(57)【要約】  ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを含む、新たな組み換え結合タンパク質、並びにこのような組み換え結合タンパク質をコードする核酸、このような組み換え結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、並びにこのような組み換え結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、疾患の治療における使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換え結合タンパク質であって、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、を含む、組み換え結合タンパク質。
【請求項２】
前記血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項３】
前記組み換え結合タンパク質が、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項４】
前記血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中で改良された保存安定性を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項５】
前記組み換え結合タンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項６】
前記組み換え結合タンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項７】
前記組み換え結合タンパク質が、１０-7Ｍ未満の阻害定数でＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項８】
１００ｎＭの濃度の前記組み換え結合タンパク質が、１００ｎＭの濃度のトラスツズマブよりもＢＴ４７４細胞におけるＡＫＴ−Ｓ４７３リン酸化のより強いダウンレギュレーションを示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質、又は請求項９に記載の核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
疾患の治療に使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌の治療に使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
乳癌、卵巣癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮癌、大腸直腸癌、膀胱癌、又はＨＥＲ２過剰発現癌の治療に使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質、又は請求項９に記載の核酸、又は請求項１０に記載の医薬組成物を含む、キット。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え結合タンパク質の産生方法であって、（ｉ）前記結合タンパク質を細菌中で発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィーを使用して前記結合タンパク質を精製する工程と、を含む、産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、欧州特許庁に２０１６年９月２２日付で出願された欧州特許出願公開第１６１９０２２１号に対する利益及び優先権を主張する。欧州特許第１６１９０２２１号の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含むその全容が、全て参照により本明細書に組み込まれ、並びに、特許協力条約の規則４．１８に従った、本明細書には含まれない、特許協力条約の規則２０．５（ａ）に言及されている明細書、特許請求の範囲若しくは図面の任意の要素又は一部の組み込みも含まれる。
【０００２】
新たな組み換え結合タンパク質が提供される。タンパク質は、ポリペプチドリンカーによって連結された、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、を含む。組み換え結合タンパク質は、疾患の治療に有用である。具体的には、組み換え結合タンパク質は、高い保存安定性を示す血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを含む。更に、当該組み換え結合タンパク質をコードする核酸、当該組み換え結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び疾患の治療における当該組み換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用が更に提供される。
【背景技術】
【０００３】
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリ（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．，Ｋｏｈｌ，Ａ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｒｉａｎｄ，Ｃ．，Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｇｒｕｔｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５７５〜５８２，２００４；Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ  ａｎｄ  Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １３，６９５〜７０１，２００８）は、標的特異的に設計されたアンキリンリピートドメインの選択に使用することができる。そのような標的特異的に設計されたアンキリンリピートドメインは、疾患の治療のための組み換え結合タンパク質の有益な成分として使用することができる。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２又はＥｒｂＢ２；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０４６２６）に対する結合特異性を有する設計された異なるアンキリンリピートドメインの選択が記載されている（国際公開第２０１４／０８３２０８号）。本発明では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを含む組み換え結合タンパク質が開示される。
【０００４】
例えば、ＦｃＲｎ再利用によってもたらされる長期の全身性半減期（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｈａｌｆ−ｌｉｖｅ）を示すＩｇＧ抗体とは異なり、設計されたアンキリンリピートドメインを含むタンパク質は、そのタンパク質が、例えば、国際公開第２０１２／０６９６５４号に記載の血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメイン等の、薬物動態特性を改善する構成要素を含まない限り、典型的には、迅速な薬物動態クリアランス及び短い終末相半減期を示す。タンパク質の薬物動態特性を改善するため血清アルブミンの結合を用いることは、当該技術分野において周知のプロセスである（例えば、国際公開第１９９１／００１７４３号；Ｆｒｅｊｄ  Ｆ．Ｙ．，２０１２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ（Ｅｄ．））「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅｉｒ  ｐｌａｓｍａ  ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ」，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２０１２，ＩＳＢＮ  ９７８−３−５２７−３２８４９−９）；並びに国際公開第２０１２／０６９６５４号を参照のこと）。血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを臨床薬の候補に使用するためには、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計された既知のアンキリンリピートドメインの保存安定性を改良することが望ましい。本明細書では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを含む組み換え結合タンパク質が開示され、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインは、保存安定性が改良されている。従来の報告とは異なり（Ｈｏｐｐ，Ｊ．，Ｈｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．，Ｚｅｔｔｌｉｔｚ，Ｋ．Ａ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ａ．，Ｆｕｓｓ，Ｎ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｄ．，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２３，８２７〜８３４，２０１０）、驚くべきことに、組み換え結合タンパク質のうちの１つの代わりに、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを有することにより、組み換え結合タンパク質の薬物動態特性を改善することができることを観察した。
【０００５】
ＨＥＲ２は、特定の種類の癌の発病及び進行において重要な役割を果たす。ＨＥＲ２は、広範なＥｒｂＢ受容体のファミリーに属する膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である（Ｂｕｂｌｉｌ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９（２），１２４〜３４，２００７）。ＥｒｂＢ受容体ファミリーは、脊椎動物全体で保存されており、また、ＥｒｂＢ１又は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）又はＨＥＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ００５３３）及び受容体ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２１８６０）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１５３０３）も含む。全てのＥｒｂＢ受容体は、広範な配列及びドメイン相同性を共有し、機能性ホモ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１−ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２−ＨＥＲ２及びＨＥＲ４−ＨＥＲ４）及び全ての組み合せでヘテロ二量体を形成する。受容体は、リガンド結合時又は受容体の過剰発現時にホモ二量体及びヘテロ二量体形成し、次に、自己リン酸化により細胞内受容体キナーゼドメインが活性化する。これにより、下流の細胞内シグナル伝達及び生体反応がトリガーされる。ＥｒｂＢシグナル伝達経路の周知のアンタゴニストとしては、モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＶに結合し、ＨＥＲ２ホモ二量体形成を阻害する）及びペルツズマブ（ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩに結合し、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を阻害する）が挙げられる。重要なことに、トラスツズマブは主に抗増殖効果を有しており、疾患のステージが進行している腫瘍は、かかる治療の対象とならない場合がある。単剤としての治療効果が予想外に低いペルツズマブは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成に干渉しトラスツズマブの活性を補完することができる。したがって、トラスツズマブとペルツズマブとの併用は、ＨＥＲ２陽性癌の治療には魅力的である（Ｃａｐｅｌａｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２４，２７３〜８２，２０１３）。
【０００６】
トラスツズマブとペルツズマブとの併用により、優れた抗腫瘍効果には、ＨＥＲ２の２つのドメインを二重標的化する必要があるという概念が導かれている。ＨＥＲ２のドメインＩＩ及びＩＶを標的とする抗体混合物、又はＨＥＲ２のドメインＩ及び別のドメインの同時標的化（米国特許第２０１１００３３４６０号；例えば、同様にドメインＩＶ）、又はドメインＩ及びドメインＩＶの同時標的化（国際公開第２０１４／０６０３６５号；Ｊｏｓｔ，Ｃｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２１，１〜１３，２０１３；Ｔａｍａｓｋｏｖｉｃ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７，１１６７２，２０１６）、又はドメインＩＩ及びドメインＩＶの同時標的化（国際公開第２０１４／０８３２０８号）、又はＨＥＲ２のドメインＩＶ上のトラスツズマブエピトープ及びＨＥＲ２のドメインＩＩ上のペルツズマブエピトープの同時標的化（国際公開第２００９／０６８６２５号）が報告されている。アプローチのうちのいくつかは、二重パラトープ性結合タンパク質を含む。興味深いことに、国際公開第２００９／０６８６２５号で試験された二重パラトープ性結合タンパク質の一部は、アンタゴニスト効果、その他のアゴニスト効果を有した。国際公開第２０１４／０８３２０８号及びＪｏｓｔ，Ｃｈ．ら（ｌｏｃ．ｃｉｔ．；国際公開第２０１４／０６０３６５号）の報告により、拮抗性の二重パラトープ性結合タンパク質の生成は容易ではないことが示される。容易ではないどころか、有効な拮抗作用のためには、個々のドメイン（エピトープ、結合特性）、並びに構造配置（配向、距離、リンカー長、リンカー組成）の精選は最適化されなければならない。加えて、薬物動態を操作する部分及びその構造的配置の選択も最適化されなければならない。併せて、これは少なくとも２５０’０００の異なる変異体からの選択を意味する。
【０００７】
本明細書には、（ｉ）ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインからなり、ＥｒｂＢシグナル伝達と拮抗する二重パラトープ性結合タンパク質と、（ｉｉ）血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ改善された保存安定性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、を含む、組み換え結合タンパク質が開示される。この組み換え結合タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）薬物候補は、様々な疾患の治療に有益な薬物候補であることが示されている。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の登録商標である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、設計された４つのアンキリンリピートドメインを含む組み換え結合タンパク質に関し、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうちの２つは、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインであり、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうちの２つは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインである。本発明は、特に、配列番号２１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換え結合タンパク質に関する。本発明は、このような組み換え結合タンパク質にも関し、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。本発明は、特に、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有する、組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、当該配列番号１４を含む、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中でそれぞれ改良された保存安定性を示す。一実施形態では、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、配列番号２１のアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質よりも、保存安定性が高い。一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質は、１０-7Ｍ未満の阻害定数でＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、１００ｎＭの濃度の本発明の組み換え結合タンパク質は、１００ｎＭの濃度のトラスツズマブよりもＢＴ４７４細胞におけるＡＫＴ−Ｓ４７３リン酸化のより強いダウンレギュレーションを示す。本発明は更に、本発明の組み換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。本発明は更に、本発明の組み換え結合タンパク質及び／若しくは核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、疾患、腫瘍性疾患、癌、乳癌、卵巣癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮癌、大腸直腸癌、膀胱癌、ＨＥＲ２過剰発現癌、ＨＥＲ２発現癌、ＨＥＲ２嗜癖のある癌（ＨＥＲ２  ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ）、部分的にＨＥＲ２嗜癖のある癌（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ＨＥＲ２  ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ）、ＨＥＲ２増幅癌、トラスツズマブ耐性癌、トラスツズマブ感受性癌、胃腸癌、又は脳癌の治療に使用するための本発明の医薬組成物にも関する。本発明は更に、本発明の組み換え結合タンパク質又は本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を含むキットに関する。本発明は更に、本発明の組み換え結合タンパク質を産生方法に関し、この方法は、（ｉ）当該組み換え結合タンパク質を細菌中で発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィーを使用して当該組み換え結合タンパク質を精製��る工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する組み換え結合タンパク質の図である。  （ａ）血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの図である。このようなアンキリンリピートドメインの例は、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む設計されたアンキリンリピートドメイン、特に、配列番号１４のアミノ酸配列を含む設計されたアンキリンリピートドメインである。（ｂ）ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの図である。このようなアンキリンリピートドメインの例は、配列番号１６〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む設計されたアンキリンリピートドメイン、特に、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を含む設計されたアンキリンリピートドメインである。（ｃ）ポリペプチドリンカーの図である（例えば、配列番号２〜９のいずれかに対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド、特に、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドリンカー）。（ｄ）Ｎ末端アミノ酸配列の図である。このようなＮ末端アミノ酸配列の例は、例えば、配列ＭＧＳ若しくはＧＳ（例えば、配列番号２１〜３０及び３２及び３３のいずれかのＮ末端に存在するものなど）、又は配列番号１に相当するアミノ酸配列により例示されるポリペプチドタグである。（ｅ）ポリペプチドリンカーによって連結されており、Ｎ末端アミノ酸配列を有する、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメイン２つと、それぞれＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメイン２つとを含む、本明細書において提供される組み換え結合タンパク質の図である。血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、その他２つの設計されたアンキリンリピートドメインと隣接している。配列番号２１のアミノ酸を含む組み換え結合タンパク質がこの図に相当する。
【図２】配列番号１４を含むタンパク質の保存安定性の改善を示す図である。  ４℃（１）、２５℃（２）、４０℃（３）、及び６０℃（４）で１週間、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬで保存したときのタンパク質＃１３−Ｈｉｓ（＃１３）及びタンパク質＃１４−Ｈｉｓ（＃１４；実施例１を参照のこと）のＳＤＳ  １５％  ＰＡＧＥ分析。タンパク質＃１４−Ｈｉｓは、タンパク質＃１３−Ｈｉｓよりも高い保存安定性を示す。Ｍ：マーカー（下側のバンド：６．５ｋＤａ；タンパク質＃１４−Ｈｉｓレベルのバンド：１４．４ｋＤａ；タンパク質＃１４−Ｈｉｓ  ＰＡＧＥの場合の上側のバンド：２１．５ｋＤａ）。
【図３】ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する組み換え結合タンパク質によるＢＴ４７４細胞の増殖の阻害を示す図である。  ＢＴ４７４乳癌細胞の増殖阻害を、実施例６に記載のように行った。配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質は、配列番号２３を含む組み換え結合タンパク質よりも低いＩＣ５０を示すことから、配列番号１６及び１７を有する組み換え結合タンパク質は、配列番号１８及び１７を有するものよりも望ましいものであることが示唆される。黒い丸（●）及び実線：タンパク質＃２１−Ｈｉｓ；黒い四角（■）及び破線：タンパク質＃２３−Ｈｉｓ；三角形（△）：阻害剤なし。ＯＤ：ＯＤ４０５−ＯＤ６２０；Ｃ：ｎＭ濃度。  図４  腫瘍異種移植片マウス実験を示す図である。
【図４ａ】ＢＴ４７４乳癌腫瘍異種移植片マウスモデル。このモデルは、実施例７に記載のように実施した。三角形（△）：ＰＢＳ；正方形（□）：トラスツズマブ；破線とひし形（◆）の組み合せ：トラスツズマブ及びペルツズマブ；黒丸（●）：ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する組み換え結合タンパク質（タンパク質＃２１−Ｈｉｓ）；Ｖ：腫瘍体積［ｍｍ3］；ｔ：時間［ｄ］。
【図４ｂ】治療の１８日目のタンパク質＃２１−Ｈｉｓ（２１）、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ（２３）、タンパク質＃２４−Ｈｉｓ（２４）、又はタンパク質＃２５−Ｈｉｓ（２５）を比較した、ＢＴ４７４乳癌腫瘍異種移植マウスモデル。この実験は、実施例７に記載のように実施した。タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、タンパク質＃２４−Ｈｉｓ（ｐ＝０．０００３）、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ、又はタンパク質＃２５よりも腫瘍成長の阻害に有意に有効である。Ｖ：腫瘍体積［ｍｍ3］；ｔ：時間［ｄ］。  ｃ．）及びｄ．）ＧＸＡ３０３９胃癌患者由来腫瘍異種移植マウスモデル。実験は、実施例７に記載のように２回実施した。ＰＢＳ（△）、ペルツズマブ（▽）、トラスツズマブ（□）、トラスツズマブ及びペルツズマブの混合物（破線と◆）、並びにタンパク質＃２１をこれらの実験で使用した。
【図４ｃ】タンパク質＃２１は、トラスツズマブとペルツズマブとの組み合わせと同様に、腫瘍成長の強力な阻害を示し、一方、トラスツズマブ単独は有効性が低い。
【図４ｄ】タンパク質＃２１は、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせと同様に、腫瘍成長の強力な阻害を示す。トラスツズマブ単独及びペルツズマブ単独は、効果が有意に低い。ＲＴＶ：治療開始時の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積［％］；ｔ；時間［日］。
【図４ｅ】ＧＸＦ２８１胃癌患者に由来する腫瘍異種移植片マウスモデル。この実験は、実施例７に記載のように実施した。ＰＢＳ（△）、ラパチニブ（□）、並びにタンパク質＃２１（●）。タンパク質＃２１は、このモデルにおいて、ラパチニブと比較して腫瘍成長の強力な阻害を示す。ＲＴＶ：治療開始時の腫瘍体積に対する相対的腫瘍体積［％］；ｔ：時間［ｄ］。  図５  マウスにおける薬物動態分析を示す図である。
【図５ａ】マウスにおいて、実施例８のタンパク質＃２１−Ｈｉｓ（●）とタンパク質＃２３−Ｈｉｓ（□）とを比較する薬物動態特性分析。この実験は、組み換え結合タンパク質中に配列番号１８ではなく配列番号１６を存在させることによる薬物動態上の利益を示す。
【図５ｂ】実施例８及び１１の、タンパク質＃３０−Ｈｉｓ（●；血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ含む）と、タンパク質＃２９−Ｈｉｓ（■；血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つ含む）とを比較する、マウスにおける薬物動態特性分析。血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ有することにより、薬物動態プロファイルは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つ有する場合に達成されるプロファイルよりも改善される。
【図５ｃ】実施例８及び１０に記載の、ＧｌｙＳｅｒポリペプチドリンカー（タンパク質＃２６−Ｈｉｓ；■）を含む組み換え結合タンパク質と、ＰｒｏＴｈｒポリペプチドリンカー（タンパク質＃２７−Ｈｉｓ；●）を含む組み換え結合タンパク質との薬物動態の比較。ＰｒｏＴｈｒポリペプチドリンカーを有することは、マウスにおける薬物動態特性に好ましい影響を有する。％ＩＤ：１時間の測定値に対して正規化された注入用量パーセント［％］；ｔ：時間数［時間］。  図６  カニクイザルにおける薬物動態分析を示す図である。
【図６ａ】実施例９のカニクイザルにおける、１ｍｇ／ｋｇでのタンパク質＃２１−Ｈｉｓ（●）及びタンパク質＃２３−Ｈｉｓ（■）の薬物動態特性分析。タンパク質＃２１−Ｈｉｓではより長い終末相半減期が観察され、組み換え結合タンパク質に配列番号１８を存在させるよりも、配列番号１６を存在させる方が好ましいことが示される。
【図６ｂ】実施例９による、カニクイザルにおける１ｍｇ／ｋｇ（●）、５ｍｇ／ｋｇ（■）、及び１０ｍｇ／ｋｇ（▲）でのタンパク質＃２１−Ｈｉｓの薬物動態特性分析。タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、１ｍｇ／ｋｇにて４７時間から、５ｍｇ／ｋｇにて１００時間、１０ｍｇ／ｋｇにて約１８０時間という、終末相半減期の用量依存的な延長を示す。Ｃ：濃度［ｎＭ］；ｔ：時間数［時間］。
【図７】ＢＴ４７４細胞におけるアポトーシス誘導を示す図である。  実施例６による、様々な濃度のタンパク質＃２１（●）、トラスツズマブ（□）、ペルツズマブ（▽）、又は１００ｎＭトラスツズマブと、様々な濃度のペルツズマブ（◇；破線）との混合物により誘導される、ＢＴ４７４細胞のアポトーシスの測定。非線形回帰近似曲線を含む結果をプロットする。ＰＢＳ（▲）及び１００ｎＭのトラスツズマブ（▼）の測定値を、５０ｐＭでの参照として示す。Ｃ：濃度［ｎＭ］；ＲＬＵ：相対光単位。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、４つの設計されたアンキリンリピートドメインを含む組み換え結合タンパク質に関し、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうちの２つは、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインであり、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうちの２つは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインである。配列番号２１は、このような組み換え結合タンパク質の例である。
【００１１】
一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、（ｉ）配列番号１４、及び／又は（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸のうち最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列から構成される。一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちのそれぞれは、（ｉ）配列番号１４、及び／又は（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸のうち最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、本出願の配列番号１２、１３、又は１５、並びに国際公開第２０１２／０６９６５４号の配列番号１７〜２５、及び４３〜４８からなる群から選択される、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの配列と同一ではない。
【００１２】
一実施形態では、配列番号１０〜２０の最後から２番目のアミノ酸はＡｌａ又はＬｅｕであり、好ましくはＡｌａである。一実施形態では、配列番号１０〜２０のいずれかのＣ末端アミノ酸はＡｌａ又はＡｓｎであり、好ましくはＡｌａであり、又は場合により欠損している。例えば、配列番号２９は、例えば、最後から２番目のアミノ酸がＬｅｕであり、かつＣ末端のアミノ酸が欠損している、配列番号１５を含む。好ましくは、本発明の組み換え結合タンパク質中に存在する、設計された任意のアンキリンリピートドメイン（すなわち、配列番号１０〜２０のいずれか）の最後から２番目のアミノ酸と、Ｃ末端アミノ酸とは、いずれもＡｌａである。
【００１３】
一実施形態では、配列番号１０〜３０及び３２〜３３のいずれかのＮ末端のアミノ酸Ｇｌｙ  Ｓｅｒは、場合により欠損している。
【００１４】
一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計された、アンキリンリピートドメインは、アミノ酸配列が少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質の、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、アミノ酸配列が同一である。
【００１５】
一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質の、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、それぞれ配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質の、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、それぞれ配列番号１４からなる。
【００１６】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質の、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、それぞれ同時に１つの血清アルブミン分子に結合し得る。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、設計されたアンキリンリピートドメインを４つ含む組み換え結合タンパク質に関し、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうちの２つは、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインであり、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうち２つは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインであり、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４からなる。
【００１８】
一実施形態では、当該配列番号１４を含む設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１３を含む設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中で改良された保存安定性を示す。一実施形態では、当該配列番号１４を含む設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１５を含む設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中で改良された保存安定性を示す。一実施形態では、当該配列番号１４からなる設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１３からなる設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中で改良された保存安定性を示す。一実施形態では、当該配列番号１４からなる設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１５からなる設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中で改良された保存安定性を示す。配列番号１２〜１５からなる設計されたアンキリンリピートドメインは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの例である。
【００１９】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインはそれぞれ配列番号１４のアミノ酸配列を含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、ＰＢＳ中で改良された保存安定性を示し、好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む設計されたアンキリンリピートドメインと比較して、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬにて４０℃で１ヶ月間保存された後の分解産物量が低減されている。
【００２０】
一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ含み、かつ当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれが配列番号１４のアミノ酸配列を含む、当該組み換え結合タンパク質は、改良された保存安定性を示し、好ましくは、相当する組み換え結合タンパク質、すなわち、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれが配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬにて４０℃で１ヶ月間保存された後の分解産物量が低減されている。配列番号２１及び２２は、それぞれ配列番号１４及び１３を含む、このような組み換え結合タンパク質の例である。
【００２１】
一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ含む、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つだけ含む、相当する組み換え結合タンパク質と比較して、薬物動態特性が改善されている。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ含む、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つだけ含む、相当する組み換え結合タンパク質と比較して、カニクイザルにおける終末相半減期が延長されている。実施例１１（図５ｂを参照のこと）は、改善された薬物動態特性を有する組み換え結合タンパク質を開示している。
【００２２】
一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのうち１つのＮ末端及び１つのＣ末端である。
【００２３】
一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうち１つは、配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうち１つは、（ｉ）配列番号１６、及び／又は（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸のうち最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは、配列番号１６を含む。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは、配列番号１６からなる。
【００２４】
一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうち１つは、（ｉ）配列番号１７、及び／又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸のうち最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは、配列番号１７を含む。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは、配列番号１７からなる。
【００２５】
一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは、配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有し、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは、配列番号１７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは（ｉ）配列番号１６、及び／又は（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸のうち最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは（ｉ）配列番号１７、及び／又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸のうち最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは配列番号１６を含み、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは配列番号１７を含む。一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは配列番号１６からなり、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのうちの１つは配列番号１７からなる。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、配列番号１７のＮ末端に配列番号１６を含む。
【００２６】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、配列番号３２と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３２、及び／又は（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸のうち最大で２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、若しくは０個のアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、設計されたアンキリンリピートドメインを４つ含む組み換え結合タンパク質に関し、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうちの２つは、配列番号１６及び１７からなる、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインであり、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインのうち２つは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインであり、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれが配列番号１４からなる。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、配列番号３２と、配列番号１４を２つとを含む、組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３２と、配列番号１４を２つとを含む組み換え結合タンパク質に関し、配列番号３２は、Ｎ末端で配列番号１４が１つ隣接しており、Ｃ末端で配列番号１４が１つ隣接している。
【００２９】
一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質中に存在する設計されたアンキリンリピートドメインを連結するポリペプチドリンカーは、配列番号２〜９、より好ましくは配列番号３〜９、より好ましくは配列番号４〜９、より好ましくは配列番号６又は９、より好ましくは配列番号９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該配列番号２〜９、より好ましくは配列番号３〜９、より好ましくは配列番号４〜９、より好ましくは配列番号６又は９、より好ましくは配列番号９は、最大で４、３、２、１、０個のアミノ酸が任意のアミノ酸で交換される。一実施形態では、配列番号７〜９のいずれかの隣接するＮ末端Ｇｌｙ  Ｓｅｒ及び／又は配列番号２〜６のいずれかの隣接するＣ末端Ｇｌｙ  Ｓｅｒは場合により欠損している。一実施形態では、配列番号２〜９のいずれかは、場合によりＣ末端にＡｒｇ  Ｓｅｒを更に含む（例えば、配列番号２９において存在する場合と同様に）。一実施形態では、当該ポリペプチドリンカーは、配列番号２〜９、より好ましくは配列番号３〜９、より好ましくは配列番号４〜９、より好ましくは配列番号６又は９、より好ましくは配列番号９のアミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質中に存在する、設計されたアンキリンリピートドメインを連結する当該ポリペプチドリンカーは、配列番号２〜９、より好ましくは配列番号３〜９、より好ましくは配列番号４〜９、より好ましくは配列番号６又は９、より好ましくは配列番号９のアミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列からなる。一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質中に存在する、設計されたアンキリンリピートドメインを連結するポリペプチドリンカーは、それぞれ配列番号９からなる。一実施形態では、本発明の組み換え結合タンパク質中に存在する当該ポリペプチドリンカーは、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が同一であり、好ましくは同一である。一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４のアミノ酸配列からなり、当該４つの設計されたアンキリンリピートドメインは、それぞれ配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーにより連結される。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ポリペプチドリンカーにより連結された配列番号１４−配列番号１６−配列番号１７−配列番号１４を含む、組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号１４−配列番号９−配列番号１６−配列番号９−配列番号１７−配列番号９−配列番号１４を含む、組み換え結合タンパク質に関する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２１、及び／又は（ｉｉ）配列番号２１のうち最大で７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が他のアミノ酸で交換されているアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２１、及び（ｉｉ）配列番号２１のうち最大で７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が他のアミノ酸で交換されているアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、組み換え結合タンパク質に関する。好ましくは、配列番号２１における当該アミノ酸の交換は、配列番号２１の位置１２７〜４４４に位置するものである。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関し、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを含み、当該２つの血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関し、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２１、及び／又は（ｉｉ）配列番号２１のうち最大で７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が他のアミノ酸で交換されているアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関し、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２１、及び／又は（ｉｉ）配列番号２１のうち最大で７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が他のアミノ酸で交換されているアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関し、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなるアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質に関する。好ましいのは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む組み換え結合タンパク質である。好ましいのは配列番号２１である。好ましいのは、アミノ酸配列が配列番号２１である、組み換え結合タンパク質である。好ましいのは、アミノ酸配列が配列番号２１である、タンパク質である。好ましいのは、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質である。好ましいのは、配列番号２１のアミノ酸配列からなる組み換え結合タンパク質である。
【００３４】
複数の特徴により、配列番号２１によってコードされるタンパク質が、本発明の好ましい組み換え結合タンパク質となる。当該タンパク質は、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインとを含み、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４からなる。ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、２つの異なるエピトープにおいてＨＥＲ２に結合する。当該タンパク質は、血清アルブミン結合及び二重パラトープ性ＨＥＲ２結合を組み合わせる第１の組み換え結合タンパク質である。配列番号１４の設計されたアンキリンリピートドメインは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計された既知のアンキリンリピートドメインと比較して、保存安定性が改善されている（実施例２及び３：図２を参照されたい）。当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、驚くべきことに、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つだけ含む、相当する組み換え結合タンパク質と比較して、組み換え結合タンパク質の薬物動態特性の改善をもたらす（実施例１１、図５）。血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインは、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計された他のアンキリンリピートドメインと隣接し、最も良好な薬物動態特性が認められた（実施例１１）。ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの選択、並びにその構造上の配置により、化合物の最大活性をもたらす（実施例５、６、及び７）。設計されたアンキリンリピートドメインを、ＰＴリッチリンカーを使用して接続すると、驚くべきことに、薬物動態特性が改善される（実施例１０及び１１）。分子は、１分子中に少なくとも２種類の薬物（例えば、トラスツズマブ及びペルツズマブ）の機能をまとめ、更に、ＨＥＲ２発現細胞におけるアポトーシスを誘導することができる（実施例６、図７）。
【００３５】
一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、配列番号２２からなる相当する組み換え結合タンパク質と比較して、保存安定性が改善されている。一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、配列番号２２からなる相当する組み換え結合タンパク質と比較して、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬにて４０℃で１ヶ月間保存された後の分解産物量が低減されている。
【００３６】
一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたＣ末端アンキリンリピートドメインが除去されている配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質と比較して、薬物動態特性が改善されている。一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸１〜４２２からなる組み換え結合タンパク質と比較して、薬物動態特性が改善されている。一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、配列番号３３からなる組み換え結合タンパク質と比較して、薬物動態特性が改善されている。
【００３７】
一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、マウス、ラット、イヌ、カニクイザル、又はヒト由来の血清アルブミン、より好ましくはマウス、カニクイザル又はヒト由来の血清アルブミン、より好ましくはカニクイザル又はヒト由来の血清アルブミン、より好ましくはヒト由来の血清アルブミンに、ＰＢＳ中で、解離定数（Ｋｄ）１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、より好ましくは１０-7Ｍ未満で結合する。一実施形態では、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、配列番号１４からなり、ＰＢＳ中で、１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、又はより好ましくは１０-7Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。表面プラズモン共鳴を使用する解離定数の決定の例は、実施例５及び国際公開第２０１４／０８３２０８号に提供されている。
【００３８】
一実施形態では、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、ＰＢＳ中で、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍ未満、又はより好ましくは１０-9Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒト由来のＨＥＲ２に結合する。一実施形態では、配列番号１６からなり、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍ未満、より好ましくは１０-9Ｍ未満、より好ましくは１０-10Ｍ未満、又はより好ましくは１０-11Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒトＨＥＲ２に結合する。一実施形態では、配列番号１７からなり、当該ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍ未満、又はより好ましくは１０-9Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒトＨＥＲ２に結合する。
【００３９】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、ＰＢＳ中で、１０-7Ｍ未満、好ましくは１０-8Ｍ未満、より好ましくは１０-9Ｍ未満、又はより好ましくは１０-10Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒト由来のＨＥＲ２に結合する。一実施形態では、配列番号３２を含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該組み換え結合タンパク質は、ＰＢＳ中で、１０-8Ｍ未満、好ましくは１０-9Ｍ未満、又はより好ましくは１０-10Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、配列番号２１を含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該組み換え結合タンパク質は、ＰＢＳ中で、１０-7Ｍ未満、好ましくは１０-8Ｍ未満、より好ましくは１０-9Ｍ未満、又はより好ましくは１０-10Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒト由来のＨＥＲ２に結合する。一実施形態では、配列番号２１からなり、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該組み換え結合タンパク質は、ＰＢＳ中で、１０-7Ｍ未満、好ましくは１０-8Ｍ未満、より好ましくは１０-9Ｍ未満、又はより好ましくは１０-10Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒト由来のＨＥＲ２に結合する。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、又はより好ましくは１０-7Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、配列番号２１を含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該組み換え結合タンパク質は、ＰＢＳ中で、１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、又はより好ましくは１０-7Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、配列番号２１からなり、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該組み換え結合タンパク質は、ＰＢＳ中で、１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、又はより好ましくは１０-7Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。
【００４０】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、又はより好ましくは１０-8Ｍ未満の阻害定数（ＩＣ50）でＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害する。このような細胞の例としては、ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＺＲ−７５−３０、ＨＣＣ１４１９、又はＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞が挙げられる。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、又はより好ましくは１０-8Ｍ未満の阻害定数（ＩＣ50）でＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、配列番号３２を含む組み換え結合タンパク質は、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、又はより好ましくは１０-8Ｍ未満の阻害定数（ＩＣ50）でＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質は、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、又はより好ましくは１０-8Ｍ未満の阻害定数（ＩＣ50）でＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質は、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、又はより好ましくは１０-8Ｍ未満の阻害定数（ＩＣ50）でＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。細胞阻害アッセイは当該技術分野で周知である。一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメイン１つのみを有する組み換え結合タンパク質よりも、ＢＴ４７４細胞の増殖をより強力に阻害する。一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ；当該当業者に周知）による補助がなくとも、ＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、ＩｇＧ１−Ｆｃ断片による補助がなくとも（ｔｈｅ  ａｉｄ  ｉｆ  ａｎ  ＩｇＧ１−Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。
【００４１】
一実施形態では、配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、ＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスを誘導する。一実施形態では、配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、１００ｎＭよりも低い半数効果濃度（ＥＣ50）で、ＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスを誘導する。好ましくは、当該組み換え結合タンパク質は、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ｎＭよりも低いＥＣ５０値で、ＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスを誘導する。好ましくは、当該組み換え結合タンパク質は、１００ｎＭにて、１００ｎＭのトラスツズマブ、１００ｎＭのペルツズマブ、又は１００ｎＭのトラスツズマブと１００ｎＭのペルツズマブとの混合物よりも強力にＢＴ４７４におけるアポトーシスを誘導する。一実施形態では、配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、ＨＥＲ２発現細胞におけるアポトーシスを誘導する。
【００４２】
一実施形態では、配列番号２１を含む当該組み換え結合タンパク質は、ＲＡＳ経路を阻害する。一実施形態では、ＢＴ４７４におけるＨＥＲ２は、配列番号２１を含む当該組み換え結合タンパク質で処理した場合、トラスツズマブで処理した場合よりもリン酸化を受けない。
【００４３】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、ＨＥＲ２及びヒト血清アルブミンに同時に結合することができる。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、２分子のヒト血清アルブミンに同時に結合することができる。このような同時結合は、当業者に周知の技術である、表面プラズモン共鳴実験（実施例５）又は静的光散乱と接続したサイズ排除クロマトグラフィー（実施例１４）を使用して示すことができる。
【００４４】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、二重パラトープの様式でＨＥＲ２に結合している。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、２つの異なるエピトープにてＨＥＲ２に結合する。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、設計された第１、第２、第３、及び第４のアンキリンリピートドメインを含む組み換え結合タンパク質に関し、当該設計された第１及び第２のアンキリンリピートドメインは、それぞれＨＥＲ２に対する結合特異性を有し、当該設計された第３及び第４のアンキリンリピートドメインは、それぞれ血清アルブミンに対する結合特異性を有する。好ましくは、当該組み換え結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖からなる。より好ましくは、当該第１、第２、第３及び第４の設計アンキリンリピートドメインは、ポリペプチドリンカーによって結合されている。配列番号２１は、このような組み換え結合タンパク質の例である。
【００４６】
一実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第１の設計されたアンキリンリピートドメインは、ＨＥＲ２の結合ドメインＩＩである。一実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第２の設計されたアンキリンリピートドメインは、ＨＥＲ２の結合ドメインＩＶである。一実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第１の設計されたアンキリンリピートドメインは、ＨＥＲ２の結合ドメインＩＩであり、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計された当該第２のアンキリンリピートドメインは、ＨＥＲ２の結合ドメインＩＶである。一実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第１の設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１６を含む。一実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第２の設計されたアンキリンリピートドメインは、配列番号１７を含む。一実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第１の設計されたアンキリンリピートドメインは配列番号１６を含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計された当該第２のアンキリンリピートドメインは配列番号１７を含む。
【００４７】
一実施形態では、配列番号１６を含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第１の設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、ＰＢＳ中で、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍ未満、より好ましくは１０-9Ｍ未満、より好ましくは１０-10Ｍ未満、又はより好ましくは１０-11Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒトＨＥＲ２に結合する。一実施形態では、配列番号１７を含み、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する当該第２の設計されたアンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍ未満、又はより好ましくは１０-9Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ヒトＨＥＲ２に結合する。
【００４８】
一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する当該第３及び第４の設計されたアンキリンリピートドメインのそれぞれは、ＰＢＳ中で、１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、又はより好ましくは１０-7Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、それぞれ配列番号１４を含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する当該第３及び第４の設計されたアンキリンリピートドメインは、それぞれＰＢＳ中で、１０-5Ｍ未満、好ましくは１０-6Ｍ未満、又はより好ましくは１０-7Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合する。
【００４９】
「第１の設計されたアンキリンリピートドメイン」、「第２の設計されたアンキリンリピートドメイン」、「第３の設計されたアンキリンリピートドメイン」、及び「第４の設計されたアンキリンリピートドメイン」において使用される用語「第１の」、「第２の」、「第３の」、及び任意に使用される「第４の」は、組み換え結合タンパク質内の、当該設計されたアンキリンリピートドメインのいかなる位置的な配列も示す、又は、含意するものではない。一実施形態では、当該設計された４つのアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第３−第１−第２−第４の順に配置される。
【００５０】
一実施形態では、組み換え結合タンパク質は、マウスにおける腫瘍異種移植モデルにおいてＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。一実施形態では、組み換え結合タンパク質は、マウスにおけるＨＥＲ２発現患者に由来する異種移植片癌モデルにおける腫瘍成長を阻害する。一実施形態では、組み換え結合タンパク質は、マウスにおけるＨＥＲ２発現患者に由来する異種移植胃癌モデルにおける腫瘍成長を阻害する。用語「ＨＥＲ２発現患者に由来する異種移植片」は、患者由来の癌組織異種移植片を意味し、ここで当該組織では、少なくとも１つの細胞がバックグラウンドを超えるＨＥＲ２を発現する。
【００５１】
所与のアミノ酸配列と少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む設計されたアンキリンリピートドメイン又は組み換え結合タンパク質に関する本発明のいずれかの実施形態において、非同一のアミノ酸は、設計されたアンキリンリピートドメイン又は組み換え結合タンパク質の任意の位置に配置されてもよい。
【００５２】
同様に、最大７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が任意のアミノ酸によって交換されている、設計されたアンキリンリピートドメイン又は組み換え結合タンパク質に関する本発明のいずれかの実施形態において、交換されたアミノ酸は、設計されたアンキリンリピートドメインの任意の位置に配置されてもよい。本発明の組み換え結合タンパク質を（例えば点変異により）修飾する技術は、当業者に周知である。当業者であれば、配列番号２１から出発して、機能活性を変化させない尤度が高い配列番号２１の配列変異体を作成するために、アミノ酸を交換する方法及び位置（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号の知識を用いる）を把握している。
【００５３】
一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、終末相半減期の延長を示し、好ましくは、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計された当該第４のアンキリンリピートドメインを欠く相当する組み換え結合タンパク質と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は４５％の終末相半減期の延長を示す。一実施形態では、当該組み換え結合タンパク質は、終末相半減期の延長を示し、好ましくは、当該血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つだけ含む相当する組み換え結合タンパク質と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は４５％の終末相半減期の延長を示す。このような終末相半減期の延長の例を、実施例１１に示す。
【００５４】
一実施形態では、配列番号２１を含み、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、カニクイザルにおいて１ｍｇ／ｋｇで約４７時間の終末相半減期を示す。一実施形態では、配列番号２１を含み、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、カニクイザルにおいて５ｍｇ／ｋｇで約１００時間の終末相半減期を示す。一実施形態では、配列番号２１を含み、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、カニクイザルにおいて１０ｍｇ／ｋｇで約１００時間の終末相半減期を示す。一実施形態では、配列番号２１を含み、好ましくは配列番号２１からなる当該組み換え結合タンパク質は、カニクイザルにおいて１００ｍｇ／ｋｇで約１００時間の終末相半減期を示す。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、本発明の設計されたアンキリンリピートドメイン又は組み換え結合タンパク質のアミノ酸配列、好ましくは本発明の組み換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組み換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、当該組み換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計されたアンキリンリピートドメイン又は組み換え結合タンパク質を、大腸菌で産生するために使用した。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、本発明の組み換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリンリピートドメイン、並びに／又は本発明の組み換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリンリピートドメインをコードする核酸、並びに場合により、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、組み換え結合タンパク質、又は組み換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに場合により、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
【００５８】
薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。更にまた、上記の、組み換え結合タンパク質及び／又は設計されたアンキリンリピートドメイン、及び／又は核酸のうちの１つ以上、特に組み換え結合タンパク質及び／又は核酸を含む、診断用組成物が考慮される。
【００５９】
医薬組成物は、本明細書に記載の組み換え結合タンパク質、及び／又は設計されたアンキリンリピートドメイン、及び／又は核酸、好ましくは組み換え結合タンパク質及び／又は核酸、並びに例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６th  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に記載のような、薬学的に許容される担体、添加物若しくは安定剤を含む。当業者に既知の、好適な担体、添加物又は安定剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤である。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生理活性化合物等の、追加の有効成分を含む、複合製剤であってもよい。
【００６０】
本発明の一実施形態は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを２つ含む、本発明の組み換え結合タンパク質の、医薬組成物の製造のための使用に関し、当該組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つのみ含む相当する組み換え結合タンパク質と比較して終末相半減期の延長を示し、好ましくは終末相半減期の少なくとも５％、好ましくは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％の延長を示す。
【００６１】
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組み換え結合タンパク質、並びに非イオン性洗剤等の洗剤、リン酸塩等の緩衝液、及びスクロース等の糖を含む。一実施形態では、このような組成物は、上記のような組み換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物又は組み換え結合タンパク質の、疾患の治療のための使用に関する。そのため、本発明による医薬組成物又は組み換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。非経口投与において、本発明の医薬組成物は、上記で定義したような薬学的に許容される添加物と共に、溶液、懸濁液又はエマルション等の単位用量の注射剤形で配合される。用量及び投与方法は、治療される個体及び具体的な疾患によって異なる。
【００６３】
更に、上記の医薬組成物又は組み換え結合タンパク質のいずれかは、疾患の治療のために検討される。
【００６４】
一実施形態では、上記の組み換え結合タンパク質又は本明細書に記載のこのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口投与のため、組み換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法に関し、方法は、このような治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組み換え結合タンパク質を投与するステップを含む。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法に関し、方法は、このような治療を必要とする患者に、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。実施例７（図４）は、配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質の癌の治療への使用の有用性を示す。一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物の、疾患の治療のための使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療において使用するための医薬組成物に関する。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子を、疾患の治療に使用することが考察される。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子を含む薬剤に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための医薬組成物における、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質の使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための当該医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための当該組み換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための当該核酸に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための薬剤としての、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子の使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子の使用に関する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子の、薬剤の製造のための使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための薬剤を製造するための、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子の使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための薬剤の製造プロセスに関し、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子は、薬剤の活性成分である。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組み換え結合タンパク質、又は核酸分子を使用して疾患を治療するプロセスに関する。
【００６７】
用語「医学的状態」（又は障害若しくは疾患）としては、自己免疫障害、炎症性疾患、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性疾患、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が挙げられる。本明細書に記載の組み換え結合タンパク質のいずれかを、このような疾患、特に、自己免疫疾患、炎症性疾患、網膜症、及び腫瘍性疾患からなる群から選択される疾患の治療のための薬剤の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、増殖過剰の状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態の治療方法に関し、方法は、このような治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組み換え結合タンパク質又は当該医薬組成物を投与するステップを含む。好ましい実施形態では、当該医学的状態は腫瘍性疾患である。本明細書で使用するとき、用語「腫瘍性疾患」は、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態又は状況を指す。一実施形態では、当該医学的状態は悪性腫瘍性疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は癌に関する。一実施形態では、当該医学的状態は、ＨＥＲ２発現癌、ＨＥＲ２嗜癖のある癌（ＨＥＲ２  ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ）、部分的にＨＥＲ２嗜癖のある癌（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ＨＥＲ２  ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ）、ＨＥＲ２過剰発現癌、ＨＥＲ２増幅癌、トラスツマ耐性癌、及び／又はトラスツズマブ感受性癌関連する。一実施形態では、当該医学的状態は、乳癌及び／又は胃腸癌及び／又は脳癌に関する。一実施形態では、当該医学的状態は、乳癌、卵巣癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮癌、大腸直腸癌、膀胱癌、及び／又はＨＥＲ２過剰発現癌に関する。用語「脳癌」は、ＨＥＲ２過剰発現癌の脳転移、ＨＥＲ２増幅癌の脳転移、ＨＥＲ２過剰発現脳癌、又はＨＥＲ２増幅脳癌の脳転移に関する。用語「胃腸管」癌は、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、大腸直腸癌、胆道癌（ｂｉｌｉａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢癌、又は膵臓腺癌に関し得る。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。一実施形態では、当該医学的状態は癌に関し、当該癌の細胞は、ＩＨＣによって判定されるように、バックグラウンドを超えるＨＥＲ２発現レベルを示す。一実施形態では、当該医学的状態は癌に関し、当該癌の細胞は、ＩＨＣによって判定されるように、その近傍の健常な細胞のＨＥＲ２発現レベルよりも高い発現レベルを示す。バックグラウンドを超えるこのようなＨＥＲ２発現レベルは、例えば、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）（Ｄａｋｏ）などのアッセイから、当業者に周知である。好ましくは、バックグラウンドを超えるＨＥＲ２発現レベルは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコア１＋、２＋、又は３＋、より好ましくは２＋、又は３＋に関する。Ｈｅｒ２過剰発現は、当業者に周知である（Ｒｕｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２５，６３７〜６５０；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１（３１），３９９７〜４０１４）。
【００６８】
特に、本発明は、本発明の医薬組成物を使用した医学的状態の治療に関し、上記の医学的状態は癌である。
【００６９】
本発明の組み換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の癌疾患の治療のための使用はまた、当該技術分野において既知の１つ以上の任意の他の療法との併用とすることができる。本明細書で使用するとき、用語「〜との併用」は、所与の投与計画の下で実施される同時投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間をずらした投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。例えば、同時投与され得る化合物の例は、タキサン、アントラサイクリン、白金系化学療法剤、５−ＦＵ、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、アピトリシブ、タセリシブ（Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ）、又はアルペリシブなど）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ又はコビメチニブなど）、ＲＡＳ阻害剤（例えば、サリラシブ（Ｓａｌｉｒａｓｉｂ））、ＲＡＦ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、アピトリシブ及びエベロリムスを含む）、Ｐａｎ−ＥＧＦＲ阻害剤、微小管阻害剤（エリブリンを含む）、細胞周期キナーゼ阻害剤を含む標的化治療（例えば、パルボシクリブ）、ＨＥＲ２阻害剤、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ＭＰ０２５０、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ウレルマブ、ウトリムマブ（Ｕｔｏｌｉｍｕｍａｂ）、又はアテゾリズマブを含む。好ましくは、これらの化合物は、推奨される用量で使用される。一実施形態では、配列番号２１を含む当該組み換え結合タンパク質は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、エリブリン、トラスツズマブ、又はラパチニブの効果を増強する。一実施形態では、配列番号２１を含む当該組み換え結合タンパク質は、疾患の治療のための、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、エリブリン、トラスツズマブ、又はラパチニブの使用する用量を低減することができる。このような組み合わせの例を実施例１７に提供する。
【００７０】
更なる実施形態では、本発明は、本発明の組み換え結合タンパク質の、医学的状態、好ましくは腫瘍性疾患、より好ましくは癌の治療に使用される薬剤の製造のための使用に関する。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の、腫瘍性疾患、特に癌であり得る、医学的状態の治療に使用される薬剤の製造のための使用に関する。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌であるべきである、又は、滅菌されるべきである。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。
【００７３】
一実施形態では、本発明は、上記のリピートドメインのいずれかを含む組み換え結合タンパク質に関する。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、当該組み換え結合タンパク質を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、当該組み換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、当該組み換え結合タンパク質、及び／又は当該組み換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又は当該医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質、及び／又は配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又は配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質を含む医薬組成物、及び／又は配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質をコードする核酸を含む、キットに関する。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、本発明の組み換え結合タンパク質を産生するための方法に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１を含む、好ましくは配列番号２１からなる本発明の組み換え結合タンパク質を産生するための方法に関し、当該方法は、（ｉ）当該組み換え結合タンパク質を細菌において発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィーを使用して当該組み換え結合タンパク質を精製する工程と、を含む。この方法は、追加の工程を含み得る。本発明の当該組み換え結合タンパク質の産生方法は、実施例１に記載される。
【００７６】
本発明は、実施例に記載の特定の実施形態に限定されない。他の供給源を使用し、下記の概要に従って処理してもよい。
【００７７】
本明細書を通して多くの文書が引用される。これらの文書の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本明細書は、「Ｐ０１５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前の、本明細書のアミノ酸配列一覧の多数のアミノ酸配列を参照しており、配列プロトコルのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
定義
本発明の文脈において、用語「タンパク質」はポリペプチドを指し、ここで、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内かつ／又は複数のポリペプチド鎖間で二次、三次、又は四次構造を形成することにより、明確な三次元配列を有する、又は、とることができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。個々に二次又は三次構造を形成することにより、明確な三次元配列を有する、又は、とることができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。このようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【００８０】
組み換えタンパク質、組み換えタンパク質ドメイン、組み換え結合タンパク質等で使用するとき、用語「組み換え」は、上記のポリペプチドが、当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術の使用によって作製されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって作製される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、このような組み換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば大腸菌）に挿入すると、この細菌は、この組み換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて産生されたポリペプチドは、組み換えポリペプチド又は組み換えタンパク質と呼ばれる。
【００８１】
本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、２つ以上、好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ以上の結合ドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、当該結合タンパク質は、組み換え結合タンパク質である。好ましくは、当該結合タンパク質は、４つのリピートドメインを含む。より好ましくは、当該結合タンパク質は、設計された４つのアンキリンリピートドメインを含む。好ましくは、当該結合タンパク質の当該結合ドメインのうち２つは、それぞれ血清アルブミンに対する標的特異性を有する。好ましくは、当該結合タンパク質の当該結合ドメインのうちの２つは、それぞれＨＥＲ２に対する標的特異性を有する。
【００８２】
更に、任意のこのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、他の結合タンパク質ドメイン、サイトカイン、ホルモン、若しくはアンタゴニストへの融合など）、又は化学修飾（例えば、ポリエチレングリコール、毒素（例えば、ＩｍｍｕｎｏｇｅｎからのＤＭ１）、小分子、及び抗生物質などへのカップリング）を含み得る。
【００８３】
用語「結合ドメイン」は、タンパク質スキャフォールドと同一の「フォールド」（すなわち二次、三次、及び／又は四次構造）を示し、以下に定義するような所定の特性を有するタンパク質ドメインを意味する。このような結合ドメインは、当該技術分野において既知の技術である、合理的であり、又は最も一般的である、コンビナトリアルなタンパク質工学の手法によって得ることができる（Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３，１２５７〜１２６８）。例えば、所定の特性を有する結合ドメインは、（ａ）以下に更に定義するようなタンパク質スキャフォールドと同一のフォールドを示すタンパク質ドメインの多様なコレクションを提供する工程と、（ｂ）上記の多様なコレクションをスクリーニングし、かつ／又は、上記の多様なコレクションから選択し、上記の所定の特性を有するタンパク質ドメインを少なくとも１つ得る工程と、を含む方法によって得ることができる。タンパク質ドメインの多様なコレクションは、使用されるスクリーニング系及び／又は選択系に従ういくつかの方法によって提供することができ、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ等の、当業者に周知の方法の使用を含み得る。好ましくは、上記の結合ドメインは、組み換え結合ドメインである。
【００８４】
用語「タンパク質スキャフォールド」は、アミノ酸の挿入、置換又は欠失を高度に許容できる露出表面積を有するタンパク質を意味する。本発明の結合ドメインの産生に使用できるタンパク質スキャフォールドの例は、単鎖Ｆｖ又はＦａｂフラグメント等の、抗体又はそれらのフラグメント、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）からのビリン結合タンパク質又は他のリポカリン、アンキリンリピートタンパク質又は他のリピートタンパク質、及びヒトフィブロネクチンである。タンパク質スキャフォールドは、当業者に既知である（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【００８５】
用語「標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子等の個々の分子を指し、このような個々の分子の任意の一部、又はこのような分子の２つ以上の複合体を含む。標的は細胞全体若しくは組織試料であってもよい、又は、任意の非天然化合物であってもよい。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド、又は、例えば、天然若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチドである。本発明の特定の用途において、標的は血清アルブミン及びＨＥＲ２である。
【００８６】
用語「所定の特性」は、標的への結合、標的の阻害、標的を介在した反応の活性化、酵素活性、及び関連の更なる特性等の特性を指す。所望の特性の種類に応じて、当業者は、所望の特性を有する結合ドメインのスクリーニング及び／又は選択を実施するためのフォーマット及び必要な工程を特定することができる。好ましくは、上記の所定の特性は、標的に特異的に結合することである。
【００８７】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ−Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も包含する。ポリペプチドは、当業者に周知である。
【００８８】
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列を指し、ここで、上記のアミノ酸配列は、上記のポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは「標的化」（すなわち、標的部位への局在）に有用であり、又は、上記のアミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、上記のアミノ酸配列はエフェクター機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部分に、直接又はポリペプチドリンカーを介して結合することができる。これらのポリペプチドタグは当該技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ（例えば配列番号１のＨｉｓタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、上記のポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクター分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。
【００８９】
用語「ポリペプチドリンカー」は、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコール等のポリマー、又は２つの配列タグを、連結させることができるアミノ酸配列を指す。このような更なるドメイン、タグ、非タンパク質化合物又はポリマー及びリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願国際公開第２００２／０２０５６５号の記載に提供されている。このようなリンカーの具体例は、グリシン−セリン−リンカー及び可変長のプロリン−トレオニン−リンカーである。グリシン−セリン−リンカーの例は、ＧＳ及び配列番号２〜６で提供されるアミノ酸配列であり、プロリン−トレオニン−リンカーの例は、配列番号７〜９のアミノ酸配列で提供される。
【００９０】
特許出願国際公開第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５３９，２〜６）は、リピートタンパク質の特徴及びリピートドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明を含む。用語「リピートタンパク質」は、１つ以上のリピートドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、リピートタンパク質は、最大６つのリピートドメインを含む。より好ましくは、リピートタンパク質は、最大５つのリピートドメインを含む。より好ましくは、リピートタンパク質は、最大４つのリピートドメインを含む。更に、上記のリピートタンパク質は、更なる非リピートタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ及び／又はポリペプチドリンカーを含む場合がある。リピートドメインは、本明細書で前述したような結合ドメインである場合がある。
【００９１】
用語「リピートドメイン」は、２つ以上の連続したリピートモジュールを構造単位として含むタンパク質ドメインを指し、上記の構造単位は同一のフォールドを有し、密に積み重なり、ジョイントに疎水性コアを有する超らせん構造を形成する。構造的相同性に次いで、このようなリピートモジュールは、配列相同性を更に有する。好ましくは、リピートドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングリピートを更に含む。明確に説明すると、キャッピングリピートは、リピートモジュールであり得る。このようなリピートドメイン、リピートモジュール、及びキャッピングリピート、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリンリピートドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチリピートドメイン（同第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチドリピートドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１（５），４９７〜５０８，２００３）、及びアルマジロリピートドメイン（同第２００９／０４０３３８号）の例から、当業者に周知である。このようなリピートドメインは、繰り返しアミノ酸配列を含むが、各繰り返しアミノ酸配列が個々のドメイン（例えばフィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成できる、又は、繰り返しアミノ酸配列が構造単位ではない、すなわち、上記の繰り返しアミノ酸配列が密に積み重ならず、ジョイントに疎水性コアを有する超らせん構造を形成しないタンパク質とは異なることが、当業者には更に周知である。リピートモジュール若しくはリピート配列モチーフを同定及び測定する、又は、このようなリピート単位若しくはモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定するための方法、例えばホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ（登録商標）等）は、生物情報学の分野において十分に確立されており、当業者に周知である。
【００９２】
用語「設計されたリピートタンパク質」及び「設計されたリピートドメイン」は、例えば、特許出願、国際公開第２００２／０２０５６５号に説明されているような発明手順の結果として得られる、リピートタンパク質又はリピートドメインをそれぞれ指す。用語「設計された」は、このようなリピートタンパク質及びリピートドメインがそれぞれ人工の、合成によるものであり、天然由来ではないという特性を指す。国際公開第２００２／０２０５６５号の設計されたリピートタンパク質又は設計されたリピートドメインは、設計されたアンキリンリピートタンパク質又は設計されたアンキリンリピートドメインをそれぞれ含む。したがって、本明細書の設計されたアンキリンリピートタンパク質は、少なくとも１つの設計されたアンキリンリピートドメインを含む本発明のタンパク質に対応する。更に、用語「天然由来ではない」は、上記の結合タンパク質又は上記の結合ドメインの配列が、非人工配列エントリーとして、配列データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ又はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに存在しないことを意味する。これらのデータベース及び他の類似の配列データベースは、当業者に周知である。本発明の組み換え結合タンパク質又は設計されたアンキリンリピートドメインは、天然に存在しない。
【００９３】
用語「リピートモジュール」、「リピート単位」、「キャッピングリピート」、「キャッピングモジュール」、並びにリピートタンパク質及びリピートドメインに関連する更なる用語は、国際公開第２００２／０２０５６５号に定義されており、これらの定義は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
用語「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「標的に高い特異性で結合する」、「標的に対して特異的」又は「標的特異性」等は、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等の非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋｄ」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０2倍、より好ましくは少なくとも１０3倍、より好ましくは少なくとも１０4倍、又はより好ましくは少なくとも１０5倍低い。タンパク質−タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質−タンパク質相互作用のＫｄの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。
【００９５】
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ  ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
【００９６】
本発明の文脈における用語「細胞増殖を阻害する」及び同様の用語は、当該組み換え結合タンパク質が細胞増殖を阻害する能力を指す。阻害の強さは、典型的には、半数阻害濃度（ＩＣ50）を評価することによって測定される。阻害という用語及びＩＣ50値の評価は、当該分野において十分に確立している。
【００９７】
用語「マウス血清アルブミン」は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわちｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６８を指す。
【００９８】
ＨＥＲ２は、本明細書で使用するとき、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（分化のクラスター３４０（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３４０））又はｐ１８５としても既知のヒト上皮増殖因子受容体２に関する。ＨＥＲ２は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２は、ヒトにおいて、ＥＲＢＢ２によりコードされる、ヒト染色体１７の長腕に位置する既知の癌原遺伝子（１７ｑ１２）である。ＨＥＲ２はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ０４６２６を有する。ヒトＨＥＲ２は、２１個のアミノ酸からなるシグナル配列、６３１個のアミノ酸からなる細胞外領域（例えば、ドメインＩ〜ＩＶを含むエクトドメイン）、２３個のアミノ酸からなる膜貫通領域、及び５８０個のアミノ酸からなる細胞質ドメインを有する、１２５５個のアミノ酸からなる。
【００９９】
本発明の文脈において「改善された保存安定性」は、分解バンドの量の減少、好ましくは、４０℃で１ヶ月間ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬで保存した後に実施するＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシー染色によって検出される、分解物の量の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくは５０％の減少を意味する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる保存安定性を評価する方法は、当業者に周知である。改善された保存安定性を有する設計されたアンキリンリピートドメイン及び組み換え結合タンパク質の例は、実施例２及び３に示す。
【０１００】
表現「血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つのみ含む組み換え結合タンパク質」は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つを除き全て除去し、かつ対応するポリペプチドリンカーを除去することにより、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの数が１つに減少されている、本発明の組み換え体結合タンパク質の組成を有する、組み換え体の結合を意味する。
【０１０１】
用語「二重パラトープ性結合タンパク質」は、同じ標的タンパク質上に位置する２つの異なるエピトープを標的とする結合タンパク質を意味する。例えば、ＨＥＲ２を標的とする二重パラトープ性結合タンパク質は、少なくとも、ＨＥＲ２上の第１のエピトープを標的化する第１の結合ドメインと、ＨＥＲ２上の異なる第２のエピトープを標的化する第２の結合ドメインと、を含む。配列番号３２からなるタンパク質は、ＨＥＲ２上の異なるエピトープを標的とし、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを含む、二重パラトープ性結合タンパク質である。配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質は、配列番号３２を含む。
【０１０２】
本発明における表現「改善された薬物動態特性を示す」、「改善された薬物動態特性」、又は「薬物動態特性の改善」は、組み換え結合タンパク質の薬物動態パラメータが、比較対象のタンパク質の対応する薬物動態パラメータに比べ、改善されているという意味を有する。対応する例は、実施例８、９、１０、及び１１に示す（図５及び６を参照されたい）。好ましくは、改善された薬物動態特性は、クリアランスの低下、及び／又は曝露の増加、及び／又は終末相半減期の延長である。より好ましくは、改善された薬物動態特性は、終末相半減期の延長である。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを少なくとも２つ含む、より好ましくは２つ含む、本発明の組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つのみ含む相当する組み換え結合タンパク質と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は２５０％の終末相半減期の延長、及び／又はクリアランスの低下、及び／又は曝露の増加を示す。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを少なくとも２つ含む、より好ましくは２つ含む、本発明の組み換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つのみ含む相当する組み換え結合タンパク質と比較して、終末相半減期の延長、好ましくは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％又は２５０％の終末相半減期の延長を示す。
【０１０３】
好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後４８時間までのデータを有する実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間〜４８時間で計算する。好ましくは、クリアランス及び／又はカニクイザルにおける曝露及び／又は終末相半減期を測定する場合、注射後７日目までのデータを有する評価を行う。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目〜５日目で計算する。更に、当業者は、標的介在クリアランスなどの効果を特定し、終末相半減期を計算する際にそれらを考慮することができる。本発明の組み換え結合タンパク質等の薬物に関係する用語「終末相半減期」は、擬平衡に達した後、哺乳動物に投与した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間〜４８時間で算出する、又は、カニクイザルでは１日目〜５日目で算出する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の投与量、より好ましくは同等の投与量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ投与量）又は等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ投与量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ投与量）、で行う。動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことが、当業者には理解される。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇから選択される。
【実施例】
【０１０４】
一般的な材料及び方法：本明細書に開示の標準物質及び試薬の全ては当業者に既知であり、市販されている、又は、周知の技術を使用して調製することができる。細胞株をＬＧＣ／ＡＴＣＣ（Ｆｒａｎｃｅ／ＵＳＡ）から購入した。細胞培養培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｕｂｉｏ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。別途記載のない限り、方法は、当業者に周知の記載された確立されたプロトコルにより実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。使用されるいくつかの方法は、国際公開第２０１２／０６９６５４号及び同第２０１４／０８３２０８号に既に記載されている。
【０１０５】
設計されたアンキリンリピートドメイン：血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを生成する方法は、国際公開第２０１２／０６９６５４号に記載されている。ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを生成する方法、及び当該設計されたアンキリンリピートドメイン及び二重特異性結合タンパク質を生成する方法の例が、国際公開第２０１４／０８３２０８号に記載されている。設計されたアンキリンリピートドメインは、広くは国際公開第２００２／０２０５６５号に詳細に記載されている。
【０１０６】
実施例１：組み換えＤＮＡ、タンパク質発現、及びタンパク質精製
設計されたアンキリンリピートドメイン又は組み換え結合タンパク質をコードするＤＮＡは、当業者に周知の遺伝学的方法によって作製した。配列番号２１〜３３のアミノ酸配列の群から選択され、場合によりＮ末端に更に配列番号１を有する組み換え結合タンパク質、又は配列番号１０〜２０のアミノ酸配列の群から選択され、場合によりＮ末端に更に配列番号１を有する、設計されたアンキリンリピートドメインを、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）のｐＱＥ発現システムを用いる標準法を使用して、大腸菌の細胞質で発現させた。アミノ酸ＧＳがＮ末端にある場合、発現ベクターによって更にコードされたＭｅｔ残基は、小さなＧｌｙ残基（すなわち、例えば配列番号２１の位置１のアミノ酸）が開始Ｍｅｔに後続するため、大腸菌の細胞質中で、発現されたポリペプチドから効率的に切断された。フレンチプレスを使用して細胞を溶解し、当業者に周知の標準的なクロマトグラフィーの手法を使用し、タンパク質を粗細胞抽出物からほぼ均質な状態に精製した。
【０１０７】
以下のリストは、本発明で使用されるタンパク質を定義する。
タンパク質＃１０−Ｈｉｓ：配列番号１０のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１１−Ｈｉｓ：配列番号１１のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１２−Ｈｉｓ：配列番号１２のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１３−Ｈｉｓ：配列番号１３のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１４−Ｈｉｓ：配列番号１４のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１５−Ｈｉｓ：配列番号１５のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１６−Ｈｉｓ：配列番号１６のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１７−Ｈｉｓ：配列番号１７のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１８−Ｈｉｓ：配列番号１８のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃１９−Ｈｉｓ：配列番号１９のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２０−Ｈｉｓ：配列番号２０のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２１：配列番号２１タンパク質＃２１−Ｈｉｓ：配列番号２１のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２２：配列番号２２タンパク質＃２２−Ｈｉｓ：配列番号２２のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２３：配列番号２３タンパク質＃２３−Ｈｉｓ：配列番号２３のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２４：配列番号２４タンパク質＃２４−Ｈｉｓ：配列番号２４のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２５：配列番号２５タンパク質＃２５−Ｈｉｓ：配列番号２５のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２６：配列番号２６タンパク質＃２６−Ｈｉｓ：配列番号２６のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２７：配列番号２７タンパク質＃２７−Ｈｉｓ：配列番号２７のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２８：配列番号２８タンパク質＃２８−Ｈｉｓ：配列番号２８のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃２９：配列番号２９タンパク質＃２９−Ｈｉｓ：配列番号２９のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃３０−Ｈｉｓ：配列番号３０タンパク質＃３０−Ｈｉｓ：配列番号３０のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃３１−Ｈｉｓ：配列番号３１（Ｎ末端にＨｉｓタグを含む）
タンパク質＃３２−Ｈｉｓ：配列番号３２タンパク質＃３２−Ｈｉｓ：配列番号３２のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
タンパク質＃３３−Ｈｉｓ：配列番号３３タンパク質＃３３−Ｈｉｓ：配列番号３３のＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号１）を融合させたもの
【０１０８】
実施例２．安定性の改善された、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの生成（配列番号１４）
設計されたアンキリンリピートについての一般的な知見とは対照的に、本発明者らは、タンパク質＃１２−Ｈｉｓ、タンパク質＃１３−Ｈｉｓ、及びタンパク質＃１５−Ｈｉｓ（国際公開第２０１２／０６９６５４号；実施例１を参照のこと）は、４０℃下、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇで長時間インキュベートすると分解し、したがって薬物候補の成分として使用するのに理想的ではないことを見出した。配列番号１３のアミノ酸配列の分析により、可能性のある分解部位が多数明らかとなった。分解は、更なる潜在的な分解部位の中でも、例えば、配列番号１３の５個のアスパラギン（アスパラギン−グリシンジペプチドを含む）、１３個のアスパルテート、又は１０個のグリシンのいずれか１つの近傍で起こり得る。配列番号１３は、多数の潜在的な酸化部位を更に含む。したがって、多くの変異体及び変異体の組み合わせを分析して、改善された保存安定特性を示す変異体を分離する。驚くべきことに、本発明者らは、配列番号１３の位置８０のみを変異させることによって、保存安定性に大きな影響を示す機能的変異体を生成することができた。配列番号１３の残基位置８０のアスパラギン酸をグルタメートに変異させると、配列番号１４に相当する、血清アルブミンに対する結合特異性を有する機能的に設計されたアンキリンリピートドメインが生成された。この変異は、保存安定性の顕著な改善を示す（実施例３、図２）。タンパク質＃１３−Ｈｉｓ同様、タンパク質＃１４−Ｈｉｓは、ｐＨ７．４のＰＢＳ中、ヒト、マウス及びカニクイザルの血清アルブミンに対しては、低いナノモル濃度の親和性（１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ））を示した（製造元（ＢｉｏＲａｄ）によるＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴により測定）。驚くべきことに、タンパク質＃１４−Ｈｉｓは、周知の技術を使用した熱によるアンフォールディングにより測定されるとおり、タンパク質＃１３−Ｈｉｓと比較して改良された熱変性中点を更に示した（Ｎｉｅｓｅｎ，Ｆ．Ｈ．，Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｈ．，Ｖｅｄａｄｉ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，２２１２〜２２２１，２００７；タンパク質＃１３−Ｈｉｓ：Ｔｍ＝８６℃；タンパク質＃１４−Ｈｉｓ，Ｔｍ＝８９．５℃；ｐＨ６．０）。
【０１０９】
実施例３．配列番号１４を使用した場合のタンパク質の安定性の改善
タンパク質＃１３−Ｈｉｓ、タンパク質＃１４−Ｈｉｓ及びタンパク質＃１５−Ｈｉｓを実施例１に記載のように調製し、サンプルをＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。続いてタンパク質＃１４−Ｈｉｓ及びタンパク質＃１５−Ｈｉｓを−８０℃又は４０℃で１ヶ月間ガラスバイアル中に保存した後、ＳＤＳ１５％  ＰＡＧＥで分析した。タンパク質＃１４−Ｈｉｓ及びタンパク質＃１５−Ｈｉｓは、−８０℃で保存した際に同等の安定性を示したが、タンパク質＃１４−Ｈｉｓは、４０℃で１ヶ月間保存後に、タンパク質＃１５−Ｈｉｓと比較して、ＳＤＳ  １５％  ＰＡＧＥ上において、分解産物の量が著しく減少（５０％超）したことを示した。同様に、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬで、４℃、２５℃、４０℃及び６０℃で１週間保存した場合、タンパク質＃１４−Ｈｉｓは、タンパク質＃１３−Ｈｉｓと比較して分解生成物の量が有意に減少していた。特に、両方とも４０℃又は６０℃でそれぞれ保存したとき、タンパク質＃１４−Ｈｉｓは、タンパク質＃１３−Ｈｉｓと比較して、ＳＤＳ１５％  ＰＡＧＥにおいて５０％超の分解物の減少を示した（図２）。これらの知見は、タンパク質＃１４−Ｈｉｓが、タンパク質＃１３−Ｈｉｓ及びンパク質＃１５−Ｈｉｓと比較して、改善された保存安定性を有することを示している。同様に、ガラス製バイアル瓶にて、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬで４０℃で１ヶ月間インキュベートすることにより、タンパク質＃１２−Ｈｉｓ、タンパク質＃１３−Ｈｉｓ、タンパク質＃１４−Ｈｉｓ、及びタンパク質＃１５−Ｈｉｓ（実施例１を参照されたい）の保存安定性を比較する場合、タンパク質＃１２−Ｈｉｓ、タンパク質＃１３−Ｈｉｓ、及びタンパク質＃１４−Ｈｉｓは、タンパク質＃１５−Ｈｉｓと比較して分解産物の３０％超の減少を示す。
【０１１０】
タンパク質＃２１及びタンパク質＃２２の保存安定性を試験すると、保存安定性の改善も観察される（それぞれ配列番号２１及び２２に対応するアミノ酸配列からなる組み換え結合タンパク質）。タンパク質＃２１及びタンパク質＃２２を実施例１に記載のように調製し、試料をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃又は４０℃で１ヶ月間ガラスバイアル中に保存した後、標準的なサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。タンパク質＃２１及びタンパク質＃２２は、−８０℃で保存した場合には同等の溶出プロファイルを示すが、タンパク質＃２１は、４０℃での保存時にタンパク質＃２２と比較して有意に多くのモノマー種を示す。これは、配列番号２１を組み換え結合タンパク質中に存在させることが、配列番号２２を存在させるよりも、保存安定性に関してより好ましいことを示している。同様に、ガラス製バイアル瓶にてＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬで４０℃で１ヶ月間保存した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、タンパク質＃２１の示す分解物はタンパク質＃２２よりも少量であり、配列番号２２を含む組み換え結合タンパク質と比較して、配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質の保存安定性がより高いことが確認される。次に、組み換え結合タンパク質中に存在する配列番号１４からなる、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを有することは、存在する配列番号１３からなる、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを有するよりも、保存安定性に関して望ましいことが示される。
【０１１１】
実施例４：薬物候補の生成
ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの例は、以前に開示されている（国際公開第２０１４／０８３２０８号、国際公開第２０１４／０６０３６５号、Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．，Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２，１２１１〜１２２７，２００８；Ｚａｈｎｄ，Ｃ．，Ｐｅｃｏｒａｒｉ，Ｆ．，Ｓｔｒａｕｍａｎｎ，Ｎ．，Ｗｙｌｅｒ，Ｅ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（４６），３５１６７〜３５１７５，２００６））。国際公開第２０１４／０８３２０８号及び同第２０１４／０６０３６５号では、異なるドメインに結合するＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインが組み合わされ、腫瘍細胞の成長阻害の増強を示す二重特異性結合タンパク質が得られた。
【０１１２】
配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質は、ポリペプチドリンカー（各々配列番号９）により連結されている、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメイン（それぞれ配列番号１６及び１７）と、隣接する、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメイン（各々配列番号１４）とを含む薬物候補である（図１を参照）。この組み換え結合タンパク質は、特にタンパク質工学及び最適化工程を含む複雑な手順によって特定されている。第１の工程では、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの数百の組み合わせを、クローニング、発現、及び精製によって二重特異性結合タンパク質として生成した（実施例１を参照されたい）。次いで、国際公開第２０１４／０８３２０８号に記載され、以下に記載されるように、ＨＥＲ２に対する親和性、並びに細胞に対する効力及び細胞増殖阻害について、二重特異性結合タンパク質をスクリーニングした。この試行により得られる二重特異性結合タンパク質の代表的な結果を実施例５及び６に示す。重要なことに、分子は、細胞阻害能を有さずに、ＨＥＲ２リード分子に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを１つだけ有することから、二重特異性である必要がある。組み換え結合タンパク質は、更に改変されている。この工程は、様々な形式で血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを、二重特異性結合タンパク質に対し追加すること（すなわち、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを、異なる数で分子内の異なる位置に追加する）、並びに様々なポリペプチドリンカーを試験することによる薬物動態工学を含んだ。これらのタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性（代表例７）、マウスにおける薬物動態（代表例８）、及びカニクイザルにおける薬物動態（代表例９）、及び細胞に対する効力について試験した。ポリペプチドリンカーの最適化は、薬物動態プロファイルに対するリンカーの効果を試験する工程を含んだ（代表例１０）。薬物動態を操作する試行の最適化は、薬物動態測定（代表例１１）及び効力測定（代表的例１２）によって評価した。更に、様々な薬物候補を、大腸菌（実施例１３）における組み換え発現レベルについて試験した。配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質は、この試行により得られるタンパク質である。これは、ヒトで使用するための薬物候補である。
【０１１３】
配列番号３１からなる組み換え結合タンパク質であるタンパク質＃３１は、タンパク質＃２１からなるタンパク質及びＮ末端の配列番号１のアミノ酸に相当する。
【０１１４】
実施例５：配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質によるＨＥＲ２の高親和性結合。
【０１１５】
タンパク質＃２１−Ｈｉｓを発現させ、実施例１に記載のように精製した。ＨＥＲ２に対するその親和性は、国際公開第２０１４／０８３２０８号に記載されているように、表面プラズモン共鳴によって評価した。異なる濃度で得られた共鳴単位の値を、当業者に周知の方法でグローバルフィッティングすることにより、２７ｐＭの解離定数を決定した。比較すると、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの別の組み合わせを含む、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ（実施例１を参照されたい）は、６４ｐＭの解離定数を示した。同様に、配列番号１６及び１７に対応する設計されたアンキリンリピートドメインの組み合わせは、国際公開第２０１４／０８３２０８号から既知のＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインに基づいて生成された組み合わせのほとんどよりも良好な解離定数を示した。
【０１１６】
表面プラズモン共鳴測定により、配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質は、ＨＥＲ３又はＥＧＦＲの細胞外ドメインとは相互作用しないことも更に示された。
【０１１７】
表面プラズモン共鳴測定により、配列番号１６又は１７からなる設計されたアンキリンリピートドメイン（それぞれＮ末端に配列番号１を更に含む）は、それぞれＨＥＲ２結合について９ｐＭ及び１５２ｐＭの解離定数を示すことが示された。
【０１１８】
表面プラズモン共鳴実験は、タンパク質＃２１がヒトＨＥＲ２及びヒト血清アルブミンに同時に結合することができることを更に示した。
【０１１９】
表面プラズモン共鳴実験は、１００ｎＭのタンパク質＃２１が、２１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でヒト血清アルブミンに結合することを更に示した。
【０１２０】
実施例６：配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質による細胞に対する高効力及び高度のアポトーシス誘導
タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びタンパク質＃２３−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。ＢＴ４７４細胞の増殖に対する組み換え結合タンパク質の効果は、ＢｒｄＵ−ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＢｒｄＵ、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）を使用してＤＮＡ合成を測定することによって判定した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートにて、１ウェルあたり１００００個のＢＴ４７４細胞を１００μＬの完全培地に蒔き、２４時間インキュベートした。組み換え結合タンパク質又は対照を添加し更に７２時間おいた。細胞標識用ＢｒｄＵを添加し、最後に２４時間おいた。製造プロトコルに従って、標識した（増殖している）細胞を検出した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを使用してデータを分析して、ｙ軸のＯＤ４５０〜６０２ｎｍに対し、ｘ軸にｌｏｇ［ｃ］をプロットした。ＩＣ50値を導出する非線形回帰のフィッティング（ｌｏｇ（アンタゴニスト）対応答−可変勾配（４つのパラメータ））を使用してデータをフィッティングさせた。結果を図３に示す。タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、見かけ上のＩＣ５０値が１．５ｎＭであるＢＴ４７４細胞の増殖を阻害する。タンパク質＃２３−Ｈｉｓでは、ＩＣ50が６０％高い（すなわち、悪い）２．４ｎＭが観察されたことから、組み換え結合タンパク質中に配列番号１８及び１７を有するよりも、配列番号１６及び１７を有する方が望ましいことが示唆される。同様にして、配列番号１６及び１７に対応する設計されたアンキリンリピートドメインの組み合せは、国際公開第２０１４／０８３２０８号より既知の、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを元に生成された組み合せのほとんどで観察されるよりも低い見かけ上のＩＣ50値で、ＢＴ４７４細胞を阻害した。
【０１２１】
配列番号２１（タンパク質＃２１）からなる組み換え結合タンパク質は、細胞株ＳＫＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＺＲ−７５−３０、ＨＣＣ１４１９、又はＭＤＡ−ＭＢ１７５を含む様々な癌細胞株に対して、強力な増殖阻害を更に示した。
【０１２２】
カスパーゼ３／７−Ｇｌｏシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してカスパーゼ３／７活性化を測定することによって、タンパク質＃２１によるアポトーシスの誘導を測定した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートにて、１ウェルあたり１００００個のＢＴ４７４細胞を１００μＬの完全培地に蒔き、２４時間インキュベートした。タンパク質＃２１及びベンチマークを添加し更に２４時間おいた。製造元のプロトコルに従って、カスパーゼＧｌｏ試薬を添加して１時間おいた。ルシフェラーゼ活性を測定することにより、カスパーゼ３／７活性化をモニターした。あるいは、アポトーシス検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳシステム（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてアポトーシスの誘導を判定した。アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。細胞数及びインキュベート時間は、カスパーゼＧｌｏの読み出しと同様とした。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを使用して、ｘ軸上のＯＤ４０５／４９０ｎｍに対する濃度をプロットし、又はｙ軸上の相対光単位（ＲＬＵ；Ｔｅｃａｎ  Ｍ−１０００リーダーで測定）をプロットして、データを分析した。非線形回帰のフィッティング（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−可変勾配（４つのパラメータ））を使用してデータをフィッティングした。結果を図７に示す。タンパク質＃２１については、２．４ｎＭのＥＣ５０が観察された。アポトーシスは、細胞株ＳＫＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＺＲ−７５−３０、ＨＣＣ１４１９、又はＭＤＡ−ＭＢ１７５のアポトーシスを誘導する際に同様に高い効力を示す。対照的に、抗体トラスツズマブ、ペルツズマブ、又はトラスツズマブとペルツズマブとの混合物は、ＢＴ４７４細胞においてアポトーシスを誘導しなかった（図７）。
【０１２３】
重要なことに、これらのアッセイは、配列番号３２が配列番号１４により隣接されているタンパク質＃２１は、配列番号３２を単独で使用する場合と同様、細胞に対し高い効力を示すことを示す。
【０１２４】
実施例７：マウス腫瘍異種移植モデルにおける、配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質の高活性
タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ、タンパク質＃２４−Ｈｉｓ、タンパク質＃２５−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。試験において、タンパク質＃２１−Ｈｉｓをトラスツズマブ及びＰＢＳと比較した。結果を図４ａに示す。ＢＴ４７４乳癌腫瘍異種移植マウスモデルは、当業者に周知の手順を用いて原則的に以下のように実施した。ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞を培養し、再懸濁し、マウス１匹あたり２*１０7個の細胞を、５０：５０でマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地で、雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス各個体の右脇腹に注入した。約２００〜３００ｍｍ3の腫瘍体積で、マウスを８匹ずつの群に無作為に割り付け、ＰＢＳ、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びペルツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はタンパク質＃２１−Ｈｉｓ（３５ｍｇ／ｋｇ）を３日間隔で７回静脈投与（Ｑ３Ｄｘ７）して腫瘍の治療を開始した。腫瘍体積を３２日間測定した。タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、トラスツズマブよりも腫瘍成長を阻害するのに有効である。
【０１２５】
ＢＴ４７４細胞（同一の設定及び手順；全て３５ｍｇ／ｋｇ用量）を使用した同様の試験において、タンパク質＃２１−Ｈｉｓを、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ、タンパク質＃２４−Ｈｉｓ、及びタンパク質＃２５−Ｈｉｓと比較した。処置の１８日後の結果を図４ｂに示す。重要なことに、タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ、タンパク質＃２４−Ｈｉｓ、又はタンパク質＃２５−Ｈｉｓよりも腫瘍を抑制するのに有効である。
【０１２６】
更に、実施例１に記載のようにタンパク質＃２１を発現させ、精製した。ＰＢＳ、タンパク質＃２１（６０ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ペルツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、並びにトラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせ（それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ）を、当業者に周知の患者由来の胃癌腫瘍異種移植マウスモデルで使用した。全ての群に３日毎に６回投与した。簡潔に述べると、ヌードマウスにおいて異種移植片を連続継代して腫瘍断片を得た。ドナーマウスから摘出した後、皮下移植のために腫瘍を断片（直径４〜５ｍｍ）に細断した。腫瘍が約１００〜１２０ｍｍ3の体積に達したときにマウスを各群に無作為に割り付けた。無作為に割り付け、治療を開始した日を、各試験において０日目として設定する。無作為に割り付けた日、及び週に２回、キャリパーを用いた２次元測定により腫瘍の成長をモニターした。第ｘ日目（Ｔｘ）における各腫瘍体積を第０日目の同一腫瘍の各体積で除算したものに１００％を乗じて、Ｘ日目の個々の腫瘍（個々のＲＴＶ）の相対体積を計算した。試験対対照群の中央ＲＴＶ値の比に１００％を乗じて、特定の日の腫瘍阻害率（Ｔ／Ｃ％）を計算した。図４ｃは、トラスツズマブ、及びトラスツズマブとペルツズマブとの組み合わせと比較した胃癌ＰＤＸモデルＧＸＡ３０３９におけるタンパク質＃２１の効果を示す。タンパク質＃２１は、トラスツズマブとペルツズマブとの組み合わせと同様に、腫瘍成長の強力な阻害を示した一方、トラスツズマブ単独は有効性が低い。図４ｄは、タンパク質＃２１と、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブとペルツズマブとの組み合わせとを比較する同じモデルにおける第２の試験を示す。タンパク質＃２１は、トラスツズマブとペルツズマブとの組み合わせと同様に、腫瘍成長の強力な阻害を示した。トラスツズマブ単独及びペルツズマブ単独は、効果が有意に低い。これは、腫瘍モデルが時間の経過と共にトラスツズマブ耐性を獲得し得ることを示す。これは次に、トラスツズマブ耐性癌においてもタンパク質＃２１が有効であることを示唆している。
【０１２７】
同様の実験では、タンパク質＃２１を、当業者に周知の胃癌ＰＤＸマウスモデルＧＸＡ２８１において、ラパチニブによる標準治療と比較して更に試験した（図４ｅ）。簡潔に述べると、腫瘍移植及び腫瘍成長のモニターは、上記のように行った。ラパチニブを、１００ｍｇ／ｋｇ／日で２１日間毎日静注し、タンパク質＃２１を、４０ｍｇ／ｋｇで３日おきに６回静注した。
【０１２８】
本実施例のこれらの実験は、疾患の治療における薬剤として使用する際の、配列番号２１を含むタンパク質の有用性を例示する。
【０１２９】
実施例８：配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質の、マウスにおける望ましい薬物動態特性
この実施例に示される測定値は、実施例１１に記載する半減期を操作しようとする試行の結果である。タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びタンパク質＃２３−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質の薬物動態特性は、他の文献に記載されるとおり、マウスにおいて評価した（Ｚａｈｎｄ，Ｃ．，Ｋａｗｅ，Ｍ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，ｄｅ  Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｃ．，Ｔａｍａｓｋｏｖｉｃ，Ｒ．，Ｎａｇｙ−Ｄａｖｉｄｅｏ  Ｓｃｕ，Ｇ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ，Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ｒ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｗａｉｂｅｌ，Ｒ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，１５９５〜１６０５，２０１０）。結果を図５に示す。タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、３０．４時間の終末相半減期を示し、４８時間後に残留しているＩＤは１９．５％であった。比較として、タンパク質＃２３−Ｈｉｓは、２４．７時間の終末相半減期を示し、４８時間後に残留しているＩＤは６．５％であった。組み換え結合タンパク質中に配列番号１６を存在させることが、配列番号１８を存在させるよりも、より好ましいことを示している。
【０１３０】
実施例９：配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質の、カニクイザルにおける望ましい薬物動態特性
この実施例に示される測定値は、実施例１１に記載する半減期を操作しようとする試行の結果である。タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、タンパク質＃２３−Ｈｉｓ、及びタンパク質＃２４−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。タンパク質の薬物動態特性をカニクイザルで評価した。１ｍｇ／ｋｇ相互間の標的用量レベルで３０分間静脈内注入することによりタンパク質をカニクイザルに投与した。血液サンプルを、タンパク質の注入前に採取し、かつ選択した時点、例えば、注入完了から（すなわち注入後）５分、１０分、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、及び２４０時間の終了後（すなわち、注入後）で再度採取した。血液試料を室温に放置し、遠心分離して血清を生成させた後、分析まで−８０℃で保存した。薬物動態パラメータは、当業者に周知の手順を使用して測定した。タンパク質の血清中濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、設計されたアンキリンリピートドメインに対するウサギモノクローナル抗体を捕捉試薬とし、かつ設計されたアンキリンリピートドメインに対するマウスモノクローナル抗体を検出試薬として使用し、標準曲線を用いて測定した。薬物動態パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＵＳＡ））又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））等の標準的なソフトフェア及び非コンパートメント解析等の標準的な解析を使用して測定した。タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びタンパク質＃２３−Ｈｉｓについての結果を図６に示す。タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、４７時間の終末相半減期を示したのに対し、タンパク質＃２３−Ｈｉｓは３５時間の終末相半減期を示し、タンパク質＃２４−Ｈｉｓは、４５時間の終末相半減期を示した。タンパク質はまた、濃度が１００ｎＭ未満になると、有意な標的介在性のクリアランスを示す。標的介在性のクリアランスは当業者に周知であり、例えば、ＨＥＲ２を標的とする抗体から知られている。
【０１３１】
同様に、タンパク質＃２１−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。タンパク質の薬物動態特性を、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで上記のようにカニクイザルにおいて評価した。薬物動態パラメータを上記のように評価し、結果を図６に示す。１ｍｇ／ｋｇにて４７時間から、５ｍｇ／ｋｇにて１００時間、１０ｍｇ／ｋｇにて１００時間超という、終末相半減期の用量依存的な延長が観察された。濃度が１００ｎＭ未満になると、標的介在性のクリアランスが観察される。
【０１３２】
タンパク質＃２１（実施例１に記載のように発現させ、精製したもの）を試験する際に、同様の結果が観察される。タンパク質の薬物動態特性は、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇで上記のようにカニクイザルにおいて評価される。薬物動態パラメータは、上記のように評価する。終末相半減期の用量依存的延長が観察される。タンパク質＃２１については、カニクイザルにおいて１００ｍｇ／ｋｇの用量で、１０９．５時間又は１３０．６時間の終末相半減期が観察された。
【０１３３】
実施例１０：ポリペプチドリンカーの選択による薬物特性の改善
タンパク質ドメインを連結させるポリペプチドリンカーは、当業者に周知である。Ｇｌｙ−Ｓｅｒリッチリンカーは、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントから周知であり、ここで、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリッチリンカーは、２つのＦｖポリペプチド鎖を連結させるのに最も適するものであることが証明されている。驚くべきことに、本発明者らは、Ｐｒｏ−Ｔｈｒリッチリンカーが、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインと、を含む、組み換え結合タンパク質の薬物動態特性に対し、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリッチリンカーと比較して正の影響を及ぼすことを見出した。タンパク質＃２６−Ｈｉｓ及びタンパク質＃２７−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。マウスにおける薬物動態試験は、実施例８に記載のように実施した。タンパク質＃２７−Ｈｉｓは、静脈内注射から４８時間後に、注入した用量の７％が残留していたのに対し、タンパク質＃２６−Ｈｉｓでは注入した用量の５．３％しか残留していなかった。同様に、タンパク質＃２７−Ｈｉｓは、タンパク質＃２６−Ｈｉｓよりも長い終末相半減期を示した。
【０１３４】
実施例１１：薬物動態特性の操作
ＰＥＧ化、ポリペプチド伸長、Ｆｃ融合、血清アルブミン融合、及び血清アルブミンへの結合を含む、薬物動態工学のための多くの選択肢が当該技術分野において既知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ（Ｅｄ．））「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅｉｒ  ｐｌａｓｍａ  ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ」，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２０１２，ＩＳＢＮ  ９７８−３−５２７−３２８４９−９）。例えば、配列番号１６及び１７を含むＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの組み合わせから出発して、薬剤候補となる可能性のある数百もの多様体が存在している（その他の態様の中でも、薬物動態を変更する操作の選択、ポリペプチドリンカーの選択（例えば、中でも配列番号２〜９））。本発明者らは、配列番号１４からなる血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインの使用（実施例２及び３を参照のこと）、並びにＰｒｏ−Ｔｈｒリッチのポリペプチドリンカー（配列番号９）の使用により、結果として、配列番号２１の有益な薬物動態特性が達成されることを見出した。これは、試験した他の形式よりも明らかな利点を有する。ポリペプチドリンカーの選択による効果についての結果を、例えば実施例１０に示す。タンパク質＃２９−Ｈｉｓ及びタンパク質＃３０−Ｈｉｓのマウス薬物動態プロファイルの比較により、驚くべきことに、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを有することには、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートタンパク質を１つのみ有することと比較して利益があることが明らかになる（図５を参照されたい）。アルブミン結合ドメインについての文献では、分子中に存在するアルブミン結合ドメインを２つ有していても、存在するアルブミン結合ドメインが１つのみである場合と比較して薬物動態特性に何ら有益さを提供しないことが示されている（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。同様に、タンパク質＃２１（配列番号２１からなる組み換え結合タンパク質）を、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたＣ末端アンキリンリピートドメインが欠損している（配列番号２１のアミノ酸１〜４２２、タンパク質＃３３が得られる）タンパク質＃２１多様体と比較すると、タンパク質＃２１では、薬物動態特性の顕著な改善、特に終末相半減期の延長が示された。用量５ｍｇ／ｋｇにて、カニクイザルにおいて、タンパク質＃２１の薬物動態プロファイルを、ＰＥＧ化タンパク質＃２８（ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計された同じアンキリンリピートドメイン（配列番号１６及び１７）を含むが、タンパク質＃２８は、血清アルブミンに対し結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインの代わりに４０ｋＤＡのＰＥＧ部分を含む）と比較すると、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを含むタンパク質は、薬物動態特性が顕著に改善されていることが示される。実施例９に記載されるように、タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びタン��ク質＃２４−Ｈｉｓの薬物動態プロファイルの比較により、配列番号１６及び１７に隣接する、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリンリピートドメインを有することは、それらのいずれをもＮ末端に有する場合よりも好ましいことが明らかになる（図６を参照されたい）。
【０１３５】
この実施例の研究に関して、タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、タンパク質＃２４−Ｈｉｓ、タンパク質＃２８−Ｈｉｓ、タンパク質＃２９−Ｈｉｓ、及びタンパク質＃３０−Ｈｉｓを実施例１に従って調製した。タンパク質＃２８−Ｈｉｓは、４０ｋＤａのＰＥＧ部分（ＮＯＦ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＬ２−４００ＭＡ）を使用して、ＰＥＧ部分をタンパク質＃２８−Ｈｉｓの遊離Ｃ末端システインにマレイミド結合して、続いて標準精製法（手順は当業者に周知のものである）を用いて均質に精製することにより、更にＰＥＧ化した。マウス又はカニクイザルにおける薬物動態分析は、実施例８及び９に記載のように実施した。
【０１３６】
実施例１２：配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質は、配列番号２４を含む組み換え結合タンパク質と比較して、より良好なｉｎ  ｖｉｖｏ力価を示す
タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びタンパク質＃２４−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。マウス異種移植片試験を実施例７に記載のように行った。結果を図４ｂに示す。処置の３２日後、タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、タンパク質＃２４−Ｈｉｓよりも有意に良好な腫瘍抑制を示す。これにより、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインが隣接している、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを有すること（配列番号２１に見られるとおり）は、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインの両方のＮ末端に血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインを有すること（配列番号２４に見られるとおり）よりも、望ましいことが示される。
【０１３７】
実施例１３：大腸菌における高い組み換え発現収率
タンパク質＃２１、タンパク質＃２３、及びタンパク質＃２５をコードする配列を標準的なＴ７プロモータベクターにクローニングし、タンパク質を大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）で発現させた。タンパク質＃２１については、力価４．４ｇ／Ｌが達成されたのに対し、タンパク質＃２３は１．９ｇ／Ｌの力価を示し、タンパク質＃２５は、２．１ｇ／Ｌの力価を示したことから、タンパク質＃２１の発現が最良であることが示された。驚くべきことに、タンパク質＃２１において使用される、設計されたアンキリンリピートドメインの配置により、同じ構成成分（設計されたアンキリンリピートドメイン及びポリペプチドリンカー）が使用されているのにもかかわらず、例えばタンパク質＃２５に使用される別の配置に関して観察されるものよりも高い組み換え体の発現をもたらす。興味深いことに、配列番号１６及び１７に対応する設計されたアンキリンリピートドメインの組み合わせは、国際公開第２０１４／０８３２０８号から既知のＨＥＲ２に対する結合特異性を有する設計されたアンキリンリピートドメインに基づいて生成されたほとんどの組み合わせよりも、良好な組み換えタンパク質発現を示した。
【０１３８】
実施例１４：タンパク質＃２１による、２つの血清アルブミン分子の同時結合
タンパク質＃２１を、実施例１に記載のように発現させ、精製した。静的光散乱（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｗｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔｒｅｘ（ＲＩ）及びＭｉｎｉＤａｗｎＴｒｅｏｓ（ＭＡＬＳ））に連結したサイズ排除クロマトグラフィーを、３０μＭのタンパク質＃２１、６０μＭのヒト血清アルブミン（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ２０％溶液を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、ヒト血清アルブミンのモノマー画分を精製した）、又はこれら２つの１：２混合物とをＰＢＳ中で使用して実施した。
【０１３９】
タンパク質＃２１をモノマーピークとして溶出し、分子量が６５．２ｋＤａであることをＭＡＬＳで決定した。この分子量は、その理論分子量の１．２ｋＤａ以内（６６４３７Ｄａ）である。血清アルブミンは、５５．１ｋＤａのモノマーピーク（理論分子量５８９１７Ｄａ）として溶出した。２分子の１：２混合物（モル比）では、１：２複合体（理論分子量：１９１．８ｋＤａ）並びに１：１複合体（１３２．８ｋＤａ）に相当する分子量の種を含む、平均分子量１６９．８ｋＤａ（範囲：１８６．２ｋＤａ〜１３６．６ｋＤａ）の主ピークが得られる。加えて、実験で使用される６．５％の血清アルブミンに対応する、遊離血清アルブミンの小さなピークが検出された。遊離タンパク質＃２１に対応する分子量を含むピークは検出されなかった。これらの結果は、タンパク質＃２１が２つの血清アルブミン分子に同時に結合することができることを示す。
【０１４０】
実施例１５：タンパク質＃２１の高い熱安定性
タンパク質＃２１を、実施例１に記載のように発現させ、精製した。窒素雰囲気（３Ｌ／分）でＪａｓｃｏ  Ｊ−８１５  ＣＤ分光計を用いて、円偏光二色性により熱安定性を評価した。溶液中温度制御センサを有する１１７．１００Ｆ−ＱＳキュベット（Ｈｅｌｌｍａ，ｄ＝１ｃｍ）において、ＰＢＳ中０．４μＭのタンパク質＃２１を測定し、２０℃〜９５℃で加熱した（４５℃未満：＋３℃／分；４５℃超：＋１℃／分にて、２２２ｎｍでシグナルを記録、９５℃で１分間の遅延後、冷却相（加熱相と比較して反転されたプログラム））。ＣＤ信号を、単位ｄｅｇ・ｃｍ2／ｄｍｏｌ-1で平均残基楕円率（ＭＲＥ）に対し正規化した。加えて、遠紫外ＣＤスペクトルを記録した。
【０１４１】
タンパク質＃２１は、２０８ｎｍ及び２２２ｎｍにて特徴的な最小値を有するα−ヘリカルなタンパク質に典型的なＣＤスペクトルを示す。タンパク質＃２１は、安定したベースライン（傾きの変化なし）の後に高い熱安定性を示し、２２２ｎｍのシグナルの消失は、７８℃超で検出される。
【０１４２】
実施例１６：ホスホプロテオームに対するタンパク質＃２１の影響
タンパク質＃２１を、実施例１に記載のように発現させ、精製した。ＢＴ４７４又はＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、タンパク質＃２１（１００ｎＭ）、トラスツズマブ（１００ｎＭ）、ペルツズマブ（１００ｎＭ）、トラスツズマブ（１００ｎＭ）とペルツズマブ（１００ｎＭ）との混合物、又はＰＢＳのいずれかで１８時間処理した。Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｄ．，Ｚｅｎ，Ｙ．，Ｑｕａｇｌｉａ，Ａ．，Ｓｅｌｚｅｒ，Ｓ．，Ｍｉｔｒａ，Ｖｌ．，Ｌｏｓｓｎｅｒ，Ｃ．，Ｊｕｎｇ，Ｓ．，Ｂｏｈｍ，Ｇ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ｐ．，Ｐｒｅｆｏｔ，Ｐ．，Ｈｏｅｈｌｅ，Ｃ．，Ｋｏｎｃａｒｅｖｉｃ，Ｓ．，Ｇｅｅ，Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｒ．，Ｗａｒｄ，Ｍ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ，Ｌ．，Ｓｔｅｂｂｉｎｇ，Ｊ．，Ｚｕｃｈｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｓａｒｋｅｒ，Ｄ．，Ｈｅａｔｏｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｐｉｋｅ，Ｉ．，２０１４．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ９（３），ｅ９０９４８）により記載されるとおり、細胞に対しホスホプロテオーム質量分析を行った。分析により、タンパク質＃２１による細胞処理により、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びこれらの両方の組み合わせと比較して、複数のリン酸化ペプチドを差次的に調節することが明らかとなる。結果を表１に示す。重要なことに、タンパク質＃２１は、ＨＥＲ２の部位１０７３／１０７８／１０８３、１１３９／１１５１、１１７２／１１７４、１１７４、及び１２４０でのリン酸化を強力に阻害するという点で、トラスツズマブ、ペルツズマブ、並びにトラスツズマブとペルツズマブとの混合物に対して、ある程度顕著な差異を示す。他のリン酸化部位では、リン酸化が増加する（７７２）。ＨＥＲ２の下流では、ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードの特定のメンバーは、タンパク質＃２１で処置する場合、差次的に制御されることが判明した。例えば、Ｓ６キナーゼ（Ｓ４４１／Ｔ４４４／Ｓ４４７）のリンペプチドは、ＰＢＳに対して０．６３倍ダウンレギュレーションされたが、これと比較して他の群で示されたダウンレギュレーションは、わずか０．８８倍の範囲であった。更に、ＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ３にマッピングされるリン酸化ペプチドは、大幅にダウンレギュレーションされた。
【０１４３】
同じサンプルをＡＫＴ−Ｓ４７３についてのリン酸化部位特異的ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ：ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）リン酸化−Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）サンドイッチＥＬＩＳＡキット＃７１６０）による分析により、タンパク質＃２１では、ＰＢＳに対しての０．１６倍のダウンレギュレーションが示されたが、これと比較して他の群で示されたダウンレギュレーションは、わずか０．３〜０．７倍の範囲であった。ＥＬＩＳＡの結果を表２に示す。
【０１４４】
これらの結果は、タンパク質＃２１が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びそれらの両方の組み合わせと比較して、ＨＥＲ２下流のシグナル伝達を差次的に調節することを示す。細胞生存のための重要な経路であるＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路において最大の差異が見られ、これにより、タンパク質＃２１がアポトーシスを誘導する理由が説明される。ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）経路は、アポトーシスを遮断することによって細胞生存を維持する重要な経路の１つであると考えられる。したがって、例えばＨＥＲ２／ＨＥＲ３−ヘテロ二量体化によるその病理学的活性化は、悪性増殖をもたらし得る。
【０１４５】
この実験では、ＢＴ４７４細胞及びＮＣＩ−Ｎ８７細胞をタンパク質＃２１に曝露することで、それぞれＰＢＳのみに曝露した場合と比較して、Ｆｏｘ３ａタンパク質の細胞レベルが１．８８及び２．８倍増加したことが更に観察された。ＢＴ４７４細胞及びＮＣＩ−Ｎ８７細胞におけるＦｏｘｏ３ａタンパク質レベルの対応する増加は、トラスツズマブへの曝露によりそれぞれ１．１４倍及び１．３２倍であり、ペルツズマブへの曝露によりそれぞれ１．２１及び１．２５倍であり、トラスツズマブ及びペルツズマブへの曝露によりそれぞれ１．２８及び１．１９倍であった。したがって、タンパク質＃２１は、トラスツズマブ若しくはペルツズマブ又はそれらの両方の組み合わせと比較して、Ｆｏｘｏ３ａタンパク質の細胞レベルをはるかに高いレベルに増加させる。Ａｋｔ１がＦｏｘ３ａをリン酸化することでＦｏｘ３ａが分解され、細胞の生存が促進されることが、当業者に既知である。Ａｋｔリン酸化の阻害は、Ｆｏｘｏ３ａの安定化につながり、したがってＦｏｘｏ３ａレベルが増加する。増加したレベルにて、Ｆｏｘｏ３ａは核に移動し、アポトーシスを誘導することができる。
【０１４６】
【表１】
2019531093.tif 000002
【０１４７】
【表２】
2019531093.tif 000003
【０１４８】
実施例１７：治療を改良するために配列番号２１を含む組み換え結合タンパク質を使用する併用療法
タンパク質＃２１及びタンパク質＃２１−Ｈｉｓを、実施例１に記載のように発現させ、精製した。当業者に周知の標準ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを実施した。簡潔に述べると、タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、他の化合物、又は他の化合物と組み合わせたタンパク質＃２１−Ｈｉｓの細胞増殖における効果を、ＢｒｄＵ−ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＢｒｄＵ、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）を使用してＤＮＡ合成を測定することによって決定した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートにて、１ウェルあたり１００００個の細胞を１００μＬの完全培地に蒔き、２４時間インキュベートした。タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及び／又は化合物を添加し更に７２時間おいた。細胞標識用ＢｒｄＵを添加し、最後に２４時間おいた。製造元のプロトコルに従って、標識した（増殖させた）細胞を検出した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェア（ｌｏｇ［ｃ］対ＯＤ４５０〜６０２ｎｍのプロット）を使用して分析した。非線形回帰のフィッティング（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−可変勾配（４つのパラメータ））を使用してデータをフィッティングした。
【０１４９】
タンパク質＃２１−Ｈｉｓとエリブリンとの組み合わせ、微小管阻害剤：タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、エリブリン、又はタンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びエリブリンの組み合わせを、ＢＴ４７４細胞及びＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞の増殖を阻害する能力について試験した。エリブリンは、タンパク質＃２１−Ｈｉｓの準最適濃度（ＢＴ４７４では２ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ１７５では４ｎＭ）の最高濃度である１’０００ｎＭで滴定を開始した。両方の分子を組み合わせたものは、両方の細胞株においてエリブリン単剤よりも優れていた。エリブリンは、単剤としてはＢＴ４７４細胞に対して活性ではなかったが、タンパク質＃２１−Ｈｉｓと組み合わせたときに強力な阻害を示した。エリブリンは、ＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞に対しては非常に低い効力を示したが、タンパク質＃２１−Ｈｉｓと組み合わせた場合には改善された。ＩＣ50値を表３に示す。これらのデータは、タンパク質＃２１−Ｈｉｓをエリブリンと組み合わせて、その活性を増強することができることを示す。
【０１５０】
タンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びＧＤＣ−０９４１、ｐＩ３Ｋ阻害剤の組み合わせ：タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、ＧＤＣ−０９４１、又はタンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びＧＤＣ−０９４１の組み合わせを、ＢＴ４７４細胞及びＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞の増殖を阻害する能力について試験した。ＧＤＣ−０９４１は、タンパク質＃２１−Ｈｉｓの準最適濃度（ＢＴ４７４では２ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ１７５では４ｎＭ）の最高濃度である２０’０００ｎＭで滴定を開始した。両方の分子を組み合わせたものは、両方の細胞株において、ＧＤＣ−０９４１単剤よりも優れていた。ＧＤＣ−０９４１は、単剤でも活性を示したが、効力は、タンパク質＃２１−Ｈｉｓと組み合わせることで増加した。ＢＴ４７４中でＧＤＣ−０９４１の効力は強く増加し、相乗効果を示唆した。同様に、タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、ＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞におけるＧＤＣ−０９４１の効力を増加させ、この効果は明らかに相加的であった。ＩＣ50値を表３に示す。これらのデータは、タンパク質＃２１−ＨｉｓをＧＤＣ−０９４１と組み合わせて、その活性を増強することができることを示す。
【０１５１】
タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、エベロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤の組み合わせ：タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、エベロリムス、又はタンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びエベロリムスの組み合わせを、ＢＴ４７４細胞及びＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞の増殖を阻害する能力について試験した。エベロリムスは、タンパク質＃２１−Ｈｉｓの準最適濃度（ＢＴ４７４では２ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ１７５では４ｎＭ）の最高濃度である１ｍＭで滴定を開始した。両方の分子を組み合わせたものは、両方の細胞株において、エベロリムス単剤よりも優れていた。エベロリムスは、単剤でも活性を示したが、効力は、タンパク質＃２１−Ｈｉｓと組み合わせることで増加した。ＢＴ４７４細胞中でエベロリムスの効力は強く増加し、相乗効果を示唆した。同様に、タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、ＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞におけるエベリムスの効力を増加させ、この効果は明らかに相加的であった。ＩＣ50値を表３に示す。これらのデータは、タンパク質＃２１−Ｈｉｓをエベリムスと組み合わせて、その活性を増強することができることを示す。
【０１５２】
タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、ラパチニブ、及びｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤の組み合わせ：タンパク質＃２１−Ｈｉｓ、ラパチニブ、又はタンパク質＃２１−Ｈｉｓ及びラパチニブの組み合わせを、ＢＴ４７４細胞及びＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞の増殖を阻害する能力について試験した。ラパチニブは、タンパク質＃２１−Ｈｉｓの準最適濃度（ＢＴ４７４では２ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ１７５では４ｎＭ）の最高濃度である１００００ｎＭで滴定を開始した。両方の分子を組み合わせたものは、両方の細胞株において、ラパチニブ単剤よりも優れていた。ラパチニブは、単剤でも活性を示したが、効力は、タンパク質＃２１−Ｈｉｓと組み合わせることで増加した。ＢＴ４７４細胞におけるラパチニブの効力は強く増加し、相乗効果を示唆した。同様に、タンパク質＃２１−Ｈｉｓは、ＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞におけるラパチニブの効力を増加させ、この効果は明らかに相加的であった。ＩＣ50値を表３に示す。これらのデータは、タンパク質＃２１−Ｈｉｓをラパチニブと組み合わせて、その活性を増強することができることを示す。
【０１５３】
タンパク質＃２１とトラスツズマブとの組み合わせ：タンパク質＃２１、トラスツズマブ、又はタンパク質＃２１とトラスツズマブとの組み合わせを、ＢＴ４７４細胞及びＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞の増殖を阻害する能力について試験した。トラスツズマブは、タンパク質＃２１の準最適濃度（ＢＴ４７４では１ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ１７５では１０ｎＭ）の最高濃度である１００ｎＭで滴定を開始した。両方の分子を組み合わせたものは、両方の細胞株において、トラスツズマブ単剤よりも優れていた。トラスツズマブは、単剤では限られた活性のみを示し、細胞増殖の停止のみを誘導するが、アポトーシスは誘導しないのに対し、タンパク質＃２１はアポトーシスを誘導する。準最適濃度のタンパク質＃２１をトラスツズマブと組み合わせることで、増殖は阻害された。これにより、両方の分子を組み合わせることができ、かつタンパク質＃２１がトラスツズマブの活性を増強することを示す。組み合わせの効果はまた、一定濃度のトラスツズマブ（５０ｎＭ）の最高濃度でタンパク質＃２１を滴定することによっても確認することができる。
【０１５４】
同様に、タンパク質＃２１とアピトリシブ、タセリシブ、アルペリシブ、パルボシクリブ、トラメチニブ、コビメチニブ、又はサリラシブとの組み合わせは、タンパク質＃２１単独又はアピトリシブ、タセリシブ、アルペリシブ、パルボシクリブ、トラメチニブ、コビメチニブ、又はサリラシブ単独のいずれかよりも、ＢＴ４７４細胞の増殖を阻害するのに効率的であった（表３を参照されたい）。アピトリシブ、タセリシブ、アルペリシブ、又はパルボシクリブを用いた実験では、タンパク質＃２１を２ｎＭで使用し、アピトリシブ、タセリシブ、アルペリシブ、又はパルボシクリブの濃度を滴定して、ＩＣ50値を決定した。トラメチニブ（１０-5Ｍ）、コビメチニブ（１０-5Ｍ）又はサリラシブ（３*１０-5Ｍ）を用いた実験では、タンパク質＃２１を滴定して、ＩＣ50値を決定した。
【０１５５】
要約すると、タンパク質＃２１又はタンパク質＃２１−Ｈｉｓは、ＨＥＲ２を過剰発現している細胞に対するそれらの増殖阻害効果を増強するために、いくつかのクラスの乳癌標準治療薬と組み合わせることができる。これは、効果を増強すること及び／又は毒性を低減する標準治療の用量を低減するという、臨床的可能性を示す。
【０１５６】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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