(57)【要約】  本発明は、ヴォールトRNA（vtRNA）が、細胞のオートファジーの重要な因子であるp62と会合するという知見に関連する。本発明は、細胞におけるオートファジーフラックスに影響を及ぼす新規の方略としてvtRNAのp62への結合の調節を提供する。このように、本発明は、細胞における病理学的な低下した又は不十分なオートファジーと関連する疾患、例えば癌及び神経変性障害の処置において使用するためのvtRNAの阻害物質を提供する。さらに、p62/vtRNAを基軸としてオートファジーを調節する新規の治療用化合物をスクリーニングする方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるオートファジーフラックスを調節するためのinvitro方法であって、該細胞におけるヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用を阻害する又は増大させる工程を含み、その際、該細胞におけるヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害は、該細胞におけるオートファジーフラックスを増大させ、その一方で、該細胞におけるヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の増大は、該細胞におけるオートファジーフラックスを減少させる、方法。
【請求項２】
前記オートファジーの調節は、前記細胞におけるオートファジーフラックスの調節である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞におけるvtRNAとp62との相互作用の阻害又は増強は、前記細胞をvtRNAの発現、機能、又は安定性のアンタゴニスト又はアゴニストと接触させることにより達成される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞におけるvtRNAとp62との相互作用の阻害又は増大は、前記細胞をvtRNAとp62との間の結合を競合的に妨害する又は増強することが可能な物質と接触させることにより達成され、又は、
前記細胞におけるvtRNAとp62との相互作用の阻害又は増大は、前記細胞をvtRNAとp62との間の結合を競合的に妨害する又は増強することが可能な物質と接触させることにより達成され、前記物質は、R139及び／又はK141を含むp62の領域に結合する、
請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
前記vtRNAは、vtRNA1-1（配列番号3）、vtRNA1-2（配列番号4）、vtRNA1-3（配列番号5）、及びvtRNA2-1（配列番号6）から選択され、又は
前記vtRNAは、vtRNA1-1（配列番号3）である、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
vtRNAのアンタゴニストは、vtRNAの配列を標的とするアンチセンス核酸、siRNA、LNA、shRNA、又はその他のアンチセンスRNA干渉オリゴヌクレオチドであり、かつvtRNAのアゴニストは、vtRNAの発現構築物であり、又は、
vtRNAのアンタゴニストは、vtRNAの配列を標的とするアンチセンス核酸、siRNA、LNA、shRNA、又はその他のアンチセンスRNA干渉オリゴヌクレオチドであり、かつvtRNAのアゴニストは、vtRNAの発現構築物であり、該発現構築物は、発現プロモーターに作動可能に連結されたvtRNA配列を含む、
請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
オートファジーの調節物質をスクリーニングするためのinvitro方法であって、細胞と候補化合物とを接触させ、vtRNAとp62との相互作用をモニタリングすることを含み、その際、vtRNAとp62との間の相互作用の増大は、該候補化合物が細胞におけるオートファジーフラックスの阻害物質であることを示し、その一方で、vtRNAとp62との間の相互作用の減少は、該候補化合物が細胞におけるオートファジーフラックスの増強物質であることを示す、方法。
【請求項８】
医療において使用するための、ヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害物質。
【請求項９】
被験体に治療的有効量のヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害物質を投与することを含む細胞オートファジーの増大／増強により被験体における疾患を処置する方法における、請求項8に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１０】
前記疾患は、該疾患により冒された細胞においてオートファジーの増大から恩恵を受ける病状を有する、又は
前記疾患は、該疾患により冒された細胞においてオートファジーの増大から恩恵を受ける病状を有し、細胞成分の病理学的蓄積に関連する疾患である、
請求項9に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１１】
前記疾患は、感染性疾患、免疫関連疾患、癌、及び／又は神経変性障害から選択され、前記神経変性障害疾患は、副腎白質ジストロフィー、アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、ウシ海綿状脳症、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョゼフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、睡眠発作、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性連合性脊髄変性症、シュピールマイヤー−フォークト−シューグレン−バッテン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー病、脊髄癆、中毒性脳症、及びこれらの疾患の組み合わせから選択され、プロテイノパチーは、α1アンチトリプシン欠乏症、孤発性封入体筋炎、肢帯型筋ジストロフィー2B型、及び三好型ミオパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ALS、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、及びこれらの疾患の組み合わせである、請求項9又は10に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１２】
候補化合物が細胞におけるオートファジーフラックスの活性化物質であるかどうかを判定するためのin vitro方法であって、細胞におけるvtRNAの発現を阻害し、前記細胞を前記候補化合物と接触させ、そして前記細胞におけるオートファジーフラックスの変化をモニタリングすることを含み、その際、オートファジーフラックスにおける増大は、該候補化合物がオートファジーフラックスの活性化物質であることを示す、方法。
【請求項１３】
前記vtRNAは、vtRNA2-1、vtRNA1-1、及びvtRNA1-2から選択され、又は、
前記vtRNAは、vtRNA1-1である、
請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害物質と、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む、医療において使用するための医薬組成物。
【請求項１５】
病理学的な低下した又は不十分なオートファジーに関連した疾患の処置において使用するための、請求項14に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヴォールトRNA（vtRNA）が、細胞のオートファジーの重要な因子であるp62と会合するという知見に関連する。本発明は、細胞におけるオートファジーフラックスに影響を及ぼす新規の方略としてvtRNAのp62への結合の調節を提供する。このように、本発明は、細胞における病理学的な低下した又は不十分なオートファジーと関連する疾患、例えば癌及び神経変性障害の処置において使用するためのvtRNAの阻害物質を提供する。さらに、p62/vtRNAを基軸としてオートファジーを調節する新規の治療用化合物をスクリーニングする方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
マクロオートファジー（オートファジー）は、タンパク質、タンパク質凝集体、及び細胞小器官を含む細胞成分を、リソソーム中での分解の標的とするための重要な機構である。このカタボリックな細胞自己消化過程は、飢餓又はストレスへの応答において誘導され、タンパク質及び細胞小器官を取り込むオートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞の形成がもたらされる。その後にオートファゴソームはリソソームと融合し、そこでオートファゴソーム及びそのカーゴが分解される。このリソソーム媒介型の細胞自己消化は、細胞内栄養をリサイクルすることで、飢餓の間の細胞代謝を維持し、ストレス中に蓄積する損傷したタンパク質及び細胞小器官を排除する役割を果たす。個々のタンパク質の排除はユビキチン媒介型のプロテアソーム分解経路によって行われるが、オートファジー経路は、タンパク質凝集体及び細胞小器官を排除し得る。このように、オートファジーは、プロテアソーム機能を補完し、それと重複することで、飢餓及びストレスの間の損傷した細胞成分の蓄積を防ぐ。これらの機能により、オートファジーは、タンパク質及び細胞小器官の品質管理を維持し、ゲノムを損傷から守り、そして細胞及び哺乳動物の生存能を持続させる必須の細胞ストレス応答である。
【０００３】
オートファジーの中心的な分子機構は、酵母から哺乳動物まで進化的に保存されたATG遺伝子の群によりコードされるタンパク質産物により制御される。オートファジー小胞の核形成は、ベクリン1（酵母Atg6の哺乳動物ホモログ）及びVps34を含むタイプIII PI3キナーゼ複合体の産物であるPtdIns3Pと2種のユビキチン様分子Atgl2及びLC3（Atg8のホモログ）とを必要とし、それらは順次にオートファゴソームの形成の媒介において機能する。第1のユビキチン化様反応において、Atgl2はAtg5に結合され、大きな多量体型タンパク質複合体を形成し、その複合体がオートファゴソームの核形成の決定に主要な役割を果たす。第2の反応において、LC3はホスファチジルエタノールアミンに結合され、オートファゴソームの伸長及び閉鎖のために重要な膜転位がもたらされる。
【０００４】
オートファジー機能不全は、限定されるものではないが、神経変性、肝臓疾患、及び癌を含む疾患の主要原因である。多くのヒトの神経変性疾患は、異常な突然変異体及び／又はポリユビキチン化タンパク質の蓄積、並びに過剰なニューロン細胞死に関連している。ターゲティングされたオートファジー欠陥を有するマウスのニューロンは、ポリユビキチン化されたp62含有タンパク質凝集体を蓄積し、その結果、神経変性が引き起こされる。ヒトの肝臓疾患である脂肪性肝炎及び肝細胞癌（HCC）の主要サブセットは、p62含有タンパク質凝集体（マロリー体）の形成に関連している（非特許文献1）。オートファジー欠陥を有するマウスの肝臓は、p62含有タンパク質凝集体、過剰な細胞死、及びHCCを有する。
【０００５】
オートファジーは、癌の発生及び処置において複雑な役割を担うことが提唱されてきている。オートファジーの活性化は、壊死性細胞死に続く腫瘍成長を助長する炎症を妨げることにより腫瘍抑制機構として機能する。一方で、オートファジーの阻害は、未知の機構によりゲノム不安定性をもたらすことがあり、それにより、多数の癌系統におけるベクリン1のヘテロ接合性の頻度の増加と、悪性上皮性卵巣癌におけるオートファジー関連タンパク質の発現の減少とが説明され得る。このように、オートファジーの慢性的な抑制は、腫瘍形成を刺激し得る。
【０００６】
細胞のゴミ処理におけるオートファジーの重要性は明らかである。それというのも、オートファジーは、細胞小器官及びタンパク質凝集体等の大きな細胞構造のターンオーバーに関して特定されている唯一の機構であるからである。細胞小器官が認識されて、分解のためにオートファゴソームに指向化される方式は、機能不全細胞小器官が発する酸化ストレスを緩和し得るマイトファジー及びERファジー等の細胞小器官に特異的な過程を必要とし得る。ストレス中に蓄積する損傷したタンパク質は、プロテアソーム経路によりリフォールディング、ユビキチン化、及び分解され得るか、又はオートファジーにより凝集及び分解され得る。損傷した又はフォールディングされなかったタンパク質をオートファジー経路に指向化するために、p62はポリユビキチン化されたタンパク質に結合して、オリゴマー化／多量体化によりタンパク質凝集体が形成され、そしてオートファゴソーム膜上のAtg8/LC3に結合することで、凝集体はオートファゴソームに標的化され、分解される。タンパク質凝集は、隔離により毒性タンパク質への細胞の曝露を抑える保護的機構であり得るとともに、損傷したタンパク質を収集し、オートファゴソームへと指向化する効果的な包み込み及び送達の機構であり得る。マウスにおける肝臓特異的オートファジー欠陥は、p62凝集体の蓄積、酸化ストレスの増加、及び肝細胞の細胞死を引き起こす。このように、いかなる動作原理に縛られるものではないが、オートファジーによりp62凝集体を処理することができないと、正常組織に対して有害になる場合があると考えられる。
【０００７】
ヴォールトは、1980年中期に同定された最も大きなリボヌクレオチド−タンパク質複合体である（非特許文献2）。ヴォールトは、広範囲の真核生物において見出されるが、例えばショウジョウバエ、線虫、又は酵母においては見られない（非特許文献3）。ヴォールトは、薬物耐性、アポトーシス、又は核輸送のような様々な細胞過程に関連している（非特許文献4）が、それらの正確な機能は未だにはっきりしていない。樽型のヴォールトは、3つのタンパク質、つまり主要なヴォールト構造を付与する主要ヴォールトタンパク質（MVP）と、ヴォールトのキャップに位置すると考えられるRNA結合性タンパク質であるテロメラーゼ関連タンパク質1（TEP1）と、粒子内部に位置するポリ-A-リボースポリメラーゼ4（PARP4）とから構成されている。さらに、ヴォールトは、小さな非コーディングのヴォールトRNA（vtRNA）を含み、それは、TEP1により結合されて複合体のキャップに位置していると予測されている（非特許文献5）。ヒトは、4つのvtRNAパラログ（vtRNA1-1、vtRNA1-2、vtRNA1-3、vtRNA2-1）を有し、それらは、88ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長であり、RNA Pol IIIにより転写され、そして5q染色体上にコードされている。沈降実験により、トータルvtRNAプールの少数のみしかヴォールト中に組み込まれないことが示唆された（非特許文献6）。vtRNA1-1の過剰発現により、EBV感染の細胞モデルにおいてアポトーシスが妨げられ（非特許文献7）、そしてPKRの失活を介してインフルエンザウイルス複製が助長されること（非特許文献8）が分かった。ヴォールトの内側又は外側にあるヴォールトRNAの正確な機能も未だに大部分は不確定のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zatloukal, K., etal. (2002), p62 is a common component of cytoplasmic inclusions in proteinaggregation diseases, Am. J. Pathol. 160, 255-263
【非特許文献２】Kedersha and Rome,1986
【非特許文献３】Stadler et al.,2009
【非特許文献４】Berger et al., 2009
【非特許文献５】Kong et al., 2000
【非特許文献６】Nandy et al., 2009
【非特許文献７】Amort et al., 2015
【非特許文献８】Li et al., 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
多くのヒトの障害の主要原因として、オートファジーを標的とする治療アプローチが依然として不十分であることがある。したがって、本発明の課題は、神経変性疾患及び癌疾患の処置を可能にするための、細胞におけるオートファジーの照準を絞った調節のための新たなアプローチを提供することである。
【００１０】
本明細書で使用される場合に、用語「ヴォールト」又は「ヴォールト粒子」は、真核細胞に見られる大きな細胞質リボヌクレオタンパク質（RNP）粒子を指す。ヴォールト又はヴォールト粒子は、MVP、VPARP、及び／又はTEP1タンパク質と、1つ以上の非翻訳vtRNA分子とから構成されている。ヒトのヴォールトは、vtRNA1-1、vtRNA1-2、vtRNA1-3、及びvtRNA2-1を含む。
【００１１】
用語「ヴォールトRNA」及び「vtRNA」は、ヴォールトの内側に会合又は含有されていることが認められる非タンパク質コーディングRNA分子を指す。
【００１２】
用語「オートファジー」は、細胞自身の成分、例えば長命タンパク質、タンパク質凝集体、細胞小器官、細胞膜、細胞小器官膜、及びその他の細胞成分の分解を伴うカタボリック過程を指す。オートファジーの機構は、（i）細胞の標的となる領域の周りに膜が形成されて、その内容物が細胞質の残りの部分から分離されること、及び（ii）得られた小胞とリソソームとが融合して、引き続きその小胞の内容物が分解されることを含み得る。例えば、オートファジーという用語は、飢餓細胞が不必要な過程からより必須の過程へと栄養を再割り当てする機構の1つを指し得る。また、例えばオートファジーは、幾つかの疾患の進行を阻止し、細胞内病原体による感染に対して防御的な役割を担う場合もある。
【００１３】
用語「オートファジー関連疾患」には、オートファジーの誘導又は低下により処置することができる疾患が含まれる。そのような疾患の例には、ミスフォールドされたタンパク質凝集体により引き起こされる疾患が含まれる。用語「ミスフォールドされたタンパク質凝集体により引き起こされる疾患」は、ミスフォールドされたタンパク質凝集体と関連する又はそれにより引き起こされる任意の疾患、障害、又は状態を含むと解釈される。例えば、そのような疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、眼咽頭型筋ジストロフィー、プリオン病、致死性家族性不眠症、α1アンチトリプシン欠乏症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、X連鎖球脊髄性筋萎縮症、及び神経核内封入体病が含まれる。用語「オートファジー関連疾患」はまた、癌、例えばオートファジーの誘導により細胞成長及び細胞分裂が阻止され、突然変異誘発が低減され、活性酸素種により損傷したミトコンドリア及びその他の細胞小器官が除去され、又は発達中の腫瘍細胞が死滅されることとなるあらゆる癌を含む。オートファジー関連疾患は、慢性疾患であり得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合に、用語「オートファジーフラックス」は、オートファジーのターンオーバー、すなわちオートファゴソーム（AP）の形成及びクリアランスの速度を指す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第1の態様においては、上記課題は、細胞におけるオートファジーを調節する方法であって、該細胞におけるヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用、或いはヴォールトとp62との間の相互作用を阻害する又は増大させる工程を含む、方法により解決される。
【００１６】
本発明によるvtRNAは、好ましくは、vtRNA1-1及びvtRNA1-2、vtRNA1-3、及びvtRNA2-1、好ましくはvtRNA1-1及びvtRNA1-2、及びvtRNA2-1を含む群から選択され、最も好ましくは、vtRNAは、vtRNA1-1である。生物に応じて、当業者は、その都度の種に見られるその他のvtRNAホモログを選択し得るものと解釈される。配列番号3〜配列番号6は、ヒト配列を示すが、特にスクリーニング目的のためには、マウス若しくはラット又はその他の哺乳動物のvtRNAも本発明の主題となり得る。
【００１７】
本発明は、驚くべきことに、オートファジーに関与するタンパク質p62の、RNA結合性タンパク質としての機能を見出した。p62は、今までRNAに結合するとは知られておらず、特にヴォールト由来のRNAがp62に結合して、その機能を調節することは新事実である。p62はまた、SQSTM1（セクエストソーム1）としても知られている。
【００１８】
p62とヴォールト又はvtRNAとの相互作用は、vtRNA（そのままで、又はヴォールト複合体の状況で）がp62タンパク質へと結合することである。ヴォールト又はvtRNAのp62への結合は、意図される場合に、本明細書で実施例部に開示される方法により測定することができる。
【００１９】
本発明の更なる追加の又は択一的な好ましい実施形態においては、オートファジーの調節は、細胞におけるオートファジーフラックスの調節である。オートファジーフラックスは、好ましくは、LC3Bの結合の調節及び／又は細胞中のp62斑点の形成をモニタリングすることにより測定される。微小管関連タンパク質1A/1B軽鎖3（LC3）は、哺乳動物組織及び培養細胞中に広範に分布している約17 kDaの分子量を有する可溶性タンパク質である。オートファジーの間に、オートファゴソームは、細胞質ゾルタンパク質及び細胞小器官を含む細胞質成分を取り込む。並行して、LC3の細胞質ゾル形（LC3-I）は、ホスファチジルエタノールアミンに結合して、LC3-ホスファチジルエタノールアミン結合体（LC3-II）を形成し、それがオートファゴソーム膜に動員される。また、オートファジーの間に、p62の自己オリゴマー化は、タンパク質凝集体の形成を促し、そのタンパク質凝集体の形成は、斑点として観察されるため、オートファジーフラックスのためのマーカーとして使用することができる。
【００２０】
本発明においては、細胞におけるオートファジーフラックスを増大させることが好ましい実施形態が存在することとなる。オートファジーフラックスの増大は、好ましくは、細胞におけるヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害により達成される。
【００２１】
けれども、本発明のその他の好ましい実施形態においては、細胞におけるオートファジーフラックスを減少させることが好ましいこととなる。本発明におけるオートファジーフラックスの減少は、細胞におけるヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の増大により達成される。
【００２２】
本発明の幾つかの好ましい実施形態においては、細胞におけるvtRNAとp62との相互作用の阻害又は増強は、上記細胞をvtRNAの発現、機能、又は安定性のアンタゴニスト又はアゴニストと接触させることにより達成される。また、細胞におけるvtRNAとp62との相互作用の阻害又は増大が、vtRNAとp62との間の結合を（競合的に）妨害する又は増強することがそれぞれ可能な物質と上記細胞を接触させることにより達成されることも含まれる。上記結合のそのような妨害因子は、好ましくは、p62（ヒトp62、その他の哺乳動物中のそれぞれの配列位置は、配列アライメントから導き出すことができる）中のアミノ酸位置R139及び／又はK141の近く又はその周辺に位置するp62の領域に結合する物質である。該領域は、好ましくは100アミノ酸長、より好ましくは約50アミノ酸長、30アミノ酸長、20アミノ酸長、15アミノ酸長、又は5アミノ酸長〜10アミノ酸長であり、（ヒト）p62のR139及び／又はK141（その他のホモログにおいては、それぞれの相応の位置）を含む。
【００２３】
vtRNA又はヴォールトとp62との相互作用を増大する物質は、好ましくは、本開示の関連においては、vtRNA又はヴォールトとp62との相互作用の増強物質と呼ばれる。本発明の増強物質は、ヴォールト又はvtRNAのp62への結合の増大を誘導し得るあらゆる物質である。好ましくは、そのような化合物は、vtRNAとp62との間の相互作用の阻害がオートファジーフラックスの増大をもたらすという本発明の知見により、オートファジーのアンタゴニストとしての作用を有する。
【００２４】
そのような増強物質は、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、抗体、小分子、リボザイム、ペプチド、又は組み換えタンパク質から選択され得る。vtRNAとp62との相互作用の増強物質の好ましい例は、細胞においてvtRNAのレベルを増大させ、したがってvtRNAのp62への結合を増大させるvtRNAミミックのオリゴヌクレオチド又はvtRNA発現構築物である。vtRNAとp62との相互作用の増強物質は、好ましくは、vtRNA配列、又はvtRNA若しくはvtRNAのcDNA配列の少なくとも50%、より好ましくは60%、70%、80%、90%、95%、最も好ましくは98%又は99%の配列同一性を有する修飾vtRNA配列（ヒトvtRNAについては、配列番号3〜配列番号6を参照）を含むヌクレオチド配列を含み得る。本発明においては、vtRNA又はvtRNAミミックの発現構築物は、vtRNA配列若しくはvtRNAミミックのcDNA配列である配列、又はvtRNAの遺伝子配列を含むが、vtRNA分子又はvtRNAミミック分子は、これらの構造のそれぞれのRNA配列を含む。vtRNAの配列、vtRNA遺伝子はそれぞれ、当該技術分野でよく知られている。
【００２５】
発現構築物は、それぞれのvtRNAをコードするvtRNAのDNA配列を含むことができ、好ましくはvtRNA配列の発現のためのプロモーターに作動可能に連結される。そのような発現構築物はよく知られており、細胞における外来DNAの発現のために適したあらゆるベクター、プラスミド、又はその他の核酸ベースの構築物であり得る。
【００２６】
その他の実施形態においては、本発明は、vtRNA又はヴォールトとp62との相互作用を阻害するための物質を提供する、又は該物質に関する。そのような物質は、以下ではvtRNA又はヴォールトとp62との相互作用の阻害物質と呼ばれる。本発明の阻害物質は、ヴォールト又はvtRNAのp62タンパク質への結合の減少を誘導し得るあらゆる物質である。好ましくは、そのような化合物は、vtRNAとp62との間の相互作用の阻害が細胞におけるオートファジーフラックスの増大をもたらすという本発明の知見により、オートファジーのアゴニストとしての作用を有する。
【００２７】
好ましくは、vtRNA又はヴォールトとp62との相互作用のそのような阻害物質は、vtRNAのアンタゴニストである。好ましいアンタゴニストは、vtRNAの配列を標的とするアンチセンス核酸又はアンチセンス分子である。本発明による用語「アンチセンス分子」は、このように、所与のvtRNA、すなわち「センス」配列に相補的な塩基配列を有する核酸分子、好ましくはRNA、DNA、RNA/DNA、又はLNA分子に関する。幾つかの実施形態においては、アンチセンス分子は、siRNA、LNA、shRNA、又はその他のアンチセンスRNA干渉オリゴヌクレオチドである。
【００２８】
本発明のアンチセンス分子の特に好ましい例は、エンドリボヌクレアーゼで作製したsiRNA（esiRNA）である。esiRNAは、長い二本鎖RNA（dsRNA）のエシェリキア・コリのRNase III又はダイサー等のエンドリボヌクレアーゼによる開裂により得られるsiRNAオリゴの混合物である。esiRNAは、化学的に合成されたsiRNAをRNA干渉（RNAi）のために使用することの代替となる概念である。esiRNAは、長い二本鎖RNAのinvitroでの酵素的消化物である。esiRNAの生成のために、vtRNA鋳型のcDNAがPCRにより増幅され、2つのバクテリオファージプロモーター配列でタグ付けされ得る。次いで、RNAポリメラーゼを使用することで、標的遺伝子のcDNAと相補的な長い二本鎖RNAが生成される。この相補的RNAは、引き続きエシェリキア・コリ由来のRNase IIIで消化されて、18塩基対から25塩基対の間の長さを有するsiRNAの短いオーバーラップしている断片が生成され得る。この短い二本鎖RNAの複雑な混合物は、in vivoでダイサー開裂により生成される混合物と類似しており、したがって、エンドリボヌクレアーゼで作製したsiRNA又は短くesiRNAと呼ばれる。したがって、esiRNAは、全てが同じmRNA配列を標的とするsiRNAの不均一混合物である。esiRNAは、特異性が高くかつ効果的な遺伝子サイレンシングをもたらす。
【００２９】
vtRNAを標的とするための本発明によるアンチセンス分子の配列同一性は、より好ましくなる順序で、vtRNA配列の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%である。配列同一性を測定する手段及び方法は、当該技術分野で知られている。好ましくは、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムは、当該技術分野で知られているように1種以上のvtRNAに関して配列同一性を測定するために使用される。一方で、本発明のsiRNA及びshRNA等の好ましいアンチセンス分子は、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び慣用のRNA合成機を使用して化学的に合成される。RNA合成試薬の供給業者としては、Proligo社（ドイツ、ハンブルク）、Dharmacon Research社（米国、コロラド州、ラファイエット）、PierceChemical社（PerbioScience社の一部、米国、イリノイ州、ロックフォード）、GlenResearch社（米国、バージニア州、スターリング）、ChemGenes社（米国、マサチューセッツ州、アッシュランド）、及びCruachem社（英国、グラスゴー）が挙げられる。
【００３０】
アンチセンス分子、siRNA、及びshRNAが、in vivoでvtRNA及び遺伝子を強力であるが、可逆的にサイレンシングする能力により、これらの分子は、本明細書で以下でも記載される本発明の医薬組成物において使用するために特に適性が良い。siRNAをヒトに投与する方法は、De Fougerolles et al., Current Opinionin Pharmacology, 2008, 8:280-285に記載されている。そのような方法はまた、shRNAのようなその他の小さなRNA分子の投与のためにも適している。したがって、そのような医薬組成物は、生理食塩水として、リポソームベース及びポリマーベースのナノ粒子アプローチを介して、結合型若しくは錯化型の医薬組成物として製剤化して、又はウイルス性送達系を介して直接的に投与することができる。直接的な投与は、組織中への注射、鼻内投与、及び気管内投与を含む。リポソームベース及びポリマーベースのナノ粒子アプローチは、カチオン性脂質のGenzyme Lipid（GL）67、カチオン性リポソーム、キトサンナノ粒子、及びカチオン性細胞膜透過ペプチド（CPP）を含む。結合型又は錯化型の医薬組成物は、PEI錯化型のアンチセンス分子、siRNA、shRNA、又はmiRNAを含む。さらに、ウイルス性送達系は、インフルエンザウイルスのエンベロープ及びウイロゾームを含む。
【００３１】
アンチセンス分子、siRNA、shRNAは、ロックド核酸（LNA）等の修飾ヌクレオチドを含み得る。LNAヌクレオチドのリボース部は、2'酸素と4'炭素とを連結する追加の架橋で修飾されている。その架橋は、A型二本鎖においてしばしば見られる3'-エンド型（North型）立体配座でリボースを「ロック」する。LNAヌクレオチドは、必要に応じて、オリゴヌクレオチドにおいてDNA又はRNA残基と混合され得る。そのようなオリゴマーは、化学的に合成され、市販されている。ロックされたリボース立体配座は、塩基スタッキング、及び骨格の事前組織化を増強する。これは、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（溶融温度）を大幅に高める。siRNAの特に好ましい例は、GapmeR（LNA（商標）GapmeR（Exiqon社））である。GapmeRは、mRNA及びvtRNA機能の効率の高い阻害のために使用される強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。GapmeRは、LNAのブロックを両側に有する中央に伸びたDNA単量体を含む。GapmeRは、好ましくは14ヌクレオチド長〜16ヌクレオチド長であり、任意に完全にホスホロチオエート化されている。そのDNAのギャップは、RNase Hに媒介される標的RNAの分解を活性化し、それはまた転写物を直接的に核内で標的とするために適している。
【００３２】
vtRNAアンタゴニストとして使用するために好ましいアンチセンス分子は、配列番号3〜配列番号6に示されるvtRNA配列のいずれかに相補的な配列を有するアンチセンス構築物である。最も好ましいのは、配列番号1又は配列番号2による配列を含む、又は本質的に該配列からなるアンチセンス分子（実施例で使用されるLNA構築物）である。
【００３３】
本発明の様々な態様の種々の好ましい実施形態によれば、本発明のvtRNA又はヴォールトとp62との相互作用の阻害物質は、アプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物、又は小分子阻害物質であってもよい。
【００３４】
この実施形態のアプタマー、リボザイム、抗体、タンパク質薬物、又は小分子阻害物質は、1種以上のvtRNA又はヴォールトに特異的に結合し、それにより該vtRNA又はヴォールトがp62に結合することを阻害する。本発明による用語「アプタマー」は、その他の分子に結合する能力に基づきランダムなプールから選択された、本来のD立体配座又はL立体配座（「spiegelmer」）のいずれかであるDNA又はRNA分子を指す。アプタマーは、核酸、タンパク質、小有機化合物、そして生物全体に結合するものさえも選択されている。アプタマーのデータベースは、http://aptamer.icmb.utexas.edu/で保全されている。より具体的には、アプタマーは、DNA若しくはRNAアプタマー、又はペプチドアプタマーとして分類され得る。前者は、オリゴヌクレオチドの（通常は短い）鎖からなるが、後者は、両端がタンパク質足場に結合された短い可変タンパク質ドメインからなる。核酸アプタマーは、様々な分子標的、例えば小分子、タンパク質、核酸、そして更に細胞、組織、及び生物に結合するin vitro選択法、すなわちSELEX法（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）を繰り返し行うことにより操作された核酸種である。本発明により想定される分子標的は、核酸、すなわちvtRNA（例えば、配列番号3〜配列番号6）である。したがって、アプタマーは、本発明の標的分子に対して製造され得る。ペプチドアプタマーは、細胞内のその他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されたペプチドである。ペプチドアプタマーは、両端がタンパク質足場に結合された可変ペプチドループからなる。この二重の構造的拘束は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵する水準（ナノモラー範囲）にまで大幅に増大する。その可変ループの長さは、一般的に10アミノ酸〜20アミノ酸から構成され、上記足場は、良好な可溶性特性を有する任意のタンパク質であり得る。最近では、細菌性タンパク質のチオレドキシン-Aが最も使用される足場タンパク質であり、その際、可変ループは、野生型タンパク質では-Cys-Gly-Pro-Cys-ループである還元性活性部位内に挿入されており、それらの2つのシステイン側鎖は、ジスルフィド架橋を形成し得る。ペプチドアプタマーは、種々のシステムを使用して選択され得るが、最も使用されるのは、最近では酵母ツーハイブリッドシステムである。最も好ましいと思われるのは、vtRNA結合の上述の結合領域でp62に結合するペプチドアプタマーである。
【００３５】
アプタマーは、通常使用される生体分子、特に抗体に匹敵する分子認識特性を有するため、生物工学的用途及び治療用途のための有用性を有する。それらの識別認識に加えて、アプタマーは、抗体を上回る利点を有する。それというのも、アプタマーは、完全に試験管中で操作することができ、化学合成により容易に製造され、所望の貯蔵特性を有し、かつ治療用途において免疫原性をほとんど誘発しないか、又は一切誘発しないからである。非修飾アプタマーは、主として、ヌクレアーゼ分解とアプタマーが本来低分子量である結果の腎臓による身体からのクリアランスとに起因して、数分ないし数時間の半減期で血流から素早くクリアランスされる。アプタマーの素早いクリアランスは、in vivo診断的イメージング等の用途において有利であり得る。幾つかの修飾、例えば2'-フッ素置換されたピリミジン、ポリエチレングリコール（PEG）結合等が科学者に利用可能であり、それによりアプタマーの半減期を、日単位の時間的規模、又はそれどころか週単位の時間的規模にまで容易に増加させることができる。
【００３６】
用語「リボザイム」は、タンパク質の不存在下で酵素として作用するRNA分子を指す。これらのRNA分子は、触媒的又は自己触媒的に作用し、例えばその他のRNAを特定の標的部位で開裂することが可能であるが、それらはまた、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも分かっている。適切な標的部位及び相応のリボザイムの選択は、例えばZaher andUnrau (2007), RNA 13 (7): 1017-1026に記載されるようにして行うことができる。
【００３７】
十分に特徴付けられた小さい自己開裂性RNAの例は、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、デルタ肝炎ウイルスリボザイム、及びin vitro選択された鉛依存性リボザイムである。これらの小さい触媒の組織化は、より大きなリボザイム、例えばグループIイントロンの組織化とは対照的である。
【００３８】
触媒的自己開裂の原理は、過去10年間で十分に定着してきている。ハンマーヘッド型リボザイムは、リボザイム活性を有するRNA分子のなかでも最も特徴付けられている。ハンマーヘッド型構造は、異種RNA配列中に組み込むことができ、それによりリボザイム活性がこれらの分子に移され得ることが示されたので、標的配列が、潜在的な合致する開裂部位を有するのであれば、ほぼあらゆる標的配列のための触媒配列を作製することができると思われる。
【００３９】
ハンマーヘッド型リボザイムを構築する基本原理は、以下の通りである：GUC（又はCUC）トリプレットを含むRNAの対象領域を選択する。それぞれ6ヌクレオチド〜8ヌクレオチドを有する2つのオリゴヌクレオチド鎖を選び、その間に触媒的ハンマーヘッド配列を挿入する。このタイプの分子を、数多くの標的配列について合成した。それらの分子は、in vitroで触媒活性を示し、幾つかの場合にはin vivoでも触媒活性を示した。最良の結果は、通常は、短いリボザイム及び標的配列で得られる。それというのも、上記標的配列は、短いRNA配列、すなわちvtRNAであるからである。アプタマー及びリボザイムも、ロックド核酸（LNA）等の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００４０】
本発明により使用される用語「抗体」は、例えばポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含む。さらに、結合特異性を依然として保持するその誘導体又はフラグメントも、用語「抗体」に含まれる。抗体フラグメント又は誘導体は、とりわけFab又はFab'フラグメント、Fd、F(ab')2、Fv又はscFvフラグメント、シングルドメインVH又はV様ドメイン、例えばVhH又はN-NARドメイン、並びに多量体形、例えばミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、又は化学的にコンジュゲートされたFab'-多量体（例えば、Altshuler et al., 2010., Holliger and Hudson, 2005を参照のこと）を含む。用語「抗体」はまた、キメラ抗体（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、単鎖抗体、及びヒト化抗体（非ヒトCDR以外がヒト抗体であるもの）等の実施形態を含む。本発明のそのような抗体は、好ましくはp62又はヴォールト若しくはvtRNAに結合し、本発明によるヴォールト又はvtRNAとp62との相互作用を阻害する。
【００４１】
本発明の第1の態様の方法は、特定の好ましい実施形態においては、細胞におけるオートファジーを増強する方法であり得る。そのような方法は、細胞における低下した又は不十分なオートファジーフラックスと関連する被験体における疾患の処置のために使用され得る。さらに医療的使用の関連において、本発明の様々な態様及び実施形態を、本明細書で以下に記載する。
【００４２】
本発明による細胞は、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ラット細胞、又はヒト細胞である。細胞型は、本発明のその都度の用途に依存して、ニューロン細胞、肝臓細胞、腫瘍細胞、又は免疫細胞から選択され得る。
【００４３】
本明細書で上記した方法は、好ましくはex vivo法若しくはin vitro法から選択され得て、又は代替的には特に医療分野においては、in vivoで実施される方法であり得る。
【００４４】
また、第2の態様においては、オートファジーの調節物質をスクリーニングする方法であって、細胞と候補化合物とを接触させ、vtRNAとp62との相互作用をモニタリングすることを含み、その際、vtRNAとp62との間の相互作用の増大は、該候補化合物が細胞におけるオートファジーフラックスの阻害物質であることを示し、その一方で、vtRNAとp62との間の相互作用の減少は、該候補化合物が細胞におけるオートファジーフラックスの増強物質であることを示す、方法が提供される。また、結合は、2つの分子vtRNA／ヴォールトとp62との間の好ましい相互作用である。
【００４５】
候補化合物は、任意の化合物であってもよく、特にvtRNA又はヴォールトとp62との相互作用の阻害物質又は増強物質として本明細書で上記の化合物から選択される。本発明の第1の態様について本明細書で先になされた各記載は、第2の態様についても同等に適用されるものとする。
【００４６】
第3の態様においては、vtRNA又はヴォールトとp62との相互作用の調節物質の医療用途が提供される。医療において使用するための化合物、又は本発明において記載される調節物質を該被験体に投与する工程を含む、被験体を処置する方法を用いたそのような医療用途が好ましい。したがって、被験体に治療的有効量のヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害物質を投与することを含む、細胞オートファジーの増大／増強により被験体における疾患を処置する方法が提供される。
【００４７】
幾つかの実施形態においては、本発明において処置されるべき疾患は、該疾患により冒された細胞におけるオートファジーの増大から恩恵を受ける病状を有し、例えば細胞成分の病理学的蓄積に関連する疾患である。その増大は、好ましい実施形態においては、vtRNA又はヴォールトとp62との相互作用の上述の阻害物質の1つを使用することにより影響される。そのような阻害物質は、オートファジーを促し、本明細書で使用される「オートファジーを促す」は、細胞又は生物又は患者内のオートファジーの速度が、処置されていないオートファジーの速度と比較して増大することを意味する。本明細書で使用される場合に、「オートファジー関連障害」は、癌、脳卒中、サルコペニア、感染症、免疫系不全症、肝臓疾患、神経変性疾患、及び心障害から選択され、以下で更に詳細に開示する。
【００４８】
本発明は、細胞又は生物におけるオートファジーを調節する新しい方略を提供するので、オートファジーの増大から恩恵を受けるあらゆる障害が、本明細書に開示される処置の対象である。オートファジーと癌から神経変性障害にまでおよぶ様々な障害との関連は、当該技術分野においてよく知られている。オートファジーと神経変性との間の関連性は、例えばTheJournal of Clinical Investigation（第125巻第1号 2015年1月）におけるRebecca A. Frake、ThomasRicketts、Fiona M.Menzies、及びDavid C.Rubinsztein による「Autophagyand neurodegeneration」の参考文献（引用することによりその全体が本出願の一部をなす）において詳細に説明されている。したがって、オートファジーの調節と神経変性疾患の処置との間には当該技術分野において確立された関連性がある。
【００４９】
本発明による阻害物質で処置されるべき好ましい被験体は、神経変性疾患若しくは肝臓疾患を有すると診断された被験体、又は以前の処置に抗療性であった被験体を含む神経変性疾患のための処置がなされた被験体である。
【００５０】
本発明の方法は、あらゆる神経変性疾患の処置のために使用され得る。特定の実施形態においては、上記神経変性疾患は、プロテイノパチー、又はタンパク質フォールディング疾患である。かかるプロテイノパチーの例としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ALS、ハンチントン病、脊髄小脳変性症及び球脊髄性筋萎縮症が挙げられる。他の実施形態において、本発明の方法は任意の神経変性疾患を処置するために使用することができる。本発明の方法で処置可能な神経変性疾患の例としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、ウシ海綿状脳症、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョゼフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、睡眠発作、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性連合性脊髄変性症、シュピールマイヤー−フォークト−シューグレン−バッテン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー病、脊髄癆、及び中毒性脳症が挙げられる。
【００５１】
本発明の方法を必要とする被験体はまた、例えば、肝臓疾患を有すると診断された被験体、又は以前の処置に抗療性であった被験体を含む肝臓疾患のための処置がなされた被験体を含み得る。特定の実施形態においては、上記肝臓疾患は、プロテイノパチー、又はタンパク質フォールディング疾患である。そのようなプロテイノパチーの1つの例は、α1アンチトリプシン欠乏症である。本発明による細胞におけるオートファジーフラックスの増大により処置され得るもう1つの肝臓疾患は、脂肪性肝炎、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）であり、こうして、特にNASHの既知の更なるステージである肝硬変及び肝癌（HCC）の発生が予防される。
【００５２】
本発明の方法を必要とする被験体はまた、例えば、筋肉疾患を有すると診断された被験体、又は以前の処置に抗療性であった被験体を含む筋肉疾患のための処置がなされた被験体を含み得る。特定の実施形態においては、上記筋肉疾患は、プロテイノパチー、又はタンパク質フォールディング疾患である。そのようなプロテイノパチーの例としては、限定されるものではないが、孤発性封入体筋炎（sporadic inclusion body myositis）、肢帯型筋ジストロフィー2B型、及び三好型ミオパチーが挙げられる。
【００５３】
本発明の方法を必要とする被験体はまた、例えば、以前の処置に抗療性であった被験体を含むプロテイノパチーを有すると診断された被験体を含み得る。プロテオパチーの例としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、脳β−アミロイドアンジオパチー、網膜神経節細胞変性、プリオン病（例えばウシ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病、異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症）、タウオパチー（例えば前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症）、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（Iclandic）、CADASIL、アレキサンダー病、セイピノパチー、家族性アミロイド性ニューロパチー、老人性全身性アミロイドーシス、セルピノパチー、ALアミロイドーシス、AAアミロイドーシス、II型糖尿病、大動脈内アミロイドーシス、ApoAIアミロイドーシス、ApoIIアミロイドーシス、ApoAIVアミロイドーシス、フィンランド型の家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎／ミオパチー、白内障、甲状腺髄様癌、心房性アミロイドーシス、下垂体プロラクチノーマ、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、皮膚苔癬アミロイドーシス、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス、肺胞蛋白症、歯原性腫瘍アミロイド（amyloid）、精嚢アミロイド、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、及び重症疾患ミオパチーが挙げられる。
【００５４】
哺乳動物等の複雑な多細胞真核生物における細胞は、正常な生理学的条件下では滅多に栄養失調を経験しない。しかしながら、そのような細胞が栄養失調又は細胞ストレスを受ける場合に、オートファジーがしばしば上方調節され、それにより細胞生存が増強される。それらの素早い成長及び遺伝的不安定性のため、癌細胞は、生存及び成長に関して、非悪性転換細胞よりもオートファジーに依存している（Ding etal.,(2009), Mol. Cancer Ther., 8(7), 2036-2045）。さらに、オートファジーは、化学療法剤により引き起こされる細胞ストレスに応答して癌細胞において生存機構として頻繁に活性化される。したがって、オートファジー阻害物質は、単独で又はその他の癌処置と組み合わせて抗癌治療剤として作用し得る（Maiuri etal., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752、Amaravadi et al, (2007) J. Clin. Invest. 117, 326-336）。しかしながら、幾つかの関連において、オートファジーはまた、特に悪性腫瘍の初期段階においては腫瘍抑制的であり得る。1つの例は、オートファジーの増強物質を使用することによるNASH患者におけるHCCの予防である（上記参照）。オートファジーと癌との間の関連は、「Autophagy inmalignant transformation and cancer progression」Galluzzi L et al. The EMBO Journal (2015) 34, 856-880（それはまた、引用することによりその全体が本出願の一部をなす）に詳細に記載されている。
【００５５】
したがって、オートファジー関連障害としての癌の処置に関連して、癌の予防、又は非常に初期の癌ステージの処置が、本明細書で先に詳細に記載された、オートファジーを増強するvtRNA又はヴォールトとp62との間の相互作用の阻害物質の使用を含むことは好ましい。一方で、末期ステージの癌の処置は、本明細書で先に詳細に記載された、オートファジーを阻害するvtRNA又はヴォールトとp62との間の相互作用の増強物質の使用を含むものとする。
【００５６】
本発明の方法及び組成物／化合物で処置可能な癌としては、限定されるものではないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮に由来する癌細胞が挙げられる。加えて、上記癌は、これらに限定されるものではないが、特に以下の組織型、悪性新生物、癌腫、未分化癌、巨細胞癌及び紡錘形細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、石灰化上皮癌、移行上皮癌、乳頭状移行上皮癌、腺癌、悪性ガストリノーマ、胆管細胞癌、肝細胞癌、混合型肝細胞癌及び胆管細胞癌、索状腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫様ポリープの腺癌、家族性大腸ポリポーシス腺癌、固形癌、悪性カルチノイド腫瘍、細気管支肺胞腺癌（bronchiolo-alveolar adenocarcinoma）、乳頭状腺癌、色素嫌性癌、好酸性癌（acidophilcarcinoma）、好酸性腺癌（oxyphilic adenocarcinoma）、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞腺癌、乳頭状濾胞腺癌、非被包性硬化性癌、副腎皮質癌、子宮内膜癌（endometrioidcarcinoma）、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮膚腺癌、耳垢腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭状嚢胞腺癌、乳頭状漿液嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性腺癌、印環細胞癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、乳房ページェット病、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生随伴腺癌、悪性胸腺腫、悪性卵巣間質腫、悪性莢膜細胞腫、悪性顆粒膜細胞腫、悪性アンドロブラストーマ（androblastoma）、セルトリ細胞腫、悪性ライディッヒ細胞腫、悪性脂質細胞腫（lipid celltumor）、悪性パラガングリオーマ、悪性乳房外パラガングリオーマ、褐色細胞腫、血管球血管肉腫、悪性黒色腫、無色素性黒色腫、表在拡大型黒色腫、巨大色素性母斑内の悪性黒色腫、類上皮細胞黒色腫、悪性青色母斑、肉腫、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児型横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、間質性肉腫、悪性混合腫瘍、ミューラー管混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、悪性間葉腫、悪性ブレナー腫瘍、悪性葉状腫瘍、滑膜肉腫、悪性中皮腫、未分化胚細胞腫、胚性癌腫、悪性奇形腫、悪性卵巣甲状腺腫、絨毛癌、悪性中腎腫、血管肉腫、悪性血管内皮腫、カポジ肉腫、悪性血管外皮腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍骨性骨肉腫、軟骨肉腫、悪性軟骨芽細胞腫、間葉性軟骨肉腫、骨巨細胞腫、ユーイング肉腫、悪性歯原性腫瘍、エナメル上皮歯牙肉腫、悪性エナメル上皮腫、エナメル上皮線維肉腫、悪性松果体腫、脊索腫、悪性神経膠腫、上衣腫、星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、線維性星状細胞腫、星状芽細胞腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、乏突起神経膠芽細胞腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳肉腫、神経節芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、嗅神経腫瘍、悪性髄膜腫、神経線維肉腫、悪性神経鞘腫、悪性顆粒細胞腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、側肉芽腫、悪性小リンパ球性リンパ腫、悪性びまん性大細胞性リンパ腫、悪性濾胞性リンパ腫、菌状息肉腫、その他の非ホジキンリンパ腫、悪性組織球症、多発性骨髄腫、マスト細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞性白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、���球性白血病、マスト細胞白血病、巨核芽球性白血病、骨髄肉腫、及び有毛細胞性白血病であり得る。
【００５７】
特定の実施形態においては、本発明の方法は、本発明の調節物質を、化学療法剤と組み合わせて投与することを含む癌の処置を含む。本発明の方法において使用するためには、あらゆる化学療法剤が、特に癌細胞における細胞ストレスを誘導する化学療法剤が適している。また、癌性障害の処置のために、本発明の調節物質と組み合わせて放射線療法も適用され得る。
【００５８】
本明細書で先に記載された発明によるオートファジーの増強から治療的恩恵を受け得るその他の疾患には、脳卒中、サルコペニア、感染症、免疫系不全症、肝臓疾患、及び心障害が含まれる。
【００５９】
また、候補化合物が細胞におけるオートファジーフラックスの活性化物質であるかどうかを判定するための方法であって、細胞におけるvtRNAの発現を阻害し、上記細胞を上記候補化合物と接触させ、そして上記細胞におけるオートファジーフラックスの変化をモニタリングすることを含み、その際、オートファジーフラックスにおける増大は、該候補化合物がオートファジーフラックスの活性化物質であることを示す、方法が提供される。本発明の本態様において、上記vtRNAは、vtRNA2-1、vtRNA1-1、及びvtRNA1-2から選択され、好ましくはvtRNA1-1である。それぞれの候補化合物は、上記調節物質から選択され、例えば抗体（例えば、コンジュゲート抗体）、タンパク質、ペプチド、小分子、RNA干渉剤、例えばsiRNA分子、LNA、shRNA、miRNA、リボザイム、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド又は構築物である。
【００６０】
もう1つの態様はまた、医療において使用するための、本明細書で先に記載されたヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害物質を提供する。医療的使用は、本明細書で先に詳細に記載されている。
【００６１】
また、別の態様において、ヴォールトRNA（vtRNA）とp62との相互作用の阻害物質又は活性化物質と、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む、医療において使用するための医薬組成物が提供される。本発明のそれぞれの化合物は、本明細書で先に既に記載されており、同様に本発明の医薬組成物が使用され得る医療的使用も記載されている。
【００６２】
幾つかの実施形態においては、本発明の主題の医薬組成物は、送達されるべき1種以上の物質を、治療的有効量の導入される治療剤又はその他の材料を患者に送達するのに十分な量で、予防的処置又は治療的処置の一部として導入することとなる。活性剤の所望の濃度は、薬物の吸収速度、不活性化速度、及び排出速度、並びに化合物の送達速度に依存することとなる。投与量の値は、緩和されるべき状態の重症度によっても変動し得ることに留意すべきである。任意の特定の被験体について、個人の要求、及び上記組成物を投与する人又は上記組成物の投与を監督する人の専門的判断に従って、詳細な投与計画が時間に伴い調整されるべきであると更に理解されるべきである。一般的に、投与は、当業者に知られる技術を使用して決定されることとなる。
【００６３】
対象の作用物質の投与量は、該作用物質の血漿濃度を参照して決定され得る。例えば、最大血漿濃度（Cmax）及び時間0から無限大までの血漿濃度−時間曲線下の面積（AUC（0-4））が使用され得る。本発明のための投与量には、Cmax及びAUC（0-4）に関する上記値を生ずる投与量、並びにそれらのパラメータのより大きい値又はより小さい値をもたらすその他の投与量が含まれる。
【００６４】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式のために望ましい治療応答を、その患者に有毒でないように達成するのに有効な有効成分の量が得られるように変動され得る。
【００６５】
選択される投与量レベルは、使用される特定の作用物質の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度又は代謝速度、処置の期間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物、及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、及び既往歴、並びに医療分野でよく知られた同様の要因を含む様々な要因に依存することとなる。
【００６６】
当該技術分野における通常の知識を有する医師又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、その医師又は獣医師は、上記医薬組成物において使用される本発明の作用物質の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで処方及び／又は投与し、そして所望の効果が達成されるまでその投与量を徐々に増大させることもできる。
【００６７】
以下の図面、配列、及び実施例は、本発明を単に例示することを目的とするものであって、本発明の範囲を、実施例に記載される本発明の具体的な実施形態に制限するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用された全ての参考資料は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】RBPとしてのp62の同定、及びp62に結合されるRNAの分析を示す図である。A．DMOG処置に際して増大及び減少したRNA結合に関するタンパク質のフォールディングの変化を列挙している比較的インタラクトームキャプチャの結果（調整済みp<0.05）。タンパク質に関する全細胞溶解物プロテオミクスデータは、右欄に列挙されている。太字の数字は、有意な変化を示す（調整済みp＜0.05）。N.A.は、検出されないことを示す。B．HuH7細胞を、DMOG又はコントロールで処理し、そしてUV架橋（CL）させるか、又はさせなかった（noCL）。小規模のmRNAインタラクトームキャプチャを実施し、そしてインプット試料及びプルダウン溶出液を、タンパク質レベルに関して分析した。C．UV架橋（CL）された細胞又はコントロール細胞からの溶解物を、RNase Aで処理し、それを使用して免疫沈降に続いてT4ポリヌクレオチドキナーゼ標識を行った。SDS-PAGE後に、そのブロットをフィルム上で一晩曝露し、引き続きそれを使用してウェスタンブロッティングを行った。D．全てのコントロール及びp62のIPからのRNAに対する有意（FDR<0.05）の架橋部位のDEseq2比較。それらの赤色の点は、p62のIPにおいて有意（調整済みp<0.01）に富化された架橋部位である。E．vtRNA1-1転写物配列上に表示されたp62のIPの有意（FDR<0.05）の架橋部位の読取り値（n=3、平均±標準誤差）。予測された二次構造は、そのRNA配列の下に表示されている（点は、一本鎖領域を表し、括弧は、二本鎖領域を表す）。
【図２】p62とRNAとのin vitro及びin vivoの相互作用を示す図である。A．32P-UTP標識されたvtRNA1-1及びMBPタグのみ、MBP-p62、又はPB1ドメインに突然変異を有するMBP-p62を使用したEMSA。B．32P-UTP標識されたvtRNA1-1及びMBP-p62、又はR106E/R107E突然変異を有するMBP-p62を使用したEMSA。C．ヒトp62ドメイン構造の図式（正寸）。D．アミノ酸98〜アミノ酸163の間のヒトp62タンパク質領域の拡大。オーソログタンパク質が下にアライメントされている。ゼブラフィッシュにおける点線領域は、長いペプチドの挿入を表す。リンカー領域及び推定ジンクフィンガー残基が示されている。グレーの斜がかかったペプチドは、RBDmapプロトコルからのN-linkペプチドを表す。突然変異解析のために使用される残基は、下方に太字で示されている。E．野生型形及び突然変異形でp62を発現する親HuH-7細胞又は安定な細胞系統をUV架橋させ、溶解させた。RNase Aで処理された溶解物を使用して、HA免疫沈降に続いてT4ポリヌクレオチドキナーゼ標識を行った。SDS-PAGE後に、そのブロットをフィルム上で一晩曝露し、引き続きそれを使用してウェスタンブロッティングを行った。RK/A(R139A+K141A)、RYK/A(R139A+Y140A+K141A)、RKF(R139A+K141A+F168A)、PB1m(R21A+D69A+D73A)、PB1m+2RE(R21A+D69A+D73A+R106E+R107E)。F．野生型形及び突然変異形でp62を発現するHuH-7細胞又は安定な細胞系統をUV架橋させ、溶解させた。HA抗体を用いて免疫沈降を行った後に、PNK標識、溶出、及びSDS-PAGEを行った。そのブロットをホスホイメージャースクリーンに曝露し、引き続きそれを使用してウェスタンブロッティングを行った。
【図３】オートファジーフラックスに対するvtRNA1-1レベルの効果を示す図である。A．細胞を、siRNA（配列番号1及び配列番号2）で72時間にわたりトランスフェクションさせ、次いで溶解させ、そしてタンパク質レベルについて分析した。B．細胞を、siRNAで72時間にわたりトランスフェクションさせ、トータルRNAを単離し、そしてノーザンブロッティングによって分析した。*は非特異的なバンドを示している。C．細胞を、示された濃度にてLNAオリゴでトランスフェクションさせ、そして48時間後に溶解させた。トータルRNAを単離し、そしてノーザンブロッティングによって分析した。D．細胞を、示された濃度にてLNAオリゴでトランスフェクションさせ、そして48時間後に溶解させた。タンパク質レベルを分析した。E．細胞を、カバーガラスに播種し、そして24時間後に、示されたLNA（50 nM）でトランスフェクションさせた。細胞を更に48時間にわたり増殖させ、固定化し、p62に関して染色し、そして蛍光顕微鏡で分析した。F．細胞を、ev又はvtRNA1-1をコードするプラスミドでトランスフェクションさせ、24時間後に溶解させた。全タンパク質レベルを分析した。G．細胞を、示されたLNAオリゴ（50 nM）及びsiRNA（20 nM）でトランスフェクションさせ、そして48時間にわたりインキュベートした。溶解前に、細胞を新しい完全培地中で1時間にわたりインキュベートし（ctrl）、1時間にわたり血清及びアミノ酸に関して飢餓状態にし（-AA）、又は50 nMのバフィロマイシンA1で5時間にわたり処理した（BafA）。溶解物を、全タンパク質レベルについて分析した。H．細胞を、示されたsiRNAでトランスフェクションさせ、そして72時間後に溶解させた。溶解物を、20000×gで予備清澄化し、そして上清を取り貯めた（S20）。ペレットを再懸濁し、そして引き続き100000×gで遠心分離した。その後に上清（S100）及びペレット（P100）を使用してウェスタンブロッティングを行った。*は非特異的なバンドを示している。
【図４】vtRNA配列のアライメントを示す図である。
【図５】示されたsiRNAで処理されたHuH-7細胞を、空のベクター（ev）又はp62野生型及び変異体（K141A、RK/Aは、R139/K141-アミノ酸を指す）でトランスフェクションさせた。細胞を254 nmのUV-C光に曝露し、溶解させ、それを使用してIPに続いてRNAの放射活性標識及びウェスタンブロッティングを行った。
【図６】vtRNA1-1は、p62を介してオートファジーを調節する。（A）細胞を、示されたvtRNAでトランスフェクションさせ、ビヒクル処理するか、又はBafAにより100 nMで5時間にわたり処理し、次いで溶解させた。溶解物をウェスタンブロッティングにより分析し、そしてLC3B染色の画像を定量化した（n=3、***p<0.005）。（B）細胞を、示されたvtRNAでトランスフェクションさせ、トータルRNAを24時間後に単離し、そしてノーザンブロッティングによって分析した。（C）細胞を、示されたLNAオリゴ及びコントロール又はp62のsiRNAでトランスフェクションさせ、そして48時間にわたりインキュベートした。示されている場合には、細胞をBafAで処理した。溶解物を、示された抗体を用いてウェスタンブロッティングによって分析した。（D）細胞を最少培地中で示された時間にわたり飢餓状態にし、254 nmのUV-C光に曝露し、そして溶解させた。溶解物を使用して、p62のIP及びRNA放射性標識アッセイを行った。SDS-PAGE及び転写の後に、そのメンブレンをフィルム上で一晩曝露し、引き続きそれを使用してウェスタンブロッティングを行った。p62のRNA結合（青線）を、免疫沈降されたタンパク質量に対する放射活性シグナルの比として定量化した。vtRNA1-1レベルを、全溶解物からノーザンブロッティングにより分析し、0時間の飢餓時点に対してプロットした（赤線）。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
配列：
配列番号1：5’-TTAAAGAACTGTCGAA-‘3(vtRNA1-1 #1)
配列番号2：5’-TTAAAGAACTGTCGA-‘3(vtRNA1-1 #3)
配列番号3：ヒトvtRNA1-1
配列番号4：ヒトvtRNA1-2
配列番号5：ヒトvtRNA1-3
配列番号6：ヒトvtRNA2-1
配列番号7〜配列番号14：図2及び図4の配列。
【実施例】
【００７０】
実施例1：DMOGは、PolIII RNA標的へのp62のRNA結合を増大させる。
【００７１】
翻訳後修飾（PTM）はタンパク質の特性及び機能に多大な影響を及ぼすので（Karve and Cheema, 2011）、本発明者らはまずは、RBPのRNA結合活性に対する水酸化の役割を調査することに着手した。この目的のために、ジメチルオキサリルグリシン（DMOG）を、酵素活性のために酸素及び第一鉄と一緒にα−ケトグルタレート（αKG）を必要とするプロリル−ヒドロキシラーゼの阻害物質として使用した。関係する新規RBPを同定するために、比較的mRNAインタラクトームキャプチャを、不活性化されたmTORC1により引き起こされる翻訳シャットダウンによるRBP結合の大きな変化を妨げるために、0.5 mMのDMOGで90分間にわたり処置した細胞で実施した。
【００７２】
全細胞溶解物のプロテオミクスにより、プロテオームにおける大きな変化が示され、その際、mTORC1複合体の主要調節因子又は主要成分は、上位の上方調節されたタンパク質（DDB1、TSC2、LAMTOR1）又は下方調節されたタンパク質（LAMTOR2、PTEN）の中に現れる。比較的インタラクトームキャプチャにより、DMOG処理に際してRNA結合が増加するため、ストレス顆粒形成、mRNA核外輸送、及び分解に関与するRBPが見つけ出され、その一方で、リボソームタンパク質、翻訳因子、及びアミノアシル−シンセターゼは、RNA結合の減少を呈し（図1A）、このRBPにおける動態は、タンパク質合成速度の減少をもたらした。インタラクトームタンパク質ペプチドにおけるペプチド水酸化レベルの調査では、DMOGとコントロール試料との間に差は生じなかったため（示していない）、それらのRBPの相違する結合が、それらのペプチド水酸化動態により影響されていないことを示唆している。
【００７３】
予想外にも、DMOG処置に際してRNA結合において最も顕著な増大を伴うタンパク質は、標的とされるオートファジーの受容体であるセクエストソーム1（p62としても知られる）であった。p62は、プロセスがmTORC1により厳しく制御される重要なオートファジータンパク質であり、p62は、mTORC1自体と複合体を形成すると記載されており（Duran et al., 2011）、それにより本発明者らは、p62の今まで知られていないRNA結合機能を更に調査するに至った。
【００７４】
DMOG処理されたHuh-7細胞からのmRNAインタラクトームキャプチャ溶出液におけるp62のRNA結合の増大は、直接的なウェスタンブロッティングによって確認することができた（図1B）。重要なことには、DMOGは、よく知られた凝集しやすいRBPであるTDP43のRNA結合における変化を誘導しなかった（示していない）。次に、細胞を254 nmのUVで架橋し（UV-CL）、RNA-タンパク質相互作用を共有結合的に保持し、次いで内因性p62を免疫沈降（IP）させ、RNAの5'末端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）を用いて蛍光体標識した（図1C）。重要なことには、p62-RNA複合体は、SDS-PAGEゲル中でRNaseの濃縮前処理に応じて上方に移動したため、RNAがリン酸化されていることが確認された。本発明者らは、同様に外因的に発現されたFLAG-p62を用いてPNK標識アッセイを繰り返した（示していない）。
【００７５】
p62のRNA標的を同定するために、RNA-タンパク質接触（架橋部位、CS）のヌクレオチド分解能での同定を可能にするiCLIP（Konig et al., 2010）を使用した。2種のp62抗体（マウスモノクローナル及びウサギポリクローナル）、空のビーズ、及び各々のアイソタイプコントロールを使用し、そしてプロテオミクスにより、p62が実際に、RNA依存性蛍光体シグナルを引き起こす精製された主要タンパク質であることが確認された。次に、本発明者らは、DMOG又はDMSOのみで処理された細胞からのp62のIP、PNK標識されたRNA-タンパク質複合体を進め、高RNase処理されたIPと引き続いてのウェスタンブロッティングにおいて精製された複合体でのp62のアイデンティティを確認した。cDNAの製造、シーケンシング、ヒトゲノムへのユニークなマッピング、フィルタリング、及び統計学的検定の後に、1998個のCS（約106個の全CSのうち）が、コントロールよりもp62試料中に豊富に見出された（図1D）。これらの部位は、大抵はtRNA及びtRNA偽遺伝子中にマッピングされた。かなりのp62の多数のマッピングされたリード（n=5221）からのCSは、5SrRNA、Y-RNA、U1 RNA、及びU6 RNAに分類された。興味深いことに、CSは、幾つかのスプライシングされていないtRNAの一次RNA転写物中にも同定されたので、p62のRNAへの結合が、核内で、恐らくPolIII転写の近くで起こっていることを示している。p62と相互作用するRNAを富化スコアに基づいて格付けするために、本発明者らは、結合されたRNA種の長さに対する定性的なCS密度を計算した。これにより、4種のヴォールトRNAのうちの3種（vtRNA2-1、vtRNA1-1、vtRNA1-2）が、上位の富化されたp62と相互作用するRNAの中にあることが指摘された（図1E）。最後に、p62のIPにおけるCSの定量的計数の比較により、DMOG処理に際してリード値の減少とともにCSが、上述のvtRNA中にもほとんど位置していないことが指摘された（図1E）。
【００７６】
ヴォールトRNAの5’配列及び3’配列は高度に保存されているとともに、末端ステムループ領域を形成し、その一方で、中央ドメインは、4種全てのvtRNAパラログの間で異なっている（Stadler et al., 2009）。vtRNA上のp62結合部位を調査し、そしてp62はvtRNA種の中央ドメインにおける一本鎖ループ領域に優先的に結合するが、明らかな配列特異性を有さないことに留意した（図1E）。重要なことには、オリゴ-dTフラクションにおいて同時精製されたvtRNAが観察されたので、PolIII標的に主として結合するにもかかわらず、オリゴ-dTに媒介されるインタラクトームキャプチャにp62が現れた理由が説明されるかもしれない。
【００７７】
これらの結果は、DMOG処理に際してRNA結合を増大させ、vtRNAを含むPolIIIで転写される一連の限られたRNAに結合するRNA結合性タンパク質としてp62が確立することを示す。
【００７８】
実施例2：vtRNA1-1は、p62オリゴマー化に影響を及ぼす。
【００７９】
全てのヴォールトRNAがヴォールト粒子に会合して見出され得るというそれらの発見及び認識以来（Nandy et al., 2009）、最も研究されたヴォールトRNAは、特にγ−ヘルペスウイルス感染に関連したvtRNA1-1である（Amort et al., 2015）。電気移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いることで、RNA-タンパク質相互作用が、放射活性標識されたvtRNA1-1及びMBPタグ付けされたp62を使用してin vitroで再現された。vtRNA1-1はMBPタグ付けされたp62と相互作用するが、MBPタグのみ（図2A）とは相互作用せず、そしてこの相互作用は非標識のvtRNA1-1の特異的な競合を受けやすいことが観察された（示していない）。MBP_p62-vtRNA1-1複合体の見掛けのKdは、60 nMの範囲であった。RNA-タンパク質複合体のシグナルは、p62の推測されるpIが5.1であり、かつEMSAのためのTBEバッファー（pH8.3）を使用したにもかかわらず、EMSAゲル中のウェルの直下であることが確認された。
【００８０】
p62タンパク質は、多様な機能を有するドメイン及びモチーフを含む（Stolz et al., 2014）。PB1ドメインは、p62のオリゴマー化に関与しており、LIR-モチーフは、GABARAB/LC-3への結合の役割を果たし、KIRモチーフは、KEAP1との相互作用に関与しており（Komatsu et al., 2010）、UBAドメインは、ポリユビキチンへの結合に関与しているが、一方で、変質したジンクフィンガーであるZZ-ドメインは、RIP-1と相互作用することが示された、まだあまり特徴付けられていないドメインであった（Sanz et al., 1999）。さらに、p62は、2つの核局在化シグナルと、核外搬出配列とを有する（Pankiv et al., 2010）（図2C）。
【００８１】
本発明者らは、vtRNA1-1がp62とのより高次の複合体の形成を、恐らくPB1ドメインを介してオリゴマー化を誘導することで、該複合体がゲル中に分解しないようにすることによって誘導するという仮説を立てた。それにもかかわらず、重合特性を無効にするPB1ドメイン中の重要な残基の突然変異（R21A、D69A、D73A）を有するp62変異体も、同様のnM範囲においてvtRNA1-1と複合体を形成し、そしてゲルのウェルの下方に蓄積した（図2A）。このことにより、vtRNA1-1が、PB1ドメインとの相互作用とは別の手段によりp62のより高次の構造に作用し得ることが示唆された。以前に、PB1とZZ-ドメインとの間のリンカー領域が、p62多量体−フィラメントを安定化する重要な役割を担うことがin vitroで示された（Ciuffa et al., 2015）。興味深いことに、フィラメント形成を妨げる領域における二重のアルギニン突然変異（R106E、R107E）（Ciuffaet al., 2015）もまたvtRNA1-1のp62への結合を著しく減少させたので（図2B）、上記リンカー領域がin vitroではRNA結合に寄与し得ることが示唆された。
【００８２】
p62においてRNA結合残基（複数の場合もある）をマッピングするために（図2C）、本発明者らは、RBDmapプロトコルを使用した（Castello et al.）。簡潔には、ポリA+RNAに架橋されたインタラクトームキャプチャのタンパク質を、低頻度のプロテアーゼ（LysC）開裂に供し、オリゴ-dTビーズにより2回富化した。RNAに架橋されたペプチドをトリプシンにより更に消化し、MSで分析した。RNAに架橋されたペプチドが予測不可能な質量シフトのため同定することができない場合に、隣接ペプチド（N-link）が、RNAに結合された残基の近接を示す（Castello et al.）。p62のN-linkペプチドは、ZZ-ドメインに分類され（図2D）、そのドメインは、CCCC残基及びCCHH残基を介して亜鉛原子を収容すると予測される。したがって、本発明者らは、FLAG-HAタグ付けされたp62の変異体の発現に続いてUV架橋、IP、及びPNK標識を行うことによって、N-linkペプチドの近位及び遠位にある潜在的なRNA結合性アミノ酸残基のアラニン突然変異のアレイを試験した。プラスミドのトランスフェクションをベースとするアッセイにより、RYK-モチーフからの残基R139及びK141が、RNA結合に関与し得ることが示された。このモチーフは、ウシガエルからヒトまで保存されており、ホモロジーモデリングは、ZZ-ドメインの外部の残基R139及びK141を「アライメントされた」順序で予測し、それにより、結合されたRNAと接触させるためのプラットフォームを形成することができた。内因性のp62が外因的に発現された突然変異p62とヘテロ多量体化する場合に、それはIP-PNK標識の後のシグナル評価を妨害し得る。本発明者らは、誘導可能な安定な細胞系統を調製し、IP-PNK標識を繰り返した（図2E）。これにより突然変異K141Aが、せいぜいp62とRNAとの結合を減少させる突然変異であると示された。次に、p62フィラメント形成とRNA結合との関連性を、安定な誘導可能な細胞系統を使用してIP-PNKアッセイによりin vivoで調査した。PB1ドメインの突然変異は、p62のRNA結合を無効にしなかったが、2RE突然変異は、in vitroデータとは対照的に、野生型又はPB1ドメイン突然変異のいずれと組み合わせても、p62のRNA結合に作用しなかった（図2E）。これは、in vivoでPTMに供されたp62による異なる様式のRNA結合、又はin vitroで繰り返すことができないRNP複合体特性を表し得る。
【００８３】
p62の多量体化は、PAGEでのp62のより大きな分子量のバンドの形成（ダブレット、トリプレット等）、及びスタッキングゲル中での凝集として観察され得る（Cha-Molstad et al., 2015）。これらの多量体は、UV-CLが適用された場合に顕著となる（示していない）。予想通り、多量体は、p62のPB1突然変異体が使用される場合には形成されなかったが、p62のK141A突然変異体が使用される場合に野生型と比較して顕著であった（図2F）。これは、単量体単位のRNA結合とは逆相関しているので（図2F）、RNA結合に欠陥のあるp62は、PB1ドメインを介した多量体化をより受けやすいことを示唆している。
【００８４】
p62タンパク質の残基K141及びR139がRNAとの相互作用に関与していることを更に示すために、本発明者らは、図5に示される実験を行った。最初に、コントロール又はp62ノックダウンを、siRNAを使用して実施した。次に、該細胞を、空のベクタープラスミド、又はそれぞれ野生型タンパク質若しくは変異体p62タンパク質をコードするプラスミドのいずれかでトランスフェクションさせた。その後に、免疫沈降及びT4 PNK標識を実施することで、p62のRNA結合を評価した。図5の右上のパネルに認められるように、残基K141のアラニンへの突然変異は、p62のRNA結合を減少させ、それはK141A/R139Aの二重突然変異により更に顕著になった。
【００８５】
したがって、vtRNA1-1は、p62のより高次の形成に影響を及ぼすが、それは、その多量体化特性を調節すること、及びPB1とZZ-ドメインとの間に位置するリンカー領域の寄与により「より低次の複合体」を誘導することによるものである。
【００８６】
実施例3：vtRNA1-1レベルは、p62-依存性オートファジーフラックスを調節する。
【００８７】
p62は、標的とされるオートファジー過程に機能を有するので、本発明者らは最初に、そのRNA結合活性が、酵母において記載されるリボファジー経路（Kraftet al., 2008）と同様に「RNA-ファジー」経路への関与を表し得ることを仮定した。これを試験するために、本発明者らは、タンパク質siRNAノックダウン（KD）の後にノーザンブロットを使用してvtRNAレベルを評価した。p62に続いて、本発明者らは、vtRNAの安定化のために必要とされるTEP1（Kickhoefer et al., 2001）と同様に、vtRNAと直接的に相互作用しないヴォールトの構造成分であるMVPもノックダウンさせた。p62のKD（図3A）は、vtRNA1-1の定常状態レベルの減少をもたらし、vtRNA1-2のより低い程度への減少をもたらす一方で、vtRNA1-3及びvtRNA2-1、又はコントロールのtRNALys及び5S rRNAは、影響がないように見えた（図4B）。予想通り、TEP1のKDは、vtRNA1-3を除く全てのvtRNA種の安定性に影響を及ぼすが、Scr又はMVPのKDは、vtRNAレベルに影響を及ぼさなかった（図3B）。このように、p62は、vtRNAの分解のために必要ではない。
【００８８】
本発明者らは次いで、vtRNA1-1に着目し、そのLNAを使用したKDが、恐らくヴォールト複合体におけるこれらの成分の相互作用により、TEP1及びMVPタンパク質レベルにおける減少をもたらすことを観察した（図3C、図3D）。興味深いことに、vtRNA1-1の減損もまたp62レベルにおける減少と、顕著なLC3B結合とをもたらし（図3C、図3D）、そしてp62斑点の形成の増加をもたらしたので（図3E）、オートファジーフラックスの増大が示唆される。反対に、本発明者らは、誘導可能なH1プロモーターを有するプラスミドによるvtRNA1-1の過剰発現により、p62レベルの増大と、LC3B結合の顕著な減少とをもたらして、細胞中のオートファジーフラックスを調べた（図3F）。vtRNA1-1過剰発現はまた、より低い程度ではあるが、LC3B結合により測定されるLNAのKD表現型を逆転させることができた。これらの実験により、vtRNA1-1のレベルが基本的なオートファジーフラックスに影響を及ぼすことが示唆された。
【００８９】
次に本発明者らは、vtRNA1-1のオートファジーに対する影響がp62に依存するかどうかを調査した。p62及びvtRNA1-1の同時のKDは、ScrsiRNAで処理された試料と比較して、LC3Bに対する結合作用を減少させた（図3G）。バフィロマイシンA1処理は、negA処理された細胞とvtRNA1-1 LNA処理された細胞との間で、結合されたLC3Bレベルにおける差異を示さなかったので、vtRNA1-1がオートファゴソームのターンオーバー段階でオートファジーに影響を及ぼさないことが指摘される（図3G）。このように、vtRNA1-1は、p62を介したオートファジーフラックスへのその作用を媒介する。
【００９０】
vtRNA1-1は、ヴォールト粒子の必須の成分であり、そのKDは、同様にMVPのレベルに影響を及ぼした（図3D、図3Gを参照）。それにもかかわらず、vtRNA1-1の約20%だけしかヴォールトと会合しない一方で、残りは遊離の細胞質中にあることが報告された（Nandy et al., 2009）。したがって、本発明者らは、100000 gの遠心分離を使用してp62、TEP1又はMVP siRNAで処理された細胞からヴォールトを単離し、ヴォールトがTEP1及びp62欠損細胞においても形成されることを観察した（図3H）。また、TEP1の大部分はヴォールトと会合しないので（図3H）、vtRNA1-1-TEP1複合体のヴォールト粒子の外側での機能について示唆される。
【００９１】
実施例4：vtRNA1-1は、オートファジーを特異的に調節する。
【００９２】
p62に媒介されるオートファジーにおけるヴォールトRNA1-1の調節能力がその他のヴォールトRNAによっても観察されるか、又はvtRNA1-1に特異的なものであるかどうかを評価するために、本発明者らは、細胞をそれぞれコントロールプラスミド又は種々のヴォールトRNAをコードするプラスミドでトランスフェクションさせ、そしてオートファジーをLC3B結合の調査によりアッセイした。図6Aは、LC3B結合がヴォールトRNA1-1の過剰発現により大幅に影響されるが、その他のヴォールトRNAによっては影響されない幾つかの独立した実験の定量化を示している。バフィロマイシンA1での処理に際して、LC3B結合比が回復されたことは重要であり、それにより、結合過程における欠陥ではなく、オートファジーフラックスにおける制限が示された。過剰発現されたヴォールトRNAのレベルを制御するために、本発明者らは、トランスフェクションされた細胞からトータルRNAを単離し、それらのレベルを図6Bに示されるようにノーザンブロッティングにより調査した。
【００９３】
実施例5：p62は、ヴォールトRNA1-1に媒介されるオートファジーに対する作用のために必要とされる。
【００９４】
ヴォールトRNA1-1のオートファジーに対する作用がp62により媒介されることを示すために、本発明者らは、コントロール又はp62のsiRNAのトランスフェクションを、コントロール又はヴォールトRNA1-1のLNAに媒介されるノックダウンと組み合わせて使用した。その一方で、LNAノックダウン細胞を、バフィロマイシンA1で処理した。図6Cは、LNAに媒介されるノックダウンが、p62レベルにおける減少及びLC3B結合の増大により観察されるように、オートファジーに影響を及ぼすことを示している（レーン1及びレーン2の比較）。次に、p62の除去は、LC3B結合に対するヴォールトRNAノックダウンの効果を低下させるので（レーン2及びレーン4の比較）、p62がヴォールトRNA1-1に媒介されるオートファジーに対する作用のために必要とされることが確認された。最後に、バフィロマイシンA1での処理により、LC3B-I種及びLC3B-II種の間の相対レベルが回復されるので（レーン5及びレーン6の比較）、ヴォールトRNA1-1が、オートファゴソーム−リソソーム融合（fusion）を阻害せず、むしろオートファジーフラックスを増大させることが確認された。
【００９５】
実施例6：RNA結合は、オートファジーにおけるp62の役割に関与している。
【００９６】
p62のRNA結合及びオートファジーにおけるその役割の間の関連性を確証するために、本発明者らは、細胞を飢餓状態にさせ、p62免疫沈降物のT4 PNK標識によりp62のRNA結合をアッセイした。図6Dに示されるこの実験により、オートファジーの過程の間に、p62が細胞質ゾルのカーゴの除去に積極的に寄与する場合に、そのRNA結合は徐々に減少することが示された。これにより、p62のRNA結合活性とそのオートファジー能力との間の逆の関連性が確証された。次に、本発明者らは、飢餓の過程においてヴォールトRNA1-1のレベルを調査し、こうして、ヴォールトRNA1-1のレベルが徐々に減少することが確認された（図6D）。この実験により、飢餓がp62阻害物質（ヴォールトRNA1-1）の除去を引き起こし、そしてヴォールトRNA1-1のレベルとp62のRNA結合との間に因果関係を確立することが示された。
【００９７】
まとめると、p62のRNA結合はヴォールトRNA又はヴォールトのオートファジークリアランスのために必要とされず、むしろvtRNA1-1は、オートファゴソーム−リソソーム融合の前にp62を介してオートファジーフラックスの負の調節因子として働く。さらに、ヴォールトの除去もオートファジーに影響を及ぼす。
【００９８】
参考文献
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【符号の説明】
【００９９】
図面訳
図1A
Gene symbol  遺伝子記号
Protein name  タンパク質名
fold change  フォールディングの変化
p. adj  調整済みp
Increased  増大
Decreas ead  減少（正：Decreased）
Sequestosome-1  セクエストソーム-1
Translin-associatedprotein X  トランスリン関連タンパク質X
Translin  トランスリン
La-related protein 1  La-関連タンパク質1
Enhancer of mRNA-decappingprotein 3  mRNA-デキャッピングタンパク質3のエンハンサー
Obscurin-like protein 1  オブスキュリン様タンパク質1
Src substrate cortactin  Src基質コルタクチン
ATP-dependent RNAhelicase DDX19A  ATP依存性RNAヘリカーゼDDX19A
Calmodulin-like protein5  カルモジュリン様タンパク質5
Gem-associated protein 5  Gem関連タンパク質5
ATP-binding cassettesub-family A member 1  ATP結合カセットサブファミリーAメンバー1
40S ribosomal protein S15a  40Sリボソームタンパク質S 15a
Pumiliodomain-containing protein C14orf21  プミリオドメイン含有タンパク質C14orf21
Tyrosine-tRNA ligase,mitochondrial  チロシン-tRNAリガーゼ、ミトコンドリア
Peroxiredoxin-5  ペルオキシレドキシン-5
60S ribosomal protein L9  60Sリボソームタンパク質L9
ATP-binding cassettesub-family F member 3  ATP結合カセットサブファミリーFメンバー3
40S ribosomal protein S9  40Sリボソームタンパク質S9
tRNA(adenine-N(1)-)-methyltransferase  tRNA（アデニン-N（1）-）メチルトランスフェラーゼ
図1B
% input  %インプット
pulldown  プルダウン
図1C
autoradiograph  オートラジオグラフ
beads  ビーズ
input  インプット
図1D
control IPs vs. p62 IPs  コントロールのIP対p62のIP
-log10 p value  -log10のp値
log2 fold enrichment  log2倍の富化
図1E
mean read value ofiCOUNT crosslink sites  iCOUNT架橋部位の平均読取り値
図2A
protein  タンパク質
図2B
protein  タンパク質
図2D
linker region  リンカー領域
zinc cluster 1  ジンククラスター1
zinc cluster 2  ジンククラスター2
HUMAN  ヒト
MOUSE  マウス
BULLFROG  ウシガエル
ZEBRAFISH  ゼブラフィッシュ
図2E
input  インプット
phosphorimage  ホスホイメージ
図2F
phosphorimage  ホスホイメージ
short exp  短い曝露
long exp  長い曝露
図3A
none  なし
図3B
none  なし
blot 1  ブロット1
blot 2  ブロット2
図5
input  インプット
図6A
LC3B-II/LC3B-I ratio  LC3B-II/LC3B-I比
図6C
condition  条件
lane  レーン
図6D
relative phosphor signalnormalized to IP yield  IP収率に正規化された相対蛍光シグナル
starv. (h)  飢餓（時間）
vtRNA1-1 levels  vtRNA1-1レベル
【図１】
2019524078.tif 000002
【図２】
2019524078.tif 000003
【図３】
2019524078.tif 000004
【図４】
2019524078.tif 000005
【図５】
2019524078.tif 000006
【図６】
2019524078.tif 000007
【配列表】
2019524078000001.app
【国際調査報告】
2019524078.tif 000008
2019524078.tif 000009
2019524078.tif 000010