(57)【要約】クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)血清型Ｏ１を特異的に認識し、ＬＰＳエンドトキシン活性を中和することができるモノクローナル抗体であって、特異的なＣＤＲ配列、またはＶＨおよびＶＬ配列を特徴とする抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)血清型Ｏ１を特異的に認識し、ＬＰＳエンドトキシン活性を中和することができるモノクローナル抗体であって、
該抗体が、
ａ）表１ａもしくは表１ｂに挙げるいずれか１つの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列を含む抗体；または
ｂ）図２ｂに示すいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体；または
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のうちいずれか１つである親抗体の機能活性バリアントである抗体であって、該機能活性バリアントはクレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１を特異的に認識し、ＬＰＳエンドトキシン活性を中和することができ、いずれかのＣＤＲ中に少なくとも１つの点変異を含み、ここで、点変異の数はそれぞれのＣＤＲ配列において０、１、２、もしくは３つの点変異のいずれかであり、それぞれのＣＤＲ配列における配列同一性は親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列と比較して少なくとも６０％である；
のいずれかから選択される、上記抗体。
【請求項２】
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ９からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １０からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １１からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １５からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １７からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １２からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １３からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １４からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １８からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １９からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２０からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体；
である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２２からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２３からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２７からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２８からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２９からなるＣＤＲ６；
ならびに
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２６からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３０からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３１からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３２からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＩＭＧＴのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体；
である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７からなるＶＬ；
ならびに
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ８からなるＶＬ；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体；
である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
二価結合についてのバイオレイヤー干渉法により測定して、エピトープを１０−８Ｍ未満のＫＤで結合する高親和性抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
Ｄ−ガラクタン−ＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae）株のエンドトキシンを中和する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
全長モノクローナル抗体、その抗体フラグメント、または融合タンパク質のいずれか１つであり、それぞれが少なくとも、Ｄ−ガラクタン−ＩＩエピトープを認識する結合部位を含むＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト由来のもの、またはその親和性成熟バリアントであって特に抗体が人工アミノ酸配列を含む非天然抗体であり、特に抗体がそのＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧアイソタイプスイッチバリアントのいずれかである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae）の感染または定着のリスクがあるかまたはそれに罹患している対象を処置して、該対象における感染を制限し、または該感染から生じる病状を改善するのに使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
対象がクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae）により引き起こされるエンドトキセミアに罹患している、請求項９の記載による使用のための抗体。
【請求項１１】
非経口配合物において請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体、および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質構築体を発現するコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗体の発現カセットまたはプラスミドを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体を製造する方法であって、該抗体を産生する条件下で請求項１４に記載の宿主細胞を培養または維持する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎杆菌）(Klebsiella pneumoniae)血清型Ｏ１のガラクタン−ＩＩ（Ｄ−ガラクタン−ＩＩ、Ｄ−ｇａｌ  ＩＩ、ｇａｌ−ＩＩ）をターゲッティングする、遊離リポ多糖（ＬＰＳ）のエンドトキシン活性の中和性を示す高親和性抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレブシエラ・ニューモニエは、著しい罹患率および死亡率を生じる尿路感染症、肺炎、および敗血症に関与する院内日和見病原体である。感受性患者はしばしば免疫機能障害をもち、この片利共生(commensal)腸内細菌により引き起こされる侵襲性感染症に対処できない。
【０００３】
よりいっそう警戒すべきことは、多剤耐性（ＭＤＲ）株が最近出現して世界的に拡散し、それに対する療法選択肢が限られていることである。モノクローナル抗体は新規療法となる可能性がある。それにもかかわらず、大部分の表面抗原を遮蔽している嵩高い莢膜多糖のため、クレブシエラ・ニューモニエの表面にあるアクセス可能な分子ターゲットは著しく限られている。他方、容易にアクセスできる莢膜多糖は高い構造変動、したがって抗原性変動を示し、そのためそれは広域抗細菌アプローチにとって魅力のないものになっている。
【０００４】
他の主要な非タンパク質系の表面抗原は、莢膜抗原より少ない変動性を示すＬＰＳである。クレブシエラ・ニューモニエにはＬＰＳ  Ｏ−側鎖の構造に基づいて識別された１０未満のＯ−血清グループがある。最も一般的な血清型はＯ１であり、それはすべてのクレブシエラ・ニューモニエのうち１／３より多くが発現するとレポートされた(1;3)。クレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１において、Ｄ−ガラクタンＩＩはＯ１抗原を規定するエピトープを提供し、Ｄ−ｇａｌ  ＩＩ反復単位構造を特徴とする：［−３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−］。
【０００５】
クレブシエラ・ニューモニエＯ１抗原の詳細な生化学的構造が以前に２つの独立したグループによって記載された(4;5)。クレブシエラ・ニューモニエＯ１抗原に対するポリクローナルおよびネズミモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体は、前記のようにTrautmannのグループによって作製され、特性分析された(1-3)。彼らの実験データに基づいて、抗−Ｏ１  ｍＡｂの療法使用が示唆された。そのような抗体は、オプソニン食作用殺菌(opsonophagocytotic killing)（ＯＰＫ）(1)を誘発し、クレブシエラ感染症のネズミモデルに保護を与えることが示された(2)。オプソニン作用の可能性に基づいて、ガラクタン−ＩＩに対するｍＡｂの使用が推定抗細菌戦略として暗示された(2,3)。しかし、Lepper et al. (FEMS Immunology and Medical Microbiology 2003, 35: 93-98)は、主にＬＰＳ側鎖エピトープを指向する天然のＯ−抗原特異的抗体は食作用殺菌に有意には寄与しないと思われると記載している。
【０００６】
クレブシエラ感染症に対して感受性である患者集団は一般に免疫無防備状態であるので、受動免疫化が最も有益であろうと思われる者においてこの作用様式に障害のある可能性がある。したがって、他の作用様式、たとえば直接的な補体仲介による殺細菌活性またはＬＰＳ分子のエンドトキシン活性の中和が望ましいであろうが、まだ記載されていない。
【０００７】
Ｏ１抗原の詳細な構造解析およびこの構造体に対するモノクローナル抗体についての先行技術がある。結合の親和性は判定されずに、先行技術の抗体はそれのオプソニン機能について選択され、すなわち有効性は感染宿主の食作用機能（食作用殺菌）に依存すると思われる。しかし、日和見病原体としてのクレブシエラ・ニューモニエは、食作用活性が著しく損なわれている可能性のある免疫無防備状態および免疫不全状態の個体に感染する傾向がある。
【０００８】
免疫無防備状態および免疫不全状態の患者は正常な免疫応答を発達させることができない。免疫不全は原発性（遺伝子欠損が免疫細胞の発生または機能に影響を及ぼす場合）または続発性（本質的には正常な免疫系をもつホストに要因が影響を及ぼして後天性免疫不全をもたらす場合）の可能性があり、それらは抗体、リンパ球、食細胞、補体系の障害、またはこれらの要因の組合わせから生じる可能性がある。
【０００９】
クレブシエラ・ニューモニエは一般に院内環境でのアウトブレイクの原因となるので、同じ臨床病棟にいて医療設備を共有している患者またはクレブシエラ・ニューモニエ感染患者の担当職員は感染するリスクが高い。
【００１０】
ＭＤＲ耐性であり、汎耐性クレブシエラ・ニューモニエ株すら出現しつつあるので、この病原体に対する新規薬物について高いメディカルニーズがある。さらに、侵襲性クレブシエラ・ニューモニエ感染症の死亡率は高く、適切な抗生物質療法がある場合ですらエンドトキシン活性を中和することを目標としてクレブシエラ・ニューモニエのターゲットを認識する抗体を含めた代替療法選択肢が必要になる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Held TK, Jendrike NR, Rukavina T, Podschun R, Trautmann M. 2000. Binding to and opsonophagocytic activity of O-antigen-specific monoclonal antibodies against encapsulated and nonencapsulated Klebsiella pneumoniae serotype O1 strains. Infect.Immun. 68:2402-2409
【非特許文献２】Trautmann M, Ruhnke M, Rukavina T, Held TK, Cross AS, Marre R, Whitfield C. 1997. O-antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolates and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Clin.Diagn.Lab Immunol. 4:550-555
【非特許文献３】Whitfield C, Richards JC, Perry MB, Clarke BR, MacLean LL. 1991. Expression of two structurally distinct D-galactan O antigens in the lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae serotype O1. J.Bacteriol. 173:1420-1431
【非特許文献４】Kol O, Wieruszeski JM, Strecker G, Fournet B, Zalisz R, Smets P. 1992. Structure of the O-specific polysaccharide chain of Klebsiella pneumoniae O1K2 (NCTC 5055) lipopolysaccharide. A complementary elucidation. Carbohydr.Res. 236:339-344
【非特許文献５】Rukavina T, Ticac B, Susa M, Jendrike N, Jonjic S, Lucin P, Marre R, Doric M, Trautmann M. 1997. Protective effect of antilipopolysaccharide monoclonal antibody in experimental Klebsiella infection. Infect.Immun. 65:1754-1760
【非特許文献６】Lepper et al. (FEMS Immunology and Medical Microbiology 2003, 35: 93-98)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、クレブシエラ・ニューモニエ感染症の予防または治療に使用するための、病原体をターゲティングする改良された適合性を備えた、クレブシエラ・ニューモニエを指向する抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この目的は本発明の対象によって解決される。
本発明によれば、
クレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１を特異的に認識し、ＬＰＳエンドトキシン活性を中和することができるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が提供され、抗体は
ａ）表１ａもしくは表１ｂに挙げるいずれか１つの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列；または
ｂ）図２ｂに示すいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列；
のいずれか１つを含み、あるいは
ｃ）ａ）またはｂ）の配列を特徴とする親抗体の機能活性バリアントである；
その機能活性バリアントは親抗体と同じエピトープを結合するかまたは親抗体と競合する特異性を有し、親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６（親ＣＤＲ配列）のうちいずれか１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含み、その機能活性バリアントは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異を含み、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００１４】
特に、本発明の抗体はクレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１を特異的に認識し、ＬＰＳエンドトキシン活性を中和することができるモノクローナル抗体であり、その抗体は下記のいずれかから選択される：
ａ）表１ａもしくは表１ｂに挙げるいずれか１つの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列を含む抗体；または
ｂ）図２ｂに示すいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体；または
ｃ）ａ）もしくはｂ）の抗体のうちいずれか１つである親抗体の機能活性バリアントである抗体；その機能活性バリアントはクレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１を特異的に認識し、ＬＰＳエンドトキシン活性を中和することができ、いずれかのＣＤＲ中に少なくとも１つの点変異を含み、その点変異の数はそれぞれのＣＤＲ配列において０、１、２、もしくは３つの点変異のいずれかであり、それぞれの親ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する。
【００１５】
特に、それぞれのＣＤＲ配列における配列同一性が親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列と比較して少なくとも６０％である、機能活性バリアントが提供される。
特に、本明細書に記載する抗体は殊にクレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１のＬＰＳ側鎖を特異的に認識する。
【００１６】
特に、本明細書に記載する抗体はクレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１のＬＰＳ側鎖内にあるＤ−ガラクタン−ＩＩ抗原（“Ｏ１抗原”）、より具体的にはｇａｌ−ＩＩエピトープを特異的に認識する。そのような抗体はクレブシエラ・ニューモニエ以外の（細菌）細胞が発現する同じエピトープまたは抗原をも認識することができる。
【００１７】
特に、抗体は図１に挙げるいずれかの抗体の抗原結合部位を特徴とする抗体、殊に下記の抗体である：
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ９からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １０からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １１からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １５からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １６からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １７からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １２からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １３からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １４からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １８からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  １９からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２０からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体。特に、機能活性バリアントは本明細書中にさらに記載する特色を特徴とする。
【００１８】
具体的には、本明細書に述べるＫａｂａｔによるＣＤＲ配列はＫａｂａｔ命名法に従って決定した抗体のアミノ酸配列であると解釈される(参照：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S.Department of Health and Human Services. (1991))。
【００１９】
特に、抗体は下記のものである：
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２２からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２３からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２７からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２８からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２９からなるＣＤＲ６；
ならびに
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２４からなるＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２５からなるＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ２６からなるＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３０からなるＣＤＲ３；
ｅ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３１からなるＣＤＲ５；および
ｆ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３２からなるＣＤＲ６；
これらにおいてＣＤＲ配列はＩＭＧＴのナンバリングシステムに従って表記されている；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体。特に、機能活性バリアントは本明細書中にさらに記載する特色を特徴とする。
【００２０】
具体的には、本明細書に述べるＩＭＧＴによるＣＤＲ配列はＩＭＧＴ方式に従って決定した抗体のアミノ酸配列であると解釈される(The international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212)。
【００２１】
特定の態様によれば、抗体は下記のものである：
Ａ）
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群から選択されるもの
ｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ５からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ７からなるＶＬ；
ならびに
ｉｉ）
下記のものを含む抗体
ａ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ６からなるＶＨ；および
ｂ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ８からなるＶＬ；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントである抗体。特に、機能活性バリアントは本明細書中にさらに記載する特色を特徴とする。
【００２２】
特に、本明細書に記載する抗体の機能活性バリアントは、そのような抗体の機能性バリアントである；たとえば、図１の表に例示した抗体と実質的に同じ結合特異性をもつ機能性バリアントであって、そこに提示される６つのＣＤＲ配列により形成される結合部位、および／またはＶＨおよびＶＬ抗体ドメインそれぞれ、たとえば図２に提示する配列を特徴とするＶＨおよびＶＬドメインの対合により形成される結合部位を含むもの。
【００２３】
バリアントを提供する目的で、そのような抗体を本明細書中で親抗体と呼び、ＣＤＲまたはフレームワーク（ＦＲ）配列を本明細書中で親ＣＤＲまたは親フレームワーク配列と呼ぶ。本明細書に記載するいずれかの抗体配列を“親”配列とみなし、それらをたとえば１以上の点変異により変異させることができるのは十分に理解されるであろう。
【００２４】
特定の側面によれば、機能性バリアント抗体は親抗体と同じエピトープを結合する。
さらなる特定の側面によれば、機能性バリアント抗体は親抗体と同じ結合部位を含む。
特に、抗体はバイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)で測定してエピトープを１０−８Ｍ未満、好ましくは５×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合する高親和性抗体である；二価結合（たとえば、全長ＩｇＧ抗体について）についてバイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)により、殊に実施例７に記載の方法を用い、ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ計測器およびｆｏｒｔｅＢＩＯ分析を利用して測定。そのような方法により、特に結合のアビディティー、すなわち本明細書中で“アビッド(avid)結合親和性”とも呼ぶものが測定される。
【００２５】
結合の高親和性は、各Ｆａｂフラグメントについての親和性を測定した場合に確認できる（一価結合）。
本明細書に記載する高い結合親和性は、特にアビッド結合親和性（二価結合剤について決定したもの）および／または親和性（アフィニティー）（一価結合剤について決定したもの）のいずれかに関するものである。
【００２６】
一般に、本明細書に記載するそのような抗体およびバリアント抗体は、Ｏ１抗原（特に、Ｄ−ガラクタン−ＩＩ抗原を保有するＯ１抗原）を１０−８Ｍ未満のＫＤ（たとえば、二価結合剤についてアビッド結合親和性を測定する場合）、および／または１０−６Ｍ未満のＫＤ（たとえば、一価結合剤について親和性を測定する場合）で結合し、Ｄ−ガラクタン−ＩＩエピトープに競合結合する高親和性抗体である。結合の競合は、好ましくは競合ＥＬＩＳＡ分析により、またはバイオレイヤー干渉(biolayer interferometry)（ＢＬＩ）分析により測定される。
【００２７】
特に、Ｏ１多糖抗原（Ｄ−ガラクタン−ＩＩエピトープを含む）をターゲティングするアビッド結合親和性は、たとえば本明細書に例示するｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ計測器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（たとえば、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＢＬＩにより測定される。特定の態様によれば、抗体はＯ１抗原に対して１０−８Ｍ未満、または５×１０−９Ｍ未満のＫＤのアビッド結合親和性をもつ。
【００２８】
本明細書に記載する親抗体の親和性成熟バリアント（たとえば、例示ｍＡｂを親ｍＡｂとして使用）は、標準的な変異形成法を用いて作製でき、より高い（アビッド）結合親和性を特徴とするｍＡｂ、たとえば１０−９Ｍ未満、または好ましくは１０−１０Ｍ未満、または好ましくは１０−１１Ｍ未満のＫＤをもつ、たとえばピコモル濃度範囲の親和性をもつｍＡｂを作製できる。親抗体の親和性成熟により作製されるバリアント、すなわち本明細書中で親和性成熟バリアントと呼ぶものは、親抗体と比較して少なくとも１  ｌｏｇ、または２  ｌｏｇ、または３  ｌｏｇのＫＤ差で増大した結合親和性をもつ可能性がある。親和性成熟バリアントは、一般に抗原を１０−９Ｍ未満のＫＤで結合する親和性をもつ。
【００２９】
特に、抗原を結合する特異性は、たとえばイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、フローサイトメトリー、ＢＬＩ）により、天然Ｏ１抗原、またはその抗原を発現する細菌、およびその抗体が有意には結合しない追加の対照抗原（単数または複数）を用いて測定される。
【００３０】
本明細書に記載する抗体は、特にさらにそれが他のいずれのクレブシエラ・ニューモニエ抗原とも交差反応しないこと、および／またはその抗体が他のいずれかのクレブシエラ・ニューモニエ抗原にはより低い親和性で結合することを特徴とし、たとえばその際、Ｏ１抗原を他のクレブシエラ・ニューモニエ抗原（Ｏ１抗原以外のもの）より優先的に結合するＫＤ差は少なくとも２  ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３  ｌｏｇである。
【００３１】
抗体、または例示抗体（親抗体）のいずれかの機能性バリアントであっていずれかの親抗体に競合して結合するものは、特に、競合ＥＬＩＳＡ分析またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定して、それのターゲットに対する相対的な結合阻害を特徴とし、その相対阻害は好ましくは３０％より大きい。
【００３２】
特に、例示抗体およびその機能性バリアントは、Ｏ１抗原、特にＤ−ガラクタン−ＩＩエピトープおよび構造体を特異的に結合する高い親和性を特徴とし、その結果、中和活性が得られ、有利には殺細菌性も得られる。
【００３３】
特に、その抗体はＤ−ガラクタン−ＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ株のエンドトキシンを中和する。驚くべきことに、そのような高親和性抗体は、クレブシエラ・ニューモニエＯ１から遊離したＬＰＳ分子のエンドトキシン活性を中和する効力を示すことが分かった。さらに、直接的な（食細胞−非依存性の）殺細菌活性、すなわちホストの細胞性免疫状態に依存しない活性が判定された。これらの新規作用様式に基づけば、本明細書に記載する抗体は、クレブシエラ・ニューモニエＯ１による侵襲性感染症の症例における追加(add-on)または独立(standalone)療法として、免疫無防備状態または免疫不全状態の患者集団を処置する際の医療に使用するのに特に適切である。
【００３４】
それらの抗体は、食作用機能が低下する免疫無防備状態になるリスクをもつ個体（たとえば、化学療法もしくは放射線療法の前の癌患者、免疫抑制療法を受けている患者、または慢性感染症を伴なう患者、たとえばＨＩＶ患者）、またはクレブシエラ・ニューモニエのアウトブレイクにさらされている臨床病棟にいる患者のための新規な予防措置を開発するのに特に適している。
【００３５】
特に、その抗体は対応する特異的ＬＰＳ分子を発現している細菌のエンドトキシン作用をインビボで中和する。それの機能はインビトロアッセイにより測定できる。その抗体は、エンドトキシン機能を中和することにより、Ｏ１タイプのクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効である；たとえばインビトロＬＡＬアッセイ、またはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）レポーターアッセイにより測定して、対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）と比較して少なくとも２０％のエンドトキシン活性低減。
【００３６】
その抗体は特に、致死的なエンドトキセミアを中和することができる。そのような機能活性は適切なインビボモデル（たとえば、参考文献６に記載されているエンドトキセミアのＧａｌＮモデル）において判定できる。特定の側面によれば、抗体はヒトおよび非ヒト動物の両方を含めた動物においてターゲット病原体を中和し、インビボで、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれのモデルにおいても発病を阻止する。
【００３７】
特に、中和力価は少なくとも、図１に定めたＣＤＲ配列を特徴とする、および／または図２に定めたＶＨおよびＶＬ配列を特徴とする、いずれかの例示抗体の力価であり、それらは機能性バリアントの中和力価を決定する際の基準抗体として用いられる。
【００３８】
特に、その抗体は殺細菌性、補体依存性細胞傷害性(complement dependent cytotoxicity)（ＣＤＣ）活性を特徴とする。特に、その抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体の構造を含み、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃを含む。特に、その抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体である。
【００３９】
本明細書中で用いる、抗体のＣＤＣは、ターゲット細胞に結合した抗体を１以上の補体タンパク質成分が認識し、続いてターゲット細胞の溶解を引き起こす反応である。
特に、その抗体は、循環中の抗原発現細菌を補体仲介によって直接殺菌するＣＤＣ活性を特徴とする；血清中において、たとえば標準ＣＤＣアッセイ、たとえばインビトロ血清殺細菌アッセイ(serum bactericidal assay)（ＳＢＡ）により測定して、対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）より少なくとも２０％多い殺細菌。
【００４０】
クレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１が血清殺菌に対して自然界では抵抗性であるにもかかわらず、本明細書に記載する抗体がＬＰＳを中和でき、かつＣＤＣ活性によって直接殺細菌できるのは驚くべきことであった。その殺細菌活性は、食細胞障害を伴なう患者または免疫無防備状態の患者を処置する際に特に関係がある。
【００４１】
そのほか、その抗体は、抗体仲介食作用によりｇａｌ−ＩＩ  Ｏ−タイプのクレブシエラ・ニューモニエに対して特に有効な可能性がある；たとえば、インビトロオプソニン食作用殺菌アッセイ（ＯＰＫ）により測定して、対照試料（抗体なし、または無関係な対照ｍＡｂを添加）より少なくとも２０％多い接種細菌取込み、または２０％低い最終ＣＦＵカウント。
【００４２】
機能活性バリアント抗体は、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかにおいて異なる可能性、あるいは共通のＶＨおよびＶＬ配列を共有し、各ＦＲに修飾を含む可能性がある。親抗体から変異形成により誘導されるバリアント抗体は、当技術分野で周知の方法により作製できる。
【００４３】
ある抗体の機能性バリアントは、たとえば抗体の親和性を改善するために、特にＣＤＲ変異抗体（少なくとも１つのＣＤＲバリアントを含む）を得るように工学操作することができる。特に、機能活性バリアントは機能活性ＣＤＲバリアントであり、それは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異をもち、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００４４】
具体的バリアントは、たとえば親抗体のヒトバリアントまたは人工バリアントであり、その際、親ＣＤＲ配列がヒトまたは人工のフレームワーク配列（たとえば非ヒト由来のもの、たとえば１以上の点変異を含むヒト  フレームワーク配列）に組み込まれ、その際、親抗体またはヒト化抗体の安定性、特異性および親和性を改善するために、場合により点変異の導入によって親ＣＤＲ配列それぞれの１、２、３、または４つのアミノ酸残基がさらに変異していてもよい。
【００４５】
特定の側面によれば、抗体は人工のＣＤＲおよびフレームワーク配列、たとえば非ヒト由来のものを含み、その際、人工の非天然配列が得られるように少なくとも１つのＣＤＲおよびフレームワーク配列が１以上の点変異を含む。
【００４６】
特定の側面によれば、抗体は全長抗体、その抗体フラグメント、または融合タンパク質のいずれかであり、それぞれ、少なくともＤ−ガラクタン−ＩＩエピトープを認識する結合部位を含むＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む。特に、抗体は全長ＩｇＧ１、二重特異性ＩｇＧ１、またはＦ（ａｂ’）２−フラグメントのいずれかである。
【００４７】
特に、抗体はヒト抗体、またはその誘導体であって人工配列もしくは動物配列（ヒト以外のもの）が組み込まれたものである；たとえば、ヒトＩｇＧ抗体、またはヒトＣＤＲ配列もしくはそのいずれかの機能性ＣＤＲバリアントおよび動物化（たとえばイヌ化）抗体を得るための動物（非ヒト）フレームワークを含む抗体。
【００４８】
特に、本明細書に記載する抗体は完全ヒト抗体である。
例に記載する抗体はヒト由来のもの、またはその親和性成熟バリアントであり、特に抗体は人工アミノ酸配列を含む非天然抗体である。人工配列（非天然）を含むバリアントは、変異形成により、または本明細書にさらに記載するように得ることができる。
【００４９】
特に、抗体はＩｇＡ、ＩｇＭ、またはそのＩｇＧアイソタイプスイッチバリアント(isotype switch variant)、たとえばＩｇＡからＩｇＧへのアイソタイプスイッチバリアント、もしくはＩｇＭからＩｇＧへのアイソタイプスイッチバリアントである。Ｆｃ部分はいかなる免疫グロブリンアイソタイプのものであってもよく、殊にＩｇＧ（たとえばＩｇＧ１）抗体のものである。
【００５０】
特定の側面によれば、本発明の抗体はＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、その際、フレームワーク配列にはヒト、人工または動物の配列が含まれる。特に抗体は１以上の定常ドメインを含み、それらはＩｇＧ抗体のもの、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプのもの、またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体のものである。
【００５１】
図２ｂに示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬそれぞれ（本明細書中で“親”ＶＨまたは“親ＶＬ”と呼ぶ）と比較してそれぞれのＦＲまたはＣＤＲ配列に修飾をもつバリアントＶＨまたはＶＬドメインであって、機能活性であり、たとえば親抗体と同じエピトープに結合し、あるいは同じ結合部位を含み、あるいは同じ結合特性をもつものを使用できる。本明細書に記載する抗体のＦＲまたはＣＤＲ配列のうちあるものを他の抗体のものと交換することもできる。
【００５２】
特に、下記のものを含むバリアントＶＨまたはバリアントＶＬを提供することができる：
ａ）親ＶＨもしくはＶＬの６つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）配列のセット、または本明細書にさらに記載するように特に少なくとも１つのＣＤＲ配列が親ＣＤＲの機能活性ＣＤＲバリアントである６つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）配列のセット；および
ｂ）親ＶＨまたはＶＬのＦＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を特徴とするＦＲ配列。
【００５３】
特に、抗体は図１に挙げるＣＤＲ配列のいずれかの機能活性ＣＤＲバリアントを含み、その機能活性ＣＤＲバリアントは下記のうち少なくとも１つを含む：
ａ）親ＣＤＲ配列における１、２、もしくは３つの点変異；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列中の４つのＣ−末端もしくは４つのＮ−末端もしくは４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１または２つの点変異；および／または
ｃ）ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列それぞれにおける、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％の配列同一性；
好ましくは、その際、機能活性ＣＤＲバリアントは４または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列中に１または２つの点変異を含む。
【００５４】
特に、機能活性バリアントは、好ましくはＣＤＲ中のアミノ酸配列における少なくとも１つの点変異において親抗体と異なり、その際、それぞれのＣＤＲアミノ酸配列における点変異の数は０、１、２または３のいずれかである。
【００５５】
特定の側面によれば、点変異は１以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失および／または挿入のいずれかである。
特定の側面によれば、クレブシエラ・ニューモニエの感染または定着のリスクがあるかまたはそれに罹患している対象を処置して、その対象における感染を制限し、またはその感染から生じる病状を改善するのに使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための、抗体が提供される。
【００５６】
さらなる特定の側面によれば、抗体はインビトロおよび／またはインビボで殺細菌であり、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含めた動物においてターゲット病原体を特異的に死滅させ、インビボで、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎、または髄膜炎のいずれかのモデルの発病を阻止する。
【００５７】
したがって、本発明はさらに、それぞれの適応症において有効量の抗体を投与することにより対象を処置する方法を提供する。
特に、対象はヒトである。特に、対象は健康なまたは疾患に罹患しているいずれかのヒトである。特に、そのヒトは免疫不全であり、殊に免疫無防備状態または免疫抑制状態の患者、またはそれに接触する者である。
【００５８】
特に、対象は食細胞の数および／または機能が損なわれていることを特徴とするホストグループの対象であり、そのホストグループは下記のいずれかである：
ａ）遺伝性または後天性の原発性または続発性免疫不全に罹患している患者；
ｂ）２８日齢未満の新生児、６５歳より高齢の患者、糖尿病、腎不全、肝硬変、トリソミー２１、外傷もしくはＨＩＶに罹患している患者、または外科的介入もしくはコルチコステロイドによる全身処置を受けた患者からなる群から選択される患者；あるいは
ｃ）特に緊急治療室または集中治療室の入院患者または病院関係者であって、クレブシエラ・ニューモニエ疾患に罹患している患者に曝露された際に感染を受けるリスクを伴なう者。
【００５９】
特に、抗体はクレブシエラ・ニューモニエ疾患の院内または医原性アウトブレイクを阻止するために用いられる。
特定の態様によれば、菌血症を予防するために予防有効量で、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ未満の抗体を投与する。
【００６０】
他の特定の態様によれば、菌血症を治療するために療法有効量で、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ未満の抗体を投与する。
特に、本発明に従って使用するための抗体が提供され、その際、その対象の生体試料をその抗体と接触させることにより対象におけるｇａｌ−ＩＩ  Ｏ−タイプのクレブシエラ・ニューモニエの全身的な感染または定着をエクスビボ判定し、その際、抗体の特異的な免疫反応により感染または定着が決定される。
【００６１】
特に、対象はクレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされるエンドトキセミアに罹患している。特定の側面によれば、たとえば種々の動物モデルにおいて判定して、本発明の抗体を用いる免疫療法は生細菌による攻撃に対して効果的に防御できる。本明細書に記載する抗体を特に、菌血症のマウスモデルにおいて防御を誘導する受動免疫化に用いた。
【００６２】
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を非経口（たとえば、ｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．）配合物中に含む、医薬製剤を提供する。
【００６３】
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体をコードする単離された核酸を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体の結合部位あるいはＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質構築体（たとえば、ポリペプチドもしくはタンパク質またはタンパク質誘導体を含むかまたはそれからなるもの）を発現するためのコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミドを提供する。
【００６４】
本発明はさらに、本明細書に記載する発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体を製造するための方法であって、その抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養または維持する方法を提供する。
【００６５】
特に好ましいのは、宿主細胞が下記のものを含む、宿主細胞およびそのような宿主細胞を用いる製造方法である：
−  抗体軽鎖を発現するためのコード配列が組み込まれた、本発明のプラスミドまたは発現カセット；および
−  抗体重鎖を発現するためのコード配列が組み込まれた、本発明のプラスミドまたは発現カセット。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１−１】図１：表１ａおよび１ｂ：  表１ａ：例示モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＤＲ配列；これらのＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表記されている；  表１ｂ：例示モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＤＲ配列；これらのＣＤＲ配列はＩＭＧＴのナンバリングシステムに従って表記されている；  本明細書中で用いる名称は下記の意味をもつ：ＶＨ  ＣＤＲ１  ＝  ＣＤＲ１ＶＨ  ＣＤＲ２  ＝  ＣＤＲ２ＶＨ  ＣＤＲ３  ＝  ＣＤＲ３ＶＬ  ＣＤＲ４  ＝  ＣＤＲ４  ＝  ＶＬ  ＣＤＲ１ＶＬ  ＣＤＲ５  ＝  ＣＤＲ５  ＝  ＶＬ  ＣＤＲ２ＶＬ  ＣＤＲ６  ＝  ＣＤＲ６  ＝  ＶＬ  ＣＤＲ３本明細書中でＫｃＰＢＯ１−１９６と表記する抗体はＭＰＧ−１９６とも呼ばれる。
【図１−２】同上。
【図２−１】図２：例示ｍＡｂのＶＨおよびＶＬ配列：ヌクレオチド配列（図２ａ）、およびアミノ酸配列（図２ｂ）。
【図２−２】同上。
【図３−１】図３：完全ヒト抗−クレブシエラ・ニューモニエＯ１  Ｏ−抗原抗体の同定；（ａ）ビオチニル化Ｏ１  Ｏ−抗原ベイト(bait)の模式的な線状化学構造；四角は反復単位を示す；ＣＰ＝共通部分；＊＝（４−１）αＨｅｐまたはＨ。（ｂ）シングル７−ＡＡＤ−、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、Ｏ１  Ｏ−抗原−反応性ヒト末梢血Ｂ細胞のフローサイトメトリー分析および単離（上）；非ビオチニル化Ｏ１  Ｏ−抗原を用いた対照染色と対比したもの。（ｃ）８個体の末梢血由来メモリーＢ細胞のＩＧＨＶ体細胞超変異(somatic hypermutation)の数；大きい中空丸および中空三角は、それぞれＫｃＰＢＯ１−１９６およびＫｅＰＢＯ１−０８４についての体細胞超変異の数を示す。ＥＬＩＳＡによるビオチニル化Ｏ抗原ベイトへのＫｃＰＢＯ１−１９６およびＫｅＰＢＯ１−０８４の濃度依存性結合（ｄ）、ならびにイムノブロットによる総Ｏ１  ＬＰＳへのＫｃＰＢＯ１−１９６およびＫｅＰＢＯ１−０８４の結合（ｅ）；ｍＧＯ５３＝陰性対照。（ｆ）（ｄ）に示したＥＬＩＳＡデータからの曲線下面積（ＡＵＣ）値；ビオチニル化Ｏ１  Ｏ−抗原およびストレプトアビジン（ＳＡ）に対するもの；線は同一抗体をつないでいる；ｂ，ｄ〜ｆ：少なくとも２つの独立した実験からの代表的データ；黒い実線は平均を示す；誤差バー＝標準偏差；破線＝陰性カットオフＯＤ。
【００６７】
図３：Ｉｇ遺伝子特徴（表）。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図４】図４：ｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６を用いたイムノブロット。Ｏ１、Ｏ２、およびＯ３株のパネルから精製した１μｇのＬＰＳを分離し、ＰＶＤＦ膜上へブロットした。分離およびブロットしたＬＰＳ試料へのＭＰＧ−１９６（本明細書中でＫｃＰＢＯ１−１９６とも呼ぶ）の結合を、ＨＲＰコンジュゲートした抗−ヒト  ＩｇＧ特異的二次抗体により検出した。
【図５】図５：クレブシエラ・ニューモニエＯ１株の表面染色。Ａ：種々の莢膜（Ｋ−）タイプを発現しているＯ１株のパネルについて、ｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６の表面結合をフローサイトメトリーにより試験した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗−ヒトｍＡｂについてＦＬ１に示した蛍光強度、およびＤＮＡ色素Ｓｙｔｏ６２についてＦＬ４に示した蛍光強度は、定量的な表面染色を表わす。Ｂ：ｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６および８Ｅ９（比較のために用いた低親和性Ｏ１−特異的ｍＡｂ）の表面染色を、３つの異なるＯ１：Ｋ２株について比較した。ヒストグラムは測定した蛍光強度を示す。
【図６】図６：クレブシエラ・ニューモニエ菌血症のマウスモデルにおける、Ｏ１特異的ｍＡｂによる防御。マウスをＭＰＧ−１９６もしくは８Ｅ９（Ｏ１−特異的ｍＡｂ）のいずれか、または無関係な対照ｍＡｂで腹腔内予防免疫化した。その後のＯ１：Ｋ２株（ＡＴＣＣ  ４３８１６）による致死的な静脈内攻撃（ＬＢ(溶原ブロス(lysogeny broth))中の対数増殖期中期培養物からの５×１０６ＣＦＵ）後に生存をモニターした。
【図７】図７：血清殺細菌アッセイ。クレブシエラ・ニューモニエＯ１株ＰＣＭ−３７（Ｐｏｌｉｓｈ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を、５０％枯渇ヒト血清試料中で種々の濃度の特異的または対照ｍＡｂの存在下に培養した。殺細菌活性を、インキュベーション期間（３時間）の開始時（Ｔ０）と対比して終了時に回収した細菌のパーセントとして表わす；両方の時点でアリコートを平板培養することにより測定したもの。
【図８】図８：インビトロでのエンドトキシン中和。ヒトＴＬＲ−４受容体複合体を発現している市販の細胞系を用いて、クレブシエラ・ニューモニエＯ１株から抽出した精製ＬＰＳによるエンドトキシンシグナル伝達をレポートする。種々の濃度のＯ１−特異的ｍＡｂまたはポリミキシンＢ（陽性対照）または無関係な対照ｍＡｂ（陰性対照）についてシグナル伝達の阻害を試験した。
【図９】図９：エンドトキセミアのネズミモデルにおけるＯ１  ｍＡｂの防御効果。指示したｍＡｂおよび用量でマウスを予防免疫化した。１日後にマウスをエンドトキシンに感作させ（ＧａｌＮ，ｉ．ｐ．，２０ｍｇ／マウス）、ＬＢ中において対数増殖期中期まで増殖させた２×１０３ＣＦＵのＯ１：Ｋ２株５２１４５で静脈内攻撃した。致死率を１４日間モニターした。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、抗体ドメイン（免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインであると解釈される）からなるかまたはそれらを含み、リンカー配列を含むかまたは含まない、ポリペプチドまたはタンパク質を表わすものとする。ポリペプチドは、抗体ドメイン構造体の少なくとも２つのベータ鎖がループ配列により連結したものからなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインであると解釈される。抗体ドメインは天然構造のものであってもよく、あるいはたとえば抗原結合特性または他のいずれかの特性、たとえば安定性または機能特性、たとえばＦｃ受容体であるＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために、変異形成または誘導体化により修飾されていてもよい。
【００６９】
本明細書中で用いる抗体は、１以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープを結合する特異的結合部位をもち、具体的には下記のものがそれに含まれる：単一の可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨの、ＣＤＲ結合部位；あるいは可変抗体ドメイン対、たとえばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対と定常抗体ドメインを含む抗体、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、または全長抗体の結合部位。
【００７０】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、特に、下記のものを含むかまたはそれらからなる抗体フォーマットを表わすものとする：単一の可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨ；あるいは可変および／または定常抗体ドメインの組合わせであって連結配列またはヒンジ領域を含むかまたは含まないもの：これには可変抗体ドメイン対、たとえばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対と定常抗体ドメインを含むかまたはそれらからなる抗体、たとえば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または全長抗体、たとえばＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ（たとえば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２サブクラス）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭアイソタイプ抗体が含まれる。用語“全長抗体”は、少なくとも天然抗体モノマーに一般的にみられるＦｃドメインおよび他のドメインの大部分を含むいずれかの抗体分子を表わすために使用できる。この句は本明細書中で特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられる。
【００７１】
用語“抗体”は、特に単離された形態の抗体を含むものとし、それらは他の抗体、すなわち異なるターゲット抗原を指向する抗体または異なる構造アレンジメントの抗体ドメインを含む抗体を実質的に含まない。ただし、単離された抗体は、単離された抗体と、たとえば少なくとも１種類の他の抗体、たとえば異なる特異性をもつモノクローナル抗体または抗体フラグメントとの組合わせを含有する組合わせ製剤に含まれていてもよい。
【００７２】
用語“抗体”は、ヒト種を含む動物、たとえばヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、リャマ、ウシおよびウマを含む哺乳類、または鳥類、たとえばニワトリに由来する抗体に適用されるものとし、この用語は特に、動物由来の配列、たとえばヒトの配列をベースとする組換え抗体を含むものとする。
【００７３】
用語“抗体”はさらに、異なる種に由来する配列、たとえばネズミおよびヒトに由来する配列を含む、キメラ抗体に適用される。
抗体に関して用いる用語“キメラ”は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列それぞれの一部が特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に対して相同であり、一方、その鎖の残りのセグメントは他の種またはクラスにおける対応する配列に対して相同である抗体を表わす。一般に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は哺乳動物のある種に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部は他の種に由来する抗体の配列と相同である。たとえば、非ヒト宿主生物由来の容易に入手できるＢ細胞またはハイブリドーマを用いて現在既知の供給源から可変領域を誘導し、たとえばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせることができる。
【００７４】
用語“抗体”は、さらにヒト化抗体に適用できる。
抗体に関して用いる用語“ヒト化”は、実質的に非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位をもち、その分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列をベースとする分子を表わす。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが可変ドメイン中の適宜なフレームワーク領域にグラフトしたもののいずれを含むこともできる。抗原結合部位は、野生型、またはたとえば１以上のアミノ酸置換により修飾されたもの、好ましくはヒト免疫グロブリンにいっそう近似するように修飾されたものであってもよい。ある形態のヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列を保存している（たとえば、マウス抗体由来の６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は元の抗体に対して変異した１以上のＣＤＲをもつ。
【００７５】
用語“抗体”はさらに、ヒト抗体に適用される。
抗体に関して用いる用語“ヒト”は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域をもつ抗体を含むと解釈される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異形成により、またはインビボでの体細胞変異により、導入された変異）を、たとえばＣＤＲ中に含むことができる。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体、あるいはヒトＢ細胞から免疫グロブリン遺伝子クローニングおよび組換え抗体発現によりまたは不死化したヒトヒトＢ細胞系から誘導された抗体が含まれる。
【００７６】
本明細書中で用いる用語“完全ヒト抗体”は、それぞれがヒト源、たとえばヒト抗体配列を発現する細胞、ヒト抗体配列を提示するライブラリー、またはヒト抗体配列をコードする遺伝子に由来するヒト部分、特にヒトＣＤＲ、ヒトＦＲ、およびヒト定常領域のみから構成されるヒト抗体を表わす。完全ヒト抗体は、天然抗体であってもよく、あるいはそれぞれ異なる起源から得られる部分で構成され、したがって自然界には存在しないと解釈される人工抗体であってもよい。代表的な人工の完全ヒト抗体はヒト抗体のヒトスイッチバリアントであり、その際、少なくとも１つの定常領域が異なるアイソタイプのヒト抗体から得られる。
【００７７】
用語“抗体”は、具体的にはいかなるクラスまたはサブクラスの抗体にも適用される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を主要クラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに配属することができ、これらのうち幾つかはさらにサブクラス、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類できる。
【００７８】
この用語はさらに、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、特に組換え抗体に適用され、この用語には、組換え手段により製造、発現、作製または単離されたすべての抗体および抗体構造体、たとえば動物、たとえばヒトを含めた哺乳類に由来する抗体であって、異なる由来の遺伝子または配列を含むもの、たとえばネズミ、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来の抗体が含まれる。さらなる例は、その抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングまたは融合することを伴なう他のいずれかの手段により製造、発現、作製または単離された抗体を表わす。
【００７９】
用語“抗体”は抗体の誘導体、特に機能活性誘導体をも表わすと解釈される。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメインもしくは抗体のいずれかの組合わせおよび／または融合タンパク質であると解釈され、それらにおいては抗体のいずれかのドメインを１以上の他のタンパク質、たとえば他の抗体のいずれかの位置に融合させることができる；たとえば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチドを含み、ただしリガンド、足場タンパク質、酵素、トキシンなどをも含む、結合構造体。抗体の誘導体は、種々の化学的手法、たとえば共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合などにより他の物質に会合または結合させることによって得ることができる。抗体に結合した他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機もしくは無機の分子、またはそのいずれかの組合わせ（たとえば、ＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であってもよい。特定の態様において、抗体は生物学的に許容できる化合物との特異的な相互作用を可能にする追加タグを含む誘導体である。抗体のターゲットへの抗体の結合に対するタグの負の影響が無いかまたは耐容できる限り、本発明に使用できるタグに関して特別な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、およびＳ−タグが含まれる。他の特定の態様において、抗体は標識を含む誘導体である。本明細書中で用いる用語“標識”は、“標識した”抗体を作製するために抗体に直接または間接的にコンジュゲートさせる検出可能な化合物または組成物を表わす。標識はそれ自体が検出可能であってもよく（たとえば放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合は基質である化合物または組成物の化学変化を触媒し、それが検出可能であってもよい。
【００８０】
本明細書に記載する好ましい誘導体は抗原結合およびエンドトキシン結合に関して機能活性であり、好ましくは、たとえばＳＢＡ、ＯＰＫまたはＬＡＬアッセイで判定してクレブシエラ・ニューモニエと戦う効力、あるいは細菌攻撃に対して防御し、またはエンドトキセミアを中和する効力をもつ。
【００８１】
本明細書に記載する好ましい誘導体はさらに、たとえばＣＤＣ（ＳＢＡ）、および／またはＯＰＫアッセイで判定してクレブシエラ・ニューモニエとの戦いに対する機能活性、あるいは細菌攻撃に対して防御する機能活性をもつ。
【００８２】
特に、本発明の抗体から誘導した抗体は、Ｏ１抗原に差示的に結合すること、たとえばＯ１抗原を特異的または選択的に結合することにおいて機能活性である、少なくとも１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域またはそのＣＤＲバリアントを含むことができる。
【００８３】
親抗体または親抗体配列、たとえば親ＣＤＲまたは親ＦＲから誘導される抗体は、本明細書において特に、たとえばインシリコ(in silico)または組換え工学あるいは化学的な誘導体化または合成により得られた変異体またはバリアントであると解釈される。
【００８４】
用語“抗体”は抗体のバリアントをも表わすと解釈され、それには親ＣＤＲ配列の機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体、および親抗体の機能活性バリアント抗体が含まれる。
特に、本明細書に記載する抗体から誘導される抗体は重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲおよび軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲもしくはＦＲ領域のうち少なくとも１つまたはＨＣもしくはＬＣの定常領域に少なくとも１つの点変異をもち、機能活性であり、たとえばＯ１抗原を特異的に結合することができる。
【００８５】
用語“バリアント”は特に、たとえば定常ドメインにおいて抗体の安定性、エフェクター機能もしくは半減期を工学操作するために、または可変ドメインにおいてたとえば当技術分野で利用できる親和性成熟法により抗原結合特性を改善するために、たとえば変異形成法、特に特定の抗体のアミノ酸配列もしくは領域における欠失、交換、挿入配列導入、またはアミノ酸配列の化学的誘導体化により得られた、変異抗体または抗体フラグメントなどの抗体を表わすものとする。既知のいずれかの変異形成法を使用でき、それには希望する位置においてたとえばランダム化法により得られる点変異が含まれる。ある場合には、位置はランダムに、たとえば抗体配列をランダム化するために可能ないずれかのアミノ酸または選択した好ましいアミノ酸について選ばれる。用語“変異形成”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更するために当技術分野で認識されているいずれかの手法を表わす。好ましいタイプの変異形成には、エラープローンＰＣＲ(error prone PCR)変異形成、飽和変異形成(saturation mutagenesis)、または他の部位特異的変異形成が含まれる。
【００８６】
用語“バリアント”は、特に機能活性バリアントを包含するものとする。
本明細書中で用いる、ＣＤＲ配列の“機能活性バリアント”という用語は、“機能活性ＣＤＲバリアント”であると解釈され、本明細書中で用いる、抗体の“機能活性バリアント”という用語は、“機能活性抗体バリアント”であると解釈される。機能活性バリアントは、この配列（親抗体または親配列）を１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾することから得られる配列、あるいはアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドを、すなわち配列の一端または両端の、たとえばＣＤＲ配列においてＮ末端および／またはＣ末端の１、２、３または４個のアミノ酸、および／または中心（すなわち、ＣＤＲ配列の中央）の１、２、３または４個のアミノ酸を化学的に誘導体化することから得られる配列であって、その修飾がこの配列の活性に影響しないもの、特に、損なわないものを意味する。選択したターゲット抗原に対する特異性をもつ結合部位の場合、これが変化する可能性、たとえば特定のエピトープに対する微細な特異性、親和性（アフィニティー）、アビディティー、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度などが変化する可能性はあるけれども、抗体の機能活性バリアントはなお前決定した結合特異性をもつであろう。たとえば、親和性成熟抗体は特に機能活性バリアント抗体であると解釈される。よって、親和性成熟抗体における修飾されたＣＤＲ配列は機能活性ＣＤＲバリアントであると解釈される。
【００８７】
たとえば、ＣＤＲバリアントは、ＣＤＲ領域における少なくとも１個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列を含み、その際、その修飾はアミノ酸配列の化学変化または部分的変更であってもよく、その修飾によりバリアントは非修飾配列の生物学的特性を保持することができる。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の欠失もしくは置換によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の付加もしくは挿入によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の化学的誘導体化によるもの、あるいはその組合わせであってもよい。
【００８８】
機能活性バリアントは、たとえば親抗体の配列を変化させることにより得ることができる；たとえば、図１に挙げるいずれかの抗体と同じ結合部位を含むけれども結合部位以外の抗体領域内に修飾を伴なう抗体、またはそのような親抗体から結合部位内ではあるけれども抗原結合性を損なわない修飾により誘導される抗体であって、好ましくはＯ１抗原を特異的もしくは選択的に結合する能力を含めて親抗体と実質的に同じ生物活性もしくは改善すらなされた活性を備えた抗体。
【００８９】
特に、本明細書に記載する機能活性バリアントは、クレブシエラ・ニューモニエＯ１を特異的に認識する効力、特にクレブシエラ・ニューモニエＯ１のｇａｌ−ＩＩ抗原を特異的に認識する効力、および中和効力、たとえばＬＡＬアッセイにおけるエンドトキシ中和機能をもつ；たとえば、クレブシエラ・ニューモニエをターゲティングする特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して、実質的に同じ生物活性をもつ。
【００９０】
特に、本明細書に記載する機能活性バリアントは、クレブシエラ・ニューモニエＯ１のｇａｌ−ＩＩ抗原を特異的に結合する効力、および循環／血清中のＯ１血清型クレブシエラ・ニューモニエ細菌を死滅させるＣＤＣ活性をもつ。
【００９１】
例示（親）抗体の機能活性バリアントは、たとえば親抗体の配列を変化させることにより得ることができる；たとえば、本明細書に記載する親抗体のいずれかと同じ結合部位を含むけれども結合部位以外の抗体領域に修飾を伴なう抗体、またはそのような親抗体から結合部位内ではあるけれども抗原結合性を損なわない修飾により誘導される抗体であって、好ましくはクレブシエラ・ニューモニエのＯ１抗原を特異的もしくは選択的に結合する能力、および中和活性、ならびに場合によりＳＢＡアッセイにおける殺細菌性ＣＤＣ活性または補体仲介殺菌効力を含めて、親抗体と実質的に同じ生物活性もしくは改善すらなされた活性を備えた抗体。場合により、機能活性バリアントはさらに、たとえば（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエをターゲティングする特異的結合アッセイまたは機能試験により測定して、ＯＰＫアッセイにおける抗体仲介食作用の効力（たとえば、実質的に同じ生物活性をもつ）を含むことができる。
【００９２】
クレブシエラ・ニューモニエを攻撃し、もしくは死滅させ、またはそれのエンドトキシンを中和する抗体は、感染を制限もしくは阻止し、および／またはそのような感染から生じる病状を改善し、あるいはクレブシエラ・ニューモニエの病理発生、特に宿主の無菌身体コンパートメント／部位内への播種およびその内部での複製を阻害することができる。これに関して、本明細書に記載する中和および殺細菌性の抗体は“防御抗体”であるとも解釈され、これはその抗体が感染因子に対する能動または受動免疫にみられる免疫に関与することを意味する。特に、本明細書に記載する防御抗体は、病原体により誘発される疾患の症状、副作用または進行を阻止し、改善し、治療し、または少なくとも部分的に停止する療法目的のために、たとえば予防または治療のために使用できる。特に、防御抗体は、療法適用に伴なって、たとえばＣＤＣまたはオプソニン食作用活性を誘導することによりクレブシエラ・ニューモニエ生細胞を死滅させ、またはその複製を妨害し、あるいは細菌細胞全体またはそのＬＰＳ分子を無菌身体部位から排除することができる（すなわち、樹立した感染症に投与した場合）。あるいは、予防的に適用された防御抗体は、上記または他のメカニズムの１つにより、感染の樹立（すなわち、非無菌部位から無菌の身体コンパートメント内へのクレブシエラ・ニューモニエの拡散）を阻害する。
【００９３】
本明細書中でターゲット抗原の結合または生物活性に関して用いる用語“実質的に同じ”は、匹敵する抗体または親抗体について判定して、実質的に同じ活性により示される活性、すなわち少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、たとえば少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、もしくはたとえば２００％に及ぶ活性、またはよりいっそう高い活性を表わす。
【００９４】
特に、本発明の抗体の機能活性バリアントは、Ｏ１抗原を高い親和性で結合する効力、およびクレブシエラ・ニューモニエの他のもの（非ガラクタン−ＩＩ抗原）と対比してガラクタン−ＩＩ抗原を優先的に結合する特異性または選択性をもつ。好ましいバリアントは、クレブシエラ・ニューモニエの他の抗原には結合せず、ＫＤ値の差は少なくとも２  ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３  ｌｏｇであり、さらにＬＡＬまたはＴＬＲ４シグナル伝達アッセイにおいて、たとえばその抗体を含まない対照試料と対比して有意のエンドトキシン活性低減を達成するエンドトキシン中和機能を含み、たとえばクレブシエラ・ニューモニエをターゲティングする特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性を備えている。機能性インビトロアッセイにおける有意の活性低減は、一般に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の低減、最大で約１００％（±１％）の完全低減を意味する。
【００９５】
好ましい態様において、親抗体の機能活性バリアントは
ａ）親抗体の生物活性フラグメントであり、そのフラグメントは親分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは９７％、９８％または９９％を含む；
ｂ）親抗体から少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失により誘導され、その機能活性バリアントは親分子またはそれの一部に対して配列同一性をもつ；たとえば少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性をもつ抗体；および／または
ｃ）親抗体またはその機能活性バリアント、およびさらにそのポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対してヘテロロガス（非相同）である少なくとも１個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる。
【００９６】
本発明の好ましい一態様において、本発明による抗体の機能活性バリアントは本質的に前記のバリアントと同一であるが、それが異なる種の相同配列に由来するという点において、それぞれそれのポリペプチドまたはヌクレオチド配列と異なる。これらは天然のバリアントまたはアナログと呼ばれる。
【００９７】
用語“機能活性バリアント”には、天然のアレルバリアント、および変異体または他のいずれかの非天然バリアントも含まれる。当技術分野で知られているように、アレルバリアントはそのポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加をもつことを特徴とする別形態の（ポリ）ペプチドである。
【００９８】
機能活性バリアントは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列変更により、たとえば１以上の点変異により得ることができ、その際、本発明の組合わせに用いた場合にその配列変更は変化していないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持または改善する。そのような配列変更には（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入を含めることができるが、これらに限定されない。
【００９９】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連性があるアミノ酸のファミリー内で起きるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小型側鎖、大型側鎖などを備えたアミノ酸である。
【０１００】
点変異は特に、ポリヌクレオチドの工学操作であって、１以上の単一（不連続）または二重のアミノ酸が異なるアミノ酸に置換もしくは交換され、欠失し、または挿入されている点において、工学操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすものであると解釈される。
【０１０１】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を表わす。これに関してアミノ酸は６４のトリプレットコドンによりコードされる２０種類の天然アミノ酸を表わす。これら２０種類のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷をもつものに分類できる：
“中性”アミノ酸をそれらのそれぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ，Ａ）  非極性，中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ，Ｎ）  極性，中性；
システイン：（Ｃｙｓ，Ｃ）  非極性，中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ，Ｑ）  極性，中性；
グリシン：（Ｇｌｙ，Ｇ）  非極性，中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ，Ｉ）  非極性，中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ，Ｌ）  非極性，中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ，Ｍ）  非極性，中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ，Ｆ）  非極性，中性；
プロリン：（Ｐｒｏ，Ｐ）  非極性，中性；
セリン：（Ｓｅｒ，Ｓ）  極性，中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ，Ｔ）  極性，中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ，Ｗ）  非極性，中性；
チロシン：（Ｔｙｒ，Ｙ）  極性，中性；
バリン：（Ｖａｌ，Ｖ）  非極性，中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ，Ｈ）  極性，正（１０％）  中性（９０％）
“正”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アルギニン：（Ａｒｇ，Ｒ）  極性，正；および
リジン：（Ｌｙｓ，Ｋ）  極性，正
“負”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ，Ｄ）  極性，負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ，Ｅ）  極性，負。
【０１０２】
本明細書に記載する抗体配列およびホモログに関する“アミノ酸配列同一性パーセント（％）”は、最大の配列同一性パーセントが達成されるように配列をアラインさせ、必要であればギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、候補配列中において特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の百分率と定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するのに適したパラメーターを決定できる。
【０１０３】
用語“抗原結合部位”または“結合部位”は、抗原結合に関与する抗体部分を表わす。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）鎖および／または軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域の、すなわちその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の“超可変領域”と呼ばれる多様性の高い３つの範囲が、より保存されたフレームワーク領域として知られるフランキング範囲間に挟まれている。抗原結合部位は結合したエピトープまたは抗原の三次元表面に対して相補的な表面を備えており、超可変領域は“相補性決定領域”、すなわち“ＣＤＲ”と呼ばれる。ＣＤＲに内包されている結合部位を本明細書中では“ＣＤＲ結合部位”とも呼ぶ。
【０１０４】
本明細書中で“ターゲット”または“ターゲット抗原”と互換性をもって用いる用語“抗原”は、ターゲット分子全体、またはそのような分子の、抗体の結合部位により認識されるフラグメントを表わすものとする。特に、一般に“エピトープ”、たとえばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと呼ばれる、抗原の免疫に関連する下部構造、たとえばポリペプチドまたは炭水化物構造を、そのような結合部位が認識できる。ガラクタン−ＩＩエピトープを含む特定の抗原は炭水化物（マンナン）構造を含み、場合により人工的キャリヤー上に付与した単離された抗原として、あるいはそれらの抗原を発現するクレブシエラ・ニューモニエ細胞またはその細胞画分の形態で提供できる。
【０１０５】
本明細書中で用いる用語“エピトープ”は、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成するかまたは特異的結合パートナーの一部であってもよい分子構造体を表わすものとする。エピトープは炭水化物、ペプチド構造体、脂肪酸、有機物質、生化学物質もしくは無機物またはその誘導体、およびそのいずれかの組合わせから構成されている可能性がある。エピトープがペプチド構造体、たとえばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合、それは通常は少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、より好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸を含むであろう。エピトープは線状または立体構造のいずれかのエピトープの可能性がある。線状エピトープはポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントから構成される。線状エピトープは連続的でもオーバーラップしていてもよい。
【０１０６】
立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて三次構造を形成することによって互いに近づいたアミノ酸または炭水化物から構成され、それらのアミノ酸は線状配列中で必ずしも互いに隣接してはいない。特に、ポリペプチド抗原に関して、立体構造または不連続エピトープは、一次配列中では離れていたけれどもポリペプチドが折り畳まれて天然タンパク質／抗原になった際にその分子の表面で調和のとれた構造に組み立てられる２個以上の不連続なアミノ酸残基の存在を特徴とする。
【０１０７】
本明細書中で用語“エピトープ”は、特に、本明細書に記載する抗体によって認識されるＯ１抗原の単一炭水化物エピトープを表わすものとする。
用語“発現”は、下記のように解釈される。目的とする発現生成物（たとえば本明細書に記載する抗体）のコード配列および作動可能な状態で連結した制御配列（たとえばプロモーター）を含む核酸分子を、発現の目的に使用できる。これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を産生することができる。形質転換を行なうために、発現系をベクターに含有させることができる；しかし、関連ＤＮＡを宿主染色体に組み込むこともできる。特にこの用語は、たとえば、そのベクターにより運ばれて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡがコードするタンパク質の発現に適した条件下にある、宿主細胞および適合するベクターに関連する。
【０１０８】
コーディングＤＮＡは、特定のポリペプチドまたはタンパク質、たとえば抗体についての特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、調節、または他の形で仲介または制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとコーディングＤＮＡは同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来するものであってよく、同じ生物または異なる生物に由来するものであってよい。組換えクローニングベクターはしばしば、クローニングまたは発現のための１以上の複製系、宿主における選択のための１以上のマーカー、たとえば抗生物質耐性、および１以上の発現カセットを含むであろう。
【０１０９】
本明細書中で用いる“ベクター”は、適切な宿主生物において、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子を転写し、それらのｍＲＮＡを翻訳するのに必要な、ＤＮＡ配列と定義される。
【０１１０】
“発現カセット”は、発現生成物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントであって、既定の制限部位においてベクターに挿入できるものを表わす。カセットの制限部位は、カセットを適正なリーディングフレームに確実に挿入するようにデザインされる。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１以上の制限部位に挿入され、次いでベクターによって、伝達可能なベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞内へ運ばれる。ＤＮＡが挿入または付加された、ＤＮＡのセグメントまたは配列、たとえば発現ベクターを、“ＤＮＡ構築体”と呼ぶこともできる。
【０１１１】
発現ベクターは発現カセットを含み、さらに通常は宿主またはゲノム組込み部位における自己複製のための起点、１以上の選択マーカー（たとえば、アミノ酸合成遺伝子、またはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素開裂部位、適切なプロモーター配列、および転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は作動可能な状態で互いに連結している。本明細書中で用いる用語“ベクター”は、自律複製ヌクレオチド配列およびゲノム組込みヌクレオチド配列を含む。一般的なタイプのベクターは“プラスミド”であり、それは一般に追加（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができかつ適切な宿主細胞に容易に導入できる、二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子(self-contained molecule)である。プラスミドベクターは、しばしばコーディングＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを収容し、かつ外来ＤＮＡの挿入に適した１以上の制限部位をもつ。特に、用語“ベクター”または“プラスミド”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、それによりその宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを表わす。
【０１１２】
本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、特定の組換えタンパク質、たとえば本明細書に記載する抗体を産生するために形質転換された初代対象細胞、およびそのいずれかの子孫を表わすものとする。必ずしもすべての子孫が厳密に親細胞と同一であるとは限らない（故意のもしくは意図しない変異または環境の相異のため）が、そのような変異した子孫は最初に形質転換された細胞のものと同じ機能性をその子孫が保持している限りこれらの用語に含まれると解釈すべきである。用語“宿主細胞系”は、組換え遺伝子を発現させて、組換えポリペプチド、たとえば組換え抗体を産生させるために用いる宿主細胞の細胞系を表わす。本明細書中で用いる用語“細胞系”は、特定の細胞タイプの樹立したクローンであって、長期間にわたって増殖する能力を獲得したものを表わす。そのような宿主細胞または宿主細胞系を細胞培養において維持および／または培養して、組換えポリペプチドを産生させることができる。
【０１１３】
本明細書中で核酸、抗体または他の化合物に関して用いる用語“単離された”または“単離”は、自然状態でそれに付随していたであろう環境から十分に隔離され、それによって“実質的に純粋な”形態で存在する化合物を表わすものとする。“単離された”は、必ずしも他の化合物もしくは物質との人為的もしくは合成による混合物の排除、または基本的活性を妨害しない、たとえば精製不完全のため存在する可能性のある不純物の存在の排除を意味するわけではない。特に、本発明の単離された核酸分子は、自然界に存在しないもの、たとえばコドン最適化した核酸もしくはｃＤＮＡ、または化学合成したものをも含むものとする。
【０１１４】
同様に、本発明の単離された抗体は、特に、自然界に存在しないもの、たとえば他の抗体または活性物質との組合わせ製剤で提供されるもの（その組合わせは自然界に存在しない）、または天然抗体の最適化もしくは親和性成熟バリアント、または抗体の加工適性を改善するために工学操作されたフレームワーク領域を備えた抗体である。そのような最適化または工学操作により、抗体はその抗体に関して自然界ではみられない１以上の合成配列または特徴を含む。
【０１１５】
本発明の核酸に関して、用語“単離された核酸”を時に用いる。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、それが由来する生物の天然ゲノム中でそれが隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を表わす。たとえば、“単離された核酸”は、ベクター、たとえばプラスミドもしくはウイルスベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用された場合、用語“単離された核酸”は主に、上記に定義した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を表わす。あるいは、この用語は、それの自然状態で（すなわち、細胞または組織において）それに付随していたであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を表わすことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的手段または合成手段で直接製造され、それの製造中に存在する他の成分から分離された分子を表わすことができる。
【０１１６】
ポリペプチドまたはタンパク質、たとえば単離された本発明の抗体またはエピトープに関して、用語“単離された”は特に、自然状態でそれらに付随する物質、たとえばそれらの自然環境で、または製造がインビトロもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ法による場合にはそれらが産生される環境（たとえば、細胞培養）でそれらと共にみられる他の化合物を含まないかまたは実質的に含まない化合物を表わすものとする。単離された化合物に希釈剤または佐剤を配合してもなお実用上の目的では単離されているということができる−たとえば、診断または療法に用いる際にそれらのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と混合することができる。特に、本発明の単離された抗体は単離された純粋な形態で提供され、好ましくは単離された抗体を唯一の活性物質として含む製剤で提供されるので、クレブシエラ・ニューモニエ株に対して形成されたポリクローナル血清製剤とは異なる。ただし、これは単離された抗体を限られた数のさらなる十分に規定された（単離された）抗体を含む組合わせ製剤で提供することを排除しない。単離された抗体を固体、半液体または液体キャリヤー、たとえばビーズ上において提供することもできる。
【０１１７】
用語“中和する”または“中和”は、本明細書においては最も広い意味で用いられ、中和が達成されるメカニズムには関係なく、病原体、たとえばクレブシエラ・ニューモニエが対象に感染するのを阻害するいずれかの分子、または病原体がエンドトキシン産生により感染を促進するのを阻害すること、またはエンドトキシンがそれらの生物活性を発揮するのを阻害することを表わす。中和は、たとえばホストにおいて粘膜表面におけるクレブシエラ・ニューモニエの定着、無菌状態の身体部位への侵入、および有害な生物学的シグナルの誘発（最悪の場合には敗血症性ショックの誘導）を阻害する抗体により達成できる。
【０１１８】
厳密な意味で、中和は、特定のＬＰＳがそれのコグネイト受容体(cognate receptor)（たとえば、Ｔｏｌｌ様受容体−４複合体）に結合してそれにより生物活性を誘発するのを阻害することを意味する。この中和力価は一般に標準アッセイ、たとえばインビトロまたはインビボ中和アッセイ、たとえばＬＡＬ試験、またはＴＬＲ−４ベースのアッセイで決定され、その際、エンドトキシンの生物活性の阻害はたとえば比色法により測定される。
【０１１９】
本明細書中で用いる用語“Ｏ１抗原”（“ガラクタン−ＩＩ”、“ｇａｌ−ＩＩ”、または“Ｄ−ｇａｌ  ＩＩ”とも呼ばれる）は、少なくとも１つの反復単位：［−３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−］を含むガラクトースポリマーおよび構造体を含むクレブシエラ・ニューモニエＬＰＳ  Ｏ−抗原の炭水化物構造体を表わすものとする。注目すべきことに、ｇａｌ−ＩＩ構造体はクレブシエラ・ニューモニエ以外の生物またはそれぞれの細胞が発現する可能性もあり、したがってそのような生物または細胞により仲介される疾患と戦う際の重要なターゲットとなる可能性がある。
【０１２０】
ｇａｌ−ＩＩ構造を含む各Ｏ−抗原を、本明細書中で“Ｏ１抗原”と呼び、それは特に本明細書に記載するＯ１特異的抗体が特異的に認識する“ガラクタン−ＩＩエピトープ”を含む。Ｏ１抗原は、Ｏ１タイプのクレブシエラ・ニューモニエ（クレブシエラ・ニューモニエＯ１）のＬＰＳの外側部分、すなわちそれに含有される１以上の特異的ｇａｌ−ＩＩエピトープを含む表面アクセス可能な抗原性炭水化物構造体であると理解される。
【０１２１】
本明細書中で用いる“特異的”な結合、認識またはターゲティングは、結合剤、たとえば抗体またはその抗原結合部分が不均質な分子集団中のターゲット抗原またはそれぞれのエピトープに対して明らかな親和性を示すことを意味する。よって、指示した条件下（たとえば、イムノアッセイ）で、ある結合剤はターゲットＯ１抗原に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子に有意量では結合しない。特異的結合は、選択に応じてターゲットのアイデンティティー、高い、中等度または低い結合親和性またはアビディティーに関して、結合が選択的であることを意味する。通常は、他のターゲットと比較して結合定数または結合動態が少なくとも１０倍の差（少なくとも１  ｌｏｇの差と解釈される）であれば、好ましくは差が少なくとも１００倍（少なくとも２  ｌｏｇの差と解釈される）、より好ましくは少なくとも１０００倍（少なくとも３  ｌｏｇの差と解釈される）であれば、選択的結合が達成される。
【０１２２】
本明細書に記載する好ましい抗体は、Ｏ１抗原を高親和性で、特に高いオン（結合）速度および／または低いオフ（解離）速度で、あるいは高い結合アビディティー（アビッド結合親和性）で結合する。抗体の結合親和性は、通常は、抗原結合部位の半分が占有される抗体濃度、すなわち解離定数（Ｋｄ、またはＫＤ）として知られているものによって特性づけられる。通常は、結合剤は、一価結合剤を用いて測定してＫＤ＜１０−６ＭもしくはＫＤ＜１０−７Ｍ、または二価結合剤を用いて測定してＫＤ＜１０−８Ｍで、ある場合には、たとえば療法目的では、より高い親和性、たとえばＫＤ＜１０−８ＭもしくはさらにＫＤ＜１０−９Ｍ（一価結合剤を用いて測定）、またはＫＤ＜１０−９ＭもしくはさらにＫＤ＜１０−１０Ｍ（二価結合剤を用いて測定）で、高親和性結合剤とみなされる。
【０１２３】
さらに、特に好ましい態様において、個々の抗原結合親和性はたとえば１０−６より高いＫＤをもつ中等度の親和性のもの、たとえばアビッド結合親和性（二価結合剤を用いて測定）である。
【０１２４】
中等度の親和性の結合剤を提供し、必要であれば親和性成熟させることができる。
親和性成熟は、ターゲット抗原に対する親和性が増大した抗体を製造する方法である。当技術分野で利用できる親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するいずれか１以上の方法を、本明細書に開示する発明の種々の態様に従って親和性成熟抗体を作製するために採用できる。代表的なそのような親和性成熟の方法および使用、たとえばランダム変異形成、細菌ミューテーター(mutator)株の継代、部位特異的変異形成、変異ホットスポットターゲティング(mutational hotspots targeting)、倹約変異形成(parsimonious mutagenesis)、抗体シャフリング(shuffling)、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異形成、ならびに本明細書に開示する本発明の種々の態様に従った方法および使用を実施できる親和性成熟ライブラリーを調製および使用する方法には、たとえば下記に開示されたものが含まれる: Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679。
【０１２５】
アミノ酸変異形成を含めた、または免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞変異の結果としての、抗体の構造変化で、抗原への結合部位のバリアントを製造し、より大きな親和性について選択した。親和性成熟抗体は、親抗体より数ｌｏｇ倍大きい親和性を示す可能性がある。単一の親抗体を親和性成熟させることができる。あるいは、ターゲット抗原に対して類似の結合親和性を備えた抗体のプールを親構造体とみなすことができ、それらを変異させて親和性成熟した単一の抗体またはそのような抗体の親和性成熟したプールを得ることができる。
【０１２６】
本明細書に記載する抗体の好ましい親和性成熟バリアントは、少なくとも２倍の結合親和性増大、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。親分子のライブラリーそれぞれを用いる選択活動の過程で、中等度の結合親和性をもつ抗体について親和性成熟を採用して、結合親和性ＫＤ＜１０−８Ｍ（たとえば、二価結合剤を用いて測定したアビッド結合親和性）の特異的ターゲット結合特性をもつ本発明の抗体を得ることができる。あるいは、本発明による抗体の親和性成熟によって親和性（たとえば、二価結合剤を用いて測定したアビッド結合親和性）をよりいっそう増大させて、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらには１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル濃度範囲のＫＤに相当する高い値を得ることができる。
【０１２７】
ある態様において、結合親和性は親和性ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。ある態様において、結合親和性はＢＩＡｃｏｒｅ、ＢＬＩ、ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイにより決定される。ある態様において、結合親和性は動力学的方法により決定される。ある態様において、結合親和性は平衡／溶解法により決定される。
【０１２８】
用語“ 同じ特異性をもつ”、“同じ結合部位をもつ”または“同じエピトープを結合する”の使用は、同等のモノクローナル抗体が同じ、または本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、前選択したターゲット結合配列への結合に対して競合することを示す。特定のターゲットに対する抗体分子の相対的特異性は、競合アッセイ、たとえば Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)に記載されたものにより相対的に決定できる。
【０１２９】
本明細書中で抗体に関して用いる用語“競合する”は、第１抗体またはその抗原結合性部分が第２抗体またはその抗原結合性部分の結合と十分に類似した様式でエピトープに結合し、したがって第１抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合の結果が第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して第２抗体の存在下では検出可能なほど低減することを意味する。その逆、すなわち第２抗体がそれのエピトープに結合する場合も第１抗体の存在下で検出可能なほど低減する可能性はあるが、必ずしもそうではない。すなわち、第１抗体は第２抗体がそれのエピトープに結合するのを阻害し、第２抗体は第１抗体がそれの各エピトープに結合するのを阻害しないという可能性がある。しかし、それぞれの抗体が他方の抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合を検出可能なほど（同じ、より大きい、またはより少ない程度であっても）阻害する場合、それらの抗体はそれらの各エピトープ（単数または複数）への結合に対して互いに“競合する”と言われる。Ｏ１抗原の結合に対して例示抗体のいずれかと競合する抗体は、特に本発明に包含される。
【０１３０】
本明細書中で“競合結合”または“競合”は、競合ＥＬＩＳＡ分析またはＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＢＬＩ分析により判定して約３０％より大きい相対的阻害を意味する。特定の状況で、たとえば意図する抗原結合機能をもつようにデザインした新規抗体を選択またはスクリーニングするために競合分析を用いる場合、適切な競合レベルの基準として、相対的阻害のより高い閾値を設定することが望ましいであろう。よって、たとえば、抗体を十分に競合性であるとみなす前に、競合結合について少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくはさらに少なくとも１００％の相対的阻害が検出される基準を設定することができる。
【０１３１】
用語“クレブシエラ・ニューモニエ感染”および“クレブシエラ・ニューモニエ定着”は、下記のように解釈される：クレブシエラ・ニューモニエは腸内細菌科(Enterobacteriaceae)のグラム陰性細菌である。それは遍在性細菌であり、ヒト宿主にも一般に腸または上気道に定着する可能性がある。日和見病原体であるため、それは免疫系によって適正に抑制されない場合にこれらの部位から無菌の身体部位に侵入する可能性がある。他の場合には無菌状態であるこれらの部位における抑制されない細菌複製は、大部分がクレブシエラ・ニューモニエから放出されるエンドトキシン（すなわち、ＬＰＳ）分子により仲介される炎症を誘発するであろう。菌血症の症例では、エンドトキシン分子は敗血症性ショックの引き金となる可能性がある。
【０１３２】
クレブシエラ・ニューモニエ定着は、対象のある部位にそれらを検出できるほど十分に高い濃度のクレブシエラ・ニューモニエ細菌があるけれどもまだその細菌が徴候または症状を引き起こしていないことを意味する。定着は長期間にわたって持続する可能性があり、消散はその生物に対する免疫応答、その部位における他の生物からの競合、および時には抗微生物薬の使用によって影響される。
【０１３３】
一般に、クレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされる菌血症を既知の一般的な抗細菌療法、たとえば抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系の炎症阻害薬による治療で処置するのに成功する可能性がある。本発明は、クレブシエラ・ニューモニエを特異的に認識する抗体を場合により抗細菌または抗炎症療法と組み合わせて用いる新規免疫療法を提供する。クレブシエラ・ニューモニエ感染症を伴なう患者を処置するために用いる代表的な抗生物質は、アミノグリコシド類、セファロスポリン類、アミノペニシリン類、カルバペネム類、フルオロキノロン類、チゲサイクリン、コリスチンなどである。
【０１３４】
多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエは、特に、３クラス以上の抗生物質、たとえば下記の薬剤／グループに対して耐性を示す株であると解釈される：ペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、フルオロキノロン類、ニトロフラントイン、トリメトプリム（およびそれの組合わせ）、ホスホマイシン(fosfomycin)、ポリミキシン類、クロラムフェニコール、アズトレオナム(azthreonam)、またはチゲサイクリン。
【０１３５】
最近の抗生物質耐性株の出現に伴なって、この性質をもつ菌血症の処置が著しくいっそう困難になった。クレブシエラ・ニューモニエ疾患を発症している患者は、クレブシエラ・ニューモニエ疾患を伴なわない患者より入院およびＩＣＵ滞在が長く、死亡率が高く、ヘルスケアコストが大きい。患者にクレブシエラ・ニューモニエが多量に定着している場合、治療よりむしろ防止、すなわちクレブシエラ・ニューモニエ疾患予防により、患者のケアを改善し、院内感染を減らすことができる。
【０１３６】
クレブシエラ・ニューモニエ疾患は、具体的にはクレブシエラ・ニューモニエ感染により引き起こされる疾患であると解釈される。そのような疾患には、局所性および全身性の疾患が含まれる。重篤な疾患症例は、たとえば原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎である。
【０１３７】
本明細書中で用いる用語“組換え（体）(recombinant)”は、“遺伝子工学操作により製造すること、またはその結果”を意味するものとする。組換え宿主は特に発現ベクターまたはクローニングベクターを含み、あるいはそれは特にその宿主に対して外来であるヌクレオチド配列を用いて組換え核酸配列を収容するように遺伝子工学的に操作されている。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることにより製造される。本明細書中で用いる用語“組換え抗体”には、組換え手段で製造、発現、作製または単離された抗体、たとえば下記のものが含まれる：（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから作製されたハイブリドーマについてトランスジェニックまたは染色体導入(transchromosomal)状態である動物（たとえば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマ(transfectoma)から、単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル−ヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合性配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴なう他のいずれかの手段で製造、発現、作製または単離された抗体。そのような組換え抗体には、たとえば抗体成熟に際して起きる再配列および変異形成を含むように遺伝子工学操作された抗体が含まれる。本発明によれば、当業者がなしうる範囲の一般的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの手法を採用できる。そのような手法は文献に十分に説明されている。たとえば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)を参照。
【０１３８】
選択的結合は、当技術分野で知られている組換え抗体最適化法によってさらに改善できる。たとえば、本明細書に記載する免疫グロブリン鎖の可変領域の特定領域に、軽鎖シャフリング、デスティネーション変異形成(destinational mutagenesis)、ＣＤＲ融合(CDR amalgamation)、ならびに選択したＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の特異的変異形成(directed mutagenesis)を含む１以上の最適化方策を施すことができる。 
【０１３９】
本明細書中で用いる用語“対象”は、温血哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物を表わすものとする。クレブシエラ・ニューモニエはきわめて重大なヒト病原体であり、動物医療において出現しつつある関心事でもある。それは広範な非ヒト動物種に存在する。よって、用語“対象”は特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含めた動物をも表わす可能性がある。特に、本発明の医療用途またはそれぞれの処置方法は、クレブシエラ・ニューモニエ感染に関連する病状の予防または治療を必要とする対象に適用される。対象は、クレブシエラ・ニューモニエ感染のリスクをもつ患者、または初期もしくは後期疾患を含めた疾患に罹患している患者であってもよい。用語“患者”には、予防処置または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象が含まれる。よって、用語“処置”は予防処置および治療処置の両方を含むものとする。
【０１４０】
対象は、たとえばクレブシエラ・ニューモニエ病状の予防または治療のために処置される。特に、感染またはそのような疾患の発症もしくは疾患再発のリスクをもつ対象、あるいはそのような感染および／またはそのような感染に関連する疾患を伴なう対象を処置する。
【０１４１】
特に、用語“予防”は防止措置を表わし、それは発病の防止または発病のリスクを低減するための予防措置を含むものとする。
特に、その処置はその状態の原因物質としてのクレブシエラ・ニューモニエの病的発生を妨害することによるものであってもよい。
【０１４２】
本明細書中で用いる用語“実質的に純粋な”または“精製した”は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、たとえば核酸分子または抗体を含む調製物を表わすものとする。純度はその化合物に適した方法（たとえば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定される。
【０１４３】
本明細書中で化合物、たとえば本発明の抗体の“有効量”または“十分な量”のいずれかと互換性をもって用いる“療法有効量”という用語は、対象に投与した際に、臨床結果を含めて有益または希望する結果を及ぼすのに十分な量または活性であり、したがって有効量またはその同義語はそれが適用される状況に依存する。
【０１４４】
有効量は、そのような疾患または障害を治療、防止または阻止するのに十分な化合物量を意味するものとする。疾患に関して、本明細書に記載する抗体の療法有効量は、特に、クレブシエラ・ニューモニエの病的発生、たとえば粘膜表面における付着および定着、無菌身体部位内での無制御な複製、ならびに細菌産物によるホスト細胞傷害の阻害が有益である疾患または状態を治療し、調節し、減弱させ、反転させ、または影響を及ぼすために用いられる。
【０１４５】
そのような有効量に相当する化合物量は、種々の要因、たとえば投与する薬物または化合物、医薬配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置される対象または宿主のアイデンティティーなどに応じて異なるであろうが、それにもかかわらず当業者がルーティンに決定できる。
【０１４６】
その必要があるヒト対象に投与される本明細書に記載する抗体の療法有効量は、特に０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲、よりいっそう好ましくは最大２０ｍｇ／ｋｇ、最大１０ｍｇ／ｋｇ、最大５ｍｇ／ｋｇであってもよいが、たとえば急性病状を処置するためにはより高い用量を処方してもよい。効力の高い抗体を用いる場合、用量はこれよりはるかに低くてもよい。そのような場合、有効量は０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
【０１４７】
さらに、療法有効量の本発明抗体による対象の治療または防止計画は、単回投与からなることができ、あるいは一連の適用を含むことができる。たとえば、抗体を少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも１月に１回、投与することができる。しかし、他の態様において、特定の処置について１週に約１回から約１日１回まで、抗体を対象に投与することができる。処置期間の長さは、多様な要因、たとえば疾患の重症度、急性または慢性のいずれの疾患であるか、患者の年齢、抗体フォーマットの濃度および活性に依存する。治療または予防のために用いる有効量が特定の治療または予防計画のコースにわたって増加または減少する可能性があることも認識されるであろう。投与量の変更が生じる可能性があり、それは当技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって明らかになる。ある場合には、長期投与が必要になる可能性がある。
【０１４８】
クレブシエラ・ニューモニエのＯ１抗原に対して高特異性であるＬＰＳ中和性および殺細菌性のｍＡｂは、クレブシエラ・ニューモニエ感染症の予防（たとえば、高リスクグループについて）および治療のために大きな可能性をもつ。一般に予防処置のための用量はより低い範囲（たとえば、少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ未満）であり、特に、対象が免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態および／またはクレブシエラ・ニューモニエと接触する危険性があると同定された場合には１回、あるいは長期処置計画により、たとえば１年または半年に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回、投与される。治療処置のための用量は、一般に疾患の急性期または慢性期に、一般に、より高い範囲（たとえば、少なくとも０．０５または０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ未満）で投与され、具体的には疾患の治癒まで、１回以上の投与により、たとえば規則的間隔で、たとえば少なくとも１日に１、２、３、もしくは４回の投与、または少なくとも１週に１、２、３、４、５、もしくは６回の投与、または少なくとも１月に１、２、３、もしくは４回の投与により、投与される。
【０１４９】
クレブシエラ菌株により引き起こされる感染症の予防および治療のためのモノクローナル抗体を開発する目的で、特異的ｍＡｂの分子ターゲットは、適切にはクレブシエラに限定された不均質性を示すＬＰＳ  Ｏ−抗原である。そのようなＯ−側鎖は、嵩高い莢膜多糖によって完全には遮蔽されていないので、免疫関連性であると考えられる。
【０１５０】
希望する結合特性を備えた抗体が同定されると、そのような抗体（抗体フラグメントを含む）は、たとえばハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ技術を含めた当技術分野で周知の方法により製造できる。
【０１５１】
組換えモノクローナル抗体は、たとえば必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクター、たとえばその抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミドまたは発現カセット（単数または複数）を用いて、発現のために組換え宿主細胞にそのコード配列をトランスフェクトすることにより製造できる。組換え宿主細胞は原核細胞または真核細胞、たとえば前記のものであってもよい。
【０１５２】
特定の側面によれば、たとえば抗体の親和性もしくは他の特性を改善するために、ヌクレオチド配列を遺伝子操作に用いて人工配列を含む抗体を得ることができる。たとえば、抗体をヒトの臨床試験および処置に用いる場合、免疫応答を避けるために定常領域を工学操作してヒト定常領域にいっそう近似させることができる。抗体配列を遺伝子操作して、Ｏ１ターゲットに対してより大きい親和性、およびクレブシエラ・ニューモニエに対してより大きい有効性を得ることが望ましいであろう。抗体に対して１以上のポリヌクレオチド変化を行なってもなおターゲットＯ１抗原に対するそれの結合能力を維持できることは当業者に明らかであろう。
【０１５３】
種々の手段による抗体分子の製造は一般に十分に理解されている。たとえばUS Patent 6331415 (Cabillyら)には、抗体を組換え製造するための方法が記載され、その場合、重鎖および軽鎖を同時に単一ベクターから、または２つの別個のベクターから、単一細胞において発現させている。Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)およびLee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198)は、プラスミドを用いて別個の宿主細胞培養物中で発現させて別個に産生された重鎖および軽鎖からモノクローナル抗体を製造することを記載している。抗体の製造に関する他の種々の手法が、たとえばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提示されている。
【０１５４】
所望により、本明細書に記載する抗体、たとえば実施例に述べる、または図１もしくは図２に挙げるいずれかのｍＡｂまたはそのバリアントを配列決定し、そのポリヌクレオチド配列を次いで発現または伝搬のためにベクター中へクローニングすることができる。抗体をコードする配列を宿主細胞においてベクター内に維持し、その宿主細胞を次いで増殖させ、将来の使用のために凍結することができる。細胞培養における組換えモノクローナル抗体の産生は、当技術分野で既知の手段によるＢ細胞からの抗体遺伝子のクローニングにより実施できる。
【０１５５】
他の側面において、本発明は、本明細書に記載する組換え抗体の産生をコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
抗体をコードする核酸は、いずれか適切な特性をもち、いずれか適切な特徴またはその組合わせを含むことができる。よって、たとえば抗体をコードする核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形態であってもよく、非天然塩基、修飾されたバックボーン、たとえば核酸の安定性を増強するホスホロチオエートバックボーン、または両方を含むことができる。有利には、ターゲット宿主細胞（単数または複数）における希望する発現、複製および／または選択を増強するフィーチャーを含む本発明の発現カセット、ベクターまたはプラスミドに、核酸を収容することができる。そのようなフィーチャーの例には、複製起点構成要素、選択遺伝子構成要素、プロモーター構成要素、エンハンサーエレメント構成要素、ポリアデニル化配列構成要素、終止構成要素などが含まれ、その多数の適切な例が知られている。
【０１５６】
本開示はさらに、本明細書に記載するヌクレオチド配列のうち１以上を含む組換えＤＮＡ構築体を提供する。これらの組換え構築体は、開示したいずれかの抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されるベクター、たとえばプラスミド、ファージミド(phagemid)、ファージまたはウイルスベクターとの組合わせで用いられる。
【０１５７】
モノクローナル抗体は、培養細胞系により、たとえば組換え真核（哺乳類または昆虫）または原核（細菌）宿主細胞を培養することにより抗体分子を産生する、いずれかの方法を用いて製造される。モノクローナル抗体を製造するのに適した方法の例には、 Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497)のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; およびBrodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63)が含まれる。
【０１５８】
本明細書に記載する抗体は、ハイブリドーマ法を用いて、またはシングルＢ細胞からの免疫グロブリン遺伝子の直接増幅、クローニングおよび組換え発現（たとえば、本明細書に例示するように特定の抗原を用いるスクリーニング法を含む）により、同定または入手できる。そのようなハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適宜な宿主動物、たとえばハムスターを免疫化して、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、適切な融合剤、たとえばポリエチレングリコールを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することができる。
【０１５９】
ハイブリドーマ細胞または組換え抗体を産生する細胞が増殖している培地を、抗原を指向したモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞または抗体を組換え産生する細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはインビトロ結合アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により判定する。
【０１６０】
次いでｍＡｂを、それのＯ１抗原の特異的結合についてさらに試験するために、ハイブリドーマ上清から、および組換え抗体を産生している細胞からの培養上清から、精製することができ、抗体をたとえば種々の診断または療法の目的で工学操作することができる。
【０１６１】
Ｇａｌ−ＩＩ特異的抗体は、ある場合には単一ｇａｌ−ＩＩ抗原に対してスクリーニングすることにより得られる。差示結合するクローンを単離する可能性を高めるために、種々の抗原に対して漸次(processively)スクリーニングすることによって多重選択圧を適用する。
【０１６２】
希望する選択的結合特性を備えた抗体を同定するためのスクリーニング法は、抗体配列またはその抗原結合性配列をディスプレーするライブラリーを用いるディスプレー技術により行なうことができる（たとえば、ファージ、細菌、酵母もしくは哺乳動物の細胞を使用；または核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するインビトロディスプレーシステム）。ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング、またはフローサイトメトリーを伴なう表面染色に基づいて、たとえば標準アッセイを用いて、反応性を査定することができる。
【０１６３】
単離された抗原（単数または複数）は、たとえば抗体ライブラリー、たとえば酵母ディスプレーされた抗体ライブラリーから抗体を選択するために使用できる。
たとえば、本発明は特にｇａｌ−ＩＩ特異的抗体を提供し、それらはｇａｌ−ＩＩ抗原を結合する特異性をもつ抗体を同定する方法により、たとえば特異的ディスカバリーセレクション(specific discovery selection)スキームにより得られる。したがって、ｇａｌ−ＩＩターゲットとの反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーを、ターゲットとの反応性について選択することができる。
【０１６４】
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は本発明に従ってボーラス注射もしくは注入として、または連続注入により投与できる。そのような投与手段を容易にするのに適した医薬用キャリヤーは当技術分野で周知である。
【０１６５】
医薬的に許容できるキャリヤーには、一般に、本発明により提供される抗体または関連の組成物もしくは組合わせと生理的に適合するすべての適切な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容できるキャリヤーのさらなる例には、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそのいずれかの組合わせが含まれる。
【０１６６】
そのような一側面において、抗体を希望する投与経路に適した１種類以上のキャリヤーと組み合わせることができ、抗体をたとえばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールと混合し、場合によりさらに好都合な投与のために打錠またはカプセル封入することができる。あるいは、抗体を生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガントゴム、および／または種々の緩衝液に溶解することができる。他のキャリヤー、佐剤、および投与様式は医薬技術分野で周知である。キャリヤーには、制御放出材料または遅延材料、たとえばモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリル単独もしくはろうを含むもの、または当技術分野で周知である他の材料を含めることができる。
【０１６７】
さらに他の医薬的に許容できるキャリヤーが当技術分野で知られており、たとえばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESに記載されている。液体配合物は液剤、乳剤または懸濁液剤であってもよく、賦形剤、たとえば懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート化剤を含有することができる。
【０１６８】
本明細書に記載する抗体および１種類以上の療法有効薬剤を配合した医薬組成物が考慮される。希望する純度をもつ前記の免疫グロブリンを任意選択的な医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥配合物または水性液剤の形態で、本明細書に記載する抗体の安定配合物を貯蔵のために調製する。インビボ投与に用いるための配合物は、特に無菌、好ましくは無菌水性液剤の形態である。これは、無菌濾過膜による濾過または他の方法によって容易に達成される。本明細書に開示する抗体および他の療法有効薬剤を、免疫リポソームとして配合し、および／またはマイクロカプセルに封入することもできる。
【０１６９】
本明細書に記載する抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、粘膜、局所（たとえば、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤など）、腹腔内、筋肉内、肺内（たとえば、吸入法または肺送達システムを採用）、膣、非経口、直腸または眼内を含めた多様な方法で行なうことができる。
【０１７０】
非経口投与に用いる代表的配合物には、皮下、筋肉内または静脈内注射に適したもの、たとえば無菌の液剤、乳剤または懸濁液剤が含まれる。
一態様において、本明細書に記載する抗体は、たとえば疾患の改変または防止用の単剤療法として対象に投与する唯一の療法有効薬剤である。
【０１７１】
他の態様において、クレブシエラ・ニューモニエをターゲティングするために、本明細書に記載する抗体をさらなる抗体とカクテル中で組み合わせ、たとえば、混合物中またはキットのパーツ中で組み合わせ、それによりカクテルはたとえば疾患の改変または防止の併用療法として対象に投与される１種類より多い療法有効薬剤を含有する。
【０１７２】
さらに、本明細書に記載する抗体を１種類以上の他の治療薬または予防薬との組合わせで投与することができ、それには標準処置、たとえば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症阻害薬、および／または他の抗体ベースの療法、たとえば抗細菌薬または抗炎症薬を用いるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
併用療法は特に標準的な計画を用いるもの、たとえばクレブシエラ・ニューモニエによる感染を処置するために用いるものである。これには、抗生物質、たとえばチゲサイクリン、コリスチン、ポリミキシンＢ、およびベータラクタム類（非ベータラクタム系阻害薬を含むかまたは含まない）を含めることができる。
【０１７４】
併用療法において、抗体を混合物として、または１種類以上の他の療法計画と併せて、たとえば併用する療法の前、同時または後に投与することができる。
本明細書に記載する抗体またはそれぞれの医薬製剤の生物学的性質を、エクスビボで細胞、組織、および全生物体(whole organism)実験において解明することができる。当技術分野で知られているように、疾患もしくは疾患モデルに対する処置についての薬物の有効性を測定するために、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性および他の特性を測定するために、薬物をしばしばインビボで、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含めた動物（これらに限定されない）において試験する。それらの動物を疾患モデルと呼ぶことができる。療法薬はしばしばマウスにおいて試験され、それにはヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）が含まれるが、これらに限定されない。そのような実験により、適切な半減期、エフェクター機能、（交差−）中和活性、および／または能動もしくは受動免疫療法に際しての免疫応答性を備えた治療薬または予防薬としてその抗体を使用する可能性を判定するための有意義なデータを得ることができる。いずれかの生物、好ましくは哺乳動物を試験に使用できる。たとえば、霊長類であるサルはヒトに対するそれらの遺伝学的類似性のため適切な療法モデルとなることができ、よって被験薬剤または組成物の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または他の特性を試験するために使用できる。薬物として承認されるためにはヒトにおける試験が最終的には要求されるので、もちろんこれらの実験も考慮する。よって、本明細書に記載する抗体およびそれぞれの療法用組成物をヒトにおいて試験して、それらの治療または予防効果、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を判定することができる。
【０１７５】
特定の場合、患者は免疫無防備状態の患者である。ある免疫無防備状態の患者は、原発性免疫不全または続発性（後天性）免疫不全に罹患する可能性がある。ある免疫無防備状態の患者は免疫抑制療法または化学療法薬で処置されているか、あるいは処置されたことがある。ある免疫無防備状態の患者は移植患者である。
【０１７６】
免疫無防備状態の患者は、食細胞障害に罹患している可能性があり、たとえば食細胞の数の減少および／または機能障害を特徴とする。
以下の障害は食細胞活性の損傷または喪失を引き起こす可能性がある：
食細胞の原発性免疫不全：
１．慢性好中球減少症：
ａ．周期性好中球減少症
ｂ．重篤な先天性好中球減少症
ｃ．シュワヒマン−ダイアモンド(Shwachman-Diamond)症候群
２．白血球接着不全
ａ．１型
ｂ．２型
ｃ．Ｒａｃ  ２欠損症
３．シグナル伝達欠損
ａ．インターフェロン−γおよびインターロイキン−１２の欠損
４．細胞内殺菌作用の欠損
ａ．小児の慢性肉芽腫性疾患
ｂ．ミエロペルオキシダーゼ欠乏症
ｃ．チェディアック-東(Chediak-Higashi)症候群
ｄ．好中球特異的顆粒欠乏症
食細胞の続発性免疫不全：
１．好中球減少症／顆粒球減少症：血中の好中球／顆粒球数の減少（＜１５００個／ｍｌ）
ａ．骨髄疾患（腫瘍浸潤、再生不良性貧血、血液悪性腫瘍、肉芽腫性疾患、放射線照射、骨髄線維症）
ｂ．免疫介在性好中球減少症（ハプテンとして作用する薬物、自己免疫疾患）
ｃ．感染症（細菌性敗血症、マラリア、トキソプラズマ症、ウイルス感染症、たとえばＥＢＶ、ＣＭＶ、インフルエンザ）
ｄ．栄養欠乏症（栄養不良、Ｂ−１２欠乏症）
ｅ．薬物、化学薬品（マクロライド類、プロカインアミド類、フェノチアジド、スルホンアミド類、クロラムフェニコール、アミノピリン、抗−甲状腺薬、たとえばチオウラシル、メチマゾール(methimazol)、チオシアネート、重金属）
ｆ．化学療法、免疫抑制（自己免疫疾患の処置、移植後）
２．食細胞の機能／走化性障害、または食細胞の産生をアップレギュレートする能力の低下
ａ．新生児（ストレス状態下において、新生児期ＰＭＮが正常な食細胞活性および殺微生物活性で機能しない。満期新生児の血液から分離したＰＭＮが走化能および接着能の低下を示す
ｂ．高齢者（食作用能の低下、細胞傷害性、酵素放出、接着性低下
ｃ．糖尿病（ＰＭＮによる殺菌性の低下、単球／マクロファージ機能障害、腎不全および肝硬変
ｄ．トリソミー２１
ｅ．外科手術、外傷
ｆ．コルチコステロイド
ｇ．ＨＩＶ
食細胞の数および機能の障害を伴なう患者を同定するためには、当業者に既知であるいずれか適切な手法を適用できる。これらには完全血球計数、白血球分類計数、末梢血スミア、接着性、走化性、食作用、食細胞の細胞内殺菌性の測定、特異的好中球酵素を測定するための、または好中球に対する自己抗体を検出するためのアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明がそれらに限定されることはない。
【実施例】
【０１７８】
実施例１
実施例１：末梢血メモリーおよび腸エフェクターＢ細胞からの完全ヒト抗−クレブシエラ・ニューモニエ  リポ多糖Ｏ１−抗原−抗体の作製
方法
１．組換え完全ヒトクレブシエラ・ニューモニエＯ−抗原−結合抗体の単離および作製
蛍光体コンジュゲートしたストレプトアビジンを用いるフローサイトメトリーによりＯ−抗原−結合Ｂ細胞を同定して、ヒト末梢血由来のＢ細胞が結合した図３ａに示すビオチニル化Ｏ１−抗原を検出した。
【０１７９】
その後、蛍光活性化セルソーティングを用いてシングルＯ−抗原−結合Ｂ細胞を単離した（図３ｂ）。
１．１  末梢血単核細胞の単離
採取したばかりのヒト末梢血をＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）で室温において１：１希釈し、５０ｍｌ遠心チューブ内の１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に徐々に添加した。細胞を室温で４０分間、最低加速、ブレーキなしで遠心した。水／Ｆｉｃｏｌｌ境界面に存在する細胞をパスツールピペットにより分離し、５０ｍｌ遠心チューブ内で最少限２５ｍｌのＲＰＭＩに室温で再懸濁した。すべての後続工程を４℃で氷上において実施した。細胞を４００ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞を１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ中で洗浄した。トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を対比染色し、Ｔｈｏｍａチャンバーを用いて計数し、その後、４００ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞をさらにフローサイトメトリー用に処理し、あるいは凍結プロトコルに従って直ちに凍結した。
【０１８０】
１．２  粘膜固有層リンパ球の単離
代替源として、たとえばヒト末端回腸外科手術試料から直接単離される粘膜固有層リンパ球(lamina propria lymphocyte)（ＬＰＬ）を使用できる。一般的なプロトコルに従って、すべての細胞を腫瘍または炎症領域から少なくとも３ｃｍ離れた健康な表現型の粘膜から単離する。ピンセットとメスを用いて粘膜および固有層を粘膜筋層(lamina muscularis)から切除する。ＰＢＳ＋（１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２％  ＦＣＳ、１×抗真菌剤／抗生物質（Ｇｉｂｃｏ））中において室温で組織を十分に洗浄する。別に記載しなければ、処理期間全体を通して組織を氷上に保持する。組織を３〜５ｍｍの切片に切断し、残存する結合組織を可能な限り十分に除去する。組織を５０ｍｌ遠心チューブに移し、１×ＰＢＳ＋で３回洗浄し、その後、３７℃の水浴に入れたボトル内で１ｍＭのジチオエリトリオールを含有するＰＢＳと共に定常攪拌下で２×１５分間インキュベートして、残存する粘液を除去する。その後、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳで組織を３回洗浄し、続いて０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳと共に上記に従って３７℃で３分間インキュベートして、上皮を除去する。１×ＰＢＳ＋で洗浄した後、０．２％（ｗ／ｖ）のＤｎａｓｅＩおよび０．５％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼＤ（両方ともＲｏｃｈｅ）を含有する１×ＰＢＳ＋を用いて３７℃で定常攪拌下に１時間、組織を消化する。不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（４０％／７０％，１×ＰＢＳ中に希釈）によりＬＰＬを単離する。４０％／７０％境界面をより良く識別するために、７０％希釈液にフェノールレッドを添加する（１：１０００；Ｇｉｂｃｏ）。それぞれ１５ｍｌの希釈液を５０ｍｌ遠心チューブに添加し、２０ｍｌの細胞懸濁液を勾配の上に徐々に添加する。遠心した後、パスツールピペットを用いてＬＰＬを４０％／７０％境界面から単離し、新たな遠心チューブに入れた最少限２５ｍｌのＲＰＭＩ中へ添加する。すべての後続工程を４℃で氷上において実施する。細胞を４００ｇで１０分間遠心する。上清を廃棄し、細胞を１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ中で洗浄する。Ｔｈｏｍａチャンバーを用いてトリパンブルー対比染色（Ｇｉｂｃｏ）により細胞を計数し、その後、４００ｇで１０分間遠心する。上清を廃棄し、細胞をさらにフローサイトメトリー用に処理し、あるいは凍結プロトコルに従って直ちに凍結する。
【０１８１】
１．３  哺乳動物細胞の凍結
細胞を計数し、熱不活性化したＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈して１×１０７細胞／ｍｌの濃度にした。細胞培養に適したＦＣＳ含有２０％（ｖ／ｖ）無菌ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を新たに調製し、５００μｌを１．８ｍｌのクライオチューブ（凍結保存チューブ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加した。５００μｌの細胞懸濁液を添加して最終濃度５×１０６細胞／ｍｌにし、バイアルを−８０℃でＣｏｏｌｃｅｌｌ（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）を用いて凍結した。
【０１８２】
１．４  フローサイトメトリーのための細胞染色
１．５ｍｌチューブ内で、２％のＦＣＳを含有する１×ＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を用いて、または１種類より多いＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ色素を用いる場合にはＨｏｒｉｚｏｎ染色用緩衝液（ＢＤ）を用いて、フローサイトメトリー細胞染色を実施した。５×１０６細胞／ｍｌを５０μｌの染色ミックス中で３０分間、４℃において暗所で、下記の抗体を用いて染色した：
マウス抗−ヒトＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＣＤ２７−ＰＥ（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＣＤ２７−ＢＶ６０５（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＩｇＧ  ＢＶ５１０（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｖ４５０（ＢＤ）、マウス抗−ヒトＩｇＡ−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ヤギ抗−ヒトＩｇＡ−ＦＩＴＣ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マウス抗−ヒトＣＤ４５−ＶｉｏＧｒｅｅｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびマウス抗−ヒトＣＤ１１ｂ−ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。死細胞を７−ＡＡＤ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により排除した。ビオチニル化Ｏ−抗原画分を２０μｇ／ｍｌの最終濃度で用い、０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検出した。その後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を５００ｇで５分間、４℃で遠心した。上清を廃棄し、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、再び遠心した。ペレットを５０μｌの染色ミックスに再懸濁し、細胞を４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。洗浄のために１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した後、遠心工程を実施した。上清を廃棄し、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、遠心した。上清を除去した後、ＦＡＣＳ緩衝液（２５０〜１０００μｌ）を用いて細胞を希釈し、メッシュ付きキャップを備えたチューブ（ＢＤ）内へ濾過した後に分析またはソーティングした。
【０１８３】
１．５  シングルＯ−抗原−結合Ｂ細胞ソーティング
Ｏ１−抗原−結合メモリーＢ細胞を、シングル７−ＡＡＤ−、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、Ｏ−抗原＋細胞として同定した。シングルセルをＡｒｉａ  ＩＩ計測器（ＢＤ）で３８４ウェルＰＣＲプレート（４ｔｉｔｕｄｅ）内へソーティングした。シングルセルソーティングの後、プレートを直ちにドライアイス上で凍結して−８０℃で保存し、あるいは直接処理した。
【０１８４】
１．６  シングル  ヒトＢ細胞のＩｇ遺伝子シーケンシング
シングル  ヒトＢ細胞の全長Ｉｇ遺伝子を、Tiller et alが記載し、Murugan et al.が改変した方法により得た(T. Tiller et al., Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cell by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods. 329, 112-24 (2008); R. Murugan, K. Imkeller, C. E. Busse, H. Wardemann, Direct high-throughput amplification and sequencing of immunoglobulin genes from single human B cell. Eur. J. Immunol. 45, 2698-700 (2015))。シングルＢ細胞の完全ｃＤＮＡを３８４ウェルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内での逆転写により合成した。ｃＤＮＡを一次３８４ウェルＰＣＲプレートに移した。一次増幅工程の後、一次ＰＣＲ生成物を二次ＰＣＲミックス中に移した。全長Ｉｇ遺伝子を増幅するために用いたプライマーは、先に他の人々が公表している(T. Tiller et al., Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cell by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods. 329, 112-24 (2008), R. Murugan, K. Imkeller, C. E. Busse, H. Wardemann, Direct high-throughput amplification and sequencing of immunoglobulin genes from single human B cells. Eur. J. Immunol. 45, 2698-700 (2015); H. Wardemann et al., Predominant autoantibody production by early human B cell precursors. Science. 301, 1374-7 (2003); J. Benckert et al., The majority of intestinal IgA+ and IgG+ plasmablasts in the human gut are antigen-specific. J. Clin. Invest. 121, 1946-55 (2011))。配列情報はＳａｎｇｅｒシーケンシングにより得られた。
【０１８５】
１．７  組換え完全ヒト  クレブシエラ・ニューモニエＯ−抗原抗体のクローニング
完全ヒト抗体を製造するために、Ｉｇ重鎖および対応するＩｇ軽鎖の遺伝子をまず、それぞれヒトＩｇγ１およびＩｇκまたはＩｇλ発現ベクター内へクローニングした。そのために、Ｉｇ重鎖および対応するＩｇ軽鎖の遺伝子を、一次ＰＣＲ生成物から適切な制限部位を含むＶ−セグメントおよびＪ−セグメント特異的プライマーを用いて特異的に増幅した。Ｉｇ遺伝子ＰＣＲフラグメントを精製し、それぞれの制限酵素を用いて消化した。その後、特異的ＰＣＲ  Ｉｇ遺伝子フラグメントを、それぞれのヒトＩｇ定常領域を含むヒトＩｇγ１およびＩｇκまたはＩｇλ発現ベクター内へライゲートした。Ｉｇγ１発現ベクターはＩｇ定常領域の分泌型スプライスバリアントを備えており、細胞培養上清中への抗体の分泌を可能にした。
【０１８６】
首尾よくライゲートした発現ベクターを増幅するために、ベクターを化学的コンピテント大腸菌(chemically competent E.coli)（ＤＨ１０Ｂ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ形質転換した。陽性クローンを選択するために、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレートに溶液全体を播種し、３７℃で最低１６時間インキュベートした。それぞれの発現ベクター内へ適正に挿入されたことを確認するために、細菌コロニー上で適切なプライマー対を用いてインサートチェックＰＣＲ(Insert check PCR)を実施し、生成物を精製およびＳａｎｇｅｒシーケンシングによる配列決定のために送った（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。まず、得られた配列をそれぞれのＩｇ遺伝子のインフレーム挿入(in-frame insertion)について検査した。その後、配列を二次ＰＣＲ生成物の配列と比較し、インサートチェックＰＣＲ配列中に追加のＰＣＲ−プローン(PCR-prone)点変異が見出されれば除外した。二次ＰＣＲ生成物中に見出された点変異がインサートチェックＰＣＲ配列中に存在しなければ、これらの変異は二次ＰＣＲプロセスの初期に発生した可能性が高いため、これらの変異は解析に含めなかった。適正にクローニングされた発現ベクターを増幅するために、適正なプラスミドを保有する細菌を、１３ｍｌの培養チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内の７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４ｍｌのＴＢ（Ｇｉｂｃｏ）中へ接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで最低１６時間、増殖させた。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ）を用い、製造業者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１８７】
１．８  組換え完全ヒト  クレブシエラ・ニューモニエＯ１−抗原抗体の発現
それぞれ接着性および非接着性ヒト胎児腎(human embryonic kidney)２９３細胞であるＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクションにより、完全ヒトＩｇＧ１抗体を製造した。
【０１８８】
１．８．１  哺乳動物細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔは３７℃で５％  ＣＯ２中において、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳおよび１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を含有する２５ｍｌのＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ培地中で培養され、それに対しＨＥＫ２９３Ｓ細胞は３７℃で５％  ＣＯ２中において、２０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養された；１８０ｒｐｍで５０ｍｌのＢｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＴＰＰ）内において。
【０１８９】
１．８．２  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＰＥＩ仲介トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過性の遺伝子伝達にカチオンポリマーＰＥＩを用いた。そのために、１０〜１５μｇのＩｇＨベクターをそれに対応する等量のＩｇＬベクターと混合し、総ＤＮＡ  ５０μｌ／μｇの１５０ｍＭ無菌塩化ナトリウム溶液を添加した。その後、ＰＥＩ［０．６ｍｇ／ｍｌ］を３：１（ｗ／ｗ）のＤＮＡ：ＰＥＩ比で添加した。溶液を直ちに１０秒間ボルテックス攪拌し、室温で１０分間インキュベートした。その間に、予め３７℃に加温した１０ｍｌのＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘでプレートを洗浄して、残存するウシ血清抗体を除去した。そうして、予め加温した２５ｍｌの発現培地（ＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ；１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）および１×無血清培地サプリメントＮｕｔｒｉｄｏｍａ（Ｒｏｃｈｅ）を含有）を添加し、さらに使用するまで細胞を３７℃で５％  ＣＯ２中においてインキュベートした。この後、トランスフェクションミックスを細胞に滴加し、細胞を３．５日間インキュベートした。その後、上清中に分泌された抗体を採集し、細胞を再び２５ｍｌの発現培地と共にインキュベートした。上清を４０００ｇで遠心して細胞屑を除去し、無菌の５０ｍｌ遠心チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内へ移した。
【０１９０】
１．８．３  ＨＥＫ２９３Ｓ細胞のＰＥＩ仲介トランスフェクション
カチオンポリマーＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｓ細胞を一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、１０ｍｌのＨＥＫ２９３Ｓ細胞を１．５×１０６細胞／ｍｌでＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地に播種した。１６時間後、Ｔｈｏｍａチャンバーを用いて細胞数はおおよそ２．５×１０６細胞／ｍｌと判定された。そうして、１０〜１５μｇのＩｇＨベクターをそれに対応する等量のＩｇＬベクターと混合し、細胞懸濁液に添加した。その後、細胞をさらに５分間インキュベートした。調製した細胞をトランスフェクトするために、ＰＥＩ［０．６ｍｇ／ｍｌ］を３：１（ｗ／ｗ）のＤＮＡ：ＰＥＩ比で添加した。２４時間後、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する１０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）を細胞に添加し、３７℃で５％  ＣＯ２中において５日間、インキュベートした。上清を４０００ｇで遠心して細胞屑を除去し、無菌の５０ｍｌ遠心チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内へ移した。
【０１９１】
１．９  抗体精製
分泌された抗体を細胞培養上清から精製するために、抗体を含有する上清１０ｍｌ当たり１２．５μｌのプロテイン−Ｇ結合ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、４０００ｇ、４℃で１０分間の遠心により５０ｍｌの氷冷した無菌１×ＰＢＳ，ｐＨ＝７．４（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。上清を慎重にビーズから分離し、１００μｌ／試料の適宜な体積を遠心チューブ内に残し、抗体上清に添加した。この混合物を少なくとも１２時間、４℃でローテータ(rotator)上においてインキュベートした。その後、４０００ｇ、４℃で１０分間、遠心し、上清を慎重に分離することによりビーズを採集し、必要であれば新たな無菌の５０ｍｌ遠心チューブ内へ添加した。２ｍｌの氷冷ＰＢＳで平衡化したクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にビーズを添加した。重力流により、または親指で圧力をかけることによりカラムを空にした。ビーズを１．５ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗浄した。そうして、４５０μｌの無菌０．１Ｍグリシン，ｐＨ＝３を３分間適用する低ｐＨパルスにより、抗体はプロテイン−Ｇから１．５ｍｌチューブ内へ放出され、１：１０当量の無菌１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液，ｐＨ＝８を添加することによりその溶液を緩衝化した。２２５μｌのグリシン溶液を用いてこの操作を繰り返し、第２の無菌１．５ｍｌチューブ内へ溶離した。おおよそ１０μｌの溶液をｐＨ指示薬小片（Ｓｉｇｍａ）上に添加することにより、溶液のｐＨ＝７．４〜８．０を確認した。
【０１９２】
１．１０  抗体濃度測定
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により精製画分中の抗体濃度を測定した。そのために、９６ウェル高結合性プレート（Ｃｏｓｔａｒ）をヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−フラグメント特異的捕獲抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）の１：５００希釈液５０μｌで、４℃において少なくとも１２時間コーティングした。そうして、プレートを脱イオン水で３回洗浄し、ウェル当たり２００μｌのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ，０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０および１ｍＭのＥＤＴＡ）を１時間添加した。さらに３回洗浄した後、プレートを８つの５０μｌ  １：２．５抗体系列希釈液（ＰＢＳ中）と共にインキュベートし、１時間インキュベートした。１μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌから出発したヒト血漿由来ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の２つの系列希釈液を基準として用いた。洗浄した後、５０μｌの１：１０００  ＨＲＰカップリングしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ二次抗体を１時間添加した。追加洗浄工程の後、１００μｌのＨＲＰ  ＡＢＴＳ基質を添加し、結合した抗体の量を４０５ｎｍにおける光学濃度として検出した。
【０１９３】
２．  抗体反応性測定
精製したモノクローナル抗体を、クレブシエラ・ニューモニエＬＰＳ  Ｏ１  Ｏ−抗原への結合についてＥＬＩＳＡまたはＩｍｍｕｎｏＢｌｏｔにより試験した。
【０１９４】
２．１  Ｏ−抗原ＥＬＩＳＡ
ビオチニル化Ｏ−抗原試料を固定化するために、高結合型９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）をＰＢＳ中１ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＮＥＢ）５０ｕｌで一夜コーティングした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した後に、クレブシエラ・ニューモニエ血清型Ｏ１（株ＡＴＣＣ４３８１６，図３ａに示す構造を特徴とするＯ１抗原）の精製ＬＰＳから調製した２μｇ／ｍｌのビオチニル化Ｏ−多糖５０μｌを添加した。
【０１９５】
室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ  ２００μｌと共に室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、出発濃度４μｇ／ｍｌの組換えヒトＩｇＧ１抗体の１：４系列希釈液をプレートに室温で１時間添加した。追加洗浄工程の後、ブロッキング緩衝液中に希釈した１：１０００のＨＲＰカップリングしたヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ）二次抗体５０μｌを用いて、濃度依存性結合を検出した。洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ  ＡＢＴＳ基質を添加し、４０５ｎｍにおける光学濃度として抗体結合を検出した。先に解明された非−多重反応性成熟ナイーブ抗体(Wardemann et al. Science 2003, 301(5638):1374-7)を陰性対照として用いた。
【０１９６】
２．２  ストレプトアビジンＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡにより、無関係なタンパク質であるストレプトアビジンへの結合によって抗原結合の特異性を判定した。Ｏ−抗原ＥＬＩＳＡセクションの記載に従ってＥＬＩＳＡを実施し、ただしプレートをビオチニル化Ｏ−抗原希釈液と共にインキュベートする代わりに１×ＰＢＳを用いた。
【０１９７】
２．３  全ＬＰＳイムノブロット：
２ｕｇ  ＬＰＳ／試料のクレブシエラ・ニューモニエＯ−血清型をＳＤＳ含有−装填色素（ＮＥＢ）中に希釈し、９５℃に５分間加熱した後、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａｎｙＫｄ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に適用した。ＬＰＳをニトロセルロース膜上へ転写し、膜の完全乾燥により固定した。膜の再活性化および追加洗浄工程の後、膜をＴＢＳ中の４％  ＢＳＡ溶液に一夜入れた。そうして、膜をメスで適宜な切片に切断し、ＴＢＳ中２ｕｇ／ｍｌのモノクローナルヒトＩｇＧ１抗体溶液中において室温で１．５時間インキュベートした。その後、膜をＴＢＳで５分間、２回洗浄し、ＨＲＰカップリングした抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体（１：１００００；１％  ＢＳＡを含有するＴＢＳ中）と共にインキュベートした。ＴＢＳで５分間、３回洗浄した後、ルミノールベースの検出（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて結合を検出した。
【０１９８】
２．４  Ｉｇ遺伝子解析：
ＩＭＧＴまたはＫａｂａｔ  ＣＤＲ定義を用いるＮＣＢＩ  Ｉｇ  Ｂｌａｓｔに埋め込まれたＩＧＭＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２．１のＩｇ遺伝子基準データベースを用いて、ヒトＩｇ遺伝子を同定した(M.-P. Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp. Immunol. 27, 55-77 (2003))。ベストマッチ(best matched)生殖細胞系列ヒットを同定した。プライマー結合領域の末端からＩＧＨＶ、ＩＧＫＶ、またはＩＧＬＶ遺伝子の末端までの体細胞超変異(somatic hypermutation)（ＳＨＭ）を計数した。挿入または欠失は、それらの長さに関係なく１つのＳＨＭとして計数された。
【０１９９】
２．５  バイオインフォマティクス：
Ｐｒｉｓｍ  ｖ６，Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ６  ｖ１６．０．３（Ａｄｏｂｅ）、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６（Ａｄｏｂｅ）、およびＲを用い、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いて、プロットを作成した(H. Wickham, ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis (Springer-Verlag New York, 2009))。
【０２００】
結果
完全ヒト抗−クレブシエラ・ニューモニエＯ１−抗原抗体
ビオチニル化抗原は、それらの検出のために蛍光体カップリングしたストレプトアビジンと組み合わせて、フローサイトメトリーを用いるタンパク質抗原反応性Ｂ細胞の同定および単離のために広く適用されている(J. F. Scheid et al., A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. J. Immunol. Methods. 343, 65-7 (2009); O. L. Rojas, C. F. Narvaez, H. B. Greenberg, J. Angel, M. A. Franco, Characterization of rotavirus specific B cells and their relation with serological memory. Virology. 380, 234-42 (2008); P. F. Kerkman et al., Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 75, 1170-1176 (2016))。
【０２０１】
ここでは、ビオチニル化クレブシエラ・ニューモニエＯ１  Ｏ−多糖をベイトとして用い、ストレプトアビジンコンジュゲートした蛍光体を多糖抗原反応性Ｂ細胞の同定および単離のために用いた（図３ａ）。ヒト末梢血メモリーＢ細胞プール内のＯ−抗原−結合メモリーＢ細胞の稀な集団をフローサイトメトリーにより検出できた（図３ｂ）。シングルＯ１−抗原−結合Ｂ細胞を蛍光活性化セルソーティングにより単離し、それらのそれぞれのＩｇ重鎖および関連するＩｇ軽鎖の遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＳａｎｇｅｒシーケンシングによりＩｇ遺伝子情報を得た。データは、末梢血中の大部分のＯ１−抗原−反応性Ｂ細胞が、種々の程度のＩＧＨＶ遺伝子体細胞超変異を伴なう抗体を発現することを示す（図３ｃ）。２つのモノクローナル抗体をクローニングし、それぞれＩｇＭおよびＩｇＡ  Ｂ細胞（ＫｃＰＢＯ１−１９６（本明細書中でＭＰＧ−１９６とも呼ぶ）およびＫｃＰＢＯ１−０８４）からＩｇＧ１として組換え発現させた。両方の抗体がＩＧＨＶ３ファミリーの遺伝子によりコードされ、平均を上回るレベルの体細胞超変異を示した。両方の抗体が、ＥＬＩＳＡにおいてビオチニル化Ｏ−抗原ベイトに、およびイムノブロットにおいて全Ｏ１  ＬＰＳに濃度依存性結合を示した（図３ｄおよび図３ｅ）が、ストレプトアビジンとはＥＬＩＳＡによって検出できるレベルの反応性がなかった（図３ｆ）。よって、両方の抗体がクレブシエラ・ニューモニエＯ１  Ｏ−抗原特異的であると結論された。Ｉｇ遺伝子フィーチャーを図３ｇに示す表に提示する。
【０２０２】
実施例２：クレブシエラ・ニューモニエＯ１ヒトｍＡｂのエピトープ
Ｏ１血清型ＬＰＳ分子は２つの異なるＯ−抗原（すなわち、細胞に繋ぎ留められたリピドＡ−コアに近接しているＤ−ガラクタン−Ｉ、およびＤ−ｇａｌ−ＩをキャッピングしているＤ−ガラクタン−ＩＩ）をもち、それらのうちＤ−ｇａｌ−ＩＩのみがＯ１に特異的である。血清型を決定するＤ−ｇａｌ−ＩＩエピトープに前記のＯ１特異的ヒトｍＡｂが結合するかどうかを判定するために、ｍＡｂに対する種々のクレブシエラ・ニューモニエ血清型の反応性を試験した。分離した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）抽出した精製ＬＰＳ分子をＰＶＤＦ膜にブロットしたものを用いるイムノブロットで、ｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６の結合特異性を確認した（図４）。ｍＡｂを１μｇ／ｍｌの濃度で１時間反応させた。ＨＲＰ−標識した抗−ヒトＩｇＧ二次抗体およびルミノグラフィー(luminography)を用いてブロットを現像した。Ｏ１特異的ｍＡｂはＬＰＳタイプＯ１の長分子量ＬＰＳ画分のみを染色し、これはガラクタン−ＩＩエピトープへの特異的結合を示唆した。Ｏ２タイプＬＰＳ分子への結合が無いことにより、この特異性が確認された（ガラクタン−Ｉまたはガラクタン−ＩＩＩ、すなわち血清型Ｏ１の他のＯ−抗原反復単位は、Ｏ１およびＯ２（ガラクタン−Ｉ）またはＯ２Ｖ（ガラクタン−ＩＩＩ）タイプＬＰＳ分により共有されているからである）。
【０２０３】
実施例３：Ｏ１  ｍＡｂは莢膜タイプに関係なく細菌表面に結合できる
ｍＡｂは表面に結合してＦｃ−依存性エフェクター機能を誘導すると判定されている。クレブシエラ・ニューモニエは、高い構造変動性を示す多量に存在する莢膜多糖（ＣＰＳ）によりそれの表面分子を遮蔽している。それでもなお、見出されたＯ１−特異的ｍＡｂは種々のＣＰＳコートの存在下で効率的に細菌表面に結合できることが示された。
【０２０４】
種々の莢膜タイプを発現しているクレブシエラ・ニューモニエＯ１株の対数中期培養物を４０μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６で染色し、その後、Ａｌｅｘａ  ４８８で標識した二次抗−ヒトＩｇＧで染色した。さらに５ｎＭ  Ｓｙｔｏ６２色素（ＤＮＡ−染色）と共にインキュベートすることにより、細菌集団の同定が可能になった。蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。図５Ａにまとめるように、莢膜タイプ（Ｋ−抗原）に関係なくすべてのＯ１株がＭＰＧ−１９６で強く染色された。さらに、３つの異なるＯ１：Ｋ２株に対するＭＰＧ−１９６の結合を、他のＯ１−特異的ｍＡｂ（８Ｅ９と呼ばれる低親和性ネズミ−ヒト  キメラ比較ｍＡｂ）のものと比較した。Ｋ２莢膜は最も厚い莢膜タイプであると考えられ（染色によっても確認される−図５Ａ）、それはしばしば臨床分離株に付随する。両方のｍＡｂがすべてのＯ１：Ｋ２株の表面に結合できたが、すべての株においてＭＰＧ−１９６による染色の方が高かった（図５Ｂ）。
【０２０５】
実施例４：菌血症のネズミモデルにおける防御能力
精製したヒト（ＭＰＧ−１９６）またはネズミ−ヒト  キメラ（８Ｅ９）ｍＡｂの防御効果をクレブシエラ・ニューモニエ菌血症のネズミモデルにおいて試験した（図６）。マウス５匹のグループを２または１０μｇのｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６および８Ｅ９で腹腔内免疫化した。対照グループには５０μｇの無関係な特異性をもつアイソタイプ適合ｍＡｂを投与した。２４時間後、動物を致死量（５×１０６ＣＦＵ）のクレブシエラ・ニューモニエＯ１：Ｋ２株ＡＴＣＣ  ４３８１６で攻撃した。致死率を１日１回、１４日間モニターした。ＭＰＧ−１９６は両方の用量で完全防御を示したが、比較Ｏ１特異的ｍＡｂ（８Ｅ９）はこのモデルにおいて有意ではない防御（１０μｇ／マウスで）または無防御（２μｇ／マウスで）を示した。同様に、以前にレポートされたＯ１−特異的ｍＡｂ(2)は、類似の致死的ネズミモデルにおいて８００ｕｇ／マウスという高い用量で部分的防御を誘導できたにすぎない（より低い用量では有意ではない防御）。したがって、ＭＰＧ−１９６の防御効果は現在までにレポートされているＯ１−特異的ｍＡｂのうちで卓越していると思われる。
【０２０６】
実施例５：食作用依存性殺細菌活性
クレブシエラ・ニューモニエ株は食作用能が限られている免疫無防備状態の患者に感染する傾向があるので、直接的な殺細菌活性をもつｍＡｂを同定するのが有利であると考えた。ｍＡｂの食作用とは無関係な補体仲介殺細菌活性を、血清殺細菌アッセイ（ＳＢＡ，図７）において試験した。Ｏ１−特異的ヒト化ｍＡｂ  Ｇ２−２７およびＧ２−３３（ヒト化した中等度親和性型の８Ｅ９）ならびにそれらの親であるネズミ−ヒト  キメラｍＡｂ（８Ｅ９）は、用量依存性の補体仲介殺細菌活性を誘導した。ヒトｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６は、低い方の試験用量で卓越した殺細菌活性を誘導した。無関係なアイソタイプ適合ｍＡｂを用いた場合、または用いた血清を熱不活性化（５６℃で３０分間）した場合（示していない）には殺細菌活性がみられず、抗体依存性の補体仲介殺菌が確証された。
【０２０７】
実施例６：エンドトキシン中和
抽出したＯ１  ＬＰＳ分子のエンドトキシン活性の中和を、ＴＬＲ−４シグナル伝達についてレポートする市販の細胞系（ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）において実施した（図８）。ポリミキシンＢ、すなわちリピドＡ−結合効力が証明されている小型の抗生物質を陽性対照として用い、一方、無関係なアイソタイプ適合ｍＡｂを陰性対照として用いた。ＭＰＧ−１９６は、基準ｍＡｂ  Ｇ２−２７およびＧ２−３３と異なり、用量依存性のエンドトキシンシグナル伝達中和を示した。阻害は６０〜７０％でプラトーに達し、それはガラクタン−ＩＩに対する特異性に起因していた（すなわち、外側ガラクタン−ＩＩ抗原を欠如するＬＰＳ分子は中和されなかった）。
【０２０８】
インビトロでみられた部分的なエンドトキシン活性中和が何らかのインビボ関連性をもつかどうかを査定するために、同じｍＡｂをエンドトキセミアのマウスモデルにおいて防御効果について試験した（図９）。マウスのグループを１０または１００μｇの種々のｍＡｂで受動免疫化した。２４時間後にマウスをＧａｌＮによりエンドトキシンに対して感作させ(6)、同時に致死量（２×１０３ＣＦＵ）の菌株＃２０２で攻撃した。生存率を１４日間モニターした。ｍＡｂ  ＭＰＧ−１９６は、それぞれ低用量および高用量で部分的または完全な防御を示した。ｍＡｂ  Ｇ２−３３は、高い方の用量で部分的防御を示したにすぎず、一方、Ｇ２−２７はいずれの用量でも何ら防御を誘導できなかった。
【０２０９】
実施例７：Ｏ１特異的ｍＡｂの結合特性
ビオチニル化Ｏ１抗原への結合を、ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ計測器（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定した。図３ａに模式的に示したビオチニル化Ｏ１−多糖（５μｇ／ｍｌ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサー（ｆｏｒｔｅＢＩＯ，Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に固定化して、約０．５ｎｍのセンサー装填量にした。抗体（６６．７ｎＭ）の会合を、３０℃の溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２  プラス  １％  ＢＳＡ）中で６００秒間モニターした。センサーを次いで同じ緩衝液に６００秒間浸漬して、抗体の解離をモニターした。完全当てはめまたは部分当てはめのいずれかを用いて、会合相と解離相のそれぞれの進行曲線を１対１結合モデルに同時に当てはめることにより、動態速度定数（ｋｏｎおよびｋｄｉｓ）を決定した（ｆｏｒｔｅＢＩＯ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）。解離定数（Ｋｄ値）をｋｄｉｓ／ｋｏｎとして計算した。
【０２１０】
Ｏ１多糖抗原に対するｍＡｂのアビッド結合親和性を、アビッド状態設定でのバイオレイヤー干渉法により測定した；その際、ビオチニル化Ｏ１抗原をセンサーに固定化し、二価抗体を溶解した。１対１結合モデルへのデータ当てはめにより、ＭＰＧ−１９６について低ｎＭ範囲（約４ｎＭ）での、ならびにＧ２−２７およびＧ２−３３について高ｎＭ範囲（３００〜７００）での、アビッド相互作用に関する見掛けの解離定数が得られる。ＭＰＧ−１９６の約２  ｌｏｇ高い親和性は、本質的にはより低いｋｄｉｓｓによるものである（下記の表を参照）。
【０２１１】
表：精製ビオチニル化Ｏ１抗原に対する抗−クレブシエラＯ１  ｍＡｂの結合（ＢＬＩ）パラメーター；抗原装填量０．５ｎｍおよびｍＡｂ濃度６７ｎＭ，ＰＢＳ，ｐＨ７．２  プラス  １％  ＢＳＡ中，３０℃。部分当てはめを用いてデータを１対１結合モデルに当てはめることにより、会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）速度定数を決定した；ＭＰＧ−１９６（完全当てはめ）を除く。多重測定を行なった場合、数値を平均±標準偏差として示す。
【０２１２】
【表１】
2019531060.tif 000002
【０２１３】
参考文献
1. Held TK, Jendrike NR, Rukavina T, Podschun R, Trautmann M. 2000. Binding to and opsonophagocytic activity of O-antigen-specific monoclonal antibodies against encapsulated and nonencapsulated Klebsiella pneumoniae serotype O1 strains. Infect.Immun. 68:2402-2409.
2. Rukavina T, Ticac B, Susa M, Jendrike N, Jonjic S, Lucin P, Marre R, Doric M, Trautmann M. 1997. Protective effect of antilipopolysaccharide monoclonal antibody in experimental Klebsiella infection. Infect.Immun. 65:1754-1760.
3. Trautmann M, Ruhnke M, Rukavina T, Held TK, Cross AS, Marre R, Whitfield C. 1997. O-antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolates and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Clin.Diagn.Lab Immunol. 4:550-555.
4. Whitfield C, Richards JC, Perry MB, Clarke BR, MacLean LL. 1991. Expression of two structurally distinct D-galactan O antigens in the lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae serotype O1. J.Bacteriol. 173:1420-1431.
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【図１−１】
2019531060.tif 000003
【図１−２】
2019531060.tif 000004
【図２−１】
2019531060.tif 000005
【図２−２】
2019531060.tif 000006
【図３−１】
2019531060.tif 000007
【図３−２】
2019531060.tif 000008
【図３−３】
2019531060.tif 000009
【図４】
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【図５】
2019531060.tif 000011
【図６】
2019531060.tif 000012
【図７】
2019531060.tif 000013
【図８】
2019531060.tif 000014
【図９】
2019531060.tif 000015
【配列表】
2019531060000001.xml
【国際調査報告】
2019531060.tif 000026
2019531060.tif 000027
2019531060.tif 000028
2019531060.tif 000029
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