(57)【要約】  本開示は、ＴＩＬの表現型の改善及び代謝的健康の増加につながるＴＩＬ集団の再刺激方法を提供し、及び再刺激後に有効性の高い注入に適切かどうかを決定するためのＴＩＬ集団のアッセイ方法を提供する。
2019532652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることを含み、前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く、及び前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団である、方法。
【請求項２】
前記方法が、
（ｉｖ）前記第３のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施することを更に含み、前記追加的な第２の拡大培養が、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたものより大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、前記より大きい治療用ＴＩＬ集団は前記第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉｉ）の後、前記細胞が前記細胞培養物から取り出され、ステップ（ｉｖ）の実施前に貯蔵培地中に凍結保存される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がステップ（ｉｖ）の実施前に解凍される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｖ）が１〜４回繰り返される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）が約４０日〜約５０日の期間内に実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）が約４２日〜約４８日の期間内に実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）が約４２日〜約４５日の期間内に実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）が約４４日以内に実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの前記細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＢＭＣがステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに前記細胞培養物に加えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉｖ）の前記治療用ＴＩＬ集団中の前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、前記第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＰＣが人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで前記第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで前記第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療用ＴＩＬ集団が患者に注入される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉｉｉ）が、前記細胞培養培地から前記細胞を取り出すステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉｉ）が１〜４回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数が約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法により作成された拡大培養ＴＩＬ集団。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法により作成された拡大培養ＴＩＬ集団であって、前記拡大培養ＴＩＬは、解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき基礎解糖が少なくとも２倍に増加している、ＴＩＬ集団。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法であって、前記細胞の基礎解糖を測定することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法であって、前記細胞の基礎呼吸を測定することを含む方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法であって、前記細胞の予備呼吸容量（ＳＲＣ）を測定することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法であって、前記細胞の解糖予備能を測定することを含む方法。
【請求項２８】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を入手すること；及び
（ｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を入手することを含み、前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く、及び前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団である、方法。
【請求項２９】
前記方法が、
（ｉｉｉ）前記第３のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより前記第３のＴＩＬ集団の追加的な第２の拡大培養を実施することを更に含み、前記追加的な第２の拡大培養が、ステップ（ｉｉ）で入手されたものより大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、前記より大きい治療用ＴＩＬ集団が前記第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を呈する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｉｉ）の前記細胞培養培地からの前記細胞が取り出され、ステップ（ｉｉｉ）の前に貯蔵培地中に凍結保存される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞がステップ（ｉｉｉ）の前に解凍される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉ）が１〜４回繰り返される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数が約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡＰＣが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、前記第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の治療方法であって、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く、及び前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であること；及び
（ｉｖ）治療上有効な投薬量の前記第３のＴＩＬ集団を前記患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項３８】
前記方法が、ステップ（ｉｖ）の前に、前記第３のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施するステップを更に含み、前記追加的な第２の拡大培養が、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたものより大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、前記より大きい治療用ＴＩＬ集団が前記第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｉｉ）の後、前記細胞培養培地から前記細胞が取り出され、請求項３８に記載の追加的な第２の拡大培養の前に貯蔵培地中に凍結保存される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、請求項３８に記載の追加的な第２の拡大培養の前に解凍される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉｉ）が１〜４回繰り返される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数が約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＰＣが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、前記第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が、黒色腫、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の治療方法であって、
（ｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を入手することであって、前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く、及び前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であること；及び
（ｉｉｉ）治療上有効な投薬量の前記治療用ＴＩＬ集団を前記患者に投与すること
を含む方法。
【請求項４８】
前記方法が、ステップ（ｉｉｉ）の前に、前記第３のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施するステップを更に含み、前記追加的な第２の拡大培養が、ステップ（ｉｉ）で入手されたものより大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、前記より大きい治療用ＴＩＬ集団が前記第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｉｉ）の前記細胞培養培地からの前記細胞が取り出され、請求項４８に記載の追加的な第２の拡大培養の前に貯蔵培地中に凍結保存される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、請求項４８に記載の追加的な第２の拡大培養の前に解凍される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉ）が１〜４回繰り返される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数が約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＰＣが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、前記第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が、黒色腫、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＴＩＬのアッセイ方法であって、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多いこと；
（ｉｖ）前記第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、及び凍結保存すること；
（ｖ）前記凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）前記第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）前記第３の集団の前記細胞培養培地にＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及びＡＰＣを添加することにより、前記解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加的な第２の拡大培養を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって実施することであって、前記第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、前記第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を前記第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の前記比に基づき、前記解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において前記第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と前記第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との前記比が５：１より大きいと決定されるとき、前記患者に治療上有効な投薬量の前記解凍された第３のＴＩＬ集団を投与すること
を含む方法。
【請求項５８】
前記ｒｅＲＥＰ期間が、前記第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と前記第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との前記比が５０：１より大きくなるまで実施される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数が約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）が約４０日〜約５０日の期間内に実施される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）が約４２日〜約４８日の期間内に実施される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）が約４２日〜約４５日の期間内に実施される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）が約４４日以内に実施される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）からの前記細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する、請求項５７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗原提示細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＰＢＭＣがステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに前記細胞培養物に加えられる、請求項６４５に記載の方法。
【請求項６７】
ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）の前記より大きいＴＩＬ集団中の前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、前記第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項５７〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＡＰＣが人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで前記第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記形質導入ステップがステップ（ｉ）の前に行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで前記第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む、請求項５７〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記形質導入ステップがステップ（ｉ）の前に行われる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＴＩＬがステップ（ｖｉｉ）の後に生存率に関してアッセイされる、請求項５７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ＴＩＬのアッセイ方法であって、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）前記第１の凍結保存ＴＩＬ集団の前記一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団の前記一部を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第１のＴＩＬ集団からの前記一部を前記第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と前記第１のＴＩＬ集団の前記一部のＴＩＬ数との前記比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記比に基づき、前記第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；及び
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と前記第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との前記比が５：１より大きいと決定されるとき、前記第１のＴＩＬ集団の残りを前記患者に治療的に投与すること
を含む方法。
【請求項７６】
前記第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と前記第１のＴＩＬ集団の前記一部のＴＩＬ数との前記比が５０：１より大きい、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法によりステップ（ｉ）からの前記第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む、請求項７５又は７６に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ｉ）からの前記第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を前記患者に投与することを更に含む、請求項７５又は７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２のＴＩＬ集団の代謝的健康を評価するステップを更に含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２のＴＩＬ集団の表現型を評価するステップを更に含む、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗原提示細胞が同種異系末梢血単核球である、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１６年１０月２６日に出願された、「Expansion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Methods of Using the Same」と題される米国仮特許出願第６２／４１３，２８３号及び同第６２／４１３，３８７号、及び２０１６年１０月３１日に出願された、「RESTIMULATION OF CRYOPRESERVED TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES」と題される米国仮特許出願第６２／４１５，４５２号に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願は本明細書によって全体として参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[0002]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を用いた大型の難治性癌の治療は、予後不良の患者に対する強力な治療手法を表す。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上、及び規制上の問題に起因して、実現が課題となっている。ＩＬ−２ベースのＴＩＬ拡大培養と、それに続く「迅速拡大培養法」（ＲＥＰ：rapid expansion process）が、その速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰは１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それにはフィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの、大過剰の（例えば２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ−２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。
【０００３】
[0003]  ＲＥＰ手順を経たＴＩＬは、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功を生み出している。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率に頼るものである。
【０００４】
[0004]  しかしながら、現行のＲＥＰプロトコル、並びに現行のＴＩＬ拡大培養プロトコルは、概して、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関しては見識をほとんど与えない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364（本明細書によって全体として明示的に援用される）、及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照のこと）。例えば、ナイーブＴ細胞はＡＴＰの産生をミトコンドリア呼吸に頼る一方、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は高度に解糖性であり、それが増殖、遊走、活性化、及び抗腫瘍有効性に必要とするバイオエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に頼る。
【０００５】
[0005]  加えて、このような拡大培養された細胞集団は凍結保存することができ、使い易さ、再発性疾患を有する患者に複数回再注入するための長期貯蔵、及び他の考慮点につながる。しかしながら、現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成の読み取り並びに拡大培養したＴＩＬベースの産物の拡大倍数及び生存率に頼る。これらの尺度は、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関しては見識をほとんど与えず、凍結保存がＴＩＬ集団に及ぼす影響についてはほとんど分かっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]  従って、本発明は、ＴＩＬの表現型の改善及び代謝的健康の増加につながるＴＩＬ集団の拡大培養及び再刺激方法に関し、及び再刺激後に有効性の高い注入に適切かどうかを決定するためのＴＩＬ集団のアッセイ方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
[0007]  本発明は、任意選択の凍結保存と組み合わせた、大規模な、時に治療用の集団におけるＴＩＬの拡大培養方法を提供する。
【０００８】
[0008]  本開示によれば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせるステップ；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせるステップ
を含む方法が提供され、ここで第３のＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養は少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団である。
【０００９】
[0009]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施するステップ
を更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたよりも大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きい治療用ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む。
【００１０】
[0010]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）の後、細胞培養物から細胞が取り出され、ステップ（ｉｖ）の実施前に貯蔵培地中に凍結保存される。
【００１１】
[0011]  一部の実施形態において、細胞はステップ（ｉｖ）の実施前に解凍される。
【００１２】
[0012]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｖ）が１〜４回繰り返される。
【００１３】
[0013]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４４日以内に実施される。
【００１４】
[0014]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。
【００１５】
[0015]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【００１６】
[0016]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｖ）の治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００１７】
[0017]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００１８】
[0018]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【００１９】
[0019]  一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【００２０】
[0020]  一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【００２１】
[0021]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団は患者に注入される。
【００２２】
[0022]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）は、細胞培養培地から細胞を取り出すステップを更に含む。
【００２３】
[0023]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉｉ）が１〜４回繰り返される。
【００２４】
[0024]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００２５】
[0025]  本開示はまた、請求項１に記載の方法により作成された拡大培養ＴＩＬ集団も提供する。
【００２６】
[0026]  本開示はまた、請求項１に記載の方法により作成された拡大培養ＴＩＬ集団も提供し、ここで拡大培養ＴＩＬは、解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき基礎解糖が少なくとも２倍に増加している。
【００２７】
[0027]  本開示はまた、本明細書に記載される方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法も提供し、これは細胞の基礎解糖を測定することを含む。
【００２８】
[0028]  本開示はまた、本明細書に記載される方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法も提供し、これは細胞の基礎呼吸を測定することを含む。
【００２９】
[0029]  本開示はまた、本明細書に記載される方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法も提供し、これは細胞の予備呼吸容量（ＳＲＣ）を測定することを含む。
【００３０】
[0030]  本開示はまた、本明細書に記載される方法により作成されたＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法も提供し、これは細胞の解糖予備能を測定することを含む。
【００３１】
[0031]  本開示はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を入手すること；及び
（ｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を入手することを含み、ここで第３のＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養は少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団である。
【００３２】
[0032]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｉｉ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより第３のＴＩＬ集団の追加的な第２の拡大培養を実施することを更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉ）で入手されたよりも大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きい治療用ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を呈する。
【００３３】
[0033]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の細胞培養培地からの細胞が取り出され、ステップ（ｉｉｉ）の前に貯蔵培地中に凍結保存される。
【００３４】
[0034]  一部の実施形態において、細胞はステップ（ｉｉｉ）の前に解凍される。
【００３５】
[0035]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉ）が１〜４回繰り返される。
【００３６】
[0036]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００３７】
[0037]  一部の実施形態において、ＡＰＣは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【００３８】
[0038]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００３９】
[0039]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００４０】
[0040]  本開示はまた、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の治療方法も提供し、この方法は、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団が、第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であること；及び
（ｉｖ）治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【００４１】
[0041]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉｖ）の前に、第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施するステップを更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたよりも大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きい治療用ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む。
【００４２】
[0042]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の後、細胞培養培地から細胞が取り出され、本明細書に記載される方法に係る追加的な第２の拡大培養の前に貯蔵培地中に凍結保存される。
【００４３】
[0043]  一部の実施形態において、細胞は、本明細書に記載される方法に係る追加的な第２の拡大培養の前に解凍される。
【００４４】
[0044]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉｉ）が１〜４回繰り返される。
【００４５】
[0045]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００４６】
[0046]  一部の実施形態において、ＡＰＣは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【００４７】
[0047]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００４８】
[0048]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００４９】
[0049]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌からなる群から選択される。
【００５０】
[0050]  本開示はまた、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の治療方法も提供し、この方法は、
（ｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を入手することであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団が、第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であること；及び
（ｉｉｉ）治療上有効な投薬量の治療用ＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【００５１】
[0051]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉｉｉ）の前に、第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施するステップを更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉ）で入手されたよりも大きい治療用ＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きい治療用ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む。
【００５２】
[0052]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の細胞培養培地からの細胞が取り出され、本明細書に記載されるとおりの追加的な第２の拡大培養の前に貯蔵培地中に凍結保存される。
【００５３】
[0053]  一部の実施形態において、細胞は本明細書に記載されるとおりの追加的な第２の拡大培養の前に解凍される。
【００５４】
[0054]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中に治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｉ）が１〜４回繰り返される。
【００５５】
[0055]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００５６】
[0056]  一部の実施形態において、ＡＰＣは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【００５７】
[0057]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００５８】
[0058]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００５９】
[0059]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌からなる群から選択される。
【００６０】
[0060]  本発明はまた、ＴＩＬ生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をより大きいＴＩＬ集団に拡大培養することによりＴＩＬの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
（ｉ）予め拡大培養された第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることを含み、ここで第３のＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養は少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、及び第３の集団は生存率に関して更にアッセイされる。
【００６１】
[0061]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施すること
を更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたよりも大きいＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きいＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、及び第３の集団は生存率に関して更にアッセイされる。
【００６２】
[0062]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）の前に、細胞は凍結保存される。
【００６３】
[0063]  一部の実施形態において、細胞はステップ（ｉ）の実施前に解凍される。
【００６４】
[0064]  一部の実施形態において、分析に十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｖ）が１〜４回繰り返される。
【００６５】
[0065]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。
【００６６】
[0066]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。
【００６７】
[0067]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。
【００６８】
[0068]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４４日以内に実施される。
【００６９】
[0069]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。
【００７０】
[0070]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【００７１】
[0071]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【００７２】
[0072]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｖ）のより大きいＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００７３】
[0073]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００７４】
[0074]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【００７５】
[0075]  一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【００７６】
[0076]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【００７７】
[0077]  一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【００７８】
[0078]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【００７９】
[0079]  一部の実施形態において、ＴＩＬは生存率に関してアッセイされる。
【００８０】
[0080]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後に生存率に関してアッセイされる。
【００８１】
[0081]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後及びステップ（ｉｖ）の後に生存率に関してアッセイされる。
【００８２】
[0082]  本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投与における更なる使用。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltratitng lymphocyte）（ＴＩＬ）のアッセイ方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多いこと；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、及び凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加的な第２の拡大培養を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって実施することであって、この第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療上有効な投薬量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【００８３】
[0083]  一部の実施形態において、ｒｅＲＥＰ期間は、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５０：１より大きくなるまで実施される。
【００８４】
[0084]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００８５】
[0085]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４４日以内に実施される。
【００８６】
[0086]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において細胞はＴＩＬである。
【００８７】
[0087]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【００８８】
[0088]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）のより大きいＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００８９】
[0089]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００９０】
[0090]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【００９１】
[0091]  一部の実施形態において、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
【００９２】
[0092]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【００９３】
[0093]  一部の実施形態において、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
【００９４】
[0094]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【００９５】
[0095]  一部の実施形態において、ＴＩＬはステップ（ｖｉｉ）の後に生存率に関してアッセイされる。
【００９６】
[0096]  本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
【００９７】
[0097]  一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
【００９８】
[0098]  一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態に記載されるとおりの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
【００９９】
[0099]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
【０１００】
[00100]  本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；及び
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団の残りを患者に治療的に投与すること
を含む。
【０１０１】
[00101]  一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
【０１０２】
[00102]  一部の実施形態において、本方法は、先行する請求項のいずれかの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
【０１０３】
[00103]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
【０１０４】
[00104]  一部の実施形態において、本方法は、第２のＴＩＬ集団の代謝的健康を評価するステップを更に含んだ。
【０１０５】
[00105]  一部の実施形態において、本方法は、第２のＴＩＬ集団の表現型を評価するステップを更に含む。
【０１０６】
[00106]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は同種異系末梢血（peripherial blood）単核球である。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
図面の簡単な説明
【図１】[00107]実施例１の結果を示す。この表が示すとおり、抗原再刺激迅速拡大培養プロトコル（「ｒｅＲＥＰ」）の後、ＴＩＬはその解糖系呼吸の著しい亢進を呈する。ＳＲＣ＝予備呼吸容量。
【図２】[00108]新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの組成。ＴＩＬをＴＣＲαβ及びＣＤ５６について染色してＴ細胞及びＮＫ集団を定義した。示されるデータは、６つの個別のＴＩＬの平均である。
【図３】[00109]メモリー表現型はＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７発現によって定義される。ＣＤ４及びＣＤ８  ＴＩＬは、大部分がエフェクターメモリー（ＥＭ）である。これは解凍ＴＩＬにおいても同じままである。各点が、分析した１つの試料である。ウィルコクソンの対応のある符号付き順位検定で有意な差は認められない。
【図４】[00110]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬとの間のＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４＋ＣＤ２８＋、及びＣＤ８＋ＣＤ２８＋頻度のピアソン相関。細胞を上記のマーカーで染色した。ｘ軸上に新鮮の値及びｙ軸上に解凍の値として、各点が１個を表す。フィッティング線は線形回帰分析を用いて描いた。
【図５】[00111]新鮮及び解凍ＴＩＬに関する比較可能な活性化マーカー。ウィルコクソンの対応のある順位検定を用いて新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬとで活性化状態に有意な差は認められなかった。各点が、分析した１つの試料を表し、平均値±ＳＥＭとして示される。
【図６】[00112]凍結保存及び解凍後のＬＡＧ−３染色の維持。Ａ：ＣＤ８  ＴＩＬのＬＡＧ−３染色。Ｂ：新鮮及び解凍ＴＩＬに関するＣＤ４及びＣＤ８集団の調節分子の％頻度。ＣＤ８＋ＴＩＭ−３＋及びＣＤ８＋ＬＡＧ−３＋解凍ＴＩＬは新鮮ＴＩＬよりも％が低い。マン・ホイットニー統計検定。
【図７】[00113]凍結保存後の注入表現型について著しく安定している腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）。
【図８】[00114]ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬの表現型の特徴付けを示す散布図。Ｑ１は１９．０％ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−を示す；Ｑ２は０．０６６％ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋を示す；Ｑ４は８０．６％ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−を示す；及びＱ３は０．３６％ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋を示す。
【図９】[00115]第１及び第２の拡大培養段階の間のｒｅＲＥＰ  ＴＩＬの表現型の特徴付けを示す図及びデータ、１４日目、第１の拡大培養後だが第２の拡大培養前に０．０８％ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−；０．０３％ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋；７３．９７％ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−；及び２５．９１％ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋。反復ＲｅＲＥＰにおけるＣＭ又はＥＭ  ＴＩＬの増殖。反復ＲｅＲＥＰを用いてセントラルメモリー（ＣＭ）ＴＩＬ及びエフェクターメモリー（ＥＭ）ＴＩＬの増殖能を試験した。簡潔に言えば、１．３×１０６個のポストＲＥＰ  ＴＩＬを１．３×１０７個のＰＢＭＣフィーダー（ＣＦＳＥ標識）、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｎｌ）及びｒｈＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）と共培養し、培養を１４日間インキュベートした。１４日目、セントラルメモリーＴＩＬ及びエフェクターメモリーＴＩＬを、それぞれ、L/D Aqua−／ＣＦＳＥ−／ＴＣＲα／β＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋及びL/D Aqua−／ＣＦＳＥ−／ＴＣＲα／β＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−集団にゲーティングし、フローサイトメトリーで選別した。細胞集団の純度は９７％であった。次に、１×１０４個のフローサイトメトリーで選別したＣＭ若しくはＥＭ又は未選別のＴＩＬを１×１０６個のＰＢＭＣフィーダー、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｎｌ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）とトリプリケートで７日間培養した。細胞をカウントし、記録した。セントラルメモリーＴＩＬはエフェクターメモリーＴＩＬと比較すると増殖性が高かった。本発明者らはより多くのポストＲＥＰ  ＴＩＬ株でこの実験を繰り返しているところである。
【図１０】[00116]図１０Ａ及び図１０Ｂ：ＲｅＲＥＰの間のＴＩＬの表現型の特徴付け。セントラルメモリーＴＩＬ（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）又はエフェクターメモリーＴＩＬ（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）メモリー表現型を明らかにするため、細胞をAqua−／ＴＣＲα／β＋／ＣＤ４＋又はＣＤ８＋でゲーティングした。統計的有意性はスチューデント「ｔ」を用いて計算した。＊ｐ＜０．０５、ｎｓ  有意差なし。
【図１１】[00117]本明細書において１Ｃプロセスと称されることもあるＴＩＬ調製プロセスの例示的概略図。
【図１２】[00118]非黒色腫腫瘍からのＴＩＬの拡大培養成功。データは非黒色腫腫瘍におけるＴＩＬ（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）の分布を示す。
【図１３】[00119]非黒色腫ＴＩＬは、幼若ＴＩＬと一致して、ＣＤ２７及びＣＤ３８を発現した。
【図１４】[00120]活性化ＴＩＬはエフェクターメモリー集団の方に偏る。
【図１５】[00121]新鮮ＴＩＬ表現型及びｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ表現型。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
[00122]  迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ：Rapid Expansion Protocol）によってエキソビボで培養したＴＩＬを利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功を生み出している。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率の数値に頼っている。
【０１０９】
[00123]  現行のＲＥＰプロトコルは、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関しては見識をほとんど与えない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364（本明細書によって全体として明示的に援用される）、及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照のこと）。例えば、ナイーブＴ細胞はＡＴＰの産生をミトコンドリア呼吸に頼る一方、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は高度に解糖性であり、それが増殖、遊走、活性化、及び抗腫瘍有効性に必要とするバイオエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に頼る。
【０１１０】
[00124]  先行論文の報告によれば、重度に解糖に頼る細胞は養子移入時に栄養枯渇を被り、その結果、移入細胞の大部分が死滅することになるため、移入前にＴＩＬの解糖を制限し、ミトコンドリア代謝を促進することが望ましい。従って、当該技術分野では、ミトコンドリア代謝を促進すればインビボ寿命が促進される可能性があると教示され、実際、免疫応答の誘導前に解糖の阻害薬を使用することが提案されている。Chang et al.（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364), 574-582）を参照のこと。
【０１１１】
[00125]  本発明は、好ましい態様において、新鮮に採取したＴＩＬ又は再刺激ＴＩＬ（本明細書において「ｒｅＴＩＬ」と称されることもある）用の解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき意外にもセントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）又はエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）表現型を含めたメモリーＴ細胞サブセットの拡大につながる、及び／又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激迅速拡大培養プロトコル」又は「ｒｅＲＥＰ」と称されることもある追加的な再刺激プロトコルでＲＥＰを増強する新規方法に関する。即ち、凍結保存ＴＩＬに対してｒｅＲＥＰ手順（即ち、第１の拡大培養と第２の拡大培養とを含む手順）を用いることにより、患者は高度に代謝的に活性で健康なＴＩＬを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。
【０１１２】
[00126]  本発明は更に、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を判定及び定量化する方法に関する。従って、本発明は、限定はされないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能を含めた１つ以上の一般的な代謝判定を用いてＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。
【０１１３】
[00127]  その上、本発明は更に、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を判定及び定量化する方法に関する。従って、本発明は、限定はされないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸容量（ＳＲＣ）、及び解糖予備能を含めた１つ以上の一般的な代謝判定を用いてＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。
【０１１４】
[00128]  加えて、任意選択の追加的な判定としては、限定はされないが、ＡＴＰ産生、ミトコンドリア質量及びグルコース取込みが挙げられる。
【０１１５】
[00129]  ある場合には、代謝的健康が増加したｒｅＲＥＰ細胞集団は、当該技術分野において概して公知のとおり患者に注入される。
【０１１６】
ＩＩ．定義
[00130]  本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団が意味される。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり（「新鮮に採取された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察するとおりの「ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は増殖した任意のＴＩＬ細胞集団である。
【０１１７】
[00131]  ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも、又は腫瘍に浸潤して治療を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。ＴＩＬは、概して、以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上の発現によって分類することができる。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられてもよく−例えば、ＴＩＬは、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い、又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。インターフェロンには、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）が含まれ得る。
【０１１８】
[00132]  本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク、又は拡大培養（ＲＥＰ  ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法はまた、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織試料と区別可能なものである。
【０１１９】
[00133]  本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
【０１２０】
[00134]  本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６〜１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ−２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９〜１．５×１０１０個の注入用の細胞集団が提供されるように行われる。
【０１２１】
[00135]  一般に、ＴＩＬは初めは患者腫瘍試料から入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載されるとおりの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるとおり再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【０１２２】
[00136]  一般に、採取された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【０１２３】
[00137]  一般に、本明細書で考察するとおり、ＴＩＬは、初めは、本明細書で考察するとおり患者から切除された腫瘍から初代ＴＩＬ集団を入手することにより調製される（「初代細胞集団」又は「第１の細胞集団」）。これに続き、細胞をＩＬ−２と培養することを利用した初期バルク拡大培養が行われ、第２の細胞集団が形成される（本明細書において「バルクＴＩＬ集団」又は「第２の集団」と称されることもある）。
【０１２４】
[00138]  用語「細胞傷害性リンパ球」には、細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球及びＣＤ４＋  Ｔ−ヘルパーリンパ球を含む）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。細胞傷害性リンパ球には、例えば、末梢血由来α／βＴＣＲ陽性Ｔ細胞又は腫瘍関連抗原によって活性化されるか、及び／又は腫瘍特異的キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体で形質導入されたα／βＴＣＲ陽性Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が含まれ得る。
【０１２５】
[00139]  用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５ＲＯ＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）、及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩＩが含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は血中のＣＤ４コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺に比例的に高濃度化する。
【０１２６】
[00140]  用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）、及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は抗原刺激後に、インターフェロン−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−５を含め、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は血中のＣＤ８コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸に比例的に高濃度化する。ＣＤ８＋  エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
【０１２７】
[00141]  用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。
【０１２８】
[00142]  用語「迅速拡大培養」は、１週間の期間で少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍）、より好ましくは１週間の期間で少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、又は９０倍）、又は最も好ましくは１週間の期間で少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬ数の増加を意味する。複数の迅速拡大培養プロトコルが本明細書に記載される。
【０１２９】
[00143]  一部の実施形態において、本開示の方法は、腫瘍組織又は腫瘍組織からの細胞を標準的な実験用培地（限定なしに、ＲＰＭＩを含む）で成長させて、照射フィーダー細胞及び抗ＣＤ３抗体などの試薬で処理することにより、ＴＩＬ数の増加及び／又は所望の細胞表面マーカー又は他の構造的、生化学的若しくは機能的特徴を含む細胞に関する集団のエンリッチメントなど、所望の効果を実現する「プレＲＥＰ」段階を更に含む。プレＲＥＰ段階は、ＴＩＬ産生を改善するための代替戦略を取り入れ易くなるように、実験グレードの試薬を（実験グレードの試薬が後のＲＥＰ段階の間に希釈されるという仮定の下に）利用してもよい。従って、一部の実施形態において、プレＲＥＰ段階の間、培養培地中には、開示されるＴＬＲアゴニスト及び／又はペプチド又はペプチドミメティクスが含まれ得る。プレＲＥＰ培養は、一部の実施形態では、ＩＬ−２を含み得る。
【０１３０】
[00144]  本発明は、好ましい態様において、新鮮に採取したＴＩＬ又は再刺激ＴＩＬ（本明細書において「ｒｅＴＩＬ」と称されることもある）用の解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき意外にもメモリーエフェクターＴ細胞サブセットを含めたメモリーＴ細胞サブセットの拡大につながる、及び／又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激迅速拡大培養プロトコル」又は「ｒｅＲＥＰ」と称されることもある追加的な再刺激プロトコルでＲＥＰを増強する新規方法に関する。即ち、凍結保存ＴＩＬに対してｒｅＲＥＰ手順を用いることにより、患者は高度に代謝的に活性で健康なＴＩＬを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。かかる再刺激プロトコルは、本明細書では細胞集団の追加的な「拡大培養」とも称され、本明細書に更に詳細に記載される。
【０１３１】
[00145]  用語「断片化する」、「断片」、及び「断片化された」は、腫瘍の破壊プロセスを記載するために本明細書で使用されるとき、腫瘍組織を押しつぶす、スライスする、分割する、及び細切するなど、機械的断片化方法、並びに腫瘍組織の物理的構造を破壊する任意の他の方法を含む。用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
【０１３２】
[00146]  用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
【０１３３】
[00147]  用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３、及びＵＣＨＴ−１が含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。
【０１３４】
[00148]  用語「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対する、ヒト、ヒト化、キメラ、若しくはマウス抗体を含めたモノクローナル抗体又はそのバイオシミラー若しくは変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech,Inc.、San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、若しくはバイオシミラーなど、市販されている形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に提供する（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３の産生能を有するハイブリドーマが米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ８００１が付与されている。ＯＫＴ−３の産生能を有するハイブリドーマはまた、欧州認証細胞培養株保存機関（ＥＣＡＣＣ：European Collection of Authenticated Cell Cultures）にも寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が付与されている。
【０１３５】
【表１】
2019532652.tif 000003
【０１３６】
[00149]  用語「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２が含まれる。ＩＬ−２については、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載される。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号３）。例えば、用語ＩＬ−２には、ヒトの組換え形態のＩＬ−２、例えばアルデスロイキン（PROLEUKIN、使い捨てバイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）、並びにCellGenix, Inc.、Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-209-b）によって商業的に供給されている組換えＩＬ−２の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物が包含される。アルデスロイキン（ｄｅｓ−アラニル−１，セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、分子量が約１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え形態のＩＬ−２である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号４）。用語ＩＬ−２にはまた、Nektar Therapeutics、South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグNKTR-214を含め、本明細書に記載されるとおりの、ペグ化形態のＩＬ−２も包含される。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１  Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６  Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適な別の形態のコンジュゲート型ＩＬ−２が、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適なＩＬ−２の製剤が米国特許第６，７０６，２８９号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１３７】
【表２】
2019532652.tif 000004
【０１３８】
[00150]  用語「ＩＬ−４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これはＴｈ２  Ｔ細胞によって産生され、並びに好酸球、好塩基球、及びマスト細胞によって産生される。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２  Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ−４によって活性化されると、続いてＴｈ２  Ｔ細胞はポジティブフィードバックループで更なるＩＬ−４を産生する。ＩＬ−４はまた、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ  ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラススイッチも誘導する。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-211）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Gibco CTP0043）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号５）。
【０１３９】
[00151]  用語「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞、並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７はＴ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ−７は、ＩＬ−７受容体αと共通γ鎖受容体とからなるヘテロ二量体のＩＬ−７受容体に結合し、それが胸腺内でのＴ細胞発達及び末梢内での生存にとって重要な一連のシグナルとなる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-254）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号６）。
【０１４０】
[00152]  用語「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２が含まれる。ＩＬ−１５については、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ−１５はβ及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有している。組換えヒトＩＬ−１５は、分子質量が１２．８ｋＤａの、１１４アミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-230-b）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号７）。
【０１４１】
[00153]  用語「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン−２１として知られるプレイオトロピックサイトカインタンパク質を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２１が含まれる。ＩＬ−２１については、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ−２１は、主としてナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、分子質量が１５．４ｋＤａの、１３２アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-408-b）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号８）。
【０１４２】
[00154]  「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、又は「治療量」が指示されるとき、本発明の組成物の正確な投与量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む医薬組成物は１０４〜１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６、１０５〜１０１０、１０５〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０１１，１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０９〜１０１１、又は１０９〜１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与されてもよいと言うことができる。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与されてもよい。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照のこと）。特定の患者に最適な投薬量及び治療レジームは、医学分野の当業者が疾患の徴候に関して患者をモニタし及びそれに応じて治療を調整することにより、容易に決定することができる。
【０１４３】
[00155]  用語「血液学的悪性腫瘍」は、限定はされないが、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含め、哺乳類における造血及びリンパ系組織の癌及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍としては、限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
【０１４４】
[00156]  用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞又は液体範囲を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌など、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられる。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散するところであって支持微小環境をもたらし得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
【０１４５】
[00157]  用語「液性腫瘍」は、事実上流体である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、限定はされないが、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、並びに他の血液学的悪性腫瘍が挙げられる。液性腫瘍から入手されるＴＩＬはまた、本明細書において骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。
【０１４６】
[00158]  用語「微小環境」は、本明細書で使用されるとき、固形腫瘍又は血液学的腫瘍の微小環境全体又は微小環境内の個々の細胞サブセットを指し得る。腫瘍微小環境は、本明細書で使用されるとき、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されるとおり、「新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、及び顕性転移が発育するためのニッチを提供する細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的キュー」の複合混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるはずの抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスはまれである。
【０１４７】
[00159]  ある実施形態において、本発明は、ｒＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、ここで患者は本発明に係るｒＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ｒＴＩＬ集団はｅＴｉｌ集団と共に提供されてもよく、ここで患者は、本発明に係るｒＴＩＬ及びｅＴｉｌの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ｒＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ｒＴＩＬ注入前２７〜２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るｒＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０１４８】
[00160]  実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、治療有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
【０１４９】
[00161]  用語「共投与」、「共投与する」、「〜と併用して投与される」、「〜と併用して投与する」、「同時の」、及び「並行した」は、本明細書で使用されるとき、両方の医薬品有効成分及び／又はその代謝産物が対象に同じ時点で存在するような対象への２つ以上の医薬品有効成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば、複数のＴＩＬとの併用での少なくとも１つのカリウムチャネル作動薬）の投与を包含する。共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時点における投与、又は２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別個の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
【０１５０】
[00162]  用語「有効量」又は「治療有効量」は、限定はされないが疾患治療を含めた、意図した適用を達成するのに十分な本明細書に記載されるとおりの化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図した適用（インビトロ又はインビボ）、又は治療下の対象及び疾患病態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患病態の重症度、又は投与方法に応じて異なり得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／又は細胞遊走の低減）を生じさせるであろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択した詳細な化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、その投与先の組織、及び化合物を運ぶ物理的デリバリーシステムに応じて異なることになる。
【０１５１】
[00163]  用語「治療」、「治療している」、「治療する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であってもよく、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であってもよい。「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「治療」はまた、疾患又は病態がない場合であっても、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「治療」は、例えばワクチンの場合に、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
【０１５２】
[00164]  用語「異種」は、核酸又はタンパク質の一部分に関連して使用されるとき、その核酸又はタンパク質が、自然中では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え産生されて、新規の機能性核酸を作り出すように編成された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、ある供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード領域、又は異なる供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然中では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列（例えば、融合タンパク質）を含むことを示す。
【０１５３】
[00165]  ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈で用語「配列同一性」、「パーセント同一性」、及び「配列パーセント同一性」（又はこれらの同義語、例えば「９９％同一」）は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮せず、対応が最大となるように比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入する）したときに同じである、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を特定の割合だけ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。パーセント配列同一性の決定に好適なプログラムとしては、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）BLASTウェブサイトから利用可能なBLASTプログラムスイートが挙げられる。２つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPのいずれかのアルゴリズムを使用して行うことができる。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、一方、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech、South San Francisco, California）又はDNASTARから利用可能なMegAlignが、配列のアラインメントに使用し得る更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによるアラインメントを最大化するための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【０１５４】
[00166]  本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、限定はされないが、参照抗体のアミノ酸配列の範囲内の又はそれに隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失及び／又は付加の点で参照抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含する。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様の荷電又は非荷電アミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語はまた、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
【０１５５】
[00167]  用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
【０１５６】
[00168]  用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
【０１５７】
[00169]  用語「迅速拡大培養」は、１週間の期間で少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍）、より好ましくは１週間の期間で少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、又は９０倍）、又は最も好ましくは１週間の期間で少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬ数の増加を意味する。複数の迅速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
【０１５８】
ＩＩＩ．凍結保存（cyropreserved）ＴＩＬの再刺激
[00170]  本明細書において考察されるとおり、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、ひいては相対的健康を増加させること、及び前記代謝的健康の試験方法に関する。概して本明細書に概説されるとおり、ＴＩＬは概して患者試料から採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で以下に考察するとおり遺伝的に操作され、次に凍結保存されてもよい。解凍後、次にＴＩＬは、患者への注入前に再刺激することによりその代謝が高められる。
【０１５９】
[00171]  以下の「ステップ」名Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図１１を参照している。以下及び図１１におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序、並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し、及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
【０１６０】
Ａ．ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する
[00172]  一般に、ＴＩＬは初めは患者腫瘍試料から入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載されるとおりの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるとおり再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【０１６１】
[00173]  患者腫瘍試料は当該技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的切除、針生検又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む試料を入手するための手段によって入手されてもよい。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からであってもよい。腫瘍試料はまた、血液学的悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであってもよい。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
【０１６２】
[00174]  用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞又は液体範囲を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌など、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散するところであって支持微小環境をもたらし得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
【０１６３】
[00175]  用語「血液学的悪性腫瘍」は、限定はされないが、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含め、哺乳類における造血及びリンパ系組織の癌及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍としては、限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
【０１６４】
[00176]  入手後、腫瘍試料は概して鋭的剥離を用いて１〜約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２〜３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ：Roswell Park Memorial Institute）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタミン酸塩、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーションと、それに続く機械的解離（例えば、組織解離装置を用いる）によって作製されてもよい。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に解離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片しか存在しなくなるまで前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製されてもよい。この処理の終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、FICOLL分枝状親水性多糖を使用した密度勾配分離を実施して、それらの細胞を除去し得る。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、当該技術分野において公知の代替的な方法を用いてもよい。前述の方法のいずれも、ＴＩＬの拡大培養方法又は癌の治療方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態において用いることができる。
【０１６５】
[00177]  一部の実施形態において、断片化は、例えば剥離並びに消化を含めた物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は剥離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
【０１６６】
[00178]  一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えば図１１のステップＡにあるように、腫瘍試料の入手後に腫瘍は物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後に、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に２、３、又は４つの断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に３又は４つの断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に４つの断片又は小片が置かれる。
【０１６７】
[00179]  一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的剥離で入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。
【０１６８】
[00180]  一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態では、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭ  GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に解離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的解離を試料に適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、Ficollを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
【０１６９】
[00181]  一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の採取された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【０１７０】
[00182]  一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載するステップＢに進む前に、任意選択で試料採取後に凍結され、凍結貯蔵されてもよい。
【０１７１】
Ｂ．ステップＢ：第１の拡大培養
[00183]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養（第１の拡大培養又は第１のＴＩＬ拡大培養とも称される）は、以下及び本明細書に記載するとおりの初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、図１１に示されるとおりのステップＢ又は第１の拡大培養ステップ；これはプレＲＥＰと称される拡大培養ステップを含み得る）と、それに続く、以下及び本明細書に記載するとおりの第２の拡大培養ステップ（例えば、図１１に示されるとおりのステップＤ；これは、例として、迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるものを含み得る）と、それに続く任意選択の凍結保存（例えば、図１１に示されるとおりのステップＤの後）と、それに続く以下及び本明細書に記載するとおりの追加的な第２の拡大培養（例えば、図１１に示されるとおりの第２のステップＤ、これは再刺激ＲＥＰステップと称されることもあるものを含み得る）を用いて実施されてもよい。このプロセスによって得られたＴＩＬは、任意選択で、本明細書に記載されるとおり表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられてもよい。一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の拡大培養（例えば、図１１に示されるとおりのステップＢ）の後に凍結され（即ち、凍結保存され）、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵され、次に１回以上の第２の拡大培養ステップ（例えば、図１１に示されるとおりのステップＤに係る１つ以上の拡大培養）に進む前に解凍される。
【０１７２】
[00184]  一部の実施形態において、腫瘍試料の入手後（例えば、図１１に示されるとおりのステップＡの間など）に細胞が凍結される場合、細胞は第１の拡大培養（例えば、図１１に示されるとおりのステップＢ）の前に解凍される。
【０１７３】
[00185]  実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。
【０１７４】
[00186]  腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中で（又は、ある場合には、本明細書に概説されるとおり、ａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養の間の成長培地はＩＬ−２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０〜３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０〜×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は４〜８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は５〜７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は実施例４に記載されるとおり調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細��培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ、又は８０００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ−２を含む。
【０１７５】
[00187]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地（culture media）の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ  １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態では（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降は２〜３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例５を参照のこと。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ−２を含む。
【０１７６】
[00188]  一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、又は２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１５日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１６日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１７日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１８日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１９日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２０日〜２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２１日間続行され得る。
【０１７７】
Ｃ．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00189]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図１１に示されるとおりのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行の一部として凍結保存される。例えば、一部の実施形態において、ＴＩＬは、図１１に示されるとおりのステップＢの後、及びステップＤの前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行の一部として凍結保存され、解凍される。例えば、一部の実施形態において、ＴＩＬはステップＢの後に凍結保存され、次にステップＤ（図１１に提供されるとおり）に進む前に解凍される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２２日〜３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２４日〜３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２６日〜３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２８日〜３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３０日の時点で行われる。
【０１７８】
Ｄ．ステップＤ：第２の拡大培養
[00190]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養を含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、又は２２日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日〜約２２日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日〜約２０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日〜約１８日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日〜約１６日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日間続行し得る。
【０１７９】
[00191]  一部の実施形態において、第２の拡大培養は添加細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、添加細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。
【０１８０】
[00192]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養を含み得る）は、先述のとおりＴ−１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。Ｔ−１７５フラスコにおけるＴＩＬの第２の拡大培養については、約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各Ｔ−１７５フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとAIM-V培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。Ｔ−１７５フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、第２の拡大培養に入って５日で３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して培地の半分を交換する。一部の実施形態において、７日目、２つのＴ−１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントしてもよく、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５〜約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
【０１８１】
[00193]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養を含み得る）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施することができ（図１）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex100フラスコを５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養に入って５日で、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心する。次に５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態では、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用し得る。次に、各フラスコに、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。G-Rex100フラスコを５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、第２の拡大培養に入って４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。一部の実施形態において、細胞は培養１４日目に回収する。
【０１８２】
[00194]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養を含み得る）は、ガス透過性容器において実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて迅速に拡大培養することができる。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大培養には約１×１０９〜約１×１０１１個の抗原提示フィーダー細胞を使用する。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２又はＩＬ−１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原によるインビトロでのＴＩＬの更なる刺激により、迅速に拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２、及びＶＥＧＦＲ２、又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬはまた、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても迅速に拡大培養し得る。或いは、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。
【０１８３】
[00195]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養を含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施することができ、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをａＡＰＣと１対１００の比で培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁してもよく、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割してもよく、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートしてもよく、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。
【０１８４】
[00196]  一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（概して新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察するとおりのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０１８５】
[00197]  別の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当該技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられてもよい。
【０１８６】
[00198]  任意選択で、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態では、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬ試料をカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態では、生存率は、例えば実施例２に記載されるCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従い決定される。
【０１８７】
[00199]  一部の実施形態において、細胞は、２つ以上の容器又はフラスコに分割する前に、７日、８日、９日、１０日、又は１１日の第２の拡大培養総時間にわたって成長させる。
【０１８８】
[00200]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察するとおり、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
【０１８９】
[00201]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０〜１対３００である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００〜１対２００である。
【０１９０】
[00202]  ある実施形態において、本明細書に記載されるＴＩＬ拡大培養手順には、第２の拡大培養（例えば、ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養と称される拡大培養を含む）の間に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。ある実施形態では、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
【０１９１】
[00203]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは照射又は熱処理のいずれかで不活性化され、ＲＥＰ手順において使用される。
【０１９２】
[00204]  一部の実施形態において、第１の拡大培養における成長培地はＩＬ−２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０〜３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０〜×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は４〜８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は５〜７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は実施例４に記載されるとおり調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ、又は８０００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ−２を含む。
【０１９３】
[00205]  一部の実施形態において、第２の拡大培養の細胞培養培地はまた、抗ＣＤ３抗体も含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
【０１９４】
[00206]  一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体をＩＬ−２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照のこと。当業者は理解するであろうとおり、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態では、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。
【０１９５】
[00207]  一部の実施形態において、第２の拡大培養における細胞は、当該技術分野において公知のとおり、高用量のサイトカイン、詳細にはＩＬ−２を含む培養培地中で成長させる。
【０１９６】
[00208]  或いは、ＴＩＬの第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１のうちの２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（本明細書によって全体として参照により明示的に援用される）に概説されるとおりである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載されるとおり、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
【０１９７】
Ｅ．任意選択でのステップＤ：第２の拡大培養の繰り返し
[00209]  一部の実施形態において、第２の拡大培養は１回以上実施され、即ち、第２の拡大培養は繰り返される。例えば、一部の実施形態において、図１１に示されるとおりのステップＤの第２の拡大培養は１回以上繰り返される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は追加的な第２の拡大培養と称される。第２の拡大培養が２回以上実施される（即ち、第２の拡大培養が繰り返される）一部の実施形態において、これは、ＴＩＬ迅速拡大培養プロトコルと称される手順を含み得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は採取及び第１の拡大培養後に数が拡大される。このプロセスは、概して当該技術分野では迅速拡大培養プロセス（ＲＥＰ：rapid expansion process）と称され、繰り返される第２の拡大培養は、ｒｅＲＥＰと称される拡大培養を含み得る。このプロトコル全体は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、１回以上の後続の第２の拡大培養が、上記に記載したとおり実施される。一部の実施形態において、１回以上の第２の拡大培養が、図１１のステップＤの下に提供されるとおり、且つ図１１に提供されるとおりのステップＥの前に実施される。一部の実施形態において、１、２、３、４回又はそれ以上の第２の拡大培養が、上記に記載したとおり実施される。一部の実施形態において、１、２、３、４回又はそれ以上の第２の拡大培養が、図１１のステップＥの前に図１１のステップＤに提供されるとおり実施される。一部の実施形態において、２回の第２の拡大培養が、上記に記載したとおり実施される。一部の実施形態において、２回の第２の拡大培養が、図１１のステップＥの前に図１１のステップＤに提供されるとおり実施される。一部の実施形態において、３回の第２の拡大培養が、上記に記載したとおり実施される。一部の実施形態において、３回の第２の拡大培養が、図１１のステップＥの前に図１１のステップＤに提供されるとおり実施される。一部の実施形態において、４回の第２の拡大培養が、上記に記載したとおり実施される。一部の実施形態において、４回の第２の拡大培養が、図１１のステップＥの前に図１１のステップＤに提供されるとおり実施される。
【０１９８】
[00210]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（例えば図１１のステップＤにあるものなど）の繰り返しは、ＴＩＬの再刺激と称することができる。一部の実施形態において、本発明は再刺激ステップ、即ち第２の拡大培養の繰り返し（例えば、図１１のステップＤからの第２の拡大培養の繰り返し）を含む。一部の実施形態において、繰り返される第２の拡大培養（これは再刺激ステップと称される拡大培養（「ｒｅＲＥＰ」）を含み得る）は、凍結保存されていた細胞に対して実施される。一部の実施形態において、ＴＩＬはステップＤの後に凍結保存される。一部の実施形態において、ステップＤにおける初回の第２の拡大培養後、細胞を通常の培地、例えば「静止」培地中で培養してもよく、次に１回以上の第２の拡大培養ステップが実施される。一部の実施形態において、静止培地はＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、静止培地はＩＬ−２を含まない。一部の実施形態において、静止培地は、当該技術分野において公知の標準的な細胞培養培地である。一部の実施形態において、静止培地は、市販の培地を含め、AIM-V、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、又は当該技術分野において公知の任意の他の標準培地である。一部の実施形態において、静止培地はAIM-Vである。
【０１９９】
[00211]  一般に、本明細書で考察するとおり、ＴＩＬは、初めは、本明細書で考察するとおり患者から切除された腫瘍から初代ＴＩＬ集団を入手することにより調製される（「初代細胞集団」又は「第１の細胞集団」）。これに続き、細胞をＩＬ−２と培養することを利用した初期バルク拡大培養が行われ、第２の細胞集団が形成される（本明細書において「バルクＴＩＬ集団」又は「第２の集団」と称されることもある）。一部の実施形態において、これは初期又は第１の拡大培養とも称される。
【０２００】
[00212]  次に、バルクＴＩＬ集団（例えば、例えば図１１のステップＡから入手される集団）が、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で、第１の拡大培養（例えば、図１１のステップＢに記載されるとおりの第１の拡大培養）と称されることもあるＲＥＰステップに供され、ここでＡＰＣは概して末梢血単核球（ＰＢＭＣ；又は、或いは本明細書で考察するとおり、抗原提示細胞を使用する）を含み、ここで迅速拡大培養（例えば、図１１のステップＤに提供されるとおりの第２の拡大培養）は少なくとも１４日間実施される。本明細書で考察するとおり、培地はまた、ＩＬ−２単独でなく、むしろＩＬ−２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２３の組み合わせを含有してもよい。一部の実施形態において、この第２の拡大培養後（例えば、図１１のステップＤ後）の拡大培養ＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団（例えば、図１１のステップＢから入手されるＴＩＬ集団）より少なくとも５０倍又は１００倍数が多い。一部の実施形態において、図１１のステップＤにおける第２の拡大培養後に入手されるＴＩＬ集団は、図１１のステップＢにおける第１の拡大培養から入手されるＴＩＬより５０倍又は１００倍数が多い。ＴＩＬは、実施例１、２、及び３を含め、本明細書と共に提供される実施例に記載される方法を含めた、当該技術分野において公知の細胞カウント方法によって測定される。一部の実施形態では、K2セルカウンターを用いてＴＩＬがカウントされる。一部の実施形態では、Cellometer IC2 Imageサイトメーターを用いてＴＩＬがカウントされる。
【０２０１】
[00213]  一部の実施形態において、本明細書で考察するとおり、第２の拡大培養後に入手されるＴＩＬ集団（第３のＴＩＬ集団又はＲＥＰ細胞集団と称されることもある）は、添加細胞培養培地（例えば、図１１のステップＤで使用される培養培地又は実施例においてＣＭ２と称される培地）から取り出され、任意選択で追加的な第２の拡大培養ステップの実施前に貯蔵培地（例えば、５％ＤＭＳＯを含有する培地）に凍結保存される。
【０２０２】
[00214]  任意選択で、ＴＩＬは、第２の拡大培養後、及び追加的な第２の拡大培養の前に凍結保存することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、図１１のステップＤの実施後、及び図１１の追加的なステップＤの実施前に凍結保存される。一部の実施形態において、凍結保存ＴＩＬは、追加的な第２の拡大培養の実施前に解凍される。一部の実施形態において、凍結保存ＴＩＬは、図１１に提供されるとおりの追加的なステップＤの実施前に解凍される。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。或いは、細胞は添加細胞培養培地（例えば、図１１のステップＤにおいて使用される培養培地）から取り出され、静止培地で培養される。かかる培地には、実施例１及び５、並びに本明細書と共に提供される他の実施例に記載されるものが含まれる。一部の実施形態において、静止培地は、ＩＬ−２を含む培地を含み得る。一部の実施形態において、静止培地は、実施例においてＣＭ１と称される培地であってもよい。
【０２０３】
[00215]  追加的な第２の拡大培養（ｒｅＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、解凍した細胞又は静止細胞のいずれかに対して、ＩＬ−２と、ＯＫＴ−３と、概して末梢血単核球（ＰＢＭＣ；又は、或いは本明細書で考察するとおり、抗原提示細胞を使用する）を含むフィーダー細胞（例えば、抗原提示細胞）とを含む添加細胞培養培地（例えば、図１１のステップＤに提供されるとおりの培地）を使用して行われ、ここで追加的な第２の拡大培養は少なくとも１４日間実施される。本明細書で考察するとおり、培地はまた、ＩＬ−２単独でなく、むしろＩＬ−２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２３の組み合わせを含有してもよい。
【０２０４】
[00216]  これにより、これらの拡大培養ＴＩＬが第２のＴＩＬ集団（例えば、バルク出発ＴＩＬ）と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を呈することを特徴とする拡大培養ＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、これらの拡大培養ＴＩＬは、図１１のステップＤから入手されるＴＩＬである。
【０２０５】
[00217]  一部の実施形態において、メモリーＴ細胞は、細胞（構成的にＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌ）である。Sallusto, et al., Annu. Rev. Immunol., 2004, 22:745-763を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される。
【０２０６】
[00218]  従って、本発明は、解糖及び呼吸などの代謝的健康の増加をもたらす解凍後方法に基づいた、凍結保存ＴＩＬの解凍時における再刺激方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、解凍した凍結保存ＴＩＬの集団を提供することであって、次にはそれを処理してその代謝的健康を増加させることにより、患者への注入時に最適な治療を実現することを含む。
【０２０７】
Ｆ．ステップＥ：ステップＤからＴＩＬを回収する
[00219]  第２の拡大培養ステップの後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１、２、３、４回又はそれ以上の第２の拡大培養ステップの後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、図１１に提供されるとおりのステップＤに係る１、２、３、４回又はそれ以上の第２の拡大培養ステップの後に回収される。
【０２０８】
[00220]  ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当該技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。
【０２０９】
Ｇ．ステップＦ：最終的な製剤化及び／又は輸注バッグに移す
[00221]  図１１に例示的順序で提供されるとおりの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説されるとおりのステップＡ〜Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
【０２１０】
[00222]  ある実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内が挙げられる。
【０２１１】
１．医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン
[00223]  ある実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が挙げられる。
【０２１２】
[00224]  任意の好適な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、好適な投薬量には、治療上十分な数のＴＩＬが必要である。一部の実施形態において、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均約７．８×１０１０個のＴＩＬである。ある実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は、特に癌が黒色腫である場合、約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。
【０２１３】
[00225]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２、及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。
【０２１４】
[00226]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ未満である。
【０２１５】
[00227]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％  １９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％  １８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％  １７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％  １６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％  １５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％  １４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％  １３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％  １２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％  １１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％  １０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％  ９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％  ８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％  ７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％  ６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％  ５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、又はｖ／ｖ超である。
【０２１６】
[00228]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
【０２１７】
[00229]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
【０２１８】
[00230]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、又は０．０００１ｇ以下である。
【０２１９】
[00231]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、又は１０ｇ超である。
【０２２０】
[00232]  本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投薬量範囲にわたって有効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物の投与形態、治療対象の性別及び年齢、治療対象の体重、並びに主治医の優先的選択及び経験に依存することになる。臨床的に確立されたＴＩＬの投薬量もまた、適宜用いられ得る。ＴＩＬの投薬量など、本明細書の方法を用いて投与される医薬組成物の量は、治療下のヒト又は哺乳類、障害又は病態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質及び処方医師の裁量に依存することになる。
【０２２１】
[00233]  一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与されてもよい。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によってもよい。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回用量で投与されてもよい。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回超であってもよい。投与は、月１回、２週間に１回、週１回、又は隔日１回であってもよい。ＴＩＬの投与は必要な限り継続されてもよい。
【０２２２】
[00234]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２、及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。
【０２２３】
[00235]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２２４】
[00236]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ、又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ、又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲である。
【０２２５】
[00237]  有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること、又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与されてもよい。
【０２２６】
Ｈ．任意選択の細胞生存率分析
[00238]  任意選択で、ステップＢの第１の拡大培養の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
【０２２７】
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00239]  一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などのマーカー、並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
【０２２８】
[00240]  ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するとおり、ＲＥＰに供し、次に凍結保存してもよい。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ  ＴＩＬ集団を好適な治療のための遺伝子修飾に供してもよい。
【０２２９】
２．細胞培養
[00241]  ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培地、又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
【０２３０】
[00242]  ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
【０２３１】
[00243]  ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；ａＡＰＣを使用して細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要期間。
【０２３２】
[00244]  ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。ある実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことなく行われる。ある実施形態において、これは、GRexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７  Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８  Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０  Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８  Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５  Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０  Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６  Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
【０２３３】
[00245]  一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２、若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。
【０２３４】
Ｉ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00246]  上記でステップＡ〜Ｅにおいて考察したとおり、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、ステップＢに係る第１の拡大培養後のバルクＴＩＬ集団又はステップＤに係る１回以上の第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存されてもよい。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯに凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯに凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例８及び９に提供される方法に従い凍結保存される。
【０２３５】
[00247]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当該技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０２３６】
Ｊ．拡大培養したＴＩＬの表現型特徴
[00248]  一部の実施形態において、ＴＩＬは拡大培養後に、本明細書及び実施例に記載されるものを含め、多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。ある実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＢの第１の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣの移行中に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣに係る移行中且つ凍結保存後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る第２の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る２回以上の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、及びＣＤ８ａからなる群から選択される。ある実施形態において、マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のマーカーの発現が調べられる。一部の実施形態では、各群から１つ以上のマーカーからの発現が調べられる。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３８、及びＣＤ６９発現のうちの１つ以上が維持される（即ち、統計的に有意な差を呈しない）。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬにおいてＴＩＬの活性化状態が維持される。
【０２３７】
[00249]  ある実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１、ＴＩＭ−３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１、及びＴＩＭ−３からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節分子発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、調節分子ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現に有意な差はない。一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現、及び／又はメモリーマーカーに有意な差はない。
【０２３８】
[00250]  一部の実施形態において、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。
【０２３９】
[00251]  一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したときの新鮮ＴＩＬの生存率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。一部の実施形態において、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方の生存率が、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は９８％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が、８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、又は９０％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８６％超である。
【０２４０】
[00252]  ある実施形態において、再刺激ＴＩＬはまた、サイトカイン遊離アッセイを用いてサイトカイン遊離に関しても判定することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３か又は自己腫瘍消化物との共培養かのいずれかによる刺激に応答したインターフェロン−７（ＩＦＮ−７）分泌に関して判定することができる。例えば、ＯＫＴ３刺激を用いる実施形態では、ＴＩＬを広範に洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した０．１又は１．０μｇ／ｍＬのＯＫＴ３をプレコートした９６ウェル平底プレートに０．２ｍＬ  ＣＭ中１×１０５細胞でデュプリケートウェルを調製する。一晩インキュベートした後、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−７をＥＬＩＳＡ（Pierce/Endogen、Woburn, MA）によって測定する。共培養アッセイについては、１×１０５個のＴＩＬ細胞を９６ウェルプレートに自己腫瘍細胞と共に（１：１比）置く。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ−７遊離を例えばＥＬＩＳＡによって定量化することができる。
【０２４１】
[00253]  細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析：細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のため、ＴＩＬ試料をアリコートに分けた。例えば実施例７、８、及び９を参照のこと。
【０２４２】
[00254]  一部の実施形態において、ＴＩＬは様々な調節マーカーに関して判定されるものである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＴＣＲα／β、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒ−、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１２２からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーはＴＣＲα／βである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ５６である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２８である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ５７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ４５ＲＡである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ４５ＲＯである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２５である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ１２７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ９５である。一部の実施形態において、調節マーカーはＩＬ−２Ｒ−である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＣＲ７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ６２Ｌである。一部の実施形態において、調節マーカーはＫＬＲＧ１である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ１２２である。
【０２４３】
Ｋ．拡大培養したＴＩＬの代謝的健康
[00255]  再刺激したＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は解凍後のＴＩＬのいずれと比較したときも、基礎解糖の有意な亢進によって特徴付けられる。
【０２４４】
[00256]  ａＥＭ３  ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬについて、ＰＢＭＣフィーダーと比較して予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能を判定することができる。Seahorse XF細胞ミトストレステストは、ミトコンドリアにおける電子伝達鎖の成分を標的にする呼吸調節因子を用いて細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を直接測定することによりミトコンドリア機能を測定する。試験化合物（オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、及びロテノンとアンチマイシンＡとの混合物、以下に記載する）を連続的に注入して、それぞれ、ＡＴＰ産生、最大呼吸、及び非ミトコンドリア呼吸を測定する。次にこれらのパラメータ及び基礎呼吸を使用してプロトンリーク及び予備呼吸容量を計算する。各調節因子が電子伝達鎖の特異的成分を標的にする。オリゴマイシンはＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）を阻害し、オリゴマイシン注射後のＯＣＲの低下は、細胞性ＡＴＰ産生に関連するミトコンドリア呼吸と相関する。カルボニルシアニド−４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）は、プロトン勾配を破綻させてミトコンドリア膜電位を破壊する脱共役剤である。結果として、電子伝達鎖を通じた電子流が抑制されず、複合体ＩＶによって酸素が最大限に消費される。ひいてはＦＣＣＰの刺激を受けたＯＣＲを使用して、最大呼吸と基礎呼吸との差として定義される予備呼吸容量を計算することができる。予備呼吸容量（ＳＲＣ）は、細胞がエネルギー要求の増加に応答する能力の尺度である。第３の注射は、複合体Ｉ阻害薬であるロテノンと、複合体ＩＩＩ阻害薬であるアンチマイシンＡとの混合物である。この組み合わせはミトコンドリア呼吸を遮断し、ミトコンドリア外部の過程によってドライブされる非ミトコンドリア呼吸の計算を可能にする。
【０２４５】
[00257]  一部の実施形態において、代謝アッセイは基礎呼吸である。一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の基礎呼吸速度を有する。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約６０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約７０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％〜約９９％である。一部の実施形態において、第２の拡大培養又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度と統計的に有意な差のない基礎呼吸速度を有する。
【０２４６】
[00258]  一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養ＴＩＬ、例えばステップＤのもの（例えば、追加的な第２の拡大培養を受けた、ｒｅＲＥＰと称されるＴＩＬを含む）などのＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の予備呼吸容量を有する。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約６０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約７０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％〜約９９％である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度と統計的に有意な差のない予備呼吸容量を有する。
【０２４７】
[00259]  一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の予備呼吸容量を有する。一部の実施形態において、測定される代謝アッセイは解糖予備能である。一部の実施形態において、代謝アッセイは解糖予備能である。一部の実施形態において、代謝アッセイは予備呼吸容量である。細胞（呼吸）代謝を測定するため、細胞をミトコンドリア呼吸及び解糖の阻害薬で処理して、以下の尺度からなるＴＩＬの代謝プロファイルを決定した：ベースライン酸化的リン酸化（ＯＣＲによる測定時）、予備呼吸容量、ベースライン解糖活性（ＥＣＡＲによる測定時）、及び解糖予備能。代謝プロファイルは、ミトコンドリアＡＴＰ産生の遮断時に細胞が解糖を遂行する能力を決定することが可能な、Seahorseコンビネーションミトコンドリア／解糖ストレステストアッセイ（Agilent（登録商標）から市販されているキットを含む）を用いて実施した。一部の実施形態において、細胞がグルコース飢餓状態にあり、次にグルコースを注入し、続いてストレス作用剤を注入する。一部の実施形態において、ストレス作用剤は、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、ロテノン、アンチマイシンＡ及び／又は２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、オリゴマイシンは１０ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、ＦＣＣＰは１０ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、ロテノンは２．５ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、アンチマイシンＡは２．５ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）は５００ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、解糖能、解糖予備能、及び／又は非解糖酸性化が測定される。一般に、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の解糖予備能を有する。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約６０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約７０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の���９５％〜約９９％である。
【０２４８】
[00260]  一部の実施形態において、代謝アッセイは基礎解糖である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養ＴＩＬ、例えばステップＤのもの（例えば、追加的な第２の拡大培養を受けた、ｒｅＲＥＰと称されるＴＩＬを含む）は、基礎解糖が少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍に増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養、例えばステップＤのもの（ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む）は、基礎解糖が約２倍〜約１０倍に増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養、例えばステップＤのもの（ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む）は、基礎解糖が約２倍〜約８倍に増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養、例えばステップＤのもの（ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む）は、基礎解糖が約３倍〜約７倍に増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養、例えばステップＤのもの（ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む）は、基礎解糖が約２倍〜約４倍に増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養、例えばステップＤのもの（ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む）は、基礎解糖が約２倍〜約３倍に増加する。
【０２４９】
[00261]  一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は追加的な第２の拡大培養、例えばステップＤのもの（例えば、追加的な第２の拡大培養を受けた、ｒｅＲＥＰと称されるＴＩＬを含む）ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の解糖予備能を有する。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約６０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約７０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％〜約９９％である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度と統計的に有意な差のない予備呼吸容量を有する。
【０２５０】
[00262]  グランザイムＢ産生：グランザイムＢは、ＴＩＬが標的細胞を死滅させる能力の別の尺度である。ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する抗体を使用して上記に記載したとおり再刺激した培地上清について、そのグランザイムＢレベルもまた、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit（R & D Systems、Minneapolis, MN）を製造者の指示に従い使用して評価した。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）はグランザイムＢ産生が増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）は細胞傷害活性が増加する。
【０２５１】
[00263]  一部の実施形態において、本方法は、上記に記載したとおりの方法を用いた、ＴＩＬ生存率を評価するためのアッセイを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図１１に提供されるとおりのものを含め、上記で考察したとおり拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、生存率の評価前に凍結保存される。一部の実施形態において、生存率評価は、第１の拡大培養、第２の拡大培養、及び追加的な第２の拡大培養の実施前にＴＩＬを解凍することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＴＩＬ集団の細胞増殖、細胞毒性、細胞死、及び／又はその他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。生存率は、上記に記載されるＴＩＬ代謝アッセイのいずれか並びに当該技術分野において公知の細胞生存率の評価について公知の任意の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、本方法は、図１１に例示されるものを含め、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養されたＴＩＬの細胞増殖、細胞毒性、細胞死、及び／又はその他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。
【０２５２】
[00264]  本発明はまた、ＴＩＬ生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をより大きいＴＩＬ集団に拡大培養することによりＴＩＬの生存率をアッセイする方法を提供し、この方法は、
（ｉ）予め拡大培養された第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、及び第３の集団が生存率に関して更にアッセイされること
を含む。
【０２５３】
[00265]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３、及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施することを更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたよりも大きいＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きいＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、及び第３の集団は生存率に関して更にアッセイされる。
【０２５４】
[00266]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）の前に、細胞は凍結保存される。
【０２５５】
[00267]  一部の実施形態において、細胞はステップ（ｉ）の実施前に解凍される。
【０２５６】
[00268]  一部の実施形態において、分析に十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｖ）が１〜４回繰り返される。
【０２５７】
[00269]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。
【０２５８】
[00270]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。
【０２５９】
[00271]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。
【０２６０】
[00272]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４４日以内に実施される。
【０２６１】
[00273]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。
【０２６２】
[00274]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【０２６３】
[00275]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０２６４】
[00276]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｖ）のより大きいＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０２６５】
[00277]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０２６６】
[00278]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０２６７】
[00279]  一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０２６８】
[00280]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【０２６９】
[00281]  一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０２７０】
[00282]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【０２７１】
[00283]  一部の実施形態において、ＴＩＬは生存率に関してアッセイされる。
【０２７２】
[00284]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後に生存率に関してアッセイされる。
【０２７３】
[00285]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後及びステップ（ｉｖ）の後に生存率に関してアッセイされる。
【０２７４】
[00286]  本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投与における更なる使用。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltratitng lymphocyte）（ＴＩＬ）をアッセイする方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多いこと；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、及び凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加的な第２の拡大培養を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって実施することであって、この第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療上有効な投薬量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０２７５】
[00287]  一部の実施形態において、ｒｅＲＥＰ期間は、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５０：１より大きくなるまで実施される。
【０２７６】
[00288]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０２７７】
[00289]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４４日以内に実施される。
【０２７８】
[00290]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において細胞はＴＩＬである。
【０２７９】
[00291]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０２８０】
[00292]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）のより大きいＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０２８１】
[00293]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０２８２】
[00294]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０２８３】
[00295]  一部の実施形態において、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
【０２８４】
[00296]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【０２８５】
[00297]  一部の実施形態において、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
【０２８６】
[00298]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われる。
【０２８７】
[00299]  一部の実施形態において、ＴＩＬはステップ（ｖｉｉ）の後に生存率に関してアッセイされる。
【０２８８】
[00300]  本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
【０２８９】
[00301]  一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
【０２９０】
[00302]  一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態に記載されるとおりの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
【０２９１】
[00303]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
【０２９２】
[00304]  一部の実施形態において、凍結保存ＴＩＬを解凍し、第２の拡大培養を実施することにより、細胞が十分に拡大したかどうかが決定される。細胞が少なくとも５：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも１０：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも１５：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも２０：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも２５：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも３０：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも３５：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも４０：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも４５：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。細胞が少なくとも５：１の比に拡大した場合、ＴＩＬは、患者への投与が十分に実行可能である。
【０２９３】
[00305]  本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日のｒｅＲＥＰ期間にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；及び
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団の残りを患者に治療的に投与すること
を含む。
【０２９４】
[00306]  一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
【０２９５】
[00307]  一部の実施形態において、本方法は、先行する請求項のいずれかの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
【０２９６】
[00308]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
【０２９７】
[00309]  一部の実施形態において、本方法は、第２のＴＩＬ集団の代謝的健康を評価するステップを更に含んだ。
【０２９８】
[00310]  一部の実施形態において、本方法は、第２のＴＩＬ集団の表現型を評価するステップを更に含む。
【０２９９】
[00311]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は同種異系末梢血（peripherial blood）単核球である。
【０３００】
Ｌ．患者の治療方法
[00312]  治療方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法については、両方ともに当該技術分野において、例えばJin et al.（J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292）（全体として参照により本明細書に援用される）により記載されている。また、以下の実施例のセクション全体を通じても記載されている。
【０３０１】
[00313]  本発明は、これまで記載されたことがない新規ＴＩＬ生成方法、例えばステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬを提供する。上記のステップＡ〜Ｆにより作製される又は別様に本明細書に記載されるとおり作製されるとおりの拡大培養ＴＩＬは、癌患者の治療に特定の使用が見出される。癌の治療にＴＩＬを使用する一般的な方法については、Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239、並びに補遺内容；全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。同様に、本発明により作製されるＴＩＬもまた、癌の治療に使用することができる。一部の実施形態では、ＴＩＬは、先述のとおり転移性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。新鮮腫瘍は無菌条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表試料を収集し得る。２ｍｍ３〜３ｍｍ３の単一の断片。一部の実施形態において、患者１人当たり５、１０、１５、２０、２５又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２０、２５、又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２０、２２、２４、２６、又は２８の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２４の試料を入手する。試料を２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ−２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニタし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載されるとおり凍結保存し得る。
【０３０２】
[00314]  一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６）のため拡大培養ＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であると見なすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、迅速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含め、第２の拡大培養（例えば、図１１のステップＤにおいて提供されるとおりの第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが、追加的な第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、図１１のステップＤに提供されるとおりの第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図１１のステップＤに係る追加的な第２の拡大培養に選択される。
【０３０３】
[00315]  一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、例えば、一部の実施形態において、腫瘍採取後及び／又は第１の拡大培養後、細胞はすぐには利用されない。かかる実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの２日前に（例えば、一部の実施形態において、ＲＥＰステップと称されるステップの２日前に）解凍することができる。かかる実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの２日前に（例えば、一部の実施形態において、図１１に提供されるとおりのステップＤの２日前に）解凍することができる。本願全体を通じて様々な実施形態に記載されるとおり、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセスを含む）では、１００：１比の照射フィーダー細胞（可能な場合には自己性）の存在下でＯＫＴ３（抗ＣＤ３）抗体（Miltenyi Biotech、San Diego, CA）及びＩＬ−２（３，０００ＩＵ／ｍＬ；Prometheus、San Diego, CA）を使用した（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの５日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの４日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの３日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの２日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、及び第２の拡大培養ステップの直前に解凍することができる。
【０３０４】
[00316]  輸注バッグＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（FlowJo）、並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ−ｇの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬ及び４  ３ベースラインレベル超（greater than 4 3 baseline levels）と定義した。
【０３０５】
１．任意選択での患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00317]  実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、治療有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明の第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図１１のステップＤに記載されるものなど）を導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
【０３０６】
[00318]  一般に、リンパ球枯渇はフルダラビン及び／又はシクロホスファミド（その活性型はマホスファミドと称される）及びこれらの組み合わせを使用して行われる。かかる方法については、Gassner et al. （Cancer Immunol Immunother. 2011, 60(1):75-85、Muranski, et al., Nat Clin Pract Oncol., 2006 3(12):668-681、Dudley, et al., J Clin Oncol 2008, 26:5233-5239、及びDudley, et al., J Clin Oncol. 2005, 23(10):2346-2357（これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
【０３０７】
[00319]  一部の実施形態において、フルダラビンは０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌフルダラビン（Sigma-Aldrich、MO, USA）の濃度である。一部の実施形態において、フルダラビンは１μｇ／ｍｌフルダラビン（Sigma-Aldrich、MO, USA）の濃度である。一部の実施形態において、フルダラビン処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上である。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間である。一部の実施形態において、フルダラビン処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間である。一部の実施形態において、フルダラビン処置は２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間である。
【０３０８】
[00320]  一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは１μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上である。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内に（即ち、ｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間である。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４〜５日間である。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４日間である。
【０３０９】
[00321]  一部の実施形態において、フルダラビン及びシクロホスファミドは患者に一緒に投与される。一部の実施形態において、４日間にわたってフルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
【０３１０】
[00322]  このプロトコルは、フルダラビン（２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．）及びシクロホスファミド（２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．）の４日間にわたる投与を含む。
【０３１１】
２．例示的治療の実施形態
[00323]  一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団より少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地中にＩＬ−２は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ−３抗体は約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第１の拡大培養は１４日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第１の拡大培養はガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１対８０〜１対４００である。一部の実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１対３００である。一部の実施形態において、治療される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、治療される癌は、黒色腫、卵巣癌、及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、治療される癌は黒色腫である。一部の実施形態において、治療される癌は卵巣癌である。一部の実施形態において、治療される癌は子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の治療方法は、患者に第３のＴＩＬ集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。
【０３１２】
３．共投与方法
[00324]  一部の実施形態において、本明細書のステップＡ〜Ｆに記載されるとおり作製されるＴＩＬは、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ−１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ−３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＣＴ−０１１、Medivation）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（BeiGene）、及び／又は抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Bristol-Myers Squibb）、及び／又はヒト化抗ＰＤ１  ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、クローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載されるとおりのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（本明細書において参照により援用される）に開示される抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載されるとおりのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（本明細書において参照により援用される）に開示される。当業者は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載されるとおりのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ−１抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗ＰＤ−１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性（refactory）黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ−１と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ−１と併用して投与される。
【０３１３】
４．養子細胞移入
[0001]  養子細胞移入（ＡＣＴ）は極めて有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養、及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来してもよい（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴ用のＴＩＬは、本明細書に記載されるとおり調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図１１に記載されるとおりの方法により調製される。ＴＩＬはまた、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合には血液から誘導されてもよく、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされてもよく、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされてもよい。注入しようとする癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自家ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により援用される）。
【０３１４】
[0002]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載されるとおり投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によってもよい。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与されてもよい。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回超であってもよい。投与は、月１回、２週間に１回、週１回、又は隔日１回であってもよい。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続されてもよい。
【０３１５】
Ｉ．例示的実施形態
[00325]  ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより第２のＴＩＬ集団を入手することであって、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むこと；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く；及び第２の細胞培養培地が、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、迅速拡大培養が少なくとも１４日間実施されること；
（ｄ）第２の細胞培養培地から細胞を取り出すこと、及び任意選択で細胞を貯蔵培地に凍結保存して第３の細胞集団を入手すること；
（ｅ）任意選択で第３の細胞集団を解凍すること；及び
（ｆ）第３の細胞培養培地中で第３のＴＩＬ集団の第２の迅速拡大培養を実施することであって、第３の細胞培養培地が、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、第２の迅速拡大培養が少なくとも１４日間実施され、それにより第４のＴＩＬ集団を入手し、第４の細胞集団が第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を呈すること；及び
ｇ）任意選択で、ステップｆ）を１回以上繰り返すこと
を含む。
【０３１６】
[00326]  ある実施形態において、本発明は、前記再刺激された細胞がＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現することを提供する。
【０３１７】
[00327]  ある実施形態において、本発明は、前記ｒｅＲＥＰ培地が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むことを提供する。
【０３１８】
[00328]  ある実施形態において、本発明は、前記ＰＢＭＣが９〜１７日目のいずれかにＴＩＬに加えられることを提供する。一部の実施形態において、本発明は、前記ＰＢＭＣが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び／又は１７日目にＴＩＬに加えられることを提供する。
【０３１９】
[00329]  ある実施形態において、本発明は、前記ｒｅＲＥＰ培地がａＡＰＣを含むことを提供する。
【０３２０】
[00330]  ある実施形態において、本発明は、凍結保存ＴＩＬが、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで形質導入されたことを提供する。
【０３２１】
[00331]  ある実施形態において、本発明は、凍結保存ＴＩＬが、Ｔ細胞シグナル伝達分子のエンドドメインに融合した免疫グロブリン軽鎖を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで形質導入されたことを提供する。
【０３２２】
[00332]  ある実施形態において、本発明は、再刺激ＴＩＬが患者に注入されることを提供する。
【０３２３】
[00333]  ある実施形態において、本発明は、ステップｄ）が第２の細胞培養培地から細胞を取り出すことを更に含むことを提供する。
【０３２４】
[00334]  ある実施形態において、本発明は、前記ＴＩＬの治療投薬量に十分なＴＩＬを入手するために、ステップｆ）が十分な回数繰り返されることを提供する。
【０３２５】
[00335]  ある実施形態において、本発明は、上記及び本明細書に記載される方法により作成される再刺激ＴＩＬ集団を提供する。
【０３２６】
[00336]  ある実施形態において、本発明は、請求項１に記載の方法により作成される再刺激ＴＩＬ集団を提供し、ここで前記再刺激ＴＩＬは、前記解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき基礎解糖が少なくとも２倍に増加している。
【０３２７】
[00337]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法を提供し、これは前記細胞の基礎解糖を測定することを含む。
【０３２８】
[00338]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法を提供し、これは前記細胞の基礎呼吸を測定することを含む。
【０３２９】
[00339]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法を提供し、これは前記細胞の予備呼吸容量（ＳＲＣ）を測定することを含む。
【０３３０】
[00340]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ細胞集団の代謝活性を評価する方法を提供し、これは前記細胞の解糖予備能を測定することを含む。
【０３３１】
[00341]  ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって患者の癌を治療する方法を提供し、この方法は、
ａ）前記患者から初代ＴＩＬ集団を入手するステップ；
ｂ）前記初代ＴＩＬ集団を迅速拡大培養して拡大培養ＴＩＬ集団を形成するステップ；
ｃ）前記拡大培養した集団を凍結保存して凍結保存ＴＩＬ集団を形成するステップ；
ｄ）前記凍結保存ＴＩＬ集団を解凍するステップ；
ｅ）ＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体を含む培地中で前記凍結保存ＴＩＬ集団を培養してｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ集団を形成するステップ；及び
ｆ）治療有効量のｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ細胞を前記患者に投与するステップ
を含む。
【０３３２】
[00342]  ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手すること
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより第２のＴＩＬ集団を入手することであって、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むこと；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く；及び第２の細胞培養培地が、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、迅速拡大培養が少なくとも１４日間実施されること；
（ｄ）第２の細胞培養培地から細胞を取り出すこと、及び任意選択で細胞を貯蔵培地に凍結保存して第３の細胞集団を入手すること；
（ｅ）任意選択で第３の細胞集団を解凍すること；
（ｆ）第３の細胞培養培地中で第３のＴＩＬ集団の第２の迅速拡大培養を実施することであって、第３の細胞培養培地が、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、第２の迅速拡大培養が少なくとも１４日間実施され、それにより第４のＴＩＬ集団を入手し、第４の細胞集団が第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を呈すること；及び
（ｇ）治療有効量のｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ細胞を前記患者に投与すること
を含む。
【０３３３】
[00343]  ある実施形態において、本発明は、ステップｄ）が第２の細胞培養培地から細胞を取り出すことを更に含むことを提供する。
【０３３４】
[00344]  ある実施形態において、本発明は、前記ＴＩＬの治療投薬量に十分なＴＩＬを入手するために、ステップｆ）が十分な回数繰り返されることを提供する。
【実施例】
【０３３５】
実施例
実施例１：再刺激プロトコル
[00345]  本明細書で考察するとおり、ＲＥＰで成長させたＴＩＬの回収又は解凍後の新鮮抗原再刺激を利用して再刺激プロトコル及びアッセイを開発した。
【０３３６】
[00346]  本実施例の目的は、再刺激アッセイにおけるポストＲＥＰ腫瘍浸潤リンパ球の増殖／拡大を試験することであった。ポストＲＥＰ  ＴＩＬ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）を同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）で再刺激した。７日目に生細胞をカウントして記録した。
【０３３７】
[00347]  インビボでのＴＩＬ生存及び拡大が促進されるように予めリンパ球枯渇させた患者にポストＲＥＰ  ＴＩＬ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）を注入した。ＴＩＬが患者に再注入されると、ＴＩＬが抗原に遭遇し、ＴＩＬの活性化がもたらされたが、ＴＩＬは最終的に短命であった。ＡＣＴにおいてＴＩＬが抗原接触を介して再刺激されるとともに、併せてＩＬ−２に曝露されると、ＴＩＬ増殖及び腫瘍制御がもたらされ得るか、又は適切な共刺激がないことに起因してアポトーシスを介した消去（活性化誘導性細胞死）又は非増殖性（アネルギー）状態の誘導につながり得る。理論によって拘束されないが、同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞によるポストＲＥＰ  ＴＩＬの再刺激（例えば図１１に係るステップＤ後のＴＩＬの再刺激）は、ＴＩＬ拡大のための抗原刺激及び必要なサイトカインを提供することにより、このインビボ過程を模倣し得る。ポストＲＥＰ  ＴＩＬ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）は、ＲＥＰフラスコ内で抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し且つＴＩＬに架橋してＴＩＬが拡大するように刺激するフィーダーＭＮＣ上の膜受容体を介して活性化された。
【０３３８】
再刺激アッセイにおけるポストＲＥＰ腫瘍浸潤リンパ球の増殖／拡大
[00348]  ポストＲＥＰ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）ＴＩＬを同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）で再刺激した。７日目に生細胞をカウントして記録した。
【０３３９】
[00349]  一部の実施形態において、この手順はまた、現行のＲＥＰプロトコルの試験又はバリデーションにも適用することができる。
【０３４０】
【表３】
2019532652.tif 000005
【０３４１】
【表４】
2019532652.tif 000006
【０３４２】
【表５】
2019532652.tif 000007
【０３４３】
[00350]  インビボでのＴＩＬ生存及び拡大が促進されるように事前にリンパ球枯渇させた患者にポストＲＥＰ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）ＴＩＬを注入した。ＴＩＬが患者に再注入されると、ＴＩＬが抗原に遭遇し、ＴＩＬの活性化がもたらされたが、ＴＩＬは最終的に短命であった。ＡＣＴにおいてＴＩＬが抗原接触を介して再刺激されるとともに、併せてＩＬ−２に曝露されると、ＴＩＬ増殖及び腫瘍制御がもたらされ得るか、又は適切な共刺激がないことに起因してアポトーシスを介した消去（活性化誘導性細胞死）又は非増殖性（アネルギー）状態の誘導につながり得る。本発明者らの仮説は、同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞によるポストＲＥＰ  ＴＩＬの再刺激が、ＴＩＬ拡大のための抗原刺激及び必要なサイトカインを提供することにより、このインビボ過程を模倣するというものであった。ポストＲＥＰ  ＴＩＬは、ＲＥＰフラスコ内で抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し且つＴＩＬに架橋してＴＩＬが拡大するように刺激するフィーダーＭＮＣ上の膜受容体を介して活性化された。
【０３４４】
手順
[00351]  新鮮ポストＲＥＰ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）又は解凍した凍結ポストＲＥＰ（図１１に係るステップＤ後のＴＩＬ）ＴＩＬのいずれかをＣＭ１培地で１回洗浄した。２４ウェル組織培養プレートにＣＭ２中２×１０６個のＭＮＣフィーダー細胞、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３、１×１０４個のポストＲＥＰ  ＴＩＬ＋３，０００ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２でＲｅ−ＲＥＰ（図１１に係るステップＤの繰り返し）をセットアップした。５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターにおいて培養物を７日間インキュベートし終えた時点で、生細胞回収率及び生存率を決定した。生細胞数に基づきＴＩＬの拡大倍数を計算した。
ＲｅＲＥＰ−０日目
ＴＩＬを調製する
新鮮ポストＲＥＰ又は凍結ポストＲＥＰからＴＩＬを入手した。ＴＩＬ培養物をインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。次に、２００μｌを取り出し、Cellometer K2を使用して細胞をカウントした。カウントは記録した。
【０３４５】
フィーダー細胞を調製する
[00352]  このプロトコルには最低２０×１０６個のフィーダー細胞が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍｌバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有した。ＬＮ２貯蔵庫からの解凍時に５０％回収率と仮定すると、各ＲＥＰにつき推定１００×１０６個の生細胞を所与として、１ロット当たり少なくとも２バイアルのフィーダー細胞を解凍することが推奨された。フィーダー細胞の解凍前に、試験する各フィーダーロットにつき約５０ｍｌのＣＭ２をｒｈＩＬ−２不含で予め加温した。指定のフィーダーロットバイアルをＬＮ２貯蔵庫から取り出し、氷上に置いた。バイアルを組織培養室に移した。３７℃の水浴中でバイアルを解凍した。バイアルをＢＳＣに移し、７０％ＥｔＯＨ又はＩＰＡを噴霧するか、又はそれで拭き取った。ホールピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を直ちに５０ｍＬコニカルチューブ内の５０ｍＬの温ＣＭ２中に移した。２００μｌを取り出し、Cellometer K2を使用して細胞をカウントした。カウントは記録した。細胞を３５０×ｇで１０分間遠心した。温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２中２×１０６細胞／ｍｌで所望の容積の上清及び再懸濁細胞を吸引した。
【０３４６】
ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ作業溶液を調製する
[00353]  必要な条件について十分な量のＣＭ２を調製した。各ウェルには２ｍｌのＣＭ２が入っていた。各ウェルに、３０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含むＣＭ２を添加した。６×１０６ＩＵ／ｍＬのストックから、各１００ｍｌのＣＭ２につき５０μｌが必要であった。
【０３４７】
MACS（登録商標）GMP CD3 pure（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する
[00354]  ４℃の冷蔵庫からＯＫＴ３（１ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液を取り出した。ＲＥＰにおいては３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＯＫＴ３を使用した。各２４ウェル内の２ｍｌのＣＭ２培地につき６０ｎｇのＯＫＴ３が必要であった。ＴＩＬ＋フィーダー、ＴＩＬ単独及びフィーダー単独条件をトリプリケートで培養した。試験した各フィーダーロットについて、１μｇ／ｍｌ（１，０００ｎｇ／ｍｌ）の作業濃度につき１０００μｌの１：１０００希釈の１ｍｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３を作成した。９ウェルについて、１０００μｌの１：１０００希釈の１ｍｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３。１μｌ  １ｍｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３＋９９９μｌの３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２を作成した。
【０３４８】
２４ウェルプレートを調製し、共培養する
[00355]  試験する各ＲｅＲＥＰについて、２４ウェルプレートのうち９ウェルが必要であった。
【０３４９】
[00356]  各プレートに、実験名、フィーダーロット番号、ポストＲＥＰ  ＴＩＬ名、日付、及び作業者イニシャルの表示を付した。各プレートに表８に掲載する構成成分を充填した。各構成成分を加え、各ウェルに合計２ｍｌを充填し、プレートを３７℃のインキュベーターに置いた。１ｍｌピペットを使用してプレートを３回慎重に混合した。
【０３５０】
【表６】
2019532652.tif 000008
【０３５１】
培地交換−５日目
[00357]  ＣＭ２を３０００ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２で調製した。１０ｍｌが必要であった。各ウェルから１ｍｌの培地を取り出し、廃棄した。１ｍｌピペットで、３０００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２を含む１ｍｌの温ＣＭ２を各ウェルに移した。プレートをインキュベーターに戻した。
【０３５２】
回収−７日目
[00358]  １ｍｌ血清用ピペットを使用して各ウェルを混合することにより、細胞集塊を全て壊した。ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出し、Cellometer K2を使用して細胞をカウントした。ＴＩＬ＋フィーダー＋ＯＫＴ３、ＴＩＬ＋ＯＫＴ３、及びフィーダー＋ＯＫＴ３について、全ての条件をカウントし、記録した。
【０３５３】
[00359]  ２４ウェルＲｅＲＥＰに加えて、４つの直立Ｔ２５組織培養フラスコに、ＣＭ２中１．３×１０７個のＭＮＣフィーダー細胞、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３、０．６５×１０５個のプレＲＥＰ  ＴＩＬ＋３，０００ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２で別のｒｅＲＥＰをセットアップした。注記：「ＬＮ−１４４の迅速拡大培養プロトコルに関する照射同種異系フィーダー細胞の判定」（実施例６）を参照されたい。
【０３５４】
[00360]  機能アッセイへの細胞の割り付け：
【０３５５】
【表７】
2019532652.tif 000009
【０３５６】
判定／適合基準
【０３５７】
【表８】
2019532652.tif 000010
【０３５８】
参考手順−以下の実施例に含まれる
【０３５９】
【表９】
2019532652.tif 000011
【０３６０】
実施例２：Cellometer K2セルカウンターを使用したＴＩＬ培養物の細胞数及び生存率の決定
[00361]  本例は、Cellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンターの操作がどのように行われたかについての例示的説明を提供する。
【０３６１】
[00362]  適用範囲：細胞培養物の総細胞数及び生存率の決定。
【０３６２】
【表１０】
2019532652.tif 000012
【０３６３】
手順
細胞懸濁液調製
トリパンブルー調製
[00363]  最終トリパンブルー濃度は０．１％であった。製造者は０．２％のストック溶液を調製することを推奨した。Cellometer K2でトリパンブルーを使用するときは、ストック（０．４％）をＰＢＳで０．２％に希釈した。トリパンブルーは０．２〜０．４ミクロンフィルタでろ過し、少量ずつアリコートに分けて、表示を付したキャップ付きのチューブに入れた。細胞懸濁液を０．２％トリパンブルーと１：１で混合した。
【０３６４】
ＡＯＰＩ調製
[00364]  Cellometer K2でＡＯＰＩを使用するときは、ＡＯＰＩ溶液を入手した。細胞試料をＡＯＰＩ溶液によって１：１で染色した。注記：高濃度培養物をカウントする際は、トリパンブルー又はＡＯＰＩとの最終的な１：１希釈の前に細胞試料を細胞培養培地で希釈した。製造者の推奨するカウント範囲を使用して、使用するのに最良の希釈を決定した。
【０３６５】
Cellometer K2セットアップ
[00365]  Cellometer K2装置の電源を入れた。関連するコンピュータモニタ上でCellometer Image Cytometerアイコンを選択した。ソフトウェアのメイン画面上で、ドロップダウンボックスのリストにあるアッセイ（Assay）のうちの１つを選択した。適切なアッセイ（Assay）を選択すると、細胞型（Cell Type）及びイメージモード（Image Mode）が自動で取り込まれた。「試料（Sample）」セクションで、ユーザ／試料ＩＤを設定する（Set User/Sample ID）をクリックして、標本に作業者の情報を入力する別画面を開いた。「ユーザＩＤ（User ID）」を入力した。これはユーザの３文字のイニシャルからなった。「試料ＩＤ（Sample ID）」を入力した。試料ＩＤは、受け取った標本情報に基づいた。
【０３６６】
希釈パラメータをセットアップする
[00366]  １：１の混合を除いて他の希釈を行わなかった場合、希釈係数は２であった。最終的な１：１混合の前に希釈を行った場合、希釈係数は前の希釈の２倍であった。希釈係数は使用した混合物に応じて更新した。
【０３６７】
細胞カウント
[00367]  Cellometerカウントチャンバスライド（SD100）の両側からプラスチックの裏当て材を取り外し、清浄なリントフリーワイプの上に置いた。細胞懸濁液の調製後、試料の少量のアリコートを取り出し、マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに移した。試料の希釈時、希釈は細胞培養培地を使用して実施した。マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに２０μｌの細胞懸濁液を加えた。２０μｌの細胞懸濁液に２０μｌの０．２％トリパンブルー又はＡＯＰＩ溶液を加え、試料を完全に混合した。２０μｌの１：１溶液を測定し、それをカウントチャンバの片側に移した。注記：スライドの透明な領域には触れなかった。必要に応じて、試料をスライドの他方の側で繰り返した。Cellometerの前面にあるスロットにチャンバを挿入した。ＡＯＰＩ細胞カウントについては、メイン画面上で「プレビュー蛍光（Preview Fl）」を選択して緑色蛍光像（生細胞）画像をプレビューした。トリパンブルーカウントについては、「プレビュー明視野（Preview Brightfield）」を選択した。ピント合わせホイールを使用して画像の焦点を最適にした。細胞は明るい中心及びはっきりと画定された輪郭線を有した。「カウント（Count）」を選択してカウントプロセスを開始した。コンピュータ画面上のカウント結果のポップアップボックス内に結果が表示され、それがカウントプロセスの結果を示した。
【０３６８】
実施例３：Cellometer IC2 Image Cytometer自動セルカウンター
[00368]  本例は、Cellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンターの操作手順を説明する。
１．定義
μｌ  マイクロリットル
ＡＯＰＩ  アクリジンオレンジヨウ化プロピジウム（propidium iodine）
ＢＳＣ  生物学的安全キャビネット
ＤＰＢＳ  ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ｍｌ  ミリリットル
ＭＮＣ  単核血球
ＮＡ  該当なし
ＰＢＭＣ  末梢血単核球
ＰＰＥ  個人用防護装備
プレＲＥＰ  培養物の迅速拡大培養プロトコル前の初期ＴＩＬ培養
ＲＥＰ  迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ  腫瘍浸潤リンパ球
７．手順
７．１  細胞懸濁液調製
７．１．１  トリパンブルー調製
最終トリパンブルー濃度は０．１％であった。製造者は０．２％のストック溶液を調製することを推奨した。
７．１．１．１  Cellometer K2でトリパンブルーを使用するときは、ストック（０．４％）をＰＢＳで０．２％に希釈した。
７．１．１．２  トリパンブルーは０．２〜０．４ミクロンフィルタでろ過し、少量ずつアリコートに分けて、表示を付したキャップ付きのチューブに入れた。
７．１．１．３  細胞懸濁液を０．２％トリパンブルーと１：１で混合した。
７．１．２  ＡＯＰＩ調製
７．１．２．１  Cellometer K2でＡＯＰＩを使用するときは、ＡＯＰＩ溶液を入手した。
７．１．２．２  細胞試料をＡＯＰＩ溶液によって１：１で染色した。
注記：高濃度培養物をカウントする際は、トリパンブルー又はＡＯＰＩとの最終的な１：１希釈の前に細胞試料を細胞培養培地で希釈した。
製造者の推奨するカウント範囲を使用して、使用するのに最良の希釈を決定した。
７．２  Cellometer K2セットアップ
７．２．１  Cellometer K2装置の電源を入れた。
７．２．２  関連するコンピュータモニタ上でCellometer Image Cytometerアイコンを選択した。
７．２．３  ソフトウェアのメイン画面上で、ドロップダウンボックスのリストにあるアッセイ（Assay）のうちの１つを選択した。
７．２．３．１  適切なアッセイ（Assay）を選択すると、細胞型（Cell Type）及びイメージモード（Image Mode）が自動で取り込まれた。
７．２．３．２  「試料（Sample）」セクションで、ユーザ／試料ＩＤを設定する（Set User/Sample ID）を選択して、標本に作業者の情報を入力する別画面を開いた。
７．２．３．２．１  「ユーザＩＤ（User ID）」を入力した。
７．２．３．２．２  「試料ＩＤ（Sample ID）」を入力した。試料ＩＤは、受け取った標本情報に基づいた。
７．２．３．３  希釈パラメータをセットアップした。
７．２．３．３．１  １：１の混合を除いて他の希釈を行わなかった場合、希釈係数は２であった。
７．２．３．３．２  最終的な１：１混合の前に希釈を行った場合、希釈係数は前の希釈の２倍であった。
７．２．３．３．３  希釈係数は、画面の希釈セクションにおいて使用した混合物に応じて更新した。鉛筆のアイコンを選択してダイアログ画面を立ち上げた。
７．２．３．３．４  Ｆｌ画像（Fl Image）及びＦ２画像（F2 Image）セクションが互いに同じであることを確認した。
７．２．３．３．５  セットアップの完了後に「保存する（Save）」ボタンを選択した。
７．３  細胞カウント
７．３．１  Cellometerカウントチャンバスライド（SD100）の両側からプラスチックの裏当て材を取り外し、清浄なリントフリーワイプの上に置いた。
７．３．２  細胞懸濁液の調製後、試料の少量のアリコートを取り出し、マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに移した。
７．３．３  試料の希釈時、希釈は細胞培養培地を使用して実施した。
７．３．４  マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに２０μｌの細胞懸濁液を加えた。
７．３．５  ２０μｌの細胞懸濁液に２０μｌの０．２％トリパンブルー又はＡＯＰＩ溶液を加え、試料を完全に混合した。
７．３．６  ２０μｌの１：１溶液を測定し、それをカウントチャンバの片側に移した。
注記：スライドの透明な領域には触れなかった。
７．３．７  必要に応じて、試料をスライドの他方の側で繰り返した。７．３．８．Cellometerの前面にあるスロットにチャンバを挿入した。
７．３．８  ＡＯＰＩ細胞カウントについては、メイン画面上で「プレビュー蛍光（Preview Fl）」を選択して緑色蛍光像（生細胞）画像をプレビューした。トリパンブルーカウントについては、「プレビュー明視野（Preview Brightfield）」を選択した。
７．３．９  ピント合わせホイールを使用して画像の焦点を最適にした。細胞は明るい中心及びはっきりと画定された輪郭線を有した。
７．３．１０  「カウント（Count）」を選択してカウントプロセスを開始した。
７．３．１１  コンピュータ画面上のカウント結果のポップアップボックス内に結果が表示され、それがカウントプロセスの結果を示した。
【０３６９】
実施例４：ＩＬ−２ストック溶液の調製（CellGenix）
[00369]  本例は、ＩＬ−２ストック溶液の例示的調製手順について説明する。
【０３７０】
[00370]  定義／略称
μＬ：マイクロリットル又はμｌ
ＢＳＣ：生物学的安全キャビネット
ＢＳＬ２：バイオセーフティレベル２
Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
Ｇ：ゲージ
ＧＭＰ：医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（Good Manufacturing Processing）
ＨＡｃ：酢酸
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ｍＬ：ミリリットル
ＮＡ：該当なし
ＰＰＥ：個人用防護装備
ｒｈＩＬ−２；ＩＬ−２：組換えヒトインターロイキン−２
ＣＯＡ：分析証明書
６．手順
６．１  ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。
６．１．１  ２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。
６．１．２  ５０ｍＬコニカルチューブに１ｍＬ  １Ｎ酢酸を加えた。
６．１．３  チューブを２〜３回反転させることにより十分に混合した。
６．１．４  Steriflipフィルタを使用してろ過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した。
６．１．５  キャップを閉め、日付を付し、溶液に「滅菌０．２％酢酸溶液」の表示を付した。
６．１．６  溶液は２ヵ月後に期限切れとした。室温で貯蔵した。
６．２  ＰＢＳ中１％ＨＳＡを調製した。
６．２．１  １５０ｍＬ滅菌フィルタユニット内の９６ｍＬ  ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。
６．２．２  溶液をろ過した。
６．２．３  キャップを閉め、日付を付し、溶液に「ＰＢＳ中１％ＨＳＡ」の表示を付した。
６．２．４  溶液は２ヵ月後に期限切れとした。４℃で貯蔵した。
６．３  調製したｒｈＩＬ−２の各バイアルについて、資料を作成した。
６．４  ｒｈＩＬ−２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した
６．４．１  ｒｈ１Ｌ−２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：
６．４．１．１  バイアル１本当たりのｒｈＩＬ−２の質量（ｍｇ）
６．４．１．２  ｒｈＩＬ−２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）
６．４．１．３  推奨される０．２％ＨＡｃ再構成容積（ｍＬ）
６．４．２  ｒｈＩＬ−２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した：
【数１】
2019532652.tif 000013
６．４．２．１  例えば、CellGenixのｒｈＩＬ−２ロット１０２００１２１  ＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ｌＵ／ｍｇであった。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ−２を再構成することが推奨されている。
【数２】
2019532652.tif 000014
６．４．３  ＩＬ−２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。
６．４．４  ３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。
６．４．５  バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。
６．４．６  栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。
６．４．７  計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
６．４．８  バイアルにゴム栓をした。
６．５  ｒｈＩＬ−２溶液の貯蔵
６．５．１  短期貯蔵（＜７２時間）については、バイアルを４℃で貯蔵した。
６．５．２  長期貯蔵（＞７２時間）については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで−２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後に期限切れとした。
６．５．３  ｒｈ−ＩＬ−２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
【０３７１】
実施例５：プレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス用の培地調製
[00371]  本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌、及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。多くの場合、本願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用した。
【０３７２】
[00372]  定義
μｇ  マイクログラム
μｍ  マイクロメートル
μＭ  マイクロモル濃度
AIM-V（登録商標）  無血清組織培養培地（Thermo Fisher Scientific）
ＢＳＣ  生物学的安全キャビネット
ＣＭ１  完全培地＃１
ＣＭ２  完全培地＃２
ＣＭ３  完全培地＃３
ＣＭ４  完全培地＃４
ＩＵ又はＵ  国際単位
ｍｌ  ミリリットル
ｍＭ  ミリモル濃度
ＮＡ  該当なし
ＰＰＥ  個人用防護装備
プレＲＥＰ  プレ迅速拡大培養プロセス
ＲＥＰ  迅速拡大培養プロセス
ｒｈＩＬ−２、ＩＬ−２  組換えヒトインターロイキン−２
ＲＰＭＩ１６４０  ロズウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute）培地、配合１６４０
ＳＯＰ  標準実施要領
ＴＩＬ  腫瘍浸潤リンパ球
７．手順
７．１  手順は全て、ＢＳＣ（クラスＩＩ、タイプＡ２）において無菌法を用いて行った。
７．１．１  使用前にフードの表面に７０％エタノールを噴霧した。
７．１．２  物品及び試薬は全て、組織培養フード内に置く前に７０％エタノールを噴霧した。
７．２  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミンのアリコート分注
７．２．１  Ｌ−グルタミンは、血清の調製に必要なよりも大きい容積で供給された（例えば、１００ｍｌ又は５００ｍｌ容積）。
７．２．２  Ｌ−グルタミンのボトルを３７℃の水浴中で解凍した。
７．２．３  Ｌ−グルタミンは解凍後に沈殿するため、解凍後、Ｌ−グルタミンを十分に混合した。アリコートに分ける前に、沈殿物が全て溶液に戻ったことを確実にする。
７．２．４  Ｌ−グルタミンの５〜１０ｍｌアリコートを滅菌１５ｍｌコニカルチューブに入れた。
７．２．５  チューブに、濃度、販売業者、ロット番号、アリコート分注日、及び有効期限の表示を付す。
７．２．６  チューブは−２０℃で貯蔵し、必要に応じて培地調製のため抜き取った。
７．３  ＣＭ１の調製
７．３．１  低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：
７．３．１．１  ＲＰＭＩ１６４０
７．３．１．２  ヒトＡＢ血清
７．３．１．３  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン
７．３．２  ４℃の貯蔵庫からＢＭＥを取り出し、組織培養フードに置いた。
７．３．３  ゲンタマイシンストック溶液を室温貯蔵庫から組織培養フードに入れた。
７．３．４  以下の表１に従い、ろ過される容積に適切な０．２μｍフィルタユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。
【０３７３】
【表１１】
2019532652.tif 000015
【０３７４】
７．３．５  ＣＭ１培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。必要に応じて培地をアリコートに分け、少容量ボトルに入れた。
７．３．６  残ったＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、又はＬ−グルタミンは全て、次回の培地調製まで４℃で貯蔵した。
７．３．７  ＢＭＥのストックボトルは４℃の貯蔵庫に戻した。
７．３．８  ゲンタマイシンのストックボトルはその適切な室温貯蔵場所に戻した。
７．３．９  培地の緩衝能力は限られているため、ＣＭ１は調製後２週間以内に、又はフェノールレッドｐＨ指示薬がｐＨの極端なシフトを示したこと（明るい赤色乃至ピンクの呈色）に伴い廃棄した。
７．３．１０  使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で加温し、６０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を加えた。
７．３．１１  追加的な添加−必要に応じたもの
７．３．１１．１  ＣＭ１にGlutaMAX（登録商標）を添加した
７．３．１１．１．１  ２ｍＭグルタミン（最終濃度、表２を参照）の代わりに２ｍＭのGlutaMAX（商標）を用いることによりＣＭ１を調製した。それが終わったら、標準配合のＣＭ１との混同を防ぐため、培地ボトルに「２ｍＭ  GlutaMAX」を追加して表示を付した。
７．３．１１．２  ＣＭ１に追加の抗生物質／抗真菌薬を添加した
７．３．１１．２．１  一部のＣＭ１配合物は、ある種の腫瘍型から成長させるプレＲＥＰ  ＴＩＬの汚染を防ぐため、追加的な抗生物質又は抗真菌薬が必要であった。
７．３．１１．２．２  以下の表２に示す最終濃度となるように抗生物質／抗真菌薬を加えた。
７．３．１１．２．３  終わったら、標準配合のＣＭ１との混同を防ぐため、追加的な抗生物質／抗真菌薬の名前を追加することにより培地ボトルに表示を付した。
【０３７５】
【表１２】
2019532652.tif 000016
【０３７６】
８．１  ＣＭ２の調製
８．１．１  冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出した、又は上記の実施例に従い新鮮ＣＭ１を調製する。
８．１．２  冷蔵庫からAIM-V（登録商標）を取り出した。
８．１．３  滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合することにより、必要な量のＣＭ２を調製した。
８．１．４  使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を加えた。
８．１．５  使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２を作成した。
８．１．６  ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。必要に応じて培地をアリコートに分け、少容量ボトルに入れた。
８．１．７  ＩＬ−２を含まないＣＭ２は全て冷蔵庫に戻し、そこで最長２週間にわたり、又はフェノールレッドｐＨ指示薬がｐＨの極端なシフト（明るい赤色乃至ピンクの呈色）を示すまで貯蔵した。
８．２  ＣＭ３の調製
８．２．１  使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。
８．２．２  ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した。
８．２．３  AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２」の表示を付した。過剰なＣＭ３がある場合、培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日、及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。
８．２．４  ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
８．３  ＣＭ４の調製
８．３．１  ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。
８．３．１．１  １ＬのＣＭ３につき１０ｍｌの２００ｍＭ  GlutaMAX（商標）を加えた。
８．３．２  AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。
８．３．３  AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＬ／ｎｉｌ  ＩＬ−２及びGlutaMAX」の表示を付した。
８．３．４  過剰なＣＭ４がある場合、培地名、「GlutaMAX」、調製者のイニシャル、培地の調製日、及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。
８．３．５  ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
【０３７７】
実施例６：ＬＮ−１４４の迅速拡大培養プロトコルに関する照射同種異系フィーダー細胞の判定
[00373]  本実施例は、γ線照射した末梢単核球（ＰＢＭＣ、別名ＭＮＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
【０３７８】
[00374]  各照射ＭＮＣフィーダーロットは個別のドナーから調製した。精製抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下におけるＲＥＰでＴＩＬを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットをＴＩＬを加えずに試験して、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
定義
・ＡＯＰＩ−アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム（propidum iodide）
・ＢＳＣ−生物学的安全キャビネット
・ＣＤ３−分化クラスター３；Ｔリンパ球の表面マーカータンパク質
・ＣＦ−遠心力
・ＣＭ１−ＴＩＬ用の完全培地、＃１
・ＣＭ２−ＴＩＬ用の完全培地、＃
・ＣＭＯ−医薬品製造受託機関
・ＣＯ２−二酸化炭素
・ＥｔＯＨ−エチルアルコール
・ＧＭＰ−医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
・Ｇｙ−グレイ
・ＩＬ−２−インターロイキン２
・ＩＵ−国際単位
・ＬＮ２−液体窒素
・ミニＲＥＰ−ミニ迅速拡大培養プロトコル
・ｍｌ−ミリリットル
・ＭＮＣ−単核球
・ＮＡ−該当なし
・ＯＫＴ３−MACS GMP CD3 pure（クローンＯＫＴ３）抗体
・ＰＰＥ−個人用防護装備
・プレＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル前
・ＱＳ−適量；この量まで充填
・ＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル
・ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球
・Ｔ２５−２５ｃｍ２組織培養フラスコ
・μｇ−マイクログラム
・μｌ−マイクロリットル
【０３７９】
装置、ソフトウェア、材料
[00375]  装置
・ＢＳＣ（生物学的安全キャビネット）
・液体窒素フリーザー
・温度制御水浴
・スイングバケットロータ付き遠心機
・加湿組織培養インキュベーター
・ピペットエイド（Pipet Aid）
・２〜２０μｌピペッター
・２０〜２００μｌピペッター
・１００〜１０００μｌピペッター
・自動セルカウンター
【０３８０】
[00376]  材料
・１５ｍｌコニカル遠心管、滅菌
・５０ｍｌコニカル遠心管、滅菌
・ＣＭ１
・ＣＭ２
・AIM V Medium CTS（治療用グレード）
・細胞対比染色溶液
・ＩＬ−２
・MACS GMP CD3 pure（クローンＯＫＴ３）抗体
・滅菌ディスポーザブル血清用ピペット
・滅菌ディスポーザブルホールピペット
・滅菌ピペットチップ
・２４ウェル組織培養プレート
・Ｔ２５フラスコ（Greiner  ＃６９０１７５）
・５．３．１４．ジッパー式貯蔵用バッグ
【０３８１】
手順
背景
[00377]  ＴＩＬ拡大培養のＲＥＰ（ステップＤ）には、γ線照射した増殖が止まったＭＮＣフィーダー細胞が必要であった。ＲＥＰ（ステップＤ）フラスコ内でフィーダーＭＮＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、及びＧＭＰ条件下で凍結保存した。
【０３８２】
[00378]  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受ける患者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要であった。従って、フィーダー細胞は、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＭＮＣ細胞が細胞生存能力を失うことにより、増殖が止められた。
【０３８３】
判定基準及び実験セットアップ
[00379]  フィーダーロットを２つの基準に関して判定した：１）共培養においてＴＩＬを＞１００倍に拡大するその能力、及び２）その複製不能性。
【０３８４】
[00380]  直立Ｔ２５組織培養フラスコ内で成長させた２つの初代プレＲＥＰ  ＴＩＬ株を利用するミニＲＥＰフォーマットでフィーダーロットを試験した。各ＴＩＬ株がＲＥＰにおいて活性化に応答して増殖するその能力はユニークであったため、フィーダーロットは２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。対照として、１）及び２）の基準：（１）共培養においてＴＩＬを＞１００倍に拡大するその能力、及び（２）その複製不能性、に適合することが歴史的に示されている照射ＭＮＣフィーダー細胞のロットを試験ロットと並行して実行した。
【０３８５】
[00381]  単一の実験で試験した全てのロットが等価な試験を受けることを確実にするため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレＲＥＰ  ＴＩＬ株の十分なストックを使用した。試験したフィーダー細胞の各ロットにつき、合計６つのＴ２５フラスコがあった：
・プレＲＥＰ  ＴＩＬ株＃１（２フラスコ）
・プレＲＥＰ  ＴＩＬ株＃２（２フラスコ）
・フィーダー対照（２フラスコ）
・注記：ＴＩＬ株＃１及び＃２が入ったフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡大させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
【０３８６】
実験プロトコル
−２／３日目、ＴＩＬ株の解凍
[00382]  実施例５、プレＲＥＰ及びＲＥＰ培地調製に従いＣＭ２培地を調製した。３７℃の水浴中でＣＭ２を加温した。３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した４０ｍｌのＣＭ２を調製した。使用時まで保温した。使用したＴＩＬ株の名前の表示を付した２つの５０ｍｌコニカルチューブの各々に、ＩＬ−２を含まない２０ｍｌの予め加温したＣＭ２を入れた。ＬＮ２貯蔵庫から２つの指定のプレＲＥＰ  ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。ＴＩＬ株識別フォームを記録した。残りの氷が少量になるまでバイアルを３７℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。解凍したバイアルは７０％エタノールを噴霧するか、又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移した。滅菌ホールピペットを使用してバイアルの内容物を直ちに表示を付した調製済み５０ｍｌコニカルチューブ内の２０ｍｌのＣＭ２中に移した。ＩＬ−２を含まないＣＭ２を使用して４０ｍｌまでＱＳ（この量まで充填）して細胞を洗浄した。４００×ＣＦで５分間遠心した。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した５ｍｌの温ＣＭ２に再懸濁した。少量のアリコート（２０μｌ）をデュプリケートで取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントは記録した。カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。細胞濃度を決定し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＣＭ２でＴＩＬを１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。加湿した３７℃インキュベーター内で必要に応じた数のウェルにおいて２４ウェル組織培養プレートのウェル当たり２ｍｌでミニＲＥＰの０日目まで培養した。混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるＴＩＬ株は別個の２４ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
【０３８７】
０日目、ミニＲＥＰを開始する
[00383]  試験するフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍｌのＣＭ２培地を調製する）。実施例５で調製したＣＭ２の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、５００ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２培地を調製する）。ＩＬ−２を含まない残りのＣＭ２は、以下に記載するとおり細胞の洗浄に使用した。
【０３８８】
ＴＩＬを調製した
７．３．２．４．各ＴＩＬ株を別々に作業して交差汚染を防ぎながら、ＴＩＬ培養物が入った２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。
７．３．２．５．滅菌ホールピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、使用するＴＩＬの各ウェルから約１ｍｌの培地を取り出し、２４ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。これは洗浄ウェルに使用した。
７．３．２．６．新鮮な滅菌ホールピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、ウェル内で残りの培地をＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次にＴＩＬ名が表示された５０ｍｌコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
７．３．２．７．確保しておいた培地でウェルを洗浄し、その容積を同じ５０ｍｌコニカルチューブに移した。
７．３．２．８．細胞を４００×ＣＦでスピンして細胞ペレットを収集した。
７．３．２．９．培地上清を吸引して取り除き、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する２〜５ｍｌのＣＭ２培地中に細胞ペレットを再懸濁した；使用した容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づいた−容積は＞１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度を確保するのに十分であった。
７．３．２．１０．血清用ピペットを使用して、細胞懸濁液を完全に混合し、容積を記録した。
７．３．２．１１．２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．３．２．１２．カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿された５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターに置いた。
７．３．２．１３．カウントを記録した。
７．３．２．１４．ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した温ＣＭ２中にそれらの細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
７．３．２．１５  必要に応じて、元の２４ウェルプレートは残りのＴＩＬの再培養用にそのままにしておいた。
７．３．２．１６．第２のＴＩＬ株についてステップ７．３．２．４〜７．３．２．１５を繰り返した。
７．３．２．１７．実験用のＴ２５フラスコにＴＩＬをプレーティングする直前に、ＴＩＬは以下のステップ７．３．２．３５に従い１．３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度に１：１０希釈した。
【０３８９】
MACS GMP CD3 pure（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する
７．３．２．１８．４℃の冷蔵庫からＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を取り出し、ＢＳＣに置いた。
７．３．２．１９．ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。
７．３．２．２０．実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍｌにつき６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であった；これは各２０ｍｌにつき６０μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液、又は各フィーダーロットについて試験する６つ全てのフラスコにつき３６０μｌの相当量である。
７．３．２．２１．試験する各フィーダーロットについて、１０μｇ／ｍｌの作業濃度に対して４００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３を作成した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、１６００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３：１６μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３＋１．５８４ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２培地を作成した）。
【０３９０】
Ｔ２５フラスコを調製する
７．３．２．２２．各フラスコに、試験したＴＩＬ株の名前、フラスコレプリケート番号、フィーダーロット番号、日付、及び分析者のイニシャルの表示を付した。
７．３．２．２３．フィーダー細胞を調製する前にフラスコにＣＭ２培地を充填した。
７．３．２．２４．フラスコを３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。
７．３．２．２５．フィーダー細胞を調製し終えたら、以下の表１４、フラスコのセットアップに示されるとおり各フラスコ内のＣＭ２に構成成分を加えた。
【０３９１】
【表１３】
2019532652.tif 000017
【０３９２】
フィーダー細胞を調製した
７．３．２．２６．本プロトコルについては、試験したロット当たり最低７８×１０６個のフィーダー細胞が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍｌバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有した。ＬＮ２貯蔵庫からの解凍時に５０％回収率と仮定すると、各ＲＥＰにつき推定１００×１０６個の生細胞を所与として、ロット当たりフィーダー細胞の１ｍｌバイアルを少なくとも２本解凍することが推奨された。或いは、１．８ｍｌバイアルで供給される場合、１本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供されるであろう。
７．３．２．２７．フィーダー細胞の解凍前に、試験しようとする各フィーダーロットにつき約５０ｍｌのＩＬ−２不含ＣＭ２を予め加温した。
７．３．２．２８．ＬＮ２貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。バイアルを組織培養室に移した。
７．３．２．２９．３７℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。
７．３．２．３０．ジッパー式バッグからバイアルを取り出し、７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移した。
７．３．２．３１．ホールピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌの温ＣＭ２中に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。
７．３．２．３２．４００×ＣＦで５分間遠心した。
７．３．２．３３．上清を吸引し、４ｍｌ温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２に再懸濁した。
７．３．２．３４．２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
７．３．２．３５．細胞を温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２中に１．３×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０３９３】
共培養をセットアップする
７．３．２．３６．ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。交差汚染を防ぐため、各ＴＩＬ株は独立に作業した。
７．３．２．３６．１．１５ｍｌコニカルチューブに４．５ｍｌのＣＭ２培地を加えた。
７．３．２．３６．２．インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍｌ血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。
７．３．２．３６．３．１．３×１０６細胞／ｍｌ  ＴＩＬ懸濁液から０．５ｍｌの細胞を取り出し、１５ｍｌコニカルチューブ内の４．５ｍｌの培地に加えた。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。
７．３．２．３６．４．十分に混合した。
７．３．２．３６．５．第２のＴＩＬ株についてステップ７．３．２．３６．１〜７．３．２．３６．４を繰り返した。
７．３．２．３６．６．１回に２つ以上のフィーダーロットを試験する場合、各フィーダーロットについてＴＩＬのプレーティング直前にＴＩＬをより低い濃度に希釈した。
７．３．２．３７．単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからＢＳＣに移した。
７．３．２．３８．１ｍｌピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、１ｍｌ（１．３×１０７細胞）を当該のフィーダーロットの各フラスコに移した。
７．３．２．３９．各フラスコに６０μｌのＯＫＴ３作業ストック（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。
７．３．２．４０．２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
７．３．２．４１．１ｍｌ（１．３×１０５）の各ＴＩＬロットを対応する表示のＴ２５フラスコに移した。
７．３．２．４２．フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。５日目まで手を加えなかった。
７．３．２．４３．試験した全てのフィーダーロットについて７．３．２．３６〜７．３．２．４２を繰り返した。
【０３９４】
７．３．３．５日目、培地を交換した。
７．３．３．１．３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含むＣＭ２を調製した。各フラスコにつき１０ｍｌが必要である。
７．３．３．２．交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、及びフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．３．３．フラスコから１０ｍｌの培地を静かに取り出し、廃棄した。
７．３．３．４．対照フラスコを含む全てのフラスコについて繰り返した。
７．３．３．５．１０ｍｌピペットで、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む１０ｍｌ温ＣＭ２を各フラスコに移した。
７．３．３．６．フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立でインキュベートした。
７．３．３．７．試験した全てのフィーダーロットについて７．３．３．１〜７．３．３．６を繰り返した。
【０３９５】
７．３．４．７日目、回収する
７．３．４．１．交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。
７．３．４．２．インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、及びフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．４．３．フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍｌの培地、及び対照フラスコの各々から１５ｍｌの培地を取り出した。
７．３．４．４．１０ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。
７．３．４．５．７日目に各フラスコの容積を記録した。
７．３．４．６．ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。
７．３．４．７．適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。
７．３．４．８．７日目のカウントを記録した。
７．３．４．９．試験した全てのフィーダーロットについて７．３．４．１〜７．３．４．８を繰り返した。
７．３．４．１０．図２に挙げる基準に従い、フィーダー対照フラスコについて複製不能性を判定し、及びＴＩＬが入ったフラスコについて０日目からの拡大倍数を判定した。
【０３９６】
７．３．５．７日目、１４日目までのフィーダー対照フラスコの継続
７．３．５．１．７日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各々に、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する新鮮ＣＭ２培地１５ｍｌを加えた。
７．３．５．２．対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。
【０３９７】
７．３．６．１４日目、フィーダー対照フラスコの非増殖の延長
７．３．６．１  交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。
７．３．６．２  インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、及びフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．６．３．フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約１７ｍｌの培地を取り出した。
７．３．６．４．５ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。
７．３．６．５．各フラスコの容積を記録した。
７．３．６．６．ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。
７．３．６．７．適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。
７．３．６．８．１４日目のカウントを記録した。
７．３．６．９．試験した全てのフィーダーロットについて、７．３．４．１〜７．３．４．８を繰り返した。
【０３９８】
予想される結果及び適合基準
予想される結果
[00384]  ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、また、０日目と比較してＲＥＰ培養の７日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
【０３９９】
[00385]  全てのフィーダーロットが、ＲＥＰ培養の７日目までにＴＩＬ成長の１００倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
【０４００】
[00386]  フィーダー対照フラスコの１４日目のカウントは、７日目に見られた非増殖傾向が続くものと予想された。
【０４０１】
適合基準
[00387]  フィーダー細胞の各ロットについて試験した各レプリケートＴＩＬ株は、以下の適合基準を満たさなければならなかった。
【０４０２】
以下のとおり（図２、適合基準に概説する）、適合は二重であった：
[00388]  ３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で培養したとき放射線量がＭＮＣフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。
【０４０３】
[00389]  複製不能かどうかは、ＲＥＰの７日目及び１４日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数（ＴＶＣ）によって判定した。
【０４０４】
[00390]  適合基準は「成長なし」であり、これは、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加していなかったことを意味する。
【０４０５】
フィーダー細胞がＴＩＬ拡大培養を支持する能力を判定する
[00391]  ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の拡大倍数の点でＴＩＬ成長を測定した。
【０４０６】
[00392]  ７日目、自動細胞カウントによって判定したとき、ＴＩＬ培養物は最低でも１００倍の拡大（即ち、ＲＥＰ  ０日目に培養を開始した総ＴＩＬ生細胞数の１００倍より多い）を実現した。
【０４０７】
[00393]  上記のこれら２つの基準に適合しなかったＭＮＣフィーダーロットは、典型的には除外された。
【０４０８】
[00394]  適合基準を満たすが、当業者が判断するとき、同じプレＲＥＰ  ＴＩＬ株で並行して試験したそれまでの他のフィーダーロットと比べてＴＩＬの拡大培養能力に関して性能が低いと判断される任意のＭＮＣフィーダーロットは、除外された可能性がある。使用した適合基準については、以下の表１５を参照のこと。
【０４０９】
【表１４】
2019532652.tif 000018
【０４１０】
[00395]  ３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で培養したとき放射線量がＭＮＣフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。
１０．２．２．１．１  複製不能かどうかは、ＲＥＰの７日目及び１４日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数（ＴＶＣ）によって判定した。
１０．２．２．１．２  適合基準は「成長なし」であったが、これは、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味した。
１０．２．２．２  フィーダー細胞がＴＩＬ拡大培養を支持する能力を判定した。
１０．２．２．２．１  ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の拡大倍数の点でＴＩＬ成長を測定した。
１０．２．２．２．１  ７日目、自動細胞カウントによって判定したとき、ＴＩＬ培養物は最低でも１００倍の拡大（即ち、ＲＥＰ  ０日目に培養を開始した総ＴＩＬ生細胞数の１００倍より多い）を実現した。
１０．２．２．３  ロットが上記の２つの基準に適合しなかった場合、そのロットは、以下のセクション１０．３に概説するコンティンジェンシープランに従い再試験した。
１０．２．２．４  不適合ロットの再試験後、当初の判定及びコンティンジェンシーテストの両方で２つの適合基準を満たさなかったＭＮＣフィーダーロットはいずれも除外した。
１０．２．２．５  適合基準を満たしたが、同じプレＲＥＰ  ＴＩＬ株で並行して試験したそれまでの他のフィーダーロットと比べてＴＩＬの拡大培養能力に関して性能が低いと判断されたＭＮＣフィーダーロットはいずれも適宜除外した。
【０４１１】
[00396]  適合基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットのコンティンジェンシーテスト
１０．３．１  ＭＮＣフィーダーロットが上記のセクション１０．２に概説される適合基準のいずれかを満たした場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。
１０．３．２  ロットのサテライトの（satellite）試験バイアルが２つ以上残っていた場合、そのロットを再試験することができた。ロットのサテライトの試験バイアルが１つ残っているか又は残っていなかった場合、上記のセクション１０．２に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
１０．３．３  問題のロットを判定した当初の人を含め、２人の訓練された担当者が、両者ともロットを同時に試験しなければならなかった。
１０．３．４  セクション７．２〜７．３の繰り返しを行い、問題のロットを再判定した。
１０．３．５  各自が問題のロット並びに対照ロット（上記のセクション７．２．４に定義されるとおり）を試験することになり得た。
１０．３．６  適格とされるには、コンティンジェンシーテストを行う担当者の両方について、問題のロット及び対照ロットがセクション１０．２の適合基準を達成しなければならなかった。
１０．３．７  これらの基準に適合すると、次にはそのロットは、上記のセクション１０．２に概説したとおりのＣＭＯ使用にリリースすることができた。
【０４１２】
実施例７：γ線照射末梢血単核球の個々のロットの適格性を判定するための手順
[00397]  本実施例は、γ線照射末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用ＴＩＬロットの生産における使用に関する照射ＰＢＭＣ細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射ＰＢＭＣロットを調製した。１００を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、ＳＤＢＢ（サンディエゴ血液バンク（San Diego Blood Bank））からの照射ＰＢＭＣロットはＲＥＰの７日目にＴＩＬを＞１００倍に拡大し得ることが示されている。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するためなおも試験しなければならないＳＤＢＢからの照射ドナーＰＢＭＣロットに適用することが意図される。それが１４日間にわたって複製不能を維持することが実証されたら、ドナーＰＢＭＣロットは、臨床用ＴＩＬロットの生産への使用に「適格である」と見なした。
【０４１３】
[00398]  キーワード及び定義
μｇ−マイクログラム
μｌ−マイクロリットル
AIM-V−市販の細胞培養培地、生物学的安全キャビネット
ＢＳＣ−分化クラスター
ＣＤ−ＴＩＬ用の完全培地＃２
ＣＭ２−３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加したＣＭ２
ＣＭ２ＩＬ２−医薬品製造受託機関
ＣＯ２−二酸化炭素
ＥｔＯＨ−エタノール
ＧＭＰ−医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
Ｇｙ−グレイ
ＩＬ−インターロイキン
ＩＵ−国際単位
ＬＮ２−液体窒素
ＭＩ−ミリリットル
ＮＡ−該当なし
ＯＫＴ３−抗ＣＤ３モノクローナル抗体名
Ｐ２０−２〜２０μｌピペッター
Ｐ２００−２０〜２００μｌピペッター
ＰＢＭＣ−末梢血単核球
Ｐ１０００−１００〜１０００μｌピペッター
ＰＰＥ−個人用防護装備
ＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル
ＳＤＢＢ−サンディエゴ血液バンク（San Diego Blood Bank）
ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球
Ｔ２５−２５ｃｍ２組織培養フラスコ
×ｇ−「重力の〜倍」−相対遠心力の尺度
【０４１４】
[00399]  標本には照射ドナーＰＢＭＣ（ＳＤＢＢ）が含まれた。
手順
背景
７．１．１  ＴＩＬの現行の標準ＲＥＰには、γ線照射した増殖が止まったＰＢＭＣが必要であった。培養下でＰＢＭＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。ＰＢＭＣロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、及びＧＭＰ条件下で凍結保存した。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受ける患者が生細胞ＰＢＭＣを注入されないことが重要である。従ってドナーＰＢＭＣは、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＰＢＭＣが細胞生存能力を失うことにより、増殖が止められた。
判定基準
７．２．１  照射ＰＢＭＣロットの判定基準はその複製不能性であった。
実験セットアップ
７．３．１  直立Ｔ２５組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをＴＩＬと共培養したかのようにミニＲＥＰフォーマットで試験した。
７．３．１．１  対照ロット：歴史的に７．２．１の基準に適合することが示されている照射ＰＢＭＣの１つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。
７．３．２  試験する照射ドナーＰＢＭＣの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
【０４１５】
実験プロトコル
[00400]  本プロトコルにおける全ての組織培養作業は、ＢＳＣにおいて無菌法を用いて行った。
０日目
７．４．１  試験しようとするドナーＰＢＭＣの各ロットにつき約９０ｍｌのＣＭ２培地を調製した。ＣＭ２は３７℃の水浴中に保温した。
７．４．２  ６×１０６ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２のアリコートを解凍した。
７．４．３  ＣＭ２培地をＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。試験するＰＢＭＣの各ロットについて、約６０ｍｌのＣＭ２を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した６×１０６ＩＵ／ｍｌストック溶液からのＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「ＣＭ２／ＩＬ２」（又は類似）の表示を付して、それを無添加のＣＭ２と区別した。
７．４．４  試験しようとするＰＢＭＣの各ロットにつき２つのＴ２５フラスコに表示を付した。表示には最低限、以下が含まれた：
７．４．４．１  ロット番号
７．４．４．２  フラスコ番号（１又は２）
７．４．４．３  培養開始日（０日目）
ＯＫＴ３を調製した
７．４．５  ４℃の冷蔵庫から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のストック溶液を取り出し、ＢＳＣに置いた。
７．４．６  ミニＲＥＰの培地には、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３の最終濃度を用いた。
７．４．７  １ｍｇ／ｍｌストック溶液からの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の１０μｇ／ｍｌ作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
７．４．７．１  試験する各ＰＢＭＣロットにつき、１５０μｌの１：１００希釈の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ストックを調製した。
例えば、１回に４つのＰＢＭＣロットを試験するには、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した５９４μｌのＣＭ２に６μｌの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を加えることにより、６００μｌの１０μ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を調製した。
フラスコを調製した
７．４．８  表示を付したＴ２５フラスコに、フラスコ当たり１９ｍｌのＣＭ２／ＩＬ−２を加え、細胞を調製する間、フラスコを３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。
照射ＰＢＭＣを調製した
７．４．９  ロットの潜在的な交差汚染を防ぐため、ドナーＰＢＭＣロット毎に個別に作業した。
７．４．１０  試験しようとするＰＢＭＣロットのバイアルをＬＮ２貯蔵庫から取り出した。それらのバイアルは解凍時まで−８０℃に置くか、又はドライアイス上に保った。
７．４．１１  解凍しようとする各ロットにつき３０ｍｌのＣＭ２（ＩＬ−２の添加なし）を５０ｍｌコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍しようとするＰＢＭＣの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップをしっかりと閉めて３７℃の水浴中に置いた。必要に応じて、５０ｍｌコニカルチューブをＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。
７．４．１２  低温貯蔵庫からバイアルＰＢＭＣを取り出し、３７℃の水浴中のフローティングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。
７．４．１３  解凍したバイアルは７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、ＢＳＣに移した。
７．４．１４  滅菌ホールピペットを使用して、バイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌのＣＭ２中に直ちに移した。チューブから約１ｍｌの培地を取り出してバイアルをリンスした；リンス液を５０ｍｌコニカルチューブに戻した。キャップをしっかりと閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
７．４．１５  室温において４００×ｇで５分間遠心した。
７．４．１６  上清を吸引し、１０００μｌピペットチップを使用して１ｍｌの温ＣＭ２／ＩＬ−２中に細胞ペレットを再懸濁した。或いは、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、ＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用して容積を４ｍｌにした。容積を記録した。
７．４．１７  少量のアリコート（例えば１００μｌ）を取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．４．１７．１  カウントは、詳細な自動セルカウンターＳＯＰに基づきデュプリケートで実施した。多くの場合に、細胞カウントの実施前にＰＢＭＣの希釈を実施する必要があった。推奨される出発希釈は１：１０であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて変わり得た。
７．４．１７．２  カウントを記録した。
７．４．１８  ステップ７．４．１５．２に従いＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用してＰＢＭＣの濃度を１．３×１０７細胞／ｍｌに調整した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
培養フラスコをセットアップした
７．４．１９  ２つの表示を付したＴ２５フラスコを組織培養インキュベーターからＢＳＣに戻した。
７．４．２０  抗ＣＤ３／ＯＫＴ３の１０μ／ｍｌバイアルをＢＳＣに戻した。
７．４．２１  各フラスコに１ｍｌの１．３×１０７  ＰＢＭＣ細胞懸濁液を加えた。
７．４．２２  各フラスコに６０μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３／ＯＫＴ３を加えた。
７．４．２３  キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく１４日間成長させた。
７．４．２４  次のロットに必要になるまで抗ＣＤ３／ＯＫＴ３バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。
７．４．２５  判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．９〜７．４．２４を繰り返した。
１４日目、ＰＢＭＣの非増殖性の測定
７．４．２６  ロット毎に独立に作業して、デュプリケートＴ２５フラスコをＢＳＣに慎重に戻した。
７．４．２７  各フラスコについて、新鮮な１０ｍｌ血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約１７ｍｌを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
７．４．２８  同じ血清用ピペットを使用して上下にピペッティングすることにより試料を十分に混合した。
７．４．２９  カウントのため各フラスコから２００μｌ試料を取り出した。
７．４．３０  自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．４．３１  判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．２６〜７．４．３１を繰り返した。
結果及び適合基準
結果
１０．１．１  ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、０日目と比較してＲＥＰ培養の１４日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
適合基準
１０．２．１  試験した各照射ドナーＰＢＭＣロットについて、以下の適合基準が満たされた：
１０．２．２  「成長なし」−１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味する。
１０．２．３  ロットが上記の基準に適合しなかった場合、そのロットは、セクション１０．４に概説するコンティンジェンシーテスト手順に従い再試験した。
１０．２．４  不適合ロットの再試験後、当初の判定及びコンティンジェンシーテストの両方で適合基準を満たさなかったＭＮＣフィーダーロットは、いずれも除外した。
適合基準を満たさなかったＰＢＭＣロットのコンティンジェンシーテスト
１０．４．１  照射ドナーＰＢＭＣロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。
１０．４．２  ロットのサテライトのバイアルが２つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが１つ残っているか又は残っていなかった場合、上記のセクション１０．２の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
１０．４．３  可能な場合は常に、２人の訓練された担当者（好ましくは問題のロットを判定した当初の人を含む）が２つの別個のバイアルの試験を独立に行った。これが好ましいコンティンジェンシーテスト方法であった。ＰＢＭＣの別個のバイアルの他に、両方の担当者が同じ試薬を使用することもできる。
１０．４．３．１．２人の担当者が利用可能でない場合、１人が不適合とされたロットについての２つのＰＢＭＣバイアルの試験を、各バイアルを独立に作業して行った。
１０．４．４  セクション７．４「実験プロトコル」の繰り返しを行い、問題のロットを再判定した。
１０．４．５  問題のロットに加えて、コンティンジェンシーテストの実行者各々が対照ロットを試験した。
１０．４．５．１  ２人の担当者がコンティンジェンシーテストを実施する場合、両方の担当者が対照ロットを独立に試験した。
１０．４．５．２  コンティンジェンシーテストの実施に１人のみが利用可能であった場合、対照ロットについて必ずしもデュプリケートで実行する必要はない。
１０．４．５．３  適格とされるには、コンティンジェンシーテストを受けるＰＢＭＣロットが、セクション１０．２の適合基準への合格に達する対照ロットと問題のロットの両方のレプリケートとの両方を有していなければならない。
１０．４．５．４  この基準を満たしたとき、次にはそのロットをセクション１０．２に概説するとおりのＣＭＯ使用にリリースした。
【０４１６】
実施例８：凍結保存前及び凍結保存後ＴＩＬの比較
[00401]  試料調製及び染色手順の開始前に試料及びＦＭＯコントロールの抗体カクテルを作成した。これらのカクテルは暗所下４℃で最長６０日間貯蔵した。以下のカクテル調製のセクションを参照のこと。
【０４１７】
【表１５】
2019532652.tif 000019
【０４１８】
【表１６】
2019532652.tif 000020
【０４１９】
【表１７】
2019532652.tif 000021
【０４２０】
【表１８】
2019532652.tif 000022
【０４２１】
【表１９】
2019532652.tif 000023
【０４２２】
コンペンセーションコントロール
１．１滴のBD Compビーズを１１本のチューブに加えた。
２．チューブ１〜７をＤＦ１からの発色団で標識した
３．チューブ８〜１０をＡＰＣｙ７、ＢＶ４２１、及びＡｘ６４７で標識した。
４．チューブ１１は非標識ビーズ用であった。
５．各チューブに５μＬの抗体を加えた。
６．暗所下、室温で１０〜３０分間インキュベートした。
７．３ｍＬ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した
８．５００ｕＬ  １％ＰＦＡに再懸濁した。
９．各チューブに１滴のBD Compネガティブビーズを加えた。
１０．暗所下４℃で貯蔵した。１週間使用可能であった。
Aquaコントロール：
１．Aquaと表示を付したチューブに１滴のArcポジティブコントロールを加えた。
２．チューブに３μＬの解凍したaqua溶液を加えた。
３．上記のとおりステップ６〜１０を繰り返した。例外で、ステップ９にはネガティブArcビーズを使用した。
【０４２３】
【表２０】
2019532652.tif 000024
【０４２４】
実施例９：凍結保存後の注入表現型について著しく安定している腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）
要約背景：
[00402]  本実施例は、治療用ＴＩＬ集団の開発を最終的な目標とした、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をベースとする癌免疫療法の開発について考察する。ＴＩＬを凍結保存すると、時間的制約が減り、最終細胞製品を安全に出荷することが可能になる（Axelsson S, Faresjo M, Hedman M, Ludvigsson J, Casas R: Cryopreserved peripheral blood mononuclear cells are suitable for the assessment of immunological markers in type 1 diabetic children. Cryobiology 2008, 57:201-8）
【０４２５】
[00403]  ここで、個別の表現型マーカーの発現に関して新鮮ＴＩＬ試料と凍結／解凍ＴＩＬ試料を判定して、凍結保存ＴＩＬに表現型の変化が起こるかどうかを評価した。（例えば、Sadeghi A, Ullenhag G, Wagenius G, Toetterman TH, Eriksson F: Rapid expansion of T cells: Effects of culture and cryopreservation and importance of short-term cell recovery. Acta Oncol. 2013,52:978-86を参照のこと）
【０４２６】
結果：
[00404]  新鮮ＴＩＬを解凍ＴＩＬと比較して、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現、又はメモリーマーカーに有意な差は認められなかった。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３８、及びＣＤ６９発現によって定義されるとおりのＴＩＬの活性化状態は維持された一方、調節分子ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３は僅かな発現の低下を示した。加えて、新鮮産物及び解凍産物の両方とも、生存率は８６％超であった。
【０４２７】
方法：
[00405]  ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）中で黒色腫腫瘍断片を培養することによりプレＲＥＰ  ＴＩＬを入手した。
【０４２８】
[00406]  GREX-100フラスコ内で照射同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞をＯＫＴ３及びＩＬ−２と共に使用して迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）細胞を１１〜１４日間惹起した。
【０４２９】
[00407]  ５％ＤＭＳＯ中に培養細胞を凍結保存した。
【０４３０】
[00408]  系列、分化、活性化、及び調節マーカーからなる４つのパネルを使用して、ＩＬ−２に１〜２時間静置した後の新鮮及び解凍ＴＩＬのフローサイトメトリーによる評価を実施した。
【０４３１】
結論：
[00409]  一部の調節分子の僅かな変化を除き、凍結保存はＴＩＬの表現型特徴の測定に影響を与えなかった。本発明者らは、臨床セッティングで凍結保存ＴＩＬを使用する可能性を調べている。
【０４３２】
実施例１０：新鮮ＴＩＬ集団とＲｅＲＥＰ  ＴＩＬ集団におけるメモリー細胞サブセット
[00410]  前出の実験では、新鮮ＴＩＬ集団にセントラルメモリーサブセットは見られなかった（図８を参照）。しかしながら、ＲｅＲＥＰ後は、以下の表２２に提供するとおり、ほぼ６０％のセントラルメモリー細胞。
【０４３３】
[00411]  生の数値に基づけば、静止細胞は非静止細胞と比べて僅かに高いＣＤ４集団を有した。予想どおり、総じてＣＤ８の割合が高かった。ＣＤ８の中では、ＣＭ（セントラルメモリー−Ｑ３）／ＥＭ（エフェクターメモリー−Ｑ４）についておよそ６０／４０分割である。ＣＤ８＋ＣＤ２８＋発現は興味深いように見える。静止細胞ではより高量である。図９及び図１０Ａ〜図１０Ｂもまた参照のこと。図１５もまた参照のこと。
【０４３４】
実施例１１：黒色腫患者における自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の投与
[00412]  黒色腫患者における自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の投与は、ＮＣＩで５５％、モフィット癌センター（Moffitt Cancer Center）で３８％、ＭＤアンダーソン癌センター（MD Anderson Cancer Center）で４８％、及びエラ癌研究所（Ella Cancer Institute）、イスラエルのシェバ（Sheba）で４０％の全奏効率を示している。ＡＣＴを使用して黒色腫患者に観察される持続的奏効は、他の固形腫瘍に対する幅広い適用を可能にし得る。本明細書に示されるとおり、ＴＩＬを成長させて他の固形腫瘍に向けたＴＩＬ療法を開発することの実現可能性が実証される。本例は、「非黒色腫腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の拡大培養及び特徴付けの成功」を示すデータを提供する。図１２〜図１４を参照のこと。
【０４３５】
[00413]  膀胱癌、子宮頸癌、及び肺癌からのＴＩＬの表現型の特徴付けは６０〜７０％超のＣＤ８＋  Ｔ細胞であった一方、頭部からのＴＩＬは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞のばらつきのある分布を示した。ＴＮＢＣから増殖したＴＩＬは８０％超のＣＤ４＋  Ｔ細胞であった。腫瘍に関わらず、ほとんどの培養物はＣＤ５６＋  ＮＫ細胞が２０％未満であった。
【０４３６】
[00414]  ＴＩＬを以下によって調製した：
ａ．入手した腫瘍をＨＢＳＳで洗浄する；
ｂ．腫瘍を角切りして断片化する（例えば、２〜３ｍｍ３断片）；
ｃ．血清及びＩＬ−２を含有する培地が入ったG-REX 10細胞培養フラスコに腫瘍断片を入れる；
ｄ．７日目に、及び１１日目から２１日目までは４〜５日毎に培地を交換する；及び
ｅ．細胞数、生存率の評価、及びフェノタイピングと、それに続く、限定はされないが、本明細書に記載されるとおりの腫瘍の治療のための患者への更なる送達を含め、更なる目的のための凍結保存を行う。
【０４３７】
[00415]  本明細書において実証されるとおり、ＴＩＬは、肺、膀胱、頭頸部、子宮頸部、及びＴＮＢＣ患者腫瘍から成長させた。
【０４３８】
[00416]  更に、本明細書において実証されるとおり、肺、膀胱、及び子宮頸部腫瘍は、より大きい割合のＣＤ８＋  ＴＩＬを示した。頭頸部及びＴＮＢＣ腫瘍は大部分がＣＤ４＋  ＴＩＬであった。加えて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＴＩＬを更に特徴付けすると、ＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋でもあるエフェクターメモリー表現型細胞が実証された。
【０４３９】
[00417]  上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのように作成及び使用すればよいかについて当業者に完全な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することは意図されない。当業者には明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形例は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。本開示に引用される参考文献は全て、各々の参考文献が個別に全体として参照により援用されたものとみなすのと同程度に参照によって援用される。
【０４４０】
[00418]  全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために、且つあくまでも参考として使用され、いかなる形であっても限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従い適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【０４４１】
[00419]  本明細書に引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物又は特許又は特許出願があらゆる目的から全体として参照により援用されると具体的且つ個別的に指示されたものとみなすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的から参照により本明細書に援用される。
【０４４２】
[00420]  当業者には明らかであろうとおり、本願の多くの改良及び変形をその趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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