(57)【要約】本発明は、非病原性微生物を用いた１ステップ発酵によって（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸またはその塩を調製するプロセスに関する。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の発酵は、特定の炭素源と窒素源を供給して行った。これらの微生物は、グルタミン酸細菌ＨＲ０５７菌株、または遺伝子操作したコリネバクテリウム・グルタミカムの一種を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非病原性微生物を用いて発酵ブロスを発酵させるステップを含む（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の生成プロセスであって、前記発酵ブロスが、炭素源と、窒素源と、非病原性微生物を用いて過剰発現させた酵素とを含み、前記炭素源と窒素源が、前記非病原性微生物を用いた１ステップ発酵によって（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に直接変換され、前記（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が、発酵中に排出された後に発酵ブロスから回収され、このとき、前記非病原性微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ブレビバクテリウム・フラバム、およびブレビバクテリウム・ブレベ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）から成る群から選択され、かつ前記非病原性微生物が、ピルビン酸と補酵素ＡをアセチルＣｏＡに変換し、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換し、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換し、かつアセト酢酸を（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する生体内変化能を有しているプロセス。
【請求項２】
前記非病原性微生物を用いて過剰発現させた酵素が、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ、および３−ＨＢデヒドロゲナーゼから成る群から選択される要素を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記微生物が、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼと３−ＨＢデヒドロゲナーゼとを過剰発現させる、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記非病原性微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム、グルタミン酸細菌ＨＲ０５７、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル、ブレビバクテリウム・フラバム、またはブレビバクテリウム・ブレベである、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはグルタミン酸細菌ＨＲ０５７である、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム・グルタミカムが、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１で寄託されている、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記炭素源が、グルコース、スクロース、マルトース、糖蜜、デンプン、およびグリセロールから成る群から選択される要素を含む、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記窒素源が、有機窒素源と無機窒素源から成る群から選択される要素を含む、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記有機窒素源が、コーンスティープリカー、糠加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、酵母粉末、ペプトン、および尿素から成る群から選択される要素を含む、請求項１〜９のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記無機窒素源が、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、およびアンモニア水から成る群から選択される要素を含む、請求項１〜１０のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が細菌性エンドトキシンを含まず、９５％以上の純度を有する、請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩ナトリウム塩、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩カリウム塩、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩マグネシウム塩、または（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩カルシウム塩の形態で調製される、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１４】
請求項１２に記載のプロセスにおける（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のラセミ化処理によって調製されるラセミ３−ヒドロキシ酪酸。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプロセスにおける（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩のラセミ化処理によって調製されるラセミ３−ヒドロキシ酪酸。
【請求項１６】
コリネバクテリウム・グルタミカム、グルタミン酸細菌ＨＲ０５７、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル、ブレビバクテリウム・フラバム、およびブレビバクテリウム・ブレベから成る群から選択される非病原性微生物。
【請求項１７】
前記非病原性微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株またはグルタミン酸細菌ＨＲ０５７菌株である、請求項１６に記載の非病原性微生物。
【請求項１８】
前記非病原性微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム菌株である、請求項１７に記載の非病原性微生物。
【請求項１９】
前記コリネバクテリウム・グルタミカム菌株が、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１で寄託されている、請求項１８に記載の非病原性微生物。
【請求項２０】
前記微生物が、請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載の１ステップ発酵プロセスで（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成できる、請求項１６に記載の非病原性微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体工学の分野、具体的には、微生物発酵による（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸およびその塩の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２０１７年４月４日に出願された米国仮出願第６２／４８１，４７６号の優先権を主張するものであり、この出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩（３−ＨＢ）はＣＡＳ番号が６２５−７２−９の光学活性キラル化合物である。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、哺乳類の肝臓における長鎖脂肪酸の代謝によって生成される。また、主要なケトン体として血漿および末梢組織に存在し、体内の大部分の組織でエネルギー源として用いることができる。
【０００４】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、多くの疾患の治療や栄養機能にも好ましい影響をもたらす。例えば、ケトン値の上昇によって生じる多くの疾患（てんかんやミオクローヌスなどの神経障害、アルツハイマー病や認知症などの神経変性疾患など）の治療に用いることができる。コエンザイムＱの酸化に伴うフリーラジカルによる損傷（虚血など）を低減できる。トレーニング効率と運動能力を改善することにより、代謝効率を高め、担体不良、アンギナ、心筋梗塞などの治療を達成できる。また、脳腫瘍などのがん関連疾患（星細胞腫など）の治療にも使うこともできる。さらに、グルコース代謝疾患（例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、ケトン性低血糖症など）の治療によい影響を及ぼす。骨減少症、骨粗鬆症、重度の骨粗鬆症および関連する骨折の管理に用いることができる。こうした機能、治療効果、栄養効果があることから、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその塩は、健康価値や薬効が高い食品添加物や医薬品として用いることができる。
【０００５】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は主に化学的方法で調製されている。これは、直接化学合成によって作成、またはポリ−３−ヒドロキシ酪酸塩とポリ−３−ヒドロキシ酪酸デポリメラーゼとの酵素分解によって調製できる。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の化学合成には、高温、高圧、および高価なキラル金属触媒が必要である。ポリ−３−ヒドロキシ酪酸の酵素分解プロセスには、大量の有機溶剤と、出発原料として極めて純粋なポリ−３−ヒドロキシ酪酸塩が必要である。反応時間の長さに加え、反応生成物のラセミ化の制御が難しい。さらにこの方法は、コストが高く効率が悪いため、工業規模での実用化に必要な高い条件を満たすには、研究室でさらに最適化させる必要がある。
【０００６】
現在、市販の３−ヒドロキシ酪酸の大部分は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸の比率が約１対１のラセミ混合物である。（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸は生理的に非活性であることが試験で示されているものの、ラセミ３−ヒドロキシ酪酸とその塩、特にナトリウム塩は、なおも主要な商品形態であり、多くの消費者に受け入れられている。単一光学活性（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその塩は、将来普及し、ラセミ３−ヒドロキシ酪酸とその塩に置き換わることが予想される。
【０００７】
一般に、天然化合物または生体化合物は、化学的に生成された化合物よりも安全（かつ非毒性）だと考えられており、薬剤、食品、化粧品の成分の原料に「天然」または「生物学的」という特徴がある方が好まれる。薬剤、食品、化粧品の製造者は、マーケティング目的で、同じ製品を生産するのに、化学的プロセスから生物学的プロセスに置き換えることに積極的である。そのため、主な方法である化学的方法の代わりに、生物学的方法で（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成することが目指されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生物学的方法で「安全で非毒性の」（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成するために、本発明者がさまざまな生物学的方法を試験したところ、思いがけず、宿主として非病原性微生物を用いた発酵手順によって、非常に効率的な１ステッププロセスで（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成できることがわかった。最適に操作した有機体を、遺伝子工学技術によってスクリーニングおよび選定し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の主要代謝経路に関連する遺伝子の発現を増強するとともに、分岐代謝経路を減衰させた。そうすることで、発酵プロセスで（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を効率的に蓄積させることができる。これは工業規模での幅広い利用が見込まれる。
【０００９】
したがって本発明は、一態様において、（例えば、１ステップ法で）（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を効率的に生成する生物学的プロセスを提供する。別の態様において、本発明は食品グレードの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその塩を提供する。さらに別の態様において、本発明は、市場のニーズを満たす食品グレードのラセミ３−ヒドロキシ酪酸とその塩を提供する。またさらに別の態様において、本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成する発酵培地を発酵させることのできる細菌をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
具体的には、本発明の一態様は、非病原性微生物を含む発酵ブロスを発酵させるステップを含む、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成するプロセスを提供する。このプロセスにおいて、発酵ブロスは、炭素源と、窒素源と、非病原性微生物を用いて過剰発現させた酵素とを含み、炭素源と窒素源は、非病原性微生物を用いた１ステップ発酵によって（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に直接変換され、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、発酵中に排出された後に発酵ブロスから回収され、非病原性微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ブレビバクテリウム・フラバム、およびブレビバクテリウム・ブレベ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）から成る群から選択される。また、非病原性微生物は、ピルビン酸と補酵素ＡをアセチルＣｏＡに変換し、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換し、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換し、かつアセト酢酸を（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する生体内変化能を有している。
【００１１】
いくつかの実施形態では、非病原性微生物を用いて過剰発現させた酵素は、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ、および３−ＨＢデヒドロゲナーゼから成る群から選択される要素を含む。いくつかの好ましい実施形態では、微生物は、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼと３−ＨＢデヒドロゲナーゼとを過剰発現させる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、非病原性微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム、グルタミン酸細菌ＨＲ０５７、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル、ブレビバクテリウム・フラバム、またはブレビバクテリウム・ブレベを含む。いくつかの好ましい実施形態では、微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはグルタミン酸細菌ＨＲ０５７を含む。いくつかのさらに好ましい実施形態では、微生物は（例えば、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１で寄託されている）コリネバクテリウム・グルタミカムである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、炭素源は、グルコース、スクロース、マルトース、糖蜜、デンプン、およびグリセロールから成る群から選択される要素を含む。いくつかの別の実施形態では、窒素源は、有機窒素源と無機窒素源から成る群から選択される要素を含む。適切な有機窒素源の例として、コーンスティープリカー、糠加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、酵母粉末、ペプトン、および尿素が挙げられるがこれに限定されない。また、適切な無機窒素源の例として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、およびアンモニア水が挙げられるがこれに限定されない。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明のプロセスで生成される（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は細菌性エンドトキシンを含まず、９５％以上の純度を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明のプロセスで生成される（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩ナトリウム塩、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩カリウム塩、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩マグネシウム塩、または（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩カルシウム塩の形態である。
【００１６】
本発明の別の態様では、本発明のプロセスに従って生成される（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩のラセミ化処理によって調製されるラセミ３−ヒドロキシ酪酸が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様では、コリネバクテリウム・グルタミカム、グルタミン酸細菌ＨＲ０５７、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル、ブレビバクテリウム・フラバム、およびブレビバクテリウム・ブレベから成る群から選択される非病原性微生物が提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、非病原性微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株またはグルタミン酸細菌ＨＲ０５７菌株である。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株は、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１で寄託されている。
【００１９】
いくつかの好ましい実施形態では、非病原性微生物は、本発明の１ステップ発酵プロセスで（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成できる。
【００２０】
本発明は、以下の技術計画を含む。
【００２１】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の発酵は、非病原性微生物を用いて行い、この非病原性微生物は、炭素源と窒素源を、発酵ブロスに排出されて直接回収できる（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に直接変換する。微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル、ブレビバクテリウム・フラバム、およびブレビバクテリウム・ブレベから成る群から選択される１つまたは複数の要素であってよい。これらの微生物は、ピルビン酸と補酵素ＡをアセチルＣｏＡに変換し、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換し、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換し、次いでアセト酢酸を（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する生体内変化能を有している。
【００２２】
好ましくは、微生物が、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ、および３−ＨＢデヒドロゲナーゼ（３−ＨＢデヒドロゲナーゼ、ＢＤＨ）から成る群から選択される１つまたは複数の酵素を過剰発現させる。
【００２３】
より好ましくは、微生物がスクシニルＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ＨＢデヒドロゲナーゼを過剰発現させる。
【００２４】
好ましくは、微生物がβ−ケトチオラーゼの発現を阻害または下方制御する。
【００２５】
好ましい実施形態では、微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、コリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１で寄託されているものである。
【００２７】
発酵プロセスにおいて、異なる微生物のために異なる培地を用いてもよい。炭素源は、グルコース、スクロース、マルトース、糖蜜、デンプン、およびグリセロールから成る群から選択してよい。発酵培地で、１つまたは複数の有機窒素源または無機窒素源を使用してもよい。有機窒素源は、コーンスティープリカー、糠加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、酵母粉末、ペプトン、および尿素から成る群から用いてよく、また、無機窒素源は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、およびアンモニア水から成る群から選択される１つまたは複数の化合物を含んでよい。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、発酵培地はグルコースを７５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーを２５〜３０ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4を２０ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4を１．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．５ｇ／Ｌ、尿素を１．０ｇ／Ｌ、ヒスチジンを３０ｍｇ／Ｌ、糖蜜を２５ｇ／Ｌ、ビオチンを１００μｇ／Ｌを含み、コリネバクテリウム・グルタミカムを添加する場合はさらに消泡剤を０．２ｇ／Ｌ含む。
【００２９】
好ましくは、バッチフィード発酵を行う場合、フィード培地は硫酸アンモニウムを５００ｇ／Ｌとグルコースを６５０ｇ／Ｌを含む。
【００３０】
本発明の発酵方法によって調製される（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の純度は、９５％より高いか、９６％より高いか、９７％より高いか、９８％より高いか、さらには９９％より高い可能性がある。
【００３１】
このように調製される純粋な（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、細菌性エンドトキシンや、苦味などの化学臭を含まない。
【００３２】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、塩基を含む塩を形成する酸である。別法として、本発明によって調製される（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、またはカルシウム塩の形態で、好ましくはナトリウム塩の形態で存在してよい。これらの塩はすべて、光学活性化合物であってよい。
【００３３】
ラセミ３−ヒドロキシ酪酸とそのナトリウム塩は、従来、食品製造業者、製薬会社、および消費者に受け入れられてきたことから、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその塩には、ラセミ３−ヒドロキシ酪酸とその塩を調製するラセミ化処理を行うことができる。例えば、ラセミ化は、水酸化ナトリウム溶液などのアルカリ性溶液中で（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を一定時間加熱することによって達成できる。
【００３４】
ラセミ３−ヒドロキシ酪酸塩は、ナトリウム３−ヒドロキシ酪酸塩、カリウム３−ヒドロキシ酪酸塩、マグネシウム３−ヒドロキシ酪酸塩、またはカルシウム３−ヒドロキシ酪酸塩であってよい。
【００３５】
本発明によって調製される（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその塩は、細菌性エンドトキシンや有害化学物質を含まず、そのため食品の安全が確保される。さらに、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は、化学残留物や化学反応不純物を含んでおらず、苦味などの化学臭もないため、薬剤やヘルスケア製品に直接使用できる。
【００３６】
本発明で作成される、遺伝子操作された微生物は、発酵プロセス中に発酵ブロスに（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を効率的に生成および蓄積でき、また下流プロセスによって、幅広い工業利用の可能性がある食品グレードの（Ｒ）体を生み出すことができる。
【００３７】
コリネバクテリウム・グルタミカムは、高収率で（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成するよう操作されている。この微生物の菌株は、２０１６年１０月１４日にＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１の受託番号で、１００１０１中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所に位置するＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託されている（ｗｗｗ．ｃｇｍｅｅ．ｎｅｔ）。
【００３８】
本明細書で使用する用語「１ステップ発酵」は、所望の生成物を得るために発酵させる発酵培地に、１つまたは複数の発酵剤（例えば、微生物）を添加するステップを含み、２回目の発酵剤を添加して２回目の発酵プロセスを行う必要のない発酵プロセスを指す。
【００３９】
本明細書で使用する用語「非病原性微生物」は、一般に別の微生物、生命体、またはヒトに、疾患、危害、死をもたらさない微生物を指す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下に、具体的な実施形態で本発明をさらに詳しく述べる。以下の実施例は、本発明を説明することを目的としており、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４１】
本発明では、別段の規定、説明、または定義がない限り、複数の物質の添加量、含量、濃度などは、質量百分率で表される。
【００４２】
本発明の実施形態では、別段の規定、説明、または指定がない限り、通常は室温（１５〜３０℃）で表される。
【００４３】
本発明では、発酵によって（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成できる微生物菌株として、「コリネバクテリウム・グルタミカム」、「コリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１」、または「グルタミン酸細菌ＨＲ０５７」を例示しているが、これに限定されない。
【００４４】
本発明では、消費者、製薬会社、および食品製造業者に、「自然化された」または「生物起源である」原料の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその塩を提供するために、微生物による（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の発酵を調査した。
【００４５】
本発明者は、遺伝子操作した菌株を作成するために、種をスクリーニングおよび選定した。大腸菌など病原性を有する可能性のある一般菌株は考慮されない。コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・ディフィシル、ブレビバクテリウム・ブレベ、およびブレビバクテリウム・ブレビカ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃａ）など、非病原性微生物を発酵菌株として選択し、遺伝子操作した。発酵によって（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生成できるいくつかの菌株がスクリーニングで得られた。発酵中、多くの人に害を及ぼす可能性のあるエンドトキシンはまったく産生されなかった。そのため、「非毒性で無害な」デザインと考えられる。
【００４６】
発酵中に高収量で（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を得るには、溶存酸素、温度、ｐＨなどのパラメータを調整および制御する必要がある。
【００４７】
発酵中、一定ｄＯ２は１５〜２５％に制御される。発酵は以下の条件下で行うことができる。通気量は約１ｖｖｍで、このときｖｖｍはタンク内の液体の実体積に対する毎分換気量の比率である（例えば、３０Ｌの発酵ブロスが入った発酵槽では１ｖｖｍは３０Ｌ／分に相当し、５Ｌの発酵ブロスが入った発酵タンクなら１ｖｖｍは５Ｌ／分に相当する）。
【００４８】
好ましくは、温度はまず発酵の初期に３０〜３２℃に制御し、その後、発酵の後期に、微生物による（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の合成と排出を促す３４〜３７℃に上昇させる。
【００４９】
ｐＨは、全般的にｐＨ６．０〜８．０に、好ましくは、発酵の初期にはｐＨ６．５〜７．０に制御する。発酵の後期に６．８〜７．０に調整し、発酵ブロスからの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の合成と排出を促してもよい。
【００５０】
上記の用語「発酵の後期」は、微生物増殖の指数期から静止期を指す。例えば、ＯＤ６００ｎｍ値で細胞密度を測定した場合、ＯＤ６００ｎｍ値はこれ以上上昇せず、低下傾向にある。
【００５１】
発酵プロセス中、残糖は１．０〜３．０％に、より正確には１．５〜２．５％に制御される。
【００５２】
発酵が終了した後、発酵ブロスを回収する必要があり、そこから（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を抽出する。例えば、発酵ブロスの上清を遠心分離によって得る。上清は必要に応じて濃縮し、精製および乾燥などの後処理によって、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を分離する。
【００５３】
発酵培地にある細胞と高分子は、ろ過（限外ろ過、ナノろ過などを含む）によって除去することができる。必要に応じて、濃縮ろ過や、例えば乾燥、精製などその他の後処理手段を用いて（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を分離してもよい。別法として、発酵ブロスの上清を得る遠心分離によって（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を分離し、次いで、限外ろ過、ナノろ過などの方法で高分子を除去するか、必要に応じて濃縮ろ過を行い、次いで、乾燥、精製などの後処理手段を用いることができる。
【００５４】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を調製するために、同量の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を、対応する塩基または金属酸化物、例えば水酸化ナトリウムと反応させる。反応温度は、３０℃以下、好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下に制御し、それにより、できるだけラセミ反応が避けられる。
【００５５】
調製プロセス全体で有機溶剤を必要としない、または用いないため、苦味のような化学臭が生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸から検出されなかったことから、生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を調剤やヘルスケア製品の製造に直接用いることができる。
【実施例１】
【００５６】
前培養と発酵
−８０℃で保管しておいたグリセロールストックＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１３１１１を解凍し、５００ｍＬ種培地（７５ｇ／Ｌのグルコース、２５〜３０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．５ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．０ｇ／Ｌの尿素、３０ｍｇ／Ｌのヒスチジン、２５ｇ／Ｌの糖蜜、１００μｇ／Ｌのビオチン、ｐＨ７．０）を入れた５０００ｍＬフラスコに接種し、３０℃で１８時間培養した。ＯＤ＝０．４〜０．５のときに種培養物の培養を終了した。
【００５７】
５００ｍＬの種培養物を、５Ｌの培地が入った７Ｌの発酵槽に接種した。発酵培地の組成は上述の種培地と同じであり、滅菌後、ｐＨは６．４〜６．７に制御した。フィード培地は５００ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと６５０ｇ／Ｌのグルコースを含んでいる。発酵温度は３０℃に設定し、タンク圧は０．０５Ｍｐａに維持し、初期換気率を１ｖｖｍとした。撹拌速度は６００ｒｐｍだった。発酵のｐＨは約ｐＨ６．５だった。
【００５８】
発酵の後期にｐＨを６．７に制御し、温度を３５℃に上昇させた。換気と撹拌速度を調整し、溶存酸素定数（ｄＯ２）を１５〜２５％に制御した。残糖値を制御するために、糖をゆっくり供給しながら、元の糖の濃度を約３．０％に下げ、残糖の濃度を１．５〜２．０％に制御した。７２時間後に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が１１．８ｇ／Ｌに蓄積した。
【実施例２】
【００５９】
発酵ブロスの分離と（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の抽出
実施例１で得られた５．２Ｌの発酵ブロスを、４５００ｒｐｍで遠心分離し、細胞を廃棄した。上清は１％珪藻土でろ過した。１％活性炭を混合して３０分間撹拌した後、清澄なろ液を回収した。
【００６０】
ろ液はナノろ過膜で濃縮し、得られたろ液を７３２陽イオン交換樹脂を通して１０００ｇ／Ｌに濃縮したろ液を得た。濃縮回収物は油性で、温かいうちに回収し、９２．５％の収率で５６．８ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を得た。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の純度は高速液体クロマトグラフィーで測定した。クロマトグラフィーカラムはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ｖｐ−ＯＤＳＣ１８カラム（１５０Ｌ×４．６）であった。移動相はアセトニトリル：水（ｖ／ｖ）＝１５：８５から成り、ＵＶ検出波長は２１０ｎｍ、注入量は２０μＬ、流量は１ｍＬ／分、カラム温度は１０℃であった。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の純度は９８％で、特定光学値は［α］Ｄ２０＝−２５°（Ｃ＝６％、Ｈ2Ｏ）であった。
【実施例３】
【００６１】
ナトリウム（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩の調製
実施例２で得られた５ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と同量の２．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液とを２５℃以下で混合し、中和反応を行った。回転濃縮し、２時間静置してから、吸引ろ過で回収し、６０℃で乾燥させて、最終的に８１％の収率で４．９ｇのナトリウム（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩粉末を得た。塩の融点は１５２℃で、特定光学値は［α］Ｄ２０＝−１４．１°（Ｃ＝１０％、Ｈ2Ｏ）であった。
【実施例４】
【００６２】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸のラセミ化
１０ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を１００ｍＬの２．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液にゆっくり添加し、混合物を６０℃で４時間加熱した。生成物の光学値は室温で０°であった。塩酸を添加し、混合物のｐＨを７．０に調整して中和反応を行った。固形物が認められるまで回転蒸発を行い、２時間静置させ、その後ろ過を行って、８５％の収率で１０．３ｇのナトリウム３−ヒドロキシ酪酸塩粉末を得た。その結果、ラセミ３−ヒドロキシ酪酸塩が得られることがわかった。
【００６３】
まとめると、本発明は、遺伝子組み換えによって操作したコリネバクテリウム・グルタミカムが、１ステッププロセスで高い収率で（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を発酵させ、これが安全で非毒性食品グレードであることが証明されたことを開示した。本発明で開示した遺伝子操作した菌株と製造プロセスには、幅広い工業利用の可能性がある。
【国際調査報告】
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