(57)【要約】細胞外小胞、その産生、および処置方法が記載される。概して、細胞外小胞は、動物細胞にスルフヒドリルブロッキング試薬を適用することによって生成することができる。細胞外小胞には、例えば動物を処置するための医薬を細胞外小胞に充填させるなど、意図された使用のための化合物を充填させることができる。本明細書中に記載されるように、細胞外小胞は大規模に生成することができ、個別化処置のために使用し得る。本開示の別の実施形態は、処置対象に細胞外小胞を提供する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外小胞を生成する方法であって、少なくとも１つの哺乳動物細胞を、スルフヒドリルブロッキング試薬を含む溶液に曝露することを含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの哺乳動物細胞から生成した前記細胞外小胞を回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が緩衝液をさらに含む、請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記溶液中の前記緩衝液濃度を調整して、前記細胞外小胞のサイズ分布を変更することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記スルフヒドリルブロッキング試薬が、架橋試薬または還元剤のうちの少なくとも１つで構成される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記架橋試薬が、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、システイン、およびグルタチオンからなる群から選択される、請求項５から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
緩衝液をさらに含み、
前記架橋試薬がパラホルムアルデヒドであり；
前記還元剤がジチオスレイトールであり；
前記緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である、
請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
パラホルムアルデヒドの濃度が約２．５ｍＭ〜約２．５Ｍであり；
ジチオスレイトールの濃度が約０．２ｍＭ〜約２００ｍＭである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
パラホルムアルデヒドの濃度が２５ｍＭであり；
ジチオスレイトールの濃度が２ｍＭである、
請求項８から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
リン酸緩衝生理食塩水の濃度が、少なくとも５倍の濃度を有する、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
リン酸緩衝生理食塩水の濃度が、０．５倍未満の濃度を有する、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
リン酸緩衝生理食塩水の濃度が、少なくとも０．５倍かつ５倍未満の濃度を有する、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞外小胞が、アクチンを実質的に含まない、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞外小胞の実質的に全てが、約２５ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲のサイズであり、約０．６未満のＰＤＩを有する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞外小胞の実質的に全てが、約１００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲のサイズであり、約０．６未満のＰＤＩを有する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞外小胞の実質的に全てが、約７００ｎｍ〜約２０００ｎｍの範囲のサイズであり、約０．６未満のＰＤＩを有する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞外小胞の実質的に全てが、約１０００ｎｍ〜１００００ｎｍの範囲のサイズであり、約０．６未満のＰＤＩを有する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
処置対象に細胞外小胞を提供するための方法であって、
少なくとも１つの哺乳動物細胞から生成された少なくとも１つの細胞外小胞を得ることと、
前記処置対象に前記少なくとも１つの細胞外小胞を投与することと
を含む方法。
【請求項２０】
生理食塩水緩衝液中の前記少なくとも１つの細胞外小胞を精製することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの細胞外小胞に医薬を充填させることをさらに含む、請求項１９から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記充填させるステップが、前記少なくとも１つの細胞外小胞を医薬と共にインキュベートすることによって実施される、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬が、少なくとも１００μｇ／ｍＬの濃度を有し、ドキソルビシンおよび表面部分からなる群から選択される、請求項２１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が前記処置対象由来である、請求項１９から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が抗原提示細胞である、請求項１９から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が、樹状細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１９から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記投与するステップが、腫瘍組織に近接して実施される、請求項１９から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記投与するステップが、前記処置対象の応答を達成し、前記応答が、Ｔ細胞の活性化および免疫応答の刺激からなる群から選択される、請求項１９から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物細胞に由来する少なくとも１つの細胞外小胞を含む、化合物の送達のための組成物であって、前記少なくとも１つの細胞外小胞が核成分を実質的に含まず、前記少なくとも１つの細胞外小胞が約１０ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する、組成物。
【請求項３０】
前記哺乳動物細胞が、幹細胞、がん細胞、抗原を提示する樹状細胞、および赤血球からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの細胞外小胞が、約０．６未満のＰＤＩを有する、請求項２９から３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞が、初代細胞、または細胞株に由来する細胞からなる群から選択される、請求項２９から３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの細胞外小胞が、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径を有する複数の細胞外小胞である、請求項２９から３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの細胞外小胞が、前記哺乳動物細胞をスルフヒドリルブロッキング試薬に曝露することによって作り出される、請求項２９から３３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの細胞外小胞が、３７℃の血清中で少なくとも６時間安定である、請求項２９から３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの細胞外小胞に医薬が充填されている、請求項２９から３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
前記医薬が、治療剤、造影剤、抗がん剤、ドキソルビシン、抗原ペプチド、および抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
生理食塩水緩衝液をさらに含む、請求項２９から３７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年１１月３０日に出願されたＫｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，への「Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」と題した米国仮出願第６２／４２８，４９７号に対する優先権を主張し、その仮出願は本明細書にその全体が参照により援用される。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより与えられた補助金第ＤＧＥ１３２１８４６号の下政府支援によりなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
本発明は、その合成方法および応用を含めて、細胞外小胞を対象とし、より詳細には、生細胞から作り出され、サイズがより均一で、高い生産レベルで作り出される、細胞外小胞を対象とする。本発明はまた、細胞外小胞によって送達される医薬、さらには患者に細胞外小胞を送達する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
薬物送達および遺伝子治療の分野では、指定された標的部位に貴重なカーゴを効果的に送達するためのナノサイズの担体を利用する（例えば、参照によりその開示が本明細書に援用される、Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．  Ｅ．ら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、４巻、３４６〜５８頁（２００３年）；Ｌｖ，  Ｈ．，  Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ、１１４巻、１００〜９頁（２００６年）；およびＳｉｌｖａ，  Ａ．  Ｋ．  Ａ．ら、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ、５巻、１１３７４〜８４頁（２０１３年）を参照されたい）。治療用送達剤は以下の２つの重要な目的を有する：身体の過酷な環境からカーゴを保護すること、および免疫原性応答を誘発することなく適切な部位にカーゴを放出すること。これらの目的を達成するために、カーゴの種類および所望の送達部位に応じて、非常に特異的な特性を有する様々なウイルス性および非ウイルス性ナノキャリアが設計されている。一般的なウイルスナノキャリアには、レトロウイルスおよびアデノウイルスが含まれる。一般的な非ウイルスナノキャリアには、リポソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーが含まれる。さらに、化合物は、受動的な膜輸送、または膜を破壊する強引な侵入（例えば、微粒子銃、超音波処理）によって細胞に送達され得る。それにもかかわらず、非特異的細胞傷害性、不十分な生体適合性、および化合物送達の低い有効性に関する問題は、依然として当該技術分野における主要な課題のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．  Ｅ．ら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、４巻、３４６〜５８頁（２００３年）
【非特許文献２】Ｌｖ，  Ｈ．，  Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ、１１４巻、１００〜９頁（２００６年）
【非特許文献３】Ｓｉｌｖａ，  Ａ．  Ｋ．  Ａ．ら、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ、５巻、１１３７４〜８４頁（２０１３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
細胞は、細胞間でｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡなどの重要な生体高分子を輸送するために細胞外小胞（ＥＶ）を放出し、標的化された組織特異的な送達を達成するために外来性ＲＮＡ充填（ｌｏａｄ）エキソソームが使用されている。１つの一般的な種類のＥＶはエキソソームであり、これは治療的送達のための有力な候補の方法として研究されてきた。培養下の細胞は自然にＥＶを産生するが、速度が治療的投与の要件を大幅に下回るため、細胞をエンドソーム輸送調節因子、修飾タンパク質、および外部ストレッサーに曝露することによってそれを改善することが試みられている。しかしながら、これらの時間および労働集約的なプロセスは細胞活性に直接影響を及ぼし、所望の細胞段階でＥＶの組成および生物学的機能を保存することを困難にする。したがって、ＥＶを迅速かつ大規模に産生するための代替的な方法を探索することが不可欠である。
【０００６】
本開示の一実施形態は、細胞外小胞を生成する方法を対象とする。様々な実施形態では、これらの小胞は、少なくとも１つの哺乳動物細胞を、スルフヒドリルブロッキング試薬を含む溶液に曝露することによって作り出される。
【０００７】
多くのそのような実施形態では、この方法は、少なくとも１つの哺乳動物細胞を、スルフヒドリルブロッキング試薬を含む溶液に曝露することによって生成される細胞外小胞を回収することからなり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、溶液はまた、緩衝液からなり得る。いくつかのそのような実施形態では、この溶液で使用される緩衝液濃度は、この実施形態の方法によって産生される細胞外小胞のサイズおよび分布を修正するために変更され得る。
【０００９】
より多くの実施形態では、多数のスルフヒドリルブロッキング試薬を使用することができる。いくつかのそのような実施形態では、方法は、架橋試薬および還元剤を含むスルフヒドリルブロッキング試薬を使用し得る。いくつかのそのような実施形態では、架橋剤はホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドから選択することができ、一方、還元剤はジチオスレイトール、システイン、およびグルタチオンから選択することができる。
【００１０】
さらに他の実施形態では、パラホルムアルデヒドを架橋試薬として、ジチオスレイトールを還元剤として、リン酸緩衝生理食塩水を緩衝液として使用することができる。
【００１１】
なおもさらに他の実施形態では、パラホルムアルデヒドの特定の濃度は約２．５ｍＭ〜約２．５Ｍの範囲であり得、一方、ジチオスレイトールの特定の濃度は約０．２ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲であり得る。いくつかのそのような実施形態では、パラホルムアルデヒドの特定の濃度は２５ｍＭであり得、一方、ジチオスレイトールの特定の濃度は２ｍＭであり得る。さらに他のそのような実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水は少なくとも５倍の濃度を有し得、リン酸緩衝生理食塩水は０．５倍未満の濃度を有し得るか、またはリン酸緩衝生理食塩水は０．５倍未満の濃度を有し得る。
【００１２】
なおもさらに他の実施形態では、この実施形態の方法によって産生される細胞外小胞は、２５〜１００ｎｍ、１００〜７００ｎｍ、７００〜２０００ｎｍ、または１０００〜１００００ｎｍの範囲のサイズであり得る。これらのサイズ範囲では、細胞外小胞は、約０．６未満、例えば、約０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１のいずれか未満の多分散指数を有し得る。
【００１３】
本開示の別の実施形態は、処置対象に細胞外小胞を提供する方法に関する。
【００１４】
多くのそのような実施形態では、方法は、少なくとも１つの哺乳動物細胞から生成された少なくとも１つの細胞外小胞を得るステップを含み得る。
【００１５】
他の実施形態では、方法は、生理食塩水緩衝液中の少なくとも１つの細胞外小胞を精製することを含む。
【００１６】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも１つの細胞外小胞に医薬を充填させるステップを含み得る。いくつかのそのような実施形態では、充填させるステップは、少なくとも１つの細胞外小胞を医薬と共に３７℃で少なくとも１時間インキュベートすることによって実施され得る。
【００１７】
さらに他の実施形態では、充填された細胞外小胞は、少なくとも１００μｇ／ｍＬの濃度を有し得、ドキソルビシンおよびワクチンから選択され得る。
【００１８】
なおもさらに他の実施形態では、少なくとも１つの哺乳動物細胞は、処置対象から生じ得、抗原提示細胞であり得る。いくつかのそのような実施形態では、これらの細胞は、樹状細胞および腫瘍細胞から選択され得る。
【００１９】
なおもさらに他の実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞の投与は、腫瘍組織と近接して実施され得る。
【００２０】
なおもさらに他の実施形態では、投与するステップは、処置対象において応答をもたらし得、ここで、応答は、Ｔ細胞活性化または免疫応答刺激からなり得る。
【００２１】
本開示のさらに別の実施形態は、化合物の送達のための組成物を対象とする。
【００２２】
多くのそのような実施形態では、化合物は、哺乳動物細胞に由来する少なくとも１つの細胞外小胞を含み得、核成分を実質的に含まない。
【００２３】
他の実施形態では、細胞外小胞は、約１０ｎｍ〜約１００００ｎｍの直径を有する。
【００２４】
さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞は、幹細胞、がん細胞、抗原を提示する樹状細胞、および赤血球から生じ得る。
【００２５】
さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞は、初代細胞、または細胞株に由来する細胞から生じ得る。
【００２６】
なおもさらに他の実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞は、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径を有する複数の細胞外小胞であり得る。
【００２７】
なおもさらに他の実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞はまた、スルフヒドリルブロッキングによって生成することができ、３７℃の血清中で少なくとも６時間安定であり得、医薬を充填され得る。
【００２８】
なおもさらに他の実施形態では、この医薬は、治療剤、造影剤、抗がん剤、ドキソルビシン、抗原ペプチド、および抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドから選択され得る。
【００２９】
さらに他の実施形態では、この実施形態の化合物は、生理食塩水緩衝液を含み得る。
【００３０】
さらなる実施形態および特徴は、以下の説明に部分的に記載されており、部分的には本明細書を検討することにより当業者に明らかになるか、または本開示の実施により習得することができる。本開示の性質および利点のさらなる理解は、本開示の一部を形成する明細書および図面の残りの部分を参照することによって実現され得る。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の図面とともに説明するときの以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、細胞から放出され得る様々な細胞外体を、これらの体が有する可能性がある一般的なサイズ範囲と共に示す。
【００３３】
【図２】図２は、本発明の実施形態による、宿主の単離された細胞から産生された細胞外小胞で宿主を処置するためのプロセスを示す。
【００３４】
【図３】図３は、本発明の様々な実施形態による、細胞外小胞形成に関連した生物学的プロセスの改変を示す。
【００３５】
【図４】図４は、本発明の様々な実施形態による、細胞外小胞形成に関連した生物学的プロセスの改変を示す。
【００３６】
【図５Ａ】図５Ａは、パラホルムアルデヒドの濃度と、本発明の様々な実施形態によって生成された細胞外小胞に会合したタンパク質含有量に対する効果とを示す棒グラフである。
【００３７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、スルフヒドリルブロッカーの濃度と、本発明の様々な実施形態によって生成された細胞外小胞に会合したタンパク質含有量に対する効果とを示すデータのグラフである。
【００３８】
【図６】図６は、精製後の本発明の様々な実施形態からのホルムアルデヒドの除去を示す。
【００３９】
【図７】図７は、本発明の様々な実施形態による細胞外小胞の電子顕微鏡写真である。
【００４０】
【図８】図８は、本発明の様々な実施形態によって生成されたスルフヒドリルブロッキング試薬を用いずにまたは用いて処理されたＥＬ４細胞の上清を比較する電子顕微鏡画像を提示する。
【００４１】
【図９】図９は、スルフヒドリルブロッキング試薬の存在下および非存在下での細胞外小胞産生を示すデータのグラフである。
【００４２】
【図１０】図１０は、天然に存在するエキソソームと比較した、本発明の様々な実施形態によって産生された細胞外小胞の安定性を記載する。
【００４３】
【図１１】図１１は、本発明の様々な実施形態に従って生成される、未処理および無充填（図１１Ａ）、スルフヒドリルブロッキング試薬で処理した（図１１Ｂ）、スルフヒドリルブロッキング試薬で処理し、ＤＯＸを充填される（図１１Ｃ）という様々な処理を施したＥＬ４細胞に由来する上清の３つの電子顕微鏡画像の合成図である。
【００４４】
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の様々な実施形態の異なる濃度のリン酸緩衝生理食塩水によって産生されたナノスケールの細胞外小胞のサイズ範囲を示す動的光散乱アッセイの結果を提示する。
【００４５】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の様々な実施形態による細胞外小胞サイズとオスモル濃度との間の相関関係を示すデータのグラフである。
【００４６】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、本発明の様々な実施形態の異なる濃度のリン酸緩衝生理食塩水によって産生されたマイクロスケールの細胞外小胞のサイズ範囲を示す動的光散乱アッセイの結果を提示する。
【００４７】
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、本発明の様々な実施形態による、異なる濃度のリン酸緩衝生理食塩水によって産生された細胞外小胞の平均サイズおよび標準分布を示す棒グラフである。
【００４８】
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、本発明の様々な実施形態による、リン酸緩衝液の濃度を変えることによって産生された細胞外小胞の画像を示す。
【００４９】
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の様々な実施形態の異なる緩衝液によって産生された細胞外小胞のサイズ範囲を示す動的光散乱アッセイの結果を提示する。
【００５０】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本発明の様々な実施形態の同一の条件下で様々な緩衝液によって産生される細胞外小胞の量を示す棒グラフである。
【００５１】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、本発明の様々な実施形態の異なる緩衝液によって産生された細胞外小胞の多分散指数を表す棒グラフである。
【００５２】
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、本発明の様々な実施形態による、ＨＥＰＥＳおよび生理食塩水緩衝液の存在下で産生されたナノスケールの細胞外小胞のサイズおよび分布を示す。
【００５３】
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、本発明の様々な実施形態による、ＨＥＰＥＳおよび生理食塩水緩衝液の存在下で産生されたマイクロスケールの細胞外小胞のサイズおよび分布を示す。
【００５４】
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、細胞および小胞中のアクチンの存在とともに、本発明の様々な実施形態によって産生されている細胞外小胞の顕微鏡画像を示す。
【００５５】
【図１５】図１５は、細胞および細胞外小胞の電子顕微鏡画像を示し、本発明の様々な実施形態によって産生され得る細胞外小胞の可能なサイズ範囲を示す。
【００５６】
【図１６】図１６は、本発明の実施形態による、ＤＯＸ充填細胞外小胞によって腫瘍を処置するためのプロセスを示す。
【００５７】
【図１７Ａ】図１７Ａは、本発明の一実施形態によって、細胞外小胞内にＤＯＸを充填させるプロセスを示す。
【００５８】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、本発明の様々な実施形態によって生成された細胞外小胞の化合物充填に対する、化合物の濃度、温度、および時間の効果を示すデータのグラフである。
【００５９】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、本発明の様々な実施形態による、充填されている細胞外小胞の細胞外小胞対ＤＯＸの濃度の効果を示す。
【００６０】
【図１８Ａ】図１８Ａは、本発明の様々な実施形態によって生成された遠心濾過後の回収部分および濾液部分中のタンパク質濃度を示すデータのグラフである。
【００６１】
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、本発明の様々な実施形態によって生成された無充填細胞外小胞のサイズをＤＯＸ充填細胞外小胞と比較したデータのグラフである。
【００６２】
【図１９Ａ】図１９Ａは、本発明の様々な実施形態の裏付けとして、ＤＯＸＩＬとＤＯＸ充填細胞外小胞とを比較した、血清を含むかまたは含まないＰＢＳ中のＤＯＸ放出を示す一対のデータのグラフである。
【００６３】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、本発明の様々な実施形態を裏付けるために生成された、ＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、またはＤＯＸ充填細胞外小胞で処理し、エンドソームまたはリソソームに対して蛍光標識したＥＬ４細胞を示す共焦点顕微鏡画像の合成図である。
【００６４】
【図２０Ａ】図２０Ａは、本発明の様々な実施形態の裏付けとして、ＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、ＤＯＸ充填細胞外小胞、および無充填（ｕｎｌｅａｄｅｄ）細胞外小胞で処理したＥＬ４細胞の生存率を示す一対のデータのグラフである。
【００６５】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、本発明の様々な実施形態の裏付けとして、ＥＬ４細胞とＨｅＬａ細胞の両方に由来するＤＯＸ充填細胞外小胞で処理したＥＬ４細胞およびＨｅＬａ細胞の生存率を示す４つのデータのグラフである。
【００６６】
【図２１Ａ】図２１Ａは、本発明の様々な実施形態の裏付けとして、ＰＢＳ、無充填細胞外小胞、ＤＯＸ充填細胞外小胞、ＤＯＸ、およびＤＯＸＩＬで処置した腫瘍体積を示すデータのグラフである。
【００６７】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、本発明の様々な実施形態の裏付けとして、ＰＢＳ、無充填細胞外小胞、ＤＯＸ充填細胞外小胞、ＤＯＸ、およびＤＯＸＩＬ、ＰＢＳ、無充填細胞外小胞、ＤＯＸ充填細胞外小胞、ＤＯＸ、およびＤＯＸＩＬで処置した腫瘍を有するマウスの生存曲線を示すデータのグラフである。
【００６８】
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、本発明の様々な実施形態の裏付けとして、ＰＢＳ、無充填細胞外小胞、ＤＯＸ充填細胞外小胞、ＤＯＸ、およびＤＯＸＩＬで処置したマウスの、血清、肺、肝臓、心臓、脾臓、および腫瘍中のＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、およびＤＯＸ充填細胞外小胞のレベルを示す一対のデータのグラフである。
【００６９】
【図２２】図２２は、本発明の実施形態による、ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する細胞外小胞を使用して、処置対象を、腫瘍を引き起こす細胞に対して免疫化するためのプロセスを示す。
【００７０】
【図２３Ａ】図２３Ａは、本発明の様々な実施形態によって生成された無充填細胞外小胞のサイズを、ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する細胞外小胞と比較したデータのグラフである。
【００７１】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、本発明の様々な実施形態による、樹状細胞に由来する細胞外小胞が抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示することができることを示すデータのグラフである。
【００７２】
【図２４】図２４は、本発明の様々な実施形態による、抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する細胞外小胞によるＴ細胞の活性化を示すデータのグラフである。
【００７３】
【図２５Ａ】図２５Ａは、本発明の様々な実施形態による、未成熟樹状細胞、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示する未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、およびＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示する成熟樹状細胞に由来する細胞外小胞によるＴ細胞の活性化を示すデータのグラフである。
【００７４】
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、本発明の様々な実施形態による、未成熟樹状細胞、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示する未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、およびＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示する成熟樹状細胞に由来する細胞外小胞上のＳＩＩＮＦＥＫＬ提示のレベルを示すデータのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
ここで図表および図面を見ると、本発明の実施形態は、概して、ＥＶ、その製造方法、およびその応用に関する（図１）。いくつかの実施形態は、天然に存在するＥＶおよびエキソソームに類似する化学的に修飾された小胞であるＥＶ自体を対象とする。これらの実施形態の多くにおいて、ＥＶは、小胞内の構造の改変をもたらす、改変されたアクチン−ミオシン機能を有する。
【００７６】
様々な実施形態はまた、化合物を充填されたＥＶを対象とする。多くの実施形態では、ＥＶは特定の処置のために化合物を保持するように処理される。したがって、小胞体に充填された化合物は、適切な用途のために選択される。いくつかの実施形態では、抗新生物化合物は、新生物、腫瘍、またはがんの処置のためにＥＶに充填される。さらに特定の実施形態では、抗新生物化合物はドキソルビシンである。他の多くの実施形態では、ＥＶは、例えばＴ細胞活性化を誘発するなどの特定の免疫応答を誘導するための抗原化合物を提示する。さらに特定の実施形態では、ＥＶはがん抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示する。
【００７７】
多くの実施形態によるＥＶの製造方法もまた記載されている。これらの実施形態の多くにおいて、ＥＶは、用途に応じて任意の動物細胞から製造することができる。例えば、患者を処置するために、患者自身の細胞を抽出して使用して、同種免疫反応の欠如を含み得るいくつかの利点を有するＥＶを製造することができる。したがって、複数の実施形態は、動物宿主供給源に由来する個別化ＥＶを対象とする。ＥＶ製造のための細胞型もまた、用途に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、選択される細胞型は、血球、線維芽細胞、または腫瘍細胞である。様々な実施形態では、細胞型は抽出および培養を容易にするために選択される。他の実施形態では、細胞型は細胞の特徴に基づいて選択される。例えば、樹状細胞は、それらの抗原提示能について選択され得、これは抗原を提示するＥＶをもたらし得る。したがって、多くの実施形態は、抗原提示細胞に由来するＥＶを対象とする。
【００７８】
多くの実施形態では、ＥＶは、細胞をスルフヒドリルブロッキング試薬と共にインキュベートすることによって産生される。これらの試薬は、ブレブ形成として知られる自然の細胞現象の機能を改変する。スルフヒドリルブロッキング試薬によるブレブ形成の改変は、改変された構造の小胞をもたらす。多くの実施形態では、スルフヒドリルブロッキング試薬は、非特異的架橋剤および還元剤で構成され得る。いくつかの実施形態では、非特異的架橋剤は、Ｎ−エチルマレアミド、ホルムアルデヒド、およびパラホルムアルデヒドから選択される。いくつかの実施形態では、還元剤はジチオスレイトール、システイン、およびグルタチオンから選択される。いくつかの実施形態では、非特異的架橋剤はパラホルムアルデヒドであり得、還元剤はジチオスレイトールであり得る。さらに特定の実施形態では、試薬の濃度は、２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドである。パラホルムアルデヒド、およびそのモノマーサブユニットであるホルムアルデヒドは非特異的架橋試薬であり、一方、ジチオスレイトールは還元剤であることに留意されたい。さらに、特定の実施形態は、ＥＶのスケーラブルな製造に関する。したがって、本明細書に記載のプロセスの実施形態は、大量の個別化ＥＶをもたらす。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、スルフヒドリルブロッキング試薬と共に緩衝液の存在下で産生され得る。いくつかの実施形態では、緩衝液濃度は、０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、９倍、および１０倍のいずれかである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳ、生理食塩水、ＤＭＥＭ、ＧＰＭＶ、ＨＥＰＥＳ、ＤＰＢＳ、または当該技術分野において公知の任意の他の緩衝液からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、緩衝液は１倍のＰＢＳであり、いくつかの実施形態では、緩衝液は０．１倍であり、いくつかの実施形態では、緩衝液は１０倍である。
【００８０】
様々な実施形態はまた、処置方法を対象とする。多くの実施形態では、処置方法は、例えばヒト患者などの動物対象に対して、化合物充填ＥＶを利用することである。様々な他の実施形態では、処置方法は、動物対象に対して抗原提示ＥＶを利用することである。処置する障害は、用途に応じて変動する。したがって、いくつかの実施形態では、ＥＶは、処置のために化合物を利用するあらゆる障害の処置に使用することができる。さらに特定の実施形態では、抗新生物化合物を充填されたＥＶは、新生物、腫瘍、またはがんを処置するために使用される。他の特定の実施形態では、抗原提示ＥＶは、障害を処置するために免疫応答を誘発するために利用される。さらに特定の実施形態では、抗原提示ＥＶによって処置される障害は、がんまたは病原性感染症である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、治療剤を充填するために生成され得る。いくつかの実施形態では、治療剤はドキソルビシン（ＤＯＸ）であり得る。ＤＯＸを充填されるＥＶを生成するために、ＥＶは、緩衝液の存在下でスルフヒドリルブロッキングを介して採取された細胞中に小胞形成を誘導することによって、特にＰＢＳの存在下でパラホルムアルデヒドおよびジチオスレイトールにより誘導される小胞形成を誘導することによって産生し得る。この手段によって生成されたＥＶは、遠心分離によって単離し、ＤＯＸの存在下でインキュベートしてＥＶにＤＯＸを充填させることができる。ＤＯＸを充填させると、ＥＶを再度濾過して、溶液から過剰なＤＯＸを除去することができる。この時点で、ＤＯＸ充填ＥＶ（ＤＯＸ−ＥＶ）を個人に投与することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、特定の表面部分を提示するために生成され得る。いくつかの実施形態では、表面部分はＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原であり得る。ＳＩＩＮＦＥＫＬ充填ＥＶ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＥＶ）を生成するために、細胞を個体から採取することができる。採取した細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原の存在下でパルスして、採取した細胞がＳＩＩＮＦＥＫＬを提示するようにできる。採取した細胞にＳＩＩＮＦＥＫＬを充填させると、緩衝液の存在下でのスルフヒドリルブロッキングを介して小胞形成が誘導され得、特にＰＢＳの存在下でのパラホルムアルデヒドおよびジチオスレイトールによって小胞形成が誘導される。この小胞形成によって生成されたＥＶは、任意の細胞または過剰な化学物質を除去するための遠心分離によって収集され得る。得られたＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＥＶを個体に投与して、ＳＩＩＮＦＥＫＬの存在に対する個体の応答を誘導することができる。
【００８３】
ここで図２を見ると、ＥＶによる個別化処置のためのプロセスの実施形態が提示されている。図２は例示的なものにすぎず、本発明の実施形態は個別化処置に限定されないことに留意されたい。プロセス２００に記載されているような個別化処置のレジメンでは、処置される宿主は、ＥＶを製造するために動物細胞を提供したのと同一の宿主である。例えば、がんを有する患者は、患者からの単離細胞（２０２）、患者の単離細胞からのＥＶの産生（２０４）、由来するＥＶへの新生物化合物の充填（２０６）、および個別化化合物充填ＥＶによる患者の処置（２０８）による個別化処置を受けることができる。ヒトが示唆されているが、しかしながら、それぞれの非ヒト動物に対する獣医学的または実験的処置もまた実施し得ることも理解されたい。
【００８４】
プロセス２００は、宿主供給源から動物細胞を抽出および単離することで開始することができる（２０２）。いくつかの実施形態では、宿主は、例えばヒト患者などの処置される任意の動物である。抽出される細胞型は、用途に応じて変動する。多くの実施形態では、細胞型は、血球または線維芽細胞などの、アクセスおよび培養が容易なものである。個別化されていない状況では、細胞は、患者または宿主から直接ではない別の供給源から採取され得る。他の供給源から細胞を採取することは、細胞培養において確立された細胞株から採取された細胞、または別の動物もしくはヒトなどの別の宿主供給源から細胞を採取することを含み得る。
【００８５】
プロセス２００は、単離された動物細胞からのＥＶの産生を継続することができる（２０４）。単離された動物細胞へのスルフヒドリルブロッキング試薬の適用は、スケーラブルな大量のＥＶを生じ得る。特定の実施形態では、スルフヒドリルブロッキング試薬は、２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドである。しかしながら、用途および最適化に応じて、使用されるスルフヒドリルブロッキング試薬およびそれらの濃度は変動し得ることを理解されたい。ＥＶが産生されると、小胞は、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、または他の適用可能な方法を含み得る許容されるプロトコールによって濃縮および精製することができる。
【００８６】
単離されたＥＶには、目的の化合物を充填させることができる（２０６）。充填される化合物は、用途によって決定される。例えば、個別化治療ががんを対象とする場合、化合物は抗新生物薬であり得る。したがって、小胞に薬物を充填させるために、ＥＶを目的の化合物と共にインキュベートする。化合物の充填手順は、ＥＶと化合物の特性によって変動するであろう。例えば、ＥＶに抗新生物薬ドキソルビシンを充填させることは、化合物濃度、温度、およびインキュベーション時間に依存する。
【００８７】
ＥＶに目的の化合物が充填されると、化合物充填小胞を宿主の処置に使用することができる（２０８）。治療部位は、用途に応じて変動するであろう。例えば、ＥＶと共に、腫瘍部位に局所的に、または任意の適切なメカニズム（例えば、経口、静脈内）によって全身的に投与することができる。
【００８８】
プロセス２００に存在するステップは、必ずしも図２に記載されている順序で完了する必要はないことに留意されたい。このように、いくつかの実施形態では、小胞に目的ステップの化合物を充填させることは、スルフヒドリルブロッキングによって小胞を産生する前に起こり得る。そのような例は、小胞に化合物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、またはペプチド）が充填され、小胞が産生されるであろう細胞によって産生される状況で起こり得る。
【００８９】
ＥＶは、ナノスケールの送達にとって刺激的な選択肢となる可能性を有している。ＥＶは、宿主の処置のために、ほとんど天然の生物学的担体を利用する独自の機会を提示する。図３に図示されるように、細胞外小胞は、個別化された治療用送達担体を開発するための説得力のある機会を提示する。一実施形態では、細胞は患者から採取され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで小胞を産生するために使用される。さらなる実施形態では、これらの小胞は、患者の罹患組織への送達のために化合物を充填されている。いくつかの実施形態では、ＥＶは、標的化を改善するための表面修飾を含む。図３の例によって示されるような個別化処置は、非自己化合物担体に関連する免疫原性応答を軽減するであろう。さらに、小胞上の表面修飾および修飾と標的化宿主細胞との相互作用によって決定されるように、ＥＶは標的化を改善することもできる。
【００９０】
治療的送達におけるそれらの高い可能性にもかかわらず、小胞に基づく治療剤は大量生産に関連する問題のために臨床治験に進むのが遅くなっていた。ｅｘ  ｖｉｖｏでの小胞の産生に関連する低収率は、産生過程におけるボトルネックにつながる主な課題である。さらに、ＥＶを産生するためのホルムアルデヒドおよびＮ−エチルマレアミドのようなスルフヒドリルブロッキング試薬の伝統的な使用は、典型的には巨大な原形質膜小胞を与える（例えば、参照によりその開示が本明細書に援用される、Ｅ．  Ｓｅｚｇｉｎら、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．、７巻、１０４２〜５１頁（２０１２年）の膜ラフト研究に示されるように）。その大きなサイズおよび多分散性のために、巨大な原形質膜小胞は、適切な治療的送達の担体ではない。
化合物の送達のための組成物
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＥＶを使用して哺乳動物細胞に由来する化合物を送達することができる。ＥＶはまた、核成分を含まなくてもよい。核成分は、細胞の核内に局在すると理解されているタンパク質および核酸によって特徴付けることができる。核成分は、核から排出されるように自然にまたは人工的に設計された細胞成分を含まない。そのため、核成分は、排出される可能性がある、糖、タンパク質、核酸からならないものであり得る。そのような核酸は、自然にまたは人工的に核から排出される、プラスミドＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、核ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子からなり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態のＥＶは、幹細胞、樹状細胞、赤血球、またはがん細胞からなる群から生じ得る有核細胞または非有核細胞から生じ得る。特定の実施形態では、ＥＶは、樹状細胞から生じ得る。いくつかの実施形態では、ＥＶは、抗原を提示する樹状細胞から生じ得る。いくつかの実施形態では、ＥＶは個体から採取された初代細胞から生じ得、またはＥＶは細胞培養で樹立された細胞株から生じ得る。
【００９３】
ＥＶが幹細胞、樹状細胞、赤血球、またはがん細胞のいずれかを含む有核細胞または非有核細胞から生じ、細胞が抗原を提示するか、または提示しない、化合物の送達のための組成物の実施形態では、これらの実施形態は複数のＥＶを含むことができ、ＥＶの平均直径は約１０ｎｍ〜約２００ｎｍである。これらの実施形態のいくつかでは、ＥＶの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が約１０ｎｍ〜約２００ｎｍであり得る。
【００９４】
化合物の送達のための組成物についての上述の実施形態のいずれにおいても、組成物はスルフヒドリルブロッキング試薬を含み得る。さらに、化合物の送達のための組成物についての実施形態のいずれかにおいても、ＥＶは架橋アクチン、架橋ミオシン、または架橋アクチンと架橋ミオシンの両方を含み得る。架橋アクチン、架橋ミオシン、または架橋アクチンと架橋ミオシンの両方を含む実施形態では、アクチン、ミオシン、またはアクチンの平均して少なくとも０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％とミオシンが架橋している。
【００９５】
化合物の送達のための組成物に関する上述の実施形態のいずれにおいても、ＥＶは、３７℃の血清中で少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１６、２４、または４８時間安定であり得る。
【００９６】
さらに、化合物の送達のための組成物に関する上述の実施形態のいずれにおいても、ＥＶに化合物を充填させることができる。これらの実施形態のいくつかでは、化合物は治療剤または造影剤である。化合物が治療剤である実施形態では、化合物は抗がん剤であり得る。化合物が抗がん剤である実施形態では、化合物はドキソルビシンであり得る。さらに、化合物が治療剤である実施形態では、化合物は、抗原性ペプチドおよび抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドから選択することができる。
【００９７】
化合物の送達のための組成物についての上述の実施形態のいずれにおいても、組成物は、ＥＶの浸透圧を維持するための薬剤を含み得る。ＥＶの浸透圧を維持するための薬剤を含む実施形態では、薬剤は生理食塩水緩衝液であり得る。
哺乳動物細胞に由来するＥＶの産生方法
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、哺乳動物細胞を架橋剤および還元剤と共にインキュベートすることによって産生され得る。ＥＶを産生するためのこれらの実施形態では、架橋試薬はホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドから選択され得る。ＥＶを産生する方法の上述の実施形態のいずれにおいても、還元剤は、ジチオスレイトール、システイン、およびグルタチオンから選択され得る。ＥＶを産生する方法の上述の実施形態のいずれにおいても、架橋剤はパラホルムアルデヒドであり得、還元剤はジチオスレイトールであり得る。架橋剤がパラホルムアルデヒドであるＥＶを産生する方法の上述の実施形態では、パラホルムアルデヒドは約２．５ｍＭ〜約２．５Ｍの濃度であり得る。還元剤がジチオスレイトールであるＥＶを産生する方法の上述の実施形態では、ジチオスレイトールは約０．２ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度であり得る。架橋剤がパラホルムアルデヒドであり還元剤がジチオスレイトールであるＥＶを産生する方法の上述の実施形態では、パラホルムアルデヒドの濃度は２５ｍＭの濃度であり得、ジチオスレイトールは２ｍＭの濃度であり得る。
【００９９】
ＥＶを産生する方法の上述の実施形態のいずれにおいても、ＥＶは、化合物と共にインキュベートすることができる。ＥＶを化合物と共にインキュベートするＥＶを産生する方法の実施形態では、ＥＶを約３７℃で化合物と共にインキュベートすることができる。ＥＶを化合物と共にインキュベートすることができる実施形態では、濃度は少なくとも１００μｇ／ｍＬの濃度であり得る。さらに、ＥＶを化合物と共にインキュベートすることができる実施形態では、ＥＶを少なくとも３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、または２４時間、化合物と共にインキュベートすることができる。ＥＶを化合物と共にインキュベートすることができる実施形態のいずれにおいても、化合物はドキソルビシンであり得る。
【０１００】
ＥＶを産生する方法の上述の実施形態のいずれにおいても、方法は、ＥＶの浸透圧を維持するための薬剤で組成物を処理することをさらに含み得る。ＥＶを産生する方法がＥＶの浸透圧を維持するための薬剤で組成物を処理することを含む実施形態では、浸透圧を維持するための薬剤は生理食塩水緩衝液であり得る。
疾患または障害を処置するための方法
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態は、疾患または障害に罹患した対象に上述のような化合物の送達のための組成物を投与することを含む、疾患または障害を処置する方法であり得、ここで組成物は、治療剤、例えば抗がん剤、ドキソルビシン、または抗原性ペプチド、および抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。疾患または障害を処置する方法の上述の実施形態では、化合物において使用される哺乳動物細胞は、対象から採取され得る。上述の実施形態のいずれかにおいて、細胞は腫瘍細胞であり得る。細胞が腫瘍細胞から採取される実施形態では、ＥＶは、腫瘍細胞に対して、または腫瘍細胞に近接して投与され得る。
【０１０２】
細胞が対象由来の哺乳動物細胞である、疾患または障害を処置する方法の実施形態では、哺乳動物細胞は対象由来の抗原提示細胞であり得る。哺乳動物細胞が抗原提示細胞である、疾患または障害を処置する方法の実施形態では、細胞は樹状細胞であり得る。ＥＶに化合物が充填され、化合物が治療剤、造影剤、抗がん剤、またはドキソルビシンである、疾患または障害を処置する方法の実施形態では、化合物は、疾患または障害のためのワクチンであり得る。
Ｔ細胞を活性化するための方法
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態は、対象に上述のような化合物の送達のための組成物を投与することを含むＴ細胞を活性化する方法からなり得、ここで組成物は、治療剤、抗がん剤、ドキソルビシン、または抗原性ペプチドおよび抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。Ｔ細胞を活性化する方法の上述の実施形態では、哺乳動物細胞は樹状細胞であり得る。
免疫応答を刺激するための方法
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態は、対象に上述のような化合物の送達のための組成物を投与することを含む免疫応答を刺激するための方法からなり得、ここで組成物は、治療剤、抗がん剤、ドキソルビシン、または抗原性ペプチドおよび抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。免疫応答を刺激するための方法の上述の実施形態では、哺乳動物細胞は樹状細胞であり得る。
ＥＶの産生および特徴付けの実施形態
【０１０５】
ＥＶの形成は、原形質膜の一部の突出および収縮である、ブレブ形成として知られる生物学的プロセスを必要とする。ブレブ形成は静水圧の変化の結果であり、細胞骨格メカニズムによって打ち消される（参照によりその開示が本明細書に援用される、Ｇ．  Ｔ．  Ｃｈａｒｒａｓら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１７５巻、４７７〜９０頁（２００６年））。細胞質の静水圧とアクチンフィラメントの収縮との間の相反する力が、小胞が放出されるかまたはブレブが収縮するかを決定する（参照によりその開示が本明細書に援用される、Ｊ．  Ｈａｇｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｍ．  ＢｕｒｇｅｒおよびＪ．  Ａ．  Ｔｈｅｒｉｏｔ、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７３巻、４８８〜９９頁（１９９９年））。したがって、ブレブ形成は、アクチンおよびミオシンの機能に大きく依存する。図３は、単離および精製の前後の架橋由来ＥＶを示す。
【０１０６】
図４に示すように、細胞をスルフヒドリルブロッキング試薬に曝露すると、不可逆的なブレブ形成の状態が誘導される。スルフヒドリルブロッキング試薬の濃度はアクチン−ミオシン機能に影響を及ぼし、また培地のオスモル濃度と相関する。これは、ブレブ形成における静水圧とアクチン−ミオシン機能の重要性を暗示する。
【０１０７】
本発明の様々な実施形態によれば、スルフヒドリルブロッキング試薬によるＥＶ形成は、その非常に速いＥＶ産生速度のために非常に有利である。カルシウムおよびストレスに誘発されるＥＶ産生などの他のＥＶを産生する方法は、著しく改善された収率を達成するために１２時間から数日を要する。本明細書に記載の実施形態による方法は、たった１時間で同様の量のＥＶを形成することができる。さらに、小胞は、それらが由来する細胞と類似の膜組成および小胞内サイトゾル成分を有するので、記載のように生成されたＥＶは、特徴付けおよび修飾が比較的容易である。
【０１０８】
図５には、スルフヒドリルブロッキング試薬の濃度を変えたＥＶの産生の実施形態が記載されている。具体的には、図５Ａは、パラホルムアルデヒドの濃度を変更し、２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドで最大生産レベルを示すような実施形態を実証している。図５Ｂは、１倍＝２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドとなるような、様々な濃度のスルフヒドリルブロッキング試薬にＨｅＬａ細胞を曝露した実施形態を示す。ＥＶを単離し、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量した。これらのデータは、ＨｅＬａ細胞によるＥＶの産生が、試験した他の濃度と比較して、２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドで最も高いことを示している。
【０１０９】
様々な実施形態では、ＥＶは、ＥＶを細胞または細胞残屑から分離するための任意の適切な手段によって回収することができる。いくつかの実施形態では、ＥＶを単離するために、１，２００ｒｐｍで５．５分間遠心分離し、続いて１０，０００ｒｐｍで１０分間細胞残屑およびマイクロサイズの小胞を除去することによって細胞を除去した。ＥＶを３０ｋＤａセントリコン（４，５００ｒｐｍで１５分間）で濃縮し、ＥＶ含有上清を濃縮し、等容量のＰＢＳで２回洗浄した。本開示の実施形態におけるＥＶの産生時に、図６に示されるように、遠心分離を使用してホルムアルデヒド残留物を除去することができる。得られたＥＶ回収物中のホルムアルデヒドの存在は、１Ｈ  ＮＭＲによって測定された。遠心分離によってホルムアルデヒドを除去する実施形態は例示にすぎず、任意の添加試薬に由来する残留物は、遠心分離、吸収、中和、または当該技術分野で公知の他の手段を含む任意の適切な手段によって除去できることに留意されたい。
【０１１０】
スルフヒドリルブロッキング試薬によるＥＶ産生のための下限サイズを分析するために、ＥＶを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）などの手段によって分析することができる。図７は、小胞形成しているＨｅＬａ細胞の上清をＴＥＭによって分析した実施形態を示す。本発明の様々な実施形態により、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理したＨｅＬａ細胞は、ＴＥＭ測定によって二次的に確認されるように大量のＥＶを生成する。対照（挿入図）はＥＶを示さないので、これらのナノサイズのＥＶは通常の細胞プロセスによって生成されるエキソソームである可能性は低い。その代わりに、スルフヒドリルブロッキング試薬に誘導されるブレブ形成は、細胞がナノサイズのＥＶを放出することをもたらす。さらに、図８は、ＰＦＡ／ＤＴＴを用いておよび用いずに処理したＥＬ４細胞のＴＥＭ画像を示す。図８ＡのＴＥＭ画像から、無血清／無試薬培地中でインキュベートしたＥＬ４細胞由来の上清が小胞をほとんどまたは全く有さないが、一方、２５ｍＭパラホルムアルデヒドおよび２ｍＭジチオスレイトールを含む無血清培地中で４時間インキュベートしたＥＬ４細胞は、丸で示すように、多くのナノサイズのＥＶを有することが実証された。ＥＶをより明確に調べるために、細胞、残屑、および巨大原形質膜小胞を１６，１００×ｇでの遠心分離によって除去した。次いで、ＥＶを単離し、１００，０００×ｇでの遠心分離により濃縮した。
【０１１１】
ＥＶは、有望な可能性のある治療用担体である。固有の小胞産生の低収率が問題である。しかしながら、スルフヒドリルブロッキング試薬を使用して、治療用カーゴを運ぶのに適したサイズのＥＶを産生することができる。図９は、スルフヒドリルブロッキング試薬の存在下および非存在下でのＥＶ産生の実施形態を実証する。ＥＬ４細胞を、３７℃で５ｍＬのＤＭＥＭ（ＦＢＳを含まない）中で２４時間、または３７℃で９０μＬの４％ＰＦＡ溶液および１０μＬの１Ｍ  ＤＴＴを含む５ｍＬのＰＢＳ中で２時間、細胞１００，０００個／ｍＬでインキュベートした。細胞および細胞残屑を１２００ｒｐｍで５．５分間の遠心分離によって除去した後、マイクロサイズの小胞を１３，２００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、上清中にＥＶを残した。次いで、ＥＶを４，５００ｒｐｍで１０分間、３０ｋＤａセントリコンによって単離した。ＥＶを５ｍＬのＤＰＢＳで３回洗浄して遊離タンパク質およびスルフヒドリルブロッキング試薬を除去した。タンパク質含有量は、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して評価した（図９）。スルフヒドリルブロッキング試薬に曝露していない細胞から産生された小胞は、エキソソームと呼ばれる。スルフヒドリルブロッキング試薬は、顕著に短い生産期間で、タンパク質定量に基づいて、天然に存在するエキソソームと比較して顕著に大量の（１０倍）量のＥＶを産生する。
【０１１２】
さらに、本発明の実施形態によって産生されたＥＶの安定性は様々な手段によって測定することができる。図１０は、特定の実施形態によって産生されたＥＶに対するエキソソームの安定性を記載する。この図において、いくつかの実施形態のエキソソームおよびＥＶのサイズ範囲は、０、２４、および４８時間に測定された動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたものとして示されている。さらに、多分散性指数（ＰＤＩ）は、時間が経過するにつれて、エキソソームが多分散性を増加させる一方で、特定の実施形態のＥＶは安定したままであることを示す。また、エキソソームのアニオン性表面電荷は経時的に減少したが、いくつかの実施形態のＥＶは、最初の測定と比較したとき、２４および４８時間後に比較的安定したままである。
【０１１３】
ここで図１１を見ると、治療剤を運ぶためにＥＶを生成し使用する能力について記載する。具体的には、図１１は、本発明の様々な実施形態によって産生されたＥＶのサイズを実証する。特に、図１１Ａは、スルフヒドリルブロッキング試薬に曝露されていない対照ＥＬ４細胞から回収した上清のＴＥＭ画像である。図１１Ｂは、スルフヒドリルブロッキングを介して産生されたいくつかの実施形態のＥＬ４のＥＶの代表的なＴＥＭ画像を示す。図１１Ｃは、スルフヒドリルブロッキングによって産生された後にドキソルビシン（ＤＯＸ）を充填されたＥＬ４のＥＶを示す。図１１のスケールバーは、２００ｎｍに等しい。
【０１１４】
さらに、本発明の実施形態では、産生されているＥＶのサイズは、緩衝液のオスモル濃度を調整することによって変更することができる（図１２）。いくつかの実施形態では、ＥＶを生成するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をスルフヒドリルブロッキング試薬と一緒に使用することができる。この図では、２５ｍＭ  ＰＦＡ、２ｍＭ  ＤＴＴを、０．１倍、１倍、および１０倍濃度のＰＢＳと共に使用して、ＥＶを生成した。これらの実施形態において産生されたＥＶのサイズ分布は、ＤＬＳアッセイによって測定された。ＰＢＳ濃度の増加は、いくつかの実施形態で、より小さく産生されるＥＶをもたらした。これらの結果は、いくつかの実施形態で産生されたＥＶのサイズが特定の必要性に適合するようにカスタマイズされ得ることを示している。
【０１１５】
具体的には、図１２Ａは、いくつかの実施形態の１０ｎｍ〜１，０００ｎｍのサイズ範囲（ナノスケールのＥＶ）のＥＶを生成するために緩衝液濃度を増加させることの効果を実証する。本開示に記載されているように、ナノスケールのＥＶの実施形態は、細胞内に小胞形成を誘導し、続いて３０ｋＤａの遠心濾過によって生成することができる。いくつかの実施形態では、３０ｋＤａの遠心濾過の前に、最初の１，２００ｒｐｍの遠心分離によって細胞を溶液から除去することができる。さらに、図１２Ｂは、オスモル濃度の増加とより小さいＥＶとの間の直線関係を示す同様の結果を実証する。
【０１１６】
同様に、図１２Ｃおよび図１２Ｄは、他の実施形態において、５００ｎｍから１５，０００ｎｍを超えるサイズ範囲（マイクロスケールのＥＶ）でＥＶを生成するために、緩衝液濃度を増加させることの効果を実証する。マイクロスケールのＥＶの実施形態は、細胞内に小胞形成を誘導し、続いて１，２００ｒｐｍで遠心分離して細胞を除去することによって生成することができる。残りの上清を、９，３００×ｇでさらに遠心分離して、マイクロスケールのＥＶを単離することができる。マイクロスケールのＥＶの単離後に残っている上清もまた、ナノスケールのＥＶをさらに単離するために３０ｋＤａの遠心濾過に供することができることに留意されたい。様々な実施形態のマイクロスケールのＥＶの画像を図１２Ｅに示す。これらの画像では、スルフヒドリルブロッキング試薬を様々な濃度のＰＢＳと共に使用して生成されたマイクロスケールのＥＶのサイズおよび分布が示されている。
【０１１７】
特定の実施形態において産生されるＥＶのサイズはまた、代替の緩衝液を使用することによって調整され得る。図１３Ａは、ＤＬＳによって測定されるときの、いくつかの実施形態によって産生されたＥＶのサイズに対するいくつかの緩衝液の効果を実証する。この図では、緩衝液ＤＰＢＳ、ＤＭＥＭ、およびＧＰＭＶが、スルフヒドリルブロッキング試薬と共に、より大きなμｍサイズのＥＶを含む、様々なサイズ範囲のＥＶを産生することが示されている。
【０１１８】
さらに、全ての緩衝液が同一の速度でＥＶを産生するとは限らない。図１３Ｂは、タンパク質含有量を評価するためのＢＣＡアッセイによって決定されるときの、様々な緩衝液によるＥＶの産生を実証する。示されるように、ＰＢＳおよびＤＰＢＳ緩衝液は、ＧＰＭＶおよびＤＭＥＭ緩衝液よりも効率的である。図１３Ｃは、ＰＢＳおよびＧＰＭＶ緩衝液によって産生されたＥＶのＰＤＩを実証する。図１３Ｃに示されるように、ＰＢＳ緩衝液はより低いＰＤＩを有するＥＶを産生し、これはＰＢＳが、ＧＰＭＶによって産生されるＥＶのほぼ完全な多分散性を示す約１のＰＤＩを有するＧＰＭＶと比べてより均一なサイズのＥＶを作り出すことを示す。さらに、図１３Ｄは、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．９％生理食塩水による小胞形成によって産生されたナノサイズのＥＶを実証しており、これらの緩衝液の間で非常に広いサイズ分布および高い多分散性を示す。同様に、図１３Ｅは、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．９％生理食塩水を使用するマイクロサイズのＥＶの産生を示しており、これらの緩衝液の間で非常に広いサイズ分布および高い多分散性を示す。
【０１１９】
図１３に示されるこれらの緩衝液のそれぞれは、浸透圧と追加の細胞増殖との均衡をとるための様々な成分を含み得る。図１３に示す結果は、溶液のオスモル濃度の変化が、様々な実施形態によって産生されるＥＶの平均サイズ、サイズ分布、または産生速度を調整する際の唯一の因子ではないことを示している。
【０１２０】
ここで図１４を見ると、これは、本発明の様々な実施形態によって産生されたＥＶ内のアクチンの存在を評価する能力を実証している。図１４Ａにおいて、左パネルは、宿主細胞から形成されているマイクロスケールのＥＶの光学顕微鏡画像を示し、一方、図１４Ａ、右パネルは、蛍光色素で染色されたアクチンの存在を示す。同様に、図１４Ｂは、いくつかの実施形態によって産生されたＥＶがアクチンを実質的に含まない可能性があることを示すために、蛍光画像を光画像上に重ね合わせている。
【０１２１】
生物学的データは、ＥＶの生成と特性記述を裏付ける。さらに、データは、治療的処置として可能な化合物送達システムにＥＶを使用することができるという概念を裏付ける。以下のデータはまた、宿主供給源由来のＥＶのスケーラビリティと強化された産生について詳述する。したがって、これらのデータは、記載されたような本発明の様々な実施形態を裏付ける。ここで図１５を見ると、特定の実施形態は、他の実施形態によって産生された様々なサイズのＥＶを利用することができる。具体的には、より小さなナノスケールのＥＶは薬物送達により適し得るが、より大きなマイクロスケールのＥＶは免疫療法における用途により適し得る。
ＥＶの薬物送達ビヒクルの実施形態
【０１２２】
本開示のいくつかの実施形態は、薬物または他の治療剤を個体に送達するために使用され得る。そのような送達メカニズムはまた、ペプチド、タンパク質、核酸、または造影剤を輸送するために使用され得る。治療剤の例は、合成または天然の化合物、例えば小分子、核酸、またはペプチドであり得る。そのような薬剤の例には、薬物、ホルモン、酵素、タンパク質、脂質、糖、糖タンパク質、転写因子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子、導入遺伝子、および色素が含まれる。即時転写のためのペプチドをコードするｍＲＮＡのような、多くの天然化合物を使用することは、所望の効果を直接的に引き出すことができる。代替的に、いくつかの化合物は、転写因子の送達が先天性遺伝子を活性化し得るように、所望の組織に応答を生じさせることができる。さらに、特定の造影剤の送達は、隣接する組織によってバックグラウンド画像化信号が生成されることなく、画像化のために特定の細胞型または組織への色素の蓄積を可能にし得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、治療剤、診断剤、または治療剤と診断剤の組み合わせを含む目的の薬剤は、ＥＶの産生の前に、同時に、その後に、またはそれらの任意の組み合わせで細胞に充填され得る。そのような実施形態では、採取した細胞に治療剤を充填させてもよく、または採取した細胞を誘導して目的の薬剤を産生してもよい。細胞に目的の薬剤を充填させる実施形態では、細胞を本開示内に記載されているのと同様の条件で目的の薬剤と共にインキュベートして、細胞に治療剤を取り込ませることができる。目的の薬剤を産生するように細胞を誘導することによって細胞に充填させる実施形態では、細胞は、治療特性を有する特定のペプチド、核酸、またはペプチドと核酸の両方を産生し得る。治療用ペプチドは、小ペプチド、タンパク質サブユニット、タンパク質全体、または上述の任意の組み合わせを含み得る。治療用核酸は、遺伝子配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、または細胞内で産生される核酸の任意の組み合わせを含み得る。さらに、リボ核タンパク質または他の任意の形態のタンパク質−核酸複合体が細胞内で産生され得る。いくつかの実施形態では、細胞に目的の薬剤が充填されると、小胞形成が誘導され得る。他の実施形態では、細胞内への治療剤の充填中に小胞形成が誘導され得る。小胞形成が充填中に起こり得る状況は、細胞が治療剤を産生している場合を含み得る。小胞形成を誘導すると、充填細胞から産生されたＥＶは、目的の薬剤を含み得る。本発明の実施形態によって産生されたＥＶはまた、直接膜浸透、化学的標識およびコンジュゲーション、静電コーティング、吸着、吸収、エレクトロポレーション、またはそれらの任意の組み合わせを介して目的の薬剤を充填させることができる。さらに、特定の実施形態によって産生されたＥＶは、いくつかの目的の薬剤が小胞形成の前に充填され得る一方で、さらなる目的の薬剤が小胞形成中またはその後に充填され得るように、複数の充填ステップを受け得る。さらに、小胞形成中にＥＶに目的の薬剤を充填させ、さらに小胞形成後に別の目的の薬剤を充填させることができる。
【０１２４】
図１６は、様々な実施形態によって、治療薬を個体に送達するための一つの戦略の例を実証する。図１６は例示にすぎず、本発明の実施形態によって治療薬を個体に送達するための全ての可能な方法を記載しているわけではないことに留意されたい。具体的には、図１６は、確立された腫瘍を有するマウスへの薬物ＤＯＸの送達を実証する。この図では、マウス由来のＥＬ４細胞が単離され、培養中に置かれた（１６０２）。さらに、ＥＬ４細胞を使用してマウスに腫瘍を確立する（１６０４）。さらに、スルフヒドリルブロッキング試薬の使用によってこれらの細胞からＥＶが産生されている（１６０６）。この図では、ホルムアルデヒドが有力な候補である試薬として実証されている。スルフヒドリルブロッキングによって産生されたＥＶにＤＯＸが充填される（１６０８）。最後に、ＤＯＸ充填ＥＶをマウスに提供して、ＥＬ４細胞によって確立された腫瘍を処置する。
【０１２５】
図１７はさらに、本発明の実施形態によってＥＶに治療剤を充填させるための様々な条件の例を実証する。具体的には、図１７Ａは、ＥＬ４細胞をＰＦＡおよびＤＴＴと共にインキュベートすることによるＥＶの産生を実証する。産生されたＥＶは、遠心分離によって回収され得る。ＥＶにＤＯＸまたは別の治療剤を充填させ、次いで遠心分離により回収することができる。ＥＶは、サイズが小さく生体適合性が高いため、治療用担体として大きな可能性を有している。ＥＬ４由来ＥＶには、一般的な化学療法薬であるドキソルビシン（ＤＯＸ）を充填させた。ＤＯＸは心臓毒性の高い事例で知られており、したがって標的化治療的送達の理想的な候補である。抗がん剤であるＤＯＸは、その比較的低い溶解度および生物学的利用能、ならびにその後の薬物充填ＥＶを介して送達されるときに改善される生体内分布の可能性のために、研究について選択された。ＤＯＸの固有の蛍光はまた、ＥＶ内の薬物捕捉の確認を助ける。化学療法のアントラサイクリン系抗生物質であるＤＯＸは赤色の蛍光を発する（励起：４８０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。ＥＶの受動的ＤＯＸ充填を、異なる薬物濃度、温度、およびインキュベーション期間で試験した（図１７Ｂ）。予想どおり、３つの因子の全てがＤＯＸ充填に影響を及ぼす。さらに、ＥＶに対するＤＯＸの比率が増加すると、ＥＶに充填されるＤＯＸの量もまた増加した（図１７Ｃ）。
【０１２６】
ＥＶ薬物送達ビヒクルの実施形態では、細胞または空のＥＶを、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬの化合物と共にインキュベートすることによってＥＶに化合物を充填させることができる。さらに、インキュベーションは、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、または４８時間行われてもよい。代替的に、充填条件は、１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：２、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の化合物に対するＥＶの比率で起こり得る。
【０１２７】
さらに、化合物充填ＥＶの多分散性は、無充填ＥＶと同様の多分散性指数（ＰＤＩ）を有し得る。そのように、化合物充填ＥＶは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０のＰＤＩを有し得る。
【０１２８】
ここで図１８を見ると、それは、実施形態によってＥＶの薬物充填を評価するための非限定的な例を示す。具体的には、ＥＬ４由来ＥＶのＤＯＸ充填を評価するために、３０ｋＤａ遠心フィルターで精製する前に、１ｍｇ／ｍＬのＤＯＸと共に１２時間インキュベートすることによってＥＶにＤＯＸを充填させた。フィルターサイズは、遊離タンパク質およびＤＯＸをなお除去しながらＥＶを単離するのに十分以上になるように選択された。３０ｋＤａの遠心濾過による最初の試験は、単一の濾過ステップが元の試料から８５％を超えるタンパク質の除去をもたらすことを示した（図１８Ａ）。この高いタンパク質損失は、この方法が、ＤＯＸを充填されたＥＶの試料（本明細書ではＤＯＸ−ＥＶと呼ぶ）からの遊離タンパク質および遊離薬物の除去に十分であるはずであることを示している。ＤＯＸ−ＥＶのサイズを、ＤＬＳによってさらに評価した（図１８Ｂ）。ＤＬＳは、ＤＯＸ−ＥＶのサイズが直径５０ｎｍ〜数百ナノメートルの範囲であることを確認した（図１８Ｂ）。ＤＯＸ−ＥＶの代表的なＴＥＭ画像は図１１に見ることができ、ここで図１１Ａはスルフヒドリルブロッキング試薬に供されていないＥＬ４細胞の上清を示し；図１１ＢはＥＬ４由来の無充填ＥＶを示し、図１１ＣはＤＯＸ−ＥＶを示している。
【０１２９】
ここで図１９を見ると、様々な実施形態によって産生されたＥＶは、他の形態の薬物送達とは異なる放出および取り込みの特性を示し得る。具体的には、図１９は、ＤＯＸの放出および取り込みを示す。具体的には、図１９Ａは、リポソームＤＯＸ（ＤＯＸＩＬ）からのＤＯＸの放出と比較した、ＰＢＳ緩衝液に血清を添加するかまたは添加していないＤＯＸ−ＥＶからのＤＯＸの放出を実証する。ＤＯＸ−ＥＶはＤＯＸＩＬよりはるかに急激な速度で薬物を放出する。事実、無血清培地（図１９Ａ、左パネル）と血清含有培地（図１９Ｂ、右パネル）の両方において、ＤＯＸ−ＥＶはＤＯＸＩＬよりも急速な放出プロファイルを示す。無血清培地中のＤＯＸＩＬおよびＤＯＸ−ＥＶ、ならびに血清含有培地中のＤＯＸＩＬおよびＤＯＸ−ＥＶについて、薬物放出は、それぞれ５１、１３、２３および１０分で最大の５０％に達した。
【０１３０】
同様に、ＤＯＸ−ＥＶは、ＤＯＸＩＬよりも急速に細胞に取り込まれた（図１９Ｂ）。図１９Ｂは、共焦点イメージングの３、６、および１２時間前に１００ｍｇ／ｍＬのＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、およびＤＯＸ−ＥＶと共にインキュベートしたＥＬ４細胞を示す。図１９Ｂでは、エンドソームをＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ−ＧＦＰで染色し、リソソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６で染色した。各時点について代表的な画像が示されている。ＤＯＸＩＬは示された時間枠にわたって最小の取り込みを示すが、ＤＯＸ−ＥＶは６時間以内にエンドソームに取り込まれ、薬物は１２時間までに核に出現する。１２時間までＤＯＸ−ＥＶで処理したＥＬ４細胞は、細胞質中にＤＯＸ蛍光を示すが、ＤＯＸＩＬ処理細胞は示さない。
【０１３１】
ここで図２０を参照されたい。図２０は、他の形態の薬物送達と比較した、様々な実施形態のＥＶによって送達された治療剤の効果を記載する。具体的には、図２０は、ＥＬ４細胞の生存率がＭＴＴアッセイを使用して三連（ｎ＝３）で評価されたことを示し、エラーバーが標準偏差を示す。試験した最高濃度において、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ事後検定により分析するとき、ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＥＶは対照から統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。ＤＯＸＩＬと比較してＤＯＸ−ＥＶの優れた取り込みの背後にあるメカニズムはこの研究では研究されていないが、それはおそらくＤＯＸＩＬのＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏ）に関連していると思われる。ＰＥＧ化はリポソームを立体的に安定化させ、より遅い放出および取り込みを可能にすることが示されている（参照によりその開示が本明細書に援用される、Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、１巻、２９７〜３１５頁（２０１６年）を参照されたい）。
【０１３２】
図２０Ａは、ＤＯＸ充填ＥＶで処理したＥＬ４細胞の生存率を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＴＴアッセイの結果を示す。ＥＬ４細胞は、ＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、ＤＯＸ−ＥＶ、または無充填ＥＶによって２４または４８時間にわたって処理した。結果は、２４時間にわたって処理した細胞と４８時間にわたって処理した細胞との間にいくつかの有意差があることを示している。２４時間の処理後、ＤＯＸ充填ＥＶは遊離ＤＯＸと同程度には機能しないが、より長いインキュベーション期間にわたって「追いつく」らしい。その主な利点（改善された生体適合性および持続放出）はｉｎ  ｖｉｖｏ送達環境において重要な要素であるため、ＤＯＸ充填ＥＶはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において遊離ＤＯＸを凌駕するとは予想されないことに留意することが重要である。
【０１３３】
図２０Ｂは、ＨｅＬａ細胞とＥＬ４細胞の両方に対する、様々な濃度のＤＯＸにおけるＤＯＸ充填ＨｅＬａ由来ＥＶおよびＥＬ４由来ＥＶの効果を示す。興味深いことに、この細胞株は他の細胞株に由来するＥＶに対して優先性を示さなかった。
【０１３４】
ここで図２１を参照されたい。図２１は、他の形態の薬物送達と比較した、様々な実施形態のＥＶによって送達された治療剤の効果を記載する。具体的には、ＤＯＸの有効性を示すｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのデータを図２１に示す。これらの試験において、ＥＬ４腫瘍は処置の８日前にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立された。処置を０日目に開始し、そこで８ｍｇ／ｋｇの当量ＤＯＸ濃度を尾静脈への静脈内注射によりマウスに与えた。図２１Ａは、ＤＯＸ−ＥＶが最も遅い腫瘍増殖をもたらしたことを示し、腫瘍サイズの減少において、ＤＯＸ−ＥＶが遊離ＤＯＸまたはＤＯＸＩＬよりも有効であったことを示している。図２１Ｂは、ＤＯＸ−ＥＶがまた、マウスの中で最高の生存率をもたらしたことを示す。
【０１３５】
ここで、図２１Ｃを参照すると、ＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、またはＤＯＸ−ＥＶで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスから血清を収集し、薬物含有量について分析した。血清中のＤＯＸ濃度（ｎ＝３）を、一連の採血および蛍光定量によって１２時間にわたって測定した。ＤＯＸＩＬとＤＯＸ−ＥＶの両方が、遊離ＤＯＸよりも長く血清中に留まる（図２１Ｃ、左パネル）。おそらくＰＥＧ化の保護効果のために、ＤＯＸＩＬはＤＯＸ−ＥＶよりも長い循環時間を有する。処置の２４時間後、マウスを屠殺し、それらの臓器を薬物含有量について評価した。図２１Ｃ、右パネルは、遊離ＤＯＸが肺に蓄積する傾向があるのに対し、ＤＯＸＩＬは肝臓によって除去される傾向があることを示す。対照的に、ＤＯＸ−ＥＶは、肺、肝臓、および検査された他の全ての組織において最小の蓄積を示す。
【０１３６】
過去１０年間で、ＥＶの形態の生体適合性ターゲティングナノキャリアを開発するという目標は、治療的送達分野における多くの研究者の目標となっている。理論的プロセスでは、患者に由来する初代細胞由来のＥＶを単離し、次いでそのＥＶを元の患者の体内の特定の部位にカーゴを送達ための治療用担体として使用する。この目標を達成するための重要な課題は、治療有効レベルのＥＶの産生の成功である（参照により、その開示が本明細書に援用される、Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ａ．ら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．、１３巻、１〜１３頁（２０１５年）を参照されたい）。これらの手順は、大量のナノサイズのＥＶを産生するための比較的単純で非常にスケーラブルなプロトコールを提供する。
【０１３７】
細胞由来ＥＶは、ポリマー、ウイルス、または脂質ベースの担体よりも低い免疫原性を有すると予想される。さらに、ＤＯＸ−ＥＶは、ＤＯＸおよびＤＯＸＩＬよりも肝臓および肺に蓄積する量が少ない。これは部分的にそれらの小さいサイズに関連している可能性があり；それらの平均直径はリポソームＤＯＸの半分である。それはまた、小胞がそれらが由来する系統の細胞と特異的に会合する能力に起因し得る。これらの生体内分布特性は、対照と比較して、ＤＯＸ−ＥＶで処置した担腫瘍マウスについて非常に改善された生存転帰をもたらす（４０日間にわたる５０％生存対０％生存、図２１Ｂ）。
【０１３８】
ここに示されている例示的なデータはがん治療のためにＤＯＸ送達ビヒクルを使用しているが、ＥＶは広範囲の有望な保健衛生用途を有する。多種多様な治療剤は不十分な生体内分布を有しており、これはＥＶを介した送達によって改善され得る。さらに、ＥＶはまた、遺伝子治療用途のためのＲＮＡの送達を改善するために利用され得る。ＥＶは治療的送達の分野に対して非常に有望であり、スケーラブルな大量生産のための記載された方法は、それらが当該技術分野におけるそれらの可能性に到達することを可能にし得る。
免疫療法を含む治療のためのＥＶの実施形態
【０１３９】
本開示のいくつかの実施形態は、個体において免疫応答を引き出す、応答を伝達する、または任意の他の形態の応答を引き起こすために使用され得る。これらの応答は、ＥＶ自体によって生じるか、またはＥＶ上の表面部分の提示によって誘発され得る。これらの表面部分は、抗原、受容体、抗体、化学的に標識された、もしくは目的のコンジュゲートされた分子、または細胞膜上に提示され得る部分の任意の他の形態を含み得る。目的のコンジュゲートされた分子は、小分子、ポリマー、無機材料、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。これらの表面部分は、タンパク質、糖、脂質、核酸、小分子、無機材料、または細胞によって産生され得る任意の種類の分子から作製され得るか、またはＥＶ産生の前に、同時に、その後に、もしくはそれらの任意の組み合わせで、標識またはコンジュゲートされ得る。これらの表面部分は、小胞形成前、小胞形成中、小胞形成後、または小胞形成前、中または後の任意の組み合わせで細胞の表面に人工的に配置され得る。いくつかの実施形態では、表面部分の提示は、パルス、ヒートショック、エレクトロポレーション、共有結合によるコンジュゲーション、および非共有結合コーティングなどの行為によって、または表面部分を原形質膜上に配置する任意の他の方法もしくは方法の組み合わせによって、人工的に行われ得る。他の実施形態では、表面部分の提示は、表面部分を産生するように細胞を誘導すること、およびそれらを原形質膜上に配置することなどの自然のプロセスを通して起こり得る。いくつかの実施形態では、いくつかの表面部分は、本開示内に記載されるような、他の目的の薬剤と組み合わせて充填され得る。そのような状況では、小胞形成の前に表面部分を充填させることができ、追加の表面部分を含む他の目的の薬剤を小胞形成中またはその後に充填させることができる複数の充填ステップを行うことが有益であり得る。さらに、表面部分を含む目的の薬剤が小胞形成の前に充填され得るが、一方で、追加の表面部分は小胞形成中またはその後に充填され得るように、表面部分を目的の薬剤の充填後に充填させることができる。ＥＶを単独で、または表面部分を提示するＥＶを使用することは、免疫移植拒絶反応または多発性硬化症などの用途にとって重要であり得る。
【０１４０】
図２２は、様々な実施形態によって、免疫応答を個体に誘発するための一つの戦略の例を実証する。図２２は例示にすぎず、本発明の実施形態によって免疫応答を個体に誘発するための全ての可能な方法を記載しているわけではないことに留意されたい。具体的には、図２２は、免疫応答を作り出すための、特定の抗原を提示するＥＶの送達の例を実証する。図２２では、細胞を個体から単離することができる（２２０２）。これらの細胞は、小胞形成を誘導する（２２０６）前に選択された抗原を提示するように操作され（２２０４）、抗原を提示するＥＶを産生することができる。これらの抗原提示ＥＶは免疫応答を生成するために個体に投与され得（２２０８）、個体が同一の抗原を提示するものによって免疫負荷される（２２１０）。
【０１４１】
具体的には、図２２は、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）が、特にがんの分野において免疫療法のために使用されたいくつかの実施形態の方法を記載する。ＢＭＤＣをスルフヒドリルブロッキング試薬に曝露することによって誘導されたＥＶは、無細胞ワクチンの形でがん免疫療法に使用することができる。樹状細胞（ＤＣ）は、抗原に対してＴ細胞を活性化し、したがって、がん特異的抗原を含む抗原に対する免疫を発達させるために使用され得る。がん免疫療法のための一般的な実験室モデルは、抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを発現するリンパ腫細胞株であるＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞に依存している。ＳＩＩＮＦＥＫＬ提示ＢＭＤＣ由来のＥＶは、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡに対するモデルワクチンとして使用するために産生された。ＤＣ由来エキソソームは、ＤＣ養子療法の代替法であることが示されている。本明細書に記載のプロセスの実施形態によれば、小胞形成は、エキソソームを使用して現在利用可能であるものよりも効率的に産生された無細胞ワクチンを可能にするであろう。
【０１４２】
図２２に記載の方法では、ＢＭＤＣをＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した（２２０２）。これらの細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原の存在下でパルスして、細胞に抗原を提示させた（２２０４）。ＢＭＤＣ細胞をスルフヒドリルブロッキング試薬で処理して（２２０６）ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示するＥＶを産生した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ提示ＥＶを、腹腔内注射（２２０８）によりマウスに投与した（２２０８）。マウスをさらにＥＧ７−ＯＶＡ細胞（２２１０）で負荷して、抗原提示ＥＶを使用して免疫応答を生じさせることの有効性を評価した。
【０１４３】
免疫療法に使用するためのＥＶの実施形態では、細胞または空のＥＶを、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬの濃度の表面部分と共にインキュベートすることによってＥＶに表面部分を充填させることができる。さらに、インキュベーションは、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、または４８時間行われてもよい。代替的に、充填条件は、１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：２、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の表面部分に対するＥＶの比率で起こり得る。
【０１４４】
ここで図２３を参照されたい。図２３は、ＥＶ上に表面部分を充填させることの有効性を人がどのように判定し得るかを実証する。具体的には、図２３はＥＶへのＳＩＩＮＦＥＫＬ充填の結果を示す。図２３Ａにおいて、ＤＬＳによって測定される、ＢＭＤＣおよびＳＩＩＮＦＥＫＬを提示するＢＭＤＣ（ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ）から産生されたＥＶのサイズ分布を示す。
【０１４５】
図２３Ｂでは、ＥＶによる抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬの提示を調べた。ＢＭＤＣ細胞（３７℃で１時間、１ｍｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスし、２回洗浄するか、または対照細胞）を、１８０μｌの４％ＰＦＡ溶液および２０μｌの１Ｍ  ＤＴＴを含む１０ｍＬのＰＢＳ中の細胞１０ｍｉｌ個／ｍｌで、３７℃で４時間小胞形成させた。１２００ｒｐｍで５．５分間遠心分離することによって細胞および細胞残屑を除去した後、マイクロサイズのＥＶを１３，２００ｒｐｍで１０分間濃縮し、１００μｌのＰＢＳ中に再分散させた。小胞をＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な蛍光標識抗体で、４℃で１時間標識し、２回洗浄した後、フローサイトメトリーによって特徴付けした。前方および側方散乱データに基づいて、マイクロサイズの小胞ゲーティングを設定し、マイクロサイズの蛍光小胞の割合を求めた。図２３Ｂは、マイクロサイズの小胞領域における蛍光事象の割合を示す。ＳＩＩＮＦＥＫＬをパルス化したＢＭＤＣ由来ＥＶのうちの７０％を超えるものが、ＳＩＩＮＦＥＫＬ提示を示している。
【０１４６】
さらに、表面部分提示ＥＶの多分散性は、無充填ＥＶと同様の多分散性指数（ＰＤＩ）を有し得る。そのように、表面部分提示ＥＶは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０のＰＤＩを有し得る。
【０１４７】
ここで図２４を見ると、表面部分を充填したＥＶの有効性がいかにして免疫応答を引き出すことになり得るかを示している。具体的には、図２４は、ＥＶが抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示したことを判定した後にこれらのＥＶがＴ細胞を活性化する能力を実証する。実施形態では、Ｔ細胞株Ｂ３Ｚの１万個の細胞を９６ウェルプレート中の９５μＬの培地（ＲＰＭＩ）に播種した。５μＬのＥＶを添加し、細胞を一晩インキュベートした（ＢＭＤＣおよびＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶは同数のＢＭＤＣ細胞から産生されたことに留意されたい）。細胞から培地を除去した後、ベータ−ガラクトシダーゼアッセイ（ＣＰＲＧ）を実施し、吸光度を５７０ｎｍで測定した。高活性のベータ−ガラクトシダーゼは、Ｔ細胞の活性化を示す。したがって、図２４はＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶがＢ３Ｚ細胞を活性化できることを示している。
【０１４８】
ここで図２５を見ると、いくつかの細胞が他のものよりも表面部分の充填に、より適している可能性がある例が実証されている。具体的には、未熟なＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶは、免疫応答を引き出すことにおいて他のＢＭＤＣのＥＶよりも有効であることが見出された。図２５Ａは、成熟ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬが成熟ＢＭＤＣおよび未成熟ＢＭＤＣに対して同様のＴ細胞応答をどのように生じたのかを説明するＣＰＲＧアッセイからのデータを示し、未成熟ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ細胞はより高レベルの応答を生じた。ＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な蛍光標識抗体を使用したアッセイの後、未成熟ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶのみがＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示した。
例示的実施形態の方法および材料
【０１４９】
細胞培養。マウスリンパ腫細胞株（ＥＬ４）をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。細胞を、５％ＣＯ２で３７℃に維持した。
【０１５０】
ＥＶの産生と単離。細胞１０７個／ｍＬを、ＰＢＳ中の２５ｍＭパラホルムアルデヒドおよび２ｍＭジチオスレイトールと共に５％ＣＯ２、３７℃で６時間インキュベートした。ＥＶを単離するために、１，２００ｒｐｍで５．５分間遠心分離することによって細胞を除去し、続いて９，３００×ｇで１０分間細胞残屑およびマイクロサイズのＥＶを除去した。ＥＶを３０ｋＤａセントリコン（４，５００ｒｐｍで１５分間）で濃縮し、ＥＶ含有上清を濃縮し、等容量のＰＢＳで２回洗浄した。
【０１５１】
ＥＶの特徴付け。ＥＶサイズ分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用した動的光散乱分析によって特徴付けられた。サイズを確認し、構造を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって分析した。１％酢酸ウラニルで染色した１０μＬのＥＶでコーティングしたＦｏｒｍｖａｒカーボンコーティング銅グリッドを、２００ｋＶで操作したＰｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ  ＣＭ−２０透過型電子顕微鏡で撮像した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＥＶを定量した。
【０１５２】
ＥＶのドキソルビシン充填。ＥＶ（タンパク質含有量で２５μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ中のＤＯＸ（１ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１２時間混合してインキュベートした。遊離薬物を除去し、ＥＶを３０ｋＤａセントリコン（４，５００ｒｐｍで１５分間）で濃縮し；回収したＥＶを等容量のＰＢＳで３回洗浄した。小胞の試料を超音波処理により１５分間溶解し、薬物含有量を蛍光分光法により定量した（励起４８５ｎｍ、蛍光５９５ｎｍ）。
【０１５３】
ドキソルビシン放出。ＤＯＸＩＬおよびＤＯＸ充填ＥＶを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬに希釈し、振とうプレート上で、３７℃でインキュベートし続けた。各時点で、試料を取り出し、３０ｋＤａセントリコンで４，５００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。フィルター上に濃縮されたままのＥＶを等容量のＰＢＳ中に再懸濁し、蛍光分光法により分析して（励起４８５ｎｍ、蛍光５９５ｎｍ）、リポソームおよびＥＶ中に残存するＤＯＸの濃度を決定した。
【０１５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生存率試験。ＥＬ４細胞を、１０％ＦＢＳを含む１００μＬのＤＭＥＭ中に２０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、図２０に記載の濃度のＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、またはＤＯＸ−ＥＶと共に２４時間または４８時間インキュベートした。ＭＴＴアッセイを実施し、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴと共に１時間インキュベートした。結晶を１００μＬのＤＭＳＯに溶解し、各ウェルの吸光度を５６０ｎｍで特徴付けた。
【０１５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ治療実験。１００μＬのＤＰＢＳ中１０６個のＥＬ４細胞を皮下注射することにより、１２週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスの右大腿部にＥＬ４腫瘍を確立した。８日後、腫瘍がはっきりと可視化され、マウスに全量１００μＬの対照ＤＰＢＳの単回用量の処置を静脈内注射した。腫瘍サイズを、処置後４０日間にわたって測定した。
【０１５６】
薬物動態学および体内分布実験のために、腫瘍を確立し、マウスを上述のように処置した。尾静脈採血は示された時点で完了し、酸性化アルコールに懸濁した。血液をＤＯＸ濃度について蛍光分光法によって分析した（励起４８５ｎｍ、蛍光５９５ｎｍ）。処置の２４時間後、マウスを屠殺して臓器を摘出した。臓器を凍結粉砕し、蛍光分光法（励起４８５ｎｍ、蛍光５９５ｎｍ）分析のために酸性化アルコールに再懸濁した。
例示的実施形態
【０１５７】
生物学的データは、ナノ小胞の生成と特性記述を裏付ける。さらに、データは、治療的処置として可能な化合物送達システムにナノ小胞を使用することができるという概念を裏付ける。以下のデータはまた、宿主供給源由来のナノ小胞のスケーラビリティと強化された産生について詳述する。したがって、これらのデータは、記載されたような本発明の様々な実施形態を裏付ける。
ＥＶを産生するためのスルフヒドリルブロッキングの最適化
【０１５８】
図５は、スルフヒドリルブロッキング試薬の濃度を変えたＥＶの産生の実施形態が記載されている。具体的には、図５Ａは、パラホルムアルデヒドの濃度を変更し、２５ｍＭパラホルムアルデヒドで最大生産レベルを示すような実施形態を実証している。図５Ｂは、１倍＝２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドとなるような、様々な濃度のスルフヒドリルブロッキング試薬にＨｅＬａ細胞を曝露する実施形態を示す。ＥＶを単離し、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量した。これらのデータは、ＨｅＬａ細胞によるＥＶの産生が、試験した他の濃度と比較して、２ｍＭジチオスレイトールを含む２５ｍＭパラホルムアルデヒドで最も高いことを示している。
ＥＶの回収と精製
【０１５９】
様々な実施形態では、ＥＶは、ＥＶを細胞または細胞残屑から分離するための任意の適切な手段によって回収することができる。いくつかの実施形態では、ＥＶを単離するために、１，２００ｒｐｍで５．５分間遠心分離することによって細胞を除去し、続いて１０，０００ｒｐｍで１０分間細胞残屑およびマイクロサイズの小胞を除去した。ＥＶを３０ｋＤａセントリコン（４，５００ｒｐｍで１５分間）で濃縮し、ＥＶ含有上清を濃縮し、等容量のＰＢＳで２回洗浄した。本開示の実施形態におけるＥＶの産生時に、図６に示されるように、遠心分離を使用してホルムアルデヒド残留物を除去することができる。得られたＥＶ回収物中のホルムアルデヒドの存在は、１Ｈ  ＮＭＲによって測定された。遠心分離によってホルムアルデヒドを除去する実施形態は例示にすぎず、任意の添加試薬に由来する残留物は、遠心分離、吸収、中和、または当該技術分野で公知の他の手段を含む任意の適切な手段によって除去できることに留意されたい。
スルフヒドリルブロッキングによるＥＶの産生
【０１６０】
図７は、小胞形成しているＨｅＬａ細胞の上清をＴＥＭによって分析した実施形態を実証する。本発明の様々な実施形態により、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理したＨｅＬａ細胞は、ＴＥＭ測定によって二次的に確認されるように大量のＥＶを生成する。対照（挿入図）はＥＶを示さないので、これらのナノサイズのＥＶは通常の細胞プロセスによって生成されるエキソソームである可能性は低い。その代わりに、スルフヒドリルブロッキング試薬に誘導されるブレブ形成は、細胞がナノサイズのＥＶを放出することをもたらす。さらに、図８は、ＰＦＡ／ＤＴＴを用いておよび用いずに処理したＥＬ４細胞のＴＥＭ画像を示す。図８ＡのＴＥＭ画像から、無血清／無試薬培地中でインキュベートしたＥＬ４細胞由来の上清が小胞をほとんどまたは全く有さないが、一方、２５ｍＭパラホルムアルデヒドおよび２ｍＭジチオスレイトールを含む無血清培地中で４時間インキュベートしたＥＬ４細胞は、丸で示すように、多くのナノサイズのＥＶを有することが実証された。ＥＶをより明確に調べるために、細胞、残屑、および巨大原形質膜小胞を１６，１００×ｇでの遠心分離によって除去した。次いで、ＥＶを単離し、１００，０００×ｇでの遠心分離により濃縮した。
【０１６１】
ＥＶは、有望な可能性のある治療用担体である。固有の小胞産生の低収率が問題である。しかしながら、スルフヒドリルブロッキング試薬を使用して、治療用カーゴを運ぶのに適したサイズのＥＶを産生することができる。図９は、スルフヒドリルブロッキング試薬の存在下および非存在下でのＥＶ産生の実施形態を実証する。ＥＬ４細胞を、５ｍＬのＤＭＥＭ中（ＦＢＳを含まない）で２４時間、または９０μＬの４％ＰＦＡ溶液および１０μＬの１Ｍ  ＤＴＴを含む５ｍＬのＰＢＳ中で３７℃で２時間、細胞１００，０００個／ｍＬでインキュベートした。細胞および細胞残屑を１２００ｒｐｍで５．５分間の遠心分離によって除去した後、マイクロサイズの小胞を１３，２００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、上清中にＥＶを残した。次いで、ＥＶを４，５００ｒｐｍで１０分間、３０ｋＤａセントリコンによって単離した。ＥＶを５ｍＬのＤＰＢＳで３回洗浄して遊離タンパク質およびスルフヒドリルブロッキング試薬を除去した。タンパク質含有量は、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して評価した（図９）。スルフヒドリルブロッキング試薬に曝露していない細胞から産生された小胞は、エキソソームと呼ばれる。スルフヒドリルブロッキング試薬は、顕著に短い生産期間で、タンパク質定量に基づいて、天然に存在するエキソソームと比較して顕著に大量の（１０倍）量のＥＶを産生する。
ＥＶの安定性の決定
【０１６２】
図１０は、特定の実施形態によって産生されたＥＶに対するエキソソームの安定性を記載する。この図において、いくつかの実施形態のエキソソームおよびＥＶのサイズ範囲は、０、２４、および４８時間に測定された動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたものとして示されている。さらに、多分散性指数（ＰＤＩ）は、時間が経過するにつれて、エキソソームが多分散性を増加させる一方で、特定の実施形態のＥＶは安定したままであることを示す。また、エキソソームのアニオン性表面電荷は経時的に減少したが、いくつかの実施形態のＥＶは、最初の測定と比較したとき、２４および４８時間後に比較的安定したままである。
特定の使用のためのＥＶサイズの調整
【０１６３】
図１２は、ＥＶを生成するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をスルフヒドリルブロッキング試薬と一緒に使用することができるいくつかの実施形態を示す。この図では、２５ｍＭ  ＰＦＡ、２ｍＭ  ＤＴＴを、０．１倍、１倍、および１０倍濃度のＰＢＳと共に使用して、ＥＶを生成した。これらの実施形態において産生されたＥＶのサイズ分布は、ＤＬＳアッセイによって測定された。ＰＢＳ濃度の増加は、いくつかの実施形態で、より小さく産生されるＥＶをもたらした。これらの結果は、いくつかの実施形態で産生されたＥＶのサイズが特定の必要性に適合するようにカスタマイズされ得ることを示している。
【０１６４】
具体的には、図１２Ａは、いくつかの実施形態の１０ｎｍ〜１，０００ｎｍのサイズ範囲（ナノスケールのＥＶ）のＥＶを生成するために緩衝液濃度を増加させることの効果を実証する。本開示に記載されているように、ナノスケールのＥＶの実施形態は、細胞内に小胞形成を誘導し、続いて３０ｋＤａの遠心濾過によって生成することができる。いくつかの実施形態では、３０ｋＤａの遠心濾過の前に、最初の１，２００ｒｐｍの遠心分離によって細胞を溶液から除去することができる。さらに、図１２Ｂは、オスモル濃度の増加とより小さいＥＶとの間の直線関係を示す同様の結果を実証する。
【０１６５】
同様に、図１２Ｃおよび図１２Ｄは、他の実施形態において、５００ｎｍから１５，０００ｎｍを超えるサイズ範囲（マイクロスケールのＥＶ）でＥＶを生成するために、緩衝液濃度を増加させることの効果を実証する。マイクロスケールのＥＶの実施形態は、細胞内に小胞形成を誘導し、続いて１，２００ｒｐｍで遠心分離して細胞を除去することによって生成することができる。残りの上清を、９，３００×ｇでさらに遠心分離して、マイクロスケールのＥＶを単離することができる。マイクロスケールのＥＶの単離後に残っている上清もまた、ナノスケールのＥＶをさらに単離するために３０ｋＤａの遠心濾過に供することができることに留意されたい。様々な実施形態のマイクロスケールのＥＶの画像を図１２Ｅに示す。これらの画像では、スルフヒドリルブロッキング試薬を様々な濃度のＰＢＳと共に使用して生成されたマイクロスケールのＥＶのサイズおよび分布が示されている。
【０１６６】
特定の実施形態において産生されるＥＶのサイズはまた、代替の緩衝液を使用することによって調整され得る。図１３Ａは、ＤＬＳによって測定されるときの、いくつかの実施形態によって産生されたＥＶのサイズに対するいくつかの緩衝液の効果を実証する。この図では、緩衝液ＤＰＢＳ、ＤＭＥＭ、およびＧＰＭＶが、スルフヒドリルブロッキング試薬と共に、より大きなμｍサイズのＥＶを含む、様々なサイズ範囲のＥＶを生成することが示されている。
【０１６７】
さらに、全ての緩衝液が同一の速度でＥＶを産生するとは限らない。図１３Ｂは、タンパク質含有量を評価するためのＢＣＡアッセイによって決定されるときの、様々な緩衝液によるＥＶの産生を実証する。示されるように、ＰＢＳおよびＤＰＢＳ緩衝液は、ＧＰＭＶおよびＤＭＥＭ緩衝液よりも効率的である。図１３Ｃは、ＰＢＳおよびＧＰＭＶ緩衝液によって産生されたＥＶのＰＤＩを実証する。図１３Ｃに示されるように、ＰＢＳ緩衝液はより低いＰＤＩを有するＥＶを産生し、これはＰＢＳが、ＧＰＭＶによって産生されるＥＶのほぼ完全な多分散性を示す約１のＰＤＩを有するＧＰＭＶと比べてより均一なサイズのＥＶを作り出すことを示す。さらに、図１３Ｄは、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．９％生理食塩水による小胞形成によって産生されたナノサイズのＥＶを実証しており、これらの緩衝液の間で非常に広いサイズ分布および高い多分散性を示す。同様に、図１３Ｅは、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．９％生理食塩水を使用するマイクロサイズのＥＶの産生を示しており、これらの緩衝液の間で非常に広いサイズ分布および高い多分散性を示す。
【０１６８】
図１３に示されるこれらの緩衝液のそれぞれは、浸透圧と追加の細胞増殖との均衡をとるための様々な成分を含み得る。図１３に示す結果は、溶液のオスモル濃度の変化が、様々な実施形態によって産生されるＥＶの平均サイズ、サイズ分布、または産生速度を調整する際の唯一の因子ではないことを示している。
ＥＶのアクチン含有量の評価
【０１６９】
図１４Ａにおいて、左パネルは、宿主細胞から形成されているマイクロスケールのＥＶの光学顕微鏡画像を示し、一方、図１４Ａ、右パネルは、蛍光色素で染色されたアクチンの存在を示す。同様に、図１４Ｂは、いくつかの実施形態によって産生されたＥＶがアクチンを実質的に含まない可能性があることを示すために、蛍光画像を光画像上に重ね合わせている。
ＥＶへのドキソルビシンの充填
【０１７０】
図１７はさらに、本発明の実施形態によってＥＶに治療剤を充填させるための様々な条件の例を実証する。具体的には、図１７Ａは、ＥＬ４細胞をＰＦＡおよびＤＴＴと共にインキュベートすることによるＥＶの産生を実証する。産生されたＥＶは、遠心分離によって回収し得る。ＥＶにＤＯＸまたは別の治療剤を充填させ、次いで遠心分離により回収することができる。ＥＶは、サイズが小さく生体適合性が高いため、治療用担体として大きな可能性を有している。ＥＬ４由来ＥＶには、一般的な化学療法薬であるドキソルビシン（ＤＯＸ）を充填させた。ＤＯＸは心臓毒性の高い事例で知られており、したがって標的化治療的送達の理想的な候補である。抗がん剤であるＤＯＸは、その比較的低い溶解度および生物学的利用能、ならびにその後の薬物充填ＥＶを介して送達されるときに改善される生体内分布の可能性のために、研究について選択された。ＤＯＸの固有の蛍光はまた、ＥＶ内の薬物捕捉の確認を助ける。化学療法のアントラサイクリン系抗生物質であるＤＯＸは赤色の蛍光を発する（励起：４８０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。ＥＶの受動的ＤＯＸ充填を、異なる薬物濃度、温度、およびインキュベーション期間で試験した（図１７Ｂ）。予想どおり、３つの因子の全てがＤＯＸ充填に影響を及ぼす。さらに、ＥＶに対するＤＯＸの比率が増加すると、ＥＶに充填されるＤＯＸの量もまた増加する（図１７Ｃ）。
【０１７１】
ＥＬ４由来ＥＶのＤＯＸ充填を評価するために、３０ｋＤａの遠心フィルターで精製する前に、１ｍｇ／ｍＬのＤＯＸと共に１２時間インキュベートすることによってＥＶにＤＯＸを充填させた。フィルターサイズは、遊離タンパク質およびＤＯＸをなお除去しながらＥＶを単離するのに十分以上になるように選択された。３０ｋＤａの遠心濾過による最初の試験は、単一の濾過ステップが元の試料から８５％を超えるタンパク質の除去をもたらすことを示した（図１８Ａ）。この高いタンパク質損失は、この方法が、ＤＯＸを充填したＥＶの試料（本明細書ではＤＯＸ−ＥＶと呼ぶ）からの遊離タンパク質および遊離薬物の除去に十分であるはずであることを示している。ＤＯＸ−ＥＶのサイズを、ＤＬＳによってさらに評価した（図１８Ｂ）。ＤＬＳは、ＤＯＸ−ＥＶのサイズが直径５０ｎｍ〜数百ナノメートルの範囲であることを確認した（図１８Ｂ）。ＤＯＸ−ＥＶの代表的なＴＥＭ画像は図１１に見ることができ、ここで図１１Ａはスルフヒドリルブロッキング試薬に供されていないＥＬ４細胞の上清を示し；図１１ＢはＥＬ４由来の無充填ＥＶを示し、図１１ＣはＤＯＸ−ＥＶを示している。
ＥＶ送達ドキソルビシン放出、取り込み、および有効性の評価
【０１７２】
図１９は、ＤＯＸの放出および取り込みを示す。具体的には、図１９Ａは、リポソームＤＯＸ（ＤＯＸＩＬ）からのＤＯＸの放出と比較した、ＰＢＳ緩衝液に血清を添加するかまたは添加していないＤＯＸ−ＥＶからのＤＯＸの放出を実証する。ＤＯＸ−ＥＶはＤＯＸＩＬよりはるかに急激な速度で薬物を放出する。事実、無血清培地（図１９Ａ、左パネル）と血清含有培地（図１９Ｂ、右パネル）の両方において、ＤＯＸ−ＥＶはＤＯＸＩＬよりも急速な放出プロファイルを示す。無血清培地中のＤＯＸＩＬおよびＤＯＸ−ＥＶ、ならびに血清含有培地中のＤＯＸＩＬおよびＤＯＸ−ＥＶについて、薬物放出は、それぞれ５１、１３、２３および１０分で最大の５０％に達した。
【０１７３】
同様に、ＤＯＸ−ＥＶは、ＤＯＸＩＬよりも急速に細胞に取り込まれた（図１９Ｂ）。図１９Ｂは、共焦点イメージングの３、６、および１２時間前に１００ｍｇ／ｍＬのＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、およびＤＯＸ−ＥＶと共にインキュベートしたＥＬ４細胞を示す。図１９Ｂでは、エンドソームをＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ−ＧＦＰで染色し、リソソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６で染色した。各時点について代表的な画像が示されている。ＤＯＸＩＬは示された時間枠にわたって最小の取り込みを示すが、ＤＯＸ−ＥＶは６時間以内にエンドソームに取り込まれ、薬物は１２時間までに核に出現する。１２時間までＤＯＸ−ＥＶで処理したＥＬ４細胞は、細胞質中にＤＯＸ蛍光を示すが、ＤＯＸＩＬ処理細胞は示さない。
【０１７４】
ここで図２０を参照されたい。図２０は、他の形態の薬物送達と比較した、ＥＶによって送達された治療剤の効果を記載する。具体的には、図２０は、ＥＬ４細胞の生存率がＭＴＴアッセイを使用して三重（ｎ＝３）に評価されたことを示し、エラーバーが標準偏差を示す。試験した最高濃度において、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ事後検定により分析するとき、ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＥＶは対照から統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。ＤＯＸＩＬと比較してＤＯＸ−ＥＶの優れた取り込みの背後にあるメカニズムはこの研究では研究されていないが、それはおそらくＤＯＸＩＬのＰＥＧ化に関連していると思われる。ＰＥＧ化はリポソームを立体的に安定化させ、より遅い放出および取り込みを可能にすることが示されている（参照によりその開示が本明細書に援用される、Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、１巻、２９７〜３１５頁（２０１６年）を参照されたい）。
【０１７５】
図２０Ａは、ＤＯＸ充填ＥＶで処理したＥＬ４細胞の生存率を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＴＴアッセイの結果を示す。ＥＬ４細胞は、ＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、ＤＯＸ−ＥＶ、または無充填ＥＶによって２４または４８時間にわたって処理した。結果は、２４時間にわたって処理した細胞と４８時間にわたって処理した細胞との間にいくつかの有意差があることを示している。２４時間の処理後、ＤＯＸ充填ＥＶは遊離ＤＯＸと同程度には機能しないが、より長いインキュベーション期間にわたって「追いつく」らしい。その主な利点（改善された生体適合性および持続放出）はｉｎ  ｖｉｖｏ送達環境において重要な要素であるため、ＤＯＸ充填ＥＶはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において遊離ＤＯＸを凌駕するとは予想されないことに留意することが重要である。
【０１７６】
図２０Ｂは、ＨｅＬａ細胞とＥＬ４細胞の両方に対する、様々な濃度のＤＯＸにおけるＤＯＸ充填ＨｅＬａ由来ＥＶおよびＥＬ４由来ＥＶの効果を示す。興味深いことに、この細胞株は他の細胞株に由来するＥＶに対して優先性を示さなかった。
【０１７７】
ここで図２１を参照されたい。図２１は、他の形態の薬物送達と比較した、ＥＶによって送達された治療剤の効果を記載する。具体的には、ＤＯＸの有効性を示すｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのデータを図２１に示す。これらの試験において、ＥＬ４腫瘍は処置の８日前にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立された。処置を０日目に開始し、そこで８ｍｇ／ｋｇの当量ＤＯＸ濃度を尾静脈への静脈内注射によりマウスに与えた。図２１Ａは、ＤＯＸ−ＥＶが最も遅い腫瘍増殖をもたらしたことを示し、腫瘍サイズの減少において、ＤＯＸ−ＥＶが遊離ＤＯＸまたはＤＯＸＩＬよりも有効であったことを示している。図２１Ｂは、ＤＯＸ−ＥＶがまた、マウスの中で最高の生存率をもたらしたことを示す。
【０１７８】
ここで、図２１Ｃを参照すると、ＤＯＸ、ＤＯＸＩＬ、またはＤＯＸ−ＥＶで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスから血清を収集し、薬物含有量について分析した。血清中のＤＯＸ濃度（ｎ＝３）を、一連の採血および蛍光定量によって１２時間にわたって測定した。ＤＯＸＩＬとＤＯＸ−ＥＶの両方が、遊離ＤＯＸよりも長く血清中に留まる（図２１Ｃ、左パネル）。おそらくＰＥＧ化の保護効果のために、ＤＯＸＩＬはＤＯＸ−ＥＶよりも長い循環時間を有する。処置の２４時間後、マウスを屠殺し、それらの臓器を薬物含有量について評価した。図２１Ｃ、右パネルは、遊離ＤＯＸが肺に蓄積する傾向があるのに対し、ＤＯＸＩＬは肝臓によって除去される傾向があることを示す。対照的に、ＤＯＸ−ＥＶは、肺、肝臓、および検査された他の全ての組織において最小の蓄積を示す。
【０１７９】
過去１０年間で、ＥＶの形態の生体適合性ターゲティングナノキャリアを開発するという目標は、治療的送達分野における多くの研究者の目標となっている。理論的プロセスでは、患者に由来する初代細胞由来のＥＶを単離し、次いでそのＥＶを元の患者の体内の特定の部位にカーゴを送達ための治療用担体として使用する。この目標を達成するための重要な課題は、治療有効レベルのＥＶの産生の成功である（参照により、その開示が本明細書に援用される、Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ａ．ら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．、１３巻、１〜１３頁（２０１５年）を参照されたい）。これらの手順は、大量のナノサイズのＥＶを産生するための比較的単純で非常にスケーラブルなプロトコールを提供する。
【０１８０】
細胞由来ＥＶは、ポリマー、ウイルス、または脂質ベースの担体よりも低い免疫原性を有すると予想される。さらに、ＤＯＸ−ＥＶは、ＤＯＸおよびＤＯＸＩＬよりも肝臓および肺に蓄積する量が少ない。これは部分的にそれらの小さいサイズに関連している可能性があり；それらの平均直径はリポソームＤＯＸの半分である。それはまた、小胞が、それらが由来する系統の細胞と特異的に結合する能力に起因し得る。これらの生体内分布特性は、対照と比較して、ＤＯＸ−ＥＶで処置した担腫瘍マウスについて非常に改善された生存転帰をもたらす（４０日間にわたる５０％生存対０％生存、図２１Ｂ）。
ＥＶへの表面部分の充填
【０１８１】
図２３は、ＥＶへのＳＩＩＮＦＥＫＬ充填の結果を示す。図２３Ａにおいて、ＤＬＳによって測定されるときの、ＢＭＤＣおよびＳＩＩＮＦＥＫＬを提示するＢＭＤＣ（ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ）から産生されたＥＶのサイズ分布を示す。
【０１８２】
図２３Ｂでは、ＥＶによる抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬの提示を調べた。ＢＭＤＣ細胞（３７℃で１時間、１ｍｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスし、２回洗浄するか、または対照細胞）を、１８０μｌの４％ＰＦＡ溶液および２０μｌの１Ｍ  ＤＴＴを含む１０ｍＬのＰＢＳ中の細胞１０ｍｉｌ個／ｍｌで、３７℃で４時間小胞形成させた。１２００ｒｐｍで５．５分間遠心分離することによって細胞および細胞残屑を除去した後、マイクロサイズのＥＶを１３，２００ｒｐｍで１０分間濃縮し、１００μｌのＰＢＳ中に再分散させた。小胞をＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な蛍光標識抗体で、４℃で１時間標識し、２回洗浄した後、フローサイトメトリーによって特徴付けした。前方および側方散乱データに基づいて、マイクロサイズの小胞ゲーティングを設定し、マイクロサイズの蛍光小胞の割合を求めた。図２３Ｂは、マイクロサイズの小胞領域における蛍光事象の割合を示す。ＳＩＩＮＦＥＫＬをパルス化したＢＭＤＣ由来ＥＶのうちの７０％を超えるものが、ＳＩＩＮＦＥＫＬ提示を示している。
【０１８３】
図２４は、ＥＶが抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを提示したことを判定した後にこれらのＥＶがＴ細胞を活性化する能力を実証する。実施形態では、Ｔ細胞株Ｂ３Ｚの１万個の細胞を９６ウェルプレート中の９５μＬの培地（ＲＰＭＩ）に播種した。５μＬのＥＶを添加し、細胞を一晩インキュベートした（ＢＭＤＣおよびＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶは同数のＢＭＤＣ細胞から産生されたことに留意されたい）。細胞から培地を除去した後、ベータ−ガラクトシダーゼアッセイ（ＣＰＲＧ）を実施し、吸光度を５７０ｎｍで測定した。高活性のベータ−ガラクトシダーゼは、Ｔ細胞の活性化を示す。したがって、図２４はＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶがＢ３Ｚ細胞を活性化できることを示している。
【０１８４】
図２５は、未熟なＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶは、免疫応答を引き出すことにおいて他のＢＭＤＣのＥＶよりも有効であることが見出されたことを実証する。図２５Ａは、成熟ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬが成熟ＢＭＤＣおよび未成熟ＢＭＤＣに対して同様のＴ細胞応答をどのように生じたのかを説明するＣＰＲＧアッセイからのデータを示し、未成熟ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ細胞はより高レベルの応答を生じた。ＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な蛍光標識抗体を使用したアッセイの後、未成熟ＢＭＤＣ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのＥＶのみがＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を提示した。
均等論
【０１８５】
上述の説明は本発明の多くの特定の実施形態を含むが、これらは本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、むしろその一実施形態の例として解釈されるべきである。したがって、本発明の範囲は、例示された実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【国際調査報告】
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