(57)【要約】  本発明は、真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体による植物又は動物宿主種の感染を予防及び／又は処理する方法に関し、前記方法は、１種以上の非病原性細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ、及び前記混合物を前記宿主種に施すステップを含む。本発明はまた、非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を含む組成物も包含する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体による植物又は動物宿主種の感染を予防及び／又は処理する方法であって、
ａ）１種以上の非病原性細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を前記宿主種に施すステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体による植物又は動物宿主種の感染を予防及び／又は処理する方法であって、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備するステップ；並びに
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を前記宿主種に別々に施すステップ
を含む、前記方法。
【請求項３】
非病原性の細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びプロバイオティック細菌からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
非病原性の細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種の細菌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株が、ＱＳＴ  ７１３株である
、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非病原性の細菌が、プロバイオティック細菌の１つ以上の種である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プロバイオティック細菌が、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．Ｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  （アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂ．ロングム（Ｂ．Ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレヴェ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
宿主種に施される第１の組成物が、非病原性の細菌を含む組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
宿主種に施される第１の組成物が、１種以上の活性化剤を含む組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
非病原性の細菌を含む組成物及び１種以上の活性化剤を含む組成物が、ほぼ同時に宿主種に施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
１種以上の活性化剤が、抗炎症活性を有する物質である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１種以上の活性化剤が、ＮＯ及び／又はＴＮＦ−αの生産を阻害することができる物質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
活性化剤が、各々、ＮＯ生産の阻害に対する１．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する２．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性化剤が、各々、ＮＯ生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．２ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
活性化剤が、各々、ＮＯ生産の阻害に対する０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
１種以上の活性化剤が、スクラレオール、ナリンギン、ノートカトン、ステビオールグリコシド及びカンナビジオールからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の活性化剤が、シオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）、ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
宿主種が、植物種である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
宿主種が、動物種である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動物種が、家畜又は農業動物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物種が、農業上重要な昆虫種、特にミツバチである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１種以上の非病原性細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せが、葉への施用によって植物に施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
１種以上の非病原性細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せが、植物が成長している培地にこれらの物質を加えることによって前記植物に施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
非病原性の細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せが、これらの物質で被覆された顆粒の形態で施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
顆粒が、さらに放出制御ポリマーを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
非病原性の細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せが、植物種の種子を蒔く前に前記種子をこれらの物質で被覆することによって施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
被覆された種子が、さらに放出制御ポリマーを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を含む組成物であって、前記１種以上の活性化剤が抗炎症活性を有する物質である、組成物。
【請求項２９】
活性化剤が、各々、ＮＯ生産の阻害に対する１．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する２．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
活性化剤が、各々、ＮＯ生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．２ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
活性化剤が、各々、ＮＯ生産の阻害に対する０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
さらに、安定剤、溶剤、金属イオン封鎖剤、乳化剤及び放出制御剤からなる群から選択される１種以上の追加の作用物質を含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
１種以上の活性化剤が、スクラレオール、ナリンギン、ノートカトン、ステビオールグリコシド及びカンナビジオールからなる群から選択される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
非病原性の細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びプロバイオティック細菌からなる群から選択される、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
非病原性の細菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種の細菌である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株が、ＱＳＴ  ７１３株である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
非病原性の細菌が、プロバイオティック細菌の１つ以上の種である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
プロバイオティック細菌が、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．Ｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  （アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂ．ロングム（Ｂ．Ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレヴェ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
スクラレオール、ナリンギン、ノートカトン、ステビオールグリコシド及びカンナビジオールからなる群から選択される、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の活性化を引き起こすことができる１種以上の作用物質の混合物を含む組成物。
【請求項４０】
農業上又は園芸上重要な植物の収量を増大する方法であって、
ａ）１種以上の非病原性細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を宿主種に施すステップ
によって、収量を増大する方法。
【請求項４１】
農業上又は園芸上重要な植物の収量を増大する方法であって、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備し；
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を宿主種に別々に施す
ことによって、収量を増大する方法。
【請求項４２】
農業上重要な動物からの生産物の収量を増大する方法であって、
ａ）１種以上の非病原性細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を宿主種に施すステップ
によって、生産物の収量を増大する方法。
【請求項４３】
農業上重要な動物からの生産物の収量を増大する方法であって、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備し；
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を宿主種に別々に施す
ことによって、生産物の収量を増大する方法。
【請求項４４】
真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体により引き起こされるダメージに耐える植物又は動物宿主種の能力を増大する方法であって、
ａ）非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を植物又は動物宿主種に施すステップ
を含む、前記方法。
【請求項４５】
真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体により引き起こされるダメージに耐える植物又は動物宿主種の能力を増大する方法であって、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備し；
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を前記宿主種に別々に施すステップを含む、前記方法。
【請求項４６】
請求項３〜２７のいずれか１項に記載の技術的特徴を含む、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある範囲のいろいろな生物宿主での微生物疾患の予防及び／又は処理における、１種以上の活性化剤と組み合わせた非病原性の細菌種の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業上及び園芸上興味のある植物及びその他の宿主種を細菌及び真菌の攻撃から保護するための非病原性の土壌細菌の使用は当技術分野で周知である。かかる系で使用される非病原性の細菌種の一例は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【０００３】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む殺真菌性及び殺細菌性の製品、並びに農業上重要な植物の微生物疾患からの保護におけるかかる製品の使用について記載しているいくつかの先行技術の刊行物がある。しかしながら、これらの製品は大部分が低レベルの活性を有しており、その結果主に慣習的な化学物質の活性を増大するための補助に使用されている。さらに、有機栽培植物の保護のために（すなわち、より強力な化学物質の使用が許容されないような状況で）唯一の作用物質としてのかかる製品の使用について記載した文献もある。
【０００４】
このように、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いた有害微生物の生物的防除の用途は宿主細胞に対するその低い毒性の故に極めて有利であるが、その比較的低レベルの活性のためにこのアプローチは農業及び園芸においてより大規模な商業的規模でより広く採用されるのが妨げられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような非病原性細菌の使用に基づく系の低い宿主毒性と、微生物の攻撃に抵抗する宿主種の能力を増強する上での大きく増大した有効性とを併せもつ、商業上重要な植物及び動物種の保護のための満たされていないニーズがある。
【０００６】
本発明はこのニーズを満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、主に、真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体により引き起こされるダメージに耐える植物又は動物宿主種の能力を増大する方法に関する。その最も一般的な形態において、この方法は、
ａ）非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を植物又は動物宿主種に施すステップ
を含む。
【０００８】
場合により、上記ステップ（ａ）で述べた２つの成分（すなわち、非病原性の細菌及び活性化剤）は別々に施してもよい。その結果として、かかる場合、真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体により引き起こされるダメージに耐える植物又は動物宿主種の能力を増大する方法は、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備するステップ；並びに
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を前記宿主種に別々に施すステップ
を含む。
【０００９】
理論に縛られることは望まないが、本発明の方法及び組成物で見られる保護効果は、直接の抗菌活性、（例えば、宿主の免疫反応を高めることによる）微生物感染に対する宿主種の抵抗性の増強、又は両方の機序の組合せに起因し得ることに注意すべきである。その結果として、上述の語句「真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体により引き起こされるダメージに耐える能力」は、微生物病原体の存在下での宿主種の増強された生存、大きさ及び健康（及び、関連のある場合には、農業又は園芸産物の増大した収量）の１つ以上の観点から、これらのパラメーターの増強に関わる実際の機序に関わらず、理解されるべきである。同様に、用語「真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体により引き起こされるダメージ」は、宿主種の細胞若しくは組織内の、又は前記宿主種にごく接近した微生物病原体の存在と直接又は間接的に関連する、前記宿主種に対するあらゆる有害な影響と理解されるべきである。これらの有害な影響としては、（限定されることはないが）宿主種の成長、大きさ又は生殖能力の障害、宿主種の１つ以上の臓器に対する致命的及び致命的でない損傷、宿主種により産生される農業上重要な産物（例えば果実、野菜、豆類、乳、蜂蜜等）の低下した収量がある。
【００１０】
本発明との関連で、用語「活性化剤」は、非病原性細菌と共に混合物中に存在しても、又はそれとは別に送達されても、前記非病原性細菌細胞の処置された植物又は動物宿主種に対する有益な効果を増強することができる物質を意味するために使用されている。この増強は、場合によっては、非病原性細菌と活性化剤との相乗的な相互作用の結果であり得る。あるいは、活性化剤及び非病原性細菌は、各々が単独で使用されたとき宿主に対して何らかの意義のある有益な効果をもっていなくてもよいが、これら２種類の物質が一緒に又は連続して施されたとき宿主種において有意な抗菌性、免疫賦活性及び／又はその他の有益な効果を生じ得る。
【００１１】
本発明者は、意外なことに、本発明の方法で使用するのに適した活性化剤の多くが、共通の特徴、すなわち、一般的に植物種よりも高等動物種に関連する（腫瘍壊死因子アルファ［ＴＮＦ−α］のような）炎症性メディエイターを阻害する能力を共有するということを見出した。このように、本発明の１つの好ましい実施形態において、１種以上の活性化剤は抗炎症活性を有する物質である。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、真菌性、細菌性及び／又はウィルス性病原体による植物又は動物宿主種の感染症を予防及び／又は処理する方法に関し、前記方法は、
ａ）非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を前記宿主種に施すステップ
を含む。
【００１３】
本発明のこの局面の代わりの実施形態において、非病原性の細菌及び活性化剤は上記に既に説明したように別々に施してもよい。
【００１４】
さらなる局面において、本発明はまた、農業上又は園芸上重要な植物の収量又は農業上重要な動物からの生産物（例えば乳又は蜂蜜）の収量を増大する方法であって、
ａ）非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を前記宿主種に施すステップ
によって、生産物の収量を増大する方法にも関する。
【００１５】
本発明のこの局面の代わりの実施形態において、非病原性の細菌及び活性化剤は既に説明したように別々に施してもよい。
【００１６】
本発明のさまざまな方法のいくつかの実施において、非病原性の細菌及び活性化剤は別々に、すなわち、交互に施してもよいことが上に開示された。かかる実施において、施される第１の組成物は、非病原性の細菌を含む組成物であっても、又は１種以上の活性化剤を含む組成物であってもよい。非病原性の細菌及び活性化剤が別々に施されるタイプの特定の他の実施形態において、これらは両方ともほぼ同時に宿主種に施される。
【００１７】
別の局面において、本発明はまた、非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を含む組成物も提供し、前記１種以上の活性化剤は以下でさらに詳細に述べるように抗炎症活性を有する物質である。
【００１８】
非病原性細菌の多くの異なる種及び菌株を、本明細書に記載されている活性化剤と組み合わせて使用することができる（又は、代わりに、別々に連続して施してもよい）。これに関連して、用語「非病原性」は、選択された種が、その細菌を含有する本発明の組成物が施される宿主種に対して有毒又はその他有害な影響を全く又はほとんどもたないことを示すために使用されている。
【００１９】
本明細書に規定されている方法及び組成物の１つの好ましい実施形態において、非病原性の細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びプロバイオティック細菌からなる群から選択される。
【００２０】
１つの好ましい実施形態において、非病原性の細菌種は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。この種のいくつかの異なる株が使用され得る。しかし、１つの極めて好ましい実施形態において、使用する株はＱＳＴ  ７１３である。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、非病原性の細菌はプロバイオティック細菌の１種以上の種から選択される。この点に関して、用語「プロバイオティック細菌」は、現在の目的から、意図された宿主において消費又はその他施されたとき健康上の利益を提供すると考えられる生きている微生物を意味すると理解されることに留意されたい。多くのかかるプロバイオティック細菌が公知であり、それらの多くがビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）及びＢ．ブレヴェ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ））又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）など）の種である。１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用されるプロバイオティック細菌は、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂ．ロングム（Ｂ．Ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレヴェ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態及び利点は説明が進むにつれて明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、抗細菌及び抗真菌効果の増強に関する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する活性化剤としての植物化学物質の使用可能性の初期スクリーニングの結果をグラフで示す。
【図２】図２は、３又は４種の異なる活性化剤の組合せの、これらと枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）との組合せを含有する組成物の殺真菌及び殺細菌活性に関する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化に対する結果を示す。
【図３】図３は、活性化剤を異なる濃度で使用した以外は図２に示したものと同様な研究の結果を示す。
【図４】図４は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の異なる製剤を使用した以外は図１に示した結果を得るのに使用したものと同様な組成物を用いた殺真菌及び殺細菌活性の結果を示す。
【図５】図５は、活性化剤を異なる濃度で使用した以外は図５の結果を得るのに使用したものと同様な組成物を用いて得られた殺真菌及び殺細菌結果を示す。
【図６】図６は、２つの植物シオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）及びハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の抽出物と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の組合せの殺真菌及び殺細菌効果を示す結果を示す。
【図７】図７は、２つの植物抽出物を異なる濃度で使用した以外は図６の結果を生成したものと同様な研究の結果を示す。
【図８−１】図８は、活性化剤と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のいろいろな組合せをキュウリ実生に接種するとキュウリ植物を真菌及び細菌感染症の両方から保護することができるということを示す。
【図８−２】図８は、活性化剤と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のいろいろな組合せをキュウリ実生に接種するとキュウリ植物を真菌及び細菌感染症の両方から保護することができるということを示す。
【図９】図９は、活性化剤と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のいろいろな組合せをトマト実生に接種するとトマト植物を微生物感染症から保護することができるということを示す結果を示す。
【図１０−１】図１０は、本発明の組成物で処理した後トマトモザイクウィルスに感染したトマト植物の増大した生存を示す結果を示す。
【図１０−２】図１０は、本発明の組成物で処理した後のトマトモザイクウィルスに感染したトマト植物の増大した生存を示す結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の組成物をコショウ（ｐｅｐｐｅｒ）植物実生に接種した後のコショウ植物における微生物感染症に対する前記組成物の保護効果を示す。
【図１２】図１２は、本発明の組成物の接種後のトウモロコシにおける微生物感染症に対する前記組成物の保護効果を示す。
【図１３】図１３は、本発明の組成物による実生の接種後のコムギにおける微生物感染症に対する前記組成物の保護効果を示す結果を示す。
【図１４】図１４は、本発明の組成物をイネ実生に接種した後のイネ植物における微生物感染症に対する前記組成物の保護効果を示す。
【図１５】図１５は、本発明の組成物による処理後のヒヨコマメ植物における微生物感染症に対する保護を示す野外研究の結果を示す。
【図１６】図１６は、本発明の組成物による処理後のソブリヌス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）（ヒトにおける虫歯の発生に関する重要な細菌種）のほとんど完全な排除を示すインビトロの結果を示す。
【図１７】図１７は、本発明の組成物による処理後のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）（ヒトにおける虫歯の発生に関する重要な種）のほとんど完全な排除を示すインビトロの結果を示す。
【図１８】図１８は、カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）による感染後の成長するニンジン及びニンジン植物の葉に対する本発明の組成物の効果の野外研究において使用した異なる処理群への畑の分割を示すトライアルマップ（ｔｒｉａｌ  ｍａｐ）である。
【図１９】図１９は、カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）により引き起こされた葉の損傷を有するニンジン植物のパーセンテージを低減する上での本発明の組成物の有益な効果をグラフで描いたものである。
【図２０】図２０は、カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）により引き起こされた損傷を有するニンジンの平均数を低減する上での本発明の組成物の有益な効果をグラフで描いたものである。
【図２１】図２１は、未処理コントロールと比較したとき、本発明の組成物でハチを処理した後ハチの巣内に存在するハチ幼虫の増大した数を示すデータを示す。
【図２２】図２２は、未処理コントロールと比較したとき、本発明の組成物でハチを処理した後ハチの巣内に存在する成虫のハチの増大した数を示すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
既に説明したように、本発明者は、意外なことに、（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプロバイオティック種のような非病原性の細菌と組み合わせて）本発明の方法に使用するのに適した活性化剤の多くが、より一般的には高等動物種に関連する（腫瘍壊死因子アルファ［ＴＮＦ−α］のような）炎症性メディエイターを阻害する能力を共有することを見出した。したがって、本発明の１つの好ましい実施形態において、１種以上の活性化剤は抗炎症活性を有する物質である。
【００２５】
既に述べたように、本発明の活性化剤に関連する上述の抗炎症活性は、少なくとも部分的に、ＴＮＦ−α及び／又は一酸化窒素（ＮＯ）のような１種以上の重要な炎症性メディエイターの阻害によって媒介されることが本発明者により見出された。その結果として、本発明の１つの好ましい実施形態において、上述の方法で使用される１種以上の活性化剤はＮＯ及び／又はＴＮＦ−αの生産を阻害することができる物質である。
【００２６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、活性化剤は各々、ＮＯ生産の阻害に対する１．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する２．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する。
【００２７】
もう１つ別の好ましい実施形態において、個々の活性化剤の各々は（単独で使用しても、又は他のかかる作用物質と組み合わせて使用しても）ＮＯ生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．２ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する。
【００２８】
さらに別の好ましい実施形態において、個々の活性化剤の各々は（単独で使用しても、又は他のかかる作用物質と組み合わせて使用しても）ＮＯ生産の阻害に対する０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する。
【００２９】
アンタゴニスト及びその他の生物学的及び薬理学的に活性な分子の効能を比較する手段としてのＩＣ５０値（すなわち、メディエイター、アゴニスト又は他の生物学的に活性な分子の最大の阻害の５０％を引き起こす作用物質の濃度）の使用は当分野の熟練した技術者に周知であることに留意されたい。簡潔にいうと、ＩＣ５０値は、特定の炎症性メディエイターの阻害のようなパラメーターに対する用量反応曲線をプロットし、前記曲線から前記値を引き出すことによって得ることができる。
【００３０】
もう１つ別の好ましい実施形態において、活性化剤はスクラレオール、ナリンギン、ノートカトン、ステビオールグリコシド及びカンナビジオール並びにこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３１】
さらに好ましい実施形態において、活性化剤（上に開示された質的及び量的な抗炎症特性を有するものを含む）は、植物材料（例えば、未精製植物抽出物、例えば全植物水性抽出物、部分的に精製又は分画した抽出物、精製した抽出物及び前記抽出物中に存在する活性分子の合成アナログ）に由来する。
【００３２】
本発明のこの局面の１つの好ましい実施形態において、植物由来活性化剤はシオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）、ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される薬草抽出物である。
【００３３】
１つの好ましい実施形態において、宿主種は植物種、例えば（限定されることはないが）野菜、豆類、穀類、熱帯種（例えばバナナ）、亜熱帯種（例えば柑橘類）、その他の高木及び低木、園芸上重要な顕花植物、などである。
【００３４】
別の好ましい実施形態において、宿主種は動物種、特に限定されることはないがミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ．Ｌ）を始めとするハチのさまざまな種のような農業上重要な昆虫種である。もう１つ別の好ましい実施形態において、処理される動物種は、ヒト被験者及び非ヒト種の両方を含む哺乳類である。後者に関しては、多くの家畜動物、又は農業上重要な動物が本発明の組成物及び方法で処理され得る。１つの好ましい実施形態において、処理される哺乳類の対象はウシ又はヒツジである。
【００３５】
１つの好ましい実施形態において、非病原性の細菌種は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００３６】
本発明の方法を実施するには枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の多くの異なる株を使用できるが、１つの好ましい実施形態において、使用される株はＱＳＴ  ７１３株である。この株はＳｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）ＡＳＯ及びＣｅａｓｅ（Ｒ）を含めてさまざまな異なる製剤として商業的に得ることができる。
【００３７】
もう１つ別の好ましい実施形態において、非病原性の細菌はプロバイオティック細菌の１つ以上の種から選択される。上記に既に説明したように、プロバイオティック細菌の多くの異なる種（例えば、限定されることはないが、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の種）が本発明の方法を実施するのに使用され得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、上述の活性化剤の１〜５種が方法のステップ（ａ）で使用される混合物を製造するのに使用される。１つの好ましい実施形態において、前記活性化剤の５種全てが使用される。
【００３９】
もう１つ別の特に好ましい実施形態において、５種の活性化剤は次の百分率範囲で混合物中に存在する。
【００４０】
【表１】
2019533009.tif 000003
【００４１】
好ましくは、混合物中の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞及び活性化剤の百分率組成は次の通りである。
【００４２】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｓｅｒｅｎａｄｅ）  ０．１％〜１０％（より好ましくは０．５％〜５％）
活性化剤  ０．０１％〜１０％（より好ましくは０．０５％〜５％）。
【００４３】
本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載されている方法の、宿主種が植物である実施形態において、ステップ（ａ）の混合物を宿主生物と接触させるための多くの異なる手段が前記方法のステップ（ｂ）で使用され得る。これらの手段には、（限定されることはないが）施肥潅漑、噴霧、乳剤、制御放出膜又は基材、及びこれらの組合せがある。
【００４４】
いくつかの好ましい実施形態において、１種以上の非病原性細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せは葉へ施すことによって植物に施される。これは、例えば、伝統的な手段を用いてこれらの物質を噴霧することによって達成できる。
【００４５】
他の好ましい実施形態において、１種以上の非病原性細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せは、植物が成長している培地にこれらの物質を加えることによって前記植物に施される。これは、非病原性の細菌及び／又は活性化剤で被覆されているか、あるいは浸漬又は他の任意の手段によりこれらの物質を内部構造中に吸収させてある顆粒又はその他の基材（例えば吸収繊維、ペレット、ビーズ等）を製造することによって達成することができる。１つの特に好ましい実施形態において、使用される送達形態は送達される物質で被覆されている複数の顆粒（例えばパーライト顆粒）を含む。通常（いつもではないが）、これらの顆粒はさらに放出制御ポリマーを含んでいてもよく、これは通常外部コーティングとして顆粒表面上に存在する。
【００４６】
さらに好ましい実施形態において、非病原性の細菌、１種以上の活性化剤及び／又はこれらの組合せは植物種の種子を蒔く前に前記種子をこれらの物質で被覆することによって施される。かかる被覆された種子はさらに１種以上の放出制御ポリマーを通常（必ずではないが）外部コーティングの形態で含んでいてもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は非病原性の細菌と活性化剤を別々に施すことを含む。かかる別々の施用もまた、本明細書に記載されている前記非病原性の細菌及び活性化剤の混合物に対して使用される施用経路のいずれかによって達成することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の混合物は数時間〜約１８０日の期間連続的に処理される宿主生物に施される。
【００４９】
乳剤法を使用するとき、処理期間は通常数時間であり、約１０日後第２の処理を施し得る。
【００５０】
制御放出膜又は基材を使用するとき、処理は約１８０日かかる。制御放出基材はいくつかの異なる種類のものでよい。１つの好ましい実施形態において、この基材は、当技術分野で熟練した技術者に周知のようにパーライト顆粒のような顆粒に形成される。制御放出基材の他の選択肢としては、その乾燥重量に対して１：１５を超える吸水度を有するさまざまなペレット、ビーズ、ミクロビーズ、繊維がある。所望の制御放出特性を達成するために、基材は（農業、農薬及び薬学分野で周知のように）ワックス、エトセル、他の放出制御ポリマー及び植物油で被覆され得る。
【００５１】
本発明の方法を使用して動物を処理する場合、本発明の組成物は局所使用のためにゲル又はクリームの形態で製剤化することができる。あるいは、組成物は、動物に日々すでに施されている固体又は液体の動物飼料に添加することができるように製剤化してもよい。最後に、動物宿主種への経口又は非経口の投与が意図される他の剤形が当分野で熟練した技術者に周知であり、すべて本発明の範囲内に含まれる。
【００５２】
本発明はまた、非病原性の細菌及び１種以上の活性化剤の混合物を含み、前記１種以上の活性化剤が抗炎症活性を有する物質である組成物を提供する。好ましくは、かかる抗炎症性物質は抗炎症性メディエイターである一酸化窒素（ＮＯ）及び／又はＴＮＦ−αの生産又は放出を阻害することができる。
【００５３】
この局面の１つの好ましい実施形態において、前記活性化剤は各々ＮＯ生産の阻害に対する１．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する２．５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する。
【００５４】
もう１つ別の好ましい実施形態において、前記活性化剤は各々、ＮＯ生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．２ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する。
【００５５】
さらに好ましい実施形態において、前記活性化剤は各々、ＮＯ生産の阻害に対する０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０及び／又はＴＮＦ−α生産の阻害に対する０．１ｍｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する。
【００５６】
この局面の１つの好ましい実施形態において、本発明は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と、スクラレオール、ナリンギン、ノートカトン、ステビオールグリコシド及びカンナビジオールからなる群から選択される１種以上の活性化剤との混合物を含む植物保護又は動物保護組成物に関する。
【００５７】
１つの好ましい実施形態において、上に開示された組成物のいずれも、浸透剤、安定剤、溶剤、金属イオン封鎖剤、乳化剤及び放出制御（例えば徐放）剤を始めとする１種以上の追加の成分をさらに含んでいてもよい。
【００５８】
適切な浸透剤、すなわち極性の非プロトン性溶剤の例はＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ−ｄ６、ジメチルホルムアミド（ＤＵＦ）である。
【００５９】
適切な非イオン性の界面活性剤の例にはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−３、１５−Ｓ−５、１５−Ｓ−７がある。
【００６０】
適切な金属イオン封鎖剤の例にはリン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、塩化カルシウム、グルコン酸カリウムがある。
【００６１】
乳化剤の例にはｐｏｌｙａｌｄｏ１０−６−０、Ｅ−４７１、Ｅ−４７５、及びＥ−４７６がある。
【００６２】
制御放出剤の例には、ジシクロペンタジエン及びアマニ油又は大豆油アルキドを含むコーティング（例えば、登録商標「Ｏｓｍｏｃｏｔｅ（Ｒ）」で販売され、イスラエルのＩＣＬ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓにより流通され、米国特許第４，６５７，５７６号に開示されている市販のコーティング組成物）、並びに日本のＳｅｋｉｓｕｉ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手できるポリマーＥ６０３がある。
【００６３】
もちろん、上に掲げた追加の成分は単に例示のために挙げたものであり、多くの他の異なる添加剤及び賦形剤も本明細書に開示されている組成物に含まれ得る。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態のいくつかにおいて、活性化剤の混合物は親水性及び疎水性の物質の両方を含むことに留意されたい。結果として、多くの場合、２つの別々の成分：すなわち、水に溶解したより多くの水溶性の物質を含有する水性の部分と、脂肪酸、中鎖トリグリセリド、エタノール、他の溶媒及びこれらの組合せに溶解したより少ない水溶性の物質を含有する疎水性の部分との乳化した混合物として組成物を製造することが必要である。
【００６５】
本発明の上に開示された組成物の１つの好ましい実施形態において、非病原性の細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びプロバイオティック細菌からなる群から選択される。
【００６６】
１つの極めて好ましい実施形態において、非病原性の細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種の細菌である。この種の多くの異なる株が使用できるが、１つの好ましい実施形態において組成物はＱＳＴ  ７１３株を含む。
【００６７】
もう１つ別の極めて好ましい実施形態において、組成物中の非病原性の細菌はプロバイオティック細菌の１つ以上の種である。この実施形態の１つの実施において、プロバイオティック細菌はＬ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．Ｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂ．ロングム（Ｂ．Ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレヴェ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００６８】
さらなる局面において、本発明はまた、スクラレオール、ナリンギン、ノートカトン、ステビオールグリコシド及びカンナビジオール、並びにこれらの組合せからなる群から選択される、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の活性化を引き起こすことができる作用物質の混合物も提供する。
【００６９】
本発明の方法及び組成物のさらなる利点は、（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びプロバイオティック細菌のような）非病原性の細菌と活性化剤との混合物が、それで処理された植物の活力に対して、特に実生の発達の早期段階で、及ぼし得る正の影響である。その結果として、もう１つ別の局面において、本発明は、
農業上又は園芸上重要な植物の収量を増大する方法であって、
ａ）１種以上の非病原性細菌と１種以上の活性化剤との混合物を準備するステップ；及び
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を前記宿主種に施すステップ
によって、収量を増大する方法に関する。
【００７０】
この局面のもう１つ別の実施形態において、本発明はまた、農業上又は園芸上重要な植物の収量を増大する方法であって、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備し、
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を前記宿主種に別々に施す
ことによって、収量を増大する方法も提供する。
【００７１】
同様に、本発明はまた、農業上重要な動物からの生産物（例えば、乳、蜂蜜等）の収量を増大する方法であって、
ａ）（ｉ）１種以上の非病原性細菌を含む組成物；及び
（ｉｉ）１種以上の活性化剤を含む組成物
を別々に準備し；
ｂ）組成物（ｉ）及び（ｉｉ）の各々を前記宿主種に別々に施す
ことによって、収量を増大する方法も包含する。
【００７２】
この方法の変形において（本発明の他の方法に関連して上に開示したように）、非病原性の細菌と１種以上の活性化剤を含む組成物とを別々に宿主種に施してもよい。
【００７３】
農業産物の収量を増大するための、及び植物又は宿主種の微生物により誘発されるダメージに耐える能力を増大するための上に定義された方法は、各々、微生物病原体による植物又は動物宿主種の感染症を予防及び／又は処理する方法に関連してすでに開示し記載した技術的特徴のいずれかを含み得る。
【００７４】
別の局面において、本発明は、真菌、細菌及び／又はウィルス性病原体により動物種で引き起こされる感染症の予防又は処理に使用するための１種以上の非病原性細菌及び１種以上の活性化剤の混合物に関する。
【００７５】
もう１つ別の局面において、本発明はまた、真菌、細菌及び／又はウィルス性病原体により植物又は動物宿主種で引き起こされる感染症の処理及び／又は予防のための、１種以上の非病原性細菌と１種以上の活性化剤との混合物の使用にも関する。
【００７６】
さまざまな処理の方法に関連して上で開示され記載された技術的特徴はすべて、直前に開示された非病原性の細菌と活性化剤の混合物の使用に等しく当てはまる。
【００７７】
以下、非限定的な実施例及び添付の図面を参照して本発明をさらに例証する。
【実施例】
【００７８】
材料及び方法
１．非病原性細菌
ａ）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
実施例１〜１８として本明細書に報告される研究のために、市販のＱＳＴ  ７１３株を使用した。この株はＢａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから２つの異なる製剤：１）Ｓｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）ＡＳＯ；及び２）Ｃｅａｓｅ（Ｒ）として入手した。以下に挙げる実施例のほとんどで、Ｓｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）ＡＳＯを枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の起源として使用した。しかし、実施例３及び１１では、Ｃｅａｓｅ（Ｒ）をＳｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）の代わりに使用した。
【００７９】
ｂ）プロバイオティック細菌
実施例１９及び２０として本明細書に報告される研究のために、「Ｊａｒｒｏ  Ｄｏｐｈｉｌｕｓ」として知られている市販のプロバイオティック混合物を使用して本発明の組成物を調製した。このプロバイオティック混合物のさらなる詳細は以下の実施例１９に見られる。
【００８０】
２．活性化剤
数多くの候補分子の初期スクリーニングの後、次の植物化学物質を本研究の最初の部分で活性化剤として使用するために選択した：
１．スクラレオール  −  クラリセージ（Ｓａｌｖｉａ  ｓｃｌａｒｅａ）から抽出されたジテルペンアルコール
【００８１】
【化１】
2019533009.tif 000004
【００８２】
２．ナリンギン  −  グレープフルーツの皮から抽出されたフラバノン−７−Ｏ−グリコシド
【００８３】
【化２】
2019533009.tif 000005
【００８４】
３．ノートカトン  −  セスキテルペン  −  オレンジの皮から抽出
【００８５】
【化３】
2019533009.tif 000006
【００８６】
４．ステビオールグリコシド  −  ステビア（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）から抽出
【００８７】
【化４】
2019533009.tif 000007
【００８８】
５．ＣＢＤ  −  カンナビジオール  −  大麻から抽出
【００８９】
【化５】
2019533009.tif 000008
【００９０】
５種以下のこれらの物質の組合せの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する活性化剤としての初期試験の後、以下の実施例４及び５に記載するように追加の薬草物質の効能も検討した。
【００９１】
［実施例１］
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する活性化剤としての使用可能性のための植物化学物質の初期スクリーニング
序：
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ）実生は発芽過程中実生を攻撃する真菌及び細菌病原体に極めて感染しやすく、したがって枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその活性化を引き起こすことができる植物化学物質をスクリーニングし較正するためにモデル植物として選択した。
【００９２】
材料及び方法：
１．植物化学物質のスクリーニング：
潜在的な植物化学物質を、ペトリ皿中の３０ｃｃのグルコース５０％Ｖ／Ｖ基質、１０ｃｃの真菌病原体カクテル及び１０ｃｃの細菌病原体カクテルの混合物に加えた。真菌カクテルは、灰色かび病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ピシウム属菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びトマトの発酵に使用される非病原性菌類を含有していた。細菌カクテルは、トマトかいよう病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）及びトマトの発酵に使用される非病原性細菌を含有していた。
【００９３】
およそ１０００の潜在的な植物化学物質を、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を活性化する能力に関して、各々の試験に対するコロニー形成インデックス（０＝コロニーなし；５＝最大のコロニーサイズ）を計算することによってスクリーニングした。試験したおよそ１０００の植物化学物質から、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する活性化剤としての優れた性能に基づいて、実施例の欄の序で掲げた５種の植物化学物質を選択した。
【００９４】
以下に報告される研究で使用される宿主生物の各々に対して、上に掲げた５種の選択された活性化剤の最適な組合せ及び濃度を決定した。選択された組合せは、予備的な研究において、所望の保護効果を生成することができる可能な最低の濃度を有することが判明したものであった。このようにして、これらの作用物質の宿主生物への施用中の可能な副作用及び環境汚染を回避した。
【００９５】
同時に、植物化学物質を、細菌及び真菌病原体のカクテルを排除する能力に関してスクリーニングした。さまざまな処理間の比較の目的で、真菌及び細菌の排除インデックスを計算した（０＝最大の排除、５＝排除なし）。
【００９６】
上に述べたグルコース基質並びに真菌及び細菌カクテルを５種全ての活性化剤植物化学物質並びに浸透剤（ＤＭＳＯ）及び溶剤（Ｔｒｉｔｏｎ）と共に含有する試験混合物を、４つの異なる濃度：すなわち濃度１、２、３及び４で使用した。各々の場合において、同量のグルコース基質並びに真菌及び細菌カクテル３０ｍｌを混合物に加えた。同様に、ＤＭＳＯ（０．５％ｖ／ｖ）及びＴｒｉｔｏｎ（０．０２％ｖ／ｖ）の濃度は全ての混合物で同じであった。しかし、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び５種の活性化剤の各々の濃度（ｖ／ｖ％）は表Ｉに記載するように各々の試験混合物で異なっていた。
【００９７】
【表２】
2019533009.tif 000009
【００９８】
５種の活性化剤のいくつか又は全ての異なる組合せを含有するさまざまな異なる試験混合物を下記表ＩＩに挙げる処理のリストに従ってこの研究に使用した。各々の場合、活性化剤、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び基質は表Ｉに示した濃度で使用した。例えば、濃度１で試験したとき活性化剤を含有する試験混合物中のスクラレオールの濃度は０．１％であったが、濃度２で試験したときスクラレオールは０．２％の濃度で存在していた、などである。
【００９９】
【表３】
2019533009.tif 000010
【０１００】
結果：
予備的な結果は、最適な抗真菌及び抗細菌活性は濃度２及び濃度３（上記表Ｉ参照）の試験混合物で得られたことを示していた。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のコロニー発生は濃度３を用いて最適であったので、これが残りの研究で使用するために選択された濃度であった。試験した濃度３で真菌排除、細菌排除及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化（コロニーサイズ）に関して得られた結果をそれぞれ図１のグラフの前列、中央及び後列に要約して示す。上記表ＩＩに要約した１１の異なる処理に、グラフのＸ軸に沿ってＴ１〜Ｔ１１と名前を付けて示す。
【０１０１】
すでに説明したように、抗真菌、抗細菌及び活性化特性を評価するために使用した３つの半定量的なインデックスは次の通り：
真菌インデックス：０（発生なし）〜５（最大の発生）
細菌インデックス：０（発生なし）〜５（最大の発生）
Ｂ．ｓインデックス（コロニー形成インデックス）：０（発生なし）〜５（最大の発生）。
【０１０２】
図１から分かるように、最良の結果、すなわち枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化及び病原体排除の両方は（上記表ＩＩに示されているように）５種の活性化剤全ての組合せを使用した処理１１を用いて得られた。
【０１０３】
追加の実験（１６の異なる作用物質混合物を試験した）の結果を次の表に示す：
【０１０４】
【表４】
2019533009.tif 000011
【０１０５】
混合物１２〜１６で得られた結果は特に興味深い：これらの混合物は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を全く含有せず、この試験系での病原菌に対する活性の完全な欠如は、明らかに、活性化剤単独が（５種全ての活性化剤の混合物を含む場合、すなわち表ＩＩａの試験混合物１２でも）不活性であることを示している。このように、所望の抗菌効果を得るためには活性化剤と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（又は別の非病原性の細菌種）の両方の存在が必要とされる。さらに、この特定の効果、すなわち、活性化剤単独、すなわち枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は他の非病原性の細菌の不在下での活性の欠如は以下に報告する研究の全てで見られた（データは示さない）ことに留意されたい。
【０１０６】
［実施例２］
活性化剤組成物の変更による、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の活性化並びに前記組成物の殺真菌及び殺細菌活性に対する効果
第２群の研究は、５種全ての成分の組合せから１つの植物化学物質を削除することか又は混合物中の１つ若しくは２つの成分の濃度を選択的に変更することの効果を試験することを目的とした。
【０１０７】
材料及び方法：
実施例１と同様
さまざまな試験混合物を濃度３又は濃度４（上記実施例１に規定した通り）で使用した。これらの試験混合物の各々の組成を次の２つの表に要約して示す：
【０１０８】
【表５】
2019533009.tif 000012
【０１０９】
【表６】
2019533009.tif 000013
【０１１０】
結果：
図２に見ることができるように、濃度３で使用した３又は４種の活性化剤を含有する全ての試験混合物が、培地のみ及び培地＋枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のコントロール（それぞれ混合物１及び２）と比較したとき、真菌及び細菌インデックスの有意な低減（それぞれ上及び中央のグラフ）並びに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化インデックスの有意な増大（下のグラフ）を引き起こした。
【０１１１】
同様に、図３に示されているように、濃度４で使用した３又は４種の活性化剤を含有する全ての試験混合物が、培地のみ及び培地＋枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のコントロール（それぞれ混合物１及び２）と比較したとき、真菌及び細菌インデックスの有意な低減（それぞれ上及び中央のグラフ）並びに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化インデックスの有意な増大（下のグラフ）を引き起こした。
【０１１２】
また、図２で観察できるように、ノートカトン及びステビア成分が両方とも高まった濃度（すなわち濃度４、一方他の全ての成分は濃度３；すなわち試験混合物８）である５成分の活性化剤混合物は３つの全てのインデックスで最大の活性を有する。
【０１１３】
また、図３は、ナリンギン濃度が濃度３に低下し、他の全ての成分が濃度４である４成分活性化剤混合物（番号７）が、３つの全てのインデックスにより測定したこのデータセットで最大の活性を有することを示している。
【０１１４】
これらのデータは、最大の５種より少ない活性化剤を含有する混合物を使用して真菌又は細菌の攻撃から宿主生物を保護することができるということを示している。加えて、これらの結果はまた、混合物の最適化が混合物中の１種以上の個々の活性化剤の濃度を操作することによって得ることができることも示している。
【０１１５】
［実施例３］
異なる枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）製剤と組み合わせたさまざまな活性化剤組成物の殺真菌及び殺細菌活性
この研究では、上記実施例２で行った実験を、異なる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）製剤を用いて繰り返した。
【０１１６】
材料及び方法：
実施例１と同様。
【０１１７】
さまざまな試験混合物を濃度３又は濃度４（上記実施例１で規定した通り）で使用した。これらの試験混合物の各々の組成は上記実施例２の表ＩＩＩ及びＩＶに要約して示した。
【０１１８】
結果：
この研究は実施例２で得られた結果を裏付ける。すなわち、図４（濃度３）及び図５（濃度４）で見られるように、３、４又は５種の活性化剤を濃度３で含有する全ての試験混合物は、真菌及び細菌インデックスの顕著な低減（それぞれ上及び中央のグラフ）を引き起こした。また、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化インデックスの有意な増大（下のグラフ）も引き起こした。
【０１１９】
（実施例２でＳｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）製剤を用いて報告された研究の場合と同様に）、濃度３で、ノートカトン及びステビア成分が両方とも高まった濃度（すなわち濃度４、一方他の全ての成分は濃度３；すなわち試験混合物８）である５成分の活性化剤混合物が３つすべてのインデックスで最大の活性を有することは特に注目すべきである（図４）。同様に、図５に示されているように、ナリンギン濃度が濃度３に低下し、他の全ての成分が濃度４である４成分の活性化剤混合物（番号７）は、３つすべてのインデックスで測定したこのデータセットで最大の活性を示した。
【０１２０】
Ｃｅａｓｅ（Ｒ）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）製剤で得られたこれらの結果はＳｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）製剤で得られた知見（上記実施例２）を裏付けており、観察された効果がいずれか１つの特定の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）製剤に特有のものではないことを示している。
【０１２１】
［実施例４］
本発明で使用した作用物質の抗炎症活性
上記実施例１〜３で報告された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と５種の活性化剤のいくつか又は全てとの組合せで得られた結果の後、殺細菌、殺真菌及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）活性化能に加えて共通の機能特性を探すために前記作用物質を検討した。
【０１２２】
一連の予備的な研究の後、本発明者は、意外なことに、上に記載した研究で試験した５種の活性化剤の各々が極めて強力な抗炎症活性も共有することを見出した。
【０１２３】
これをさらに検討するために、先の実施例で使用した活性化剤の３つを、別々に、互いに組み合わせて、そして枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と組み合わせて、培養したマクロファージ株で２つの重要な炎症性阻害剤：一酸化窒素（ＮＯ）及びＴＮＦ−αのインビトロ生産を阻害する能力に関して試験した。加えて、マクロファージの生存能力を、抗炎症性アッセイを実施した時ＮＯ及びＴＮＦ−αの阻害に対応する適当なＩＣ５０値で測定した。
【０１２４】
方法：
ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞株：
ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを、標準の増殖培地（５％ＦＢＳ、抗生物質及びグルタミンを補充したＤＭＥＭ）を用いて平底フラスコで増殖させた。細胞を当技術分野で周知の標準の手順に従って維持した。細胞がコンフルエンスに達した後、機械的な手段を用いてフラスコから取り出し、次いで遠心により濃縮し、少量の新鮮な培養培地に再懸濁した。細胞濃度を増殖培地で調節して、９６ウェルプレートの各々のウェルに約７５，０００細胞を加えることができるようにした。２５μｇ／ｍＬのＬＰＳ及び１０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ  ＤＭＥＭの組合せをマクロファージの活性化に使用した。活性化の１時間前にさまざまな試験物質をウェルに加えた。次に、細胞をさらに２４時間インキュベートした後、炎症性メディエイター生産及び細胞生存能力をアッセイした。
【０１２５】
細胞生存能力の決定：
１００μＬの１０％Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ溶液を各々のウェルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートすることによって生存能力のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを行った。蛍光を測定し（励起５４５ｎｍ、発光５９５ｎｍ）、未処理コントロール細胞の値に対する百分率として表した。
【０１２６】
Ｇｒｉｅｓｓアッセイによる一酸化窒素生産の決定：
さまざまな処理に付したマクロファージによるＮＯの生産を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬（等容量の１％スルファニルアミド及び０．１％ナフチルエチレンジアミン（ｎａｐｔｈｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｄｉａｍｉｎｅ）、５％ＨＣｌ中）を用いてアッセイした。各々の試験ウェルの上清７０μＬを新鮮な９６ウェルプレートに移し、７０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬と混合し、生成したすみれ色を５４０ｎｍで測定した。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−αの決定：
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＴＮＦ−α濃度を決定した。一次抗体はＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。希釈剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中）中ＴＮＦ−α標準０〜１０００ｐｇ／ｍＬの連続希釈を内部標準として使用した。ＴＮＦ−αはビオチニル化された第二抗体及び検出試薬としてのＴＭＢとのアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて検出した。発色を６５５ｎｍでモニターし、５分毎に読み取った。２５分後、０．５Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１２８】
試験した作用物質：
上に記載した方法を使用して、スクラレオール、ナリンギン及びステビオール、及びそれらの互いの並びに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）との組合せの、ＮＯ及びＴＮＦ−α生産、並びに細胞生存能力に対する効果を決定した。抗炎症活性の結果を、ＮＯ及びＴＮＦ−α生産の阻害に対するＩＣ５０値として、下記表Ｖに細胞生存能力の結果と共に示す。加えて、科学文献（Ａ．Ｓ．  Ｒａｖｉｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  ＢＭＣ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １２：１７３  ″Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ″）から得られた、２つの追加の植物種、すなわち、シオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）及びハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の水性抽出物に関する同等な結果を表の最後に示す。これら２つの種の抽出物は、本発明者により、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と組み合わせたその殺真菌及び殺細菌効果に関して研究された。これらの研究の結果は以下の実施例５に示す。
【０１２９】
結果：
さまざまな作用物質で処理した培養マクロファージの抗炎症性及び生存能力アッセイに対して得られた結果を以下の表Ｖに示す。
【０１３０】
【表７】
2019533009.tif 000014
2019533009.tif 000015
【０１３１】
試験した処理剤のいずれもマクロファージの生存能力に対して有意な副作用をもっていなかったようである。よって、これらの作用物質により引き起こされた２つの炎症性メディエイターの生産のいかなる阻害も一般的な細胞毒性の影響の結果ではなかった。
【０１３２】
この表から、別々に使用したとき、３つの作用物質スクラレオール、ナリンギン及びステビオールのＮＯ阻害に対するＩＣ５０がそれぞれ０．０４、０．０４及び０．０２であることに留意するべきである。また、互いに組み合わせて使用したとき、前記組合せはさらにより強力であり、ＮＯ阻害に対するＩＣ５０は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の不在下で０．００４、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の存在下で０．００１である。これらの結果をＡ．Ｓ．Ｒａｖｉｐａｔｉら（２０１２）による上述の論文に公表された４４の選択された植物抽出物のＮＯ阻害に対する同等なＩＣ５０値と比較すると、スクラレオール、ナリンギン及びステビオールの値は前記論文の値の範囲（０．０３〜１．４９）の下の方にあり、１つの場合（ステビオール）にはその範囲の最下限を超えることが分かる。同様に、スクラレオール、ナリンギン及びステビオールの平均値を論文に報告された４４の植物に対する値と比較すると、前者（０．０３）が前記公表された値から引き出された平均（０．２６）よりずっと低いことが注目され得る。
【０１３３】
また、別々に試験したときスクラレオール、ナリンギン及びステビオールによるＴＮＦ−αの阻害に関しても、Ａ．Ｓ．Ｒａｖｉｐａｔｉら（２０１２）により公表された４４の植物抽出物に対する結果（範囲＝０．０７〜２．５；平均＝１．０４）と比較して、それぞれ０．０８、０．０９及び０．０８のＩＣ５０値（範囲＝０．０８〜０．０９；平均＝０．０８３）であり、同様な結論が引き出され得る。
【０１３４】
このように、上記実施例１〜３で選択し試験した３つの作用物質は、いずれも抗炎症活性を有しており、ＮＯ及びＴＮＦ−α阻害に関して、漢方薬に一般に使用される４４種の薬草抽出物の組（Ａ．Ｓ．Ｒａｖｉｐａｔｉら（２０１２））のほとんどより強力である（すなわち、より低いＩＣ５０を有する）と結論することができる。
【０１３５】
さらに、興味のあることに、表Ｖから、効力がより弱い抗炎症性の植物抽出物（例えばシオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）、ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ）及びタイリントキソウ（Ｐｌｅｉｏｎｅ  ｂｕｌｂｏｃａｄｉｏｉｄｅｓ））の場合であっても、前記抽出物はまた（以下の実施例５に示されるように）抗真菌及び抗細菌活性に関して枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する活性化剤として有効であることに注意するべきである。
【０１３６】
［実施例５］
２つの異なる植物抽出物と枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の組合せの殺真菌及び殺細菌活性
抗炎症特性を有する２つの植物シオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）及びハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の抽出物が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の殺真菌及び殺細菌活性に対する強力な効果を有する可能性を検討した。
【０１３７】
方法：
抗真菌及び抗細菌特性をアッセイするために上記実施例１で使用したのと同じ方法をこの研究で枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とシオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）及びハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の水性抽出物との組合せに応用した。下記表ＶＩに要約するように、２つの異なる濃度の抽出物及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）懸濁液を使用した。
【０１３８】
【表８】
2019533009.tif 000016
【０１３９】
抽出物と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）懸濁液のさまざまな組合せを調製し、表ＶＩＩに示すスキームに従って試験した。これらの組合せの全てを濃度３及び濃度４の両方で試験した。
【０１４０】
【表９】
2019533009.tif 000017
【０１４１】
結果：
図６は、表ＶＩＩの組合せを濃度３で用いて得られた結果をグラフで示す。上のグラフから分かるように、試験した組合せの全てが殺真菌活性を示し、この点に関して最も有効な組合せが組合せ５、すなわち枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の抽出物の組合せであった。図７の上のグラフに示されているように、同様な結果が濃度４で得られる。しかしながら、この場合は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とシオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ）の組合せも同様な結果を生じた。殺細菌活性に関しては、図６の中央のグラフが示すように、濃度３で、試験した全ての組合せのうち枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の組合せが細菌細胞の数の最も大きい低減を引き起こす。しかし、濃度４のデータに関しては、図７の中央のグラフに示されている殺細菌性研究の結果は、上で述べた濃度４の殺真菌データの場合と同様に、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と二成分の植物抽出物の両方の組合せが最も大きい殺細菌効果を生じたことを示している。
【０１４２】
最後に、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の活性化に関しては、図６及び図７の両方の下のグラフから明らかなように、二成分の植物抽出物と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の組合せの各々が最大の効果を示す。
【０１４３】
この予備的な研究から、抗炎症特性を有する２つの植物の水性抽出物は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の活性化剤として機能し、その抗細菌及び抗真菌活性を増大させると結論できる。
【０１４４】
［実施例６］
キュウリ実生の接種
方法：
活性化剤、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び追加の成分（上記実施例１の表Ｉ及びＩＩに記載した細菌及び／又は真菌カクテルを含む）の各々の混合物１０ｃｃを関連のペトリ皿からサンプリングし、播種１０時間後の発芽キュウリ種子の４つの複製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）に注入した。
【０１４５】
処理の５日後半定量的接種インデックス（０＝健康、５＝死）を用いて各々の植物の健康状態を評価した。
【０１４６】
結果
この研究の結果を図８にグラフで示す。ここで、４つの別々のグラフは（上から下に）活性化剤を濃度１、２、３及び４で用いて得られたデータを要約して示す。
【０１４７】
図８の最初の（上の）グラフから分かるように、処理プロトコルのいずれも、最低の濃度（濃度１）で使用したとき、植物を微生物感染から保護することができなかった（全ての処理に対して接種インデックス５）。
【０１４８】
図８の第２のグラフが示しているように、このシリーズで次に高い濃度（濃度２）では、活性化剤混合物６〜１１は全てキュウリ植物を真菌及び細菌の感染症から完全に保護する。図８の第３のグラフに示されているように、作用物質を濃度３で使用したときも同様な結果が見られた。
【０１４９】
最も高い濃度（濃度４；図８の最後のグラフ）では、活性化混合物５〜１１で保護効果が見られる。
【０１５０】
要約すると、多成分活性化剤混合物の全て、並びに１つの活性化剤のみを含有する混合物のいくつかが、濃度２〜４で使用したときインビボでキュウリ植物を保護するのに有効であった。この研究で得られた半定量的なデータはさまざまな処理に付された植物の外観と非常に良く相関している。
【０１５１】
［実施例７］
トマト実生の接種
方法：
上記実施例６と同様にして、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びさまざまな組合せの活性化性植物化学物質を含有する試験混合物をトマト実生に接種した。しかし、使用したさまざまな試験混合物の組成及び濃度は実施例６と異なっており、次の２つの表に要約して示す（濃度は全て％ｖ／ｖである）：
【０１５２】
【表１０】
2019533009.tif 000018
【０１５３】
加えて、混合物は全て浸透剤（ＤＭＳＯ）を濃度０．５％ｖ／ｖで、溶剤（Ｔｒｉｔｏｎ）を濃度０．０２％ｖ／ｖで含有していた。
【０１５４】
【表１１】
2019533009.tif 000019
【０１５５】
結果
この接種研究の結果を図９にグラフで要約して示す。この図から分かるように、濃度２（上のグラフ）では、試験混合物６のみがトマト植物のほぼ最大の保護を生じた。しかし、濃度３及び４（それぞれ中央及び下のグラフ）では、両方の処理６及び７で最大の保護が得られた。
【０１５６】
［実施例８］
トマト植物−野外研究
序：
イスラエルでトマトが成長する主要な地方は国の南西部である。一昨年、この地方はトマトモザイクウィルス（ＴｏＭＶ）の新しい攻撃性の株にひどく感染した。このウィルスが植物に感染し、商業的収量は通常の収量レベルの半分未満に低下した。残念ながら、遺伝的に耐性がある品種はまだ存在していなかった。現在開示されている方法がＴｏＭＶに感染したトマト植物の生存率を増大できるかどうか評価するために前記方法を用いて野外研究を実施した。
【０１５７】
方法：
先の生育期にウィルスがひどく感染したトマトのネットハウスで枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び活性化性植物化学物質の試験を実施した。
【０１５８】
使用した処理混合物は上記実施例１に記載したものと同じで、濃度２で使用した。
【０１５９】
使用した実施方法は次の通り：
ａ）噴霧；
ｂ）噴霧及び施肥潅漑；
ｃ）施肥潅漑；
ｄ）未処理コントロール。
【０１６０】
トマト植物を南向き又は北向きの区画に定植し、各々１４日毎に６、５及び４回処理した。
【０１６１】
結果
この研究の結果を図１０にグラフで示す。この図の最初の３つのグラフは北向きの区画で成長する植物に関し、一方次の組の３つのグラフは南向きの区画で成長する植物の結果を示す。
【０１６２】
この図から分かるように、６回処理及び５回処理の方法（上から第１及び第２のグラフ）では両方とも、施肥潅漑（各々の組のバー５及び６）又は施肥潅漑及び噴霧の組合せ（バー３及び４）により組成物を施したとき（低下した接種インデックスにより示されるように）良好な結果が得られた。
【０１６３】
また、これらの結果から、これらの処理及び実施方法に対して、南向きの列のトマト植物の方が北向きの区画のものよりも反応することも分かる。
【０１６４】
［実施例９］
コショウ植物実生
方法：
上記実施例７に記載したトマト実生に接種するための方法と同じ方法を使用してコショウ植物実生に対する本発明の組成物の活性を試験した。処理プロトコルも、上記表Ｖ及びＶＩに記載されている、実施例７に使用したのと同じであった。
【０１６５】
結果：
コショウ植物実生の処理の結果を図１１に要約して示す。上のグラフは濃度２で使用した活性化混合物の結果を示し、中央のグラフは濃度３で使用した混合物に関し、下のグラフは濃度４の混合物の結果を示す。
【０１６６】
これらのグラフから分かるように、濃度２で、活性化混合物５及び６は実生に対して完全な保護を示した。しかし、濃度３及び４では、活性化混合物５及び６による完全な保護に加えて、活性化混合物４がほぼ完全な保護を示した。
【０１６７】
［実施例１０］
トウモロコシ実生接種
方法：
上記実施例７及び９に記載したトマト及びコショウ実生に接種したのと同じ方法を使用して、実施例１の表Ｉ及びＩＩに規定されている活性化剤混合物（４つの異なる濃度）をトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｓｓｐ．  Ｍａｙｓ）に接種した。この研究に使用した処理プロトコルと先の実施例に記載したものとの唯一の違いは、使用した細菌及び真菌カクテルの組成に関連する。すなわち、この研究で、真菌カクテルはピシウム属菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、リゾクトニア属の種（Ｒｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．）及びペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）を含んでいたが、細菌カクテルは黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・ディソルベンス（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）及びエンテロバクター・ディソルベンス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）を含有していた。
【０１６８】
結果：
この接種研究の結果を図１２にグラフを用いて要約して示すが、４つのグラフは濃度１、２、３及び４（降順）で使用した１１の活性化混合物に対する結果を示す。
【０１６９】
これらのグラフから分かるように、真菌及び細菌の感染に対する最良の保護が濃度２、３及び４で使用したときの活性化混合物１１で得られた。
【０１７０】
［実施例１１］
コムギ実生
方法：
上記実施例７及び９に記載した、トマト及びコショウ実生に接種したのと同じ方法を使用して実施例１の表Ｉ及びＩＩに規定した活性化剤混合物（４つの異なる濃度）をコムギ実生（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）に接種した。この研究で使用した処理プロトコルと先の実施例に記載したものとの唯一の違いは使用した細菌及び真菌カクテルの組成に関する。すなわち、この研究では、真菌カクテルはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ピシウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、及びピシウム・ミリオチルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ）を含んでおり、細菌カクテルはシュードモナス・シリガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｇａｅ）、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、及びタマネギ腐敗病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）を含有していた。
【０１７１】
結果：
この接種研究の結果を図１３にグラフにより要約して示すが、４つのグラフは濃度１、２、３及び４（降順）で使用した１１の活性化混合物に対する結果を示す。
【０１７２】
これらのグラフから分かるように、真菌及び細菌の感染に対する最良の保護は濃度２、３及び４で使用したときの活性化混合物１１、並びに濃度３及び４で使用したときの活性化混合物１０で得られた。
【０１７３】
［実施例１２］
イネ実生
方法：
上記実施例７及び９に記載したトマト及びコショウ実生に接種したのと同じ方法を使用して、実施例１の表Ｉ及びＩＩに規定した活性化剤混合物（４つの異なる濃度）をイネ実生（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）に接種した。この研究で使用した処理プロトコルと先の実施例に記載したものとの唯一の違いは使用した細菌及び真菌カクテルの組成に関する。すなわち、この研究では、真菌カクテルはピシウム・スピノスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ピシウム・ディソトクム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｔｏｃｕｍ）を含んでおり、細菌カクテルはイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  Ｏｒｙｚａｅ）及び黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｉｓａｎｔｅｍｉ）を含有していた。
【０１７４】
結果：
この接種研究の結果を図１４にグラフを用いて要約して示すが、４つのグラフは濃度１、２、３及び４（降順）で使用した１１の活性化混合物の結果を示す。
【０１７５】
これらのグラフから分かるように、真菌及び細菌の感染に対する最良の保護は、試験した４つの全ての濃度の活性化混合物１１で、濃度３及び４で使用したときの混合物１０で、濃度３及び４の混合物９で、そして濃度４使用したときのみの活性化混合物８で得られた。
【０１７６】
［実施例１３］
ヒヨコマメ−野外研究
方法：
野外試験は２０１５年１０月９日イスラエルのＮａｈａｌａｌで重粘土に播種した。
【０１７７】
イスラエルのヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  Ｌ）の通常の播種期は、主として２つの主要な病原体アスコキタ・ラビエイ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｒａｂｉｅｉ）及びフザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．シセロ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｃｉｃｅｒｏ）のため、２月の初めである。
【０１７８】
存在する品種はこれらの病原体に対して軽度の耐性を有しているが、イスラエルの冬を越すことができない。
【０１７９】
この試験用に選んだ畑は過去フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のひどい被害を受けたことがあった。
【０１８０】
２０１６年２月１６日以前畑を処理しなかったので、畑全体にわたって２つの病原体の両方の重い症状が観察された。
【０１８１】
２０１６年２月１６日、最初の処理を施した。
【０１８２】
４つのヒヨコマメ品種１、１１、１２、及び１３を試験に含め、各々の品種の植物を３つの異なるプロトコル、すなわち、２つの異なる処理プロトコル（赤色及び青色プロトコル；下記表Ｘ参照）及び未処理コントロールプロトコルの１つに供した。
【０１８３】
【表１２】
2019533009.tif 000020
【０１８４】
次のいろいろな施用手順を使用して処理及びコントロールプロトコルにより植物を処理した。
１．２０１６年２月１６日、１回の噴霧
２．２０１６年２月１６日、１回の施肥潅漑
３．２０１６年２月１６日、１回の噴霧＋施肥潅漑
４．２０１６年２月１６日及び２０１６年３月１日、２回の噴霧＋施肥潅漑。
【０１８５】
さまざまな処理の成功又はその他を、各々の処理地域の収量を測定し、次いでその重量をＫｇ／ドゥナム（１０００ｍ２）に外挿することによって決定した。
【０１８６】
結果
さまざまな処理の結果を図１５にグラフで要約して示す。この図から分かるように、ヒヨコマメの品種１３は両方の活性化混合物処理（青色及び赤色プロトコル）に対して、処理を施した方法に関わらず試験した他の品種よりずっと大きな程度で反応した。すなわち、青色プロトコル及び最良の施用経路での品種１３の外挿収量は６８４ｋｇである。
【０１８７】
この収量はコントロールより４．２倍大きく、イスラエルで期待される最良の商業的収量レベルの２倍を超えることに注意されたい。
【０１８８】
青色プロトコルによる処理では、４ヵ月早く播種し、これらの収量結果を得ることが可能であった。
【０１８９】
注目するべきことに、プロトコルによる処理の頻度をチェックしたところ、最良の結果は処理の頻度が極めて集約的であったときに得られることが明らかになって来た。これは、本発明の組成物は、徐放及び／又は制御放出膜を介して施用して一定のレベルの前記組成物に宿主種を曝露するのが有利であり得ることを示唆している。この可能性をさらに検討したが、その結果は以下に示す（実施例１８）。
【０１９０】
［実施例１４］
ヒト被験者における虫歯に関連する細菌病原体のインビトロ研究
序：
この予備的な研究では、ヒト被験者において虫歯の発生に関係するとされている２つの細菌種に対する本発明の組成物の効果をインビトロで試験した：
１．ソブリヌス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）
２．ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）。
【０１９１】
口腔内にあるとき、これらの細菌はその栄養を主に摂取したショ糖から引き出す。よって、本インビトロ研究のため、ショ糖も増殖基質として使用した。
【０１９２】
方法：
さまざまな処理間の比較の目的で接種インデックスを計算した（０＝最大の排除、５＝排除なし）。
【０１９３】
５０％ｖ／ｖショ糖に懸濁した、３０ｍｌの試験する細菌を５種全ての活性化性植物化学物質並びに浸透剤（ＤＭＳＯ）及び溶剤（Ｔｒｉｔｏｎ）と共に含有する試験混合物を、４つの異なる濃度：濃度１、２、３及び４で使用した。各々の場合に、同量の細菌懸濁液３０ｍｌを混合物に加えた。同様に、ＤＭＳＯ（０．５％ｖ／ｖ）及びＴｒｉｔｏｎ（０．０２％ｖ／ｖ）の濃度は全ての混合物で同じであった。しかし、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び５種の活性化剤の各々の濃度（ｖ／ｖ％）は、上記実施例１の表Ｉに記載したように各々の試験混合物で異なっていた。
【０１９４】
５種の活性化剤のいくつか又は全ての異なる組合せを含有するさまざまな試験混合物を下記表ＸＩに挙げるリストの処理に従ってこの研究に使用した。
【０１９５】
【表１３】
2019533009.tif 000021
【０１９６】
結果：
試験細菌ソブリヌス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）で得られた結果を図１６に示し、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）で得られた対応する結果を図１７に示す。
【０１９７】
使用する濃度に関わらず活性化混合物６を使用したときに（ソブリヌス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の両方で）細菌のほぼ完全な排除が見られる。加えて、混合物５を濃度２、３又は４で使用したときにほぼ最大の排除が観察される。この後者の結果は、混合物５中に存在しない植物化学物質ＣＢＤがこの研究で試験した２つのう蝕原性細菌種のいずれかに感染させたときに観察された保護効果を得るのに本質的ではないことを示唆しているであろう。しかし、５種全ての植物化学物質を含有する（すなわちＣＢＤを含む）混合物６はより一貫した結果を保証することが可能である。
【０１９８】
［実施例１５］
カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）による感染症に対してニンジンを保護するための本発明の組成物を用いた予備的な野外試験
序：
カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）はリゾビウム科（ｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のグラム陰性菌の属である。今までのところこれらの細菌を培養維持することは可能ではなく、その検出及び定量化は通常特異的プライマーによるその１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を用いて達成される。属のメンバーは主としてキジラミにより伝染する植物病原体である。
【０１９９】
これらの細菌はニンジン及び柑橘類（グリーニング病）に感染することができ、その際に重要な商業的ダメージを引き起こし得る。
【０２００】
この研究の目的は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と活性化剤の組合せを含む本発明の組成物が全生育期間中ニンジン植物を保護することができるかどうか検討することであった。
【０２０１】
材料及び方法：
パーライト顆粒を、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と活性化剤の組合せを含有する製剤に浸し、次いで徐放性ポリマーで被覆した。
【０２０２】
顆粒を蒔き溝の底に蒔き、播種後、植物及びニンジンをカンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）による感染症の症状の発生に関してモニターした。
【０２０３】
試験プロトコルの詳細は次の通り：
１．播種は２０１７年２月８日１９３ｃｍの床に付き３つの三つ組列で行った。
２．試験区域を完全な発芽までＡｇｒｉｎｅｔ網で覆った。
３．潅漑はミニスプリンクラーを用いて４ｑｍ／ｄで行った。
ａ）発芽中は７０％ペンマン（ｐｅｎｍａｎ）を毎日。
ｂ）発芽後は９０％ペンマンを４日毎。
４．肥料：試験の月２及び３の間：窒素１０単位。
５．殺菌剤：１０日毎、Ｐｏｌａｒ（Ａｍｉｒａｎ  Ｋ  Ｌｔｄ．，  Ｎａｉｒｏｂｉ、ケニア）、Ｓｈａｖｉｔ（Ａｄａｍａ  Ｌｔｄ．、イスラエル）、及びＡｍｉ−ｏｚ．）を用いたうどん粉病（Ｏｉｄｉｕｍ  ａｎｄ  Ｏｉｄｉｏｐｓｉｓ）白カビに対する処理
６．除草剤：
ａ）発芽前
ｂ）葉が閉じる前（Ｂｅｆｏｒｅ  ｔｈｅ  ｆｏｌｉａｇｅ  ｃｌｏｓｅｓ）。
７．ニンジンハエ媒介生物であるニンジンサビバエ（Ｐｓｉｌａ  ｒｏｓａｅ）に対する処理は作物に行わなかった。
【０２０４】
使用したトライアルマップを図１８に示す。このフィールドマップに示されているように、２つの異なる処理（Ｔ１及びＴ２）及びコントロール群を使用した。各々の試験処理は以下の２つの異なる種類のパーライト顆粒の施用からなっていた。
ａ）活性化剤の乳化した混合物に浸した顆粒、この混合物は表ＸＩＩに示す活性化剤を含んでいた：
【０２０５】
【表１４】
2019533009.tif 000022
【０２０６】
次いで、浸した顆粒を乾燥し、（噴霧により）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）制御放出ポリマーで被覆する。２つの異なる処理（Ｔ１及びＴ２）は調製した顆粒のポリマー濃度の点で異なる：
Ｔ１：１０％（ｗ／ｗ）
Ｔ２：２０％（ｗ／ｗ）
【０２０７】
ｂ）枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（５００ｍｌの水中に混合した１．２５ｇのＳｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）粉末）に浸した顆粒。乾燥した後、顆粒を上に記載した活性化剤を含有する顆粒と同じ制御放出ポリマーで噴霧被覆する。使用した２つの処理方法の各々で、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）顆粒は次のポリマー濃度を有していた：
Ｔ１：５％（ｗ／ｗ）
Ｔ２：１０％（ｗ／ｗ）
【０２０８】
各々の処理列に、活性化剤を含有する顆粒を２０個、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含有する２０の顆粒（それぞれ上記（ａ）及び（ｂ））を各々の１ｍの列に３つずつ加えた（すなわち各顆粒タイプを２０×３＝６０個）。
【０２０９】
野外研究で使用したさまざまな処理を表ＸＩＩＩに要約して示す：
【０２１０】
【表１５】
2019533009.tif 000023
【０２１１】
コントロール列は処理物質（活性化剤又は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））も制御放出コーティングも含有しないパーライト顆粒で処理した。
【０２１２】
結果：
植物の葉と発育中のニンジンの両方の状態を試験期間中ずっとモニターした。
【０２１３】
葉：
播種の５ヵ月後、３つの群（コントロール、処理Ｔ１、処理Ｔ２）の各々において、カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）の存在により悪影響を受けた植物の百分率を評価し、平均の結果を計算し、図１９に示す。この図から分かるように、処理方法Ｔ２は悪影響を受けた葉をもつ植物の百分率の顕著な低下を引き起こした（コントロール植物の４０．６％に対してＴ２群は２６．１％）。この差は統計的に有意であることが判明した（ｐ＜０．０５）。
【０２１４】
ニンジン：
カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）感染の存在により悪影響を受けたニンジンの平均数を、３つの群の各々について計算した。図２０から分かるように、影響を受けたニンジンの平均数は、Ｔ１及びＴ２方法の両方でコントロール群と比較して有意に低下した。
【０２１５】
結論：
この予備的な研究は、本発明の組成物を含有する顆粒状の製剤で成長中のニンジン植物を処理すると、カンキツグリーニング病菌（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）感染により引き起こされた損傷を含有する植物及びニンジンの両方の数を有意に低下させることを立証している。
【０２１６】
［実施例１６］
ミツバチの生存に対する本発明の組成物の効果の予備的な研究
序：
近年、ミツバチ（主としてセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）種）の数の劇的な減少が観察されている。農業及び園芸に関するミツバチの重要性のため、この現象（峰群崩壊症候群として知られる）は、その活動分野に厳しい結果をもたらしている。峰群崩壊症候群は、コロニーの多数の働きバチの消失により特徴付けられ、通常女王と残りの未成熟のハチの面倒を見る小数だけの看護バチと共に女王が置き去りにされる。峰群崩壊症候群の正確な原因はまだ最終的に知られていないが、ことによると（ウィルス性感染症の媒介生物として行動する）ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ）のようなダニによる寄生を伴うかもしれないウィルス及び／又は菌類の感染が主要な役割を果たしている可能性がある。例えば、ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ）のような破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）ダニはミツバチコロニーに対して極めて破壊的であり、これは少なくとも部分的に、媒介され得るチヂレバネウィルス及び急性ミツバチ麻痺ウィルスを始めとするウィルスに起因することが知られている。イスラエル急性麻痺ウィルスを含めて他のウィルスもこの現象に関係している。また、ノゼマ微胞子虫（Ｎｏｓｅｍａ  ａｐｉｓ）及びノゼマ原虫（Ｎｏｓｅｍａ  ｃｅｒａｎａｅ）のようなある種の真菌種が、峰群崩壊症候群に至る発病過程に関係している可能性があることを示す証拠もある。最後に、少なくとも１つの主要な研究によって、ウィルス性（イリドウィルス６型）及び真菌性（ノゼマ原虫（Ｎ．ｃｅｒａｎａｅ））の作用物質の組合せがこの現象の発症に関与している可能性があることが判明している。
【０２１７】
本研究において、本発明者らは、広いスペクトルの抗菌活性を有する本発明の抗菌性組成物が、ミツバチの喪失を阻止又は予防することができるのではないかと仮定した。
【０２１８】
方法：
この研究は、スペイン、Ｅｘｔｒｅｍａｄｕｒａ地方のＣａｍｉｎｏｍｏｒｉｓｃｏに設置した７対のハチの巣を用いて行った。各対の１つの巣（「巣番号−Ａ」と名付けた）を本発明の組成物で処理した。他の巣（「巣番号−Ｂ」と名付けた）は、前記組成物で処理しなかったがミツバチの巣に日常的に施される日常の慣習的維持管理処理をし続けたのでコントロールとして働かせた。
【０２１９】
試験巣（「Ａ」）を処理するのに使用した組成物は次の成分を含む：
ａ）油相
スクラレオール９８％            ８．００ｇ
ノートカトン９８％            １６．００ｇ
ＣＢＤ  ３％                  １６．００ｇ
ＡＬＤＯ  ＭＯ、ＨＬＢ＝２    ３０．６１ｇ
ＭＣＴ                        ６８．００ｇ
エタノール                    １２．２５ｇ
ｂ）水相
Ｔｗｅｅｎ  ８０            １７０．１０ｇ
ナリンギン９８％                ８．００ｇ
ステビア６％                  １４．００ｇ
水                          ６５７．０４ｇ
（２つの相の総重量：１０００ｇ）
【０２２０】
２つの相を互いに混合してエマルションを形成した。
【０２２１】
次いで３００ｇのエマルションを、２０ｍｌの水に懸濁した２０ｇの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）製剤Ｓｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）と共に混合した。次にさらに８０ｍｌの水を加えて、４００ｍｌの処理溶液を得た。次いでこの処理溶液を２つのロット：すなわちハチの処理用の３００ｍｌ、及び幼虫の処理用の１００ｍｌに分割した。
【０２２２】
３００ｍｌの前記溶液をハチ飼料製剤（８５０ｍｌの蜂蜜と混合した３００ｍｌの蒸留水）に加えることによって、処理溶液を巣「Ａ」の成虫のハチに施した。
【０２２３】
１００ｍｌの前記溶液を幼虫飼料製剤（８０ｇの蜂蜜中に混合した４８０ｇの花粉）に加えることによって、処理溶液を巣「Ａ」のハチ幼虫に施した。
【０２２４】
各々のハチの巣は１０個のトレイを含有し、各々のトレイはウェル列を備えており、そのいくつかは成虫のハチを含有し、他はハチ幼虫を含有していた。試験の初め、次にその後１４、２８、４２及び６２日目に、巣の中のハチ集団に対する処理の影響を解明するために、これらのトレイ内の成虫のハチ及び幼虫の数を評価して集団インデックスを得た。
【０２２５】
結果：
１対の巣（他の理由からコロニーの全てが死んだ５Ａ及び５Ｂ）を除いて、成虫のハチ及び幼虫の数に関するデータが７対の巣から得られた。結果を図２１（幼虫）及び２２（成虫のハチ）に要約して示す。これらの図から分かるように、本発明の組成物による処理では（巣「Ａ」）、未処理コントロールのハチの巣（巣「Ｂ」）よりも多数の幼虫及び成虫のハチの両方の生存が見られた。
【０２２６】
したがって、本発明の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び活性化剤の混合物は、ミツバチ集団の低減を予防するか又は逆転させるのに有効であると結論できる。
【０２２７】
［実施例１７］
牛乳中の体細胞数に対する本発明の組成物の効果
序：
牛乳の高い体細胞数は、酪農業で感染症の可能性の指標として使用されており、食品製造において消費及び使用のためのミルクとして不適格とされる。したがって高い体細胞数は牛乳生産業者にとってミルクを捨てる必要が生じる結果として直接金銭的損失を招き得る。加えて、生産者は罰金を払わなければならないこともあり得る。また、いくつかの地方では、高い体細胞数の２つの報告の結果、卸業者が影響を受けた生産者からのさらなるミルクの供給の受け取りを拒絶することがある。
【０２２８】
方法：
乳中に既に高まったレベルの体細胞が存在すると確認された６頭のウシを各々次の局所ゲル製剤の１つで処理した：
１．市販のクリーム製剤（イスラエルＡｒａｄのＳｅａ  ｏｆ  Ｓｐａにより製造された、コムギクリームオイルで富化されたＢｉｏ  Ｓｐａ）中に５％水中油エマルションを含有するゲル（２頭のウシ）。
２．市販のＡｌｏｅ−Ｖｅｒａクリーム中に５％水中油エマルションを含有するゲル（２頭のウシ）。
３．製剤（１）に対するクリームのみのコントロール（１頭のウシ）。
４．製剤（２）に対するクリームのみのコントロール（１頭のウシ）。
【０２２９】
本発明の組成物を含有するエマルションは、別々の油相及び水相として調製し、次いでこれらを合わせた。エマルションの組成を次の表に示す：
【０２３０】
【表１６】
2019533009.tif 000024
【０２３１】
０．５ｇのＳｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）粉末を９９．５ｇの上記エマルションに加えて処理乳剤を作り、次いでこれを上に記載した２つのクリーム製剤の各々に５％の濃度で加えた。
【０２３２】
処理は、搾乳の直後に５ｍｌのゲルでウシの乳首を覆うことによって行った。
【０２３３】
ウシは一日二回搾乳しクリーム製剤で処理した。
【０２３４】
試験開始前並びに１５日及び２１日後分析のために体細胞サンプルを集めた。
【０２３５】
結果：
試験に含ませた６頭のウシの各々の乳中の体細胞の数を表ＸＶに示す：
【０２３６】
【表１７】
2019533009.tif 000025
【０２３７】
これらの結果は、本発明の組成物で処理した４頭のウシの３頭から採った乳サンプル中の体細胞の数の劇的な減少を明らかに示している。この減少は試験の開始から２１日目に特に明白であった。本発明の組成物で処理したウシの１頭では（ウシ番号９８９）、結果は他の３つの試験サンプルと同じような劇的な変化を示さなかったが、それでも体細胞数の有意な減少がある（出発値の約２５％）。
【０２３８】
これらの結果が示しているように、農業で使用される畜牛及びその他の乳を生産する動物において、予防の局所処理として本発明の組成物を用いて乳中の体細胞の数を制御することができる。
【０２３９】
［実施例１８］
野外研究：本発明の組成物によるヒヨコマメ種子の直接被覆
序：
イスラエルでのヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  Ｌ）の通常の播種期は、主として２つの土壌伝染性の真菌病原体アスコキタ・ラビエイ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｒａｂｉｅｉ）及びフザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．シセロ（フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｃｉｃｅｒｏ）に直面する問題のため２月初めである。現存するヒヨコマメの品種はこれらの病原体が存在する結果としてイスラエルの冬を越すことができない。
【０２４０】
この研究の目的は、本発明の組成物によるヒヨコマメ種子の直接被覆のヒヨコマメ植物の生存率に対する影響を検討することであった。
【０２４１】
方法：
ヒヨコマメを乳剤Ａ（本発明の組成物−下記参照）で被覆し、その後制御放出ポリマー（Ｅ６０３、Ｓｅｋｉｓｕｉ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、日本）で被覆した。
【０２４２】
乳剤Ａは次の成分から調製した：
Ｓｅｒｅｎａｄｅ（Ｒ）      ０．０２１グラム
スクラレオール          ０．０３４グラム
ナリンギン              ０．０３４グラム
ノートカトン            ０．０３４グラム
ステビア                ０．００３グラム
ＣＢＤ                  ０．００１グラム
Ｔｗｉｎ  ８０          ０．７２３グラム
Ｐｏｌｙａｌｄｏ        ０．１３０グラム
ＭＣＴ                  ０．２８９グラム
ＥＴＯＨ                ０．０５２グラム
水                      ２．９２９グラム
【０２４３】
次に、ヒヨコマメ種子（品種１３、平均重量０．５ｇ／種子）の３つの異なるロットを調製した：
ロットＡ：流動床塗工機を用いて、７０００のヒヨコマメを１．２５ｇの乳剤Ａ（水で４０ｍｌに希釈）で被覆した。続いて、乳剤被覆した種子を４２５ｇのポリマーＥ６０３で被覆した。
ロットＢ：使用した乳剤Ａ（水で４０ｍｌに希釈する前）の量が２．５ｇであった以外はロットＡと同様に７０００のヒヨコマメを処理した。乳剤被覆した種子をロットＡと全く同じ制御放出ポリマーで被覆した。
コントロール：３０００のヒヨコマメを被覆しないままとし、他にいかなる処理もしなかった。
【０２４４】
重粘土を含有し、イスラエルのＮａｈａｌａｌに位置する試験区画（総面積１０００平方メートル）に、２０１６年９月１５日、上に記載した３つの異なるロットに割り当てて合計１７０００の品種１３の種子（種子当たり平均重量０．５ｇ）を蒔いた。この畑は、過去の経験からフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）にひどく汚染されたことが知られていた。
【０２４５】
結果：
さまざまな処理の成功その他は、各々の処理区域のヒヨコマメの収量を測定し、次にその重量をＫｇ／ドゥナム（１０００ｍ２）に外挿することによって決定した。さまざまな処理の結果を次の表に要約して示す：
【０２４６】
【表１８】
2019533009.tif 000026
【０２４７】
これらの結果から分かるように、本発明の組成物及び放出制御コーティングで被覆された種子を含有するロット（すなわちロットＡ及びＢ）の両方で、未処理コントロールと比較して増大したヒヨコマメの収量が得られた。最大の収量増大は、ロットＡの種子と比較して二倍の量の本発明の組成物で被覆したロットＢの種子で見られた。
【０２４８】
これらの結果が示しているように、本発明の組成物による農業上の種子の直接被覆は、発育中の実生が病原体の土壌伝染性の微生物による感染に耐えることを可能にすることができる。この効果は用量依存的なようである。
【０２４９】
［実施例１９］
プロバイオティック細菌の混合物と組み合わせたさまざまな活性化剤の殺真菌及び殺細菌活性
この研究では、プロバイオティック抗細菌種の混合物を１種以上の活性化剤と組み合わせて使用して、かかる種が前記活性化剤と組み合わせて、上で報告された細菌種が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるときに本発明者により見られたのと同じ効果を有するかどうかを検討した。
【０２５０】
方法：
この研究では、活性化剤と組み合わせて使用する細菌混合物が、イスラエルでＡｌｔｍａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌｔｄ．により流通させられている商業的プロバイオティック製品である「Ｊａｒｒｏ  Ｄｏｐｈｉｌｕｓ」である。
【０２５１】
この製品の細菌含量は、表ＸＶＩＩに示す通りである：
【０２５２】
【表１９】
2019533009.tif 000027
【０２５３】
濃度０．５％Ｗ／Ｗのこのプロバイオティック製品を、上に挙げた他の実施例で使用した枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）製剤の代わりに使用した。このプロバイオティック混合物と５種までの活性化剤との組合せを、上の実施例１に記載したようにして、先の実施例に記載したのと同じ濃度（濃度３及び４）で試験した。したがって、この研究と上記実施例１に報告したものとの唯一の違いは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をプロバイオティック細菌の混合物に替えたことだけである。
【０２５４】
結果：
下記表ＸＶＩＩＩＡ−Ｃに見られるように、このプロバイオティック細菌の混合物を組成物の細菌成分として用いて得られた結果は、上記実施例１に報告された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含有する混合物で得られたものと本質的に同じであった。これらの表に示す結果は、濃度４で使用した活性化剤を含有する組合せに対するものである。
【０２５５】
【表２０】
2019533009.tif 000028
【０２５６】
【表２１】
2019533009.tif 000029
【０２５７】
【表２２】
2019533009.tif 000030
【０２５８】
結論：この研究で使用したプロバイオティック細菌の混合物は、上で報告された抗菌活性の研究における枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と同じように機能するように見え、したがって本発明の組成物及び方法において前記枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と替えることができる。
【０２５９】
［実施例２０］
プロバイオティック細菌の混合物と組み合わせたさまざまな活性化剤を用いたトウモロコシの実生の接種
この研究では、接種混合物（すなわち本発明の組成物）が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の代わりに実施例１９に記載したプロバイオティック混合物「Ｊａｒｒｏ  Ｄｏｐｈｉｌｕｓ」を含んでいた以外は上記実施例１０に記載したのと同じようにしてトウモロコシの種子に接種した。
【０２６０】
結果：
次の表は、濃度４の活性化混合物で行った接種の結果を示す：
【０２６１】
【表２３】
2019533009.tif 000031
【０２６２】
これらの結果から分かるように、この研究で使用したプロバイオティック混合物は、表ＸＩＸに示されている活性化剤と組み合わせてトウモロコシ種子に施したとき、非病原性の細菌種が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であった組成物（実施例１０）とほぼ同様に、かつ同じ程度に発育中のトウモロコシ実生を保護することができた。
【図１】
2019533009.tif 000032
【図２】
2019533009.tif 000033
【図３】
2019533009.tif 000034
【図４】
2019533009.tif 000035
【図５】
2019533009.tif 000036
【図６】
2019533009.tif 000037
【図７】
2019533009.tif 000038
【図８−１】
2019533009.tif 000039
【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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