(57)【要約】  レプチンレベルを増加させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤。本発明はまた、満腹感をサポートするため、及び体重維持をサポートし、かつ／又は肥満を治療若しくは予防するための、そのような作用剤の使用にも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レプチンレベルを増加させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤。
【請求項２】
満腹感をサポートするのに使用するための、請求項１に記載の作用剤。
【請求項３】
体重維持をサポートするのに、かつ／又は肥満を治療若しくは予防するのに使用するための、請求項１又は２に記載の作用剤。
【請求項４】
前記作用剤が、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの活性を増加させる、請求項１〜３に記載の使用のための作用剤。
【請求項５】
前記作用剤が、減量介入中又はその後に、好ましくは減量介入後に対象に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
【請求項６】
前記作用剤が、対象においてＢＣＫＤＨのレベルを増加させる、好ましくは、前記作用剤が、対象においてＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットのレベルを増加させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
【請求項７】
前記作用剤が、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）の活性に影響を及ぼさない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
【請求項８】
前記作用剤が、レスベラトロール若しくはバルプロ酸から選択されるか、又は表１ａ若しくは表１ｂに記載された作用剤から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
【請求項９】
前記作用剤が、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）の活性を減少させ、好ましくは前記作用剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための作用剤。
【請求項１０】
前記作用剤が、ＢＣＫＤＨキナーゼのレベルを減少させる、請求項９に記載の使用のための作用剤。
【請求項１１】
前記作用剤が、α−クロロイソカプロン酸若しくはα−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）であるか、又は表２に記載された作用剤から選択される、請求項９又は１０に記載の使用のための作用剤。
【請求項１２】
対象において体重維持をサポートすること、及び／又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）前記候補作用剤が、前記ＢＣＫＤＨポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記ＢＣＫＤＨが、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、ＢＣＫＤＨを含む前記製剤を候補作用剤と接触させること、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を測定すること、を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象において体重維持をサポートすること、及び／又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）前記候補作用剤が、前記ＢＣＫＤＨキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記方法が、ＡＴＰの存在下で、ＢＣＫＤＨキナーゼを含む前記製剤を候補作用剤と接触させること、及び基質中へのリン酸の取り込みを測定すること、又はＡＴＰからＡＤＰへの変換を測定すること、を含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を調整する（modulate）ことができる作用剤、及び特にレプチンレベルを増加させるのに使用するための、治療におけるそのような作用剤の使用に関する。本発明はまた、満腹感をサポートするため、及び体重維持をサポートし肥満を治療するための、そのような作用剤の使用に関する。本発明はまた、このような作用剤を特定する方法にも関する。
【０００２】
［背景技術］
肥満は、世界の多くの地域で流行の域に達している慢性の代謝障害である。肥満は、２型糖尿病、心臓血管疾患、脂質異常症、及びある特定の種類のがんなどの重篤な共存症の主要な危険因子である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  Ｓｅｒ．（２０００）８９４：ｉ〜ｘｉｉ、１〜２５３）。
【０００３】
肥満は、炭水化物、脂肪などからのエネルギーが過剰に蓄積された結果として、個体の体重が通常より重い状態を指す。余分な体重は、通常、皮下又は内臓周囲に脂肪の形態で保持される。
【０００４】
経験的データによれば、初期体重の少なくとも１０％の減量（weight loss）が、肥満関連共存症のリスクを大幅に低下させることが示唆されている（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．（２０００）８９４：ｉ〜ｘｉｉ，１〜２５３）。しかし、減量能力は対象間で大きく異なる。
【０００５】
エネルギー摂取量がエネルギー消費量を超える場合に肥満は誘発される。したがって、肥満を改善するために、脂肪、炭水化物などからのエネルギー摂取量を減少させる方法、又は生体内の代謝を促進することによってエネルギー消費量を増加させる方法が望まれる。そのため、食習慣及び運動の改善は、肥満及び肥満関連障害の予防及び改善のための有効な方法であると考えられる。例えば、低カロリー食（ＬＣＤ）介入は減量に非常に有効であり得るものであり、概して、この減量に伴って肥満関連共存症、特に２型糖尿病のリスクが改善すると長い間認識されてきた（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．（２０００）８９４：ｉ〜ｘｉｉ，１〜２５３）。
【０００６】
減量を促進するための数多くの方法が知られているが、減量介入期間が終了したら、対象は減少した体重がリバウンドするというリスクに直面する。そのような後退により、減量に関連した利益が減少する、又は潜在的には完全に元に戻る危険性がある。
【０００７】
したがって、減量を促進する改善された方法だけでなく、体重維持をサポートする（減少した体重がリバウンドするのを防止又は抑制する、したがって、減量介入後に達成されたものと同様のレベルに体重を維持するのをサポートする）ための方法が、依然として大いに必要とされている。このような改善により、肥満のための治療はより完全なものとなり、よって肥満関連障害のリスクは減少するであろう。特に、減少した体重がリバウンドするリスクを低下させるために、減量後の期間にうまく適用することができる方法が必要である。
【０００８】
レプチンは一般に、食欲抑制及び調節に関連すると理解されている。本出願の発明者らは、驚くべきことに、レプチン発現レベルとＢＣＫＤＨＢ遺伝子の制御領域との間の関連を認めた。
【０００９】
［発明の概要］
本発明者らは、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ研究から得られた減量介入データに対して、タンパク質の量的形質遺伝子座（ｐＱＴＬ）の解析を行った。この研究は、全ヨーロッパの無作為化対照食事介入研究であり、８つのヨーロッパの施設で肥満及び過体重の家族において減量及び体重維持に対する食事タンパク質及びグリセミックインデックスの影響を調査している（Ｌａｒｓｅｎら（２００９）Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｖ．１１：７６〜９１）。簡潔に述べると、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ研究では、スクリーニングした参加者に低カロリー食（ＬＣＤ）期間（ＣＩＤ１）を設け、この期間では、過体重／肥満対象には８週間のＭｏｄｉｆａｓｔ（登録商標）食（約８００ｋＣａｌ／日）を遵守させ、次に体重維持期間（ＣＩＤ２）を続けた。
【００１０】
本発明の状況において、ｐＱＴＬは、ＬＣＤ期間中のタンパク質レベルの変化に関与するゲノム遺伝子座である。本発明者らは、減量と相関する発現変化を示すタンパク質と関連するｐＱＴＬを詳細に解析した。
【００１１】
本発明者らは、減量と顕著に関連する、ＬＣＤ期間中のレプチンの示差的発現を観察した。この発見は、レプチンが食欲抑制及び調節に関連するという当分野における認識と相関する。本発明者らはまた、レプチンの示差的発現と関連する最も好適なｐＱＴＬが、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の制御領域内に位置することを認めた。
【００１２】
ＢＣＫＤＨＢは、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼＥ１  Ｂサブユニットをコードしており、このサブユニットは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）ロイシン、イソロイシン及びバリンの分解に関与する酵素複合体の一部である。ＢＣＡＡ自体が食欲抑制と関連していることから、ＢＣＫＤＨＢと食欲抑制及び調節との間に２つの独立した関連が立証されている。
【００１３】
したがって、本発明者らは、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）と食欲抑制及び調節との間の有意な関係を立証し、よって体重維持及び肥満の治療をサポートするための新しい介入を提供する。
【００１４】
したがって、一態様において本発明は、レプチンのレベルを増加させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、対象の食欲を抑制するのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感をサポートする又は持続させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食物摂取を減少させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤を提供する。別の態様では、本発明は、対象における脂肪沈着を減少させるのに使用するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、体重維持をサポートするための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、肥満を治療又は予防するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食欲を抑制するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感を持続させるための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食物摂取を減少させるための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象における脂肪沈着を減少させるための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、体重維持をサポートする必要がある対象に投与することを含む、体重維持をサポートする方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、食欲を抑制する必要がある対象に投与することを含む、対象の食欲を抑制する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、満腹感を持続させる必要がある対象に投与することを含む、満腹感を持続させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、食物摂取を減少させる必要のある対象に投与することを含む、対象の食物摂取を減少させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、脂肪沈着を減少させる必要がある対象に投与することを含む、対象における脂肪沈着を減少させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の作用剤を、肥満を治療又は予防する必要がある対象に投与することを含む、肥満を治療又は予防する方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、作用剤は、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの活性を増加させる。
【００１９】
ＢＣＫＤＨ及び／又はＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの活性は、本発明の作用剤の非存在下での活性と比較して増加し得る。ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）の活性は、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上増加し得る。
【００２０】
ＢＣＫＤＨ活性（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）は、例えば、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）に対してアゴニスト作用を示す、又は細胞においてＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）のレベルを増加させる、作用剤の使用によって増加させてもよい。
【００２１】
一実施形態では、作用剤は満腹感を増大又は持続させる。別の実施形態では、作用剤は対象の食物摂取を減少させる。別の実施形態では、作用剤は対象における脂肪沈着を減少させる。
【００２２】
一実施形態では、作用剤は、減量介入中又はその後に、好ましくは減量介入後に対象に投与される。減量介入は、例えば、食事療法（例えば低カロリー食）及び／又は運動療法であってもよい。
【００２３】
一実施形態では、作用剤は対象においてＢＣＫＤＨのレベルを増加させる。好ましくは、作用剤は対象においてＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットのレベルを増加させる。これに関連して、「レベル」は、ＢＣＫＤＨ又はＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの量を指し、例えば、発現されたタンパク質の量を分析することによって、及び／又は対応するｍＲＮＡの存在量を分析することによって測定することができる。好ましくは、作用剤は、ＢＣＫＤＨ及び／又はＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの発現を増加させる。
【００２４】
例えば、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂ及び／又はＡサブユニット）をコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入して、コードされたポリペプチドを細胞に発現させてもよい。したがって、本発明の作用剤は、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂ及び／又はＡサブユニット）をコードするポリヌクレオチドの形態であってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクターの形態である。
【００２５】
ＢＣＫＤＨ及び／又はＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットのレベルは、本発明の作用剤の非存在下でのレベルと比較して増加し得る。ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）のレベルは、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上増加し得る。
【００２６】
一実施形態では、作用剤は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）の活性に影響を及ぼさない。一実施形態では、作用剤はフェノフィブラートではない。
【００２７】
一実施形態では、作用剤は、レスベラトロール若しくはバルプロ酸、又は植物生理活性物質から選択される。一実施形態では、作用剤は、表１ａに記載された作用剤から選択される。一実施形態では、作用剤は２，４−ジニトロトルエンである。一実施形態では、作用剤は塩化アンモニウムである。一実施形態では、作用剤はベンゾ（ａ）ピレンである。一実施形態では、作用剤はクプリゾンである。一実施形態では、作用剤はジエチルニトロソアミンである。一実施形態では、作用剤は塩化メチル水銀である。一実施形態では、作用剤はピリニクス酸（pirinixic acid）である。一実施形態では、作用剤はクロム（ＶＩ）酸カリウムである。一実施形態では、作用剤はテトラクロロジベンゾダイオキシンである。一実施形態では、作用剤は、表１ｂに記載された作用剤から選択される。一実施形態では、作用剤は１，１２−ベンゾペリレンである。一実施形態では、作用剤は、１７−エチニル−５−アンドロステン−３，７，１７−トリオール（17−ethynyl−5−androstene−3,7,17−triol）である。一実施形態では、作用剤は２，４−ジニトロトルエンである。一実施形態では、作用剤はアセトアミノフェンである。一実施形態では、作用剤はアミオダロンである。一実施形態では、作用剤は塩化アンモニウムである。一実施形態では、作用剤はアトラジンである。一実施形態では、作用剤はビスフェノールＡである。一実施形態では、作用剤はカルバマゼピンである。一実施形態では、作用剤は四塩化炭素である。一実施形態では、作用剤はクロロプレンである。一実施形態では、作用剤はクロフィブラートである。一実施形態では、作用剤はエチニルエストラジオールである。一実施形態では、作用剤はフルオロウラシルである。一実施形態では、作用剤はフランである。一実施形態では、作用剤はケタミンである。一実施形態では、作用剤はピリニクス酸である。一実施形態では、作用剤はストレプトゾシンである。一実施形態では、作用剤はテトラサイクリンである。一実施形態では、作用剤はトポテカンである。一実施形態では、作用剤はツニカマイシンである。一実施形態では、作用剤はバンコマイシンである。一実施形態では、作用剤はビンクロゾリンである。
【００２８】
一実施形態では、作用剤は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）の活性を減少させる。
【００２９】
ＢＣＫＤＨキナーゼの活性は、本発明の作用剤の非存在下での活性と比較して減少し得る。ＢＣＫＤＨキナーゼの活性は、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％減少し得る。
【００３０】
作用剤は、例えば、ＢＣＫＤＨキナーゼ拮抗剤又は阻害剤であってもよい。好ましくは、作用剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子からなる群から選択される。ポリペプチドは、例えば抗体であってもよい。したがって、本発明の作用剤は、ＢＣＫＤＨキナーゼを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又はポリペプチド（例えば抗体）の形態であってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクターの形態である。
【００３１】
一実施形態では、作用剤はＢＣＫＤＨキナーゼのレベルを減少させる。これに関連して、「レベル」は、ＢＣＫＤＨキナーゼの量を指し、例えば、発現されたタンパク質の量を分析することによって、及び／又は対応するｍＲＮＡの存在量を分析することによって測定することができる。好ましくは、作用剤はＢＣＫＤＨキナーゼの発現を減少させる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、ＢＣＫＤＨキナーゼの発現を低減させ得る。
【００３２】
ＢＣＫＤＨキナーゼのレベルは、本発明の作用剤の非存在下でのレベルと比較して減少し得る。ＢＣＫＤＨキナーゼのレベルは、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％減少し得る。
【００３３】
一実施形態では、作用剤は、α−クロロイソカプロン酸若しくはα−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）であるか、又は表２に記載された作用剤から選択される。
【００３４】
本発明の作用剤は、本発明の方法によって特定された作用剤であってもよい。
【００３５】
別の態様では、本発明は、対象において体重維持をサポートすること、及び／又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）候補作用剤が、ＢＣＫＤＨポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００３６】
ＢＣＫＤＨポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性は、候補作用剤の存在下及び非存在下（すなわち対照実験）でのＢＣＫＤＨポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を比較することによって、分析することができる。
【００３７】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨはＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットである。
【００３８】
一実施形態では、方法は、ＢＣＫＤＨを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を測定すること、を含む。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換は、分光光度法により分析することができる。
【００３９】
別の態様では、本発明は、対象において体重維持をサポートすること、及び／又は肥満を治療若しくは予防することができる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）候補作用剤が、ＢＣＫＤＨキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００４０】
ＢＣＫＤＨキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性は、候補作用剤の存在下及び非存在下（すなわち対照実験）でのＢＣＫＤＨキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を比較することによって、分析することができる。
【００４１】
一実施形態では、方法は、ＡＴＰの存在下で、ＢＣＫＤＨキナーゼを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及び基質中へのリン酸の取り込みを測定すること、又はＡＴＰからＡＤＰへの変換を測定すること、を含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）ＢＣＫＤＨポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）候補作用剤が、ＢＣＫＤＨポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００４３】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨはＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットである。
【００４４】
一実施形態では、方法は、ＢＣＫＤＨを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及びＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を測定すること、を含む。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換は、分光光度法により分析することができる。
【００４５】
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）の活性を減少させる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）ＢＣＫＤＨキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製剤を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）候補作用剤が、ＢＣＫＤＨキナーゼポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００４６】
一実施形態では、方法は、ＡＴＰの存在下で、ＢＣＫＤＨキナーゼを含む製剤を候補作用剤と接触させること、及び基質中へのリン酸の取り込みを測定すること、又はＡＴＰからＡＤＰへの変換を測定すること、を含む。
【００４７】
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）、好ましくはＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの発現又はプロセシングを増加させる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）細胞、好ましくはＢＣＫＤＨを発現している細胞を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）候補作用剤がＢＣＫＤＨの発現又はプロセシングを増加させるかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）の発現又はプロセシングを減少させる作用剤を特定する方法であって、
（ａ）ＢＣＫＤＨキナーゼを発現している細胞を候補作用剤と接触させるステップと、
（ｂ）候補作用剤がＢＣＫＤＨキナーゼの発現又はプロセシングを減少させるかどうかを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００４９】
本発明の方法は、対象の食欲を抑制することができる作用剤を特定するための、満腹感を増大又は持続させるための、対象の食物摂取を減少させるための、及び／又は対象における脂肪沈着を減少させるための、方法であってもよい。
【００５０】
別の態様では、本発明は、体重維持をサポートする、対象の食欲を抑制する、満腹感を増大若しくは持続させる、対象の食物摂取量を減少させる、対象における脂肪沈着を減少させる、かつ／又は肥満を治療若しくは予防する作用剤を特定する方法における、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）、特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット、若しくはＢＣＫＤＨキナーゼ、又は前述のものをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、体重維持をサポートする、対象の食欲を抑制する、満腹感を増大若しくは持続させる、対象の食物摂取を減少させる、対象における脂肪沈着を減少させる、かつ／又は肥満を治療若しくは予防するのに使用するための医薬を製造するための、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）の活性を増加させることができる作用剤の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】第６染色体のＢＣＫＤＨＢ遺伝子の制御領域中に位置する領域に関して拡大したマンハッタンプロットである。
【図２】トランスに作用するＳＮＰ遺伝子型に基づいて層別化されたタンパク質発現は、発現の顕著な差異を明確にしなかったことを示すボックスプロットである。
【図３】低カロリー食（ＬＣＤ）介入前（１）及び後（２）のロイシン、イソロイシン及びバリンの変数分布である。
【００５３】
［発明を実施するための形態］
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
【００５４】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。このような技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００５５】
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）は、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）バリン、ロイシン及びイソロイシンの異化作用において重要な役割を果たす、ミトコンドリア内膜上に位置するタンパク質複合体である。ＢＣＡＡ異化作用において、ＢＣＫＤＨ複合体は、異化経路全体における律速段階である分岐鎖α−ケト酸の酸化的脱炭酸を触媒する。
【００５６】
ＢＣＫＤＨ複合体は、以下の３つのサブユニットからなる。
【００５７】
１．分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を示すＥ１サブユニット（ＥＣ１．２．４．４）。Ｅ１サブユニットは、ＢＣＫＤＨＡ及びＢＣＫＤＨＢ遺伝子によってコードされるＡ鎖及びＢ鎖（それぞれα及びβとしても知られる）で構成される。
２．リポアミドアシルトランスフェラーゼ活性を示すＥ２サブユニット（ＥＣ  ２．３．１．１６８）、及び
３．リポアミドデヒドロゲナーゼ活性を示すＥ３サブユニット（ＥＣ  １．８．１．４）。
【００５８】
Ｅ２サブユニットは、ＢＣＫＤＨ複合体のコアとして働き、八面体対称の２４個の複製物として又は二十面体対称の６０個の複製物として見出される。サブユニットＥ１及びＥ３は非共有結合を介してＥ２に結合し、それぞれ複数の複製物を有する。
【００５９】
ＢＣＫＤＨ複合体中の変異、特にＥ１  Ｂサブユニット中に位置する変異は、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＰ；Aｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ８：２７７〜２９１）を含めヒトにおける多くの障害に関連している。
【００６０】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨはヒトＢＣＫＤＨである。
【００６１】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットのアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００００４７．１で寄託された配列である。
【００６２】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットのアミノ酸配列の例は以下である：
ＭＡＶＶＡＡＡＡＧＷＬＬＲＬＲＡＡＧＡＥＧＨＷＲＲＬＰＧＡＧＬＡＲＧＦＬＨＰＡＡＴＶＥＤＡＡＱＲＲＱＶＡＨＦＴＦＱＰＤＰＥＰＲＥＹＧＱＴＱＫＭＮＬＦＱＳＶＴＳＡＬＤＮＳＬＡＫＤＰＴＡＶＩＦＧＥＤＶＡＦＧＧＶＦＲＣＴＶＧＬＲＤＫＹＧＫＤＲＶＦＮＴＰＬＣＥＱＧＩＶＧＦＧＩＧＩＡＶＴＧＡＴＡＩＡＥＩＱＦＡＤＹＩＦＰＡＦＤＱＩＶＮＥＡＡＫＹＲＹＲＳＧＤＬＦＮＣＧＳＬＴＩＲＳＰＷＧＣＶＧＨＧＡＬＹＨＳＱＳＰＥＡＦＦＡＨＣＰＧＩＫＶＶＩＰＲＳＰＦＱＡＫＧＬＬＬＳＣＩＥＤＫＮＰＣＩＦＦＥＰＫＩＬＹＲＡＡＡＥＥＶＰＩＥＰＹＮＩＰＬＳＱＡＥＶＩＱＥＧＳＤＶＴＬＶＡＷＧＴＱＶＨＶＩＲＥＶＡＳＭＡＫＥＫＬＧＶＳＣＥＶＩＤＬＲＴＩＩＰＷＤＶＤＴＩＣＫＳＶＩＫＴＧＲＬＬＩＳＨＥＡＰＬＴＧＧＦＡＳＥＩＳＳＴＶＱＥＥＣＦＬＮＬＥＡＰＩＳＲＶＣＧＹＤＴＰＦＰＨＩＦＥＰＦＹＩＰＤＫＷＫＣＹＤＡＬＲＫＭＩＮＹ
（配列番号１）
【００６３】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００００５６．４で寄託された配列である。
【００６４】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は以下である：
ＡＴＧＧＣＧＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＴＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＡＣＴＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＴＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＧＣＧＧＴＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＡＴＣＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＡＣＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＣＣＴＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴＴＧＣＡＴＣＧＧＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＣＴＡＴＴＧＡ
（配列番号２）
【００６５】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットは、配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号１で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００６６】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号１で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００６７】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号１で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００６８】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットのアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００７００．１で寄託された配列である。
【００６９】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットのアミノ酸配列の例は以下である：
ＭＡＶＡＩＡＡＡＲＶＷＲＬＮＲＧＬＳＱＡＡＬＬＬＬＲＱＰＧＡＲＧＬＡＲＳＨＰＰＲＱＱＱＱＦＳＳＬＤＤＫＰＱＦＰＧＡＳＡＥＦＩＤＫＬＥＦＩＱＰＮＶＩＳＧＩＰＩＹＲＶＭＤＲＱＧＱＩＩＮＰＳＥＤＰＨＬＰＫＥＫＶＬＫＬＹＫＳＭＴＬＬＮＴＭＤＲＩＬＹＥＳＱＲＱＧＲＩＳＦＹＭＴＮＹＧＥＥＧＴＨＶＧＳＡＡＡＬＤＮＴＤＬＶＦＧＱＹＲＥＡＧＶＬＭＹＲＤＹＰＬＥＬＦＭＡＱＣＹＧＮＩＳＤＬＧＫＧＲＱＭＰＶＨＹＧＣＫＥＲＨＦＶＴＩＳＳＰＬＡＴＱＩＰＱＡＶＧＡＡＹＡＡＫＲＡＮＡＮＲＶＶＩＣＹＦＧＥＧＡＡＳＥＧＤＡＨＡＧＦＮＦＡＡＴＬＥＣＰＩＩＦＦＣＲＮＮＧＹＡＩＳＴＰＴＳＥＱＹＲＧＤＧＩＡＡＲＧＰＧＹＧＩＭＳＩＲＶＤＧＮＤＶＦＡＶＹＮＡＴＫＥＡＲＲＲＡＶＡＥＮＱＰＦＬＩＥＡＭＴＹＲＩＧＨＨＳＴＳＤＤＳＳＡＹＲＳＶＤＥＶＮＹＷＤＫＱＤＨＰＩＳＲＬＲＨＹＬＬＳＱＧＷＷＤＥＥＱＥＫＡＷＲＫＱＳＲＲＫＶＭＥＡＦＥＱＡＥＲＫＰＫＰＮＰＮＬＬＦＳＤＶＹＱＥＭＰＡＱＬＲＫＱＱＥＳＬＡＲＨＬＱＴＹＧＥＨＹＰＬＤＨＦＤＫ
（配列番号３）
【００７０】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００７０９．３で寄託された配列である。
【００７１】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットをコードするヌクレオチド配列の例は以下である：
ＡＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＡＡＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＡＧＴＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＧＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＴＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＣＧＣＡＣＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＣＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＡＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＧＴＣＡＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＴＡＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＧＣＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＡＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＡ
（配列番号４）
【００７２】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットは、配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号３で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００７３】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号３で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００７４】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号３で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００７５】
ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａ及びＢサブユニットはミトコンドリアタンパク質であり、それらの配列はミトコンドリア標的シグナル配列を含み得る。このようなシグナル配列は、タンパク質がミトコンドリアを標的とする際に切断されることがあり、よってタンパク質はシグナル配列を欠く成熟型で天然に存在することがある。当業者は、適切なバイオインフォマティクス及び分子生物学技術を使用して、そのようなシグナル配列を容易に決定することができる。例えば、配列番号１の残基１〜５０及び配列番号３の残基１〜４５は、シグナル配列として機能し得る。
【００７６】
分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）
ＢＣＫＤＨの活性は、リン酸化／脱リン酸化サイクルによって制御される。分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＨキナーゼ）は、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットのリン酸化によってＢＣＫＤＨ複合体を不活性化し、ＢＣＫＤＨホスファターゼは、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットを脱リン酸化することによって複合体を活性化する。
【００７７】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨキナーゼはヒトＢＣＫＤＨキナーゼである。
【００７８】
ＢＣＫＤＨキナーゼのアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５８７２．２で寄託された配列である。
【００７９】
ＢＣＫＤＨキナーゼのアミノ酸配列の例は以下である：
ＭＩＬＡＳＶＬＲＳＧＰＧＧＧＬＰＬＲＰＬＬＧＰＡＬＡＬＲＡＲＳＴＳＡＴＤＴＨＨＶＥＭＡＲＥＲＳＫＴＶＴＳＦＹＮＱＳＡＩＤＡＡＡＥＫＰＳＶＲＬＴＰＴＭＭＬＹＡＧＲＳＱＤＧＳＨＬＬＫＳＡＲＹＬＱＱＥＬＰＶＲＩＡＨＲＩＫＧＦＲＣＬＰＦＩＩＧＣＮＰＴＩＬＨＶＨＥＬＹＩＲＡＦＱＫＬＴＤＦＰＰＩＫＤＱＡＤＥＡＱＹＣＱＬＶＲＱＬＬＤＤＨＫＤＶＶＴＬＬＡＥＧＬＲＥＳＲＫＨＩＥＤＥＫＬＶＲＹＦＬＤＫＴＬＴＳＲＬＧＩＲＭＬＡＴＨＨＬＡＬＨＥＤＫＰＤＦＶＧＩＩＣＴＲＬＳＰＫＫＩＩＥＫＷＶＤＦＡＲＲＬＣＥＨＫＹＧＮＡＰＲＶＲＩＮＧＨＶＡＡＲＦＰＦＩＰＭＰＬＤＹＩＬＰＥＬＬＫＮＡＭＲＡＴＭＥＳＨＬＤＴＰＹＮＶＰＤＶＶＩＴＩＡＮＮＤＶＤＬＩＩＲＩＳＤＲＧＧＧＩＡＨＫＤＬＤＲＶＭＤＹＨＦＴＴＡＥＡＳＴＱＤＰＲＩＳＰＬＦＧＨＬＤＭＨＳＧＡＱＳＧＰＭＨＧＦＧＦＧＬＰＴＳＲＡＹＡＥＹＬＧＧＳＬＱＬＱＳＬＱＧＩＧＴＤＶＹＬＲＬＲＨＩＤＧＲＥＥＳＦＲＩ
（配列番号５）
【００８０】
ＢＣＫＤＨキナーゼをコードするヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５８８１．３で寄託された配列である。
【００８１】
ＢＣＫＤＨキナーゼをコードするヌクレオチド配列の例は以下である：
ＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＴＣＣＧＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＣＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＡＴＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣＧＴＣＣＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＡＣＴＴＣＧＡＧＧＣＴＴＧＧＡＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＴＣＧＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＧＣＣＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＣＣＴＡＧＡＣＡＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＡＴＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＴＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＣＧＴＣＡＣＧＧＧＣＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＣＧＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＡ
（配列番号６）
【００８２】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨキナーゼは、配列番号５に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号５で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００８３】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号５で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００８４】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくはこのアミノ酸配列は、配列番号５で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００８５】
ＢＣＫＤＨキナーゼはミトコンドリアタンパク質であり、その配列はミトコンドリア標的シグナル配列を含み得る。このようなシグナル配列は、タンパク質がミトコンドリアを標的とする際に切断されることがあり、よってタンパク質はシグナル配列を欠く成熟型で天然に存在することがある。当業者は、適切なバイオインフォマティクス及び分子生物学的手法を使用して、そのようなシグナル配列を容易に決定することができる。例えば、配列番号５の残基１〜３０は、シグナル配列として機能し得る。
【００８６】
減量及び体重維持
「減量」は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（body mass index）（ｋｇ／ｍ２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、臀囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータの減少を指し得る。
【００８７】
減量は、介入（例えば食事及び／又は運動療法）の終了時における前述のパラメータのうちの１つ以上の値を、介入開始時のそのパラメータの値から引くことによって計算することができる。
【００８８】
減量度（degree of weight loss）は、前述の体重表現型パラメータ（例えば、対象の体重（例えば、キログラム）又は体格指数（ｋｇ／ｍ２）の変化パーセント）のうちの１つの変化（％）として表すことができる。例えば、対象は、その初期体重の少なくとも１０％、その初期体重の少なくとも８％、又はその初期体重の少なくとも５％が減少し得る。単に一例として、対象は、その初期体重の５〜１０％が減少し得る。
【００８９】
一実施形態では、初期体重の少なくとも１０％の減量度は、肥満関連共存症のリスクを大幅に減少させる。
【００９０】
「体重維持」は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇ／ｍ２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、臀囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータが維持されることを指し得る。体重維持は、例えば、介入（例えば食事及び／又は運動療法）後に減少した体重を維持することを指し得る。
【００９１】
体重維持度は、ある期間にわたって前述のパラメータのうちの１つ以上の変化を求めることによって計算することができる。この期間は、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０週間とすることができる。
【００９２】
本発明の作用剤によってサポートされる体重維持は、例えば、ある期間にわたって前述のパラメータの１つ以上の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の変化（例えば増加）をもたらし得る。
【００９３】
体重維持度は、減量達成後のある期間中のリバウンドした体重として、例えば、減量を達成するまでの間に減少した体重のパーセンテージとして表すことができる。
【００９４】
本発明の作用剤によってサポートされる体重維持は、作用剤の投与後に対象の食欲を抑制することによってもたらされてもよい。そのため対象は、本発明の作用剤の非存在下での食欲と比較して減少した食欲を有し得る。
【００９５】
本発明の作用剤によってサポートされる体重維持は、作用剤の投与後に対象の食欲を調節することによってもたらされ得る。例えば減量介入期間の後に、対象はしたがって食欲の調節を維持することができ、したがって体重を維持することができる。
【００９６】
特に、本発明の作用剤は、減量介入（例えば食事又は運動療法）期間中及び／又はその後に、食欲抑制又は調節によって体重維持をサポートし得る。
【００９７】
一態様において、本発明は、例えば減量期間の後に、健康な体組成を維持するための本発明の作用剤の非治療的使用を提供する。
【００９８】
肥満
「過体重」は、成人では２５〜３０の体格指数（ＢＭＩ）を有することと定義される。
【００９９】
「体格指数」は、体重（ｋｇ）を身長（メートル）の二乗で割った比率を意味する。
【０１００】
「肥満」とは、動物、特にヒト及び他の哺乳動物の脂肪組織に蓄えられた天然の貯蔵エネルギーが、ある特定の健康状態又は死亡率の増加に関連する点まで増加した状態である。「肥満の」とは、成人では３０を超えるＢＭＩを有することと定義される。
【０１０１】
「標準体重」は、成人では１８．５〜２５のＢＭＩを有することと定義され、「低体重」は、１８．５未満のＢＭＩと定義され得る。
【０１０２】
肥満は、世界の多くの地域で流行の域に達している慢性の代謝障害であり、２型糖尿病、心臓血管疾患、脂質異常症、及びある特定の種類のがんなどの重篤な共存症の主要な危険因子である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  Ｓｅｒ．（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１〜２５３）。
【０１０３】
「肥満関連疾患」は、肥満個体において発症リスクが増加している任意の状態を指す。肥満関連障害は、糖尿病（例えば２型糖尿病）、脳卒中、コレステロール高値、心臓血管疾患、インスリン抵抗性、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、高血圧及び脂肪肝を含む。
【０１０４】
スクリーニング方法
本発明は、ＢＣＫＤＨの活性を増加させること、及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの活性を減少させることができる作用剤を提供し、更にそのような作用剤を特定するための方法を提供する。
【０１０５】
本発明の作用剤は、定性的又は定量的結果のいずれかを提供する方法によって特定され得る。更に、そのような方法は、本発明の作用剤を特定するだけでなく特徴付けるために使用してもよい。
【０１０６】
候補作用剤は、潜在的に関心対象となる任意の作用剤、例えばペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、核酸又は小分子であり得る。好ましくは、候補作用剤は、潜在的に治療上の関心対象となる化合物又は混合物である。好ましくは、候補作用剤は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性のものである。いくつかの実施形態では、候補作用剤は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む、栄養剤及び／又は食品原材料を含み得る。
【０１０７】
候補作用剤は、作用剤のライブラリー、例えばコンビナトリアルケミストリー又はファージディスプレイライブラリーによって製造されたライブラリーの一部を形成してもよい。一実施形態では、候補作用剤は、植物生理活性分子のライブラリーの一部を形成する。
【０１０８】
ＢＣＫＤＨ活性
本発明はまた、ＢＣＫＤＨの活性を増加させることができる作用剤を特定するための方法、及びそのような方法によって特定される作用剤も提供する。ＢＣＫＤＨの活性は、例えばＢＣＫＤＨの酵素活性を分析することによって、直接分析することができる。
【０１０９】
ＢＣＫＤＨ活性を測定するための多くの技術が当技術分野において知られている。これらの技術は、細胞から単離されたＢＣＫＤＨに適用され得る。ＢＣＫＤＨは、組み換え技術を使用して発現されていてもよい。ＢＣＫＤＨは精製されていることが好ましい。
【０１１０】
一実施形態では、ＢＣＫＤＨは、例えばＢＣＫＤＨの基質であるα−ケトイソ吉草酸の存在下で、ＮＡＤ＋からのＮＡＤＨの生成を監視することによって分光光度法により測定される。そのようなアッセイ技術は、例えば、Ｈａｗｅｓ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２４：２００〜２０７において記載されている。
【０１１１】
ＢＣＫＤＨキナーゼ活性
本発明はまた、ＢＣＫＤＨキナーゼの活性を増加させることができる作用剤を特定するための方法、及びそのような方法によって特定される作用剤も提供する。ＢＣＫＤＨキナーゼの活性は、例えばＢＣＫＤＨキナーゼの酵素活性を分析することによって、直接分析することができる。
【０１１２】
候補作用剤がタンパク質、例えばキナーゼなどの酵素の活性を低減させる能力は、ＩＣ５０値で表され得る。ＩＣ５０は、タンパク質の活性を５０％低減させる（例えば、酵素活性を５０％低減させる）のに必要な作用剤の濃度である。ＩＣ５０値の計算は当技術分野においてよく知られている。本発明の作用剤は、ＢＣＫＤＨキナーゼの阻害のＩＣ５０値が、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満であることが好ましい。
【０１１３】
キナーゼ活性を測定するための多くの技術が当技術分野において知られている。これらの技術は、細胞から単離されたキナーゼ、例えばＢＣＫＤＨキナーゼに適用され得る。ＢＣＫＤＨキナーゼは、組み換え技術を使用して発現されていてもよい。ＢＣＫＤＨキナーゼは精製されていることが好ましい。
【０１１４】
一実施形態では、キナーゼ活性は、基質中へのリン酸の取り込み、例えばＢＣＫＤＨ基質又はその好適な断片中への［γ−３２Ｐ］標識ＡＴＰからの放射標識リン酸の取り込みを監視することによって測定される。そのようなアッセイ技術は、例えば、Ｈａｓｔｉｅ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：９６８〜９７１において記載されている。
【０１１５】
別の実施形態では、キナーゼ活性は、キナーゼ反応において生成されるＡＤＰの量を監視すること（例えばＡＤＰ生成速度を監視すること）によって測定される。そのようなアッセイ系（例えばＰｒｏｍｅｇａにより製造されている市販のＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙなど）は、ＡＤＰ（キナーゼ反応において生成される）からＡＴＰへの再変換に基づくことができ、この再変換は、例えばルシフェラーゼによる発光シグナルの生成によって、検出することができる。このようなアッセイにおいて、発光シグナルはキナーゼ活性と相関する。このようなアッセイは、広範囲の精製されたキナーゼの活性に対する候補作用剤の影響を測定するのに特に好適であり、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するために大変適している。
【０１１６】
別の実施形態では、キナーゼ活性は、反応中のある特定の時点で残存するＡＴＰの量を監視すること（例えばＡＴＰ消費速度を監視すること）によって測定される。このようなアッセイにおいて、シグナルは存在するＡＴＰの量と相関し、このＡＴＰ量はキナーゼ活性とは逆相関する。このようなアッセイ系（例えばＰｒｏｍｅｇａの市販のＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙなど）は、ルシフェラーゼによる発光シグナルの生成に基づくことができる。
【０１１７】
ＢＣＫＤＨ及びＢＣＫＤＨキナーゼ結合
本発明はまた、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼに結合すること、これに代えて又はこれに加えてそのような結合を特徴付けることができる作用剤を特定する方法も提供する。例えば、方法は、絶対的な若しくは相対的な結合親和性、並びに／又は結合のエンタルピー及びエントロピーを測定することを可能にし得る。結合親和性は、平衡解離定数（Ｋｄ）又は結合定数（Ｋａ）で表すことができる。
【０１１８】
候補作用剤とタンパク質との結合を特定するために、多くのアッセイ技術が当技術分野において知られている。用いられるアッセイ技術は、好ましくは、自動化及び／又は候補作用剤のハイスループットスクリーニングに適したものである。アッセイは、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、樹脂又は類似物などの使い捨て固相担体で行うことができる。
【０１１９】
例えば、標的ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼは、固相担体、例えばマイクロビーズ、樹脂、マイクロタイタープレート又はアレイ上に固定化することができる。次に、候補作用剤を、固定化した標的タンパク質と接触させることができる。任意に、弱く又は非特異的に結合している作用剤を除去するために洗浄手順を適用してもよい。その後、標的タンパク質に結合している作用剤を検出及び特定することができる。結合した作用剤の検出を容易にするために、候補作用剤を、容易に検出可能なマーカーで標識してもよい。マーカーは、例えば、放射標識、酵素標識、抗体標識、蛍光標識、粒子（例えばラテックス又は金）標識又は類似物を含み得る。
【０１２０】
あるいは、上記の手順を逆にしてもよく、候補作用剤を固定化してもよく、標的ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又は標的ＢＣＫＤＨキナーゼをかかる固定化した作用剤と接触させてもよい。任意に、弱く又は非特異的に結合した標的タンパク質を除去するために洗浄手順を適用してもよい。その後、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼが結合する作用剤を、検出及び特定することができる。結合の検出を容易にするために、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼを、上記のような容易に検出可能なマーカーで標識してもよい。
【０１２１】
上記のアッセイに加えて、他の好適なアッセイ技術が当技術分野において知られている。そのような技術の例としては、ラジオアッセイ、蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、蛍光異方性、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などが挙げられる。これらのアッセイを、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼに結合する作用剤を特定するために適用することができる。実際、ハイスループットスクリーニングを容易にするために、これらの技術の多くを自動化するためのプラットフォームが当技術分野において広く知られている。
【０１２２】
ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼに対する候補作用剤の結合を詳細に理解するために、複数のアッセイ技術を使用してもよい。例えば、定性的な結合情報が得られるアッセイを方法の第１のステップとして使用して、その後、異なる技術を使用した更なるアッセイを行って、定量的な結合データ及び／又は標的タンパク質の活性に対する影響に関するデータを得てもよい。
【０１２３】
上述のアッセイ技術を、競合的結合試験を行うように適合させてもよい。例えば、これらの技術は、候補作用剤の存在下でタンパク質の基質又は補因子への結合を分析するために、等しく好適である。したがって、上記の技術を使用して、タンパク質とその基質又は補因子との結合を調整する、よってタンパク質の活性に影響を有する作用剤をスクリーニング及び特定することが可能となる。例えば、これらのアッセイは、候補作用剤の存在下で、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１サブユニットとチアミン二リン酸との、又はＢＣＫＤＨキナーゼとＡＴＰとの結合を検出することを可能にする。
【０１２４】
本発明の作用剤は、高い親和性で結合することが好ましい。例えば、本発明の作用剤は、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼに、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＫｄで結合する。
【０１２５】
結合親和性は、当技術分野において既知の標準的な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡなど（例えば上記のような）を使用して測定することができ、解離（Ｋｄ）又は結合（Ｋａ）定数のいずれかで定量することができる。
【０１２６】
本発明の作用剤を特定するために、構造に指南されたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング（in silico structure−guided screening）などのバイオインフォマティクスに基づく手法もまた使用することができる。
【０１２７】
ＢＣＫＤＨ及びＢＣＫＤＨキナーゼレベル
本発明は、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）レベルを増加させるため及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼレベルを減少させるための作用剤を提供する。当該タンパク質のレベルは、細胞又は生物内でのそのタンパク質の発現レベルと同等とみなし得る。タンパク質レベルは、例えばそのタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを分析することによって、直接又は間接的に分析することができる。
【０１２８】
ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現を分析するための方法は、タンパク質のレベルに対する候補作用剤の影響をスクリーニングするために本発明において用いることができる。
【０１２９】
タンパク質の発現レベルを決定するための多くの技術が、当技術分野において知られている。これらの技術を、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現レベルに対する候補作用剤の影響を試験するために適用することができる。用いられる技術は、好ましくは、自動化及び／又は候補作用剤のハイスループットスクリーニングに適したものである。
【０１３０】
例えば、レポーター部分と作動可能に連結されたＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼをコードするポリヌクレオチドを有する細胞を使用して、スクリーニングを行うことができる。レポーター部分は、内因性ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結することができる。あるいは、レポーター部分に作動可能に連結されたＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの外因性コピーを、細胞中に挿入してもよい。この実施形態では、天然のＢＣＫＤＨ及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼ発現を欠損するように細胞を改変してもよい。ＢＣＫＤＨ及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼに連結されたレポーター部分は、互いに異なりかつ識別可能であってもよい。好適なレポーター部分としては、蛍光標識、例えば緑色、黄色、チェリー、シアン色又はオレンジ色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１３１】
「作動可能に連結した」は、記載されている構成要素が、意図されたように機能することを可能にする関係にあることと理解されるべきである。
【０１３２】
そのような細胞を、候補作用剤と接触させることができ、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現レベルを、細胞内でのレポーター部分の発現レベルを分析することによって監視することができる。蛍光レポーター部分は、当技術分野において知られている多くの技術、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び蛍光顕微鏡法によって分析することができる。ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現は、同一細胞内で別々に又は同時に分析することができる。ＢＣＫＤＨ（特に、ＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現レベルは、候補作用剤との接触の前後で比較することができる。あるいは、ＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現レベルは、候補作用剤と接触させた細胞と対照細胞との間で比較することができる。
【０１３３】
タンパク質、例えばＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの発現を分析するために、他の方法を使用してもよい。タンパク質発現は直接分析することができる。例えば、発現は、クマシー又は銀染色による可視化を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析などの方法を使用して、定量的に分析することができる。あるいは発現は、タンパク質産物に結合する抗体プローブを用いてウェスタンブロッティング又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して定量的に分析してもよい。前述のようにレポーター部分で標識したＢＣＫＤＨ（特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニット）及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼもまた、これらの方法において使用することができる。あるいは、タンパク質発現は、例えば細胞内で転写されるタンパク質に対応するｍＲＮＡの量を試験することによって、間接的に分析することができる。これは、定量的逆転写ＰＣＲ及びノーザンブロッティングなどの方法を使用して実現することができる。
【０１３４】
同様の技術はまた、レプチンタンパク質発現の分析にも使用することができる。
【０１３５】
作用剤
本発明は、ＢＣＫＤＨの活性を増加させること、及び／又はＢＣＫＤＨキナーゼの活性を減少させることができる作用剤を提供し、更にそのような作用剤を特定するための方法を提供する。
【０１３６】
本発明の作用剤は、例えば、ペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、核酸（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ）又は小分子であり得る。好ましくは、作用剤は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性のものである。いくつかの実施形態では、作用剤は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む、栄養剤及び／又は食品原材料を含み得る。
【０１３７】
一実施形態では、本発明の作用剤はレスベラトロールである。レスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシ−ｔｒａｎｓ−スチルベン）は、損傷に反応して、又は病原体から攻撃を受けたときに、多くの植物が天然に産生するスチルベノイドでありファイトアレキシンである。レスベラトロール源となる食品としては、ブドウ果皮、ブルーベリー、ラズベリー及びクワが挙げられる。
【０１３８】
一実施形態では、本発明の作用剤はバルプロ酸である。バルプロ酸は、てんかん、双極性障害及び片頭痛の治療において使用される医薬である。バルプロ酸は、欠神発作、部分発作及び全般発作を有する対象においててんかん発作を予防し得る。バルプロ酸の構造は以下である：
【０１３９】
【化１】
2019513736.tif 000002
【０１４０】
一実施形態では、本発明の作用剤はα−クロロイソカプロン酸である。α−クロロイソカプロン酸は、ロイシンの類似体であり、ＢＣＫＤＨキナーゼの最も強力な既知の阻害剤である（Ｓｋｉｍｏｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３６：２５０Ｓ〜２５３Ｓ）。α−クロロイソカプロン酸の構造は以下である：
【０１４１】
【化２】
2019513736.tif 000003
【０１４２】
一実施形態では、本発明の作用剤は、α−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）である。ロイシンのアミノ基転移反応生成物であるα−ケトイソカプロン酸は、ＢＣＫＤＨキナーゼの既知の生理学的阻害剤である（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３６：２５０Ｓ〜２５３Ｓ）。α−ケトイソカプロン酸の構造は以下である：
【０１４３】
【化３】
2019513736.tif 000004
【０１４４】
特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ｂサブユニットの活性に影響を及ぼすことによって、ＢＣＫＤＨの活性に影響を及ぼす作用剤の例としては、表１ａに記載した作用剤が挙げられる（Ｄａｖｉｓ  ＡＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｓｅｐ  １９）。
【０１４５】
【表１】
2019513736.tif 000005
【０１４６】
特にＢＣＫＤＨ  Ｅ１  Ａサブユニットの活性に影響を及ぼすことによって、ＢＣＫＤＨの活性に影響を及ぼす作用剤の例としては、表１ｂに記載した作用剤が挙げられる（Ｄａｖｉｓ  ＡＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｓｅｐ  １９）。
【０１４７】
【表２】
2019513736.tif 000006
【０１４８】
ＢＣＫＤＨキナーゼの活性に影響を及ぼす作用剤の例としては、表２に記載した作用剤が挙げられる（Ｄａｖｉｓ  ＡＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｓｅｐ  １９）。
【０１４９】
【表３】
2019513736.tif 000007
【０１５０】
本発明による使用のための作用剤は、例えば、塩又はエステル、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在してもよい。
【０１５１】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ
ＢＣＫＤＨキナーゼの発現は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を使用して調整することができる。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって介在される転写後遺伝子サイレンシングは、外来遺伝子の発現を調節するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルスなどの要素のランダムな組み込みは、相同な一本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的な分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：４２９〜４３３）。ＲＮＡｉの機構では、長鎖ｄｓＲＮＡを約２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ二本鎖にプロセシングする。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターである小分子干渉又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞において、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡが、タンパク質合成の停止及び非特異的ｍＲＮＡの分解を引き起こすインターフェロン応答を活性化することが分かっている（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：２２７〜６４）。しかしながら、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することによってこの応答を回避することができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７〜８８；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４〜８）、培養された哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することが可能である。
【０１５２】
ｓｈＲＮＡは、短いループ配列で隔てられた短い逆方向ＲＮＡ反復配列からなる。これらは細胞機構によって１９〜２２ｎｔのｓｉＲＮＡに速やかにプロセシングされ、それによって標的遺伝子の発現が抑制される。
【０１５３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、その３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することによって標的ｍＲＮＡの翻訳を効果的に抑制する、小さな（長さ２２〜２５ヌクレオチド）ノンコーディングＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される小分子ＲＮＡの非常に大きな群であり、その少なくとも一部は、標的遺伝子の発現を制御する。マイクロＲＮＡファミリーの当初のメンバーは、ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４である。ｌｅｔ−７遺伝子は、線虫の発生過程で内因性タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する、高度に保存された小さなＲＮＡ種をコードする。活性ＲＮＡ種は、まず約７０ｎｔの前駆体として転写され、これが約２１ｎｔの成熟型に転写後プロセシングされる。ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４は両方とも、ヘアピンＲＮＡ前駆体として転写され、これがＤｉｃｅｒ酵素によって成熟型にプロセシングされる。
【０１５４】
アンチセンスの概念は、修飾されている可能性もある短いＤＮＡ又はＲＮＡ分子を、細胞内のメッセンジャーＲＮＡに選択的に結合させ、コードされたタンパク質の合成を防止することである。
【０１５５】
標的タンパク質の発現を調整するためのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡの設計方法、並びにこれらの作用剤を目的の細胞に送達するための方法は、当技術分野においてよく知られている。更に、例えば組織特異的プロモーターを使用することによって、生物体内である特定の細胞タイプにおけるタンパク質の発現を特異的に調整する（例えば減少させる）ための方法は、当技術分野でよく知られている。
【０１５６】
抗体
「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、選択された標的に結合することができる完全抗体又は抗体断片を指し、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２、モノクローナル及びポリクローナル抗体、改変抗体（キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体を含む）、並びにファージディスプレイ又は代替技術を使用して生成された人工選択抗体を含む。
【０１５７】
加えて、伝統的な抗体の代替物、例えば「アビボディ（avibody）」、「アビマー（avimer）」、「アンチカリン（anticalin）」、「ナノボディ（nanoboy）」及び「ＤＡＲＰｉｎ」もまた本発明で使用することができる。
【０１５８】
抗体の製造方法は当業者に知られている。あるいは、抗体は商業的供給源から得てもよい。
【０１５９】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ又はウマ）を免疫することができる。免疫した動物の血清を回収し、既知の手順に従って処理することができる。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を製造及び処理するための技術は、当技術分野において知られている。
【０１６０】
本発明において使用される抗原（例えばタンパク質）に対するモノクローナル抗体もまた、当業者は容易に製造することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製するための一般的方法はよく知られている。細胞融合によって、また、発がん性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技術によって、抗体を産生する不死細胞系を作出することができる。抗原に対して製造されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性に関して、例えばアイソタイプ及びエピトープ親和性に関して、スクリーニングすることができる。
【０１６１】
代替技術は、例えば、ファージが多種多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するそのコートの表面上にｓｃＦｖ断片を発現する、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを伴う。この技術は当技術分野でよく知られている。
【０１６２】
抗原に対する抗体は、モノクローナル及びポリクローナルの両方とも、診断において特に有用であり、中和抗体は受動免疫療法において有用である。特にモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を産生させるために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、保護したい感染病原体の抗原の「内部イメージ（internal image）」を有する免疫グロブリンである。
【０１６３】
抗イディオタイプ抗体を産生させるための技術は当技術分野において知られている。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、治療のために、並びに抗原の免疫原性領域を解明するためにも有用であり得る。
【０１６４】
ポリペプチド及びポリヌクレオチドの細胞への導入
本発明において使用するための作用剤は、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、本発明の方法又はスクリーニングアッセイの一部として細胞中に導入される必要がある。
【０１６５】
本発明がポリペプチドを利用する場合、ポリペプチドは、細胞に直接投与されてもよく（例えばポリペプチド自体が投与されてもよい）、又は、対象とする細胞内でポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することによって、投与されてもよい。ポリヌクレオチドは、ベクターを使用して細胞中に導入してもよい。
【０１６６】
ベクターは、ある実体を１つの環境から別の環境に移動させることを可能にする、又は容易にするツールである。本発明によれば、また例として、組み換え核酸技術において使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの実体を標的細胞に移動させることができる。ベクターは、細胞内に異種核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を維持するのに、核酸のセグメントを含むベクターの複製を容易にするのに、又は核酸のセグメントにコードされるタンパク質の発現を容易にするのに、役立ち得る。ベクターは、非ウイルス性又はウイルス性であり得る。組み換え核酸技術において使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、例えば裸の核酸（例えばＤＮＡ）であってもよい。最も単純な形態において、ベクター自体が目的のヌクレオチドであってもよい。
【０１６７】
本発明において使用されるベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターであってもよく、ポリヌクレオチドの発現用プロモーター及び場合によりプロモーターのレギュレーターを含む。
【０１６８】
本発明において使用されるポリヌクレオチドを含むベクターは、形質導入及びトランスフェクションなどの当技術分野で知られている様々な技術を使用して細胞中に導入することができる。この目的に好適ないくつかの技術、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス及び単純ヘルペスウイルスなどの組み換えウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入並びにバイオリスティック形質転換などが当技術分野において知られている。
【０１６９】
非ウイルス性送達系としては、ＤＮＡトランスフェクション法が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、トランスフェクションは、標的細胞に遺伝子を送達するための非ウイルス性ベクターを使用するプロセスを含む。
【０１７０】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの移動は、細胞膜を物理的又は化学的に透過処理することができる、当技術分野において知られている方法のいずれかによって行うことができる。細胞透過性ペプチドもまた、細胞中にポリペプチドを移動させるために使用することができる。
【０１７１】
加えて、本発明は、遺伝子ターゲティングプロトコール、例えばＤＮＡ修飾剤の送達を用いてもよい。
【０１７２】
ベクターは発現ベクターであってもよい。本明細書に記載の発現ベクターは、転写可能な配列を含む核酸の領域を含む。よって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡをコードする配列はこの定義に含まれる。
【０１７３】
発現ベクターは、宿主細胞にコード配列を発現させることができる調節配列に作動可能に連結された、本発明において使用するためのポリヌクレオチドを含むことが好ましい。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、調節配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような方法で、ライゲーションされる。調節配列を、例えば、更なる転写制御エレメントを付加することによって修飾して、調節配列によって指令される転写のレベルを、転写モジュレーターに対してより反応性にしてもよい。
【０１７４】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。遺伝コードの縮重の結果として、非常に多くの異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードすることができるということが当業者には理解されるであろう。また、当業者であれば、本発明のポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、通常の技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさない核酸置換を行うことができることが理解されるべきである。
【０１７５】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法によって変更することができる。そのような変更は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性又は寿命を向上させるために実施してもよい。
【０１７６】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組み換えにより、合成により、又は当業者に利用可能な任意の手段によって製造することができる。これらはまた、標準的な技術によってクローニングされてもよい。
【０１７７】
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組み換え手段を使用して、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるクローニング技術を使用して、製造される。この技術では、クローニングしたい標的配列に隣接するプライマー（例えば約１５〜３０ヌクレオチド）のペアを作製し、これらのプライマーを、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ、例えば動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させ、所望の領域を増幅させる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し（例えばアガロースゲルで反応混合物を精製することによって）、増幅されたＤＮＡを回収する。プライマーは、増幅されたＤＮＡを好適なベクター中にクローニングすることができるように、好適な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
【０１７８】
タンパク質
本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、単鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合手段により連結されている、複数のポリペプチドの複合体を含む。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、それらがペプチド又はジスルフィド結合を介してつなぎ合わされている、ポリマーを指す。
【０１７９】
多様体、誘導体、アナログ、ホモログ、及び断片
本明細書で言及されている特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明は、それらの多様体（variant）、誘導体、アナログ、ホモログ及び断片も包含する。
【０１８０】
本発明の状況において、任意の配列の多様体は、残基（アミノ酸残基又は核酸残基のいずれであっても）の特定の配列が、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドが内因性の機能のうちの少なくとも１つを保持するように変更されている、配列である。多様体配列は、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置き換え及び／又は多様性によって得ることができる。
【０１８１】
本明細書で使用する「誘導体」という用語は、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して、その配列からの又はそれに対する１つ（以上）のアミノ酸残基の任意の置換、多様性、修飾、置き換え、欠失及び／又は付加を含み、ただし、得られるタンパク質又はポリペプチドはその内因性の機能のうちの少なくとも１つを保持する。
【０１８２】
本明細書で使用する「アナログ」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して、任意の模倣物、すなわち、模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内因性の機能のうちの少なくとも１つを保有する化合物を含む。
【０１８３】
典型的には、アミノ酸置換は、例えば１、２又は３〜１０又は２０の置換を行ってもよく、ただし、変更された配列は必要な活性又は能力を保持する。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含み得る。
【０１８４】
本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレントな変化をもたらし、結果として機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有してもよい。内因性の機能が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する無電荷極性頭部を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びチロシンが挙げられる。
【０１８５】
保存的な置換は、例えば下記の表３に従って行うことができる。２列目の同じ区画内のアミノ酸、好ましくは３列目の同じ行内にあるアミノ酸は、互いに置換することができる。
【０１８６】
【表４】
2019513736.tif 000008
【０１８７】
「ホモログ」という用語は、野生型アミノ酸配列又は野生型ヌクレオチド配列とある一定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同等とみなすことができる。
【０１８８】
本発明の状況において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９７％又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むと考えられる。典型的には、ホモログは、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性（すなわち類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関して考察することもできるが、本発明の状況においては、相同性は配列同一性に関して表すことが好ましい。
【０１８９】
本発明の状況において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９７％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと考えられる。相同性は類似性に関して考察することもできるが、本発明の状況においては、相同性は配列同一性に関して表すことが好ましい。
【０１９０】
好ましくは、本明細書に詳述されている配列番号のうちのいずれか１つに対してある同一性（％）を有する配列についての言及は、参照する配列番号の全長に対して記載の同一性（％）を有する配列を指す。
【０１９１】
相同性比較は、目測で、又はより一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の相同性又は同一性（％）を計算することができる。
【０１９２】
相同性（％）は、連続的な配列に対して計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中の各アミノ酸又はヌクレオチドを他方の配列中の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【０１９３】
これは極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、それ以外の点では同一の配列ペアにおいて、アミノ酸又はヌクレオチド配列中の１つの挿入又は欠失により、後続する残基又はコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合には、相同性（％）が大幅に低下する可能性がある。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを適用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適なアラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１９４】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸又はヌクレオチドに関して、２つの比較配列間の関係性がより高いことを反映する可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的には、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続する各残基にはより小さなペナルティを課す、「アフィンギャップコスト（Affine gap cost）」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、ギャップペナルティが高いと、ギャップのより少ない最適化アラインメントが生成される。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。
【０１９５】
したがって、最大相同性（％）の算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ  ｓｕｉｔｅの比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは両方ともオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、いくつかの用途については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓという別のツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７（１）：１８７〜８）。
【０１９６】
最終的な相同性（％）は同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、通常、イエスかノーか（all−or−nothing）のペア比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる、置換類似性スコア行列（scaled similarity score matrix）が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴスイートプログラムのデフォルト行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、パブリックデフォルト値（public default value）、又は提供される場合はカスタムシンボル（customsymbol）比較表のいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの用途については、ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いるか、他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用するのが好ましい。
【０１９７】
ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。典型的には、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を生成する。
【０１９８】
「断片」もまた多様体であり、この用語は典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいて、対象となる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって「断片」は、完全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。
【０１９９】
このような多様体は、部位特異的変異導入などの標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。挿入がなされる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に相当する５’及び３’隣接領域と合わせて挿入部位をコードしている、合成ＤＮＡが作製され得る。隣接領域は、配列が適切な酵素により切断され、合成ＤＮＡが切断部分にライゲーションされ得るように、天然に存在する配列中の部位に対応する好都合な制限部位を含有する。次に、このＤＮＡを本発明により発現させて、コードされているタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作するための当技術分野で知られている数多くの標準的な技術を単に例示するものであり、他の既知の技術も使用することができる。
【０２００】
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号及び国際公開第２００１／７９５１８号において以前記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンの偏りは、その細胞タイプにおける特定のｔＲＮＡの相対的な存在量の偏りに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的な存在量に一致するように調整されるように配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることができる。同様の理由で、特定のタイプの細胞において低頻度であることが知られている対応するｔＲＮＡのコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることができる。したがって、更に高度な翻訳調節が利用可能である。哺乳動物細胞について、並びに様々な他の生物について、コドン使用頻度表は当技術分野において知られている。
【０２０１】
治療方法
本明細書において「治療」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療を含むことを理解されたい。哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び動物の両方の治療が本発明の範囲内にある。
【０２０２】
投与
本発明において使用するための作用剤は単独で投与することもできるが、一般に、特にヒトの治療では、医薬担体、添加剤又は賦形剤と混合して投与される。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、作用剤は、栄養剤、食品添加物又は食品原材料であり、したがって好適な食品組成物中に配合することができる。よって、作用剤は、例えば、食品製品、飲料、ペットフード製品、栄養補助食品、ニュートラシューティカルズ又は栄養フォーミュラの形態で投与することができる。
【０２０４】
投与量
当業者は、過度な実験を行うことなく、対象に投与するための本発明の作用剤の１つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は個々の患者に最も好適となる実際の投与量を決定するが、これは、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与方法及び時間、排泄速度、併用薬物、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている治療を含む様々な因子によって決まるであろう。当然ながら、より高い又はより低い投与量範囲が妥当である個々の事例があってもよく、こういった事例も本発明の範囲内である。
【０２０５】
対象
「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物のいずれかを指す。
【０２０６】
ヒト以外の動物の例としては、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類動物（特に高等霊長類動物）、イヌ、齧歯類動物（例えばマウス、ラット又はモルモット）、ブタ及びネコが挙げられる。ヒト以外の動物はコンパニオンアニマルであってもよい。
【０２０７】
好ましくは、対象はヒトである。
【実施例】
【０２０８】
実施例１
この研究は、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ減量介入データに対し実施したタンパク質量的形質遺伝子座（ｐＱＴＬ）解析に関する。Ｄｉｏｇｅｎｅｓ研究は、全ヨーロッパの無作為化対照食事介入研究であり、８つのヨーロッパの施設において肥満及び過体重家族における減量及び体重維持に対する食事タンパク質及びグリセミックインデックスの影響を調査している（Ｌａｒｓｅｎら（２００９）Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｖ．１１：７６〜９１）。簡潔に述べると、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ研究では、スクリーニングした参加者に低カロリー食（ＬＣＤ）期間（ＣＩＤ１）を設け、この期間で、過体重／肥満対象には８週間のＭｏｄｉｆａｓｔ（登録商標）食（約８００ｋＣａｌ／日）を遵守させ、次に体重維持期間（ＣＩＤ２）を続けた。
【０２０９】
これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａチップ上で遺伝子型を同定したありふれた多様体（common variant）と、介入中のタンパク質発現変化との間の関連を試験し、体格指数（ＢＭＩ）変化に関連するタンパク質に注目した最初の研究である。
【０２１０】
この研究において、Ｉｌｌｕｍｉｎａチップ上で観察されないＳＮＰは、ヨーロッパ人の１０００ゲノム（1000 Genome）集団を参照ゲノムとして用いて、Ｍｉｎｉｍａｃ３ツールを使用して補完（impute）した。以下の特定のＱＣ閾値：ＭＡＦ≧０．０１及びＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡からの有意なずれ（Ｐ＞１．０ｅ−６）を超えた多様体から、最も存在確率の高い（best−guess）遺伝子型（８０％の最も存在確率の高いジェノタイプをもとに算出）を使用して、解析を行った。これらの新たなデータに基づいて新たなｐＱＴＬ解析を行って、以前に関連していた領域中の更なる関連シグナルを抽出するか、又は新たな領域を特定した。
【０２１１】
材料及び方法
データ
コホートには、血漿から抽出した１１２９のＳｏｍａｌｏｇｉｃタンパク質に関するＣＩＤ１及びＣＩＤ２における情報を有する４９８名の参加者が含まれていた。遺伝子データインピュテーション（imputation）により、ＱＣプロセスを通過した４０２０７５６のＳＮＰが導かれた。Ｓｏｍａｌｏｇｉｃ技術を用いてタンパク質発現情報を得た。データを前処理し、品質を管理した。遺伝子発現（ｒｎａＳＥＱ技術、品質管理後、脂肪組織からの１５０００近くの転写物に関して情報が利用可能である）及びメタボロミクスデータもまた利用可能であり、この研究で使用した。
【０２１２】
方法
低カロリー食（ＬＣＤ）の間のＢＭＩと各タンパク質発現変化との関連を、線形回帰（「単変量」回帰）を用いて試験した。ＢＭＩ変化を交絡補助因子（confounding cofactor）（性別、年齢及び施設）に関して回帰させ、残差をΔタンパク質発現に対して回帰させた。Ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの標準的な偽発見率補正を使用して多重検定補正した。
【０２１３】
ＳＮＰとタンパク質発現との間のｐＱＴＬ関連付けを、線形混合モデル（ＬＭＭ）を使用して行った。ＬＭＭは、関連マッピングのための新しい選択方法であり、遺伝的な集団不均一性（ヨーロッパ各地の異なる参加者募集施設により生じた地理的集団構造）の補正を可能にする。基本的な手法は、チップ上の利用可能な全ての（又は一部の）ＳＮＰを使用して（このステップの間は推測された（imputed）ＳＮＰは使用しなかった）、ゲノムワイドなサンプル構造（研究における全ての患者の遺伝的バックグラウンド）をモデル化した遺伝的関係行列（ＧＲＭ）を構築するというものである。ランダム効果モデルを用いてタンパク質発現分散への関与を推定し、この分散の成分の理由となる関連統計値をコンピュータ計算する。ＬＭＭ関連方法は、ヒト及びモデル生物の研究における遺伝子多様体と形質との間の偽陽性関連を防止するのに有効である。本研究において、従属変数は、年齢、性別及び施設に関する回帰のタンパク質発現残差であり、独立変数はＳＮＰであった。各タンパク質について、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行い、各ＳＮＰを独立に試験した。
【０２１４】
研究中のＳＮＰと同じ染色体に属する全てのＳＮＰを除外する「ｌｏｃｏ」オプションでＬＭＭ演算処理にＧＣＴＡソフトウェアを使用して、多重共線性を回避した。研究中のＳＮＰ、及び連鎖不平衡の状態にある全てのＳＮＰをＧＲＭにおいて使用した場合、ヌルモデルの対数尤度は、そうであるべきものよりも高くなり、試験統計値のデフレーション（deflation）及び検出力の低下をもたらすであろう。この現象は「プロキシマルコンタミネーション（proximal contamination）」と呼ばれる。
【０２１５】
全てのタンパク質についてＧＷＡＳ  ｐＱＴＬを行った。介入中のＢＭＩ変化に関連するΔ発現を有するタンパク質について結果を抽出した。多重検定補正は適用しなかった。本発明者らの目的は、トランスクリプトミクス及びジェネティクス（ゲノム配列決定）を含むオミクス情報を用いて更に解析するためにｐＱＴＬを強調／優先することであった。
【０２１６】
Ｒスクリプト（ｌａｕｎｃｈ＿ｌｏｃｕｓｚｏｏｍ．Ｒ）で実行されるＬｏｃｕｓＺｏｏｍソフトウェアを使用して、１０００ゲノム（1000 Genomes）ヨーロッパ人遺伝子データを参照（ｈｇ１９）として使用して、結果をプロットした。
【０２１７】
ＧｅｎｅＭＡＮＩＡ（Ｚｕｂｅｒｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１１５−２２）を使用して、遺伝子共発現を評価した。定義により、遺伝子発現研究においてそれらの発現レベルが複数の条件にわたって同様であれば、２つの遺伝子は連結されている（共発現される）。これらのデータの大部分はＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）から収集されており、出版物に関連するデータだけを収集している。
【０２１８】
ＱＣステップ、並列化ｐＱＴＬ  ＧＷＡＳ、有意なシグナルの抽出及びプロットを含む結果抽出に対するＭｉｎｉｍａｃ補完データ出力によるＲにパイプラインを書き込んだ。
【０２１９】
ＬＣＤ中の発現変化がＢＭＩ変化と関連していた「上位（top）」タンパク質のセットに基づいて、ｐＱＴＬ結果を抽出し、調査した。ＬＣＤ中のタンパク質若しくは発現、ＢＭＩ又は他の共変数の変化は、明記されていない限り、本発明の前後の発現／レベルの変化を意味する。
【０２２０】
結果
解析を開始する前に、全てのタンパク質についてＦＤＲ  ｑ値＜０．２０、かつＭＡＦ＞０．０５のＳＮＰを抽出した。次に、それらがシス／トランスに作用する影響を、対応するコード遺伝子の周囲の＋／−５００ｋｂの位置によって評価した。ｑ値は、所与の試験及びより小さいｐ値を（及びことによると、ＦＤＲを改善するならば更により大きいｐ値も）有する全ての試験を受けることによって被った偽発見率（ＦＤＲ）の尺度となる。
【０２２１】
全ての１１２９のタンパク質で、ｑ値＜０．０５関連カットオフに達するシス作用性ＳＮＰはなかった。０．２０の緩和ＦＤＲカットオフ（relaxing FDR cutoff）では、シス作用性ＳＮＰは特定されず、トランス作用性ＳＮＰだけが特定された。
【０２２２】
ＬＣＤ中のタンパク質発現変化
多重検定補正し、ｐ値カットオフを５％に設定すると想定したら、減量介入中に５５のタンパク質がＢＭＩと正に、５２が負に相関していた。ＬＣＤ中にＢＭＩと関連する全てのタンパク質に関して、Ｋｅｎｄａｌ相関τ相関係数に基づいて相関ヒートマップを構築した。Ｋｅｎｄａｌｌτ順位相関は、２つの順序（又は順位変換）変数（Ｓｐｅａｒｍａｎの変数に類似）間の統計的従属性に関するノンパラメトリック検定であるが、これはＳｐｅａｒｍａｎのものとは異なり、同順位（タイ）を扱うことができる。階層的クラスタリングを用いて、潜在的クラスターを特定した。本発明者らによれば、おそらくこの大きなリストにおける非常に多くの偽陽性結果のために、タンパク質について明確な境界のある大きなブロックは観察されなかった。
【０２２３】
９のタンパク質に関して、Ｐ＜１．０ｅ−０６の関連（ＢＨ多重検定補正後）が観察された。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正後、これらの９のタンパク質間で、非常に有意に相関するブロックが認められた。多重検定補正した５％未満のｐ値を有するタンパク質ペアに関するＫｅｎｄａｌｌ相関レベル。ＩＬ１ＲＡＰ遺伝子コードタンパク質以外の全てを含むタンパク質について２つの反相関ブロックが観察された。
【０２２４】
表４は、これらの９タンパク質の概要を、Ｓｏｍａｌｏｇｉｃ  ＩＤ、コード遺伝子名、ＵＮＩＰＲＯＴ  ＩＤ、ＢＭＩとｐ値との相関方向（推定ｐ値、ＰＶＡＬ：及びＢｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（ＢＨ）に基づいて多重検定補正されたｐ値、ＰＢＨ）とともに示す。レプチン、成長ホルモン受容体、ＴＩＧ２（ケメリン）及びＳＡＰを含むタンパク質の第１のブロックは、ＬＣＤ中のＢＭＩ変化と正に相関し、ＮＲＰ１、ＳＨＢＧ、ＩＧＦＢＰ−２、アンジオポエチン−２及びＩＬ−１  Ｒ  ＡｃＰを含む第２のブロックはＢＭＩ変化と負に相関していた。
【０２２５】
【表５】
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【０２２６】
下記の結果は、肥満及び／又は関連する形質に関与する可能性がある遺伝子において有望なｐＱＴＬ結果を有するタンパク質に関するものである。他の遺伝子は、ＧＷＡ  ｐＱＴＬ強化シグナルを有さない、及び上位ＳＮＰが潜在的に関心対象となる遺伝子を標的化していないとして廃棄した。
【０２２７】
レプチン
ｐＱＴＬ結果
「満腹ホルモン」であるレプチンは、空腹感を抑えることによってエネルギー収支を制御するのに役立つ、脂肪細胞によって生成されるホルモンである。肥満では、レプチンに対する感受性の減少が起こり、多量のエネルギーが蓄えられているにもかかわらず満腹感を感知できなくなる。減量中、レプチンレベルは低下し、食物摂取の感情的、認知的及び感覚的な調節に関与する領域において脳の活動が増加する。レプチンレベルが回復すると減量は維持され、脳活動の変化は元に戻る。このように、レプチンは、エネルギー貯蔵の減少を摂食行動に関連させる重要な因子である（Ａｈｉｍａ，Ｒ．Ｓ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：２３８０〜２３８３）。
【０２２８】
ＱＱプロットは、関連シグナルの強化を示した（ゲノムインフレーション因子（genomic inflation factor）（ＧＩＦ）＝１．０１４７１５３，１．６９３０７６７×１０−５）。この強化は、第６染色体上の特定領域を標的とする。
【０２２９】
レプチンに関する上位１０位のｐＱＴＬ結果は、同じ標的領域中のＳＮＰを含む（表５は、完全な連鎖不平衡（ＬＤ）にはない上位１０位のＳＮＰだけを示す）。この領域は、ｎｃＲＮＡを含み、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の制御領域中に位置する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＢＣＫＤＨＢ＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝ＢＣＫＤＨＢ）。図１は、第６染色体のこの特定領域に関して拡大したマンハッタンプロットを示す。
【０２３０】
ＢＣＫＤＨＢ酵素複合体は、ロイシン、イソロイシン及びバリンの通常の分解において１つのステップを担う。これらの３つのアミノ酸は、食事から得られ、多種類の食品、特に乳、肉、卵などのタンパク質が豊富な食品中に存在する。
【０２３１】
【表６】
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【０２３２】
トランス作用性ＳＮＰ遺伝子型に基づいて層別化されたタンパク質発現は、図２に示す有意性にもかかわらず、発現の顕著な差異を明確にしなかった。しかしながら、ＳＮＰは一般に機能的多様体のサロゲートマーカーであるため、インピュテーションしたにもかかわらず真の原因となる多様体は利用できない可能性がある。
【０２３３】
ＢＣＫＤＨＢ遺伝子発現分析
ＢＣＫＤＨＢ遺伝子に関して、ｒｎａＳＥＱからの発現データが利用可能であった。この遺伝子は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用した多重検定補正後に、ＬＣＤ介入中に顕著に下方制御された（Ｐ＝１．１ｅ−１１）。ＢＭＩ変化に対する関連は、名目上のレベル（nominal level）（Ｐ＝０．０１６）で観察されたが、多重検定補正を通過しなかった（Ｐ＝０．１７９）。プロテオミクス及びｒｎａＳＥＱデータを有する１２６名の参加者のサブセットに関して、有意な正の関連が観察された。ＢＭＩは、レプチン（Ｐ＝１．６ｅ−８）及びＢＣＫＤＨＢ（Ｐ＝２．４ｅ−２）発現と正に関連（交絡補助因子についての補正後）しており、レプチンタンパク質の発現もまた、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子発現と正の関連を示した（Ｐ＝２．６ｅ−３）。
【０２３４】
レプチン遺伝子とタンパク質発現は高度に相関（関連ｐ値＝３．１５ｅ−９）しており、ＬＣＤ中のＢＣＫＤＨＢとレプチン（ＬＥＰ）変化（ｐ＝２．８ｅ−９）、及びより少ない程度ではあるがＢＣＫＤＨＢとレプチンタンパク質（ｐ＝０．００２６）も同様であった。関連の方向は、試験した変数の全てのペアに関して同じ（正）であった。
【０２３５】
メタボロミクスとの統合
ＢＣＫＤ酵素複合体は、ロイシン、イソロイシン及びバリンの分解に関与してエネルギーを供給するミトコンドリアにおいて活性である。Ｓｔｒｏｅｖｅら（Ｓｔｒｏｅｖｅ，Ｊ．Ｈ．（２０１６）Ｏｂｅｓｉｔｙ  ２４：３７９〜３８８）は、バリンが減量成功には不利に働くことを観察した。
【０２３６】
ロイシン、バリン及びイソロイシンについて抽出されたメタボロミクスデータの分析から、全ての３つの分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）はＬＣＤ中に示差的に発現された（ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ対応のある検定、表６及び図３）。
【０２３７】
【表７】
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【０２３８】
ＢＣＫＤＨＢ遺伝子発現は、ＬＣＤ中のバリン及びロイシンの変化に関連していた（表７）が、イソロイシンとは関連していなかった。
【０２３９】
【表８】
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【０２４０】
上記明細書で言及した全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された作用剤及び方法の様々な修正形態及び変形形態が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかとなるであろう。本発明を特定の好適な実施形態とともに記載したが、請求される本発明は、こうした特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施するための記載された方法の様々な修正は、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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