(57)【要約】  本発明は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法に関し、より詳細には、オフターゲット活性およびオンターゲット活性を同時に特定することが可能な多標的システムを用いて標的特異的ヌクレアーゼシステムをスクリーニングおよび選択するための方法に関する。本発明により、低下したオフターゲット効果および増大したオンターゲット効果を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することができる。
2019517802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムであって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および前記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステム。
【請求項２】
前記スクリーニングシステムは、前記ヌクレアーゼのオンターゲット効果およびオフターゲット効果を同時に特定することが可能である、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項３】
前記複数標的は、１つのオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項４】
前記複数標的は、ベクター、プラスミドまたは宿主細胞ゲノムに含まれる、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項５】
前記オンターゲットは、ベクターまたはプラスミドに含まれ、前記オフターゲットは、宿主細胞ゲノムに含まれる、請求項３に記載のスクリーニングシステム。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ）からなる群から選択される、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼは、前記ＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ）である、請求項６に記載のスクリーニングシステム。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムである、請求項７に記載のスクリーニングシステム。
【請求項９】
前記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子である、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼによる前記オンターゲット効果および前記オフターゲット効果を特定するための前記選択要素として、１つまたは複数の選択要素が用いられる、請求項９に記載のスクリーニングシステム。
【請求項１１】
前記スクリーニングシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および毒素遺伝子ｃｃｄＢを用いて行われる、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項１２】
前記スクリーニングシステムは、哺乳類細胞および毒素遺伝子ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を用いて行われる、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項１３】
前記スクリーニングシステムは、酵母および毒素遺伝子ＵＲＡ３を用いて行われる、請求項１に記載のスクリーニングシステム。
【請求項１４】
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニング用組成物であって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および前記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素 を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備える組成物。
【請求項１５】
前記ヌクレアーゼは、前記ＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ）である、請求項１４に記載のスクリーニング用組成物。
【請求項１６】
前記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子である、請求項１４に記載のスクリーニング用組成物。
【請求項１７】
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）前記ａ）において選択要素が発現するか否かに基づいて前記オンターゲット効果および前記オフターゲット効果を特定することにより前記細胞を選別する段階と、
ｃ）ｂ）における選別された細胞中に含まれる前記ヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する前記標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法。
【請求項１８】
前記ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を前記細胞に前記導入する段階は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、カチオン系ポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン系リポソームトランスフェクション、イムノリポソームトランスフェクション、非リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、遺伝子銃デリバリー、インペールフェクション、ソノポレーションおよび光トランスフェクションからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いて行われる、請求項１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
【請求項１９】
前記ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を前記細胞に前記導入する段階は、エレクトロポレーションを用いて行われる、請求項１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
【請求項２０】
前記ｂ）における前記細胞は、選択要素が発現するか否かに基づく特定に伴い、オンターゲット効果が増大しオフターゲット効果が低下したものが選別される、請求項１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼの配列は、前記ｃ）において前記選別された細胞から得られる前記ヌクレアーゼを配列決定することにより取得される、請求項１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
【請求項２２】
１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的
を備える、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキット。
【請求項２３】
前記複数標的は、宿主細胞中にある、請求項２２に記載のスクリーニングキット。
【請求項２４】
標的特異的ヌクレアーゼを選択するための前記スクリーニングキットは、
標的を認識することが可能な部分、および前記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
宿主細胞と
からなる群から選択される１つまたは複数の成分をさらに備える、
請求項２２に記載のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法に関し、より詳細には、オフターゲット活性およびオンターゲット活性を同時に特定することが可能な多標的システムを用いて標的特異的ヌクレアーゼシステムをスクリーニングおよび選択するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、標的とすべき遺伝子または核酸と相補的な配列を有するガイドＲＮＡと、標的とすべき遺伝子または核酸を切断する酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素とからなり、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、形成されたＣＲＩＳＰＲ複合体の標的となる遺伝子または核酸を切断または改変する。
【０００３】
しかしながら、標的とすべき遺伝子または核酸を改変するという上記の効果に加えて、標的でない遺伝子または核酸を改変してしまうという課題は、依然として解決されていない。
【０００４】
標的でない遺伝子または核酸がガイドＲＮＡと部分的に相補的な配列を含むことによってガイドＲＮＡと部分的に相互作用する場合があり、この相互作用により、ＣＲＩＳＰＲ複合体は対応する遺伝子、すなわち所望のものでない遺伝子または核酸を切断または改変してしまう。この効果は、オフターゲット効果と呼ばれる。
【０００５】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いて標的の遺伝子または核酸を改変する効率を増大させるべくオンターゲット効果を増大させること、または所望のものでない遺伝子または核酸の改変によって生じ得る遺伝子異常などの課題を解決するべくＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのオフターゲット効果を低減するまたは取り除くことが重要である。さらに、上記のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのオフターゲット効果が低減されることに伴い、標的とすべき遺伝子または核酸を的確に改変することが可能な精度および特異性の両方を期待することができる。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのオフターゲット効果を低減するまたは取り除く、および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの精度および特異性を向上させるには、オフターゲット効果の小さいガイドＲＮＡを選択（すなわち、オフターゲット効果の小さい標的を選択）または改変し、ＣＲＩＳＰＲ酵素の活性（または効率）および特異性を調節することが、重要な点と考えられる。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素の活性または特異性を調節するべく、細胞群中のＣａｓ９の濃度を調節するまたはＣａｓ９ニッカーゼを用いて一本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせるための方法、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを触媒不活性化Ｃａｓ９と融合することにより生成される融合タンパク質を用いるための方法、およびガイドＲＮＡの５'末端の部分的配列を除去したトランケートガイドＲＮＡ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）の利用など、様々な方策が企図および開発されている。
【０００８】
よって、本発明者らは、高い特異性および／または活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニング方法を開発し、当該スクリーニング方法を用いることによって様々な改変ヌクレアーゼの候補群のうちから優れた標的特異的ヌクレアーゼを効果的に選択できることを確認し、それにより本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
ＷＯ２０１３−０９８２４４
ＷＯ２０１５−１２３３３９
ＷＯ２０１４−０９３６６１
ＷＯ２０１４−２０４７２４
ＫＲ１０−２０１６−００５８７０３
【非特許文献】
【００１０】
１．  Ａｎｄｅｒｓ，  Ｃ．ら、２０１４年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＰＡＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ５１３  （７５１９）、５６９−５７３
２．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｅ．Ｍ．ら、２０１５年、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｌｏｗ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１１、５６−６５
３．  Ｆｒｏｃｋ，  Ｒ．Ｌ．ら、２０１５年、Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３３（２）、１７９−１８６
４．  Ｂａｕｅｒ，  Ｄ．Ｅ．ら、２０１５年、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｖｉａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｊ．  Ｖｉｓ．  Ｅｘｐ．  ９５
５．  Ｂｒｉｎｋｍａｎ，  Ｅ．Ｋ．ら、２０１４年、Ｅａｓｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｃｅ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４２（２２）、ｅ１６８
６．  Ｃｈｏ，  Ｓ．Ｗ．ら、２０１４年、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２４  （１）、１３２−１４１
７．  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  Ｍ．ら、２０１０年、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６  （２）、７５７−７６１
８．  Ｃｒａｄｉｃｋ，  Ｔ．Ｊ．ら、２０１３年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  β−ｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ＣＣＲ５  ｇｅｎｅｓ  ｈａｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１  （２０）、９５８４−９５９２
９．  Ｃｒｏｓｅｔｔｏ，  Ｎ．ら、２０１３年、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０  （４）、３６１−３６５
１０．  Ｄａｈｌｅｍ，  Ｔ．Ｊ．ら、２０１２年、Ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬＥＮｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｇｅｎｏｍｅ、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．  ８  （８）、ｅ１００２８６１
１１．  Ｄｏｅｎｃｈ，  Ｊ．Ｇ．ら、２０１６年、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｇＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３４  （２）、１８４−１９１
１２．  Ｆｕ，  Ｙ．ら、２０１３ａ、Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１  （９）、８２２−８２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムを提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼの選択システムを提供することにある。
【００１３】
本発明のまた別の目的は、複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングおよび／または選択するためのキットまたは組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングおよび／または選択するための複数標的を含む細胞、および／または当該細胞を生成するための方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のまたさらに別の目的は、複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングおよび選択するためのシステム、およびこれを用いることによる選択されたヌクレアーゼのあらゆる利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
これらの課題を解決するべく、本発明は、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステム、およびこれの様々な利用を提供する。
【００１７】
標的特異的ヌクレアーゼは、標的を特異的に認識することが可能な部分と、認識された標的を切断または改変することが可能な部分とを含んでよく、スクリーニングシステムによって、標的を特異的に認識することが可能な部分および／または認識された標的を切断または改変することが可能な部分をスクリーニングおよび／または選択することができる。
【００１８】
［スクリーニングシステム］
本明細書で用いる場合、「標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステム」という用語は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するのに用いられる組成物およびキット、これを用いるための方法、ならびにそれらのプロセスの間に誘導される様々な中間体の全てを含む概念を指す。
【００１９】
よって、本明細書において「システム」として説明される発明は、本発明が所望の標的特異的ヌクレアーゼの選択に用いられる限りにおいて、組成物または方法として、対応する発明の態様に適するように解釈されてよい。
【００２０】
本発明の一態様は、標的特異的ヌクレアーゼシステムをスクリーニングするための方法、およびこれに用いられる組成物に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、当該スクリーニング方法によって高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法、およびこれに用いられる組成物に関する。
【００２２】
好適な具体的実施形態として、本発明は、
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムまたは組成物であって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステムまたは組成物を提供する。
【００２３】
別の好適な具体的実施形態として、本発明は、
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムまたは組成物であって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つのオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステムまたは組成物を提供する。
【００２４】
また別の好適な具体的実施形態として、本発明は、
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムまたは組成物であって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つの選択要素を含む複数標的であって、１つのオンターゲットおよび１つのオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステムまたは組成物を提供する。
【００２５】
当該スクリーニングシステムは、様々な標的候補群のうちから高特異性および／または高活性を有する優れた標的特異的ヌクレアーゼを選択するために用いられてよい。
【００２６】
［ヌクレアーゼ］
「標的特異的ヌクレアーゼ」という用語は、所望の（標的のまたは標的とする）ゲノムにおける核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特定の位置を認識および切断することが可能なヌクレアーゼを指す。本発明において、標的特異的ヌクレアーゼはまた、特定のヌクレアーゼに所望の機能を実行させることを可能とするのに必要な他の要素を含む概念としても用いられる。
【００２７】
当該ヌクレアーゼは、ゲノム中の特定の標的配列をそれぞれ認識および切断することが可能なドメイン（部分）とドメイン（部分）とが融合されたヌクレアーゼを含んでよく、その例としては、限定されることなく、メガヌクレアーゼ、ゲノム中の特定の標的配列を認識することが可能なドメインである植物病原遺伝子から誘導される転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＴＡＬＥＮ）である転写アクチベーター様（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ）（ＴＡＬ）エフェクタードメインおよび切断ドメインが融合した融合タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＲＧＥＮ）が含まれてよい。好ましくは、本発明においてはＲＧＥＮが用いられてよい。
【００２８】
本発明において、「ＲＧＥＮ」は、標的特異的ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む。
【００２９】
本発明の「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム」は、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含み、その発現または活性の誘発に関与する全ての要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターシステムであってよい。
【００３０】
当該ベクターシステムに含まれる構成要素は、互いに作用可能に連鎖する。「作用可能に連鎖」という用語は、配列が所望の機能をコードするものとなるような核酸配列間の機能的接続を指す。例えば、所望の遺伝子、例えば選択マーカーのコード配列は、連鎖したプロモーターおよび／または調節領域が当該コード配列の発現を機能的に調節する場合、そのプロモーターおよび／またはその調節配列と作用可能に連鎖した状態にある。これは、複数のコード配列が同じ連鎖プロモーターおよび／または調節領域によって調節されることが可能となるようなこれらコード配列間の接続を指し、このコード配列間の接続はまた、あるフレームまたは同じコードフレームにおける接続を指してもよい。「作用可能に連鎖」という用語はまた、機能的配列であるが非コード配列である配列、例えば自己増殖配列または複製起点の接続を指す。これらの配列は、その正常な機能を実行できる場合、例えば、宿主細胞中で当該配列を含むベクターを複製、増殖、および／または分離することができる場合、作用可能に連鎖した状態にある。
【００３１】
加えて、本発明の「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム」は、ガイドＲＮＡの配列およびＣＲＩＳＰＲ酵素のタンパク質またはポリペプチドを含み、その発現または活性の誘発に関与する全ての要素を含み、またＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素が複合体を形成するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）システムであってよい。この場合、当該ＲＮＰは、タンパク質・ＲＮＡ複合体であり、ＲＮＡとＲＮＡ結合タンパク質との相互作用により形成される複合体の形態を指す。
【００３２】
本発明の「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの主タンパク質成分であり、ガイドＲＮＡと複合体を形成することで、活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムまたは不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを形成する。
【００３３】
この場合、不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能の全てまたは一部が不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを指し、機能が部分的に不活性化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、一本鎖核酸を切断するニッカーゼとして機能し得る。
【００３４】
一例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａの変異をＣａｓ９タンパク質に導入することにより調製されてよく、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９タンパク質、Ｈ８４０Ａ  Ｃａｓ９タンパク質、すなわちＣａｓ９タンパク質の１つの活性部位のみに変異を導入することにより生成されるＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡに結合すると、ニッカーゼとして機能し得る。
【００３５】
別の例として、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａの両方の変異をＣａｓ９タンパク質に導入することにより生成されるＤ１０Ａ／Ｈ１０Ａ  Ｃａｓ９タンパク質、すなわちＣａｓ９タンパク質の２つの活性部位に変異を導入することにより生成される不活性化Ｃａｓ９タンパク質（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９）がガイドＲＮＡに結合した場合、不活性化Ｃａｓ９タンパク質は、標的遺伝子または核酸配列を切断しない核酸結合複合体として機能し得る。
【００３６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはポリペプチド（またはタンパク質）をコードする配列を有する核酸であり、代表的には、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が通常用いられる。
【００３７】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の例にはＣａｓ９が含まれ、Ｃａｓ９は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）Ｃａｓ９、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ  Ｃａｓ９、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  Ｃａｓ９、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ  Ｃａｓ９、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ  Ｃａｓ９、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃａｓ９、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ  Ｃａｓ９、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ  Ｃａｓ９、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  Ｃａｓ９（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃａｓ９、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  Ｃａｓ９、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ｃａｓ９）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃａｓ９、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  （例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９、およびＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９などの、様々な微生物から誘導されるＣａｓ９であってよい。
【００３８】
「Ｃａｓ９」は、ガイドＲＮＡに結合することにより標的とすべき遺伝子または核酸の配列または位置を切断または改変することが可能な酵素であり、ガイドＲＮＡに相補的に結合する核酸鎖を切断することが可能なＨＮＨドメインと、ガイドＲＮＡに非相補的に結合する核酸鎖を切断することが可能なＲｕｖＣドメインと、標的を認識することが可能なＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識することが可能なＰＩドメインとからなるものであってよい。Ｃａｓ９の具体的な構造的特徴については、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕら（２０１４年）のＣｅｌｌ  １５６：９３５−９４９を参照されたい。
【００３９】
加えて、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の例にはＣｐｆ１が含まれ、Ｃｐｆ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから誘導されるＣｐｆ１であってよい。
【００４０】
Ｃｐｆ１の例は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに対応する類似のＲｕｖＣドメインを含み、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインが欠けて代わりにＮｕｃドメインが含まれ、またＣｐｆｌは、標的を認識することが可能なＲＥＣドメインおよびＷＥＤドメインならびにＰＡＭを認識することが可能なＰＩドメインからなるものであってよい。Ｃｐｆ１の具体的な構造的特徴については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏら（２０１６年）のＣｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照されたい。
【００４１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することができ、ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類および／またはソースに応じて異なるものであってよい。
【００４２】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＧＧ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＡＧＡＡＷ−３′（Ｗ＝ＡまたはＴ）であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３′（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＹ＝ＣまたはＴ）であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＦｎＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′ＴＴＮ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′−ＴＴＴＮ−３′であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【００４３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素についての情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができるが、ソースはこれに限定されない。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「ガイドＲＮＡ」という用語は、標的の遺伝子または核酸に特異的なＲＮＡを指し、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合することによってＣＲＩＳＰＲ酵素を標的の遺伝子または核酸に導くことができる。
【００４５】
ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を含むｃｒＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するｔｒａｃｒＲＮＡとからなるものであってよく、この場合、ｃｒＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合することが可能な部分であるガイド配列を含む。
【００４６】
ガイド配列は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を有し、標的とすべき遺伝子または核酸の配列を認識するよう機能する。さらに、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分と相補的な配列を有する部分を含み、そのため、ｔｒａｃｒＲＮＡに部分的に相補的に結合し得る。
【００４７】
この場合、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが各々別個に存在するデュアルガイドＲＮＡ（ｄｕａｌ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが互いに接続されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）であってよく、ガイドＲＮＡがシングルガイドＲＮＡである場合、リンカーを含んでよい。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じてｃｒＲＮＡのみを含むものであってよい。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、標的特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってよい。
【００４９】
ＺＦＮは、選択された遺伝子に結合するよう工学設計されたジンクフィンガータンパク質と、切断ドメインまたは切断ハーフドメインにおける標的部位とを含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するよう工学設計されたものであってよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）のＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１、  Ｐａｂｏら（２００１年）のＡｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１年）のＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１年）のＣｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏら（２０００年）のＣｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６を参照することができる。自然起源のジンクフィンガータンパク質と比較した場合、工学設計されたジンクフィンガー結合ドメインは、新規な結合特異性を有するものであってよい。工学設計の方法には、合理的設計法および様々な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計法には、例えば三連（または四連）ヌクレオチド配列、および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの利用が含まれ、この場合、それぞれ三連または四連のヌクレオチド配列が、ある特定の三連または四連の配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数の配列と組み合わされる。
【００５０】
標的配列の選択ならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築は、当業者に知られているものであり、米国特許公報第２００５／００６４４７４号および第２００６／０１８８９８７号において詳細に説明されており、これらの全内容が参照として本明細書に組み込まれる。
【００５１】
さらに、これらの参照文献および他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、任意の適したリンカー配列、例えば５つ以上のアミノ酸を含む長さのリンカーによって連鎖し合う場合がある。アミノ酸６つ以上の長さのリンカー配列の例については、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号を参照することができる。本明細書において説明するタンパク質は、タンパク質のジンクフィンガー各々の間の適したリンカーの任意の組み合わせを含んでよい。
【００５２】
加えて、ＺＦＮおよび／またはメガヌクレアーゼなどの標的特異的ヌクレアーゼは、切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含んでよい。
【００５３】
よく知られているように、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとは異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインとは異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメインのように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインと非相同であり得る。非相同な切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの誘導元となり得る例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（標的部位において）配列特異的に結合される場合があり、それによりＤＮＡを結合部位またはその近傍で切断する。一部の制限酵素（例えばＩＩＳ型）は、ＤＮＡを認識部位から離れた部位で切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断可能ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、ＤＮＡの二本鎖切断を、一方の鎖では認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、他方の鎖では認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置で触媒する。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、ＩＩＳ型制限酵素に由来する少なくとも１つの切断ドメインと、１つまたは複数のジンクフィンガードメイン（これは工学設計されたものであってもなくてもよい）を含む。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「ＴＡＬＥドメイン」という用語は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復モジュールを介して配列特異的にヌクレオチドに結合することが可能なタンパク質ドメインを指す。ＴＡＬＥドメインは、少なくとも１つのＴＡＬＥ反復モジュール、好ましくは１〜３０個のＴＡＬＥ反復モジュールを含むが、これらに限定されない。本発明において、「ＴＡＬエフェクタードメイン」および「ＴＡＬＥドメイン」という用語は、交換可能に用いることができる。ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ反復モジュールの半数を含むものであってよい。
【００５６】
［複数標的］
本発明は、オンターゲット効果（活性）および／またはオフターゲット効果（活性）を同時に特定することが可能な複数標的システムまたは同時標的システムを用いることを特徴とする。
【００５７】
本発明の「標的」は、標的特異的ヌクレアーゼによる切断または改変の対象であり、標的のもしくは所望の遺伝子もしくは核酸またはその配列と交換可能に用いることができる。
【００５８】
標的特異的ヌクレアーゼの「標的」を認識することが可能な部分は、標的の遺伝子または核酸の配列と相補的な核酸配列を含む。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混成物であってよいが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「複数標的」という用語は、１つまたは複数のオンターゲット効果および１つまたは複数のオフターゲット効果を含む概念であり、試験ヌクレアーゼのオンターゲット効果およびオフターゲット効果を同時にまたは個別に特定することが可能なシステムを形成する標的を指す。
【００６０】
よって、「複数標的」は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよく、複数標的は、２つ以上の標的であってよく、また複数標的は、オンターゲットおよびオフターゲットからなるものであってよい。
【００６１】
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置を指し、オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合し、所望のものでないヌクレアーゼの活性が生じる標的の遺伝子または核酸の配列または位置を指す。オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが標的としない遺伝子もしくは核酸の配列もしくは位置、またはオンターゲットの核酸配列との配列相同性が１００％未満である核酸配列であってよい。オンターゲットの核酸配列との配列相同性が１００％未満である核酸配列は、オンターゲットの核酸配列と類似の核酸配列であり、１つまたは複数の異なる塩基配列が含まれる、または１つまたは複数の塩基配列が欠失した核酸配列であってよい。
【００６２】
複数標的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットからなるものであってよく、オンターゲットおよびオフターゲットの各々の数は限定されるものではなく、さらに、オンターゲットおよびオフターゲットの数は同じでなくてよい。すなわち、複数標的は、１つのオンターゲットおよび２つのオフターゲットを含む複数標的であってよく、加えて複数標的は、２つのオンターゲットおよび５つのオフターゲットを含む複数標的であってよく、また複数標的は、これらに限定されることなく設計することができる。
【００６３】
さらに、本発明のスクリーニングシステムの選択の信頼性を増大させるべく、標的特異的ヌクレアーゼによる切断または改変の対象は、複数の標的、所望の遺伝子、核酸、またはその配列として設計することができる。複数の標的は、標的の数が２つ以上であることを意味し、標的の数は、２、３、４、５、６、７、またはそれよりも多数であってよく、その数は限定されない。
【００６４】
この場合、複数の標的および複数標的を考慮してシステムの構成を設計することができる。
【００６５】
複数標的は、オンターゲット効果およびオフターゲット効果を特定することが可能な選択要素に接続される。
【００６６】
［選択要素］
本発明の「選択要素」という用語は、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出するためのマーカーを指す。よって、「選択要素」は、「選択マーカー」と交換可能に用いることができる。
【００６７】
選択要素が発現したか否かに基づいて、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出することができる。すなわち、オンターゲット効果が増大したかおよび／またはオフターゲット効果が低下したかを検出することができる。
【００６８】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子（ｔａｇｇｉｎｇ  ｇｅｎｅ）、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【００６９】
「毒素遺伝子」は、毒性物質（タンパク質）をコードする遺伝子または核酸の配列であり、毒性物質は、毒素遺伝子の発現により生成され、生成された毒性物質によって毒素遺伝子を含む細胞の生存を調節することができる。代替的に、毒素遺伝子は、毒素遺伝子を含む細胞の生存に必要な物質の合成または分解に影響を及ぼすことにより細胞の生存を調節することが可能な物質であってよい。
【００７０】
毒素遺伝子は、Ｈｏｋ、ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＴｘｐＡ／ＢｒｎＴ、ＳｙｍＥ、ＸＣＶ１２６２、ＣｃｄＢ、ＰａｒＥ、ＭａｚＦ、ｙａｆＯ、ＨｉｃＡ、Ｋｉｄ、Ｚｅｔａ、ＤａｒＴ、Ｓｘｔ遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、またはＵＲＡ３であってよく、これらに限定されない。
【００７１】
宿主がＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合、毒素遺伝子ｃｃｄＢを用いることができる。
【００７２】
宿主細胞が哺乳類細胞である場合、毒素遺伝子ＨＰＲＴを用いることができる。
【００７３】
宿主が酵母である場合、毒素遺伝子ＵＲＡ３を用いることができる。
【００７４】
「抗生物質耐性遺伝子」は、抗生物質にさらされた状態において抗生物質耐性が発現することを可能とする遺伝子または核酸の配列であってよい。
【００７５】
抗生物質は、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、ゼオシン、ピューロマイシン、またはクロラムフェニコールであってよく、これらに限定されない。
【００７６】
「蛍光タンパク質」は、蛍光を発現するタンパク質であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、またはオレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ）であってよく、これらに限定されない。
【００７７】
タグは、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、Ｓｎｏｏｐ  Ｔａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＨａｌｏＴａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、またはポリ（ＮＡＮＰ）であってよい。さらに、タグは、蛍光タンパク質を用いることができる。
【００７８】
本発明の具体的実施形態として、１つまたは複数の選択要素を、ヌクレアーゼによるオンターゲット効果およびオフターゲット効果を特定するための選択要素として用いることができる。
【００７９】
一例として、ｌａｃＺ遺伝子を選択要素として用いる場合、ｌａｃＺを含む標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、ｌａｃＺは発現しない。これは、青白スクリーニング法によって検出することができる。青白スクリーニング法は、ｌａｃＺ遺伝子から発現されるβ−ガラクトシダーゼを用いたスクリーニング方法であり、無色５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）がβ−ガラクトシダーゼによって切断されると、５−ブロモ−４−クロロ−インドキシルが形成されて自然発生的にダイマーとなり、それにより、酸化されて明るい色を呈する不溶性顔料である５，５′−ジブロモ−４，４′−ジクロロ−インディゴが形成される。したがって、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞がＸ−ｇａｌの存在下で青色を呈する現象を用いることにより、ｌａｃＺ遺伝子が発現したか否かを特定することができ、これを用いて、ｌａｃＺ遺伝子を含む標的の遺伝子または核酸の配列の切断または改変を予測することができる。
【００８０】
別の例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび細胞のゲノム中に存在するオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットを含むベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果としてゲノムは切断されないということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が生存することができ、オンターゲットおよびオフターゲットの両方が切断された細胞は、オフターゲットの切断によってゲノムが切断されるため生存することができず、それによりこれら２種類の細胞を互いに区別することができる。
【００８１】
さらに別の例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび選択要素として蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットを含むベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果として蛍光タンパク質が発現するということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が生存することができ、またこれは蛍光タンパク質と区別することもできる。
【００８２】
したがって、これらの選択要素が発現するか否かに基づいて、オンターゲットのみを効果的に切断する高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することができる。
【００８３】
［ヌクレアーゼの選択］
当該スクリーニングシステムを用いることにより、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを含む細胞が試験ヌクレアーゼから選別され、そこから所望のヌクレアーゼを選択（特定）することができる。
【００８４】
具体的実施形態として、本発明は、
標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
ａ）スクリーニングシステムのｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）ａ）において選択要素が発現するか否かに基づいてオンターゲット効果およびオフターゲット効果を特定することにより細胞を選別する段階と、
ｃ）ｂ）における選別された細胞中に存在するヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法を提供する。
【００８５】
ｉ）成分およびｉｉ）成分の細胞への導入には、公知の方法を用いることができる。
【００８６】
いくつかの具体的実施形態においては、細胞にトランスフェクトする。適したトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、カチオン系ポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルストランスフェクション、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン系リポソームトランスフェクション、イムノリポソームトランスフェクション、非リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、遺伝子銃デリバリー、インペールフェクション、ソノポレーション、光トランスフェクション、および核酸の専用薬剤促進取り込み（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ａｇｅｎｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）が含まれる。トランスフェクション方法は、当技術分野において広く知られている（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州、２００３年、または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、第３版、２００１年を参照）。好適な実施形態においては、ｉ）成分およびｉｉ）成分をエレクトロポレーションにより細胞に導入することができる。
【００８７】
具体的実施形態において、ｉ）成分またはｉｉ）成分をコードするＤＮＡは、ベクター中に存在するものであってよい。適したベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ｋｉｄ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等）が含まれる。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「ベクター」という用語は、所望の（所期の、特定の、または必要な）核酸を輸送するのに利用されるキャリア核酸分子を指し、ベクターは、一本鎖核酸、二本鎖核酸、または部分二本鎖核酸であってよく、さらにベクターは、１つまたは複数の自由末端または非自由末端（例えば環状）からなるものであってよい。
【００８９】
「プロモーター」は、ベクター中の遺伝子の発現を調節する調節要素として含めることができる。プロモーターは、ベクターが導入される細胞に応じて異なるものであってよい。プロモーターは、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター、またはＨ１プロモーター等）、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、またはＥＦ１αプロモーター等）、またはｐｏｌ  Ｉプロモーターであってよい。
【００９０】
別の具体的実施形態において、ｉ）成分としてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素が複合体を形成するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で存在するものであってよい。
【００９１】
一方、ｂ）において、選択要素が発現するか否かに基づく特定に伴い、オンターゲット効果が増大しオフターゲット効果が低下した細胞が選別される。
【００９２】
また、ヌクレアーゼの配列は、ｃ）において選別された細胞から得られたヌクレアーゼを配列決定することにより取得され、それにより高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼが得られる。当該方法により得られた標的特異的ヌクレアーゼの配列を用いて、遺伝子編集等に用いられるヌクレアーゼを調製することができる。
【００９３】
得られたヌクレアーゼの配列を取得するための方法として、例えば以下の方法を行うことができる。
【００９４】
すなわち、例えば、３０℃で１６時間にわたりカナマイシン、クロラムフェニコール、およびアラビノースを含むＬＢ寒天培地プレート中でエレクトロポレーションにかけたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を培養することにより、裸眼で視認可能なサイズに達するコロニーを生成したら、これらのコロニーの各々１つをクロラムフェニコールを含むＬＢバッファー１０ｍｌに混入し、次いで４２℃で１２時間にわたり振盪培養機中で培養する。遠心分離によりＥ．ｃｏｌｉペレットが得られた後、ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてペレットからプラスミドを抽出する。抽出されたプラスミドは、例えばサンガー配列決定法を用いて配列決定することができる。プライマーの場合は、Ｃａｓ９のＮ末端およびＣ末端の外側に存在するＣＭＶ−ＦおよびＢＧＨ−Ｒなどのユニバーサル配列決定プライマー、およびＣａｓ  ９の中間部における配列決定プライマーを用いることができる。
【００９５】
［スクリーニングキット］
さらに、本発明は、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を含む高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキットを提供する。当該キットは、組成物の形態であってよい。
【００９６】
この場合、複数標的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含み、これについての説明は上述のものと同じである。
【００９７】
必要に応じ、本発明のキットは、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を含む一液型キットとして提供されてよい。
【００９８】
必要に応じ、本発明のキットは、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的および宿主細胞をそれぞれ含む二液型キットとして提供されてよい。
【００９９】
この場合、当該キットは、宿主細胞中に選択要素を含む複数標的を含めることによって一液型として提供されてもよい。例えば、当該キットは、宿主細胞中の別個のプラスミドとして含まれてもよく、宿主細胞ゲノムに取り込むことにより提供されてもよい。
【０１００】
必要に応じ、本発明のキットは、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的、宿主細胞、および試験ヌクレアーゼをそれぞれ含む三液型キットとして提供されてよい。
【０１０１】
この場合、当該キットはまた、宿主細胞中に選択要素を含む複数標的を含めることによって二液型として提供されてよい。例えば、当該キットは、宿主細胞中の別個のプラスミドとして含まれてもよく、宿主細胞ゲノムに取り込むことにより提供されてもよい。
【０１０２】
上述のように、本発明は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼシステムを選択するためのシステムに関し、好ましくは、本発明は、オフターゲット活性およびオンターゲット活性を同時に特定することが可能な多標的システムを用いて標的特異的ヌクレアーゼシステムをスクリーニングおよび選択するためのシステム、ならびにこれの様々な利用の両方を含む。
【０１０３】
本発明の原理が用いられた例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の特徴および利点がより理解されるであろう。これらおよび他の実施形態は、説明されているか、または以下の詳細な説明から明らかであり、よってそれらも包含される。
【発明の効果】
【０１０４】
依然として、標的特異的ヌクレアーゼを用いて遺伝子を修正または操作するときに生じるオフターゲットの課題が残されている。この課題を解消するには、オフターゲットを生じない、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼを開発することが重要である。
【０１０５】
そのため、本発明は、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするためのシステムを開発した。本発明のスクリーニングシステムは、オフターゲット効果が低下しオンターゲット効果が増大する標的特異的ヌクレアーゼを選択することが可能なシステムであり、複数標的を用いて、オフターゲット効果の低下およびオンターゲット効果の増大を同時に満たすことが可能な高特異性および／または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングおよび選択することに有用に利用することができる。
【０１０６】
さらに、複数標的を設計する場合、複数標的に含まれる選択要素を、実験の目的に応じて様々に設計することができ、また選択要素に応じて様々な検出方法を用いることによって標的特異的ヌクレアーゼの選択に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】複数標的を用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのスクリーニング方法を模式的に示す。
【０１０８】
プラスミドＡは、アラビノースプロモーターの後に、毒性ｃｃｄＢ遺伝子を有する標的部位およびＮＧＧ  ｐａｍを含む。プラスミドＢは、ＰｌｔｅｔＯ−１プロモーターの制御下にｓｇＲＮＡを含み、Ｃａｓ９の存在下でプラスミドＡの標的部位を切断することができる。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ配列は、ｓｇＲＮＡ配列とミスマッチする。プラスミドＣは、ＣＭＶ−ｐｌｔｅｔＯ−１デュアルプロモーターの制御下にＣａｓ９ライブラリ配列を含む。
【０１０９】
【図２】複数標的のうちのオフターゲット核酸配列の設計に応じたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのスクリーニング結果を示すグラフである。
【０１１０】
このグラフは、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡに挿入したＥＭＸ−１配列と、２つのミスマッチ配列を含むプラスミドＢとを用いた対照実験の結果である。ＣＫは、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢ寒天培地における単位当たりの形成されたコロニーの数を指し、ＣＫＡは、クロラムフェニコール、カナマイシン、およびアラビノースを含むＬＢ寒天培地における単位当たりの形成されたコロニーの数を指す。２つのミスマッチをシード領域の近傍に配置した場合（５６−ＷＴ−ＣＡＳ９）、Ｃａｓ９が導入されたＥ．ｃｏｌｉの０．１％未満が生存した。一方、Ｃａｓ９に代えて陰性対照である空ベクター（ｎｕｌｌ  ｖｅｃｔｏｒ）をＥ．ｃｏｌｉに導入した場合、Ｅ．ｃｏｌｉのおよそ０．０１％が生存した。この陰性対照の結果は、プラスミドＡが作用しないことによる効果が原因と考えられる。
【０１１１】
【図３】複数標的のうちのオフターゲット核酸配列の設計に応じたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのスクリーニング結果を示すグラフである。
【０１１２】
このグラフは、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡに挿入したＥＭＸ−１配列と、１つのミスマッチ配列を含むプラスミドＢとを用いた対照実験の結果である。図中、ＣＫは、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢ寒天培地における単位当たりの形成されたコロニーの数を指し、ＣＫＡは、クロラムフェニコール、カナマイシン、およびアラビノースを含むＬＢ寒天培地における単位当たりの形成されたコロニーの数を指す。１つのミスマッチをシード領域の近傍に配置した場合（７−ＷＴ−ＣＡＳ９）、Ｃａｓ９が導入されたＥ．ｃｏｌｉの０．１％未満が生存した。一方、Ｃａｓ９に代えて陰性対照である空ベクターをＥ．ｃｏｌｉに導入した場合、Ｅ．ｃｏｌｉのおよそ０．０１％が生存した。この陰性対照の結果は、プラスミドＡが作用しないことによる効果が原因と考えられる。
【０１１３】
【図４】複数標的を用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのＣａｓ９多様体のスクリーニング結果を示すグラフである。
【０１１４】
プラスミドＡおよびＢのライブラリ、１つのミスマッチ（７）を含むＢＷ２５１４１４−ＥＭＸ１（７）、ならびに３つの種類（変異体株：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＸＬ−１  Ｒｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓから誘導、Ａｇｉｌｅｎｔ：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ  ｋｉｔ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）のスクリーニングである。１Ｇ１Ｓ（７）（１世代１シリーズ）：ＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのライブラリスクリーニング結果である。１Ｇ２Ｓ（７）：１Ｇ１Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのスクリーニング結果である。１Ｇ３Ｓ（７）：１Ｇ２Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのスクリーニング結果である。１Ｇ４Ｓ（１７）：１Ｇ３Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７）についてのスクリーニング結果である。１Ｇ５Ｓ（１７）：１Ｇ４Ｓ（１７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７）についてのスクリーニング結果である。
【０１１５】
【図５】複数標的を用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのＣａｓ９多様体のスクリーニング結果を示すグラフである。
【０１１６】
プラスミドＡおよびＢのライブラリ、２つのミスマッチ（５６）を含むＢＷ２５１４１４−ＥＭＸ１（５６）、ならびに３つの種類（変異体株：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＸＬ−１  Ｒｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓから誘導、Ａｇｉｌｅｎｔ：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ  ｋｉｔ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）のスクリーニングである。１Ｇ１Ｓ（１７１８）（１世代１シリーズ）：ＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７１８）についてのライブラリスクリーニング結果である。１Ｇ２Ｓ（１７１８）：１Ｇ１Ｓ（１７１８）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７１８）についてのスクリーニング結果である。１Ｇ３Ｓ（１７１８）：１Ｇ２Ｓ（１７１８）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７１８）についてのスクリーニング結果である。２Ｇ１Ｓ（７）：１Ｇ３Ｓ（１７）のシャッフリング後のライブラリのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのスクリーニング結果である。２Ｇ２Ｓ（７）：２Ｇ１Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのスクリーニング結果である。２Ｇ３Ｓ（７）：２Ｇ２Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのスクリーニング結果である。２Ｇ４Ｓ（７）：２Ｇ３Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（７）についてのスクリーニング結果である。２Ｇ５Ｓ（１７）：２Ｇ４Ｓ（７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７）についてのスクリーニング結果である。２Ｇ６Ｓ（１７）：２Ｇ５Ｓ（１７）スクリーニングのＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１（１７）についてのスクリーニング結果である。
【０１１７】
図６および７は、特定の遺伝子（ＥＭＸ１およびＴ−ＤＭＤ）についての複数標的によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムのＣａｓ９多様体の低下したオフターゲット活性を特定する結果を示すグラフである。
【図６】２つの方法により同時に行ったスクリーニングにより得られた完全な状態のライブラリを用いてＤＭＤ遺伝子のオンターゲット活性およびオフターゲット活性を測定した結果を示す。
【図７】２つの方法により同時に行ったスクリーニングにより得られた完全な状態のライブラリを用いてＥＭＸ１遺伝子のオンターゲット活性およびオフターゲット活性を測定した結果を示す。
【０１１８】
図８および９は、スクリーニングにより選択された３つのクローンを用いて哺乳類細胞中のＤＭＤ遺伝子およびＥＭＸ１遺伝子の各々についてオンターゲット実験およびオフターゲット実験を行うことにより得られた結果であり、向上した特異性を特定する結果である。
【図８】ＨＥＫ２９３ｔ細胞中のヒトＥＭＸ−１を標的とする３つの異なるクローン（＃１、＃２０および＃３５）のオンターゲット活性およびオフターゲット活性を示す。
【図９】ＨＥＫ２９３ｔ細胞中のヒトＴ−ＤＭＤを標的とする３つの異なるクローン（＃１、＃２０および＃３５）のオンターゲット活性およびオフターゲット活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
［用語の定義］
「切断する（ｃｌｅａｖｅ）」、「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」、および／または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」という用語は、特定の核酸に切断を生成する作用を指す。切断（破壊）は、当業者に理解されるように、平滑末端または粘着末端（すなわち、５'または３'オーバーハング）を残すものであってよい。この用語は、一本鎖ＤＮＡ切断（「ニック」）および二本鎖ＤＮＡ切断も含む。
【０１２０】
「組換細胞」という用語は、遺伝子工学技術（すなわち、組み換え技術）を用いて母細胞を遺伝子的に改変することにより生成される宿主細胞を指す。組換細胞には、母細胞のゲノムにおいてヌクレオチド配列を付加、欠失、および／または改変したものが含まれてよい。
【０１２１】
「相同性」という用語は、２つ以上の核酸配列、または２つ以上のアミノ酸配列の間の同一性を指す。配列同一性は、％同一性（または類似性もしくは相同性）として測定することができ、％が高いほど配列間の同一性が高い。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオーソログを標準的な方法を用いてアライメントすると、配列同一性が比較的高くなる。比較のために、配列をアライメントする方法が当技術分野においてよく知られている。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが文献［参照：Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２、１９８１年；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３、１９７０年；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４、１９８８年；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ、７３：２３７−４４、１９８８年；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０、１９８８年；  Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  Ｂｉｏｓｃ．  ８、１５５−６５、１９９２年；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２４：３０７−３１、１９９４年．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０、１９９０年］において説明されており、配列アライメント方法および相同性計算方法の詳細が説明されている。配列解析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと用いるには、文献［参照：ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０、１９９０年］がＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ、Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．  ２０８９４）およびインターネットを含む様々なソースから利用可能である。ＮＣＢＩのウェブサイトにてさらなる情報を見出すことができる。
【０１２２】
「交雑」という用語は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化した複合体を形成する反応を指す。当該水素結合は、ワトソン・クリック型塩基対合によって、フーグスティーン型結合によって、または任意の他の配列特異的な方式で生じるものであってよい。当該複合体は、二重構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己交雑鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含むものであってよい。
【０１２３】
「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えばｍＲＮＡまたは別のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコード化されたポリペプチドは、まとめて「遺伝子生成物」と称されてよい。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれてよい。
【０１２４】
「選択要素」または「選択マーカー」という用語は、本明細書で説明するようなヌクレアーゼのオンターゲット効果および／またはオフターゲット効果を特定および選択するガイドとして機能する遺伝子を指す。選択要素は、限定されるものではないが、毒素遺伝子、蛍光マーカー、発光マーカー、および薬剤選択マーカーを含んでよい。蛍光マーカーとしては、限定されるものではないが、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＦＰ）等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が含まれてよい。発光マーカーとしては、限定されるものではないが、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質をコードする遺伝子を含まれてよい。本明細書で提供する方法および組成物において用いるのに適した薬剤選択マーカーとしては、限定されるものではないが、例えばアンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、およびネオマイシンといった抗生物質に対する耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、選択は、ポジティブセレクション、すなわち、マーカーを発現する細胞群を集団から単離して、例えば選択マーカーを含む濃縮細胞集団を生成するものであってよい。別の例において、選択は、ネガティブセレクション、すなわち、集団を細胞群から単離して、例えば選択マーカーを含まない濃縮細胞集団を生成するものであってよい。分離は、用いられる選択マーカーに対して適切な任意の好都合な技法によって行うことができる。例えば、蛍光マーカーを用いる場合は、蛍光活性化細胞選別によって細胞群を分離することができ、一方でそこに細胞表面マーカーを挿入する場合は、アフィニティ分離技術、例えば磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、固相マトリックスに付着させたアフィニティ試薬を用いた「パニング」、または他の好都合な技法によって、細胞群を異種集団から分離することができる。
【０１２５】
本発明の実装には、別途指示のない限り、免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム学および組み換えＤＮＡの典型的技法を用いる。
【０１２６】
以下、本発明の原理が用いられる例示的実施形態により、本発明を詳細に説明する。
【０１２７】
［スクリーニングシステム］
［１．スクリーニングシステム］
本発明は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムに関する。本明細書で用いる場合、「標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステム」という用語は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするのに用いられる組成物およびキット、これを用いるための方法、ならびにそれらのプロセスの間に誘導される様々な中間体の全てを含む概念を指す。本明細書において用語「システム」として説明される発明は、本発明が所望の標的特異的ヌクレアーゼのスクリーニングに用いられる限りにおいて、組成物または方法として、対応する発明の態様に適するように解釈されてよい。
【０１２８】
よって、本発明の一実施形態は、
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニング用組成物であって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備える組成物である。
【０１２９】
［１−１．標的特異的ヌクレアーゼ：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム］
「標的特異的ヌクレアーゼ」は、標的を特異的に認識することが可能な部分と、認識された標的を切断または改変することが可能な部分とからなるものであってよい。
【０１３０】
標的を特異的に認識することが可能な部分は、標的の遺伝子または核酸の配列に応じて異なるものであってよい。
【０１３１】
認識された標的を切断または改変することが可能な部分は、認識された標的を切断または改変することができる。この場合、標的を特異的に認識することが可能な部分および認識された標的を切断または改変することが可能な部分は、各々別個に存在してよく、または単一の構造体として機能的に分割されて存在してもよい。
【０１３２】
標的特異的ヌクレアーゼは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせであってよく、好ましくはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよいが、これらに限定されない。
【０１３３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０１３４】
この場合、ガイドＲＮＡは、標的を特異的に認識することが可能な部分であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、認識された標的を切断または改変することが可能な部分であってよい。
【０１３５】
［１−１−１  ガイドＲＮＡ］
ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合する核酸配列を含んでよい。
【０１３６】
ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を含むｃｒＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するｔｒａｃｒＲＮＡとからなるものであってよい。
【０１３７】
この場合、ｃｒＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合することが可能な部分であるガイド配列を含む。ガイド配列は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を有し、標的とすべき遺伝子または核酸の配列を認識するよう機能してよい。
【０１３８】
ガイド配列のサイズは、５〜５０、５〜４０、５〜３０、または５〜２０ｂｐｓであってよいが、これらに限定されない。好ましくは、ガイド配列は、５〜２０ｂｐｓのサイズを有してよい。
【０１３９】
ガイド配列の核酸配列は、５０〜１００％が標的とすべき遺伝子または核酸の配列または位置と相補的に結合する核酸配列を含んでよいが、これに限定されない。
【０１４０】
さらに、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分と相補的な配列を有する部分を含み、したがって、ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡに部分的に相補的に結合し得る。
【０１４１】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが各々独立に存在するデュアルガイドＲＮＡであってよい。代替的に、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが互いに接続されたシングルガイドＲＮＡであってよい。この場合、シングルガイドＲＮＡは、リンカーを含んでよい。
【０１４２】
さらに、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じてｃｒＲＮＡのみを含むものであってよい。
【０１４３】
ガイドＲＮＡは、化学的修飾を含んでよい。この場合、化学的修飾は、ガイドＲＮＡに含まれる核酸のうち１つまたは２つ以上の核酸において、ホスホロチオエート連鎖、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を改変するものを含んでよい。
【０１４４】
ガイドＲＮＡは、５'末端の部分的配列がトランケートされたガイドＲＮＡであってよい。
【０１４５】
ガイドＲＮＡの核酸配列は、標的の遺伝子または核酸の配列に応じて設計することができる。
【０１４６】
ガイドＲＮＡは、ベクターに含まれてよく、この場合、ベクターは、ＰｌｔｅｔＯ−１、ａｒａｐＢＡＤ、ｒｈａｍｐＢＡＤまたはＴ７プロモーターなどの、ガイドＲＮＡの発現に適したプロモーターを含んでよい。
【０１４７】
ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたものであってよい。
【０１４８】
［１−１−２  ＣＲＩＳＰＲ酵素］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸であってよい。
【０１４９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸は、ベクターに含まれてよい。この場合、ベクターは、ＣＭＶまたはＣＡＧなどの、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現に適したプロモーターを含んでよい。
【０１５０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０１５１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、導入される対象に適したものとなるようコドン最適化されてよい。
【０１５２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０１５３】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であってよい。
【０１５４】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃｐｆ１酵素であってよい。
【０１５５】
Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）またはそれらのオーソログであってよいが、これらに限定されない。好ましくは、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９またはＣｊＣａｓ９であってよい。
【０１５６】
Ｃａｓ９は、活性Ｃａｓ９または不活性Ｃａｓ９であってよい。
【０１５７】
不活性Ｃａｓ９は、完全不活性化Ｃａｓ９および部分不活性化Ｃａｓ９（例えばニッカーゼ）を含んでよい。
【０１５８】
Ｃａｓ９に関して、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメイン中に存在する１つまたは２つ以上のアミノ酸が変異していてよい。
【０１５９】
Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうちＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３およびＤ９８６からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１６０】
Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうちＲ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５およびＨ９８２からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１６１】
Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうちＧ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５およびＴ１３３７からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１６２】
Ｃｐｆ１は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）またはそれらのオーソログであってよいが、これらに限定されない。
【０１６３】
Ｃｐｆ１は、活性Ｃｐｆ１または不活性Ｃｐｆ１であってよい。
【０１６４】
不活性Ｃｐｆ１は、完全不活性化Ｃｐｆ１および部分不活性化Ｃｐｆ１（例えばニッカーゼ）を含んでよい。
【０１６５】
Ｃｐｆ１に関して、ＲｕｖＣ、Ｎｕｃ、ＷＥＤ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメイン中に存在する１つまたは２つ以上のアミノ酸が変異していてよい。
【０１６６】
Ｃｐｆ１は、ＦｎＣｐｆ１のアミノ酸のうちのＤ９１７、Ｅ１００６またはＤ１２５５、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸のうちのＤ９０８、Ｅ９９３またはＤ１２６３、ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸のうちのＤ８３２、Ｅ９２５、Ｄ９４７またはＤ１１８０からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣｐｆ１オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１６７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することができる。
【０１６８】
ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のソースに応じて異なるものであってよい。
【０１６９】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＧＧ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＡＧＡＡＷ−３′（Ｗ＝ＡまたはＴ）であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３′（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＹ＝ＣまたはＴ）であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＦｎＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′ＴＴＮ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′−ＴＴＴＮ−３′であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０１７０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインを追加的に含んでよい。この場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０１７１】
機能ドメインは、非相同機能ドメイン（ＨＦＤ）であってよい。
【０１７２】
機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写リリース因子活性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性および分子スイッチ（例えば光誘導性）からなる群から選択されるものであってよい。
【０１７３】
機能ドメインは、メチラーゼ、デメチラーゼ、ホスファーゼ、チミジンキナーゼ、システインデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼからなる群から選択されるものであってよい。
【０１７４】
機能ドメインをＣＲＩＳＰＲ酵素に接続するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素と機能ドメインとの間にリンカーを追加的に含めることができる。
【０１７５】
リンカーは、（Ａ）ｎ、（Ｇ）ｎ、ＧＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＳＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、ＸＴＥＮまたは（ＸＰ）ｎであってよく、この場合、ｎは１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上であってよい。ただし、リンカーおよびｎはこれらに限定されない。
【０１７６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、核局在配列（ＮＬＳ）を追加的に含んでよい。
【０１７７】
［１−１−３  ＣＲＩＳＰＲ酵素の変異］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０１７８】
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全不活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素および部分不活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばニッカーゼ）を含んでよい。
【０１７９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源でないＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０１８０】
この場合、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素の少なくとも１つまたは複数のアミノ酸が変異したＣＲＩＳＰＲ酵素であってよく、この変異は、アミノ酸の置換、除去、および付加等であってよい。
【０１８１】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１８２】
ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩまたはＲｕｖＣＩＩＩドメインであってよい。
【０１８３】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１８４】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１８５】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１８６】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮｕｃドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１８７】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＷＥＤドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０１８８】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、各変異ＣＲＩＳＰＲ酵素の一部分を連結することにより組み換えられたＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０１８９】
例えば、自然状態で存在するＣＲＩＳＰＲ酵素（すなわち、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素）のＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＩドメインを、それぞれＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１のＲｕｖＣドメイン、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体２のＨＮＨドメイン、およびＣＲＩＳＰＲ酵素多様体３のＰＩドメインと置換するまたは組み換えることができる。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５００（またはこれをコードする核酸配列）をＣＲＩＳＰＲ酵素多様体２のアミノ酸配列のアミノ酸番号５０１〜１０００（またはこれをコードする核酸配列）およびＣＲＩＳＰＲ酵素多様体３のアミノ酸配列のアミノ酸番号１００１〜末端（またはこれをコードする核酸配列）と組み合わせることにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１、２、および３とは異なる新たなＣＲＩＳＰＲ多様体を構築することができる。
【０１９０】
別の例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１の一部分、例えばそのアミノ酸配列のアミノ酸番号５０〜７００（またはこれをコードする核酸配列）を、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体２のアミノ酸配列のアミノ酸番号５０〜７００（またはこれをコードする核酸配列）と置換するまたは組み換えることができる。
【０１９１】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、異なるＣＲＩＳＰＲ酵素を組み合わせることにより生成されるＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０１９２】
例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインは、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインと置換するまたは組み換えることができる。
【０１９３】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素に機能ドメインが追加的に含まれたＣＲＩＳＰＲ酵素多様体であってよい。
【０１９４】
機能ドメインは、非相同機能ドメイン（ＨＦＤ）であってよい。機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写リリース因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性および分子スイッチ（例えば光誘導性）からなる群から選択されるものであってよい。
【０１９５】
機能ドメインは、メチラーゼ、デメチラーゼ、ホスファーゼ、チミジンキナーゼ、システインデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼからなる群から選択されるものであってよい。
【０１９６】
機能ドメインをＣＲＩＳＰＲ酵素に接続するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素と機能ドメインとの間にリンカーを追加的に含めることができる。
【０１９７】
リンカーは、（Ａ）ｎ、（Ｇ）ｎ、ＧＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＳＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、ＸＴＥＮまたは（ＸＰ）ｎであってよく、この場合、ｎは１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上であってよい。ただし、リンカーおよびｎはこれらに限定されない。
【０１９８】
例えば、ＣＰＩＳＰＲ酵素多様体は、不活性酵素における転写抑制ドメインを含み、またＣＰＩＳＰＲ酵素多様体は、標的の遺伝子または核酸の配列の発現を抑制する多様体であってよい。加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体は、不活性酵素におけるシチジンデアミナーゼを含み、またＣＲＩＳＰＲ酵素多様体は、標的の遺伝子または核酸の配列の特定の塩基配列を変化させることにより、対応する遺伝子または核酸の配列の発現を抑制または増進することが可能な多様体であってよい。
【０１９９】
［１−１−４  ＣＲＩＳＰＲ酵素の変異効果］
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸（すなわちオンターゲット）に対する切断効果が増大するよう変異したものであってよい。
【０２００】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸（すなわちオンターゲット）に対する切断効果が低下するよう変異したものであってよい。
【０２０１】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的でない遺伝子または核酸（すなわちオフターゲット）に対する切断効果が増大するよう変異したものであってよい。
【０２０２】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的でない遺伝子または核酸（すなわちオフターゲット）に対する切断効果が低下するよう変異したものであってよい。
【０２０３】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸に結合される能力が増大するよう改変されたものであってよい。
【０２０４】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸に結合される能力が低下するよう改変されたものであってよい。
【０２０５】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する能力が増大するよう改変されたものであってよい。
【０２０６】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列におけるＰＡＭを認識する能力が低下するよう改変されたものであってよい。
【０２０７】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ動態（ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）が改変されたものであってよい。
【０２０８】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、改変に応じた構造再構成（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を含んでよい。
【０２０９】
［１−２．ＣＲＩＳＰＲ複合体］
ＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してよい。
【０２１０】
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の外部で形成されてよい。
【０２１１】
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の細胞質内で形成されてよい。
【０２１２】
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の核内で形成されてよい。
【０２１３】
ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列中に存在するＰＡＭを認識することができる。
【０２１４】
ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合することができる。
【０２１５】
ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的とすべき遺伝子または核酸の配列に結合すると、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的とすべき遺伝子または核酸の配列を切断または改変することができる。
【０２１６】
この場合、標的特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することができる。
【０２１７】
標的特異的ヌクレアーゼの細胞への導入は、ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等により行うことができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０２１８】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０２１９】
［１−３  複数標的］
標的は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよい。
【０２２０】
複数標的は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列（すなわちオンターゲット）および標的でない遺伝子または核酸の配列（すなわちオフターゲット）からなるものであってよい。
【０２２１】
複数標的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットからなるものであってよい。一実施形態として、複数標的は、１つのオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットからなるものであってよい。別の実施形態として、複数標的は、１つのオンターゲットおよび１つのオフターゲットからなるものであってよい。
【０２２２】
複数標的は、細胞中に存在する、または外部源から導入されるものであってよい。
【０２２３】
複数標的が細胞中に存在する場合、複数標的は、宿主細胞のゲノム中に存在するものであってよい。好ましくは、１つまたは複数のオフターゲットは、宿主細胞のゲノム中に存在するものであってよい。
【０２２４】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、ベクターシステムを用いて複数標的を導入することができる。
【０２２５】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、ベクターシステムを用いて複数標的を導入することができる。
【０２２６】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、標的ごとに異なるベクターを用いて複数標的を導入することができる。すなわち、複数標的が１つのオンターゲットおよび１つのオフターゲットからなる場合、ベクターは、オンターゲットを含むベクターおよびオフターゲットを含むベクターからなるものであってよい。
【０２２７】
複数標的の細胞への導入は、ウイルスベクターシステム、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等により行うことができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０２２８】
［１−３−１  オンターゲット］
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２２９】
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識することが可能な部分の核酸配列と相補的な配列を有する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２３０】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２３１】
この場合、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列は、５〜５０ｂｐｓであってよく、さらに、その長さはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列の長さに応じて調節されてよい。
【０２３２】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列を含んでよい。
【０２３３】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列とを含んでよい。
【０２３４】
この場合、オンターゲットのガイドＲＮＡまたはＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の５'末端に位置してよい。
【０２３５】
この場合、オンターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の３'末端に位置してよい。
【０２３６】
オンターゲットは、（Ｎ）５〜５０−ＰＡＭまたはＰＡＭ−（Ｎ）５〜５０であってよく、この場合、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０２３７】
加えて、オンターゲットは、細胞のゲノム中に位置してよい。
【０２３８】
細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０２３９】
この場合、オンターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０２４０】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０２４１】
毒素遺伝子は、Ｈｏｋ、ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＴｘｐＡ／ＢｒｎＴ、ＳｙｍＥ、ＸＣＶ１２６２、ＣｃｄＢ、ＰａｒＥ、ＭａｚＦ、ｙａｆＯ、ＨｉｃＡ、Ｋｉｄ、Ｚｅｔａ、ＤａｒＴまたはＳｘｔ遺伝子であってよく、好ましくはＣｃｄＢであってよいが、これらに限定されない。
【０２４２】
毒素遺伝子は、オンターゲットのソースに応じて（すなわち発生源に応じて）変化するものであってよい。すなわち、毒素遺伝子は、宿主細胞の種類に応じて当業者により適切に選択および使用することができる。
【０２４３】
宿主がＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合、毒素遺伝子ｃｃｄＢを用いることができる。
【０２４４】
宿主細胞が哺乳類細胞である場合、毒素遺伝子ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いることができる。
【０２４５】
宿主が酵母である場合、毒素遺伝子ＵＲＡ３を用いることができる。
【０２４６】
抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質の種類に応じて様々に設計されてよい。
【０２４７】
抗生物質は、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、ゼオシン、ピューロマイシン、またはクロラムフェニコールであってよく、これらに限定されない。
【０２４８】
「蛍光タンパク質」は、蛍光を発現するタンパク質であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、またはオレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ）であってよく、これらに限定されない。
【０２４９】
タグは、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、Ｓｎｏｏｐ  Ｔａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＨａｌｏＴａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、またはポリ（ＮＡＮＰ）であってよい。
【０２５０】
この場合、選択要素を含むオンターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、選択要素が発現しなくなり得る。
【０２５１】
［１−３−２  オフターゲット］
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合する非標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２５２】
オフターゲットは、オンターゲット中の１つまたは複数の他の塩基配列を含む核酸の配列であってよい。
【０２５３】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識することが可能な部分の核酸配列と部分的に相補的な配列を有する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２５４】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２５５】
この場合、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列は、５〜５０ｂｐｓであってよく、さらに、その長さはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列の長さに応じて調節されてよい。
【０２５６】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列を含んでよい。
【０２５７】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列とを含んでよい。
【０２５８】
この場合、オフターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の５'末端に位置してよい。
【０２５９】
この場合、オフターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の３'末端に位置してよい。
【０２６０】
オフターゲットは、（Ｎ）５〜５０−ＰＡＭまたはＰＡＭ−（Ｎ）５〜５０であってよく、この場合、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０２６１】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識する部分の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２６２】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識する部分の核酸配列との相補性が１００％未満である結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。配列相同性が１００％未満である核酸配列は、オンターゲットの核酸配列と類似の核酸配列であり、１つまたは複数の異なる塩基配列が含まれる、または１つまたは複数の塩基配列が欠失した核酸配列であってよい。
【０２６３】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２６４】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列との相補性が１００％未満である結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２６５】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列のうち１つまたは複数のミスマッチ核酸配列を含んでよい。
【０２６６】
この場合、オフターゲットは、細胞のゲノム中に位置してよい。
【０２６７】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０２６８】
この場合、オフターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０２６９】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０２７０】
この場合、選択要素を含むオフターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、選択要素が発現しなくなり得る。
【０２７１】
この場合、選択要素を含むオフターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されないときは、選択要素が発現し得る。
【０２７２】
［１−４  選択要素の効果］
本発明の「選択要素」という用語は、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出するためのマーカーを指す。よって、「選択要素」は、「選択マーカー」と交換可能に用いることができる。
【０２７３】
選択要素が発現したか否かに基づいて、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出することができる。すなわち、オンターゲット効果が増大したかおよび／またはオフターゲット効果が低下したかを検出することができる。
【０２７４】
オンターゲットおよび／またはオフターゲットに含まれる選択要素は、標的特異的ヌクレアーゼの高特異性または高活性を判定する要素であってよい。
【０２７５】
一例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび選択要素として抗生物質耐性遺伝子を含むオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットおよびオフターゲットを含むそれぞれのベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果として抗生物質耐性遺伝子が発現するということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が、抗生物質で処理された場合に生存することができる。したがって、これらの選択要素が発現するか否かに基づいて、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングすることができる。
【０２７６】
別の例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび細胞のゲノム中に存在するオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットを含むベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果としてゲノムは切断されないということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が生存することができ、オンターゲットおよびオフターゲットの両方が切断された細胞は、オフターゲットの切断によってゲノムが切断されるため生存することができず、それによりこれら２種類の細胞を互いに区別することができる。
【０２７７】
さらに別の例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび選択要素として蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットを含むベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果として蛍光タンパク質が発現するということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が生存することができ、またこれを蛍光タンパク質と区別することもできる。
【０２７８】
上述のように、選択要素に応じて、標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法を様々に設計することができる。
【０２７９】
［２．スクリーニング方法］
スクリーニングシステムを用いて、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングすることができる。
【０２８０】
一態様として、本発明は、複数の標的特異的ヌクレアーゼ試験群のうちから高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法に関する。
【０２８１】
本発明において、「標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法」という用語は、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを含む細胞の選別を指す。すなわち、当該方法は、特定のヌクレアーゼを特定するステップよりも前のステップを指す。
【０２８２】
特に、当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼライブラリを改良することにより調製される様々なヌクレアーゼの多様体のうちから高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するときに非常に有用である。
【０２８３】
［２−１．スクリーニング方法の第１の実施形態］
具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼの様々な「多様体」のうちから高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法として利用することができる。
【０２８４】
当該方法は、
ｉ）１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ｉｉ）標的特異的ヌクレアーゼ多様体と
を用いる方法であって、
ａ）ｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）ａ）においてオンターゲットのみが改変された細胞を選別する段階と
を含む方法である。
【０２８５】
［２−１−１  成分］
この場合、ｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉ）成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
【０２８６】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよく、それに加えてＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＦｏｋＩ、またはそれらの混合物であってよく、これらに限定されない。
【０２８７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０２８８】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼ多様体は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの多様体であってよく、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素の多様体であってよいが、これらに限定されない。ヌクレアーゼ多様体は、電磁波、ＵＶ、放射線、化学物質、および外来／内在遺伝子作用等により生成することができる。一例において、ＷＴ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムにＵＶを照射することによって多様体を得た。
【０２８９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素の多様体は、Ｃａｓ９の多様体であってよい。
【０２９０】
Ｃａｓ９の多様体は、オンターゲット効果が増大または低下した多様体であってよい。この場合、オンターゲット効果は、オンターゲット位置がＣａｓ９によって切断または改変されることを意味する。
【０２９１】
Ｃａｓ９の多様体は、オフターゲット効果が増大または低下した多様体であってよい。この場合、オフターゲット効果は、オフターゲット位置がＣａｓ９によって切断または改変されることを意味する。
【０２９２】
好ましくは、Ｃａｓ９の多様体は、オンターゲット効果が増大および／またはオフターゲット効果が低下した多様体であってよい。
【０２９３】
ｉｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、同じベクターまたは異なるベクターに含まれてよい。
【０２９４】
ｉｉ）成分はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）システムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ・タンパク質複合体の形態であってよい。
【０２９５】
ｉｉ）成分は、人工的に合成されたものであってよい。
【０２９６】
ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたものであってよく、またＣＲＩＳＰＲ酵素は、人工的に合成されたタンパク質またはポリペプチドであってよい。
【０２９７】
ｉ）成分において、オンターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２９８】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０２９９】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を形成する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０３００】
ｉ）成分において、オンターゲットおよび／またはオフターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０３０１】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０３０２】
［２−１−２  方法］
この場合、ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０３０３】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０３０４】
一方、オフターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０３０５】
ｉ）成分のうちのオフターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオンターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０３０６】
一方、オンターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０３０７】
ｉ）成分のうちのオンターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオフターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０３０８】
ｂ）において、
ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分が導入された細胞群のうち、ｉ）成分のうちのオンターゲットのみがｉｉ）成分によって切断された細胞を選別することができる。
【０３０９】
オンターゲットに含まれる選択要素の発現の抑制により、オンターゲットのみが切断された細胞を選択することができる。
【０３１０】
例えば、オンターゲットが毒素遺伝子を含む場合、オンターゲットが切断されることに伴う毒素遺伝子の発現の抑制に起因して、細胞が生存することができる。
【０３１１】
さらに、ｉ）成分のうちのオフターゲットは、ｉｉ）成分によって切断されない細胞を選別することができる。
【０３１２】
オフターゲットが切断されないことに起因する選択要素の発現により、オフターゲットが切断されない細胞を選択することができる。
【０３１３】
例えば、オフターゲットが抗生物質耐性遺伝子を含む場合、オフターゲットが切断されないことに伴う抗生物質耐性遺伝子の発現により、抗生物質耐性を有する細胞を抗生物質の存在下で選別することができる。
【０３１４】
代替的に、オフターゲットが細胞のゲノム中に位置する場合、細胞のゲノムがｉｉ）成分により切断されず、それにより細胞のゲノムが正常なまま維持され、結果として細胞が生存することができる。
【０３１５】
この場合、ｂ）における選別された細胞は、ｉｉ）成分によってｉ）成分のオンターゲットが切断されてｉ）成分のオフターゲットが切断されない細胞であってよい。選択要素により、これらの細胞を区別することができる。
【０３１６】
したがって、上述のように、スクリーニング方法を用いて様々な標的特異的ヌクレアーゼ多様体のうちからオンターゲットのみを効果的に切断する高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングすることができ、またこの場合、様々な選択要素を用いた様々な検出方法によってスクリーニング方法を設計することができる。
【０３１７】
［２−２．スクリーニング方法の第２の実施形態］
別の具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼ「ライブラリ」における高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法として利用することができる。
【０３１８】
当該スクリーニング方法は、
ｉ）１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ｉｉ）標的特異的ヌクレアーゼライブラリと
を用いる方法であって、
ａ）ｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）ａ）においてオンターゲットのみが改変された細胞を選別する段階と
を含む方法である。
【０３１９】
［２−２−１  成分］
この場合、ｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉ）成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
【０３２０】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよく、それに加えてＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＦｏｋＩ、またはそれらの混合物であってよく、これらに限定されない。
【０３２１】
標的特異的ヌクレアーゼライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムライブラリであってよい。ヌクレアーゼライブラリは、直接作製されてよく、市販のものであってもよく、データベースから得られるものであってもよい。
【０３２２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０３２３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムライブラリは、ガイドＲＮＡライブラリおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素ライブラリであってよい。
【０３２４】
ｉｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、同じベクターまたは異なるベクターに含まれてよい。
【０３２５】
ｉｉ）成分はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）システムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ・タンパク質複合体の形態であってよい。
【０３２６】
ｉｉ）成分は、人工的に合成されたものであってよい。
【０３２７】
ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたものであってよく、またＣＲＩＳＰＲ酵素は、人工的に合成されたタンパク質またはポリペプチドであってよい。
【０３２８】
ｉ）成分において、オンターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０３２９】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０３３０】
成分ｉ）において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を形成する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０３３１】
ｉ）成分において、オンターゲットおよび／またはオフターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０３３２】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０３３３】
［２−２−２  方法］
この場合、ａ）においてｉ）およびｉｉ）成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０３３４】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０３３５】
一方、オフターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０３３６】
ｉ）成分のうちのオフターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオンターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０３３７】
一方、オンターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０３３８】
ｉ）成分のうちのオンターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオフターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０３３９】
ｂ）において、
ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分が導入された細胞群のうち、ｉ）成分のうちのオンターゲットのみがｉｉ）成分によって切断された細胞を選別することができる。
【０３４０】
オンターゲットに含まれる選択要素の発現の抑制により、オンターゲットのみが切断された細胞を選択することができる。
【０３４１】
例えば、オンターゲットが毒素遺伝子を含む場合、オンターゲットが切断されることに伴う毒素遺伝子の発現の抑制に起因して、細胞が生存することができる。
【０３４２】
さらに、ｉ）成分のうちのオフターゲットは、ｉｉ）成分によって切断されない細胞を選別することができる。
【０３４３】
オフターゲットが切断されないことに起因する選択要素の発現により、オフターゲットが切断されない細胞を選択することができる。
【０３４４】
例えば、オフターゲットが抗生物質耐性遺伝子を含む場合、オフターゲットが切断されないことに伴う抗生物質耐性遺伝子の発現により、抗生物質耐性を有する細胞を抗生物質の存在下で選別することができる。
【０３４５】
代替的に、オフターゲットが細胞のゲノム中に位置する場合、細胞のゲノムがｉｉ）成分により切断されず、それにより細胞のゲノムが正常なまま維持され、結果として細胞が生存することができる。
【０３４６】
この場合、ｂ）における選別された細胞は、ｉｉ）成分によってｉ）成分のオンターゲットが切断されてｉ）成分のオフターゲットが切断されない細胞であってよい。選択要素により、これらの細胞を区別することができる。
【０３４７】
したがって、上述のように、スクリーニング方法を用いることにより、選択された細胞によって標的特異的ヌクレアーゼライブラリにおける高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングすることができ、またこの場合、様々な選択要素を用いた様々な検出方法によってスクリーニング方法を設計することができる。
【０３４８】
［選択システム］
［３．標的特異的ヌクレアーゼの選択システム］
当該スクリーニングシステムを用いることにより、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを含む細胞が試験ヌクレアーゼから選別され、さらに、そこから所望のヌクレアーゼを選択（特定）することができる。
【０３４９】
本発明の別の態様は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼの選択システムに関する。
【０３５０】
「標的特異的ヌクレアーゼの選択システム」という用語は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択し、その具体的構成を特定するのに用いられる組成物およびキット、これを用いるための方法、ならびにそれらのプロセスの間に誘導される様々な中間体の全てを含む概念を指す。本明細書において「システム」として説明される発明は、本発明が所望の標的特異的ヌクレアーゼの選択に用いられる限りにおいて、組成物または方法として、対応する発明の態様に適するように解釈されてよい。
【０３５１】
選択システムは、複数標的および標的特異的ヌクレアーゼからなるものであってよい。
【０３５２】
［３−１．標的特異的ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）］
この場合、「標的特異的ヌクレアーゼ」は、標的を特異的に認識することが可能な部分と、認識された標的を切断または改変することが可能な部分とからなるものであってよい。
【０３５３】
標的を特異的に認識することが可能な部分は、標的の遺伝子または核酸の配列に応じて異なるものであってよい。
【０３５４】
認識された標的を切断または改変することが可能な部分は、認識された標的を切断または改変することができる。この場合、標的を特異的に認識することが可能な部分および認識された標的を切断または改変することが可能な部分は、各々別個に存在してよく、または単一の構造体として機能的に分割されて存在してもよい。
【０３５５】
標的特異的ヌクレアーゼは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせであってよく、好ましくはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよいが、これらに限定されない。
【０３５６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０３５７】
この場合、ガイドＲＮＡは、標的を特異的に認識することが可能な部分であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、認識された標的を切断または改変することが可能な部分であってよい。
【０３５８】
［３−１−１  ガイドＲＮＡ］
ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合する核酸配列を含んでよい。
【０３５９】
ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を含むｃｒＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するｔｒａｃｒＲＮＡとからなるものであってよい。
【０３６０】
この場合、ｃｒＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合することが可能な部分であるガイド配列を含む。ガイド配列は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を有し、標的とすべき遺伝子または核酸の配列を認識するよう機能してよい。
【０３６１】
ガイド配列のサイズは、５〜５０、５〜４０、５〜３０、または５〜２０ｂｐｓであってよいが、これらに限定されない。好ましくは、ガイド配列は、５〜２０ｂｐｓのサイズを有してよい。
【０３６２】
ガイド配列の核酸配列は、５０〜１００％が標的とすべき遺伝子または核酸の配列または位置と相補的に結合する核酸配列を含んでよいが、これに限定されない。
【０３６３】
さらに、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分と相補的な配列を有する部分を含み、したがって、ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡに部分的に相補的に結合し得る。
【０３６４】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが各々別個に存在するデュアルガイドＲＮＡであってよい。代替的に、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが互いに接続されたシングルガイドＲＮＡであってよい。この場合、シングルガイドＲＮＡは、リンカーを含んでよい。
【０３６５】
さらに、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じてｃｒＲＮＡのみを含むものであってよい。
【０３６６】
ガイドＲＮＡは、化学的修飾を含んでよい。この場合、化学的修飾は、ガイドＲＮＡに含まれる核酸のうち１つまたは２つ以上の核酸において、ホスホロチオエート連鎖、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル  ３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル  ３'チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を改変するものを含んでよい。
【０３６７】
ガイドＲＮＡは、５'末端の部分的配列がトランケートされたガイドＲＮＡであってよい。
【０３６８】
ガイドＲＮＡの核酸配列は、標的の遺伝子または核酸の配列に応じて設計することができる。
【０３６９】
ガイドＲＮＡは、ベクターに含まれてよく、この場合、ベクターは、ＰｌｔｅｔＯ−１、ａｒａｐＢＡＤ、ｒｈａｍｐＢＡＤまたはＴ７プロモーターなどの、ガイドＲＮＡの発現に適したプロモーターを含んでよい。
【０３７０】
ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたものであってよい。
【０３７１】
［３−１−２  ＣＲＩＳＰＲ酵素］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸であってよい。
【０３７２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸は、ベクターに含まれてよい。この場合、ベクターは、ＣＭＶまたはＣＡＧなどの、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現に適したプロモーターを含んでよい。
【０３７３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０３７４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、導入される対象に適したものとなるようコドン最適化されてよい。
【０３７５】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０３７６】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であってよい。
【０３７７】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃｐｆ１酵素であってよい。
【０３７８】
Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）またはそれらのオーソログであってよいが、これらに限定されない。好ましくは、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９またはＣｊＣａｓ９であってよい。Ｃａｓ９は、活性Ｃａｓ９または不活性Ｃａｓ９であってよい。
【０３７９】
不活性Ｃａｓ９は、完全不活性化Ｃａｓ９および部分不活性化Ｃａｓ９（例えばニッカーゼ）を含んでよい。
【０３８０】
Ｃａｓ９に関して、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメイン中に存在する１つまたは２つ以上のアミノ酸が変異していてよい。
【０３８１】
Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうちＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３およびＤ９８６からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０３８２】
Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうちＲ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５およびＨ９８２からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０３８３】
Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうちＧ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５およびＴ１３３７からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０３８４】
Ｃｐｆ１は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）またはそれらのオーソログであってよいが、これらに限定されない。
【０３８５】
Ｃｐｆ１は、活性Ｃｐｆ１または不活性Ｃｐｆ１であってよい。
【０３８６】
不活性Ｃｐｆ１は、完全不活性化Ｃｐｆ１および部分不活性化Ｃｐｆ１（例えばニッカーゼ）を含んでよい。
【０３８７】
Ｃｐｆ１に関して、ＲｕｖＣ、Ｎｕｃ、ＷＥＤ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメイン中に存在する１つまたは２つ以上のアミノ酸が変異していてよい。
【０３８８】
Ｃｐｆ１は、ＦｎＣｐｆ１のアミノ酸のうちのＤ９１７、Ｅ１００６またはＤ１２５５、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸のうちのＤ９０８、Ｅ９９３またはＤ１２６３、ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸のうちのＤ８３２、Ｅ９２５、Ｄ９４７またはＤ１１８０からなるアミノ酸群、またはこれらに対応する他のＣｐｆ１オーソログのアミノ酸群における１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０３８９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することができる。
【０３９０】
ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のソースに応じて異なるものであってよい。
【０３９１】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＧＧ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＡＧＡＡＷ−３′（Ｗ＝ＡまたはＴ）であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９である場合、ＰＡＭは５′−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３′（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＹ＝ＣまたはＴ）であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＦｎＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′ＴＴＮ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′−ＴＴＴＮ−３′であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０３９２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインを追加的に含んでよい。この場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０３９３】
機能ドメインは、非相同機能ドメイン（ＨＦＤ）であってよい。  機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写リリース因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性および分子スイッチ（例えば光誘導性）からなる群から選択されるものであってよい。
【０３９４】
機能ドメインは、メチラーゼ、デメチラーゼ、ホスファーゼ、チミジンキナーゼ、システインデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼからなる群から選択されるものであってよい。
【０３９５】
機能ドメインをＣＲＩＳＰＲ酵素に接続するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素と機能ドメインとの間にリンカーを追加的に含めることができる。
【０３９６】
リンカーは、（Ａ）ｎ、（Ｇ）ｎ、ＧＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＳＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、ＸＴＥＮまたは（ＸＰ）ｎであってよく、この場合、ｎは１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上であってよい。ただし、リンカーおよびｎはこれらに限定されない。
【０３９７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、核局在配列（ＮＬＳ）を追加的に含んでよい。
【０３９８】
［３−１−３  ＣＲＩＳＰＲ酵素の改変］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０３９９】
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全不活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素および部分不活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばニッカーゼ）を含んでよい。
【０４００】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源でないＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０４０１】
この場合、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素の少なくとも１つまたは複数のアミノ酸が変異したＣＲＩＳＰＲ酵素であってよく、この変異は、アミノ酸の置換、除去、および付加等であってよい。
【０４０２】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０４０３】
ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩまたはＲｕｖＣＩＩＩドメインであってよい。
【０４０４】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０４０５】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０４０６】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０４０７】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮｕｃドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０４０８】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然起源ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメイン中に存在するアミノ酸のうち１つまたは２つ以上のアミノ酸の変異を含んでよい。
【０４０９】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、各変異ＣＲＩＳＰＲ酵素の一部分を連結することにより組み換えられたＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０４１０】
例えば、自然状態で存在するＣＲＩＳＰＲ酵素（すなわち、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素）のＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＩドメインを、それぞれＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１のＲｕｖＣドメイン、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体２のＨＮＨドメイン、およびＣＲＩＳＰＲ酵素多様体３のＰＩドメインと置換するまたは組み換えることができる。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５００（またはこれをコードする核酸配列）をＣＲＩＳＰＲ酵素多様体２のアミノ酸配列のアミノ酸番号５０１〜１０００（またはこれをコードする核酸配列）およびＣＲＩＳＰＲ酵素多様体３のアミノ酸配列のアミノ酸番号１００１〜末端（またはこれをコードする核酸配列）と組み合わせることにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１、２、および３とは異なる新たなＣＲＩＳＰＲ多様体を構築することができる。
【０４１１】
別の例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体１の一部分、例えばそのアミノ酸配列のアミノ酸番号５０〜７００（またはこれをコードする核酸配列）を、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体２のアミノ酸配列のアミノ酸番号５０〜７００（またはこれをコードする核酸配列）と置換するまたは組み換えることができる。
【０４１２】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、異なるＣＲＩＳＰＲ酵素を組み合わせることにより生成されるＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
【０４１３】
例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインは、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインと置換するまたは組み換えることができる。
【０４１４】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素に機能ドメインが追加的に含まれたＣＲＩＳＰＲ酵素多様体であってよい。
【０４１５】
機能ドメインは、非相同機能ドメイン（ＨＦＤ）であってよい。  機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写リリース因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性および分子スイッチ（例えば光誘導性）からなる群から選択されるものであってよい。
【０４１６】
機能ドメインは、メチラーゼ、デメチラーゼ、ホスファーゼ、チミジンキナーゼ、システインデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼからなる群から選択されるものであってよい。
【０４１７】
機能ドメインをＣＲＩＳＰＲ酵素に接続するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素と機能ドメインとの間にリンカーを追加的に含めることができる。
【０４１８】
リンカーは、（Ａ）ｎ、（Ｇ）ｎ、ＧＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＳＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、ＸＴＥＮまたは（ＸＰ）ｎであってよく、この場合、ｎは１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上であってよい。ただし、リンカーおよびｎはこれらに限定されない。
【０４１９】
例えば、ＣＰＩＳＰＲ酵素多様体は、不活性酵素における転写抑制ドメインを含み、またＣＰＩＳＰＲ酵素多様体は、標的の遺伝子または核酸の配列の発現を抑制する多様体であってよい。加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素多様体は、不活性酵素におけるシチジンデアミナーゼを含み、またＣＲＩＳＰＲ酵素多様体は、標的の遺伝子または核酸の配列の特定の塩基配列を変化させることにより、対応する遺伝子または核酸の配列の発現を抑制または増進することが可能な多様体であってよい。
【０４２０】
［３−１−４  ＣＲＩＳＰＲ酵素の変異効果］
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸（すなわちオンターゲット）に対する切断効果が増大するよう変異したものであってよい。
【０４２１】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸（すなわちオンターゲット）に対する切断効果が低下するよう変異したものであってよい。
【０４２２】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的でない遺伝子または核酸（すなわちオフターゲット）に対する切断効果が増大するよう変異したものであってよい。
【０４２３】
変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的でない遺伝子または核酸（すなわちオフターゲット）に対する切断効果が低下するよう変異したものであってよい。
【０４２４】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸に結合される能力が増大するよう改変されたものであってよい。
【０４２５】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸に結合される能力が低下するよう改変されたものであってよい。
【０４２６】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する能力が増大するよう改変されたものであってよい。
【０４２７】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列におけるＰＡＭを認識する能力が低下するよう改変されたものであってよい。
【０４２８】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ動態が改変されたものであってよい。
【０４２９】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、改変に応じた構造再構成を含んでよい。
【０４３０】
［３−２．ＣＲＩＳＰＲ複合体］
ＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してよい。
【０４３１】
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の外部で形成されてよい。
【０４３２】
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の細胞質内で形成されてよい。
【０４３３】
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の核内で形成されてよい。
【０４３４】
ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列中に存在するＰＡＭを認識することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ガイドＲＮＡは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合することができる。
【０４３５】
ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的とすべき遺伝子または核酸の配列に結合すると、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的とすべき遺伝子または核酸の配列を切断または改変することができる。
【０４３６】
この場合、標的特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することができる。
【０４３７】
標的特異的ヌクレアーゼの細胞への導入は、ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等により行うことができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０４３８】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０４３９】
［３−３．複数標的］
この場合、標的は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよい。
【０４４０】
複数標的は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列（すなわちオンターゲット）および標的でない遺伝子または核酸の配列（すなわちオフターゲット）からなるものであってよい。
【０４４１】
複数標的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットからなるものであってよい。一実施形態として、複数標的は、１つのオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットからなるものであってよい。別の実施形態として、複数標的は、１つのオンターゲットおよび１つのオフターゲットからなるものであってよい。
【０４４２】
複数標的は、細胞中に存在する、または外部源から導入されるものであってよい。
【０４４３】
複数標的が細胞中に存在する場合、複数標的は、宿主細胞のゲノム中に存在するものであってよい。好ましくは、１つまたは複数のオフターゲットは、宿主細胞のゲノム中に存在するものであってよい。
【０４４４】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、ベクターシステムを用いて複数標的を導入することができる。
【０４４５】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、標的ごとに異なるベクターを用いて複数標的を導入することができる。すなわち、複数標的が１つのオンターゲットおよび１つのオフターゲットからなる場合、ベクターは、オンターゲットを含むベクターおよびオフターゲットを含むベクターからなるものであってよい。
【０４４６】
複数標的の細胞への導入は、ウイルスベクターシステム、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等により行うことができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０４４７】
［３−３−１  オンターゲット］
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４４８】
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識することが可能な部分の核酸配列と相補的な配列を有する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４４９】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４５０】
この場合、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列は、５〜５０ｂｐｓであってよく、さらに、その長さはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列の長さに応じて調節されてよい。
【０４５１】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列を含んでよい。
【０４５２】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列とを含んでよい。
【０４５３】
この場合、オンターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の５'末端に位置してよい。
【０４５４】
この場合、オンターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の３'末端に位置してよい。
【０４５５】
オンターゲットは、（Ｎ）５〜５０−ＰＡＭまたはＰＡＭ−（Ｎ）５〜５０であってよく、この場合、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０４５６】
この場合、オンターゲットは、細胞のゲノム中に位置してよい。
【０４５７】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０４５８】
この場合、オンターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０４５９】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０４６０】
毒素遺伝子は、Ｈｏｋ、ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＴｘｐＡ／ＢｒｎＴ、ＳｙｍＥ、ＸＣＶ１２６２、ＣｃｄＢ、ＰａｒＥ、ＭａｚＦ、ｙａｆＯ、ＨｉｃＡ、Ｋｉｄ、Ｚｅｔａ、ＤａｒＴ、またはＳｘｔ遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０４６１】
毒素遺伝子は、オンターゲットのソースに応じて（すなわち発生源に応じて）変化するものであってよい。すなわち、毒素遺伝子は、宿主細胞の種類に応じて当業者により適切に選択および使用することができる。
【０４６２】
宿主がＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合、毒素遺伝子ｃｃｄＢを用いることができる。
【０４６３】
宿主細胞が哺乳類細胞である場合、毒素遺伝子ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いることができる。
【０４６４】
宿主が酵母である場合、毒素遺伝子ＵＲＡ３を用いることができる。
【０４６５】
抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質の種類に応じて様々に設計されてよい。
【０４６６】
抗生物質は、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、ゼオシン、ピューロマイシン、またはクロラムフェニコールであってよく、これらに限定されない。
【０４６７】
蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、またはオレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ）であってよく、これらに限定されない。
【０４６８】
タグは、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、Ｓｎｏｏｐ  Ｔａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＨａｌｏＴａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、またはポリ（ＮＡＮＰ）であってよい。
【０４６９】
この場合、選択要素を含むオンターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、選択要素が発現しなくなり得る。
【０４７０】
［３−３−２  オフターゲット］
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合する非標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４７１】
オフターゲットは、オンターゲット中の１つまたは複数の他の塩基配列を含む核酸の配列であってよい。
【０４７２】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識することが可能な部分の核酸配列と部分的に相補的な配列を有する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４７３】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４７４】
この場合、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列は、５〜５０ｂｐｓであってよく、さらに、その長さはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列の長さに応じて調節されてよい。
【０４７５】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列を含んでよい。
【０４７６】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列とを含んでよい。
【０４７７】
この場合、オフターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の５'末端に位置してよい。
【０４７８】
この場合、オフターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の３'末端に位置してよい。
【０４７９】
オフターゲットは、（Ｎ）５〜５０−ＰＡＭまたはＰＡＭ−（Ｎ）５〜５０であってよく、この場合、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０４８０】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識する部分の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４８１】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識する部分の核酸配列との相補性が１００％未満である結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。配列相同性が１００％未満である核酸配列は、オンターゲットの核酸配列と類似の核酸配列であり、１つまたは複数の異なる塩基配列が含まれる、または１つまたは複数の塩基配列が欠失した核酸配列であってよい。
【０４８２】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４８３】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列との相補性が１００％未満である結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０４８４】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列のうち１つまたは複数のミスマッチ核酸配列を含んでよい。
【０４８５】
この場合、オフターゲットは、細胞のゲノム中に位置してよい。
【０４８６】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０４８７】
この場合、オフターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０４８８】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０４８９】
この場合、選択要素を含むオフターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、選択要素が発現しなくなり得る。
【０４９０】
この場合、選択要素を含むオフターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されないときは、選択要素が発現し得る。
【０４９１】
［３−４  選択要素の効果］
本発明の「選択要素」という用語は、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出するためのマーカーを指す。よって、「選択要素」は、「選択マーカー」と交換可能に用いることができる。
【０４９２】
選択要素が発現したか否かに基づいて、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出することができる。すなわち、オンターゲット効果が増大したかおよび／またはオフターゲット効果が低下したかを検出することができる。
【０４９３】
オンターゲットおよび／またはオフターゲットに含まれる選択要素は、標的特異的ヌクレアーゼの高特異性または高活性を判定する要素であってよい。
【０４９４】
一例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび選択要素として抗生物質耐性遺伝子を含むオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットおよびオフターゲットを含むそれぞれのベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果として抗生物質耐性遺伝子が発現するということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が、抗生物質で処理された場合に生存することができる。したがって、これらの選択要素が発現するか否かに基づいて、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングすることができる。
【０４９５】
別の例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび細胞のゲノム中に存在するオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットを含むベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果としてゲノムは切断されないということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が生存することができ、オンターゲットおよびオフターゲットの両方が切断された細胞は、オフターゲットの切断によってゲノムが切断されるため生存することができず、それによりこれら２種類の細胞を互いに区別することができる。
【０４９６】
さらに別の例として、選択要素として毒素遺伝子を含むオンターゲットおよび選択要素として蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むオフターゲットを用いて標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングする場合、オンターゲットを含むベクターおよび標的特異的ヌクレアーゼを含むベクターが細胞に導入されると、高特異性を呈する標的特異的ヌクレアーゼがオンターゲットを切断し、結果として毒素遺伝子の発現が抑制され、一方でオフターゲットは切断されず、結果として蛍光タンパク質が発現するということが期待できる。よって、高特異性を有する標的特異的ヌクレアーゼが導入された、オンターゲットのみが切断されてオフターゲットは切断されない細胞が生存することができ、またこれを蛍光タンパク質と区別することもできる。
【０４９７】
したがって、オンターゲットおよび／またはオフターゲットに含まれる選択要素は、標的特異的ヌクレアーゼの高特異性または高活性を判定および選択するための基準であってよい。
【０４９８】
［４．ヌクレアーゼの選択方法］
選択システムを用いて、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することができる。
【０４９９】
一態様として、本発明は、複数の標的特異的ヌクレアーゼ試験群のうちから高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法に関する。
【０５００】
本発明において、「標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法」は、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを含む細胞を選択する段階と、次いで特異的ヌクレアーゼの構成を特定する段階とを備える。例えば、本発明により、優れた標的特異的ヌクレアーゼの配列情報を得ることができる。
【０５０１】
特に、当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼライブラリを改良することにより調製される様々なヌクレアーゼの多様体のうちから高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するときに非常に有用である。
【０５０２】
［４−１．選択方法の第１の具体的実施形態］
具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼの様々な「多様体」のうちから高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法として利用することができる。
【０５０３】
当該方法は、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
ｉ）１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ｉｉ）標的特異的ヌクレアーゼ多様体と
を用いる方法であって、
ａ）ｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）前記ａ）において選択要素が発現するか否かに基づいて前記オンターゲット効果および前記オフターゲット効果を特定することにより前記細胞を選別する段階と、
ｃ）ｂ）における選別された細胞中に含まれる前記ヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する前記標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法である。
【０５０４】
［４−１−１  成分］
この場合、ｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉ）成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
【０５０５】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよく、それに加えてＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＦｏｋＩ等であってよく、これらに限定されない。
【０５０６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０５０７】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼ多様体は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの多様体であってよく、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素の多様体であってよいが、これらに限定されない。ヌクレアーゼ多様体は、電磁波、ＵＶ、放射線、化学物質、および外来／内在遺伝子作用等により生成することができる。一例において、ＷＴ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムにＵＶを照射することによって多様体を得た。
【０５０８】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素の多様体は、Ｃａｓ９の多様体であってよい。
【０５０９】
Ｃａｓ９の多様体は、オンターゲット効果が増大または低下した多様体であってよい。この場合、オンターゲット効果は、オンターゲット位置がＣａｓ９によって切断または改変されることを意味する。
【０５１０】
Ｃａｓ９の多様体は、オフターゲット効果が増大または低下した多様体であってよい。この場合、オフターゲット効果は、オフターゲット位置がＣａｓ９によって切断または改変されることを意味する。
【０５１１】
好ましくは、Ｃａｓ９の多様体は、オンターゲット効果が増大および／またはオフターゲット効果が低下した多様体であってよい。
【０５１２】
ｉｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、同じベクターまたは異なるベクターに含まれてよい。
【０５１３】
ｉｉ）成分はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）システムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ・タンパク質複合体の形態であってよい。
【０５１４】
ｉｉ）成分は、人工的に合成されたものであってよい。
【０５１５】
ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたものであってよく、またＣＲＩＳＰＲ酵素は、人工的に合成されたタンパク質またはポリペプチドであってよい。
【０５１６】
ｉ）成分において、オンターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５１７】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５１８】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を形成する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５１９】
ｉ）成分において、オンターゲットおよび／またはオフターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０５２０】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０５２１】
［４−１−２  方法］
この場合、ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０５２２】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０５２３】
一方、オフターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０５２４】
ｉ）成分のうちのオフターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオンターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０５２５】
一方、オンターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０５２６】
ｉ）成分のうちのオンターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオフターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０５２７】
この場合、ｂ）において、
ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分が導入された細胞群のうち、ｉ）成分のうちのオンターゲットのみがｉｉ）成分によって切断された細胞を選択することができる。
【０５２８】
オンターゲットに含まれる選択要素の発現の抑制により、オンターゲットのみが切断された細胞を選択することができる。
【０５２９】
例えば、オンターゲットが毒素遺伝子を含む場合、オンターゲットが切断されることに伴う毒素遺伝子の発現の抑制に起因して、細胞が生存することができる。
【０５３０】
さらに、ｉ）成分のうちのオフターゲットは、ｉｉ）成分によって切断されない細胞を選択することができる。
【０５３１】
オフターゲットが切断されないことに起因する選択要素の発現により、オフターゲットが切断されない細胞を選択することができる。
【０５３２】
例えば、オフターゲットが抗生物質耐性遺伝子を含む場合、オフターゲットが切断されないことに伴う抗生物質耐性遺伝子の発現により、抗生物質耐性を有する細胞を抗生物質の存在下で選択することができる。
【０５３３】
代替的に、オフターゲットが細胞のゲノム中に位置する場合、細胞のゲノムがｉｉ）成分により切断されず、それにより細胞のゲノムが正常なまま維持され、結果として細胞が生存することができる。
【０５３４】
この場合、ｂ）における選別された細胞は、ｉｉ）成分によってｉ）成分のオンターゲットが切断されてオフターゲットが切断されない細胞であってよい。選択要素により、これらの細胞を区別することができる。
【０５３５】
この場合、ｃ）において、ｂ）における選別された細胞を用いて、選別された細胞に導入されたｉｉ）成分、すなわち標的特異的ヌクレアーゼを特定することができる。
【０５３６】
ｂ）における選別された細胞を用いることによる、選別された細胞に導入されたｉｉ）成分、すなわち標的特異的ヌクレアーゼは、オンターゲットのみを選択的に切断または改変することが可能な標的特異的ヌクレアーゼであってよい。
【０５３７】
ヌクレアーゼの配列は、ｃ）において選別された細胞から得られたヌクレアーゼを配列決定することにより取得することができ、それにより高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼが得られる。
【０５３８】
例えば、３０℃で１６時間にわたりカナマイシン、クロラムフェニコール、およびアラビノースを含むＬＢ寒天培地プレート中でエレクトロポレーションにかけたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を培養することにより、裸眼で視認可能なサイズに達するコロニーを生成したら、これらのコロニーの各々１つをクロラムフェニコールを含むＬＢバッファー１０ｍｌに混入し、次いで４２℃で１２時間にわたり振盪培養機中で培養する。遠心分離によりＥ．ｃｏｌｉペレットが得られた後、ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてペレットからプラスミドを抽出する。抽出されたプラスミドは、例えばサンガー配列決定法を用いて配列決定することができる。プライマーの場合は、Ｃａｓ９のＮ末端およびＣ末端の外側に存在するＣＭＶ−ＦおよびＢＧＨ−Ｒなどのユニバーサル配列決定プライマー、およびＣａｓ  ９の中間部における配列決定プライマーを用いることができる。
【０５３９】
本発明の具体的実施形態において、図１を参照して説明すると、標的特異的ヌクレアーゼを特定するための方法において、プラスミドＡ、Ｂ、およびＣの全てを、プラスミドＢおよびＣの特定マーカーであるカナマイシンおよびクロラムフェニコールならびにアラビノースプロモーターを作用させるアラビノースを含むＬＢ寒天培地プレートにエレクトロポレーションにより導入し、無水テトラサイクリンを含むＳＯＣ中で１時間インキュベートしたＥ．ｃｏｌｉを分取すると、プラスミドＣのヌクレアーゼによってプラスミドＡが切断されたが、ゲノムＤＮＡが切断されなかったＥ．ｃｏｌｉのみが生存した。
【０５４０】
したがって、上述のように、当該方法を用いることにより、選別された細胞によって高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することができる。
【０５４１】
［４−２．選択方法の第２の具体的実施形態］
別の具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼ「ライブラリ」における高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法として利用することができる。
【０５４２】
当該方法は、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
ｉ）１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ｉｉ）標的特異的ヌクレアーゼライブラリと
を用いる方法であって、
ａ）ｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）ａ）においてオンターゲットのみが改変された細胞を選別する段階と、
ｃ）ｂ）における選択された細胞を用いてｉｉ）成分を特定する段階と
を含む方法である。
【０５４３】
［４−２−１  成分］
この場合、ｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉ）成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
【０５４４】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよく、それに加えてＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＦｏｋＩ等であってよく、これらに限定されない。
【０５４５】
標的特異的ヌクレアーゼライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムライブラリであってよい。ヌクレアーゼライブラリは、直接作製されてよく、市販のものであってもよく、データベースから得られるものであってもよい。
【０５４６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０５４７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムライブラリは、ガイドＲＮＡライブラリおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素ライブラリであってよい。
【０５４８】
ｉｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、同じベクターまたは異なるベクターに含まれてよい。
【０５４９】
ｉｉ）成分はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）システムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ・タンパク質複合体の形態であってよい。
【０５５０】
ｉｉ）成分は、人工的に合成されたものであってよい。
【０５５１】
ｉ）成分において、オンターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５５２】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５５３】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列と非相補的な１つまたは複数の結合を形成する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５５４】
ｉ）成分において、オンターゲットおよび／またはオフターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０５５５】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０５５６】
［４−２−２  方法］
この場合、ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０５５７】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０５５８】
一方、オフターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０５５９】
ｉ）成分のうちのオフターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオンターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０５６０】
一方、オンターゲットは、細胞のゲノム中に存在してよい。
【０５６１】
ｉ）成分のうちのオンターゲットが細胞ゲノム中に存在する場合、ｉ）成分のオフターゲットおよびｉｉ）成分を含むベクターを細胞に導入することができる。
【０５６２】
ｂ）において、
ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分が導入された細胞群のうち、ｉ）成分のうちのオンターゲットのみがｉｉ）成分によって切断された細胞を選択することができる。
【０５６３】
オンターゲットに含まれる選択要素の発現の抑制により、オンターゲットのみが切断された細胞を選択することができる。
【０５６４】
例えば、オンターゲットが毒素遺伝子を含む場合、オンターゲットが切断されることに伴う毒素遺伝子の発現の抑制に起因して、細胞が生存することができる。
【０５６５】
さらに、ｉ）成分のうちのオフターゲットは、ｉｉ）成分によって切断されない細胞を選択することができる。
【０５６６】
オフターゲットが切断されないことに起因する選択要素の発現により、オフターゲットが切断されない細胞を選択することができる。
【０５６７】
例えば、オフターゲットが抗生物質耐性遺伝子を含む場合、オフターゲットが切断されないことに伴う抗生物質耐性遺伝子の発現により、抗生物質耐性を有する細胞を抗生物質の存在下で選択することができる。
【０５６８】
代替的に、オフターゲットが細胞のゲノム中に位置する場合、細胞のゲノムがｉｉ）成分により切断されず、それにより細胞のゲノムが正常なまま維持され、結果として細胞が生存することができる。
【０５６９】
この場合、ｂ）における選別された細胞は、ｉｉ）成分によってｉ）成分のオンターゲットが切断されてオフターゲットが切断されない細胞であってよい。選択要素により、これらの細胞を区別することができる。
【０５７０】
この場合、ｃ）において、ｂ）における選別された細胞を用いて、選別された細胞に導入されたｉｉ）成分、すなわち標的特異的ヌクレアーゼを特定することができる。
【０５７１】
ｂ）における選別された細胞を用いることによる、選別された細胞に導入されたｉｉ）成分、すなわち標的特異的ヌクレアーゼは、オンターゲットのみを選択的に切断または改変することが可能な標的特異的ヌクレアーゼであってよい。
【０５７２】
ヌクレアーゼの配列は、ｃ）において選別された細胞から得られたヌクレアーゼを配列決定することにより取得することができ、それにより高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼが得られる。
【０５７３】
例えば、３０℃で１６時間にわたりカナマイシン、クロラムフェニコール、およびアラビノースを含むＬＢ寒天培地プレート中でエレクトロポレーションにかけたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を培養することにより、裸眼で視認可能なサイズに達するコロニーを生成したら、これらのコロニーの各々１つをクロラムフェニコールを含むＬＢバッファー１０ｍｌに混入し、次いで４２℃で１２時間にわたり振盪培養機中で培養する。遠心分離によりＥ．ｃｏｌｉペレットが得られた後、ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてペレットからプラスミドを抽出する。抽出されたプラスミドは、例えばサンガー配列決定法を用いて配列決定することができる。プライマーの場合は、Ｃａｓ９のＮ末端およびＣ末端の外側に存在するＣＭＶ−ＦおよびＢＧＨ−Ｒなどのユニバーサル配列決定プライマー、およびＣａｓ  ９の中間部における配列決定プライマーを用いることができる。
【０５７４】
本発明の具体的実施形態において、図１を参照して説明すると、標的特異的ヌクレアーゼを特定するための方法において、プラスミドＡ、Ｂ、およびＣの全てを、プラスミドＢおよびＣの特定マーカーであるカナマイシンおよびクロラムフェニコールならびにアラビノースプロモーターを作用させるアラビノースを含むＬＢ寒天培地プレートにエレクトロポレーションにより導入し、無水テトラサイクリンを含むＳＯＣ中で１時間インキュベートしたＥ．ｃｏｌｉを分取すると、プラスミドＣのヌクレアーゼによってプラスミドＡが切断されたが、ゲノムＤＮＡが切断されなかったＥ．ｃｏｌｉのみが生存した。
【０５７５】
したがって、上述のように、当該方法を用いることにより、選別された細胞によって標的特異的ヌクレアーゼライブラリにおける高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することができる。
【０５７６】
［５．組成物またはキット］
本発明の別の態様は、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を含む高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキットに関する。当該キットは、組成物の形態であってよい。
【０５７７】
具体的実施形態において、当該組成物またはキットは、
ｉ）１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的と、
ｉｉ）標的特異的ヌクレアーゼおよび／またはｉｉｉ）宿主細胞と
からなるものであってよい。
【０５７８】
本発明に係る高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキットまたは組成物は、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を不可欠な成分として含み、標的特異的ヌクレアーゼおよび／または宿主細胞を選択的に含む。
【０５７９】
必要に応じ、本発明のキットは、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を含む一液型キットとして提供されてよい。
【０５８０】
必要に応じ、本発明のキットは、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的および宿主細胞をそれぞれ含む二液型キットとして提供されてよい。
【０５８１】
この場合、当該キットは、宿主細胞中に選択要素を含む複数標的を含めることによって一液型として提供されてもよい。例えば、当該キットは、宿主細胞中の別個のプラスミドとして含まれてもよく、宿主細胞ゲノムに取り込むことにより提供されてもよい。
【０５８２】
必要に応じ、本発明のキットは、１つまたは複数の選択要素を含有する複数標的、宿主細胞、および試験ヌクレアーゼをそれぞれ含む三液型キットとして提供されてよい。
【０５８３】
この場合、当該キットはまた、宿主細胞中に選択要素を含む複数標的を含めることによって二液型として提供されてよい。例えば、当該キットは、宿主細胞中の別個のプラスミドとして含まれてもよく、宿主細胞ゲノムに取り込むことにより提供されてもよい。
【０５８４】
この場合、ｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉ）成分において、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
【０５８５】
ｉｉ）成分の標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであってよく、それに加えてＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＦｏｋＩ等であってよく、これらに限定されない。
【０５８６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素からなるものであってよい。
【０５８７】
ｉｉ）成分はベクターシステムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、同じベクターまたは異なるベクターに含まれてよい。
【０５８８】
ｉｉ）成分はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）システムを用いることができ、ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ・タンパク質複合体の形態であってよい。
【０５８９】
ｉｉ）成分は、人工的に合成されたものであってよい。
【０５９０】
ｉｉ）成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたものであってよく、またＣＲＩＳＰＲ酵素は、人工的に合成されたタンパク質またはポリペプチドであってよい。
【０５９１】
ｉ）成分において、オンターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５９２】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５９３】
ｉ）成分において、オフターゲットは、ｉｉ）成分のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を形成する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０５９４】
ｉ）成分において、オンターゲットおよび／またはオフターゲットは、選択要素に接続されてよい。
【０５９５】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０５９６】
ｉｉｉ）成分の宿主細胞は、選択要素の発現に適した任意の細胞であってよい。ｉｉｉ）成分の宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０５９７】
例えば、毒素遺伝子ｃｃｄＢを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主として用いることができ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いる場合、哺乳類に由来する細胞を宿主細胞として用いることができ、毒素遺伝子ＵＲＡ３を用いる場合、酵母を宿主として用いることができる。
【０５９８】
また、本発明の技術分野における当業者であれば、ヌクレアーゼのスクリーニングおよび選択に適した種類の細胞を任意に選択および使用できることは明白であろう。
【０５９９】
さらに、必要に応じ、当該組成物またはキットは、バッファー、選択のための様々な物質（例えば抗生物質、およびＸ−ｇａｌ等）または細胞への導入に用いる様々な試薬（例えばトランスフェクション試薬、およびリポフェクタミン等）を追加的に含んでよい。
【０６００】
［６．細胞（株）または細胞を生成するための方法］
さらに、本発明は、標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングおよび／または選択するための複数標的を含む細胞、および／または当該細胞を生成するための方法を提供する。
【０６０１】
当該細胞は、複数標的を含むことを特徴とする。
【０６０２】
この場合、複数標的は、細胞のゲノム中に存在する、または外部源から細胞に導入されたものであってよい。
【０６０３】
当該細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。
【０６０４】
［６−１  複数標的］
標的は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよい。
【０６０５】
複数標的は、標的とすべき遺伝子または核酸の配列（すなわちオンターゲット）および標的でない遺伝子または核酸の配列（すなわちオフターゲット）からなるものであってよい。
【０６０６】
複数標的は、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットからなるものであってよい。
【０６０７】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、ベクターシステムを用いて複数標的を導入してよい。
【０６０８】
複数標的が外部源から細胞に導入される場合、標的ごとに異なるベクターを用いて複数標的を導入することができる。すなわち、複数標的が１つのオンターゲットおよび１つのオフターゲットからなる場合、ベクターは、オンターゲットを含むベクターおよびオフターゲットを含むベクターからなるものであってよい。
【０６０９】
［６−１−１  オンターゲット］
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６１０】
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識することが可能な部分の核酸配列と相補的な配列を有する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６１１】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６１２】
この場合、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列は、５〜５０ｂｐｓであってよく、さらに、その長さはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列の長さに応じて調節されてよい。
【０６１３】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列を含んでよい。
【０６１４】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オンターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列とを含んでよい。
【０６１５】
この場合、オンターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の５'末端に位置してよい。
【０６１６】
この場合、オンターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の３'末端に位置してよい。
【０６１７】
オンターゲットは、（Ｎ）５〜５０−ＰＡＭまたはＰＡＭ−（Ｎ）５〜５０であってよく、この場合、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０６１８】
この場合、オンターゲットは、細胞のゲノム中に位置してよい。
【０６１９】
この場合、オンターゲットは、選択要素を含んでよい。
【０６２０】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０６２１】
選択要素を含むオンターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、選択要素が発現しなくなり得る。
【０６２２】
［６−１−２  オフターゲット］
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合する非標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６２３】
オフターゲットは、オンターゲット中の１つまたは複数の他の塩基配列を含む核酸の配列であってよい。
【０６２４】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識することが可能な部分の核酸配列と部分的に相補的な配列を有する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６２５】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に部分的に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６２６】
この場合、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する遺伝子または核酸の配列は、５〜５０ｂｐｓであってよく、さらに、その長さはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列の長さに応じて調節されてよい。
【０６２７】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列を含んでよい。
【０６２８】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列とを含んでよい。
【０６２９】
この場合、オフターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の５'末端に位置してよい。
【０６３０】
この場合、オフターゲットのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列に相補的に結合する核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列の３'末端に位置してよい。
【０６３１】
オフターゲットは、（Ｎ）５〜５０−ＰＡＭまたはＰＡＭ−（Ｎ）５〜５０であってよく、この場合、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであってよい。
【０６３２】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識する部分の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６３３】
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼの標的を特異的に認識する部分の核酸配列との相補性が１００％未満である結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６３４】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列と非相補的な１つまたは複数の結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６３５】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのガイド配列の核酸配列との相補性が１００％未満である結合を含む遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
【０６３６】
標的特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである場合、オフターゲットは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識するＰＡＭ配列のうち１つまたは複数のミスマッチ核酸配列を含んでよい。
【０６３７】
この場合、オフターゲットは、細胞のゲノム中に位置してよい。
【０６３８】
オフターゲットは、選択要素を追加的に含んでよい。
【０６３９】
選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子であってよく、これらに限定されない。
【０６４０】
この場合、選択要素を含むオフターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されると、選択要素が発現しなくなり得る。
【０６４１】
この場合、選択要素を含むオフターゲットが標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されないときは、選択要素が発現し得る。
【０６４２】
当該細胞は、標的特異的ヌクレアーゼの標的に応じて様々に設計される複数標的を含んでよい。
【０６４３】
加えて、当該細胞は、複数標的のうち一部の標的のみを含むものであってよい。
【０６４４】
すなわち、当該細胞は、複数標的のうちオンターゲットのみまたはオフターゲットのみを含むものであってよい。
【０６４５】
［６−２  生成方法］
当該細胞を生成するための方法は、複数標的を含むベクターシステムを細胞に導入するための方法を用いることができる。
【０６４６】
複数標的の細胞への導入は、ウイルスベクターシステム、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等により行うことができるが、導入方法はこれらに限定されない。
【０６４７】
さらに、複数標的の細胞への導入は、複数標的を同時に導入することができる。
【０６４８】
すなわち、複数標的であるオンターゲットを含むベクターおよびオフターゲットを含むベクターを同時に細胞に導入することができる。
【０６４９】
複数標的の細胞への導入は、複数標的を別個に導入することができる。
【０６５０】
すなわち、複数標的のうち、最初にオンターゲットを含むベクターを細胞に導入した後に、オフターゲットを含むベクターを導入することができる。代替的に、複数標的のうち、最初にオフターゲットを含むベクターを細胞に導入した後に、オンターゲットを含むベクターを導入することができる。
【０６５１】
さらに、複数標的の細胞への導入は、複数標的のうち一部の標的のみを導入することができる。
【０６５２】
すなわち、複数標的におけるオンターゲットを含むベクターのみを細胞に導入することができる。代替的に、複数標的におけるオフターゲットを含むベクターのみを細胞に導入することができる。
【０６５３】
本発明のシステムは、任意のヌクレアーゼ試験群のうちから、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することに有用に利用することができる。さらに、本発明のシステムを用いて選択されたヌクレアーゼは、遺伝子を修正または操作する場合に、オフターゲット効果を低下させオンターゲット効果を増大させることができる。
【０６５４】
［実施例］
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。
【０６５５】
これらの実施例は、本発明を例示することのみを目的としており、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業者には明白であろう。
【０６５６】
［実施例１．  Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣａｓ９多様体のスクリーニング］
［１−１  対照実験］
ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＴＡＣＡＴＧＡ  ＮＡＧ（配列番号１）は、Ｋ１２  Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡにおいて見られる反復配列である。この配列は、ＮＧＧに類似のＰＡＭ配列ＮＡＧを含み、そのためＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９酵素によって切断される効率が低いことが知られている。
【０６５７】
この配列からの２０ｍｅｒのガイド配列であるＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＴＡＣＡＴＧＡ（配列番号２）を、プラスミドＢにおけるｓｇＲＮＡとして用いた。ｓｇＲＮＡの標的となる２３ｍｅｒの標的配列であるＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＴＡＣＡＴＧＡ  ＴＧＧ（配列番号３）を、標的部位としてプラスミドＡに挿入した。この標的配列は、ＮＡＧに代えて高い切断効率を呈することが見込まれるＮＧＧをＰＡＭ部位として有する。
【０６５８】
プラスミドＡおよびＢの両方を、エレクトロポレーションを用いてＢＷ２５１４１  Ｅ．ｃｏｌｉに導入した。プラスミドＡおよびＢが導入された細胞群を、アンピシリンおよびカナマイシンの抗生物質を含むＬＢ培地中で３７℃の条件下で培養した。細胞培養によってコロニーを生育させた後、標準的な方法を用いてこのコロニーからエレクトロコンピテントセルを調製した。
【０６５９】
陽性対照としてのＷＴ  ＣＡＳ９を含むプラスミドＣまたは陰性対照としての空ベクターを、プラスミドＡおよびＢを含むエレクトロコンピテントセルに導入した。細胞群をＳＯＣ培地中で１時間培養した後、培養した細胞群の半数をクロラムフェニコールを含むＬＢ培地中で培養し、培養した細胞群のもう半数をクロラムフェニコール、カナマイシン、１０ｍＭアラビノース、および１００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を含むＬＢ培地中で培養した。
【０６６０】
結果として、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地中ではプラスミドＣおよび空ベクターが各々導入された全細胞の約１０，０００コロニーを特定することができ、一方でクロラムフェニコール、カナマイシン、アラビノース、およびアンヒドロテトラサイクリンを含むＬＢ培地中ではコロニーが見られなかった。上記の結果について以下で説明する。
【０６６１】
ＷＴ  ＣＡＳ９を含むプラスミドＣが導入された細胞群においては、発現したＷＴ  ＣＡＳ９が、置換されたＰＡＭ配列であるＮＡＧに対して残存活性を有していたため、ＮＡＧを含むＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ配列が切断された。一方、何も含まないプラスミドＣ（すなわち空ベクター）が導入された細胞群においては、切断活性がないため毒素遺伝子を含むプラスミドＡを切断することができず、アラビノースを含むＬＢ培地中で毒素遺伝子の発現が誘発され、それによりアポトーシスを示した。
【０６６２】
さらなる対照のために、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡには存在しない配列であるｃｔａｇａｔｇａｇａｃｃｇｇａｔｃｃｇｇｔｃｔｃｃＴＧＧ（配列番号４）およびｃｔａｇａｔｇａｇａｃｃｇｇａｔｃｃｇｇｔｃｔｃｃ（配列番号５）をそれぞれ含むプラスミドＡ'およびＢ'を陽性対照として用いた。ＷＴ  ＣＡＳ９を含むプラスミドＣをこれに導入した後、クロラムフェニコールのみを含むＬＢ培地と、クロラムフェニコール、カナマイシン、アラビノース、およびアンヒドロテトラサイクリンを含むＬＢ培地との両方において、各々約１０，０００コロニーが観察された。これは、ＷＴ  ＣＡＳ９がゲノムＤＮＡを損なうことなくプラスミドＡを効率的に切断した結果と考えられる。
【０６６３】
［１−２  変異］
対照実験に成功した後、誤差率の低い実験方法を用い、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩキットを使用して、ＷＴ  ＣＡＳ９の配列のＰＣＲ増幅によるランダム変異を導入した。ＰＣＲ生成物を、二重切断されたプラスミドＣのバックボーンにライゲーションした。ライゲーションにより生成したプラスミドを高効率エレクトロコンポネントセル（ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に導入することにより、サイズ１，０００，０００のライブラリを構築した。このランダムライブラリを、先に調製したプラスミドＡおよびＢを含むエレクトロコンポネントセルに導入した。その後、この細胞を先の実験と同じように２つの培地中で培養した。結果として、クロラムフェニコールのみを含むＬＢ培地中では約２，５００コロニーが特定され、一方でクロラムフェニコール、カナマイシン、アラビノース、およびアンヒドロテトラサイクリンを含むＬＢ培地中では１８０コロニーが現れた。各コロニーをクロラムフェニコールを含むＬＢ培地中で培養して、ランダム変異を含むプラスミドＣを発現させた。培養したコロニーから得られたランダム変異の全配列は、共通（ｇｅｎｅｒａｌ）のＰＡＭ配列であるＮＧＧに対して活性を有し、一方でこの全配列は、類似だが共通でないＰＡＭ配列であるＮＡＧに対しては阻害された活性を示す効果的な変異として特定された。
【０６６４】
実験により、ガイド配列について特異性を有するＣａｓ９多様体が見つかった。この場合、ｓｇＲＮＡの配列についてのミスマッチ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ内在ゲノムＤＮＡ配列であるか、またはＥ．ｃｏｌｉに外部源から導入および挿入された人工的配列であり得る。
【０６６５】
上述のスクリーニング方法を用いることにより、共通のＰＡＭ配列であるＮＧＧに対しては活性を有するが、類似だが共通でないＰＡＭ配列であるＮＡＧに対しては活性が低下した複数のＣａｓ９多様体を特定することに成功した。
【０６６６】
［実施例２：ヌクレアーゼの選択］
ＷＴ  ＥＭＸ１遺伝子における標的位置のガイド配列に関して１つのミスマッチを有する２０ｍｅｒのｓｇＲＮＡは、ミスマッチを有しない、すなわち完全にマッチするｓｇＲＮＡを用いた場合と比較して、低い活性を有することが以前の研究で確認された。ＷＴ  ＥＭＸ１遺伝子は、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡ中に存在し、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡ中のＷＴ  ＥＭＸ１遺伝子を含む５００ｍｅｒの塩基配列を増幅することにより得られたＰＣＲ生成物を、標準的な方法（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＧＪら、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００６、６、３９）を用いてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＷ２５１４１）のゲノムＤＮＡに挿入した。結果として、得られた株をＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１と名付けてから、これを使用した。
【０６６７】
標的配列であるｇａｇｔｃｃｇａｇｃａｇａａｇａａｇａａｇｇｇ（配列番号６）に関して１つまたは２つのミスマッチを含む２０ｍｅｒのガイド配列、すなわち、  本発明の本実施例においては、
５６：ｇａｇｔｃｃｇａｇｃａｇａａＡＧａｇａａ（配列番号７）
１７１８：  ｇａＡＣｃｃｇａｇｃａｇａａｇａａｇａａ（配列番号８）
７：ｇａｇｔｃｃｇａｇｃａｇａＧｇａａｇａａ（配列番号９）および
１７：ｇａｇＣｃｃｇａｇｃａｇａａｇａａｇａａ（配列番号１０）
を、プラスミドＢにおけるｓｇＲＮＡとして用いた。
【０６６８】
ｓｇＲＮＡに対応する２３ｍｅｒの標的配列（すなわち５６（ｇａｇｔｃｃｇａｇｃａｇａＧｇａａｇａａ  ｇｇｇ）、１７１８（ｇａＡＣｃｃｇａｇｃａｇａａｇａａｇａａ  ｇｇｇ）、７（ｇａｇｔｃｃｇａｇｃａｇａＧｇａａｇａａ  ｇｇｇ）、１７（ｇａｇＣｃｃｇａｇｃａｇａａｇａａｇａａ  ｇｇｇ））を、プラスミドＡに標的位置として挿入した。
【０６６９】
上述のように生成したプラスミドＡおよびＢの両方を、エレクトロポレーションを用いてＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１  Ｅ．ｃｏｌｉ株に導入した。プラスミドＡおよびＢが導入された細胞群を、アンピシリンおよびカナマイシンの抗生物質を含むＬＢ培地中で３７℃の条件下で培養した。コロニーを培養した後、標準的な手順を用いてエレクトロコンポネントセルを作製した。細胞培養によってコロニーを生育させた後、標準的な方法を用いてこのコロニーからエレクトロコンピテントセルを調製した。
【０６７０】
［ｉ）５６および１７１８の対照反応］
対照反応のために、ＷＴ  ＣＡＳ９を含むプラスミドＣまたは陰性対照としての空ベクターを、プラスミドＡおよびＢを含むエレクトロコンポネントセルに導入した。プラスミドＣまたは空ベクターが導入された細胞群を、１，０００ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンを含むＳＯＣ培地中で１時間培養した後、培養した細胞群の半数をクロラムフェニコールを含むＬＢ中で培養し、培養した細胞群のもう半数をクロラムフェニコール、カナマイシン、１０ｍＭアラビノース、および１，０００ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンを含むＬＢ培地中で培養した。
【０６７１】
Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡに挿入されたＥＭＸ−１配列に関して２つのミスマッチ配列を含むプラスミドＢ、すなわち５６を含むプラスミドＢおよび１７１８を含むプラスミドＢについて対照実験を行うことにより得られた結果として、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（ＣＫ）中の単位当たりの形成されたコロニーの数と、クロラムフェニコール、カナマイシン、アラビノース、および１，０００ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地（ＣＫＡ−１，０００ｎｇ／ｍｌ  ＡＴＣ）中の単位当たりの形成されたコロニーの数との間の比較が示された（図２）。
【０６７２】
２つのミスマッチをシード領域の近傍に配置した場合（５６−ＷＴ−ＣＡＳ９）、Ｃａｓ９が導入されたＥ．ｃｏｌｉの０．１％未満が生存した。一方、Ｃａｓ９に代えて陰性対照である空ベクターをＥ．ｃｏｌｉに導入した場合、Ｅ．ｃｏｌｉのおよそ０．０１％が生存した。この陰性対照の結果は、プラスミドＡが作用しないことによる効果が原因と考えられる。
【０６７３】
［ｉｉ）７および１７の対照反応］
対照反応のために、ＷＴ  ＣＡＳ９を含むプラスミドＣまたは陰性対照としての空ベクターを、プラスミドＡおよびＢを含むエレクトロコンポネントセルに導入した。プラスミドＣまたは空ベクターが導入された細胞群を、１０ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンを含むＳＯＣ培地中で１時間培養した後、培養した細胞群の半数をクロラムフェニコールを含むＬＢ中で培養し、培養した細胞群のもう半数をクロラムフェニコール、カナマイシン、１０ｍＭアラビノース、および１０ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンを含むＬＢ培地中で培養した。
【０６７４】
Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡに導入されたＥＭＸ−１配列に関して１つのミスマッチ配列を含むプラスミドＢ、すなわち７を含むプラスミドＢおよび１７を含むプラスミドＢについて対照実験を行うことにより得られた結果として、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（ＣＫ）中の単位当たりの形成されたコロニーの数と、クロラムフェニコール、カナマイシン、アラビノース、および１０ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地（ＣＫＡ−１０ｎｇ／ｍｌ  ＡＴＣ）中の単位当たりの形成されたコロニーの数との間の比較が示された（図３）。
【０６７５】
１つのミスマッチをシード領域の近傍に配置した場合（７−ＷＴ−ＣＡＳ９）、Ｃａｓ９が導入されたＥ．ｃｏｌｉの０．１％未満が生存した。一方、Ｃａｓ９に代えて陰性対照である空ベクターをＥ．ｃｏｌｉに導入した場合、Ｅ．ｃｏｌｉのおよそ０．０１％が生存した。この陰性対照の結果は、プラスミドＡが作用しないことによる効果が原因と考えられる。
【０６７６】
［ｉｉｉ）５６および１７１８のスクリーニング］
対照実験に成功した後、３つの異なる手段によってランダム変異を導入した。
【０６７７】
１．Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｋｉｔを用いたＷＴ  ＣＡＳ９配列のＰＣＲ増幅
【０６７８】
２．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ
【０６７９】
３．誤差率の低い標準的な実験方法を用いた変異原性Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＸＬ１−ｒｅｄ）
【０６８０】
当該方法により得られた各ＰＣＲ生成物を、二重切断されたプラスミドＣのバックボーンにライゲーションした。ライゲーションにより生成したプラスミドを高効率エレクトロコンポネントセルに導入することにより、サイズ２，０００，０００のライブラリを各々構築した。ランダムライブラリの各々を、先に調製した（５６を含む）プラスミドＡおよび（５６を含む）プラスミドＢを含むＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１を用いて調製したエレクトロコンポネントセルに導入した。
【０６８１】
各ランダムライブラリが導入された細胞群をクロラムフェニコール、カナマイシン、およびアラビノースを含む培地（ＣＫＡ）中で培養し、この細胞群がコロニーを形成し、形成されたコロニーの数をカウントして形成されたコロニーを収集することにより、統合ライブラリを形成した。
【０６８２】
温度感受性の源を含むｓｇＲＮＡベクターを選択的に取り除くべく、得られたライブラリを、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地中で４２℃の条件下で培養した。培養の後、ライブラリベクターを得るべく、ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてライブラリを精製した。
【０６８３】
さらなる選択のために、上述と同じように、（１７１８を含む）プラスミドＡおよび（１７１８を含む）プラスミドＢを含むＢＷ２５１４１−ＥＭＸ１を用いて、精製により得られたライブラリベクターに対して同じ実験を行った。
【０６８４】
ＣＫＡ／ＣＫコロニーの比率が１００％に達するまで、ライブラリベクターの選択を継続して行った。
【０６８５】
［ｉｖ）シャッフリング反応］
さらなる改変を含む標準的なシャッフリング方法を用いて、選択によって得られたライブラリをシャッフリング反応に用いた。通常、ＰＣＲ生成物が１ｋｂよりも大きくなると、シャッフリングの効率が著しく悪化することが知られている。よって、４，３００ｂｐｓの長さを有するＣａｓ９ベクターのシャッフリング反応は、容易には生じない。
【０６８６】
Ｃａｓ９ベクターを５つのフラグメントに分割し、各ＰＣＲフラグメントを標準的な方法を用いてシャッフリングした。次いで、シャッフリング混合物をまとめ、改めてＰＣＲ反応を行った。それにより得られたＰＣＲ生成物を、Ｃａｓ９の５'末端および３'末端を標的とするプライマーを用いて増幅すると、増幅したＰＣＲ生成物から、アガロースゲルを用いて生成物のサイズを特定することにより、シャッフリングライブラリが生成したことが確認された。
【０６８７】
［ｖ）７および１７のスクリーニング］
５６および１７１８を用いたスクリーニング反応と類似の方式で（７または１７を含む）プラスミドＡおよび（７または１７を含む）プラスミドＢを含むＥＭＸ１−ＢＷ２５１４１を用いることにより、ＡｇｉｌｅｎｔおよびＣｌｏｎｔｅｃｈのキットを用いて調製されたシャッフリングライブラリおよびランダム変異ライブラリを繰り返しスクリーニングした。安定した比率に達するまで、スクリーニング反応を繰り返した。結果として、得られたコロニーを標準的な配列決定方法を用いて解析した。
【０６８８】
［ｖｉ）検証］
２つの方法（１ミスマッチ（７または１７）スクリーニングによるシャッフリング＋１ミスマッチ（７または１７）スクリーニングおよび２ミスマッチ（５６または１７１８）スクリーニング）を同時に行うことにより得られた完全な状態のライブラリを用いて、ＤＭＤ遺伝子およびＥＭＸ１遺伝子の各々に対してオンターゲット実験およびオフターゲット実験を行った。
【０６８９】
結果として、スクリーニングを２ミスマッチ（５６または１７１８）で開始した場合、オフターゲット効果がＷＴ  Ｃａｓ９と比較してより明確に低下したことが確認できた（図６および図７）。
【０６９０】
スクリーニングにより選択された３つのクローンを用いて、哺乳類細胞における特異性の向上を特定する実験を行った。ＤＭＤ遺伝子およびＥＭＸ１遺伝子の各々に対してオンターゲット実験およびオフターゲット実験を行った。
【０６９１】
２つの方法により同時に行ったスクリーニングによって得られた完全な状態のライブラリを用いてＤＭＤ遺伝子のオンターゲット活性およびオフターゲット活性を判定した結果として、スクリーニングを２ミスマッチで開始した場合、オフターゲット活性がＷＴ  Ｃａｓ９と比較してより明確に低下したことが確認できた（図８）。
【０６９２】
２つの方法により同時に行ったスクリーニングによって得られた完全な状態のライブラリを用いてＥＭＸ１遺伝子のオンターゲット活性およびオフターゲット活性を判定した結果として、スクリーニングを２ミスマッチで開始した場合、オフターゲット活性がＷＴ  Ｃａｓ９と比較してより明確に低下したことが確認できた（図９）。
【０６９３】
これらの結果より、２つの遺伝子の両方が、ＷＴ−ｓｐＣａｓ９と比較して向上した特異性を有することが確認された。
【０６９４】
［実施例３：哺乳類細胞のスクリーニング］
実施例１および２において説明したような実験を、哺乳類細胞を用いて行うことができる。
【０６９５】
毒素遺伝子ｃｃｄＢと同様に、ＨＰＲＴ遺伝子が用いられてよい。ＨＰＲＴとミスマッチを有するｇＲＮＡの配列をチミジンキナーゼおよびシステインデアミナーゼの５'末端（開始コドンの後）に結合し、ゼオシンまたはピューロマイシンなどの選択マーカーを含む全配列を標準的な方法を用いてＨＥＬＡ細胞などの哺乳類細胞に挿入することができ、抗生物質を用いてそこから得られた細胞を選別することによって安定な細胞株を調製することができる。トランスポゾン（この場合、トランスポザーゼを含み、例えば、Ｐｉｇｇｙｂａｃ、およびｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙ等であってよい）またはウイルス（レンチウイルス）を用いた標準的な方法により、Ｃａｓ９多様体を含むベクターを細胞株のゲノムＤＮＡに挿入することができる。ＨＰＲＴを標的とするｓｇＲＮＡベクターを細胞株にトランスフェクトすることができ、ＨＰＲＴおよびＴＫまたはＣＤの各々を、６−チオグアニンおよびガンシクロビルまたは５−フルオロシトシンを用いて選択することができる。
【０６９６】
このように選択されたコロニーは、特異性が向上したＣａｓ９多様体を含む。当該スクリーニング方法はＴＫまたはＣＤなしで用いることができ、活性の増大したＣａｓ９を見つけるべく、無視できるほどの活性を示すｓｇＲＮＡを用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０６９７】
本発明のシステムは、任意のヌクレアーゼ試験群のうちから、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することに有用に利用することができる。さらに、本発明のシステムを用いて選択されたヌクレアーゼは、遺伝子を修正または操作する場合に、オフターゲット効果を低下させオンターゲット効果を増大させ得る。
【図１】
2019517802.tif 000003
【図２】
2019517802.tif 000004
【図３】
2019517802.tif 000005
【図４】
2019517802.tif 000006
【図５】
2019517802.tif 000007
【図６】
2019517802.tif 000008
【図７】
2019517802.tif 000009
【図８】
2019517802.tif 000010
【図９】
2019517802.tif 000011
【配列表】
2019517802000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月13日(2019.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的特異的ヌクレアーゼの特異性または活性を評価するための方法であって、
ａ）標的特異的ヌクレアーゼの標的とすることが可能な少なくとも２つの標的を含む細胞を調製する段階であって、
前記少なくとも２つの標的は、少なくとも第１核酸および第２核酸を含み、
前記第１核酸の配列および前記第２核酸の配列は、互いに等しい配列ではないが類似の配列を有し、
前記第２核酸は、前記第１核酸との配列相同性が１００％未満であり、
前記第２核酸は、前記第１核酸と比較して少なくとも１つの異なるヌクレオチド配列を含み、
前記第１核酸は、第１プラスミドに含まれ、前記第２核酸は、第２プラスミドまたは前記細胞のゲノムに含まれ、
前記第１プラスミドは、第１選択要素を含み、前記第１選択要素は、前記第１核酸に作用可能に連鎖し、
前記第２プラスミドは、第２選択要素を含み、前記第２選択要素は、前記第２核酸に作用可能に連鎖する、調製する段階と、
ｂ）標的特異的ヌクレアーゼを前記調製された細胞に導入する段階であって、
前記標的特異的ヌクレアーゼは、前記第１核酸、前記第２核酸またはその両方を改変することが可能である、導入する段階と、
ｃ）前記標的特異的ヌクレアーゼを導入することにより改変された１つの標的を有する細胞を特定する段階であって、
前記標的特異的ヌクレアーゼを導入することにより改変された前記１つの標的は、前記第１核酸または前記第２核酸であり、
前記標的特異的ヌクレアーゼを導入することにより改変された１つの標的を有する前記細胞は、
ｉ）前記第１選択要素が発現したか否か、
ｉｉ）前記第２選択要素が発現したか否か、および
ｉｉｉ）前記細胞が死滅したか否か
のうちの少なくとも１つを特定することが可能である、段階と、
ｄ）前記特定の結果に基づいて前記標的特異的ヌクレアーゼの前記特異性または前記活性を評価する段階と
を備える方法。
【請求項２】
前記第１核酸および前記第２核酸のうち、一方は前記標的特異的ヌクレアーゼのオンターゲットであり、他方は前記標的特異的ヌクレアーゼのオフターゲットである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓタンパク質を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムのＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、
Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記調製された細胞に含まれ、
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記第１プラスミドまたは前記第２プラスミドに含まれる、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的特異的ヌクレアーゼは、タンパク質、リボ核タンパク質、またはこれをコードする核酸のうち少なくとも１つの形態により、前記調製された細胞に導入される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１選択要素は、毒素遺伝子であり、
前記毒素遺伝子は、前記細胞の種に応じて選択され、
前記毒素遺伝子は、
前記細胞がＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合、ｃｃｄＢ遺伝子、
前記細胞が哺乳類細胞である場合、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子、および
前記細胞が酵母である場合、ＵＲＡ３遺伝子
のうちの少なくとも１つである、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的特異的ヌクレアーゼの特異性または活性を評価するための組成物であって、
標的特異的ヌクレアーゼの標的とすることが可能な少なくとも２つの標的を備え、
前記少なくとも２つの標的は、少なくとも第１核酸および第２核酸を含み、
前記第１核酸の配列および前記第２核酸の配列は、互いに等しい配列ではないが類似の配列を有し、
前記第２核酸は、前記第１核酸との配列相同性が１００％未満であり、
前記第２核酸は、前記第１核酸と比較して少なくとも１つの異なるヌクレオチド配列を含み、
前記第１核酸は、第１プラスミドに含まれ、前記第２核酸は、第２プラスミドまたは細胞のゲノムに含まれ、
前記第１プラスミドは、第１選択要素を含み、前記第１選択要素は、前記第１核酸に作用可能に連鎖し、
前記第２プラスミドは、第２選択要素を含み、前記第２選択要素は、前記第２核酸に作用可能に連鎖する、
組成物。
【請求項１０】
前記第１核酸および前記第２核酸のうち、一方は前記標的特異的ヌクレアーゼのオンターゲットであり、他方は前記標的特異的ヌクレアーゼのオフターゲットである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、前記第１核酸または第２核酸に相補的に結合するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに備え、
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記第１プラスミドまたは前記第２プラスミドに含まれる、
請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
標的特異的ヌクレアーゼの特異性または活性を評価するための細胞であって、
標的特異的ヌクレアーゼの標的とすることが可能な少なくとも２つの標的を備え、
前記少なくとも２つの標的は、少なくとも第１核酸および第２核酸を含み、
前記第１核酸の配列および前記第２核酸の配列は、互いに等しい配列ではないが類似の配列を有し、
前記第２核酸は、前記第１核酸との配列相同性が１００％未満であり、
前記第２核酸は、前記第１核酸と比較して少なくとも１つの異なるヌクレオチド配列を含み、
前記第１核酸は、第１プラスミドに含まれ、前記第２核酸は、第２プラスミドまたは細胞のゲノムに含まれ、
前記第１プラスミドは、第１選択要素を含み、前記第１選択要素は、前記第１核酸に作用可能に連鎖し、
前記第２プラスミドは、第２選択要素を含み、前記第２選択要素は、前記第２核酸に作用可能に連鎖し、
前記第１核酸および前記第２核酸のうち、一方は前記標的特異的ヌクレアーゼのオンターゲットであり、他方は前記標的特異的ヌクレアーゼのオフターゲットである、
細胞。
【請求項１４】
前記細胞は、前記第１核酸または第２核酸に相補的に結合するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに備え、
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記第１プラスミドまたは前記第２プラスミドに含まれる、
請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記第１選択要素は、毒素遺伝子であり、
前記毒素遺伝子は、前記細胞の種に応じて選択され、
前記毒素遺伝子は、
前記細胞がＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合、ｃｃｄＢ遺伝子、
前記細胞が哺乳類細胞である場合、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子、および
前記細胞が酵母である場合、ＵＲＡ３遺伝子
のうちの少なくとも１つである、
請求項１３に記載の細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９７】
本発明のシステムは、任意のヌクレアーゼ試験群のうちから、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することに有用に利用することができる。さらに、本発明のシステムを用いて選択されたヌクレアーゼは、遺伝子を修正または操作する場合に、オフターゲット効果を低下させオンターゲット効果を増大させ得る。
［項目１］
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムであって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および上記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステム。
［項目２］
上記スクリーニングシステムは、上記ヌクレアーゼのオンターゲット効果およびオフターゲット効果を同時に特定することが可能である、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目３］
上記複数標的は、１つのオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目４］
上記複数標的は、ベクター、プラスミドまたは宿主細胞ゲノムに含まれる、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目５］
上記オンターゲットは、ベクターまたはプラスミドに含まれ、上記オフターゲットは、宿主細胞ゲノムに含まれる、項目３に記載のスクリーニングシステム。
［項目６］
上記ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ）からなる群から選択される、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目７］
上記ヌクレアーゼは、上記ＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ）である、項目６に記載のスクリーニングシステム。
［項目８］
上記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムである、項目７に記載のスクリーニングシステム。
［項目９］
上記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子である、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目１０］
上記ヌクレアーゼによる上記オンターゲット効果および上記オフターゲット効果を特定するための上記選択要素として、１つまたは複数の選択要素が用いられる、項目９に記載のスクリーニングシステム。
［項目１１］
上記スクリーニングシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および毒素遺伝子ｃｃｄＢを用いて行われる、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目１２］
上記スクリーニングシステムは、哺乳類細胞および毒素遺伝子ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を用いて行われる、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目１３］
上記スクリーニングシステムは、酵母および毒素遺伝子ＵＲＡ３を用いて行われる、項目１に記載のスクリーニングシステム。
［項目１４］
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニング用組成物であって、
ｉ）標的を認識することが可能な部分、および上記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ｉｉ）１つまたは複数の選択要素 を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備える組成物。
［項目１５］
上記ヌクレアーゼは、上記ＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼ）である、項目１４に記載のスクリーニング用組成物。
［項目１６］
上記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子である、項目１４に記載のスクリーニング用組成物。
［項目１７］
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
ａ）項目１から１１のいずれか一項に記載のｉ）成分およびｉｉ）成分を細胞に導入する段階と、
ｂ）上記ａ）において選択要素が発現するか否かに基づいて上記オンターゲット効果および上記オフターゲット効果を特定することにより上記細胞を選別する段階と、
ｃ）ｂ）における選別された細胞中に含まれる上記ヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する上記標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法。
［項目１８］
上記ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を上記細胞に上記導入する段階は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、カチオン系ポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン系リポソームトランスフェクション、イムノリポソームトランスフェクション、非リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、遺伝子銃デリバリー、インペールフェクション、ソノポレーションおよび光トランスフェクションからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いて行われる、項目１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
［項目１９］
上記ａ）においてｉ）成分およびｉｉ）成分を上記細胞に上記導入する段階は、エレクトロポレーションを用いて行われる、項目１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
［項目２０］
上記ｂ）における上記細胞は、選択要素が発現するか否かに基づく特定に伴い、オンターゲット効果が増大しオフターゲット効果が低下したものが選別される、項目１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
［項目２１］
上記ヌクレアーゼの配列は、上記ｃ）において上記選別された細胞から得られる上記ヌクレアーゼを配列決定することにより取得される、項目１７に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
［項目２２］
１つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、１つまたは複数のオンターゲットおよび１つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的
を備える、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキット。
［項目２３］
上記複数標的は、宿主細胞中にある、項目２２に記載のスクリーニングキット。
［項目２４］
標的特異的ヌクレアーゼを選択するための上記スクリーニングキットは、
標的を認識することが可能な部分、および上記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
宿主細胞と
からなる群から選択される１つまたは複数の成分をさらに備える、
項目２２に記載のスクリーニングキット。
【国際調査報告】
2019517802.tif 000012
2019517802.tif 000013
2019517802.tif 000014
2019517802.tif 000015