(57)【要約】  本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の共有結合型閉環状（ｃｃｃ）ＤＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド組成物を提供する。また、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害、例えば、慢性Ｂ型肝炎感染症、肝不全又は肝硬変、及び肝細胞癌を有すると診断された、又は疑われる対象を治療するための方法も開示される。
2019533472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１００のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノム配列内の複数のヌクレオチドに相補的である配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、前記ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６７〜ヌクレオチド位置１３２２に対応するゲノム領域に存在する少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列が、配列番号１〜６５からなる群から選択される、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、第２のヌクレオチドに対するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有する少なくとも１つの第１のヌクレオチドを含有し、前記第１のヌクレオチドが、Ｆ及びＯ−アルキルからなる群から選択される置換で２’位において修飾され、前記Ｏ−アルキルが、任意にアルコキシで置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
シトシン核酸塩基を有する前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、２’−Ｏ−Ｍｅ、５−メチルシトシン（５ｍｍＣ）であるように修飾され、各他のヌクレオチドが、２’位においてＯ−Ｍｅ修飾（ｍＡ、ｍＧ及びｍＵ）を含むように修飾され、各ヌクレオチドが、ヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含有する、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列が、配列番号６６〜７２及び７４〜８２からなる群から選択される、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、第２のヌクレオチドに対するチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を有する少なくとも１つの第１のヌクレオチドを含有し、前記第１のヌクレオチドが、Ｆ及びＯ−アルキルからなる群から選択される置換で２’位において修飾され、前記Ｏ−アルキルが、任意にアルコキシで置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
シトシン核酸塩基を有する前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、２’−Ｏ−Ｍｅ、５−メチルシトシン（５ｍｍＣ）を含むように修飾され、各他のヌクレオチドが、２’位においてＯ−Ｍｅ修飾（ｍＡ、ｍＧ及びｍＵ）を含むように修飾され、各ヌクレオチドが、ヌクレオチド間にチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を含有する、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列が、配列番号７３である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドに共役された少なくとも１つの標的化部分を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドに共役された前記標的化部分が、ＧａｌＮＡｃ、パルミトイル及びトコフェロール誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列が、配列番号８０〜８２からなる群から選択される、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ＨＢＶの治療を必要とする対象において前記治療を行う方法であって、有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列が、配列番号１〜８２からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドの投与が、前記対象におけるＨＢｅＡｇレベル、ＨＢｓＡｇレベル又はＨＢＶ  ＤＮＡレベルのうちの少なくとも１つの減少をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドの投与が、前記対象におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの低減をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
抗ウイルス剤、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド類似体、逆転写酵素阻害剤、免疫調節物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害剤、カプシド阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｃｃｃＤＮＡ阻害剤からなる群から選択される１種又は２種以上の追加の治療剤を、別個に、連続的に又は同時に前記対象に投与することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＢＶの前記治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年１１月１１日出願の米国出願第６２／４２０，８０１号及び２０１７年９月１４日出願の同第６２／５５８，７７０号の利益及び優先権を主張するものであり、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus、ＨＢＶ）の共有結合型閉環状（covalently closed circular、ｃｃｃ）ＤＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド組成物、並びにＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害、例えば、慢性Ｂ型肝炎感染症を有すると診断された、又は疑われる対象を治療するために、それを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本開示の背景の以下の説明は、単に本開示を理解する助けとして提供され、そのような開示が本開示の先行技術であることを容認することを意図するものではない。
【０００４】
ＨＢＶは、複製プロセスにおいて逆転写酵素を利用する数少ないＤＮＡウイルスのうちの１つであり、この複製プロセスは、核へのウイルスゲノムの侵入、脱殻、及び輸送を含む複数の段階を伴う。最初に、ＨＢＶゲノムの複製は、ＲＮＡ中間体の生成を伴い、中間体は次いで逆転写されてＤＮＡウイルスゲノムを産生する。ＨＢＶで細胞を感染させると、ウイルスゲノム弛緩型環状ＤＮＡ（relaxed circular DNA、ｒｃＤＮＡ）は、細胞核内に輸送され、ウイルスｍＲＮＡの転写テンプレートとして機能するエピソーム二本鎖の共有結合型閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換される。転写及び核輸出後、細胞質ウイルスプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）は、ＨＢＶポリメラーゼ及びカプシドタンパク質とアセンブルされてヌクレオカプシドを形成し、その中で、ポリメラーゼ触媒による逆転写により、マイナス鎖ＤＮＡが得られ、これはその後、プラス鎖ＤＮＡにコピーされて、子孫ｒｃＤＮＡゲノムを形成する。次いで、成熟ヌクレオカプシドは、ウイルスエンベロープタンパク質と共にパッケージ化され、ビリオン粒子として退出するか、又は細胞内ｃｃｃＤＮＡ増幅経路を通してｃｃｃＤＮＡリザーバを増幅するために核に移送される。ｃｃｃＤＮＡは、ＨＢＶ複製サイクルの必須成分であり、感染及びウイルス持続の確立に関与する。
【０００５】
世界中の少なくとも２億５千万人が、逆転写を通して複製する肝変性ＤＮＡウイルスである、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性的に感染している。慢性感染は、終末期肝疾患のリスクを大幅に増加させる。現在の療法は、共有結合型閉環状（ｃｃｃ）ＤＮＡと呼ばれる細胞内ウイルス複製中間体の難治性のために、完全な治癒を達成することはめったにない。感染時に、ｃｃｃＤＮＡは、入ってくるビリオン中のタンパク質結合した弛緩型環状（ＲＣ）ＤＮＡゲノムから、宿主細胞核内のプラスミド様のエピソームとして生成される。ｃｃｃＤＮＡは、全てのウイルスＲＮＡ、したがって新しいビリオンのテンプレートとして機能する。ｃｃｃＤＮＡは、急性ＨＢＶ感染から回復した患者において数十年間にわたって持続し得る。
【０００６】
蓄積する証拠は、ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体（ＮＡ）又はインターフェロン（interferon、ＩＦＮ）などの現在の抗ウイルス治療単独では、ｃｃｃＤＮＡの持続性のために、ほとんどの慢性Ｂ型肝炎（chronic hepatits B、ＣＨＢ）患者を治癒できないことを実証している。ＮＡは、ウイルスポリメラーゼを直接阻害することによってＨＢＶ複製を抑制する一方で、ＩＦＮは、ＨＢＶ感染症に対する宿主免疫を強化する。ウイルスのリバウンドは、抗ウイルス治療の中止後に起こることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ｃｃｃＤＮＡを標的とする新規抗ウイルス剤の必要性があるか、又はそれ故にｃｃｃＤＮＡを含有する肝細胞は、慢性ＨＢＶ感染を治癒するために必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、オリゴヌクレオチド及びその医薬組成物を対象とする。オリゴヌクレオチドは、配列番号１００のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノム配列内の複数のヌクレオチドに相補的である配列を含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノム内の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である配列を含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内で少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６７〜ヌクレオチド位置１３２２に対応する領域に存在する、少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である配列を含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１〜６５のうちのいずれか１つである。
【０００９】
実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、第２のヌクレオチドに対するホスホロチオエート（ＰＳ）結合又はチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を有する少なくとも１つの第１のヌクレオチドを含有する。実施形態では、第１のヌクレオチドは、フッ素（Ｆ）又はＯ−アルキル、例えばＯ−メチル（Ｏ−Ｍｅ）、Ｏ−エチル（Ｏ−Ｅｔ）等を含む置換で、２’位において更に修飾される。Ｏ−アルキルは、アルコキシ、例えばＯ−メチル（Ｏ−Ｍｅ）、Ｏ−エチル（Ｏ−Ｅｔ）等で更に置換されてもよい。実施形態では、シトシン核酸塩基を有する任意の第１のヌクレオチドは、メチルシトシンであるように更に修飾される。
【００１０】
実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、２’位におけるＯ−メチル置換と共に、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合又はチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を含有し、シトシン核酸塩基を有する任意のヌクレオチドは、メチルシトシン核酸塩基を含むように更に修飾される。実施形態では、配列番号１〜６５を有するオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、２’位におけるＯ−メチル置換と共に、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合又はチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を含有し、シトシン核酸塩基を有する任意のヌクレオチドは、メチルシトシン核酸塩基を含むように更に修飾される。実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６６〜７９のうちのいずれか１つである。
【００１１】
実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに共役された少なくとも１つの標的化部分を含有するように修飾される。オリゴヌクレオチドに共役された標的化部分は、ＧａｌＮＡｃ、パルミトイル又はトコフェロール誘導体であってもよい。実施形態では、配列番号１〜７９を有するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに共役された少なくとも１つの標的化部分を含有するように修飾される。実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号８０〜８２のうちのいずれか１つである。
【００１２】
実施形態では、医薬組成物は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノム内の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内で少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６７〜ヌクレオチド位置１３２２に対応する領域に存在する、少なくとも１２ヌクレオチドに相補的である配列を含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの第１のヌクレオチドは、第２のヌクレオチドに対するホスホロチオエート（ＰＳ）結合又はチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合、及び２’位においてフッ素（Ｆ）又はＯ−アルキル（任意にアルコキシで更に置換された）置換を含有するように修飾され、任意のシトシン核酸塩基は、メチルシトシンであるように更に修飾される。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端で共役されたＧａｌＮＡｃ、パルミトイル又はトコフェロール誘導体などの標的化部分で修飾される。実施形態では、医薬組成物中のオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１〜８２のうちのいずれか１つである。
【００１３】
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の治療を必要とする対象において、治療する方法を更に対象とする。本方法は、有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物を対象に投与することを含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１〜８２のうちのいずれか１つである。実施形態では、オリゴヌクレオチドの投与は、対象におけるＨＢｅＡｇレベル、ＨＢｓＡｇレベル又はＨＢＶ  ＤＮＡレベルのうちの少なくとも１つの減少をもたらす。実施形態では、オリゴヌクレオチドの投与は、対象におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの低減をもたらす。
【００１４】
本開示の方法は、抗ウイルス剤、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド類似体、逆転写酵素阻害剤、免疫調節物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害剤、カプシド阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｃｃｃＤＮＡ阻害剤からなる群から選択される１種又は２種以上の追加の治療剤を、別個に、連続的に又は同時に対象に投与することを更に含む。
【００１５】
加えて、本開示は、ＨＢＶの治療に使用するための開示されたオリゴヌクレオチドを対象とする。
【００１６】
一態様では、本開示は、配列番号１〜８２又はその修飾からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、配列番号１〜８２のうちのいずれかの相補的配列又はその修飾を含むオリゴヌクレオチドも提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内にあるＨＢＶ  ＤＮＡ配列（すなわち、ＨＢＶゲノムのヌクレオチド位置９６０と１３３０とを含めてそれらの間に位置する標的ヌクレオチド配列）を標的とする。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置９６９と位置９８７との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。ある特定の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１０９４と位置１１１６との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１１３６と位置１１５５との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１１７４と位置１１９４との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。他の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１１９４と位置１２１６との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１２９７と位置１３１５との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。
【００１９】
一態様では、本開示は、ＨＢＶ感染症若しくはＨＢＶ関連障害の治療、及び／又はＨＢＶ感染症若しくはＨＢＶ関連障害の徴候若しくは症状の治療を必要とする対象において治療するための方法を提供し、治療有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜８２からなる群から選択される配列を含む。
【００２０】
一態様では、本開示は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを配列番号１〜８２のうちのいずれか１つの配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにおけるＤループ形成を誘導するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、ヌクレオチド位置９００〜１３１０（エンハンサーＩ領域）からなるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムの標的領域を、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの標的領域に対して少なくとも９０％相補的であるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにおけるＤループ形成を誘導するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡとハイブリダイズして、抗原性Ｄループ構造の形成を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｄループ形成の誘導は、先天性免疫を刺激する。
【００２１】
一態様では、本開示は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ付近又はその中の複数のヌクレオチドに相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを提供し、ここでエンハンサーＩは、配列番号１００のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノム配列のヌクレオチド位置９００〜ヌクレオチド位置１３１０に対応する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内で少なくとも１５ヌクレオチドに相補的である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内で少なくとも１９ヌクレオチドに相補的である。
【００２２】
別の態様では、本開示は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６０〜ヌクレオチド位置１３３０に対応するゲノム領域に存在する少なくとも１５ヌクレオチドに相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを提供し、ここでＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノム配列は、配列番号１００である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６０〜ヌクレオチド位置１３３０に対応するゲノム領域に存在する、少なくとも１９ヌクレオチドに相補的である配列を含む。追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１〜８２からなる群から選択される。追加的に又は代替的に、上記実施形態のうちのいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、第２のヌクレオチドへのＰＳ結合を有する少なくとも１つの第１のヌクレオチドを含み、当該第１のヌクレオチドは、Ｆ及びＯ−アルキルからなる群から選択される置換で２’位において修飾され、当該Ｏ−アルキルは、任意にアルコキシで置換される。追加的に又は代替的に、上記の実施形態のうちのいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＰＳ結合によってオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドに結合され、Ｏ−Ｍｅで２’位において修飾される。
【００２３】
別の態様では、本開示は、ＨＢＶを治療する必要のある対象において治療する方法であって、有効量の本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれかを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域内で少なくとも１５ヌクレオチドに相補的である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６０〜ヌクレオチド位置１３３０に対応するゲノム領域に存在する、少なくとも１９ヌクレオチドに相補的である配列を含む。追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１〜８２からなる群から選択される。
【００２４】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの投与は、対象におけるＨＢｅＡｇレベル、ＨＢｓＡｇレベル又はＨＢＶ  ＤＮＡレベルのうちの少なくとも１つの減少をもたらす。追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの投与は、対象におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの肝臓レベルの低減をもたらす。オリゴヌクレオチドは、経口、局所、全身、静脈内、皮下、経皮、髄腔内、鼻腔内、腹腔内、肝内又は筋肉内投与され得る。
【００２５】
追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、本方法は、抗ウイルス剤、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド類似体、逆転写酵素阻害剤、免疫調節物質、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害剤、カプシド阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｃｃｃＤＮＡ阻害剤からなる群から選択される１種又は２種以上の追加の治療剤を、別個に、連続的に又は同時に対象に投与することを更に含む。
【００２６】
別の態様では、本開示は、ＨＢＶの治療に使用するためのオリゴヌクレオチドを提供し、ここでオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ付近又はその中の複数のヌクレオチドに相補的である配列を含み、エンハンサーＩは、配列番号１００のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９００〜ヌクレオチド位置１３１０に対応する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのヌクレオチド位置９６０〜ヌクレオチド位置１３３０に対応するゲノム領域に存在する、少なくとも１５ヌクレオチドに相補的である配列を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１〜８２からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＢＶゲノムの物理的マップを示す。ＨＢＶゲノムは、長さがおよそ３２００ヌクレオチドであり、エンハンサーＩ領域のヌクレオチド配列は、位置９００で始まり、位置１３１０で終わる。
【図２Ａ】様々な濃度の配列番号７１で治療されたＨＢＶ感染したＰＨＨのサザンブロット結果を示す。
【図２Ｂ】様々な濃度の配列番号７１で治療されたＨＢＶ感染したＰＨＨのｑＰＣＲ結果を示す。
【図２Ｃ】様々な濃度の配列番号７１で治療されたＨＢＶ感染したＰＨＨのｃｃｃＤＮＡレベルの低減率％を示す。
【図２Ｄ】様々な濃度の配列番号７５、配列番号７２及び配列番号７０で治療されたＨＢＶ感染したＰＨＨのサザンブロット結果を示す。図２Ａ〜図２Ｄにおいて、ＰＨＨを０日目にＨＢＶに感染させ、４日目に示されたｃｃｃＤＮＡ標的化オリゴヌクレオチドで治療した。１１日目にＨｉｒｔ  ＤＮＡ抽出法を使用して、ＰＨＨからＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを抽出した。
【図３Ａ】投与後２４時間、７２時間、又は１６８時間のマウスにおける、配列番号７１及び配列番号８０（配列番号７１は３’ＧａｌＮＡｃを有する）のインビボ肝臓濃度を示す。
【図３Ｂ】マウスにおける配列番号７１及び配列番号８０の肝臓Ｃｍａｘ及び肝臓半減期を示す。図３Ａ〜図３Ｂについて、１０ｍｇ／ｋｇの示されたオリゴヌクレオチドを、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウス（ｎ＝３）に皮下送達した。
【図４Ａ】配列番号７１及び配列番号７２で治療されたＨＢＶ感染したＰＨＨが、ＩＦＮ活性化遺伝子発現の増加を呈したことを示す。
【図４Ｂ】配列番号７１、配列番号７２、ＰＢＳ（陰性対照）及びレシキモド（Ｒ８４８）（陽性対照）と接触させたＰＢＭＣ（ＨＢＶ陰性ドナー由来）において観察されたサイトカイン誘導のレベルを示す。
【図５Ａ】コンセンサスＨＢＶゲノム配列（配列番号１００）を示す。
【図５Ｂ】コンセンサスＨＢＶゲノム配列（配列番号１００）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
現在の抗ウイルス療法は、細胞質ＨＢＶゲノム複製を阻害するが、これらの療法は、ウイルス転写をテンプレートとし、ウイルス持続性を維持するゲノム形態である核ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡに直接影響を及ぼさないため、治癒的ではない。したがって、ｃｃｃＤＮＡ調節を直接標的とする新規アプローチが非常に望ましい。ｃｃｃＤＮＡを直接標的とする小分子薬物又は治療用抗体の開発は困難である。
【００２９】
本開示は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの発現及び／又は活性を低減することができるオリゴヌクレオチド組成物を提供する。本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ分子のエンハンサーＩ領域において、又はその付近の標的配列にハイブリダイズし、それによってエンハンサーＩ領域において、又はその付近にＤループを生成する。理論に束縛されるものではないが、ｃｃｃＤＮＡ分子におけるＤループ構造の生成は、対象におけるＤＮＡ編集及びＤＮＡ修復機構のための合図として機能し得、おそらくＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの崩壊につながり得（Ｋａｓａｍａｔｓｕ，Ｈ．；Ｒｏｂｂｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｖｉｎｏｇｒａｄ，Ｊ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．６８（９）：２２５２−２２５７（１９７１）、Ｓｅｂｅｓｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  １２（９）：６９１−６９８（２０１３））、また宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの転写に干渉し得る。いくつかの実施形態では、Ｄループ構造の生成は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡに感染した対象における先天性免疫認識を刺激する。
【００３０】
定義
本明細書で使用するとき、数字に関して「約」という用語は、一般に、特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り（そのような数が、可能な値の０％未満又は１００％超である場合を除いて）、１％、５％又は１０％の範囲内でいずれかの方向（より大きい、又はそれ未満）に収まる数を含むと解釈される。
【００３１】
本明細書で使用するとき、対象への薬剤、薬物、又は化合物の「投与」は、対象に化合物を導入又は送達して、その意図される機能を実行する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、髄腔内、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内、若しくは皮下）、局所的、肝内、経皮的、又は本明細書に記載される任意の他の経路を含む、任意の好適な経路によって実行することができる。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。
【００３２】
本明細書で使用するとき、核酸配列に関して「増幅させる」又は「増幅」という用語は、試料中の核酸配列の集団の表現を増加させる方法を指す。核酸増幅法、例えばＰＣＲ、等温法、ローリングサークル法等は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｉｋｉ，「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ」ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９９０，ｐｐ１３−２０、Ｗｈａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｎ  １；２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４、Ｈａｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００１  Ａｐｒ；３０（４）：８５２−６，８５８，８６０の諸所を参照されたい。増幅反応においてインビトロで生成された特定の核酸配列のコピーは、「アンプリコン」又は「増幅産物」と呼ばれる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「相補的」又は「相補性」は、ポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して、塩基対合則を指す。本明細書で使用するとき、核酸配列の相補体は、１つの配列の５’末端が他方の３’末端と対になるように核酸配列と位置合わせされると、「逆平行会合」であるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。天然に存在する核酸中に通常見られないある特定の塩基は、本明細書に記載の核酸に含まれてもよい。これらには、例えば、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。相補性は、完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対、変性又は不一致塩基を含有してもよい。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度及びミスマッチ塩基対の頻度を含む多くの変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を判断することができる。相補配列はまた、ＤＮＡ配列又はその相補配列に相補的なＲＮＡ配列であり得、またｃＤＮＡでもあり得る。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「対照」は、比較目的のために実験で使用される代替的な試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が、特定の種類の疾患の治療のための治療剤の有効性の相関を決定することである場合、陽性対照（所望の治療効果を呈することが知られている化合物又は組成物）及び陰性対照（治療を受けないか又はプラセボを受ける対象又は試料）が、典型的に用いられる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「Ｄループ（変位ループ）」は、ＨＢＶの二本鎖ｃｃｃＤＮＡ分子を本開示のオリゴヌクレオチドと接触させることによって生成される、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの新たに形成された三本鎖領域を指し、ｃｃｃＤＮＡ分子の２つの鎖が、伸張のために分離され、本開示のオリゴヌクレオチドに対応する第３の鎖によって隔てられている。第３の鎖は、ｃｃｃＤＮＡの鎖のうちの１つに相補的であり、それと対合する塩基配列を有し、したがって領域内の他の相補的なｃｃｃＤＮＡ鎖を変位させる。変位された鎖は、「Ｄ」のループを形成する。
【００３６】
本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、所望の治療効果及び／又は予防効果、例えば、本明細書に記載される疾患若しくは病態、又は本明細書に記載される疾患若しくは病態に関連する１つ若しくは２つ以上の兆候若しくは症状の減少をもたらす量を指す。治療用途又は予防用途の文脈において、対象に投与される組成物の量は、その組成物、疾患の程度、種類、及び重症度、並びに個体の特性、例えば一般的な健康、年齢、性別、体重及び薬物に対する耐性などに応じて変化する。当業者であれば、これらの因子及び他の因子に応じて適当な用量を決定することができるであろう。組成物はまた、１つ又は２つ以上の追加の治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。本明細書に記載される方法において、治療組成物は、本明細書に記載される疾患又は病態の１つ又は２つ以上の兆候又は症状を有する対象に投与されてもよい。本明細書で使用するとき、組成物の「治療有効量」とは、疾患又は病態の生理学的効果が改善又は排除される組成物レベルを指す。治療有効量は、１回又は２回以上の投与で与えることができる。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「Ｂ型肝炎ウイルス」又は「ＨＢＶ」は、ヘパドナウイルス（Hepadnaviridae）科に属する周知の非カニクイザル、肝臓−トロピックＤＮＡウイルスを指す。ＨＢＶゲノムは、オーバーラップするリーディングフレームを有する、部分的に二本鎖の環状ＤＮＡである。Ｃ、Ｘ、Ｐ及びＳと呼ばれるＨＢＶゲノムによってコードされる４つの既知の遺伝子が存在する（図１を参照）。コアタンパク質は、遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によってコードされる。ＨＢｅＡｇ（エンベロープ抗原）は、プレコア（ｐｒｅ−Ｃ）タンパク質のタンパク質分解処理によって産生される。ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子Ｐによってコードされる。遺伝子Ｓは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、遺伝子を３つの領域、ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２、及びＳに分割する、３つの「開始」（ＡＴＧ）コドンをフレーム内に含有する１つの長いオープンリーディングフレームである。これらの複数の開始コドンのために、大（Ｌ）、中（Ｍ）及び小（Ｓ）と呼ばれる３つの異なるサイズのポリペプチド（それぞれ、ｐｒｅ−Ｓ１＋ｐｒｅ−Ｓ２＋Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ２＋Ｓ、又はＳ）が産生される。遺伝子Ｘは、血液中のＨＢｓＡｇが、抗ＨＢｓＡｇ抗体を隔離することを可能にし、感染性ウイルス粒子が免疫検出を逃れることを可能にする、デコイタンパク質をコードする。Ａ〜Ｈと指定された、ＨＢＶの８つの遺伝子型が同定されており、各々が明確な地理的分布を有する。用語「ＨＢＶ」は、ＨＢＶの８つの遺伝子型（Ａ〜Ｈ）のうちのいずれかを含む。本明細書で使用するとき、用語「ＨＢＶ」はまた、ＨＢＶゲノムの天然に存在するＤＮＡ配列の変動を指す。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「Ｂ型肝炎ウイルス関連疾患」又は「ＨＢＶ関連疾患」は、急性Ｂ型肝炎、急性劇症性Ｂ型肝炎、慢性肝炎Ｂ、肝不全、末期肝疾患、肝硬変、及び肝細胞癌を含む、ＨＢＶ感染及び／若しくは複製によって引き起こされるか、又はそれに関連する疾患若しくは障害を指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイズ」は、２本の実質的に相補的な核酸鎖（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドにわたって少なくとも約６５％相補的、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％相補的）が、適切にストリンジェントな条件下で互いにアニーリングし、相補的塩基対間の水素結合の形成によって二本鎖又はヘテロ二本鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは、典型的にかつ好ましくは、プローブ長の核酸分子、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜５０ヌクレオチド長で実施される。核酸ハイブリダイゼーションの手法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、使用する条件のストリンジェンシー、及び形成されたハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）などの因子によって影響される。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定的にハイブリダイズする一方で、より低い相補性を有するものがハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定及び調節する方法を理解している。ハイブリダイゼーション条件及びパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊを参照されたい。いくつかの実施形態では、特定のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で起こる。標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、プローブ又はプライマー）は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズ」する。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「個体」、「患者」、又は「対象」は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、又はヒトであり得る。好ましい実施形態では、個体、患者又は対象は、ヒトである。
【００４１】
オリゴヌクレオチドの文脈における用語「修飾」としては、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾又は３’末端修飾、（ｂ）塩基の置換又は除去を含む、核酸塩基（又は「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’及び／又は４’位における修飾を含む、糖修飾、並びに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、主鎖修飾、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
用語「修飾ヌクレオチド」は、一般に、塩基、糖、及びホスホジエステル結合又はヌクレオチドリン酸を含む主鎖部分のうちの１つ又は２つ以上の化学構造に対する修飾を有するヌクレオチドを指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「オリゴヌクレオチド」は、主に同一のモノマー単位を定義された間隔で含む主鎖上に核酸塩基の配列を有する分子を指す。塩基は、オリゴヌクレオチドの塩基に相補的である塩基の配列を有する核酸と結合することができるように、主鎖上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の主鎖を有する。２’位にヒドロキシル基を有しないオリゴデオキシリボヌクレオチドと、２’位にヒドロキシル基を有するオリゴリボヌクレオチドとの区別を行うことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えば、アリル基で置換される誘導体も含み得る。プライマー又はプローブとして機能する方法のオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも約１４〜２５ヌクレオチド長であるが、より短い又はより長いオリゴヌクレオチドが、本方法で使用されてもよい。正確なサイズは、多くの因子に依存し、これは次に、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば、化学合成、ＤＮＡ複製、プラスミド若しくはファージＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、逆転写、ＰＣＲ、又はこれらの組み合わせを含む任意の方法で生成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、メチル基、ビオチン若しくはジゴキシゲニン部分、蛍光タグの付加によって、又は放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾されてもよい。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」は、標的核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、すなわち、異なるヌクレオチド三リン酸及び適切な緩衝液中のポリメラーゼ（「緩衝剤」は、ｐＨ、イオン強度、補因子等を含む）の存在下、及び好適な温度で、核酸配列合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーのヌクレオチドのうちの１つ又は２つ以上は、例えば、メチル基、ビオチン又はジゴキシゲニン部分、蛍光タグを付加することによって、又は放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾され得る。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、プライマーの５’末端に取り付けられてもよく、プライマー配列の残部は、鎖に対して実質的に相補的である。本明細書で使用するとき、用語プライマーは、ペプチド核酸プライマー、ロック核酸プライマー、ホスホロチオエート修飾プライマー、標識プライマー等を含む、合成され得る全ての形態のプライマーを含む。本明細書で使用するとき、用語「フォワードプライマー」は、ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖にアニーリングするプライマーを意味する。「逆プライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニーリングする。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを介して標的核酸と相互作用する核酸を指す。プローブは、標的核酸配列に完全に相補的であってもよく、又は部分的に相補的であってもよい。相補性のレベルは、一般にプローブの機能に基づく多くの因子に依存する。プローブは、標識若しくは非標識であり得るか、又は当該技術分野において周知の多くの方法のうちのいずれかで修飾され得る。プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイズし得る。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであってもよい。プローブは、オリゴヌクレオチド、人工染色体、断片化人工染色体、ゲノム核酸、断片化ゲノム核酸、ＲＮＡ、組み換え核酸、断片化組み換え核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸、環状複素環のオリゴマー、又は核酸の複合体であってもよい。プローブは、修飾された核酸塩基、修飾された糖部分、及び修飾されたヌクレオチド間結合を含み得る。プローブは、典型的には、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００ヌクレオチド以上の長さである。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「試料」は、患者から得られた臨床試料を指す。好ましい実施形態では、試料は、生体源（すなわち、「生体試料」）、例えば組織、又は対象から収集された体液から得られる。試料源としては、糞便、粘液、痰（処理済又は未処理）、気管支肺胞洗浄液（bronchial alveolar lavage、ＢＡＬ）、気管支洗浄（bronchial wash、ＢＷ）、血液、体液、脳脊髄液（cerebrospinal fluid、ＣＳＦ）、尿、血漿、血清、又は組織（例えば、生検材料）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「センス鎖」は、機能性タンパク質のコード配列の少なくとも一部を含む、二本鎖ＤＮＡ（double-stranded DNA、ｄｓＤＮＡ）の鎖を意味する。「アンチセンス鎖」は、センス鎖の逆相補体であるｄｓＤＮＡの鎖を意味する。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「別個の」治療用使用は、異なる経路による、同時又は実質的に同時の、少なくとも２つの活性成分の投与を指す。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「連続的な」治療用使用は、異なる時間における少なくとも２つの活性成分の投与を指し、投与経路は、同一であるか又は異なっている。より具体的には、連続的な使用は、他の開始剤（複数可）の投与前の活性成分のうちの１つの全投与を指す。したがって、他の活性成分（複数可）を投与する前に、数分間、数時間、又は数日間にわたって活性成分のうちの１つを投与することが可能である。この場合、同時治療は行われない。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「同時」治療用使用は、少なくとも２つの活性成分を同じ経路で同時に、又は実質的に同時に投与することを指す。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも以下のようにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％  ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ、及び５×デンハルト溶液中、４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳによる４５℃での洗浄；及び０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳによる４５℃での洗浄。別の例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０個の連続ヌクレオチドにわたって３つ以上の塩基が異なる、２つの核酸のハイブリダイゼーションを可能にしてはならない。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「実質的に相補的」は、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。当業者であれば、実質的に相補的な配列は、その全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。具体的には、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする塩基の連続配列に対して３’又は５’に配置される、標的配列にハイブリダイズしない連続配列の塩基を含んでよい。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「標的配列」は、試料中に存在し、本開示のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、関心対象の核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ分子のエンハンサーＩ領域に、又はその付近にある。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドに対する標的配列のハイブリダイゼーションは、宿主ＤＮＡ修復機序によるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ分子の破壊をもたらす。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「治療する」又は「治療」は、ヒトなどの対象における疾患又は病態（例えば、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害）の治療を網羅し、（ｉ）疾患若しくは病態の発生を低減するか、若しくは疾患若しくは病態を阻害すること、すなわち、その発達を停止すること、（ｉｉ）疾患若しくは病態を緩和すること、すなわち、疾患若しくは病態の退行を引き起こすこと、（ｉｉｉ）疾患若しくは病態の進行を遅延させること、及び／又は（ｉｖ）疾患若しくは病態の１つ若しくは２つ以上の症状の発生を阻害、緩和、遅延させるか、若しくは進行を遅延させること、を含む。いくつかの実施形態では、治療は、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害の完全な治癒をもたらす。
【００５５】
ＨＢＶ感染症又はＨＢＶ関連障害は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ、又はＨＢＶ遺伝子型Ｈなどの１つ又は２つ以上のＨＢＶ遺伝子型によって引き起こされ得る。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ関連障害は、慢性肝炎Ｂ、肝不全、肝硬変、又は肝細胞癌である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００５６】
本方法のいくつかの実施形態では、対象は、正常な対照対象と比較して、上昇したＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡのレベルを示す。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドによる治療は、対象におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡのレベルを低減する。追加的に又は代替的に、本方法のいくつかの実施形態では、対象は、正常な対照対象と比較して、上昇したＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの肝臓レベルを示す。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドによる治療は、対象におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの肝臓レベルを低減する。上記の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベルは、オリゴヌクレオチドの投与後約１時間〜約８０時間低減される。
【００５７】
ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害の症状としては、肝ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの存在、血清及び／又は肝ＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ）の存在、ＡＬＴの上昇、ＡＳＴの上昇、抗ＨＢＶ抗体の非存在又は低レベル、肝傷害、肝硬変、デルタ肝炎、急性Ｂ型肝炎、急性Ｂ型劇症肝炎、慢性Ｂ型肝炎、肝線維症、末期肝疾患、肝細胞癌、血清病様症候群、食欲不振、悪心、嘔吐、微熱、筋肉痛、易疲労感、味覚力及び嗅覚異常（食物及びタバコへの嫌悪感）、右上腹部及び心窩部痛（断続的、軽度から中程度）、肝性脳症、傾眠、睡眠パターン障害、精神錯乱、昏睡、腹水、消化管出血、凝固障害、黄疸、肝腫大（ゆっくりと拡大、軟肝臓）、脾腫、手掌紅斑、くも状母斑、筋消耗、くも状血管腫、血管炎、静脈りゅう出血、末梢性浮腫、女性化乳房、精巣萎縮、腹部側副静脈（メズサの頭）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase、ＡＳＴ）の高レベル（１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬの範囲内）、ＡＳＴ値より高いＡＬＴ値、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（gamma-glutamyl transpeptidase、ＧＧＴ）及び／又はアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase、ＡＬＰ）濃度の上昇、アルブミン濃度の低下、血清鉄濃度の上昇、白血球減少（すなわち、顆粒球減少）、リンパ球増加、赤血球沈降速度（erythrocyte sedimentation rate、ＥＳＲ）の上昇、赤血球寿命の短縮、溶血、血小板減少症、国際標準化比（international normalized ratio、ＩＮＲ）の延長、血清ＨＢＶ  ＤＮＡの存在、アミノトランスフェラーゼの上昇（ＵＬＮの５倍未満）、ビリルビン濃度の上昇、プロトロンビン時間（prothrombin time、ＰＴ）の延長、高グロブリン血症、抗平滑筋抗体（anti-smooth muscle antibodies、ＡＳＭＡ）又は抗核抗体（antinuclear antibodies、ＡＮＡ）などの組織非特異的抗体の存在、甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在、リウマチ因子（rheumatoid factor、ＲＦ）の濃度上昇、高ビリルビン血症、血小板数及び白血球数の低値、ＡＬＴ値より高いＡＳＴ値、変性及び新生肝細胞の変化を伴う小葉性炎症、及び大部分の小葉中心壊死が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。
【００５８】
本明細書に記載される疾患又は病態の治療の様々な様式は、完全な治療を含むが、完全な治療に満たず、ある程度の生物学的又は医学的に関連する結果が達成される「実質的」を意味することが意図されることも理解されたい。治療は、慢性疾患の治療のための継続的な長期治療であっても、急性状態の治療のための単回又は数回の投与であってもよい。
【００５９】
本開示のオリゴヌクレオチド組成物
本開示は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの発現及び／又は活性を低減することができるオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物を提供する。本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ分子のエンハンサーＩ領域において、又はその付近の標的配列にハイブリダイズし、それによってエンハンサーＩ領域において、又はその付近にＤループを生成する。図１は、エンハンサーＩ領域のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド位置９００で始まり、ヌクレオチド位置１３１０で終わることを示し、図５Ａ〜図５Ｂは、コンセンサスＨＢＶゲノム配列であることを示す。
【００６０】
本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの標的領域に対して少なくとも９０％相補的であるオリゴヌクレオチドを有する、ヌクレオチド位置９００〜１３１０（エンハンサーＩ領域）からなるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムの領域を標的とする。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、エンハンサーＩ領域内にあるＨＢＶ  ＤＮＡ配列（すなわち、ＨＢＶゲノムのヌクレオチド位置９００と１３１０とを含めて、それらの間に位置する標的ヌクレオチド配列）を標的とする。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、エンハンサーＩ領域の上流の５０塩基対以下、４５塩基対以下、４０塩基対以下、３５塩基対以下、３０塩基対以下、２５塩基対以下、２０塩基対以下、１５塩基対以下、１０塩基対以下、又は５塩基対以下であるＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。ある特定の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、エンハンサーＩ領域の下流の５０塩基対以下、４５塩基対以下、４０塩基対以下、３５塩基対以下、３０塩基対以下、２５塩基対以下、２０塩基対以下、１５塩基対以下、１０塩基対以下、又は５塩基対以下であるＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置９６９と位置９８７との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。ある特定の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１０９４と位置１１１６との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１１３６と位置１１５５との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１１７４と位置１１９４との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。他の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１１９４と位置１２１６との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノムの位置１２９７と位置１３１５との間のどこかに位置するＨＢＶ  ＤＮＡ配列を標的とする。
【００６４】
本開示のオリゴヌクレオチドの例を表１に提示する。
【００６５】
【表１−１】
2019533472.tif 000003
【００６６】
【表１−２】
2019533472.tif 000004
【００６７】
ある特定の実施形態では、配列番号１〜６５は、例えば、本開示に記載されるように修飾される。
【００６８】
本開示のオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれかの１つ若しくは２つ以上の核酸塩基又はその相補体は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、３’−アミノ−２’−デオキシ−２，６−ジアミノプリン、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基、６−アゾウラシル、シトシン及びチミンの他のアルキニル誘導体、５−ウラシル（偽性ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル並びに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル並びに５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンの中から選択される修飾核酸塩基で置換され得る。
【００６９】
本開示のオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれかの１つ若しくは２つ以上の核酸塩基又はその相補体は、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−ａｍ−オエルホキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３，２，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）の中から選択される修飾核酸塩基で置換され得る。
【００７０】
追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれかの１つ若しくは２つ以上の核酸塩基の糖又はその相補体は、２’−ＯＨ（リボース）ヌクレオシド、２’−Ｏ−メチル化（２’−Ｏ−Ｍｅ）ヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオシド、２’−リボ−Ｆヌクレオシド、２’−アラビノ−Ｆヌクレオシド、２’−Ｍｅヌクレオシド、及び２’−Ｍｅ−２’−Ｆヌクレオシドから選択される修飾糖で置換され得る。いくつかの実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれかの１つ若しくは２つ以上の核酸塩基の糖又はその相補体は、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−アルキルの中から選択される修飾糖で置換されてもよく、当該Ｏ−アルキルは、任意にアルコキシで置換されている。
【００７１】
追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれかの１つ若しくは２つ以上の核酸塩基又はその相補体の元の主鎖結合は、ホスホジエステルサブユニット間結合、チオホスフェートサブユニット間結合、ホスホロアミダートサブユニット間結合、及びチオホスホロアミダートサブユニット間結合の中から選択される代替的なサブユニット間連結で置き換えられてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドのうちの１つ又は２つ以上は、糖環の２’位の修飾又はヌクレオチド間サブユニット結合の修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態は、１つ又は２つ以上の２’−Ｆ又は２’−Ｏ−アルキルを含み、当該Ｏ−アルキルは、任意にアルコキシで置換され、例えば、いくつかの実施形態は、２’−ＯＭｅ及び／又は２’−Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間サブユニット結合のうちの１つ又は２つ以上は、チオホスフェート結合である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間サブユニット結合のうちの１つ又は２つ以上は、ホスホロアミダート結合である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間サブユニット結合のうちの１つ又は２つ以上は、チオホスホロアミダート結合である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本開示の化合物は、式（Ｉ）のヌクレオチドを含み得、
【００７４】
【化１】
2019533472.tif 000005
式中、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、各場合において独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、Ｒ’は、各場合において独立して、Ｈ又はＦである。
【００７５】
式（Ｉ）のヌクレオチドでは、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、各場合においてＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｆであり、例えば、１、２、３、４、５、６又は７つのＲ’は、Ｆである。いくつかの実施形態では、ＣＲ’３は、１、２又は３つのＦ部分を含有する。例えば、実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（又はＭＯＥ）、−ＣＦ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＦ３、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦＣＨＦＯＣＨ３、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＨＦ２、及び−ＣＨ２ＣＨＦＯＣＨ３からなる群から選択される。実施形態では、式Ｉのヌクレオチドは、次のものである
【００７６】
【化２】
2019533472.tif 000006
【００７７】
実施形態では、本開示の化合物は、少なくとも１つの式（ＩＩ）のヌクレオチドを含み、
【００７８】
【化３】
2019533472.tif 000007
式中、ＹはＳ又はＯであり、ＲはＨ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは核酸塩基であり、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−ＣＲ’２ＯＣＲ’３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３、若しくは−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３であり、又は、Ｒ２は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、ＹはＯであり、Ｒ’は、各場合において独立してＨ又はＦである。
【００７９】
式（ＩＩ）のヌクレオチドでは、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−（ＣＲ’２）１−３ＯＣＲ’３、又は−（ＣＲ’２）１−２ＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＣＲ’３又は−ＣＲ’２ＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、各場合においてＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｆであり、例えば、１、２、３、４又は５つのＲ’は、Ｆである。いくつかの実施形態では、ＣＲ’３は、１、２又は３つのＦ部分を含有する。例えば、実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３（又はＭｅ）、−ＣＦＨ２、−ＣＨＦ２、ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＦＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦ２ＯＣＨ３、−ＣＦ３ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨ２ＯＣＨＦ２、−ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦＨ２ＯＣＨ３、−ＣＦＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＦＨ２ＯＣＨＦ２、−ＣＦＨ２ＯＣＦ３、−ＣＨＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨＦ２ＯＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＯＣＦ３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３、−ＣＨ２ＣＨ３（又はＥｔ）、−ＣＦＨ２ＣＨ３、−ＣＨＦ２ＣＨ３、−ＣＦ３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦＨ２、−ＣＨ２ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＦＨ２ＣＨ３、−ＣＦＨ２ＣＦＨ２、−ＣＦＨ２ＣＨＦ２、−ＣＦＨ２ＣＦ３、−ＣＨＦ２ＣＨ３、−ＣＨＦ２ＣＦＨ２、−ＣＨＦ２ＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＦ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨＦＣＨ２ＣＨ３、ＣＨＦＣＨＦＯＣＨ３、ＣＨＦＣＨ２ＣＦＨ２、ＣＨＦＣＨ２ＣＨＦ２及びＣＨ２ＣＨＦＣＨ３からなる群から選択される。実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３（又はＭｅ）又は−ＣＨ２ＣＨ３（又はＥｔ）である。実施形態では、式ＩＩのヌクレオチドは、次のものからなる群から選択される
【００８０】
【化４】
2019533472.tif 000008
【００８１】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物では、Ｙは、Ｏ又はＳであり得る。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１回の場合においてＳであり、少なくとも別の場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、各場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＯである。
【００８２】
開示されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｉ）のヌクレオチドを含む。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（ＩＩ）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜４０個のヌクレオチド、例えば、８〜２６個のヌクレオチド、又はそれらの間の整数のヌクレオチドを含む。
【００８３】
２つ以上の式（Ｉ）のヌクレオチドが含まれる実施形態では、ヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の式（ＩＩ）のヌクレオチドが含まれ、それらは同じであっても異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｉ）のヌクレオチドと、少なくとも１つの式（ＩＩ）のヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＲ１がＭＯＥである、少なくとも１つの式（Ｉ）のヌクレオチドと、Ｒ２がＭｅ又はＥｔである、少なくとも１つの式（ＩＩ）のヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、交互の２’修飾（例えば、Ｍｅ−ＭＯＥ−Ｍｅ−ＭＯＥ．．．又は、Ｅｔ−ＭＯＥ−Ｅｔ−ＭＯＥ−Ｅｔ−ＭＯＥ．．．）を有する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチド。
【００８４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩＩａ）及び／又は（ＩＩＩｂ）の２’−フルオロヌクレオチドを含み、
【００８５】
【化５】
2019533472.tif 000009
式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、核酸塩基である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの式（Ｉ）又は（ＩＩ）及び式（ＩＩＩａ）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の交互のヌクレオチドを含む。
【００８７】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、及び（ＩＩＩｂ）のヌクレオチドの核酸塩基Ｂは、各々独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であってよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、任意にアデニンを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意にウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、アデニンを含まず、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意にウラシルを含まない。
【００８８】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、及び（ＩＩＩｂ）の各ヌクレオチドにおけるＹは、独立して、Ｏ又はＳであり得る。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１回の場合においてＳであり、少なくとも別の場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、各場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＯである。
【００８９】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、及び（ＩＩＩｂ）の各々の２つ以上のヌクレオチドが含まれる実施形態では、２つ以上のそのような式のヌクレオチドは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、式（Ｉ）の少なくとも１つのヌクレオチドに加え、式（Ｉ）（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、及び（ＩＩＩｂ）の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）の少なくとも２つの交互のヌクレオチドを含む。例えば、開示されるオリゴヌクレオチドは、交互の２’修飾を有する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチドを含んでよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、上記の修飾のうちの１つ又は２つ以上を含み、核ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡに対する親和性を有するか、又はＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ分子のエンハンサーＩ領域又はその付近にある標的配列にハイブリダイズすることにより、エンハンサーＩ領域又はその付近にＤループを生成／維持する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、本明細書に列挙される配列のうちの１つによる上記修飾及び核酸塩基配列のうちの１つ又は２つ以上を含有する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本技術のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本開示の化合物は、式（Ｉ）のヌクレオチドを含み、
【００９２】
【化６】
2019533472.tif 000010
式中、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、各場合において独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、Ｒ’は、各場合において独立して、Ｈ又はＦである。
【００９３】
式（Ｉ’）のヌクレオチドでは、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、各場合においてＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｆであり、例えば、１、２、３、４、５、６又は７つのＲ’は、Ｆである。いくつかの実施形態では、ＣＲ’３は、１、２又は３つのＦ部分を含有する。例えば、実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（又はＭＯＥ）、−ＣＦ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＦ３、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦＣＨＦＯＣＨ３、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＨＦ２、及び−ＣＨ２ＣＨＦＯＣＨ３からなる群から選択される。実施形態では、式Ｉのヌクレオチドは、次のものである。
【００９４】
【化７】
2019533472.tif 000011
【００９５】
実施形態では、本開示の化合物は、式（Ｉ’）の少なくとも１つのヌクレオチド及び／又は式（ＩＩ’）の少なくとも１つのヌクレオチドを含み、
【００９６】
【化８】
2019533472.tif 000012
式中、ＹはＳ又はＯであり、ＲはＨ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは核酸塩基であり、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−ＣＲ’２ＯＣＲ’３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３、若しくは−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３であり、又は、Ｒ２は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、ＹはＯであり、Ｒ’は、各場合において独立してＨ又はＦである。
【００９７】
式（ＩＩ’）のヌクレオチドでは、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−（ＣＲ’２）１〜３ＯＣＲ’３又は−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＣＲ’３又は−ＣＲ’２ＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、各場合においてＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｆであり、例えば、１、２、３、４又は５つのＲ’は、Ｆである。いくつかの実施形態では、ＣＲ’３は、１、２又は３つのＦ部分を含有する。例えば、実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３（又はＭｅ）、−ＣＦＨ２、−ＣＨＦ２、ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＦＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦ２ＯＣＨ３、−ＣＦ３ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨ２ＯＣＨＦ２、−ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦＨ２ＯＣＨ３、−ＣＦＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＦＨ２ＯＣＨＦ２、−ＣＦＨ２ＯＣＦ３、−ＣＨＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨＦ２ＯＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＯＣＦ３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３、−ＣＨ２ＣＨ３（又はＥｔ）、−ＣＦＨ２ＣＨ３、−ＣＨＦ２ＣＨ３、−ＣＦ３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦＨ２、−ＣＨ２ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＦＨ２ＣＨ３、−ＣＦＨ２ＣＦＨ２、−ＣＦＨ２ＣＨＦ２、−ＣＦＨ２ＣＦ３、−ＣＨＦ２ＣＨ３、−ＣＨＦ２ＣＦＨ２、−ＣＨＦ２ＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＦ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨＦＣＨ２ＣＨ３、ＣＨＦＣＨＦＯＣＨ３、ＣＨＦＣＨ２ＣＦＨ２、ＣＨＦＣＨ２ＣＨＦ２及びＣＨ２ＣＨＦＣＨ３からなる群から選択される。実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３（又はＭｅ）又は−ＣＨ２ＣＨ３（又はＥｔ）である。実施形態では、式ＩＩのヌクレオチドは、次のものからなる群から選択される
【００９８】
【化９】
2019533472.tif 000013
【００９９】
式（Ｉ’）又は（ＩＩ’）の化合物では、Ｙは、Ｏ又はＳであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１回の場合においてＳであり、少なくとも別の場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、各場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＯである。
【０１００】
開示されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｉ’）のヌクレオチドを含む。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（Ｉ’）のヌクレオチドを含む。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（ＩＩ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜４０個のヌクレオチド、例えば、８〜２６個のヌクレオチド、又はそれらの間の整数のヌクレオチドを含む。
【０１０１】
２つ以上の式（Ｉ’）のヌクレオチドが含まれる実施形態では、ヌクレオチドは、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の式（ＩＩ’）のヌクレオチドが含まれ、それらは同じであっても異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｉ’）のヌクレオチド及び少なくとも１つの式（ＩＩ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｉ’）のヌクレオチド（式中、少なくとも１つのＲ１が、ＭＯＥである）及び少なくとも１つの式（ＩＩ’）のヌクレオチド（式中、Ｒ２が、Ｍｅ又はＥｔである）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの式（Ｉ’）及び式（ＩＩ’）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、交互の２’修飾（例えば、Ｍｅ−ＭＯＥ−Ｍｅ−ＭＯＥ．．．又は、Ｅｔ−ＭＯＥ−Ｅｔ−ＭＯＥ−Ｅｔ−ＭＯＥ．．．）を有する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチド。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ’）及び／又は式（ＩＩ’）のヌクレオチドが含まれてもよく、以下によって表される。
【０１０３】
【化１０】
2019533472.tif 000014
【０１０４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（Ｉ）のヌクレオチドを含み、かつ／又は式（ＩＩＩａ’）及び／若しくは（ＩＩＩｂ’）の２’−フルオロヌクレオチドを含み、
【０１０５】
【化１１】
2019533472.tif 000015
式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、核酸塩基である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの式（Ｉ’）及び式（ＩＩＩａ’）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の交互のヌクレオチドを含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態は、４〜４０個のヌクレオチドを含む、及び式（ＩＶ’）を含む、オリゴヌクレオチドを含み、
【０１０８】
【化１２】
2019533472.tif 000016
式中、ＹはＳ又はＯであり、ＲはＨ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは核酸塩基であり、Ｒ１は−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、Ｒ２は、−ＯＣＲ’３、−ＯＣＲ’２ＯＣＲ’３、−Ｏ（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３又は−Ｏ（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３及びＦから選択され、Ｒ’は、各場合において独立してＨ又はＦであり、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数であり、２０までの場合、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０である。
【０１０９】
本開示の化合物は、次式（ＩＩＩ’）を含む化合物を含み、
【０１１０】
【化１３】
2019533472.tif 000017
式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、各場合において独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、任意に、式（Ｉ’）、（ＩＩ’）及び／又は（ＩＶ’）のうちの１つ又は２つ以上を含む。
【０１１１】
式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩａ’）、（ＩＩＩｂ’）、（ＩＶ’）及び（Ｖ’）のヌクレオチドの核酸塩基Ｂは、各々独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であってよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、任意にアデニンを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意にウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、アデニンを含まず、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意にウラシルを含まない。
【０１１２】
式（ＩＩ’）、（ＩＩＩａ’）、（ＩＩＩｂ’）、（ＩＶ’）及び（Ｖ’）の各ヌクレオチドにおけるＹは、独立して、Ｏ又はＳであり得る。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１回の場合においてＳであり、少なくとも別の場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、各場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＯである。
【０１１３】
２つ以上の式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩａ’）、（ＩＩＩｂ’）、（ＩＶ’）及び（Ｖ’）の各々のヌクレオチドが含まれる実施形態では、２つ以上のそのような式のヌクレオチドは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｉ）のヌクレオチドに加え、少なくとも１つの式（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも２つの式（Ｉ’）及び／又は式（ＩＩ’）及び／又は（ＩＩＩ’）及び／又は（ＩＶ’）、（Ｖ’）及び／又は（Ｖ’）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、開示されるオリゴヌクレオチドは、交互の２’修飾を有する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチドを含んでよい。
【０１１４】
実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、次のものからなる群から選択され、
【０１１５】
【化１４】
2019533472.tif 000018
式中、Ｂは、任意の天然又は修飾塩基であり得る。
【０１１６】
本開示の化合物は、以下の式（Ｖ”）を含む化合物を含み、
【０１１７】
【化１５】
2019533472.tif 000019
式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、各場合において独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、Ａは、−（ＣＲ”Ｒ”）１〜２−であり、Ｒ”は、各場合において独立して、Ｈ、Ｆ又はＭｅであり、任意に式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）又は（Ｖ’）のうち１つ又は２つ以上を含む。
【０１１８】
式（Ｖ”）を含む化合物では、Ａは、−（ＣＲ”Ｒ”）１〜２−である。いくつかの実施形態では、Ａは−（ＣＲ’’Ｒ’’）−であり、他の実施形態では、Ａは−（ＣＲ’’Ｒ’’）２−である。Ｒ’’は、各場合において独立してＨ又はＭｅである。いくつかの実施形態では、１つのＲ”が、Ｍｅであり、残りはＨである。他の実施形態では、全てのＲ”が、Ｈである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＡがＣＨ２である場合、Ｙは、Ｓである。他の実施形態では、ＡがＣＨ２ＣＨ２である場合、Ｙは、Ｏ又はＳである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＣＨ２ＣＨ（Ｍｅ）又はＣＨ（Ｍｅ）であり、Ｙは、Ｏ又はＳである。
【０１２０】
式（Ｖ”）を含む化合物では、Ｙは、Ｏ又はＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１回の場合においてＳであり、少なくとも別の場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、各場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回等）の場合においてＯである。
【０１２１】
式（Ｖ”）の化合物（及び任意に式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）及び／又は（Ｖ’）の化合物は、オリゴヌクレオチドの一部であってもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＶ’）（及び任意に式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）及び／又は（Ｖ’）を含む化合物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（Ｖ”）（及び式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、及び／又は（Ｖ’））のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜４０個のヌクレオチド、例えば、８〜２６個のヌクレオチド、又はそれらの間の整数のヌクレオチドを含む。
【０１２２】
２つ以上の式（Ｖ’）のヌクレオチドが含まれる実施形態では、２つ以上の式（Ｖ’）のヌクレオチドは、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドが含まれ、それらは同じであっても異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも１つの式（Ｖ’）のヌクレオチドと、少なくとも１つの式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも２つの式（Ｖ”）並びに式（Ｉ’）、及び／又は（ＩＩ’）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、交互の２’修飾を有する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチド。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、式（Ｖ’）（及び任意に式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）及び／又は（Ｖ’））を含むヌクレオチドは、以下の構造：
【０１２４】
【化１６】
2019533472.tif 000020
の２−フルオロヌクレオチドを更に含み、
式中、Ｙ、Ｒ及びＢは、式（Ｉ’）と同じである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも４つの式（Ｖ’）及び２−フルオロヌクレオチドの交互のヌクレオチドを含む。
【０１２５】
本開示の化合物は、次式（Ｖ’）を含む化合物を含み、
【０１２６】
【化１７】
2019533472.tif 000021
式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電された対イオンであり、Ｂは、各場合において独立して、天然若しくは未修飾の核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、任意に、式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）及び／又は（Ｖ”）のうちの１つ又は２つ以上を含む。
【０１２７】
以下の略語を本開示で用いる。２’−Ｈ（デオキシリボース）ヌクレオシドは、核酸塩基に対応する大文字、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴによって言及される。２’−Ｏ−メチル化（２’−Ｏ−Ｍｅ）ヌクレオシドは、小文字ｍ及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ｍＡ、ｍＣ、ｍＧ及びｍＵによって言及される。２’−Ｏ−Ｍｅ、５−メチルシトシンは、５ｍｍＣと略記される。
【０１２８】
ヌクレオチドの主鎖又はサブユニット間結合について、リン酸ジエステルサブユニット間結合は、「ＰＯ」と称されるか、又は一般に配列の詳細には含まれない。チオリン酸サブユニット間結合は、小文字「ｐｓ」と略記される。ホスホロアミダートサブユニット間結合は、小文字「ｎｐ」と略記される。チオホスホロアミダートサブユニット間結合は、小文字「ｎｐｓ」と略記される。
【０１２９】
実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれか１つの少なくとも１つのヌクレオチドは、５−メチルシトシン核酸塩基、２’位におけるＯ−Ｍｅ修飾（ｍＡ、５ｍｍＣ、ｍＧ及びｍＵ）、並びにヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むように修飾される。実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれか１つの各ヌクレオチドは、以下のように修飾される。
（ａ）シトシン核酸塩基を有する各ヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ、５−メチルシトシン（５ｍｍＣ）であるように修飾され、
（ｂ）各他のヌクレオチドもまた、２’位にＯ−Ｍｅ修飾（ｍＡ、ｍＧ及びｍＵ）を含むように修飾され、及び
（ｃ）各ヌクレオチドは、ヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含有する。
【０１３０】
例えば、配列番号１〜１３は、表２に記載されるように修飾され得る。配列番号１のオリゴヌクレオチドは、配列番号６６として修飾され得る。配列番号２のオリゴヌクレオチドは、配列番号６７として修飾され得る。配列番号３のオリゴヌクレオチドは、配列番号６８として修飾され得る。配列番号４のオリゴヌクレオチドは、配列番号６９として修飾され得る。配列番号５のオリゴヌクレオチドは、配列番号７０として修飾され得る。配列番号６のオリゴヌクレオチドは、配列番号７１として修飾され得る。配列番号７のオリゴヌクレオチドは、配列番号７２として修飾され得る。配列番号８のオリゴヌクレオチドは、配列番号７４として修飾され得る。配列番号９のオリゴヌクレオチドは、配列番号７５として修飾され得る。配列番号１０のオリゴヌクレオチドは、配列番号７６として修飾され得る。配列番号１１のオリゴヌクレオチドは、配列番号７７として修飾され得る。配列番号１２のオリゴヌクレオチドは、配列番号７８として修飾され得る。配列番号１３のオリゴヌクレオチドは、配列番号７９として修飾され得る。
【０１３１】
実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれか１つの少なくとも１つのヌクレオチドは、５−メチルシトシン核酸塩基、２’位におけるＯ−Ｍｅ修飾（ｍＡ、５ｍｍＣ、ｍＧ及びｍＵ）並びにヌクレオチド間のチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を含むように修飾される。実施形態では、配列番号１〜６５のうちのいずれか１つの各ヌクレオチドは、以下のように修飾される。
（ａ）シトシン核酸塩基を有する各ヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ、５−メチルシトシン（５ｍｍＣ）であるように修飾され、
（ｂ）各他のヌクレオチドもまた、２’位にＯ−Ｍｅ修飾（ｍＡ、ｍＧ及びｍＵ）を含むように修飾され、及び
（ｃ）各ヌクレオチドは、ヌクレオチド間にチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合を含有する。
【０１３２】
例えば、配列番号７のオリゴヌクレオチドは、表２に記載されるように配列番号７３として修飾されてもよい。
【０１３３】
【表２】
2019533472.tif 000022
【０１３４】
実施形態では、リガンド標的化部分は、オリゴヌクレオチドに共役される。標的化部分は、ＧａｌＮＡｃ−１−１３などのＧａｌＮＡｃを含む。例えば、以下のＧａｌＮＡｃ誘導体が、いくつかの実施形態に含まれる。以下は、構造に示されるように、リンカー又は支持体に結合したＧａｌＮＡｃ部分を示す。
【０１３５】
【化１８】
2019533472.tif 000023
【０１３６】
【化１９】
2019533472.tif 000024
【０１３７】
【化２０】
2019533472.tif 000025
【０１３８】
【化２１】
2019533472.tif 000026
【０１３９】
ＧａｌＮＡｃ誘導体は、本開示のオリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端で共役されてもよい。例えば、配列番号７１のオリゴヌクレオチドは、３’ＧａｌＮＡｃ（配列番号８０）を含み得る。他の標的化部分は、パルミトイル又はトコフェロール修飾を含み得る。例えば、配列番号７１のオリゴヌクレオチドは、３’パルミトイル（配列番号８１）又は３’トコフェロール（配列番号８２）を含み得る。
【０１４０】
治療及び予防方法
以下の記述は、単に例として提示され、制限することを意図したものではない。
【０１４１】
本開示の一態様は、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害を有する、その疑いがある、又はそのリスクがあると診断された対象を治療するための方法を含む。治療用途では、本開示のオリゴヌクレオチドを含む組成物は、そのような疾患（例えば、対象の血清及び／若しくは肝臓中のＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの持続、ＨＢｓＡｇ及び／若しくはＨＢｅＡｇ）の存在、又は高ＨＢＶウイルス負荷レベル）の疑いがある、又はそのような疾患に既に罹患している対象に、疾患の発症におけるその合併症及び中間の病理学的表現型を含む、疾患の症状を治癒する、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。
【０１４２】
ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害に罹患している対象は、本明細書に記載されるＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連障害の典型的な症状の検出を含む、当該技術分野において既知の診断又は予後アッセイのいずれか又は組み合わせによって同定することができる。
【０１４３】
本開示は、有効量の本開示のオリゴヌクレオチド組成物を対象に投与することを含む、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連疾患を有すると診断された又はその疑いがある対象を治療するための方法を提供する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物で治療された対象は、次の症状、すなわち肝ＨＢＶ  ＣＣＣＤＮＡの存在、血清及び／又は肝ＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ）の存在、抗ＨＢＶ抗体、肝障害、肝硬変、デルタ肝炎、急性Ｂ型肝炎、急性Ｂ型劇症肝炎、慢性Ｂ型肝炎、肝線維症、末期肝疾患、肝細胞癌、血清病様症候群、食欲不振、悪心、嘔吐、微熱、筋肉痛、易疲労感、味覚力及び嗅覚異常（食物及びタバコへの嫌悪感）、右上腹部及び心窩部痛（断続的、軽度〜中程度）、肝性脳症、傾眠、睡眠パターン障害、精神錯乱、昏睡、腹水、消化管出血、凝固障害、黄疸、肝腫大（ゆっくりと拡大、軟肝臓）、脾腫、手掌紅斑、くも状母斑、筋消耗、くも状血管腫、血管炎、静脈りゅう出血、末梢性浮腫、女性化乳房、精巣萎縮、腹部側副静脈（メズサの頭）、ＡＳＴ値より高いＡＬＴ値、白血球減少（すなわち、顆粒球減少）、アルブミン濃度の低下、血清鉄濃度の上昇、リンパ球増加、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の上昇、赤血球寿命の短縮、溶血、血小板減少症、国際標準化比（ＩＮＲ）の延長、血清ＨＢＶ  ＤＮＡの存在、プロトロンビン時間（ＰＴ）の延長、高グロブリン血症、抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）又は抗核抗体（ＡＮＡ）などの組織非特異的抗体の存在、甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在、高ビリルビン血症、血小板数及び白血球数の低値、ＡＬＴ値より高いＡＳＴ値、変性及び新生肝細胞の変化を伴う小葉性炎症、並びに大部分の小葉中心壊死のうちの１つ又は２つ以上の改善又は排除を示す。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物で治療された対象は、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連疾患に罹患している未治療の対象と比較して、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ビリルビン、及びリウマチ因子（ＲＦ）の中から選択される１つ又は２つ以上のバイオマーカーの発現レベルの低減を示す。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連疾患を有する対象にＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを投与し、それにより、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベル、ＨＢＶ抗原レベル、ＨＢＶウイルス負荷レベル、ＡＬＴレベル、及び／又はＡＳＴレベル、例えば、細胞、組織、血液又は対象の他の生物学的流体は、オリゴヌクレオチドの投与前に対象において観察されるレベルと比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上低減される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染症及び／又はＨＢＶ関連疾患を有する対象にＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを投与し、それにより例えば、細胞、組織、血液又は対象の他の生物学的流体中の抗ＨＢＶ抗体のレベルは、オリゴヌクレオチドの投与前に対象において観察されるレベルと比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上増加する。
【０１４８】
本開示の方法は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベルが、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６又は約８０時間にわたって低減されるように、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド組成物を投与することを含む。一実施形態では、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベルは、長期間、例えば、少なくとも約２日、３日、４日、５日、６日、７日以上、又は約１週間、２週間、３週間、若しくは約４週間以上にわたって減少する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は器官中の肝ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの存在、ＨＢＶ  ＤＮＡ（例えば、ｒｃＤＮＡ）のレベル、血清及び／又は肝ＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ及び／若しくはＨＢｅＡｇ）の存在、ＡＬＴレベル並びに／又はＡＳＴレベルを、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上、例えば、アッセイの検出レベルを下回るまで低減する。
【０１５０】
追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は器官中の血清及び／又は肝臓抗ＨＢＶ抗体の存在を、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上増加させる。
【０１５１】
一態様では、本開示は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを配列番号１〜８２のうちのいずれか１つの配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにおけるＤループ形成を誘導するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、ヌクレオチド位置９００〜１３１０（エンハンサーＩ領域）からなるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムの標的領域を、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの標的領域に対して少なくとも９０％相補的であるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにおけるＤループ形成を誘導するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡとハイブリダイズして、抗原性Ｄループ構造の形成を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｄループ形成の誘導は、先天性免疫を刺激する。
【０１５２】
治療用途の場合、本開示のオリゴヌクレオチド組成物は、対象に投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１日当たり１回、２回、３回、４回、又は５回投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１日当たり５回よりも多く投与される。追加的に又は代替的に、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、毎日、１日おき、３日おき、４日おき、５日おき、又は６日おきに投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、毎週、隔週、３週間ごと、又は毎月投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１、２、３、４、又は５週間の期間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、６週間以上にわたって投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１２週間以上にわたって投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１年未満の期間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１年を超える期間にわたって投与される。
【０１５３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１週間以上にわたって毎日投与される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、２週間以上にわたって毎日投与される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、３週間以上にわたって毎日投与される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、４週間以上にわたって毎日投与される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、６週間以上にわたって毎日投与される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、１２週間以上にわたって毎日投与される。
【０１５４】
疾患の治療の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重篤度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を維持するために必要な薬剤の用量、疾患マーカーのレベル又は治療されている所与の疾患に対して適切な任意の他の測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。そのようなパラメータのうちのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、治療の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＣＨＢの治療の有効性は、例えば、ウイルス負荷及びトランスアミナーゼレベルの定期的なモニタリングによって評価できる。初期値とその後の値を比較することによって、処置が有効であるかどうかの指標が提供される。
【０１５５】
投与様式
本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物及び製剤を提供する。医薬組成物は、ＨＢＶ感染症に関連する疾患又は障害を治療するのに有用である。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、及び医薬的に許容される担体を含む。そのような医薬組成物は、送達様式に基づいて配合される。
【０１５７】
本開示の医薬組成物は、局所治療が所望されるか又は全身治療が所望されるかに応じて、また治療されるべき領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は、例えば、噴霧器、気管内、鼻腔内、上皮、経口、直腸、又は非経口によるものを含む、散剤又はエアロゾルの吸入又は吹送によって、局所、肝内、経皮（例えば、経皮パッチによる）、肺であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射若しくは注入、皮下、例えば、移植されたデバイスを介して、又は頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内又は心室内投与によるものが挙げられる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口送達を介した、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、頭蓋内、又は皮下での全身投与用に配合される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、脳実質への直接送達、例えば、連続ポンプ注入による脳への注入のために配合される。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、投与は、デポー注射を介して行われる。デポー注射は、長期間にわたって一貫した方法でオリゴヌクレオチドを放出することができる。したがって、デポー注射は、所望の治療効果又は予防効果を得るために必要とされる投与頻度を低減することができる。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。デポー注射は、皮下注射又は筋肉内注射を含み得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプを介して行われる。ポンプは、外部ポンプ又は外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。ある特定の実施形態では、ポンプは皮下移植された浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈、又は硬膜外注入に使用されてもよい。ある特定の実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、オリゴヌクレオチドを肝臓に送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
【０１６１】
局所投与用の医薬組成物及び製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、スプレー、液体及び粉末を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性塩基、増粘剤等が含まれてもよい。好適な局所製剤としては、本開示において特徴付けられるオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤などの局所送達剤と混和されるものが挙げられる。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロホスファチジルコリン）、アニオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）又はカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）であってもよい。本開示において特徴付けられるオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得るか又はリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成することができる。代替的に、オリゴヌクレオチドは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化され得る。好適な脂肪酸及びエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリアクレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸グリセリル、１−ドデシルシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はその医薬的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号に詳述されている。
【０１６２】
経口投与の場合、液体又は固体製剤が使用されてもよい。そのような製剤の例としては、錠剤、ゼラチンカプセル、ピル、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、チューインガム等が挙げられる。本開示のオリゴヌクレオチドは、当業者に理解されるように、好適な医薬担体（ビヒクル）又は賦形剤と混合することができる。担体及び賦形剤の例としては、デンプン、乳、糖、ある特定の種類の粘土、ゼラチン、乳酸、ステアリン酸又はこれらの塩（ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウムを含む）、タルク、植物性脂肪若しくは油、ガム及びグリコールが挙げられる。
【０１６３】
口腔用組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、又はカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用することができる。口腔用組成物はまた、口内洗浄剤として使用するための流体キャリアを使用して調製することもできる。医薬的に適合性のある結合剤、及び／又はアジュバント物質は、組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分又は同様の性質の化合物のうちのいずれかを含有することができる：微結晶セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチンなどの結合剤；デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プライモゲル、若しくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロース若しくはサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ風味などの香味剤。
【０１６４】
本開示の医薬組成物は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを標的とするのに十分な投与量で投与され得る。
【０１６５】
一実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、体重ベースの用量として対象に投与される。「体重ベースの用量」（例えば、ｍｇ／ｋｇの用量）は、対象の体重に応じて変化するオリゴヌクレオチドの用量である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、固定用量として対象に投与される。「固定用量」（例えば、ｍｇの用量）は、重量などの任意の特定の対象に関連する因子にかかわらず、全ての対象に対して同じオリゴヌクレオチド用量が使用されることを意味する。特定の一実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドの固定用量は、所定の重量又は年齢に基づく。
【０１６６】
一般に、本開示のオリゴヌクレオチドの好適な用量は、１日当たり、レシピエントの体重１キログラム当たり約０．０００１〜約２００．０ミリグラムの範囲又は１日当たり、体重１キログラム当たり約１〜５０ｍｇの範囲である。例えば、オリゴヌクレオチドは、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、又は約５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０１６７】
対象には、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．７ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、３．９ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．１ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．３ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．７ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、４．９ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．１ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．３ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．７ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ、５．９ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．１ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、６．９ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．１ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．３ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．７ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、７．９ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．１ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．３ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．７ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、８．９ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．１ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．３ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．７ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、９．９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、又は約５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドが投与され得る。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部として企図される。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部として企図される。
【０１６９】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部として企図される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部として企図される。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、対象には、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなど、単一の治療有効量のオリゴヌクレオチドを投与することができる。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部として企図される。
【０１７２】
他の実施形態では、対象は、治療有効量のオリゴヌクレオチドの複数回投与、例えば約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。複数回投与レジメンは、治療有効量のオリゴヌクレオチドを毎日、例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間又はそれ以上にわたって投与することを含み得る。
【０１７３】
他の実施形態では、対象は、治療有効量のオリゴヌクレオチドの反復投与、例えば約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。反復投与レジメンは、治療有効量のオリゴヌクレオチドを、定期的に、例えば、１日おき、３日おき、４日おき、週２回、週１回、隔週、又は月１回投与することを含んでもよい。
【０１７４】
例えば、本開示のオリゴヌクレオチド、例えば、医薬組成物中のオリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。前述の値の中間の値もまた、本開示の一部であることが意図される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１００ｍｇ〜約９００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約４００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約４００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約５００ｍｇの固定用量として投与される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、又は約９００ｍｇの固定用量で投与される。
【０１７７】
医薬組成物は、一定期間にわたって、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は約２５分の期間にわたって、静脈内注入によって投与することができる。投与は、例えば、定期的に、例えば週１回、隔週（すなわち、２週間ごと）、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月又はそれ以上にわたって繰り返されてもよい。初期治療の投薬計画後、頻度を減らして治療薬を投与してもよい。例えば、３ヶ月にわたり週１回又は２週間に１回投与した後、６ヶ月又は１年以上にわたって、月１回の投与を繰り返してよい。
【０１７８】
医薬組成物は、１日１回投与され得るか、又はオリゴヌクレオチドは、１日に適切な間隔で２回、３回若しくはそれ以上のサブ用量として、若しくは更には制御放出製剤を介した連続注入若しくは送達を使用して投与され得る。一実施形態では、各サブ用量に含まれるオリゴヌクレオチドは、全日投与量を達成するために、対応してより少なくなければならない。投与単位はまた、例えば、数日の期間にわたってオリゴヌクレオチドの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたって送達するために配合することもできる。持続放出製剤は、当該技術分野において周知であり、特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。一実施形態では、投与単位は、対応する複数の１日用量を含有する。
【０１７９】
他の実施形態では、単一用量の医薬組成物は、後続の投与が３、４、若しくは５日間隔以下で、又は１、２、３、若しくは４週間間隔以下で投与されるように、長い持続性であり得る。いくつかの実施形態では、単一用量の本開示の医薬組成物は、１週間に１回投与される。他の実施形態では、単一用量の本開示の医薬組成物は、隔月に投与される。いくつかの実施形態では、単一用量の本開示の医薬組成物は、１ヶ月当たり１回、隔月、又は四半期に１回（すなわち、３ヶ月ごと）に投与される。
【０１８０】
本開示に包含される個々のオリゴヌクレオチドの有効投与量及びインビボ半減期の推定は、従来の方法論を使用して、又は適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて行うことができる。
【０１８１】
本方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、経口、局所、全身、静脈内、皮下、経皮的、髄腔内、鼻腔内、腹腔内、肝内、又は筋肉内投与される。
【０１８２】
本方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１週間以上にわたって毎日投与される。本方法の他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２週間以上にわたって毎日投与される。本方法のある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３週間以上にわたって毎日投与される。本方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４週間以上にわたって毎日投与される。本方法の他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、６週間以上にわたって毎日投与される。本方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２週間以上にわたって毎日投与される。
【０１８３】
併用療法
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物は、ＨＢＶ感染症又は／又はＨＢＶ関連障害の寛解又は治療のための１種又は２種以上の追加の治療剤と組み合わせることができる。併用療法では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物及びＨＢＶ感染症の１つ又は２つ以上の追加の治療が、同じ組成物若しくは別個の組成物中で同時に投与されてもよく、又は別々に、同時若しくは連続的に投与されてもよいことが理解される。
【０１８４】
併用療法で使用され得る追加の治療剤の例としては、抗ウイルス剤、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド類似体、逆転写酵素阻害剤（例えば、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェンアミド、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン、ＡＧＸ−１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）、ＰＣ１３２３、ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ、チモシン−α、ＣＭＸ１５７、ＡＧＸ−１００９、及びガンシクロビル）、免疫刺激剤（例えば、ペグ化インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｃ２ａ）、インターフェロンα−２ｂ、組み換えヒトインターロイキン−７、及びＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニスト）、治療ワクチン（例えば、ＧＳ−４７７４、ＤＶ−６０１、ＴＧ１０５０、ヘプリスラブ、ＡＢＸ２０３、及びＩＮＯ−１８００）、ウイルス侵入阻害剤（例えば、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ）、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＡＲＣ５２０、ＡＲＣ５２１、ＡＬＮ−ＨＢＶ、ＡＲＢ−１４６７等）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＩＯＮＩＳ−ＨＢＶ−Ｌ  Ｒｘ等）、ＨＢｓＡｇの分泌若しくは放出を阻害するオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＥＰ  ９ＡＣ）、カプシド阻害剤（例えば、Ｂａｙ４１−４１０９、ＮＶＲ−１２２１、ＮＶＲ３−７７８、ＪＮＪ−３７９、ＡＢ−４２３、ＧＬＳ−４、ＨＡＰ−１、及びＡＴ−１）、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤（例えば、ＩＨＶＲ−２５）、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＧＳ−９６２０、ＡＲＢ−１５９８、ＡＮＡ９７５、ＲＧ７７９５（ＡＮＡ７７３）、ＭＥＤＩ９１９７、ＰＦ−３５１２６７６、及びＩＭＯ−２０５５）、ｍｉＲＮＡ模倣体若しくは阻害剤、アプタマー、立体的遮断剤、短い活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、免疫調節性オリゴヌクレオチド、又は他の治療剤及び／若しくは手順、例えば、肝移植、及び化学療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
複数の治療剤は、任意の順序で、又は同時に投与されてもよい。同時の場合、複数の治療剤は、単一の統一形態で又は複数の形態で（単なる例として、単一の丸剤として又は２つの別個の丸剤として）提供されてもよい。治療剤のうちの１つは、複数の用量で与えられてもよく、又は両方が複数の用量として与えられてもよい。同時ではない場合、複数の用量の間のタイミングは、０週間超〜４週間未満で変動し得る。加えて、組み合わせ方法、組成物及び製剤は、２つの薬剤のみの使用に限定されるものではない。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの投与に加えて、本方法は、抗ウイルス剤、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド類似体、逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤、治療ワクチン、ウイルス侵入阻害剤、カプシド阻害剤、及びｃｃｃＤＮＡ阻害剤からなる群から選択される１種又は２種以上の追加の治療剤を、別個に、連続的に又は同時に対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素阻害剤は、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェンアミド、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン、ＡＧＸ−１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）、ＰＣ１３２３、ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ、チモシン−α、ＣＭＸ１５７、ＡＧＸ−１００９、又はガンシクロビルである。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、免疫刺激剤は、ペグ化インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｃ２ａ）、インターフェロンα−２ｂ、組み換えヒトインターロイキン−７、又はＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストである。いくつかの実施形態では、治療ワクチンは、ＧＳ−４７７４、ＤＶ−６０１、又はＴＧ１０５０である。他の実施形態では、ウイルス侵入阻害剤は、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘであり、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤は、ＩＨＶＲ−２５である。いくつかの実施形態では、カプシド阻害剤は、Ｂａｙ４１−４１０９、ＮＶＲ−１２２１、ＮＶＲ３−７７８、又はＪＮＪ−３７９である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＡＲＣ５２０、ＡＲＣ５２１、ＡＬＮ−ＨＢＶ、又はＡＲＢ−１４６７であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＯＮＩＳ−ＨＢＶ−Ｌ  Ｒｘである。
【０１８８】
キット
本開示はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｃｃｃＤＮＡを標的とするキットを提供する。本開示のキットは、配列番号１〜８２からなる群から選択される配列又はその修飾を含む、１つ又は２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。キットはまた、使用のための説明書、商業的販売のために意図されるパッケージなどのパッケージ等を含んでもよい。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：本開示のオリゴヌクレオチドは感染した一次ヒト肝細胞中のウイルス抗原を低減する
全てのオリゴヌクレオチドを固相合成により調製した。（＋）又は（−）ＤＮＡ鎖のいずれかに及ぶ、約２００の異なるオリゴヌクレオチドを合成した。ＨＢＶ遺伝子発現（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ｔｏｘ）に対する異なるオリゴヌクレオチドの生物学的効果を、３つの異なる用量（０．３、３、又は３０μＭ）でＨＢＶ（＋）一次ヒト肝細胞（Primary Human Hepatocytes、ＰＨＨ）中でスクリーニングした。
【０１９０】
培養及び感染。一次ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）を解凍し、製造元の指示に従ってＢｉｏｃｏａｔ（商標）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ  ９６ウェル、２４ウェル又は６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）上に播種した。細胞を水浴中３７℃で解凍し、一次肝細胞解凍及び播種培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で１０分間、１００×ｇで回転させた。細胞を再懸濁させ、ＦＢＳ、インスリン、ＥＧＦ及びデキサメタゾン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で補充した肝細胞維持培地（ＨＭＭ）：ＤＭＥＭ中に８×１０５／ｍＬでプレートフォーマットで播種した。ＰＨＨは、４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ  ８０００（Ｓｉｇｍａ）の存在下、肝細胞維持培地（ＨＭＭ）中で播種した１６時間後に５０のＧＥ  ＨＢＶに感染させた。２４時間後、ウイルス含有培地を除去し、細胞を４回洗浄し、更にＨＭＭ中で４日間インキュベートした。４日間の期間後、製造元の指示に従って、Ｌｉｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるトランスフェクションを介して、ＰＨＨを０．００１５〜１０μＭのオリゴヌクレオチド又はビヒクルで処理した。次いで、処理したＰＨＨを、６日間のインキュベーション期間の中間点で１回培地変更しながら６日間更にインキュベートした。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡ。ＨＢｅＡｇ  ＥＬＩＳＡ及びＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡの各々を、それぞれＨＢｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）及びｓＡｇ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）を用いてＰＨＨ上清上で実施した。
【０１９２】
ｑＰＣＲ。全ＨＢＶ  ＤＮＡを、製造元の指示に従って、ＭａｇＭａｘ全核酸単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＰＨＨから抽出し、ＨＢＶ  ＤＮＡのコア領域の標準ｑＰＣＲアッセイ増殖を使用して定量した。
【０１９３】
結果。ＰＨＨアッセイで試験した２００オリゴヌクレオチドのうち、ヌクレオチド位置９６０付近で開始し、ヌクレオチド位置１３３０で終わる、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡゲノムのエンハンサーＩ領域周囲の配列を標的とするオリゴヌクレオチドは、驚くべきことに、開示されたオリゴヌクレオチドで処理されたＰＨＨの上清中に残っているＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの低減に基づいて有意な抗ウイルス活性を示した。表３は、この抗ウイルス活性が観察された３つの試験された用量：０．３、３．０及び３０μＭのうちのいずれか１つのオリゴヌクレオチド濃度を示す。
【０１９４】
【表３−１】
2019533472.tif 000027
【０１９５】
【表３−２】
2019533472.tif 000028
【０１９６】
抗ウイルス活性を有することが示されるある特定のオリゴヌクレオチドを、修飾のために選択した。具体的には、配列番号１のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号６６のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号２のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号６７のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号３のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号６８のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号４のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号６９のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号５のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７０のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号６のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７１のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号７のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７２のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号８のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７４のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号９のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７５のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号１０のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７６のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号１１のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７７のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号１２のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７８のオリゴヌクレオチドを産生した。配列番号１３のオリゴヌクレオチドを修飾して、配列番号７９のオリゴヌクレオチドを産生した。オリゴヌクレオチドは、以下の手順に従って修飾した。
【０１９７】
２’−Ｏ−Ｍｅホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成。各オリゴヌクレオチドは、Ｎ６−ベンゾイル−２’−ＯＭｅアデノシン、２’−ＯＭｅ−ウリジン、又はＮ６−イソブチリル−２’−ＯＭｅグアノシンで誘導体化された長鎖アルキルアミン制御細孔を有する標準的な固体支持体を使用して、１又は２μモルスケールでＭｅｒｍａｄｅ  １２合成装置（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｏ，Ｔｅｘａｓ）中で合成した。３’端のヌクレオチドが、５−メチル−２’−Ｏ−メチル−シトシンである場合、代わりにユニバーサルリンカー固体支持体（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＭＡ）を使用した。３’−ＧａｌＮａｃ及び３’−トコフェロール共役オリゴヌクレオチドについては、対応する修飾された固体支持体を使用した。使用されるサイクルの後に、脱ブロッキング−カップリング−キャッピング−酸化−キャッピングの工程が続いた。２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトを、乾燥アセトニトリル中０．１Ｍ溶液として調製した。５−エチルチオテトラゾールを活性化剤として使用し、ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸を使用して、ＴＨＦ中の無水酢酸を脱トリチル化し、ＴＨＦ中の１６％  Ｎ−メチルイミダゾールを使用してキャップし、ピリジン中のキサンタンヒドリドの０．１Ｍ溶液を硫化に使用した。脱トリチル化を（２×４５）秒間にわたって行った。全ての塩基について、（２×３６０）秒で定量的カップリングを達成した。各キャッピング工程を９０秒間行った。硫化を１２０秒で達成した。固体支持体からの脱保護及び開裂は、６５℃で１５分間アンモニアメチルアミン（ＡＭＡ）で達成された。万能リンカーを使用した場合、脱保護を６５℃で１時間放置した。固体支持体を除去するために濾過した後、脱保護溶液を真空下、ＧｅｎｅＶａｃ遠心蒸発器で除去した。粗産物を１Ｍ  ＰＢＳに溶解し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ−Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ−２０００  ＭＷＣＯ（Ｇｅｎｅｒｏｎ  Ｌｔｄ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて限外濾過により脱塩した。純度及び分子量は、ＨＰＬＣ分析（６０℃、ＩＥＸ−Ｔｈｅｒｍｏ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００、Ａ−２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリルｐＨ１１、Ｂ−１．８Ｍ  ＮａＢｒ  ２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリルｐＨ１１；ＲＰＩＰ−Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８，Ａ−１００ｍＭ  ＨＦＩＰ  ７ｍＭ  ＴＥＡ  Ｂ−７：３メタノール／アセトニトリル）及びＸｃａｌｉｂｕｒのＰｒｏｍａｓｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎを使用したＥＳＩ−ＭＳ分析によって決定した。純度及び分子量は、ＨＰＬＣ分析（６０℃、ＩＥＸ−Ｔｈｅｒｍｏ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００、Ａ−２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリルｐＨ１１、Ｂ−１．８Ｍ  ＮａＢｒ  ２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリルｐＨ１１；ＲＰＩＰ−Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８，Ａ−１００ｍＭ  ＨＦＩＰ  ７ｍＭ  ＴＥＡ  Ｂ−７：３メタノール／アセトニトリル）及びＸｃａｌｉｂｕｒ（Ｎｏｖａｔｉａ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＰＡ）のＰｒｏｍａｓｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎを使用したＥＳＩ−ＭＳ分析によって決定した。
【０１９８】
加えて、配列番号７のオリゴヌクレオチドを修飾して、以下の手順に従って配列番号７３のオリゴヌクレオチドを産生した。
【０１９９】
３’−アミノ−２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成。３’−アミノ−２’−デオキシホスホロチオエートは、Ｚｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｄ．；Ｐｏｎｇｒａｃｚ，Ｋ；Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４７，４４９５−４４９９（２００６）に記載されるように合成した。３’−アミノ−２’−デオキシホスホロチオテトラホスホルアミダイトモノマーは、Ｐｈａｒｍａｒｏｎにおいてカスタム合成した。乾燥剤を用いて、全てのモノマーを真空デシケーター内で乾燥させた（ＫＯＨ及びＰ２Ｏ５、室温で２４時間）。第１の５’残基に結合した長鎖アルキルアミン制御細孔を有する固体担体は、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）から入手した。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、デブロック−カップリング−酸化−カップリング−酸化−キャッピングサイクルを使用して、固体支持体上に予め装填されたオリゴヌクレオチドの５’残基から出発した標準的なオリゴヌクレオチドホスホロアミダート化学反応を使用して、Ｍｅｒｍａｄｅ  １２合成装置（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｏ，Ｔｅｘａｓ）上で合成した。ホスホルアミダイトを、乾燥アセトニトリル中０．１Ｍ溶液として調製した。５−エチルチオテトラゾールを活性化剤として使用し、ジクロロメタン中５％のジクロロ酢酸を使用して、脱トリチル化（５０秒）した。ＡＣＮ中のイソ酪酸無水物−ルチジン−ＡＣＮ  １：１：８及びＮ−メチルイミダゾールを使用してキャップし、ピリジン中のキサンタンヒドリドの０．１Ｍ溶液を硫化に使用した。全ての塩基について、（２×１２０）秒で最適なカップリングを達成した。キャッピング工程を９０秒間行った。硫酸化は、２４０秒で達成された（２つのカップリングで分割された）。固体支持体からの脱保護及び開裂は、５５℃で５時間、アンモニア水溶液を用いて達成された。固体支持体を除去するために濾過した後、脱保護溶液を真空下、ＧｅｎｅＶａｃ遠心蒸発器で除去した。次いで、粗産物を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５％  ＣＨ３ＣＮ、１．８Ｍ  ＮａＢｒ、勾配５〜５０％  Ｂ  ２０カラム体積）を使用して、ＧＥ  Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ上で精製し、画分を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＨＰＬＣ上の逆相イオン対クロマトグラフィーによって分析した。純粋画分を貯留し、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ−２０００  ＭＷＣＯ（Ｇｅｎｅｒｏｎ  Ｌｔｄ．，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用する）によって脱塩し、ＧｅｎｅＶａｃ蒸発器上で蒸発乾固させた。純度及び分子量は、ＨＰＬＣ分析（６０℃、ＩＥＸ−Ｔｈｅｒｍｏ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００、Ａ−２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリルｐＨ１１、Ｂ−１．８Ｍ  ＮａＢｒ  ２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリルｐＨ１１；ＲＰＩＰ−Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８，Ａ−１００ｍＭ  ＨＦＩＰ  ７ｍＭ  ＴＥＡ  Ｂ−７：３メタノール／アセトニトリル）及びＸｃａｌｉｂｕｒ（Ｎｏｖａｔｉａ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＰＡ）のＰｒｏｍａｓｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎを使用したＥＳＩ−ＭＳ分析によって決定した。精製オリゴヌクレオチ���を、２’−Ｏ−Ｍｅホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの合成について上述したように分析した。
【０２００】
表４は、更なる修飾のために選択された本開示のオリゴヌクレオチド、それらのヌクレオチド長、オリゴヌクレオチドによって標的化される配列及びオリゴヌクレオチドの方向のまとめを提供する。
【０２０１】
【表４】
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【０２０２】
各オリゴヌクレオチドのＥＣ５０値及びＣＣ５０値を表５にまとめる。表５に示すように、本開示のオリゴヌクレオチドは、低濃度でのＨＢＶウイルス抗原（ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ）の発現レベルを阻害するのに有効であった。実際に、オリゴヌクレオチドのＥＣ５０値は、ＨＢｅＡｇ阻害については０．０１３μＭ〜０．３５μＭの範囲であり、ＨＢｓＡｇ阻害については０．０１８μＭ〜１．１２μＭの範囲であった。表５を参照されたい。
【０２０３】
【表５】
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【０２０４】
これらの結果は、本開示のオリゴヌクレオチドが、ＨＢＶ感染した肝細胞中のウイルス抗原を低減し得ることを実証する。したがって、本開示のオリゴヌクレオチドは、対象におけるＨＢＶ感染症を治療するための方法において有用である。
【０２０５】
表６に記載されるように、配列番号７０〜７２、７４及び７５もまた、ＨＢＶ  ＤＮＡの低減について試験した。
【０２０６】
【表６】
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【０２０７】
更に、図２Ａは、用量依存的な方法での未治療対照と比較して、配列番号７１が、１０μＭ〜０．０８μＭの範囲の濃度で、ＨＢＶ感染したＰＨＨ中のｒｃＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡレベルを減少させたことを実証する。図２Ｂ〜図２Ｃは、配列番号７１による治療が、用量依存的な方法での未治療対照と比較して、ｃｃｃＤＮＡレベルの低減（例えば、１０μＭで６６．３％低減）をもたらしたことを実証する。
【０２０８】
図２Ｄは、配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７５による治療が、ＨＢＶ感染したＰＨＨ中のｃｃｃＤＮＡレベルの用量依存的低減（ｃｃｃＤＮＡレベルの約５０〜７５％の最大低減）をもたらしたことを実証する。配列番号７０、配列番号７２及び配列番号７５のＩＣ５０値は、それぞれ０．０３μＭ、０．０４μＭ及び０．１６μＭであった。
【０２０９】
図３Ａ〜図３Ｂは、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウスにおける、配列番号７１及び配列番号８０のインビボ肝臓濃度及び肝臓半減期を示す。配列番号７１の肝臓半減期は、３１９時間であった。配列番号８０の肝臓半減期は、安定であった。同様のパターンが、本明細書に開示される他のｃｃｃＤＮＡ標的オリゴヌクレオチドで観察された。これらの結果は、本開示のｃｃｃＤＮＡ標的オリゴヌクレオチドが、インビボで肝臓に送達されることを実証する。
【０２１０】
免疫不全状態のＦＲＧマウスをＨＢＶに感染させ、屠殺前に安定したビレミアに到達させた。感染した肝細胞を播種し、３つの異なる濃度の示されたオリゴヌクレオチドで（三連で）直ちに治療した。治療の９日後に、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベルをサザンブロットによって評価した。配列番号８０による治療は、未治療対照と比較して、エクスビボでＨＢＶ感染したＦＲＧ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）マウス肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルの＞６０％低減をもたらした。
【０２１１】
エクスビボＰＸＢ肝細胞をＨＢＶに感染させ、−１日目（感染の１日前）、０日目（感染と同日）、及び１日目（感染の１日後）に異なる濃度の示されたオリゴヌクレオチド（自由摂取）で治療した。感染後１２日目に、ｃｃｃＤＮＡレベルをｑＰＣＲによって評価した。配列番号８２による治療は、ＨＢＶに感染したエクスビボＰＸＢ肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルの＞５０％低減をもたらした。表７は、配列番号７１、８０及び８２についてのＨＢｓＡｇ  ＥＣ５０、ｃｃｃＤＮＡ低減、及び肝臓ＡＵＣのまとめを提示する。
【０２１２】
【表７】
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＊非共役親オリゴのＥＣ５０値（配列番号７１）
【０２１３】
図４Ａは、ＩＦＮ活性化遺伝子（ＩＳＧ）が、これらの治療された細胞内でのＤ−ループ構造の形成と一致する配列番号７１及び配列番号７２による治療時に、ＨＢＶ感染したＰＨＨにおいて上方調節されたことを示す。
【０２１４】
図４Ｂは、サイトカインが、配列番号７１及び配列番号７２と接触したＨＢＶ陰性細胞において誘導されなかったことを実証し、したがって、図４Ａで観察された免疫応答が、ＨＢＶ感染した細胞においてｃｃｃＤＮＡに特異的であったことを実証する。
【０２１５】
これらの結果は、本開示のオリゴヌクレオチドが、ＨＢＶ感染した肝細胞中のウイルス抗原及びウイルスＤＮＡを選択的に低減し得ることを実証する。したがって、本開示のオリゴヌクレオチドは、対象におけるＨＢＶ感染症を治療するための方法において有用である。
【０２１６】
同等物
本開示は、本開示の個々の態様の単一の説明として意図される、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるものではない。本開示の多くの修正及び変形は、当業者には明らかとなるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本開示の範囲内の機能的に同等な方法及び装置は、本明細書で列挙されるものに加えて、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正及び変形は、本開示の範囲内に含まれることが意図される。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的システムに限定されるものではなく、これらは無論のこと変更可能であることは理解されるはずである。また、本明細書において使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、限定的なものではない点も理解されるはずである。
【０２１７】
加えて、本開示の特徴又は態様が、マーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、それにより本開示がまた、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーの下位群に関して記載されることを認識するであろう。
【０２１８】
当業者には理解されるように、任意の及び全ての目的のために、特に記載された説明を提供するという観点から、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意の及び全ての可能な部分範囲及びそれらの部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が、少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分解されることを可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で説明される各範囲は、下３分の１、中間３分の１及び上３分の１等に容易に分解することができる。当業者には理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」等の全ての言語は、列挙された数を含み、上述のように、その後に部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は、各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４又は５個の細胞を有する群等を指す。
【０２１９】
本明細書で参照又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願及び刊行物は、全ての図面及び表を含めて、本明細書の明白な教示と矛盾しない程度で参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2019533472.tif 000038
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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