(57)【要約】本発明は、単一の選択可能マーカを使用した複数の送達ベクターの逐次ローディングを可能にする部位特異的組換えを用いて核酸を自己複製核酸に標的化して組み込む新規方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の選択可能マーカを使用して複数の送達ベクターを細胞内の自己複製核酸に逐次ロードする方法であって、
第１の組換えシステムを用いてマーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と第１の目的核酸とを含む第１の送達ベクターを前記自己複製核酸に組み込むステップ；
第２の組換えシステムをシグナル部位αとともに用いて前記自己複製核酸から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第１の目的核酸は前記自己複製核酸上に残ったままであるステップ；
前記第１の組換えシステムを用いて前記マーカ遺伝子と前記薬物耐性遺伝子と第２の目的核酸とを含む第２の送達ベクターを前記自己複製核酸に組み込むステップ；及び
前記第２の組換えシステムをシグナル部位βとともに用いて前記自己複製核酸から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第２の目的核酸は前記自己複製核酸上に残ったままであるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の組換えシステムを用いて前記マーカ遺伝子と前記薬物耐性遺伝子と第３の目的核酸とを含む第３の送達ベクターを前記自己複製核酸に組み込むステップ；及び
前記第２の組換えシステムをシグナル部位γとともに用いて前記自己複製核酸から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第３の目的核酸は前記自己複製核酸上に残ったままであるステップ
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己複製核酸が内因性染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記自己複製核酸が合成染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記合成染色体が哺乳類合成染色体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記合成染色体がヒト合成染色体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の組換えシステムがλインテグラーゼシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の組換えシステムがＣｒｅ／ｌｏｘ組換えシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナル部位α及びシグナル部位βが、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ５１７１、ＬｏｘＭ２及びＬｏｘＰから選択され、但しシグナル部位αとシグナル部位βとは同じでない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカ遺伝子が蛍光タンパク質の遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
単一の選択可能マーカを使用して複数の送達ベクターを細胞内の自己複製合成染色体に逐次ロードする方法であって、
第１の組換えシステムを用いてマーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と第１の目的核酸とを含む第１の送達ベクターを前記自己複製合成染色体に組み込むステップ；
第２の組換えシステムをシグナル部位αとともに用いて前記自己複製合成染色体から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第１の目的核酸は前記自己複製合成染色体上に残ったままであるステップ；
前記第１の組換えシステムを用いて前記マーカ遺伝子と前記薬物耐性遺伝子と第２の目的核酸とを含む第２の送達ベクターを前記自己複製合成染色体に組み込むステップ；
前記第２の組換えシステムをシグナル部位βとともに用いて前記自己複製合成染色体から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第２の目的核酸は前記自己複製合成染色体上に残ったままであるステップ；
前記第１の組換えシステムを用いて前記マーカ遺伝子と前記薬物耐性遺伝子と第３の目的核酸とを含む第３の送達ベクターを前記自己複製合成染色体に組み込むステップ；及び
前記第２の組換えシステムをシグナル部位γとともに用いて前記自己複製合成染色体から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第３の目的核酸は前記自己複製合成染色体上に残ったままであるステップ
を含む方法。
【請求項１２】
前記合成染色体がヒト合成染色体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の組換えシステムがλインテグラーゼシステムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の組換えシステムがＣｒｅ／ｌｏｘ組換えシステムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル部位α、シグナル部位β、及びシグナル部位γが、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ５１７１、ＬｏｘＭ２及びＬｏｘＰから選択され、但しシグナル部位α、β、及びγのいずれも同じでない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法によって作られる、第１、第２及び第３の目的核酸を含む合成染色体。
【請求項１７】
前記切り出すステップが、第２のリコンビナーゼをコードする核酸ベクターを前記細胞に導入することによるか、前記第２のリコンビナーゼを前記細胞に導入することによるか、又は封入された第２のリコンビナーゼを前記細胞に送達することにより実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記切り出すステップが、前記第２のリコンビナーゼをコードする核酸ベクターを前記細胞に導入することにより実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子が前記自己複製合成染色体から切り出されたかどうかについて、切り出すステップが終わる毎に前記細胞をＦＡＣＳソーティングすることによって決定するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の組換えシステムを用いて前記マーカ遺伝子と前記薬物耐性遺伝子と第４の目的核酸とを含む第４の送達ベクターを前記自己複製合成染色体に組み込むステップ；及び
前記第２の組換えシステムをシグナル部位δとともに用いて前記自己複製合成染色体から前記マーカ遺伝子及び前記薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、前記第４の目的核酸は前記自己複製核酸上に残ったままであるステップ
を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１１の前記合成染色体を含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一の選択可能マーカを使用した複数の送達ベクターの逐次ローディングを可能にする部位特異的組換えを用いて自己複製核酸に送達された標的組込み体の薬物を使わない選択方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
以下の考察では、背景及び導入として特定の物及び方法が記載される。本明細書に含まれるいかなる事項も、先行技術の「承認」と解釈されてはならない。本出願人は、適宜、本明細書で参照されるそれらの物及び方法が適用法規条項に基づく先行技術をなすものではないことを立証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
完全に機能的な哺乳類合成染色体を作成可能であるということは、遺伝的障害を細胞ベースで修正し、トランスジェニック動物で組換えタンパク質を産生し、種々の細胞型並びにヒト疾患の動物モデルで大型ヒト遺伝子の調節及び発現を分析し、減数分裂及び染色体構造を研究し、細胞分化及び脱分化を誘導し、人工多能性幹細胞を形成し、新規オートクリン及びパラクリン細胞間情報伝達ネットワークを作り出し、複数のコードされる因子の化学量論的産生が可能な多重発現系を作り出し、生物学的回路を作製し、核構造を探索可能なＤＮＡエレメントを挿入し、その核構造における発見された相互作用を用いて下流用途でゲノム発現を調節し、及び限定はされないが合成染色体上での染色体腕の交換又は合成染色体への複数の大型ＤＮＡエレメントの取込みなど、大型ＤＮＡエレメントを操作する強力なシステムを意味する。
【０００４】
完全に機能的な哺乳類合成染色体は、ウイルスベースの送達システムと比べて、ペイロードサイズの増加、染色体外に維持されるため宿主細胞破壊の可能性が回避されること、導入された遺伝子の転写サイレンシング及び免疫学的合併症の可能性の回避を含め、幾つかの利点をもたらし、及び哺乳類合成染色体は、その合成染色体を挿入しようとする種から誘導し、それに合わせて作ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、哺乳類合成染色体の作製の成功が−複数の組込み部位を有する哺乳類合成染色体を含め−実証されているものの、現在、哺乳類合成染色体に複数の核酸をロードする方法は限られており、及び同じマーカ遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を何回でも無制限に再利用できる効率的な方法はない。送達ベクターが正しく組み込まれた細胞をフローサイトメトリーによって効率的に同定及び単離可能であれば、合成染色体のバイオエンジニアリングは著しく向上することになる。重要なことには、薬物選択を用いる必要がなくなると、発現した薬物マーカに対する宿主応答の可能性が軽減される。本発明は、これらの利点をもたらす方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本概要は、以下で詳細な説明に更に説明する概念のうちの選ばれた幾つかを簡潔な形で紹介するため提供される。本概要は、特許請求される主題の主要な又は必須の特徴を特定しようと意図するものではなく、また特許請求される主題の範囲を限定するために用いられることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に例示される、且つ添付の特許請求の範囲に定義される態様を含め、以下の記載の詳細な説明から明らかであろう。
【０００７】
本発明は、単一の選択可能マーカを使用した複数の送達ベクターの逐次ローディングを可能にする部位特異的組換えを用いて自己複製核酸に送達された標的組込み体の薬物を使わない選択方法を包含する。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、単一の選択可能マーカを使用して複数の送達ベクターを逐次ロードする方法を提供し、この方法は、第１の組換えシステムを用いてマーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と第１の目的核酸とを含む第１の送達ベクターを自己複製核酸に組み込むステップ；第２の組換えシステムをシグナル部位αとともに用いて自己複製核酸からマーカ遺伝子及び薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、第１の目的核酸は自己複製核酸上に残ったままであるステップ；第１の組換えシステムを用いてマーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と第２の目的核酸とを含む第２の送達ベクターを自己複製核酸に組み込むステップ；及び第２の組換えシステムをシグナル部位βとともに用いて自己複製核酸からマーカ遺伝子及び薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、第２の目的核酸は自己複製核酸（ｎｕｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）上に残ったままであるステップを含む。
【０００９】
更に他の実施形態において、本発明は、第１の組換えシステムを利用してマーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と第３の目的核酸とを含む第３の送達ベクターを自己複製核酸（ｎｕｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に組み込むステップ；及び第２の組換えシステムをシグナル部位γとともに利用してマーカ遺伝子及び薬物耐性遺伝子を切り出すステップであって、第３の目的核酸は自己複製核酸（ｎｕｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）上に残ったままであるステップを更に含む。好ましい実施形態において、本方法のステップは、自己複製核酸（ｎｕｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に所望の数の目的核酸がロードされるまで繰り返される。
【００１０】
これらの実施形態の一部の態様において、自己複製核酸は内因性染色体であり、及び他の態様において、自己複製核酸は合成染色体である。一部の態様において、合成染色体は哺乳類染色体であり、及び一部の態様において、合成染色体はヒト合成染色体である。
【００１１】
一部の態様において、第１の組換えシステムはλインテグラーゼシステムであり、及び一部の態様において、第２の組換えシステムはＣｒｅ／ｌｏｘ組換えシステムである。一部の態様において、シグナル部位α、β、及びγは、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ５１７１、ＬｏｘＭ２、及びＬｏｘＰから選択され、但しシグナル部位α、β、及びγは全て異なる。
【００１２】
一部の態様において、マーカ遺伝子は蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。
詳細な説明に本発明の上記及び他の態様及び使用を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る送達ベクターの簡略化した図。
【図２】単一の選択可能マーカを使用した複数の送達ベクターの逐次ローディングを可能にする部位特異的組換えを用いて核酸を自己複製核酸に標的化して組み込むための方法ステップの簡略化したフローチャート。
【図３】ｐＮＥＸＵＳ＿ＴＴＳローディングベクターのマップであり、プロモータレスＧＦＰ：：ＢＳＤ融合遺伝子がｌｏｘ部位に隣接している図。
【図４】ＢＬｏＶｅＬ＿ＴＴＳローディングベクターのマップであり、プロモータレスｅＧＦＰ：：ＢＳＲ融合遺伝子がｌｏｘ部位に隣接している図。
【図５】ｐＦＵＳＬｏｘローディングベクターのマップ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に記載される方法は、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び細胞工学技術の従来技術及び記載を用いることもあり、それらは全て当業者の技能の範囲内にある。かかる従来技術には、オリゴヌクレオチド合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーション、細胞の形質転換及び形質導入、組換えシステムの操作、トランスジェニック動物及び植物の作出、及びヒト遺伝子療法が含まれる。好適な技法の具体的な例示については、本明細書の例を参照することができる。しかしながら、当然ながら、等価な従来手順を用いることもできる。かかる従来技術及び記載は、「ゲノム解析：実験マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）」、第Ｉ〜ＩＶ巻、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編、１９９９年；「遺伝的変異：実験マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら編、２００７年；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング：実験マニュアルからの要約プロトコル（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、２００６年；及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、２００２年（全てコールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）発行）；「タンパク質方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ボラグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９６年；「遺伝子療法用の非ウイルスベクター（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９９年；「ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」、カプリフト（Ｋａｐｌｉｆｔ）及びローウィ（Ｌｏｅｗｙ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年；「免疫学方法マニュアル（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ）」、レフコビッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年；「遺伝子療法テクニック、研究室から臨床への応用及び規制（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）」、ミーガ（Ｍｅａｇｅｒ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９９年；Ｍ・ジャッカ（Ｍ．Ｇｉａｃｃａ）著、「遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２０１０年；「遺伝子療法プロトコル（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、レドゥー（ＬｅＤｏｕｘ）編、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２００８年；「細胞及び組織培養：バイオテクノロジーにおける実験室手順（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）及びグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９８年；「哺乳類染色体エンジニアリング−方法及びプロトコル（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｇ・ハドラツキー（Ｇ．Ｈａｄｌａｃｚｋｙ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年；「基本的幹細胞方法（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びクリマンスカヤ（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年；「幹細胞療法：臨床供与のクオリティ及び安全性の確保に向けた好機：合同ワークショップ要旨（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｆｆｅｒｉｎｇｓ：Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ａ  Ｊｏｉｎｔ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）」、ヘルスサイエンス政策委員会（Ｂｏａｒｄ  ｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｏｌｉｃｙ）、ナショナル・アカデミー・プレス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１４年；「幹細胞生物学の基礎（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びアタラ（Ａｔａｌａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１３年；及び「幹細胞ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」、アタラ（Ａｔａｌａ）及びランツァ（Ｌａｎｚａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１２年（これらは全て、本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される）などの標準的な実験マニュアルに見出すことができる。本組成物、研究ツール及び方法を説明する前に、本発明は記載される特定の方法、組成物、標的及び使用に限定されず、従って当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するために過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。従って、例えば「組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」と言うとき、それは１つの組成物又は組成物の混合物を指し、及び「アッセイ（ａｎ  ａｓｓａｙ）」と言うとき、それは当業者に公知の均等なステップ及び方法への言及を含むなどである。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及される全ての刊行物は、その刊行物中で説明されている、且つ本明細書に記載する発明との関連で使用し得る装置、配合及び方法論を説明及び開示する目的で参照により本明細書に援用される。
【００１７】
値の範囲が提供される場合、当該の範囲の上限と下限との間にある各中間値及び当該の明記される範囲にある任意の他の明記される値又は中間値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、明記される範囲における任意の具体的に除外される限界値を条件として、独立にそのより小さい範囲に含まれ得る。明記される範囲が限界値の両方を含む場合、それらの含まれる限界値のうち一方のみを除く範囲もまた本発明に含まれる。
【００１８】
以下の説明においては、本発明のより完全な理解を提供するため多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、当業者には、本明細書を読めば、それらの具体的な詳細の１つ以上がなくても本発明を実施し得ることは明らかであろう。他の場合には、本発明が曖昧になることがないよう、当業者に周知された周知の特徴及び手順は説明していない。
【００１９】
定義
明示的に定めない限り、本明細書で使用される用語は、当業者が理解するとおりの平易な且つ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は読者が本発明を理解する助けとなることを意図するものであり、具体的に指示されない限り、かかる用語の意味を変更したり、又は他の形で限定したりする意図はない。
【００２０】
「自己複製核酸」は、合成染色体及び内因性染色体を含め、細胞内で自律的に複製する任意の核酸を含む。
「結合している」は、本明細書で使用されるとき（例えば、ポリペプチドの核酸結合ドメインに関連して）、ポリペプチドと核酸との間の非共有結合性相互作用を指す。非共有結合性相互作用と言うとき、ポリペプチド及び核酸は「会合している」、「相互作用している」、又は「結合している」と言われる。結合相互作用は概して１０−６Ｍ未満〜１０−１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は結合の強度を指し、高い結合親和性ほど、より低いＫｄと関連付けられる。
【００２１】
「結合ドメイン」とは、非共有結合的に別の分子に結合可能なポリペプチド又はタンパク質ドメインが意味される。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。
【００２２】
「セントロメア」は、染色体が細胞分裂を通じて娘細胞に分離する能力を付与する任意の核酸配列である。セントロメアは、セントロメアを含有する合成染色体を含め、核酸配列の有糸分裂及び減数分裂を通じた安定な分離をもたらし得る。セントロメアは、必ずしもそれが導入される細胞と同じ種に由来する必要はないが、好ましくはセントロメアは、当該の種の細胞におけるＤＮＡ分離を促進する能力を有する。「二動原体」染色体は、２つのセントロメアを含む染色体である。「以前二動原体であった染色体（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｄｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」は、二動原体染色体が断片化すると生じる染色体である。「染色体」は、細胞の分裂時に細胞内で複製及び分離する能力を有する核酸分子−及び関連するタンパク質−である。典型的には、染色体は、セントロメア領域、複製起点、テロメア領域、及びセントロメア領域とテロメア領域との間にある核酸領域を含む。「アクロセントリック染色体」は、腕の長さが不均等な染色体を指す。
【００２３】
「コード配列」又はペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下に置かれたとき生体内で転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）されてポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、典型的には５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンとによって決まる。
【００２４】
用語ＤＮＡ「制御配列」は、まとめて、プロモータ配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列（ＴＴＳ）、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位、エンハンサーなどを指し、これらはまとめて受容細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写及び翻訳されることが可能である限り、この種の制御配列が全て存在する必要はない。
【００２５】
「内因性染色体」は、合成染色体の作成又は導入前に細胞に見られる染色体を指す。
本明細書で使用されるとき、「ユークロマチン」は、散在性に染色される、典型的には遺伝子を含有するクロマチンを指し、「ヘテロクロマチン」は、通常凝縮したままで、転写的に不活性と考えられるクロマチンを指す。セントロメアを取り囲むヘテロクロマチンの領域には、通常、高度に反復性のＤＮＡ配列（サテライトＤＮＡ）が位置する。
【００２６】
用語「異種ＤＮＡ」又は「外来ＤＮＡ」（又は「異種ＲＮＡ」又は「外来ＲＮＡ」）は同義的に使用され、天然ではその所在であるゲノムの一部として存在しない、或いはゲノム又は細胞において、それが天然に存在する場合と異なる１つ又は複数の位置に及び／又は量で見られるＤＮＡ又はＲＮＡを指す。異種ＤＮＡの例としては、限定はされないが、１つ又は複数の目的の遺伝子産物をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡの他の例としては、限定はされないが、追跡可能なマーカタンパク質をコードするＤＮＡ並びに調節ＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２７】
「作動可能に連結された」は、そのように記載される構成要素がその通常の機能を果たすように構成されるエレメントの配置を指す。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、そのコード配列の発現を生じさせる能力を有する。制御配列は、それがコード配列の発現を導く働きをする限り、コード配列に連続している必要はない。従って、例えば、プロモータ配列とコード配列との間に、翻訳はされないが転写はされる介在配列が存在してもよく、それでもなお、そのプロモータ配列はコード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。事実、かかる配列は同じ連続するＤＮＡ分子（即ち染色体）上にある必要はなく、それでもなお、調節の変化をもたらす相互作用を有し得る。
【００２８】
「プロモータ」又は「プロモータ配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核小体ＲＮＡの核内低分子又は任意のクラスの任意のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩによって転写される任意の種類のＲＮＡなど、ポリヌクレオチド又はポリペプチドコード配列の転写を開始させる能力を有するＤＮＡ調節領域である。本発明において使用されるプロモータは構成的であっても、又は誘導性であってもよい。
【００２９】
「認識配列」は、タンパク質、ＤＮＡ、又はＲＮＡ分子、又はこれらの組み合わせ（限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ又はリコンビナーゼなど）が認識して結合する特定のヌクレオチド配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）とそれに隣接する８塩基対のコアを含む、ｌｏｘＰと称される３４塩基対配列である（例えば、サウアー（Ｓａｕｅｒ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第５巻、ｐ．５２１〜５２７、１９９４年を参照のこと）。認識配列の他の例としては、限定はされないが、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ、ａｔｔＲ及びａｔｔＬ並びにその他の、リコンビナーゼ酵素バクテリオファージλインテグラーゼによって認識されるものが挙げられる。ａｔｔＢと称される組換え部位は、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位及び７塩基対のオーバラップ領域を含む約３３塩基対配列である；ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位及びアーム型Ｉｎｔ結合部位並びに補助タンパク質ＩＨＦ、ＦＩＳ、及びＸｉｓに対する部位を含む約２４０塩基対配列である（例えば、ランディ（Ｌａｎｄｙ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、ｐ．６９９〜７０７１、１９９３年を参照のこと）。
【００３０】
「リコンビナーゼ」は、特定の組換え部位におけるＤＮＡセグメントの交換を触媒する酵素である。インテグラーゼとは、通常はウイルス又はトランスポゾン、並びに恐らくは古代ウイルスにも由来するリコンビナーゼを指す。「組換えタンパク質」には、１つ以上の組換え部位を用いた組換え反応に関与する切出しタンパク質、組込みタンパク質、酵素、補因子及び関連タンパク質が含まれる（ランディ（Ｌａｎｄｙ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、ｐ．６９９〜７０７、１９９３年を参照のこと）。本明細書の方法において使用される組換えタンパク質は、プラスミドなど、適切なベクター上の発現カセットを介して細胞に送達することができる。他の実施形態において、組換えタンパク質は、所望の１つ又は複数の核酸の送達に用いられる同じ反応混合物中においてタンパク質の形態で細胞に送達することができる。更に他の実施形態において、リコンビナーゼはまた、細胞にコードし、厳密に制御された誘導性プロモータを用いて必要に応じて発現させてもよい。
【００３１】
「リボソームＲＮＡ」（ｒＲＮＡ）は、リボソームの構造の一部を形成してタンパク質合成に関与する特殊なＲＮＡである。リボソームＲＮＡは、真核細胞では複数のコピーで存在する遺伝子の転写によって産生される。ヒト細胞では、一倍体ゲノム当たり約２５０コピーのｒＲＮＡ遺伝子（即ち、ｒＲＮＡをコードする遺伝子）が少なくとも５つの異なる染色体（１３番、１４番、１５番、２１番及び２２番染色体）上にクラスターを成して分散している。ヒト細胞では、高度に保存されたｒＲＮＡ遺伝子の複数のコピーが、一連のタンデムに並んだｒＤＮＡ単位に位置し、ｒＤＮＡ単位は概して約４０〜４５ｋｂ長であり、転写領域と、長さ及び配列が様々であり得るスペーサ（即ち遺伝子間スペーサ）ＤＮＡとして知られる非転写領域とを含む。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「選択可能マーカ」は、細胞、特に本発明の文脈では培養下の細胞に導入される、人為淘汰に好適な形質を付与する遺伝子を指す。一般的用途の選択可能マーカは当業者に周知である。好ましい実施形態において、ヒト合成染色体システムに用いられる選択可能マーカはヒトにおいて非免疫原性でなければならず、限定はされないが、ヒト神経成長因子受容体（米国特許第６，３６５，３７３号明細書に記載されるように、ＭＡｂで検出される）；トランケート型ヒト成長因子受容体（ＭＡｂで検出される）；突然変異型ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ；蛍光ＭＴＸ基質利用可能）；分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ；蛍光基質利用可能）；ヒトチミジル酸シンターゼ（ＴＳ；抗癌剤フルオロデオキシウリジン耐性を付与する）；ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼα（ＧＳＴＡ１；グルタチオンを幹細胞選択的アルキル化薬ブスルファンにコンジュゲートする；ＣＤ３４＋細胞における化学保護的選択可能マーカ）；造血幹細胞におけるＣＤ２４細胞表面抗原；Ｎ−ホスホノアセチル（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ）−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）に対する耐性を付与するヒトＣＡＤ遺伝子；ヒト多剤耐性１（ＭＤＲ−１；薬剤耐性の増加によって選択可能な、又はＦＡＣＳによってエンリッチされるＰ糖タンパク質表面タンパク質）；ヒトＣＤ２５（ＩＬ−２α；Ｍａｂ−ＦＩＴＣによって検出可能）；メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ；カルムスチンによって選択可能）；及びシチジンデアミナーゼ（ＣＤ；Ａｒａ−Ｃによって選択可能）が挙げられる。ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、テトラサイクリンなど、薬物選択可能な（薬物耐性をもつ、又は薬剤耐性の）マーカもまた利用し得る。加えて、ＦＡＣｓソーティングを用いて任意の蛍光マーカ遺伝子をポジティブ選択に使用してもよく、化学発光マーカ（例えばＨａｌｏｔａｇ）なども同様に使用し得る。
【００３３】
「部位特異的組換え」は、単一の核酸分子上の２つの特定の部位間又は２つの異なる分子間で生じる、インテグラーゼ又はリコンビナーゼなどの外因性タンパク質の存在が必要な部位特異的組換えを指す。ある種の部位特異的組換えシステムを用いてＤＮＡを特異的に欠失させ、逆位させ、又は挿入することができ、正確なイベントはそれらの特定の部位の向き、具体的なシステム及びアクセサリータンパク質又は因子の存在によって制御される。加えて、染色体間でＤＮＡのセグメントを交換することができる（染色体腕の交換）。
【００３４】
「合成染色体」（「人工染色体」とも称される）は、細胞において内因性染色体と共に安定に複製及び分離する核酸分子、典型的にはＤＮＡであり、異種遺伝子を受け入れてそれを発現させる能力を有する。「哺乳類合成染色体」は、１つ又は複数の活性な哺乳類セントロメアを有する染色体を指す。「ヒト合成染色体」は、ヒト細胞で機能し、且つ好ましくはヒト細胞で産生されるセントロメアを含む染色体を指す。例示的な人工染色体については、例えば、米国特許第８，３８９，８０２号明細書；同第７，５２１，２４０号明細書；同第６，０２５，１５５号明細書；同第６，０７７，６９７号明細書；同第５，８９１，６９１号明細書；同第５，８６９，２９４号明細書；同第５，７２１，１１８号明細書；同第５，７１２，１３４号明細書；同第５，６９５，９６７号明細書；及び同第５，２８８，６２５号明細書及び国際公開第９７／４０１８３号及び同第９８／０８９６４号を参照のこと。
【００３５】
用語「対象」、「個体」又は「患者」は本明細書では同義的に使用されてもよく、哺乳類、及び一部の実施形態ではヒトを指し得る。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルスコンストラクト、コスミド、細菌人工染色体、Ｐ−１由来人工染色体又は酵母人工染色体（ｙｅａｔ  ｓａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）など、別のＤＮＡセグメントを付加し得るレプリコンである。一部の例では、ベクターは、組換え部位を含むように操作された１つの内因性染色体から合成染色体に腕を交換する場合のような染色体であってもよい。ベクターは、細胞におけるＤＮＡセグメントの形質導入及び発現に使用される。
【００３６】
発明
本発明は、単一の選択可能マーカを利用した複数の送達ベクターの逐次ローディングを可能にする部位特異的組換えを用いて自己複製核酸に送達された標的組込み体の薬物を使わない選択方法を提供する。
【００３７】
本発明は、所望の標的部位を含む合成染色体など、自己複製核酸への核酸送達ベクターの部位特異的挿入に関して選択する新規方法を提供する。例として、蛍光タンパク質遺伝子及び薬物耐性遺伝子の両方が機能的蛍光及び薬剤耐性の両方を備えた一つのタンパク質を形成するように、薬物耐性遺伝子（ブラストサイジン耐性）とインフレームで蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質）の上流に連結されるバクテリオファージλ標的部位ａｔｔＢを含有する送達ベクターが提供される。蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子配列には、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えシステムからのｌｏｘ部位など、第２の組換えシステムからの一組の部位特異的組換え配列が両側に隣接する。更に、この送達ベクターは、ａｔｔＢ配列上流の強力な転写終止点、及び自己複製核酸に標的化されるべき目的の核酸を含む（図１を参照；ＴＴＳ）。ａｔｔＢ組換え部位の上流にＴＴＳを取り込むことにより、上流の送達ベクター配列からでたらめに転写されること（即ち偽陽性組込み体）が防止され、それにより合成プラットフォーム染色体上に正しく組み込まれた送達ベクターの効率的な同定が可能となる。この例では、標的核酸は１つ以上のａｔｔＰバクテリオファージλＤＮＡ配列エレメントを含有する。標的核酸は、内因性染色体、合成染色体又は細胞内に収容された任意の自己複製核酸であってよい。
【００３８】
図２は、単一の選択可能マーカを使用した複数の送達ベクターの逐次ローディングを可能にする部位特異的組換えを用いて核酸を自己複製核酸に標的化して組み込むための方法ステップの簡略化したフローチャートである。図２のステップ１で、第１の組換えシステムによってマーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と第１の目的核酸とを含む第１の送達ベクターが自己複製核酸に組み込まれる。ステップ２で、第２の組換えシステムをシグナル部位αとともに用いてマーカ遺伝子及び薬物耐性遺伝子が自己複製核酸から切り出され、ここで第１の目的核酸は自己複製核酸上に残ったままである。ステップ３で、第１の組換えシステムを利用して同じマーカ遺伝子と同じ薬物耐性遺伝子と第２の目的核酸とを含む第２の送達ベクターが自己複製核酸に組み込まれ、及びステップ４で、第２の組換えシステムをシグナル部位βとともに利用してマーカ遺伝子及び薬物耐性遺伝子が再び切り出され、ここで第２の目的核酸は自己複製核酸上に残ったままである。これらのステップは、自己複製核酸に全ての目的核酸がロードされるまで繰り返すことができる。
【００３９】
標準的な核酸送達方法を用いるか、又は必要な場合には、標的核酸（例えばａｔｔＰ）を担持する目的の細胞型に特殊化した核酸送達方法を用いて、上記に記載した、且つ図１に例示されるような送達ベクターが目的の細胞に送達される。送達ベクターと同時に、又は連続して、リコンビナーゼもまた目的の細胞に送達される。リコンビナーゼは、１）リコンビナーゼをコードするベクター、２）精製リコンビナーゼタンパク質、又は３）封入リコンビナーゼタンパク質の形態であってもよい。送達ベクター及びリコンビナーゼの送達後、細胞は約３日間培養され、次に標準的な蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）方法によって回収される。一例では、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞が、その細胞型（即ち、自己複製核酸を含む選択の細胞クローン）に適切な細胞培養培地が入った９６ウェル細胞培養プレートの個々のウェルにシングルセルソーティングされる。ソーティングされた細胞は、１〜３週間培養下に維持することにより個々のクローンが増殖され、適切な細胞数になったところで回収されて低温貯蔵及び分子解析に供され、一方で目的核酸の発現又は機能の評価のため培養は継続される。分析には、限定はされないが、１）送達ベクターが標的部位に正しく組み込まれたかどうかを評価するために用いられる適切なプライマーセットによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析；２）限定はされないが、代謝試験；転写物レベルの測定、表現型アッセイ、又は目的遺伝子のタンパク質産物に特異的な抗体を用いたタンパク質産物の検出を含めた、目的核酸の活性の評価；及び／又は３）組み込まれた送達ベクターのＤＮＡシーケンシングが含まれる。
【００４０】
自己複製核酸への複数の送達ベクターの逐次ローディングは、蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の取出し及び再使用によって達成される。これらのＤＮＡ配列の取出しは第２の組換えシステム（例えば、この例ではＣｒｅ／ｌｏｘ）によって実施される。蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を取り出すため、第１の目的核酸配列を担持する細胞株がＣｒｅリコンビナーゼに曝露され、それが蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の両側に隣接する直列反復のｌｏｘ配列の組換え及び切出し（又はｌｏｘ配列が蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の両側に隣接する逆方向反復として位置している場合には、プロモータを伴わずにそれらを残すその逆位）を主導する。第２のリコンビナーゼへの曝露は、第２のリコンビナーゼをコードする核酸ベクター、精製リコンビナーゼタンパク質又は封入リコンビナーゼを標準方法を用いて導入することにより達成されてもよい。リコンビナーゼの導入後、細胞が約３日間培養され、次に回収してＦＡＣｓソーティングにかけられ、それにより蛍光タンパク質をもはや発現しない細胞が、その細胞型（即ち、自己複製核酸を含む選択の細胞）に適切な細胞培養培地が入った９６ウェル細胞培養プレートの個々のウェルにシングルセルソーティングされる。ソーティングされた細胞は、１〜３週間培養下に維持することにより個々のクローンが増殖され、適切な細胞数になったところで回収されて低温貯蔵及び分子解析に供され、一方で第１の目的核酸の発現又は機能の再評価のため培養は継続される。
【００４１】
蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の正しい切出しが確認された後、第１の目的遺伝子に用いられた方法と同じように第２の目的遺伝子の導入が達成されてもよい。このプロセスでは、第２の目的核酸配列を担持する第２の送達ベクターは、別のｌｏｘ配列（例えば、ｌｏｘＰ  ５１１）が隣接する同じ蛍光タンパク質遺伝子及び同じ薬剤耐性遺伝子を有し、自己複製核酸を含む細胞に導入される。後続の送達ベクターにおいて例えばｌｏｘ配列を変えることは、蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の切出し後に自己複製核酸上にある残留ｌｏｘ部位と新たに組み込まれた送達ベクター上のｌｏｘ部位との間でＣｒｅ／ｌｏｘ組換えが起こる可能性を排除するのに決定的に重要である。例えば、例示的ｌｏｘ変異配列を表１に示す：
【００４２】
【表１】
2019513397.tif 000002
【００４３】
正しい切出しの分析には、限定はされないが、１）送達ベクターが標的部位に正しく組み込まれたかどうかを評価するために用いられる適切なプライマーセットによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析；２）限定はされないが、代謝試験；転写物レベルの測定、表現型アッセイ、又は目的遺伝子のタンパク質産物に特異的な抗体を用いたタンパク質産物の検出を含めた、目的核酸の活性の評価；及び／又は３）組み込まれた送達ベクターのＤＮＡシーケンシングが含まれる。前出のとおり、第２の組換えシステムによって蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の取出しが行われる。
【００４４】
本発明の方法は、蛍光タンパク質遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を何回でも無制限に再利用することが可能である。また本方法を用いると、単一の組換えシステムの複数の組換え部位に加え、複数の組換えシステムを取り込むこともできる。
【００４５】
特に、本発明の方法により、自己複製核酸への核酸の送達時における薬物選択の必要性が軽減される。ひいては薬物選択の必要がなくなり、発現した薬物マーカに対する宿主免疫応答が潜在的に軽減される。更に、複数の蛍光マーカ（異なる蛍光波長のマーカ）を使用するため、自己複製ＤＮＡ片に複数の核酸を共送達することができる。
【００４６】
送達ベクター
マーカ遺伝子、薬物耐性遺伝子及び目的核酸を自己複製核酸に送達するのに使用する送達ベクターの選択は、そこでの増殖が所望される細胞のタイプなど、種々の要因に依存する。適切なベクターの選択は十分に当業者の技能の範囲内にあり、多くのベクターが市販されている。コンストラクトの調製には、マーカ遺伝子と薬物耐性遺伝子と目的核酸とを含むポリヌクレオチド（図１を参照のこと）が、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位への配列のライゲーションを用いてベクターに挿入される。或いは、所望のヌクレオチド配列が相同組換え又は部位特異的組換えによって挿入されてもよい。かかる配列を含む核酸は、例えばオリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、又は相同性領域及び所望のヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加することができる。使用し得る例示的ベクターとしては、限定はされないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡに由来するものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９などのプラスミドベクター及びＭ１３  ｍｐ系ベクターを使用してもよい。バクテリオファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８〜２３、λＺＡＰ／Ｒ及びＥＭＢＬ系バクテリオファージベクターを挙げることができる。利用し得るコスミドベクターとしては、限定はされないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６及びシャロミド９系ベクターが挙げられる。更なるベクターとしては、バクテリア人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＢＡＣ）、機能性稔性プラスミドベースのもの（Ｆプラスミド）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びＰ１バクテリオファージのＤＮＡに由来するＤＮＡコンストラクトであるＰ１由来人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＰＡＣ）が挙げられる。或いは、及び好ましくは、組換えウイルスベクターは、限定はされないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来するものを含め、操作されてもよい。
【００４７】
細胞への送達ベクターの送達
自己複製核酸へのマーカ遺伝子、薬物耐性遺伝子及び目的核酸の送達用に選択されたベクターは、自己複製核酸を含む細胞へと当該技術分野において公知の任意の方法により送達することができる。用語のトランスフェクション及び形質転換は、任意のコード配列が実際に発現するか否かに関わらず、外因性核酸、例えば発現ベクターが宿主細胞によって取り込まれることを指す。例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性形質転換、プロトプラスト形質転換（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性形質転換、電気穿孔、プロトプラスト融合、及びマイクロセル融合を含む）、脂質介在性送達、リポソーム、電気穿孔、ソノポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント及び炭化ケイ素ウイスカ介在性形質転換及びこれらの組み合わせ（例えば、パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第３巻、ｐ．２７１７〜２７２２、１９８４年；ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１９９巻、ｐ．１６９〜１７７、１９８５年；ライヒ（Ｒｅｉｃｈ）ら著、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、ｐ．１００１〜１００４、１９８６年；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、ｐ．７０〜７３、１９８７年；米国特許第６，１４３，９４９号明細書；パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、「植物の細胞培養及び体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」、第６巻、「植物核遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ）」、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）及びバシル（Ｖａｓｉｌ）編、アカデミック・パブリッシャーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８９年；及びフレーム（Ｆｒａｍｅ）ら著、プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．）、第６巻、ｐ．９４１〜９４８、１９９４年を参照のこと）；リン酸カルシウムを使用した直接取込み（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７６巻、ｐ．１３７３〜１３７６、１９７９年）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性ＤＮＡ取込み；リポフェクション（例えば、シュトラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）著、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第５４巻、ｐ．３０７〜３２７、１９９６年を参照のこと）；マイクロセル融合（ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８８巻、ｐ．５９０７〜５９１１、１９９１年；米国特許第５，３９６，７６７号明細書；ソーフォード（Ｓａｗｆｏｒｄ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１３巻、ｐ．２７９〜２８４、１９８７年；ダール（Ｄｈａｒ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー��ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１０巻、ｐ．５４７〜５５９、１９８４年；及びマクニール＝キラリー（ＭｃＮｅｉｌｌ−Ｋｉｌｌａｒｙ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第２５４巻、ｐ．１３３〜１５２、１９９５年）；脂質介在性担体システム（例えば、テイフェル（Ｔｅｉｆｅｌ）ら著、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１９巻、ｐ．７９〜８０、１９９５年；アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら著、アニュアルズ・オブ・ヘマトロジー（Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第７２巻、ｐ．７３〜７９、１９９６年；ホルメン（Ｈｏｌｍｅｎ）ら著、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．）、第３１巻、ｐ．３４７〜３５１、１９９５年；レミー（Ｒｅｍｙ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５巻、ｐ．６４７〜６５４、１９９４年；ル・ボルシュ（Ｌｅ  Ｂｏｌｃｈ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、第３６巻、ｐ．６６８１〜６６８４、１９９５年；及びレフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第２１７巻、ｐ．５９９〜６１８、１９９３年を参照のこと）；又は他の好適な方法による数多くのトランスフェクション方法が当業者に公知である。合成染色体の送達方法はまた、米国特許出願第０９／８１５，９７９号明細書にも記載されている。トランスフェクションの成功は、概して、トランスフェクト細胞内における異種核酸の存在の検出、例えば、異種核酸の何らかの視覚化、選択可能マーカの発現又は宿主細胞内でのベクターの作動の何らかの指標などによって認識される。本発明の実施において有用な送達方法の説明については、米国特許第５，０１１，７７６号明細書；米国特許第５，７４７，３０８号明細書；米国特許第４，９６６，８４３号明細書；米国特許第５，６２７，０５９号明細書；米国特許第５，６８１，７１３号明細書；キム（Ｋｉｍ）及びエーベルワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）著、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第３９７巻、第８号、ｐ．３１７３〜３１７８、２０１０年を参照のこと。
【００４８】
マーカ遺伝子
上記に考察されるとおり、本発明は、自己複製核酸への目的核酸の送達をモニタすることを可能にするマーカ遺伝子を利用する。マーカ遺伝子は、好ましい実施形態では、蛍光、リン光又は化学発光タンパク質などのタンパク質である。好ましい実施形態において、標識は、自己複製核酸を含む標的細胞によってタンパク質に転写及び翻訳される蛍光標識である。本発明に特に用いられる蛍光タンパク質としては、限定はされないが、タグＢＦＰ（ＴａｇＢＦＰ）、タグＣＦＰ（ＴａｇＣＦＰ）、タグＧＦＰ２（ＴａｇＧＦＰ２）、タグＹＦＰ（ＴａｇＹＦＰ）、タグＲＦＰ（ＴａｇＲＦＰ）、フュージョンレッド（ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ）、ｍケイト２（ｍＫａｔｅ２）、ターボＧＦＰ（ＴｕｒｂｏＧＦＰ）、ターボＹＦＰ（ＴｕｒｂｏＹＦＰ）、ターボＲＦＰ（ＴｕｒｂｏＲＦＰ）、ターボＦＰ６０２（ＴｕｒｂｏＦＰ６０２）、ターボＦＰ６３５（ＴｕｒｂｏＦＰ６３５）、又はターボＦＰ６５０（ＴｕｒｂｏＦＰ６５０）（全てエブロジェン（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、モスクワから入手可能）；Ａｍシアン１（ＡｍＣｙａｎ１）、ＡｃｖＧＦＰ１、Ｚｓグリーン１（ＺｓＧｒｅｅｎ１）、Ｚｓイエロー１（ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、ｍバナナ（ｍＢａｎａｎａ）、ｍオレンジ（ｍＯｒａｎｇｅ）、ｍオレンジ２（ｍＯｒａｎｇｅ２）、Ｄｓレッド−エクスプレス２（ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２）、Ｅｓレッド−エクスプレス（ＥｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ）、ｔｄトマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）、Ｄｓレッド−モノマー（ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｄｓレッド２（ＤｓＲｅｄ２）、Ａｓレッド２（ＡｓＲｅｄ２）、ｍストロベリー（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ）、ｍチェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）、Ｈｃレッド１（ＨｃＲｅｄ１）、ｍラズベリー（ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ）、Ｅ２クリムゾン（Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ）、ｍプラム（ｍＰｌｕｍ）、デンドラ２（Ｄｅｎｄｒａ  ２）、タイマー（Ｔｉｍｅｒ）、及びＰＡｍチェリー（ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ）（全てクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルトから入手可能）；ＨＡＬＯタグ；赤外タグ（近赤外シフト）タグ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソンから入手可能）；及び当該技術分野において公知の他の蛍光タグ、並びに今後発見される蛍光タグが挙げられる。
【００４９】
視覚化及びモニタリング
自己複製核酸に組み込まれたベクターから翻訳された蛍光、リン光又は化学発光タンパク質の位置決定は、蛍光顕微鏡法で達成し得る。概して、細胞が特定の使用蛍光標識の励起波長の光源で励起され、得られた蛍光が発光波長で検出される。好ましい実施形態において、励起光源は蛍光標識の励起に適切なレーザである。標識の検出に使用される共焦点顕微鏡は、細胞培養ディッシュ全体を自動で走査するようにコンピュータ制御のステージを備えた自動化されたものであってもよい。同様に、顕微鏡は、培養下の各細胞又は細胞コロニーによって産生される蛍光シグナルを自動で記録するように、自動データ収集システムに取り付けられた光トランスデューサ（例えば、光電子増倍管、固体アレイ、ＣＣＤカメラ等）を装備したものであってもよい。或いはまた、各「細胞」がレーザを通り過ぎるときの写真を速写する（例えばフローサイト（Ｆｌｏｗｓｉｇｈｔ）（アムニス（Ａｍｎｉｓ）；ワシントン州シアトル）；従って合成染色体の産生に関する各細胞コロニーの評価を自動化するフローサイトメータを利用してもよい。
【００５０】
（実施例）
実施例１：サテライトＤＮＡベースの人工染色体のデノボ作成
合成染色体（ｃｈｒｏｍｏｍｓｏｍｅ）のデノボ作製のため、外因性ＤＮＡ配列をＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株に導入し、それがアクロセントリック染色体のセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に組み込まれると、アクロセントリック染色体の短腕（ｒＤＮＡ／セントロメア領域）の大規模増幅が惹起された。増幅イベントの間にセントロメアが複製されて２つの活性セントロメアを有する二動原体染色体になった。続く有糸分裂イベントによって二動原体染色体の切断及び分離が起こり、主にサテライト反復配列を含む約２０〜１２０Ｍｂサイズの離脱につながり、そこには増幅されたｒＤＮＡコピーも含み得る共増幅されたトランスフェクト導入遺伝子のサブドメインが含まれた。新規に作成された合成染色体は、内因性染色体タグ及びＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株内に操作された合成染色体タグを用いた蛍光染色体ペイント又はＦＩＳＨの観察によってバリデートされる。
【００５１】
トランスフェクションの前日、ＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株の細胞を約２．０〜８．０×１０４接着細胞密度となるように２４ウェル組織培養ディッシュに分け、外来ＤＮＡを含むベクターを精製し（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）エンドフリー・プラスミド・マキシキット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ）を使用）、線状化し、及びトランスフェクション用にベクターの濃度を決定した。培養ＨＴ１０８０細胞は、トランスフェクション前に３〜５時間フィードした。標準的なトランスフェクション試薬、例えば、サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のビアフェクト（Ｖｉａｆｅｃｔ）、又はインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のリン酸カルシウムトランスフェクションキットを使用したＨＴ１０８０細胞のトランスフェクションには、２４ウェルセミコンフルエント組織培養ディッシュ当たり２２５ｎｇのｐＳＴＶ２８ＨｕｒＤＮＡベクター及び１２．５ｎｇ  ｐ１５Ａ７２４８ｌａｃＥＦ１ａｔｔＰＰｕｒｏベクターを使用した。ｐＳＴＶ２８ＨｕｒＤＮＡベクターはリボソームＤＮＡ配列を含む。ｐ１５Ａ７２４８ｌａｃＥＦ１ａｔｔＰＰｕｒｏベクターは、部位特異的組換えシステムの構成要素、ＬａｃＯリピート並びにアンピシリン及びピューロマイシン耐性遺伝子を含む。細胞をトランスフェクション後１〜３日間維持した時点でそれらをトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュにリプレーティングした。プレーティング時又はプレーティングの１〜３日後に１０ｃｍディッシュに選択培地を加えた。２〜３日おきに培地を交換しながら選択的条件を１０〜２１日間維持した。コロニーが直径２〜３ｍｍに達したところで抗生物質耐性クローンをピックした。十分に離れているコロニーが好ましかった。クローニングシリンダ及びトリプシンを使用して細胞を剥がし取り、２４ウェルプレートに移して増殖させた。
【００５２】
実施例２：合成染色体への目的核酸の逐次ローディング
Ｎｅｘｕｓ−ＴＳＳ（図３）（ｐＮＥＸｕｓ＿ＴＴＸには、以下のエレメントが存在する：ＴＴＳ＝転写終結シグナル；ａｔｔＢ＝部位特異的組換え部位；ｌｏｘ＝部位特異的組換え部位；ＧＦＰ＝蛍光タンパク質；ＢＳＲ＝ブラストサイジン耐性遺伝子；Ｍ１３Ｏｒｉ＝複製起点；Ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子）、又はＢＬｏＶｅＬ−ＴＴＳ（図４）（ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳには、以下のエレメントが存在する：ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、及びｓｏｐＣ＝プラスミド分割タンパク質；ＳＶ４０ｐＡｎ＝ＳＶ４０ポリＡ；ＴＴＳ＝転写終結シグナル；ａｔｔＢ＝部位特異的組換え部位；ｌｏｘ＝部位特異的組換え部位；ｅＧＦＰ＝蛍光タンパク質；Ｂｓｒ＝ブラストサイジン耐性遺伝子；ｒｅｐＥ＝複製開始部位；Ｏｒｉ２＝複製起点；ＣｍＲ＝クロラムフェニコール耐性遺伝子；ＳＶ４０ｐｏｌｙＡｎ＝ポリＡ；Ｔ７Ｐｒ＝プロモータ；Ｅｃｏ５３ｋｌ＝制限部位）ベクターをローディングベクターとして使用して、目的核酸を合成染色体に逐次的に挿入する。０日目、合成染色体（ｈＳｙｎＣ）を含有する受容細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）を２４ウェルディッシュの１ウェル当たり約４Ｅ４細胞で播種し、ウェルが１日目に約７０％コンフルエントになる。適切な培地（例えば、ＨＴ１０８０についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）中において細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、製造者の指示に従い（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）、プラス（Ｐｌｕｓ）試薬含有）、送達ベクター（例えば、Ｎｅｘｕｓ−ＴＳＳ、又はＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ）及び組換えタンパク質をコードするプラスミド（例えばｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ）の両方をＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）をオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする２４ウェルディッシュの各ウェルにつき１．５μｌ  ＬＴＸ／５０μｌ  オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ））に希釈し、オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中５０μｌの希釈ＬＴＸに２５０ｎｇ  ＤＮＡ（例えば１２５ｎｇ  ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳプラスミド及び１２５ｎｇ  ｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ／ウェル）を加える。各約５０μｌ  ＤＮＡ−ＬＴＸ−オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に０．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、各試料を室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地を使用して培地を交換する。この細胞にＤＮＡ−脂質複合体を加えて、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【００５３】
２〜２４日目、薬物選択を実施する。デュプリケート２４ウェルのウェルのうちの１つからの細胞をトリプシン処理し、薬物選択（例えば、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン）を含む新鮮培地が入った１０ｃｍディッシュに移す。次に細胞を適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、コロニー形成に関してモニタする。培地は約７２時間毎に交換する。個別コロニーが形成されたら（約１０日）、各コロニーをガラスシリンダによって単離し、トリプシン処理して、２４ウェルディッシュのウェルに移す。次に、クローンを低温貯蔵下に置いてＰＣＲ分析用のゲノムＤＮＡを単離するのに十分な細胞が利用可能になるまで、これらの「クローン」を培養下で増殖させる（約２週間；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウィザードＳＶ（Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ）ゲノムＤＮＡ精製）。
【００５４】
或いは、デュプリケートウェルにある細胞は、トリプシン処理して、薬物選択を含まない新鮮培地が入った６ｃｍディッシュに置き、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしてもよい。３又は４日目、６ｃｍディッシュ内の細胞をトリプシン処理し、セルソータにかけることにより、ベクターが組み込まれた、且つ送達ベクター（Ｎｅｘｕｓ−ＴＳＳ、又はＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ）上の蛍光タンパク質を発現する蛍光細胞をシングルセルソーティングする。目的の遺伝子／ＤＮＡエレメントを含有するベクターの組込みは、適切なＰＣＲプライマーを使用した合成染色体と送達ベクター（Ｎｅｘｕｓ−ＴＳＳ、又はＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ）との間の組換え部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の産生によって同定される。試験ゲノムＤＮＡ試料と併せて、水と宿主ゲノムＤＮＡ（例えばＨＴ１０８０）との陰性対照ＰＣＲ反応を実施する。ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳベクター組込みからのジャンクションＰＣＲ産物の増幅に使用するＰＣＲプライマーは、ジャンクション１−予想産物サイズ３９２ｂｐ（ＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣ［配列番号１］及びｃｔｃｇｃｃｇｃａｇｃｃｇｔｇｔａａ［配列番号２］）；ジャンクション２−予想産物サイズ４０１ｂｐ（ｇｃｇｃｔａａｔｇｃｔｃｔｇｔｔａｃａｇｇｔ［配列番号３］及びＧＧＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧ［配列番号４］）である。ソータは組込み後のインフレームＧＦＰ陽性組換え体を同定することに留意されたく、これは本発明の方法のユニークな側面の一つである。
【００５５】
正しいジャンクションＰＣＲ産物サイズの候補クローンを同定した後、更なるＰＣＲ反応を実施して、当初送達ベクターにロードし、今は合成染色体上にある目的ＤＮＡエレメント（例えば目的核酸１、２、３など）の存在が確認される。
【００５６】
実施例３：ＧＦＰ−ＢＳＤカセットの切出し
合成染色体を有する細胞株にＣＲＥ発現プラスミドをトランスフェクトする。０日目、細胞を６ｃｍ細胞培養ディッシュ当たり２Ｅ５細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、ＣＲＥ発現プラスミド（例えばＰＳＦ−ＣＭＶ−ＣＲＥ−Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター；シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を製造者のプロトコルに従いリポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）で合成染色体を有する細胞株にトランスフェクトする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）はオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）培地に希釈し（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする各６ウェルディッシュにつき７．２５μｌ  ＬＴＸ／５００μｌオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ））、オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中に希釈したＬＴＸ５００μｌに１．２５μｇ  ＤＮＡを加える（例えば６ｃｍディッシュ当たりのＰＳＦ−ＣＭＶ−ＣＲＥ−ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクター）。次に各約５００μｌ  ＤＮＡ−ＬＴＸ−オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に１．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地に交換する。細胞にＤＮＡ−脂質複合体を加え、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２日目、６ｃｍディッシュからＣＲＥトランスフェクト細胞をトリプシン処理によって回収し、ゲーティングにより非蛍光細胞を収集する。非蛍光細胞はＣＲＥ−ｌｏｘ組換えを受けており、ｅＧＦＰ−ＢＳＲカセットの除去が生じている。非蛍光細胞は９６ウェルディッシュにシングルセルソーティングしてもよく、及び／又はチューブにバルクソーティングして、次に細胞培養ディッシュ（例えば６ｃｍディッシュ）にプレーティングしてもよい。次に細胞が培養下で増殖するときの蛍光に関して細胞をモニタする。蛍光を示さない単細胞クローンを低温貯蔵及びゲノムＤＮＡ単離用に培養下で増殖させる。ＰＣＲによる正しいＣＲＥ−ｌｏｘ組換えイベントの確認は、以下のプライマーを用いて決定する（ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳベースのベクターについて）：Ｌｏｘカセットフォワード：
（ＡＧＣＣＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＧＣＡＴＡＧｔｇａａｇｃｃｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔａｃｔａａｃｔｔｇａｇｃｇａａ［配列番号５］）
Ｌｏｘカセットリバース：
（ＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＡＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧ［配列番号６］）
４６２ｂｐ産物を示す候補がｅＧＦＰ−ＢＳＲカセットの正しい切出しを示し、一方、１，８１９ｂｐ産物は切出しが起こらなかったことを示す。正しいＰＣＲ産物の候補をＰＣＲによって更に試験して、目的のＤＮＡエレメントの存在を確認する。次に、第１のＤＮＡエレメントのローディングに用いたのと同じ手順を用いて第２のｌｏｘ配列変異体と第２のＤＮＡエレメントとを含む第２のＮｅｘｕｓ−ＴＳＳ又はＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳベクターを染色体にロードすることができる。
【００５７】
実施例４：再利用可能な薬物マーカの代替的反復
再利用可能な薬物マーカのこの例では、ＧＦＰコード配列の開始コドンの後ろのＮ端側末端にｌｏｘ変異配列を取り込む。ｌｏｘＰ、ｌｏｘ  ５１７１、ｌｏｘ  ２２７２、及びｌｏｘ  Ｍ２配列は、正しいリーディングフレームにおいて、ＧＦＰなどのレポータ遺伝子に融合し得る小さいペプチドをコードすることができる。従って、得られる送達ベクターはａｔｔＢ配列（合成プラットフォーム染色体（例えばｈＳｙｎＣ）上のａｔｔＰ部位のターゲティングに使用される）をｌｏｘ−ＧＦＰコード配列に直接隣接して置く。
ＬｏｘＰ配列：
５’ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ  ＡＴＧＴＡＴＧＣ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ  ３’［配列番号７］
ｌｏｘＰ  ＯＲＦ（５’３’フレーム１）：
ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ［配列番号７］
Ｉ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｎ  Ｖ  Ｃ  Ｙ  Ｔ  Ｋ  Ｌ［配列番号８］
Ｌｏｘ  ５１７１配列：
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ  ＡＴＧＴｇＴａＣ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ［配列番号９］
Ｌｏｘ  ５１７１  ＯＲＦ（５’３’フレーム１）
Ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔｇｔａｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ［配列番号９］
Ｉ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｎ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｔ  Ｋ  Ｌ［配列番号１０］
Ｌｏｘ  ２２７２配列：
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ  ＡａＧＴＡＴｃＣ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ［配列番号１１］
Ｌｏｘ２２７２（５’３’フレーム１）
Ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａａｇｔａｔｃｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ［配列番号１１］
Ｉ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｔ  Ｋ  Ｌ［配列番号１２］
ＬｏｘＭ２配列：
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ  ＡｇａａＡｃｃａ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ［配列番号１３］
ＬｏｘＭ２（５’３’フレーム１）
Ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｇａａａｃｃａｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ［配列番号１３］
Ｉ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｋ  Ｋ  Ｐ  Ｙ  Ｔ  Ｋ  Ｌ［配列番号１４］
次に、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子（ＢＳＲ）、ポリＡシグナル配列、及び下流ｌｏｘ配列（又はｌｏｘ変異体）をコードする第２の断片に、ＧＦＰ  ＯＲＦに取り込まれた上流ｌｏｘ配列に対して直列反復の向きでｌｏｘ−ＧＦＰ融合タンパク質を付加する。得られる再利用可能薬物カセットの順番は以下のとおりである：ａｔｔＢ−ＡＴＧ−ｌｏｘ−ＧＦＰ−ＢＳＲ−ポリＡ−ｌｏｘ−ベクターの残り。次に、得られたベクターコンストラクト、ｐＦＵＳＬｏｘを利用して、目的遺伝子を合成プラットフォーム染色体（例えばｈＳｙｎＣ）にターゲティングすることができる。図５を参照のこと。
【００５８】
実施例５：リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）を使用したｈＳｙｎＣプラットフォームへの目的遺伝子を有するｐＦＵＳＬｏｘの送達
０日目、２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＩＩＩ血清＋５マイクログラム／ｍｌピューロマイシンが入った６ウェルディッシュの１つのウェルにＨＴ１０８０  ｈＳｙｎＣ含有細胞を２×１０５細胞で播種する。１日目、目的遺伝子を含有するｐＦｕｓＬｏｘ  １．２５マイクログラムを５００マイクロリットルの血清不含オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））に希釈する。チューブに１．２５マイクロリットルのプラス（Ｐｌｕｓ）試薬（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））を加え、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートする。ＤＮＡ／プラス（Ｐｌｕｓ）試薬チューブに７．５マイクロリットルのリポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））を加え、穏やかに混合し、室温で２５分間インキュベートする。培地を２．５ｍｌ  抗生物質不含ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＩＩＩ＋グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）に交換し、細胞にｐＦｕｓＬｏｘ／オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）／プラス（Ｐｌｕｓ）試薬／ＬＴＸを加え、このトランスフェクション反応物を３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで一晩インキュベートする。２日目、トランスフェクト細胞をトリプシン処理することによって細胞を回収し、３ｍｌ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＩＩＩ血清＋３マイクログラム／ｍｌピューロマイシンに再懸濁する。次に細胞をセルソータにかけ、ＧＦＰ＋細胞に関してゲーティングする。蛍光細胞のシングルセルソートを実施し、単細胞クローンを増殖させて、ＰＣＲ分析によりｈＳｙｎＣプラットフォームへの送達を確認する。
【００５９】
実施例６：Ｃｒｅ介在性組換えによるｌｏｘ−ＧＦＰ−ＢＳＲ−ポリＡ−Ｌｏｘカセットの再利用
０日目、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＩＩＩ血清＋５マイクログラム／ｍｌピューロマイシンが入った６ウェルディッシュの１つのウェルに２×１０５個のｈＳｙｎＣ／ｐＦｕｓＬｏｘ改変細胞を播種する。１日目、細胞に１．２５マイクログラムのＰＳＦ−ＣＭＶ−ＣＲＥ−ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクター（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））のベクターを上記に記載したとおりのリポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）トランスフェクション試薬プロトコルを利用してトランスフェクトする。次にこのトランスフェクション反応物を３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２４時間インキュベートする。２日目、トリプシン処理によって細胞を回収し、３ｍｌ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＩＩＩ血清＋３マイクログラム／ｍｌピューロマイシンに再懸濁する。細胞をセルソータにかけ、ｇｆｐ−細胞（非蛍光）に関してゲーティングする。非蛍光細胞に関してシングルセルソート又はバルクソートを実施する。単細胞クローンを増殖させて、ＰＣＲ分析によりｈＳｙｎＣプラットフォームへの送達を確認する。
【００６０】
上記は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載又は図示されないものの本発明の原理を具体化し、且つその趣旨及び範囲内に含まれる様々な変形例を考案可能であることが理解されるであろう。更に、本明細書に記載される例及び条件付きの文言は全て、主として、本発明の原理及び本発明者らが当該技術分野の拡大に寄与する概念についての読者の理解の助けとなることを意図し、かかる具体的に記載される例及び条件に限定されないものと解釈されなければならない。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態並びにその具体的な例を記載する本明細書における記述は全て、その構造的均等物及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる均等物は、現在公知の均等物、及び将来開発される均等物、即ち構造に関わらず同じ機能を果たす開発される任意の要素の両方を含むことが意図される。従って本発明の範囲が、本明細書に図示及び記載される例示的実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって具体化される。以下の特許請求の範囲においては、用語「手段」が使用されない限り、そこに記載されるいかなる特徴又は要素も、米国特許法第１１２条第１６段落に準ずるミーンズ・プラス・ファンクション限定と解釈されてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019513397.tif 000008