(57)【要約】  本発明は、ＦＫＢＰポリペプチドのＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列を含む組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質であって、その「インサートインフラップ」（ＩＦ）ドメインが、ペプチド配列Ｘ−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸５〜２０個のアミノ酸配列（「Ｑ−タグ」）で少なくとも一部置換されており、前記ＴＧ基質がＫｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ  ＴＧのＴＧ機能に対する基質である、組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質に関する。本発明はさらに、前記基質の使用に関する。【選択図】図４
2019508366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式Ｉ
（Ｆ＊−Ｌ）ｙ−Ｘ  （Ｉ）
による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質であって、
Ｆ＊が、ＦＫＢＰポリペプチドのＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列から選択され、その「インサートインフラップ」（ＩＦ）ドメインが、アミノ酸５〜２０個のアミノ酸配列（「Ｑ−タグ」）で少なくとも一部置換されており、Ｑ−タグがペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有する連続する５個のアミノ酸のサブ配列を含み、Ｘ１およびＸ２が不存在またはリンカーアミノ酸を構成し；
Ｌが不存在またはリンカーアミノ酸配列から選択され；
Ｘが目的タンパク質であり；
ｙが１〜１００の整数であり、
前記ＴＧ基質が、配列番号２３によるＫｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ  ＴＧのＴＧ機能に対する基質である、
前記組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質。
【請求項２】
前記ＦＫＢＰドメインが、ＦＫＢＰ１２、ＡＩＰ、ＡＩＰＬ１、ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ７、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９、ＦＫＢＰ９Ｌ、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ１１、ＦＫＢＰ１４、ＦＫＢＰ１５、ＦＫＢＰ５２、ＬＯＣ５４１４７３、およびＳＬＹＤ、およびこれらのＦＫＢＰドメインのホモログから選択される真核生物または細菌ＦＫＢＰポリペプチドから選択される、請求項１に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質。
【請求項３】
前記ＦＫＢＰドメインが、約１２０〜１７０個、好ましくは約１３０〜１６０個、および最も好ましくは約１４５〜１５５個の、前記ＦＫＢＰポリペプチドのＮ末端アミノ酸を含む、請求項１または２に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質。
【請求項４】
前記ＦＫＢＰドメインがＳＬＹＤポリペプチドのＮ末端アミノ酸１〜６４および１２３〜１４９を含み、アミノ酸６５〜１２２が前記Ｑ−タグで置換されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質。
【請求項５】
前記リンカー配列Ｌが１〜２０個のアミノ酸を含み、好ましくは前記アミノ酸が、ＦＫＢＰドメインおよび／または目的タンパク質を本質的に妨害しない、請求項１から４のいずれか１項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質。
【請求項６】
前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質。
【請求項７】
目的タンパク質を標識化するインビトロ方法であって、
ａ）目的タンパク質と結合させた、請求項１から６のいずれか１項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質を用意するステップ、
ｂ）有効量の、好ましくは配列番号２３による、Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａのトランスグルタミナーゼを用意するステップ、
ｃ）例えばリジンなどの、アルキル−アミン基を含む、結合させる適切な標識を用意するステップ、および、
ｄ）ａ）〜ｃ）による前記成分を接触させ、それにより前記トランスグルタミナーゼが前記標識を前記基質に結合させるステップ、
を含む、前記インビトロ方法。
【請求項８】
Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａの前記トランスグルタミナーゼが組換え産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が、酵素、ビオチン、放射性基、蛍光色素などの色素、同位体、化学発光標識、および金属から選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識化が、標識および目的タンパク質の化学量論比、例えば約１：１で実現される、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、請求項７から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の方法に従って産生される、少なくとも１つの標識された目的タンパク質を、薬学的に許容される担体化合物とともに含む医薬組成物または診断用組成物。
【請求項１３】
前記目的タンパク質が、標識および目的タンパク質の化学量論比、例えば約１：１で標識される、請求項１２に記載の医薬組成物または診断用組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の診断用組成物を、任意選択で、イムノアッセイを実施するためのその他の成分とともに含む診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＫＢＰポリペプチドのＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列を含む組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質であって、その「インサートインフラップ（ｉｎｓｅｒｔ−ｉｎ−ｆｌａｐ）」（ＩＦ）ドメインが、ペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）、特にこのペプチド配列のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸５〜２０個のアミノ酸配列（「Ｑ−タグ」）で少なくとも一部置換されており、前記ＴＧ基質がＫｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ  ＴＧ（ＫａｌｂＴＧ）のＴＧ機能に対する基質である、組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質に関する。本発明はさらに、前記基質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロでの診断検査には、可溶性および／または免疫反応性の抗原およびそのバリアントが必須である。例として、ＨＩＶ−１感染症を検出するために、ウイルス外被タンパク質ｇｐ４１の組換えおよび可溶性バリアントが使用される。
【０００３】
免疫反応性抗原およびそのバリアントに必要な溶解性は、有効なアッセイの設計における難題となる場合があるが、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）活性を有する１つまたは複数のシャペロンユニットと融合させることにより改善することができる。スキャホールドにより提示されるポリペプチドドメインを操作するための、タンパク質スキャホールドを使用する技術が、抗体および抗体断片の分野で既知である。このように、抗体の抗原結合領域の可変ループなどのドメインを大きく操作して、既知の標的への結合性（例えば親和性および／または特異性）が改善されたアミノ酸配列セグメントが産生されてきた（ＷＯ  ２０１４／０７１９７８を参照のこと）。
【０００４】
ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）は、酵母からヒトまで多くの真核生物で確認されており、プロリン残基を含むタンパク質のタンパク質フォールディングシャペロンとして機能する。シクロフィリンとともに、ＦＫＢＰはイムノフィリンファミリーに属する。ヒトゲノムでは、そのセグメントが、強力な免疫抑制性マクロライドであるＦＫ５０６またはラパマイシンの標的である１２ｋＤａのタンパク質の配列と有意な相同性を有するタンパク質１５種がコードされている。ＦＫＢＰ−１２として知られる、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）の１２ｋＤａの原型は豊富に存在する細胞内タンパク質である。ＦＫＢＰ１２は、プロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓコンフォメーション相互転換を触媒するＰＰＩアーゼとして機能する。ＦＫＢＰは、タンパク質フォールディング、細胞シグナル伝達、アポトーシスおよび転写を含む様々な細胞の機能に関与する。ＦＫＢＰは、標的タンパク質に直接結合してコンフォメーションを変化させることによりその機能を引き出し、したがって分子スイッチとして作用する。
【０００５】
細菌ｓｌｙＤ遺伝子は、ＦＫＢＰ型ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）をコードする。ＳｌｙＤは、分子シャペロン、プロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ、およびニッケル結合タンパク質として機能する２ドメインの細菌タンパク質である。ＳｌｙＤの一方のドメインに存在するシャペロン機能はツインアルギニン移行に関与し、タンパク質フォールディングにおけるプロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼドメインの触媒効率を２桁増加させる。
【０００６】
ＳｃｈｌａｐｓｃｈｙおよびＳｋｅｒｒａ（Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１１；７０５：２１１〜２４にて）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、組換え遺伝子産物のフォールディング、およびタンパク質凝集すなわち封入体形成に関する問題に頻繁に直面することについて開示している。このことは特に、抗体断片、サイトカイン、増殖因子、および真核生物細胞表面受容体の細胞外断片を含む、構造上ジスルフィド結合を有するタンパク質に当てはまる。したがって彼らは、確立された４種のペリプラズムシャペロンおよび／またはフォールディング触媒：ジスルフィド架橋の形成および異性体化を触媒するチオール−ジスルフィドオキシドレダクターゼＤｓｂＡおよびＤｓｂＣ、ならびにシャペロン活性を有する２種のペプチジル−プロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ、ＦｋｐＡおよびＳｕｒＡの過剰発現をもたらすヘルパープラスミドｐＴＵＭ４を開発した。
【０００７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳｌｙＤおよびＦＫＢＰ１２（野生型および突然変異体Ｃ２３ＡおよびＣ２３Ｓ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶性形態として高収量で組換え産生可能である（Ｓｔａｎｄａｅｒｔ、Ｒ．Ｆ．、ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６  （１９９０）  ６７１〜６７４）。好熱性生物由来ＦＫＢＰおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＳｌｙＤは、Ｅ．ｃｏｌｉでのキメラポリペプチドの組換え発現においてシャペロンとして使用可能である（Ｉｄｅｎｏ、Ａ．、ら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６４  （２００４）  ９９〜１０５）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳｌｙＤおよびＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ポリペプチドを可逆的にフォールディングさせる（Ｓｃｈｏｌｚ、Ｃ、ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１  （１９９６）  １２７０３〜１２７０７）。Ｌｏｗ  Ｃ、らＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３９８  （２０１０）  ３７５〜３９０は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の金属シャペロンＳｌｙＤの結晶構造および機能的特徴について報告している。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、２つの機能性ユニットに相当する２つのドメインからなる。ＰＰＩアーゼ活性は典型的なＦＫＢＰドメインに存在し、シャペロン機能は自律的にフォールディングされたインサートインフラップ（ＩＦ）ドメインに関連する。これら２つの分離したドメインは溶液中で安定かつ機能性である。
【０００８】
Ｋｏｖｅｒｍａｎｎら（Ｋｏｖｅｒｍａｎｎ  Ｍ、Ｓｃｈｍｉｄ  ＦＸ、Ｂａｌｂａｃｈ  Ｊ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ＳｌｙＤ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ａｕｇ；３９４（８）：９６５〜７５にて）は、ＳｌｙＤが分子シャペロン、プロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ、およびニッケル結合タンパク質として機能する２ドメインの細菌タンパク質であることを開示している。彼らは、ＳｌｙＤの分子酵素機構についての最近の発見をまとめている。ＳｌｙＤの一方のドメインに存在するシャペロン機能はツインアルギニン移行に関与し、タンパク質フォールディングにおけるプロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼドメインの触媒効率を２桁増加させる。
【０００９】
ＦＫＢＰ１２ポリペプチドのアミノ酸配列は、６０位に単一のトリプトファン残基を含む。したがって、トリプトファン蛍光を分析するだけで、ＦＫＢＰ１２突然変異体を構造上の完全性について分析することができる（ＤｅＣｅｎｚｏ、Ｍ．Ｔ．、ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９  （１９９６）  １７３〜１８０）。残ったロタマーゼ（ｒｏｔａｍａｓｅ）活性を決定することで、ＦＫＢＰ１２突然変異体の残った酵素活性についての試験を実施することができる（Ｂｒｅｃｈｔ、Ｓ．、ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２０  （２００３）  １０３７〜１０４８；  Ｓｃｈｏｒｉｅｓ、Ｂ．、ら、Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  １３  （２００７）  ４７５〜４８０；  Ｔｉｍｅｒｍａｎ、Ａ．Ｐ．、ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０  （１９９５）  ２４５１〜２４５９）。ＦＫ５０６またはラパマイシンとの結合について決定することでも、ＦＫＢＰ１２突然変異体の構造上の完全性を決定することができる（ＤｅＣｅｎｚｏ、Ｍ．Ｔ．、ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９  （１９９６）  １７３〜１８０）。
【００１０】
Ｇｅｉｔｎｅｒら（Ｇｅｉｔｎｅｒ  ＡＪ１、Ｖａｒｇａ  Ｅ、Ｗｅｈｍｅｒ  Ｍ、Ｓｃｈｍｉｄ  ＦＸ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ａ  ｐａｒｖｕｌｉｎ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ＳｕｒＡ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１３  Ｎｏｖ  １５；４２５（２２）：４０８９〜９８にて）は、フォールディング酵素の触媒ドメインとして機能する低分子プロリルイソメラーゼとしてのパルブリン（ｐａｒｖｕｌｉｎ）について開示している。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのペリプラズム由来のＳｕｒＡ（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）は、不活性（Ｐａｒ１）および活性（Ｐａｒ２）パルブリンドメイン、ならびにシャペロンドメインからなる。シャペロンドメインが存在しない状態では、Ｐａｒ２のフォールディング活性は実質的に失われる。彼らは、ＦＫＢＰファミリーにおける無関係のフォールディング酵素であるＳｌｙＤのシャペロンドメインを、ＳｕｒＡの分離したＰａｒ２ドメインのループに挿入することによりキメラタンパク質を作り出した。これにより、Ｐａｒ２がその天然のシャペロンドメインと結合しているＳｕｒＡの活性より大きい値まで、Ｐａｒ２のフォールディング活性が４５０倍増加した。天然および外来性のシャペロンドメイン両方が存在する状態では、Ｐａｒ２のフォールディング活性が１５００倍増加した。このように、関連するシャペロンドメインも無関係のシャペロンドメインも、プロリルイソメラーゼＰａｒ２のフォールディング活性を増強するのに同様に効率的である。各種シャペロンドメインの配列分析により、可動鎖領域（ｍｏｂｉｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ）において曝露されるメチオニン残基のクラスターが、フォールディングされていないタンパク質鎖との全体的な相互作用において重要である可能性があることが示唆される。この結合は非常にダイナミックであり、フォールディングしつつあるタンパク質鎖がシャペロンおよび触媒ドメイン間を頻繁に移行することができる。
【００１１】
免疫学的診断システムでは、抗原および／もしくは抗体またはその他の免疫学的結合相手（目的タンパク質）が大抵、これらの検出のため、例えばビオチン（ストレプトアビジンと固定化させるため）、またはルテニウムなどのその他の標識とさらにコンジュゲートされる。通常、このようなマーカーを反応性のアミノまたはスルフヒドリル部分とコンジュゲートさせるのには化学的方法が使用される。
【００１２】
不運なことに、タンパク質改変における従来の化学的戦略は制御が困難であり、それぞれが各自のインビボでの特徴を有する、可変の化学量論組成での不均一なイムノコンジュゲート集団を生じさせる。さらに、コンジュゲートされる分子または標識の数が制御不可能であり、そのため規定されず、通常は正規分布に従うことにより、反応を定量化しようとすると問題が起こる。
【００１３】
部位特異的かつ化学量論的なタンパク質改変のための、人工の生体直交性基（ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）の導入は、この問題に対し見込みのある解決策をもたらす。このような戦略は流行しているものの、大抵は労力を要し、産物が不均一となるおそれが依然としてある。さらに、系の成分全てが、長期間およびコンジュゲーション条件下で安定でなければならず、また安定なままでなければならない。また、コンジュゲーションの位置／場所を制御することができない。例えばタンパク質の活性中心、もしくはその近くに、または免疫学的活性を媒介する位置、もしくはその位置近くにマーカーを非特異的に含めると、免疫反応性が妨害されるか、これが完全に阻害されることさえありうる。
【００１４】
マーカーを、酵素により部位特異的にコンジュゲートさせる方法は既知である（例えばソルターゼ、ＭＴＧ）が、これらには、標識化される目的タンパク質にさらなる特異的な認識配列（タグ配列）の存在が必要である。
【００１５】
微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）は、多くの食品およびバイオテクノロジー用途でのタンパク質およびペプチドの架橋において最も重要な酵素の１つである。ＭＴＧは最初に生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓで発見され、後にこれより抽出された。組換え産生されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ  ＭＴＧは、今日工業的に使用されるＭＴＧのバルクの代表例である。この酵素は、アシル基、例えばグルタミン（Ｑ）側鎖と、アルキル−アミン、例えばリジン（Ｋ）側鎖との間でのイソペプチド結合の形成を触媒する。反応性アミン基が存在しない状態では、水との酵素反応でグルタミン側鎖の脱アミノが起こる。この細菌酵素は、Ｃａ２＋またはＧＴＰなどの補因子の添加なしに、広範なｐＨ、緩衝液および温度条件で作用する。ＭＴＧは治療用抗体−薬物コンジュゲートの開発に既に使用されているが、酵素の特異性が低いため、このようなＭＴＧ媒介性コンジュゲートの大規模産生は未だ確立されていない。既知の活性な微生物トランスグルタミナーゼの全ての種類が、３８ｋＤａ超の分子量を示す。天然に存在する架橋酵素であるため、微生物トランスグルタミナーゼは、アミン供与体分子に対しては広範な基質特異性を示し、アシル供与体に対しては比較的低い特異性を示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｉｓ由来の酵素およびホモログ酵素の基質特異性が知られているのみであるため、生体直交性コンジュゲーション手法、例えば、２つ以上の異なる標識−基質および２種類以上のトランスグルタミナーゼを使用する、生体分子の同時標識化は現時点では不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記のことを考慮して、本発明の目的は、免疫学的診断システムおよび／または治療システムならびに免疫学的診断法および／または治療法の状況における、抗原および／または抗体またはその他の免疫学的結合相手（目的タンパク質）の効率的かつ制御された標識化を提供するための新規の手段および方法を提供することである。その他の態様および目的は、本発明についての以下のより詳細な記載を読めば当業者には明らかとなるはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
その第１の態様によれば、上記の目的は、以下の一般式Ｉ
（Ｆ＊−Ｌ）ｙ−Ｘ  （Ｉ）
による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質を提供することによって解決される。
【００１８】
前記式（Ｉ）において、Ｆ＊は、好ましくは、未改変のポリペプチドでは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）型のプロリルイソメラーゼである宿主ドメインの表面ループにゲストとして内部に挿入されている「インサートインフラップ」（ＩＦ）ドメインを含む、ＦＫＢＰポリペプチドのＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列から選択される。それにも関わらず、本発明は、Ｑ−タグが酵素の相同な位置に挿入された、「インサートインフラップ」（ＩＦ）ドメインを天然に（未改変では）含まないＦＫＢＰドメインも含む（例えば、以下のＫｎａｐｐｅらを参照のこと）。
【００１９】
前記「インサートインフラップ」（ＩＦ）ドメインは、連続する５個のアミノ酸のサブ配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む５〜２０個の長さのアミノ酸を有するアミノ酸配列（「Ｑ−タグ」）で少なくとも一部置換されており、サブ配列はペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）と、特にペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｘ１およびＸ２は不存在かリンカーアミノ酸を構成する。具体的な実施形態において、ＩＦドメインは、５〜１５個または５〜２０個の長さのアミノ酸を有するＸ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）（「Ｑ−タグ」）で少なくとも一部置換されており、Ｑ−タグはアミノ酸５個の連続するサブ配列（すなわち連続する５個のアミノ酸残基からなるサブ配列）を含み、サブ配列はペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｘ１およびＸ２は不存在かリンカーアミノ酸を構成する。
【００２０】
より具体的な実施形態においては、Ｘ１のみが不存在であり、ペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２の長さがアミノ酸６〜１５個または６〜２０個である。さらにより具体的な実施形態において、Ｘ２は、ＹＲＹＲＱサブ配列またはＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有するサブ配列の後に直接、アルギニン残基を含む（か、これらからなっていてよい）。
【００２１】
さらに非常に具体的な実施形態において、ペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有する連続する５個のアミノ酸残基からなるサブ配列において、グルタミン残基がサブ配列の選択された位置にあり、サブ配列におけるその位置は、第３位、第４位、第５位、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２２】
さらに非常に具体的な実施形態において、ペプチド配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）のＹＲＹＲＱ部分と少なくとも８０％の配列同一性を有する連続する５個のアミノ酸残基からなるサブ配列において、アルギニン残基がサブ配列の選択された位置にあり、サブ配列におけるその位置は、第４位、第５位、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２３】
本発明によれば、リンカーアミノ酸Ｘ１およびＸ２がもしあれば、互いに独立に選択されることがさらに理解される。
配列Ｘ１−ＹＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１）、Ｘ１−ＲＹＲＱＲ−Ｘ２（配列番号２）、Ｘ１−ＲＹＳＱＲ−Ｘ２（配列番号３）、Ｘ１−ＦＲＱＲＱ−Ｘ２（配列番号４）、Ｘ１−ＲＱＲＱＲ−Ｘ２（配列番号５）、Ｘ１−ＦＲＱＲＧ−Ｘ２（配列番号６）、Ｘ１−ＱＲＱＲＱ−Ｘ２（配列番号７）、Ｘ１−ＹＫＹＲＱ−Ｘ２（配列番号８）、Ｘ１−ＱＹＲＱＲ−Ｘ２（配列番号９）、Ｘ１−ＹＲＱＴＲ−Ｘ２（配列番号１０）、Ｘ１−ＬＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１１）、Ｘ１−ＹＲＱＳＲ−Ｘ２（配列番号１２）、Ｘ１−ＹＱＲＱＲ−Ｘ２（配列番号１３）、Ｘ１−ＲＹＴＱＲ−Ｘ２（配列番号１４）、Ｘ１−ＲＦＳＱＲ−Ｘ２（配列番号１５）、Ｘ１−ＱＲＱＴＲ−Ｘ２（配列番号１６）、Ｘ１−ＷＱＲＱＲ−Ｘ２（配列番号１７）、Ｘ１−ＰＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号１８）、Ｘ１−ＡＹＲＱＲ−Ｘ２（配列番号１９）、Ｘ１−ＶＲＹＲＱ−Ｘ２（配列番号２０）、Ｘ１−ＶＲＱＲＱ−Ｘ２（配列番号２１）、およびＸ１−ＹＲＱＲＡ−Ｘ２（配列番号２２）から選択され、Ｘ１およびＸ２が上記の通りである、本発明によるＱ−タグが好ましい。
【００２４】
驚くべきことに、ＩＦドメインのＦＫＢＰドメイン上流および下流挿入の２つの部分（ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｐａｒｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＫＢＰ  ｄｏｍａｉｎ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＦ  ｄｏｍａｉｎ）が、構造的に相当に強固かつ正確なスキャホールド、またはＩＦドメイン部分に挿入されるかつ／もしくはこれを置換する配列のための「カラー（ｃｏｌｌａｒ）」（「ヘッド」、「Ｑ−タグ」）として機能することが発見された。このため、挿入／置換の提示および方向づけにより基質のその他の成分の任意のその他の機能、具体的には目的タンパク質（Ｘ）の機能が実質的に妨害されることは、確実になくなる。さらに、−この場合−ＴＧ基質結合部位（Ｑ−タグ）の提示により、標識の高度に制御された化学量論的結合、したがって目的タンパク質の標識化につながる。
【００２５】
式（Ｉ）において、Ｌは不存在かリンカーアミノ酸配列から選択される。好ましくは、前記リンカー配列Ｌは１〜２０個のアミノ酸を含み、より好ましい前記アミノ酸は、ＦＫＢＰドメインの機能（具体的には置換／挿入）および／またはタンパク質（目的ｓ９）の機能（例えば免疫学的機能）を本質的に阻害しない。
【００２６】
Ｘは目的タンパク質を示し；好ましくは酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される。
式（Ｉ）において、ｙは１〜１００の整数であり、したがって、いくつかのマーカー基Ｆ＊−Ｌが目的タンパク質に結合されうる。
【００２７】
好ましくは、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質は、例えばＮおよび／またはＣ末端に、ビオチン、マルトースまたはｈｉｓタグなどの、精製および／または固定化用タンパク質タグをさらに含んでいてよい。
【００２８】
好ましくは、ＴＧ活性を使用する制御された基質標識化を可能にするため、基質Ｆ＊、Ｌおよび／またはＸの様々な成分が互いに共有結合される。基質は融合タンパク質として組換え産生可能であり、例えば、細菌または酵母宿主細胞などの宿主細胞から発現および精製されうる。各方法は当業者にとって周知である。成分は、別々にまたは一部産生（例えば合成）することもでき、次いで、状況および望ましい目的に応じて、共有結合またはコンジュゲートされる。
【００２９】
本発明によれば、発明によるＴＧ基質は、配列番号２３によるＫｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ  ＴＧ、またはそのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５、９８もしくは９９％同一であり、本明細書に記載される実質的なＴＧ活性を示す相同なタンパク質のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）機能に対する基質である。好ましくは、ＴＧポリペプチド、またはその、実質的なトランスグルタミナーゼ機能もしくは活性を有する一部が宿主細胞でクローニングおよび組換え産生され、次いで、状況および望ましい目的に応じて（少なくとも一部）精製される。各方法は当業者に周知である。ＴＧ活性は、これも当業者に周知のアッセイを使用して測定することができる。本発明の文脈での「組換えＴＧ基質」は、基質が概して天然には存在しないことを意味するものとする。
【００３０】
本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質に使用されるＦＫＢＰドメインは、好ましくはＦＫＢＰ１２、ＡＩＰ、ＡＩＰＬ１、ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ７、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９、ＦＫＢＰ９Ｌ、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ１１、ＦＫＢＰ１４、ＦＫＢＰ１５、ＦＫＢＰ５２、ＬＯＣ５４１４７３、およびＳＬＹＤ、および、これらのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５、９８または９９％同一であり、Ｑ−タグの挿入に適した、これらのＦＫＢＰドメインのホモログから選択される真核生物または細菌ＦＫＢＰポリペプチドから選択される。各ドメインを、本明細書および文献に記載されるように、例えば、具体的には構造上のアラインメントを特定するためアラインメントプログラムを使用して、その適合性について分析することができる。
【００３１】
一実施形態において、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質に使用されるＦＫＢＰドメインは、ＰＰＩアーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含む。ＰＰＩアーゼ活性を有するポリペプチドは、原核生物または真核生物起源であるか、それらの人工のバリアント（突然変異体）としての、ＰＰＩアーゼ活性を有するポリペプチドである。ＰＰＩアーゼ活性を有するポリペプチドの人工のバリアントは、タンパク質工学の最新技術による技術で生成可能である。本発明によれば、ＰＰＩアーゼ活性を有するポリペプチドの人工のバリアントは、例えば１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失を特徴とする。具体的な実施形態では、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ基質に使用されるＦＫＢＰドメインのＰＰＩアーゼ活性および／またはシャペロン機能が、人工のバリアントで保存される。
【００３２】
Ｋｎａｐｐｅら（Ｋｎａｐｐｅ  ＴＡ、Ｅｃｋｅｒｔ  Ｂ、Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔ  Ｐ、Ｓｃｈｏｌｚ  Ｃ、Ｓｃｈｍｉｄ  ＦＸ．  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ＦＫＢＰ１２  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００７  Ｍａｙ  １８；３６８（５）：１４５８〜６８．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｍａｒ  １４にて）は、プロリルイソメラーゼとしてのヒトＦＫＢＰ１２の触媒活性が、短いペプチドに対しては高いがプロリン制限性のタンパク質フォールディング反応では非常に低いことを開示している。対照的に、ＦＫＢＰファミリーのメンバーであるＳｌｙＤタンパク質は、フォールディング酵素として非常に活性である。これらは、プロリルイソメラーゼ活性部位近くにさらなる「インサートインフラップ」つまりＩＦドメインを含む。このドメインを除去しても、短いペプチド基質に対するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＳｌｙＤのプロリルイソメラーゼ活性に影響はなかったが、プロリン制限性タンパク質フォールディング反応では触媒活性が失われた。ヒトＦＫＢＰ１２にＳｌｙＤのＩＦドメインを相互挿入（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）するとフォールディング活性が２００倍増加し、ＳｌｙＤ自体よりも活性なフォールディング触媒が生じた。ＩＦドメインはリフォールディングしつつあるタンパク質鎖に結合し、そのためシャペロンモジュールとして機能する。
【００３３】
Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＳＬＹＤのアミノ酸１〜６９がＰＰＩアーゼドメインの第１の部分を形成し、アミノ酸７６〜１２０がＩＦ−シャペロン（ドメイン）を形成し、アミノ酸１２９〜１５１がＰＰＩアーゼドメインの第２の部分を形成すると考えられている。したがって、アミノ酸１〜１５１がＦＫＢＰドメインを形成する。アミノ酸１５２〜１９６は金属結合に関与する。
【００３４】
前記ＦＫＢＰドメインが、約１２０〜１７０個、好ましくは約１３０〜１６０個、および最も好ましくは約１４５〜１５５個の長さの、前記ＦＫＢＰポリペプチドのＮ末端アミノ酸を有する、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質が好ましい。これは、ＩＦドメイン配列を含む。
【００３５】
本発明の文脈では、「約」は所与の値の＋／−１０％を意味するものとする。
前記ＦＫＢＰドメインがＳＬＹＤポリペプチドのＮ末端アミノ酸１〜６４および１２３〜１４９を含み、アミノ酸６５〜１２２が前記Ｑ−タグで置換されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質が好ましい。
【００３６】
上記の通り、リンカー配列Ｌは１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸を含んでいてよく、好ましくは、前記アミノ酸はＦＫＢＰドメインおよび／または目的タンパク質を本質的に妨害しない。好ましいリンカーアミノ酸はグリシンまたはアラニンなどの低分子アミノ酸である。アミノ酸リンカーおよびそれらの組成物は当技術分野で既知である（例えばＣｈｉｃｈｉｌｉらＬｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２０１３  Ｆｅｂ；  ２２（２）：  １５３〜１６７を参照のこと）。
【００３７】
本発明の文脈において目的タンパク質とは、概して、本技術を使用して標識化されうるタンパク質全てである。前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質が好ましい。本発明は、定量化が望ましい場合の免疫学的反応およびアッセイに特に使用される。
【００３８】
次いで、本発明の別の態様は、目的タンパク質を標識化するインビトロ方法であって、ａ）目的タンパク質を含む、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質を用意するステップ；ｂ）本明細書に記載される、有効量の、Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａのトランスグルタミナーゼ（例えば配列番号２３による）またはそのホモログを用意するステップ、ｃ）例えばリジンなどの、アルキル−アミン基（「アミン供与体」）を含む適切な標識を用意するステップ、および、ｄ）ａ）〜ｃ）による前記成分を接触させ、それにより前記トランスグルタミナーゼ（活性）が前記標識を前記基質に結合させるステップを含む、インビトロ方法に関する。
【００３９】
本明細書に記載されるＫｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａの前記トランスグルタミナーゼまたはそのホモログが、本明細書に記載されるように組換え産生される、本発明による方法が好ましい。
【００４０】
本発明によるこの方法において、Ｑ−タグ（任意選択でＩＦ−ドメイン領域を置換）を含むＦ＊基を含む基質は、Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａのトランスグルタミナーゼ活性を使用して標識化される。好ましくは、結合される標識は、酵素、ビオチン、放射性基（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）、蛍光色素などの色素、同位体、および金属から選択される。前記標識は、例えばリジンなどの、アルキル−アミン基を含む標識成分／化合物の一部である。最も好ましくは、前記標識成分／化合物は、ペプチド配列ＲＹＥＳＫと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミン供与体タグ（「Ｋ−タグ」）を含む。好ましいＫ−タグおよびそれらの組成物の例は以下に記載され、文献でも見つけることができる。
【００４１】
前記標識化が、制御され、かつ例えば、標識および目的タンパク質の化学量論比例えば約１：１で実現される、本発明による方法が好ましい。２つまたは偶数倍の標識を単一／複数の目的タンパク質に結合させるため、さらなる酵素（例えばＫａｌｂ−ＴＧ以外のＴＧ）およびその他の各ＴＧ基質を使用して、複数標識化を実現することもできる。
【００４２】
前記目的タンパク質が、酵素、ウイルスタンパク質などの抗原、抗体またはその断片、およびその他の免疫学的結合相手から選択される、本発明による方法が好ましい。本発明は、定量化が望ましい場合の免疫学的反応およびアッセイに特に使用される。
【００４３】
目的タンパク質の選択は、療法、研究および／または診断のいずれかにおける、使用されるｐｉＲＮＡ分子の意図される用途によっても決まる。前記目的タンパク質が、がん、神経疾患、免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、妊孕性（例えば繁殖率または数）、動物産生（例えば肉または乳の量）に関係する／を引き起こすタンパク質、細胞増殖および／もしくは発達、ｍＲＮＡ分解、翻訳抑制、ならびに／または転写遺伝子のサイレンシングに必須のタンパク質から選択される、本発明による方法が好ましい。
【００４４】
次いで、本発明の別の態様は、本発明による少なくとも１つの組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質を、緩衝液などの、薬学的に許容される担体および成分とともに含む医薬組成物または診断用組成物に関する。２つまたは偶数倍の標識を単一／複数の目的タンパク質に結合させることができるように、さらなる酵素（例えばＫａｌｂ−ＴＧ以外のＴＧ）およびその他の各ＴＧ基質を含む、複数標識化のための医薬組成物または診断用組成物を得ることもできる。
【００４５】
次いで、本発明の別の態様は、本発明による方法に従って産生される少なくとも１つの標識化された目的タンパク質を、緩衝液などの薬学的に許容される担体および成分とともに含む医薬組成物または診断用組成物に関する。
【００４６】
前記目的タンパク質が、標識および目的タンパク質の化学量論比例えば約１：１で標識化される、本発明による医薬組成物または診断用組成物が好ましい。２つまたは偶数のいくつかの標識を単一／複数の目的タンパク質に結合させることもできる。
【００４７】
次いで、本発明の別の態様は、本発明による診断用組成物を、任意選択で、イムノアッセイを実施するためのその他の成分とともに含む診断用キットに関する。キットは、共同のまたは別々の容器に、微生物組換えトランスグルタミナーゼ、例えば本明細書に記載されるＫｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ微生物トランスグルタミナーゼと少なくとも８０％の配列同一性を有する精製済み微生物トランスグルタミナーゼを含んでいてよい。キットは、ペプチド配列ＲＹＥＳＫと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミン供与体タグを含む基質などの基質をさらに含んでいてよい。キットは、本発明による標識化されたまたは標識化されていない基質の使用が必要な反応（例えばイムノアッセイ）を実施するための説明書も含んでいてよい。
【００４８】
本発明の別の態様は、具体的には、定量化が望ましい場合の免疫学的反応およびアッセイにおける、目的タンパク質を標識化するためのまたは目的タンパク質の標識化での、本発明による組換えトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）基質、医薬組成物または診断用組成物、またはキットの使用に関する。
【００４９】
本発明の方法は、インビボでもインビトロでも、具体的には実験動物でも培養物でも実施可能である。
これより、本発明について、添付の図を参照して以下の非限定的な例でさらに説明を行う。本発明において、本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献が、その全内容にわたって参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ由来のトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列（データベース番号ＷＰ_０３０１１１９７６）、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｌｙＤのアミノ酸配列、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＡＫ２４のｓｌｙＤのアミノ酸配列、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍのｓｌｙＤのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】以下の実施例による、Ｃｙ３またはＣｙ５を使用した標識化の結果を示す図である。図２Ｂは、６．２〜９．０の範囲では比較的ｐＨ非依存であることを示す。
【図３】図３Ａは、ルテニウム（ｒｈｕｔｅｎｉｕｍ）で標識化された融合構築物の一般的な構造を示す図である。図３Ａは、以下の実施例による、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した標識化の結果を示す図である。
【図４】本発明による、基質を標識化された目的タンパク質（ここでは、抗体の鎖２本）の好ましい実施形態を示す図である。
【図５−１】図５Ａ：配列番号６０の「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」を示す概略図である。ＳｌｙＤ部分、さらに実施例で示す、融合タンパク質中のＱ−タグ、および第Ｘａ因子プロテアーゼの認識部位、および「ｇｐ２１」部分が示される。星はルテニウム標識を象徴する。図５Ｂ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓの細菌トランスグルタミナーゼによる、組換えｇｐ２１（ＨＴＬＶ）抗原の特異的および非特異的ルテニウム標識化について示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の結果を示す図である。Ｒｕ標識化後の、非標識化、一重標識化、二重標識化、および三重標識化された「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」融合タンパク質が示される。
【図５−２】図５Ｃ：ルテニウム標識について示す図である。
【図６−１】図６Ａ：Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにおいて、配列番号６２による標識化された「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」を使用した結果を示す図である。
【図６−２】図６Ｂ−Ｄ：Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにおいて、配列番号６２による標識化された「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」を使用した結果を示す図である。
【図６−３】図６Ｅ：Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにおいて、配列番号６２による標識化された「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」を使用した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
配列番号１〜２２は、本発明の文脈で特定されるＱ−タグモチーフの配列を示し、Ｎ末端のＸは上記の通りＸ１、Ｃ末端のＸは上記の通りＸ２である。
配列番号２３は、Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ由来のトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列（データベース番号ＷＰ_０３０１１１９７６）を示す。
【００５２】
配列番号２４は、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｌｙＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＡＫ２４のｓｌｙＤのアミノ酸配列を示す。
【００５３】
配列番号２６は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＦのｓｌｙＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｌｙＤのＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号２８は、Ｅ．ｃｏｌｉのＦＫＢＰ１６のＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｌｙＤのＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５５】
配列番号３０〜５１は、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸が１つの例示的なグリシンリンカーである、本発明の文脈で特定されるＱ−タグモチーフの配列を示す。
配列番号５２は、ＳｌｙＤのＦＫＢＰドメインに組換えにより移植された、ＫａｌｂＴＧグルタミン供与体配列のアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号５３は、トランスグルタミナーゼリジン供与体配列（Ｋ−タグ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５４はＳｌｙＤアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号５５は、ＭＴＧ  Ｑ−タグを有するＳｌｙＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、ＫａｌｂＴＧ  Ｑ−タグを有するＳｌｙＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号５７はＳｌｐＡアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号５８は、主要なＨＴＬＶ抗原およびウイルスエンベロープ糖タンパク質アミノ酸配列「ｇｐ２１」を示す。
配列番号５９は、イムノアッセイにおけるより良好な溶解性、安定性および反応性のために操作された、改変「ｇｐ２１」エクトドメインポリペプチド配列のアミノ酸配列を示す。
【００５９】
配列番号６０は、組換え融合タンパク質「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、組換え融合タンパク質「ＴｔＳｌｙＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」のアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号６２は、組換え融合タンパク質「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００６１】
ＩＦドメインの位置の特定
基本的には、例えばプログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを使用して、置換される（または付加される）ＩＦドメインの位置を特定するため、ＦＫＢＰドメインのアミノ酸配列の一次構造のアラインメントを使用することができる。ドメインが構造的に保存されたエレメントを構成することから、特に非細菌ＦＫＢＰに関しては、代替法は３Ｄ構造のアラインメントである（例えばプログラムＰｙＭｏｌを使用して）。
【００６２】
具体的な例は以下の通りである：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（株Ｋ１２）ＦＫＢＰドメインのＳＬＹＤ_ＥＣＯＬＩ  ＦＫＢＰ型ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＳｌｙＤ、ＩＦドメインに二重下線を引いてある。
【００６３】
【化１】
2019508366.tif 000003
【００６４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（株Ｋ１２）ＦＫＢＰドメインのＥＣＯＬＩ  ＦＫＢＰ型１６ｋＤａペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ、ＩＦドメインに二重下線を引いてある。
【００６５】
【化２】
2019508366.tif 000004
【００６６】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（株ＨＢ８／ＡＴＣＣ２７６３４）ＦＫＢＰドメインのペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ、ＩＦドメインに二重下線を引いてある。
【００６７】
【化３】
2019508366.tif 000005
【００６８】
ＫａｌｂＴＧに対するＱ−タグ配列の分析
ＮおよびＣ末端グリシン残基３つ（Ｇ１およびＧ２）が結合した５−ｍｅｒアミノ酸配列を含む一連のペプチドを用いた標識化アッセイを使用して特定されたＫａｌｂＴＧペプチド基質の分析により、これらの基質が共有する一連の特徴が明らかとなった。具体的な例は以下の通りであった：
Ｇ１−ＹＲＹＲＱ−Ｇ２（配列番号３０）、Ｇ１−ＲＹＲＱＲ−Ｇ２（配列番号３１）、Ｇ１−ＲＹＳＱＲ−Ｇ２（配列番号３２）、Ｇ１−ＦＲＱＲＱ−Ｇ２（配列番号３３）、Ｇ１−ＲＱＲＱＲ−Ｇ２（配列番号３４）、Ｇ１−ＦＲＱＲＧ−Ｇ２（配列番号３５）、Ｇ１−ＱＲＱＲＱ−Ｇ２（配列番号３６）、Ｇ１−ＹＫＹＲＱ−Ｇ２（配列番号３７）、Ｇ１−ＱＹＲＱＲ−Ｇ２（配列番号３８）、Ｇ１−ＹＲＱＴＲ−Ｇ２（配列番号３９）、Ｇ１−ＬＲＹＲＱ−Ｇ２（配列番号４０）、Ｇ１−ＹＲＱＳＲ−Ｇ２（配列番号４１）、Ｇ１−ＹＱＲＱＲ−Ｇ２（配列番号４２）、Ｇ１−ＲＹＴＱＲ−Ｇ２（配列番号４３）、Ｇ１−ＲＦＳＱＲ−Ｇ２（配列番号４４）、Ｇ１−ＱＲＱＴＲ−Ｇ２（配列番号４５）、Ｇ１−ＷＱＲＱＲ−Ｇ２（配列番号４６）、Ｇ１−ＰＲＹＲＱ−Ｇ２（配列番号４７）、Ｇ１−ＡＹＲＱＲ−Ｇ２（配列番号４８）、Ｇ１−ＶＲＹＲＱ−Ｇ２（配列番号４９）、Ｇ１−ＶＲＱＲＱ−Ｇ２（配列番号５０）、およびＧ１−ＹＲＱＲＡ−Ｇ２（配列番号５１）。
【００６９】
ＫａｌｂＴＧについて、式Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５を有する５−ｍｅｒアミノ酸配列を含むアシル供与体基質が、Ｘａａが任意のアミノ酸である場合に、概していくつかの設計ルールに従うことがデータより明らかとなった。まず、各５−ｍｅｒ配列は少なくとも１つのグルタミン（Ｑ）を含んでいた。より具体的には、５−ｍｅｒ配列の第３、第４、および第５位（すなわち、Ｘａａ３、Ｘａａ４、およびＸａａ５）のうち少なくとも１つがグルタミンであった。第３および第５位のそれぞれにグルタミンを含む配列がいくつか観察された。さらに、各５−ｍｅｒ配列が少なくとも１つのアルギニン（Ｒ）を含むことが観察された。より具体的には、５−ｍｅｒ配列の第４および第５位（すなわち、Ｘａａ４およびＸａａ５）のうち少なくとも１つがアルギニンであった。
【００７０】
標識化アッセイ
１．蛍光色素
標識化アッセイでは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のシャペロンＳｌｙＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）番号Ｑ５ＳＬＥ７）を、ＫａｌｂＴＧに対する標識化スキャホールドとして使用した。ＳｌｙＤ配列は：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＰＨＤＰＥＧＶＱＶＶＰＬＳＡＦＰＥＤＡＥＶＶＰＧＡＱＦＹＡＱＤＭＥＧＮＰＭＰＬＴＶＶＡＶＥＧＥＥＶＴＶＤＦＮＨＰＬＡＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨ（配列番号２９）
である。
【００７１】
ＫａｌｂＴＧグルタミン供与体配列（Ｑ−タグ、下線）を、ＳｌｙＤのＦＫＢＰドメインに組換えにより移植し、以下のポリペプチド配列を得た：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧＧＧＧＲＹＲＱＲＧＧＧＧＧＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号５２）。
【００７２】
８Ｘ−ヒスチジン−タグ付きタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ  Ｂｌ２１  Ｔｕｎｅｒで産生させ、標準的なＮｉセファロースベースの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ペプチドは全て、標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）ベースの固相ペプチド合成により合成した。
【００７３】
（Ｎ末端〜Ｃ末端の順序で）Ｚ−保護基（すなわちカルボキシベンジル基）、トランスグルタミナーゼリジン供与体配列（Ｋ−タグ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｏ２Ｏｃ）、ペプチド、およびＣｙ３またはＣｙ５蛍光色素を有するように、標識化されたペプチドを化学的に合成した。標識化されたペプチドの一次化学構造は：
Ｚ−ＲＹＥＳＫＧ−Ｏ２Ｏｃ−ＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵＥＵ−Ｃ（ｓＣｙ３−ＭＨ）−ＯＨ（配列番号５３）
であった。
【００７４】
２００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．２および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に７２μＭ基質タンパク質、７２０μＭ標識ペプチドおよび１μＭトランスグルタミナーゼが存在する状態で、３７℃で１５分間標識化反応を実施した。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍＭ  Ｋ−タグ−Ｃｙ５または−Ｃｙ３を添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。５０ｍＭ  ＴＣＡを添加して反応を停止させた。インキュベーションステップの間に試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、インゲル蛍光（ｉｎ−ｇｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃゲルドキュメンテーションシステム、Ｃｙ３およびＣｙ５ＬＥＤならびにフィルターセット）で分析した。結果を図２に示す。
【００７５】
２．ルテニウム（ｒｈｕｔｅｎｉｕｍ）標識
標識がルテニウム（ｒｈｕｔｅｎｉｕｍ）標識である、ｓｌｙＤ  Ｑ−タグｇｐ２１融合物（図３Ｂを参照のこと）からなる同様のＱ−タグ構築物について試験した。図３ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、標識対構築物が良好な１：１比であることを示している。
【００７６】
ビオチンおよびルテニウムで標識化されたＴｔＳｌｙＤ−ｇｐ２１（ＨＴＬＶ）抗原の産生
さらなる標識化アッセイでは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のシャペロンＳｌｙＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）番号Ｑ５ＳＬＥ７）、ＨＴＬＶウイルスエンベロープ糖タンパク質「ｇｐ２１」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ２２４０３２．１）および、一例では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のシャペロンＳｌｐＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＭ０）の間の組換え融合物を、ＭＴＧまたはＫａｌｂＴＧに対する標識化スキャホールドとして使用した。ＳｌｙＤ配列は：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＰＨＤＰＥＧＶＱＶＶＰＬＳＡＦＰＥＤＡＥＶＶＰＧＡＱＦＹＡＱＤＭＥＧＮＰＭＰＬＴＶＶＡＶＥＧＥＥＶＴＶＤＦＮＨＰＬＡＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨ（配列番号５４）
である。
【００７７】
ＭＴＧまたはＫａｌｂＴＧグルタミン供与体配列（Ｑ−タグ）を、ＳｌｙＤのＦＫＢＰドメインに組換えにより移植し、以下のポリペプチド配列を得た：
ＭＴＧ  Ｑ−タグを有するＳｌｙＤ：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧＧＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨ（配列番号５５）
ＫａｌｂＴＧ  Ｑ−タグを有するＳｌｙＤ：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧＧＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨ（配列番号５６）
ＳｌｐＡ配列は：
ＭＳＥＳＶＱＳＮＳＡＶＬＶＨＦＴＬＫＬＤＤＧＴＴＡＥＳＴＲＮＮＧＫＰＡＬＦＲＬＧＤＡＳＬＳＥＧＬＥＱＨＬＬＧＬＫＶＧＤＫＴＴＦＳＬＥＰＤＡＡＦＧＶＰＳＰＤＬＩＱＹＦＳＲＲＥＦＭＤＡＧＥＰＥＩＧＡＩＭＬＦＴＡＭＤＧＳＥＭＰＧＶＩＲＥＩＮＧＤＳＩＴＶＤＦＮＨＰＬＡＧＱＴＶＨＦＤＩＥＶＬＥＩＤＰＡＬＥＡ（配列番号５７）
である。
【００７８】
主要なＨＴＬＶ抗原およびウイルスエンベロープ糖タンパク質配列「ｇｐ２１」は：
ＩＶＳＳＡＣＮＮＳＬＩＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＶＧＳＲＳＲＲＡＶＰＶＡＶＷＦＶＳＡＬＡＭＧＡＧＶＡＧＧＩＴＧＳＭＳＬＡＳＧＫＳＬＬＨＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＡＩＶＫＮＨＫＮＬＬＫＩＡＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＬＱＥＱＣＣＦＬＮＩＴＮＳＨＶＳＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲＶＬＴＧＷＧＬＮＷＤＬＧＬＳＱＷＡＲＥＡＬＱＴＧＩＴＬＶＡＬＬＬＬＶＩＬＡＧＰＣＩＲＣＰＣＲＴＭＨＰ（配列番号５８）
である。
【００７９】
イムノアッセイにおけるより良好な溶解性、安定性および反応性のために操作された、ｇｐ２１エクトドメインポリペプチド配列は：
ＭＳＬＡＳＧＫＳＬＬＨＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＡＩＶＫＮＨＫＮＬＬＫＩＡＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＡＫＡＬＱＥＱＡＡＦＬＮＩＴＮＳＨＶＳＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲＶＬＴＧＷＧＬＮＷＤＬＧＬＳＱＷＡＲＥＡＬＱＴＧ（配列番号５９）
である。
【００８０】
標識化アッセイに使用した組換え融合物配列は：
「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧＧＧＧＤＹＡＬＱＧＧＧＧＧＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＩＥＧＲＭＳＬＡＳＧＫＳＬＬＨＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＡＩＶＫＮＨＫＮＬＬＫＩＡＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＡＫＡＬＱＥＱＡＡＦＬＮＩＴＮＳＨＶＳＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲＶＬＴＧＷＧＬＮＷＤＬＧＬＳＱＷＡＲＥＡＬＱＴＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６０）
「ＴｔＳｌｙＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＰＨＤＰＥＧＶＱＶＶＰＬＳＡＦＰＥＤＡＥＶＶＰＧＡＱＦＹＡＱＤＭＥＧＮＰＭＰＬＴＶＶＡＶＥＧＥＥＶＴＶＤＦＮＨＰＬＡＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＩＥＧＲＭＳＬＡＳＧＫＳＬＬＨＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＡＩＶＫＮＨＫＮＬＬＫＩＡＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＡＫＡＬＱＥＱＡＡＦＬＮＩＴＮＳＨＶＳＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲＶＬＴＧＷＧＬＮＷＤＬＧＬＳＱＷＡＲＥＡＬＱＴＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６１）
「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧＧＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＭＳＥＳＶＱＳＮＳＡＶＬＶＨＦＴＬＫＬＤＤＧＴＴＡＥＳＴＲＮＮＧＫＰＡＬＦＲＬＧＤＡＳＬＳＥＧＬＥＱＨＬＬＧＬＫＶＧＤＫＴＴＦＳＬＥＰＤＡＡＦＧＶＰＳＰＤＬＩＱＹＦＳＲＲＥＦＭＤＡＧＥＰＥＩＧＡＩＭＬＦＴＡＭＤＧＳＥＭＰＧＶＩＲＥＩＮＧＤＳＩＴＶＤＦＮＨＰＬＡＧＱＴＶＨＦＤＩＥＶＬＥＩＤＰＡＬＥＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＩＥＧＲＭＳＬＡＳＧＫＳＬＬＨＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＡＩＶＫＮＨＫＮＬＬＫＩＡＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＡＫＡＬＱＥＱＡＡＦＬＮＩＴＮＳＨＶＳＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲＶＬＴＧＷＧＬＮＷＤＬＧＬＳＱＷＡＲＥＡＬＱＴＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）
であった。
【００８１】
８Ｘ−ヒスチジン−タグ付きタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ  Ｂｌ２１  Ｔｕｎｅｒで産生させ、標準的なＮｉセファロースベースの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
【００８２】
（Ｎ末端〜Ｃ末端の順序で）「Ｚ−」基（すなわちカルボキシベンジル基）、トランスグルタミナーゼリジン供与体配列（Ｋ−タグ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド、およびビオチン標識またはビピリミジンルテニウム（ＢＰＲｕ）複合体を有するように、標識化されたペプチドを化学的に合成した。標識化されたペプチドの一次化学構造は：
ＫａｌｂＴＧ  Ｋ−タグ−Ｂｉ（「Ｂｉ」はビオチン標識を表す）：
Ｚ−ＲＹＥＳＫＧ−ＰＥＧ２７−Ｋ（Ｂｉ）−ＯＨ（２５３２．０ｇ／ｍｏｌ）
ＫａｌｂＴＧ  Ｋ−タグ−Ｒｕ（「Ｒｕ」は、電気化学発光用のルテニウムベースの標識を表す）：
Ｚ−ＲＹＥＳＫＧ−ＰＥＧ２７−Ｋ（ＢＰＲｕ）−ＯＨ（２９５８．４ｇ／ｍｏｌ）
であった。
【００８３】
別途注記されない限り、典型的な標識化反応は、ＫａｌｂＴＧ酵素による標識化では、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．４に６５μＭ基質タンパク質、１０００μＭ標識ペプチドおよび０．１μＭトランスグルタミナーゼが存在する状態で３７℃で、またＭＴＧ酵素では２００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．４中に７２μＭ基質タンパク質、７２０μＭ標識ペプチドおよび１μＭトランスグルタミナーゼが存在する状態で３７℃で、１５分間実施した。トランスグルタミナーゼによる標識化については、出願ＵＳ２０１６／０１７８６２７「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」およびＷＯ２０１６／０９６７８５「ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＲＡＮＳＧＬＵＴＡＭＩＮＡＳＥ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＦＯＲ」により詳細に記載されている。
【００８４】
標識化反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離し、標識化された融合タンパク質を含む画分をその後の分析用に単離した。
【００８５】
ビオチンおよびルテニウム標識化の分析ならびにイムノアッセイ
標識化反応の質および量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ビオチン標識化の効率は、クーマシー染色したゲルにおけるバンドの分子量変化により推定した。ルテニウム標識化の効率は、クーマシー染色したゲルにおけるバンドの分子量変化、およびインゲル蛍光（ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃゲルドキュメンテーションシステム、Ｃｙ３ＬＥＤおよびフィルターセット）により推定した。Ｅｌｅｃｓｙｓ  ｅ４１１装置で、製造業者の説明書に従い、試験の試薬Ｒ１におけるビオチン標識化された抗原部分を、ＭＴＧでビオチン標識化された「ＴｔＳｌｙＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」またはＫａｌｂＴＧでビオチン標識化された「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」でそれぞれ置き換え、かつ、試験の試薬Ｒ２におけるルテニウム標識化された抗原部分を、ＭＴＧでルテニウム標識化された「ＴｔＳｌｙＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」またはＫａｌｂＴＧでルテニウム標識化された「ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」でそれぞれ置き換えて、診断用イムノアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  ＨＴＬＶ  Ｉ／ＩＩ）を実施した。ＨＴＬＶ陽性血清および市販のＨＴＬＶ  Ｉ／ＩＩキットを用いて陽性対照を実施した。ＨＴＬＶ陰性血清、ならびに様々なキャリブレータおよび対照溶液と組み合わせたＨＴＬＶ陽性血清を用いて陰性対照を実施した。
【００８６】
結果については、図５および６を参照のこと。
ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈルテニウム標識化の質量分析
図５Ａは、配列番号６０の融合タンパク質「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」を図式的に示す。図５Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓの細菌トランスグルタミナーゼによる、組換えｇｐ２１（ＨＴＬＶ）抗原の特異的および非特異的ルテニウム標識化について示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の結果を示す。Ｒｕ標識化後の、非標識化、一重標識化、二重標識化、および三重標識化された「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」融合タンパク質が示される。Ｒｕ−標識については図５Ｃを参照のこと。
【００８７】
ルテニウム標識化された融合タンパク質のプールされた２つの画分、［１］ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ＿Ｆｒａｃｔｉｏｎ１７〜１９および［２］ＴｔＳｌｙＱＤＸａ−ｇｐ２１−８Ｈ＿Ｆｒａｃｔｉｏｎ２０〜２３について分析した；非標識化「ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ」タンパク質は、対照（ＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ）として機能した。
【００８８】
ペプチドマッピングを実施した。トリプシンによる消化、クロマトグラフィー分離、その後のＭＳ／ＭＳ分析、および手動の解釈ツールと組み合わせたデータベース検索によるペプチドマッピング後、以下のことが発見された：
【００８９】
【化４】
2019508366.tif 000006
【００９０】
上記（ａ〜ｃ）で与えられるＴｔＳｌｙＱＤ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈトリプシンペプチドのアミノ酸配列には太字でかつ下線を引いて印を付けている：
【００９１】
【化５】
2019508366.tif 000007
【００９２】
Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａの細菌トランスグルタミナーゼを使用してビオチンおよびルテニウムにより部位特異的に標識化された組換えｇｐ２１（ＨＴＬＶ）抗原により、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩインビトロ診断用アッセイにおける本発明の利点が実証される。
【００９３】
結果を図６および以下に提示する。
図６Ａは、ルテニウムおよびビオチン標識化されたｇｐ２１抗原（Ｑ＝ＫａｌｂＴＧ  Ｑ−タグ、Ｌ＝リンカー、Ｘａ＝第Ｘａ因子切断部位、８Ｈ＝Ｈｉｓ−タグ）の一次構造、および診断検査の原理を示す概略図を示す；患者試料由来の血清抗体（赤）が、ビオチンおよびルテニウム標識化された抗原（緑）を架橋している。
【００９４】
図６Ｂ〜Ｄ：ＫａｌｂＴＧによるｇｐ２１の一重ビオチンまたはルテニウム標識化について示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ：ビオチン標識化を示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、レーン１：染色済みタンパク質分子量マーカー、レーン２：ＫａｌｂＴＧおよびビオチン標識とともにインキュベートしたＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ。Ｃ：ルテニウム標識化を示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、レーン３ａ：ＫａｌｂＴＧおよびルテニウム標識とともにインキュベートしたＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ、レーン４ａ：未改変ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈ（対照）。Ｄ：Ｃに示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の蛍光画像。レーン３ｂ〜４ｂはレーン３ａ〜４ａに対応する。
【００９５】
図６Ｅ：ＭＴＧで標識化された試薬または市販のキット（対照）試薬を使用した、ＨＴＬＶ抗体についての血清陰性（左）および陽性（右）での、Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイ（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ）。対照における標識化のための化学量論組成が１：１より大きいため、陽性対照シグナルがＫａｌｂＴＧで標識化されたｇｐ２１シグナルより高いことに留意されたい。つまり、ＫａｌｂＴＧで標識化された分子はより少ない標識を保持する。測定は二連で実施し、平均シグナルを示した。
【００９６】
ＴｔＳｌｙＫＱＤ−ＳｌｐＡ−Ｘａ−ｇｐ２１−８Ｈのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＫＶＧＱＤＫＶＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧＧＧＧＹＲＹＲＱＧＧＧＧＧＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥＬＬＨＧＨＡＨＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＭＳＥＳＶＱＳＮＳＡＶＬＶＨＦＴＬＫＬＤＤＧＴＴＡＥＳＴＲＮＮＧＫＰＡＬＦＲＬＧＤＡＳＬＳＥＧＬＥＱＨＬＬＧＬＫＶＧＤＫＴＴＦＳＬＥＰＤＡＡＦＧＶＰＳＰＤＬＩＱＹＦＳＲＲＥＦＭＤＡＧＥＰＥＩＧＡＩＭＬＦＴＡＭＤＧＳＥＭＰＧＶＩＲＥＩＮＧＤＳＩＴＶＤＦＮＨＰＬＡＧＱＴＶＨＦＤＩＥＶＬＥＩＤＰＡＬＥＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＩＥＧＲＭＳＬＡＳＧＫＳＬＬＨＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＡＩＶＫＮＨＫＮＬＬＫＩＡＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＡＫＡＬＱＥＱＡＡＦＬＮＩＴＮＳＨＶＳＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲＶＬＴＧＷＧＬＮＷＤＬＧＬＳＱＷＡＲＥＡＬＱＴＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）。
【図１】
2019508366.tif 000008
【図２】
2019508366.tif 000009
【図３】
2019508366.tif 000010
【図４】
2019508366.tif 000011
【図５−１】
2019508366.tif 000012
【図５−２】
2019508366.tif 000013
【図６−１】
2019508366.tif 000014
【図６−２】
2019508366.tif 000015
【図６−３】
2019508366.tif 000016
【配列表】
2019508366000001.app
【国際調査報告】
2019508366.tif 000017
2019508366.tif 000018
2019508366.tif 000019
2019508366.tif 000020
2019508366.tif 000021