(57)【要約】本開示の実施形態は、概して、リンカー分子を介して付着する高電荷量部分を有するヌクレオチドを含む、合成ヌクレオチドであるレポーター組成物に関する。重合が影響を受けないように、リンカー分子の長さをある程度変えて、高電荷量部分がＤＮＡポリメラーゼ複合体の外に伸びるようにすることが可能である。
2019503174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドまたはその誘導体と；
第三級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、リン酸基、フェノール性ヒドロキシル基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の荷電基を含んだ芳香族骨格または脂肪族骨格を含む高電荷量部分と；
前記ヌクレオチドまたはその誘導体および前記高電荷量部分に付着したリンカー分子とを含むレポーター組成物であって、
前記１つまたは複数の荷電基は、前記レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性に、検出可能な変化を生じさせるのに十分な電荷量を含み、
前記リンカー分子光切断可能な切断可能リンカー分子は、以下の化合物６〜１０：
【化１】
2019503174.tif 000107
、
それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む、レポーター組成物。
【請求項２】
ヌクレオチドまたはその誘導体と；
以下の化合物１〜５：
【化２】
2019503174.tif 000108
、
それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む、高電荷量部分と；
前記ヌクレオチドまたはその誘導体および前記高電荷量部分に付着したリンカー分子とを含むレポーター組成物であって、
前記化合物は、前記レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性に、検出可能な変化を生じさせるのに十分な電荷量を含み、
前記リンカー分子は、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、アミン基、アミド基、芳香族基、およびナフタレン基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含んだ直鎖または分岐鎖を含む、レポーター組成物。
【請求項３】
前記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、および合成ヌクレオチド、およびそれらの任意のアイソフォームからなる群から選択される、請求項１または２に記載のレポーター組成物。
【請求項４】
前記リンカー分子は光切断可能または化学的に切断可能である、請求項２に記載のレポーター組成物。
【請求項５】
前記化学的に切断可能なリンカー分子は、４−ニトロフェニル２−（アジドメチル）ベンゾエート、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニル２−（アジドメチル）ベンゾエート、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項４に記載のレポーター組成物。
【請求項６】
前記光切断可能な切断可能リンカー分子は、以下の化合物６〜１０：
【化３】
2019503174.tif 000109
、
それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項４に記載のレポーター組成物
【請求項７】
前記直鎖または分岐鎖における、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、アミン基、アミド基、芳香族基、およびナフタレン基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせの数は、１〜１０００である、請求項２に記載のレポーター組成物。
【請求項８】
前記リンカー分子または前記高電荷量部分は、ポリメラーゼによるヌクレオチド重合に影響を与えないように構成される、請求項１〜７の何れか一項に記載のレポーター組成物。
【請求項９】
前記高電荷量部分は、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体の外に伸びるように構成される、請求項１〜８の何れか一項に記載のレポーター組成物。
【請求項１０】
前記リンカー分子または前記高電荷量部分は、前記高感度検出ナノ構造またはセンサに届くように、新生鎖から突出するように構成される、請求項１〜９の何れか一項に記載のレポーター組成物。
【請求項１１】
前記高電荷量部分は、以下の化合物１〜５、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含み：
【化４】
2019503174.tif 000110
式中、前記化合物は、前記レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性に検出可能な変化を生じさせるのに十分な電荷量を含む、請求項１に記載のレポーター組成物。
【請求項１２】
前記高電荷量部分の正味電荷量は、正もしくは負であるか、または、ｐＨに応じて可変的である、請求項１に記載のレポーター組成物。
【請求項１３】
前記高電荷量部分の正味電荷量は、酸性ｐＨでは正である、請求項１に記載のレポーター組成物。
【請求項１４】
前記高電荷量部分の正味電荷量は、アルカリ性ｐＨでは負である、請求項１に記載のレポーター組成物。
【請求項１５】
前記リンカー分子および／または高電荷量部分は、除去可能であるように構成される、請求項１〜１４の何れか一項に記載のレポーター組成物。
【請求項１６】
前記レポーター組成物は、以下の化合物：：
【化５】
2019503174.tif 000111
【化６】
2019503174.tif 000112
それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項１〜１５の何れか一項に記載のレポーター組成物
【請求項１７】
請求項１〜１６の何れか一項のレポーター組成物を含む、ヌクレオチオ配列を決定するためのキット。
【請求項１８】
請求項１〜１６の何れか一項のレポーター組成物を合成する方法であって：
前記ヌクレオチドと前記リンカーの第一官能基の間で第一共有結合を生成するステップであって、前記ヌクレオチドのリン酸基、糖または塩基を、前記リンカーの第一官能基に結合させる、ステップと；
前記リンカーの第二官能基と前記高電荷量部分に存在する任意の官能基の間で第二共有結合を生成するステップとを含む、方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチドは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される三リン酸基を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドのリン酸基はチオホスフェートまたはホスホラミダートを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第１４／９８７，６８７号の継続出願であり、米国特許出願第１４／９８７，６８７号は、２０１４年１０月２３日に出願された米国特許出願第１４／５２２，１８５号の一部継続出願であり、米国特許出願第１４／５２２，１８５号は、２０１４年１０月２８日の米国特許第８，８７１，９２１号に対して発行された、２０１１年３月３日に出願された米国特許出願第１３／０６２，２０６号の継続出願であり、米国特許第８，８７１，９２１号は、２００８年９月３日に出願された米国仮特許出願番号第６１／０９４，０２５号の利益を主張する、アメリカ合衆国を指定する２００９年９月３日を国際出願日とする先のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７０２５号の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第３７１条に基づく国内段階移行である。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれるものとし、本明細書により明示的に本出願の一部となる。
【技術分野】
【０００２】
〔分野〕
本開示のいくつかの実施形態は、概して、長リンカー分子を介して電荷量レポーター分子(charge mass reporter molecule)を有するヌクレオチドを含む、合成ヌクレオチドに関する。リンカー分子は、重合の一部の側面が全体的にまたは部分的に影響を受けないように、長さをある程度変えて、レポーター部分がＤＮＡポリメラーゼ複合体の外に伸びるようにすることが可能である。
【背景技術】
【０００３】
〔関連技術の説明〕
ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボースリン酸に結合したプリン基またはピリミジン基を含む、ヌクレオシドのリン酸エステルと定義することが可能である。プリンヌクレオチドは塩基として主にアデニン（Ａ）またははグアニン（Ｇ）を有し、ピリミジンヌクレオチドはシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）を有し、これらは、ＤＮＡおよびＲＮＡにおける基本的な反復単位である（Henderson's dictionary of biological terms, 1989）。
【０００４】
ＤＮＡは、デオキシリボースヌクレオチドの単位を含む長いポリマーであり、ＲＮＡは、リボースヌクレオチドのポリマーである。このヌクレオチド塩基配列が、個々の遺伝形質を決定し得る。
【０００５】
分子生物学のセントラルドグマにより、生体情報の通常の流れが一般的に説明される：ＤＮＡがＤＮＡに複製され得、ＤＮＡの遺伝情報がｍＲＮＡに「転写」され得、タンパク質が、翻訳と呼ばれる過程でｍＲＮＡの情報から翻訳され得、その過程において、ｍＲＮＡにｔＲＮＡ（各ｔＲＮＡは、その配列に応じて特定のアミノ酸を担持する）が結合することにより、タンパク質のサブユニット（アミノ酸）が、（ｍＲＮＡひいてはＤＮＡの配列により規定されるような）順番で結合するのに十分な程度まで近接する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の実施形態に従って、レポーター組成物を開示する。レポーター組成物は、ヌクレオチドまたはその誘導体と、ヌクレオチドまたはその誘導体に付着し得るリンカー分子と、レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノセンサまたはマイクロセンサの特性を変化させるのに十分な電荷量を含んだ高電荷量部分とを含む。いくつかの実施形態では、レポーター組成物中に存在するヌクレオチドまたはその誘導体は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、任意の合成ヌクレオチド、それらの任意のアイソフォーム、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択することができる。
【０００７】
いくつかの他の実施形態では、リンカー分子は以下の一般式：Ｈ２Ｎ−Ｌ−ＮＨ２の分子を含み、式中、Ｌは、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、芳香族基、ナフタレン基、アミン基、アミド基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１つまたは複数を含む、直鎖または分岐鎖を含み得る。リンカー中のＬは、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、芳香族基、ナフタレン基、アミン基、アミド基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された１つまたは複数を含む、直鎖または分岐鎖を含み得、直鎖における官能基の数は、種々の例において、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜２５または１〜１０００である。いくつかの例では、直鎖または分岐鎖における官能基の数は、１０００を超えてよい。リンカー分子および／または高電荷量部分は、ポリメラーゼによるヌクレオチド重合に影響を与えず、また除去可能であるように構成される。リンカー分子は、ヌクレオチドまたはその誘導体のリン酸基、糖類または塩基に結合することが可能である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、レポーター組成物中に存在する高電荷量部分は正または負であってよく、さらにこの部分の電荷量はｐＨに応じて可変的であり得る。いくつかの例において、高電荷量部分は、芳香族骨格および／または脂肪族骨格を含んでもよく、該骨格は、第三級アミノ基、アルコールヒドロキシル基、フェノール性ヒドロキシル基、およびそれらの任意の組み合わせのうち１つまたは複数を含む。いくつかの例において、高電荷量部分は、以下の基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせのうち1つまたは複数を含む：
【化１】
2019503174.tif 000003
【０００９】
さらに、高電荷量部分に存在する前述の基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせの数は、種々の実施形態において、１〜１０、１１〜５０、５１〜１００、または１００超であり得る。
【００１０】
本発明のある態様において、レポーター組成物は以下の分子を含み得る：
【化２】
2019503174.tif 000004
式中、Ｒは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、任意の合成ヌクレオチド、それらの任意のアイソフォーム、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の他の態様において、レポーター組成物は以下の分子を含み得る：
【化３】
2019503174.tif 000005
式中、Ｒは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、任意の合成ヌクレオチド、それらの任意のアイソフォーム、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される）。
【００１２】
本発明のさらなる別の態様において、レポーター組成物は以下の分子を含み得る：
【化４】
2019503174.tif 000006
式中、Ｒは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、任意の合成ヌクレオチド、それらの任意のアイソフォーム、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される）。
【００１３】
ヌクレオチドまたはその誘導体、リンカー分子、および高電荷量部分を含むレポーター組成物を含んだヌクレオチド配列を決定するためのキットもまた、本発明の実施形態に従って開示する。
【００１４】
レポーター組成物の合成方法もまた、開示する。該方法は：ヌクレオチドまたはその誘導体とリンカーの第一アミン基の間で第一共有結合を生成するステップであって、ヌクレオチドまたはその誘導体のリン酸基、糖または塩基を、リンカーの第一アミン基に結合させる、ステップと；リンカーの第二アミン基と高電荷量部分に存在する任意の官能基の間で第二共有結合を生成するステップとを含み；少なくとも２つのアミン基を含むリンカーもまた、本出願との関連で開示する。いくつかの実施形態において、前記方法で使用されるヌクレオチドまたはその誘導体は、一リン酸基を含み得る。他のいくつかの実施形態において、前記方法で使用されるヌクレオチドまたはその誘導体は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、およびウリジン一リン酸（ＵＭＰ）からなる群から選択され得る。
【００１５】
さらに別の態様では、ヌクレオチドまたはその誘導体と、第三級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、リン酸基、フェノール性ヒドロキシル基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の荷電基を含んだ芳香族骨格または脂肪族骨格を含む高電荷量部分と、前記ヌクレオチドまたはその誘導体および前記高電荷量部分に付着したリンカー分子とを含むレポーター組成物であって、前記１つまたは複数の荷電基は、前記レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性に、検出可能な変化を生じさせるのに十分な電荷量を含み、前記リンカー分子は、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、アミン基、アミド基、芳香族基、およびナフタレン基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含んだ直鎖または分岐鎖を含む、レポーター組成物を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、レポーター組成物中のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、合成ヌクレオチド、およびそれらの任意のアイソフォームからなる群から選択される。
【００１７】
他のいくつかの実施形態において、レポーター組成物の高電荷量部分は、以下の化合物１〜５、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む：
【化５】
2019503174.tif 000007
【００１８】
ある実施形態では、レポーター組成物中のリンカー分子は、光切断可能または化学的に切断可能である。ある実施形態のいくつかでは、化学的に切断可能なリンカー分子は、４−ニトロフェニル２−（アジドメチル）ベンゾエート、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニル２−（アジドメチル）ベンゾエート、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む。
【００１９】
代替の実施形態において、光切断可能な切断可能リンカー分子は、以下の化合物６〜１０、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む：
【化６】
2019503174.tif 000008
【００２０】
いくつかの他の実施形態では、リンカーの直鎖または分岐鎖における、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、アミン基、アミド基、芳香族基、およびナフタレン基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせの数は、１〜１０００である。
【００２１】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物中のリンカー分子または高電荷量部分は、ポリメラーゼによるヌクレオチド重合に影響を与えないように構成される。
【００２２】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物中の高電荷量部分は、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体の外に伸びるように構成される。
【００２３】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物中のリンカー分子または高電荷量部分は、高感度検出ナノ構造またはセンサに届くように、新生鎖から突出するように構成される。
【００２４】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物中の高電荷量部分の正味電荷量は、正もしくは負であるか、または、ｐＨに応じて可変的である。
【００２５】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物の高電荷量部分の正味電荷量は、酸性ｐＨでは正である。
【００２６】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物の高電荷量部分の正味電荷量は、アルカリ性ｐＨでは負である。
【００２７】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物中のリンカー分子および／または高電荷量部分は、除去可能であるように構成される。
【００２８】
さらにいくつかの他の実施形態では、レポーター組成物は、以下の化合物、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含む：
【化７】
2019503174.tif 000009
【化８】
2019503174.tif 000010
【００２９】
さらに、上記で論じた実施形態のうち何れかのレポーター組成物を含んだヌクレオチド配列を決定するためのキットもまた、本発明の実施形態に従って開示する。
【００３０】
また、上記で論じた実施形態のうち何れかのレポーター組成物を合成する方法もまた、開示する。該方法は：ヌクレオチドとリンカーの第一官能基の間で第一共有結合を生成するステップであって、ヌクレオチドのリン酸基、糖または塩基を、リンカーの第一官能基に結合させる、ステップと；リンカーの第二官能基と高電荷量部分に存在する任意の官能基の間で第二共有結合を生成するステップとを含み得る。
【００３１】
レポーター組成物を合成する方法のいくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ）からなる群から選択される、三リン酸基を含む。いくつかの他の実施形態では、ヌクレオチドのリン酸基は、チオホスフェートまたはホスホロアミダートを含む。
【００３２】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な手数料の支払いにより、庁より提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】緩衝液、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）およびｄＴＴＰ＊（デオキシチミジン三リン酸）に対するナノワイヤ応答の経時的な電流のグラフを示す図である。
【図２】３−（ヒドロキシメチル）ナフタレン−２−オール誘導体を用いて行ったＬＣＭＳ解析の結果を示す図である。
【図３Ａ】プライマー伸長アッセイの結果を示す図である。
【図３Ｂ】融解解析の結果を示す図である。
【図４】単一Ｃｙ３  ｄＣＴＰがＳＣＴＴＰに組み込まれた後の表面で観察される蛍光を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
〔ある実施形態についての詳細な説明〕
ヒトゲノムの配列決定およびそれに続く研究が、それ以来、ヒトのＤＮＡ配列を知る価値の大きさを示してきた。ゲノムＤＮＡ配列の解析により得られる情報は、特定の疾患を発症させる個体の相対的危険性についての情報を提供し得る（例えば、乳癌とＢＲＣＡ１遺伝子およびＢＲＣＡ２遺伝子など）。さらに、腫瘍に由来するＤＮＡの解析により、ステージおよび段階分けについての情報を提供することが可能である。
【００３５】
ウイルスまたは細菌により引き起こされるような感染性疾患もまた、ヌクレオチドポリマーゲノム（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）においてそれらの遺伝情報を保有する。今日、これらの多くは配列決定されており（または、十分なゲノムが配列決定されて、診断検査の実施を可能にしており）、臨床サンプルに由来する感染性疾患ゲノムの解析（分子診断学と呼ばれる分野）は、高感度かつ特異的に疾患を診断する重要な方法のうちの１つとなった。
【００３６】
サンプル中におけるｍＲＮＡ種の存在または不在ならびにその存在量を測定することにより、個体の健康状態、疾患ステージ、予後についての情報、ならびに薬理遺伝学的情報および薬理ゲノム学的情報を得ることが可能である。これらの発現アレイは、早くも、複雑な疾患に対する戦いにおけるツールとなりつつあり、価格が下落し始めれば、一般性を獲得する可能性がある。
【００３７】
約言すれば、ヌクレオチドポリマー（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の解析は、臨床ルーチンにおいて重要となりつつあるが、コストが依然として広範な世界的規模の採用に対する障壁となっている。このことの１つの理由は、ＲＴ−ＰＣＲ実験が進むにつれて、最大４つの異なる蛍光チャネルを高感度で測定することが可能な高価なデバイスを必要とする、解析の複雑さである。電気泳動ゲルなどのより廉価な代替法は、ローテク装置を作動させて解釈する熟練技術者を必要とする場合があり、これもまた高価であり得、また、発展途上国では、熟練技術者を欠くために手が届かない。
【００３８】
これを解決するために、使用が廉価で容易なデバイスを必要とし得るヌクレオチドポリマー解析の方法が必要とされ得る。本開示のいくつかの実施形態は、このようなデバイスにおいて概して利用することが可能な化学試薬、合成ヌクレオチドについて記載する。本開示に関連して使用される種々の実施形態は、リンカー分子を介して付着した（例えば、５´リン酸基に付着した）高負電荷量レポーター部分を有し、該リンカー長は、ポリメラーゼの作用に対して著しい有害効果を引き起こさないように、重合時にポリメラーゼ複合体から突出するような長さである、少なくともいくつかの標準的なヌクレオチド（または任意の修飾体、もしくはアイソフォーム）を含む新規の合成ヌクレオチドについて記載する。
【００３９】
本明細書の種々の実施形態で使用する場合、ヌクレオチドは、限定されるわけではないが、以下の化合物、アデノシン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびイノシン、ならびにいずれかの修飾ヌクレオチド、いずれかのヌクレオチド誘導体、およびいずれかの縮重塩基ヌクレオチドの１つであり得る。このようなヌクレオチドのいくつかの非限定例には、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、任意の合成ヌクレオチド、それらの任意のアイソフォーム、およびそれらの任意の誘導体が含まれ得る。さらに、一本鎖デオキシリボース核酸（ｓｓＤＮＡ）は、概して、ヌクレオチドを含む一本鎖ヌクレオチドポリマー分子であり得、二本鎖デオキシリボース核酸（ｄｓＤＮＡ）は、概して、相補的逆方向に、例えば、水素結合により一体に結合した、２つのｓｓＤＮＡ分子を含む二本鎖であり得る。
【００４０】
ヌクレオチドは、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、様々な方法により合成され得る。これは、実験室における、サルベージ合成（有用部分を置換するために、分解反応および合成反応により新たなヌクレオチドを再合成する際に、ヌクレオチドの一部を再使用すること）、または保護基の使用を伴い得る。後者の場合には、精製されたヌクレオシドまたはヌクレオ塩基を保護して、ホスホルアミダイトを作製することが可能であり、該ヌクレオシドまたはヌクレオ塩基を使用して、天然では存在しない類似体を得るおよび／またはオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド合成は、ヌクレオシド（糖に連結した窒素性塩基）の形成を含む。ヌクレオチドの合成および構造に関与する糖は、リボースまたはデオキシリボースであり得；後者の場合、ウラシルを除くすべての場合で、ヌクレオシド名の前に、「デオキシ」という接頭辞が付加される場合がある。次に、この糖にリン酸官能基をエステル化させ、ヌクレオチドを作製することが可能である。リン酸基は、１つ、２つ、または３つのリン酸を含み得、それぞれ、一リン酸、二リン酸、または三リン鎖を形成する。
【００４２】
本開示の他のいくつかの実施形態は、ヌクレオチドおよびレポーター部分を含む特定の合成ヌクレオチドのデザイン、合成、および使用について記載し、前記レポーター部分は、リンカーを介して付着したポリメラーゼ酵素ブロック部分として作用することはできない。
【００４３】
本発明に関連する種々の実施形態で使用されるレポーター部分またはレポーター組成物は、バイオセンサまたは他の検出方法（目視など）によって容易に検出される分子であり、対象の分子を検出または増幅する、生体分子またはプローブまたはプライマーに付着する。
【００４４】
種々の実施形態で使用されるリンカー分子は、ヌクレオチドにレポーター分子を結合させる、２つ以上のサブユニットから成るポリマーである。リンカー分子の例は、ジアミンリンカーＨ２Ｎ−Ｌ−ＮＨ２であって、Ｌはさらなるいくつかサブユニットを表す。
【００４５】
したがって、本開示には、電荷量におけるわずかな変動を表面でまたは表面近くで検出することが可能な高感度バイオセンサにおいて、検出可能な変化を得るのに十分な高電荷を全面的に有するレポーター部分を付着させるリンカー分子を有する任意のヌクレオチドまたはその誘導体を含む、あらゆる構造が含まれるものと解釈されるべきである。従って、本出願に存在するいくつかの例は、例示のためにのみ提示され、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００４６】
種々の実施形態において、合成ヌクレオチドは、以下の態様のうち少なくともいくつかを有し得る：
１．レポーター部分は、酵素活性、蛍光などではなくて、電荷量に基づいて報告する；
２．各合成ヌクレオチドは、同じ電荷量のレポーター部分を有する場合も、異なる電荷量を保有する場合もある；
３．レポーター部分は、容易に切断され得る；および／または
４．ヌクレオチドは、廉価かつ容易に大量合成され得る。
【００４７】
リンカーおよびレポーター部分の付着に利用可能であると考えられ得る位置がいくつか存在する。別のヌクレオチドポリマーにおいて、その補体塩基とハイブリダイズする場合（つまり、逆補体ＤＮＡの２本の鎖がハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ分子を形成する場合）、ヌクレオチドの塩基間の重合または水素結合に干渉しないようにリンカーを付着させることが重要である。考えられ得る一位置はヌクレオチドのリン酸結合であり得る。さらに、リンカーをリン酸の５´位置に付着させることによって、ホスホジエステル結合形成が妨げられることから、さらなるヌクレオチドの付加がブロックされるであろう。
【００４８】
リンカーとレポーター部分の付着に利用可能であると考えられ得る他の位置は、糖基上または塩基上である。
【００４９】
他のいくつかの実施形態は、検出後、リンカーおよびレポーター部分を、反復的方法で合成ヌクレオチドから切断することが可能な使用方法について記載する。リンカーに付着する可能性のある場所の１つは、リン酸基の５´−リン酸端であり、これは、さらなるヌクレオチドの付加を防ぐため、リンカーを切断することによりこのブロックを取り除くと、さらなるヌクレオチドの付加が可能となる。
【００５０】
例として、５´−リン酸末端における合成を促進しうる、利用可能な少なくとも２つの選択肢が存在する：
１．チオホスフェート；および／または
２．ホスホルアミデート。
【００５１】
したがって、少なくとも一部の実施形態において、提起されるリンカーは、以下の構造：
Ｈ２Ｎ−Ｌ−ＮＨ２
を有し、式中、Ｌは、限定されるわけではないが、ヌクレオチドおよび高電荷量部分（これらの両方が合成ヌクレオチドに存在する）に結合するように構成された、任意の直鎖状分子または分枝鎖状分子であり得る。いくつかの実施形態において、Ｌは、種々の長さを有する、複数のアルキル基、オキシアルキル基、またはこれらの組合せを含む。一実施形態において、Ｌ中のアルキル基、オキシアルキル基、またはこれらの組合せの数は、１〜１００である。別の実施形態では、Ｌ中のアルキル基、オキシアルキル基、またはこれらの組合せの数は、１〜７５である。さらに別の実施形態では、Ｌ中のアルキル基、オキシアルキル基、またはこれらの組合せの数は、１〜５０である。さらに別の実施形態では、Ｌ中のアルキル基、オキシアルキル基、またはこれらの組合せの数は、１〜２５である。いくつかの他の実施形態では、Ｌ中のアルキル基、オキシアルキル基、またはこれらの組合せの数は、１００超であり得る。例示を目的としてＮＨ２を示すが、このＮＨ２は、ヌクレオチドまたはその誘導体および高電荷量部分（これらの両方が合成ヌクレオチド中に存在する）に架橋し得る他の任意の官能基で置換することができる。ＮＨ２の代わりに使用され得るいくつかの例示的な例には、限定するわけではないが、任意のアルキル基（例えば、ＣｎＨ２ｎ＋１（式中、ｎは、１、２、３など正の整数を表わす））、任意のアルコール基（例えば、ＣｎＨ２ｎＯＨ（式中、ｎは、１、２、３など正の整数を表わす））、任意のカルボキシル基（例えば、ＣＯＯＨ）、任意のアミド基（例えば、ＣＯＮＨ）、およびこれらの任意の誘導体が含まれる。リンカー分子は、重合の一部の側面が、全体的にまたは部分的に影響されることがないように、長さおよび化学構造をある程度変えて、レポーター部分が、ヌクレオチドポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および他）複合体から外に伸びるようにすることが可能である。
【００５２】
リンカーの所望の長さを、全体的であれ部分的であれ知ることができない状況において、種々の長さのリンカーを容易に入手できることは、利益と考えることができる。これにより、最適化実験が容易となり得る。
【００５３】
したがって、少なくともいくつかの実施形態において、ヌクレオチドを有するリンカー（例えば、例示的な例としては、アデノシン）は、以下の構造を有し得る。以下のいくつかの例ではアデノシンを示すが、他のいくつかの実施形態では、このアデノシンを、他の任意の天然ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチド、その任意の修飾体、およびその任意の誘導体で置換することが可能である。
【化９】
2019503174.tif 000011
【００５４】
いくつかの実施形態において、この位置における種々の長さのリンカーは、以下の構造を有し得る（アデノシンを用いて例示する）：
１．エチレンジアミン（２炭素結合長離れる）
【化１０】
2019503174.tif 000012
２．ペンタンジアミン（５炭素結合長離れる）
【化１１】
2019503174.tif 000013
３．１３炭素結合長と同等の長さ離れる
【化１２】
2019503174.tif 000014
【００５５】
したがって、いくつかの実施形態において、このようにして選択されるリンカーは：
１．入手が容易であり；
２．連結および切断が容易であり（以下の考えられ得るプロトコルを参照されたい）；ならびに／または
３．ポリメラーゼおよびポリ核酸鎖と相互作用せず、および／もしくは、ヌクレオチド重合および新生ヌクレオチドポリマーの伸長に影響を及ぼさないことが可能である。
【００５６】
レポーター部分：本明細書で使用する場合、「レポーター部分」は、バイオセンサまたは他の検出方法（目視など）により容易に検出され、その存在を「報告」するレポーター部分の存在なしには検出することが通常困難である対象の分子を検出または増幅する生体分子、またはプローブ、またはプライマーに付着する分子である。レポーター部分は、任意の荷電分子、荷電分子群、および樹枝状に配列されたさらに多くの荷電分子であり得る。報告様式はその電荷であり、それは、ナノワイヤ／ナノチューブＦＥＴＳ、ナノポアおよび他の圧電性バイオセンサなどの高感度電荷検出バイオセンサにより検出される。いくつかの実施形態において、レポーター部分は、ＵＶ検出器もしくは可視光検出器による電荷の検出を可能とする発色性、または蛍光検出により電荷を検出する蛍光発光性など、他の特性と関連し得る。さらに、レポーター部分の質量は、表面プラズモン共鳴バイオセンサおよびカンチレバーなどの質量を検出可能なバイオセンサを用いて利用することが可能である。
【００５７】
レポーターの電荷：本発明のある実施形態は、高電荷量を保有するレポーター部分について記載する。一実施形態において、レポーター部分は、合成ヌクレオチド中に存在するヌクレオチドまたはその誘導体の電荷量より大きな電荷量を、合成ヌクレオチドに導入し得る。しかし、別の実施形態では、レポーター部分により導入される電荷量は、合成ヌクレオチド中に存在するヌクレオチドまたはその誘導体の電荷量と実質的に同等かまたはそれより小さい場合がある。レポーター部分のいくつかの非限定的で例示的な例を、本明細書で提供する。これらの例は、例示だけを目的とするものであり、そのため、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。レポーター部分の化学構造および／または寸法（例えば、レポーター部分として使用される分子の長さ、サイズ、および質量）は、レポーター部分が合成ヌクレオチドに電荷量を提供し、また、部分的であれ全体的であれヌクレオチドの重合反応に影響を及ぼさないように構成される限り、制約され得ない。
【００５８】
該部分における電荷は、正の場合も負の場合もある。結合の性質を考慮しつつ、以下により、本開示のいくつかの実施形態で使用される可能性のある電荷選択の一部の側面を提示する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、高電荷量を有し、それにより高電荷量部分と特定されるレポーター部分は、第三級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、リン酸基、フェノール性ヒドロキシル基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の荷電基を含んだ芳香族骨格または脂肪族骨格を含み得、前記１つまたは複数の荷電基は、レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性を変化させるのに十分な電荷量を含む。
【００６０】
正電荷：いくつかの実施形態では、芳香族骨格または脂肪族骨格に第三級アミノ基を組み込むことにより、多数の正電荷を、概して、レポーター部分に誘導することが可能である。このような実施形態では、酸性ｐＨ（７未満）において、これらの基は、該基を検出可能にする正電荷を獲得し得る。
【００６１】
負電荷：他のいくつかの実施形態では、芳香族骨格または脂肪族骨格にカルボキシル基、ヒドロキシル基、リン酸基、アルコールヒドロキシル基、および／またはフェノール性ヒドロキシル基（または官能基）を組み込むことにより、負電荷を、概して、レポーター部分に誘導することが可能である。上述の基準を満たす、提案したレポーター部分の一部を以下に挙げる。以下に列挙する断片は入手可能であり、アミノ末端を介してリンカーに結合可能であり得る。さらなる利点は、ホスホルアミデート結合形成のために提案される試薬が、このアミド結合形成と同じである可能性があるということである（したがって、系の費用がさらに削減される）。
【００６２】
さらに、少なくともある程度は、アルカリ性のｐＨ（７超）に対するこの結合の安定性により、負電荷の誘導プロセスは、干渉性を示さないか、または干渉性が実質的にわずかである。
【００６３】
例示を目的として、以下の３つの非限定的例を示す。これらの例は、例示のためにのみ提供するものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。したがって、以下の例に対する任意の修正は、本発明の範囲内に確実に含まれる。例えば、その例と関連付けられる１つまたは複数の基（例えば、−ＯＨ、＝Ｏ、ＣＯＯＨ、または他）の任意の置換を実施することが可能である。また、以下の例のうちの１つまたは複数のオリゴマー化または重合も、許容することが可能である。さらに、種々の寸法（例えば、レポーター部分の長さ、サイズ、および質量）を有する任意の他の化学構造または分子を、そのような化学構造または分子が、合成ヌクレオチドに荷電量を提供するように、また、部分的であれ全体的であれヌクレオチドの重合反応に影響を及ぼさないように構成される限り、レポーター部分として使用することが可能である。
【００６４】
【化１３】
2019503174.tif 000015
【００６５】
帯電後、ある実施形態におけるこれらのレポーターのうちの一部は、以下のように存在し得るが、
【化１４】
2019503174.tif 000016
一方、レポーター１およびレポーター３は市販品で入手可能であり、レポーター２は注文合成することができる。
【００６６】
提起されるレポーター部分は、概して、以下のようであり得る：
１．入手もしくは合成が容易であり；
２．高電荷を保有し；
３．廉価であり；ならびに／または
４．結合および切断が容易である。
【００６７】
最終化合物（単量体）：上記の提起に基づくと、リンカーおよびレポーターを有するヌクレオチドの最終構造は、少なくとも実施形態のある部分では以下のようになろう。以下のいくつかの最終化合物例もまた、例示のためにのみ提供するものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。上記で説明した通り、ヌクレオチドまたはその誘導体、リンカーおよび高電荷量レポーター部分について許容される任意の変化も、最終化合物に対して許容される。したがって、いくつかの例の５´−リン酸末端におけるヌクレオチドとしてのアデノシンについては、リンカーが、例えば、Ｃ１３同等物（上記の選択肢３）であるならば、種々のリンカーは、以下のような最終構造様相をなすだろう：
【００６８】
提起される１つの最終合成ヌクレオチド１（レポーターは単量体形態であり、これは、必要に応じて、これらの単量体を凝集させて電荷量を増大させることにより増大させることが可能であることに注意されたい）：
【化１５】
2019503174.tif 000017
【００６９】
提起される別の合成ヌクレオチド２（レポーターは単量体形態であり、これは、必要に応じて、これらの単量体を凝集させて電荷量を増大させることにより増大させることが可能であることに注意されたい）：
【化１６】
2019503174.tif 000018
【００７０】
提起されるさらに別の合成ヌクレオチド３（レポーターは単量体形態であり、これは、必要に応じて、これらの単量体を凝集させて電荷量を増大させることにより増大させることが可能であることに注意されたい）：
【化１７】
2019503174.tif 000019
【００７１】
以下は、少なくともいくつかの実施形態において使用される合成プロトコルの、非限定的で例示的な例である：
１．アデノシンの５´−ホスホルアミデートの合成：（ヌクレオチドとジアミンリンカーの結合）。アデノシンホスホルアミデートの５´−アミノ誘導体を合成するには、ジアミンおよびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を水中に溶解させるChuらの方法を用いることができる。その後ＥＤＡＣを加え、連続的に撹拌しながら室温でインキュベートした。反応が完了するまでモニタリングした。
２．提起される最終構造物の合成：（ジアミンリンカーとレポーター部分の結合）。アデノシンホスホルアミデートの５´−アミノ誘導体を合成するには、ジアミンおよびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を水中に溶解させるChuらの方法を用いることができる。その後ＥＤＡＣを加え、次いで、連続的に撹拌しながら室温でインキュベートした。反応が完了するまでモニタリングした。
【００７２】
同様の手順の１つの利点は、それが、単量体としての最終化合物の形成をもたらす両方のステップに適合しうることである。
【００７３】
いくつかの実施形態のいくつかの例示的な例では（下記を参照されたい）、リンカーおよびレポーター部分の切断を実施する必要がある場合がある。ホスホルアミデートのような結合は、概して、周囲温度でトリフルオロ酢酸のような酸を用いることにより多少容易に切断され得る。例示的な例として、提起される合成ヌクレオチド２を、以下の考えられ得る３Ｄ図として示す。該分子の左下の芳香環は、微弱なアルカリ性条件下であれば負電荷へと転換される可能性がある、３つのヒドロキシ官能基を有する。以下は、リンカー３を介してレポーター１に付着したアデノシンの３Ｄ立体配座および関連データである。
【００７４】
【化１８】
2019503174.tif 000020
【００７５】
ホスホルアミデートと末端荷電原子の間のおおよその距離は約２０オングストロームであり、これは、概して、検出表面に帯電電位を誘導するのに十分であり得る。少なくともある程度リンカー長を変化させることによる位相のさらなる修正により、この距離をさらに変化させることが可能である。末端のレポーター部分の電荷はまた、レポーター部分の化学的性質の変化によっても変化し得る。
【００７６】
ある実施形態において、添付の特許請求の範囲に記載するレポーター組成物は、高電荷量部分に付着する切断可能なリンカー分子を有する任意のヌクレオチドを含み、前記合成ヌクレオチド（他にはレポーター組成物という）は、レポーター組成物がナノ構造に作動可能に連結している場合、（例として、合成手順による配列決定時に合成ヌクレオチド（レポーター組成物）が新生鎖に付加することにより、）高感受性検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性に検出可能な変化を引き起こすのに十分な電荷を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、プライマー伸長によるナノワイヤの電気的特性の変化をモニタリングすることにより、シーケンシング反応をトラッキングすることが可能である。このような例では、各ヌクレオチドを１つずつ付加し、ナノワイヤのコンダクタンスをモニタリングする。コンダクタンスが著しく変化する（例えば、コンダクタンスの変化が検出可能である）場合、ヌクレオチドが新生鎖に組み込まれている。
【００７８】
ある実施形態では、シーケンシング反応において、レポーター組成物、例えば、ヌクレオチドまたはその誘導体と、第三級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、リン酸基、フェノール性ヒドロキシル基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の荷電基を含んだ芳香族骨格または脂肪族骨格を含む高電荷量部分と、前記ヌクレオチドまたはその誘導体および前記高電荷量部分に付着したリンカー分子とを含むレポーター組成物であって、前記１つまたは複数の荷電基は、前記レポーター組成物に作動可能に連結した高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性を変化させるのに十分な電荷量を含み、前記リンカー分子は、アルキル基、オキシアルキル基、アルコール基、カルボキシル基、アミン基、アミド基、芳香族基、およびナフタレン基、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数を含んだ直鎖または分岐鎖を含む、レポーター組成物を利用することができる。
【００７９】
ある実施形態では、レポーター組成物は、電荷密度の変化を（例えば、抵抗の変化を検出することにより）検出することが可能なナノ構造を使用して、レポーター部分と関連する電荷を感知することにより、個々のヌクレオチドの付加を検出するように構成される。このような実施形態のうちいくつかでは、荷電部分（またはレポーター部分）は、高感度ナノ構造の電気特性を変化させるのに十分な電荷を有し、この場合、レポーター組成物は、その高感度ナノ構造に作動可能に連結している。例えば、レポーター組成物を含有し得る新しいヌクレオチドが、シーケンシング・バイ・シンセシス反応において成長ポリマーに付加されると、高感度ナノ構造の表面または表面近くで電荷密度が増大し、これを、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性の変化により検出することが可能である。より具体的には、ナノワイヤを検出構造として使用する場合、少なくともいくつかの実施形態では、（荷電部分を有する）レポーターの付加により引き起こされる電荷の増大は、電界効果と呼ばれる現象を原因とする、ワイヤにおける抵抗の変化によって検出することができる。言い換えると、少なくともいくつかの実施形態では、特許請求するレポーター組成物は、その高電荷のおかげで、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサに連結された際に、その高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサにおいて電気的変化（抵抗）を引き起こすことが可能である。高感度ナノ構造もしくはセンサの表面もしく表面近くで、抵抗変化、例えば、電荷変化を検出する際、または、高感度ナノ構造もしくはセンサの表面もしくは表面近くで、新しく付加されたヌクレオチドにより付加される生得的電荷を検出する際、電荷の距離は、デバイス操作のモードおよびゲート誘導体／流体界面に左右され、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）では、反対に荷電された種の電荷中和に基づき０〜１００ｎｍの範囲内に収まり、その範囲を超えると、クーロン相互作用の効果は相殺され−ただし、当業者にはよく理解されるだろうが、他の間接的な検出法では、その範囲は高感度検出ごとに異なり得る）、そのため、新しいヌクレオチドが、高感度ナノ構造の表面または表面近くに位置するシーケンシングされるヌクレオチド配列の成長鎖に付加されると、電荷の距離が生じ得る。ある代替の実施形態では、距離は、使用するバイオセンサの関数であり得る。したがって、例えば、バイオセンサが電界効果トランジスタである場合、距離は、溶液および電界効果トランジスタセンサに左右され、いくつかのある場合では、距離は、センサのミクロン内またはセンサの感知範囲内であり得る。抵抗変化の検出を測定して、新たに付加されたヌクレオチドの識別情報を求めることが可能である。言い換えると、いくつかの実施形態では、このような検出は、新規のヌクレオチドが付加される前後で、任意の追加ステップ、例えば、ヌクレオチド配列の成長鎖から（もしくは反応ゾーンから）それまでに付加された１つもしくは複数のヌクレオチドを除去するステップ、ヌクレオチド配列の成長鎖への新規のヌクレオチドの付加をブロックする化合物を除去するステップ、ならびに／または、新規に付加されたヌクレオチドの化学的および／もしくは物理的特性を変換するステップなどを必要としない。そのため、いくつかの実施形態では、検出は、新しいヌクレオチドが反応ゾーン（またはヌクレオチド配列の成長鎖）に付加されてすぐに、または実質的には直後に、起こり得る。しかしながら、いくつかの代替の実施形態では、新規のヌクレオチドが付加される前後に、任意の追加ステップ、例えば、ヌクレオチド配列の成長鎖から（または反応ゾーンから）それまでに付加された１つもしくは複数のヌクレオチドを除去するステップ、ヌクレオチド配列の成長鎖への新規のヌクレオチドの付加をブロックする化合物を除去するステップ、ならびに／または、新規に付加されたヌクレオチドの化学的および／もしくは物理的特性を変換するステップなどが起きる場合もある。
【００８０】
ある実施形態では、本出願に開示する組成物または化合物の何れかの、１つまたは複数の誘導体を利用することができる。このような実施形態のいくつかでは、誘導体には、そのそれぞれの元の化合物と比較して、同じかまたは実質的に同じ官能性（または活性）を有し、要素（例えば、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｈ、およびそれ以上）の何れか、官能基（例えば、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ３、およびそれ以上）の何れか、ならびに化合物の骨格または枝の任意の部分に、１つまたは複数の置換を有する化合物が含まれ得る。このような誘導体の例は、限定するわけではないが、組み合わせの範囲で以下に示す、レポーター組成物１および４を組み合わせたものとすることが可能である：
【化１９】
2019503174.tif 000021
【００８１】
過荷電（supercharged）ヌクレオチドは、リンカーを介して該ヌクレオチドに付着したレポーター部分を有し得る。リンカーの長さおよび性質は変化し得るが、レポーター組成物は、高負電荷を有する。レポーター部分の高負電荷は、いくつかの機能を果たす。レポーター部分組成物（１〜５）のいくつかの例示的で非限定的な例を以下に示す：
【化２０】
2019503174.tif 000022
【００８２】
レポーター部分は、ナノワイヤに近接した場合、非修飾ヌクレオチドのそれと比較して過荷電ヌクレオチドの電子効果を増幅させ、特定の塩基を、シグネチャー電気応答に基づいてコールすることを可能にし、それはまた、電荷がナノワイヤ表面からさらに検出され得ることから（ナノワイヤは、その表面近くの電荷を検出するのみである）、より長いリード長を可能にする（電荷が感知され得るナノワイヤからの距離は、デバイ長と呼ばれる）。図１は、緩衝液、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）およびｄＴＴＰ＊（デオキシチミジン三リン酸）に対するナノワイヤ応答の時間と電流との関係を示す。図１に示す結果については、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）の付加の前後で、シリコンナノワイヤのリアルタイムのコンダクタンス変化を検出することにより、感知実験を行った。コンダクタンスの変化は、ナノワイヤの表面の負に荷電したヌクレオチドの導入に起因する。図のグラフは、０．０５Ｘ  ＰＢＳ緩衝液中の、ｄＡＴＰと過荷電ｄＴＴＰの等モル溶液（１０μＭ）の検出をそれぞれ示す。負に荷電した標準的なｄＡＴＰの注入が１０００秒時点で起き、その検出が、コンダクタンスにおける１６％の変化で示される。２０００秒時点では、非標準的な過荷電ｄＴＴＰを注入し、コンダクタンスの正のシフト（２０％）は、ナノワイヤ表面に関連する過荷電部分の負の電荷の増加に起因する。これらの結果は、異なる負電荷を保有する２つのヌクレオチドは、ナノワイヤの電気コンダクタンスプロファイルにおける変化により、検出および区別が可能であることを示す。
【００８３】
反応が進むと、ヌクレオチドがさらに、リンカー長が重要になり得るナノワイヤ表面から付加され得る。そして最終的には、リンカーは、進行中の重合への妨害を避けるまたは最小にするため、高電荷量部分がＤＮＡポリメラーゼ複合体から外に伸長することを可能にするように機能し得る。過荷電ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｔ、およびＣ（ＳＣＡＴＰ、ＳＣＧＴＰ、ＳＣＴＴＰ、およびＳＣＣＴＰ）のいくつかの例示的で非限定的な例を、以下に示す：
【化２１】
2019503174.tif 000023
【化２２】
2019503174.tif 000024
ＳＣＣＴＰ誘導体
【００８４】
ヌクレオチドが新生鎖にいったん組み込まれると、高荷電レポーター部分は、必ずではないが、除去（切断）され、レポーター部分を有する次の合成ヌクレオチド完全体が、組み込まれる。例えば、還元条件に影響されやすい２つのタイプの切断可能リンカー：ジスルフィド架橋およびアゾ化合物がある。それらは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｂ−メルカプトエタノール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のようなマイルドな還元剤により効率的にかつ即時に切断される。切断可能な官能基のいくつかの例示的で非限定的な例を以下に示す：
【化２３】
2019503174.tif 000025
【００８５】
さらに、多数の光開裂可能な保護基が利用可能であり得、このような基の１つには、オルト−ニトロベンジルモチーフを含有する化合物が含まれる（例えば、以下の化合物１０番を参照されたい）。既知の光除去可能基、例えば、例６〜１０などは、上記の通り、ヌクレオチドの文脈でこれまで使用されたことがない。光除去可能な保護基（ｐｐｇ）は、ある波長（例えば、３５０ｎｍ）の照射により、ヌクレオチド塩基の損傷を回避しながら、水性媒体において効率的に除去することが可能である。
【００８６】
【化２４】
2019503174.tif 000026
式中、Ｒは、限定するわけではないが、アルキル基、オキシアルキル基、炭化水素、ヒドラゾン、ペプチドリンカー、またはそれらの組み合わせを含む、直鎖または分岐鎖を含む。
【００８７】
例示を目的として、３−（ヒドロキシメチル）ナフタレン−２−オール誘導体の初期試験を実行した。分子をメタノールと水の混合物に溶解し、次に、９０分間、約２５０ｎｍの波長の光を発する水銀ランプからの光で照射した。ＬＣＭＳ解析により、出発物質の５０％消失が示された。さらに９０分後、約２０％の出発物質が残った。
【００８８】
図２に示すように、ＵＶ検出によるＬＣＭＳにおいて、５分時点で主なピークが観察されたが、それは、正のモードでも負のモードでもイオン化しなかった。１Ｈ  ＮＭＲ分光法により、他のシグナルを有する残渣開始物質が示され、該シグナルは第２ベンジル基に相当し、これはジオールの放出に相当する。図２に示す実験では、分子をメタノールと水の混合物に溶解し、次に、９０分間、約２５０ｎｍの波長の光を発する水銀ランプからの光で照射した。ＬＣＭＳ解析により、出発物質の５０％消失が示された。さらに９０分後、約２０％の出発物質が残った。図に見られるように、ＡＭ−５−１２４−１は９０分後であり、ＡＭ−５−１２４−２はさらに９０分後である。７．２分時点でのピークは開始物質であり、それはナトリウム塩であることから、ＭＳにおいてｍ／ｚ４０４と示される。５分時点でのピークは、放出されたジオールに起因し得る。
【００８９】
特定されたように、少なくともいくつかの実施形態において、リンカー鎖は、ヌクレオチドがポリメラーゼ基質のままでいることを可能にするのに重要な役割を果たし得、したがって、任意の修飾ヌクレオチドが生物学的に活性であることが示されなければならない。これを例示するためかつある実施形態の例として、ポリメラーゼ反応混合物を、４４個のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰヌクレオチドの配列が続く単一のＳＣ−ＴＴＰヌクレオチドの組み込みを要する、Ｒｏｔｏｒ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いたリアルタイムプライマー伸長解析に使用することができる。
【００９０】
プライマー伸長反応を、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ  Ｑリアルタイムサーモサイクラーを使用してモニタリングしたが、これは、プライマー伸長を、第２融解解析を伴うｄｓＤＮＡインターカレータ―（ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ）を使用し蛍光的にモニタリングして、生成組成物についてのさらなる情報を提供することを可能にする。この方法は、単一ＳＣ−ＴＴＰヌクレオチドの組み込みとプライマー伸長を完了させ得るように設計された、オリゴヌクレオチドプライマー／鋳型対とともに使用することが可能である。最初に、実験を４０℃インキュベーションで行い、次に、６５℃（大部分の商用ＤＮＡポリメラーゼにとって最適な温度）のインキュベーションを繰り返した。標準ｄＮＴＰ（ポジティブコントロール）およびｄＮＴＰなし（ネガティブコントロール）を用いた対照反応が、誤組み込みの対照と並んで含まれた。図３Ａは、標準ｄＮＴＰ（黄色）の存在下での、またＳＣＴＴＰを含有する反応（青色、黄色）でのプライマー伸長を捕えるが、ただし、ＳＣ−ＴＴＰ（青色）の組み込みに関連する最大蛍光強度はわずかに減少し、最終生成物濃度のわずかな減少を示す。ｄＴＴＰまたはＤＮＡポリメラーゼを欠いた反応は、蛍光の同等の増加を示さず、プライマー伸長の失敗（赤色および紫色）を示した。図３Ｂは、融解解析を示し、それぞれ６４．３℃と８０．５℃で融解ピークを有するネガティブコントロール反応（ポリメラーゼなし、赤色および紫色）とポジティブコントロール反応（標準ｄＮＴＰ、黄色）の間での、最終生成物の多様性を確認するものである。興味深いことに、非常に弱い第２融解ピークがｄＴＴＰなし（ＧＣＡ）で確認され、これは、誤組み込みの頻度が低いことを示した。
【００９１】
過荷電ヌクレオチドの組み込みを、正確なステージモーター（Nanomotion、イスラエル）と、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウエハ上のマイクロ流体スポッティングデバイス官能化領域の組み合わせを使用して、さらに確認することが可能である。いくつかの実施形態では、非常に小さい体積の材料を、尖鋭なチップにより表面に移す。
【００９２】
プライマー伸長を光学的に示すため、ＳＣ−ＴＴＰを、Ｃｙ３ラベル付きｄＣＴＰより先に配列に組み込んだ。ＳＣ−ＴＴＰは、配列においてＳＣ−ＴＴＰ後にＣｙ３  ｄＣＴＰが組み込まれることにより、蛍光部分を含有せず；修飾ＳＣ−ＴＴＰの組み込みが示され得た（図４）。単一のＣｙ３  ｄＣＴＰ組み込みのための条件が、セットアップされ、バルクシリコン基板に移された標準ＰＡＧＥ−ゲルを使用して明らかにされた。鋳型に対し相補的な競争相手のオリゴヌクレオチドもまた、一本鎖生成物のゲル解析を助けるように設計した。プライマー伸長反応を、以下の反応混合物を使用して行った：
２μＬの１０Ｘポリメラーゼ緩衝液
０．５μＬの８００ｎＭプライマー
０．５μＬの６００ｎＭ鋳型
２μＬの２．５ｍＭｄＮＴＰ混合物
２μＬの１０００μ／ｍＬのＤＮＡポリメラーゼ
１３μＬの超純水
【００９３】
ホットブロックにおける４０℃でのインキュベーション後、電気泳動のために二本鎖ＤＮＡ二本鎖の変性を促進するホルムアミドと競争相手オリゴヌクレオチドに加え、ポリメラーゼ活性を阻害するキレート剤を含有する「停止緩衝剤」を付加することにより反応を終わらせた。興味深いことに、ＳＣ−ＴＴＰを含有する反応において、ポジティブコントロール反応よりも大きなシフトを有するバンドが観察された。追加シフトは、標準ｄＣＴＰと比較し、ゲル移動を遅らせる可能性のある、ＳＣ−ＴＴＰの分子量の増加の結果である可能性がある。したがって、このシフトは、ＳＣ−ＴＴＰ組み込みの成功に対する証拠を提供する。
【００９４】
シーケンシング反応を、典型的な４×４アレイフォーマット中のＡＰＤＭＥＳ／ＰＤＣ修飾Ｓｉ／ＳｉＯ２表面に固定された、３´および５´の表面テザー３０ｍｅｒＤＮＡの両方を使用して、バルクＳｉ／ＳｉＯ２表面上で実行した。ここで、Ｃｙ３ラベル付きｄＣＴＰは、共有結合した３０ｍｅｒのプローブを鋳型として使用して、ハイブリダイズしたプライマーに選択的に組み込まれた。反応混合物をシリコン表面に広げ、周辺温度で暗い湿度室において一晩インキュベーションした。次に、シリコンを１ＸのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液においてすすぎ、窒素管を使用して乾燥させた。蛍光を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０を使用して可視化し、Ａｘｉｏ  ｖｉｓｉｏｎカメラおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ３．１ソフトウェアを使用して画像化した。
【００９５】
図４は、シーケンシングおよび洗浄ステップ後の印刷済みアレイで撮った蛍光画像である。非常に弱い蛍光は、Ｃｙ３ラベル付きｄＣＴＰの単一塩基組み込みを示す。各スポットは、プライマー伸長が起きたいくつかのＤＮＡ鎖を含有し、そのため、観察される蛍光は、ただの一塩基ではない、いくつかのＣｙ３  ｄＣＴＰを原因とすることに注意されたい。プライマーが反応混合物に導入されなかった対照実験では、表面に蛍光は生じなかった。
【実施例】
【００９６】
以下の記載は、本開示のいくつかの実施形態の例示的な例である。
【００９７】
〔実施例１−ＤＮＡシーケンシング〕
一例におけるシーケンシング方法論では、蛍光と高価な高感度カメラを使用することはできないが、その代りに、本開示のいくつかの態様で記載した合成ヌクレオチドの付加を、少なくともある程度、レポーター部分の電荷を、表面または表面近くの電荷量の蓄積を検出することが可能であり得る高感度ナノ構造またはセンサを使用して感知することにより、検出することができる。シーケンシング・バイ・シンセシス反応において、新しいヌクレオチドが成長ポリマーに付加されると、高感度ナノ構造の表面または表面近くの電荷密度が上昇し得、これは、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサにおける特性の変化により検出することが可能である（例えば、検出構造としてナノワイヤまたはカーボンナノチューブを使用する場合、その表面近くにヌクレオチドが付加されたことにより引き起こされる電荷の増加は、電界効果と呼ばれる現象を原因とする、ワイヤにおける抵抗の変化により検出することができる）。しかしながら、ポリマーが成長すると、付加されるヌクレオチドが保有する電荷が、高感度ナノ構造（例えば、ナノワイヤ）またはセンサから離れすぎて、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性変化を感知できなくなるため、シグナルは小さくなる場合があり、シグナルが観察されない場合もある。そのため、「リード長」（このヌクレオチドシーケンシング法により得ることができる配列データの量）が限定される可能性がある。
【００９８】
本明細書で使用する場合、この特定の例、「高感度検出ナノ構造」は、表面または表面近くでの電荷の任意の変化を検出することが可能であり、任意の点で、約５００ナノメートル未満、典型的には約２００ナノメートル未満、より典型的には約１５０ナノメートル未満、さらにより典型的には約１００ナノメートル未満、さらにより典型的には約５０ナノメートル未満、さらにより典型的には約２０ナノメートル未満、さらにより典型的には約１０ナノメートル未満、さらには約５ナノメートル未満の、少なくとも１つの断面寸法を有し得る、任意の構造（ナノスケールであれ、それ以外であれ）であり得る。他の実施形態では、断面寸法の少なくとも１つは、概して、約２ナノメートル未満または約１ナノメートルであり得る。一組の実施形態では、高感度検出ナノ構造またはセンサは、約０．５ナノメートル〜約２００ナノメートルの範囲の少なくとも１つの断面寸法を有し得る。ある構造またはセンサでは、電荷の変化の検出は、直接的ではなく間接的な場合があり、つまり、電荷の基本的変化の関数である、付加特性の検出による場合がある。
【００９９】
高感度検出ナノ構造またはセンサの特性は、表面または表面近くの電荷に応じて、圧電測定、電気化学的測定、電磁測定、光検出、機械的測定、超音波測定、および重量測定などによって測定可能であるように、変化し得る。高感度検出ナノ構造またはセンサの例には、限定されるわけではないが、二次元電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）、カンチレバー、（ＦＥＴまたはインピーダンスまたはその他として操作される）ナノワイヤ、ナノポア、圧電フィルム、カーボンナノチューブ、および全ての適切な、マクロ構造、マイクロ構造、ナノ構造、ピコ構造、ゼプト構造、またはより小さい構造が含まれ得る。センサは、また、導波管とすることもできる。
【０１００】
本開示のある実施形態は、反応が進むにつれリンカー長が伸びる、リンカー分子を介して付着した（例えば、５´リン酸基に付着した）高負（または正）電荷量レポーター部分と共に、通常のヌクレオチドを含み得る合成ヌクレオチドを使用することによって、少なくとも部分的に、この制限に対処することができる。この電荷量は、高感度ナノ構造（例えば、ナノワイヤ）に「届い」て、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの特性変化（例えば、使用する高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサに応じた、構造における電界効果または他の圧電変化）を引き起こすようにデザインすることが可能である。増え続ける電界効果を引き起こす多くのレポーター部分の蓄積を解消することにより、良好な品質管理測定を可能にし、長いリード長を確保するため、これらのレポーター部分は、少なくともある実施形態では切断されて、シーケンシング・バイ・シンセシス配列において、次のヌクレオチドの付加を可能にする。
【０１０１】
そのため、一部の実施形態では、周期性反応は、以下の一連の事象の全てまたは一部のうち少なくともいくつかまたは全てを含み得る：
１．シーケンシングされる鋳型ｓｓＤＮＡ分子が、高感度検出ナノ構造もしくはナノ／マイクロセンサにライゲーションされ、プライマーを付加されるか、高感度検出ナノ構造もしくはナノ／マイクロセンサ上の予め固定されたプライマー配列に結合するか、または、高感度検出ナノ構造もしくはナノ／マイクロセンサと共に配列されたマイクロ流体チャネルにおいて解かれるまたは長くされる。
２．高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサを、水または低塩緩衝液（１ｘＳＳＣなど）で洗浄することが可能である。
３．高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの測定を行うことが可能である。
４．１つの合成ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および重合反応に必要な他の要素を含有する混合物が加えられ得る。一例では、付加されるヌクレオチドが、プライマー配列直後のマイナス鎖上の塩基に対し相補的である場合、そのヌクレオチドはポリメラーゼにより成長鎖に組み込まれ得る。
５．次に反応物を、水または低塩緩衝液（１ｘＳＳＣなど）で洗浄することが可能である。
６．レポーター部分の高電荷量により引き起こされる影響を観察することが可能な高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサの測定を、行うことが可能である。
７．次に、レポーター部分を、（例えば酸性溶液により、または酵素的に）切断することが可能である。
８．ポイント２〜７は、４つのヌクレオチドそれぞれについて繰り返すことが可能である。そして、これは、明確なシグナルが劣化するまで、何度も繰り返すことが可能である。
【０１０２】
鋳型分子をプローブに固定または結合させ、該プローブを、次に、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサに固定することが可能ないくつかの実施形態では、高電荷レポーター部分を合成ヌクレオチドに付着させるリンカー長は長くなり、電荷が、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサに「届い」て効果を発揮することを可能にし得る。これは、シーケンシング・バイ・シンセシス反応が進み得ると、成長ヌクレオチドポリマーが、次のヌクレオチド付加部位を、高感度検出ナノ構造またはナノ／マイクロセンサからさらに遠くに動かし得ることから、少なくともいくつかの実施形態において必要であり得る。
【０１０３】
鋳型分子が、高感度検出ナノ構造もしくはナノ／マイクロセンサに固定されることも、プライマー／プローブにハイブリダイズして、次に高感度検出ナノ構造もしくはナノ／マイクロセンサに固定されることもなく、その代りに、鋳型分子が遊離しているかまたは高感度検出ナノ構造もしくはナノ／マイクロセンサのクラスタに水平に固定され得るいくつかの他の実施形態では、単一リンカー長を、サイクル反応それぞれで使用することが可能である。
【０１０４】
〔実施例２−プライマー伸長〕
いくつかの実施形態では、合成ヌクレオチドは、本開示のいくつかの態様においてプライマー伸長実験のために記載され、検出は、電気的バイオセンサ（ナノワイヤ／ナノチューブＦＥＴ、２Ｄ  ＦＥＴＳ、ナノポア、圧電フィルム／表面など）において実行される。プライマー伸長は、概して、ＤＮＡまたはＲＮＡの５´端をマッピングするまたは特定することができる技法として定義される。例えば、プライマー伸長を使用して、遺伝子の転写開始部位の開始部位を特定することが可能である。この技法は、概して、ラベル付きプライマーを必要とし、該プライマーは、標的遺伝子の３´端近くの領域に対し相補的である。プライマーは、標的遺伝子の転写物に対しアニールすることが可能であり、逆転写酵素を使用して、転写物に対して相補的なｃＤＮＡを、それが転写物の５´端に到達するまで、合成する。ゲル上の配列長さが、開始部位からラベル付きプライマーまでの距離を表すことから、ポリアクリルアミドゲル上で生成物を走らせることにより、転写開始部位を特定することが可能である。ｃＤＮＡの合成時に、本出願で開示する合成ヌクレオチドを使用することが可能であり、該合成ヌクレオチドは、新生ｃＤＮＡ鎖に付加され得る。特異的な合成核酸（例えば、アデニン、グアニン、チミジン、またはシスチンを有するデオキシヌクレオチド）の付加は、ナノセンサにより検出することが可能である。ナノセンサについてはさらに以下に記載するが、該ナノセンサはプライマーに付着させることが可能であり、その結果、いくつかの実施形態において、新生ｃＤＮＡ鎖がナノセンサに付着することができる。あるいは、いくつかの他の実施形態では、標的配列の転写物は、ナノセンサ（例えば、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノビーズ、ナノポア、ナノギャップ、および他）に付着し得る。
【０１０５】
バイオセンサ
種々の実施形態で使用する場合、バイオセンサは、概して、生体成分と物理化学的検出成分を組み合わせた分析物の、検出デバイスである。いくつかの実施形態では、それは、３つの部分を含み得る：１．高感度生体要素（生体物質（例えば、組織、微生物、オルガネラ、細胞受容体、酵素、抗体、核酸等）、生物学的に由来する物質または生体模倣）。高感度要素は、生物工学により作成することが可能である；２．変換器、または、分析物と生体要素との相互作用により生じるシグナルを、より容易に測定および定量化することが可能な別のシグナルに変換する検出要素（物理化学的方法：光学、圧電、電気化学などで機能する）（つまり、変換器）；３．分かりやすい方法での結果の表示を主に担う関連電子機器またはシグナルプロセッサ。いくつかの他の例では、シグナル処理ユニットは、さらに、シグナル感知ユニット、シグナル記録ユニット、データ処理ユニット、およびデータ報告ユニットのうち１つまたは複数を含み得る。
【０１０６】
ナノ構造
種々の実施形態で使用する場合、ナノワイヤは、細長いナノスケールの半導体であり、これは、その長さに沿った任意の点で、少なくとも１つの断面寸法を有し、いくつかの実施形態では、５００ナノメートル未満、好適には２００ナノメートル未満、より好適には１５０ナノメートル未満、さらにより好適には１００ナノメートル未満、さらにより好適には７０未満、さらにより好適には５０ナノメートル未満、さらにより好適には２０ナノメートル未満、さらにより好適には１０ナノメートル未満、さらには５ナノメートル未満の、２つの直断面寸法を有する。他の実施形態では、断面寸法は２ナノメートル未満または１ナノメートル未満であり得る。一組の実施形態では、ナノワイヤは、０．５ナノメートル〜２００ナノメートルの範囲の少なくとも１つの断面寸法を有し得る。ナノワイヤがコアと外側領域を有すると記載される場合、上記寸法は、コアの寸法に関する。細長い半導体の断面は、限定するわけではないが、円形、方形、矩形、楕円形、および管状を含む、任意の恣意的な形を有し得る。定形および不定形の形が含まれる。本発明のナノワイヤを作ることが可能な材料の非限定的例の一覧を以下に載せる。
【０１０７】
ナノチューブは、本発明で使用され得るナノワイヤの一種であり、一実施形態では、本発明のデバイスは、ナノチューブと同等のスケールのワイヤを含む。本明細書で使用する場合、「ナノチューブ」は、中を刳り貫いたコアを有するナノワイヤであり、当業者に既知のナノチューブが含まれる。「非ナノチューブナノワイヤ」は、ナノチューブではない任意のナノワイヤである。本発明の一組の実施形態では、非修飾（ナノチューブが置かれる環境において、ナノチューブに固有ではない補助的な反応体が含まれない）表面を有する非ナノチューブナノワイヤが、ナノワイヤまたはナノチューブを使用することが可能な、本明細書に記載の発明の任意の装置で使用される。「ワイヤ」は、少なくとも半導体または金属の伝導性を有する任意の材料を指す。例えば、用語「導電性」または「導体」または「導電体」は、「伝導性」ワイヤまたはナノワイヤに関連して使用する場合、ワイヤが電荷を通す能力を指す。好適な導電性材料は、１０−３オーム・メートル未満の抵抗性、より好適には１０−４オーム・メートル未満、最も好適には１０−６オーム・メートルまたは１０−７オーム・メートル未満の抵抗性を有する。
【０１０８】
ナノポアは、概して、電気絶縁性膜に１つまたは複数の小孔を有し、これは、単一分子検出器として使用することが可能である。場合によっては、それは、高電気抵抗脂質二重膜における生物学的タンパク質チャネルか、または固体膜における孔であり得る。ナノポアは、概して、１つまたは複数の孔を有するナノスケールサイズの球状構造である。いくつかの態様によると、ナノポアは、炭素または任意の伝導性材料でできている。
【０１０９】
ナノビーズは、概して、ナノスケールサイズの球状構造である。ナノビーズの形状は、概して、球状であるが、円形、方形、矩形、楕円形、および管状でもあり得る。定形および不定形の形が含まれる。いくつかの例では、ナノビーズは、中に孔を有し得る。
【０１１０】
ナノギャップは、概して、２つの接触面の間のナノメーター範囲の離隔からなるバイオセンサで使用される。それは、標的分子またはいくつかの標的分子が、いつその２つの接触面の間でハイブリダイズするかまたは結合して、電気シグナルに分子を通過させ得たかを感知する。
【０１１１】
前記ナノ構造、つまり、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノポア、ナノビーズ、およびナノギャップは、本発明の範囲を限定するためではなく、いくつかの実施形態の即時の例示を提供するために記載されるものである。前記例に加え、ナノスケールサイズを有し、本出願で開示する核酸検出法および装置に適用するのが適切な任意のナノ構造も、本発明の範囲に含まれると考えるべきである。 検出は、また、以下でさらに論じる、ミクロンスケールのＦＥＴアレイなどの他の非ナノスケール構造でも起き得ることを理解されたい。
【０１１２】
概して、分子および化合物を検出するためにナノ構造またはナノセンサを使用する感知戦略は、その表面もしくは表面近く、または、ナノギャップもしくはナノポア全体で、電荷の変化を感知することであり、該電荷の変化は、その特性（電界効果トランジスタ、ナノギャップ、または圧電ナノセンサなど）において、標的核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）を検出および定量化するための測定可能な変化を引き起こす。
【０１１３】
本発明の態様は、サンプル中の分析物を決定するように構築および配列される系の一部を好適に形成するナノワイヤを提供し、前記サンプル中の分析物に前記ナノワイヤは晒される。「決定する」とは、この文脈では、サンプル中の分析物の量および／または存在を決定することを意味する。分析物の存在は、ナノワイヤにおける特性、典型的には電気特性または光学特性における変化を決定することにより決定され得る。例えば、分析物は、ナノワイヤの導電性または光学特性において検出可能な変化を引き起こす。一実施形態では、ナノワイヤは、本質的に、分析物を決定する能力を有する。ナノワイヤは官能化され得、つまり、分析物が結合する表面官能性部分を含み、ナノワイヤに測定可能な特性変化を引き起こす。結合事象は、特異的または非特異的であり得る。官能性部分は、限定するわけではないが、−−ＯＨ、−−ＣＨＯ、−−ＣＯＯＨ、−−ＳＯ３Ｈ、−−ＣＮ、−−ＮＨ２、−−ＳＨ、−−ＣＯＳＨ、ＣＯＯＲ、ハロゲン化物を含む群から選択される単純基と；限定されるわけではないが、アミノ酸、タンパク質、糖類、ＤＮＡ、抗体、抗原、および酵素を含む生体分子実体と；限定するわけではないが、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリアクリル酸を含むポリマー群から選択される、ナノワイヤコアの直径未満の鎖長さを有するグラフト化ポリマー鎖と；限定するわけではないが、以下の材料群：金属、半導体、および絶縁体を含み、金属元素、酸化物、硫化物、窒化物、セレン化物、ポリマー、およびポリマーゲルであり得る、ナノワイヤコアの表面を被覆する薄いコーティングとを含み得る。別の実施形態では、本発明は、ナノワイヤと、分析物と相互作用し、該分析物がナノワイヤの特性の変化を求めることにより決定され得るようにナノワイヤに対して位置付けられる、反応体とを提供する。
【０１１４】
マイクロ構造またはマイクロセンサ
いくつかの実施形態では、形状、構造、および特性の点では前記ナノ構造と類似しているが、寸法は異なる、例えば、マイクロスケールのセンサを使用することが可能である。したがって、いくつかの例では、マイクロ構造は、細長いマイクロスケールの半導体の形態をとり得、これは、その長さに沿った任意の点で、少なくとも１つの断面寸法を有し、いくつかの実施形態では、５００マイクロメートル未満、好適には２００マイクロメートル未満、１５０マイクロメートル未満、１００マイクロメートル未満、７０未満、５０マイクロメートル未満、２０マイクロメートル未満、１０マイクロメートル未満、５マイクロメートル未満、４マイクロメートル未満、３マイクロメートル未満、２マイクロメートル未満、さらには１マイクロメートル未満の、２つの直断面寸法を有する。他の実施形態では、断面寸法は、２マイクロメートル未満または１マイクロメートル未満であり得る。一組の実施形態では、マイクロワイヤは、０．５マイクロメートル〜２００マイクロメートルの範囲の少なくとも１つの断面寸法を有し得る。マイクロワイヤがコアと外側領域を有すると記載される場合、上記寸法は、コアの寸法に関する。細長い半導体の断面は、限定するわけではないが、円形、方形、矩形、楕円形、および管状を含む、任意の恣意的な形を有し得る。定形および不定形の形が含まれる。本発明のマイクロワイヤを作ることが可能な材料の非限定的例の一覧を以下に載せる。あるいは、または、組み合わせて、マイクロ構造またはマイクロセンサは、任意の形状または構造を取り得、例えば、構造の少なくとも一部分、例えば、マイクロスケールの断面、深さ、および／または長さの寸法は異なるが、電気シグナルを感知するという点では、ナノ構造と本質的に類似した特性を有する、マイクロチューブ、マイクロポア、マイクロビーズ、およびマイクロギャップであり得る。
【０１１５】
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）
電界効果は、一般的に、Ｆ（反応速度などについて）の記号で表される、対象の中心と、離れた単極または双極との間の、結合ではなく空間を通した直接作用による分子内クーロン相互作用の実験的に観察できる効果のことをいう。電界効果（または「直接効果」）の大きさは、単極電荷／双極モーメント、双極の向き、対象の中心と離れた単極または双極との間の最短距離、および、有効誘導率に左右され得る。これは、コンピュータ向けトランジスタにおいて、およびごく最近では、ナノセンサとして使用されるＤＮＡ電界効果トランジスタにおいて活用されている。
【０１１６】
電界効果形トランジスタ（ＦＥＴ）は、概して、バイオセンサとして機能する生体分子の部分電荷による電界効果を使用し得る電界効果トランジスタである。ＦＥＴの構造は、バイオセンサＦＥＴでは表面受容体として作用する固定化されたプローブ分子の層により置き換えられ得るゲート構造を除いて、金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）の構造と同様であり得る。標的生体分子が受容体とハイブリダイズするかまたは結合すると、表面近くの電荷分布が変化し、これが次に、半導体変換器（例えばナノワイヤ）を通しての電流輸送を調節する。
【０１１７】
生体サンプル
サンプルまたは生体サンプルの用語は、概して、生物学的供給源からの任意の細胞、組織もしくは体液（「生体サンプル」）、または、血清もしくは水などを含む、本発明に従って評価することが可能な生物学的もしくは非生物学的な任意のその他媒体のことをいう。サンプルは、限定されるわけではないが、生物（例えばヒト、非ヒト哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌、藻類、細菌、ウイルスなど）から得られる生体サンプル、ヒトによる消費のために設計された食物から得られるサンプル、家畜飼料、乳のような動物による消費のために設計された食物を含むサンプル、臓器提供サンプル、血液供給を目的とする血液サンプル、水道からのサンプルなどを含む。サンプルの一例は、特定の核酸配列の有無を決定するためにヒトまたは動物から得られるサンプルである。
【０１１８】
核酸またはオリゴヌクレオチド
用語核酸またはオリゴヌクレオチドまたは本明細書における文法的同等物は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好適には一本鎖または二本鎖であり、概して、ホスホジエステル結合を含有するが、場合によっては、以下で概説するように、例えば、ホスホルアミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）および前記文献中の参考文献；Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 57；Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487；Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470；ならびにPauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419)、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437；および米国特許第５，６４４，０４８号明細書）、ホルホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合methylphophoroamidite linkages（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照）を含む代替主鎖、ならびにペプチド核酸主鎖および結合（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895；Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008；Nielsen (1993) Nature, 365: 566； Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207）を有し得る核酸類似体が含まれる。他の核酸類似体には、正電荷の主鎖（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097；非イオン性主鎖（米国特許第５３８６０２３号；同第５６３７６８４号；同第５６０２２４０号；同第５２１６１４１号；および同第４４６９８６３号；Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423；Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470；Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395；Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))、ならびに、米国特許第５２３５０３３号および同第５０３４５０６号、およびChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されているものを含む、非リボース主鎖を有する核酸が含まれる。１つまたは複数の炭素環状糖を含有する核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp. 169-176参照）。いくつかの核酸類似体がRawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35に記載されている。リボース−リン酸主鎖においてこれらの修飾を行って、ラベルなどの追加部分の付加を促進するかまたは生理学的環境における斯かる分子の安定性および半減期を増加させることができる。
【０１１９】
感知戦略
本発明の一態様において、ナノ構造に結合するように構成された生体材料は核酸である。このような核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの任意の誘導体が含まれ得る。一実施形態において、生体材料はＤＮＡである。ＤＮＡがナノ構造に付着する場合、ヌクレオチド数は、５塩基〜１００塩基におよび得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡヌクレオチド数は、７塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基、６０塩基、７０塩基、８０塩基、９０塩基、および１００塩基であり得る。いくつかの他の実施形態では、リボ核酸および任意の核酸誘導体が、ナノ構造に付着し得る。さらにいくつかの他の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体が同時に使用され得る。そのため、一例では、ＤＮＡ配列がナノ構造に付着し得る一方、別の例では、ＲＮＡ配列がナノ構造に付着し得、さらに別の例では、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、モルホリノ、ロックドヌクレオチド、グリコールヌクレオチド、トレオースヌクレオチド、任意の合成ヌクレオチド、それらの任意のアイソフォーム、およびそれらの任意の誘導体などの核酸誘導体がナノ構造に付着し得る。いくつかの他の例では、ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡと核酸誘導体、ＲＮＡと誘導体、およびＤＮＡとＲＮＡと誘導体を含むヌクレオチド配列が、ナノ構造に付着し得る。
【０１２０】
本発明の別の態様では、ナノ構造は導電性であり、本出願で開示する合成ヌクレオチドに由来する電荷を、その表面、近傍、内管、および／または中のポアにおいて感知することが可能である。任意の診断デバイスの重要な態様の１つは、それが如何に特異的（つまり、低偽陽性率）かつ高感度（つまり、低偽陰性率）に検出するかにより決定される性能で、生体分子を正確に検出する能力である。ナノセンサは、その表面もしくは表面近くで、またはナノギャップもしくはナノポア全体で、標的分子がナノ構造上またはナノ構造近くに固定されたプローブに結合することを少なくとも部分的な原因として、ナノセンサの特性に測定可能な変化を引き起こす電荷の変化を感知することが可能であり、前記ナノセンサは、ラベル（検出デバイスが対象の生体分子または分子を「感知」することを可能にする、該生体分子または分子に結合可能な高価な化学物質）を必要とする、用法を限定された、または限定されない、超高感度検出のための方法を提供する。
【０１２１】
本開示は、概して、ナノセンサとともに使用する分子生物学的プロトコルおよび感知戦略に関し、前記ナノセンサは、その表面もしくは表面近くで、またはナノギャップもしくはナノポア全体で、標的核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）を検出および定量化するための測定可能な変化をナノセンサの特性（例えば、電界効果トランジスタ、ナノギャップ、または圧電性のナノ構造もしくはナノセンサ）において引き起こす電荷の変化を感知することにより、分子および化合物を検出し得る。これらのバイオセンサの基本的機能は、ヌクレオチドポリマープローブ（または、ＰＮＡ、モルホリノなどの合成ヌクレオチドポリマー）を、ナノ構造上、またはその近くに固定することを必要とする場合があり、プローブに結合した標的分子の蓄積は、プローブの電荷を原因として、ナノ構造またはナノセンサの表面またはその近くの電荷密度の上昇を引き起こし得る。例えば、ナノワイヤに固定された、（標的ヌクレオチドポリマーに対し逆相補配列を有する）プローブに結合する増幅ＰＣＲ断片は、電界効果と呼ばれる現象に起因するナノワイヤ表面またはその近くでの負電荷の増加により、測定可能なコンダクタンス変化（ΔＧ）を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド自体および高電荷量レポーター部分に由来する合成ヌクレオチド中に存在する電荷を、ナノ構造／ナノセンサにより検出することが可能である。
【０１２２】
これらのナノセンサは、生体分子の高感度で動的な検出の可能性を提供し得るが、この感度はいくつかの問題点を抱える場合がある。例えば、サンプルマトリックス内の表面における電荷の自然な揺らぎは、標的ヌクレオチドポリマー分子の隣接配列（つまり、プローブに結合していない突出配列）を部分的に原因として、ノイズを引き起こす場合がある。さらに、多くの標的分子がナノセンサのアレイ上で同時に検出される場合、これらの分子それぞれのサイズ、ひいては電荷量を標準化して、より厳格な比較と品質コントロールとを可能にすることが好適であろう。さらに、全ての標的分子のサイズが標準的であれば、アレイアッセイ設計におけるプローブハイブリダイゼーション条件の標準化が可能になる。
【０１２３】
バイオセンサシステム
バイオセンサは、概して、分子事象を電気シグナルに変換し得る解析デバイスである。バイオセンサで使用されるナノ構造は、概して、核酸などの対象成分を検出するために使用される。バイオセンサは、概して、液相または気相において動作し得、例えば、集積化デバイスおよび下流の用途向けなど、極めて多様な用途をもたらす。そのため、バイオセンサは、安価かつ携帯用に製造可能であり、任意選択的に、埋め込み型の検出およびモニタリングデバイスとして使用される。あるいは、バイオセンサは、質量分析器など他の高分解能装置と組み合わせ、標的生体分子の存在、存在量、および／または構造変種の検出を含む、さらなる情報を提供することが可能である。
【０１２４】
本発明の一態様は、電気的感知要素であり得るバイオセンサの感知要素と、分析物を含有するまたは含有するとみられるサンプル（例えば、流体サンプル）中の分析物の有無を検出することが可能なナノワイヤとに関する。本発明のナノスケールセンサは、例えば、ｐＨまたは金属イオンの存在を検出するための化学的用途；タンパク質、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど）、糖もしくは炭水化物、および／または金属イオンを検出するための生物学的用途；ならびにｐＨ、金属イオンもしくはその他の対象分析物を検出するための環境的用途で使用することができる。
【０１２５】
本発明の別の態様は、サンプル露出領域と、分析物の有無を検出することが可能なナノワイヤを含む、バイオセンサという物品に関する。サンプル露出領域は、ナノワイヤに近接した任意の領域であり得、サンプル露出領域中のサンプルが、ナノワイヤの少なくとも一部の位置を決める。サンプル露出領域の例としては、限定するわけではないが、ウェル、チャネル、マイクロチャネル、およびゲルが挙げられる。好適な実施形態では、サンプル露出領域はナノワイヤに近接してサンプルを保持するか、または、サンプル中の分析物の決定のために、ナノワイヤにサンプルを向けることができる。ナノワイヤは、サンプル露出領域に隣接して、またはサンプル領域内に位置し得る。あるいは、ナノワイヤは、流体または流体流路に挿入されたプローブであり得る。ナノワイヤプローブはまた、マイクロ針を含み得、サンプル露出領域は、生体サンプルにより位置決定可能であり得る。この場合、マイクロ針プローブを生体サンプルに挿入するために構築および配置されたデバイスは、サンプル露出領域を定義する、マイクロ針を取り囲む領域を含み、サンプル露出領域中のサンプルは、ナノワイヤにより位置決定可能であり、逆もまた同じである。流体流動チャネルは、１９９７年９月１８日に公開され、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第９７／３３７３７号に記載されているもののような種々の技法を使用して、本発明の使用に有利なサイズおよびスケール（マイクロチャネル）で作成することが可能である。
【０１２６】
本発明の別の態様では、物品は１つまたは複数の分析物の複数の有無を検出することが可能な複数のナノワイヤを含み得る。個々のナノワイヤは、上記のように、区別してドープすることにより、分析物に対する各ナノワイヤの感度を変えることができる。あるいは、個々のナノワイヤを、特異的な分析物と相互作用するそれらの能力に基づいて選択することにより、種々の分析物の検出が可能になる。複数のナノワイヤは、ランダムに方向付けられるか、または互いに平行であり得る。あるいは、複数のナノワイヤは、基板上のアレイにおいて方向付けられ得る。
【０１２７】
検出器が存在する場合、ナノワイヤに関連する特性を決定することが可能な任意の検出器を使用することが可能である。特性は、電気的、光学的などであり得る。ナノワイヤの電気的特性は、例えば、その伝導性、抵抗などであり得る。ナノワイヤに関連する光学的特性には、その発光強度が含まれるか、または、ナノワイヤが、発光がｐ−ｎ接合で起きる発光性ナノワイヤである場合は、発光波長が含まれ得る。例えば、電気特性または磁性特性（例えば、電圧、電流、伝導性、抵抗、インピーダンス、インダクタンス、電荷など）の変化を測定するために構築された検出器を使用することが可能である。検出器は、典型的には、電源と電圧計または電流計を含む。一実施形態では、１ｎＳ未満のコンダクタンスを検出することが可能である。好適な実施形態では、数千ｎＳの範囲のコンダクタンスを検出することが可能である。種または分析物の濃度は、マイクロモル未満〜モル濃度以上まで検出することができる。既知の検出器とともにナノワイヤを使用することにより、感度は単分子まで拡張可能である。一実施形態では、本発明品は、ナノワイヤに刺激を送ることが可能であり、検出器は、刺激から生じるシグナルを求めるように構築および配置する。例えば、ｐ−ｎ接合を含むナノワイヤに刺激（電流）を送ることが可能であり、ここで検出器は、該刺激から生じるシグナル（電磁放射線）を決定するように構築および配置される。このような場合、分析物とナノワイヤ、または、ナノワイヤに近接して位置づけられた反応体との相互作用は、検出可能な方法でシグナルに影響を与え得る。別の例において、反応体が量子ドットである場合、該量子ドットは、一波長の電磁放射線を受け、異なる波長の電磁放射線を放出するように構築することができる。刺激が電磁放射である場合、それは、分析物との相互作用に影響され得、検出器は、それに起因するシグナルの変化を検出することが可能である。刺激の例としては、定電流／電圧、交流電圧、および光などの電磁放射線が挙げられる。
【０１２８】
本発明の別の態様は、ナノワイヤと、該ナノワイヤの電気的特性の変化を求めるように構築および配置された検出器とを含む物品を提供する。ナノワイヤの少なくとも一部は、分析物を含有するまたは含有するとみられるサンプルによって、位置決定可能である。句「流体により位置決定可能」とは、流体中にあるとみられる分析物がナノワイヤと相互作用できるように、ナノワイヤに対し位置づけられる流体の能力と定義する。流体は、ナノワイヤと近接してもよいし、ナノワイヤと接触してもよい。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ナノ構造は、現在入手可能なマイクロ流体システムおよびそれと適合性のあるフォーマットよりも高密度なマイクロカラムなどの複数の平行アレイに組み立てることが可能である。ナノ構造アレイは、任意選択的に、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノポア、ナノビーズ、ナノギャップ、またはそれらの組み合わせなどの、複数のナノ構造を含む。アレイの各ナノ構造は、ナノワイヤのコンダクタンスの任意の変化を検出するために、ナノワイヤおよび検出器全体に電圧を印加するバッテリーに対し、例えば、２つ以上の電極を介して電気的に接続され得る。あるいは、各ナノ構造は、電気を別々に受け取る場合もあるし、共に配列されたナノ構造の一部のみが、電気的に接続される場合もある。
【０１３０】
単一検出器または検出器の組み合わせを任意選択的に使用して、ナノワイヤアレイからのシグナルを検出する。例えば、同じまたは異なるプローブに結合しうる、異なる標的配列を含むプローブと結合した各ナノワイヤを、任意選択的に別々に検出して、複数のナノワイヤの空間的並びを使用して、例えば血液のような生体サンプル中に存在する複数の異なるヌクレオチド配列を迅速に同定できる。いくつかの例では、ナノ構造の複数の区画をアレイ中に調製し、各区画は、生体サンプル中の多数の標的配列を検出するように異なるプローブを提示する。あるいは、いくつかの他の例では、アレイに存在するナノ構造全体が同じプローブを提示する場合があり、それにより、一標的配列のみが、該配列の存在、存在量、および／または変種についてテストされることになる。
【０１３１】
ナノ構造またはナノセンサによる検出物は、概して、ナノ構造またはその環境のコンダクタンス変化である。シグナルは、ナノ構造全体での電圧の変化またはナノ構造を通る電流の変化に換算して表され得る。このような変化は、典型的には、例えば、電圧計および／または電流計を用いて、電気的に検出される。あるいは、シグナルは、デジタル方式で検出される。一実施形態では、電圧をナノ構造、例えば、ナノワイヤ全体に印加し、定常状態のシグナルを得る。結合事象がナノ構造に付着したプローブで起きる場合、ナノ構造近辺の電界は変化し、ナノ構造のコンダクタンスも変化し、定常状態のシグナルにおいて揺らぎまたはシフトを生じさせる。シグナルは、電気的にまたはデジタル方式で検出され得、対象事象のリアルタイム検出を提供する。
【０１３２】
バイオセンサは、また、生体分子の存在、レベル、および／または変種を検出するためのシステムに組み込むことが可能である。ある態様では、斯かるシステムは、ナノ構造要素全体の電流を適用および測定するための、給電モニタリングシステムを含み得る。別の態様では、斯かるシステムは、さらに、ナノ構造のプログラミング済み操作を可能にし、有用な解析を受領し、保存し、提供することを可能にするデータ処理機能と、得られたデータの表示部を含み得る。さらに、得られたデータを処理するためのコンピュータシステムと、追加のプロセッサも、所望であれば、バイオセンサシステムに組み込むことができる。コンピュータシステムまたはバイオセンサシステム中に存在する任意の追加の要素は、データ解析もしくは自動操作のためのソフトウェア、および／または、バイオセンサを用いた検出プロセスを実行するためのマニュアルを提供し得る。さらに、バイオセンサの性能を高め得る任意の追加要素も加えることが可能である。本発明のバイオセンサは、リアルタイムデータを収集することが可能である。
【０１３３】
〔実施例３−マイクロアレイなどのハイブリダイゼーション〕
他の実施形態では、本開示のいくつかの態様で開示する合成ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション手順に使用することが可能である。ハイブリダイゼーション手順の、いくつかの非限定的で例示的な例には、核酸およびタンパク質用マイクロアレイが含まれる。さらに、ハイブリダイゼーションを必要とし、標的生体分子の存在、存在量、または任意の構造変種を求めることが可能な任意の他の手順も含まれ得る。
【０１３４】
一例では、マイクロアレイで使用するプローブは、ナノセンサ（例えば、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノビーズ、ナノポア、ナノギャップ、および他のナノ構造）などの媒体に付着し得る。場合によっては、生体サンプルから得られた標的ヌクレオチド配列にラベルを付し、プローブと接触させる。このような場合、標的ヌクレオチドは合成ヌクレオチドを組み込み得、それにより、該標的ヌクレオチドに「高電荷量」のラベルを付すことができる。したがって、標的配列のプローブへの結合は、プローブが付着したナノセンサにより容易に求めることが可能である。さらに、本出願で開示する合成ヌクレオチドは、例えば、対象出願の関連出願、２００８年９月３日に出願された米国仮出願第６１／０９４０１７号（この開示は、ここに参照によりその全体が明示的に組み込まれ、ここに明示的に本出願の一部をなすものとする）に開示される核酸の存在、存在量、および／または構造変種を検出する方法において、使用することが可能である。したがって、本出願の合成ヌクレオチドの使用は限定されず、適用可能であれば、さらに広げることが可能である。
【０１３５】
〔実施例４−過荷電ＴＴＰ（ＳＣＴＴＰ）の合成〕
・５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン
【化２５】
2019503174.tif 000027
【０１３６】
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（５．００ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５７．５ｍＬ）に溶解し、窒素下で撹拌した。５分後、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（８６ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１９９ｍｇ、２７５μＬ、１．９７ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、続いて４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロリド（５．７３ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた反応混合物を室温で４時間撹拌し、それを次にメタノール（８．３ｍＬ）でクエンチしてから減圧下で濃縮した。得られた残渣を水（２５０ｍＬ）とジクロロメタン（２５０ｍＬ）に分けた。水相をジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を混合し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して黄色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→８０％）を順相条件下で使用し精製して、５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（８．５９ｇ、９３％）を淡黄色固体として得た。
【０１３７】
Rf0.20 (ジクロロメタン−酢酸エチル, 8 : 2, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): 11.76 (s, 1H, NH), 8.01 (s, 1 H, CH), 7.33 (m, 9 H, 9×ArH), 6.90 (m, 4 H, 4×ArH), 6.10 (t, J = 7.1 Hz, 1 H, CH), 5.32 (d, J= 4.5 Hz, 1 H, OH), 4.23 (m, 1 H, CH), 3.90 (m, 1 H, CH), 3.74 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.17 (m, 2 H, CH2), 2.22 (m, 2 H, CH2).
【０１３８】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン
【化２６】
2019503174.tif 000028
【０１３９】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１０．２ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２０５ｍＬ）に溶解した。４−（ジメチルアミノ）ピリジン（９５ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．９５ｇ、５．４４ｍＬ、３９．０ｍｍｏｌ）を加え、続いて無水トリメチル酢酸（５．９７ｇ、６．５０ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を撹拌し、還流状態で２０時間加熱し、その後それを室温まで冷却し、メタノール（６．６ｍＬ）を加えた。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して褐色の油を得、これを、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→７０％）を順相条件下で使用して精製し、３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（９．２２ｇ、８０％）を白色固体として得た。未反応の５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（２．０８ｇ）も回収して、再利用した。
【０１４０】
Rf0.68 (ジクロロメタン−酢酸エチル, 8 : 2, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): 11.80 (s, 1H, NH), 8.08 (s, 1 H, CH), 7.29 (m, 9 H, 9×ArH), 6.89 (m, 4 H, 4×ArH), 6.10 (t, J = 7.1 Hz, 1 H, CH), 5.21 (m, 1 H, CH), 3.99 (m, 1 H, CH), 3.74 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.27 (m, 2 H, CH2), 2.28 (m, 2 H, CH2), 1.12 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１４１】
３’−Ｏ−ピバロイル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン
【化２７】
2019503174.tif 000029
【０１４２】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（５．３５ｇ、７．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３４ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（６１５μＬ）を滴下した。結果として生じた反応混合物 を室温で１時間撹拌した。トリフルオロ酢酸の第２部分（６１５μＬ）を加え、混合物を室温でさらに１時間撹拌した。トリフルオロ酢酸の第３部分（６１５μＬ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。結果として生じた混合物をジクロロメタン（１２０ｍＬ）で希釈し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、水相をジクロロメタン（８０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して淡黄色固体を得た。この固体を、２８５ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルがジクロロメタン中の酢酸エチルが０→６０％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（２．５６ｇ、８１％）を白色固体として得た。
【０１４３】
Rf0.41 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 7 : 3, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): 11.74 (s, 1H, NH), 8.40 (s, 1 H, CH), 6.14 (t, J = 7.1 Hz, 1 H, CH), 5.33 (t, J= 5.0 Hz 1 H, OH), 5.20 (m, 1 H, CH), 3.97 (m, 1 H, CH), 3.64 (m, 2 H, CH2), 2.28 (m, 2 H, CH2), 1.16 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１４４】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミド−プロピニル）−２’−デオキシウリジン
【化２８】
2019503174.tif 000030
【０１４５】
３’−Ｏ−ピバロイル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（２．５５ｇ、５．８２ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２２１ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６７０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３６．５ｍＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、窒素でパージした。ヒューニッヒ塩基（１．５０ｇ、１．９８ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−プロパルギルアミン（２．７１ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を加え、結果として生じた混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１７０ｍＬ）で希釈し、５％のＥＤＴＡ水溶液（２×６０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。この油を、２９５ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→１００％）を順相条件下で用いて精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジン（２．３１ｇ、８５％）を黄色の固体として得た。
【０１４６】
Rf0.38 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 1 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): 11.68 (s, 1H, NH), 7.34 (t, J = 5.6 Hz, 1 H, NH), 8.16 (s, 1 H, CH), 6.14 (t, J= 7.1 Hz, 1 H, CH), 5.27 (t, J = 5.0 Hz, 1 H, OH), 5.19 (m, 1 H, CH), 3.95 (m, 3 H, CH + CH2), 3.63 (m, 2 H, CH2), 2.28 (m, 2 H, CH2), 1.39 (s, 9 H, 3×CH3), 1.16 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１４７】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジントリフルオロアセテート
【化２９】
2019503174.tif 000031
【０１４８】
３’−Ｏ−ピバロイル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジン（２．０２ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（６ｍＬ）を加えた。結果として生じた混合物を２時間室温で撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。残留トリフルオロ酢酸を、ジクロロメタン（４×５０ｍＬ）で共沸除去した。得られた物質を、２８７ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントは０．１％のトリフルオロ酢酸中のアセトニトリルが０→６０％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥した後、３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジントリフルオロアセテート（断片１）（１．５５ｇ、７５％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０１４９】
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO) 11.80 (s, 1H, NH), 8.28 (br, 4 H, CH + NH3+), 6.14 (t, J = 7.1 Hz, 1 H, CH), 5.32 (br, 1 H, OH), 5.21 (m, 1 H, CH), 3.99 (m, 3 H, CH + CH2), 3.64 (m, 2 H, CH2), 2.28 (m, 2 H, CH2), 1.16 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１５０】
・３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル
【化３０】
2019503174.tif 000032
【０１５１】
エチル３−ヒドロキシベンゾエート（２．２３ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）、ブロモエチル−１，３−ジオキソラン（８．９７ｇ、５．５６ｍＬ、５３．７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．７２ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（０．８１ｇ、５．３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、反応混合物を１２０℃で１７時間撹拌した。結果として生じた懸濁液を室温まで冷却し、水（５０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、水（５×１００ｍＬ）で洗浄し、（ＭｇＳＯ４）で乾燥し、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→３５％）を順相条件下で使用し精製して、３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（３．１２ｇ、９２％）を無色油として得た。
【０１５２】
Rf0.40 (ガソリン-酢酸エチル, 75 : 25, v/v).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (dt, 1 H, J = 7.5, 1.1 Hz, ArH), 7.59 (dd, 1 H, J = 2.6, 1.5 Hz, ArH), 7.34 (t, 1 H, J = 7.9 Hz, ArH), 7.14 (ddd, 1 H, J = 8.3, 2.6, 1.0 Hz, ArH), 5.31 (t, 1 H, J = 4.1 Hz, CH), 4.36 (q, 2 H, 7.2 Hz, OCH2), 4.02 (m, 6 H, OCH2CH2O + ArOCH2), 1.39 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH3).
【０１５３】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル
【化３１】
2019503174.tif 000033
【０１５４】
３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（３．１２ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）とアジドトリメチルシラン（１．５７ｇ、１．８１ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）の混合物に、塩化スズ（ＩＶ）（２０６ｍｇ、９３μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。結果として生じた混合物を２％のメタノール水溶液（２０ｍＬ）で希釈し、３０分間撹拌してから減圧下で濃縮した。残渣をエタノール（２×１５ｍＬ）で共沸乾燥して、無色の粘性油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→７０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（２．４６ｇ、６９％）を無色油として得た。
【０１５５】
Rf0.40 (ガソリン-酢酸エチル, 53 : 47, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.69 (dt, 1 H, J = 7.7, 1.2 Hz, ArH), 7.59 (dd, 1 H, J = 2.6, 1.5 Hz, ArH), 7.36 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, ArH), 7.13 (ddd, 1 H, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, ArH), 4.89 (t, 1 H, J = 5.1 Hz, CH), 4.38 (q, 2 H, 7.1 Hz, OCH2), 4.19 (m, 2 H, ArOCH2), 4.00 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.80 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.40 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH3).
【０１５６】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化３２】
2019503174.tif 000034
【０１５７】
３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（２．３９ｇ、８．１０ｍｍｏｌ）をエタノール（２２ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム溶液（２２ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌し、体積を真空下で３／４に減らした。結果として生じた混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、２Ｍの塩酸でｐＨ１〜２まで酸性化した。この混合物をジクロロメタン（３×８０ｍＬ）で抽出した。混合有機相を飽和食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して、３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（２．２０ｇ、９９％）を無色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０１５８】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.76 (dt, 1 H, J = 7.7, 1.2 Hz, ArH), 7.65 (dd, 1 H, J = 2.4, 1.4 Hz, ArH), 7.41 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, ArH), 7.19 (ddd, 1 H, J = 8.2, 2.7, 1.0 Hz, ArH), 4.90 (t, 1 H, J = 5.1 Hz, CH), 4.21 (m, 2 H, ArOCH2), 4.03 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 3 H, 0.5×OCH2+ OCH2).
【０１５９】
・３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化３３】
2019503174.tif 000035
【０１６０】
無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（２．２０ｇ、８．３１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に水酸化ナトリウム（０．９９ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃で１０分間撹拌した。ブロモ酢酸エチル（３．０５ｇ、２．０３ｍＬ、１８．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで５時間超温めた。反応を氷水（２０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。水層を２Ｍの塩酸の添加によりｐＨ１〜２まで酸性化し、ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して無色油を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→６０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．２７ｇ、４３％）を無色油として得た。
【０１６１】
Rf  0.6 (酢酸エチル-ジクロロメタン, 4 : 6 v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.75 (dt, 1 H, J = 7.7, 1.2 Hz, ArH), 7.64 (dd, 1 H, J = 2.7, 1.5 Hz, ArH), 7.40 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, ArH), 7.19 (ddd, 1 H, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, ArH), 4.95 (dd, 1 H, J = 5.5, 4.6 Hz, CH), 4.14 (m, 7 H, ArOCH2 + 0.5×OCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 3.86 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.28 (t, 3 H, J = 7.2 Hz, CH3).
【０１６２】
・Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート
【化３４】
2019503174.tif 000036
【０１６３】
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２．０８ｇ、２．０５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（１．８５ｇ、１．５５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（３．３０ｇ、９９％）を白色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０１６４】
ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（１．０４ｇ、４．０６ｍｍｏｌ）トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間撹拌した。結果として生じた混合物を減圧下で濃縮し、残留トリフルオロ酢酸をクロロホルム（３×１０ｍＬ）で共沸除去した。得られた物質を５０℃で２時間真空乾燥して、Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．０７ｇ、９９％）を黄色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０１６５】
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO) δ 9.58 (br t, 1 H, NH), 7.99 (br s, 3 H, NH3+), 3.43 (m, 2 H, CH2N), 2.97 (m, 2 H, CH2N).
【０１６６】
・［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル
【化３５】
2019503174.tif 000037
【０１６７】
無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（０．７９ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．９５ｇ、１．２８ｍＬ、７．３４ｍｍｏｌ）、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（０．８７ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（１．４１ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→９０％）を順相条件下で使用し精製して、［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（１．１６ｇ、９６％）を無色油として得た。
【０１６８】
Rf0.48 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 1 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.01 (br, 1 H, NH), 7.39 (m, 3 H, 3×ArH), 7.10 (dt, 1 H, J= 5.8, 3.0 Hz, ArH), 6.97 (br, 1 H, NH), 4.93 (t, 1 H, J = 5.1 Hz, CH), 4.18 (m, 6 H, ArOCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 4.04 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.87 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 2 H, OCH2), 3.69 (m, 2 H, CH2N), 3.62 (m, 2 H, CH2N), 1.30 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH3).
【０１６９】
・［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル
【化３６】
2019503174.tif 000038
【０１７０】
酢酸エチル（２５ｍＬ）中の３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（０．８２ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（４１０ｍｇ、０．４１ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１．３４ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、およびヒューニッヒ塩基（０．６６ｇ、０．４１ｍＬ、５．１２ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を酢酸エチル（２０ｍＬ）と１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）に分けた。水相を分離し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を混合し、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して黄色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→８０％）を順相条件下で使用して精製した。生成物を含有する留分を混合し、減圧下で蒸発させた。得られた物質を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、および飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して、［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（０．９８ｇ、８６％）を黄色油として得た。
【０１７１】
Rf0.41 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 1 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.42 (m, 2 H, 2×ArH), 7.34 (t, 1 H, J = 7.8 Hz, ArH), 7.07 (m, 1 H, ArH), 5.04 (br, 1 H, NH), 4.94 (t, 1 H, J = 5.1 Hz, CH), 4.22 (m, 2 H, OCH2), 4.15 (m, 4 H, ArOCH2 + OCH2C(O)), 4.04 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.88 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 2 H, OCH2), 3.57 (m, 2 H, CH2N), 3.41 (m, 2 H, CH2N), 1.44 (s, 9 H, 3×CH3), 1.30 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH3).
【０１７２】
・２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム
【化３７】
2019503174.tif 000039
【０１７３】
方法Ａ
［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（１．１６ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム溶液（７ｍＬ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２．５時間撹拌してから減圧下で濃縮した。残渣を水（８０ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（２×７０ｍＬ）で洗浄した。水層を１Ｍの塩酸を使用してｐＨ２まで酸性化し、ジクロロメタン（３×７０ｍＬ）で洗浄した。結果として生じた水層を１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ８まで中和し、減圧下で蒸発させて白色固体を得て、これをジクロロメタンおよびメタノール（２×１４０ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）とともに伴出した。得られた固体を吸引濾過により集め、捨てた。濾液を減圧下で濃縮して残留粗ゴム（crude gum）を得た。このゴムはジクロロメタンおよびメタノール（１０ｍＬ、９：１、ｖ／ｖ）とともに伴出し、得られた不溶性白色固体を吸引濾過により集め、捨てた。濾液を減圧下で濃縮して（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（１．１１ｇ、１００％）を白色のガラス状発泡体として得た。
【０１７４】
方法Ｂ
エタノール（４ｍＬ）中の［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（０．５９ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）溶液に、４Ｍの水酸化ナトリウム溶液（４ｍＬ）を加え、混合物を２．５時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮して、残渣を水（１５ｍＬ）に溶解した。この水性混合物を、２Ｍの塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、ジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、次に減圧下で濃縮して、［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸（０．５２g、９２％）を無色油として得た。
【０１７５】
ジクロロメタン（１．５ｍＬ）中の［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）溶液にトリフルオロ酢酸（８０μＬ）を加え、混合物を室温で４０分間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮して、無色油を得た。この油をジクロロメタン（２ｍＬ）と１Ｍの塩酸（２ｍＬ）に分けた。有機層を捨て、水層を３Ｍの水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ８に調整してから減圧下で濃縮した。得られた白色固体をジクロロメタンとメタノール（２×１０ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）の混合物と共に伴出し、沈殿物は廃棄した。濾液を蒸発させ、残渣をジクロロメタンとメタノール（１０ｍＬ、９：１、ｖ／ｖ）の混合物とともに伴出し、沈殿物は廃棄した。濾液を減圧下で濃縮して（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（４３ｍｇ、９９％）を白色のガラス状固体として得た。
【０１７６】
1H NMR (300 MHz, D2O) δ 7.31 (m, 3 H, 3×ArH), 7.11 (ddd, 1 H, J = 7.8, 2.6, 1.5 Hz, ArH), 4.99 (t, 1 H, J = 4.5 Hz, CH), 4.15 (m, 2 H, ArOCH2), 3.94 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.79 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2C(O)), 3.58 (m, 4 H, OCH2+ CH2N), 3.10 (t, 2 H, J = 5.8 Hz CH2N), 1.30 (t, 3 H, J= 7.1 Hz, CH3).
【０１７７】
・２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（断片２）
【化３８】
2019503174.tif 000040
【０１７８】
１，３，５−ベンゼントリカルボン酸トリメチル（２．００ｇ、７．９３ｍｍｏｌ）をメタノール（１８０ｍＬ）に懸濁し、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（７．１４ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１８時間撹拌した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して白色固体を得て、これをジクロロメタン（１５０ｍＬ）と飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）に分けた。有機相を分離し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で抽出してから捨てた。その混合水層を、濃塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（１．６６ｇ、８８％）を白色固体として得た。
【０１７９】
３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（０．８０ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４２５ｍｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７６ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２０時間撹拌した。懸濁液をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）で濾過し、濾液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、および飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→１００％）を順相条件下で使用し精製して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（１．０６ｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０１８０】
Rf0.44 (ガソリン-酢酸エチル, 4 : 6, v/v).
【０１８１】
無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（０．９５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）および（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（０．９２ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．６１ｇ、０．８３ｍＬ、４．７２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）でクエンチした。水相を分離し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、混合有機相を水（５×５０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。結果として生じた溶液を乾燥してから（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→５０％）を順相条件下で使用し精製して、２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（断片２）（０．９２ｇ、６６％）を白色のガラス状固体として得た。
【０１８２】
Rf0.37 (ジクロロメタン-メタノール, 83 : 17, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO) δ 9.42 (br s, 1 H, NH), 8.99 (br s, 1 H, NH), 8.66 (d, 2 H, J = 1.5 Hz, 2×ArH), 8.53 (t, 1 H, J = 1.5 Hz, ArH), 7.50 (m, 1 H, ArH), 7.43 (d, 1 H, J = 7.7 Hz, ArH), 7.33 (t, 1 H, J = 7.9 Hz, ArH), 7.07 (dd, 1 H, J = 8.0, 2.4 Hz, ArH), 5.21 (t, 1 H, J = 5.0 Hz, CH), 4.24 (dd, 1 H, J = 10.6, 4.4 Hz, 0.5×ArOCH2), 4.07 (dd, 1 H, J = 10.6, 5.9 Hz, 0.5×ArOCH2), 3.88 (m, 8 H, OCH2+ 2×OCH3), 3.84 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.77 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.62 (m, 2 H, OCH2C(O)), 3.40 (m, 4 H, 2×CH2N).
【０１８３】
・予備切断可能なＳＣＴＴＰ
【化３９】
2019503174.tif 000041
【０１８４】
３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジントリフルオロアセテート（１．０４ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した。次に、ヒューニッヒ塩基（０．８０ｇ、１．０８ｍＬ、６．１８ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（０．９１ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（０．６２ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌し、１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈した。水相を分離し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機相を、水（５×６０ｍＬ）、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）、および食塩水（６０ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオフホワイト色の固体を得た。この固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→１０％）を順相条件下で使用し精製して、予備切断可能なＳＣＴＴＰ（１．２０ｇ、８３％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０１８５】
Rf 0.42 (ジクロロメタン-メタノール, 92 : 8, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO) δ 11.69 (s, 1 H, デオキシuridine NH), 9.09 (br t, 1 H, NH), 8.68 (d, 2 H, J = 1.6 Hz, 2×ArH), 8.64 (br t, 1 H, NH), 8.58 (t, 1 H, J = 1.6 Hz, ArH), 8.26 (t, 1 H, J = 5.8 Hz, NH), 8.16 (s, 1 H, デオキシuridine CH), 7.46 (m, 2 H, 2×ArH), 7.38 (t, 1 H, J = 7.8 Hz, ArH), 7.13 (m, 1 H, ArH), 6.12 (dd, 1 H, J = 8.3, 6.0 Hz, CH), 5.27 (m, 1 H, CHN), 5.16 (m, 2 H, CHOPiv + OH), 4.23 (dd, 1 H, J = 10.4, 4.5 Hz, 0.5×ArOCH2), 4.13 (m, 2 H, 0.5×ArOCH2+ 0.5×OCH2), 3.88 (m, 10 H, CH2N + OCH2 + 2×OCH3), 3.85 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.68 (m, 2 H, デオキシuridine CH2), 3.63 (m, 2 H, OCH2C(O)), 3.46 (m, 4 H, 2×CH2N), 2.27 (m, 2 H, デオキシuridine CH2), 1.15 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１８６】
・ペンタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＴＴＰ
【化４０】
2019503174.tif 000042
【０１８７】
予備切断可能なＳＣＴＴＰ（３９０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（０．３９ｍＬ）およびピリジン（１．２ｍＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、窒素雰囲気でパージした。１，４−ジオキサン（４６０μＬ、０．４６ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍのサリチルクロロホスファイト溶液を加え、反応混合物を１０分間撹拌した。ＤＭＦ（１．２５ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスフェート溶液およびトリブチルアミン（３５８ｍｇ、４６０μＬ、１．９３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２０分間撹拌した。ピリジンおよび水（８．４ｍＬ、９８：２）中の１％のヨウ素溶液を加え、溶液を１５分間撹拌してから５％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた物質を、２８７ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントはｐＨ７．０の０．１ＭのＴＥＡＡ中のアセトニトリルが０→４０％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥してから不純な保護された切断可能ＳＣＴＴＰ（３６０ｍｇ）を得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０１８８】
保護された切断可能ＳＣＴＴＰ（３６０ｍｇ）を水（３．０ｍＬ）に溶解し、結果として生じた溶液を１５分間撹拌してから１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（３．０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液（ｐＨ８．５、１０ｍＬ）でクエンチした。結果として生じた溶液を一晩凍結乾燥し、残渣を水（４ｍＬ）に溶解して１００ｍｇ／ｍＬの濃縮物を得た。この溶液を、１００μＬ分注入し、純物質を含有する溶離液を収集するセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。混合留分の体積を、アセトニトリルと大部分の水を除去することにより減らし、最終的に凍結乾燥して、ペンタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＴＴＰ（２３３ｍｇ、２工程にわたって３５％）を白色固体として得た。
【０１８９】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１５ｍｍ×２５０ｍｍ
溶媒グラジエント：２２分で９０％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液から８４．５％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液。残りはアセトニトリルである。
流速：７．８ｍＬ／分
温度：３０℃
検出：２８７ｎｍのＵＶ
これらの条件下で、生成物の保持時間は約１７〜１９分だった。
【０１９０】
〔実施例５：過荷電ＣＴＰ（ＳＣＣＴＰ）の合成）
・５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン
【化４１】
2019503174.tif 000043
【０１９１】
５−ヨード−２’−デオキシシチジン（５００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（６．０ｍＬ）に溶解し、窒素下で撹拌した。５分後、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２２ｍｇ、３０μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、続いて４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロリド（５７６ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた混合物を一晩室温で撹拌し、メタノール（〜１．０ｍＬ）でクエンチしてから減圧下で濃縮した。得られた残渣を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）とジクロロメタン（２５ｍＬ）に分けた。層を分離し、水相をジクロロメタン（２５ｍＬ）で抽出した。有機相を混合し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して黄色の半固体を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが１．５→２４％）を順相条件下で使用し精製して、５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（０．５８ｇ、６２％）を白色固体として得た。
【０１９２】
Rf0.35 (ジクロロメタン-メタノール, 94 : 6, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): 7.97 (s, 1 H, CH), 7.89 (br, 1 H, 0.5×NH2), 7.32 (m, 9 H, 9×ArH), 6.91 (m, 4 H, 4×ArH), 6.66 (br, 1 H, 0.5×NH2), 6.11 (t, J = 6.7 Hz, 1 H, CH), 5.29 (d, J = 4.1 Hz, 1 H, OH), 4.20 (m, 1 H, CH), 3.91 (m, 1 H, CH), 3.74 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.17 (m, 2 H, CH2), 2.21 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.09 (m, 1 H, 0.5×CH2).
【０１９３】
・４−Ｎ−３’−Ｏ−ジ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン
【化４２】
2019503174.tif 000044
【０１９４】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（０．５７ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１１．４ｍＬ）に溶解した。４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３６９ｍｇ、０．５１ｍＬ、３．６５ｍｍｏｌ）を加え、続いて無水トリメチル酢酸（０．６５ｇ、０．７１ｍＬ、３．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を撹拌し、還流状態で２０時間、窒素下で加熱し、次に室温まで冷却し、メタノール（〜１．０ｍＬ）を加えた。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して、粗残渣を得て、これを、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが３→３０％）を順相条件下で使用し精製して、４−Ｎ−３’−Ｏ−ジ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（０．７０ｇ、９７％）を静置状態で固形の無色油として得た。
【０１９５】
Rf0.32 (ガソリン-酢酸エチル, 85 : 15, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): 7.32 (m, 9 H, 9×ArH), 6.90 (m, 4 H, 4×ArH), 6.08 (t, J = 6.8 Hz, 1 H, CH), 5.21 (m, 1 H, CH), 4.04 (m, 1 H, CH), 3.74 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.30 (obscured, 2 H, CH2), 2.40 (obscured, 2 H, CH2), 1.19 (s, 9 H, 3×CH3), 1.13 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１９６】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン
【化４３】
2019503174.tif 000045
【０１９７】
４−Ｎ−３’−Ｏ−ジ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（０．７０ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を無水メタノール（８．８ｍＬ）に溶解し、ヒューニッヒ塩基（１６５ｍｇ、２２１μＬ、１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を密封バイアル内で〜１１０℃で３時間加熱してから減圧下で濃縮した。結果として生じた不純物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが１→１０％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（０．５０ｇ、８０％）を白色固体として得た。
【０１９８】
Rf0.33 (ジクロロメタン-メタノール, 96 : 4, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): δ 8.02 (s, 1 H, CH), 7.94 (br, 1 H, 0.5×NH2), 7.33 (m, 9 H, 9×ArH), 6.90 (m, 4 H, 4×ArH), 6.73 (br, 1 H, 0.5×NH2), 6.12 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, CH), 5.19 (m, 1 H, CH), 3.98 (m, 1 H, CH), 3.74 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.27 (m, 2 H, CH2), 2.33 (m, 2 H, CH2), 1.13 (s, 9 H, 3×CH3).
【０１９９】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミド−プロピニル）−２’−デオキシシチジン
【化４４】
2019503174.tif 000046
【０２００】
３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（０．５０ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（８１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５．９ｍＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、次に窒素で４回パージした。ヒューニッヒ塩基（１７５ｍｇ、２３０μＬ、１．３５ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−プロパルギルアミン（３１５ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を加え、結果として生じた混合物を真空にし、窒素でパージしてから室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、５％のＥＤＴＡ水溶液（２５ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、水相を酢酸エチル（１０ｍＬ）で洗浄した。混合有機層を飽和食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の固体を得た。この固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが１→１３％）を順相条件下で使用し精製して３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミド−プロピニル）−２’−デオキシシチジン（４７０ｍｇ、９１％）を淡黄色固体として得た。
【０２０１】
Rf0.33 (ジクロロメタン-メタノール, 96 : 4, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO): δ 7.94 (s, 1 H, CH), 7.92 (br, 1 H, 0.5×NH2), 7.31 (m, 9 H, 9×ArH), 6.89 (m, 5 H, 4×ArH + 0.5×NH2), 6.15 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, CH), 5.23 (m, 1 H, CH), 4.02 (m, 1 H, CH), 3.85 (m, 2 H, CH2), 3.74 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.38 (obscured, 1 H, 0.5×CH2), 3.17 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.35 (m, 2 H, CH2), 1.38 (s, 9 H, 3×CH3), 1.13 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２０２】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシシチジントリフルオロアセテート
【化４５】
2019503174.tif 000047
【０２０３】
３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−（Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミド−プロピニル）−２’−デオキシシチジン（４６５ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１１．９ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２．７７ｇ、１．８７ｍＬ、２４．３ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌し、続いて、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮し、残留トリフルオロ酢酸をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で共沸除去した。不純物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントは０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中のアセトニトリルが０→４０％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥した後、３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシシチジントリフルオロアセテート（断片１）（２６９ｍｇ、９２％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０２０４】
1H NMR (300 MHz, DMSＯ−d6): δ 8.33 (br, 1 H, 0.5×NH2), 8.27 (s, 1 H, CH), 8.24 (br, 3 H, NH3+), 7.32 (br, 1 H, 0.5×NH2), 6.14 (m, 1 H, CH), 5.19 (m, 1 H, CH), 3.98 (m, 3 H, CH + CH2), 3.64 (m, 2 H, CH2), 2.28 (m, 2 H, CH2), 1.17 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２０５】
・３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル
【化４６】
2019503174.tif 000048
【０２０６】
エチル３−ヒドロキシベンゾエート（３．５０ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）、ブロモエチル−１，３−ジオキソラン（１４．１ｇ、８．７２ｍＬ、８４．３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５．８３ｇ、４２．１ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（１．２６ｇ、８．４３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、反応混合物を１２０℃で２０時間撹拌した。懸濁液を室温まで冷却し、水（３０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、水（５×１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の残留油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→３０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（５．０９ｇ、９６％）を無色油として得た。
【０２０７】
Rf0.40 (ガソリン-酢酸エチル, 75 : 25, v/v).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.66 (dt, J = 7.5, 1.1 Hz, 1 H, ArH), 7.59 (dd, J = 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.34 (t, J = 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.14 (ddd, J = 8.3, 2.6, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 5.31 (t, J = 4.1 Hz, 1 H, CH), 4.36 (q, J = 7.2 Hz, 2 H, OCH2), 4.02 (m, 6 H, OCH2CH2O + ArOCH2), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０２０８】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル
【化４７】
2019503174.tif 000049
【０２０９】
３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（５．０８ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）とアジドトリメチルシラン（２．５５ｇ、２．９４ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）の混合物に、塩化スズ（ＩＶ）（３３６ｍｇ、１５１μＬ、１．２９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。結果として生じた混合物を２％のメタノール水溶液（６０ｍＬ）で希釈し、３０分間撹拌してから減圧下で濃縮した。残渣をエタノール（２×３０ｍＬ）で共沸乾燥して無色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→７０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（３．５９ｇ、５９％）を無色油として得た。
【０２１０】
Rf0.41 (ガソリン-酢酸エチル, 53 : 47, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.69 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.59 (dd, J = 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.13 (ddd, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.89 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.38 (q, J = 7.1 Hz, 2 H, OCH2), 4.19 (m, 2 H, ArOCH2), 4.00 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.80 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０２１１】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化４８】
2019503174.tif 000050
【０２１２】
３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（３．５１ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）をエタノール（３０ｍＬ）溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌し、次に体積を真空下で３／４に減らした。結果として生じた混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、２Ｍの塩酸でｐＨ１〜２まで酸性化した。この混合物をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。混合有機相を飽和食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（３．３９ｇ、定量的）を無色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２１３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.76 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.65 (dd, J = 2.4, 1.4 Hz, 1 H, ArH), 7.41 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.19 (ddd, J = 8.2, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.90 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.21 (m, 2 H, ArOCH2), 4.03 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2).
【０２１４】
・３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化４９】
2019503174.tif 000051
【０２１５】
無水ＴＨＦ（１８ｍＬ）中の３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．４２ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に水酸化ナトリウム（０．６４ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃で１０分間撹拌した。ブロモ酢酸エチル（１．９５ｇ、１．３０ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで５時間超温めた。結果として生じた混合物を氷水（２０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（２×７０ｍＬ）で洗浄した。水層を２Ｍの塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、ジクロロメタン（３×７０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して無色油を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→６０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（０．６２ｇ、３３％）を無色油として得た。
【０２１６】
Rf  0.45 (酢酸エチル-ジクロロメタン, 4 : 6 v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.75 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.64 (dd, J = 2.7, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.19 (ddd, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.95 (dd, J = 5.5, 4.6 Hz, 1 H, CH), 4.14 (m, 7 H, ArOCH2 + 0.5×OCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 3.86 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3).
【０２１７】
・Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート
【化５０】
2019503174.tif 000052
【０２１８】
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２．０８ｇ、２．０５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にトリフルオロ酢酸エチル（１．８５ｇ、１．５５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮してｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（３．３０ｇ、９９％）を白色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２１９】
ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（１．０４ｇ、４．０６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間撹拌した。結果として生じた混合物を減圧下で濃縮し、残留トリフルオロ酢酸をクロロホルム（３×１０ｍＬ）で共沸除去した。得られた物質を５０℃で２時間真空乾燥して、Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．０７ｇ、９９％）を黄色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２２０】
1H NMR (300 MHz, DMSＯ−d6): δ 9.58 (br, 1 H, NH), 7.99 (br, 3 H, NH3+), 3.43 (m, 2 H, CH2N), 2.97 (m, 2 H, CH2N).
【０２２１】
・［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル
【化５１】
2019503174.tif 000053
【０２２２】
無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．３１ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（１．５７ｇ、２．１２ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ）、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．４３ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（２．３２ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌してから、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（４０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（５×１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して残留黄色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→９０％）を順相条件下で使用し精製して、［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（１．７５ｇ、８８％）を無色油として得た。
【０２２３】
Rf0.48 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 1 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (br, 1 H, NH), 7.39 (m, 3 H, 3×ArH), 7.10 (dt, J = 5.8, 3.0 Hz, 1 H, ArH), 6.97 (br, 1 H, NH), 4.93 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.18 (m, 6 H, ArOCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 4.04 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.87 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 2 H, OCH2), 3.69 (m, 2 H, CH2N), 3.62 (m, 2 H, CH2N), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０２２４】
・（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム
【化５２】
2019503174.tif 000054
【０２２５】
［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（０．９０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７ｍＬ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２．５時間撹拌してから減圧下で濃縮した。得られた物質を水（５５ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で洗浄した。水層を１Ｍの塩酸を使用してｐＨ２まで酸性化し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を除去し、捨てる一方、水層を１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を使用してｐＨ８まで中和し、減圧下で蒸発させて白色固体を得て、これをジクロロメタンおよびメタノール（２×９５ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）とともに伴出した。得られた固体を吸引濾過により除去した。混合濾液を減圧下で濃縮してゴムを得た。この不純ゴムをジクロロメタンおよびメタノール（１０ｍＬ、９：１、ｖ／ｖ）とともに伴出し、得られた不溶性白色固体を吸引濾過により除去した。濾液を減圧下で濃縮して（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（０．７６ｇ、定量的）を白色発泡体として得た。
【０２２６】
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.31 (m, 3 H, 3×ArH), 7.11 (ddd, J = 7.8, 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 4.99 (t, J = 4.5 Hz, 1 H, CH), 4.15 (m, 2 H, ArOCH2), 3.94 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.79 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2C(O)), 3.58 (m, 4 H, OCH2+ CH2N), 3.10 (t, J = 5.8 Hz, 2 H, CH2N).
【０２２７】
・２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（断片２）
【化５３】
2019503174.tif 000055
【０２２８】
１，３，５−ベンゼントリカルボン酸トリメチル（２．００ｇ、７．９３ｍｍｏｌ）をメタノール（１８０ｍＬ）に懸濁し、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７．１４ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して白色固体を得て、これをジクロロメタン（１５０ｍＬ）と飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）に分けた。有機相を分離し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で抽出してから捨てた。その混合水層を、濃塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（１．６６ｇ、８８％）を白色固体として得た。
【０２２９】
３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（０．８０ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４２５ｍｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７６ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。結果として生じた懸濁液をＣｅｌｉｔｅで濾過し、濾液を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、および飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→１００％）を順相条件下で使用し精製して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（１．０６ｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０２３０】
Rf0.44 (ガソリン-酢酸エチル, 4 : 6, v/v).
【０２３１】
無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（０．９５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）および（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（０．９２ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．６１ｇ、０．８３ｍＬ、４．７２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）でクエンチした。水相を分離し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、混合有機相を水（５×５０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。結果として生じた溶液を乾燥してから（ＭｇＳＯ４）減圧下で濃縮して、白色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→５０％）を順相条件下で使用し精製して、２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（断片２）（０．９２ｇ、６６％）を白色のガラス状固体として得た。
【０２３２】
Rf0.37 (ジクロロメタン-メタノール, 83 : 17, v/v).
1H NMR (300 MHz, d６−DMSO) δ 9.42 (br, 1 H, NH), 8.99 (br, 1 H, NH), 8.66 (d, J = 1.5 Hz, 2 H, 2×ArH), 8.53 (t, J = 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.50 (m, 1 H, ArH), 7.43 (d, J = 7.7 Hz, 1 H, ArH), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.07 (dd, J = 8.0, 2.4 Hz, 1 H, ArH), 5.21 (t, J = 5.0 Hz, 1 H, CH), 4.24 (dd, J= 10.6, 4.4 Hz, 1 H, 0.5×ArOCH2), 4.07 (dd, J = 10.6, 5.9 Hz, 1 H, 0.5×ArOCH2), 3.88 (m, 8 H, OCH2 + 2×OCH3), 3.84 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.77 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.62 (m, 2 H, OCH2C(O)), 3.40 (m, 4 H, 2×CH2N).
【０２３３】
・予備切断可能なＳＣＣＴＰ
【化５４】
2019503174.tif 000056
【０２３４】
３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシシチジントリフルオロアセテート（３７９ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１１．１ｍＬ）に溶解した。ヒューニッヒ塩基（２９２ｍｇ、３９１μＬ、２．２６ｍｍｏｌ）を加え、続いて、２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（３３２ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（２２３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）で洗浄した。水相を分離し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機相を水（５×５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して淡黄色固体を得た。この固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが２→１６％）を順相条件下で使用し精製して、予備切断可能なＳＣＣＴＰ（４１０ｍｇ、７７％）を白色固体として得た。
【０２３５】
Rf 0.46 (ジクロロメタン-メタノール, 92 : 8, v/v).
1H NMR (300 MHz, DMSＯ−d6): δ 9.09 (br t, J= 5.8 Hz, 1 H, NH), 8.68 (d, J = 1.6 Hz, 2 H, 2×ArH), 8.63 (br t, J = 5.8 Hz, 1 H, NH), 8.59 (t, J = 1.6 Hz, 1 H, ArH), 8.24 (t, J = 5.4 Hz, 1 H, NH), 8.11 (s, 1 H, デオキシcytidine CH), 7.86 (br, 1 H, 0.5×NH2), 7.46 (m, 2 H, 2×ArH), 7.38 (t, J = 7.8 Hz, 1 H, ArH), 7.13 (m, 1 H, ArH), 6.94 (br, 1 H, 0.5×NH2), 6.12 (dd, J = 8.4, 5.8 Hz, 1 H, CH), 5.24 (t, J = 5.2 Hz, 1 H, OH), 5.16 (m, 2 H, CHOPiv + CHN), 4.23 (dd, J = 10.4, 4.5 Hz, 1 H, 0.5×ArOCH2),  4.13 (m, 3 H, 0.5×ArOCH2 + OCH2), 3.88 (m, 10 H, CH2N + CH + 0.5×OCH2 + 2×OCH3), 3.85 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.68 (m, 2 H, OCH2C(O)), 3.62 (m, 2 H, デオキシcytidine CH2), 3.47 (m, 4 H, 2×CH2N), 2.17 (m, 2 H, デオキシcytidine CH2), 1.16 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２３６】
・ペンタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＣＴＰ
【化５５】
2019503174.tif 000057
【０２３７】
予備切断可能なＳＣＣＴＰ（１５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（５１０μＬ）と無水ピリジン（４３０μＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、窒素雰囲気で３度パージした。１，４−ジオキサン（４８０μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍのサリチルクロロホスファイト溶液を加え、反応混合物を１０分間撹拌した。無水ＤＭＦ（４８０μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスフェート溶液およびトリ−ｎ−ブチルアミン（１２９ｍｇ、１６５μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を同時に加え、反応混合物を１５分間撹拌した。ピリジンと水（３．４ｍＬ、９２：８ｖ／ｖ）に溶解させた１％のヨウ素溶液を加え、溶液を３０分間撹拌してから５％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（１００μＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた物質を、２９２ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントはｐＨ８の０．１ＭのＴＥＡＡ中のアセトニトリルが０→１００％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥してから保護された不純切断可能ＳＣＣＴＰ（１４７ｍｇ、５９％）を得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２３８】
１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７３０μＬ）を、水（８００μＬ）中の保護された切断可能ＳＣＣＴＰ（９４ｍｇ）溶液に加え、室温で４０分間撹拌した。反応混合物を１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液（ｐＨ８．５、６ｍＬ）でクエンチした。結果として生じた溶液を一晩凍結乾燥し、物質を水（１ｍＬ）に溶解して１１５ｍｇ／ｍＬの濃縮物を得た。この溶液を、６０μＬ分を注入し、純物質を含有する溶離液を収集するセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。混合留分の体積をアセトニトリルと大部分の水を除去することにより減らし、最終的には凍結乾燥してペンタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＣＴＰ（４５ｍｇ、２工程にわたって１７％）を白色固体として得た。
【０２３９】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１５ｍｍ×２５０ｍｍ
溶媒グラジエント：２２分で９０％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液から８５．６％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液。残りはアセトニトリルである。
流速：７．８ｍＬ／分
温度：３０℃
検出：２９０ｎｍのＵＶ
これらの条件下で、生成物の保持時間は約１９〜２１分だった。
【０２４０】
〔実施例６：過荷電ＡＴＰ（ＳＣＡＴＰ）の合成〕
・７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン
【化５６】
2019503174.tif 000058
【０２４１】
６−クロロ−７−ヨード−７−デアザプリン（０．５６ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（２５ｍＬ）中の水酸化カリウム（２３６ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ）およびトリス（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）アミン（８１ｍｇ、８０μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）の微細スラリーに加え、結果として生じた混合物を１０分間撹拌した。３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボフラノシルクロリド（０．９７ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、結果として生じた黄色の混合物を２５分間撹拌した。結果として生じた混合物をＣｅｌｉｔｅで濾過し、濾過ケークをアセトニトリル（１０ｍＬ）で洗浄し、続いてジクロロメタン（１００ｍＬ）で洗浄した。混合濾液を減圧下で濃縮し、得られた物質を２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→４０％）を順相条件下で使用し精製して、７−デアザ−６−クロロ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（０．９４ｇ、７５％）を淡黄色固体として得た。
【０２４２】
７−デアザ−６−クロロ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（０．９４ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）をメタノール（１９ｍＬ）中のアンモニウム７Ｎ溶液に懸濁し、マイクロ波照射下で、１２０℃で１０時間加熱した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮し、得られた残渣を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→２０％）を順相条件下で使用し精製して、７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４７６ｍｇ、８５％）を白色固体として得た。
【０２４３】
Rf0.46 (ジクロロメタン-メタノール, 9 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, DMSＯ−d6): δ 8.10 (s, 1 H, ArH), 7.66 (s, 1 H, ArH), 6.68 (br s, 2 H, NH2), 6.48 (dd, J = 8.3, 5.6 Hz, 1 H, CH), 5.26 (d, J = 4.6 Hz, 1 H, OH), 5.05 (t, J= 5.4 Hz, 1 H, OH), 4.32 (m, 1 H, CH), 3.81 (m, 1 H, CH), 3.53 (m, 2 H, OCH2), 2.44 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.15 (m, 1 H, 0.5×CH2).
【０２４４】
・５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン
【化５７】
2019503174.tif 000059
【０２４５】
７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４７５ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（６ｍＬ）に溶解し、窒素下で撹拌した。５分後、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１８ｍｇ、２３μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、続いて４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロリド（４７０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた反応混合物を室温で一晩撹拌し、メタノール（３ｍＬ）でクエンチしてから減圧下で濃縮した。ピリジン残渣をメタノール（３×１０ｍＬ）およびジクロロメタン（１０ｍＬ）で共沸除去して白色固体を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→１０％）を順相条件下で使用し精製して、５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４５０ｍｇ、５３％）を白色固体として得た。
【０２４６】
Rf0.36 (ジクロロメタン-メタノール, 9 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.16 (s, 1 H, ArH), 7.36 (m, 2 H, 2×ArH), 7.25 (m, 8 H, 8×ArH), 6.78 (m, 4 H, 4×ArH), 6.61 (t, J = 6.6 Hz, 1 H, CH), 5.61 (s, 2 H, NH2), 4.54 (m, 1 H, CH), 4.01 (m, 1 H, CH), 3.73 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.31 (m, 2 H, CH2), 2.42 (m, 2 H, CH2).
【０２４７】
・Ｎ−３’−ジ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン
【化５８】
2019503174.tif 000060
【０２４８】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４２０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（９ｍＬ）に溶解した。４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４１４ｍｇ、５７０μＬ、４．０９ｍｍｏｌ）、および無水トリメチル酢酸（０．７６ｇ、０．８３ｍＬ、４．０９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５０℃で４８時間撹拌した。結果として生じた混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。不純物質をジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で共沸乾燥して、淡黄色のガラス状固体を得て、これを、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→１０％）を順相条件下で使用し精製してＮ−３’−Ｏ−ジピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（０．５２ｇ、定量的）を白色固体として得た。
【０２４９】
Rf0.60 (ジクロロメタン-メタノール, 9 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.92 (s, 1 H, NH), 8.74 (s, 1 H, ArH), 7.62 (s, 1 H, ArH), 7.43 (m, 2 H, 2×ArH), 7.31 (m, 7 H, 7×ArH), 6.86 (m, 4 H, 4×ArH), 6.78 (m, 1 H, CH), 5.54 (m, 1 H, CH), 4.19 (m, 1 H, CH), 3.81 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.50 (m, 1 H, 0.5×CH2), 3.41 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.79 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.59 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.25 (s, 18 H, 6×CH3).
【０２５０】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン
【化５９】
2019503174.tif 000061
【０２５１】
Ｎ−３’−Ｏ−ジピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（０．５２ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１０．５ｍＬ）に溶解し、ヒューニッヒ塩基（１１９ｍｇ、１６０μＬ、０．９２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、マイクロ波照射下で１１０℃で６時間加熱してから減圧下で濃縮した。不純物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→１０％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４２３ｍｇ、９１％）を淡黄色固体として得た。
【０２５２】
Rf0.44 (ジクロロメタン-メタノール, 96 : 4, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.14 (s, 1 H, ArH), 7.30 (m, 10 H, 10×ArH), 6.76 (m, 4 H, 4×ArH), 6.61 (m, 1 H, CH), 6.29 (s, 2 H, NH2), 5.43 (m, 1 H, CH), 4.09 (m, 1 H, CH), 3.73 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.37 (m, 2 H, CH2), 2.66 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.43 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.17 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２５３】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−（３−Ｂｏｃ−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシアデノシン
【化６０】
2019503174.tif 000062
【０２５４】
３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４２０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（４．２ｍＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、次に窒素で４回パージした。ヒューニッヒ塩基（１４２ｍｇ、１８７μＬ、１．１０ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−プロパルギルアミン（２５６ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を加え、結果として生じた混合物を真空にし、窒素でパージしてから室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、５％のＥＤＴＡ水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、水相を酢酸エチル（１０ｍＬ）で洗浄した。混合有機層を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して暗黄色の固体を得た。この固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→１３％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−（３−Ｂｏｃ−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシアデノシン（０．５１ｇ）を黄色の固体として得た。
【０２５５】
Rf0.51 (ジクロロメタン-メタノール, 9 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.18 (s, 1 H, ArH), 7.26 (m, 10 H, 10×ArH), 6.76 (m, 4 H, 4×ArH), 6.58 (m, 1 H, CH), 5.94 (s, 2 H, NH2), 5.37 (m, 1 H, CH), 4.94 (m, 1 H, CH), 4.10 (m, 1 H, NH), 4.01 (d, J = 5.7 Hz, 2 H, CH2), 3.73 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.32 (m, 2 H, CH2), 2.62 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.40 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.39 (s, 9 H, 3×CH3), 1.17 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２５６】
・３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシアデノシンジ−トリフルオロアセテート
【化６１】
2019503174.tif 000063
【０２５７】
３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−７−デアザ−７−（３−Ｂｏｃ−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシアデノシン（０．５１ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１．７０ｍＬ）を滴下した。次に混合物を室温で２時間撹拌し、続いてジクロロメタン（２５ｍＬ）で希釈した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮し、残留トリフルオロ酢酸をジクロロメタン（４×２５ｍＬ）で共沸除去した。得られた粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントは０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中のアセトニトリルが０→４０％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥した後、必要な３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシアデノシンジ−トリフルオロアセテート（断片１）（２５７ｍｇ、２工程にわたって７６％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０２５８】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 8.29 (m, 7 H, ArH + 2×NH3+), 7.98 (m, 1 H, ArH), 6.50 (m, 1 H, CH), 5.32 (m, 1 H, CH), 4.03 (m, 3 H, CH + CH2), 3.62 (m, 2 H, CH2), 2.72 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.40 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.19 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２５９】
・３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル
【化６２】
2019503174.tif 000064
【０２６０】
エチル３−ヒドロキシベンゾエート（３．５０ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）、ブロモエチル−１，３−ジオキソラン（１４．１ｇ、８．７２ｍＬ、８４．３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５．８３ｇ、４２．１ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（１．２６ｇ、８．４３ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、反応混合物を１２０℃で２０時間撹拌した。懸濁液を室温まで冷却し、水（３０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、水（５×１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→３０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（５．０９ｇ、９６％）を無色油として得た。
【０２６１】
Rf0.40 (ガソリン-酢酸エチル, 75 : 25, v/v).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.66 (dt, J= 7.5, 1.1 Hz, 1 H, ArH), 7.59 (dd, J= 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.34 (t, J= 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.14 (ddd, J = 8.3, 2.6, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 5.31 (t, J= 4.1 Hz, 1 H, CH), 4.36 (q, J = 7.2 Hz, 2 H, OCH2), 4.02 (m, 6 H, OCH2CH2O + ArOCH2), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０２６２】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル
【化６３】
2019503174.tif 000065
【０２６３】
３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（５．０８ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）とアジドトリメチルシラン（２．５５ｇ、２．９４ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）の混合物に塩化スズ（ＩＶ）（３３６ｍｇ、１５１μＬ、１．２９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。結果として生じた混合物を、２％のメタノール水溶液（６０ｍＬ）で希釈し、３０分間撹拌してから減圧下で濃縮した。残渣をエタノール（２×３０ｍＬ）で共沸乾燥して無色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→７０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（３．５９ｇ、５９％）を無色油として得た。
【０２６４】
Rf0.41 (ガソリン-酢酸エチル, 53 : 47, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.69 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.59 (dd, J = 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.13 (ddd, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.89 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.38 (q, J = 7.1 Hz, 2 H, OCH2), 4.19 (m, 2 H, ArOCH2), 4.00 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.80 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０２６５】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化６４】
2019503174.tif 000066
【０２６６】
３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（３．５１ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）をエタノール（３０ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌し、次に体積を真空下で３／４に減らした。結果として生じた混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、２Ｍの塩酸でｐＨ１〜２まで酸性化した。この混合物をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。混合有機相を飽和食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（３．３９ｇ、定量的）を無色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２６７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.76 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.65 (dd, J = 2.4, 1.4 Hz, 1 H, ArH), 7.41 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.19 (ddd, J = 8.2, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.90 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.21 (m, 2 H, ArOCH2), 4.03 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2).
【０２６８】
・３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化６５】
2019503174.tif 000067
【０２６９】
無水ＴＨＦ（１８ｍＬ）中の３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．４２ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、水酸化ナトリウム（０．６４ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃で１０分間撹拌した。ブロモ酢酸エチル（１．９５ｇ、１．３０ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで５時間超温めた。結果として生じた混合物を氷水（２０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（２×７０ｍＬ）で洗浄した。水層を、２Ｍの塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、ジクロロメタン（３×７０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して無色油を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→６０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（０．６２g、３３％）を無色油として得た。
【０２７０】
Rf  0.45 (酢酸エチル-ジクロロメタン, 4 : 6 v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.75 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.64 (dd, J = 2.7, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.19 (ddd, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.95 (dd, J = 5.5, 4.6 Hz, 1 H, CH), 4.14 (m, 7 H, ArOCH2 + 0.5×OCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 3.86 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3).
【０２７１】
・Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート
【化６６】
2019503174.tif 000068
【０２７２】
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２．０８g、２．０５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（１．８５g、１．５５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮してｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（３．３０g、９９％）を白色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２７３】
ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（１．０４g、４．０６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間撹拌した。結果として生じた混合物を減圧下で濃縮し、残留トリフルオロ酢酸をクロロホルム（３×１０ｍＬ）で共沸除去した。得られた物質を５０℃で２時間真空乾燥して、Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．０７ｇ、９９％）を黄色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０２７４】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 9.58 (br t, 1 H, NH), 7.99 (br s, 3 H, NH3+), 3.43 (m, 2 H, CH2N), 2.97 (m, 2 H, CH2N).
【０２７５】
・［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル
【化６７】
2019503174.tif 000069
【０２７６】
無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．３１ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（１．５７ｇ、２．１２ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ）、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．４３ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（２．３２ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌してから酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（４０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（５×１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮し、黄色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→９０％）を順相条件下で使用し精製して、［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（１．７５ｇ、８８％）を無色油として得た。
【０２７７】
Rf0.48 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 1 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (br, 1 H, NH), 7.39 (m, 3 H, 3×ArH), 7.10 (dt, J= 5.8, 3.0 Hz, 1 H, ArH), 6.97 (br, 1 H, NH), 4.93 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.18 (m, 6 H, ArOCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 4.04 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.87 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 2 H, OCH2), 3.69 (m, 2 H, CH2N), 3.62 (m, 2 H, CH2N), 1.30 (t, J= 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０２７８】
・（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム
【化６８】
2019503174.tif 000070
【０２７９】
［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（０．９０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７ｍＬ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２．５時間撹拌してから減圧下で濃縮した。得られた物質を水（５５ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（２×４８ｍＬ）で洗浄した。水層を１Ｍの塩酸を使用してｐＨ２まで酸性化し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を除去し、捨てる一方、水層を１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を使用してｐＨ８まで中和し、減圧下で蒸発させて白色固体を得て、これをジクロロメタンとメタノール（２×９５ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）とともに伴出した。得られた固体を吸引濾過により除去した。混合濾液を減圧下で濃縮してゴムを得た。この粗ゴムをジクロロメタンとメタノール（１０ｍＬ、９：１、ｖ／ｖ）とともに伴出し、得られた不溶性白色固体を吸引濾過により除去した。濾液を減圧下で濃縮して（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（０．７６ｇ、定量的）を白色発泡体として得た。
【０２８０】
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.31 (m, 3 H, 3×ArH), 7.11 (ddd, J = 7.8, 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 4.99 (t, J = 4.5 Hz, 1 H, CH), 4.15 (m, 2 H, ArOCH2), 3.94 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.79 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2C(O)), 3.58 (m, 4 H, OCH2+ CH2N), 3.10 (t, J = 5.8 Hz, 2 H, CH2N).
【０２８１】
・Ｎ−ヒドロスクシンイミド３，５−ビス｛［（Ｓ）−１，５−ジメトキシ−１，５−ジオキソペンタン−２−イル］カルバモイル｝ ベンゾエート
【化６９】
2019503174.tif 000071
【０２８２】
１，３，５−ベンゼントリカルボン酸トリメチル（４．００ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３６０ｍＬ）に懸濁し、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１４．３ｍＬ、１４．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を勢いよく室温で１８時間撹拌した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して白色固体を得て、これをジクロロメタン（３００ｍＬ）と飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）に分けた。有機相を分離し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）で抽出してから捨てた。混合水性抽出物を濃塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、酢酸エチル（２×３００ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（３．１０ｇ、８２％）を白色固体として得た。
【０２８３】
無水ピリジン（１５ｍＬ）中の３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（１．３５ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、トシルクロリド（１．８４ｇ、９．６３ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブタノール（０．５０ｇ、０．６４ｍＬ、６．８０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２０時間撹拌した。結果として生じた懸濁液を酢酸エチル（７５ｍＬ）と２０％のクエン酸水溶液（７５ｍＬ）で希釈した。水層をジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出し、混合有機層を２０％のクエン酸水溶液（１００ｍＬ）、１Ｍの塩酸（１００ｍＬ）、水（３×１００ｍＬ）、および飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して淡黄色固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→５０％）を順相条件下で使用し精製して、１−（ｔｅｒｔ−ブチル）３，５−ジメチルベンゼン−１，３，５−トリカルボキシレート（１．１０ｇ、６６％）を白色固体として得た。
【０２８４】
Rf0.32 (酢酸エチル-ガソリン, 3 : 7, v/v).
【０２８５】
１−（ｔｅｒｔ−ブチル）３，５−ジメチルベンゼン−１，３，５−トリカルボキシレート（０．５０ｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）に懸濁し、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）を加えた。結果として生じた懸濁液を室温で２時間撹拌した。反応混合物のｐＨを、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の添加により１１に調整し、結果として生じた混合物を１時間撹拌した。反応混合物を１Ｍの塩酸で中和してから、体積を１／３に圧縮した。この結果として生じた混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、ｐＨを２Ｍの塩酸の添加により２に調整した。形成された沈殿物を吸引濾過により集め、アセトニトリル（３×１０ｍＬ）で共沸乾燥してオフホワイト色の固体を得た。この反応順序を、結果として生じた固体に残されたモノ−メチルエステルの存在により繰り返して、５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）イソフタル酸（４２８ｍｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０２８６】
無水ＤＭＦ（７ｍＬ）中のＨ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＯＭｅヒドロクロリド（１．２７ｇ、５．９９ｍｍｏｌ）とヒューニッヒ塩基（１．０３ｇ、１．３９ｍＬ、７．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＭＦ（８ｍＬ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）イソフタル酸（０．５３ｇ、２．００ｍｍｏｌ）溶液を加え、続いてＰｙＢＯＰ（２．２９ｇ、４．３９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２０時間撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）でクエンチした。水層を分離し、次に酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（７０ｍＬ）、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（７０ｍＬ）、水（５×７０ｍＬ）、および飽和食塩水（７０ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色固体を得た。この固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→７０％）を順相条件下で使用し精製して、テトラメチル２，２’−｛［５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）イソフタロイル］ビス（アザンジイル）｝（２Ｓ，２’Ｓ）−ジグルタラート（０．６９ｇ、６０％）を白色固体として得た。
【０２８７】
Rf0.44 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 6 : 4, v/v).
【０２８８】
テトラメチル２，２’−｛［５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）イソフタロイル］ビス（アザンジイル）｝（２Ｓ，２’Ｓ）−ジグルタラート（０．６７ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（９ｍＬ）中で１時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、残留トリフルオロ酢酸をクロロホルム（５×１０ｍＬ）とジエチルエーテル（３×１０ｍＬ）で共沸除去して５−ビス｛［（Ｓ）−１，５−ジメトキシ−１，５−ジオキソペンタン−２−イル］カルバモイル｝安息香酸（０．６１ｇ、９９％）を白色発泡体として得た。
【０２８９】
この反応を繰り返して、さらなる量の物質を産出した。
【０２９０】
５−ビス｛［（Ｓ）−１，５−ジメトキシ−１，５−ジオキソペンタン−２−イル］カルバモイル｝安息香酸（０．６４ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１５６ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２７９ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２０時間撹拌した。懸濁液をＣｅｌｉｔｅで濾過し、濾液を、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２×３０ｍＬ）、水（２×３０ｍＬ）、および飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色発泡体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→１００％）を順相条件下で使用し精製して、Ｎ−ヒドロスクシンイミド３，５−ビス｛［（Ｓ）−１，５−ジメトキシ−１，５−ジオキソペンタン−２−イル］カルバモイル｝ベンゾエート（０．６３ｇ、７９％）を白色固体として得た。
【０２９１】
Rf0.44 (ガソリン-酢酸エチル, 4 : 6, v/v).
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6): δ 9.32 (d, J = 7.5 Hz, 2 H, 2×NH), 8.77 (m, 1 H, ArH), 8.71 (m, 2 H, 2×ArH), 4.53 (m, 2 H, 2×α-CH), 3.67 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.59 (s, 6 H, 2×OCH3), 2.94 (s, 4 H, 2×CH2-su), 2.46 (m, 4 H, 2×CH2), 2.07 (m, 4 H, 2×CH2).
【０２９２】
・２−｛２−［１−アジド−２−（３−｛［２−（３，５−ビス｛［（Ｓ）−１，５−ジメトキシ−１，５−ジオキソペンタン−２−イル］カルバモイル｝ベンズアミド）エチル］カルバモイル｝フェノキシ）エトキシ］エトキシ｝酢酸
【化７０】
2019503174.tif 000072
【０２９３】
無水ＤＭＦ（７ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（０．７８ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）および（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（４４５ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（２９５ｍｇ、４００μＬ、２．２８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２０時間撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）でクエンチした。水相を分離し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、混合有機相を水（５×５０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。結果として生じた溶液を乾燥してから（ＭｇＳＯ４）減圧下で濃縮して白色発泡体を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→５０％）を順相条件下で使用し精製して２−｛２−［１−アジド−２−（３−｛［２−（３，５−ビス｛［（Ｓ）−１，５−ジメトキシ−１，５−ジオキソペンタン−２−イル］カルバモイル｝ ベンズアミド）エチル］カルバモイル｝フェノキシ）エトキシ］エトキシ｝酢酸（断片２）（０．８３ｇ、８３％）を白色固体として得た。
【０２９４】
Rf0.43 (ジクロロメタン-メタノール, 83 : 17, v/v).
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6): δ 9.26 (br s, 1 H, NH), 9.17 (d, J = 7.3 Hz, 2 H, 2×NH), 8.95 (br s, 1 H, NH), 8.55 (m, 2 H, 2×ArH), 8.47 (m, 1 H, ArH), 7.55 (m, 1 H, ArH), 7.49 (m, 1 H, ArH), 7.37 (t, J = 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.11 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 5.20 (t, J = 5.0 Hz, 1 H, CH), 4.49 (m, 2 H, 2×α-CH), 4.25 (dd, J = 10.7, 4.5 Hz, 1 H, 0.5×CH2), 4.14 (dd, J = 10.7, 5.3 Hz, 1 H, 0.5×CH2), 3.89 (m, 2 H, CH2), 3.80 (m, 2H, CH2), 3.65 (s, 8 H, 2×OCH3 + CH2), 3.59 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.49 (br, 4 H, 2×CH2), 2.47 (m, 4 H, 2×CH2), 2.07 (m, 4 H, 2×CH2).
【０２９５】
・予備切断可能なＳＣＡＴＰ
【化７１】
2019503174.tif 000073
【０２９６】
３’−Ｏ−ピバロイル−５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジンジ−トリフルオロアセテート（３６６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解した。ヒューニッヒ塩基（２９５ｍｇ、３９０μＬ、２．２８ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（３９９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１８２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で洗浄した。水相を分離し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。混合有機相を水（５×４０ｍＬ）と飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の固体を得た。この固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステムを順相条件下で使用し精製して（シリカカラム、グラジエントは酢酸エチル中のメタノールが０→３０％）、予備切断可能なＳＣＡＴＰ（３０７ｍｇ、５４％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０２９７】
Rf 0.41 (酢酸エチル-メタノール, 9 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 9.10 (d, J = 7.3 Hz, 2 H, 2×NH), 8.92 (br s, 1 H, NH), 8.65 (br s, 1 H, NH), 8.48 (s, 2 H, 2×ArH), 8.37 (t, J = 5.4 Hz, 1 H, ArH), 8.10 (s, 1 H, ArH), 7.75 (s, 1 H, ArH), 7.46 (m, 2 H, 2×ArH), 7.36 (t, J = 7.8 Hz, 1 H, ArH), 7.13 (dd, J = 7.7, 2.1 Hz, 1 H, ArH), 6.45 (dd, J = 9.0, 5.5 Hz, 1 H, CH), 5.31 (m, 2 H, OH + CH), 5.15 (t, J= 4.5 Hz, 1 H, CHN3), 4.51 (m, 2 H, 2×α-CH), 4.22 (dd, J = 10.5, 4.6 Hz, 1 H, 0.5×CH2), 4.14 (m, 3 H, 0.5×CH2 + CH2), 3.97 (m, 5 H, CH + 2×CH2), 3.86 (m, 2 H, CH2), 3.67 (br, 8 H, 2×OCH3 + CH2), 3.59 (s, 6 H, 2×OCH3), 3.46 (br, 4 H, 2×NCH2), 2.72 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.47 (m, 4 H, 2×CH2), 2.35 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.07 (m, 4 H, 2×CH2), 1.19 (s, 9 H, 3×CH3).
【０２９８】
・ヘプタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＡＴＰ
【化７２】
2019503174.tif 000074
【０２９９】
予備切断可能なＳＣＡＴＰ（３００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（０．７３ｍＬ）と無水ピリジン（２４５μＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、窒素雰囲気で４回パージした。１，４−ジオキサン（２７０μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍのサリチルクロロホスファイト溶液を加え、反応混合物を１０分間撹拌した。無水ＤＭＦ（０．７３ｍＬ、０．３６ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスフェート溶液とトリブチルアミン（１８７ｍｇ、２４０μＬ、１．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２０分間撹拌した。ピリジンと水（４．９ｍＬ、９８：２ｖ／ｖ）における１％のヨウ素溶液を加え、溶液を１５分間撹拌してから５％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（０．６０ｍＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた物質を、２７９ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントはｐＨ８の０．１ＭのＴＥＡＡ中のアセトニトリルが０→４０％）を逆相条件下で使用し精製し、凍結乾燥してから、保護された不純切断可能ＳＣＡＴＰ（１７８ｍｇ、４２％）を得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３００】
保護された切断可能ＳＣＡＴＰ（１７５ｍｇ）を水（１．２３ｍＬ）に溶解し、結果として生じた溶液を１５分間撹拌してから１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．４７ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４０分間撹拌し、１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液（ｐＨ８、３ｍＬ）で希釈した。結果として生じた溶液を一晩凍結乾燥し（２５０ｍｇ）、物質を水（３．６ｍＬ）に溶解して６９．４ｍｇ／ｍＬの濃縮物を得た。この溶液を、１００μＬ分注入し、純物質を含有する溶離液を収集するセミ分取ＨＰＬＣを使用して精製した。混合留分の体積を、アセトニトリルと大部分の水を除去することにより減らし、最終的には凍結乾燥してヘプタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＡＴＰ（１５０ｍｇ、７５％）を白色固体として得た。
【０３０１】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１５ｍｍ×２５０ｍｍ
溶媒グラジエント：３０分で９０％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液（ｐＨ７．０）から８５．５％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液（ｐＨ７．０）。残りはアセトニトリルである。
流速：７．８ｍＬ／分
温度：３０℃
検出：２７７ｎｍのＵＶ
これらの条件下で、生成物の保持時間は約２３〜３０分だった。
【０３０２】
〔実施例７：過荷電ＧＴＰ（ＳＣＧＴＰ）の合成〕
・６−Ｏ−メチル−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン
【化７３】
2019503174.tif 000075
【０３０３】
粉状水酸化カリウム（１．１４ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）とトリス−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）アミン（ＴＤＡ―１）（９６ｍｇ、９５μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）の微細スラリーを無水アセトニトリル（４０ｍＬ）中で、室温で１５分間撹拌した。２−アミノ−４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１．００ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１０分間撹拌した。３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トリル）−２−デオキシ−Ｄ−リボフラノシルクロリド（２．３９ｇ、５．９９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３０分間撹拌した。結果として生じた混合物をＣｅｌｉｔｅで濾過し、濾過ケークをアセトニトリル（１０ｍＬ）で洗浄し、濾液を濃縮して褐色固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→１１％）を順相条件下で使用し精製して、４−クロロ−７−（（４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｐ−トリルオキシ）−５−（（ｐ−トリルオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミン（１．９８ｇ、６４％）をオフホワイト色の発泡体として得た。
【０３０４】
Rf0.37 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 96 : 4, v/v).
【０３０５】
無水メタノール（３５ｍＬ）中の４−クロロ−７−（（４Ｓ，５Ｒ）−４−（ｐ−トリルオキシ）−５−（（ｐ−トリルオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミン（１．９８ｇ、３．８０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、メタノール（８４ｍＬ、４１．８ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍのナトリウムメトキシド溶液を加え、混合物を６５℃で２時間加熱した。結果として生じた溶液を室温まで冷却し、減圧下で濃縮してオフホワイト色の固体を得た。この残渣物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→２５％）を順相条件下で使用し精製して、６−Ｏ−メチル−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン（０．８９ｇ、８４％）を白色発泡体として得た。
【０３０６】
Rf0.50 (ジクロロメタン-メタノール, 90 : 10, v/v).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.10 (d, J = 3.7 Hz, 1 H, CH), 6.40 (m, 1 H, CHN), 6.27 (d, J = 3.7 Hz, 1 H, CH), 6.22 (br s, 2 H, NH2), 5.22 (d, J = 3.8 Hz, 1 H, OH), 4.94 (t, J = 5.6 Hz, 1 H, OH), 4.28 (m, 1 H, CH), 3.91 (s, 3 H, CH3), 3.77 (m, 1 H, CH), 3.50 (m, 2 H, CH2), 2.39 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.09 (m, 1 H, 0.5×CH2).
【０３０７】
・６−Ｏ−メチル−２，３’，５´−トリピバロイル−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン
【化７４】
2019503174.tif 000076
【０３０８】
無水ピリジン（３３ｍＬ）中の６−Ｏ−メチル−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン（０．８９ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、イソブチルクロリド（３．０５ｇ、３．００ｍＬ、２８．６ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を１時間この温度で撹拌した。メタノール（２ｍＬ）を加え、混合物を０℃で１５分間撹拌した。懸濁液を濃縮し、残渣を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）と酢酸エチル（５０ｍＬ）に分けた。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で希釈した。混合有機層を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して黄色油を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→５８％）を順相条件下で使用し精製して、６−Ｏ−メチル−２，３’，５´−トリピバロイル−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン（１．４６ｇ、９４％）を無色油として得た。
【０３０９】
Rf0.47 (ガソリン-酢酸エチル, 34 : 66, v/v).
1H NMR(300 MHz, Methanol-d4) δ 7.31 (d, J = 3.7 Hz, 1 H, CH), 6.68 (dd, J = 8.7, 5.8 Hz, 1 H, CHN), 6.54 (d, J = 3.7 Hz, 1 H, CH), 5.43 (m, 1 H, CH), 4.38 (m, 2 H, CH2), 4.26 (m, 1 H, CH), 4.01 (s, 3 H, CH3), 2.90 (m, 2 H, 2×CH), 2.65 (m, 2 H, CH + 0.5×CH2), 2.53 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.24 (m, 12 H, 4×CH3), 1.17 (m, 6 H, 2×CH3).
【０３１０】
・６−Ｏ−メチル−２，３’，５´−トリピバロイル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン
【化７５】
2019503174.tif 000077
【０３１１】
無水ＤＭＦ（１８ｍＬ）中の６−Ｏ−メチル−２，３’，５´−トリピバロイル−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン（１．１３ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヨードスクシンイミド（０．５５ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。結果として生じた赤色の溶液を濃縮して残留赤色油を得て、これをジエチルエーテル（２０ｍＬ）と飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）に分けた。層を分離し、水層をジエチルエーテル（２×２５ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（４×５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して褐色固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが７→４９％）を順相条件下で使用し精製して、６−Ｏ−メチル−２，３’，５´−トリピバロイル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（１．０８ｇ、７６％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０３１２】
Rf0.37 (ガソリン-酢酸エチル, 72 : 28, v/v).
1H NMR (300 MHz, Methanol-d4) δ 7.46 (s, 1 H, CH), 6.65 (m, 1 H, CHN), 5.43 (m, 1 H, CH), 4.37 (m, 2 H, CH2), 4.26 (m, 1 H, CH), 4.11 (s, 3 H, CH3), 2.85 (m, 2 H, CH + 0.5×CH2), 2.62 (m, 3 H, 2×CH + 0.5×CH2), 1.21 (m, 18 H, 6×CH3).
【０３１３】
・７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン
【化７６】
2019503174.tif 000078
【０３１４】
２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（６５ｍＬ）と１，４−ジオキサン（９ｍＬ）中の６−Ｏ−メチル−２，３’，５´−トリピバロイル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（１．４０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）の懸濁液を９５℃で一晩加熱した。混合物を室温まで冷却し、１，４−ジオキサンを真空下で除去した。水溶液を２Ｍの塩酸でｐＨ＝７まで中和し、濃縮し、乾燥して白色固体を得た。この残留固体を水（１００ｍＬ）に懸濁し、固体を吸引濾過により集め、アセトニトリル（２０ｍＬ）で洗浄し、４０℃で２時間真空乾燥して、７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（０．９０ｇ）を白色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３１５】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.52 (s, 1 H, NH), 7.12 (s, 1 H, CH), 6.35 (br s, 2 H, NH2), 6.26 (dd, J = 8.5, 5.7 Hz, 1 H, CHN), 5.21 (d, J = 3.7 Hz, 1 H, OH), 4.92 (t, J = 5.4 Hz, 1 H, OH), 4.27 (m, 1 H, CH), 3.75 (m, 1 H, CH), 3.49 (m, 2 H, CH2), 2.32 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.05 (m, 1 H, 0.5×CH2).
【０３１６】
・５´−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル)−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン
【化７７】
2019503174.tif 000079
【０３１７】
無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（０．９０ｇ、２．２９ｍｍｏｌ）の溶液にイミダゾール（３７５ｍｇ、５．５１ｍｍｏｌ）を加え、続いてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（３９８ｍｇ、２．６４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２０時間撹拌した。結果として生じた黄色溶液を減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが７→３６％）を順相条件下で使用し精製して、５´−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（０．８１ｇ、２工程にわたって７０％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０３１８】
Rf0.43 (ジクロロメタン-メタノール, 88 : 12, v/v).
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 10.48 (s, 1 H, NH), 7.05 (s, 1 H, CH), 6.35 (br s, 2 H, NH2), 6.27 (dd, J = 8.2, 5.8 Hz, 1 H, CHN), 5.25 (d, J = 3.7 Hz, 1 H, OH), 4.26 (m, 1 H, CH), 3.79 (m, 1 H, CH), 3.70 (m, 2 H, CH2), 2.25 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.10 (m, 1 H, 0.5×CH2), 0.89 (s, 9 H, TBDMS tert-ブチル), 0.08 (s, 3 H, TBDMS CH3), 0.07 (s, 3 H, TBDMS CH3).
【０３１９】
・３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン
【化７８】
2019503174.tif 000080
【０３２０】
無水ピリジン（２０ｍＬ）中の５´−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（０．８０ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ジメチルアミノ−ピリジン（ＤＭＡＰ）（３９ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、続いて無水トリチル酢酸（４４２ｍｇ、４８１μＬ、２．３７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８５℃で一晩加熱した。さらなる当量の無水トリチル酢酸（２９５ｍｇ、３２１μＬ、１．５８ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（３９ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を８５℃で２日間加熱した。結果として生じた溶液を室温まで冷却し、濃縮して乾燥した。残渣を酢酸エチル（２５ｍＬ）と飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）に分けた。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して褐色の発泡体を得て、これを、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→１００％、次に酢酸エチル中のメタノールが０→５０％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（０．６３ｇ、６８％）を褐色の発泡体として得た。
【０３２１】
Rf0.41 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 40 : 60, v/v).
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 10.53 (s, 1 H, NH), 7.09 (s, 1 H, CH), 6.39 (br s, 2 H, NH2), 6.26 (dd, J = 9.0, 5.7 Hz, 1 H , CHN), 5.14 (m, 1 H, CH), 3.95 (m, 1 H, CH), 3.76 (m, 2 H, CH2), 2.5 (不明瞭m, 1 H, 0.5×CH2), 2.29 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.17 (s, 9 H, tert-ブチル), 0.90 (s, 9 H, TBDMS tert-ブチル), 0.10 (s, 3 H, TBDMS CH3), 0.08 (s, 3 H, TBDMS CH3).
【０３２２】
・３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン
【化７９】
2019503174.tif 000081
【０３２３】
無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中の３’−Ｏ−ピバロイル−５´−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＴＨＦ（０．２５ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）中の１ＭのＴＢＡＦを滴下し、混合物を室温で１時間撹拌した。結果として生じた溶液を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、反応混合物を水（１０ｍＬ）でクエンチした。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×１０ｍＬ）とクロロホルム（５ｍＬ）で抽出した。混合有機物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して黄色の固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントは酢酸エチル中のメタノールが０→８０％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（７７ｍｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０３２４】
Rf0.60 (酢酸エチル-メタノール, 9 : 1, v/v).
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 10.51 (s, 1 H, NH), 7.20 (s, 1 H, CH), 6.36 (br s, 2 H, NH2), 6.24 (m, 1 H, CHN), 5.28 (m, 1H, CH) 5.11 (t, J=5.4 Hz, 1 H , OH) 3.95 (m, 1 H, CH), 3.76 (m, 2 H, CH2), 2.60 (不明瞭m, 1 H, 0.5×CH2), 2.23 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.18 (s, 9 H, tert-ブチル).
【０３２５】
・３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−Ｂｏｃ−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシグアノシン
【化８０】
2019503174.tif 000082
【０３２６】
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（７５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）とヨウ化銅（６ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液を１０分間脱酸素化した。Ｎ−Ｂｏｃ−プロパルギルアミン（７３ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）とヒューニッヒ塩基（４１ｍｇ、５５μＬ、０．３１ｍｍｏｌ）を加え、溶液をさらに１０分間脱酸素化し、反応混合物を一晩、室温の暗所で撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、５％のＥＤＴＡ水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、水相を酢酸エチル（２×１５ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（２×１５ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して褐色の発泡体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが５→８０％）を順相条件下で使用し精製して、３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−Ｂｏｃ−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシグアノシン（５７ｍｇ、７２％）を褐色固体として得た。
【０３２７】
Rf0.37 (ジクロロメタン-メタノール, 93 : 7, v/v).
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 10.56 (s, 1 H, NH), 7.31 (m, 2 H, CH + NH), 6.36 (br s, 2 H, NH2), 6.25 (dd, J = 9.5, 5.9 Hz, 1 H, CHN), 5.25 (m, 1 H, CH), 5.13 (t, 1 H, J= 5.6 Hz, OH), 3.90 (m, 2 H, CH2), 3.55 (m, 2 H, CH2), 2.5 (不明瞭m, 1 H, 0.5×CH2), 2.25 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.39 (s, 9 H, Boc tert-ブチル), 1.17 (s, 9 H, tert-ブチル).
【０３２８】
・３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシグアノシントリフルオロアセテート 
【化８１】
2019503174.tif 000083
【０３２９】
３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−Ｂｏｃ−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシグアノシン（８５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１．２５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２６０μＬ、３．３８ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残留トリフルオロ酢酸をクロロホルム（２×１０ｍＬ）とジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）で共沸除去した。不純物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントは０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中のアセトニトリルが０→３６％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥した後、３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシグアノシントリフルオロアセテート（断片１）（６０ｍｇ、６９％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０３３０】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (s, 1 H, NH), 8.25 (br s, 3 H, NH3+), 7.39 (s, 1 H, CH), 6.43 (br s, 2 H, NH2), 6.27 (dd, J = 9.1, 5.8 Hz, 1 H, CHN), 5.27 (m, 1 H, CH), 3.96 (m, 3 H, CH + CH2), 3.58 (m, 2H, CH2), 2.62 (m, 1 H, 0.5×CH2), 2.25 (m, 1 H, 0.5×CH2), 1.18 (s, 9 H, tert-ブチル).
【０３３１】
・３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル
【化８２】
2019503174.tif 000084
【０３３２】
エチル３−ヒドロキシベンゾエート（３．５０ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）、ブロモエチル−１，３−ジオキソラン（１４．１ｇ、８．７２ｍＬ、８４．３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５．８３ｇ、４２．１ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（１．２６ｇ、８．４３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、反応混合物を１２０℃で２０時間撹拌した。懸濁液を室温まで冷却し、水（３０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、水（５×１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄してから乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。この残留物を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→３０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（５．０９ｇ、９６％）を無色油として得た。
【０３３３】
Rf0.40 (ガソリン-酢酸エチル, 75 : 25, v/v).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.66 (dt, J = 7.5, 1.1 Hz, 1 H, ArH), 7.59 (dd, J = 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.34 (t, J = 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.14 (ddd, J = 8.3, 2.6, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 5.31 (t, J = 4.1 Hz, 1 H, CH), 4.36 (q, J = 7.2 Hz, 2 H, OCH2), 4.02 (m, 6 H, OCH2CH2O + ArOCH2), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０３３４】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル
【化８３】
2019503174.tif 000085
【０３３５】
３−［（１，３）ジオキソラン−２−イルメトキシ］安息香酸エチルエステル（５．０８ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）とアジドトリメチルシラン（２．５５ｇ、２．９４ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）の混合物に、塩化スズ（ＩＶ）（３３６ｍｇ、１５１μＬ、１．２９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。結果として生じた混合物を２％のメタノール水溶液（６０ｍＬ）で希釈し、３０分間撹拌してから減圧下で濃縮した。残渣をエタノール（２×３０ｍＬ）で共沸乾燥して無色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→７０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（３．５９ｇ、５９％）を無色油として得た。
【０３３６】
Rf0.41 (ガソリン-酢酸エチル, 53 : 47, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.69 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.59 (dd, J = 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.13 (ddd, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.89 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.38 (q, J = 7.1 Hz, 2 H, OCH2), 4.19 (m, 2 H, ArOCH2), 4.00 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.80 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０３３７】
・３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化８４】
2019503174.tif 000086
【０３３８】
３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸エチルエステル（３．５１ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）をエタノール（３０ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌し、次に体積を真空下で３／４に減らした。結果として生じた混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、２Ｍの塩酸でｐＨ１〜２まで酸性化した。この混合物をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。混合有機相を飽和食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（３．３９ｇ、定量的）を無色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３３９】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.76 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.65 (dd, J = 2.4, 1.4 Hz, 1 H, ArH), 7.41 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.19 (ddd, J = 8.2, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.90 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.21 (m, 2 H, ArOCH2), 4.03 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2).
【０３４０】
・３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸
【化８５】
2019503174.tif 000087
【０３４１】
無水ＴＨＦ（１８ｍＬ）中の３−［２−アジド−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．４２ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に水酸化ナトリウム（０．６４ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃で１０分間撹拌した。ブロモ酢酸エチル（１．９５ｇ、１．３０ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで５時間超温めた。結果として生じた混合物を氷水（２０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（２×７０ｍＬ）で洗浄した。水層を２Ｍの塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、ジクロロメタン（３×７０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して無色油を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→６０％）を順相条件下で使用し精製して、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（０．６２ｇ、３３％）を無色油として得た。
【０３４２】
Rf  0.45 (酢酸エチル-ジクロロメタン, 4 : 6 v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.75 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1 H, ArH), 7.64 (dd, J = 2.7, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, ArH), 7.19 (ddd, J = 8.3, 2.7, 1.0 Hz, 1 H, ArH), 4.95 (dd, J = 5.5, 4.6 Hz, 1 H, CH), 4.14 (m, 7 H, ArOCH2 + 0.5×OCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 3.86 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3).
【０３４３】
・Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート
【化８６】
2019503174.tif 000088
【０３４４】
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２．０８ｇ、２．０５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（１．８５ｇ、１．５５ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた溶液を減圧下で濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（３．３０ｇ、９９％）を白色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３４５】
ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル］カルバメート（１．０４ｇ、４．０６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間撹拌した。結果として生じた混合物を減圧下で濃縮して、残留トリフルオロ酢酸をクロロホルム（３×１０ｍＬ）で共沸除去した。得られた物質を５０℃で２時間真空乾燥して、Ｎ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．０７ｇ、９９％）を黄色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３４６】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 9.58 (br, 1 H, NH), 7.99 (br, 3 H, NH3+), 3.43 (m, 2 H, CH2N), 2.97 (m, 2 H, CH2N).
【０３４７】
・［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル
【化８７】
2019503174.tif 000089
【０３４８】
無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドトリフルオロアセテート（１．３１ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（１．５７ｇ、２．１２ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ）と、３−［２−アジド−２−（２−エトキシカルボニルメトキシエトキシ）エトキシ］安息香酸（１．４３ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）と、ＰｙＢＯＰ（２．３２ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌してから酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（４０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（５×１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥してから（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して黄色油を得た。この油を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中の酢酸エチルが０→９０％）を順相条件下で使用し精製して、［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（１．７５ｇ、８８％）を無色油として得た。
【０３４９】
Rf0.48 (ジクロロメタン-酢酸エチル, 1 : 1, v/v).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (br, 1 H, NH), 7.39 (m, 3 H, 3×ArH), 7.10 (dt, J= 5.8, 3.0 Hz, 1 H, ArH), 6.97 (br, 1 H, NH), 4.93 (t, J = 5.1 Hz, 1 H, CH), 4.18 (m, 6 H, ArOCH2 + OCH2 + OCH2C(O)), 4.04 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.87 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.81 (m, 2 H, OCH2), 3.69 (m, 2 H, CH2N), 3.62 (m, 2 H, CH2N), 1.30 (t, J= 7.1 Hz, 3 H, CH3).
【０３５０】
・（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム
【化８８】
2019503174.tif 000090
【０３５１】
［２−（１−アジド−２−｛３−［２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチルカルバモイル］フェノキシ｝エトキシ）エトキシ］酢酸エチルエステル（０．９０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７ｍＬ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２．５時間撹拌してから減圧下で濃縮した。得られた物質を水（５５ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（２×４８ｍＬ）で洗浄した。水層を１Ｍの塩酸を使用してｐＨ２まで酸性化し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を除去し捨てる一方、水層を１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を使用してｐＨ８まで中和し、減圧下で蒸発させて白色固体を得て、これをジクロロメタンとメタノール（２×９５ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）とともに伴出した。得られた固体を吸引濾過により除去した。混合濾液を減圧下で濃縮してゴムを得た。この不純ゴムをジクロロメタンとメタノール（１０ｍＬ、９：１、ｖ／ｖ）とともに伴出し、得られた不溶性白色固体を吸引濾過により除去した。濾液を減圧下で濃縮して、（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝ エトキシ）酢酸ナトリウム（０．７６ｇ、定量的）を白色発泡体として得た。
【０３５２】
1H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.31 (m, 3 H, 3×ArH), 7.11 (ddd, J = 7.8, 2.6, 1.5 Hz, 1 H, ArH), 4.99 (t, J = 4.5 Hz, 1 H, CH), 4.15 (m, 2 H, ArOCH2), 3.94 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.79 (m, 3 H, 0.5×OCH2 + OCH2C(O)), 3.58 (m, 4 H, OCH2+ CH2N), 3.10 (t, J = 5.8 Hz, 2 H, CH2N).
【０３５３】
・２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（断片２）
【化８９】
2019503174.tif 000091
【０３５４】
１，３，５−ベンゼントリカルボン酸トリメチル（２．００ｇ、７．９３ｍｍｏｌ）をメタノール（１８０ｍＬ）に懸濁し、１ＭのＮａＯＨ水溶液（７．１４ｍＬ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で１８時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮して白色固体を得て、これをジクロロメタン（１５０ｍＬ）と飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）に分けた。有機相を分離し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で抽出してから捨てた。その混合水層を濃塩酸を使用してｐＨ１〜２まで酸性化し、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（１．６６ｇ、８８％）を白色固体として得た。
【０３５５】
３，５−ビス（メトキシカルボニル）安息香酸（０．８０ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４２５ｍｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７６ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた混合物を室温で２０時間撹拌した。懸濁液をＣｅｌｉｔｅで濾過し、濾液を、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、および飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが０→１００％）を順相条件下で使用し精製して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（１．０６ｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０３５６】
Rf0.44 (ガソリン-酢酸エチル, 4 : 6, v/v).
【０３５７】
無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンゾエート（０．９５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）および（２−｛２−［３−（２−アミノエチルカルバモイル）フェノキシ］−１−アジドエトキシ｝エトキシ）酢酸ナトリウム（０．９２ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．６１ｇ、０．８３ｍＬ、４．７２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）でクエンチした。水相を分離し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、混合有機相を水（５×５０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。結果として生じた溶液を乾燥してから（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して白色のガラス状固体を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０→５０％）を順相条件下で使用し精製して、２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（断片２）（０．９２ｇ、６６％）を白色のガラス状固体として得た。
【０３５８】
Rf0.37 (ジクロロメタン-メタノール, 83 : 17, v/v).
1H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ 9.42 (br s, 1 H, NH), 8.99 (br s, 1 H, NH), 8.66 (d, J= 1.5 Hz, 2 H, 2×ArH), 8.53 (t, J = 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.50 (m, 1 H, ArH), 7.43 (d, J = 7.7 Hz, 1 H, ArH), 7.33 (t, J= 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.07 (dd, J = 8.0, 2.4 Hz, 1 H, ArH), 5.21 (t, J = 5.0 Hz, 1 H, CH), 4.24 (dd, J = 10.6, 4.4 Hz, 1 H, 0.5×ArOCH2),4.07 (dd, J = 10.6, 5.9 Hz, 1 H, 0.5×ArOCH2), 3.88 (m, 8 H, OCH2 + 2×OCH3), 3.84 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.77 (m, 1 H, 0.5×OCH2), 3.62 (m, 2 H, OCH2C(O)), 3.40 (m, 4 H, 2×CH2N).
【０３５９】
・予備切断可能なＳＣＧＴＰ
【化９０】
2019503174.tif 000092
【０３６０】
３’−Ｏ−ピバロイル−７−デアザ−７−（３−アミノプロパ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシグアノシントリフルオロアセテート（１５２ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。ヒューニッヒ塩基（１３８ｍｇ、１８６μＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−（２−｛１−アジド−２−［３−（｛２−［３，５−ビス（メトキシカルボニル）ベンズアミド］エチル｝カルバモイル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）酢酸（１５７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１０７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、１Ｍの塩酸（１０ｍＬ）で洗浄した。水相を分離し、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。混合有機相を、水（４×２０ｍＬ）、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮してオレンジ色の固体を得た。この粗固体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが４→２６％）を順相条件下で使用し精製して、予備切断可能な ＳＣＧＴＰ（１９７ｍｇ、７３％）をオレンジ色の固体として得た。
【０３６１】
Rf 0.46 (ジクロロメタン-メタノール, 92 : 8, v/v).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.54 (br, 1 H, NH), 9.08 (br, 1 H, NH), 8.68 (d, J= 1.6 Hz, 2 H, 2×ArH), 8.63 (br t, 1 H, NH), 8.58 (t, J = 1.6 Hz, 1 H, ArH), 8.22 (t, J= 5.7 Hz, 1 H, NH), 7.46 (m, 2 H, 2×ArH), 7.37 (t, J = 7.8 Hz, 1 H, ArH), 7.30 (s, 1 H, デオキシグアノシン CH), 7.13 (m, 1 H, ArH), 6.35 (br s, 2 H, デオキシグアノシン NH2), 6.24 (dd, J = 9.2, 5.6 Hz, 1 H, CHN), 5.25 (m, 1 H, OH), 5.14 (m, 2 H, CHOPiv + CHN3), 4.23 (dd, J = 10.4, 4.5 Hz, 1 H, 0.5×ArOCH2),  4.13 (m, 3 H, 0.5×ArOCH2 + 0.5×OCH2 + CH), 3.88 (m, 11 H, CH2N + 1.5×OCH2+ 2×OCH3), 3.68 (m, 2 H, デオキシグアノシン CH2), 3.55 (m, 2 H, OCH2C(O)), 3.46 (m, 4 H, 2×CH2N), 2.59 (m, 1 H, デオキシグアノシン 0.5×CH2), 2.25 (m, 1 H, デオキシグアノシン 0.5×CH2), 1.17 (s, 9 H, 3×CH3).
【０３６２】
・ペンタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＧＴＰ
【化９１】
2019503174.tif 000093
【０３６３】
予備切断可能なＳＣＧＴＰ（１８５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（０．５７ｍＬ）と無水ピリジン（１９１μＬ）に溶解し、フラスコを真空にし、窒素雰囲気で３回パージした。１，４−ジオキサン（２１０μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍのサリチルクロロホスファイト溶液を加え、反応混合物を１０分間撹拌した。無水ＤＭＦ（０．５７ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロホスフェート溶液とトリブチルアミン（１４８ｍｇ、１９０μＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を同時に加え、反応混合物を１５分間撹拌した。ピリジンおよび水（３．８ｍＬ、９２：８ｖ／ｖ）中の１％のヨウ素溶液を加え、溶液を１５分間撹拌してから５％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（１００μＬ）でクエンチし、混合物を減圧下で濃縮した。得られた残留物を、２７２ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（Ｃ１８カラム、グラジエントはｐＨ８の０．１ＭのＴＥＡＡ中のアセトニトリルが０→４０％）を逆相条件下で使用し精製して、凍結乾燥してから保護された不純切断可能ＳＣＧＴＰ（１６６ｍｇ、５８％）を得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３６４】
水（１．２０ｍＬ）中の保護された切断可能ＳＣＧＴＰ（１６６ｍｇ）溶液に、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．１８ｍＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で４０分間撹拌した。さらに１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（０．６０ｍＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間４０分撹拌した。１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（０．２０ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０分間撹拌し、溶液を１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液（ｐＨ８、５ｍＬ）で希釈した。結果として生じた溶液を一晩凍結乾燥し（２２０ｍｇ）、物質を１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液（２．０ｍＬ）に溶解して、１１０ｍｇ／ｍＬの濃縮物を得た。この溶液を、８０μＬ分を注入し、純物質を含有する溶離液を収集するセミ分取ＨＰＬＣにより精製した。混合留分の体積をアセトニトリルと大部分の水を除去することにより減らし、最終的には凍結乾燥してペンタ−トリエチルアンモニウム切断可能ＳＣＧＴＰ（９７ｍｇ、５８％）を白色固体として得た。
【０３６５】
ＨＰＬＣ条件：
カラム: Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１５ｍｍ×２５０ｍｍ
溶媒グラジエント：２２分で９０％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液（ｐＨ７．０）から８５．６％、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液（ｐＨ７．０）。残りはアセトニトリルである。
流速：７．８ｍＬ／分
温度：３０℃
検出：２９０ｎｍのＵＶ
これらの条件下で、生成物の保持時間は約１８〜１９．５分だった。
【０３６６】
〔実施例８：光切断可能リンカーの合成〕
３−（ヒドロキシメチル）ナフタレン−２−オール誘導体の合成
・（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート
【０３６７】
【化９２】
2019503174.tif 000094
【０３６８】
バイアルに入った、アセトン（８．２ｍＬ）中の３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸メチル（４９８ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（６８３ｍｇ、４．９４ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、臭化アリル（４１９ｍｇ、３２１μＬ、３．７１ｍｍｏｌ）を加えた。バイアルを封止し、８０℃で３．５時間加熱した。室温まで冷却した後、臭化アリル（４１９ｍｇ、３２１μＬ、３．７１ｍｍｏｌ）とヨウ化カリウム（６１６ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）を加えた。バイアルを封止し、８０℃でさらに７２時間加熱した。室温まで冷却した後、反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（２×１０ｍＬ）、３Ｍの水酸化ナトリウム（１０ｍＬ）、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、３−（アリルオキシ）−２−ナフトエ酸メチル（６１５ｍｇ、９８％）を黄色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３６９】
無水ＴＨＦ（６．２ｍＬ）中の３−（アリルオキシ）−２−ナフトエ酸メチル（３００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を窒素下で氷槽において冷却し、ヘキサン（２．７３ｍＬ、２．７３ｍｍｏｌ）中の１．０ＭのＤＩＢＡＬ溶液を滴下した。撹拌を一晩続け、この時間中に反応混合物を室温まで温めた。結果として生じた混合物を０℃まで冷却し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（１０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（２×３０ｍＬ）、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して黄色油を得た。この粗体を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントは酢酸エチル中のガソリンが５→４０％）を順相条件下で使用し精製して、（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メタノール（２２０ｍｇ、８３％）、を黄色油として得た。
【０３７０】
Rf = 0.20 (酢酸エチル-ガソリン, 1 : 4 v/v)
【０３７１】
無水アセトニトリル（５ｍＬ）中の（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メタノール（２１５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素下でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３３５ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）とピリジン（１０３ｍｇ、１０６μＬ、１．３１ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を室温で一晩続けた。混合物を蒸発させて乾燥し、残渣をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（３×２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（２６３ｍｇ、７４％）を白色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３７２】
・(３−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート
【化９３】
2019503174.tif 000095
【０３７３】
ジオキサン（１ｍＬ）中のトリエチルアミン（１１１ｍｇ、１５３μＬ、１．１０ｍｍｏｌ）の溶液を、水（２ｍＬ）中のＨ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ（１４３ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）スラリーに加えた。透明な溶液をいったん得たら、無水ジオキサン（２ｍＬ）中の（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（２６０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の溶液を加え、室温で一晩撹拌を続けた。溶液を水（６ｍＬ）に注ぎ、２．０Ｍの硫酸水素ナトリウム水溶液で〜ｐＨ３．０まで酸性化し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（３×３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、Ｎ−（（（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジルセリン（２９０ｍｇ、９１％）を無色油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３７４】
無水ＤＭＦ（０．７５ｍＬ）中の酢酸鉛（ＩＶ）（３５７ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を、窒素下で、氷槽において冷却し、無水ＤＭＦ（０．７５ｍＬ）中のＮ−（（（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−ベンジルセリン（２９０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）溶液を滴下した。撹拌をこの温度で３０分間続け、さらに４時間撹拌を続け、この時間の間に反応混合物を室温まで温めた。酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（１０ｍＬ）でクエンチした。層を分離し、水層を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、１−（（（（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（ベンジルオキシ）酢酸エチル（３２６ｍｇ）を黄色油として得た。
【０３７５】
１−（（（（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−２−（ベンジルオキシ）酢酸エチル（３２４ｍｇ）を無水メタノール（３．５ｍＬ）に溶解した。溶液を、マイクロ波照射下で、１００℃で３０分間加熱してから減圧下で濃縮した。残留酢酸をメタノール（３×３ｍＬ）で共沸除去して、（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート（２７６ｍｇ、２工程にわたって９８％）を黄色／オレンジ色の油として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３７６】
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の、（３−（アリルオキシ）ナフタレン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート（１２７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）と５，５−ジメチル−１，３―シクロヘキサンジオール（１２７ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素下でＰｄ（ＰＰｈ３）４（１０４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を室温で一晩続けた。混合物を蒸発させて乾燥し、残渣を水（１０ｍＬ）にとり、酢酸エチル（５×１０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（４×１０ｍＬ）、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、ダークオレンジ色の粘性固体を得た。この粗体をまず、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジクロロメタン中のメタノールが０．５→４％）を順相条件下で使用し精製して、不純（３−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメートを得た。２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはジエチルエーテル中のメタノールが０→１％）を順相条件下で使用したさらなる精製により、（３−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート（１０５ｍｇ、９２％）を淡褐色半固体として得た。
【０３７７】
Rf = 0.80 (メタノール-ジエチルエーテル, 0.5 : 95.5 v/v)
【０３７８】
２−ヒドロキシメチル−ｐ−ヒドロキノン誘導体の合成
・２，５−ジメトキシベンジル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート
【化９４】
2019503174.tif 000096
【０３７９】
無水アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２，５−ジメトキシベンジルアルコール（０．６７ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（１．３３ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を加え、続いてピリジン（４０９ｍｇ、４１９μＬ、５．１８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩室温で撹拌した。混合物を濃縮し、ジクロロメタン（６０ｍＬ）とともに再構成し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３×６０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）、飽和食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。物質をアセトニトリル（３×２０ｍＬ）とジエチルエーテル（２０ｍＬ）で共沸乾燥して、２，５−ジメトキシベンジル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（１．１５ｇ、９３％）を白色固体として得た。
【０３８０】
・（３，６−ジソキソシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメートに向けて
【化９５】
2019503174.tif 000097
【０３８１】
水（１０ｍＬ）中のＯ−ベンジルセリン（０．７３ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）にジオキサン（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（０．５６ｇ、０．７８ｍＬ、５．５８ｍｍｏｌ）を加え、続いて２，５−ジメトキシベンジル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（１．１５ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩室温で撹拌した。結果として生じた混合物を水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（３×５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮してＯ−ベンジル−Ｎ−（（（２，５−ジメトキシベンジル）オキシ）カルボニル）セリン（１．３７ｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０３８２】
−１０℃の無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中の四酢酸鉛（ＩＶ）（１．８４ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）に、無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＯ−ベンジル−Ｎ−（（（２，５−ジメトキシベンジル）オキシ）カルボニル）セリン（１．３５ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物をこの温度で３０分間撹拌し、続いて室温で一晩撹拌した。結果として生じた混合物を酢酸エチル（６０ｍＬ）で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）で洗浄した。水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出し、混合有機抽出物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、２−（ベンジルオキシ）−１−（（（（２，５−ジメトキシベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）酢酸エチル（１．３８ｇ、９９％）を黄色油として得た。
【０３８３】
メタノール（１０ｍＬ）中の２−（ベンジルオキシ）−１−（（（（２，５−ジメトキシベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）酢酸エチル（０．９５ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）をマイクロ波反応器において１００℃で３０分間加熱した。結果として生じた溶液を濃縮し、メタノール（３×１０ｍＬ）で共沸乾燥して２，５−ジメトキシベンジル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート（０．８４ｇ、９５％）をオレンジ色の油として得た。
【０３８４】
２−ヒドロキシメチルアントラキノンカーボネート誘導体の合成
・（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート
【化９６】
2019503174.tif 000098
【０３８５】
氷酢酸（１０ｍＬ）中の酢酸ナトリウム（１．５０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）と無水酢酸（５ｍＬ）のスラリーに、２−ブロモメチル−９，１０−アントラキノン（０．５０ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を還流状態で一晩窒素下で加熱した。室温まで冷却した後、溶媒を蒸発させ、残渣を水（１０ｍＬ）中でスラリー化し、ブフナー漏斗を使用して吸引濾過により集めた。この物質を水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、室温で一晩真空乾燥して、２−メチルアセテート−９，１０−アントラキノン（４６４ｍｇ、定量的）を淡黄色固体として得た。
【０３８６】
水（２．３ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（８２ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）溶液を２−メチルアセテート−９，１０−アントラキノン（４５９ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、混合物を還流状態で４時間加熱した。室温まで冷却した後、反応混合物を水（１８ｍＬ）で希釈し、結果として生じた固体を吸引濾過により集めた。この物質を水（２×６ｍＬ）で洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して、２−ヒドロキシメチル−９，１０−アントラキノン（３６１ｍｇ、９２％）を淡黄色固体として得た。
【０３８７】
無水アセトニトリル（７．５ｍＬ）中の２−ヒドロキシメチル−９，１０−アントラキノン（３５８ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素下で、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（５００ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）とピリジン（１５４ｍｇ、１５８μＬ、１．９５ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を室温で一晩続けた。結果として生じた混合物を蒸発させて乾燥し、残渣をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解した。溶液を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、次に層を分け、水層をクロロホルム（４×３０ｍＬ）で抽出した。混合有機物を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（３×３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（２６３ｍｇ）を淡黄色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３８８】
さらに、水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈することにより物質を得て、次に結果として生じた固体を吸引濾過により集めた。これを室温で７２時間真空乾燥して、（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（３２１ｍｇ）を淡黄色固体として得て、これをさらなる精製なしに使用した。
【０３８９】
・（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート
【化９７】
2019503174.tif 000099
【０３９０】
ジオキサン（３．４ｍＬ）中のトリエチルアミン（１２６ｍｇ、１７４μＬ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、水（２．２５ｍＬ）中のＨ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ（１６２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）のスラリーに加えた。透明な溶液をいったん得たら、（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（３１５ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌を続けた。溶液を水（６ｍＬ）に注ぎ、２．０Ｍの硫酸水素ナトリウム水溶液で〜ｐＨ３．０まで酸性化し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）を抽出した。混合有機層を水（３×３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）を洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、Ｏ−ベンジル−Ｎ−（（（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メトキシ）カルボニル）セリン（２３６ｍｇ、６２％）を淡黄色固体として得た。
【０３９１】
無水ＤＭＦ（０．５５ｍＬ）中の酢酸鉛（ＩＶ）（２６６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を窒素下で氷槽において冷却し、無水ＤＭＦ（０．５５ｍＬ）中のＯ−ベンジル−Ｎ−（（（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メトキシ）カルボニル）セリン（２３０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。撹拌をこの温度で３０分間続け、続いてさらに３時間続け、この時間の間に反応混合物を室温まで温めた。酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、混合物を飽和重炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチした。層を分離し、水層を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して２−（ベンジルオキシ）−１−（（（(９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）酢酸エチル（２７０ｍｇ）を黄色油として得た。
【０３９２】
２−（ベンジルオキシ）−１−（（（（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）酢酸エチル（２７０ｍｇ）を無水メタノール（２ｍＬ）と無水１，２−ジメトキシエタン（１．２ｍＬ）に溶解した。溶液をマイクロ波照射下で、１００℃で３０分間加熱してから減圧下で濃縮した。残留酢酸をメタノール（３×３ｍＬ）で共沸除去して、（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イル）メチル（２−（ベンジルオキシ）−１−メトキシエチル）カルバメート（２０１ｍｇ、２工程にわたって９０％）を淡黄色固体として得た、
【０３９３】
２−ヒドロキシ−置換リンカー誘導体の合成
・１−（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムテトラフルオロボラート
【化９８】
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【０３９４】
無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール（５００ｍｇ、３．３３ｍｍｏｌ）にカルボニルジイミダゾール（５６７ｍｇ、３．５０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩室温で撹拌した。不純物質をシリカ上に乾式装填し、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが７→７７％）を順相条件下で使用し精製して、４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル１Ｈ−イミダゾール−１−カルボキシレート（４６１ｍｇ、５７％）を白色固体として得た。
【０３９５】
Rf = 0.45 (酢酸エチル-ガソリン, 3 : 7 v/v)
【０３９６】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル１Ｈ−イミダゾール−１−カルボキシレート（５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびトリメチルオキソニウムテトラフルオロボラート（３１ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１ｍＬ）において一晩室温で撹拌した。混合物を濃縮して、１−（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムテトラフルオロボラート（５５ｍｇ）を得て、これを精製なしに使用した。
【０３９７】
・５−（２−（（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）オキシ）アセチル）−２−ヒドロキシ安息香酸
【化９９】
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【０３９８】
ベンジルブロミド（２．４９ｇ、１．６５ｍＬ、６．９４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の５−アセチル−２−ヒドロキシ安息香酸（１．００ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１．９８ｇ、６．９４ｇ）の溶液に滴下し、混合物を１２０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、水（１５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（４×１５ｍＬ）で抽出した。混合有機層を水（５×１５ｍＬ）、飽和食塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。不純残渣を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが５→１００％）を順相条件下で使用し精製して、ベンジル５−アセチル−２−（ベンジルオキシ）ベンゾエート（１．８６ｇ、９３％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０３９９】
Rf = 0.45 (酢酸エチル-ガソリン, 1 : 4 v/v) 
【０４００】
トリメチルフェニルアンモニウムトリブロミド（ＰＴＴ）（１．５６ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のベンジル５−アセチル−２−（ベンジルオキシ）ベンゾエート（１．５０ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）に少しずつ加え、混合物を２０分間撹拌した。氷水（９０ｍＬ）を加え、４℃で保管することにより結晶化を引き起こした。結晶をブフナー漏斗を使用して吸引濾過により集め、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で洗浄して、４０℃で１時間真空乾燥した後、ベンジル２−（ベンジルオキシ）−５−（２−ブロモアセチル）ベンゾエート（１．５１ｇ、８３％）をオフホワイト色の結晶固体として得た。
【０４０１】
エタノール（４ｍＬ）中のベンジル２−（ベンジルオキシ）−５−（２−ブロモアセチル）ベンゾエート（１．５１ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）の懸濁液に水（２ｍＬ）中の酢酸ナトリウム（３１０ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）と酢酸（２００μＬ）とを加え、混合物を８０℃で３時間撹拌した。結果として生じた混合物を室温まで冷却し、４℃で保管することにより結晶化を引き起こした。結晶をブフナー漏斗を使用して吸引濾過により集め、続いて氷水（１０ｍＬ）と氷冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、４０℃で１時間真空乾燥した後、５−（２−アセトキシアセチル）−２−（ベンジルオキシ）ベンゾエート（７０７ｍｇ、４９％）を白色の結晶固体として得た。
【０４０２】
メタノール（３ｍＬ）中のベンジル５−（２−アセトキシアセチル）−２−（ベンジルオキシ）ベンゾエート（３００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）に、２Ｍの塩酸（１．８ｍＬ）を加え、溶液を７０℃で１時間撹拌した。結果として生じた混合物を室温まで冷却し、水（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。不純物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが１２→８５％）を順相条件下で使用し精製して、ベンジル２−（ベンジルオキシ）−５−（２−ヒドロキシアセチル）ベンゾエート（２２５ｍｇ、８３％）を白色固体として得た。
【０４０３】
Rf = 0.42 (酢酸エチル-ガソリン, 1 : 1 v/v)
【０４０４】
無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のベンジル２−（ベンジルオキシ）−５−（２−ヒドロキシアセチル）ベンゾエート（８０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）に、１−（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾール−３−イウムテトラフルオロボラート（５５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応が不十分であることが示され、混合物を還流状態で５時間加熱した。不純物質をシリカ上に乾式装填し、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが１０→１００％）を順相条件下で使用し精製して、ベンジル２−（ベンジルオキシ）−５−（２−（（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）オキシ）アセチル）ベンゾエート（８８ｍｇ、８０％）を無色油として得た。
【０４０５】
Rf = 0.45 (酢酸エチル-ガソリン, 1 : 1 v/v)
【０４０６】
炭素（８．５ｍｇ）上の１０％パラジウムを、慎重に、窒素下で、酢酸エチル（２ｍＬ）で濡らし、ベンジル２−（ベンジルオキシ）−５−（２−（（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）オキシ）アセチル）ベンゾエート（８５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。水素雰囲気をバルーンにより導入し、混合物を室温で２時間撹拌した。触媒を、懸濁液をＣｅｌｉｔｅの薄層で濾過することにより除去し、濾液を濃縮して５−（２−（（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）カルボニル）オキシ）アセチル）−２−ヒドロキシ安息香酸（６０ｍｇ、１００％）を白色固体として得た。
【０４０７】
〔実施例９：化学的に切断可能なリンカーの合成〕
・メチル２−（アジドメチル）ベンゾエート
【化１００】
2019503174.tif 000102
【０４０８】
無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中のメチル２−（ブロモメチル）ベンゾエート（２５０ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）にアジ化ナトリウム（５６５ｍｇ、８．７０ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で一晩撹拌した。結果として生じた溶液を水（４０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）に抽出した。混合有機層を水（５×４０ｍＬ）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、メチル２−（アジドメチル）ベンゾエート（２０３ｍｇ、９７％）を淡黄色固体として得た。
【０４０９】
・２−（アジドメチル）安息香酸
【化１０１】
2019503174.tif 000103
【０４１０】
ＴＨＦ（１ｍＬ）中のメチル２−（アジドメチル）ベンゾエート（２００ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）に３Ｍの水酸化ナトリウム（１．５ｍＬ）を加え、溶液を室温で一晩撹拌した。結果として生じた溶液を水（１０ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（３×１０ｍＬ）で洗浄した。水層を、２Ｍの塩酸でｐＨ２に調整し、続いて酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して２−（アジドメチル）安息香酸（１７４ｍｇ、９５％）を白色固体として得た。
【０４１１】
・２−（アジドメチル）ベンゾイルクロリド
【化１０２】
2019503174.tif 000104
【０４１２】
無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中の２−（アジドメチル）安息香酸（１７０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）と無水ＤＭＦ（３．５ｍｇ、４μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）に、塩化チオニル（３４２ｍｇ、２１０μＬ、２．８８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６０℃で２時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、濃縮して、２−（アジドメチル）ベンゾイルクロリド（１８１ｍｇ、定量的）を黄色の固体として得て、これを精製なしに即時に使用した。
【０４１３】
・４−ニトロフェニル２−（アジドメチル）ベンゾエート
【化１０３】
2019503174.tif 000105
【０４１４】
無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中の２−（アジドメチル）ベンゾイルクロリド（９０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１７ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）に、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中の４−ニトロフェノール（７４ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた不純物質をシリカ上に乾燥装填し、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが１２→１００％）を順相条件下で使用し精製して、４−ニトロフェニル２−（アジドメチル）ベンゾエート（８９ｍｇ、５５％）を白色固体として得た。
【０４１５】
Rf = 0.54 (酢酸エチル-ガソリン, 1 : 1 v/v)
【０４１６】
・７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニル２−（アジドメチル）ベンゾエート
【化１０４】
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【０４１７】
無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中の２−（アジドメチル）ベンゾイルクロリド（９０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１７ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）に、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中の４−メチルウンベリフェロン（９３ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。結果として生じた不純物質をシリカ上に乾式装填し、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅのＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィシステム（シリカカラム、グラジエントはガソリン中の酢酸エチルが１２→７５％）を順相条件下で使用し精製して、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニル２−（アジドメチル）ベンゾエート（８０ｍｇ、５６％）を白色固体として得た。
【０４１８】
Rf = 0.57 (酢酸エチル-ガソリン, 1 : 1 v/v)
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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