(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−１７Ａ結合分子、特に、単一ドメイン抗体を含んでなる安定かつ非凝集性の組成物に関する。このような組成物は、例えば皮膚疾患または喘息などの疾患の治療における局所投与のために有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一可変重鎖ドメイン抗体、
ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン
を含んでなり、ｐＨが約５〜約９である、組成物。
【請求項２】
前記単一可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号４を有するＣＤＲ３を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記単一可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号２を有するＣＤＲ１、配列番号３を有するＣＤＲ２、および配列番号４を有するＣＤＲ３を含んでなる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記単一可変重鎖ドメイン抗体が配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、以下の賦形剤：０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、０．１〜１５％のソルビトールおよび／または０．１〜３０％のプロピレングリコールのうち１以上をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
５０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン、５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、５〜１５％のソルビトール、および４〜３０％のプロピレングリコールを含んでなり、ｐＨが約５〜約９である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
約１００ｍＭのトリス／グリシン、約１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、約１０％のソルビトール、約６％のプロピレングリコールを含んでなり、ｐＨが７．５〜８．５である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記相同性が、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記単一ドメイン抗体が配列番号１または配列番号７４を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が局所投与に好適である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
浸透促進剤をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記浸透促進剤がトランスクトール（商標）  ステアレス−２０、ステアレス−２、オクチルデカノール、またはミリスチン酸イソプロピルから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
粘度調整剤をさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記粘度調整剤がポロキサマーである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
単一ドメイン抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
２〜８℃、２０〜２５℃、または−７０℃で少なくとも１、２、３、６、または１２か月間の保存時に安定である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
疾患の治療における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
皮膚障害または自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
治療上有効な量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、皮膚障害または自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項２０】
疾患の治療において使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記疾患が皮膚障害または自己免疫疾患である、請求項２０に記載の組成物、請求項１７もしくは１８に記載の使用、または請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
投与が局所的である、請求項２１に記載の組成物、使用、または方法。
【請求項２３】
前記皮膚障害が乾癬、脊椎関節症、ブドウ膜炎、歯肉炎またはアトピー性皮膚炎から選択される、請求項２１または２２に記載の組成物、使用、または方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患が喘息である、請求項２１または２２に記載の組成物、使用、または方法。
【請求項２５】
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨドメインを含んでなる、有効量の少なくとも１種類の単一可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン
を含んでなり、ｐＨが約５〜約９である、凍結または噴霧乾燥組成物。
【請求項２６】
前記単一可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号４を有するＣＤＲ３を含んでなる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記単一可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号２を有するＣＤＲ１、配列番号３を有するＣＤＲ２、および配列番号４を有するＣＤＲ３を含んでなる、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記単一可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸をさらに含んでなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
約１００ｍＭのトリス／グリシン、約１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸を含んでなり、ｐＨが約８である、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１６または請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる容器。
【請求項３２】
再構成剤をさらに含んでなる、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、再構成された凍結または噴霧乾燥組成物。
【請求項３３】
請求項１〜１６、２０〜２４、２５〜３０、または３２のいずれか一項に記載の組成物と、場合により使用説明書とを含んでなる、キット。
【請求項３４】
再構成剤をさらに含んでなる、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物を準備することと、再構成剤を添加することを含んでなる、局所投与用の再構成処方物を作製するための方法。
【請求項３６】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、局所投与用のクリーム、ローション、ゲル、または液体。
【請求項３７】
賦形剤と、ＩＬ−１７Ａと結合することができる単一ドメイン抗体とを合わせることを含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の処方物を作製するための方法。
【請求項３８】
前記単一ドメイン抗体が配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記賦形剤が１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシンを含んでなる、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜１６、２０〜２４、または３２のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる、液体、クリーム、粉末、ローション、ゲル、包帯、パッチ剤、または硬膏。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に局所投与のための、ＩＬ−１７Ａ結合分子を含んでなる安定かつ非凝集性の組成物、および疾患の治療におけるこのような組成物の使用に関する。
【０００２】
緒論
乾癬は、世界の人口の２〜３％（約１億２千５百万人の患者）に影響を及ぼす慢性再発型および寛解型の炎症性皮膚疾患であり、主として臨床再燃と皮膚の目に付く領域の美観を損ねる病変、全身症状および薬物関連副作用のために重大な病的状態と生活の質の低下を招く。「尋常性乾癬斑」と呼ばれるこの疾患の一般形態は８０％を超える患者に見られ、最小のものから皮膚表面全体の関与まで大きさが異なり得る紅斑性鱗状斑（一般に、肘、膝、頭皮および臀部）を特徴とする。
【０００３】
体表面積（ＢＳＡ）関与の程度に応じて、乾癬は、軽度（＜３％ＢＳＡ関与）、中等度（３〜１０％ＢＳＡ）および重度（＞１０％ＢＳＡ）疾患に分類することができる。コルチコステロイド、ビタミンＤ誘導体、コールタールおよび局所用レチノイドなど局所用薬剤は、乾癬の初期管理の基礎であり、疾患の重篤度のスペクトルにわたって患者に適用される治療ラダーの重要な部分である。軽度〜中等度疾患と診断された患者は一般に、単剤療法として局所用薬剤を処方される。重度疾患を有する患者は一般に、光線療法またはメトトレキサート、シクロスポリンもしくは経口レチノイドなどの全身（小分子）療法の補助として局所用薬剤を処方される。中等度〜重度乾癬の治療計画にはまた、抗体に基づく療法も含まれる。
【０００４】
現在、乾癬治療の市場にある治療製品は、様々な程度の症状緩和を与え、再発率を引き下げるが、現在のところ治療法と見なされるものはなく、従って、長期投与を必要とする。多くの既存の局所用薬剤は短期間有効であり得るが、治療制限毒性のためにほとんどのものが短期間の使用に制限される。このことは、患者が副作用の日常的監視と新しい治療プロトコールへの定期的循環を必要とすることを意味する。
【０００５】
重度疾患を有する患者は一般に、光線療法またはメトトレキサート、シクロスポリンもしくは経口レチノイドなどの全身（小分子）療法の補助として局所用薬剤を処方される(Nast et al., Arch Dermatol Res (2007) 299:111-138)。光線療法は有効であり得るが、不便であり、皮膚癌の重大なリスクを伴う。小分子全身療法は、心血管リスクの増大、腎機能障害、白血球減少および血小板減少症を伴う。例えば、メトトレキサートは、好中球減少症および肝障害を引き起こすことがあり、予防措置なしに生殖年齢の男性および女性には禁忌である。シクロスポリンは、強力な免疫抑制剤であり、腎臓および血圧に対して潜在的有害作用がある。アシトレチンは、一定範囲の副作用を有する経口レチノイドであり、これもまた予防措置なしに生殖年齢の女性には禁忌である(Nast et al., Arch Dermatol Res (2007) 299:111-138)。
【０００６】
中等度〜重度乾癬の治療計画にはまた、抗体に基づく療法も含まれる。承認済みの治療としては、ＴＮＦ−アルファ（α）に対して活性を有するヒト化モノクローナル抗体であるアダリムマブ（ヒュミラ(Humira)（商標））、ＴＮＦ−α阻害剤エタネルセプト（エンブレル(Enbrel)（商標））、ＴＮＦ−α阻害剤インフリキシマブ（レミケード(Remicade)（商標））およびさらに最近では、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の共通ｐ４０サブユニットを標的とし、それにより両サイトカインのシグナル伝達を遮断するヒトｍＡｂであるウステキヌマブ（ステラーラ(Stelara)（商標））が含まれる。
【０００７】
近年では、Ｔｈ１７経路の重要性は乾癬において十分にバリデートされるようになっており、ＩＬ−１７を標的とするいくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、これらのサイトカインを調節し、乾癬に影響を与えることの大きな重要性を示している。Ｔ細胞由来サイトカインであるＩＬ−１７は、皮膚における局所療法の標的である。乾癬は、患者によっては全身成分を有することがあるが、この疾患は主として皮膚のものである。Ｔｈ１７細胞により分泌されたＩＬ−１７は表皮ケラチノサイトに対して、これらの細胞上に存在するＩＬ−１７Ｒ複合体を介して働き、ケラチノサイトヘルパーの増殖と進行中の炎症のフィードバックループを誘導し、それにより乾癬斑を生成する。病的活性の主要な要素は皮膚に局在し、従って、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ｒ相互作用の阻害は、局所療法の最もよくバリデートされた標的であると考えられる。これは、活性の重要な相が所属リンパ節にあるＩＬ−２３などの他のバリデート済みのＴｈ１７標的とは対照的である。
【０００８】
いくつかの他のモノクローナル抗体薬剤は、中等度〜重度の乾癬斑を有する患者の疾患重篤度を著しく軽減することが示されている。これらの薬剤には、イキセキズマブ（トルツ(Taltz)（商標））およびセクキヌバブ（コセンティクス(Costentyx)（商標））（両方ともＩＬ−１７Ａを標的とする）、ならびにＩＬ−１７ＲＡと結合してそのシグナル伝達を阻害し、従って、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／ＦおよびおそらくはＩＬ−１７Ｅを含むこの受容体を利用するＩＬ１−７ファミリーメンバーを遮断すると思われるブロダルマブ（シリク(Siliq)（商標））が含まれる。ＩＬ−１７阻害剤に関する予備的な臨床結果は、乾癬病態生理学におけるＩＬ−１７Ａの重要性を示す。実質的確証第ＩＩＩ相臨床試験までを含む独立した臨床試験プログラムでは、３つ総ての薬剤が中等度〜重度の乾癬斑を有する患者において疾患重篤度を著しく軽減することを報告している。セクキヌバブは、サイトカイン、ケモカインおよび病変皮膚における炎症性応答に関連するタンパク質を下方調節することが示されている。要するに、ＩＬ−１７Ａの阻害は、選択的介入が乾癬斑における調節不全の免疫系に接近することを可能とする(Girolomoni et al., The British Journal of Dermatology. 2012a; 167(4):717-724, Huebner et al., Gut 2012; 61: 1693-700, Papp et al., New Engl J Med 2012; 366: 1181-9, Mease et al., N Engl J Med. 2014 12;370(24):2295-306 and Langley et al., New Engl J Med 2014; 371: 326-38)。
【０００９】
現在、乾癬治療の市場にある治療製品は、様々な程度の症状緩和を与え、再発率を引き下げるが、現在のところ治療法と見なされるものはなく、従って、長期投与を必要とする。多くの既存の局所用薬剤は短期間有効であり得るが、治療制限毒性のためにほとんどのものが短期間の使用に制限される。このことは、患者が副作用の日常的監視と新しい治療プロトコールへの定期的循環を必要とすることを意味する。光線療法は有効であり得るが、不便であり、皮膚癌の重大なリスクを伴い、多くの従来の（小分子）全身療法は、心血管リスクの増大、腎機能障害、白血球減少および血小板減少症を伴う。全身性の生物製剤は中等度〜重度の乾癬の治療を変容させたが、免疫抑制計画と同様に、長期使用は感染または悪性腫瘍のリスクの増大などの重大な副作用を有する可能性がある。治療計画は、回転療法または逐次療法、休薬、および併用療法を含む、毒性を軽減するための戦略を採用することにより、このことを考慮しなければならない。重要なこととして、数種の薬物については、どの患者も安全に受容できる暴露に対して絶対的な寿命限界がある。
【００１０】
ＩＬ−１７ファミリーのサイトカインには、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５、およびＩＬ−１７Ｆの６つのメンバーが含まれ、これらは複数の細胞種によって産生される。このファミリーのメンバーは、システインノット折り畳み構造を含む保存性の高いＣ末端を有する。ほとんどのＩＬ−１７タンパク質はジスルフィド結合した二量体として分泌され、例外として非共有結合ホモ二量体として分泌されるＩＬ−１７Ｂがある。
【００１１】
ＩＬ−１７ファミリーサイトカインによるシグナル伝達は、ＩＬ−１７受容体ファミリーのメンバーであるＩＬ−１７Ｒ／ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ、およびＩＬ−１７ＲＥにより媒介される。これらの受容体の活性化は、炎症性サイトカインおよび抗微生物ペプチドの産生を誘導する細胞内経路を惹起する。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−１７Ａ／Ｆは、主として、活性化されたＴ細胞により産生され、ＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＣからなるオリゴマー化受容体複合体を介してシグナルを伝達する。この複合体に対するリガンドの結合は、細胞内アダプタータンパク質Ａｃｔ１およびＴＲＡＦ−６の動員、および下流の転写因子ＮＦκＢ、ＡＰ−１、およびＣ／ＥＢＰの活性化をもたらす。ＩＬ−１７Ｅは、ＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−１７ＲＢにより形成される受容体複合体を介して類似のシグナル伝達経路を活性化する。ＩＬ−１７Ｅによるシグナル伝達は、Ｔｈ２型免疫応答を誘導し、喘息の病因の促進に関与する可能性がある。他のＩＬ−１７ファミリーサイトカインによって活性化されるシグナル伝達経路についてはあまり知られていない。最近の研究では、ＩＬ−１７Ｃは主として上皮細胞により産生され、ＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＥからなる受容体複合体と結合することが示唆されている。上皮細胞におけるＩＬ−１７Ｃによる自己分泌シグナル伝達は、抗微生物ペプチドおよび炎症性サイトカインの産生を刺激するが、ＩＬ−１７Ａと同様に、ＩＬ−１７Ｃの過剰発現は、自己免疫疾患の発症に寄与し得る。ＩＬ−１７Ｅと同様に、ＩＬ−１７ＢはＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−１７ＲＢに結合するが、主要な標的細胞およびＩＬ−１７Ｂシグナル伝達の効果は報告されてない。加えて、ＩＬ−１７Ｄに対する受容体およびＩＬ−１７ＲＤのリガンドも現在知られていない。
【００１２】
ヒトＩＬ１７Ａに結合する単一ドメイン抗体は、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２０１６／１１３５５７に記載されている。
【００１３】
ＩＬ−１７経路は、乾癬および喘息などの疾患の発症に主要な役割を果たす。ＩＬ−１７は、表皮層のケラチノサイト細胞を傷害し、崩壊させる炎症性応答に寄与することによって乾癬を促進させる。疾患におけるそれらの役割のために、ＩＬ−１７阻害剤は、種々の疾患に対する潜在的治療として検討されている。しかしながら、安定かつ活性なタンパク質処方物、特に、局所送達用のものの開発は、タンパク質の物理的および化学的安定性、タンパク質処方物の製造、保存、および送達に関する問題のために困難な課題となり得る。
【００１４】
上記で示されているように、局所用および全身用の両方のための、ＩＬ−１７シグナル伝達に関連する疾患の新たな有効かつ安全な治療選択肢の必要がある。特に、この分野における、特に、局所用処方物のための安定な薬物処方物の必要がある。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、局所投与のための、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる単離された結合分子、特に、抗体またはそのフラグメントを含んでなる医薬組成物および処方物に関する。好ましいフラグメントは、単一ドメイン抗体、特に、単一可変重鎖ドメイン抗体である。
【００１６】
一つの側面において、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一可変重鎖ドメイン抗体、
ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン
を含んでなる組成物に関し、前記本発明のｐＨは約５〜約９である。
【００１７】
例えば、前記単一可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号４を有するＣＤＲ３を含んでなる。別の実施形態では、前記単一可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号２を有するＣＤＲ１、配列番号３を有するＣＤＲ２および配列番号４を有するＣＤＲ３を含んでなる。別の実施形態では、前記単一可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる。別の実施形態では、前記単一可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号７４またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる。
【００１８】
一つの実施形態では、前記組成物は、以下の賦形剤：０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、０．１〜１５％のソルビトールおよび／または０．１〜３０％のプロピレングリコールのうち１以上をさらに含んでなる。
【００１９】
一つの側面において、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一ドメイン抗体、ここで、前記単一ドメイン抗体ドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン、および場合により以下の賦形剤：０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、０．１〜１５％のソルビトールおよび／または０．１〜３０％のプロピレングリコールのうち１以上を含んでなる組成物を提供し、前記組成物βのｐＨは約５〜約９である。
【００２０】
この組成物は、液体、噴霧乾燥形態または凍結乾燥形態であり得る。
【００２１】
一つの側面において、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一ドメイン抗体、ここで、前記単一ドメイン抗体ドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、
ｂ）５０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン、
ｃ）５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、
ｄ）５〜１５％のソルビトール、および
ｅ）４〜３０％のプロピレングリコール
を含んでなる組成物に関し、前記組成物のｐＨは約５〜約９である。
【００２２】
一つの実施形態では、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の単一ドメイン抗体、ここで、前記単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、
ｂ）約１００ｍＭのトリス／グリシン、
ｃ）約１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、
ｄ）約１０％のソルビトール、および
ｅ）約６％のプロピレングリコール
を含んでなる組成物に関し、前記組成物のｐＨは７．５〜８．５、例えば約８である。
【００２３】
一つの側面において、本発明は、疾患の治療における上記のような組成物の使用に関する。
【００２４】
一つの実施形態では、薬剤は、局所投与に好適である。
【００２５】
一つの側面において、本発明は、上記のような組成物の治療上有効な量を投与することを含んでなる、疾患を治療する方法に関する。
【００２６】
一つの側面において、本発明は、疾患の治療における使用のための、上記のような組成物に関する。
【００２７】
一つの実施形態では、疾患は、皮膚障害、例えば、乾癬、脊椎関節症、ブドウ膜炎、歯肉炎またはアトピー性皮膚炎から選択される。
【００２８】
一つの側面において、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一ドメイン抗体、例えば、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる単一ドメイン抗体、
ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン
を含んでなる凍結または噴霧乾燥組成物に関し、前記組成物のｐＨは約５〜約９である。
【００２９】
一つの側面において、本発明は、プロピレングリコールおよび／またはソルビトールなどの再構成剤をさらに含んでなる上記のような組成物を含んでなる、再構成された凍結乾燥または噴霧乾燥組成物に関する。
【００３０】
一つの側面において、本発明は、上記のような組成物と場合により使用説明書とを含んでなるキットに関する。
【００３１】
さらなる側面において、本発明は、上記のような組成物を含んでなる容器、例えば、ネブライザーまたは吸入器に関する。
【００３２】
別の側面において、本発明は、上記のような組成物を準備することと、プロピレングリコールなどの再構成剤を添加することを含んでなる、局所投与用の再構成処方物を作製するための方法に関する。
【００３３】
別の側面において、本発明は、上記のような組成物を含んでなる、局所投与用のクリーム、軟膏、ローション、ゲル、パッチ剤、硬膏、包帯、蒸気または粉末または液体に関する。
【００３４】
別の側面において、本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の単一ドメイン抗体、例えば、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる単一ドメイン抗体を含んでなる処方物の調製における、１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシンを含んでなるバッファーの使用に関する。
【００３５】
一つの実施形態では、バッファーは、
ａ）約１００ｍＭのトリス／グリシン、
ｂ）約１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、
ｃ）約１０％のソルビトール、および
ｄ）約６％のプロピレングリコール
を含んでなり、前記組成物のｐＨは７．５〜８．５、例えば約８である。
【００３６】
一つの側面において、本発明は、上記のような原薬バッファーとＩＬ−１７分子結合分子を合わせることを含んでなる、上記のような組成物を作製するための方法に関する。
【００３７】
一つの側面において、本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の単一ドメイン抗体（ここで、例えば、単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる）を１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシンを含んでなるバッファーに添加することを含んでなる、障害の治療のための処方物を調製するための方法に関する。
【００３８】
本発明を以下の非限的的な図面でさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】上位４つの原薬処方物に対する６週間加速安定性試験（各処方物に関して左から右へと示すＴ＝０〜Ｔ＝６）。
【図２】３か月にわたる２〜８℃保存の、原薬バッファー中４０ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ１．１（配列番号７４）の安定性。ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて測定。
【図３】３か月にわたる２〜８℃保存の、原薬バッファー中４０ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ１．１（配列番号７４）。ＳＤＳ  ｐａｇｅを用いて測定。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ乾癬皮膚モデルにおいて処方物中の抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ  １．１（配列番号７４）によって阻害された幾つかのバイオマーカーの遺伝子発現。Ｘ軸：供試処方物およびバイオマーカー。Ｙ軸：遺伝子発現の誘導百分率。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ乾癬皮膚モデルにおける処方物中のＶＨ１．１（配列番号７４）によるサイトカイン／ケモカイン阻害。Ｘ軸：供試処方物およびサイトカイン／ケモカイン。Ｙ軸：サイトカイン／ケモカインの放出百分率。
【図６】蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ原理の実例。
【図７】Ｇｙｒｏｓ  ＶＨ１．１アッセイの実例。
【図８】ＣＣＬ２０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ乾癬モデルにおいて、処方物中の局所的抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ１．１（配列番号７４、１００μｌ）（低用量であっても）により阻害される。
【図９】乾癬皮膚構築物を用いた、局所適用される選択的処方物中のＶＨ１．１（配列番号７４）によるＣＣＬ２０放出試験−９６時間。供試処方物は表３〜５の通り。
【図１０】ＲＥＴ分析を用いた、選択的処方物中の抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ１．１（配列番号７４）による乾癬組織サンプルの浸透。供試処方物は表３〜５の通り。
【図１１】５℃で１２か月の原薬処方物および付加的処方物の安定性。ＳＥ  ＨＰＬＣ。
【図１２】−２０℃で１２か月の原薬処方物および付加的処方物の安定性。ＳＥ  ＨＰＬＣ。
【図１３】ＳＥ−ＨＰＬＣを用いた、−７０℃で１２か月の原薬処方物および付加的処方物の安定性。
【図１４】ＳＥ−ＨＰＬＣを用いた、−７０℃でのバルク原薬に対する安定性試験の１２か月データ。
【図１５】ＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いた、−７０℃でのバルク原薬に対する安定性試験の１２か月データ。
【図１６】ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いた、−７０℃でのバルク原薬に対する安定性試験の１２か月データ。
【図１７】ＳＥ−ＨＰＬＣを用いた、−７０℃でのバルク原薬（ＰＧ不含処方物）に対する安定性試験の１２か月データ。
【図１８】ＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いた、−７０℃でのバルク原薬（ＰＧ不含処方物）に対する安定性試験の１２か月データ。
【図１９】ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いた、−７０℃でのバルク原薬（ＰＧ不含処方物）に対する安定性試験の１２か月データ。
【００４０】
詳細な説明
以下、本発明をさらに説明する。以下の節で、本発明の種々の側面がより詳細に定義される。このように定義される各側面は、そうではないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示されているいずれの特徴も、好ましいまたは有利であると示されている他のいずれの１または複数の特徴と組み合わせてもよい。
【００４１】
一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関して使用される名称およびその技術は、当技術分野で周知かつ慣用されるものである。本開示の方法および技術は一般に、当技術分野で周知であり、また、そうではないことが示されない限り、本明細書中に引用および記述されている種々の一般的な、またより特殊な参照文献に記載されているような従来法に従って実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))参照。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当技術分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、医化学および製薬化学に関して使用される名称、ならびにその実験室手順および技術は当技術分野で周知かつ慣用されるものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、処方、および送達、ならびに患者の治療には標準的技術が使用される。
【００４２】
本発明者らは、単離されたＩＬ−１７Ａ結合分子が本明細書に記載されるような好適な賦形剤を用いて局所送達用に処方できることを実証した。よって、本発明は、ＩＬ−１７Ａ結合分子を含んでなる、安定かつ非凝集性の組成物／処方物、特に、局所送達に好適な組成物および処方物を提供する。一つの側面において、本発明は、凍結または噴霧乾燥組成物として処方されるこのような組成物を提供する。これらは投与のために再構成することができる。別の側面において、本発明は、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏もしくは粉末吸入のため蒸気として処方される組成物、または硬膏もしくはパッチ剤などを用いて投与される組成物を提供する。
【００４３】
よって、一つの側面において、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の結合分子、例えば、少なくとも１種類の単一ドメイン抗体、および
ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン
を含んでなる組成物を提供し、前記組成物のｐＨは約５〜約９である。
【００４４】
本明細書でさらに説明されるように、一つの実施形態では、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、好ましくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）から選択される。一つの実施形態では、単一ドメイン抗体は、単一可変ドメイン抗体である。一つの実施形態では、単一可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。一つの実施形態では、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨまたはＶＨＨドメインを含んでなる少なくとも１種類の単一ドメイン抗体（「ＶＨまたはＶＨＨ単一ドメイン抗体」）から選択される。ＶＨドメインは一般に、ヒト可変重鎖ドメインと呼ばれると理解される。ＶＨＨドメインは一般に、ラクダ科動物可変重鎖ドメインと呼ばれると理解される。
【００４５】
本発明の組成物の一つの実施形態では、組成物は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨドメインを含んでなる、有効量の少なくとも１種類の単一ドメイン抗体を含んでなり、ここで、前記ＶＨドメインは、アミノ酸残基ＧＥＩＬＰＬＹＦＤＹ（配列番号４）を有するＣＤＲ３配列を含んでなる配列、または配列番号４と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ３を含んでなる配列を有する。一つの実施形態では、前記ＣＤＲ３配列は、配列番号４の変異体であり、かつ前記配列番号４の１以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失を含んでなる。
【００４６】
一つの実施形態では、前記ＶＨドメインは、アミノ酸残基ＳＹＳＭＹ（配列番号２）を有するＣＤＲ１、または１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸改変を有する配列を有する配列を含んでなる。一つの実施形態では、前記ＣＤＲ１配列は、配列番号２の変異体であり、かつ前記配列番号２の１以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失を含んでなる。
【００４７】
一つの実施形態では、前記ＶＨドメインは、アミノ酸残基ＥＩＫＱＤＧＳＶＱＹＹＶＳＤＶＫＧ（配列番号３）を有するＣＤＲ２、または配列番号３と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる。一つの実施形態では、前記ＣＤＲ２配列は、配列番号３の変異体であり、かつ前記配列番号３の１以上のアミノ酸残基の置換、付加、挿入または欠失を含んでなる。
【００４８】
一つの実施形態では、ＶＨドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有し、ここで、前記ＣＤＲ１は、配列番号２または１以上のアミノ酸残基の置換、付加もしくは欠失を含んでなるその変異体を有し、前記ＣＤＲ２は、配列番号３、または１以上のアミノ酸残基の置換、付加、挿入もしくは欠失を含んでなるその変異体を有し、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号４、または１以上のアミノ酸残基の置換、付加、挿入または欠失を含んでなるその変異体を有する。一つの実施形態では、ＶＨドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有し、ここで、前記ＣＤＲ１は配列番号２を有し、前記ＣＤＲ２は配列番号３を有し、かつ、前記ＣＤＲ３は配列番号４を有する。
【００４９】
別の実施形態では、前記ＶＨドメインは、配列番号１、またはそれと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。配列番号１を以下に示す。
配列番号１（ＣＤＲ１、２および３を太字と下線で示す）
【化１】
2019524719.tif 000003
【００５０】
本明細書でさらに説明されるように、一つの側面において、１以上の任意選択の賦形剤を、特に、局所送達のために、上記の組成物に添加することができる。局所送達は、本明細書において身体の特定のスポットへの投与を表すために使用され、身体表面への投与ならびに局所用薬剤による肺投与を含む。局所投与は皮膚、眼、歯肉、膜または肺に対するものであり得る。第２の側面において、上記の本発明の組成物は、１以上の任意選択の賦形剤とともに凍結または噴霧乾燥させることができる。このような組成物は、投与前に局所送達に好適な１以上の賦形剤で再構成してもよい。
【００５１】
本開示を通して、百分率および比などの表現は総て、そうではないことが示されない限り「重量」によるものである。本明細書で使用する場合、「重量」は用語「質量」と同義であり、本明細書に定義される比または百分率が容量、厚さ、または他の何らかの尺度ではなく重量に従って定義されることを示す。
【００５２】
本発明は、医薬組成物および処方物である処方物および組成物に関する。本明細書で使用する場合、用語「処方物」または「組成物」は、有効分子と薬学的に許容可能な賦形剤との組合せを表す。用語「医薬組成物」または「医薬処方物」は、有効成分の生物活性を有効とさせるような形態にある製剤を指す。用語「薬学的に許容可能な」とは、重大な有害医学事象なく動物（例えば、哺乳動物）に投与することができる化合物またはタンパク質を指す。
【００５３】
ＩＬ−１７ファミリーのサイトカインには、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５、およびＩＬ−１７Ｆの６つのメンバーが含まれ、これらは複数の細胞種によって産生される。このファミリーのメンバーは、システインノット折り畳み構造を含む保存性の高いＣ末端を有する。ほとんどのＩＬ−１７タンパク質は、非共有結合ホモ二量体として分泌されるＩＬ−１７Ｂの例外があるが、ジスルフィド結合した二量体として分泌される。
【００５４】
ＩＬ−１７ファミリーサイトカインによるシグナル伝達は、ＩＬ−１７受容体ファミリーのメンバーであるＩＬ−１７Ｒ／ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ、およびＩＬ−１７ＲＥにより媒介される。これらの受容体の活性化は、炎症性サイトカインおよび抗微生物ペプチドの産生を誘導する細胞内経路を惹起する。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−１７Ａ／Ｆは、主として、活性化されたＴ細胞により産生され、ＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＣからなるオリゴマー化受容体複合体を介してシグナルを伝達する。この複合体に対するリガンドの結合は、細胞内アダプタータンパク質Ａｃｔ１およびＴＲＡＦ−６の動員、および下流の転写因子ＮＦκＢ、ＡＰ−１、およびＣ／ＥＢＰの活性化をもたらす。ＩＬ−１７Ｅは、ＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−１７ＲＢにより形成される受容体複合体を介して類似のシグナル伝達経路を活性化する。ＩＬ−１７Ｅによるシグナル伝達は、Ｔｈ２型免疫応答を誘導し、喘息の病因の促進に関与する可能性がある。他のＩＬ−１７ファミリーサイトカインによって活性化されるシグナル伝達経路についてはあまり知られていない。最近の研究では、ＩＬ−１７Ｃは主として上皮細胞により産生され、ＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＥからなる受容体複合体と結合することが示唆されている。上皮細胞におけるＩＬ−１７Ｃによる自己分泌シグナル伝達は、抗微生物ペプチドおよび炎症性サイトカインの産生を刺激するが、ＩＬ−１７Ａと同様に、ＩＬ−１７Ｃの過剰発現は、自己免疫疾患の発症に寄与し得る。ＩＬ−１７Ｅと同様に、ＩＬ−１７ＢはＩＬ−１７ＢＲ／ＩＬ−１７ＲＢに結合するが、主要な標的細胞およびＩＬ−１７Ｂシグナル伝達の効果は報告されてない。加えて、ＩＬ−１７Ｄに対する受容体およびＩＬ−１７ＲＤのリガンドも現在知られていない。
【００５５】
ＩＬ−１７Ａ結合分子は、本明細書で使用する場合、ヒトＩＬ−１７Ａ（シグナルペプチドを含む全長前駆体ＩＬ−１７Ａを示す受託番号Ｑ１６５５２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）配列番号７５）および／またはカニクイザルＩＬ−１７（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｇ７Ｐ４Ｕ９）に結合する。ヒトＩＬ−１７Ａは、２本の１５５アミノ酸の鎖からなるホモ二量体である。各ポリペプチド鎖は、２３アミノ酸のＮ末端ペプチドを含み、これが切断されて１３２残基の成熟ポリペプチドを生じる。ＩＬ−１７Ａは、ＩＬ−１７受容体ＡおよびＣに結合し、それらの活性化を介してその効果を発揮する。
配列番号７５
【化２】
2019524719.tif 000004
【００５６】
用語「ＩＬ−１７結合分子」、「抗ＩＬ−１７結合分子」、「ＩＬ−１７結合タンパク質」、「抗ＩＬ−１７単一ドメイン抗体」または「抗ＩＬ−１７抗体」は総て、ヒトＩＬ−１７Ａ抗原に結合することができる分子を指す。よって、本明細書で使用する場合、ＩＬ−１７は、そうではないことが示されない限りまたは文脈がそうではないことを指さない限り、通常、ＩＬ−１７Ａを指す。結合反応は、例えば、その受容体に対するＩＬ−１７結合の阻害を判定するための結合アッセイ、競合アッセイもしくはバイオアッセイ、または抗体が無関連の特異性を持つ陰性対照試験を参照する任意の種類の結合アッセイを含む、標準的な方法（定性アッセイ）によって示すことができる。用語「ＩＬ−１７結合分子」には、ＩＬ−１７結合タンパク質またはヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるその一部が含まれる。好ましい実施形態では、ＩＬ−１７結合分子は、抗体またはそのフラグメント、例えば、抗ＩＬ−１７単一ドメイン抗体である。より好ましい実施形態では、ＩＬ−１７結合分子は、本明細書に記載されるようなＶＨドメインを含んでなる抗ＩＬ−１７単一ドメイン抗体である。
【００５７】
用語「抗体」は、広義には、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖で構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、もしくはその抗原結合部分、またはＩｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体、もしくは誘導体を指す。このような突然変異体、変異体、または誘導体抗体形式は当技術分野で公知である。全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域が散在する。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
【００５８】
用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲが存在し、これらは可変領域のそれぞれに対してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。用語「ＣＤＲセット」は、抗原と結合することができる単一可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる体系により異なる定義がなされている。本明細書では、Ｋａｂａｔにより記載されている体系が使用される。用語「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ標識」は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体、またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域内の他のアミノ酸残基よりもより可変な（すなわち、超可変）アミノ酸残基をナンバリングする体系を指す(Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。
【００５９】
用語「抗原結合部位」は、抗原と特異的に結合する領域を含んでなる抗体または抗体フラグメントの部分を指す。抗原結合部位は、１以上の抗体可変ドメインにより提供されてもよい。好ましくは、抗原結合部位は、抗体または抗体フラグメントの会合したＶＨおよびＶＬ内に含まれる。
【００６０】
抗体フラグメントは、例えば、（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓＦｖなどとしての抗体の部分である。全長抗体の機能的フラグメントは、全長抗体の標的特異性を保持する。従って、組換え機能的抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ(Fragment, antibody)、ｓｃＦｖ(single variable chain fragments)および単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ｍＡｂに基づく治療薬に代わるものとしての治療薬を開発するために使用されてきた。
【００６１】
ｓｃＦｖフラグメント（約２５ｋＤａ）は、２つの可変ドメインＶＨおよびＶＬからなる。本来、ＶＨドメインとＶＬドメインは疎水性相互作用を介して非共有結合的に会合し、解離する傾向がある。しかしながら、安定なフラグメントは、これらのドメインを親水性のフレキシブルリンカーで架橋して単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作出することによって工作することができる。
【００６２】
最小の抗原結合フラグメントは、単一可変フラグメント、すなわち、ＶＨまたはＶＬドメインである。標的結合には、軽鎖／重鎖相手それぞれへの結合は必要とされない。このようなフラグメントが単一ドメイン抗体内で使用される。従って、単一ドメイン抗体（約１２〜１５ｋＤａ）は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかからなる、または含んでなる。
【００６３】
用語「単一ドメイン抗体、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）」は、当技術分野で周知であり、標的抗原に結合する抗体の単一可変フラグメントを表す。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。以下に説明されるように、本発明の種々の側面の好ましい実施形態では、単一可変ドメインは、ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）もしくはドメイン抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体（もしくは単一ドメイン抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）、他の単一可変ドメイン、またはそのいずれか一つの任意の好適なフラグメントであり得る。単一ドメイン抗体は当技術分野で記載されており、それらは、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチド、例えば、可変ドメイン、例えば、ヒト可変重鎖ドメイン（ＶＨ）ポリペプチドの一部である抗体である。可変ドメインがＶＨＨドメインである単一可変ドメイン抗体も本発明の範囲内にある。（単一）ドメイン抗体の概要については、Ward et al. 1989 (Nature 341 (6242): 544-546) and to Holt et al. 2003 (Trends Biotechnol. 21(11): 484-490)もまた参照。
【００６４】
一つの実施形態では、本発明の結合分子は、前記可変ドメインがＶＨドメインである単一可変ドメイン抗体を含んでなる。このような分子はＶＨ単一ドメイン抗体または単一ＶＨドメイン抗体と呼ばれる。ヒト重鎖可変ドメイン抗体が特に好ましい。単一可変ドメイン抗体を含んでなる結合分子（ここで、前記ドメインはヒトＶＨドメインである）はまた、本明細書ではヒューマボディ(Humabody)（商標）ＶＨとも呼ばれる。よって、一つの実施形態では、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、ヒューマボディ（商標）ＶＨである。ヒューマボディ（商標）は、Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄの商標である。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語ＶＨまたは「可変ドメイン」は、Kabat et al. (1991)により定義された免疫グロブリン可変ドメインを指す。ＣＤＲアミノ酸残基のナンバリングおよび位置決定は、本明細書で使用する場合、周知のＫａｂａｔナンバリング規則に従ったものである。
【００６６】
一つの実施形態では、処方物および本発明の他の側面で使用される、単離された結合分子は、少なくとも１種類の単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなり、ここで、前記ドメインはヒトＶＨドメインである。よって、一つの側面において、本発明の結合分子は、ＶＨドメインを有するがＶＬドメインを欠く少なくとも１種類の免疫グロブリン単一可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる。
【００６７】
各単一ＶＨドメイン抗体は、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含んでなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。よって、本発明の一つの実施形態では、ドメインは、以下の式ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有するＶＨドメインである。
【００６８】
本発明による組成物で使用される単一ドメイン抗体を含むＩＬ１７Ａ結合分子は、単離された分子である。用語「単離された」単一ドメイン抗体とは、異なる抗原特異性を有する他の単一ドメイン抗体、抗体または抗体フラグメントを実質的に含まない単一ドメイン抗体を指す。さらに、単離された単一ドメイン抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００６９】
本明細書でさらに説明されるように、好ましい実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を発現するトランスジェニックマウスで生成され、本発明に従って使用される。
【００７０】
本発明の種々の側面および実施形態によれば、本発明の単一ドメイン抗体の可変ドメインは好ましくは、ヒト可変ドメイン（ヒト可変ドメインは一般にＶＨと呼ばれる）である。本明細書で使用する場合、ヒトＶＨドメインは、完全なヒトまたは実質的に完全なヒトＶＨドメインを含む。本明細書で使用する場合、用語ヒトＶＨドメインはまた、特に、例えばＷＯ２０１６／０６２９９０および実施例に記載されるように、対象とする抗原による免疫誘導に応答して完全ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスによって作製された重鎖単独抗体から単離されたＶＨドメインも含む。一つの実施形態では、ヒトＶＨドメインはまた、ヒトＶＨドメインアミノ酸またはこのようなＶＨドメインをコードする核酸配列に由来するまたは基づくＶＨドメインも含み得る。よって、この用語には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する、またはそれによりコードされる可変重鎖領域が含まれる。ヒトＶＨドメインに由来するまたは基づく実質的ヒトＶＨドメインまたはＶＨドメインは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｖｉｔｒｏにおいて例えばランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入される、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて体細胞突然変異により導入される突然変異）を含んでもよい。従って、用語「ヒトＶＨドメイン」にはまた、１以上のアミノ酸残基が改変された実質的ヒトＶＨドメインも含まれる。例えば、実質的ヒトＶＨドメインは、完全ヒト配列に比べて最大１０、例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸改変を含み得る。
【００７１】
しかしながら、用語「ヒトＶＨドメイン」または「実質的ヒトＶＨドメイン」は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されない。いくつかの実施形態では、用語「ヒトＶＨドメイン」は、本明細書で使用する場合、ラクダ化ＶＨドメイン、すなわち、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＶＨドメイン配列において所定の位置を選択し、その所定の位置において１以上の所定の残基をラクダ科動物ＶＨＨドメインに見出せる特定の残基に変化させるために１以上の点突然変異を導入するための従来の突然変異誘発法によって特異的に改変されているヒトＶＨドメインは含まない。
【００７２】
よって、一つの実施形態では、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるヒトＶＨドメインを含んでなる少なくとも１種類の単一ドメイン抗体から選択される。一つの実施形態では、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる少なくとも１種類の単一ＶＨドメイン抗体から選択される。別の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
【００７３】
ＶＨフレームワークに対する改変は、結合および／またはその他の特性を改善するために行うことができる。例えば、ＶＨドメインは、Ｃ末端またはＮ末端延長を含んでなってもよい。
【００７４】
「相同性」は一般に、配列をアラインした後に、いくつかの実施形態では、最大相同性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、かつ、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮せずに、候補配列が比較されるポリペプチドの残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率を指す。Ｎ末端もしくはＣ末端延長、タグまたは挿入はいずれも同一性または相同性を低下させると解釈されるべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは周知である。
【００７５】
本明細書で示されるように、一つの実施形態では、本発明の組成物は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類のＶＨドメイン抗体を含んでなり、前記ＶＨドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％の相同性を有する配列を含んでなる。一つの実施形態では、前記配列相同性または同一性は、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１に比べて１以上のアミノ酸改変を有し、かつ、単一ドメイン抗体の生物学的機能を保持する、配列番号１に定義される単一ＶＨドメイン抗体の変異体である単一ＶＨドメイン抗体を提供する。この改変は、アミノ酸残基の１以上の置換、欠失、挿入またはその他の付加であり得る。変異体は、表１に示されるように配列番号５〜７３から選択することができる。
【００７７】
一つの実施形態では、変異体単一ＶＨドメイン抗体は、操作された配列であり得る。改変には、天然配列ＶＨ単一ドメイン抗体またはポリペプチドに比べてアミノ酸配列に変化を生じる単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１以上のコドンの少なくとも一つの置換、欠失または挿入が含まれる。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、例えば、ロイシンのセリンによる置換、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、場合により約１〜１０の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸であってよい。許容されるバリエーションは、配列においてアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に作出し、得られた変異体を全長または成熟天然配列により示される活性に関して試験することによって判定することができる。配列番号１で定義されるＶＨ単一ドメイン抗体の変異体は、好ましくは、非変異体分子と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。
【００７８】
一つの実施形態では、改変は、保存的配列改変である。本明細書で使用する場合、用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼさないまたはそれを変更しないアミノ酸改変を指すものとする。このような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。よって、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、本明細書に記載の機能アッセイを用い、変更された抗体を保持される機能（すなわち、上記（ｃ）〜（ｌ）に示される機能）に関して試験することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、１以上の配列改変を含んでなる配列番号１に定義されるＶＨ単一ドメイン抗体の変異体を提供し、非改変単一ドメイン抗体と比較した場合に結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の軽減、または溶解度などの特性のうち１以上に改善を有する。
【００８０】
一つの実施形態では、改変は、単一ドメイン抗体の免疫原性を軽減するために行うことができる。例えば、一つのアプローチは、１以上のフレームワーク残基を、相当するヒト生殖細胞系配列に戻すことである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた単一ドメイン抗体は、その単一ドメイン抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含んでよい。このような残基は、単一ドメイン抗体フレームワーク配列を、その単一ドメイン抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって同定することができる。
【００８１】
フレームワーク領域配列内のアミノ酸残基のうち１以上をそれらの生殖細胞系構成に戻すために、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖細胞系配列に「復帰突然変異」させることができる。
【００８２】
別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内または１以上のＣＤＲ領域内であっても１以上の残基を、Ｔ細胞エピトープを除去しそれにより抗体の潜在的免疫原性を軽減するように突然変異させることを含む。
【００８３】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるように変更することができる。このような糖鎖改変は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらしてそれによりその部位のグリコシル化を除去する１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増強し得る。
【００８４】
当業者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ発現ライブラリーを含め、本明細書に記載されるような抗原結合分子を同定、取得および最適化するための様々な方法が存在することを知っているであろう。このことは実施例にさらに記載される。当技術分野で公知の最適化技術、例えば、ディスプレー（例えば、リボソームおよび／またはファージディスプレー）ならびに／または突然変異誘発（例えば、エラープローン突然変異誘発）が使用可能である。よって、本発明はまた、本明細書に記載の単一ドメイン抗体の配列最適化変異体も含んでなる。
【００８５】
一つの実施形態では、ＶＨドメインは、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなること以外は配列番号１を含んでなる、またはからなる。一つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。別の実施形態では、ＶＨドメインは、ＣＤＲ配列、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内に１、２、３、４または５個のアミノ酸置換を含んでなること以外は配列番号１を含んでなる、またはからなる。例えば、配列番号１のＣＤＲ３（配列番号４）またはその変異体では、１以上のＹがＨに置換されていてよい。
【００８６】
一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、以下の表１に示されるアミノ酸配列の一つから選択される（表１は、全長ＶＨアミノ酸配列を示し、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の配列はそれぞれ、参照しやすいように表１の別の欄に示される）。
【００８７】
【表１】
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2019524719.tif 000006
2019524719.tif 000007
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【００８８】
ＶＨドメインのＣ末端はＶＴＶＳＳ（配列番号７７）で終わる。本明細書に記載の結合分子の一つの実施形態では、ＶＨドメインは、付加的Ｃ末端残基、例えば、１〜１５個の付加的Ｃ末端残基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の付加的アミノ酸を含んでなる。一つの実施形態では、ＶＨドメインは、１〜１５個のアミノ酸残基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の付加的Ｃ末端残基を含んでなり、前記残基はＣＨ１ドメインの残基である。言い換えれば、ＶＨドメインは、ＣＨ１ドメインへと延長される。一つの実施形態では、前記延長は、少なくとも１個のアラニン残基、例えば、単一のアラニン残基、２個のアラニン残基または３個のアラニン残基を含んでなる。このような延長されたＶＨドメインは、本発明の範囲内にある。一つの実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端は末端切断され、ＶＴＶＳＳ（配列番号７７）のうち１以上が欠失されていてもよい。一つの実施形態では、ＶＴＶＳＳ（配列番号７７）の１以上が別の残基に置換されていてもよい。
【００８９】
また、付加的なＣ末端またはＮ末端残基、例えば、リンカー残基および／またはＨｉｓタグ、例えばヘキサＨｉｓなどのタグの標識を含んでなるＶＨドメインも本発明の範囲内にある。一つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１の変異体を含んでなり、またはからなり、実施例に示されるように以下のアミノ酸配列を有するＶＨ１．１（配列番号７４）と呼ばれる。
配列番号７４
【化３】
2019524719.tif 000012
【００９０】
よって、一つの側面において、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一ドメイン抗体、ここで、前記単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、および
ｂ）１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン
を含んでなる局所送達のための組成物に関し、前記組成物のｐＨは約５〜約９である。
【００９１】
一つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１または７４を含んでなる、またはからなる。
【００９２】
一つの実施形態では、組成物は、約１０〜約１５０ｍＭ、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭの濃度でトリス／グリシンを含んでなる。本発明の組成物の一つの実施形態では、トリス／グリシンの濃度は、約５０〜約１５０ｍＭ、例えば５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭである。一つの実施形態では、濃度は約９０〜１１０ｍＭである。一つの実施形態では、濃度は約１００ｍＭである。
【００９３】
一つの実施形態では、組成物は、以下の賦形剤：約０．１〜約１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、約０．１〜約１５％のソルビトールおよび／または約０．１〜約３０％のプロピレングリコールのうち１以上をさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸をさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜１５％のソルビトールをさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜３０％のプロピレングリコールをさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸および０．１〜１５％のソルビトールをさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜１５％のソルビトールおよび０．１〜３０％のプロピレングリコールをさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸および０．１〜３０％のプロピレングリコールをさらに含んでなる。一つの実施形態では、組成物は、０．１〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、０．１〜１５％のソルビトールおよび０．１〜３０％のプロピレングリコールをさらに含んでなる。
【００９４】
本発明の組成物の一つの実施形態では、Ｌ−アルギニン／グルタミン酸の濃度は、約５０〜約１５０ｍＭ、例えば約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭである。一つの実施形態では、この濃度は約９０〜１１０ｍＭである。一つの実施形態では、この濃度は約１２５ｍＭである。
【００９５】
本発明の組成物の一つの実施形態では、ソルビトールの濃度は、５〜１５％、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％である。一つの実施形態では、この濃度は約１０％である。
【００９６】
本発明の組成物の一つの実施形態では、プロピレングリコールの濃度は、約４  約３０％、例えば４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％である。一つの実施形態では、この濃度は、約５〜１５％、１０％〜１５％、１５％〜２０％または２０％〜２５％である。一つの実施形態では、この濃度は約６％である。一つの実施形態では、この濃度は約１４％である。
【００９７】
本発明の組成物のいくつかの実施形態によれば、ｐＨは約７〜約８．５、好ましくは７．５〜８．５の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５から選択することができる。一つの実施形態では、ｐＨは約８．０である。
【００９８】
当業者は、上記に示されるような組成物の成分の様々な濃度を組み合わせることができることを理解するであろう。
【００９９】
一つの実施形態では、組成物は、５０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン、５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、５〜１５％のソルビトールおよび４〜３０％のプロピレングリコールを含んでなり、前記組成物のｐＨは、約５〜約９、例えば７．５〜８．５である。
【０１００】
一つの実施形態では、組成物は、約１００ｍＭのトリス／グリシン、約１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、約１０％ソルビトールのおよび約６％のプロピレングリコールを含んでなり、前記組成物のｐＨは、７．５〜８．５、例えば約８である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１種類の抗ＩＬ−１７Ａ結合分子、例えば、本明細書に記載されるようなＶＨ単一ドメイン抗体を含んでなる。いくつかの実施形態では、２以上の抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ単一ドメイン抗体が存在してよい。一つの実施形態では、組成物は、二重パラトープ性または二価の抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ単一ドメイン抗体を含んでなる。別の実施形態では、組成物は、ＶＨ単一ドメイン抗体ではない第２の抗体または抗体フラグメントをさらに含んでなる。抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ単一ドメイン抗体はまた、抗体の有効性を増強および／または補足する働きをする他の薬剤とともに使用および投与することもできる。
【０１０２】
本発明の処方物において使用するための多重特異性結合分子は、技術分野で既知の方法を用いて構築することができる。
【０１０３】
二重パラトープ性または多重特異性結合分子では、これらの部分は一般にリンカー、例えば、ポリペプチドリンカーによって連結される。例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（式中、ｎ＝１〜１０、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０）などのＧＳ残基を含むリンカーを含んでなる好適なリンカーが当技術分野で公知である。
【０１０４】
所望であれば、二重特異性または多重特異性結合分子は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方、および場合によりヒンジ領域を含んでなる抗体Ｆｃ領域またはそのフラグメントに連結することができる。例えば、単一のヌクレオチド配列としてＦｃ領域またはそのフラグメントに連結された二重特異性または多重特異性結合分子をコードするベクターを、このようなポリペプチドを作製するために使用することができる。
【０１０５】
例示的な第２の抗原標的としては、白血球受容体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそれらのリガンド；ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−６またはＣＤ２０が含まれる。この一覧は、記載されている薬剤に限定されない。
【０１０６】
一つの実施形態では、例えば結合分子の半減期を延長するために、第２（または第３、第４、第５など）の部分を、ＩＬ−１７Ａと結合するＶＨドメインに連結することができる。この部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するタンパク質、例えば抗体、またはその一部を含んでなってよい。一つの実施形態では、第２の部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合するＶＨドメインを含んでなってよい。
【０１０７】
第２の部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＣ３４Ｓなどのその変異体を含んでなってよい。さらに、ＶＨドメインおよびＦｃドメインまたはそのフラグメントを含んでなる、本明細書に記載されるような結合分子も提供され、例えば、ここで、ＶＨドメインは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントに接続される。さらに、第２の抗原と特異的に結合する第２の可変ドメインを含んでなる結合分子も提供され、ここで、第２の抗原は、ヒトＩＬ−１７Ａ以外の抗原である。第２の抗原は、分化抗原群（ＣＤ）分子または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子であり得る。
【０１０８】
本明細書に記載の結合分子は、内因性の免疫グロブリンを欠くトランスジェニックノックアウト（ＫＯ）齧歯類、例えばマウスを使用することによって得ることができる。好ましくは、マウスは、機能的重鎖、λ軽鎖およびκ軽鎖遺伝子座を含まない。これらの遺伝子座は、欠失、挿入、遺伝子編集または当技術分野で公知の他の技術によって非機能的とされ得る。非機能的な内因性λおよびκＬ鎖遺伝子座を有するマウスは、例えば、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００３／０００７３７に開示されるように作出することができる。非機能的重鎖遺伝子座を有するマウスは、例えば、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００４／０７６６１８に開示されるように作出することができる。
【０１０９】
例えば、トランスジェニックマウスは、異種重鎖遺伝子座を発現するためのベクター、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含んでなる。ＹＡＣは、酵母において極めて大きな対象ＤＮＡをクローニングするために使用できるベクターである。天然酵母染色体のように挙動するために不可欠な３つのシス作用構造要素（自立複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）および２つのテロメア（ＴＥＬ））を総て含んでなるだけでなく、大きなＤＮＡ挿入を受け入れるそれらの能力は、それらを、染色体様の安定性と酵母細胞における伝達の忠実性に必要とされる最小サイズ（１５０ｋｂ）とすることを可能とする。ＹＡＣの構築および使用は当技術分野で周知である（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopaedia of Life Sciences 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net）。
【０１１０】
例えば、ＹＡＣは、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２０１６／０６２９９０に開示されるように、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサーおよび調節領域を欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて過多のヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子を含んでなってよい。
【０１１１】
トランスジェニックマウスは、標準的技術に従って作出することができる。トランスジェニックマウスをＩＬ−１７Ａ抗原で免疫してよく、次いで、前記マウス由来のＶＨドメイン配列を含んでなる配列のライブラリーを生成させる。前記ライブラリー由来のＶＨドメイン配列を含んでなる配列は、標準的技術を用いて単離される。
【０１１２】
組成物中に存在する有効分子、例えば、ヒトＩＬ−１７Ａに結合する抗体、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体またはＶＨ単一ドメイン抗体は、に約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で組成物中存在してよい。いくつかの実施形態では、有効分子の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌまたは約１０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、この濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２７ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約２９ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３１ｍｇ／ｍｌ、約３２ｍｇ／ｍｌ、約３３ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ、約３５ｍｇ／ｍｌ、約３６ｍｇ／ｍｌ、約３７ｍｇ／ｍｌ、約３８ｍｇ／ｍｌ、約３９ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約４１ｍｇ／ｍｌ、約４２ｍｇ／ｍｌ、約４３ｍｇ／ｍｌ、約４４ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ／ｍｌ、約４６ｍｇ／ｍｌ、約４７ｍｇ／ｍｌ、約４８ｍｇ／ｍｌ、約４９ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約５１ｍｇ／ｍｌ、約５２ｍｇ／ｍｌ、約５３ｍｇ／ｍｌ、約５４ｍｇ／ｍｌ、約５５ｍｇ／ｍｌ、約５６ｍｇ／ｍｌ、約５７ｍｇ／ｍｌ、約５８ｍｇ／ｍｌ、約５９ｍｇ／ｍｌ、約６１ｍｇ／ｍｌ、約６２ｍｇ／ｍｌ、約６３ｍｇ／ｍｌ、約６４ｍｇ／ｍｌ、約６５ｍｇ／ｍｌ、約６６ｍｇ／ｍｌ、約６７ｍｇ／ｍｌ、約６８ｍｇ／ｍｌ、約６９ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約７１ｍｇ／ｍｌ、約７２ｍｇ／ｍｌ、約７３ｍｇ／ｍｌ、約７４ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約７６ｍｇ／ｍｌ、約７７ｍｇ／ｍｌ、約７８ｍｇ／ｍｌ、約７９ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約８１ｍｇ／ｍｌ、約８２ｍｇ／ｍｌ、約８３ｍｇ／ｍｌ、約８４ｍｇ／ｍｌ、約８５ｍｇ／ｍ、約８６ｍｇ／ｍ、約８７ｍｇ／ｍ、約８８ｍｇ／ｍ、約８９ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約９１ｍｇ／ｍｌ、約９２ｍｇ／ｍｌ、約９３ｍｇ／ｍｌ、約９４ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ、約９６ｍｇ／ｍｌ、約９７ｍｇ／ｍｌ、約９８ｍｇ／ｍｌ、約９９ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌである。一つの実施形態では、この濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌである。一つの実施形態では、この濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌである。一つの実施形態では、この濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌである。
【０１１３】
一つの実施形態では、ＶＨドメインの濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約２０ｍｇ／ｍｌまたは約４０ｍｇ／ｍｌである。
【０１１４】
治療適用のための処方物のモル浸透圧濃度は重要である。血液／血清の通常のモル浸透圧濃度は、約３００〜３１０ｍＯｓｍ／Ｌである。実施例に示されるように、処方物中の結合分子は、生理学的レベルを超えたモル浸透圧濃度を示した。よって、一つの実施形態では、処方物のモル浸透圧濃度は、生理学的レベルかそれ以上である。例えば、モル浸透圧濃度は、約２ｍＯｓｍ／ｋｇ以上である。一つの実施形態では、モル浸透圧濃度は、約２，３８６ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【０１１５】
実施例に示されるように、本発明による組成物は、種々の条件下で安定である。本明細書で使用する場合、用語「安定性」は一般に、生物学的に活性な薬剤、すなわち、本明細書に記載のＩＬ−１７結合分子の完全性を維持すること、またはその分解、変性、凝集もしくは折り畳みの解除を最小限にすることに関する。組成物中の有効分子の安定性は、当業者に知られている様々な手段によって決定することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、抗体の安定性または凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、すなわち、成分、例えば抗体またはそのフラグメントの分子サイズ、それらの拡散係数、および表面特性に基づく分離技術によって決定される。よって、例えば、ＳＥＣは、それらの天然三次元立体配座にある抗体または抗体フラグメントを、種々の変性状態の抗体、および／または分解された抗体から分離することができる。ＳＥＣでは、固定相は一般に、ガラスまたはスチールカラム内に稠密三次元マトリックスとして充填された不活性粒子から構成される。移動相は、純水、水性バッファー、有機溶媒、これらの混合物、または他の溶媒であり得る。固定相粒子は、特定の大きさに満たない種だけを入らせる小さな孔および／または溝を有する。従って、大きな粒子はこれらの孔および溝から排除されるが、より小さな粒子は流動している移動相から除去される。粒子が固定相孔で不動となって費やす時間は、一部には、それらの粒子が孔の中へどれだけ浸透できるかによって決まる。移動相流からの粒子の除去は、それらの粒子がカラムから溶出するのを長引かせ、粒子のサイズの違いに基づいて粒子間の分離が起こる。
【０１１７】
水性または水性／有機移動相中での生体分子の分離については、ＳＥＣはゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）と呼ばれ、一方、非水性移動相中での有機ポリマーの分離はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と呼ばれる。
【０１１８】
ＳＥＣは、当業者に知られているタンパク質、またはそれらのフラグメントを同定または特性評価するための同定技術と組み合わせることができる。タンパク質同定および特性評価は、限定されるものではないが、クロマトグラフィー技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イムノアッセイ、電気泳動、紫外線／可視光／赤外線分光法、ラマン分光法、表面増強ラマン分光法、質量分析、ガスクロマトグラフィー、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、尿素誘導タンパク質変性技術、内部トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、および／またはＡＮＳタンパク質結合を含む種々の技術によって達成することができる。
【０１１９】
タンパク質は高速液体クロマトグラフィーによって同定することができる。周知の技術は、ＨＰＬＣ、例えば、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ−ＨＰＬＣ）である。対象とするタンパク質を含有する液体溶媒を分離カラムにロードし、そこで分離が起こる。ＨＰＬＣ分離カラムには固体粒子（例えば、シリカ、ポリマー、または吸着剤）が充填され、サンプル混合物はカラム粒子と相互作用するので化合物に分離される。ＳＥＣおよびＨＰＬＣは組み合わせることができ、しばしばＳＥ−ＨＰＬＣと呼ばれる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、安定性は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、尿素誘導タンパク質変性技術、内部トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、およびｌ−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）タンパク質結合技術または当技術分野で公知の他の技術により測定した場合に、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下および０．５重量％以下のタンパク質凝集を含む、低〜検出不能な凝集レベルを有する処方物を指す。
【０１２１】
液体組成物の安定性はまた、抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその一部（ＶＨドメインを含む）の能力を測定するための、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイを含む種々の免疫学的アッセイによって評価されるような、上記の条件下での長期保存中の抗体（フラグメント／その一部を含む）の生物活性を調べることによって決定することもできる。一つの実施形態では、本発明の組成物は、上記で定義された期間保存した後に、保存前の処方物の初期生物活性の、すなわち、保存前のＩＬ−１７結合ＶＨドメインに相当する参照分子または処方物に比べて、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超または９９．５％超を保持する。
【０１２２】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、保存時に、向上した凝集および安定性プロフィールを維持する。別の実施形態では、本発明の組成物は、不溶性凝集の発生率低減を示す。一つの実施形態では、本発明の組成物は、室温（約２０℃〜約２５℃）で長期間保存した際に、改善された凝集および安定性プロフィールを維持する。
【０１２３】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、低温（約１０℃未満、約２℃〜約８℃、例えば５℃）、最大約１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５年の長期間保存した際に、改善された安定性および／または凝集プロフィールを維持する。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明の組成物は、低温、例えば、０℃以下、例えば０℃〜−７０℃、例えば−１℃、−２℃、−３℃、−４℃、−５℃、−６℃、−７℃、−８℃、−９℃または−１０℃で、最大約１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５年の長期間保存した際に、改善された安定性および／または凝集プロフィールを維持する。
【０１２５】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、浸透促進剤をさらに含んでなる。多くの化学浸透促進剤が当技術分野で公知であり、本発明の組成物において使用可能である。これらには、限定されるものではないが、水、アルコール、好ましくは最大６個の炭素原子を有するアルコール、例えば、エタノール、グリコール、例えば、アルコールジエチレングリコール（トランスクトール(Transcutol)（商標））、アルキル−Ｎ，Ｎ−二置換アミノアセテート、例えば、ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノアセテート、エステル、例えば、酢酸エチル、アゾン（商標）および誘導体、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、テルペンおよびテルペノイド、例えば、ｄ−リモネン、脂肪酸、例えば、オレイン酸、尿素および誘導体、例えば、１，３−ジフェニル−尿素、ピロリドン、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、カルボン酸ピロリドン、例えば、２−ピロリドン−５−カルボン酸、シクロデキストリン、例えば、β−シクロデキストリン、スルホキシド、例えば、ジメチルスルホキシドが含まれる。他の皮膚浸透促進剤も当業者に知られている。一つの実施形態では、皮膚浸透促進剤は、トランスクトール（商標）、ミリスチン酸イソプロピルまたはアゾンのうち１以上から選択される。
【０１２６】
よって、一つの実施形態では、本発明は、トランスクトール（商標）をさらに含んでなる上記のような組成物に関する。実施例に示されるように、トランスクトール（商標）を含んでなる組成物は浸透の向上および良好な安定性の保持を示したことが実証された。トランスクトール（商標）の濃度は、約１〜６０％、例えば約４０％であり得る。
【０１２７】
一つの実施形態では、本発明は、１０％を超える、例えば、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％またはそれを超えるプロピレングリコール濃度を有する上記のような組成物に関する。実施例に示されるように、より高い濃度のプロピレングリコールを含んでなる組成物は浸透の向上および良好な安定性の保持を示したことが実証された。
【０１２８】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、局所投与用の組成物の粘度を高めるためにゲル化剤を含んでなる。これは、カルボマー、ポロキサマーまたはセルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択することができる。ゲル化剤の濃度は、０．５％〜２０％であり得る。一つの実施形態では、ゲル化剤はポロキサマーである。ポロキサマーの濃度は、例えば、０．５％〜２０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％から選択される。
【０１２９】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、浸透促進剤およびゲル化剤、例えば、トランスクトール（商標）およびポロキサマーを含んでなる。
【０１３０】
さらなる実施形態では、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨドメインを含んでなる、有効量の単一ドメイン抗体、ここで、前記ＶＨドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、
ｂ）約１００ｍＭのトリス／グリシン、
ｃ）約１２５ｍＭのＬアルギニン／グルタミン酸、
ｄ）約１０％のソルビトール、および
ｅ）約１４％のプロピレングリコール
に関し、前記組成物のｐＨは７．５〜８．５、例えば８である。
【０１３１】
さらなる実施形態では、本発明は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨドメインを含んでなる、有効量の単一ドメイン抗体、ここで、前記ＶＨドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、
ｂ）約１００ｍＭのトリス／グリシン、
ｃ）約１２５ｍＭのＬアルギニン／グルタミン酸、
ｄ）約１０％のソルビトール、
ｅ）約６％のプロピレングリコール、および
ｆ）約２０％のトランスクトール（商標）
に関し、前記組成物のｐＨは７．５〜８．５、例えば８である。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、保存剤を含んでなり得る。保存剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルトニウム(benzalthonium chloride)、フェノキシエタノールおよびメチルパラベンから選択することができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、組成物は、酸化防止剤を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、酸化防止剤は、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼ、および白金を含んでなる群から選択される。
【０１３４】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、以下の賦形剤：アゾン、Ｂ−シクロデキストリン、ベンジルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ＰＥＧ１００ステアレート、ヘキシレングリコール、ヒスチジン、ヒドロキシプロピルセルロース、ミリスチン酸イソプロピル、液体パラフィン（軽油）、中鎖トリグリセリド（カプテックス(captex)３００）、サリチル酸メチル、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、ポロキサマー、例えば、ポロキサマー−４０７、ポリビニルアルコール、ソルビン酸カリウム、プロリン、没食子酸プロピル、ピロリジノンカルボン酸、モノオレイン酸ソルビタン（スパン(Span)８０）、ステアリン酸ソルビタン（スパン６０）、ステアレス−２０、ステアリン酸、テフォース(Tefose)６３、トランスクトール（商標）、トリアセチン、ステアレス−２０、ステアレス−２、ジメチルスルホキシド、オクチルドデカノール、カプテックス３００、ポリソルベート８０、スパン８０、プロリン、軽油またはアルラセル(Arlacel)１６５のうち１以上を含んでなる。
【０１３５】
本発明の組成物において使用可能な他の意図される賦形剤としては、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、帯電防止剤、リン脂質または脂肪酸などの脂質、コレステロールなどのステロイド、ゼラチン、カゼイン、ナトリウムなどの塩形成対イオンなどが含まれる。これらの、またさらなる既知の製薬賦形剤、例えば、本発明の処方物における使用に好適な生理学的に許容可能な担体および／または添加剤は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされる"The Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4版, Rowe et al.編, American Pharmaceuticals Association (2003)；および引用することにより本明細書の一部とされるRemington: the Science and Practice ofPharmacy, 21st edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)に挙げられているように当技術分野で公知である。用語「生理学的に許容可能な担体」は、被処置宿主に重大な有害な影響を与えず、かつ、それが一緒に投与される化合物の治療特性を保持する担体を指す。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、表３に示されるような１以上のさらなる賦形剤を含んでなる。よって、賦形剤は、トランスクトール（商標）、ステアレス−２０、ステアレス−２、オクチルデカノールまたはミリスチン酸イソプロピルのうち１以上から選択される。
【０１３７】
一つの実施形態では、上記のような本発明の組成物は、皮膚、歯肉または眼の表面への局所投与用に処方される。よって、組成物は、液体、ゲル、懸濁液、軟膏、クリーム、またはローションなどの形態である。
【０１３８】
別の実施形態では、上記のような本発明の組成物は、凍結または噴霧乾燥させる。一つの実施形態では、凍結または噴霧乾燥組成物は、上記に示される成分を含んでなるが、プロピレングリコールおよび／またはソルビトールを欠く。
【０１３９】
上記で説明されるように、本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の少なくとも１種類の単一ドメイン抗体と１０〜１５０ｍＭのトリス／グリシンとを含んでなる凍結または噴霧乾燥組成物を提供し、前記組成物のｐＨは約５〜約９である。本発明の組成物の一つの実施形態では、トリス／グリシンの濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭである。本発明の組成物の一つの実施形態では、トリス／グリシンの濃度は、約５０〜約１５０ｍＭ、例えば５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭである。一つの実施形態では、この濃度は、約９０〜１１０ｍＭである。一つの実施形態では、この濃度は約１００ｍＭである。一つの実施形態では、組成物は５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸をさらに含んでなり、前記組成物のｐＨは約５〜約９である。本発明の組成物の一つの実施形態では、Ｌ−アルギニン／グルタミン酸の濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭである。本発明の組成物の一つの実施形態では、Ｌ−アルギニン／グルタミン酸の濃度は、約５０〜約１５０ｍＭ、例えば約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭである。一つの実施形態では、この濃度は約９０〜１１０ｍＭである。一つの実施形態では、この濃度は約１２５ｍＭである。
【０１４０】
本発明の凍結または噴霧乾燥組成物の一つの実施形態では、組成物は、
ａ）ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨドメインを含んでなる、有効量の単一ドメイン抗体、ここで、前記ＶＨドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、
ｂ）約１００ｍＭのトリス／グリシン、および
ｃ）約１２５ｍＭのＬアルギニン／グルタミン酸
を含んでなり、前記組成物のｐＨは、７．５〜８．５、例えば８である。
【０１４１】
凍結または噴霧乾燥組成物では、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、本明細書の他所に記載される通りである。例えば、ＩＬ−１７Ａ結合分子は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができるＶＨドメインを含んでなる少なくとも１種類の単一ドメイン抗体を含んでなる。別の実施形態では、前記ＶＨドメインは、配列番号４のＣＤＲ３を含んでなる。別の実施形態では、前記ＶＨドメインは、配列番号１またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％または７５％の相同性を有する配列を含んでなる。別の実施形態では、前記ＶＨドメインは、表１から選択され、配列番号５〜７３または配列番号７４のいずれかで定義されるＶＨドメインを含んでなる。
【０１４２】
本発明の凍結または噴霧乾燥組成物は、１以上の許容可能な賦形剤／再構成剤を用いて再構成される。例えば、プロピレングリコールなどの浸透促進剤が含まれてよい。
【０１４３】
よって、別の側面において、本発明は、上記のような組成物を含んでなり、かつ、プロピレングリコールを、例えば、４〜３０％、例えば４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％の濃度でさらに含んでなる再構成された凍結または噴霧乾燥組成物に関する。一つの実施形態では、この濃度は、約５〜１５％、１０％〜１５％、１５％〜２０％または２０％〜２５％である。一つの実施形態では、この濃度は約６％または１４％である。
【０１４４】
一つの実施形態では、凍結または噴霧乾燥組成物は、局所投与のために再構成される。一つの実施形態では、再構成賦形剤は、Ｌ−アルギニン／グルタミン酸、ソルビトールおよび／またはプロピレングリコールのうち１以上から選択される。
【０１４５】
一つの実施形態では、再構成賦形剤は、５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、例えば５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、５〜１５％のソルビトール、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のソルビトールおよび／または４〜３０％のプロピレングリコール、例えば４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％のプロピレングリコールを含んでなる。
【０１４６】
好ましくは、前記組成物のｐＨは、５〜９、例えば７．５〜８．５、例えば８である。
【０１４７】
別の側面において、本発明は、上記のような凍結または噴霧乾燥組成物を準備することと、許容可能な賦形剤／再構成剤、例えば、プロピレングリコールなどの浸透促進剤を添加することを含んでなる、局所投与用の再構成処方物を作製するための方法に関する。プロピレングリコールは、４〜３０％、例えば４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％の濃度で添加してよい。一つの実施形態では、この濃度は、約５〜１５％、１０％〜１５％、１５％〜２０％または２０％〜２５％である。一つの実施形態では、この濃度は約６％または１４％である。
【０１４８】
一つの実施形態では、本発明の凍結または噴霧乾燥組成物は、室温（約２０℃〜約２５℃）で長期間または低温度（約１０℃未満、約２℃〜約８℃、例えば５℃）で最大約１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５年保存した場合に、改善された安定性および凝集プロフィールを維持する。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明の凍結または噴霧乾燥組成物は、最大約１週間、最大約２週間、最大約３週間、最大約１か月、最大約２か月、最大約３か月、または最大約６か月などの期間、約０℃〜約８℃、例えば約５℃の温度で保存した場合に、改善された安定性および／または凝集プロフィールを維持する。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明の凍結または噴霧乾燥組成物は、低温度、例えば０℃以下、例えば０℃〜−７０℃、例えば−１℃、−２℃、−３℃、−４℃、−５℃、−６℃、−７℃、−８℃、−９℃または−１０℃で、最大約１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５年の長期間保存した場合に、改善された安定性および／または凝集プロフィールを維持する。
【０１５１】
好ましい実施形態では、本発明の凍結または噴霧乾燥組成物は、例えば、最大約１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５年の長期間、約２０℃〜約２５℃、例えば２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃で保存した場合に、改善された安定性および／または凝集プロフィールを維持する。
【０１５２】
本発明はさらに、対象に本発明の組成物を投与することを含んでなる、疾患の予防および／または治療のための方法に関する。
【０１５３】
治療目的で、用語「対象」は、いずれの対象も含み、好ましくは、標的とする病態、例えば、自己免疫疾患の治療を必要とする対象である。予防目的で、対象は、いずれの対象であってもよく、好ましくは、標的とする病態、例えば、自己免疫疾患を発症するリスクがあるか、または発症する素因のある対象である。用語「対象」は、生物、例えば、原核生物および真核生物を含むものとする。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。本発明の特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１５４】
より詳しくは、本発明は、本明細書に列挙される疾患および障害からなる非限定群から選択される疾患の予防および／または治療のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に薬学上有効な量の本発明の結合分子または医薬組成物を投与することを含んでなる。本発明に従って治療可能な免疫関連疾患の例は、当業者には本明細書の開示に基づいて自明であり、例えば、自己免疫疾患、炎症病態、アレルギーおよびアレルギー性病態、過敏反応、重度感染、および器官または組織移植拒絶を含む。
【０１５５】
本発明はまた、疾患の治療において使用するための本発明の組成物に関する。別の側面において、本発明は、本明細書に列挙される疾患および障害からなる非限定群から選択される疾患の治療において使用するための本発明の組成物に関する。
【０１５６】
別の側面において、本発明は、本明細書に列挙される疾患および障害からなる非限定群から選択される疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症病態、アレルギーおよびアレルギー性病態、過敏反応、重度感染、および器官または組織移植拒絶の治療のための薬剤の製造における本発明の組成物の使用に関する。
【０１５７】
上記の種々の側面によれば、疾患は以下の非限定一覧から選択されてよい：乾癬、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症性ミオパチー、シェーグレン症候群、全身性血管炎、類肉腫症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害またはギランバレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害）、肝胆道疾患（例えば、感染性、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎）、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸症、およびウィップル病、自己免疫性または免疫介在性皮膚疾患（水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む）、アレルギー性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症およびじんま疹）、肺の免疫疾患（好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎など）、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血および特発性血小板減少症）、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症候群を含む）、移植関連疾患（移植片拒絶および移植片対宿主病を含む）。
【０１５８】
本発明の組成物はまた、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫、および気道の他の閉塞性または炎症性疾患の治療、予防、または改善のためにも有用である。
【０１５９】
好ましい実施形態では、疾患は皮膚疾患である。一つの実施形態では、疾患は、乾癬、脊椎関節症、ブドウ膜炎、歯肉炎、アトピー性皮膚炎および喘息から選択される。
【０１６０】
本発明の組成物は、ＩＬ−１７により媒介される、またはＩＬ−１７産生もしくはＩＬ−１７によるＴＮＦ放出の促進を含む望ましくない急性および超急性炎症反応、例えば、急性感染、例えば、敗血性ショック（例えば、内毒素ショックおよび成人性呼吸窮迫症候群）、髄膜炎、肺炎；および重度の火傷の治療；ならびに病的なＴＮＦ放出に関連する、感染、癌、もしくは臓器機能不全の結果として起こる悪液質または消耗症候群、特に、例えばＨＩＶ感染に関連する、もしくはＨＩＶ感染の結果として起こるＡＩＤＳ関連悪液質の治療に有用である。
【０１６１】
本発明の組成物は、骨関節炎、骨粗鬆症およびその他の炎症性関節炎を含む骨代謝の疾患、ならびに一般に、加齢性骨量減少を含む骨量減少、特に、歯周病の治療に特に有用である。
【０１６２】
本発明の組成物は、例えば、上述の疾患の治療または予防のために、単独の有効成分として、または１以上の他の薬物、例えば、免疫抑制もしくは免疫調節薬またはその他の抗炎症薬と組み合わせて投与してよい。例えば、本発明の結合分子は、免疫抑制モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６もしくはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；その他の免疫調節化合物、例えば、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に連結されたＣＴＬＡ４もしくはその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部、例えば、ＣＴＬＡ４もしくはその突然変異体の少なくとも細胞外部分を有する組換え結合分子、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ６８６２９と呼称）もしくはその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−Ｉアンタゴニスト、ＩＣＡＭ−Ｉもしくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または化学療法薬、例えば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ薬、例えば、ＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩもしくはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体構築物、例えば、エタネルセプト（商標）、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症性サイトカインの遮断薬、ＩＬ−Ｉ遮断薬、例えば、アナキンラまたはＩＬ−Ｉトラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６遮断薬；ケモカイン遮断薬、例えば、プロテアーゼ、例えばメタロプロテアーゼの阻害剤または活性剤、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＣＤ２０抗体、アスピリンなどのＮＳＡＩＤ、または抗感染薬と組み合わせて使用してよい。この一覧は記述された薬剤に限定されない。
【０１６３】
本発明の組成物は、他の薬物と同時にまたは異なる時点で、例えば、同時、別々に、または逐次に投与してよい。
【０１６４】
本発明による組成物は、特に局所送達用である。よって、これらの組成物は、好ましくは、クリーム、ローション、スプレー、粉末、蒸気、溶液、ゲル、軟膏、ペースト、懸濁液、エマルション、またはフォームなどの形態である。
【０１６５】
これらの組成物はまた、硬膏、パッチ剤、生体接着剤または包帯として適用してもよい。よって、本発明はまた、本発明の処方物を含んでなる硬膏、パッチ剤、生体接着剤または包帯に関する。
【０１６６】
一つの実施形態では、局所送達は、吸入による肺へのものである。よって、本発明の組成物はまた、蒸気として、特に、噴霧乾燥または凍結乾燥組成物の場合には直接的に粉末として投与される。
【０１６７】
これらの組成物は、いずれの皮膚科的に許容可能な担体を用いて処方してもよい。例示的担体としては、アルミナ、クレイ、微晶質セルロース、シリカ、もしくはタルクなどの固体担体；および／または水、アルコール、グリコール、もしくは水−アルコール／グリコールブレンドなどの液体担体が含まれる。これらの治療薬はまた、治療薬が皮膚に入ることを可能とするリポソーム処方物中で投与してもよい。
【０１６８】
特定の実施形態では、治療を必要とする領域に局所的に組成物を投与することが望ましいものであり得る。
【０１６９】
よって、本発明の総ての側面の好ましい実施形態では、本発明の組成物の投与は、健康なまたは罹患した皮膚への局所投与による。結合分子は、少なくとも皮膚の外層に浸透することができ、従って、皮膚にまたは経皮的に送達することができる。よって、本発明の種々の側面の一つの実施形態では、本発明の組成物または結合分子の皮膚への局所送達は、非全身性の局所的な暴露のための皮膚への直接送達である。別の実施形態では、本発明の組成物または結合分子の皮膚への局所送達は、皮膚の全層を経た浸透の後に全身性暴露を提供するための皮膚への直接送達である。
【０１７０】
処置される皮膚は罹患した皮膚でもまたは健康な皮膚でもよい。好ましい実施形態では、皮膚疾患は、乾癬またはアトピー性皮膚炎である。
【０１７１】
好ましくは、それが適用される表面積は、体表面積の１％〜３０％、例えば、１％〜１０％または１〜２０％である。従って、投与は、体表面積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２７％、２６％、２８％、２９％または３０％に対するものであり得る。一つの実施形態では、病態は軽度である。別の実施形態では、病態は中等度である。別の実施形態では、病態は重度である。乾癬の治療に関しては、投与は、侵された領域、一般に、肘、膝、掌、頭皮、足の裏、生殖器、大腿上部、鼠径部、臀部、顔面および胴から選択される１以上の領域に対する。アトピー性皮膚炎の治療に関しては、投与は、侵された領域、一般に、顔面、前腕および手首から選択される１以上の領域に対する。
【０１７２】
特定の障害または病態の治療において有効／活性な本発明の結合分子の量は、その障害または病態の性質によって決まり、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な用量範囲を特定する助けとするために、場合によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用することができる。組成物中に使用される厳密な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重篤度によっても決まり、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
【０１７３】
本発明の組成物は、好適な用量が得られるような有効量の本発明の結合分子を含んでなる。これらの化合物の正確な用量は、特定の処方物、適用様式、およびその特定の部位、宿主および処置される疾患に応じて異なる。齢、体重、性、食餌、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬物の組合せ、反応感受性および疾患の重篤度のような他の因子も考慮されるべきである。
【０１７４】
一つの実施形態によれば、用量は、約１μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１１ｍｇ／ｋｇ（その用量が投与される哺乳動物の質量）である有効分子の量を含有する。いくつかの実施形態では、その用量は、約２０μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの有効分子を含有する。
【０１７５】
投与計画は、医師が達成しようとする薬物動態減衰のパターンによって決まり得る。例えば、いくつかの実施形態では、週に１〜４回の投与が企図される。少ない投与頻度でも使用可能である。いくつかの実施形態では、その用量は、１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１５週間毎、２０週間毎、２５週間毎、またはそれより長い期間毎に１回投与される。いくつかの実施形態では、用量は、１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、またはそれより長い期間毎に１回投与される。この療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投与計画は経時的に変えることができる。
【０１７６】
医学的処置のために本発明の組成物中で使用されるＩＬ１７結合分子は、本明細書の他所に記載される通りである。例えば、ＩＬ１７結合分子は、本明細書に記載されるような配列番号２、３および４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでなるＶＨ単一ドメイン抗体から選択することができる。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、表１から選択される。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列、例えば、配列番号７４を含んでなる。
【０１７７】
別の側面において、本発明は、上記の疾患の治療のために有用な本発明の組成物を含んでなるキットまたは製品を提供する。このキットは、対象とする組成物を含む、例えば局所投与用に好適な形態の容器と場合により使用説明書とを含んでなり得る。一つの側面において、本発明は、本発明の組成物を含んでなる容器、例えば、ネブライザーまたは吸入器を提供する。一つの実施形態では、この組成物は、本発明の凍結または噴霧乾燥組成物である。容器またはキットの組成物中で使用されるＩＬ１７結合分子は、本明細書の他所に記載されるような本発明の組成物である。例えば、ＩＬ１７結合分子は、本明細書に記載されるような配列番号２、３および４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでなるＶＨ単一ドメイン抗体から選択することができる。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は表１から選択される。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列、例えば、配列番号７４を含んでなる。
【０１７８】
別の側面において、本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる有効量の単一ドメイン抗体、例えば、前記ＶＨドメインが配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる単一ドメイン抗体を含んでなる処方物を調製する際の、
ａ）５０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン、
ｂ）５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、
ｃ）５〜１５％のソルビトール、および
ｄ）４〜３０％のプロピレングリコール
を含んでなるバッファーの使用に関し、
前記組成物のｐＨは、約５〜９、例えば７．５〜８．５である。
【０１７９】
一つの実施形態では、バッファーは、
ａ）約１００ｍＭのトリス／グリシン、
ｂ）約１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、
ｃ）約１０％のソルビトール、および
ｄ）約６％のプロピレングリコール
を含んでなり、
前記組成物のｐＨは、７．５〜８．５、例えば約８である。
【０１８０】
組成物中に使用されるＩＬ１７結合分子は、本明細書の他所に記載される通りである。例えば、ＩＬ１７結合分子は、本明細書に記載されるような配列番号２、３および４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでなるＶＨ単一ドメイン抗体から選択することができる。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は表１から選択される。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列、例えば、配列番号７４を含んでなる。
【０１８１】
別の側面において、本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａと結合することができる、有効量の単一ドメイン抗体を、
ａ）５０〜１５０ｍＭのトリス／グリシン、
ｂ）５０〜１５０ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、
ｃ）５〜１５％のソルビトール、および
ｄ）４〜３０％のプロピレングリコール
を含んでなるバッファーに添加することを含んでなる、障害の治療のための処方物を調製するための方法に関する。
【０１８２】
組成物中で使用されるＩＬ１７結合分子は、本明細書の他所に記載される通りである。例えば、ＩＬ１７結合分子は、本明細書に記載されるような配列番号２、３および４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでなるＶＨ単一ドメイン抗体から選択することができる。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は表１から選択される。一つの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列、例えば、配列番号７４を含んでなる。
【０１８３】
別の側面において、本発明は、実施例および／または添付の図面で示されるような組成物を提供する。
【０１８４】
本明細書でそうではないことが定義されない限り、本開示に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を持つものとする。以上の開示は、本発明を作製および使用する方法ならびにその最良の実施態様を含む、本発明の範囲内に包含される主題の全般的説明を提供するが、以下の実施例は、当業者に本発明を実施することをさらに可能とさせるため、およびその完全な明細書記載を提供するために示される。しかしながら、当業者は、これらの実施例の明細が本発明の限定として読まれるべきでなく、その範囲は特許請求の範囲および本開示に付属するそれらの等価物から理解されるべきであることを認識するであろう。本発明の種々のさらなる側面および実施形態は、本開示に照らして当業者に自明である。
【０１８５】
遺伝子受託番号の参照を含め、本明細書に記載される総ての文献は、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１８６】
「および／または」は、本明細書で使用する場合、他を伴うまたは伴わない２つの明示された特徴または成分のそれぞれの具体的開示として理解されるべきである。例えば、「Ａ  および／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂおよび（ｉｉｉ）ＡとＢのそれぞれが本明細書に個々に示されているかのような、それぞれの具体的開示として理解されるべきである。文脈がそうではないことを示さない限り、上記に示された特徴の記載および定義は、本発明のいずれの特定の側面または実施形態にも限定されず、記載されている総ての側面および実施形態に等しく当てはまる。
【０１８７】
本発明を限定されない例でさらに説明する。
【実施例】
【０１８８】
実施例１  ＶＨドメインの作出
１．１  Ｔｇ／ＴＫＯマウスの構築
内因性の重鎖および軽鎖抗体発現がサイレンシングされたバックグラウンド内の生殖細胞系構成に重鎖抗体トランスジェニック遺伝子座を有するマウス（トリプルノックアウトまたはＴＫＯ）を従前に記載されるように作出した（ＷＯ２００４／０７６６１８およびＷＯ２００３／０００７３７、Ren et  al. Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003およびＷＯ２０１６／０６２９９０）。簡単に述べれば、トランスジェニックマウスは、受精したばかりの卵母細胞に、過多のヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子を、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサーおよび調節領域を欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて含んでなる酵母人工染色体（ＹＡＣ）で前核マイクロインジェクションを行った後に誘導された。トランスジェニック創始マウスを、内因性の免疫グロブリン発現を欠く動物と戻し交配して、記載される免疫誘導試験で使用されるＴｇ／ＴＫＯ系統を作出した。
【０１８９】
１．２．  免疫誘導のための抗原
免疫誘導では組換え精製タンパク質を使用した。組換えヒトＩＬ−１７Ａは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＦ−２００−１７）から購入した。
【０１９０】
１．３．  免疫誘導プロトコール
本場合では、組換えタンパク質をＴｇ／ＴＫＯに投与した。簡単に述べれば、８〜１２週齢のマウスそれぞれにフロイントの完全アジュバントに乳化させて皮下送達する合計１０ｕｇの組換えタンパク質を施した後、フロイントの不完全アジュバントに乳化させて、この場合にも皮下投与され、初期プライミング後様々な期間で与えられる、１〜１０ｕｇの組換えタンパク質で追加免疫を行った。最終用量の抗原は、アジュバントの不在下、リン酸緩衝生理食塩水中で腹膜内に投与した。別の免疫誘導経路および手法も使用することができる。例えば、フロイントのアジュバントの代わりに違ったアジュバントまたは免疫増強法を使用してもよい。ＤＮＡ免疫誘導は多くの場合、筋肉内送達されるか、または遺伝子銃による。トランスフェクトされた細胞またはこのような細胞由来の膜調製物が、他を排するものではないが、多くの場合、腹膜内に投与される。
【０１９１】
１．４．  血清ＥＬＩＳＡ
免疫誘導中および誘導後に、血清をマウスから採取し、免疫原に対する重鎖抗体応答の存在をＥＬＩＳＡにより確認した。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号４４３４０４）を５０μｌ／ウェルの５μｇ組換え抗原／ＰＢＳ溶液ｍｌで、４℃にて一晩コーティングした。抗原溶液をデカントした後、０．０５％ツイーン（商標）２０（ｓｉｇｍａ  Ｐ１３７９）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ錠、Ｏｘｏｉｄカタログ番号ＢＲ００１４Ｇから調製）を用いてプレートを洗浄した後、ツイーン（商標）を添加しないＰＢＳで洗浄した。非特異的タンパク質相互作用を遮断するために、ＰＢＳ中３％脱脂乳粉末（Ｍａｒｖｅｌ）の溶液をウェルに加え、プレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。３％脱脂乳粉末／ＰＢＳ中血清の希釈液をポリプロピレンチューブまたはプレート内で調製し、室温で少なくとも１時間インキュベートした後、遮断されたＥＬＩＳＡプレートに移し、そこでさらに少なくとも１時間のインキュベーションを行った。次に、結合していないタンパク質を、ＰＢＳ／ツイーン（商標）、次いでＰＢＳでの反復洗浄を用いて洗い流した。その後、ＰＢＳ／３％μ中に調製したビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγサブクラス１特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  １１５−０６５−２０５）の溶液を各ウェルに加え、さらに室温で少なくとも１時間のインキュベーションを行った。結合していない検出抗体を、ＰＢＳ／ツイーン（商標）およびＰＢＳを用いて反復洗浄することにより除去した。次に、３％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中、ニュートラビジン−ＨＲＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  ３１０３０）をＥＬＩＳＡプレートに加え、少なくとも３０分間結合させた。さらに洗浄した後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）を用いてＥＬＩＳＡを現像し、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号３２０５０１）の添加により１０分後に反応を停止させた。吸光度は、４５０ｎｍで読み取ることによって決定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの別のアッセイもまた、免疫誘導重鎖抗体応答に関して確認するために使用可能である。
【０１９２】
１．５．  免疫マウスからのライブラリーの作製
ａ．  組織の処理、ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ作製
各免疫動物から脾臓、鼠径リンパ節および上腕リンパ節をＲＮＡｌａｔｅｒに採取した。各動物について、脾臓の１／３および４つのリンパ節を別個に処理した。まず、これらの組織をホモジナイズし、組織をライシングマトリックスＤビーズチューブ（ＭＰ  Ｂｉｏカタログ番号１１６９１３１００）に移した後に、β−メルカプトエタノールを含有する６００μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（商標）キット  カタログ番号７４１０４）を加え、その後、ＭＰ  Ｂｉｏ  Ｆａｓｔｐｒｅｐホモジナイザー（カタログ番号１１６００４５００）にて６ｍ／ｓの４０秒サイクルを用いてホモジナイズした。ホモジナイズ組織を含有するチューブを氷に移し、１０ｇで５分の微小遠心分離により残渣をペレットとした。４００μｌの上清を取り出し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【０１９３】
まず、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（商標）キット  カタログ番号７４１０４を製造者のプロトコールに従って用いてＲＮＡを抽出した。次に、各ＲＮＡサンプルを、スーパースクリプトＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲハイフィデリティキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５７４−０３５）を用いてｃＤＮＡを作製するために使用した。各脾臓およびＬＮ  ＲＮＡサンプルについて、５回のＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、それぞれ存在する各ＶＨファミリーに対するプライマーと組み合わせてＶＨ＿Ｊ／Ｆ（ロング）プライマーを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、以下のチューブ反応成分に基づきマスターミックスを調製した。
１２．５μｌの２倍反応混合物
０．５μｌのフォワードプライマー（１０ｕＭ）
０．５μｌのリバースプライマー（１０ｕＭ）
０．５μｌの酵素混合物
５００ｎｇ〜１μｇ  ＲＮＡ
水で２５μｌとする。
【０１９４】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにて以下の条件を用いて行った。
５０℃２０分
９４℃２分
９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃３０秒の３５サイクル
６８℃５分
４℃で保持。
【０１９５】
３７０ｂｐの範囲の産物をゲル電気泳動により確認した。
各マウスについて、所与の系統に関して１／３脾臓および４つのリンパ節のそれぞれから増幅したＶＨ産物を、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＪｅｔ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号Ｋ０７０２）（製造者の説明書に従って使用し、産物は５０μｌの水中に溶出させた）を用いる精製のためにプールした。
【０１９６】
ｂ．  ファージミドベクターへのクローニング
ファージミドベクターｐＵＣＧ３をこれらの試験において使用した。示されているように、ＶＨは、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを用いた制限酵素消化、連結および形質転換を含む従来の方法を用いてｐＵＣＧ３にクローニング可能である。あるいは、ＰＣＲに基づく方法を用いて、ＶＨファージミドライブラリーを構築してもよい。これらの手法の両方を、増幅されたＶＨ配列からライブラリーを作製するために使用した。前者の方法は当技術分野で広く使用されている。ＧＣバッファーを含むＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（カタログ番号Ｆ５３２Ｌ、ＮＥＢ）を、以下の試薬を含んでなるＰＣＲ反応に使用した。
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＧＣ  ２倍混合物  ２５μｌ
ｐＵＣＧ３                        ５〜１０ｎｇ
プライマー（１０ｕＭ）            各１．２５μｌ
ＤＭＳＯ                          １．５μｌ
ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏ              最終容量５０μｌまで
【０１９７】
使用したサイクリング条件は以下であった。
９８℃３０秒
９８℃１０秒、５８℃２０秒、６８℃２分３０秒の１０サイクル
９８℃１０秒、５８℃２０秒、６８℃３分の２０サイクル
６８℃５分
４℃で保持。
【０１９８】
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＪｅｔゲル精製キット（カタログ番号Ｋ０６９１）を製造者の説明書に従って用いてＰＣＲ産物（３１５２ｂｐ）をゲル精製し、最終的に４０μｌの溶出バッファー中に溶出させた。精製されたＶＨ  ＲＴ−ＰＣＲ産物をメガプライマーとして、線状化したｐＵＣＧ３とともに使用して、以下の反応に基づく形質転換およびライブラリー作出のためのファージミド産物を得た。
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＧＣ  ２倍混合物  ２５μｌ
線状化ｐＵＣＧ３                  ７００ｎｇ
ＶＨＰＣＲ産物                    ２５０ｎｇ
ＤＭＳＯ                          １．５μｌ
ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏ            最終容量５０μｌまで。
【０１９９】
ＰＣＲは次のように行った。
【化４】
2019524719.tif 000013
【０２００】
ＰＣＲの産物を１％アガロースゲルで分析した。
【０２０１】
種々の系統のＶＨ／ファージミド産物を、ＰＣＲ精製キット（カタログ番号Ｋ０７０２）としてのＦｅｒｍｅｎｔを製造者の説明書に従って用いて精製し、最終溶出は２５μｌ  Ｈ２Ｏ中であり、ＢｉｏＲａｄ（商標）１０×１ｍｍキュベット（ＢｉｏＲａｄ（商標）カタログ番号１６５−２０８９、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）Ｅｐｏｒａｔｏｒおよび予温回収媒体（Ｌｕｃｉｇｅｎ、特許混合物）を用いたエレクトロポレーションによるＴＧ１大腸菌(E. coli)（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ：６０５０２−２）の形質転換に使用した。２μｌの精製産物をエレクトロポレーションのために２５ｕｌの細胞に加え、各ＶＨ／ファージミド産物について１８００ｖで最大１０回のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを受けた細胞をプールし、５０ｍｌのファルコンチューブに回収し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換体のアリコートの１０倍希釈系を作製し、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを添加した２倍ＴＹ寒天を含むペトリディッシュに播種した。これらのディッシュ上に生じたコロニーを、ライブラリーサイズを評価するために使用した。残りの形質転換体を、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを添加した２倍ＴＹ寒天を含む大規模形式のバイオアッセイディッシュに播種した。全寒天プレートを３０℃で一晩インキュベートした。１０ｍｌの２倍ＴＹ培養液を大規模形式のバイオアッセイディッシュに加え、コロニーをすりつけ、ＯＤ６００を測定した（ＯＤ１．０＝５×１０８細胞／ｍｌ）。アリコートを、５０％ｖ／ｖグリセロール溶液（５０％）を添加した後にクライオバイアルにて−８０℃で保存するか、またはそのままファージ選択プロセスに使用した。
【０２０２】
場合によっては、クローンを直接採取し、ライブラリーの多様性の評価を得るために配列を決定した。一般に、各マウスについて、そのマウスのＶＨ多様性を完全に捕捉するために、１ｅ８を超える組換えを有するファージディスプレーライブラリーを構築した。次に、ナイーブＶＨライブラリーを構築した。ライブラリーファージストックの作製およびファージディスプレー選択は、公開されている方法(Antibody Engineering, Edited by Benny Lo, chapter 8, p161-176, 2004)に従って行った。
【０２０３】
種々の選択からのＶＨを、中和特性を有する特定のＶＨを同定するために、結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングした。また、精製されたものと未精製の原形質周辺抽出物の両方のＶＨを、ＩＬ−１７Ａと組換えＩＬ−１７ＲＡ−Ｆｃの相互作用を阻害するそれらの能力に関して試験した。
【０２０４】
細胞株ＨＴ１０８０（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１１５０５）からのＩＬ−１７Ａにより誘導されるＩＬ６放出を阻害するＩＬ−１７Ａ結合ＶＨの能力を測定するためのアッセイを開発した。細胞株を、非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したアール(Earles)の塩を含むＭＥＭ中で対数増殖に維持し、加湿インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。アッセイのために、５０，０００細胞／ウェルを９６平底組織培養プレートに播種し、一晩培養した。精製ＶＨの連続希釈液を調製し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１７Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＦ２００−１７）を添加した培養培地／ＰＢＳとともに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＶＨ／ＩＬ−１７Ａ混合物（または好適な対照）をＨＴ１０８０細胞（培養培地を吸引した）に移し、ＣＯ２インキュベーター内でさらに５時間インキュベートした。細胞培養上清を回収し、ＩＬ−６  Ｄｕｏｓｅｔ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２０６）を製造者の説明書に従って用いてＩＬ６に関してアッセイした。抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨ抗体の結合動態をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置にて測定した。上記のスクリーニングカスケードの後、阻害特性を示した、ＩＬ−１７Ａと結合するＶＨドメインを特定した。このＶＨドメインを最適化して配列番号１で示されるＶＨドメインを得た。最適化は、免疫応答の際に標的とされる体細胞超突然変異ホットスポットを同定するためにリードＶＨを同じ系譜の他のメンバーとアラインすることによって行った。最適化されたＶＨは、ＩＬ−１７細胞系アッセイにおいてより緩慢な解離速度のために、ＩＬ−１７に対して改善された親和性と改善された効力を示す。本明細書に開示されるようなＶＨドメインを、上記のようにＥＬＩＳＡにより結合特異性を確立するために特性評価した。配列番号１で示されるものを含めいくつかのＶＨドメインは、ヒトＩＬ−１７Ａに対して良好な結合特性を有することが示された。同定されたＶＨは、ＩＬ−１７ＣおよびＩＬ−１７Ｆなどの近縁種と交差反応しないことが示された。配列番号１をコードする核酸を以下に示す。
【０２０５】
【化５】
2019524719.tif 000014
【０２０６】
実施例２  原薬賦形剤スクリーニング
２．１．  原薬バッファー処方物の作製：組成物の種々の部分の濃度およびｐＨ
最適な原薬バッファー賦形剤および最適ｐＨを特定するために、ＶＨ１．１（配列番号７４）を用いた初期適合性スクリーニングを行った。ＶＨ１．１の最適ｐＨ範囲は、ｐＨ７．５〜８．５、好ましくは８．０として特定された。次に、このｐＨで種々の濃度のいくつかの異なるバッファー種に処方したＶＨ１．１を検討するために、スクリーニング試験とその後の実験計画法（ＤＯＥ）を使用した。
【０２０７】
処方物スクリーニング試験をまず、加速条件（高温）下で行った。分析は、外観、ＵＶ分析（濃度および光散乱）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＮＲ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ＲＰ  ＨＰＬＣ、ＡＩＥＸおよび結合ＥＬＩＳＡを用いて行った。ＶＨ１．１を、広いｐＨ範囲にわたってバッファーを評価するために初期加速安定性試験で試験した。次に、これらをまた、単一濃度の５種類の賦形剤を用いる場合および用いない場合で試験した。より高いｐＨ（約ｐＨ８．０）のバッファーが、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＡＩＥＸ−ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡによって測定した場合にＣＢ００１の安定性を改善したことが認められた。このスクリーンで試験した賦形剤のうち、プロピレングリコールは、生成物の安定性を高めることも示された。安定性は試験を２〜８℃で１か月に延長することによって確認され、この場合、分解は見られなかった。
【０２０８】
次に、さらに加速スクリーニング安定性試験を、最適ｐＨ前後の別のバッファーで、さらなる供試賦形剤を用いて、また用いずに行った。バッファー単独サンプルのうち、トリス／グリシンおよびリン酸塩／クエン酸塩は、供試した他のバッファーよりも安定性を改善することが示された。１００ｍＭ濃度もまた、より高い安定性を与えることが示された。この試験から、これら２つのバッファー系をＤｏＥ試験でさらに試験した。これにより、種々のレベルの、４つの異なる賦形剤（プロピレングリコール、Ｌ−アルギニン／Ｌ−グルタミン酸、ポロキサマーおよびソルビトール）のうち１つを含むバッファーを評価した。次に、トリス−グリシンを、それがリン酸塩／クエン酸塩系よりも一貫してより安定なモノマーレベルを示したことから最終バッファー系として選択した。ＤｏＥ分析から、以下の処方物が最も安定であると予測された：１００ｍＭのトリス／グリシン、１２５ｍＭのＡｒｇ／ｇｌｕ、１０％のソルビトール、１５％のプロピレングリコールｐＨ８．０。次に、これをさらに、ＤｏＥ分析後に安定であると予測された３つの他の組合せに対して、６週間加速安定性試験で試験した。種々の処方物を加速安定性試験で試験し、ＳＥ−ＵＰＬＣ、ＵＶ  Ａ２８０ｎｍおよび外観によって調べた。統計モデリングの後、４つの最適な原薬バッファー（ＤＳＢ）処方物（表２ａに示される通り、２ｂも参照）が選択された。
【０２０９】
本明細書で使用する場合、用語原薬バッファーは、有効なＩＬ−１７結合分子を含まない不活性バッファーを指す。本明細書で使用する場合、用語原薬（ＤＳ）は、ヒトＩＬ１７Ａに結合する有効分子と原薬バッファーとを含んでなる処方物を指す。
【０２１０】
【表２】
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【０２１１】
処方物１は、以下に示されるように処方した。
【０２１２】
【表３】
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【０２１３】
表２に示されるような４種類の組合せを６週間加速安定性試験で試験し、ＳＥ−ＵＰＬＣ、ＡＩＥＸ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＵＶ  Ａ２８０ｎｍ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡを用いて分析した。試験データは、１００ｍＭのトリス／グリシン、１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、６％のプロピレングリコール、１０％のソルビトール、ｐＨ８．０を含んでなる処方物は安定であり、低い凝集を示したことを実証した。図１参照。
【０２１４】
２．２．  ＤＳに関するより長期の安定性スクリーニング
ＶＨ１．１の大規模バッチを１００ｍＭのトリス／グリシン、１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、６％のプロピレングリコール、１０％のソルビトール、ｐＨ８．０（ＤＳ）中に４０ｍｇ／ｍＬで製造し、複数の温度で長期安定性を調べた。サンプルをｐＨ、ＵＶ  Ａ２８０ｎｍ、ＳＥ−ＵＰＬＣ、ＲＰ−ＵＰＬＣ、ＡＩＥＸ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、内毒素およびバイオバーデンに関して分析した。３か月にわたる２〜８℃での保存時にＤＳの良好な安定性を示すデータ例を図２および図３に示す。
【０２１５】
原薬バッファー中４０ｍｇ／ｍＬのＶＨ１．１は、モル浸透圧濃度を用いて凝固点降下により測定した場合、２，３８６ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を示し、これは生理学的レベルよりも高い。血液／血清の通常のモル浸透圧濃度は、約３００〜３１０ｍＯｓｍ／Ｌである。
【０２１６】
実施例３  局所投与用処方物のさらなる開発
３．１  適合性試験
賦形剤／処方成分を、局所用処方物とともに使用するための有効分子との適合性に関して、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて評価される加速安定性試験で試験した。処方物をさらに安定性試験および有効性試験でも試験した。表３および表４参照。
【０２１７】
【表４】
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【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
【表６】
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【０２２０】
原薬バッファーは１００ｍＭのトリス／グリシン、１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、６％のプロピレングリコール、１０％のソルビトール、ｐＨ８．０であり、原薬は原薬バッファー中４０ｍｇ／ｍＬ  ＶＨ１．１である。これらを、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いた加速安定性試験、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ皮膚構築物を用いた有効性および浸透効率により評価した（第２．２節も参照）。
【０２２１】
これらの試験は、処方物１〜６が総てｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性および浸透性を示し、処方物１、２および３がより優れた浸透性を示し、１と３が最高の安定性であることを実証した。
【０２２２】
３．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性：ＭａｔＴｅｋモデル（ＤＳおよび他の処方物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性）
ＭａｔＴｅｋの３Ｄ乾癬組織モデル（Ａｙｅｈｕｎｉｅ、２０１２）に基づくモデルを使用した。乾癬組織モデルを、正常ヒト表皮ケラチノサイトおよび乾癬線維芽細胞を用いて培養した。再構築された乾癬組織は、基本細胞増殖の増加、乾癬関連バイオマーカーの発現、およびサイトカイン放出の上昇により証明されるような乾癬の表現型を採る(MatTek Corporation, 2016)。ＩＬ−１７Ａの付加によって修正されたＭａｔＴｅｋの３Ｄ乾癬組織モデルを、試験バッファーおよび原薬バッファー中でのＶＨ１．１の有効性試験のために使用した。
【０２２３】
このモデルへのＩＬ−１７Ａの付加（培養培地を介する）は、遺伝子発現により証明されるように乾癬表現型（有意な上方調節（＞２倍）遺伝子発現がＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ５、ＨＢＤ−２、ＩＬ−８およびプソリアシンで示された）ならびにサイトカイン／ケモカイン放出（サイトカイン／ケモカイン生産の有意な増加がＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ６、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αで示された）をさらに上方調節したことが実証された。次に、この上方調節モデルを用いて、このモデルでのＶＨ１．１の有効性に関して試験した。
【０２２４】
組織を予備バッファー（５０ｍＭトリシン）ｐＨ８．０中、局所的または全身的のいずれかで（すなわち、培養培地へのまたは組織構築物の頂端側表面への添加による基底側への送達）ＶＨ１．１に曝した。組織を４日間処理し、４８時間および９６時間で評価した。遺伝子分析のために、標準的なＲＮＡ単離プロトコールを用いてＲＮＡを単離した。６つの乾癬および皮膚関連遺伝子の発現レベルを決定するために定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。加えて、ケモカイン／サイトカインレベルを、市販のキットを用いて評価した。これは、これらの乾癬マーカーが総て有意に低減され得、従って、このモデルにおいてＶＨ１．１の有効性を示すことを実証した（図４および図５）。
【０２２５】
ＣＣＬ２０は、それが明確な用量依存的効果を示し、臨床的に関連のあるバイオマーカーであることから、局所用処方物のさらなる試験で使用するために選択された。次に、この試験を、ＶＨ１．１が局所的に加えられた場合（上記のように原薬として）に効果を有するために必要とされる用量をさらに評価するために拡張した。
【０２２６】
ＶＨ１．１を４日間毎日添加した後、表６に詳細に示されるように２４時間後に培地交換を行った。培地は分析まで−８０℃で保存した。
【０２２７】
【表７】
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【０２２８】
その後、次の試験は、ＣＣＬ２０は、試験バッファー（５０ｍＭトリシン）ｐＨ８．０中、ＶＨ１．１の低用量の局所添加によってさえ阻害されたことを示し（図８）、この試験計画を７つの医薬品（ＤＰ）処方物を比較するために使用した（図９）。
【０２２９】
ＶＨ１．１は、表２〜４に従って処方した。次に、組織構築物の浸透を、図６に記載されるようなＦＲＥＴアッセイ、またはストレプトアビジンコーティングビーズを用いて捕捉させたビオチン化２型抗イディオタイプＦａｂ（ＩＬ−１７Ａを伴ってまたは伴わずにＶＨ１．１と結合する）を用いるＧｙｒｏｓアッセイのいずれかを用いて測定した。その後、検出は図７のように蛍光団標識ウサギ抗ＶＨ１．１ｐＡｂを用いる。
【０２３０】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）複合体は、ウサギポリクローナル抗ＶＨ抗体へのビオチン化ＩＬ−１７ＶＨの結合から形成される。この相互作用の検出は、ドナー蛍光団としてストレプトアビジンユウロピウムクリプテートを、そしてＦＲＥＴ複合体中のアクセプター蛍光団としてヤギ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７を用いて行う。ひと度、複合体が形成されれば、ドナー蛍光団の励起がアクセプター蛍光団へのＦＲＥＴをもたらす（それらが近接するため）。その後、時間分解アクセプター蛍光発光を測定する。
【０２３１】
このアッセイは、競合形式で非ビオチン化ＩＬ−１７ＶＨを検出するために使用できる。ＩＬ−１７ＶＨは、ウサギポリクローナル抗ＶＨ抗体との結合をめぐってビオチン化ＩＬ−１７ＶＨと競合し、アクセプター蛍光団からの蛍光発光の低下をもたらす。競合の程度は、ＩＬ−１７ＶＨの濃度に依存する。試験サンプル中に存在するＶＨの量は、既知濃度の精製ＩＬ−１７ＶＨの存在下での発光シグナルの標準曲線を用いて定量される。この競合的アッセイ形式のために、定量の直線範囲が限定されるならば、このようなサンプルはこの範囲内に入ることを保証するために複数の希釈率で試験される。
【０２３２】
処方物１〜６は総て良好な皮膚浸透を示し、処方物１〜３は最高レベルの皮膚浸透を示した（図１０）。
【０２３３】
実施例４．  さらなる医薬品の開発
トランスクトール（商標）（処方物２からの浸透促進剤）；プロピレングリコール（処方物３からの浸透促進剤）を用いてさらなる開発を行った。
【０２３４】
ＤＯＥで使用された実用範囲を決定するために、初期加速安定性試験（ＳＥ−ＵＰＬＣでアッセイされた通り）を、原薬バッファー中、種々の濃度のこれらの賦形剤およびＶＨ１．１を用いて行った。加えて、薄いゲルを作製するために必要とされたポロキサマー４０７の範囲を決定した。ここで、原薬バッファーは１００ｍＭのトリス／グリシン、１２５ｍＭのＬ−アルギニン／グルタミン酸、６％のプロピレングリコール、１０％のソルビトール、ｐＨ８．０であり、成分は相応に調整した。ＰＧを加えた場合、表７に示されるような値は、ＤＳＢ中にその量をすでに含むように最終濃度の調整を行った。
【０２３５】
この後、ＶＨ濃度の異なる２つの処方物（それぞれ２０ｍｇ／ｍＬおよび３０ｍｇ／ｍＬ）と原薬（それぞれ２０、３０および４０ｍｇ／ｍＬ）（表７）を、ＳＥ−ＵＰＬＣおよびＡＩＥＸ−ＨＰＬＣにより測定されるような長期安定性を調べるために選択した。
【０２３６】
【表８】
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【０２３７】
総ての処方物は５℃で（図１１）、またより低い温度で（図１２および図１３）安定であった。結果はまた、高いＰＧ濃度が安定性においていくつかの付加的な利益を与えることを示した。
【０２３８】
噴霧乾燥処方物および凍結乾燥処方物
長期保存が可能で、その後、使用の時点で再構成可能なバルク原薬を生産するために処方物中ＶＨ１．１を噴霧乾燥または凍結乾燥させる。再構成は、再構成溶液中での、有益な特性、例えば、浸透または粘度の増大を有するさらなる賦形剤の使用を可能とする。例えば、特に高温下での限定された安定性のために長期保存にあまり適切でない賦形剤は、再構成溶液に含めることができる。
【０２３９】
一例では、上記のような原薬を噴霧乾燥または凍結乾燥させる。あるいは、有効分子を、ＰＧおよび／またはソルビトールを含まないこと以外は原薬バッファーに相当するバッファー中に処方し、噴霧乾燥または凍結乾燥させる。ＰＧおよび／またはソルビトールは、噴霧乾燥または凍結乾燥処方物を再構成するための再構成溶液中で使用することができる。図１４は、１か月の時間経過における、ＰＧを含まないＤＳＢ中のＶＨ１．１の安定性試験の結果を示す。これは−７０℃で１か月間、処方物の良好な安定性を示す。
【０２４０】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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