(57)【要約】  本発明は真菌、真菌が感染した植物、真菌によって生成する産物、及び関連する方法に関する。より詳細には本発明は、真菌を選択及び/又は特徴付けするための方法であって、真菌に遺伝子分析を施す工程を含み、遺伝子分析が一つ又は複数の非コードnrDNA領域をシーケンシングする工程、一つ又は複数のタンパク質コード遺伝子領域をシーケンシングする工程、シーケンシングした領域の遺伝的変動を評価する工程、及び任意選択で所望の遺伝的変動を有する真菌を選択する工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌を選択及び/又は特徴付けするための方法であって、真菌を遺伝子分析に供する工程を含み、遺伝子分析が
一つ又は複数の非コードnrDNA領域をシーケンシングする工程、
一つ又は複数のタンパク質コード遺伝子領域をシーケンシングする工程、
シーケンシングした領域の遺伝的変動を評価する工程、及び
任意選択で所望の遺伝的変動を有する真菌を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２】
nrDNAが小サブユニット(SSU)、大サブユニット(LSU)、及び5.8S nrDNAをコードする遺伝子、並びにこれらの断片の一つ又は複数から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
非コードnrDNAがETS、NTS又はITSスペーサーの一つ又は複数から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
非コードnrDNAがITSスペーサーである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質コード遺伝子が高度に保存されていない遺伝子である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質コード遺伝子がtub2遺伝子、tefA遺伝子及びact1遺伝子、並びにこれらの断片の一つ又は複数から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質コード遺伝子がtub2遺伝子である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
真菌が植物の内生菌である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
植物が草類である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
草類が飼料、芝生又はバイオエネルギー用草類である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
草類がビロードキビ-ウロクロア複合群の植物である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
真菌を形態分析に供する更なる工程を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
真菌を代謝分析に供する更なる工程を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
真菌の地理的起源を評価する更なる工程を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真菌、真菌が感染した植物、真菌によって生成する産物、及び関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、一定範囲の産業部門において利用される可能性がある新規な遺伝子及び化合物の、非常に貴重な供給源となる。科学文献は、環境除染及び食品と化粧品の生産におけるそれらの使用以外に、抗生物質、免疫抑制剤、抗がん剤及びコレステロール低下薬の主要供給源である多数種の微生物を与える。内生菌として知られ、生存植物の組織内に存在する、比較的調査されていない微生物群は、社会、及び特に農業に重要な利点をもたらし得る新規な化合物及び遺伝子の非常に多様な供給源となる。
【０００３】
内生菌はそれらの宿主と相利共生関係を形成することが多く、内生菌は、しばしば防御化合物の生成によって宿主に高い適合性をもたらす。同時に宿主植物は内生菌に、保護された環境及び栄養供給の利点をもたらす。
【０００４】
ビロードキビ-ウロクロア(Brachiaria-Urochloa)種複合群のメンバーはイネ科(Poaceae family)の草類に属する。数種のビロードキビ-ウロクロアは市販品種として発売されている経済的に重要な熱帯性飼料草類であり、Ｂ．ブリザンタ(B.brizantha)、Ｂ．デクムベンス(B.decumbens)、Ｂ．ディクティオネウラ(B.dictyoneura)、Ｂ．フミディコラ(B.humidicola)及びＢ．ルジジエンシス(B.ruziziensis)、並びに対応する種間及び種内ハイブリッドを含む。
【０００５】
内部転写スペーサー(ITS)核リボゾームDNA配列データに基づく遺伝子多様性分析は、ウロクロアとビロードキビの間の強いアフィニティーを示し、これらの草類属間の連続階調を示す形態及び解剖試験をサポートする。
【０００６】
種子伝搬内生真菌がＢ．ブリザンタにおいて観察されている。これらの内生菌は、斑点病を引き起こすドレクスレラ種(Drechslera spp.)等の真菌病原体から、ビロードキビ-ウロクロアを保護する際に役割を果たし得る。
【０００７】
ビロードキビ-ウロクロア種複合群の真菌内生菌、及び内生菌の同定法と特徴付け法、並びにビロードキビ-ウロクロア植物改良プログラムにおけるそれらの発生に関する情報及び知識は一般に欠如している。
【０００８】
内生菌の同定と特徴付けは、一般に形態学的特徴付けと分子学的分類分析に基づく。形態学的特徴付けは、顕微鏡の分析、及び培養培地で増殖した内生菌の顕微鏡による構造分析を含む。分子学的分類分析は、主に核リボゾームDNA(nrDNA)中のスペーサー領域の遺伝子配列分析、特にファイロゲノミクスに基づく。しかしながら、nrDNA配列に基づく従来のファイロゲノミクス法は、密接に関連した種の分岐を反映することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Perdomoら(2013).Phialemoniopsis, a new genus of Sordariomycetes;Mycologia 105(2) 398〜421頁
【非特許文献２】Kornerup及びWanscher(1978):Methuen Handbook of Colour、3rd Edition、Methuen London
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本出願の目的は、従来技術に関する一つ又は複数の難点又は欠陥を克服する、又は少なくとも軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ビロードキビ-ウロクロア由来及びその中の新規な内生菌をそれぞれ同定、単離、特徴付け及び接種するための方法を記載し、それらを使用して畜産業の牧草生産を改善するため新規な内生菌-ビロードキビ/ウロクロアの関連を立証することができる。
【００１２】
ビロードキビ-ウロクロア牧草に関する新規な真菌内生菌の発見、特徴付け、及び接種は、世界中の温暖気候内での畜産のための、これらの牧草の変種開発プロセスにおいて役立ち得る。
【００１３】
市販のビロードキビ-ウロクロア牧草の多くは無胞子繁殖アポミクトである。これらの草類は配偶子を必要とせずに種子を介して無性繁殖し、したがって母型遺伝子型が伝わる。
【００１４】
アポミクト繁殖には、真菌内生菌-草類宿主の関連についての研究、及びその使用に関して幾つかの重要な利点がある。ビロードキビ-ウロクロアにおける内生菌の種子伝搬が、実用に関して示唆するところは大きい。種子貯蔵条件が真菌の生存率を低減させないという条件で、真菌は、植物に結合した後、種子を介して自身を永続させることができる。
【００１５】
第一の態様では、本発明は、ビロードキビ-ウロクロア種複合群の植物から精製又は単離した実質的精製又は単離真菌を提供し、前記真菌が植物に接種した際、前記植物は未接種対照植物と比較して改善された疾患及び/又はペスト耐性を有する。
【００１６】
真菌は、本明細書に記載する菌株(即ち単離株)1.1A、菌株3.3A、菌株3.3B、菌株3.3C、菌株4.9A、菌株4.9B、菌株5.1A、菌株5.1B、菌株5.1D、菌株5.1E、菌株7.1A、菌株8.1A、菌株8.1B、菌株8.1C、菌株9.2A、菌株9.2B、菌株9.2C、菌株10.1A、菌株11.1A、菌株12.1A、菌株12.1B、菌株12.1C、菌株12.1D、菌株12.1E、菌株14.1B、菌株14.1C、菌株15.2C、菌株15.2D、菌株15.2Eからなる群から選択されることが好ましい。
【００１７】
真菌はアクレモニウム(Acremonium)種菌株、フィアレモニウム(Phialemonium)種菌株、シンプリシリウム(Simplicillium)種菌株、エメリセロプシス(Emericellopsis)種菌株、又は関連若しくは密接に関連した種の菌株であってよい。理論によって拘束されたくないが、菌株1.1Aはアクレモニウム・スクレロチウム(Acremonium sclerotigenum)種菌株であり、菌株3.3Aはフィアレモニウム・アトログリセウム(Phialemonium atrogriseum)種菌株であり、菌株5.1Bはフィアレモニウム・アトログリセウム種菌株であり、菌株9.2Aはシンプリシリウム種菌株であり、菌株12.1Aはエメリセロプシス種菌株であり、且つ菌株12.1Bはアクレモニウム・スクレロチウム種菌株であると考えられる。したがって好ましい実施形態では、真菌はアクレモニウム・スクレロチウム種菌株、フィアレモニウム・アトログリセウム種菌株(以前はアクレモニウム・アトログリセウム(Acremonium atrogriseum))、シンプリシリウム種菌株、エメリセロプシス種菌株、又は密接に関連した種の菌株であってよい。
【００１８】
代表的試料、即ち菌株1.1A(1.1A)、3.3A(3.3A)、5.1B(5.1B)、9.2A(9.2A)及び12.1A(12.1A)は、2011年6月15日にそれぞれ受託番号V11/011370、V11/011371、V11/011372、V11/011373、及びV11/011374で1/153 Bertie Street、Port Melbourne、VIC3207、オーストラリアのThe National Measurement Instituteに寄託された。
【００１９】
「実質的に精製された」によって、真菌が他の生物を含まないことを意味する。したがって、この用語は例えば無菌培養中の真菌を含む。好ましくは、真菌は少なくとも約90%純粋、より好ましくは少なくとも約95%純粋、更により好ましくは少なくとも約98%純粋、更により好ましくは少なくとも約99%純粋である。
【００２０】
用語「単離された」は、真菌がその本来の環境(例えば、それが天然に存在する場合は天然環境)から除去されたことを意味する。例えば、生存植物内に存在する天然真菌は単離されていないが、天然系中の共存物質の一部又は全体から分離された同じ細菌は単離されている。
【００２１】
その天然環境において、真菌は内生菌である可能性があり、即ち植物内で相利共生的に生存する可能性がある。或いは、真菌は着生菌である可能性があり、即ち植物に結合して又は植物上で増殖する可能性がある。真菌は真菌内生菌であることが好ましい。
【００２２】
本発明の真菌は、その天然環境においてビロードキビ-ウロクロア種複合群の植物に結合し得る。より詳細には、ビロードキビ-ウロクロア種複合群の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ(Brachiaria brizantha)、ブラキアリア・デクムベンス(Brachiaria decumbens)、ブラキアリア・フミディコラ(Brachiaria humidicola)、ブラキアリア・ストロニフェラ(Brachiaria stolonifera)、ブラキアリア・ルジジエンシス(Brachiaria ruziziensis)、ウロクロア・ブリザンタ(Urochloa brizantha)、ウロクロア・デクムベンス(Urochloa decumbens)、ウロクロア・フミディコラ(Urochloa humidicola)、ウロクロア・モサンビセンシス(Urochloa mosambicensis)、ブラキアリア・マルロチ(Brachiaria marlothii)、ブラキアリア・ニグロペデタ(Brachiaria nigropedata)、ウロクロア・ディクティオネウラ(Urochloa dictyoneura)、ウロクロア・オリゴトリカ(Urochloa oligotricha)、ウロクロア・パニコイデス(Urochloa panicoides)、ブラキアリア・オブタシフロラ(Brachiaria obtusiflora)、ブラキアリア・セリフォリア(Brachiaria serrifolia)、ウロクロア・アドベナ(Urochloa advena)、ウロクロア・アレクタ(Urochloa arrecta)、ウロクロア・ブラチュラ(Urochloa brachyura)、ウロクロア・エミニ(Urochloa eminii)、ウロクロア・モリス(Urochloa mollis)、ウロクロア・キサントレウカ(Urochloa xantholeuca)、ウロクロア・オリゴトリカ(Urochloa oligotricha)、ウロクロア・パニコイデス(Urochloa panicoides)、ウロクロア・プランタギネア(Urochloa plantaginea)、ウロクロア・プラチノトア(Urochloa platynota)及びウロクロア・キサントレウカ(Urochloa xantholeuca)、並びにビロードキビ-ウロクロア種複合群の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される。
【００２３】
特に好ましい実施形態では、ビロードキビ-ウロクロア複合群は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクムベンス、ブラキアリア・フミディコラ及びウロクロア・モサンビセンシスからなる群から選択される。
【００２４】
本文脈における「結合した」によって、真菌が植物上、植物内又は植物と非常に密に生存することを意味する。例えば真菌は、例えば植物の内部組織内に生存する内生菌である可能性があり、又は例えば植物上外部で増殖する着生菌である可能性がある。
【００２５】
真菌は増殖に有機炭素を使用する従属栄養菌、より詳細には残渣・残骸（detritus）を消費することによって栄養を得る腐生菌であり得る。
【００２６】
更なる態様では、本発明は、本明細書で前に記載した真菌を接種した植物を提供し、前記植物は前記真菌を安定的に感染させた無真菌宿主植物を含む。真菌が結合した植物は、未接種対照植物と比較して改善されたペスト及び/又は疾患耐性を有することが好ましい。好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は殺虫又は防虫活性を含む。更なる好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は抗真菌活性を含む。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明に従い2つ以上の真菌菌株を宿主植物に接種することができる。
【００２８】
植物は、草類種、好ましくは飼料、芝生又はバイオエネルギー用草類等の農作植物、例えばブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクムベンス、ブラキアリア・フミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ブラキアリア・ルジジエンシス、Ｂ．ディクティオネウラ、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクムベンス、ウロクロア・フミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシスを含めたビロードキビ-ウロクロア種複合群（パニックグラス（キビ属の草類））に属する植物、並びにビロードキビ-ウロクロア種複合群の種間及び種内ハイブリッド、並びにホソムギ(L. perenne)ペレニアルライグラス(perennial ryegrass)及びＬ．アルンディナセウム(L. arundinaceum)トールフェスク(tall fescue)及びネズミムギ(L. multiflorum)イタリアンライグラス(Italian ryegrass)を含めたドクムギ及びフェスク(Lolium and Festuca)属に属する植物であることが好ましい。
【００２９】
接種、繁殖、交配、ハイブリダイゼーション及びこれらの組合せからなる群から選択される方法によって、真菌を植物に感染させることが好ましい。
【００３０】
真菌感染植物は周知の技法によって培養することができる。当業者は、培養する植物に応じて適切な培養条件を容易に決定することができる。
【００３１】
更なる態様では、本発明は、植物、本発明の植物に由来し本発明の真菌を安定的に感染させた、植物種子又は他の植物部分を提供する。真菌が結合した植物、植物種子又は他の植物部分は、未接種対照植物、植物種子又は他の植物部分と比較して改善されたペスト及び/又は疾患耐性を有することが好ましい。好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は殺虫又は防虫活性を含む。更なる好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は抗真菌活性を含む。
【００３２】
好ましくは、植物細胞、植物、植物種子又は他の植物部分は、草類、より好ましくは飼料、芝生又はバイオエネルギー用草類、例えばブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクムベンス、ブラキアリア・フミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ブラキアリア・ルジジエンシス、Ｂ．ディクティオネウラ、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクムベンス、ウロクロア・フミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシスを含めたビロードキビ-ウロクロア種複合群(パニックグラス)に属する植物、並びにビロードキビ-ウロクロア種複合群の種間及び種内ハイブリッド、ブラキアリア・ルジジエンシス×ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・ルジジエンシス×ブラキアリア・デクムベンス、[ブラキアリア・ルジジエンシス×ブラキアリア・デクムベンス]×ブラキアリア・ブリザンタ、[ブラキアリア・ルジジエンシス×ブラキアリア・ブリザンタ]×ブラキアリア・デクムベンス間の種間ハイブリッド等、並びにホソムギ(ペレニアルライグラス)及びＬ．アルンディナセウム(トールフェスク)及びネズミムギ(イタリアンライグラス)を含めたドクムギ及びフェスク属に属する植物に由来する。
【００３３】
「植物細胞」によって、半透膜によって区切られたプラスチドを含有する任意の自己繁殖細胞を意味する。更なる繁殖が望まれる場合、このような細胞は細胞壁も必要とする。本明細書で使用する植物細胞は、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を非制限的に含む。
【００３４】
更なる態様では、本発明は、前記真菌を安定的に感染させた植物を生成するための、本明細書で前に記載した真菌の使用を提供する。真菌が結合した植物は、未接種対照植物と比較して改善されたペスト及び/又は疾患耐性を有することが好ましい。好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は殺虫又は防虫活性を含む。更なる好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は抗真菌活性を含む。
【００３５】
本発明の更なる態様では、植物におけるペスト及び/又は疾患耐性を増大する方法を提供し、前記方法は本明細書で前に記載した真菌を前記植物に接種する工程を含む。真菌が結合した植物は、未接種対照植物と比較して改善されたペスト及び/又は疾患耐性を有することが好ましい。好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は殺虫又は防虫活性を含む。更なる好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は抗真菌活性を含む。
【００３６】
本発明の更なる態様では、
複数の真菌の試料を提供する工程、
前記真菌に遺伝子分析を施す工程、
前記真菌に代謝分析を施す工程、及び
所望の遺伝子及び代謝プロファイルを有する真菌を選択する工程
を含む方法によって、真菌を選択及び/又は特徴付けすることができる。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明のこの態様は、真菌の地理的起源を評価し、所望の遺伝子及び代謝プロファイル及び所望の地理的起源を有する真菌を選択する更なる工程を含み得る。
【００３８】
好ましい実施形態では、
真菌を含有し得る複数の植物試料を提供する工程、及び
前記植物試料から真菌を単離する工程
を含む方法によって、複数の真菌の試料を提供することができる。
【００３９】
好ましい実施形態では、遺伝子分析は、単純反復配列等の多型マーカーの有無を検出する工程を含む。
【００４０】
本出願人は、SSRマーカー等のマーカーを用いた植物内の真菌の特異的検出は、多様な草類集団中の真菌遺伝子多様性を有効に評価するためのツール、及び新規な真菌菌株の発見の可能性をもたらしたことを発見した。
【００４１】
「複数の」内生菌試料又は植物試料によって、個々の真菌内生菌の遺伝子プロファイルと代謝プロファイルの比較を可能にするのに充分な数を意味する。約10個と1,000,000個の間の内生菌試料又は植物試料、より好ましくは約100個と1,000個の間の内生菌試料又は植物試料を提供することが好ましい。
【００４２】
「遺伝子分析」によって、内生菌の核及び/又はミトコンドリアDNAの分析を意味する。
【００４３】
この分析は、単純反復配列(SSR)又は交配型マーカー等の、多型マーカーの有無を検出する工程を含み得る。マイクロサテライトとも呼ばれるSSRは、タンデムリピート状態の1〜7のヌクレオチドコアエレメント、より典型的には1〜4のヌクレオチドコアエレメントをベースとする。SSRアレイは複雑な隣接DNA配列中に埋まっている。マイクロサテライトは複製でスリップする性質が原因で生じると考えられ、その中でDNAポリメラーゼ酵素が機能停止し、その鋳型に対して一時的にスリップし、その結果短い隣接配列が反復される。幾つかの配列モチーフは他のモチーフよりスリップする傾向が高く、異なるモチーフ型に基づきSSR遺伝子座の相対数の変動が生じる。複製後、更なるスリップ及び/又は不均一な姉妹染色分体交換が原因で、SSRアレイが更に膨張(又は収縮)する可能性がある。SSR部位の全体数は多く、したがって原則として、このような遺伝子座は任意の連結遺伝子用のタグを与えることができる。
【００４４】
SSRは反復数の変動が原因で非常に多型であり共優性遺伝する。それらの検出は、ごく少量のDNAを必要とし自動化に適したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく。SSRは真核生物ゲノム中に偏在し、真菌ゲノム中及び植物ゲノム中に発生することが分かっている。したがってSSRは、遺伝子多様性分析、ゲノムマッピング、形質マッピング及びマーカー支援選択等の広範囲の適用例に理想的なマーカーである。
【００４５】
代替的、又は追加的に、遺伝子分析はゲノム及び/又はミトコンドリアDNAをシーケンシングする工程、及び配列比較を実施して真菌間の遺伝的変動（genetic variation、遺伝的多様性）を評価する工程を含み得る。好ましい実施形態では、内部転写スペーサー(ITS)配列を遺伝子分析に使用することができる。
【００４６】
「代謝分析」によって、真菌によって生成された代謝産物、特に毒素の分析を意味する。各真菌用の接種植物を調製し植物中の毒素レベルを測定することによって、これを行うことが好ましい。各真菌用の同系遺伝子型接種植物を調製し植物中の毒素レベルを測定することによって、これを行うことがより好ましい。
【００４７】
「所望の遺伝子及び代謝プロファイル」によって、真菌が宿る、又は他の場合真菌が結合した植物において有益な表現型をもたらす遺伝子及び代謝特性を、真菌が含むことを意味する。
【００４８】
このような有益な性質は、真菌が結合した植物における改善された水及び/又は栄養ストレス耐性、並びに改善されたペスト及び/又は疾患耐性を含む。好ましい実施形態では、有益な性質は殺虫又は防虫活性を含む。更なる好ましい実施形態では、改善されたペスト及び/又は疾患耐性は抗真菌活性を含む。
【００４９】
例えば、植物におけるペスト及び/又は疾患耐性を、真菌内生菌を含有しない未接種植物と比較して、少なくとも約5%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約100%増大することができる。好ましくは、植物におけるペスト及び/又は疾患耐性を、真菌内生菌を含有しない未接種植物と比較して、約5%と約50%の間、より好ましくは約10%と約25%の間増大することができる。
【００５０】
代替的、又は追加的に、主に遺伝子分析に基づいて真菌を選択及び/又は特徴付けすることができる。
【００５１】
したがって更なる態様では、本発明は、真菌を選択及び/又は特徴付けするための方法であって、前記方法は真菌に遺伝子分析を施す工程を含み、遺伝子分析が
一つ又は複数の非コードnrDNA領域をシーケンシングする工程、
一つ又は複数のタンパク質コード遺伝子領域をシーケンシングする工程、
シーケンシングした領域の遺伝的変動を評価する工程、及び
任意選択で所望の遺伝的変動を有する真菌を選択する工程
を含む方法を提供する。
【００５２】
nrDNAによって非リボソームDNAを意味する。真核生物nrDNAは、遺伝子コード小サブユニット(SSU)、大サブユニット(LSU)、及び5.8S nrDNAを含む。SSUとLSUnrDNAは2つの外部転写スペーサー(ETS)、及び非転写スペーサー(NTS)、非コード領域によって隔てられる。5.8S rDNAは2つの内部転写スペーサー(ITS1及びITS2)非コード領域中に埋まっている。
【００５３】
したがって非コードnrDNAはETS、NTS又はITSスペーサーであり得る。好ましい実施形態では、非コードnrDNAはITSスペーサーである。
【００５４】
タンパク質コード遺伝子は特に限定されないが、高度に保存されていない遺伝子であることが好ましい。タンパク質コード遺伝子によって密接に関連した種の識別を助長することができ、これらの種は保存状態のタンパク質コード遺伝子領域中の実質的又は全体同一性によって特徴付けられる。一つ又は複数、例えば2つ又は3つ又はそれより多くのタンパク質コード遺伝子をこの方法用にシーケンシングすることができる。
【００５５】
適切なタンパク質コード遺伝子候補は、tub2遺伝子(β-チューブリン生合成用)、tefA遺伝子(翻訳伸長因子1)及びact1遺伝子(アクチン生合成用)を含む。好ましい実施形態では、タンパク質コード遺伝子はtub2遺伝子である。
【００５６】
シーケンシングは、周知の技法、即ちPCRによる増幅及びSangerシーケンシング技法によって実施することができる。当業者は、適切な方法及び条件を容易に決定することができる。非コードnrDNA領域のシーケンシング及びタンパク質コード遺伝子領域のシーケンシングは、最大全ゲノムを含めた他のDNAのシーケンシングを含み得る。したがって、nrDNA及び/又はタンパク質コード遺伝子領域はそこから抽出することができる。
【００５７】
非コードnrDNA及び/又はタンパク質コード遺伝子の領域は、非コードnrDNA又はタンパク質コード遺伝子全体である可能性があり、又はそれらの断片であり得る。例えばITSスペーサーに関して、その領域はスペーサー全体である可能性があり、又はそれらの断片であり得る。同様にtub2遺伝子に関して、その領域は遺伝子全体である可能性があり、又はそれらの断片であり得る。適切な断片サイズは特に限定されておらず、非コードnrDNA又はタンパク質コード遺伝子、及び幾つかの要因、即ちPCR用プライマーの選択等に依存し得る。好ましくは、断片は少なくとも20ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、及びより好ましくは少なくとも200ヌクレオチドのサイズを有する。好ましい実施形態では、非コードnrDNA及びタンパク質コード遺伝子の領域は、それぞれほぼ非コードnrDNA及びタンパク質コード遺伝子全体である。
【００５８】
シーケンシングした領域の遺伝的変動の評価は、別の真菌の同じ領域又はその一部分の配列に対する、シーケンシングした領域の比較を通常含む。他の真菌は、同じであるか又は異なる真菌、例えば密接に関連した真菌、又は同じ若しくは類似起源の真菌であってよい。別の真菌の同じ領域又はその一部分の配列は同じ方法で、即ちそれらの領域をシーケンシングすることにより得ることができる。代替的、又は追加的に、別の真菌の同じ領域又はその一部分の配列は、既存のリソース、例えば配列データのデータベースから得ることができる。比較は例えば配列アライメントによる比較であってよい。
【００５９】
変動の程度は全又は無、又はその間の任意の量であってよい。例えば、別の真菌の同じ領域又はその一部分の配列と比較すると、比較領域がそれぞれ実質的に同一又は同一であるように、変動がほとんどない又は変動がない可能性がある。逆に、比較領域間に全く同一性がないように、変動が完全である可能性がある。非コードnrDNA及びタンパク質コード遺伝子の領域の変動の程度は個々に異なる可能性がある。
【００６０】
変動の程度を使用して真菌を特徴付けする、例えば真菌をクレードに割り当てる、又はそれを分類群に指定することができる。特徴付けは新種の割り当ても含み得る。
【００６１】
所望の遺伝的変動を有する真菌を、例えば更なる分析又は適用例に選択することもできる。所望の遺伝的変動は例えば完全な変動、変動がほとんどないこと、又は変動がないことであり得る。例えば、別の真菌、例えば真菌が宿る、又は他の場合真菌が結合した植物において有益な表現型をもたらす遺伝子及び代謝特性を含む真菌との密接な関係を示すため、変動がほとんどない又は変動がないことが望ましい可能性がある。
【００６２】
したがって真菌は、植物、例えば草類の内生菌であり得る。植物は、本明細書で前に記載した飼料、芝生又はバイオエネルギー用草類、より好ましくはビロードキビ-ウロクロア複合群の植物であることが好ましい。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、真菌に形態分析を施す更なる工程を含むことができる。形態分析によって、真菌又はその一部の形態又は形状の研究を意味する。好ましい実施形態では、形態分析は比較形態分析であり得る。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、真菌に代謝分析を施す更なる工程を含むことができる。「代謝分析」によって、真菌によって生成された代謝産物、特に毒素の分析を意味する。各真菌用の接種植物を調製し植物中の毒素レベルを測定することによって、これを行うことが好ましい。各真菌用の接種植物を調製し植物中の毒素レベルを測定することによって、これを行うことがより好ましい。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、真菌の地理的起源を評価する更なる工程を含むことができる。好ましい実施形態では、この方法は、真菌の地理的起源を評価し、所望の遺伝子及び代謝プロファイル及び所望の地理的起源を有する真菌を選択する、更なる工程を含むことができる。
【００６６】
更なる態様では、本発明は本明細書で前に記載した真菌を培養する方法を提供し、前記方法は、炭水化物源、例えばデンプン/糖ベース寒天又はブロス、ポテトデキストロース寒天若しくはポテトデキストロースブロス等、又はシリアルベース寒天若しくはブロス、オートミール寒天若しくはオートミールブロス等を含む培地上で、前記真菌を増殖する工程を含む。
【００６７】
真菌は好気的条件又は嫌気的条件下で培養することができる。
【００６８】
特に好ましい実施形態では、ポテトデキストロース又はオートミール、例えばポテトデキストロース寒天、オートミール寒天、ポテトデキストロースブロス又はオートミールブロスを含む培養培地上で、真菌を培養することができる。
【００６９】
約1〜約100日、より好ましくは約10〜約50日、より好ましくは約10〜約30日の間、真菌を培養することができる。
【００７０】
好ましい実施形態では、バイオリアクター内で真菌を培養することができる。「バイオリアクター」によって、生物活性環境をサポートするデバイス又はシステム、本発明の真菌及び/又はその生成物に関する化学反応プロセスをその中で実施する容器等を意味する。化学反応プロセスは好気的又は嫌気的であってよい。バイオリアクターは、ミリリットル〜立方メートル、例えば約50ml〜50,000リットルの大きさの範囲の体積を有し得る。バイオリアクターは、バッチ培養、バッチフィード培養、灌流培養又は連続培養、例えば攪拌タンクバイオリアクター内での連続培養によって操作することができる。バイオリアクター内で培養する真菌は懸濁状態又は固定状態であってよい。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、細胞内組織を含めた真菌細胞内から、培養培地(例えば分泌液)から、又は培養培地又は真菌に付随した空間(例えば分泌蒸気)から、真菌によって生成された有機化合物を回収する更なる工程を含むことができる。
【００７２】
蒸気は真菌から直接生じる、又は蒸気と液相の間に転移する分泌液から生じる可能性がある。
【００７３】
有機化合物を回収する工程は、培養培地からの細胞の分離、又は培養培地若しくは真菌に付随した蒸気の捕捉によって行うことが好ましい。
【００７４】
したがって有機化合物は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、分別蒸留及び吸収クロマトグラフィー、圧力振動吸収等からなる群から選択される方法によって単離又は精製することが好ましい。
【００７５】
「有機化合物」によって、その分子が炭素を含有する化学化合物を意味する。
【００７６】
好ましい実施形態では、有機化合物は殺虫活性又は防虫活性を有し得る。特に好ましい実施形態では、有機化合物はペラミン、又はそのアナログ、誘導体又は塩であってよい。
【００７７】
「誘導体」によって、本発明の化合物から得た、又は本発明の化合物から誘導されたとみなされる有機化合物を意味する。誘導体の例には、一つ又は複数の結合の飽和度が変化した(例えば、単結合が二重結合又は三重結合に変化した)、又は一つ又は複数の原子が異なる原子若しくは官能基によって置換された化合物がある。異なる原子及び官能基の例は、非制限的に、水素、ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミン、アミド、ケトン及びアルデヒドを含み得る。
【００７８】
前記有機化合物は、本明細書で前に記載した方法によって生成することが好ましい。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明の真菌から有機化合物を得ることができる。
【００８０】
本発明の他の更なる態様では、殺虫剤又は防虫剤としての本発明による有機化合物の使用を提供する。
【００８１】
本発明の他の更なる態様では、抗真菌化合物としての本発明による有機化合物の使用を提供する。
【００８２】
本発明の更なる態様では、有機化合物を生成する方法を提供し、前記方法は、前記有機化合物を生成するのに適した条件下で、本明細書で前に記載した真菌を培養する工程を含む。その条件は、本明細書で前に記載した条件であることが好ましい。
【００８３】
有機化合物はペラミン、又はそのアナログ、誘導体又は塩であることが好ましい。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、本明細書で前に記載した真菌によって生成された有機化合物を回収する、更なる工程を含むことができる。
【００８５】
前述の寄託に基づいて、菌株1.1.A(1.1A)、3.3.A(3.3A)、5.1.B(5.1B)、9.2.A(9.2A)及び12.1.A(12.1A)からなる群から選択される真菌の全体ゲノムを参照により本明細書に組み込む。
【００８６】
したがって更なる態様では、本発明は、本発明の有機化合物の生成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子、例えば前記有機化合物の合成をもたらす一つ又は複数の生化学的経路由来の酵素をコードする遺伝子を含む核酸を同定する工程及び/又はクローニングする工程を含む。
【００８７】
「生化学的経路」によって、2つ以上の酵素又は酵素サブユニットによって触媒され基質の生成物への転換をもたらす、細胞内で起こる複数の化学反応を意味する。これは例えば、(それぞれが別の遺伝子によってコードされる別個のタンパク質である)2つ以上の酵素サブユニットが組合わさり、基質を生成物に転換するプロセッシングユニットを形成する状況を含む。「生化学的経路」は時間的又は空間的連続性によって制約されない。
【００８８】
このような遺伝子をコードする核酸を同定する及び/又はクローニングするための方法は当業者には知られており、cDNA又はゲノムライブラリー等の核酸ライブラリーの作製、及び例えば前記有機化合物に関する生化学的経路由来の酵素をコードする遺伝子用のプローブを使用した、このようなライブラリーのスクリーニング、又は例えば化学的又はトランスポゾン突然変異誘発を使用した、本発明の真菌のゲノムの突然変異、本発明の有機化合物の生成の変化の確認、及びしたがって前記有機化合物に関する生化学的経路由来の酵素をコードする遺伝子の同定を含む。
【００８９】
したがって、本発明の更なる態様では、本発明の有機化合物の生成に関与するポリペプチドをコードする実質的に精製又は単離された核酸を提供する。
【００９０】
好ましい実施形態では、核酸はペラミン、又はそのアナログ、誘導体又は塩の生成に関与するポリペプチドをコードし得る。
【００９１】
好ましい実施形態では、核酸はグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードする遺伝子、又はその機能活性断片若しくは変異体を含み得る。特に好ましい実施形態では、核酸は本明細書において配列ID番号2、3、4、5及び6で示す配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、並びにその機能活性断片及び変異体を含み得る。
【００９２】
好ましい実施形態では、核酸はperA遺伝子、又はその機能活性断片若しくは変異体を含み得る。特に好ましい実施形態では、核酸は本明細書において配列ID番号8、9及び10で示す配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、並びにその機能活性断片及び変異体を含み得る。
【００９３】
「核酸」によって、遺伝情報を伝えることができるヌクレオチド鎖を意味する。一般的に、この用語は、遺伝子又はその機能活性断片若しくは変異体、及び/又はその表現型に影響を与える生物のゲノム中の他の配列を指す。用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖であり、合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基、合成核酸及びこれらの組合せを任意選択で含有する、(cDNA又はゲノムDNA等の)DNA及び(mRNA又はマイクロRNA等の)RNAを含む。
【００９４】
「本発明の有機化合物の生成に関与するポリペプチドをコードする核酸」によって、本発明の有機化合物の合成をもたらす経路における工程を触媒する、本発明の真菌中に通常存在する酵素をコードする核酸を意味する。
【００９５】
本発明は、本発明の核酸の機能活性断片及び変異体を包含する。核酸に関する「機能活性」によって、(アナログ、誘導体又は突然変異体等の)断片又は変異体が、例えば有機化合物の合成をもたらす経路に関与することができる酵素に転換することによって、本発明の有機化合物の合成を操作する能力があることを意味する。このような変異体は、対立遺伝子変異体及び非天然変異体を含む。修飾が断片又は変異体の機能活性の消失をもたらさない限り、一つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び誘導体化が企図される。機能活性断片又は変異体は、断片又は変異体が相当する前述した配列の関連部分と少なくとも約80%の同一率、より好ましくは少なくとも約90%の同一率、更により好ましくは少なくとも約95%の同一率、最も好ましくは少なくとも約98%の同一率を有することが好ましい。このような機能活性断片及び変異体は、例えば保存的核酸変化があるものを含む。
【００９６】
断片は少なくとも20ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも200ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500ヌクレオチドのサイズを有することが好ましい。
【００９７】
「保存的核酸変化」によって、遺伝子コードの縮重のため、コードタンパク質中のアミノ酸の保存をもたらす核酸置換を意味する。このような機能活性断片及び変異体は、例えば、対応するアミノ酸配列中の一つ又は複数の残基の保存的アミノ酸置換をもたらす核酸変化があるものも含む。
【００９８】
「保存的アミノ酸置換」によって、同じクラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味し、それらのクラスは以下の通りである:
無極性:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
非電荷極性:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:Lys、Arg、His
【００９９】
他の保存的アミノ酸置換を以下のように行うこともできる:
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトンドナー:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトンアクセプター:Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
【０１００】
本発明の更なる態様では、本発明による核酸を含む遺伝子構築物を提供する。
【０１０１】
「遺伝子構築物」によって、組換え核酸分子を意味する。
【０１０２】
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子構築物はベクターであってよい。
【０１０３】
「ベクター」によって、標的細胞に遺伝物質を伝えるために使用される遺伝子構築物を意味する。
【０１０４】
ベクターは任意の適切な型であってよく、ウイルス性又は非ウイルス性であってよい。ベクターは発現ベクターであってよい。このようなベクターは、染色体、非染色体及び合成核酸配列、例えば植物ウイルスの誘導体、細菌プラスミド、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のTiプラスミドの誘導体、アグロバクテリウム・リゾゲネス由来のRiプラスミドの誘導体、ファージDNA、酵母人工染色体、細菌人工染色体、バイナリー細菌人工染色体、プラスミドとファージDNAの組合せ由来のベクターを含む。しかしながら、標的細胞においてそれが複製可能又は組み込み可能又は生存可能である限り、任意の他のベクターを使用することができる。
【０１０５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、遺伝子構築物はプロモーター及びターミネーターを更に含むことができ、前記プロモーター、遺伝子及びターミネーターは作動可能に連結する。
【０１０６】
「プロモーター」によって、作動可能に連結した核酸配列の転写を誘導するのに充分な核酸配列を意味する。
【０１０７】
「作動可能に連結」によって、核酸とプロモーター等の制御配列が、適切な条件下で、例えば転写アクチベータータンパク質等の適切な分子が制御配列と結合したとき、前記核酸の発現を可能にするように連結していることを意味する。作動可能に連結したプロモーターは関連核酸の上流に位置することが好ましい。
【０１０８】
「上流」によって、核酸に沿った3'->5'方向を意味する。
【０１０９】
プロモーター及びターミネーターは、それらが標的細胞において機能的であるという条件で、任意の適切な型であってよく、標的細胞に内在性であってよく又は外因性であってよい。
【０１１０】
本発明の遺伝子構築物において利用することができる様々なターミネーターも当業者によく知られている。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子又は異なる遺伝子に由来してよい。特に適切なターミネーターはポリアデニル化シグナルである。
【０１１１】
遺伝子構築物は、プロモーター、遺伝子及びターミネーター以外に、核酸の発現に必要な更なるエレメント、例えばベクター骨格、複製起点(ori)、マルチクローニングサイト、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン、抗生物質耐性遺伝子及び他の選択可能マーカー遺伝子[ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nptll)遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hph)遺伝子等]、及びレポーター遺伝子(β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(gusA)等]を異なる組合せで含むことができる。遺伝子構築物は翻訳開始のリボソーム結合部位も含有し得る。遺伝子構築物は発現を増幅するのに適した配列も含み得る。
【０１１２】
当業者は、遺伝子構築物の様々な成分は、前記核酸の発現をもたらすように作動可能に連結することを理解している。本発明の遺伝子構築物の成分を作動可能に連結させるための技法は、当業者にはよく知られている。このような技法は、例えば一つ又は複数の制限酵素部位を含む合成リンカー等の、リンカーの使用を含む。
【０１１３】
遺伝子構築物は、実質的に精製状態又は単離状態であることが好ましい。「実質的に精製状態」によって、遺伝子構築物が、本発明の核酸又はプロモーターが由来した生物の本来存在するゲノム中で、その核酸又はプロモーターと隣接した遺伝子を含まないことを意味する。したがって、この用語は、ベクター中、自己複製プラスミド若しくはウイルス中、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた、又は他の配列と独立に別の分子(例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ消化により生じたcDNA又はゲノム又はcDNA断片)として存在する遺伝子構築物を例えば含む。この用語は、別のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である遺伝子構築物も含む。好ましくは、実質的に精製状態の遺伝子構築物は少なくとも約90%純粋、より好ましくは少なくとも約95%純粋、更により好ましくは少なくとも約98%純粋、更により好ましくは少なくとも約99%純粋である。
【０１１４】
用語「単離状態」は、その本来の環境(例えば、それが天然に存在する場合は天然環境)から物質が除去されたことを意味する。例えば、生存植物中に存在する天然核酸は単離状態ではないが、天然系中の共存物質の一部又は全体から分離した同じ核酸は単離状態である。このような核酸はベクターの一部であり得るか、及び/又はこのような核酸は組成物の一部である可能性があり、このようなベクター又は組成物がその天然環境の一部ではない点で更に単離され得る。
【０１１５】
選択可能マーカー遺伝子を使用し形質転換宿主細胞選択用の表現型形質を得る代替として、形質転換細胞中の遺伝子構築物の存在を、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、組織化学的アッセイ(例えばGUSアッセイ)、ノーザン及びウエスタンブロットハイブリダイゼーション分析等の、当技術分野でよく知られる他の技法によって決定することができる。
【０１１６】
本発明の遺伝子構築物は、任意の適切な技法によって植物又は真菌中に導入することができる。(例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換又は遺伝子標的化により)植物細胞又は真菌細胞中に本発明の遺伝子構築物を組み込むための技法は当業者によく知られている。このような技法は、アグロバクテリウム媒介導入、リゾビウム媒介導入、組織、細胞及びプロトプラストへのエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、生殖器官への注入、未熟胚への注入、及び細胞、組織、カルス、未熟胚及び成熟胚への高速プロジェクタイル導入、バイオリスティック形質転換、Whiskers形質転換、及びこれらの組合せを含む。技法の選択は形質転換する植物又は真菌の型に大きく依存し、当業者によって容易に決定され得る。植物プロトプラストの形質転換には、PEG媒介形質転換が特に好ましい。真菌プロトプラストの形質転換には、エレクトロポレーション及びPEG媒介形質転換が特に好ましい。真菌菌糸の形質転換には、アグロバクテリウム媒介形質転換が特に好ましい。
【０１１７】
本発明の遺伝子構築物を組み込む細胞は以下に記載するように選択することができ、次いで当技術分野でよく知られる技法を使用して、適切な培地で培養し形質転換植物又は真菌を再生することができる。例えば温度、pH等の培養条件は当業者には明らかとなる。生成した植物は、当技術分野でよく知られる方法を使用し有性生殖又は無性生殖させて、連続世代の形質転換植物又は真菌を得ることができる。
【０１１８】
本発明は、本発明の有機化合物の生成に関与する、実質的に精製状態又は単離状態のポリペプチドも提供する。
【０１１９】
好ましい実施形態では、ポリペプチドはペラミン、又はそのアナログ、誘導体若しくは塩の生成に関与し得る。
【０１２０】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは本発明による核酸によってコードされ得る。
【０１２１】
本発明は、本発明のポリペプチドの機能活性断片及び変異体を包含する。本文脈における「機能活性」によって、断片又は変異体が、その断片又は変異体が由来した対応するタンパク質の一つ又は複数の生物学的性質を有することを意味する。修飾が断片又は変異体の機能活性の消失をもたらさない限り、一つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、置換及び誘導体化が企図される。断片又は変異体は、その断片又は変異体が相当する前述した配列の関連部分と少なくとも約80%の同一率、より好ましくは少なくとも約90%の同一率、より好ましくは少なくとも約95%の同一率、最も好ましくは少なくとも約98%の同一率を有することが好ましい。このような機能活性変異体及び断片は、例えば対応するアミノ酸配列中の一つ又は複数の残基の保存的アミノ酸置換があるものを含む。
【０１２２】
断片は少なくとも10アミノ酸、より好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸、より好ましくは少なくとも100アミノ酸、より好ましくは少なくとも200アミノ酸のサイズを有することが好ましい。文脈が他の事を要求する場合を除いて、本明細書で使用する用語「comprise」並びに、「comprising」、「comprises」及び「comprised」等のこの用語の変形は、更なる添加物、成分、整数又は工程を除外することは意図しない。
【０１２３】
本明細書中の任意の従来技術の言及は、この従来技術がオーストラリア若しくは任意の他の管轄範囲における共通一般知識の一部を形成すること、又はこの従来技術が当業者により適切であるとして確認、理解及び認識されることが妥当に予想され得ることを承認する、又は何らかの形で示唆するわけではなく、そのように解釈すべきではない。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
ここで本発明を、添付の実施例と図面を参照しながら、より完全に記載する。しかしながら、以下の記載は単なる例示的なものであり、決して前に記載した本発明の一般性を制限するものとして解釈すべきでないことは理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】主要スコアSSRマーカーを使用したビロードキビ-ウロクロア草種間の遺伝子多様性の主成分分析(PCA)による分析の図である。
【図２】ビロードキビ-ウロクロア草種から真菌内生菌を単離した図である。A.ビロードキビ-ウロクロア草類種由来の内部表面滅菌した若木組織片をポテトデキストロース寒天(PDA)培地上に置き、真菌内生菌を生長させるため暗所において25℃で培養する。B.4週間後、真菌内生菌は若木組織片から生長し、新たなPDA培地に継代培養する。
【図３】ビロードキビ-ウロクロア草種から単離した29の真菌内生菌に関する、核rDNAITS領域の配列分析からの近隣結合法による系統樹の図である。全ITS配列のアライメント後、コンティグの全長は619bpであり120の節減情報部位を含有していた。系統樹中の分岐点の正確性は1000のブートストラップ(bootstrap)再サンプリングによって試験した。枝部分の数字はブートストラップのパーセンテージである。
【図４】ビロードキビ-ウロクロア草種から単離した代表的真菌内生菌の形態の図である。ITS配列分析に基づいて内生菌単離株をグループ分けする。
【図５】種子から発芽したビロードキビ-ウロクロア草の若木に真菌内生菌の菌糸体を接種した図である。A.種子は種皮処理し(挿入図)滅菌する。B.暗中26℃で9日後の種子の発芽。C.若木に内生菌の菌糸体を接種する。D.MS培地上での4週間後、植物を土壌に移す。E.土壌中で生長した7日後の植物。F.温室条件の下、土壌中に樹立した植物を内生菌の存在に関して試験しDNAマーカーベースのアッセイを使用して確認する。
【図６】ビロードキビ-ウロクロア草由来のin vitro再生カルスに単離した継代培養真菌内生菌を接種した図である。A.ビロードキビ-ウロクロア草の分裂組織由来増殖胚カルスの作製。B.ビロードキビ-ウロクロア草のin vitro培養胚カルス由来の組織片。C.新芽(及び根)の再生、次に内生菌接種。D.植物再生。E.MS培地上での4週間後、植物を土壌に移す。F.成熟植物を内生菌の存在に関して試験しDNAマーカーベースのアッセイを使用して確認する。
【図７】対応する真菌内生菌が結合したブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクムベンス、ブラキアリア・フミディコラ及びウロクロア・モサンビセンシスの擬似茎組織試料のLC-MS(ITMS+pESI Full ms[80.00-2000.00])分析後の、全代謝化合物の主成分分析(PCA)プロットの図である。技法用レプリカは一群をなすのが示される。成分1、2及び3は、それぞれ最大19.2%、11.3%及び5.6%の変動率を説明する。
【図８】抽出イオンクロマトグラムを示すウロクロア・モサンビセンシス草-真菌内生菌結合体のLC-MS分析の図である。A.陽イオン抽出。B.ペラミン抽出イオンクロマトグラムm/z248。C.保持時間3.00分での質量分析。
【図９】抗真菌アッセイにおける阻害反応の一例の図である。内生菌単離株9.2Aを、8種の病原体真菌に対する抗真菌活性に関して試験した。
【図１０】5つの真菌内生菌単離株のホモログとアカパンカビ(Neurospora crassa)由来のGAPDH遺伝子のDNA配列アライメントの図である。5つの単離株が属する3つの異なる核rDNAITSグループは以下の通りである。第2ライン-グループ2、第3ライン-グループ3、ライン4、5及び6-グループ1。
【図１１】新規な同一率の3単離株を示すGAPDHタンパク質のアライメントから誘導した、近隣結合法による系統樹の関連セクションの図である。ITSグループ1、2及び3に対応する内生菌をボックスで強調表示する。注釈、このITSグループ内のメンバー間のGAPDHタンパク質のアミノ酸同一率により、ITSグループ1由来の1単離株(12.1.E)のみを系統樹中に示す。
【図１２】ITSグループ1(3.3.A、5.1.B及び12.1.E)由来の単離株由来の相同遺伝子とエピクロエ・フェスカ(Epichloe festucae)perA遺伝子(1_0)のアライメントの図である。
【図１３】3.3A及び選択参照真菌単離株におけるITS領域の部分配列の最尤推定(Maximum Likelihood analysis)によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図１４】3.3A及び選択参照真菌単離株における28S領域の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図１５】3.3A及び選択参照真菌単離株の部分tub2遺伝子配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与える。
【図１６】グループ1型試料単離株3.3Aの形態学的特徴付けの図である。グループ1は、Perdomoら(2013).Phialemoniopsis, a new genus of Sordariomycetes;Mycologia 105(2) 398〜421頁中に記載されたフィアレモニウム・アトログリセウム(Phialemonium atrogriseum)の形態学的記載及び画像と非常によく適合する。
【図１７】1.1A及び選択参照真菌単離株におけるITS領域の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図１８】1.1A及び選択参照真菌単離株における18S領域の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図１９】1.1A及び選択参照真菌単離株における28S領域の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図２０】1.1A及び選択参照真菌単離株におけるtub2遺伝子の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号は分類名の隣に与える。
【図２１】グループ2型試料単離株1.1Aの形態学的特徴付けの図である。1.1Aの形態はＡ．スクレロチゲナム(A. sclerotigenum)型の記載と非常によく適合する。
【図２２】9.2A及び選択参照真菌単離株におけるITS領域の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図２３】9.2A及び選択参照真菌単離株におけるtub2遺伝子の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。各参照に関するGenBank受託番号は分類名の隣に与える。
【図２４】グループ3型試料単離株9.2Aの形態学的特徴付けの図である。この単離株はシンプリシリウム内で形態学的に適合する。
【図２５】12.1A及び選択参照真菌単離株におけるITS領域の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図２６】12.1A及び選択参照真菌単離株におけるtub2遺伝子の部分配列の最尤推定によって作製したブートストラップ共通系統樹の図である。500のブートストラップ複製から60%を超えるブートストラップ値を有する枝部分を、各枝部分の隣に記す。各参照に関するGenBank受託番号及びCBS番号(入手可能な場合)は分類名の隣に与え、TはTYPE菌株を指す。
【図２７】グループ4型試料単離株12.1Aの形態学的特徴付けの図である。形態学的に最もマッチするのは、ITS領域と97%でエメリセロプシス・グラブラである。
【図２８】新規な宿主種への接種後に選択内生菌の植物内分布を決定するためサンプル採取したブラキアリアの器官/組織の図である。
【図２９】ブラキアリア・フミディコラの根及び擬似茎中で内生菌菌株12.1.Bの存在を確認した図である。菌糸体はアニリンブルーで染色し、明視野顕微鏡の下40倍の倍率で調べた。
【実施例１】
【０１２６】
ビロードキビ-ウロクロア草の分子学的特徴付け
ビロードキビ-ウロクロア草種のシードバッチはオーストラリア国内から供給された(Table 1(表1))。このリソースは、草類種複合群ビロードキビ-ウロクロアからの内生菌の発見と特徴付けの基礎となった。
【０１２７】
【表１】
2019524130.tif 000002
【０１２８】
草類種の多様性を特徴付け、ビロードキビ-ウロクロア複合群に対するそれらの割り当てを確認するため、ビロードキビ-ウロクロア由来の単純配列反復(SSR)マーカーを使用して、遺伝子多様性分析を実施した。プライマー対BbUNICAMP001、BbUNICAMP002、BbUNICAMP003、BbUNICAMP004、BbUNICAMP005、BbUNICAMP006及びBbUNICAMP007を選択し(Jungmannら1999)、これらを使用してビロードキビ-ウロクロア種間を増幅した。異なるビロードキビ-ウロクロア種間の倍数性レベルは変化するので、各SSR遺伝子座の対立遺伝子を主に記録し(有/無)、主成分分析(PCA)を実施した(図1)。
【０１２９】
これらのマーカーを使用すると、ビロードキビ-ウロクロア種のそれぞれを効率よく識別された。アポミクト種に関して予想したように、集団内の変化は観察されなかった。ブラキアリア・ブリザンタとブラキアリア・デクムベンスは、ブラキアリア・フミディコラとウロクロア・モサンビセンシスより互いに類似している。2つのブラキアリア・フミディコラ集団、フミディコラ2とは別のフミディコラ1及びウロクロア・モサンビセンシスが存在する。フミディコラ1植物とフミディコラ2植物の遺伝学上別個の性質は、分析したブラキアリア・フミディコラのシードバッチ中に2つの異なる(亜)-種が存在することを示唆する。
【実施例２】
【０１３０】
ビロードキビ-ウロクロア草からの真菌内生菌の単離
ビロードキビ-ウロクロア草由来の真菌内生菌を表面滅菌した若木組織片から単離した(図2)。合計31の真菌内生菌を単離し継代培養した。29の真菌内生菌単離株をin vitro培養における形態分析によって同定した。2つの真菌内生菌単離株(14.1.Aと14.1.D)は更なる分析から除外した。Table 2(表2)は、ビロードキビ-ウロクロア草から単離した真菌内生菌の要約を示す。
【０１３１】
【表２】
2019524130.tif 000003
【実施例３】
【０１３２】
ビロードキビ-ウロクロア草由来の真菌内生菌の遺伝学的特徴付け
内部転写スペーサーITS配列を更なる特徴付けに使用した。内部転写スペーサーITS1及びITS2と5.8Sサブユニットの両方を含む核リボソームDNAの全体領域を、プライマーITS5及びITS4を使用してPCR増幅した(Whiteら1990)。精製したPCR増幅産物は、Sangerのシーケンシング技術を使用してシーケンシングした。単離した継代培養内生菌は、次いでITS配列同一率に基づいてグループ分けした。配列データはBLASTn分析において使用し、NCBIデータベースにおけるマッチを確認した(Table 3(表3))。
【０１３３】
ビロードキビ-ウロクロア草から単離した29の真菌内生菌の系統発生分析によって、核rDNAITS配列に基づき4種の別個のクレードを確認した(図3)。内生菌の形態差異は、これらのITSグループ間と内の両方で存在する(図4)。各クレード内の内生菌単離株は、広範囲の異なる子嚢菌類(Ascomycetes)とマッチした(同一率99%以上)(Table 3(表3))。ビロードキビ-ウロクロア草から単離した内生菌単離株はいずれも、公開データベース内の他の真菌由来の核rDNAITS配列と100%の同一率を示さず、独自の真菌内生菌を単離したことを示した。
【０１３４】
核rDNAITSデータを用いた29の内生菌単離株の分子学的分析によって、植物9.2及び12.1に関して同じ植物内の多数の内生菌菌株の存在を確認した(Table 4(表4))。一宿主植物内での多数の内生菌菌株の存在は、ペレニアルライグラス及びトールフェスク等の他の草類種において常に観察されるわけではなく、ブラキアリアにおける新規な発見を示唆する。
【０１３５】
【表３Ａ】
2019524130.tif 000004
【表３Ｂ】
2019524130.tif 000005
【０１３６】
【表４】
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【実施例４】
【０１３７】
ビロードキビ-ウロクロア草-内生菌結合体の代謝プロファイリング
制御環境内に維持した成熟植物のビロードキビ-ウロクロア草-内生菌結合体に、代謝プロファイリング分析を施した。各シードバッチ由来の3つの個々の植物(生物学的レプリカ)を、植物あたり2つの技法用レプリカで、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を使用して分析した。SSRベース遺伝子多様性分析において確認したフミディコラ1及びフミディコラ2亜群を表す他の植物は、シードバッチ2、4及び8から選択した。凍結-乾燥擬似茎試料を、80%メタノール抽出手順を使用してLC-MS分析用に調製した。
【０１３８】
完全LC-MSデータセットに基づく主成分分析(PCA)によって、分析したそれぞれのビロードキビ-ウロクロア草-内生菌結合体の代謝プロファイルの違いが明らかになる(図7)。それぞれの結合体は別個のクラスターを形成し、種/集団内の変化は限られていることを示す。SSRベース遺伝子分析に関して、2つの別のブラキアリア・フミディコラ集団、残りの集団とは別のクラスターを形成するフミディコラ1試料が存在する。3DPCAプロットは、ブラキアリア・デクムベンスとブラキアリア・ブリザンタの関係は、フミディコラ2とウロクロア・モサンビセンシスの関係と類似した代謝プロファイルを共有することを示す。
【０１３９】
殺虫活性を有することが知られている真菌内生菌由来化合物ペラミンが植物において生成され、したがって、ウロクロア・モサンビセンシス草-真菌内生菌結合体の代謝プロファイルにおいて同定された(図3)。ペラミンの存在はMS(248の質量-電荷比[m/z]で抽出したイオン)によって確認した。試験した全てのウロクロア・モサンビセンシス草-真菌内生菌結合体試料が、内生菌由来殺虫化合物ペラミンを生成した(Table 5(表5)及び図8)。
【０１４０】
【表５】
2019524130.tif 000007
【実施例５】
【０１４１】
ビロードキビ/ウロクロア種複合群から単離した内生菌の抗真菌活性
ある以前の刊行物は、ブラキアリア・ブリザンタから単離した内生菌真菌アクレモニウム・インプリカタム(Acremonium implicatum)における抗真菌活性を報告した(Kelemuら2001)。ここで単離した内生菌における抗真菌活性を調べるため、全29の内生菌真菌を、8つの試験モデル真菌、アルタナリア・アルタナータ(Alternaria alternate)、コレトトリクム・グラミニコラ(Colletotrichum graminicola)、リゾクトニア・セレアリス(Rhizoctonia cerealis)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、ホーマ・ソルグヒナ(Phoma sorghina)、ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea)、バイポラリス・ポルツアセア(Bipolaris portulaceae)及びドレクスレラ・ブリザエ(Drechslera brizae)に対して試験した。ポテトデキストロース寒天を含有するペトリ皿に各内生菌単離株の中心コロニーを接種し、24℃で10日間インキュベートした。試験モデル真菌の2つの接種物を次いで各皿の反対側に配置した。5日間暗所において室温で培養物をインキュベートし、0〜5(0-阻害なし;1-非常に弱い阻害;2-弱い阻害;3-適度な阻害;4-強い阻害;5-非常に強い阻害)のスケールで阻害領域の大きさを目視で評価した。それぞれの内生菌-真菌病原体の組合せに関して、5つのレプリカを記録し、その記録を平均した。内生菌単離株9.2Aは強力な、広範囲の抗真菌活性を示し、ボトリティス・シネレア及びトリコデルマ・ハルジアナム以外の全ての増殖を阻害した(Table 6(表6)、図9)。ITSグループ内の抗真菌活性のレベルには明確な差があり、グループ3(単離株9.2A)が最大、次にグループ2(単離株12.1.Aと12.1.D)及びグループ2(5単離株)が活性を示した。ITSグループ1内の内生菌単離株は、病原体真菌の増殖の最小阻害を示した(Table 6(表6))。
【０１４２】
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
2019524130.tif 000009
【実施例６】
【０１４３】
ビロードキビ-ウロクロア草から単離した真菌内生菌の全ゲノムシーケンシング
Illumina HiSeq2000等のシーケンシングプラットホームを使用した、シーケンシング反応の大量比較化に基づく真菌内生菌の全ゲノムシーケンシングに関する方法が確立している。液体培地内で継代培養しビロードキビ-ウロクロア草から単離した真菌内生菌由来の菌糸体試料から、高品質ゲノムDNAを調製する。それぞれの真菌内生菌菌株由来のDNAは、確立した方法を使用してシーケンシング用に調製する。指数化方式手法を使用して多重に試料をシーケンシングすることができる。Illumina HiSeq2000プラットホームは合成手法によるシーケンシングに基づくものであり、この場合数百万個のDNA断片をガラスフローセルの表面に結合させ、次いでin situで増幅して別個のDNA鎖クラスターを生成する。ポリメラーゼと、各サイクルで1ヌクレオチドのみが取り込まれることを確実にする不活性3'-OH基を有する差次的に蛍光標識した4ヌクレオチドの添加によって、シーケンシングを行う。各塩基の取り込みに画像捕捉を続け、次いで化学的切断して蛍光色素を除去し塩基延長を可能にする。シーケンシングサイクルの終了後、画像オーバーレイにより配列を編集する。編集した配列は、ゲノム構築及び分析前に品質をチェックする。
【０１４４】
Illumina HiSeq2000プラットホームを使用して、5つの内生菌単離株(1.1.A、3.3.A、5.1.B、9.2.A及び12.1.E)をシーケンシングした。各単離株からのペアエンド(paired end)読み取り値をde novoゲノム配列構築用のインプット値として使用した。構築配列の分析によって、同じITSグループ内からの単離株は同様の配列構築特性を示したことが明らかになった(Table 7(表7))。
【０１４５】
【表７】
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【０１４６】
5つの内生菌菌株(1.1.A、3.3.A、5.1.B、9.2.A及び12.1.E)間の多様性のレベルを調べるため、5つの内生菌単離株由来のコンティグを含む配列データベースのBLASTn検索において、クエリとしてアカパンカビのGAPDHcDNA配列を使用することによりGAPDH遺伝子を同定した。ITSグループ間でGAPDH遺伝子配列は多型であったが、グループ内では非常に類似しており(図10)、単離株3.3.A、5.1.B及び12.1.Eが同じ菌株であり得ることを示唆した。GAPDHタンパク質の系統発生分析によって、内部真菌データベース内で、単離株1.1.A、9.2.A及び12.1.Eが属する3つのITSグループは互い及び全ての他の真菌から分岐したことを確認した(図11)。
【０１４７】
ITSグループ1に属する3単離株間の多様性のレベルを更に確かめるため、エピクロエ・フェスカ(Epichloe festucae)ペラミンA遺伝子(perA)(GenBank受託番号BAE06845)と、ITSグループ1の内生菌3.3.A、5.1.B及び12.1.E内の相同遺伝子をアライメントした。ITSグループ1の単離株内で、おそらく異なる菌株を示唆する配列多型を観察した(図12)。
【実施例７】
【０１４８】
分子学的分類及び形態学的分析
分子学的分類のための方法
臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)抽出法により凍結乾燥状態の真菌菌糸体からゲノムDNAを抽出し、そのDNAの質と量は、アガロースゲル電気泳動及びNanoDrop2000分光光度計(Thermo Scientific社)を使用した特異的吸光度測定の両方によって評価した。内部転写スペーサーITS1とITS2及び5.8Sサブユニットの両方を含む核リボゾームDNAの全体領域を、プライマーITS5及びITS4を使用してPCR増幅した。精製したPCR増幅産物を、Sangerシーケンシング技術を使用してシーケンシングした。配列データをBLASTN分析において使用して、NCBIデータベース内のマッチを確認した。
【０１４９】
各真菌DNA試料用に、400bpの大きさのinserts c.を含むペアエンドライブラリーを、標準プロトコール(TruSeq DNA Sample Prep V2 Low Throughput:Illumina Inc社、San Diego、USA)を使用しペアエンドアダプターを用いて調製した。ライブラリーの定量化を、KAPAライブラリー定量化キット(KAPA Biosystems社、Boston、USA)を使用して実施した。ペアエンドライブラリーは、製造者の標準プロトコールに従い、HiSeq2000プラットホーム(Illumina Inc社)を使用して結合アダプター及び分析した配列の性質に従いプールした。生成した全ての配列の読み取り値は、品質統計データを計算しトリミングした読み取り値を数個のfastqファイルに保存するカスタムPythonスクリプトを使用して、品質に基づく読み取り値のフィルタリング及びトリミングによって確認した。
【０１５０】
18S、28S、tub2、及びtefA等のそれぞれの、関心がある遺伝子配列を構築するため、各遺伝子に関してマッチングした読み取り値を、参照として密接に関連した種由来の遺伝子配列を使用するBLASTNによって、各真菌遺伝子に関してトリミングした全ての読み取り値のデータベースから確認し、E値閾値を0.1として定義した。このBLASTアウトプットから、全ての対応するペアエンド読み取り値(フォワードとリバースの両方)をデータベースから抽出し、Linux（登録商標）ベースde novoアセンブラーVelvet ver.1.2.10を使用して遺伝子構築を実施した。21〜61の範囲の異なるハッシュ長(K-merサイズ)を異なる配列読み取り値セットに関して適宜に試験し、最小コンティグ長は常に100bpとして定義した。推定カバレッジの値とカバレッジのカットオフ値は自動設定した。
【０１５１】
各遺伝子に関する全体遺伝子配列の多重アライメントを、ClustaIW及びデフォルトパラメーターを使用して個別に実施した。系統樹配置を再構築するため、MEGA5.2及びデフォルトパラメーター及び500のブートストラップ複製での実施と同様に最尤推定法を使用した。分析中、ギャップ及び欠落データを含有する全ての位置を除外した。
【０１５２】
形態学的分析のための方法
形態学的特徴付けのため、オートミール寒天(OA:30gのオートフレーク、20gの寒天、1Lの蒸留水)、ポテトデキストロース寒天(PDA、Difco Laboratories社)及び麦芽エキス寒天(MEA)において単離株を調べた。培養物は25℃において暗所中でインキュベートした。コロニー径を第9日及び再度第24日に測定した(単離株/培地の組合せあたり3レプリカ)。コロニーの色は生長第24日に決定した。(以下の)記載中、括弧内のカラーコロニーコードは、Kornerup及びWanscher(1978):Methuen Handbook of Colour、3rd Edition、Methuen Londonのコードを指す。顕微鏡で特徴を調べ、油浸(1000倍)を使用して光学顕微鏡(Olympus BX-50)の下乳酸において測定した。
【０１５３】
グループ01-型試料単離株3.3A-分子学的分類
TYPE材料由来の配列を使用した3.3Aに関するITS配列比較によって、87%のカバレッジでフィアレモニウム・アトログリセウムCBS604.67TYPE(NR111521.1)と99%のマッチを得た。MEGA5.2での実施と同様に最尤推定法を使用しITS(図13)、28S(図14)及びtub2遺伝子(図15)の部分配列に基づいて、3.3A真菌菌株及びフィアレモニウム・アトログリセウム及びフィアレモニウム・アトログリセウムの密接に関連した種に関する系統発生関係を再構築した。同様の系統樹配置を各ゲノム領域に関して観察し(図13〜15)、各フィログラムにおいて、真菌菌株3.3AはCBS番号604.67を有する型試料によって示されるフィアレモニウム・アトログリセウム由来の参照配列とクラスタリングした。
【０１５４】
グループ01-型試料単離株3.3A-形態学的記載
OA上のコロニー:9日後に18〜23mm径及び25℃で24日後に57〜62mm径、白い縁を有しフラット、オリーブグレー(7E3)、滲出液なし、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１５５】
PDA上のコロニー:9日後に19〜24mm径及び25℃で24日後に52〜61mm径、粉末状、薄いグレー(7B1)、滲出液なし、裏面ピンク-ブラウン色(7D4)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１５６】
MEA上のコロニー:9日後に22〜27mm径及び25℃で24日後に47〜65mm径、薄色の縁を有し綿毛状、オリーブグレー(28D2)、滲出液なし、裏面チョコレートブラウン色(7F8)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１５７】
PDA及びMEA上で直接上方に生長した着生凝集菌糸において多量の胞子形成。OAにおける生長は非常に異なり、顆粒状の様相、着生菌糸体なし。OA培地の表面に散在した暗色のフィアライド群。菌糸は茶色に色素沈着し、凝集体に融合した。
【０１５８】
着生菌糸の側面から単独(PDA、MEA)又はクラスター(OA上)で生じたフィアライド、フラスコ形状、時折著しく膨張した基底を有し、かろうじて目に見えるカラレット（collarette）を有する。基底で(5-)9-11(-12)×(1-)3〜4μm幅、基底中隔なし。卵形の分生子、滑らかな壁、1-細胞、3-5(-7)×(2.5-)3〜4μm幅、淡色〜薄いブラウン、粘液性頭部(図16)。
【０１５９】
グループ01-型試料単離株3.3A-提案分類名
前述の事項に基づき、提案分類名はフィアレモニウム・アトログリセウムである。
【０１６０】
グループ02-型試料単離株1.1A-分子学的分類
TYPE材料由来の配列を使用した1.1Aに関するITS配列比較によって、85%のカバレッジでアクレモニウム・スクレロチウム[CBS124.42、砂丘の砂由来、TYPE(AJ61772.1)]と100%のマッチ、及び93%のカバレッジでアクレモニウム・エジプチアカム[CBS114785、臨床関連試料、TYPE、(FN706550.1)]と99%のマッチを得た。MEGA5.2での実施と同様に最尤推定法を使用しITS(図17)、18S(図18)、28S(図19)及びtub2(図20)遺伝子の部分配列に基づいて、1.1A真菌菌株及びアクレモニウム・スクレロチウム及び密接に関連したアクレモニウム種に関する系統発生関係を再構築した。ITS配列由来のフィログラムは、アクレモニウム・スクレロチウム、及びアクレモニウム・エジプチアカム、及びアクレモニウム・アルターナタムと1.1Aの充分なアフィニティーを示すが、18S、28S、及びtub2配列のフィログラムはアクレモニウム・スクレロチウムとしての1.1Aの分類状態を明らかに示す。
【０１６１】
グループ02-型試料単離株1.1A-形態学的記載
OA上のコロニー:9日後に32〜33mm径及び25℃で24日後にプレートの端部(85mm径)、綿毛状の薄いブラウン色の着生菌糸体(5B3)、滲出液なし、裏面薄いブラウン色(5B3)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１６２】
PDA上のコロニー:9日後に32〜41mm径及び25℃で24日後に72〜75mm径、綿毛状の白色の着生菌糸体(4A1)、滲出液なし、裏面クリーム色(4A3)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１６３】
MEA上のコロニー:9日後に34〜41mm径及び25℃で24日後に72〜80mm径、綿毛状の薄いクリーム〜サーモン色の着生菌糸体(4A2-5A2)、中心から四方に折れた状態、滲出液なし、裏面薄いオレンジ-ブラウン色(5B6)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１６４】
全ての培地上の着生菌糸において多量の胞子形成。コロニーの古い部分では、菌糸は厚いロープ状に凝集する。挿入膨張細胞を有する幾つかの菌糸は(薄壁の厚膜胞子であり得る)。
【０１６５】
着生菌糸から単独で独占的に生じたフィアライド、細長く、頂点部分に向かって次第に先細る、(19-)26-38(-60)×1〜2μm、基底中隔あり。球状の粘液性頭部で形成された分生子。卵形〜楕円形の分生子(大部分がレモン種子のような形状)、滑らかな壁、1-細胞、3.5-4.5(-5.5)×(1.0-)1.5-2.0(-3.0)μm(図21)。
【０１６６】
グループ02-型試料単離株1.1A-提案分類名
前述の事項に基づくと、提案分類名はアクレモニウム・スクレロチウムであるが、アクレモニウム・スクレロチウム型は更にシリンダー形状の分生子を有し、一方1.1Aはレモン種子形状の分生子を有する。
【０１６７】
グループ03-型試料単離株9.2A-分子学的分類
TYPE材料由来の配列を使用した9.2Aに関するITS配列比較によって、97%のカバレッジでシンプリシリウム・アオガシマエンセ(Simplicillium aogashimaense)[日本国内土壌由来のJCN18167、TYPE(NR111026.1)]と99%のマッチ、及び6つの他のシンプリシリウム種型と96〜97%のマッチを得た。MEGA5.2での実施と同様に最尤推定法を使用しITS(図22)及びtub2(図23)遺伝子の部分配列に基づいて、9.2A真菌菌株及びシンプリシリウム・アオガシマエンセ及び密接に関連したシンプリシリウム種に関する系統発生関係を再構築した。ITS配列由来のフィログラムは、シンプリシリウム・アオガシマエンセと9.2Aの密接な関係を示す。
【０１６８】
グループ03-型試料単離株9.2A-形態学的記載
OA上のコロニー:9日後に29〜32mm径及び25℃で24日後に62〜66mm径、ビロード状、白色の着生菌糸体、滲出液なし、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１６９】
PDA上のコロニー:9日後に32〜43mm径及び25℃で24日後に61〜66mm径、ビロード状、白色、滲出液なし、裏面クリーム-黄色(4A3)及び濃いブラウン色の中心部(9F7)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１７０】
MEA上のコロニー:9日後に28〜32mm径及び25℃で24日後に67〜72mm径、ビロード状、白色、滲出液なし、裏面濃いブラウン色(9F7)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１７１】
着生菌糸体において適度な胞子形成、菌糸凝集は観察せず。
【０１７２】
着生菌糸から右の角度に単独で直接生じたフィアライド、非常に長く細長い、72〜115×0.7〜1.0μm、基底中隔なし。球状の粘液性頭部で形成された分生子。シリンダー形状の分生子、滑らかな壁、1-細胞、3.5〜5.5×1.0〜1.5(-2.0)μm(図24)。
【０１７３】
グループ03-型試料単離株9.2A-提案分類名
前述の事項に基づき、提案分類名はシンプリシリウム種である。それらのフィアライドは記載した他の種よりはるかに長く、9.2Aは密接に関連したシンプリシリウム種である可能性もある。
【０１７４】
グループ04-型試料単離株12.1A-分子学的分類
TYPE材料由来の配列を使用した12.1Aに関するITS配列比較によって、93%のカバレッジでエメリセロプシス・フミコラ[CBS180.56、海藻ヒバマタ属関連、TYPE、(AY632659.1)]と99%のマッチ、98%のカバレッジでアクレモニウム・エクスビアルム[エメリセロプシスとアフィニティーを有するトカゲ関連真菌、TYPE(NR077167.1)]と98%のマッチ、及び93%のカバレッジでエメリセロプシス・グラブラ[CBS119.40、海藻ヒバマタ属関連、TYPE(AY632657.1)]と97%のマッチを得た。MEGA5.2での実施と同様に最尤推定法を使用しITS(図25)及びtub2(図26)遺伝子の部分配列に基づいて、12.1A真菌菌株及びエメリセロプシス種に関する系統発生関係を再構築した。両方のフィログラムによって、12.1Aゲノムの独自の性質を示す類似した配置が明らかとなった。
【０１７５】
グループ04-型試料単離株12.1A-形態学的記載
OA上のコロニー:9日後に33〜39mm径及び25℃で24日後にプレートの端部(85mm径)、粉末状、サーモンピンク色(6A4)、綿毛状白色の着生菌糸体の房あり、滲出液なし、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１７６】
PDA上のコロニー:9日後に36〜38mm径及び25℃で24日後に52〜72mm径、粉末状、サーモンピンク色(6A4)、濃色の中心部(6A3)及び綿毛状白色の着生菌糸体の房あり、滲出液なし、裏面サーモンピンク色(6A7)、完全な縁、可溶性色素生成せず。
【０１７７】
MEA上のコロニー:9日後に29〜32mm径及び25℃で24日後に43〜70mm径、粉末状、グレーがかったピンク色(6B3)、クリーム色部分(5A2)あり、中心から四方に折れた状態、まばらな薄黄色の滴が滲出液を形成、裏面黄色-ブラウン色(5C8)、完全な縁、可溶性色素生成せず。MEA上、コロニーの端部において、分生子柄は頂点の分生子の滴と共に直接上方に生長する。
【０１７８】
全培地の表面上において多量の胞子形成、粘液性の様相を与え、コロニーの古い部分では、菌糸は厚いロープ状に凝集する。
【０１７９】
フィアライド単独、細長く、頂点部分に向かって次第に先細る、(25-)27-33(-39)×1.5〜2μm、基底中隔あり。球状の粘液性頭部で形成された分生子(おそらく鎖中)。様々な形状の分生子、卵形、楕円形又はシリンダー状、滑らかな壁、1-細胞、4.0〜5.5×1.5〜2.0μm(図27)。
【０１８０】
グループ04-型試料単離株12.1A-提案分類名
前述の事項に基づき、提案分類名はエメリセロプシス種、おそらく新規なエメリセロプシス種である。
【実施例８】
【０１８１】
ブラキアリア-ウロクロア宿主植物群への真菌内生菌の接種
ブラキアリア-ウロクロア草種由来の若木(図5)及び再生カルス(図6)に単離し継代培養した真菌内生菌を接種するための方法を開発して、ブラキアリア-ウロクロア草種と(ブラキアリア-ウロクロア複合群内の種を含めた)一定範囲の草類種から単離した内生菌の間での、新規な草類宿主-真菌内生菌結合体の作製を可能にした。
【０１８２】
内生菌の選択
4つのrDNA配列で定義したクレードを表す5つの真菌内生菌を、ブラキアリア-ウロクロア宿主群への接種及び特徴付けの候補として同定した(Table 8(表8))。
【０１８３】
【表８】
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【０１８４】
ブラキアリア宿主群
市販の妥当なブラキアリア-ウロクロア胚形質を含む宿主群を確立し、一宿主遺伝子型への遺伝学上新規で非常に多様な内生菌単離株の接種を可能にした。無菌状態で微生物が存在しない宿主植物への内生菌接種に最適な方法を開発し、高頻度の首尾よい接種を容易にした(即ち、前述の図6と同様)。
【０１８５】
宿主群は、ブラキアリア・ディスタチャ、ブラキアリア・デクムベンス、ブラキアリアのハイブリッド、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・ブリザンタ及びブラキアリア・フミディコラを含めた市販の妥当な広く様々な品種を表す。
【０１８６】
ブラキアリア-ウロクロア宿主群への内生菌の接種
選択した内生菌菌株を宿主群に接種して、ブラキアリア-ウロクロア種-内生菌結合体のマトリックスを作製した。それぞれの内生菌菌株に関して約50回の接種を実施した(Table 9(表9))。多大な産業用途(接種効率)がある市販のブラキアリア種及び内生菌単離株を、このマトリックスを開発する際に優先した。
【０１８７】
【表９】
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【０１８８】
接種後約6カ月で、それぞれの内生菌単離株用の単純配列反復(SSR)マーカー(即ち、それぞれの内生菌のそれぞれのSSR遺伝子座での特異的対立遺伝子サイズ)の診断セットを使用して、それぞれの候補内生菌に関する内生菌接種頻度を決定した。
【０１８９】
首尾よい接種をリボソームDNA配列で定義したクレード1、2及び4由来の代表的内生菌に実施した(Table 10(表10))。Table 10(表10)に関するデータは、接種後3〜6カ月で確認した安定的ブラキアリア-ウロクロア内生菌結合体に関するものである。ブラキアリア-ウロクロア内生菌に特異的なSSRマーカーの診断セットを使用して、植物における内生菌の存在及び同一性を試験する。示すのは、採取した全数の植物から確認した内生菌陽性植物のパーセンテージである。内生菌を単離したブラキアリア-ウロクロア種を明るいグレーで強調表示する。
【０１９０】
【表１０】
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【０１９１】
異なるITSグループを表す内生菌単離株間の変動を観察した。ITS2(12.1.B)>ITS1(5.1.B)>ITS2(1.1.A)>ITS3(12.1.A)>ITS4(9.2.A)。交雑種適合性も観察した。この試験において、単離株5.1.B及び12.1.Bは、適度に適合性がある1.1.A及び12.1.Aと比較してより広範囲の適合性を示す。候補内生菌9.2A(ITS3)に関する結合は確認されなかったが、これは、接種後の植物生存に対するこの内生菌の、観察された有害な影響による可能性が最も高い。
【実施例９】
【０１９２】
植物内のブラキアリア内生菌の物理的性質を決定するための方法
ブラキアリア宿主植物において接種した内生菌の分布
植物内のブラキアリア-ウロクロア内生菌の分布を選択内生菌菌株に関して決定した。他の真菌内生菌が存在する混同効果なしでの、これらの内生菌の分布を特徴付けするため、(前に実施例8中で記載したのと同様に)ブラキアリア-ウロクロア宿主群に単離株を接種した。内生菌菌株5.1.B(ITS1)及び12.1.B(ITS2)の分布は、内生菌接種した成熟ブラキアリア植物の異なる器官/組織における内生菌の存在に関する分子学的分析によって決定した。分析した組織は宿主植物全体を表す。薄茶色根(FR)、白根(WR)、下部擬似茎(LP)、中部擬似茎(MP)、上部擬似茎(UP)、葉(L)、及び利用可能な場合、花部(I)(図28)。
【０１９３】
それぞれの宿主-内生菌の組合せに関して、2〜5の植物を独立に試験した。試料は反復して分析し、それぞれの試料に関して50〜60mg(乾燥重量)の植物材料を使用した。採取した植物材料は凍結乾燥させ、製造者の勧める方法に従いDNeasy植物用96キット(Qiagen社、Hilden、ドイツ)を使用してDNAを抽出した。精製したDNAは-20℃で保存した。
【０１９４】
それぞれの試料に関して、内生菌菌株特異的SSRマーカーを用いた全ゲノムDNA鋳型からのアンプリコン作製によって、内生菌の存在を検出した。5μLのゲノムDNA(5〜10ng)、1×PCRバッファー(Bioline社、ロンドン、UK)、0.2mMの各dNTP(GE Healthcare社、Chalfont St Giles、UK)、0.5UのImmolase(Bioline社)、0.25μMの各プライマー(Applied Biosystems社、Foster City、カリフォルニア、USA;Invitrogen社、Van Allen Way、Carlsbad USA)を含有する20μLの反応混合物においてPCR増幅を実施した。それぞれの反応に関する循環条件は、95℃で10分間、次に94℃で30秒間、初期アニーリング温度(65℃)で60秒間、(サイクルあたり1℃温度を下げる)、及び72℃で1分間の10サイクル、次に94℃で30秒間、最終アニーリング温度(55℃)で60秒間、72℃で1分間の20サイクル、次に72℃で10分間最終延長からなっていた。所定の内生菌陽性及び内生菌陰性植物遺伝子型由来の鋳型を対照として含めた。
【０１９５】
増幅産物を滅菌超純水(Sartorius AG社)で1:10の割合に希釈し、2μLの希釈産物を、ABI3730xl自動式キャピラリー電気泳動プラットホーム(Applied Biosystems社)での分析前に、7.95μLのHi-Diホルムアミド(Applied Biosystems社)及び0.05μLの500LIZ(Applied Biosystems社)サイズ標準と混合した。GeneMapperバージョン3.7ソフトウエア(Applied Biosystems社、2004年)を使用して産物を検出し、内生菌陽性試料は、少なくとも2つの菌株特異的SSRマーカーに特異的な増幅ピークの存在によって確認した。
【０１９６】
選択した候補内生菌の分布をTable 11(表11)中に要約する(組織/器官型に関するコードは図28中に記載する)。内生菌菌株5.1.Bは、主にブラキアリア・フミディコラの根中に位置するようである。内生菌菌株12.1.Bは、試験した宿主植物、ブラキアリア・フミディコラとブラキアリア・デクムベンス全体に分布するようである。花部の更なる特徴付けが、この器官内の内生菌の存在を決定するため必要とされる。
【０１９７】
【表１１】
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【０１９８】
内生菌菌株の存在を検鏡によって更に確認した。擬似茎試料を、Hignightら(1993)によって記載された改変手順を使用して調製した。簡単に述べると、試料を殺傷しCarnoy溶液(6:3:1エチルアルコール:クロロホルム:85%氷酢酸)中に24時間固定し、アニリンブルーで染色し、サリチル酸メチル:エチルアルコールの勾配を使用して浄化した。根の試料を固定し、アニリンブルーで染色した。検鏡によりブラキアリア・フミディコラの根及び擬似茎組織において内生菌菌株12.1.Bを観察した(図29)。
【０１９９】
接種した真菌内生菌の再単離
接種した真菌内生菌5.1.B及び12.1.Bは、擬似茎及び根の組織から直接単離した。5本の若木及び根の材料はそれぞれの内生菌接種ブラキアリア植物から除去し、水道水で洗浄して如何なる目に見える泥も除去した。80%(v/v)エタノールで2分間、次に5%(w/v)NaOCl(漂白液)で5分間、薄層フローキャビネットにおいて組織片を表面滅菌した。その後、組織片を滅菌水で3回すすぎ、如何なる残留漂白液も除去し、放置して滅菌紙(Whatman Qualitative3、9cm径)上で完全に乾燥させ、若木の底部は薄層フローフードの前面に向けた。根の材料と若木の材料の両方を約2mm片に切断し、250mg/lのセフォタキシムを補充したポテトデキストロース寒天培地(PDA)上に下向きに置いた。ペトリ皿は密閉し、25℃で最大4週間インキュベートし、毎日汚染に関してモニタリングした。成長する菌糸体は新たなPDA培地に継代培養し、22℃で暗所においてインキュベートした。菌株の同一性は、ITS配列分析及び菌株特異的SSR分析によって確認する。
【０２００】
本明細書中に開示し定義する本発明が、本文又は図面で言及済み又はそこから明らかな2つ以上の個別の特徴の、全ての他の組合せに及ぶことは理解されよう。これらの異なる組合せの全てが、本発明の様々な他の態様を構成する。
【０２０１】
参考文献
Jungmann, L., A. C. B. Sousa, et al. (2009). Isolation and characterization of microsatellite markers for Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stap. Conservation Genetics 10(6): 1873-1876.
Kelemu, S., White J.F, Jr., et al. (2001). "An endophyte of the tropical forage grass Brachiaria brizantha: Isolating, identifying, and characterizing the fungus, and determining its antimycotic properties." Canadian Journal of Microbiology 47(1): 55-62.
White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications pp. 315-322. Academic Press.
Hignight, K.W., Muilenburg, G.A., van Wijk, A.J.P. (1993) A clearing technique for detecting the fungal endophyte Acremonium sp. in grasses. Biotechnic and Histochemistry 68 (2): 87-90.
【０２０２】
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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