(57)【要約】  本発明は、アゴニズム及びエフェクター機能が増強した、改変抗体及び他のＦｃドメイン含有分子に関する。
2019533427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された改変抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーの抗体であって、前記抗体は、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体は、前記野生型の親抗体と比較して増強したアゴニスト活性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記Ｔ４３７Ｒ変異を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を介在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体は、第２の変異を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記第２の変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＮ２９７Ａ変異、ＩｇＧ２のＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記第２の変異は、前記ＩｇＧ２のＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記第２の変異は、前記ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記第２の変異は、前記ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、抗体架橋とは無関係なアゴニスト活性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、配列番号：６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４の重鎖定常領域を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、及び製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
対象における、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強させる方法であって、前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を準備することと、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｋ２４８Ｅ変異、Ｋ３３８Ａ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を前記抗体に導入して、前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する改変抗体を生成することと、前記改変抗体を前記対象に投与することとを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、又はＣＤＣを介在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体は、第２の変異を更に含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＮ２９７Ａ変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の変異は、前記ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の変異は、前記ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の変異は、前記ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体は、配列番号：６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４の重鎖定常領域を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象は癌を有する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌は充実性腫瘍である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記充実性腫瘍は、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頚癌、又は癌の転移性病変である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）である、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
対象における癌の治療方法であって、前記対象に、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含むＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する抗体（残基番号は、ＥＵインデックスに従う）を、前記癌を治療するのに十分な時間、投与することを含む、前記方法。
【請求項３２】
前記抗体はＴ３４７Ｒ変異を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体は、親抗体と比較して増強したアゴニスト活性を有する、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体は、第２の変異を更に含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＮ２９７Ａ変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体は、配列番号：６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４の重鎖定常領域を含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌は、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頚癌、又は癌の転移性病変である、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＮＦＲファミリーの受容体は、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）である、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離されたＦｃドメイン含有分子であって、前記ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、前記Ｆｃドメイン含有分子。
【請求項４２】
前記Ｔ４３７Ｒ変異を含む、請求項４１に記載のＦｃドメイン含有分子。
【請求項４３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む、請求項４１に記載のＦｃドメイン含有分子。
【請求項４４】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、請求項４１に記載のＦｃドメイン含有分子。
【請求項４５】
前記ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のＦｃドメイン含有分子。
【請求項４６】
前記Ｆｃドメイン含有分子はモノクローナル抗体である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のＦｃドメイン含有分子。
【請求項４７】
配列番号：６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載のＦｃドメイン含有分子。
【請求項４８】
単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ．Ｆｃドメイン含有分子であって、前記ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含むＦｃドメイン含有分子をコードする、
ｂ．配列番号：６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のＦｃドメインをコードする、又は
ｃ．配列番号：７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、又は８６のポリヌクレオチド配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５０】
発現ベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項４９又は５０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
前記Ｆｃドメイン含有分子が発現する条件で、請求項５１に記載の宿主細胞を培養することと、前記Ｆｃドメイン含有分子を単離することとを含む、請求項４１に記載のＦｃドメイン含有分子の作製方法。
【請求項５３】
野生型の親抗体と比較してＴ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、癌の治療に使用するための、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体。
【請求項５４】
前記癌は、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頚癌、又は癌の転移性病変である、前記癌の治療に使用するための、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
癌の治療のための薬剤の製造における、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体の使用。
【請求項５６】
前記癌は、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頚癌、又は癌の転移性病変である、請求項３５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される配列表を含み、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。２０１７年６月２６日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルは、ファイル名がＪＢＩ５０９４ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは２０５キロバイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アゴニズム及びエフェクター機能が増強した、改変抗体及び他のＦｃドメイン含有分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
所望の治療応答を達成するために、目的の抗体及び他のＦｃドメイン含有分子を改変して適合させることには、例えば、抗体エフェクター機能、半減期、及び安定性を調節するための、Ｆｃドメイン改変アプローチが含まれる。更に、抗体結合腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーなどの、特定の種類の分子に対し、アゴニズムを誘導して抗腫瘍免疫効果を刺激する改変アプローチが開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗体及び他のＦｃドメイン含有治療用構築物の、Ｆｃドメイン介在性機能を調節するための、更なる改変アプローチが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、単離された、改変抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーの抗体であって、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、抗体を提供する。
【０００６】
本発明は、Ｔ４３７Ｒ変異を含む、単離された改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体もまた提供する。
【０００７】
本発明は、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む、単離された改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体もまた提供する。
【０００８】
本発明は、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、単離された改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体もまた提供する。
【０００９】
本発明は、本発明の抗体及び製薬上許容できる担体を含む医薬組成物もまた提供する。
【００１０】
本発明は、対象における、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニスト活性を増強させる方法であって、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を準備することと、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｋ２４８Ｅ変異、Ｋ３３８Ａ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する改変抗体を生成することと、改変抗体を対象に投与することとを含む、方法もまた提供する。
【００１１】
本発明は、対象における癌の治療方法であって、対象に、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含むＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する抗体を、癌を治療するのに十分な時間投与することを含む、方法もまた提供する。
【００１２】
本発明は、ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ変異を含む、単離されたＦｃドメイン含有分子もまた提供する。
【００１３】
本発明は、ＦｃドメインにＫ３３８Ａ変異を含む、単離されたＦｃドメイン含有分子もまた提供する。
【００１４】
本発明は、ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む、単離されたＦｃドメイン含有分子もまた提供する。
【００１５】
本発明は、ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、単離されたＦｃドメイン含有分子もまた提供する。
【００１６】
本発明は、ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、Ｆｃドメイン含有分子をコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【００１７】
本発明は、配列番号：６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のＦｃドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【００１８】
本発明は、配列番号：７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、又は８６のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【００１９】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクターもまた提供する。
【００２０】
また、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２１】
本発明は、Ｆｃドメイン含有分子が発現する条件で、本発明の宿主細胞を培養することと、Ｆｃドメイン含有分子を単離することとを含む、本発明のＦｃドメイン含有分子の作製方法もまた提供する。
【００２２】
本発明は、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、癌治療に使用するための、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体もまた提供する。
【００２３】
本発明は、癌治療のための薬剤の製造における、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体の使用もまた提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】多量体モデル内のＣＨ３ドメインのアラインメント後にそれぞれのＣＨ２ドメインの衝突を示す、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（タンパク質データバンクエントリー３ＡＶＥ）の結晶構造に由来する２つの半分のＦｃ分子（黒色及びライトグレー）の図である。
【図２Ａ】単一変異した抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ３３８Ａの、溶液中でのアゴニスト活性の図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図２Ｂ】単一変異した抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ３３８ＡにＤａｕｄｉ細胞により架橋させた際の、アゴニスト活性の図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図２Ｃ】ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ及びＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１に関して二重変異した抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ、及びＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ／Ｋ３３８Ａの、溶液中でのアゴニスト活性の図である。アゴニズムは、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図２Ｄ】Ｄａｕｄｉ細胞による架橋によりＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅのアゴニスト活性が増強されることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図２Ｅ】Ｄａｕｄｉ細胞による架橋によりＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａのアゴニスト活性が増強されることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図２Ｆ】Ｄａｕｄｉ細胞による架橋によりＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１のアゴニスト活性が増強されることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図２Ｇ】Ｄａｕｄｉ細胞による架橋によりＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒのアゴニスト活性が増強されることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図３Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１の、溶液中でのアゴニスト活性の図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図３Ｂ】Ｄａｕｄｉ細胞による架橋によりＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒのアゴニスト活性が増強されることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図３Ｃ】Ｄａｕｄｉ細胞による架橋によりＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅのアゴニスト活性が増強されることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図４Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒのアゴニスト活性が、ＦｃγＲＩＩＢに依存して、架橋により更に増強されることを示す図である。増強は、抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６により阻害された。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図４Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅのアゴニスト活性が、ＦｃγＲＩＩＢに依存して、架橋により更に増強されることを示す図である。増強は、抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６により阻害された。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図５】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８ＥのＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）ＰＰＩアッセイより得られた、補正生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の図であり、ＯＸ４０発現細胞の表面における、抗体多量体化の程度を示す。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度にわたる、補正ＮａｎｏＢＲＥＴ比率の上昇を示し、細胞表面における抗体の会合を示す。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒに対する、補正ＮａｎｏＢＲＥＴ比率は、バックグラウンドレベルであった。ｎ＝Ｎａｎｏｌｕｃにコンジュゲートした抗体。ｈ＝Ｈａｌｏｔａｇにコンジュゲートした抗体。
【図６】Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異が、Ｆｃサイレント抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ４ＰＡＡでのアゴニズムをレスキューすることを示す図である。アゴニズムは、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価した。
【図７】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して増大した力価でＡＤＣＣを介在することを示す図である。Ｙ軸は、抗体を含まない試料に対して、ＡＤＣＣ活性の活性化が何倍であるかを示す。
【図８】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅが、同レベルでＡＤＣＰを介在することを示す図である。Ｙ軸は、殺傷された細胞の百分率（％）を示す。
【図９Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅが、ＣＤＣを増強させたことを示す図である。Ｙ軸は、細胞傷害の百分率（％）を示す。
【図９Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａと比較して増大した力価でＡＤＣＰを介在することを示す図である。Ｙ軸は、殺傷された細胞の百分率（％）を示す。
【図１０】記載の抗体を投与したＴｇ３２ヘミ接合マウスのＰＫプロファイルを示す図である。データは、曲線の線形（β）位相の最初の時点に対して正規化し、体重１ｋｇあたり２ｍｇのボーラス投与の後の、投与に対する最大濃度（％）として表現した。レベルが検出限界未満であったことから、３群の１４日目及び２１日目の血清濃度は示さない。各データ点は、１群当たり５匹の動物の、平均±標準誤差を示す。
【図１１】記載の抗体を投与したＴｇ３２ホモ接合ＳＣＩＤマウスのＰＫプロファイルを示す図である。半減期の値であるｔ1/2を、以下のとおりに推定した：ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ：ｔ1/2＝９．５±０．７ｄ；ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ：ｔ1/2＝８．３±０．５ｄ；ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１：ｔ1/2＝９．２±０．６ｄ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。
【００２６】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２７】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
【００２８】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【００２９】
「抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体」、又は抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する抗体を意味する。
【００３０】
「ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー」は、表１に示す受容体を含む、自然発生するＴＮＦＲ多様体を含む、ＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体を含む。ＴＮＦＲは通常、Ｉ型膜貫通タンパク質として発現し、細胞外ドメインに、１〜６個のシステインリッチなドメインを含有する。シグナル伝達は、ＴＮＦＲ三量体として発生する。各ＴＮＦＲの１個のアイソフォームに対するアミノ酸配列を、表１に示す。特定のＴＮＦＲのリガンドもまた、表１に示す。
【００３１】
【表１】
2019533427.tif 000003
【００３２】
配列番号１
ＭＧＬＳＴＶＰＤＬＬＬＰＬＶＬＬＥＬＬＶＧＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＧＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＣＳＮＣＫＫＳＬＥＣＴＫＬＣＬＰＱＩＥＮＶＫＧＴＥＤＳＧＴＴＶＬＬＰＬＶＩＦＦＧＬＣＬＬＳＬＬＦＩＧＬＭＹＲＹＱＲＷＫＳＫＬＹＳＩＶＣＧＫＳＴＰＥＫＥＧＥＬＥＧＴＴＴＫＰＬＡＰＮＰＳＦＳＰＴＰＧＦＴＰＴＬＧＦＳＰＶＰＳＳＴＦＴＳＳＳＴＹＴＰＧＤＣＰＮＦＡＡＰＲＲＥＶＡＰＰＹＱＧＡＤＰＩＬＡＴＡＬＡＳＤＰＩＰＮＰＬＱＫＷＥＤＳＡＨＫＰＱＳＬＤＴＤＤＰＡＴＬＹＡＶＶＥＮＶＰＰＬＲＷＫＥＦＶＲＲＬＧＬＳＤＨＥＩＤＲＬＥＬＱＮＧＲＣＬＲＥＡＱＹＳＭＬＡＴＷＲＲＲＴＰＲＲＥＡＴＬＥＬＬＧＲＶＬＲＤＭＤＬＬＧＣＬＥＤＩＥＥＡＬＣＧＰＡＡＬＰＰＡＰＳＬＬＲ
【００３３】
配列番号：２
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＦＡＬＰＶＧＬＩＶＧＶＴＡＬＧＬＬＩＩＧＶＶＮＣＶＩＭＴＱＶＫＫＫＰＬＣＬＱＲＥＡＫＶＰＨＬＰＡＤＫＡＲＧＴＱＧＰＥＱＱＨＬＬＩＴＡＰＳＳＳＳＳＳＬＥＳＳＡＳＡＬＤＲＲＡＰＴＲＮＱＰＱＡＰＧＶＥＡＳＧＡＧＥＡＲＡＳＴＧＳＳＤＳＳＰＧＧＨＧＴＱＶＮＶＴＣＩＶＮＶＣＳＳＳＤＨＳＳＱＣＳＳＱＡＳＳＴＭＧＤＴＤＳＳＰＳＥＳＰＫＤＥＱＶＰＦＳＫＥＥＣＡＦＲＳＱＬＥＴＰＥＴＬＬＧＳＴＥＥＫＰＬＰＬＧＶＰＤＡＧＭＫＰＳ
【００３４】
配列番号：３
ＭＬＧＬＲＰＰＬＬＡＬＶＧＬＬＳＬＧＣＶＬＳＱＥＣＴＫＦＫＶＳＳＣＲＥＣＩＥＳＧＰＧＣＴＷＣＱＫＬＮＦＴＧＰＧＤＰＤＳＩＲＣＤＴＲＰＱＬＬＭＲＧＣＡＡＤＤＩＭＤＰＴＳＬＡＥＴＱＥＤＨＮＧＧＱＫＱＬＳＰＱＫＶＴＬＹＬＲＰＧＱＡＡＡＦＮＶＴＦＲＲＡＫＧＹＰＩＤＬＹＹＬＭＤＬＳＹＳＭＬＤＤＬＲＮＶＫＫＬＧＧＤＬＬＲＡＬＮＥＩＴＥＳＧＲＩＧＦＧＳＦＶＤＫＴＶＬＰＦＶＮＴＨＰＤＫＬＲＮＰＣＰＮＫＥＫＥＣＱＰＰＦＡＦＲＨＶＬＫＬＴＮＮＳＮＱＦＱＴＥＶＧＫＱＬＩＳＧＮＬＤＡＰＥＧＧＬＤＡＭＭＱＶＡＡＣＰＥＥＩＧＷＲＮＶＴＲＬＬＶＦＡＴＤＤＧＦＨＦＡＧＤＧＫＬＧＡＩＬＴＰＮＤＧＲＣＨＬＥＤＮＬＹＫＲＳＮＥＦＤＹＰＳＶＧＱＬＡＨＫＬＡＥＮＮＩＱＰＩＦＡＶＴＳＲＭＶＫＴＹＥＫＬＴＥＩＩＰＫＳＡＶＧＥＬＳＥＤＳＳＮＶＶＱＬＩＫＮＡＹＮＫＬＳＳＲＶＦＬＤＨＮＡＬＰＤＴＬＫＶＴＹＤＳＦＣＳＮＧＶＴＨＲＮＱＰＲＧＤＣＤＧＶＱＩＮＶＰＩＴＦＱＶＫＶＴＡＴＥＣＩＱＥＱＳＦＶＩＲＡＬＧＦＴＤＩＶＴＶＱＶＬＰＱＣＥＣＲＣＲＤＱＳＲＤＲＳＬＣＨＧＫＧＦＬＥＣＧＩＣＲＣＤＴＧＹＩＧＫＮＣＥＣＱＴＱＧＲＳＳＱＥＬＥＧＳＣＲＫＤＮＮＳＩＩＣＳＧＬＧＤＣＶＣＧＱＣＬＣＨＴＳＤＶＰＧＫＬＩＹＧＱＹＣＥＣＤＴＩＮＣＥＲＹＮＧＱＶＣＧＧＰＧＲＧＬＣＦＣＧＫＣＲＣＨＰＧＦＥＧＳＡＣＱＣＥＲＴＴＥＧＣＬＮＰＲＲＶＥＣＳＧＲＧＲＣＲＣＮＶＣＥＣＨＳＧＹＱＬＰＬＣＱＥＣＰＧＣＰＳＰＣＧＫＹＩＳＣＡＥＣＬＫＦＥＫＧＰＦＧＫＮＣＳＡＡＣＰＧＬＱＬＳＮＮＰＶＫＧＲＴＣＫＥＲＤＳＥＧＣＷＶＡＹＴＬＥＱＱＤＧＭＤＲＹＬＩＹＶＤＥＳＲＥＣＶＡＧＰＮＩＡＡＩＶＧＧＴＶＡＧＩＶＬＩＧＩＬＬＬ
ＶＩＷＫＡＬＩＨＬＳＤＬＲＥＹＲＲＦＥＫＥＫＬＫＳＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫＳＡＴＴＴＶＭＮＰＫＦＡＥＳ
【００３５】
配列番号：４
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
【００３６】
配列番号：５
ＭＶＲＬＰＬＱＣＶＬＷＧＣＬＬＴＡＶＨＰＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳＱＣＣＳＬＣＱＰＧＱＫＬＶＳＤＣＴＥＦＴＥＴＥＣＬＰＣＧＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＨＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰＧＦＧＶＫＱＩＡＴＧＶＳＤＴＩＣＥＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷＴＳＣＥＴＫＤＬＶＶＱＱＡＧＴＮＫＴＤＶＶＣＧＰＱＤＲＬＲＡＬＶＶＩＰＩＩＦＧＩＬＦＡＩＬＬＶＬＶＦＩＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶＱＥＲＱ
【００３７】
配列番号：６
ＭＬＧＩＷＴＬＬＰＬＶＬＴＳＶＡＲＬＳＳＫＳＶＮＡＱＶＴＤＩＮＳＫＧＬＥＬＲＫＴＶＴＴＶＥＴＱＮＬＥＧＬＨＨＤＧＱＦＣＨＫＰＣＰＰＧＥＲＫＡＲＤＣＴＶＮＧＤＥＰＤＣＶＰＣＱＥＧＫＥＹＴＤＫＡＨＦＳＳＫＣＲＲＣＲＬＣＤＥＧＨＧＬＥＶＥＩＮＣＴＲＴＱＮＴＫＣＲＣＫＰＮＦＦＣＮＳＴＶＣＥＨＣＤＰＣＴＫＣＥＨＧＩＩＫＥＣＴＬＴＳＮＴＫＣＫＥＥＧＳＲＳＮＬＧＷＬＣＬＬＬＬＰＩＰＬＩＶＷＶＫＲＫＥＶＱＫＴＣＲＫＨＲＫＥＮＱＧＳＨＥＳＰＴＬＮＰＥＴＶＡＩＮＬＳＤＶＤＬＳＫＹＩＴＴＩＡＧＶＭＴＬＳＱＶＫＧＦＶＲＫＮＧＶＮＥＡＫＩＤＥＩＫＮＤＮＶＱＤＴＡＥＱＫＶＱＬＬＲＮＷＨＱＬＨＧＫＫＥＡＹＤＴＬＩＫＤＬＫＫＡＮＬＣＴＬＡＥＫＩＱＴＩＩＬＫＤＩＴＳＤＳＥＮＳＮＦＲＮＥＩＱＳＬＶ
【００３８】
配列番号：７
ＭＲＡＬＥＧＰＧＬＳＬＬＣＬＶＬＡＬＰＡＬＬＰＶＰＡＶＲＧＶＡＥＴＰＴＹＰＷＲＤＡＥＴＧＥＲＬＶＲＬＬＱＡＬＲＶＡＲＭＰＧＬＥＲＳＶＲＥＲＦＬＰＶＨ
【００３９】
配列番号：８
ＭＡＲＰＨＰＷＷＬＣＶＬＧＴＬＶＧＬＳＡＴＰＡＰＫＳＣＰＥＲＨＹＷＡＱＧＫＬＣＣＱＭＣＥＰＧＴＦＬＶＫＤＣＤＱＨＲＫＡＡＱＣＤＰＣＩＰＧＶＳＦＳＰＤＨＨＴＲＰＨＣＥＳＣＲＨＣＮＳＧＬＬＶＲＮＣＴＩＴＡＮＡＥＣＡＣＲＮＧＷＱＣＲＤＫＥＣＴＥＣＤＰＬＰＮＰＳＬＴＡＲＳＳＱＡＬＳＰＨＰＱＰＴＨＬＰＹＶＳＥＭＬＥＡＲＴＡＧＨＭＱＴＬＡＤＦＲＱＬＰＡＲＴＬＳＴＨＷＰＰＱＲＳＬＣＳＳＤＦＩＲＩＬＶＩＦＳＧＭＦＬＶＦＴＬＡＧＡＬＦＬＨＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ
【００４０】
配列番号：９
ＭＲＶＬＬＡＡＬＧＬＬＦＬＧＡＬＲＡＦＰＱＤＲＰＦＥＤＴＣＨＧＮＰＳＨＹＹＤＫＡＶＲＲＣＣＹＲＣＰＭＧＬＦＰＴＱＱＣＰＱＲＰＴＤＣＲＫＱＣＥＰＤＹＹＬＤＥＡＤＲＣＴＡＣＶＴＣＳＲＤＤＬＶＥＫＴＰＣＡＷＮＳＳＲＶＣＥＣＲＰＧＭＦＣＳＴＳＡＶＮＳＣＡＲＣＦＦＨＳＶＣＰＡＧＭＩＶＫＦＰＧＴＡＱＫＮＴＶＣＥＰＡＳＰＧＶＳＰＡＣＡＳＰＥＮＣＫＥＰＳＳＧＴＩＰＱＡＫＰＴＰＶＳＰＡＴＳＳＡＳＴＭＰＶＲＧＧＴＲＬＡＱＥＡＡＳＫＬＴＲＡＰＤＳＰＳＳＶＧＲＰＳＳＤＰＧＬＳＰＴＱＰＣＰＥＧＳＧＤＣＲＫＱＣＥＰＤＹＹＬＤＥＡＧＲＣＴＡＣＶＳＣＳＲＤＤＬＶＥＫＴＰＣＡＷＮＳＳＲＴＣＥＣＲＰＧＭＩＣＡＴＳＡＴＮＳＣＡＲＣＶＰＹＰＩＣＡＡＥＴＶＴＫＰＱＤＭＡＥＫＤＴＴＦＥＡＰＰＬＧＴＱＰＤＣＮＰＴＰＥＮＧＥＡＰＡＳＴＳＰＴＱＳＬＬＶＤＳＱＡＳＫＴＬＰＩＰＴＳＡＰＶＡＬＳＳＴＧＫＰＶＬＤＡＧＰＶＬＦＷＶＩＬＶＬＶＶＶＶＧＳＳＡＦＬＬＣＨＲＲＡＣＲＫＲＩＲＱＫＬＨＬＣＹＰＶＱＴＳＱＰＫＬＥＬＶＤＳＲＰＲＲＳＳＴＱＬＲＳＧＡＳＶＴＥＰＶＡＥＥＲＧＬＭＳＱＰＬＭＥＴＣＨＳＶＧＡＡＹＬＥＳＬＰＬＱＤＡＳＰＡＧＧＰＳＳＰＲＤＬＰＥＰＲＶＳＴＥＨＴＮＮＫＩＥＫＩＹＩＭＫＡＤＴＶＩＶＧＴＶＫＡＥＬＰＥＧＲＧＬＡＧＰＡＥＰＥＬＥＥＥＬＥＡＤＨＴＰＨＹＰＥＱＥＴＥＰＰＬＧＳＣＳＤＶＭＬＳＶＥＥＥＧＫＥＤＰＬＰＴＡＡＳＧＫ
【００４１】
配列番号：１０
ＭＧＮＳＣＹＮＩＶＡＴＬＬＬＶＬＮＦＥＲＴＲＳＬＱＤＰＣＳＮＣＰＡＧＴＦＣＤＮＮＲＮＱＩＣＳＰＣＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴＣＤＩＣＲＱＣＫＧＶＦＲＴＲＫＥＣＳＳＴＳＮＡＥＣＤＣＴＰＧＦＨＣＬＧＡＧＣＳＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
【００４２】
配列番号：１１
ＭＡＰＰＰＡＲＶＨＬＧＡＦＬＡＶＴＰＮＰＧＳＡＡＳＧＴＥＡＡＡＡＴＰＳＫＶＷＧＳＳＡＧＲＩＥＰＲＧＧＧＲＧＡＬＰＴＳＭＧＱＨＧＰＳＡＲＡＲＡＧＲＡＰＧＰＲＰＡＲＥＡＳＰＲＬＲＶＨＫＴＦＫＦＶＶＶＧＶＬＬＱＶＶＰＳＳＡＡＴＩＫＬＨＤＱＳＩＧＴＱＱＷＥＨＳＰＬＧＥＬＣＰＰＧＳＨＲＳＥＨＰＧＡＣＮＲＣＴＥＧＶＧＹＴＮＡＳＮＮＬＦＡＣＬＰＣＴＡＣＫＳＤＥＥＥＲＳＰＣＴＴＴＲＮＴＡＣＱＣＫＰＧＴＦＲＮＤＮＳＡＥＭＣＲＫＣＳＲＧＣＰＲＧＭＶＫＶＫＤＣＴＰＷＳＤＩＥＣＶＨＫＥＳＧＮＧＨＮＩＷＶＩＬＶＶＴＬＶＶＰＬＬＬＶＡＶＬＩＶＣＣＣＩＧＳＧＣＧＧＤＰＫＣＭＤＲＶＣＦＷＲＬＧＬＬＲＧＰＧＡＥＤＮＡＨＮＥＩＬＳＮＡＤＳＬＳＴＦＶＳＥＱＱＭＥＳＱＥＰＡＤＬＴＧＶＴＶＱＳＰＧＥＡＱＣＬＬＧＰＡＥＡＥＧＳＱＲＲＲＬＬＶＰＡＮＧＡＤＰＴＥＴＬＭＬＦＦＤＫＦＡＮＩＶＰＦＤＳＷＤＱＬＭＲＱＬＤＬＴＫＮＥＩＤＶＶＲＡＧＴＡＧＰＧＤＡＬＹＡＭＬＭＫＷＶＮＫＴＧＲＮＡＳＩＨＴＬＬＤＡＬＥＲＭＥＥＲＨＡＲＥＫＩＱＤＬＬＶＤＳＧＫＦＩＹＬＥＤＧＴＧＳＡＶＳＬＥ
【００４３】
配列番号：１２
ＭＥＱＲＧＱＮＡＰＡＡＳＧＡＲＫＲＨＧＰＧＰＲＥＡＲＧＡＲＰＧＰＲＶＰＫＴＬＶＬＶＶＡＡＶＬＬＬＶＳＡＥＳＡＬＩＴＱＱＤＬＡＰＱＱＲＡＡＰＱＱＫＲＳＳＰＳＥＧＬＣＰＰＧＨＨＩＳＥＤＧＲＤＣＩＳＣＫＹＧＱＤＹＳＴＨＷＮＤＬＬＦＣＬＲＣＴＲＣＤＳＧＥＶＥＬＳＰＣＴＴＴＲＮＴＶＣＱＣＥＥＧＴＦＲＥＥＤＳＰＥＭＣＲＫＣＲＴＧＣＰＲＧＭＶＫＶＧＤＣＴＰＷＳＤＩＥＣＶＨＫＥＳＧＴＫＨＳＧＥＶＰＡＶＥＥＴＶＴＳＳＰＧＴＰＡＳＰＣＳＬＳＧＩＩＩＧＶＴＶＡＡＶＶＬＩＶＡＶＦＶＣＫＳＬＬＷＫＫＶＬＰＹＬＫＧＩＣＳＧＧＧＧＤＰＥＲＶＤＲＳＳＱＲＰＧＡＥＤＮＶＬＮＥＩＶＳＩＬＱＰＴＱＶＰＥＱＥＭＥＶＱＥＰＡＥＰＴＧＶＮＭＬＳＰＧＥＳＥＨＬＬＥＰＡＥＡＥＲＳＱＲＲＲＬＬＶＰＡＮＥＧＤＰＴＥＴＬＲＱＣＦＤＤＦＡＤＬＶＰＦＤＳＷＥＰＬＭＲＫＬＧＬＭＤＮＥＩＫＶＡＫＡＥＡＡＧＨＲＤＴＬＹＴＭＬＩＫＷＶＮＫＴＧＲＤＡＳＶＨＴＬＬＤＡＬＥＴＬＧＥＲＬＡＫＱＫＩＥＤＨＬＬＳＳＧＫＦＭＹＬＥＧＮＡＤＳＡＭＳ
【００４４】
配列番号：１３
ＭＡＲＩＰＫＴＬＫＦＶＶＶＩＶＡＶＬＬＰＶＬＡＹＳＡＴＴＡＲＱＥＥＶＰＱＱＴＶＡＰＱＱＱＲＨＳＦＫＧＥＥＣＰＡＧＳＨＲＳＥＨＴＧＡＣＮＰＣＴＥＧＶＤＹＴＮＡＳＮＮＥＰＳＣＦＰＣＴＶＣＫＳＤＱＫＨＫＳＳＣＴＭＴＲＤＴＶＣＱＣＫＥＧＴＦＲＮＥＮＳＰＥＭＣＲＫＣＳＲＣＰＳＧＥＶＱＶＳＮＣＴＳＷＤＤＩＱＣＶＥＥＦＧＡＮＡＴＶＥＴＰＡＡＥＥＴＭＮＴＳＰＧＴＰＡＰＡＡＥＥＴＭＮＴＳＰＧＴＰＡＰＡＡＥＥＴＭＴＴＳＰＧＴＰＡＰＡＡＥＥＴＭＴＴＳＰＧＴＰＡＰＡＡＥＥＴＭＩＴＳＰＧＴＰＡＳＳＨＹＬＳＣＴＩＶＧＩＩＶＬＩＶＬＬＩＶＦＶ
【００４５】
配列番号：１４
ＭＧＬＷＧＱＳＶＰＴＡＳＳＡＲＡＧＲＹＰＧＡＲＴＡＳＧＴＲＰＷＬＬＤＰＫＩＬＫＦＶＶＦＩＶＡＶＬＬＰＶＲＶＤＳＡＴＩＰＲＱＤＥＶＰＱＱＴＶＡＰＱＱＱＲＲＳＬＫＥＥＥＣＰＡＧＳＨＲＳＥＹＴＧＡＣＮＰＣＴＥＧＶＤＹＴＩＡＳＮＮＬＰＳＣＬＬＣＴＶＣＫＳＧＱＴＮＫＳＳＣＴＴＴＲＤＴＶＣＱＣＥＫＧＳＦＱＤＫＮＳＰＥＭＣＲＴＣＲＴＧＣＰＲＧＭＶＫＶＳＮＣＴＰＲＳＤＩＫＣＫＮＥＳＡＡＳＳＴＧＫＴＰＡＡＥＥＴＶＴＴＩＬＧＭＬＡＳＰＹＨＹＬＩＩＩＶＶＬＶＩＩＬＡＶＶＶＶＧＦＳＣＲＫＫＦＩＳＹＬＫＧＩＣＳＧＧＧＧＧＰＥＲＶＨＲＶＬＦＲＲＲＳＣＰＳＲＶＰＧＡＥＤＮＡＲＮＥＴＬＳＮＲＹＬＱＰＴＱＶＳＥＱＥＩＱＧＱＥＬＡＥＬＴＧＶＴＶＥＳＰＥＥＰＱＲＬＬＥＱＡＥＡＥＧＣＱＲＲＲＬＬＶＰＶＮＤＡＤＳＡＤＩＳＴＬＬＤＡＳＡＴＬＥＥＧＨＡＫＥＴＩＱＤＱＬＶＧＳＥＫＬＦＹＥＥＤＥＡＧＳＡＴＳＣＬ
【００４６】
配列番号：１５
ＭＡＰＲＡＲＲＲＲＰＬＦＡＬＬＬＬＣＡＬＬＡＲＬＱＶＡＬＱＩＡＰＰＣＴＳＥＫＨＹＥＨＬＧＲＣＣＮＫＣＥＰＧＫＹＭＳＳＫＣＴＴＴＳＤＳＶＣＬＰＣＧＰＤＥＹＬＤＳＷＮＥＥＤＫＣＬＬＨＫＶＣＤＴＧＫＡＬＶＡＶＶＡＧＮＳＴＴＰＲＲＣＡＣＴＡＧＹＨＷＳＱＤＣＥＣＣＲＲＮＴＥＣＡＰＧＬＧＡＱＨＰＬＱＬＮＫＤＴＶＣＫＰＣＬＡＧＹＦＳＤＡＦＳＳＴＤＫＣＲＰＷＴＮＣＴＦＬＧＫＲＶＥＨＨＧＴＥＫＳＤＡＶＣＳＳＳＬＰＡＲＫＰＰＮＥＰＨＶＹＬＰＧＬＩＩＬＬＬＦＡＳＶＡＬＶＡＡＩＩＦＧＶＣＹＲＫＫＧＫＡＬＴＡＮＬＷＨＷＩＮＥＡＣＧＲＬＳＧＤＫＥＳＳＧＤＳＣＶＳＴＨＴＡＮＦＧＱＱＧＡＣＥＧＶＬＬＬＴＬＥＥＫＴＦＰＥＤＭＣＹＰＤＱＧＧＶＣＱＧＴＣＶＧＧＧＰＹＡＱＧＥＤＡＲＭＬＳＬＶＳＫＴＥＩＥＥＤＳＦＲＱＭＰＴＥＤＥＹＭＤＲＰＳＱＰＴＤＱＬＬＦＬＴＥＰＧＳＫＳＴＰＰＦＳＥＰＬＥＶＧＥＮＤＳＬＳＱＣＦＴＧＴＱＳＴＶＧＳＥＳＣＮＣＴＥＰＬＣＲＴＤＷＴＰＭＳＳＥＮＹＬＱＫＥＶＤＳＧＨＣＰＨＷＡＡＳＰＳＰＮＷＡＤＶＣＴＧＣＲＮＰＰＧＥＤＣＥＰＬＶＧＳＰＫＲＧＰＬＰＱＣＡＹＧＭＧＬＰＰＥＥＥＡＳＲＴＥＡＲＤＱＰＥＤＧＡＤＧＲＬＰＳＳＡＲＡＧＡＧＳＧＳＳＰＧＧＱＳＰＡＳＧＮＶＴＧＮＳＮＳＴＦＩＳＳＧＱＶＭＮＦＫＧＤＩＩＶＶＹＶＳＱＴＳＱＥＧＡＡＡＡＡＥＰＭＧＲＰＶＱＥＥＴＬＡＲＲＤＳＦＡＧＮＧＰＲＦＰＤＰＣＧＧＰＥＧＬＲＥＰＥＫＡＳＲＰＶＱＥＱＧＧＡＫＡ
【００４７】
配列番号：１６
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【００７４】
配列番号：４３
ＭＤＤＳＴＥＲＥＱＳＲＬＴＳＣＬＫＫＲＥＥＭＫＬＫＥＣＶＳＩＬＰＲＫＥＳＰＳＶＲＳＳＫＤＧＫＬＬＡＡＴＬＬＬＡＬＬＳＣＣＬＴＶＶＳＦＹＱＶＡＡＬＱＧＤＬＡＳＬＲＡＥＬＱＧＨＨＡＥＫＬＰＡＧＡＧＡＰＫＡＧＬＥＥＡＰＡＶＴＡＧＬＫＩＦＥＰＰＡＰＧＥＧＮＳＳＱＮＳＲＮＫＲＡＶＱＧＰＥＥＴＶＴＱＤＣＬＱＬＩＡＤＳＥＴＰＴＩＱＫＧＳＹＴＦＶＰＷＬＬＳＦＫＲＧＳＡＬＥＥＫＥＮＫＩＬＶＫＥＴＧＹＦＦＩＹＧＱＶＬＹＴＤＫＴＹＡＭＧＨＬＩＱＲＫＫＶＨＶＦＧＤＥＬＳＬＶＴＬＦＲＣＩＱＮＭＰＥＴＬＰＮＮＳＣＹＳＡＧＩＡＫＬＥＥＧＤＥＬＱＬＡＩＰＲＥＮＡＱＩＳＬＤＧＤＶＴＦＦＧＡＬＫＬＬ
【００７５】
配列番号：４４
ＭＥＳＭＡＶＡＴＤＧＧＥＲＰＧＶＰＡＧＳＧＬＳＡＳＱＲＲＡＥＬＲＲＲＫＬＬＭＮＳＥＱＲＩＮＲＩＭＧＦＨＲＰＧＳＧＡＥＥＥＳＱＴＫＳＫＱＱＤＳＤＫＬＮＳＬＳＶＰＳＶＳＫＲＶＶＬＧＤＳＶＳＴＧＴＴＤＱＱＧＧＶＡＥＶＫＧＴＱＬＧＤＫＬＤＳＦＩＫＰＰＥＣＳＳＤＶＮＬＥＬＲＱＲＮＲＧＤＬＴＡＤＳＶＱＲＧＳＲＨＧＬＥＱＹＬＳＲＦＥＥＡＭＫＬＲＫＱＬＩＳＥＫＰＳＱＥＤＧＮＴＴＥＥＦＤＳＦＲＩＦＲＬＶＧＣＡＬＬＡＬＧＶＲＡＦＶＣＫＹＬＳＩＦＡＰＦＬＴＬＱＬＡＹＭＧＬＹＫＹＦＰＫＳＥＫＫＩＫＴＴＶＬＴＡＡＬＬＬＳＧＩＰＡＥＶＩＮＲＳＭＤＴＹＳＫＭＧＥＶＦＴＤＬＣＶＹＦＦＴＦＩＦＣＨＥＬＬＤＹＷＧＳＥＶＰ
【００７６】
配列番号：４５
ＭＳＭＬＦＹＴＬＩＴＡＦＬＩＧＩＱＡＥＰＨＳＥＳＮＶＰＡＧＨＴＩＰＱＡＨＷＴＫＬＱＨＳＬＤＴＡＬＲＲＡＲＳＡＰＡＡＡＩＡＡＲＶＡＧＱＴＲＮＩＴＶＤＰＲＬＦＫＫＲＲＬＲＳＰＲＶＬＦＳＴＱＰＰＲＥＡＡＤＴＱＤＬＤＦＥＶＧＧＡＡＰＦＮＲＴＨＲＳＫＲＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲＲＡ
【００７７】
配列番号：４６
ＭＴＩＬＦＬＴＭＶＩＳＹＦＧＣＭＫＡＡＰＭＫＥＡＮＩＲＧＱＧＧＬＡＹＰＧＶＲＴＨＧＴＬＥＳＶＮＧＰＫＡＧＳＲＧＬＴＳＬＡＤＴＦＥＨＶＩＥＥＬＬＤＥＤＱＫＶＲＰＮＥＥＮＮＫＤＡＤＬＹＴＳＲＶＭＬＳＳＱＶＰＬＥＰＰＬＬＦＬＬＥＥＹＫＮＹＬＤＡＡＮＭＳＭＲＶＲＲＨＳＤＰＡＲＲＧＥＬＳＶＣＤＳＩＳＥＷＶＴＡＡＤＫＫＴＡＶＤＭＳＧＧＴＶＴＶＬＥＫＶＰＶＳＫＧＱＬＫＱＹＦＹＥＴＫＣＮＰＭＧＹＴＫＥＧＣＲＧＩＤＫＲＨＷＮＳＱＣＲＴＴＱＳＹＶＲＡＬＴＭＤＳＫＫＲＩＧＷＲＦＩＲＩＤＴＳＣＶＣＴＬＴＩＫＲＧＲ
【００７８】
配列番号：４７
ＭＳＩＬＦＹＶＩＦＬＡＹＬＲＧＩＱＧＮＮＭＤＱＲＳＬＰＥＤＳＬＮＳＬＩＩＫＬＩＱＡＤＩＬＫＮＫＬＳＫＱＭＶＤＶＫＥＮＹＱＳＴＬＰＫＡＥＡＰＲＥＰＥＲＧＧＰＡＫＳＡＦＱＰＶＩＡＭＤＴＥＬＬＲＱＱＲＲＹＮＳＰＲＶＬＬＳＤＳＴＰＬＥＰＰＰＬＹＬＭＥＤＹＶＧＳＰＶＶＡＮＲＴＳＲＲＫＲＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧＲＴ
【００７９】
配列番号：４８
ＭＬＰＬＰＳＣＳＬＰＩＬＬＬＦＬＬＰＳＶＰＩＥＳＱＰＰＰＳＴＬＰＰＦＬＡＰＥＷＤＬＬＳＰＲＶＶＬＳＲＧＡＰＡＧＰＰＬＬＦＬＬＥＡＧＡＦＲＥＳＡＧＡＰＡＮＲＳＲＲＧＶＳＥＴＡＰＡＳＲＲＧＥＬＡＶＣＤＡＶＳＧＷＶＴＤＲＲＴＡＶＤＬＲＧＲＥＶＥＶＬＧＥＶＰＡＡＧＧＳＰＬＲＱＹＦＦＥＴＲＣＫＡＤＮＡＥＥＧＧＰＧＡＧＧＧＧＣＲＧＶＤＲＲＨＷＶＳＥＣＫＡＫＱＳＹＶＲＡＬＴＡＤＡＱＧＲＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＡＣＶＣＴＬＬＳＲＴＧＲＡ
【００８０】
配列番号：４９
ＧＨＴＡＮＫＰＣＬＡＫＦＥＬＬＴＳＫＷＱＭＴＳＲＫＰＰＣＶＮＳＬＰＥＧＫＬＫＩＬＱＤＧＬＹＬＩＹＧＱＶＡＰＳＴＡＹＫＧＶＡＰＦＡＶＱＬＲＫＮＥＡＭＬＱＴＬＴＳＮＳＴＩＹＤＶＧＧＴＹＥＦＨＡＧＤＩＩＤＬＩＦＤＤＥＨＱＶＬＫＮＮＴＹＷＧＩＶＬＬＡＮＬＦＩＳ
【００８１】
配列番号：５０
ＭＧＹＰＥＶＥＲＲＥＬＬＰＡＡＡＰＲＥＲＧＳＱＧＣＧＣＧＧＡＰＡＲＡＧＥＧＮＳＣＬＬＦＬＧＦＦＧＬＳＬＡＬＨＬＬＴＬＣＣＹＬＥＬＲＳＥＬＲＲＥＲＧＡＥＳＲＬＧＧＳＧＴＰＧＴＳＧＴＬＳＳＬＧＧＬＤＰＤＳＰＩＴＳＨＬＧＱＰＳＰＫＱＱＰＬＥＰＧＥＡＡＬＨＳＤＳＱＤＧＨＱＭＡＬＬＮＦＦＦＰＤＥＫＰＹＳＥＥＥＳＲＲＶＲＲＮＫＲＳＫＳＮＥＧＡＤＧＰＶＫＮＫＫＫＧＫＫＡＧＰＰＧＰＮＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＱＧＰＰＧＩＰＧＩＰＧＩＰＧＴＴＶＭＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＱＧＰＰＧＬＱＧＰＳＧＡＡＤＫＡＧＴＲＥＮＱＰＡＶＶＨＬＱＧＱＧＳＡＩＱＶＫＮＤＬＳＧＧＶＬＮＤＷＳＲＩＴＭＮＰＫＶＦＫＬＨＰＲＳＧＥＬＥＶＬＶＤＧＴＹＦＩＹＳＱＶＹＹＩＮＦＴＤＦＡＳＹＥＶＶＶＤＥＫＰＦＬＱＣＴＲＳＩＥＴＧＫＴＮＹＮＴＣＹＴＡＧＶＣＬＬＫＡＲＱＫＩＡＶＫＭＶＨＡＤＩＳＩＮＭＳＫＨＴＴＦＦＧＡＩＲＬＧＥＡＰＡＳ
【００８２】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」とは、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、又は特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに、他の抗原よりも高い親和性で結合する、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体を意味する。典型的には、結合の平衡解離定数（ＫD）が、約１×１０-8Ｍ以下、例えば、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は、約１×１０-12Ｍ以下である場合、抗体は、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するＫDの、少なくとも１／１００未満のＫDで、「特異的に結合する」。ＫDは、標準的な手順を使用して測定することができる。しかし、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、又は特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに特異的に結合する、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの、他の種（ホモログ）からの同じ抗原に対する交差反応性を有してよい。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する。
【００８３】
「抗体」は、広い意味を持ち、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体断片、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに、必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の、任意の他の改変された構成を含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
【００８４】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づく（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１〜５０）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「高頻度可変領域」、すなわち、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」とは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋにより定義されるとおり、構造が高頻度可変性である抗体可変ドメインの領域を意味する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１〜１７）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準的番号及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの標記の対応関係については、（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５〜７７）に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【００８５】
免疫グロブリンは、重鎖定常領域アミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４へと更に細分類される。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つのはっきりと異なるタイプ、即ちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうち１つに割り当てることができる。
【００８６】
「抗体フラグメント」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２、及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保持する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体断片は、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、並びに、１個のＶＨドメイン又は１個のＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して結合し、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、個別の一本鎖抗体構築物により発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子間で対形成し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体を形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
【００８７】
「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からのＣ末端リジンの除去などの、可能な周知の変更、又は、アミノ酸の翻訳後修飾、例えばメチオニン酸化、若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解による変更を除いて、各重鎖及び各軽鎖に、１個のアミノ酸組成を有する抗体集団を意味する。モノクローナル抗体は通常、１個の抗原性エピトープに特異的に結合するが、二重特異性又は多重特異性モノクローナル抗体は、２つ以上の異なる抗原性エピトープに特異的に結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
【００８８】
「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない、抗体又は抗体断片を意味する（例えば、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。「単離された抗体」は、純度が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の抗体など、高純度に単離された抗体を包含する。
【００８９】
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換を含む可能性があることから、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでなくてもよい。
【００９０】
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指し、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限に抑えられるように最適化される。抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
【００９１】
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系の代表的なものには、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウス又はラットなどといったヒト以外の遺伝子導入動物を含む。「ヒト抗体」は、抗体及びヒト免疫グロブリン座を得るために用いられる系間の違い、体細胞変異の導入、又はフレームワーク若しくは抗原結合部位、又はこれらの両方への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子と比較したときにアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコード化されているアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば、（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６）に記載されている、ヒトフレームワーク配列分析により誘導される、コンセンサスフレームワーク配列、又は、例えば、（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６）、及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されている、ファージに表示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた、合成ＨＣＤＲ３を含有してよい。
【００９２】
ヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ファージディスプレイ組み込み合成ＣＤＲ及び／又は合成フレームワークなどの系を用いて生成することもでき、インビトロでの突然変異導入に供して抗体特性を改善した結果、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
【００９３】
抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【００９４】
「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及びその他のタンパク質を指す。
【００９５】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的には、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖などの部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体「エピトープ」は、エピトープを識別するために使用する方法論によって異なる。
【００９６】
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの、他の種（ホモログ）からの同じ抗原に対し交差反応性を有し得る、あるいは、２つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
【００９７】
「多重特異性」とは、同じ抗原内の２つ以上の異なる抗原、又は２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を意味する。
【００９８】
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して生物系（例えば、細胞、ウイルス、動物、植物）及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ、又はこれらのハイブリッドであってよく、一本鎖又は二本鎖であってよい。
【００９９】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。
【０１００】
「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、合成ポリヌクレオチドの典型例である。
【０１０１】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
【０１０２】
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【０１０３】
「価数」とは、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記された数で存在することを意味する。そのため、「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」なる用語はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。
【０１０４】
「アゴニスト」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの少なくとも１つの生物活性を誘導する抗体を意味し、抗体は、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの天然リガンドにより誘導されるアゴニストに結合する。例示的なアゴニスト活性としては、インビトロアッセイにて、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現した、分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生の誘導、樹状細胞（ＤＣ）でのＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲ表面発現の増加により評価される、ＤＣ分化の誘導、Ｂ細胞の細胞増殖の増加又はＢ細胞でのＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲ表面発現の増加により評価されるＢ細胞の活性化、以前に抗原に曝露した患者から単離したＰＢＭＣによるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生により評価される、抗原特異的Ｔ細胞のリコール応答の誘導、並びにＣＤ４+又はＣＤ８+  Ｔ細胞増殖の誘導が挙げられる。アゴニスト活性（例えば、アゴニズム）は、架橋依存性であり得る、又は抗体架橋とは無関係であり得る。
【０１０５】
「アゴニスト活性の増強」又は「アゴニズムの増強」とは、アゴニスト活性を測定した際に、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体により誘導されるＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生により、改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニズムが野生型の親抗体と比較して改善していることを意味する。改変抗体は、架橋依存性又は架橋非依存性のいずれかで、１μｇ／ｍＬの抗体濃度の野生型親抗体と比較して、少なくとも２０％高いレベルで、ＳＥＡＰ産生を誘導する場合に、「アゴニスト活性の増強」を有する。
【０１０６】
「架橋」とは、ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＢ  ｃｉｓ又はｔｒａｎｓへの抗体結合、及び、その後のＴＮＦＲアゴニスト活性の誘導により誘導される、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを発現する細胞上での、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のハイオーダーでの多量体化を意味する。架橋は、架橋剤として抗ヒトＦ（ａｂ’）２を使用すること、又はＲａｊｉ細胞などのＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞を使用することによりインビトロで評価することができる。
【０１０７】
「抗体架橋に無関係なアゴニスト活性」とは、抗体が、ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ）を発現するＲａｊｉ細胞の非存在下にて、溶液中で、本明細書の実施例３に記載するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）レポーターアッセイによりＳＥＡＰの産生を誘導することを意味する。
【０１０８】
「Ｆｃドメイン含有分子」とは、少なくとも１個の免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、単量体、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を意味する。例示的なＦｃドメイン含有分子は、Ｆｃドメインに結合した、表１に示すものなどのＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメインを含有する、融合タンパク質である。
【０１０９】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」には、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物などの全ての脊椎動物が含まれる。
【０１１０】
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されるＥＵインデックスに従っている。
【０１１１】
従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを、表２に示すとおりに本明細書で使用する。
【０１１２】
【表２】
2019533427.tif 000004
【０１１３】
組成物
本発明は、アゴニスト活性が増強した、及び所望により、エフェクター機能が増強した、改変抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーの抗体、並びに、抗体の使用及び作製方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのＦｃ領域に特定の変異を導入することにより、アゴニズムが増強した、及び所望により、エフェクター機能が増強した改変抗体がもたらされることの識別に基づく。
【０１１４】
本発明は、改変抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーの抗体であって、抗体が、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異を含み、場合により、Ｋ２４８Ｅ変異又はＫ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を更に含む、抗体を提供する。
【０１１５】
本発明は、改変抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーの抗体であって、抗体が、野生型の親抗体と比較して、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む、抗体を提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号：６３の重鎖定常領域（ＨＣ）を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号：６４の重鎖定常領域（ＨＣ）を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号：６５の重鎖定常領域（ＨＣ）を含む。
【０１２２】
2019533427.tif 000005
【０１２３】
2019533427.tif 000006
【０１２４】
2019533427.tif 000007
【０１２５】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型の親抗体と比較して、増強したアゴニスト活性を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞からＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の、抗体により誘導された産生を測定することにより、測定される。
【０１２７】
Ｔ４３７Ｒ変異は、改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニスト活性を増強させる。
【０１２８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異は、改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニスト活性を増強させる。
【０１２９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異は、改変抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強させる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介在する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を介在する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、抗体はＣＤＣを介在する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異を更に含む、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合よりＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異を更に含む、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異を更に含む、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、抗体は、抗体架橋とは無関係なアゴニスト活性を有し、アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞からの、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の、抗体により誘導された産生を測定することにより測定される。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ＦｃγＲが介在する抗体架橋とは無関係なアゴニスト活性を有する。したがって、本発明の抗体は、アゴニスト活性に関して、腫瘍微小環境でＦｃγＲを発現する細胞の生物学的利用能及び密度によらないものであることもでき、十分なＦｃγＲの細胞湿潤を欠く環境において、ＴＮＦＲシグナル伝達を誘導することができる。
【０１４８】
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、天然リガンドのアゴニズムを下回る、アゴニズムのレベルを示し得、それ故、向上した安全性プロファイルを提供し得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、腫瘍壊死因子受容体１（配列番号：１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号：２）、リンホトキシンβ受容体（配列番号：３）、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ４０（配列番号：５）、Ｆａｓ受容体（配列番号：６）、デコイ受容体３（配列番号：７）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ３０（配列番号：９）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、細胞死受容体４（配列番号：１１）、細胞死受容体５（配列番号：１２）、デコイ受容体１（配列番号：１３）、デコイ受容体２（配列番号：１４）、ＲＡＮＫ（配列番号：１５）、オステオプロテゲリン（配列番号：１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号：１７）、ＴＡＣＩ（配列番号：１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号：１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（配列番号：２０）、神経成長因子受容体（配列番号：２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号：２２）、ＧＩＴＲ（配列番号：２３）、ＴＲＯＹ（配列番号：２４）、細胞死受容体６（配列番号：２５）、細胞死受容体３（配列番号：２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号：２７）である。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーはＯＸ４０（配列番号：４）である。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーはＣＤ２７（配列番号：８）である。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーはＣＤ４０（配列番号：５）である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーはＣＤ１３７（配列番号：１０）である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーはＧＩＴＲ（配列番号：２３）である。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、配列番号：６３の定常領域を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＡＤＣＣを介在する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異及びＩｇＧ１アイソタイプを含み、ＡＤＣＣを介在する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＡＤＣＰを介在する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＡＤＣＰを介在する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＣＤＣを介在する。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＣＤＣを介在する。
【０１６４】
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３）、又はＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）を導入することにより、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニスト活性を増強させるための、既報のＦｃを改変する試みにより、ＡＤＣＣを消失した抗体が得られた。Ｃｈｕ及びＭｉｍｏｔｏにより説明される抗体とは対照的に、Ｔ４３７Ｒ変異を含む本発明のＩｇＧ１抗体を、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望される場合に使用することができる。例示的なこのような例は、腫瘍微小環境でＧＩＴＲ及び／又はＯＸ−４０発現Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させて、抗腫瘍免疫を増強させるというものである。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、Ｔ４３７Ｒ変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃが介在するエフェクター機能を低減させる、又は消失させる第２の変異を更に含んでよい。Ｔ４３７Ｒ変異、及び、抗体Ｆｃが介在するエフェクター機能を低減させる又は消失させる第２の変異を含む、本発明の抗体はそれ故、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望されない場合で使用することができる。例示的なこのような例は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療処置である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異を更に含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異を更に含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、配列番号：６６の定常領域を含む。
【０１７２】
2019533427.tif 000008
【０１７３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、配列番号：６７の定常領域を含む。
【０１７５】
2019533427.tif 000009
【０１７６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０１７７】
Ｔ４３７Ｒ変異、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を含む本発明の抗体は、架橋とは無関係なアゴニスト活性を維持したが、ＡＤＣＣを介在することはできなかった。Ｔ４３７Ｒ変異、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を有する抗体はそれ故、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望されない場合に使用することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異を更に含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０１８５】
Ｔ４３７Ｒ変異及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む本発明の抗体は、架橋とは無関係なアゴニスト活性を維持したが、ＡＤＣＣを介在することはできなかった。Ｔ４３７Ｒ変異及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有する抗体はそれ故、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望されない場合に使用することができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、配列番号：６８の定常領域を含む。
【０１８８】
2019533427.tif 000010
【０１８９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、抗体架橋とは無関係なアゴニスト活性を有し、アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞からの、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の、抗体により誘導された産生を測定することにより測定される。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号：１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号：２）、リンホトキシンβ受容体（配列番号：３）、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ４０（配列番号：５）、Ｆａｓ受容体（配列番号：６）、デコイ受容体３（配列番号：７）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ３０（配列番号：９）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、細胞死受容体４（配列番号：１１）、細胞死受容体５（配列番号：１２）、デコイ受容体１（配列番号：１３）、デコイ受容体２（配列番号：１４）、ＲＡＮＫ（配列番号：１５）、オステオプロテゲリン（配列番号：１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号：１７）、ＴＡＣＩ（配列番号：１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号：１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（配列番号：２０）、神経成長因子受容体（配列番号：２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号：２２）、ＧＩＴＲ（配列番号：２３）、ＴＲＯＹ（配列番号：２４）、細胞死受容体６（配列番号：２５）、細胞死受容体３（配列番号：２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号：２７）を結合する。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）を結合する。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号：４）を結合する。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号：８）を結合する。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号：５）を結合する。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号：１０）を結合する。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号：２３）を結合する。
【０１９７】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療における使用に好適である。
【０１９８】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療における使用に好適である。
【０１９９】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、充実性腫瘍の治療における使用に好適である。
【０２００】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療における使用に好適である。
【０２０１】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療における使用に好適である。
【０２０２】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療における使用に好適である。
【０２０３】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平ＮＳＣＬＣの治療における使用に好適である。
【０２０４】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療における使用に好適である。
【０２０５】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、腎臓明細胞癌、若しくは腎臓乳頭状細胞癌）、又はこれらの転移性病変の治療における使用に好適である。
【０２０６】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療における使用に好適である。
【０２０７】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の治療における使用に好適である。
【０２０８】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療における使用に好適である。
【０２０９】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療における使用に好適である。
【０２１０】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療における使用に好適である。
【０２１１】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療における使用に好適である。
【０２１２】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療における使用に好適である。
【０２１３】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、肝癌の治療における使用に好適である。
【０２１４】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば膵臓癌の治療における使用に好適である。
【０２１５】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療における使用に好適である。
【０２１６】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮細胞癌の治療における使用に好適である。
【０２１７】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管癌の治療における使用に好適である。
【０２１８】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療における使用に好適である。
【０２１９】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療における使用に好適である。
【０２２０】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、脳腫瘍の治療における使用に好適である。
【０２２１】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療における使用に好適である。
【０２２２】
本明細書に記載する本発明のいくつかの実施形態では、そして、以下に記載する付番した実施形態のそれぞれ、及び全てのもののいくつかの実施形態では、充実性腫瘍は泌尿生殖器癌である。
【０２２３】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療における使用に好適である。
【０２２４】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頚癌の治療における使用に好適である。
【０２２５】
Ｔ４３７Ｒ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の転移性病変の治療における使用に好適である。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、抗体は配列番号：６４のＨＣを含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＡＤＣＣを介在する。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＡＤＣＣを介在する。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＡＤＣＰを介在する。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＡＤＣＰを介在する。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＣＤＣを介在する。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＣＤＣを介在する。
【０２３４】
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３）、又はＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）を導入することにより、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強させるための、既報のＦｃを改変する試みにより、ＡＤＣＣを消失した抗体が得られた。Ｃｈｕ及びＭｉｍｏｔｏにより説明される抗体とは対照的に、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む本発明のＩｇＧ１抗体を、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望される場合に使用することができる。例示的なこのような例は、腫瘍微小環境でＧＩＴＲ及び／又はＯＸ−４０発現Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させて、抗腫瘍免疫効果を増強させるというものである。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃが介在するエフェクター機能を低減させる又は消失させる第２の変異を、更に含んでよい。Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、及び、抗体Ｆｃが介在するエフェクター機能を低減させる又は消失させる第２の変異を含む、本発明の抗体はそれ故、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望されない場合で使用することができる。例示的なこのような例は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療処置である。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異を更に含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異を更に含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、配列番号：６９の定常領域を含む。
【０２４２】
2019533427.tif 000011
【０２４３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、配列番号：７０の定常領域を含む。
【０２４６】
2019533427.tif 000012
【０２４７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異を更に含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、配列番号：７１の定常領域を含む。
【０２５６】
2019533427.tif 000013
【０２５７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、抗体架橋とは無関係なアゴニスト活性を有し、アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞からの、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の、抗体により誘導された産生を測定することにより測定される。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号：１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号：２）、リンホトキシンβ受容体（配列番号：３）、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ４０（配列番号：５）、Ｆａｓ受容体（配列番号：６）、デコイ受容体３（配列番号：７）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ３０（配列番号：９）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、細胞死受容体４（配列番号：１１）、細胞死受容体５（配列番号：１２）、デコイ受容体１（配列番号：１３）、デコイ受容体２（配列番号：１４）、ＲＡＮＫ（配列番号：１５）、オステオプロテゲリン（配列番号：１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号：１７）、ＴＡＣＩ（配列番号：１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号：１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（配列番号：２０）、神経成長因子受容体（配列番号：２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号：２２）、ＧＩＴＲ（配列番号：２３）、ＴＲＯＹ（配列番号：２４）、細胞死受容体６（配列番号：２５）、細胞死受容体３（配列番号：２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号：２７）を結合する。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）を結合する。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号：４）を結合する。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号：８）を結合する。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号：５）を結合する。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号：１０）を結合する。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号：２３）を結合する。
【０２６６】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば癌の治療における使用に好適である。
【０２６７】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば癌の治療における使用に好適である。
【０２６８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、充実性腫瘍の治療における使用に好適である。
【０２６９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療における使用に好適である。
【０２７０】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療における使用に好適である。
【０２７１】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療における使用に好適である。
【０２７２】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平ＮＳＣＬＣの治療における使用に好適である。
【０２７３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療における使用に好適である。
【０２７４】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、腎臓明細胞癌、若しくは腎臓乳頭状細胞癌）、又はこれらの転移性病変の治療における使用に好適である。
【０２７５】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療における使用に好適である。
【０２７６】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の治療における使用に好適である。
【０２７７】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療における使用に好適である。
【０２７８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療における使用に好適である。
【０２７９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療における使用に好適である。
【０２８０】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療における使用に好適である。
【０２８１】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療における使用に好適である。
【０２８２】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、肝癌の治療における使用に好適である。
【０２８３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば膵臓癌の治療における使用に好適である。
【０２８４】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療における使用に好適である。
【０２８５】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮細胞癌の治療における使用に好適である。
【０２８６】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管癌の治療における使用に好適である。
【０２８７】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療における使用に好適である。
【０２８８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療における使用に好適である。
【０２８９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、脳腫瘍の治療における使用に好適である。
【０２９０】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療における使用に好適である。
【０２９１】
本明細書に記載する本発明のいくつかの実施形態では、そして、以下に記載する付番した実施形態のそれぞれ、及び全てのもののいくつかの実施形態では、充実性腫瘍は泌尿生殖器癌である。
【０２９２】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療における使用に好適である。
【０２９３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば子宮頚癌の治療における使用に好適である。
【０２９４】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の転移性病変の治療における使用に好適である。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、抗体は配列番号：６５のＨＣを含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＡＤＣＣを介在する。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、ＡＤＣＣを介在する。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＡＤＣＰを介在する。
【０３００】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、ＡＤＣＰを介在する。
【０３０１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＣＤＣを介在する。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、ＣＤＣを介在する。
【０３０３】
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３）、又はＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）を導入することにより、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニスト活性を増強させるための、既報のＦｃを改変する試みにより、ＡＤＣＣを消失した抗体が得られた。Ｃｈｕ及びＭｉｍｏｔｏにより説明される抗体とは対照的に、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む本発明のＩｇＧ１抗体を、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望される場合に使用することができる。例示的なこのような例は、腫瘍微小環境でＧＩＴＲ及び／又はＯＸ−４０発現Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させて、抗腫瘍免疫を増強させるというものである。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃが介在するエフェクター機能を低減させる又は消失させる第２の変異を更に含んでよい。Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異、及び、抗体Ｆｃが介在するエフェクター機能を低減させる又は消失させる第２の変異を含む、本発明の抗体はそれ故、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が所望されない場合で使用することができる。例示的なこのような例は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療処置である。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ変異を更に含む。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ変異を更に含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、場合によりＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態において、抗体は配列番号：７２のＨＣを含む。
【０３１１】
2019533427.tif 000014
【０３１２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０３１３】
いくつかの実施形態において、抗体は配列番号：７３のＨＣを含む。
【０３１４】
2019533427.tif 000015
【０３１５】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプのものであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ変異を更に含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して、場合によりＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異を更に含む。
【０３１８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０３２０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む。
【０３２１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ変異を更に含む。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、場合によりＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０３２３】
いくつかの実施形態において、抗体は配列番号：７４のＨＣを含む。
【０３２４】
2019533427.tif 000016
【０３２５】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を更に含む。
【０３２６】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
【０３２７】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、抗体架橋とは無関係なアゴニスト活性を有し、アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞からの、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の、抗体により誘導された産生を測定することにより測定される。
【０３２８】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号：１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号：２）、リンホトキシンβ受容体（配列番号：３）、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ４０（配列番号：５）、Ｆａｓ受容体（配列番号：６）、デコイ受容体３（配列番号：７）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ３０（配列番号：９）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、細胞死受容体４（配列番号：１１）、細胞死受容体５（配列番号：１２）、デコイ受容体１（配列番号：１３）、デコイ受容体２（配列番号：１４）、ＲＡＮＫ（配列番号：１５）、オステオプロテゲリン（配列番号：１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号：１７）、ＴＡＣＩ（配列番号：１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号：１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（配列番号：２０）、神経成長因子受容体（配列番号：２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号：２２）、ＧＩＴＲ（配列番号：２３）、ＴＲＯＹ（配列番号：２４）、細胞死受容体６（配列番号：２５）、細胞死受容体３（配列番号：２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号：２７）を結合する。
【０３２９】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）を結合する。
【０３３０】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号：４）を結合する。
【０３３１】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号：８）を結合する。
【０３３２】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号：５）を結合する。
【０３３３】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号：１０）を結合する。
【０３３４】
いくつかの実施形態において、抗体はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号：２３）を結合する。
【０３３５】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療における使用に好適である。
【０３３６】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療における使用に好適である。
【０３３７】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、充実性腫瘍の治療における使用に好適である。
【０３３８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療における使用に好適である。
【０３３９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療における使用に好適である。
【０３４０】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療における使用に好適である。
【０３４１】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平ＮＳＣＬＣの治療における使用に好適である。
【０３４２】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療における使用に好適である。
【０３４３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、腎臓明細胞癌、若しくは腎臓乳頭状細胞癌）、又はこれらの転移性病変の治療における使用に好適である。
【０３４４】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療における使用に好適である。
【０３４５】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の治療における使用に好適である。
【０３４６】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療における使用に好適である。
【０３４７】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療における使用に好適である。
【０３４８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療における使用に好適である。
【０３４９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療における使用に好適である。
【０３５０】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療における使用に好適である。
【０３５１】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、肝癌の治療における使用に好適である。
【０３５２】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療における使用に好適である。
【０３５３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療における使用に好適である。
【０３５４】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮細胞癌の治療における使用に好適である。
【０３５５】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管癌の治療における使用に好適である。
【０３５６】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療における使用に好適である。
【０３５７】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療における使用に好適である。
【０３５８】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、脳腫瘍の治療における使用に好適である。
【０３５９】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療における使用に好適である。
【０３６０】
本明細書に記載する本発明のいくつかの実施形態では、そして、以下に記載する付番した実施形態のそれぞれ、及び全てのもののいくつかの実施形態では、充実性腫瘍は泌尿生殖器癌である。
【０３６１】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療における使用に好適である。
【０３６２】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頚癌の治療における使用に好適である。
【０３６３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の転移性病変の治療における使用に好適である。
【０３６４】
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在細胞傷害」、すなわち「ＡＤＣＣ」は、エフェクター細胞で発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）によって、抗体被覆標的細胞の、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に依存して、細胞死を誘導する機序である。例えば、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。ＴＮＦＲ発現細胞などの抗体被覆標的細胞の死滅は、膜孔形成タンパク質及びプロテアーゼの分泌によるエフェクター細胞の活動が理由で生じる。本発明の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、抗体を、その抗体が結合する標的を発現する細胞に、免疫エフェクター細胞と組み合わせて添加してよく、これは、標的細胞の細胞溶解をもたらす抗原抗体複合体により活性化され得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。そのようなアッセイの代表的なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、標的細胞１に対してエフェクター細胞５０の比で使用する。標的細胞をＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により３７℃で２０分間前標識し、２回洗浄し、ＤＭＥＭ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）中に再懸濁する。標的細胞（１×１０4個）及びエフェクター細胞（０．５×１０6個）を一緒にし、１００μＬの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに加える。追加の１００μＬを、試験抗体と共に、又は試験抗体なしで添加する。プレートは、２００ｇで３分間遠心分離され、３７℃で２時間培養され、次に、２００ｇで３分間再び遠心分離される。１ウェル当たり合計２０μＬの上清が除去され、細胞溶解が、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ  Ｅｕｒｏｐｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって測定される。データは、０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大細胞傷害に対して正規化され、また抗体の非存在下での標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小値の対照が決定される。あるいは、ＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載されるとおり、受容体の活性化によりルシフェラーゼレポーターの発現がもたらされるレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＡの活性化を評価することにより評価することができる。
【０３６５】
「抗体依存性細胞貪食作用」（「ＡＤＣＰ」）とは、例えばマクロファージ又は樹状細胞などの貪食細胞による取り込みにより、抗体被覆標的細胞を排除する機序を指す。ＡＤＣＰは、単核細胞由来のマクロファージを、エフェクター細胞及びＤａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２１３（商標）として、又は抗体が結合する標的を、ＧＦＰ又は別の標識された分子を発現するように改変された標的細胞として発現する、Ｂ細胞白血病若しくはリンパ腫若しくは腫瘍細胞として使用することにより評価されてよい。エフェクター細胞と標的細胞の比は、例えば４：１であってよい。エフェクター細胞を、標的細胞と共に、試験抗体を添加し又は添加せずに４時間インキュベートすることができる。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体により識別され得るが、貪食作用の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１+及びＣＤ１４+マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。
【０３６６】
本発明の抗体のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣは、抗体の、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）又は補体への結合を増強させる追加の変異を、抗体Ｆｃに導入することにより更に増強することができる。
【０３６７】
変異により、本発明の抗体の活性化ＦｃγＲへの結合を増加させる、かつ／又は抗体エフェクター機能を増強させることができるＦｃ位置は、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許公開第２０１５／０２５９４３４号、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６０４）（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：４００５〜１０）（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：８８８２〜９０）（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：２５１７〜２７）（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３）に記載されているものであり、位置２３６、２３９、２４３、２５６、２９０、２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（残基番号はＥＵインデックスに従う）を含む。単一で、又は組み合わせて作製可能な例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ、及びＰ３９６Ｌ変異である。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加した抗体をもたらす、例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１における、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異である。
【０３６８】
変異により、本発明の抗体のＣＤＣを増強させることが可能なＦｃ位置は、例えば、国際公開第２０１４／１０８１９８号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５７１〜５）及び（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ２：１８１〜９）に記載されているものであり、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５、及び４３０が挙げられる。単一で、又は組み合わせて作製可能な例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、及びＥ４３０Ｔ変異である。ＣＤＣが増加した抗体をもたらす、例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１における、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ変異である。
【０３６９】
「補体依存性細胞傷害」すなわち「ＣＤＣ」は、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合してこれを活性化し、かかる補体成分Ｃ１ｑが次に補体カスケードを活性化して標的細胞の細胞死をもたらす、細胞死を誘導するための機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせ得、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＡＤＣＣを容易にする。細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、１×１０5個／ウェル（５０μＬ／ウェル）でＲＰＭＩ−Ｂ（１％のＢＳＡを添加したＲＰＭＩ）に蒔き、５０μＬの試験抗体を、０〜１００μｇ／ｍＬの終濃度でウェルに添加し、反応を１５分間室温でインキュベートし、１１μＬのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応を４５分間３７℃でインキュベートすることにより測定することができる。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
【０３７０】
本発明の抗体がＡＤＣＣを誘導する能力は、それらのオリゴ糖補体を改変することによってもまた増強させることができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ−グリコシル化される。グリカンのほとんどは、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態のものである。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により生成される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に付加された二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ活性を変更することなく、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の改善によって抗体のＡＤＣＣを増強する。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化抗体の良好な発現をもたらすことが報告された種々の方法、例えば、培養物浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４：２４９〜６５）、多様体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜４０）、多様体ＣＨＯ株ＥＢ６６の宿主細胞株としての適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ  ２：４０５〜１５）、ラットハイブリドーマ細胞ＹＢ２／０の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜７３）、低分子干渉ＲＮＡを、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的に導入すること（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１〜８）、又は、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα−マンノシダーゼＩＩ、若しくは潜在的なα−マンノシダーゼＩ阻害剤、キフネンシンの同時発現（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３：８５１〜６１；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：５０３２〜６）を使用して達成することができる。
【０３７１】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣを増強させる第２の変異を含む。
【０３７２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｇ２３６Ａ変異、Ｓ２３９Ｄ変異、Ｆ２４３Ｌ変異、Ｔ２５６Ａ変異、Ｋ２９０Ａ変異、Ｒ２９２Ｐ変異、Ｓ２９８Ａ変異、Ｙ３００Ｌ変異、Ｖ３０５Ｌ変異、Ｋ３２６Ａ変異、Ａ３３０Ｋ変異、Ｉ３３２Ｅ変異、Ｅ３３３Ａ変異、Ｋ３３４Ａ変異、Ａ３３９Ｔ変異、Ｐ３９６Ｌ変異、Ｓ２６７Ｅ変異、Ｈ２６８Ｆ変異、Ｓ３２４Ｔ変異、Ｋ３２６Ａ変異、Ｋ３２６Ｗ変異、Ｅ３３３Ａ変異、Ｅ４３０Ｓ変異、Ｅ４３０Ｆ変異、及びＥ４３０Ｔ変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣを増強させる第２の変異を含む。
【０３７３】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ変異、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ変異、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ変異、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ変異、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣを増強させる第２の変異を含む。
【０３７４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、約０％〜約１５％、例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％  １０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。
【０３７５】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％  １０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。
【０３７６】
「フコース含量」とは、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらは、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるように、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ構造及び高マンノース構造）の使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ  Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素を用いた消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ）による、ｍＡｂの成分ペプチドへの消化、並びにそれに続くＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＣ）による分離、検出、及び定量化、あるいは５）Ａｓｎ２９７でＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた酵素による特異的脱グリコシル化による、ｍＡｂタンパク質からのｍＡｂオリゴ糖の分離、により特性評価され、定量化され得る。放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識され、分離され、グリカン構造の細かな特性評価を可能にする様々な補足的技術、すなわち、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ  Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ  Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光（ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量によって特定することが可能であ。
【０３７７】
「低フコース」又は「低フコース含量」とは、約０％〜約１５％のフコース含量を有する抗体を意味する。
【０３７８】
「正常なフコース」又は「正常なフコース含量」とは、約５０％を超える、通常は約６０％、７０％、８０％を超える、又は８５％を超えるフコース含量を有する抗体を意味する。
【０３７９】
エフェクター機能が所望されない場合において、本発明の抗体を更に改変して、抗体Ｆｃ内に、抗体の、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低下させる、かつ／又は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低下させる、少なくとも１個の変異を導入してよい。
【０３８０】
変異により、抗体の活性化ＦｃγＲへの結合を低下させ、続いてエフェクター機能を低下させることができるＦｃ位置は、例えば、（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６０４）、国際公開第２０１１／０６６５０１号、米国特許第６，７３７，０５６号及び同第５，６２４，８２１号、（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００：１６〜２６）、（Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７〜４３）Ａ、（Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：４０３〜１１）、（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：５６３〜７１）、（Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１２５６〜６４）、（Ｇｈｅｖａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：２９２９〜３８）、（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ  １：５７２〜９）に記載されているものであり、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単一で、又は組み合わせて作製可能な例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低下するように作製可能な例示的な組み合わせ変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４におけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７〜２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１〜４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４  Ｆｃドメインを使用してもよい。
【０３８１】
Ｓ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に作製して、ＩｇＧ４の安定性を増強させることができる。
【０３８２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｋ２１４Ｔ変異、Ｅ２３３Ｐ変異、Ｌ２３４Ｖ変異、Ｌ２３４Ａ変異、Ｇ２３６欠失、Ｖ２３４Ａ変異、Ｆ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、Ｐ２３８Ａ変異、Ｐ２３８Ｓ変異、Ｄ２６５Ａ変異、Ｓ２６７Ｅ変異、Ｈ２６８Ａ変異、Ｈ２６８Ｑ変異、Ｑ２６８Ａ変異、Ｎ２９７Ａ変異、Ａ３２７Ｑ変異、Ｐ３２９Ａ変異、Ｄ２７０Ａ変異、Ｑ２９５Ａ変異、Ｖ３０９Ｌ変異、Ａ３２７Ｓ変異、Ｌ３２８Ｆ変異、Ａ３３０Ｓ変異、及びＰ３３１Ｓ変異からなる群から選択される第２の変異を含み、残基番号はＥＵインデックスに従う。
【０３８３】
本発明の抗体を、例えば、（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２３５１４〜２４）、（Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：１５７〜９）、（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：６２１３〜６）、（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６〜５６）、（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６０４）、（Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９〜６９）、（Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３５：８６〜９４）、（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１２８３〜８）、（Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０：３２６９〜７７）、及び（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２８１９〜２５）に記載されているものなどの、更なるＦｃ変異を導入することにより更に改変して、抗体の半減期を更に調節してよく、かかる変異は位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５を含む。単一で、又は組み合わせて作製可能な例示的な変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒ変異である。抗体の半減期を延長させるために作製可能な、例示的な単一又は組み合わせの変異は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異である。抗体の半減期を短縮するために作製可能な、例示的な単一又は組み合わせの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒ変異である。
【０３８４】
保存的改変を更に含む本発明の抗体は、本発明の範囲内である。
【０３８５】
「保存的改変」とは、保存的改変を含有する抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的置換は、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、ポリペプチドの任意の天然残基もまた、アラニン・スキャニング変異導入について以前に述べられているように、アラニンで置換することができる。本発明の抗体におけるアミノ酸置換は、既知の方法、例えばＰＣＲによる変異導入により行うことができる。あるいは、変異体のライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
【０３８６】
本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又は自然に生じない共有改変（例えば、ポリエチレングリコール部分の付加（ＰＥＧ化）及び脂質化）などのプロセスにより、翻訳後に改変することができる。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体にポリエチレングリコールをコンジュゲートさせる（ＰＥＧ化）ことによって薬物動態のプロファイルを向上させることができる。コンジュゲートは当業者に既知の技術によって行われ得る。治療用抗体のＰＥＧとのコンジュゲートによって機能を低下させずに薬力学的動態が増強することが示されている。
【０３８７】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するために改変され得る本発明の抗体は、本発明の範囲内である。抗体の安定性は、（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとのペアリングに影響を及ぼすタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基のためのＨ結合ネットワーク、並びに（５）他の分子内及び分子間力における表面電荷及び極性残基の分布、を含む幾つかの因子によって影響を受ける。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、抗体の安定性に対する残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つには、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔm）を高くするというものがある。一般に、タンパク質のＴmはその安定性と相関し、溶液中でのアンフォールディング及び変性に対する感度、並びに、タンパク質のアンフォールディングのし易さに応じた分解プロセスと逆相関する。多数の研究により、ＤＳＣにより熱安定性として測定した、配合物の物理的安定性の格付けと、他の方法によって測定した物理的安定性の格付けとの相関が見出されている（Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４０：１５５〜６８；Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：２００〜８；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８：２００３；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：１３５３〜６１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜８９）。配合物の研究により、ＦａｂのＴmは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。
【０３８８】
Ｃ末端リジン（ＣＴＬ）は、血流におけるカルボキシペプチダーゼの体内循環により、注入した抗体から取り除くことができる（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８：４０４〜１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ2+、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ−Ｆｅ3+の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。抗体のＣＴＬ含量は、公知の方法を用いて測定することができる。
【０３８９】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約４０％〜約７０％、約５５％〜約７０％、又は約６０％の、Ｃ末端リジン含量を有する。
【０３９０】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、約０％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＣ末端リジン含量を有する。
【０３９１】
本発明の抗体の作製方法
改変Ｆｃドメインを有する本発明の抗体を、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４配列を鋳型として使用する、標準的なクローニング及び発現技術を使用して生成することができる。例えば、部位特異的変異導入又はＰＣＲによる変異導入を行い、変異を抗体Ｆｃに導入してよく、抗体のＦｃγＲへの結合効果、アゴニスト活性、又は他の対象の特性を、本明細書に記載の方法を使用して評価することができる。
【０３９２】
抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のＶＨ及びＶＬドメインを、新規に生成してよい。
【０３９３】
例えば、（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜７のハイブリドーマ法を使用して、モノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマ法において、マウス、又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット、若しくはサルを、ヒトＴＮＦＲ、又はＴＮＦＲの細胞外ドメインで免疫した後、免疫した動物の脾臓細胞を、標準的な方法を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原親和性などの所望の特性を有する抗体の生成についてスクリーニングする。
【０３９４】
様々な宿主動物を使用して、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体を作製することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス抗ヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外の動物において作製された抗体を、よりヒトに近い配列を生成するための様々な技術を使用してヒト化することもできる。
【０３９５】
ヒトアクセプターフレームワークの選択を含む、例示的なヒト化技術が知られており、ＣＤＲグラフティング（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフティング（同第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９〜９８）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５６号）、又は超ヒト化（同第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに親抗体のＣＤＲを移植する。
【０３９６】
ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレームワーク支持残基を組み込むこと（復帰突然変異）によって、又は任意のＣＤＲに変異を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
【０３９７】
例えば、ゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座位を有するマウス又はラットなどのトランスジェニック動物を使用して、標的タンパク質に対するヒト抗体を生成することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９）、（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３〜２１）、（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５〜９３）、（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３〜６）に記載されている。このような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組み換えを用いて、導入染色体（transchromosome）を用いて、又はミニ遺伝子を用いて、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。
【０３９８】
ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーから選択することができ、ここでファージは、ヒト免疫グロブリン、あるいは例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対化若しくは対化抗体可変領域などのそれらの部分を発現するよう改変されている。本発明の抗体は、例えば（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６）、及び国際公開第０９／０８５４６２号に記載されているように、バクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質を有する融合タンパク質として、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリーから、単離されてよい。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＴＮＦＲのファージ結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長のＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。
【０３９９】
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、抗原は、当該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
【０４００】
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のＶＨ／ＶＬ領域はまた、既存の抗ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体抗体から入手することもできる。
【０４０１】
米国特許第８１３３９８３号、同第７９６０５１５号、米国特許公開第２０１３／０２８０２７５号、国際公開第２０１３／０２８２３１号、及び米国特許公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている、抗ＯＸ４０抗体のＶＨ及びＶＬ領域を使用して、本発明の抗体を改変することができる。更に、抗ＯＸ４０抗体ＭＥＤＩ−６４６９、ＢＭＳ−９８６１７８、ＭＯＸＲ−０９１６、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−０５６２、ＰＦ−０４５１８６００、又はＧＳＫ−３１７４９９８のＶＨ／ＶＬ領域を使用してよい。本発明の改変抗ＯＸ４０抗体を生成するために使用可能な、例示的なＶＨ及びＶＬ領域は、以下のとおりである：
【０４０２】
配列番号：５１（米国特許出願第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗体ＳＦ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０４０３】
配列番号：５２（米国特許出願第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗体ＳＦ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０４０４】
配列番号：５３（米国特許出願第２０１４／０３７７２８４号に記載されている１２Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０４０５】
配列番号：５４（米国特許出願第２０１４／０３７７２８４号に記載の１２Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０４０６】
配列番号：５５（米国特許出願第２０１４／０３７７２８４号に記載されている２０Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＳＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＮＹＹＧＳＳＬＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０４０７】
配列番号：５６（米国特許出願第２０１４／０３７７２８４号に記載の２０Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０４０８】
本発明の抗体を改変するために使用可能な抗ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、それぞれ米国特許第７，２８８，２５１号（抗体２１．４．１）及び同第８，３０３，９５５号に記載されている、ＣＰ−８７０，８９３及びヒト化Ｓ２Ｃ６、並びに、国際公開第２００１／０５６６０３号、同第２００１／０８３７５５号、同第２０１３／０３４９０４号、及び同第２０１４／０７０９３４号に記載されている抗ＣＤ４０抗体のものである。本発明の改変抗ＣＤ４０抗体を生成するために使用可能な、例示的なＶＨ及びＶＬ領域は、以下のとおりである：
【０４０９】
配列番号：５７（Ｍ９抗体のＶＨ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＩＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＮＩＹＹＲＧＤＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＦＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０４１０】
配列番号：５８（Ｍ９抗体のＶＬ）
ＱＳＡＬＴＱＰＰＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＶＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＮＮＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０４１１】
本発明の抗体を改変するために使用可能な、抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、米国特許第７，８１２，１３５号、同第８，５９１，８８６号、及び同第７，６１８，６３２号、又は国際公開第２０１１／０２８６８３号、同第２０１３／０３９９５４号、同第２００５／００７１９０号、及び同第２００７／１３３８２２号に記載されているものである。
【０４１２】
本発明の抗体を改変するために使用可能な、抗ＣＤ２７抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、米国特許第９１６９３２５号、及び米国特許公開第２０１３０１８３３１６号に記載されているものである。
【０４１３】
本発明の抗体を改変するために使用可能な、抗ＣＤ１３７抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、米国特許第７２８８６３８号、同第８７１６４５２号、及び同第８８２１８６７号に記載されているものである。
【０４１４】
完全長の二重特異性抗体に改変された本発明の抗体は、本発明の範囲内である。
【０４１５】
「完全長の抗体」とは、２つの完全長抗体重鎖、及び２つの完全長抗体軽鎖を有する抗体を意味する。完全長の抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖可変ドメイン及び定常ドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。完全長の抗体軽鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインＶＬ及びＣＬからなる。完全長の抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠いていてもよい。
【０４１６】
完全長二重特異性抗体は、例えば、インビトロで無細胞環境下にて、又は同時発現を使用して、各半分子の重鎖ＣＨ３界面において置換を導入することにより、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成を補助する、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を用い、生成することができる。「Ｆａｂアーム」又は「半分子」とは、抗原に特異的に結合する、１つの重鎖−軽鎖対を意味する。
【０４１７】
Ｆａｂアームの交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果として生じる。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に改変されてもよい。得られる生成物は、それぞれが異なるエピトープ、即ち、ＴＮＦＲ上のエピトープと第２の抗原上のエピトープを結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【０４１８】
「ホモ二量体化」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。「ホモ二量体」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０４１９】
「ヘテロ二量体化」とは、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。「ヘテロ二量体」とは、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０４２０】
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ノブ−イン−ホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ−ｍａｔｃｈｅｄ）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、鎖交換改変ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）を使用して二重特異性フォーマットに改変することができる。
【０４２１】
「ノブ−イン−ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照）において、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異を導入され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の同時発現後、「ホール」を有する重鎖の、「ノブ」を有する重鎖との好ましい相互作用により、ヘテロ二量体が形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置：Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖとして表現される。
【０４２２】
ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術において、「ノブ−イン−ホール」戦略を利用してＦａｂアーム交換を促進することに加えて、半アームのうちの１つに、得られる二重特異性抗体の正しい軽鎖対形成を保証するために交換されたＣＨ１及びＣＬドメインを有する（例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照されたい）。
【０４２３】
他の交差戦略を使用して、一方のアーム又は両方のアームのいずれかにおける、重鎖と軽鎖との間若しくは二重特異性抗体の重鎖内の、可変領域若しくは定常領域、又は両方の領域を交換することによって、完全長二重特異性抗体を生成することができる。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第２００９／０８０２５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２００９／０８０２５２号に記載されるＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣＬ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
【０４２４】
米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるような他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進を使用して、二重特異性抗体を作製することができる。他の手法では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号に記載されているように、以下の置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表す）により促進することができる。
【０４２５】
ＬＵＺ−Ｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。この技術では、ロイシンジッパーをＣＨ３ドメインのＣ末端に付加して、（Ｗｒａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７：４３３３１〜９）に記載されるように、精製後に除去される親ｍＡｂからヘテロ二量体アセンブリを駆動する。
【０４２６】
ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許第２００７／０２８７１７０号に記載されるように、ヘテロ二量体化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ残基を有する。
【０４２７】
二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号（ＤｕｏＢｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下で、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、セルフリー環境においてインビトロで生成されてもよい。この方法においては、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように改変されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合の異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換によって二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る還元剤の例は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン及びβ−メルカプトエタノールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
【０４２８】
抗体ドメイン及び番号は、周知である。「非対称」とは、抗体内の２本の別の重鎖の２つのＣＨ３ドメインにおける、同一でない置換を意味する。ＩｇＧ１  ＣＨ３領域は通常、ＩｇＧ１上の残基３４１〜４４６（残基番号はＥＵインデックスに従う）からなる。
【０４２９】
本発明の抗体は、様々な周知の抗体形態に設計されてもよい。
【０４３０】
Ｆｃドメイン含有分子
本発明は、ＦｃドメインにＴ４３７Ｒ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む、単離されたＦｃドメイン含有分子もまた提供する。
【０４３１】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ変異を含む。
【０４３２】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含む。
【０４３３】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含む。
【０４３４】
いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
【０４３５】
いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ１アイソタイプである。
【０４３６】
いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ２アイソタイプである。
【０４３７】
いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ３アイソタイプである。
【０４３８】
いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ４アイソタイプである。
【０４３９】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０４４０】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０４４１】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０４４２】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０４４３】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０４４４】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０４４５】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０４４６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０４４７】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０４４８】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０４４９】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０４５０】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０４５１】
哺乳類ＩｇＧ重鎖の定常領域配列は、配列中でＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３として示される。ＩｇＧの「ヒンジ」、「ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」は一般に、ＥＵインデックスに従うと、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６を含み、Ｐｒｏ２３０で終結するとして定義されるが、機能的には、鎖の可撓性部分は、Ｇｌｕ２１６〜Ｇｌｙ２３７などの上部及び下部ヒンジ領域と称される追加の残基を含むと見なされてもよく、下部ヒンジは、ＦｃγＲ結合が一般に寄与される、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３９と称される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間のＳ−Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列されてもよい。ＥＵインデックスにより番号表記されるため、境界は僅かに異なり得るが、ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインと、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対するアミノ末端とに隣接し、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端寄りの）定常領域、例えば、ＥＵ位置でおよそ１１８〜２１５を含む。Ｆｃドメインはアミノ酸２３１からアミノ酸４４７に延び、ＣＨ２ドメインは、およそＡｌａ２３１からＬｙｓ３４０又はＧｌｙ３４１までであり、ＣＨ３はおよそＧｌｙ３４１又はＧｌｎ３４２からＬｙｓ４４７までである。ＣＨ１領域のＩｇＧ重鎖定常領域の残基は、Ｌｙｓで終結する。Ｆｃドメイン含有分子は、抗体定常領域の、少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、それ故、ＩｇＧ重鎖定常領域のおよそＡｌａ２３１からＬｙｓ４４７までの領域を含む。Ｆｃドメイン含有分子は場合により、ヒンジ領域の少なくとも一部を含んでよい。
【０４５２】
例示的なＦｃドメイン含有分子は、異種タンパク質、又はタンパク質の一部（表１に記載しているものなどの、例えばペプチド、サイトカイン、ケモカイン、又は膜タンパク質の細胞外ドメイン（例えば、ＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメイン））に結合した、抗体定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む異種融合タンパク質である。
【０４５３】
本発明のＦｃドメイン含有分子は、標準的な分子生物学的技術により作製することができる。
【０４５４】
本発明は、本発明のＦｃドメイン含有分子をコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４５５】
本発明は、配列番号：７５のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４５６】
本発明は、配列番号：７６のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４５７】
本発明は、配列番号：７７のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４５８】
本発明は、配列番号：７８のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４５９】
本発明は、配列番号：７９のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６０】
本発明は、配列番号：８０のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６１】
本発明は、配列番号：８１のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６２】
本発明は、配列番号：８２のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６３】
本発明は、配列番号：８３のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６４】
本発明は、配列番号：８４のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６５】
本発明は、配列番号：８５のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６６】
本発明は、配列番号：８６のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた提供する。
【０４６７】
配列番号：７５  ＩｇＧ１  Ｔ４３７ＲをコードするｃＤＮＡ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧ
【０４６８】
配列番号：７６  ＩｇＧ１  Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８ＥをコードするｃＤＮＡ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧ
【０４６９】
配列番号：７７  ＩｇＧ１  Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８ＡをコードするｃＤＮＡ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＧＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
【０４７０】
配列番号：７８  ＩｇＧ１ｓｉｇｍａ  Ｔ４３７ＲをコードするｃＤＮＡ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ
【０４７１】
配列番号：７９  ＩｇＧ１ｓｉｇｍａ  Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８ＥをコードするｃＤＮＡ
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【０４７８】
配列番号：８６  ＩｇＧ４ＰＡＡ  Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８ＡをコードするｃＤＮＡ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＴＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡ
【０４７９】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０４８０】
本発明は、配列番号：７５のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８１】
本発明は、配列番号：７６のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８２】
本発明は、配列番号：７７のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８３】
本発明は、配列番号：７８のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８４】
本発明は、配列番号：７９のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８５】
本発明は、配列番号：８０のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８６】
本発明は、配列番号：８１のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８７】
本発明は、配列番号：８２のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８８】
本発明は、配列番号：８３のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４８９】
本発明は、配列番号：８４のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４９０】
本発明は、配列番号：８５のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４９１】
本発明は、配列番号：８６のポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。
【０４９２】
また、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０４９３】
本発明は、Ｆｃドメイン含有分子が発現する条件で、本発明の宿主細胞を培養することと、Ｆｃドメイン含有分子を単離することとを含む、本発明のＦｃドメイン含有分子の作製方法もまた提供する。
【０４９４】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン含有分子は抗体である。
【０４９５】
医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子、及び製薬上許容できる担体を含む医薬組成物もまた提供する。治療用途では、本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子は、製薬上許容できる担体中に活性成分として、有効量の抗体又はＦｃドメイン含有分子を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤等を含むことができる。このような医薬製剤中の本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子の濃度は、約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１st  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０４９６】
治療用途のための、本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子の投与経路は、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子としての製剤を使用し、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当該技術分野において周知の、当業者が理解する他の手段に含有される、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与などの、抗体を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【０４９７】
本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の好適な経路によって対象に投与することができる。静脈内注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、若しくは２４０分間にわたって、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２時間にわたって行ってよい。
【０４９８】
対象に投与される用量は、治療されている疾患を緩和する又は少なくとも部分的に停止させるのに十分（「治療的に有効な量」）なものであり、時に、０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ若しくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ若しくは約２４ｍｇ／ｋｇ、又は例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／ｋｇであり得るが、更に多量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０４９９】
例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの一定の単位用量を与えてもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ2の用量を与えてもよい。通常、１〜８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。
【０５００】
本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後に繰り返すことができる。治療コースを繰り返してもよく、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であってもよいし、又は異なる用量であってもよい。例えば、本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子は、静脈内注入により８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで１週間間隔で８週間にわたり投与され、８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで２週間毎に更に１６週間の投与が続き、その後、８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで４週間毎の投与を続けて行うことができる。
【０５０１】
例えば、本発明の方法における抗体又はＦｃドメイン含有分子は、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０日目のうちの少なくとも１日に、又は代替として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、又はこれらの任意の組み合わせで、２４、１２、８、６、４、又は２時間毎の単一用量又は分割用量を使用して、又はこれらの任意の組み合わせで、提供され得る。
【０５０２】
本発明の方法における抗体又はＦｃドメイン含有分子はまた、癌の進行リスクを低減させ、癌の進行におけるイベントの発生の開始を遅延させ、かつ／又は癌が緩解した際の再発リスクを低減させるために、予防的に投与されてもよい。
【０５０３】
本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子は、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体で再構成することができる。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
【０５０４】
方法及び使用
本発明の抗体又はＦｃドメイン含有分子は、インビトロ及びインビボで、診断上、並びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体を、培養中の細胞にインビトロ若しくはエクスビボで投与して、又は対象に投与して、癌及び感染性疾患などの様々な疾患を治療、予防及び／若しくは診断することができる。
【０５０５】
本発明は、対象における、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強させる方法であって、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を準備することと、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｋ２４８Ｅ変異、Ｋ３３８Ａ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する改変抗体を生成することと、改変抗体を対象に投与することとを含む、方法を提供する。
【０５０６】
本発明は、対象における癌の治療方法であって、対象に、癌を治療するのに十分な時間、Ｔ４３７Ｒ変異、Ｋ２４８Ｅ変異、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異、又はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅを含むＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する抗体を投与することを含む、方法もまた提供する。
【０５０７】
本発明の方法において、抗体はＡＤＣＣを介在する。
【０５０８】
本発明の方法において、抗体はＡＤＣＰを介在する。
【０５０９】
本発明の方法において、抗体はＣＤＣを介在する。
【０５１０】
本発明のいくつかの方法において、抗体は、抗体架橋とは無関係な抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのアゴニスト活性を増強させ、アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞からの、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の、抗体により誘導された産生を測定することにより測定される。
【０５１１】
本発明の方法において、抗体は場合により、ＡＤＣＣを低減させる第２の変異を更に含む。
【０５１２】
本発明の方法において、対象はウイルス感染を有する。
【０５１３】
本発明の方法において、対象は癌を有する。
【０５１４】
本発明の方法において、癌は充実性腫瘍である。
【０５１５】
本発明の方法において、充実性腫瘍は、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頚癌、又は癌の転移性病変である。
【０５１６】
本発明の方法において、ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体１（配列番号：１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号：２）、リンホトキシンβ受容体（配列番号：３）、ＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ４０（配列番号：５）、Ｆａｓ受容体（配列番号：６）、デコイ受容体３（配列番号：７）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ３０（配列番号：９）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、細胞死受容体４（配列番号：１１）、細胞死受容体５（配列番号：１２）、デコイ受容体１（配列番号：１３）、デコイ受容体２（配列番号：１４）、ＲＡＮＫ（配列番号：１５）、オステオプロテゲリン（配列番号：１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号：１７）、ＴＡＣＩ（配列番号：１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号：１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（配列番号：２０）、神経成長因子受容体（配列番号：２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号：２２）、ＧＩＴＲ（配列番号：２３）、ＴＲＯＹ（配列番号：２４）、細胞死受容体６（配列番号：２５）、細胞死受容体３（配列番号：２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号：２７）である。
【０５１７】
本発明の方法において、ＴＮＦＲはＯＸ４０（配列番号：４）、ＣＤ２７（配列番号：８）、ＣＤ４０（配列番号：５）、ＣＤ１３７（配列番号：１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号：２３）である。
【０５１８】
本発明の方法において、ＴＮＦＲはＯＸ４０（配列番号：４）である。
【０５１９】
本発明の方法において、ＴＮＦＲはＣＤ２７（配列番号：８）である。
【０５２０】
本発明の方法において、ＴＮＦＲはＣＤ４０（配列番号：５）である。
【０５２１】
本発明の方法において、ＴＮＦＲはＣＤ１３７（配列番号：１０）である。
【０５２２】
本発明の方法において、ＴＮＦＲはＧＩＴＲ（配列番号：２３）である。
【０５２３】
ＴＮＦＲ１／２／ＴＮＦ−α、ＣＤ７０／ＣＤ２７、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬを含む、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー及びこれらのリガンドの多くは、癌治療の標的として示唆されており、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを標的化するいくつかのアゴニスト抗体、例えば抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７抗体が、様々な充実性腫瘍、並びに、ヘム悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫及びＢ細胞悪性腫瘍など）に対して臨床開発されている。場合によりエフェクター機能と一体となった、アゴニスト活性の増強という点で改善された性質を有する、本発明の抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７、及び他の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、充実性腫瘍を含む様々な癌の治療において、治療的に有効であると予測することができる。
【０５２４】
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の各実施形態を、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
【実施例】
【０５２５】
実施例１  抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を改善するための、Ｆｃ改変アプローチ
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する免疫活性化受容体を標的とするアゴニスト抗体が、癌免疫治療のための、有望な薬剤候補として出現している。アゴニスト活性及び／又はエフェクター機能を増強させることにより、抗ＴＮＦＲ抗体の抗腫瘍活性を強めることができる、いくつかのＦｃ改変アプローチが最近発見された。
【０５２６】
抗腫瘍免疫を刺激するモノクローナル抗体が、重要なクラスの癌治療薬として出現している（Ｍｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０〜９）（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：２２７〜４２）。免疫チェックポイント受容体ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１を標的化する抗体が、進行した黒色腫、肺癌のための単独療法として認可されており、他の種類のヒトの癌の治療に対して評価されている。阻害経路の標的化の他に、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の免疫活性化受容体に対して向けられたアゴニスト抗体もまた、抗腫瘍免疫を刺激することが可能であり、癌免疫治療法の臨床開発における有望な分野として出現している（Ｓｃｈａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：７）。
【０５２７】
多くの免疫活性化受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属している。これらのうち、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、及びＧＩＴＲはエフェクターＴ細胞上で発現し、これらのリガンド及びアゴニスト抗体は、受容体を活性化し、Ｔ細胞の増殖及び活性化を刺激することができる（Ｋａｎａｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：７３０６〜１４）（Ｇｒａｍａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：６５１０〜７）（Ｐｏｌｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５０：７７１〜８１）（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３７）。ＣＤ４０は抗原提示細胞上に発現し、この受容体の活性化により、活性化したＴ細胞への腫瘍抗原のより効果的な提示が容易になる（Ｋｈａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｕｐｄａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２：６１〜５）（Ｍａｎｇｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：１１１５〜２６）。多くのエビデンスにより、治療用抗体の、これらのＴＮＦ受容体へのアゴニスト活性は、それらの抗腫瘍活性に対して重要であることが示された（Ｍａｎｇｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：１１１５〜２６）（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１：４１７４〜８３）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９：１０１〜１３）。他方では、ＯＸ４０及びＧＩＴＲなどのいくつかのＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、制御性Ｔ細胞（Ｔreg）における発現が増加し、これは腫瘍免疫を負に調節する。いくつかの研究では、抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体は、抗体のエフェクター機能により、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の選択的除去を促進し得ることが明らかとなっている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０：１６８５〜９３）（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９２：４７５〜８０）。かかる抗体が介在する制御性Ｔ細胞の殺傷は、治療用抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性のため、抗体が介在するエフェクターＴ細胞の活性化よりも重要で有り得る。
【０５２８】
集まったエビデンスにより、免疫調節抗体が、アゴニスト活性及びエフェクター機能のため、異なる種類のＦｃ受容体と連結することが示された。下流のシグナル伝達経路を活性化するために、ＴＮＦＲの三量体化が必要とされる。しかし、１つの抗体分子は一般に、ＴＮＦ受容体をクラスター化するのに十分ではない。代わりに、抗体架橋が、インビボアッセイにおける受容体活性化に必要である（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：３１１２〜２１）。マウスにおける最近の研究は、阻害性のＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合は、ＣＤ４０を含む多数のＴＮＦＲ標的に対する抗体のアゴニスト活性に重要であることを示した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１０３０〜４）（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７：１７５４〜６３）、細胞死受容体５（ＤＲ５）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９：１０１〜１３）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １１：３３４３〜４）及びＣＤ９５（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：５６２〜８）。ＩｇＧ  ＦｃのＦｃγＲＩＩＢ受容体への架橋により、２つ以上の抗体分子を多量体化することができ、これにより、シグナル伝達経路活性化のため十分なＴＮＦＲのクラスター化を促進することができる。他方では、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰなどの抗体エフェクター機能は、様々な活性化Ｆｃγ受容体との相互作用に左右される。マウスにおける研究により、活性化Ｆｃγ受容体が、腫瘍内制御性Ｔ細胞を選択的に除去することにより、免疫調節性抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性に寄与することが明らかになった（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０：１６８５〜９３）（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９２：４７５〜８０）。
【０５２９】
ヒトＩｇＧ抗体は、ＦｃγＲＩ以外のほとんどのヒトＦｃ受容体に対しては不十分な結合親和性を有する（Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：９４〜１０８）。免疫活性化ＴＮＦ受容体に対するアゴニスト抗体の抗腫瘍活性を最適化するために、１つのアプローチとしては、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を改変して、Ｆｃγ受容体との結合、特にＦｃγＲＩＩＢ受容体との結合を改善することがある。これに関し、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩｇＧ１  ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異により、ＦｃγＲＩＩＢ結合親和性が増強されたことを記載した（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３）。このような変異により改変した抗ＣＤ１９抗体は、Ｂ細胞受容体が介在するヒト一次Ｂ細胞の活性化に対する阻害性が改良されていた。しかし、更なる研究により、このようなＦｃ多様体は、活性化ＦｃγＲＩＩＡ受容体のＲ１３１アロタイプに対する結合の増強もまた有することが明らかとなった（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）。近年、Ｍｉｍｏｔｏらは、ＦｃγＲＩＩＡ受容体のＨ１３１又はＲ１３１アロタイプのいずれかに対する結合が関連して増加することなく、ＦｃγＲＩＩＢ結合が選択的に増強する、ＩｇＧ１  Ｆｃにおける６個の変異のセット（まとめてＶ１２変異と呼ばれる）について報告した（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）。改変Ｖ１２変異を有する抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、ＦｃγＲＩＩＢの結合に応じ、更に増強したアゴニスト活性を示した。
【０５３０】
ＦｃγＲＩＩＢ結合の最適化は実現可能なアプローチではあるものの、このような改変抗体のアゴニスト活性は、局所微小環境におけるＦｃγＲ発現に大いに左右され、このような抗体の有効性は、作用に関係する解剖学的部位に限定され得る。本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＢに対する架橋が、受容体を活性化させるアゴニスト抗体のクラスター化を増加させることのみを目的とする場合、抗体の多量体化を促進することができるかかるＦｃ変異は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋を必要とせずにＴＮＦ受容体に対する抗体のアゴニズムを増強させ得るという仮説を立てた。Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、選択的Ｆｃ変異により、細胞表面での標的結合時に、ＩｇＧ抗体の六量体形成が促進され得ることを報告した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３）。このようなＩｇＧ六量体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を大いに活性化可能であることが報告されているが、本発明者らは、別の用途として、オリゴマー化された抗ＴＮＦ受容体抗体により、受容体のクラスター化が促進され、受容体が活性化され得ると考えている。
【０５３１】
この研究は、抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムの増強における、異なるＦｃ改変アプローチの評価について記載している。加えて、改変抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰエフェクター機能におけるＦｃ変異の効果もまた、評価した。このような研究は、抗腫瘍活性が改良された、ＯＸ４０及び他のＴＮＦ受容体に対する改変抗体の設計について指針を立てる助けとなり得る。
【０５３２】
実施例２  Ｆｃドメインの多量体形成を促進するヒトＩｇＧの変異の同定
Ｆｃが介在する多量体化を促進することによりアゴニスト活性を増強させ得る、ヒトＩｇＧの変異を同定することを目標とし、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＰＤＢ）に蓄積された配列ベースの構造検索（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２３５〜４２）をまず実施し、Ｆｃドメインを含有するエントリを特定した。構造のサブセットに対して結晶対称性を応用することにより、多量体化を促進する変異の特定を補助するモデルとして使用可能なＦｃドメインからなる閉鎖型（closed）の六量体配置が得られるとの予測により、かかるリストのうち六角形の結晶（hexagonal crystal）ファミリーに属する結晶から生じる構造を調査した。これにより、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０（ＰＤＢ  １ＨＺＨ）に対し特異性を有する、インタクトなＩｇＧ１分子の結晶構造（Ｓａｐｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５５〜９）を、Ｆｃドメインがパッキングされ閉鎖環状構造を形成しているものとして特定した。
【０５３３】
Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは以前に、ＩｇＧ分子の六量体形成は構造１ＨＺＨで観察されるものに類似しており、ＣＤＣの活性化に重要で有り得るという仮説を立て、このモデルを、六量体形成を促進する変異の特定に対して使用している（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３）。多量体モデルにより、分子の閉鎖環状の配置を安定化させる最大の接触は、隣接するＦｃ分子のＣＨ３ドメイン間のものであったことが明らかとなった。したがって、分子が、多量体モデルで観察されたようにパッキングされるのであれば、多量体化を促進する１つの方法は、ＣＨ３表面上の残基に変異を導入して、隣接するＣＨ３表面との相互作用を最適化することであろうと仮定された。結晶構造３ＡＶＥに存在するＩｇＧ１  ＦｃのＣＨ３ドメインに多量体モデルのＣＨ３ドメインを重ねると、隣接するＦｃドメインの３ＡＶＥ  ＣＨ２ドメインの衝突が観察された（図１）。このような衝突は、Ｄａｖｉｅｓらによっても言及されていたが、ＣＨ２ドメインＡＢループ内における構造変化は、このような衝突の発生を防止することができることが示唆された（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６２：４６〜５３）。あるいは、多量体モデルのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン間の角度を変えることにより、隣接する分子のＣＨ２ドメインと衝突させずに、記載のとおりにＣＨ３ドメインをパッキングさせることができる。
【０５３４】
したがって、ＣＨ３ドメインに対するＣＨ２ドメインの柔軟性が増大することにより、ＣＨ２は、立体構造の衝突を回避し、場合によりパッキングの相互作用に好ましく寄与する構造を一層容易にとることが可能となり、これによりＦｃ分子は一層容易に会合して多量体構成をとることが可能となると仮定された。ＣＨ２への変異：ＣＨ３界面は、ＣＨ２ドメインの柔軟性を変化させることが示されている（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２６：１７９９〜８１１）（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５６：１３１〜９）。したがって、変異について、ＩｇＧ多量体化を促進するものとして２つのカテゴリーを定義した。かかるカテゴリーは、分子間接触の最適化により、Ｆｃ間のＣＨ３：ＣＨ３相互作用を増強させるもの、及び、ＣＨ２ドメインの柔軟性の増強を促進するための、分子内ＣＨ２：ＣＨ３界面を弱めるものである。プログラムＣｏｏｔ及びＰｙＭｏｌを使用して、多量体モデルを手作業で調査し、想定した機序のうち少なくとも１つにより多量体化を促進することが予想される変異のリストを考案した。抗ＯＸ４０抗体２０Ｅ５に対し様々な変異を導入し、溶液中、又はＲａｊｉ細胞による架橋のいずれかで、アゴニスト活性を試験した。これらの初期実験から、Ｆｃ変異Ｋ２４８Ｅ、Ｋ３３８Ａ、及びＴ４３７Ｒを更なる研究のために選抜した。
【０５３５】
実施例３  材料及び方法
抗ＯＸ４０抗体のＦｃ改変
抗ＯＸ４０抗体２０Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２（本明細書では２０Ｅ５と呼称する）のＶＨ及びＶＬ領域（ＶＨ：配列番号：５５、ＶＬ：配列番号：５６）をヒト野生型ＩｇＧ１又はＩｇＧ２にクローニングし、選択した置換をＦｃに対し導入して、置換が抗体のアゴニスト活性及びエフェクター機能に及ぼす効果を評価した。作成した抗体の名称、及びこれらのＦｃ置換を表３に示す。
【０５３６】
【表３】
2019533427.tif 000017
【０５３７】
抗体の発現及び精製
トランスフェクションキットの使用説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、抗体重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードするプラスミドを１：３（ＨＣ：ＬＣ）のモル比でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に同時導入した。トランスフェクションの５日後、細胞を遠心沈殿させ、上清を０．２μｍのフィルターでろ過した。抗体発現の力価を、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して定量した。キットの使用説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、プレパックタイプのプロテインＡスピンカラムを使用して抗体精製を行った。透析により、精製した抗体をＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）に緩衝液交換し、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によりタンパク質濃度を測定した。還元試料及び非還元試料を高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることにより、質を評価した。
【０５３８】
ＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ
抗ＯＸ４０ＳＦ２抗体の軽鎖のコード配列を、それぞれＣ末端にＮａｎｏｌｕｃ配列及びＨａｌｏｔａｇ配列を有するよう、ｐＮＬＦ−Ｃ及びｐＨＴＣハロタグベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にインフレームでクローニングした。これらの軽鎖を重鎖と組み合せ、軽鎖のＣ末端にＮａｎｏｌｕｃ又はＨａｌｏｔａｇのいずれかを有する、Ｆｃ改変ＳＦ２抗体を発現させた。標準的なプロテインＡスピンカラムを用いて、これらの改変抗体を精製した。
【０５３９】
ＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、細胞表面上での抗体の多量体化を研究するために、０．２５×１０5個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、５０μＬアッセイ培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ血清低減培地、フェノールレッド不含有＋４％  ＦＢＳ）中において、等濃度のＮａｎｏｌｕｃタグ抗体（ドナー）及びＨａｌｏｔａｇタグ抗体（アクセプター）を、細胞に添加した。５０μＬアッセイ培地で１：１０００に希釈したＨａｌｏｔａｇ  ６１８リガンドを実験用ウェルに添加した。またリガンド無添加の対照ウェルは、アッセイ培地でＤＭＳＯを１：１０００に希釈したものとして設定した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞をアッセイ培地で２回洗浄し、１００μＬアッセイ培地に再懸濁した。ＦＢＳ非含有のアッセイ培地で１：２００に希釈した、２５μＬのＮａｎｏ−Ｇｌｏ基質を、各ウェルに添加した。３０秒間振盪した後、ドナーの発光（４６０ｎｍ）及びアクセプターの発光（６１８ｎｍ）を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎにより測定した。ｍｉｌｌｉＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）のそのままのＮａｎｏＢＲＥＴ比の値を、ＲａｗＢＲＥＴ＝６１８ｎｍEm／４６０ｎｍEm*１０００として計算した。ドナーが寄与するバックグラウンド又はブリードスルー（bleed through）を要素として計算に入れるために、ｍｉｌｌｉＢＲＥＴ単位を有する補正ＮａｎｏＢＲＥＴ比の値を、ＣｏｒｒｅｃｔｅｄＢＲＥＴ＝ＲａｗＢＲＥＴ実験試料−ＲａｗＢＲＥＴ非リカ゛ント゛対照試料として計算した。これは、タンパク質−タンパク質相互作用による、生物発光タンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー移動を反映している。
【０５４０】
フローサイトメトリー染色
ヒトＦｃγＲＩ（ＮＭ＿０００５６６）（配列番号：５９）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＮＭ＿０２１６４２）（配列番号：６０）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＮＭ＿００４００１）（配列番号：６１）、及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＮＭ＿０００５６９）（配列番号：６２）をコードするｃＤＮＡを発現するプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリーアッセイを実施した。トランスフェクションしたＦｃ受容体の発現を確認するために、特異的抗体：ＦｃγＲＩについては１０．１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦｃγＲＩＩＡについてはＩＶ．３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦｃγＲＩＩＢについては（社内で調製）２Ｂ６（Ｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２１：３９２〜４０４）、及びＦｃγＲＩＩＩＡについては３Ｇ８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、陽性対照としてフローサイトメトリー染色に用いた。Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−８６）もまた使用して、抗ＯＸ４０抗体のＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合を試験した。
【０５４１】
１ウェル当たり２×１０5個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、４℃にて３０分間、ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）にてブロッキングした。細胞を、氷上で４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベーションした。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ−ＰＥ標識抗ヒト又は抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４℃で４５分間、インキュベートした。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、その後、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬのＳｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁した。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によってそれぞれＢ２及びＢ４チャンネルを使用して検出した。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００の生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを測定した。解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用した。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって非線形回帰分析を行い、ＥＣ50値を算出した。
【０５４２】
配列番号５９
ＭＷＦＬＴＴＬＬＬＷＶＰＶＤＧＱＶＤＴＴＫＡＶＩＴＬＱＰＰＷＶＳＶＦＱＥＥＴＶＴＬＨＣＥＶＬＨＬＰＧＳＳＳＴＱＷＦＬＮＧＴＡＴＱＴＳＴＰＳＹＲＩＴＳＡＳＶＮＤＳＧＥＹＲＣＱＲＧＬＳＧＲＳＤＰＩＱＬＥＩＨＲＧＷＬＬＬＱＶＳＳＲＶＦＴＥＧＥＰＬＡＬＲＣＨＡＷＫＤＫＬＶＹＮＶＬＹＹＲＮＧＫＡＦＫＦＦＨＷＮＳＮＬＴＩＬＫＴＮＩＳＨＮＧＴＹＨＣＳＧＭＧＫＨＲＹＴＳＡＧＩＳＶＴＶＫＥＬＦＰＡＰＶＬＮＡＳＶＴＳＰＬＬＥＧＮＬＶＴＬＳＣＥＴＫＬＬＬＱＲＰＧＬＱＬＹＦＳＦＹＭＧＳＫＴＬＲＧＲＮＴＳＳＥＹＱＩＬＴＡＲＲＥＤＳＧＬＹＷＣＥＡＡＴＥＤＧＮＶＬＫＲＳＰＥＬＥＬＱＶＬＧＬＱＬＰＴＰＶＷＦＨＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩＲＫＥＬＫＲＫＫＫＷＤＬＥＩＳＬＤＳＧＨＥＫＫＶＩＳＳＬＱＥＤＲＨＬＥＥＥＬＫＣＱＥＱＫＥＥＱＬＱＥＧＶＨＲＫＥＰＱＧＡＴ
【０５４３】
配列番号６０
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
【０５４４】
配列番号６１
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡＮＰＴＮＰＤＥＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ
【０５４５】
配列番号６２
ＭＡＥＧＴＬＷＱＩＬＣＶＳＳＤＡＱＰＱＴＦＥＧＶＫＧＡＤＰＰＴＬＰＰＧＳＦＬＰＧＰＶＬＷＷＧＳＬＡＲＬＱＴＥＫＳＤＥＶＳＲＫＧＮＷＷＶＴＥＭＧＧＧＡＧＥＲＬＦＴＳＳＣＬＶＧＬＶＰＬＧＬＲＩＳＬＶＴＣＰＬＱＣＧＩＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＦＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ
【０５４６】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＮＦ−κＢレポーターアッセイ
ＮＦ−κＢ誘導性プロモーター（ＩＦＮ−β最小プロモーター）の制御下で分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現するように改変されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１細胞に、ＯＸ４０発現プラスミド（ｐＵＮＯ１−ｈＯＸ４０）をトランスフェクションし、ヒトＯＸ４０を発現する安定なＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞株（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０）を樹立した。レポーターアッセイに関して、２００μＬ培地に再懸濁した、１×１０5個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分け、ＯＸ４０リガンド又は抗ＯＸ４０抗体を添加した。架橋効果を試験するために、１μＬのプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）又は１×１０5個Ｒａｊｉ細胞のいずれかを、同じアッセイセルに添加した。３７℃で一晩インキュベーションした後、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ検出キット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用し、誘導により分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を定量することにより、抗体のアゴニスト活性を評価した。手短かに言えば、４０μＬの細胞培養上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ試薬と混合し、適切な青色が生じるまで、３７℃でインキュベーションした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、６５０ｎｍにおけるＯＤを測定した。抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンドにより誘導される活性に対する活性（％）として、正規化した。
【０５４７】
ＡＤＣＣアッセイ
製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）により指示されるとおりに、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにより、抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。手短かに言えば、１ウェル当たり２５，０００個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を、９６ウェルプレートに一晩配置し、ＦｃγＲＩＩＩＡレポーター遺伝子の活性化によりルシフェラーゼレポーターの発現をもたらす改変エフェクター細胞と混合した。抗ＯＸ４０抗体を細胞に添加し、３７℃で６時間インキュベーションした。次に、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加し、ルシフェラーゼシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎにより定量した。抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を、試験抗体を添加しない活性化に対して、ルシフェラーゼシグナルの活性化が何倍であるかとして表現した。
【０５４８】
ＣＤＣアッセイ
抗ＯＸ４０抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を、補体が介在する細胞殺傷アッセイにより評価した。手短かに言えば、ウサギ補体（Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ  Ｌａｂｓ）及び試験抗ＯＸ４０抗体と共に、１００，０００個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を９６ウェルプレートで１時間、インキュベーションした。溶解させたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の細胞質基質から上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）により定量した。補体が介在する細胞傷害を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により溶解されたものに対する細胞傷害性（％）として表現した。
【０５４９】
ＡＤＣＰアッセイ
ＧＦＰを発現するＯＸ４０標的細胞株を、Ｔｕｒｂｏ  ＧＦＰ形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を感染させることにより樹立した。安定なＧＦＰ発現細胞を、ピューロマイシンを用いて選抜した。ＣＤ１６が枯渇（depletion）していない、陰性ヒト単球濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ヒトＣＤ１４+ＣＤ１６+単球をＰＢＭＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ）から単離した。１０％  ＦＢＳを含有するＸ−ＶＩＶＯ−１０培地（Ｌｏｎｚａ）に、単離した単球を蒔き、２５ｎｇ／ｍＬのマクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を７日間添加することで、単球をマクロファージに分化させた。ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、分化の最後の２４時間の間添加した。ＡＤＣＰアッセイのため、１×１０5個／ウェルの分化したマクロファージを、９６ウェルＵ底プレートで、２００μＬ培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）中、０．２５×１０5個／ウェルのＧＦＰ発現ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞（４：１比）と混合した。試験抗体を添加し、プレートを３７℃のインキュベーター内で２４時間、インキュベーションした。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を剥離させ、ＢＳＡ染色緩衝液に再懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を連結した抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、マクロファージを染色した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）を使用するフローサイトメトリーにより、ＧＦＰ陽性ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞及びＡｌｅｘａ６４７陽性マクロファージを識別した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用してデータを分析し、以下の式：殺傷された標的細胞の割合＝（（抗体濃度が最小の場合のＧＦＰ+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１４-細胞の割合）−（抗体濃度が試験濃度の場合のＧＦＰ+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１４-細胞の割合））／（抗体濃度が最小の場合のＧＦＰ+、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１４-細胞の割合）×１００を使用して、ＧＦＰ蛍光の減少を測定することにより、ＡＤＣＰが介在する細胞殺傷を測定した。
【０５５０】
実施例４  Ｋ２４８Ｅ、Ｋ３３８Ａ、及びＴ４３７Ｒ変異を単一又は組み合わせで有する抗ＯＸ４０抗体の特性評価
抗体アゴニズム
最近の研究により、ＦｃγＲＩＩＢは架橋活性をもたらすことができ、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体のアゴニスト活性を促進することができることが示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １１：３３４３〜４）。したがって、単一及び組み合わせでの、変異Ｋ２４８Ｅ、Ｋ３３８Ａ、及びＴ４３７Ｒの、生成した抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ３３８Ａ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ、及びＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ／Ｋ３３８Ａのアゴニスト特性に対する効果（表３に示す）を、溶液中で、及びヒトＢリンパ芽球腫Ｒａｊｉ細胞による架橋後に試験した。かかるＲａｊｉ細胞は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）レポーターアッセイにおいて、優勢にＦｃγＲＩＩＢを発現する（Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０８：２３８４〜９１）。
【０５５１】
図２Ａは、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に対する活性度（％）として評価される、溶液中での、単一変異導入した抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、及びＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ３３８Ａのアゴニスト活性を示す。全ての抗体が、溶液中でアゴニズムを示した。Ｄａｕｄｉ細胞による架橋により更にアゴニズムが増加し、Ｔ４３７Ｒ変異を有する抗体が最も高いアゴニスト活性を示した（図２Ｂ）。二重変異した抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ、及びＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｋ２４８Ｅ／Ｋ３３８Ａの全てが、溶液中で、野生型ＩｇＧ１抗体と比較して、増強したアゴニスト活性を示した（図２Ｃ）。アゴニスト活性は、Ｄａｕｄｉ細胞により架橋したＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ（図２Ｄ）、及びＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ（図２Ｅ）では、野生型抗体ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１について観察されたものよりも高レベルで実質的に増強した（図２Ｆ）。ＯＸ４０２０Ｅ５ＩｇＧ１Ｔ４３７ＲのＤａｕｄｉ細胞との架橋により、その抗体のアゴニスト活性もまた増強した（図２Ｇ）。
【０５５２】
第２の抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２（ＶＨ：配列番号：５１、ＶＬ：配列番号：５２）のＶＨ／ＶＬ領域もまた改変して、単一で又は組み合わせて変異を導入したＦｃドメインにすることで、抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａを生成した。これらの抗体を、溶液中での、及びＤａｕｄｉ細胞による架橋時のアゴニズムについて試験した。改変２０Ｅ５抗体と同様に、Ｔ４３７Ｒ又はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、及びＴ４３７Ｒ／Ｋ３３８Ａ変異を有するＳＦ２由来の抗体は、溶液中で野生型親抗体と比較して、アゴニズムが増強した（即ち、架橋とは無関係なアゴニズム）（図３Ａ）。Ｄａｕｄｉ細胞による架橋により、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ（図３Ｂ）及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ（図３Ｃ）のアゴニズムが増強した。
【０５５３】
抗体を、ＦｃγＲＩＩＢを発現するＢ細胞に由来する別の細胞株であるＲａｊｉ細胞により架橋した場合、改変抗ＯＸ４０ＳＦ２抗体のアゴニズムが増加する同様の効果が観察された。抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６が、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ（図４Ａ）及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ（図４Ｂ）のアゴニズムにおいて、Ｒａｊｉ細胞が介在する増加を阻害したことから、架橋はＦｃγＲＩＩＢが介在したものであることが確認された。
【０５５４】
抗体の多量体化
溶液中における改変抗ＯＸ４０  ＳＦ２抗体の凝集状態を、サイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。手短かに言えば、抗体をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３ＳＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ）に注入し、クロマトグラフィーによりサイズで分離した。Ｆｃ変異を有する改変抗体は、未改変のＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体と同様に、約８．５分にて溶出した主要なタンパク質ピークを有し、すなわち、溶液中に改変抗体の主要なモノマー形態が存在することを示した。いくつかの抗体は、抗体のオリゴマー形態であり得る、高分子量タンパク質ピークの画分（５％未満）を微量に示した。
【０５５５】
改変抗体が、細胞表面での抗原結合時に多量体化するかを評価するために、改変抗ＯＸ４０  ＳＦ２抗体に対しＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を実施した。未改変のＩｇＧ１を有する、及び、Ｔ４３７Ｒ、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、又はＥ３４５Ｒ変異を有するＳＦ２抗体を更に改変して、それぞれドナー及びアクセプターとして、軽鎖のＣ末端に付加したＮａｎｏｌｕｃタグ又はＨａｌｏｔａｇのいずれかを有するようにした。安定してＯＸ４０を発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞に、ドナー及びアクセプター抗体を適用することにより、ＮａｎｏＢＲＥＴ  ＰＰＩアッセイを実施した。計算した補正ＮａｎｏＢＲＥＴ比は、多量体を形成した抗体の会合を反映する。
【０５５６】
タグ化した抗体は、レポーターアッセイにおいて、タグ化していない対応する抗体に相当する機能活性を示し、すなわち、軽鎖のタグが抗体の機能的性質に影響を及ぼさなかったことが示された。ＮａｎｏＢＲＥＴ  ＰＰＩアッセイにおいて、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒは、バックグラウンド補正ＮａｎｏＢＲＥＴ比を示した（図５）。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅのいずれかを有するＳＦ２抗体は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度にわたる、はるかに高い補正ＮａｎｏＢＲＥＴ比を示し（図５）、すなわち抗体が細胞表面にて多量体化したことを示した。
【０５５７】
様々なＦｃγＲに結合する抗体
一過的にトランスフェクションしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現した様々なＦｃγＲ受容体に対する、改変抗ＯＸ４０  ＳＦ２抗体の結合を、実施例３に記載するように、フローサイトメトリーによって評価した。
【０５５８】
野生型抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して、同様の結合特性を有するこれらの受容体に、モノマーＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ抗体が溶液中で結合したため、変異Ｔ４３７Ｒ及びＫ２４８Ｅはいずれも、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩＡへの多様体抗体の結合に影響を及ぼさなかった。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して、抗体はまた、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに対しても同様の結合能を有する可能性を示した。表４は、結合に対するＥＣ50値を示す。ＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞株であるＲａｊｉ細胞に対する、改変抗ＯＸ４０  ＳＦ２抗体の結合もまた、フローサイトメトリーにより評価した。ＦｃγＲＩＩＢの発現はＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６により検出可能であるが、恐らく、異所に（ectopically）トランスフェクションした細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞においてはＦｃγＲＩＩＢの発現が低かったために、改変抗ＯＸ４０（ＳＦ２）及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のいずれも、Ｒａｊｉ細胞に対する著しい結合を有しなかったことが観察された（データ非掲載）。
【０５５９】
【表４】
2019533427.tif 000018
【０５６０】
実施例５。エフェクターが無効の形態に改変した抗ＯＸ４０抗体の特性評価
様々な抗体を、エフェクターが無効なＦｃアイソフォームにクローニングして発現させ、精製し、実施例３に記載の方法に従って特性評価した。生成した抗体を表５に示す。
【０５６１】
【表５】
2019533427.tif 000019
【０５６２】
抗体凝集
溶液中での改変抗体の凝集状態を、実施例３に記載のとおりにサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。改変抗体は、未改変のＩｇＧ１  Ｆｃを有する対応抗体と同様に、約８．５分にて溶出した主要なタンパク質ピークを有し、すなわち溶液中に改変抗体の主要なモノマー形態が存在することを示した。これらのうちいくつか、主にＩｇＧ４ＰＡＡ抗体は、抗体のオリゴマー形態であり得る、高分子量タンパク質ピークの画分（＜３％）を微量に示した。
【０５６３】
Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異は、Ｆｃエフェクター機能が無効な抗体においてアゴニズムをレスキューする。
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ４ＰＡＡ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ４ＰＡＡ／Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅのアゴニスト活性を、溶液中、又はＲａｊｉ細胞による架橋のいずれかにおいて、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢレポーターアッセイを使用して評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ４ＰＡＡはいずれも、溶液中でアゴニスト活性を有しなかったが、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ４ＰＡＡ／Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅの両方において、アゴニズムをレスキューした（図６）。Ｒａｊｉ細胞による架橋は、アゴニスト活性の増加において、よくても微妙なものであった（データ非掲載）。
【０５６４】
実施例６。改変抗体のエフェクター機能
ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣを介在する、Ｔ４３７Ｒ又はＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を有する改変抗ＯＸ４０抗体の能力を、実施例３に記載のとおりに評価した。
【０５６５】
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅの両方が、野生型抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して、改善された力価でＡＤＣＣを介在した（図７）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ４ＰＡＡ／Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅの両方が、依然としてＡＤＣＣを介在不能のままであったため、変異は、既にエフェクターが無効となった抗体ではＡＤＣＣをレスキューしなかった（データ非掲載）。
【０５６６】
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅの両方が、野生型ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１により介在されるＡＤＣＰに相当するレベルで、ＡＤＣＰを介在した（図８）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅはまた、野生型抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較して、改善された力価でＣＤＣを介在した（図９Ａ）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅに対するＡＤＣＰ活性が、ＯＸ４０ＦＳ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａに対して観察された活性よりも高い濃度まで上昇したため、変異は、既にエフェクターが無効となった抗体においてある程度ＡＤＣＰをレスキューした（図９Ｂ）。
【０５６７】
実施例７。Ｔｇ３２ヘミ接合マウスにおける、Ｔ４３７Ｒ及びＴ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を有する抗体の薬物動態特性
方法  １８匹のＴｇ３２ヘミ接合マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、１群当たり５匹として、２ｍｇ／ｋｇの投与量で試験抗体（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、又はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）を尾静脈より注入した。時点を、注射後１時間、１日、３日、７日、１４日、及び２１日でとった。これらの時点で、ＣＯ2麻酔をかけたマウスの後眼窩静脈叢から連続採血を行い、最後の血液は心臓穿刺により得た。室温で３０分後に、血液試料を２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離にかけ、分析のために血清を回収した。
【０５６８】
血清試料中のヒトＩｇＧの濃度を、電気化学発光イムノアッセイにより測定した。ストレプトアビジン金マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、４℃にて一晩、５０μＬ／ウェルの５μｇ／ｍＬビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−０５５−０８８）でコーティングし、０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄した。血清試料及び標準をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、プレートに添加し、振盪器にて室温で２時間インキュベーションした。振盪器で２時間、１．５μｇ／ｍＬにて、スルホタグで標識したマウス抗ヒトＦｃ抗体・Ｒ１０Ｚ８Ｅ９を使用して、結合した抗体を検出した。プレートを洗浄し、読み取り緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で読み取った。
【０５６９】
ＰＫ血清試料が、試験試料のＰＫに影響を及ぼし得る著しい免疫力価を有したかを測定するために、それぞれの試験物品で１０μｇ／ｍＬでコーティングした９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＃４４６６１２）にて、４℃で一晩ＥＬＩＳＡを行った。血清試料を１％  ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、プレートでインキュベーションした。西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、捕捉した抗体を検出し、続いて、基質を反応させるためにＯＰＤ又はＴＭＢを添加した。プレートを読み取り、バッファ又は対照血清値を３倍上回った分光計読取り値を陽性と見なし、１：１倍希釈として表現した。
【０５７０】
自然対数濃度対時間の線形回帰により適合させた一相指数関数的減衰モデルを用い、Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＰＫ試験の排出期の終末相半減期（ｔ1/2）の計算値を求めた。非線形最小二乗法による減衰モデルを、「１／適合された濃度」により重み付けした。式ｔ1/2＝ｌｎ２／β（式中、βは、初回の投与後に開始する最小二乗法による回帰分析により適合された直線の傾斜である）を使用して、排出期の半減期の計算値を求めた。試験群内の各動物について算出されたｔ1/2値の平均をとることにより、抗体の終末相半減期値を求めた。
【０５７１】
結果
抗体の血清ＩｇＧ濃度対時間プロファイルは、半対数プロットにおいて経時的に低下を示す（図１０）。動物の免疫応答を試験した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅを投与したマウスは、７日目、１４日目、及び２１日目において、著しい免疫力価（１：１０００〜１：１４，０００）を示した。
【０５７２】
曲線の線形位相の最初の時点に対して血清レベルを正規化し、抗体のＰＫプロファイル間における差を強調した。１時間の最初の時点は、マウスへの投与が完了したことを示した。３つ以上のデータポイントを有する動物のみを使用し、７日目、１４日目、又は２１日目において免疫力価を有する動物からのデータを除外した。
【０５７３】
結果は、Ｔ４３７Ｒ変異を含有する抗体が、野生型抗体の半減期と比較して短い半減期を有したことを示した。様々な抗体の半減期の値は、以下のとおりであった：ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒはｔ1/2＝３．９±２．１ｄ；ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１  Ｔ４３７ＲＫ２４８Ｅはｔ1/2＝２．４±０．８ｄ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１はｔ1/2＝１１．３±１．１ｄ。
【０５７４】
まとめると、ＰＫ研究では、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅの半減期の値は、１１日の半減期を有する野生型ＩｇＧ１抗体の値と比較して３〜４倍短いことが示され、これは、マウス研究の正常範囲に収まっている。しかし、ＰＫ結果の解釈は、血清ＩｇＧレベルに著しく影響を受けた試験動物、特にＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅの群における免疫応答により構成された。これらのマウスで観察されたあらゆる免疫応答は、ヒトで予想されるものとは対応しないため、マウスで観察されるより短い半減期の値は、通常のヒトＩｇＧ循環血清半減期を反映しない可能性がある。
【０５７５】
実施例８。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプの文脈における、抗体の多量体化及びアゴニズムに対するＫ２４８Ｅ及びＴ４３７Ｒ変異の効果の、構造的な論理的説明
ＩｇＧ１とＩｇＧ２、ＩｇＧ１とＩｇＧ３、及びＩｇＧ１とＩｇＧ４の配列差を、ＣＨ３ドメインを介して多量体モデルに位置合わせされた、それぞれＩｇＧ２  Ｆｃ及びＩｇＧ４  Ｆｃの結晶構造上にマッピングした。配列差の位置が、Ｋ２４８及びＴ４３７の両方の位置から構造的に離れていることを特定した。ＩｇＧ１と同様に、上述した方法による、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４  Ｆｃ構造の位置合わせにより、並置されたＦｃドメインのＣＨ２ドメイン間で衝突が生じ、すなわち、これらのドメインは、Ｆｃドメインを多量体モデルにパックするために、観察した構造と比較して再配置する必要があろうことが示唆された。ＩｇＧ１に関しては、ＣＨ２ドメインのＫ２４８と、Ｋ２４８Ｅ変異を有するＣＨ３ドメインのＥ３８０との間の、分子内塩橋相互作用が破壊されることにより、ＣＨ２ドメインの再配向と多量体化を促進する、ＣＨ２：ＣＨ３界面が弱まり得るという仮説が立てられた。この塩橋相互作用は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の構造で保存されている。したがって、Ｋ２４８Ｅ変異の導入が、ＩｇＧ１の場合と同様に機能するという仮説が立てられる。更に、多量体モデルにおけるＦｃ間ＣＨ３：ＣＨ３界面の残基が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の間で保存されているため、ＩｇＧ１に関して元々仮説を立てられたのと同様に、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のいずれかに導入したＴ４３７Ｒ変異は、隣接するＦｃ内のＥ３８２との塩橋相互作用を形成することにより、この界面を強化するという仮説が立てられる。これらを合わせると、Ｋ２４８Ｅ及びＴ４３７Ｒ変異は、多量体化して、ＩｇＧのサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）とは関係に抗ＴＮＦＲ抗体のアゴニズムを増強させるということが実験により判明し、この結果は、構造モデリングから得られる観測結果と一致している。これらの変異は、Ｆｃ−ＦｃＲｎ結合界面に近接しているものの、これらの残基は、ＦｃＲｎとは直接接触していない（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７：８６７〜７７）。
【０５７６】
実施例９。ＦｃＲｎトランスジェニックＳＣＩＤマウスにおける、Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ変異を有する抗体の薬物動態特性
方法  抗体のＰＫ研究のため、４〜８週齢の雌性Ｔｇ３２ホモ接合ＳＣＩＤマウス（Ｓｔｏｃｋ  ０１８４４１，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、１群当たり５匹として、２ｍｇ／ｋｇの投与量で試験抗体を尾静脈より注入した。これらの時点で、ＣＯ2麻酔をかけたマウスの後眼窩静脈叢から連続採血を行い、最後の血液は心臓穿刺により得た。室温で３０分後に、血液試料を３，０００×ｇで１５分間遠心分離にかけ、血清を分析のため回収した。ＰＫ研究は、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣにおける動物実験委員会により認可された。
【０５７７】
マウス血清中のヒトＩｇＧを、電気化学発光イムノアッセイを使用して測定した。ストレプトアビジン金９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、４℃にて一晩、５０μＬ／ウェルの２．５μｇ／ｍＬビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2抗体でコーティングした。プレートを、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄し、２％ウシ血清アルブミン−ＴＢＳＴに希釈した試料及び標準をプレートに添加し、振盪器で室温で２時間、インキュベーションした。抗ヒトＦｃγ−ｐａｎ抗体であるスルホタグ標識Ｒ１０Ｚ８Ｅ９を使用して、結合した抗体を検出した。プレートを洗浄し、２００μＬのＭＳＤリード緩衝液を添加し、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で読み取った。血清Ａｂ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の５パラメータ非線形回帰プログラムを使用して検量線から測定した。
【０５７８】
自然対数濃度対時間の非線形回帰により適合させた一相指数関数的減衰モデルを用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ＰＫ試験の排出期（β期）の終末相半減期（ｔ1/2）の計算値を求めた。式ｔ1/2＝ｌｎ２／β（式中、βは、１日目の後に開始する最小二乗法による回帰分析により適合された直線の負の傾斜である）を使用して、排出期（β期）の半減期の計算値を求めた。終末相抗体半減期の値は、試験群内のｔ1/2値の平均であった。各抗体対ＩｇＧ１の値をＴ検定により比較し、ｐ値＜０．０５は有意差があると見なした。
【０５７９】
結果
２回目のＰＫ研究を実施して、ＦｃＲｎトランスジェニックＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスにおいてＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅを評価した。かかる免疫不全マウスは、機能性Ｂ及びＴリンパ球を欠損しており、それ故、試験抗体に対する免疫応答が最小限に抑えられる。Ｔｇ３２ホモ接合ＳＣＩＤマウス（５匹／群）に、２ｍｇ／ｋｇの投与量で抗体を静脈内注射した。注射後、１時間、及び１、３、７、１４、及び２１日目に、各マウスの後眼窩静脈叢からの連続採血を行った。血清を準備し、電気化学発光イムノアッセイによりヒトＩｇＧの量を測定した。各抗体の平均血清濃度を図１１に示した。全試料に関して、２１日間にわたり、血清濃度の線形低下が見られ、試験群間で有意差（ｐ＜０．０５）は観察されなかった。半減期の値であるｔ1/2を、以下のとおりに推定した：ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ：ｔ1/2＝９．５±０．７ｄ；ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ：ｔ1/2＝８．３±０．５ｄ；ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１：ｔ1/2＝９．２±０．６ｄ。これらのデータにより、改変抗体のＰＫプロファイルが未改変のＩｇＧ１  ＦｃのＰＫプロファイルに相当することが明らかとなった。
【０５８０】
このＰＫ研究において、ＳＣＩＤマウスを使用することで、非ＳＣＩＤマウスを使用した以前のＰＫ研究の結果を組み合せた試験抗体に対するマウスの免疫応答が著しく低下した。したがって、ＳＣＩＤマウスで観察された相当するＰＫプロファイルは、通常のヒトＩｇＧ循環血清半減期を反映しない。
【０５８１】
実施例１０。改変抗体のＦｃＲｎへの結合
方法ＦｃＲｎへの競合的結合についてのインビトロアッセイ
競合的結合アッセイを使用して、ポリヒスチジン親和性タグ（ＦｃＲｎ−Ｈｉｓ６）を有する組み換えヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインに対する、異なる抗体試料の相対的な親和性を評価した。銅でコーティングした９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬでＦｃＲｎ−Ｈｉｓ６を捕捉し、その後、プレートを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次に、阻害試薬（０．０５Ｍ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、０．０２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０、１０％  ｃｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でインキュベーションした。プレートを上記のとおりに洗浄し、競合試験抗体の阻害試薬中段階希釈液を、一定濃度（１μｇ／ｍＬ）のインジケータ抗体（ビオチン化ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）の存在下で、プレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、上記のとおりに３回洗浄し、その後、室温で３０分間、１：１０，０００希釈のストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベーションして、ビオチン化抗体を結合させた。プレートを上記のとおりに５回洗浄し、安定して反応停止するＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）ペルオキシダーゼ基質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加し、４分間インキュベーションすることにより、結合したストレプトアビジン−ＨＲＰを検出した。０．５Ｍ  ＨＣｌを添加することにより、発色を停止した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍの波長で光学密度を測定した。
【０５８２】
結果
Ｔ４３７Ｒ及びＫ２４８Ｅ変異は共に、ＦｃＲｎ受容体に対する既知の結合部位の近くに位置するため、これらの変異から本発明の多様体抗体とＦｃＲｎとの適切な相互作用に生じ得る干渉を、インビトロ競合的結合アッセイを使用して評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒ／Ｋ２４８Ｅ、及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｔ４３７Ｒは共に、ビオチン化ヒトＩｇＧ１の競合（ＩＣ５０：１．５μｇ／ｍＬ）において、ＦｃＲｎ結合についてＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と明白に同様の力価（ＩＣ５０：それぞれ１．６μｇ／ｍＬ及び１．１μｇ／ｍＬ）を示し、すなわち、改変変異は、ＦｃＲｎ結合に対して明らかな影響をほとんど、又は全く有しないことが示された。他の潜在的な、ＰＫによる影響が存在しない中でのこの結果は、Ｔ４３７Ｒ及びＫ２４８Ｅの変異は、血清半減期に対し著しい影響を有しないであろうことを予測させるものであった。
【０５８３】
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Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｋａｒｋｉ  ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｌａｚａｒ（２０１０）．「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｒｅｃｒｕｉｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．」Ｍａｂｓ  ２（２）：１８１〜９。
Ｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｒ．Ｋｕｎｉ−Ｋａｍｏｃｈｉ，Ｎ．Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．Ｗａｋｉｔａｎｉ，Ｋ．Ｙａｍａｎｏ，Ｈ．Ｉｍａｉ，Ｙ．Ｋａｎｄａ，Ｒ．Ｎｉｗａ，Ｓ．Ｉｉｄａ，Ｋ．Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．Ｓｈｉｔａｒａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓａｔｏｈ（２００４）．「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８（７）：９０１〜８。
Ｍｏｒｒｉｓ，Ｎ．Ｐ．，Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｒ．Ｍｏｎｔｌｅｒ，Ｈ．Ｍ．Ｈｕ，Ｂ．Ｄ．Ｃｕｒｔｉ，Ｗ．Ｊ．Ｕｒｂａ  ａｎｄ  Ａ．Ｄ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（２００７）．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ：ＯＸ４０Ｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋｅｄ  ｖｉａ  ａ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４（１２）：３１１２〜２１。
Ｏｌｉｖｉｅｒ，Ｓ．，Ｍ．Ｊａｃｏｂｙ，Ｃ．Ｂｒｉｌｌｏｎ，Ｓ．Ｂｏｕｌｅｔｒｅａｕ，Ｔ．Ｍｏｌｌｅｔ，Ｏ．Ｎｅｒｒｉｅｒｅ，Ａ．Ａｎｇｅｌ，Ｓ．Ｄａｎｅｔ，Ｂ．Ｓｏｕｔｔｏｕ，Ｆ．Ｇｕｅｈｅｎｎｅｕｘ，Ｌ．Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｍ．Ｂｅｒｔｈｏｍｅ，Ｈ．Ｖｉｅ，Ｎ．Ｂｅｌｔｒａｍｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍｅｈｔａｌｉ（２０１０）．「ＥＢ６６  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ａ  ｄｕｃｋ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＡＤＣＣ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」ＭＡｂｓ  ２（４）：４０５〜１５。
Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．（１９９１）．「Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｈｉｌｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８（４〜５）：４８９〜９８。
Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．，Ｓ．Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｔ．Ｊ．Ｓｐｒｏｕｌｅ，Ｇ．Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｈ．Ａｌ  Ｋｈａｂｂａｚ，Ａ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ，Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄ．Ｃ．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ（２００６）．「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＦｃＲｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍｏｒａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８（１２）：１７５９〜６９。
Ｐｏｌｌｏｋ，Ｋ．Ｅ．，Ｙ．Ｊ．Ｋｉｍ，Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｈｕｒｔａｄｏ，Ｋ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｒ．Ｔ．Ｐｉｃｋａｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｓ．Ｋｗｏｎ（１９９３）．「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４−１ＢＢ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５０（３）：７７１〜８１。
Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｖ．，Ｋ．Ｓｕｎｄａｒａｐａｎｄｉｙａｎ，Ｂ．Ｚｈａｏ，Ｍ．Ｂｙｌｅｓｊｏ，Ｈ．Ｃ．Ｍａｒｓｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｋｅｌｅｒ（２０１５）．「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤ２７  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３７。
Ｒａｎｋｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｍ．Ｃ．Ｖｅｒｉ，Ｓ．Ｇｏｒｌａｔｏｖ，Ｎ．Ｔｕａｉｌｌｏｎ，Ｓ．Ｂｕｒｋｅ，Ｌ．Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｄ．Ｉｎｚｕｎｚａ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，Ｓ．Ｋｏｅｎｉｇ  ａｎｄ  Ｅ．Ｂｏｎｖｉｎｉ（２００６）．「ＣＤ３２Ｂ，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃ−ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ，ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．」Ｂｌｏｏｄ  １０８（７）：２３８４〜９１。
Ｒｅｍｍｅｌｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｎ．Ｓ．Ｎｉｇｈｔｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ａｎｄ  Ｗ．Ｒ．Ｇｏｍｂｏｔｚ（１９９７）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ−１Ｒ）ｌｉｑｕｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：２００〜８。
Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｓ．Ｋａｒｋｉ，Ｇ．Ａ．Ｌａｚａｒ，Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ（２００８）．「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７（８）：２５１７〜２７。
Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓ．Ａｋｉｌｅｓｈ（２００７）．「ＦｃＲｎ：ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ．」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７（９）：７１５〜２５。
Ｒｏｔｈｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｓ．Ａ．Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．Ｆ．Ｍｏｊｃｉｋ，Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｄｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌ．Ｂｅｌｌ（２００７）．「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｎｏｃｔｕｒｎａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ．」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１１）：１２５６〜６４。
Ｓａｐｈｉｒｅ，Ｅ．Ｏ．，Ｐ．Ｗ．Ｐａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ，Ｍ．Ｂ．Ｚｗｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｐ．Ｍ．Ｒｕｄｄ，Ｒ．Ａ．Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ｌ．Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｉ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ（２００１）．「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＩＧＧ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１：ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５３２）：１１５５〜９。
Ｓｃｈａｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｄ．Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ−Ｃｙｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ（２０１４）．「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：７。
Ｓｈｉ，Ｌ．，Ｊ．Ｃ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ｓｗｅｅｔ，Ｊ．Ｌｕ，Ｊ．Ｌｕｏ，Ｍ．Ｔｏｒｎｅｔｔａ，Ｂ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｒ．Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．Ｂｒｉｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｌ．Ｂｏｒｏｚｄｉｎａ，Ｑ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ａｍｅｇａｄｚｉｅ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｃ．Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｓｕｉ（２０１０）．「Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆａｂ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｐｈａｇｅ  ａｓ  ｐＩＸ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７（２）：３８５〜９６。
Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｊ．Ｌａｉ，Ｒ．Ｋｅｃｋ，Ｌ．Ｙ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｋ．Ｈｏｎｇ，Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｗｅｉｋｅｒｔ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ（２００２）．「Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：２６７３３〜４０。
Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，Ａ．Ｋ．Ｎａｍｅｎｕｋ，Ｋ．Ｈｏｎｇ，Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ，Ｊ．Ｒａｅ，Ｊ．Ｂｒｉｇｇｓ，Ｄ．Ｘｉｅ，Ｊ．Ｌａｉ，Ａ．Ｓｔａｄｌｅｎ，Ｂ．Ｌｉ，Ｊ．Ａ．Ｆｏｘ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ（２００１）．「Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｆｏｒ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩ，Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩ，Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ，ａｎｄ  ＦｃＲｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＩｇＧ１  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（９）：６５９１〜６０４。
Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．Ｙａｍａｎｅ，Ｅ．Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａ，Ｙ．Ｋａｎｄａ，Ｍ．Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｋ．Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．Ａｎａｚａｗａ，Ｍ．Ｓａｔｏｈ，Ｍ．Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｎ．Ｈａｎａｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｓｈｉｔａｒａ（２００３）．「Ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｏｒ  ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：３４６６〜７３。
Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｓ．Ｇｏｒｌａｔｏｖ，Ｎ．Ｔｕａｉｌｌｏｎ，Ｃ．Ｔ．Ｒａｎｋｉｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｂｕｒｋｅ，Ｌ．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｖｉｊｈ，Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｂｏｎｖｉｎｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｅｎｉｇ（２００７）．「Ｆｃ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｋｉｌｌ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｕｍｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｖｉａ  ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７（１８）：８８８２〜９０。
Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．，Ｙ．Ｚｈａｏ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ，Ｇ．Ｏｂｍｏｌｏｖａ  ａｎｄ  Ｇ．Ｌ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（２０１３）．「ＩｇＧ２  Ｆｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５６（１〜２）：１３１〜９。
Ｖａｃｃａｒｏ，Ｃ．，Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ｒ．Ｊ．Ｏｂｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｓ．Ｗａｒｄ（２００５）．「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｅｖｅｌｓ．」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３（１０）：１２８３〜８。
Ｖｅｒｉ，Ｍ．Ｃ．，Ｓ．Ｇｏｒｌａｔｏｖ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｂｕｒｋｅ，Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，Ｋ．Ｅ．Ｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｂｏｎｖｉｎｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｅｎｉｇ（２００７）．「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃｇａｍｍａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃｇａｍｍａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２１（３）：３９２〜４０４。
Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｈ．Ｔ．Ｃｈａｎ，Ａ．Ｒｏｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．Ｒ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｃ．Ｉ．Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ａ．Ｌ．Ｔｕｔｔ，Ｓ．Ｖ．Ｄｉｘｏｎ，Ｄ．Ａｊｏｎａ，Ｊ．Ｓ．Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ａ．Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ｍ．Ｓ．Ｃｒａｇｇ，Ｓ．Ａ．Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ（２０１１）．「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７（４）：１７５４〜６３。
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｂ．Ｙａｎｇ，Ａ．Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｌｏｅｓｅｒ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｄ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｙ．Ｌｉ，Ｒ．Ｐｉｔｔｉ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｙｅｅ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｎｅｓ，Ｙ．Ｌｕ，Ｃ．Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｏｆｆｒｉｎｇａ，Ｂ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｓ．Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｄ．Ｄａｎｉｅｌ，Ｇ．Ｍｅｎｇ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２０１１）．「Ａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９（１）：１０１〜１３。
Ｗｒａｎｉｋ，Ｂ．Ｊ．，Ｅ．Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ｊａｃｋｍａｎ，Ａ．Ｃ．Ｖｅｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｄ．Ｅａｔｏｎ（２０１２）．「ＬＵＺ−Ｙ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＩｇＧ−ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７（５２）：４３３３１〜９。
Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ（１９７０）．「Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ．」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２（２）：２１１〜５０。
Ｘｕ，Ｄ．，Ｍ．Ｌ．Ａｌｅｇｒｅ，Ｓ．Ｓ．Ｖａｒｇａ，Ａ．Ｌ．Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ，Ａ．Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｖ．Ｌ．Ｐｕｌｉｔｏ，Ｌ．Ｓ．Ｈａｎｎａ，Ｋ．Ｐ．Ｄｏｌａｎ，Ｐ．Ｗ．Ｐａｒｒｅｎ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｌ．Ｋ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｚｉｖｉｎ（２０００）．「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＯＫＴ３  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００（１）：１６〜２６。
Ｘｕ，Ｙ．，Ａ．Ｊ．Ｓｚａｌａｉ，Ｔ．Ｚｈｏｕ，Ｋ．Ｒ．Ｚｉｎｎ，Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｘ．Ｌｉ，Ｗ．Ｊ．Ｋｏｏｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｐ．Ｋｉｍｂｅｒｌｙ（２００３）．「Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１（２）：５６２〜８。
Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，Ｘ．Ｗｕ，Ａ．Ｅ．Ｒｅｙｅｓ，２ｎｄ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｎｅｓ，Ｓ．Ｌｉｅｎ，Ｊ．Ｌｏｗｅ，Ｍ．Ｍａｉａ，Ｗ．Ｆ．Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ，Ｌ．Ａ．Ｄａｍｉｃｏ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂ．Ｌｏｗｍａｎ（２０１０）．「Ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０（８）：３２６９〜７７。
Ｚａｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．，Ａ．Ｋ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｈ．Ｍ．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋａｒｋｉ，Ｉ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｓｐｒｏｕｌｅ，Ｇ．Ａ．Ｌａｚａｒ，Ｄ．Ｃ．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ（２０１０）．「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８（２）：１５７〜９。
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｓ．Ｒｏｙ，Ｌ．Ｓ．Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．Ａ．Ｋｅｒｗｉｎ，Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｗ．Ｒａｎｄｏｌｐｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ（２００４）．「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜８９。
【図１】
2019533427.tif 000020
【図２Ａ】
2019533427.tif 000021
【図２Ｂ】
2019533427.tif 000022
【図２Ｃ】
2019533427.tif 000023
【図２Ｄ】
2019533427.tif 000024
【図２Ｅ】
2019533427.tif 000025
【図２Ｆ】
2019533427.tif 000026
【図２Ｇ】
2019533427.tif 000027
【図３Ａ】
2019533427.tif 000028
【図３Ｂ】
2019533427.tif 000029
【図３Ｃ】
2019533427.tif 000030
【図４Ａ】
2019533427.tif 000031
【図４Ｂ】
2019533427.tif 000032
【図５】
2019533427.tif 000033
【図６】
2019533427.tif 000034
【図７】
2019533427.tif 000035
【図８】
2019533427.tif 000036
【図９Ａ】
2019533427.tif 000037
【図９Ｂ】
2019533427.tif 000038
【図１０】
2019533427.tif 000039
【図１１】
2019533427.tif 000040
【配列表】
2019533427000001.app
【国際調査報告】
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2019533427.tif 000042
2019533427.tif 000043