(57)【要約】  ＭＥＴ発現腫瘍細胞に結合し、それを死滅させ、ＭＥＴ発現がんの治療に有効である抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）が提供される。また、そのようなＡＤＣを生成するための新規な化合物およびＭＥＴ抗体を複合体化する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
【化１】
2019536780.tif 000030
式中、ＡはＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、を含み、
ｎは１〜９である、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項２】
Ａが、
（ａ）前記第１の重鎖および第２の重鎖であって、前記重鎖の各々が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、前記第１の重鎖および第２の重鎖と、
（ｂ）前記第１の軽鎖および第２の軽鎖であって、前記軽鎖の各々が配列番号９のアミノ酸配列を含む、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項３】
前記第１の重鎖が、前記第１の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第２の重鎖が、前記第２の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１の重鎖が、前記第２の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、請求項１または２に記載のＡＤＣ。
【請求項４】
Ａが、グリコシル化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項５】
ｎが１〜９であり、平均ＤＡＲが２〜５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣの混合物を含む組成物。
【請求項６】
前記平均ＤＡＲが、２．９〜４である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記平均ＤＡＲが、２．９〜３．３である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、腫瘍細胞上に発現する細胞表面ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、インビトロの増殖、血管新生、および／または遊走バイオアッセイにおける有意な機能的アゴニスト活性を有しない、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩。
【請求項１１】
がんの治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩。
【請求項１２】
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、もしくは肺がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胆管がん、黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫である、請求項１１に記載の使用のためのＡＤＣまたはその塩。
【請求項１３】
前記がんが、１つ以上のＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、エクソン１４、および／またはＰＩ３Ｋの変異を有する細胞を含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の使用のための、ＡＤＣまたはその塩。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記がんが、ヒトにおける、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、もしくは肺がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胆管がん、黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、エクソン１４、および／またはＰＩ３Ｋの変異からなる群から選択される１つ以上の変異を有する細胞を含むことを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の式の化合物。
【化２】
2019536780.tif 000031
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞毒性薬と複合体化させた、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体を有する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、その製造方法、ＭＥＴ  ＡＤＣを含有する薬学的組成物、および様々ながんを治療するためのその使用を提供する。
【０００２】
ＡＤＣの一般的な概念はよく知られており、強力な細胞毒性薬物を抗原発現腫瘍細胞に選択的に送達するためにモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の特異性を利用することを目的としている。よく知られている概念にもかかわらず、有効性および忍容性が改善された標的療法の目的を完全に実現するために、適切な抗原標的、その抗原標的に結合する適切な抗体、細胞毒性ペイロード、リンカー、複合体化方法、および放出機構を含む、ＡＤＣの様々な側面を慎重に選択しなければならない。過去数十年にわたる進歩にもかかわらず、ＡＤＣの化学的および物理的安定性に関連する重大な問題に当業者でも頻繁に遭遇し、それが無効または有毒な化合物さえもたらすことが一般に認識されている。例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン（以前にＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）として市販されている）は、急性骨髄性白血病を治療するために２０００年５月にＦＤＡによって承認された抗ＣＤ３３  ＡＤＣである。しかしながら、それは、その後２０１０年６月に臨床試験で、肝毒性、特定の患者群における致命的な合併症、患者の死亡の増加、および従来のがん療法を超える追加の有効性の利点が無いことが明らかにされた時点で市場から撤退された。ＡＤＣは、親抗体自体と比較して、有意に短い消失半減期を有し得る。これらの問題を十分に克服するために、アミノ酸の変更が必要となり得る。抗体、リンカーおよび薬物は、改善された有効性および忍容性を有する標的ＡＤＣ療法をもたらすために、多くの場合改変されなければならない。さらに、そのような特性を低減、排除、および／または回避するために必要とされる構造的変化は、ほとんどの場合日常的ではないか、または通常の一般的な知識から導き出されない。
【０００３】
チロシンキナーゼスーパーファミリーのメンバーであるＭＥＴは、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のヒト受容体である。ＨＧＦは、ＭＥＴに結合する唯一のリガンドである。ＨＧＦのＭＥＴへの結合により、受容体の二量体化または多量体化、細胞内領域における複数のチロシン残基のリン酸化、触媒活性化、および下流シグナル伝達が起こる。ＨＧＦ／ＭＥＴ経路の活性化は、胚発生、細胞増殖、遊走、形態形成、生存および創傷治癒における通常の過程において重要であると考えられるが、その調節不全は、がんの発生、転移、および薬物耐性において役割を果たすと考えられる。ＭＥＴはまた、受容体の過剰発現、増幅、および変異を含むリガンド非依存的な機構によっても活性化される。ＨＧＦおよびＭＥＴはまた、抗がん療法の標的である。例えば、当技術分野においてワンアーム型５Ｄ５、ＯＡ５Ｄ５またはＭｅｔＭＡｂとしても知られているオナツズマブは、ＭＥＴ刺激性モノクローナル抗体５Ｄ５に由来するヒト化一価拮抗性抗ＭＥＴ抗体である（例えば、Ｓｐｉｇｅｌ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｏｎ  Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１３；３１（３２）：４１０５−４１１４、およびＸｉａｎｇ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ（ＭｅｔＭＡｂ）：Ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−Ｅｆｆｅｃｔ  Ｄａｔａ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９（１８）：５０６８−５０７８（２０１３）を参照）。オナツズマブはＭＥＴに結合し、ＭＥＴと共に細胞表面に居続け、ＨＧＦの結合およびその後のＭＥＴリン酸化ならびに下流シグナル伝達活性および細胞応答を妨害する。がん治療におけるオナツズマブの可能性についての初期の熱気にもかかわらず、オナツズマブの開発は、後期臨床試験において臨床的に意味のある有効性の欠如により最終的に中止された（例えば、Ｓｐｉｇｅｌ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩｂ  ａｎｄ  ＩＶ  ＮＳＣＬＣ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ＭＥＴＬｕｎｇ（ＯＡＭ４９７１ｇ）ｇｌｏｂａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２，ａｂｓｔｒ  ８０００（２０１４）を参照）。同様に、ＡｍｇｅｎおよびＡｖｅｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙの両方は、それぞれ、どちらも高い親和性および特異性でＨＧＦリガンドに結合し、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔの生物学的活性を阻害する、ＨＧＦ抗体のフィクラツズマブ（以前にＡＶ−２９９として知られている）およびリロツムマブ（以前にＡＭＧ１０２として知られている）の臨床開発をすべて中止した。より具体的には、Ａｖｅｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の変異の両方が陽性の患者がより高い中止率を経験し、フィクラツズマブの開発の中止を促したと報告した。報告によれば、Ａｍｇｅｎによるリロツムマブの開発中止の決定は、化学療法治療のみの治療群と比較した場合の、リロツムマブおよび化学療法治療の治療群における死亡数の増加の発見に基づいていた（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｐｌａｃｅｂｏ（Ｐ）−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ  ａｓ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＴ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｇａｓｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ（Ｇ／ＧＥＪ）ｃａｎｃｅｒ：ＲＩＬＯＭＥＴ−１  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３３：（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ  ４０００）（２０１５）を参照）。
【０００４】
ＷＯ２０１０／０５９６５４は、ＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合し、かつＨＧＦの存在下または不在下において、および既知のＭＥＴアンタゴニストに対して耐性を付与する変異を特徴とする腫瘍において、ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する、高親和性拮抗性抗体を含む様々なＭＥＴ抗体について記載している。ＷＯ２０１０／０５９６５４において開示されているＭＥＴ抗体のうちの１つのＬＹ２８７５３５８は、ＭＥＴに対して機能的アゴニスト活性を有していない（すなわち無視できる）ことが報告されている（例えば、Ｚｅｎｇ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）１０４ｔｈ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ｐｏｓｔｅｒ  ＃５４６５を参照）。この抗体は、進行胃がんおよび非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の臨床試験で研究されている。その世界保健機関（ＷＨＯ）が推奨する国際非所有者名（ＩＮＮ）は、エミベツズマブである。ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１，２０１５，ｐｐ．８２−８３。
【０００５】
ＷＯ２０１６／０９４４５５およびＦｕ，Ｙ．ら（２０１４）は、チューブリン阻害剤ＤＭ１またはドキソルビシン類似体と鎖間システイン部位で複合体化させた、ＭＥＴに結合するＩｇＧ１抗体を有するＡＤＣを開示している（Ｆｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，ｃ−Ｍｅｔ  ｉｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，３７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ｐｏｓｔｅｒ  ＃Ｐ２−１６−０３）（２０１４））。
【０００６】
当該技術分野において周知であるように、物理的および化学的なＡＤＣのリンカー、ペイロード、およびｍＡｂの不安定性は、分子の毒性、免疫原性、および有効性に潜在的に影響を及ぼし得る（Ｒｏｓｓ，Ｐ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ，Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５：３９１−３９７（２０１６））。実際、当該技術分野における技術（例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」（２０１３）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．Ｄｕｃｒｙ，Ｌａｕｒｅｎｔ（Ｅｄ．）に概ね従うことによって、ＷＯ２０１０／０５９６５４の様々な抗ＭＥＴ抗体を含むＭＥＴ  ＡＤＣを作成することを試みた場合に、本発明者らは、内因性ヒトＩｇＧ４と交換し得るか、または標的受容体であるＭＥＴに関して増大したアゴニスト特性となり得る半ｍＡｂの形成に関連した重大な問題に直面した。実際、これらの問題を回避するかまたは十分に克服するために、異なる抗体、ペイロード、リンカー、および／または複合体化戦略を含む広範な工学的努力が必要であった。これらの問題を克服するために必要とされる構造の変更の必要性、ならびに実際の変更は、関連技術において示唆されていない。さらに、いくつかの変更は日常的ではないか、または通常の一般知識から導き出されず、構造工学の結果は驚くべきことであり、有利であった。したがって、広範な研究努力により、新規の複合体化プロセス、ペイロード中間体、ならびに驚くほど安定で、十分耐容性があり、有効なＭＥＴ  ＡＤＣの同定がもたらされた。
【０００７】
したがって、本発明は、高い親和性でＭＥＴと結合し、ＨＧＦによるＭＥＴ活性化を効果的に中和するＡＤＣを提供する。さらに、ＭＥＴ  ＡＤＣは、機能的なＭＥＴアゴニスト活性を最小限でまたは引き出さずに、細胞表面上のＭＥＴ抗体および細胞毒性薬（すなわちＭＭＡＥ）の共局在化および細胞毒性薬の効果的な放出を可能にする。驚くべきことに、このＭＥＴ  ＡＤＣは、ＭＥＴが発現する腫瘍細胞において、複合体化されていない親抗体のエミベツズマブと比較して、少なくとも同程度の、ＭＥＴの内在化および分解を誘導する能力を示す。さらに、本明細書で提供されるＭＥＴ  ＡＤＣは、治療困難ながん（例えば、肺がん、胃がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、および腎がん）、ＲＡＳ活性化（例えば、１つ以上のＫＲＡＳ変異）を有することを特徴とするもの、低ＭＥＴ発現腫瘍、または限定されないが、メレスチニブを含む、１つ以上の抗ＭＥＴ抗体および／または１つ以上の低分子阻害剤に耐性がある、または耐性となった腫瘍を含む、ＭＥＴ発現腫瘍の治療において、関連する単剤の組み合わせと比較して（単剤および／または単剤の組み合わせに対して）向上した有効性を示す。さらに、本明細書で提供されるＭＥＴ  ＡＤＣは、循環中に非常に安定であり、インビボ安定性、限定されないが、熱安定性、溶解性、低い自己会合性、ならびにがんの治療におけるＡＤＣの開発および／または使用に対して許容される薬物動態学的特性を含む、物理的および化学的安定性を示す。驚くべきことに、これらはまた、エミベツズマブと同程度の物理的および化学的安定性を有すると思われる。
【０００８】
本発明は、式Ｉの化合物であって、式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖と、
ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化１】
2019536780.tif 000002
【０００９】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、
式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を各重鎖が含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を各軽鎖が含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、
式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を各重鎖が含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を各軽鎖が含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、
式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）各重鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｉ）各軽鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、２つの重鎖（ＨＣ）ポリペプチドと２つの軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドとを含み、両方のＨＣポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、両方のＬＣポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号９のアミノ酸配列からなり、両方の第２のポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含み、ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、式Ｉの化合物であって、式中、Ａが、Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ４またはエミベツズマブである、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、式Ｉの化合物であって、式中、ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１７】
ｎが１〜９である式Ｉの化合物に加えて、本発明は、ｎが１〜９である式Ｉの化合物の混合物を含む組成物を提供する。式Ｉの化合物の混合物は、用語「薬物抗体比」（すなわち、ＤＡＲ）によって表される分布として特徴付けられ得る。
【００１８】
ＤＡＲ値は、ｎが１〜９である式Ｉの各化合物についての薬物負荷分布を最初に決定することによって計算され得る。これは、分光光度アッセイ、放射分析法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および質量分析法などの当分野で周知の分析技術を使用することによって達成され得る。より具体的には、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴｏＦ）によるデコンボリューションされた質量スペクトルが混合物について得られる。各ｎ値に対する個々のピークは、イオン数に基づいて積分される。各ｎ値についてのイオン数を、全てのピークのイオン数の合計で割り、次いで１００％を掛けて、薬物負荷分布が得られる。
【００１９】
薬物負荷分布（％）＝（ｎが１〜９である式Ｉの化合物のイオン数をイオン数の合計で割ったもの）×１００（％）。特定のｎ値を表す各ピークについて計算が繰り返される。
【００２０】
次に、ｎが１〜９である式Ｉの各化合物の薬物負荷分布（％）にその対応する値のｎを掛け、得られた積を１００で割った。得られた商は、混合プロファイルに対する特定のｎ値を有する式Ｉの各化合物の加重ＤＡＲ寄与を表す。最後に、ＤＡＲ寄与を合計することにより、混合物についての平均ＤＡＲが得られる。
ＤＡＲ寄与＝（特定のｎ値を有する式Ｉの各化合物の薬物負荷分布（％））×（ｎ）／１００。
平均ＤＡＲ＝Σ（ＤＡＲ寄与）。
【００２１】
本発明は、平均ＤＡＲが２〜６である式Ｉの化合物の混合物を含む組成物を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、平均ＤＡＲが２〜５である組成物を提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、平均ＤＡＲが３〜４である組成物を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、平均ＤＡＲが３．３である組成物を提供する。
【００２５】
式Ｉの特定の化合物は、式中、ｎが１〜９である、
【化２】
2019536780.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩である。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、がんの治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩である。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、ＭＥＴが患者の腫瘍に発現するがんの治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩である。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、ｉ）ＭＥＴが患者の腫瘍に低、中、または高レベルで発現するがん、および／またはｉｉ）１つ以上のＲＡＳ（ＫＲＡＳを含むが、これに限定されない）、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、および／またはＰＩ３Ｋの変異を有する腫瘍の治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩である。そのような発明の様々な実施形態において、ＭＥＴが患者の腫瘍に低、中、または高レベルで発現するがん、および／または１つ以上のＲＡＳ（ＫＲＡＳを含むが、これに限定されない）、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、および／またはＰＩ３Ｋの変異を有する腫瘍の治療のためにＭＥＴ  ＡＤＣを使用することは、本発明のＭＥＴ  ＡＤＣまたはその塩を患者に投与する工程の前に、がんの治療を必要とする患者を同定する工程をさらに含み得る。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、ならびに限定されないがＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む肺がん、ならびに胆管がん、または限定されないがブドウ膜黒色腫を含む黒色腫、の治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩である。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、がんを治療する方法であって、それを必要とするヒト患者に、有効量の前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩を投与することを含む、方法である。
【００３３】
さらに、本発明は、膵臓がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００３４】
さらに、本発明は、結腸直腸がんの治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその塩を提供する。
【００３５】
さらに、本発明は、がんの治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその塩を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、膵臓がんの治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその塩を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、式Ｉの化合物の調製に有用な特定の中間体化合物を提供する。特定の中間体化合物は、式ＩＩの化合物である。
【化３】
2019536780.tif 000004
【００３８】
本発明の化合物は、立体異性体として存在し得ることが理解される。本発明の実施形態は、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、およびこれらの混合物を含む。好ましい実施形態は、単一のジアステレオマーであり、より好ましい実施形態は、単一のエナンチオマーである。したがって、式Ｉの化合物は、式Ｉａの化合物であると理解される。
【化４】
2019536780.tif 000005
さらに、式ＩＩの化合物は、式ＩＩａの化合物であると理解される。
【化５】
2019536780.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ａｌｅｘａ  ４８８標識エミベツズマブに対する、ＨＴ−２９腫瘍細胞上の細胞表面ＭＥＴへのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１およびエミベツズマブの競合的結合の結果を示す。明確に示した通り、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の結合は、複合体化されていない親ＭＥＴ抗体、エミベツズマブの結合とかなり同程度である。細胞表面ＭＥＴへの結合は、ＦＡＣＳ分析によって決定された。
【図２】Ｃａｋｉ−１細胞におけるｐａｎ−ＡＫＴリン酸化（ｐＡＫＴ）の誘導を測定するインビトロでのバイオアッセイの結果を示し、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１はエミベツズマブと比較してアゴニスト活性が増加していないことを示している。
【図３】細胞において、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１、エミベツズマブ、アイソタイプ対照ＡＤＣ（すなわち、ｈＩｇＧ４  Ｌｙｓ−ＭＭＡＥ）、またはアイソタイプ対照（すなわち、ｈＩｇＧ４）で処理した後に、細胞表面のＭＥＴ変化をＦＡＣＳ分析により測定した場合に、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１が、膵臓腫瘍ＢＸＰ３細胞においてエミベツズマブと同様の内在化活性を示すことを示す。
【図４】インビトロでのＨＴ−２９殺細胞アッセイにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の活性を示す。このアッセイにおいて、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１はＨＴ−２９細胞を死滅させるのに非常に強力である。
【図５】インビトロでのＲＫＯ殺細胞アッセイにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の活性を示す。このアッセイにおいて、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１はＲＫＯ細胞を死滅させるのに非常に強力である。
【図６】インビボＨＴ−２９異種移植モデルにおける、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１およびＭＥＴ−ＡＤＣ＃７（すなわち、Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ２−Ｃｙｓ−ＭＭＡＥ）の有効性を示す。
【図７】インビボＢｘＰＣ−３異種移植モデルにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の有効性を示す。
【図８】インビボＫＰ−４異種移植モデルにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の有効性を示す。
【図９】インビボＨｓ７４６ｔ異種移植モデルにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の有効性を示す。
【図１０】インビボＣａｌｕ−６異種移植モデルにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の有効性を示す。
【図１１】インビボ胆管がんＰＤＸモデルにおけるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の有効性を示す。
【００４０】
「ＭＥＴ受容体」および「ＭＥＴ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、別途指示のない限り、ヒト肝細胞増殖因子に結合する、ヒト受容体チロシンキナーゼ、ならびにその機能的に活性な変異形態を指すことを意図している。ＭＥＴの具体例としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００２４５で提供されるヌクレオチド配列によってコードされるヒトポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２３６で提供されるヌクレオチド配列によってコードされるヒトタンパク質が挙げられる。ＭＥＴは、限定されないが、ｃ−ＭＥＴ、ｃＭＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、またはその他の変形を含む他の名称で当技術分野においてしばしば言及される。ＭＥＴの構造は、概略的に以下の通り記載される。
【化６】
2019536780.tif 000007
【表１】
2019536780.tif 000008
【００４１】
ヒトＭＥＴの細胞外ドメインは、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する。しかしながら、配列番号１１のアミノ酸１〜２４はシグナル配列を含む。したがって、特に明記しない限り、本明細書で使用される「ＭＥＴ−ＥＣＤ」という用語は、配列番号１１のアミノ酸２５から開始し、アミノ酸９３２で終了する成熟タンパク質（すなわち、配列番号１２）を意味する。ＳＥＭＡドメインは、ＭＥＴのＮ末端における約５００アミノ酸残基からなり、α鎖（配列番号１１のアミノ酸残基２５〜３０７（すなわち配列番号１３）およびβ鎖（配列番号１１のアミノ酸残基３０８〜５１９（すなわち配列番号１４））の一部を含有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、腫瘍または細胞株についてのＭＥＴの細胞表面発現に関して、用語「低」、「中」、および「高」は、それぞれ細胞あたり約１０万未満、約１０万超、および約５００万超の受容体を意味することを意図している。
【００４３】
別途指示のない限り、本明細書で使用される場合の「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む免疫グロブリン分子を指すことを意図している。各鎖のアミノ末端部分は、中に含まれるＣＤＲによる抗原認識を主に担う約１００〜約１２０個のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ４」は、それぞれが配列番号９のようなアミノ酸配列を有する２本の軽鎖と、それぞれが配列番号２３のようなアミノ酸配列を有する２本の重鎖と、を含む抗体を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「エミベツズマブ」は、それぞれが配列番号９のようなアミノ酸配列を有する２本の軽鎖と、それぞれが配列番号２３のようなアミノ酸配列を有する２本の重鎖と、を含む抗体を指し、これは、ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  Ｎａｍｅｓ（ＩＮＮ）Ｌｉｓｔ  １１１，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，Ｎｏ．２，Ｊｕｌｙ  ２０１４に記載されている。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗体のＨＣポリペプチドとＬＣポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接の抗原結合部位を意味することを意図している。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５（１９９６）；およびＮｏｒｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０６，２２８−２５６（２０１１）を含む他者によって記載されており、ここで、定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。
【００４７】
ＣＤＲには、フレーム領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび配置決めは、既知の慣例（例えば、Ｋａｂａｔ（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８７）、および／またはＮｏｒｔｈ（２０１１））に従う。
【００４８】
「薬学的に許容される塩」という用語は、分子の酸性部分と組み合わせて存在する塩基付加塩、または式Ｉの化合物の塩基性部分と組み合わせて存在する酸付加塩を含む。そのような塩としては、薬学的に許容される塩、例えば、当業者に知られている、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２に列挙されているものが挙げられる。
【００４９】
薬学的に許容可能な塩に加えて、他の塩も本発明において企図される。それらは、化合物の精製、または他の薬学的に許容可能な塩の調製において、中間体としての役割を担い得るか、または、本発明の化合物の同定、分析、または精製のために有用である。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、哺乳類動物などの動物を指し、ヒトを含む。ヒトは好ましい患者である。
【００５１】
当業者は現在症状を示している患者に有効量の式Ｉの化合物を投与することによって感受性がんを治療することができることもまた認識される。したがって、用語「治療すること」（または「治療する」または「治療」）は、全てのプロセス指し、既存の疾患および／またはその症状の進行の遅延、中断、停止、制御、または停止があり得るが、必ずしも全ての症状の完全な排除を示すとは限らないことを意図している。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することによって、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイム相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原または抗体断片−抗原の相互作用の平衡解離定数を指すことを意図している。
【００５４】
用語「結合する」などは、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、ＳＰＲ（本明細書の実施例６を参照）、または抗原（すなわちＭＥＴ）の天然リガンド（すなわちＨＧＦ）に対する競合結合アッセイもしくは親抗体（エミベツズマブ）およびＭＥＴ  ＡＤＣに対する競合結合アッセイ（本明細書の実施例８を参照）などが挙げられる。本発明の文脈において使用される場合、例えば、ＭＥＴに「結合する」抗体は、ＳＰＲアッセイ（例えば、本明細書の実施例６を参照）で測定した場合に、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＫＤで、ＭＥＴ−ＥＣＤ（またはＳＥＭＡドメインもしくはそのα鎖部分）に結合する抗体を含む。好ましくは、本発明のＭＥＴ  ＡＤＣは、親和性測定に対する結合活性効果（すなわち、非結合活性結合）を回避または排除するように設計されたＳＰＲアッセイ（例えば、本明細書の実施例６を参照）で測定した場合に、約５０ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約１５ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約１５ｎＭ〜約１．０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１．０ｎＭ、約７．５ｎＭ〜約１．０ｎＭ、約６ｎＭ〜約１．０ｎＭ、約３ｎＭ〜約１．０ｎＭ、約１ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約０．７５ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約０．５ｎＭ〜約０．１ｎＭのＫＤで、ＭＥＴ−ＥＣＤ（またはＳＥＭＡドメインもしくはそのα鎖部分）に結合する。
【００５５】
本発明で説明する化学式において、窒素（Ｎ）へのＡの波状結合は、グループＡのリジン残基を表し、ＡはＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であることが理解される。したがって、本発明は、式Ｉの化合物を調製するのに有用な式ＩＩＩの化合物を提供する。
【化７】
2019536780.tif 000009
【００５６】
本発明の実施形態は、式Ｉの化合物であって、
【化８】
2019536780.tif 000010
式中、
Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖と、
ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００５７】
本発明の他の実施形態は、式Ｉの化合物であって、
式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖と、
ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物であって、
【化９】
2019536780.tif 000011
式中、
Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を各重鎖が含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を各軽鎖が含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩である。そのような発明の他の実施形態では、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉ）両方の重鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｉ）両方の軽鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含む。さらに、そのような発明の様々な実施形態では、ＭＥＴ  ＡＤＣは、ＨＧＦ非依存性およびＥＧＦ非依存性の細胞表面ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する。
【００５９】
本明細書に開示されるＭＥＴ  ＡＤＣ化合物のいくつかの実施形態では、配列番号７の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号８の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、両方とも抗ＭＥＴクローンＣ８−Ｈ２４１（これはＷＯ２０１０／０５９６５４に詳細に記載されている）に由来し、ＭＥＴに結合するＭＥＴ抗体の抗原結合部位を形成するために使用することができる。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、（ａ）第１のポリペプチドの両方が配列番号２３のアミノ酸配列を含む２つの第１のポリペプチドと、（ｂ）第２のポリペプチドの両方が配列番号９のアミノ酸配列を含む２つの第２のポリペプチドと、を含む、ＭＥＴに結合するＭＥＴ  ＡＤＣである。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、（ａ）第１のポリペプチドの両方が配列番号２３のアミノ酸配列を含む２つの第１のポリペプチドと、（ｂ）第２のポリペプチドの両方が配列番号９のアミノ酸配列を含む２つの第２のポリペプチドと、を含むＭＥＴ  ＡＤＣ、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、式Ｉの化合物であって、
【化１０】
2019536780.tif 000012
式中、
Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉｉｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖と、
ｉｖ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法である。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、式Ｉの化合物であって、式中、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖と、
ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法である。
【００６４】
本発明の別の実施形態は、がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、式Ｉの化合物であって、
【化１１】
2019536780.tif 000013
式中、
Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉｉｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を各重鎖が含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｖ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を各軽鎖が含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含み、
ｎが１〜９である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法である。そのようながんを治療する方法の他の実施形態では、Ａが、ＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
ｉｉｉ）両方の重鎖が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖および第２の重鎖と、
ｉｖ）両方の軽鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含む。さらに、そのようながんを治療する方法の様々な実施形態では、ＭＥＴ  ＡＤＣは、ＨＧＦ非依存性の細胞表面ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する。
【００６５】
本明細書に開示されるがんを治療する方法のいくつかの実施形態では、配列番号７の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号８の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、両方とも抗ＭＥＴクローンＣ８−Ｈ２４１（これはＷＯ２０１０／０５９６５４に詳細に記載されている）に由来し、ＭＥＴに結合するＭＥＴ抗体の抗原結合部位を形成するために使用することができる。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、ＭＥＴに結合し、（ａ）第１のポリペプチドの両方が配列番号２３のアミノ酸配列を含む２つの第１のポリペプチドと、（ｂ）第２のポリペプチドの両方が配列番号９のアミノ酸配列を含む２つの第２のポリペプチドと、を含む式Ｉの化合物を投与することを含む、方法である。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、（ａ）第１のポリペプチドの両方が配列番号２３のアミノ酸配列を含む２つの第１のポリペプチドと、（ｂ）第２のポリペプチドの両方が配列番号９のアミノ酸配列を含む２つの第２のポリペプチドと、を含むＭＥＴ  ＡＤＣ、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物の使用である。
【００６８】
本発明のＭＥＴ  ＡＤＣ化合物の少なくとも１つを用いてがんを治療する方法のいくつかの実施形態では、がんは、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、ならびに限定されないがＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む肺がん、ならびに胆管がん、または限定されないがブドウ膜黒色腫を含む黒色腫である。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＭＥＴ  ＡＤＣ化合物の少なくとも１つを用いてがんを治療する方法であって、腫瘍が１つ以上のＫＲＡＳ変異を有する細胞を含むことを特徴とする、方法が提供される。本発明の他の実施形態はまた、がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、薬学的有効量の前述のＭＥＴ  ＡＤＣの１つまたはその塩を投与することを含み、ＭＥＴが低、中、または高レベルで患者の腫瘍に発現し、かつ／または腫瘍が１つ以上の抗ＭＥＴ抗体（例えば、エミベツズマブなど）および／または１つ以上のＭＥＴの低分子阻害剤（例えば、クリゾチニブ、メレスチニブなど）に対して耐性であるか、または耐性になった（限定されないが、ＫＲＡＳ変異を有する腫瘍を含む）、方法を提供する。そのような発明の様々な実施形態では、がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、薬学的有効量の前述のＭＥＴ  ＡＤＣの１つまたはその塩を投与することを含み、ＭＥＴが低、中、または高レベルで患者の腫瘍に発現し、かつ／または腫瘍が１つ以上の抗ＭＥＴ抗体（例えば、エミベツズマブなど）および／または１つ以上のＭＥＴの低分子阻害剤（例えば、クリゾチニブ、メレスチニブなど）に対して耐性であるか、または耐性になった（限定されないが、ＫＲＡＳ変異を有する腫瘍を含む）、方法は、ＭＥＴ  ＡＤＣまたはその塩を患者に投与する工程の前に、患者の腫瘍に発現するＭＥＴのレベルを測定すること、および／または患者の腫瘍が１つ以上のＫＲＡＳ変異を有する細胞を含むかどうかを評価することによって、がんの治療を必要とする患者を同定する工程をさらに含み得る。
【００７０】
ＭＥＴ抗体は、当技術分野において周知の技術を使用して組換え発現によって調製され得る。
【００７１】
原核生物または真核生物の宿主細胞において抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核生物細胞が好ましく、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞であり、なぜなら、そのような細胞は、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性がより高いからである。本発明で使用される組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０，１９８０に記載されたｄｈｆｒマイナスＣＨＯ細胞を含み、ＤＨＦＲ選択可能マーカー、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−２１，１９８２に記載されたものと共に使用される］、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２／０細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現、またはより好ましくは当該技術分野において周知の適切な条件下で宿主細胞が増殖している培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的な精製方法を使用して、宿主細胞および／または培養培地から回収され得る。
【００７２】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ型のものであり、より好ましくは、ＩｇＧ４サブタイプのものである。
【００７３】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【００７４】
本発明はまた、治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩を提供する。
【００７５】
本発明はまた、がんの治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩を提供する。
【００７６】
本発明はまた、ＭＥＴが発現するがんの治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩を提供する。
【００７７】
本発明はまた、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、ならびに限定されないがＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む肺がん、ならびに胆管がん、または限定されないがブドウ膜黒色腫を含む黒色腫、の治療に使用するための、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩を提供する。
【００７８】
本発明はまた、がんを治療する方法であって、それを必要とするヒト患者に、有効量の前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、またはその塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００７９】
「がん（ｃａｎｃｅｒ）」（または「がん（ａ  ｃａｎｃｅｒ）」）という用語は、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、頭頸部がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、食道がん、限定されないがブドウ膜黒色腫を含む黒色腫、肝臓がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がんもしくは尿管がん、腎細胞がん、乳頭状腎細胞がん、甲状腺細胞がん、腎盂がん（上記のがんのいずれかの難治性のものを含む）、または上記がんの１つ以上の組み合わせなどの増殖性疾患を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、本明細書に記載の結腸直腸がんなどの障害を治療するのに有効な量、すなわち投与量を指す。当業者であれば、従来技術の使用によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、有効量を容易に決定することができる。有効量または用量を決定する際に、多くの要因が考慮され、限定されないが、投与される化合物、使用される場合は、他の薬物の共投与、哺乳動物の種、そのサイズ、年齢、および一般的な健康状態、結腸直腸がんなどの障害の程度または重症度、個々の患者の応答、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択された投薬レジメン、他の併用薬の使用、およびその他の関連する状況が挙げられる。有効量はまた、ＭＥＴ  ＡＤＣまたはその塩の任意の有害作用（複数可）よりも、治療上有益な作用が上回る量である。
【００８１】
有効量は、対象に治療上の利益を付与するのに必要な、活性物質の最小量以上であるが、全体的に有害な量未満である。言い換えれば、本発明の抗体の有効量または治療有効量は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、がん細胞の数を減少させる、腫瘍のサイズを小さくする、末梢組織器官へのがん細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅くするか、または停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅くするか、または停止させる）、腫瘍の増殖をある程度阻害する、および／またはがんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度緩和する量である。本発明のＭＥＴ  ＡＤＣの有効量は、単回投与または複数回投与で投与され得る。さらに、本発明のＭＥＴ  ＡＤＣの有効量は、一度だけ投与される場合、有効量未満である量の複数回投与で投与され得る。
【００８２】
医学分野において周知であるように、いずれか１人の対象に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。用量は、さらに、疾患の種類および重症度に依存して変化し得る。典型的な用量は、例えば、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好ましくは約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、さらにより好ましくは約２００ｍｇ〜約４００ｍｇ、さらにより好ましくは約２００ｍｇ〜約３００ｍｇ、さらにより好ましくは約２２５ｍｇ〜約２７５ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０ｍｇ〜約２７５ｍｇの範囲であり得るが、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲未満またはそれよりも多い用量が想定される。１日の非経口投与レジメンは、約２５０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。進行は定期的な評価によって監視されてもよく、それに従って用量が調整されてもよい。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＭＥＴ  ＡＤＣの単回用量は、成人患者におけるがんを治療するために静脈内投与され得る。静脈内投与のための典型的な単回用量は、例えば、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好ましくは、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好ましくは、約１０ｍｇ〜約４００ｍｇ、より好ましくは、約１０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、より好ましくは、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、さらにより好ましくは、約１０ｍｇ〜約２７５ｍｇ、さらにより好ましくは、約１０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、さらにより好ましくは、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、さらにより好ましくは、約１０ｍｇ〜約１７５ｍｇ、さらにより好ましくは、約１０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、最も好ましくは、約１０ｍｇ〜約１２５ｍｇの範囲であり得るが、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲未満またはそれよりも多い用量が想定される。あるいは、本発明のＭＥＴ  ＡＤＣの静脈内投与のための典型的な単回用量は、例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇであり得る。そのような用量は、例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または１ヶ月に１回静脈内投与され得る。進行は定期的な評価によって監視されてもよく、それに従って用量が調整されてもよい。
【００８４】
本発明のＭＥＴ  ＡＤＣのこれらの示唆された量は、治療上の裁量に多大に依存する。適切な投与およびスケジューリングを選択することにおける主な要因は、得られた結果である。これに関連して想定される要因は、治療される特定の障害、個々の患者の病態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に既知の他の要因を含む。
【００８５】
本発明のＭＥＴ  ＡＤＣは、様々な経路によって投与される、ヒトの医療における医薬として使用されてもよい。したがって、本発明はまた、前述のＭＥＴ  ＡＤＣのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。最も好ましくは、そのような組成物は、非経口投与用である。本明細書で使用される場合、非経口という用語は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または腹腔内投与を含む。静脈内または腹腔内または皮下投与による非経口の送達が好ましい。静脈内投与が最も好ましい。そのような投与に適したビヒクルは、当技術分野において周知である。
【００８６】
薬学的組成物は、典型的に、滅菌されている必要があり、提供される容器、例えば、密封バイアル、シリンジ、または他の送達装置、例えばペン等を含む容器内での製造および保存の条件下で安定している必要がある。したがって、薬学的組成物は、製剤作製後、濾過滅菌され得るか、またはそうでなければ微生物汚染がないようにされ得る。
【００８７】
本発明のＡＤＣは、単独で、あるいは、薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤と組み合わせた薬学的組成物の形態（その割合および性質は、選択される化合物の安定性、選択される投与経路、および標準的薬務を含む、溶解性および化学的特性によって決定される）で、単回投与または複数回投与でヒト対象に投与されてもよい。そのような薬学的組成物は、選択される投与様式に適するように設計され、薬学的に許容される希釈剤、担体、および／または賦形剤、例えば、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、限定されないが塩化ナトリウムを含む等張剤、安定剤などが、適切な場合に使用される。該組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に開示されている従来技術に従って設計可能であり、この文献は、医師には一般的に既知であるような製剤技術の概要を提供している。薬学的組成物に適切な担体は、本発明の抗体と組み合わされる場合、分子の活性を保持し、対象の免疫系に反応しない任意の物質を含む。本発明の化合物は、それ自体有効ではあるが、結晶化の便宜、溶解度の向上などのために、その薬学的に許容される塩の形態で製剤化および投与されてもよい。
【００８８】
式Ｉの化合物は、化学技術分野において周知のプロセスによって、または本明細書に記載の新規のプロセスによって調製されてもよい。式Ｉの化合物および式Ｉの化合物の製造のための新規中間体の調製プロセスは、本発明のさらなる特徴を提供し、以下の手順で説明される。
【００８９】
一般に、ｎが１〜９である式Ｉの化合物は、式ＩＩの化合物から調製されてもよい（スキーム１）。より具体的には、式ＩＩの化合物を、リン酸緩衝食塩水およびＤＭＳＯなどの溶媒中で、ｎが１〜９である式ＩＩＩの化合物と反応させて、式Ｉの化合物を得る。
【化１２】
2019536780.tif 000014
【００９０】
一般に、式ＩＩＩの化合物は、ＭＥＴ抗体式ＩＶ）のリジン基を（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートと反応させることによって調製されてもよい（スキーム２）。より具体的には、Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ４またはより具体的にはエミベツズマブなどのＭＥＴモノクローナル抗体である式ＩＶ、Ａの化合物を、リン酸緩衝食塩水およびＤＭＳＯなどの溶媒中で、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートと反応させて、２−アジドアセチル−リジン基の数を表すｎが１〜９である式ＩＩＩの化合物を得る。１１：１〜５：１で式ＩＶの化合物の量に対してモル過剰の（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートが典型的に使用される。好ましくは、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートと式ＩＶの化合物とのモル比は、約９：１〜６：１である。より好ましくは、モル比は、約７．７５：１である。ｎの値および平均薬物抗体比（ＤＡＲ）に対するその寄与は、この工程において、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートと式ＩＶの化合物とのモル比を含む反応条件ならびに他の標準的な技術の変更によって制御され得る。
【化１３】
2019536780.tif 000015
【００９１】
一般に、式ＩＩの化合物は、式Ｖの化合物から調製されてもよい（スキーム３）。より具体的には、式Ｖの化合物を、ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下で、（１Ｒ，９Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イル−９−イル−メチル（４−ニトロフェニル）カーボネートと反応させて、式ＩＩの化合物を得る。反応は、典型的には、ジメチルホルムアミドなどの溶媒中で行われる。式Ｖの化合物は、ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基およびヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性化剤の存在下で、式ＶＩの化合物を、式ＶＩＩの化合物と最初に反応させることによって調製されてもよい。反応は、典型的には、ジメチルホルムアミドなどの溶媒中で行われる。得られたカップリング生成物を、メタノールなどの溶媒中で水酸化リチウム水溶液などの塩基と反応させて式Ｖの化合物を得る。
【００９２】
式ＶＩの化合物は、調製物および実施例に記載の通りに調製されてもよい。式ＶＩＩの化合物は、国際特許出願公開第ＷＯ２００２／０８８１７２号に開示されているものを含む、当業者によって認識されている手順により調製されてもよい。
【化１４】
2019536780.tif 000016
調製物および実施例
略語（網羅的なリストではない）
ＤＡＲ：薬物抗体比
ＤＩＰＥＡ：Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＨＯＢｔ：ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＭＭＡＥ：モノメチルアウリスタチンＥ
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＭｅＯＨ：メタノール
ＬｉＯＨ：水酸化リチウム
ＥＡ：酢酸エチル
ＰＥ：石油エーテル
ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｓｔｄ．Ｅｒｒ：標準誤差
ＡＶＧ：平均
ＭＦＩ：平均蛍光強度
【００９３】
調製物１
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−（４−（ヒドロキシメチル）−２−ニトロフェノキシ）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートの合成。
【化１５】
2019536780.tif 000017
アセトニトリル（２００ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−ブロモ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレート（９．５ｇ、２３．９２ｍｍｏｌ）の溶液に、４−（ヒドロキシメチル）−２−ニトロフェノール（４ｇ、２３．６５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を撹拌しながら０℃に冷却する。酸化銀（２７．３ｇ、１１７．８１ｍｍｏｌ）を反応物にゆっくり添加する。混合物を２０時間撹拌しながら１０℃に保つ。物質を濾過し、酢酸エチル（２００ｍｌ）で洗浄する。物質を真空下で濃縮する。粗生成物をシリカのフラッシュクロマトグラフィー（ＥＡ：ＰＥ＝５：１）により精製して、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−（４−（ヒドロキシメチル）−２−ニトロフェノキシ）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートを黄色の固体として得る（９．８０ｇ、８５．３７％収率）。ＭＳ  ｍ／ｚ  ５０８（Ｍ＋Ｎａ）。
【００９４】
調製物２
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−（２−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートの合成。
【化１６】
2019536780.tif 000018
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−（４−（ヒドロキシメチル）−２−ニトロフェノキシ）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレート（９．８ｇ、２０．１９ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶かした溶液に、テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）および二酸化白金（０．９８ｇ、４．３２ｍｍｏｌ）を添加する。反応容器を水素で３回パージする。混合物を２０時間撹拌しながら１０℃に保つ。物質を濾過し、酢酸エチルで洗浄する。物質を真空下で濃縮して、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−（２−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートを無色の油状物として得る（８．１ｇ、８８．０９％収率）。ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５６（Ｍ＋Ｈ）。
【００９５】
調製物３
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−６−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−プロパンアミド）−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）−３，４，５−トリアセトキシ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートの合成。
【化１７】
2019536780.tif 000019
３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパン酸（５．７４ｇ、１８．４４ｍｍｏｌ）にテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）を添加する。混合物を撹拌しながら０℃に冷却する。塩化オキサリル（５ｍｌ、５７．６３ｍｍｏｌ）を反応物にゆっくり添加する。次いで、ＤＭＦを３滴、反応混合物に添加する。混合物を２時間撹拌しながら１０℃に保つ。物質を蒸発下で濃縮して、対応する酸塩化物を得る。（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−３，４，５−トリアセトキシ−６−（２−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレート（８ｇ、１７．５７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（６ｍＬ、３４．４０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら容器に添加する。混合物を撹拌しながら０℃に冷却する。上記の酸塩化物を２０ｍｌのＤＣＭに溶解し、反応混合物に滴加する。混合物を２時間撹拌しながら１０℃に保つ。反応をＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）でクエンチする。混合物をジクロロメタン（１００ｍｌ×３）で抽出し、水相を捨てる。物質をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して乾燥させた。粗生成物をシリカのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＥＡ＝１：１）により精製して、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−６−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−プロパンアミド）−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）−３，４，５−トリアセトキシ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートを黄色油状物として得る（７．９ｇ、６０．０６％収率）。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７４９（Ｍ＋Ｈ）。
【００９６】
調製物４
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−６−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパンアミド）−４−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）−フェノキシ）−３，４，５−トリアセトキシ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートの合成。
【化１８】
2019536780.tif 000020
ジクロロメタン（２５０ｍＬ）およびピリジン（３ｍＬ、３７．１０ｍｍｏｌ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−６−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−カルボニルアミノ）プロパンアミド）−４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）−３，４，５−トリアセトキシ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレート（７．２ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）の混合物を、０℃に冷却する。２０ｍｌのＤＣＭ中の４−ニトロフェニルクロロホルメート（７．７３ｇ、３８．３５ｍｍｏｌ）を、反応混合物に滴加する。混合物を２時間撹拌しながら０℃に保つ。反応をＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍｌ）でクエンチする。混合物をジクロロメタン（１５０ｍｌ×３）で抽出し、水相を捨てる。物質をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して乾燥させた。粗生成物をシリカのフラッシュクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ）により精製して、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−メチル−６−（２−（３−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロパンアミド）−４−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシ）メチル）−フェノキシ）−３，４，５−トリアセトキシ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキシレートを得る（７．０２ｇ、７９．８８％収率）。ＭＳ  ｍ／ｚ  ９１４．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００９７】
調製物５
（３Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）−６−［２−（３−アミノプロパノイルアミノ）−４−［［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニル−エチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−プロピル］ピロリジン−１−イル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソ−ブチル］−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル］カルバモイル］−２−メチル−プロピル］−メチル−カルバモイル］オキシメチル］フェノキシ］−３，４，５−トリヒドロキシ−テトラヒドロピラン−２−カルボン酸（すなわち、ＮＨ２−β−グルカン−ＭＭＡＥ）の合成。
【化１９】
2019536780.tif 000021
メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−３，４，５−トリアセトキシ−６−［２−［３−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］−４−［（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシメチル］フェノキシ］テトラヒドロピラン−２−カルボキシレート（１５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニル−エチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−プロピル］ピロリジン−１−イル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソ−ブチル］−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル］−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド（ＭＭＡＥ）（１４６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、溶液にＤＩＰＥＡ（３６μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（８ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を添加する。室温で一晩撹拌する。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）および１Ｎ  ＬｉＯＨ（１ｍＬ）を添加する。濃縮し、ＨＰＬＣ（カラム；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  ＡＸＩＡ充填３０×７５ｍｍカラム、移動相；Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ、モニター；２１４ｎｍ、流速；８５ｍＬ／分、勾配；１０〜３８％、勾配時間；８分）により精製する。収集した画分を凍結乾燥機で乾燥させて、所望の生成物の、（３Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）−６−［２−（３−アミノプロパノイルアミノ）−４−［［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニル−エチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−プロピル］ピロリジン−１−イル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソ−ブチル］−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル］カルバモイル］−２−メチル−プロピル］−メチル−カルバモイル］オキシメチル］フェノキシ］−３，４，５−トリヒドロキシ−テトラヒドロピラン−２−カルボン酸（ＮＨ２−β−グルカン−ＭＭＡＥ）を得る（１２２ｍｇ、収率６４％）。ＭＳ  ｍ／ｚ  １１３０（Ｍ＋Ｈ）。
【００９８】
調製物６
（３Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）−６−［２−［３−（９−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］−４−［［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニル−エチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−プロピル］ピロリジン−１−イル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソ−ブチル］−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル］カルバモイル］−２−メチル−プロピル］−メチル−カルバモイル］オキシメチル］フェノキシ］−３，４，５−トリヒドロキシ−テトラヒドロピラン−２−カルボン酸（オクチン−β−グルカン−ＭＭＡＥ）の合成
【化２０】
2019536780.tif 000022
（３Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）−６−［２−（３−アミノプロパノイルアミノ）−４−［［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニル−エチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−プロピル］ピロリジン−１−イル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソ−ブチル］−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル］カルバモイル］−２−メチル−プロピル］−メチル−カルバモイル］オキシメチル］フェノキシ］−３，４，５−トリヒドロキシ−テトラヒドロピラン−２−カルボン酸（６１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）（ＮＨ２−β−グルカン−ＭＭＡＥ）を、ＤＩＰＥＡ（１９μＬ、０．１０９ｍｍｏｌ）、（１Ｒ，９Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イル−９−イル−メチル（４−ニトロフェニル）カーボネート（２２ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合物に溶解する。室温で一晩撹拌する。濃縮し、ＨＰＬＣ（カラム；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  ＡＸＩＡ充填３０×７５ｍｍカラム、移動相；Ａ：水中１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ＝１０）、Ｂ：アセトニトリル、モニター；２１４ｎｍ、流速；８５ｍＬ／分、勾配；１０〜４６％、勾配時間；８分）により精製して、所望の生成物の、（３Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）−６−［２−［３−（９−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］−４−［［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニル−エチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−プロピル］ピロリジン−１−イル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソ−ブチル］−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル］カルバモイル］−２−メチル−プロピル］−メチル−カルバモイル］オキシメチル］フェノキシ］−３，４，５−トリヒドロキシ−テトラヒドロピラン−２−カルボン酸（オクチン−β−グルカン−ＭＭＡＥ）を得る（４５ｍｇ、収率６４％）ＭＳ  ｍ／ｚ  １３０６（Ｍ＋Ｈ）。
【００９９】
実施例１：抗ＭＥＴ抗体の発現および精製
本明細書で提供されるＭＥＴ  ＡＤＣの生成のために使用される抗ＭＥＴ抗体は、本質的に以下のように発現および精製することができる。
配列番号２４のＤＮＡ（配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードする）および配列番号１０のＤＮＡ（（配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードする）を含有するグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを、エレクトロポレーションによりチャイニーズハムスター細胞株のＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ，Ｓｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をトランスフェクトするために使用する。この発現ベクターは、ＳＶ初期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞について、５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いてバルク選択を行う。ＭＳＸによるＧＳの阻害は、選択のストリンジェンシーを高めるために利用される。宿主細胞ゲノムの転写活性領域に発現ベクターｃＤＮＡを組み込んだ細胞が、内因性レベルのＧＳを発現するＣＨＯＫ１ＳＶ野生型細胞に対して選択される。トランスフェクトされたプールを低密度でプレーティングして、安定した発現細胞のクローンに近い成長（ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ｃｌｏｎａｌ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にする。マスターウェルを抗ＭＥＴ  ＩｇＧ発現についてスクリーニングし、次いで必要に応じて無血清懸濁培養において拡大してもよい。適切な細胞株が同定されたら、それを必要に応じて無血清懸濁培養において拡大してもよい。抗ＭＥＴ  ＩｇＧが分泌されている清澄化培地を、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）またはトリス緩衝液（ｐＨ７．４）などの適合緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティーカラムに適用する。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗ＭＥＴ  ＩｇＧは、例えば、ｐＨ勾配（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８〜０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５〜３．０など）によって、溶出される。抗体画分は、２８０ｎｍでの吸光度カット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または分析的サイズ排除などによって、検出および／または収集される。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効率的に除去することができる。抗ＭＥＴ  ＩｇＧは、一般的な技術を使用して、濃縮および／または滅菌濾過されてもよい。これらのクロマトグラフィーの工程後の抗ＭＥＴ  ＩｇＧの純度は、９０％より高く、好ましくは、９８％より高い。抗ＭＥＴ  ＩｇＧは、−７０℃で直ちに凍結されてもよく、または４℃で数ヶ月間保存されてもよい。
【０１００】
実施例２：エミベツズマブの複合体化
パートＡ：エミベツズマブとβ−グルカン−ＭＭＡＥの複合体化
実施例２のこのパートＡにおいて記載される複合体化の結果は、以下に示されるＭＥＴ−ＡＤＣ＃１複合体の混合物であることが理解される。
【化２１】
2019536780.tif 000023
【０１０１】
抗ＭＥＴ抗体のエミベツズマブは、ｐＨ７．０〜７．２のＰＢＳ緩衝液中で１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈される。新たに調製した、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートを無水ＤＭＳＯに溶解した２ｍｇ／ｍＬの溶液を、抗体溶液に対して７．７５〜１０モル当量の（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートの最終比まで添加する（正確な比は（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートの供給源および純度に依存する）。反応混合物を、穏やかに混合しながら３７℃で２．５時間または２２℃±２℃で３時間以上インキュベートする。インキュベーション後、脱塩カラム、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ｐＳＥＣ）、接線流濾過（ＴＦＦ）または透析を使用して、過剰の未反応または酸化（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートを試料から除去する。２−アジドアセテートを有する抗体の濃度を、８〜１０ｍｇ／ｍＬに調整する。無水ＤＭＳＯに溶解したオクチン−β−グルカン−ＭＭＡＥ（調製物６）を、オクチン−β−グルカン−ＭＭＡＥ対抗体が１０〜１５：１のモル当量の最終比になるまで添加する。次いで、混合物を、穏やかに混合しながら３７℃で８時間以上または２２℃±２℃で１６時間以上インキュベートする。インキュベーション後、試料を所望の緩衝液に交換し、脱塩カラム、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ｐＳＥＣ）、接線流濾過（ＴＦＦ）、または透析を使用して、過剰のオクチン−β−グルカン−ＭＭＡＥを除去する。
【０１０２】
薬物抗体比（ＤＡＲ）を決定するために、約１ｍｇ／ｍＬの５０μｌＡＤＣ試料をＰＢＳ中で調製する。次に、１．５μｌの２．５Ｕ／ｍＬ  Ｎ−グリカナーゼ酵素を、１．５μｌの５×Ｎ−グリカナーゼ反応緩衝液と一緒に添加し、続いて３７℃で４時間インキュベートして、抗体からＮ−結合グリコシル化を除去する。エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴｏＦ）を使用して、最終平均ＤＡＲを決定する。試料を、０．１％ギ酸中の１０〜８０％アセトニトリル勾配を使用してＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ３カラムに通し、続いてＡｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴｏＦ  ＭＳを使用して陽イオンモードで５００〜１０，０００ｍ／ｚの収集速度で毎秒１スキャンでＴｏＦ−ＭＳ分析を行う。
【０１０３】
ＡＤＣのＤＡＲは、ｎとイオン数の合計の割合との積として計算されてもよい：ＤＡＲ寄与＝ｎ×合計の割合。例として、ｎ＝２の値について、ＤＡＲ寄与は、２×０．２０３＝０．４１である。平均ＤＡＲは、ＤＡＲ寄与の合計である。検出可能な最も高いｎは、機器の感度に依存し得る。
【０１０４】
表１に示した通り、この実施例２において本質的に上記の通りに調製されたＭＥＴ−ＡＤＣ＃１複合体の混合物の平均ＤＡＲは、約３．３であると決定された。
【表２】
2019536780.tif 000024
【０１０５】
パートＢ：代替リンカーを用いたエミベツズマブとβ−グルカン−ＭＭＡＥの複合体化
実施例２において本質的に上に記載した通りの方法では、本明細書で特にＭＥＴ−ＡＤＣ＃２、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃３、またはＭＥＴ−ＡＤＣ＃４と呼ばれる他のＭＥＴ  ＡＤＣの混合物を調製するために、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−アジドアセテートの代わりに、それぞれ（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）４−アジドブタン酸、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、またはアジド−ＰＥＧ８−ＮＨＳエステルなどの、様々な長さの代替リンカーを使用してもよい。
【０１０６】
パートＣ：エミベツズマブとＭａｌ−Ｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥの複合体化
当技術分野において周知の方法を使用して、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃６複合体の混合物は、約３．３〜３．８のＤＡＲを有するＭＥＴ−ＡＤＣ＃６複合体の混合物をもたらすように最適化された条件下で、エミベツズマブとマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＥ（すなわち、Ｍａｌ−Ｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）とを複合体化させることによって生成された。
【０１０７】
実施例４：マウス血漿中でのエクスビボリンカー−ペイロード複合体の安定性
ＡＤＣの重要な特徴は、抗体とペイロード（細胞毒性）との間のリンカーの安定性である。血液中でのペイロードの急速な放出は、毒性および効力の両方の観点から有害であり得る。リンカー−ペイロード複合体の末梢血安定性に対するリンカーの組成の影響への洞察を得るための手段として、マウス血漿中での時間インキュベーション法を使用して、エクスビボ評価を行った。マウスマトリックス中のエクスビボ血漿リンカー−ペイロード複合体の安定性を用いて、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃２、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃３およびＭＥＴ−ＡＤＣ＃４内のリンカーによって与えられる複合体化安定性の程度を評価した。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃２、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃３およびＭＥＴ−ＡＤＣ＃４のリンカー−ペイロードの安定性プロファイルは、各ＡＤＣにマウス血漿を３７℃で７２時間スパイクした後のＤＡＲ（薬物抗体比）を測定することによって特徴付けられた。血漿インキュベーション後のＤＡＲを、インキュベーション前の最初のＤＡＲと比較した（表２）。各ＡＤＣのＤＡＲを、ビーズベースの抗ヒトＩｇＧ免疫親和性捕捉法を使用して測定した。ＡＤＣの捕捉後、試料を（ビーズ上で）脱グリコシル化し、酸を使用して溶出し、還元した後、報告される通り、ＬＣ−ＭＳシステム（Ｑ−ＴＯＦ）を使用して重鎖および軽鎖の構造を検出した（例えば、Ｋａｕｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，２０１３，５（２）：２０１−２２６を参照）。エクスビボマウス血漿の所見は、リンカーによって与えられる複合体化安定性の順位が、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃２＞ＭＥＴ−ＡＤＣ＃３＞ＭＥＴ−ＡＤＣ＃４であることを示す。データは、疎水性成分を増加させたより短いリンカーが、ＭＥＴ抗体であるエミベツズマブとの複合体化安定性を増加させたことを示している。
【表３】
2019536780.tif 000025
【０１０８】
実施例５：マウスにおける薬物動態およびリンカー−ペイロード複合体の安定性
ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１およびＭＥＴ−ＡＤＣ＃２の総ＩｇＧおよび複合体化されたＩｇＧペイロードの薬物動態は、インビボ系におけるそれらの曝露プロファイルおよびリンカー−ペイロードの安定性を評価するために、２．５ｍｇ／ｋｇのレベルの単回投与での単回静脈内（ＩＶ）投与後の雄ＣＤ−１マウスにおいて特徴付けられた。総ＩｇＧ濃度および複合体化されたＩｇＧペイロードを、ビーズベースの抗ヒトＩｇＧ免疫親和性捕捉法を使用して測定した。ＡＤＣの捕捉後、ＬＣ−ＭＳを使用して重鎖を検出する前に、総ＩｇＧ試料を還元し、アルキル化し、トリプシンで処理した。ＩｇＧ複合体化ペイロードの分析のために、試料を、グリコシド結合の加水分解をもたらし、抗体からペイロード（ＭＭＡＥ）を遊離させる（すなわち脱複合体化させる）β−グルクロニダーゼでさらに処理した。放出されたペイロードをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量して、複合体化されたＩｇＧペイロードの濃度を測定する。
【０１０９】
マウスのＰＫパラメータを表３に提示する。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の複合体化されたＩｇＧペイロードの分析と比較して、総ＩｇＧに由来するマウスのＰＫパラメータ（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ＣＬおよびＴ１／２）はかなり類似している（表３）。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１についての総ＩｇＧおよび複合体化されたＩｇＧペイロード由来のクリアランス（ＣＬ）値は、０．４ｍＬ／時／ｋｇであり、一方で消失半減期（Ｔ１／２）の値は、それぞれ〜１８７時間および〜１２５時間である。２つの分析から得られた同等のＣＬ値は、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１のリンカー−ペイロード成分が、マウスの血液循環中に安定であることを示している。
【０１１０】
ＭＥＴ−ＡＤＣ＃２についての総ＩｇＧおよび複合体化されたＩｇＧペイロード由来のクリアランス（ＣＬ）値は、それぞれ０．３および０．６ｍＬ／時／ｋｇの値であり、〜２倍の差を示す（表３）。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃２についての消失半減期（Ｔ１／２）の値は、総ＩｇＧおよび複合体化されたＩｇＧペイロードのアッセイにおいて、それぞれ１７５時間および８０時間である。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃２について観察された総ＩｇＧおよび複合体化されたＩｇＧペイロードのＣＬ値のより大きな差は、分子がインビボでＭＥＴ−ＡＤＣ＃１ほど安定ではない可能性があることを示唆している。
【表４】
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【０１１１】
実施例６：ＭＥＴ−ＥＣＤに対するエミベツズマブおよびＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の結合分析
当該分野で周知の方法に従って、抗体およびＡＤＣの結合速度および親和性を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用してもよい。特記しない限り、全ての試薬および材料は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入することができ、測定は生理的条件を模倣するために３７℃で実施されてもよい。
【０１１２】
簡単に説明すると、試料を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチル−  ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４または７．６）に溶解してもよい。４つ全てのフローセル（ＦＣ）上の固定化プロテインＡ（標準ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成されてもよい）を含有するＣＭ５  Ｓセンサーチップを使用して、捕捉方法を用いてもよい。抗体またはＡＤＣ試料は、最初に泳動バッファーで希釈することによって０．５μｇ／ｍＬで調製することができ、次いでそれらの捕捉を流速１０μｌ／分で１分間試験してもよい。捕捉された量に基づいて、抗体またはＡＤＣの濃度または注入時間は、それに応じて約２５ＲＵから３５ＲＵの所望の捕捉量を目標とするように調整され得る。泳動緩衝剤中に希釈することによって、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９、０．２および０（ブランク）ｎＭの最終濃度で、ＭＥＴ−ＥＣＤを調製してもよい。各分析サイクルは以下からなり得る：（１）別々のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４）上に抗体試料を捕捉すること、（２）１００μＬ／分で２５０μＬ（１５０秒）のＭＥＴ−ＥＣＤを全Ｆｃにわたって注入すること、（３）解離相をモニターするために２０分間緩衝液流に戻すこと、（４）１０μＬ／分で全Ｆｃにわたって５μＬ（３０秒）のグリシン、ｐＨ１．５を注入することでチップ表面を再生すること。標準的な二重参照を使用してデータを処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン２．０またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン１．０を使用して１：１結合モデルに適合させて、会合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ、ｓ−１単位）、Ｒｍａｘ（ＲＵ単位）、および結合親和性ＫＤ（ｎＭ）を測定することができる。
【０１１３】
ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎの関係から平衡解離定数（ＫＤ）を計算する。
【０１１４】
ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１を上記の通り試験して、ＭＥＴ−ＥＣＤに対するその結合速度および結合親和性を測定した。結果を以下の表４に示す。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、エミベツズマブと同等の結合親和性（ＫＤ）でＭＥＴ−ＥＣＤに結合する。
【表５】
2019536780.tif 000027
【０１１５】
実施例７：ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、エミベツズマブと比較して増加したアゴニスト活性を有しない。
有意なアゴニスト活性なしに高結合親和性のＭＥＴ抗体を生成することの困難さは当該分野において十分に実証されている。例えば、Ｓａｔｏらは、ＭＥＴに対する治療用抗体の発見は非常に困難であり、ＨＧＦと競合する抗体は典型的には受容体を二量体化することによりアゴニストとして作用すると報告した（Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１１：４  ｐｐ．３５５−３６４，（２００９）ｃｉｔｉｎｇ  Ｐｒａｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１１（Ｐｔ２），２３７−２４７（１９９８））。さらに、ＷＯ１９９６／３８５５７およびＷＯ２０１０／０５９６５４の両方は、アゴニスト活性を有することが示されている種々のＭＥＴ抗体（それぞれ５Ｄ５およびＯｐｔＤ１１を含む）を記載している。したがって、臨床設定のために開発されたいくつかのＭＥＴ抗体（例えば、５Ｄ５）は、そのようなｃＭＥＴ抗体のアゴニスト活性を、抗体を一価（すなわち、片腕）抗体に修飾した場合の抗がん活性の臨床試験で許容可能なレベルに低下させる試みにおいて、一価（すなわち、片腕）になるように操作された（Ｊｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，ＭｅｔＭａｂ，ｔｈｅ  ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ５Ｄ５  ａｎｔｉ−ｃ−Ｍｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８，４３６０−４３６８（２００８））。しかしながら、ＭＥＴのその結合に関して化合物の価数を減少させること（二価と比較して一価）は、インビボでその抗腫瘍活性を減少させることが予想され得る。Ｌｉｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２０（２３）；６０５９−７０（２０１４）では、陽性対照としてＨＧＦおよびアゴニスト二価ＭＥＴ抗体５Ｄ５を使用して種々のＭＥＴ抗体（Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ４を含む）のアゴニスト特性を特徴付けるために、一連のインビトロバイオアッセイを使用したことが以前に報告されている。Ｌｉｕら（２０１４）は以前に、エミベツズマブが、ＭＥＴに結合した際にｐａｎ−ＡＫＴの弱い一時的なリン酸化のみを誘導し、ｐａｎ−ＡＫＴのこの弱いリン酸化は７つの機能性ＭＥＴアゴニストアッセイにおいて生物活性を刺激しなかったことを報告した。しかしながら、ＭＥＴ抗体５Ｄ５およびＯｐｔＤ１１により誘導されるより高レベルのＡＫＴリン酸化は、同じ機能性アッセイにおいて、細胞増殖、移動度、および抗アポトーシス（すなわち、がん治療薬としての使用には望ましくない活性）とよく相関した（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４））。
【０１１６】
ＭＥＴアゴニスト抗体は肝細胞の増殖および毒性を増加させることが報告されているので、リン酸ＡＫＴアッセイを使用して、ＭＥＴアゴニスト活性についてＭＥＴ−ＡＤＣを試験してもよい。簡潔に述べると、Ｃａｋｉ−１細胞を０．１％ＢＳＡを含む無血清培地中で一晩飢餓状態にし、次いで５μｇ／ｍＬのＡＤＣまたはネイキッドＭＥＴ抗体で所望の期間処理してもよい。細胞溶解物を、例えばＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによってｐａｎ−ＡＫＴのリン酸化について分析してもよい。
【０１１７】
この実施例７において本質的に上記したとおりに実施されたインビトロのリン酸−ＡＫＴバイオアッセイにおいて、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、その複合体化されていない親抗体である、エミベツズマブと同じく低いまたは全くないアゴニスト活性を有すると決定された（図２参照）。同じアッセイにおいて、アゴニストの二価ＭＥＴ抗体ｏｐｔＤ１１を、陽性対照として使用した（図２参照）。驚くべきことに、エミベツズマブを用いた他の複合体化方法（例えば、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃６（図２参照））は、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１および／または複合体化されていないエミベツズマブと比較して有意に高いアゴニスト活性を有するＭＥＴ−ＡＤＣ複合体をもたらした。
【０１１８】
実施例８：結腸がん細胞株ＨＴ−２９上の細胞表面ＭＥＴへのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の結合は、複合体化されていない親ＭＥＴ  Ａｂであるエミベツズマブと同程度である。
結腸がん細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＨＴＢ３８Ｄ）は、表面にＭＥＴを高レベルで発現し、少なくともＢＲＡＦ、Ｐ５３およびＰＩＫ３の変異を有する。複合体化されていない親抗体と比較して、細胞表面ＭＥＴに対する結合親和性がＭＥＴ−ＡＤＣ＃１において維持されているかどうかを決定するために、Ａｌｅｘａ  ４８８標識エミベツズマブおよび１００ｎＭの未標識エミベツズマブまたはＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の２倍希釈液を含有するＦＡＣＳ緩衝液に、ＨＴ２９結腸がん細胞を氷上で４５分間懸濁させてもよい。細胞を緩衝液で２回洗浄してもよく、ＦＡＣＳ分析を使用して、ＨＴ−２９腫瘍細胞の表面上のＭＥＴへの結合について、ＭＥＴ−ＡＤＣまたはＭＥＴ抗体の、Ａｌｅｘａ  ４８８標識エミベツズマブと競合する能力を測定してもよい。
【０１１９】
細胞表面上に発現したＭＥＴタンパク質に対するＭＥＴ−ＡＤＣおよびＭＥＴ抗体の結合を測定するための実験は、本質的に実施例８に上記した通りに行った。図１に示した通り、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、複合体化されていない親ＭＥＴ抗体であるエミベツズマブと同等の、細胞表面ＭＥＴを発現するＨＴ−２９に対する結合活性を示すことが示された（図１）。
【０１２０】
実施例９：ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１およびエミベツズマブは細胞表面ＭＥＴの内在化について同等の活性を示す。
ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１が、その親ＭＥＴ抗体のエミベツズマブと同様にＭＥＴ内在化を誘導するかどうかを測定するために、細胞を、終濃度３３ｎｍｏｌ／ＬのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１、エミベツズマブ、対照ＩｇＧ４−Ｌｙｓ−ＭＭＡＥ、または対照ＩｇＧ４で一晩処理し、無酵素解離溶液で解離した。解離した細胞を、２ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識Ｌｉｌｌｙ独自のＭＥＴ検出抗体（これはエミベツズマブとは別のエピトープに結合する）で１時間標識した。各試料について、１０，０００の事象がＦＡＣＳによって得られた。結果を、対照ＩｇＧ４または対照ＩｇＧ４−Ｌｙｓ−ＭＭＡＥに対する、エミベツズマブまたはＭＥＴ−ＡＤＣ＃１で処理した試料のパーセンテージとしてプロットした。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、エミベツズマブと同等の内在化率を示した（図３）。
【０１２１】
実施例１０：ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、様々な既知の耐性付与変異にかかわらず、ＭＥＴ過剰発現腫瘍細胞を死滅させる。
結腸がん細胞株ＨＴ−２９は、ＭＥＴが高レベル（約１６１，０００ＭＥＴ受容体／細胞）で発現すること、ならびにＢＲＡＦ変異（複数可）を有することが示された。したがって、試験のＭＥＴ−ＡＤＣがインビトロでＭＥＴ過剰発現腫瘍細胞を死滅させることができるかどうかを決定するために、ＨＴ−２９細胞株を使用してもよい。
【０１２２】
簡潔に説明すると、１００μＬの培養培地中に２〜３×１０３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートしてもよい。ＭＥＴ−ＡＤＣ、ＭＥＴ抗体、対照ＭＭＡＥ、またはシステイン複合体化抗体でＭＭＡＥに複合体化した対照ｈＩｇＧ４は、５０μＬ中１００ｎＭ（最終）から始めて無血清培養培地中で１：３に希釈して、ＨＴ−２９細胞に対して３倍の濃度としてもよい。５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中、３７℃でさらに５〜６日間の細胞増殖の終わりに、プレートを３０分間、室温に平衡化してもよく、次いで、１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ）を添加して細胞生存率を評価してもよい。細胞生存率は、発光を測定することによって決定されてもよい。
【０１２３】
本質的にこの実施例１０に記載される通りに実施されたアッセイは、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１が、親抗ＭＥＴ抗体、エミベツズマブ、遊離ＭＭＡＥ、またはエミベツズマブと遊離ＭＭＡＥの組み合わせよりも良好にＭＥＴ発現ＨＴ−２９腫瘍細胞を死滅させることを示す。より具体的には、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、ＥＣ５０＝０．０３８±０．００７ｎＭ以上でＨＴ−２９細胞を死滅させ、ＭＭＡＥに複合体化した非結合対照ｈＩｇＧ４リシン（すなわち、ｈＩｇＧ４−Ｌｙｓ−ＭＭＡＥ）も全てのアッセイに含まれて殺細胞が抗原依存性であることを確認した。驚くべきことに、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃６は、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１よりも活性が低く、同じ抗体を用いた最適化リンカー、ペイロードおよび複合体化方法が抗腫瘍活性に違いを与えることを示している。親抗体、エミベツズマブ、およびｈＩｇＧ４−ＭＭＡＥ対照は、ＨＴ−２９細胞において有意な殺細胞活性を示さなかった。興味深いことに、システイン残基を介してＭＭＡＥと複合体化した抗ＭＥＴ抗体であるＡＢＴ−７００を含むＭＥＴ−ＡＤＣのＡＢＢＶ−３９９は、本質的に実施例１０のこのパートＡに記載された通りに実施したＨＴ−２９殺傷アッセイにおいて、ＥＣ５０＝９．０±１．４ｎＭを実証した（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．）ＡＢＢＶ−３９９と比較して、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１で観察されたＨＴ−２９腫瘍細胞の殺傷における２００倍高い効力は、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１とＡＢＢＶ−３９９の間の驚くべき機能的差異のほんの一例である。
【０１２４】
他の細胞を使用した同様の実験において、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、ＭＥＴを過剰発現している結腸がん細胞のＲＫＯ（ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３）、ＣＸＦ−２６９Ｌ（ＴＰ５３）、およびＬＳ４１１Ｎ（ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３）を、示された下流の変異（データは示さず）および様々なレベルのＭＥＴ発現（すなわち、それぞれ約１６，０００〜５０，０００、１８５，０００、および１９８，０００受容体／細胞のＭＥＴ密度）にもかかわらず、死滅させた。さらに、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃６（すなわち、エミベツズマブ−Ｍａｌ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）よりも優れた殺傷活性を示した。
【０１２５】
実施例１１：腫瘍細胞ＭＥＴ発現レベルとＭＥＴ−ＡＤＣに対する感受性との相関
ＭＥＴ受容体密度について評価する場合に、本質的に実施例１０に上記した通りに、様々な腫瘍細胞株および正常ヒト細胞を、ＭＥＴ−ＡＤＣ誘導殺細胞活性について試験してもよい。ＭＥＴ細胞表面密度は、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ）を使用して、培養細胞上の細胞表面抗原の間接免疫蛍光染色によって測定された。簡潔に説明すると、細胞を、ＦＡＣＳ分析について上記した通り培養フラスコから採取し、９６ウェルプレートに添加し、５μｇ／ｍＬのエミベツズマブまたはｈＩｇＧ４と共に４℃でインキュベートしてもよい。４５分間のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１：５０に希釈したＦＩＴＣ複合体化抗体と共に氷上で１時間インキュベートしてもよい。次いで、細胞を洗浄してもよく、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して、ＱＩＦＩＫＩＴビーズの間接免疫蛍光染色によって受容体数を測定してもよい。
【０１２６】
本質的に実施例１０および１１に記載した通りに実施した実験の結果を表１０に示す。簡潔に述べると、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、１６，０００受容体／細胞と少ないＲＫＯ腫瘍細胞を死滅させたが、同様の受容体数を有する正常なヒト内皮細胞を死滅させるのにあまり効果的ではなかった。全体として、ＭＥＴ受容体数は、より低い受容体密度で殺傷の増強を示し、ＣＦＰＡＣ−１が不十分な内在化のために抵抗性になるオートクリンＨＧＦ−ＫＰ４を除いて、殺傷活性と相関する。ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１で観察された結果とは著しく対照的に、ＡＢＢＶ−３９９媒介腫瘍細胞殺傷は、システイン残基を介してモノメチルアウリスタチンＥと複合体化したＭＥＴ抗体のＡＢＴ−７００を含むＭＥＴ−ＡＤＣのＡＢＢＶ−３９９に対する感受性について、ＭＥＴ細胞表面分子のおおよその閾値＞１００，０００を有すると報告されている（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｓｅ  １，ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＡＢＢＶ−３９９，ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃ−Ｍｅｔ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（ｐｔｓ）ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３４，（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ  ２５１０）（２０１６）を参照）。さらに、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肝がん、膠芽腫、肺がん、前立腺がん、および頭頸部がんを含む様々なＭＥＴ過剰発現腫瘍において殺細胞活性を示した（表１０）。腫瘍細胞が、ＨＧＦを分泌せず、ＭＭＡＥに感受性である場合、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、細胞あたりの受容体ＭＥＴ細胞表面密度＞３２，０００のおおよその閾値で腫瘍細胞を死滅させ得る。
【表６】
2019536780.tif 000028
【０１２７】
実施例１２：ＣＲＣ（ＨＴ−２９）、膵臓（Ｂｘｐｃ３およびＫＰ−４）、胃（Ｈｓ７４６ｔ）、および肺（Ｃａｌｕ−６）のがんに対するマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖の阻害
６〜７週齢の雌の無胸腺ヌードマウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から市販されている。マウスを１週間順応させ、通常の低脂肪（４．５％）食餌を自由に摂取させ、それを試験期間中継続してもよい。腫瘍細胞はＡＴＣＣから購入することができ、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳを補充した２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭピルビン酸Ｎａを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの細胞培地で培養することができる。細胞を分離し、無血清培地で洗浄し、次いで無血清ＲＰＭＩ  １６４０中に５０×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁してもよい。約５×１０６個の腫瘍細胞を、無血清増殖培地とＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）との１：１混合物中の対象マウスの後側腹部に皮下注射することができる。腫瘍と体重の測定は週に２回行われる。処置前に、無作為化アルゴリズムを用いて腫瘍サイズに基づいてマウスを無作為化することができる。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに治療を開始する。無作為化マウスを異なる群に分け、週１回尾静脈注射により抗体を投与した。
【０１２８】
ＭＥＴ−ＡＤＣおよび対照ｈＩｇＧ４−ＭＭＡＥは、投与前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製することができる。腫瘍サイズは、キャリパー測定によって決定され得る。腫瘍体積（ｍｍ３）は、式Ａ２×Ｂ×０．５３６から推定することができ、ここで、Ａは、より小さな垂直直径であり、Ｂはより大きな垂直直径である。腫瘍体積データを対数スケールに変換して、時間と処置群の分散を均等にする。対数体積データは、ＳＡＳ  ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｉｎｃ、ノースカロライナ州ケアリー）を用いて、時間および処理による二方向反復測定ＡＮＯＶＡで分析することができる。処置群は各時点で特定の対照群と比較される。
【０１２９】
パートＡ：ＨＴ−２９結腸がん腫瘍異種移植片を担持する免疫不全マウスをこの実施例１２に上記したように作製し、そしてＭＥＴ−ＡＤＣ＃１およびＭＥＴ−ＡＤＣ＃７で３週間連続して週に１回処置した。結果を以下の表１１に示す。図６は、１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇでのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃７（すなわち、Ｃ８−Ｈ２４１−ＩｇＧ２−Ｃｙｓ−ＭＭＡＥ）、およびｈＩｇＧ４−Ｃｙｓ−ＭＭＡＥ対照それぞれの治療結果を示す。
【０１３０】
ＨＴ−２９異種移植片で試験した場合、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１はｈＩｇＧ４−Ｃｙｓ−ＭＭＡＥまたはＭＥＴ−ＡＤＣ＃７と比較してはるかに優れた効果を示した（図６参照）。本質的に実施例１２に記載されているように行われた別の実験において、複合体化されていない親抗体、エミベツズマブはＨＴ−２９腫瘍増殖を阻害しなかった（データは示さず）。
【表７】
2019536780.tif 000029
【０１３１】
パートＢ：膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ−３およびＫＰ−４は低レベルの細胞表面ＭＥＴ発現を有する。ＢｘＰＣ−３またはＫＰ−４細胞のいずれかを用いて本質的にこの実施例１２に上記したように生成された膵臓がん異種移植モデルにおいて、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は対照ｈＩｇＧ４−Ｌｙｓ−ＡＤＣと比較して劇的な抗腫瘍活性を示した（図７または図８参照）。
【０１３２】
パートＣ：胃がん細胞株Ｈｓ７４６Ｔは細胞表面のＭＥＴを中程度のレベルで発現し、そしてＭＥＴエクソン１４の欠失を有する。この種の胃がんにおけるＭＥＴ−ＡＤＣの活性を評価するために、Ｈｓ７４６Ｔがん細胞を用いた胃がん異種移植モデルを開発することができる。
【０１３３】
ＭＥＴエクソン１４のスキッピングを伴うＨｓ７４６Ｔがん細胞を用いた胃がん異種移植モデルは、本質的にこの実施例１２に上記したようにして作製した。Ｈｓ７４６Ｔ異種移植片を有するマウスを、ＩｇＧ４  Ｌｙｓ−ＡＤＣ対照（３ｍｇ／ｋｇ）およびＭＥＴ−ＡＤＣ＃１のいずれかで処置した。簡潔に述べると、週に１回３ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１で４週間処置したマウスＨｓ７４６Ｔ細胞異種移植片は、ＩｇＧ４  Ｌｙｓ−ＭＭＡＥ対照処置よりも有意に高い抗腫瘍効果をもたらした（図９）。結果は、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１が胃がんＨｓ７４６ｔモデルにおいて耐久性のある完全な腫瘍退縮を誘導したことを示した。Ｃａｌｕ−６非小細胞肺がんモデルでは、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１による治療後に初期腫瘍退縮および安定した疾患状態が観察された（図１０）。
【０１３４】
実施例１３：様々な種類のがんについての患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける腫瘍増殖の阻害
患者由来の腫瘍サンプルを入手することができ、そして個々の患者由来の腫瘍フラグメントを単一の免疫不全マウスに移植し、そしてそれがおよそ１００〜２００ｍｍ３の体積に達するまで増殖させることができる。ＭＥＴ−ＡＤＣまたはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照ＡＤＣは、５ｍｇ／ｋｇで４週間連続して週に１回投与されてもよい。腫瘍は週２回、電子キャリパーを介して測定することができる。体重も定期的に評価することができる。腫瘍体積は、式：Ａ２×Ｂ×０．５３６を使用して計算することができ、ここで、Ａは、より小さな垂直直径であり、Ｂはより大きな垂直直径である。
【０１３５】
パートＡ：膵臓腫瘍はＭＥＴを過剰発現することが当該分野で既知であり、そして９０％を超えるＫＲＡＳ変異を有する（Ｙａｂａｒ、Ｃ．Ｓ．およびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  ４５：４２９−４４５（２０１６））。４０人のヒト膵臓がん患者からの膵臓腫瘍サンプルを、本質的にこの実施例１２に記載したように、異なる免疫無防備状態マウスに個々に移植した（すなわち、各マウスは患者の膵臓腫瘍に由来する１つの腫瘍を保有した）。治療された４０人の患者由来の異種移植片のうちの３８個を、５ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１を合計４つの４用量で毎週投与した後に評価した。試験したほとんどすべてのＰＤＸ腫瘍は、腫瘍細胞において中程度から高レベルのＭＥＴ発現を有することが示された（データは示さず）。
【０１３６】
簡単に述べると、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、ＰＤＸ腫瘍を有する対照ｈＩｇＧ４−ＡＤＣ処置動物と比較した場合、膵臓がんＰＤＸ腫瘍の体積を著しく減少させた。
ＣＲ：完全奏効（腫瘍容積≦１４ｍｍ３）：８
ＰＲ：部分奏効（％回帰≦−５０％、腫瘍体積＞１４ｍｍ３）：９
ＳＤ：安定した疾患（％Ｄｅｌｔａ  Ｔ／Ｃ≦１０％および％回帰＞−５０％）：７
ＰＤ：進行性疾患（％Ｄｅｌｔａ  Ｔ／Ｃ＞１０％）：１６
ＯＲＲ：総合奏効率（合計４０を超えるＣＲ＋ＰＲ）：４３％
ＤＣＲ：疾病管理率：（合計４０を超えるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）：６０％
本質的にこの実施例１３に記載されているように実施された実験において、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１はゲムシタビンとアブラキサンの併用（すなわち膵臓がんの標準治療療法）よりも良好な有効性を示した。無増悪生存（ＰＦＳ）確率（ハザード比＝０．５６）においてほぼ２倍の減少（データは示さず）。腫瘍は細胞表面上に高レベルのＭＥＴを発現していると決定された。一般に、膵臓腫瘍はＫＲＡＳ変異、高い間質含有量、そして標的療法、化学療法、または小分子ＭＥＴ阻害剤に対する耐性を示す。
【０１３７】
パートＢ：３７人のヒト結腸直腸がん患者からの結腸直腸腫瘍試料を、本質的にこの実施例１３に上記したように、異なる免疫無防備状態マウスに個々に移植した（すなわち、各マウスは患者の膵臓腫瘍に由来する１つの腫瘍を担持した）。合計４回の投与について１または３ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１と共に毎週投与された３７人の患者由来の異種移植片からのデータを評価した。膵臓がんＰＤＸモデルにおいてＭＥＴ−ＡＤＣ＃１によって示される著しい抗腫瘍活性とは著しく対照的に、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は、ＰＤＸ腫瘍を有する対照ｈＩｇＧ４−ＡＤＣ処置動物と比較した場合、結腸直腸がんＰＤＸモデルにおいてほとんど活性を示さなかった。より具体的には、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１の投与は、５．４％（２／３７）の完全奏効（ＣＲ）および８％（３／３７）の安定疾患（ＳＤ）をもたらした。
【０１３８】
パートＣ：４人のヒト胆管がん患者からの腫瘍試料を、本質的にこの実施例１３に記載したように、異なる免疫無防備状態マウスに個別に移植した（すなわち、各マウスは患者の胆管がん腫瘍に由来する１つの腫瘍を担持した）。患者由来の異種移植片に、合計４回の投与のために５ｍｇ／ｋｇのＭＥＴ−ＡＤＣ＃１を毎週投与した。図１１に示すように、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１は腫瘍増殖を劇的に阻害した。
【０１３９】
この実施例１３に記載されている試験では、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１処置中に体重の有意な減少は観察されなかった。
【図１】
2019536780.tif 000032
【図２】
2019536780.tif 000033
【図３】
2019536780.tif 000034
【図４】
2019536780.tif 000035
【図５】
2019536780.tif 000036
【図６】
2019536780.tif 000037
【図７】
2019536780.tif 000038
【図８】
2019536780.tif 000039
【図９】
2019536780.tif 000040
【図１０】
2019536780.tif 000041
【図１１】
2019536780.tif 000042
【配列表】
2019536780000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月22日(2019.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
【化１】
2019536780.tif 000043
式中、ＡはＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、を含み、
ｎは１〜９である、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項２】
Ａが、
（ａ）前記第１の重鎖および第２の重鎖であって、前記重鎖の各々が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、前記第１の重鎖および第２の重鎖と、
（ｂ）前記第１の軽鎖および第２の軽鎖であって、前記軽鎖の各々が配列番号９のアミノ酸配列を含む、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項３】
前記第１の重鎖が、前記第１の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第２の重鎖が、前記第２の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１の重鎖が、前記第２の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、請求項１または２に記載のＡＤＣ。
【請求項４】
Ａが、グリコシル化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項５】
ｎが１〜９であり、平均ＤＡＲが２〜５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣの混合物を含む組成物。
【請求項６】
前記平均ＤＡＲが、２．９〜４である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記平均ＤＡＲが、２．９〜３．３である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、腫瘍細胞上に発現する細胞表面ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、インビトロの増殖、血管新生、および／または遊走バイオアッセイにおける有意な機能的アゴニスト活性を有しない、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩。
【請求項１１】
がんの治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩。
【請求項１２】
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、もしくは肺がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胆管がん、黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫である、請求項１１に記載の使用のためのＡＤＣまたはその塩。
【請求項１３】
前記がんが、１つ以上のＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、エクソン１４、および／またはＰＩ３Ｋの変異を有する細胞を含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の使用のための、ＡＤＣまたはその塩。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
以下の式の化合物。
【化２】
2019536780.tif 000044
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
この実施例１３に記載されている試験では、ＭＥＴ−ＡＤＣ＃１処置中に体重の有意な減少は観察されなかった。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
以下の式の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
【化２２】
2019536780.tif 000045
式中、ＡはＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、を含み、
ｎは１〜９である、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
［２］
Ａが、
（ａ）前記第１の重鎖および第２の重鎖であって、前記重鎖の各々が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、前記第１の重鎖および第２の重鎖と、
（ｂ）前記第１の軽鎖および第２の軽鎖であって、前記軽鎖の各々が配列番号９のアミノ酸配列を含む、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含む、［１］に記載のＡＤＣ。
［３］
前記第１の重鎖が、前記第１の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第２の重鎖が、前記第２の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１の重鎖が、前記第２の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、［１］または［２］に記載のＡＤＣ。
［４］
Ａが、グリコシル化されている、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
［５］
ｎが１〜９であり、平均ＤＡＲが２〜５である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＡＤＣの混合物を含む組成物。
［６］
前記平均ＤＡＲが、２．９〜４である、［５］に記載の組成物。
［７］
前記平均ＤＡＲが、２．９〜３．３である、［６］に記載の組成物。
［８］
前記組成物が、腫瘍細胞上に発現する細胞表面ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する、［５］〜［７］のいずれか一項に記載の組成物。
［９］
前記組成物が、インビトロの増殖、血管新生、および／または遊走バイオアッセイにおける有意な機能的アゴニスト活性を有しない、［５］〜［８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］
治療に使用するための、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩。
［１１］
がんの治療に使用するための、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩。
［１２］
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、もしくは肺がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胆管がん、黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫である、［１１］に記載の使用のためのＡＤＣまたはその塩。
［１３］
前記がんが、１つ以上のＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、エクソン１４、および／またはＰＩ３Ｋの変異を有する細胞を含むことを特徴とする、［１１］または［１２］に記載の使用のための、ＡＤＣまたはその塩。
［１４］
［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
［１５］
がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその塩を投与することを含む、方法。
［１６］
前記がんが、ヒトにおける、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、もしくは肺がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胆管がん、黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫である、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記がんが、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、エクソン１４、および／またはＰＩ３Ｋの変異からなる群から選択される１つ以上の変異を有する細胞を含むことを特徴とする、［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
以下の式の化合物。
【化２３】
2019536780.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月29日(2019.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
【化１】
2019536780.tif 000047
式中、ＡはＭＥＴに結合するＩｇＧ４抗体であり、
（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、を含み、
ｎは１〜９である、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ａが、
（ａ）前記第１の重鎖および第２の重鎖であって、前記重鎖の各々が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、前記第１の重鎖および第２の重鎖と、
（ｂ）前記第１の軽鎖および第２の軽鎖であって、前記軽鎖の各々が配列番号９のアミノ酸配列を含む、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖と、を含む、請求項１に記載のＡＤＣまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記第１の重鎖が、前記第１の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第２の重鎖が、前記第２の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１の重鎖が、前記第２の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、請求項１または２に記載のＡＤＣまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ａが、グリコシル化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
ｎが１〜９であり、平均ＤＡＲが２〜５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその薬学的に許容される塩の混合物を含む組成物。
【請求項６】
前記平均ＤＡＲが、２．９〜４である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記平均ＤＡＲが、２．９〜３．３である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、腫瘍細胞上に発現する細胞表面ＭＥＴの内在化および／または分解を誘導する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、インビトロの増殖、血管新生、および／または遊走バイオアッセイにおける有意な機能的アゴニスト活性を有しない、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物、あるいは、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
がんの治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＤＣまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物、あるいは、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がん、乳頭状腎がん、甲状腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、もしくは肺がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胆管がん、黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記がんが、１つ以上のＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、Ｐ５３、エクソン１４、および／またはＰＩ３Ｋの変異を有する細胞を含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
以下の式の化合物。
【化２】
2019536780.tif 000048
【国際調査報告】
2019536780.tif 000049
2019536780.tif 000050
2019536780.tif 000051
2019536780.tif 000052