(57)【要約】  グラニュリンのＮ末端領域に由来するペプチドは、細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒の促進における活性を有する。さらに、付加的なジスルフィド結合が、そのようなペプチドに組み込まれて、ペプチドのフォールディングを改善するか、あるいは他の方法で修飾し得る。ペプチドはまた、例えばプロリン残基において修飾され、細胞増殖を促進するペプチドの能力を改善し得る。
2019531089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
1Ｘn Ｃ  2ＸＤ  3ＸＶＹＴＣＲ  4ＸＧＱＴＣ  Ｃ／Ａ  ＲＧＬＨＧＹＧＣ  5Ｘm（配列番号１）、
又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、
を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたペプチド。
【請求項２】
ｎが０〜１０である、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
ｎが１〜１０である場合、1Ｘが任意のアミノ酸である、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
ｎが３である場合、1Ｘ＝ＳＰＳであり；又はｎが４である場合、1Ｘ＝ＲＳＰＳである、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
ｎが１１である場合、1Ｘ＝ＭＤＴＬＱＰＩＲＳＰＳである、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
ｍが０〜４である、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
ｍが１〜４である場合、5Ｘが任意のアミノ酸である、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
ｍが１である場合、5Ｘ＝Ｃ又はＡである、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
ｍが４である場合、5Ｘ＝ＡＰＭＤ又はＣＰＭＤである、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
2Ｘ、3Ｘ、4Ｘのそれぞれが、Ｐ又はＡである、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの少なくとも２つ、又はそれぞれが、Ｐである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの１つが、Ａである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離されたペプチドであって、配列番号２〜１０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたペプチド。
【請求項１４】
２つ又は３つの鎖内ジスルフィド結合を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１〜１１のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを修飾する方法であって、当該ペプチドのアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を組み込むステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記ペプチドの修飾が、前記ペプチドの１つ又は複数の増加又は増強された生物学的活性をもたらす、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、又は請求項１５に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離された核酸を含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項２０】
請求項１９に記載の遺伝子コンストラクトを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
細胞増殖、遊走を促進し及び／又は創傷を治癒する薬剤の製造方法であって、細胞増殖、遊走を促進し及び／又は創傷を治癒する請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチドのアナログ、模倣物（mimetic）又はアゴニストを同定、操作、スクリーニング又は設計するステップを含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法に従って製造された薬剤。
【請求項２３】
薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド、請求項１８に記載の単離された核酸、又は請求項２２に記載の薬剤を含有する、医薬組成物。
【請求項２４】
細胞増殖及び／又は遊走を促進する方法であって、１つ又は複数の細胞と、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド、請求項１８に記載の単離された核酸、請求項２２に記載の薬剤、又は請求項２３に記載の医薬組成物とを接触させ、それによって、１つ又は複数の細胞の増殖及び／又は遊走を開始、刺激又は促進するステップを含む、方法。
【請求項２５】
創傷を治癒する方法であって、創傷と、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド、請求項１８に記載の単離された核酸、請求項２２に記載の薬剤、又は請求項２３に記載の医薬組成物とを接触させ、それによって、少なくとも部分的に創傷を治癒するステップを含む、方法。
【請求項２６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、創傷治癒ペプチドに関する。より具体的には、本発明は、グラニュリンタンパク質のＮ末端領域に由来するペプチドであって、細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒を促進するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
グラニュリンは、広範な生理学的機能、並びに胚形成、創傷修復、炎症および腫瘍増殖を含む疾患過程に関与するタンパク質増殖因子のファミリーである［１］。ヒト寄生性肝吸虫のタイ肝吸虫（Opisthorchis viverrini）は、Ｏｖ−ＧＲＮ−１と呼ばれるグラニュリンファミリーメンバーを分泌し、これは発がん性吸虫の排泄／分泌（ＥＳ）産物から最初に単離された［２、３］。Ｏｖ−ＧＲＮ−１は、宿主細胞の増殖を引き起こす病原体から記載された最初の増殖因子であった［４、５］。本発明者らは、ピコモル濃度の組み換えＯｖ−ＧＲＮ−１が、血管新生を誘導し、かつ局所投与時にマウスにおいて創傷修復を促進すること、肝吸虫のグラニュリンが創傷の治療として開発される可能性があることを示唆する発見を示した［６］。
【０００３】
Ｏｖ−ＧＲＮ−１についての構造活性相関を理解することは、創傷を治癒するためのこのグラニュリンの最も有効な形態の設計を可能にするであろう。Ｏｖ−ＧＲＮ−１の三次元構造は、実験的に決定されていないが、いくつかの種のグラニュリンの構造が報告されている。決定された最初のグラニュリン構造は、コイグラニュリン−１（carp granulin-1）のものであった；これは、ジスルフィド結合の格子状配置で６つのジスルフィド結合によって一緒に架橋した４つのβ−ヘアピンを含む［７］。コイグラニュリン−１について観察された明確に定義された構造にも関わらず、グラニュリンの構造機能相関は複雑であり、一次配列に大きく依存するようである。これはヒトグラニュリンに特に明白である。哺乳動物グラニュリンの前駆体タンパク質（プログラニュリン、ＰＧＲＮ）は、７個半のグラニュリンドメインを含み、斯かるドメインは、分子量が約６ｋＤａであり、細胞からのＰＧＲＮの分泌後に個々のグラニュリンモジュールへとタンパク質分解的にプロセシングされる［１］。パラグラニュリンと称される「半グラニュリン」単位は、６個のシステイン残基のみを含む［８］。
【０００４】
７個のヒトグラニュリンモジュールは個別に発現され、その構造はＮＭＲ分光法によって分析された［９］。３個は溶液中で比較的明確に定義された三次元構造を含むが（Ａ、Ｃ及びＦ）、その他のものは主として構造の乏しいジスルフィド異性体の混合物である［９］。ヒトグラニュリンＡの構造は、コイグラニュリン−１と類似のβ−ヘアピン構造を含むが、Ｃ末端領域に顕著な構造的障害がある。十分に折り畳まれたヒトグラニュリンモジュールのうち、グラニュリンＡは、乳癌細胞株の増殖の強力な抑制を示すが、対照的に、ヒトグラニュリンＦは細胞増殖を刺激する［９］。不十分に折り畳まれたペプチドは、弱い阻害又は活性を示すか、あるいは阻害又は活性を示さない。しかしながら、制限された活性は、標的細胞中に重要なシグナル伝達経路が存在しないこと、及び／又は細菌における組み換えペプチドの産生が不完全／不正確なフォールディングを誘導したことに起因する可能性があることに留意すべきである。今日まで、グラニュリン活性及び結合パートナーの範囲は広く、一見すると器官依存性及び補因子依存性である［１０〜１３］。
【０００５】
ＮＭＲ分光法による構造分析は、コイグラニュリン−１及びヒトグラニュリンＡのＮ末端領域が、Ｃ末端領域とは無関係にフォールディングできることを示した［１４、１５］。２個のジスルフィド結合のみを含むこれら２つのグラニュリンの切断されたアナログは、コイグラニュリン−１の３０残基のＮ末端ドメインについて示されているように、β−ヘアピン構造を有する（図１）。
【発明の概要】
【０００６】
概要
驚くべきことに、グラニュリンのＮ末端領域に由来するペプチドは、細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒の促進における活性を有する。さらに、付加的なジスルフィド結合は、そのようなペプチドに組み込まれて、ペプチドのフォールディングを改善するか、あるいは他の方法で修飾し得る。
【０００７】
本発明の広義の形態は、グラニュリンタンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列に由来するか、又はそれに基づくアミノ酸配列を含む単離されたペプチドを提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、単離されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
1Ｘn Ｃ  2ＸＤ  3ＸＶＹＴＣＲ  4ＸＧＱＴＣ  Ｃ／Ａ  ＲＧＬＨＧＹＧＣ  5Ｘm（配列番号１）、
又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、
を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたペプチドを提供する。
【０００９】
好ましくは、ｎは０〜１０である。
【００１０】
ｎが１〜１０である場合、1Ｘは、任意の同一又は異なったアミノ酸若しくはアミノ酸（複数）である。
【００１１】
一実施形態では、ｎが３である場合、1Ｘ＝ＳＰＳであり、
一実施形態では、ｎが４である場合、1Ｘ＝ＲＳＰＳであり、
一実施形態では、ｎが１１である場合、1Ｘ＝ＭＤＴＬＱＰＩＲＳＰＳであり、
好ましくは、ｍが０〜４である。
【００１２】
ｍが１〜４である場合、5Ｘは、任意の同一又は異なったアミノ酸若しくはアミノ酸（複数）であり得る。
【００１３】
一実施形態では、ｍが１である場合、5Ｘ＝Ｃ又はＡであり、
一実施形態では、ｍが４である場合、5Ｘ＝ＡＰＭＤであり、
別の実施形態では、ｍが４である場合、5Ｘ＝ＣＰＭＤである。
【００１４】
2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの各々は、それぞれ、任意の同一又は異なったアミノ酸若しくはアミノ酸（複数）であり得る。
【００１５】
好ましくは、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘのそれぞれは、独立してＰ又はＡである。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態では、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又はそれぞれが、Ｐである。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態では、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの２つが、Ａである。
【００１８】
関連する態様では、本発明は、単離されたペプチドであって、配列番号１１以外の図１〜１３又は表３のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたペプチドを提供する。
【００１９】
特定の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
前述した態様のいくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、２つ又は３つの鎖内ジスルフィド結合を含むか、又は形成することができる。
【００２１】
前述した態様のいくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、プロリンｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体を形成することができる。
【００２２】
第２の態様では、配列番号１〜１１のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドを修飾する方法であって、当該ペプチドのアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を組み込むステップを含む、方法が提供される。
【００２３】
好ましくは、ペプチドの修飾は、ペプチドの１つ又は複数の増加又は増強された生物学的活性をもたらす。
【００２４】
本発明の第３の態様は、第２の態様の方法に従って修飾された単離されたペプチドを提供する。
【００２５】
また、第１又は第３の態様の単離されたペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントが提供される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、第１又は第３の態様の単離されたペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、前述の核酸の単離された核酸を含む遺伝子コンストラクトを提供する。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、前述の態様の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに、前述の態様の単離されたペプチド又は単離された核酸を含有する、医薬組成物を提供する。
【００３０】
別のさらなる態様では、本発明は、細胞増殖及び／又は遊走を促進する方法であって、１つ又は複数の細胞と、前述の態様の単離されたペプチド、単離された核酸、又は医薬組成物とを接触させ、それによって、１つ又は複数の細胞の増殖及び／又は遊走を開始、刺激又は促進するステップを含む、方法を提供する。
【００３１】
さらに別のさらなる態様では、本発明は、創傷を治癒する方法であって、創傷と、前述の態様の単離されたペプチド、単離された核酸、又は医薬組成物とを接触させ、それによって、少なくとも部分的に創傷を治癒するステップを含む、方法を提供する。
【００３２】
さらに別のさらなる態様では、本発明は、細胞増殖、遊走を促進し及び／又は創傷を治癒する薬剤の製造方法であって、細胞増殖及び／又は遊走を促進し、及び／又は創傷を治癒する前述の態様の単離されたペプチドのアナログ又はアゴニストを同定、操作、スクリーニング又は設計するステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
本態様はまた、本態様の方法によって製造された細胞増殖、遊走を促進し及び／又は創傷を治癒する薬剤を提供する。
【００３４】
好適には、薬剤は、前述の態様の方法に従って使用され得る。
【００３５】
本明細書を通して、特に明記しない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」は、排他的ではなく包括的に使用され、従って、記載された整数又は整数群は、１つ又は複数の他の記載されていない整数又は整数群を含み得る。
【００３６】
「から本質的になる」とは、本文脈において、単離されたタンパク質又は各免疫原性フラグメントが、列挙されたアミノ酸配列に加えて、１個、２個の、又は３個以下のアミノ酸残基を有することを意味する。付加的なアミノ酸残基は、列挙されたアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に存在し得るが、これらに限定されない。
【００３７】
不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、単数の不定冠詞として、あるいは他の方法で不定冠詞が指す１つを超える又は単一よりも多い主題を除外するものとして解釈されるべきではないことも理解されよう。例えば、「ａ」タンパク質は、１つのタンパク質、１つ又は複数のタンパク質、あるいは複数のタンパク質を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】コイグラニュリン−１の３０残基Ｎ末端ドメインの三次元構造。（Ａ）ＰＤＢコード１ＱＧＭ、β鎖は紫色の矢印として、ジスルフィド結合は黄色の球棒形態で示されている。この画像はＭｏｌＭｏｌを用いて作成した。（Ｂ）全長コイグラニュリン−１タンパク質におけるジスルフィド結合性［７］。システインは連続したローマ数字Ｉ〜ＸＩＩで示される。切断されたコイグラニュリン−１における２つの結合は、黄色で強調されている。
【図２】Ｏｖ−ＧＲＮ−１切断アナログの配列及び二次シフト。（Ａ）配列は、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩがアラニン残基により置換されたことを示している；システインは赤色で強調され、置換は青で示される。コイグラニュリン−１のＮ末端３０残基も提供され、ＣｙｓＩＶ及びＶＩがアラニン残基で置換されている。配列識別子は、以下の通りである：Ｏｖ−ＧＲＮ（１〜３５）＝配列番号２；Ｏｖ−ＧＲＮ（８〜３８）＝配列番号３；Ｏｖ−ＧＲＮ（１２〜３４）＝配列番号４；及びＯｖ−ＧＲＮ（１２〜３５）＝配列番号５。（Ｂ）４つのシステイン残基を有するＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドの二次シフト（Ｏｖ−ＧＲＮ1-35、Ｏｖ−ＧＲＮ8-38及びＯｖ−ＧＲＮ12-34）。二次シフトは、αＨシフトからランダムコイルシフト［１６］を差し引くことによって導き出された。保存された残基についての二次シフトの類似性は、全体の折り畳みが３つのペプチドにおいて同じであることを示している。配色は以下の図で保持されている。両方のパネル：黒色の接続線はジスルフィド結合の結合性を表す。
【図３】Ｏｖ−ＧＲＮ12-34及びＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sの構造分析。（Ａ）コイグラニュリン1-30と比較したＯｖ−ＧＲＮ12-34及びＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sの二次シフト。二次シフトは、αＨシフトからランダムコイルシフト［１６］を差し引くことによって導き出された。Ｏｖ−ＧＲＮ12-34は、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s及びｃａｒｐ1-30と比較して、有意に異なる二次シフトを有し、βシート構造の欠如を示す正のシフトを欠く。配列の違いにも関わらず、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sとｃａｒｐ1-30との間の二次シフトについての傾向は類似しており、コイグラニュリン−１に存在するβシートがＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sにも存在することを示している（黒色矢印）。（Ｂ）Ｏｖ−ＧＲＮ12-34及びＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sの構造は、ＮＭＲ分光法を用いて決定され、Ｏｖ−ＧＲＮ12-34はβシート構造を含まないが、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sは含むことを確認する（青色矢印）。ジスルフィド結合は黄色の球棒表現として示され、ｃａｒｐ1-30の構造が比較のために示されている。残基Ｓｅｒ１７及びＳｅｒ２７の側鎖はｃａｒｐ1-30構造上で強調されて、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩのＣｙｓ−Ｓｅｒ置換部位を示す。この構造に基づいて、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sにおける可能性のある結合性と一致して、ｃａｒｐ1-30のＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩはジスルフィド結合を形成することができる可能性があるように思われる。
【図４】肝吸虫グラニュリンペプチドは細胞増殖を誘導する。（Ａ）コイグラニュリン1-30ではなくタイ肝吸虫グラニュリンペプチドは、xCELLigenceを用いてモニターしたところ、ある範囲の濃度でＨ６９ヒト胆管細胞の増殖を誘導した。視覚化を補助するために、選択された処置のみがグラフ化されている。最良適合の可変スロープ（Variable slope）用量反応線は、処置の単回適用の４日後の増殖を示す。有意に増加した細胞増殖を特徴とするＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sの効力は、≧１５ｎＭの最終濃度で観察された（ｐ＜０．０５）。黒色矢印は、パネルＢで使用された４００〜４８３ｎＭ濃度を示す。（Ｂ）パネルＡからの４００ｎＭの全てのＯｖ−ＧＲＮ−１合成ペプチド、及び４８３ｎＭのＯｖ−ＧＲＮ−１タンパク質における平均増殖。ｎｓ＝有意でない、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。両方のパネル：多重比較のためのダネット補正（Dunnett’s correction）を用いた二元配置分散分析試験を用いて、処置と関連処置対照とを比較した（チオレドキシン発現に対するＯｖ−ＧＲＮ−１タンパク質は、ペプチド対照に対する組み換えタンパク質対照及びペプチドと一致した）。４〜６回の反復からの平均値を２〜４回の実験からプールし、ＳＥＭバーを明確性のために上又は下のいずれかに示した。
【図５】Ｏｖ−ＧＲＮ−１及びペプチドのマウス創傷治癒活性。（Ａ＋Ｂ）耳の間の頭皮への生検パンチから生じる〜０．２ｃｍ2の創傷に０〜４日目から５０μｌ容量で毎日塗布された１．５％メチルセルロースゲル中の、５６ｐｍｏｌの組み換えＯｖ−ＧＲＮ−１、Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド、非関連ペプチド、チオレドキシン（ＴＲＸ）タンパク質対照、及び７１ｐｍｏｌのRegranexによる処置からの創傷治癒結果。視覚化を補助するために、データを２つのグラフに分割し、Ｏｖ−ＧＲＮ−１及びペプチド対照群を両方のパネルに示した。非関連ペプチド対照、ＰＢＳ、又はＴＲＸタンパク質対照の間の有意差はどの時点でも認められなかった。黒色矢印は、パネルＣに使用された４日目の時点を示す。（Ｃ）４日目からのＰＢＳビヒクル対照に対する創傷治癒。全てのパネル：ＳＥＭバーでプロットされた４〜５匹の動物の群の２〜６つの生物学的反復の平均治癒率。群は、見やすくするために左又は右にわずかにシフトされている。多重比較のためのダネット補正を用いた反復測定二元配置分散分析試験は、各群を他の各群と比較する。ペプチド／タンパク質対照に対する有意性は、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＝ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない、によって示される。Regranexに対して有意な処置は、＃＝ｐ＜０．０５で示される。アスタリスク又はハッシュの色は、関連する群を表す。色及び記号は、図２〜５にわたって維持されている。
【図６】化学シフト比較。切断型のコイ（carp）グラニュリンの公表されているシフト［１４］と、Ｃ１７Ａ及びＣ２７Ａ突然変異を有する突然変異体との間の化学シフト比較。
【図７】グラニュリンファミリーにおける保存されたシステインフレームワーク。Ａ）Ｃａｒｐ−１グラニュリンにおけるジスルフィド結合の結合性パターン。（Ｂ）合成Ｎ末端Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド（ＧＲＮ  12-35_3s）におけるジスルフィド結合の結合性パターン。ＣｙｓＩＶとＣｙｓＶＩとの間の予測された結合性に基づくＧＲＮ12-35_3sにおける非天然ジスルフィド結合は、赤色で強調されている；「−−−」は任意の残基であり得る。
【図８】操作されたペプチドのＨＰＬＣトレース。全てのペプチドは、室温で２４時間、自由空気酸化で酸化された。ＭＡＬＤＩ分光法分析に従って予想された分子量を有する酸化されたペプチドに対応する収集画分は、＊でマークされる。
【図９】ＮＨ領域においてＧＲＮ3Alaと比較したＧＲＮ12-35_3sのＴＯＣＳＹ二次元ＮＭＲスペクトル。ＴＯＣＳＹスペクトルを、０．２ｍＭの濃度、２９０Ｋ、及び８０ｍｓの混合時間で記録した。割り当てられた残基は、それらの残基名及び番号で示される。ＧＲＮ12-35_3sによる複数の確認の採用から生じた付加的なピークを囲んでいる。
【図１０】Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sと比較したＯｖ−ＧＲＮ12-35_3s操作ペプチドの二次シフト。二次シフトは、αＨシフトからランダムコイルシフトを差し引くことによって導き出された。二次シフトについての傾向は、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sと比較して類似であり、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s中に存在するβシートがプロリン突然変異体アナログにおいて維持されていることを示している。
【図１１】Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s（左）及びＧＲＮ3Ala（右）の三次元構造。構造をＮＭＲ分光法を用いて決定した。プロリン２、プロリン４及びプロリン１０残基の側鎖が、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s上で強調されている。ＧＲＮ3Alaでは、プロリン残基は、側鎖が強調されているアラニンで置換されている。
【図１２】Ｈ６９細胞のインビトロ細胞増殖に対する操作されたＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sペプチドの影響。Ｈ６９細胞を、２００ｎＭのペプチド濃度で４８時間処理した。ペプチドの増殖率を、材料及び方法に記載したように測定し、値をパーセンテージとして与える。データを一元配置分散分析によって分析した。有意性はｎｓ  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１  ＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１に設定した。Ｐ＜０．０００１（Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s、ＧＲＮP2A、ＧＲＮP4A及びＧＲＮP10A）及びＰ＝０．９０（ＧＲＮ３Ａｌａ）の統計的に異なる値を、対照ペプチドＬｏｏｐ６と比較して決定した。
【図１３】Ｏｖ−ＧＲＮ−１及びペプチドのマウス創傷治癒活性。（Ａ）４日目の創傷治癒結果を、耳の間の頭皮への生検パンチから生じる〜０．２ｃｍ2の創傷に０〜４日目から５０μｌ容量で毎日塗布された１．５％メチルセルロースゲル中の、５６ｐｍｏｌのペプチド対照と比較した、５６ｐｍｏｌの組み換えＯｖ−ＧＲＮ−１、Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド、チオレドキシン（ＴＲＸ）タンパク質対照、及び７１ｐｍｏｌのRegranexによる処置から示している。（Ｂ）ペプチドのアミノ酸配列。ＧＲＮ２７ｓｐｓ＝配列番号１０。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
配列表の簡単な説明
配列番号１      切断されたＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２      Ｏｖ−ＧＲＮ（１〜３５）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号３      Ｏｖ−ＧＲＮ（８〜３８）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号４      Ｏｖ−ＧＲＮ（１２〜３４）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号５      Ｏｖ−ＧＲＮ（１２〜３５）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号６      ＧＲＮ（Ｐ２Ａ）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号７      ＧＲＮ（Ｐ４Ａ）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号８      ＧＲＮ（Ｐ１０Ａ）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号９      ＧＲＮ（３Ａｌａ）ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１０    ＧＲＮ２７ｓｐｓのアミノ酸配列。
配列番号１１    Ｃａｒｐ（１〜３０）ペプチドのアミノ酸配列。
【００４０】
詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、Ｏｖ−ＧＲＮ−１の切断型、及び／又はその変異体の合成に基づいており、それらのフォールディング特性及びそれらの細胞増殖及び創傷治癒における活性を決定する。Ｏｖ−ＧＲＮ−１のＮ末端領域は、新規なフォールディング特性、及び強力な細胞増殖活性を示した。いくつかのそのような切断されたペプチド及び変異体は、創傷治癒のマウスモデルにおいて試験され、全長タンパク質と同じくらい強力であり、かつ臨床的に使用されている創傷治癒薬剤であるRegranexと同程度又はさらにそれよりも優れている。
【００４１】
従って、本発明の態様は、単離されたペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたペプチドに関する。
【００４２】
本発明の目的のために、「単離された」とは、その天然状態から取り出されたか、又は他の方法で人為的操作を受けた物質を意味する。単離された物質は、実質的又は本質的に、その天然状態に通常伴う成分を含まないか、あるいはその天然状態に通常伴う成分と一緒に人工状態となるように操作され得る。単離された物質は、天然、化学合成又は組み換え型であり得る。
【００４３】
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当該技術分野でよく理解されている天然又は非天然アミノ酸、Ｄ−又はＬ−アミノ酸であり得る。
【００４４】
用語「タンパク質」は、典型的には５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質を記述するために使用される「ペプチド」、並びに、典型的には５０個超のアミノ酸を有するタンパク質を記述するために使用される「ポリペプチド」を含みかつ包含する。本発明の一実施形態は、単離されたポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００４５】
単離されたペプチドは、以下のアミノ酸配列：
1Ｘn Ｃ  2ＸＤ  3ＸＶＹＴＣＲ  4ＸＧＱＴＣ  Ｃ／Ａ  ＲＧＬＨＧＹＧＣ  5Ｘm（配列番号１）、ここで、ｎは０〜１１であり、かつｍは０〜４である；又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。
【００４６】
ｎがゼロである場合、アミノ酸は存在しないことが理解されるであろう。ｎが１〜１０である場合、1Ｘは、任意の同一又は異なったアミノ酸若しくはアミノ酸（複数）である。
【００４７】
一実施形態では、ｎが４である場合、1Ｘ＝ＲＳＰＳであり、
一実施形態では、ｎが３である場合、1Ｘ＝ＳＰＳであり、
一実施形態では、ｎが１１である場合、1Ｘ＝ＭＤＴＬＱＰＩＲＳＰＳである。
【００４８】
ｍがゼロである場合、アミノ酸は存在しないことが理解されるであろう。ｍが１〜４である場合、5Ｘは、任意の同一又は異なったアミノ酸若しくはアミノ酸（複数）であり得る。
【００４９】
一実施形態では、ｍが１である場合、5Ｘ＝Ｃ又はＡである。
【００５０】
一実施形態では、ｍが４である場合、5Ｘ＝ＡＰＭＤである。
【００５１】
別の実施形態では、ｍが４である場合、5Ｘ＝ＣＰＭＤである。
【００５２】
2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの各々は、それぞれ、任意の同一又は異なったアミノ酸若しくはアミノ酸（複数）であり得る。
【００５３】
好ましくは、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘのそれぞれは、独立してＰ又はＡである。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態では、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又はそれぞれが、Ｐである。
【００５５】
いくつかの好ましい実施形態では、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの１つが、Ａである。
【００５６】
特定の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【００５７】
配列番号２〜５のそれぞれのアミノ酸配列からなる単離されたペプチドは、本明細書中で以下のように称され得る：
配列番号２    Ｏｖ−ＧＲＮ1-35、Ｏｖ−ＧＲＮ（１〜３５）、又はＧＲＮ1-35；
配列番号３    Ｏｖ−ＧＲＮ8-38、Ｏｖ−ＧＲＮ（８〜３８）、又はＧＲＮ8-38；
配列番号４    Ｏｖ−ＧＲＮ12-34、Ｏｖ−ＧＲＮ（２〜２４）、又はＧＲＮ2-24；
配列番号５    Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s、Ｏｖ−ＧＲＮ（１２〜３５）、又はＧＲＮ12-35_3s。
【００５８】
実施例及び図４及び５を参照すると、配列番号２〜５からなる単離されたペプチドは、Regranexと同程度又はそれよりも高い程度又はレベルまで、細胞増殖及び／又は創傷治癒を促進することができることが実証された。
【００５９】
いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、２つ又は３つの鎖内ジスルフィド結合を含む。図２に示されたアミノ酸配列から理解されることになるように、配列番号２〜４は、２つのジスルフィド結合を形成する４個のシステイン残基を含むが、配列番号５は、３つのジスルフィド結合を形成する６個のシステイン残基を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、配列番号５の単離されたペプチドは、全長グラニュリンタンパク質と同様の様式で折り畳まれ得ることが提唱される。
【００６０】
配列番号６〜８のそれぞれのアミノ酸配列からなる単離されたペプチドは、本明細書中で以下のように称され得る：
配列番号６    Ｏｖ−ＧＲＮP2A、Ｏｖ−ＧＲＮ（Ｐ２Ａ）、ＧＲＮP2A、ＧＲＮ２４（Ｐ２Ａ）；
配列番号７    Ｏｖ−ＧＲＮP4A、Ｏｖ−ＧＲＮ（Ｐ４Ａ）、ＧＲＮP4A、ＧＲＮ２４（Ｐ４Ａ）；
配列番号８    Ｏｖ−ＧＲＮP10A、Ｏｖ−ＧＲＮ（Ｐ１０Ａ）、ＧＲＮP10A、ＧＲＮ（Ｐ１０Ａ）；
【００６１】
配列番号６〜８のアミノ酸配列のそれぞれは、配列番号１の形態であり、ここでは、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの１つがアラニンであり、かつ残りの2Ｘ、3Ｘ、4Ｘがプロリンである。実施例及び表３を参照すると、配列番号６〜８のアミノ酸配列のそれぞれはまた、配列番号５のアミノ酸配列の変異体でもあり、ここで、配列番号５のそれぞれの単一のプロリン残基は、アラニン残基で置換されている。
【００６２】
別の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列、又はそのフラグメント若しくは変異体を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。配列番号９のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドは、Ｏｖ−ＧＲＮ3Ala、Ｏｖ−ＧＲＮ（３Ａｌａ）、又はＧＲＮ3Alaと称され得る。配列番号９のアミノ酸配列は、配列番号１の形態であり、ここでは、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘのそれぞれが、アラニンである。実施例及び表３を参照すると、配列番号９はまた、配列番号５のアミノ酸配列の変異体でもあり、ここで、配列番号５の３個のプロリン残基のそれぞれは、アラニン残基で置換されている。
【００６３】
実施例及び図１２に記載されているように、配列番号６〜８のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドと同じ又はそれよりも大きな速度で細胞増殖を増強した。しかしながら、配列番号９のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドは、細胞増殖を増強しなかった。従って、いくつかの好ましい実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列であって、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの少なくとも１つ、しかし好ましくは３つ未満が、アラニンであるアミノ酸配列を含む。好ましくは、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの１つが、アラニンである。好ましくは、2Ｘ、3Ｘ、4Ｘの少なくとも１つが、プロリンである。
【００６４】
実施例及び図９〜１０を参照すると、配列番号５〜８のアミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号９のアミノ配列を有するペプチドに存在しなかった複数の立体配座を示したことがさらに理解されるであろう。理論に拘束されることなく、これら複数の立体配座は、配列番号９ではなく配列番号５〜８におけるプロリンｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体の形成の結果であると考えられている。これら複数の立体配座は、配列番号５〜８のアミノ酸配列を有するペプチドに存在するが、配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドには存在しない観察された生物学的活性に寄与し得る。
【００６５】
従って、いくつかの好ましい実施形態では、単離されたペプチドは、プロリンｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体を形成することができる。配列番号１０は、Ｎ末端アミノ酸配列ＳＰＳを含む。配列番号１０は、本明細書中で、Ｏｖ−ＧＲＮsps、Ｏｖ−ＧＲＮ（ＳＰＳ）、ＧＲＮsps、又はＧＲＮ２７ｓｐｓと称され得る。
【００６６】
本発明はまた、本明細書中でペプチド「変異体」と称される、配列番号１〜１０のいずれか一つと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドを提供する。
【００６７】
本明細書で使用される、ペプチド「変異体」は、配列番号１〜１０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。本明細書に開示されたペプチド「変異体」は、欠失した又は異なるアミノ酸によって置換された１つ又は複数のアミノ酸を有し得る。いくつかのアミノ酸は、ペプチドの生物学的活性を変化させることなく置換又は欠失され得ることがよく理解されるであろう（保存的置換）。好適には、変異体は、配列番号１〜１０のいずれか一つの単離されたペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を有する。特定の実施形態では、変異体は、２つ又は３つの鎖内ジスルフィド結合を含むか、又はそれらを形成することができる。
【００６８】
それぞれのタンパク質及び核酸の間の配列相関を説明するために本明細書で一般に使用される用語としては、「比較ウインドウ（comparison window）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質的同一性」が挙げられる。それぞれの核酸／タンパク質は、（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ又は複数の部分のみ、並びに（２）核酸／タンパク質間で相違する１つ又は複数の部分、をそれぞれ含み得るので、配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定及び比較するための「比較ウインドウ」にわたって配列を比較することによって行われる。「比較ウインドウ」とは、参照配列と比較される、典型的には６、９又は１２個の連続した残基の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、それぞれの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウを整列するための配列の最適なアラインメントは、コンピューター化されたアルゴリズムの実装によって（IntelligeneticsによるGeneworks program;GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Drive Madison、WI、USA、参照により本明細書に組み込まれる）又は調査によって行うことができ、最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたってもっとも高いパーセンテージの相動性をもたらす）は、選択された種々の方法のいずれかによって生成される。参照はまた、例えばAltschulら、1997、Nucl. Acids Res. 25 3389（参照により本明細書に組み込まれる）によって開示されたプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに対して行うことができる。配列分析の詳細な議論は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubelらのユニット19.3に見出すことができる（John Wiley & Sons Inc NY、1995-2015）。
【００６９】
用語「配列同一性」は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、標準的なアルゴリズムを用いて適切なアラインメントを考慮して、配列が比較のウインドウにわたって同一である程度を考慮して、正確なヌクレオチド又はアミノ酸一致の数を含む。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列で生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、そして結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウインドウズ用のVersion 2.5;Hitachi Software engineering Co., Ltd.、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手可能）によって計算された「一致率」を意味することが理解され得る。
【００７０】
本発明はまた、本明細書に開示された単離されたペプチドのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、フラグメントは、配列番号１〜１０のいずれか一つの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３又は３４個のアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。特定の実施形態では、フラグメントは、２つ又は３つの鎖内ジスルフィド結合を含むか、又はそれらを形成することができる。
【００７１】
好適には、フラグメントは生物学的に活性である。好ましくは、フラグメントは、配列番号１〜１０のいずれか一つの単離されたペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を有する。
【００７２】
本明細書に開示された単離されたペプチドの誘導体も提供される。本明細書で使用される、「誘導体」タンパク質又はペプチドは、例えば、他の化学的部分とのコンジュゲーション又は複合体化によって、当該技術分野で理解されるように、翻訳後修飾（例えばリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化）、化学修飾（例えば架橋、アセチル化、ビオチン化、酸化又は還元など）、標識とのコンジュゲーション（例えばフルオロフォア、酵素、放射性同位体）、及び／又は、付加的なアミノ酸配列を含めることによって、変更されている。
【００７３】
これに関して、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより広範な方法論についてはCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE、Eds. Coliganらのチャプター15（John Wiley & Sons NY 1995~2015）を参照する。
【００７４】
付加的なアミノ酸配列は、融合タンパク質を作製する融合パートナーアミノ酸配列を含み得る。例として、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び／又は精製を助けることができる。非限定的な例としては、金属結合（例えばポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、タンパク質Ａ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ）、エピトープタグ、例えばｍｙｃ、ＦＬＡＧ、及び血球凝集素タグが挙げられる。
【００７５】
本発明の単離されたペプチド、変異体及び／又は誘導体は、化学合成、及び組み換えＤＮＡ技術を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られた任意の方法によって製造することができる。
【００７６】
化学合成は、固相及び液相合成を含む。そのような方法は当該技術分野でよく知られているが、SYNTHETIC VACCINES Ed. Nicholsonnのチャプター9（Blackwell Scientific Publications）及びCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coliganらのチャプター15（John Wiley & Sons, Inc.NY USA 1995~2008）に提供された化学合成の例が参照される。これに関して、国際公開ＷＯ９９／０２５５０及び国際公開ＷＯ９７／４５４４４も参照される。
【００７７】
組み換えタンパク質は、例えば以下のものに記載された標準的なプロトコルを用いて当業者によって便利に調製することができる：Sambrookら、MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press、1989）、特にセクション１６及び１７;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubelら（John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995~2008）、特にチャプター１０及び１６;及びCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coliganら（John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995~2008）、特にチャプター１、５及び６。
【００７８】
本発明の関連した態様は、配列番号１、配列番号５、若しくは配列番号１０に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを、修飾、変更、又は変化させる方法であって、ペプチドのアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を組み込むステップを含む、方法を提供する。
【００７９】
好ましくは、ペプチドの修飾、変更、又は変化は、ペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を増加又は増強する。好ましい実施形態では、生物学的活性は、細胞増殖に対する活性、及び創傷治癒に対する活性から選択される。
【００８０】
本態様に従って修飾されるペプチドが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその変異体である特定の好ましい実施形態では、当該方法は、ペプチドのアミノ酸配列にバリン残基を挿入及び／又は欠失させるステップを含む。図２（Ａ）を参照すると、配列番号２〜５に記載のアミノ酸配列は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対する、配列番号１１のＣｙｓＩ残基とＣｙｓＩＩ残基との間のバリン挿入を特徴とする。さらに、配列番号２〜５に記載のアミノ酸配列は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対する、配列番号１１のＣｙｓＩＩＩ残基とＣｙｓＩＶ残基との間のバリン欠失を特徴とする。図４〜５に記載されているように、配列番号２〜５に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと比較して、細胞増殖及び／又は創傷治癒に関して、増加又は増強された活性を示した。
【００８１】
本態様に従って修飾されるペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又はその変異体である特定の好ましい実施形態では、当該方法は、アラニン残基をシステイン残基に置換するステップを含む。好ましくは、アラニン／システイン置換は、ペプチドのアミノ酸配列において、システインシステインモチーフをもたらす。図２（Ａ）を参照すると、配列番号５に記載のアミノ酸配列は、配列番号１１のアラニンに対するシステイン置換を特徴とする。システイン置換（substation）は、配列番号１１のＣｙｓＩＩＩ残基とＣｙｓＩＶ残基との間に位置し、配列番号５におけるシステインシステインモチーフを形成する。
【００８２】
修飾されるペプチドが、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又はその変異体である特定の好ましい実施形態では、当該方法は、プロリン残基をアラニン残基に置換するステップを含む。表３を参照すると、配列番号６〜８は、配列番号５のプロリンに対するアラニン置換を特徴とする。図１２に記載されているように、配列番号６〜８のそれぞれに記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと比較して、より高い増加率の細胞増殖率を示した。
【００８３】
本発明の別の態様は、先行する態様の方法に従って製造された単離されたペプチドを提供する。好ましくは、当該単離されたペプチドは、増加又は増強された生物学的活性を有する。
【００８４】
本発明はまた、単離された核酸であって、配列番号１〜１０のいずれか一つの単離されたペプチド、又は単離されたペプチドを含む単離されたポリペプチド、又は複数の当該ペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。
【００８５】
用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを指す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ及び自己触媒性ＲＮＡを含む。核酸はまた、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。核酸はヌクレオチド配列を含み、斯かるヌクレオチド配列は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ塩基を含むヌクレオチドを典型的には含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、他の塩基、例えばイノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシン及び／又はチオウリジンを含み得るが、これらに限定されない。
【００８６】
一態様では、単離された核酸は遺伝子コンストラクト中にあり、斯かる遺伝子コンストラクトは、１つ又は複数の他の遺伝的構成要素に操作可能に連結又は接続された単離された核酸を含む。遺伝子コンストラクトは、単離された核酸の治療的送達、又は宿主細胞における組み換えタンパク質産生に適している可能性がある。
【００８７】
広範には、遺伝子コンストラクトは、当該技術分野でよく理解されるように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母、又は細菌の人工染色体の形態であるか、あるいはそれらの遺伝的構成要素を含む。遺伝子コンストラクトは、細菌又は他の宿主細胞における単離された核酸の維持及び伝播、組み換えＤＮＡ技術による操作、及び／又は、本発明の核酸又はコードされたタンパク質の発現に適している可能性がある。
【００８８】
宿主細胞発現の目的のために、遺伝子コンストラクトは、発現コンストラクトである。好適には、発現コンストラクトは、発現ベクターにおいて１つ又は複数の付加的な配列に操作可能に連結された本発明の核酸を含む。「発現ベクター」は、自己複製型染色体外ベクター、例えばプラスミド、又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００８９】
「操作可能に連結された」とは、前記の付加的なヌクレオチド配列（複数）が本発明の核酸に対して配置されて、好ましくは転写を開始、調節するか、又はさもなければ制御することを意味する。
【００９０】
調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適しているであろう。様々なタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列が、様々な宿主細胞について当該技術分野で知られている。
【００９１】
典型的には、前記１つ又は複数の調節ヌクレオチド配列は、これらに限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含み得る。
【００９２】
当該技術分野で知られている構成的、抑制性又は誘導性プロモーターが、本発明によって企図される。
【００９３】
発現コンストラクトはまた、融合パートナー（典型的には発現ベクターによって提供される）をコードする付加的なヌクレオチド配列を含んでもよく、従って、組み換えタンパク質は、本明細書で前述した融合タンパク質として発現される。
【００９４】
発現コンストラクトはまた、選択マーカー、例えばａｍｐR、ｎｅｏR又はｋａｎRをコードする付加的なヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。
【００９５】
創傷又は対象への単離された核酸の送達に関連する特定の実施形態では、発現コンストラクトは、プラスミドＤＮＡの形態であってもよく、斯かるプラスミドＤＮＡは好適には、動物細胞において作動可能なプロモーターを含む（例えばＣＭＶ、αＡ−クリスタリン又はＳＶ４０プロモーター）。他の実施形態では、核酸は、ウイルスコンストラクト、例えばアデノウイルス、ワクシニア、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターの形態であってもよい。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子又は遺伝子コンストラクトで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００９７】
発現に適した宿主細胞は、原核又は真核であってもよい。例えば、好適な宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、哺乳動物細胞（例えばＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ細胞）、酵母細胞（例えば（サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、バキュロウイルス発現系を用いて又は用いずに利用される昆虫細胞（例えばＳｆ９、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni））、植物細胞（例えばコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、フェオダクチラム（Phaeodactylum tricornutum））又は細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）が挙げられる。宿主細胞（原核又は真核のいずれであっても）への遺伝子コンストラクトの導入は、当該技術分野でよく知られており、例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubelら（John Wiley & Sons, Inc.1995~2015）、特にチャプター９及び１６に記載されている。
【００９８】
特定の態様では、本発明は、細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒を促進するための、本明細書に開示された単離されたペプチドの使用、例えば配列番号１〜１０のいずれか一つのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドの使用を提供する。また、細胞増殖、遊走、及び／又は創傷治癒を促進するための、本明細書に開示された単離されたペプチドをコードする核酸、あるいは同核酸を含む遺伝子コンストラクト又はベクターの使用が提供される。
【００９９】
本発明の一態様は、細胞増殖及び／又は遊走を促進する方法であって、１つ又は複数の細胞と、単離されたペプチド又はコード核酸とを接触させ、それによって、１つ又は複数の細胞の増殖及び／又は遊走を開始、刺激又は促進するステップを含む、方法を提供する。
【０１００】
本発明の別の態様は、創傷を治癒する方法であって、創傷と、単離されたペプチド又はコード核酸とを接触させ、それによって、少なくとも部分的に創傷を治癒するステップを含む、方法を提供する。
【０１０１】
したがって、本明細書に開示された単離されたペプチドは、対象における創傷治癒を促進する細胞の増殖及び／又は遊走を促進し得る。これは、代替的に又は付加的に、創傷治癒を促進する創傷への細胞の遊走を促進することを含み得る。そのような細胞は、マクロファージ、好中球、上皮細胞、ケラチノサイト、樹状細胞（例えばランゲルハンス細胞）、血管細胞、線維芽細胞、血小板、リンパ球、及び／又は、これら細胞のいずれかの前駆細胞を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
本明細書で一般的に使用される、「創傷」とは、外皮系、例えば皮膚に対する任意の損傷的な擦過傷又は物理的破損であり、切り傷、病変、潰瘍及び火傷を含み得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明は、擦り傷、切り傷、病変、潰瘍及び火傷を含む創傷の治療を提供する。「治療」とは、疾患、障害又は状態の１つ又は複数の症状若しくは転帰を少なくとも部分的に改善、減少、除去又は抑制する治療的作用過程を意味する。いくつかの実施形態では、治療は、代替的に又は付加的に、疾患、障害又は状態の１つ又は複数の症状又は転帰の再発（recurrence）又は再発（reappearance）が少なくとも部分的に予防される予防（prophylaxis）を含み得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、創傷と単離されたペプチド又はコード核酸とを接触させるステップは、対象への単離されたペプチド又はコード核酸の全身投与、あるいは創傷への単離されたペプチド又はコード核酸の局所投与を含み得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、対象への投与の目的のために、単離されたペプチド、又はコード核酸は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに、単離されたペプチド又はコード核酸を含有する医薬組成物の形態であり得る。
【０１０６】
「担体、希釈剤又は賦形剤」とは、一般に、全身投与に安全に使用することができる固体又は液体の充填剤、希釈剤、溶媒、ビヒクル、又は封入物質（encapsulating substance）を意味する。特定の投与経路に応じて、当該技術分野でよく知られている様々な担体が使用され得る。これら担体は、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、流動促進剤、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水、並びに塩、例えば、塩酸塩、臭化物塩及び硫酸塩を含む鉱酸塩、有機酸、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩及びマロン酸塩、並びに発熱物質除去水（pyrogen-free 水）を含む群から選択することができる。
【０１０７】
担体、希釈剤及び賦形剤を記載する有用な一般的参考文献は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co. N.J. USA、1991）（参照により本明細書に組み込まれる）である。
【０１０８】
任意の好適な手順が、組成物、例えばワクチン組成物を製造するために企図される。例示的な手順としては、例えば、New Generation Vaccines（1997、Levine et al.、Marcel Dekker, Inc. New York、Basel、Hong Kong）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載された手順が挙げられる。
【０１０９】
任意の安全な投与経路が、動物に本発明の組成物を提供するために使用され得る。例えば、局所、経口、直腸、非経口、舌下、頬側、静脈内、鼻腔内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内。及び経皮投与が使用され得る。
【０１１０】
剤形としては、錠剤、分散剤、懸濁剤、軟膏（salves）、軟膏剤（ointments）、クリーム剤、ペースト剤、分散剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、経鼻スプレー剤、坐剤、エアロゾル剤、経皮パッチなどが挙げられる。これら剤形はまた、この目的のために特別に設計された制御放出装置、あるいはこの様式でさらに作用するように改変された他の形態のインプラントを注射又は移植することを含み得る。治療用薬剤の制御放出は、例えば、アクリル樹脂を含む疎水性ポリマー、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、並びに特定のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、当該薬剤をコーティングすることによって達成することができる。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを用いて達成することができる。
【０１１１】
投与に適した組成物は、個別の単位、例えばカプセル剤、カプレット剤、サシェ剤、機能性食品／飼料、又は錠剤として、又は粉末若しくは顆粒として、又は、水性溶体、非水性液体中の溶液又は懸濁液、水中油型エマルジョン若しくは油中水型エマルジョンとして提示され得る。組成物は、剤形に適合する方法で、かつ免疫学的に有効な量で、投与することができる。対象に投与される用量は、適切な期間にわたって対象に有益な応答をもたらすのに十分であるべきである。投与されることになる薬剤（複数）の量は、年齢、性別、体重及びその一般的健康状態を含む治療されることになる対象、施術者の判断に左右されるであろう要因に依存し得る。
【０１１２】
本明細書で一般的に使用されるように、「対象」は、哺乳動物を含む任意の動物、好ましくはヒトであり得る。獣医学的適用は、動物、例えば、これらに限定されるものではないが、魚、家禽、家庭用ペット、競走馬、家畜、及び他の非ヒト対象における創傷治癒に適している可能性がある。
【０１１３】
さらに別のさらなる態様では、本発明は、細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒を促進する薬剤の製造方法であって、細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒を促進する本明細書に開示された単離されたペプチドのアナログ、模倣物（mimetic）又はアゴニストを同定、操作、スクリーニング又は設計するステップを含む、方法を提供する。
【０１１４】
本発明がＯｖ−ＧＲＮ−１のフォールディングについての洞察を提供すること、並びにＮ末端領域が生物活性に寄与することが理解されるであろう。大量にＯｖ−ＧＲＮ−１を製造することの難しさを考慮すると、生物活性を維持又は増加させるタンパク質に由来するペプチドの開発（例えば配列番号１〜１０）は、新規な創傷治癒薬剤の開発のためのリード分子であり得る単離されたペプチドのアナログ、模倣物又はアゴニストを同定、操作、スクリーニング、又は設計することを促進することができる。薬剤は、本明細書に開示された単離されたペプチドの活性を少なくとも部分的に模倣する細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒活性を有するペプチド又は他のタンパク質、有機小分子、単糖、オリゴ糖若しくは多糖、脂質、核酸、あるいはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの有利な実施形態では、薬剤の生物活性は、分子間で比較した場合に単離されたペプチドの生物活性よりも大きい可能性がある。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、所望の又は予想された構造特性若しくは特徴に基づいてデノボ（de novo）で合理的に設計又は操作することができ、斯かる特性若しくは特徴は、薬剤が、本明細書に開示された単離されたペプチドの活性を少なくとも部分的に模倣する細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒活性を有することを示す。他の実施形態では、薬剤は、所望の又は予想された構造特性若しくは特徴に基づいて初期選択無しに分子のライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができ、斯かる特性若しくは特徴は、薬剤が、本明細書に開示された単離されたペプチドの活性を少なくとも部分的に模倣する細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒活性を有することを示す。そのようなライブラリーは、タンパク質、ペプチド、核酸のランダムに生成又は指向されたライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、天然に存在する分子のライブラリー、及び／又は合成有機分子のコンビナトリアルライブラリー（combinatorial libraries）を含み得る。
【０１１６】
候補モジュレーターの設計及び／又はスクリーニングに適用可能な技術の非限定的な例は、当該技術分野でよく知られているように、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、構造データベースのコンピューター支援スクリーニング、コンピューター支援モデリング、あるいは、分子フォールディング及び／又は結合相互作用を検出、モデル化又は予測する生化学若しくは生物物理学的技術を用いることができる。
【０１１７】
分子相互作用を同定する生物物理学的及び生化学的技術は、競合放射性リガンド結合アッセイ、免疫共沈降、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）結合アッセイを含む蛍光ベースのアッセイ、電気生理学、分析超遠心分離、ラベルトランスファー（label transfer）、化学架橋、質量分析、微量熱量測定、表面プラズモン共鳴、及び光学バイオセンサーに基づく方法を含み、これは、例えばCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coliganら（John Wiley & Sons、1997~2015）のチャプター２０に提供されている。生化学的技法、例えばツーハイブリッド（two-hybrid）及びファージディスプレイスクリーニング法は、CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coliganら（John Wiley & Sons、1997~2015）のチャプター１９に提供される。
【０１１８】
本明細書に開示されたように同定、操作、スクリーニング又は設計された薬剤は、前述のように細胞増殖、遊走及び／又は創傷治癒を促進する方法に適している可能性があることが理解されるであろう。
【０１１９】
また、本明細書に開示された単離されたペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントも提供される。「特異的に結合する」とは、抗体又は抗体フラグメントが、別のタンパク質、例えば野生型グラニュリンタンパク質よりも実質的に高い親和性で、単離されたペプチドに結合することを意味する。抗体は、当該技術分野でよく知られているように、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。抗体フラグメントは、単鎖フラグメント、例えばｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂ及びＦａｂ’２フラグメント、ダイアボディ及びトリアボディを含むが、これらに限定されるものではない。ポリクローナル抗体は、単離されたペプチドによる免疫化、続く血清抗体精製によって産生され得る。モノクローナル抗体は、単離されたペプチドによる免疫化、続く脾臓細胞融合及び抗体精製によって産生することができ、あるいは組み換えＤＮＡ技術によって産生することができる。組み換え抗体又は抗体フラグメントは、所望の抗原結合アミノ酸配列（例えばＣＤＲ配列）を含むように操作され、及び／又は、抗体の異種部分に対する望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を低減して、特定の対象への投与を促進するように修飾され得る（例えばヒト化）。
【０１２０】
本発明が完全に理解され、実用的な効果がもたらされるように、以下の非限定的な例を参照する。
【実施例】
【０１２１】
実施例
実施例１．グラニュリン足場に基づく強力な創傷治癒剤の開発
材料及び方法
ペプチド合成及び精製
切断されたグラニュリンペプチドを、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を用いた手動の固相ペプチド合成を用いて合成した。ペプチドを、２−クロロトリチルクロリド樹脂（Auspep、オーストラリア）上に集めた。アミノ酸を、ペプチドグレードのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Auspep、オーストラリア）中の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ - Iris Germany）を用いて活性化した。ペプチドを、９５％ＴＦＡ／２．５％ＴＩＰＳ／２．５％Ｈ2Ｏの混合物を用いて切断した。ＴＦＡを、窒素と共に蒸発させることによって除去し、氷冷ジエチルエーテルを残渣に添加した。エーテルを濾過により除去し、ペプチドを、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する４０％アセトニトリル／水混合物中に溶解し、その後凍結乾燥した。得られた粗ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてＣ−１８分取カラム（Phenomenex Jupiter 10μm C18 300Å 250x21.2 mm）上で精製した。１％／分の０％〜８０％溶媒Ｂ（Ｈ2Ｏ中、０．０４５％ＴＦＡ中の９０％アセトニトリル）及び溶媒Ａ（Ｈ2Ｏ中の水性０．０４５％ＴＦＡ）の勾配を使用し、溶出液を２１５及び２８０ｎｍでモニターした。５ｍＭの還元グルタチオンを含有する１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．２）中のペプチド溶液を攪拌することによってペプチドを酸化し、室温で一晩放置し、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてＣ−１８分取カラム（Phenomenex Jupiter 10μm C18 300Å 250x21.2 mm）上で精製した。
【０１２２】
切断されたペプチドのジスルフィド結合性を確認するために、Ｏｖ−ＧＲＮ12-34を、システイン残基の選択的保護により合成した。Ｃｙｓ１及びＣｙｓ１４は、ＡＣＭ基で側鎖保護され、Ｃｙｓ８及びＣｙｓ２３は、（Ｔｒｔ）保護基で保護された。粗ペプチドの切断及び精製に続いて、Ｃｙｓ８とＣｙｓ２３との間のジスルフィド結合を１００ｍＭの重炭酸アンモニウム中で形成し、ペプチドを上述の手順を用いて精製した。その後、０．５ｍＬのＴＦＡ、１０μＬのアニソール及び２５ｍｇのトリフルオロメタンスルホン酸銀中の２ｍｇのペプチドを４℃で１．５時間攪拌することによって、Ｓ−ＡＣＭ基を除去した。冷エーテル（１０ｍＬ）を混合物に添加し、沈殿物を遠心分離によって回収した。沈殿物をエーテルで２回洗浄し、さらに精製することなく、０．５ＭのＨＣｌ中の５０％ＤＭＳＯの溶液を用いて一晩酸化させた。溶液を水で１５倍希釈し、完全に折り畳まれたペプチドを、１％ＡＣＮ勾配を用いてＨＰＬＣによってＣ−１８分取カラム（Phenomenex Jupiter 10μm C18 300Å 250x21.2 mm）上で精製した。
【０１２３】
大腸菌における組み換えタンパク質発現の自動誘導
ｐＥＴ３２ａ（Novagen）プラスミド内に含まれるＯｖ−ｇｒｎ−１  ｐＥＴ４１ａ又は大腸菌（Escherichia coli）チオレドキシン（ｔｒｘ）ｃＤＮＡｓを、ＢＬ２１大腸菌細胞（Life Technologies）にトランスフェクトし、記載されたように自己誘導を有する組み換えタンパク質を生成するために使用した［４、２２］。簡潔には、ＺＹＭ−５０５２培地に、１００μＭのＦｅ（ＩＩＩ）Ｃｌ3及び１００μｇ／Ｌのカナマイシンを補充して、組み換えタンパク質（ｒＯｖ−ＧＲＮ−１）を産生するか、又は５０μｇ／Ｌのアンピシリンを補充してＴＲＸを産生した。１リットルのバッフル付き三角フラスコ中の２００ｍｌの接種培地を、３７℃、３００ｒｐｍの回転で一晩インキュベートして、自己誘導で発現を誘導した。
【０１２４】
組み換えタンパク質精製
ｒＯｖ−ＧＲＮ−１の精製を、ＡＫＴＡ１０精製システムを用いて４℃で行った（GE Healthcare）［２３］。ＢＬ２１大腸菌ペレットを３回の凍結／融解サイクルで溶解し、続いてＱ４０００ユニット（Qsonix）を用いて氷上で超音波処理した。得られた不溶性ペレットの２０ｇを、４００ｍｌの尿素含有ニッケル結合緩衝液（８Ｍの尿素／３００ｍＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのイミダゾール／５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８［Sigma］）中で４℃で２４時間ゆっくりと攪拌しながら可溶化した。０．２２μＭの濾過上清を、２×５ｍｌのHistrap IMACニッケルカラム（GE Healthcare）上を通過させ、増加するイミダゾール濃度（５０ｍＭで２カラム容量［ＣＶ］／１００ｍＭで５ＣＶ）で洗浄し、結合緩衝液中の５００ｍＭのイミダゾールで溶出させた。対照ＴＲＸタンパク質を、同じ様式であるが、ネイティブ条件（カオトロピック剤を含まない）下で発現し、Histrap IMAC Nickelカラムで精製した［２３］。
【０１２５】
タンパク質のリフォールディング及び精製
尿素変性ｒＯｖ−ＧＲＮ−１のリフォールディングを、記載されたようにＸＫ１６／２０カラム（ＧＥ）上の２８ｍＬのG10 Sephadex（ＧＥ）樹脂を用いて行った［２３］。１２０ｍｌのSuperdex 30 XK16/60カラム（ＧＥ）を使用して、３ｍｌのリフォールドｒＯｖ−ＧＲＮ−１を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６中に、１ｍｌ／分の流速で分画した。〜１ｋＤａと同程度のサイズで溶出するｒＯｖ−ＧＲＮ−１モノマーを含む画分（１０．４ｋＤａの変性した分子サイズに関わらずグラニュリンタンパク質のフォールドに基づいて）をプールした。マイクロプレートBradfordアッセイ（Biorad）と２８０ｎｍでの吸光度との組み合わせによって、タンパク質濃度を決定した。
【０１２６】
ＮＭＲ分光法及び構造決定
精製したペプチドを、９０％Ｈ2Ｏ／１０％Ｄ2Ｏ中に溶解して、〜０．２ｍＭのストックを得た。２Ｄ  1Ｈ−1Ｈ  ＴＯＣＳＹ、1Ｈ−1Ｈ  ＮＯＥＳＹ、1Ｈ−1Ｈ  ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣ、及び1Ｈ−13Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを、極低温冷却プローブを備えた600 MHz AVANCE III NMR分光計（Bruker、カールスルーエ、ドイツ）を用いて２９０Ｋで得た。スペクトルを、１秒の走査間遅延（interscan delay）で記録した。ＮＯＥＳＹスペクトルを２００ｍｓの混合時間で得て、ＴＯＣＳＹスペクトルを８０ｍｓの等方性混合期間で得た。Wuthrichらによって記載されたアプローチ［２５］に基づいてＣＣＰＮＭＲ［２４］を用いて、全てのスペクトルを割り当てた。実験のαＨ化学シフトからWishartら［２６］のランダムコイル1Ｈ  ＮＭＲ化学シフトを差し引くことによって、αＨ二次シフトを決定した。
【０１２７】
Ｏｖ−ＧＲＮ12-34及びＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sの三次元構造を決定した。２Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルを自動的に割り当て、構造のアンサンブルをプログラムＣＹＡＮＡ［２７］を用いて計算した。ＴＡＬＯＳ＋を用いて予測されたねじれ角拘束（Torsion-angle restraints）を構造計算に使用した。ジスルフィド結合結合性（Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ１４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ２３）は、Ｏｖ−ＧＲＮ12-34についての計算に含まれた。それは、これらの結合がシステイン残基の選択的保護によって確認されたためである。システイン残基の選択的保護は、最もエネルギー的に好ましい形態を単離する試みにおいて、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sには使用されなかった。結果として、構造は、１５の可能なジスルフィド結合性で計算された。ＣＹＡＮＡ標的関数（target functions）の分析を、最も可能性のある結合性を決定するために行った。構造をＭＯＬＭＯＬ［２８］を用いて可視化した。
【０１２８】
哺乳動物細胞培養
非悪性胆管細胞株Ｈ６９は、Dr. Gregory J. Gores（Mayo Clinic、ロチェスター、ミネソタ）により提供された、ヒト肝臓に由来するＳＶ４０形質転換ヒト胆管上皮細胞株である。Ｈ６９細胞［２３、２９、３０］は、軽微な変更を加えて、記載されたように単層としてＴ７５ｃｍ2のベントフラスコ（vented flasks）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に維持された［３１］。細胞は、増殖因子補充専門完全培地［３０］［ＤＭＥＭ／Ｆ１２であって、以下のものを含む：高グルコース、１０％ＦＣＳ、１×抗生物質／抗真菌剤、２５μｇ／ｍｌのアデニン、５μｇ／ｍｌのインスリン、１μｇ／ｍｌのエピネフリン、８．３μｇ／ｍｌのホロトランスフェリン、０．６２μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１３．６ｎｇ／ｍｌのＴ３、及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ-Life Technologies］を含む完全培地［ＲＰＭＩ（Sigma）］中で２〜５日毎に０．２５％のトリプシン（Life Technologies）を用いて定期的に分割しながら維持した。細胞増殖アッセイのための低栄養培地は、５％完全培地、すなわち０．５％ＦＣＳ及び完全培地について上記に記載された１／２０番目の増殖因子濃度であった。細胞株の同一性（ヒト由来）は、２０１５年１月におけるシングルタンデムリピート（single tandem repeat）（ＳＴＲ）分析で確認され（２つの対立遺伝子にわたって１５／１５のポジティブ遺伝子座）、ＡＣＬＡＳＳを通してＣＡＰ、ＩＳＯ／ＩＥＣ  １７０２５：２００５によって認定／認証されたDNA Diagnostics Centre（ＤＤＣ）-medical（Ｕ．Ｓ．Ａ．）でマイコプラズマフリーで確認された。
【０１２９】
xCELLigenceを用いたリアルタイムでの細胞増殖モニタリング
細胞を、Ｅ−プレート（ACEA Biosciences）中の１８０μｌの完全培地（上記）に１，５００細胞／ウェルで播種し、xCELLigence SPシステム（ACEA Biosciences）でモニターしながら一晩増殖させた。斯かるxCELLigence SPシステムは、組織培養プレートの基部に組み込まれた嵌合した金微小電極にわたって電気的インピーダンスを測定することによってリアルタイムで細胞事象をモニターする［３２］。１８０μｌの低栄養培地（上記）を添加する前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらなる処理の前に最低６時間インキュベートした。処理物を１０×濃度で調製し、２０μｌの総容量で各ウェルに添加した。xCELLigenceシステムは、処理後５〜６日間１時間の間隔でセルインデックス（cell indexes）を記録した。セルインデックスの読み取りを処理前に正規化し、細胞増殖率を生物学的四重測定から決定し、４日目に対照細胞と比較した細胞の相対数を表す。処理に応答した細胞増殖の誘導の比較は、GraphPad Prism 6.02を使用してダネットの多重比較補正で二元配置分散分析試験を用いて行った。
【０１３０】
マウス創傷アッセイ
これらの研究は、記載されたように、James Cook University Small Animal Ethics Committee、申請Ａ１８０６及びＡ２２０４の承認を得て行われた［６］。簡潔には、１群当たり４〜５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを麻酔し（腹腔内キシラジン１６ｍｇ／ｋｇ；ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ）、その後、５ｍＭの生検パンチ（Zivic instruments）を用いて頭頂部に皮膚深部創傷を負わせた。ベタジン液体消毒剤（Sanofi）を塗布し、１．５％のメチルセルロース（Sigma）で懸濁した７１ｐｍｏｌのRegranex（製造業者Smith and Nephewによって推奨されるように、７１ｐｍｏｌの処置は０．２５ｃｍ2の創傷当たり１μｇに等しい）、５６ｐｍｏｌのｒＯｖ−ＧＲＮ−１、Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド、対照ペプチド（ＥＡＤＲＫＹＤＥＶＡＲＫＬＡＭＶＥＡＤＬ）、ＴＲＸ又はＰＢＳのいずれかを含んだ５０μｌの塗布に続いた。創傷を毎日写真撮影し、処置群を盲検化した後、病変の面積をImageJソフトウェアで測定し、元の創傷画像から創傷閉鎖のパーセントとしてプロットした。創傷率の割合を、GraphPad prism 6.02を使用して多重比較のためのダネット補正を用いた二元配置分散分析試験で比較した。各マウス創傷研究を、再現性を得るために少なくとも２回行った。
【０１３１】
結果
切断されたＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドの設計及び合成
Ｏｖ−ＧＲＮ−１のＮ末端領域が独立してフォールディングできるかを決定するために、いくつかの切断されたペプチドを、ＦＭＯＣ化学を用いて設計及び合成した。合成ペプチドの配列を図２Ａに示す。
【０１３２】
Ｏｖ−ＧＲＮ1-35、Ｏｖ−ＧＲＮ8-38及びＯｖ−ＧＲＮ12-34は全て、全長タンパク質内にＣｙｓＩ、ＣｙｓＩＩ、ＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＶに相当する４個のシステイン残基を含む（残りの報告に関して、ローマ数字は全長タンパク質に存在する番号付けを指す）。コイグラニュリン−１の三次元構造に基づいて、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩは、それぞれＣｙｓＶＩＩ及びＣｙｓＩＸとジスルフィド結合を形成することが予想された［７］。切断されたアナログにおいて、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩは、これら残基間でのジスルフィド結合形成を防ぐために、アラニン残基で置換された。システイン残基の選択的保護を使用して、フォールディングを指向し、予測されるジスルフィド結合性を形成した（すなわちＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＩＩ−ＣｙｓＶ）。
【０１３３】
Ｏｖ−ＧＲＮ−１は、グラニュリンの大半には存在しない伸長されたＮ末端テール（最初のシステイン残基の前の１１残基）を含み、これら残基は、それらが生物活性における役割を果たすかを決定するために、Ｏｖ−ＧＲＮ1-35に含まれた。Ｏｖ−ＧＲＮ8-38においてＮ末端は切断され、Ｃ末端は伸長されて、コイグラニュリン−１切断型ペプチドと類似した数の残基を有するアナログを提供した。Ｏｖ−ＧＲＮ12-34は、４個のシステイン残基（ＣｙｓＩ、ＣｙｓＩＩ、ＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＶ）を含む最小配列であり、Ｎ−及びＣ末端領域がフォールディング及び活性に必要とされるかを決定するために設計された。
【０１３４】
追加のペプチドは、切断されたＮ末端を有するが、Ｏｖ−ＧＲＮ−１の最初の６個のシステインを含む合成された（Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s）であった（「３ｓ」は、ペプチド中の３つのジスルフィド結合の存在を示す）。このペプチドは、システイン残基に関して哺乳動物のパラグラニュリン（上記）に類似している。それはシステイン残基の選択的保護無しに合成され、主要な立体配座はその構造及び活性の分析のために精製された。
【０１３５】
ＮＭＲ分光法による構造分析
ＮＭＲ分光法を用いて、ペプチドの構造を分析した。Ｏｖ−ＧＲＮ1-35、Ｏｖ−ＧＲＮ8-38及びＯｖ−ＧＲＮ12-34の一次元スペクトルは、２つの天然ジスルフィド結合の形成にも関わらずβ−シート構造の欠如と一致してアミド領域における限られた分散を有する。二次元スペクトル（ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ）を使用して、共鳴を割り当て、αＨシフトからランダムコイルシフト［１６］を差し引くことによって二次シフトを決定した。二次シフトは、図２Ｂに示すように、これら３つのペプチドについての等価な残基にわたって類似であり、構造が類似であったこと、結果として、これらペプチドのＮ−及びＣ−末端における違いが全体の折り畳みに影響を及ぼさなかったことを示している。さらに、二次シフトは主に負であり、かつβ−シート構造は正の二次シフトによって特徴づけられるので、二次シフトはβ−シート構造の欠如と一致していた。Ｏｖ−ＧＲＮ12-34の三次元構造は、図３Ａに示すように、ＮＭＲ分光法を用いて決定した。特徴的なグラニュリンフォールドとは対照的に、構造は、ターン及び３10ヘリックスの領域を含んでいた。構造統計は、補足表２に示されている。
【０１３６】
２つのジスルフィド結合を含むＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドとは対照的に、３つのジスルフィド結合を有するＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sは、一次元ＮＭＲスペクトルにおけるアミド領域により多くの分散を有する。さらに、おそらくプロリン残基の異性化に起因して、付加的なピークがスペクトルに存在した。これら付加的なピークにも関わらず、主要な立体配座は完全に割り当てられ、二次シフトは切断型コイグラニュリン−１［１４］と類似であった（図３Ｂ）。このことは、全体的な構造の類似性を示している。残基１〜３０を含む切断型コイグラニュリン−１は、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩをセリン残基で置換して以前に合成され、β−シート構造を形成することが示された［１４］。ここでは、本発明者らは、Ｏｖ−ＧＲＮ−１の切断されたペプチドと一致するように、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩをアラニン残基で置換してコイグラニュリン1-30を合成した。セリン置換を有するコイグラニュリン−１の公開された［１４］化学シフトとアラニン置換を有するペプチドとの間でわずかな変動のみが明らかであり（図６）、全体のフォールドが依然として維持されていることを示す。
【０１３７】
Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sの構造がコイグラニュリン1-30と類似しているかどうかを確認するために、三次元構造をＣＹＡＮＡを用いて計算した。構造を最初にジスルフィド結合拘束なしに計算した。これら構造において、β−ヘアピンは残基１４〜２３から存在したが、残基１〜８は定義されていなかった。残基１〜８についての定義の欠如は、最も可能性のある結合性への洞察を提供する硫黄−硫黄距離の分析を妨げた。それゆえ、代替アプローチが使用され、これによって構造は、１５の可能なジスルフィド結合結合性で計算された。このアプローチは、ジスルフィド結合結合性を分析するためにジスルフィドリッチペプチド、例えばシクロチドに以前に使用されてきた［１７、１８］。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sに対する１５の結合性についてのＣＹＡＮＡ標的関数を表１に示す。最も低いＣＹＡＮＡ標的関数を有する結合性は、ＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ、ＣｙｓＩＩ−ＣｙｓＶ及びＣｙｓＩＶ−ＣｙｓＶＩであった。この結合性を有するＯｖ−ＧＲＮ12-35_３ｓの三次元構造は図３Ａに示され、構造統計は補足表Ｓ１に提供される。分子の最もよく定義された領域は、残基１４〜２３間のβ−ヘアピンであった。ＣｙｓＩ及びＣｙｓＩＩを包含するＮ末端領域は、顕著な構造的障害を示した。
【０１３８】
細胞増殖
リアルタイムでのＨ６９胆管細胞の増殖に対するＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドの影響を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価し、用量応答曲線をペプチドについて決定した。２μＭの最終濃度でのＯｖ−ＧＲＮ12-35_3sは、対照ペプチドと比較して細胞増殖の４１％の増加をもたらした（ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）。Ｏｖ−ＧＲＮ−１について得られたものと同様の用量応答曲線が、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s処置で観察され、これは≧１５ｎＭの最終濃度で有意に増加した細胞増殖を特徴とする（ｐ＜０．０５）。Ｏｖ−ＧＲＮ12-34に代表される用量応答曲線で、２つのジスルフィド結合Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチドは、ナノモル濃度ではそれほど強力でなかったが、２μＭでは有意な細胞増殖を促進した（１４〜２５％の上記ペプチド対照；ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。
【０１３９】
これは、全ての試験濃度で最小細胞増殖（有意でない）、並びに３２ｎＭでのペプチド対照に対して９％の最大増殖を誘導したコイグラニュリン1-30と対照的である。全Ｏｖ−ＧＲＮペプチドの４００ｎＭでの応答は（図４Ｂ）、２つのジスルフィド結合ペプチドと比較して３つのジスルフィド結合ペプチド（Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s）の増強された効力を強調している。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sは、その最も強力なものがＯｖ−ＧＲＮ1-35（ペプチド対照に対して９％の有意でない増加）であった最小増殖を誘導した残りのペプチドと比較して、細胞増殖における非常に有意な（ｐ＜０．０００１）増加を促進した（ペプチド対照に対して２６％）。
【０１４０】
マウス創傷治癒モデル
メチルセルロースを配合した切断型Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチドを、創傷治癒のマウスモデルで試験した。全てのＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドは、メチルセルロース中の対照ペプチドと比較して、局所適用された場合に、強力な活性を示した（図５Ａ、Ｂ）。Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド、Ｏｖ−ＧＲＮ−１タンパク質及びRegranexは、２〜４日目にペプチド対照と比較して有意に治癒を改善した（ｐ＜０．０５）。創傷が閉鎖すると、処置間の差異及び有意差は４日目を超えて明白ではなかった。Regranex及び様々なグラニュリンペプチドはほぼ同一の最適曲線を示し、インタクトなＯｖ−ＧＲＮ−１はここで、３日目及び４日目にRegranexを超える有意な改善を提供した唯一の試験化合物であった（ｐ＜０．０５；図５Ｂ）。メチルセルロースを配合した様々な陰性対照群（ＰＢＳビヒクル対照、ペプチド対照、及びチオレドキシン（ＴＲＸ）組み換えタンパク質対照を含む）の間で、有意差は観察されなかった。
【０１４１】
４日目の治癒を、各生物学的反復からＰＢＳビヒクルに対して評価した場合、Ｏｖ−ＧＲＮ−１タンパク質及びペプチドによる創傷の処置は、対照と比較して創傷治癒を有意に加速させた（ｐ＜０．０１、４日目：ＰＢＳに対して２６〜４１％）。Ｏｖ−ＧＲＮ−１タンパク質、Ｏｖ−ＧＲＮ1-35及びＯｖ−ＧＲＮ12-34（ＰＢＳに対して３７〜４１％）は、Regranex（ＰＢＳに対して２９％）と比較して改善された治癒を提供したが、これら比較のいずれも４日目の時点で有意に達しなかった。
【０１４２】
議論
グラニュリンの構造／活性相関を解明することは、このタンパク質ファミリーにおける配列及び構造の多様性を考慮すると困難であった。生物活性を有する領域はあまり理解されておらず、この増殖因子のための潜在的な受容体については不確実性が残っている［１９、２０］。
【０１４３】
Ｏｖ−ＧＲＮ−１は、他のグラニュリンと比較して異なるフォールディング経路を有すると思われる。２つの天然ジスルフィド結合（ＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＩＩ−Ｖ）を含むＯｖ−ＧＲＮ−１のＮ末端領域は、コイグラニュリン−１及びヒトグラニュリンＡとは対照的に、天然様β−ヘアピン構造へと独立してフォールドしない。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sにおける第三の非天然ジスルフィド結合の導入が、コイグラニュリン−１及びヒトグラニュリンＡペプチドに存在するものと同様のβ−ヘアピン構造をもたらすことは、注目に値する［１４、１５］。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sのジスルフィド結合結合性は、２つの天然ジスルフィド結合（ＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＩＩ−Ｖ）を、ＣｙｓＩＶ−ＣｙｓＶＩジスルフィド結合に加えて、含むと思われる。結合対が種を超えて保存されている場合［７、９］、ＣｙｓＩＶはＣｙｓＶＩＩに、そしてＣｙｓＶＩはＣｙｓＩＸに結合することが予測されるので、後者の結合は全長Ｏｖ−ＧＲＮ−１に存在しないと予測される。
【０１４４】
哺乳動物プログラニュリンのパラグラニュリン（半グラニュリン）ドメインは、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sに存在する等価な６個のシステイン残基を含み、生物学的に活性であって［２１］、このことは、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sが同じジスルフィド結合性を潜在的に含むことを示唆している。コイグラニュリン1-30ペプチドは、このＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ、ＣｙｓＩＩ−ＣｙｓＶ、ＣｙｓＩＶ−ＣｙｓＶＩ結合性に適応し得る［１４］。コイグラニュリン1-30ペプチドは、２つの天然ジスルフィド結合（ＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＩＩ−ＣｙｓＶ）のみを含むが、構造の分析は、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶＩを置換するセリン残基の側鎖が近接していることを示し、これらシステイン残基がジスルフィド結合を形成することが実現可能であることを示唆している。
【０１４５】
Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sにおけるジスルフィド結合性は、全長Ｏｖ−ＧＲＮ−１の構造に影響を及ぼし、斯かる構造は、十分な量の正確に折り畳まれた組み換え材料が利用可能でないままであるので、実験的に決定されていない。それゆえ、天然タンパク質のジスルフィド結合性は、コイグラニュリン−１についてもともと示された結合性に適合することが示されなかった［７］。タンパク質は、最初の６個のシステイン残基を含むジスルフィドドメイン（Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sに見られるものと等価）、並びに最後の６個のシステイン残基を含む第２のドメインを含むと考えられる。全長タンパク質の構造、及び寄生虫によって分泌される天然タンパク質との比較は無く、これは推論のままである。しかしながら、これまでの報告は、グラニュリンのジスルフィド結合性における曖昧さを明らかにした［９、１５］。ヒトグラニュリンＡ及びＦの構造は、明確に定義されたＮ末端領域を有するが、不規則なＣ末端領域は、全てのジスルフィド結合の特徴付けを妨げた。さらに、ヒトグラニュリンＡのジスルフィド結合性の化学分析は、決定的ではなかった［９］。
【０１４６】
Ｏｖ−ＧＲＮ−１のフォールディングへの洞察を提供することに加えて、現在の研究は、Ｎ末端領域が生物活性に寄与し、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sのβ−ヘアピンがさらに細胞増殖活性を増強することを明らかにした。しかしながら、β−ヘアピン構造は、増殖活性に関して完全なストーリーとは程遠く、それは、コイグラニュリン1-30ペプチドが二重のβ−ヘアピンを含み、そして、Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチドとは対照的に、試験した８つの濃度（１０ｎＭ〜２μＭ）で実質的な増殖を示さなかったためである。Ｏｖ−ＧＲＮ−１とコイグラニュリン−１の配列との比較は、ＣｙｓＩとＣｙｓＶＩとの間に２個の保存された非システイン残基のみが存在することを明らかにする。このループ配列における保存の欠如は、フォールディング及び生物活性の両方における違いを説明する可能性が高い。
【０１４７】
天然構造の欠如にも関わらず、Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチドを含む２つのジスルフィド結合は、高濃度（＞８００ｎＭ）で細胞増殖を促進し、マウスにおける皮膚創傷の有意な治癒を刺激した。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sは、細胞増殖アッセイにおいて最も強力なペプチドであったが、他のＯｖ−ＧＲＮ−１ペプチドと同様にインビボで活性がなかった。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sのβ−ヘアピンがインビボでの創傷治癒に関与している場合、本発明者らはマウスにおける違いを観察しなかった。細胞増殖活性は細胞株特異的である可能性があり、あるいはマウス創傷修復において試験された濃度は最適ではなかった。いずれの場合にも、マウスで観察された活性は、インビトロ分析からの知見よりも優れた生物学的及び治療的結果であり得る。将来的に、本発明者らは、Ｏｖ−ＧＲＮ−１の構造−活性相関の役割の我々の理解を深めるために、多様な器官及び組織からの幅広い細胞の探索、並びに創傷治癒における欠点を示すマウスの調査を構想している。
【０１４８】
結論として、ＮＭＲ分光法による構造分析は、Ｏｖ−ＧＲＮ−１が、おそらく一次配列に起因する、他のグラニュリンと比較して独特のフォールディング特性を示すことを示唆した。本発明らは、全長組み換えタンパク質よりも免疫原性が低く、かつ容易に産生される可能性が高いＯｖ−ＧＲＮ−１の生物活性領域を同定した。生物活性を維持する肝吸虫グラニュリンのペプチド及び誘導体は、創傷治療のための新規療法の同定に向けた重要な進歩を表す。
【０１４９】
概要
Ｏｖ−ＧＲＮ−１の生物活性領域（複数）の分析中に、４つの切断されたアナログのセットを合成し、ＮＭＲ分光法を用いて構造的に特徴づけた。２つ又は３つのジスルフィド結合のいずれかを含むＯｖ−ＧＲＮ−１のＮ末端領域に由来するペプチドは、ヒト胆管細胞株の増殖を促進し、マウスにおける強力な創傷治癒を示した。２つの天然ジスルフィド結合のみを含むＯｖ−ＧＲＮ−１からのペプチドは、グラニュリンに特徴的なβ−ヘアピン構造を欠いている。注目すべきことに、非天然ジスルフィド結合の導入は、β−ヘアピン構造の形成に重要であった。Ｏｖ−ＧＲＮ−１に由来するペプチドは、全長タンパク質よりも免疫原性が低く、かつ産生するのにより便利である可能性があるので、新規な創傷治癒薬の優れたリードである。
【０１５０】
実施例２．肝吸虫由来グラニュリンのフォールディングへの洞察
導入
グラニュリンは、細胞増殖への影響を含む多様な生物学的機能を有する大きなファミリーのジスルフィドリッチタンパク質である［３３］。グラニュリンドメイン間には限られた配列保存性があるが、全て、保存されたフレームワークを有する１２個のシステイン残基を含む［３４］。構造に関して最もよく研究されているグラニュリンは、コイグラニュリン−１であり、これは、６つのジスルフィド結合と一緒に留められた（stapled）β−ヘアピンの積み重ねを示す（図７−Ａ）［３５］。保存されたシステインフレームワークにも関わらず、構造／機能相関は複雑であり、いくつかのグラニュリンドメインは、細胞増殖活性を示し、いくつかは細胞増殖に阻害活性を有する［３６、３７］。
【０１５１】
タイ肝吸虫から単離された肝吸虫グラニュリンであるＯｖ−ＧＲＮ−１は、インビボで強力な創傷治癒活性を示すが［３４］、組み換え発現における低収量がその治療薬としての開発を制限している。構造／機能相関を解明することはまた、研究のための有意な量を産生することの困難性によって影響を受けた。しかしながら、本発明者らは、Ｏｖ−ＧＲＮ−１の切断されたアナログが、正常な組織修復機構が圧倒される慢性創傷、例えば糖尿病性潰瘍の治療における可能性を有する機能的模倣物［３４］を表すことを示した［３８〜４１］。
【０１５２】
本発明者らのＯｖ−ＧＲＮ−１の切断型アナログは、フォールディング及び生物活性領域への洞察を提供し始めたが、二次構造形成及び構造安定性についての重要な特徴に関して疑問が残されている。例えば、Ｏｖ−ＧＲＮ−１における残基１２〜３５に対応するペプチド（Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s）は、コイグラニュリン−１の切断形態とは対照的に１つのβ−ヘアピンのみを含む［３４］。興味深いことに、このペプチドは、予測された結合性に基づいて非天然ジスルフィド結合を含み、二次構造の安定化におけるこの結合の役割は完全に理解されていない（図７−Ｂ）。Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sはまた、ＮＭＲスペクトルにおける付加的な立体配座の証拠を示す。これら付加的な立体配座は、プロリンｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化の結果であると思われるが、どのプロリン残基が関与しているかを決定するためにさらなる研究が必要とされている。現在の研究において、本発明者らは、構造、フォールディング及び活性におけるプロリン残基の役割を決定するために、突然変異研究を用いた。最も構造的に安定かつ強力なアナログを決定することは、新規な創傷治癒剤としてのＯｖ−ＧＲＮ−１由来ペプチドの開発を促進すると思われる。
【０１５３】
材料及び方法
ペプチド合成、精製及び特徴付け
グラニュリンアナログを、タンパク質Technologies PS3合成機で段階的固相ペプチド合成手順によって合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（Auspep、オーストラリア）を、ＨＣＴＵ（Iris、ドイツ）を用いて活性化し、ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦを用いて２−クロロトリチルクロリド樹脂状にカップリングした。ペプチドを、以下の切断カクテルを用いて樹脂から切断した：９５％ＴＦＡ：２．５％ＴＩＰＳ：２．５％ｄＨ2Ｏ。次のステップで、ペプチドを、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、５０％アセトニトリル：５０％ｄＨ2Ｏ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中に溶解し、その後、凍結乾燥した。得られた白色粉末を、Ｃ−１８分取カラム（Phenomenex Jupiter 250x21.2 mm）、及び０．０５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含有するアセトニトリル−水混合物による１％勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣによって精製した。溶出を２１４及び２８０ｎｍでモニターし、質量をMALDI TOF/TOF分光計を用いて決定した。
【０１５４】
ジスルフィド形成
室温で２４時間、５ｍＭの還元グルタチオンを含有する０．１Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８〜８．２）中で０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドを一晩空気酸化することによって、ジスルフィド結合を形成した；溶液を酸性化、濾過し、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてＣ−１８分取カラム上で精製し、ペプチド質量を5800 MALDI TOF/TOF分光計を用いて分析した。
【０１５５】
ＮＭＲ分光法及び構造分析
試料を、９０％Ｈ2Ｏ：１０％Ｄ2Ｏ中に約０．２ｍＭの濃度で凍結乾燥ペプチドから調製した。全てのＮＭＲスペクトルを600 MHz AVANCE III NMR分光計（Bruker、カールスルーエ、ドイツ）で記録した。２９０Ｋでの２Ｄ  1Ｈ−1Ｈ  ＴＯＣＳＹ、1Ｈ−1Ｈ  ＮＯＥＳＹ、1Ｈ−1Ｈ  ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、1Ｈ−15Ｎ  ＨＳＱＣ、及び1Ｈ−13Ｃ  ＨＳＱＣを割り当てのために使用した。全てのスペクトルを、１秒の走査間遅延で記録した。ＮＯＥＳＹスペクトルを２００ｍｓの混合時間で得て、ＴＯＣＳＹスペクトルを８０ｍｓの等方性混合期間で得た。Wuthrichらに記載されたアプローチ［４３］に基づいてＣＣＰＮＭＲ［４２］を用いて、全てのスペクトルを割り当てた。実験のαＨ化学シフトからWishartら［４４］のランダムコイル1Ｈ  ＮＭＲ化学シフトを差し引くことによって、αＨ二次シフトを決定した。２Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルを割り当て、構造のアンサンブルをプログラムＣＹＡＮＡ［４５］を用いて計算した。合計１００個の初期構造を、ＣＹＡＮＡプログラムを用いて計算した。ＴＡＬＯＳ  Ｎを用いて予測されたねじれ角拘束を構造計算に使用した。構造をＭＯＬＭＯＬ［４６］を用いて可視化した。
【０１５６】
哺乳動物細胞培養
Ｈ６９細胞株、非悪性胆管細胞株を、Dr. Gregory J. Gores（Mayo Clinic、ロチェスター、ミネソタ）から入手した［３４］。Ｈ６９細胞を、３７℃及び５％インキュベーターで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、スコットランド）を補充した、１×抗生物質／抗真菌剤及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Life Technologies）中で、以前に記載［３４］されたように増殖及び維持した。以前の研究に記載されたように特定の濃度範囲で０．５％ＦＢＳ及び特定のホルモン及び増殖因子を補充した改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて、細胞増殖アッセイを行った［３４］。
【０１５７】
xCELLigenceを用いたリアルタイムでの細胞増殖モニタリング
リアルタイムでの増殖研究を、以前に記載［３４］されたようにxCELLigence SPシステム（ACEA Biosciences）を用いて行った。Ｈ６９細胞を、９６−ウェルxCELLigence E-plate（ACEA Biosciences）内に２０００細胞／ウェルの密度で播種した；次に、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内に設置したxCELLigenceシステムに入れ、一晩モニターした［４７］。次に、完全培地を、１８０μｌの飢餓培地（以前に記載［３４］されたように、５％ＦＢＳを補充した改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）と交換し、少なくとも６時間インキュベートした。２００ｎＭの最終濃度を提供するために、２０μｌの総容量で各ウェルに処理剤を添加した。４８時間の測定にわたって、細胞はコンフルエントに達し、システムはセルインデックス（ＣＩ）を記録した。細胞増殖率を、経時的に対照細胞と比較して処理細胞の相対数として計算した（４８時間の培養）。GraphPad Prism 6.02を、一元配置分散分析、続いてダネットの多重比較検定に使用した。各処理を四連で測定した。
【０１５８】
結果
ＧＲＮ12-35_3s突然変異体の設計及び合成
どのプロリン残基が複数の立体配座の採用に関与しているかを決定するために、ＧＲＮ12-35_3sの３つの単一突然変異体（Ｐ２Ａ、Ｐ４Ａ、Ｐ１０Ａ）（ここで、各突然変異体は３個のプロリンのうち１個がアラニンに変更されている）を化学合成した。ＧＲＮ3Alaと称するさらなるアナログでは、３個全てのプロリン残基がアラニンで置換された。合成Ｏｖ−ＧＲＮ−１切断型ペプチドの配列を表１に示す。
【０１５９】
全てのペプチドを、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成を用いて化学合成した。粗ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し、質量分析をＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行った。室温で２４時間、０．１Ｍの重炭酸アンモニウム及び５ｍＭのグルタチオン中で、ジスルフィド結合を形成させた。酸化的フォールディング反応のＨＰＬＣトレースを図８に示す。ペプチドの大部分について、比較的鋭い、早く溶出するピークが存在する。この早期溶出ピークの収率は、他のペプチドと比較してＧＲＮ3Ala突然変異体で有意に高い。現在の研究で使用された条件下では、ＧＲＮ12-35_3sは、単一の異性体に効率的にフォールドしない。ＧＲＮP10Aを除いて、全てのペプチドについて、主要なピーク（図８においてアスタリスクで強調されている）が、さらなる特徴づけのために各反応から単離された。４８時間の酸化期間後であっても、ＧＲＮP10Aのフォールディング反応に存在する多数のピークは、単一の主要なジスルフィド異性体の精製を妨げた。
【０１６０】
ＮＭＲ分光法による構造分析
ＧＲＮ12-35_3sアナログについての精製画分又は部分精製画分の構造を、ＮＭＲ分光法を用いて分析した。全てのペプチドの一次元スペクトルは、β−シート構造の存在と一致するアミド領域の有意な分散を有する。個々のプロリン突然変異体についてのＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルの分析は、プロリン残基の異性化の結果として最も可能性の高い複数の立体配座の存在を示している。対照的に、ＧＲＮ3Alaペプチドは、複数の立体配座を有するようには見えなかった（図９）。
【０１６１】
二次元スペクトル（ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ）を使用して主要な立体配座を割り当て、αＨシフトからランダムコイルシフト［４８］を差し引くことによって二次シフトを決定した。二次シフトは、一般に、図１０に示したように、Ｎ末端Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド、ＧＲＮ12-35_3sと比較して全てのプロリン突然変異体についての等価残基にわたって類似しており、全体の構造が類似であることを示している。正の二次シフトのストレッチは、β−シート構造の存在と一致している。
【０１６２】
Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチドの構造がＧＲＮ12-35_3sと類似のフォールドを維持するかを確認するために、選択されたアナログの三次元構造を、プログラムＣＹＡＮＡを使用して決定した。効率的なフォールディング、立体配座不均一性の欠如による全構造分析のため、並びに全体のフォールドに対するプロリン残基の影響を決定するために、ＧＲＮ3Alaが選択された。ＧＲＮ12-35_3sのジスルフィド結合パターンは以前に、ＣｙｓＩ−ＣｙｓＩＩＩ、ＣｙｓＩＩ−ＣｙｓＶ及びＣｙｓＩＶ−ＣｙｓＶＩであると予測された［４９］。ＧＲＮ3Alaの三次元構造は、ＧＲＮ12-35_3sとペプチドのＣ末端領域でβ−ヘアピンを共有するが、Ｎ末端領域は、図１１に示したように残基４〜１１からのα−ヘリックスを含む。
【０１６３】
xCELLigenceを用いたリアルタイムでの細胞増殖モニタリング
構造研究に加えて、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sの構造−機能相関への洞察を得るために、全ての操作されたペプチドを、インビトロ細胞増殖アッセイで試験した。図１２は、４８時間にわたるxCELLigenceプレートの読み取りからの各ペプチドについての細胞増殖の速度を示す。個々のプロリン突然変異体は、陰性対照ペプチド（トロポミオシン由来の２０残基ペプチド）と比較して有意な細胞増殖を示した。ＧＲＮ２４P2A、P4A及びP10Aの増殖率は、対照ペプチドに対してそれぞれ、１３１．７％（Ｐ＜０．０００１）、１４１．６％（Ｐ＜０．０００１）及び１３１．４％（Ｐ＜０．０００１）であった。対照的に、ＧＲＮ3Alaは、対照ペプチドと比較して細胞増殖に関して統計的に有意な影響を示さなかった（Ｐ＝０．９０）。
【０１６４】
議論
Ｏｖ−ＧＲＮ−１は、新規な創傷治癒剤の開発における潜在的可能性を有するが、構造／機能相関に関する情報は限られている。ここで、本発明者らは、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sにおける３個全てのプロリン残基が、構造及び機能の両方において重要な役割を果たすことを示す。
【０１６５】
個々のプロリン残基の突然変異は、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sの全体のフォールドを乱さなかったが、複数の立体配座が依然としてＮＭＲスペクトルに存在した。対照的に、３個全てのプロリン残基がアラニン残基に突然変異された場合、単一の立体配座に対応する単一のピークのセットが、ＮＭＲスペクトルにおいて観察された。これらの結果は、３個全てのプロリン残基がｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化に関与していることを示している。
【０１６６】
Ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化は、タンパク質のフォールディングにおける律速段階である可能性があり［４９］、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sのフォールディングに影響を及ぼすようである。アラニン残基によるプロリン１０の突然変異は、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sと比較してフォールディングを改善しなかったが、ＧＲＮP2A及びＧＲＮP4Aのフォールディング収率は改善された。３個全てのプロリン残基の除去によるｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化の防止は、最も高いフォールディング収率をもたらした（図８）。これら結果は、プロリン残基が一般的に、現在の条件下でフォールディングに有害であることを示している。
【０１６７】
プロリン残基はまた、インビトロ細胞増殖に影響を有する。ＧＲＮ3Alaの活性の欠如は、Ｎ末端領域における構造の摂動（perturbation）に関連するように思われる。プロリン残基の除去は、らせん構造の形成を可能にし、そしてこの立体配座は結合パートナーとの相互作用を可能にしないかもしれない。個々のプロリン残基をアラニン残基で置換しても依然として細胞増殖が生じることを考慮すると、プロリン残基との直接的相互作用が生物活性に関与しているとは考えにくい。しかしながら、３個のプロリン残基の全ては、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sの最初の１０残基内に存在するので、Ｃ末端ヘアピンよりもむしろこの領域が生物活性において重要であると思われる。
【０１６８】
ヒトグラニュリンモジュールに関する以前の研究は、本発明者らの現在の研究と一致して、配列がフォールディング収率に有意な影響を及ぼし得ることを示している。哺乳動物において、グラニュリンはプログラニュリンとして発現され、これは７個半のグラニュリンモジュールを含む［３３］。ヒトプログラニュリンにおける７個のグラニュリンモジュールは、大腸菌においてチオレドキシン融合タンパク質として発現された［５０］。発現されたペプチドは、精製され、組み換えエンテロキナーゼによって切断されて、グラニュリンモジュールを放出した。ＨＰＬＣ分析及びＮＭＲ分析によるフォールディングの分析は、グラニュリンＡ、Ｃ及びＦが、少なくともペプチドの領域に関して、比較的明確に定義された構造を示すことを示している。対照的に、グラニュリンＢ及びＥは、ＮＭＲスペクトルにおいて有意な分散を示さず、グラニュリンＤ及びＧは、ユニークなプロトンについてＮＭＲスペクトルにおいて複数のシグナルを有することが報告された［５０］。グラニュリンＢ及びＦは、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sにおけるプロリン２と一致して配列内の最初のシステインの直後にプロリン残基を含む。グラニュリンＢは、フォールディング反応のＨＰＬＣプロファイルにおいて主要な鋭いピークを有さないが、グラニュリンＦは有する［５０］。この比較に基づいて、このプロリン残基が、全長ヒトグラニュリンモジュールのフォールディングに有意な影響を及ぼすことはないようである。
【０１６９】
概要
全体として、本発明者らの結果は、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3sの構造及び機能におけるプロリン残基の重要性を強調している。さらに、データは、新世代のＯｖ−ＧＲＮ−１ベースの強力なアナログの設計に不可欠な情報を提供する。
【０１７０】
実施例３．ペプチドのマウス創傷治癒活性の評価
４日目の創傷治癒を、本明細書に記載されたペプチドを用いて評価した（Ｏｖ−ＧＲＮ−１、Ｏｖ−ＧＲＮ1-35、Ｏｖ−ＧＲＮ8-38、Ｏｖ−ＧＲＮ12-34、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s、ＧＲＮ２４−３ａｌａ、ＧＲＮ２４−Ｐ２Ａ、ＧＲＮ２４−Ｐ４Ａ、及びＧＲＮ２７ｓｐｓ）。結果は、耳の間の頭皮への生検パンチから生じる〜０．２ｃｍ2の創傷に０〜４日目から５０μｌ容量で毎日塗布された１．５％メチルセルロースゲル中の、５６ｐｍｏｌの組み換えＯｖ−ＧＲＮ−１、Ｏｖ−ＧＲＮ−１ペプチド、チオレドキシン（ＴＲＸ）タンパク質対照、及び７１ｐｍｏｌのRegranexによる処置から、５６ｐｍｏｌのペプチド対照に対して示されている（図１３（Ｂ））。いかなる時点においても、非関連ペプチド対照、ＰＢＳ、又はＴＲＸタンパク質対照の間で有意差は認められなかった（ｎｓ）。ペプチドＯｖ−ＧＲＮ−１、Ｏｖ−ＧＲＮ1-35、Ｏｖ−ＧＲＮ8-38、Ｏｖ−ＧＲＮ12-34、Ｏｖ−ＧＲＮ12-35_3s、ＧＲＮ２４−３ａｌａ、及びＧＲＮ２４−３ｐ４ａは、対照と比較して創傷治癒の有意な増加を示した。
【０１７１】
全てのパネル：４〜５匹の動物の群の２〜６個の生物学的反復の平均治癒率を、ＳＥＭバーと共にプロットした。見やすくするために、群は左右にわずかにシフトされている。多重比較のためのダネット補正を用いた反復測定二元配置分散分析試験は、ペプチド対照に対して各群を比較する。ペプチド／タンパク質対照に対する有意性は、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＝ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない、によって示された。アスタリスク又はハッシュの色は関連する群を表す。
【０１７２】
本明細書を通して、目的は、発明をいずれか一つの実施形態又は特定の特徴の集合に限定することなく、発明の好ましい実施形態を記載することであった。それゆえ、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく例示された特定の実施形態において、種々の修正及び変更を行うことができることが当業者によって理解されるであろう。
【０１７３】
本明細書で言及される全てのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
参考文献
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【０１７５】
表
【表１】
2019531089.tif 000003
【０１７６】
【表２】
2019531089.tif 000004
【０１７７】
【表３】
2019531089.tif 000005
【図１】
2019531089.tif 000006
【図２】
2019531089.tif 000007
【図３】
2019531089.tif 000008
【図４】
2019531089.tif 000009
【図５】
2019531089.tif 000010
【図６】
2019531089.tif 000011
【図７】
2019531089.tif 000012
【図８】
2019531089.tif 000013
【図９】
2019531089.tif 000014
【図１０】
2019531089.tif 000015
【図１１】
2019531089.tif 000016
【図１２】
2019531089.tif 000017
【図１３】
2019531089.tif 000018
【国際調査報告】
2019531089.tif 000019
2019531089.tif 000020
2019531089.tif 000021
2019531089.tif 000022
2019531089.tif 000023
2019531089.tif 000024