(57)【要約】  本発明は、少なくとも１Ｉ、１１Ａ、１１Ｅ、１１Ｉ、３５Ｒ、３５Ｉ、及び４２Ｌからなる群から選択されたアミノ酸を有する一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質に関する。 本発明はさらに、このＩｇ結合タンパク質を含む親和性マトリックスに関する。 本発明はまた、免疫グロブリンの親和性精製のためのこれらのＩｇ結合タンパク質又は親和性マトリックスの使用、及び本発明のＩｇ結合タンパク質を用いた親和性精製方法に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質において、少なくとも一のＩｇ結合ドメインが、配列番号：１と比較して少なくとも１、２、３又は４個の置換であって、１位におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位におけるアラニン、グルタミン酸又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位におけるアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び４２位におけるロイシンへのアミノ酸置換からなる群から選択された置換を有する、配列番号：１の親アミノ酸配列の変異体を含むことを特徴とする免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質。
【請求項２】
一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質において、少なくとも一のＩｇ結合ドメインが、配列番号：２と比較して少なくとも１、２、３又は４個の置換であって、１位におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位におけるアラニン、グルタミン酸又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位におけるアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び４２位におけるロイシンへのアミノ酸置換からなる群から選択された置換を有する、配列番号：２の親アミノ酸配列の変異体を含むことを特徴とする免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質。
【請求項３】
前記Ｉｇ結合ドメインが、１位におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位におけるアラニン、グルタミン酸又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位におけるアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び４２位におけるロイシンへのアミノ酸置換からなる群から選択された置換を有する、配列番号：３、４、１０、１４、２１、２５、４７、４８，４９及び５０からなる群から選択される親アミノ酸配列の変異体を含む、ことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項４】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：５乃至８のいずれかの親アミノ酸配列の変異体を含み、前記変異体が１位におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位におけるアラニン、グルタミン酸又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位におけるアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び４２位におけるロイシンへのアミノ酸置換からなる群から選択された少なくとも１、２、３又は４個のアミノ酸置換を有する、ことを特徴とする、請求項１に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項５】
前記変異体が、１Ｉ；１１Ａ；３５Ｒ；４２Ｌ；１１Ｅ；１１Ｉ；３５Ｉ；１Ｉ／１１Ａ；１Ｉ／３５Ｒ；１１Ａ／３５Ｒ；１Ｉ／４２Ｌ；１１Ａ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ；１Ｉ／１１Ｉ；１１Ｉ／３５Ｒ；１１Ｅ／３５Ｒ；１１Ｉ／４２Ｌ；１１Ｅ／４２Ｌ；１Ｉ／３５Ｉ；１１Ａ／３５Ｉ；１１Ｉ／３５Ｉ；１１Ｅ／３５Ｉ；３５Ｒ／４２Ｌ；３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ａ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｉ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｉ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｉ；１Ｉ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／３５Ｉ／４２Ｌ；１１Ｉ／３５Ｒ／４２Ｌ；１１Ｉ／３５Ｉ／４２Ｌ；１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ；１１Ａ／３５Ｉ／４２Ｌ；１１Ｅ／３５Ｒ／４２Ｌ；１１Ｅ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／２８Ｎ／３５Ｉ／４２Ｌ；及び１Ｉ／１１Ｅ／２８Ｎ／３５Ｉ／４２Ｌからなる群から選択された置換又は複数の置換を含むことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項６】
３又は４個のアミノ酸位置が１Ｉ位、１１Ａ位、３５Ｒ位、及び４２Ｌ位からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項７】
前記Ｉｇ結合ドメインが、更に１、２、３、４、５、又は６個の修飾を含み、各個々の修飾が単一アミノ酸置換、単一アミノ酸欠失、及び単一アミノ酸挿入からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項８】
一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質において、少なくとも一つのＩｇ結合ドメインが配列番号：５２のアミノ酸配列を含み、５位のアミノ酸がＨ又はＦから選択され、７位のアミノ酸はＫ又はＥから選択され、８位のアミノ酸はＤ、Ａ又はＥから選択され、２５位のアミノ酸はＤ又はＥから選択され、２８位のアミノ酸はＳ又はＮから選択され、４２位のアミノ酸はＬ又はＫ、好ましくはＬから選択され、４４位のアミノ酸はＩ又はＶから選択され、４６位のアミノ酸はＧ又はＡから選択され、４９位のアミノ酸はＫ又はＱから選択され、５４位のアミノ酸はＡ又はＳから選択され、５８位のアミノ酸はＰ又はＫから選択されることを特徴とする、Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項９】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：２０、２６、３０、及び４２乃至４５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、又は配列番号：２０、２６、３０、及び４２乃至４５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項８に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１３】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：４３に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が、互いに結合した２、３、４、５、６、７、又は８個のＩｇ結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質が固相支持体にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｉｇ結合タンパク質が、前記Ｉｇ結合タンパク質の固相支持体への部位特異的共有結合用の付着部位をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載のＩｇ結合タンパク質。
【請求項１８】
前記Ｉｇ結合タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｆｃ領域を含むＩｇフラグメント、ＩｇのＦｃ領域を含む融合タンパク質、及びＩｇのＦｃ領域を含むコンジュゲートに結合することを特徴とする、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質を含むことを特徴とする、親和性分離マトリックス。
【請求項２０】
免疫グロブリンの親和性精製のための、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質、又は請求項１９に記載の親和性分離マトリックスの使用。
【請求項２１】
免疫グロブリンの親和性精製方法において、当該方法が：
（ａ）免疫グロブリンを含む液体を提供するステップと；
（ｂ）親和性マトリックスであって、当該親和性分離マトリックスに結合した請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の少なくとも一つのＩｇ結合タンパク質を含む親和性分離マトリックスを提供するステップと；
（ｃ）前記液体と前記親和性分離マトリックスとを接触させるステップであって、前記免疫グロブリンが前記Ｉｇ結合タンパク質に結合する、ステップと：
（ｄ）前記マトリックスから前記免疫グロブリンを溶出し、これによって前記免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップと；
を具えることを特徴とする、免疫グロブリンの親和性精製方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）と（ｄ）の間に、前記親和性分離マトリックスに非特異的に結合している分子の一部又は全部を、当該親和性分離マトリックスから除去するのに十分な条件下で前記親和性マトリックスを洗浄するステップをさらに具えることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１Ｉ、１１Ａ、１１Ｅ、１１Ｉ、３５Ｒ、３５Ｉ、及び４２Ｌからなる群から選択されるアミノ酸を有する１つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含むアルカリ安定免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質に関する。本発明はさらに、本発明のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を含む親和性マトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンの親和性精製用のこれらのＩｇ結合タンパク質又は親和性マトリックスの使用、及び本発明のＩｇ結合タンパク質を使用した親和性精製方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
バイオテクノロジーや製薬の用途の多くは、抗体を含む試料から汚染物質を除去する必要がある。抗体の捕捉及び精製の確立された手順は、免疫グロブリン用の選択的リガンドとして黄色ブドウ球菌由来の細菌細胞表面タンパク質Ａを使用する親和性クロマトグラフィーである（例えば、Ｈｕｓｅらによる総説、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１、２００２：２１７−２３１を参照）。野生型タンパク質Ａは、高い親和性と選択性でＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合し、高温で、また広範囲にわたるｐＨ値で安定である。アルカリ安定性のような改善された特性を有するタンパク質Ａの変異体は抗体の精製に利用可能であり、タンパク質Ａリガンドを含む種々のクロマトグラフィーマトリックスは市場で入手可能である。しかしながら、特に野生型タンパク質Ａベースのクロマトグラフィーマトリックスは、アルカリ性条件への曝露後に免疫グロブリンに対する結合能の喪失を示す。
【０００３】
［発明が解決しようとする課題］
抗体又はＦｃ含有融合タンパク質の最も大規模な製造工程では、親和性精製用にタンパク質Ａを使用する。しかしながら、親和性クロマトグラフィーにおけるタンパク質Ａので適用に制限があるため、この分野では、免疫グロブリンに特異的に結合する改良された性質を有する新規Ｉｇ結合タンパク質を提供して、免疫グロブリンの親和性精製を容易にすることが必要である。Ｉｇ結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックスの価値を最大限に引き出すためには、親和性リガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい。クロマトグラフィーサイクルの間には、消毒及びマトリックス上の残留汚染物質の除去のために徹底的な洗浄手順が必要とされる。この手順では、高濃度のＮａＯＨを含むアルカリ溶液を親和性配位子マトリックスに塗布するのが一般的な方法である。野生型タンパク質Ａドメインは、このような過酷なアルカリ性条件に長時間耐えることができず、免疫グロブリンに対する結合能を急速に失う。したがって、この分野においては、免疫グロブリンに結合できる新規のアルカリ安定性タンパク質を得ることが継続的に必要とされている。本発明は、免疫グロブリンの親和性精製に特によく適しているが、従来技術の欠点を克服するアルカリ安定性免疫グロブリン結合タンパク質を提供する。特に、本発明のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の重要な利点は、親タンパク質と比較して高いｐＨで安定性が改善されていることである。上記の概説は、必ずしも本発明によって解決される全ての問題を説明するものではない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む親和性精製に適したアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質であって、少なくとも一のＩｇ結合ドメインが、１位又はそれに対応する位置におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位又はそれに対応する位置におけるアラニン、グルタミン酸、もしくはイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位又はそれに対応する位置のアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び４２位又はそれに対応する位置のロイシンへのアミノ酸置換、からなる群から選択された少なくとも１、２、３、又は４つの置換を有する配列番号：１又は配列番号：２の親アミノ酸配列の変異体を含む、親和性精製に適したアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質で達成される。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも一つのＩｇ結合ドメインが配列番号：５２のコンセンサスアミノ酸配列を含むＩｇ結合タンパク質を含む。
第二の態様において、本発明は、第１の態様のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を含む親和性分離マトリックスに関する。
第三の態様において、本発明は、第１の態様のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の使用、又は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンのＦｃ部分を含むタンパク質の親和性精製に関する第二の態様の親和性分離マトリックスの使用に関する。
第四の態様では、本発明は、免疫グロブリン、又は免疫グロブリンのＦｃ部分を含むタンパク質の親和性精製方法であって、（ａ）免疫グロブリンを含む液体を提供するステップと；（ｂ）親和性分離マトリックスに結合した第１の態様の固定アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を含む親和性分離マトリックスを提供するステップと；（ｃ）この液体と親和性分離マトリックスとを接触させるステップであって、免疫グロブリンが固定Ｉｇ結合タンパク質に結合するステップと；（ｄ）このマトリックスから免疫グロブリンを溶出し、それによって免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップと；を具える方法に関する。
本発明のこの要約は、必ずしも本発明の全ての特徴を説明しているわけではない。他の実施形態は、続く詳細な説明を検討することから明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、アルカリ安定Ｉｇ結合ドメインのアミノ酸配列である。１、１１、３５、４２位が灰色で表示されている。最上列の数字は、Ｉｇ結合ドメイン中の対応するアミノ酸位置である。図１Ａは、人工アルカリ安定Ｉｇ結合ドメインのアミノ酸配列である。図１Ｂは、アルカリ安定人工Ｉｇ結合ドメインのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。
【図２】図２は、親ＩＢ１４の点突然変異変異体のアルカリ安定性の分析を示す。１、１１、３５、又は４２位に点突然変異を有する変異体を６時間連続で０．５Ｍ  ＮａＯＨで処理した後のＩｇ結合の残存活性（％）の、親ＩＢ１４との比較である。
【図３】図３は、１、１１、及び３５位、選択的に２８及び４２位に置換を有する親ＩＢ１４の様々な変異体のアルカリ安定性の分析を示す。１、１１、２８、３５、及び／又は４２位（黒の列）における置換の組み合わせに関する６時間連続で０．５Ｍ  ＮａＯＨで処理した後のＩｇ結合の残存活性（％）を、親ＩＢ１４（薄灰色の列）と比較した。ｃｓ１４−１は、配列番号：１８（１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ）であり、ｃｓ１４−２は、（１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ）の配列番号：１９、ｃｓ１４−３は配列番号：２０（１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ）を意味する。
【図４】図４は、１、１１、及び３５位、及び選択的に場合により４２位に３つ又は４つの置換の組み合わせを有する、様々な変異体のアルカリ安定性の分析を示す。変異体Ｉｇ結合タンパク質（黒の列）の６時間の連続０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理後のＩｇ結合の残存活性（％）を、親ＩＢ２７（薄灰色の列）と比較した。ｃｓ２７−１は配列番号：２９（１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ）を意味し、ｃｓ２７−２は配列番号：３０（１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ）を意味する。
【図５】図５は、アルカリ処理後のＩｇ結合ドメインのＩｇ結合活性を示す図である。６時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理後の、エポキシ樹脂上の様々なＩｇ結合ドメインのアルカリ安定性の分析を示す。１１、１１Ａ、３５Ｒ、及び４２ＬのＩｇ結合ドメインが示されている。アルカリ安定性Ｉｇ結合ドメイン：ｃｓ１４−３（配列番号：２０）、ｃｓ７４ｈ１（配列番号：４２）、ｃｓ７４ｈ２（配列番号：４３）、ｃｓ４７ｈ３（配列番号：４４）、及びｃｓ４７ｈ４（配列番号：４５）、ｃｓ２５−２（配列番号：２６）；親ドメイン：ＩＢ１４。
【０００６】
［発明の詳細な説明］
定義
本発明を以下に詳細に記載する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変化するため、これらには限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用されている用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。他に定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０００７】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「多言語のバイオテクノロジー用語：（ＩＵＰＡＣ勧告）」，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．及びＫｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０バーゼル，スイス）において提供されている定義に一致する。
【０００８】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈が必要としない限り、単語「含む」、ならびに「含む」の変形は、記載したメンバー、整数、又はステップ、メンバー、整数、又はステップの群を包含すると理解されるが、その他のメンバー、整数又はステップを排除するものではない。
【０００９】
本発明の説明及び特許請求の範囲で使用する場合、単数形は交換可能に使用され、文脈が明確に示さない限り、複数形を含むとともに、各々の意味を含むことを意図する。また、本明細書で使用する場合、「及び／又は」は、列挙された項目のうちの１つ又は複数のありとあらゆる可能な組み合わせ、並びに代替（「又は」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を意味し、これに及ぶ。
【００１０】
本明細書で使用される「約」という用語は、明示的に列挙された量及びそれからの±１０％の偏差を包含する。より好ましくは、５％の偏差が「約」という用語に包含される。
【００１１】
いくつかの文書（例えば、特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号登録システムなど）が本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書中のいかなるものも、従来の発明によって本発明がこれらの開示に先行する権利がないことの承認として解釈するべきではない。本明細書に引用された文書のいくつかは、「参照により組み込まれる」として特徴付けられている。そのような組み込まれた参考文献の定義又は教示と本明細書に列挙された定義又は教示との間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先される。
【００１２】
本明細書で言及されている全ての配列は、その全内容及び開示とともに、本明細書の一部である添付の配列表に開示されている。
【００１３】
本発明の文脈において、「免疫グロブリン結合タンパク質」又は「Ｉｇ結合タンパク質」又は「免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合することができるタンパク質を説明するために使用される。Ｆｃ領域へのこの特異的結合により、本発明の「Ｉｇ結合タンパク質」は、全免疫グロブリンを、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン断片、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、及び免疫ブロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートに結合させることができる。本明細書の本発明のＩｇ結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ領域への特異的結合を示すが、Ｉｇ結合タンパク質が低い親和性で免疫グロブリンのＦａｂ領域のようなその他の領域へさらに結合できることを排除するものではない。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質が、一又はそれ以上のアルカリ安定Ｉｇ結合ドメインを含む。
【００１５】
用語「解離定数」又は「ＫＤ」は特異的結合親和性を定義する。本明細書中で使用する場合、用語「ＫＤ」（通常、「ｍｏｌ／Ｌ」で測定され、時に「Ｍ」と略される）は、第１のタンパク質と第二のタンパク質との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すことを意図する。本発明の文脈において、用語ＫＤは、Ｉｇ結合タンパク質と免疫グロブリンとの間の結合親和性を説明するために特に使用されている。
【００１６】
本発明のＩｇ結合タンパク質は、免疫グロブリンに対する解離定数ＫＤが少なくとも１μＭ以下、又は好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらに好ましくは１０ｎＭ以下である場合、免疫グロブリンに結合すると考えられる。
【００１７】
本発明による用語「結合」は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」とは、本発明のＩｇ結合タンパク質が、他の非免疫グロブリン標的への結合と比較して、それが特異的である免疫グロブリンにより強く結合することを意味する。
【００１８】
本明細書で互換的に用いられる「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有する２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を含む。さらに、そのフラグメント又は変異体も用語「免疫グロブリン」に含まれる。本明細書で理解されているＩｇ断片は、無傷又は完全なＩｇよりも少ないアミノ酸残基を含む。この用語はまた、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖及びヒト化（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）免疫グロブリンなどの実施形態を含む。
【００１９】
本明細書で理解されている「免疫グロブリン」は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ２ＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ２、ウシＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ； ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡなどの哺乳動物ＩｇＧ；及びＦｃ領域を含む免疫グロブリン断片、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、及び免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートを含むが、必ずしもこれらに限定されない。なお、本発明の天然に存在するタンパク質Ａドメイン及び人工Ｉｇ結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ３に結合しない。
【００２０】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２又はそれ以上のアミノ酸の任意の直鎖状分子鎖を意味し、特定の長さの生成物をいうわけではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２又はそれ以上のアミノ酸鎖を指すのに使用される他の任意の用語は「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに、又はこれらの用語と同じ意味で使用される。用語「ポリペプチド」はまた、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解的切断、天然に存在しないアミノ酸による修飾、及びこの分野で良く知られている同様の修飾を含む、ポリペプチドの翻訳後の修飾の生成物を指すことを意図する。したがって、２又はそれ以上のタンパク質ドメインを含むＩｇ結合タンパク質も、「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語の定義に含まれる。
【００２１】
用語「アルカリ安定」又は「アルカリ安定性」又は「腐食安定」又は「腐食安定性」（本明細書では「ｃｓ」と略される）は、免疫グロブリンに結合する能力を有意に失うことなくアルカリ条件に耐える本発明のＩｇ結合タンパク質の能力を意味する。当業者は、例えば実施例に記載されているように、Ｉｇ結合タンパク質を水酸化ナトリウム溶液でインキュベートし、続いてクロマトグラフィー法によるなど、当業者に公知の日常的実験により免疫グロブリンに対する結合活性を試験することにより、アルカリ安定性を容易に試験できる
【００２２】
本発明のＩｇ結合タンパク質及び本発明のＩｇ結合タンパク質を含むマトリックスは、「増加した」又は「改善された」アルカリ安定性を示し、これはこのＩｇ結合タンパク質を組み込んだ分子及びマトリックスが、親タンパク質と比べてアルカリ条件下で長期間安定であることを意味する。すなわち、免疫グロブリンに結合する能力は失われず、親タンパク質に比べて免疫グロブリンに結合する能力の度合いが小さくなることもない。
【００２３】
「結合活性」という用語は、本発明のＩｇ結合タンパク質が免疫グロブリンに結合する能力を意味する。例えば、結合活性はアルカリ処理の前及び／又は後に決定することができる。結合活性は、Ｉｇ結合タンパク質について、又はマトリックスに結合したＩｇ結合タンパク質について、すなわち固定化結合タンパク質について決定することができる。 「人工の」という用語は、天然には存在しない物質を意味する。すなわち、この用語は、人間が生産又は改造した物質を意味する。例えば、人間が（例えば実験室での遺伝子工学によって、シャッフリング法によって、又は化学反応などによって）生成した、又は意図的に修飾されたポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は人工的なものである。
【００２４】
本明細書で使用される「親タンパク質」又は「親ドメイン」という用語における「親」という用語は、後に修飾されてこの親タンパク質又はドメインの変異体を生成するＩｇ結合タンパク質を意味する。この親タンパク質又はドメインは、人工ドメイン（例えば、限定するものではないが、配列番号：３、４、１０、１４、２１、２５、４７、４８、４９、５０）、天然に存在する黄色ブドウ球菌タンパク質Ａドメインのドメイン、又は天然に存在する黄色ブドウ球菌タンパク質Ａドメインの変異型もしくは改変型、である。
【００２５】
本明細書で使用される「変異型」又は「変異型Ｉｇ結合ドメイン」又は「Ｉｇ結合ドメイン変種」又は「Ｉｇ結合タンパク質変種」という用語は、親タンパク質のものとは異なるＩｇ結合タンパク質又はドメイン、又は親と比較して少なくとも一つのアミノ酸置換によるドメインアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。さらに一又はそれ以上の修飾によって親分子とは異なる人工分子を意味する。これらの修飾は、遺伝子工学によって、又は人によって行われる化学合成もしくは化学反応によって生成することができる。例えば、ドメインＺは、天然に存在するタンパク質ＡドメインＢの変異体である。例えば、配列番号：３０は、親タンパク質ＩＢ２７の変異体である。
【００２６】
本明細書で使用される「コンジュゲート」という用語は、第２のタンパク質又は非タンパク質性部分など、その他の物質に化学的に結合した少なくとも第１のタンパク質を含むか、又は本質的にこのタンパク質からなる分子に関する。
【００２７】
用語「修飾」又は「アミノ酸修飾」は、他のアミノ酸による親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を意味する。既知の遺伝子コードや、組換え及び合成ＤＮＡ技術を考えると、当業者はアミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【００２８】
用語「置換」又は「アミノ酸置換」は、他のアミノ酸による親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸の置換を指す。例えば、置換Ｓ１１Ａは、１１位のセリンがアラニンによって置換されている変異型Ｉｇ結合タンパク質を指す。上記の例では、１１Ａは１１位のアラニンを指す。本明細書の目的では、複数の置換は通常スラッシュによって分けられている。例えば、Ａ１Ｉ／Ｓ１１Ａ／Ｋ３５Ｒは、置換Ａ１Ｉ、Ｓ１１Ａ、及びＫ３５Ｒの組み合わせを含む変異を意味する。
【００２９】
「欠失」又は「アミノ酸欠失」という用語は、親ポリペプチド配列中の特定の位置においてアミノ酸が除去されていることを意味する。
【００３０】
用語「挿入」又は「アミノ酸挿入」は、親ポリペプチド配列へアミノ酸が付加されていることを意味する。
【００３１】
この説明全体を通して、図１のアミノ酸残基位置番号付け規則が使用されており、位置番号は、例えば、配列番号：１−８に対応するように指定されている。
【００３２】
用語「アミノ酸配列同一性」とは、２又はそれ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（又は相違）の定量的比較を意味する。基準ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「パーセント同一」又は「同一性」は、配列を整列させ、必要があればギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【００３３】
配列同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列を基準タンパク質の配列と整列させる。整列させる方法は当技術分野において周知である。例えば、基準アミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を決定するためには、自由に利用可能であるＳＩＭ局所類似性プログラムを使用することが好ましい（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ及びＷｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｒｍｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７）．（http://www.expasy.org/tools/sim-prot.htmlも参照）。マルチプルアラインメント分析には、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用するのが好ましい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０）。配列同一性パーセンテージを計算するときに、ＳＩＭローカル類似性プログラム又はＣｌｕｓｔａｌＷのデフォルトパラメーターを使用することが好ましい。
【００３４】
本発明の文脈において、特に明記しない限り、修飾した配列とそれが由来する配列との間の配列同一性の程度は、一般に、未修飾配列の全長に対して計算される。
【００３５】
所定位置で基準アミノ酸配列と異なるクエリー配列の各アミノ酸は、一差異として数えられる。この差異の合計は基準配列の長さに関連しており、ある割合の非同一性が生じる。定量的な同一性割合は、非同一性の割合を１００から引いたものとして計算される。
【００３６】
本明細書で使用されているように、２つのポリペプチド配列の文脈において、「同一」又は「アミノ酸配列同一性（％）」又は「同一性」というフレーズは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定した場合に、それぞれ最大に対応するように比較し整列させたときの、いくつかの実施形態においては少なくとも８９．５％、いくつかの実施形態では少なくとも９１％、いくつかの実施形態では少なくとも９３％、いくつかの実施形態では少なくとも９４％、いくつかの実施形態では少なくとも９６％、いくつかの実施形態では少なくとも９８％、いくつかの実施形態では１００％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する、２又はそれ以上の配列又は部分配列を意味する。同一性は、いくつかの実施形態では少なくとも約５０残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５１残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５２残基の領域にわたって、いくつかの実施形態ではいくつかの実施形態では少なくとも約５３残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５４残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５５残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５６残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５７残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも約５８残基の領域にわたって、存在する。いくつかの実施形態においては、同一性は、配列の全長にわたって存在する。
【００３７】
「融合した」という用語は、成分が直接又はペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって結合されていることを意味する。
【００３８】
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第二のタンパク質に遺伝的に結合した少なくとも第１のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２又はそれ以上の遺伝子を結合することによって生じる。したがって、融合タンパク質は、単一の直鎖状ポリペプチドとして発現する同一又は異なるタンパク質の多量体を含み得る。
【００３９】
本明細書で使用されているように、用語「リンカー」は、その最も広い意味において、少なくとも２つのその他の分子を共有結合させる分子を意味する。本発明の典型的な実施形態では、「リンカー」は、Ｉｇ結合ドメインを少なくとも一のさらなるＩｇ結合ドメインと結合させる部分、すなわち、２つのタンパク質ドメインを互いに結合して多量体を生成する部分として理解される。好ましい実施態様においては、「リンカー」はペプチドリンカーであり、すなわち２つのタンパク質ドメインを連結するこの部分は１つの単一アミノ酸か、又は２又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドである。
【００４０】
「クロマトグラフィー」という用語は、移動相及び固定相を用いて試料中のその他の分子（例えば混入物）から１種類の分子（例えば免疫グロブリン）を分離する分離技術を意味する。液体移動相は分子の混合物を含み、これらの混合物を固定相（例えば固相マトリックスなど）を横切って又は通過して輸送する。
【００４１】
移動相中の異なる分子と固定相との作動相互作用がによって、移動相中の分子を分離することができる。
【００４２】
「親和性クロマトグラフィー」という用語は、固定相に結合したリガンドが移動相（試料）中の分子（すなわち免疫グロブリン）と相互作用する、すなわちリガンドが生成するべき分子に対して特異的結合親和性を有する、クロマトグラフィーの特定のモードを意味する。本発明の文脈で理解されるように、親和性クロマトグラフィーは、免疫グロブリンを含む試料を、本発明のＩｇ結合タンパク質のようなクロマトグラフィーリガンドを含む固定相に添加することを含む。
【００４３】
用語「固相支持体」又は「固相マトリックス」は、固定相と互換的に使用される。
【００４４】
本明細書で互換的に使用されている「親和性マトリックス」又は「親和性分離マトリックス」又は「親和性クロマトグラフィーマトリックス」という用語は、マトリックス、例えば、親和性リガンド、例えば本発明のＩｇ結合タンパク質が付着しているクロマトグラフィーマトリックスといった、マトリックスを意味する。このリガンド（例えば、Ｉｇ結合タンパク質）は、精製されるか又は混合物から除去される、対象となる分子（例えば、上記で定義した免疫グロブリン）に特異的に結合できる。
【００４５】
本明細書で使用される「親和性精製」という用語は、マトリックスに固定化されているＩｇ結合タンパク質に上記で定義した免疫グロブリンを結合させることによって液体から上記に定義した免疫グロブリンを精製する方法を意味する。これによって、免疫グロブリンを除く混合物の他の全ての成分が除去される。さらなる工程において、結合した免疫グロブリンを精製された形で溶出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の様々な態様がより詳細に定義されている。以下に定義される各態様は、そうでないことが明確に示されていない限り、他の任意の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると表示された特徴は、好ましい又は有利であると示されたその他の一又はそれ以上の特徴と組み合わせることができる。
【００４７】
第１の態様において、本発明は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質に関するものであり、ここで、少なくとも一つのＩｇ結合ドメインは、１位におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位におけるアラニン、グルタミン酸、又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位におけるアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、４２位におけるロイシンへのアミノ酸置換、からなる群から選択された少なくとも１、２、３又は４個の置換を有する親アミノ酸配列の変異体を含む、本質的にこれらの変異体からなる、あるいはこれらの変異体からなる。いくつかの実施形態では、この少なくとも一つの変異体Ｉｇ結合ドメインは、１、２、３、４、５、又は６個の修飾をさらに含み、この各々の修飾は、単一アミノ酸置換、単一アミノ酸欠失、単一アミノ酸挿入からなる群から選択される。
【００４８】
変異体Ｉｇ結合タンパク質の利点は、アルカリ条件下で長期間安定であることである。 この特徴は、マトリックス上の汚染物質を除去して、例えばマトリックスを数回使用できるようにするためにＮａＯＨ濃度が高いアルカリ性溶液を使用する洗浄手順を用いるクロマトグラフィーアプローチにとって重要である。変異体Ｉｇ結合タンパク質は、親ポリペプチドに比べて、アルカリ処理後により安定である。
【００４９】
上記に定義した親タンパク質中の１、１１、３５、及び／又は４２位における置換は、免疫グロブリン結合特性を損なうことなく、親タンパク質に比べて改善されたアルカリ安定性を付与する。
【００５０】
親配列番号：１
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン結合タンパク質が、（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８９．５％の配列同一性を示すアミノ酸配列、配列番号：１の１位におけるイソロイシンへのアミノ酸置換、配列番号：１の１１位におけるアラニン、グルタミン酸、又はイソロイシンへのアミノ酸置換、配列番号：１の３５位におけるアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び配列番号：１の４２位におけるロイシンへのアミノ酸置換、からなる群から選択された、少なくとも１、２、３、又は４個の置換を有する。この変異体Ｉｇ結合タンパク質は、１、２、３、４、５、もしくは６個の置換又は１、２、３、４、５、６個の欠失といった、さらなる修飾を含んでいてもよい。
【００５１】
配列番号：１に示されるＩｇ結合ドメインは親ドメインであり、１、１１、３５、及び／又は４２位に置換を有するこのＩｇ結合ドメインは、配列番号：１の変異体である。配列番号：１は、本発明の変異体についての親ドメイン、好ましくは（ｉ）配列番号：３、４、１０、１４、２１、２５、４７、４８、４９、５０を含む人工Ｉｇ結合ドメイン；（ｉｉ）配列番号：５乃至８を含む天然に存在するタンパク質Ａドメイン又は変異体；を網羅するコンセンサス配列である。配列番号：１の親タンパク質は以下のアミノ酸配列である；Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＸ１５Ｘ１６ＬＸ１８Ｘ１９ＰＸ２１ＬＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＱＲＸ２８Ｘ２９ＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５ＡＰＸ５８。ここで、１位のアミノ酸（Ｘ１）は、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｖ、又はＱから選択され、２位のアミノ酸（Ｘ２）は、Ａ、Ｄ、又はＱから選択され、３位のアミノ酸（Ｘ３）は、Ａ、Ｎ、又はＳ、好ましくはＡ又はＮから選択され、４位のアミノ酸（Ｘ４）は、Ｋ又はＮ、好ましくは、Ｋから選択され、５位のアミノ酸（Ｘ５）は、Ｈ又はＦから選択され、６位のアミノ酸（Ｘ６）は、Ｄ、Ｎ、Ａ、又はＳ、好ましくはＤ又はＮから選択され、７位のアミノ酸（Ｘ７）は、Ｋ又はＥから選択され、１位のアミノ酸（Ｘ８）は、Ｄ、Ａ、又はＥから選択され、１１位のアミノ酸（Ｘ11）はＳ又はＮから選択され、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＥ又はＱから選択され、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＩ又はＶから選択され、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）はＨ又はＮから選択され、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）は、Ｌ又はＭから選択され、２１位のアミノ酸（Ｘ２１）は、Ｎ、Ｓ、又はＤ、好ましくはＮから選択され、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）は、Ｔ又はＮから選択され、２４位のアミノ酸（Ｘ２４）はＥ又はＡから選択され、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＤ又はＥから選択され、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）は、Ｓ、Ｎ、又はＡから、好ましくはＮ又はＳから選択され、２９位のアミノ酸（Ｘ２９）は、Ａ又はＧから選択され、４０位のアミノ酸（Ｘ４０）はＶ、Ｑ、又はＴから、好ましくはＶ又はＱから選択され、４２位のアミノ酸（Ｘ４２）は、Ｋ、Ａ、又はＴから選択され、４３位のアミノ酸（Ｘ４３）は、Ｅ、Ｎ又はＳから、好ましくはＥ又はＮから選択され、４４位のアミノ酸（Ｘ４４）は、Ｉ、Ｖ、又はＬから選択され、４６位のアミノ酸（Ｘ４６）は、Ｇ又はＡから選択される、４９位のアミノ酸（Ｘ４９）は、Ｋ又はＱから選択され、５２位のアミノ酸（Ｘ５２）は、Ｎ、Ｄ、又はＳから、好ましくはＮから選択され、５３位のアミノ酸（Ｘ５３）は、Ｄ又はＥから選択され、５４位のアミノ酸（Ｘ５４）は、Ａ又はＳから選択され、５８位のアミノ酸（Ｘ５８）は、Ｐ又はＫから選択される。
【００５２】
親配列番号：５乃至８
第１の態様の一実施形態では、親ドメインは、配列番号：５乃至８のアミノ酸配列、又は配列番号：５乃至８のアミノ酸配列に対して少なくとも８９．５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むか、本質的にこのアミノ酸配列からなるか、又はこのアミノ酸配列からなる。Ｉｇ結合ドメインは、１位のイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位のアラニン、グルタミン酸、又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位のアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、及び４２位のロイシンへのアミノ酸置換、からなる群から選択される少なくとも１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を有する変異体からなる。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、１、２、３、４、５、又は６個の修飾をさらに含み、各個々の修飾は、単一アミノ酸置換、単一アミノ酸欠失、単一アミノ酸挿入からなる群から選択される。
【００５３】
親配列番号：２
第１の態様の別の好ましい実施形態において、前記少なくとも一つのＩｇ結合ドメインは、配列番号：２の親アミノ酸配列の変異体を含み、この変異体は、配列番号：２の１位のイソロイシンへのアミノ酸置換、配列番号：２の１１位のアラニン、グルタミン酸、又はイソロイシンへのアミノ酸置換、配列番号：２の３５位のアルギニンへのアミノ酸置換、及び配列番号：２の４２位のロイシンへのアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１、２、３又は４個の置換を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのＩｇ結合ドメインは、１、２、３、４、５、又は６個の修飾をさらに含み、個々の各修飾は、単一アミノ酸置換、単一アミノ酸欠失、単一アミノ酸挿入からなる群から選択される。
【００５４】
配列番号：２は、限定するものではないが、Ｉｇ結合タンパク質に関する人工Ｉｇ結合ドメインＩＢ１４、ＩＢ２５、ＩＢ２７、ＩＢ７４、及びＩＢ４７などの好ましい親タンパク質についてのコンセンサス配列である。好ましくは、本発明は、Ｉｇ結合タンパク質に関するものであり、少なくとも一つのＩｇ結合ドメインが、親配列番号：２のアミノ酸配列の変異体、又は親配列番号：２に対して少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列アミノの変異体を含む、本質的にこれらの変異体からなる、あるいはこれらの変異体からなる。配列番号：２は、配列番号：１：Ｘ１ＡＡＸ４Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＸ２５ＱＲＸ２８ＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶＳＫＥＸ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＮＤＸ５４ＱＡＰＸ５８、の好ましい実施形態であり、ここで１位のアミノ酸（Ｘ１）はＰ、Ｎ、又はＡから選択され、５位のアミノ酸（Ｘ５）はＨ又はＦから選択され、７位のアミノ酸（Ｘ７）はＫ又はＥから選択され、８位のアミノ酸（Ｘ８）はＤ、Ａ、又はＥから選択され、１１位のアミノ酸（Ｘ１１）がＳ又はＮ、好ましくはＳから選択され、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＤ又はＥから選択され、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＮ、好ましくはＮから選択され、４４位のアミノ酸（Ｘ４４）はＩ又はＶから選択され、４６位のアミノ酸（Ｘ４６）はＧ又はＡから選択され、４９位のアミノ酸（Ｘ４９）はＫ又はＱから選択され、５４位のアミノ酸（Ｘ５４）はＡ又はＳから選択され、５８位のアミノ酸（Ｘ５８）はＰ又はＫから選択される。
【００５５】
例示的な親タンパク質
いくつかの実施形態では、このＩｇ結合ドメインは、配列番号：３、４、１０、１４、２１、２５、４７乃至５０からなる群から選択される親アミノ酸配列の変異体を含み、この変異体は、１位におけるアラニン又はプロリンからイソロイシンへのアミノ酸置換、１１位におけるセリンからアラニン、グルタミン酸、又はイソロイシンへのアミノ酸置換、３５位におけるリジンからアルギニン又はイソロイシンへのアミノ酸置換、４２位におけるリジンからロイシンへのアミノ酸置換、からなる群から選択された少なくとも１、２、３又は４個のアミノ酸置換を有する。
【００５６】
親タンパク質としてのＩＢ１４
第１の態様の好ましい実施形態において、親タンパク質は、配列番号：３のアミノ酸配列、又は親配列番号：３に対して少なくとも８９．５％の同一性を有するタンパク質である。配列番号：３に対して少なくとも８９．５％の同一性を有する親タンパク質の例は、配列番号：２１（１Ｐ／２８Ｎ）、配列番号：１０（１Ａ／２８Ｓ）、配列番号：１４（１Ｐ／２８Ｓ）、 配列番号：２５（４６Ａ／５８Ｋ）、配列番号：４７（５Ｆ／７Ｅ／８Ａ）、配列番号：４８（５Ｆ／７Ｅ／８Ａ／２５Ｅ）、配列番号：４９（４４Ｖ／４９Ｑ／５４Ｓ／５８Ｋ）、配列番号：５０（２５Ｅ／ ４４Ｖ／４９Ｑ／５４Ｓ／５８Ｋ）、ＩＢ１３（１Ｐ／４Ｑ／２８Ｓ）、ＩＢ２３（１Ｐ／２１Ｓ／２８Ａ／４０Ｔ／４３Ｓ）、ＩＢ１５（２Ｄ／３Ｎ／５Ｆ／７Ｅ／８Ａ／２８Ａ）、及びＩＢ１６（２Ｄ／３Ｓ／５Ｆ／７Ｅ／８Ａ／２８Ａ）からなる群から選択することができる。
【００５７】
親タンパク質としてのＩＢ２７
第１の態様の別の好ましい実施形態では、親タンパク質は配列番号：４、又は親の配列番号：４に対して少なくとも８９．５％の同一性を有するタンパク質である。少なくとも８９．５％の同一性を有する親タンパク質の例は、配列番号：５０（５Ｈ／７Ｋ／８Ｄ）、配列番号：４９（５Ｈ／７Ｋ／８Ｄ／２５Ｄ）、配列番号：４８（４４Ｉ／ ４９Ｋ／５４Ａ／５８Ｐ）、及び配列番号：４７（２５Ｄ／４４Ｉ／４９Ｋ／５４Ａ／５８Ｐ）、からなる群から選択される。
【００５８】
さらに好ましい親ドメイン
第１の態様の一実施形態では、親タンパク質が配列番号：２５のアミノ酸配列である。第１の態様の別の実施形態では、親タンパク質が配列番号：５０又は配列番号：４９のアミノ酸配列である。第１の態様の別の実施形態では、親タンパク質が、配列番号：４８又は配列番号：４７のアミノ酸配列である。
【００５９】
アルカリ安定性蛋白質中の好ましいアミノ酸位置
いくつかの実施形態では、変異型Ｉｇ結合タンパク質のＩｇ結合ドメインは、一の置換又は複数の置換を含む。
【００６０】
１位におけるイソロイシン（Ｉ）への置換は、唯一の置換（例えば、配列番号：９）であってもよく、あるいはＩｇ結合ドメインが、例えば、親タンパク質の少なくとも１１位及び／又は３５位及び／又は４２位における置換といったさらなる突然変異を含んでいてもよい。アルカリ安定性タンパク質の１位のアミノ酸は、スレオニン（Ｔ）でないことが好ましい。１位のアミノ酸はイソロイシン（Ｉ）又はアラニン（Ａ）であることが好ましい。
【００６１】
１１位におけるアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、又はイソロイシン（Ｉ）への置換は、唯一の置換（例えば、配列番号：１１乃至１３）であってもよく、又はＩｇ結合ドメインが、さらなる突然変異、好ましくは少なくとも１位及び／又は３５位及び／又は４２位における置換を含んでいてもよい。１１位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）又はリジン（Ｋ）ではないことが好ましい。１１位のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）又はプロリン（Ｐ）、より好ましくはＡ、Ｉ又はＥ、最も好ましくはＡであることが好ましい。
【００６２】
３５位におけるアルギニン（Ｒ）又はイソロイシン（Ｉ）への置換は、唯一の置換（例えば、配列番号：１５乃至１６）であってもよく、又はＩｇ結合ドメインが、さらなる突然変異、好ましくは少なくとも１位及び／又は１１位及び／又は４２位における置換を含んでいてもよい。３５位のアミノ酸は、プロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）又はメチオニン（Ｍ）ではないことが好ましい。３５位のアミノ酸はＲ又はＩであることが好ましい。４２位におけるロイシン（Ｌ）への置換は、唯一の置換（例えば、配列番号：１７）であってもよく、又はＩｇ結合ドメインが、さらなる突然変異、好ましくは少なくとも１位及び／又は１１位及び／又は３５位に置換を含んでいてもよい。４２位のアミノ酸はチロシン（Ｙ）ではないことが好ましい。４２位のアミノ酸はＬであることが好ましい。
【００６３】
Ｉｇ結合ドメインにおけるアミノ酸の好ましい組み合わせ
驚くべきことに、１位、１１位、及び３５位、及び選択的に１位、１１位、３５位、４２位、及び選択的に１位、１１位、２８位、３５位、及び４２位におけるアミノ酸の特定の組み合わせは、図面及び実施例に示されるように、親ドメインと比較して変異型Ｉｇ結合ドメインのアルカリ安定性を増加させる。１位、１１位、３５位、４２位における置換に加えて、アルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインは、置換、欠失、又は挿入などの１、２、又は３個の追加の修飾を含んでいてもよい。例えば、この少なくとも一つのＩｇ結合ドメインは、親配列と比較して一又はそれ以上の置換を含み、この一又はそれ以上の置換は、少なくとも：
１Ｉ；１１Ａ；３５Ｒ；４２Ｌ；１１Ｅ；１１Ｉ；３５Ｉ；１Ｉ／１１Ａ；１Ｉ／３５Ｒ；１１Ａ／３５Ｒ；１Ｉ／４２Ｌ；１１Ａ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ；１Ｉ／１１Ｉ；１１Ｉ／３５Ｒ；１１Ｅ／３５Ｒ；１１Ｉ／４２Ｌ；１１Ｅ／４２Ｌ；１Ｉ／３５Ｉ；１１Ａ／３５Ｉ；１１Ｉ／３５Ｉ；１１Ｅ／３５Ｉ；３５Ｒ／４２Ｌ；３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ａ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｉ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｉ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｉ；１Ｉ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／３５Ｉ／４２Ｌ；１１Ｉ／３５Ｒ／４２Ｌ；１１Ｉ／３５Ｉ／４２Ｌ；１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ；１１Ａ／３５Ｉ／４２Ｌ；１１Ｅ／３５Ｒ／４２Ｌ；１１Ｅ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｅ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｉ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ｉ／２８Ｎ／３５Ｉ／４２Ｌ；及び１Ｉ／１１Ｅ／２８Ｎ／３５Ｉ／４２Ｌ；
からなる群から選択される。１Ｉ；１１Ａ；３５Ｒ；４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ；１Ｉ／３５Ｒ；１Ｉ／４２Ｌ；１１Ａ／４２Ｌ；１１Ａ／３５Ｒ；３５Ｒ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ａ／４２Ｌ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ；及び１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌからなる群から選択される置換が好ましい。いくつかの実施形態においては、３又は４個のアミノ酸位置が、１Ｉ、１１Ａ、３５Ｒ、及び４２Ｌからなる群から選択される。その他の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインが、１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ；１Ｉ／１１Ａ／３５Ｒ／４２Ｌ及び１Ｉ／１１Ａ／２８Ｎ／３５Ｒ／４２Ｌからなる群から選択される置換の組み合わせを含む。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明のＩｇ結合タンパク質は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含むか、又は本質的にこの結合ドメインからなり、ここで１位のアミノ酸残基がイソロイシンであり、１１位のアミノ酸残基がアラニンである。本発明の別の好ましいＩｇ結合タンパク質は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含むか、又は本質的にこの結合ドメインからなり、ここで１位のアミノ酸残基がイソロイシンであり、１１位のアミノ酸残基がアラニンであり、３５位のアミノ酸残基がアルギニンである。本発明の別の好ましいＩｇ結合タンパク質は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含むか、又は本質的にこの結合ドメインからなり、１位のアミノ酸残基がイソロイシンであり、１１位のアミノ酸残基がアラニンであり、３５位のアミノ酸残基がアルギニンであり、４２位のアミノ酸残基がロイシンである。本発明の別の好ましいＩｇ結合タンパク質は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含むか、又は本質的にこの結合ドメインからなり、ここで１位のアミノ酸残基がイソロイシンであり、１１位のアミノ酸残基がアラニンであり、３５位のアミノ酸残基がアルギニンであり、４２位のアミノ酸残基がロイシンであり、２８位のアミノ酸残基がアスパラギンである。本発明の別の好ましいＩｇ結合タンパク質は、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含むか、又は本質的にこの結合ドメインからなり、ここで１１位のアミノ酸残基がアラニンであり、３５位のアミノ酸残基がアルギニンであり、４２位のアミノ酸残基がロイシンである。
【００６５】
アルカリ安定蛋白質の配列
本発明のＩｇ結合タンパク質は、配列番号：５２のアミノ酸配列を含む、又は本質的にこのアミノ酸配列からなる、又はこのアミノ酸配列からなる、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：５２に対して少なくとも８９．５％同一であるアミノ酸を含む。 配列番号：５２は、例えば配列番号：１８乃至２０、２６、２９乃至３０、４２乃至４５、５６乃至６１のＩｇ結合ドメインといった、好ましい人工Ｉｇ結合タンパク質のコンセンサス配列である。配列番号：５２は、以下のアミノ酸配列：ＩＡＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＱＱＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＸ２５ＱＲＸ２８ＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＸ４２ ＥＸ４４ ＬＸ４６ ＥＡＸ４９ ＫＬＮＤＸ５４ＱＡＰＸ５８であり（図１Ｂ参照）：ここで、５位（Ｘ５）のアミノ酸はＨ又はＦから選択され、７位（Ｘ７）のアミノ酸はＫ又はＥから選択され、８位（Ｘ８）のアミノ酸はＤ、Ａ、又は  Ｅから選択され、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＤ又はＥから選択され、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＮから選択され、４２位のアミノ酸（Ｘ４２）はＬ又はＫ、好ましくはＬから選択され、４４位のアミノ酸（Ｘ４４）はＩ又はＶから選択され、４６位のアミノ酸（Ｘ４６）はＧ又はＡから選択され、４９位のアミノ酸（Ｘ４９）はＫ又はＱから選択され、５４位のアミノ酸（Ｘ５４）はＡ又はＳから選択され、５８位のアミノ酸（Ｘ５８）はＰ又はＫから選択される。
【００６６】
Ｉｇ結合タンパク質中の１位、１１位、３５位、４２位における３又は４個のアミノ酸を組み合わせた結果としての高いアルカリ安定性
いくつかの実施形態では、実施例及び図面に示すように、１位におけるイソロイシン、１１位におけるアラニン、３５位におけるアルギニン、及び４２位におけるロイシンから選択される少なくとも３又は４個のアミノ酸の組合せが、Ｉｇ結合タンパク質の驚くほど特に良好なアルカリ安定性を提供している。２８位はアスパラギンであることが好ましい。以下の実施例に示されるように、本発明の全てのＩｇ結合タンパク質はアルカリ処理後であってもＩｇに結合することがわかった。本発明のＩｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で少なくとも６時間高いアルカリ安定性、特に対応する親タンパク質に比べて改善されたアルカリ安定性を示す。
【００６７】
１位におけるイソロイシンと、１１位におけるアラニン、グルタミン酸、又はイソロイシンと、３５位におけるアルギニン又はイソロイシンと、及び選択的に４２位におけるロイシンに対して、少なくとも３又は４個のアミノ酸の組み合わせを有するＩｇ結合タンパク質が、アルカリ処理後であっても数時間Ｉｇに結合できるというのは、驚くべきかつ予想外のことであった。アミノ酸１Ｉ、１１Ａ又は１１Ｅ、又は１１Ｉ、３５Ｒ又は３５Ｉ、及び選択的に４２Ｌ、好ましくは１Ｉ、１１Ａ、３５Ｒ、及び４２Ｌの組合せを含むＩｇ結合タンパク質が、アルカリ処理後であっても数時間Ｉｇに結合できることは、最も驚くべきかつ予想外のことであった。Ｉｇ結合タンパク質のアルカリ安定性は、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で６時間インキュベートした後のＩｇ結合活性の喪失を比較することによって決定される。いくつかの実施形態においては、これは、対応する親タンパク質のＩｇ結合活性の喪失と比較されている。結合活性の喪失は、０．５Ｍ  ＮａＯＨでの６時間のインキュベートの前後の結合活性を比較することによって決定される。
【００６８】
図中の比較データに示すように、１Ｉ、１１Ａ又は１１Ｅ、又は１１Ｉ、３５Ｒ又は３５Ｉ、及び４２Ｌから選択された少なくとも３又は４個のアミノ酸を有するＩｇ結合ドメインのＩｇ結合活性は、親タンパク質と比較して少なくとも２５％増加している。これは、親タンパク質と比べて、驚くべきかつ有利な性質である。
【００６９】
好ましいアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質
特定の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：１８乃至２０、２６、２９乃至４０、４２乃至４５、及び５６乃至６１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このドメインは、配列番号：２０、２６、３０、４２乃至４５からなる群のアミノ酸配列を含む。アルカリ安定ドメインは、挿入、欠失、又はさらなる置換など、さらなる修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合ドメインが、１、２、３、４、５、又は６個のさらなる置換を有する。他の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインが、そのＮ末端の最初の４個のアミノ酸内に１、２、３又は４個のアミノ酸の欠失を、及び／又は、Ｃ末端に１又は２個のアミノ酸の欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合ドメインはＮ末端、例えば１、２、及び４位に、又は１、２、及び３位に欠失がある。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、Ｃ末端、例えば、５７位及び／又は５８位に欠失がある。いくつかの実施形態は、配列番号：２０、２６、３０、４２乃至４５、例えば限定するものではないが、配列番号：９乃至１９、２９、５３乃至５４、５６乃至６１からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも８９．５％の配列同一性を有する配列に関する。いくつかの実施形態は、前述の配列番号のいずれかに対するアミノ酸配列に対して少なくとも８９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関し、ここでは、１、１１、３５及び４２位の少なくとも３又は４つの位置に、あるいは配列番号：２０、２６、２９、３０、４２乃至４５の各アミノ酸位置に対応する位置に、同じアミノ酸を有しており、そこから、少なくとも８９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列が誘導されている。好ましいアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の配列を図１に示す。１Ｉ、１１Ａ、３５Ｒ、及び４２Ｌ位置の少なくとも３又は４個が保存されていることが好ましい。４位がＱではないことがさらに好ましい。
【００７０】
配列番号：２０（ｃｓ１４）及び変異体
具体的な実施形態では、アルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一であるアミノ酸配列、例えば配列番号：１８乃至１９、２６、４２乃至４５、５６を含むか、本質的にこれらのアミノ酸配列からなるか、又はこれらのアミノ酸配列からなる。好ましい実施形態では、配列番号：２０の変異体が、４位にＱを有しない。特定の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインが、配列番号：２０のアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、図３及び図５は、長期にわたる連続０．５Ｍ  ＮａＯＨでの処理後のＩｇ結合の残存活性を示す。
【００７１】
表１は、配列番号：２０、及びこのアミノ酸配列と少なくとも９１％同一である好ましい変異体のアミノ酸との違いを示す。５位がＨ又はＦ、７位がＫ又はＥ、８位がＤ又はＡ、２５位がＤ又はＥ、４４位がＩ又はＶ、４６位がＧ又はＡ、４９位がＫ又はＱ、５４位はＡ又はＳ、５８位が、Ｐ又はＫであることが好ましい。人工アルカリ安定配列番号：２０の任意の野生型タンパク質Ａドメインに対する同一性は、７８％より低い。
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【００７２】
配列番号：３０（ｃｓ２７）と変異体
特定の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：３０のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列、例えば配列番号：２９を含むか、本質的にこのアミノ酸配列からなる、又はこのアミノ酸配列からなる。配列番号：３０の、任意の野生型タンパク質Ａドメインに対する同一性は７６％より低い。図４は、６時間の連続０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理後の配列番号：３０及び２９の残存活性を示す。
【００７３】
配列番号：２６（ｃｓ２５）と変異体
特定の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：２６のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にこのアミノ酸配列からなる、又はこのアミノ酸配列からなる。配列番号：２６の、任意の野生型タンパク質Ａドメインに対する同一性は８１％より低い。 図５は、６時間の連続０．５Ｍ ＮａＯＨ処理後の配列番号：２６の残存Ｉｇ結合活性を示す。
【００７４】
配列番号：４２（ｃｓ７４）と変異体
特定の実施形態では、アルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：４２のアミノ酸配列、及びこのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、例えば配列番号：４３を含むか、本質的にこのアミノ酸配列からなる、又はこのアミノ酸配列からなる。配列番号：４２の、任意の野生型タンパク質Ａドメインに対する同一性は７８％より低い。 図５は、６時間の連続０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理後の配列番号：４２、４３の残存Ｉｇ結合活性を示す。
【００７５】
配列番号：４４（ｃｓ４７）とその変異体
特定の実施形態では、アルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインは、配列番号：４４のアミノ酸配列、及びこのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、例えば配列番号：４５を含むか、又は本質的にこのアミノ酸配列からなる。配列番号：４４の、任意の野生型タンパク質Ａドメインに対する同一性は７８％より低い。図５は、６時間の連続０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理後の、少なくとも９８％の同一性を有する配列番号：４４、４５の残存Ｉｇ結合活性を示す。
【００７６】
免疫グロブリンに対する親和性
本発明のＩｇ結合タンパク質はすべて、好ましくは１μＭより低い、あるいは１００ｎＭより低い、さらにより好ましくは１０ｎＭ又はそれ以下の解離定数ＫＤで、免疫グロブリンに結合する。Ｉｇ結合タンパク質又はドメインの結合親和性を決定する、すなわち解離定数ＫＤを決定する方法は当業者に公知であり、例えばこの技術分野で知られている以下の方法から選択することができる：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、分析超遠心分離、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、及び増強化学発光法（ＥＣＬ）。
【００７７】
これらの方法のいくつかは実施例にさらに記載されている。通常は、解離定数ＫＤは、２０℃、２５℃、又は３０℃で決定される。特記しない限り、本明細書に記載のＫＤ値は、表面プラズモン共鳴によって２２℃±３℃で決定される。第１の態様の実施形態において、Ｉｇ結合タンパク質は、０．１ｎＭから１００ｎＭの間、好ましくは０．１ｎＭから１０ｎＭの間の、ヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤを有する。
【００７８】
多量体
本発明の一実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、互いに結合した１、２、３、４、５、６、７、又は８個、好ましくは２、３、４、５又は６個のＩｇ結合ドメインを含む。すなわち、Ｉｇ結合タンパク質は、例えば、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、又は六量体であり得る。多量体は、２個、３個、４個、又はそれ以上の結合ドメインを含んでいてもよい。
【００７９】
本発明の多量体は、一般的には当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によって人工的に生成した融合タンパク質である。本発明のＩｇ結合タンパク質は、平易な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多くの従来の周知の技術、又は市場で入手可能な自動合成装置によって作製することができる。
【００８０】
いくつかの好ましい実施形態では、多量体は、例えばＩｇ結合タンパク質のすべてのアルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインのアミノ酸配列が同一である、ホモ多量体である。アルカリ安定性多量体は、２つ以上のＩｇ結合ドメインを含んでいてもよく、この場合、Ｉｇ結合ドメインは、好ましくは、配列番号：１８乃至２０、２６、２９乃至３８、４２乃至４５、５６乃至６１からなる群から選択された配列、又は前述の配列番号のいずれかに対して少なくとも８９．５％の配列同一性を有する配列を含む、又は本質的にこの配列からなる。いくつかの実施形態では、このドメインは配列番号：１８乃至２０、２６、２９乃至３８、４２乃至４５、５６乃至６１の誘導体であり、さらに各誘導体は、誘導体がベースとしている配列番号：１８乃至２０、２６、２９乃至３８、４２乃至４５、５６乃至６１（例えば、配列番号：２３、２４、２７を参照）のうちの１つに対して、そのＮ末端の４つのアミノ酸内に１、２、又は３個のアミノ酸の欠失、及び／又はＣ末端における１又は２個のアミノ酸の欠失を有する。
【００８１】
例えば、配列番号：１４及び配列番号：２０を用いて、本明細書の実施例１に記載のホモ多量体融合構造（二量体、四量体、五量体、及び六量体）を生成した。さらに、配列番号：３０の二量体、四量体、五量体、及び六量体を生成した。例えば、配列番号：２３、２４、２７、２８参照。
【００８２】
第１の態様に関するいくつかの実施形態では、多量体がヘテロ多量体であり、例えば、少なくとも一つのアルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインは、免疫グロブリン結合タンパク質内のその他のＩｇ結合ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する。
【００８３】
リンカー
第１の態様のいくつかの実施形態では、１つ又は複数のＩｇ結合ドメインは互いに直接結合している。その他の実施形態において、一又はそれ以上のＩｇ結合ドメインは、一又はそれ以上のリンカーを介して互いに結合している。これらの典型的な実施形態において好ましいのはペプチドリンカーである。これは、ペプチドリンカーが、第１のＩｇ結合ドメインを、第二のＩｇ結合ドメインに結合させるアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、ドメインのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって第１のＩｇ結合ドメイン及び第２のＩｇ結合ドメインに結合され、これによって単一の直鎖状ポリペプチド鎖を生成する。リンカーの長さ及び組成は、少なくとも１個から最大約３０個のアミノ酸の間で変動し得る。より具体的には、ペプチドリンカーは、１乃至３０アミノ酸の間の長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４  、２５、２６、２７、２８、２９、３０のアミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、苛性条件及びプロテアーゼに対して安定であることが好ましい。リンカーは、Ｉｇ結合タンパク質中のドメインの立体配座を不安定にするべきではない。グリシン及びセリンなどの小型アミノ酸を含むリンカーがよく知られている。リンカーはグリシンを豊富に含んでいてもよい（例えば、リンカー中の残基の５０％超がグリシン残基であり得る）。また、更なるアミノ酸を含むリンカーも好ましい。本発明のその他の実施形態は、アラニン、プロリン、及びセリンからなるリンカーを含む。タンパク質を融合させるその他のリンカーは、この分野では公知であり使用できる。
【００８４】
固相支持体へのコンジュゲート
本発明のいくつかの態様において、Ｉｇ結合タンパク質は固相支持体にコンジュゲートされている。本発明のいくつかの実施形態において、Ｉｇ結合ドメインは、固相支持体へＩｇ結合タンパク質を部位特異的共有結合させる付着部位を含む。本発明のいくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、例えばＮ末端のリーダー配列、及び／又は、Ｎ−末端又はＣ−末端におけるタグ付き又はタグなしのカップリング配列（例えば、配列番号：３９及び４０を参照のこと）など、Ｎ末端及び／又はＣ末端にさらなるアミノ酸残基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質が、固相（マトリックス）へ共有結合させる付着部位を含む。好ましくは、この付着部位は特異的であり、固相への部位特異的付着を提供する。特異的結合部位は、例えばシステイン又はリジンなどの天然アミノ酸を含み、これによって、固相の反応基又は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、エポキシ、又はアルケン基から選択される固相とタンパク質との間のリンカーとの特異的化学反応が生じる。付着部位は、Ｉｇ結合タンパク質のＣ末端又はＮ末端に直接存在していてもよく、あるいはＮ末端又はＣ末端とカップリング部位との間にリンカー、好ましくはペプチドリンカーが存在してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、末端にシステインを有する、３乃至２０個のアミノ酸、好ましくは４乃至１０個のアミノ酸の短いＮ末端又はＣ末端ペプチド配列を含んでいてもよい。Ｃ末端付着部位用のアミノ酸は、好ましくはプロリン、アラニン、及びセリンから選択することができ、例えば、結合用にＣ末端に単一のシステインを有する、ＡＳＰＡＰＳＡＰＳＡＣ（配列番号：４１）であってもよい。別の実施形態では、Ｃ末端付着部位用のアミノ酸は、好ましくはカップリング用にＣ末端に単一のシステインを有するグリシン及びセリンから選択され、例えば、ＧＧＧＳＣである。
【００８５】
Ｃ末端にシステインを有することの利点は、Ｉｇ結合タンパク質のカップリングが、システインチオールと支持体上の求電子基との反応を通して行われ、チオエーテル架橋カップリングを生じることである。これは結合タンパク質の優れた移動性を提供し、結合能力を上げる。
【００８６】
代替の実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質の固相支持体へのカップリングが、アルカリ安定性Ｉｇ結合ドメインの４３、４６、又は４７位のシステインを介して行われる。システインが４３位、４６位、又は４７位に位置する場合、５０位又は５８位のアミノ酸はシステインではない（例えば、配列番号：５３又は５４を参照のこと）。好ましくは、５０位のアミノ酸はリジンであり、５８位のアミノ酸はプロリン又はリジンから選択される。
【００８７】
親和性分離マトリックス
別の態様において、本発明は、第１の態様のＩｇ結合タンパク質を含む親和性分離マトリックスに関する。
【００８８】
第二の態様の好ましい実施形態においては、親和性分離マトリックスが固相支持体である。
【００８９】
親和性分離マトリックスは本発明の少なくとも一つのＩｇ結合タンパク質を含む。
【００９０】
本発明のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を含むこのマトリックスは、上記に定義した免疫グロブリン、すなわちＩｇ、Ｆｃ領域を含むＩｇ変異体、ＩｇのＦｃ領域を含む融合タンパク質、及びＩｇのＦｃ領域を含むコンジュゲートの、例えばクロマトグラフィーによる分離に有用である。親和性マトリックスは免疫グロブリンの分離に有用であり、洗浄プロセスの間に適用されるような高アルカリ性条件の後でも、Ｉｇ結合特性を保持するはずである。このようなマトリックスの洗浄は、マトリックスを長期間繰り返し使用するために不可欠である。
【００９１】
親和性クロマトグラフィー用の固相支持体マトリックスはこの分野で公知であり、例えば、限定するものではないが、アガロース及びアガロースの安定化誘導体（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ、Ｐｒａｅｓｔｏ（登録商標）Ｐｕｒｅ；ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）、ｒＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）、及びその他）、セルロース又はセルロースの誘導体、細孔制御ガラス（例えば、ＰｒｏＳｅｐｖＡ樹脂（登録商標））、モノリス（例えば、ＣＩＭ（登録商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（例えば、ＣＭジルコニア又はＣＰＧ（登録商標））、酸化チタン、又は合成ポリマー（例えば、Ｐｏｒｏｓ ５０Ａ又はＰｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）Ａ樹脂などのポリスチレン、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなど）、及び種々の組成のヒドロゲル、を含む。特定の実施形態では、この支持体は多糖などのポリヒドロキシポリマーを含む。支持体に適した多糖類の例には、寒天、アガロース、デキストラン、デンプン、セルロース、プルランなど、及びこれらの安定化変異体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
固相支持体マトリックスのフォーマットは、任意の適切な周知の種類のものであってもよい。本発明のＩｇ結合タンパク質を結合するこのような固相支持体マトリックスは、例えば、カラム、キャピラリー、粒子、膜、フィルター、モノリス、繊維、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセット、又はその他のクロマトグラフィーで一般的に使用され、当業者に知られているフォーマットを具えていてもよい。
【００９３】
一実施形態では、このマトリックスが、例えばセファロース又はアガロースビーズなどのビーズとしても知られている実質的に球状の粒子からできている。適切な粒径は、５乃至１００μｍ、例えば１０乃至１００μｍ、例えば１０乃至１００μｍ、例えば２０乃至８０μｍの直径範囲であってもよい。粒子の形態のマトリックスは、充填層として、又は膨張層を含む懸濁形態で使用することができる。
【００９４】
別の実施形態では、固相支持体マトリックスが、例えばヒドロゲル膜などの膜である。いくつかの実施形態では、親和性精製は、第１の態様のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質が共有結合しているマトリックスとしての膜を含む。固相支持体は、カートリッジ内の膜の形態であってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、親和性精製は、第１の態様のアルカリ安定Ｉｇ結合タンパク質が共有結合している固相支持体マトリックスを含むクロマトグラフィーカラムを含む。
【００９６】
本発明のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質は、例えば、本発明のＩｇ結合タンパク質中に存在するアミノ−基、スルフヒドロキシ−基及び／又はカルボキシ−基を利用して、従来の結合技術によって適切な固相支持体マトリックスに付着することができる。このカップリングは、Ｉｇ結合タンパク質の窒素、酸素、又は硫黄原子を介して行われる。好ましくは、Ｎ末端又はＣ末端ペプチドリンカーに含まれるアミノ酸が、前記窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子を含む。
【００９７】
Ｉｇ結合タンパク質は、支持マトリックスに直接的に、あるいはスペーサ要素を介してマトリックス表面と本発明のＩｇ結合タンパク質との間に適切な距離を提供して間接的に結合することができ、Ｉｇ結合タンパク質の利用可能性を改善し、支持体に対する本発明のＩｇ結合タンパク質の化学結合を促進する。
【００９８】
タンパク質リガンドを固相支持体に固定化する方法はこの分野ではよく知られており、この分野の当業者は標準的な技術及び装置を用いてより容易に行うことができる。Ｉｇ結合タンパク質及び特定の条件に応じて、このカップリングは、例えばいくつかのリジンを介する多点カップリングであってもよく、あるいは、例えばシステインを介する単点カップリングであってもよい。
【００９９】
アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の使用
第３の態様において、本発明は、第１の態様のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の使用、又は免疫グロブリン又はその変異体の親和性精製用の第２の態様の親和性マトリックスの使用、すなわち本発明のＩｇ結合タンパク質を親和性クロマトグラフィーに使用することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のＩｇ結合タンパク質は、本発明の第２の態様に記載したように固相支持体上に固定化されている。
【０１００】
免疫グロブリンの親和性精製方法
第４の態様において、本発明は、免疫グロブリンの親和性精製方法に関する。この方法は、（ａ）免疫グロブリンを含む液体を提供するステップと；（ｂ）親和性分離マトリックスに結合した第１の態様の固定化アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を含む液体を提供するステップと；（ｃ）この液体を親和性分離マトリックスに接触させて、免疫グロブリンを固定化Ｉｇ結合タンパク質に結合させるステップと；（ｄ）このマトリックスから前記免疫グロブリンを溶出し、これによって免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップと；を具える。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、この親和性精製方法は、更に、親和性分離マトリックスからそれに非特異的に結合している分子の一部又は全部を除去するのに十分な条件下で、ステップ（ｃ）と（ｄ）の間に行われる一又はそれ以上の洗浄ステップをさらに具えていてもよい。非特異的に結合したとは、本開示の主題の少なくとも一つの結合ドメインと免疫グロブリンとの間の相互作用を含まないあらゆる結合を意味する。
【０１０２】
ここに開示された使用及び方法に適した親和性分離マトリックスは、上述した実施形態によるものであり、当業者に知られているマトリックスである。第４の態様のいくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）におけるマトリックスからの免疫グロブリンの溶出が、ｐＨの変化及び／又は塩濃度の変化を通してもたらされる。タンパク質Ａ媒体からの溶出に使用される適切な溶液は、例えばｐＨ５以下の溶液、又はｐＨ１１以上の溶液によって使用することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、親和性マトリックスを効率的に洗浄するためのさらなるステップ（ｆ）が、好ましくは、例えばｐＨが１３乃至１４のアルカリ性液体を使用することによって加えられる。特定の実施形態では、洗浄液は０．１乃至１．０ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくは０．２５乃至０．５ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。
【０１０４】
本発明のＩｇ結合タンパク質の高アルカリ安定性により、このような強アルカリ溶液を洗浄目的に使用することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、親和性マトリックスは、ステップ（ａ）〜（ｅ）の繰り返しによって、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、又は少なくとも１００回、再使用することができ、選択的にステップ（ａ）乃至（ｆ）を少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、又は少なくとも１００回、繰り返すことができる。
【０１０６】
一般に、親和性精製方法を実施する適切な条件は当業者、特にタンパク質Ａクロマトグラフィーの当業者に周知である。
【０１０７】
核酸分子
第５の態様では、本発明は、上記に開示した任意の実施形態のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質をコードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子に関する。一実施形態においては、本発明は、この核酸分子を含むベクターに関する。ベクターとは、タンパク質コード情報を宿主細胞に転写するのに使用できる任意の分子又はもの（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。一実施形態では、ベクターが発現ベクターである。
【０１０８】
第６の態様では、本発明は、上記に開示した核酸又はベクター、例えば大腸菌などの原核生物宿主細胞、例えば酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真核生物宿主細胞、又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞を含む発現系に関する。
【０１０９】
アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の製造方法
第７の態様では、本発明は、本発明のアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の製造方法であって、（ａ）結合タンパク質の発現に適した条件下で第６の態様の宿主細胞を培養して、アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を得るステップと；（ｂ）選択的に、アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質を単離するステップと；を具える。原核生物又は真核生物宿主の培養に適切な条件は当業者に周知である。
【０１１０】
本発明のＩｇ結合分子は、平易な有機合成戦略、固相支援合成技術、又は市場で入手可能な自動合成装置といった、多くの従来の周知の技術のいずれかによって調製することができる。一方、それらは、従来の組換え技術単独で、又は従来の合成技術と組み合わせても調製することができる。
【０１１１】
本発明の一実施形態は、上述した本発明によるアルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の調製方法に関し、この方法は、（ａ）上記に定義したＩｇ結合タンパク質をコードする核酸を調整するステップと（ｂ）この核酸を発現ベクターに導入するステップと；（ｃ）発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと；（ｄ）宿主細胞を培養するステップと；（ｅ）Ｉｇ結合タンパク質が発現する培養条件に宿主細胞を供するステップと、それによって（ｅ）上述したＩｇ結合タンパク質を産生するステップと；選択的に（ｆ）ステップ（ｅ）で製造したタンパク質を単離するステップと；（ｇ）選択的に、上述したようにタンパク質を固相マトリックスにコンジュゲートさせるステップと；を具える。
【０１１２】
本発明のさらなる実施形態では、アルカリ安定性Ｉｇ結合タンパク質の産生は、無細胞インビトロ転写／翻訳によって行われる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものである。しかしながら、本発明はこれらに限定されるものではなく、以下の実施例は単に本発明の実用性を示すものである。
【０１１４】
実施例１：シャッフリングによる親タンパク質の生成
初めに、親タンパク質（例えば、配列番号：３、４、１０、１４、２１、２２、２５、４７乃至５０）を、天然に存在するタンパク質Ａドメイン及びタンパク質Ａドメイン変異体（例えば、Ｚドメイン又は、例えばＺ／２などの任意の天然ドメインに対して少なくとも８９．５％の同一性を有するドメイン）のシャッフリング工程によって生成した。より詳細には、本明細書で理解されるシャフリング工程は、非同一の既知のアミノ酸配列セットから人工アミノ酸配列を作製する組み立て工程である。このシャフリング工程は以下のステップ：ａ）５つの天然に存在するタンパク質ＡドメインＥ、Ｂ、Ｄ、Ａ、及びＣ、ならびにタンパク質Ａ変異体ドメインＺ又はＺ／２の配列を提供するステップと；ｂ）これらの配列のアラインメントを取るステップと；ｃ）コンピュータでスクリーニングして統計的断片化を行い、組み換えられた部分配列を同定するステップと；次いでｄ）これらの種々の断片の新しい人工配列を組み立てて、モザイク生成物、すなわち新規のアミノ酸配列を生成するステップと；を具える。ステップｃ）で生成したフラグメントは、任意の長さ、例えば、断片化された親配列の長さがｎであれば、断片の長さは１乃至ｎ−１であった。
【０１１５】
このモザイク生成物中のアミノ酸の相対位置は、出発アミノ酸配列に対して維持された。Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｋ３５、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ａ５６、Ｐ５７の位置の少なくとも９０％が、例えばＩＢ１４、ＩＢ２５、ＩＢ７４ｈ１、ＩＢ７４ｈ２、ＩＢ４７ｈ３、ＩＢ４７ｈ４、又は／及びＩＢ２７の人工アミノ酸配列と、天然に存在するタンパク質Ａドメイン又はタンパク質Ａ変異体との間で同一である。Ｉｇ結合タンパク質ＩＢ１４、ＩＢ２５、ＩＢ７４ｈ１、ＩＢ７４ｈ２、ＩＢ４７ｈ３、ＩＢ４８ｈ４、及びＩＢ２７の全アミノ酸配列は人工のものであり、天然に存在する任意のタンパク質Ａドメイン又はドメインＺのいずれかのアミノ酸配列全体との同一性が８５％より低い。初期の人工Ｉｇ結合タンパク質を生成した後、アミノ酸配列の部位特異的ランダム化によってタンパク質をさらに修飾し、結合タンパク質を更に修飾した。このさらなる修飾は、個々のアミノ酸残基の部位飽和突然変異によって導入された。
【０１１６】
Ｉｇ結合タンパク質ＩＢ１４、ＩＢ２５、ＩＢ４７、ＩＢ７４又は／及びＩＢ２７、ならびに配列番号：５乃至８の遺伝子を合成し、当業者に公知の標準的な方法を用いて大腸菌発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定を使用して挿入した断片配列の正しい配列を確認した。
【０１１７】
多量体Ｉｇ結合タンパク質を生成するために、（例えば、配列番号：１４、２０、３０の）２、３、４、５、又は６個の同一のＩｇ結合ドメインをアミノ酸リンカーを介して遺伝的に融合させた。
【０１１８】
特異的な膜の取り付け及び精製を行うために、Ｃ末端Ｃｙｓを有する短いペプチドリンカー（ＡＳＰＡＰＳＡＰＳＡＣ；配列番号：４１）と、選択的に連鎖球菌タグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号：４６）をＩｇ結合タンパク質（例えば、配列番号：３９−４０を参照）のＣ末端に付加した。その他の実施形態では、特異的な膜の取り付け及び精製を行うために、４３、４６、又は４７位をシステインで置換した（例えば、配列番号：５３乃至５４を参照）。
【０１１９】
実施例２：変異体を生成する突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発用に、Ｑ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ；カタログ番号Ｅ０５５４Ｓ）を製造業者の指示に従って使用した。それぞれ特定の置換をコードするオリゴヌクレオチドと、テンプレートとして配列番号：１４を含むプラスミドを用いてＰＣＲを行った。生成物を結合させ、電気穿孔法によって大腸菌ＸＬ２−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。単一コロニーを単離し、インサート含有クローンにＤＮＡ配列決定を用いて正しい配列を確認した。結果を図２に示す。
【０１２０】
ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）合成（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、いくつかの点突然変異の組み合わせを生成した。Ｓｔｒｉｎｇｓ  ＤＮＡフラグメントは精製されたＰＣＲ産物に対応し、ｐＥＴ２８ａベクターの誘導体にクローン化した。連結反応生成物は、電気穿孔法によって大腸菌ＸＬ２−ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。単一コロニーをＰＣＲによってスクリーニングして、正しいサイズのインサートを含む構築物を同定した。ＤＮＡ配列決定を使用して正しい配列を確認した。点突然変異を有する変異体は、例えば、配列番号：９乃至１３、１５乃至１７、及び２１に示されている。
【０１２１】
実施例３：Ｉｇ結合タンパク質の発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を、Ｉｇ結合タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。細胞を選択性寒天プレート（カナマイシン）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。前培養物を、１００ｍｌの２ｘＹＴ培地中の単一コロニーから接種し、ラクトースと消泡剤を含まない１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したバッフル付き１Ｌエルレンマイヤーフラスコ中で３７℃、１６０ｒｐｍで１６時間培養した。ＯＤ６００の読み取りは６乃至１２の範囲であった。主培養物を、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１Ｌ厚壁三角フラスコ中の４００ｍｌのスーパーリッチ培地（修飾Ｈ１５培地２％グルコース、５％酵母抽出物、０．８９％グリセロール、０．７６％ラクトース、２５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２０２ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４、消泡剤ＳＥ１５）中で、０．５の調整開始ＯＤ６００を用いて、前の一晩培養物から接種した。培養物を共鳴音響ミキサー（ＲＡＭｂｉｏ）に移し、３７℃で２０×ｇでインキュベートした。オキシポンプストッパーで、曝気を促進した。グルコースを代謝させ、次いでラクトースを細胞に入れることによって、組換えタンパク質の発現を誘導した。所定の時点で、ＯＤ６００を測定し、５／ＯＤ６００に調整した試料を取り出し、ペレットにし、そして−２０℃で凍結させた。約４５乃至６０の最終ＯＤ６００に達するまで細胞を約２４時間一晩増殖させた。バイオマスを集めるために、細胞を２０℃で１０分間、１６０００×ｇで遠心分離した。ペレットを秤量し（湿重量）、上清中のｐＨを測定した。処理前は細胞を−２０℃で保存した。
【０１２２】
実施例４：ＩｇＳ結合タンパク質の発現と溶解度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
発酵中に採取した試料を３００μｌの抽出緩衝液（０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、７．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０Ｕベンゾナーゼを補充したＰＢＳ）中に再懸濁させ、サーモミキサー中で、７００ｒｐｍ、室温で１５分間撹拌することにより可溶化させた。遠心分離（１６０００×ｇ、２分、室温）によって可溶性タンパク質を不溶性タンパク質から分離した。上清を回収し（可溶性画分）、ペレット（不溶性画分）を等量の尿素緩衝液（８Ｍ尿素、０．２Ｍトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に再懸濁させた。可溶性画分と不溶性画分の両方から５０μｌを取り出し、１２μｌの５×サンプルバッファー及び５μｌの０．５Ｍ  ＤＴＴを加えた。試料を９５℃で５分間煮沸した。最後に、これらの試料８μｌを、製造業者の推奨に従って流し、クマシーで染色したＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％ビス−トリスＳＤＳゲルに適用した。選択された時間内に最適化条件で、全てのＩｇ結合タンパク質の高レベルな発現が見られた（データは示さず）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、発現したＩｇ結合タンパク質は全て９５％以上溶解した。
【０１２３】
実施例５：Ｉｇ結合タンパク質の精製
Ｉｇ結合タンパク質は、Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号：４６）を有する大腸菌の可溶性画分中に発現した。この細胞を２回の凍結／融解サイクルで溶解させ、製造業者（ＩＢＡ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の説明書に従ってＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）樹脂を用いて精製工程を実施した。ジスルフィド形成を回避するために、緩衝液に１ｍＭのＤＴＴを添加した。
【０１２４】
代替的に、Ｉｇ結合タンパク質は、Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ（配列番号：４６）を有する大腸菌の可溶性画分中に発現した。細胞を細胞破壊緩衝液に再懸濁させ、一定の細胞破壊システム（Ｕｎｉｔ  Ｆ８Ｂ、Ｈｏｌｌｙ  Ｆａｒｍ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ）により、２サイクルの１ｋｂａｒで溶解させた。製造業者の説明書に従って、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎｒｅｓｉｎ（ＩＢＡ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び追加のゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製工程を行った。ジスルフィド形成緩衝液を避けるために、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ精製用緩衝液に１ｍＭ  ＤＴＴを添加し、クエン酸緩衝液（２０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）をゲル濾過用のランニング緩衝液として使用した。
【０１２５】
実施例６．高い親和性でのＩｇ結合タンパク質のＩｇＧへの結合（ＥＬＩＳＡによって測定される）
ＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４に対するＩｇ結合タンパク質の親和性は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。ＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４含有抗体（例えば、ＩｇＧ１の場合はセツキシマブ、ＩｇＧ２の場合はパニツムマブ、又はＩｇＧ４の場合はナタリズマブ）を９６ウェルＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（２μｇ／ｍｌ）。４℃で１６時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、ウェルをＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックした（室温で２時間）。陰性対照はＢＳＡのみでブロックしたウェルにあった。ブロックした後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温でＩｇ結合タンパク質（ＰＢＳＴ中）で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰ（１：１００００）（ＩＢＡ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、室温で１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼの活性は、ＴＭＢ−Ｐｌｕｓ基質を添加することによって視覚化された。３０分後、０．２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ヒトＩｇＧ１に対するＫＤは、配列番号：１４について４．９ｎＭであり、ドメインＺについては３．４ｎＭ、ドメインＢについて３．１ｎＭ、ドメインＣについては２．８ｎＭである。
【０１２６】
実施例７．高い親和性でＩｇ結合タンパク質のＩｇＧへの結合（表面プラズモン共鳴実験で測定決定される）
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＰＲランニング緩衝液で平衡化した。表面に露出したカルボキシル基は、ＥＤＣとＮＨＳの混合物に通すことによって活性化されて、反応性エステル基が生じた。７００乃至１５００ＲＵのオンリガンドをフローセルに固定化し、オフリガンドを別のフローセルに固定化した。リガンド固定化後のエタノールアミンの注入により、非共有結合したＩｇ結合タンパク質を除去する。リガンドが結合すると、タンパク質分析物が表面に蓄積して屈折率が上がった。この屈折率の変化はリアルタイムで測定され、時間に対する応答又は共鳴単位（ＲＵ）としてプロットした。この分析物を適切な流速（μｌ／分）で段階希釈してチップに塗布した。各実験の後、チップ表面を再生緩衝液で再生し、ランニング緩衝液で平衡化した。対照試料をマトリックスに適用した。上述したように、再生及び再平衡化を行った。結合試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で行った。データ評価は、製造業者によって提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアで、ラングミュア１：１モデル（ＲＩ＝０）を使用して行った。評価を行った解離定数（ＫＤ）を標的外に対して標準化し、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、セツキシマブ（ＩｇＧ１）、ナタリズマブ（ＩｇＧ４）、又はパニツモマブ（ＩｇＧ２）についての様々な人工アルカリ安定Ｉｇ結合タンパク質のＫＤ値を表２に示す。
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【０１２７】
実施例８．エポキシ活性化マトリックスに結合したＩｇ結合タンパク質のアルカリ安定性
精製したＩｇ結合タンパク質を、製造業者の説明書（カップリング条件：一晩、ｐＨ９．０、エタノールアミンで５時間ブロッキング）に従ってエポキシ活性化マトリックス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、ＧＥ；カタログ番号１７−０４８０−０１）に結合させた。 セツキシマブをＩｇＧ試料として使用した（５ｍｇ； １ｍｇ／ｍｌマトリックス）。セツキシマブを、固定化Ｉｇ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。このマトリックスを１００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．５で洗浄して、固定化ＩｇＧ結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出した。溶出したＩｇＧの濃度をＢＬＩ（タンパク質Ａオクテットセンサーと、標準としてセツキシマブを用いて定量化）によって測定し、Ｉｇ結合タンパク質の結合活性を決定した。
【０１２８】
カラムを０．５Ｍ  ＮａＯＨで、室温（２２℃＋／−３℃）で６時間インキュベートした。固定化したタンパク質のＩｇ結合活性を、０．５Ｍ  ＮａＯＨで６時間インキュベートした前後に分析した。ＮａＯＨ処理前の固定化タンパク質のＩｇ結合活性を１００％と定義した。
【０１２９】
図２は、ＩＢ１４（配列番号：１４）の点変異変異体のアルカリ安定性の分析を示す。１Ｂ１４の１、１１、３５、及び４２位における点突然変異の６時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ連続処理後のＩｇ結合の残存活性（％）を、親のＩＢ１４と比較する。置換Ｐ１Ｉ、Ｓ１１Ｅ、Ｓ１１Ｉ、Ｓ１１Ａ、Ｋ３５Ｉ、Ｋ３５Ｒ、又はＫ４２Ｌは、Ｉｇ結合活性を少なくとも約２５％改善する。
【０１３０】
図３は、例えば１、１１、２８、３５、及び／又は４２位において３、４、又は５個の置換の組み合わせを有する変異体タンパク質の活性が、親タンパク質ＩＢ１４（配列番号：１４）の活性に比較してより高いことを示している。０．５Ｍ  ＮａＯＨで６時間インキュベートした後、ＩＢ１４と比較して、Ｉｇ結合タンパク質ｃｓ１４−１（配列番号：１８）は約５０％、ｃｓ１４−２（配列番号：１９）は約７０％、ｃｓ１４−３（配列番号：２０）は、約８０％、より高いＩｇ結合活性を示した。
【０１３１】
図４は、１、１１、３５、及び／又は４２位における３、４、又は５個の置換の組み合わせを有する変異型Ｉｇ結合タンパク質の活性が、親タンパク質ＩＢ２７の活性と比較してより高いことを示している。ｃｓ２７−１（配列番号：２９）は、０．５Ｍ  ＮａＯＨで６時間インキュベートした後、親タンパク質と比較して約３０％、ｃｓ２７−２（配列番号：３０）は約４０％、より高いＩｇ結合活性を示した。
【０１３２】
図５は、１Ｉ、１１Ａ、３５Ｒ、及び４２Ｌの組み合わせを有する変異型Ｉｇ結合タンパク質の活性が、ここではＩＢ１４として示される親タンパク質の活性と比較してより高いことを示している（その他の親タンパク質はＩＢ１４に匹敵する；データは示さず）。Ｉｇ結合タンパク質ｃｓ７４ｈ１（配列番号：４２）、ｃｓ７４ｈ２（配列番号：４３）、ｃｓ４７ｈ３（配列番号：４４）、ｃｓ４７ｈ４（配列番号：４５）、及びｃｓ２５（配列番号：２６）は、０．５Ｍ  ＮａＯＨで６時間インキュベートした後のＩＢ１４と比較して有意により高いＩｇ結合活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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