(57)【要約】核酸、例えば、DNAまたはRNAなどのようなものを配列決定する方法を提供する。それは、（1）核酸の進行性酵素的消化によって単一ヌクレオシド三リン酸のストリームを生成するステップ；（2）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下に、少なくとも一の単一ヌクレオシド三リン酸と、対応する生物学的プローブで、（a）制限エンドヌクレアーゼのニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、ならびにニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれが少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーを、フルオロフォアがクエンチされるように伴うもの、が含まれる、第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれるものと、を反応させることによって少なくとも一の実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの使われたプローブを生産するステップ；（3）使われたプローブの第一のオリゴヌクレオチドの鎖をニッキング部位にて、別々の第一のオリゴヌクレオチドの成分でそれぞれがフルオロフォアおよびクエンチャーを伴うものを作り出すために、ニッキング制限エンドヌクレアーゼでニッキングするステップ；（4）ステップ（3）において生成された第一のオリゴヌクレオチドの成分を使われたプローブの相補的な鎖から分離するステップ、および（5）それらを伴う分離されたオリゴヌクレオチドの成分でのフルオロフォアを検出するステップによって特徴付けられる。この方法は微小液滴において実行するのに適する。この方法により使用するための新しい生物学的プローブおよびプローブシステムもまた記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）核酸の進行性酵素的消化によって単一ヌクレオシド三リン酸のストリームを生成するステップ；（2）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下に、少なくとも一の単一ヌクレオシド三リン酸と、対応する生物学的プローブで、（a）制限エンドヌクレアーゼのニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、ならびにニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれが少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーを、フルオロフォアがクエンチされるように伴うもの、が含まれる、第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれるものと、を反応させることによって少なくとも一の実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの使われたプローブを生産するステップ；（3）使われたプローブの第一のオリゴヌクレオチドの鎖をニッキング部位にて、別々の第一のオリゴヌクレオチドの成分でそれぞれがフルオロフォアおよびクエンチャーを伴うものを作り出すために、ニッキング制限エンドヌクレアーゼによりニッキングするステップ；（4）ステップ（3）において生成された第一のオリゴヌクレオチドの成分を、使われたプローブの相補的な鎖から分離するステップ、および（5）それらを伴う分離されたオリゴヌクレオチドの成分でのフルオロフォアを検出するステップによって特徴付けられる、核酸を配列決定する方法。
【請求項２】
ステップ（4）および（5）間に、使われたプローブの分離された相補的な鎖を、使われたプローブと同じさらなる実質二本鎖のオリゴヌクレオチド生産物を生産するために、別の第一のオリゴヌクレオチドと反応させるステップ、およびステップ（3）および（4）の繰返しステップをさらに含むことによって特徴付けられる、請求項1に請求する方法。
【請求項３】
クエンチャー領域は、フルオロフォア領域によって伴われるものと同じフルオロフォアを含み、およびすべてのフルオロフォアは互いにクエンチするように配置されることを特徴とする、請求項1または請求項2に請求する方法。
【請求項４】
第二のオリゴヌクレオチドおよび第三のオリゴヌクレオチドはリンカー領域によって接続されることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに請求する方法。
【請求項５】
リンカー領域はオリゴヌクレオチド領域を含むことを特徴とする、請求項4に請求する方法。
【請求項６】
使われたプローブの相補的な鎖は閉ループを含むことを特徴とする、請求項4または5に請求する方法。
【請求項７】
ニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位は捕捉部位を含むオリゴヌクレオチド領域であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに請求する方法。
【請求項８】
使われたプローブの両方の鎖を開裂するのに適したエンドヌクレアーゼが採用され、および使われたプローブの相補的な鎖はエンドヌクレオリシスに耐性にされることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに請求する方法。
【請求項９】
プローブのシステムは、複数の第一のオリゴヌクレオチドのタイプで、それぞれが異なる捕捉部位および特徴的な検出可能な要素を備えるものを含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに請求する方法。
【請求項１０】
最大で四つまでの異なるセットのオリゴヌクレオチドプローブのシステムが採用され、各セットの第一のオリゴヌクレオチドは自然発生性DNAまたはRNAの特徴的なヌクレオチド塩基の一つに対して選択的な捕捉部位および異なる検出可能な要素をもつことを特徴とする、請求項9に請求する方法。
【請求項１１】
ステップ（1）は対応する微小液滴において各単一ヌクレオシド三リン酸が含まれることをさらに含み、およびステップ（2）ないし（5）は各微小液滴において遂行されることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに請求する方法。
【請求項１２】
（a）制限エンドヌクレアーゼのニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、ならびにニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれが少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーを、フルオロフォアがクエンチされるように伴うもの、が含まれる、第一の一本鎖オリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチド、を含むことによって特徴付けられる、多成分生物学的プローブ。
【請求項１３】
クエンチャー領域はフルオロフォア領域によって伴われるものと同じフルオロフォアを含み、およびすべてのフルオロフォアは互いに自己クエンチするように配置されることを特徴とする、請求項12に請求する生物学的プローブ。
【請求項１４】
第二のオリゴヌクレオチドおよび第三のオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドリンカー領域によって接続されることを特徴とする、請求項12または請求項13に請求する生物学的プローブ。
【請求項１５】
第一のオリゴヌクレオチドでのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位は捕捉部位を含むことを特徴とする、請求項12ないし14のいずれかに請求する生物学的プローブ。
【請求項１６】
（1）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下に、単一ヌクレオシド三リン酸と、対応する生物学的プローブで、（a）制限エンドヌクレアーゼのニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、ならびにニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれが少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーを、フルオロフォアがクエンチされるように伴うもの、が含まれる、第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれるものと、を反応させることによって少なくとも一の実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの使われたプローブを生産するステップ；（2）使われたプローブの第一のオリゴヌクレオチドの鎖をニッキング部位にて、別々の第一のオリゴヌクレオチドの成分でそれぞれがフルオロフォアおよびクエンチャーを伴うものを作り出すために、ニッキング制限エンドヌクレアーゼによりニッキングするステップ；（3）ステップ（2）において生成される第一のオリゴヌクレオチドの成分を、使われたプローブの相補的な鎖から分離するステップ、および（4）それらを伴う分離されたオリゴヌクレオチドの成分でのフルオロフォアを検出するステップによって特徴付けられる、単一ヌクレオシド三リン酸を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、単一ヌクレオチドの検出および特徴付け用の方法および関連する生物学的プローブに関する。それはDNAまたはRNAのシーケンシングにおいて使用するために特に適する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝物質の次世代シーケンシングは、シーケンシングの単価が、ますます速くなるシーケンシング機の市場投入に合わせて低下するので、概して生物科学、および特に医学に対してすでに著しい影響を与えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
我々の前の出願の国際公開（WO）2014/053853、WO2014/053854、WO2014/167323、WO2014/167324およびWO2014/111723において、我々は新しいシーケンシング法を説明し、それは単一ヌクレオチドの順序付けられたストリーム、好ましくは、単一ヌクレオシド三リン酸のストリームを生成するために、ポリヌクレオチド分析物の進行性消化に関係し、それらの各々は微小液滴ストリームにおいて対応する液滴中に一つずつ捕捉することができる。その後、各液滴は、それが元々含まれていた特定の単一ヌクレオチドを明らかにするために化学的に、および/または酵素的に操作されることができる。ある実施形態では、これらの化学的および/または酵素的操作は、分析物が構成される単一ヌクレオチドタイプの一つをそれから選択的に捕捉することができるようにそれらの各々が適応される一またはそれよりも多く（一以上とも言う）の二成分オリゴヌクレオチドプローブタイプの使用に関係する方法を含む。典型的には、そのようなプローブタイプの各々において、二つのオリゴヌクレオチド成分の一方は特徴的なフルオロフォアを含み、およびプローブの未使用状態において、これらのフルオロフォアの蛍光を発する能力は近接して存在するクエンチャーの理由によって、または自己クエンチングによって失われたままである。使用に際して、プローブがその対応する単一ヌクレオチドを捕捉したとき、それはその後のエキソヌクレオリシス（exonucleolysis）を受けやすくされ、それによってフルオロフォアがクエンチャーから遊離され、および/または互いにそれらが自由に蛍光を発することが可能にされる。この方法によって、各液滴において存在する元の単一ヌクレオチドは分光学的方法によって間接的に推論することができる。
【０００４】
この方法の変形はWO201405385およびWO2016012789を含む我々の他の係属中の出願に記載してあり；後者は三成分プローブシステムの使用に関係する。特に、WO2016012789は、（1）核酸の進行性消化によって単一ヌクレオシド三リン酸のストリームを生成するステップ；（2）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下に、少なくとも一の単一ヌクレオシド三リン酸と、対応するプローブシステムで、（a）例えば、特徴的なフルオロフォアにより検出不可能な状態において標識された第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な（complementary）領域にハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチドを含むものと、を反応させることによって少なくとも一の実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの使われたプローブを生産するステップ；（3）使われたプローブを、フルオロフォアを検出可能な状態においておよび少なくとも部分的に第一のオリゴヌクレオチドの配列補足物（complement）である一本鎖の第四のオリゴヌクレオチドを産生するために二本鎖エキソヌクレオチド鎖分解性（二本鎖外ヌクレオチド鎖分解性とも言う）活性をもつ酵素により消化するステップ；（4）第四のオリゴヌクレオチドを、使われたプローブに対応する実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの生産物を生産するために、別の第一のオリゴヌクレオチドにより反応させるステップ；（5）ステップ（3）および（4）を周期的に反復するステップ、および（6）ステップ（3）の各繰返しにおいて放出されたフルオロフォアを検出するステップによって特徴付けられる、改善された方法を記載する。この方法は、ステップ（3）および（4）を周期的に繰り返すことによって蛍光シグナルを強く増大させることができ、それによってヌクレオチド検出の全体的な感度、および従って信頼性が向上されるという利益を有する。一実施形態において、第二および第三のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド捕捉の後、それらがエキソヌクレオシスに対して有利に耐性である閉ループの一本鎖のオリゴヌクレオチドの成分を形成するように連結される。
【０００５】
他の先行技術に関して、Fan（ファン）らは、Nature Reviews Genetics（ネイチャー・レビューズ。ジェネティクス）7(8)632-644（2006）において、遺伝子型決定、コピー数測定、ヘテロ接合性の喪失、対立遺伝子特異的発現およびメチル化のシーケンシングならびに検出のための高度に並行な（highly parallel）ゲノムアッセイを可能にした方法およびプラットフォームの開発の一般的な総説を提供する。この概説の図2aは、3'および5'端を有する環状化可能プローブ（circularizable probe）の使用を概略的に示し、それは分析物での一塩基多型（SNP）の部位の上流および下流にアニールし、それによってギャップが残され、それは続いてヌクレオチドで満たされ、それは、十分な環状プローブを形成するためにSNPの補足物であり、それは次いで解放後に増幅され得る。しかしながら、我々の方法とは異なり、ヌクレオチドは、それが充填プロセス間に捕捉され、分析物それ自体から直接得られない。
【０００６】
WO03080861は、ヌクレオチドに、それが解放されるとき直接付着するヌクレオチド特異的反応性標識の存在下に、核酸分析物が進行性ピロリン酸分解を受ける方法を開示する。これは我々が採用する方法とはまったく異なるだけでなく、実際に、測定される蛍光シグナルは、標識されたヌクレオチドが続いて調べられるとき、関連するバックグラウンドノイズより高い確かな識別を可能にするにはおそらく弱すぎるであろう。
【０００７】
最後に、WO9418218は、分析物を、単一ヌクレオチド二リン酸（single nucleotide diphosphates）または一リン酸のストリームを生成するために進行性エキソヌクレオリシスに供し、それを次いで検出する前に蛍光増強マトリクス中に組み込むDNAシーケンシング法を教示する。これは、ここで我々が説明したものとはまったく異なるアプローチであるだけでなく、我々は再度、生成された任意のシグナルが信頼できる検出および識別をするにはおそらく弱すぎるであろうことを観察する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のエキソヌクレオリシスに基づく方法の一つの欠点は、蛍光シグナルの生成の速度が消化段階のスピードによって制限されることである。これは方法の有用性にとって決して致命的ではないが、それでもなお、より一層速いシーケンシング（配列決定とも言う）を可能にするために蛍光におけるこの成長に関連するインキュベーション期間を減らすことは；特に長いシーケンシングリードが考えられる場合、技術的観点から非常に望ましいことに変わりはない。このことは、我々が、使われたプローブのエキソヌクレオチド鎖分解性の消化を、クエンチングされたフルオロフォアを伴う鎖の比較的速い選択的エンドヌクレオチド鎖分解性（選択的内ヌクレオチド鎖分解性とも言う）のニッキングで置き換えることによって今回達成した。したがって、本発明によれば、（1）核酸の進行性酵素的消化によって単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成するステップ；（2）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下に、少なくとも一の単一ヌクレオシド三リン酸と、対応する生物学的プローブで、（a）制限エンドヌクレアーゼのニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、およびニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれが少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーを、フルオロフォアがクエンチされるように伴うもの、が含まれる、第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチドを含むものと、を反応させることによって少なくとも一の実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの使われたプローブを生産するステップ；（3）使われたプローブの第一のオリゴヌクレオチドの鎖をニッキング部位にて、別々の第一のオリゴヌクレオチドの成分でそれぞれがフルオロフォアおよびクエンチャーを伴うものを作り出すために、ニッキング制限エンドヌクレアーゼによりニッキングするステップ；（4）ステップ（3）において生成された第一のオリゴヌクレオチドの成分を使われたプローブの相補的な鎖から分離するステップ、および（5）それらを伴う分離されたオリゴヌクレオチドの成分でのフルオロフォアを検出するステップによって特徴付けられる、核酸を配列決定する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】反応のdNTP成分の存在および不存在下に、経時的な蛍光強度の増加をモニターし、それらの結果をグラフで示す。
【図２】マイクロ流体配列決定装置を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
好ましい一実施形態において、ステップ（3）および（4）は、ステップ（5）において検出のために解放されるフルオロフォアの数を著しく増加させるために下記のように繰り返される。
【００１１】
本発明の方法のステップ（1）は、単一ヌクレオシド三リン酸のストリーム（流れとも言う）を核酸分析物から進行性酵素的消化によって生成することを含む。一実施形態では、これは、分析物（分析対象、被分析物などとも言う）の進行性エキソヌクレオリシス、次いで取得された単一ヌクレオシド一リン酸でのキナーゼの作用が続くことによって達成することができる。しかしながら、好ましくは、ヌクレオシド三リン酸は、分析物から進行性加ピロリン酸分解（progressive pyrophosphorolysis）によって直接生産される。このステップにおいて採用される分析物は、適切には二本鎖ポリヌクレオチドであり、その長さは原則として無制限であることができ；例えば、ヒト遺伝子または染色体フラグメントにおいて見出される最大で何百万までの核酸塩基が含まれる。しかしながら、典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも50、好ましくは少なくとも150ヌクレオチド対の長さであろうし；適切にはそれは500よりも多く、1000よりも多く、および多くのケースでは数千の長さのヌクレオチド対であろう。分析物それ自体は、自然起源の（例えば、植物、動物、細菌またはウイルスに由来する）好ましくはRNAまたはDNAであるが、合成的に生産されたRNAまたはDNA、あるいはまた全体的または部分的に、ヌクレオチドで、その核酸塩基が自然では一般的に見られない；すなわち、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）およびウラシル（U）以外の核酸塩基であるものから作成される他の核酸をシーケンシングするために使用することもできる。そのような核酸塩基の例には、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノ-メチルウリジン、ジヒドロウリジン、2-O-メチルプソイドウリジン（methylpseudouridine）、2-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンチルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、5-メトキシウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、ワイブトシン、プソイドウリジン、キュェオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、2-O-メチル-5-メチルウリジンおよび2-O-メチルウリジンが含まれる。DNAの場合では、生成される単一ヌクレオシド三リン酸はデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、その一方で、RNAの場合、それらはリボヌクレオシド三リン酸である。
【００１２】
本方法の一実施形態では、ステップ（1）は、分析物を基材に付着させる第一のサブステップをさらに含む。典型的には、この基材には、マイクロ流体表面、マイクロビーズまたは透過膜が含まれ；例えば、ガラスまたは非分解性ポリマー製のものである。好ましくは、基材には、分析物を受入れるように特に適合される表面がさらに含まれる。分析物をそのような表面に付着させることができる多くの方法があり、それらのいずれも原則的にこのサブステップにおいて使用することができる。例えば、一つの方法には、例えば、エポキシシラン、アミノヒドロカルビルシランまたはメルカプトシランなどのような官能化シランによりガラス表面をプライミング（下塗りとも言う）することが包含される。そのようにして生成される反応部位は、次いで末端アミン、スクシニルまたはチオール基を含むように修飾された分析物の誘導体で処理することができる。
【００１３】
ステップ（1）の別の実施形態では、分析物は、単一のヌクレオシド三リン酸のストリームを生成するために加ピロリン酸分解され、その順序は分析物の配列の順序に対応する。そのような加ピロリン酸分解は、20ないし90℃の範囲での温度にて；例えば、適切なポリメラーゼを含む反応媒体の存在下に遂行し得る。好ましくは、それは、単一ヌクレオシド三リン酸が遊離するにつれて反応ゾーンから連続的に取り出されるように、連続流の条件下で遂行される。最も好ましくは、加ピロリン酸分解は、酵素および他の典型的な添加剤を含有する水性緩衝化媒体が分析物を結合している表面にわたって連続的に流れるようにすることによって遂行される。
【００１４】
さらに別の実施形態では、用いられる酵素は、分析物の進行性の3'-5'加ピロリン酸分解を引き起こし、高忠実度を有し、および妥当な反応速度でのヌクレオシド三リン酸のストリームを生じさせることができるものである。好ましくは、この分解速度は可能な限り速く、および一実施態様では、毎秒1ないし50ヌクレオシド三リン酸の範囲にある。
【００１５】
ポリヌクレオチドの消化に適用されるピロリン酸分解反応に関するさらなる情報は、例えば、J. Biol. Chem.（ザ・ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー）244（1969）pp. 3019-3028に見出すことができる。適切には、加ピロリン酸分解消化は、ピロリン酸アニオンおよびマグネシウムカチオンを；好ましくはミリモル濃度においてさらに含む媒体の存在下に遂行される。
【００１６】
本発明の方法のステップ（2）において、ストリームにおいて少なくとも一の単一ヌクレオシド三リン酸、好ましくは各単一ヌクレオシド三リン酸を、実質二本鎖の使用されたプローブを生成するためにポリメラーゼおよびリガーゼの存在下にプローブシステムと反応させる。好ましくは、このステップを遂行する前に、ステップ（1）の生産物を、任意の残留ピロリン酸をリン酸アニオンに加水分解するためにピロホスファターゼにより処理する。
【００１７】
このステップにおいて使用されるポリメラーゼは、反応条件下で本質的にエキソヌクレアーゼ活性もエンドヌクレアーゼ活性もどちらも示さないものからなる群より適切に選ばれる。有利に使用することができるポリメラーゼの例には、制限されないが、原核生物pol 1酵素または細菌、例えば、Escherichia coli（エシェリキア・コリ、E. coli、大腸菌などとも言う）（例えば、Klenow（クレノー）フラグメントポリメラーゼ）、Thermus aquaticus（テルムス・アクウァーティクス）（例えば、Taq Pol）、Bacillus stearothermophilus（バチルス・ステアロサーモフィルス）、Bacillus caldovelox（バチルス・カルドベロックス）およびBacillus caldotenax（バチルス・カルドテナクス）などのようなものから得られる酵素誘導体が含まれる。原則として、このステップにおいて任意の適切なリガーゼを使用することができる。
【００１８】
ステップ（2）において採用される生物学的プローブは三つの成分から構成され；（a）検出不可能な状態において特徴的な検出可能な要素により標識された第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域にハイブリダイズすることが可能な第二および第三の非標識の一本鎖のオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、第二および第三のオリゴヌクレオチドは別々の実体であり、その一方で、別のものでは、それらはリンカー領域を使って互いに連結される。この後者の場合では、一実施形態において、リンカー領域は第二および第三のオリゴヌクレオチドの端部を連結する。リンカー領域は原則として、任意の二価の基であることができるが、しかし便利には別のオリゴヌクレオチド領域である。一実施形態では、このオリゴヌクレオチドリンカー領域は、第一のオリゴヌクレオチドと実質的にハイブリダイズすることができない。
【００１９】
第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドは、ステップ（2）において、第二および第三のオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドでの3'側および5'側のフランキング領域にそれぞれハイブリダイズすることができるように選ばれ、それら自体は、捕捉部位で、単一ヌクレオチドを含み、その核酸塩基が、検出されるヌクレオシド三リン酸によって伴われる（borne by）ものと相補的であるものの両側に並置される。このことは、三成分のプローブシステムをその特定のヌクレオシド三リン酸について高度に選択的にする。したがって、例えば、分析物がDNAから導き出され、および第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドから構成される場合、捕捉部位はデオキシアデノシン三リン酸について、それが含むヌクレオチドがチミン核酸塩基を伴う場合、高度に選択的であろう。したがって、本発明の有用な一実施形態において、ステップ（2）は、複数のプローブのタイプから構成されるプローブシステムの存在において遂行し得；例えば、一、二、三または四つのプローブタイプは、それらのそれぞれが、求められる様々な異なる核酸塩基およびそれに付着する異なる検出可能な要素に特徴的な異なる捕捉部位を有する第一のオリゴヌクレオチドを含む。
【００２０】
典型的には、第一のオリゴヌクレオチドは最大で150ヌクレオチド長まで、好ましくは10および100ヌクレオチド間である。一実施形態では、第二のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドの相補的3'側フランキング領域よりも少なくとも1ヌクレオチドだけ短い。別のものでは、この時点でヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐために、第一のオリゴヌクレオチドの3'端および第二のオリゴヌクレオチドでのその反対側のヌクレオチド間に単一ヌクレオチドミスマッチがある。同様に、一実施形態では、第三のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドの相補的5'側フランキング領域よりも少なくとも一ヌクレオチドだけ長く、その一方、別のものでは、第三のオリゴヌクレオチドの3'端および第一のオリゴヌクレオチドでのその反対側のヌクレオチド間に、この時点で、ヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐために、単一ヌクレオチドミスマッチがある。
【００２１】
第一のオリゴヌクレオチドの特色は、それがそれ自身の独特のタイプのフルオロフォア（発蛍光団とも言う）で標識される領域を提供され、およびこれらのフルオロフォアが、プローブシステムを未使用状態にするとき、実質検出不可能なように配置されることである。好ましくは、それらは、フルオロフォアが検出されるように設計される場合、それらの波長において本質的に非蛍光性であるように配置される。したがって、フルオロフォアは、電磁スペクトルの広い部分にわたって一般的な、低レベルのバックグラウンド蛍光を見せることがあるが、典型的には、一つまたは少数の特定の波長または波長エンベロープが存在するであろうし、そこでは蛍光の強度が最大である。それは、最大値の一以上であり、そこではフルオロフォアが特徴的に検出され、本質的に蛍光が生じるべきでない。この特許の関連で、用語「本質的に非蛍光性（essentially non-fluorescing）」または等価の言い回しによって、関連する特徴的な波長または波長エンベロープにて第一のオリゴヌクレオチドに付着したフルオロフォアの合計数の蛍光の強度が25％未満；好ましくは10％未満；より一層好ましくは1％未満、最も好ましくは等価な数の遊離フルオロフォアの蛍光の対応する強度の0.1％未満であることを意味する。
【００２２】
原則として、任意の方法を、第一のオリゴヌクレオチドの未使用状態においてフルオロフォアが本質的に非蛍光性であることを確実にするために使用することができる。一実施形態では、これは、フルオロフォアおよびクエンチャー（消光剤とも言う）をそれぞれフルオロフォアおよびクエンチング（消光とも言う）領域においてニッキング部位の両側に並べることによって達成される。別のものでは、それは、ニッキング部位の両側の二つの領域にフルオロフォアを並べ、および複数のフルオロフォアが互いに非常に近接しているときにそれらが互いに十分によくクエンチングする傾向があるという観察に頼ることによって達成され、それは、前の段落に記載した基準を、クエンチャーについての必要性を伴わずに達成することができる。この特許の関連において、フルオロフォア間またはフルオロフォアおよびクエンチャー間の「近接」を構成するものは、使用される特定のフルオロフォアおよびクエンチャー、およびおそらく第一のオリゴヌクレオチドの構造的特徴に依存するであろう。結果として、この用語は、二つの領域内の様々な要素のいかなる特定の構造的配置よりもむしろ要求される成果を参照して解釈されるべきであることが意図される。しかしながら、および例示だけを提供する目的として、隣接するフルオロフォアまたは隣接するフルオロフォアおよびクエンチャーが特徴的なフェルスター距離（Forster distance）に対応する距離（典型的には5nm未満）だけ離れているとき、十分なクエンチングが大抵は達成されるであろう。
【００２３】
フルオロフォアそれら自体に関して、それらは原則として、本技術において慣習的に使用されるいずれかのものから選ぶことができ、制限されないが、キサンテン部分、例えば、フルオレセイン、ローダミンおよびそれらの誘導体、例えば、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミンBおよびその他同種類のものなど；クマリン部分（例えば、ヒドロキシ-、メチル-およびアミノクマリン）ならびにシアニン部分、例えば、Cy2、Cy3、Cy5およびCy7などのようなものが含まれる。具体例には、以下の普通に使用される色素（ダイ、染料などとも言う）：アレクサ色素（Alexa dyes）、シアニン色素、アトテック色素（Atto Tec dyes）、およびローダミン色素から導き出されたフルオロフォアが含まれる。例にはまた：Atto 633（ATTO-TEC GmbH（アト-テック社））、Texas RedTM（テキサスレッド商標）、Atto 740（ATTO-TEC GmbH）、Rose Bengal（ローズベンガル）、Alexa FluorTM（アレクサフルオロ）750 C5-マレイミド（Invitrogen（インビトロゲン））、Alexa FluorTM 532 C2-マレイミド（Invitrogen）およびRhodamine Red（ローダミンレッド）C2-マレイミドおよびRhodamine Green（ローダミングリーン）ならびにホスホロマダイト色素（phosphoramaditedyes）、例えば、Quasar（クエーサー）570などのようなものが含まれる。あるいはまた、量子ドットまたは近赤外染料、例えば、LI-COR Biosciences（LI-CORバイオサイエンシーズ）によって供給されるものなどのようなものを採用することができる。フルオロフォアは、典型的には、本技術で既知の化学的方法を用いてヌクレオチド塩基を介して第一のオリゴヌクレオチドに付着される。
【００２４】
適切なクエンチャーには、Forster共鳴エネルギー移動（FRET）機構によって作用するものが含まれる。上記のフルオロフォアと関連して使用することができる商業上利用可能なクエンチャーの例には、制限されないが、DDQ-1、Dabcyl（ダブシル）、Eclipse（エクリプス）、Iowa Black（アイオワ・ブラック）FQおよびRQ、IR Dye（IRダイ）-QCl、BHQ-0、BHQ-1、-2および-3およびQSY-7および-21が含まれる。
【００２５】
第一のオリゴヌクレオチドの特色は、プローブが使用されているとき、選択的な、ニッキングエンドヌクレオリシスを受けるように適合された一本鎖制限エンドヌクレアーゼニッキング部位の両側に並置されたフルオロフォアおよびクエンチャー領域の理由でプローブの未使用状態においてフルオロフォアが検出不能にされ、および二本鎖状態にあることである。好ましい一実施形態において、このニッキング部位は、それ自体が捕捉部位を含む第一のオリゴヌクレオチドでのオリゴヌクレオチド領域を含む。別の実施形態において、一よりも多くのプローブシステムが採用される場合、それにもかかわらず、一つだけのニッキング制限エンドヌクレアーゼの必要性が採用されるように、各々異なって標識された第一オリゴヌクレオチドが共通のニッキング部位を含むのが好ましい。したがって、これを達成するために、好ましくは、ニッキング部位は、場合によっては、RNAまたはDNAの典型的なヌクレオチドのそれぞれの少なくとも一つを含む配列から構成されるであろう。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、ここに規定するようにニッキング制限エンドヌクレアーゼは、使われたプローブの両方の鎖を別なふうに開裂することが可能である慣習的な制限エンドヌクレアーゼであり、およびニッキング部位の領域において相補的な鎖はエンドヌクレオシスに対して耐性にされ；例えば、一以上のエンドヌクレオチド鎖分解性ブロッキング部位を含むことによる。一実施形態では、これらのブロッキング基は、ホスホロチオアート連結および本技術で普通に使用される他の骨格修飾、C3スペーサー、リン酸基、およびその他同種類のものなどから選ばれ得る。
【００２７】
ステップ（2）は、ストリームにおいて各単一ヌクレオシド三リン酸を20ないし80℃の範囲での温度にて上記のような酵素および一以上のプローブと接触させることによって適切に遂行される。
【００２８】
本発明の方法のステップ（2）の生産物は、上記のように、実質二本鎖の使われたプローブであり、その構成鎖はそれぞれ第一のオリゴヌクレオチド、および第二のオリゴヌクレオチド、単一ヌクレオシド三リン酸から導き出されたヌクレオチド、および最後に第三のオリゴヌクレオチドから構成される相補的オリゴヌクレオチドである。第二および第三のオリゴヌクレオチドがリンカー領域によって一緒に予め接合されている場合、そのときこの相補的オリゴヌクレオチドが閉ループ鎖を含むであろうことは容易に分かるであろう。
【００２９】
ステップ（3）において、使われたプローブは30ないし100℃の範囲での温度にてニッキング制限エンドヌクレアーゼにより処理される。このステップにおいて、第一のオリゴヌクレオチドから導き出された使われたプローブの鎖を二つの別々の成分に分け、次いでそれをステップ（4）においてプローブの相補鎖から脱ハイブリダイズさせ、それによってフルオロフォアおよびクエンチャー領域が互いから分離され、およびフルオロフォアが蛍光を発するようにされる。したがって、エンドヌクレオリシスおよび脱ハイブリダイゼーションが起こると、観察員は蛍光シグナルの急速な成長を見る。次いでこの蛍光の特徴は、関連プローブシステムによって当初に捕捉された単一ヌクレオシド三リン酸の性質を間接的に反映する。ステップ（4）は、ニッキングされ使われたプローブを30ないし100℃の範囲での温度にて加熱することによって最も効果的に達成することができる。
【００３０】
その後、およびステップ（5）において、ステップ（4）において、またはステップ（3）および（4）の種々の反復を介して遊離されるフルオロフォアが検出され、および単一ヌクレオシド三リン酸に結合した核酸塩基の性質が推論によって決定される。ステップ（1）において生成されたストリームでのすべての単一ヌクレオシド三リン酸について本発明の方法を体系的に遂行することによって、元の核酸分析物の配列に特徴的なデータを生成し、および分析することができる。これを行う方法は本技術においてよく知られており；例えば、反応媒体をレーザーからの光で調べることができ、および発生した任意の蛍光を光検出器または等価の装置を用いて検出し、様々なフルオロフォアの特徴的な蛍光波長（群、「群」は複数もあり得ることを示すのに使用する）または波長エンベロープ（群）に調整することができる。これにより、光検出器が、既知のアルゴリズムを使用してコンピュータにおいて処理および分析することができる特徴的な電気シグナルを発生させる。
【００３１】
上述のように、好ましい一実施形態では、ステップ（4）の終わりに、使われたプローブから導き出された相補的なオリゴヌクレオチドは、今回一本鎖形態で存在し、別の対応する第一のオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズするようにされ、それによって使われたプローブとして、対応する、すなわち同じ化学的および物理的構造を有する、実質二本鎖の新しいオリゴヌクレオチド生産物が生産される。次いで、この生産物はステップ（3）の反復においてニッキングされ、それによってさらなるフルオロフォアが検出可能な状態において放出され、およびステップ（4）の反復後に相補的なオリゴヌクレオチドが再度再生される。しかる後、ステップ（3）および（4）が繰り返され、蛍光シグナルにおいてさらに増強され；原則として、実質すべての第一のオリゴヌクレオチドが消費されてしまうまでである。結果として、観察員は、別なふうに得られたであろうものよりもはるかに大きい蛍光シグナルの増強を見る。
【００３２】
特に好ましい一実施形態では、本発明の方法は、微小液滴のストリームにおいて、その少なくとも一部分が単一ヌクレオシド三リン酸を含有し；適切には順序付けられたストリームにおいて全体的に、または部分的に遂行される。そのような方法は、例えば、順序付けを保存するのを助けるために、ステップ（1）において生成されたヌクレオシド三リン酸を、不混和性担体溶媒、例えば、炭化水素またはシリコーン油などのようなものにおいて維持される水性微小液滴の対応するストリーム中に一つずつ挿入することによって開始し得る。あるいはまた、これは、消化（加ピロリン酸分解）ゾーンの下流に微小液滴を直接作り出すことによって；例えば、反応媒体を、適切な寸法の微小液滴ヘッドから溶媒の流動ストリーム中に出現させることによって達成することができる。あるいはまた、ステップ（1）からの反応媒体の小アリコートは、溶媒において懸濁された既存の水性微小液滴のストリーム中に規則的に、および連続的に注入することができる。この後者のアプローチが採用される場合、各微小液滴は、酵素およびステップ（2）ないし（4）を達成するのに必要な任意の他の試薬（例えば、緩衝剤）と一緒にプローブシステム（群）の種々の成分を既に含んでいてもよい。さらに別のアプローチでは、前の実施形態において作り出された微小液滴を、その後、同様の成果を達成するために、そのような既存の微小液滴のストリームと一体化させることができる。これらの微小液滴法では、次いでステップ（5）は、好ましくは、微小液滴を貯蔵エリアに送ること、および遊離されたフルオロフォアを識別するために各微小液滴を調べることを包含する。しかる後、各微小液滴から得られる結果は、元の核酸分析物の配列に特徴的なデータのストリーム中にまとめられる。
【００３３】
与えられる微小液滴が一よりも多くのヌクレオシド三リン酸を含有する危険性を回避するために、各充填された微小液滴が平均して1から20まで、好ましくは2ないし10の空のものだけ分離されるような速度で各ヌクレオシド三リン酸を解放することが好ましい。しかる後、溶媒において充填された、および充填されていない微小液滴のストリームは、それらが不連続状態に維持され、および互いと一体化する機会をもたないような速度にて、およびマナーにおいて、流路、適切にはマイクロ流体流路に沿って流される。適切には、採用される微小液滴は、100ミクロン（100μmとも言う）未満、好ましくは50ミクロン未満、より一層好ましくは20ミクロン未満、およびさらにより一層好ましくは15ミクロン未満の有限直径を有する。最も好ましくは、それらのすべての直径は、2ないし20ミクロンの範囲にある。一実施形態では、システム全体を通る微小液滴流速は、毎秒50ないし3000微小液滴の範囲、好ましくは100ないし2000にある。
【００３４】
本発明の第二の態様において、（a）制限エンドヌクレアーゼニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、およびニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれはフルオロフォアがクエンチされるように少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーを伴うものを含む第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三のオリゴヌクレオチドを含むことによって特徴付けられる多成分生物学的プローブもまた提供される。
【００３５】
一実施形態において、オリゴヌクレオチド領域は少なくとも一のフルオロフォアが伴われるフルオロフォア領域および少なくとも一のクエンチャーが伴われるクエンチャー領域を含む。別の実施形態では、二つの領域は両方ともフルオロフォア、またはフルオロフォアおよびクエンチャーの混合物を伴う。この場合、すべてのフルオロフォアは互いに自己クエンチするように配置される。適切なフルオロフォアおよびクエンチャーには、制限されないが、上記のものが含まれる。別の実施形態では、第二および第三のオリゴヌクレオチドは、上で説明したようにリンカー領域によって接続され；リンカー領域自体は、好ましくは別のオリゴヌクレオチド領域である。好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドでのニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位には、捕捉部位が含まれる。
【００３６】
上記に説明したように、DNAまたはRNAの配列決定の目的のために、ここに記載の生物学的プローブは、捕捉部位の核酸塩基特徴（A、G、C、およびTまたはU）および使用されるフルオロフォアにおいてだけが異なる一から四までの異なる第一のオリゴヌクレオチドのタイプから構成される対応する生物学的プローブシステム中にアセンブルすることができる。別の実施形態では、生物学的プローブシステムは、一旦プローブシステム内での二本鎖の使われたプローブが作り出されたなら、少なくとも一のリガーゼ、ポリメラーゼおよびニッキング部位にニッキングすることが可能なニッキング制限エンドヌクレアーゼをさらに含むキットとして明示される（made manifest）。
【００３７】
本発明の方法、プローブおよびプローブシステムと共に使用することができる適切なニッキング制限エンドヌクレアーゼの詳細は、http：//rebase.neb.comにて関連するデータベースで見出すことができる。
【００３８】
上記の配列決定方法において使用される検出方法はまた、生物学的サンプルまたはそれから導き出される分析物において単一ヌクレオシド三リン酸の分析、特徴付けまたは定量化にも概して適用可能であると考えられる。したがって、本発明の第三の態様において、（1）ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下に、単一ヌクレオシド三リン酸と、対応する生物学的プローブで、（a）制限エンドヌクレアーゼのニッキング部位、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチドの捕捉部位、ならびにニッキング部位の両側に並置されたオリゴヌクレオチド領域で、それぞれが少なくとも一のフルオロフォアおよび少なくとも一のクエンチャーをフルオロフォアがクエンチされるように伴うものが含まれる第一の一本鎖のオリゴヌクレオチド、および（b）第一のオリゴヌクレオチドでの相補的な領域に捕捉部位の両側でハイブリダイズすることが可能な第二および第三の一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれるものと、を反応させることによって少なくとも一の実質二本鎖のオリゴヌクレオチドの使われたプローブを生産するステップ；（2）使われたプローブの第一のオリゴヌクレオチドの鎖をニッキング部位にて、別々の第一のオリゴヌクレオチドの成分でそれぞれがフルオロフォアおよびクエンチャーを伴うものを作り出すために、ニッキング制限エンドヌクレアーゼによりニッキングするステップ；（3）ステップ（2）において生成される第一のオリゴヌクレオチドの成分を、使われたプローブの相補鎖から分離するステップ、および（4）それら（フルオロフォア？）を伴う分離されたオリゴヌクレオチドの成分でのフルオロフォアを検出するステップによって特徴付けられる単一ヌクレオシド三リン酸を分析する方法が提供される。
【００３９】
そのような方法において、採用される様々なステップおよび生物学的プローブの性質は、適切には上記のようなものであろう。一実施形態では、単一ヌクレオシド三リン酸は、加ピロリン酸分解によって前駆体の二本鎖DNA分析物から導き出されるであろう。別の例では、それは、例えば、キナーゼを使用して前駆体の単一ヌクレオシド一リン酸または単一ヌクレオシド二リン酸から生成されるであろう（例えば、Bao（バオー）およびRyu（リュー）によるBiotechnology and Bioengineering（DOI 10.1002/bit.21498）を参照）。
【実施例】
【００４０】
本発明を次に、以下の例を参照して例示する。
【００４１】
例1-プローブシステムの準備および使用
【００４２】
一本鎖の第一のオリゴヌクレオチド1を調製したが、以下のヌクレオチド配列を有し：
5'-ATGTTCTGATATCXCGTATTCATTGCQTGATGCCCTTAGC-3'
式中、A、C、G、およびTは、DNAの関連する特徴的なヌクレオチド塩基を伴うヌクレオチドを表し；Xは、慣習的なアミンアタッチメント化学を用いるAtto 655色素により標識されたデオキシチミジンヌクレオチド（T）を表し、およびQはBHQ-2クエンチャーにより標識されたデオキシチミジンヌクレオチドを表す。それは、その5'端から21番目の塩基にて、デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTPs）の混合物においてデオキシグアノシン三リン酸ヌクレオチド（dGTPs）を捕捉するために選択的な、捕捉領域（Cヌクレオチド）、およびニッキングエンドヌクレアーゼNb.BsrDIについての認識配列、‘NNCATTGC’をさらに含む。
【００４３】
別の一本鎖のオリゴヌクレオチド2は、四つの塩基ミスマッチを有する第一のオリゴヌクレオチドの3'端に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド領域を含み、および一本鎖のオリゴヌクレオチド3は、四つの塩基ミスマッチおよび5'リン酸基を有する第一のオリゴヌクレオチドの5'端に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド領域を含み、それらも調製した。それらは以下のヌクレオチド配列を有した：
オリゴヌクレオチド2：5'-TTCCGCATCAAGCAAT-3'
オリゴヌクレオチド3：5'-PAATACGAGATATGTCT-3'
式中、Pは5'リン酸基を表す。
【００４４】
次いで、プローブシステムを含む反応混合物を準備した。それは以下の調剤物から導き出されたものに対応する組成を有した：
20uL（μL）の5×緩衝剤pH7.9
10uLのオリゴヌクレオチド1、1000nM
10uLのオリゴヌクレオチド2、10nM
10uLのオリゴヌクレオチド3、10nM
10uLのスペルミン溶液、10mM
10UのNb.BsrDIニッキングエンドヌクレアーゼ（例：New England Biolabs Inc.（ニュー・イングランド・バイオラボ社））
20UのE. coliリガーゼ
5.8UのBst Large Fragment（Bstラージフラグメント）ポリメラーゼ
10uLのdNTPsの混合物、1nM
100uLまでの水
そこで、5×緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
25uLのTrizma Acetate（トリズマアセタート）、1M、pH7.9
50uLの水性Magnesium Acetate（マグネシウムアセタート）、1M
25uLの水性Potassium Acetate（カリウムアセタート）、1M
50uLのTriton（トリトン）X-100界面活性剤（10％）
500μgのBSA
1mLまでの水。
【００４５】
次いで、dGTPsの捕捉および使われたプローブを形成するためにオリゴヌクレオチド2のオリゴヌクレオチド3への連結は、混合物を37℃で30分間インキュベートし、その後温度をさらに120分間60℃に上昇させることによって遂行した。反応混合物を633nmラインのHelium-Neon（ヘリウム-ネオン）レーザーを用いて照射し、および得られるAtto 655色素の特徴的な蛍光を、エンドヌクレオリシスおよび見出される使われたプローブの再生のサイクルとしてカメラを用いて検出した。
【００４６】
反応のdNTP成分の存在および不存在下に、経時的な蛍光強度の増加をモニターし、および結果を図1にグラフで示した。このことから、プローブシステムがdGTPsを効率的に捕捉することを見ることができ、本発明のプロセスの周期的性質（cyclic nature）は蛍光シグナルの急速な成長をもたらす。反対に、比較実験では、反応混合物においてdNTPsが存在しなかったが、オリゴヌクレオチド1でのAtto 655色素は何ら有意な程度には蛍光を示さなかった。
【００４７】
例2-プローブシステムを用いた液滴マイクロ流体方法
【００４８】
図2は、マイクロ流体配列決定装置を概略的に示し、そこでは、微小液滴はそれぞれ単一のヌクレオチド塩基を含み、上述のような上の種類のプローブシステムと反応するように作られる。
【００４９】
ヒトDNAから導き出される100ヌクレオチド塩基ポリヌクレオチド分析物の進行性加ピロリン酸分解によって得られる単一ヌクレオチド三リン酸のストリームを含む水性媒体1を、PDMSポリマーから製造された直径十ミクロンのマイクロ流体チューブを通して流れるようにする。加ピロリン酸分解反応自体は、Taq Polおよび1リットル当たり2ミリモル濃度のピロリン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムの各々を有する溶液を含む水性、緩衝化（pH7.5）反応媒体のストリームを、ガラスマイクロビーズ上に通すことによって遂行され、その上に分析物がスクシニル架橋を使って予め付着された。1での単一ヌクレオチドの順序は、それがマイクロビーズの下流にあり、分析物の配列に対応する。1は液滴ヘッド2から第一のチャンバ3中に出現し、そこではそれが不混和性の軽質シリコーンオイル4の一以上のストリームと接触する。これらのストリームの速度は、乱流混合を回避し、およびオイルにおいて懸濁した水性球状液滴5を作り出すように選ばれ、それぞれおよそ八ミクロンの直径を有する。典型的には、隣接する充填液滴間に平均10の空のものが存在するように速度が調整される。次に、5のストリームが、同じ直径の第二のマイクロ流体チューブに沿って第二のチャンバ6へと前進させられ、その中に、五ミクロンの水性球状液滴7の第二のストリームもまた第二の液滴ヘッド8を使って供給される。液滴5および7は、直径でおよそ九ミクロンの拡大された水滴9を形成するために逐次的様式において一体化させられる。7の各々は、5の各々において存在するあらゆる残留ピロリン酸アニオンを破壊するために無機ピロホスファターゼを含有する。
【００５０】
次に、9のストリームはマイクロ流体チュービングを介して同じ速度で第三のチャンバ10に前進させられ、そこでこれらの液滴を対応する液滴ヘッド12を通してそこにまた供給される五ミクロンの水性球状液滴11の第三のストリームと接触させる。9の各々についてチャンバ6および10間を移動するのにかかる時間はc.（約とも言う）2分である。
【００５１】
次に、液滴9および11を、液滴13（直径でおよそ十ミクロン）を生産するために10において一体化させる。11の各々には、中温性リガーゼ、好熱性ポリメラーゼ、ニッキング制限エンドヌクレアーゼNb.BsrDI（例は、New England Biolabs Inc.）および例1に記載のものと同様の四つのセットの一本鎖のオリゴヌクレオチドを含むプローブシステムが含まれ、それぞれが異なるフルオロフォアにより標識された異なる第一のオリゴヌクレオチドを有する。
【００５２】
そのようにして形成された一体化微小液滴13のストリームは次に、37℃で30分間、続いて60℃で120分間インキュベートに付される。この時間の終わりに13が検出システム、14に移される。
【００５３】
検出システム（示してない）は典型的に、検出ウィンドウを含み、そこでは、各液滴がレーザーからの入射光により調べられる。次いで、この光の作用により、各液滴において放出されたフルオロフォアが、捕捉分子に本来組み込まれていた単一ヌクレオチド塩基の特徴的なやり方において蛍光を発するようにされる（または液滴が元々空であった場合は本質的にまったくそうでない）。次いで、この蛍光の存在または不存在は、上述した四つのオリゴヌクレオチドセットと関連した四つのフルオロフォアの四つの特徴的な波長にて検出される。このようにして、液滴が順番に調べられると、元のポリヌクレオチド分析物においてヌクレオチド塩基の配列を事実上読み取ることができる。
【図１】
2019532623.tif 000002
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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