(57)【要約】有機化合物をヒドロキシ化するための、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素の使用。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機化合物をヒドロキシ化するための、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素の使用。
【請求項２】
脂肪族基または芳香環のヒドロキシ化を触媒するために前記シトクロムＰ−４５０酵素が使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ヒドロキシ化がｐＨ５．５〜１３、好ましくはｐＨ８〜１１で起こる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
プロピル基またはブチル基のヒドロキシ化を触媒するために、好ましくはイソプロピル基またはイソブチル基のヒドロキシ化を触媒するために、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基のヒドロキシ化を触媒するために、前記シトクロムＰ−４５０酵素が使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ヒドロキシ化される化合物が式（ＩＩ）の化合物であり、
【化１】
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式中、Ｒは化合物の残りの部分を表し、Ｒ１はＣＨ３またはＨである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ヒドロキシ化される化合物が、ボセンタン、ジクロフェナク、ブパルバコン、ＢＩＲＢ７９６またはリトナビルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記シトクロムＰ−４５０酵素が、還元酵素成分と、好ましくはフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素成分と併用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記シトクロムＰ−４５０酵素が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性、より好ましくは９６％の同一性、さらにより好ましくは９７％の同一性、最も好ましくは１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｐ−４５０酵素が、精製された形態、部分精製された形態、粗酵素抽出物、組換え宿主細胞の形態、または天然宿主細胞の形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型が、アミコラトプシス・ルリダ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｌｕｒｉｄａ）（ＮＲＲＬ−２４３０）細胞に存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型が、アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ２４３０）由来の、前記酵素をコードする異種核酸を含む少なくとも１種の組み換え
微生物によって発現される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ヒドロキシ化有機化合物の生産法であって、前記有機化合物と、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素とを反応させることを含む、前記生産法。
【請求項１３】
プロピル基またはブチル基のヒドロキシ化を触媒するために、好ましくはイソプロピル基またはイソブチル基のヒドロキシ化を触媒するために、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基のヒドロキシ化を触媒するために、前記酵素が使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式（ＩＩ）の化合物のヒドロキシ化を触媒するために前記酵素が使用され、
【化２】
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式中、Ｒは化合物の残りの部分を表し、Ｒ１はＣＨ３またはＨである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキシ化される化合物が、ボセンタン、ジクロフェナク、ブパルバコン、ＢＩＲＢ７９６またはリトナビルである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記シトクロムＰ−４５０酵素が、還元酵素成分と、好ましくはフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素成分と併用される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シトクロムＰ−４５０酵素が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性、より好ましくは９６％の同一性、さらにより好ましくは９７％の同一性、最も好ましくは１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｐ−４５０酵素が、精製された形態、部分精製された形態、粗酵素抽出物、組換え宿主細胞の形態、または天然宿主細胞の形態である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型がアミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）細胞に存在し、且つ、前記細胞がヒドロキシ化される有機化合物を投与され、その後所望により前記細胞が回収および精製されることで前記ヒドロキシ化された化合物が得られる、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型が、アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ２４３０）由来の、前記酵素をコードする異種核酸を含む少なくとも１種の組み換え微生物によって発現され、前記少なくとも１種の組み換え微生物がヒドロキシ化される有機化合物を投与され、その後所望により精製工程にかけられることで、前記ヒドロキシ化された化合物が得られる、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒドロキシ化される化合物がジクロフェナクである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
ｉ）配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、もしくは配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素、または、ｉｉ）配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、もしくは配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素を発現する微生物を含み、且つ、有機化合物をヒドロキシ化するための使用説明書をさらに含む、キット。
【請求項２３】
還元剤、好ましくはフェレドキシン還元酵素およびフェレドキシンをさらに含み、所望により緩衝液をさらに含み、所望によりこれらが別々の成分として提供される、または単一の融合タンパク質コンストラクト内で連結されている、請求項２２に記載の使用のためのキット。
【請求項２４】
１または複数の他のＣＹＰ−４５０酵素をさらに含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記シトクロムＰ−４５０酵素または微生物が凍結乾燥されている、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有機基質のヒドロキシ化を触媒するためのシトクロムＰ−４５０酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）はヘム−チオレートタンパク質のスーパーファミリーであり、それらに一酸化炭素が結合した化学種が４５０ｎｍに吸光度スペクトルのピークを有することから命名がなされた。シトクロムＰ４５０は動物、植物、真菌、原生生物、細菌、古細菌（archeae）等の全ての生物界に存在しており、さらに、巨大ウイルスである
多食アメーバ（A. polyphaga）由来の、Ｐ４５０と推定されるものが最近報告された（Lamb, DC; Lei, L; Warrilow, AG; Lepesheva, GI; Mullins, JG; Waterman, MR; Kelly, SL (2009). "The first virally encoded cytochrome P450". Journal of Virology. 83 (16): pp8266-9）。シトクロムＰ４５０は大腸菌（E.coli）では確認されていない（Roland Sigel; Sigel, Astrid; Sigel, Helmut (2007). The Ubiquitous Roles of Cytochrome
P450 Proteins: Metal Ions in Life Sciences. New York: Wiley. ISBN 0-470-01672-8; Danielson PB (December 2002). "The cytochrome P450 superfamily: biochemistry, evolution and drug metabolism in humans". Curr. Drug Metab. 3 (6): pp561-97）。
【０００３】
シトクロムＰ４５０はその反応化学特性において驚くほどの多様性を示し、多様な一連の内在性基質および生体異物基質の酸化的代謝、過酸化的代謝および還元的代謝を支えている。
【０００４】
ヒトにおいては、シトクロムＰ４５０は第Ｉ相の薬物代謝におけるその中心的役割で最もよく知られており、そこでは、シトクロムＰ４５０が、臨床薬理学において最も重大な問題のうちの２つ、すなわち薬物相互作用および薬物代謝における個体間変動、において決定的な重要性をもつ。
【０００５】
シトクロムＰ４５０によって触媒される最も一般的な反応はモノオキシゲナーゼ反応である。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼはヘム基を利用して分子を酸化し、しばしば、極性基の付加または露出によって分子をより水溶性にする。一般的に、これらの酵素によって触媒される反応は以下のようにまとめることができる：
Ｒ−Ｈ＋Ｏ２＋２ｅ−→Ｒ−ＯＨ＋Ｈ２Ｏ
【０００６】
式中、Ｒ−Ｈは基質であり、Ｒ−ＯＨは酸素が付加された基質である。前記酸素はＣＹＰ酵素の中心にあるヘム基に結合し、水素イオン（Ｈ＋）は通常、ＣＹＰ酵素の特定のアミノ酸を通じて還元された補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに由来する。ＣＹＰ酵素は、シトクロムｂ５、フェレドキシン還元酵素とフェレドキシン、およびアドレノドキシン還元酵素とアドレノドキシン等の、一連の酸化還元パートナータンパク質から電子を受け取ることができる。
【０００７】
シトクロムＰ４５０の分類および命名法はかなり複雑であるが、I. Hanukoglu (1996).
"Electron Transfer Proteins of Cytochrome P450 Systems". Advances in Molecular and Cell Biology. Advances in Molecular and Cell Biology. 14: 29-56によって提唱
されている、それらの酸化還元パートナー輸送タンパク質系によって分類することができる。要約すると、シトクロムＰ４５０は以下の群に分類できる。
電子を補因子からシトクロムＰ４５０に移動させるためにシトクロムＰ５４０還元酵素ま
たはシトクロムｂ５を利用するミクロソーム型Ｐ４５０系；
電子を還元された補因子からシトクロムＰ４５０に移動させるためにアドレノドキシン還元酵素とアドレノドキシンを利用するミトコンドリア型Ｐ４５０系；
電子を還元された補因子からシトクロムＰ４５０に移動させるためにフェレドキシン還元酵素とフェレドキシンを利用する細菌型Ｐ４５０系；
補因子からシトクロムＰ４５０への電子移動のためにシトクロムｂ５を利用するＣＹＢ５Ｒ−ｃｙｔｂ５−Ｐ４５０系；
電子パートナー還元酵素が縮合ＦＭＮドメインであるＦＭＮ−Ｆｄ−Ｐ４５０系；
酸化還元パートナータンパク質を必要としないＰ４５０のみの系、例えば、Ｐ４５０ＢＭ−３。
【０００８】
単離された細菌性のシトクロムＰ４５０酵素は公知であり、プチダ菌（Pseudomonas putida）由来のＰ４５０ｃａｍ（J Biol Chem (1974) 249, 94）；共に巨大菌（Bacillus megaterium）（ＡＴＣＣ１４５８１）由来のＰ４５０ＢＭ−１およびＰ４５０ＢＭ−３（Biochim Biophys Acta (1985) 838, 302、およびJ Biol Chem (1986) 261, 1986, 7160）
；ダイズ根粒菌（Rhizobium japonicum）由来のＰ４５０ａ、Ｐ４５０ｂ、およびＰ４５
０ｃ（Biochim Biophys Acta (1967) 147, 399）；並びに、ノカルジアＮＨＩ（Nocardia
NHI）由来のＰ４５０ｎｐｄ（Microbios (1974) 9, 119）が挙げられる。
【０００９】
しかし相対的に、放線菌微生物から精製されたシトクロムＰ４５０酵素は報告がないままである。Biochem and Biophys Res Comm (1986) 141, 405には、大豆粉によるストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）におけるシトクロムＰ−４５０の誘導（Ｐ４５０ｓｏｙ）が記述されている。他の報告された例としては、Biochemistry (1987) 26, 6204に記載される、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）（元々はストレプトマイセス・エリスラエウス（Streptomyces erythraeus）に分類）からの、農薬不活性化の効果を及ぼすＰ４５０の２つの形態（Ｐ４５０ＳＵ１およびＰ４５０ＳＵ２）並びに６−デオキシエリトロノリドＢヒドロキシラーゼの２つの形態の単離および特性が挙げられる。米国特許第６８８４６０８号には、アミコラトプシス・オリエンタリス（Amycolatopsis orientalis）（元々はストレプトマイセス・オリエンタリス（Streptomyces orientalis）に分類）の菌株によって産生されるヒドロキシ化酵素に
よって果たされる、エポチロンＢのエポチロンＦへの酵素的ヒドロキシ化が記述されている。
【００１０】
医薬品化学の分野では、化学物質の特性を改変するために、化学物質の修飾が用いられている。例えば、薬らしい分子の合成において、医薬品化学者は疎水性の導入のために第三ブチル部分をしばしば使用する。しかし、そのさらなる修飾により、係る化合物の力価プロファイル、選択性プロファイルおよび溶解性プロファイルを向上させてもよく、例えばヒドロキシ化を用いることができる。ヒドロキシ化はまた、薬理学および医薬品化学の別の重要な側面である代謝分解の主要な経路でもある。動物組織による生体内変換を用いた、これらのヒドロキシ化された代謝産物の生産法が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、アミコラトプシス・ルリダ（Amycolatopsis lurida）（ＮＲＲＬ−２４３０）に存在するシトクロムＰ−４５０酵素を、広範囲の有機基質のヒドロキシ化に使用できることが分かった。
【００１２】
特に配列番号３を有するシトクロムＰ−４５０酵素は、化合物の物理化学的特性および薬理学的特性の活性化または改変を目的とした、有機化合物のヒドロキシ化に使用することができる。特に好ましい実施形態では、配列番号３を有するシトクロムＰ−４５０酵素
は、化合物の物理化学的特性や薬理学的特性のＣ−Ｈ活性化またはＣ−Ｈ修飾を目的とした、イソプロピル部分もしくは第三ブチル部分、またはそのような部分を含む化学物質のヒドロキシ化に使用される。
【００１３】
本発明の第一の態様は、有機化合物をヒドロキシ化するための、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素の使用を提供する。
【００１４】
本発明の第二の態様は、有機化合物と、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素を部分的に含有する酵素調製物とを反応させることを含む、ヒドロキシ化された有機化合物の生産法を提供する。
【００１５】
本発明の第三の態様は、ｉ）配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、もしくは配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素、または、ｉｉ）配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、もしくは配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素を発現する微生物を含み、有機化合物をヒドロキシ化するための使用される説明書および他の補因子試薬をさらに含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】本発明によって発揮される生体内変換の例を模式的に示している。図１（ａ）はボセンタンのヒドロキシ化を示しており；図１（ｂ）はブパルバコンのヒドロキシ化を示しており；図１（ｃ）はリトナビルのヒドロキシ化を示している。
【図１Ｂ】本発明によって発揮される生体内変換の例を模式的に示している。図１（ｄ）はチバンチニブのヒドロキシ化を示しており；図１（ｅ）はジクロフェナクのヒドロキシ化を示している。
【図２Ａ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号１はＰ４５０ａｌｕＣ０９およびフェレドキシンａｌｕＦ０３の核酸配列であり；配列番号２はＰ４５０ａｌｕＣ０９およびフェレドキシンａｌｕＦ０３のコード配列である。
【図２Ｂ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号３はＰ４５０ＡｌｕＣ０９のアミノ酸配列であり；配列番号４はフェレドキシンＡｌｕＦ０３のアミノ酸配列であり；配列番号９は、ＤＮＡ２．０製の、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩによりｐＤ４５４−ＳＲプラスミドにサブクローニングされた合成ＤＮＡである。
【図２Ｃ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号１０はフェレドキシンＦｄ１のアミノ酸配列であり；配列番号１１はフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａのアミノ酸配列である。
【図２Ｄ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号１４はフェレドキシン還元酵素ｃａｍＡおよびフェレドキシンｃａｍＢのコード配列である。
【図２Ｅ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号１５はフェレドキシン還元酵素ＣａｍＡのアミノ酸配列であり；配列番号１６はフェレドキシンＣａｍＢのアミノ酸配列であり；配列番号２３は、ジェンスクリプト社（Genscript）製の、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩによりｐＥＴ２９ａにサブクローニングされた合成ＤＮＡである。
【図２Ｆ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号２４は切断型Ｐ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列である。
【図２Ｇ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号２５はＰ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメインとインフレームで融合されたＰ４５０ａｌｕＣ０９のコード配列である。
【図２Ｈ】様々なＩＤ配列を示している。配列番号２６はＰ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメインとインフレームで融合されたＰ４５０ＡｌｕＣ０９のアミノ酸配列である。
【図３】Ｐ４５０ａｌｕＣ０９タンパク質（矢印を参照）を含有する粗酵素抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。試料はｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞のＩＰＴＧ誘導培地から調製した。
【図４】Ｐ４５０ａｌｕＣ０９タンパク質を含有する粗酵素抽出物の一酸化炭素差スペクトル（carbon monoxide difference spectrum）を示している。試料はｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞のＩＰＴＧ誘導培地から調製した。
【図５Ａ】１００μＬのスクリーニング規模で行われた各種反応の超高速高分離液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）のクロマトグラムを示している。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【図５Ｇ】同上。
【図６】ＤＭＳＯ−ｄ６中のＯＨ−ボセンタンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（上段）とＤＭＳＯ−ｄ６中のボセンタン（下段）との比較。３．４２ｐｐｍにおける新たなシグナルの出現（２Ｈ、二重線、ＣＨ２ＯＨ）と、ヒドロキシボセンタンにおける６Ｈと比較した場合のボセンタンにおける９Ｈからのメチルシグナル積分値の減少とから、ヒドロキシ化の場所がｔ−ブチル基であることが確認される。
【図７】ブパルバコン（上段）と比較したＨＯ−ブパルバコン（下段）のＤＭＳＯ−ｄ６中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。４．３１ｐｐｍ（１Ｈ、三重線、ヒドロキシプロトン）および３．１２ｐｐｍ（２Ｈ、二重線、ＣＨ２ＯＨ）における新たなシグナルの出現と、ヒドロキシブパルバコンにおける６Ｈと比較した場合のブパルバコンにおける９Ｈからのメチルシグナル積分値の減少とから、ヒドロキシ化の場所がｔ−ブチル基であることが確認される。
【図８】ＤＭＳＯ−ｄ６中のε−ＨＯ−Ｎ−メチルイソプロピルチアゾロイルメチル−リトナビルのＨＭＢＣ  ＮＭＲスペクトル。イソプロピルメチルシグナルは１．４９ｐｐｍおよび１．４８ｐｐｍの一重線であり、７１．５ｐｐｍのヒドロキシ化された架橋炭素、１８１ｐｐｍのチアゾリル炭素、および３０ｐｐｍの互いの炭素に対して相関性を示している。新たなヒドロキシプロトンは５．９１ｐｐｍの一重線として明らかであり、同じ炭素に対して相関性を示している。７．１６ｐｐｍのチアゾリルプロトン一重線も１８１ｐｐｍの前記炭素と相関している。
【図９】発現ベクターｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３。
【図１０】異なる反応ｐＨにおける凍結乾燥された（lyophisised）酵素調製物の無細胞活性試験から得られたヒドロキシ−ボセンタン生成物の収率。
【図１１】凍結乾燥された酵素調製物の無細胞活性試験および異なる反応ｐＨから得られた５−ヒドロキシ−ジクロフェナク生成物および４｀−ヒドロキシ−ジクロフェナク生成物の収率。
【図１２】発現ベクターｐＤ４５４−ＳＲ：２４２３７０。
【図１３】発現ベクターｐ３Ｃ．１−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３。
【図１４】発現ベクターｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３。
【図１５】発現ベクターｐ３Ｃ−ＡｌｕＣ０９。
【図１６】発現ベクターｐＣａｍＡＢｎ。
【図１７】発現ベクターｐＥＴ２９ａ−ＰｄＲ−ＰｄＸ。
【図１８】発現ベクターｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＰｄＲ−ＰｄＸ。
【図１９】発現ベクターｐＥＴ２１ａ−ＢＭ３。
【図２０】発現ベクターｐＥＴ２１ａ−ＡｌｕＣ０９＿ＢＭ３。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第一の態様は、有機化合物をヒドロキシ化するための、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素の使用を提供する。
【００１８】
具体的には、本発明はシトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９酵素の使用を提供する。この酵素は配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
前記酵素は、農業研究局微生物株保存機関（ARS Culture Collection）、国立農業利用研究センター（National Center for Agricultural Utilization Research）（1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA）に受託番号ＮＲＲＬ２４３０で寄託されたアミコラトプシス・ルリダ菌株に存在する。この菌株はアメリカ培養細胞系統保存機関（American Tissue Culture Collection）にも受託番号ＡＴＣＣ１４９３０で寄託されている。
【００２０】
この酵素、またはその変異型は、好適な還元酵素成分と組み合わされた場合、有機化合物をヒドロキシ化することができる。
【００２１】
当業者によって理解されるように、前記シトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９酵素は、公知のアミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）から、または他の菌種から、精製有りまたは無しで抽出することができ、あるいは、シトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９を大腸菌（E.coli）などの発現系にクローニングすることによって、組換え発現系から、精製有りまたは無しで同様に抽出することができる。
【００２２】
アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を含む放線菌類は、自然要因から、さらには、紫外線照射、放射線治療および化学的治療等の人為的な処置の結果としても、変異を起こし易い。本発明は、アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）の全ての増殖性変異体を包含する。また、これらの変異株には、遺伝子組換え、形質導入および形質転換等の遺伝子操作によって得られるあらゆる菌株が包含される。また、周知の通り、放線菌類の特性は、同じ菌株であっても、連続的な培養後にある程度変化する。従って、培養物の特性には僅かな差異があるため、菌株同士は必ずしも分類学的に区別可能でなくてもよい。本発明は、前記シトクロムＰ−４５０酵素のうちの１または複数を産生できる全ての菌株、および、特に、ＮＲＲＬ−２４３０菌株またはその変異株と明確に区別できない菌株を包含する。
【００２３】
本明細書に例示される特定のアミノ酸配列の変異型が本発明に包含されてもよいことは、当業者には明らかである。１または複数のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、欠失または付加された、本明細書に開示されるアミノ酸配列のそれに類似したアミノ酸配列を有する変異型が特に好ましい。中でも、本発明のタンパク質の特性と活性を変化させないサイレント置換、サイレント付加およびサイレント欠失が好ましい。類似の特性を有する多様なアミノ酸が存在するが、ある物質の１または複数のそのようなアミノ酸は、その物質の所望の活性を除去することなく、１または複数の他のアミノ酸で置換できる場合が多い。すなわち、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンはしばしば、互いに置換可能である（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換の中でも、グリシンおよびアラニンを用いて互いに置換することが好ましく（これらは比較的短い側鎖を有しているため）、また、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを用いて互いに置換することが好ましい（これらは疎水性の巨大な脂肪族側鎖を有するため）。互いに置換できる場合が多い他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
、システインおよびメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。変異型には自然発生的な変異型と人工的な変異型とが包含される。人工的な変異型は、核酸分子、細胞または生物に適用されるものを含む突然変異誘発法を用いて生成することができる。前記変異型は、本明細書に例示されるアミノ酸配列と実質的同一性を有することが好ましい。本明細書で使用される場合、用語「変異型」または「その変異体」とは、配列番号３と、「実質的同一性」を有するアミノ酸配列を指し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．１％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．３％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列が好ましい。「実質的同一性」という用語は、望ましくは、前記配列が、従来技術のアミノ酸配列とよりも、本明細書に記載される配列のいずれかと、より大きな程度の同一性を有することを示す。アミノ酸配列を比較するために、ＣＬＵＳＴＡＬプログラム等のプログラムを利用することができる。このプログラムは、アミノ酸配列同士を比較するものであり、必要に応じていずれかの配列にスペースを挿入することで最適なアラインメントを見つける。最適アラインメントを目的として、アミノ酸の同一性または類似性（アミノ酸種類の同一性および保存）を算出することができる。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列が最長となるようにアラインメントを行い、その一致に対して値を割り当てる。すなわち、類似領域がいくつか存在し、それぞれが異なるスコアを有する場合も、比較を行うことができる。上記は本出願で開示される全てのアミノ酸配列に準用される。
【００２４】
好ましい実施形態において、用語「変異型」または「その変異体」は、通常、配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ４５０活性を有する配列を指し、配列番号３と少なくとも９０％の同一性または配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有することがより好ましく、配列番号３と９６％の同一性を有することがさらに好ましく、配列番号３と９７％の同一性を有することがさらにより好ましく、配列番号３と１００％の同一性を有することが最も好ましい。
【００２５】
特許請求の範囲に記載されたシトクロムＰ−４５０酵素を用いて様々な化合物をヒドロキシ化することができる。好ましい実施形態では、本明細書の実施例７に記載されるものと同じ条件を用いて、ヒドロキシ化される有機化合物は少なくとも３％のヒドロキシ化された誘導体への変換率を有し、より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは１００％のヒドロキシ化された誘導体への変換率を有する。
【００２６】
前記ヒドロキシ化される有機化合物はエポチロンではないことが好ましい。
【００２７】
前記シトクロムＰ−４５０酵素によりヒドロキシ化される化合物は、置換されていてもよいイソプロピルまたはｔｅｒｔ−ブチル等の分岐アルキル基を有して、それがヒドロキシ化されてもよいし；あるいは、置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール等の芳香族基を有して、それがヒドロキシ化されてもよい。
【００２８】
これらの化合物からヒドロキシ化された誘導体への変換率は、特許請求の範囲に記載されたシトクロムＰ−４５０酵素を使用した場合に特に高くなる。
【００２９】
ヒドロキシ化される化合物は式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物であることが好ましい。
【００３０】
【化１】
2019536479.tif 000003
式中、Ｒは化合物の残りの部分を表す。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してＨまたはＣ１−１２アルキルまたはＣ６−１０アリールから選択され、あるいは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちいずれか２つが互いに結合して、置換されていてもよいシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、あるいは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が互いの架橋炭素と結合してオレフィン、アリールまたはヘテロアリールを形成していてもよい。Ａは置換されていてもよいベンジル、アリールまたはヘテロアリールである。
【００３１】
Ｒは置換されていてもよいアルキル；置換されていてもよいオレフィン、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールまたは置換されていてもよいヘテロシクロアルキルであることが好ましい。
【００３２】
Ａは、１または複数のハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ基、＿−ＣＯＯＨ基、Ｃ１〜Ｃ８−ＣＯＯＨ基、シアノ基、アミノ基またはアルキルアミノ基で置換されていてもよいベンジル、アリールまたはヘテロアリールであることが好ましい。
【００３３】
Ａは、１または複数のハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、−ＣＯＯＨ基またはＣ１〜Ｃ４アルキル−ＣＯＯＨ基で置換されていてもよいベンジル、アリールまたはヘテロアリールであることがより好ましい。
【００３４】
Ａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ基、−ＣＯＯＨ基、Ｃ１〜Ｃ８−ＣＯＯＨ基、シアノ基、アミノ基またはアルキルアミノ基で置換されていてもよいＣ６アリールまたはＣ４〜Ｃ２０の二環式もしくは三環式のヘテロアリールであることがより好ましい。
【００３５】
Ａは、インドリル、イソインドリル（isindolyl）、アザインドリルまたは下記式を有
する基であることが最も好ましい。
【００３６】
【化２】
2019536479.tif 000004
【００３７】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基を意味し、直
鎖状であっても分岐鎖状であっても環式であってもよい。例としてプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。Ｃ３〜Ｃ１０のアルキル部分であることが好ましい。Ｃ５〜Ｃ６のアルキル部分であることがより好ましい。前記アルキルは置換されていてもよいシクロヘキシルであることが好ましい。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、上記で定義されたようなアルキル基に酸素原子が結合したものを意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」とはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルアミノ」とは、本明細書で定義されたような少なくとも１つのアルキル基が、アミノ基を介して親分子部分に付加されていることを意味する。好適なアルキルアミノ基の例として、メチルアミノ（methlamino）、エチルアミノ（ethlamino）、プロピルアミノ（proylamino）、ブチルアミノおよびヘキシルアミ
ノが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４１】
用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素炭素二重結合と、１〜１０個の炭素原子とを含有する直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を意味する。
【００４２】
明確にするために記すと、シクロアルキルという用語は環状アルキル基のことである。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「アリール」とは、フェニル、ビフェニル、ナフチル（napthyl）、アントラセニル等の置換されていてもよい単環式、二環式または三環式の芳香
族ラジカルを意味する。前記アリールは置換されていてもよいＣ６アリールであることが好ましい。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」とは、酸素、窒素および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する置換されていてもよい単環式、二環式または三環式の芳香族ラジカルを意味し、例えば、フラニル、ピロリル、チアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チエニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、インドリル、アザインドリル、イソインドリル、キノリル、イソキノリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリルが挙げられる。前記ヘテロアリールは置換されていてもよいチオアゾールであることが好ましい。
【００４５】
本明細書で使用される場合、ヘテロシクロアルキルとは、１〜４個の炭素原子がヘテロ原子で置換されている、置換されていてもよいシクロアルキルを意味する。前記ヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄または亜リン酸（phosphorous）から選択されることが好ましい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「置換されていてもよい」とは、Ｈが化合物から除去されており、炭素、水素、窒素、酸素および硫黄を任意に組み合わせて構成されるもの等の有機断片と置換されていることを意味する。
【００４７】
前記式（Ｉ）の化合物は５０〜２０００の分子量を有することが好ましく、例えば１００〜７００の分子量が挙げられ、２００〜５００の分子量を有することがより好ましい。
【００４８】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも２つはＣ１〜１２アルキルまたはＣ６〜１０アリールから選択されることが好ましい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ６−１０アリールから選択されることが好ましいが、ただし、Ｒ１、Ｒ
２およびＲ３のうち１つだけがＨである、またはどれもＨでないことが好ましい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してＨ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルから選択されることが最も好ましいが、ただし、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうち１つだけがＨである、またはどれもＨでないことが好ましい。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、ヒドロキシ化される化合物は式（ＩＩ）の化合物であり、
【００５０】
【化３】
2019536479.tif 000005
式中、Ｒは化合物の残りの部分を表し、Ｒ１はＣＨ３またはＨである。
【００５１】
この場合、前記シトクロムＰ−４５０酵素は以下の反応を触媒する。
【００５２】
【化４】
2019536479.tif 000006
【００５３】
すなわち、特に好ましい実施形態では、前記有機化合物はイソプロピル基またはｔｅｒｔ−ブチル基を含む。ヒドロキシ化される基がｔｅｒｔ−ブチル部分であることが最も好ましい。前記シトクロムＰ−４５０酵素が、ｔｅｒｔ−ブチル部分を有する基質化合物のヒドロキシ化ｔｅｒｔ−ブチル誘導体への変換を触媒する。
【００５４】
特に好ましい実施形態では、前記シトクロムＰ−４５０酵素はボセンタン、ジクロフェナク、ブパルバコン、チバンチニブ、ＢＩＲＢ７９６またはリトナビル等の化合物と反応する。前記シトクロムＰ−４５０酵素はボセンタン、ブパルバコン、ＢＩＲＢ７９６またはリトナビルと反応することが最も好ましい。
【００５５】
式（Ｉ）の化合物は通常、以下の構造式の化合物である。
【００５６】
【化５】
2019536479.tif 000007
【００５７】
【化６】
2019536479.tif 000008
【００５８】
【化７】
2019536479.tif 000009
【００５９】
【化８】
2019536479.tif 000010
【００６０】
【化９】
2019536479.tif 000011
【００６１】
【化１０】
2019536479.tif 000012
【００６２】
前記シトクロムＰ−４５０酵素は、前記シトクロムＰ−４５０を活性化する還元酵素成分と組み合わせて使用されてもよい。好ましい実施形態では、フェレドキシンおよびフェ
レドキシン還元酵素成分が使用される。シトクロムＰ−４５０を活性化するものであればいかなる成分が用いられてもよく、例えば、直接的もしくは間接的に作用する小分子化学物質、溶液状のタンパク質化学物質、または直接的にもしくはペプチド結合で融合したもの、または、電極を介した電気的なもの、が挙げられる。特に好ましい実施形態では、前記配列番号３を有するシトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素を、好適なフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素成分と組み合わせることで、基質化合物をヒドロキシ化された誘導体に変換するのに効果的な系が得られる。
【００６３】
好ましい実施形態では、前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型はアミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）細胞に存在する。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型は、アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ２４３０）に由来する、前記酵素をコードする異種核酸を含む少なくとも１種の組み換え微生物によって発現される。本明細書で使用される場合、用語「含む」は、特許請求の範囲に記載された配列を少なくとも含有することを意味することを意図したものであるが、他の配列を含んでもよい。一実施形態において、前記組み換え微生物は前記酵素またはその変異型をコードする異種核酸を含む。別の実施形態では、前記組み換え微生物は還元酵素剤をコードする異種核酸も含む。
【００６５】
本発明の別の態様において、有機化合物と、配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素とを反応させることを含む、ヒドロキシ化された有機化合物の生産法が提供される。
【００６６】
ヒドロキシ化される化合物の選択に関しては上記の通りである。
【００６７】
好ましい実施形態では、前記酵素はプロピル基またはブチル基のヒドロキシ化を触媒するために使用され、より好ましくはイソプロピル基またはイソブチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基のヒドロキシ化を触媒するために使用される。最も好ましくは、前記酵素はｔｅｒｔ−ブチル部分のヒドロキシ化を触媒するために使用される。前記シトクロムＰ−４５０酵素はｔｅｒｔ−ブチル部分を有する基質化合物の、ヒドロキシ化された−ｔｅｒｔ−ブチル誘導体への変換を触媒することができる。
【００６８】
特に好ましい実施形態では、前記ヒドロキシ化される化合物はボセンタン、ジクロフェナク、チバンチニブ、ブパルバコン、ＢＩＲＢ７９６またはリトナビルである。前記ヒドロキシ化される化合物はボセンタン、ブパルバコン、ＢＩＲＢ７９６またはリトナビルであることが最も好ましい。
【００６９】
前記シトクロムＰ−４５０酵素を活性化するために、１または複数の追加成分が使用されてもよい。本発明による実施形態では、前記シトクロムＰ−４５０酵素は還元酵素成分と組み合わされて使用され、好ましくはフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素成分と組み合わされて使用される。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型はアミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）細胞に存在する。前記細胞はヒドロキシ化される有機化合物を投与される場合がある。この方法は、前記細胞をその後回収し精製することでヒドロキシ化された化合物を得る追加の工程を含んでもよい。
【００７１】
Ｐ−４５０酵素抽出物を生産するためのアミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３
０）の培養は、係る微生物との共に使用されることがよく知られている栄養分を含有する従来培地の播種によって、好適に行われる。すなわち、前記培地は同化できる炭素の供給源および同化できる窒素の供給源を含有する。前記培地は無機塩類を含有していてもよい。同化できる炭素の供給源の例としては、グルコース、スクロース、デンプン、グリセリン、水飴、糖蜜およびダイズ油が挙げられる。同化できる窒素の供給源の例としては、ダイズ固形分（大豆ミールまたは大豆粉等）、コムギ胚芽、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、乾燥酵母、および硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩類が挙げられる。必要であれば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウムおよび各種リン酸塩類等の無機塩類が含まれてもよい。前記培地は、滅菌され、５〜８に調整されたｐＨを有することが好ましい。
【００７２】
当業者には理解されることであるが、特定の培養法の使用は本発明にとって重大な意味を持つわけではなく、また、放線菌の培養に一般に使用されるいかなる方法も本発明に等しく採用され得る。通常、採用される方法は産業的な効率を考慮して選ばれる。すなわち、産業的な観点からは、液体培養が通常好ましく、液内培養が最も好都合である。培養は好気条件下で行われることが好ましい。
【００７３】
本発明の酵素は誘導酵素であり、誘導剤が存在しない限りは生産されない。この誘導剤は、単離された酵素の目的基質と同じとなるように選択されることが好ましいが、それに限定はされない。播種後４時間から３日間経過してから、好ましくは０．０５〜５ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭの誘導剤を添加し、その後、２時間から１週間、好ましくは約１日間、培養を継続する。培養温度は通常は２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３０℃であり、最適は約２７℃である。振盪培養またはエアレーション法を用いることができる。
【００７４】
前記培養により得られた細胞は、緩衝溶液中での高圧ホモジナイズ法等の細胞破壊法によって破壊される場合がある。遠心分離により得られた上清から粗酵素溶液が得られる。例えば、本発明の酵素は、３８，０００×ｇで２０分間の遠心分離により生じた上清中に得ることができる。
【００７５】
別の実施形態では、前記シトクロムＰ−４５０酵素またはその変異型は、アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ２４３０）に由来する、前記酵素をコードする異種核酸を含む少なくとも１種の組み換え微生物によって発現される。
【００７６】
ここで、前記少なくとも１種の組み換え微生物には、ヒドロキシ化される有機化合物を投与することができる。この方法はヒドロキシ化された化合物を得るための精製工程を含んでもよい。
【００７７】
好ましい実施形態において、これは、インタクトなヘムを有する機能的なシトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９タンパク質の組換え発現によって達成できる。これは、補因子酵素のうちのいずれかまたは全てと発現できる。特に好ましい実施形態では、フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素が発現され得る。これは、多シストロン性プラスミドの使用によって又は融合タンパク質を介して、リンカーを介して又は直接的に、単一のタンパク質産物へと、達成できる。
【００７８】
あるいは、前記機能的なシトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９タンパク質は、補因子酵素と混合させずに、単独で発現される場合がある。好ましい実施形態では、補因子酵素は、物質生産後に活性がある酵素反応を与えるように用量設定され得る。前記補因子は、野生型または組換え型の、植物由来または微生物発酵由来の物質からの抽出によって得てもよい。Hussain & Ward,. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(1):373-382には使用され得る
クローニング法が記載されている。
【００７９】
組換え酵素または抽出酵素を発現する天然生物、宿主菌株は、一相性、二相性または三相性の水性媒体中で基質と直接接触していることが好ましく、係る多相系は分散形態か層状形態である。ｐＨおよび温度の選択をはじめとする反応条件は当業者には明らかであり、従来技術に基づくものである。例えば、ｐＨ値が５〜１２の範囲内、より好ましくは６．５〜１１．０の範囲内、最も好ましくは約７．４の、微生物増殖培地またはリン酸緩衝液を選択して使用してよい。特に注目すべきは、高いｐＨ値（例えばｐＨ値１１）におけるこの組換え酵素の活性である。そのようなｐＨでも反応を触媒可能であることは、カルボキシル部分を有する化合物等の、ｐＨが高くなるほど溶解性が向上する選択された基質について、基質添加量を増加させることができるため、特別な商業的利点をもたらす。より高いｐＨにおける触媒作用の他の利点は、化学合成、原料の塩基触媒加水分解、またはｐＨ上昇を利用して反応が停止された別の酵素による反応産物等、生成物をもたらした前の工程から係る生成物をそのまま利用することができることである。反応温度は好ましくは１０℃〜４５℃の範囲内、より好ましくは２５℃〜３０℃の範囲内である。反応媒体中の基質の濃度は０．０１重量％〜５．０重量％の範囲内であることが好ましい。前記反応に許容される時間は、反応混合物中の基質濃度、反応温度、および他の要因に応じて変動し得るが、通常は１分間〜５日間であり、さらには、１時間〜１６時間である場合が多い。抽出された酵素物質は、抽出後にそのまま使用されることもあるし、凍結溶液中で保存後に使用されることもある。特に好ましい実施形態では、前記抽出された酵素物質は、後の使用のために、他の酵素補因子成分等の、反応に必要な他の成分を添加して又は添加せずに、好ましくは凍結乾燥によって、乾燥されることがある。
【００８０】
変換反応の完了後、ヒドロキシ化された化合物は従来の方法を用いて単離することができ、例えば、濾過、溶媒抽出、クロマトグラフィー、結晶化、および他の単離法が挙げられる。そのような方法は、生成物の固有性を考慮に入れて選択されることになる。単離前、単離中、または単離後に、必要に応じて、生成物は誘導体化されてもよいし、誘導体化されなくてもよい。
【００８１】
前記酵素の基質としての出発物質は、合成経路由来であってもよいし、天然であってもよく、植物性材料等の天然バイオマスを介したものでも、発酵によって生成されてもよく、またはその混合経路によるものでもよい。酵素反応は、純粋な材料を用いて行うこともできるし、精製されていない材料を用いて行うこともでき、得られた反応物は後の反応成分または未反応成分の精製を促すために用いてよい。
【００８２】
出発物質として使用される基質化合物のうち、トシル酸塩または塩酸塩類等の、有機性または無機性の、遊離塩基類、アルカリ金属塩類、例えばナトリウム塩類またはカリウム塩類、または酸性塩類が、使用に適している。
【００８３】
変換反応の完了後、所望の化合物が、前記反応系から生成され、収集され、単離され、必要であれば常法により精製されるか、以降の工程で未精製形態でそのまま使用され得る。例えば、前記反応産物は遠心分離または濾過され、上清または濾液が疎水性樹脂、イオン交換樹脂または酢酸エチル等の水非混和性有機溶剤で抽出される。前記抽出物の溶媒の蒸発後、残りの粗ヒドロキシ化化合物、例えば残りの粗ヒドロキシ化ｔｅｒｔ−ブチル化合物は、シリカゲルもしくはアルミナまたは逆相固定相を用いるカラムクロマトグラフィにかけ、好適な溶離液で溶離させることによって、精製され得る。出発物質が混合物である場合、生成物はヒドロキシ化された化合物の混合物として単離され、所望により、クロマトグラフィーまたは他の好適な方法を用いて分離され得る。
【００８４】
通常、前記ヒドロキシ化された化合物は、生理活性力価等の医薬品もしくは農薬として
の特性が向上したり、溶解性が向上したり、非特異的な相互作用が低減したり、以降の合成用等、単純にさらに有用であったり、分析用標準として有用となり得る。上記の式（Ｉ）および式（ＩＩ）のヒドロキシ化された化合物が特に好ましい。
【００８５】
構造が著しく異なる２種類の基質、すなわち、ボセンタン等の芳香族ｔｅｒｔ‐ブチル化合物、およびブパルバコン等のｔｅｒｔ‐ブチルが芳香族炭素環系に直接結合していない化合物、を参照しながら、本発明をさらに説明する。
【００８６】
本発明のシトクロムＰ−４５０酵素調製物を、基質としてのボセンタンと、ｐＨ７．４で５分間、（ａ）フェレドキシン、（ｂ）フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋−還元酵素、（ｃ）ＮＡＤＰ＋、（ｄ）ＮＡＤＰＨ再生系、および（ｅ）溶存酸素と共に、反応させる場合、反応温度は少なくとも４℃から６０℃までの範囲にある。各シトクロムに最適なｐＨは６．５〜１１．０の範囲にある。４℃、ｐＨ７．４に２４時間保持された場合、各シトクロムは安定である。
【００８７】
フェレドキシン、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋−還元酵素、酸素およびＮＡＤＰＨの使用は必須ではない。シトクロムＰ−４５０を活性化できるものであればいかなる成分を用いてもよい。
【００８８】
酵素活性の測定は通常、２つの方法のうちの一方を用いて実行される。
【００８９】
（ｉ）シトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９に関する測定
Omura and Sato et al. (J Biol Chem, 239. 1964, 2370)の方法に従って測定を行う。すなわち、下記式を用いて、４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおける差スペクトルの減少に対する、還元されたＣＯの吸光度差に基づいて、シトクロムＰ−４５０ａｌｕＣ０９が定量分析される。
【００９０】
【数１】
2019536479.tif 000013
【００９１】
（ｉｉ）ボセンタンからヒドロキシ−ボセンタンの形成率測定。
以下の成分の混合物を用いる。
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）  ５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ
発現されたフェレドキシン、フェレドキシン還元酵素、Ｐ４５０を含有する酵素溶液  シトクロムＰ４５０濃度において２．４μＭ
ＮＡＤＰ＋  １ｍＭ
グルコース−６−リン酸  ５ｍＭ
グルコース−６−リン酸脱水素酵素  ２ＵＮ／ｍｌ
ボセンタン基質  ０．１ｍｇ／ｍｌ
総体積  ０．５０ｍｌ
【００９２】
酵素活性の測定のために、上記表の成分を混合し、その溶液を３０℃で１６〜２０時間振盪した後、５００μｌのアセトニトリルを添加して反応を止める。この酵素系により形成されたヒドロキシ−ボセンタンの量を、ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣで確認する。
【００９３】
活性を測定するための試験法を用いて、温度およびｐＨの変化に伴う活性の低下を確認することができる。
【００９４】
例えば、前記シトクロムは、２０％グリセロールおよび２ｍＭジチオスレイトールの存在下、ｐＨ７．４、７０℃に６０分置くと完全に不活性化される。前記シトクロムはｐＨ３またはより酸性側のｐＨで不活性化される。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、ｉ）配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、もしくは配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素、または、ｉｉ）配列番号３を含むシトクロムＰ−４５０酵素、もしくは配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有し且つＣＹＰ−４５０活性を有する変異型酵素を発現する微生物を含み、且つ、有機化合物をヒドロキシ化するための使用説明書をさらに含む、キットを提供する。
【００９６】
前記キットにより使用者は目的化合物のヒドロキシ化のスクリーニング検査が可能となる。
【００９７】
好ましい実施形態では、前記キットは電子供与剤をさらに含む。前記キットは、電子供与剤としてフェレドキシン還元酵素およびフェレドキシンを、補因子であるＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、またはＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋、グルコースもしくはグルコース−６−リン酸、およびグルコース脱水素酵素もしくはグルコース−６−リン酸脱水素酵素等の補因子再生系と共に含むことが好ましい場合がある。しかし、好適であればいかなる電子供与剤も用いてよい。
【００９８】
前記キットは、別個に又は他の構成要素に含まれて、緩衝液をさらに含んでもよい。
【００９９】
前記キットは、１または複数の他のシトクロムＰ４５０酵素をさらに含むことが好ましい場合がある。前記シトクロムＰ−４５０酵素または微生物は、凍結乾燥されるか、または、他の高分子、もしくはアルギン酸ビーズ、ニッケルカラムおよび電気化学電極等の支持材に固定化もしくは係留されることが好ましい。
【０１００】
以下の実施例で本発明の方法を説明する。これらの実施例は例示としてのみ与えられたものであって、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）発酵を用いたヒドロキシ−ボセンタンの生産
５ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酵母エキスペプトン、２ｇ／Ｌの肉エキス、５ｇ／Ｌの真菌用ペプトン、１ｇ／Ｌの二塩基性リン酸アンモニウム、３ｇ／ｌの塩化ナトリウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水化物および３．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含有する培地を調製し、ｐＨ７．０に調整した。１２個の２５０ｍｌ体積の三角フラスコに、この培地をそれぞれ５０ｍｌ含ませ、１１５℃で１５分間滅菌した。アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を、液体窒素中に保存されたクライオバイアル内ストックから戻して、５０ｍｌの上記増殖培地を含む２個のフラスコ内に播種した。２７℃、２００ｒｐｍで、２日間増殖させた後、そのシード培養物（２％ｖ／ｖ）を用いて、５０ｍＬの上記増殖培地をそれぞれ含む１０個の２５０ｍＬ三角フラスコに播種した。培養物を２７℃、２００ｒｐｍで２４時間発酵させた後、５２．７ｍｇのボセンタンを１．０５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させて、その溶液を１００μＬずつ各フラスコに加え、ボセンタンの最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとした。培養物を２７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。２７時間後、１０個全てのフラスコの内容物を合わせ、５００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、得られた抽出物を集めて乾燥させることで、１８９．３ｍｇの粗抽出物を得た。
【０１０２】
この抽出物を２ｍｌのＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ（３：１））に溶解させ、分取ＨＰＬＣで次の通りに精製した。ウォーターズ社製（Waters）Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８カラム（１９×１００ｍｍ）、流速１７ｍｌ／分、以下の勾配を用いて溶出。勾配は、まず９０／５／５（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／２％ギ酸水溶液）を１分間維持し、１分間で８０／１５／５に増加し、２３．９分かけてゆっくりと５５／４０／５に増加し、１分間かけて０／９５／５にさらに増加し（ｔ＝２６分）、さらに２分間維持し、１分間かけて開始条件に戻し、さらに５分間再平衡化して、これを繰り返す。１９分〜２０．５分に溶出された標的産物を乾燥させたところ、ＬＣ−ＵＶによる９５％超の純度を有する、２５．２ｍｇのヒドロキシ化されたボセンタン産物が得られた。
【０１０３】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 11.31 (1H, s), 9.09 (2H, d, 4.9 Hz), 8.30 (2H, d, 8.2), 7.67 (1H, t, 4.8), 7.53 (2H, d, 8.4), 7.09 (1H, d, 8.1), 7.04 (1H, t, 7.6),
6.81, (1H, t, 7.6), 6.71 (1H, d, 8.0), 4.71 (1H, t, 5.3), 4.67 (1H, t, 5.3), 4.33 (2H, t, 5.4), 3.80 (3H, s), 3.47 (2H, m), 3.42 (2H, d, 4.8), 1.21, 6H, s).
【０１０４】
実施例２：アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）発酵を用いたヒドロキシ−ブパルバコンの生産
５ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酵母エキスペプトン、２ｇ／Ｌの肉エキス、５ｇ／Ｌの真菌用ペプトン、１ｇ／Ｌの二塩基性リン酸アンモニウム、３ｇ／ｌの塩化ナトリウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水化物および３．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含有する培地を調製し、ｐＨ７．０に調整した。１２個の２５０ｍｌ体積の三角フラスコに、この培地をそれぞれ５０ｍｌ含ませ、１１７℃で１５分間滅菌した。アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を、液体窒素中に保存されたクライオバイアル内ストックから戻して、５０ｍｌの上記増殖培地を含む２個のフラスコ内に播種した。２７℃、２００ｒｐｍで、２日間増殖させた後、そのシード培養物（２％ｖ／ｖ）を用いて、５０ｍＬの上記増殖培地をそれぞれ含む１０個の２５０ｍＬ三角フラスコに播種した。培養物を２７℃、２００ｒｐｍで２４時間発酵させた後、２０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中１ｍｇ／ｍｌのブパルバコン（１ｍｌのＤＭＳＯ中の５２．６ｍｇのブパルバコンという原液の５０分の１希釈により調製）を、フラスコ当たり５ｍｌずつ加えて、１０５ｍｇ／Ｌという濃度を得た。投与後の培養物の経時変化を追い、標的代謝産物であるヒドロキシ−ブパルバコンの生産を評価した。経時的解析に基づき、２４時間後に培養物を回収し抽出した。
【０１０５】
培養後、細胞を遠心分離で集めた。細胞塊をＭｅＣＮで抽出し、減圧下で乾固し、凍結乾燥した。上清をＨＰ２０に吸着させ、水で洗浄し、ＭｅＣＮで溶出した後、濃縮することで、以下に記載されるような精製の準備をした。
【０１０６】
精製：合わせた抽出物をウォーターズ社製Ｘ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃ１８カラム（１９×１００ｍｍ）で分画し、流速２０ｍｌ／分で以下の勾配を用いて溶出した。勾配は、まず９５／５（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ（共に０．１％ギ酸を含む））を２分間維持し、０．２分間で５０／５０に増加し、９．８分間かけて２０／８０に増加し、０．２分間かけて２／９８に増加し、さらに２．３分間維持し、０．１分間かけて開始条件に戻し、さらに０．４分間再平衡化した。８分〜８．６分に溶出された標的を乾燥させたところ、ＬＣ−ＵＶで９５％超の純度を有する、１４．０ｍｇのヒドロキシ化されたブパルバコン産物が得られた。
【０１０７】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 7.96 (2H, t, 7.6 Hz), 7.81 (1H, td, 7.5, 1.4), 7.75
(1H, td, 7.5, 1.4), 4.31 (1H, t, 5.4), 3.11 (2H, d, 4.1), 2.36 (2H, d, 7.0), 1.68 (2H, m), 1.63 (2H, m), 1.46 (1H, m), 1.16 (1H, m), 0.90 (4H, m), 0.70 (6H, s)
.
【０１０８】
実施例３：アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）発酵を用いたヒドロキシ−リトナビルの生産
５ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酵母エキスペプトン、２ｇ／Ｌの肉エキス、５ｇ／Ｌの真菌用ペプトン、１ｇ／Ｌの二塩基性リン酸アンモニウム、３ｇ／ｌの塩化ナトリウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水化物および３．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含有する培地を調製し、ｐＨ７．０に調整した。４２個の２５０ｍｌ体積の三角フラスコに、この培地をそれぞれ５０ｍｌ含ませ、１１５℃で１５分間滅菌した。アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を、液体窒素中に保存されたクライオバイアル内ストックから戻して、５０ｍｌの上記増殖培地を含む２個のフラスコ内に播種した。２７℃、２００ｒｐｍで、２日間増殖させた後、そのシード培養物（２％ｖ／ｖ）を用いて、５０ｍＬの上記増殖培地をそれぞれ含む４０個の２５０ｍＬ三角フラスコに播種した。培養物を２７℃、２００ｒｐｍで２４時間発酵させた後、リトナビルを１００ｍｇ／Ｌの濃度で投与した。リトナビルは、上記実施例２のブパルバコンに関して記載されたように配合してから投与した。投与後の培養物の一日の経時変化を追い、標的産物であるヒドロキシ−リトナビルの生産を評価した。経時的解析に基づき、７２時間後に培養物を回収し抽出した。
【０１０９】
培養後、細胞を遠心分離で集めた。細胞塊をＭｅＣＮで抽出し、減圧下で乾固し、凍結乾燥した。上清をＨＰ２０に吸着させ、水で洗浄し、ＭｅＣＮで溶出させた。
【０１１０】
精製：合わせた抽出物を、ウォーターズ社製Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ１８カラム（４０×１００ｍｍ）＋ガードカラム（４０×１０ｍｍ）で分画した。流速は５０ｍｌ／分であり、勾配は、まず９０／５／５％（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／２００ｍＭギ酸アンモニウム＋２％ギ酸水溶液）を１．１分間維持し、１７分間で４５／５０／５に増加し、１分間かけて０／９５／５に再度増加し、４分間洗浄し、１分間かけて開始条件に戻し、４分間かけて再平衡化した。純粋でない標的ヒドロキシ−リトナビルが１６．０分〜１７．５分に溶出した。
【０１１１】
標的生成物をウォーターズ社製Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８カラム（１９×１００ｍｍ）で精製し、流速１７ｍｌ／分で以下の勾配を用いて溶出した。勾配は、まず９０／５／５（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／２％ギ酸含有ＭｅＣＮ）を１分間維持し、１分間で６０／３０／５に増加し、さらに２０分間維持し、２分間かけて０／９５／５に増加し、さらに２分間維持し、１分間かけて開始条件に戻し、さらに４分間再平衡化した。１３分〜１４分に溶出された標的を乾燥させたところ、ＬＣ−ＵＶで９５％超の純度を有する、２１．５ｍｇのヒドロキシ化されたリトナビル産物が得られた。
【０１１２】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 9.05 (1H, s), 7.85 (1H, s), 7.70 (1H, d, 8.4), 7.16
(14H, m), 6.87 (1H, d, 9.4), 6.01 (1H, d, 8.7), 5.91 (1H, s), 5.15 (2H, m), 4.62 (1H, d, 6.3), 4.42 (2H, s), 4.14 (1H, m), 3.92, 1H, dd, 8.7, 7.7), 3.82 (1H, q, 9.3), 3.58 (1H, q, 8.8), 2.86 (3H, s), 2.67 (2H, m), 2.62 (2H, m), 1.88 (1H, m), 1.49 (3H, s), 1.48 (3H, s), 1.45 (1H, m), 0.77 (1H, m), 0.74 (6H, d, 6.8).
【０１１３】
１．４９ｐｐｍおよび１．４８ｐｐｍのイソプロピルメチルは、架橋しているメチン位におけるヒドロキシ化の後、一重線となる。
【０１１４】
実施例３ａ：アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）発酵を用いたヒドロキシ化されたチバンチニブ代謝産物の生産
５ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酵母エキスペプトン、
２ｇ／Ｌの肉エキス、５ｇ／Ｌの真菌用ペプトン、１ｇ／Ｌの二塩基性リン酸アンモニウム、３ｇ／ｌの塩化ナトリウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水化物および３．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含有する培地を調製し、ｐＨ７．０に調整した。４０個の２５０ｍｌ体積の三角フラスコに、この培地をそれぞれ５０ｍｌ含ませ、１１５℃で１５分間滅菌した。アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を、液体窒素中に保存されたクライオバイアル内ストックから戻して、５０ｍｌの上記増殖培地を含む２個のフラスコ内に播種した。２７℃、２００ｒｐｍで、２日間増殖させた後、そのシード培養物（２％ｖ／ｖ）を用いて、５０ｍＬの上記増殖培地をそれぞれ含む４０個の２５０ｍＬ三角フラスコに播種した。培養物を２７℃、２００ｒｐｍで２４時間発酵させた後、チバンチニブをＤＭＳＯに溶解させ、各フラスコに加えて、チバンチニブの最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとした。培養物を２７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。７２時間後、４０個全てのフラスコの内容物を合わせて遠心分離した。細胞塊をＭｅＣＮ（１．５Ｌ）で抽出し、回転蒸発で濃縮した。水性のブロス上清をＨＰ２０に吸着させ（５００ｍｌ）、水で洗浄し、ＭｅＣＮ（１．５Ｌ）で溶出し、回転蒸発で濃縮した。このＨＰ２０濃縮物と細胞抽出物濃縮物とを合わせ（５００ｍｌ）、酢酸エチル（３×５００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を回転蒸発により乾固し、得られた物質をアセトニトリル−Ｈ２Ｏ（９：１、５００ｍｌ）とヘキサン（５００ｍｌ）との間で分割した。ヘキサン層を廃棄し、アセトニトリル層を濃縮乾固した。この物質をウォーターズ社製Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ１８カラム（４０×１００ｍｍ）＋ガードカラム（４０×１０ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣで分画した。流速は５０ｍｌ／分であり、勾配は、まず９０／５／５％（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／２００ｍＭギ酸アンモニウム＋２％ギ酸水溶液）を１．１分間維持し、次の１０分間で１５／８０／５に直線的に増加させ、１分間かけて０／９５／５に再度増加させ、２分間洗浄し、１分間かけて開始条件に戻し、５分間かけて再平衡化した。モノヒドロキシ化された代謝産物を含有する画分は６．５分〜８．０分（画分１４〜１６）に溶出されていることが分かり、さらなる精製のためにこれらを濃縮乾固した。
【０１１５】
画分１４をウォーターズ社製Ｘ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃ１８カラム（１９×１００ｍｍ）でさらに精製し、２０ｍｌ／分の流速で以下の勾配を用いて溶出した。勾配は、まず９５／５（１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液／ＭｅＣＮ）を２分間維持し、０．１分間で７５／２５に増加し、さらに１４．９分間この組成で維持し、０．１分間かけて９５／５に増加し、さらに１分間維持し、０．１分間かけて開始条件に戻し、さらに０．９分間再平衡化した。１３分〜１４分に溶出するピークおよび１４分〜１５分に溶出するピークを、別々に集め、濃縮乾固したところ、それぞれ１９．０ｍｇの化合物と６．８ｍｇの化合物が得られ、ＮＭＲにより、チバンチニブ代謝産物であるＭ４とＭ５であると同定された（T. Murai et al. (2014) Metabolism and disposition of [14C]tivantinib after oral administration to humans, dogs and cats. Xenobiotica 44: 996-1008）。しかし、こ
れらの２種のエピマーを区別することはできなかった。
【０１１６】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):
【０１１７】
第一代謝産物：11.45 (1H, bs), 11.03 (1H, d, 2.8 Hz), 7.41 (1H, d, 7.8 Hz), 7.38 (1H, d, 2.5 Hz), 7,36 (1H, d, 8.4 Hz), 7.36 (1H, s), 7.27 (1H, d, 8.0 Hz), 7.08 (1H, ddd, 8.2, 7.1, 1.1 Hz), 7.05 (1H, d, 7.1 Hz), 6.96 (1H, d, 8.0 Hz), 6.95 (1H, t, 7.7 Hz), 5.34 (1H, d, 5.4 Hz), 4.89 (1H, q, 5.1 Hz), 4.53 (1H, d, 7.0 Hz), 4.48 (1H, d, 7.0 Hz), 4.14 (2H, m), 2.11 (2H, m).
【０１１８】
第二代謝産物：11.51 (1H, bs), 11.02 (1H, d, 2.9 Hz), 7.41 (1H, d, 7.9 Hz), 7.37 (1H, d, 2.7 Hz), 7.36 (1H, m), 7.35 (1H, s), 7.27 (1H, d, 8.2), 7.08 (1H, ddd,
8.1, 7.0, 1.1 Hz), 7.05 (1H, d, 7.1 Hz), 6.96 (1H, t, 7.8 Hz), 6.94 (1H, t, 8.0
Hz), 5.34 (1H, q, 5.3 Hz), 4.90 (1H, d, 5.2 Hz), 4.51 (1H, d, 6.9 Hz), 4.48 (1H
, d, 7.0 Hz), 4.14 (2H, m), 2.11 (2H, m).
【０１１９】
画分１５を、ウォーターズ社製Ｘｂｒｉｄｇｅフェニルカラム（１９×１００ｍｍ）を用い、２０ｍｌ／分の流速で、以下の勾配で溶出することで、さらに精製した。９５／５（０．１％アンモニア水／ＭｅＣＮ）から開始し、この組成を２．５分間維持し、次の７．５分間をかけて５／９５に直線的に増加し、この組成をさらに０．９分間維持し、その後０．１分間かけて開始条件に戻し、さらに１．０分間再平衡化した。６．０分〜６．５分に溶出するピークを集め、濃縮乾固することにより、ＮＭＲ分光分析法で同定されたところの、６．６ｍｇのチバンチニブ代謝産物Ｍ７が得られた（T. Murai et al. (2014) Metabolism and disposition of [14C]tivantinib after oral administration to humans, dogs and cats. Xenobiotica 44: 996-1008）。
【０１２０】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 11.38 (1H, bs), 10.61 (1H, d, 2.4 Hz), 8.93 (1H, bs), 7.31 (1H, s), 7.17 (1H, d, 7.5 Hz), 7.16 (1H, d, 8.5 Hz), 7.13 (1H, d, 2.1Hz), 6.88 (1H, t, 7.4 Hz), 6.84 (1H, d, 6.8 Hz), 6.71 (1H, d, 2.1 Hz), 6.49 (1H, dd, 8.5, 2.2 Hz), 4.44 (1H, d, 6.7 Hz), 4.35 (1H, d, 6.7 Hz), 4.10 (2H, dd, 6.6, 4.6 Hz), 2.90 (2H, t, 6.0 Hz), 2.10 (2H, dt, 11.1, 5.6 Hz).
【０１２１】
画分１６を、ウォーターズ社製Ｘｂｒｉｄｇｅフェニルカラムを用い、２０ｍｌ／分の流速で、以下の勾配で溶出することで、さらに精製した。勾配は、まず９５／５（０．１％アンモニア水／ＭｅＣＮ）を２分間維持し、０．１分間で８５／１５に増加し、次の７．９分間をかけて７５／２５に直線的に増加し、０．１分間かけて９５／５に増加し、さらに０．８分間維持し、０．１分間かけて開始条件に戻し、さらに１．０分間再平衡化した。５．７分〜６．３分に溶出するピークを集め、濃縮乾固したところ、ＮＭＲ分光分析法による同定によればチバンチニブ代謝産物Ｍ９であり得る、０．６ｍｇの化合物が得られた（T. Murai et al. (2014) Metabolism and disposition of [14C]tivantinib after
oral administration to humans, dogs and cats. Xenobiotica 44: 996-1008）。
【０１２２】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 11.06 (1H, d, 2.5 Hz), 7.32 (1H, s), 7.24 (1H d 2.6
Hz), 7.16 (1H, d, 7.8 Hz), 6.88 (1H, t, 7.4 Hz), 6.84 (1H, d, 7.2 Hz), 6.82 (1H, d, 8.0 Hz), 6.75 (1H, t, 7.7 Hz), 6.49 (1H, d, 7.4 Hz), 4.47 (1H, d, 6.8 Hz), 4.41 (1H, d, 6.8 Hz), 4.09 (2H, t, 5.7 Hz), 2.90 (2H, t, 6.0 Hz), 2.11 (2H, p, 5.6 Hz).
【０１２３】
実施例３ｂ：アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）発酵を用いたヒドロキシ化されたジクロフェナク代謝産物の生産
５ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酵母エキスペプトン、２ｇ／Ｌの肉エキス、５ｇ／Ｌの真菌用ペプトン、１ｇ／Ｌの二塩基性リン酸アンモニウム、３ｇ／ｌの塩化ナトリウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水化物および３．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含有する培地を調製し、ｐＨ７．０に調整した。２０個の２５０ｍｌ体積の三角フラスコに、この培地をそれぞれ５０ｍｌ含ませ、１１５℃で１５分間滅菌した。アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を、液体窒素中に保存されたクライオバイアル内ストックから戻して、５０ｍｌの上記増殖培地を含む２個のフラスコ内に播種した。２７℃、２００ｒｐｍで、２日間増殖させた後、そのシード培養物（２％ｖ／ｖ）を用いて、５０ｍＬの上記増殖培地をそれぞれ含む２０個の２５０ｍＬ三角フラスコに播種した。培養物を２７℃、２００ｒｐｍで２４時間発酵させた後、ＤＭＳＯに溶解させたジクロフェナクを各フラスコに加えて、ジクロフェナクの最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとした。培養物を２７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。２２時間後、２０個全てのフラスコの内容物を合わせ、遠心することにより、水性上清を細胞から分離した。この細胞をアセトニトリル（９００ｍｌ）で１時間抽出した後、再度遠心してアセト
ニトリル抽出物を集めた。これを前記水性ブロス上清と混合し、硫酸アンモニウム（１３２ｇ）を加えた。この混合物を２相分離するまで撹拌した。アセトニトリル層を集め、回転蒸発することで、水性濃縮物を得た。この物質を、ウォーターズ社製Ｓｙｍｍｅｔｒｙ
Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８カラム（１９×１００ｍｍ）を用い、１７ｍｌ／分の流速で以下の勾配により溶出される、逆相ＨＰＬＣで分画した。勾配は、５５／４５／５（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ammomium acetate）＋２％ギ酸水溶液）から開始し、１０分間かけて４５／５０／５に直線的に増加し、この濃度でさらに２０分間維持し、その後、開始条件に戻した。溶出液を２８０ｎｍでモニターし、６．５分と９分とに溶出したピークを集めて、濃縮乾固したところ、それぞれ５−ヒドロキシジクロフェナク（１１．６ｍｇ）および４’−ヒドロキシジクロフェナク（１２．４ｍｇ）が得られた。
【０１２４】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):
【０１２５】
５−ヒドロキシジクロフェナク：7.43 (2H, d, 8.1 Hz), 7.03 (1H, t, 8.1 Hz), 6.65
(1H, d, 2.8 Hz), 6.49 (1H, dd, 8.5, 2.8 Hz), 6.25 (1H, d, 8.5), 3.57 (2H, s).
【０１２６】
４’−ヒドロキシジクロフェナク：7.03 (1H, dd 7.5, 1.6 Hz), 6.92 (2H, s), 6.90 (1H, dd, 7.6, 1.6 Hz), 6.66 (1H, td, 7.4, 1.2 Hz), 6.08 (1H, dd, 8.0, 1.2 Hz), 3.43 (2H, s).
【０１２７】
実施例４：Ｐ４５０ａｌｕＣ０９およびフェレドキシンａｌｕＦ０３のクローニング
アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ２４３０）からのゲノムＤＮＡの抽出
アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ２４３０）の発酵物質の細胞ペレットからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。４ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ麦芽エキス、４ｇ／Ｌグルコースを含有し、ｐＨ７．０に調整された培地。２個の２５０ｍｌ体積の三角フラスコに、この培地をそれぞれ５０ｍｌ含ませ、１１５℃で２０分間滅菌した。アミコラトプシス・ルリダ（ＮＲＲＬ−２４３０）を、液体窒素中に保存されたクライオバイアル内ストックから戻して、５０ｍｌの上記増殖培地を含む２個のフラスコ内に播種した。２７℃、２００ｒｐｍで２日間増殖させた後、５０ｍｌの培養液を５０ｍｌ遠心管に移し、遠心して、ペレット化された細胞を集めた。このペレットを等張緩衝液で１回洗浄することで残留培地成分を除去し、その後、下記の通りの後のゲノムＤＮＡ抽出用にこのペレットを−８０℃で凍結した。この細胞ペレットを解凍し、７．５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）に再懸濁した。７５μｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液を加え、その溶液を３７℃で１時間インキュベートした後、７５０μｌの１０％（ｗ／ｖｏｌ）ＳＤＳを加え、反転により混合した。２０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロナーゼを加え、３７℃で１．５時間インキュベートした後、その溶液に１６μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ溶液を加え、続いて、３７℃で１時間および５０℃で１時間の別のインキュベーション工程を行った。９００μｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えた後、その溶液を等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））で２回抽出した。水層を集め、１倍
量のイソプロパノールおよび遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分間、２０℃）でゲノムＤＮＡを沈殿させた。ゲノムＤＮＡペレットを１００％エタノールで１回、７０％エタノールで２回洗浄した（各洗浄工程で約３０ｍｌ）。ゲノムＤＮＡペレットを風乾し、５ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。ＮａｎｏＤｒｏｐ装置（サーモサイエンティフィック社（Thermo Scientific））を用いてゲノムＤＮＡの濃度および純度を測定し、ゲノムＤＮ
Ａの完全性をアガロースゲル電気泳動で評価した。
【０１２８】
ＰＣＲ反応
遺伝子間領域を含めて、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪＫ５２１８４．１；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション（Uniprot Accession）：Ａ０Ａ０９３ＢＣＧ８；ロ
ーカスタグ（Locus tag）：ＢＢ３１＿０１５３５）と、フェレドキシンａｌｕＦ０３（
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪＫ５２１８３．１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ａ０Ａ０９３ＢＩＺ３；ローカスタグ：ＢＢ３１＿０１５３０）とから構成されるオペロンをコードするＤＮＡ配列を、ゲノムＤＮＡから、ａｌｕＣ０９−Ｆ０３＿ｆプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａＣＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣ）（配列番号５）と、ａｌｕＣ０９−Ｆ０３＿ｒプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇａｇｇｇｃｇｇｇｇｃａｔＡＡＧＣＴＴＣＣＴＡＴＴＡＡＧＣＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＧ）（配列番号６）とを用いる総反応体積５０μｌのＰＣＲにより、増幅した。ＰＣＲ反応は、１０μｌの５×ＨＦ緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ユニット；ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs））、約９０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各
０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含有し、この反応はＭｉｌｌｉＱ（登録商標）のＨ２Ｏで総体積５０μｌにフィルアップした。バイオラド社製（Biorad）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーシステムで、以下のサイクル条件を用いて、ＰＣＲ反応を行った：９８℃、３０秒間、３５サイクル（９８℃、１０秒間、５７℃、１５秒間、７２℃、４５秒間）、７２℃、５分間。ＰＣＲアンプリコンの予測サイズは１４６８ｂｐであった。
【０１２９】
プラスミド骨格ｐＱＲ３６８ｂｂをコードするＤＮＡ配列を、プラスミドｐＱＲ３６８（Hussain & Ward. Appl Environ Microbiol. 2003; 69:373-82）から、ｐＱＲ３６８＿
ｂｂＳＣＦ１５ａ＿ｆプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｔａａｔａｇｇＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＧＣＧＧＧ）（配列番号７）およびｐＱＲ３６８＿ｂｂＳＣＦ１５ａ＿ｒプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇｃｃｇｃｃＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ）（配列番号８）を用いる総反応体積５０μｌのＰＣＲによって、増幅した。ＰＣＲ反応は、１０μｌの５×ＨＦ緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ユニット）、１５ｎｇのプラスミドＤＮＡ  ｐＱＲ３６８、各０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含有し、この反応はＭｉｌｌｉＱ（登録商標）のＨ２Ｏで総体積５０μｌにフィルアップした。バイオラド社製Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーシステムで、以下のサイクル条件を用いて、ＰＣＲ反応を行った：９８℃、３０秒間、３５サイクル（９８℃、１０秒間、５６℃、１５秒間、７２℃、３分２５秒）、７２℃、１０分間。ＰＣＲアンプリコンの予測サイズは６７６８ｂｐであった。
【０１３０】
全てのＰＣＲ反応をアガロースゲル電気泳動解析にかけ、そのアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社（Qiagen））を用いてＰＣＲ産物を抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ装置（サーモサイエンティフィック社）を用いて、精製されたＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度を測定した。
【０１３１】
Ｐ４５０ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３のクローニング
環状ポリメラーゼ伸長クローニング（circular polymerase extension cloning）（Ｃ
ＰＥＣ；Quan & Tian. Nat Protoc. 2011;6:242-51）により、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３オペロンをベクター骨格ｐＱＲ３６８ｂｂにクローニングした。
【０１３２】
ＣＰＥＣに先立ち、前記ｐＱＲ３６８ｂｂアンプリコンをＮｄｅＩ制限酵素で消化して、ｐＱＲ３６８＿ｂｂＳＣＦ１５ａ＿ｒプライマーにより導入された５’オーバーハングを除去した。１０μｌの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ  ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）、１．５μｌのＮｄｅＩ（３０ユニット；ニュー・イングランド・バイオラボ社）、約１．７μｇの
ｐＱＲ３６８ｂｂ  ＰＣＲ産物を含有する総体積１００μｌで、３７℃で４時間、制限消化を行ったが、この反応はＭｉｌｌｉＱ（登録商標）のＨ２Ｏで１００μｌにフィルアップした。６５℃で２０分間のＮｄｅＩの不活性化により反応を止めた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、消化後のｐＱＲ３６８ｂｂ  ＰＣＲ産物を精製した。
【０１３３】
Ｐ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３オペロンのｐＱＲ３６８ｂｂへのＣＰＥＣを、４μｌの５×ＨＦ緩衝液、０．６μｌのＤＭＳＯ、１．６μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０４ｎｇのｐＱＲ３６８ｂｂベクター骨格、４３ｎｇのＰ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３  ＰＣＲ産物、および０．２μｌのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．４ユニット）を含有する総反応体積２０μｌにおいて行った。バイオラド社製Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーシステムで、以下のサイクル条件を用いて、ＣＰＥＣ反応を行った：９８℃、３０秒間、５サイクル（９８℃、１０秒間、５０℃、３０秒間、７２℃、２分４５秒）、７２℃、５分間。４μｌのＣＰＥＣ反応物を用いて、５０μｌのケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。３７℃で１２〜１６時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する溶原培地（ＬＢ）プレート上でクローンを選択した。クローンをピッキングし、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ中で、３７℃、２５０ｒｐｍで１２〜１６時間培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、これらの培養物から組換えプラスミドを単離し、適切な酵素を用いた制限消化によって解析した。
【０１３４】
ＤＮＡの塩基配列決定および解析
クローニングされたＰ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３オペロンおよびｐＱＲ３６８ｂｂベクター骨格の還元酵素部分というＤＮＡ配列を、ユーロフィンジェノミクス社（Eurofins Genomics）（ドイツ）におけるサンガー法シーケンシングで確認
した。構築したプラスミドはｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３と称した。
【０１３５】
組換え発現菌株の構築
Ｐ４５０ａｌｕＣ０９、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａの組換え発現用の宿主として、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン社）を用いた。この発現菌株を構築するために、ヒートショック法を用いて、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞をプラスミドｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３で形質転換した。５０μｌのケミカルコンピテントセルを０．５μｌ（６８ｎｇ）のプラスミドｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３と混合した後、氷上で５０分間インキュベートする。４２℃の水浴中で４５秒間のヒートショックを行った後、細胞を氷上でおよそ２分間冷却した。８００μｌのＬＢを添加した後、Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ（エッペンドルフ社（Eppendorf））において、３
７℃、５００ｒｐｍで１．５時間、細胞をインキュベートした。この混合物１μｌをＬＢ５０μｌと混合し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートに播種した。プレートを３７℃でおよそ１４時間インキュベートした。
【０１３６】
この発現菌株のグリセロールストックを作製するため、単一コロニーをピッキングし、同一の抗生物質を含有する５ｍｌのＬＢに播種し、３７℃、２５０ｒｐｍでおよそ１４時間培養した。この培養物５００μｌを、クライオバイアル内の５００μｌの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールと混合し、−８０℃で保存した。
【０１３７】
実施例５：組換えＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３の発現
形質転換／寒天プレート：
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを、５０％グリセロール凍結ストックから得たｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドを持つ大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳと共に画線することによって、ＬＢ寒天プレートに対して添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１３８】
播種：
３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ培地に、上記のように作製された寒天プレートから得られた大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３の単一コロニーを接種した。細胞を３７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。
【０１３９】
接種：
バッフル付２５０ｍｌフラスコに、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとを添加した５０ｍｌのテリフィックブロス（Terrific Broth）培地を、０．５ｍｌの前記播種培養物と共に接種し、ＯＤ（６００）が０．６〜０．８に達するまで３７℃、２００ｒｐｍで細胞増殖させた。この時点で、０．１ｍＭの最終濃度に達するまでＩＰＴＧを添加することにより遺伝子発現を誘導し、さらに、この培養物にＦｅＳＯ４および５‘−アミノレブリン酸をそれぞれ０．１ｍＭおよび８０μｇ／ｍｌの濃度に達するまで添加した。誘導された細胞を２７℃、１４０ｒｐｍでさらに４時間培養した後、培養物を遠心分離で回収した。
【０１４０】
実施例６：酵素物質の抽出および加工
実施例５に記載されるように、１ｇの細胞に対し１５ｍｌの緩衝液の割合で、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ中に、組換えＰ４５０ａｌｕＣ０９、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａを含有する、細胞ペレットの懸濁物を得た。３サイクルの３０ｋｐｓｉによる高圧破壊で、溶解細胞を得た。溶解した物質を３８，０００×ｇで３０分間（４℃）遠心分離し、その上清を０．２２ミクロンフィルターに通すことにより滅菌することで、２．９μＭの組換えＰ４５０ａｌｕＣ０９および９１９ＵＮの組換えフェレドキシン還元酵素を含有する酵素調製物を得た。次に、この粗抽出物をガラス製バイアルに分注し（２ｍｌバイアル当たり０．５ｍｌ）、エドワーズ社（Edwards）
製Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ凍結乾燥機を用いて凍結および凍結乾燥し、その後、使用のために必要とされるまで標準的な実験用冷凍庫内で−２０℃で保存した。
【０１４１】
実施例７：ヒドロキシラーゼ活性／スペクトラム試験
実施例５および実施例６に記載されるように、組換えＰ４５０ａｌｕＣ０９、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａの凍結乾燥物質を作製し、最終濃度２．９μＭのＰ４５０ＡｌｕＣ０９および最終濃度９１９ＵＮのフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａとなるように水に懸濁させた。３０℃の以下の条件下で生体触媒作用を実施した：最終体積１００μＬ中、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌの基質化合物、例えば、ボセンタン（カルボシンス社（CarboSynth Ltd）、英国）、ブパルバコン（メドケムトロニカ社（MedChemtronica）、スウェーデン）、ＢＩＲＢ７９６（ストラテック・サイエンティフィック社（Stratech
Scientific Limited）、英国）、ジクロフェナク（シグマ・アルドリッチ社、英国）、
エポチロンＢ（ＬＣラボラトリーズ社（LC Laboratories）、米国）またはリトナビル（
ＴＣＩ社、英国）、チバンチニブ（メドケムトロニカ社、スウェーデン）、２．４μＭのＰ４５０ＡｌｕＣ０９、７６７ＵＮのフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａ、５ｍＭのＧ６Ｐ、１ｍＭのＮＡＤＰ、２ＵＮ／ｍｌのＧ６ＰＤＨ。１６〜２０時間後、反応物を等量のアセトニトリルで抽出し、遠心分離することで沈殿したタンパク質を除去し、ＵＰＬＣ
−ＭＳ解析で変換を評価した。
【０１４２】
ＵＰＬＣデータは以下のように得た。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８、１．７μｍ、内径２．１ｍｍ、長さ５０ｍｍ
溶媒：Ｈ２Ｏ、Ｂ：アセトニトリル、共に０．１％ギ酸を含有
流速：１．０ｍｌ／分
検出器：ウォーターズ社製Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＰＤＡ（紫外可視検出）およびウォーターズ社製Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＱＤＡ（ＭＳ）
滞留時間：ボセンタン基質：１．７５分；ヒドロキシ化されたボセンタン：１．４２分
【０１４３】
クロマトグラフィーの保持および質量スペクトルは基準試料のそれと一致した。
【０１４４】
実施例８：ヒドロキシラーゼ活性に対する溶液ｐＨの影響
実施例７に記載された凍結乾燥物質と同様に作製された凍結乾燥物質を用いて、様々な反応ｐＨのヒドロキシラーゼ活性に対する影響を、ボセンタンとジクロフェナクという２種類の基質を用いて評価した。緩衝液交換の部分を除き実施例７の方法に従った。４種類の異なる緩衝液を選んだ：ａ）５０ｍＭ  酢酸塩  ｐＨ５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；ｂ）５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；ｃ）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；ｄ）５０ｍＭ  ピペリジン  ｐＨ１１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２。各緩衝液条件について、凍結乾燥された粗抽出物の懸濁液１．５ｍｌを、濃縮および新たな緩衝液による前記物質の希釈を３サイクル行うことによりカットオフされたＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０Ｋを用いて交換した。５０ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ７．５、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２で交換したとき、酵素調製物の作製および評価用に通常の前記緩衝液は、緩衝液交換プロセス中の前記物質のロバストネス制御を与えた。表示ｐＨで１６〜２０時間インキュベートした後、反応物を等量のアセトニトリルで抽出し、遠心分離により沈殿タンパク質を除去し、実施例７に記載されたＵＰＬＣ−ＭＳ解析と同様のＵＰＬＣ−ＭＳ解析により変換を評価した。結果を図１０および図１１に示す。ヒドロキシラーゼ活性が７．５以上のｐＨ値（ｐＨ８〜１１）で変わらないこと、および、ヒドロキシラーゼ活性がｐＨ５ではほとんど検出されないこと、が示された。特に注目すべきは、そのような高ｐＨ値（例えばｐＨ値１１）におけるこの組換え酵素の活性である。そのようなｐＨでも反応を触媒可能であることは、カルボキシル部分を有する化合物等の、ｐＨが高くなるほど溶解性が向上する選択された基質について、基質添加量を増加させることができるため、特別な商業的利点をもたらす。より高いｐＨにおける触媒作用の他の利点は、化学合成、原料の塩基触媒加水分解、またはｐＨ上昇を利用して反応が停止された別の酵素による反応産物等、生成物をもたらした前の工程から係る生成物をそのまま利用することができることである。
【０１４５】
実施例９：ヒドロキシラーゼ活性に対するインキュベーション温度の影響
実施例７に記載された凍結乾燥物質と同様に組換えＰ４５０ａｌｕＣ０９、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａの凍結乾燥物質を用いて、様々なインキュベーション温度のヒドロキシラーゼ活性に対する影響を、ボセンタン、ジクロフェナク、リトナビル、およびチバンチニブ（tivantanib）という４種類の基質を用いて評価した。評価した温度は表１に示した通りであった。表示温度で１６〜２０時間インキュベートした後、反応物を等量のアセトニトリルで抽出し、遠心分離により沈殿タンパク質を除去し、実施例７に記載されたＵＰＬＣ−ＭＳ解析と同様のＵＰＬＣ−ＭＳ解析により変換を評価した。結果を表１に示す。ヒドロキシラーゼ活性は１０℃において概して最も高く、２２℃と２７℃とにおいても同様の触媒変換であったが、３７℃への、さらには４５℃への温度の上昇によって変換は大きく減少した。
【０１４６】
表１：ボセンタン、ジクロフェナク、リトナビル、およびチバンチニブ（tivantanib）を対象としたＰ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３−フェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａのヒドロキシラーゼ活性に対する温度の影響
【表１】
2019536479.tif 000014
【０１４７】
実施例１０：異なるプラスミドコピー数におけるヒドロキシラーゼ活性
高コピープラスミド（ｐＵＣ複製開始点）と中コピープラスミド（ｐＢＲ３２２複製開始点）とにおいてＰ４５０ａｌｕＦ０３、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａを発現する組換え型菌株の、ボセンタン基質およびジクロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１４８】
高コピー型ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３の構築
ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドから、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３−フェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａオペロンを切り出し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより、高コピーｐＵＣ複製開始点を含有するベクター骨格にサブクローニングした。
【０１４９】
ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドをＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化することによりＰ４５０ａｌｕＣ０９−フェレドキシンａｌｕＦ０３−フェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａオペロンを得て、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）により、アガロースゲルから、２８０１ｂｐという予測サイズを有するバンドを精製した。
【０１５０】
ｐＤ４５４−ＳＲ：２４２３７０は、単一の多シストロン性オペロン形態のフェレドキシンｆｄ１およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａ（配列番号９）を含有する高コピーベクターであり、ＤＮＡ２．０社によって構築された。このｐＤ４５４−ＳＲ：２４２３７０プラスミドを、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩによって消化し、４０２１ｂｐという予測サイズを有するバンドを上記のように精製した。切り出された断片（１４０ｍｇ）を、総反応体積を２０μＬとするＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）によりベクター骨格（４０ｍｇ）にライゲーションした。反応物を室温で１．５時間インキュベートし、さらに６５℃で２０分間インキュベートして、リガーゼ酵素を不活性化した。ライゲーション反応混合物（０．５μＬ）を、５０μＬのケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ５αに、化学的な形質転換によって直接導入した。組換え型菌株の塩基配列決定および構築は、実施例４に記載されたものと同様に行った。構築したプラスミドはｐ３Ｃ
．１−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３と称した。
【０１５１】
全細胞ヒドロキシ化活性に対するプラスミドコピー数の影響
組換え発現株の、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３を有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびｐ３Ｃ．１−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３を有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、実施例５と同様にテリフィックブロス培地中で培養し、最終濃度が１ｍＭに達するようにＩＰＴＧを添加することで遺伝子発現を誘導した。実施例５と同様に、培養物にＦｅＳＯ４および５‘−アミノレブリン酸を添加した。
【０１５２】
２７℃、２００ｒｐｍで４時間インキュベートした後、２４ウェルブロック（エンジスクリーン社（Enzyscreen））内で、２．５ｍＬの誘導培養物に、１０μＬのボセンタンまたはジクロフェナク（各２５ｍｇ／ｍＬ）を投与した。この全細胞生体触媒活性反応物を、３０℃、３００ｒｐｍで２４時間さらにインキュベートした。等量のアセトニトリルで反応を止め、実施例７における記載と同様にＵＰＬＣ−ＭＳ解析により変換を評価した。
【０１５３】
異なる数のプラスミドコピーを有する組換え型菌株は共に、全細胞生体内変換において、ボセンタンおよびジクロフェナクをヒドロキシ化することができた。親代謝産物の変換率を表２に示す。高コピー発現株（ｐ３Ｃ．１−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３）と比較した場合、中コピー発現株（ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３）は、ボセンタンおよびジクロフェナクに対する全細胞ヒドロキシラーゼ活性の向上を示した。この結果は、様々なプラスミドコピー数の使用により発現を加減でき、直観に反してはいるが、高コピー数プラスミドよりも低コピー数プラスミドの使用が好ましいことを示している。
【０１５４】
表２：様々なプラスミドコピー数の全細胞生体触媒作用に対する影響
【表２】
2019536479.tif 000015
【０１５５】
実施例１１：異なる抗生物質耐性マーカーを用いたヒドロキシラーゼ活性
アンピシリン耐性プラスミドとカナマイシン耐性プラスミドとにおいてＰ４５０ａｌｕＦ０３、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａを発現する組換え型菌株の、ボセンタン基質およびジクロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１５６】
ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３のカナマイシン耐性誘導体の構築
ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドからＰ４５０ａｌｕＣ０９
−フェレドキシンａｌｕＦ０３−フェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａオペロンを切り出し、実施例１０における実施と同様に、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを介し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ｐＥＴ２９ａベクター骨格にクローニングした。構築したプラスミドはｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３と称した。
【０１５７】
抗生物質選択マーカーの全細胞ヒドロキシ化活性に対する影響
組換え発現株の、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３を有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３を有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの全細胞ヒドロキシ化活性を、実施例１０の記載と同様に実施した。
【０１５８】
アンピシリン耐性組換え発現菌株およびカナマイシン耐性組換え発現菌株は共に、全細胞生体内変換において、ボセンタンおよびジクロフェナクをヒドロキシ化することができた。親代謝産物の変換率を表３に示す。アンピシリン耐性発現株（ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３）と比較した場合、カナマイシン耐性発現株（ｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３）は、ボセンタンおよびジクロフェナクに対する全細胞ヒドロキシラーゼ活性の向上を示した。このデータは、異なる抗生物質耐性遺伝子の使用により発現レベルを向上でき、より安定な抗生物質を使用するほど全培養期間を通じてより大きな選択圧が得られることを示している。
【０１５９】
表３：異なる抗生物質耐性マーカーの全細胞生体触媒作用に対する影響
【表３】
2019536479.tif 000016
【０１６０】
実施例１２：異なるＢＬ２１由来発現宿主を用いたヒドロキシラーゼ活性：
異なるＢＬ２１由来発現宿主においてＰ４５０ａｌｕＦ０３、フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａを発現する組換え型菌株の、ボセンタン基質およびジクロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１６１】
組換え発現菌株の構築
実施例４における記載と同様に、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドを各種ＢＬ２１由来発現宿主に導入した。
【０１６２】
発現宿主の全細胞ヒドロキシ化活性に対する影響
ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドを全て持つ各種組換え発現株、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ
３）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの全細胞ヒドロキシ化活性を、実施例１０の記載と同様に実施した。
【０１６３】
全ての発現菌株が、全細胞生体内変換において、ボセンタンおよびジクロフェナクをヒドロキシ化することができた。親代謝産物の変換率を表４に示す。ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、他のＢＬ２１誘導発現宿主と比較して、ボセンタンおよびジクロフェナクに対してより大きな全細胞ヒドロキシラーゼ活性を示した。表４の結果は、Ｐ４５０ＡｌｕＦ０３−フェレドキシンＡｌｕＦ０３−フェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａ多シストロン性オペロンが、他のＢＬ２１由来発現宿主において発現可能であり且つ触媒活性があることを示している。
【０１６４】
表４：異なるＢＬ２１由来発現宿主を用いて観察された全細胞生体触媒活性
【表４】
2019536479.tif 000017
【０１６５】
実施例１３：他の酸化還元パートナーを用いたヒドロキシラーゼ活性：
Ａ：元のフェレドキシンａｌｕＦ０３のストレプトマイセス・グリセウス（１１７９６）由来フェレドキシンｆｄ１との交換
Ｐ４５０ａｌｕＦ０３と、フェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａと、元のフェレドキシンａｌｕＦ０３または近縁生物由来の別のフェレドキシン（ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）（１１７９６）由来のＦｄ１、Hussain & Ward,. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(1):373-82）とを発現する組換え型菌株の、ボセンタン基質およびジク
ロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１６６】
ＰＣＲ反応
ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３由来Ｐ４５０ａｌｕＣ０９をｐＤ４５４−ＳＲ：２４２３７０プラスミドにクローニングすることによって、元のフェレドキシンａｌｕＦ０３を、ストレプトマイセス・グリセウス（１１７９６）由来のフェレドキシンｆｄ１と交換した。前記Ｐ４５０ａｌｕＣ０９遺伝子は、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドＤＮＡから、ａｌｕＣ０９＿ｐ３Ｃ＿Ｆプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｃｔｔｔｔｔｇａｇａｃｃｔｔａａｇｇａｇｇｔａａａａａＡＴＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣ）（配列番号１２）およびａｌｕＣ０９＿ｐ３Ｃ＿Ｒプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇａｔｃｃｇｃａｃｔｃａｃｃｃｇｃａｔｇｇｔｃａｔｇａａｔｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔａｔａａＴＴ
ＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＧ）（配列番号１３）を用いたＰＣＲにより、実施例４の記載と同様に増幅した。１２９４ｂｐの予測サイズのアンプリコンをアガロースゲルから精製した。
【０１６７】
ｐ３Ｃ−ＡｌｕＣ０９プラスミドの構築
ｐＤ４５４−ＳＲ：２４３７０プラスミドをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、予測サイズが５６１６ｂｐの生成物を得た。この消化生成物を、実施例４に記載のようにアガロースから精製した。Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）により、この精製ＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＤ４５４−ＳＲ：２４２３７０プラスミドにアセンブルした。プロトコルは製造業者の取扱説明書に従い、等温インキュベーション工程は２０分間行った。構築したプラスミドはｐ３Ｃ−ＡｌｕＣ０９と称した。
【０１６８】
元のフェレドキシンａｌｕＦ０３のストレプトマイセス・グリセウス（１１７９６）由来フェレドキシンｆｄ１との交換の全細胞ヒドロキシ化活性に対する影響
実施例１０の記載と同様にして、ｐ３Ｃ．１−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３プラスミドまたはｐ３Ｃ−ＡｌｕＣ０９プラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの、ボセンタン基質およびジクロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１６９】
両方の発現菌株が、全細胞生体内変換において、ボセンタンおよびジクロフェナクをヒドロキシ化することができた。親代謝産物の変換率を表５に示す。元のフェレドキシンパートナーを含むｐ３Ｃ．１−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、フェレドキシンｆｄ１を発現する菌株と比較した場合、ボセンタンおよびジクロフェナクに対して、より大きな全細胞ヒドロキシラーゼ活性を示した。表５の結果は、フェレドキシンｆｄ１の場合は程度が小さくなるが、ストレプトマイセス・グリセウス（１１７９６）由来のフェレドキシンｆｄ１等の、近縁微生物由来の他のフェレドキシンパートナーであっても、還元型ＮＡＤＨ補因子または還元型ＮＡＤＰＨ補因子からシトクロムへの電子移動を支持できることを示している。
【０１７０】
表５：フェレドキシンパートナー交換の全細胞生体触媒活性に対する影響
【表５】
2019536479.tif 000018
【０１７１】
Ｂ：ＡｌｕＦ０３−ＳＣＦ１５Ａ  フェレドキシン−フェレドキシン還元酵素のプチダ菌由来ＰｄＲ−ＰｄＸとの交換
さらに、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９が他の酸化還元パートナーからも電子を受け取れることを確認するために。ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミド由来のフェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａを、プチダ菌（Psuedomonas putida）（ＡＴＣＣ１７４５３）由来のフェレドキシンｃａｍＢおよびフェレドキシン還元酵素ｃａｍＡ酸化還元パートナーと交換した（Koga et al. J Biochem. 1989; 106(5):831-6）。
【０１７２】
ＰＣＲ反応
フェレドキシン還元酵素ｃａｍＢ−フェレドキシンｃａｍＡオペロンを、プチダ菌（ＡＴＣＣ１７４５３）から、ＰｄＲ−Ｐｄｘ＿ｏｐ＿Ｆプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇｔａａａａａａｔｇｔｃｔｃａｔＡＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＧ）（配列番号１７）およびＰｄＲ−Ｐｄｘ＿ｏｐ＿Ｒプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇｔｇａｇａｃｃｔｃａａｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａＴＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＧＡＡＣ）（配列番号１８）を用いたＰＣＲによって、実施例４の記載と同様に増幅した。１７０４ｂｐの予測サイズのアンプリコンをアガロースゲルから精製した。
【０１７３】
ｐＣａｍＡＢｎプラスミドの構築
実施例１３の記載と同様にして、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙにより、この精製ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＤ４５４−ＳＲ：２４２３７０プラスミドにアセンブルした。構築したプラスミドはｐＣａｍＡＢｎと称した。
【０１７４】
ｐＥＴ２９ａ−ＰｄＲ−ＰｄＸの構築
実施例１０の記載と同様にして、フェレドキシン還元酵素ｃａｍＡ−フェレドキシンｃａｍＢオペロンを、ｐＣａｍＡＢｎからｐＥＴ２９ａプラスミドにサブクローニングした。ｐＣａｍＡＢｎプラスミドおよびｐＥＴ２９ａプラスミドはＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、それぞれ１６５８ｂｐおよび５３４５ｂｐの断片をアガロースゲルから精製した。フェレドキシン還元酵素ｃａｍＡ−フェレドキシンｃａｍＢオペロンを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりｐＥＴ２９ａベクター骨格にサブクローニングした。構築したプラスミドはｐＥＴ２９ａ−ＰｄＲ−ＰｄＸと称した。
【０１７５】
ｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＰｄＲ−ＰｄＸの構築
Ｐ４５０ａｌｕＣ０９遺伝子をｐＥＴ２９ａ−ＰｄＲ−ＰｄＸプラスミドにクローニングすることで、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９、フェレドキシン還元酵素ｃａｍＡおよびフェレドキシンｃａｍＢを含有する単一の多シストロン性オペロンを得た。
【０１７６】
前記Ｐ４５０ａｌｕＣ０９遺伝子は、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドＤＮＡから、ＡｌｕＣ０９＿ｆプライマー（５’−プライマー配列−３’：ａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣ）（配列番号１９）およびＡｌｕＣ０９＿ｒプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｇａｃｇａｔｇａｃｃａｃｇｔｔｇｔｃｇｔｔｔｇｃｇｔｔｃａｔｇａａｔｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔａｔａａＴＴＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＧ）（配列番号２０）を用いたＰＣＲにより、実施例４の記載と同様に増幅した。１２９５ｂｐの予測サイズのアンプリコンをアガロースゲルから精製した。実施例１３Ａの記載と同様にして、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙにより、この精製ＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＥＴ２９ａ−ＰｄＲ−ＰｄＸプラスミドにアセンブルした。構築したプラスミドはｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＰｄＲ−ＰｄＸと称した。
【０１７７】
フェレドキシンａｌｕＦ０３およびフェレドキシン還元酵素ＳＣＦ１５Ａとプチダ菌（ＡＴＣＣ１７４５３）由来のフェレドキシン還元酵素ｃａｍＡおよびフェレドキシンｃａｍ
Ｂとの交換の全細胞ヒドロキシ化活性に対する影響
実施例１０の記載と同様にして、ｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３プラスミドまたはｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＰｄＲ−ＰｄＸプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、ボセンタン基質およびジクロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１７８】
両方の発現菌株が、全細胞生体内変換において、ボセンタンおよびジクロフェナクをヒドロキシ化することができた。親代謝産物の変換率を表６に示す。フェレドキシン還元酵素ｃａｍＡおよびフェレドキシンｃａｍＢを発現する菌株と比較した場合、元のフェレドキシンパートナーを含むｐＨＤ０２−ＡｌｕＣ０９−ＡｌｕＦ０３を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ボセンタンおよびジクロフェナクに対して、より大きくはあるが同様の全細胞ヒドロキシラーゼ活性を示した。表５の結果と合わせて、表６の結果は、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９の生体触媒活性が、元のフェレドキシンパートナー以外の他のフェレドキシンパートナーとのペアリングを介して変化し得るため、元のフェレドキシンパートナー以外のフェレドキシンパートナーのより幅広いスクリーニングにより向上が期待できることを示している。
【０１７９】
表６：フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素のパートナー交換の全細胞生体触媒活性に対する影響
【表６】
2019536479.tif 000019
【０１８０】
Ｃ：Ｐ４５０ａｌｕＣ０９−ＢＭ３融合タンパク質
Scheps et al. Microb Biotechnol. 2013; 6(6):694-707に記載される方法と同様にし
て、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９を、巨大菌由来Ｐ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメインにインフレームで融合するように操作した。
【０１８１】
ＰＣＲ反応
終止コドンを持たないＰ４５０ａｌｕＣ０９を、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３から、ＡｌｕＣ０９＿ＢＭ３＿Ｆｏｒプライマー（５’−プライマー配列−３’：ｔｃｔｃａｔＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣ）（配列番号２１）およびＡｌｕＣ０９＿ＬＢＭ３＿Ｒｅｖプライマー（５’−プライマー配列−３’：ＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧ）（配列番号２２）を用いたＰＣＲによって、実施例４の記載と同様に増幅した。１２６９ｂｐの予測サイズのアンプリコンをアガロースゲルから精製した。
【０１８２】
ｐＥＴ２１ａ−ＡｌｕＣ０９＿ＢＭ３プラスミドの構築
ｐＥＴ２１ａ＿ＢＭ３プラスミドはＰ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメイン（配列番号２３）を含有しており、ジェンスクリプト社（Genscript）によって構築された。ｐＥＴ２１
ａ＿ＢＭ３プラスミドをＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで消化し、実施例４の記載と同様にして
、７１５５ｂｐの予測サイズを有するバンドをアガロースゲルから精製した。
【０１８３】
精製したＰＣＲ  ＤＮＡもＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで消化し、実施例１０の記載と同様にして、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより、上記の精製された消化後ｐＥＴ２１ａ＿ＢＭ３断片とライゲーションした。構築したプラスミドはｐＥＴ２１ａ−ＡｌｕＣ０９＿ＢＭ３と称した。
【０１８４】
Ｐ４５０ａｌｕＣ０９とＰ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメインとの融合の全細胞ヒドロキシ化活性に対する影響
実施例１０の記載と同様にして、ｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３プラスミドまたはｐＥＴ２１ａ−ＡｌｕＣ０９＿ＢＭ３プラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの、ボセンタン基質およびジクロフェナク基質に対する全細胞ヒドロキシ化活性を比較した。
【０１８５】
両方の発現菌株が、全細胞生体内変換において、ボセンタンおよびジクロフェナクをヒドロキシ化することができた。親代謝産物の変換率を表７に示す。Ｐ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメインとインフレームで融合されたＰ４５０ａｌｕＣ０９を発現する菌株と比較して、元のフェレドキシンパートナーを含むｐＱＲ３６８ｂｂ−ａｌｕＣ０９−ａｌｕＦ０３を持つ大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの方が、ボセンタンおよびジクロフェナクに対してより大きな全細胞ヒドロキシラーゼ活性を示したが、活性の存在によって、Ｐ４５０ａｌｕＣ０９が融合タンパク質産物に組み込まれた場合も触媒活性を示すことができることが確認された。Scheps et al. Microb Biotechnol. 2013; 6(6):694-707に記載される方法と同様にしてリンカーの長さとリンカーの組成を変えることにより、
融合産物の活性が向上することが期待される。
【０１８６】
表７：Ｐ４５０ａｌｕＣ０９とＰ４５０ＢＭ３の還元酵素ドメインとの融合の全細胞生体触媒活性に対する影響
【表７】
2019536479.tif 000020
【図１Ａ】
2019536479.tif 000023
【図１Ｂ】
2019536479.tif 000024
【図２Ａ】
2019536479.tif 000025
【図２Ｂ】
2019536479.tif 000026
【図２Ｃ】
2019536479.tif 000027
【図２Ｄ】
2019536479.tif 000028
【図２Ｅ】
2019536479.tif 000029
【図２Ｆ】
2019536479.tif 000030
【図２Ｇ】
2019536479.tif 000031
【図２Ｈ】
2019536479.tif 000032
【図３】
2019536479.tif 000033
【図４】
2019536479.tif 000034
【図５Ａ】
2019536479.tif 000035
【図５Ｂ】
2019536479.tif 000036
【図５Ｃ】
2019536479.tif 000037
【図５Ｄ】
2019536479.tif 000038
【図５Ｅ】
2019536479.tif 000039
【図５Ｆ】
2019536479.tif 000040
【図５Ｇ】
2019536479.tif 000041
【図６】
2019536479.tif 000042
【図７】
2019536479.tif 000043
【図８】
2019536479.tif 000044
【図９】
2019536479.tif 000045
【図１０】
2019536479.tif 000046
【図１１】
2019536479.tif 000047
【図１２】
2019536479.tif 000048
【図１３】
2019536479.tif 000049
【図１４】
2019536479.tif 000050
【図１５】
2019536479.tif 000051
【図１６】
2019536479.tif 000052
【図１７】
2019536479.tif 000053
【図１８】
2019536479.tif 000054
【図１９】
2019536479.tif 000055
【図２０】
2019536479.tif 000056
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月19日(2019.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019536479000001.app
【国際調査報告】
2019536479.tif 000057
2019536479.tif 000058
2019536479.tif 000059
2019536479.tif 000060
2019536479.tif 000061