(57)【要約】  本発明は、対象における少なくとも１つのシトルリン化エピトープ：ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡの存在によって媒介される、ヒト対象における自己免疫疾患を治療するための方法に関し、本方法は、治療有効量の、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する抗体またはその特異的結合断片を投与することを含む。本発明のさらなる態様は、ヒトシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する、抗体またはその特異的結合断片を含む。
2019508415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡを含むＨＬＡ−ＤＲ４シトルリン化共有エピトープの存在によって媒介されるヒト対象における自己免疫疾患を治療するための方法であって、治療有効量の、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する抗体またはその特異的結合断片を、それを必要とする前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記自己免疫疾患が、炎症性関節炎、多発性硬化症、１型糖尿病、ライム病誘発性関節炎、関節リウマチ、ヒドララジン誘発性女性全身性エリテマトーデス、妊婦性類天疱瘡、落葉状天疱瘡、閉塞性肥大型心筋症、乾癬性関節炎、乾癬、ＩｇＡ腎症、「共有症候群」−全身性硬化症／関節リウマチ及びリウマチ性多発性筋痛症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、及びライム病誘発性関節炎である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、患者の白血球の表面上に存在するシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡの存在について最初にスクリーニングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡの存在が、患者のＢ細胞を用いて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者のＢ細胞上のシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡの存在が、前記患者のＢ細胞をモノクローナル抗体ＩＦ９と混和することと、モノクローナル抗体ＩＦ９と前記シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡとの間の特異的結合を測定することとによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
患者のＢ細胞上のシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡの存在が、フローサイトメトリーを用いて決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する前記抗体またはその特異的結合断片が、静脈内、皮下、または腹腔内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者がまた、抗炎症剤、化学療法剤、細胞傷害性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、小分子酵素阻害剤、もしくは受容体調節剤、またはこれらの組み合わせも投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＬＡ−ＤＲ４上に存在するヒトシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する抗体またはその特異的結合断片。
【請求項１２】
ヒトシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡに特異的に結合する、請求項１１に記載の抗体またはその特異的結合断片。
【請求項１３】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体またはその特異的結合断片。
【請求項１４】
ヒトシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡに特異的に結合する前記抗体またはその特異的結合断片が、モノクローナル抗体ＩＦ９、もしくはその抗原結合断片と表記される、請求項１３に記載の抗体またはその特異的結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本ＰＣＴ国際特許出願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮出願第６２／２９３，６２１号の利益を主張するものであり、この開示は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、抗シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４抗体またはその特異的結合断片を含む組成物、及びそれを使用するヒト対象における自己免疫疾患の治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、単核細胞、マクロファージ、樹状細胞及びＢリンパ球（Ｂ細胞）を含む免疫系の抗原提示細胞によって発現される細胞表面受容体のファミリーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子の機能は、「抗原提示」として既知のプロセスにおいて、小さな潜在的に抗原性のペプチドをＴリンパ球（Ｔ細胞）に提示することである。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体を用いて、ＭＨＣクラスＩＩとペプチドとの組み合わせを検討し、提示されたペプチドがホストプロテオームの正常な成分（自己）であるか、したがって無視することができるか、または提示されたペプチドがこれに関して「外来性」（非自己）であるかを決定する。ＭＨＣクラスＩＩによって提示された外来ペプチドの認識は、免疫応答を開始させ、すなわち、Ｔ細胞は、サイトカインの増殖及び産生によって応答し、外来ペプチドに遭遇したことのシグナルを抗原提示細胞に送り返す。
【０００４】
抗原が少量で存在するとき、最も効率的な抗原提示細胞はＢ細胞である。各Ｂ細胞は、抗体の表面結合形態である、特有の高親和性細胞表面受容体を発現する。この高親和性受容体を用いて、Ｂ細胞は、非常に低濃度で抗原を捕捉することができる。補捉された抗原は呑み込まれ、ペプチドに処理加工され、そしてこれらペプチドは、Ｔ細胞に提示するために、ＭＨＣクラスＩＩ分子に利用可能にされる。Ｔ細胞が、Ｂ細胞のＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドを認識する場合、これは、Ｂ細胞に対して、増殖して抗体産生細胞に分化するように命令する。このように産生された抗体は、インタクト抗原を捕捉した元々のＢ細胞表面受容体の高親和性抗原結合能を共有する。
【０００５】
個々のＭＨＣクラスＩＩのペプチドに結合し、それらをＴ細胞に提示するための能力は制限されており、全ての可能なペプチドが提示され得るわけではない。したがって、自然界は、各個体に、それぞれがわずかに異なるペプチドに結合しかつそれを提示することができ、これによって、総ペプチド結合能力の幅広さを拡張する、最大６つの異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を提供する。種レベルで、人間は、数十もの異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を産生するための遺伝的能力を有する。各個体が、最大で６つの異なる形態を発現するという事実と相まって、種内で可能なＭＨＣクラスＩＩ分子の非常に大きな多様性のために、２つの個体が６つのＭＨＣクラスＩＩ分子の同じセットを発現するということは非常に可能性が低い。これが、組織移植拒絶の根拠である。組織ドナーからのＭＨＣクラスＩＩ分子は、組織レシピエントのＴ細胞には外来性と見なされる。この「外来性」認識事象は、ドナー（異質）ＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合の不在下であっても発生する可能性があり、空の（ペプチドがない）ＭＨＣクラスＩＩ単独の認識は、不適合レシピエントにおける大部分のＴ細胞を活性化するのに十分なものである（同種抗原反応性）（１）。
【０００６】
ヒト関節リウマチ（ＲＡ）は自己免疫疾患であると一般的に考えられている。ＲＡに罹患している大部分の患者が、ＭＨＣクラスＩＩの１つの種類のＨＬＡ−ＤＲ４を発現することが長い間認識されている。ＨＬＡ−ＤＲ４は、ＨＬＡ−ＤＲ血清型であり、これは、類似の構造を共有する複数のＤＲＢ１＊０４遺伝子産物を含む。ＨＬＡ−ＤＲ４血清型のメンバーとしては、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０２、ＤＲＢ１＊０４０３、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０６、ＤＲＢ１＊０４０７、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０４１０、ＤＲＢ１＊０４１１、ＤＲＢ１＊０４１２、及びＤＲＢ１＊０４１３が挙げられるが、これらに限定されない。頻度は低いものの、ＨＬＡ−ＤＲ４よりはむしろ他のＭＨＣクラスＩＩ血清型（ＨＬＡ−ＤＲ１及びＨＬＡ−ＤＲ１４）が、ＲＡの患者で発現される。ＤＮＡ塩基配列決定技術の出現で、ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）のβ鎖中の５つのアミノ酸の並び（７０〜７４）が、ＲＡに対する感受性と最も強く関連するＨＬＡ−ＤＲ４の領域であることが発見された。多くの場合、５つのアミノ酸配列は、ＤＲＢ１＊０４０１中にあるような、グルタミン−リシン−アルギニン−アラニン−アラニン（ＱＫＲＡＡ）である。一部の場合、このアミノ酸配列は、わずかに異なり、ＱＲＲＡＡ（ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０１０１、及びＤＲＢ１＊０４０５において）、またはＲＲＲＡＡ（ＤＲＢ１＊１００１において）である。いずれの場合にも、７１位において正に帯電しているアミノ酸（ＫまたはＲ）及び７２位において正に帯電しているＲがある。この５つのアミノ酸の並びの発現を共有しないＤＲＢ１＊０４対立遺伝子は、ＲＡ感受性には関連していない。この「共有エピトープ」（ＳＥ）は、ほぼ全てのヒトＲＡ患者における共通因子であると思われる。その最も基本的な形態において、共有エピトープの仮説は、これらの５つの共通のアミノ酸が、ＲＡ患者において何とかして固有のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することを可能にすること、及びこのペプチド−ＭＨＣの組み合わせが、Ｔ細胞にとっては外来性と思われることを提案している。この関節炎性ペプチドの同定は、未だ決定されていない。
【０００７】
ＲＡ患者における免疫応答の別の固有特徴は、抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）の産生である。これらの抗体は、ＲＡ患者の約７０％で見られ、他の疾患または健常な個体ではめったに見られない。ＡＣＰＡの存在は、ＲＡについての信頼性の高い診断ツールになっている。シトルリン化は、アルギニン（Ｒ）の別のアミノ酸のシトルリン（Ｃｉｔ）への酵素的転換（脱イミノ化）である。タンパク質またはペプチドのシトルリン化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）ファミリーメンバーのＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ４によって媒介される。シトルリン化フィブリノゲン及びビメンチンを含むＡＣＰＡによって結合されるいくつかの天然に存在するシトルリン化タンパク質が特定されている。ＡＣＰＡがＲＡの病理に関与するかどうかは現在のところ未知である。これらの抗体の存在は、貯蔵血漿試料中で疾患の発症前に最長で１０年間見出されており、これらが直接的病原性ではないことを示唆している。
【０００８】
ＲＡと関連する遺伝子または遺伝子突然変異を探求する複数の遺伝子関連研究が公開されている。最も強く遺伝的に関連するものは、圧倒的にＨＬＡ−ＤＲ４β鎖（ＤＲＢ１＊０４０１）または他の共有エピトープ含有ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子である。ＰＡＤ４（ＰＡＤＩ４）をコード化する遺伝子を含む少数の他の遺伝子が複数の研究で関連付けられている。したがって、ＲＡ患者において、疾患は、１）特異的なＭＨＣクラスＩＩ分子、２）タンパク質をシトルリン化する酵素、及び３）抗シトルリン化タンパク質抗体産生と強い相関がある。これらの観測結果は、ほぼ１０年間の精力的な研究の焦点であった仮説の生成をもたらした。この仮説は、調節不全のＰＡＤ４が、通常は、免疫系によって外来性とは認識されない細胞外タンパク質（例えば、フィブリノゲンまたはビメンチン）をシトルリン化することを提案している。シトルリン化タンパク質は、シトルリン化タンパク質を認識する表面受容体を発現するＢ細胞によって捕捉され、摂取されて、ペプチドに処理加工される。処理加工されたペプチドのいくつかは、これらがかつてアルギニンを発現したシトルリン残基を含有し、この帯電したアミノ酸の喪失は、修飾ペプチドを、未修飾ペプチドが結合することができなかったＨＬＡ−ＤＲ４に結合することを可能にする。シトルリン化ペプチドは、Ｔ細胞に提示され、Ｔ細胞はこの組み合わせを外来性として認識し、抗原提示Ｂ細胞に抗シトルリン化タンパク質抗体を産生させるように指示する。
【０００９】
一部のシトルリン化ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲ４に、天然の非シトルリン化ペプチドよりも良好に結合することができることを実証するいくつかの研究が公開されている。他の研究は、シトルリン化ビメンチンまたはフィブリノゲンに由来するペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲ４によって提示されると、Ｔ細胞にサイトカインを産生させるか、または未修飾のペプチドに応答するＴ細胞よりもわずかに多く増殖させることができることを報告している。１つの研究室は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４を発現するように遺伝子操作を受けたマウスが、シトルリン化ヒトフィブリノゲンで免疫化されると、関節炎を発症し得ることを報告しているが、他の研究室は、これらの所見の再現が不可能なことを報告している。長年にわたる多くの研究にもかかわらず、ＨＬＡ−ＤＲ４によって提示されるとき、ヒトもしくはマウスにおいて関節炎を引き起こすか、またはＴ細胞における強力な増殖応答を生成することができる特異的なペプチドは特定されていない。したがって、元のペプチド提示仮説は、証明されていない。
【００１０】
ＨＬＡ−ＤＲ４共有エピトープのペプチド提示の役割を強力に支持するデータの不在下において、対立仮説が提示されている。Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚらは、Ｔ細胞へのペプチド提示とは独立して、共有エピトープの代替機能を定義した。彼らは、共有エピトープが、自然免疫の強力なメディエーターであるカルレティキュリンに直接結合することができることを報告し、この相互作用が、それ自体がシグナル伝達及び一酸化窒素の生成を活性化する炎症誘発であると仮定した。この提案された共有エピトープの役割は、Ｔ細胞へのペプチド提示から独立しているだけでなく、これはまた、シトルリン化、ＰＡＤ４、及びＡＣＡＰからも独立している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国仮出願第６２／２９３，６２１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、対象における少なくとも１つのシトルリン化エピトープ：ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡを有するＨＬＡ−ＤＲ４の存在によって媒介される、ヒト対象における自己免疫疾患、例えば、関節リウマチを治療するための方法を提供する。本方法は、治療有効量の、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する抗体またはその特異的結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１３】
第２の関連する態様では、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ４受容体タンパク質配列中に存在する、ヒトシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する、抗体またはその特異的結合断片を提供する。ヒトシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、もしくはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する、抗体またはその特異的結合断片は、ＨＬＡ−ＤＲ４受容体タンパク質配列中に存在するＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、またはＲＲＲＡＡペプチド配列には、実質的に結合しない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＲＡ患者において自己免疫応答を生成するためのＴ細胞を活性化するために、Ｂ細胞上のＨＬＡ−ＤＲ４受容体からのシトルリン化共有エピトープの提示についての提案された機構の概略図を描写する。
【図２】図２Ａは、様々な抗原：ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＲＡＡ）、シトルリン化ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＣｉｔＡＡ）、エノラーゼ、シトルリン化エノラーゼ、Ｈ３タンパク質及びシトルリン化Ｈ３タンパク質に対する単離された抗ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＣｉｔＡＡ）モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合の結果を描写する。図２Ｂは、様々な抗原：ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＲＡＡ）、シトルリン化ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＣｉｔＡＡ）、Ｈ３ペプチド（１−２１）及びシトルリン化Ｈ３ペプチド（Ｃｉｔ  Ｒ  ２＋８＋１７）に対する及び単離された抗ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＣｉｔＡＡ）モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合の結果を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本開示の目的のため、別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。これらの参考文献は、これによって、その全体が参照により本開示に組み込まれる。
【００１６】
本明細書に記述される全ての刊行物及び参考文献は、参照により組み込まれる。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような公開に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００１７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００１８】
移行句「〜からなる」または「〜から本質的になる」を含む実施形態は、列挙された構成要素及び不活性成分のみを含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、それが使用されている数の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲にあることを意味する。
【００２０】
「任意」または「任意に」は、それに続いて記載される構造、事象または状況が発生していても発生していなくてもよく、事象が発生している場合の例及び発生していない場合の例の両方を含むことを意味するものであると取ってもよい。
【００２１】
「エピトープ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体の抗原結合部位（パラトープと呼ばれる）によって抗体が結合する抗原上の領域を一緒に形成する、分子の一次構造及び電荷などの集合的な特徴を指す。エピトープは、タンパク質の一次配列中に一緒に近くに位置するアミノ酸残基のセットとして、または一次配列中で十分に分離されているが、タンパク質のその天然の完全に機能的な形状への自然の折り畳みの結果として一緒にされているアミノ酸残基のセットとしてのいずれかを定義することができる。一次配列中に一緒に近くに位置する残基からなるエピトープは、隣接、連続、逐次または直線状エピトープと呼ばれ、一方一次配列における分離された残基からなるエピトープは、対照的に不連続、高次構造または組立エピトープと呼ばれる。
【００２２】
エピトープは自然界に存在しており、ヒトによって、マッピングされ、単離され、精製され、ないしは別の方法で調製／誘導され得る。例えば、エピトープは、天然資源からの単離によって調製することができるか、またはこれらは、当該技術分野における標準プロトコールに従って合成することができる。これらの方法のうちの１つは、抗体による結合を可能にするために、全抗原の相同部分に十分に類似し得るタンパク質抗原の合成断片（ペプチド）の使用である。抗体のエピトープに対する親和性は、抗体／ペプチド複合体が、イムノアッセイの条件下で著しく解離することがないようにされねばならない。この状況は直線状エピトープで起こり、したがって、これらのエピトープを画定するためのペプチドの使用、及び個々のエピトープを画定するためのアミノ酸ならびにアミノ酸ミミックの使用を可能にする。誘導／調製されたエピトープは、天然エピトープの類似体であり得る。本開示を通して、エピトープ及びハプテンという用語は、しばしば互換的に使用される。
【００２３】
「特異的結合分子」という用語は、本明細書において、分子、好ましくは、特異的な結合が可能な小分子を指すように使用される。特異的結合とは、この点において、分子が選択された標的分子に結合する能力があるが、一方これが、別の無関係の標的分子には同じ条件下で結合しないであろうことを意味するよう意図する。例えば、結合分子は、それが血清アルブミンに結合し、別の、または好ましくは血清中に見られる任意の他のタンパク質にはほとんどもしくは全く結合しない場合に、血清アルブミンに特異的に結合すると言われる。本発明において本明細書で使用される好ましい特異的結合分子には、特異的結合薬剤、例えば、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡに結合する抗体もしくはその抗体断片が含まれ、あるいはこれは、シトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡに結合することができる。
【００２４】
この文脈における「シトルリン化エピトープと特異的に反応する」または「シトルリン化エピトープと反応性」もしくは「シトルリンエピトープと反応性」という用語は、特異的結合分子または抗体が、シトルリン残基を含有するペプチド、例えば、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡなどの構造と反応するが、一方この抗体、またはその抗体断片が、シトルリン残基の代わりにアルギニン残基を含有する同じ構造とはほとんど、または好ましくは全く結合しないことを意味する。「ペプチド」という用語は、本明細書に記載される特異的結合分子との免疫反応性のための適切な状況下において、好ましくは、それがヒトまたは動物の体内で出現するのと同じ状況下で、好ましくは天然ポリペプチドの状況において、シトルリン残基を提示することが可能である構造として解釈されるべきである。
【００２５】
「特異的結合分子」は、標的化合物に特異的に結合することが可能である、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質ドメイン、総タンパク質、またはこれらの組み合わせもしくはこれらの部分から構成される分子、好ましくは小分子であり得る。特異的結合分子の好ましい例は、ペプチドまたは抗体もしくはその抗体結合断片である。
【００２６】
天然抗体（免疫グロブリンとしても知られる）は、脊椎動物の血液または他の体液中で見ることができるガンマグロブリンタンパク質であり、細菌及びウイルスなどの異物を特定して無効にするために免疫系によって使用される。
【００２７】
天然抗体は、通常、それぞれが２つの大きな重鎖及び２つの小さな軽鎖を有する基本構造単位から形成され、例えば、１つの単位を有するモノマー、２つの単位を有するダイマー、または５つの単位を有するペンタマーである。抗体は、Ｂ細胞と呼ばれる白血球によって産生される。重鎖のいくつかの異なる型があり、その結果、異なる種類の抗体をもたらす。抗体は、それらがどの重鎖を有するかに基づいて、異なるアイソタイプにグループ分けすることができる。異なる役割を実行し、それらが遭遇する異物のそれぞれの異なる種類に対して適切な免疫応答を支持する助けとなる、５つの異なる抗体アイソタイプが哺乳動物で知られている。ラクダ科動物（例えば、ラマ）及びサメなどの一部の動物種は、変型の抗体構造を有し得る。
【００２８】
全ての抗体の一般構造は、非常に類似しているが、タンパク質の先端部における小領域は非常に多様であり、わずかに異なる先端構造を有する何百万もの抗体が存在することを可能にする。この領域は、超可変領域として知られている。これらの変型のそれぞれは、抗原として知られる異なる標的に結合することができる。抗体のこの巨大な多様性は、免疫系が抗原の同じように広範な多様性を認識することを可能にする。
【００２９】
抗体によって認識される抗原の特有な部分がエピトープと呼ばれる。これらのエピトープは、抗体が、生体を作り上げている数百万もの異なる分子の真っただ中でそれらの特有な抗原を特定し、それに結合することを可能にする高度に特異的な相互作用で、それらの抗体と結合する。抗体による抗原の認識は、免疫系の他の部分による攻撃に対してそれをタグ付けする。抗体はまた、例えば、感染を引き起こすために必要とされる病原体の一部に結合することによって、標的を直接無効化することができる。
【００３０】
抗体の大規模かつ多様な集団は、異なる抗原結合部位（すなわちパラトープ）をコード化する遺伝子セグメントのセットのランダムな組み合わせ、それに続く、さらなる多様性を生み出す、抗体遺伝子のこの領域におけるランダム突然変異によって生成される。抗体遺伝子はまた、重鎖の塩基を別のものに変化させて、抗原特異的可変領域を保持する抗体の異なるアイソタイプを創出する、クラススイッチ組換えと呼ばれるプロセスにおいて再編成される。これは、単一の抗体が、免疫系のいくつかの異なる部分によって、いくつかの異なるアイソタイプで使用されることを可能にする。
【００３１】
野生型抗体は、通常、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成されており、各対は、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。重鎖及び軽鎖のそれぞれは、可変及び定常領域と称される、２つの別個の領域で構成されている。したがって、可変重鎖（ＶＨ）、定常重鎖（ＣＨ）、可変軽鎖（ＶＬ）及び定常軽鎖（ＣＬ）が存在する。抗体の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、分子の抗原結合配列を含有し、したがって、抗体のその標的抗原に対する特異性を決定する。可変領域において、重鎖及び軽鎖の可変ドメインのそれぞれについての３つのループが、抗原結合部位を形成する。３つのループのそれぞれは、相補性決定領域または「ＤＣＲ」と称される。６つの、すなわち、重鎖につき３つ、そして軽鎖につき３つのＣＤＲがあり、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３と表記される。ＣＤＲの外側の、そしてＣＤＲの間の可変領域は、フレームワーク領域と称される。
【００３２】
抗体は、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、組換え抗体、モノクローナル抗体、天然抗体もしくはアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質、ＶＨＨ抗体としても知られるシングルドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ナノボディ（ラクダ科動物由来シングルドメイン抗体）、ＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来シングルドメイン抗体断片、アンチカリン、アプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、及びこれらの活性成分もしくは断片からなる群から選択され得る。
【００３３】
別の実施形態では、抗体は、天然抗体またはＤＮＡもしくはＲＮＡの形態のアプタマーなどのアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。
【００３４】
抗体または他の特異的結合分子との関連において「またはその部分」または「その特異的結合断片」という用語は、抗体もしくは特異的結合分子の特異的結合部位を構成している抗体もしくは特異的結合分子の部分を指すよう意味し、完全な抗体もしくは特異的結合分子と同じエピトープとなお反応することが可能である抗体もしくは特異的結合分子の部分として解釈されてもよい。
【００３５】
ヒト抗体またはその特異的結合断片は、本開示の好ましい実施形態である。好ましくは、ＩｇＧ１重鎖及びラムダもしくはカッパ軽鎖を有するＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１）抗体は、好都合に使用され得る。しかしながら、カッパもしくはラムダ軽鎖と組み合わせたＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む、他のヒト抗体アイソタイプも本開示によって包含される。また、様々なアイソタイプの全ての動物由来の抗体も本開示で使用することができる。抗体は、完全長抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ断片、またはシングルドメインＶＨＨ、ＶＨもしくはＶＬシングルドメインを含む、抗体の抗原結合断片とすることができる。
【００３６】
「シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４エピトープと反応性の特異的結合分子」という用語は、ＨＬＡ−ＤＲ４ポリペプチドまたはその部分などのより大きな構造との関連においてシトルリン残基と特異的に反応する特異的結合分子と解釈されるべきである。
【００３７】
「単離された」とは、その中に本発明による抗体、そのような抗体をコード化する核酸及び宿主細胞が、好ましくは存在する状態を指す。抗体及び核酸については、「単離された」とは、抗体及び核酸が、一般的に、それらがその天然の環境において、あるいはそれらが調製される環境において、そのような調製が組換えＤＮＡ技術によるものである場合（例えば、細胞培養）で、それらと共に見出される他のポリペプチドまたは核酸などの、それらが自然に結びついた物質を含まないか、または実質的に含まないことを意味する。宿主細胞に適用されるとき、「単離された」とは、例えば、細胞培養中の細胞などのそれらが由来する生物体から分離された宿主細胞を指す。抗体、核酸、及び宿主細胞は、希釈剤またはアジュバントと配合されてもよく、実用的な目的のために、さらに単離されてもよい。
【００３８】
「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を指す。「置換」とは、ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸残基の、別のアミノ酸残基による置き換えを指す。「挿入」とは、ポリペプチド配列中の特定の位置における、２つの既存のアミノ酸残基間のアミノ酸残基の付加を指す。「欠失」とは、ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸残基の除去を指す。
【００３９】
様々な実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−ＤＲ４によるシトルリン化ペプチドの提示を必要としないが、ＰＡＤ４及びＡＣＡＰと関連付けられている、共有エピトープに対する新規な役割を提供する。
【００４０】
Ａ．抗シトルリン化共有エピトープ抗体
本開示は、ＨＬＡ−ＤＲ４によるシトルリン化ペプチドの提示を必要としないが、ＰＡＤ４及びＡＣＡＰと関連付けられている、共有エピトープに対する新規な役割を特定する。これは、以下の観察結果：１）ＰＡＤ４が自己シトルリン化されること、２）ＲＡ患者のサブセットが、ＰＡＤ４を認識する抗体を作り出すこと、３）共有エピトープ配列ＱＫＲＡＡが、シトルリン化され得るアルギニン残基を含有することを、活用する。本開示は、シトルリン化ＰＡＤ４、非シトルリン化ＰＡＤ４、またはＰＡＤ４によるシトルリン化の過程におけるタンパク質を認識することが可能な細胞表面受容体を有するＢ細胞が、細胞表面上でＰＡＤ４を直接的または間接的に捕捉することができることを提案する。補捉されたＰＡＤ４は、酵素的に活性のままであり、Ｂ細胞表面上またはファゴソーム内のいずれかで、共有エピトープＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、またはＲＲＲＡＡにおいて隣接するＨＬＡ−ＤＲ４分子をシトルリン化する。共有エピトープの７２位のアルギニンは、シトルリン化残基のうちの１つである。このように修飾されると、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４は、アロ反応性様式でＴ細胞にとって外来性と見なされる。あるいは、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４は、ＨＬＡ−ＤＲ４がシトルリン化されなかった場合に提示されないであろう特有のペプチドをＴ細胞に提示し得る。いずれかの状況において、応答Ｔ細胞は、Ｂ細胞に、抗ＰＡＤ４、抗シトルリン化ＰＡＤ４、または他のシトルリン化タンパク質を含む、表面受容体と同じ結合特異性を有する抗体を産生するように命令するであろう。
【００４１】
この新規機序の認識は、細胞溶解性治療用抗体、抗体の共有エピトープ結合断片、またはシトルリン化共有エピトープに結合し、シトルリン化ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞を破壊し、Ｔ細胞活性化を防止する抗体様生体分子が挙げられるが、これらに限定されない、ＲＡの治療または予防のための新しい薬理学的薬剤の開発に情報を与える。
【００４２】
図１に示すように、パートＢ〜Ｄは、共有エピトープＱＫＲＡＡのＱＫＣｉｔＡＡへの直接的シトルリン化を描写している。図示されていないが、共有エピトープはまた、ＰＡＤによってシトルリン化されて、Ｔ細胞反応性エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、及びＲＲＣｉｔＡＡを生成することができるＱＲＲＡＡ、またはＲＲＲＡＡＡも含み得る。図１のパートＢに示した例示的な実施形態では、シトルリン化タンパク質に特異的なＢ細胞膜面免疫グロブリン（Ｙ）は、自己シトルリン化ＰＡＤに結合する。ＰＡＤ酵素は、近くのＨＬＡーＤＲ４分子上で、共有エピトープＱＫＲＡＡをＱＫＣｉｔＡＡにシトルリン化する（ＨＬＡ−ＤＲ４（Ｈ）上の小円）。シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４分子は、追加の結合ペプチドの有無にかかわらず、Ｔ細胞受容体（Ｗ）によって直接認識される。Ｔ細胞は、Ｂ細胞に、抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＡＰ）を産生するように命令する。
【００４３】
図１のパートＣにおいて、ＩｇＧに特異的なＢ細胞膜面免疫グロブリン（Ｙ）は、ＰＡＤに結合した抗体に結合する。結合したＰＡＤは、共有エピトープ配列を近くのＨＬＡ−ＤＲ４分子（Ｈ）上でシトルリン化する。シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４分子は、追加の結合ペプチドの有無にかかわらず、Ｔ細胞受容体（Ｗ）によって直接認識される。Ｔ細胞は、Ｂ細胞に、抗ＩｇＧ抗体（リウマチ因子）を産生するように命令する。
【００４４】
図１のパートＤにおいて、ＰＡＤに特異的なＢ細胞膜面免疫グロブリン（Ｙ）は、ＰＡＤに結合する。ＰＡＤに結合したＢ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ４（Ｈ）中の共有エピトープＱＫＲＡＡを、近くのＨＬＡ−ＤＲ４分子（Ｈ）上でＱＫＣｉｔＡＡアミノ酸配列にシトルリン化する。シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４分子は、追加の結合ペプチドの有無にかかわらず、Ｔ細胞受容体（Ｗ）によって直接認識される。Ｔ細胞は、Ｂ細胞に、抗ＰＡＤ抗体を産生するように命令する。本明細書で使用される場合、例示のＰＡＤとしては、ＰＡＤ４またはＰＡＤ２もしくはこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００４５】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、シトルリン化ＰＡＤ４、非シトルリン化ＰＡＤ４、またはＰＡＤ４によるシトルリン化の過程におけるタンパク質を認識し、またはこれに結合することが可能な細胞表面受容体を有するＢ細胞が、Ｂ細胞の細胞表面上でＰＡＤ４を直接的または間接的に捕捉することができると考えられる。補捉されたＰＡＤ４は、酵素的に活性のままであり、Ｂ細胞表面上またはＢ細胞ファゴソーム内のいずれかで隣接するＨＬＡ−ＤＲ４分子をシトルリン化する。ＨＬＡ−ＤＲ４の共有エピトープの７２位のアルギニンは、シトルリン化残基のうちの１つである。このように修飾されると、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４受容体は、アロ反応性様式でＴ細胞にとって外来性と見なされる。あるいは、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４は、ＨＬＡ−ＤＲ４がシトルリン化されなかった場合にＴ細胞に提示されないであろう特有のペプチドをＴ細胞に提示し得る。いずれかの状況において、応答Ｔ細胞は、活性化されるようになり、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインを放出することに加えて、Ｂ細胞に、ＰＡＤ４、シトルリン化ＰＡＤ４、または他のシトルリン化タンパク質を含む、表面受容体と同じ結合特異性を有する抗体を産生するように命令するであろう。
【００４６】
この新規機序の認識は、細胞溶解性治療用抗体、その抗原結合断片、またはシトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡに結合し、シトルリン化ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞を破壊する抗体様生体分子が挙げられるが、これらに限定されない、ＲＡの治療または予防のための新しい薬理学的薬剤の開発に情報を与える。抗体または抗体様生体分子の、抗原提示細胞、例えばＢ細胞上に存在するシトルリン化共有エピトープへの結合は、数ある機構の中でも特に、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機構、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介して、これらの細胞の排除を可能にする。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡに特異的であり、かつこれらと高親和性で結合する哺乳動物抗体を含む有用な治療用組成物を提供する。本明細書で使用される場合、このアミノ酸配列は、シトルリン化共有エピトープを指し、シトルリン化する前のエピトープが、ＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、またはＲＲＲＡＡであり、シトルリン化する前のエピトープ中のアルギニン残基のうちの１つが、アルギニンをシトルリン（「Ｃｉｔ」）に脱イミノ化することによる酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって作用される。
【００４８】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質中のアルギニン残基のシトルリン残基への転換を触媒する。シトルリンにはｔＲＮＡは存在せず、タンパク質中のシトルリン残基の存在は、もっぱら翻訳後修飾の結果である。哺乳動物（ヒト、マウス及びラット）において、それぞれが全く別の遺伝子によってコードされる、５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６、「ＰＡＤ４」及び「ＰＡＤ５」は、同じアイソタイプに使用される）が特定されている（Ｖｏｓｓｅｎａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２５，１１０６−１１１８，２００３）。全てのこれらの酵素は、活性に関してＣａ２＋の存在に強く依存しており、遊離Ｌ−アルギニンを遊離Ｌ−シトルリンに転化することはできない。遊離Ｌアルギニンは、真核生物では、一酸化窒素合成酵素（ＥＣ１．１４．１３．３９）によって遊離Ｌ−シトルリンに転化され得るか、または細菌ではアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）によって転化され得る。これらの酵素は、Ｃａ２＋依存性ではない。
【００４９】
シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡに特異的であり、かつこれらと高親和性で結合する、哺乳動物抗体またはその断片を作製するための方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９１６，７７１号に開示されるものなどの、モノクローナル抗体を作製するための細胞融合法を、本発明の方法において使用することができる。簡単に言えば、この方法によれば、所望の重鎖（または重鎖の断片）をコード化するＤＮＡが、第１の哺乳動物宿主細胞中に導入され、一方で、所望の軽鎖（または軽鎖の断片）をコード化するＤＮＡが、第２の哺乳動物宿主細胞中に導入される。第１の形質転換された宿主細胞及び第２の形質転換された宿主細胞が、次いで、細胞融合によって組み合わされて、第３の細胞を形成する。第１及び第２の細胞の融合の前に、形質転換細胞は、特に所望の特性、例えば高レベルの発現について選択され得る。融合後に、得られたハイブリッド細胞は、所望の重鎖をコード化するＤＮＡ及び所望の軽鎖をコード化するＤＮＡの両方を含有し、かつこれらを発現して、多量体抗体の産生をもたらす。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、標準的な技法によって産生される。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知であるハイブリドーマベースの方法によって産生される。様々な実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ４の配列からのエピトープＱＫＣｉｔＡＡに対するマウスモノクローナル抗体の産生法が当業者に既知であり、例えば、ある特定のこのような実施形態では、マウス、ラット、ハムスター、サル、または他の哺乳動物などの好適な動物が、免疫原によって免疫化され、抗体分泌細胞を産生する。様々な実施形態では、免疫原は、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡとすることができるか、これは、ポリペプチドもしくはタンパク質に結合または融合したシトルリン化エピトープのうちの１つとすることができる。これらの実施形態では、スクリーニングプロセスが、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡには結合しているが、複合化ポリペプチドもしくはタンパク質には結合していないモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを産出するであろう。
【００５０】
ある特定の実施形態では、抗体分泌細胞は、リンパ球または脾細胞などのＢ細胞である。ある特定の実施形態では、リンパ球（例えば、ヒトリンパ球）は、インビトロで免疫化され、抗体分泌細胞を生成する。例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３９９５−３９９９を参照されたい。
【００５１】
ある特定の実施形態では、抗体分泌細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために、骨髄系細胞株などの「不死化」細胞株と融合される。ある特定の実施形態では、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が、例えばＥＬＩＳＡによって特定される。ある特定の実施形態では、このような細胞は、次いで、標準的な方法を用いて、サブクローンされ培養され得る。ある特定の実施形態では、このような細胞は、好適な動物宿主における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、親和性クロマトグラフィーなどの標準的な分離手順を用いて、ハイブリドーマ培養培地、血清、または腹水から単離される。ある特定の実施形態によるハイブリドーマの産生及びモノクローナル抗体の精製について指針は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｈ．８（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に提供されている。
【００５２】
ある特定の実施形態では、マウスモノクローナル抗体は、遺伝子変調されたマウスを免疫原で免疫化することによって産生される。ある特定のこのような実施形態では、マウスは、ＨＬＡ−ＤＲ４欠損マウスである。ある特定のこのような実施形態では、マウスは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４をコード化する遺伝子のうちの全てまたは一部を欠如する「ノックアウト」マウスである。ある特定の実施形態では、このようなノックアウトマウスは、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡで（単独で、またはポリペプチドもしくはタンパク質に複合化される場合のいずれかで）免疫化される。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体を産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）において生じる。例えば、米国特許第６，０７５，１８１Ａ号及び同第６，１１４，５９８  Ａ号、ならびにＷＯ９８／２４８９３  Ａ２を参照されたい。例えば、ある特定の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子が、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスに導入される（例えば、酵母人工染色体、ヒト染色体断片、または生殖細胞系の統合を用いて）。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７、及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（トランスジェニックマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ＩＩ．ＲＴＭ．系統を記載する）を参照されたい。
【００５４】
ある特定の実施形態では、このようなトランスジェニックマウスは、免疫原で免疫化される。ある特定のこのような実施形態では、リンパ細胞（Ｂ細胞など）は、抗体を発現するマウスから得られる。ある特定のこのような実施形態では、このような回収された細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために、骨髄系細胞株などの「不死化」細胞株と融合される。ある特定のこのような実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、注目の抗原に対して特異的な抗体を産生するものを特定するために、スクリーニングかつ選択される。ヒトモノクローナル抗体の産生に好適な特定の例示的な方法及びトランスジェニックマウスは、例えば、Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３、及びＷＯ９８／２４８９３に記載されている。ある特定の実施形態では、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡに対するヒトモノクローナル抗体は、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチの治療に治療用抗体またはその断片として使用するために好適である。
【００５５】
ファージ及び酵母ディスプレイベースの方法
ある特定の実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、以下に記載されるもののいずれかなどのディスプレイベースの方法を用いて産生される。
【００５６】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイ技法によって産生される。ある特定の例示的な抗体ファージディスプレイ法は当業者に既知であり、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００２）１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ａｉｔｋｅｎ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）に記載されている。例えば、ある特定の実施形態では、抗体のライブラリーが、非溶解繊維状ファージｆｄまたはＭ１３などの繊維状ファージの表面上に表示される。ある特定の実施形態では、抗体は、ＶＨ−ＶＬ対を安定化させるために操作された分子間ジスルフィド結合を有するｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖなどの抗体断片、及びダイアボディである。ある特定の実施形態では、次いで、所望の結合特異性を有する抗体が選択され得る。抗体ファージディスプレイ法のある特定の例示的な実施形態が、以下にさらに詳細に説明される。
【００５７】
ある特定の実施形態では、抗体ファージディスプレイライブラリーは、当業者に既知のある特定の方法を用いて調製され得る。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００２）１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ａｉｔｋｅｎ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照されたい。ある特定の実施形態では、可変遺伝子レパートリーが、抗体分泌細胞のｍＲＮＡに由来するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調製される。例えば、ある特定の実施形態では、ｃＤＮＡは、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡに対する抗体を発現するＢ細胞のｍＲＮＡから調製される。ある特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖の可変領域をコード化するｃＤＮＡが、例えばＰＣＲによって増幅される。
【００５８】
ある特定の実施形態では、重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡは、好適なベクターにクローンされる。ある特定の実施形態では、重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡは、クローニングプロセス中に無作為に組み合わされ、これによって、多様なｓｃＦｖまたはＦａｂをコード化するｃＤＮＡライブラリーのアセンブリをもたらす。ある特定の実施形態では、重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡは、好適なベクターにクローンされる前に連結される。ある特定の実施形態では、重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡは、好適なベクターへの段階的なクローンによって連結される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、ｃＤＮＡは、ファージミドベクターなどのファージディスプレイベクター中にクローンされる。ある特定の例示的なファージミドベクター、例えばｐＣＥＳ１は、当業者に既知である。ある特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖の両方をコード化するｃＤＮＡは、同じベクター上に存在する。例えば、ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖをコード化するｃＤＮＡは、微量成分のファージコートタンパク質ｐｉｌｌをコード化する遺伝子ＩＩＩの全てまたは一部とインフレームでクローンされる。ある特定のこのような実施形態では、ファージミドは、ファージ表面上のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体の発現を指令する。あるいは、ある特定の実施形態では、重鎖（または軽鎖）をコード化するｃＤＮＡは、遺伝子ＩＩＩの全てまたは一部とインフレームでクローンされ、軽鎖（または重鎖）をコード化するｃＤＮＡは、同じベクター内のシグナル配列の下流にクローンされる。シグナル配列は、軽鎖の（または重鎖の）宿主細胞のペリプラズム中での発現を指令し、ここで重鎖及び軽鎖がＦａｂ断片を組み立てる。あるいは、ある特定の実施形態では重鎖をコード化するｃＤＮＡ及び軽鎖をコード化するｃＤＮＡは、別々のベクター上に存在する。ある特定のこのような実施形態では、重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡは、一方はファージミドに、そして他方はファージベクターに（これらの両方とも、宿主細胞におけるインビボ組換えのためのシグナルを含有する）、別々にクローンされる。組換えファージミドまたはファージベクターは、好適な細菌宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ中に導入される。ファージミドを使用する、ある特定の実施形態では、宿主は、ヘルパーファージに感染され、ファージ構造タンパク質を供給し、これによって、抗体−ｐｉｌｌ融合タンパク質を運ぶファージ粒子のファージ表面上での発現を可能にする。
【００６０】
様々な例示的な実施形態では、「合成」抗体ライブラリーが、インビトロで再編成される可変遺伝子のレパートリーを用いて構築される。例えば、ある特定の実施形態では、重鎖または軽鎖をコード化する個々の遺伝子セグメント（それぞれ、Ｖ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）が、ＰＣＲを用いて無作為に組み合わされる。ある特定のこのような実施形態では、追加の配列多様性が、ＣＤＲ中に、可能であればＦＲ中に、例えばエラープローンＰＣＲによって導入され得る。ある特定のこのような実施形態では、追加の配列多様性は、ＣＤＲ３中に、例えば、重鎖のＨ３に導入される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、「ナイーブ」または「ユニバーサル」ファージディスプレイライブラリーが、非免疫化動物からの核酸を用いて、上述のように構築される。ある特定の実施形態において、非免疫化動物は、ヒトである。ある特定の実施形態では、「免疫化」ファージディスプレイライブラリーが、免疫化動物からの核酸を用いて、上述のように構築される。ある特定の実施形態では、免疫化動物は、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、またはサルである。ある特定のこのような実施形態では、動物は、以下に記載される免疫原のうちのいずれかで免疫化される。
【００６２】
ある特定の実施形態では、所望の結合特異性を有する抗体のファージディスプレイライブラリーからの選択は、連続的パンニングステップによって達成される。パンニングのある特定の実施形態では、ライブラリーファージ調製物は、抗原に曝露される。ある特定のこのような実施形態では、ファージ−抗原複合体が洗浄され、未結合ファージが廃棄される。ある特定のこのような実施形態では、結合ファージが回収され、その後Ｅ．ｃｏｌｉを感染させることによって増幅される。ある特定のこのような実施形態では、モノクローナル抗体産生ファージは、単一プラークを採集することによってクローンされてもよい。ある特定の実施形態では、上記プロセスが繰り返される。
【００６３】
ある特定実施形態では、パンニングで使用される抗原は、以下に記載される免疫原のうちのいずれかである。ある特定の実施形態では、抗原は、親和性クロマトグラフィーによる抗原結合ファージの精製を可能にするために、固体支持体上で固定化される。ある特定の実施形態では、抗原はビオチン化されており、これによって、ストレプトアビジンがコートされた磁性ビーズを用いて、結合ファージを未結合ファージから分離することを可能にする。ある特定の実施形態では、抗原は、細胞上に（直接パンニングのために）、組織凍結切片内に、または膜上に（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース膜）に固定化されてもよい。ある特定のパンニング手順の他の変更例は、当業者によって日常的に決定されてもよい。
【００６４】
ある特定の実施形態では、酵母ディスプレイシステムは、モノクローナル抗体を産生するために使用される。ある特定のこのようなシステムでは、抗体は、酵母ＡＧＡ２タンパク質のうちの全てまたは一部との融合タンパク質として発現され、酵母細胞壁の表面上に表示されるようになる。ある特定のこのような実施形態では、所望の結合特異性を有する抗体を発現する酵母細胞は、次いで、細胞を蛍光標識抗原に曝露することによって特定され得る。ある特定のこのような実施形態では、抗原に結合する酵母細胞は、次いで、フローサイトメトリーによって単離され得る。例えば、Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７を参照されたい。
【００６５】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、組換え技法によって産生される。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。ある特定のこのような実施形態では、モノクローナル抗体鎖をコード化する核酸は、好適な宿主細胞中でクローンされて発現される。例えば、ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、標準的方法を用いて、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞などの所望の抗体を発現する細胞から調製され得る。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、次いで、標準的な方法を用いて、ｃＤＮＡを作成するために使用され得る。ある特定の実施形態では、重鎖または軽鎖ポリペプチドをコード化するｃＤＮＡが、例えば特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって増幅される。ある特定の実施形態では、ｃＤＮＡは、好適な発現ベクター中にクローンされる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、次いで、内因的に抗体を産生しない宿主細胞などの、好適な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトされる。ある特定の例示的な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び骨髄腫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖及び軽鎖が同じ宿主中で同時発現される、ある特定の実施形態では、再構成された抗体が単離されてもよい。
【００６６】
ある特定の実施形態では、重鎖または軽鎖をコード化するｃＤＮＡは、修飾され得る。例えば、ある特定の実施形態では、マウス重鎖または軽鎖の定常領域は、ヒト重鎖または軽鎖の定常領域で置き換えることができる。このように、ある特定の実施形態では、ヒト抗体定常領域を有するが、マウス抗体の結合特異性を保持するキメラ抗体が産生され得る。
【００６７】
ある特定の実施形態では、組換え抗体は、ある特定の細胞株で発現され得る。ある特定の実施形態では、特定の抗体をコード化する配列は、好適な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用され得る。ある特定の実施形態によれば、形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するため任意の既知の方法によるものとすることができる。ある特定の例示的な方法としては、ポリヌクレオチドをウイルス中に（またはウイルスベクター中に）パッケージングし、及び宿主細胞をウイルスで（またはベクターで）形質導入すること、ならびに米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、及び同第４，９５９，４５５号に例示されるように、当該技術分野において既知のある特定のトランスフェクション手順を使用することが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存し得る。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入のためのある特定の例示的な方法は、当該技術分野において既知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム中の封入、及びＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
発現のための宿主として利用可能なある特定の例示的な哺乳動物細胞株は、当該技術分野において既知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）を含むアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株、及び多くの他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞株は、どの細胞株が、シトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する高レベルの抗体を産生するかを決定することによって選択されてもよい。
【００６９】
様々な実施形態では、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４エピトープに結合する抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒトの（通常、マウスまたはラットの）免疫グロブリンからの１つ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、これらが存在する場合、これらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上が同一である。したがって、ヒト化免疫グロブリンのうちの全ての部分が（ＣＤＲを除く可能性はある）、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。
【００７０】
「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリン含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるために、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。一説によれば、ドナー抗体は、得られたヒト化抗体が、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるために、「ヒト化」のプロセスによって、「ヒト化」されている。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。
【００７１】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンのもので、アミノ酸残基置換、欠失または付加（すなわち、突然変異）の導入によって変更されているものも含むであろう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、誘導体である。このようなヒト化抗体は、１つ以上の非ヒトＣＤＲ中に、アミノ酸残基置換、欠失または付加を含む。ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体と比べて、同じ結合、より良好な結合、またはより不良な結合を実質的に有し得る。具体的な実施形態では、ＣＤＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸残基が、置換、欠失または付加されている（すなわち、変異されている）。ヒト化抗体におけるさらなる詳細については、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、同第ＥＰ５９２，１０６号、及び同第５１９，５９６号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号及び同第ＷＯ９３／１７１０５号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５８５，０８９号、同第５，７６６，８８６号、及び同第６，４０７，２１３号を参照されたい。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））及び／または「超可変ループ」からのこれらの残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖとしては、二重特異性ｓｃＦｖ及びヒト化ｓｃＦｖが挙げられる。
【００７４】
Ｂ．治療法
このように、本開示は、したがって、例えば、炎症性関節炎、多発性硬化症、１型糖尿病、ライム病誘発性関節炎、関節リウマチ、ヒドララジン誘発性女性全身性エリテマトーデス、妊婦性類天疱瘡、落葉状天疱瘡、閉塞性肥大型心筋症、乾癬性関節炎、乾癬、ＩｇＡ腎症、「共有症候群」−全身性硬化症／関節リウマチ及びリウマチ性多発性筋痛症を含み得る、シトルリン−ＨＬＡ−ＤＲ４関連自己免疫疾患の治療または予防で使用するための、ＨＬＡ−ＤＲ４分子上に存在するシトルリン化共有エピトープに結合する特異的結合分子に関する。いくつかの実施形態では、シトルリン−ＨＬＡ−ＤＲ４関連自己免疫疾患の治療または予防で使用するための、本発明のＨＬＡ−ＤＲ４分子上に存在するシトルリン化共有エピトープに結合する特異的結合分子、例えば、抗体は、関節リウマチの治療に使用される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して治療可能な疾患及び病態としては、炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び乾癬を挙げることができる。したがって、本開示は、関節炎、炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び乾癬からなる群から選択される疾患の治療または予防で使用するための、ＨＬＡ−ＤＲ４分子上に存在するシトルリン化共有エピトープに特異的に結合する、特異的結合分子、例えば、抗体またはその特異的結合断片に関する。本開示は、特に、自己免疫疾患の治療及び／または予防のための、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４共有エピトープ（例えば、ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ）に対して高親和性を有し、かつこれらに特異的に結合する、特異的結合分子（例えば、抗体またはその特異的結合断片）に関する。これらの自己免疫疾患は、抗原提示細胞、例えば、Ｂ細胞上に存在するＨＬＡ−ＤＲ４受容体上に存在するシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡの存在によって、全体または一部において媒介される。Ｂ細胞などの抗原提示細胞によって提示されたシトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＱＲＣｉｔＡＡ、またはシトルリン化エピトープＲＲＣｉｔＡＡを担持するＨＬＡ−ＤＲ４分子は、Ｔ細胞によって外来性として認識され、これによって、Ｔ細胞活性化及び病原性免疫応答の開始をもたらす。
【００７６】
いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４共有エピトープと反応性の特異的結合分子（例えば、抗体またはその特異的結合断片）の投与が、特異的結合分子の、抗原提示細胞、例えば、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４共有エピトープをＴ細胞に提示するＢ細胞への結合をもたらし得ると考えられる。このように、本発明の抗体、またはその特異的結合断片を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ４分子上に存在するシトルリン化共有エピトープに結合し、患者のＴ細胞が、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲエピトープを有する外来性に見えるＨＬＡ−ＤＲ４に反応することを防止する。これらの抗原提示細胞、例えばＢ細胞は、その後、とりわけ、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機構、及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を通して排除され得る。
【００７７】
ヒトの治療で使用するとき、抗体、またはその抗体断片は、好ましくは、本発明の抗体またはその特異的結合断片に対する抗体の産生を引き起こさないように、主としてヒト抗体配列からなり、すなわち、これはヒト化されている。
【００７８】
治療的使用については、適した抗体またはその特異的結合断片は、ヒト患者への投与後に安定である。例えば、投与後に、ヒトにおいて長い半減期を有するべきであり、かつ短時間にプロテアーゼによって分解されるべきではない。好適な抗体は、数日間よりはむしろ数週間の半減期を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、上記で概説したシトルリン−ＨＬＲ−ＤＲ４関連自己免疫疾患を有するか、またはシトルリン−ＨＬＲ−ＤＲ４関連自己免疫疾患を有すると疑われる対象は、有効量の特異的結合分子（例えば、本開示のシトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４共有エピトープ（例えば、ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ）に特異的に結合する抗体またはその特異的結合断片）と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む薬学的組成物で治療され得る。様々な実施形態では、特異的結合分子は、シトルリン化共有エピトープ、例えば、ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡに特異的に結合する抗体、またはその断片であり、例えば、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４エピトープ、例えば、アミノ酸配列ＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡを有するシトルリン化共有エピトープに特異的に結合する、ポリクローナル、もしくはモノクローナル抗体、またはキメラ抗体もしくはヒト化抗体、あるいは完全ヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わされると、その成分が生物活性を保持することを可能にし、かつ対象の免疫系と非反応性である任意の物質を含み、生理学的適合性があり、非毒性で、活性抗シトルリン化共有エピトープ抗体またはその抗原結合断片の作用機序に干渉しない、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、担体、分散媒体、コーティング、抗菌ならびに抗真菌剤、等張性ならびに吸収性遅延剤などを含み得る。好ましくは、薬学的に許容される賦形剤は、（例えば、注射または吸入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与に好適である。投与経路に応じて、活性成分、すなわち、特異的結合分子は、特異的結合分子を、特異的結合分子を不活性化し得る酸及び他のプロテアーゼの作用から保護するために物質中にコーティングされてもよい。
【００８０】
本開示に従って使用される、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に十分に説明かつ例証されているように、所望の純度を有する抗体もしくはその抗原結合断片を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、薬学的に許容される凍結製剤、溶液及び／または懸濁液として、保管用に調製され得る。許容される担体、賦形剤、緩衝液または安定剤は、使用される投与量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、本開示の薬学的組成物で用いることができる適切な水性及び／または非水性賦形剤、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要な粒径の維持により、かつ表面活性剤、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液の使用により、維持されてもよい。抗酸化剤、例えば、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど、及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リンなど、防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）が含まれてもよい。他の例示的な薬学的に許容される賦形剤としては、ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩生成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【００８１】
１つの例示的な実施形態では、薬学的組成物は、任意に、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、ならびに毒性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウム）の生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は製剤化され、当該技術分野において既知の凍結乾燥及び再構成技法に従って、使用する前に、保管用に凍結乾燥され、かつ好適な賦形剤中で再構成され得る。抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含有する１つの例示的な薬学的組成物において、本組成物は、静脈内または皮下投与のために、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の無菌の、防腐剤を含まない溶液として製剤化される。本製剤は、単回使用プレフィルドペン、例えば単回使用の約１ｍＬのプレフィルドガラス注射器として、または単回使用の医療機関用バイアルとしてのいずれかで供給され得る。好ましくは、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含有する薬学的組成物は、約６．９〜５．０のｐＨ、好ましくは、６．５〜５．０のｐＨ、及びさらにより好ましくは約６．０〜約５．０の範囲のｐＨを伴い、透明かつ無色である。様々な実施形態では、本薬学的組成物を含む製剤は、再構成されて、対象に投与されるとき、溶液１ｍＬ当たり、約１，０００ｍｇ〜約１０ｍｇ、または約５００ｍｇ〜約２０ｍｇ、または約４００ｍｇ〜約３０ｍｇ、または約３００ｍｇ〜約５０ｍｇの抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含有することができる。非経口投与用の、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与用の、例示的な注射または注入用賦形剤としては、マンニトール、クエン酸一水和物、第二リン酸ナトリウム二水和物、リン酸一ナトリウム二水和物、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び水を挙げることができる。
【００８２】
別の例示的な実施形態では、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、またはより好ましくは、約５〜７５ｍｇ／ｍＬ、またはさらにより好ましくは、約１０〜５０ｍｇ／ｍＬ、またはさらにより好ましくは、約１０〜４０ｍｇ／ｍＬの抗体を、酢酸ナトリウム、ポリソルベート８０、及び塩化ナトリウムと共に、約５〜６の範囲のｐＨで含有する無菌水溶液として、静脈内または皮下投与用に製剤化される。好ましくは、静脈内または皮下製剤は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｍＬの抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムと共に、ｐＨ５．５で含有する無菌水溶液である。さらに、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む溶液は、多くの他の化合物の中でもとりわけ、ヒスチジン、マンニトール、スクロース、トレハロース、グリシン、ポリ（エチレン）グリコール、ＥＤＴＡ、メチオニン、及びこれらの任意の組み合わせ、ならびに関連技術において既知の多くの他の化合物を含むことができる。
【００８３】
一実施形態では、本開示の薬学的組成物は、以下の成分：５〜１００ｍｇの本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、及び０．０１％のポリソルベート８０を、ｐＨ５．８で含む。この組成物は、凍結乾燥粉末として提供され得る。粉末が最大容量で再構成されるとき、本組成物は同じ処方を保持する。あるいは、粉末は半分の容量で再構成されてもよく、この場合、組成物は、１０〜２００ｍｇの本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片、２０ｍＭのヒスチジン、１０％のスクロース、及び０．０２％のポリソルベート８０をｐＨ５．８で含む。
【００８４】
一実施形態では、用量の一部が静脈内ボーラスによって投与され、残りが、抗体製剤の注入によって投与される。例えば、いくつかの実施形態では、約０．００１〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの量の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片が、ボーラスとして、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の静脈内投与を介して提供され、抗体用量の残りが、静脈内注射によって投与されてもよい。抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の所定の量が、例えば、１時間から２時間、５時間までの時間にわたって投与されてもよい。
【００８５】
さらなる実施形態では、用量の一部が、皮下注射及び／またはボーラスの形態の注入による、静脈内投与によって投与され、残りが、抗体製剤の注入によって投与される。いくつかの例示的な用量では、抗体製剤は、約０．００１〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲の、例えば、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片で、静脈内または皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、用量は、ボーラスとして提供されてもよく、抗体用量の残りは、皮下または静脈内注射によって投与されてもよい。抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の所定の量が、例えば、１時間から２時間、５時間までの時間にわたって投与されてもよい。
【００８６】
本明細書に提供される例示的な製剤は、治療されている特定の適応症に対して必要に応じて２つ以上の活性薬剤、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性薬剤を含有してもよい。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましい場合もある。あるいは、またはこれに加えて、本組成物は、抗炎症剤、化学療法剤、細胞傷害性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、及び／または小分子酵素阻害剤、または受容体調節剤を含んでもよい。かかる分子は、好適には、意図される目的のために有効な量で組み合わせで存在する。
【００８７】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌であるべきか、またはほぼ無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【００８８】
様々な実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物の例示的な製剤は、製剤処方の分野において広く知られた方法を用いて、調製することができる。一般的に、そのような調製方法は、活性成分を１つ以上の担体または１つ以上の他の補助成分と関連付け、その後、望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に梱包するステップを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物はまた、小胞中、特に、１つ以上のリポソーム表面部分、例えば、ポリエチレングリコール、抗体及びその抗体断片を含有するリポソーム中で送達することができ、リポソームは、特異的細胞または臓器中に選択的に輸送され、したがって、標的化薬物送達を向上させる。
【００９０】
選択された媒体中の活性成分（複数可）の最適な濃度は、当業者に周知の手順に従って、経験的に決定することができ、望ましい最終的な製剤処方及び使用される用途に応じるであろう。
【００９１】
本開示はまた、最小でも、本明細書に記載されるような抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含むであろう、本開示の薬学的組成物の成分のうちの１つ以上で充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。他の実施形態では、キットは、薬学的に許容される賦形剤、例えば、希釈剤を提供する、１つ以上のさらなる容器を含有してもよい。一実施形態では、キットは、少なくとも１つの容器を含むことができ、この容器は、本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片、あるいは本明細書に開示される薬学的組成物及び／または抗炎症薬、及び／または細胞毒を含む免疫複合体、及び／または化学療法薬及び／もしくは放射性同位元素を含むことができる。キットはまた、シトルリン−ＨＬＲ−ＤＲ４媒介疾患または障害の治療のための、最終薬学的組成物を調製して、それを必要とする対象に投与するための説明書のセットも含み得る。
【００９２】
様々な実施形態では、本明細書に記載される活性薬剤の適切な用量は、例えば治療に影響を及ぼすか、または治療に影響を及ぼすと予測されることが当該技術分野において既知であるか、またはその疑いがあるパラメータまたは因子を用いて、臨床医によって作成される。いくつかの実施形態では、堅実な医療行為により、初回量が、最適用量よりも幾分少ない量で開始し、その後、これが、所望または最適な効果がいかなる負の副作用と比べても達成されるまで、少しずつ増加されるであろう。重要な診断的尺度には、例えば、炎症のこれらの症状もしくは産生された炎症性サイトカインのレベル、自己抗体の力価、組織損傷、またはシトルリン−ＨＬＲ−ＤＲ４媒介疾患過程、例えば関節リウマチにおける推定される活性もしくは段階が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の対象、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変化され得る。本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は、１つ以上の投与様式によって、例えば、静脈内注射、連続注入によって、または、例えば、１日、数日、１週間の投与の間隔で、または１週間当たり１〜７回の投与により、対象に、例えばヒト対象に投与され得る。投与は、非経口に、例えば、静脈内、または皮下で提供され得る。
【００９３】
実例としてのみ、かつ適切な用量及び投与頻度を決定するための様々な因子を考慮に入れると、投与を必要とする患者に施される、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む例示的な用量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．０２〜約５０、より好ましくは、約０．０２〜約１０、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重（投与される）の単回用量で、１日当たり１回以上、及び／または１週間当たり１回以上、例えば、治療の必要に応じて、１週から４週の間、または１週から８週の間、または１週から１２週の間、または１週から１４週の間、または１ヶ月から数年の範囲の期間を含み得る。いくつかの実施形態では、例示的な投与計画は、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、毎日の総用量または毎週の総用量は、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００９４】
別の例では、投与を必要とする患者に施される、本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む例示的な用量（治療有効用量、または治療用量であり得る）は、１日当たり投与される患者の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇであり、これは、単回用量で、例えば、単位用量で投与されるか、または１日当たり２回以上の分割用量で投与されてもよい。投与を必要とする対象への投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、及びこれらの間の任意の投与量であってもよい。非限定的な例として、本開示による治療は、単回用量または２４、１２、８、６、４、もしくは２時間毎の分割用量で、またはこれらの任意の組み合わせを用いて、治療の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０週目のうちの少なくとも１週に、またはこれらの任意の組み合わせにおいて、１日当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量で、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇの量で、抗体もしくはその抗原結合断片の毎日投与量として提供されてもよい。
【００９５】
病態の重症度、及び本明細書で論じられる様々な因子に応じて、治療の用量、頻度及び持続時間は、当業者に既知の適切な医療標準を考慮して、それに応じて調整することができる。ある特定の例示的な実施形態では、本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇまで、または約５０ｍｇまでを初回量として投与することができる。第１の用量は初回負荷量であってもよく、これは、その後、複数の維持投与量に続く。ある特定の例示的な実施形態では、初回量は、初回量のものとほぼ同じであるかまたは少なくすることができる抗体もしくはその抗原結合断片の第２または複数の後続用量に続くことができ、後続用量は、少なくとも１日〜３日、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも５週、少なくとも６週、少なくとも７週、少なくとも８週、少なくとも９週、少なくとも１０週、少なくとも１２週、または少なくとも１４週まで離れているか、または本開示の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の用量は、繰り返されてもよく、この投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月、または少なくとも６ヶ月まで離れてもよい。
【００９６】
本開示の組成物の投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚塗布、静脈内、腹腔内、皮下、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内、皮内、脳髄液内、病巣内、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射ならびに注入による注射もしくは注入、または持続放出系もしくは移植片によるものであってもよい。注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴などのための投与形態を含み得る。多数の再利用可能なペン及びオートインジェクタ送達得デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達における適用例を有する。本抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の投与において本明細書で企図される例示的なペンベースの送達方法としての例には、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳ−ＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡ−ＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＶＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒ−ｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに必ずしも限定されるものではない。本開示の薬学的組成物の皮下送達における適用例を有するペンベースのデバイスの例示の実施例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）が挙げられる。
【００９７】
様々な実施形態では、本発明による、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は、例えば、対象が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ  ＲＡ分類基準の点から見て、関節リウマチを有すると見なされるとき、堅実な医療行為に従う１つ以上の関節炎判定基準を呈する患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、表１に本明細書で示した関節リウマチについての２０１０アメリカリウマチ学会／欧州リウマチ学会のリウマチ分類基準に従って、診断未確定関節炎、もしくは診断未確定滑膜炎を提示するか、または決定的なＲＡを有すると判定される対象は、本発明による抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片で治療され得る。様々な実施形態では、本発明による抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片の投与による治療は、いつでも開始することができ、症状が解消するまで継続されるか、または症状の寛解により示される所定の期間もしくは不特定の期間にわたって継続される。
【表１】
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＊この基準は、この基準は関節炎を新たに発症した患者の分類を目的としている。関節リウマチ（ＲＡ）に伴う典型的な骨びらんを有し、かつて２０１０基準を満たしたことがあれば関節リウマチと分類する。罹病期間が長い患者（治療の有無を問わず疾患活動性が消失している患者を含む）で、以前のデータで２０１０基準を満たしたことがあればＲＡと分類する。
†鑑別診断は患者の症状により多岐にわたるが、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、痛風などを含む。鑑別診断が困難な場合は、リウマチ専門医に意見を求めるべきである。
‡合計点が５／１０点以下の場合はＲＡと分類できないが、将来的に分類可能となる場合もあるため、再評価してもよい。
§罹患関節とは、検査時に腫脹または圧痛が認められる関節を指し、滑膜炎の画像診断による証拠によって認められてもよい。遠位指節間関節、第１手根中手関節、及び第１中足趾節関節は評価対象から除外する。関節の分布に関する区分は、罹患関節の部位と数により分類し、罹患関節パターンに基づき、とりうる最高位の区分に分類する。
¶「大関節」とは、肩関節、肘関節、股関節、膝関節、足関節を指す。
＃「小関節」とは、中手指節関節、近位指節間関節、第２〜５中足趾節関節、母指指節間関節、手関節を指す。
＊＊このカテゴリーでは、少なくとも１ヶ所以上の罹患関節が小関節である必要があるものの、他の関節には、大関節とさらなる小関節の組み合わせ、ならびに他に特記していないその他の関節（例えば、顎関節、肩鎖関節、胸鎖関節など）を含めることができる。
††陰性とは、該当する臨床検査及びアッセイについてＩＵ値が正常上限値（ＵＬＮ）以下である場合を指し、弱陽性とは、該当する臨床検査及びアッセイについてＩＵ値がＵＬＮを超えるが、ＵＬＮの３倍以下である場合を指し、強陽性とは、該当する臨床検査及びアッセイについてＩＵ値がＵＬＮの３倍を超える場合を指す。リウマチ因子（ＲＦ）について陽性または陰性の情報のみが得られている場合、陽性結果はＲＦについて弱陽性と見なしてスコア化する。ＡＣＰＡ＝抗シトルリン化タンパク質抗体。
‡‡正常／異常は、各施設の臨床検査基準により判断する。ＣＲＰ＝Ｃ反応性タンパク質、ＥＳＲ＝赤血球沈降速度。
§§症状の持続期間とは、評価時点で臨床的に罹患が確認される関節について、患者が自己申告する滑膜炎の徴候または症状（例えば、疼痛、腫脹、圧痛）の持続期間を指す（治療の有無は問わない）。
【００９８】
本発明による抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は、診断で、または研究ツールとして使用することができる。例えば、本発明による１つ以上の抗体は、シトルリン化ＨＬＡ−ＤＲ４共有エピトープ（サイトカイン産生の上方調節（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１７）、Ｔ細胞増殖及び他の炎症誘発性細胞の動員を含むＴ細胞媒介免疫活性の促進における原因物質）を有する抗原提示細胞の存在を試験するための診断用キットに陽性対照として含まれてもよい。
【００９９】
インビトロで使用される場合の抗体またはその特異的結合断片についての好適な濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとすることができる。低バックグラウンドで（良好な信号対雑音比で）好適なシグナルを生成する適切な濃度は、当業者によって見出され得る。抗体の希釈に好適な媒体もまた当該技術分野において既知であり、例えば、任意にＢＳＡを補充したリン酸緩衝生理食塩水とすることができる。
【０１００】
本発明の１つのさらなる態様は、本発明による抗体を含む診断用キットである。このようなキットは、好ましくは、ＥＬＩＳＡプレート、フローサイトメトリー、または抗体分析用の他のプラットフォーム、加えて標識化抗ヒト抗体などの抗体検出用試薬及び好適な緩衝液を含む。したがって、本発明による抗体は、インビトロ診断用に使用することができる。いくつかの実施形態では、対象は、患者の白血球の表面上に存在するシトルリン化エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡの存在について最初にスクリーニングされ得る。この診断試験は、本発明による抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を用いて実行することができる。いくつかの実施形態では、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片は、検出部分、例えば、蛍光タンパク質または試薬（例えば、フルオレセイン、またはＧＦＰ）、放射性標識、化学発光標識などで標識される。患者の白血球、例えば、抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞）の表面上のシトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡの存在は、本明細書に定義される自己免疫疾患を有する対象が、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を用いて治療可能であり得ることを示す。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＲＡを有することが確認され得ないが、治療の好適な候補であり得る対象は、シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡを保有しているかどうかを決定するために、１つ以上の診断試験を実行しておくことができる。いくつかの実施形態では、診断試験は、末梢血Ｂ細胞上のシトルリン化共有エピトープの存在を検出するために使用されるであろう。いくつかのアッセイ、例えば、１）抗Ｃｉｔ  ＳＥ  ｍＡｂを用いるフローサイトメトリー、２）サンドイッチ内の補捉抗体として同じｍＡｂ（例えば、ＩＦ９モノクローナル抗ＱＫＣｉｔＡＡ  ＳＥ  ＨＬＡ−ＤＲ４抗体、及び非シトルリン化天然エピトープを認識する第２の抗ＤＲ４  ｍＡｂ）を用いる細胞溶解物のＥＬＩＳＡ、及び３）試験される対象に由来するＢ細胞溶解物からの免疫沈降ＨＬＡ−ＤＲ４の質量分析法を使用することができる。免疫沈降は、任意の抗ＨＬＡ−ＤＲ４  ｍＡｂ（例えば、抗ＤＲ４  ｍＡｂ（Ｌ２４３））を使用することができる。免疫沈降された物質は、次いで、トリプシン消化を受け、得られたペプチドは、ＬＣ−質量分析またはＭＳを用いて解明かつ特定することができ、これは、シトルリン化エピトープペプチドが、エピトープＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、またはＲＲＲＡＡ中のアルギニン残基のうちの１つがシトルリン化されていない場合、より大きいことが予期される質量を有するためである。いくつかの実施形態では、診断アッセイは、抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を用いる治療から恩恵を被ることができる対象を特定するために使用することができる。本診断アッセイにおいて、ＲＡ患者におけるリウマチ滑膜の分子イメージングは、単一光子放射断層（ＳＰＥＣＴ）イメージングでは９９ｍＴｃで標識された、または光学イメージングでは、近赤外染料（ＮＩＲ）で標識された、本発明の抗シトルリン化共有エピトープＱＫＣｉｔＡＡ、ＱＲＣｉｔＡＡ、またはＲＲＣｉｔＡＡ抗体もしくはその抗原結合断片を用いて実行され得る。
【実施例】
【０１０２】
実施例１．シトルリン化ＥＱＫＣｉｔＡＡペプチドハプテンに対するモノクローナル抗体の産生
マウスの免疫化
アミノ酸配列Ｃ−アミノヘキサン酸−ＥＱＫＣｉｔＡＡを有するペプチドを、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌの科学者が設計し、その合成をＬｅｆｅＴｅｉｎ，ＬＬＣに委託した。Ｎ末端システイン（Ｃ）を、担体タンパク質への化学結合を可能にするために組み込んだ。アミノヘキサン酸は、担体タンパク質と所望のハプテンとの間に物理的空間を提供するリンカーである。ＤＲＢ１＊０４０１からの合計で６つのアミノ酸、アミノ酸６９〜７４（ＥＱＫＲＡＡ）が、通常７２位で見られるアルギニン（Ｒ）が、アミノ酸シトルリン（Ｃｉｔ）によって置き換えられた状態で、ハプテンとして含まれた。市販のキット（Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、このペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質に連結させて、「免疫原」を生成した。
【０１０３】
免疫原を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２００μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。０日目に、１ｍｌの免疫原を１ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合して、乳化させた。３匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをそれぞれ、５０μｇの免疫原：ＣＦＡエマルジョンにより腹腔内（ＩＰ）で免疫化した。１４日目及び３４日目に、１ｍｌの免疫原を１ｍｌの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合して、乳化させた。３匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスのそれぞれに、５０μｇの免疫原：ＩＦＡエマルジョンをＩＰで再度注射（追加免疫）した。６５日目に、５０μｇの免疫原を、アジュバントなしに尾静脈に注射した。６８日目に、１匹のマウスを犠死させて、ハイブリドーマ産生のために脾臓を採取した。
【０１０４】
モノクローナル抗体の産生
無菌単一細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ−１６４０基本培地中でマウス脾臓細胞から作製した。脾臓中の赤血球を、ＴＲＩＳ緩衝塩化アンモニウムによる処理によって溶解させた。残りの白血球を、ＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁させて、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と、５：１の脾臓細胞／骨髄腫比で合わせた。細胞をペレット状にして、液体を吸引し、細胞ペレットを５０％のポリエチレングリコールで処理して、細胞融合及びハイブリドーマ形成を誘導した。融合細胞を９６ウェルの組織培養プレートに播種し、ＨＡＴ培地中で増殖させて、ハイブリドーマを選択した。選択から１０日後に、上清を、免疫原のペプチド部分に結合することが可能なモノクローナル抗体の存在について試験した。このスクリーニングは、プレート結合したハプテンペプチド（Ｃ−アミノヘキサン酸−ＥＱＫＣｉｔＡＡ）に対するＥＬＩＳＡによって行った。同様に、選択性を決定するためのカウンタースクリーニングを、シトルリンの代わりにアルギニンを含有するレート結合対照ペプチド（Ｃ−アミノヘキサン酸−ＥＱＫＲＡＡ）に対するＥＬＩＳＡによって行った。１つのモノクローナル抗体、１Ｆ９は、シトルリン含有ペプチドに結合するが、アルギニン含有ペプチドには結合しないことが判明した。このモノクローナル抗体を、プレート結合したヒトアルファエノラーゼ、シトルリン化ヒトアルファエノラーゼ、ヒストンＨ３（完全長タンパク質）、シトルリン化ヒストンＨ３（完全長タンパク質）、ヒストンＨ３テールペプチド（アミノ酸１〜２１）、及びシトルリン化ヒストンＨ３テールペプチド（Ｒ２、Ｒ８、及びＲ１７においてシトルリン化）への結合について、ＥＬＩＳＡでさらに特性化した。１Ｆ９抗体は、シトルリン化ハプテンペプチド（Ｃ−アミノヘキサン酸−ＥＱＫＣｉｔＡＡ）だけに結合した。これは、シトルリン化されているか、もしくはシトルリン化されていない、試験したいかなる他のペプチドまたはタンパク質にも結合しなかった。これは、１Ｆ９モノクローナル抗体が、共有エピトープ配列のシトルリン化型に特異的であることを示している。１Ｆ９モノクローナル抗体の特異的な結合が、共有エピトープ配列のシトルリン化型に特異的であるとの発見をサポートするために、様々な抗原を９６ウェルプレートに置き、様々な濃度の１Ｆ９モノクローナル抗体を用いてスクリーニングした。プレートをコートするために使用された抗原は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＲＡＡ）、シトルリン化ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ＥＱＫＣｉｔＡＡ）、エノラーゼ、シトルリン化エノラーゼ、Ｈ３タンパク質及びシトルリン化Ｈ３タンパク質を含んだ。図２Ａ及び２Ｂに示すように、１Ｆ９モノクローナル抗体は、シトルリン化ペプチドに特異的に結合する。ペプチド（例えば、Ｈ３（１−２１）ペプチド及びシトルリン化Ｈ３ペプチド（１−２１）（２、８、及び１７位でのＣｉｔアルギニン）を用いて、１Ｆ９モノクローナル抗体の特異性を試験した場合でも、シトルリン化ＭＨＣクラスＩＩペプチドだけが、１Ｆ９モノクローナル抗体に特異的に結合した。
【０１０５】
実施例２．インビトロで組換えＰＡＤ４を用いたＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスからのＢ細胞上でのＤＲＢ１＊０４０１タンパク質のシトルリン化
内因性マウスＭＨＣクラスＩＩ発現の不在下でヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１遺伝子を発現するマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ、モデル＃４１４９−Ｆまたは４１４９−Ｍから得る。これらのマウスの脾臓からのＢ細胞は、共有エピトープアミノ酸配列ＱＫＲＡＡを含有するＤＲＢ１＊０４０１ベータ鎖を含む、ＨＬＡ−ＤＲ４ヘテロ二量体タンパク質をそれらの表面上で発現する。これらのマウスのうちの１匹からの脾臓を無菌条件下で採取し、その開示が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ３．１，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ”に記載されるように、単一細胞懸濁液を生成する。脾臓細胞を、１ｍＭのＣａＣｌ２を補充したＴＲＩＳ緩衝生理食塩溶液中に、１×１０７細胞／ｍｌで懸濁される。
【０１０６】
脾臓細胞の０．５ｍＬのアリコートを、組換えヒトＰＡＤ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号＃１０５００、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ  ＵＳＡ）で、１ｍＬ当たり０、０．０５、０．２、１及び５μｇで、３０分間、３７℃で処理する。細胞を１５０×ｇで５分間遠心分離して、上清を廃棄し、細胞ペレットを０．２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のウシ血清アルブミン及び０．０１％のアジ化ナトリウムで補充したハンクス平衡塩類溶液）中に再懸濁させる。
【０１０７】
この細胞懸濁液に、２μＬのＦＩＴＣ複合化抗Ｂ２２０  ＭＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ＃１０３２０５）及び２マイクログラムのＡＰＣ複合化１Ｆ９  ｍＡｂを添加する。抗Ｂ２００は全てのＢ細胞を染色し、１Ｆ９  ｍＡｂは、シトルリン化共有エピトープを発現するＢ細胞のみを染色する。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、１５０×ｇで遠心分離し、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁される。細胞は、フローサイトメトリーによって分析される。ＰＡＤ４の処理は、１Ｆ９抗体によってその後認識されるＤＲＢ１＊０４０１鎖の共有エピトープ領域のシトルリン化をもたらす。
【０１０８】
実施例３．ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスからのＢ細胞上でのＤＲＢ１＊０４０１タンパク質のシトルリン化がＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を誘導する
組換えヒトＰＡＤ４（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号＃１０５００、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ  ＵＳＡ）をヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号Ａ−１０６６６）に、ＳｏｌｕｌｉｎｋからのＳ−ＨｙＮｉｃ／４ＦＢコンジュゲーション技術（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｓ−１００２、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ＵＳＡ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、１：１のモル比で、化学的に結合させる。本質的に、組換えヒトＰＡＤ４は、Ｓ−ＨｙＮｉｃリンカー（スクシンイミジル−６−ヒドラジノ−ニコチンアミド）に複合化され、ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ抗体に結合された４ＦＢ（４−ホルミルベンズアミド）リンカーを介してヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ抗体に複合化される。ＨｙＮｉｃ修飾組換えヒトＰＡＤ４を、ＴｕｒｂｏＬｉｎｋ（商標）触媒コンジュゲーション反応において、製造業者のプロトコールに従って（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｓ−２００６−１０５、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ＵＳＡ）、４ＦＢ修飾ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ抗体と共にインキュベートする。
【０１０９】
その結果、３５４ｎｍにおいて測定可能な吸光度を有する、ＵＶトレース可能な安定な結合（ビス−アリールヒドラゾン）を介して複合化された組換えヒトＰＡＤ４／ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ抗体複合体となる。この「ＰＡＤ４／抗マウスＩｇ複合体」を、完全培地中１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、滅菌濾過して、４℃で保存する。
【０１１０】
内因性マウスＭＨＣクラスＩＩ発現の不在下でヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１遺伝子を発現するマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから得る（Ａｂｂノックアウト／トランスジェニックＨＬＡ−ＤＲ４、カタログ番号４１４９−Ｆまたは４１４９−Ｍ、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ  ＵＳＡ）。これらのマウスの脾臓からのＢ細胞は、共有エピトープ配列ＱＫＲＡＡを含有するＤＲＢ１＊０４０１ベータ鎖を含む、ＨＬＡ−ＤＲ４ヘテロ二量体タンパク質をそれらの表面上で発現する。これらのマウスのうちの１匹からの脾臓を無菌条件下で採取し、その開示が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ３．１，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ”に記載されるように、単一細胞懸濁液を生成する。脾臓細胞を、「完全培地」（１０％のウシ胎児血清、１ｍＭのＣａＣｌ２、及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０）中に、２×１０６／ｍＬの濃度で懸濁させて、氷上で４℃にて３０分間冷却する。
【０１１１】
１０ｍｌ（合計で２×１０７個の細胞）の脾臓細胞懸濁液を、４℃にて１５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄して、細胞ペレットを１ｍＬの４℃の完全培地中に再懸濁させる。この１ｍＬの脾臓細胞懸濁液に、１００μＬの無菌ＰＡＤ４／抗マウスＩｇ複合体を添加し、氷上で１時間インキュベートする。次いで、細胞を、４℃にて１５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄して、細胞ペレットを１０ｍＬの４℃の完全培地中に再懸濁させる。細胞を、４℃にて１５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄して、細胞ペレットを１０ｍＬの４℃の完全培地中に再懸濁させる。この懸濁液中のＢ細胞上の膜面免疫グロブリン受容体が、ここで抗マウスＩｇ／ＰＡＤ４複合体によって結合され、未結合複合体を洗い流す。
【０１１２】
シトルリン化共有エピトープに結合する１Ｆ９モノクローナル抗体を、完全培地中、１ｍｇ／ｍＬで希釈し、滅菌濾過して、使用の準備ができるまで４℃で保持する。
【０１１３】
滅菌９６ウェル丸底マイクロタイタープレートにおいて、脾臓細胞及び抗体を混合し、以下の条件で培養する：
Ａ．ＰＡＤ４／抗マウスＩｇ複合体で処理されていない１００μＬの脾臓細胞懸濁液（２×１０５個細胞）を含有する６つのウェルに、１００μＬの完全培地を加える。
Ｂ．ＰＡＤ４／抗マウスＩｇ複合体で処理されている１００μＬの脾臓細胞懸濁液（２×１０５個細胞）を含有する６つのウェルに、１００μＬの完全培地を加える。
Ｃ．ＰＡＤ４／抗マウスＩｇ複合体で処理されていない１００μＬの脾臓細胞懸濁液（２×１０５個細胞）を含有する６つのウェルに、１００μＬの１Ｆ９モノクローナル抗体希釈物を加える。
Ｄ．ＰＡＤ４／抗マウスＩｇ複合体で処理されている１００μＬの脾臓細胞懸濁液（２×１０５個細胞）を含有する６つのウェルに、１００μＬの１Ｆ９モノクローナル抗体希釈物を加える。
【０１１４】
９６ウェルを３７℃のＣＯ２インキュベータに移し、７２時間置く。培養の７２時間後に、それぞれの条件での６つのウェルのうちの３つについての上清を取り出し、ＴＮＦ−αの産生をＥＬＩＳＡによって、製造業者の使用説明書に従って評価する（例えば、ＴＮＦ−α（マウス）ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号５００８５０、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ  ＵＳＡを参照）。各条件での残りの３つのウェルについては、各ウェルにおけるＴ細胞増殖の度合いを、その開示が、全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｕｎｉｔ  ７．１０．１６，Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ２に記載されるように、３Ｈ−チミジンの取込みによって評価する。
【０１１５】
ＴＮＦ−αの産生またはＴ細胞増殖は、条件ＡまたはＣの下では検出されていない。最高レベルのＴＮＦ−αの産生及びＴ細胞増殖が、条件Ｂの下で検出されている。中間レベルのＴＮＦ−α及びＴ細胞増殖が、条件Ｄの下で検出されている。
【０１１６】
実施例４．ＲＡ患者から単離したＢ細胞上でのシトルリン化ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１の特定
抗シトルリン化タンパク質抗体陽性（ＡＣＰＡ＋）関節リウマチを有するヒト患者及び健常な対照から得られる新たに採取した末梢血を、Ｄｘ  Ｂｉｏｓａｍｐｌｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ  ＵＳＡ）（または他の有資格供給メーカー）から購入する。各血液試料２ｍＬを、２０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  カタログ＃Ａ１０４９２０１）に添加し、１０分間室温で放置して赤血球を溶解させる。次いで、試料を１５０×ｇで５分間遠心分離し、生白血球を含有する細胞ペレットを、２ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１０ｍＭのヨードアセトアミド、及びタンパク質分解酵素抑制剤（Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁させる。溶解物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、不溶性物質を除去する。浄化した溶解物を新しい管に移し、５０μＬのセファロースビーズ−と共に、４℃で３０分間インキュベート（プレクリアー）する。溶解物を、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、セファロースをペレット状にする。プレクリアーした溶解物を、新しい管に移し、１００μｇのマウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ［Ｌ２４３］モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体［Ｌ２４３］、カタログ番号ａｂ１３６３２０、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ＵＳＡ）に共有結合したセファロースビーズ５０μＬを溶解物に添加し、回転させながら１時間インキュベートする。溶解物及びＬ２４３−セファロースを、回転させながら４℃で４時間インキュベートする。管を、卓上小型微量遠心機において１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレット状のＬ２４３−セファロース複合体から上清を廃棄する。Ｌ２４３−セファロース複合体を、１ｍＬの溶解緩衝液で洗浄し、続いて、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する洗浄溶液１ｍＬで洗浄する。０．５ｍＬの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０を添加することによって、ＨＬＡ−ＤＲ分子を、Ｌ２４３−セファロース複合体から溶出させる。溶出したＨＬＡ−ＤＲ４分子を、トリプシン消化アミノ酸分析のために、ＭＳ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ，ＵＳＡ）に送り、共有エピトープ領域ＱＫＲＡＡのシトルリン化があるかどうかを決定する。
【０１１７】
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、上記の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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