(57)【要約】  本発明は、ＮＲＰ１過発現患者由来細胞およびこれを含む動物モデルを用いて抗−ＮＲＰ１抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法に関し、より具体的には、ＮＲＰ１を含有する患者由来細胞およびそれを移植した動物モデルをそれぞれ用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏパンニングにより、抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法に関する。【選択図】図１
2019524057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＮＲＰ１を発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングするステップと、
（ｉｉ）前記スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片で、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップと、
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップと、
を含む、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法。
【請求項２】
（ｉ）ＮＲＰ１を発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を１次スクリーニングするステップと、
（ｉｉ）前記１次スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片ライブラリーで、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップと、
（ｉｉｉ）前記ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞が移植されている動物モデルに、前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去した抗体またはその抗原結合断片を投与し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を２次スクリーニングするステップと、
（ｉｖ）前記２次スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片のうち、ＮＲＰ１以外の抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップと、
を含む、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合断片は、細胞内に内在化される抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞は、下記ステップを経て収得されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法:
（ａ）分離された癌患者由来の癌組織を粉砕した後、前記粉砕物から細胞分画を収得するステップ; および
（ｂ）前記収得された細胞分画をタンパク質分解酵素で処理した後、濾過および遠心分離し、懸濁して単細胞化するステップ。
【請求項５】
前記ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞が移植されている動物モデルは、免疫欠乏マウスであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫欠乏マウスは、ヌードマウス、ＮＯＤ（ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウス、ＳＣＩＤ（Ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウス、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、またはＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  Ｉ１２ｒｇ−／−）マウスであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法によって選別された抗体またはその結合断片をＩｇＧ形態で製作するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載の方法によってスクリーニングされた、ＮＲＰ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＲＰ１過発現患者由来細胞およびこれを含む動物モデルを用いて抗−ＮＲＰ１抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法に関し、より具体的には、ＮＲＰ１を含有する患者由来細胞およびそれを移植した動物モデルをそれぞれ用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏパンニングにより、抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロピリン（ＮＲＰ）はＮＲＰ１とＮＲＰ２を含み、これは、神経細胞で最初に発見された。ＮＲＰ１は約９２３個のアミノ酸で構成され、ＮＲＰ２は約９２６個のアミノ酸で構成されており、これらは、共通的に類似のドメイン構造を有し、且つ全体的に４４％のアミノ酸相同性を有すると知られている。
【０００３】
ＮＲＰ１は、軸索誘導を調節するためにプレキシン補助−受容体に作用する、セマフォリン３Ａリガンドに結合する受容体と知られている。以後、ＮＲＰ１は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）リガンドファミリーの構成員に結合し、血管新生を媒介することが明らかになった。
【０００４】
血管系の発生により、数多くの生理的過程と病理的過程が進行される。腫瘍のように活動的に成長する組織には、血液が適切に供給されなければならない。これらの組織は、一般に、新しい血管形成と維持を増進させる親−血管新生因子を生成させることで、血管新生により血液を供給する。血管形成は、単純な過程ではないが、次のようなステップを経て行われる：ａ）内皮細胞（ＥＣ）が既存の内皮細胞から増殖または分化されるステップ；ｂ）内皮細胞が移動して癒着し、コード（ｃｏｒｄ）−類似構造を形成させるステップ；ｃ）血管コードが細管形成を進行し、中央に内腔のある血管を形成させるステップ；ｄ）既存のコードや血管に発芽が始り、二次血管を形成させるステップ；ｅ）原始血管叢がさらなる再形成と再生を進行するステップ；およびｆ）内皮周辺細胞を動員して内皮管に入れ、血管に対する維持および調整機能を提供するステップ（このような細胞には、小さい毛細血管の場合は血管周囲細胞、大きい血管の場合は平滑筋細胞、および心臓内の心筋細胞が含まれる）。
【０００５】
ＮＲＰ１は、種々のヒト腫瘍細胞株およびヒト腫瘍（膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、精巣癌、大腸癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、食道癌、および前立腺癌など）で発現されると知られており、ＶＥＧＦおよびセマフォリンの癌細胞の増殖、生存、および転移に及ぶ影響にも関連すると知られている。また、ＮＲＰ１の発現程度によって、癌の進行程度が増加するか、癌患者の予後が良くないと知られている。
【０００６】
腫瘍成長の場合、血管新生は、過形成物から新生物に転移されるのにおいて決定的であり、腫瘍の成長と転移における栄養を提供するのにおいても決定的な役割をし得る。新生血管の形成により、腫瘍細胞は、正常細胞に比べて成長利点と増殖自律性を獲得することになる。腫瘍は、通常用可能な毛細血管層からの距離のため、数立方ミリメートルのサイズにのみ増殖できる単一異常細胞として始り、さらなる成長と伝染なしに、長期間「潜伏」状態で停滞され得る。引き続き、いくつかの腫瘍細胞は、血管新生表現型に転換されて内皮細胞を活性化させ、新しい毛細血管に増殖および成熟される。このように新しく形成された血管は、原発性腫瘍を成長させ続けるだけでなく、転移性腫瘍細胞を伝播し再集落化させ得る。
【０００７】
これに係わり、ＮＲＰ１を過発現する癌を治療するために、ＮＲＰ１に高い親和力で結合し、癌細胞の成長を阻害することのできる抗−ＮＲＰ１抗体が求められている。
【０００８】
抗体医薬品は、高い治療効果および標的治療性などにより、バイオ医薬品の分野でも最も急速に成長している。抗体医薬品市場は、２００余個のバイオ医薬品の中でも最も速く成長している分野であって、全バイオ医薬品市場の３７％を占めるほど、その比重が高い。また、世界市場の規模は、２０１２年５１５億ドルから、年平均１１．８％の成長率で成長し、２０１７年には８９９億ドルに達すると予想される（２０１３バイオ医薬品動向分析報告書、韓国産業通商資源部、２０１３）。
【０００９】
抗体医薬品の主要標的となる疾患は、殆どが難治性がん（４９％）および免疫疾患（３５％）などのような特定疾患の適応症に集中されていて、類似の適応症製品間の販売競争が極めて激しい状況である。それにもかかわらず、疾患中に細分化される治療標的が存在するため、これからも、抗癌用抗体治療剤の開発分野は成長し続けると考えられる。
【００１０】
かかる抗体医薬品の主要活性医薬物質である抗体候補物質の同定および確保に用いられる技術は、ハイブリドーマ細胞株を用いたキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）またはヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の開発、形質転換マウス（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ）を利用する方法、および抗体ディスプレイ技術を利用する方法に大別される。
【００１１】
１９７５年に、癌細胞と正常細胞を融合して製作した雑種細胞として単クローン抗体を生産するハイブリドーマ技術が開発されたことを始め、活発な抗体医薬品の開発が始まり、マウス単クローン抗体がヒトに適用される際に生じるＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）反応を解決するために、ヒト化抗体、さらにはヒト抗体を同定する技術が開発された。
【００１２】
ヒト抗体を製作するための技術分野は、大別して、形質転換マウスおよび抗体ディスプレイ（ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、リボソームディスプレイなど）が挙げられる。最近多く試されている形質転換マウスを用いた抗体の開発は、ヒト抗体遺伝子を移植した形質転換マウスに既存のハイブリドーマ技術を適用してヒト単クローン抗体を製造する技術である。この技術は、生体内親和度成熟（ｉｎ−ｖｉｖｏ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）が可能であるため、親和力の高い抗体を製造することができ、ヒト抗体を効果的に製作可能であるという大きい利点があるが、形質転換マウスの使用条件が高価であり、製作ノウハウなどの技術的進入が難しい点がある。
【００１３】
抗体ディスプレイ技術のうち、ファージディスプレイ技術は、バクテリオファージの表面に抗体断片をディスプレイさせて抗体をスクリーニングする技術であって、Ｍ１３  ＰＩＩＩファージに基づくディスプレイ技術が最も広く用いられている。しかしながら、かかるファージディスプレイ技術は、遺伝子の組換えにより発現された抗体断片をバクテリオファージの表面にディスプレイさせるため、Ｇ−タンパク質レセプターのような細胞表面に存在するタンパク質、または組換え発現が困難な抗体をスクリーニングするには困難さがある。
【００１４】
このような問題点を解決するために、スクリーニングステップで組換えタンパク質を使用しない戦略が開発されたが、これは、細胞表面に存在するタンパク質自体をスクリーニングに用いる戦略である。
【００１５】
既存の引用文献から、抗体候補物質と細胞をともに培養することで、細胞表面に発現される抗原と直接的に結合する抗体またはペプチドをスクリーニングすることができるということが知られている(Andersen PS, et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:1820-1824, 1999; Barry MA, et al., Nat Med 2:299-305, 1995; Cai X, Garen A. Proc Natl Acad Sci USA 92:6537-6541, 1995)。
【００１６】
しかし、上記の細胞を用いたディスプレイ方法は、実験室で培養された細胞を用いてスクリーニングするため、実際に患者に適用した時に、前記方法によりスクリーニングされた抗体がその効果が十分に発揮できないという欠点があった。
【００１７】
一方、抗体−薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、リンカーを介して抗体に細胞毒性薬物を結合させたものであって、単クローン抗体がターゲット特異的特性を示すため、抗体−薬物複合体中の薬物は、選択的標的能を有する単クローン抗体により認知される抗原／標的を発現する腫瘍に伝達されることができる。理想的には、投与後における血液中のプロドラッグ状態の抗体−薬物複合体は毒性があってはならず、抗体が標的腫瘍抗原に結合してから癌細胞内に内在化されると、薬物が活性形態で放出され、腫瘍細胞を殺害することになる。 
【００１８】
このように抗体が結合する標的／抗原を決定することが、抗体−薬物複合体の製作において重要な開示点となる。特に、抗体が結合する標的／抗原は、腫瘍細胞で優勢に発現（過発現）する細胞表面タンパク質となって来た。
【００１９】
ヒト癌の細胞表面で発現される抗原の定義は、正常組織に比べて過多発現されるか、突然変異および選択的に発現される広範囲な目標物を意味する。核心的な問題は、抗体に基づく治療法に適した抗原を同定することである。このような治療剤は、抗原や受容体の機能（すなわち、刺激剤や拮抗剤としての機能）の変化を媒介し、ＦｃとＴ細胞の活性化によって免疫システムを調節し、特定抗原を目標とする抗体に結合される特定薬物を伝達することで、その効能を発揮する。抗体薬動学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）、作用機能、サイズと免疫刺激性を変化させ得る分子技術は、新しい抗体に基づく治療法の開発において核心的な要素として登場している。癌患者を対象とした治療抗体の臨床試験で得られた証拠らは、目標抗原と抗体の親和性および結合性、抗体構造の選択、治療的アプローチ（シグナル伝逹の遮断や免疫作用機能）を含む、最適化された抗体を選択するためのアプローチの重要性を強調している状況である。
【００２０】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、種々の癌で発現されると知られているＮＲＰ１に結合し、細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）される坑癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、ファージディスプレイ技術を用いてＮＲＰ１に高い親和力で結合し細胞内に内在化される抗−ＮＲＰ１抗体を開発し、このような抗−ＮＲＰ１抗体が、癌細胞の移動を著しく抑制させることができることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞を用いた抗体スクリーニング方法を提供するところにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞およびこれを含む動物モデルを用いた抗体スクリーニング方法を提供するところにある。
【００２３】
本発明のさらに他の目的は、前記スクリーニング方法によって選別された抗体またはその結合断片を提供するところにある。 
【００２４】
本発明のさらに他の目的は、前記スクリーニング方法によって選別された抗体またはその結合断片を有効性分として含む、癌の予防または治療用組成物を提供するところにある。 
【課題を解決するための手段】
【００２５】
前記目的を達成するために、本発明は、（ｉ）ＮＲＰ１を発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングするステップと、（ｉｉ）前記スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片で、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップと、を含む、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、（ｉ）ＮＲＰ１を発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を１次スクリーニングするステップと、（ｉｉ）前記１次スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片ライブラリーで、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップと、（ｉｉｉ）前記ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞が移植されている動物モデルに、前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去した抗体またはその抗原結合断片を投与し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を２次スクリーニングするステップと、（ｉｖ）前記２次スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片のうち、ＮＲＰ１以外の抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップと、を含む、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法を提供する。
【００２７】
また、本発明は、前記スクリーニング方法によって選別された抗体またはその結合断片を提供する。
【００２８】
また、本発明は、前記抗体またはその結合断片を含む、癌の予防または治療用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の方法を示した概念図である。
【図２】本発明の一実施例による、Ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ  １（ＮＲＰ１）抗原と結合する抗体をスクリーニングする方法を図式化した図である。
【図３】ＮＲＰ１抗原と結合する抗体をｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングする方法を図式化した図である。
【図４】本発明の一実施例による抗−ＮＲＰ１抗体断片の生産のためのファージミドベクターの構成図である。
【図５】本発明の一実施例によって精製された各抗−ＮＲＰ１抗体断片のクーマシー染色の結果を示した図である。
【図６】本発明の一実施例によって選別した３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片のＮＲＰ１に対する結合力を示すＥＬＩＳＡ結果を示した図である。
【図７】本発明の一実施例によって選別した３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の濃度によるＮＲＰ１に対する結合力を示すＥＬＩＳＡ結果を示した図である。
【図８】本発明の一実施例によって選別した３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片のＫＤ値をＳＰＲにより分析した結果を示した図である。
【図９】ＮＲＰ１過発現患者由来細胞に対して、本発明の一実施例によって選別した抗−ＮＲＰ１抗体断片の結合能を示すＦＡＣＳ分析結果である。
【図１０ａ】本発明の一実施例によって選別した３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の内在化機能を示す共焦点レーザー走査顕微鏡の写真である。
【図１０ｂ】本発明の一実施例によって選別した３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の内在化機能を示す共焦点レーザー走査顕微鏡の写真である。
【図１０ｃ】本発明の一実施例によって選別した３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の内在化機能を示す共焦点レーザー走査顕微鏡の写真である。
【図１１】本発明の一実施例によって選別した抗−ＮＲＰ１抗体断片の結合エピトープを確認した結果である。
【図１２】ＮＲＰ１を過発現する細胞株を選別するために行ったＲＮＡ−ｓｅｑ分析結果を示した図である。
【図１３】３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の生産純度を示した結果である。
【図１４】３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体に対するエンドトキシンテスト（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｔｅｓｔ）の結果を示した図である。
【図１５】ＥＬＩＳＡを用いて抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体のＫＤ値を測定した結果を示した図である。
【図１６】３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体のヒトＮＲＰ１に対する特異的な結合能を測定した結果を示した図である。
【図１７】本発明の方法によって選別された３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が患者由来の癌細胞に内在化されることを確認した結果を示した図である。
【図１８】本発明の方法によって選別された３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が癌細胞特異的内在化を示すことを確認した結果を示した図である。
【図１９】本発明の方法によって選別された３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が、公知のＮＲＰ１抗体に比べて、優れた正常細胞と癌細胞に対する結合力の差を示すことを確認した結果を示した図である。
【図２０】本発明の方法によって選別された３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が、優れた癌細胞移動の抑制効果を示すことを確認した結果を示した図である。
【図２１】本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が、優れた癌細胞移動の抑制効果を示すことを確認した結果を示した図である。
【図２２】本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体によるシグナル伝逹物質の変化を確認した結果を示した図である。
【図２３】ＴＵＮＥＬ  ａｓｓａｙにより、本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体による細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が増加することを確認した結果を示した図である。
【図２４】本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の膠芽細胞癌に対する効能評価結果を示した図である。
【図２５】本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の肺癌に対する効能評価結果を示した図である。
【図２６】本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の膠芽細胞癌への特異的結合を確認した結果を示した図である。
【図２７】本発明の方法によって選別された抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の正常組織における分布評価結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００３１】
本発明者らは、今後の臨床で成功可能性が高く、且つ内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されて細胞内部で効果的に作用できる抗体を選別するために、ＮＲＰ１を含有している患者由来細胞を用いて抗癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、 本発明者らは、 ファージディスプレイ技術を利用して、ＮＲＰ１に高い親和力で結合して細胞内に内在化する抗体を選別して、このような抗体が細胞内に内在化することを確認しようとした。
【００３２】
そこで、本発明の一実施例では、種々の癌で発現されると知られているＮＲＰ１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）に結合して細胞内に内在化される抗体を選別するために、膠芽細胞腫患者由来の細胞に基づくファージディスプレイを行った。その結果、選別された抗−ＮＲＰ１抗体が、癌細胞の表面に発現されたＮＲＰ１に結合された後、細胞内に内在化されることを確認し（図９ａ〜９ｃ）、抗体の結合エピトープが既存の抗体と異なることを確認した（図１０）。
【００３３】
したがって、本発明は、一観点において、（ｉ）ＮＲＰ１を発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングするステップと、（ｉｉ）前記スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片で、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップと、を含む、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法に関する。 
【００３４】
本発明で用いられる用語「発現」は、ＮＲＰ１が構造的遺伝子から生産される過程を意味し、遺伝子がｍＲＮＡに転写、およびｍＲＮＡが抗原に翻訳される過程を含む。一般に、ＮＲＰ１が疾病、例えば、癌の生成に寄与し得て、ＮＲＰ１が過発現されて例えば、癌細胞の細胞死を抑制したり、ＮＲＰ１の過発現は、例えば、癌細胞の浸潤（ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）または移動を増加させ得るため、本発明によるＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法において、「抗原の発現」は、ＮＲＰ１の過発現または異常な活性を含む意味であり得る。
【００３５】
本発明で用いられる用語「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＹ、およびＩｇＧからなる群から選択される免疫グロブリンであって、目標抗原に特異的に結合してもよい。前記抗体は、軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）と重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）がそれぞれ２つずつ集まってなり、それぞれの鎖は、アミノ酸配列が可変的な可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）と、一定のアミノ酸配列を有する固定領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）と、から構成されている。可変領域の３次元構造の末端に抗原が結合する部位が位置し、この部位は、軽鎖と重鎖にそれぞれ３個ずつ存在する相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）が集まって形成される。相補性決定部位は、可変領域の中でもアミノ酸配列の可変性が特に高い部分であって、かかる高い可変性により、様々な抗原に対して特異的な抗体が捜し出される。本発明の範囲には、完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。 
【００３６】
本発明で用いられる用語「ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、単鎖断片抗体または抗体断片）」は、軽鎖および重鎖の可変領域を連結した抗体である。前記ＳｃＦｖは、場合によっては、１５個内外のアミノ酸が連結されたペプチド鎖からなるリンカー（ｌｉｎｋｅｒ、連結部位）を含んでもよく、この際、ＳｃＦｖは、軽鎖可変領域−連結部位−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−連結部位−軽鎖可変領域の構造を有してもよく、親抗体と同一もしくは類似の抗原特異性を有する。 
【００３７】
完全型抗体は、二つの全長（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および二つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有して、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００３８】
抗体の抗原結合断片または抗体断片とは、抗原結合能力を有する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖを含む。抗体断片の中Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有している最小の抗体断片として、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、 ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−Ｃｈａｉｎ ｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されているされたり、またはＣ末端で直ちに連結されるため、二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を形成することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術を介して製作することができる。
【００３９】
本発明で用いられる用語「抗体（またはＳｃＦｖ）ライブラリー」は、互いに異なる配列を有する種々の抗体遺伝子の集まりである。抗体ライブラリーから任意の抗原に対して特異的な抗体を分離するためには、非常に高い多様性が求められ、互いに異なる抗体クローンからなるライブラリーが構築されて用いられる。このような抗体ライブラリーを成す抗体遺伝子は、例えば、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターにクローニングされて宿主細胞（大腸菌）に形質転換され得る。
【００４０】
本発明で用いられる用語「核酸」は、「遺伝子」または「ヌクレオチド」と混用され得て、例えば、天然／合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、天然／合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｃＲＮＡからなる群から選択されてもよいが、これに制限されるものではない。
【００４１】
本発明で用いられる用語「ファージミド」ベクターは、ファージディスプレイに用いられ、ファージ複製開始点（ｐｈａｇｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有するプラスミドＤＮＡであって、通常、抗生剤耐性遺伝子を選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ）として有している。ファージディスプレイに用いられるファージミドベクターの場合、Ｍ１３ファージのｇＩＩＩ遺伝子またはその一部が含まれており、ＳｃＦｖ遺伝子は、ｇＩＩＩ遺伝子の５´末端にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）されて宿主細胞を介して発現される。
【００４２】
本発明で用いられる用語「ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）」は、ファージミドがファージ粒子でパッケージングされるように必要な遺伝情報を提供するファージである。ファージミドには、ファージ遺伝子のうちｇＩＩＩもしくはその一部のみが存在するため、ファージミドで形質転換された宿主細胞（形質転換体）をヘルパーファージで感染させ、残りのファージ遺伝子を供給することになる。前記ヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７もしくはＶＣＳＭ１３などの種類があり、殆どカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）などの抗生剤耐性遺伝子を含んでヘルパーファージで感染された形質転換体を選択するようにしている。また、パッケージングシグナル（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）に欠陥があるため、ヘルパーファージ遺伝子よりもファージミド遺伝子が選別的にファージ粒子中にパッケージングされる。
【００４３】
本発明で用いられる用語「シグナル配列」は、遺伝子の５´末端部分に位置し、遺伝子からコードされたタンパク質が外部に分泌される際に必要なシグナルとして機能する塩基配列、もしくはそれに相当するアミノ酸配列である。
【００４４】
本発明で使用される用語「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速かつ効率よく分類することができるとの事実にある。ペプチドおよびタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイするのは、特異的結合特性を有するポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに使用されてきた。
【００４５】
ファージディスプレイ技術は、特定リカンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成および選別するための強力なツールを提供した。ファージディスプレイ技術を使用して、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させて、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質またはポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低水準で発現されて野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現されて粒子感染性が維持される。
【００４６】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現と宿主細胞のペリプラズムにおける機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発するに当たり重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多くの方式、例えば無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法または関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象として、目的する特徴を伴った抗体または抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【００４７】
ファージディスプレイ技術は、目的する特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマおよび組換え方法に比べていくつかの利点を有している。このような技術は動物を使用しなくても短時間で様々な配列を有する大きい抗体ライブラリーを生成させることができるようにする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間を要することがある。また、免疫が全く求められないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性や抗原性が低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。さらにファージ抗体ライブラリーを使用して新規な治療的抗体を生成および確認することができる。
【００４８】
ファージディスプレイライブラリーを使用して免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖細胞系列配列、または未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を使用することができる。各種リンパ系組織を使用して、未感作または非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
【００４９】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認および分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離するのは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における産生効率およびライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは、抗体または抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的産生によって減少される。細菌性細胞における発現は、抗体または抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／不変界面の表面や選別されたＣＤＲ残基における残基を交代で突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞で抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
【００５０】
高親和性抗体分離において、抗体または抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、これらがたびたび抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列および構造的立体形態面で非常に多様であるため、これを利用して様々なライブラリーを製造することができる。
【００５１】
また、各位置で２０個のアミノ酸全てを使用して可変重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個全てのアミノ酸を使用すると多様性が大きい変異体抗体配列が生成されて、新規な抗体を確認する機会が増加する。
【００５２】
本明細書の「ニューロピリン」または「ＮＲＰ」は、集合的にニューロピリン−１（ＮＲＰ１）、ニューロピリン−２（ＮＲＰ２）およびそれらのイソ型および変異体を含む。ニューロピリンは、１２０〜１３０ｋＤａ非−チロシンキナーゼ受容体である。多数のＮＲＰ−１およびＮＲＰ−２スプライス変異体および可溶性イソ型がある。ニューロピリンの基本構造は、５個のドメインを含む：３個の細胞外ドメイン（ａ１ａ２、ｂ１ｂ２およびｃ）、膜貫通ドメインおよび細胞質性ドメイン。ａ１ａ２ドメインは、２個のジスルフィドブリッシを形成する４個のシステイン残基を一般に含有する補体成分ＣｌｒおよびＣｌｓ（ＣＵＢ）と相同性である。ｂ１ｂ２ドメインは、凝固因子ＶおよびＶＩＩＩと相同性である。ｃドメインの中央部は、メプリン（ｍｅｐｒｉｎ）、Ａ５および受容体チロシンフォスファターゼμタンパク質との相同性のために、ＭＡＭと命名される。ａ１ａ２およびｂ１ｂ２ドメインは、リカンド結合に責任がある一方、ｃドメインは同種−二量体化または、異種−二量体化において決定的である。
【００５３】
「ニューロピリン−１媒介生物学的活性」は、ニューロピリン−１が実質的役割をする生理的または病理学的状態を意味する。例えば、胚芽神経系発生または神経細胞再生の間のエクソン案内、血管形成（血管再形成含む）、腫瘍生成および腫瘍転移であってもよいが、これに制限さない。
【００５４】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などを含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、抗体の抗原結合断片または抗体断片を含み、前記断片は、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）および抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体(AC) を含んでもよい。
【００５５】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在することができる可能な天然発生的突然変異を除いては同じであることを指し示す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。
【００５６】
前記「ヒト化」形態の非−ヒト（例：ミューリン）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、収容者の超可変領域からの残基を目的する特異性、親和性および能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基で代替させたヒト免疫グロブリン（収容者抗体）である。
【００５７】
前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されているものを意味する。
【００５８】
重鎖および／または軽鎖の一部が特別な種から由来したり特別な抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である一方、残りの鎖（等）は、さらに他の種から由来したりさらに他の抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでなく目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
【００５９】
本願に使用されたような「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、および骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を指し示す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指し示す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指し示す。
【００６０】
「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）」は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し示す。各可変ドメインは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００６１】
「骨格領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された四つのＦＲを有する。
【００６２】
本発明の方法は、（ｉ）ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングするステップを含む。
【００６３】
前記患者由来細胞は、例えば、癌患者由来細胞であってもよい。癌患者由来の癌細胞は、正常細胞とは異なる生理学的特徴を示すが、このような生理学的特徴は、正常細胞と比較して癌細胞特異的に抗原の発現が増加または減少する遺伝子の発現様相によって決定される。かかる遺伝子の発現様相は、患者特異的または患者の組織特異的な差を示し得る。
【００６４】
前記患者由来細胞および正常細胞の抗原含有量を測定する方法は、抗原をコードする遺伝子またはタンパク質の発現量を測定して比較することを含んでもよく、好ましくは、ＦＡＣＳ、 ＥＬＩＳＡ、 Ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで構成された群から選択される一つ以上の方法により行われてもよいが、これに限定されるものではない。
【００６５】
本発明において、ライブラリーは、抗体および／またはその抗原結合断片の集まりであって、スクリーニングのためにディスプレイされることができ、全長抗体で製作されてもよい。前記ライブラリーにおいて、抗体および／またはその抗原結合断片は、例えば、リボソーム、ファージ、または細胞上にディスプレイされることができる。
【００６６】
本発明において、前記患者由来細胞は、固形癌患者に由来するものであることを特徴とし、前記固形癌は、肝癌、膠芽細胞腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎臓細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、および肺癌からなる群から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００６７】
前記患者由来細胞を収得する方法は、特に制限されないが、例えば、（ａ）分離された癌患者由来の癌組織を粉砕した後、前記粉砕物から細胞分画を収得するステップと、（ｂ）前記収得された細胞分画をタンパク質分解酵素で処理した後、濾過および遠心分離し、懸濁して単細胞化するステップと、を含んでもよい。 
【００６８】
本発明において、前記タンパク質分解酵素は、タンパク質加水分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）を行うことのできる酵素を意味し、タンパク質中のアミノ酸を連結するペプチド結合を加水分解するタンパク質の異化作用によりタンパク質を分解するエンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、およびタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端からペプチド結合を加水分解するエキソペプチダーゼ（ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を含んでもよい。
【００６９】
本発明の前記方法は、さらに、（ｉｉ）前記スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片で、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップを含む。
【００７０】
前記ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）で選択された抗体またはその抗原結合断片に対するネガティブ選別（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）をするためのステップであって、（ｉｉｉ）前記（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップを含み、これにより、抗原に対して高い選択性を有する抗体をスクリーニングすることができる。
【００７１】
本発明において、前記ステップ（ｉｉ）のＮＲＰ１が発現されないように除去された患者由来細胞は、自然に抗原を発現しない細胞であってもよく、ＮＲＰ１が発現されないように人為的に操作した患者由来細胞であってもよい。人為的に操作する方法としては、ＮＲＰ１が発現されないようにする方法であれば如何なる方法も使用可能であるが、前記抗原を発現しない患者由来細胞は、好ましくは、ＮＲＰ１に結合するアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される１つ以上を処理することで収得されてもよい。
【００７２】
本発明において、前記ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を用いて、ＮＲＰ１に結合する抗体のみを選別するステップは、ネガティブ選別過程である。これは、直前のポジティブ選別ステップの次に行われ、選別された抗体のＮＲＰ１に対する正確度を向上させる効果がある。
【００７３】
場合によって、本発明の前記方法は、前記ステップ（ｉｉ）中に、または前記ステップ（ｉｉ）の後に、４℃でファージディスプレイを行った後、温度を３７℃に上昇させ、細胞内に内在化される抗体を選別する過程を行うステップをさらに含んでもよい。これにより、細胞内に内在化される抗体をスクリーニングすることができる。
【００７４】
前記抗体またはその抗原結合断片の分離・除去は、電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、イソエレクトリック（等電点）フォーカシング及びこれの様々な変化及び複合方法などが利用可能であるが、これに限定されない。
【００７５】
前記抗体またはその抗原結合断片の分離・除去は、例えば遠心分離または、限外ろ過によって不純物を除去して、その結果を、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを利用して精製することにより行われてもよい。さらにその他の精製技術、例えば陰イオンまたは、陽イオン交換クロマトグラフィー、疏水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用されてもよい。
【００７６】
本発明は、他の観点において、（ｉ）ＮＲＰ１を発現する患者由来細胞を、抗体またはその抗原結合断片を含むライブラリーで処理し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を１次スクリーニングするステップと、（ｉｉ）前記１次スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片ライブラリーで、ＮＲＰ１が発現されない患者由来細胞を処理するステップと、（ｉｉｉ）前記ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞が移植されている動物モデルに、前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去した抗体またはその抗原結合断片を投与し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を２次スクリーニングするステップと、（ｉｖ）前記２次スクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片のうち、ＮＲＰ１以外の抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去するステップと、を含む、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法に関する。
【００７７】
上述のスクリーニング方法で説明された構成と同様の構成についての説明が同様に適用されることができる。
【００７８】
本発明の他の実施例では、種々の癌で発現されると知られているＮＲＰ１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）に結合して細胞内に内在化される抗体を選別するために、膠芽細胞腫患者由来の細胞に基づいたファージディスプレイを行った後、１次選別した抗体候補群を、患者由来細胞を含む免疫欠乏マウスに注入し、生体内で２次スクリーニングを行った。その結果、選別された抗−ＮＲＰ１抗体が、癌細胞の表面に発現されたＮＲＰ１に結合された後、細胞内に内在化されることを確認した（図９ａ〜９ｃ）。また、抗体の結合エピトープが、既存の抗体と異なることを確認した（図１０）。
【００７９】
本発明の前記方法は、特に、（ｉｉｉ）前記ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞が移植されている動物モデルに、前記ステップ（ｉ）で選別された抗体またはその抗原結合断片のうち、ステップ（ｉｉ）の患者由来細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を分離・除去した抗体またはその抗原結合断片を投与し、ＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を２次スクリーニングするステップをさらに含む。
【００８０】
前記ステップを含む本発明によるスクリーニング方法によると、ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞を移植した動物モデルにより、患者の特性を十分に反映できることになるため、患者毎のオーダーメード治療剤の選別および治療方法の選択などに有用に用いられるだけでなく、患者の特性に最適な抗体またはその抗原結合断片を高い選択度で選別することができる。
【００８１】
本発明において、ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞が移植されている動物モデルは、患者由来細胞を含む動物であれば何れもよいが、好ましくは、免疫欠乏マウスであることを特徴とする。「免疫欠乏マウス」とは、膠芽細胞腫が発病するように、免疫システムを構成する一部の構成要素を遺伝子レベルで人為的に損傷させ、正常な免疫システムが実現されないように操作して製造されたマウスを意味する。最も好ましくは、ヌードマウス、ＮＯＤ（ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウス、ＳＣＩＤ（Ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウス、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、またはＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  Ｉ１２ｒｇ−／−）マウスであることを特徴とする。
【００８２】
本発明による方法によると、例えば、患者由来細胞で過発現されるＮＲＰ１に結合する抗体をスクリーニングすることができるが、これに限定されるものではない。前記抗体は、例えば、ＮＲＰ１のＶＥＧＦ１６５ドメインに結合する抗体であってもよいが、これは、ＮＲＰ１のＶＥＧＦ１６５ドメインに結合する抗体として知られている従来の抗体（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社のＭＮＲＰ１６８５Ａ抗体）とは、結合するエピトープが異なってもよい。
【００８３】
本発明の前記方法によって選別された抗体またはその結合断片は、例えば、ＩｇＧ形態、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）であってもよいが、好ましくは、ＩｇＧ形態で製作されてもよい。
【００８４】
本発明は、さらに他の観点において、前記方法によってスクリーニングされた抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００８５】
:本発明の抗体または抗体断片は、ＮＲＰ１を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗−ＮＲＰ１抗体の配列だけでなく、これの生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度および／またはその他生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸の側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疏水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて起きる。アミノ酸の側鎖置換体の大きさ、形および種類に対する分析によって、アルギニン、リジンとヒスチジンは共に正電荷を帯びる残基で；アラニン、グリシンとセリンは、類似する大きさを有して；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、類似する形を有することが分かる。従って、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、生物学的に機能均等物といえる。
【００８６】
変異を導入するに当たり、アミノ酸の疏水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、疏水性と電荷により疏水性インデックスが付与されている: アルギニン(+３．０); リジン(+３．０); アスパルタート(+３．０± 1); グルタメート(+３．０±1); セリン(+０．３); アスパラギン(+０．２); グルタミン(+０．２); グリシン(０); トレオニン(-０．４); プロリン(-０．５±1); アラニン(-０．５); ヒスチジン(-０．５); システイン(-１．０); メチオニン(-１．３); バリン(-１．５); ロイシン(-１．８); イソロイシン (-１．８); チロシン(-２．３); フェニルアラニン(-２．５); およびトリプトファン(-３．４)。
【００８７】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するに当たり、疏水性アミノ酸インデックスは大変重要である。類似する疏水性インデックスを有するアミノ酸で置き換えてこそ類似の生物学的活性を保有できることは公示された事実である。疏水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の疏水性インデックス差を示すアミノ酸の間に置換を行う。
【００８８】
一方、類似する親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くことも周知である。米国特許第４５５４１０１号に開示された通り、次の親水性値が各アミノ酸残基に付与されている:アルギニン(+３．０); リジン(+３．０); アスパルタート(+３．０± １); グルタメート(+３．０±１); セリン(+０．３); アスパラギン(+０．２); グルタミン(+０．２); グリシン(0); トレオニン(-０．４); プロリン(-０．５±１); アラニン(-０．５); ヒスチジン(-０．５); システイン(-１．０); メチオニン(-１．３); バリン(-１．５); ロイシン(-１．８); イソロイシン (-１．８); チロシン(-2.3); フェニルアラニン(-２．５); およびトリプトファン(-３．４) 。
【００８９】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸置換は、当該分野に公示されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常的に起きる交換は、アミノ酸残基Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu および Asp/Gly間の置換である。
【００９０】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮するならば、本発明の抗体またはこれをコードする核酸分子は、配列一覧に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、よりさらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、ＮＢＣＩなどからアクセス可能で、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００９１】
本発明において、本発明はＮＲＰ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングする方法を提供してもよい。 
【００９２】
本発明は、さらに他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む、癌の予防または治療用組成物に関する。
【００９３】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＮＲＰ１に対する抗体またはその抗原結合断片の薬剤学的有効量；および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物であってもよい。本発明はまた、患者に必要な有効な量で本発明に係るＮＲＰ１に対する抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む、癌の予防または治療方法に関する。
【００９４】
前記組成物は、上述した本発明の抗−ＮＲＰ１抗体またはその抗原結合断片を有効性分として利用するため、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００９５】
下記の実施例で立証された通り、本発明に係る抗−ＮＲＰ１抗体は、ＮＲＰ１を発現する癌細胞の移動を抑制することができる。このように本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＮＲＰ１に高い親和度で結合してＮＲＰ１を過発現する癌細胞の移動を抑制することができるので、癌の予防および治療に使用可能である。
【００９６】
本発明の一実施例によると、本発明による方法によって選別された抗−ＮＲＰ１抗体は、癌細胞特異的な内在化（実施例９）を示すことができ、細胞死効果の増加、および固形癌、例えば、膠芽細胞癌および肺癌で目的とする腫瘍成長抑制の効果を示すことができる（実施例１１）ことを確認した。特に、本発明による方法によって選別された抗−ＮＲＰ１抗体は、正常組織に対する結合力が低いか、殆どないことが確認され、このことから、副作用を最小化することが可能であることを予想することができる（実施例１２）。
【００９７】
「予防」とは、本発明に係る組成物の投与で癌を抑制させたり進行を遅延させるいずれの行為を意味し、「治療」とは、癌の発展の抑制、癌の軽減または癌の除去を意味する。
【００９８】
前記組成物に採用される疾患である癌は、ＮＲＰ１を過発現する癌であり、例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、睾丸癌、大腸癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、食道癌、および 前立腺癌等であってもよい。
【００９９】
「ＮＲＰ１を過発現する癌」とは、同じ組織類型の非−癌性細胞と比較して有意に高い水準でＮＲＰ１を癌細胞表面に有している癌を意味する。
【０１００】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明の組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
【０１０１】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。
【０１０２】
経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃腸からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されてもよい。
【０１０３】
本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のうような要因によって多様であるが、通常の熟練した医師は、目的する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の薬学組成物の１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。 本明細書で用語「薬剤学的有効量」とは、癌を予防または治療するのに十分な量を意味する。
【０１０４】
本発明の薬剤学組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または、賦形剤を利用して製剤化することによって、単位容量形態で製造されるか、または多用量容器内に内含させて製造されることができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態やエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【０１０５】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与されてもよい。
【０１０６】
実施例
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【０１０７】
実施例１．患者由来細胞を用いた内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体の１次 同定
抗−ＮＲＰ１抗体断片の同定のための細胞パンニング（ｃｅｌｌ  ｐａｎｎｉｎｇ）に必要な細胞を選別するために、事業団（サムスンメディカルセンターの難治癌研究事業団）で保有している患者由来細胞のＮＲＰ１発現レベルを、ＲＮＡ−Ｓｅｑの後、ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｌｏｂａｓｅ  Ｍｉｌｌｉｏｎ）方法により分析し（図１２）、ｃｕｌｔｕｒｅの有無とＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｏｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）方法により選別して、患者由来細胞を細胞パンニングに用いた。
【０１０８】
既存に製作されている合成ｓｃＦｖ抗体断片ファージライブラリー（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．２７：２２５−２３５，２００９）を用いて、ヒトＮＲＰ１に結合するｓｃＦｖ抗体断片をファージディスプレイスクリーニングにより同定した。大腸菌宿主ＥＲ２５３７中に導入されているファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターをファージ（ｐｈａｇｅ）形態で回収するために、４個の下位ライブラリーサンプルを、各４００ｍｌの培養培地（ＳＢ／アンピシリン／２％のグルコース）で２時間培養した。Ｏ．Ｄ６００で吸光度が０．５−０．７程度になると、５０００ｇで２０分間遠心分離して上清液を除去した後、４００ｍｌの２次培養培地（ＳＢ／アンピシリン）中で浮遊させてから、１０１２ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）のヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加して１時間培養した。次に、カナマイシン抗生剤（ヘルパーファージ中に導入された抗生剤遺伝子）７０μｇ／ｍｌを添加した後、３０℃で一晩培養することで、ファージライブラリーが宿主細胞外に分泌されるようにした。次いで、遠心分離により得られた培養物を、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）溶液を用いてファージ形態のみが沈殿されるようにすることで、ファージライブラリーを得た。
【０１０９】
このように得られたファージライブラリーと、ＮＲＰ１の発現が高い患者由来細胞（４Ｘ１０６）とを混合し、総５ｍｌのＮＢＡ（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れ、４℃の回転機に固定させた後、１−２時間３６０度で回転させた。次に、患者由来細胞に結合しないファージ粒子を除去するために、３００ｇで５分間遠心分離して細胞を分離させた後、さらに５ｍｌのＮＢＡを入れる洗浄過程を行った。この過程を４回繰り返し、最後の過程では、予め３７℃のインキュベーターに置いたＮＢＡ５ｍｌを使用し、患者由来細胞とファージをＴフラスコに入れて３７℃で３０分間培養させることで、細胞の表面に付いたファージ粒子が内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）により細胞内に入り込むように誘導した。
【０１１０】
次に、１５ｍｌのチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ）に移した後、３００ｇで５分間遠心分離して細胞を分離させた後、冷たいＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）５ｍｌを入れる洗浄過程を６回繰り返して行い、細胞パンニングの回次数が重なるにつれて、この過程の回数を増加させた。その後、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．２）５ｍｌを入れ、常温で５分間放置することで、細胞の表面にあるファージ粒子を細胞の表面から分離させた。その後、３００ｇで５分間遠心分離して細胞のみを分離し、１００ｍＭのＴＥＡを０．５ｍｌ入れ、これをｅ−チューブに移して常温で１５分間置いた。次に、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞残渣を分離してから、細胞中のファージ粒子がある上清液を取り、２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）１ｍｌと混合して中和させた後、予め育てておいたＥＲ２５３７が入っている培養培地（ＰＢ）８．５ｍｌに入れ、３７℃で１２０ｒｐｍで培養させることで、ファージ粒子を大腸菌宿主であるＥＲ２５３７に感染させた。その後、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、沈んだＥＲ２５３７を培養培地（ＳＢ）５００μｌに混合した後、１５ｃｍの培養培地に塗抹して培養した後、５ｍｌのＳＢ培養培地（５０％グリセロール）を添加してコロニーを回収および保管（−８０℃）した。次いで、繰り返される細胞パンニング回次を進行するために、保管された前回のファージ溶液中の１ｍｌを取り、ファージ粒子の増幅作業を行った。宿主細胞であるＥＲ２５３７に培養後、ヘルパーファージを入れて回収されたファージ粒子は、ＰＥＧ沈殿により分離した。これを、次回のパンニング時にも同様に使用した。３回目のパンニングを行い、このような細胞パンニング過程を図２に示した。回次数が重なるにつれて、パンニング前に比べてパンニング後のファージ粒子の割合が増加することを確認した。これは、細胞パンニングを経て、内在化されたファージ粒子が増幅されることを意味し、その結果を表１に示した。
【０１１１】
【表１】
2019524057.tif 000003
【０１１２】
実施例２．抗−ＮＲＰ１抗体断片候補の選別のためのＥＬＩＳＡおよび配列分析
３回目の細胞パンニングで回収されたファージ粒子を、宿主細胞（ＥＲ２５３７）感染により培養培地でコロニーとして確認した。このコロニーを取り、２００μｌのＳＢ／アンピシリン培養培地の入った９６−ウェルプレートに接種した後、３７℃で２−３時間培養した。
【０１１３】
次に、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩタンパク質の発現を誘導するために、各ウェルに、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理し、３０℃で一晩培養した。培養したプレートは、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を除去した後、培養細胞の周辺質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）内にあるファージ粒子を回収するために、各ウェル当たり４０μｌのＴＥＳ溶液（２０％ｗ／ｖスクロース、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れ、４℃で３０分間静置することで細胞を溶解させた。その後、０．２ x  ＴＥＳ溶液６０μｌを処理し、４℃で３０分間放置し浸透圧で細胞を分解させた後、プレートを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、上清液のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩタンパク質を得た。
【０１１４】
予め準備したヒトＮＲＰ１タンパク質がコーティングされた９６−ウェルプレートの各該当ウェルに、上記で得られた上清液中の２５μｌを添加した後、１時間室温で結合させてから、ＴＢＳＴと蒸留水を用いて６回洗浄した。その後、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩのＨＡ  ｔａｇに結合し得るＨＲＰが結合された抗−ＨＡ抗体を用いて、室温で１時間結合させた後、さらにＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）と蒸留水を用いて６回洗浄した。ＴＭＢ溶液を用いた発色反応を誘導した後、Ｈ２ＳＯ４溶液で発色反応を止め、Ｏ．Ｄ４５０ｎｍでその値を測定した。
【０１１５】
分析された総クローン数は３８４個であり、このうち４１個のクローン（結合能倍数＞２）が、ヒトＮＲＰ１に対する高い結合能を示した。対照群としてはＢＳＡ溶液が使用され、この４１個のクローンのうち、再確認ＥＬＩＳＡにより、結合能の高い１０個のクローンを選択した。その後、１０個のクローンからファージミドを回収した後、ＤＮＡ配列分析を行い、総６個の異なる配列を有するクローンを選別した。１Ｃ０８と同一の配列である３Ｈ１０を除き、それぞれ異なる配列を有するクローンが選別された。最終的に、３Ｈ１０、１Ａ０３、および４Ｆ１２クローンを抗−ＮＲＰ１抗体断片候補として選択した。３Ｈ１０、１Ａ０３、および４Ｆ１２クローンのアミノ酸配列を表２および表３に示した。
【０１１６】
【表２】
2019524057.tif 000004
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
実施例３．患者由来細胞を用いた内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体の２次同定
実施例１における３回目の細胞パンニングで回収した候補抗体を、実施例１で使用した患者由来細胞が皮下移植されたマウスに腫瘍内投与（ｉｎｔｒａ−ｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注入した。
【０１１９】
２０時間が経過した後、マウスを犠牲にした。癌組織を単細胞単位に分離した後、細胞内に内在化された抗体断片を得て、実施例２の方法と同様にＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１２０】
このような生体内細胞パンニング過程を図３に示した。回次数が重なるにつれて、パンニング前に比べてパンニング後のファージ粒子の割合が増加することを確認した。これは、細胞パンニングを経て、内在化されたファージ粒子が増幅されることを意味し、その結果を表４に示した（単位：ｃｆｕ／ｍｌ）。
【０１２１】
【表４】
2019524057.tif 000006
【０１２２】
実施例４．抗−ＮＲＰ１抗体断片の生産およびＮＲＰ１結合能の確認
ファージミドの基本構成は図４で確認することができる。上記の実施例で使用された宿主細胞ＥＲ２５３７の場合、ｐｈａｇｅ  ｐＩＩＩの前に位置した転写抑制コドン（ａｍｂｅｒ  ｃｏｄｏｎ（ＵＡＧ））を抑制するため、ｓｃＦｖ単独発現が不可能である。したがって、非抑制宿主（ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）である発現菌株（ＴＯＰ１０Ｆ´）を用いて、ファージミドを発現菌株中に形質導入した。その後、ＤＮＡ配列分析により、各ファージミドが突然変異なしに導入された発現菌株であることを確認した。この発現菌株をコロニーとして取った後、ＬＢ／アンピシリン培養培地３ｍｌに接種してから、３７℃で一晩培養した。その後、一晩培養させた培養液３ｍｌを４００ｍｌの培養培地（ＳＢ／アンピシリン）に移し、Ｏ．Ｄ６００で０．５−０．７になるまで培養した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３０℃で一晩培養した。培養液は、遠心分離後に、ＴＥＳ溶液４０ｍｌを用いて発現宿主を溶解させた後、０．２ x ＴＥＳ６０ｍｌを投入して、周辺質中のファージ粒子を回収した。回収した上清液は、０．４５μｍのフィルターで濾過した。濾過された溶液中に存在するｓｃＦｖタンパク質は、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製のために、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｂｅａｄ（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌが添加されて常温で１時間結合された後、重力カラム（ｇｒａｖｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）にパッキングされ、２００ｍＭのイミダゾール溶液を用いて回収した。各クローンの発現および精製の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）により、ｓｃＦｖの大きさが約２８ｋＤａであることを確認した（図５）。
【０１２３】
精製されたｓｃＦｖを用いてＥＬＩＳＡを行い、標的ＮＲＰ１に対する結合能があるかを確認した。ＥＬＩＳＡ（３回繰り返す）で、２００ｎｇのＮＲＰ１タンパク質をコーティングした９６ウェルと、対照群として２００ｎｇのＢＳＡをコーティングした９６ウェルに、各クローン当たり５μｇ／ｍｌレベルで常温で１時間結合させた。その後、０．１％のＴＢＳＴを用いて３回洗浄した後、ＨＲＰが結合されたＨＡ抗体を１時間処理し、再び洗浄してから、ＴＭＢ溶液で５分間静置させた。そして、２Ｍの硫酸溶液で発色反応を停止させた後、ＯＤ値を測定した。
【０１２４】
測定結果、ＮＲＰ１に結合しない１２Ｂ  ｓｃＦｖに比べて、１Ａ０３、３Ｈ１０、および４Ｆ１２  ｓｃＦｖはＮＲＰ１に対する特異的な結合能を示した（図６）。
【０１２５】
次に、各抗体断片の濃度による、ヒトＮＲＰ１に対する結合能を測定するために、それぞれ２００ｎｇのＮＲＰ１またはＢＳＡがコーティングされた９６ウェルに、各ｓｃＦｖを２，０００ｎｇ／ｍｌ、１，０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、または１５．６２ｎｇ／ｍｌの濃度で処理してＯＤ値の変化を分析した。ＮＲＰ１に対する結合能において、１２Ｂ  ｓｃＦｖの場合は、濃度の変化によるＯＤ値の変化がないのに対し、１Ａ０３、３Ｈ１０、および４Ｆ１２  ｓｃＦｖの場合は、高濃度になるにつれて、ＢＳＡに比べてＮＲＰ１に結合したｓｃＦｖが増加することを、ＯＤ値の変化から確認することができた（図７）。
【０１２６】
３種のｓｃＦｖ抗体断片のＮＲＰ１タンパク質に対する結合能の強度を数値化することで正確に調べるために、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ、ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）装備であるｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて、ｋａとｋｄ値を用いた最終的なＫＤ値を得た。ＫＤ値は、ｋｄ値をｋａ値で除した値であって、その値が低いほど、該当物質に対する結合能が大きい。分析結果、４Ｆ１２  ｓｃＦｖの場合、ＫＤ（Ｍ）値が７３．６０Ｘ１０−９と最も低く、１Ａ０３  ｓｃＦｖは８９．４０Ｘ１０−９のＫＤ（Ｍ）値を示し、３Ｈ１０  ｓｃＦｖは２９５．４Ｘ１０−９のＫＤ（Ｍ）値を示した（図８）。
【０１２７】
実施例５．ＮＲＰ１過発現細胞株を用いた抗−ＮＲＰ１抗体断片結合能の確認
ヒトＮＲＰ１タンパク質に対する結合能をＥＬＩＳＡにより確認した後、実際に細胞膜に存在するＮＲＰ１に結合するかを調べるために、ＮＲＰ１の発現が高い患者由来細胞を用いてＦＡＣＳ分析をした。各ｓｃＦｖ当たり５Ｘ１０５個の患者由来細胞と４℃で約１時間結合させた後、ＦＡＣＳ溶液１ｍｌで３回洗浄した。その後、赤色蛍光（ＰＥ；ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ）が結合されたＨＡ抗体１μｇを処理し、４℃で３０分間結合させた。次いで、ＦＡＣＳ溶液１ｍｌで３回洗浄した後、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭシステムを用いて分析した。
【０１２８】
分析結果、ＰＥが結合されたＨＡ抗体と１２Ｂを処理した細胞に比べて、１Ａ０３、３Ｈ１０、および４Ｆ１２などの３種の抗体断片は、何れもＮＲＰ１が過発現された細胞株に特異的に結合していた（図９）。
【０１２９】
実施例６．抗−ＮＲＰ１抗体断片のＮＲＰ１過発現癌細胞への透過能確認
３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の場合、細胞中への透過性を細胞免疫蛍光染色法により確認した。チャンバースライドにＰＤ−リシン溶液を入れ、常温で１−２時間コーティングさせた。その後、溶液を除去した後、スライドを乾燥させた。次に、５Ｘ１０４個の患者由来細胞が入っているＮＢＡ溶液２００μｌをスライドに処理した後、３７℃で４−５時間培養してスライドに固定させた。次に、ＮＢＡ溶液を除去し、４％のパラホルムアルデヒドを入れ、４℃で１０分間固定させた。その後、ＰＢＳで洗浄過程を３回経た後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を処理した細胞の透過度増進作業を行った。その後、ＮＲＰ１タンパク質の染色のために、抗−ヒトＮＲＰ１抗体（Ｒ＆Ｄ）と同時に抗−ＮＲＰ１抗体断片を処理し、３７℃で１５／３０／６０分に分けて結合させた。ＰＢＳで洗浄過程を３回経た後、非特異的な結合を阻止するために、１％のＢＳＡ溶液で室温で１時間程度ブロッキングした。２次抗体としては、ＮＲＰ１タンパク質が見られるように緑色蛍光（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８）が標識された塩素抗−マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理し、抗−ＮＲＰ１抗体断片を見るための抗−ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を処理した後、常温で１時間結合させた。最後に、核を染色するためのＤＡＰＩ染色を行った後、最終洗浄してから、ガラス蓋をスライド上に固定させ、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて観察した。
【０１３０】
その結果、３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片ではいずれも、１５分と３０分では、表面に付いた抗−ＮＲＰ１抗体断片と細胞内に挿入された抗−ＮＲＰ１抗体断片が混在されていたが、６０分程度経過した時には、殆どの抗−ＮＲＰ１抗体断片が細胞中に透過して挿入されたことを確認することができた（図１０ａ〜１０ｃ）。特に、１Ａ０３と３Ｈ１０よりは４Ｆ１２抗体断片が、相対的に細胞透過性が時間の経過にしたがって著しく現われた（図１０ａ）。このような結果は、本発明の抗体を、特定タンパク質の発現を抑制するための物質、または治療／診断用化学薬物などを癌細胞中に伝達させる目的で使用可能であることを示唆する。
【０１３１】
実施例７．抗−ＮＲＰ１抗体断片から抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧへのｔｒａｎｓｆｏｒｍ
抗−ＮＲＰ１抗体断片をＩｇＧ形態に形態転換させるために、ＮＲＰ１抗体断片の重鎖配列と軽鎖配列の遺伝子をＥｘｐｉ  ２９３Ｆ発現システム（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて形質注入した。培養液にある抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体を得るために、ＡＫＴＡタンパク質精製システムとＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いて精製した。生産量は、ＩＲＣＲ−１０１（ＩｇＧ形態に転換した３Ｈ１０）は１２０ｍｇ／Ｌ、１Ａ０３は６６ｍｇ／Ｌ、４Ｆ１２は１５ｍｇ／Ｌであった。精製した抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の純度を確認するために、高速液体クロマトグラフィーを導入した。ＩｇＧの大きさが１５０ｋＤであるため、マーカーピークが１６．３８８分に現れる物質に該当する。３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体がこのピークで検出され、純度は９９．５、９９．４、９９．５％であった（図１３）。生産された３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体のエンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）数値を調べるために、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）ＱＣＬ−１０００ＴＭキットを用いた。分析結果、３種の抗体は０．５−３．１ＥＵ／ｍｇ程度であって、治療用タンパク質のエンドトキシン正常数値に該当した（図１４）。
【０１３２】
３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体を用いて、ヒトＮＲＰ１に対する結合力をＥＬＩＳＡとＳＰＲ  ａｎａｌｙｓｉｓにより分析した結果、１Ａ０３、ＩＲＣＲ−１０１、４Ｆ１２の順に結合力が強いことを確認した。特に、４Ｆ１２の場合、現在の治療用抗体の結合力水準である０．６ｎＭのＫＤ値を有していた（図１５）。ヒトＮＲＰ１と類似の構造を有する他のタンパク質と比較することでヒトＮＲＰ１に対する特異的結合力を分析した結果、３個の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体はいずれもヒトＮＲＰ１にのみ結合することを確認した（図１６）。
【０１３３】
実施例８．抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体の結合エピトープの確認
ＭＮＲＰ１６８５Ａの結合ドメインがＶＥＧＦドメインであるため、ＭＮＲＰ１６８５Ａを陽性対照群として使用した。９６ウェルプレートに、各ウェル当たりｈＮＲＰ１タンパク質をコーティングさせた後、５００ｎＭのＩＲＣＲ−１０１とＭＮＲＰ１６８５Ａを２５℃で１時間結合させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ビオチンを結合させたＶＥＧＦ、Ｓｅｍａ３Ａを常温で１５分間結合させた。
【０１３４】
前記プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ抗体を入れて、ＴＭＢ発色反応をＥＬＩＳＡで確認した結果、ＭＮＲＰ１６８５ＡおよびＩＲＣＲ−１０１は何れもＶＥＧＦ１６５結合ドメイン（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）に結合することを確認することができた（図１１の左側パネル）。
【０１３５】
陽性対照群とＩＲＣＲ−１０１の結合エピトープを確認するために、９６ウェルプレートに、各ウェル当たり２００ｎｇのｈＮＲＰ１タンパク質をコーティングさせた後、５００ｎＭのＩＲＣＲ−１０１とＭＮＲＰ１６８５Ａを２５℃で１時間結合させた後、ＰＢＳＴで洗浄し、ビオチンを結合させてから、ＩＲＣＲ−１０１、ＭＮＲＰ１６８５Ａを常温で１５分間結合させた。
【０１３６】
前記プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体を入れ、ＴＭＢ発色反応をＥＬＩＳＡで確認した結果、対照群とＩＲＣＲ−１０１の結合エピトープが互いに異なることを確認することができた（図１１の右側パネル）。
【０１３７】
実施例９：癌細胞と正常細胞を用いて癌特異的な内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および結合力確認
ｐＨｒｏｄｏＲ  Ｒｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＃ｐ３５３６３）を用いて、３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が癌細胞と正常細胞に内在化される様相を比較した。前記キットの原理は、抗体に発色試料をコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させ、該抗体が細胞外にある際には発色されず、細胞内に入り込んで周囲環境が酸性化すると発色することになることであり、この原理を用いて、該抗体の細胞内在化を確認することができる。３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体にコンジュゲートさせ、患者由来癌細胞と正常細胞であるＨＵＶＥＣ細胞を用いて内在化様相を比較した結果、患者由来癌細胞では、２０分が経過した時から内在化された抗体が観察され始めた（図１７）。
【０１３８】
これに対し、正常細胞であるＨＵＶＥＣ細胞で、４Ｆ１２は、２時間経過時に内在化された抗体が観察され始め、ＩＲＣＲ−１０１、１Ａ０３抗体は、内在化された抗体が発見されなかった。これから、ＩＲＣＲ−１０１、１Ａ０３抗体が、癌細胞特異的な内在化を示すことを確認した（図１８）。
【０１３９】
４℃の結合条件で、ＩＲＣＲ−１０１と既存のＮＲＰ１抗体（ＭＮＲＰ抗体、特許（ＷＯ２０１１１４３４０８）に開示の配列合成により自体製作）を用いて正常細胞と癌細胞に対する結合力の差を比較した。同一の濃度で処理した時に、既存のＮＲＰ１抗体は、癌細胞に比べて正常細胞に対してより大きい結合力を示すのに対し、ＩＲＣＲ−１０１は、癌細胞に特異的な結合力を示すことを確認した（図１９）。
【０１４０】
実施例１０：癌細胞移動とシグナル下位因子調節の確認
膠芽細胞癌細胞株であるＵ８７ＭＧと患者由来細胞を用いて、３種の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体が癌細胞の移動を抑制するかを確認した。各抗体処理後、３７℃で２４時間培養させてから確認し結果、ＩＲＣＲ−１０１、１Ａ０３の場合、両方の細胞で５０％以上の癌細胞移動を抑制しており、４Ｆ１２は、患者由来細胞で４０％程度の癌細胞移動を抑制した（図２０）。
【０１４１】
最終の抗−ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体であるＩＲＣＲ−１０１を用いて、乳癌細胞株であるＭＢＡＭＢ２３１と肺癌細胞株であるＡ５４９を用いて移動抑制（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を観察した結果、濃度毎の癌細胞移動抑制能を確認した。ＩＲＣＲ−１０１（１０ｕｇ／ｍｌ）処理時、乳癌モデルで６０％、肺癌モデルで３０％の癌細胞移動が抑制されることを確認していた（図２１）。
【０１４２】
ＩＲＣＲ−１０１処理時における関連シグナル伝逹物質の変化を調べるために、膠芽細胞腫患者由来の細胞で１５、３０、１２０分にＮＲＰ１、ＡＫＴ、ＥＲＫ変化を免疫ブロット法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により確認した。ＮＲＰ１は、３０分経過した時に完全に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されて見えないことを確認し、ＡＫＴとＥＲＫは、リン酸化されたＡＫＴとＥＲＫが減少することで、これに係るシグナル伝達機構を抑制することを確認した（図２２）。
【０１４３】
実施例１１：Ｉｎ  ｖｉｖｏモデルでＩＲＣＲ−１０１効能評価と標的確認
膠芽細胞癌患者由来細胞を用いて２種の皮下投与モデル（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ）を製作し、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＣＲ−１０１を週３回静脈注射で注入した後、腫瘍サイズを測定した。対照群に比べて３０−４０％の腫瘍サイズを抑制し、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により、ＩＲＣＲ−１０１による細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が増加することをＴＵＮＥＬ  ａｓｓａｙで確認した（図２３）。
【０１４４】
膠芽細胞癌細胞株であるＵ８７ＭＧを用いた皮下投与モデルを製作し、競争抗体としてＭＮＲＰ１６８５Ａ（ＭＮＲＰ１６８５Ａ抗体、特許（ＷＯ２０１１１４３４０８Ａ１）に記載の配列合成により自体製作）とその効能を評価・比較した。５ｍｇ／ｋｇを週２回注入した群で、ＭＮＲＰ１６８５Ａは６０％抑制、ＩＲＣＲ−１０１は８０％の腫瘍成長の抑制を示した（図２４）。
【０１４５】
肺癌細胞株であるＡ５４９を用いた皮下投与モデルを製作し、競争抗体としてＭＮＲＰ１６８５Ａとその効能を評価・比較した。２５ｍｇ／ｋｇを週２回注入した群で、ＭＮＲＰ１６８５Ａは１９％抑制、ＩＲＣＲ−１０１は５７％の腫瘍成長の抑制を示した（図２５）。
【０１４６】
膠芽細胞癌正常位モデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍｏｄｅｌ）で、ＩＲＣＲ−１０１に蛍光物質を標識した後、それを静脈注射で注入し、蛍光強度の経時変化を観察した。１５ｍｉｎ、１ｈｒ、１ｄａｙ、２ｄａｙを観察した結果、１ｄａｙで、腫瘍位置と一致する部位で強く蛍光が発色し、３ｄａｙまで同一位置で蛍光が発色することを確認した（図２６）。
【０１４７】
実施例１２：Ｍｏｎｋｅｙ  ＴＭＡを用いた正常組織における分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）評価
ＩＲＣＲ−１０１の副作用（ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔ）を調べるために、既存のＮＲＰ１抗体（ＭＮＲＰ１６８５Ａ抗体、特許（ＷＯ２０１１１４３４０８Ａ１）に記載の配列合成により自体製作）とそのとともに雄および雌のＭｏｎｋｅｙ  ＴＭＡ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏＡｒｒａｙ）を行った。分析結果、殆どの正常臓器組織で、ＩＲＣＲ−１０１が既存のＮＲＰ１抗体よりも結合が低いか、殆どないことを確認した。したがって、正常組織に対して結合力が低いか、殆どないことから、臨床試験時にＩＲＣＲ−１０１の副作用は低いと予測される（図２７）。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明によるスクリーニング方法は、患者由来細胞を用いることで、患者特異的過発現タンパク質をターゲットする抗体をスクリーニングすることが可能であるだけでなく、本発明によってスクリーニングされた抗体を用いて、患者毎のオーダーメード抗体を製作することができるため、患者毎のオーダーメード治療剤の開発において有用である。また、本発明の方法により選別された抗体またはその抗原結合断片は、今後の臨床での成功可能性が高いと予測される。さらに、本発明によるスクリーニング方法により、内在化される抗体を選別することができるため、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の製作に適した抗体の選別が可能となる。
【０１４９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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