(57)【要約】  本発明は、薬剤学及び医学の分野に関し、特に、サイズが制御された構造成分を有する、磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁形態を製造する方法であって、当該懸濁形態が事前水和を必要としない方法、及びこの方法により製造される、組織の修復再生を刺激するための製品に関する。
2019531160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズが制御された構造成分を有する、磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁形態を調製する方法であって、前記懸濁形態が、事前水和を必要とせず、前記方法が:
精製した線維性細胞外マトリックスのシートを分離し、前記層を磨砕して、前記精製した細胞外マトリックスの粒子から微粉末を調製する工程、
次いで前記粉末を分画する工程、及び
コラーゲンの変性を引き起こさない温度で、粒子を液体媒体中において撹拌するサイクルと、分散させるサイクルとを交互に繰り返すことによって、前記精製した細胞外マトリックスの選択した粒子画分を液体媒体中に懸濁させる工程であって、前記撹拌処理を経時的に優勢とする工程、並びに
前記得られた粒子懸濁液を脱気する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞外マトリックスが、同種又は異種の結合組織に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ホモジナイザー・ディスパーサーが、浸漬デバイスである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
ホモジナイザー・ディスパーサーが、循環デバイスである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記撹拌及び分散が実施される前記液体媒体が、等張の又は高張の溶液である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記液体媒体が、増殖因子、形成タンパク質、ホルモン、治療物質及び治療薬物、例えば、抗生物質製剤、止血剤、鎮痛剤及び局所麻酔剤等、並びに治療に役立つ天然の多糖類を含む群から選択される少なくとも1つの成分を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁形態の細胞外マトリックスの構造成分のサイズが、完全に無傷の束からそれより小さい束及び線維まで変化し得るコラーゲン線維束の線維の離解度分離によって決定され、前記使用される精製したマトリックスのタイプに応じて、前記撹拌処理及び分散処理の継続時間を変化させることによって並びに繰り返すサイクルの回数によって制御される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
全ての前記工程が、無菌条件下で実施され、前記得られる懸濁形態の無菌性が提供される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記得られる懸濁液を最終包装材中で放射線滅菌する工程を更に含み、前記得られる懸濁形態の無菌性が提供される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
シートを磨砕して微粉末を調製する前記工程が、室温で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
磨砕する工程の前に、前記脱細胞化細胞外マトリックスが、架橋剤で更に処理される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
組織の修復再生を刺激するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって調製される製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤学及び医学の分野に関し、特に、サイズが制御された構造成分を有する、磨砕した脱細胞化(decellularized)細胞外マトリックスの懸濁形態を製造する方法であって、当該懸濁形態が事前水和を必要としない方法、及びこの方法により製造される、組織の修復再生を刺激するための製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱細胞化(無細胞の)細胞外マトリックスを主成分とする医療製品は、現在、形成手術及び再建手術において広く使用されている。更に、再生医療の分野におけるそのような医療製品の適用は増加し続けている。このタイプの生体吸収型材料に対して科学的及び実際的な関心が生じるのは、その修復特性が高いためであり、この修復特性は、主として組織中に存在する細胞外マトリックスの三次元の超微細構造が維持されること、その空間的な形態及び化学組成によってもたらされるものである。多くの研究が、種々の方法によって様々な源から製造された脱細胞化細胞外マトリックスの、走化性、細胞遊走及び分化、並びに自家組織の再構築を促進する能力を示している(Crapo P.M.、Gilbert T.W.、Badylak S.F.、「An overview of tissue and whole organ decellularization processes.」Biomaterials、2011年、第32巻、No. 12、3233〜3243頁)。
【０００３】
市場で入手可能な脱細胞化細胞外マトリックス系の製品の大多数は、凍結乾燥したプレート又は膜に代表され、それらは、中空器官の壁の欠損の修復(Burger G.W.、Halm J.A.、Wijsmuller A.R.、ten Raa S.、Jeekel J.、「Evaluation of new prosthetic meshes for ventral hernia repair.」Surgical endoscopy、2006年、第20巻、No. 8、1320〜1325頁)、歯科学における骨組織の再生(Bunyaratavej P.、Wang H.L.、「Collagen membranes: a review.」Journal of periodontology、2001年、第72巻、No. 2、215〜229頁)、靱帯及び腱の回復、並びに程度は低くなるが、種々の原因の創傷皮膚欠損の処置(Cornwell K.G.、Landsman A.、James K.S.、「Extracellular matrix biomaterials for soft tissue repair.」Clinics in podiatric medicine and surgery、2009年、第26巻、No. 4、507〜523頁)において使用することを目的としている。しかしながら、主に泌尿器科学及び耳鼻咽喉科学の分野における一部の病態の外科的処置においては、並びに美容学における輪郭形成術(contouring procedures)においては、組織の失われた機械的機能の置換、及び自家組織の形成をもたらす修復プロセスの活性化を可能にする生体適合性材料の注射可能な形態を使用する必要がある。また、軽度の滲出を伴う慢性創傷の処置においては、創傷欠損を容易に充填し、水分を多量に含有する創傷ドレッシング材を使用することが好ましい。上記の特徴と、精製した細胞外マトリックスの生物学的特性とを組み合わせた医療デバイスの開発という課題は、磨砕したマトリックスの粒子を液相に懸濁させて使用することによって、概ね解決することができる。例えば、US 6,933,326 B1及びEP 1087756 A1は、同種源又は異種源に由来する、磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスを凍結乾燥したものを製造する方法であって、当該マトリックスが使用前に事前に再水和されなければならない方法を記載している。LifeCell Corporation社(米国)は、この特許の方法に基づいて、医療デバイスCymetra÷を製造しており、これは、磨砕した真皮の同種細胞外マトリックスを凍結乾燥してシリンジに充填したものである。公開データによれば、Cymetra÷は、気管食道穿刺(Seshamani M.、Ruiz C.、Kasper Schwartz S.、Mirza N.、「Cymetra injections to treat leakage around a tracheoesophageal puncture.」Journal of oto-rhino-laryngology and its related specialities、2006年、第68巻、No. 3、146〜148頁)、一側性声帯麻痺の患者の喉頭形成術(Milstein C.F.、Akst L.M.、Hicks M.D.、Abelson T.I.、Strome M.、「Long-term effects of micronized Alloderm injection for unilateral vocal fold paralysis.」Laryngoscope、2005年、第115巻、No. 9、1691〜1696頁)、及び口唇拡大術(Sclafani A. P.、Romo T.、Jacono A.A.、「Rejuvenation of the aging lip with an injectable acellular dermal graft(Cymetra).」Archives of fascial plastic surgery、2002年、第4巻、No. 4、252〜257頁)において治療効果を示している。更に、公開データによれば、ブタ膀胱の細胞外マトリックスを精製し、磨砕して、注射の直前に液相と混合したものは、尿失禁(Wood J.D.、Simmons-Byrd A.、Spievack A.R.、Badylak S.F.、「Use of a particulate extracellular matrix bioscaffold for treatment of acquired urinary incontin
ence in dogs.」Journal of the American veterinary medical association、2005年、第226巻、No. 7、1095〜1097頁)及びイヌの寛骨大腿関節の変形性関節症(Rose W.、Wood J. D.、Simmons-Byrd A.、Spievack A.R.、「Effect of a xenogeneic urinary bladder injectable bioscaffold on lameness in dogs with osteoarthritis of the coxofemoral joint(hip): a randomized, double blinded controlled trial.」International journal of applied research in veterinary medicine、2009年、第7巻、No. 1、13〜22頁)の処置に適用することに成功した。
【０００４】
上記の磨砕した脱細胞化マトリックスを使用する方法の重大な欠点(処置方法におけるその適用を大きく制限する)は、非経口又は外用で投与するために、材料を水和させた後に、その懸濁形態を調製することが困難であることである。この困難の原因は、主に材料の粒子の凝集及び粒子の不均一な湿潤であり、このため、粒子が均一に懸濁することが阻害される。
【０００５】
細胞が成長するマトリックスの構造要素のサイズを低減すると、細胞の生存率の上昇、並びに細胞の遊走及び分化の加速が促進されることが、公開データから知られている(Stevens M.M.、George J.H.、「Exploring and engineering the cell surface interface.」Science、2005年、第310巻、No. 5751、1135〜1138頁)。この現象は、表面積の増加、及びその結果としての、利用可能な膜受容体結合部位の数の増加と関連している。一方で、磨砕した脱細胞化マトリックスを液体中に単純に懸濁させても、マトリックスの粒径を変えること以外には、固体分散相の成分の寸法の特徴を変化させることはできない。このため、ひいては、修復特性が制御された注射可能な生体吸収型材料を得ることが極めて困難となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US 6,933,326 B1
【特許文献２】EP 1087756 A1
【特許文献３】RU 2353397
【特許文献４】US 5336616 A
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Crapo P.M.、Gilbert T.W.、Badylak S.F.、「An overview of tissue and whole organ decellularization processes.」Biomaterials、2011年、第32巻、No. 12、3233〜3243頁
【非特許文献２】Burger G.W.、Halm J.A.、Wijsmuller A.R.、ten Raa S.、Jeekel J.、「Evaluation of new prosthetic meshes for ventral hernia repair.」Surgical endoscopy、2006年、第20巻、No. 8、1320〜1325頁
【非特許文献３】Bunyaratavej P.、Wang H.L.、「Collagen membranes: a review.」Journal of periodontology、2001年、第72巻、No. 2、215〜229頁
【非特許文献４】Cornwell K.G.、Landsman A.、James K.S.、「Extracellular matrix biomaterials for soft tissue repair.」Clinics in podiatric medicine and surgery、2009年、第26巻、No. 4、507〜523頁
【非特許文献５】Seshamani M.、Ruiz C.、Kasper Schwartz S.、Mirza N.、「Cymetra injections to treat leakage around a tracheoesophageal puncture.」Journal of oto-rhino-laryngology and its related specialities、2006年、第68巻、No. 3、146〜148頁
【非特許文献６】Milstein C.F.、Akst L.M.、Hicks M.D.、Abelson T.I.、Strome M.、「Long-term effects of micronized Alloderm injection for unilateral vocal fold paralysis.」Laryngoscope、2005年、第115巻、No. 9、1691〜1696頁
【非特許文献７】Sclafani A. P.、Romo T.、Jacono A.A.、「Rejuvenation of the aging lip with an injectable acellular dermal graft(Cymetra).」Archives of fascial plastic surgery、2002年、第4巻、No. 4、252〜257頁
【非特許文献８】Wood J.D.、Simmons-Byrd A.、Spievack A.R.、Badylak S.F.、「Use of a particulate extracellular matrix bioscaffold for treatment of acquired urinary incontinence in dogs.」Journal of the American veterinary medical association、2005年、第226巻、No. 7、1095〜1097頁
【非特許文献９】Rose W.、Wood J. D.、Simmons-Byrd A.、Spievack A.R.、「Effect of a xenogeneic urinary bladder injectable bioscaffold on lameness in dogs with osteoarthritis of the coxofemoral joint(hip): a randomized, double blinded controlled trial.」International journal of applied research in veterinary medicine、2009年、第7巻、No. 1、13〜22頁
【非特許文献１０】Stevens M.M.、George J.H.、「Exploring and engineering the cell surface interface.」Science、2005年、第310巻、No. 5751、1135〜1138頁
【非特許文献１１】Badylak S.F.、Taylor D.、Uygun K.、「Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.」Annual review of biomedical engineering、2011年、第15巻、No. 13、27〜53頁
【非特許文献１２】ISO-3310-1
【非特許文献１３】GOST R 52249
【非特許文献１４】GOST R ISO 13408
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、サイズが制御された構造成分を有する、磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁形態を調製する方法であって、当該形態が事前水和を必要とせず、当該形態を所望の部位に切開せずに注射することができ、当該形態を種々の組織の開放創に容易に充填することができる方法の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この課題は、サイズが制御された構造成分を有する、磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁形態を調製する方法であって、当該懸濁形態が事前水和を必要とせず、当該方法が次の工程:
精製した線維性細胞外マトリックスのシートを分離する工程、
シートを磨砕して、精製した細胞外マトリックスの粒子から微粉末を調製する工程、
次いで粉末の分画により、必要なサイズの粒子の画分を得る工程、
コラーゲンの変性を引き起こさない温度で、粒子を液体媒体中において撹拌するサイクルと、分散させるサイクルとを交互に繰り返すことによって、精製した細胞外マトリックスの選択した粒子画分を液体媒体中に懸濁させる工程であって、撹拌処理を経時的に優勢とする工程、
得られた粒子懸濁液を脱気する工程
を含む方法の開発によって解決される。
【００１０】
懸濁形態の細胞外マトリックスの構造成分のサイズは、完全に無傷の束からそれより小さい束及び線維まで変化し得るコラーゲン線維束の線維の離解度によって決定され、提案される本方法によれば、使用される精製したマトリックスのタイプに応じて、撹拌処理及び分散処理の継続時間を変化させること、並びに交互に繰り返すサイクルの回数によって制御することができる。
【００１１】
本発明の特定の実施形態では、細胞外マトリックスは、同種又は異種の結合組織に由来する。
【００１２】
本発明の特定の実施形態では、浸漬デバイス又は循環デバイスが、ホモジナイザー・ディスパーサーとして使用される。
【００１３】
本発明の別の特定の実施形態では、撹拌及び分散が行われる液体媒体は、増殖因子、形成タンパク質(morphogenetic proteins)、ホルモン、治療に役立つ(therapeutic) 天然の多糖類、並びに治療物質及び治療薬物、例えば、抗生物質製剤、止血剤、鎮痛剤及び局所麻酔剤等を含む群から選択される少なくとも1つの成分を更に含んでもよい、等張の又は高張の溶液である。
【００１４】
本発明の更に1つの特定の実施形態では、全ての工程が無菌条件下で実施され、得られる懸濁液の無菌性が提供される。
【００１５】
本発明の別の特定の実施形態は、得られる懸濁液を最終包装材中で放射線滅菌する工程を更に含み、これにより、得られる懸濁液の無菌性が提供される。
【００１６】
本発明の更に1つの特定の実施形態では、シートを磨砕して微粉末を調製する工程は、室温で実施される。
【００１７】
本発明の別の特定の実施形態では、磨砕する工程の前に、脱細胞化細胞外マトリックスは架橋剤で更に処理される。
【００１８】
本発明の別の目的は、修復組織再生を刺激すること、特に、皮膚創傷を治癒することを目的とする、上記の方法により調製される製品である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】60秒間(左)及び10分間(右)の単回の分散によって得られた、水和済みの磨砕したウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁液を含むシリンジの外観を示す。
【図２】60秒間(A)及び10分間(B)の単回の分散によって得られた、水和済みの磨砕したウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁液の顕微鏡的構造を示す。光学顕微鏡法。微分干渉コントラスト法。
【図３】60秒間及び10分間の単回の分散によって得られた、水和済みの磨砕したウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁液、及び10%グルコース溶液(対照)を注射した組織の組織切片の部位を示す。切片はヘマトキシリン及びエオシンで染色されている。代表的な顕微鏡写真が示されている。
【図４】60秒間及び10分間の単回の分散によって得られた、水和済みの磨砕したウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁液を含むドレッシング材、及び懸濁液を含まない固定包帯(対照)を当てて、創傷を治癒していた動物の創面の相対面積を示す。アステリスクでマークした値は、対照群の値と統計的に有意に(p<0.05)異なっている。
【図５】60秒間及び10分間の単回の分散によって得られた、水和済みの磨砕したウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁液を含むドレッシング材、及び懸濁液を含まない固定包帯(対照)を当てて、創傷を治癒していた動物の創面の代表的な顕微鏡写真を示す。
【図６】60秒間及び10分間の単回の分散によって得られた、水和済みの磨砕したウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁液を含むドレッシング材、及び懸濁液を含まない固定包帯(対照)を当てて、創傷を治癒していた動物の創傷の中心部位の組織切片中の肉芽組織の面積を示す。アステリスクでマークした値は、対照群の値と統計的に有意に(p<0.05)異なっている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
医療用途用の懸濁液剤形は、主に線維状タンパク質(コラーゲン及びエラスチン)から構成される脱細胞化細胞外マトリックスから調製される。マトリックスは、特許取得済みの方法(例えば、RU 2353397又はUS 5336616 Aによる)、及び科学文献に開示されている方法又は方法の組合せ(Badylak S.F.、Taylor D.、Uygun K.、「Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.」Annual review of biomedical engineering、2011年、第15巻、No. 13、27〜53頁)の両方によって調製することができる。アルカリ性溶液での処理に基づいた精製方法が好ましい。更に、使用した精製方法によって、得られる材料中のDNAの残量が50ng/mg乾燥質量未満になれば好ましい。精製した細胞外マトリックスの源は、同種又は異種の結合組織とするべきである。真皮網状層の細胞外マトリックスが、懸濁形態を調製するのに最適である。しかしながら、心膜、腹膜、大血管壁、腸及び他の器官の結合組織に由来するマトリックスもまた、この目的に使用されてもよい。脱細胞化マトリックスは、架橋剤(例えば、可溶性のカルボジイミド又はグルタルアルデヒド)で予備的に処理して、その生分解に対する抵抗性を高めてもよい。
【００２１】
得られた脱細胞化細胞外マトリックスは、分割されてシートになる。シートの幅は、次にシートを摩砕機に導入する都合に応じて選択される。次いで、シートを空気中で又は凍結乾燥処理によって乾燥して、材料の機械的抵抗を低減し、磨砕中の材料の局部変形を防止する。
【００２２】
乾燥が完了してから、得られた材料を、好ましくは室温(+15〜+25eCの範囲)で磨砕する。磨砕は、低硬度又は中硬度の乾燥した線維性材料を磨砕するためのミル(例えば、PULVERISETTE 15(FRITSCH社、ドイツ))を使用して実施される。種々の孔径を有するスクリーンインサートをデバイス設計中に設けることが好ましい。このインサートにより、孔直径を変化させることで、得られるマトリックス粒子の粒度分布を変えることが可能になる。磨砕後、マトリックスは粒径が5〜4000ιmの微粉末になる。
【００２３】
懸濁液の固体分散相を構成する粒子の径によって、その流動学的特性及び生物学的特性の大部分が決まる。概して、美容学の手技で使用される小直径の針(30G、27G)による皮内注射については、5〜400ιmの径を有する粒子を含む懸濁液を使用することが好都合である。しかし、手術で使用される、大直径の針による懸濁液の注射については、400〜800ιmの直径を有する粒子の断片を使用する方がより好ましい。また、注射を必要としない外用については、700〜1000ιmの直径を有する粒子の懸濁液が最も好ましい。更に、懸濁液の粒子が大きいほど、生分解の時間が長くなる傾向がある。これに関連して、次なる磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁形態の調製については、磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスに分画を施して、必要な径の粒子を得る。この目的のために、乾式篩い分けに使用される、必要な径の孔を有する織り篩又は微細精密篩一式を備えた振動性の篩振盪機(例えば、ANALYSETTE 3 PRO(FRITSCH社、ドイツ))の中でマイクロスクリーニングが実施される。清浄な製造に使用される篩は、ISO-3310-1に従って作製されるべきである。マイクロスクリーニングにおいて、篩い分け処理は0.2〜2.5mmの範囲の振幅で実施されることが好ましい。これにより、散粉中にデバイスの壁に材料が定着することによる材料の損失が低減される。ある特定の径の粒子を分離する特別なモードがデバイスの設計及びソフトウェアによって提供されている場合、これを適用することも可能である。
【００２４】
磨砕及び分画によって得られる細胞外マトリックスは、更なる懸濁液の調製に使用される。この目的のため、選択された粒子の画分は、ホモジナイザー・ディスパーサー中で懸濁液の液相と混合され、次いで分散される。液相は、等張の(例えば、0.9%塩化ナトリウム溶液又は5%グルコース溶液)又は高張の(例えば、10%グルコース溶液)溶液が好ましい。懸濁形態の治療特性を向上させるために、液体の分散媒の組成には、種々の追加成分、例えば、増殖因子、形成タンパク質、ホルモン、治療物質及び治療薬物、特に抗生物質製剤、止血剤、鎮痛剤、及び局所麻酔剤等、及び治療に役立つ天然の多糖類(例えば、ヒアルロン酸)、並びにそのような成分の組合せを添加することができる。
【００２５】
ホモジナイザー・ディスパーサーは、浸漬デバイス(例えば、ULTRA-TURRAX(IKA社、ドイツ)でも循環デバイス(例えば、magic LAB(IKA社、ドイツ)でもよい。成分の撹拌及び分散は、浸漬ディスパーサーを使用する場合は、実験用容器、例えばガラスビーカー中で行われ、循環ディスパーサーを使用する場合は、デバイスのリザーバー中で行われる。どちらの場合も、懸濁液を調製するプロセスを通して、分散モジュールの各部分に対する材料の摩擦による加熱で上昇する懸濁液の温度を制御する必要がある。使用される脱細胞化細胞外マトリックスの主要タンパク質が不可逆的変性する温度を、懸濁液の温度が上回るのを回避することが望ましい。循環ディスパーサーは、追加のサーモスタット制御モジュール(冷却及び加熱の両方)を備えることができる。これらのモジュールは、デバイスの様々な部分と組み合わされて、最適温度モードを作り出すことができる。例えば、4lCまで冷却するモジュールは、分散モジュールに設置して局部加熱を最小限にすることができ、27eCまで加熱するモジュールは、リザーバージャケットに設置して、混合物の流動学的パラメーターをシステムの操作粘度パラメーター内に維持することができる。
【００２６】
懸濁液を調製する最初の工程において、液相の体積の一部を容器又はリザーバーの中に導入する。次いで、そこに撹拌モジュール、例えば、アンカータイプの混合機を配置する。その後、必要な量の磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスを、手作業で徐々に導入する。次いで、体積を計算した残りの液相を導入し、混合機を作動させる。好ましい回転速度は20〜45rpmである。循環デバイスはまた、固体分散相の漸次導入を自動化する特別なモジュールを、これに設置して含むこともできる。混合機の力が懸濁液を均等に混合するのに十分でない場合、棒又は別の実験用具を用いて手作業で更に混合することができる。混合の完了後、分散モジュールを容器又はリザーバーの中に浸漬する。回転子と固定子との間に最大ギャップを事前設定しておく。0.6〜2mmの範囲のギャップが最も好ましい。トルク値は予め設定しておかなければならず(例えば、3000〜6000rpm)、次いで分散モジュールを作動させる。
【００２７】
懸濁形態の調製中に、撹拌サイクルは分散サイクルと交互に繰り返されなければならず、撹拌処理を経時的に顕著に優勢とする。撹拌処理は、最初の分散処理の前に行われなければならず、これにより、磨砕したマトリックスに必要な水和が確実なものになる。撹拌サイクル及び分散サイクルの継続時間を変化させることによって、精製した線維性細胞外マトリックスを磨砕したものの中のコラーゲン線維束の線維の離解度を制御することが可能となる。これにより、異なる流動学的特性及び生物学的特性を有する懸濁液が提供される。例えば、線維の離解度がより大きい懸濁液は、直径がより小さい針を通過することができるであろうし、また、生分解速度もより速いであろう。無傷のコラーゲン線維束のフラグメントで形成された粒子からなる懸濁液は、撹拌サイクルの継続時間が10分〜4時間であり、分散サイクルの継続時間が30秒〜10分である場合に得られる。主成分が、大きさの桁のより小さいコラーゲン線維束である懸濁形態を調製するには、分散サイクルの継続時間は1〜60分とするが、撹拌サイクルの時間は同じままとする。分散サイクルの継続時間は固体分散相の質量分率に応じて選択される。即ち、脱細胞化マトリックスの濃度の高い懸濁液を調製するには、原則として、分散サイクルを長くする必要がある。撹拌-分散サイクルの回数は、作業に使用される精製したマトリックスのタイプに応じ、経験に基づいて調整しなければならない。「激しい」精製(例えば、アルカリ性溶液を用いる精製)によって調製されるマトリックスの場合、通常、1回の撹拌-分散サイクルで十分である。一方、「穏やかな」方法(例えば、界面活性剤を用いた処理による)によって調製される試料の場合、サイクルの反復回数を多くすることが必要である。
【００２８】
撹拌後、充填する前に、得られた懸濁液を、真空脱気システムを使用して(例えば、プロセスプラントであるMagic Plant(IKA社、ドイツ)に標準で含まれている真空ポンプを使用して)脱気する。懸濁液が浸漬ホモジナイザー・ディスパーサーを使用して調製されている場合、それをデガッサーのリザーバーに移さなければならない。懸濁液が循環ホモジナイザー・ディスパーサーを使用して調製されている場合、それをデガッサーのリザーバーに移すこともでき、又はデバイスの追加の構成要素として通常製造元から提供される特別な脱気モジュールを使用することもできる。
【００２９】
脱気後、懸濁液を、手作業で、又は工業用充填ユニットを使用して、最終包装材(例えば、シリンジ又はチューブ)に充填する。
【００３０】
得られた製品の無菌性を確実にするために、製造プロセスは、GOST R 52249及びGOST R ISO 13408に従い、好ましくは無菌条件下で行われる。更に、懸濁液は、放射線に曝露して製品の成分が分解しても治療特性に大きな影響を及ぼさない場合には、放射線を使用して、最終包装材中で滅菌することができる。
【００３１】
応用分野
本発明に記載の方法により製造される、水和済みの磨砕した脱細胞化細胞外マトリックスの懸濁形態は、次の分野:
(1)皮膚科学及び美容学、急性及び慢性の皮膚創傷の処置用、及び萎縮性瘢痕及びしわの矯正用;
(2)泌尿器科、尿失禁及び膀胱尿管逆流の処置用;
(3)耳鼻咽喉科、声帯の形成手術用;
(4)再建手術、種々の組織の欠損の機能的置換用
において使用することができる。
【００３２】
本発明に従って調製される懸濁形態はまた、止血剤及び組織工学における細胞移植の基材として使用することもできる。
【００３３】
本発明に開示されている方法に従って調製されるマトリックス懸濁液は、注射又は表面塗布の両方によって、又はその方法の組合せによって、所望の部位に投与することができる。これはまた、固定包帯又は他の医療製品に応用することもできる。
【実施例】
【００３４】
面積が400〜700cm2のウシ真皮の脱細胞化細胞外マトリックスのシートを、RU 2353397に記載されている精製方法によって得た。材料中の残留DNA量は6.5ng/mg乾燥質量であったが、文献によると、これは細胞成分が有効に除去されたことを示している(Crapo P.M.、Gilbert T.W.、Badylak S.F.、「An overview of tissue and whole organ decellularization processes.」Biomaterials、2011年、第32巻、No. 12、3233〜3243頁)。これらの層を切断し、空気中で乾燥して残留水分量を30%にした。次いで、これらを、孔径500≒mの篩インサートを設置して含むPULVERISETTE 15カッティングミル(FRITSCH社、ドイツ)で磨砕した。得られた、精製したマトリックスの微粉末を、孔径が100、250、400、500又は1000ミクロンの乾式篩い分け用微細精密篩一式を備えた振動性の篩振盪機、ANALYSETTE 3 PRO(FRITSCH社、ドイツ)に入れてマイクロスクリーニングを施した。分画後、篩い分け処理中に、振幅を0.2mm〜2.5mmの範囲で変化させた。更なる懸濁液の調製については、200〜300≒mの粒径を有する粉末画分を選択した。水和済みの磨砕したマトリックスの懸濁形態は、magic LAB循環ホモジナイザー・ディスパーサー(IKA社、ドイツ)を使用して調製した。液体分散媒は10%グルコース溶液とし、200mlの量をデバイスのリザーバーに注ぎ入れた。次いで、アンカータイプの混合機を、事前に設定した回転速度20rpmで作動させた。次いで、磨砕したマトリックス70g及びグルコース溶液800mlをリザーバーに添加し、得られた懸濁液を40分間撹拌した。この時点の最後に撹拌を停止し、回転子と固定子との間に1mmのギャップを事前設定した、4eCまで冷却する分散モジュールのスイッチを入れた。無傷のコラーゲン線維束の粒子を含有する形態は、15分間撹拌し、次いで3000rpmで60秒間分散させることによって調製した。また、直径10〜20≒mのコラーゲン線維束からなる形態は、同じ径のマトリックス粒子の別のバッチを、分散処理の時間以外は同様に処理することによって調製した。この場合は、懸濁液を10分間分散させた。材料がデバイスのリザーバーに存在するようになるまで、組み込み式の温度計を使用して、懸濁液の温度をモニターした。試料の温度は20〜40lCの範囲であった。
【００３５】
次いで、ディスパーサーのチャンバー中で、プロセスプラントであるMagic Plant(IKA社、ドイツ)に標準で含まれている真空ポンプを使用して、懸濁液を脱気した。その後、無菌条件下で、体積1.5mlのルアーロックポリプロピレンシリンジに、懸濁形態を手作業で充填した。シリンジを栓「Combi-stopper」(B.Braun社、ドイツ)で塞ぎ、無菌化用のロール(steriCLIN、ドイツ)に充填した。次いで、懸濁形態に線量11kGyで放射線滅菌を施した。
【００３６】
図1に示すように、得られた製品は、プラグのついたシリンジに充填された、不透明な粘性の白色懸濁液であった。60秒間分散させることによって得られた懸濁液は識別可能な個々の粒子を含んでおり、一方、10分間分散させた懸濁液は均質であった。
【００３７】
得られた試料の構造は、その形態を光学顕微鏡で調べることによって分析した。光学顕微鏡検査用に、懸濁液の製剤を、スライドとカバーガラスとの間に50≒lの試料を配置することで調製した。得られた製剤を、ニコンNi-U顕微鏡(ニコン社、日本)で、ニコンPlan Fluor 10X/0.3レンズ(ニコン社、日本)を使用し、微分干渉コントラスト(DIC)法によって分析した。
【００３８】
光学顕微鏡検査により、得られた試料は、精製した線維性マトリックスを磨砕したもののフラグメントが浸漬された液体分散媒からなるものであることが示された(図2を参照)。60秒間分散させた懸濁液の試料中では、これらのフラグメントは、ぎっしり重なったコラーゲン線維束からなる、径が200〜300≒mの個々の粒子に代表されるものであった。一方、10分間分散させた懸濁液の試料の固体分散相は、絡み合う網状の、好ましくは直径が10〜20≒mのコラーゲン線維束であった。
【００３９】
得られた医療デバイスの生物学的効果については、マウスにおけるその生分解性及び修復特性を、皮下埋め込みモデルで、及び全層皮膚創傷の治癒を試験することによって、それぞれ評価した。生分解のプロセスを分析するために、マウスの肩甲部に24Gの針で懸濁液250≒lを皮下注射した。対照群のマウスには、この医療デバイスの液相である10%グルコース溶液を、同体積与えた。注射後1日目及び5日目に、組織学的検査のために、マウスを安楽死させ、試料を注射した部位から皮弁を摘除し、所属リンパ節も摘除した。注射ゾーンの埋め込みの存在、並びに注射地点の周囲の組織中及び所属リンパ節中の病理学的な変化を定性的に評価した。
【００４０】
修復特性を試験するために、Zoletil(Virbac社、フランス、40mg/kg体重)を用いた麻酔下で、マウスの肩甲間部に、直径0.7cmの全層皮膚創傷を手術によって作製した。創傷直後に、試験群の動物の創傷には適切な懸濁液を完全に充填し、固定包帯「Hydrofilm」(Paul Hartmann社、ドイツ)で覆った。一方、対照動物の創傷は直接固定包帯で覆った。手術直後及び安楽死前にも、後続の写真による面積測定分析(photoplanimetric analysis)のために、創傷のデジタル拡大写真を撮影した。治癒7日目に、動物を安楽死させ、組織を採取した。得られた組織に組織学的検査を行った。創面の上皮化の程度及び肉芽組織の面積について、組織切片を形態計測学的に評価した。
【００４１】
皮下埋め込みモデルにおける試験結果により、懸濁液の生分解速度において有意差が示された。例えば、60秒間分散させることによって得られた試料は、両方の試験時点で全ての動物の注射ゾーンで検出された。一方、10分間の分散により得られた懸濁液のフラグメントは、投与後1日目に動物の50%にしか見られなかった。5日目にはこれらの試料は完全に再吸収されていた(Table 1(表1)及び図3を参照)。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
定性的形態学的試験により、どちらのタイプの懸濁液も、投与すると、周囲の結合組織に目立ち方の弱い浮腫の発症(これは実験5日目までにほぼ完全に消失する)、及び注射ゾーンの白血球浸潤を引き起こすことが示された。1日目と5日目の両日ともに、浸潤物中の主な細胞型は単球/マクロファージであった。埋め込まれた試料の材料の中に白血球が活発に侵入したことがわかった。これは、医療デバイスが細胞遊走に有効な基材として作用する能力を示している。注射部位に、顕著な他の病理学的な変化、特に、壊死、出血及び線維症等はなかった。どちらのタイプの懸濁液についても、それを注射した組織における炎症性変化の重症度は、グルコース溶液の投与によって誘導された非特異的な組織反応の規模を大きく上回るものではなかった(図3を参照)。試料の投与はまた、リンパ節炎及び所属リンパ節における他の病変を引き起こすものでもなかった。
【００４４】
全層皮膚創傷の治癒モデルにおける、得られた懸濁液の修復特性の試験により、10分間分散させた懸濁液で創傷を処置した動物の創傷表面積には、対照と比較して、2倍超、統計的に有意な減少が示された(図4及び図5を参照)。60秒間分散させた懸濁液を与えた群でのこの指標の平均値もまた、対照より小さかったが、その効果の規模はそれほど顕著ではなかった(図4を参照)。10分間分散させた懸濁形態のドレッシング材を当てた創傷の治癒は、創傷欠損面積における肉芽組織の量が有意に4倍増加するという結果になった(図6を参照)。一方、60秒間分散させた懸濁液を創傷に適用すると、この指標の値の増加は平均で2倍未満であった(図6を参照)。これらの実験の結果は、分散処理の時間が、得られた懸濁液の特性に影響することを示している。例えば、60秒間分散させた懸濁液の構造(図2を参照)は、10分間分散させた懸濁液と比較して、その再吸収にかかる時間が長い。一方、10分間分散させた懸濁液の方が、修復皮膚再生のプロセスを大いに効果的に促進する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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