(57)【要約】本開示の主題は、腸神経堤系統細胞への幹細胞の分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、およびこのような方法による腸神経堤系統細胞を提供する。本開示の主題はまた、腸神経系障害（例えば、ヒルシュスプルング病）を予防および／または処置するため、ならびに腸神経系障害（例えば、ヒルシュスプルング病）を予防および／または処置するために適した化合物をスクリーニングするための、このような腸神経堤系統細胞の使用を提供する。
2019503679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約１１日目またはそれより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞集団を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触させるステップを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記分化細胞集団が、１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
さらに前記分化細胞を１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記分化細胞を前記腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な前記条件が、前記分化細胞を適切な細胞培養培地中で培養することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへの腸神経堤（ＥＮＣ）前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記分化細胞が、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む前記適切な細胞培養培地中で約４日間培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、
幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、および
さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるステップ
の後に幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
【請求項４１】
前記細胞集団が、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触される、請求項４０に記載の分化細胞集団。
【請求項４２】
前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、請求項４０または４１に記載の分化細胞集団。
【請求項４３】
前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に行われる、請求項４２に記載の分化細胞集団。
【請求項４４】
前記幹細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に行われる、請求項４３に記載の分化細胞集団。
【請求項４５】
前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、約１１日目またはそれより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項４６】
前記幹細胞集団が、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項４７】
前記幹細胞集団が、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触される、請求項４６に記載の分化細胞集団。
【請求項４８】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項４９】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に行われる、請求項４８に記載の分化細胞集団。
【請求項５０】
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に行われる、請求項４８に記載の分化細胞集団。
【請求項５１】
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項５２】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項５３】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、請求項４０から５２のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項５４】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項４０から５３のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項５５】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４０から５４のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項５６】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４０から５４のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項５７】
前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触される、請求項５６に記載の分化細胞集団。
【請求項５８】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、請求項５７に記載の分化細胞集団。
【請求項５９】
前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触される、請求項５６に記載の分化細胞集団。
【請求項６０】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、請求項５９に記載の分化細胞集団。
【請求項６１】
前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、請求項５６または６０に記載の分化細胞集団。
【請求項６２】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、請求項５６または６０に記載の分化細胞集団。
【請求項６３】
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、請求項４０から６２のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項６４】
前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる、請求項４０から６３のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項６５】
前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、請求項６４に記載の分化細胞集団。
【請求項６６】
１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する、請求項４０から６５のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項６７】
前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、請求項６６に記載の分化細胞集団。
【請求項６８】
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項４０から６７のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項６９】
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項４０から６７のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項７０】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の分化細胞集団を含む、組成物。
【請求項７１】
１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
【請求項７２】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、適切な細胞培養培地中で培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、請求項７１に記載の分化細胞集団。
【請求項７３】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、適切な細胞培養培地中で少なくとも約１日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、請求項７１または７２に記載の分化細胞集団。
【請求項７４】
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む、請求項７３に記載の分化細胞集団。
【請求項７５】
前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、請求項７４に記載の分化細胞集団。
【請求項７６】
前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、ＧＤＮＦ、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、請求項７５に記載の分化細胞集団。
【請求項７７】
前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む、請求項７６に記載の分化細胞集団。
【請求項７８】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む適切な細胞培養培地中で約４日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞集団から誘導される、請求項７７に記載の分化細胞集団。
【請求項７９】
前記適切な細胞培養培地が、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む、請求項７２から７６のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項８０】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団が、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む適切な細胞培養培地中で約１０日間、約２５日間、または約４５日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞集団から誘導される、請求項７９に記載の分化細胞集団。
【請求項８１】
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項８２】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項８３】
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、請求項７１から８２のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
【請求項８４】
１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する請求項７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、組成物。
【請求項８５】
対象の腸神経系障害を予防および／または処置する方法であって、腸神経系障害に罹患している対象に、有効量の、以下：
（ａ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団、
（ｂ）請求項７０に記載の組成物、
（ｃ）１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する請求項７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団、および
（ｄ）請求項８４に記載の組成物
の１つを投与するステップを含む、方法。
【請求項８６】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する、請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項８８】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項８７に記載の分化細胞集団。
【請求項８９】
腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
【請求項９０】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項８９に記載の使用。
【請求項９１】
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、請求項７０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する、請求項７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項９４】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項９３に記載の細胞集団。
【請求項９５】
腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する請求項７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
【請求項９６】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項９５に記載の使用。
【請求項９７】
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９８】
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
ヒルシュスプルング病、ヒルシュスプルング病関連遺伝的欠陥、および／または別の腸神経系障害を予防および／または処置するのに適した化合物を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団、１種または複数の腸神経のマーカーを発現する請求項７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団、およびそれらの組合せから選択される細胞集団によって提示される少なくとも１つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、事前分化した幹細胞が、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）においてホモ接合性機能喪失変異を含む、方法。
【請求項１００】
（ａ）（ｉ）前記細胞集団、および（ｉｉ）試験化合物を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、
（ｃ）前記細胞集団の遊走挙動を測定するステップと
を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞集団が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞集団が、前記試験化合物と少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間接触される、請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、
（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および
（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含む指示書
を含む、キット。
【請求項１０４】
前記指示書が、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるための指示を含む、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、請求項１０３または１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、請求項１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を含む、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０９】
前記指示書が、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるための指示を含む、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、請求項１０３から１０９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１１】
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるための指示を含む、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１０３から１１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１４】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１０８から１１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１５】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、請求項１０３から１１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１０３から１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１９】
迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子を含む、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１２０】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種を含む、請求項１１８に記載のキット。
【請求項１２２】
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子である、請求項１２１に記載のキット。
【請求項１２３】
前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、請求項１２２に記載のキット。
【請求項１２４】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、請求項１２２に記載のキット。
【請求項１２５】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含み、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、方法。
【請求項１２６】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、さらに、前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるステップの後に幹細胞集団から誘導され、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、分化細胞集団。
【請求項１２８】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、請求項１２７に記載の分化細胞集団。
【請求項１２９】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させ、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるための指示を含む指示書を含む、キット。
【請求項１３０】
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約７０％が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、
前記細胞集団の約１５％未満が、幹細胞マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
【請求項１３２】
前記腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される、請求項１３１または１３２に記載の組成物。
【請求項１３４】
前記ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、請求項１３１から１３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、請求項１３１から１３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３６】
前記ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、請求項１３１から１３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、請求項１３１から１３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される、請求項１３１から１３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約１×１０４〜約１×１０１０個の細胞集団を含む、請求項１３１から１３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約７０％が、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、
前記細胞集団の約１５％未満が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
【請求項１４１】
前記腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、請求項１４０または１４１に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される、請求項１４０から１４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、請求項１４０から１４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、請求項１４０から１４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、請求項１４０から１４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、請求項１４０から１４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される、請求項１４０から１４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する約１×１０５〜約１×１０７個の細胞集団を含む、請求項１４０から１４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５０】
ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、対象に有効量のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項１５１】
前記ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ２８８６７２１、ＬＹ２８１１３７６、ベルベセスタット（ＭＫ−８９３１）、およびＡＺＤ３８３９からなる群から選択される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ＢＡＣＥ２の阻害剤が、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（ＢＡＣＥ阻害剤Ｃ３）である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、対象に有効量の酸性プロテアーゼの阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項１５５】
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡ、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびＬＹ−４５０１３９からなる群から選択される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、ＢＡＣＥ阻害剤の使用。
【請求項１５８】
ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１２月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／３８７，４６８号に基づく優先権を主張しており、その内容は、その全体が参考として援用され、そしてそれに基づく優先権が主張される。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ型式で電子的に提出された、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年１２月２０日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「０７２７３４０４５１Ｓｅｑｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名され、１，１６２バイトのサイズである。
【０００３】
１．緒言
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から誘導された腸神経堤系統細胞、および腸神経系疾患、例えばヒルシュスプルング病の細胞ベースの処置および薬物の発見のための腸神経堤系統細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．主題の背景
腸神経系（ＥＮＳ）は、正常な胃腸管（ＧＩ）機能にとって非常に重要である。ＥＮＳは、３０種を超える異なる神経伝達物質を発現する細胞を有し、脊髄のニューロン数を凌ぐニューロン数を有する、自律神経系の最大で最も多様な構成成分である１。ＥＮＳは、大部分が脳および脊髄からの入力とは独立に機能することができ、したがって、その自律性および複雑な細胞構築を前提として、「第２の脳」１と呼ばれている。ＥＮＳ発生の欠損は、ヒルシュスプルング病（ＨＤ）を含む様々なヒト障害２の原因になる。ＨＤは、ＧＩ管、特に遠位結腸に遊走するＥＮＳ前駆細胞の発生不全によって引き起こされた衰弱性遺伝障害である３。ヒトＥＮＳ系統の発生は、適切なモデル系が欠如しており、主要組織へのアクセスが制限されていることにより、まだ理解が深まっていない。
【０００５】
神経堤（ＮＣ）を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）系統を誘導するための小分子ベースのプロトコールは、既に確立されている４〜７。しかし、多大な努力や、ＧＩ障害の重要な医学的意味にもかかわらず、ヒトＥＮＳ系統のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘導は、依然として獲得しにくい。したがって、ヒト幹細胞からＥＮＳ前駆体を直接的に産生するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法およびプロトコールが依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
３．主題の概要
本開示の主題は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によって、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から誘導された腸神経堤系統細胞に関する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、幹細胞集団を、有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および有効量のウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約８日以内に、前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記細胞集団と有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、幹細胞集団と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる。明確にするために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同日、またはその１日後、または２日後、または３日後に添加され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、９６時間以内に接触する。
【０００９】
本明細書に記載される期間において、１種または複数の薬剤は、同日（同じ２４時間以内）に添加される場合、本明細書で別途定める場合を除き、任意の順序で添加され得る。
【００１０】
本開示の主題はまた、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるステップを含む方法によって、幹細胞集団から誘導される。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約８日以内に、前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるステップを含む方法によって、幹細胞集団から誘導される。ある特定の実施形態では、前記細胞集団と有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、幹細胞集団と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
【００１２】
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、および（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子を含む。ある特定の実施形態では、キットはさらに、（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、有効量の前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含む指示書を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、前記指示書は、（ｉ）前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示、および（ｉｉ）前記幹細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約０日〜４日以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるステップを含む。
【００１４】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子の最初の接触日から始まる約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触後、少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触後、約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、前記幹細胞集団は、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、約１１日目またはそれより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している。
【００１８】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記幹細胞集団を、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるステップを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記幹細胞集団と、有効量の前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日（同じ２４時間以内）に、前記幹細胞集団を、有効量の前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する。ある特定の実施形態では、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【００２５】
ある特定の実施形態では、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子は、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレンからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、迷走神経堤パターン形成を誘導する分子は、レチノイン酸である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、前記幹細胞集団は、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導するレチノイン酸と接触される。ある特定の実施形態では、前記幹細胞集団は、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触される。ある特定の実施形態では、前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、前記Ｗｎｔ活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、前記迷走神経堤パターン形成は、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（homoebox）（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子は、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される。
【００２８】
ある特定の実施形態では、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーは、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、前記分化細胞集団は、１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する。ある特定の実施形態では、前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーは、ＣＤ４９Ｄである。
【００２９】
ある特定の実施形態では、前記幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある特定の実施形態では、前記幹細胞は、非ヒト幹細胞、例えば、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞等である。ある特定の実施形態では、前記幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原（primoridal）胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞からなる群から選択される。
【００３０】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記分化細胞を腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を適切な細胞培養培地中で培養することを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、腸ニューロンへの腸神経系前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへの腸神経系前駆体の成熟を増強する前記１種または複数の分子は、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、前記成長因子は、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子（「ＦＧＦ活性化因子」）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、少なくとも１日間接触させることを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と約４日間接触させることを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約１０日間、約１５日間、または約４５日間接触させることを含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、前記分化細胞集団は、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する。ある特定の実施形態では、前記１種または複数の腸ニューロンマーカーは、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される。
【００３２】
本開示の主題はさらに、対象の腸神経系障害を予防および／または処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載される有効量の分化細胞集団を、腸神経系障害に罹患している対象に投与するステップを含む。
【００３３】
本開示の主題はさらに、対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、本明細書に記載される分化細胞集団を提供する。
【００３４】
本開示の主題はさらに、腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、本明細書に記載される分化細胞集団の使用を提供する。
【００３５】
ある特定の実施形態では、腸神経系障害は、ヒルシュスプルング病である。
【００３６】
ある特定の実施形態では、腸神経系障害は、中毒性巨大結腸症である。
【００３７】
さらに、本開示の主題は、ヒルシュスプルング病、および／またはヒルシュスプルング病関連遺伝的欠陥、および／または別の腸神経系障害を予防および／または処置するのに適した化合物を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載される分化細胞および／または分化細胞集団（１種もしくは複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団、および／または１種もしくは複数の腸ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団）によって提示される少なくとも１つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、事前分化した幹細胞は、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）においてホモ接合性機能喪失変異を含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）（ｉ）前記分化細胞または分化細胞集団、および（ｉｉ）試験化合物を提供するステップと、（ｂ）前記分化細胞または分化細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）前記分化細胞または分化細胞集団の遊走挙動を測定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、前記分化細胞または分化細胞集団は、前記試験化合物と少なくとも約６時間、１２時間、または２４時間接触させる。
【００３８】
本開示の主題はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。
【００３９】
本開示の主題はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。
【００４０】
ある特定の非限定的な実施形態では、腸神経堤系統マーカーは、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される。
【００４１】
ある特定の非限定的な実施形態では、腸ニューロンマーカーは、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される。
【００４２】
ある特定の非限定的な実施形態では、幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される。
【００４３】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＮＳマーカーは、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される。
【００４４】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＮＣマーカーは、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される。
【００４５】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＭＮＣマーカーは、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される。
【００４６】
ある特定の非限定的な実施形態では、神経細胞マーカーは、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される。
【００４７】
ある特定の非限定的な実施形態では、間葉系前駆体マーカーは、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される。
【００４８】
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約１×１０４〜約１×１０１０個の細胞集団を含む。
【００４９】
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約１×１０５〜約１×１０７個の細胞集団を含む。
【００５０】
本開示の主題はまた、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＢＡＣＥの阻害剤は、ＢＡＣＥ２の阻害剤、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ２８８６７２１、ＬＹ２８１１３７６、ベルベセスタット（ＭＫ−８９３１）、およびＡＺＤ３８３９からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＢＡＣＥの阻害剤は、ＢＡＣＥ２の阻害剤である。ある特定の実施形態では、ＢＡＣＥ２の阻害剤は、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（ＢＡＣＥ阻害剤Ｃ３）である。前記阻害剤は、対象に全身投与されるか、または胃腸管（例えば、結腸）に局所注入され、かつ／もしくは胃腸管（例えば、結腸）に輸血され得る。
【００５１】
さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の酸性プロテアーゼの阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、酸性プロテアーゼの阻害剤は、ペプスタチンＡ、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびＬＹ−４５０１３９からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、酸性プロテアーゼの阻害剤は、ペプスタチンＡである。前記阻害剤は、対象に全身投与されるか、または胃腸管（例えば、結腸）に局所注入され、かつ／もしくは胃腸管（例えば、結腸）に輸血され得る。
【００５２】
さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、ＢＡＣＥ阻害剤の使用を提供する。
【００５３】
さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用を提供する。
【００５４】
Ａ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子（「Ｗｎｔ活性化因子」）と接触させ、さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞（「腸神経系（ＥＮＳ）前駆体」）集団を生成するステップを含む方法を提供する。
【００５５】
Ａ１．前記細胞集団を、有効量の前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００５６】
Ａ２．前記幹細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００５７】
Ａ３．前記幹細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００５８】
Ａ４．前記幹細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００５９】
Ａ５．前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、約１１日目またはより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、Ａの前述の方法。
【００６０】
Ａ６．前記幹細胞集団を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００６１】
Ａ７．前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００６２】
Ａ８．前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に、前記幹細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００６３】
Ａ９．前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記幹細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００６４】
Ａ１０．前記集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００６５】
Ａ１１．前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ａの前述の方法。
【００６６】
Ａ１２．前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ａの前述の方法。
【００６７】
Ａ１３．前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、Ａの前述の方法。
【００６８】
Ａ１４．前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ａの前述の方法。
【００６９】
Ａ１５．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００７０】
Ａ１６．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の活性化因子、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００７１】
Ａ１７．前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００７２】
Ａ１８．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、Ａの前述の方法。
【００７３】
Ａ１９．前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触させるステップを含む、Ａの前述の方法。
【００７４】
Ａ２０．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、Ａの前述の方法。
【００７５】
Ａ２１．前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００７６】
Ａ２２．前記Ｗｎｔ活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００７７】
Ａ２３．前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる、Ａの前述の方法。
【００７８】
Ａ２４．前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００７９】
Ａ２５．前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００８０】
Ａ２６．前記分化細胞集団が、１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する、Ａの前述の方法。
【００８１】
Ａ２７．前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、Ａの前述の方法。
【００８２】
Ａ２８．前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、Ａの前述の方法。
【００８３】
Ａ２９．前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００８４】
Ａ３０．前記幹細胞が、非ヒト幹細胞である、Ａの前述の方法。
Ａ３１．前記分化細胞を１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップを含む、Ａの前述の方法。
【００８５】
Ａ３２．前記分化細胞を前記腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な前記条件が、前記分化細胞を適切な細胞培養培地中で培養することを含む、Ａの前述の方法。
【００８６】
Ａ３３．前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む、Ａの前述の方法。
【００８７】
Ａ３４．前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００８８】
Ａ３５．前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００８９】
Ａ３６．前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む、Ａの前述の方法。
【００９０】
Ａ３７．前記分化細胞が、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む前記適切な細胞培養培地中で約４日間培養される、Ａの前述の方法。
【００９１】
Ａ３８．ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００９２】
Ａ３９．前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、Ａの前述の方法。
【００９３】
Ｂ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞（「ＥＮＳ前駆体」）集団であって、
幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、および
さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるステップ
の後に幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団を提供する。
【００９４】
Ｂ１．前記細胞集団が、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【００９５】
Ｂ２．前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【００９６】
Ｂ３．前記細胞集団と、迷走神経堤パターン形成を誘導する前記１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に行われる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【００９７】
Ｂ４．前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に行われる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【００９８】
Ｂ５．前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、約１１日目またはより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、Ｂの前述の分化細胞集団。
【００９９】
Ｂ６．前記幹細胞集団が、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１００】
Ｂ７．前記幹細胞集団が、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０１】
Ｂ８．前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０２】
Ｂ９．前記幹細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に行われる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０３】
Ｂ１０．前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触が、前記幹細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に行われる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０４】
Ｂ１１．前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０５】
Ｂ１２．前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０６】
Ｂ１３．前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０７】
Ｂ１４．前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０８】
Ｂ１５．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１０９】
Ｂ１６．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１０】
Ｂ１７．前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１１】
Ｂ１８．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１２】
Ｂ１９．前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１３】
Ｂ２０．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１４】
Ｂ２１．前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１５】
Ｂ２２．前記Ｗｎｔ活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１６】
Ｂ２３．前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１７】
Ｂ２４．前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１８】
Ｂ２５．前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１１９】
Ｂ２６．１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１２０】
Ｂ２７．前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１２１】
Ｂ２８．前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１２２】
Ｂ２９．前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、Ｂの前述の分化細胞集団。
【０１２３】
Ｃ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の分化細胞集団を含む、組成物を提供する。
【０１２４】
Ｄ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団から誘導される、分化細胞集団を提供する。
【０１２５】
Ｄ１．１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団を、適切な細胞培養培地中で培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団から誘導される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１２６】
Ｄ２．１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団を、適切な細胞培養培地中で少なくとも約１日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団から誘導される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１２７】
Ｄ３．前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１２８】
Ｄ４．前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１２９】
Ｄ５．前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３０】
Ｄ６．前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３１】
Ｄ７．１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団を、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む適切な細胞培養培地中で約４日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団から誘導される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３２】
Ｄ８．前記適切な細胞培養培地が、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３３】
Ｄ９．１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む適切な細胞培養培地中で約１０日間、約２５日間、または約４５日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前述の細胞集団から誘導される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３４】
Ｄ１０．前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３５】
Ｄ１１．前記１種または複数のＷｎｔ活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３６】
Ｄ１２．前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、Ｄの前述の分化細胞集団。
【０１３７】
Ｅ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する前述の分化細胞集団を含む、組成物を提供する。
【０１３８】
Ｆ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、対象の腸神経系障害を予防および／または処置する方法であって、腸神経系障害に罹患している対象に、有効量の、以下：
（ａ）前述の分化ＥＮＳ前駆体集団、
（ｂ）前述の分化ＥＮＳ前駆体集団を含む組成物、
（ｃ）前述の腸ニューロン集団、および
（ｄ）前述の腸ニューロン集団を含む組成物
の１つを投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１３９】
Ｆ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｆの前述の方法。
【０１４０】
Ｆ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｆの前述の方法。
【０１４１】
Ｇ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、前述の分化ＥＮＳ前駆体集団を提供する。
【０１４２】
Ｇ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｇの前述の分化細胞集団。
【０１４３】
Ｇ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｇの前述の分化細胞集団。
【０１４４】
Ｈ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、前述の分化ＥＮＳ前駆体集団の使用を提供する。
【０１４５】
Ｈ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｈの前述の使用。
【０１４６】
Ｈ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｈの前述の使用。
【０１４７】
Ｉ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、前述の分化ＥＮＳ前駆体集団を含む、組成物を提供する。
【０１４８】
Ｉ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｉの前述の組成物。
【０１４９】
Ｉ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｉの前述の組成物。
【０１５０】
Ｊ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、前述の分化腸ニューロン集団を提供する。
【０１５１】
Ｊ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｊの前述の分化細胞集団。
【０１５２】
Ｊ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｊの前述の分化細胞集団。
【０１５３】
Ｋ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、前述の分化腸ニューロン集団の使用を提供する。
【０１５４】
Ｋ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｋの前述の使用。
【０１５５】
Ｋ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｋの前述の使用。
【０１５６】
Ｌ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、前述の分化腸ニューロン集団を含む、組成物を提供する。
【０１５７】
Ｌ１．腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、Ｌの前述の組成物。
【０１５８】
Ｌ２．腸神経系障害が、中毒性巨大結腸症である、Ｉの前述の組成物。
【０１５９】
Ｍ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒルシュスプルング病および／またはヒルシュスプルング病関連遺伝的欠陥を予防および／または処置するのに適した化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前述の分化ＥＮＳ前駆体、前述の分化腸ニューロンおよびそれらの組合せから選択される細胞集団によって提示される少なくとも１つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、幹細胞が、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）においてホモ接合性機能喪失変異を含む、方法を提供する。
Ｍ１．
（ａ）（ｉ）前記細胞集団、および（ｉｉ）試験化合物を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、
（ｃ）前記細胞集団の遊走挙動を測定するステップと
を含む、Ｍの前述の方法。
【０１６０】
Ｍ２．前記細胞集団が、ＥＮＳ前駆体集団である、Ｍの前述の方法。
【０１６１】
Ｍ３．前記細胞集団が、前記試験化合物と少なくとも約２４時間接触する、Ｍの前述の方法。
【０１６２】
Ｎ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、
（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および
（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、前記有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含む指示書
を含む、キットを提供する。
【０１６３】
Ｎ１．前記指示書が、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１６４】
Ｎ２．前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１６５】
Ｎ３．前記指示書が、前記幹細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１６６】
Ｎ４．前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１６７】
Ｎ５．ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤をさらに含む、Ｎの前述のキット。
【０１６８】
Ｎ６．前記指示書が、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１６９】
Ｎ７．前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、Ｈの前述のキット。
【０１７０】
Ｎ８．前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１７１】
Ｎ９．前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるための指示を含む、Ｎの前述のキット。
【０１７２】
Ｎ１０．前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｎの前述のキット。
【０１７３】
Ｎ１１．前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｎの前述のキット。
【０１７４】
Ｎ１２．前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、Ｎの前述のキット。
【０１７５】
Ｎ１３．前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｎの前述のキット。
【０１７６】
Ｎ１４．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、Ｎの前述のキット。
【０１７７】
Ｎ１５．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、Ｎの前述のキット。
【０１７８】
Ｎ１６．迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子を含む、Ｎの前述のキット。
【０１７９】
Ｎ１７．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、Ｎの前述のキット。
【０１８０】
Ｎ１８．迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種を含む、Ｎの前述のキット。
【０１８１】
Ｎ１９．前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、Ｎの前述のキット。
【０１８２】
Ｎ２０．前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、Ｎの前述のキット。
【０１８３】
Ｎ２１．前記Ｗｎｔ活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、Ｎの前述のキット。
【０１８４】
Ｏ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含み、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、方法を提供する。
【０１８５】
Ｏ１．前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、Ｏの前述の方法。
【０１８６】
Ｐ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるステップの後に幹細胞集団から誘導され、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、分化細胞集団を提供する。
【０１８７】
Ｐ１．前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に行われる、Ｐの前述の分化細胞集団。
【０１８８】
Ｑ．ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させ、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるための指示を含む指示書を含む、キットを提供する。
【０１８９】
Ｑ１．前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、Ｑの前述のキット。
【０１９０】
Ｒ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、
細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
【０１９１】
Ｒ１．腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９２】
Ｒ２．幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９３】
Ｒ３．ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９４】
Ｒ４．ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９５】
Ｒ５．ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９６】
Ｒ６．神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９７】
Ｒ７．間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される、Ｒの前述の組成物。
【０１９８】
Ｒ８．前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約１×１０４〜約１×１０１０個の細胞集団を含む、Ｒの前述の組成物。
【０１９９】
Ｓ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、
細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
【０２００】
Ｓ１．腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０１】
Ｓ２．腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０２】
Ｓ３．幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０３】
Ｓ４．ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０４】
Ｓ５．ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０５】
Ｓ６．ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０６】
Ｓ７．神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０７】
Ｓ８．間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される、Ｓの前述の組成物。
【０２０８】
Ｓ９．前記１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する約１×１０５〜約１×１０７個の細胞集団を含む、Ｓの前述の組成物。
【０２０９】
Ｔ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の阻害剤を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０２１０】
Ｔ１．ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ２８８６７２１、ＬＹ２８１１３７６、ベルベセスタット（ＭＫ−８９３１）、およびＡＺＤ３８３９からなる群から選択される、Ｔの前述の方法。
【０２１１】
Ｔ２．ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤である、Ｔの前述の方法。
【０２１２】
Ｔ３．ＢＡＣＥ２の阻害剤が、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（ＢＡＣＥ阻害剤Ｃ３）である、Ｔの前述の方法。
【０２１３】
Ｕ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の酸性プロテアーゼの阻害剤を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０２１４】
Ｕ１．酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡ、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびＬＹ−４５０１３９からなる群から選択される、Ｕの前述の方法。
【０２１５】
Ｕ２．酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡである、Ｕの前述の方法。
【０２１６】
Ｖ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、ＢＡＣＥ阻害剤の使用を提供する。
【０２１７】
Ｗ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用を提供する。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１ＡＢＣＤ】図１Ａ〜１Ｊは、ｈＥＳＣからのＥＮＣ前駆体の誘導を示す。（Ａ）腸ＮＣ（ＥＮＣ）細胞の誘導のために開発したプロトコール（０〜１１日目）の略図。（Ｂ）（Ａ）で詳述したプロトコール後の分化１１日目の、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＣＤ４９Ｄ発現についてのＥＮＣのフローサイトメトリー。（Ｃ）ＣＮＣ（ＲＡなし）と比較した、ＣＤ４９Ｄ＋分類（sorted）ＥＮＣについてのＳＯＸ１０、迷走神経ＮＣマーカーＨＯＸＢ２〜ＨＯＸＢ５およびＨＯＸＢ９のｑＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）ＣＤ４９Ｄ＋  ＥＮＣにおけるＰＡＸ３、ＲＥＴおよびＥＤＮＲＢについての免疫蛍光染色の定量。（ＥおよびＦ）同等のＣＮＳ前駆体（分化１１日目）に対する、ＣＤ４９Ｄ＋  ＮＣの教師なしクラスタリングおよび主構成成分分析。（Ｇ）ＣＮＳ前駆体に対する、ＣＤ４９＋ＥＮＣにおける、上位１０個および選択した追加の（太字）最も差次的に発現した転写産物。（Ｈ）ＲＦＰ＋およびＣＤ４９Ｄ＋ＥＮＣが、発達中のニワトリ胚への移植（１１日目）のためにＦＡＣＳ精製される。（ＩおよびＪ）ＲＦＰ＋細胞の胚内での遊走；発達中の消化管内の細胞のサブセット。（Ｉ）注射後２４時間でのＲＦＰ＋細胞の分布を示す全組織標本落射蛍光。（Ｊ）躯幹レベルでの胚の断面画像が、消化管原基におけるＲＦＰ＋細胞の位置（左パネル）および囲んだエリアの拡大図（右パネル）を示す。ｈ（中央パネル）においてスケールバー＝２５μｍ；ｉで２００μｍ；ｊで１０μｍ；ｐ値は：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ｔ検定、ＣＮＣと比較したＥＮＣ；ｎ＝３）。
【図１ＥＦ】図１Ａ〜１Ｊは、ｈＥＳＣからのＥＮＣ前駆体の誘導を示す。（Ａ）腸ＮＣ（ＥＮＣ）細胞の誘導のために開発したプロトコール（０〜１１日目）の略図。（Ｂ）（Ａ）で詳述したプロトコール後の分化１１日目の、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＣＤ４９Ｄ発現についてのＥＮＣのフローサイトメトリー。（Ｃ）ＣＮＣ（ＲＡなし）と比較した、ＣＤ４９Ｄ＋分類（sorted）ＥＮＣについてのＳＯＸ１０、迷走神経ＮＣマーカーＨＯＸＢ２〜ＨＯＸＢ５およびＨＯＸＢ９のｑＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）ＣＤ４９Ｄ＋  ＥＮＣにおけるＰＡＸ３、ＲＥＴおよびＥＤＮＲＢについての免疫蛍光染色の定量。（ＥおよびＦ）同等のＣＮＳ前駆体（分化１１日目）に対する、ＣＤ４９Ｄ＋  ＮＣの教師なしクラスタリングおよび主構成成分分析。（Ｇ）ＣＮＳ前駆体に対する、ＣＤ４９＋ＥＮＣにおける、上位１０個および選択した追加の（太字）最も差次的に発現した転写産物。（Ｈ）ＲＦＰ＋およびＣＤ４９Ｄ＋ＥＮＣが、発達中のニワトリ胚への移植（１１日目）のためにＦＡＣＳ精製される。（ＩおよびＪ）ＲＦＰ＋細胞の胚内での遊走；発達中の消化管内の細胞のサブセット。（Ｉ）注射後２４時間でのＲＦＰ＋細胞の分布を示す全組織標本落射蛍光。（Ｊ）躯幹レベルでの胚の断面画像が、消化管原基におけるＲＦＰ＋細胞の位置（左パネル）および囲んだエリアの拡大図（右パネル）を示す。ｈ（中央パネル）においてスケールバー＝２５μｍ；ｉで２００μｍ；ｊで１０μｍ；ｐ値は：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ｔ検定、ＣＮＣと比較したＥＮＣ；ｎ＝３）。
【図１ＧＨＩＪ】図１Ａ〜１Ｊは、ｈＥＳＣからのＥＮＣ前駆体の誘導を示す。（Ａ）腸ＮＣ（ＥＮＣ）細胞の誘導のために開発したプロトコール（０〜１１日目）の略図。（Ｂ）（Ａ）で詳述したプロトコール後の分化１１日目の、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＣＤ４９Ｄ発現についてのＥＮＣのフローサイトメトリー。（Ｃ）ＣＮＣ（ＲＡなし）と比較した、ＣＤ４９Ｄ＋分類（sorted）ＥＮＣについてのＳＯＸ１０、迷走神経ＮＣマーカーＨＯＸＢ２〜ＨＯＸＢ５およびＨＯＸＢ９のｑＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）ＣＤ４９Ｄ＋  ＥＮＣにおけるＰＡＸ３、ＲＥＴおよびＥＤＮＲＢについての免疫蛍光染色の定量。（ＥおよびＦ）同等のＣＮＳ前駆体（分化１１日目）に対する、ＣＤ４９Ｄ＋  ＮＣの教師なしクラスタリングおよび主構成成分分析。（Ｇ）ＣＮＳ前駆体に対する、ＣＤ４９＋ＥＮＣにおける、上位１０個および選択した追加の（太字）最も差次的に発現した転写産物。（Ｈ）ＲＦＰ＋およびＣＤ４９Ｄ＋ＥＮＣが、発達中のニワトリ胚への移植（１１日目）のためにＦＡＣＳ精製される。（ＩおよびＪ）ＲＦＰ＋細胞の胚内での遊走；発達中の消化管内の細胞のサブセット。（Ｉ）注射後２４時間でのＲＦＰ＋細胞の分布を示す全組織標本落射蛍光。（Ｊ）躯幹レベルでの胚の断面画像が、消化管原基におけるＲＦＰ＋細胞の位置（左パネル）および囲んだエリアの拡大図（右パネル）を示す。ｈ（中央パネル）においてスケールバー＝２５μｍ；ｉで２００μｍ；ｊで１０μｍ；ｐ値は：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ｔ検定、ＣＮＣと比較したＥＮＣ；ｎ＝３）。
【０２１９】
【図２ＡＢＣ】図２Ａ〜２Ｉは、ｈＥＳＣ由来ＮＣ集団の特徴付けを示す。（Ａ）脳ＮＣ（ＣＮＣ）およびメラニン形成細胞コンピテントＮＣ（ＭＮＣ）誘導プロトコール５の略図。（Ｂ）ＣＮＣおよびＭＮＣ細胞におけるＣＤ４９ＤおよびＳＯＸ１０：：ＧＦＰについてのフローサイトメトリー。（Ｃ）ＳＯＸ１０についての未分類およびＣＤ４９Ｄ分類分化ＮＣ細胞の免疫蛍光。（Ｄ）Ｈ９  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣならびに対照および家族性自律神経失調症ｈｉＰＳＣにおけるＣＤ４９Ｄについてのフローサイトメトリー。（ＥおよびＦ）１１日目での腸前駆体系統マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける代表的免疫蛍光画像およびフローサイトメトリー。（Ｇ）同等のステージのＣＮＳ前駆体１１と比較した、ＣＮＣのＲＮＡＳｅｑ分析からの上位１０個および選択した追加の最も差次的に発現した転写産物のリスト。（Ｈ）同等のステージのＣＮＳ前駆体１１と比較した、ＭＮＣのＲＮＡＳｅｑ分析からの上位１０個および選択した追加の最も差次的に発現した転写産物のリスト。（Ｉ）注射後２４〜３６時間での発達中のニワトリ胚におけるＣＮＣおよびＭＮＣ細胞の分布。右パネル：発達中の表皮外胚葉におけるＭＮＣ細胞クラスターのより強力な画像。略語：ＮＴ＝神経管、ＮｏｔｏＣ＝脊索、Ｓ＝体節、ｃにおいてスケールバー＝５０μｍ；ｅで２５μｍ；ｉの左パネルで１ｍｍ；中央で５０μｍ；および右パネルで２５μｍ。
【図２ＤＥＦ】図２Ａ〜２Ｉは、ｈＥＳＣ由来ＮＣ集団の特徴付けを示す。（Ａ）脳ＮＣ（ＣＮＣ）およびメラニン形成細胞コンピテントＮＣ（ＭＮＣ）誘導プロトコール５の略図。（Ｂ）ＣＮＣおよびＭＮＣ細胞におけるＣＤ４９ＤおよびＳＯＸ１０：：ＧＦＰについてのフローサイトメトリー。（Ｃ）ＳＯＸ１０についての未分類およびＣＤ４９Ｄ分類分化ＮＣ細胞の免疫蛍光。（Ｄ）Ｈ９  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣならびに対照および家族性自律神経失調症ｈｉＰＳＣにおけるＣＤ４９Ｄについてのフローサイトメトリー。（ＥおよびＦ）１１日目での腸前駆体系統マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける代表的免疫蛍光画像およびフローサイトメトリー。（Ｇ）同等のステージのＣＮＳ前駆体１１と比較した、ＣＮＣのＲＮＡＳｅｑ分析からの上位１０個および選択した追加の最も差次的に発現した転写産物のリスト。（Ｈ）同等のステージのＣＮＳ前駆体１１と比較した、ＭＮＣのＲＮＡＳｅｑ分析からの上位１０個および選択した追加の最も差次的に発現した転写産物のリスト。（Ｉ）注射後２４〜３６時間での発達中のニワトリ胚におけるＣＮＣおよびＭＮＣ細胞の分布。右パネル：発達中の表皮外胚葉におけるＭＮＣ細胞クラスターのより強力な画像。略語：ＮＴ＝神経管、ＮｏｔｏＣ＝脊索、Ｓ＝体節、ｃにおいてスケールバー＝５０μｍ；ｅで２５μｍ；ｉの左パネルで１ｍｍ；中央で５０μｍ；および右パネルで２５μｍ。
【図２ＧＨＩ】図２Ａ〜２Ｉは、ｈＥＳＣ由来ＮＣ集団の特徴付けを示す。（Ａ）脳ＮＣ（ＣＮＣ）およびメラニン形成細胞コンピテントＮＣ（ＭＮＣ）誘導プロトコール５の略図。（Ｂ）ＣＮＣおよびＭＮＣ細胞におけるＣＤ４９ＤおよびＳＯＸ１０：：ＧＦＰについてのフローサイトメトリー。（Ｃ）ＳＯＸ１０についての未分類およびＣＤ４９Ｄ分類分化ＮＣ細胞の免疫蛍光。（Ｄ）Ｈ９  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣならびに対照および家族性自律神経失調症ｈｉＰＳＣにおけるＣＤ４９Ｄについてのフローサイトメトリー。（ＥおよびＦ）１１日目での腸前駆体系統マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける代表的免疫蛍光画像およびフローサイトメトリー。（Ｇ）同等のステージのＣＮＳ前駆体１１と比較した、ＣＮＣのＲＮＡＳｅｑ分析からの上位１０個および選択した追加の最も差次的に発現した転写産物のリスト。（Ｈ）同等のステージのＣＮＳ前駆体１１と比較した、ＭＮＣのＲＮＡＳｅｑ分析からの上位１０個および選択した追加の最も差次的に発現した転写産物のリスト。（Ｉ）注射後２４〜３６時間での発達中のニワトリ胚におけるＣＮＣおよびＭＮＣ細胞の分布。右パネル：発達中の表皮外胚葉におけるＭＮＣ細胞クラスターのより強力な画像。略語：ＮＴ＝神経管、ＮｏｔｏＣ＝脊索、Ｓ＝体節、ｃにおいてスケールバー＝５０μｍ；ｅで２５μｍ；ｉの左パネルで１ｍｍ；中央で５０μｍ；および右パネルで２５μｍ。
【０２２０】
【図３ＡＢＣ】図３Ａ〜３Ｋは、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の、様々な腸ニューロンサブタイプへの分化を示す。（Ａ）ＥＮＣ前駆体の神経分化および成熟のために開発したプロトコールの略図。（Ｂ）ＴＵＪ１およびＰＨＯＸ２Ａの発現を有する腸ニューロン系統に沿った、単層分化前の精製ＥＮＣから凝集したＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現３Ｄスフェロイド全体の画像。（ＣおよびＤ）４０日目のＥＮＣ系統細胞の位相差および免疫蛍光画像ならびに定量。細胞は、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬおよびＰＨＯＸ２Ａ／Ｂを発現することが示される。ＰＨＯＸ２Ｂ発現をさらに、Ｈ９  ｈＥＳＣベースのＰＨＯＸ２Ｂ：：ＧＦＰレポーター系（Ｇ．Ｌｅｅ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから厚意により提供された）を使用して確認した。（ＥおよびＦ）多様な神経伝達物質の発現を示す免疫蛍光分析および定量。注釈：全ての細胞は、ＮＣ系統起源を確実にするためにＣＤ４９Ｄ＋、ＦＡＣＳ精製ＮＣに由来した。（Ｇ）チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）の発現を介するＥＮＣ由来ニューロンの光刺激活性化の略図。（Ｈ）ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養後に光刺激に供した培養物の位相差および生蛍光画像。（Ｉ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮の程度を表す図。（Ｊ）組織工学的に作製された結腸（ＴＥＣ）の発生のための略図。（Ｋ）ヒト細胞質マーカーＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジン（ｈＳＹＮ）について染色したＴＥＣ。点線は、筋肉と上皮／粘膜下様層との間の境界のおよその位置を示す。ｂ（全てのパネル）においてスケールバー＝１００μｍ；ｃ、ｅ、ｈで５０μｍ；ｋの左および中央パネルで２０μｍ；ｋの右パネルで４０。
【図３ＤＥＦ】図３Ａ〜３Ｋは、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の、様々な腸ニューロンサブタイプへの分化を示す。（Ａ）ＥＮＣ前駆体の神経分化および成熟のために開発したプロトコールの略図。（Ｂ）ＴＵＪ１およびＰＨＯＸ２Ａの発現を有する腸ニューロン系統に沿った、単層分化前の精製ＥＮＣから凝集したＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現３Ｄスフェロイド全体の画像。（ＣおよびＤ）４０日目のＥＮＣ系統細胞の位相差および免疫蛍光画像ならびに定量。細胞は、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬおよびＰＨＯＸ２Ａ／Ｂを発現することが示される。ＰＨＯＸ２Ｂ発現をさらに、Ｈ９  ｈＥＳＣベースのＰＨＯＸ２Ｂ：：ＧＦＰレポーター系（Ｇ．Ｌｅｅ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから厚意により提供された）を使用して確認した。（ＥおよびＦ）多様な神経伝達物質の発現を示す免疫蛍光分析および定量。注釈：全ての細胞は、ＮＣ系統起源を確実にするためにＣＤ４９Ｄ＋、ＦＡＣＳ精製ＮＣに由来した。（Ｇ）チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）の発現を介するＥＮＣ由来ニューロンの光刺激活性化の略図。（Ｈ）ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養後に光刺激に供した培養物の位相差および生蛍光画像。（Ｉ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮の程度を表す図。（Ｊ）組織工学的に作製された結腸（ＴＥＣ）の発生のための略図。（Ｋ）ヒト細胞質マーカーＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジン（ｈＳＹＮ）について染色したＴＥＣ。点線は、筋肉と上皮／粘膜下様層との間の境界のおよその位置を示す。ｂ（全てのパネル）においてスケールバー＝１００μｍ；ｃ、ｅ、ｈで５０μｍ；ｋの左および中央パネルで２０μｍ；ｋの右パネルで４０。
【図３ＧＨＩ】図３Ａ〜３Ｋは、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の、様々な腸ニューロンサブタイプへの分化を示す。（Ａ）ＥＮＣ前駆体の神経分化および成熟のために開発したプロトコールの略図。（Ｂ）ＴＵＪ１およびＰＨＯＸ２Ａの発現を有する腸ニューロン系統に沿った、単層分化前の精製ＥＮＣから凝集したＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現３Ｄスフェロイド全体の画像。（ＣおよびＤ）４０日目のＥＮＣ系統細胞の位相差および免疫蛍光画像ならびに定量。細胞は、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬおよびＰＨＯＸ２Ａ／Ｂを発現することが示される。ＰＨＯＸ２Ｂ発現をさらに、Ｈ９  ｈＥＳＣベースのＰＨＯＸ２Ｂ：：ＧＦＰレポーター系（Ｇ．Ｌｅｅ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから厚意により提供された）を使用して確認した。（ＥおよびＦ）多様な神経伝達物質の発現を示す免疫蛍光分析および定量。注釈：全ての細胞は、ＮＣ系統起源を確実にするためにＣＤ４９Ｄ＋、ＦＡＣＳ精製ＮＣに由来した。（Ｇ）チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）の発現を介するＥＮＣ由来ニューロンの光刺激活性化の略図。（Ｈ）ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養後に光刺激に供した培養物の位相差および生蛍光画像。（Ｉ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮の程度を表す図。（Ｊ）組織工学的に作製された結腸（ＴＥＣ）の発生のための略図。（Ｋ）ヒト細胞質マーカーＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジン（ｈＳＹＮ）について染色したＴＥＣ。点線は、筋肉と上皮／粘膜下様層との間の境界のおよその位置を示す。ｂ（全てのパネル）においてスケールバー＝１００μｍ；ｃ、ｅ、ｈで５０μｍ；ｋの左および中央パネルで２０μｍ；ｋの右パネルで４０。
【図３ＪＫ】図３Ａ〜３Ｋは、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の、様々な腸ニューロンサブタイプへの分化を示す。（Ａ）ＥＮＣ前駆体の神経分化および成熟のために開発したプロトコールの略図。（Ｂ）ＴＵＪ１およびＰＨＯＸ２Ａの発現を有する腸ニューロン系統に沿った、単層分化前の精製ＥＮＣから凝集したＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現３Ｄスフェロイド全体の画像。（ＣおよびＤ）４０日目のＥＮＣ系統細胞の位相差および免疫蛍光画像ならびに定量。細胞は、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬおよびＰＨＯＸ２Ａ／Ｂを発現することが示される。ＰＨＯＸ２Ｂ発現をさらに、Ｈ９  ｈＥＳＣベースのＰＨＯＸ２Ｂ：：ＧＦＰレポーター系（Ｇ．Ｌｅｅ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから厚意により提供された）を使用して確認した。（ＥおよびＦ）多様な神経伝達物質の発現を示す免疫蛍光分析および定量。注釈：全ての細胞は、ＮＣ系統起源を確実にするためにＣＤ４９Ｄ＋、ＦＡＣＳ精製ＮＣに由来した。（Ｇ）チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）の発現を介するＥＮＣ由来ニューロンの光刺激活性化の略図。（Ｈ）ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養後に光刺激に供した培養物の位相差および生蛍光画像。（Ｉ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮の程度を表す図。（Ｊ）組織工学的に作製された結腸（ＴＥＣ）の発生のための略図。（Ｋ）ヒト細胞質マーカーＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジン（ｈＳＹＮ）について染色したＴＥＣ。点線は、筋肉と上皮／粘膜下様層との間の境界のおよその位置を示す。ｂ（全てのパネル）においてスケールバー＝１００μｍ；ｃ、ｅ、ｈで５０μｍ；ｋの左および中央パネルで２０μｍ；ｋの右パネルで４０。
【０２２１】
【図４ＡＢ】図４Ａ〜４Ｅは、ｈＥＳＣ由来腸神経系統の特徴付けを示す。（Ａ）ＴＲＫＣおよびＰＨＯＸ２Ａ発現についてのフローサイトメトリー。（Ｂ）ＴＲＫＣ陽性およびＴＲＫＣ陰性ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体についてのＰＨＯＸ２ＡおよびＡＳＣＬ１の免疫蛍光。（Ｃ）より延長したｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化期間中の腸系統マーカーの時系変化ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（ＤおよびＥ）分化４０および６０日目のＥＮＣ由来ニューロンにおける腸ニューロン前駆体および神経マーカーのフローサイトメトリー定量。スケールバー＝５０μｍ；略語：ＦＣ＝倍率変化。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、ｈＥＳＣ由来腸神経系統の特徴付けを示す。（Ａ）ＴＲＫＣおよびＰＨＯＸ２Ａ発現についてのフローサイトメトリー。（Ｂ）ＴＲＫＣ陽性およびＴＲＫＣ陰性ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体についてのＰＨＯＸ２ＡおよびＡＳＣＬ１の免疫蛍光。（Ｃ）より延長したｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化期間中の腸系統マーカーの時系変化ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（ＤおよびＥ）分化４０および６０日目のＥＮＣ由来ニューロンにおける腸ニューロン前駆体および神経マーカーのフローサイトメトリー定量。スケールバー＝５０μｍ；略語：ＦＣ＝倍率変化。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、ｈＥＳＣ由来腸神経系統の特徴付けを示す。（Ａ）ＴＲＫＣおよびＰＨＯＸ２Ａ発現についてのフローサイトメトリー。（Ｂ）ＴＲＫＣ陽性およびＴＲＫＣ陰性ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体についてのＰＨＯＸ２ＡおよびＡＳＣＬ１の免疫蛍光。（Ｃ）より延長したｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化期間中の腸系統マーカーの時系変化ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（ＤおよびＥ）分化４０および６０日目のＥＮＣ由来ニューロンにおける腸ニューロン前駆体および神経マーカーのフローサイトメトリー定量。スケールバー＝５０μｍ；略語：ＦＣ＝倍率変化。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ｈＥＳＣ由来腸神経系統の特徴付けを示す。（Ａ）ＴＲＫＣおよびＰＨＯＸ２Ａ発現についてのフローサイトメトリー。（Ｂ）ＴＲＫＣ陽性およびＴＲＫＣ陰性ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体についてのＰＨＯＸ２ＡおよびＡＳＣＬ１の免疫蛍光。（Ｃ）より延長したｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化期間中の腸系統マーカーの時系変化ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（ＤおよびＥ）分化４０および６０日目のＥＮＣ由来ニューロンにおける腸ニューロン前駆体および神経マーカーのフローサイトメトリー定量。スケールバー＝５０μｍ；略語：ＦＣ＝倍率変化。
【０２２２】
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、ＣＮＣが自律神経系統において豊富なニューロンをもたらすことを示す。（Ａ〜Ｃ）ＣＮＣ由来ニューロンにおける５−ＨＴ（セロトニン）、ＴＵＪ１およびＴＨの発現についての代表的な免疫蛍光画像。ＥＮＣ由来系統とは対照的に、多くのＴｕｊ１＋ニューロンの存在およびＴＨ＋細胞の増大したパーセンテージにもかかわらず、頭蓋条件下でセロトニン作動性（５ＨＴ＋）ニューロンは検出されなかった。（ＥおよびＥ）ＣＮＣおよびＥＮＣ条件下でのＴＲＫＢおよびＴＲＫＣについてのフローサイトメトリー。スケールバー＝５０μｍ。
【０２２３】
【図６ＡＢＣＤ】図６Ａ〜６Ｈは、ヒトＥＮＣ前駆体が正常およびＨＤ成体結腸において広範に遊走することを示す。（Ａ）マウス成体ホストの結腸への移植パラダイムの略図。（Ｂ）成体ＮＳＧ結腸壁内の移植したＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の全組織標本蛍光画像。（Ｃ）ＴＵＪ１染色を示す、ＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体をグラフトしたＮＳＧ結腸の断面の免疫蛍光染色。（Ｄ）マトリゲルのみを受容したＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ動物に対する、ｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体をグラフトしたＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ動物の生存曲線。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ移植片を受容した動物に対する、対照動物における巨大結腸症様表現型。（Ｆ）正常、またはマトリゲルもしくは正常なＥＮＳと同様の筋層間および粘膜下層におけるｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の分布を示すＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＨＤ結腸の断面の免疫蛍光染色。破線は、粘膜下層と筋層との間の境界を示す。（Ｇ）ＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジン（ｈＳＹＮ）の発現を示す、マトリゲルまたはＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＨＤ結腸の断面の免疫蛍光染色。（Ｈ）ヒト（ＳＣ１２１免疫反応性）細胞のサブセットにおけるＧＡＢＡおよび５ＨＴの発現を示す、ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌＨＤマウスの結腸への移植後のグラフトしたｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の代表的な画像。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験を盲検様式で行った。ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ突然変異を全てのグラフトした動物で確認した。ｂにおいてスケールバー＝１ｃｍ；ｃの左パネルで５００μｍ；ｃの右パネル、ｆおよびｇで１００μｍ；ならびにｈで２５μｍ；略語：ＡＵ＝任意単位。生存分析のｐ値は、数値で、ログランク（マンテル−コックス）検定で与える；各々ｎ＝６。
【図６ＥＦＧＨ】図６Ａ〜６Ｈは、ヒトＥＮＣ前駆体が正常およびＨＤ成体結腸において広範に遊走することを示す。（Ａ）マウス成体ホストの結腸への移植パラダイムの略図。（Ｂ）成体ＮＳＧ結腸壁内の移植したＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の全組織標本蛍光画像。（Ｃ）ＴＵＪ１染色を示す、ＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体をグラフトしたＮＳＧ結腸の断面の免疫蛍光染色。（Ｄ）マトリゲルのみを受容したＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ動物に対する、ｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体をグラフトしたＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ動物の生存曲線。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ移植片を受容した動物に対する、対照動物における巨大結腸症様表現型。（Ｆ）正常、またはマトリゲルもしくは正常なＥＮＳと同様の筋層間および粘膜下層におけるｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の分布を示すＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＨＤ結腸の断面の免疫蛍光染色。破線は、粘膜下層と筋層との間の境界を示す。（Ｇ）ＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジン（ｈＳＹＮ）の発現を示す、マトリゲルまたはＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＨＤ結腸の断面の免疫蛍光染色。（Ｈ）ヒト（ＳＣ１２１免疫反応性）細胞のサブセットにおけるＧＡＢＡおよび５ＨＴの発現を示す、ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌＨＤマウスの結腸への移植後のグラフトしたｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の代表的な画像。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験を盲検様式で行った。ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ突然変異を全てのグラフトした動物で確認した。ｂにおいてスケールバー＝１ｃｍ；ｃの左パネルで５００μｍ；ｃの右パネル、ｆおよびｇで１００μｍ；ならびにｈで２５μｍ；略語：ＡＵ＝任意単位。生存分析のｐ値は、数値で、ログランク（マンテル−コックス）検定で与える；各々ｎ＝６。
【０２２４】
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、ＳＭＣとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来腸ニューロンの機能的特徴付けを示す。（Ａ）平滑筋細胞（ＳＭＣ）分化プロトコールの略図。（Ｂ）ＳＭＡおよびＩＳＬ１についてのＳＭＣ前駆細胞の免疫蛍光染色。（Ｃ）様々なＥＮＣ由来ニューロンサブタイプの、ＳＭＡ＋細胞との関連。（Ｄ）ＳＭＣとの共培養４０日目のＥＮＣ由来ニューロンおよびＳＭＣの非存在下の同等のステージのニューロンにおけるシナプシン：：ＥＹＦＰ発現。（Ｅ）ＳＭＣのＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物に対する、ＳＭＣの単独培養物。上部パネル：共培養物におけるＳＭＣの形態学的変化を示す位相差画像を示す。下部パネル：ＳＭＣのＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物に対する、ＳＭＣの単独培養物における、成熟ＳＭＣマーカーＭＹＨ１１およびアセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）の免疫蛍光染色を示す。ｂ、ｃ、ｅにおいてスケールバー＝５０μｍ；ｄで１００μｍ。
【０２２５】
【図８ＡＣ】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【図８Ｂ−１】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【図８Ｂ−２】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【図８Ｂ−３】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【図８Ｂ−４】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【図８Ｂ−５】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【図８Ｂ−６】図８Ａ〜８Ｃは、ＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物におけるｈＥＳＣ由来ＳＭＣの収縮を示す。（Ａ）アセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ媒介脱分極への曝露後の、ＳＭＣの単独培養物に対する、ＳＭＣのＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物の収縮応答を示す動画スナップショット。（Ｂ）ＳＭＣ＋組織の収縮の程度を表す図。矢印は、薬理学的刺激の時間を示す。（Ｃ）光刺激前および様々な４５０ｎｍ光パルス周波数での刺激中のＳＭＣの収縮応答を示す動画スナップショット。光遺伝学的活性化後の応答の定量については、図３Ｉを参照のこと。黄色点は、位相差に基づくソフトウェアにより発生させ、かつ動きの定量のために使用した偽着色を表す。全ての動画は、実時間より５倍速い。
【０２２６】
【図９ＡＢＣＤＥ】図９Ａ〜９Ｊは、ＮＳＧおよびＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの成体結腸における移植したｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体の特徴付けを示す。（Ａ）細胞が適切な位置に注射されたことを確認するための移植後１時間での、ならびに細胞の分散および細胞サブセットの明確なクラスターの集合を示すための２週間での、注射部位でのＲＦＰ発現を追跡する、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体を移植した結腸の全組織標本顕微鏡検査。破線は、インタクトな結腸組織の外側境界を示す。（ＢおよびＣ）成体結腸壁の内側のグラフトしたＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＣＮＳ前駆体およびＣＤ４９Ｄ精製ＣＮＣ前駆体の全組織標本蛍光画像化および遊走の定量。（ＤおよびＥ）ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの結腸におけるグラフトしたＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体の全組織標本蛍光画像化および遊走の定量。（Ｆ）マトリゲルのみをグラフトしたマウスに対する、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体をグラフトしたＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスのカーミン染料胃管栄養によるＧＩ総通過時間。（ＧおよびＨ）ＴＵＪ１およびＳＣ１２１（Ｆ）ならびに（Ｇ）のヒト特異的ＧＦＡＰ（ＳＣ１２３）を共発現するＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの結腸への移植後３ヶ月の、グラフトしたｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体の代表的な画像。破線は、粘膜下層と筋層との間の境界を示す。（ＩおよびＪ）ＮＳＧ（ＷＴ）およびＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの結腸への移植後６週間の、グラフトしたｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の代表的な画像。破線は、粘膜下層と筋層との間の境界を示す。ａにおいてスケールバー＝２００μｍ；ｂおよびｄで１ｃｍ；ｇ〜ｊで１００μｍ；略語：ＡＵ＝任意単位。（Ｆ）のｐ値は、数値で、ウェルチ修正を伴うｔ検定にて与える；ｎ＝３。
【図９ＦＧＨＩＪ】図９Ａ〜９Ｊは、ＮＳＧおよびＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの成体結腸における移植したｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体の特徴付けを示す。（Ａ）細胞が適切な位置に注射されたことを確認するための移植後１時間での、ならびに細胞の分散および細胞サブセットの明確なクラスターの集合を示すための２週間での、注射部位でのＲＦＰ発現を追跡する、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体を移植した結腸の全組織標本顕微鏡検査。破線は、インタクトな結腸組織の外側境界を示す。（ＢおよびＣ）成体結腸壁の内側のグラフトしたＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来ＣＮＳ前駆体およびＣＤ４９Ｄ精製ＣＮＣ前駆体の全組織標本蛍光画像化および遊走の定量。（ＤおよびＥ）ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの結腸におけるグラフトしたＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体の全組織標本蛍光画像化および遊走の定量。（Ｆ）マトリゲルのみをグラフトしたマウスに対する、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体をグラフトしたＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスのカーミン染料胃管栄養によるＧＩ総通過時間。（ＧおよびＨ）ＴＵＪ１およびＳＣ１２１（Ｆ）ならびに（Ｇ）のヒト特異的ＧＦＡＰ（ＳＣ１２３）を共発現するＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの結腸への移植後３ヶ月の、グラフトしたｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体の代表的な画像。破線は、粘膜下層と筋層との間の境界を示す。（ＩおよびＪ）ＮＳＧ（ＷＴ）およびＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの結腸への移植後６週間の、グラフトしたｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の代表的な画像。破線は、粘膜下層と筋層との間の境界を示す。ａにおいてスケールバー＝２００μｍ；ｂおよびｄで１ｃｍ；ｇ〜ｊで１００μｍ；略語：ＡＵ＝任意単位。（Ｆ）のｐ値は、数値で、ウェルチ修正を伴うｔ検定にて与える；ｎ＝３。
【０２２７】
【図１０ＡＢＣＤＥ】図１０Ａ〜１０Ｌは、ＥＤＮＲＢシグナル伝達が、ヒトＥＮＣ前駆体細胞遊走を調節することを示す。（Ａ）ＥＤＮＲＢの標的化に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＤ疾患モデリングパラダイムの説明図。（ＢおよびＣ）ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ（クローン１〜４）におけるスクラッチアッセイの代表的な画像および続く定量。（Ｄ）化学化合物スクリーニングパラダイムの略図。（Ｅ）ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの遊走に対するペプスタチンＡの効果についての用量応答。（ＦおよびＧ）ペプスタチンＡ（１０μＭ）およびＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（１μＭ）での処理後の、ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ遊走の代表的な画像および定量。（ＨおよびＩ）ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける、ＢＡＣＥ２に対する５つの異なるｓｉＲＮＡのプールおよび４つの個々のｓｉＲＮＡを使用したＢＡＣＥ２ノックダウン後の、細胞遊走の代表的な画像および定量。（Ｊ）ペプスタチンＡ移植前処理パラダイムの略図。（Ｋ）ペプスタチンＡ前処理ありまたはなしの、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＮＳＧマウスの結腸の全組織標本画像。（Ｌ）注射部位からの増大する距離での、結腸に存在するヒト細胞を有する動物の画分の定量。（Ｋ）および図Ｓ９ＣのＲＦＰシグナルの生データと比較されたい。ｂ、ｆおよびｈにおいてスケールバー＝２００μｍ；ｊで１ｃｍ。ｃおよびｉでのｐ値は：＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ；ダネット検定（ｗｔと比較して））である。Ｌ（注射部位からの所与の距離の細胞を有する動物の画分）における分析のｐ値は、数値で、ログランク（マンテル−コックス）検定で与える；各群当たりｎ≧８。
【図１０ＦＧＨ】図１０Ａ〜１０Ｌは、ＥＤＮＲＢシグナル伝達が、ヒトＥＮＣ前駆体細胞遊走を調節することを示す。（Ａ）ＥＤＮＲＢの標的化に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＤ疾患モデリングパラダイムの説明図。（ＢおよびＣ）ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ（クローン１〜４）におけるスクラッチアッセイの代表的な画像および続く定量。（Ｄ）化学化合物スクリーニングパラダイムの略図。（Ｅ）ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの遊走に対するペプスタチンＡの効果についての用量応答。（ＦおよびＧ）ペプスタチンＡ（１０μＭ）およびＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（１μＭ）での処理後の、ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ遊走の代表的な画像および定量。（ＨおよびＩ）ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける、ＢＡＣＥ２に対する５つの異なるｓｉＲＮＡのプールおよび４つの個々のｓｉＲＮＡを使用したＢＡＣＥ２ノックダウン後の、細胞遊走の代表的な画像および定量。（Ｊ）ペプスタチンＡ移植前処理パラダイムの略図。（Ｋ）ペプスタチンＡ前処理ありまたはなしの、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＮＳＧマウスの結腸の全組織標本画像。（Ｌ）注射部位からの増大する距離での、結腸に存在するヒト細胞を有する動物の画分の定量。（Ｋ）および図Ｓ９ＣのＲＦＰシグナルの生データと比較されたい。ｂ、ｆおよびｈにおいてスケールバー＝２００μｍ；ｊで１ｃｍ。ｃおよびｉでのｐ値は：＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ；ダネット検定（ｗｔと比較して））である。Ｌ（注射部位からの所与の距離の細胞を有する動物の画分）における分析のｐ値は、数値で、ログランク（マンテル−コックス）検定で与える；各群当たりｎ≧８。
【図１０ＩＪＫＬ】図１０Ａ〜１０Ｌは、ＥＤＮＲＢシグナル伝達が、ヒトＥＮＣ前駆体細胞遊走を調節することを示す。（Ａ）ＥＤＮＲＢの標的化に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＤ疾患モデリングパラダイムの説明図。（ＢおよびＣ）ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ（クローン１〜４）におけるスクラッチアッセイの代表的な画像および続く定量。（Ｄ）化学化合物スクリーニングパラダイムの略図。（Ｅ）ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの遊走に対するペプスタチンＡの効果についての用量応答。（ＦおよびＧ）ペプスタチンＡ（１０μＭ）およびＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（１μＭ）での処理後の、ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ遊走の代表的な画像および定量。（ＨおよびＩ）ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける、ＢＡＣＥ２に対する５つの異なるｓｉＲＮＡのプールおよび４つの個々のｓｉＲＮＡを使用したＢＡＣＥ２ノックダウン後の、細胞遊走の代表的な画像および定量。（Ｊ）ペプスタチンＡ移植前処理パラダイムの略図。（Ｋ）ペプスタチンＡ前処理ありまたはなしの、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＮＳＧマウスの結腸の全組織標本画像。（Ｌ）注射部位からの増大する距離での、結腸に存在するヒト細胞を有する動物の画分の定量。（Ｋ）および図Ｓ９ＣのＲＦＰシグナルの生データと比較されたい。ｂ、ｆおよびｈにおいてスケールバー＝２００μｍ；ｊで１ｃｍ。ｃおよびｉでのｐ値は：＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ；ダネット検定（ｗｔと比較して））である。Ｌ（注射部位からの所与の距離の細胞を有する動物の画分）における分析のｐ値は、数値で、ログランク（マンテル−コックス）検定で与える；各群当たりｎ≧８。
【０２２８】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＥＤＮＲＢヌルｈＥＳＣ系の確立および特徴付けを示す。（Ａ）ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−クローンの標的化領域におけるＣａｓ９−ニッカーゼ誘導二対立遺伝子ナンセンス突然変異の配列。（Ｂ）突然変異体クローンＣ１〜Ｃ４におけるタンパク質発現の欠損を示す、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体におけるＥＤＮＲＢのウェスタンブロット分析。（Ｃ）ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣが、ＣＤ４９Ｄ発現（Ｃ）およびＳＯＸ１０発現（図示せず）に基づいてＣＤ４９Ｄ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣに効率的に分化し得る。（Ｄ）ＷＴ由来細胞に対する、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの増殖。（Ｅ）ＷＴ由来細胞に対する、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける細胞生存能のＬＤＨ活性測定。（Ｄ）のｐ値は：＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝３である。
【図１１ＢＣＤＥ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＥＤＮＲＢヌルｈＥＳＣ系の確立および特徴付けを示す。（Ａ）ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−クローンの標的化領域におけるＣａｓ９−ニッカーゼ誘導二対立遺伝子ナンセンス突然変異の配列。（Ｂ）突然変異体クローンＣ１〜Ｃ４におけるタンパク質発現の欠損を示す、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体におけるＥＤＮＲＢのウェスタンブロット分析。（Ｃ）ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣが、ＣＤ４９Ｄ発現（Ｃ）およびＳＯＸ１０発現（図示せず）に基づいてＣＤ４９Ｄ＋  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣに効率的に分化し得る。（Ｄ）ＷＴ由来細胞に対する、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの増殖。（Ｅ）ＷＴ由来細胞に対する、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおける細胞生存能のＬＤＨ活性測定。（Ｄ）のｐ値は：＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝３である。
【０２２９】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＮＣ前駆体の遊走を救済する化合物の化学スクリーニングを示す。（Ａ）化学スクリーニングアッセイに関するタイムラインおよび実験ステップならびに遊走スコア付けシステムの略図。（Ｂ）スクリーニングプレートレイアウトおよびＤＭＳＯ対照ウェルの位置の例。（Ｃ）Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー化合物およびＤＭＳＯ対照の遊走スコア。（Ｄ）一次ヒット化合物で処理したＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の遊走アッセイおよびスコア。（Ｃ）における一次ヒット化合物のＺスコアは、数値で与える（ＤＭＳＯ対照と比較して、ｎ＝２２４）。
【図１２ＢＣＤ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＮＣ前駆体の遊走を救済する化合物の化学スクリーニングを示す。（Ａ）化学スクリーニングアッセイに関するタイムラインおよび実験ステップならびに遊走スコア付けシステムの略図。（Ｂ）スクリーニングプレートレイアウトおよびＤＭＳＯ対照ウェルの位置の例。（Ｃ）Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー化合物およびＤＭＳＯ対照の遊走スコア。（Ｄ）一次ヒット化合物で処理したＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の遊走アッセイおよびスコア。（Ｃ）における一次ヒット化合物のＺスコアは、数値で与える（ＤＭＳＯ対照と比較して、ｎ＝２２４）。
【０２３０】
【図１３ＡＢＣ】図１３Ａ〜１３Ｆは、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の遊走の薬理学的調節を示す。（Ａ）同等のステージのＣＮＳ前駆体と比較した、１１日目の様々なｈＥＳＣ由来ＮＣサブ系統におけるＢＡＣＥ２発現。（Ｂ）対照ｓｉＲＮＡと比較した、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の、ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおけるＢＡＣＥ２のノックダウンを確認するためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｃ）ペプスタチンＡ前処理ありまたはなしの、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＮＳＧマウスの結腸の全組織標本画像の定量（図３Ｉと比較されたい）。（Ｄ）ＥＤＮ３およびＢＱ−７８８（ＥＤＮＲＢ阻害剤）で処理したＷＴ  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの代表的な画像。（Ｅ）ＢＱ７８８での前処理後のＷＴ  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体における結腸遊走アッセイ。（Ｆ）（Ｅ）のデータの定量。ｅにおいてスケールバー＝１ｃｍ；略語：ＡＵ＝任意単位。
【図１３ＤＥＦ】図１３Ａ〜１３Ｆは、ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の遊走の薬理学的調節を示す。（Ａ）同等のステージのＣＮＳ前駆体と比較した、１１日目の様々なｈＥＳＣ由来ＮＣサブ系統におけるＢＡＣＥ２発現。（Ｂ）対照ｓｉＲＮＡと比較した、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の、ＣＤ４９Ｄ精製ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣにおけるＢＡＣＥ２のノックダウンを確認するためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｃ）ペプスタチンＡ前処理ありまたはなしの、ＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体を移植したＮＳＧマウスの結腸の全組織標本画像の定量（図３Ｉと比較されたい）。（Ｄ）ＥＤＮ３およびＢＱ−７８８（ＥＤＮＲＢ阻害剤）で処理したＷＴ  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ由来ＥＮＣの代表的な画像。（Ｅ）ＢＱ７８８での前処理後のＷＴ  ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体における結腸遊走アッセイ。（Ｆ）（Ｅ）のデータの定量。ｅにおいてスケールバー＝１ｃｍ；略語：ＡＵ＝任意単位。
【発明を実施するための形態】
【０２３１】
５．主題の詳細な説明
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腸ニューロンにさらに誘導され得る、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（腸神経系（ＥＮＳ）前駆体）への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、このような方法によって生成された細胞（ＥＮＳ前駆体および腸ニューロン）、およびこのような細胞を含む組成物に関する。また、ヒルシュスプルング病を予防および／または処置するため、ならびにヒルシュスプルング病を予防および／または処置するのに適した化合物をスクリーニングするための、このような細胞の使用を提供する。
【０２３２】
本開示を、制限することなく明らかにする目的で、詳細な説明を、以下の小区分に分ける。
５．１．定義
５．２．幹細胞を分化させる方法
５．３．分化細胞集団を含む組成物
５．４．腸神経系障害を予防および／または処置する方法
５．５．治療用化合物をスクリーニングする方法
５．６．キット
【０２３３】
５．１  定義
本明細書において使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作成し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するためのある特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
【０２３４】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、この範囲は、部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の限界に応じて決まる。例えば、「約」は、当技術分野の実施に従って、標準偏差の３倍以内または３倍超を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、例えば１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系またはプロセスに関して、この用語は、値のある指標以内、例えば５倍以内または２倍以内であることを意味し得る。
【０２３５】
本明細書で使用される、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質とのリガンドの結合または他の刺激によって活性化されるか、またはその他の方式で影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例として、ＳＭＡＤ、ベータ−カテニン（catnin）を含むウィングレス（Ｗｎｔ）複合体タンパク質、ＮＯＴＣＨ、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３Ｐ）タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質については、リガンドと受容体の相互反応は、細胞の応答に直結しない。リガンドによって活性化された受容体は、最初に、細胞内の他のタンパク質と相互反応することができ、その後、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理的効果が生じる。しばしば、相互反応する一連のいくつかの細胞タンパク質の挙動が、受容体の活性化または阻害後に変わる。受容体の活性化によって誘導された一連の細胞変化の全体は、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
【０２３６】
本明細書で使用される「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する、内部および外部の因子を指す。それらは、化学的または物理的性質であり得る。
【０２３７】
本明細書で使用される「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、形質転換成長因子−ベータ（ＴＦＧβ）、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等を指す。
【０２３８】
本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、分子または経路のシグナル伝達機能を妨害する（例えば、低減、低下、抑制、排除、またはブロックする）、化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。阻害剤は、一例として、ＳＭＡＤシグナル伝達と直接接触し、ＳＭＡＤ  ｍＲＮＡと接触し、ＳＭＡＤのコンフォメーション変化を引き起こし、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させ、またはシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されるものを含む）とのＳＭＡＤの相互反応を妨害し、ＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現に影響を及ぼすことによって、命名されたタンパク質（シグナル伝達分子、命名されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、命名された関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、それらに限定されるものではないが、本明細書に記載されるシグナル伝達分子を含む）の任意の活性を変化させる、任意の化合物または分子であり得る。また阻害剤には、上流シグナル伝達分子（例えば、細胞外ドメイン内）を遮断することによってＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子が含まれ、シグナル伝達分子および効果の例として、骨形成タンパク質を封鎖し、ＡＬＫ受容体１、２、３および６の活性化を阻害し、したがって下流ＳＭＡＤ活性化を防止するノギンが挙げられる。同じく、コーディン、ケルベロス、フォリスタチンも同様に、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を封鎖する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦｂシグナル伝達分子を封鎖する疑似受容体として作用する。アクチビン、ノーダル、ＴＧＦｂ、およびＢＭＰをブロックする抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達等の細胞外活性化因子を中和するための使用を企図される。阻害剤は、命名された分子の阻害を引き起こす命名されたシグナル伝達分子から上流にある分子に結合し、影響を及ぼすことによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するような方式で、活性部位に結合する）およびアロステリック（allostenc）阻害（タンパク質の活性部位との化合物の結合を妨害するような方式で、タンパク質コンフォメーションを変化させる方式でタンパク質に結合する）に関して説明される。阻害剤は、実際にシグナル伝達標的と接触することによって、シグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
【０２３９】
本明細書で使用される「活性化因子」という用語は、分子または経路のシグナル伝達機能、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を増大し、誘導し、刺激し、活性化し、容易にし、または増強する化合物を指す。
【０２４０】
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、類似のコア構造を有する化合物を指す。
【０２４１】
本明細書で使用される「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも２個の細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。集団は、１種の細胞型を含む純粋な集団、例えば腸神経系前駆体の集団、または未分化幹細胞の集団であり得る。あるいは、集団は、１種を超える細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。
【０２４２】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、培養で無期限に分裂し、指定された細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒト由来の幹細胞を指す。
【０２４３】
本明細書で使用される「腸神経系前駆体」、「ＥＮＳ前駆体」、「腸神経堤前駆体、「腸ＮＣ前駆体」または「ＥＮＣ前駆体」という用語は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞を指す。ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンに成熟する能力を有する細胞である。ヒトＥＮＳ前駆体は、ヒト由来のＥＮＳ前駆体を指す。腸神経堤系統マーカーの非限定的な例として、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１が挙げられる。
【０２４４】
本明細書で使用される「腸ニューロン」という用語は、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞を指す。ヒト腸ニューロンは、ヒト由来の腸ニューロンを指す。腸ニューロンマーカーの非限定的な例として、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰが挙げられる。
【０２４５】
本明細書で使用される「胚幹細胞」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、着床前段階の胚から誘導される一次（未分化）細胞を指す。ヒト胚幹細胞は、ヒト由来の胚幹細胞を指す。本明細書で使用される「ヒト胚幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、胚盤胞段階を含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
【０２４６】
本明細書で使用される「胚幹細胞系」という用語は、数日間、数ヶ月間から数年間まで、分化なしに増殖を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で培養された、胚幹細胞集団を指す。
【０２４７】
本明細書で使用される「全能性（totipotent）」という用語は、身体のあらゆる細胞型に加えて、胎盤などの胚体外組織を構成する細胞型のすべてを生じる能力を指す。
【０２４８】
本明細書で使用される「複能性（multipotent）」という用語は、身体の１種を超える細胞型に発達する能力を指す。
【０２４９】
本明細書で使用される「多能性（pluripotent）」という用語は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む、生物の３種の発達上の胚葉に発達する能力を指す。
【０２５０】
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、ある特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）が、体細胞、例えばＣＩ  ４、Ｃ７２等に導入されることによって形成された、胚幹細胞に類似したタイプの多能性幹細胞を指す（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、TakahashiおよびYamanaka、Cell  １２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年）を参照されたい）。
【０２５１】
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、配偶子（卵または精子）以外の体内の任意の細胞を指し、時に「成体」細胞と呼ばれる。
【０２５２】
本明細書で使用される「体細胞（成体）幹細胞」という用語は、自己再生（実験室中）および分化の両方について能力が制限されている、多くの臓器および分化した組織に見出される相対的に稀な未分化細胞を指す。このような細胞は、それらの分化能が異なっているが、通常は起源臓器の細胞型に限定される。
【０２５３】
本明細書で使用される「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体、ならびにその突起である軸索および１つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することによって、他のニューロンまたは細胞に情報を伝送する。
【０２５４】
本明細書で使用される「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
【０２５５】
本明細書で使用される「未分化」という用語は、指定された細胞型にまだ発達していない細胞を指す。
【０２５６】
本明細書で使用される「分化」という用語は、指定されていない胚性細胞が、心臓、肝臓または筋細胞などの指定された細胞の特質を獲得するプロセスを指す。分化は、通常は細胞表面に埋め込まれたタンパク質を伴うシグナル伝達経路を介して、細胞遺伝子と細胞外側の物理的および化学的条件との相互反応によって制御される。
【０２５７】
本明細書で使用される「定方向性分化」という用語は、腸ニューロン前駆体などの特定の（例えば所望の）細胞型への分化を誘導するための、幹細胞の培養条件の操作を指す。
【０２５８】
幹細胞に関して本明細書で使用される「定方向性分化」という用語は、多能性状態から、より成熟したまたは指定された細胞の運命（例えば、腸ニューロン前駆体、腸ニューロン等）への幹細胞の移行を促進するための、小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
【０２５９】
細胞に関して本明細書で使用される「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）から非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）への変化を指す。したがって、「幹細胞の分化を誘導する」は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型（例えば、遺伝子分析、例えばマイクロアレイによって決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、タンパク質、例えばＳＯＸ１０およびＣＤ４９Ｄの発現の変化）を有する子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。
【０２６０】
本明細書で使用される「細胞培養」という用語は、研究または医療処置のための人工培地におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。
【０２６１】
本明細書で使用される「培養培地」という用語は、培養容器、例えばペトリプレート、マルチウェルプレート等の細胞を被覆し、細胞に栄養を与え、細胞を補助するための栄養分を含有する液体を指す。また培養培地は、細胞内の所望の変化をもたらすために添加される成長因子を含み得る。
【０２６２】
本明細書で使用される、細胞を化合物（例えば、１種または複数の阻害剤、活性化因子、および／または誘導因子）と「接触させる」という用語は、化合物を、細胞に触れさせる位置に置くことを指す。接触は、任意の適切な方法を使用して遂行され得る。例えば接触は、化合物を、細胞を入れた管に添加することによって遂行され得る。また接触は、化合物を、細胞を含む培養培地に添加することによって遂行され得る。化合物のそれぞれ（例えば、阻害剤、活性化因子、および本明細書に開示される迷走神経堤パターン形成を誘導する分子）は、細胞を含む培養培地に、溶液（例えば、濃縮溶液）として添加され得る。あるいはまたはさらには、化合物（例えば、阻害剤、活性化因子、および本明細書に開示される迷走神経堤パターン形成を誘導する分子）ならびに細胞は、配合された細胞培養培地中に存在し得る。
【０２６３】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物によって例示されるが、それらに限定されない。
【０２６４】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で生じるプロセスまたは反応、例えば胚発達、細胞分化、神経管形成等を指す。
【０２６５】
遺伝子またはタンパク質に関して本明細書で使用される「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察され得るｍＲＮＡまたはタンパク質を作製すること指す。
【０２６６】
本明細書で使用される「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のためのマーカーは、１種のマーカーに限定することができず、複数のマーカーは、マーカーの指定の群によって、ある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定することができるように、マーカーの「パターン」を指すことができる。
【０２６７】
本明細書で使用される「から誘導された」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、本明細書で開示される任意の細胞に関する場合、細胞系、組織中の親細胞（例えば、解離された胚、または体液）から、任意の操作、例えばそれらに限定されるものではないが、単細胞単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を使用する処置および／または変異誘発、ＤＮＡ配列、例えばモルフォゲン等を用いるトランスフェクション、培養した親細胞に含有されている任意の細胞の選択（例えば連続培養による）を使用して得られた（例えば、単離された、精製された等）細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、分類手順等に対する応答に関して、混合集団から選択され得る。
【０２６８】
本明細書の「個体」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物、スポーツ用動物、げっ歯類およびペットが含まれるが、それらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに非ヒト霊長類、例えば類人猿およびサルが挙げられる。
【０２６９】
本明細書で使用される「疾患」という用語は、細胞、組織または臓器の正常な機能を損なうまたは妨害する任意の状態または障害を指す。
【０２７０】
本明細書で使用される「処置する」または「処置」という用語は、処置を受ける個体または細胞の疾患過程を変えるための臨床的な介入を指し、この処置は、予防のために、または臨床病理の過程中のいずれかに実施され得る。処置の治療効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の低下、病状の回復または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、それらに限定されない。疾患または障害の進行を予防することによって、処置は、影響を受けているもしくは診断を受けた対象、または障害を有することが疑われる対象の障害に起因する悪化を予防することができ、障害の危険性がある、または障害を有すると疑われる対象の障害または障害の症候の発症を予防することもできる。
【０２７１】
５．２  幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体細胞幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例として、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
【０２７２】
本発明者らは、あるタイプの神経系統への幹細胞（例えば、ｈＰＳＣ）の分化を誘導するための二重ＳＭＡＤ阻害の使用を、既に開示している（その全体が参照によって組み込まれるChambers（２００９年））。さらに、本発明者らは、逐次的なＳＭＡＤシグナル伝達の阻害、その後のＷｎｔシグナル伝達の活性化による、侵害受容器（神経堤によって誘導された細胞系統）への幹細胞の分化を既に開示している（それらの全体が参照によって組み込まれる、Chambers（２０１２年）；ＷＯ２０１１／１４９７６２）。これらの神経堤（ＮＣ）分化方法およびプロトコールは、前部／脳の同一性を示す、ＨＯＸ陰性であるＳＯＸ１０＋ＮＣ前駆体；脳ＮＣ（ＣＮＣ）をもたらし、これらの方法およびプロトコールは、主に感覚ニューロンおよび侵害受容性ニューロンを生じる。
【０２７３】
本明細書の本開示の主題は、腸神経系（ＥＮＳ）前駆体（例えば、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞）が、逐次的なＳＭＡＤシグナル伝達の阻害、その後のＷｎｔシグナル伝達の活性化、その後の迷走神経堤同一性の誘導によって、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から分化できるという新規な知見を開示している。ＥＮＳは、迷走神経および仙骨神経堤（ＮＣ）の両方から発生する。ＥＮＳの主な機能は、平滑筋層の協調活性化を介して腸のぜん動運動を制御することである。迷走神経堤（ＮＣ）は、ＥＮＳの大部分を作製し、尾部に遊走して、腸の全長でコロニー形成する３。
【０２７４】
ＥＮＳ前駆体への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化
ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）への幹細胞の分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、幹細胞集団（例えば、ヒト幹細胞）を、有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ノーダル、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流エフェクターをブロックすることによって、それらのシグナル経路をブロックする。ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、それらの全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Chambers（２００９年）、およびChambers（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。
【０２７５】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。「ＳＢ４３１５４２」は、ＣＡＳ番号３０１８３６−４１−９、分子式Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３、および名称４−［４−（１、３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドを有する分子を指す。例えば、以下の構造を参照されたい。
【化１】
2019503679.tif 000003
【０２７６】
幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、または少なくとも約３０日間接触させることができる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間まで、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、約２１日間まで、約２２日間まで、約２３日間まで、約２４日間まで、約２５日間まで、約２６日間まで、約２７日間まで、約２８日間まで、約２９日間まで、または約３０日間まで接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約４日間〜約３０日間の間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間〜約２６日間の間、約４日間〜約２５日間の間、約４日間〜約２４日間の間、約４日間〜約２０日間の間、約４日間〜約１５日間の間、約４日間〜約１０日間の間、約５日間〜約１５日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２０日間の間、約１０日間〜約２０日間の間、約２０日間〜約２５日間の間、または約２５日間〜約３０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、１０日間〜約１５日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日��、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間接触する。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１ｎＭ〜約３００ｎＭ、約５ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約８０ｎＭ〜約１２０ｎＭ、約９０ｎＭ〜約１１０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、または約２５０ｎＭ〜約３００ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約８０ｎＭ〜約１２０ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１００ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、前述の濃度のいずれか１つのＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１００ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日接触する。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）への幹細胞の分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、幹細胞を、有効量のＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、それらの全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Chambers（２００９年）、およびChambers（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。「ＬＤＮ１９３１８９」は、化学式Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６の、次式を有する小分子ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンを指す。
【化２】
2019503679.tif 000004
【０２８０】
ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能し得る。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤であり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害して、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝送を阻害し、その後、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化を阻害する（参照によって本明細書に組み込まれる、Yuら（２００８年）Nat  Med  １４巻：１３６３〜１３６９頁；Cunyら（２００８年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.  １８巻：４３８８〜４３９２頁）。
【０２８１】
幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、または少なくとも約３０日間接触させることができる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間まで、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、約２１日間まで、約２２日間まで、約２３日間まで、約２４日間まで、約２５日間まで、約２６日間まで、約２７日間まで、約２８日間まで、約２９日間まで、または約３０日間まで接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約４日間〜約３０日間の間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間〜約２６日間の間、約４日間〜約２５日間の間、約４日間〜約２４日間の間、約４日間〜約２０日間の間、約４日間〜約１５日間の間、約４日間〜約１０日間の間、約５日間〜約１５日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２０日間の間、約１０日間〜約２０日間の間、約２０日間〜約２５日間の間、または約２５日間〜約３０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、１０日間〜約１５日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間接触する。
【０２８２】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約５μＭ〜１５μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１０μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、前述の濃度のいずれか１つのＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１０μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日接触する。
【０２８３】
ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）への幹細胞の分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、細胞を、有効量のウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化因子（「Ｗｎｔ活性化因子」とも呼ばれる）と接触させるステップを含む。リガンドに関して本明細書で使用される「ＷＮＴ」または「ウィングレス」という用語は、ＷＮＴ受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーの受容体と相互反応することができる分泌タンパク質（すなわちヒトのＩｎｔｌ（インテグレーション１））の群を指す。シグナル伝達経路に関して本明細書で使用される「ＷＮＴ」または「ウィングレス」という用語は、β−カテニンが媒介するまたは媒介しない、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成されたシグナル経路を指す。本明細書に記載される目的では、好ましいＷＮＴシグナル伝達経路は、β−カテニンによる媒介、例えばＷＮＴ／−カテニンを含む。
【０２８４】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、ＧＳＫ３β阻害剤であり得る。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、例えば、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Cadiganら、J  Cell  Sci.  ２００６年；１１９巻：３９５〜４０２頁；Kikuchiら、Cell  Signalling.  ２００７年；１９巻：６５９〜６７１頁を参照されたい。本明細書で使用される「グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤」という用語は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Dobleら、J  Cell  Sci.  ２００３年；１１６巻：１１７５〜１１８６頁を参照されたい。
【０２８５】
Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例は、それらの全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Chambers（２０１２年）、およびCalderら、J  Neurosci.  ２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」としても公知である）は、次式を有する、ＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。
【化３】
2019503679.tif 000005
【０２８７】
ＣＨＩＲ９９０２１は、高度に選択的であり、関係するキナーゼおよび無関係のキナーゼのパネルに対してほぼ千倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭであり、げっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモルのＩＣ５０値を有する。
【０２８８】
幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間接触させることができる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、約２１日間まで、約２２日間まで、約２３日間まで、約２４日間まで、約２５日間まで、約２６日間まで、約２７日間まで、約２８日間まで、約２９日間まで、または約３０日間まで接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間〜約３０日間の間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間〜約２６日間の間、約４日間〜約２５日間の間、約４日間〜約２４日間の間、約４日間〜約２０日間の間、約４日間〜約１５日間の間、約４日間〜約１０日間の間、約５日間〜約１５日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２０日間の間、約１０日間〜約２０日間の間、約２０日間〜約２５日間の間、または約２５日間〜約３０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、５日間〜約１５日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１１日間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１０日間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約９日間接触する。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約３μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、前述の濃度のいずれか１つのＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約３μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触する。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）への幹細胞の分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、細胞を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む。迷走神経ＮＣパターン形成は、それらに限定されるものではないが、ホメオボックスＢ２（ＨＯＸＢ２）、ホメオボックスＢ３（ＨＯＸＢ３）８、ホメオボックスＢ４（ＨＯＸＢ４）、およびホメオボックスＢ５（ＨＯＸＢ５）９を含む１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けることができる。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子は、レチノイン酸（ＲＡ）、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子は、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、迷走神経堤パターン形成を誘導する分子は、レチノイン酸（ＲＡ）である。ＲＡは、依然に、例えば運動ニューロンの指定中に、ＣＮＳ前駆体の領域の同一性を、前部からより尾部の運命へとシフトするための外因性因子として使用されている１０。本発明者らは、ＲＡが、神経堤系統の領域の同一性を方向付けるだけでなく、迷走神経マーカーの発現も誘導することを発見した。実施例１を参照されたい（例えば、図１Ａ）。
【０２９３】
細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、または少なくとも約２１日間接触させることができる。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間まで、約３日間まで、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、または約２１日間まで接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、１つまたは複数の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間〜約２１日間の間、約２日間〜約２０日間の間、約２日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２１日間の間、約２日間〜約６日間の間、約２日間〜約５日間の間、または約５日間〜約１０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間〜約１０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、５日間〜約２０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間〜約６日間の間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間〜約１０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２０日間まで接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、または約２１日間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約６日間接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間接触する。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約５μＭ〜１５μＭの濃度の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１０μＭの濃度の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、前述の濃度のいずれか１つの迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、毎日接触する。ある特定の実施形態では、細胞は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、約１０μＭの濃度の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、毎日接触する。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１２日間接触し、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１０日間接触し、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約６日間接触する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間接触し、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約９日間接触し、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間接触する。
【０２９６】
ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１２日間接触し、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約６日間接触する。ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）集団を生成するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１１日間接触し、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間接触する。
【０２９７】
腸神経系（ＥＮＳ）前駆体（例えば、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞）は、それらと、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、および迷走神経堤パターン形成を誘導する分子の少なくとも１つとの初期接触後、約２０日未満、約１９日未満、約１８日未満、約１７日未満、約１６日未満、約１５日未満、約１４日未満、約１３日未満、約１２日未満、約１１日未満、約１０日未満、約９日未満、約８日未満、約７日未満、約６日未満、約５日未満、または約４日未満で、幹細胞から分化し得る。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、それらと、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、および迷走神経堤パターン形成を誘導する分子の少なくとも１つとの初期接触後、約１１日目またはより後に、幹細胞から分化する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、それらと、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、および迷走神経堤パターン形成を誘導する分子の少なくとも１つとの初期接触後、約１１日目に、幹細胞から分化する。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種または分子は、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である。ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子の非限定的な例として、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、およびＦＧＦ８が挙げられる。Ｗｎｔ活性化因子の非限定的な例として、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａが挙げられる。
【０２９９】
腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導
ＥＮＳ前駆体は、数十の別個の神経伝達物質およびホルモンを生成する多様なニューロンサブセットを生じるそれらの能力が独特である。ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンにｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに誘導／成熟され得る。腸ニューロンは、未成熟腸ニューロン、成熟腸ニューロン、またはそれらの組合せであり得る。分化ＥＮＳ前駆体は、ＥＮＳ前駆体を腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に付すことができる。
【０３００】
ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な条件は、分化ＥＮＳ前駆体を、適切な細胞培養培地中で培養することを含む。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、ＮＢ培地である。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｉｂｃｏ製、２５０３０−１６４）、Ｎ２（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、０７１５６）、およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１７５０４０４４）を補充されたＮＢ培地である。分化ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、適切な細胞培養培地中、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約４５日間、または少なくとも約５０日間培養され得る。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な条件は、分化ＥＮＳ前駆体を、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子は、本明細書に記載される成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される。成長因子の非限定的な例として、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子（ＦＧＦ活性化因子）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸が挙げられる。ある特定の実施形態では、分化ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロン集団を生成するために、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１つまたは複数のＷＮｔ活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷＮＴ活性化因子を含む。ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子の非限定的な例として、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７が挙げられる。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子は、ＦＧＦ２である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＷＮＴ活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【０３０２】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約１日間〜約１０日間の間、約１日間〜約５日間の間、約５日間〜約１０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約１日間〜約５日間の間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約４日間接触する。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１ｎＭ〜１００ｎＭ、約１ｎＭ〜２０ｎＭ、約１ｎＭ〜１５ｎＭ、約１ｎＭ〜１０ｎＭ、約１ｎＭ〜５ｎＭ、約５ｎＭ〜１０ｎＭ、約５ｎＭ〜１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜４０ｎＭ、約４０ｎＭ〜５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜６０ｎＭ、約６０ｎＭ〜７０ｎＭ、約７０ｎＭ〜８０ｎＭ、約８０ｎＭ〜９０ｎＭ、または約９０ｎＭ〜１００ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約５ｎＭ〜１５ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１０ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、前述の濃度のいずれか１つのＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日、１日おきに、または２日ごとに接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１０ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触する。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度の１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１μＭ〜５μＭの濃度の１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約３μＭ濃度の１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、前述の濃度のいずれか１つの１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、毎日、１日おきに、または２日ごとに接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約３μＭの濃度の１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、毎日接触する。
【０３０５】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、細胞培養培地中で接触する。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＮＢ培地である。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｉｂｃｏ製、２５０３０−１６４）、Ｎ２（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、０７１５６）、およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１７５０４０４４）を補充されたＮＢ培地である。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、分化ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロン集団を生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と接触する。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約４５日間、または少なくとも約５０日間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と、約１日間〜約５０日間の間、約１日間〜約１０日間の間、約２０日間〜約３０日間の間、約３０日間〜約４０日間の間、または約４０日間〜約５０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約１０日間〜約２０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約２０日間〜約３０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約４０日間〜約５０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約１０日間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約２５日間接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約４５日間接触する。
【０３０８】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１ｎＭ〜１００ｎＭ、約１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ〜６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ〜７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ〜９０ｎｇ／ｍＬ、または約９０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、前述の濃度のいずれか１つのＧＤＮＦと、毎日、１日おきに、または２日ごとに接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと、毎日接触する。
【０３０９】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約５０μＭ〜２００μＭ、約５０μＭ〜１００μＭ、または約１００μＭ〜２００μＭの濃度のアスコルビン酸と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約５０μＭ〜２００μＭの濃度のアスコルビン酸と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１００μＭの濃度のアスコルビン酸と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、前述の濃度のいずれか１つのアスコルビン酸と、毎日、１日おきに、または２日ごとに接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、約１００μＭの濃度のアスコルビン酸と毎日接触する。
【０３１０】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と、細胞培養培地中で接触する。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＮＢ培地である。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｉｂｃｏ製、２５０３０−１６４）、Ｎ２（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、０７１５６）、およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１７５０４０４４）を補充されたＮＢ培地である。
【０３１１】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、１種または複数のＦＤＦ活性化因子および１種または複数のＷＮＴ活性化因子と接触し、その後、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と接触する。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、ＦＧＦ２およびＣＨＩＲ９９０２１４と接触し、その後、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と接触する。ある特定の実施形態では、腸ニューロンは、未成熟腸ニューロンである。ある特定の実施形態では、未成熟腸ニューロンは、それらに限定されるものではないが、ベータ３クラスＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、対合（paired）様ホメオボックス２Ａ（ＰＨＯＸ２Ａ）、対合様ホメオボックス２Ｂ（ＰＨＯＸ２Ｂ）、神経栄養チロシンキナーゼ受容体タイプ３（ＴＲＫＣ）、ＡＳＣＬ１、心臓および神経堤の発現誘導体２（ＨＡＮＤ２）、ならびにＥＤＮＲＢを含む１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する。
【０３１２】
未成熟腸ニューロンは、成熟腸ニューロンにさらに分化し得る。ある特定の実施形態では、腸ニューロンは、成熟腸ニューロンである。ある特定の実施形態では、成熟腸ニューロンは、それらに限定されるものではないが、５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、およびコリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）を含む１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する。
【０３１３】
ある特定の実施形態では、腸ニューロンは、未成熟腸ニューロンおよび成熟腸ニューロンの混合物または組合せである。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な条件は、分化ＥＮＳ前駆体を３Ｄスフェロイドに凝集させ、その３Ｄスフェロイドを懸濁培養液中で培養することをさらに含む。ある特定の実施形態では、３Ｄスフェロイドは、懸濁培養液中で、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間培養される。ある特定の実施形態では、３Ｄスフェロイドは、懸濁液中で約４日間培養される。ある特定の実施形態では、懸濁培養培地は、Ｎ２補充物、ならびにＣＨＩＲ９９０２１および線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）を含むＢ２７（登録商標）補充物を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地である。
【０３１５】
ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な条件は、３Ｄスフェロイドを懸濁培養液中で培養した後、自発的分化のために、アスコルビン酸（ＡＡ）およびＧＤＮＦの存在下で、３Ｄスフェロイドを接着培養液中で培養することをさらに含む。
【０３１６】
３Ｄスフェロイドは、接着培養液中で約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、または約１２週間培養され得る。ある特定の実施形態では、３Ｄスフェロイドは、接着培養液中で約３週間、例えば約２０日間培養される。ある特定の実施形態では、３Ｄスフェロイドは、接着培養液中で約６週間、例えば約４０日間培養される。ある特定の実施形態では、接着培養培地は、Ｎ２補充物、ならびにＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含むＢ２７（登録商標）補充物を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地である。ある特定の非限定的な実施形態では、接着培養は、適切なコーティング、例えば、ポリオルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、またはそれらの組合せを用いた表面上で実施される（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Zeltnerら（２０１４年）に記載されている方法）。ある特定の実施形態では、３Ｄスフェロイドに凝集した細胞は、最初に、接着培養液中で未成熟ニューロン集団に分化し、３Ｄスフェロイドから遊走して出る。
【０３１７】
細胞培養培地
ある特定の実施形態では、前述の阻害剤、活性化因子および分子は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）血清置換（「ＫＳＲ」）培地、Ｎ２培地、およびＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地（例えば、Ｎ２およびＢ−２７（登録商標）補充物を補充されたＮＢ培地）が含まれるが、それらに限定されない。ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、Ｅ８／Ｅ６培地およびＮＢ培地は、商業的に利用可能である。
【０３１８】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させるための培地は、ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される培地である。ある特定の実施形態では、幹細胞を、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させるための培地は、Ｅ８／Ｅ６培地である。ある特定の実施形態では、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞（ＥＮＳ前駆体）を、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞（腸ニューロン）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導するための培地は、ＮＢ培地である。
【０３１９】
ＫＳＲ培地は、未分化ｈＥＳＣ細胞を培養で成長させ、維持するために最適化された、定義された無血清配合物である。ＫＳＲ培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、ノックアウトＤＭＥＭ、ノックアウト血清置換、Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ、および１３−メルカプトエタノールを含む。ある特定の実施形態では、ＫＳＲ培地１リットルは、ノックアウトＤＭＥＭ８２０ｍＬ、ノックアウト血清置換１５０ｍＬ、２００ｍＭのＬ−グルタミン１０ｍＬ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ１０ｍＬ、１０ｍＭのＭＥＭ１０ｍＬ、および５５μＭの１３−メルカプトエタノールを含み得る。
【０３２０】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にＫＳＲ培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤、活性化因子、および迷走神経堤パターン形成を誘導する分子の少なくとも１つとの初期接触後、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約７日目、約８日目から、増量したＮ２培地で徐々に置き換えられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にＫＳＲ培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤、活性化因子、および迷走神経堤パターン形成を誘導する分子の少なくとも１つとの初期接触後、約４日目（例えば、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、４日目）から、増量したＮ２培地で徐々に置き換えられる。
【０３２１】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、および迷走神経パターン形成を誘導する１種または複数の分子と接触する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、および迷走神経パターン形成を誘導する１種または複数の分子は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。
【０３２２】
Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大増殖を支持する、フィーダーを含まないおよび異種成分を含まない培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞再プログラムを支持することが証明されている。さらに、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣ培養の特注培地の配合のためのベースとして使用され得る。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、Chenら、Nat  Methods.  ２０１１年５月；８巻（５号）：４２４〜９頁に記載されている。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ１５／０７７６４８に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレニウム（selenum）、インスリン、ＮａＨＣＯ３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。Ｅ８／Ｅ６培地は、活性なＢＭＰまたはＷｎｔ成分を含まないという点で、ＫＳＲ培地とは異なる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞集団を培養して、腸神経堤前駆体（ＥＮＳ前駆体）集団に分化させるためにＥ８／Ｅ６培地が使用される場合、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（例えば、ＢＭＰを阻害する阻害剤）は、Ｅ８／Ｅ６培地に添加される必要はない。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、および迷走神経パターン形成を誘導する１種または複数の分子と接触する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、および迷走神経パターン形成を誘導する１種または複数の分子は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地である。
【０３２３】
Ｎ２補充物は、未分化神経幹細胞および前駆細胞を培養で拡大増殖させるために使用される、化学的に定義された、動物質を含まない補充物である。Ｎ２補充物は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と使用されることを意図される。Ｎ２培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｎ２培地は、グルコース、重炭酸ナトリウム、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびインスリンを補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む。ある特定の実施形態では、Ｎ２培地１リットルは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末を含む蒸留Ｈ２Ｏ９８５ｍｌ、グルコース１．５５ｇ、重炭酸ナトリウム２．００ｇ、プトレシン（蒸留水１００ｍＬに溶解した１．６１ｇの一定分量１００ｕＬ）、プロゲステロン（１００％エタノール１００ｍＬに溶解した０．０３２ｇの一定分量２０ｕＬ）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中０．５ｍＭ溶液の一定分量６０ｕＬ）、トランスフェリン１００ｍｇ、および５ｍＭのＮａＯＨ１０ｍＬ中インスリン２５ｍｇを含む。
【０３２４】
本開示の幹細胞集団を培養するために使用される細胞培養培地によって、幹細胞と接触させる阻害剤が決定されるだけでなく（例えば、ＫＳＲ培地では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が必要であり、Ｅ８／Ｅ６培地では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤だけが必要である）、前述の阻害剤、活性化因子および分子を幹細胞と接触させる順番も決定される。
【０３２５】
ある特定の実施形態では、細胞と、有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内（例えば、同時（同日）、約１日目、約２日目、約３日目、または約４日目）に行われる。Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同日、またはその１日後、２日後もしくは３日後に添加され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、９６時間以内に接触する。
【０３２６】
本明細書に記載される期間において、１種または複数の薬剤（活性化因子、阻害剤、分子）が同日（同じ２４時間以内）に添加される場合、これらは、本明細書で矛盾が別段特定されない限り、任意の順序で添加され得る。
【０３２７】
ある特定の実施形態では、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、例えば最初に、これらの阻害剤およびＷｎｔシグナル伝達活性化因子を、幹細胞を含む細胞培養培地に同日に添加することによって、同日に行われる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触は、幹細胞と、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触と同日に、例えば最初に、これらの阻害剤を、幹細胞を含む細胞培養培地に同日に添加することによって行われる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。ある特定の実施形態では、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約１日〜約４日の間（例えば、約１日目、約２日目、約３日目、または約４日目）に行われる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。ある特定の実施形態では、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に行われる。
【０３２９】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させるための細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地であり、細胞と、１種または複数のＷｎｔ活性化因子との初期接触は、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触と同日に、例えば最初に、Ｗｎｔ活性化因子およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤を、幹細胞を含む細胞培養培地に同日に添加することによって行われる。ある特定の実施形態では、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）活性剤は、Ｅ８／Ｅ６培地に添加される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間培養した後、培地から取り除かれる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、約３日間の培養後に、培地から取り除かれる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、培養培地中に、約０．５〜約２０ｎｇ／ｍＬの間、または約１〜約１５ｎｇ／ｍｌの間、または約２〜約１０ｎｇ／ｍｌの間、または約３〜約５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、培養培地中に、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０３３０】
ある特定の実施形態では、細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から、または初期接触から始まる約８日間以内（約８日以内）に行われる。ある特定の実施形態では、幹細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に行われる。ある特定の実施形態では、細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、幹細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約７日目または約８日目に行われる。
【０３３１】
ある特定の実施形態では、細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に行われる。ある特定の実施形態では、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触は、０日目に行われ、幹細胞と、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触は、０日目に行われ、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、２日目に行われ、細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、６日目に行われる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、またはそれらの組合せである。
【０３３２】
ある特定の実施形態では、幹細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約６日目に行われる。ある特定の実施形態では、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触は、０日目に行われ、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触は、０日目に行われ、細胞と、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触は、６日目に行われる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地である。
【０３３３】
マーカーおよびレポーター
分化ＥＮＳ前駆体は、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する。腸神経堤系統マーカーの非限定的な例として、対合ボックス３（ＰＡＸ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）ならびにｒｅｔ  ｐｒｏｔｏ癌遺伝子（ＲＥＴ）、対合様ホメオボックス２Ａ（ＰＨＯＸ２Ａ）、対合様ホメオボックス２Ｂ（ＰＨＯＸ２Ｂ）、神経栄養チロシンキナーゼ受容体タイプ３（ＮＴＲＫ−３）、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体ホモログ１（ＡＳＣＬ１）、心臓および神経堤の発現誘導体２（ＨＡＮＤ２）、ホメオボックスＢ３（ＨＯＸＢ３）、ホメオボックスＢ５（ＨＯＸＢ５）が挙げられる。
【０３３４】
ある特定の実施形態では、分化ＥＮＳ前駆体は、１種または複数の全般的神経堤マーカーをさらに発現する。全般的神経堤マーカーの非限定的な例として、フォークヘッドボックスＤ３（ＦＯＸＤ３）、転写因子ＡＰ−２アルファ（ＴＦＡＰ２Ａ）、Ｔ−ボックス２（ＴＢＸ２）、ＲＰ４−７９２Ｇ４．２、ＲＮＡ、２８Ｓリボソーム５（ＲＮＡ２８Ｓ５）、転写因子ＡＰ−２ベータ（ＴＦＡＰ２Ｂ）、ｉｎｓｃｕｔｅａｂｌｅホモログ（ＩＮＳＣ）、ＲＰ１１−２００Ａ１３．２、ｃｉｌｉａおよびｆｌａｇｅｌｌａ関連タンパク質１２６（Ｃ１ｏｒｆ１９２）、レチノイドＸ受容体ガンマ（ＲＸＲＧ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、ならびにＳＯＸ１０が挙げられる。
【０３３５】
ある特定の実施形態では、分化ＥＮＳ前駆体は、１種または複数の迷走神経マーカーをさらに発現する。迷走神経マーカーの非限定的な例として、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５が挙げられる。
【０３３６】
ある特定の実施形態では、分化ＥＮＳ前駆体細胞は、１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する。ある特定の実施形態では、ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーは、ＣＤ４９Ｄである。
【０３３７】
腸ニューロンは、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する。腸ニューロンマーカーの非限定的な例として、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰが挙げられる。
【０３３８】
分化ＥＮＳ前駆体または腸ニューロンは、１種または複数のレポーターをさらに発現し得る。レポーターの非限定的な例として、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、酵素（例えばオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ）、ならびに抗原分子が挙げられる。本明細書で使用される「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」という用語は、発色タンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、またはベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素などの、容易に検出可能な、または容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝的構築物を指す。ある特定の実施形態では、レポーターは、腸神経堤系統マーカー遺伝子の組換えプロモーター、例えばＳＯＸ１０プロモーターによって駆動され得る。
【０３３９】
分化ＥＮＳ前駆体およびさらに成熟した腸ニューロンは、例えば細胞培養培地中で分化した後、精製され得る。本明細書で使用される「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」および「単離」という用語は、試料から、少なくとも１種の汚染物質の量を低減することを指す。例えば、所望の細胞型は、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、および少なくとも９０％未満、精製される。「精製する」という用語は、試料から、ある特定の細胞（例えば、望ましくない細胞）を除去することを指すことができる。非侵害受容器細胞の除去または選択によって、試料中の所望の侵害受容器細胞のパーセンテージが増大する。ある特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも１種のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカー、例えばＣＤ４９Ｄを発現する細胞に分類することによって精製される。ある特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも１種の腸神経堤系統マーカー、例えばＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５および／またはＡＳＣＬ１を発現する細胞に分類することによって精製される。
【０３４０】
本開示の主題はまた、本明細書に記載される方法によって生成された、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団、およびこのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞を含む組成物を提供する。本開示の主題はまた、本明細書に記載される方法によって生成された、１種または複数の腸神経のマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団、およびこのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞を含む組成物を提供する。
【０３４１】
５．３  分化細胞集団を含む組成物
本開示の主題は、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法によって生成された分化腸神経堤系統細胞（または「ＥＮＳ前駆体」）集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化腸神経堤系統細胞（または「ＥＮＳ前駆体」）から成熟した腸ニューロン集団を含む組成物を提供する。
【０３４２】
さらに、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、腸ニューロンマーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する組成物を提供する。
【０３４３】
さらに、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する組成物を提供する。
【０３４４】
腸神経堤系統マーカーの非限定的な例として、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１が挙げられる。
【０３４５】
腸ニューロンマーカーの非限定的な例として、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰが挙げられる。
【０３４６】
幹細胞マーカーの非限定的な例として、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３が挙げられる。
【０３４７】
ＣＮＳマーカーの非限定的な例として、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１が挙げられる。
【０３４８】
神経細胞マーカーの非限定的な例として、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰが挙げられる。
【０３４９】
間葉系前駆体マーカーの非限定的な例は、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３である。
【０３５０】
ＣＮＣマーカーの非限定的な例として、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１が挙げられる。
【０３５１】
ＭＮＣマーカーの非限定的な例として、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１が挙げられる。
【０３５２】
ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０４〜約１×１０１０個、約１×１０４〜約１×１０５個、約１×１０５〜約１×１０９個、約１×１０５〜約１×１０６個、約１×１０５〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０８個、約１×１０７〜約１×１０８個、約１×１０８〜約１×１０９個、約１×１０８〜約１×１０１０個、または約１×１０９〜約１×１０１０個の、本開示の幹細胞由来の腸神経堤系統細胞または成熟腸ニューロン集団を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０５〜約１×１０７個の、本開示の幹細胞由来の腸神経堤系統細胞または成熟腸ニューロン集団を含む。
【０３５３】
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生体適合性のある足場またはマトリックス、例えば、細胞が対象にインプラントまたはグラフトされると組織再生を容易にする、生体適合性のある三次元足場をさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性のある足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含む多糖類、および／またはヒドロゲルを含む。（例えば、それぞれの内容全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照されたい）。
【０３５４】
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、添加剤、賦形剤またはそれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、腸ニューロン関連障害、例えばヒルシュスプルング病（ＨＳＣＲ）を予防および／または処置するために使用され得る。
【０３５５】
５．４  腸神経系障害を予防および／または処置する方法
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞（「幹細胞由来の腸神経堤（ＮＣ）前駆体」または「ＥＮＳ前駆体」とも呼ばれる）は、腸神経系障害（ＥＮＳ）を予防および／または処置するために使用され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化ＥＮＳ前駆体から成熟した腸ニューロンは、ＥＮＳを予防および／または処置するためにも使用され得る。本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置する方法であって、ＥＮＳ障害に罹患している対象に、有効量の、以下：
（ａ）本明細書に記載される分化した本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体（ＥＮＳ前駆体）集団、
（ｂ）このような幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体（ＥＮＳ前駆体）を含む組成物、
（ｃ）本明細書に記載される本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体（ＥＮＳ前駆体）から成熟した腸ニューロン集団、および
（ｄ）このような腸ニューロンを含む組成物
の１つまたは複数を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０３５６】
さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体（ＥＮＳ前駆体）もしくはそれらを含む組成物、または幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体（ＥＮＳ前駆体）から成熟した本開示の腸ニューロンの使用を提供する。ＥＮＳ障害の非限定的な例として、ヒルシュスプルング病（ＨＤ）、中毒性巨大結腸症、任意の腸管神経節細胞僅少症、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、胃不全麻痺、腸関連の薬物副作用または他の処置合併症が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ障害は、ヒルシュスプルング病（ＨＤ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、細胞表面マーカーＣＤ４９Ｄを発現する。
【０３５７】
ＨＤに罹患している子供は、現在、腸の神経節細胞欠損部分の外科的除去によって処置されている。外科的手術は、救命に至るが、生存患者に残ったＧＩ管の永久的な機能不全に対処するものではない１７。ＨＤのための細胞治療の開発における主な困難は、広範な距離にわたってＥＮＳを生着させる必要があるということである。成人個体では、小腸および大腸の長さは、それぞれおよそ５メートルおよび１．５メートルである１８。したがって、移植のためのいずれの候補細胞型も、並外れた遊走特性を必要とし得る。過去の研究では、胎児または生後結腸への様々な候補細胞源の移植が試験された１９〜２１。マウス胎仔由来のＥＮＣ前駆体によって、機能的統合の証拠と共に最も有望なデータが得られたが、ｉｎ  ｖｉｖｏ遊走能には限界があった２２。さらに、一次ＥＮＣ前駆体は、拡張性が非常に限られており、ヒト供給源から容易に得ることができない。
【０３５８】
腸神経堤（ＥＮＣ）の非常に重要な１つの機能特性は、迷走神経ＮＣレベルで神経管から剥離した後に、広範に遊走し、腸の全長でコロニー形成する能力である３。本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、対象（例えば、成人）の結腸内で広範なｉｎ  ｖｉｖｏ遊走能を有する（例えば、結腸内で広範に遊走する）。本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、対象（例えば、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象）の腸および結腸に生着する。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体の投与は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象の結腸に、対象の盲腸から直腸までの全長にわたって生着する。本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体の広範な生着は、腸の神経節細胞欠損部分の、永久的な真実の修復を可能にし得る。また本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、パラクリンサイトカイン放出、免疫調節、および／またはバリア機能変化に影響を及ぼすことができ、それによって、ＨＤ関連死を予防することに寄与し得る。したがって、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）のための新規な治療機会を提供する。
【０３５９】
本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、ＥＮＳ障害を処置または予防するために、対象に全身的または直接的に投与または提供され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、目的の臓器（例えば、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）によって影響を受けている臓器）に直接的に注射される。本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、対象の腸領域、例えば、小腸、結腸、盲腸、および／または直腸に直接的に投与（注射）され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象の盲腸に投与される。さらに、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、小腸、結腸、盲腸、および／または直腸の壁、平滑筋、結合組織（issue）および／またはリンパ（lyphatic）管に直接的に投与（注射）され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象の盲腸壁に投与される。注射された細胞は、小腸、結腸、盲腸および／または直腸の平滑筋に遊走し、機能的神経筋接合部を形成し得る。
【０３６０】
本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンは、任意の生理的に許容される媒体により投与され得る。本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンおよびそれらを含む医薬組成物は、局所注射、同所（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンは、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に、同所（ＯＴ）注射を介して投与される。
【０３６１】
本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンおよびそれらを含む医薬組成物は、好都合には、無菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供することができ、これらは、選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は、普通は、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも容易に調製される。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに、いくらかより好都合である。他方では、粘性組成物は、特定の組織とより長期間接触させるのに適した粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、この担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。注射可能な滅菌溶液剤は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンを含む組成物を、所望に応じて様々な量のその他の成分と共に、必要量の適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。このような組成物は、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖などの、適切な担体、賦形剤、または添加剤の混合物で存在し得る。また組成物は、凍結乾燥させることができる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散化剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加物質または増粘添加物質、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有し得る。過度の実験方法なしに適切な調製物を調製するために、参照によって本明細書に組み込まれる「REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCE」、第１７版、１９８５年などの標準書を参考にすることができる。
【０３６２】
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含めた、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物質を添加することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確保され得る。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（alum  inurn）およびゼラチンを使用することによってもたらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意の媒体、賦形剤、または添加物質は、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体と適合性がなければならない。
【０３６３】
組成物の粘度は、所望に応じて薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持され得る。メチルセルロースは、容易に、経済的に利用可能であり、取り扱いが容易であるため使用され得る。他の適切な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が含まれる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて決まり得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、適切な担体および他の添加物質の選択は、正確な投与経路、および特定の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、組成物を、溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態、例えば持続放出形態または液体充填形態のいずれに製剤化すべきか）に応じて決まる。
【０３６４】
当業者は、組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体の生存率または有効性に影響を及ぼさないことを認識されよう。このことは、当業者にとって、化学的および薬学的原理の問題にならず、または問題は、標準書を参照することによってもしくは簡単な実験によって（過度の実験方法を伴わない）、本開示および本明細書に引用される文献から容易に回避され得る。
【０３６５】
本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体の治療上の使用に関する１つの考察は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。最適な効果には、それらに限定されるものではないが、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象の腸への生着、結腸への生着、ならびに腸および結腸への生着、ならびに／または対象の腸機能の改善が含まれる。
【０３６６】
「有効量」（または「治療有効量」）は、処置時に有益なまたは所望の臨床的な結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１回または複数の用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量とは、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）の進行を緩和し、回復させ、安定化し、逆行させ、もしくは緩徐するか、またはそうでなければＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）の病理学的結果を低減するのに十分な量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の知識の範囲内である。典型的に、有効量を達成するのに適した投与量を決定する場合には、複数の因子が考慮される。これらの因子には、対象の年齢、性別および体重、処置を受ける状態、状態の重症度、ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が含まれる。
【０３６７】
ある特定の実施形態では、有効量は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象の腸に生着する、結腸に生着する、または腸および結腸に生着するのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象の腸の機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常なヒトの腸の機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％であり得る。
【０３６８】
投与される細胞の量は、処置を受ける対象ごとに変わる。ある特定の実施形態では、約１×１０４〜約１×１０１０個、約１×１０４〜約１×１０５個、約１×１０５〜約１×１０９個、約１×１０５〜約１×１０６個、約１×１０５〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０８個、約１×１０７〜約１×１０８個、約１×１０８〜約１×１０９個、約１×１０８〜約１×１０１０個、または約１×１０９〜約１×１０１０個の、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンが、対象に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０５〜約１×１０７個の、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンが、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される。ある特定の実施形態では、約２×１０５個の、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンが、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０６〜約１×１０７個の、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンが、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される。ある特定の実施形態では、約２×１０６〜約４×１０６個の、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロンが、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される。有効用量とみなされ得る量の正確な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む、各対象について個別の因子基づき得る。投与量は、本開示および当技術分野の知識から、当業者によって容易に確認され得る。
【０３６９】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するために、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される細胞は、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体集団である。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するために、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される細胞は、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体から分化／成熟した腸ニューロン集団である。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ障害を処置するために、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与される細胞は、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体から分化／成熟した腸神経節、感覚ニューロンおよび運動ニューロンの集団である。
【０３７０】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法は、それを必要とする対象に、有効量のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の阻害剤を投与するステップを含む。
【０３７１】
ある特定の実施形態では、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法は、それを必要とする対象に、有効量の酸性プロテアーゼの阻害剤を投与するステップを含む。
【０３７２】
さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、ＢＡＣＥ阻害剤の使用を提供する。さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用を提供する。
【０３７３】
ＢＡＣＥ阻害剤の非限定的な例として、ＢＡＣＥ２の阻害剤、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ２８８６７２１、ＬＹ２８１１３７６、ベルベセスタット（ＭＫ−８９３１）、およびＡＺＤ３８３９が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＢＡＣＥ２阻害剤は、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（ＢＡＣＥ阻害剤Ｃ３）である。
【０３７４】
酸性プロテアーゼ阻害剤の非限定的な例として、ペプスタチンＡ、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびＬＹ−４５０１３９の阻害剤が挙げられる。
【０３７５】
酸性プロテアーゼの阻害剤（例えば、ペプスタチンＡ）は、ＥＤＮＲＢにおいてホモ接合性機能喪失変異を含む、本開示の幹細胞から誘導された腸ＮＣ前駆体の遊走欠損を救済することができる。ある特定の実施形態では、ペプスタチンＡの救済効果は、ＢＡＣＥ２媒介効果である。
【０３７６】
さらに、ＢＡＣＥ阻害剤（例えば、ＢＡＣＥ２阻害剤、例えば、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ）は、ＥＤＮＲＢにおいてホモ接合性機能喪失変異を含む、本開示の幹細胞から誘導された腸ＮＣ前駆体の遊走欠損を救済することができる。
【０３７７】
したがって、酸性プロテアーゼの阻害剤（例えば、ペプスタチンＡ）、およびＢＡＣＥ阻害剤（例えば、ＢＡＣＥ２阻害剤、例えば、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ）は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するために使用され得る。
【０３７８】
５．５  治療用化合物を同定する方法
本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体および／または成熟腸ニューロンは、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）をモデル化し、疾患関連遊走欠損を克服することができる候補化合物をスクリーニングするためのプラットフォームとして働くことができる。ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を軽減する候補化合物の能力は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を引き起こす遺伝変異によって引き起こされた生理的欠損または細胞の欠損を救済する候補化合物の能力をアッセイすることによって決定され得る。本発明者らによるＨＤ関連遊走欠損の救済におけるペプスタチンＡおよびＢＡＣＥ２阻害の同定は、薬物発見における本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体の使用についての概念証明となる。実施例１を参照されたい。
【０３７９】
本開示の主題は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤおよび／またはＨＤ関連遺伝的欠陥）を予防および／または処置するのに適した化合物を同定またはスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、細胞可動性関連遺伝子、例えばエンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）においてホモ接合性機能喪失変異を含む細胞集団によって提示された少なくとも１つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、ここで細胞集団は、幹細胞（例えば、多能性幹細胞）から誘導された本開示の腸ＮＣ前駆体、幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体から誘導された本開示の腸ニューロン、およびそれらの組合せまたは混合物からなる群から選択される。ＥＤＮＲＢにおける機能喪失変異は、ＨＤ患者のサブセットにおける周知の遺伝的原因である２８。
【０３８０】
ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）（ｉ）幹細胞（例えば、多能性幹細胞）から誘導された本開示の腸ＮＣ前駆体、幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体から誘導された本開示の腸ニューロン、およびそれらの組合せまたは混合物からなる群から選択される、ＥＤＮＲＢにおいてホモ接合性機能喪失変異を含む細胞集団、および（ｉｉ）試験化合物を提供するステップと、（ｂ）細胞集団を、試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）細胞集団の遊走挙動を測定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、細胞集団（例えば、腸ＮＣ前駆体および／または腸ニューロン）は、試験化合物と少なくとも約６時間、約１２時間、約２４時間（１日）、例えば約２４時間（１日）、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間接触する。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、細胞集団は、幹細胞から誘導された腸ＮＣ前駆体である。
【０３８２】
腸ＮＣ前駆体の遊走挙動を測定するために使用され得る、任意の適切な遊走アッセイには、例えば、スクラッチアッセイ（例えば、細胞培養プレートのオープンスペースへの遊走）、創傷治癒アッセイ、遊出アッセイ（例えば、マイクロポアの通過）、細胞除外帯域アッセイ、マイクロ流体アッセイ、およびＯｒｉｓ（登録商標）細胞遊走アッセイが含まれる。さらに、腸ＮＣ前駆体の遊走挙動を測定するための方法は、半固体培養培地、例えばヒドロゲル培養培地中に腸ＮＣ前駆体が遊走する能力を測定するステップを含む。ある特定の実施形態では、腸ＮＣ前駆体は、それらの遊走挙動について測定される前に固定される。
【０３８３】
ある特定の実施形態では、この方法は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤまたは中毒性巨大結腸症）の原因となる遺伝変異を決定するステップをさらに含む。それらに限定されるものではないが、家族性患者群における遺伝系統分析、マウスモデルを使用する順遺伝学および逆遺伝学を含む、ＨＤの原因となる遺伝変異を決定するための方法は、当技術分野で公知である。
【０３８４】
５．６．キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化因子、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書を含む。
【０３８５】
ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞を、阻害剤、活性化因子および分子と、特定の順番で接触させるための指示を含む。阻害剤、活性化因子および分子の接触する順番は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定され得る。
【０３８６】
ある特定の実施形態では、指示書は、細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約６日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から、または初期接触から始まる約４日間以内（例えば、同時に（同日）、約１日目、約２日目、約３日目、または約４日目）に、細胞を、有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるための指示を含む。
【０３８７】
ある特定の実施形態では、キットはさらに、有効量のＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、同時に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約１日〜約４日以内に、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞と、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む。
【０３８８】
ある特定の実施形態では、指示書は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から、または初期接触から始まる約８日間以内に、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約７日目または約８日目に、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む。
【０３８９】
ある特定の実施形態では、指示書は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約６日目に、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、０日目に最初に接触させるための指示、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、０日目に最初に接触させるための指示、および細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、６日目に最初に接触させるための指示を含む。
【０３９０】
ある特定の実施形態では、指示書は、細胞と、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、０日目に最初に接触させるための指示、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、０日目に最初に接触させるための指示、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、２日目に最初に接触させるための指示、および細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、６日目に最初に接触させるための指示を含む。
【０３９１】
ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、または少なくとも約３０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間まで、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、約２１日間まで、約２２日間まで、約２３日間まで、約２４日間まで、約２５日間まで、約２６日間まで、約２７日間まで、約２８日間まで、約２９日間まで、または約３０日間まで接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約４日間〜約３０日間の間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間〜約２６日間の間、約４日間〜約２５日間の間、約４日間〜約２４日間の間、約４日間〜約２０日間の間、約４日間〜約１５日間の間、約４日間〜約１０日間の間、約５日間〜約１５日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２０日間の間、約１０日間〜約２０日間の間、約２０日間〜約２５日間の間、または約２５日間〜約３０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、１０日間〜約１５日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、��ＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間接触させるための指示を含む。
【０３９２】
ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、または少なくとも約３０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間まで、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、約２１日間まで、約２２日間まで、約２３日間まで、約２４日間まで、約２５日間まで、約２６日間まで、約２７日間まで、約２８日間まで、約２９日間まで、または約３０日間まで接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約４日間〜約３０日間の間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間〜約２６日間の間、約４日間〜約２５日間の間、約４日間〜約２４日間の間、約４日間〜約２０日間の間、約４日間〜約１５日間の間、約４日間〜約１０日間の間、約５日間〜約１５日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２０日間の間、約１０日間〜約２０日間の間、約２０日間〜約２５日間の間、または約２５日間〜約３０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、１０日間〜約１５日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間接触させるための指示を含む。
【０３９３】
ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、約２１日間まで、約２２日間まで、約２３日間まで、約２４日間まで、約２５日間まで、約２６日間まで、約２７日間まで、約２８日間まで、約２９日間まで、または約３０日間まで接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間〜約３０日間の間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間〜約２６日間の間、約４日間〜約２５日間の間、約４日間〜約２４日間の間、約４日間〜約２０日間の間、約４日間〜約１５日間の間、約４日間〜約１０日間の間、約５日間〜約１５日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２０日間の間、約１０日間〜約２０日間の間、約２０日間〜約２５日間の間、または約２５日間〜約３０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、５日間〜約１５日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１１日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約９日間接触させるための指示を含む。
【０３９４】
ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約８日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、または少なくとも約２１日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間まで、３日間まで、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間まで、または約２１日間まで接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２０日間まで接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間〜約２１日間の間、約２日間〜約２０日間の間、約２日間〜約１０日間の間、約１０日間〜約１５日間の間、約１５日間〜約２１日間の間、約２日間〜約６日間の間、約２日間〜約５日間の間、または約５日間〜約１０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間〜約１０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、５日間〜約２０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間〜約６日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間〜約１０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、または約２１日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約６日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、約５日間接触させるための指示を含む。
【０３９５】
ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１２日間接触させるための指示、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と約１０日間接触させるための指示、ならびに細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間接触させるための指示、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と約９日間接触させるための指示、ならびに細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約５日間接触させるための指示を含む。
【０３９６】
ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１２日間接触させるための指示、ならびに細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、指示書は、ＥＮＳ前駆体を生成するために、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１１日間接触させるための指示、ならびに細胞を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約５日間接触させるための指示を含む。
【０３９７】
ある特定の実施形態では、キットはさらに、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書を含む。
【０３９８】
ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、適切な細胞培養培地中でＥＮＳ前駆体を培養する指示を含む。ある特定の実施形態では、キットはさらに、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含み、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、ＥＮＳ前駆体を、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導する１種または複数の分子と接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子は、成長因子およびＷＮＴ活性化因子からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、成長因子は、ＦＧＦ活性化因子、ＧＤＮＦ、およびアスコルビン酸からなる群から選択される。
【０３９９】
ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約１日間〜約１０日間、約１日間〜約５日間の間、約５日間〜約１０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約１日間〜約５日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約４日間接触させるための指示を含む。
【０４００】
ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約４５日間、または少なくとも約５０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と、約１日間〜約５０日間の間、約１日間〜約１０日間の間、約２０日間〜約３０日間の間、約３０日間〜約４０日間の間、または約４０日間〜約５０日間の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、ＥＮＳ前駆体は、腸ニューロンを生成するために、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約１０日間〜約２０日間の間接触する。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約４０日〜約５０日の間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約１０日間接触させるための指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約２５日間接触させる指示を含む。ある特定の実施形態では、腸ニューロンへのＥＮＳ前駆体の成熟を誘導するための指示書は、腸ニューロンを生成するために、ＥＮＳ前駆体を、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸と約４５日間接触させるための指示を含む。さらに、本開示の主題は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／もしくは処置または予防するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、有効量の本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体集団、またはこのような前駆体を含む単位剤形の組成物を含む。ある特定の実施形態では、キットは、治療組成物を含有する無菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、管、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または医薬を保持するのに適した他の材料から製造され得る。
【０４０１】
ある特定の実施形態では、キットは、本開示の幹細胞由来の腸ＮＣ前駆体集団またはそれを含む組成物を、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）に罹患している対象に投与するための指示書を含む。指示書は、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置するための細胞または組成物の使用に関する情報を含み得る。ある特定の実施形態では、指示書は、治療剤の説明、ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）もしくはその症状を予防および／もしくは処置するための投与スケジュールおよび投与、注意、警告、効能、禁忌（counter-indication）、過剰投与情報、有害反応、動物薬理、臨床研究、ならびに／または参照の少なくとも１つを含む。指示書は、容器（存在する場合）上に直接的に印刷することができ、または容器に適用されたラベルとして、または容器内にもしくは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして存在し得る。
【実施例】
【０４０２】
６．実施例
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
【０４０３】
（実施例１）
６．１  実施例１
要約
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からのＥＮＳ前駆細胞の効率的な誘導および単離ならびに多様な神経伝達物質表現型の機能的腸ニューロンへのそれらのさらなる分化が、本明細書で示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来ＥＮＳ前駆体は、以下に説明するように、発達中のニワトリ胚における標的化遊走およびマウス成体結腸の広範なコロニー形成の能力を示した。移植したｈＰＳＣ由来ＥＮＳ前駆体は遊走し、ＨＤのマウスモデル（ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ）の結腸に生着し、疾患関連死亡率の救済を誘発した。最後に、ＥＤＮＲＢ突然変異ＥＮＳ前駆体を確立することにより、ＨＤ関連遊走欠陥のモデリングならびに新しい候補治療薬としてのペプスタチンＡおよび他のＢＡＣＥ阻害剤の識別を可能にした。本明細書で説明する研究は、ヒトＥＮＳ発達研究のためのｈＰＳＣベースのプラットフォームを確立し、かつＨＤの処置のための新規細胞および薬物ベースの戦略を確立した。
【０４０４】
方法
ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ系の、ＮＣ細胞への分化は、ｄｕａｌ  ＳＭＡＤ阻害１１およびＣＨＩＲ９９０２１媒介ＧＳＫ３ｂ阻害を介するＷＮＴシグナル伝達活性化５に基づいてなされた。迷走神経／腸ＮＣ（ＥＮＣ）を、ＮＣ誘導の間のＲＡの存在下で誘導した。ＥＮＣ前駆体をさらに、非粘着性プレートにおける簡易的（４日間）３Ｄ培養ステップによりニューロンに分化させた（細胞１×１０５個／ｃｍ２）。ＧＤＮＦおよびＡＡを含有するＮ２培地中で神経分化を行った。脳およびメラニン形成細胞偏向ＮＣ前駆体５、ＲＡ誘導ＥＮＣ前駆体ならびに分化したニューロンを、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡシークエンシングを使用する全遺伝子発現分析により特徴付けた。ＥＮＣ前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏ遊走機能を、ＨＨ１４ステージの発達中のニワトリ胚における移植により査定し、２４〜３６時間後に分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結性研究のために、ｈＥＳＣを、アクチビンＡおよびＢＭＰ４曝露ならびにＴＧＦβでの処理１３後に、ＳＭＣに分化させた。機能的アッセイを、Ｈ９−ＳＹＮ：：ＣｈＲ２−ＹＦＰ  ｈＥＳ細胞から発生したＥＮＣ由来ニューロンを４５０ｎｍの光パルス（４ｍｓ、２〜１０Ｈｚ、２〜４ｍＷ）で刺激することにより行った。分化したＥＮＣ前駆体の、初代マウス腸組織との機能的相互作用を、マウス初代腸オルガノイド単位１６をヒトｈＥＳＣ−ＥＮＣ前駆体と共に再凝集させ、続いてＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに移植することによる、ｉｎ  ｖｉｖｏ結腸組織工学アプローチを使用して評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏ遊走および分化研究のために、ＥＮＣ前駆体を、成体盲腸（ＮＳＧまたはＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウス）に正所性移植した。結腸組織を、全組織標本蛍光および組織学分析のために、様々な時点で回収した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化により確立したＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ系由来のＥＮＣ前駆体を使用して、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（登録商標）のハイスループットスクリーニングを、９６ウェルフォーマットにおけるスクラッチアッセイを使用して行った。用量応答曲線および機械的研究を、スクリーニングからの一次ヒットであるペプスタチンＡについて行った。ＢＡＣＥ−２のＢＡＣＥ阻害剤ＩＶおよびｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを、ＣＤ４９Ｄ＋  ＥＮＣ前駆体について行った。別様に記載のない限り、データは平均値＋／−ＳＥＭとして表し、少なくとも３回の独立した実験から得た。表１は、図の各々についての実験の詳細の短い説明を示す。
【表１−１】
2019503679.tif 000006
【表１−２】
2019503679.tif 000007
【表１−３】
2019503679.tif 000008
【表１−４】
2019503679.tif 000009
【表１−５】
2019503679.tif 000010
【０４０５】
未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養
ｈＥＳＣ系Ｈ９（ＷＡ−０９）および誘導体（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ；ＳＹＮ：：ＣｈＲ２−ＹＦＰ；ＳＹＮ：：ＹＦＰ；ＰＨＯＸ２Ｂ：ＧＦＰ；ＥＦ１：：ＲＦＰ  ＥＤＮＲＢ−／−）ならびに２つの独立したｈｉＰＳＣ系（健康および家族性自律神経失調症、センダイベース、ＯＭＳＫ（Ｃｙｔｏｔｕｎｅ））を、以前に説明するように１１、ｈＥＳＣ培地を含有するＫＳＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０８２８−０２８）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）上で維持した。細胞を、１ヶ月間隔でマイコプラズマ試験に供し、ＳＴＲプロファイルして、研究の開始時の細胞の同一性を確認した。
【０４０６】
神経堤誘導。
ｈＥＳＣを、１０ｎＭ  ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含有するｈＥＳＣ培地中のマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５４２３４）コーティング皿にプレーティングした（細胞１０５個／ｃｍ２）。分化を、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＩ）を含有するノックアウト血清置換（ＫＳＲ）培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ＋１５％  ＫＳＲ、Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２５０３０−０８１）、ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１１４０−０５０））中で開始させた。ＫＳＲ培地を、以前に説明するように１１、４日目〜１０日目まで増大する量のＮ２培地で徐々に置き換えた。脳ＮＣ（ＣＮＣ）誘導のために、細胞を、２日目〜１１日目までＬＤＮおよびＳＢに加えて３ｕＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）で処理した。腸ＮＣ（ＥＮＣ）分化は、６日目〜１１日目までのレチノイン酸（１０μＭ）での追加の処理を含んだ。メラニン形成細胞コンピテントＮＣ（ＭＮＣ）を得るために、ＬＤＮを、６日目〜１１日目まで、ＢＭＰ４（１０ｎＭ−、Ｒ＆Ｄ、３１４ｂｐ）およびＥＤＮ３（１０ｎＭ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、８８−５−１０Ｂ）で置き換えた５。分化した細胞を、１１日目でＣＤ４９Ｄについて分類した。ＣＮＳ前駆体対照細胞を、以前に説明するように１１、０日目〜１１日目までのＬＤＮおよびＳＭでの処理により発生させた。本文書全体を通して、０日目は、培地がｈＥＳＣ培地からＬＤＮおよびＳＢ含有培地に替えられた日である。本文および図中の分化の日は、多能性ステージ（０日目）以来の日数を指す。
【０４０７】
ＦＡＣＳおよび免疫蛍光分析（ＩＦ）
ＩＦのために、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ−ＵＳＢ、１９９４３）で２０分間固定し、その後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２０９）および０．３％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）を使用してブロックおよび透過処理した。細胞をその後、一次抗体溶液中で４℃（摂氏）にて一晩インキュベートし、発蛍光団コンジュゲート二次抗体で室温にて１時間染色し、染色した細胞をその後、ＤＡＰＩ（１ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ９５４２−５ＭＧ）とインキュベートし、数回洗浄し、その後画像化した。フローサイトメトリー分析のために、製造業者の使用説明書に従って、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＴ１０４）で分離し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５４７２２）溶液を使用して固定および透過処理し、その後洗浄し、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５４７２３）を使用してブロックおよび透過処理した。細胞をその後、一次（４で一晩）および二次（室温で３０分間）抗体で染色し、ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア）を使用して分析した。一次抗体および作業希釈液のリストを、表２に示す。ＰＨＯＸ２Ａ抗体は、Ｊ−Ｆ  Ｂｒｕｎｅｔ博士により寄贈された（ウサギ、１：８００希釈）。
【表２−１】
2019503679.tif 000011
【表２−２】
2019503679.tif 000012
【０４０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ移植片。
受精卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ飼育場から）を、注射前に、３７で５０時間インキュベートした。２×１０５個のＣＤ４９Ｄ分類ＲＦＰ標識ＮＣ細胞を、体節２と６との間の領域を標的化して胚の迷走神経領域の体節間空間に注射した（ＨＨ１４胚、２０〜２５体節ステージ）。胚を３６時間後に、全組織標本落射蛍光および組織学分析のために回収した。
【０４０９】
遺伝子発現分析。
ＲＮＡシークエンシングのために、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０６）を使用して抽出した。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのために、全ＲＮＡ試料を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１８０６４−０１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（Ｑｉａｇｅｎ、２０４１４８）を使用して設定した。各データ点は、３つの独立した生物学的繰返しを表す。
【０４１０】
ＥＮＣの、腸ニューロンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化。
ＥＮＣ細胞を、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ６ウェル培養プレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４７１）中の３Ｄスフェロイド（細胞５００万個／ウェル）に凝集させ、ＣＨＩＲ（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）およびＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で培養した。４日間の懸濁培養後、スフェロイドを、ＧＤＮＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０−１０）およびアスコルビン酸（１００ｕＭ、Ｓｉｇｍａ、Ａ８９６０−５Ｇ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中の、ポリオルニチン／ラミニン／フィブロネクチン（ＰＯ／ＬＭ／ＦＮ）コーティング皿（以前に説明するように３８調製した）上にプレーティングした。ＥＮＣ前駆体は、プレーティングしたスフェロイドから遊走し、１〜２週間でニューロンに分化した。細胞を、分化２５日目、４０日目および６０日目に免疫染色のために固定するか、または遺伝子発現分析のために回収した。
【０４１１】
ＳＭＣの誘導。
中胚葉の指定を、ＳＴＥＭＰＲＯ−３４（Ｇｉｂｃｏ、１０６３９−０１１）培地中で行った。ｈＥＳＣを、アクチビンＡ処理（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、３３８−ＡＣ−０１０）に２４時間、続いてＢＭＰ４処理（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、３１４−ｂｐ）に４日間供した１３。細胞をその後、ＰＤＧＦ−ＢＢ（５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００−１４Ｂ）、ＴＧＦｂ３（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、２４３−Ｂ３−２００）および１０％  ＦＢＳでの処理によりＳＭＣ前駆細胞に分化させた。ＳＭＣ前駆細胞は、１０％  ＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中で拡張可能であった。
【０４１２】
ＥＮ−ＳＭＣ共培養。
ＳＭＣ前駆細胞を、ＥＮＣ由来ニューロンの添加３日前に、ＰＯ／ＬＭ／ＦＮコーティング培養皿（以前に説明するように３８調製した）上にプレーティングした。ニューロンを、分化３０日目に（ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＴ１０４を使用して）分離し、ＳＭＣ単層培養物上にプレーティングした。培養物を、ＧＤＮＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０−１０）およびアスコルビン酸（１００ｕＭ、Ｓｉｇｍａ、Ａ８９６０−５Ｇ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で維持した。機能的連結性を、共培養８〜１６週間で査定した。
【０４１３】
共培養したＳＭＣの薬理学的刺激および光遺伝学的刺激。
ＳＭＣのみおよびＳＭＣ−ＥＮＣ由来ニューロン共培養物を、共培養開始３ヶ月後に、塩化アセチルコリン（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ、Ａ６６２５）、塩化カルバモイルコリン（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｃ４３８２）およびＫＣｌ（５５ｍＭ、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ３６６−５００）処理に供した。光遺伝学的刺激を、４５０ｎｍのピグテールダイオードポンプ式固体レーザー（ＯＥＭレーザー、ＰＳＵ−ＩＩＩ  ＬＥＤ、ＯＥＭ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用して２〜４ｍＷ／ｍｍ２の照度を達成して行った。パルス幅は４ｍｓであり、刺激周波数は２〜１０Ｈｚの範囲であった。動きの定量のために、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して、画像を積み重ね、高コントラストを有する領域を特定した（図８で黄色標識されている）。１フィールド当たり５つの代表的な高コントラスト領域の動きを自動的にトレースした（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア）。データを、以前のフレームについて、ｘおよびｙ方向のピクセルでの動き（距離）としてキネトグラムで示す。動きの自動トレーシングはときには、２倍を超える動きの増大を有する培養物における最も強い動きを捕えなかった。それゆえ、これらのデータは、部分的に実際の動きを低く見積もっている場合がある。
【０４１４】
キメラ組織工学的に作製された結腸（ＴＥＣ）の発生。
以前に説明した方法を、ＴＥＣの発生のために使用した１６。簡単に説明すると、ドナー結腸組織を回収し、ディスパーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７１０５−０４１）およびコラゲナーゼ１型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社、ＣＬＳ−１）を使用してオルガノイド単位に消化した。オルガノイド単位をその後、ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体（分化１５日目）と即座に（任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を伴わずに）混合し、ポリ−Ｌラクチド（ＰＬＬＡ）（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を伴う２ｍｍの長さの管の形状にした生分解性ポリグリコール酸スキャフォールド（２ｍｍシート厚、６０ｍｇ  ｃｍ−３バルク密度；多孔性＞９５％、Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ  Ｆｉｂｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  ＲＩ）上に播種した。播種したスキャフォールドをその後、成体（＞２ヶ月齢）ＮＳＧマウスの大網上に置き、かつその中に包んだ。移植の直前、これらのマウスを、３５０ｃＧＹで照射した。播種したスキャフォールドを、追加の４週間、網内で結腸様構造に分化させ、その後、それらを組織分析のために外科的に除去した。
【０４１５】
成体結腸におけるＥＮＣ前駆体の移植。
全てのマウス手技は、ＮＩＨガイドラインに従って行い、現地の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、インスティテューショナルバイオセイフティ委員会（ＩＢＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）および胚性幹細胞研究委員会（ＥＳＣＲＯ：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。３〜６週齢の雄のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスまたは２〜３週齢のＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ（ＳＳＬ／ＬｅＪ）マウス３９（ｎ＝１２、雄６匹、雌６匹）を、これらの研究に使用した。動物数は、ホモ接合のホストの入手可能性および処理対対照（ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ）の間の大きな効果を検出するために、ならびに遊走挙動（ＮＳＧ）の強固さを示すために十分な統計力に基づくものであった。動物を様々な処理パラダイム（ＮＳＧおよびＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ）についてランダムに選択したが、各群（ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌ）内の雄／雌比の等しい分布を確実にした。動物を、手技全体を通してイソフルラン（１％）で麻酔し、腹部小切開を行い、腹壁筋系を持ち上げ、盲腸を露出し、外に出した。盲腸を湿潤に維持するために温かい生理食塩水を使用した。ＰＢＳ中の７０％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５４２３４）中の２０μｌの細胞懸濁液（２００〜４００万個のＲＦＰ＋  ＣＤ４９Ｄ精製ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体）または２０μｌのＰＢＳ中の７０％マトリゲルのみ（対照グラフト動物）を、２７ゲージの針を使用して盲腸に（筋層を標的化して）ゆっくりと注射した。細胞注射のための担体としての７０％マトリゲルの使用は、細胞が注射後に原位置に留まることを確実にし、かつ腹膜への逆流を防いだ。注射後、その針を引き抜き、注射部位の上にＱチップを３０秒間置いて出血を防いだ。盲腸を腹腔に戻し、腹壁を、４〜０バイクリルおよび先細針を使用して結節縫合パターンで閉鎖し、皮膚を、滅菌創傷クリップを使用して閉鎖した。創傷閉鎖後、動物を床敷の上の紙上に置き、意識が回復するまで、好ましくは飲食するまで立ち会った。組織学分析のために、組織を移植後の様々な時点（２週間〜４ヶ月の範囲）で回収した。ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスを、毎日のシクロスポリン注射（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、Ｓｉｇｍａ、３００２４）により免疫抑制した。
【０４１６】
全組織標本蛍光画像化および組織学
回収した結腸試料を、４％  ＰＦＡ中で４℃にて一晩固定し、その後画像化した。画像化を、Ｍａｅｓｔｒｏ蛍光画像化システム（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を使用して行った。組織試料を、３０％ショ糖（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ２２０−１）溶液中で４℃にて２日間インキュベートし、その後、ＯＣＴ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＣ９６３８９３８）中に包埋し、凍結切片にした。切片をその後、１％  ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２０９）でブロックし、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）で透過処理した。切片をその後、一次抗体溶液で４℃にて一晩、および発蛍光団コンジュゲート二次抗体溶液で室温にて３０分間染色した。染色した切片をその後、ＤＡＰＩ（１ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ９５４２−５ＭＧ）とインキュベートし、数回洗浄した後、それらをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｖｅｃｔｏｒ、Ｈ１２００）で封入し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０）または共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＳＰ５）を使用して画像化した。
【０４１７】
ＧＩ総通過時間
マウスに、２４番先端丸形給餌針を使用して、６％カーミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃ１０２２−５Ｇ）、０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ、２７４４２９−５Ｇ）および０．９  ＮａＣｌを含有する０．３ｍｌの染料溶液を胃管栄養で与えた。吐き戻しを防ぐために胃管栄養後、針を数秒間マウス食道内に保持した。１時間後、胃管栄養マウスについて糞便の色を１０分毎にモニターした。各マウスについて、ＧＩ総通過時間は、胃管栄養時〜赤い糞便が観察された時間であった。
【０４１８】
遺伝子標的化
二重ニッカーゼＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム４０を、ＥＦ１：：ＲＦＰ  Ｈ９  ｈＥＳＣのＥＤＮＲＢ遺伝子座を標的化するために使用した。約２０ｂｐ離れたＰＡＭ標的を有するコード配列を標的化するために、２つのガイドＲＮＡを（ＣＲＩＳＰＲ設計ツール、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／を使用して）設計した（ｑＲＮＡ１番標的特異的配列：ＡＡＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧ［配列番号１］、ＲＮＡ２番標的特異的配列：ＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧ［配列番号２］）。細胞に、ｇＲＮＡ構築物およびＧＦＰ融合Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼをトランスフェクトした。ＧＦＰ発現細胞を２４時間後にＦＡＣＳ精製し、ＭＥＦ上に低密度（細胞１５０個／ｃｍ２）でプレーティングした。コロニーを７日後に採取し、２回継代した後ゲノムＤＮＡを単離し、スクリーニングした。ＥＤＮＲＢ遺伝子の標的化領域をＰＣＲ増幅し（フォワードプライマー：ＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧ［配列番号３］、リバースプライマー：ＧＴＣＡＧＧＣＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴ［配列番号４］）、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４５０２４５）にクローニングした。両対立遺伝子（各ｈＥＳＣコロニーからの）が表され、シークエンスされることを確実にするために、１０個の細菌クローン（各ｈＥＳＣクローンについて）をプラスミド精製および続くシークエンシングに選択した。二対立遺伝子ナンセンス突然変異を有するクローンを拡張させ、フォローアップアッセイのために分化させた。
【０４１９】
遊走アッセイ
ＥＮＣ細胞を、ＰＯ／ＬＭ／ＦＮコーティングした（以前に説明するように３８調製した）９６ウェルまたは４８ウェル培養プレート上にプレーティングした（３０，０００／ｃｍ２）。２４時間後、ピペット先端を使用して手作業で培養菌叢をスクラッチした。細胞に追加の２４〜４８時間を与えて、スクラッチエリアに遊走させ、画像化および定量のために固定した。定量は、遊走期間後にスクラッチエリアに位置する核のパーセンテージに基づいてなされた。スクラッチエリアを、スクラッチング直後に固定した参照ウェルを使用して規定した。オープンソースデータ分析ソフトウェアＫＮＩＭＥ４１（ｈｔｔｐ：／／ｋｎｉｍｅ．ｏｒｇ）を使用して、他で詳述される４２「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＯＩ」プラグインで、細胞の遊走を定量した。
【０４２０】
増殖アッセイ
増殖を定量するために、ＦＡＣＳ精製ＥＮＣ細胞を、ＣｙＱＵＡＮＴ  ＮＦ細胞増殖アッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃ３５００６）を使用して製造業者の使用説明書に従ってアッセイした。簡単に説明すると、標準を発生させるために、細胞を様々な密度でプレーティングし、蛍光ＤＮＡ結合染料試薬を使用して染色した。総蛍光強度をその後、プレートリーダー（４８５ｎｍで励起および５３０ｎｍで発光検出）を使用して測定した。直線範囲を決定した後、ＣＤ４９Ｄ＋  ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ＥＮＣ前駆体をプレーティングし（細胞６０００個／ｃｍ２）、０、２４、４８および７２時間でアッセイした。アッセイ中、細胞を、ＣＨＩＲ（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）およびＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で培養した。
【０４２１】
生存能アッセイ
ＷＴおよびＥＤＮＲＢ−／−  ＥＮＣ前駆体の生存能をモニターするために、細胞を、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を使用してＬＤＨ活性についてアッセイした。簡単に説明すると、細胞を９６ウェルプレートに３０，０００個／ｃｍ２でプレーティングした。上清および細胞溶解物を２４時間後に回収し、プレートリーダー（４９０ｎｍ吸光度）を使用してＬＤＨ活性についてアッセイした。生存能を、溶解物のＬＤＨシグナルを（溶解物＋上清からの）ＬＤＨシグナルの合計で割ることにより計算した。アッセイ中、細胞を、ＣＨＩＲ（３μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）およびＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で培養した。
【０４２２】
ハイスループットスクリーニング
化学化合物スクリーニングを、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（登録商標）を使用して行った。ＥＮＣ細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし（３０，０００個／ｃｍ２）、化合物の添加２４時間前に手作業でスクラッチした。細胞を２つの濃度の化合物（１０μＭおよび１μＭ）で処理した。プレートをプレート全体の画像化のために２４時間後に固定した。化合物を、２４時間でスクラッチの充填を促進するそれらの能力に基づいてスコア付けした。毒性効果（ＤＡＰＩ染色により査定される細胞数における劇的な低減に基づく）を示した化合物を０とスコア付けし、効果を有しない化合物を１とスコア付けし、中程度の効果を有する化合物を２とスコア付けし、強い効果を有する（スクラッチエリアの完全な充填をもたらした）化合物を３とスコア付けし、ヒット化合物として特定した。ヒットをさらに、再現性を確実にするために確証した。細胞を、用量応答分析のために様々な濃度の選択したヒット化合物（ペプスタチンＡ）で処理した。最適用量（最適応答および生存能に基づいて１０μＭ）を、フォローアップ実験に使用した。前処理実験のために、細胞を、１１日目でＣＤ４９Ｄ精製し、１２日目〜１５日目までペプスタチンＡで処理し、続いてＮＳＧマウスの結腸壁に移植した。アッセイ中、細胞を、ＣＨＩＲ（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）およびＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で培養した。
【０４２３】
ＢＡＣＥ２阻害およびノックダウン
ＢＡＣＥ２を阻害するために、ＥＮＣ前駆体を、１μＭ  β−セクレターゼ阻害剤ＩＶ（ＣＡＳ  ７９７０３５−１１−１  −  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理した。ＢＡＣＥ２をノックダウンするために、細胞を、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＴ１０４）を使用して分離し、ｓｉＲＮＡプール（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＢＡＣＥ２  ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌ−００３８０２−００−０００５）または４つの異なる個々のｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＬＱ−００３８０２−００−０００２  ２ｎｍｏｌ）を（リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１３７７８−１５０を使用して）逆トランスフェクトした。ノックダウンを、対照ｓｉＲＮＡプール（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的化プール、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ−００１８１０−１０−０５）に対する、ＢＡＣＥ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＢＡＣＥ２  ｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ測定により確認した。トランスフェクトした細胞を、プレーティング２４時間後にスクラッチし、遊走定量のために４８時間後に固定した。アッセイ中、細胞を、ＣＨＩＲ（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）およびＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含有するＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）で補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で培養した。
【０４２４】
統計分析
データは、平均値±ＳＥＭとして示され、少なくとも３回の独立した実験から得た。繰返し（ｎ）に基づくデータを、図の凡例および表１に示す。統計分析を、スチューデントｔ検定（２つの群を比較する）またはダネット検定によるＡＮＯＶＡ（対照に対して多数の群を比較する）を使用して行った。生データの分布は、正規性について試験するために十分な数の繰返しを有するデータについての正常分布（コルモゴロフスミルノフ正規性検定）に近似した。ログランク（マンテル−コックス）検定を使用して生存分析を行った。一次ヒットについてのＺスコアを、Ｚ＝（ｘ−μ）／σとして計算した。ｘは、遊走スコア値であり、全てのヒット化合物について３である。μは平均遊走スコア値であり、σは全ての化合物およびＤＭＳＯ対照についての標準偏差である（ｎ＝２２４）。
【０４２５】
結果
現在のＮＣ分化プロトコール４、５は、ＨＯＸ陰性（前部／脳の同一性を示す；脳ＮＣ（ＣＮＣ））であるＳＯＸ１０＋  ＮＣ前駆体をもたらし、主に感覚ニューロンおよび侵害受容性ニューロンを生じる。対照的に、迷走神経ＮＣの同一性(identity)は、ＨＯＸＢ３８およびＨＯＸＢ５９を含む特異的な領域限定ＨＯＸ遺伝子の発現により特徴付けられる。レチノイン酸（ＲＡ）は、以前に、例えば運動ニューロンの指定中に、ＣＮＳ前駆体の領域の同一性を前部から、より尾部の宿命へとシフトするための外因性因子として使用されている１０。本発明者らは、ＲＡの添加がＮＣ系統の領域の同一性を同様に方向付け、迷走神経マーカーの発現を誘導することができるかどうかを試験した（図１Ａ）。ＲＡ曝露に際して、Ｓｏｘ１０：：ＧＦＰ＋  ＮＣ前駆体は、ＣＮＣ条件に匹敵する収率で得られ、ＲＡ処理が全体的なＮＣ誘導を妨害しないことを示した（図１Ｂ、図２Ｂ）。様々なｈＰＳＣ系にわたる純粋なＮＣ集団の単離を容易にするために、候補表面マーカースクリーニングを行い、ＣＤ４９Ｄ（α４−インテグリン）を初期ＳＯＸ１０＋  ＮＣ系統を確実に特徴付ける（図１Ｂｂ、図２Ａ〜２Ｃ）エピトープとして特定した。ＣＤ４９Ｄを、追加のｈＰＳＣ系（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の両方）についてＲＡの存在下でのＮＣ誘導を確証し、強固さを確認するためのマーカーとして使用した（図２Ｄ）。ＲＡの存在下で得た、精製ＣＤ４９Ｄ＋  ＮＣ前駆体は、迷走神経の同一性８、９を示すＨＯＸＢ２〜Ｂ５を発現したが、より尾部のＨＯＸ転写産物、例えばＨＯＸＢ９は発現しなかった（図１Ｃ）。迷走神経の同一性とさらに一致して、ＣＤ４９Ｄ＋、ＲＡ処理ＮＣ前駆体は、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢおよびＲＥＴを含む初期腸ＮＣ（ＥＮＣ）系統３のマーカーを発現した（図１Ｄｄ、図２Ｅおよび２Ｆ）。ヒト腸ＮＣ発達についての発達データの不足のために、ｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体における、脳ＮＣ（ＣＮＣ）（ＲＡなし）における、およびメラニン形成細胞偏向ＮＣ（ＭＮＣ）における（図２Ａ）、ならびに同等のステージのＣＮＳ前駆体１１における全遺伝子発現プロファイルを規定するためにＲＮＡｓｅｑ分析を行った。教師なしクラスタリングおよび主構成成分分析は、全てのｈＰＳＣ由来ＮＣ集団のトランスクリプトームをＣＮＳ系統細胞から確実に隔離し（図１Ｅ）、さらに様々なＮＣサブ系統に分類した（図１Ｅおよび１Ｆ）。ＣＮＳ系統と比較してＥＮＣにおいて最も差次的に発現した遺伝子は、一般的なＮＣマーカー、例えばＦＯＸＤ３またはＴＦＡＰ２Ａを含んだが、また、ＰＡＸ３およびＨＯＸ遺伝子はＥＮＣ系統に特異的に関連した（図１Ｇ）。また、ＣＮＣおよびＭＮＣは、一般的なＮＣマーカーを多く含んだが、それぞれ、それらのＮＣサブタイプの同一性と適合する、高レベルのＮＥＵＲＯＧ１、ＩＳＬ１またはＭＬＡＮＡ、ＴＹＲ、ＤＣＴ発現を示した（図２Ｇおよび２Ｈ）。様々なＮＣ系統の直接比較は、ヒト迷走神経ＮＣ／ＥＮＣ系統の新規候補マーカーをもたらした（図１Ｇ）。ＮＣ系統の各々について上位２００個の最も富化された転写産物のリストを、表３〜５として示す。生のＲＮＡｓｅｑデータは、ＧＥＯ（ｈｔｔ���：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／アクセス番号：ＧＳＥ６６１４８）で入手可能である。
【表３−１】
2019503679.tif 000013
【表３−２】
2019503679.tif 000014
【表３−３】
2019503679.tif 000015
【表３−４】
2019503679.tif 000016
【表３−５】
2019503679.tif 000017
【表４−１】
2019503679.tif 000018
【表４−２】
2019503679.tif 000019
【表４−３】
2019503679.tif 000020
【表４−４】
2019503679.tif 000021
【表４−５】
2019503679.tif 000022
【表４−６】
2019503679.tif 000023
【表５−１】
2019503679.tif 000024
【表５−２】
2019503679.tif 000025
【表５−３】
2019503679.tif 000026
【表５−４】
2019503679.tif 000027
【表５−５】
2019503679.tif 000028
【表５−６】
2019503679.tif 000029
【０４２６】
ＥＮＣの１つの重要な機能特性は、迷走神経ＮＣレベルで神経管から剥離した後に広範に遊走するおよび消化管の全長でコロニー形成する能力である３。ＲＦＰ標識ＣＤ４９Ｄ＋精製ｈＰＳＣ由来ＥＮＣ前駆体の、迷走神経ＮＣレベルでの発達中のニワトリ胚（図１Ｈ）への注射は、ヒト細胞による（５７個注射したうちの２２個の胚における）胚の躯幹に沿った遊走およびニワトリ消化管のコロニー形成をもたらした。対照的に、ステージの一致したＣＮＣまたはＭＮＣ前駆体は、胚の脳領域への遊走を含むより多様な遊走経路（“ＣＮＣ）または真皮へのより大きく限定された遊走経路（ＭＮＣ）のいずれかを示した（図２Ｉ）。ＣＮＣを注射した２０個の胚のうちの２個のみが、ニワトリ消化管において一部のヒト細胞の存在を示した。それゆえ、分子データ、表現型データおよび遊走データは、ｈＰＳＣから迷走神経／ＥＮＣについて富化する実行可能性を確認する。
【０４２７】
ＰＮＳ内で、ＥＮＳ前駆体は、数十種類の別個の神経伝達物質およびホルモンを生成する多様なニューロンサブセットを生じる能力において独特である。ｈＥＳＣ由来ＥＮＣ前駆体が広範囲のニューロンサブタイプに分化することができるかどうかに取り組むために、精製ＣＤ４９Ｄ＋  ＥＮＣ前駆体を３Ｄスフェロイドで４日間維持し、続いてアスコルビン酸（ＡＡ）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下で粘着培養物中にて自発的に分化させた（図３Ａ）。３Ｄスフェロイド中間培養ステップは、ＣＤ４９Ｄ＋細胞の単離後、高レベルのＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現を保持するために必要であった（図３Ｂ）。分化条件下で３Ｄスフェロイドを再プレーティングした後、汎ニューロンマーカーＴｕｊ１および腸ニューロン前駆体マーカーＰＨＯＸ２Ａを発現する未成熟ニューロンが出現した（分化２０日目；図３Ｂ）。また、ＰＨＯＸ２Ａ＋細胞の大多数は、次のＰＨＯＸ２Ａ＋およびＡＳＣＬ１＋前駆体の富化に好適な腸ニューロン前駆体で発現される表面マーカーである１２ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３）について陽性であった（図４Ａおよび４Ｂ）。一時的発現分析（図４Ｃ〜４Ｅ）は、分化４０日目までのＥＮＣ神経前駆体マーカー発現の維持（図３Ｃおよび３Ｄ）、続いて６０日目までの成熟ニューロンのパーセンテージにおける強固な増大（図３Ｅおよび３Ｆ）を示した。腸ニューロンの同一性と一致して、５ＨＴ＋、ＧＡＢＡ＋およびＮＯＳ＋ニューロンを含む、広範囲の神経伝達物質表現型が観察された。これらの神経伝達物質はＥＮＳの外側の他のＮＣ誘導体では発現しないので、精製ＣＤ４９Ｄ＋  ＲＡ処理ＮＣ前駆体に由来する培養物中のこれらの神経伝達物質の存在は、ＥＮＣ起源を示す。実際に、５ＨＴ＋ニューロンは、ＣＮＣ条件下で得られるＨＯＸ陰性ＣＤ４９Ｄ＋細胞由来の並行培養物では観察されなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。ＣＮＣ由来前駆体は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現ニューロンに分化し（図５Ｃ）、ＴＲＫＣ陽性前駆体よりＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）陽性の高い割合を生じ、交感神経ニューロン系統の富化を示唆した（図６Ｄ）。対照的に、ＥＮＣ由来前駆体の大多数は、ＴＲＫＢよりＴＲＫＣを発現した（図５Ｅ）。
【０４２８】
ＥＮＳの主な機能は、平滑筋層の協調的活性化による蠕動性消化管運動の制御である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来腸ニューロンの機能性を、平滑筋細胞（ＳＭＣ）とのそれらの連結性を査定することにより調査した。ｈＥＳＣ由来ＳＭＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアクチビンＡおよびＢＭＰ４への曝露後の中胚葉中間部１３およびＴＧＦβの存在下での培養により発生させた（図７Ａ）。得られたＳＭＣ前駆細胞は、ＩＳＬ１を発現し、臓側中胚葉の同一性１４を示唆し、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）について免疫反応性であった（図７Ｂ）。連結性研究のために、腸ニューロンを、ヒトシナプシンプロモーターの制御下でチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）−ＥＹＦＰを発現するｈＥＳＣ系から誘導した。光遺伝学的レポーター系の使用は、神経活性の光誘導制御を可能にした（図３Ｇ）。これらの共培養物中のＧＡＢＡ＋および５ＨＴ＋ニューロンは、物理的連結性を確立することと適合して、ＳＭＣと密接に関連付けられた（図７Ｃ）。２５日目のニューロンの、ＳＭＣとの共培養は、ＳＹＮ：：ＥＹＦＰの増大した発現により示されるように神経成熟の加速を誘発した（図７Ｄ）。反対に、また、ｈＥＳＣ由来ＳＭＣは、成熟平滑筋マーカー、例えばミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）およびアセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ；図７Ｅ）の発現により示されるように、共培養条件下で成熟の加速の徴候ならびにアセチルコリン、カルバコールまたはＫＣｌ処理に応答して収縮する能力（図８Ａおよび８Ｂ）を示した。自発的収縮は、光または薬理学的刺激の非存在下ではＳＭＣとＥＮＣ由来ニューロンとの共培養物で観察されなかった（共培養９０日目）。対照的に、ＣｈＲ２の光媒介活性化（１０Ｈｚの周波数）の５〜１０秒後、ＳＭＣ収縮の波を、ＳＹＮ：：Ｃｈｒ２−ＹＦＰニューロン含有培養物で誘発することができた（図３Ｈ、３Ｉおよび８Ｃ）。興味深いことに、光誘導および薬物誘導ＳＭＣ収縮の両方とも遅く、シート様構造の動きを含み、おそらくＳＭＣのギャップ結合媒介カップリングによる１５細胞間の協調を示唆した。これらの研究は、ｈＥＳＣ由来腸ニューロンとＳＭＣとの間の機能的連結性を示す。しかしながら、消化管内のＥＮＳのｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用は、より複雑であり、多数の細胞種を含む。３Ｄでのそれらの相互作用のモデリングにおける第１のステップとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来ヒトＥＮＣ前駆体（ＣＤ４９Ｄ＋、１５日目）と事前培養なしのマウス初代腸組織（図３Ｊ）とを組み合わせる、組織工学アプローチを使用した。オルガノイド単位を形成するための以前に確立されたプロトコール１６を使用して、組換え組織構築物をスキャフォールド上に播種し、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏでの成熟のために免疫不全ホストの網上に移植した１６。ヒト細胞は、ＳＣ１２１およびヒトシナプトフィジンを含むヒト特異的マーカーの発現に基づいて消化管様構造内で容易に検出された。重要なことに、細胞は、粘膜下および筋層の両方に位置し（図３Ｋ）、両方の標的細胞種と相互作用する能力を示した。
【０４２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来ＥＮＳ系統を使用した消化管への生着は、ＥＮＳ障害、例えばＨＤのための新規治療機会をもたらし得る。以前の研究は、様々な候補細胞供給源の、胎児または出生後結腸への移植を試験した１９〜２１。マウス胎児由来ＥＮＣ前駆体は、機能的統合の証拠を有する最も有望なデータをもたらしたが、ｉｎ  ｖｉｖｏ遊走能において限定された２２。さらに、初代ＥＮＣ前駆体は、スケーラビリティが極めて限定されており、ヒト供給源から容易に得ることができない。ｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体の、出生後または成体結腸内で遊走する能力を査定するために、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおいてＣＤ４９Ｄ＋  ＲＦＰ標識前駆体の正所性（ＯＴ）注射を行った（図６Ａ）。細胞を、盲腸壁内に筋層を狙って注射し（図６Ａ）、注射後１時間でＲＦＰ＋細胞の十分に規定された沈着をもたらした（図９Ａ、左パネル、図６Ｂ、上部パネル）。注目すべきことに、移植後２〜４週間までに、ＲＦＰ＋細胞は、広範に遊走し、盲腸から直腸までの全長にわたりホスト結腸に生着した（図６Ｂ）。グラフトした腸ＮＣ前駆体は、ＴＵＪ１を発現する（図６Ｃ）結腸に沿ったクラスター（図９Ａ、右パネル）を生じた。対照的に、同一の条件下でグラフトした同等のステージのＣＮＳおよびＣＮＣ前駆体は、限定された遊走挙動しか示さなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【０４３０】
グラフトした細胞の、ホスト結腸に生着する並外れた能力から、ＨＤの動物モデルにおけるこれらの腸ＮＣ前駆体の治療利益を査定するためにｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行った。１つの広く使用されているＨＤの遺伝的モデルは、ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスである２３。これらのマウスは、適切なＥＮＳ機能の欠損が異常な蠕動を引き起こすので、巨大結腸症を発症する。その結果、突然変異マウスは、４〜６週齢までの高い死亡率を示す。ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスに、生後２〜３週間でＲＦＰ＋  ｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体（処置群）またはマトリゲル媒体（対照群）を注射した。対照注射動物（ｎ＝６）の大多数は、特徴的な巨大結腸病理（図６Ｅ）を有して４〜５週の期間にわたり死亡した（図６Ｄ）。対照的に、ｈＥＳＣ由来ＮＣ前駆体を注射した全ての動物（ｎ＝６）は生存した（図６Ｄ）。グラフトした動物を、６〜８週齢でグラフト生存および遊走の程度について査定した。全組織標本蛍光画像化により、ＨＤ結腸内でのｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体の遊走を確認し、ＲＦＰ＋細胞は結腸全体を通して検出された（図９Ｄおよび９Ｅ）。また、予備研究で、処置６週間を超えて生存した小サブセットのマトリゲル処置動物に対して、グラフトした動物において、カーミン染料胃管栄養を使用して測定されるＧＩ通過時間が改善する傾向が観察された（図９Ｆ）。移植後６週間および３ヶ月での組織学分析により、ＨＤ結腸における移植したヒト細胞の筋層間および粘膜下局在を確認した。ヒト細胞位置は内因性ＥＮＳの態様を模倣したが、粘膜下領域に向かう嗜好性があった（図６Ｆ；図９Ｇ上部パネル）。また、ヒト細胞は、内因性ＴＵＪ１＋細胞が大きく減少していた領域における遠位結腸（図９Ｇ、下部パネル）で検出された。ＳＣ１２１およびヒト特異的シナプトフィジンについての免疫細胞化学は、マトリゲル注射動物では検出されず（図６Ｇ、左パネル）、結腸組織におけるヒト細胞の存在を確認し、グラフトした細胞上のシナプス前マーカーの発現を示した（図６Ｇ、右パネル）。神経マーカー、例えばＴＵＪ１の発現（図９Ｇ）に加えて、また、ヒト特異的ＳＣ−１２３抗体を使用してＧＦＡＰの発現が観察された（図９Ｈ）。最後に、５−ＨＴ、ＧＡＢＡおよびＮＯＳを含むニューロンサブタイプマーカーとヒト特異的マーカーＳＣ１２１との共発現が、ホスト結腸壁内で観察された（図６Ｈ、９Ｉおよび９Ｊ）。これらの移植研究は、ｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体がＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌの結腸内で広範に遊走し、ホスト動物の生存を改善することができることを示す。
【０４３１】
これらの発見は、野生型ｈＰＳＣ由来ＥＮＳ前駆体はＨＤマウスの結腸に生着することができることを示す。しかしながら、ＨＤを引き起こす突然変異は多くの場合、細胞自律的様式でＥＮＳ前駆体の遊走に影響する３、２４。それゆえ、ＨＤのための患者適合細胞療法の開発は、移植前にＥＮＳ前駆体遊走の欠陥を克服するための補足的な遺伝学的または薬理学的戦略を必要とし得る。ＨＤ患者における原因となる遺伝的欠陥は多くの場合、公知でないか、または複雑であり３、２５、ＨＤ小児の処置においては迅速に行動する必要があるため、移植前遺伝子修正は、妥当な選択肢ではない場合がある。それゆえ、本発明者らは、ｈＰＳＣ由来ＥＮＳ前駆体がＨＤをモデリングするために使用され、疾患関連遊走欠陥を克服し得る候補化合物についてスクリーニングするためのプラットフォームとして働き得るかどうかを査定した。第１のステップとして、ＥＤＮＲＢのホモ接合性機能喪失変異を有する同質遺伝子ｈＥＳＣ系を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子標的化技術２６、２７を使用して確立した（図９Ａ、９Ｂおよび１０Ａ）。ＥＤＮＲＢにおける機能欠失突然変異は、あるサブセットのＨＤ患者における周知の遺伝的原因である２８。腸ＮＣ前駆体は、ＥＤＮＲＢ突然変異系および対照系から同等の効率で誘導することができた（図９Ｃ）。しかしながら、４つのＥＤＮＲＢ−／−クローンからのＣＤ４９Ｄ＋腸ＮＣ前駆体は、ＷＴ非標的化同質遺伝子系と比較してスクラッチアッセイで著しい遊走欠陥を示し、ＨＤ関連ＥＮＳ表現型の態様２９、３０をモデリングした（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。本発明者らは次に、ＥＤＮＲＢ−／−  ＥＮＣが、野生型ＥＮＣと比較して、細胞増殖または生存において大きな差を示すかどうかを査定した。再プレーティング後２４時間（スクラッチアッセイで査定した時点）で、いずれのアッセイについても有意な差は観察されなかった（図９Ｄおよび９Ｅ）。７２時間までに、ＥＤＮＲＢ−／−  ＥＮＣは、増殖の低減を示さず、細胞生存能は影響されないままであった（図９Ｄおよび９Ｅ）。
【０４３２】
ＥＤＮＲＢ突然変異腸ＮＣ前駆体で観察される遊走欠陥を救済することができる化合物を特定するために、小分子スクリーニングを行った（図１０Ｄおよび１１）。ＦＤＡ承認化合物で構成される１２８０個の化合物のライブラリー（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（登録商標））を、将来の解釈を容易にするためにスクリーニングした。結果を、効果がない、毒性効果を有する、中程度の効果を有する、または強い効果を有する化合物に分けて保存した（図１０Ｄおよび１２Ａ〜１２Ｃ）。ヒットをさらに、非ＨＴＳ条件下でスクラッチアッセイを繰り返すことにより確証し（図１２Ｄ）、再現性のある強い効果を有する化合物をさらなるフォローアップに選択した。それらの確証した化合物のうち、ＥＤＮＲＢ−／−  ｈＥＳＣ由来ＮＣ前駆体における遊走欠陥の用量依存的で、ほぼ完全な救済を示した（図１０Ｅ）分子、ペプスタチンＡに、特に焦点を当てた。ペプスタチンＡは、酸プロテアーゼならびにＥＲＫおよびＮＦＡＴ１ｃを含む様々なシグナル伝達経路の公知の阻害剤である３１。可能性のあるペプスタチン標的のうち、ＲＮＡｓｅｑデータが、ｈＥＳＣ由来ＮＣ系統におけるアップレギュレーションを示したので（図１３Ａ）、およびＢＡＣＥ−２は最近、発達中のゼブラフィッシュ胚でＮＣ誘導体の遊走を調節することが示されているので３２、ＢＡＣＥ２を探索した。ＢＡＣＥ２がペプスタチンＡの効果を媒介するかどうかに取り組むために、ＢＡＣＥ２を標的化する構造的に関連しない小分子の効果を試験した。ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶへの曝露は、ペプスタチンＡと同様に、スクラッチアッセイにおける遊走欠陥を救済した（図１０Ｆおよび１０Ｇ）。さらに、４つの異なるｓｉＲＮＡを使用したＢＡＣＥ２ノックダウンにより、ＢＡＣＥ−２の抑制がＥＤＮＲＢ−／−細胞における遊走欠陥を救済することを確認した（図１０Ｈ、１０Ｉおよび１３Ｂ）。最後に、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのペプスタチンＡ曝露（図１０Ｊで概略される）がＥＤＮＲＢ−／−  ＥＮＣ前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏ遊走挙動を救済するのに十分かどうかを試験した。ＥＤＮＲＢ−／−細胞に由来するＮＣ前駆体は、成体結腸への移植後に、顕著なｉｎ  ｖｉｖｏ遊走欠陥を示した（図１０Ｋおよび１０Ｌ）。対照的に、移植前にペプスタチンＡで７２時間前処理したＥＤＮＲＢ−ヌル前駆体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ遊走挙動の顕著な救済を示した（図１０Ｋ、１０Ｌおよび１３Ｃ）。興味深いことに、ＥＤＮＲＢの薬理学的阻害剤で処理した野生型由来ＥＮＣ前駆体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで同様の遊走欠陥を示し（図１３Ａ〜１３Ｃ）、さらにヒトＥＮＣ遊走およびＨＤにおけるＥＤＮＲＢの役割を支持した（図１３Ｄ〜１３Ｆ）。
【０４３３】
考察
この実施例で説明した研究は、ヒトＥＳＣから腸ＮＣ前駆体を誘導し、将来的に精製する効率的な戦略を説明する。モデル生物における研究と一致して１、３、ｈＥＳＣ由来腸ＮＣは、ＥＮＳに特徴的な広範囲の神経伝達物質表現型を生じることが示された。ＥＮＳにおけるかかる著しいニューロンサブタイプ多様性は、それぞれ、主にグルタミン酸作動性、カテコールアミン作動性またはコリン作動性ニューロンを発生する感覚、交感神経または副交感神経ＰＮＳ系統から区別される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＥＮＳ発達をモデリングすることができれば、いかなる他のヒト細胞供給源からも現在利用可能でない技術である、規定されたヒト腸ニューロンサブタイプの大スケール生成が可能になるはずである。例えば、ｈＰＳＣ由来腸５ＨＴ−ニューロンは、ＣＮＳ作用薬、例えばＰｒｏｚａｃのＧＩ副作用をモデリングするためのツールとして働き得る３３。
【０４３４】
ＨＤにおけるｈＥＳＣ由来腸ＮＣ系統の可能性のある細胞治療適用に主に焦点を当てた。最も顕著な発見のうちの１つは、成体ホスト結腸におけるヒト腸ＮＣ前駆体の広範なｉｎ  ｖｉｖｏ遊走能であった。ＮＳＧマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究（全部で１０２匹の動物にグラフトした）のほとんどが、５〜６週間の生存期間に限定されたが、移植後３ヶ月または４ヶ月で分析した動物は、腫瘍形成または他のグラフト関連有害効果の任意の証拠を伴わない、同等のｉｎ  ｖｉｖｏ特性を示した。細胞の治療可能性は、ＥＤＮＲＢｓ−ｌ／ｓ−ｌマウスの生存を救済するそれらの能力により示される。細胞の広範囲にわたる生着の可能性は、消化管の神経節細胞欠損部分の永久的な真実の修復を可能にし得る。
【０４３５】
ＨＤ関連遊走欠陥の救済におけるペプスタチンＡおよびＢＡＣＥ２阻害の特定は、薬物発見におけるｈＥＳＣ由来腸ＮＣ前駆体の使用についての概念証明となる。遊走の際のＢＡＣＥ−２阻害の機構は、解明されないままである。可能性のあるＢＡＣＥプロテアーゼの標的は、以前にＮＣ系統遊走で示唆された３４〜３６ニューレグリンおよびＥｒｂＢ受容体を含む。ＢＡＣＥ阻害剤は現在、アルツハイマー病の処置３７を含む様々な適応症について臨床開発中である。ＢＡＣＥ阻害剤の治療可能性は、マウスのＨＤモデルで試験された。例えば、それらの化合物が、任意の細胞ベースの介入から独立して、内因性前駆体を直接調節することができるかどうかを試験する。かかる戦略は、妊娠中の無神経節症の予防または出生後段階での腸ニューロン機能の標的修復を可能にし得る。この実施例で説明した研究は、ＥＤＮＲＢ−／−腸ＮＣ前駆体の遊走の改善を可能にするネオアジュバント処置としてペプスタチンＡを組み合わせることに焦点を当てた。ペプスタチンＡ前処理が、ＨＤマウスにおける致死率または他の疾患関連表現型を救済し得るかどうかを試験する。発見から、化合物が様々なＨＤ関連遺伝的欠陥にわたり腸ＮＣ前駆体の遊走を向上し得るという見込みが生じる。結論として、これらの研究は、ヒトＥＮＳ発達へのアクセスを可能にし、ＨＤにおける新規の細胞および薬物ベースの療法を確立する強力な分化の戦略を示す。ヒトＰＳＣは、ヒトの健康および疾患における「第２の脳１」を探索するための有望なプラットフォームとなる。
【０４３６】
７．参考文献
1  Gershon,  M.  The  Second  Brain  -  A  Groundbreaking  New  Understanding  of  Nervous  Disorders  of  the  Stomach  and  Intestine.    (Harper  Collins,  1999).
2  Furness,  J.  B.  The  enteric  nervous  system  and  neurogastroenterology.  Nature  Reviews  Gastroenterology  &  Hepatology  9,  286-294,  (2012).
3  Heanue,  T.  A.  &  Pachnis,  V.  Enteric  nervous  system  development  and  Hirschsprung's  disease:  advances  in  genetic  and  stem  cell  studies.  Nat  Rev  Neurosci  8,  466-479,  (2007).
4  Chambers,  S.  M.  et  al.  Combined  small-molecule  inhibition  accelerates  developmental  timing  and  converts  human  pluripotent  stem  cells  into  nociceptors.  Nat  Biotechnol  30,  715-720,  (2012).
5  Mica,  Y.,  Lee,  G.,  Chambers,  S.  M.,  Tomishima,  M.  J.  &  Studer,  L.  Modeling  neural  crest  induction,  melanocyte  specification,  and  disease-related  pigmentation  defects  in  hESCs  and  patient-specific  iPSCs.  Cell  Rep  3,  1140-1152,  (2013).
6  Menendez,  L.,  Yatskievych,  T.  A.,  Antin,  P.  B.  &  Dalton,  S.  Wnt  signaling  and  a  Smad  pathway  blockade  direct  the  differentiation  of  human  pluripotent  stem  cells  to  multipotent  neural  crest  cells.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  108,  19240-19245,  (2011).
7  Lee,  G.  et  al.  Isolation  and  directed  differentiation  of  neural  crest  stem  cells  derived  from  human  embryonic  stem  cells.  Nat  Biotechnol  25,  1468-1475,  (2007).
8  Chan,  K.  K.  et  al.  Hoxb3  vagal  neural  crest-specific  enhancer  element  for  controlling  enteric  nervous  system  development.  Dev  Dyn  233,  473-483,  (2005).
9  Fu,  M.,  Lui,  V.  C.,  Sham,  M.  H.,  Cheung,  A.  N.  &  Tam,  P.  K.  HOXB5  expression  is  spatially  and  temporarily  regulated  in  human  embryonic  gut  during  neural  crest  cell  colonization  and  differentiation  of  enteric  neuroblasts.  Dev  Dyn  228,  1-10,  (2003).
10  Wichterle,  H.,  Lieberam,  I.,  Porter,  J.  A.  &  Jessell,  T.  M.  Directed  differentiation  of  embryonic  stem  cells  into  motor  neurons.  Cell  110,  385-397,  (2002).
11  Chambers,  S.  M.  et  al.  Highly  efficient  neural  conversion  of  human  ES  and  iPS  cells  by  dual  inhibition  of  SMAD  signaling.  Nat  Biotechnol  27,  275-280,  (2009).
12  Chalazonitis,  A.  et  al.  Neurotrophin-3  induces  neural  crest-derived  cells  from  fetal  rat  gut  to  develop  in  vitro  as  neurons  or  glia.  J  Neurosci  14,  6571-6584,  (1994).
13  Laflamme,  M.  A.  et  al.  Cardiomyocytes  derived  from  human  embryonic  stem  cells  in  pro-survival  factors  enhance  function  of  infarcted  rat  hearts.  Nat  Biotechnol  25,  1015-1024,  (2007).
14  Nathan,  E.  et  al.  The  contribution  of  Islet1-expressing  splanchnic  mesoderm  cells  to  distinct  branchiomeric  muscles  reveals  significant  heterogeneity  in  head  muscle  development.  Development  135,  647-657,  (2008).
15  Christ,  G.  J.,  Moreno,  A.  P.,  Melman,  A.  &  Spray,  D.  C.  Gap  junction-mediated  intercellular  diffusion  of  Ca2+  in  cultured  human  corporal  smooth  muscle  cells.  Am  J  Physiol  263,  C373-383,  (1992).
16  Barthel,  E.  R.  et  al.  Tissue  engineering  of  the  intestine  in  a  murine  model.  Journal  of  visualized  experiments  :  JoVE,  e4279,  (2012).
17  Di  Lorenzo,  C.,  Solzi,  G.  F.,  Flores,  A.  F.,  Schwankovsky,  L.  &  Hyman,  P.  E.  Colonic  motility  after  surgery  for  Hirschsprung's  disease.  The  American  journal  of  gastroenterology  95,  1759-1764,  (2000).
18  Drake,  R.  L.  V.,  W.;  Mitchell,  A.W.M.  Gray's  Anatomy  for  Students.    (Churchill  Livingstone,  2010).
19  Hotta,  R.,  Natarajan,  D.,  Burns,  A.  J.  &  Thapar,  N.  Stem  cells  for  GI  motility  disorders.  Curr  Opin  Pharmacol  11,  617-623,  (2011).
20  Gershon,  M.  D.  Transplanting  the  enteric  nervous  system:  a  step  closer  to  treatment  for  aganglionosis.  Gut  56,  459-461,  (2007).
21  Schafer,  K.  H.,  Micci,  M.  A.  &  Pasricha,  P.  J.  Neural  stem  cell  transplantation  in  the  enteric  nervous  system:  roadmaps  and  roadblocks.  Neurogastroenterol  Motil  21,  103-112,  (2009).
22  Hotta,  R.  et  al.  Transplanted  progenitors  generate  functional  enteric  neurons  in  the  postnatal  colon.  J  Clin  Invest  123,  1182-1191,  (2013).
23  Gariepy,  C.  E.,  Cass,  D.  T.  &  Yanagisawa,  M.  Null  mutation  of  endothelin  receptor  type  B  gene  in  spotting  lethal  rats  causes  aganglionic  megacolon  and  white  coat  color.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  93,  867-872,  (1996).
24  Kruger,  G.  M.  et  al.  Temporally  distinct  requirements  for  endothelin  receptor  B  in  the  generation  and  migration  of  gut  neural  crest  stem  cells.  Neuron  40,  917-929,  (2003).
25  Tam,  P.  K.  &  Garcia-Barcelo,  M.  Genetic  basis  of  Hirschsprung's  disease.  Pediatric  surgery  international  25,  543-558,  (2009).
26  Jinek,  M.  et  al.  RNA-programmed  genome  editing  in  human  cells.  eLife  2,  e00471,  (2013).
27  Cong,  L.  et  al.  Multiplex  genome  engineering  using  CRISPR/Cas  systems.  Science  339,  819-823,  (2013).
28  Chakravarti,  A.  Endothelin  receptor-mediated  signaling  in  hirschsprung  disease.  Hum  Mol  Genet  5,  303-307,  (1996).
29  Tobin,  J.  L.  et  al.  Inhibition  of  neural  crest  migration  underlies  craniofacial  dysmorphology  and  Hirschsprung's  disease  in  Bardet-Biedl  syndrome.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  105,  6714-6719,  (2008).
30  Zhang,  Y.,  Kim,  T.  H.  &  Niswander,  L.  Phactr4  regulates  directional  migration  of  enteric  neural  crest  through  PP1,  integrin  signaling,  and  cofilin  activity.  Genes  Dev  26,  69-81,  (2012).
31  Yoshida,  H.  et  al.  Pepstatin  A,  an  aspartic  proteinase  inhibitor,  suppresses  RANKL-induced  osteoclast  differentiation.  J  Biochem  139,  583-590,  (2006).
32  Haas,  H.  A.  Extending  the  search  for  folk  personality  constructs:  the  dimensionality  of  the  personality-relevant  proverb  domain.  J  Pers  Soc  Psychol  82,  594-609,  (2002).
33  Gershon,  M.  D.  &  Tack,  J.  The  serotonin  signaling  system:  from  basic  understanding  to  drug  development  for  functional  GI  disorders.  Gastroenterology  132,  397-414,  (2007).
34  Vassar,  R.  et  al.  Function,  therapeutic  potential  and  cell  biology  of  BACE  proteases:  current  status  and  future  prospects.  J  Neurochem  130,  4-28,  (2014).
35  Torii,  T.  et  al.  In  vivo  knockdown  of  ErbB3  in  mice  inhibits  Schwann  cell  precursor  migration.  Biochem  Biophys  Res  Commun  452,  782-788,  (2014).
36  Wakatsuki,  S.,  Araki,  T.  &  Sehara-Fujisawa,  A.  Neuregulin-1/glial  growth  factor  stimulates  Schwann  cell  migration  by  inducing  alpha5  beta1  integrin-ErbB2-focal  adhesion  kinase  complex  formation.  Genes  Cells  19,  66-77,  (2014).
37  Cully,  M.  Deal  watch:  Lilly  buys  back  into  the  BACE  race  for  Alzheimer's  disease.  Nature  reviews.  Drug  discovery  13,  804,  (2014).
38  Zeltner,  N.,  Lafaille,  F.  G.,  Fattahi,  F.  &  Studer,  L.  Feeder-free  derivation  of  neural  crest  progenitor  cells  from  human  pluripotent  stem  cells.  Journal  of  visualized  experiments  :  JoVE,  (2014).
39  Hosoda,  K.  et  al.  Targeted  and  natural  (piebald-lethal)  mutations  of  endothelin-B  receptor  gene  produce  megacolon  associated  with  spotted  coat  color  in  mice.  Cell  79,  1267-1276,  (1994).
40  Ran,  F.  A.  et  al.  Double  nicking  by  RNA-guided  CRISPR  Cas9  for  enhanced  genome  editing  specificity.  Cell  154,  1380-1389,  (2013).
41  Berthold,  M.  et  al.  in  Data  Analysis,  Machine  Learning  and  Applications    Studies  in  Classification,  Data  Analysis,  and  Knowledge  Organization  (eds  Christine  Preisach,  Hans  Burkhardt,  Lars  Schmidt-Thieme,  &  Reinhold  Decker)  Ch.  38,  319-326  (Springer  Berlin  Heidelberg,  2008).
42  Dreser,  N.  et  al.  Grouping  of  histone  deacetylase  inhibitors  and  other  toxicants  disturbing  neural  crest  migration  by  transcriptional  profiling.  Neurotoxicology  50,  56-70,  (2015).
【０４３７】
様々な特許および他の出版物を本明細書で引用し、それらの内容は、それらを全体として参照により本明細書に組み込む。
【図１ＡＢＣＤ】
2019503679.tif 000030
【図１ＥＦ】
2019503679.tif 000031
【図１ＧＨＩＪ】
2019503679.tif 000032
【図２ＡＢＣ】
2019503679.tif 000033
【図２ＤＥＦ】
2019503679.tif 000034
【図２ＧＨＩ】
2019503679.tif 000035
【図３ＡＢＣ】
2019503679.tif 000036
【図３ＤＥＦ】
2019503679.tif 000037
【図３ＧＨＩ】
2019503679.tif 000038
【図３ＪＫ】
2019503679.tif 000039
【図４ＡＢ】
2019503679.tif 000040
【図４Ｃ】
2019503679.tif 000041
【図４Ｄ】
2019503679.tif 000042
【図４Ｅ】
2019503679.tif 000043
【図５】
2019503679.tif 000044
【図６ＡＢＣＤ】
2019503679.tif 000045
【図６ＥＦＧＨ】
2019503679.tif 000046
【図７】
2019503679.tif 000047
【図８ＡＣ】
2019503679.tif 000048
【図８Ｂ−１】
2019503679.tif 000049
【図８Ｂ−２】
2019503679.tif 000050
【図８Ｂ−３】
2019503679.tif 000051
【図８Ｂ−４】
2019503679.tif 000052
【図８Ｂ−５】
2019503679.tif 000053
【図８Ｂ−６】
2019503679.tif 000054
【図９ＡＢＣＤＥ】
2019503679.tif 000055
【図９ＦＧＨＩＪ】
2019503679.tif 000056
【図１０ＡＢＣＤＥ】
2019503679.tif 000057
【図１０ＦＧＨ】
2019503679.tif 000058
【図１０ＩＪＫＬ】
2019503679.tif 000059
【図１１Ａ】
2019503679.tif 000060
【図１１ＢＣＤＥ】
2019503679.tif 000061
【図１２Ａ】
2019503679.tif 000062
【図１２ＢＣＤ】
2019503679.tif 000063
【図１３ＡＢＣ】
2019503679.tif 000064
【図１３ＤＥＦ】
2019503679.tif 000065
【配列表】
2019503679000001.app
【国際調査報告】
2019503679.tif 000066
2019503679.tif 000067
2019503679.tif 000068
2019503679.tif 000069