(57)【要約】  改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインであって、前記トランスフェリンは、ラクトフェリンＬＴＦ、セロトランスフェリンＴＦ、メラノトランスフェリンＭＴＦ又はオボトランスフェリンＯＴＦであり、前記各トランスフェリンのＮ末端が相同のＤＮＡ結合ドメインを有し、ＤＮＡ結合ドメインの１０番目及び２０番目がそれぞれＣであり、前記改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列は、ジスルフィド結合を形成できないよう、１０番目と２０番目のＣをその他のアミノ酸に置き換えたものであるＤＮＡ結合ドメインを提供する。更に、本発明は、前記改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡポリメラーゼとカップリングした組み換えＤＮＡポリメラーゼとその調製方法を提供する。更に、前記組み換えＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ検出試薬キットを提供する。【選択図】図１
2019524643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインであって、
前記トランスフェリンは、ラクトフェリンＬＴＦ、セロトランスフェリンＴＦ、メラノトランスフェリンＭＴＦ又はオボトランスフェリンＯＴＦであり、前記各トランスフェリンのＮ末端が相同のＤＮＡ結合ドメインを有し、ＤＮＡ結合ドメインの１０番目及び２０番目がそれぞれＣであり、
前記改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列は、ジスルフィド結合を形成できないよう、前記ＤＮＡ結合ドメインの１０番目と２０番目のＣをその他のアミノ酸に置き換えたものであることを特徴とするＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項２】
前記１０番目のＣがＲに置き換えられ、２０番目のＣがＡ又はＧに置き換えられたことを特徴とする請求項１に記載の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合ドメインの１〜５番目のアミノ酸をＫＦＫＹＫに置き換え、及び／又は、２８〜３１番目をＫＫＶＫに置き換えたことを特徴とする請求項１又は２に記載の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項４】
前記ラクトフェリンＬＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示されるマウス由来のものを用い、
前記セロトランスフェリンＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示されるマウス由来のものを用い、
前記メラノトランスフェリンＭＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示されるマウス由来のものを用い、
前記オボトランスフェリンＯＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に示されるニワトリ由来のものを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項５】
前記ラクトフェリンＬＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示されるマウス由来のものを用い、
前記セロトランスフェリンＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示されるマウス由来のものを用い、
前記メラノトランスフェリンＭＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示されるマウス由来のものを用い、
前記オボトランスフェリンＯＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に示されるニワトリ由来のものを用いることを特徴とする請求項３に記載の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメイン。
【請求項６】
組み換えＤＮＡポリメラーゼの調製方法であって、
請求項１〜５のいずれかに記載の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築するか、
或いは、請求項１〜５のいずれかに記載の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおける同一のＤＮＡ結合ドメイン又は異なるＤＮＡ結合ドメインを直列に連結した後にＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで、組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築するか、
或いは、上記で構築した組み換えＤＮＡ酵素をその他の組み換えＤＮＡポリメラーゼ又は未改変のＤＮＡポリメラーゼと混合した後に複合組み換えＤＮＡポリメラーゼを取得することを特徴とする方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素であることを特徴とする請求項６に記載の組み換えＤＮＡポリメラーゼの調製方法。
【請求項８】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項７に記載の組み換えＤＮＡポリメラーゼの調製方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の調製方法で調製される組み換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
請求項９に記載の組み換えＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とするＰＣＲ検出試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、特に、改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメイン、組み換えＤＮＡポリメラーゼ及び調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、生命の遺伝情報を保存し伝達する担体である。また、細胞内でデオキシリボ核酸の合成に関わるＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、ＤＮＡ分子の自己複製及び遺伝情報の伝達機能を実現する重要分子である。一方、バイオテクノロジーの進展に伴い、ＤＮＡ分子の体外複製方法が提案されている。当該方法から発展した核酸分子検出技術は各種バイオ検出におけるキーテクノロジーとなりつつあり、医薬品開発、食品安全検査、病原微生物同定、疾病メカニズム及び薬物による分子標的治療等の理論研究や検証に幅広く応用されている。
【０００３】
体外酵素法でＤＮＡ分子を合成する場合には、例えば、ＰＣＲ増幅する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、酵素阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）に対し耐性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、極端に低い鋳型濃度でもＤＮＡ増幅可能な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなど、各種ニーズを満たす耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を取得することが重要となる。
【０００４】
また、臨床体外診断では、体液中の核酸を増幅して検出せねばならないことが多いが、体液中には、ヘミン、カルシウムイオン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンといった様々なＰＣＲ反応阻害剤が存在する。これらＰＣＲ阻害剤の存在により、体液をそのまま用いてＰＣＲ増幅するには限界がある。そこで、通常は核酸精製によってＰＣＲ反応阻害剤を除去した後、精製済みの核酸を用いてＰＣＲ増幅を実行する必要がある。
【０００５】
海外の研究では、古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）の核酸結合タンパク質のＤＮＡ結合モチーフ（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）を用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を組み換える（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）ことで、鋳型ＤＮＡに対する親和力（ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）を高めつつ、元のＤＮＡポリメラーゼの各種機能も保持する新型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを構築可能なことが発見されている。このような組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには次のような特徴がある。
【０００６】
（１）鋳型ＤＮＡ分子との親和力が大幅に向上するため、鋳型ＤＮＡ分子の濃度が大変低い場合であっても結合し、ＤＮＡ合成を開始可能である。
（２）鋳型ＤＮＡ分子との親和力が向上した組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、汚染物質や干渉分子を含むＤＮＡ一次産物、或いは原材料溶液といったより複雑な反応環境においてもＤＮＡ合成を開始可能である。
（３）特異な病原体ゲノムの一部ＤＮＡ領域に対して明らかに高い親和力を有し、より低い鋳型ＤＮＡ濃度や、より複雑な干渉分子の存在下であってもＤＮＡ合成を開始可能である。
【０００７】
これらの特徴によって核酸分子の検出過程を改善可能となり（検出過程の更なる簡略化及び操作の大規模化）、且つ、検出感度と安定性が向上する。
【０００８】
しかし、現在のところ上記の利点を有する組み換えＤＮＡポリメラーゼは数が少なく、この方面の研究開発の強化が早急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体高分子（多糖類、タンパク質）や有機及び無機汚染分子（ＤＮＡ放出及び変性生体高分子の化合物への混入）等の阻害を受けにくい新型の組み換えＤＮＡポリメラーゼを取得し、ダイレクトＰＣＲを実現すること、及び、鋳型分子との親和力を向上させた新型の組み換えＤＮＡポリメラーゼを取得し、より低濃度の鋳型に対する増幅を実現することで検出の感度と安定性を向上すること、を解決すべき技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は以下の技術方案を用いる。
【００１１】
改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインであって、前記トランスフェリンは、ラクトフェリンＬＴＦ、セロトランスフェリンＴＦ、メラノトランスフェリンＭＴＦ又はオボトランスフェリンＯＴＦであり、前記各トランスフェリンのＮ末端が相同のＤＮＡ結合ドメインを有し、ＤＮＡ結合ドメインの１０番目及び２０番目がそれぞれＣであり、前記改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列は、ジスルフィド結合を形成できないよう、前記ＤＮＡ結合ドメインの１０番目と２０番目のＣをその他のアミノ酸に置き換えたものである。
【００１２】
更に、前記１０番目のＣがＲに置き換えられ、２０番目のＣがＡ又はＧに置き換えられる。
【００１３】
更に、前記ＤＮＡ結合ドメインの１〜５番目のアミノ酸をＫＦＫＹＫに置き換え、及び／又は、２８〜３１番目をＫＫＶＫに置き換える。
【００１４】
更に、前記ラクトフェリンＬＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示されるマウス由来のものを用い、前記セロトランスフェリンＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示されるマウス由来のものを用い、前記メラノトランスフェリンＭＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示されるヒト由来のものを用いるか、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示されるマウス由来のものを用い、前記オボトランスフェリンＯＴＦのＤＮＡ結合ドメインには、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に示されるニワトリ由来のものを用いる。
【００１５】
本発明は、更に、組み換えＤＮＡポリメラーゼの調製方法であって、上記の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築するか、或いは、上記の改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおける同一のＤＮＡ結合ドメイン又は異なるＤＮＡ結合ドメインを直列に連結した後にＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで、組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築するか、或いは、上記で構築した組み換えＤＮＡ酵素をその他の組み換えＤＮＡポリメラーゼ又は未改変のＤＮＡポリメラーゼと混合した後に複合組み換えＤＮＡポリメラーゼを取得する方法を提供する。
【００１６】
更に、前記ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素である。
【００１７】
更に、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。
【００１８】
本発明は、更に、上記の調製方法で調製される新型の組み換えＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００１９】
本発明は、更に、前記組み換えＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ検出試薬キットを提供する。
【発明の効果】
【００２０】
上記の技術方案を用いることで、本発明は少なくとも以下の利点を有する。
【００２１】
本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築可能な新型のＤＮＡ結合ドメインであるトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインが取得される。構築される組み換えＤＮＡポリメラーゼは、生体高分子（多糖類、タンパク質）や有機及び無機汚染分子（ＤＮＡ放出及び変性生体高分子の化合物への混入）等の阻害を受けにくく、ダイレクトＰＣＲを実現可能である。更には、検出手順を簡略化可能であり、効率が向上し、操作が容易となる。且つ、費用の削減、コストダウン、検出時間の短縮が可能であり、効果が増加する。また、構築される組み換えＤＮＡポリメラーゼは鋳型分子との親和力が向上するため、より低濃度の鋳型に対する増幅を実現可能となり、検出の感度と安定性が向上する。
【００２２】
上記は本発明の技術方案の概略にすぎない。そこで、本発明の技術的手段をより明確に理解可能となるよう、以下に図面と具体的実施形態を組み合わせて本発明につき更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実施例３の組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑＤＮＡポリメラーゼの増幅効率の比較結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例３の組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑＤＮＡポリメラーゼの増幅速度の比較結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例３の組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑＤＮＡポリメラーゼの血清耐性の比較結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
阻害されにくく、且つ鋳型に対する濃度要求の低い新型のＤＮＡポリメラーゼを取得するために、本発明では、組み換え方式によって組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築した。膨大な研究の結果、トランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインは、一部アミノ酸を置き換えて改変することで、上記の効果を有する組み換えＤＮＡポリメラーゼの構築に適用可能となることが見出された。
【００２５】
トランスフェリンには、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ＬＴＦ）、セロトランスフェリン（ｓｅｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ＴＦ）、メラノトランスフェリン（Ｍｅｌａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ＭＴＦ）、オボトランスフェリン（ｏｖｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ＯＴＦ）という４種類の相同タンパク質が存在する。これら４種類のタンパク質は、Ｎ末端に相同のＤＮＡ結合ドメインを有する。また、ＤＮＡ結合ドメインの１０番目、２０番目がそれぞれＣとなっている。
【実施例１】
【００２６】
本実施例において、３種類のヒト由来、３種類のマウス由来、１種類のニワトリ由来のトランスフェリンにおけるＤＮＡ結合ドメインを検出したところ、アミノ酸配列はそれぞれ以下の通りであった。
ヒトＬＴＦ（ＨＬＴＦ）：ＧＲＲＲＲＳＶＱＷＣＡＶＳＱＰＥＡＴＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）
ヒトＴＦ（ＨＴＦ）：ＡＶＰＤＫＴＶＲＷＣＡＶＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）
ヒトＭＴＦ（ＨＭＴＦ）：ＶＬＧＧＭＥＶＲＷＣＡＴＳＤＰＥＱＨＫＣＧＮＭＳＥＡＦＲＥＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）
マウスＬＴＦ（ＭＬＴＦ）：ＬＡＫＡＴＴＶＱＷＣＡＶＳＮＳＥＥＥＫＣＬＲＷＱＮＥＭＲＫＶＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）
マウスＴＦ（ＭＴＦ）：ＡＶＰＤＫＴＶＫＷＣＡＶＳＥＨＥＮＴＫＣＩＳＦＲＤＨＭＫＴＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）
マウスＭＴＦ（ＭＭＴＦ）：ＶＶＣＶＭＥＶＱＷＣＴＩＳＤＡＥＱＱＫＣＫＤＭＳＥＡＦＱＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）
ニワトリＯＴＦ（ＧＯＴＦ）：ＡＰＰＫＳＶＩＲＷＣＴＩＳＳＰＥＥＫＫＣＮＮＬＲＤＬＴＱＱＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）
【００２７】
上記ＤＮＡ結合ドメインの改変方法は以下の通りであった。
【００２８】
トランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインは２つのアミノ酸Ｃを有してジスルフィド結合を形成可能である。しかし、ジスルフィド結合は高温下で不安定化するため、ジスルフィド結合を形成できないよう、１０番目と２０番目のＣをその他のアミノ酸に置き換えた。例えば、好ましくは、断片中の１０番目のＣをＲに置き換え、２０番目のＣをＡに置き換えるか、或いは、これら２種類のアミノ酸よりも小さなＧに置き換えた。この改変後のＤＮＡ結合ドメインを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと直接カップリングすることで、組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを形成可能であった。
【００２９】
改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列は以下の通りであった。
ヒトＬＴＦ’（ＨＬＴＦ’）：ＧＲＲＲＲＳＶＱＷＲＡＶＳＱＰＥＡＴＫＡＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）
ヒトＴＦ’（ＨＴＦ’）：ＡＶＰＤＫＴＶＲＷＲＡＶＳＥＨＥＡＴＫＡＱＳＦＲＤＨＭＫＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）
ヒトＭＴＦ’（ＨＭＴＦ’）：ＶＬＧＧＭＥＶＲＷＲＡＴＳＤＰＥＱＨＫＡＧＮＭＳＥＡＦＲＥＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）
マウスＬＴＦ’（ＭＬＴＦ’）：ＬＡＫＡＴＴＶＱＷＲＡＶＳＮＳＥＥＥＫＡＬＲＷＱＮＥＭＲＫＶＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）
マウスＴＦ’（ＭＴＦ’）：ＡＶＰＤＫＴＶＫＷＲＡＶＳＥＨＥＮＴＫＡＩＳＦＲＤＨＭＫＴＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）
マウスＭＴＦ’（ＭＭＴＦ’）：ＶＶＣＶＭＥＶＱＷＲＴＩＳＤＡＥＱＱＫＡＫＤＭＳＥＡＦＱＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）
ニワトリＯＴＦ’（ＧＯＴＦ’）：ＡＰＰＫＳＶＩＲＷＲＴＩＳＳＰＥＥＫＫＡＮＮＬＲＤＬＴＱＱＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）
【実施例２】
【００３０】
実施例１で取得したトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインを更に改変してもよい。そこで、トランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおける１〜５番目のアミノ酸をＫＦＫＹＫに置き換え、２８〜３１番目をＫＫＶＫに置き換えた。このうち、１〜５番目のアミノ酸の改変が大変重要であった。これにより、ＤＮＡポリメラーゼの性能を更に向上可能であった。
【００３１】
第２の手順で改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列は以下の通りであった。
ヒトＬＴＦ’’（ＨＬＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＳＶＱＷＲＡＶＳＱＰＥＡＴＫＡＦＱＷＱＲＮＭＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）
ヒトＴＦ’’（ＨＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＴＶＲＷＲＡＶＳＥＨＥＡＴＫＡＱＳＦＲＤＨＭＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）
ヒトＭＴＦ’’（ＨＭＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＥＶＲＷＲＡＴＳＤＰＥＱＨＫＡＧＮＭＳＥＡＦＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）
マウスＬＴＦ’’（ＭＬＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＴＶＱＷＲＡＶＳＮＳＥＥＥＫＡＬＲＷＱＮＥＭＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）
マウスＴＦ’’（ＭＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＴＶＫＷＲＡＶＳＥＨＥＮＴＫＡＩＳＦＲＤＨＭＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）
マウスＭＴＦ’’（ＭＭＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＥＶＱＷＲＴＩＳＤＡＥＱＱＫＡＫＤＭＳＥＡＦＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）
ニワトリＯＴＦ’’（ＧＯＴＦ’’）：ＫＦＫＹＫＶＩＲＷＲＴＩＳＳＰＥＥＫＫＡＮＮＬＲＤＬＴＫＫＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）
【実施例３】
【００３２】
実施例１及び２で改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインをＴａｑＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで、組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを形成した。
【００３３】
（１）増幅効率の比較実験：
精製したＴａｑ、ＨＬＴＦ’−Ｔａｑ、ＨＬＴＦ’’−Ｔａｑ、ＨＴＦ’−Ｔａｑ、ＨＴＦ’’−Ｔａｑ、ＭＭＴＦ’−Ｔａｑ、ＭＭＴＦ’’−Ｔａｑ、ＧＯＴＦ’−Ｔａｑ、ＧＯＴＦ’’−Ｔａｑについて１：２の段階希釈を行い、希釈度ごとに１μＬを取った。そして、２０μＬの反応体積中で１．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（２５ｃｙｃｌｅｓ）。図１に示すように、アガロースゲル電気泳動（ｌｏａｄｉｎｇ  ５μｌ／ｌａｎｅ）の１〜６レーンは、酵素タンパク質濃度の等しいＴａｑ又は組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１：２段階希釈（１，１／２，１／４，１／８，１／１６，１／３２）して増幅した結果をそれぞれ示している。
【００３４】
（２）増幅速度の比較実験：図２に示すように、Ｔａｑ、ＨＬＴＦ’−Ｔａｑ、ＨＬＴＦ’’−Ｔａｑ、ＨＴＦ’−Ｔａｑ、ＨＴＦ’’−Ｔａｑ、ＭＭＴＦ’−Ｔａｑ、ＭＭＴＦ’’−Ｔａｑ、ＧＯＴＦ’−Ｔａｑ、ＧＯＴＦ’’−Ｔａｑを２０秒間延長する条件で、１．５ｋｂ、２．５ｋｂ、３．５ｋｂ及び４．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【００３５】
実験結果より、組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも増幅効率が高く（図１参照）、増幅速度が速い（図２参照）ことが証明された。
【００３６】
（３）血清耐性の比較実験
Ｔａｑ、ＨＬＴＦ’−Ｔａｑ、ＨＬＴＦ’’−Ｔａｑ、ＨＴＦ’−Ｔａｑ、ＨＴＦ’’−Ｔａｑ、ＭＭＴＦ’−Ｔａｑ、ＭＭＴＦ’’−Ｔａｑ、ＧＯＴＦ’−Ｔａｑ、ＧＯＴＦ’’−Ｔａｑで定量ＰＣＲ反応系（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）を調製し、ＰＣＶ２  ＤＮＡウィルス粒子（１０３  ＰＣＶ２  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＰＣＶ２プライマー及び各量のブタ血清を添加して（ｅａｃｈ  ０，１，２，３，４μＬ  ｏｆ  ｐｉｇ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ｔｏｔａｌ  ２０μｌ  ｏｆ  ｑＰＣＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ＰＣＲ増幅を行った。その結果、血清を添加したサンプル（１〜４μＬ）は血清を添加しなかった（０μＬ）サンプルに比べて増幅効率が明らかに低下したが、組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅したサンプルとＴａｑを用いて増幅したサンプルは低下率において極めて著しい差を有した（図３参照）。実験結果より、組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも血清耐性が高いことが証明された。
【実施例４】
【００３７】
実施例１及び２で改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインを逆転写酵素とカップリングすることで、組み換え逆転写酵素を形成した。ＲＴ−ＰＣＲ実験分析を行ったところ、実施例３と類似の増幅効率比較実験、増幅速度比較実験、血清耐性比較実験において、増幅効率が高く、増幅速度が速く、血清耐性が高いという基本的に同様の結果が得られた。
【実施例５】
【００３８】
実施例１及び２で改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおける同一のＤＮＡ結合ドメインを連結した後にＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで、組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築した。或いは、実施例１及び２で改変されたトランスフェリンのＤＮＡ結合ドメインにおける異なるＤＮＡ結合ドメインを直列に連結した後にＤＮＡポリメラーゼとカップリングすることで、組み換えＤＮＡポリメラーゼを構築した。これらによれば、いずれも増幅効率が高く、増幅速度が速く、血清耐性が高いという類似の実験結果が得られた。
【００３９】
また、実施例１及び２で構築した組み換えＤＮＡ酵素、又は、本実施例で構築した前記組み換えＤＮＡ酵素を従来技術におけるその他の組み換えＤＮＡポリメラーゼ又は未改変のＤＮＡポリメラーゼと混合して得られる複合組み換えＤＮＡポリメラーゼは、通常のＤＮＡポリメラーゼよりも増幅効率が高く、増幅速度が速く、血清耐性が高いとの利点を有していた。
【００４０】
最後に、本発明で記載した１０番目、２０番目とは固定の位置ではなく、これら２つの位置に対応するアミノ酸がいずれもＣであり、且つ、２つのＣ同士の差が１０個のアミノ酸であることを示している。また、その他の１〜５番目、２８〜３１番目とは、１０番目に対する位置である。即ち、４０個のアミノ酸からなるＤＮＡ結合ドメインの場合、２つのアミノ酸がいずれもＣであり、且つ、これらの差が１０個のアミノ酸である場合、これら２つのアミノ酸に対応する位置を１０番目、２０番目とする。
【００４１】
以上の記載は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を何らかの形態に制限するものではない。当業者が上記に開示の技術内容を用いて実施する些細で簡単な修正や等価の変形或いは補足は、いずれも本発明の保護の範囲に含まれる。
【図１】
2019524643.tif 000003
【図２】
2019524643.tif 000004
【図３】
2019524643.tif 000005
【配列表】
2019524643000001.app
【国際調査報告】
2019524643.tif 000006
2019524643.tif 000007
2019524643.tif 000008
2019524643.tif 000009
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2019524643.tif 000011
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2019524643.tif 000013