(57)【要約】  本発明は、修飾された抗体に関する。特に、本発明は、減少したエフェクター機能及び標的抗原による細胞シグナル活性を媒介する改変された能力を有する、キメラ、霊長類化又はヒト化抗体若しくは断片を含む組換えモノクローナル抗体又は断片に関する。更に、本発明は、そのような抗体をコードする核酸分子、並びにそのような核酸分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、更に、本発明の抗体を産生するための方法、及び疾患の治療においてこれらの抗体を使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体であって、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ａｓｎ２９７及び／又はＰｒｏ３２９を含み、前記置換がＡｓｎ２９７Ａｓｐ及び／又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙであり、残基はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされ、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能が、親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して低減しており、変異体重鎖を含む抗体が、残存するＡＤＣＰ機能を保持する、抗体。
【請求項２】
エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
親非置換抗体が、オビヌツズマブ又はリツキシマブである、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
親非置換抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合が消失した、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能が、親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して、消失又は大きく低減している、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
親非置換抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合が低減した、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
変異体重鎖領域が、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１を含み、かつ、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
Ｐｒｏ１５１が、フェニルアラニンで置換されている、請求項８又は９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がＣＤ２０に特異的に結合する、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記増殖性障害が、ＣＤ２０発現がんであることを特徴とする、請求項１４に記載の使用のための抗体。
【請求項１６】
請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患を治療するための方法。
【請求項１７】
前記増殖性障害が、ＣＤ２０発現がんであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
医薬の製造のための、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
医薬が、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患を治療するためである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、修飾された抗体に関する。特に、本発明は、減少したエフェクター機能及び標的抗原による細胞シグナル活性を媒介する改変された能力を有する、キメラ、霊長類化又はヒト化抗体若しくは断片を含む組換えモノクローナル抗体又は断片に関する。更に、本発明は、そのような抗体をコードする核酸分子、並びにそのような核酸分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、更に、本発明の抗体を産生するための方法、及び疾患の治療においてこれらの抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と対合した２つの同一の重（Ｈ）鎖、すなわち４つのポリペプチド鎖を含む基本構造を有する。各重鎖及び軽鎖は、可変領域（それぞれＶＨ及びＶＬ）及び定常領域（それぞれＣＨ及びＣＬ）を含む。ＣＨ領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有するが、より小さいＣＬ領域は１つのドメインのみ（簡単にＣＬと称する）を有する。各ＶＨ及びＶＬ領域は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で４つのフレームワーク領域に隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、Ｖ領域の最も可変性の部分であり、抗体の抗原特異性を決定する。一緒に、対合したＶＨ及びＶＬ領域は抗原結合部位を形成し、二価抗体はそのような抗原結合部位を２つ有する。
【０００３】
抗体のＦｃ領域、すなわち、抗体スパニングドメインＣＨ２、ＣＨ３の重鎖の末端及びヒンジ領域の一部は、可変性が制限されており、抗体が果たす生理学的役割の達成に関与している。抗体のＦｃ領域に起因するエフェクター機能は、抗体のクラス及びサブクラスによって異なり、様々な生物学的応答をトリガーする細胞上の特異的Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）へのＦｃ領域を介した抗体の結合を含む。
【０００４】
これらの受容体は、典型的には、Ｆｃとの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内の一部のシグナル伝達事象を媒介することができる細胞内ドメインを有する。Ｆｃ受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞含む様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、結合した抗原の部位にこれらのエフェクター細胞を動員し、典型的には、細胞内のシグナル伝達事象、並びに炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、及び細胞傷害性攻撃などの重要なその後の免疫応答を生じる。細胞傷害性及び食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する潜在的機序である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（Ravetch, et al., Annu Rev Immunol 19 (2001) 275-290）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）と呼ばれる（Ravetch, et al., Annu Rev Immunol 19 (2001) 275-290）。更に、分子のＦｃ領域上の重複部位は、補体が媒介する細胞非依存性細胞傷害性機能の活性化を制御し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）としても知られている。
【０００５】
抗体のＩｇＧクラスでは、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、Ｆｃ領域とＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれる受容体のファミリーとの結合によって支配される。ヒトでは、このタンパク質ファミリーは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃＲγＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＣを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；及びアイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢを含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む（Raghavan, and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes, et al., Expert Reviews VOL 5(6), (2009) 735-747）。ＦｃγＲは、様々な免疫細胞上で発現され、Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は結合した抗原の部位にこれらのエフェクター細胞を動員し、典型的には、シグナル伝達、並びに炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、及び細胞傷害性攻撃などのその後の免疫応答を生じる。更に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ／ｃ、及びＦｃγＲＩＩＩＡは、細胞内免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）によって特徴付けられる活性化受容体であるが、ＦｃγＲＩＩＢは阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、従って阻害性である。また、de Reys, et al., Blood, 81, (1993) 1792-1800は、例えばＣＤ９のように、モノクローナル抗体によって誘導された血小板活性化及び凝集は、ＦｃγＲＩＩ−受容体が関与する、Ｆｃドメイン依存性のステップが続く抗原認識によって開始される（Taylor, et al., Blood 96 (2000) 4254-4260も参照）と結論した。ＦｃγＲＩは単量体ＩｇＧに高親和性で結合するが、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＩは低親和性受容体であり、複合体形成又は凝集したＩｇＧと相互作用する。
【０００６】
多くの状況において、免疫グロブリンのＦｃ領域によって媒介される結合及びエフェクター機能の刺激は、非常に有益であるが、場合によっては、エフェクター機能は疾患の抗体介在治療中に有害作用をもたらし得る。これは、薬物（例えば、毒素及び同位体）を標的細胞に送達するように設計された抗体について特に当てはまり、そこではＦｃ／ＦｃγＲ媒介性エフェクター機能が健常な免疫細胞を致死的ペイロードの近傍に至らしめ、標的細胞と共に正常リンパ組織の枯渇をもたらす。他の場合、例えば、広範に発現する受容体とその同族リガンドとの相互作用を遮断することが目的である場合、免疫エフェクター細胞の動員は望まれない毒性をもたらす。また、治療抗体が多数のヒト組織にわたって無差別な結合を示す場合、エフェクター機能の誘導は有害事象及び毒性をもたらす。最後に、ＦｃγＲＩＩ受容体に対する親和性は、そのような抗体の重篤な副作用である、ＦｃγＲＩＩ受容体結合を介した血小板活性化及び凝集をもたらすことができる。
【０００７】
エフェクター機能を媒介することに加えて、モノクローナル抗体は、細胞シグナル伝達経路を誘導又は阻害することによって細胞機能を調節することができる。例えば、モノクローナル抗体は、抗原架橋を媒介し、死受容体を活性化し（例えば、受容体のオリゴマー化を促進するか、又はリガンド結合を模倣することによって）、かつ細胞増殖分化及び／又は増殖経路におけるリガンド媒介性細胞シグナル伝達を遮断する（例えば、Ludwig et al, Oncogene (2003) 22: 9097- 9106を参照）。アポトーシス又はプログラム細胞死は、幾つかの異なる機序によってトリガーされ得る。例えば、細胞膜結合「細胞死受容体」、例えば腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーを介するシグナル伝達経路の活性化は、直接細胞死の誘導につながり得る。同様に、表面抗原、例えばＣＤ２０の二量体化又は架橋も、直接細胞死を誘導し得る（例えば、Ludwig et al, Oncogene (2003) 22: 9097-9106を参照）。例えば、ＩｇＧ型抗体の可変ドメインの配向が、直接細胞死の抗体媒介性誘導に関して重要な役割を果たすようである。
【０００８】
ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとの間の界面は、保存されたアミノ酸を含む（例えば、Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8):188-190を参照）。接触領域は、「分子のボール・ソケットジョイント」と記載することができる。このジョイントは、ＣＨ１及びＣＬ領域に対するＶＨ領域及びＶＬ領域の「肘の動き」、及びいわゆる「肘角度」を決定し、Ｖ領域とＣ領域との間に剛性接触が形成されることを防止する（Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8): 188-190）。このボール・ソケットジョイントの「ソケット」は、ＶＨフレームワーク領域のアミノ酸残基によって形成され、「ボール」はＣＨ１ドメインのアミノ酸残基によって形成される。これらの位置におけるアミノ酸の相違は、Ｖ領域とＣ領域との間に形成される肘角度、ひいてはＶＨ−ＶＬ二量体の配向を決定することができる（Lesk and Chothia, Nature (1988) 335(8): 188-190を参照）。肘角度のコンフォメーション変化は、全体的な親和性を変化させることなく、抗体／抗原相互作用の結合挙動の有意な変化の原因となることが確認されている。
【発明の概要】
【０００９】
エフェクター機能を誘導する能力が低下し、直接細胞死を誘導する改変された能力を有する修飾抗体の非常に高い治療可能性を認識し、本発明者らは、そのような抗体及びそのような抗体の製造方法を開発した。とりわけ、この方法は、組換え体、キメラ抗体又はそのキメラ断片を産生することを含む。
【００１０】
ヒト治療の治療可能性が改善されたモノクローナル抗体が依然として必要とされている。モノクローナル抗体によるエフェクター機能の誘導を調節し、シグナル伝達経路を増強することは非常に困難であるが、限定されないが、エフェクター機能を制御しながら直接細胞死を誘導することを含む、細胞シグナル伝達に関連する抗原を調節することは、がん治療の改善のために非常に必要とされている。予期せぬことに、本発明者らは、点突然変異Ａｓｎ２９７Ａｓｐが、エフェクター機能の低減又は消失をもたらすが、ＡＤＣＰ機能の残存をもたらすことを見出した。本発明者らは更に、突然変異Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙもまた、エフェクター機能の低減又は消失をもたらすが、ＡＤＣＰ機能の残存をもたらし、かつＡｓｎ２９７Ａｓｐ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ突然変異が、予想外に、エフェクター機能の活性化に匹敵するユニークなパターンを示すことを見出した。驚くべきことに、この突然変異は、本明細書に開示された抗体の肘ヒンジ部分における突然変異と組み合わせて、直接細胞死の誘導の改変を導くことができる。組み合わせて、本明細書中に開示される修飾は、非修飾親抗体と比較して、直接細胞死の誘導及びエフェクター機能の選択的除去の調節を可能にする。
【００１１】
従って、本発明の一態様は、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含み、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ機能の大きな低減又は消失、ＡＤＣＰ機能の残存、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃ１ｑへの結合の低減又は消失、及び毒性の低減又は消失をもたらす抗体である。本発明の別の態様は、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体であり、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐである。本発明の別の態様は、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体であり、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記置換はＰｒｏ３２９Ｇｌｙである。本発明の更なる態様は、エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される、本明細書に記載の抗体である。
【００１２】
本発明の特定の態様では、前記親非置換抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。本発明の別の特定の態様では、親非置換抗体は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体である。本発明の更に別の特定の態様では、親非置換抗体は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である。本発明の好ましい態様では、親非置換抗体は、オビヌツズマブである。本発明の別の好ましい態様では、親非置換抗体は、リツキシマブである。
【００１３】
本発明の別の態様は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合が消失した、本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能が消失又は大きく低減した、本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合が低減した、本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能の誘導が低減した、本明細書に記載の抗体であり、ここで変異体重鎖を含む前記抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を保持する。本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＣＤＣ機能の誘導が、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるＣＤＣ機能と比較して大きく低減した、本明細書に記載の抗体である。本発明の別の態様は、親非置換抗体がアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合が消失した、本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能が消失又は大きく低減した、本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合が低減した、本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能の誘導が低減した、本明細書に記載の抗体であり、ここで変異体重鎖を含む前記抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を保持する。本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＣＤＣ機能の誘導が、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＣＤＣ機能と比較して大きく低減した、本明細書に記載の抗体である。
【００１４】
本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域が、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１を含み、かつ、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、本明細書に記載の抗体である。本発明の別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、本明細書に記載の抗体である。本発明の別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、本明細書に記載の抗体である。
【００１５】
本発明の別の態様は、Ｐｒｏ１５１がアラニン及びフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、本明細書に記載の抗体である。本発明の特定の態様は、Ｐｒｏ１５１がフェニルアラニンで置換されている本明細書に記載の抗体である。本発明の別の態様は、Ｐｒｏ１５１がアラニンで置換されている本明細書に記載の抗体である。
【００１６】
本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域が、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ｖａｌ１１を含み、かつ、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｖａｌ１１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、本明細書に記載の抗体である。本発明の別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、本明細書に記載の抗体である。本発明の別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、本明細書に記載の抗体である。
【００１７】
本発明の別の態様は、Ｖａｌ１１がアラニン、グリシン、フェニルアラニン、スレオニン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、本明細書に記載の抗体である。本発明の特定の態様は、Ｖａｌ１１がフェニルアラニン、スレオニン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、本明細書に記載の抗体である。本発明の特定の態様は、Ｖａｌ１１がアラニン及びグリシンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、本明細書に記載の抗体である。
【００１８】
本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体であって、その親非置換抗体の重鎖領域が、アミノ酸残基Ａｓｎ２９７及びＰｒｏ１５１を含み、前記変異体重鎖領域が親非置換重鎖領域に対するアミノ酸置換を含み、前記置換がＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、ここで、エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、前記変異体重鎖領域が、重鎖の位置Ｐｒｏ１５１に少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を含み、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、抗ＣＤ２０抗体である。本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体であって、その親非置換抗体の重鎖領域が、アミノ酸残基Ｐｒｏ３２９及びＰｒｏ１５１を含み、前記変異体重鎖領域が親非置換重鎖領域に対するアミノ酸置換を含み、前記置換がＰｒｏ３２９Ｇｌｙであり、ここで、エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、前記変異体重鎖領域が、重鎖の位置Ｐｒｏ１５１に少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を含み、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、抗ＣＤ２０抗体である。
【００１９】
本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体であって、その親非置換抗体の重鎖領域が、アミノ酸残基Ａｓｎ２９７及びＶａｌ１１を含み、前記変異体重鎖領域が親非置換重鎖領域に対するアミノ酸置換を含み、前記置換がＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、ここで、エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、前記変異体重鎖領域が、重鎖の位置Ｖａｌ１１に少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を含み、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、抗ＣＤ２０抗体である。本発明の更に別の態様は、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体であって、その親非置換抗体の重鎖領域が、アミノ酸残基Ｐｒｏ３２９及びＶａｌ１１を含み、前記変異体重鎖領域が親非置換重鎖領域に対するアミノ酸置換を含み、前記置換がＰｒｏ３２９Ｇｌｙであり、ここで、エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、前記変異体重鎖領域が、重鎖の位置Ｖａｌ１１に少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を含み、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、抗ＣＤ２０抗体である。
【００２０】
本発明の別の態様は、抗体がＣＤ２０に特異的に結合する、本明細書に記載の抗体である。本発明の特定の態様では、抗体は、スキャッチャード分析によって決定されるように、１０ｎＭ以下の、細胞に対する解離定数（Ｋｄ）でＣＤ２０に結合する。
【００２１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体の変異体重鎖領域をコードするポリヌクレオチドである。本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体の軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドである。本発明の更に別の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含むベクターである。本発明の別の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むポリシストロニックベクターである。本発明の別の態様は、本明細書に記載のベクター又はポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【００２２】
本発明の別の態様は、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養すること；（ｉｉ）培養培地から前記抗体を回収することを含む、本明細書に記載の抗体の製造方法である
【００２３】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。本発明の更に別の態様は、医薬としての使用のための本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の抗体である。
【００２４】
本発明の別の態様は、前記増殖性障害がＣＤ２０発現がんであることを特徴とする、本明細書に記載の増殖性障害の治療における使用のための本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、前記がんがリンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択されることを特徴とする、ＣＤ２０発現がんの治療における使用のための本明細書に記載の抗体である。本発明の更に別の態様は、前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択されることを特徴とする、本明細書に記載の自己免疫疾患の治療における使用のための本明細書に記載の抗体である。
【００２５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患を治療するための方法である。本発明の更に別の態様は、個体に本明細書に記載の抗体の有効量を投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法であって、前記増殖性障害がＣＤ２０発現がんである方法である。本発明の更に別の態様は、個体に本明細書に記載の抗体の有効量を投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法であって、前記がんが、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択される方法である。本発明の更に別の態様は、本明細書に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、自己免疫疾患を有する個体を治療する方法であって、前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＣＤ２０を発現するマントル細胞リンパ腫（Ｚ−１３８）を用いて、アネキシンＶ結合及びＰＩ染色によって測定した、ＣＤ２０抗体（オビヌツズマブ、リツキシマブ）Ｆｃ変異体による細胞死の誘導を決定した。Ｆｃ変異体（野生型、糖鎖操作型（ＧＥ）、Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ｄ）を、２１時間かけて１６ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの抗体濃度を用いて試験した。
【図２】抗体Ｆｃ変異体（野生型、糖鎖操作型（ＧＥ）、Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＮ２９７Ｄ）との４時間のインキュベーション後の腫瘍細胞溶解によって測定した、ＣＤ２０抗体（オビヌツズマブ、リツキシマブ）Ｆｃ変異体によるＡＤＣＣの誘導。  Ａ）ＦＡＣＳ分析によって測定された、抗体Ｆｃ変異体の存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によって誘導されるＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の溶解。  Ｂ）ＦＡＣＳ分析によって測定された、抗体Ｆｃ変異体の存在下でＰＢＭＣによって誘導されるＺ−１３８細胞の溶解。  Ｃ）抗ＣＤ１０７ａの結合及びフローサイトメトリーによって評価される、抗体Ｆｃ変異体の存在下でのＳＵ−ＤＨＬ−４細胞との共培養後のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の脱顆粒  Ｄ）抗ＣＤ１０７ａの結合及びフローサイトメトリーによって評価される、抗体Ｆｃ変異体の存在下でのＺ−１３８細胞との共培養後のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の脱顆粒
【図３】ＣＤ２０（オビヌツズマブ、リツキシマブ）Ｆｃ変異体によって誘導されたＣＤ２０発現腫瘍細胞のＣＤＣ依存性溶解を、ウサギ補体の存在下で抗体Ｆｃ変異体（野生型、糖鎖操作型（ＧＥ）、Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＮ２９７Ｄ）とのインキュベーション後に測定した。  Ａ）抗体Ｆｃ変異体の存在下での、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞のウサギ補体との２時間のインキュベーション後の腫瘍細胞溶解。  Ｂ）抗体Ｆｃ変異体の存在下での、Ｚ−１３８細胞のウサギ補体との２時間のインキュベーション後の腫瘍細胞溶解。  Ｃ）抗体Ｆｃ変異体の存在下での、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞のウサギ補体との２２時間のインキュベーション後の腫瘍細胞溶解。  Ｄ）抗体Ｆｃ変異体の存在下での、Ｚ−１３８細胞のウサギ補体との２２時間のインキュベーション後の腫瘍細胞溶解。
【図４】オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体（野生型、糖鎖操作型（ＧＥ）、Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＮ２９７Ｄ）によって誘導された健康なドナーからの全血におけるＢ細胞枯渇を、ＣＤ２０／ＣＤ１９陽性細胞を計数することによって測定した。ヒト全血を抗体変異体と共に２０時間インキュベートした。  Ａ）ドナー１からの全血におけるＦＡＣＳ分析によって測定したＢ細胞枯渇  Ｂ）ドナー２からの全血におけるＦＡＣＳ分析によって測定したＢ細胞枯渇
【図５】ヒトＭ１又はＭ２ｃエフェクター細胞の存在下での、オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体（野生型、糖鎖操作型（ＧＥ）及びＮ２９７Ｄ）によって誘導されたＡＤＣＰを、標的細胞との同時インキュベーション後にＦＡＣＳ分析によって測定した。  Ａ）抗体Ｆｃ変異体の存在下で、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞とヒトＭ１エフェクター細胞との４時間のインキュベーション後のＡＤＣＰ  Ｂ）抗体Ｆｃ変異体の存在下で、Ｚ−１３８細胞とヒトＭ１エフェクター細胞との４時間のインキュベーション後のＡＤＣＰ  Ｃ）抗体Ｆｃ変異体の存在下で、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞とヒトＭ２ｃエフェクター細胞との４時間のインキュベーション後のＡＤＣＰ  Ｄ）抗体Ｆｃ変異体の存在下で、Ｚ−１３８細胞とヒトＭ２ｃエフェクター細胞との４時間のインキュベーション後のＡＤＣＰ
【図６】４９日目まで、ＳＣＩＤｂｅｉｇｅマウスにおけるＳＣ  ＳＵ−ＤＨＬ−４腫瘍の誘導後の腫瘍体積の発達及び腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）値を測定した。腫瘍細胞接種後２１日目に、オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体（野生型、糖鎖操作型（ＧＥ）、Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ）））を用いた単独療法を開始し、１週間に１回の用量として４週間投与を続けた。
【図７】固定された抗Ｈｉｓ捕捉抗体を有するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で測定したＦｃγＲＩ結合。  Ａ）ハーセプチン、Ｐ−セレクチン及び５つの異なる濃度のオビヌスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ））の間で比較したＦｃγＲＩ結合  Ｂ）ハーセプチン、Ｐ−セレクチン及びオビヌツズマブＮ２９７Ｄとの間で比較したＦｃγＲＩ結合  Ｃ）オビヌツズマブ変異体Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ））のＦｃγＲＩ結合及び定常状態親和性  Ｄ）異なるヒトＩｇＧ変異体間で比較したＦｃγＲＩ結合
【図８】固定された抗Ｈｉｓ捕捉抗体を有するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で測定したＦｃγＲＩＩＩ結合。  Ａ）ハーセプチン、Ｐ−セレクチン及び５つの異なる濃度のオビヌスツズマブ（ＧＡ１０１）変異体Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ））の間で比較したＦｃγＲＩＩＩ結合  Ｂ）５つの異なる濃度のオビヌスツズマブ（ＧＡ１０１）変異体Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ））について比較したＦｃγＲＩＩＩ結合  Ｃ）異なるヒトＩｇＧ変異体間で比較したＦｃγＲＩＩＩ結合
【図９】固定された抗Ｈｉｓ捕捉抗体を有するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で測定したＦｃγＲＩＩ結合。  Ａ）異なるヒトＩｇＧ変異体間で比較したＦｃγＲＩＩ結合  Ｂ）異なるヒトＩｇＧ変異体間で比較したＦｃγＲＩＩ結合
【図１０】ＣＤ２０を発現するマントル細胞リンパ腫（Ｚ−１３８）を用いて、アネキシンＶ結合及びＰＩ染色によって測定した、ＣＤ２０抗体（オビヌツズマブ、ＧＡ１０１）Ｆｃ変異体による直接細胞死の誘導を決定した。  Ａ）ＧＡ１０１変異体（ＧＡ１０１−野生型、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ａ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｇ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｔ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｆ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｗ、ＧＡ１０１−Ｓｅｒ１１４ｄｅｌ、ＧＡ１０１−Ｓｅｒ１１４ｉｎｓ、ＧＡ１０１−Ｐ１５１Ａ、ＧＡ１０１−ＬＣ  １０８、ＧＡ１０１−Ｐ１５１Ｆ、ＧＡ１０１−ヒンジ  ｉｎｓ、ＧＡ１０１−ヒンジ  ｄｅｌ、ＧＡ１０１−Ｐ３２９Ｆ）を１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した。  Ｂ）ＧＡ１０１変異体（ＧＡ１０１−野生型、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ａ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｇ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｔ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｆ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｗ、ＧＡ１０１−Ｓｅｒ１１４ｄｅｌ、ＧＡ１０１−Ｓｅｒ１１４ｉｎｓ、ＧＡ１０１−Ｐ１５１Ａ、ＧＡ１０１−ＬＣ  １０８、ＧＡ１０１−Ｐ１５１Ｆ、ＧＡ１０１−ヒンジ  ｉｎｓ、ＧＡ１０１−ヒンジ  ｄｅｌ、ＧＡ１０１−Ｐ３２９Ｆ）を０．１μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した。  Ｃ）ＧＡ１０１  Ｆａｂ変異体（ＧＡ１０１−野生型、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｆ及びＧＡ１０１−Ｐ１５１Ｆ）及びＦａｂ／Ｆｃ変異体の組み合わせ（ＧＡ１０１−Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｆ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、ＧＡ１０１−Ｐ１５１Ｆ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＧＡ１０１−ヒンジ  ｄｅｌ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ）を直接細胞死の誘導について比較した；  Ｄ）双方ともにＧＡ１０１  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ骨格である、Ｆａｂ変異体（Ｖ１１Ｆ、Ｐ１５１Ｆ及びヒンジ  ｄｅｌ）及びＦａｂ変異体の組み合わせ（Ｖ１１Ｆ  Ｐ１５１Ｆ、Ｐ１５１Ｆ  ヒンジ  ｄｅｌ及びＶ１１Ｆ  Ｐ１５１Ｆ  ヒンジ  ｄｅｌ）を直接細胞死の誘導について比較した。
【図１１】オビヌツズマブ変異体（ＧＡ１０１−野生型、ＧＡ１０１−Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、ＧＡ１０１−Ｖ１１Ｆ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＧＡ１０１−Ｐ１５１Ｆ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ）によって誘導されたＢ細胞枯渇を、ＣＤ２０／ＣＤ１９陽性細胞を計数することによって測定した。ヒト全血を異なる濃度で、及び１日又は２日間、抗体変異体と共にインキュベートした。
【図１２】ＳＣＩＤｂｅｉｇｅマウスにおけるＧＡ１０１−Ｖ１１Ｆ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、ＧＡ１０１−Ｐ１５１Ｆ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＧＡ１０１−Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａの濃度−時間プロファイル。
【図１３Ａ−１３Ｂ】トリプトファン蛍光で測定した、ＧＡ１０１−Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ））、ＧＡ１０１−Ｐ３２９Ｇ、ＧＡ２０１−Ｎ２９７Ｄ（アグリコ（ａｇｌｙｃｏ））及びＧＡ２０１−Ｐ３２９Ｇの融解温度プロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の実施態様の詳細な記載
Ｉ．定義
用語は、以下及び本明細書で別に定義されない限り、本明細書中で一般的に当該技術分野で使用されるものとして使用される。
【００２８】
用語「重鎖」、「重鎖ドメイン」及び「重鎖領域」は、本明細書では互換的に使用され、本質的に、免疫グロブリン重鎖の重鎖、又は免疫グロブリン重鎖と比較して同じ機能性を保持するその断片からなるポリペプチド鎖を指す。本明細書及び特許請求の範囲において、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)のものである。Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、このアミノ酸残基番号付けシステムを任意の重鎖領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)によって可変ドメイン配列について規定された番号付けシステムを指す。本明細書では、特に明記しない限り、重鎖領域の残基番号１１への言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付け（Ｋａｂａｔ番号付け）を意味する。免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する場合には、「ＥＵ番号付け」システム又は「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」を使用することができる。ＫａｂａｔのＥＵインデックスはヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。残基の番号付けは、抗体の配列の相同性領域での「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けをされた配列とのアライメントにより、所定の抗体について決定することができる。本明細書で別段の記載がない限り、残基番号１５１及び２９７への言及は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)によって規定されたＥＵ番号付けシステムによる残基番号付け（ＥＵ番号付け）を意味する。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ番号付け又はＥＵ番号付け）に従って、特に１１位（Ｋａｂａｔ番号付け）、１５１位（ＥＵ番号付け）及び２９７位（ＥＵ番号付け）に番号が付けられた２つの抗ＣＤ２０抗体の例が本明細書に含まれる（配列番号０１、配列番号０２）。本明細書で特に明記しない限り、残基番号３２９への言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。
【００２９】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００３０】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書中に開示されるものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例示的な実施態様を本明細書に開示する。
【００３１】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の改変があり、かかる改変が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト活性」は、薬剤（例えば、抗原結合分子）が細胞表面に結合した分子と相互作用する（例えば、結合する）と、反応を開始又は誘導する、薬剤の活性を指すことを意図する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「改変された細胞シグナル伝達活性」とは、標的抗原の細胞シグナル伝達活性を誘導又は阻害する抗体の能力の増加又は減少を指すことを意図している。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「１つ以上の標的抗原の架橋の改変」とは、抗体が、互いにより近接する、かつ／又は他の膜結合分子とより近接する、かつ／又は（例えば、タンパク質の架橋又は膜結合受容体のオリゴマー化を介して）複合体を形成し、細胞シグナル伝達活性を開始させることができる相互作用標的抗原に対して、より好ましいコンフォメーションをもたらす能力の増加又は減少を指すことを意図している。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「直接細胞死の誘導の改変」とは、標的抗原の細胞シグナル伝達活性を誘導又は阻害する抗体の能力の増加又は減少を指すことを意図している。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「エフェクター機能の誘導の改変」又は「改変されたエフェクター機能」とは、エフェクター機能を誘導する抗体の能力の増加又は減少を指すことを意図している。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」は、参照配列（例えば、抗体などの親分子）における１つ以上のアミノ酸の置換を指すことを意図する。一実施態様では、アミノ酸置換は、例えば、親非置換配列と比較して、ポリペプチドをコードする核酸の配列中の点突然変異によって達成することができる。別の実施態様では、アミノ酸残基の置換は、親ポリペプチドのフレームワーク領域全体を、例えば親を参照して置換されるべき位置に所望のアミノ酸を含むＦｃ領域配列で置換することによって達成することができる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト活性」は、細胞上の分子と相互作用し（例えば、結合する）、反応の開始又は誘導を妨げるか、又は進行中の反応を中断するときの薬剤（例えば、抗原結合分子）の活性を指すことを意図する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに結合特異性を保持する抗体断片、及び免疫グロブリンの重鎖領域に相当する領域を含み、かつ結合特異性を保持する融合タンパク質を含む全ての抗体分子を包含することを意図する。また、限定するものではないが、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、及びテトラボディーを含む、結合特異性を保持する「抗体断片」も包含される（例えば、Hudson and Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)を参照。これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。また、ヒト化抗体、霊長類化抗体及びキメラ抗体も包含される。本明細書で使用される場合、「全抗体」とは、２つの「重鎖」及び２つの「軽鎖」を含み、それらの各々が可変及び定常領域を含む免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用される場合、用語「修飾された抗体」は、重鎖可変領域及び／又はＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸残基置換、及び／又は軽鎖可変領域及び／又はＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸残基置換、及び／又はＦｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体を指すことを意図する。
【００４０】
目的の抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的と「結合する」抗体は、その抗体が、抗原を発現する細胞又は組織を標的とする際の治療剤として有用であり、他のタンパク質とは有意に交差反応しないように、十分な親和性で抗原に結合するものである。このような実施態様では、抗体と「非標的」タンパク質との結合度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定した場合、抗体とその特定の標的タンパク質との結合の約１０％未満であろう。標的分子への抗体の結合に関しては、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチド又はエピトープに「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、結合活性を有さない類似の構造の分子であるコントロール分子の結合と比較した分子の結合を測定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似するコントロール分子、例えば過剰の非標識標的との競合によって決定することができる。この場合、特異的結合は、プローブとの標識標的の結合が、過剰な非標識標的により競合的に阻害される場合に示される。本明細書で使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的である」といった用語は、例えば、約１０−４Ｍ以下、あるいは約１０−５Ｍ以下、あるいは約１０−６Ｍ以下、あるいは約１０−７Ｍ以下、あるいは約１０−８Ｍ以下、あるいは約１０−９Ｍ以下、あるいは約１０−１０Ｍ以下、あるいは約１０−１１Ｍ以下、あるいは約１０−１２Ｍ以下又はそれ以下の、標的に対するＫｄを有する分子によって示され得る。一実施態様では、用語「特異的結合」は、分子が特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド上のエピトープに、実質的に任意の他のポリペプチド若しくはポリペプチドエピトープにも結合することなく結合することを指す。
【００４１】
用語「抗ＣＤ２０抗体」及び「ＣＤ２０に特異的に結合する抗体」は、ＣＤ２０を標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＣＤ２０に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体の、無関係な、非ＣＤ２０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＣＤ２０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体は、スキャッチャード分析によって測定される場合、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、異なる種由来のＣＤ２０の間で保存されているＣＤ２０のエピトープに結合する。抗ＣＤ２０抗原への抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性に応じて、抗ＣＤ２０抗体の２つの型（Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体）がCragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052により区別され得る。表１を参照のこと。
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【００４２】
Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の１つの本質的な特性は、それらの結合様式である。従って、Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブと比較して、前記抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６）上のＣＤ２０に対する結合能の比によって分類することができる。
【００４３】
「直接細胞死を誘導する」又は「アポトーシスを誘導する」又は「アポトーシス様の直接細胞死を誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成（アポトーシス小体と呼ばれる）により決定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。細胞は通常、ＣＤ２０ポリペプチドを発現する細胞である。好ましくは、細胞は腫瘍細胞である。より好ましくは、細胞は、自己免疫に関与する悪性Ｂ細胞又はＢ細胞などの造血細胞である。直接細胞死に関連づけられる細胞事象を評価するために様々な方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転位置は、アネキシン結合によって測定することができる。
【００４４】
「細胞死を誘導する」抗体は、生細胞を育成不能にする抗体である。細胞は、ＣＤ２０ポリペプチドを発現する細胞であり、ＣＤ２０ポリペプチドを特異的に発現若しくは過剰発現する細胞型である。細胞は、特定の細胞型のがん性細胞又は正常細胞でよい。細胞は、自己免疫に関与する正常なＢ細胞であり得る。細胞はがん細胞であってもよい。好ましくは、細胞は悪性Ｂ細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死は、エフェクター機能によって誘導される細胞死を区別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で決定される。このように、細胞死のアッセイは、熱不活性化血清を用いて（すなわち、補体の非存在下で）、かつ免疫エフェクター細胞の非存在下で実行され得る。抗体が細胞死を誘導することができるかどうかを決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)参照）又は７−ＡＡＤの取り込みにより評価される膜完全性の喪失を、非処理細胞と比較して評価することができる。
【００４５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害が改変された抗体」（「ＡＤＣＣ」）とは、当業者に周知の任意の適切な方法によって決定されるような改変されたＡＤＣＣを有する、本明細書で定義される用語のような抗体を意味する。一つの許容されるｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイは、次の通りである：
１）アッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが既知である標的細胞を使用する；
２）アッセイは、エフェクター細胞として、無作為に選ばれた健常なドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）アッセイは、次のプロトコールに従って実施される：
ｉ）標準的な密度遠心分離手順を使用してＰＢＭＣを単離し、５ｘ１０６細胞／ｍｌでＲＰＭＩ細胞培養培地に懸濁させる；
ｉｉ）標準的な組織培養法により標的細胞を増殖させ、生存率が９０％を越える指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地に再懸濁させる；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終標的細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を細胞培養培地で４０００ｎｇ／ｍから０．０４ｎｇ／ｍｌに連続希釈し、５０マイクロリットルの得られた抗体溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に添加し、上記の全濃度範囲をカバーする様々な抗体濃度を３重に試験する。
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールに対して、標識された標的細胞を含むプレート中の更なる３つのウェルに、抗体溶液（上記のｉｖ項）に代えて、５０マイクロリットルの非イオン性洗浄剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の２％（ＶＮ）水溶液を添加する；
ｖｉ）自然放出（ＳＰ）コントロールに対して、標識された標的細胞を含むプレート中の更なる３つのウェルに、抗体溶液（上記のｉｖ項）に代えて、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を添加する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを５０ｘｇで１分間遠心分離し、１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）エフェクター：標的細胞の比率が２５：１となるように各ウェルに５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記のｉ項）を添加して、該プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４時間インキュベーター内に配置する；
ｉｘ）各ウェルから無細胞の上清を回収し、ガンマカウンターを使用して、実験的に放出された放射能（ＥＲ）を定量する；
ｘ）特異的溶解の百分率を、各抗体濃度について、式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００［式中、ＥＲはその抗体濃度について定量された平均放射活性（上記ｉｘ項参照）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記ｖ項参照）について定量された平均放射活性（上記ｉｘ項参照）であり、ＳＲはＳＲコントロール（上記ｖｉ項参照）について定量された平均放射活性（上記ｉｘ項参照）である］に従って計算する。
４）「増加したＡＤＣＣ」は、本明細書中で試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大百分率の増加、及び／又は本明細書中で試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大百分率の半分を達成するのに必要な抗体濃度の減少の何れかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、同じ標準的な産生、精製、製剤化、及び貯蔵方法（これらは当業者に周知である）を用いて、但し本明細書に開示されるアミノ酸置換又は糖鎖工学によって修飾されていない、同じ型の宿主細胞により産生される同じ抗体によって媒介され、上記アッセイにより測定される、ＡＤＣＣに対して相対的なものである。従って、「減少したＡＤＣＣ」は、本明細書中で試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大百分率の減少、及び／又は本明細書中で試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大百分率の半分を達成するのに必要な抗体濃度の増加の何れかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化、及び貯蔵方法（これらは当業者に周知である）を用いて、但し本明細書に開示されるアミノ酸置換又は糖鎖工学によって修飾されていない、同じ型の宿主細胞により産生される同じ抗体によって媒介され、上記アッセイにより測定される、ＡＤＣＣに対して相対的なものである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「アポトーシス」は、核断片化及び／又は細胞質、原形質膜及び／又は細胞小器官の凝縮によるアポトーシス小体の形成などの特定の細胞事象を特徴とするプログラム細胞死を指すものとする。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「結合」又は「特異的に結合する」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、腫瘍抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、精製された野生型抗原を含むプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）であり得る。抗ＣＤ２０抗体の場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは好ましくはスキャッチャード分析である。結合の親和性は、用語ＫＤによって定義される。結合又は特異的結合は、１０−８Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、より好ましくは１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【００４８】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＣＤ２０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＣＤ２０を指す。その用語は、「全長」で未処理のＣＤ２０、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ２０を含む。その用語はまた、ＣＤ２０の天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を含む。ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５及びＬＦ５としても知られており；配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ１１８３６によって特徴付けられる）は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置する分子量がおよそ３５ｋＤの疎水性膜貫通タンパク質である（Valentine, M.A. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568）。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られている、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンスプライス境界によって特徴付けられ、造血細胞及び非リンパ系組織間で独特の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発達及び分化に参画するＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中でも１１ｑ１２に局在する。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする２つの転写変異体を生じる。用語「ＣＤ２０」及び「ＣＤ２０抗原」は、本明細書において区別せずに使用され、細胞により天然に発現されたか又はＣＤ２０遺伝子でトランスフェクトされた細胞上に発現したヒトＣＤ２０の任意の変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含む。本発明の抗体のＣＤ２０抗原への結合は、ＣＤ２０を介してシグナル伝達すること、ＣＤ２０を不活性化すること、又はＣＤ２０を架橋することによる、ＣＤ２０を発現する細胞の死滅を媒介する。好ましくは、細胞は腫瘍細胞である。ＣＤ２０を発現する細胞の死滅は、以下の機序の一又は複数により生じ得る：直接細胞死／アポトーシス誘導、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ。当該技術分野で認識されているＣＤ２０の同義語は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５を含む。
【００４９】
本明細書において使用される用語「ＣＤ２０発現がん」は好ましくは、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病を指す。このようなリンパ腫及びリンパ性白血病は、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）、辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、大細胞型リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺性Ｂ細胞性リンパ腫を含む）、ヘアリー細胞白血病、リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキン病を含む。より好ましくは、ＣＤ２０発現がんという用語は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を指す。
【００５０】
用語「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、補体存在下での本発明の抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解を意味する。ＣＤＣは、好ましくは、補体の存在下で、本発明による抗ＣＤ２０抗体を用いてＣＤ２０発現細胞の調製物を処理することにより測定される。ＣＤＣは、抗体が、１００ｎＭの濃度で４時間後に２０％以上の腫瘍細胞の溶解（細胞死）を誘導する場合に見出される。アッセイは、好ましくは５１Ｃｒ又はＥｕで標識した腫瘍細胞及び放出された５１Ｃｒ又はＥｕの測定により実行される。コントロールには、腫瘍標的細胞の補体とのインキュベーションが含まれるが、抗体は含まれない。
【００５１】
典型的には、ＩｇＧ１アイソタイプのＩ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、特徴的なＣＤＣ特性を示す。互いに比較して、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体は増加したＣＤＣを有し（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は減少したＣＤＣを有する（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）。好ましくは、Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の両方がＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「細胞シグナル伝達機構」又は「細胞シグナル伝達活性」は、特定の細胞事象又は生物学的機能、並びに経路に沿った任意のシグナル伝達段階を導くシグナル伝達（例えば、シグナル伝達（signal transduction））経路全体を指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ１領域」は、可変領域に対してちょうどＣ末端であり、ヒンジ領域に対してＮ末端である免疫グロブリンの重鎖のドメインを指すことを意図する。ＩｇＧ型の免疫グロブリンにおいて、例えば、ＣＨ１は通常Ｋａｂａｔの位置１１４〜２２３によって定義される（Ｋａｂａｔ番号付け）。
【００５４】
当該技術分野で使用される及び／又は許容される用語の２つ以上の定義がある場合には、本明細書で使用する用語の定義は、明示的に反対の記載がない限り、そのような意味の全てを含むことが意図される。特定の例は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される隣接していない抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)及びChothia et al., J MoI Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、その定義は、互いに比較したときのアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すために何れかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
【００５５】
「保存的」アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的性質を有する別のアミノ酸で置換することによって、すなわち、保存的アミノ酸置換によって作製されたものであり、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性、及び／又は関与する残基のバルクサイズに基づいて作製され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み；正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。「置換」、「挿入」又は「欠失」は、好ましくは約１〜２０アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜４アミノ酸、最も好ましくは１アミノ酸の範囲である。許容される変異は、組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を系統的に作り、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって実験的に決定することができる。
【００５６】
「急性輸液反応」である「サイトカイン放出症候群」は、例えばＣＤ２０−抗体リツキシマブのような抗体注入の使用で生じる一般的な直接の合併症である。病因は、抗体がＴ細胞受容体に結合し、前記Ｔ細胞を活性化することを特徴とする。活性化されたＴ細胞によって放出されたサイトカインは、低血圧、発熱及び悪寒を特徴とする重症感染に見られるものと同様のある種の全身性炎症反応を生じる。サイトカイン放出症候群による死亡が報告されており、患者が水分過負荷であれば生命を脅かす肺水腫を引き起こす可能性がある。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「細胞傷害性剤」とは、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、かつ／又は細胞死若しくは細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されるものではないが、放射性同位体（２１１アスタチン、１３１ヨウ素、１２５ヨウ素、９０イットリウム、１８６レニウム、１８８レニウム、１５３サマリウム、２１２ビスマス、３２リン、２１２鉛、及びルテチウムの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（限定されるものではないが、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素等の毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）、及び以下に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗がん剤を含む。
【００５８】
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【００５９】
本明細書で使用する「エフェクター機能」又は「Ｆｃ媒介エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例としては、限定されるものではないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合親和性、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌を含む。本明細書中で使用される場合、エフェクター機能と関連して「低減した」という用語は、対応する親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、本発明により修飾された抗体によって誘導されるエフェクター機能の測定可能な低減を指す。エフェクター機能は、本明細書中に開示されるように、及び本明細書中に開示される実施例を参照して測定され得る。本明細書中で使用される場合、エフェクター機能と関連して「大きく低減した」、「消失した」及び「残存する」という用語は、対応する親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、本発明に従って修飾された抗体によって誘導される命名されたエフェクター機能の低減を指すと考えられる。対応する親非置換抗体によって誘導されるそれぞれのエフェクター機能と比較して、「大きく低減した」とは５０％以下に低減したことを意味し、「消失した」とは１０％以下に低減したことを意味し、「残存」とは１０％以上を意味する。従って、本発明のＦｃ変異体を含む本発明の抗体は、以下の特性のうちの少なくとも１つ以上を含む：ＡＤＣＣの低減又は消失、ＣＤＣの低減又は消失、ＡＤＣＰの低減又は消失、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃｌｑへの結合の低減又は消失、及び急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失。１つの好ましい実施態様では、抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む該抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能は、親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して低減され、変異体重鎖領域を含む該抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能の１０％超が、親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して保持されている。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「操作する（engineer）、操作された（engineered）、操作すること（engineering）、糖鎖操作する（glycoengineer）、糖鎖操作された（glycoengineered）、糖鎖工学（glycoengineering）」、「グリコシル化操作（glycosylation engineering）」及び「ＧＥ」は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド（例えば、抗体又はその断片）のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと考えられる。グリコシル化操作には、細胞内で発現される糖タンパク質のグリコシル化の改変を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝操作が含まれる。一実施態様では、グリコシル化操作はグリコシルトランスフェラーゼ活性の改変である。特定の実施態様では、操作はグルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の改変をもたらす。
【００６１】
用語「ＣＤ２０抗原の発現」は、細胞中、好ましくは、腫瘍又はがん（好ましくは非固形腫瘍）にそれぞれ由来する、好ましくはＴ又はＢ細胞（より好ましくはＢ細胞）の細胞表面上における、ＣＤ２０抗原の発現の有意なレベルを示すことが意図される。「ＣＤ２０発現がん」を有する患者は、当該技術分野において知られている標準的なアッセイにより決定することができる。用語「ＣＤ２０抗原の発現」はまた、自己免疫疾患において、細胞、好ましくはＴ細胞又はＢ細胞、より好ましくはＢ細胞の細胞表面上におけるＣＤ２０抗原の有意なレベルの発現を示すことが意図されている。ＣＤ２０抗原発現は、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出、ＦＡＣＳを使用して、又は対応するｍＲＮＡのＰＣＲに基づく検出を介して測定することができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指すことが意図される。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸長すると定義される。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃ媒介性細胞傷害」は、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）及びヒトＦｃ領域を含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質によって媒介される細胞性細胞傷害を含む。これは、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「抗体標的化細胞」の溶解を導く免疫機構であり、ここでヒト免疫エフェクター細胞は、それらが抗体又はＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域に結合してエフェクター機能を果たすＦｃ受容体をその表面に提示する白血球の集団である。そのような集団には、限定されないものの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれ得る。抗体標的細胞は、抗体又はＦｃ融合タンパク質によって結合された細胞である。抗体又はＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域のＮ末端のタンパク質部分を介して標的細胞に結合する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「融合」及び「キメラ」は、抗体などのポリペプチドに関連して使用される場合、異なる種由来の抗体の部分のような、２つ以上の異種ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。キメラ抗体については、例えば、非抗原結合成分は、チンパンジー及びヒトのような霊長類を含む広範囲の種に由来し得る。キメラ抗体の定常領域は、天然ヒト抗体の定常領域と実質的に同一であることが最も好ましく；キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくは、目的の抗原に特異的に結合する非ヒト（すなわち、ドナー）抗原結合分子に由来する。キメラ抗体は、ドナー可変領域全体を含み得る；あるいは、キメラ抗体は、ヒト化抗体又は霊長類化抗体を含み得る。ヒト化抗体は、融合又はキメラ抗体の特に好ましい形態である。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから改変又は変更されたものである。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を作製するための方法は、現在当技術分野で周知の一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照のこと。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「重鎖可変領域」は、免疫グロブリン重鎖のＮ末端ドメインを指すことを意図する。一例では、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔの１位〜１１３位によって定義される（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)によって指定されるような特定の残基での可能な挿入を伴う）。本発明の一実施態様によれば、修飾された抗体は、重鎖可変領域の機能的断片を含むことができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメインを指すことを意図する。重鎖定常領域の５つの天然に存在するクラス：ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＭがある。一例において、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
【００６７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3のサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループＩＩＩである。
【００６８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又は本明細書に開示される、ヒト抗体を製造するための任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生成することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能な方法は、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載の方法である。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)にも開示される。ヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を産生するように改変されているが、内因性遺伝子座は無効にされているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに、抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術について米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号に開示される）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関しては、例えばLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)を参照されたい。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化」は、非ヒト抗原結合分子に由来する抗原結合分子、例えば、親分子の抗原結合特性を保持するか、又は実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性が低いマウス抗体を指すために使用される。これは、（ａ）キメラ抗体を生成するために非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域上に移植すること、（ｂ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要なもの）の保持を伴うか又は伴わないで、ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様セクションで「覆う」ことを含む、様々な方法によって達成することができる。そのような方法は、Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sd., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol, 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)に開示され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのそれぞれには、一般に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が存在し、それらには抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのそれぞれにおいて４つのフレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）が隣接している：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ヒト化抗体の議論は、とりわけ、米国特許第６，６３２，９２７号及び公開された米国出願第２００３／０１７５２６９号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書で使用される場合、用語「霊長類化」は、非霊長類抗原結合分子に由来する抗原結合分子、例えば、親分子の抗原結合特性を保持するか、又は実質的に保持するが、霊長類において免疫原性が低いマウス抗体を指すために使用される。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、本発明の核酸配列に「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」核酸は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性した剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートすることでハイブリダイズし、その後約６５℃で０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄したポリヌクレオチドを指す
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明のポリペプチド及び抗原結合分子を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を包含する。宿主細胞は、限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｙ０骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞を含む培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。一実施態様では、宿主細胞は、修飾されたグリコフォームを有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作される。好ましい実施態様では、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、又は融合タンパク質である。
【００７２】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００７３】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００７４】
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価方法の概説は、とりわけ、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)に開示される。
【００７５】
「単離された核酸」は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００７６】
「抗ＣＤ２０抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数の核酸分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞において一又は複数の位置に存在するこのような核酸分子が含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に開示されている。
【００７８】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００７９】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の「軽鎖」と２つの同一の「重鎖」からなる約１５０’０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、これには３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの何れかに割り当てることができる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８１】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「親抗体」又は「親非修飾抗体」又は「親非置換抗体」という用語は、ポリヌクレオチド配列によってコードされる特定のアミノ酸配列を有する抗体を指す。親分子の配列（すなわち、「親配列」）は、結果として得られる分子の、エフェクター機能を誘導し、及び／又はシグナル伝達活性及び／又は抗原の架橋を誘導する能力を改変するアミノ酸残基置換を行うための参照配列となる。同様に、親分子（例えば、「親非置換抗体」）の活性は、置換がエフェクター機能及び／又は細胞シグナル伝達活性及び／又は抗原の架橋に効果を有するかどうか、及び該当する場合、その効果の程度を決定する場合にその基準となる。
【００８３】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的製剤の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されなるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
【００８４】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、天然又は非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などは定義内に含まれる。全長タンパク質及びその断片の両方がこの定義に包含される。これらの用語はまた、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、及びリン酸化を含む、ポリペプチドの翻訳後修飾も含む。
【００８５】
更に、本明細書中の「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する単一又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加及び置換などの修飾されたタンパク質をも指す。例えば、セリン残基を置換して単一の反応性システインを除去するか、又はジスルフィド結合を除去するか、又は保存的アミノ酸置換を行って切断部位を除去することができる。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を介するなど計画的であり得るか、又はタンパク質を産生する宿主の突然変異のように偶然的であり得るか、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に起因する誤差であり得る。
【００８６】
「リツキシマブと比較した、抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６）上ＣＤ２０に対する結合能の比」は、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６）を有するＦＡＣＳＡｒｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、Ｃｙ５とコンジュゲートした前記抗ＣＤ２０抗体及びＣｙ５とコンジュゲートしたリツキシマブを用いて、直接的免疫蛍光測定により決定され（平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定する）、次のように計算される：
Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ２０に対する結合能の比（ＡＴＣＣ−番号ＣＣＬ−８６）＝
2019517991.tif 000003
ＭＦＩは平均蛍光強度である。本明細書で使用される「Ｃｙ５標識率」とは、抗体１分子あたりのＣｙ５標識分子数を意味する。
【００８７】
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、或いは宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体など、組換え手段により調製、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体を含むことが意図される。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態の、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞超変異に供されている。従って、組換え抗体のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列配列に由来し、かつそれらに関連しているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しないであろう配列である。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【００８９】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称することができる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称することができる。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含む。
【００９０】
本明細書で用いられる「変異体タンパク質」、「タンパク質変異体」又は「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親タンパク質のタンパク質とは異なるタンパク質を意味する。変異体は、タンパク質自体、そのポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ配列を指す。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有し、例えば親と比較して、約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。本明細書に開示されるタンパク質の変異体配列は、好ましくは親タンパク質配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。変異体タンパク質は、変異体タンパク質それ自体、タンパク質変異体を含む組成物、又はそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。従って、本明細書で使用する「抗体変異体（antibody variant）」、「変異体抗体（variant antibody）」又は「変異体重鎖領域（variant heavy chain region）」とは、限定されるものではないが、アミノ酸置換、欠失又は挿入を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親抗体とは異なる抗体又は抗体の一部を意味する。本明細書で使用する「ＩｇＧ変異体（IgG variant）」又は「変異体ＩｇＧ（variant IgG）」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親ＩｇＧとは異なる抗体を意味し、本明細書で使用する「免疫グロブリン変異体（immunoglobulin variant）」又は「変異体免疫グロブリン（variant immunoglobulin）」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親免疫グロブリン配列のものと異なる免疫グロブリン配列を意味する。
【００９１】
本発明の文脈において、用語「変異体（variant）」は、用語「変異した（mutated）」と互換的に用いられる。従って、本明細書で使用する「抗体変異体（antibody mutant）」、「変異した抗体（mutated antibody）」又は「変異した重鎖領域（ｍutaded heavy chain region）」とは、限定されるものではないが、アミノ酸置換、欠失又は挿入を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親抗体とは異なる抗体又は抗体の一部を意味する。本明細書で使用する「ＩｇＧ変異体（IgG mutant）」又は「変異したＩｇＧ（mutated IgG）」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親ＩｇＧとは異なる抗体を意味し、本明細書で使用する「免疫グロブリン変異体（immunoglobulin mutant）」又は「変異体免疫グロブリン（mutant immunoglobulin）」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親免疫グロブリン配列のものと異なる免疫グロブリン配列を意味する。
【００９２】
用語「可変ドメイン」との関連における用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントが抗体間で配列が大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸全長にわたって均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域で分離された１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲを含み、大部分がβシート構成をとり、３つの超可変領域により繋がっており、この３つの超可変領域はβシート構造と繋がり、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域はＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与といった、種々のエフェクター機能を呈する。
【００９３】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。同一又は類似のポリペプチドをコードする組換え変異体は、遺伝コード中の「重複性」を利用することによって合成又は選択することができる。プラスミド又はウイルスベクターへのクローニング、又は特定の原核若しくは真核系での発現を最適化するために、種々の制限部位を生み出すサイレント変化のような種々のコドン置換を導入することができる。リガンド結合親和性、鎖間親和性、又は分解／代謝回転速度などの特性を変化させるために、ポリヌクレオチド配列における突然変異が、ポリペプチド、又はポリペプチドの任意の部分の特性を改変するためにポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映され得る。
【００９４】
本明細書で使用する「野生型ポリペプチド」及び「野生型（ヒト）Ｆｃ領域」という用語は、導入されておらず、例えばコントロールとして機能を果たすので、本明細書中に開示されるＦｃ領域の修飾の１つ以上を欠くアミノ酸配列を含むポリペプチド及びＦｃ領域をそれぞれ指す。野生型ポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域又は既存のアミノ酸配列修飾（付加、欠失及び／又は置換など）を有するＦｃ領域を含み得る。
【００９５】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５つの点変異を含み得るということ以外は、同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。
【００９６】
特定の事項として、任意の特定の核酸分子又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的な一致を決定する好ましい方法は、グローバル配列アライメントとも呼ばれ、Brutlag et al, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントでは、クエリー配列及び対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果はパーセント同一性である。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメーターは、マトリクス＝ユニタリ、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象ヌクレオチド配列の何れか短い方。
【００９７】
対象配列が、内部欠失のためではなく、５’又は３’欠失のためにクエリー配列よりも短い場合、結果を手動で修正する必要がある。これは、パーセント同一性を計算する場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは対象配列の５’又は３’切断を考慮しないためである。クエリー配列に対して５’又は３’末端で切断された対象配列については、一致していない／整列していない対象配列の５’及び３’であるクエリー配列の塩基数を、クエリー配列の全塩基のパーセントとして計算することによりパーセント同一性を補正する。ヌクレオチドが一致／整列しているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、指定されたパラメーターを用いて本明細書に開示されるＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性から差し引かれ、最終パーセント同一性スコアに到達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって表示されるように、クエリー配列と一致していない／整列していない、対象配列の５’及び３’塩基の外側の塩基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために計算される。
【００９８】
例えば、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリー配列に整列され、パーセント同一性が決定される。欠失は、対象配列の５’末端で起こり、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対塩基は、配列の１０％（一致しない５’及び３’末端の塩基の数／クエリー配列中の塩基の総数）を表し、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致した場合、最終のパーセント同一性は９０％であろう。別の例では、９０塩基の対象配列を１００塩基のクエリー配列と比較する。今回は、欠失は内部欠失であるため、クエリーと一致／整列していない対象配列の５’又は３’末端に塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は手動で修正されない。再び、クエリー配列と一致／整列していない対象配列の５’及び３’末端の塩基のみが手動で補正される。本発明の目的のために、他の手動補正は行われない。
【００９９】
本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列の１００個のアミノ酸ごとに最大５個のアミノ酸の改変を含み得ることを除いて、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、クエリー配列と同一であることが意図される。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基の５％までが挿入され、欠失され、又は他のアミノ酸で置換されていてもよい。参照配列のこのような改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において散在して生じ得る。
【０１００】
実際問題として、特定のポリペプチドが参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的な一致を決定する好ましい方法は、グローバル配列アライメントとも呼ばれ、Brutlag et al, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列アライメントでは、クエリー配列及び対象配列は、両方のヌクレオチド配列又は両方のアミノ酸配列の何れかである。前記グローバル配列アラインメントの結果はパーセント同一性である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメーターは、マトリクス＝ＰＡＭ  ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝Ｏ、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の何れか短い方。
【０１０１】
対象配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端又はＣ末端の欠失のためにクエリー配列よりも短い場合、結果を手動で修正する必要がある。これは、グローバル・パーセント同一性を計算する場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは対象配列のＮ末端又はＣ末端の切断を考慮しないためである。クエリー配列に対してＮ末端又はＣ末端で切断された対象配列については、対応する対象残基と一致していない／整列していない対象配列のＮ末端又はＣ末端であるクエリー配列の残基数を、クエリー配列の全塩基のパーセントとして計算することによりパーセント同一性を補正する。残基が一致／整列しているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、指定されたパラメーターを用いて本明細書に開示されるＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性から差し引かれ、最終パーセント同一性スコアに到達する。この最終のパーセント同一性スコアが、本発明の目的のために使用されるものである。クエリー配列と一致していない／整列していない、対象配列のＮ末端及びＣ末端の残基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、クエリー残基は、対象配列の最も遠いＮ末端残基及びＣ末端残基の外側に位置する。
【０１０２】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、１００残基のクエリー配列と整列され、パーセント同一性が決定される。欠失は、対象配列のＮ末端で起こり、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対残基は、配列の１０％（一致しないＮ末端及びＣ末端の残基の数／クエリー配列中の残基の総数）を表し、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終のパーセント同一性は９０％であろう。別の例では、９０残基の対象配列を１００残基のクエリー配列と比較する。今回は、欠失は内部欠失であるため、クエリーと一致／整列していない対象配列のＮ末端又はＣ末端に残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は手動で修正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢアラインメントに表示されるように、クエリー配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端又はＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。本発明の目的のために、他の手動補正は行われない。
【０１０３】
ＩＩ．発明による実施態様
本発明による修飾された抗体
ヒト治療の治療可能性が改善されたモノクローナル抗体が依然として必要とされている。エフェクター機能を低減させつつ直接細胞死の誘導を強制することが、がん治療の改善のために切望されている。予期しないことに、本発明者らは、本明細書に開示されるようなＦｃ領域におけるＡｓｎ２９７Ａｓｐ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙの置換がＣＤＣ及びＡＤＣＣ機能を大きく低減させるが、残存するＡＤＣＰ機能を保持することを見出した。更に驚くべきことに、この突然変異は、本発明による肘ヒンジ領域の突然変異と組み合わせて、直接細胞死誘導の変化（増加又は低減）をもたらすことができる。組み合わせて、本発明による修飾は、非置換親抗体と比較して、エフェクター機能の誘導及び／又は直接細胞死の誘導の選択的かつ独立した調節を可能にする。
【０１０４】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｋａｂａｔの位置２９７でのアスパラギン残基の置換又はＫａｂａｔの位置３２９でのプロリン残基の置換がエフェクター機能の低減をもたらすことを見出した。より具体的には、位置２９７のアスパラギン残基のアスパラギン酸への置換、又はＫａｂａｔの位置３２９のプロリン残基のグリシンへの置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能を大きく低減させたが、ＡＤＣＰ機能は残存した。従って、一実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐである。更なる実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記置換はＰｒｏ３２９Ｇｌｙである。
【０１０５】
更なる態様は、エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される抗体が提供される。一態様では、本発明は、Ｆｃ領域にアミノ酸修飾を有する抗体であって、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含み、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ機能の大きな低減又は消失、ＡＤＣＰ機能の残存、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃ１ｑへの結合の低減又は消失、及び毒性の低減又は消失をもたらす抗体が提供される。
【０１０６】
別の実施態様では、Ｆｃ変異体を含む前記抗体は、野生型ヒトＦｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲ）及び／又はヒト補体受容体に対して低減した親和性を示す。更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの少なくとも１つに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、本発明のなお更なる態様では、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩＩ受容体及びＣ１ｑに対する親和性が低減し、かつ、本発明のなお更なる態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＣ１ｑ受容体に対する親和性が低減している。
【０１０７】
親非修飾抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＥであるが、これらに限定されない）の何れかであり得る。特定の実施態様では、本発明の抗体は、抗体のＩｇＧクラスのメンバーである。特定の実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラスである。本発明の更に別の態様では、重鎖定常領域変異体及びＦｃ変異体を含む抗体は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。本発明のなお更なる態様では、変異体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である。特定の実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１サブクラスであり、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、残基はＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従って番号付けされる。更に特定の実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１サブクラスであり、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、残基はＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従って番号付けされる。別の特定の実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１サブクラスであり、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、変異体重鎖領域は、Ｆｃ領域のアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含む。別の特定の実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１サブクラスであり、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、変異体重鎖領域は、Ｆｃ領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む。一実施態様では、アミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む本発明の抗体は、トリプトファン蛍光によって測定されるように、アミノ酸残基Ａｓｎ２９７でのアミノ酸置換を含む親非置換抗体の変異体と比較して、より高い融解温度を有する。一実施態様では、アミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む本発明の抗体は、トリプトファン蛍光によって測定されるように、Ａｓｎ２９７Ａｓｐ置換を含む親非置換抗体の変異体と比較して、より高い融解温度を有する。
【０１０８】
本発明による親非置換抗体には、限定されないものの、モノクローナル抗体が含まれる。一態様では、本発明の抗体は、いわゆるキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。更なる態様では、本発明の抗体は、全長抗体又は同じ生物学的活性を有する抗体断片であり、アミノ酸配列変異体及び／又はこのような抗体若しくは断片のグリコシル化変異体を含む。
【０１０９】
本発明による親非置換抗体には、限定されるものではないが、以下が含まれる。３Ｆ８（抗ＧＤ２）、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）（抗ＣＡ−１２５）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ））、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＮＦ−α）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）、アフェリモマブ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＴＮＦ−α）；アフツズマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）（抗ＶＥＧＦＲ２）、ＡＬＤ５１８（抗ＩＬ−６）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（Ｃａｍｐａｔｈ、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ５２）、アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ）、アナツモマブ（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＴＡＧ−７２）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）（ＩＭＡ−６３８、抗ＩＬ−１３）、アポリズマブ（Ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ６２Ｌ）、アトリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、アクテムラ（Ａｃｔｅｍｒａ）、ロアクテムラ、抗ＩＬ−６受容体）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗Ｒｈｅｓｕｓ因子）、バピノイズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）（抗ベータアミロイド）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（シムレクト（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、抗ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖））、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、抗ＣＤ２２）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）（Ｂｅｎｌｙｓｔａ、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ、抗ＢＡＦＦ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１２５）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＣＬｌｌ（エオタキシン１））、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）（Ｓｃｉｎｔｉｍｕｎ、抗ＣＥＡ関連抗原）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ、抗ＶＥＧＦ−Ａ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）（ＦｉｂｒｉＳｃｉｎｔ，抗フィブリンＩＩベータ鎖）、ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４４  ｖ６）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（ＢｉＴＥ、抗ＣＤ１９）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（ｃＡＣ１０、抗ＣＤ３０  ＴＮＦＲＳＦ８）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）（抗ＩＬ−１２、ＩＬ２３）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）（Ｉｌａｒｉｓ、抗ＩＬ−１）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）（Ｃ２４２、抗ＣａｎＡｇ）、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（レモバブ（Ｒｅｍｏｖａｂ）、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ３）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、セルトリズマブペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）（Ｃｉｍｚｉａ  抗ＴＮＦ−α）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＩＭＣ−Ｃ２２５、抗ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトキス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、シキスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４）、Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ（抗ＭＵＣ  ｌ）、クリバツズマブ（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＲ６２６１（抗インフルエンザＡ赤血球凝集素）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）、抗ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖））、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ３８，環状ＡＤＰリボース加水分解酵素）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）（プロリア（Ｐｒｏｌｉａ）、抗ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｂリンパ腫細胞）、ドルリモマブ（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ）、ドルリキシズマブ（Ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）（ソリリス（Ｓｏｌｉｒｉｓ）、抗Ｃ５）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）（抗ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）（パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、ＭＡｂｌ７−１Ａ、抗ＥｐＣＡＭ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）（ラプティバ（Ｒａｐｔｉｖａ）、抗ＬＦＡ−１（ＣＤ  １１ａ））、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）（マイコグラブ（Ｍｙｃｏｇｒａｂ）、抗Ｈｓｐ９０）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＳＬＡＭＦ７）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＩＬ−６）、エンリモマブペゴール（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）（抗ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４））、エピツモマブ（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２２）、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８））、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（レキソムン（Ｒｅｘｏｍｕｎ）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｂｅｇｒｉｎ、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ανβ３）、エキスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗Ｂ型肝炎表面抗原）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）（ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ、抗ＣＤ１５）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）（抗インターフェロン受容体）、
ファーレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（抗葉酸受容体１）、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）（抗呼吸器合胞体ウイルス）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）（抗ＩＬ−２２）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１受容体）、ホントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＦＮ−γ）、ホラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）（抗狂犬病ウイルス糖タンパク質）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＧＦ−β）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ８０）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）（抗ベータアミロイド）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ１４７（ｂａｓｉｇｉｎ））、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３３）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（抗炭酸脱水酵素９）、グレンバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＲ０１１、抗ＧＰＮＭＢ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）（Ｓｉｍｐｏｎｉ、抗ＴＮＦ−ａ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体））、イバリズマブ（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）（Ｉｎｄｉｍａｃｉｓ−１２５、抗ＣＡ−１２５）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）（Ｍｙｏｓｃｉｎｔ、抗心筋ミオシン）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、抗ＴＮＦ−α）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ５１）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖））、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２２）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ１５２）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、抗ＣＥＡ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−１３）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）（抗ＮＣＡ−９０（顆粒球抗原））、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＧＦβ２）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３３））、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）（抗Ｔ細胞受容体）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）（Ｂｏｓａｔｒｉａ、抗ＩＬ−５）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＧＦβ１）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ７４）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＴＡＧ−７２）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＢＥＣ−２、抗ＧＤ３ガングリオシド）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗アカゲザル因子）、モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）（Ｎｕｍａｘ、抗呼吸器合胞体ウイルス）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３、抗ＣＤ３）、ナコロマブ（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ）（抗Ｃ２４２）、ナプツモマブ（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）（抗５Ｔ４）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、抗インテグリンα４）、ネバクマブ（Ｎｅｂａｃｕｍａｂ）（抗エンドトキシン）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＴＮＦ−α）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）（Ｔｈｅｒａｃｉｍ、Ｔｈｅｒａｌｏｃ、抗ＥＧＦＲ）、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オズリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）（アフオリモマブ（Ａｆｏｌｉｍｏｍａｂ）、抗ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ））、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）（アーゼラ（Ａｒｚｅｒｒａ）、抗ＣＤ２０）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）（抗ＰＤＧＦ−Ｒα）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）（ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）、抗ＩｇＥ  Ｆｃ領域）、オポルツズマブ（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）（ＯｖａＲｅｘ、抗ＣＡ−１２５）、
オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３）、パギバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）（抗リポテイコ酸）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）、アボシナジス（Ａｂｂｏｓｙｎａｇｉｓ）、抗呼吸器合胞体ウイルス）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）（抗緑膿菌）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−４）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｔｈｅｒａｇｙｎ、抗ＭＵＣｌ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（Ｏｍｎｉｔａｒｇ、２Ｃ４、抗ＩＩＥＲ２／ｎｅｕ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗Ｃ５）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）（抗腺癌抗原）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ＰＲＯ  １４０（抗ＣＣＲ５）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（１Ｅ１０、抗（Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ、ＮＧＮＡ）−ガングリオシド  ＧＭ３））、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）（抗狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦＲ２）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）（ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、抗ＶＥＧＦ−Ａ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）（抗炭疽毒素、防御抗原）、レガビルマブ（Ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）（抗サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−５）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＨＧＦ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＭａｂＴｈｅｒａ、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）、抗ＣＤ２０）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１受容体）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＦＮ−ａ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）（ＬｅｕｋＡｒｒｅｓｔ、抗ＣＤ１１、ＣＤ１８）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）（Ａｎｔｏｖａ、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ））、サツモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＴＡＧ−７２）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）（抗サイトメガロウイルス）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＦＡＰ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＩＦＮ−ａ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＩＬ−６）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２）、（Ｓｍａｒｔ）ＭＩ９５（抗ＣＤ３３）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）（抗ベータアミロイド）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）（抗スフィンゴシン−１−リン酸）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）（抗エピシアリン）、スタムルマブ（ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）（抗ミオスタチン）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）（ＬｅｕｋｏＳｃａｎ、（抗ＮＣＡ−９０（顆粒球抗原）、タカツズマブ（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）（抗αフェトプロテイン）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）（抗インテグリンαＩＩｂβ３）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕ��ａｂ）（抗ＩｇＥ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）（抗ＮＧＦ）、タプリツモマブ（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ１９）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）（Ａｕｒｅｘｉｓ、（抗クランピング因子Ａ））、テリモマブ（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗ｔｅｎａｓｃｉｎ  Ｃ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３）、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８）、チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、（抗ＣＴＬＡ−４））、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（抗ＩＬ−１３）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、アクテムラ（Ａｃｔｅｍｒａ）、ロアクテムラ（ＲｏＡｃｔｅｍｒａ）、（抗ＩＬ−６受容体））、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ））、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ））、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＴＬＡ−４）、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）（抗ＥｐＣＡＭ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）（抗Ｂ型肝炎ウイルス）、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）（抗大腸菌）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）（ステラーラ（Ｓｔｅｌａｒａ）、抗ＩＬ−１２、ＩＬ−２３）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１））、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗インテグリンα４β７）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）（ヌヴィオン（Ｎｕｖｉｏｎ）、抗ＣＤ３）、ビタキシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）（抗血管インテグリンαｖ３）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）（抗インテグリンα５β１）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（ＨｕｍａＳＰＥＣＴ、抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、（抗ＥＧＦＲ））、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４、抗ＣＤ４）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４７（ｂａｓｉｇｉｎ））、ゾリモマブ（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ５）、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、アレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）（Ａｒｃａｌｙｓｔ）、１４Ｆ７（抗ＩＲＰ−２（鉄調節タンパク質２））、１４Ｇ２ａ（抗ＧＤ２ガングリオシド、国立がん研究所から、メラノーマ及び固形腫瘍用）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ、前立腺がん用にウェイル・コーネル・メディカル大学から）、２２５．２８Ｓ（抗ＨＭＷ−ＭＡＡ（高分子量メラノーマ抗原）、Ｓｏｒｉｎ  Ｒａｄｉｏｆａｒｒｎａｃｉ  Ｓ．Ｒ．Ｌ．（Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）、メラノーマ用）、ＣＯＬ−１（抗ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＧＭ１、米国国立がん研究所から、結腸直腸がん及び胃がん用に）、ＣＹＴ−３５６（Ｏｎｃｏｌｔａｄ（登録商標）、前立腺がん用）、ＨＮＫ２０（ＯｒａＶａｘ  Ｉｎｃ．呼吸器合胞体ウイルス用）、ＩｍｍｕＲＡＩＴ（ＮＨＬ用にＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓから）、Ｌｙｍ−１（抗ＨＬＡ−ＤＲ１０、がん用にＰｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍ．）、ＭＡＫ−１９５Ｆ（抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子；ＴＮＦＡ、ＴＮＦ−α；ＴＮＦＳＦ２）、Ａｂｂｏｔｔ／Ｋｎｏｌｌから、敗血症毒性ショック用）、ＭＥＤＩ−５００（Ｔ１０Ｂ９、抗ＣＤ３、ＴＲαβ（Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ）、複合体、移植片対宿主病用にＭｅｄｌｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃから）、ＲＩＮＧ  ＳＣＡＮ（抗ＴＡＧ  ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、乳がん、結腸がん及び直腸がん用にＮｅｏｐｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．から）、アビシジン（Ａｖｉｃｉｄｉｎ）（抗ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、抗ＴＡＣＳＴＤ１（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサ１）、抗ＧＡ７３３−２（消化管腫瘍関連タンパク質２）、抗ＥＧＰ−２（上皮糖タンパク質２）；抗ＫＳＡ（ＫＳ１／４抗原；Ｍ４Ｓ；腫瘍抗原１７−１Ａ；ＣＤ３２６、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん及びＮＨＬ用にＮｅｏＲｘ  Ｃｏｒｐ．から）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、ＮＪ）、Ｓｍａｒｔ  ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）、Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ、ＣＡ）、Ａｌｌｏｍｕｎｅ（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ、ＣＡ）、抗ＶＥＧＦ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＣＡ）；ＣＥＡｃｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ、ＮＪ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ＩｍＣｌｏｎｅ、ＮＪ）及びセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（ＩｍＣｌｏｎｅ、ＮＪ）。
【０１１０】
好ましい実施態様では、親非置換抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。そのような抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。また、好ましくは、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体からなる群より選択される。最も好ましい態様では、前記抗体は、全長抗ＣＤ２０抗体及び同じ生物学的活性を有する抗ＣＤ２０抗体断片からなる群から選択され、アミノ酸配列変異体及びこのような抗体若しくは断片のグリコシル化変異体を含む。本発明によるヒト化抗ＣＤ２０の親非置換抗体は、ＩＮＮ名リツキシマブ（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第７３８１５６０号及び欧州特許第２０００１４９（Ｂ１）号、例えば図４及び図５を参照）、オクレリズマブ（国際公開第２００４／０５６３１２号及び国際公開第２００６／０８４２６４号に開示される）、イブリツモマブ（国際公開第９４／０１１０２６号を参照）、トシツモマブ（WHO Drug Information, Vol. 12, No. 4, 1998, p.281）、ベルツズマブ（WHO Drug Information, Vol. 22, No. 3, 2008, p.28）及びオビヌツズマブ（推奨ＩＮＮ、WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453）と明記される。
【０１１１】
本発明による親非置換ＣＤ２０抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．及びＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＬｔｄによってＭＡＢＴＨＥＲＡ（商標）又はＲＩＴＵＸＡＮ（商標）の商品名で販売されているリツキシマブ（Ｉ型抗ＣＤ２０抗体）である。リツキシマブは、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラヒトガンマ１マウス定常ドメイン含有モノクローナル抗体である。このキメラ抗体は、ヒトガンマ１定常ドメインを含み、１９９８年４月１７日に発行され、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に譲渡された米国特許第５７３６１３７号（Ａｎｄｅｒｓｏｎら）での「Ｃ２Ｂ８」という名称で特定される。リツキシマブは、再発性又は難治性の低悪性度又は濾胞性のＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療用に承認されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用機序研究は、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すことを示している（Reff, M.E., et. al., Blood 83 (1994) 435-445）。加えて、リツキシマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて有意な活性を示す。リツキシマブはアフコシル化されていない。
【０１１２】
好ましい実施態様では、本発明による親非置換抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとのキメラ化及びその後のヒト化によって、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖の可変領域（ＶＨ）：配列番号３；マウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）：配列番号４）（Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3(1987) 131-139参照）から得られた、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されているようなヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指す（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号参照）。これらのヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号で詳細に開示されている。一実施態様では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号５から配列番号２１（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２からＢ−ＨＨ９及びＢ−ＨＬ８からＢ−ＨＬ１７）の群から選択される重鎖の可変領域（ＶＨ）を有する。特定の一実施態様では、このような可変ドメインは、配列番号５、６、９、１１、１３、１５及び１７（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１及びＢ−ＨＬ１３）からなる群より選択される。特定の一実施態様では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号２２（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）の軽鎖の可変領域（ＶＬ）を有する。特定の一実施態様では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、配列番号９（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ６）の重鎖の可変領域（ＶＨ）と配列番号２２（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）の軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを有する。更に一実施態様では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体はＩｇＧ１抗体である。本発明の一態様によれば、そのようなアフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、 Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号に記載の手順に従って、Ｆｃ領域において糖鎖操作（ＧＥ）されている。一実施態様では、本発明による親非置換抗体は、アフコシル化糖鎖操作（ＧＥ）ヒト化Ｂ−Ｌｙ１Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥである。好ましい実施態様では、本発明による親非置換抗体は、オビヌツズマブである（推奨ＩＮＮ、WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453）。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１と同義である。これは、以前の全てのバージョン（例： Vol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）に取って代わるものであり、以前はアフツズマブ（推奨ＩＮＮ、WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176;Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124）として知られている。
【０１１３】
好ましい実施態様では、親非置換抗体は、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体である。Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の１つの本質的な特性は、それらの結合様式である。特に、Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブと比較して、前記抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６）上のＣＤ２０に対する結合能の比によって分類することができる。Ｉ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブと比較して、前記抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６）上のＣＤ２０に対する結合能の比が０．８〜１．２、好ましくは０．９〜１．１である。好ましいＩ型親非置換抗ＣＤ２０抗体は、欧州特許第２０００１４９（Ｂ１）号（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、図４及び５を参照）におけるリツキシマブ、１Ｆ５  ＩｇＧ２ａ（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ；Press et al., Blood 69/2:584-591 (1987)）、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（国際公開第２００５／１０３０８１号に開示される）、２Ｆ２  ＩｇＧ１又はオファツムマブ（国際公開第２００４／０３５６０７号及び国際公開第２００５／１０３０８１号に開示される）及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０５６３１２号及び国際公開第２００６／０８４２６４号に開示される（表１と表２に開示された変異体を含むが、これに限定されない））を含む。好ましくは、前記Ｉ型親非置換抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。一実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含むＩ型抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される。好ましい実施態様では、親非置換抗体はリツキシマブである。
【０１１４】
別の好ましい実施態様では、親非置換抗体は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブと比較して、前記抗ＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６）上のＣＤ２０に対する結合能の比が０．３〜０．６、好ましくは０．３５〜０．５５、より好ましくは０．４〜０．５である。好ましいＩＩ型親非置換抗ＣＤ２０抗体は、オビヌツズマブ、トシツモマブ（Ｂ１  ＩｇＧ２ａ）、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開第２００５／０４４８５９号に開示のキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号に開示）及びＡＴ８０  ＩｇＧ１を含む。好ましくは、前記ＩＩ型親非置換抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である（国際公開第２００５／０４４８５９号に開示される）。更なる実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含むＩＩ型抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される。好ましい実施態様では、親非置換抗体はオビヌツズマブである。
【０１１５】
野生型ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。一般に、野生型ポリペプチドのＦｃ領域は、天然型又は野生型配列Ｆｃ領域、好ましくはヒト天然配列Ｆｃ領域（ヒトＦｃ領域）を含む。しかし、野生型ポリペプチドのＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域からの１つ以上の既存のアミノ酸配列の改変又は修飾を有し得る。例えば、Ｆｃ領域のＣｌｑ又はＦｃγ結合活性は、以前に改変されていてもよい（他のタイプのＦｃ領域の修飾が本明細書においてより詳細に記載される）。更なる実施態様では、親ポリペプチドＦｃ領域は「概念的」であり、それは物理的に存在しないものの、当業者は所望の変異体Ｆｃ領域アミノ酸配列を選択し、その配列を含むポリペプチド又は所望の変異体Ｆｃ領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡを生成する。しかし、本発明の好ましい実施態様では、野生型ポリペプチドのＦｃ領域（例えば、野生型重鎖領域）をコードする核酸が利用可能であり、この核酸配列は、Ｆｃ領域変異体をコードする変異体核酸配列を生成するように改変される。
【０１１６】
本発明の一実施態様は、Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、置換又は欠失を含み、結果として少なくとも１つのＦｃ受容体に対する親和性が低減又は消失する、抗体のＦｃ領域を含むポリペプチドを包含する。Ｆｃ領域は、限定されないが、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ）、補体タンパク質Ｃ１ｑ、並びにタンパク質Ａ及びＧのような他の分子を含む、多数の受容体又はリガンドと相互作用する。これらの相互作用は、限定されないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む、様々なエフェクター機能及び下流のシグナル伝達事象に必須である。従って、ある実施態様では、本発明の変異体は、本発明のＦｃ変異体を含むが、Ｆｃ領域への少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、置換、又は欠失を含まないポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチド（本明細書では「親非置換」ポリペプチド又は抗体とも呼ばれる）と比較して、エフェクター機能に関与するＦｃ受容体に対する親和性が低減又は消失している。特定の実施態様では、本発明のＦｃ変異体を含む抗体は、以下の特性のうちの少なくとも１つ以上を含む：エフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能の低減又は消失、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃｌｑへの結合の低減又は消失、及び急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失。より具体的には、本発明の実施態様は、抗ＣＤ２０（オビヌツズマブ又はリツキシマブと同じ）、抗ＣＤ９（ＴＡと同じ）、抗セレクチン（ｐＳｅｌ）、抗ＣＤ３７、抗ＨＥＲ２、及びＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ）に対する親和性が低減した抗ＥＧＦＲ抗体及び／又は補体タンパク質Ｃ１ｑを与える。
【０１１７】
一実施態様では、本発明の抗体は、位置Ａｓｎ２９７に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含み、ここで重鎖の番号付けシステムは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスの番号付けシステムである。特定の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖領域にアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここではエフェクター機能の誘導は、親非置換抗体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される。更なる実施態様では、本発明の抗体は、位置Ｐｒｏ３２９に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含み、ここで重鎖の番号付けシステムは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスの番号付けシステムである。特定の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖領域にアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここではエフェクター機能の誘導は、親非置換抗体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される。更なる実施態様では、前記抗体は、以下の特性のうちの少なくとも１つ以上を含む：エフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能の低減又は消失、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃｌｑへの結合の低減又は消失、及び急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失。
【０１１８】
従って、一実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して消失している。更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して、消失又は大きく低減している。更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して低減している。本発明の更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能の誘導は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して低減しており、変異体重鎖を含む抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を保持する。更に別の実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＣＤＣ機能の誘導は、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるＣＤＣ機能と比較して消失している。更なる実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記置換はＰｒｏ３２９Ｇｌｙであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合は、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して消失している。更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここでは変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能が、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して、消失又は大きく低減している。更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここでは変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合が、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して低減している。本発明の更なる実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能の誘導は、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して低減しており、変異体重鎖を含む抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を保持する。更に別の実施態様では、本明細書に記載の抗体が提供され、ここで、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＣＤＣ機能の誘導は、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＣＤＣ機能と比較して消失している。
【０１１９】
更に別の実施態様では、本発明の重鎖変異体は、野生型Ｆｃ領域を含む親抗体と比較して、ヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲ）及び／又はヒト補体受容体に対して低減した親和性を示す。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む前記抗体は、野生型ヒトＦｃ領域を含む親抗体と比較して、ヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲ）及び／又はヒト補体受容体に対して低減した親和性を示す。更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの少なくとも１つに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、本発明のなお更なる態様では、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩＩ受容体及びＣ１ｑに対する親和性が低減し、かつ、本発明のなお更なる態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＣ１ｑ受容体に対する親和性が低減している。なお更なる実施態様では、重鎖変異体を含む前記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは低減する。本発明のなお更なる態様では、野生型Ｆｃポリペプチドを含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ及びＣＤＣは低減又は消失する。更なる態様では、本明細書に開示されるＦｃ変異体を含む抗体は、野生型Ｆｃポリペプチドを含む親抗体と比較して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰの減少を示す。更に別の実施態様では、本発明は、親非置換抗体と比較して、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失をもたらす、抗体のＦｃ領域にアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含む抗体を対象とする。更に別の実施態様では、本発明は、親非置換抗体と比較して、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失をもたらす、抗体のＦｃ領域にアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む抗体を対象とする。別の特定の実施態様では、親非置換抗体はオビヌツズマブである。別の特定の実施態様では、親非置換抗体はリツキシマブである。
【０１２０】
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載されるようなエフェクター機能が低減した修飾されたＦｃ領域を有する抗体であって、修飾された重鎖ＣＨ１及び／又はＶＨ領域を更に含み、それによりこれらの抗体が標的抗原の細胞シグナル伝達活性を誘導する能力及び／又は標的抗原の架橋を媒介する能力を増強（すなわち誘導又は増加）又は低減（すなわち抑制又は減少）させることができる抗体を対象とする。更なる態様では、前記抗体は、修飾されたＦｃ領域であって、それにより抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導が低減する修飾されたＦｃ領域と、直接細胞死の誘導が変化する修飾されたＣＨ１領域とを含む。更なる態様では、前記抗体は、修飾されたＦｃ領域であって、それにより抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導が低減する修飾されたＦｃ領域と、直接細胞死の誘導が変化する修飾されたＶＨ領域とを含む。更なる態様では、Ｆｃ領域に対する前記修飾は、ＡＤＣＰ機能の誘導を低減させるが、消失させない。更なる態様では、本発明に従って修飾された抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を保持する。
【０１２１】
一実施態様では、本発明は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導の低減をもたらす、抗体のＦｃ領域の位置Ａｓｎ２９７に修飾を有する本明細書に記載の抗体を対象とし、前記抗体は、ＣＨ１領域中の位置Ｐｒｏ１５１での修飾及び／又はＶＨ領域中のＬｅｕ１１での修飾を更に含み、抗体の変化したシグナル伝達挙動をもたらす。一実施態様では、本発明は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導の低減をもたらす、抗体のＦｃ領域の位置Ｐｒｏ３２９に修飾を有する本明細書に記載の抗体を対象とし、前記抗体は、ＣＨ１領域中の位置Ｐｒｏ１５１での修飾及び／又はＶＨ領域中のＬｅｕ１１での修飾を更に含み、抗体の変化したシグナル伝達挙動をもたらす。特定の実施態様では、本発明の変異体Ｆｃ及び／又はＣＨ１及び／又はＶＨを含む抗体は、以下の特性のうちの少なくとも１つ以上を含む：直接細胞死の誘導の増加又は減少、エフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能の低減又は消失、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃｌｑへの結合の低減又は消失、及び急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失。より具体的には、本発明の実施態様は、直接細胞死の誘導が増加し、かつＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ）に対する親和性が低減した抗ＣＤ２０抗体を提供する。
【０１２２】
本発明の抗体の修飾された重鎖ＣＨ１、ＶＨ及びＦｃ領域は、対応する非置換親ポリペプチド領域と、少なくとも１つのアミノ酸置換により異なる。「親」、「開始」、「非修飾」又は「非置換」ポリペプチドは、好ましくは、抗体重鎖領域の少なくとも一部を含み、Ｆｃ領域並びに重鎖ＣＨ１及びＶＨ領域又はその一部を含むポリペプチドを生成するための当該技術分野で利用可能な技術を用いて調製することができる。
【０１２３】
従って、一実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１を含み、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、１５１位でプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している。従って、一実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記置換はＰｒｏ３２９Ｇｌｙであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１を含み、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、１５１位でプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、本明細書に記載の抗体が提供される。更に別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、本明細書に記載の抗体が提供される。更に別の実施態様では、Ｐｒｏ１５１がアラニン及びフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、本明細書に記載の抗体が提供される。更に別の実施態様では、Ｐｒｏ１５１がフェニルアラニンで置換されており、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、本明細書に記載の抗体が提供される。更に別の実施態様では、Ｐｒｏ１５１がアラニンで置換されており、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、本明細書に記載の抗体が提供される。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、オビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、オビヌツズマブと比較して、ＣＨ１領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含む。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、オビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、オビヌツズマブと比較して、ＣＨ１領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、リツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、リツキシマブと比較して、ＣＨ１領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含む。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、リツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、リツキシマブと比較して、ＣＨ１領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む。
【０１２４】
更なる実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記置換はＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｖａｌ１１を含み、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｖａｌ１１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、１１位でバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している。更なる実施態様では、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記置換はＰｒｏ３２９Ｇｌｙであり、エフェクター機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減され、変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域はアミノ酸残基Ｖａｌ１１を含み、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｖａｌ１１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、１１位でバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、本明細書に記載の抗体が提供される。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、本明細書に記載の抗体が提供される。別の実施態様では、Ｖａｌ１１が、アラニン、グリシン、フェニルアラニン、スレオニン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、本明細書に記載の抗体が提供される。更に別の実施態様では、Ｖａｌ１１が、フェニルアラニン、スレオニン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されており、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、本明細書に記載の抗体が提供される。更に別の実施態様では、Ｖａｌ１１が、アラニン及びグリシンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されており、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、位置Ｖａｌ１１でバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、本明細書に記載の抗体が提供される。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、オビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、オビヌツズマブと比較して、ＶＨ領域のアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含む。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、リツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、リツキシマブと比較して、ＶＨ領域のアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含む。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、オビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、オビヌツズマブと比較して、ＶＨ領域のアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む。別の特定の実施態様では、親非置換抗体は、リツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、リツキシマブと比較して、ＶＨ領域のアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＦｃ領域のアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含む。
【０１２５】
従って、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｆｃ領域中のＡｓｎ２９７及び／又はＰｒｏ３２９の位置に修飾を有し、エフェクター機能を誘導する能力が低減した抗体、並びに重鎖ＣＨ１中の位置Ｐｒｏ１５１における修飾、及び／又は重鎖ＶＨ領域中の位置Ｌｅｕ１１における修飾を有し、修飾された抗体が標的抗原と複合体形成された（例えば、結合された）場合、標的抗原の細胞シグナル伝達活性を誘導する能力の改変をもたらす抗体を生成するために、本発明に従って修飾することができる。細胞シグナル伝達活性は、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性であり得る。本発明の一態様によれば、アゴニスト活性は、修飾された抗原結合分子が細胞膜結合受容体に結合し、細胞シグナル伝達経路を開始するとき、その修飾された抗原結合分子によって誘導される。特定の実施態様では、細胞シグナル伝達経路はアポトーシス経路である。別の実施態様では、細胞シグナル伝達経路は細胞分化経路である。本発明の別の態様によれば、修飾された抗原結合分子によるアンタゴニスト活性は、例えば、抗体が細胞膜結合受容体に結合し、細胞シグナル伝達経路の誘導を妨げるか、進行中のシグナルを妨害する場合に生じる。アンタゴニスト活性は、例えば、内因性リガンドの結合及びその後のシグナル伝達を遮断することによって、かつ／又は細胞シグナル伝達経路の誘導に必要とされるであろう受容体又は他の分子の架橋又はオリゴマー化を防止することによって、達成することができる。一実施態様では、阻害又は妨害される細胞シグナル伝達経路は、細胞増殖経路である。別の実施態様では、阻害又は妨害される細胞シグナル伝達経路は、細胞分裂経路である。別の実施態様では、阻害又は妨害される細胞シグナル伝達経路は、細胞生存経路である。同様に、親ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、Ｆｃ領域中のＡｓｎ２９７及び／又はＰｒｏ３２９の位置に修飾を有し、エフェクター機能を誘導する能力が低減した抗体、並びに重鎖ＣＨ１中の位置Ｐｒｏ１５１における修飾、及び／又は重鎖ＶＨ領域中の位置Ｌｅｕ１１における修飾を有し、修飾された抗体が標的抗原と複合体形成された（例えば、結合された）場合、１つ又は複数の標的抗原の架橋を媒介する能力が改変された抗体を生成するために、本発明に従って修飾することができる。一実施態様では、結合した標的抗原（例えば、細胞表面受容体分子）は、それらが対応する非置換親抗体によるであろうよりも、互いにより近接せしめられ、かつ／又は相互作用のためのより好ましいコンフォメーションにされ、それによって結合した抗原間の架橋及びオリゴマー化を増加させる。別の実施態様では、結合した標的抗原（例えば、細胞表面受容体分子）は、それらが対応する非置換親抗体によるであろうよりも、互いに遠く離れて保持され、かつ／又は相互作用のためにはあまり好ましくないコンフォメーションにされ、それによって結合した抗原間の架橋及びオリゴマー化を低減させ又は防止する。特定の実施態様では、増加した架橋又はオリゴマー化は、増加した直接細胞死をもたらす。別の実施態様では、増加した架橋又はオリゴマー化は、増加した細胞分化をもたらす。別の実施態様では、架橋又はオリゴマー化の低減は、細胞増殖の減少、細胞分裂の減少、又は細胞生存の減少をもたらす。
【０１２６】
特定の実施態様では、本発明は、対応する非修飾親抗体と比較して、エフェクター機能を誘導する能力が減少し、かつ、アポトーシスを誘導する能力が増加した修飾抗体を対象とする。例えば、アポトーシスを誘導する能力をほとんど又は全く有さないが、エフェクター機能を誘導する強い能力を有する親抗体が、本発明に従って修飾され、アポトーシスを誘導する能力を有するか、又はアポトーシスを誘導する能力が増加し、かつ、強いエフェクター機能を誘導する能力を有さない修飾抗体を生成することができる。同様に、強いエフェクター機能を誘導する親抗体は、アポトーシスを誘導する可能性を保持又は増加させつつ、弱いエフェクター機能を誘導する修飾抗体を生成するために修飾することができる。本発明はまた、対応する非修飾親抗体と比較して、増殖停止又は細胞分化を誘導する能力が増加し、かつ、エフェクター機能又はサイトカイン放出活性の誘導が低減又は消失した修飾された抗体を対象とする。例えば、増殖停止又は細胞分化を誘導する能力をほとんど又は全く有さない親抗体が、本発明に従って修飾され、例えば、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）などの有害事象を減少させつつ、増殖停止又は分化を誘導する能力を有する修飾抗体を生成するか、又は増殖停止又は分化を誘導する能力が増加している抗体を生成することができる。
【０１２７】
本発明の更なる態様は、修飾された抗ＣＤ２０抗体の提供である。好ましい実施態様では、本明細書に開示される抗体はＣＤ２０に特異的に結合する。特定の実施態様では、本明細書に開示される修飾された抗ＣＤ２０抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ又は１０−９Ｍから１０−１３Ｍである。好ましい実施態様では、本明細書中に開示される抗体は、スカッチャード分析によって決定されるように、１０ｎＭ以下の、細胞に対する解離定数（Ｋｄ）でＣＤ２０に結合する。一実施態様では、本発明は、Ｉ型親抗ＣＤ２０抗体と比較して重鎖領域に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む修飾された抗ＣＤ２０抗体であって、該置換が、修飾された抗ＣＤ２０抗体によるエフェクター機能の誘導の減少及び直接細胞死の誘導の増加をもたらす修飾された抗ＣＤ２０抗体を対象とする。別の実施態様では、本発明は、本明細書に開示するアミノ酸置換の結果として直接細胞死を誘導する実質的な能力を失うことなく、エフェクター機能の誘導の減少を有する修飾されたＩＩ型抗ＣＤ２０抗体を対象とする。一実施態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、親分子と比較して重鎖中に２つ以上のアミノ酸の置換を含む。別の実施態様では、本発明は、変異体重鎖領域を含む、修飾された抗ＣＤ２０抗体を対象とし、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐ及びＰｒｏ１５１Ｐｈｅを含み、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されたエフェクター機能及び直接細胞死と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能及び直接細胞死が変化している。別の実施態様では、本発明は、変異体重鎖領域を含む、修飾された抗ＣＤ２０抗体を対象とし、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ及びＰｒｏ１５１Ｐｈｅを含み、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されたエフェクター機能及び直接細胞死と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能及び直接細胞死が変化している。別の実施態様では、本発明による変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加している。別の実施態様では、本発明による変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少している。別の実施態様では、本発明による変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減又は消失している。好ましい実施態様では、本発明による変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加し、本発明の変異体重鎖領域を含む抗体によって誘���されるエフェクター機能は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して低減又は消失される。更に好ましい実施態様では、前記アミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含む本発明による抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を保持する。
【０１２８】
本発明の更なる実施態様では、親非置換抗体と比較して、本明細書中に開示される変異体ＣＨ１及び／又はＶＨ領域と、本明細書に開示される変異体Ｆｃ領域とを含む、修飾された抗ＣＤ２０抗体が提供される。一実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、親非置換抗体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死及びエフェクター機能と比較して、直接細胞死の誘導が増加し、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣの誘導が消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、かつ、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。一実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、親非置換抗体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死及びエフェクター機能と比較して、直接細胞死の誘導が増加し、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣの誘導が消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、かつ、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。更なる実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、親非置換抗体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死及びエフェクター機能と比較して、直接細胞死の誘導が増加し、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣの誘導が消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、かつ、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。更なる実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、親非置換抗体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死及びエフェクター機能と比較して、直接細胞死の誘導が増加し、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣの誘導が消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、かつ、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。更なる態様では、前記抗体は、野生型Ｆｃ領域を有する抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩ及び／又はＦｃγＲＩＩ及び／又はＦｃγＲＩに対して低減した親和性を示す。更なる態様では、Ｆｃ領域における前記修飾は、エフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能の低減又は消失、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃｌｑへの結合の低減又は消失、及び急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失をもたらす。
【０１２９】
より具体的な実施態様では、本発明は、野生型ヒト重鎖領域を含むポリペプチドと比較して、直接細胞死の誘導が増加し、ヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲ）及び／又はヒト補体受容体に対する親和性が低減した抗ＣＤ２０抗体を提供する。更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの少なくとも１つに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、更なる実施態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩに対する親和性が低減し、本発明のなお更なる態様では、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩＩ受容体及びＣ１ｑに対する親和性が低減し、かつ、本発明のなお更なる態様では、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＣ１ｑ受容体に対する親和性が低減している。
【０１３０】
本発明の別の態様では、Ｖａｌ１１、Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体であって、変異体重鎖領域を含む抗体によるエフェクター機能の誘導及び／又はＦｃγ受容体への結合並びに直接細胞死の誘導が変化した抗体が提供される。本発明の別の態様では、Ｖａｌ１１、Ｐｒｏ１５１、Ａｓｎ２９７及びＰｒｏ３２９からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体であって、変異体重鎖領域を含む抗体によるエフェクター機能の誘導及び／又はＦｃγ受容体への結合並びに直接細胞死の誘導が変化した抗体が提供される。一実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合が低減される。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合は、親非置換重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に低減する。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合は、親非置換重鎖領域を含む抗体によるＦｃＲＩＩＩ結合の０％〜２０％に低減する。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合は、親非置換重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して消失する。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＣ機能の誘導が低減される。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＣ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣ機能の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に低減する。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＣ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣ機能の０％〜８０％、更により好ましい実施態様では０〜２０％に低減する。最も好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＣ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して消失する。更なる実施態様では、ＡＤＣＣは、エフェクター細胞の存在下で細胞上清中に放出されるＬＤＨの定量化によって測定され得る。更に別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩへの結合が低減される。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩへの結合は、親非置換重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して消失する。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩへの結合は、親非置換重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に低減する。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩへの結合は、親非置換重鎖領域を含む抗体によるＦｃＲＩ結合の１０％〜９０％、最も好ましい実施態様では２０％〜６０％に低減する。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＣ機能の��導が低減される。更なる実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＰ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して消失する。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＰ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＰ機能の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に低減する。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＡＤＣＰ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＰ機能の１０％〜９０％、更により好ましい実施態様では２０〜６０％に低減する。最も好ましい実施態様では、本発明の抗体は、残存するＡＤＣＰ機能を維持する。更なる実施態様では、ＡＤＣＰは、標的細胞との同時インキュベーション後のＣＦＳＥ−ＰＫＨ２６−二重陽性マクロファージの定量によって測定することができる。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＣＤＣ機能の誘導が低減される。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＣＤＣ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＣＤＣ機能の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に低減する。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＣＤＣ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＣＤＣ機能の０％〜８０％、更により好ましい実施態様では０〜２０％に低減する。最も好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によるＣＤＣ機能の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導されるＣＤＣ機能と比較して消失する。更なる実施態様では、ＣＤＣは、補体の存在下で細胞上清中に放出されるＬＤＨの定量化によって測定され得る。別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体による急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）の誘導が低減される。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体による急性輸液反応の誘導は、親非置換重鎖領域を含む抗体により誘導される急性輸液反応の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に低減する。最も好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体による急性輸液反応の誘導が消失する。
【０１３１】
従って、更なる実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加している。本発明の別の態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の少なくとも１１０％に増加している。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の少なくとも１２０％に増加している。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％に増加している。最も好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の１２０％〜２００％に増加している。本発明の更なる態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少している。更に別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の９０％以下に減少している。好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の８０％以下に減少している。より好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に減少する。別のより好ましい実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死の０％〜７０％、更により好ましい実施態様では０〜２０％に減少する。更に別の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は消失する。更なる実施態様では、直接細胞死の誘導は、アネキシンＶ結合及びＰＩ染色によって測定することができる。
【０１３２】
ＦｃγＲへの結合を変化させることが好ましいが、新生児受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性が変化したＦｃ領域変異体もまた本明細書において企図される。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有するＦｃ領域変異体は、より長い血清半減期を有することが予想され、そのような分子は、投与されたポリペプチドの長い半減期が所望される哺乳類を（例えば、慢性疾患又は障害を治療するために）治療する方法において有用な用途を有するであろう。逆に、ＦｃＲｎ結合親和性が減少したＦｃ領域変異体は、より短い半減期を有することが期待され、そのような分子は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ診断イメージングのために、又は血流中に長期間循環しているときに有毒な副作用を有するポリペプチドのために短縮された循環時間が有利であり得る場合に、例えば、哺乳類に投与されてもよい。減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ領域変異体は、胎盤を通過する可能性が低いと予想され、従って、妊婦の疾患又は障害の治療に利用され得る。ＦｃＲｎに対する変化した結合親和性を有するＦｃ領域変異体は、アミノ酸位置２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９又は４４７の任意の１つ以上のアミノ酸位置でＦｃ領域のアミノ酸修飾を含むものを含む。ＦｃＲｎへの結合の低減を示すものは、通常、アミノ酸位置２５２、２５３、２５４、２５５、２８８、３０９、３８６、３８８、４００、４１５、４３３、４３５、４３６、４３９又は４４７の任意の１つ以上のアミノ酸位置でＦｃ領域のアミノ酸修飾を含み；かつＦｃＲｎへの結合が増加したものは、通常、アミノ酸位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の任意の１つ以上のアミノ酸位置でＦｃ領域のアミノ酸修飾を含む。
【０１３３】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減する。更に特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減する。
【０１３４】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、かつ、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。更に特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、かつ、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１３５】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）が低減する。更に特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）が低減する。
【０１３６】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。別の特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。
【０１３７】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。別の特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。
【０１３８】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が減少する。特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＰｒｏ２９７Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が減少する。
【０１３９】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）が低減し、かつ、１５１位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が減少する。
【０１４０】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１１位のバリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＰｒｏ３２９を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１１位のバリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。
【０１４１】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減し、かつ、１１位のバリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が減少する。
【０１４２】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗ＣＤ２０抗体が提供され、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含み、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、２９７位のアスパラギンを含む親非置換抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）が低減し、かつ、１１位のバリンを含む親非置換抗体によって誘導される直接細胞死と比較して、直接細胞死の誘導が増加する。
【０１４３】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減する。特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９ＧｌｙＡｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減する。
【０１４４】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで親非置換抗体は、重鎖領域にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、残基はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされ、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能は、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して低減又は消失し、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）は、オビヌツズマブによって誘導される急性輸液反応と比較して低減又は消失する。
【０１４５】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１４６】
特定の実施態様では、変異重鎖を含む抗体が提供され、ここで、親非変異抗体は重鎖にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７（ＥＵ番号付け）を含むオビヌツズマブであり、前記変異重鎖は、親非変異重鎖に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１４７】
特定の実施態様では、変異重鎖を含む抗体が提供され、ここで、親非変異抗体は重鎖にアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９（ＥＵ番号付け）を含むオビヌツズマブであり、前記変異重鎖は、親非変異重鎖に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１４８】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１４９】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで親非置換抗体は、重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、残基はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされ、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能は、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して低減又は消失し、かつ、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１５０】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減し、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。
【０１５１】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＰｒｏ３２９を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。
【０１５２】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減し、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１５３】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減し、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。
【０１５４】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＰｒｏ３２９を含むオビヌツズマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、オビヌツズマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、オビヌツズマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１５５】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導が低減する。
【０１５６】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで親非置換抗体は、重鎖領域にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能は、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して低減又は消失し、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される急性輸液反応（サイトカイン放出症候群）は、リツキシマブによって誘導される急性輸液反応と比較して低減又は消失する。
【０１５７】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１５８】
特定の実施態様では、変異重鎖を含む抗体が提供され、ここで、親非変異抗体は重鎖にアミノ酸残基Ａｓｎ２９７（ＥＵ番号付け）を含むリツキシマブであり、前記変異重鎖は、親非変異重鎖に対してアミノ酸置換Ａｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１５９】
特定の実施態様では、変異重鎖を含む抗体が提供され、ここで、親非変異抗体は重鎖にアミノ酸残基Ｐｒｏ３２９（ＥＵ番号付け）を含むリツキシマブであり、前記変異重鎖は、親非変異重鎖に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持される。
【０１６０】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１６１】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで親非置換抗体は、重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター（ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）機能は、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して低減又は消失し、かつ、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１６２】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減し、かつ、直接細胞死の誘導が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。
【０１６３】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｐｒｏ１５１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。
【０１６４】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減し、かつ、直接細胞死の誘導が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１６５】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ａｌａ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減し、かつ、直接細胞死の誘導が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて減少する。
【０１６６】
特定の実施態様では、変異体重鎖領域を含む抗体が提供され、ここで、親非置換抗体は重鎖領域にアミノ酸残基Ｖａｌ１１及びＡｓｎ２９７を含むリツキシマブであり、前記変異体重鎖領域は、親非置換重鎖領域に対してアミノ酸置換Ｖａｌ１１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐを含み、ここで、リツキシマブによって誘導されるエフェクター機能と比較して、ＦｃγＲＩＩＩ結合が消失し、ＡＤＣＣが消失又は大きく低減し、ＦｃγＲＩ結合が低減し、ＡＤＣＰ機能の誘導は低減するが残存するＡＤＣＰ機能は維持され、かつ、直接細胞死の誘導が、リツキシマブによって誘導される直接細胞死に比べて増加する。
【０１６７】
アミノ酸修飾（置換、付加、欠失）を含む本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができる。これら方法には、限定されないが、部位特異的（又はオリゴヌクレオチド媒介性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びポリペプチドをコードする先に調製された核酸のカセット突然変異誘発による調製を含む。部位特異的変異誘発は、置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技術は、当該技術分野で周知である（例えば、Carter et a Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)及びKunkel et. al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 82: 488 (1987)を参照。これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発の実施において、出発ＤＮＡは、最初に、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをこのような出発ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイズさせることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、出発ＤＮＡの一本鎖を鋳型として用いて、第２の鎖全体を合成する。従って、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られた二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。
【０１６８】
ＰＣＲ突然変異誘発はまた、非修飾出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製すために適している（例えば、Vallette et. al, Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989)を参照。この全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔には、少量の鋳型ＤＮＡがＰＣＲにおいて出発物質として使用される場合、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域と配列がわずかに異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型と異なる位置でのみ鋳型配列と異なる比較的多量の特定のＤＮＡ断片を生成することができる。
【０１６９】
本発明の抗体変異体、カセット突然変異誘発を調製するための本発明による別の方法は、Wells et al, Gene 34: 315-323 (1985)に記載された技術に基づいており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出発物質は、修飾される出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異される開始ＤＮＡ中のコドンが同定される。同定された突然変異部位の各側には、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。そのような制限部位が存在しない場合、本明細書に開示されたオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて制限部位が生成され、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適切な位置に制限部位を導入することができる。これらの部位でプラスミドＤＮＡを切断して線状化する。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の突然変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが、標準的な手順を用いて合成され、ここで、オリゴヌクレオチドの２つの鎖は別々に合成され、次いで標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、線状化されたプラスミドの末端に適合する５’及び３’末端を有するように設計され、プラスミドに直接連結され得る。このプラスミドは、今や突然変異したＤＮＡ配列を含む。
【０１７０】
あるいは、又は更に、抗体変異体をコードする所望のアミノ酸配列を決定することができ、このようなアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列を合成的に生成することができる。
【０１７１】
親Ｆｃ領域に適切なアミノ酸配列修飾を導入することにより、（ａ）ヒトエフェクター細胞の存在下で１つ以上のエフェクター機能をあまり効果的には媒介しない、及び／又は（ｂ）親ポリペプチドよりも小さな親和性でＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合する変異体Ｆｃ領域を生成することができる。このような修飾されたＦｃ領域は、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むであろう。同様に、適切なアミノ酸配列修飾を導入することにより、親非置換ポリペプチドと比較して多かれ少なかれ効果的に直接細胞死の改変された誘導を媒介する変異体ＣＨ１及びＶＨ領域を生成することができる。Ｆｃ及びＣＨ１及び／又はＶＨ領域の組み合わされた変異体は、親領域ポリペプチドに個別に置換を導入し、修飾された領域を組み合わされたＦｃ及びＣＨ１及び／又はＶＨ変異体に組み合わせることによって、又は全てのアミノ酸置換を同時に導入することによって生成することができる。
【０１７２】
好ましい実施態様では、親ポリペプチドＦｃ領域はヒトＦｃ領域であり、限定されないが、天然のヒトＦｃ領域ヒトＩｇＧ１（Ａ及び非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び任意の種のＦｃ領域から知られているか又は発見された全てのアロタイプが含まれる。そのような領域は、米国仮特許出願第６０／６７８，７７６号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような配列を有する。
【０１７３】
特定の実施態様では、改変されたエフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰを含むがこれに限定されない）を有する修飾されたＦｃ領域を更に含む重鎖ＣＨ１及びＶＨ領域における１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体を生成するために、親ポリペプチドは、好ましくは、既存のエフェクター機能を有する（例えば、親ポリペプチドがヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む）。幾つかの実施態様では、改変されたエフェクター機能を有する修飾されたＦｃ領域は、エフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰを含むがこれに限定されない）を、天然配列ＩｇＧ１又はＩｇＧ３  Ｆｃ領域を有する抗体よりも実質的に効果的でないように媒介する。
【０１７４】
修飾された重鎖領域を有する本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの所望の又は意図した使用に依存して、１つ以上の更なる修飾を受けることができる。そのような修飾には、例えば、限定されるものではないが、アミノ酸配列の更なる改変（アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失）、異種ポリペプチドへの融合及び／又は共有結合修飾を含む。このような更なる改変は、本明細書に開示されるアミノ酸改変の前に、同時に、又は後に行うことができ、これはシグナル伝達活性及び／又はＦｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の変化をもたらす。
【０１７５】
本発明の別の態様では、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。好ましくは解離定数は、１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍである。
【０１７６】
本発明の一態様では、解離定数Ｋｄは、ユーロピウム標識抗体を用いたスキャッチャード分析及び異なる抗体濃度での結合／遊離比の分析によって測定される。２ｘ１０５個のＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、２０％ＦＣＳ（５０μｌ）を含有する培地中でＶ底プレート（ＮＵＮＣ）に播種する。次いで、５０μｌのユーロピウム標識抗体を異なる濃度で添加し、２５℃で１時間インキュベートする。その後、１５０μｌの完全培地を添加し、プレートを遠心分離する。細胞を培地全体を置換することにより２回洗浄し、新しいプレートに移し、再び２回洗浄する。最後に、遠心分離後に培地を除去し、ペレットを２００μｌのエンハンサー溶液に再懸濁し、黒色９６ウェルプレートに移し、１０分間シェーカー上に置く。この工程により、結合したユーロピウムが上清中に放出され、蛍光が増強され、次いでＢＭＧ  ＰｈｅｒａＳｔａｒ装置（ｅｘ３３７／ｅｍ６１５）で分析した。結合した抗体のモル濃度は、基準の（ユーロピウム−抗体）滴定曲線からの相対蛍光単位（ＲＦＵ）の使用によって計算される。遊離抗体の量は、全抗体ウェルで測定されたシグナルから結合した抗体を差し引くことによって計算される。結合対遊離抗体の比を、結合した抗体分子の数に対してプロットし、曲線の傾き（Ｓ）を決定する。抗体の親和性は、以下の式を使用して決定される：Ｋｄ（Ｍ）＝１／−Ｓ．
【０１７７】
別の実施態様によれば、解離定数Ｋｄは、以下のアッセイによって開示されるような目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて行われる放射性標識抗原又はＦｃ受容体結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを均衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）で一晩コーティングし、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳて２〜５時間室温（およそ２３℃）でブロックする。非吸着プレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ７３６６）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合する（例えば、Presta 、et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは、平衡状態に達したことを確認するために長時間（例えば約６５時間）続くかもしれない。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で１時間インキュベートする。次いで、溶液を除去し、０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳでプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭ  γカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選定する。
【０１７８】
別の実施態様によれば、抗体の解離定数Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、−１０応答単位（ＲＵ）での固定化抗原又はＦｃ受容体ＣＭ５チップを用いて２５℃で測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質のおよそ１０反応単位（ＲＵ）を達成するように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定では、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。Ｋｄは比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、結合速度は、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【０１７９】
特定の実施態様では、親非置換重鎖領域は、配列番号１に開示されるようなオビヌツズマブに由来するものであり、更に本明細書において開示される。Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置１１、１５１及び２９７には下線が引かれている。
【０１８０】
オビヌツズマブ重鎖アミノ酸配列（配列番号１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＹＳＷＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲ
ＩＦＰＧＤＧＤＴＤＹＮＧＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＶ
ＦＤＧＹＷＬＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ
ＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹ
ＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ
ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳ
ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶ
ＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬ
ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
【０１８１】
特定の実施態様では、親非置換重鎖領域は、配列番号１に開示されるようなオビヌツズマブに由来するものであり、更に本明細書において開示される。Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置１１、１５１及び２９７には下線が引かれている。
【０１８２】
リツキシマブ重鎖アミノ酸配列（配列番号２）
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡ
ＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴ
ＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ
ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ
ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ
ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹ
ＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰ
ＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ
ＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１８３】
修飾された抗体の発現
当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、親抗体の実質的に同じ結合特異性を有する修飾抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照。
【０１８４】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の抗体のコード配列を発現させることができる。好ましくは、哺乳動物細胞が、目的のタンパク質のコード配列及び融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えプラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞系として使用される。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が宿主細胞系として使用される。発現系及び選択方法の幾つかの例は、以下の参考文献とその中の参考文献に開示されている： Werner et al, Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), Chadd and Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001)。代替の実施態様では、他の真核生物宿主細胞系が意図されてもよく、これには、例えば、米国特許出願第６０／３４４１６９号及び国際公開第０３／０５６９１４号（非ヒト真核宿主細胞におけるヒト様糖タンパク質の産生方法）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されるような、本発明の抗体のコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母細胞；親抗体と実質的に同じ結合特異性を有する修飾抗体のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた植物細胞系、又は本発明の抗体のコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系であって、限定されるものではないが、米国特許第６，８１５，１８４号（遺伝子操作されたウキクサからの生物学的に活性なポリペプチドの発現及び分泌のための方法）；国際公開第２００４／０５７００２号（グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の導入によるコケ植物細胞におけるグリコシル化タンパク質の産生）及び国際公開第２００４／０２４９２７号（コケプロトプラストにおいて細胞外異種非植物タンパク質を生成する方法）；及び米国特許出願第６０／３６５，７６９号、６０／３６８，０４７号、及び国際公開第２００３／０７８６１４号（機能性哺乳類ＧｎＴＩＩＩ酵素を含むトランスジェニック植物における糖タンパク質プロセシング）（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示される発現系を含む植物細胞系；又は組換えウイルス発現ベクターで感染させた動物細胞系（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）であって、安定して増幅されるか（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）、又は二重微小染色体中において不安定に増幅される（例えば、マウス細胞株）、親抗体と実質的に同じ結合特異性を有する修飾抗体をコードするＤＮＡの複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む動物細胞系が含まれる。一実施態様では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリシストロニックである。好ましい実施態様では、抗体はヒト化抗体である。
【０１８５】
一実施態様では、本発明は、本発明の１つ以上の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び／又は宿主細胞を対象とする。本発明の一態様によれば、軽鎖及び重鎖を、別々のプラスミド中、又は単一の（ポリシストロンを含むがこれに限定されない）ベクター上の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を用いて、別々に発現させることができる従って、本発明の別の態様では、抗体の変異体重鎖領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明の一態様では、抗体の軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明の一態様では、抗体の変異体重鎖及び／又は軽鎖をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。更なる態様では、前記ベクターはポリシストロニックである。本発明の一実施態様は、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を対象とする。また、本発明は、（ｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養すること；（ｉｉ）培養培地から前記抗体を回収することを含む、本発明の抗体を宿主細胞内で製造する方法を対象とする。
【０１８６】
本発明の方法では、安定した発現は、典型的にはより再現性のある結果を達成し、かつ大規模生産により適しているので、一般的に一過性発現より好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーによって制御されるそれぞれのコード核酸で形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、プラスミドを染色体に安定に組み込み、増殖して病巣を形成する細胞の選択を可能にし、次いでこれをクローン化して細胞株へ増殖させることができる。
【０１８７】
多くの選択システムが使用されてもよく、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al, Cell 11:223 (1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 48:2026 (1962)）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al, Cell 22:817 (1980)）遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞に用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al, Natl Acad. Sd. USA 77:3567 (1989); O'Hare et al, Proc. Natl Acad. ScL USA 78: 1527 (1981)）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, Proc. Natl Acad. ScL USA 78:2072 (1981)）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapin et al, J. MoI Biol 150:1 (1981)）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerre et al, Gene 30:147 (1984)の遺伝子の選択の基礎として使用することができる。最近、更なる選択可能な遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman & Mulligan, Proc. Natl Acad. ScL USA S5:8047 (1988)）；グルタミン合成酵素系；及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＥＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)）が記載されている。
【０１８８】
本発明の方法による修飾された抗体の治療的適用
最も広い意味で、本発明の修飾された抗体は、標的抗原を発現する細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的化するために、特に、前記標的抗原が細胞表面上に発現される場合に使用することができる。標的抗原を発現する細胞は、診断目的又は治療目的のために標的化することができる。一態様では、本発明の修飾された抗体は、標的抗原を発現する細胞における細胞シグナル伝達活性を変化させながらエフェクター機能を制御するために使用することができる。別の態様では、本発明の修飾された抗体を用いて、エフェクター機能を抑制し、かつ／又は１つ以上の標的抗原の架橋及び／又はオリゴマー化を改変することができる。本発明の修飾された抗体の標的抗原は、細胞表面受容体であり得るが、限定されないものの、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ４７、ＣＤ９９、ＣＤ２、ＣＤ４５、Ｈｅｒ１（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２）、ＴＮＦＲ、ＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦＲ１）、ＩＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、及び他の細胞表面結合受容体が含まれる。特定の実施態様では、標的抗原はＣＤ２０である。本発明の修飾された抗体はまた、細胞周期を停止させ、標的細胞の直接細胞死を引き起こし、血管新生を阻害し、かつ／又は標的細胞の分化を引き起こすように作用する。
【０１８９】
別の態様では、本発明は、標的抗原のエフェクター機能の抑制及び／又は細胞シグナル伝達活性の改変によって治療可能な疾患の治療方法であって、本発明の修飾された抗体の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を対象とする。特定の実施態様では、修飾された抗体はヒト化される。修飾された抗体が投与され得る疾患の例は、限定されないが、細胞増殖性疾患又は障害、自己免疫疾患又は障害、及び細菌又はウイルス感染に関連する疾患又は障害が含まれる。
【０１９０】
一実施態様では、本明細書による抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患を治療するための方法を対象とする。更なる態様では、前記方法は、本発明の修飾された抗体（コンジュゲート型、限定されないがイムノトキシン、又は非コンジュゲート型）の少なくとも１つを含有する組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含む。一実施態様では、前記増殖性障害には、限定されないものの、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する新生物、がん、悪性腫瘍及び／又は腫瘍が含まれる。本発明の抗体で治療することができる特定の新生物、がん、悪性腫瘍及び／又は腫瘍には、限定されるものではないが、表皮及び扁平上皮細胞癌、神経膠腫、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、肺がん、脳腫瘍、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃がん、子宮頸がん、子宮内膜癌、食道がん、肝臓がん、皮膚がん、尿路癌、絨毛癌、喉頭がん、喉頭がん、卵胞膜細胞腫症、セルトリ間質細胞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経節芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、過誤芽腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、甲状腺肉腫、ユーイング肉腫、及びウィルムス腫瘍が含まれる。好ましい実施態様では、前記増殖性障害は、ＣＤ２０を発現するがんである。別の好ましい実施態様では、前記がんは、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択される。このようなリンパ腫及びリンパ性白血病は、限定されないが、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）、辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、大細胞型リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺性Ｂ細胞性リンパ腫を含む）、ヘアリー細胞白血病、リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキン病を含む。好ましい実施態様では、前記ＣＤ２０発現がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からなる群より選択される。
【０１９１】
更なる態様では、本発明は、Ｂ細胞枯渇に基づく、Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞増殖性障害を治療するための改善された方法であって、治療的有効量の本発明の抗体を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む方法を対象とする。好ましい実施態様では、抗体は、マウスＢ−Ｌｙ１抗体と実質的に同じ結合特異性を有する抗ＣＤ２０抗体である。別の好ましい実施態様では、抗体はヒト化されている。別の好ましい実施態様では、抗体は、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含み、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記置換がＰｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能及び直接細胞死に比べて、エフェクター機能の誘導は低減又は消失し、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は増加する。本発明のこの態様では、本発明の抗体は、正常なＢ細胞の血液を長期間枯渇させるために使用される。
【０１９２】
本発明は更に、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害する方法、対象の腫瘍を治療する方法、及び対象の増殖型疾患を治療する方法を提供する。これらの方法は、本発明の組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【０１９３】
他の細胞増殖障害も、本発明の修飾された抗体により治療することができる。本発明に包含されるように、前記細胞増殖障害には、限定されるものではないが、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性障害、異常タンパク血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、及び本明細書中に列挙する臓器系に位置する新生物以外の任意の他の細胞増殖性障害が含まれる。
【０１９４】
別の実施態様では、本発明は、自己免疫疾患を治療するための方法を対象とする。一実施態様では、前記自己免疫疾患は、限定されないが、免疫媒介性血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、レンサ球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多形性紅斑、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性ユビテランス（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ  ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、多発筋痛症、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維化肺胞炎、炎症反応、例えば炎症性皮膚疾患、例えば乾癬及び皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患に関連する応答（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、呼吸促迫症候群（例えば、成人呼吸促迫症候群、ＡＲＤＳ）、皮膚炎、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、例えば湿疹及び喘息及び他の状態、例えばＴ細胞の浸潤及び慢性炎症性応答、粥状動脈硬化、白血球接着欠乏、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病（例えば１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病）、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、アレルギー性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、若年性糖尿病、及び典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎に見られるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型過敏症に付随する免疫応答、悪性アメニア（アジソン病）、白血球血管外漏出に関する病気、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器傷害症候群、溶血性貧血（限定されないが、寒冷グロブリン血症又はクームス陽性貧血）、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性の病気、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質症候群、アレルギー性神経炎、グレーブス病、ランバート・イートン症候群、類天疱瘡水疱性、天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌不全症、ライター病、全身硬直症候群、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチー、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫性血小板減少症を含む。好ましい実施態様では、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される。
【０１９５】
更なる態様では、本発明は、Ｂ細胞枯渇に基づく、本明細書で定義される自己免疫疾患を治療するための改善された方法であって、治療的有効量の本発明の抗体を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む方法を対象とする。好ましい実施態様では、抗体は、マウスＢ−Ｌｙ１抗体と実質的に同じ結合特異性を有する抗ＣＤ２０抗体である。別の好ましい実施態様では、抗体はヒト化されている。別の好ましい実施態様では、抗体は、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含み、ここで、親非置換抗体の重鎖領域は、アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１及びＡｓｎ２９７を含み、前記置換がＰｒｏ１５１Ｐｈｅ及びＡｓｎ２９７Ａｓｐであり、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能及び直接細胞死に比べて、エフェクター機能の誘導は低減又は消失し、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死は増加する。本発明のこの態様では、本発明の抗体は、正常なＢ細胞の血液を長期間枯渇させるために使用される。
【０１９６】
本発明の修飾された抗体は、単独で、又は他の治療法若しくは治療剤と組み合わせて使用して、エフェクター機能を改変すること、及び／又は細胞シグナル伝達活性を増加若しくは減少させること、及び／又は１つ以上の標的抗原を架橋することによって治療可能である障害を治療することができる。一実施態様では、本発明の修飾された抗体を単独で使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を標的化及び死滅させることができる。修飾された抗体はまた、ヒトの癌を治療するための適切な治療剤と組み合わせて使用することができる。例えば、修飾された抗体は、化学療法、放射線療法などの標準的若しくは従来の治療法と組み合わせて使用することができ、又は癌の部位への治療剤の送達のために、治療剤又は毒素、並びにリンホカイン又は腫瘍阻害性増殖因子にコンジュゲート又は連結させることができる。特定の実施態様では、本発明の修飾された抗体のコンジュゲートは、（１）イムノトキシン（修飾された抗体と細胞傷害性部分とのコンジュゲート）及び（２）標識された（例えば、放射性標識、酵素標識、又は蛍光色素標識）修飾抗体（標識は標識された抗体を含む免疫複合体を同定するための手段を提供する）を含む。イムノトキシンの細胞傷害性部分は、細胞毒性薬物又は細菌若しくは植物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのような毒素の酵素的に活性な断片（「Ａ鎖」）であってもよい。使用される酵素的に活性な毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、及びエノマイシンである。別の実施態様では、修飾された抗体は小分子抗がん剤にコンジュゲートされる。修飾された抗体とそのような細胞傷害性部分とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。そのような試薬の例は、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）である。毒素の溶解部分は、修飾された抗体のＦａｂ断片に結合され得る。例えば、公開された米国特許出願第２００２／０１２８４４８号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、更なる適切な毒素は、当該技術分野において周知である。
【０１９７】
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、放射性標識又は毒素のような更なる部分にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートされた修飾抗体は、当該技術分野で周知の多くの方法によって産生され得る。
【０１９８】
様々な放射性核種が本発明に適用可能であり、当業者は、様々な状況下でどの放射性核種が最も適切であるかを容易に決定する能力があると信じられている。例えば、１３１ヨウ素は標的化免疫療法に用いられる既知の放射性核種である。しかしながら、１３１ヨウ素の臨床的有用性は、以下を含む幾つかの因子によって制限され得る：８日間の物理的半減期；血液及び腫瘍部位の両方におけるヨード化抗体の脱ハロゲン化；及び腫瘍における局所的な線量蓄積に対して準最適であり得る放射特性（例えば、大きなガンマ成分）を有する。優れたキレート剤の出現により、金属キレート基をタンパク質に結合させる機会は、１１１インジウム及び９０イットリウムなどの他の放射性核種を利用する機会を増加させた。９０イットリウムは、放射免疫療法用途での利用に幾つかの利点を提供する：９０イットリウムの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体の蓄積を可能にするのに十分な長さであり、例えば、１３１ヨウ素とは異なり、９０イットリウムは、その崩壊においてγ放射を伴うことなく、１００〜１０００細胞直径からなる組織の範囲で高エネルギーの純粋なβ線を放射する放射体である。更に透過性放射線の量が最小であることは、外来患者に９０イットリウム標識抗体を投与することを可能にする。更に、標識抗体の内在化は細胞死滅のために必要ではなく、電離放射線の局所放出は、標的抗原を欠いている隣接する腫瘍細胞にとって致命的であるべきである。
【０１９９】
本発明の９０イットリウム標識修飾抗体の単回治療線量（すなわち、治療的有効量）は、約５〜約７５ｍＣｉ、より好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの範囲である。本発明の１３ヨウ素標識修飾抗体の有効な単回治療非骨髄破壊的線量（effective single treatment non-marrow ablative dosage）は、約５〜約７０ｍＣｉ、より好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの範囲である。本発明の１３１ヨウ素標識修飾抗体の有効な単回治療破壊的線量（すなわち、自己骨髄移植を必要とする場合がある）は、約３０〜約６００ｍＣｉ、より好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉの範囲である。本発明によるキメラ抗体と併せて、マウス抗体に対して循環半減期がより長いおかげで、１３１Ｉヨード標識キメラ抗体の有効な単回治療非骨髄破壊的線量は、約５〜約４０ｍＣｉの範囲、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満である。１１１インジウム標識の画像化基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。
【０２００】
本発明の放射性標識した抗体に関して、それによる治療は、単一の治療処置を用いるか又は複数の処置を用いることができる。放射性核種成分のために、治療に先立って、放射線に起因する致命的な骨髄毒性を経験する患者の末梢幹細胞（「ＰＳＣ」）又は骨髄（「ＢＭ」）を「採取」することが好ましい。ＢＭ及び／又はＰＳＣを標準的な技術を用いて採取し、次いで可能な再注入のためにパージされ、凍結する。更に、治療前に、診断用に標識された抗体を用いた（限定されないが、１１１インジウムを用いることを含む）診断的線量測定研究が、患者について行われることが最も好ましく、この目的は、治療用に標識された抗体（例えば９０イットリウムを用いる）が、必ずしも、任意の正常な臓器又は組織において無用に「濃縮」されないということを保証することである。
【０２０１】
一実施態様では、本発明のキメラ、修飾抗体は、リシンＡ鎖にコンジュゲートされる。最も有利なことに、リシンＡ鎖は脱グリコシル化されており、組換え手段を通して産生される。リシンイムノトキシンを製造する有利な方法は、Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987)を参照のこと。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
診断目的でｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトがん細胞を死滅させるために使用される場合、コンジュゲートは、典型的には、少なくとも約１０ｎＭの濃度で細胞培地に加えられるであろう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いるための製剤及び投与様式は重要ではない。培養又は灌流培地と適合する水性製剤が通常使用されるであろう。細胞傷害性は、がんの存在又は程度を決定するための従来の技術によって読み取ることができる。
【０２０３】
本明細書で議論されるように、がんを治療するための細胞傷害性放射性医薬品は、放射性同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）を本発明のキメラ修飾抗体にコンジュゲートさせることによって作製することができる。本明細書で使用する用語「細胞傷害性部分」は、そのような同位体を含むことが意図される。
【０２０４】
別の実施態様では、リポソームに細胞傷害性薬物が充填され、そのリポソームを本発明の抗体でコーティングする。本発明の修飾された抗体の標的分子の多くが細胞表面上に発現する（例えば、悪性Ｂ細胞の表面上に多くのＣＤ２０分子が存在する）ため、この方法は、正しい細胞型に大量の薬物を送達することを可能にする。
【０２０５】
このような治療剤を抗体にコンジュゲートさせるための技術は周知である（例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et at, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson etal. (eds.), pp.623-53 (Marcel Defcker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；及びThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) を参照。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０６】
本発明の抗体の更に他の治療的用途には、限定されないが、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換することができる酵素に対する、組換えＤＮＡ技術によるコンジュゲーションを含むコンジュゲーション又は連結、及びプロドラッグを腫瘍部位において細胞傷害性剤に変換するためのプロドラッグと組み合わせたその抗体−酵素コンジュゲートの使用が含まれる（例えば、Senter et al., "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. ScL USA 55:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989)；及びSenter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy," FASEB J. 4:188-193 (1990)を参照）。
【０２０７】
本発明の抗体の更に別の治療的使用は、がん患者の骨髄から腫瘍細胞を除去するために、非コンジュゲート又は抗体薬物若しくは抗体毒素コンジュゲートの一部としての使用を含む。このアプローチによれば、自己骨髄は、抗体で処置することによってｅｘ  ｖｉｖｏでパージされ、骨髄は患者の体内に注入される（例えば、Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol, 8(2):81-88 (1988)を参照）。
【０２０８】
更に、本発明が、親抗体と実質的に同じ結合特異性を可能にする抗原結合ドメイン（限定されないが、親抗体のＣＤＲを含むポリペプチドを含む）を含み、かつ更に毒素ポリペプチドを含む単鎖イムノトキシンを含むことが意図される。本発明の単鎖イムノトキシンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト癌を治療するために使用され得る。
【０２０９】
同様に、限定されないが、リンフォカイン又はオンコスタチンを含む抗腫瘍活性を有する第２のタンパク質の少なくとも機能的に活性な部分に連結された、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト癌を治療するために使用することができる。
【０２１０】
従って、本発明は、限定されないが、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ４７、ＣＤ９９、ＣＤ２、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ１（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２）、ＴＮＦＲ、ＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦＲ１）、ＩＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、及び他の細胞表面結合受容体を含む細胞表面受容体を発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させる方法を提供する。この方法は、本発明の修飾された抗体（コンジュゲート型、例えば、イムノトキシンとして、又は非コンジュゲート型）が前記腫瘍細胞と反応することを含む。これらの腫瘍細胞は、ヒト癌由来であり得る。
【０２１１】
更なる態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明の抗体に関する。一実施態様では、本発明は、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の治療における使用のための本発明に係る抗体に関する。本発明の１つの態様によれば、前記増殖性障害は、Ｂ細胞リンパ腫、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫からなる群より選択され、本明細書中のがんの何れかの難治性のもの、又は本明細書中のがんの１つ以上の組み合わせ、又は本明細書中に開示される前がん症状若しくは病変を含む。前がん症状又は病変として、例えば、口腔白板症、光線性角化症（日光角化症）、結腸又は直腸の前がん性ポリープ、胃の上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、バレット食道、膀胱異形成、及び前がん性頸部状態からなる群を含む。好ましくは、がんは、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、皮膚がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がん、腎臓がん及び脳がんからなる群より選択される。好ましい実施態様では、前記増殖性障害は、ＣＤ２０を発現する癌である。別の好ましい実施態様では、前記がんは、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択される。
【０２１２】
一実施態様では、前記自己免疫疾患は、限定されないが、免疫媒介性血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、レンサ球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多形性紅斑、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性ユビテランス（thromboangitis ubiterans）、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、多発筋痛症、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維化肺胞炎、炎症反応、例えば炎症性皮膚疾患、例えば乾癬及び皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患に関連する応答（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、呼吸促迫症候群（例えば、成人呼吸促迫症候群、ＡＲＤＳ）、皮膚炎、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、例えば湿疹及び喘息及び他の状態、例えばＴ細胞の浸潤及び慢性炎症性応答、粥状動脈硬化、白血球接着欠乏、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病（例えば１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病）、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、アレルギー性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、若年性糖尿病、及び典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎に見られるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型過敏症に付随する免疫応答、悪性アメニア（アジソン病）、白血球血管外漏出に関する病気、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器傷害症候群、溶血性貧血（限定されないが、寒冷グロブリン血症又はクームス陽性貧血）、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性の病気、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質症候群、アレルギー性神経炎、グレーブス病、ランバート・イートン症候群、類天疱瘡水疱性、天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌不全症、ライター病、全身硬直症候群、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチー、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫性血小板減少症からなる群より選択される。好ましい実施態様では、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される。
【０２１３】
更に別の実施態様は、がんの治療若しくは予防のため、又は前がん状態若しくは病変の治療若しくは予防のため、又は自己免疫疾患の治療のための医薬の製造のための、本発明による抗体の使用である。がん及び前がん状態は本明細書で定義される。一実施態様では、前記がんはＣＤ２０発現がんである。特定の前記がんは、好ましくはリンパ腫又はリンパ性白血病である。別の特定の実施態様では、前記がんは、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）、辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、大細胞型リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺性Ｂ細胞性リンパ腫を含む）、ヘアリー細胞白血病、リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキン病からなる群より選択される。好ましい実施態様では、前記がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からなる群より選択される。好ましい実施態様では、前記がんは、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択される。別の好ましい実施態様では、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される。
【０２１４】
本発明は、ヒト癌及び自己免疫疾患を治療するための薬学的組成物、組み合わせ、使用及び方法を包含する。本発明は、薬学的に有効量の本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、ヒト癌及び自己免疫疾患の治療における使用のための薬学的組成物を含む。
【０２１５】
本発明の抗体組成物は、限定されないが、静脈内、腹腔内、経口、腹腔内、又は腫瘍への直接投与を含む従来の投与様式を用いて投与することができる。静脈内投与が好ましい。
【０２１６】
本発明は更に、本発明の修飾された抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。本発明の一態様では、本発明の抗体を含有する治療用製剤は、貯蔵のために、所望の純度を有する抗体と、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度で受容者に対して非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０２１７】
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤を用いて高タンパク質濃度まで再構成することができ、再構成製剤は、本明細書で治療される個体に皮下投与することができる。
【０２１８】
また、本明細書中の製剤は治療される特定の適応症に必要な一を超える活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有していてよい。例えば、細胞傷害性剤、化学療法薬剤、サイトカイン又は免疫抑制剤（例えば、Ｔ細胞に作用する薬剤、例えば、シクロスポリン、又はＴ細胞に結合する抗体、例えばＬＦＡ−１に結合する抗体）を更に提供することが望ましい。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するアンタゴニストの量、疾患若しくは障害又は治療の種類、及び本明細書に議論される他の要因に依存する。これらは、一般的に、上文で用いられたのと同じ用量及び投与経路で使用されるか、又は従来用量の約１〜９９％の用量で使用される。
【０２１９】
活性成分もまた、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンで、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入され得る。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２２０】
徐放性製剤が調製されてもよい。適切な徐放性製剤は、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）のような分解ＬＵＰＲＯＮ性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０２２２】
本発明の組成物は、限定されないが、液体溶液又は懸濁液、錠剤、ピル、粉末、座剤、重合体マイクロカプセル又はマイクロベシクル、リポソーム及び注射又は輸液溶液を含む様々な投与形態であり得る。好ましい形態は、投与様式及び治療的適用に依存する。
【０２２３】
本発明の組成物はまた、好ましくは従来の薬学的に許容される担体及び当業者に既知であるアジュバント、例えばヒト血清アルブミン、イオン交換物質、アルミナ、レシチン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、及び塩又は電解質、例えば硫酸プロタミンを含む。
【０２２４】
本発明の薬学的組成物の最も効果的な投与様式及び投与レジメンは、疾患の重篤度及び経過、患者の健康及び治療への応答、並びに治療する医師の判断に依存する。従って、組成物の投与量は個々の患者に対して滴定されるべきである。それにもかかわらず、本発明の組成物の有効用量は、一般に、約０．０１〜約２０００ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。
【０２２５】
本発明の投薬量は、場合によっては、予測バイオマーカーの使用によって決定され得る。予測バイオマーカーは、例えば、腫瘍関連遺伝子若しくはタンパク質、又は腫瘍に関連するシグナル伝達経路の細胞成分の発現及び／又は活性化のパターンを決定する（すなわち、観察及び／又は定量する）ために使用される分子マーカーである。腫瘍組織における標的療法の生物学的効果を解明し、これらの影響を臨床応答と相関させることは、腫瘍において働く優勢な増殖経路及び生存経路を同定し、それにより、可能性のある応答者のプロファイルを確立し、逆に、治療に対する耐性を克服する戦略を設計するための論理的根拠を提供するのに役立つ。
【０２２６】
予測バイオマーカーは、限定されないが、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫蛍光、捕捉及び検出アッセイ、並びに逆相アッセイ、及び／又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０９７（Ａ１）号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるアッセイを含む当該技術分野で周知である細胞アッセイにより計測されてもよい。
【０２２７】
従って、一態様では、本発明は、標的抗原による細胞シグナル伝達の改変又は調節不全、及び／又は１つ以上の標的抗原の架橋及び／又はオリゴマー化を媒介する能力の改変に関する障害を治療するための方法であって、ここで、抗体療法によって媒介されるエフェクター機能の低減が、患者のために有益であり、標的抗原による細胞シグナル伝達の改変又は調節不全、及び／又は１つ以上の標的抗原の架橋及び／又はオリゴマー化を媒介する能力の改変に関連する障害（例えばがん）についての予測バイオマーカーの発現及び／又は活性化を検出する１つ又は複数の試薬による治療の前に、ヒト対象由来の試料をアッセイすることによって、治療を必要とするヒト対象において修飾された抗体を用いた治療に対する応答を予測し；１つ以上の予測バイオマーカーの発現及び／又は活性化のパターンを決定し、ここで、そのパターンが修飾された抗体による治療へのヒト対象の応答を予測し；かつ修飾された抗体での治療に陽性に応答すると予測されたヒト対象に、本発明の修飾された抗体を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法を提供する。本明細書に使用される場合、修飾された抗体治療に陽性に応答すると予測されるヒト対象は、修飾された抗体が、標的抗原による細胞シグナル伝達の改変又は調節不全、及び／又は１つ以上の標的抗原の架橋及び／又はオリゴマー化を媒介する能力の改変に関連する疾患又は障害について計測可能な効果（例えば、腫瘍退縮／縮小）を有するヒトであり、かつ修飾された抗体治療の利益が、有害作用（例えば、毒性）を下回ることがないヒトである。本明細書に使用される場合、試料は、１つの生物体、特にヒト由来の任意の生物学的試料を意味し、１つ以上の細胞、例えば任意の器官、組織、又は生検試料であって、乳房、肺、消化管、皮膚、子宮頸部、卵巣、前立腺、腎臓、脳、頭部及び頸部などの器官、又は身体の任意の他の器官若しくは組織から除去された試料、並びに、限定されないが、スメア、淡、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿、及び糞便を含む他の身体試料を含む。
【０２２８】
本発明の修飾された抗体を含む組成物は、医学実行動規範に合致する方法で処方され、調剤され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき因子としては、治療される特定の疾患又は障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患又は障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。投与される治療的有効量のアンタゴニストは、このように考慮することによって管理されるであろう。
【０２２９】
好ましい実施態様では、本発明による修飾された抗体は、ヒト化抗体である。そのような非コンジュゲート抗体の適切な投与量は、例えば、約２０ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。一実施態様では、本発明による修飾された抗体の投与量は、非置換の親抗体に現在推奨されている投与量と等しい。一実施態様では、本発明による修飾された抗体の投与量は、非置換の親抗体に現在推奨されている投与量と異なる。一実施態様では、本発明による修飾された抗体の投与量は、非置換の親抗体に現在推奨されている投与量と比較して少ない。一実施態様では、本発明による修飾された抗体の投与量は、非置換の親抗体に現在推奨されている投与量と比較して多い。一実施態様では、本発明による修飾された抗体は、抗体の実質的に３７５ｍｇ／ｍ２未満の１つ以上の用量で患者に投与され、限定されないが、その用量は、約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２、又は約５０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２の範囲である。別の実施態様では、修飾された抗体は、約３７５ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の治療的有効量で使用される。
【０２３０】
本発明によれば、抗体の１つ以上の初回用量（単数又は複数）に続いて１つ以上の次の用量が投与され、ここで、次の用量（単数又は複数）における抗体のｍｇ／ｍ２用量は、初回用量（単数又は複数）における抗体のｍｇ／ｍ２用量を超える。例えば、初回用量は、約２０ｍｇ／ｍ２から約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよく、その後の用量は、約２５０ｍｇ／ｍ２から約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよい。
【０２３１】
しかし、本明細書中に記載されるように、修飾された抗体のこれらの示唆された量は、多大な治療上の慎重さを必要とする。適切な用量と日程を選択する際の重要な要因は、本明細書に示されているように、得られた結果である。例えば、進行中及び急性疾患の治療のために、最初は比較的高用量が必要とされる場合がある。最も効果的な結果を得るためには、疾患又は障害に応じて、アンタゴニストは、疾患若しくは障害の最初の徴候、診断、出現、又は発生に可能な限り近くで投与されるか、又は疾患若しくは障害の寛解の間に投与される。
【０２３２】
本発明の修飾された抗体は、非経口、皮下、腹腔内、髄腔内、及び鼻腔内、並びに局所免疫抑制治療のために所望される場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。更に、アンタゴニストは、パルス注入によって、例えば、アンタゴニストの用量を減少させて、適切に投与することができる。好ましくは、投薬は、投与が短時間であるか長期であるかに応じて、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によって行われる。
【０２３３】
本発明によれば、細胞傷害性剤、化学療法剤、免疫抑制剤及び／又はサイトカインのような他の化合物が本明細書のアンタゴニストとともに投与される。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する共投与、及び何れかの順序での連続投与が含まれ、好ましくは両方の（又は全ての）活性剤がその生物学的活性を同時に発揮する期間がある。
【０２３４】
治癒を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量は、スケジュールの最適化により更に低減され得ることが明らかであろう。
【０２３５】
本発明の実施に従って、薬学的担体は、脂質担体であってもよい。脂質担体はリン脂質であってもよい。更に、脂質担体は脂肪酸であってもよい。また、脂質担体は界面活性剤であってもよい。本明細書で使用される場合、界面活性剤は、液体の表面張力を変化させ、一般にそれを下げる任意の物質である。
【０２３６】
本発明の一例では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。非イオン性界面活性剤の例には、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られる）、Ｂｒｉｊ及びＴｒｉｔｏｎ（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  ＷＲ−１３３９及びＴｒｉｔｏｎ  Ａ−２０）が含まれる。
【０２３７】
あるいは、界面活性剤は、イオン性界面活性剤であってもよい。
【０２３８】
更に、本発明によれば、脂質担体はリポソームであってもよい。本出願で使用される場合、「リポソーム」は、本発明の任意の分子又はそれらの組み合わせを含む任意の膜結合小胞である。
【０２３９】
例示的な実施態様
本発明による抗体は、親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含み、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ機能の大きな低減又は消失、ＡＤＣＰ機能の残存、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃ１ｑへの結合の低減又は消失、及び毒性の低減又は消失をもたらす。従って、以下のような例示的な実施態様が提供される。
１．親非置換重鎖領域に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体重鎖領域を含む抗体であって、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ａｓｎ２９７及び／又はＰｒｏ３２９を含み、前記置換がＡｓｎ２９７Ａｓｐ及び／又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙである、抗体。
２．エフェクター機能の誘導が、親非置換重鎖領域を含む抗体によって誘導されるエフェクター機能と比較して低減される、実施態様１に記載の抗体。
３．抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
４．親非置換抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、実施態様１から３の何れか一項に記載の抗体。
５．親非置換抗体が、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体である、実施態様１から４の何れか一項に記載の抗体。
６．親非置換抗体が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である、実施態様１から４の何れか一項に記載の抗体。
７．前記親非置換抗体が、オビヌツズマブである、実施態様１から４、又は６の何れか一項に記載の抗体。
８．前記親非置換抗体が、リツキシマブである、実施態様１から５の何れか一項に記載の抗体。
９．２９７位のアスパラギン又は３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩＩＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩＩＩ結合が消失した、実施態様１から８の何れか一項に記載の抗体。
１０．変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能が、２９７位のアスパラギン又は３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＣ機能と比較して、消失又は大きく低減している、実施態様１から９の何れか一項に記載の抗体。
１１．２９７位のアスパラギン又は３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によるＦｃγＲＩへの結合と比較して、変異体重鎖領域を含む抗体によるＦｃγＲＩ結合が低減した、実施態様１から１０の何れか一項に記載の抗体。
１２．変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能が、２９７位のアスパラギン又は３２９位のプロリンを含む親非置換抗体によって誘導されるＡＤＣＰ機能と比較して低減しており、変異体重鎖を含む抗体が、残存するＡＤＣＰ機能を保持する、実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体。
１３．変異体重鎖領域が、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ｐｒｏ１５１を含み、かつ、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｐｒｏ１５１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、実施態様１から１２の何れか一項に記載の抗体。
１４．変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、実施態様１３に記載の抗体。
１５．変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１５１位のプロリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、実施態様１３に記載の抗体。
１６．Ｐｒｏ１５１が、アラニン及びフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、実施態様１３に記載の抗体。
１７．Ｐｒｏ１５１が、フェニルアラニンで置換されている、実施態様１３又は１４の何れか一項に記載の抗体。
１８．Ｐｒｏ１５１が、アラニンで置換されている、実施態様１３又は１５の何れか一項に記載の抗体。
１９．変異体重鎖領域が、親非置換重鎖領域に対して更なるアミノ酸置換を含み、親非置換抗体の重鎖領域がアミノ酸残基Ｖａｌ１１を含み、かつ、前記更なる置換が前記アミノ酸残基Ｖａｌ１１にあり、変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して変化している、実施態様１から１８の何れか一項に記載の抗体。
２０．変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して増加する、実施態様１９に記載の抗体。
２１．変異体重鎖領域を含む抗体によって誘導される直接細胞死が、１１位のバリンを含む抗体によって誘導される直接細胞死と比較して減少する、実施態様１９に記載の抗体。
２２．Ｖａｌ１１が、アラニン、グリシン、フェニルアラニン、スレオニン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、実施態様１９に記載の抗体。
２３．Ｖａｌ１１が、フェニルアラニン、スレオニン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、実施態様１９又は２０に記載の抗体。
２４．Ｖａｌ１１が、アラニン及びグリシンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、実施態様１９又は２１に記載の抗体。
２５．抗体がＣＤ２０に特異的に結合する、実施態様１から２４の何れか一項に記載の抗体。
２６．抗体が、スキャッチャード分析によって決定されるように、１０ｎＭ以下の、細胞に対する解離定数（Ｋｄ）でＣＤ２０に結合する、実施態様１から２５の何れか一項に記載の抗体。
２７．実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体の変異体重鎖領域をコードするポリヌクレオチド。
２８．実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体の軽鎖領域をコードするポリヌクレオチド。
２９．実施態様２７及び２８に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含むベクター。
３０．ポリシストロニックである実施態様２９に記載のベクター。
３１．実施態様２９及び３０に記載のベクターの１つ、又は実施態様２７及び２８に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む宿主細胞。
３２．（ｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、実施態様３０に記載の宿主細胞を培養すること；及び（ｉｉ）培養培地から前記抗体を回収することを含む、実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体の製造方法。
３３．実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
３４．医薬としての使用のための、実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体。
３５．増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体。
３６．前記増殖性障害が、ＣＤ２０発現がんであることを特徴とする、実施態様３５に記載の使用のための抗体。
３７．前記がんが、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択されることを特徴とする、実施態様３６に記載の使用のための抗体。
３８．前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される、実施態様３５に記載の使用のための抗体。
３９．実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患を治療するための方法。
４０．前記増殖性障害が、ＣＤ２０発現がんであることを特徴とする、実施態様３９に記載の方法。
４１．前記がんが、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択されることを特徴とする、実施態様４０に記載の方法。
４２．前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される、実施態様３９に記載の方法。
４３．医薬の製造のための、実施態様１から２６の何れか一項に記載の抗体の使用。
４４．医薬が、増殖性障害及び自己免疫疾患からなる群より選択される疾患を治療するためである、実施態様４３に記載の使用。
４５．前記増殖性障害が、ＣＤ２０発現がんであることを特徴とする、実施態様４４に記載の使用。
４６．前記がんが、リンパ腫及びリンパ性白血病からなる群より選択されることを特徴とする、実施態様４５に記載の使用。
４７．前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群及び移植拒絶反応からなる群より選択される、実施態様４４に記載の使用。
【０２４０】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。以下の調製物及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施できるようにするために与えられる。しかしながら、本発明は、本発明の単なる態様の例示として意図された例示的な実施形態によって範囲が限定されず、機能的に等価な方法も本発明の範囲内である。実際、本明細書に開示されたものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような修正は、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【実施例】
【０２４１】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２４２】
実施例１
抗体
下記の実験では、ＣＤ２０に対する抗体（オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、推奨ＩＮＮ、WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453及びリツキシマブ、米国特許第７，３８１，５６０号及び欧州特許第２０００１４９（Ｂ１）号）を使用した。本明細書に開示される全ての変異体、例えば、オビヌツズマブ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、オビヌツズマブ  Ｎ２９７Ｄ、リツキシマブ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びリツキシマブＮ２９７Ｄは、ＰＣＲに基づく突然変異誘発を用いて生成された。ＩｇＧ分子をＨＥＫ−ＥＢＮＡ又はＨＥＫ２９３系において発現させ、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２４３】
実施例２
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体による腫瘍標的の細胞死誘導
ＣＤ２０発現マントル細胞リンパ腫（Ｚ−１３８）を用いて、オビヌツズマブ及びリツキシマブ変異体による細胞死の誘導を試験した。簡潔には、細胞は採取され、計数され、生存率をチェックされて、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ中に、１ｍｌあたり０．５２６×１０６個の細胞で再懸濁された。１９０μｌの細胞懸濁液（０．１×１０６個の細胞を含む）を、丸底９６ウェルプレート中、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間〜２４時間、細胞インキュベーター中で、異なる濃度のオビヌツズマブ又はリツキシマブＦｃ変異体（１６ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。最終体積は２００μｌ／ウェルであった。その後、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＡＯＨ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）で１回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＬＵＯＳ（Ｒｏｃｈｅ＃１１８２８６８１００１、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合緩衝液で１：７５に予め希釈したもの）とともに、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を８０μｌ／ウェルのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合緩衝液の添加により洗浄し、予め希釈したＰＩ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｐ４８６４，１：４０００）の添加後、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより直ちに分析した。
【０２４４】
図１は、異なるオビヌスツズマブ又はリツキシマブＦｃ変異体の存在下でのアネキシンＶ結合並びにＰＩ染色によって測定した、Ｚ−１３８上のホスファチジルセリン表面発現の誘導を示す。全てのオビヌツズマブ変異体は、２１時間のインキュベーション中にＺ−１３８の有意な細胞死を誘導したが、一方全てのリツキシマブ変異体は、選択された条件下ではほとんど細胞死を誘導しなかった。細胞死の誘導は、抗体のＦｃ部分とは無関係であった。高抗体濃度でのみ、オビヌツズマブ  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びオビヌツズマブＮ２９７Ｄは、オビヌツズマブ  ＷＴ及びＧＥよりわずかに劣っているようであった。
【０２４５】
実施例３
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体によるＡＤＣＣ誘導
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体によって媒介されるＣＤ２０発現腫瘍細胞の溶解及びその後のＮＫ細胞活性化を、Ｚ−１３８細胞（マントル細胞リンパ腫）及びＳＵ−ＤＨＬ−４（Ｂ−ＮＨ）について評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、腫瘍細胞溶解を、異なる抗ＣＤ２０抗体との４時間のインキュベーション後に検出した。簡潔には、標的細胞を採取し、洗浄し、丸底９６ウェルプレートを用いて３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なヒトドナーから得られた新鮮な血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製した。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重層した（Ｓｉｇｍａ、１０７７１）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温、ブレーキなし）の後、ＰＢＭＣ含有中間層より上の血漿を捨て、続いてＰＢＭＣを新たなファルコン管に移し、その後５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離（３５０×ｇ、１０分間、室温）し、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離行程は３００×ｇ、１０分間）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、１２．５又は１５×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ  Ｖに再懸濁した。ＡＤＣＣについては、指示された濃度で抗体を添加した（０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で３重に）。更に、抗ＣＤ１０７ａ（ＰＥ抗ヒトＣＤ１０７ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３２８６０８）をアッセイに直接添加した。ＰＢＭＣを最終的なＥ：Ｔ比が２１：１又は２５：１で標的細胞に添加した。標的細胞の溶解を、３７℃、５％ＣＯ２での４時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１６４４７９３００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、抗体なしでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞を指す。ＡＤＣＣの際に生じるＮＫ細胞活性化の評価のために、細胞を４００ｘｇで４分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳ＋５ｍＭＥＤＴＡ＋０．２５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で２回洗浄した。ＣＤ３（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００４２０）及びＣＤ５６（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ５６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１８３１０）の表面染色を供給者の指示に従って行った。細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ＃３４９２０２）を用いて固定した。試料をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて分析した。
【０２４６】
図２Ａ及びＢは、オビヌツズマブ及びリツキシマブＧＥ抗体が、ＣＤ２０＋標的細胞の強い標的特異的死滅を誘導したことを示している。オビヌツズマブ ＧＥはリツキシマブＧＥよりも優れており、両方の抗体は、オビヌツズマブ及びリツキシマブのＷＴ  Ｆｃ変異体よりも優れていた。また、ＷＴ  Ｆｃ変異体として、オビヌツズマブはリツキシマブより優れていた。オビヌツズマブ若しくはリツキシマブのＮ２９７Ｄ又はＰ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ  Ｆｃ変異体は、標的としてＺ−１３８又はＳＵ−ＤＨＬ−４を用いた検出可能な腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。フローサイトメトリーによるＮＫ細胞脱顆粒の分析は、試験したＦｃ変異体のデータ及び活性を確認した（図２Ｃ、Ｄ）。オビヌツズマブ及びリツキシマブＧＥ抗体は、ＮＫ細胞上でのＣＤ１０７ａ発現によって測定されるように、強い脱顆粒を誘導した。オビヌツズマブＧＥはリツキシマブＧＥよりも優れており、両方の抗体は、オビヌツズマブ及びリツキシマブのＷＴ  Ｆｃ変異体よりも優れていた。また、ＷＴ  Ｆｃ変異体として、オビヌツズマブはリツキシマブより優れていた。オビヌツズマブ若しくはリツキシマブのＮ２９７Ｄ又はＰ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ  Ｆｃ変異体は、検出可能なＣＤ１０７ａ発現を誘導しなかった。
【０２４７】
実施例４
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体によるＣＤＣ誘導
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体によって媒介されるＣＤ２０発現腫瘍細胞のＣＤＣ依存性溶解の誘導を、Ｚ−１３８細胞及びＳＵ−ＤＨＬ−４について評価した。ウサギ補体（低毒性ウサギ補体、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ＃ＣＬ３０５１）を補体として使用し、腫瘍細胞溶解を、異なる抗ＣＤ２０抗体とのインキュベーションの２時間又は２４時間後に検出した。簡潔には、標的細胞を採取し、洗浄し、丸底９６ウェルプレートを用いて５０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。ＣＤＣについては、５０μｌ／ウェルにおいて示された濃度（０．０１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌで３重に）で抗体を添加し、細胞と共に室温で１０分間インキュベートした。一方、補体を１ｍｌのＣｅｄａｒｌａｎｅ細胞傷害性培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  ＃ＣＬ９５１００）及び２ｍｌのＡＩＭ  Ｖ（バイアルあたり）に溶解した。調製した補体５０μｌ／ウェルを細胞に添加した。標的細胞の溶解を、３７℃、５％ＣＯ２での２時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１６４４７９３００１）により評価した。３５μｌ／ウェルのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ＃ＤＡＬ１１００）を添加した後、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で更に２２時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（励起５８４ｎｍ、放出６１２ｎＭ）を用いて、腫瘍細胞生存率を測定した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、抗体なしでＣＤＣと共にインキュベートした標的細胞を指す。
【０２４８】
図３Ａ〜Ｄは、リツキシマブＧＥ及びＷＴ抗体が、ＣＤ２０＋標的細胞の強力かつ標的特異的な死滅を２時間及び２２時間後に誘導したことを示す。オビヌツズマブＧＥ及びＷＴ  Ｆｃ変異体もまたＣＤＣを誘導したが、リツキシマブＧＥ及びＷＴに比べて有意に劣っていた。オビヌツズマブ若しくはリツキシマブのＮ２９７Ｄ又はＰ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  Ｆｃ変異体は、標的としてＺ−１３８又はＳＵ−ＤＨＬ−４を用いた検出可能な腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。
【０２４９】
実施例５
オビヌツズマブ又はリツキシマブＦｃ変異体により媒介されるヒトの全血におけるＢ細胞枯渇
オビヌツズマブ又はリツキシマブＦｃ変異体によって媒介される正常なＢ細胞枯渇も、健常なボランティアからの新鮮なヘパリン添加ヒト血液を用いて評価した。簡潔に述べると、新鮮な血液をヘパリン含有注射器に採取した。血液アリコート（１９０μＬ／ウェル）を９６ディープウェルプレートに入れ、オビヌツズマブ又はリツキシマブＩｇＧ変異体希釈物を補充し（０．１μｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で１０μＬ／ウェル）、加湿した細胞インキュベーター中、３７℃及び５％ＣＯ２で２０時間〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、血液を上下にピペッティングして混合し、３５μＬ／ウェルの血液アリコートを９６丸底プレートに移し、フローサイトメトリー用に総量５５μＬで、蛍光抗ＣＤ４５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４５、ＢＤ＃５５５４８５）、抗ＣＤ１９（ＰＥ抗ヒトＣＤ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２２０８）及び抗ＣＤ３（ＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００４２０）と共にインキュベートした。室温（暗所）で１５分間インキュベートした後、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ＃３４９２０２）を添加して赤血球を枯渇させ、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いたフローサイトメトリーの前に細胞を固定した。
【０２５０】
図４Ａ（ドナー１）及びＢ（ドナー２）は、オビヌツズマブ及びリツキシマブＧＥ抗体が、健常なヒト全血においてＣＤ２０＋／ＣＤ１９＋  Ｂ細胞の強い死滅を誘導したことを示す。オビヌツズマブ ＧＥはリツキシマブＧＥよりも優れており、両方の抗体は、オビヌツズマブ及びリツキシマブのＷＴ  Ｆｃ変異体よりも優れていた。また、ＷＴ  Ｆｃ変異体として、オビヌツズマブはリツキシマブより優れていた。オビヌツズマブＮ２９７Ｄ及びＰ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ  Ｆｃ変異体はまた、オビヌツズマブによって媒介されるＦｃ非依存性直接細胞死効果に起因する、いくらかのＢ細胞枯渇を誘導した。それとは対照的に、リツキシマブＮ２９７Ｄ及びＰ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ  Ｆｃ変異体は、検出可能なＢ細胞枯渇を誘導しなかった。Ｉ型ＣＤ２０バインダーとして、実施例２に示すように、リツキシマブは、オビヌツズマブと比較してわずかな直接細胞死の誘導しか誘導しなかった。表２は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで計算した対応するＥＣ５０値を示す。
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【０２５１】
実施例６
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体によるＡＤＣＰ誘導
オビヌツズマブ及びリツキシマブＦｃ変異体によって媒介される単球由来マクロファージ（Ｍ１又はＭ２ｃ）によるＣＤ２０発現腫瘍細胞の抗体依存性食作用（ＡＤＣＰ）を、Ｚ−１３８細胞（マントル細胞リンパ腫）及びＳＵ−ＤＨＬ−４（Ｂ−ＮＨ）について評価した。パン単球をヒトＰＢＭＣから単離し（ＰＢＭＣ単離は実施例３を参照）、３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを用いて７日間でマクロファージに分化させ、続いて１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０と２日間インキュベートし、Ｍ２ｃマクロファージを生成し、又は１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｇ＋１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと１日間インキュベートし、Ｍ１マクロファージを生成した。分化したＭ１及びＭ２ｃマクロファージを、製造業者の指示に従ってＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、エフェクターとして使用し、異なる抗ＣＤ２０抗体との４時間のインキュベーション後に食作用を検出した。簡単には、標的細胞を採取し、洗浄し、２μＭのＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、次いで９６ウェルＵｐＣｅｌｌプレートを用いて３０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。ＡＤＣＰについては、１０ｍｇ／ｍｌのＲｅｄｉｍｕｎｅ（Ｂｅｈｒｉｎｇ）の存在下又は非存在下で、抗体を５０ｎｇ／ｍｌ又は１０００ｎｇ／ｍｌで３重に添加した。ＰＫＨ２６標識Ｍ１又はＭ２ｃマクロファージを最終Ｅ：Ｔ比３：１で標的細胞に添加した。ＡＤＣＰは、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを用いたフローサイトメトリーにおいてＣＦＳＥ−ＰＫＨ２６−二重陽性細胞を分析することにより、３７℃及び５％ＣＯ２での４時間のインキュベーション後に評価した。
【０２５２】
図５Ａ〜Ｄは、１０ｍｇ／ｍｌの非特異的ヒトＩｇＧ（Ｒｅｄｉｍｕｎｅ）の存在下で、ＳＵ−ＤＨＬ−４又はＺ−１３８をＭ１又はＭ２ｃマクロファージとともに４時間インキュベートした後のＡＤＣＰを示す。Ｍ１及びＭ２ｃマクロファージは、選択した条件下で同等の食作用を働いた。４時間後、ＳＵＤＨＬ４の食作用は、Ｚ−１３８と比較して１０００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２０抗体の存在下で有意に高かった。オビヌツズマブＷＴ及びＮ２９７Ｄは、ＳＵ−ＤＨＬ−４及びＺ−１３８を使用して、有意で同等の食作用を誘導した。オビヌツズマブ ＧＥは、１０ｍｇ／ｍｌのＲｅｄｉｍｕｎｅの存在下で、オビヌツズマブＷＴ及びＮ２９７Ｄと比較して、エフェクターとしてＭ２ｃを用いて、主にＣＤ２０＋  ＳＵ−ＤＨＬ−４標的細胞のわずかに強い食作用を誘導した。
【０２５３】
実施例７
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体であるオビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ及びオビヌツズマブ変異体ＧＡ１０１  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びＧＡ１０１アグリコ（Ｎ２９７Ｄ）の抗腫瘍活性
試験薬剤
抗体は、ヒスチジン緩衝液中でＲｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔ  ＡＧ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからストック溶液として提供された。抗体を、ｉｎ−ｖｉｖｏ適用の前に０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈した。
【０２５４】
細胞株及び培養条件
ヒトＳＵ−ＤＨＬ−４リンパ腫細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中、３７℃、５％ＣＯ２の水飽和空気中で培養した。ｉｎ−ｖｉｖｏ異種移植実験のために、細胞にマトリゲルを同時注入した。
【０２５５】
動物
到着時に５〜６週齢の雌ＳＣＩＤｂｅｉｇｅマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入）を動物施設の隔離部分で１週間維持し、その後ガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明／１２時間暗の毎日のサイクルで特定の病原体を含まない条件下で維持した。Ｒｏｃｈｅと地方自治体が実験的研究プロトコールをレビューし承認した（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ、登録番号５５．２−１−５４−２５３１．２−２６−０９）。規制食（ＫＬＩＢＡ  ＮＡＦＡＧ  ３８０７）及び水（濾過）は自由に与えられた。
【０２５６】
ＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅマウスにおけるＳＣ  ＳＵ−ＤＨＬ−４腫瘍の誘導
雌のＳＣＩＤｂｅｉｇｅマウスの右脇腹に、マトリゲル（５０：５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を含む１００μｌのＰＢＳ中の５百万個（５×１０６）のＳＵ−ＤＨＬ−４腫瘍細胞を皮下注射した。
【０２５７】
モニタリング
動物は、臨床症状及び副作用の検出のために毎日モニターされた。実験の間、動物の体重を週に２回確認し、腫瘍体積をノギスで測定した。
【０２５８】
動物の治療
動物の治療は、腫瘍細胞接種の２１日後の無作為化の日に開始された。ヒト化ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、リツキシマブ、ＧＡ１０１  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ及びオビヌツズマブＮ２９７Ｄを、単剤として腹腔内に（ｉ．ｐ．）ｑ７ｄで４週間週１回（２１、２８、３５及び４２日目）、３０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。対応するビヒクルを同じ日に投与した。
【０２５９】
４９日目の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）
ＧＡ１０１  Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、リツキシマブ又はオビヌツズマブＮ２９７Ｄを用いた単独療法は、それぞれ６２％、７１％又は９３％の腫瘍増殖阻害をもたらした（中央値に基づく）。オビヌツズマブ治療は、腫瘍細胞接種後４９日目に腫瘍退縮（ＴＧＩ＞１００％）を示した。
【０２６０】
４９日目のノンパラメトリックな治療対コントロール比（ＴＣＲｎｐａｒ）
腫瘍細胞接種後４９日目の統計学的有意性を評価するために、ノンパラメトリックな治療対コントロール比（ＴＣＲｎｐａｒ）及び両側ノンパラメトリック信頼区間（ＣＩ）をベースライン補正データに基づいて比によって計算した。各治療は、コントロール群と比較して統計学的に有意であった。
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【０２６１】
実施例８
ＦｃγＲＩ  ＳＰＲアッセイ
捕捉されたＦｃγＲＩ及びＩｇＧ１  Ｆｃ変異体のＳＰＲ相互作用分析は、高固定化抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。抗Ｈｉｓ捕捉抗体の固定は、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ溶液中で、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＣＭ５チップ上で行った。抗Ｈｉｓの固定化レベルは１０．０００ＲＵ以上に達した。ＦｃγＲＩを、ランニング緩衝液ＨＢＳ−Ｐ＋中で、１００ｎＭの溶液で適用し、毎分３０μｌの流速で６０秒のパルスで捕捉した。続いて、ＧＡ１０１  Ｎ２９７ＤをＨＢＳ−Ｐ＋中で１０００〜６２．５ｎＭの段階希釈で、毎分３０μｌの流速で６０秒間適用した。解離相を１８０秒間モニターした。表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いて３０ｍＭ／分の流速で６０秒間の洗浄工程によって再生した。安定化期間は６０秒を要した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアをデータ分析に使用した。
【０２６２】
ＦｃγＲＩ  ＳＰＲアッセイの定常状態評価
定常状態親和性濃度決定のために、会合の終了からの応答値を使用して、濃度に対する応答をプロットした。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて、プロットからの固定化ＦｃγＲＩ受容体に対する試料の親和性を計算した。
【０２６３】
野性型ＩｇＧ１（ハーセプチンＷＴ）分子及びＩｇＧ４ＳＰＬＥ分子（Ｐ−セレクチン）と比較した、ＧＡ１０１  Ｎ２９７ＤのＦｃγＲＩとの相互作用の測定は、明確な結合順序を示した（図７Ａ）。２００ｎＭの抗体濃度で測定して、ＩｇＧ１  ＷＴは、２５０応答単位（ＲＵ）までの最高の相互作用シグナルを示し、ＧＡ１０１  Ｎ２９７Ｄは１５０のＲＵシグナルを表示し、一方Ｐ−セレクチンは２５応答単位の非常に低い結合シグナルしか示さなかった（図７Ｂ）。ＩｇＧ１  Ｗｔ抗体は、ナノモル範囲の親和性でＦｃγＲＩに結合することが知られている。ＧＡ１０１  Ｎ２９７Ｄの親和性を決定するために、定常状態親和性決定を行った。親和性は、２３４ｎＭとして測定され（図７Ｃ）、これはＩｇＧ１  Ｗｔ親和性より約５０倍低いが、ＩｇＧ４ＳＰＬＥ  ＦｃγＲＩ結合の低減と比較して著しく強く、特定の親和性を決定することができない。
【０２６４】
実施例９
ＦｃγＲＩＩＩ  ＳＰＲアッセイ
捕捉されたＦｃγＲＩＩＩＡ及びＩｇＧ１  Ｆｃ変異体のＳＰＲ相互作用分析は、高固定化抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。抗Ｈｉｓ捕捉抗体の固定は、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ溶液中で、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＣＭ５チップ上で行った。抗Ｈｉｓの固定化レベルは１０．０００ＲＵ以上に達した。ＦｃγＲＩＩＩＡを、ランニング緩衝液ＨＢＳ−Ｐ＋中で、２００ｎＭの溶液で適用し、毎分３０μｌの流速で６０秒のパルスで捕捉した。続いて、ＧＡ１０１  Ｎ２９７ＤをＨＢＳ−Ｐ＋中で１０００〜６２．５ｎＭの段階希釈で、毎分３０μｌの流速で６０秒間適用した。解離相を１８０秒間モニターした。表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いて３０ｍＭ／分の流速で６０秒間の洗浄工程によって再生した。安定化期間は６０秒を要した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアをデータ分析に使用した。
【０２６５】
ＧＡ１０１  Ｎ２９７Ｄの時間分解結合測定は、ハーセプチンＷＴ  ＩｇＧ１分子とは対照的に、ＦｃγＲＩＩＩＡとの測定可能な相互作用を示さなかった（図８Ａ）。類似の定常状態親和性決定実験を実施すると、明確な濃度依存性結合シグナルは測定できなかった。１μＭの最高濃度は５のＲＵ値のみを示し、相互作用の飽和は観察されなかった（図８Ｂ）。結果として、可飽和性相互作用は、関連する相互作用シグナルも示さなかった、ＩｇＧ４  ＳＰＬＥコントロールの親和性と同等に、ＳＰＲによって決定され得る値（高μＭ範囲）よりも低かった（図８Ａ）。
【０２６６】
実施例１０
ＳＰＲ  ＦｃγＲ捕捉セットアップ（図７Ｄ、８Ｃ、９Ａ、９Ｂ）
捕捉されたＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ１３１）及びＦｃγＲＩＩａ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８））及びＩｇＧ１  Ｆｃ変異体のＳＰＲ相互作用分析は、高固定化抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。抗Ｈｉｓ捕捉抗体の固定は、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ溶液中で、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＣＭ５チップ上で行った。抗Ｈｉｓの固定化レベルは＞１００００ＲＵに達した。ＦｃγＲは、ランニング緩衝液ＨＢＳ−Ｐ＋を用いてそれぞれ１００ｎＭの溶液として調製し、流速３０μｌ／分で６０秒のパルスで捕捉した。続いて、ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｈｉｓタグ付き変異体を、ＨＢＳ−Ｐ＋中で１００ｎＭの濃度で、流速３０μｌ／分で６０秒間適用した。解離相を１８０秒間モニターした。表面を、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を用いて３０μｌ／分の流速で６０秒の洗浄工程によって再生した。安定化期間は６０秒に設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアをデータ分析に使用した。
【０２６７】
実施例１１
熱安定性
融解温度Ｔｍを、Ｏｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）を用いて内因性トリプトファン蛍光を記録することにより評価した。試料を、２０ｍＭヒスチジンクロライド、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で約１ｍｇ／ｍＬで調製し、９μＬマルチキュベットアレイに移した。マルチキュベットアレイを０．１℃／分の一定速度で３０℃から９０℃に加熱した。本装置は、励起後の蛍光発光スペクトルを２６６ｎｍレーザーで連続的に記録し、約０．６℃毎にデータポイントを提供する。融解温度Ｔｍは、蛍光強度を温度に対してプロットすることによって決定され、Ｔｍは、これらの曲線における変曲点として定義される。
【０２６８】
両方のＮ２９７Ｄ変異体は、それぞれのＰ３２９Ｇ変異体に比べて６℃低い凝集温度を示す（図１３）。更に、脱グリコシル化されたＮ２９７Ｄ変異体の融解温度は、より安定なＰ３２９Ｇ変異体よりも低い。Ｐ３２９Ｇはより高い温度で活性なコンフォメーションにとどまり、より良好な構造的完全性を示す。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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