(57)【要約】  本発明は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、結合体の少なくとも９０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が４以下である。本発明はさらに、前記細胞標的化結合体を含む医薬組成物、ならびに、特に癌の処置における、医薬としての前記結合体および前記組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化部分と、前記標的化部分にリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含む、細胞標的化結合体であって、前記リンカーは、遷移金属錯体を含み、前記結合体の少なくとも９０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が４以下である、細胞標的化結合体。
【請求項２】
前記結合体の少なくとも５０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が２または３である、請求項１に記載の細胞標的化結合体。
【請求項３】
前記標的化部分が、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、またはナノボディである、請求項１または２に記載の細胞標的化結合体。
【請求項４】
前記官能性部分の、前記標的化部分への結合が、前記標的化部分を修飾することなく実行されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体。
【請求項５】
前記官能性部分の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％が、前記標的化部分のＦｃ部分、好ましくは抗体のＦｃ部分に結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体。
【請求項６】
標的化部分と、前記標的化部分にリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含む、細胞標的化結合体であって、前記リンカーは、遷移金属錯体を含み、前記標的化部分は、抗体であり、前記官能性部分の少なくとも７０％が、前記抗体のＦｃ部分に結合している、細胞標的化結合体。
【請求項７】
前記官能性部分の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％が、前記抗体のＦｃ部分に結合している、請求項６に記載の細胞標的化結合体。
【請求項８】
前記リンカーは、白金錯体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体。
【請求項９】
前記リンカーは、二座部分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体。
【請求項１０】
前記官能性部分は、治療用化合物、診断用化合物、および／またはキレート剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体。
【請求項１１】
前記標的化部分は、トラスツズマブ、オビニツズマブ、またはオファツムマブであり、前記官能性部分は、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、オーリスタチンＦ（ＡＦ）等の超毒性薬物から選択され、またはキナーゼ阻害剤の群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体と、細胞標的化結合体とを含む医薬組成物であって、前記結合体は、標的化部分と、前記標的化部分にリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、前記リンカーは、遷移金属錯体を含み、前記結合体の少なくとも９０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が４以下である、医薬組成物。
【請求項１４】
前記結合体の少なくとも５０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が２または３である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記結合体の前記リンカーは、白金錯体を含む、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記結合体の前記リンカーは、二座部分を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記結合体の前記標的化部分は、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、またはナノボディである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
標的化部分において、前記官能性部分の、前記標的化部分への結合が、前記標的化部分を修飾することなく実行されている、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記官能性部分の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％が、前記標的化部分のＦｃ部分、好ましくは抗体のＦｃ部分に結合している、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記結合体の前記官能性部分は、治療用化合物、診断用化合物、および／またはキレート剤である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記標的化部分は、トラスツズマブ、オビニツズマブ、またはオファツムマブであり、前記官能性部分は、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、オーリスタチンＦ（ＡＦ）等の超毒性薬物から選択され、またはキナーゼ阻害剤の群から選択される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
医薬として用いるための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体、または請求項１２もしくは１３〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
癌の処置に用いるための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体、または請求項１２もしくは１３〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
乳癌または胃癌の処置に用いるための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体、または請求項１２もしくは１３〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
癌の処置を必要とする患者に、薬学的に有効な量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞標的化結合体、または請求項１２もしくは１３〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の処置方法。
【請求項２６】
前記癌は、乳癌または胃癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
医薬として用いるための、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含む細胞標的化結合体であって、前記リンカーは、遷移金属錯体を含む、細胞標的化結合体。
【請求項２８】
癌、特に乳癌または胃癌の処置に用いられる、請求項２７に記載の細胞標的化結合体。
【請求項２９】
前記結合体の前記リンカーは、白金錯体を含む、請求項２７または２８に記載の細胞標的化結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含む細胞標的化結合体に関し、リンカーは、遷移金属錯体を含む。本発明はさらに、前記細胞標的化結合体を含む医薬組成物、ならびに前記医薬組成物および前記細胞標的化結合体の医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大多数の利用可能な生体結合技術は、タンパク質への有機リンカーの共有結合に依存している。主な例として、反応性のエステルまたはマレイミドを組み込んで、リジン残基またはシステイン残基にそれぞれ連結するリンカーがある。細胞標的化結合体（抗体−薬物結合体またはＡＤＣとも呼ばれる）の分野では、双方のリンカーが、臨床的に承認されたＡＤＣ  Ｋａｄｃｙｌａ（商標）（トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、Ｔ−ＤＭ１）およびＡｄｃｅｔｒｉｓ（商標）（ブレンツキシマブベドチン）に首尾よく利用されている。
【０００３】
ＡｄｃｅｔｒｉｓおよびＫａｄｃｙｌａによりある程度の成功を収めたにも拘らず、細胞標的化結合体の設計および開発の分野の専門家は、当該細胞標的化結合体に利用されるリンカーのタイプが双方とも、細胞標的化結合体の有効性および耐容性に関して、最適下限の品質であることを認識している。したがって、一般に、リンカー戦略および結合体戦略用の多数の開発プログラムにおいて、細胞標的化結合体の有効性および耐容性の向上が目標とされている。
【０００４】
抗体およびペイロード（以下、官能性部分と呼ぶ）、例えば治療用化合物または診断用化合物に隣接して用いられるリンカーシステムは、細胞標的化結合体の３つの主要成分の１つであり、どの細胞が標的にされるか、どのように官能性部分（例えば細胞傷害性薬物）が放出されるか、そして官能性部分が薬物である場合には、どの作用機序によって細胞が死滅することとなるかを決定する。用いられるリンカーシステムは、細胞標的化結合体の安定性および官能性部分の放出に、様々なレベルで影響を及ぼし得るので、細胞標的化結合体の有効性および毒性にとって非常に重要である。
【０００５】
第一に、官能性部分（例えば細胞傷害性薬物）は、インビボ投与後に循環系において抗体から放出されて、正常組織における官能性部分（例えば薬物）の隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）をもたらし得る。第二に、抗体それ自体は、１つ以上の官能性部分（例えば細胞傷害性薬物）との結合によって不安定化されて、完全な結合体のより速い血液クリアランス、ならびに肝臓および脾臓のような分解器官における隔離をもたらし得る。この現象は、例えば、リジン残基およびシステイン残基への薬物の確率的結合の際に観察される。この確率的結合は、ポアソン分布に従う不均一な薬物−抗体比（ＤＡＲ）をもたらし、結合体のクリアランスが迅速であるほど、ＤＡＲは高くなる（７〜９）。
【０００６】
第三に、標的依存性メカニズムまたは標的非依存性メカニズムによるＡＤＣの細胞取込み、およびそれに続く異化作用の後、官能性部分は切り離されて、最終的に細胞から放出され得る。官能性部分が細胞傷害性薬物であるならば、引き続いて隣接細胞を死滅させる虞があるだけでなく、毒性を生じさせる虞もあり、これらは、予測可能な有効性および耐容性をより低くする可能性がある。
【０００７】
今日では、細胞標的化結合体の治療ウィンドウディベロッパを向上させた細胞標的化結合体を開発するのに、化学的手段またはタンパク質工学による抗体の修飾による部位特異的結合に焦点が当てられている。しかしながら、臨床段階における大多数の細胞標的化結合体は、依然として、上記のような従来の結合技術に依存している。部位特異的結合体について知られているいくつかの方法は、１）ｍＡｂ操作を介した操作システインもしくは非天然アミノ酸の利用、２）酵素的結合の利用、または３）抗体のヒンジ領域における還元システインの再架橋である。
【０００８】
これら３つの方法は全て、抗体の修飾を、ペイロードが抗体に結合される前に必要とする。抗体修飾は、抗体の免疫学的特性に影響を及ぼして、不所望の毒性が生じる虞がある。さらに、修飾抗体については、市場認可に関する規制のハードルが予想される。したがって、これを考慮して、規制上の承認が得られている（または得られることとなる）抗体と組み合わせて用いられ得る細胞標的化結合体を得ることが有益であろう。結局のところ、抗体それ自体に関する予想外の毒性問題が回避され得る。さらに、そのような承認された抗体を含む細胞標的化結合体を用いるための市場認可を得るのに必要とされるコストおよび時間が、かなり少なくなろう。
【０００９】
したがって、有効性および薬物動態学的特性が向上した細胞標的化結合体を提供する抗体結合技術が緊急に必要とされている。すなわち、肝臓および細網内皮系による取込みが、最小限にされるべきである。抗体結合技術の向上によって提供される細胞標的化結合体の免疫反応性は低くあるべきであり、かつ薬物−リンカー結合および抗体−リンカー結合は双方とも、十分に安定するべきである。さらに、標的への結合有効性、および結合された抗体の内在化は、結合して直ぐは受ける影響が最小限であるべきであり、好ましくは全く影響を受けない。
【発明の概要】
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、結合体の少なくとも９０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が４以下である。
【００１１】
本発明により、標的化部分に対する官能性部分の分布プロファイルが比較的狭い、すなわち、結合体の少なくとも９０％において、官能性部分と標的化部分（例えば抗体）との比が４以下である細胞標的化結合体を調製することが可能であることが見出された。これは重要な側面である。なぜなら、標的化部分の限られた数のアミノ酸しか結合に関与していないことを示しているからであり、これは、結合が、特定のアミノ酸に向けられていることを意味している。
【００１２】
他の種類のリンカーでは、官能性部分と標的化部分との比の範囲は非常に広い、すなわち抗体薬物結合体のＤＡＲ分布は、０から８超に及ぶことが観察される。明らかに、これらの他の種類のリンカーは、標的化部分（例えば抗体）の豊富に存在するアミノ酸に、ランダムに連結している。結果として、そのような他の種類のリンカーと、豊富に存在するアミノ酸との結合強度は、かなり変動する虞がある。このことは、官能性部分（すなわち細胞傷害性薬物）の一部が、標的化部分（例えば抗体）から、あまりにも早い段階で切り離される虞があると、懸念を生じさせる。これは、治療ウィンドウの縮小に至る。というのも、そのような細胞標的化結合体は、比較的低い用量でしか用いられ得ないためである。さらに、多過ぎる官能性部分が標的化部分（例えば抗体）に結合しているならば、前記部分は、標的部位に到達しない虞がある。なぜなら、細網内皮系が標的化部分を循環から除去するためである。この問題は、本発明に従う細胞標的化結合体により解決された。
【００１３】
本発明の第２の態様は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、標的化部分は、抗体であり、官能性部分の少なくとも７０％が、抗体のＦｃ部分に結合している。
【００１４】
驚くべきことに、官能性部分は、特に、（リンカーを介して）抗体のＦｃ部分に連結していることが見出された。これは非常に有利である。なぜならこれは、かなりの量の官能性部分が抗体の抗原結合部位に結合することを妨げているからであり、このことは、標的への結合のための部位（抗原結合部位）が、官能性部分によって「曇らされ」て、標的部位への結合が妨げられることはないことを意味している。
【００１５】
本発明の第３の態様は、薬学的に許容される担体と、上記の細胞結合体とを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の第４の態様は、医薬として用いるための、本発明に従う細胞標的化結合体または本発明に従う医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明の第５の態様は、癌の処置に用いるための、好ましくは乳癌または胃癌の処置に用いるための、本発明に従う細胞標的化結合体または本発明に従う医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明の第６の態様は、癌の処置方法であって、癌は、好ましくは、乳癌または胃癌であり、癌の処置を必要とする患者に、薬学的に有効な量の、本発明に従う細胞標的化結合体、または本発明に従う薬学的組成物を投与することを含む方法に関する。
【００１９】
本発明の最後の態様は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、前記細胞標的化結合体は、医薬として用いられる。
【００２０】
定義
本明細書中で用いられる用語「リンカー」は、一般に、その従来の意味を有するので、標的化部分と官能性部分との間に、これらの２つが互いに結合するように架橋様構造を形成する化学的部分を指す。
【００２１】
本明細書中で用いられる用語「官能性部分」は、特定の生物学的機能、化学的機能、治療的機能、および／または診断的機能をエクスビボまたはインビボで有する化学基または化学分子を指す。典型的な官能性部分は、治療用化合物（すなわち薬物）または診断用化合物（すなわちトレーサまたは色素）である。
【００２２】
本明細書中で用いられる用語「標的化部分」は、特異的結合対のメンバー、すなわち、一対の分子のメンバーを指し、一対の分子の一方は、その表面上に、他方の分子の特定の空間的構成および極性的構成に特異的に結合する領域、またはキャビティを有するので、他方の分子の特定の空間的構成および極性的構成と相補的であると定義される。その結果、当該対は、互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合対のタイプの例として、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡがある。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「特異的結合対」は、一対の分子由来のメンバーを指し、一対の分子の一方は、その表面上に、他方の分子の特定の空間的構成および極性的構成に特異的に結合する領域、またはキャビティを有するので、他方の分子の特定の空間的構成および極性的構成と相補的であると定義される。その結果、当該対のメンバーは、互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合対のタイプの例として、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−タンパク質がある。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「標的薬物」は、標的化部分、例えば抗体に連結した薬物を指す。
【００２５】
本明細書中で用いられる用語「免疫反応性」は、その通常の科学的意味を有し、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、またはナノボディ等の特異的結合対のメンバーの結合親和性を指す。
【００２６】
本明細書中で用いられる用語「官能性部分の、標的化部分に対する比」は、標的化部分（例えば抗体）に（例えば、共有結合または配位結合を介して）結合している官能性部分（例えば細胞傷害性薬物分子）の数に関する。当該技術における用語「薬物抗体比」または「ＤＡＲ」は、官能性部分と抗体との比率を示すのに一般的に用いられている。しかしながら、上記から明らかなように、本発明に従う標的化部分として、抗体以外にも、例えばペプチド、抗体フラグメント、またはナノボディがあり得る。しかしながら、読みやすさの理由から、これらのタイプの標的化部分（すなわち非抗体）に関しても、本発明では用語「ＤＡＲ」を用いることとする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｌｘ結合技術、およびＤＦＯ−Ｌｘの、トラスツズマブへの結合の概略図である。
【図２】ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブの分析的特徴付けである：Ａ．２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラム、Ｂ．ＬＣ−ＭＳクロマトグラム、Ｃ．ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブ（ＤＡＲ２．６）とＤＦＯ−トラスツズマブ（ＤＡＲ２．９；リジンへの直接結合）とのＤＡＲ分布の比較。ＤＦＯ−Ｌｘの結合は、ＤＡＲ範囲がより狭いＡＤＣをもたらすことに注目されたい。このことは、結合に関与するアミノ酸が少ないことを意味している。
【図３】Ａ．ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、Ｂ．ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブの化学構造である。
【図４】ｍＡｂ分子の全体にわたるＤＦＯ−Ｌｘ結合の評価である：Ａ．非還元ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび還元ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブ（それぞれレーン１および２）、ならびに非還元ＤＦＯ−トラスツズマブおよび還元ＤＦＯ−トラスツズマブ（それぞれレーン３および４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くリン光体撮像装置による分析。ＤＦＯ−Ｌｘの、重鎖への優先的結合に注目されたい。Ｂ．ＤＴＴ還元またはペプシン消化もしくはパパイン消化後のペイロードの分布。ＤＦＯ−Ｌｘの、Ｆｃフラグメントへの優先的結合に注目されたい。
【図５】ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウスにおける注射後７２時間での８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブ（灰色のバー）および８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブ（黒色のバー）の生体内分布である。
【図６】インビトロ細胞生存率アッセイである。Ａ．ＮＣＩ−Ｎ８７、Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｃ．ＪＩＭＴ−１の、生存率に及ぼすＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ（黒色の四角）、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ（上三角）、トラスツズマブエムタンシン（下三角）、およびＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２（円）の効果、ならびにＤ．薬物リンカーＡＦ−Ｌｘ（黒色の白抜き四角）およびＡＦ−Ｍａｌ（白抜き三角）の細胞生存率の、それらの対応するＡＤＣであるそれぞれＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ（黒塗り四角）およびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ（黒塗り三角）との、ＮＣＩ−Ｎ８７に及ぼす効果の比較。
【図７】ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウスにおけるトラスツズマブの生体内分布特性に及ぼす、ＡＦ−Ｌｘ結合の効果を示す図である。  Ａ．ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ（黒色の四角）、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ（三角）、およびトラスツズマブ−８９Ｚｒ（円）の血中動態。  Ｂ．ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ（黒色のバー）、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ（薄い灰色のバー）、および８９Ｚｒ−トラスツズマブ（暗い灰色のバー）の、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間での生体内分布。  Ｃ．ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒの注射９６時間後のＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍マウスのＰＥＴ−ＣＴ画像。
【図８】Ａ．ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウス、Ｂ．ＪＩＭＴ−１腫瘍担持マウスにおけるＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブの治療有効性を示す図である。レジェンド：ビヒクル（灰色の線、星）、トラスツズマブ（菱形）、トラスツズマブエムタンシン（下三角）、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ１５ｍｇ／ｋｇ（黒色の線、黒塗り四角）、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ３０ｍｇ／ｋｇ（黒色の線、白抜き四角）、ＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２（円）、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ１５ｍｇ／ｋｇ（黒塗り上三角）、およびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ１５ｍｇ／ｋｇ（白抜き上三角）。
【図Ｓ１】様々なｍＡｂへのＤＦＯ−Ｌｘ連結の一貫性を示す図である。Ａ．ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブ（ＤＡＲ３．２）、Ｂ．ＤＦＯ−Ｌｘ−オビヌツズマブ（ＤＡＲ２．９）、およびＣ．ＤＦＯ−Ｌｘ−オファツムマブ（ＤＡＲ３．０）のＬＣ−ＭＳクロマトグラム。
【図Ｓ２】ｍＡｂ分子の全体にわたるＤＦＯ−Ｌｘ結合の評価である：ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよびＤＦＯ−トラスツズマブについてのＳＥＣ−ＭＳによる重鎖および軽鎖のＤＡＲ判定。
【図Ｓ３】ｍＡｂ分子の全体にわたるＡＦ−Ｌｘ結合の評価である：Ａ．無傷、Ｂ．ＤＴＴ還元、Ｃ．ペプシン還元、およびＤ．パパイン還元の、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブのＳＥＣ−ＭＳ。
【図Ｓ４】ラジオ−ＴＬＣ、ラジオ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のリン光体撮像装置による分析、およびＬｉｎｄｍｏ  ｅｔ  ａｌに従う結合アッセイによって評価した、Ａ．８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブ、およびＢ．８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブのインビトロ血清安定性を示す図である。
【図Ｓ８】Ａ．ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウス、Ｂ．ＪＩＭＴ−１腫瘍担持マウスのカプラン−マイヤー生存曲線である。レジェンド：ビヒクル（灰色の線、星）、トラスツズマブ（菱形）、Ｔ−ＤＭ１（下三角）、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ１５ｍｇ／ｋｇ（黒色の線、黒塗り四角）、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ３０ｍｇ／ｋｇ（黒色の線、白抜き四角）、ＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２（円）、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ１５ｍｇ／ｋｇ（黒塗り上三角）、およびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ１５ｍｇ／ｋｇ（白抜き上三角）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の第１の態様は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、結合体の少なくとも９０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲ）が４以下（すなわち、１から４（４を含む））である。
【００２９】
狭い一定の分布プロファイルのため、標的化部分の少数のアミノ酸のみが、リンカーとの連結に関与していると結論付けられ得る。さらに、これらの特定のアミノ酸とリンカーとの結合は、強い。これは、インビボ投与後、官能性部分（前記リンカーを介して標的化部分に連結されている）が、循環中に標的化部分から放出されないことを意味する。したがって、正常組織における官能性部分（例えば細胞傷害性薬物）の隔離は、回避される。さらに、部位指定結合が重要である。なぜなら、官能性部分が、多過ぎる様々なアミノ酸に結合され得るならば、標的化部分（例えば抗体）の免疫反応性が、官能性部分の存在によって影響を受けることとなるからである。結局、そのような場合、多過ぎる官能性部分が、１つの標的化部分に結合する可能性があり（すなわち、ＤＡＲが高くなり過ぎることとなり）、標的化部分の免疫反応性がかなり低下する虞がある。
【００３０】
本発明の結合体の有利な性質を考慮すると、広い治療ウィンドウを達成することができる。
【００３１】
さらに、リンカーが遷移金属錯体（例えば白金）を含む事実により、標的化部分（例えば抗体）は、リンカーと標的化部分との連結を促進するための修飾を必要としない。したがって、標的化部分は、別個の販売認可が実現または申請されている形態のままであることができる。その結果、標的化部分（例えば抗体）に対してなされた変更を調べる必要がないので、細胞−標的化結合体全体についての規制承認時間は、著しく短縮され得る。
【００３２】
好ましくは、結合体の少なくとも５０％は、官能性部分の、標的化部分に対する比（ＤＡＲとも呼ばれる）が２または３である。本発明者らは、結合体が、標的化部分（例えば抗体）あたり２〜３個の官能性部分を含むならば、前記標的化部分の免疫反応性は優れたままであること、そして十分な官能性部分（例えば細胞傷害性薬物）が、注目する組織に供給されることを見出した。
【００３３】
官能性部分は、本発明の好ましい態様において、治療用化合物、診断用化合物、またはキレート剤である。
【００３４】
官能性部分が、細胞系におけるシグナル伝達カスケードを阻害し、細胞骨格を妨害し、またはＤＮＡ二重螺旋中にインターカレートする治療化合物である場合が、特に好ましい。官能性部分が、抗炎症性、抗高血圧性、抗線維性、抗血管新生性、抗腫瘍性、免疫刺激性、またはアポトーシス誘導性の活性を有することがさらに好ましい。好ましくは、治療用化合物は、抗腫瘍活性を有する。
【００３５】
本発明に従えば、官能性部分は、キナーゼ阻害剤、またはそのプロドラッグの群から選択される治療用化合物であってよい。本発明の別の実施形態では、キナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィニチブ、イマチニブ、ペントキシフィリン、ＰＤＴＣ、ＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、バタナリブ、ＬＹ３６４９４７、Ｙ２７６３２、ＡＧ１２９５、ＳＰ６００１２５である。
【００３６】
これ以外にも、選択される官能性部分は、ロサルタン等のアンギオテンシン受容体遮断薬である。
【００３７】
これ以外にも、官能性部分は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）等の組換えタンパク質である。これ以外にも、官能性部分は、ベータ放射体９０Ｙもしくは１７７Ｌｕ、またはアルファ放射体２１１Ａｔ等の治療用放射性核種である。
【００３８】
これ以外にも、官能性部分は、タキサン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、カリケアマイシン、マイタンシノイド、オーリスタチン、ツブリシン、デュオカルマイシン、アマニチン、またはピロロベンゾジアザピン類似体の群から選択される（超）毒性薬物である。
【００３９】
官能性部分として治療用化合物を用いること以外に、診断用化合物を用いることもできる。代替の実施形態では、官能性部分として、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＤＹ−８００、ＤＹ−８３１、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７９０、およびインドシアニングリーン等の蛍光色素がある。
【００４０】
本発明において官能性部分として用いられ得る他の診断化合物として、放射性核種、ＰＥＴ画像化剤、ＳＰＥＣＴ画像化剤、またはＭＲＩ画像化剤がある。
【００４１】
官能性部分としてのキレート剤を、リンカーを介して、標的化部分に連結することも可能である。当該キレート剤は、標的化部分への連結の前または後に、治療用もしくは診断用の放射性核種または非放射性金属がロードされてもよい。考えられるキレート剤として、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、およびデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）がある。しかしながら、遷移金属ＰＥＴ放射性同位体、非放射性金属、または遷移金属ＳＰＥＣＴ放射性同位体、例えば９９ｍＴｃまたは１９５ｍＰｔが連結されている、ＤＯＴＡまたはｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ等の大環状キレート剤が用いられてもよい。
【００４２】
これ以外にも、２種類以上の官能性部分が用いられる。このようにして、様々な官能性部分、例えば、治療化合物の様々な有用な組合せ、または有用な診断化合物の様々な組合せを、一標的化部分に結合することが可能である。このようにして、治療用化合物の好ましい組合せが、注目する組織に送達され得る。
【００４３】
インビボ用途に十分に適した安定性のある結合を得るために、標的化部分および／または官能性部分は、１つ以上の硫黄含有反応部位および／または１つ以上の窒素含有部位を含むことが好ましい。治療用化合物等の官能性部分は、１つ以上の硫黄基および／または１つ以上の窒素基、好ましくは複素環アミンもしくは脂肪族アミンまたは芳香族窒素基を含むことが特に好ましい。
【００４４】
標的化部分は、好ましくは、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、またはナノボディである。
【００４５】
標的化部分は、好ましくは、特異的結合対のメンバーを含むので、特定の細胞または組織の特有の部分に結合することができる。このようにして、標的化部分は、これにリンカーを介して付着している官能性部分を、注目する場所に導くことができる。
【００４６】
標的化部分は、抗体、例えばモノクローナル抗体、その誘導体またはフラグメントを含んでもよいし、ペプチドを含んでもよい。
【００４７】
抗体の誘導体は、本明細書中で、生じた化合物の少なくとも１つの特性、好ましくは抗原−結合特性が、本質的に種類は同じであるが、量は必ずしも同じでないように改変された抗体として定義される。誘導体は、多くの方法で、例えば保存的アミノ酸置換によって提供される。これによってアミノ酸残基は、別の残基によって置換されて、全体の機能が深刻には影響されないような、一般的に類似の特性（サイズ、疎水性等）を有する。
【００４８】
抗体のフラグメントは、前記抗体と少なくとも１つの同じ特性を有する部分として定義され、この特性について、種類は同じであるが、量は必ずしも同じでない。前記官能性部分は、必ずしも同程度ではないが、前記抗体と同じ抗原に結合することができる。抗体のフラグメントは、好ましくは、単一ドメイン抗体（ナノボディとも呼ばれる）、一本鎖抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。適切には、標的化部分は、モノクローナル抗体であり、最も好ましくは、選択的腫瘍標的化の能力を示してきた抗体、例えば、アダリムマブ、ベバシズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブ、またはそれらの組合せの群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００４９】
これ以外にも、標的化部分は、抗体フラグメント、例えば治療用ＦＡＢ、例えばラニビズマブ、ダイアボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、アフィボディ、ナノボディ、例えばＡＬＸ−０６５１、またはアンチカリンである。
【００５０】
リンカーは、好ましくは、白金錯体を含む。白金錯体は、トランス白金錯体であっても、シス白金錯体であってもよい。シス白金錯体が好ましく、これは、好ましくは、安定化架橋として不活性二座部分を含む。別の実施形態では、（白金）錯体は、安定化架橋として三座配位子部分を含む。
【００５１】
そのようなリンカーを含む本発明の細胞標的化結合体の、４以下の比較的低い官能性部分対標的化部分比（ＤＡＲ）は、本発明に従う細胞標的化結合体の優れた免疫反応性に寄与する。例えば、二官能性白金（ＩＩ）錯体であるエチレンジアミン白金（ＩＩ）ジクロリド（以下、「Ｌｘ」リンカーとも呼ぶ）（白金錯体を含み、さらに不活性二座部分を含むリンカーである）が、本発明の細胞標的化結合体の向上に首尾よく利用された。
【００５２】
例えば、安定した、効果的に標的化する本発明の細胞標的化結合体は、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）フルオロフォアと、二官能性白金（ＩＩ）錯体であるエチレンジアミン白金（ＩＩ）ジクロリドリンカーを介して結合した、ｍＡｂ、トラスツズマブを含む結合体である。
【００５３】
前述のように、本発明に従えば、標的化部分、例えば、ペプチド、抗体、もしくはそれらのフラグメント、またはナノボディを、官能性部分がリンカーを介して連結される前に修飾する必要がないことが、本発明の抗体−薬物結合体の多くの利点の１つである。ペプチドまたは抗体のアミノ酸側鎖の修飾は、ペプチド、ナノボディ、または抗体における構造変化のリスクを負うので、それらの修飾は、ペプチド、抗体、またはナノボディの標的化能の喪失をもたらす虞がある。さらに、修飾が、標的化部分の結合部位の領域にあるならば、ペプチド、抗体、またはナノボディの修飾は、標的細胞に対する親和性の低下を、または標的化能の喪失すらももたらす虞がある。
【００５４】
したがって、一実施形態では、本発明は、本発明に従う細胞標的化結合体に関し、ペプチド、抗体、それらの抗体フラグメント、またはナノボディは、ペプチド、抗体、その抗体フラグメント、またはナノボディ中に、リンカーのための連結部位を導入するように修飾されていない。
【００５５】
驚くべきことに、標的化部分が抗体である本発明の細胞標的化結合体の標的化部分の有益な、高度に維持された細胞標的化能に加えて、本発明の細胞標的化結合体の高い有益な安定性は、官能性部分が、結合リンカー、好ましくはいわゆる「Ｌｘリンカー」を介して、抗体の重鎖に主に結合することに起因することを、本発明者らは見出した。すなわち、標的化部分が抗体である本発明の細胞標的化結合体は、細胞標的化、および標的細胞（例えば癌細胞）の意図される部位への官能性部分の送達に特に有効であり、これは、とりわけ、抗体、および主に抗体の重鎖にある官能性部分の、結合側の位置に起因する。本発明の細胞標的化結合体において、官能性部分の少なくとも８９％が、抗体の重鎖に結合していることが見出された。また、本発明の細胞標的化結合体において、官能性部分の少なくとも８７％が、抗体の重鎖のＦｃ部分に結合していることが見出された。
【００５６】
ゆえに、標的化部分として抗体を有する本発明の細胞標的化結合体は、ＤＡＲが４以下と低いことが、本発明の一部であり、官能性部分は、主に、抗体の重鎖に結合しており、好ましくは、主に、重鎖のＦｃ部分に結合している。したがって、本発明の一実施形態では、官能性部分の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％が、標的化部分として用いられる抗体のＦｃ部分に結合している。
【００５７】
上記に鑑みて、本発明の第２の態様は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、標的化部分は、抗体であり、官能性部分の少なくとも７０％が、抗体のＦｃ部分に結合している。
【００５８】
本発明の好ましい態様において、官能性部分の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％が、抗体のＦｃ部分に結合している。
【００５９】
なお、当該細胞標的化結合体に関して、標的化部分、官能性部分、およびリンカー（および細胞標的化結合体の他の特徴）は、本発明の第１の態様に関して上述した通りであり得ることを明示する。
【００６０】
本発明の第３および第４の態様は、本発明の第１および第２の態様に関して上述したような細胞標的化結合体（またはそれらの混合物）を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、加えて、薬学的に許容される担体を含む。
【００６１】
本発明に従えば、用語「医薬組成物」は、上記のような安定した細胞標的化結合体を含む組成物に関する。そのような医薬組成物は、治療的に有効な量の安定した当該細胞標的化結合体、および薬学的に許容される担体を含む。
【００６２】
当該医薬組成物は、生理学的に許容される担体と共に、患者に投与されてよい。本明細書中で用いられる用語「担体」は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し、これらと共に治療薬は投与される。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば水であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。生理食塩水、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液に、液体担体として使用され得る。適切な医薬賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノール等が挙げられる。組成物はまた、所望する場合、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【００６３】
当該医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤の形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドにより、座薬として処方されてよい。
【００６４】
適切な医薬担体の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、治療的に有効な量の細胞標的化結合体を、患者への適切な投与用の形態を提供するのに適した量の担体と共に含有することとなる。製剤は、投与方法に適しているべきである。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ルーチンの手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性バッファ中の溶液である。一般に、成分は、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェ等の密封容器内に、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位剤形で、別々に供給され、または一緒に混合されている。組成物は、注入によって投与されることとなる場合、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含有する注入ボトルで分配されてよい。組成物は、注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供されてよい。
【００６６】
経口使用および局所使用に適した医薬グレードの有機もしくは無機の担体および／または希釈剤を用いて、治療的に活性な化合物を含有する組成物を作り出すことができる。組成物はまた、以下の１つ以上を含んでもよい：担体タンパク質、例えば血清アルブミン；バッファ；充填剤、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、コーンスターチおよび他のデンプン；結合剤；甘味料および他の香味料；着色剤；ならびにポリエチレングリコール。添加剤は、当該技術において周知であり、そして種々の製剤において用いられている。
【００６７】
本発明の第５の態様は、医薬として用いられる上記の細胞標的化結合体または医薬組成物に関する。前記結合体およびその医薬組成物は、癌、特に乳癌および／または胃癌の処置における使用に特に適している。
【００６８】
本発明の第６の態様は、癌の処置方法に関し、当該方法は、これを必要とする患者に、薬学的に有効な量の細胞標的化結合体またはその薬学的組成物を投与することを含む。前記方法は、乳癌および／または胃癌の処置に用いるのに特に適している。
【００６９】
本発明の最後の態様は、細胞標的化結合体に関し、当該結合体は、標的化部分と、これにリンカーを介して結合した１つ以上の官能性部分とを含み、リンカーは、遷移金属錯体を含み、前記細胞標的化結合体は、医薬として用いられる。前記細胞標的化結合体は、癌、特に乳癌または胃癌の処置に用いるのに特に適している。リンカーは、好ましくは、白金錯体を含む。標的化部分は、好ましくは、抗体である。この点について、本発明の本態様に従う細胞標的化結合体は、本発明の他の態様に関連して上述したものと同じ、または以下の例に記載したものと同じ、好ましい実施形態および代替の実施形態で提供され得ることを明示する。
【００７０】
以下の非限定的な例によって、本発明をさらに説明することとする。
【００７１】
例
材料および方法
一般的な材料
用いた細胞株は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＪＩＭＴ、ＢＴ−４７４、およびＳＫＢＲ３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ、ならびに胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７であった。ＪＩＭＴ−１は、２０１２年３月１９日にＤＳＭＺ  Ｇｅｒｍａｎｙから、細胞遺伝学的検査の後に入手して、蘇生後６ヶ月以内に用いた。ＮＣＩ−Ｎ８７は、２０１２年２月２９日にＡＴＣＣ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから、細胞遺伝学的検査の後に入手して、蘇生後６ヶ月以内に用いた。ＳＫＢＲ３は、Ｔ．Ｏｕｄｅ  Ｍｕｎｎｉｎｋ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＲｏｃｈｅから、そしてＳＫ−ＯＶ−３は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ＶＵ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍから入手した。全ての細胞株を、一次増殖特性（形態および増殖速度）およびＨＥＲ２発現についてチェックした。ＭＤＡ−ＭＢ２３１は、ＨＥＲ２発現が低い細胞株であり；ＳＫＢＲ３、ＢＴ−４７４、ＳＫＯＶ−３、およびＮＣＩ−Ｎ８７は、ＨＥＲ２を過剰発現し；ＪＩＭＴ−１は、トラスツズマブ耐性患者の腫瘍細胞から作製され、ＨＥＲ２陽性である（２７）［「２００４，Ｔａｎｎｅｒ」］。全ての出発試薬および溶媒を、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手して、特に明記しない限り、さらに精製することなく用いた。オーリスタチンＦ（ＡＦ）を、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から入手した。デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、トラスツズマブ、オビニツズマブ、オファツムマブ、セツキシマブ、およびＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（Ｔ−ＤＭ１）を、病院薬局から入手した。８９Ｚｒ（１ｍｏｌ／Ｌシュウ酸中０．１５ＧＢｑ／ｎｍｏｌ以上）を、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍから入手した。水を、ミリＱ水濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）によって蒸留して脱イオン化した（１８ＭΩ／ｃｍ）。
【００７２】
ＬｘベースのＡＤＣとベンチマークの結合、および８９Ｚｒによる標識化
Ｌｘ錯体であるＤＦＯ−ＬｘおよびＡＦ−Ｌｘを、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１６／０５０１６３号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）に本質的に記載されるように、様々なｍＡｂに結合させた。
【００７３】
ＤＦＯ−ＬｘおよびＡＦ−Ｌｘの、ｍＡｂへの結合
トラスツズマブ（７１．０μＬ、２１ｍｇ  ｍＬ−１）を、トリシンバッファ（１２．３μＬ、２００ｍＭ、ｐＨ８．５）で希釈して、白金錯体（４０．０μＬ、５ｍＭストック溶液）を加えた。サンプルを、５５０ｒｐｍのサーモミキサ内で３７℃にて２４時間インキュベートした後、Ｈ２Ｏ中チオ尿素溶液（１２３．３μＬ、２０ｍＭ）を加えて、混合液を３７℃にてさらに３０分間インキュベートした。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタユニット（３０ｋＤ  ＭＷＣＯ，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、溶媒としてのＰＢＳと用いて、結合体を精製した。オビニツズマブ、オフマツマブ、およびＩｇＧ−Ｂ  １２をバッファ交換して、トリシンバッファ（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）中で２１ｍｇ／ｍＬ−１に濃縮してから、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタユニットを用いて結合させた。
【００７４】
ＡＦ−Ｍａｌの、ｍＡｂへの結合
ＡＦ−Ｍａｌを、様々なｍＡｂに結合させた。トラスツズマブ（７１．０μＬ、２１ｍｇ  ｍＬ−１）を、Ｈ２Ｏ（１００μＬ）およびホウ酸バッファ（３８．８μＬ、２５０ｍＭホウ酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭジエチレントリアニン五酢酸、ｐＨ８．０）で希釈して、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（３．３当量、１３．８μＬ、Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ）を加えた。サンプルを、５５０ｒｐｍのサーモミキサ内で３７℃にて２時間インキュベートした後、ＡＦ−Ｍａｌ溶液（６当量、２０．６μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を加えて、混合液を０℃にてさらに６０分間インキュベートした。最後に、結合を、０℃にて５分間、Ｎ−アセチル−システイン（５μＬ、１００ｍＭ）でクエンチして、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタユニット（３０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、溶媒としてのＰＢＳと用いて、精製した。
【００７５】
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９ＺｒおよびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒの生成
ｍＡｂ中のリシン残基への、スクシニル化したＤＦＯの活性化エステルの結合を、Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２６）［「２００３，Ｖｅｒｅｌ」）によって記載される手順に従って実行した。所望のＤＦＯ対ｍＡｂ比が得られ、結合効率は５０％であった。最初にトラスツズマブをＤＦＯで予め修飾し（ＤＦＯ：トラスツズマブ比は１）、続いて、上記の方法に従って、ＡＦ−ＬｘまたはＡＦ−Ｍａｌを、予め修飾したトラスツズマブに結合させ、そして最後に、Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２６）［「２００３，Ｖｅｒｅｌ」］によって記載される手順に従って、結合体を８９Ｚｒで標識化することによって、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９ＺｒおよびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒを得た。
【００７６】
用いた分析手順
ＵＶ
ＵＶ分光法（ＵＶ−６３００ＰＣ，ＶＷＲ）によって、トラスツズマブまたはＩｇＧ−Ｂ  １２の検量線を用いて、タンパク質濃度を判定した。
【００７７】
ＨＰＬＣ
Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ５μカラム（４．６×２５０ｍｍ）を備えたＪａｓｃｏ  ＨＰＬＣシステム、および１ｍＬ／分の流量でのＭｅＣＮ／水、０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、ＤＦＯ−Ｌｘ、ＡＦ−Ｌｘ、およびＡＦ−Ｍａｌの分析高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析を実行した。
【００７８】
Ｓｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００カラム（３００Å、７．８×３００ｍ）およびＳｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００ガードカラム（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）を備えたＪａｓｃｏ  ＨＰＬＣシステムを用いて、０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ６．８）、および０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＮ３の混合液を、溶離液として、１ｍＬ／分の流量にて用いて、ＡＤＣのＨＰＬＣ分析を実行した。溶離液の放射活性を、インラインＮａＩ（Ｔｌ）放射線検出器（Ｒａｙｔｅｓｔ  Ｓｏｃｋｅｔｔ）を用いて監視した。
【００７９】
ｉＴＬＣ
ＡＤＣの放射化学的純度を評価するために、ＡＤＣのインスタント薄層クロマトグラフィ（ｉＴＬＣ）分析を実行した。シリカ含浸ガラス繊維シート（ＰＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＢＶ）を用いた。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファ（ｐＨ５．０）／ＭｅＯＨ（３／７）であった。８９Ｚｒについて、読取りとして、ガンマウェルカウンタ（Ｗａｌｌａｃ  ＬＫＢ−ＣｏｍｐｕＧａｍｍａ  １２８２；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるガンマ−ウェル同位体計数を用いた。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＡＤＣの構造的完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判定した。サンプルを、ローディングバッファと１：１にて混合して、Ｐｈａｓｔｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、予め形成した７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、非還元条件および還元条件下で用いて、走らせた。ゲルを、リン光体撮像装置を用いる同位体計数によって分析して、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアで定量化した。
【００８１】
結合アッセイ
Ｌｉｎｄｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２８）［「１９８４，Ｌｉｎｄｍｏ」］によって本質的に記載されるような免疫反応性アッセイにおいて、０．２％グルタルアルデヒド固定ＳＫＯＶ細胞の段階希釈液、および固定量の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブまたは８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブを用いて、ＡＤＣの結合特性を判定した。４℃にて一晩インキュベートした後、細胞懸濁液を遠心分離して、特異的結合を、アッセイにおいて、細胞結合放射活性の、放射活性の総量に対する比として計算した。これを、非特異的結合について、５００倍過剰の非放射性トラスツズマブで判定して、補正した。全ての結合アッセイを、３反復実行した。
【００８２】
ＬＣ−ＭＳ
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結したＺｅｎｉｘ  ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＬＣ−ＭＳ分析を実行した。Ｚｅｎｉｘ−Ｃカラム（４．６ｘ３００ｍｍ；５μｍ；Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）を用いて、質量測定を実行した。移動相は、水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、およびギ酸（それぞれ７９．９／１９．９／０．１／０．１、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の混合液からなった。１７分のイソクラティック分析を、３５０μＬ／ｍｉｎの流量にて実行した。１０μＬのサンプルを注入した。質量分析計上に存在する切替弁を用いて、ＬＣ流をＭＳ源に、２〜１０分で向けた。源汚染を防ぐために、残りの溶媒流を廃棄物に向けた。以下の設定を用いて、ＭＳ分析を陽イオン化モードで行った：ＥＳＩ電圧、４．５ｋＶ；乾燥ガス温度、１９０℃；乾燥ガス流量、８Ｌ／分；ネブライザ圧、１．６バール；インソース衝突誘起解離エネルギー、１２０ｅＶ；イオンエネルギー、５ｅＶ；衝突セルエネルギー、１５ｅＶ。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、データを分析した。Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアの「Ｃｈａｒｇｅ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ」ユーティリティを用いて、タンパク質イオン電荷の割当ておよび分子量の判定を実行した。
【００８３】
遊離薬物の判定
５０μＬ  ＡＤＣを１００μＬアセトニトリルで沈殿させてから、遠心分離（１０．０００ｒｐｍ、５分間）して、上清をＣ１８逆相ＨＰＬＣ分析することによって、ＡＤＣ溶液中の遊離薬物のパーセンテージを判定した。定量化のために、検量線を、ＡＦ−Ｌｘ−チオ尿素錯体を用いて作製した。
【００８４】
ＬｘベースのＡＤＣの分子特性
ｍＡｂ中のペイロード（すなわち官能性部分）位置の判定を、ＤＴＴ還元、ＡＤＣのペプシン消化またはパパイン消化、その後のＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、またはＳＥＣ−ＭＳ分析によって実行した。抗体１００μｇあたり２単位／μｇの酵素を用いて、ＡＤＣ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で脱グリコシル化した。サンプルを、３７℃にて２４時間インキュベートした。ＡＤＣ（１００μＬ、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）をＤＴＴ（１００μＬ、Ｈ２Ｏ中１００ｍＭ）と６５℃にて２０分間インキュベートすることによって、ＡＤＣのシステイン架橋の還元を実行した。ＮａＯＡｃバッファ（２０ｍＭ、ｐＨ４．０）中でＡＤＣを再緩衝化して、１ｍｇ／ｍＬに濃縮してから、ペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（２．５μＬ、１０ｍＭ  ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬ）を加えることによって、ペプシン消化を実行した。混合液を３７℃にて２４時間インキュベートした後、ペプシンを、トリスバッファ（１０μＬ、２Ｍ、ｐＨ８．０）を加えることによって失活させた。トリス−ＨＣＬバッファ（２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５ｍＭシステインを含有する１００ｍＭ、ｐＨ７．６）中でＡＤＣを再緩衝化して、１ｍｇ／ｍＬに濃縮してから、パパイン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（４μＬ、Ｈ２Ｏ中０．５ｍｇ／ｍＬ）を加えることによって、パパイン消化を実行した。混合液を、３７℃にて４時間インキュベートした。
【００８５】
ＬｘベースのＡＤＣの品質試験および安定性
ＡＤＣの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブを、１容量当量の０．９％ＮａＣｌまたは５０％ヒト血清と、３７℃にてインキュベートした。様々な時点にて、結合体の放射化学的純度を、ｉＴＬＣおよびラジオＨＰＬＣによって測定した一方、結合体の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くリン光体撮像装置による分析によって分析した。ＡＤＣのインビトロ結合特性を、Ｌｉｎｄｍｏ結合アッセイによって判定した。
【００８６】
インビトロ細胞生存率アッセイ
ＡＦ−Ｌｘ、ＡＦ−Ｍａｌ、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｍａｌ−ＩｇＧ−Ｂ１２、Ｔ−ＤＭ１、およびトラスツズマブの、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＪＩＭＴ、ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ３、ＳＫＯＶ−３、およびＮＣＩ−Ｎ８７の細胞生存率に及ぼす効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。アッセイを開始する前に、ＡＦ−ＬｘおよびＡＦ−Ｍａｌを、１モル当量のチオ尿素（２時間、３７℃）およびｎ−アセチル−システイン（３０分、０℃）とそれぞれインキュベートすることによって、当該化合物をクエンチした。０日目に、細胞をトリプシン処理して、９６ウェル平底組織培養プレート内にプレーティングした。１日目に、上記の化合物から、段階希釈系列（９×４倍希釈）を、１０または１０００ｎＭから始めて（細胞および化合物の種類によって決める）作製して、細胞に加えた（ＡＤＣの場合、ｍＡｂの濃度を用いた）。５日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬を加えて、３７℃にて２時間インキュベートした。生存細胞を、ＴｅＣａｎプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）によって、５６０ＥＸ／５９０ＥＭｎｍにて測定した。サンプルの蛍光値を、細胞培養培地のバックグラウンドについて補正した。処理細胞の蛍光値を、未処理対照細胞の値で割ることによって、結果（生存率として示す）を算出した。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアで分析した。
【００８７】
ＬｘベースのＡＤＣの生体内分布
雌ヌードマウス（Ｈｓｄ胸腺欠損ｎｕ／ｎｕ、２５〜３２ｇ；Ｈａｒｌａｎ  ＣＰＢ）非腫瘍担持マウスまたはＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を両脇腹に有するマウスのいずれかにおいて、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブ、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ、およびＡＦ−トラスツズマブ−８９Ｚｒの結合体の生体内分布を比較した。全ての動物実験は、Ｄｕｔｃｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの実験動物管理の原則およびオランダ国内法（「Ｗｅｔ  ｏｐ  ｄｅ  ｐｒｏｅｆｄｉｅｒｅｎ」、Ｓｔｂ  １９８５，３３６）に従って実行した。マウスに、２．０ＭＢｑの１００μＬの総容量（１００μｇ  ｍＡｂ）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。感染後（ｐ．ｉ．）１、４、２４、４８、７２、および９６時間目に、尾の裂傷によって採血した。注射の７２または９６時間後に、マウスを麻酔して、採血して、安楽死させて解剖した。血液および臓器を秤量して、さらに処理した。各サンプル中の放射活性量を、ガンマカウンターで測定した。放射活性の取込みを、組織１グラムあたりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として算出した。
【００８８】
ＬｘベースのＡＤＣによるインビボＭＴＤおよび治療研究
治療研究を始める前に、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブおよびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブについて、ＭＴＤを判定した。この目的のために、５頭のヌードマウスの５群に、１５、３０、または６０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ、または対照としての標準的な生理食塩水を、腹腔内（ｉ．ｐ．）ボーラス注射によって与えた。体重を週に３回測定して、体重減少が対照マウスと比較して＞１０％となった場合に、ＭＴＤに達したとした。ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ、およびＴ−ＤＭ１の治療有効性を、生体内分布研究について記載したのと同じヌードマウスモデルにおいて研究した。この目的のために、両脇腹にＮＣＩ−Ｎ８７またはＪＩＭＴ−１の異種移植片が確立された８または９頭のマウスの７群を用いた。研究開始時の平均腫瘍サイズは、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍またはＪＩＭＴ−１腫瘍による研究について、それぞれ１４０±３０ｍｍ３および１４０±３０ｍｍ３であり、異なる処置群についても同様であった。全マウスが、ｉ．ｐ．ボーラス注射を受けた。ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍による研究では、群１が対照群であり、１００μＬの生理食塩水を受けた。群２は、１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブを受け、群３は、１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）を受け、群４は、１５ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２を受け、群５は、１５ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブを受け、群６および群７は、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブを受けた。トラスツズマブエムタンシンを、臨床有効性が証明された参照ＡＤＣとして、本研究に含めた。ＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２を、非結合対照として含め、そしてＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブを、ベンチマーク結合体として加えた。ＪＩＭＴ−１腫瘍による研究では、群１が対照群であり、１００μＬの生理食塩水を受けた。群２は、１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブを受け、群３は、１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブエムタンシンを受け、群４および群６は、それぞれ１５および３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブを受け、群５および群７は、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブを受けた。体重および腫瘍容量を、処置終了後最長４ヶ月まで、週に３回測定した。
【００８９】
統計分析
全ての動物実験を、独立サンプルについてのＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて、統計的に分析した。両側有意水準を算出して、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【００９０】
結果
デスフェリオキサミン−Ｌｘ錯体（ＤＦＯ−Ｌｘ）の合成、その、ｍＡｂへの結合、および８９Ｚｒによる標識化
本発明で用いられる、官能性部分を標的化部分に連結する方法（Ｌｘ技術とも呼ばれる）は、（毒性）ペイロード（官能性部分）を、モノクローナル抗体等のタンパク質担体（標的化部分）に結合させる２段階法である（図１）。第一段階では、官能性部分を、リンカー、すなわちシスプラチン誘導体［Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ２］（すなわち「Ｌｘリンカー」または「Ｌｘ」）に配位してから、ペイロード−Ｌｘ錯体を標的化部分、例えば天然のｍＡｂに結合させる。
【００９１】
デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）を、第一級アミンを介して、Ｌｘリンカーに直接配位することもできたが、最初にＤＦＯをコハク酸基で修飾してから、ピペリジン配位基を加えることにした（図１）。Ｌｘリンカーへの配位は、［Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ２］をＡｇＮＯ３で活性化してから、鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ））をキレート化したピペリジン修飾ＤＦＯと反応させることによって、達成した。粗生成物の精製を、分取ＨＰＬＣによって実行して、ＤＦＯ−Ｌｘ錯体を＞９５％の純度（λ４３０ｎｍ）で得た。錯体を、２０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する水中５ｍＭ溶液として貯蔵した。４℃にて少なくとも１年間貯蔵した際にＨＰＬＣによって観察したところ、分解はなかった。
【００９２】
ｍＡｂへのＬｘ錯体（すなわち、官能性部分−リンカー錯体）の結合を、直接的な方法で実行した。ＤＦＯ−Ｌｘ錯体を、トラスツズマブと３７℃にて２４時間インキュベートした（図１）。精製後、結合が、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって明確に観察された。凝集は観察されなかった（図２ａ）。ＤＦＯ−Ｌｘ：ｍＡｂ比（これ以降、官能性部分対標的化部分の比、または薬物−抗体−比（ＤＡＲ）と呼ぶ）は、質量分析によって容易に判定され、２．６であった（図２ｂ）。
【００９３】
トラスツズマブ、オビヌツズマブ、およびオファツムマブを、ＤＦＯ−Ｌｘ錯体と、同一の結合条件下で結合させることによって、結合法の汎用性を試験した。２０ｍＭトリシンバッファ（ｐＨ８．５）中での結合前に、ｍＡｂ溶液を２１ｍｇ／ｍＬにバッファ交換して結合体（９９％単量体）を得、平均ＤＡＲは、ＬＣ−ＭＳで判定して、２．９〜３．２であった（図Ｓ１）。一貫した分布プロファイルが観察された。非結合体抗体のパーセンテージは非常に低かった（１〜５％）一方、ＤＡＲが２〜４および１〜５の範囲である結合体は、分子のそれぞれ７６〜７８％、９４〜９６％を表した。
【００９４】
生体内分布研究では、ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブを、リジン結合類似体（ＤＦＯ−トラスツズマブ）に対してベンチマークした。スクシニル化されたＤＦＯの活性化エステルを、ｍＡｂ中のリジン残基に結合させて、平均ＤＡＲが２．９である結合体を得た［Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ＲＥＦ］。興味深いことに、ＤＦＯ−トラスツズマブと比較して、ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブについてより狭い分布プロファイルが見出され、このことから、ＤＦＯ−Ｌｘへの連結には、より少数のアミノ酸部位が関与していることが示唆された（図２ｃ）。
【００９５】
ＤＦＯベースの結合体の、８９Ｚｒによる放射性標識化を、Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２６）［「２００３，Ｖｅｒｅｌ」］によって記載される手順に従って実行した。これは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）へのトランスキレート化によるＦｅ（ＩＩＩ）の除去、および８９Ｚｒによる標識化を意味する。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブの放射化学的純度は、＞９９％であり、免疫反応性の画分は、双方の結合体について類似していた。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＨＰＬＣ分析は、単量体産物を示した。このことは、ｍＡｂの構造的完全性が、結合および放射性標識化の際に保存されたままであったことを示している。
【００９６】
ＡＦ−Ｌｘ錯体の合成、およびその、ｍＡｂへの結合
治療的ＡＤＣアプローチにおけるＬｘリンカーの性能を評価するために、非常に強力なオーリスタチンＦ（ＡＦ）を、細胞毒性ペイロードとして選択した。カルボキシル基を、その活性を妨げることなく非開裂性スペーサで修飾することができることが示されている（２９，３０）［「２００６，Ｄｏｒｏｎｉｎａ」および「２０１２，Ａｘｕｐ」］。Ｌｘリンカーへの安定した連結を可能にするために、ＡＦをピペリジン配位基で修飾した（図３ａ）。薬物とリンカーとの間にエチレングリコールスペーサを加えて、薬物の水溶性を向上させた。これは、白金の正電荷によってさらに向上した。
【００９７】
ピペリジン修飾したＡＦの、Ｌｘリンカーによる配位、およびそれに続く、形成されたＡＦ−Ｌｘ錯体の、ｍＡｂへの結合は、ＤＦＯシステムについて記載したものと類似した。ＡＦ−Ｌｘの、トラスツズマブへの結合により、ＡＤＣが得られ、これは、＞９９％単量体であり、ＤＡＲが２．５〜２．７の範囲にあった。
【００９８】
Ｌｘリンカーが、ＡＦベースのＡＤＣの治療有効性を修飾するかを評価するために（図３ａ）、Ｌｘリンカーの代わりにマレイミド結合基を有する薬物−リンカーベンチマークを設計した（図３ｂ）。
【００９９】
マレイミド化学は、オーリスタチンベースのペイロードをｍＡｂに結合させるための従来の結合方法であり、ＭＭＡＥをブレンツキシマブに結合させて、ＦＤＡ承認のＡＤＣ  Ａｄｃｅｔｒｉｓを得る際に実行されたものと同様である。マレイミド部分は、ｍＡｂのヒンジ領域におけるシステイン架橋の還元を介して得られた遊離システインチオールと反応する。ＤＡＲがＬｘベースのＡＤＣに匹敵する結合体を調製するために、ｍＡｂを、材料および方法の節に記載したようにして部分的に還元した。結合方法により、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブＡＤＣが得られた。これは、＞９９％単量体であり、平均ＤＡＲが２．０〜２．３に及んだ。
【０１００】
ＬｘベースのＡＤＣの分子特性
抗体中のＬｘ結合ペイロードの位置を評価するために、８９Ｚｒ放射性標識化結合体をＤＴＴで還元して、重鎖（ＨＣ）を軽鎖（ＬＣ）から分離した。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてリン光体撮像装置による分析は、ＨＣへの優先結合を示した（ＨＣへの放射活性結合は８９％、ＬＣへは１１％）が、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブについては、６１：３９のＨＣ／ＬＣ比が見出された（図４ａ）。Ｆｅ標識化抗体結合体のＳＥＣ−ＭＳ分析は、８９Ｚｒ標識化対応物について見出されるのと同一のＨＣ／ＬＣ分布を与えた（図Ｓ２ａ〜ｂ）。これに次いで、還元ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブのＳＥＣ−ＭＳ分析もまた、Ｌｘリンカーの、ＨＣへの優先結合を確認した。
【０１０１】
ｍＡｂ中のＬｘ−ペイロード（すなわち官能性部分）の連結位置のさらなる洞察を得るために、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブをペプシンまたはパパインで消化して、Ｆｃ領域をＦ（ａｂ）２またはＦａｂからそれぞれ分離した（図４ｂまたは図Ｓ３）。ペプシン消化したＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブのＳＥＣ−ＭＳ分析は、Ｆ（ａｂ）２部分の平均ＤＡＲが０．３８であることを明らかにした。これは、総ペイロード（ＤＡＲ２．７）の１５％である。言い換えれば。ペイロードのおよそ８５％が、ｍＡｂのＦｃ部分にある。この部位指定結合を、パパイン消化したＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブのＳＥＣ−ＭＳ分析によって確認した。さらに、類似したペイロード位置の分布を、ペイロード−ＬｘおよびｍＡｂの様々な組合せについて見出した。
【０１０２】
ＬｘベースのＡＤＣの品質試験および安定性
ＬｘベースのＡＤＣのインビトロ血清安定性を、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブにより、５０％ヒト血清中で３７℃にて測定した。なぜなら、そのような放射性免疫結合体を、インビトロおよびインビボでのＬｘ性能の試験用のモデルとして用いることにより、正確かつ容易な定量化が可能になるからである（図Ｓ４）。ラジオ−ＴＬＣ、ラジオ−ＨＰＬＣ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のリン光体撮像装置による分析は、最大２００時間のインキュベーションの直後に、８９Ｚｒの放出を示さなかった。これらの条件下で、Ｌｉｎｄｍｏ結合アッセイによって判定した免疫反応性の画分は、約３００時間後に３〜４％減少した。これらの品質試験の結果は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブと８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブについて、非常に類似していた。後者は、共有結合によって得られる結合体を表しており、多くの前臨床８９Ｚｒ免疫ＰＥＴ研究および臨床８９Ｚｒ免疫ＰＥＴ研究において評価されてきた（図Ｓ４ａ−ｂ）。
【０１０３】
ＬｘベースのＡＤＣのインビボ安定性および腫瘍標的化能を評価するために、皮下ＨＥＲ２発現ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を両脇腹に有するヌードマウスにおいて、生体内分布研究を実行した（図５ｂ）。結合過負荷によって導入される薬物動態学的影響を回避するために、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブを、それぞれ０．８および０．６の比較的低いＤＦＯ：ｍＡｂ比で調製した。全体として、臓器中の８９Ｚｒレベルは、双方の結合体について、肝臓（８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブについて、それぞれ３．８±１．７および７．１±２．４）および血液（５．４±０．８および４．０±０．３）を除いて、類似していた。
【０１０４】
腫瘍中の８９Ｚｒレベルは、双方の結合体について類似していた一方、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブでは、より高い腫瘍対血液比が得られ、このことは、白金（ＩＩ）−リンカーの組込みが、安定した結合および効率的な腫瘍標的化を可能にすることを実証している。
【０１０５】
インビトロ細胞生存率アッセイ
官能性部分としてオーリスタチン、標的化部分としてトラスツズマブ、および白金錯体リンカーＬｘを含む細胞標的化結合体（以下、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ）の殺細胞能を判定した。
【０１０６】
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅアッセイで測定し、そしてそのマレイミド結合類似体、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ、およびトラスツズマブエムタンシンと比較した。さらに、非腫瘍結合性ｍＡｂ  ＩｇＧ−Ｂ１２、ＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２を含むＬｘベースのＡＤＣを実験に含めて、陰性対照として用いた。
【０１０７】
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ、およびトラスツズマブエムタンシンは、ＨＥＲ２陽性細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫＯＶ−３、ＳＫ−ＢＲ３、およびＢＴ−４７４において、類似したナノモル以下の効力を示し、ＩＣ５０は１０〜２００ｐＭであった（図６ａ、表Ｓ１）。一方、非結合ＡＤＣ、ＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２は、測定範囲においてＩＣ５０を明らかにしなかった。このことは、細胞が抗原依存的に死滅していることを示している。これは、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＡＤＣの低い効力によって支持される（図６ｂ）。Ｔ−ＤＭ１のより低いＩＣ５０は、ＤＭ１が実験中に放出されることを示唆している。興味深いことに、ＡＦベースのＡＤＣは双方とも、Ｔ−ＤＭ１耐性ＪＩＭＴ−１細胞株においてナノモル以下の効力を示したが、Ｔ−ＤＭ−１のＩＣ５０は、予想されるように、１桁高かった。一方、遊離ＤＭ１の寄与は除外され得ない。
【０１０８】
薬物リンカーＡＦ−ＬｘおよびＡＦ−Ｍａｌが自由に利用可能になった場合に起こり得ることを予測するために、これらの化合物の毒性もまた、試験した全細胞株において判定した（図６ｄ）。実験の前に、ＡＦ−ＬｘおよびＡＦ−Ｍａｌをそれぞれチオ尿素およびｎ−アセチル−システインとインキュベートすることによって、当該化合物をクエンチした。試験した全細胞株において、薬物−Ｌｘの組合せの効力は、その対応するＡＤＣと比較して、常に１０３〜１０４倍低かったが、マレイミドベースのリンカーおよび対応するＡＤＣについては、この差はわずか１０〜１００倍である。さらに、薬物−リンカーの２つの組合せを比較することによって、ＡＦ−ＬｘのＩＣ５０は常に、ＡＦ−Ｍａｌよりも１０２〜１０３倍高いように思われる。
【０１０９】
ＬｘベースのＡＤＣの生体内分布
ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウスに、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ、またはトラスツズマブ−８９Ｚｒを注射することによって、ｍＡｂ薬物動態、腫瘍標的化、および生体内分布に及ぼすＬｘ結合ＡＦの効果を調べた（図７）。
【０１１０】
血中動態は、有意差を示さなかった：トラスツズマブ−８９Ｚｒ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ、およびＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒについてそれぞれ、ｐ．ｉ．１時間にて、血中レベルは２８．２±２．２、２９．１±１．６、および２９．０±６．８であり、ｐ．ｉ．９６時間にて、３．２±１．２、５．１±２．５、および５．６±２．１にゆっくりと低下した（図７ａ）。Ｌｘ結合ＡＤＣの腫瘍取込み（２６．１±４．９）は、マレイミド結合ＡＤＣの取込み（３１．０±６．０）および非結合トラスツズマブの取込み（２９．２±６．８）と類似していた。ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒの優れた腫瘍選択性は、図７ｃにおいて、ＰＥＴ−ＣＴによって視覚化される。正常な組織では、肝臓以外、８９Ｚｒの取込みに有意差は観察されなかった。肝臓では、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ−８９Ｚｒおよびトラスツズマブ−８９Ｚｒ（それぞれ７．０±１．４および５．７±０．８）よりもＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ−８９Ｚｒ（１１．６±２．４）の方が高かった。
【０１１１】
ＬｘベースのＡＤＣによるインビボＭＴＤおよび治療研究
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ（ＤＡＲ２．３）およびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ（ＤＡＲ２．６）によるインビボ安全性研究を実行した。非腫瘍担持マウスに、１５、３０、または６０ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス注射をした。３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブで処置したマウスは、９６％の体重減少を示したが、６０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブで処置したマウスでは、体重減少は１０％超増大する傾向があった。６０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブで処置したマウスの体重減少は、９６％であった。
【０１１２】
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ（ＤＡＲ２．６）のインビボ有効性を、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を有するマウスにおいて評価した（図８ａ）。ＰＢＳ、トラスツズマブ、およびＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２（ＤＡＲ２．４）の注射を対照として用いた一方、トラスツズマブエムタンシンおよびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ（ＤＡＲ２．０）をベンチマークとして含めた。全てのＡＤＣを、１５ｍｇ／ｋｇの用量にて単回ボーラス注射として投与した。
【０１１３】
最初に、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍は、トラスツズマブＡＤＣの注射後に退縮したが、非結合対照ＡＤＣトラスツズマブは、増殖の遅延しか引き起こさなかった。トラスツズマブエムタンシンで処置した腫瘍では、２０日目から再増殖が始まった一方、双方のＡＦベースのＡＤＣ群の腫瘍は退縮し続けた。ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブとＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブで処置した群間の腫瘍増殖差が、６０日後に明らかになった。ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブで処置したマウスの腫瘍は、この時点で再増殖を開始したが、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブで処置したマウスの腫瘍は、１２５日目の実験終了まで、平均容量が一定のままであった。最後に、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブで処置した９頭のマウスのうち８頭が、当該研究を生存したが、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブで処置した９頭のマウスは、２頭が生存した（図Ｓ５ａ）。腫瘍サイズ（＞１０００ｍｍ３）の結果として、全てのマウスを試験から離脱させた。治癒を、追跡期間中に退縮した個々の腫瘍の増殖がないと定義して、１２５日目にＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ処置群において、１６個の腫瘍のうち１２個（９頭のマウスのうち６頭）について観察した。ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ処置群における治癒数は、４個の腫瘍のうち２個であった。
【０１１４】
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブのインビボ治療有効性を、ＪＩＭＴ−１異種移植マウスでさらに評価した。ＪＩＭＴ−１細胞株は、ＨＥＲ２発現について陽性であるが、ＪＩＭＴ−１腫瘍は、トラスツズマブ耐性およびトラスツズマブエムタンシン耐性であることが示されている（２７、３１〜３３）［「２００４，Ｔａｎｎｅｒ」，「２０１０，Ｋｏｎｉｎｋｉ」，「２０１５，Ｌａｇｏｎｚｏ」、および「Ｂａｒｏｋ，２０１５］。本研究の設定は、ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片による有効性研究と類似しており、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマンおよびＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマンのＤＡＲは、それぞれ２．６および２．３であった。さらに、この研究では、３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブの用量にて単回ボーラス注射で処置した２つの群を含めた。トラスツズマブ処置およびトラスツズマブエムタンシン処置は双方とも、引き起こした増殖遅延が最小であった（図８ｂ）。一方、ＡＦベースの双方の結合体で処置したマウスの腫瘍は、注射後に退縮した。注射後２０日目頃には、双方のＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ処置群において、一部の腫瘍が再増殖し始めたが、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ群における全腫瘍は、完全に退縮し、１２５日目の実験終了まで、再増殖は観察されなかった。最後に、１５ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブで処置した９頭のマウスのうち７頭が、当該研究を生存したが、３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブで処置した９頭のマウスは、９頭が生存した（図Ｓ５ｂ）。マレイミドベンチマーク群の生存率は、１５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブで処置した群について、それぞれ９頭中５頭および８頭中４頭であった。
【０１１５】
補足情報
表Ｓ１．ＡＤＣであるＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブ、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、およびＡＦ−Ｌｘ−ＩｇＧ−Ｂ１２、ならびに薬物−リンカーであるＡＦ−ＬｘおよびＡＦ−Ｍａｌで処置した際の、様々な細胞株のインビトロ細胞生存率。
【表１】
2019517565.tif 000002
【０１１６】
補足情報  化学
ＤＦＯ−およびＡＦ−Ｌｘ錯体の合成、ならびに対応するベンチマーク
特に明記しない限り、全ての試薬は購入時のまま用いた。１Ｈおよび１３Ｃの核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ２５０  ＭＨｚ、Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＳＬ  ４００  ＭＨｚ、Ｂｒｕｋｅｒ  ５００  ＭＨｚ分析計で記録し、スペクトルを２５℃の温度にて記録した。化学シフト（δ）をｐｐｍで与えて、残留溶媒共鳴を内部参照とした（１Ｈ：δ＝７．２９ｐｐｍ、１３Ｃ：δ＝７７．０ｐｐｍ）。フラッシュカラムクロマトグラフィをＡｌｄｒｉｃｈシリカゲル（６０Å、２３０〜４００メッシュ）で実行した。アジレント質量分析計でＥＳＩ−ＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化−飛行時間）を用いて、高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ、ＥＳＩ）を記録した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）をＭｅｒｃｋシリカプレート（６０Ｆ−２５４）で実行して、化合物を、短波長ＵＶ光およびＫＭｎＯ４染色によって可視化した。特に明記しない限り、Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ５μカラム（２２×２５０ｍｍ）、ならびに１０  ｍＬ／分の流量での水＋０．１％ＴＦＡ（溶離液Ａ）およびＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（溶離液Ｂ）の直線勾配を用いて、分取ＨＰＬＣを実行した。Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ５μカラム（４．６×２５０ｍｍ）を備えたＪａｓｃｏ  ＨＰＬＣシステム、および１ｍＬ／分の流量でのＭｅＣＮ／水、０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いて、分析高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析を実行した。
【０１１７】
白金錯体ＤＦＯ−Ｌｘの合成
【化１】
2019517565.tif 000003
Ｎ−スクシニルデスフェリオキサミン（１）
【化２】
2019517565.tif 000004
Ｎ−スクシニルデスフェリオキサミン（Ｎ−ｓｕｃ−ＤＦＯ）を、Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｖｅｒｅｌ，Ｉ．，Ｖｉｓｓｅｒ，Ｇ．Ｗ．Ｍ．，Ｂｏｅｌｌａａｒｄ，Ｒ．，Ｓｔｉｇｔｅｒ−ｖａｎ  Ｗａｌｓｕｍ，Ｍ．，Ｓｎｏｗ，Ｇ．Ｂ．，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ，Ｇ．Ａ．Ｍ．Ｓ．（２００３）８９Ｚｒ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＥＴ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ８９Ｚｒ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４，１２７１−１２８１．）によって記載される手順に従って調製した。
Ｆｅ−Ｎ−スクシニルデスフェリオキサミン（３）
【化３】
2019517565.tif 000005
【０１１８】
ＦｅＣｌ３のストック溶液（０．５Ｍ  ＨＣｌ中４００ｍｇ／ｍＬの１６７μＬ）を、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（５．５ｍＬ）および０．９％ＮａＣｌ（４．８ｍＬ）中の（２）（２５０ｍｇ、０．３７８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に滴加した。混合液を室温（ＲＴ）にて１時間撹拌した後、２．８５％ＴＦＡ水溶液（６ｍＬ、ＤＦＯに対して４当量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））を加えて、容量を水でおよそ３０ｍＬに調整した。溶液を、６個のＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８  Ｐｌｕｓカートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，３６０  ｍｇ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  ｐｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，５５−１０５μｍ，Ｗａｔｅｒｓ）、２個のカートリッジ（メタノール（１０ｍｌ／カートリッジ）に続いて水（６０ｍｌ／カートリッジ）で活性化した）上にシリーズ方式で（ｉｎ  ｓｅｒｉｅｓ）ロードした。次に、セットアップ全体を、水（１００ｍｌ／カートリッジ）で洗浄し、その後カラムを空気でパージしてから、アセトニトリル（５ｍｌ／カートリッジ）で生成物を溶出した。生成物を等容量の水で希釈し、そして凍結乾燥して、褐色の固体（２６３ｍｇ、９７％）を得た。
ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が純粋であることを示した。
Ｆｅ−Ｎ−スクシニル−（アミノメチル）ピペリジンデスフェリオキサミン（４）
【化４】
2019517565.tif 000006
【０１１９】
（３）（１５０ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２．５ｍｌ）中に溶解して、ＨＯＢｔ（４２．６ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６０．４ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０３６ｍｌ、０．３１５ｍｍｏｌ）、およびｔｅｒｔ−ブチル４−（アミノメチル）ピペリジン−１−カルボキシラート（４５ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応物を２０時間撹拌してから濃縮した。粗生成物を、水／ＭｅＯＨ混合液（９／１、１０ｍＬ）中に取り込んで、１０個のＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８  ｐｌｕｓカラム（メタノール（１０ｍｌ／カートリッジ）に続いて水（６０ｍｌ／カートリッジ）で活性化した）上に（パラレル方式で（ｉｎ  ｐａｒａｌｌｅｌ））ロードした。次に、セットアップ全体を、水（１００ｍｌ／カートリッジ）で洗浄し、その後カラムを空気でパージしてから、アセトニトリル（５ｍｌ／カートリッジ）で生成物を溶出した。生成物の画分を等容量の水で希釈し、そして凍結乾燥して、１９３ｍｇの生成物を得た。ＨＰＬＣ分析は、ＨＯＢｔの存在を明らかにした。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４０Ｈ６９ＦｅＮ８Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋計算値９１０．４４５７、実測値９１０．４４６４。
【０１２０】
凍結乾燥した生成物を、４ｍｌのＤＣＭ／ＴＦＡ（１：１）中に溶解して、ＲＴにて７５分間撹拌した。続いて、反応混合液を濃縮し、その後固体を１０ｍｌの水中に溶解し、そして凍結乾燥した。生成物をメタノール中に溶解して、１つのＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＳＣＸ−２  ２Ｇカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ）（メタノールで活性化した）上にチャージした。カラムを、メタノール中０．２５Ｍアンモニアで３回洗浄し、メタノール中１Ｍアンモニア１５ｍｌおよびメタノール中７Ｍアンモニア４０ｍｌで溶出し、その後溶液を濃縮して、褐色の固体（１４２ｍｇ、８４％）を得た。
ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が純粋であることを示した。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ３５Ｈ６１ＦｅＮ８Ｏ１０［Ｍ＋Ｈ］＋計算値８１０．３９３３、実測値８１０．４６０２。
【０１２１】
白金錯体［Ｐｔ（ｅｎ）（Ｆｅ−Ｎ−スクシニル−（アミノメチル）ピペリジンデスフェリオキサミン）Ｃｌ］（ＴＦＡ）（５）の合成
【化５】
2019517565.tif 000007
ＡｇＮＯ３（２７．０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中［Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ２］（５０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）の懸濁液（１ｍＬ）に加えて、暗所においてＲＴにて１６時間撹拌した。混合液をＣｅｌｉｔｅ上で濾過して、フィルタを１ｍｌのＤＭＦでリンスした。続いて、０．７８ｍｌの溶液（０．０６２ｍｍｏｌ）を（４）（５０ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）に加えて、混合液を暗所においてＲＴにて１６時間撹拌してから、溶媒を減圧下で除去した。分取ＨＰＬＣによる精製（４０分の１０〜２５％ＭｅＣＮ）、それに続く生成物の画分の凍結乾燥により、生成物（２５ｍｇ、３７％）を褐色の固体として得た。ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が純粋であることを示した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ３７Ｈ６９ＣｌＦｅＮ１０Ｏ１０Ｐｔ［Ｍ＋Ｈ］＋計算値１１００．３９５１、実測値１１００．３６９４。
【０１２２】
白金錯体オーリスタチンＦ−Ｌｘ（ＡＦ−Ｌｘ）の合成
【化６】
2019517565.tif 000008
１）ＤＭＦ中（６），ＨＡＴＵ，ＤＩＰＥＡ
ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アミノ）メチル）ピペリジン−１−カルボキシラート（６）
【化７】
2019517565.tif 000009
４−ニトロフェニルカルボノクロリダート（２．５７３ｇ、１２．７２２ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブチル４−（アミノメチル）ピペリジン−１−カルボンキシラート（２．７３７ｇ、１２．７７２ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．１ｍｌ、１２．７７２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（６６ｍｌ）に、アルゴン下で室温にて加えた。反応物を加熱還流して６時間撹拌した。続いて、反応物を濃縮して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、水、およびブラインで洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、濾過して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ（ｃＨｅｘ中１０〜５０％ＥｔＯＡｃ）による精製によって、生成物（６）（２．１２ｇ、４７％）をクリーム色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．３７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１８（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７８−１．６６（ｍ，３Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．１７（ｑｄ，Ｊ＝１２．５，３．７Ｈｚ，２Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５５．８，１５４．７，１５３．３，１４４．６，１２５．１，１２１．９，７９．５，４６．７，４３．４，３６．５，２９．５，２８．４．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８Ｈ２５Ｎ３Ｏ６［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値４０２．１６３６、実測値４０２．１６２５。
ｔｅｒｔ−ブチル４−（１２−アミノ−３−オキソ−７，１０−ジオキサ−２，４−ジアザドデシル）ピペリジン−１−カルボキシラート（７）
【化８】
2019517565.tif 000010
【０１２３】
ＤＣＭ中のトリエチルアミン（０．１１ｍｌ、０．７９０ｍｍｏｌ）および２，２’−（エタン−１，２−ジイルビス（オキシ））ジエタノールアミン（０．５８ｍｌ、３．９５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液（１０ｍｌ）に、ＲＴにて、（５）（３００ｍｇ、０、７９０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ中の溶液（５ｍＬ）として加えた。反応物をＲＴにて２時間撹拌した。続いて、反応物を２０ｍＬのＤＣＭに希釈して、１Ｍ  ＮａＯＨ（３×２ｍＬ）および水（２×２ｍＬ）で洗浄した。合わせた水層をＤＣＭ（１０ｍＬ）で抽出し、その後、合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、濾過して、シリカゲル上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ中０〜１０％ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（９：１）（高速用）、次いでＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（９：１）＋５％ＭｅＯＨ）によって精製して、生成物（７）（２５６ｍｇ、８３％）を淡黄色の油として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．８０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｂｒｓ，２Ｈ），３．６２−３．５７（ｍ，４Ｈ），３．５５−３．５２（ｍ，４Ｈ），３．３５（ｔｄ，Ｊ＝５．４，４．７Ｈｚ，２Ｈ），３．０２（ｂｒｓ，２Ｈ），２．８９（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｂｒｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｓ，２Ｈ），１．６６−１．５３（ｍ，３Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．０６（ｑｄ，Ｊ＝１２．０，４．４Ｈｚ，２Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５８．９，１５４．８，７９．２，７２．１，７０．６，６９．９，６９．８，４５．５，４１．３，４０．０，３６．９，２９．７，２８．４．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８Ｈ３７Ｎ４Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋計算値３８９．２７５９、実測値３８９．２７６６。
ＡＦ−（４−（１２−アミノ−３−オキソ−７，１０−ジオキサ−２，４−ジアザドデシル）ピペリジン）（８）
【化９】
2019517565.tif 000011
【０１２４】
ＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解したオーリスタチンＦ（ＡＦ、２９．８ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）（ＡＦ）を、（７）（４６．６ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）に加えた。ＨＡＴＵ（３０．４ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２１ｍｌ、０．１２０ｍｍｏｌ）を連続して加えて、混合液をＲＴにて６時間撹拌し、その後反応物を濃縮した。生成物を水中３０％ＭｅＣＮ（４ｍｌ）中に取り込んで、分取ＨＰＬＣ（４０分のＨ２Ｏ中３０〜５０％ＭｅＣＮ）によって精製して、生成物を無色の固体として得た。
【０１２５】
ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が純粋であることを示した。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５８Ｈ１０２Ｎ９Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋計算値１１１６．７６４２、実測値１１１６．７７７４
【０１２６】
生成物をＤＣＭ（２ｍＬ）中に取り込んで、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えて、混合液をＲＴにて８０分間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。生成物をＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（２ｍｌ）中に取り込んで、ＤＣＭ（１０ｍｌ）で予備洗浄したＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＳＣＸ−２カラム上にロードした。カラムを、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で洗浄して、生成物を、ＤＣＭ中１Ｍメタノール性アンモニア（１：１）で溶出した。合わせた生成物の画分を濃縮して、ＤＣＭで数回同時蒸発させて、微量のアンモニアを除去して、生成物（３０．５ｍｇ、７５％）を無色の油として得た。
ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が純粋であることを示した。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５２Ｈ９１Ｎ９Ｏ１０［Ｍ＋２Ｈ］２＋計算値５０８．８５９６、実測値５０８．８６４２
【０１２７】
白金錯体［Ｐｔ（ｅｎ）（ＡＦ−（４−（１２−アミノ−３−オキソ−７，１０−ジオキサ−２，４−ジアザドデシル）ピペリジン））Ｃｌ］（Ｃｌ）（９）の合成
【化１０】
2019517565.tif 000012
ＡｇＮＯ３（１４．３ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中に溶解して、ＤＭＦ中の［Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ２］（５０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）の懸濁液（７．５ｍＬ）に加えて、ＲＴにて２４時間撹拌し、その後、溶液をセライト上で濾過した。続いて、この溶液の３．５２ｍｌ（０．０６０ｍｍｏｌ）を、（８）（３０．５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）に加えて、混合液を暗所においてＲＴにて１６時間撹拌し、その後２０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（２ｍｌ）を加えてから、溶媒を減圧下で除去した。生成物を分取ＨＰＬＣ（４０分の１０〜２５％Ｂ、溶離液Ａ：ＭｉｌｉＱ中２０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：９：１  ＭｅＣＮ：ＭｉｌｉＱ中２０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、生成物の画分（およそ２０ｍＬ）を、およそ４ｍＬに濃縮した。続いて、溶液を、２０ｍＭ  ＮａＣｌでおよそ２０ｍＬに希釈して、メタノール（２０ｍＬ）に続いて水（１２０ｍＬ）で予備活性化した２つのＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８  Ｐｌｕｓカラム上にシリーズ方式でロードした。生成物をロードした後、カラムを水（５０ｍＬ）で洗浄して、空気でパージして、生成物をメタノール（１０ｍＬ）で溶出した。濾液を、ロータリーエバポレータによって直接濃縮して、微量の溶媒を高真空（２時間）によって除去して、白色の半固体（２１．２ｍｇ、５４％）を得た。固体を、２０ｍＭ  ＮａＣｌ＋１０％ＤＭＡ中の５ｍＭ溶液として、−１８℃にて保存した。
【０１２８】
ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が９５％純度であることを示した。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５５Ｈ１０１ＣｌＮ１１Ｏ１０Ｐｔ［Ｍ＋Ｈ］＋計算値１３０４．７０４３、実測値１３０４．６９６８。
【０１２９】
オーリスタチン−マレイミド（ＡＦ−Ｍａｌ）の合成
【化１１】
2019517565.tif 000013
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−（２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロリル）ヘキサンアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバマート）（ＢｏｃＮＨ−ＰＥＧ１−アミド−Ｈｅｘ−Ｍａｌ）（１０）
【化１２】
2019517565.tif 000014
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノアート（６２．１ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解して、ＤＭＦ（１ｍＬ）中ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバマート（５０ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で滴加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．０５３ｍｌ、０．３０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温にて４０時間撹拌してから、シリカ上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ中１〜４％ＭｅＯＨ）による精製によって、生成物（１０）（５６ｍｇ、６３％）を無色の油として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．６６（ｓ，２Ｈ），６．０５（ｂｒｓ，１Ｈ），５．０２（ｂｒｓ，１Ｈ），３．７０−３．３６（ｍ，１２Ｈ），３．３６−３．２０（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．３１−１．２５（ｍ，２Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７２．７，１７０．８，１５５．９，１３４．０，７９．３，７０．２，７０．１，７０．１，６９．９，４０．２，３９．１，３７．６，３６．３，２８．３，２８．２，２６．３，２５．０．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２１Ｈ３５Ｎ３Ｏ７［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値４６４．２３６７、実測値４６４．２３６３
ＡＦ−ＰＥＧ１−アミド−Ｈｅｘ−Ｍａｌ（１１）
【化１３】
2019517565.tif 000015
【０１３０】
（１０）（１１．２５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．１５ｍＬ）中に溶解して、当該溶液にＴＦＡ（０．１５ｍＬ）を加えた。混合液を１０５分間撹拌してから、窒素流下で、続いて高真空下（１時間）で蒸発させた。次いで、ＡＦ（１９．０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を、粗反応混合物を含有するバイアルに加え、その後、ＨＡＴＵ（１９．３７ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０１３ｍｌ、０．０７６ｍｍｏｌ）を連続して加えた。混合液を、アルゴン下でＲＴにて２時間撹拌し、その後混合液を濃縮した。分取ＨＰＬＣ（４０分のＨ２Ｏ中３０〜４５％ＭｅＣＮ）による精製によって、生成物を無色の固体として得た。生成物を、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ溶液として、−１８℃にて保存した。
ＨＰＬＣ分析および質量分析は、生成物が９５％純度であることを示した。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５６Ｈ９３Ｎ８Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋計算値１０６９，６９０８、実測値１０６９．６８７７；［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋計算値５４６．３４００、実測値５４６．３３６８。
【０１３１】
抗体−薬物−結合体（ＡＤＣ）の調製における二官能性リンカーとしてのシスプラチン誘導体であるエチレンジアミン白金（ＩＩ）ジクロリド、Ｌｘの可能性を探求してきた。この新しいリンカー技術の概念は、次の通りである；第一段階において、適切な配位基を有するペイロード（トレーサまたは薬物；官能性部分とも呼ばれる）を、「Ｌｘ」と呼ばれる白金系リンカーに配位させて、ペイロード−Ｌｘ錯体を得る。Ｎ−配位錯体が安定した結合をもたらすことが示された。興味深いことに、形成された白金錯体は荷電されているので、ペイロード−Ｌｘ錯体の水溶性は、著しく増大する。結合手順は、以下の通りである；ペイロード−Ｌｘ錯体を、抗体溶液と、わずかに塩基性の条件下で３７℃にて２４時間混合し、続いてチオ尿素による後処理工程を行って、弱い結合錯体を除去する。形成された結合体は、ＰＢＳ中で安定しており、表面プラズモン共鳴分析は、結合後の抗体の結合親和性の喪失を示さないことが実証された。
【０１３２】
本出願において、ＡＤＣ用のリンカーとしてのＬｘの可能性を調べている。２つのＬｘペイロード（すなわち官能性部分）、すなわちデスフェラール−Ｌｘ（ＤＦＯ−Ｌｘ）およびオーリスタチンＦ−Ｌｘ（ＡＦ−Ｌｘ）を設計して、インビボ挙動および抗腫瘍効果をそれぞれ研究した。結局のところ、ＡＤＣの殺腫瘍能は、その商業的成功を決定するので、ほとんどの研究において、焦点は抗腫瘍効果に当てられる。しかしながら、ＡＤＣの有効性は、ＡＤＣのインビボ安定性および腫瘍標的化能に強く依存するので、ＡＤＣのインビボ挙動の情報は重要である。さらに、インビボ挙動を研究することによって、腫瘍中に蓄積しないＡＤＣの運命を判定し、これによって潜在的な毒性のあらゆる危険性に関する情報を提供する。インビボ特性化の最も簡単で最も信頼できる方法は、例えばＤＦＯキレート剤中へのＰＥＴ同位体８９Ｚｒの導入のように、ＡＤＣを放射標識化するものである。
【０１３３】
ＤＦＯ−Ｌｘ錯体およびＡＦ−Ｌｘ錯体の双方を、トラスツズマブと、３７℃にて２４時間結合させると、薬物−抗体比（ＤＡＲ）が２．５〜２．７である９９％単量体のＡＤＣが得られた。トラスツズマブを、オビヌツズマブ、オフツムマブ、またはＩｇＧ−Ｂ１２と置き換えることによって、結合法の汎用性を実証したところ、同一の特性を有するＡＤＣが得られた。現在の結合手順において、ＤＡＲを考慮して、結合効率が約１３％である場合、２０倍過剰のペイロード−Ｌｘ錯体が用いられる。非結合抗体のパーセンテージは、平均ＤＡＲが約２．５である結合体について、一貫して５％未満である。さらに、平均ＤＡＲが２．５の、２〜４および１〜５の範囲のＤＡＲ集団は、分子のそれぞれ７６〜７８％および９４〜９６％を表した。
【０１３４】
興味深いことに、ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブのＤＡＲ分布プロファイルは、平均ＤＡＲが匹敵するリジン結合類似体ＤＦＯ−トラスツズマブと比較して、狭かった。このことは、Ｌｘ結合技術に関与するアミノ酸部位の数が少ないことを意味している。
【０１３５】
ＤＴＴによる鎖間システイン架橋の還元による抗体の重鎖および軽鎖の分離によって、ｍＡｂ中のＬｘペイロードのカップリング位置を判定した。ＳＥＣ−ＭＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ペイロードのおよそ９０％が重鎖に結合していることが明らかになった。Ｆｃ領域をＦ（ａｂ）２またはＦａｂから分離するそれぞれペプシンまたはパパインでさらに調査したところ、およそ８５％がＦｃ領域に結合していることが明らかとなった。ｍＡｂのＦｃ部分に主に結合するＬｘのこの興味深い性質は、ｍＡｂの結合領域における結合の変化を減少させることによって、ｍＡｂの免疫反応性、したがって腫瘍標的化能に影響するので、有利である。
【０１３６】
ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブのインビトロ殺細胞を、ＨＥＲ２発現細胞株のパネルに試験した。２つのベンチマーク、すなわちＦＤＡ承認のＡＤＣ  Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）（Ｔ−ＤＭ１）およびマレイミド類似体のＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブを含めた。後者は、Ｓｅａｔｔｌｅ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって用いられる結合戦略を模倣している。３つの結合体は全て、ＨＥＲ２過剰発現細胞株ＳＫＯＶ−３、ＢＴ−４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、およびＳＫ−ＢＲ−３について、ＩＣ５０を２０〜２００ｐＭの範囲で示した。興味深いことに、ＡＦベースの結合体は双方とも、トラスツズマブおよびＴ−ＤＭ１耐性細胞株において、ＩＣ５０をピコモルの範囲で示した。ＡＦ−Ｌｘは、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブと比較して、毒性が１０３〜１０４倍低かったが、ＡＦ−Ｍａｌは、ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブよりも毒性が１０倍しか低くなかった。さらに、ＡＦ−Ｌｘは、ＡＦ−Ｍａｌよりも毒性が１０２〜１０３倍低い。
【０１３７】
インビボ安定性は、ＡＤＣリンカーの重要な要件である。血流中での抗体からの薬物の早期放出は、遊離薬物を正常な器官に曝露して、許容できない毒性をもたらす。皮下ＨＥＲ２発現ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有するヌードマウスにおける８９Ｚｒ−ＤＦＯ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブの比較生体内分布研究は、双方の結合体について、腫瘍、および肝臓を除く全ての臓器において、類似した８９Ｚｒレベルを明らかにした。この結果は、Ｌｘリンカー技術が、安定した結合および効率的な腫瘍標的化を可能にすることを示している。ペイロードまたはスペーサの疎水性および電荷、ならびに連結されたペイロードの数は、ｍＡｂの物理化学的特性、ひいては薬物動態学および腫瘍標的化に有害な影響を及ぼす虞がある。したがって、皮下ＨＥＲ２発現ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有するヌードマウスにおいて、８９Ｚｒ−ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブおよびそのマレイミド結合ベンチマーク８９Ｚｒ−ＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブにより、第２の生体内分布研究を実行した。腫瘍、および肝臓を除く器官におけるＬｘ結合体の８９Ｚｒの取込みは、８９Ｚｒ−ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブおよび非結合８９Ｚｒ−トラスツズマブに類似していた。双方の生体内分布研究は、ベンチマークと比較して、ＬｘベースのＡＤＣの方が高い肝臓取込みを示した。
【０１３８】
最後に、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブの有効性を、２つの異なる腫瘍モデル、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＴ−ＤＭ１耐性ＪＩＭＴ−１で評価した。双方の有効性研究において、Ｌｘベースの結合体は、そのマレイミドベンチマーク、およびＦＤＡ承認のＴ−ＤＭ１よりも優れている。これらの結果は驚くべきものである。というのも、ＡＦ−Ｌｘ−トラスツズマブとＡＦ−Ｍａｌ−トラスツズマブとの間で、インビトロ細胞生存率アッセイまたは生体内分布研究のいずれにおいても有意差が観察されなかったことを考えると、オーリスタチンベースの結合体のインビボ有効性の向上が、Ｌｘによって増強されることが示唆されるからである。
【０１３９】
結論として、二官能性シス白金（ＩＩ）類似体、Ｌｘの遷移金属配位化学に基づく新しいＡＤＣリンカー技術が示される。結合手順は、強力かつ直接的であり、抗体修飾を必要としない。形成されたＡＤＣは安定しており、天然のｍＡｂの物理化学的特性が維持されている。さらに、オーリスタチンＦと組み合わせると、Ｌｘは抗腫瘍有効性を高める効果がある。
【０１４０】
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３２．Ｋｏｅｎｉｎｋｉ  Ｋ，Ｂａｒｏｋ  Ｍ，Ｔａｎｎｅｒ  Ｍ，Ｓｔａｆｆ  Ｓ，Ｐｉｔｋａｅｎｅｎ  Ｊ，Ｈｅｍｍｉｌａｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｌａｐａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＪＩＭＴ−１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０；２９４（２）：２１１−１９．
３３．Ｌｏｇａｎｚｏ  Ｆ，Ｔａｎ  Ｘ，Ｓｕｎｇ  Ｍ，Ｊｉｎ  Ｇ，Ｍｙｅｒｓ  ＪＳ，Ｍｅｌａｍｕｄ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｖａｒｉｅｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｂｕｔ  Ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２０１５；１４（４）：９５２−６３．
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３６．Ｄｅｕｂｅｌ  ＤＶ．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｎｅ  ｂａｓｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｄｉｃａｔｉｏｎｉｃ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００２；１２４（２０）：５８３４−４２．
３７．Ｂｏｓｗｅｌｌ  ＣＡ，Ｔｅｓａｒ  ＤＢ，Ｍｕｋｈｙａｌａ  Ｋ，Ｔｈｅｉｌ  Ｆ−Ｐ，Ｆｉｅｌｄｅｒ  ＰＪ，Ｋｈａｗｌｉ  ＬＡ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０；２１（１２）：２１５３−６３．
３８．Ｉｇａｗａ  Ｔ，Ｔｓｕｎｏｄａ  Ｈ，Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｔ，Ｍａｅｄａ  Ａ，Ｍｉｍｏｔｏ  Ｆ，Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１０；２３（５）：３８５−９２．
３９．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ＤＣ，Ａｋｉｌｅｓｈ  Ｓ．ＦｃＲｎ：ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７；７（９）：７１５−２５．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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【図Ｓ４】
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【図Ｓ８】
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【国際調査報告】
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