(57)【要約】  ｉＰＳＣ細胞などの前駆細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法が開示される。開示された肝臓オルガノイドは、肝不全および／または薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）、および／または薬物毒性などの重篤な有害事象（ＳＡＥ）についてのスクリーニングに使用することができる。開示された肝臓オルガノイドは、肝障害を有する個体を治療するために、または好ましい治療薬を同定するためにも使用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＰＳＣ細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法であって、
ａ）後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１〜約３日間、前記ｉＰＳＣ細胞由来の胚体内胚葉（ＤＥ）を、ＦＧＦ経路活性化剤およびＧＳＫ３阻害剤と接触させるステップと；
ｂ）前記肝臓オルガノイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１〜約５日間、好ましくは約４日間、レチノイン酸（ＲＡ）の存在下でステップａの前記後部前腸スフェロイドをインキュベートするステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞がヒトｉＰＳＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前腸スフェロイドが、基底膜マトリックス、好ましくはＭａｔｒｉｇｅｌに埋め込まれている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＬＯが、好ましくは発現が４０日目から５０日目に測定される場合に、前記ＨＬＯが、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）およびシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、ＨＮＦ４ａ、Ｅ−カドヘリン、ＤＡＰＩ、およびＥｐｃａｍを発現することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＬＯが、前記ＨＬＯが胆汁輸送活性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
間葉系細胞を含む内在化微絨毛を含む管腔構造を含む、幹細胞由来の肝臓オルガノイドであって、前記管腔構造が極性肝細胞および基底膜によって囲まれている、肝臓オルガノイド。
【請求項７】
前記幹細胞がヒトｉＰＳＣである、請求項６に記載の肝臓オルガノイド。
【請求項８】
前記肝臓オルガノイドが、機能的星細胞および機能的クッパー細胞を含む、請求項６または請求項７に記載の肝臓オルガノイド。
【請求項９】
前記肝臓オルガノイドが、以下：胆汁産生能、胆汁輸送活性、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｈ発現、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｂ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ３発現；少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ４発現、少なくとも１，０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のフィブリノゲン産生、および少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のアルブミン産生、のうちの１つ以上を有することを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の肝臓オルガノイド。
【請求項１０】
前記肝臓オルガノイドが、少なくとも１０，０００ｎｇ／ｍＬ  １ｘｅ６細胞／２４時間の総肝臓タンパク質発現を有することを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載の肝臓オルガノイド。
【請求項１１】
前記肝臓オルガノイドが、ＰＲＯＸ１、ＲＢＰ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＢＣＣ１１、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ５、ＡＬＢ、ＦＢＧ、ＭＲＰ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ６８、ＣＤ３４、ＣＤ３１から選択される１つ以上の遺伝子を発現する、請求項６〜１０のいずれかに記載の肝臓オルガノイド。
【請求項１２】
前記ＨＬＯが、薬物代謝シトクロム変異体、好ましくはＣＹ２Ｃ９＊２変異体を含む、請求項６〜１１のいずれかに記載の肝臓オルガノイド。
【請求項１３】
前記肝臓オルガノイドが浮遊しており、炎症細胞、例えばＴ細胞または他の炎症性分泌タンパク質を含まない、請求項６〜１２のいずれかに記載の肝臓オルガノイド。
【請求項１４】
重篤な有害事象（ＳＡＥ）、好ましくは肝不全および／または薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）についてスクリーニングする方法であって、対象となる薬物を請求項１〜１３のいずれかに記載の肝臓オルガノイドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１５】
前記方法が、フルオレセインジアセテート（ＦＤ）の摂取および／または流出を測定するステップを含み、排出障害が、前記薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象となる薬物の毒性が、ミトコンドリア膜電位、ＲＯＳの測定、肝臓ミトコンドリアの膨潤、およびそれらの組み合わせから選択されるパラメータの測定によって決定され、前記ミトコンドリアに対する損傷が、前記薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法がオルガノイド生存率を測定するステップを含み、オルガノイド生存率の決定における障害が、前記薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
肝障害を有する個体を治療する方法であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の肝臓オルガノイドを前記個体に移植することを含む方法。
【請求項１９】
前記肝障害が、代謝性肝疾患、末期肝疾患、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象となるｉＰＳＣ由来の肝臓オルガノイドを候補化合物と接触させることを含む、個体にとって好ましい治療薬を同定する方法。
【請求項２１】
前記対象となるｉＰＳＣが、前記個体に見出される１つ以上の変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象となるｉＰＳＣが、前記個体と同じ民族的背景に由来する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象となるｉＰＳＣが前記個体に由来する、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，３７１号、および２０１６年６月９日に出願された第６２／５１７，４１４号の優先権および利益を主張するものであり、これらの各内容は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、外因性化合物の解毒および凝固、ならびに脂質、タンパク質、アンモニウム、および胆汁の生成など、生命に不可欠な多くの代謝機能を提供する重要な器官である。患者の肝臓のインビトロ再構成は、再生療法、創薬および薬物毒性研究を含む用途を提供し得る。肝細胞を用いた既存の方法論は、必須の解剖学的構造の欠如に主に起因しているが、非常に貧弱な機能性を示し、それは製薬産業におけるそれらの実際的使用を制限している。
【０００３】
製薬産業では、初期スクリーニングで同定された候補薬の失敗により、医薬品開発から毎年数十億ドルが失われ、そのような失敗のために３分の１近くの薬が市場から回収される（ＴａｋｅｂｅおよびＴａｎｉｇｕｃｈｉ，２０１４）。薬物候補の失敗は、患者の治療機会の甚大なる喪失をもたらす。前臨床試験は一般的に、「ヒット」化合物を同定するための主要な有効性スクリーニングとしてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価と、それに続く代謝および毒性の機序を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性試験と、で構成される。この非効率性は、ヒトにおける薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）を評価するのに高いスループットを伴う生理学的に関連する前臨床モデルが実質的に欠如していることから説明することができ、したがって、絶え間なく増大する化合物ライブラリの莫大な数を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏヒトスクリーニングモデルを早急に開発する必要がある。
【０００４】
初代肝細胞は、高度に極性のある代謝細胞型であり、微絨毛線チャネルを有する毛細胆管構造を形成し、末梢循環を胆汁酸分泌経路から分離する。ＤＩＬＩの最も上流の局面は、肝細胞による薬物（またはそれらの反応性代謝産物）解毒および多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）輸送体などの輸送体を介した毛細胆管への排泄を含む。これは、ＤＩＬＩ病理学を予測するために肝細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの重要な特性としてこれらの独自に組織化された構造を再構築する必要性を示唆している。しかしながら、トログリタゾン、ネファゾドンおよびトルカポンの場合においてのように（ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｖｅｒｔｏｘ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、単離された初代ヒト肝細胞または肝細胞株の使用を伴う現在の単純化された培養モデルとｉｎ  ｖｉｖｏ生理学との間には、薬物毒性プロファイルにかなりの違いがある。したがって、毒性学的特性の決定は主に、薬物開発のための必須のステップとして動物に依存しているが、ヒトと動物との間の生理学には顕著な違いがあるために、ヒトの結果に対する忠実度は著しく欠如している（Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。さらに、特異体質性ＤＩＬＩ（ＩＤＩＬＩ）の発症は非常にまれであるが、それにもかかわらず、米国の急性肝不全の約１０〜１５％に関与しており（Ｒｅｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、予測はほとんど不可能である（Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。まとめると、提案された薬物の解毒および排泄を試験する化合物をスクリーニングするために効果的なヒト細胞モデルが必要とされている。
【０００５】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からのヒト肝細胞分化方法の斬新的進歩にもかかわらず、ヒト幹細胞を用いたディッシュでの臨床試験は依然として「誇大宣伝」である。有効性および／または毒性についての薬物スクリーニングのみならず、例えば、移植用のブリッジとして、また精密（個別化医療）用のブリッジとして、生体人工肝臓装置に使用されるための肝細胞モデルが必要とされている。本開示は、当該技術分野における前述の必要性のうちの１つ以上に対処しようと努めたものである。
【発明の概要】
【０００６】
ｉＰＳＣ細胞などの前駆細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法が開示される。開示された肝臓オルガノイドは、肝不全および／または薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）、および／または薬物毒性などの重篤な有害事象（ＳＡＥ）についてのスクリーニングに使用することができる。開示された肝臓オルガノイドは、肝障害を有する個体を治療するために、または好ましい治療薬を同定するためにも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するだろう。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
【０００８】
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を伴うこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および手数料の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【０００９】
【図１】管腔構造を伴うｉＰＳＣからのヒト肝臓オルガノイドの生成。Ａ．肝臓オルガノイドについての分化方法の概要。Ｂ．ヒト肝臓オルガノイドの位相差画像。Ｃ．オルガノイド中のアルブミン（ＡＬＢ）、ＩＶ型コラーゲン（コラーゲンＩＶ）およびＺＯ−１の免疫染色。核をヘマトキシリン（青）で染色した。バー、５０μｍ。Ｄ．未分化ｉＰＳ細胞、分化の７、１１、２０および３０日目のオルガノイド、ならびに初代肝細胞（ＰＨ）における、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）およびシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ。相対的発現値を未分化ｉＰＳＣ（ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＲＢＰ４およびＣＫ１９）または７日目のオルガノイド（ＨＮＦ６）または１１日目のオルガノイド（ＣＹＰ３Ａ４）で比較した。バーは平均値±ＳＤを表し、ｎ＝３である。Ｅ．未分化ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、肝特定細胞（ＨＳ）、肝前駆細胞（ＨＰ）、ｉＰＳＣ由来胆管細胞（ｉＤＣ）、正常ヒト胆管細胞（ＮＨＣ）、ｉＰＳＣ由来後部前腸（ｐＦＧ）、ｉＰＳＣ由来ヒト肝臓オルガノイド、初代肝細胞、胎児肝臓組織、ヒト肝臓の肝臓組織および右葉における、ＲＮＡ配列データに基づく主成分分析。Ｆ．２５〜３０日目のオルガノイドからのアルブミン（ＡＬＢ、ｎ＝１０）およびフィブリノゲン（ＦＢＧ、ｎ＝４）分泌レベル。バーは平均値±ＳＥＭを表す。Ｇ．２５〜３０日目のオルガノイドからの補体因子分泌レベル。ＦＨ：Ｈ因子、ＦＢ：Ｂ因子。バーは平均±ＳＥＭ、ｎ＝５を表す。
【図２】ヒトｉＰＳＣ肝臓オルガノイドにおける胆汁酸合成、取り込みおよび排泄。Ａ．単一のオルガノイドにおける多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）および胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）の免疫染色。バー、５０μｍ。Ｂ．微絨毛（Ｖ）管腔内表面を示すオルガノイドの透視電子顕微鏡組織；Ｎ：核。バー、１０μｍ。Ｃ．未分化ｉＰＳＣ細胞、分化の２０日目（ＮＴＣＰ）および３０日目（ＡＢＣＢ１１）のオルガノイド、ならびに初代肝細胞（ＰＨ）における、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢメンバー１１（ＡＢＣＢ１１）、およびタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ。相対的発現値を未分化ｉＰＳ細胞（ＡＢＣＢ１１）または１１日目のオルガノイド（ＮＴＣＰ）で比較した。バーは平均値±ＳＤを表し、ｎ＝３である。Ｄ．２７日目のオルガノイド内部の総胆汁酸分泌レベル。バーは平均値±ＳＥＭを表し、ｎ＝４である。Ｅ．蛍光胆汁酸（ＣＧａｍＦ）の存在下で３０分培養後のオルガノイドによる胆汁酸の取り込み。Ｆ．４つのｉＰＳＣ株由来のオルガノイドに対するＣＬＦ輸送活性。Ｔ、Ｗ、１、およびＦは、ｉＰＳ細胞株のクローン名を示す。グリーン：ＣＬＦ。
【図３】ボセンタン（Ｂｏｓｅｔａｎ）誘発胆汁うっ滞は、ＣＹＰ２Ｃ９＊２  ｉＰＳＣ−肝臓オルガノイドに特異的である。Ａ．ＣＹＰ２Ｃ９＊２のｒｓ１７９９８５３およびＵＧＴ１Ａ１＊６のｒｓ４１４８３２３の代表的な対立遺伝子画像は、それぞれ、ボセンタンおよびイリノテカンによるＤＩＬＩのリスクＳＮＰを示す。この表は、各ｉＰＳ細胞株におけるリスク対立遺伝子の保有率を示す。Ｂ．ＣＬＦ輸送活性およびボセンタンによる阻害の画像。Ｃ．異なる４つのｉＰＳ細胞株に由来する個々のオルガノイドにおけるＣＬＦ強度レベル。＊：ｐ<０．０１、＊＊：ｐ<１Ｅ−４、＊＊＊＊：ｐ<１Ｅ−８、ウィルコクソン−マン−ホイットニー検定。ＮＳ：有意でない。ボックスプロットでは、ボックスの上および下は、７５パーセンタイルおよび２５パーセンタイルを表し、中心線が中央値を表す。ドットは各オルガノイドからのデータを示す。
【図４】オルガノイドを用いた高い忠実度の薬物誘発胆汁うっ滞モデル。Ａ．オルガノイドの外側から内側へのフルオレセインジアセテートの流出についての連続画像。Ｂ．フルオレセインジアセテート流出輸送の比較。Ｃ．オルガノイドへのフルオレセインジアセテート流出輸送の定量化。例示的な左の図は、オルガノイドの内側と外側との間のフルオレセイン強度の定量化された比である。右の図は、対照（ＤＭＳＯ）、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）、および陰性対照としてストレプトマイシン（ＳＴＰ）を用いた検証試験の結果を示す。バーは平均値±ＳＤを表し、＊＊：ｐ<０．０１、ｎ＝４である。Ｄ．９つのトレーニング化合物で２４時間処置した後のフルオレセインジアセテート輸送阻害の画像。Ｅ．トレーニング化合物の処置後の輸送阻害の定量化、バーは平均値±ＳＤ、＊：ｐ<０．０５、＊＊：ｐ<０．０１、ｎ＝４〜６を表す。トレーニング化合物の処置後のＭＭＰ変化の定量化、バーは平均値±ＳＤ、＊：ｐ<０．０５、＊＊：ｐ<０．０１、ｎ＝４〜５を表す。ＣＯＮ：対照試料、ＳＴＰ：ストレプトマイシン、ＴＯＬ：トルカポン、ＤＩＣＬＯ：ジクロフェナク、ＢＯＳ：ボセンタン、ＣＳＡ：シクロスポリン。
【図５】オルガノイドを用いた高い忠実度の薬物誘発ミトコンドリア毒性スクリーニング。Ａ．９つのトレーニング化合物の処置後のＴＭＲＭ上のミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の画像。下段：トレーニング化合物の処置後の輸送阻害の定量化、バーは平均値±ＳＤ、＊：ｐ<０．０５、＊＊：ｐ<０．０１、ｎ＝４〜６を表す。Ｃ．トレーニング化合物の処置後のＭＭＰ変化の定量化、バーは平均値±ＳＤ、＊：ｐ<０．０５、＊＊：ｐ<０．０１、ｎ＝４〜５を表す。ＣＯＮ：対照サンプル、ＳＴＰ：ストレプトマイシン、ＴＯＬ：トルカポン、ＤＩＣＬＯ：ジクロフェナク、ＢＯＳ：ボセンタン、ＣＳＡ：シクロスポリンＡ、ＴＲＯ：トログリタゾン、ＮＥＦＡ：ネファゾドン、ＥＮＴＡ：エンタカポン、ＰＩＯ：ピオグリタゾン。Ｂ．Ｏｏｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６（Ｏｏｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）で言及された９つのトレーニング化合物（ＴＣ）のセットの分類。クラスＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＩＬＩについての既知の報告を有するＴＣを表し、クラスＢのものは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物誘発性胆汁うっ滞についての報告を有するＴＣである。文献データに基づく毒性の機序もまた提供される。クラスＣ化合物は一般にＤＩＬＩに関して安全であると考えられる。Ｃ．薬物処置後７２時間の生存率と二重リスクパラメータ、薬物誘発性胆汁うっ滞の可能性およびミトコンドリア毒性の可能性との間の分析。胆汁うっ滞およびミトコンドリア毒性（Ｍｉｔｏ−ｔｏｘ）指数は、図３のデータから導き出された。円の大きさは、生存率低下の大きさを示した。
【図６】ＮＡＣ暴露により救済された脆弱状態における薬物誘発性肝障害のモデリング。Ａ．脆弱なオルガノイドモデルに対する薬物誘発細胞毒性の評価の概要。Ｂ．脂質蓄積に関する脆弱モデルのプロファイリング（青：核、緑：脂質、赤：Ｆ−アクチン）。Ｃ  ＲＯＳ産生（青：核、緑：ＲＯＳ）およびＤ．ミトコンドリア健康度（青：核、赤：ミトコンドリア）。Ｅ．薬物処置の２４時間後のオルガノイドの画像。Ｆ．脂質蓄積により誘発された脆弱オルガノイドモデルに関する生存率評価。バーは平均値±ＳＤを表し、＊：ｐ<０．０５、ｎ＝５〜６である。ＣＯＮ：対照、ＳＴＰ：ストレプトマイシン、ＴＲＯ：トログリタゾン、ＮＡＣ：Ｎ−アセチルシステイン。
【図７】毒性予測のための多重肝臓オルガノイドに基づくスクリーニング。
【図８】レチノイン酸処置プロトコルＡの最適化。レチノイン酸処置の時期と期間の計画。ＲＡ：レチノイン酸、ＨＣＭ：肝細胞培養培地。Ｂ．異なる期間のＲＡ処置における２５日目のオルガノイド中のアルブミン分泌レベル。
【図９】Ｄ２０におけるオルガノイドの形態。Ｄ２０におけるオルガノイドの総数は３０５であった。内腔を伴うオルガノイド：２１６、内腔を伴わないオルガノイド：８９。
【図１０】オルガノイド中の細胞数を決定するための換算式  Ａ．単一オルガノイドの位相差画像。Ｂ．各単一オルガノイドの直径および細胞数。Ｃ．単一オルガノイドにおける直径と細胞数との間の相関関係。
【図１１】図４の補足。複数のＰＳＣ株からのオルガノイドの生成。異なるｉＰＳ細胞株（３１７Ｄ６および１３８３Ｄ６）由来オルガノイドの位相差画像とアルブミン分泌レベル。
【図１２】１０種類の化合物での処置の２４時間後の細胞生存率。脂質蓄積により誘発された脆弱オルガノイドモデルに関する生存率評価。ＣＯＮ：対照試料、ＳＴＰ：ストレプトマイシン、ＴＯＬ：トルカポン、ＤＩＣＬＯ：ジクロフェナク、ＡＭＩＯ：アミオダロン、ＢＯＳ：ボセンタン、ＣＳＡ：シクロスポリンＡ、ＴＲＯ：トログリタゾン、ＮＥＦＡ：ネファゾドン、ＥＮＴＡ：エンタカポン、ＰＩＯ：ピオグリタゾン。バーは平均値±ＳＤを表し、ｎ＝４〜６である。
【図１３】脂肪毒性肝臓オルガノイドにおけるミトコンドリアのＲＯＳ生成と形態変化。Ａ．８００μＭのオレイン酸（ＯＡ）の処理による脂質蓄積誘発性脆弱性オルガノイドモデル上の全細胞中のＲＯＳを産生する細胞数の比率。Ｂ．脆弱オルガノイドモデルについてのオルガノイド中のミトコンドリアの画像。赤：ミトコンドリア、紫：Ｆ−アクチン、青：核。Ｃ．脆弱オルガノイドモデルについてのミトコンドリアの数およびサイズ。バーは平均値±ＳＤを表し、＊：ｐ<０．０５、ｎ＝５〜６である。
【図１４】細胞Ｍａｔｒｉｇｅｌフリー法の概略図。オルガノイドを生成するためにＭａｔｒｉｇｅｌを使用しない肝臓オルガノイド生成方法の概略図が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特に明記しない限り、用語は当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。
【００１１】
「約」もしくは「およそ」という用語は、当業者による決定に従って、例えば、測定システムの制限の、その値がどのように測定され、または、決定されるかに依存する、特定の値に対して許容できる誤差範囲内にあることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における実務に従って、１以上の標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値の２０％まで、または１０％まで、または５％まで、または１％までの範囲であることを意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【００１２】
本明細書中で使用されるとき、用語「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）は、胚性細胞型および胚体外細胞型に分化することのできる幹細胞である。そのような細胞は完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は卵細胞と精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生された細胞も全能性である。
【００１３】
本明細書で使用されるとき、用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内胃壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系））を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞に分化できる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前の胚盤胞の内細胞塊細胞の子孫であり得るか、または特定の遺伝子の発現を強制することによって、成体体細胞などの非多能性細胞の誘導により得ることができる。多能性幹細胞は、任意の適切な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例には、ヒト、げっ歯類、ブタ、およびウシを含む哺乳動物の供給源が含まれる。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、一般にｉＰＳ細胞とも略され、特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、成体体細胞などの通常は非多能性細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の一種を指す。ｈｉＰＳＣはヒトｉＰＳＣを指す。
【００１５】
本明細書中で使用されるとき、用語「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」はまた一般にＥＳ細胞とも略され、多能性であり、かつ初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本発明の目的のために、用語「ＥＳＣ」は、胚性生殖細胞も場合により包含するように広く使用される。
【００１６】
本明細書中で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、１つ以上の前駆細胞がそれ自体を再生する能力または１つ以上の特殊化細胞型に分化する能力を獲得することになる、本明細書に記載の方法において使用され得る任意の細胞を包含する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば増殖因子）の処理に供される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔまたはｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞；多能性幹細胞（誘導型または非誘導型）；多分化能性幹細胞；オリゴ分化能性幹細胞および単分化能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、胚、幼児、子供、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性が遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処置を介して付与されるような処置を受ける体細胞であり得る。
【００１７】
発生生物学において、細胞分化は、それほど特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になる過程である。本明細書中で使用されるとき、用語「指向性分化」は、それほど特殊化されていない細胞が特定の特殊化された標的細胞型になるプロセスを指す。特殊化された標的細胞型の特異性は、初期細胞の運命を定義または変更するために使用できる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法としては、遺伝子操作、化学的処理、タンパク質処理、および核酸処理が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
胚性細胞由来の多能性幹細胞
いくつかの実施形態において、１つのステップは、多能性であるかまたは多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は当技術分野において周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９−ｈＥＳＣ）は、本明細書に記載されている例示的な実施形態において使用されるが、本明細書に記載されている方法およびシステムは任意の幹細胞に適用可能であることは当業者には理解されよう。
【００１９】
本発明に従う実施形態において使用され得るさらなる幹細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）；ＷＩＳＣ  ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｉ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ−ＳＣＲＭＣ）；Ｎｏｖｏｃｅｌｌ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）；ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）；Ｔｅｃｈｎｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）；ならびにＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａが保有するｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ；によって提供されるものか、それらが保有するデータベースに記載されているものを含むが、これらに限定されない。本発明に従う実施形態において使用され得る例示的な胚性幹細胞は、ＳＡ０１（ＳＡ００１）；ＳＡ０２（ＳＡ００２）；ＥＳ０１（ＨＥＳ−１）；ＥＳ０２（ＨＥＳ−２）；ＥＳ０３（ＨＥＳ−３）；ＥＳ０４（ＨＥＳ−４）；ＥＳ０５（ＨＥＳ−５）；ＥＳ０６（ＨＥＳ−６）；ＢＧ０１（ＢＧＮ−０１）；ＢＧ０２（ＢＧＮ−０２）；ＢＧ０３（ＢＧＮ−０３）；ＴＥ０３（１３）；ＴＥ０４（１４）；ＴＥ０６（１６）；ＵＣ０１（ＨＳＦ１）；ＵＣ０６（ＨＳＦ６）；ＷＡ０１（Ｈ１）；ＷＡ０７（Ｈ７）；ＷＡ０９（Ｈ９）；ＷＡ１３（Ｈ１３）；ＷＡ１４（Ｈ１４）を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
胚性幹細胞についてのさらなる詳細は、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９１）：１１４５−１１４７；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ（ＥＳ）  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）  ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃｏｉｎ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３３：１５２６−１５３０；Ｍａｒｔｉｎ  １９８０，"Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９（４４５８）：７６８−７７６；Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ２９２（５８１９）：１５４−１５６；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，"Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ，"Ｌａｎｃｅｔ  ３６５（９４７１）：１６３６−１６４１、において見出され得るが、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、成体線維芽細胞などの非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは典型的には、レトロウイルスのようなウイルスベクターを通して達成される。トランスフェクトされた遺伝子はマスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることが示唆されている。３〜４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が多能性幹細胞と形態学的および生化学的に類似するようになり、通常は形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択を通じて単離される。本明細書中で使用されるとき、ｉＰＳＣには、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、レトロウイルス系を用いて、４つの中心遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを用いて、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換する。別の実施形態では、レンチウイルス系を用いて体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換する。発現がｉＰＳＣにおいて誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ−３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆ１）；Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）；Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを作製するために非ウイルス系技術が使用される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚および肝臓細胞のＤＮＡに輸送し、その結果、胚性幹細胞と同一の細胞を得ることができる。アデノウイルスはそれ自身の遺伝子のいずれも標的宿主に組み込まないので、腫瘍を作り出す危険性が排除される。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非常に低い効率ではあるが、ウイルストランスフェクション系を全く用いることなく、プラスミドを介して達成することができる。他の実施形態では、タンパク質の直接送達を使用してｉＰＳＣを作製し、したがってウイルスまたは遺伝子改変の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣ細胞の作製は、類似の方法論を使用して可能である：ポリアルギニンアンカーを介して細胞内に導かれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態では、多能性誘導遺伝子の発現はまた、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによっても増加させることができる。
【００２３】
胚性幹細胞に関するさらなる詳細は、Ｋａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，"Ｖｉｒｕｓ  ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７７１−７７５；Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，"ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７６６−７７０；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４９−９５３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，"Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４５−９４９；およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（５）：３８１−３８４；において見出されることができ、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、例示的なｉＰＳ細胞株はｉＰＳ−ＤＦ１９−９；ｉＰＳ−ＤＦ１９−９；ｉＰＳ−ＤＦ４−３；ｉＰＳ−ＤＦ６−９；ｉＰＳ（包皮）；ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）；およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）を含むがこれらに限定されない。
【００２５】
ＤＥ発生に関連するシグナル伝達経路の機能に関するさらなる詳細は、例えば、ＺｏｒｎおよびＷｅｌｌｓ，２００９，"Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５：２２１−２５１；Ｄｅｓｓｉｍｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，"ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｇｕｔ  ｔｕｂｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，"Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２３：４２−５５；ＭｃＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，"Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"１３４：２２０７−２２１７；ＷｅｌｌｓおよびＭｅｌｔｏｎ，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：１５６３−１５７２；ｄｅ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０（７）：１３２２−１３３２；において見出されることができ、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を作製するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を作製するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。例示的な方法は、例えば、ＵＳ９７／１９０６８Ｂ２（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．），"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，"およびＵＳ２０１７／０２４０８６６Ａ１（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ），"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」に記載されている。いくつかの実施形態では、多能性細胞は桑実胚に由来する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞を含み得るが、これに限定されない。胚性幹細胞は、胚の内部細胞塊または胚の生殖巣堤に由来し得る。胚性幹細胞または生殖細胞は、ヒトを含む種々の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない種々の動物種に由来し得る。いくつかの実施形態において、ヒト胚性幹細胞は胚体内胚葉を産生するために使用される。いくつかの実施形態において、ヒト胚性生殖細胞は、胚体内胚葉を産生するために使用される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは胚体内胚葉を産生するために使用される。本発明において使用することができるＤＥ細胞を取得または作製するためのさらなる方法としては、米国特許第７，５１０，８７６号（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第７，３２６，５７２号（Ｆｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．）；Ｋｕｂｏ１  ｅｔ  ａｌ．，２００４，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：１６５１−１６６２；Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１５３４−１５４１；およびＡｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，"Ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＮＦ３／ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１３０１−１３１５に記載されたものを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
出願人は、ヒトｉＰＳＣを用いて３Ｄ肝臓構造を作製する方法を見出した。この構造は、極性肝上皮、星細胞、および小管構造を含む微小肝臓構造を含む。開示された組成物は、既存のモデルと比較して、肝機能、胆汁輸送活性、および耐久性において改善を示す。３Ｄ構造モデルは、薬物スクリーニング試験および／または薬物毒性スクリーニング、移植、血清タンパク質産物の産生、ならびに個別化治療の開発のための新規かつ頑強なモデルとして使用され得る。１つの特定の用途において、組成物および方法は、肝臓毒性について薬物化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００２８】
３Ｄ凝集肝細胞が報告されているが、開示された組成物はアルブミン産生（ｉＰＳＣ由来肝細胞を使用する従来の最高標準モデルと比較して最大１０倍の増加）などの非常に高い機能活性を有し、内部管腔構造に起因して改善された酸素および／または栄養供給が可能となり、そのために、はるかにより長い培養（少なくとも６０日以上）と薬物検査に有用な長期検査プラットフォームとが可能になる。開示された組成物は、低アルブミン血症の治療のための凝固因子生成物であるアルブミンのような血漿生成物の産生に有用であり、またヒトｉＰＳＣ由来のミニチュア肝臓を移植してｉｎ  ｖｉｖｏで障害を治療できる治療的移植にも有用であり得る。最後に、開示された組成物は、個別化医療（治療の個別化）に使用することができる。
【００２９】
一態様では、ｉＰＳＣ細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法が開示される。方法は、以下の
【００３０】
ａ）後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１〜約３日間、ｉＰＳＣ細胞由来の胚体内胚葉（ＤＥ）をＦＧＦ経路活性化剤およびＧＳＫ３阻害剤と接触させるステップと、ｂ）肝臓オルガノイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１〜約５日間、好ましくは約４日間、レチノイン酸（ＲＡ）の存在下で、ステップａで得られた後部前腸スフェロイドをインキュベートするステップと、を含み得る。
【００３１】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関与する増殖因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用はＦＧＦシグナル伝達に必須であることが示されている。適切なＦＧＦ経路活性化剤は、当業者には容易に理解されよう。例示的なＦＧＦ経路活性化剤としてはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを用いてこれらの経路を活性化してもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＤＥ培養物は、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；７５ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；２００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１，０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１，２００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１，５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；２，０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；５，０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；７，０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；１０，０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上；あるいは１５，０００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度の本明細書に記載のＦＧＦシグナル伝達経路の１つ以上の分子で処置される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子の濃度は処置の間、一定に維持される。他の実施形態では、シグナル伝達経路の分子の濃度は、処置の過程で変化する。いくつかの実施形態において、本発明によるシグナル伝達分子は、ＤＭＥＭおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地に懸濁される。ＦＢＳは、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、または５０％以上の濃度であり得る。当業者は、本明細書に記載されるレジメンが、限定されるものではないがＦＧＦシグナル伝達経路における任意の分子を含む、本明細書に記載されるシグナル伝達経路の任意の既知の分子に単独でまたは組み合わせて適用可能であることを理解するであろう。
【００３３】
適切なＧＳＫ３阻害剤は、当業者には容易に理解されよう。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、限定されないが、例えば、ＧＳＫ３βを阻害するＣｈｉｒｏｎ／ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。当業者は、開示された方法を実施するのに適したＧＳＫ３阻害剤を認識するであろう。ＧＳＫ３阻害剤は、約１μＭ〜約１００μＭ、または約２μＭ〜約５０μＭ、または約３μＭ〜約２５μＭの量で投与されてもよい。当業者は、適切な量および期間を容易に認識するであろう。
【００３４】
一態様では、幹細胞は、哺乳動物、またはヒトのｉＰＳＣであり得る。
【００３５】
一態様において、前腸スフェロイドは、例えば、商標名Ｍａｔｒｉｇｅｌとして販売されている市販の基底膜マトリックスなどの基底膜マトリックス中に埋め込むことができる。
【００３６】
一態様では、肝臓オルガノイドは、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、シトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、ＨＮＦ４ａ、Ｅ−カドヘリン、ＤＡＰＩ、およびＥｐｃａｍを発現し得ることを特徴とし得る。そのような発現は、例えば、４０日目から５０日目に起こり得る。発現レベルは、ヒト肝細胞において観察されるもの、例えば、成体肝細胞のものと類似していてもよい。
【００３７】
一態様において、肝臓オルガノイドは、胆汁輸送活性を有することを特徴とし得る。
【００３８】
一態様では、肝臓オルガノイドは幹細胞に由来してもよく、内在化微絨毛細胞および間葉系細胞をさらに含む管腔構造を含んでもよい。管腔構造は、極性肝細胞および基底膜によって囲まれていてもよい。肝臓オルガノイドは、機能的星細胞および機能的クッパー細胞を含み得る。
【００３９】
ある態様では、肝臓オルガノイドは、以下：胆汁産生能、胆汁輸送活性、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｈ発現、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｂ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ３発現、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ４発現、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のフィブリノゲン産生、および少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のアルブミン産生、のうちの１つ以上を有することを特徴とし得る。一態様では、肝臓オルガノイドは、少なくとも１０，０００ｎｇ／ｍＬ  １ｘｅ６細胞／２４時間の総肝臓タンパク質発現を有することを特徴とし得る。肝臓オルガノイドは、ＰＲＯＸ１、ＲＢＰ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＢＣＣ１１、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ５、ＡＬＢ、ＦＢＧ、ＭＲＰ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ６８、ＣＤ３４、ＣＤ３１から選択される１つのまたは複数の遺伝子を発現し得ることを特徴とし得る。一態様では、肝臓オルガノイドは、例えば、ＣＹ２Ｃ９＊２変異体などの薬物代謝シトクロム変異体を含む細胞を含み得る。肝臓オルガノイドは、ＵＳ  ２０１６／０１７７２７０号に記載されているもののような血管系を含み得る。
【００４０】
一態様では、肝臓オルガノイドは、肝臓オルガノイドが炎症細胞、例えば、Ｔ細胞または他の炎症性分泌タンパク質を含まないことを特徴とし得る。
【００４１】
一態様では、重篤な有害事象（ＳＡＥ）についてスクリーニングする方法が開示される。ＳＡＥは、肝不全および／または薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）であり得る。この方法は、毒性が目的とされる対象となる薬物を本明細書に記載の肝臓オルガノイドと接触させるステップを含み得る。一態様では、方法は、フルオレセインジアセテート（ＦＤ）の摂取および／または流出を測定するステップを含んでもよく、ここで、排出障害は、薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す。対象となる薬物の毒性は、ミトコンドリア膜電位、ＲＯＳの測定、肝臓ミトコンドリアの膨潤、およびそれらの組み合わせから選択されるパラメータの測定によって決定されてもよく、ここで、ミトコンドリアに対する損傷は、薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す。一態様では、方法は、オルガノイド生存率を分析するステップを含み、ここで、オルガノイド生存率の障害または低下は、対象となる薬物が重篤な有害事象を誘発する可能性があることを示す。
【００４２】
一態様では、肝障害を有する個体を治療する方法が開示され、この方法は、本明細書に記載の肝臓オルガノイドをそれを必要とする個体に移植するステップを含み得る。肝障害は、例えば、代謝性肝疾患、末期肝疾患、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４３】
一態様では、個体にとって好ましい治療薬を同定する方法が開示される。この態様では、方法は、目的のｉＰＳＣに由来する肝臓オルガノイドを候補化合物と接触させるステップを含むことができ、ここで、例えば、目的のｉＰＳＣは、かかる個体において見出される１つ以上の突然変異を含むか、または例えば、目的のｉＰＳＣは、かかる個体と同じ倫理的背景に由来するか、またはさらに、目的のｉＰＳＣは、かかる個体に由来するものである。
【実施例】
【００４４】
本研究において、出願人は、毛細胆管膜を横切ってＭＲＰ２によって毛細胆管ネットワークに排出されたフルオレセインジアセテートを使用して胆汁輸送活性を試験した（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。トログリタゾンおよびシクロスポリンがＭＲＰ２を阻害することは以前に報告されている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｌｅｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらに、排出トランスポーターＭＲＰ２は、ボセンタンの輸送を仲介する（Ｆａｈｒｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ネファゾドンによるＭＲＰ２の阻害は報告されていないが、ＭＲＰ２は肝細胞における胆汁酸の毛細胆管排泄のためのＡＴＰ依存性胆汁酸塩トランスポーターであるため、ネファゾドンによるミトコンドリアストレスは、胆汁輸送活性、フルオレセインジアセテートの流出の減少に関連し得る。
【００４５】
薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）のリスク化合物の前臨床的検出は、依然として薬物開発における重要な課題であり、予測的なヒトシステムの必要性が強調されている。ここで、出願人は、オルガノイド解像度で臨床ＤＩＬＩ病理を分析するためのヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）モデルを開発した。ヒトｉＰＳＣからの分化型ＨＬＯは、毛細胆管様構造によって裏打ちされた内腔を有する極性肝細胞を含み、一方向性の胆汁酸輸送経路を確立している。出願人は、ＬｏＴ（肝臓オルガノイドに基づく毒性スクリーニング）と呼ばれる肝臓オルガノイドイメージングを使用してＤＩＬＩをモデル化することによってオルガノイドの構造的特徴を活用した。ＬｏＴは、胆汁うっ滞性および／またはミトコンドリア毒性に基づいて、１０種の市販薬と５体の異なるドナーで機能的に検証される。ボセンタン誘発胆汁うっ滞は、ＣＹＰ２Ｃ９低代謝ドナー由来ＨＬＯに特異的である。興味深いことに、脂肪症のオルガノイドは診療所で示唆されたようにロシグリタゾン毒性に対して脆弱であり、大量のオルガノドの死からの化学的救助が続いた。したがって、ＬｏＴは、薬物の安全性を分析するために使用することができる高い忠実度のオルガノイドモデルであり、さらに費用対効果の高いプラットフォームであり、化合物の最適化を容易にし、機構的研究を提供し、そして個別化医療および抗ＤＩＬＩ治療スクリーニング用途をもたらす。
【００４６】
製薬産業では、初期スクリーニングで同定された候補薬の失敗により、医薬品開発から毎年数十億ドルが失われ、そのような失敗のために多くの（３分の１の）薬が市場から回収される（ＴａｋｅｂｅおよびＴａｎｉｇｕｃｈｉ，２０１４）。有望な有効性にも関わらず、薬物候補の失敗は、患者の治療機会の甚大なる喪失をもたらす。前臨床試験は一般的に、「ヒット」化合物を同定するための主要な有効性スクリーニングとしてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価と、それに続く代謝および毒性の機序を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性試験と、で構成される。この非効率性は、ヒトにおける薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）を評価するのに生理学的に関連する前臨床モデルが実質的に欠如していることから説明することができ、したがって、絶え間なく増大する化合物ライブラリの莫大な数を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏヒトスクリーニングモデルを早急に開発する必要がある。
【００４７】
初代肝細胞は、高度に極性のある代謝細胞型であり、微絨毛線チャネルを有する毛細胆管構造を形成し、末梢循環を胆汁酸分泌経路から分離する。ＤＩＬＩの最も上流の局面は、肝細胞による薬物（またはそれらの反応性代謝産物）解毒および多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）輸送体などの輸送体を介した毛細胆管への排泄を含む。これは、ＤＩＬＩ病理学を予測するために肝細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの重要な特性としてこれらの独自に組織化された構造を再構築する必要性を示唆している。しかしながら、トログリタゾン、ネファゾドンおよびトルカポンの場合においてのように（ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｖｅｒｔｏｘ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、単離された初代ヒト肝細胞または肝細胞株の使用を伴う現在の単純化された培養モデルとｉｎ  ｖｉｖｏ生理学との間には、薬物毒性プロファイルにかなりの違いがある。したがって、毒性学的特性の決定は主に、薬物開発のための必須のステップとして動物に依存しているが、ヒトと動物との間の生理学には顕著な違いがあるために、ヒトの結果に対する忠実度は著しく欠如している（Ｌｅｓｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。さらに、特異体質性ＤＩＬＩ（ＩＤＩＬＩ）の発症は非常にまれであるが、それにもかかわらず、米国の急性肝不全の約１０〜１５％に関与しており（Ｒｅｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、予測はほとんど不可能である（Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。まとめると、提案された薬物の解毒および排泄を試験する化合物をスクリーニングするために効果的なヒト細胞モデルが非常に期待されている。
【００４８】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からのヒト肝細胞の分化方法の革新的進歩にもかかわらず、ヒト幹細胞を用いたディッシュでの臨床試験は「誇大宣伝」のままである。ある程度まで、これは、（１）ロット差の克服、（２）実験的バッチ差の最小化、（３）アッセイスループットの向上、および（４）臨床試験データとの関連性における改善、を含む、以前の細胞に基づくアプローチにおける課題によって説明できる。本出願人は、安定的に拡張可能なヒト幹細胞、すなわちｉＰＳＣを使用して比較的単純かつ頑強なオルガノイドに基づく試験プラットフォームを開発することによってこれらの問題に対処する。出願人はまず、ヒトＰＳＣを後部前腸オルガノイドに指向させ、定義された因子およびマトリックスを用いた極性培養を通して漸進的な肝細胞分化を続けた。生成されたヒト肝臓オルガノイドは、極性肝細胞に囲まれた管腔内構造を有し、タンパク質および胆汁酸産生ならびに輸送機能を含む重要なヒト肝細胞機能を果たすことができることが示されている。興味深いことに、本出願人は、ライブ画像に基づく蛍光ジアセテートの取り込みおよび排泄の動的検出が、高レベルの再現性を伴って、胆汁排泄の阻害剤として特徴付けられる一連のＤＩＬＩ薬によって誘発される胆汁うっ滞を正確にモデル化することを見出した。別に、ミトコンドリア膜電位評価は、臨床試験によって確立されたＤＩＬＩ薬の従来の分類を反映して、各化合物について独立したリスク評価を可能にした。さらに、本出願人は、脂肪毒性ストレスによって誘発されるモデル条件へのアプローチを拡張し、活性酸素種（ＲＯＳ）産生によるＤＩＬＩの可能性の増強を確認した。オルガノイドに基づく生存率評価により、Ｎ−アセチルシステインによるＤＩＬＩの逆転が確認され、抗ＤＩＬＩ薬物スクリーニングに対する我々のアプローチの可能性が強調された。総合すると、肝臓オルガノイドに基づく毒性スクリーニング（ＬｏＴ）と呼ばれるこの頑強なアッセイは、ヒト肝臓オルガノイドにおいて開発された最初の機能的読み出しであると考えられ、診断、機能研究、薬物開発および個別化医療を容易にする。
【００４９】
結果
複数のヒトｉＰＳＣからの極性肝臓オルガノイドの生成と特徴付け
出願人は、まず、ヒトｉＰＳＣ由来の前腸スフェロイドを使用することによって新規肝臓オルガノイド分化方法を確立した（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）（図１Ａ）。第一ステップとして、出願人は、以前に記載されたように（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、胚体内胚葉への分化を促進するためにＢＭＰおよびアクチビンＡを使用した。さらに、ＦＧＦ４およびＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）を使用して前腸スフェロイドを誘導し、出芽スフェロイドを観察した。穏やかなピペッティングによりディッシュ上に播種した間葉系細胞を剥離した後、オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込んだ。レチノイン酸（ＲＡ）は、毛細胆管および小管周囲鞘のサイズおよび複雑さの増大によって示されるように細胞極性を増強することが報告されている（Ｆａｌａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。胆汁輸送モデリングに適した極性オルガノイドを生成するために、オルガノイドをＲＡで処置した。オルガノイド生成方法を最適化するために、出願人は最初にＲＡ処置の期間を変化させた。オルガノイドのアルブミン分泌レベルは、１、２、３、４、および５日間のＲＡ処置について、それぞれＤ２５で１１６０、１０５４、３０９２、４７０９、および３８６５ｎｇ／ｍＬであり、４日間のＲＡ処置プロトコルは最高レベルに達する傾向があった（図８）。したがって、アルブミン分泌のレベルに基づいて、ＲＡの期間を４日間に設定した。形態学的には、ＲＡ処置後約１０日で、上皮細胞で覆われた３００を超えるオルガノイドが首尾よく生成され、管腔化構造を有するオルガノイドの比率は７１％（２１６／３０５）であった（図１、パネルＢおよび図９）。免疫組織化学分析は、アルブミンがオルガノイドの上皮細胞において陽性であることを明らかにし、そして興味深いことに、ＩＶ型コラーゲンは外表面に局在化し、ＺＯ−１（接着帯閉塞）は管腔内層を染色し、これは、これらのオルガノイドが極性特性を有することを示唆する（図１、パネルＣ）。
【００５０】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析により、オルガノイド中の細胞は、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、胆管細胞分化を制御する肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、および分化中のシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）などの肝マーカー遺伝子の発現が有意に増加したことが明らかになった（図１、パネルＤ）。しかしながら、バルクオルガノイド由来ＲＮＡから抽出された最も肝臓的な遺伝子の発現レベルは、初代肝細胞よりもオルガノイドにおいて低かった。理論によって制限されることを意図しないが、これらの異なるｍＲＮＡプロファイルは、間質細胞マーカーによって同定された細胞の約３０％が非実質細胞であるため、間質系列の存在に一部起因すると考えられ、これにより、オルガノイドは初代肝細胞よりもｉｎ  ｖｉｖｏの肝臓組織により近いものとなる。出願人はさらに、ＲＮＡ配列（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いた包括的な遺伝子発現分析によってオルガノイドをプロファイリングした。主成分分析は、オルガノイドにおける遺伝子発現が、ｉＰＳＣ由来胆管細胞および正常ヒト胆管細胞と類似していないことを示した（図１、パネルＥ）。さらに、培養上清中、ＡＬＢ、フィブリノゲン（Ｆｂｇ）および補体因子などの肝細胞特異的タンパク質がＥＬＩＳＡによって確認された（図１、パネルＦ〜Ｇ）。オルガノイドの肝機能性を定量するために、出願人は細胞数によって正規化されたアルブミン分泌レベルを調べた（図１０）。アルブミン分泌レベルは、２１３３ｎｇ／日／１０６細胞であり（図１、パネルＦ）、公表されたｉＰＳＣ由来肝細胞（Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｖｏｓｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に関連するｈＰＳＣのＨＬＣへの２Ｄおよび３Ｄ分化における他の実験（１５０〜１０００ｎｇ／日／１０６細胞）よりも高く、一方で、初代肝細胞は、３Ｄ足場において３０〜４０μｇ／日／１０６細胞を産生する（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｄｖｉｒ−Ｇｉｎｚｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これらの結果は、公表された文献において、肝臓オルガノイドが幹細胞由来の肝細胞と比較して妥当なアルブミン分泌活性を有する肝細胞を含んでいることを示した。重要なことに、このオルガノイド生成方法は再現性があり、したがって、管腔内オルガノイドがアルブミン分泌能を有する３１７Ｄ６および１３８３Ｄ６のｉＰＳ細胞株の両方から生成されたので、他のＰＳＣ株に適用可能である（図１１）。まとめると、出願人は、肝細胞の特徴を有する多数の極性肝臓オルガノイドを生成するためのプロトコルを確立した。
【００５１】
胆汁酸産生ヒトｉＰＳＣ−肝臓オルガノイドのミクロ解剖学的特徴付け
次に、肝臓オルガノイドが胆汁輸送活性を有するかどうかを試験するために、出願人は最初に胆汁合成および排泄機能に関与する主要なタンパク質を染色することによってオルガノイドを特徴付けた。ＢＳＥＰおよびＭＲＰ２の免疫蛍光染色は、これらのタンパク質が管腔内領域に優先的に局在することを実証した（図２、パネルＡ）。胆管は最小の肝内分泌チャネルであり、毛細胆管腔は隣接する肝細胞の対向する原形質膜の修飾された先端領域によって形成された空間からなる（Ｃｕｔｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｔｓｕｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。さらに、それは密着帯複合体によって区切られ、微絨毛は毛細胆管内腔の内側に位置する（Ｔｓｕｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＺＯ−１染色は肝臓の毛細胆管領域を染色することが知られており、図１、パネルＣは密着帯が我々の肝臓オルガノイドの内側に位置することを示唆した。透過型電子顕微鏡検査は、オルガノイドが内腔に指向した微絨毛を含有することを明らかにした（図２、パネルＢ）。これらの解剖学的特徴と一致して、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、オルガノイドがＡＢＣＢ１１およびＮａ  ＋  −タウロコール酸共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）の遺伝子発現を有することを明らかにしたが、そのレベルは初代肝細胞よりもオルガノイドにおいて低かった（図２、パネルＣ）。したがって、オルガノイドは、接着帯によって内腔から分離された極性ヒト肝細胞を含み、これはｉｎ  ｖｉｖｏ肝毛細胆管を模倣する独特のミクロ解剖学的構造を反映する。
【００５２】
次に、胆汁酸（ＢＡ）産生能力を決定するために、出願人は、オルガノイド培養物から収集した管腔内液にＥＬＩＳＡを実施した。管腔内液の総ＢＡプールのレベルは、２６．７μｇ／日／１０６細胞（直径２００μｍのオルガノイド中で約１２５μｍｏｌ／Ｌ）であり（図２、パネルＤ）、そして驚くべきことに、ＢＡ濃度は、以前の報告（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）におけるサンドイッチ培養由来の初代肝細胞のもの（約４０μｇ／日／１０６細胞、培養上清中１０μｍｏｌ／Ｌ）に匹敵した。このように、オルガノイドは毛細胆管様の形態を有するだけでなく、胆汁酸産生および分泌活性も有し、これは、胆汁酸輸送経路が正しく構築されていることを示唆している。
【００５３】
ヒト肝臓オルガノイドにおける胆汁酸摂取と排泄の動的可視化
胆汁酸排泄は、胆汁流の主要な決定要因であり、それ故に、この系における欠陥は様々な肝疾患病理に関連した胆汁分泌障害（胆汁うっ滞）をもたらす可能性がある（Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。肝細胞の頂端（毛細胆管）膜に位置する排出輸送タンパク質は、薬物および代謝物を含む多くの内因性および外因性化合物の肝臓除去において重要な役割を果たしている（ＫｏｃｋおよびＢｒｏｕｗｅｒ，２０１２）。ＢＳＥＰおよびＭＲＰ２は、ヒトにおいて毛細胆管胆汁酸塩輸送を媒介する。胆汁輸送のための主要なタンパク質の発現陽性を実証した後、出願人は次に、オルガノイドが胆汁酸をその内腔に活発に輸送することができるかどうか考えた。第一に、オルガノイドへの胆汁酸の摂取を調べるために、出願人は、胆汁酸塩アナログ（Ｍｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）であるコリルグリチルアミド−フルオレセイン（ＣＧａｍＦ）を用いてオルガノイドに挑戦した。外部からのＣＧａｍＦの処理後、オルガノイドの管腔内へのＣＧａｍＦの蓄積は首尾よく確認された（図２、パネルＥ）。同様に、蛍光胆汁酸コリル−リシル−フルオレセイン（ＣＬＦ）は再現性よく排泄され、複数のヒトｉＰＳＣ株からオルガノイド内に蓄積されることが見出された（図２、パネルＦ）。このアッセイの特異性を決定するために、出願人は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集アプローチを用いてＢＳＥＰ非官能化対立遺伝子を有するｉＰＳＣ株を開発した。ＢＳＥＰは胆汁輸送に関与し、これと一致して、ＢＳＥＰ−ＫＯ  ｉＰＳＣ−オルガノイドは、親対照オルガノイドと比較して蛍光胆汁酸を蓄積することができなかった。まとめると、これらのデータは、オルガノイドが胆汁酸を外側から摂取し、それらをオルガノイドの内側に排出する能力を有することを示唆している。
【００５４】
ＣＹＰ２Ｃ９＊２  ｉＰＳＣ−肝臓オルガノイドに特異的なボセンタン誘発胆汁うっ滞
オルガノイドに基づく胆汁うっ滞表現型決定法の臨床的関連性を試験するために、出願人は、忠実度の問題に対処するために、我々のシステムに薬理ゲノム学的洞察を採用した。具体的には、周知の感受性遺伝子変異体（すなわち、例えば、ボセンタンについては、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ｄｅｃ；９４（６）：６７８−８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｌｐｔ．２０１３．１４３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊｕｌ  １７．「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ９＊２  ｗｉｔｈ  ｂｏｓｅｎｔａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ」に記載されているＣＹＰ２Ｃ９＊２）を保有する複数のｉＰＳＣ株が収集され（図３、パネルＡ）、ボセンタンの存在下でそれらの胆汁うっ滞性の可能性を比較した（図３、パネルＢ）。興味深いことに、オルガノイドへのＣＬＦ排泄は、ＣＹ２Ｃ９＊２保有オルガノイドでは著しく損なわれたが、非保有オルガノイドでは損なわれなかった。これは、図３、パネルＣに示されるように、ＣＹＰ２Ｃ９  ＊  ２の不在下で３つの異なるｉＰＳＣ由来オルガノイドにおいて示される、ボセンタンにより誘導される胆汁うっ滞に対する臨床的傾向と一致する。対照的に、イリノテカンに基づく胆汁うっ滞は、ＣＹＰ２Ｃ９＊２  ｉＰＳＣ株に特異的ではなかった。これらの結果は、オルガノイドに基づく胆汁うっ滞アッセイがヒトの多様性のいくつかの局面を予測することを示した。
【００５５】
オルガノイドにおけるハイスループット薬物誘発性胆汁うっ滞評価
薬物によって誘発されたＤＩＬＩにおける胆汁うっ滞の重要な役割を考慮して、出願人は次に、このオルガノイドモデルが特定の化合物の存在下でのＤＩＬＩの病理学を反映するかどうかを考えた。多数の化合物を試験する前に、出願人は、ＣＬＦおよびＣＧａｍＦの両方がいくつかの問題：１．バックグラウンドが強く、手動での洗浄プロセスが必要となる；２．シグナル強度が弱いため、慎重な集録設定が必要となる、に起因して高速イメージングに適用できないので、まずハイスループット蛍光ベースアッセイを開発しようとした。あるいは、肝細胞における排出輸送の有用なマーカーであると報告されているフルオレセインジアセテート（ＦＤ）の使用が提案されている（ＢａｒｔｈおよびＳｃｈｗａｒｚ，１９８２；Ｂｒａｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。極性蛍光代謝物フルオレセインは、細胞から毛細胆管腔内に活発に輸送されるまで細胞内に捕捉される（Ｍａｌｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。培地交換や曝露量の調整をせずにＦＤを輸送能力の生の評価に使用できるかどうかを判断するために、経時的肝胆道輸送活性を低速度撮影イメージングを用いてさらに調べた。オルガノイドをフルオレセインジアセテートと共に４５分間インキュベートし、そして管腔内蓄積が処理後２０分でオルガノイドの内部に観察された（図４、パネルＡ、Ｂ）。この輸送の流れの反対方向は、オルガノイドへのＦＤの微量注入によって決定された。管腔内へのジアセテートの微量注入後、フルオレセインは内部に留まり、オルガノイドの外部には観察されなかった（図４、パネルＣ）。要約すると、このＦＤに基づく評価モデルは、単純な蛍光ライブイメージング分析によって肝臓オルガノイドにおける一方向性の排出胆汁輸送を評価するためのハイスループットの可能性を有する。
【００５６】
次に、出願人は、ＦＤＡが承認した１０種類の薬物の実行可能な投与量を評価することによってＦＤに基づくアッセイの忠実度を検証し、細胞損傷による二次的な障害を測定した。出願人は、許容可能な生存率を有する９つの化合物について最適用量を首尾よく見出した。対照的に、アミオダロン（ＡＭＩＯ）は試験された範囲内でオルガノイドに対して有意に有毒であり、それ故、ＡＭＩＯはさらなる潜在的なＤＩＬＩ評価試験から排除された（図１２）。出願人は、ＤＩＬＩ機序に基づいて３つのタイプ：胆汁うっ滞を伴わないＤＩＬＩ化合物（クラスＡ）、胆汁うっ滞を伴うＤＩＬＩ化合物（クラスＢ）、およびＤＩＬＩ化合物として報告されていない化合物（クラスＣ）（Ｏｏｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）のうちの１つとして分類された９つのトレーニング化合物（ＴＣ）と共にＦＤを使用して、オルガノイドにおける胆汁うっ滞の可能性を調査した。ＦＤ排泄の阻害可能性を定量化するために、出願人は、画像Ｊによってオルガノイドの外側と内側との間の蛍光強度比を決定することによって、単純だが頑健な定量化方法を開発した（図４、パネルＢ）。検証研究として、出願人は最初にシクロスポリンＡ（ＣＳＡ）を用いて阻害率を評価する能力を確認した。ＦＤ処置後５分で、対照（ＤＭＳＯ）と比較して、２４時間ＣＳＡで処置した群において有意な減少（対照と比較して０．４）が観察された（図４、パネルＢ）。次に、出願人は、このアプローチの忠実度を評価するために９つのＴＣを複数の濃度でスクリーニングした。興味深いことに、このスクリーニングシステムでは、ＴＣの処置後２４時間で、臨床的観察と同様に、ＦＤの排出はクラスＢ化合物、ボセンタン、ＣＳＡ、トログリタゾンおよびネファゾドンにおいて有意に減少した（ｐ<０．０１または０．０５）が、一方で、クラスＡおよびクラスＣの化合物では阻害効果は観察されなかった（図４、パネルＤの上の画像および図４、パネルＥ）。これらの結果は、肝臓オルガノイドモデルが、ヒト表現型との関連性が高い薬物開発における候補化合物についての胆汁輸送阻害効力を分類するのに有用であることを示唆した。
【００５７】
オルガノイドにおけるミトコンドリア過負荷の評価
さらに、ミトコンドリアの毒性は、ＤＩＬＩの発症に関連する複数の機序においてＤＩＬＩにおける中心的な役割を果たすので（Ｐｅｓｓａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、出願人はミトコンドリアの健康評価を調査した。この研究では、オルガノイド中のミトコンドリアの健康度を調べるために、ミトコンドリアの健康度を直接読み取ることにより、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の指標を用いて無傷細胞のＭＭＰをモニターした（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。２４時間のＴＣの処置後、ＭＭＰの用量依存的な増加がトルカポン（２〜８倍の変化、ｐ<０．０１）、ジクロフェナク（７〜１３倍の変化、ｐ<０．０５または０．０１）、ＣＳＡ（３〜７倍の変化、ｐ<０．０１）およびネファゾドン（４〜４２倍の変化、ｐ<０．０１）の処置で観察された（図５、パネルＡの下の画像およびグラフ）。さらに、用量依存性は観察されなかったが、トログリタゾンはオルガノイド中のＭＭＰも増加させた（３〜５倍の変化、ｐ<０．０５）。一方、ボセンタン、エンタカポンおよびピオグリタゾンの処置後、ＭＭＰの増加は複数回投与においてさえ明確に観察されなかった。これらの結果は、肝臓オルガノイドに基づく毒性スクリーニング（ＬｏＴ）と命名されたこのライブ画像に基づくアッセイが、ミトコンドリア毒性のあるなしにかかわらず化合物を区別することを実証した。
【００５８】
ＬｏＴシステムによるＤＩＬＩ化合物の機構的分類の再検討
ヒトＤＩＬＩの重度の症状発現は多因子性であり、ミトコンドリアおよびＢＳＥＰ阻害などのＤＩＬＩの既知の機序に特に関連する薬効の組み合わせと高度に関連している（Ａｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、現在のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能モデルはそのような多因子寄与を評価することは困難である。ＬｏＴシステムにおける多重化された生の機能的読み出しの利点を考慮して、出願人は、生存、胆汁うっ滞およびミトコンドリアストレスの間の関係を分析することを試みた。注目すべきことに、ＣＳＡ、ＴＲＯおよびＮＥＦＡなどの２４時間で二重作用（胆汁うっ滞およびミトコンドリアストレス）を有する薬物は、ＴＯＬ、ＤＩＣＬＯおよびＢＯＳと比べて７２時間で細胞生存率を有意に低下させた。これらのデータは、二重毒性がＤＩＬＩの重症度と非常に関連していることを示す臨床データと同等であり、以前の報告（Ａｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と一致する（図５、パネルＢ、Ｃ）。さらに、本出願人はまた、１３０μＭでのエンタカポン処置はオルガノイド生存率を減少させた（２４時間で８５％から７２時間で６４％まで）ことを指摘した。エンタカポンは、ＤＩＬＩを誘導するために血漿タンパク質、主にアルブミンへの広範な結合を必要とする（Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかしながら、利用可能な方法に基づいて、エンタカポンがどのように肝臓に対して有毒であるかは依然として分かっていない（Ｏｏｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。まとめると、ＬｏＴシステムはＤＩＬＩの主要な機序分類のための有利な人体モデルシステムであり、未知の複雑な機序をさらに詳しく説明するための有用な試験プラットフォームである。
【００５９】
ヒト肝臓オルガノイドにおけるＤＩＬＩに対する脆弱性の評価
ＤＩＬＩの発生率は多数の宿主因子によってしばしば混乱することが知られている。確かに、アセトアミノフェンのようないくつかの薬物からの肝毒性の危険性が、げっ歯類とヒトの両方において、肥満およびＮＡＦＬＤに起因して、非常に増加するという証拠が増えている（ＡＰＡＰ）（Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，２０１３；Ｍｉｃｈａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。したがって、無症状の段階であっても、患者に対してそのような「脆弱な」状態にあるＤＩＬＩ可能性を予測することは重要である。本研究では、出願人は、不飽和脂肪酸、オレイン酸への同時曝露によって脂肪毒性オルガノイドモデルを確立した（図６、パネルＡ）。オルガノイドに対するオレイン酸処置の３日後、オルガノイド中の脂質蓄積は激しくなった（図６、パネルＢ）。脂肪酸の酸化は活性酸素種（ＲＯＳ）の重要な供給源であり、それはＡＴＰおよびニコチンアミドジヌクレオチドの枯渇をもたらし、脂肪肝におけるＤＮＡ損傷を誘発する（ＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＨｏｒｔｏｎ，２００４）。これと一致して、ＲＯＳ産生は脂質処置オルガノイドにおいて観察された（図６、パネルＣおよび図１３、パネルＡ）。さらに、脂肪酸は、公表されている表現型と同様に肝臓ミトコンドリアの大量の腫脹を誘発した（図６、パネルＤおよび図１３、パネルＢ）（ＺｂｏｒｏｗｓｋｉおよびＷｏｊｔｃｚａｋ，１９６３）。ラットモデルにおいて肝ミトコンドリア機能障害がＮＡＦＬＤの発症に先行するので（Ｒｅｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、これらの結果は、肝毒性オルガノイドがある程度ｉｎ  ｖｉｖｏ脂肪肝モデルをモデル化することを示している。
【００６０】
この脂肪毒性オルガノイドモデルを強化されたＲＯＳ産生を伴う脆弱な状態として認識して、トログリタゾン（０〜５０μＭ）を２４時間処置し、オルガノイドにおける細胞生存率を評価した。５０μＭのトログリタゾン単独の処置により、細胞生存率は２４時間で８５％であり、一方、７２時間で６７％に減少した。しかしながら、脂肪毒性状態に対するトログリタゾンの処置後、オルガノイド死のためにオルガノイドの大量の断片化が観察された。その後の細胞生存率分析によりこの結果が確認された（対照と比較して約４０％、ｐ<０．０５）（図６、パネルＥおよび６、パネルＦ）。
【００６１】
次に、出願人は、潜在的な治療用化合物によってオルガノイドをＤＩＬＩ様状態から回復できるかどうかを調べた。静脈内ＮＡＣはアセトアミノフェンに関連しない急性肝不全患者の生存率を改善し（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、トログリタゾン誘発性細胞毒性を減少させた（Ｒａｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）ので、出願人は、ＲＯＳ産生を阻害するためにＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、抗酸化剤を用いた。予想通り、細胞生存率はＮＡＣによって有意に改善され、これはＮＡＣが脆弱な条件下でさえオルガノイドにおける細胞死を救済したことを示唆している（図６、パネルＥおよび６、パネルＦ）。ほとんどのＤＩＬＩの場合、唯一の介入は、原因薬物が同定できればそれを除去することである（ＰｏｌｓｏｎおよびＬｅｅ，２００５）（Ｂｏｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ＮａｖａｒｒｏおよびＳｅｎｉｏｒ，２００６）。このＬｏＴシステムは、ＤＩＬＩを治療するための多剤レジメンおよび創薬に関連する原因薬物を同定するための有用なツールとなり得る。
【００６２】
肝不全を含む重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、臨床開発中の薬物の減少または市販医薬品の中止の主な原因である。特に、ＤＩＬＩは薬物開発における重大な課題であり、ここで、トランスポーター活性の阻害によって誘導される薬物誘発性胆汁うっ滞は１つの主要な原因である。ヒト初代肝細胞を用いるサンドイッチ培養は、医薬品における現在の最良の選択である。最近の報告は、ヒト線維芽細胞からの分化転換細胞を用いた肝細胞に基づく胆汁うっ滞モデルの有望性を示したが（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ヒト肝細胞供給源が多様かつ制限されているため、ならびに複雑な定量化アルゴリズムが必要であるために、これらのアッセイプラットフォームは依然として再現性の課題ならびにスループットの問題を有する。さらに、ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｅｐａＲＧ細胞も胆汁うっ滞の特徴を評価するのに有用であるが、それらの低いＢＳＥＰ（胆汁酸塩排出ポンプ、またはＡＢＣＢ１１、胆汁酸排出のための重要な輸送体、ならびに胆汁うっ滞剤の主な標的）活性および時間のかかる分化手順のために、その使用が制限される（Ｌｅ  Ｖｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに重要なことに、本質的な解剖学的構造の欠如はそれらの製薬産業への実用化を制限する。あるいは、記載された方法は、試験化合物の存在下でライブ蛍光イメージングにより胆汁輸送活性を測定するための簡単で、頑強な、かつハイスループットなシステムを可能にする。ＬｏＴアッセイの主な利点は以下：１．費用対効果（５０オルガノイドあたり１２．３５ドル、３８４ウェルあたり９４．８５ドル）、２．アッセイスループット（単一オルガノイドで測定可能）、３．ミトコンドリアストレスなどの他の因子間の相互作用を分析するための多重読み出し、を含む。特に、上述のように、遡及的研究は、細胞生存率が二重読み出し；ミトコンドリアおよび胆汁うっ滞ストレスに依存して減少したため、複数の細胞ストレス可能性がＤＩＬＩ（Ａｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）の発生率と関連しており、ＬｏＴアッセイはこの研究を用いた結果と同等であることを明らかにした。酸化ストレスは細胞死に重要な役割を果たしており、胆汁うっ滞性肝障害の発症と関連付けられた（Ｓｅｒｖｉｄｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。疎水性胆汁酸は、胆汁うっ滞の間に細胞内に蓄積し、正常なミトコンドリアの電子伝達を妨害し、呼吸複合体ＩおよびＩＩＩの活性を阻害し、その結果アデノシン三リン酸合成を減少させ（Ｋｒａｈｅｎｂｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ミトコンドリア機能不全誘導アポトーシスをもたらす（Ｂｅｒｎａｒｄｉ，１９９６）。これらの知見と一致して、出願人のこれらの二重読み出しの相関分析は、図５に見られるように、胆汁うっ滞ストレスがミトコンドリアストレスと比較して肝障害についてより支配的な因子であることを示した。したがって、ＬｏＴシステムはＤＩＬＩ機序を調査するためのモデルシステムとして使用することができる。
【００６３】
さらに、最近のｉＰＳＣパネル集団の確立を考慮すると、個人における異なる感受性についての潜在的評価もまた有望である（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイシステムにおけるＳＡＥの予測は、一般的に個体差に焦点を合わせていないが、ＳＡＥは多くの場合、ＳＡＥが発生しやすい小さな準患者群で起こる（ＳｔｅｖｅｎｓおよびＢａｋｅｒ，２００９）。ＬｏＴシステムを多様な集団ｉＰＳＣパネルに適用することにより、以前は到達できないものであったＳＡＥに対する異なる感受性について提供できるようになる。ＤＩＬＩの極めてまれな性質を考慮すると、特定のゲノムまたは民族的要因を有する患者の細胞の使用は、現在知られていないＤＩＬＩの特異体質的な機序を解明するのに役立つだろう。したがって、ＬｏＴは、ＤＩＬＩの可能性を最小にするための本質的な洞察を提供することによって、製薬産業にとってゲームチェンジング的戦略として役立ち得る（図７）。
【００６４】
このオルガノイドモデルにおける一つの制限は免疫学的反応の欠如である。過敏性反応から生じる免疫学的効果は、特異体質性ＤＩＬＩについての１つの可能な機序である。薬物による過敏性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは限られているが、トログリタゾン誘導性細胞傷害性による感受性は、肝細胞株、Ｈｕｈ７細胞およびＴＨＰ−１細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養モデルを用いて高められた（Ｅｄｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。したがって、免疫系統に焦点を当てることによってＬｏＴプラットフォームを進めることは、肝細胞炎症を評価するために興味深いものとなる。それにもかかわらず、ＬｏＴ試験プラットフォームは、複数のＦＤＡ承認薬物による胆汁排出機能の阻害がこのアッセイにおいて再現可能に観察されるので、個々のオルガノイドから再現可能かつ大量のデータセットを生成することにおいて優れているように思われる。胆汁うっ滞が薬物誘発性、脂肪毒性、感染性および先天性の状態を含む広範囲の肝疾患によって誘発されることを考慮すると（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、オルガノイドに基づくＬｏＴアッセイは、機序的研究ならびにＤＩＬＩを超えた薬物スクリーニング用途の可能性を伴って、様々な状況における肝内胆汁うっ滞の分析に有用である。
【００６５】
ＬｏＴアッセイによる脆弱なヒト肝状態の研究
肥満などの宿主因子は、ＤＩＬＩの発症に大きな影響を与えることが知られている（Ｈｅｉｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が、その複雑な性質のために臨床現場では多くの場合理解されていない。肥満または脂肪肝の存在は、生体異物および非毒性化学物質（例えば、薬物）によって引き起こされる肝障害に対して患者を脆弱にする可能性があり、これらは危険因子の存在下でより低用量で肝毒性になる可能性がある（Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，２０１３）。それにもかかわらず、現在の臨床試験システムは、一握りのバイオマーカー（ＡＬＴ、ＡＳＴ）レベルで脆弱な肝臓条件下でボランティアを層別化するためには設計されていない。脂肪症を有する患者の数は無症状であり、投薬前にバイオマーカーで検出不可能であるため、臨床段階に入る前にこの脆弱条件における結果を予測することが重要である。
【００６６】
リード化合物の生成／最適化などの初期薬物スクリーニング段階におけるこれらの脆弱条件における毒性を評価するために、ＬｏＴシステムを発展させる努力を重ね、出願人は、肝臓オルガノイドに脂肪毒性ストレスを適用し、ＤＩＬＩに対する高糖尿病薬物トログリタゾンの多大な相乗効果を実証した。実際、オルガノイド系は、オルガノイド中の肝細胞へのトリグリセリドの蓄積によって促進される大量の肝細胞死を示すことによって、この特徴をうまく反映している。肥満におけるＤＩＬＩの機序の１つは、グルタチオン（ＧＳＨ）レベルの低下を説明することができる（Ｍｉｃｈａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。薬物誘発性酸化ストレスには、いくつかの原因があり得るが、特にＧＳＨ枯渇およびミトコンドリア呼吸鎖の阻害による（Ｂｅｇｒｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐｅｓｓａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。脆弱モデルは、細胞内ＧＳＨレベルの低下、およびＮＡＣを提供することによる改善されるミトコンドリア機能障害を介するトログリタゾン誘導酸化ストレスの悪化、を反映し得る。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の罹患率の劇的な上昇を考慮すると、既存のＮＡＦＬＤを悪化させるかまたはより頻繁に急性肝炎を誘発するための薬物の最小限のリストがまだあることは注目に値する。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ還元系は、単離された宿主因子がオルガノイドに効果的に展開され得るので、以前試験されなかった宿主因子を研究するための以前には予期されなかったウィンドウを提供する。
【００６７】
ＬｏＴに基づく精密医療
個別化医療の観点から、ＬｏＴを用いた最適な薬物療法の選択は、臨床において主要な関心事となるであろう。例えば、抗精神病薬の選択において考慮される戦略は、精神科病処置集団における無視できない肝障害の発生率に従って肝耐性を考慮しなければならない；考えられるＤＩＬＩ薬の１６％が神経精神薬である（Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＮＡＳＨが多くの場合、鬱病などの心理的障害を伴うことを考慮すると、抗鬱剤（三環系薬剤またはＳＳＲＩ）、気分安定剤、および神経遮断薬のより安全な組合せ選択が必要である（Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。また、加齢に伴う慢性状態の増加のために、複数剤併用（すなわち、多剤併用）は高齢者に医療を提供することの一般的な結果であり（ＭａｒｃｕｍおよびＧｅｌｌａｄ，２０１２）、ＤＩＬＩが疑われる場合に、原因となる薬を特定することが非常に困難となる。患者由来のｉＰＳＣ−オルガノイドは無限かつ再現性のある供給源を提供するので、ＬｏＴは患者におけるＤＩＬＩの可能性を層別化するためのパネルとして役立ち、個別化の観点からより安全な薬物を選択するための情報を提供することができる。
【００６８】
ＤＩＬＩに対するＬｏＴに基づく創薬
同様に重要なのは、ＬｏＴ系を用いた抗ＤＩＬＩ治療用化合物スクリーニングの潜在的用途である。多くの薬は肝臓とＤＩＬＩに有害な影響を及ぼしており、それは臨床的に大きな問題である。実際には、アセトアミノフェンは、米国におけるＤＩＬＩの症例の約半分を占める（Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。世界の他の地域、例えば発展途上国では、抗結核薬などの他の薬がＤＩＬＩの主な原因である可能性がある（ＢｅｌｌおよびＣｈａｌａｓａｎｉ，２００９）。しかし、利用可能な対症療法は数えるほどしかない。ここで、概念実証実験として、出願人は、トログリタゾンによって証明されるように、ＤＩＬＩの毒性機序に抵抗する化合物の治療効果を評価するためのオルガノイド生存実験を確立した。ＮＡＣがパラセタモール過量投与の主な治療選択である（Ｍａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；ＶｅｒｍａおよびＫａｐｌｏｗｉｔｚ，２００９）が、最近では、研究の焦点は非パラセタモール性ＤＩＬＩにおけるＮＡＣの使用の調査へと変化している（Ｃｈｕｇｈｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＬｏＴシステムは、非パラセタモール薬によるＤＩＬＩに対するＮＡＣの有効性を評価するのに有用である。さらに、このさらなるハイスループットアプローチは、ＤＩＬＩ様症状をｉｎ  ｖｉｔｒｏで回復する大規模化合物ライブラリをスクリーニングするための強力なツールとして役立つ。本明細書に記載の方法を組み合わせて、臨床ＤＩＬＩ表現型に関連する細胞内因性および外因性因子を同定および研究するために使用することができ、リード化合物最適化、機序研究、および精密化医療、ならびに抗ＤＩＬＩ療法スクリーニング用途が容易となる。
【００６９】
方法
ＰＳＣの維持
この研究で使用されたＣＹＰ２Ｃ９＊２変異体ヒトｉＰＳＣクローンを有するＴｋＤＡ３は、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉの好意により提供された。他の適切な株には、京都大学から寄贈されたヒトｉＰＳＣ株およびＣｏｒｉｅｌｌ  Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから購入した株が含まれ、以前に記載されたように維持された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。未分化ｈｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ１培地中でフィーダー不含条件下で維持された（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）。他の適切な培地は、ＬｏｎｚａからのＥ８、またはＡｉｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｃｏ．からのＳｔｅｍＦｉｔを含む。プレートを５％ＣＯ２／９５％空気を伴うインキュベーター中、３７℃で、１／３０希釈のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）でコーティングした。ｈＰＳＣ維持。Ｍａｔｒｉｇｅｌの代わりに、Ｍｉｐｐｉ  ＣｏまたはＢｉｏｌａｍｉｎａ  ＣｏのＬａｍｉｎｉｎ  ５１１、Ｌａｍｉｎｉｎ  ４１１を使用することができる。
【００７０】
肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）の産生
胚体内胚葉へのｈｉＰＳＣの分化は、以前に記載された方法にいくつかの修飾を加えて使用して、誘導された（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。簡単に説明すると、ｈｉＰＳＣのコロニーをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で単離し、１５００００〜３０００００細胞をＭａｔｒｉｇｅｌまたはラミニンコート組織培養２４ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に蒔いた。細胞が高密度になったとき（９０％超の細胞がウェルを覆う）、１日目には、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および５０ｎｇ／ｍＬの骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に、２日目には、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび０．２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地に、および３日目には、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地に、培地を交換した。４〜６日目に、細胞を、５００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ４；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含有するＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を伴うアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）中で培養した。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中で３７℃で維持し、培地は毎日交換した。分化した胚体内胚葉は、７日目にプレート上で発芽を示した。スフェロイドがＭａｔｒｉｇｅｌ中に包埋するのに十分でない場合は、４〜６日目の培地を再び添加し、３７℃で一晩インキュベートする。
【００７１】
肝臓オルガノイドへの分化３つの方法：「Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ法」、「Ｍａｔｒｉｇｅｌサンドイッチ法」、および「Ｍａｔｒｉｇｅｌフリー法」を使用して、ＤＥを肝臓オルガノイドに分化させてもよく、各方法については以下に記載される。
【００７２】
Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ法：７〜８日目に、プレーティングした細胞を有する胚体内胚葉オルガノイドを静かにピペッティングして、ディッシュから剥離した。単離したスフェロイドを８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、ディッシュ上の１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋した。プレートを５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中、３７℃で５〜１５分間置いた。Ｍａｔｒｉｇｅｌが固化した後、アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２に、Ｂ２７、Ｎ２およびレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）２μＭを１〜５日間添加した。培地を一日おきに交換した。ＲＡ処理後、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ中に包埋されたオルガノイドを、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を伴う肝細胞培養培地（ＨＣＭ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で培養した。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中で３７℃に維持し、培地は３日毎に交換した。２０〜３０日目頃に、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ中に包埋されたオルガノイドを、あらゆる分析のために、スクラッチおよび穏やかなピペッティングによって単離した。
【００７３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌサンドイッチ法：７〜８日目に、プレーティングした細胞を有する胚体内胚葉オルガノイドを静かにピペッティングして、ディッシュから剥離した。単離したスフェロイドを８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、それらを１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。同時に、全てのサプリメントを含む肝細胞培養培地を同容量の１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。ＨＣＭおよびＭａｔｒｉｇｅｌ混合物をディッシュの底にプレーティングして、プレート上に厚いコーティング（０．３〜０．５ｃｍ）を作り、次いで、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で１５〜３０分間置いた。Ｍａｔｒｉｇｅｌを固化させた後、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合したスフェロイドを、Ｍａｔｒｉｇｅｌで厚くコーティングされたプレート上に播種した。プレートを５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中、３７℃で５分間置いた。アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２に、Ｂ２７、Ｎ２およびレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）２μＭを１〜５日間添加した。培地を一日おきに交換した。ＲＡ処理後、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ中に包埋されたオルガノイドを、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を伴う肝細胞培養培地（ＨＣＭ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で培養した。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中で３７℃に維持しそして培地を３日毎に交換した。２０〜３０日目頃に、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ中に包埋されたオルガノイドを、あらゆる分析のために、スクラッチおよび穏やかなピペッティングによって単離した。
【００７４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌフリー法：７〜８日目に、プレーティングした細胞を有する胚体内胚葉オルガノイドを、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）レチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）２μＭを含むアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）中で平面培養を４日間続けた。培地を一日おきに交換した。４日間の平面培養の後、オルガノイドは出芽し始めるが、一方で、２Ｄ細胞は肝細胞に分化する。オルガノイドおよび肝細胞の両方は、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）、および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０日間を伴う肝細胞培養培地（ＨＣＭ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）下で６０日間にわたって維持することができる。オルガノイドアッセイのために、浮遊オルガノイドは、超低接着マルチウェルプレート６ウェルプレートに収集することができ、必要に応じて、その後のアッセイに使用することができる。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中で３７℃に維持しそして培地を３日毎に交換した。
【００７５】
Ｈ&Ｅ染色および免疫組織化学
肝臓オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから収集し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、次いで、パラフィン中に包埋した。切片をＨ&Ｅ染色および免疫組織化学染色にかけた。以下の一次抗体を使用した：抗ヒトアルブミン抗体（１：２００希釈  ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＩＶ型コラーゲン抗体（１：２００希釈  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＺＯ−１抗体（１：２００希釈  ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）および抗ＭＲＰ２抗体（１：２００希釈  Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）。色素結合二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８結合ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ；１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１００４２）を室温で２時間、オルガノイドに適用した。核を１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１０分間染色し、その後オルガノイドを洗浄用緩衝液で３回再度洗浄した。標本を蛍光顕微鏡または明視野下で観察した。全組織標本免疫組織化学染色のために、肝臓オルガノイドを４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、２．５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）で室温で透過処理した後、オルガノイドを、ＰＢＳで希釈した以下の一次抗体：ポリクローナル抗ＢＳＥＰ抗体（１：２００  Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で一晩インキュベートした。蛍光色素結合二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８結合ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ；１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１００４２）を室温で２時間、オルガノイドに適用した。反応後、細胞を洗浄用緩衝液（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００［Ｓｉｇｍａ］および０．５％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ］を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。核を１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１０分間染色し、その後オルガノイドを洗浄用緩衝液で３回再度洗浄した。標本をＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒｓｉ倒立共焦点顕微鏡で実施した共焦点イメージングの下で観察した。
【００７６】
ＲＮＡ単離、ＲＴ−ｑＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＲＮＡを単離した。製造元のプロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて逆転写を行った。ｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３  リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）上でＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｍｅｓ）を使用して実施した。各標的遺伝子についての全てのプライマーおよびプローブ情報は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｑｐｃｒ．ｐｒｏｂｅｆｉｎｄｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｇａｎｉｓｍ．ｊｓｐ）から入手した。
【００７７】
ＲＮＡ配列データの主成分分析
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００での配列決定は、以前に記載されている（Ａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＴｏｐＨａｔ（バージョン２．０．１３）を用いてＲＮＡ−Ｓｅｑリードをヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に整列させた。ＴｏｐｈａｔからのアラインメントデータをアセンブラーＣｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．２．１）に供給して、アラインメントされたＲＮＡ−Ｓｅｑリードを転写物に組み立てた。注釈付き転写物は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）およびＥｎｓｅｍｂｌデータベースから得た。転写物存在量は、マッピングされた百万フラグメント当たりのエキソンの１キロベース当たりのフラグメント数（ＦＰＫＭ）で測定された。
【００７８】
ｐＨＬＯの系統を比較するために、出願人は、以下のようにインハウスのＲＮＡ配列データ（ｐＦＧおよびオルガノイド）を前処理した公開データと組み合わせた：ｉＰＳＣ、ＤＥ、ＨＳ、ＨＰ、ｉＤＨおよびＮＨＣの転写物存在量は、ＧＳＥ８６００７から得た（Ｊａｌａｎ−Ｓａｋｒｉｋａｒ    ｅｔ  ａｌ．，２０１６）；小児肝臓組織、成体肝臓組織、成体右葉組織、胎児肝臓組織、および初代肝細胞のものが、エンコード（ＥＮＣＯＤＥ）（ＥＮＣＦＦ４１８ＢＶＦ、ＥＮＣＦＦ８０４ＱＷＦ、ＥＮＣＦＦ９６５ＩＱＨ、ＥＮＣＦＦ９１８ＳＪＯ、ＥＮＣＦＦ３６７ＦＪＪ、ＥＮＣＦＦ０２９ＩＵＦ、ＥＮＣＦＦ２８０ＹＮＯ、ＥＮＣＦＦ３４７ＴＸＷ、ＥＮＣＦＦ７２４ＣＱＩ、ＥＮＣＦＦ６２４ＬＱＬ、ＥＮＣＦＦ９６２ＳＯＤ、ＥＮＣＦＦ１７０ＡＥＣ）（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１２；Ｓｌｏａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）およびＧＳＥ８５２２３（Ａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）から得られた。可能なデータ前処理の後に全てのデータセットが同一の遺伝子記号を有する場合には遺伝子を使用した。出願人は、ｌｏｇ２空間でＦＰＫＭ＋１およびＲＰＫＭ＋１データの四分位数正規化を行い、続いて中央値発現レベルの上位１００００以内の遺伝子を選択した。ＲパッケージＦａｃｔｏＭｉｎｅＲ（バージョン１．３５）を使用することによってスケール化された遺伝子発現レベルを使用することによって、主成分分析を実施した（Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ  Ｌｅ，２００８）。
【００７９】
タンパク質分泌分析
オルガノイドのアルブミン、フィブリノゲンおよび補体因子の分泌レベルを測定するために、超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上のオルガノイドの培養上清２００μＬを収集した。培養上清を回収し、使用時まで−８０℃で保存した。ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量セット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＴＸ、ＵＳＡ）およびフィブリノゲン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元の指示に従って用いて、上清をアッセイした。補体因子を分析するために、Ｌｕｍｉｎｅｘシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造業者の指示に従って用いて、上清を測定した。細胞数当たりのアルブミン産生量を算出するために、細胞数のオルガノイド直径による線形回帰式を用いた。管腔内オルガノイドの総胆汁酸分泌レベルを測定するために、マイクロインジェクションＮａｎｏｊｅｃｔ  ＩＩ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて、オルガノイド内部の液体を吸収した。吸収した液体をＰＢＳで希釈し、次いで、総胆汁酸ＥＬＩＳＡキット（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ、Ｉｎｃ．、ＧＡ、ＵＳＡ）を用いてアッセイした。総胆汁酸の容量を算出するために、オルガノイド中の細胞の数を、アルブミン産生についてと同じ方法で線形回帰式を用いて算出し、また、コール酸の分子量を算出のために使用し、以前の報告における容量と比較した。
【００８０】
透過電子顕微鏡法
透過型電子顕微鏡法のために、簡単には、オルガノイドを４℃で一晩３％グルタルアルデヒド中で固定し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中で洗浄し、次いで、４％四酸化オスミウム中で１時間インキュベートした。続いてそれらを洗浄し、次いでエタノール系列中で脱水し、そして最後にプロピレンオキシド／ＬＸ１１２中に包埋した。次に組織を切片化し、２％酢酸ウラニル、続いてクエン酸鉛で染色した。画像はＨｉｔａｃｈｉ透過型電子顕微鏡で視覚化した。
【００８１】
ＣＧａｍＦアッセイ
簡単に説明すると、オルガノイドを、輸送用緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ  ３、４．８３ｍＭ  ＫＣｌ、０．９６ｍＭ  ＫＨ  ２  ＰＯ  ４、１．２０ｍＭ  ＭｇＳＯ  ４、１２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭグルコース、１．５３ｍＭ  ＣａＣｌ  ２、ｐＨ７．４に調整）と共に３０分間プレインキュベートした。次に、オルガノイドを１０μＭの蛍光標識胆汁酸（ＣＧａｍＦ；Ｄｒ  Ｈｏｆｍａｎｎから寄贈）で１時間処理し、その後、オルガノイドをＰＢＳで３回洗浄した。画像を蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）上で得た。
【００８２】
胆汁輸送阻害の評価
フルオレセインジアセテートをオルガノイド中の胆汁輸送活性を評価するために使用した。２５日目頃に、オルガノイドをＰＢＳですすぎ、フルオレセインジアセテートを培地中でオルガノイドに処理した。さらに、輸送の方向を調べるために、Ｎａｎｏｊｅｃｔ  ＩＩＩ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてフルオレセインジアセテートをオルガノイドに注入した。フルオレセインジアセテートの処理または注射の後、画像を蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で捕捉した。次に、試験システムの実現可能性を確認するために、ＨＣＭ中の１０ｍｇ／ｍＬフルオレセインジアセテート（Ｓｉｇｍａ）に２０μＭシクロスポリンＡ（ＣＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を４５分間添加し、蛍光顕微鏡法ＢＺ−９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を使用して画像を連続的に捕捉した。胆汁輸送阻害の評価のために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）、陰性対照としてストレプトマイシン（ＳＴＰ；Ｓｉｇｍａ）、トルカポン（Ｔｏｌ；Ｓｉｇｍａ）、ジクロフェナク（Ｄｉｃｌｏ；Ｓｉｇｍａ）、ボセンタン（ＢＯＳ；Ｓｉｇｍａ）、ＣＳＡ、トログリタゾン（Ｔｒｏ；Ｓｉｇｍａ）、ネファドゾン（Ｎｅｆａ；Ｓｉｇｍａ）、エンタカポン（Ｅｎｔａ；Ｓｉｇｍａ）およびピオグリタゾン（ＰＩＯ、Ｓｉｇｍａ）での処理後、ＨＣＭ中の１０ｍｇ／ｍＬフルオレセインジアセテートを加えた。５分間インキュベートした後、オルガノイドをＰＢＳで３回すすぎ、そして蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７１０を用いて画像を連続的に捕捉した。Ｉｍａｇｅｊ  １．４８ｋソフトウェア（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨＲ、ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用して、オルガノイドの外側と内側の強度の比を計算することによって、分析を行った。処理中の明度またはコントラストの変化は、画像全体にわたって等しく適用された。
【００８３】
ミトコンドリア毒性可能性の評価
各培養条件下の超低接着マルチウェルプレート６ウェルプレートにて培養した後、オルガノイドを拾い上げ、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ  ８ウェルガラスボトム（Ｉｂｉｄｉ、ＷＩ、ＵＳＡ）に播種した。ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の評価のために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）、陰性対照としてストレプトマイシン（ＳＴＰ；Ｓｉｇｍａ）、トルカポン（Ｔｏｌ；Ｓｉｇｍａ）、ジクロフェナク（Ｄｉｃｌｏ；Ｓｉｇｍａ）、ボセンタン（ＢＯＳ；Ｓｉｇｍａ）、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ；Ｓｉｇｍａ）、トログリタゾン（Ｔｒｏ；Ｓｉｇｍａ）、ネファドゾン（Ｎｅｆａ；Ｓｉｇｍａ）、エンタカポン（Ｅｎｔａ；Ｓｉｇｍａ）およびピオグリタゾン（ＰＩＯ、Ｓｉｇｍａ）での２４時間の処理後、２５０ｎＭ  テトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩（ＴＭＲＭ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。３０分間インキュベートした後、オルガノイドをＰＢＳで３回すすぎ、６０倍の水浸対物レンズを用いてＮｉｋｏｎ  Ａ１倒立共焦点顕微鏡（日本）上で画像をスキャンした。ＴＭＲＭのアリアス（Ａｒｉａｓ）および強度は、ＩＭＡＲＩＳ  ８（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりＭＭＰとして計算された。胆汁うっ滞性ストレスおよびミトコンドリア性ストレスを評価するために、薬物処置後２４時間目にオルガノイドごとにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることにより細胞生存率を測定し、細胞死に至る細胞損傷に起因する二次的変化を回避するために、各用量にて生存率が低下しないことが確認された。
【００８４】
ミトコンドリアおよび胆汁うっ滞性ストレスとオルガノイドにおける細胞生存率との関係の分析
細胞生存率とミトコンドリアおよび胆汁うっ滞性ストレスとの関係を実証するために、まず、ミトコンドリアおよび胆汁うっ滞性ストレスアッセイから得られた値に基づいて、以下の式：「指数＝−（サンプル値−対照値）×１００」を用いて、指数を設定した。ミトコンドリアおよび胆汁うっ滞性ストレスに関連する細胞損傷を分析するために、薬物処置後７２時間目に、オルガノイド当たりのＡＴＰ含量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。これらのデータは、Ｉｎｆｏｇｒ．ａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｆｏｇｒ．ａｍ）：無料のウェブベースのツールを使用して図４、パネルＢとして示された。
【００８５】
脆弱条件におけるオルガノイドの生存率の評価
実験は図５Ａに示すように実施した。Ｍａｔｒｉｇｅｌから排除され洗浄された後、オルガノイドは、超低接着マルチウェルプレート６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で３日間８００μＭオレイン酸で処理された。次に、５０μＭのトログリタゾンを５０μＭのＮＡＣの存在下または非存在下で２４時間処理した。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００を用いて画像を連続的に得た。
【００８６】
脂質誘発ミトコンドリアストレス評価
各培養条件下の超低接着マルチウェルプレート６ウェルプレートにて培養した後、２０個のオルガノイドを拾い上げ、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ  ８ウェルガラスボトム（Ｉｂｉｄｉ、ＷＩ、ＵＳＡ）に播種し、生細胞染色に付した。以下の試薬またはキットを使用した：脂質用のＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および細胞骨格用のＳｉＲアクチンキット（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＬ、ＵＳＡ）、ＲＯＳ用のＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）緑色試薬（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ミトコンドリア用のＴＭＲＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。オルガノイドを可視化し、６０倍の水浸対物レンズを用いてＮｉｋｏｎ  Ａ１倒立共焦点顕微鏡（日本）でスキャンした。ＲＯＳ産生、ミトコンドリアのサイズおよび数は、ＩＭＡＲＩＳ８によって分析された。
【００８７】
統計学
統計的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定または一元配置分散分析とダネットの多重比較事後検定を用いて決定した。Ｐ<０．０５を有意と見なした。
【００８８】
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Ｆａｈｒｍａｙｒ，Ｃ．，Ｋｏｎｉｇ，Ｊ．，Ａｕｇｅ，Ｄ．，Ｍｉｅｔｈ，Ｍ．，Ｍｕｎｃｈ，Ｋ．，Ｓｅｇｒｅｓｔａａ，Ｊ．，Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｔ．，Ｔｒｅｉｂｅｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．（２０１３）．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ＭＲＰ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｂｏｓｅｎｔａｎ  ｉｎ  ａ  ＭＤＣＫＩＩ−ＯＡＴＰ１Ｂ１−ＣＹＰ３Ａ４−ＵＧＴ１Ａ１−ＭＲＰ２  ｑｕａｄｒｕｐｌｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １６９，２１−３３．
Ｆａｌａｓｃａ，Ｌ．，Ｆａｖａｌｅ，Ａ．，Ｓｅｒａｆｉｎｏ，Ａ．，Ａｒａ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｔｉ  Ｄｅｖｉｒｇｉｌｉｉｓ，Ｌ．（１９９８）．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅ−ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２９３，３３７−３４７．
Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．，Ｃｒｏｆｔ−Ｂａｋｅｒ，Ｊ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．，Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｐ．，ａｎｄ  ＭｃＬｅａｎ，Ａ．Ｊ．（２００２）．Ｅｎｔａｃａｐｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  １７，１３６２−１３６５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １３９７−１４００．
Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．（２０１３）．Ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５８，８２４−８２６．
Ｈｅｉｄａｒｉ，Ｒ．，Ｎｉｋｎａｈａｄ，Ｈ．，Ｊａｍｓｈｉｄｚａｄｅｈ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｂｄｏｌｉ，Ｎ．（２０１４）．Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ：ａｎｔｉｔｈｙｒｏｉｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｓ  ｉｎｓｔａｎｃｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｍｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０，２３７−２４８．
Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎａｇａｔａ，Ｎ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２０１４）．ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇａｍｅ  ｃｈａｎｇｅｒ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ３３，４０９−４１７．
Ｊａｌａｎ−Ｓａｋｒｉｋａｒ，Ｎ．，Ｄｅ  Ａｓｓｕｎｃａｏ，Ｔ．Ｍ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ａｌｍａｄａ，Ｌ．Ｌ．，Ｌｏｍｂｅｒｋ，Ｇ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｚａｐｉｃｏ，Ｍ．Ｅ．，Ｕｒｒｕｔｉａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｈｕｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｃ．（２０１６）．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ａｎ  ＥＺＨ２−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１，ｅ０１６８２６６．
Ｋｏｃｋ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｋ．Ｌ．（２０１２）．Ａ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｅｆｆｌｕｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９２，５９９−６１２．
Ｋｒａｈｅｎｂｕｈｌ，Ｓ．，Ｔａｌｏｓ，Ｃ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｎ，Ｊ．（１９９４）．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９，４７１−４７９．
Ｌｅ  Ｖｅｅ，Ｍ．，Ｎｏｅｌ，Ｇ．，Ｊｏｕａｎ，Ｅ．，Ｓｔｉｅｇｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｆａｒｄｅｌ，Ｏ．（２０１３）．Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ＨｅｐａＲＧ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７，１９７９−１９８６．
Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｃ．，Ｒｅｉｃｈｅｌ，Ｖ．，Ｍｏｅｎｎｉｎｇ，Ｕ．，Ｒｅｉｃｈｅｌ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｃｋｅｒ，Ｇ．（２０１０）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ２；ＡＢＣＣ２）  ｉｎ  ＭＤＣＫＩＩ−ＭＲＰ２  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ７５，２８４−２９０．
Ｌｅｅ，Ｗ．Ｍ．，Ｈｙｎａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｒｏｓｓａｒｏ，Ｌ．，Ｆｏｎｔａｎａ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｔｒａｖｉｔｚ，Ｒ．Ｔ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｄａｖｅｒｎ，Ｔ．Ｊ．，２ｎｄ，Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｇ．，ＭｃＣａｓｈｌａｎｄ，Ｔ．，Ｒｅｉｓｃｈ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｎｏｎ−ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７，８５６−８６４，８６４  ｅ８５１．
Ｌｅｓｌｉｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｐ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｒ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｋ．Ｌ．（２００７）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｎａ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＴＣＰ／ＳＬＣ１０Ａ１）ｂｙ  ｂｏｓｅｎｔａｎ：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３２１，１１７０−１１７８．
Ｌｉ，Ｎ．，Ｏｑｕｅｎｄｏ，Ｅ．，Ｃａｐａｌｄｉ，Ｒ．Ａ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｈｅ，Ｙ．Ｄ．，Ｈａｍａｄｅｈ，Ｈ．Ｋ．，Ａｆｓｈａｒｉ，Ｃ．Ａ．，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ−Ｄｕｎｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｐ．Ｋ．（２０１４）．Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  １４２，２６１−２７３．
Ｍａｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｗｅｎｄｏｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．（１９９５）．Ａ  ７−ｙｅａｒ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（１９８７−１９９３）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９，１９０７−１９１６．
Ｍａｌｉｎｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｋａｎｎｉｎｅｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｏｒｌｕ，Ａ．，Ｉｓｏｎｉｅｍｉ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｏｕ，Ｙ．Ｒ．，Ｙｌｉｐｅｒｔｔｕｌａ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｕｒｔｔｉ，Ａ．Ｏ．（２０１４）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｇｅｌａｔｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，５１１０−５１２１．
Ｍａｒｃｕｍ，Ｚ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｌｌａｄ，Ｗ．Ｆ．（２０１２）．Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ．Ｃｌｉｎ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｍｅｄ  ２８，２８７−３００．
Ｍｉｃｈａｕｔ，Ａ．，Ｌｅ  Ｇｕｉｌｌｏｕ，Ｄ．，Ｍｏｒｅａｕ，Ｃ．，Ｂｕｃｈｅｒ，Ｓ．，ＭｃＧｉｌｌ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎａｉｓ，Ｓ．，Ｇｉｃｑｕｅｌ，Ｔ．，Ｍｏｒｅｌ，Ｉ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊａｅｓｃｈｋｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２９２，４０−５５．
Ｍｉｋｉ，Ｔ．，Ｒｉｎｇ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｊ．（２０１１）．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７，５５７−５６８．
Ｍｏｒｋ，Ｌ．Ｍ．，Ｉｓａｋｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｂｏｒａｎ，Ｎ．，Ｅｒｉｃｚｏｎ，Ｂ．Ｇ．，Ｓｔｒｏｍ，Ｓ．，Ｆｉｓｃｈｌｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ，Ｅ．（２０１２）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２，３１５−３２２．
Ｎａｖａｒｒｏ，Ｖ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｅｎｉｏｒ，Ｊ．Ｒ．（２００６）．Ｄｒｕｇ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４，７３１−７３９．
Ｎｉ，Ｘ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ｗｕ，Ｚ．，Ｍａ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｈｕｉ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｎ，Ｇ．（２０１６）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（ｈｉＨｅｐｓ）  ｗｉｔｈ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６，３８６９４．
Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｔ．，Ｇａｔｍａｉｔａｎ，Ｚ．，Ｃｈｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａｒｉａｓ，Ｉ．Ｍ．（１９９１）．Ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ａｎ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８，６５９０−６５９４．
Ｏｏｒｔｓ，Ｍ．，Ｂａｚｅ，Ａ．，Ｂａｃｈｅｌｌｉｅｒ，Ｐ．，Ｈｅｙｄ，Ｂ．，Ｚａｃｈａｒｉａｓ，Ｔ．，Ａｎｎａｅｒｔ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈｅｒｔ，Ｌ．（２０１６）．Ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ３４，１７９−１８６．
Ｐｅｓｓａｙｒｅ，Ｄ．，Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．，Ｂｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｌｅｔｔｅｒｏｎ，Ｐ．，Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ａ．（２０１２）．Ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｎ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  ４４，３４−８７．
Ｐｅｓｓａｙｒｅ，Ｄ．，Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ａ．，Ｂｅｒｓｏｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．（２０１０）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３１１−３６５．
Ｐｏｌｓｏｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｗ．Ｍ．（２００５）．ＡＡＳＬＤ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ：ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１，１１７９−１１９７．
Ｒａｃｈｅｋ，Ｌ．Ｉ．，Ｙｕｚｅｆｏｖｙｃｈ，Ｌ．Ｖ．，Ｌｅｄｏｕｘ，Ｓ．Ｐ．，Ｊｕｌｉｅ，Ｎ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．（２００９）．Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ，ｄａｍａｇｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２４０，３４８−３５４．
Ｒｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｔｈｙｆａｕｌｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｕｐｔｅｒｇｒｏｖｅ，Ｇ．Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｐｌｅｓ，Ｓ．Ｐ．，Ｂｏｒｅｎｇａｓｓｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｍｉｋｕｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｌａｙｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｂｏｏｔｈ，Ｆ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａｎ  ｏｂｅｓｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５２，７２７−７３６．
Ｒｕｓｓｏ，Ｍ．Ｗ．，Ｇａｌａｎｋｏ，Ｊ．Ａ．，Ｓｈｒｅｓｔｈａ，Ｒ．，Ｆｒｉｅｄ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｐ．（２００４）．Ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ｄｒｕｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ  １０，１０１８−１０２３．
Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ  Ｌｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｈｕｓｓｏｎ（２００８）．ＦａｃｔｏＭｉｎｅＲ：Ａｎ  Ｒ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２５．
Ｓｅｒｖｉｄｄｉｏ，Ｇ．，Ｐｅｒｅｄａ，Ｊ．，Ｐａｌｌａｒｄｏ，Ｆ．Ｖ．，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｊ．，Ｂｏｒｒａｓ，Ｃ．，Ｃｕｔｒｉｎ，Ｊ．，Ｖｅｎｄｅｍｉａｌｅ，Ｇ．，Ｐｏｌｉ，Ｇ．，Ｖｉｎａ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓａｓｔｒｅ，Ｊ．（２００４）．Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９，７１１−７２０．
Ｓｌｏａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａｌｌａｄｉ，Ｖ．Ｓ．，Ｓｔｒａｔｔａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｉｔｚ，Ｂ．Ｃ．，Ｇａｂｄａｎｋ，Ｉ．，Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ａ．Ｋ．，Ｈｏ，Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．ＥＮＣＯＤＥ  ｄａｔａ  ａｔ  ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  ｐｏｒｔａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４，Ｄ７２６−７３２．
Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｌｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｓ．，Ａｎ，Ｄ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍａ，Ｍ．（２０１５）．Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｖｉａ  ３Ｄ  ｃｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５，１６８８４．
Ｓｏｎｇ，Ｚ．，Ｃａｉ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｚｈａｏ，Ｄ．，Ｙｏｎｇ，Ｊ．，Ｄｕｏ，Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｘ．，Ｇｕｏ，Ｙ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．，Ｑｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９，１２３３−１２４２．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｋｕｈａｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｏｌｌｅ，Ｋ．，Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｉ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７０，１０５−１０９．
Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｔ．Ｋ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｓａｆｅｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｎａｒｒｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｏｃｕｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １４，１６２−１６７．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．，Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １３１，８６１−８７２．
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Ｔｉａｎ，Ｘ．，Ｚａｍｅｋ−Ｇｌｉｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｋ．Ｌ．（２００４）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（Ｍｒｐ２）  ａｎｄ  Ｍｒｐ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６６，１００４−１０１０．
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Ｖｅｒｍａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋａｐｌｏｗｉｔｚ，Ｎ．（２００９）．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｇｕｔ  ５８，１５５５−１５６４．
Ｖｏｓｏｕｇｈ，Ｍ．，Ｏｍｉｄｉｎｉａ，Ｅ．，Ｋａｄｉｖａｒ，Ｍ．，Ｓｈｏｋｒｇｏｚａｒ，Ｍ．Ａ．，Ｐｏｕｒｎａｓｒ，Ｂ．，Ａｇｈｄａｍｉ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｂａｈａｒｖａｎｄ，Ｈ．（２０１３）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｓｃａｌａｂｌｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  ２２，２６９３−２７０５．
Ｙａｎｇ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｈｅａｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｐ．Ｂ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｋ．Ｌ．（２０１４）．Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９６，５８９−５９８．
Ｚｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｏｊｔｃｚａｋ，Ｌ．（１９６３）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｂｙ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｃｈａｉｎ  Ｌｅｎｇｔｈ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７０，５９６−５９８．
【００８９】
他に指示がない限り、パーセンテージおよび割合は全て重量で計算される。
【００９０】
全てのパーセンテージおよび割合は、特に指示がない限り、組成物全体を基準にして計算される。
【００９１】
本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最大数値限定には、それより小さいあらゆる数値限定が、そのようなより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含まれることを理解すべきである。本明細書全体を通じて記載されるあらゆる最小数値限定は、それよりも大きいあらゆる数値限定を、あたかもこうしたそれよりも大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含む。本明細書全体を通じて記載されるあらゆる数値範囲は、こうしたより広い数値範囲内に入る、それよりも狭いあらゆる数値範囲を、あたかもこうしたそれよりも狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのように含む。
【００９２】
本明細書に開示した寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に指定されないかぎり、そのような各寸法は、列挙された値とその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味することが意図されている。例えば、「２０ｍｍ」として開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味するものとする。
【００９３】
相互参照されるまたは関連特許もしくは出願のいずれも含めた、本明細書に引用されているすべての文書は、明示的に除外される、または特に限定されないかぎり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いかなる文献の引用も、本明細書中で開示または特許請求される任意の発明に対する先行技術であるとはみなされず、あるいはそれを単独でまたは他の任意の参考文献（単数または複数）と組み合わせたときに、そのような発明すべてを教示、示唆、または開示するとはみなされない。さらに、本文書における用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれた文書内の同じ用語の意味または定義と矛盾する場合、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が適用されるものとする。
【００９４】
本発明の特定の実施形態を例示し説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の様々な変更および修正を加えることができることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更および修正を添付の特許請求の範囲で網羅することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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