(57)【要約】試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性の分析のための方法およびシステムが開示される。本明細書において開示される方法およびシステムは、患者における血栓性血小板減少性紫斑病の診断のために有用であり得る。上記の方法およびシステムは、質量分析および／または液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＡＤＡＭＴＳ１３を測定する方法を含み得る。
2019532649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の酵素活性を決定するための方法であって、
（ａ）酵素的切断産物を生成するために、前記試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；
（ｂ）前記切断産物の多価気相イオンを作製するために、前記酵素的切断産物をイオン化するステップ；および
（ｃ）前記試料中の酵素的切断産物の存在または量を決定するために、前記多価気相イオンを質量分析によって分析するステップであって、前記試料中の前記酵素的切断産物の産物の存在または量が前記試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の存在または量を示す、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の後でステップ（ｂ）の前に、前記酵素的切断産物を部分的に精製するステップをさらに含み、ステップ（ｂ）が部分的に精製された前記酵素的切断産物に対して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素的切断産物を部分的に精製する前記ステップが遠心分離を含み、ステップ（ｂ）が前記酵素的切断産物を含む上清に対して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素的切断産物を部分的に精製する前記ステップが、前記酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動および固相抽出またはろ過のうちの１つまたは複数を含み、ステップ（ｂ）が前記溶出物に対して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素的切断産物を部分的に精製する前記ステップが、前記酵素的切断産物を含む保持画分を生成するろ過を含み、ステップ（ｂ）が前記保持画分に対して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素的切断産物を部分的に精製する前記ステップが、前記酵素的切断産物のアフィニティー濃縮の使用を含み、ステップ（ｂ）がアフィニティー濃縮された前記酵素的切断産物に対して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記アフィニティー濃縮技術が、固定化金属アフィニティーレジン、抗体、抗体断片、ストレプトアビジン、プロテインＧ、プロテインＡまたはアプタマーのうちの１つまたは複数を使用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）と（ｂ）の間で、任意選択の部分的精製ステップの前に、インキュベートされている前記試料中の前記酵素的切断を終結させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記終結させるステップが、インキュベートされている前記試料に沈殿試薬を添加すること；インキュベートされている前記試料のｐＨをｐＨ５未満またはｐＨ９を超えるように調整すること；インキュベートされている前記試料を摂氏５０度を超える温度に加熱すること；インキュベートされている前記試料を摂氏１５度未満の温度に冷却すること；またはインキュベートされている前記試料にＡＤＡＭＴＳ１３の阻害剤を添加することのうちの１つまたは複数を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記外来性ペプチド基質が、配列番号３に対して少なくとも７０％配列類似性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素的切断産物が配列番号４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および大気圧光イオン化のうちの少なくとも１つを含むイオン化技術を使用して前記酵素的切断産物をイオン化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析するステップ（ｃ）がタンデム質量分析を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析するステップ（ｃ）が、６０２．８±２、１８２．１±２、２８１．１±２、４６２．７±２、５１２．３±２、６００．３±２、６０５．３±２、８１１．４±２、９２４．５±２および１０２３．５±２のうちの少なくとも１つを含む質量／電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析するステップ（ｃ）が、前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
内部標準が、次の時点：（ｉ）ステップ（ａ）の前；（ｉｉ）ステップ（ａ）の際；または（ｉｉｉ）ステップ（ａ）の後でステップ（ｂ）の前のうちのいずれか１つで前記試料に添加され、前記内部標準の存在または量が、ステップ（ｃ）における前記酵素的切断産物の存在または量と共に決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記内部標準の存在または量が、ステップ（ｃ）における前記酵素的切断産物の存在または量と共に決定され、前記内部標準が前記酵素的切断産物の同位体標識等価物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記内部標準の決定された量と前記酵素的切断産物の決定された量との間の比が、ステップ（ａ）において形成された前記酵素的切断産物の量および／または前記試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、患者から得られた生体液の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体液が血漿または血清である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）と（ｂ）との間で、前記任意選択の部分的精製ステップの前または後のいずれかで前記終結ステップの後に、前記酵素的切断産物の分子構造を改変するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記改変するステップが、前記酵素的切断産物を加水分解するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記加水分解が酵素または化学試薬を使用して行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記加水分解が、トリプシン、ペプシン、ＬｙｓＣ、ギ酸または臭化シアンのうちの少なくとも１つを使用して行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素的切断産物が前記改変するステップの際に誘導体化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記誘導体化が、酵素により触媒される誘導体化または化学的付加である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の前記活性の量を述べる報告を作成するステップをさらに含み、前記試料が患者から得られ、前記報告が、前記患者におけるトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性の低下に関連する疾患または状態の診断に有用である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患または前記状態が血栓性血小板減少性紫斑病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性の量を決定するための方法であって、
（ａ）未標識切断産物ペプチドを形成するために、前記試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質および切断産物ペプチドの同位体標識等価物と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；
（ｂ）インキュベートされている前記試料中の前記酵素的切断を終結させるステップ；
（ｃ）酵素的切断産物および内部標準を前記試料の他の構成成分から部分的に精製するステップ；および
（ｄ）前記試料中の酵素的切断産物および前記内部標準の量を決定するために、部分的に精製された前記酵素的切断産物および前記標準を質量分析によって分析するステップであって、前記酵素的切断産物と前記内部標準との決定された量の比が前記試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を示す、ステップ
を含む方法。
【請求項３０】
対象における血栓性血小板減少性紫斑病を診断するための方法であって、
（ａ）酵素的切断産物を生成するために、前記対象から取得された試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；
（ｂ）前記切断産物の多価気相イオンを作製するために、前記酵素的切断産物をイオン化するステップ；および
（ｃ）前記試料中の酵素的切断産物の存在または量を決定するために、前記多価気相イオンを質量分析によって分析するステップであって、前記試料中の前記酵素的切断産物の産物の存在または量が前記試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の存在または量を示す、ステップ
を含み、
正常値の１０％未満のＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルが、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を高度に示す、
方法。
【請求項３１】
試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性を決定するためのシステムであって、
（ａ）酵素的切断産物を生成するために、前記試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするためのステーション；
（ｂ）前記切断産物の多価気相イオンを作製するために、前記酵素的切断産物をイオン化するためのステーション；および
（ｃ）前記試料中の前記酵素的切断産物の存在および／または量を決定するために、前記多価気相イオンを質量分析によって分析するためのステーションであって、前記酵素的切断産物の量が前記試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の前記活性を示す、ステーション
を含むシステム。
【請求項３２】
液体クロマトグラフィーを使用して前記酵素的切断産物をクロマトグラフィーで分離するためのステーションをさらに含む、請求項３１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１０月１１日に出願された米国仮出願番号第６２／４０６，６９３号の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、患者における血栓性血小板減少性紫斑病の診断のために有用である可能性がある、ＡＤＡＭＴＳ１３（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｍｏｔｉｆ，ｍｅｍｂｅｒ  １３：トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３）の活性を決定するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、微小血管において血栓が形成される原因となる血液障害である。これは、低血小板数（血小板減少症）を生じる一方で、血栓は腎臓、心臓および脳を含む多数の器官を損傷する場合がある。処置をしないとＴＴＰについての致死率は、約９０％である。典型的な処置は血漿交換であり、６カ月での致死率を約１０％に低減する。
【０００４】
ＴＴＰの大部分の症例は、血中糖タンパク質フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）を特異的に切断するプロテアーゼであるＡＤＡＭＴＳ１３の活性の低下によって生じる。ＡＤＡＭＴＳ１３は、高せん断応力の循環条件下でｖＷＦをチロシン１６０５とメチオニン１６０６との間で特異的に切断する。ＡＤＡＭＴＳ１３は、フォン・ウィルブランド因子切断プロテアーゼとも称される。ＡＤＡＭＴＳ１３活性の先天性および後天性（自己免疫性）の両方の欠損は、正常血漿において見出される小さな多量体よりもさらに血小板接着性である、著しく大きなｖＷＦ因子多量体の存在によって特徴付けられ、ＴＴＰを生じる。
【０００５】
大部分のＴＴＰ症例は、特発性であり、循環からのＡＤＡＭＴＳ１３のクリアランスの増加を通じて循環中の機能的酵素レベルを低減する、またはＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質分解活性の阻害を方向付ける、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体に関連しているが、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体は、先天性欠損を有する患者においては通常検出されない。研究は、ＡＤＡＭＴＳ１３に対するＩｇＧ特異的自己抗体についての定量的イムノアッセイが、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体を検出するための機能性（即ち、阻害）アッセイよりさらに感受性であることを示した。
【０００６】
症候的に、ＴＴＰは、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、全身にわたる微小血管中の血栓の形成によって特徴付けられ、微小血管症性溶血性貧血および血小板減少症を生じる場合がある。ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定は、異なる潜在的原因を有する臨床的に類似している多数の状態からＴＴＰを識別することに役割を果たすことができる。妊娠、臓器移植およびある特定の薬物療法に関連する場合があるこれらの症候群は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルに顕著な低減を一般に示さない。溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）は、ＴＴＰに臨床的に類似しているが、急性腎不全に関連する。下痢関連ＨＵＳは、多くの症例の原因であり、通常、志賀毒素産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｏ１５７：Ｈ７）への感染によって生じる。下痢陰性または非定型的ＨＵＳ（ａＨＵＳ）は、小児および成人の両方において生じる管理されていない補体の活性化によって生じると考えられており、ＴＴＰと多くの臨床的特徴を共有している；しかし、ａＨＵＳはＡＤＡＭＴＳ１３活性の重度の低減（即ち、＜１０％）を伴わない。確かに、アップショー・シュールマン症候群とも称される先天性ＡＤＡＭＴＳ１３活性欠損は、正常ＡＤＡＭＴＳ１３活性の１０％未満のＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルを伴う常染色体劣性障害である。臨床的特徴だけに基づく疾患分類は信頼できない場合があり、不適切な処置または有効な処置の開始に遅れを生じる場合がある。したがって、血小板減少症および微小血管性溶血の実験室的証拠を呈している患者では、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定は、他の臨床的に類似している状態からＴＴＰを識別するために重要である可能性がある。
【０００７】
一般に、臨床症状に基づいてＴＴＰが疑われる場合には、その症状の激しさおよび重症度のために救命全血漿交換（ＴＰＥ）治療がＡＤＡＭＴＳ１３活性検査の前に開始される。多くの症例においてＴＰＥは、正常なＡＤＡＭＴＳ１３活性検査結果が得られた場合に停止される。このため迅速なＡＤＡＭＴＳ１３検査結果が得られるほど、より迅速にＴＰＥ治療を停止でき、それは１）（不必要な）ＴＰＥ治療に関連する費用を低減し、２）臨床医が症状についての代替原因、およびそれにより適切な治療に注目できるようにする（Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｎ．  Ｔ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２０１６年、５６巻（２号）、３５４〜３５９頁）。
【０００８】
したがって、ＴＴＰについてのリスクがあるまたはそれを有すると疑われる個体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための臨床検査の改善に対する必要性がある。費用効率がより高く、それにより、より高頻度での検査を可能にし、さらに迅速に検査結果を臨床医に提供もする臨床検査の改善に対する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｎ．  Ｔ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２０１６年、５６巻（２号）、３５４〜３５９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要旨
本発明は、患者におけるＴＴＰの診断のために有用であり得るＡＤＡＭＴＳ１３の活性を決定するための方法およびシステムを提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、質量分析および／または液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってＡＤＡＭＴＳ１３を測定する方法を含む。
【００１１】
例えば、一部の実施形態では、本発明は、試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有するＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性を決定するための方法であって、（ａ）酵素的切断産物を生成するために、試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；（ｂ）切断産物の多価気相イオンを作製するために、酵素的切断産物をイオン化するステップ；および（ｃ）試料中の酵素的切断産物の存在または量を決定するために、多価気相イオンを質量分析によって分析するステップであって、試料中の酵素的切断産物の産物の存在または量が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の存在または量を示す、ステップを含む方法を含む。  
【００１２】
ある特定の実施形態では、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を決定するための方法であって、（ａ）試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質および試料に対する産物ペプチドの同位体標識等価物と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；（ｂ）インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップ；（ｃ）液体クロマトグラフィーまたは他の精製技術を使用して酵素的切断産物および内部標準を試料の他の構成成分から部分的に精製するステップ；および（ｄ）試料中の酵素的切断産物および内部標準の量を決定するために、部分的に精製された酵素的切断産物および標準を質量分析によって分析するステップであって、酵素的切断産物と内部標準との決定された量の比が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を示す、ステップを含む方法を含み得る。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性を決定するためのシステムであって、（ａ）酵素的切断産物を生成するために、試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするためのステーション；（ｂ）切断産物の多価気相イオンを作製するために、酵素的切断産物をイオン化するためのステーション；および（ｃ）試料中の酵素的切断産物の存在および／または量を決定するために、多価気相イオンを質量分析によって分析するためのステーションであって、酵素的切断産物の量が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性を示す、ステーションを含むシステムを含み得る。一部の実施形態では、システムは、酵素的切断産物を部分的に精製するためのステーションをさらに含み得る。一部の実施形態では、システムは、液体クロマトグラフィーを使用して前記酵素的切断産物をクロマトグラフィーで分離するためのステーションを含み得る。
【００１４】
本発明の方法およびシステムの両方は、様々な実施形態を含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、本方法は、インキュベーションのステップの後でイオン化のステップの前に、イオン化のステップが部分的に精製された酵素的切断産物に対して行われるように酵素的切断産物を部分的に精製するステップを含み得る。ある特定の実施形態では、システムは、そのようなステップを行うためのステーションを含んでもよい。
【００１５】
ある実施形態では、酵素的切断産物を部分的に精製するステップが遠心分離を含み、イオン化のステップが酵素的切断産物を含む上清に対して行われる。追加的かつ／または代替的に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップは、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、液体クロマトグラフィーを含むことができ、イオン化のステップは溶出物に対して行われる。追加的かつ／または代替的に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップは、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、キャピラリー電気泳動を含むことができ、イオン化のステップは溶出物に対して行われる。追加的かつ／または代替的に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップは、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、固相抽出を含み、イオン化のステップは溶出物に対して行われる。追加的かつ／または代替的に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップは、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、ろ過を含み、イオン化のステップは溶出物に対して行われる。追加的かつ／または代替的に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップは、酵素的切断産物を含む保持画分を生成するろ過を含み、イオン化のステップは保持画分に対して行われる。追加的かつ／または代替的に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップは、酵素的切断産物のアフィニティー濃縮の使用を含み、イオン化のステップはアフィニティー濃縮された酵素的切断産物に対して行われる。ある特定の実施形態では、アフィニティー濃縮技術は、固定化金属アフィニティーレジンを使用する。例えば様々な実施形態では、アフィニティー濃縮技術は、抗体またはＦａｂ断片など抗体の断片を利用することもできる。またはアフィニティー濃縮技術は、ストレプトアビジンを利用することもできる。またはアフィニティー濃縮技術は、プロテインＧもしくはプロテインＡを利用することもできる。またはアフィニティー濃縮技術は、アプタマーを利用することもできる。
【００１６】
ある特定の実施形態では、方法およびシステムは、分析および／または部分的な精製の前にインキュベーションを終結させるためのステップを含む。例えばある特定の実施形態では、方法および／またはシステムは、インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップ（またはそのようなステップを実施するためのステーション）を含んでもよい。ある特定の実施形態では、終結させるステップは、インキュベートされている試料に沈殿試薬を添加することを含んでもよい。様々な沈殿試薬を使用することもできる。これにより代替的実施形態では、沈殿試薬は、メタノール、および／またはアセトニトリル、および／またはアセトン、および／または２−プロパノール、および／または硫酸、および／またはトリクロロ酢酸、および／または過塩素酸を含んでもよい。ある特定の実施形態では、反応の終結は、酵素が機能的であるための好適な範囲を外れた範囲にｐＨを変化させることによって行われる。例えば、終結させるステップは、インキュベートされている試料のｐＨをｐＨ５未満にまたは代替的にｐＨ９を超えるように調整することを含み得る。ある特定の実施形態では、終結させるステップは、酵素が機能的であるために好適な範囲の外の範囲に温度を調整することを含み得る。例えば、終結させるステップは、インキュベートされている試料を摂氏５０度を超える温度に加熱すること、または代替的にインキュベートされている試料を摂氏１５度未満の温度に冷却することを含み得る。ある特定の実施形態では、終結させるステップは、インキュベートされている試料にＡＤＡＭＴＳ１３の阻害剤を添加することを含み得る。例えば、一実施形態では、阻害剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり得る。
【００１７】
反応において使用される基質は、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性の測定を可能にするように設計されている。ある特定の実施形態では基質は、フォン・ウィルブランド因子Ａ２ドメイン（ｖＷＦ  Ａ２ドメイン）またはその一部を含む。一実施形態では、外来性ペプチド基質は、ｖＷＦアミノ酸配列またはその一部に少なくとも７０％配列同一性を有する。ある特定の実施形態では基質は、機能的ＡＤＡＭＴＳ１３切断部位を含む。一実施形態では基質は、機能的ＡＤＡＭＴＳ１３エキソサイトを含む。一実施形態では基質は、外来性ペプチドを含む。外来性ペプチドは、合成ペプチドであってもよい。例えば、一実施形態では外来性基質は、ｖＷＦ７３（配列番号３）のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％配列類似性を有する合成ペプチドである。一実施形態ではペプチドは、配列番号３である。
【００１８】
一部の実施形態では、合成ペプチド基質が１つまたは複数のアフィニティータグを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアフィニティータグが、ＭＹＣ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ポリＨｉｓ−タグまたはＧＳＴ−タグからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアフィニティータグは抗体に対するエピトープを含有する。追加的かつ／または代替的に、外来性ペプチド基質が１つまたは複数の非天然アミノ酸を含んでもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の非天然アミノ酸はビオチン化されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の非天然アミノ酸は安定同位体標識されたアミノ酸である。
【００１９】
基質は、ＡＤＡＭＴＳ１３とのインキュベーションにおいて、２つの小さなペプチドに切断される。生じる産物は、外来性基質として使用されるペプチドに依存する。例えば、配列番号３の外来性基質（またはＮ末端に追加的なまたはより少ないアミノ酸を有する基質）を使用すると、酵素的切断産物は、ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹ（配列番号４）の配列を有するペプチドを含み得る。基質ペプチドのＣ末端に追加的アミノ酸がある場合に他の産物が形成される可能性があることが企図される。
【００２０】
イオン化ステップは、多価（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）イオンの形成を生じる。ある特定の実施形態では、イオン化のステップは、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化または大気圧光イオン化などのイオン化技術を使用して酵素的切断産物をイオン化することを含む。イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および大気圧光イオン化からなる群から選択され得る。
【００２１】
分析するステップは、イオン化ステップにおいて形成される多価イオンの特徴付けおよび定量を可能にする。ある特定の実施形態では、分析するステップは、ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性を決定することを含む。一部の実施形態では、分析するステップは、タンデム質量分析を使用する。配列番号４の産物を生成するために配列番号３の基質を使用して、分析するステップは、ある特定の実施形態では、６０２．８±２、１８２．１±２、２８１．１±２、４６２．７±２、５１２．３±２、６００．３±２、６０５．３±２、８１１．４±２、９２４．５±２および１０２３．５±２からなる群から選択されるｍ／ｚを有するイオンを使用してもよい。
【００２２】
上に記載のとおり、本発明の方法およびシステムは、内部標準を使用してもよい。一部の実施形態では、内部標準は、イオン化ステップの前に添加される。代替的に内部標準は、基質と同時に添加されてもよい。さらに他の実施形態では、内部標準は、インキュベーションステップの前に試料に添加されてもよい。または内部標準は、インキュベートされている試料に添加されてもよい。ある特定の実施形態では、内部標準の存在または量は、酵素的切断産物の存在または量と共に決定される。ある特定の実施形態では、内部標準の決定された量と酵素的切断産物の決定された量との間の比は、形成された酵素的切断産物の量を示す。一部の実施形態では、内部標準の決定された量と酵素的切断産物の決定された量との間の比は試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性量（例えば、比活性）を示す。
【００２３】
様々な内部標準が使用されてもよい。一部の実施形態では、内部標準は切断産物とは異なるペプチドである。しかし一部の他の実施形態では、内部標準は、酵素的切断産物の同位体標識等価物である。
【００２４】
様々な生物学的試料が使用されてもよい。ある特定の実施形態では、試料は、患者から得られた生体液である。例えば生体液は、血漿または血清であってもよい。または他の種類の生体液（例えば、唾液、痰、汗、脳脊髄液）は、使用されてもよい。
【００２５】
一部の実施形態では、方法およびシステムは、任意選択の部分的な精製ステップの前または後のいずれかで、終結させるステップ後に、インキュベートされている試料中の酵素的切断の分子構造を改変するステップ（および／またはそのようなステップを行うためのステーション）を使用する場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、改変ステップは、酵素的切断産物を加水分解することをさらに含んでもよい。例えば、加水分解は、酵素を使用して行われてもよい。ある特定の実施形態では、酵素は、トリプシン、ペプシンまたはＬｙｓＣの内の１つであってもよい。または他の酵素が使用されてもよい。他の実施形態では、加水分解は、化学試薬を使用して行われてもよい。例えば化学試薬は、ギ酸または臭化シアンの内の１つであってもよい。または他の化学的試薬が使用されてもよい。一部の実施形態では、酵素的切断産物は、誘導体化されてもよい。例えば、一部の実施形態では、誘導体化は、酵素により触媒される。または誘導体化は、化学的付加を含んでもよい。
【００２６】
これらおよび他の実施形態は、本明細書に記載される。
【００２７】
本発明は、続く非限定的な図面を参照することによってより良好に理解され得る。図面は、本発明のある特定の実施形態および／または特徴を例示するものであり、本発明の任意の記述（単数または複数）を補うものである。図面は、書かれた記述がその通りであることを明らかに示さない限り、本発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ｖＷＦ（配列番号１）の部分的アミノ酸配列ならびに下線を付けたＡＤＡＭＴＳ１３のための切断部位および斜字体で示されたエキソサイトを含むｖＷＦのＡ２ドメイン（配列番号２）を示す。
【００２９】
【図２】図２は、下線を付けたＡＤＡＭＴＳ１３のための切断部位および斜字体で示されたエキソサイトを含むｖＷＦのＡ２ドメイン（配列番号２）についてのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
【図３】図３は、下線を付けたＡＤＡＭＴＳ１３切断部位および斜字体で示されたエキソサイトを含むｖＷＦアミノ酸配列に基づくＡＤＡＭＴＳ１３のための合成ポリペプチド基質のアミノ酸配列（配列番号３）、ならびに生じる切断産物のアミノ酸配列（「ＤＲＥペプチド」；配列番号４）を示す。
【００３１】
【図４】図４は、本発明の実施形態によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＤＲＥペプチド（配列番号４）の検出による、ＡＤＡＭＴＳ１３活性のアッセイのためのワークフローの概要を示す。内部標準（配列番号５）も示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（詳細な説明）
以下の記載は、本発明の様々な態様および実施形態を述べたものである。本発明の範囲を限定しようとする特定の実施形態はない。むしろ実施形態は、本発明の範囲内に少なくとも含まれる様々な方法およびシステムの非限定的な例を単に提供するものである。この記載は、当業者の観点から読み取られ、したがって当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。
【００３３】
（略称）
本出願では様々な略称が使用され得る。全てではないとしてもほとんどの場合、そのような略称の意味は当業者に公知である。これらの略称は、下記の略称を含み、その意味を提示する。他の略称は本明細書において定義される。
【００３４】
ＡＤＡＭＴＳ１３＝トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３酵素
ＤＲＥ＝１０アミノ酸ポリペプチド、ｖＷＦ７３の酵素的切断産物として形成され得、配列ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹ（配列番号４）を有する；図３に例示されている。
ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ＝液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析
ＭＳ＝質量分析
ＭＳ／ＭＳ＝タンデム質量分析
ＴＴＰ＝血栓性血小板減少性紫斑病
ｖＷＦ＝フォン・ウィルブランド因子タンパク質（糖タンパク質）
ｖＷＦ７３＝ｖＷＦ残基Ａｓｐ１５９６からＡｒｇ１６６８の天然アミノ酸配列由来の７３アミノ酸残基ポリペプチド（図３に例示される）
【００３５】
（定義）
下記の用語は、他に指示しない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
【００３６】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、他に特に記載しない限り、１つまたは複数を指すことができる。
【００３７】
本出願の全体を通して、「約」という用語は、値が、デバイスに関する誤差の固有のばらつき、値を決定するのに用いられる方法、または研究対象の中に存在するばらつきを含むことを示すのに使用される。
【００３８】
本明細書において使用される「酵素活性」または「酵素的活性」という用語は、参照標準値または正常プール血漿の較正曲線のいずれかと比べたＡＤＡＭＴＳ１３比活性の測定値を指す。用語は、「量」または「レベル」という用語と併せて使用されてもよい。
【００３９】
本明細書において使用される、「エキソサイト」という用語は、切断を開始するために酵素が認識する、ＡＤＡＭＴＳ１３基質の一部を指す。エキソサイトを含まない基質は、一般に酵素によって効率的に認識されない（Ｋｏｋａｍｅら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０３巻：６０７〜６１２頁）。
【００４０】
本明細書で使用される「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語の使用は、医師などの医療専門家に対するいかなる種類の関係も示唆しない。
【００４１】
本明細書で使用される「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」という語句は、試料中の１種または複数の分子または分析物を、試料中のその他の分析物から分離するためのプロセスを指すのに使用される。ＬＣでは、流体の均一性が、微細化された物質のカラム内を移動するにつれて、流体溶液の１種または複数の分析物が遅速化する。遅速化は、１つまたは複数の固定相と移動相との間に混合物の成分が分布することによって起こる。ＬＣには、例えば、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。一部の場合では、ＬＣは、疎水性固定相を、水および／またはメタノールもしくはアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒からなる移動相との組合せで含む逆相ＬＣを指す。一部の場合では、ＬＣは、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、順相液体クロマトグラフィーまたは親水性相互作用クロマトグラフィーを指す場合がある。
【００４２】
本明細書において使用される、「キャピラリー電気泳動」（ＣＥ）という用語は、電場に曝露した際の電解質溶液中のそれらのイオン移動度に基づく、試料中の他の分析物からの試料中の１つまたは複数の分子または分析物の分離のためのプロセスを指す。ＣＥは、例えば、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を含む。
【００４３】
本明細書で使用される「分離する」または「精製する」などの用語は、試料マトリックスからの目的の分析物以外の、全ての材料の除去を指すのに必ずしも使用されない。代わりに、一部の実施形態では、この用語は、試料マトリックス中に存在する１種または複数のその他の成分に比べて目的の１種または複数の分析物の量を豊富にする手順を指すのに使用される。一部の実施形態では、「分離」または「精製」は、例えば質量分析法による分析物の検出を妨げる可能性のある、試料からの１種または複数の成分の量を、除去するまたは減少させるのに使用されてもよい。
【００４４】
本明細書で使用される「質量分析法」または「ＭＳ」という用語は、試料中の分子の同定および／または定量のための技法を指す。ＭＳは、試料中の分子をイオン化して、気相中に荷電分子（イオン）を形成し；それらの質量対電荷比に従って荷電分子を分離し；荷電分子を検出することを含む。ＭＳは、試料中の分子の定性的および定量的検出の両方を可能にする。分子は、当業者に公知の任意の適切な手段によって、イオン化され検出されてもよい。「タンデム質量分析法」または「ＭＳ／ＭＳ」という語句は、本明細書では、試料中の分子の同定および／または定量のための技法であって、１つ超の質量分析法が、複数の質量分析装置を使用して同時にまたは単一の質量分析装置を使用して逐次行われる技法を指すのに使用される。本明細書で使用される「質量分析計」は、分子をイオン化しかつ荷電分子を検出する手段を含む装置である。
【００４５】
本明細書で使用される「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、分子の断片化を回避しながら試料中の分子をイオン化するのに、質量分析法で使用される技法を指す。試料は、エレクトロスプレーによって微細なエアロゾル中に分散される。試料は、溶媒、通常は水と混合された揮発性有機化合物（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）と、典型的には混合されることになる。次いでエアロゾルを、毛管を通して質量分析計に移し、これを加熱して、荷電液滴からのさらなる溶媒蒸発を助けることができる。次に、エアロゾルを、オリフィス（荷電液滴からの溶媒蒸発をさらに助け、最終的に、試料中の分子の気相イオンを形成すために加熱してもよい）を通して質量分析計に移す。
【００４６】
本明細書において使用される、「安定同位体標識」という用語は、所与の原子の非放射性同位体を含む分子を濃縮し、分子内の前記原子の平均質量を変更し、それにより前記分子の平均質量を変更するプロセスを包含する。一般にこれは、天然においておよび天然の分子において高い頻度で見出される軽い同位体（例えば、炭素１２または窒素１４）を、稀な重い同位体（例えば、炭素１３または窒素１５）を用いて置き換えることによって達成される。
【００４７】
本明細書で使用される「四重極分析装置」は、ＭＳで使用されるあるタイプの質量分析装置である。この分析装置は、互いに高度に平行に設定された４個の円形ロッド（２対）からなる。四重極は、当該技術分野で公知のように三連四重極の形式であってもよい。四重極分析装置は、試料の荷電粒子をそれらの質量対電荷比に基づいて組織する機器の構成要素である。当業者なら、四重極分析装置の使用は、結果の高い特異性をもたらすことができることを理解されよう。１対のロッドは正電位に設定され、他方の対のロッドは負電位にある。検出するには、イオンが、位置合わせされたロッドと境を接しかつ平行な軌道経路の中心を通過しなければならない。四重極が、直流および無線周波電圧の所与の振幅で動作するとき、所与の質量対電荷比のイオンのみが、共鳴することになり、四重極を通過しかつ検出される安定な軌道を有することになる。本明細書で使用される「正のイオンモード」は、正に荷電したイオンが質量分析装置によって検出されるモードを指し、「負のイオンモード」は、負に荷電したイオンが質量分析装置によって検出されるモードを指す。「選択イオンモニタリング」または「ＳＩＭ」の場合、直流および無線周波電圧の振幅は、特定の質量のみを観察するように設定される。
【００４８】
「遠心分離」という用語は、遠心機を用いて不均一な混合物の遠心沈降のための向心力の適用を含むプロセスを指す。例えばチューブに含有されている、試料への有効重力の増加は、沈殿（ペレット）をさらに迅速かつ完全にチューブの底に集める。残りの溶液は「上清」と呼ばれる。
ＴＴＰは、公知の、本文書の他所、例えば「背景技術」のセクションにおいてさらに詳細に考察される比較的稀な血液障害である。
【００４９】
「基質」または「酵素基質」という用語は、本明細書では、酵素が作用する物質を指すのに使用される。
【００５０】
「外来性」基質という用語は、試料以外に由来する基質である。ある特定の実施形態では「外来性」基質は「合成」基質である。
【００５１】
「合成」という用語は、本明細書において、例えば実験室または他の同様の施設において生成された人工分子を指すのに使用される。これは、化学合成および組換え分子技術（即ち、組換え核酸構築物からの発現）の両方を包含する。
【００５２】
「配列」という用語は、「一次構造」としても記載される場合があり、ポリペプチド中のアミノ酸の順序、またはアミノ酸の特定の順序を有するポリペプチドなどのポリペプチド分子を指すのに使用されてもよい。
【００５３】
２つまたはそれより多くのアミノ酸配列の文脈において「配列同一性」または「配列類似性」は、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大一致について比較およびアラインされた場合に、同じであるまたは同じであるアミノ酸の特定のパーセンテージ（例えば、特定の領域にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに高い同一性、を有する２つまたはそれより多くの配列またはサブ配列を指す。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡから入手可能であるｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴなどの配列類似性を測定するための様々なツールが利用可能である。配列比較のために、典型的には１つの配列が、検査配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査および参照配列はコンピューターに入力され、サブ配列座標が指定され、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。初期設定プログラムパラメーターが使用されてもよく、または代替的パラメーターが指定されてもよい。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する検査配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００５４】
「切断」「酵素切断」または「酵素的切断」という用語は、本明細書では、酵素プロテアーゼ（ペプチダーゼまたはプロテイナーゼ）によってもたらされるポリペプチドの酵素的加水分解のプロセスまたは結果を指すのに使用される。
【００５５】
「切断部位」という用語は、本明細書では、ポリペプチド中のプロテアーゼによる切断の位置を指すのに使用される。「切断部位」という用語は、プロテアーゼが特異的であるポリペプチド中の切断部位を意味する「特異的切断部位」を包含し、示すのに使用されてもよい。
【００５６】
「切断産物」という用語は、本明細書では、プロテアーゼによる酵素的切断から生じるポリペプチドを指すのに使用される。
【００５７】
フォン・ウィルブランド因子（ｖＷｆ）は、血漿中に存在する大きな多量体糖タンパク質であり、内皮（バイベル・パラーデ小体において）、巨核球（血小板のα顆粒）および内皮下結合組織において超大型ｖＷＦとして構成的に生成される。基本のｖＷＦモノマーは、特定の機能を有する多数の特異的ドメインを含有する２０５０アミノ酸タンパク質である。ｖＷＦモノマーは、翻訳後にＮ−グリコシル化され、小胞体中で二量体に、およびジスルフィド結合を介するシステイン残基の架橋結合によってゴルジ装置中で多量体に配置される。ｖＷＦ多量体は、８０を超えるｖＷＦモノマーを含有する場合がある。ｖＷＦの主な公知の機能は、他のタンパク質、具体的には第ＶＩＩＩ因子に結合することであり、創傷部位への血小板粘着において重要であることが公知である。
【００５８】
ＡＤＡＭＴＳ１３は、フォン・ウィルブランド因子切断プロテアーゼ（ｖＷＦＣＰ）としても公知であるメタロプロテイナーゼである。それは、ｖＷＦを切断する亜鉛含有メタロプロテアーゼ酵素である。それは、血中に分泌され、大きなｖＷｆ多量体を分解し、それらの活性を減少させる。
【００５９】
（ＡＤＡＭＴＳ１３活性の存在または量を決定するための方法）
本発明は、様々な方法で具体化されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明は、質量分析によってＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための方法を含む。一部の実施形態ではタンデムＭＳ／ＭＳが使用される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定される。同様にＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するためのシステムも含まれる。
【００６０】
図１および２は、下線を付けたＡＤＡＭＴＳ１３のための切断部位を含むｖＷＦの部分的なアミノ酸配列（図１の配列番号１；図１および２の配列番号２）を示している。本明細書に記載の方法は、ｖＷＦ  Ａ２ドメイン（残基Ｄ１４５９〜Ｌ１６６４）の一部を基質（図２に示す配列番号２および図１中の太字）として使用する場合がある。ＡＤＡＭＴＳ１３切断部位（下線付き）（残基１６０５〜１６０６）およびエキソサイト（斜字体）（残基１６６０〜１６６８）も示されている（図１および２を参照されたい）。図３は、ＡＤＡＭＴＳ１３切断部位（下線を付けたフォント）を有する基質ペプチドおよび、図３に示す基質ポリペプチドのＡＤＡＭＴＳ１３切断の産物である生じたＮ末端ペプチド産物ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹ（配列番号４）（即ち「ＤＲＥペプチド」）を示している。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本発明は、図４に模式的に例示されるとおり行われる。本発明の例示的な実施形態は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性を決定するための方法であって、試料をＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質（配列番号３）と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートしてＤＲＥペプチド（配列番号４）を生成するステップ、任意選択で、インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップ、任意選択で、液体クロマトグラフィーを使用して酵素的切断産物をクロマトグラフィーで分離するステップ、ならびに質量分析によって酵素的切断産物を分析して、試料中の酵素的切断産物の存在または量を決定するステップを含み得る方法である。試料中の酵素的切断産物の産物の存在または量は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の存在または量を示している。図４に示されるとおり、方法は、例えば、［１３Ｃ，１５Ｎ］−ロイシンを用いて安定同位体標識されたＤＲＥペプチド（配列番号５）などの内部標準を使用してもよい。公知のとおり、他の種類の内部標準が使用されてもよい。例えば内部標準は、未標識であるが異なるアミノ酸配列を有してもよい、またはペプチド中の別のアミノ酸が標識されてもよい。内部標準および基質ペプチド（複数可）は、化学合成または組換え法によって作製されてもよい。
【００６２】
したがってある特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、患者から得た血漿試料を図１に示されている配列（配列番号１）に基づいた合成ポリペプチド基質とインキュベートすることによって決定されてもよい。合成基質は、図１に示されている配列よりも小さくてもよい。一実施形態では、ｖＷＦ７３と呼ばれる合成基質は、ｖＷＦの部分的アミノ酸、残基Ａｓｐ１５９６からＡｒｇ１６６８（配列番号３）に基づく、図３に示されている７３アミノ酸残基ポリペプチドである。ｖＷＦ７３は、切断部位Ｔｙｒ１６０５／Ｍｅｔ１６０６を有する。合成基質は、図３におよび、図１に太字で示される配列と同じ配列を必ずしも有さず；配列の変種および改変が可能である。一部の実施形態では、基質は、図１（配列番号１）に示されていないアミノ酸残基配列を有してもよく、および／またはアフィニティータグまたは非天然アミノ酸の含有など、追加的配列を含んでもよい。この例として、ＭＹＣタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−配列番号６）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ−配列番号７）、ポリＨＩＳタグ（ＨＨＨＨＨＨ−配列番号８）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグまたはビオチン化アミノ酸が挙げられる。しかし、ＡＤＡＭＴＳ１３のための切断部位は、合成基質に存在する。代替的実施形態では、合成基質は、ｖＷＦ７３配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％配列類似性を有する。
【００６３】
ＡＤＡＭＴＳ１３による合成基質の切断は、検出可能な産物を生じる。例えば、ｖＷＦ７３のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断では、１０アミノ酸残基ペプチドが「ＤＲＥ産物」と呼ばれる、配列ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹを有して、基質のＮ末端から形成される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、インキュベーション期間の際に創出されるＤＲＥ産物の量に比例している。次いでＤＲＥ産物は、質量分析によって測定されてもよい。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、酵素のメタノール沈殿によって終結され、ＤＲＥ産物を含有する上清は質量分析を使用して直接分析されてもよい。ある特定の実施形態ではＤＲＥ産物は、ＤＲＥ産物を測定するために、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と結合された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または別の精製技術（例えば、キャピラリー電気泳動）によって分析される。
【００６４】
試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の量は、内部標準を使用して決定されてもよい。例えば、同位体希釈質量分析を使用して、切断産物の（例えば、ＤＲＥ産物の）安定同位体標識類似体が、変動について標準化するために内部標準として試料に添加され、ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって酵素的切断産物と同時に測定される。一実施形態では、内部標準は、合成基質ペプチドと同時に添加されてもよい。他の実施形態では、内部標準は、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成基質の切断後に添加されてもよい。一実施形態では、測定された分析物：内部標準の比は、形成されたＤＲＥ産物の量に比例し、それにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性に直接比例する。したがって、測定された分析物：内部標準の比は、試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３酵素的切断の量を示している。ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、例えば正常ＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルを有する患者に由来するプールされた血漿によって規定された１００％正常活性を用いて「パーセント正常活性」の単位で表され得る。
【００６５】
本発明の実施形態による方法は、試料を提供することを含む。この文脈において、「提供する」という用語は広く解釈される。この用語は、生体試料を提供する対象を排他的に指すものではない。例えば、現場から離れた臨床実験室の技術者は、例えば、試料が抽出および／またはクロマトグラフィーによる精製のために調製されるとき、試料を「提供する」と言える。
【００６６】
試料は、任意の特定の試料タイプに限定されない。試料は、ＡＤＡＭＴＳ１３を含有するが、一般にその他の成分も含有する。一部の実施形態では、試料は、抽出および／またはクロマトグラフィーによる精製のために加工され調製された試料である。そのような加工は、後続の精製ステップの有効性を最適化するのに役立ててもよい。そのような加工方法は、当業者に周知である。
【００６７】
本発明は、試料の取扱いの、任意の特定の手段に限定されない。一部の実施形態では、抽出および／またはクロマトグラフィーにより部分的に精製する前に、試料を２つまたはそれ超の画分に分離するのに役立ててもよい。一部のそのような実施形態では、特定のカラム化学に関する分離の感度または選択性を改善するのを助けるため、そのような画分の２つまたはそれ超を異ならせて調製してもよい。一部の実施形態では、本方法は、多数の液体クロマトグラフィーシステム全体にわたって繰り返し注入するための、単一の試料を調製することを含む。
【００６８】
本発明は、任意の特定の試料サイズにも組成にも限定されない。一部の実施形態では、試料は、生体試料を含む。そのような実施形態では、試料は、溶媒、緩衝液、および抗凝固剤などの、その他の成分を含んでいてもよい。試料が生体試料を含む実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、組織ホモジネート、唾液、羊水、胆汁、粘液、腹水、またはリンパ液の１種または複数とすることができる。本発明は、生体試料の任意の特定の体積に限定されない。一部の実施形態では、生体試料は、体積が少なくとも約０．５〜２５０μＬ、少なくとも約１〜１００μＬ、または少なくとも約２〜５０μＬである。ある特定の実施形態では、生体試料は、体積が少なくとも約２〜５０μＬである。
【００６９】
インキュベートされている試料における酵素的切断の終結は、いかなる特定の方法にも限定されない。一部の実施形態では、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３による酵素的切断の終結は、適切なインキュベーション期間後の試料への、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素的反応を終結させるために十分な量での沈殿試薬の添加によって達成される。沈殿試薬は、メタノール、アセトニトリル、アセトン、２−プロパノール、硫酸アンモニウム、トリクロロ酢酸または過塩素酸であってもよい。一部の実施形態では、温度は、反応を効果的に終結させるために使用され得る。試料は、ＡＤＡＭＴＳ１３を不活性化させるために加熱されてもよく、または試料は、効果的に停止するために反応を遅くするように冷却、凍結される可能性があってもよい。一部の実施形態では反応は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を促さない試料ｐＨ、例えば約ｐＨ３未満または約ｐＨ９を超えるように調整することによって停止されてもよい。他の実施形態では反応はＡＤＡＭＴＳ１３の阻害剤、ＥＤＴＡまたは他のプロテアーゼ阻害剤などを添加することによって停止されてもよい。一部の実施形態では、酵素的反応を終結させる必要がない場合もある。例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素的反応は、一時点での測定よりむしろ一定期間にわたる反復的サンプリングによって、インキュベーションステップの際に継続的にモニターされてもよい。
【００７０】
試料の部分的な精製は、部分的に精製された試料を提供する。部分的な精製は、方法の様々な段階で実施されてもよい。例えば、一部の実施形態では、部分的な精製は、試料のインキュベーションおよびＡＤＡＭＴＳ１３活性の終結後に実施されてもよく、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素的切断産物を含む試料を生じる。一部の他の実施形態では、部分的な精製は、インキュベーションステップの前に実施されてもよい。１つより多い部分的な精製ステップが、本発明の実施形態による方法において使用されてもよい。部分的な精製は、部分的な精製の方法または結果によって限定されない。一部の実施形態では、目的の構成成分以外の試料中の１つまたは複数の様々な構成成分の濃度は、低減されている。例えば、他の構成成分の濃度は、酵素的切断産物の濃度と比較して部分的に精製された試料において低減されてもよい。別の例では、他の構成成分の濃度は、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度と比較して部分的に精製された試料において低減されてもよい。
【００７１】
したがって「除去する」または「除去」という用語は、構成成分の完全な除去を必ずしも意味しない。除去された構成成分の一部の量が部分的に精製された試料中にまだ存在する場合があるが、目的の構成成分のものと比較してその濃度は、抽出前試料においてよりも低い。一部の実施形態では、部分的に精製された試料中の酵素的切断産物に対する、除去された構成成分の相対濃度は、部分的な精製ステップ前の試料中の酵素的切断産物に対するその相対濃度の９０％以下、または７５％以下、または５０％以下、または３３％以下、または２５％以下、または、１０％以下、または５％以下、または１％以下である。本発明は、除去された構成成分のいかなる具体的な種類にも限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数の除去された構成成分は、質量分析による分析または液体クロマトグラフィーに干渉する可能性がある化合物である。部分的な精製方法の一例は、有機溶媒の添加による反応の終結後の遠心分離である。遠心分離の際に、このように処置された試料の沈殿構成成分は除去され、一方、上清はさらに精製および／または分析される。
【００７２】
本発明の一部の実施形態では、部分的に精製された試料には、クロマトグラフ分離の前に１つまたは複数の加工ステップを行うことができる。例えば、一部の実施形態では、部分的に精製された試料を蒸発させる。次いで得られた残留物を、溶媒系に入れて元に戻す。任意の適切な溶媒系を、残留物を元に戻すために使用することができる。一部の実施形態では、溶媒系は、クロマトグラフ分離に適合性のある溶媒系である。一部の実施形態では、元に戻すための溶媒系は、水、メタノール、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。一部の他の実施形態では、部分的に精製された試料は、酵素的切断産物を改変するような化学的または酵素的処置を受けてもよい。例えば切断産物は、化学的に誘導体化またはさらに加水分解されてもよい。一部の実施形態では、切断産物は、他の酵素を用いてさらに加水分解されてもよい。
【００７３】
一部の実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィーを使用して、ポリペプチドの酵素的切断産物、例えば、ＤＲＥ産物をクロマトグラフィーで分離することを含む。本発明は、液体クロマトグラフィーを行う任意の特定の手法に限定されない。一般に、クロマトグラフ分離ステップは、少なくとも１つの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムを使用することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、２つもしくはそれ超、または３つもしくはそれ超、または４つもしくはそれ超のＬＣカラムなど、多数のＬＣカラムを使用する。一部のそのような実施形態では、２、３、４、５、６、８、または１０個のＬＣカラムが使用される。一部のそのような実施形態では、これらのＬＣカラムの２つまたはそれ超が互いに平行に配置構成され、同じ質量分析計にインライン接続される。
【００７４】
本発明は、カラムの任意の特定のタイプに限定されない。酵素的切断産物の分離に適切な任意のカラムを使用することができる。一部の実施形態では、カラムは、Ｃ１８カラムであるが、Ｃ１２、Ｃ８、Ｃ４、フェニル−ヘキシル、アミド、アミンまたはＰＦＰから構成することもできる。
【００７５】
さらに、本発明は、任意の特定の移動相に限定されない。任意の適切な移動相を、移動相が特定のＬＣカラムと共に使用するのに適切である限り、およびＬＣカラム内で酵素的切断産物をクロマトグラフィーで分離するのに適切である限り、使用することができる。一部の実施形態では、移動相は、アセトニトリル（０〜１００％）で構成されている。あるいは、移動相は、メタノール（０〜１００％）で構成されていてもよい。一部のそのような実施形態では、移動相は、２種またはそれ超の溶媒の相対比が経時的に変化するように、勾配を用いる。一部の実施形態では移動相は、トリフルオロ酢酸、ギ酸、アンモニウム、ヘプタフルオロ酪酸および／または酢酸などのイオン対試薬からなる。
【００７６】
ある特定の実施形態では、２つまたはそれ超のＬＣカラムを、平行にかつ同じ質量分析計にインライン接続して、例えばスループットを改善するために使用することができる。一部のそのような実施形態では、試料（部分的に精製された試料であり得る）を、２つまたはそれ超のＬＣカラムに異なる時間で導入する。一部の実施形態では、２つまたはそれ超のＬＣカラムへの試験試料の導入は互い違いになされ、これは２つまたはそれ超のＬＣカラムへの試料の導入を切り離す、事前に決定された時間間隔があることを意味する。適切な時間間隔は、溶出時間、カラム化学、およびその他のＬＣカラムの１つまたは複数から溶出された酵素的切断産物の分析の妨害を回避する潜在的な必要性を含む、様々な要因に基づいて選択することができる。
【００７７】
本発明の一部の実施形態では、ＬＣカラムを、別のカラムと直列に配置することができる。例えば、一部の実施形態では、適切なガードカラムを用いることができる。当業者なら、本発明の方法で使用するのに適切なガードカラムを選択することが可能である。一部の実施形態では、ガードカラムを別のＬＣカラムと平行に配置する。そのような直列の２つまたはそれ超のカラムを平行に配置構成して、各直列のカラムが２つまたはそれ超のカラムを含有する、平行に動作する２つまたはそれ超の直列のカラムが存在するようにすることもできる。他の実施形態では、オンライン抽出カラムが、使用されてもよい。例えば、方法の一部の実施形態ではオンライン固相抽出カラムは使用されてもよい。
【００７８】
本発明の一部の実施形態では、酵素的切断産物は、電気泳動によって精製されてもよい。例えば一部の実施形態では、酵素的切断産物は、干渉する可能性がある物質からキャピラリー電気泳動を使用して分離される。
【００７９】
一部の実施形態では、本方法は、質量分析法によって、クロマトグラフィーで精製または分離された酵素的切断産物を分析することにより、酵素的切断産物の存在または量を決定することを含む。一部の実施形態では、ＬＣカラムの２つまたはそれ超が、同じ質量分析計に流れ込む。一部のさらなる実施形態では、ＬＣカラムの３つまたはそれ超が同じ質量分析計に流れ込む。一部の実施形態では、質量分析計が、合わせたＬＣ−ＭＳシステムの部分である。
【００８０】
本発明は、質量分析計の任意の特定のタイプに限定されない。任意の適切な質量分析計を使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、タンデム質量分析計を用いる。一部のそのような実施形態では、酵素的切断産物を分析することは、酵素的切断産物をイオン化すること、イオン化した酵素的切断産物を分析すること、酵素的切断産物を２つまたはそれ超の断片イオンに断片化すること、および断片イオンを分析することを含む。
【００８１】
本発明は、任意の特定のイオン化方法を使用する質量分析計に限定されない。本方法は、酵素的切断産物からの多価イオンの生成に好適なイオン化技術を使用することができる。適切なイオン化方法には、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、および電子捕獲イオン化が含まれるが、これらに限定されない。そして、断片化を用いる実施形態では、任意の適切な断片化技法を使用することができる。適切な技法には、衝突誘起解離、電子捕獲解離、電子移動解離、赤外多光子解離、放射解離、電子脱離解離、および表面誘起解離が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
一部の実施形態では、タンデム質量分析計が、ＭＤＳ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ５５００三連四重極質量分析計である。一部の実施形態では、タンデム質量分析計は大気圧イオン化源を有し、分析するステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、電子捕獲イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃／液体二次イオン化（ＦＡＢ／ＬＳＩ）、電場イオン化、電場脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、粒子線イオン化、およびいわゆる「ハイブリッドイオン化」技術、例えば、レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（ＬＡＥＳＩ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、またはマトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化（ＭＡＬＤＥＳＩ）からなる群から選択されるイオン化方法を含む。イオン化方法は、陽イオンモードであっても陰イオンモードであってもよい。分析するステップは、多数の反応のモニタリング（ＭＲＭ、選択反応モニタリングまたはＳＲＭとも呼ばれる）または選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を含んでいてもよく、２つまたはそれ超の生体分子が同時にまたは順次分析される。一部の実施形態では、分析するステップは、四重極分析計を使用する。一部の実施形態では、質量分析計は、三連四重極質量分析計である。一部の実施形態では、分析するステップは、並行反応モニタリング（ＰＲＭ）においてなどの四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）または四重極オービトラップ（ｏｒｂｉｔｒａｐ）装置での産物イオンスキャンを用いて行われてもよい。
【００８３】
本方法は、一部の実施形態において、内部標準を使用することを含む。そのような実施形態では、内部標準は、イオン化ステップの前の任意の適切な点で導入することができる。任意の適切な内部標準を使用することができる。一部の実施形態では、内部標準は、酵素的切断産物の安定な同位体で標識された等価物である。一部のそのような実施形態では、内部標準は、１つまたは複数のアミノ酸の安定同位体濃縮によって標識される。例えば、一部の実施形態では内部標準は、［１３Ｃ，１５Ｎ］−ロイシンを有するＤＲＥペプチドである。または他の同位体が使用される、および／もしくはアミノ酸が標識されてもよい。
【００８４】
一部の実施形態では、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３酵素的切断の量は、定量される必要はない。一部の実施形態では、方法は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３酵素的活性の存在または非存在を決定するために使用されてもよい。他の実施形態では、方法は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３酵素的活性の量を決定するために使用される。例えば、一部の実施形態および／または態様では、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の量を決定するための方法であって、試料をＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質（および内部標準）と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ、任意選択で、インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップ、任意選択で、液体クロマトグラフィーを使用して酵素的切断産物および内部標準を試料の他の構成成分からクロマトグラフィーで分離するステップ、ならびに酵素的切断産物および内部標準をイオン化して、試料中の酵素的切断産物および内部標準の量を決定するために質量分析によって分析される多価イオンを作製するステップであって、酵素的切断産物と内部標準との決定された量の比が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を示す、ステップを含む方法を提供する。
【００８５】
一部の実施形態では、方法は、定量下限（ＬＬＯＱ）および／または定量上限（ＵＬＯＱ）によって限定されない。一部の実施形態では、ＬＬＯＱは２％であり、ＵＬＯＱは１００％である。
【００８６】
試料中の活性の量は、外部標準曲線との比較によって決定されてもよい。例えば、ＤＲＥペプチドの量は、系列希釈される（例えば、２％ＡＤＡＭＴＳ１３活性まで）およそ１００％ＡＤＡＭＴＳ１３を含むプールされた正常血漿を使用して作成された較正標準の外部標準曲線と比較されてもよい。方法は、特定の数の較正レベルに限定されない。一部の実施形態では、較正曲線を作成するために１点だけが必要である。一部の実施形態では較正物質が、試料に添加されてもよい。
【００８７】
（報告作成方法）
少なくとも１つの態様では本発明は、対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３の活性の低減に関連する疾患または状態を診断するための報告を作成するための方法を提供する。そのような疾患または状態の一例はＴＴＰである。そのような方法は、試料をＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質および内部標準生成ペプチドと共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ、任意選択で、インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップ、任意選択で、液体クロマトグラフィーを使用して酵素的切断産物および内部標準を試料の他の構成成分からクロマトグラフィーで分離するステップ、酵素的切断産物および内部標準をイオン化して、試料中の酵素的切断産物および内部標準の量を決定するために質量分析によって分析される多価イオンを作製するステップであって、酵素的切断産物と内部標準との決定された量の比が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を示す、ステップ、ならびに試料におけるＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を記載する報告を作成するステップを含み得る。
【００８８】
試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量についての情報に基づいて、対象が異常に低い量のそのような活性を有するかどうかを評価できる。そのような情報は、対象においてＡＤＡＭＴＳ１３活性の異常なレベルに関連する１つまたは複数の疾患または障害を診断するために有用である可能性がある。報告作成のステップ以外の全てのステップの特徴および実施形態は、直前に記述されている。上述のように、本方法は、同じ質量分析計に平行にインライン接続された１つ超のカラム、例えば２つまたはそれ超のカラムを用いることができる。
【００８９】
一実施形態では、１０％未満のＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルは、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を高度に示しているが、ある特定の実施形態では、別の医学的に確立された診断用産物または手順による診断の検証を行うことなく単独の診断手段として使用されるべきでない。反対に、１０％を超えるＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルは、ＴＴＰの臨床診断を完全には除外できない。臨床的に診断されたＴＴＰを有する患者の４０％程度もが、１０％を超えるＡＤＡＭＴＳ１３レベルを有する。正常または軽度から中等度欠損したＡＤＡＭＴＳ１３活性を有する場合がある他の状態として、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）および造血幹細胞および臓器移植に関連する他の血栓性微小血管症、肝疾患、ＤＩＣ、敗血症、妊娠またはある特定の薬物療法（例えば、チクロピジン、クロピドグレル、シクロスポリン、マイトマイシンＣ、キニーネ）の影響が挙げられる。
【００９０】
一部の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３阻害物質の存在および／または在量を決定するために使用されてもよい。既知の低い活性を有する試料を既知の正常な活性を有する試料と既知の割合で混合することによって、得られた混合試料の活性を測定できる。混合物の既知の比および個々の試料の既知の活性に基づいて、混合物において測定された活性を混合物において予測された活性と比較でき、それにより、予測した活性より低く測定された活性は、低活性試料中の阻害物質の存在および量を示している。一部の場合では、低活性試料は熱不活性化されている場合がある。
【００９１】
（システム）
別の態様では、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の存在または量を決定するためのシステムを提供する。例えば、システムは、試料をＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするためのステーションと、酵素的切断産物を多価に荷電させ（即ち、イオン化し）、質量分析によって分析して試料中の酵素的切断産物の量を決定するためのステーションであって、酵素的切断産物の量が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の量を示す、ステーションとを含む。システムは、液体クロマトグラフィーまたは他の分離方法（例えば、キャピラリー電気泳動）を使用して酵素的切断産物をクロマトグラフィーで分離するためのステーションを含んでもよい。
【００９２】
そのようなシステムは、本発明の実施形態に従う方法に関する上述の内容に類似した、様々な実施形態およびサブ実施形態を含むことができる。これらのシステムは、様々なステーションを含む。本明細書で使用される「ステーション」という用語は、広く定義され、列挙される方法を実施するために適切な、任意の適切な装置または装置の集合体を含む。ステーションは、任意の特定の方法で互いに一体的に接続されまたは据えられる必要はない。本発明は、互いに対してステーションの任意の適切な配置構成を含む。例えばステーションは、同じ室内にある必要もない。しかし、一部の実施形態では、ステーションは、一体型ユニット内で互いに接続される。
【００９３】
本発明の実施形態による方法およびシステムは様々な利点を有する。例えば、本発明の方法およびシステムにおけるＬＣ−ＭＳ／ＭＳの使用は、特に有利である。ＡＤＡＭＴＳ１３の以前のアッセイは、イムノアッセイ手順（Ｋａｔｏら、２００６年、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４６巻：１４４４〜１４５２頁）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Ｋｏｋａｍｅら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００５年、１２９巻：９３〜１００頁、または（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）−質量分析（Ｊｉｎら、Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００６年、４巻：３３３〜３３８頁）のいずれかを使用している。本明細書に記載の方法およびシステムは、イムノアッセイと比較して感受性（例えば、ＬＬＯＱの２％）および特異性を向上させ、ＦＲＥＴと比較してスループットを増大させかつ費用を低減し、エレクトロスプレーイオン化による多価イオンの生成によって特異性を増大させ、これは、例えば（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）−ＭＳと比較してタンデム質量分析による分析を促進する。
【００９４】
（非限定的な実施形態）
非限定的な実施形態は、下記を含む：
１．試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の酵素活性を決定するための方法であって、
（ａ）酵素的切断産物を生成するために、試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；
（ｂ）切断産物の多価気相イオンを作製するために、酵素的切断産物をイオン化するステップ；および
（ｃ）試料中の酵素的切断産物の存在または量を決定するために、多価気相イオンを質量分析によって分析するステップであって、試料中の酵素的切断産物の産物の存在または量が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の存在または量を示す、ステップ
を含む方法。
【００９５】
２．ステップ（ａ）の後でステップ（ｂ）の前に、酵素的切断産物を部分的に精製するステップをさらに含み、ステップ（ｂ）が部分的に精製された酵素的切断産物に対して行われる、パラグラフ１の方法。
【００９６】
３．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが遠心分離を含み、ステップ（ｂ）が酵素的切断産物を含む上清に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【００９７】
４．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、液体クロマトグラフィーを含み、ステップ（ｂ）が溶出物に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【００９８】
５．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、キャピラリー電気泳動を含み、ステップ（ｂ）が溶出物に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【００９９】
６．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、固相抽出を含み、ステップ（ｂ）が溶出物に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【０１００】
７．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが、酵素的切断産物を含む溶出物を生成する、ろ過を含み、ステップ（ｂ）が溶出物に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【０１０１】
８．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが、酵素的切断産物を含む保持画分を生成するろ過を含み、ステップ（ｂ）が保持画分に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【０１０２】
９．酵素的切断産物を部分的に精製するステップが、酵素的切断産物のアフィニティー濃縮の使用を含み、ステップ（ｂ）がアフィニティー濃縮された酵素的切断産物に対して行われる、パラグラフ２の方法。
【０１０３】
１０．アフィニティー濃縮技術が、固定化金属アフィニティーレジンを使用する、パラグラフ９の方法。
【０１０４】
１１．アフィニティー濃縮技術が、抗体、を使用する、パラグラフ９の方法。
【０１０５】
１２．アフィニティー濃縮技術が、抗体の断片、例えば、Ｆａｂ断片を使用する、パラグラフ９の方法。
【０１０６】
１３．アフィニティー濃縮技術が、ストレプトアビジンを使用する、パラグラフ９の方法。
【０１０７】
１４．アフィニティー濃縮技術が、プロテインＧを使用する、パラグラフ９の方法。
【０１０８】
１５．アフィニティー濃縮技術が、プロテインＡを使用する、パラグラフ９の方法。
【０１０９】
１６．アフィニティー濃縮技術が、アプタマーを使用する、パラグラフ９の方法。
【０１１０】
１７．ステップ（ａ）と（ｂ）の間で、任意選択でパラグラフ２の部分的精製ステップの前に、インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
【０１１１】
１８．終結させるステップが、インキュベートされている試料に沈殿試薬を添加することを含む、パラグラフ１７の方法。
【０１１２】
１９．沈殿試薬が、メタノールを含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１３】
２０．沈殿試薬が、アセトニトリルを含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１４】
２１．沈殿試薬が、アセトンを含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１５】
２２．沈殿試薬が、２−プロパノールを含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１６】
２３．沈殿試薬が、スルフェートを含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１７】
２４．沈殿試薬が、トリクロロ酢酸を含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１８】
２５．沈殿試薬が、過塩素酸を含む、パラグラフ１８の方法。
【０１１９】
２６．終結させるステップが、インキュベートされている試料のｐＨをｐＨ５未満に調整することを含む、パラグラフ１７の方法。
【０１２０】
２７．終結させるステップが、インキュベートされている試料のｐＨをｐＨ９を超えるように調整することを含む、パラグラフ１７の方法。
【０１２１】
２８．終結させるステップが、インキュベートされている試料を摂氏５０度を超える温度に加熱することを含む、パラグラフ１７の方法。
【０１２２】
２９．終結させるステップが、インキュベートされている試料を摂氏１５度未満の温度に冷却することを含む、パラグラフ１７の方法。
【０１２３】
３０．終結させるステップが、インキュベートされている試料にＡＤＡＭＴＳ１３の阻害剤を添加することを含む、パラグラフ１７の方法。
【０１２４】
３１．阻害剤がエチレンジアミン四酢酸である、パラグラフ３０の方法。
【０１２５】
３２．外来性基質が、ｖＷＦ７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％配列類似性を有する合成ペプチドである、パラグラフ１の方法。
【０１２６】
３３．外来性ペプチド基質が、フォン・ウィルブランド因子配列に対して少なくとも７０％配列類似性を有する、パラグラフ１の方法。
【０１２７】
３４．外来性ペプチド基質がＡＤＡＭＴＳ１３の切断部位を含む、パラグラフ１の方法。
【０１２８】
３５．合成ペプチド基質が１つまたは複数のアフィニティータグを含む、パラグラフ１の方法。
【０１２９】
３６．１つまたは複数のアフィニティータグが、ＭＹＣ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ポリＨｉｓ−タグおよびＧＳＴ−タグからなる群から選択される、パラグラフ３５の方法。
【０１３０】
３７．１つまたは複数のアフィニティータグが抗体に対するエピトープを含有する、パラグラフ３５の方法。
【０１３１】
３８．外来性ペプチド基質が１つまたは複数の非天然アミノ酸を含む、パラグラフ１の方法。
【０１３２】
３９．１つまたは複数の非天然アミノ酸がビオチン化されている、パラグラフ３８の方法。
【０１３３】
４０．１つまたは複数の非天然アミノ酸が安定同位体標識されたアミノ酸である、パラグラフ３８の方法。
【０１３４】
４１．酵素的切断産物が、ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹの配列を有するポリペプチドを含む、パラグラフ１の方法。
【０１３５】
４２．ステップ（ｂ）が、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および大気圧光イオン化からなる群から選択されるイオン化技術を使用して酵素的切断産物をイオン化することを含む、パラグラフ１の方法。
【０１３６】
４３．分析するステップ（ｃ）がタンデム質量分析を使用する、パラグラフ１の方法。
【０１３７】
４４．分析するステップ（ｃ）が、６０２．８±２、１８２．１±２、２８１．１±２、４６２．７±２、５１２．３±２、６００．３±２、６０５．３±２、８１１．４±２、９２４．５±２および１０２３．５±２からなる群から選択されるｍ／ｚを有するイオンを使用する、パラグラフ１の方法。
【０１３８】
４５．分析するステップ（ｃ）が、ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性を決定することを含む、パラグラフ１の方法。
【０１３９】
４６．内部標準が、ステップ（ｂ）の前に添加される、パラグラフ１の方法。
【０１４０】
４７．内部標準が、基質と同時に添加される、パラグラフ４６の方法。
【０１４１】
４８．内部標準が、インキュベーションのステップ（ａ）の前に試料に添加される、パラグラフ４６の方法。
【０１４２】
４９．内部標準が、インキュベートされている試料に添加される、パラグラフ４６の方法。
【０１４３】
５０．内部標準が、酵素的切断産物の同位体標識等価物である、パラグラフ４６の方法。
【０１４４】
５１．内部標準の存在または量が、ステップ（ｃ）における酵素的切断産物の存在または量と共に決定される、パラグラフ４６の方法。
【０１４５】
５２．内部標準の決定された量と酵素的切断産物の決定された量との間の比が、ステップ（ａ）において形成された酵素的切断産物の量を示す、パラグラフ５１の方法。
【０１４６】
５３．内部標準の決定された量と酵素的切断産物の決定された量との間の比が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性量を示す、パラグラフ５１の方法。
【０１４７】
５４．試料が、患者から得られた生体液である、パラグラフ１の方法。
【０１４８】
５５．生体液が血漿である、パラグラフ５４の方法。
【０１４９】
５６．生体液が血清である、パラグラフ５４の方法。
【０１５０】
５７．ステップ（ａ）と（ｂ）との間で、任意選択で部分的精製ステップの前または後のいずれかで終結ステップの後に、インキュベートされている試料における酵素的切断の分子構造を改変するステップを含む、パラグラフ１、２および１７のいずれか１つの方法。
【０１５１】
５８．改変するステップが、酵素的切断産物を加水分解するステップをさらに含む、パラグラフ５７の方法。
【０１５２】
５９．加水分解が酵素を使用して行われる、パラグラフ５８の方法。
【０１５３】
６０．酵素が、トリプシンである、パラグラフ５９の方法。
【０１５４】
６１．酵素が、ペプシンである、パラグラフ５９の方法。
【０１５５】
６２．酵素が、ＬｙｓＣである、パラグラフ５９の方法。
【０１５６】
６３．加水分解が化学試薬を使用して行われる、パラグラフ５９の方法。
【０１５７】
６４．化学試薬が、ギ酸である、パラグラフ６３の方法。
【０１５８】
６５．化学試薬が、臭化シアンである、パラグラフ６３の方法。
【０１５９】
６６．酵素的切断産物が誘導体化される、パラグラフ５７の方法。
【０１６０】
６７．誘導体化が、酵素により触媒される誘導体化である、パラグラフ６６の方法。
【０１６１】
６８．誘導体化が、化学的付加である、パラグラフ６６の方法。
【０１６２】
６９．試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性の量を決定するための方法であって、
（ａ）試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する合成ペプチド基質および試料に対する産物ペプチドの同位体標識等価物と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による合成ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするステップ；
（ｂ）インキュベートされている試料中の酵素的切断を終結させるステップ；
（ｃ）液体クロマトグラフィーまたは他の精製技術を使用して酵素的切断産物および内部標準を試料の他の構成成分から部分的に精製するステップ；および
（ｄ）試料中の酵素的切断産物および内部標準の量を決定するために、部分的に精製された酵素的切断産物および標準を質量分析によって分析するステップであって、酵素的切断産物と内部標準との決定された量の比が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を示す、ステップ
を含む方法。
【０１６３】
７０．患者から得られた試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性の低減に関連する疾患または状態を診断するために有用な報告を作成する方法であって、上のパラグラフのいずれかの方法のいずれかを行うことおよび試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性の量を述べる報告を作成することを含む方法。
【０１６４】
７１．疾患または状態が血栓性血小板減少性紫斑病である、パラグラフ７０の方法。
【０１６５】
７２．対象における血栓性血小板減少性紫斑病を診断するための方法であって、上記パラグラフの任意の方法のいずれかを実施することを含み、正常値の１０％未満のＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルが、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を高度に示す、方法。
【０１６６】
７３．試料中のトロンボスポンジン１型モチーフを有する酵素ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性を決定するためのシステムであって、
（ａ）酵素的切断産物を生成するために、試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する外来性ペプチド基質と共に、ＡＤＡＭＴＳ１３による外来性ペプチド基質の酵素的切断を可能にする条件下でインキュベートするためのステーション；
（ｂ）切断産物の多価気相イオンを作製するために、酵素的切断産物をイオン化するためのステーション；および
（ｃ）試料中の酵素的切断産物の存在および／または量を決定するために、多価気相イオンを質量分析によって分析するためのステーションであって、酵素的切断産物の量が試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の前記活性を示す、ステーション
を含むシステム。
【０１６７】
７４．液体クロマトグラフィーを使用して酵素的切断産物をクロマトグラフィーで分離するためのステーションをさらに含む、パラグラフ７３に記載のシステム。
【０１６８】
下記の実施例は、現在開示されている主題の代表的な実施形態を実施するために、当業者に指針を提供するよう含めている。本開示および当業者の一般的レベルに照らし、当業者なら、下記の実施例は単なる例示であり、現在開示されている主題の範囲から逸脱することなく数多くの変更例、修正例、および代替例を用いることができることを、理解することができる。
【実施例】
【０１６９】
患者血漿を合成基質と共に最適化（即ち、非生理学的）条件下でインキュベートすることによってＡＤＡＭＴＳ１３活性を決定する。ｖＷＦ７３と称される合成基質は、ｖＷＦ残基アスパラギン酸１５９６からアルギニン１６６８の天然アミノ酸配列に由来する７３アミノ酸残基ペプチドであり、それはＡＤＡＭＴＳ１３切断部位（チロシン１６０５／メチオニン１６０６）を有する。ｖＷＦ７３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断で、１０アミノ酸残基産物ペプチドが基質のＮ末端から形成され、産物ペプチドは配列ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹ（配列番号４）を有する。ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、３０分間のインキュベーションの際に創出された産物ペプチドの量に比例し、これは、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）に結合させた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を使用してメタノール沈殿後の同位体希釈によって測定する。アッセイは、臨床的に正常な個体由来のプールされた血漿を使用して外部較正し、ＷＨＯ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ＡＤＡＭＴＳ１３  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ（１２／２５２）に対して標準化した。「パーセント正常活性」の単位で表された標準化ＡＤＡＭＴＳ１３活性を、合成マトリクスと共に使用した、プールされた正常血漿の希釈から２から１００％正常活性のスパンで創出した外部較正曲線から内挿する。
【０１７０】
（検体）
推奨される試料は、クエン酸ナトリウム緩衝液中に分注した０．１〜０．８ｍＬの血清または血漿である。約１０〜２０μＬを各アッセイのために使用する。標準サンプリングチューブまたは分離ゲルを含有するチューブを使用して血清を収集する。血清／血漿は、収集の１時間以内に細胞から取り出し、プラスチック輸送チューブに移されなければならない。血清および血漿は、使用まで−２０℃で凍結保存されるべきである。
【０１７１】
（試薬調製）
ＡＤＡＭＴＳ１３アッセイ用、生成緩衝液（１０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０）を使用する。
【０１７２】
ＤＲＥペプチド５０μｇ／ｍＬおよび内部標準（ＩＳ）、ＮＨ２−ＤＲＥＱＡＰＮＬ＊ＶＹ−ＯＨ（配列番号５）Ｌ＊＝［１５Ｎ、１３Ｃ６］−ロイシン）（ＳＩＬ．ｖＷＦ１０）のストック溶液は、ＮＡＴ．ｖＷＦ１０またはＳＩＬ．ｖＷＦ１０の単一の０．０５ｍｇバイアルに１ｍＬの０．００１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６を直接添加して５０μｇ／ｍＬ濃度とすることによって作製される。溶液を混合し、使用前に少なくとも１５分間室温に保つ。溶液は、２時間以内に使用するかまたは凍結し、−７０℃未満で２年間まで安定である。
【０１７３】
アミノ酸分析によって決定された濃度（典型的には、１００から１０００μｍｏｌ／Ｌ）を有する、３０％アセトニトリル、０．１％ギ酸中の基質ペプチド（ｖＷＦ７３）のストック基質溶液は、製造元から直接購入する。ストック基質は、−７０℃未満で２年間まで保存できる。
【０１７４】
ｖＷＦ７３の配列を下および図１〜３に示す。
ＮＨ２−ＤＲＥＱＡＰＮＬＶＹＭＶＴＧＮＰＡＳＤＥＩＫＲＬＰＧＤＩＱＶＶＰＩＧＶＧＰＮＡＮＶＱＥＬＥＲＩＧＷＰＮＡＰＩＬＩＱＤＦＥＴＬＰＲＥＡＰＤＬＶＬＱＲ−ＯＨ（配列番号３）
【０１７５】
ストック溶液を０．００１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３  １６中に適切に希釈することにより、使用基質−内部標準混合物（９００ｎｍｏｌ／Ｌ  ｖＷＦ７３、５０ｎｇ／ｍＬ）（ＳＩＬ．ｖＷＦ１０）を作製する。それを−７０℃未満で３カ月まで保存する。アリコートは、２回凍結／融解後に廃棄する。
【０１７６】
０．００１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６中の使用システム適合性検査溶液（１０ｎｇ／ｍＬ  ＮＡＴ．ｖＷＦ１０）を作製する。それを、−７０℃未満で２年間まで保存する。
【０１７７】
ブランクマトリクス（６０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中）を作製する。
【０１７８】
プール正常血漿（ＰＮＰ）を低および中等度品質カットオフ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）対照を生成するために使用する。ＰＮＰを作製するために、２０名の表面上は正常な個体由来の５回反復検体を３．２％クエン酸ナトリウムチューブに収集する（合計１００個の検体）。検体を通常の手順により処理し、溶血した検体は廃棄し、プールし、直ちに使用するまたは凍結する。それらを−７０℃未満で２カ月まで保存する。熱不活化プール正常血漿（ＨＩＰＮＰ）を調製するために、１０から５０ｍＬアリコートのＰＮＰを１２から１６時間、５６℃、水浴中でインキュベートする。ＨＩＰＮＰは、１週間まで冷蔵保存（２〜８℃）または１年間まで−１０℃未満で保存できる。
【０１７９】
（較正および参照標準）
ＤＲＥペプチドの量を、２％ＡＤＡＭＴＳ１３活性まで系列希釈される１００％ＡＤＡＭＴＳ１３を有するＰＮＰを使用して作成された較正標準の外部標準曲線と比較する。許容可能な較正曲線適合は、範囲全体を通じて８５から１１５％の間であると規定する。追加的標準化は、参照標準として、希釈されていない場合に９１．０％活性を示すＷＨＯ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ＡＤＡＭＴＳ１３  ｉｎ  ｐｌａｓｍａを使用する。参照標準についての平均回収率は、９０から１１０％の間でなければならない。したがって参照標準回収率は、較正物質値を補正するために使用される。例えば、参照標準回収率が１１２．３％である場合、２０％較正物質に対して与えられる値は１７．８１％（２０％／１．１２３）である。
【０１８０】
（マトリクス対照）
次のマトリクス対照（ＱＣ）をプール正常血漿（ＰＮＰ）に調製する。ＱＣの調製において使用するＰＮＰのロットは、使用較正物質において使用するＰＮＰのロットとは異なっていなければならない。
【０１８１】
正常（即ち、ＰＮＰ）の５〜１５％の間の平均ＡＤＡＭＴＳ１３活性を有するようにＰＮＰをＨＩ−ＰＮＰで希釈することにより、低ＱＣを作製する。ＡＤＡＭＴＳ１３抗体をＰＮＰに添加して約１：５０の抗体混合物を作製し、次いで（追加のＰＮＰで）希釈して希釈物が２０〜４０％の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を有することを確認することにより、中等度ＱＣを作製する。
【０１８２】
（ＡＤＡＭＴＳ１３アッセイ手順）
水浴を４５℃（±３℃）に予熱し、ブランク、標準、対照、試料および凍結試薬を環境条件下で融解させる。ブランク、標準、対照および試料のアリコート１３μＬを１．２ｍＬ、９６ディープウェルプレート（プレートＡ）の別々のウェルにピペット分取する。次に、生成緩衝液のアリコート９２３μＬをプレートＡの各ウェルにピペット分取する。次にプレートを封止し（例えば、箔を用いて）、試薬と混合するために渦動させる。
【０１８３】
この時点で使用基質／内部標準混合物のアリコート（２５μＬ）を新たな１．２ｍＬ、９６ディープウェルプレート（即ち、プレートＢ）の合致するウェルに添加する。両方のプレートは、二重ブランク（０．００１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６）のためのウェルを含む。この時点で、プレートＡから２５μＬの希釈試料をプレートＢ中の使用基質／内部標準に移す。次いでプレートＢを封止し（例えば、接着性シーラントを用いて）、遠心分離に供し、完全な移行および混合を確実にするために渦動させる。次いでプレートＢを４５℃（±３℃）水浴で３０分間（±１分間）インキュベートする。次いでプレートＢを遠心分離し、反応を終結させるために２５０μＬのメタノールを各ウェルに添加する。
【０１８４】
この時点で、試料は、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析のための準備ができている。ウェルを封止後（例えば、箔を用いて）、試料（即ち、プレートＢ）を渦動させ（５分間）、遠心分離する（例えば、約３２５０ｒｐｍで１０分間）。次いで、上清の各試料のアリコート（２００μＬ）をプレートＢから新たなプレート、プレートＣに移す。封止後（例えば、箔を用いて）、試料を冷却し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供する。ＬＣは、アセトニトリル勾配を用いる逆相Ｃ１８固定相を使用する。ローディングは、ローディングを改善するために追加的水性試薬を添加するための第２のポンプを含む。ＤＭＳＯもアセトニトリル勾配に含まれてよい。表１に示されるとおり、ＭＳ／ＭＳは、クオンティファイア（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）シグナルが混入物（複数可）によって損なわれていないことを確実にするために、２つのクオリファイア（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）（即ち、追加的断片）を使用する。
【表１】
2019532649.tif 000003
（分析的測定可能範囲）
【０１８５】
検証において決定された定量下限（ＬＬＯＱ）および定量上限（ＵＬＯＱ）を下の表２に列挙する。
【表２】
2019532649.tif 000004
（臨床的に報告可能な範囲）
【０１８６】
検証において決定された報告可能な下限（ＬＲＬ０および上限（ＵＲＬ）を下の表３に列挙する。
【表３】
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（参照間隔および解釈）
【０１８７】
アッセイの検証の際に確立された正常参照間隔は：＞６６％正常ＡＤＡＭＴＳ１３活性である。６６％未満のレベルは、潜在的状態を示している。
【０１８８】
本発明の好ましい実施形態が例示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がそこになされ得ることは理解されよう。本出願において参照する全ての公表された特許および刊行物は、この参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019532649.tif 000012