーター細胞（ＷＩＬ２−Ｓ）を用いて実施された。
【０１８６】
ＧＩＴＲ＋ＣＦ２細胞及びＧＩＴＲ−ＣＦ２細胞を７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）で、およそ８０％コンフルエントに到達するまで増殖させた。ＰＢＳ中１：１０希釈の０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによってそれらを解離し、生存率について試験した。ＧＩＴＲ＋ＣＦ２細胞を標的細胞として使用し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）無血清）で希釈した１ウェルあたり２×１０４細胞の密度で９６ウェル細胞平底マイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に播種した。αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１（ＣＨ２を有する）ならびに対照（αＧＩＴＲ１０−ＩｇＧ（陽性対照）ならびにＧＩＴＲ１０−ＰＤ−Ｌ１及びＦ１０−ＰＤＬ１（陰性対照）を、ＡＤＣＣアッセイ培地で連続希釈した。４つの抗体を、２０ｍｇ／ｍＬ（最高濃度）で開始し、続いてそれぞれ２ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、及び０．０２ｍｇ／ｍＬ（１：１０の段階希釈）で濃度依存的に添加し、そして室温で５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、エフェクター細胞ＷＩＬ２−ＳをＡＤＣＣアッセイ培地で懸濁し、ウェルあたり１０×１０６細胞で標的細胞／抗体混合物に添加した。エフェクター細胞対標的細胞の比は５：１（Ｅ／Ｔ）に設定された。３７℃（５％ＣＯ２）での約６時間のインキュベーション後、等体積のＢｉｏ−Ｇｉｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、インキュベートした（室温、１０分間）。細胞の発光をＰｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａを用いて測定した。アッセイは三つ組で実施した。全てのデータはエクセルを用いてプロットした。
【０１８７】
ＧＩＴＲ＋ＣＦ２細胞に対する、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤＬ１の、ＣＤＣアッセイ
ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−α−ＰＤＬ１  ｔＢｓＡｂの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の試験のために、構成細胞中でＤＮＡに結合するＣｅｌｌＴｏｘ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＣｅｌｌＴｏｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、子ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。死細胞ＤＮＡに結合する色素によって生じる蛍光シグナルは細胞毒性に比例する。アッセイは、製造者のプロトコールに従って実施した。ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施されたアッセイの発色及び解析を除いて、補体依存性細胞傷害の試験のための実験手順及び設定は上述のＣＤＣ試験と同様であった。補体依存性細胞傷害について試験された抗体は、αＧＩＴＲ１０−αＰＤＬ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−α−ＰＤＬ１四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）であった。αＧＩＴＲ  ｍＡｂは陽性対照として使用され、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１は陰性対照として使用された。
【０１８８】
３７℃（５％ＣＯ２）での約４時間のインキュベーション後、等体積のＣｅｌｌＴｏｘ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、インキュベートした（室温、１０分間）。Ｐｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａを用いて蛍光を測定した。アッセイは三つ組で実施した。全てのデータはエクセルを用いてプロットした。
【０１８９】
実施例６：αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの単離及び特性決定
発現ベクターの生成
全部で６つのベクターにおいて、（αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１）が構築されて、所望のｔＢｓＡｂを産生し、追加の３つのベクターは、対照のＡｂ（αＧＩＴＲ１−Ｆ１０、αＧＩＴＲ１０−Ｆ１０、及びＦ１０−αＰＤ−Ｌ１）の産生のためであった。発現ベクターは、上述のクローニング戦略に従って生成した。
【０１９０】
受容発現ベクターｐｃＤＮＡ  ３．４及び全てのドナーベクター（６つのＶＨＧＩＴＲ−リンカーＶＬＧＩＴＲ及びインサート及び１つのＶＨＦ１０−ＶＬＦ１０インサート）を、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で切断し、断片を１％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。７つの消化物のＳｆｉＩ及びＮｏｔＩの消化パターンは、理論計算値に一致した。消化した受容ベクターｐｃＤＮＡ３．４ベクターは、７５００ｂｐを含み、正しいレベル（レーン１、８０００ｂｐ）のラダーで検出できた。レーン１のより小さな断片は、５００〜１０００ｂｐを示し、以前に使用されたｓｃＦｖのＶＨＸ−リンカーＶＬＸに対応する。ＧＩＴＲインサート（レーン２〜６）及びＦ１０インサート（レーン７）は、５００〜１０００ｂｐに集まった。８０００ｂｐのレベルに見られるより大きなバンド（レーン２〜７）は、対応する派生ベクターを表す。
【０１９１】
２つの追加の対照プラスミド（２）及び（３）が構築された。αＧＩＴＲ１−αＰＤＬ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤＬ１  ｓｃＦｖをコードする受容発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４をＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩ  Ｒｅで消化して、ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１断片をＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０断片で置き換えた。ｐｃＤＮＡ３．１ドナーベクターからＶＨＦ１０−リンカー−ＶＬＦ１０断片を単離するために、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を含むフォワード及びリバースプライマー（番号１及び番号２）を設計した。ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを単離した後、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩ  ＲＥで消化した。全ての３つの消化物のゲル解析は理論値と一致した。予想されたように、Ｆ１０断片のＰＣＲは、ラダーに対して正しい位置に１つのバンドのみを示す。２つの消化した受容ベクター（それぞれＶＨＧＩＴＲ１−ＶＬＧＩＴＲ１またはＶＨＧＩＴＲ１０−ＶＬＧＩＴＲ１０を含む）は、約８０００ｂｐのサイズで、ベクターの理論上のサイズ（７５００ｂｐ）と一致する。
【０１９２】
全ての消化した断片を、アガロースゲルから抽出して精製し、それぞれのライゲーション反応を実施した。得られたプラスミドは成功裏に構築され、そしてシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）により確認された。
【０１９３】
ＧＩＴＲ−ＰＤＬ１二重特異性抗体及びαＧＩＴＲ−ＩｇＧの発現
αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１タンパク質は２９３Ｆ  ＨＥＫ細胞において発現し、Ｎｉ−ＮＴＡ精製によって単離された。αＧＩＴＲ  ＩｇＧタンパク質はＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現し、プロテインＡ精製によって単離された。収率をＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計によって測定し、表６に列挙する。
【０１９４】
（表６）２９３Ｆ  ＨＥＫ発現の抗体収率
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【０１９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ｔＢｓＡｂ  αＧＩＴＲ１−αＰＤＬ１、αＧＩＴＲ１０−αＰＤＬ１、αＧＩＴＲ１１−αＰＤＬ１、αＧＩＴＲ１４−αＰＤＬ１、αＧＩＴＲ１５−αＰＤＬ１、αＧＩＴＲ１７−αＰＤＬ１、及びＦ１０−αＰＤ−Ｌ１の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。３μｇ〜５μｇのタンパク質試料をゲルに負荷し、電気泳動で分離し、クマシーブルーによって染色した。
【０１９６】
注目すべきことに、非還元条件下で、特に注意を引く２つのバンドが存在する。上部のバンドは１１５ｋＤａ及び１４０ｋＤａの範囲内にある。各タンパク質プロファイルにおけるこのバンドの量的優位性及びその見かけの分子サイズのαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）（１３０ｋＤａ）の分子サイズとの近似性は、抗体産生の成功を示している。下部のバンドは７０〜８０ｋＤａの間にあり、したがって、かなりの量の単量体タンデムｓｃＦｖ（６５ｋＤａ）からなる可能性がある。これとは別に、１４０ｋＤａを超えるいくらかの弱いバンドが観察可能であり、これは凝集体の形成を示唆している。
【０１９７】
還元条件下では、７０〜８０ｋＤａの間に１つのバンドしか見られず、これはｔＢｓＡｂのタンデムｓｃＦｖ（６５ｋＤａ）へのジスルフィド結合の還元を示唆する。見かけの値と理論計算値との間の分子量のずれは、翻訳後修飾（グリコシル化及びリン酸化など）ならびにそれがＳＤＳ  ＰＡＧＥを泳動する際のタンパク質の立体配座に起因し得る。ゲルに負荷された差の量は、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂ間のバンドの強度の差を説明することができる。
【０１９８】
さらに、αＧＩＴＲ−ＩｇＧの純度もＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。非還元条件下で、解析は１４０ｋＤａの見かけの分子量を有する１つのバンドを示し、そしてこれはαＧＩＴＲ  ＩｇＧの理論計算分子量（１５０ｋＤａ）にほぼ等しい。還元ＳＤＳ解析は、２本のバンドを明らかにし、これは、重鎖（５０ｋＤａ）及び軽鎖（２５ｋＤａ）をもたらすαＧＩＴＲ  ＩｇＧのジスルフィド結合の還元の成功を示唆する。
【０１９９】
受動的に吸着したＰＤ−Ｌ１抗原に対するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの直接ＥＬＩＳＡ
αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの直接ＥＬＩＳＡを、それらのＰＤ−Ｌ１抗原に対する反応性を特性決定するために実施した。図１９に示すように、ＰＤ−Ｌ１抗原に対する反応性は、全てのαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂにおいて観察することができたが、ＣＣＲ４に対する非特異的な粘着性は見られなかった（示さず）。読み出しシグナルは、全ての濃度の全てのαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂについて非常に類似していた。最も高いＥＬＩＳＡシグナルが最高濃度で測定された。さらに、αＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂ結合の吸光度値は市販のαＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂに対するものと同程度であり、強度シグナルはより低い濃度で減少した。ＥＬＩＳＡは、高濃度では飽和を示さず、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度では非常に弱いシグナルを有する。
【０２００】
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２に対するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂの、細胞に基づくＥＬＩＳＡ
αＧＩＴＲ  ＩｇＧの以前の研究では、αＧＩＴＲ１  ＩｇＧ及びαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧが最良の特徴を有することが証明されており、そのため、ここでのプロジェクトでは以下の実験をαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂに絞り込んだ。細胞に基づく酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）は、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して種々の濃度のαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１を試験してそれらの反応性を解析するのに使用された。図２０に示すように、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２に対する反応性は、αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体について観察することができた。αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のＯＤ値は、それらのそれぞれの濃度に依存する。予想と一致して、より強いシグナルはより高い濃度で測定され、その後濃度が減少するにつれて徐々に減少した。
【０２０１】
αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のシグナル強度は、全ての濃度でαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１よりも優れていた。驚くべきことに、陰性対照のＦ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は吸光度を示すだけでなく、濃度依存的な挙動をもするようである。αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びＦ１０−αＰＤ−Ｌ１では、０．１２３５ｍｇ／ｍＬの閾値を下回る読み出しシグナルは検出されなかった。全体として、平均の標準偏差は非常に高かった。
【０２０２】
以前のＥＬＩＳＡの驚くべき結果（図２０を参照）のために、実験を繰り返した。ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞をアセトン−メタノール溶液の代わりに８％パラホルムアルデヒドで固定したことを除いて、設定は同一のままとした。この第２のアプローチの結果は、αＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体の同様のシグナル読み出し観察を明らかにしたが、わずかに高い吸光度値を有していた（図２１を参照）。しかしながら、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体はシグナル活性を示し続け、その吸光度は依然として使用される濃度に依存している。ｔＢｓＡｂはＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞とインキュベートしたときには結合を全く示さなかった。図３２を参照されたい。
【０２０３】
細胞に基づく第３のＥＬＩＳＡを実施して、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体を市販のαＧＩＴＲ  ＩｇＧと比較した。両方の抗体の反応性がＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞で観察された（図２２）が、ＧＩＴＲ−  ＣＦ２細胞では観察されなかった（図３３を参照）。ここでもまたαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１の結果は、以前に記録されたデータと一致した。αＧＩＴＲ  ｍＡｂのシグナル強度は、全ての濃度でαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１よりも優れていた。驚くべきことに、より高い濃度では、シグナル読み出しの飽和は観察されなかった。対照抗体Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１（陰性対照）は、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対しては濃度依存的シグナル活性を示したが、ＣＦ２細胞（ＧＩＴＲ＋発現なし）に対しては示さなかった。図３３を参照されたい。
【０２０４】
ＧＩＴＲ＋細胞に対するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂのフローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析は、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対するαＧＩＴＲ１−αＰＤ−Ｌ１及びαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体の結合を評価する（図２３及び２４）。結果は、両方の抗体（ＡＰＣ標識Ｈｉｓ−タグ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で共染色）がＧＩＴＲ＋  ＣＦ２に特異的に結合できることを示している。さらに、ｔＢｓＡｂはＧＩＴＲ−  ＣＦ２に対して反応性を示さなかった（図３４）。対照に示されるように、いくらかの非特異的結合が二次抗体によって引き起こされることに留意されたい（図３４）。２つの抗体を互いに比較すると、それらが同一条件下で同様の結合を示すことが示される。したがって、さらなる特性決定のためにαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂのみを選択した。αＧＩＴＲ１  ＩｇＧ及びαＧＩＴＲ１０  ＩｇＧの標準測定は、ｔＢｓＡｂと比較したときに同様の結合特性を明らかにした。
【０２０５】
実施例７：ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ｂｓＡｂの単離及び特性決定
細菌発現ベクターの生成
以前の研究において、αＧＩＴＲ１０  ｍＡｂが、最良の特徴を示すことが証明されており、そのため、ＣＨ２ドメインを含む新しいコンストラクトの改変のための発現ベクターとしてαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１が選ばれた。ベクターは上述のクローニング戦略に従って生成され、以下の順番の遺伝子：ＶＨＧＩＴＲ−リンカー−ＶＬＧＩＴＲ−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−リンカー−ＶＨＰＤ−Ｌ１−リンカー−ＶＬＰＤ−Ｌ１をもたらした。
【０２０６】
部位特異的変異導入は、ＩｇＧ１ヒンジ領域とリンカー（ＧＧＧＧＳ）６との間で、受容ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の導入を可能にした。大腸菌株ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換した後、１６個のクローンを選び、次いでＤＮＡ精製を行った。１％アガロースゲル上に表示されたＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いた制限酵素消化解析は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の正しい導入について試験した（図２５参照）。１６個のクローンのうち、クローン番号１０のみが２つのバンドを示した。５００〜１０００ｂｐに集まるより小さいバンドのサイズは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ消化の理論サイズ（８００ｂｐ）に対応する。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩはプラスミド中の唯一の制限部位を表すので、この結果はクローン番号１０の細胞のＤＮＡへのＨｉｎｄＩＩＩの成功裏の導入を示した。
【０２０７】
クローン番号１０のさらなるゲル解析を、それを元のＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含まない）と比較するために実施した。図２６を参照されたい。クローン番号１０（Ｈｉｎｄｌｌｌを含むＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１）及びＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１（Ｈｉｎｄｌｌｌを含まない）の各々は、個別に３つの消化を行った。第１の消化はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素のみを用いて、第２の消化はＮｏｔＩ制限酵素のみを用いて、そして第３の消化はＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩ制限酵素の両方を用いて行った。クローン番号１０を単一の酵素で消化した結果、開環構造が得られ、８０００ｂｐ付近に集まった。対照的に、クローン番号１０のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素による二重消化は、２つのバンドをもたらした。下部のバンドは５００ｂｐ未満で集まっており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ消化断片についての理論計算値（１１７ｂｐ）に対応する。αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１プラスミドはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含まず、これにより、ＨｉｎｄＩＩＩ単一消化のゲル解析はスーパーコイルプラスミドＤＮＡを予想通り明らかにした。これらの結果は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の正しい導入を強く示唆している。
【０２０８】
クローン番号１０のシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）の結果は、ヒンジとリンカードメインとの間のＨｉｎｄＩＩＩの正しい導入を確認した。しかしながら、全部で６つの（ＧＧＧＧＳ）反復のうちの５つのリンカー反復の欠失が部位特異的変異導入の間に起こった。その結果、新しいコンストラクトは、６個のリンカー反復ではなく、ただ１つのリンカー配列の反復を示した。それにもかかわらず、ヒンジ領域とそれに続く１つの単一リンカー反復（ＧＧＧＧＳ）とを含むこの新たに作製されたプラスミドを用いてプラスミド構築を続けることが決定された。
【０２０９】
ＩｇＧ１プラスミドからＣＨ２ドメインを単離するために２つのプライマー（フォワード及びリバース）を設計した。各プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含んだ。受容ベクターＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む）及びＣＨ２断片をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で単一消化し、１％アガロースゲルで解析した（図２７）。どちらの消化でも、理論計算値：ＨｉｎｄＩＩＩを含む受容ベクターＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１について７．５ｂｐ、ＣＨ２断片について３５０ｂｐと一致する断片のサイズが得られた。
【０２１０】
したがって、ＣＨ２を有するｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１は成功裏に構築され、そしてシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）により確認された。
【０２１１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１タンパク質は、２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞において発現し、Ｎｉ−ＮＴＡ精製によって単離された。合計１００ｍＬの培地は２００ｎｇのタンパク質収量をもたらした（ＮａｎｏＤｒｏｐ解析）。ＣＨ２を有するＧＩＴＲ１０−ＰＤＬ１  ｔＢｓＡｂの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した（図２８）。全部で３μｇのタンパク質試料をゲルに負荷し、電気泳動で分離し、クマシーブルーによって染色した。注目すべきことに、非還元条件下で、特に注意を引く２つのバンドが存在する。上部のバンドは１４０ｋＤａよりわずかに上にある。このバンドの量的優位性及びその見かけの分子サイズがＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１  ｔＢｓＡｂ（１５０ｋＤａ）の分子サイズとの近似性は、抗体産生の成功を示唆する。下部のバンドは８０ｋＤａの見かけの分子量を有し、したがって、二量体化しなかったＣＨ２（７５ｋＤａ）を含むかなりの量のタンデムｓｃＦｖからなる可能性がある。還元条件下では、８０ｋＤａの１つのバンドしか見られず、これはｔＢｓＡｂのタンデムｓｃＦｖ（７５ｋＤａ）へのジスルフィド結合の還元を示唆する。
【０２１２】
ＧＩＴＲ＋ＣＦ２に対する、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１四量体二重特異性抗体（ｔＢｓＡｂ）の、細胞に基づくＥＬＩＳＡ
細胞に基づく酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）は、ＧＩＴＲ＋ＣＦ２に対する、種々の濃度の、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１を試験してそれらのシグナル強度を解析するために実施された。
【０２１３】
図２９に示すように、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２に対する反応性は、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体において観察することができたが、ＧＩＴＲ−ＣＦ２に対する非特異的な粘着性は認められなかった。図３５を参照されたい。ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のＯＤ値は、それらのそれぞれの濃度に依存する。予想と一致して、最大のシグナルは最高濃度で測定され、その後濃度が減少するにつれて徐々に減少した。αＧＩＴＲ  ＩｇＧのシグナル強度は、多くの濃度でＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１よりも優れていた。驚くべきことに、より高い濃度では、シグナル読み出しの飽和は観察されなかった。対照抗体（Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１）は最高濃度（５μｇ／ｍＬ）で試験され、以前に示すように（図２２及び２１）、いくらかの反応性を有した。
【０２１４】
実施例８：ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの機能的試験
機能的データを確立するための最初の試みにおいて、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂについて試験した。しかし、結果は決定的ではなかった。
【０２１５】
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２に対する、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの、ＡＤＣＣレポーターアッセイ
ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂは、ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞（標的細胞）及びＷＩＬ２−Ｓ（エフェクター細胞）を用いて（Ｅ／Ｔ＝５：１）、ＡＤＣＣ活性について試験された。ＡＤＣＣにおける抗体の生物活性は、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されるルシフェラーゼを通して定量化され、そしてエフェクター細胞におけるその活性は発光読み出しにより定量化された。ＡＤＣＣ解析において、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１は、驚くべき結果を示した（図３０）。陰性対照Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１は、標的細胞及びエフェクター細胞のみと比較してＡＤＣＣについて同様のシグナル強度を示し、様々な濃度に対して不偏である。一方、陽性対照αＧＩＴＲ  ＩｇＧは、予想通り、より高い濃度で増加する値を示した。驚くべきことに、αＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１及びＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１については、ＡＤＣＣシグナル強度はより高い濃度で減少し、２０μｇ／ｍＬのｔＢｓＡｂでの標的細胞及びエフェクター細胞のみのシグナルよりも実質的に低かった。
【０２１６】
ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１のＡＤＣＣ活性は、様々な濃度で測定された。全ての抗体を、２０ｍｇ／ｍＬの最高濃度から０．０２ｍｇ／ｍＬまで連続希釈し（１：２）、ウェルあたり２０，０００個のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対して試験した。エフェクター細胞（ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２）対標的細胞（Ｗｉｌｓ−２）の比は５：１であった。αＧＩＴＲ  ＩｇＧは陽性対照を表し、Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１は陰性対照である。縦軸は、発光読み出しにより定量したエフェクター細胞中のルシフェラーゼ活性の生の値を表す。各試料を各濃度において三つ組で試験し、平均標準偏差を括弧内に示す。ＲＰＭＩ培地中のＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞のバックグラウンドを、得られた値から引いた。
【０２１７】
ＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞に対する、ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂの、ＣＤＣ解析
ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１抗体は、ＧＩＴＲを発現するＣＦ２細胞に対する補体依存性細胞傷害について、構成ＤＮＡに結合した蛍光ＣｅｌｌＴｏｘ  Ｇｒｅｅｎの量を測定することによって試験された。溶解の割合は、試料から得られたシグナルの強度の、完全に溶解したＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞からのシグナルの強度に対する比として計算される（図３１）。
【０２１８】
陰性対照Ｆ１０−αＰＤ−Ｌ１  ＢｓＡｂは、陽性対照αＧＩＴＲ  ＩｇＧと同程度の細胞傷害性の割合を示した。ＣＨ２を有するαＧＩＴＲ１０−αＰＤ−Ｌ１は、６５％〜７０％の範囲の全濃度で同様の細胞傷害レベルを示し、濃度依存的ではないようであった。測定された抗体のいずれも、実質的に高い細胞傷害性の割合を有さなかった。これらの知見は予想される結果と大きく矛盾し、これらの不一致の考えられる理由は、使用されたＧＩＴＲ＋  ＣＦ２細胞のあり得る低い生存率である。
【０２１９】
他の実施形態
本発明は、それらの詳細な説明と共に記載されてきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図し、それを限定することを意図しない。他の態様、利点、及び改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2019533675.tif 000023
【図２】
2019533675.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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