(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、発がんにおけるＴＵＴａｓｅの、ＬＩＮ２８に非依存的な役割である。本明細書に提供されるのは、ＴＵＴａｓｅの阻害を介してがんを処置するための組成物および方法である。ＴＵＴａｓｅの枯渇はまた、ＲＮＡ代謝および／またはタンパク質代謝における乱れに対しても、細胞を敏感にさせる。よって、本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するため、ＴＵＴａｓｅインヒビター、ＲＮＡ代謝を乱す剤、およびタンパク質代謝を乱す剤を組み合わせる、併用治療のストラテジーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを処置する方法であって、方法が、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターを含む組成物を投与することを含み、ここでがＴＵＴａｓｅんが、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない、前記方法。
【請求項２】
ＴＵＴａｓｅが、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＴＵＴａｓｅの酵素活性を阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、以下：SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＴＵＴａｓｅの発現を低減させる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６を標的にするＲＮＡｉである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、Ｃａｓ９にＺＣＣＨＣ１１遺伝子またはＺＣＣＨＣ６遺伝子を標的にさせるガイドＲＮＡとを共発現するベクターであり、これによってＺＣＣＨＣ６遺伝子またはＺＣＣＨＣ１１遺伝子が、Ｃａｓ９によって切断される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗体または抗体断片が、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６に特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、治療的に有効な量のＲＮＡ代謝を乱す剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、５’フルオロピリミジンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
５’フルオロピリミジンが、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、フトラフルフトラフル、またはウラシルテガフール（ＵＦＴ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
５’フルオロピリミジンが、５−ＦＵである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、以下：６−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および６−チオグアニンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、葉酸代謝拮抗薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質代謝を乱す剤が、タンパク質の代謝回転を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質代謝を乱す剤が、プロテアソームインヒビターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
プロテアソームインヒビターが、以下：ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ONX-0912）、デランゾミブ（CEP-18770）、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガラート、エポキソミシン、およびＭＧ１３２ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質代謝を乱す剤が、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲインヒビターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンまたはラパログである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ラパログが、以下：シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲインヒビターが、ＡＴＰ競合性ｍＴｏｒキナーゼインヒビターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＡＴＰ競合性ｍＴｏｒキナーゼインヒビターが、Torin1またはTorin2である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
組成物が、転移を予防する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
組成物が、注射を介してがんへ投与される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
組成物が、全身に投与される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対象が、哺乳動物である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物が、ヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物が、齧歯動物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
齧歯動物が、ラットである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
齧歯動物が、マウスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＴＵＴａｓｅインヒビターなしと比較して、がん細胞におけるｍＲＮＡの半減期を増加させる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
がんを処置する方法であって、方法が、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターおよびＲＮＡ代謝を乱す剤を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
ＴＵＴａｓｅが、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＴＵＴａｓｅの酵素活性を阻害する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、以下：SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＴＵＴａｓｅの発現を低減させる、請求項４１の方法。
【請求項４５】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６を標的にするＲＮＡｉである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、Ｃａｓ９にＺＣＣＨＣ１１遺伝子またはＺＣＣＨＣ６遺伝子を標的にさせるガイドＲＮＡとを共発現するベクターであり、これによってＺＣＣＨＣ６遺伝子またはＺＣＣＨＣ１１遺伝子が、Ｃａｓ９によって切断される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
抗体または抗体断片が、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６に特異的である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、５’フルオロピリミジンである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
５’フルオロピリミジンが、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フトラフル、またはウラシルテガフール（ＵＦＴ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
５’フルオロピリミジンが、５−ＦＵである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬が、以下：６−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および６−チオグアニンからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、葉酸代謝拮抗薬である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
葉酸代謝拮抗薬が、以下：メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
組成物が、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む、請求項３９〜５５いずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
タンパク質代謝を乱す剤が、タンパク質の代謝回転を阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
タンパク質代謝を乱す剤が、プロテアソームインヒビターである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
プロテアソームインヒビターが、以下：ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ONX-0912）、デランゾミブ（CEP‐18770）、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガラート、エポキソミシン、およびＭＧ１３２ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
タンパク質代謝を阻害する剤が、ＰＩ３Ｋ／ｍＴｏｒインヒビターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
ＰＩＫ３／ｍＴｏｒインヒビターが、ラパマイシンまたはラパログである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ラパログが、以下：シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＰＩＫ３／ｍＴｏｒインヒビターが、ＡＴＰ競合性ｍＴｏｒキナーゼインヒビターである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＡＴＰ競合性ｍＴｏｒキナーゼインヒビターが、Torin1またはTorin2である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
がんが、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない、請求項３９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
組成物が、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
組成物が、転移を予防する、請求項３９〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
組成物が、注射を介してがんへ投与される、請求項３９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
組成物が、全身に投与される、請求項３９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
対象が、哺乳動物である、請求項３９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
哺乳動物が、ヒトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
哺乳動物が、齧歯動物である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
齧歯動物が、ラットである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
齧歯動物が、マウスである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ＴＵＴａｓｅインヒビターが、ＴＵＴａｓｅなしと比較して、がん細胞におけるｍＲＮＡの半減期を増加させる、請求項３９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
がんを処置するための末端ウリジルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターを含む医薬組成物であって、がんが、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない、前記医薬組成物。
【請求項７８】
がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターおよびＲＮＡ代謝を乱す剤を含む、医薬組成物。
【請求項７９】
ＲＮＡ代謝を乱す剤が、５−フルオロウラシルである、請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
組成物が、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
タンパク質代謝を乱す剤が、プロテアソームインヒビターである、請求項８０に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブである、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
タンパク質代謝を乱す剤が、ＰＩＫ３／ｍＴｏｒインヒビターである、請求項８０に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
組成物が、薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2016年6月7日に出願された米国仮特許出願第62/347,048号の、35 U.S.C. § 119(e)下の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本開示は、国立衛生研究所によって授与された5R01GM107536およびT32GM007753下の政府の支援を受けてなされた。政府は本開示においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
３’−末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）は、ＬＩＮ-２８／ＡＢに依存的な様式でのマイクロＲＮＡ（例として、ｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡ）生物発生における役割を果たすことが、指し示されてきた。ＴＵＴａｓｅ（例として、哺乳動物細胞におけるＺＣＣＨＣ６またはＺＣＣＨＣ１１）によるｐｒｅ−ｌｅｔ−７のウリジル化は、その分解に繋がり、そして順に、成熟ｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡの抑制に繋がる。数多のがんは、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂに媒介されるｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡの抑制と結び付けられてきた。しかしながら、発がんにおけるＴＵＴａｓｅの、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂに非依存的な役割は、記載されていない。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、３’末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）の阻害を介して、がん（例として、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しないがん）を処置するための組成物および方法を提供する。本明細書に示されるとおり、哺乳動物のＴＵＴａｓｅ（例として、ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１）は、ＬＩＮ２８に非依存的なかつマイクロＲＮＡに非依存的な様式で、ｍＲＮＡのウリジル化および代謝回転を調節する。さらに、ＴＵＴａｓｅは、多様なタイプのがんにおいて過剰発現されており、およびＴＵＴａｓｅの枯渇は、がんの成長を阻害する。その結果、本明細書に記載されているのは、ＴＵＴａｓｅインヒビターを使用してがんを処置する方法と、ＴＵＴａｓｅ枯渇細胞がＲＮＡおよび／またはタンパク質の代謝の乱れに敏感であるという発見に基づく併用治療とである。
【０００５】
本開示のいくつかの側面は、がんを処置する方法であって、これを必要とする対象へ、がんを処置するための治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターを含む組成物を投与することを含む前記方法を提供し、ここでがんが、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない。
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅは、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６である。
【０００６】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である。いくつかの様態において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＴＵＴａｓｅの酵素活性を阻害する。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、以下：SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される。
【０００７】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＴＵＴａｓｅの発現を低減させる。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６を標的にするＲＮＡｉである。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、Ｃａｓ９にＺＣＣＨＣ１１遺伝子またはＺＣＣＨＣ６遺伝子を標的にさせるガイドＲＮＡ(a guide RNA that targets the Cas9 to the ZCCHC11 or ZCCHC6 gene)とを共発現するベクターであり、これによってＺＣＣＨＣ６遺伝子またはＺＣＣＨＣ１１遺伝子は、Ｃａｓ９によって切断される。
いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６に特異的である。
【０００８】
いくつかの態様において、組成物は、治療的に有効な量のＲＮＡ代謝を乱す剤(an agent that disrupts RNA metabolism)をさらに含む。いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する。いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬(a purine and pyrimidine antimetabolite)である。いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、５’フルオロピリミジンである。いくつかの態様において、５’フルオロピリミジンは、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、フトラフル、またはウラシルテガフール（ＵＦＴ）である。いくつかの態様において、５’フルオロピリミジンは、５−ＦＵである。
【０００９】
いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、以下：６−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスリジン、シタラビン、および６−チオグアニンからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、葉酸代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、葉酸代謝拮抗薬は、メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの態様において、組成物は、タンパク質代謝を乱す剤(an agent that disrupts protein metabolism)をさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、タンパク質の代謝回転を阻害する。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、プロテアソームインヒビターである。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、以下：ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ONX-0912）、デランゾミブ（CEP-18770）、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガラート、エポキソミシン、およびＭＧ１３２ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。
【００１１】
いくつかの態様において、タンパク質代謝を阻害する剤は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴｏｒインヒビターである。いくつかの態様において、ＰＩＫ３／ｍＴｏｒインヒビターは、ラパマイシンまたはラパログ(a rapalog)である。いくつかの態様において、ラパログは、以下：シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターは、ＡＴＰ競合性ｍＴＯＲキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、ＡＴＰ競合性ｍＴＯＲキナーゼインヒビターは、Torin1またはTorin2である。
【００１２】
いくつかの態様において、組成物は、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる。いくつかの態様において、組成物は、転移を予防する。
いくつかの態様において、組成物は、注射を介してがんへ投与される。いくつかの態様において、組成物は、全身に投与される。
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。
【００１３】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＴＵＴａｓｅインヒビターなしと比較して、がん細胞におけるｍＲＮＡの半減期を増加させる。
本開示の他の側面は、がんを処置する方法であって、これを必要とする対象へ、がんを処置するために、治療的に有効な量の末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターおよびＲＮＡ代謝を乱す剤を含む組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅは、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６である。
【００１４】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、または抗体断片である。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＴＵＴａｓｅの酵素活性を阻害する。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、以下：SCH 202676臭化水素酸塩、Tryphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、およびIPA-3からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＴＵＴａｓｅの発現を低減させる。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６を標的にするＲＮＡｉである。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、Ｃａｓ９にＺＣＣＨＣ１１遺伝子またはＺＣＣＨＣ６遺伝子を標的にさせるガイドＲＮＡとを共発現するベクターであり、これによってＺＣＣＨＣ６遺伝子またはＺＣＣＨＣ１１遺伝子は、Ｃａｓ９によって切断される。いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６に特異的である。
【００１５】
いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、ヌクレオチドの合成または代謝を阻害する。いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、５’フルオロピリミジンである。いくつかの態様において、５’フルオロピリミジンは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フトラフル、またはウラシルテガフール（ＵＦＴ）である。いくつかの態様において、５’フルオロピリミジンは、５−ＦＵである。
【００１６】
いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、以下：６−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および６−チオグアニンからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、葉酸代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、葉酸代謝拮抗薬は、メトトレキサート、ペメトレキセド、ノラトレキシド、ラルチトレキセド、およびZD9331からなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの態様において、組成物は、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、タンパク質の代謝回転を阻害する。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、プロテアソームインヒビターである。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、以下：ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ONX-0912）、デランゾミブ（CEP‐18770）、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガラート、エポキソミシン、およびＭＧ１３２ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラートからなる群から選択される。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。
【００１８】
いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲインヒビターである。いくつかの態様において、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターは、ラパマイシンまたはラパログである。いくつかの態様において、ラパログは、以下：シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムスからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターは、ＡＴＰ競合性ｍＴＯＲキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、ＡＴＰ競合性ｍＴＯＲキナーゼインヒビターは、Torin1またはTorin2である。
【００１９】
いくつかの態様において、がんは、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない。
いくつかの態様において、組成物は、がん細胞の成長を阻害し、および腫瘍サイズを低減させる。いくつかの態様において、組成物は、転移を予防する。
いくつかの態様において、組成物は、注射を介してがんへ投与される。いくつかの態様において、組成物は、全身に投与される。
【００２０】
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、ＴＵＴａｓｅなしと比較して、がん細胞におけるｍＲＮＡの半減期を増加させる。
【００２１】
本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターを含む医薬組成物であり、ここでがんは、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない。
本明細書にさらに提供されるのは、がんを処置するための、末端ウリジルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）インヒビターおよびＲＮＡ代謝を乱す剤を含む医薬組成物である。
【００２２】
いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、５−フルオロウラシルである。いくつかの態様において、組成物は、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、プロテアソームインヒビターである。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターである。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
【００２３】
本開示の限定の各々は、本開示の様々な態様を網羅し得る。したがって、いずれの１つの要素または要素の組み合わせを伴う本開示の限定の各々は、本開示の各側面に包含され得ることが、予期される。本開示は、その適用において、以下の記載において記述されるかまたは図面において説明される、構造の詳細および構成要素の配置に限定されない。本開示は、その他の態様であることも可能であり、および様々なやり方で実践されることまたは実行されることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な記載
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために包含されるものであるが、これらは、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうち１つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂ。ＺＣＣＨＣ６／１１は、厳選した正常な成人組織において発現される。図１Ａは、１４名の健常なヒトの組織からの溶解物のウェスタンブロット分析を示す。ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１の主要なアイソフォームの予想されるサイズは、右手に指し示される。星印は、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現する組織の印である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、３０名の健常なヒトの組織からの試料の、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析を示す。種々の線は、右手に指し示されるとおり、ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１の明確な予測スプライスアイソフォームを表す。データは、GTEx Portal（gtexportal.org）から得られた。
【００２６】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂ。ＺＣＣＨＣ６／１１は、多様なタイプのがんにおいて高度に発現される。図２Ａは、種々のタイプの腫瘍からのヒト患者試料におけるＺＣＣＨＣ６／１１ ｍＲＮＡレベル（Ｚ−スコア）を示す。ヒートマップは、集約された発現データを描写する一方で、ヒストグラムは、腫瘍タイプによってグループ分けされたデータを示す。各バーは、個々の患者を表す。データは、cBio Portal（cbioportal.org）から得られた。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々のタイプのがんを表す３０種のヒトがん細胞株のウェスタンブロット分析を示す。ＢＪ１線維芽細胞は、正常な組織の参照として包含される。
【００２７】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅ。ＴＵＴａｓｅの過剰な発現は、発がん性形質転換を促進する。図３Ａは、ＧＦＰ、野生型ＺＣＣＨＣ６（Ｚ６（ＷＴ））、無触媒性(catalytic-null)ＺＣＣＨＣ６（Ｚ６（ＤＡＤＡ））、または突然変異体ＫＲＡＳ（ＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ））がレンチウイルスによって過剰発現されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の軟寒天におけるコロニー形成を示す。３つの独立した実験の代表的な画像が示される。倍率４×。
【図３Ｂ−３Ｃ】図３Ｂは、図３Ａからのコロニー形成アッセイの定量化を提示する。値は、４つの独立した視野からの総数(the sum of counts)を表す。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図３Ｃは、図３Ａ〜３Ｂにおいて分析された細胞のウェスタンブロット分析を示す。
【００２８】
【図３Ｄ−３Ｅ】図３Ｄは、指し示される構築物がレンチウイルスによって過剰発現されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の軟寒天におけるコロニー形成を示す。ＲＡＳ＝ＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）、ＭＹＣ＝Ｃ−ＭＹＣ。３つの独立した実験の代表的な画像が示される。倍率４×。図３Ｅは、図３Ｄからのコロニー形成アッセイの定量化を示す。値は、４つの独立した視野からの総数を表す。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；ｎ．ｓ．＝有意でない（Ｐ＞０．０５）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００２９】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜４Ｇ。ＴＵＴａｓｅの枯渇は、多様ながん細胞のタイプにおける成長を損なう。図４Ａは、６つの異なるタイプのがんを表す１９種の細胞株の一団のＺＣＣＨＣ６／１１ ｓｉＲＮＡスクリーニングからの結果の概要を提示する。ＴＵＴａｓｅの二重ノックダウンの際に成長が損なわれるという表現型をもつ（濃灰色）またはもたない（薄灰色）細胞株のパーセンテージが表示される。図４Ｂは、代表的なＴＵＴａｓｅ依存性細胞株の細胞増殖分析を示す。細胞は、ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＺ６+Ｚ１１）または陰性対照（ｓｉＮＣ）でリバーストランスフェクションされ(reverse transfected)、２４ｈ後に計数され（ｄ０）、およびもう９６ｈ後に再計数された（ｄ４）。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３０】
【図４Ｃ−４Ｄ】図４Ｃは、ＺＣＣＨＣ６を標的にするｓｇＲＮＡ（ＫＯ）またはＧＦＰを標的にする対照ｓｇＲＮＡ（ＷＴ）を使用する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるノックアウト後のＨＣＴ１１６細胞のフォーカス形成を示す。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊＊Ｐ＜０．０１。代表的な画像（クリスタルバイオレット染色）は、右手に示される。倍率４×。図４Ｄは、ＺＣＣＨＣ６を標的にするｓｇＲＮＡ（ＫＯ）またはＧＦＰを標的にする対照ｓｇＲＮＡ（ＷＴ）を使用する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるノックアウト後のＨＣＴ１１６細胞の軟寒天におけるコロニー形成を示す。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５。代表的な画像（クリスタルバイオレット染色）は、右手に示される。倍率４×。
【００３１】
【図４Ｅ−４Ｆ】図４Ｅは、ＺＣＣＨＣ６を標的にするｓｇＲＮＡ（ｇＺ６；下の線）、またはＧＦＰを標的にする対照ｓｇＲＮＡ（ｇＧＥＦ；上の線）を使用する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるノックアウト後のＨＣＴ１１６細胞から産出される皮下異種移植片の成長曲線を示す。注射後の日数は、ｘ軸上に指し示される。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝７）；＊＊＊Ｐ＜０．００１（線形回帰試験）。図４Ｆは、回収の時点（４３日目）での図４Ｅからの異種移植片の腫瘍重量測定値を示す。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝７）；＊＊Ｐ＜０．０１。腫瘍の代表的な画像は、右手に示される。
【図４Ｇ】図４Ｇは、、回収の時点（４３日目）での図４Ｅからの異種移植片腫瘍のウェスタンブロット分析を示す。
【００３２】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂ。ＴＵＴａｓｅの喪失は、がん細胞をＲＮＡ代謝の乱れに対して敏感にする。図５Ａは、利用された薬物およびそれらの作用機序の概要（上の表）、および実験的ワークフローの概略図（下）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに指し示されるとおり、種々の濃度の指し示された薬物での処置の下、ＺＣＣＨＣ６を標的にするｓｇＲＮＡ（ＫＯ）またはＧＦＰを標的にする対照ｓｇＲＮＡ（ＷＴ）を使用する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるノックアウト後のＨＣＴ１１６細胞の成長曲線を示す。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３３】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆ。ＴＵＴａｓｅは、ｍＲＮＡをウリジル化し、およびそれらの代謝回転をがん細胞において増強する。図６Ａは、ＺＣＣＨＣ６ノックダウン（ｓｉＺ６）後のＨＣＴ１１６細胞におけるｍＲＮＡウリジル化の頻度を示すＴＡＩＬ−ｓｅｑデータ（ｎ＝３）を提供する。スクランブルｓｉＲＮＡ(A scrambled siRNA)は、陰性対照（ｓｉＮＣ）として働いた。合計のポリ（Ａ）＋の総読み取りデータ(reads)のうち、ｍＲＮＡの読み取りデータの割合は、各ポリ（Ａ）テールのサイズ範囲に示される。指し示されるように、薄灰色は、Ｕではない読み取りデータを指す一方、より暗い色合いの方は、ウリジル化された読み取りデータを表す。実験的ワークフローの概略図は、上に示される。
【００３４】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＺＣＣＨＣ６ノックダウン後のｍＲＮＡ発現レベルの分布を示すＲＮＡ−ｓｅｑデータ（ｎ＝３）を提供する。ｘ軸は、個々の遺伝子を描写し、ｙ軸は、それらのｍＲＮＡレベルにおいて対応するＬｏｇ２倍の変化を指し示す。指し示されるとおり、ライブラリは、２つの代替プロトコルを使用して調製された。２つのプロトコルから得られたデータ間の相関関係は、下に示される。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ウリジル化頻度（図１２Ａ〜１２Ｄにおいて示されるＨｅＬａデータを使用する）と、ｍＲＮＡ半減期（Tani et al.,2012からのＨｅＬａデータを使用する）との間の相関関係を、遺伝子ごとに(on a per gene basis)示す。
【００３５】
【図６Ｄ】図６Ｄは、RiboZero ＲＮＡ−ｓｅｑと連動させたアクチノマイシンＤ追跡(actinomycin D chase)を使用する、ゲノム全体のｍＲＮＡ半減期の測定値（ｎ＝３）を示す。上の概略図は、実験のワークフローを指し示し、下のグラフは、ＺＣＣＨＣ６ノックダウン（ｓｉＺ６）後vs.対照（ｓｉＮＣ）の平均ｍＲＮＡ半減期を、遺伝子ごとに（左）、または集約されたものとして（右）、描写する。
【図６Ｅ−６Ｆ】図６Ｅは、図６Ｄからの半減期の測定値のｑＲＴ-ＰＣＲ検証（ｎ＝３）を示す。４つの代表的な遺伝子に関するデータが示される。図６Ｆは、ＺＣＣＨＣ６ノックダウン後の低分子非コードＲＮＡ(short non-coding RNAs)の半減期のｑＲＴ-ＰＣＲ分析（ｎ＝３）を示す。実験は、１２ｈ時点の追加はあるが、本質的に図６Ｄに示されるとおりに実施された。
【００３６】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃ。結腸直腸の腫瘍形成におけるＴＵＴａｓｅに対する要求のin vivoでの評価。図７Ａは、結腸直腸がんのマウスモデルからの組織溶解物のウェスタンブロット分析を示す。腸の腫瘍（上）および結腸の腫瘍（下）の両方が、分析された。試料は、標準のＡｐｃＭｉｎモデル、およびより悪性のＡｐｃＭｉｎ＋Ｌｉｎ２８ａおよびＡｐｃＭｉｎ＋ＬＩＮ２８Ｂモデルから得られた。野生型動物からの正常な粘膜は、対照として働いた。各レーンは、独立した腫瘍を表す。
【００３７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、ヒトの結腸直腸がん患者からの組織溶解物のウェスタンブロット分析を示す。適合した患者（右）および適合しない患者（左）からの正常な粘膜は、対照として働いた。各レーンは、独立した腫瘍を表し、適合した試料は、角括弧でグループ分けされている。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＡｐｃＭｉｎマウスモデルにおける結腸直腸腫瘍形成に対するＴＵＴａｓｅの要求の評価のためのブリーディングストラテジー(the breeding strategy)を示す。
【００３８】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂ。ドキシサイクリン誘導性ＴＵＴａｓｅを過剰発現するＥＳＣの産生。図８Ａは、ドキシサイクリン誘導性ＺＣＣＨＣ６／１１（ｉＺＣＣＨＣ６／１１）対立遺伝子の概略図を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｉＺＣＣＨＣ６（左）およびｉＺＣＣＨＣ１１（右）のＥＳＣクローンのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【００３９】
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄ。ＬＩＮ２８ＢおよびＺＣＣＨＣ６／ＴＵＴ７は、細胞質においてＲＮＡに依存的な様式で相互作用する。図９Ａは、Ｌｉｎ２８ａとＬＩＮ２８Ｂとのタンパク質パートナー間の共通集合を描写するベン図である。図９Ｂは、ＢＥ２Ｃ細胞から精製されたＬＩＮ２８Ｂの質量分析の分析データ(mass spectrometry analysis)を示す。図９Ｃは、質量分析データ(the mass spectrometry data)のウェスタンブロット検証を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＢＥ２Ｃ細胞からの細胞下画分のウェスタンブロット分析を示す。チューブリンおよびフィブリラリンは夫々、細胞質マーカーおよび核マーカーとして働く。ＷＣＥ＝全細胞抽出物。Ｃｙｔ＝細胞質；Ｎｕｃ＝核。
【００４０】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃ。ＺＣＣＨＣ６／１１の枯渇は、成熟ｌｅｔ−７のレベルを普遍的には変更しない。ＨｅｐＧ２（図１０Ａ）、ＢＥ２Ｃ（図１０Ｂ）、および２９３Ｔ（図１０Ｃ）細胞における、２つの独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉＢ−２およびｓｉＢ−３）、ＺＣＣＨＣ６（ｓｉＺ６）、ＺＣＣＨＣ１１（ｓｉＺ１１）、またはＺＣＣＨＣ６とＺＣＣＨＣ１１との両方（ｓｉＺ６＋１１）でのＬＩＮ２８Ｂのノックダウンの後の成熟ｌｅｔ−７のレベルが、示される。ノックダウンのウェスタンブロット検証は夫々、各図の下に示される。分析は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの９６ｈ後に実施された。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃ。ＺＣＣＨＣ６／１１の枯渇は、成熟ｌｅｔ−７のレベルを普遍的には変更しない。ＨｅｐＧ２（図１０Ａ）、ＢＥ２Ｃ（図１０Ｂ）、および２９３Ｔ（図１０Ｃ）細胞における、２つの独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉＢ−２およびｓｉＢ−３）、ＺＣＣＨＣ６（ｓｉＺ６）、ＺＣＣＨＣ１１（ｓｉＺ１１）、またはＺＣＣＨＣ６とＺＣＣＨＣ１１との両方（ｓｉＺ６＋１１）でのＬＩＮ２８Ｂのノックダウンの後の成熟ｌｅｔ−７のレベルが、示される。ノックダウンのウェスタンブロット検証は夫々、各図の下に示される。分析は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの９６ｈ後に実施された。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００４１】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂ。ＺＣＣＨＣ６／１１は、ヒトの腫瘍において、滅多に増幅されることも、欠失されることも、突然変異されることもない。図１１Ａは、種々のタイプの腫瘍からのヒト患者試料における、ＺＣＣＨＣ６／１１の突然変異、欠失、および増幅の頻度を示す。各バーが、明確なタイプのがんを表す。データは、cBio Portal（cbioportal.org）から得られた。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、種々のタイプのがんからのヒト患者試料における、ＺＣＣＨＣ６／１１における特定の突然変異の頻度を示す。データは、cBio Portal（cbioportal.org）から得られた。
【００４２】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｂ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとする遺伝的な乱れは、ＲＮＡｉをベースとする表現型を確認する。図１２Ａは、２つの独立したｓｇＲＮＡ（ＫＯ＃１およびＫＯ＃２）でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるＺＣＣＨＣ６のノックアウト後のＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖分析を示す。ＧＦＰを標的にする２つのｓｇＲＮＡ（ＷＴ＃１およびＷＴ＃２）は、陰性対照として使用された。細胞は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡレンチウイルス粒子で形質導入され、ピューロマイシンで５日間選択され、開始細胞数を確立するために計数され（ｄ０）、９６ｈ後に再計数された（ｄ４）。集団レベルのノックアウトの効率のウェスタンブロット評価は、下に示される。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５。
【００４３】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１のノックアウト（ＤＫＯ）後のＨ１２９９細胞の細胞増殖分析を示す。ＧＦＰを標的にする二重のｓｇＲＮＡは、陰性対照（ＷＴ）として使用された。アッセイは、図１２Ａの実験と類似して実施された。集団レベルのノックアウトの効率のウェスタンブロット評価は、下に示される。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００４４】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｂ。ＴＵＴａｓｅの枯渇は、ＬＩＮ２８かつｍｉＲＮＡに非依存的な様式で、がん細胞の成長を損なう。２つの独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉＺ６＃１およびｓｉＺ６＃２）、ＺＣＣＨＣ１１（ｓｉＺ１１）、またはＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１の両方（ｓｉＺ６＃１＋１１およびｓｉＺ６＃２＋１１）でのＺＣＣＨＣ６のノックダウン後の、野生型ＨＣＴ１１６細胞（図１３Ａ）およびＤＩＣＥＲＥｘ５（図１３Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖の分析が、示される。細胞は、リバーストランスフェクションされ、２４ｈ後に計数され、およびもう９６ｈ後に再計数された。最終的な総数(counts)は、最初に各条件についての開始総数に対して正規化され、次いで対照条件（ＳｉＮＣ）に対して正規化された。ノックアウトの効率のウェスタンブロット評価は夫々各図の下に示される。
【００４５】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄ。ＴＡＩＬ−ｓｅｑは、３’ｍＲＮＡウリジル化を、定量的に評価し得る。図１４Ａは、ＴＡＩＬ−ｓｅｑのための実験手順を描写する（出典Chang et al., 2014）。図１４Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＴＡＩＬ-ｓｅｑプロトコルの４つの最適化バージョン（ｓ１〜ｓ４）を使用して得られたｍＲＮＡ読み取りデータ数を示す。下のバーは、ポリ（Ａ）配列を欠く読み取りデータ（非ポリ（Ａ））を指す一方、下から上へ続くバーは夫々、無ウリジル化（無Ｕ）、モノ−ウリジル化（Ｕ）、ジ−ウリジル化（ＵＵ）、またはトリ−以上のウリジル化（Ｕ≧３）であるポリ（Ａ）＋の読み取りデータを表す。データ処理は、変更を加えて、Chang et al.（2014）に記載されるとおりに実施された（詳細については例の節を参照）。
【００４６】
【図１４Ｃ−１４Ｄ】図１４Ｃは、試料ｓ１〜ｓ４のウリジル化の頻度を示す。ポリ（Ａ）＋の総読み取りデータのうちｍＲＮＡの読み取りデータの割合は、各ポリ（Ａ）テールのサイズ範囲に示される。指し示されるとおり、薄灰色は、無Ｕの読み取りデータを指す一方、より暗い色合いの方は、ウリジル化の読み取りデータを表す。図１４Ｄは、我々のデータ（ｓ１およびｓ２は、代表的な試料として使用される）と、Chang et al. (2014)からの公開のデータとの共通集合を描写するベン図を表す。
【００４７】
【図１５】図１５。ＲＮＡ分解因子のスクリーニングにおいて使用される、ｓｇＲＮＡの検証。ＨＣＣＴ１１６細胞における、指し示されたＲＮＡ分解因子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析が、示される。５つの明確なｓｇＲＮＡ（１〜５）が試験された。ＧＦＰを標的にするｓｇＲＮＡは、陰性対照として働いた。細胞は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡレンチウイルス粒子で形質導入され、ピューロマイシンで５日間選択され、およびＲＮＡの単離のために回収された。枠で囲まれたｓｇＲＮＡは、スクリーニングにおける使用のために選択された。
【００４８】
【図１６】図１６。ＴＵＴａｓｅの喪失は、タンパク質の代謝回転に対して下流影響を有する。上、ＯＰ−ピューロマイシン蛍光アッセイによって測定されたとおりの、全体的なｍＲＮＡ翻訳の相対速度が、示される。ｓｉＮＣ＝陰性対照のｓｉＲＮＡ。ｓｉＺ6＝ｓｉＺＣＣＨＣ６。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５。下、種々の濃度のボルテゾミブでの処置の下、ＺＣＣＨＣ６を標的にするｓｇＲＮＡ（ＫＯ）、またはＧＦＰを標的にする対照ｓｇＲＮＡ（ＷＴ）を使用する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるノックアウト後のＨＣＴ１１６細胞の成長曲線が示される。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本開示は、本明細書に記載の具体的な方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、それ自体変動してもよいことが理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語は、具体的な態様を記載することしか目的としておらず、専らクレームによって定義される本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５０】
本明細書におよびクレームにおいて使用されるとき、単数形は、文脈から明らかにそうではないと指し示されていない限り、その複数形として引用するもの(the plural reference)を包含し、その逆もまたしかりである。用語「または」は、例えば「いずれか」によって修飾されていない限り、包括的である。実施例(the operating examples)において以外、または他に指し示される場合以外、本明細書に使用される、成分の分量または反応条件を表現するすべての数は、すべての実例において用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。「約」は、パーセンテージに関係して使用されるとき、他に特定されない限り、±１％を意味する。
【００５１】
特定されたすべての特許および他の刊行物は、記載および開示の目的のため参照により本明細書に明示的に組み込まれる。例えば、本開示に関係して使用された可能性のあるような刊行物において記載された方法論である。
これらの刊行物は、本出願の出願日に先立ち、専らそれらの開示のために提供されている。この点に関し、本発明者らに対して、先の開示のためにまたは他の何らかの理由のために、かかる開示に先行する権利が与えられないという自白として、解釈されるべきものは何もない。これらの文書の日付に関する陳述またはその内容に関する表示はすべて、本出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる自白も構成するものではない。
【００５２】
他に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本開示に関連する当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。知られているいずれの方法、デバイス、および材料は、本開示の実践または試験において使用されてもよいが、この点に関する方法、デバイス、および材料は、本明細書に記載されている。
【００５３】
ＲＮＡウリジリルトランスフェラーゼは、非コードの３’オリゴＵテールのＲＮＡへの付加を触媒する酵素である。いくつかの実例において、ＲＮＡウリジリルトランスフェラーゼはまた、「末端ウリジリルトランスフェラーゼ（ＴＵＴａｓｅ）」、または「３’末端ウリジリルトランスフェラーゼ」とも称される。これらの用語は、本開示において相互交換可能に使用される。
【００５４】
ＴＵＴａｓｅは、ＬＩＮ２８に依存的な様式で、がんという状況下でのマイクロＲＮＡの生物発生を調節することにおいて、重要な役割を果たす。ＬＩＮ２８は、Ｌｅｔ７の生物発生を介して、遺伝子発現を部分的に調節するＲＮＡ結合タンパク質である。Ｌｅｔ７ファミリーのｍｉＲＮＡは、がん遺伝子（ｃ−ｍｙｃ、Ｒａｓ、ＨＭＧＡ−２)および細胞周期因子（サイクリンＤ１、Ｄ２）を包含する、細胞運命決定を制御する多くの因子を調節する。
【００５５】
哺乳動物において、ＬＩＮ２８Ａ、およびその近縁の(closely related)パラログであるＬＩＮ２８Ｂは、それらが自己複製および増殖の維持において重要な役割を果たすところである多能性細胞において、高度に発現されている。例えば、米国特許公報US20140328858において、ＴＵＴａｓｅs（例として、哺乳動物の、相同のＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１）は、マイクロＲＮＡ前駆体であるｐｒｅ−ｌｅｔ−７をウリジル化するために、ＬＩＮ２８によって、動員される。ｐｒｅ−ｌｅｔ−７のウリジル化は、その分解、および成熟ｌｅｔ−７マイクロＲＮＡの抑制に繋がり、これは順に、細胞の発がん性形質転換に繋がり、およびそれらの成長および腫瘍形成能を促進する。しかしながら、ｐｒｅ−ｌｅｔ−７ウリジル化の他に、ＴｕＴａｓｅに媒介されるＲＮＡのウリジル化と発がんの間の直接的な結び付きは、以前から記載も示唆もない。
【００５６】
本開示の一側面は、ＴＵＴａｓｅが、ＬＩＮ２８Ａ／ＢおよびマイクロＲＮＡから独立した経路を介して、発がんを促進するという新規かつ予想外の発見に、少なくとも一部において、基づく。本開示の図および例において記載されるとおり、ＴＵＴａｓｅｓ（例として、ＺＣＣＨＣ１１およびＺＣＣＨＣ６）をノックダウンすることは、細胞のｌｅｔ-７レベルに対してあまり影響を及ぼさなかった一方、ＬＩＮ２８Ｂノックダウンは、ｌｅｔ−７の抑制解除を引き起こした。このことは、ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１が、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂと連携して、ｌｅｔ−７を普遍的には調節していないことを指し示している。その代わり、Lim et al.,Cell. 2014 December 4; 159(6): 1365-1376において記載されるとおり、ＴＵＴａｓｅは、ｍＲＮＡのウリジル化、および全体的なｍＲＮＡ崩壊の調節における役割を果たしているように見える。さらに、本開示は、ＴＵＴａｓｅ（ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１）が、数タイプのがん（例として、結腸、肺、および肝臓）において過剰発現されるという証拠を提供する。
【００５７】
正常細胞におけるＴＵＴａｓｅの誘導過剰発現は、発がん性形質転換を促進し得る一方、多様ながんタイプにおけるＴＵＴａｓｅの枯渇は、がん細胞の成長を阻害した。興味深いことに、ＴＵＴａｓｅｓとがんとの間の相関関係は、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂの発現とは無関係である。よって、本明細書に提供されるのは、ＴＵＴａｓｅをがん遺伝子の新しいクラスとして確立するデータ、およびＬＩＮ２８Ａ／Ｂ陽性または陰性のがんを包含するがんを処置するための、ＴＵＴａｓｅの発がんにおける新しい役割を活用するストラテジーである。
【００５８】
その結果、本開示のいくつかの側面は、がんを処置するための医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、治療的に有効な量のＴＵＴａｓｅインヒビターを含む。
【００５９】
いくつかの態様において、がんは、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しない。ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現しないがんはまた、「ＬＩＮ２８陰性がん」とも称されてもよい。がんが、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを発現するかどうかを決定するために、当業者、例として、内科医または臨床医は、がんの試料（例として、生検試料）を得て、およびタンパク質発現分析に使用されてもよい当該技術分野において周知の数多の技術を介してＬＩＮ２８の発現を分析してもよい。
【００６０】
かかる技術は、限定せずに、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色アッセイ、およびｑＲＴ−ＰＣＲを包含する。ＬＩＮ２８ＡおよびＬＩＮ２８Ｂの発現が、抗ＬＩＮ２８Ａ（Ａ１７７）（Cell Signaling）を使用して検出された、Triboulet et al., Cell Rep. 2015 Oct 13; 13(2): 260-266を参照。また、ＬＩＮ２８の発現が、乳がん細胞株の一団において、ウェスタンブロッティングによって、および免疫組織化学によって分析された、Liu et al., PLoS One. 2013; 8(12): e83083も参照。
【００６１】
本開示は、ＬＩＮ２８陽性のがん、すなわち、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂの発現に関連するがんの処置を除外するものではないことが理解されるべきである。本明細書に開示されるＴＵＴａｓｅインヒビターはまた、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂ陽性のがんの処置にも有効であるだろうことが予想される。
【００６２】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅは、哺乳動物の相同のＺＣＣＨＣ６（ＴＵＴ７としてもまた知られている）またはＺＣＣＨＣ１１（ＴＵＴ４としてもまた知られている）である。ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１は両方とも、脱アデニル化されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的のウリジル化を通した、ｍｉＲＮＡに誘導された遺伝子サイレンシングに関与し、およびいくつかのｍｉＲＮＡ前駆体（ｌｅｔ−７のそれ（ｐｒｅ−ｌｅｔ−７）を包含する）の末端ウリジル化を媒介することによって、ｍｉＲＮＡの生物発生のサプレッサーとして作用する。ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１は、それらのドメイン構成および活性において高度に類似する。ｍｉＲＮＡウリジル化またはｍＲＮＡウリジル化におけるそれらの機能的役割は、重複していることが示されれきた。
【００６３】
本開示のいくつかの側面は、ＴＵＴａｓｅインヒビターを提供する。用語「阻害」または「阻害する」は、遺伝子発現および／またはＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６などのＴＵＴａｓｅのタンパク質またはその機能的ドメインの活性を指すとき、その機能のレベルにおける低減または防止、またはその遺伝子発現産物の低減を指す。枯渇、またはＴＵＴａｓｅの枯渇という用語は、本明細書に使用されるとき、ＴＵＴａｓｅの発現またはＴＵＴａｓｅの活性の枯渇を指す。例えば、ＴＵＴａｓｅの枯渇は、ＴＵＴａｓｅが、遺伝的にノックダウンされること、またはＴＵＴａｓｅの活性が、例として小分子インヒビターによって、阻害されることを意味してもよい。
【００６４】
ＴＵＴａｓｅの酵素活性が、阻害されたとき、それは、ＴＵＴａｓｅの酵素活性における、ＴＵＴａｓｅインヒビターが存在しない細胞において見出されたＴＵＴａｓｅの酵素活性の少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％までの減少があることを意味する。一態様において、ＴＵＴａｓｅの酵素活性レベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％まで減少される。
【００６５】
いくつかの態様において、「ＴＵＴａｓｅインヒビター」は、ＴＵＴａｓｅ活性を阻害する小分子インヒビターである。例えば、Linらによる近年の刊行物（RNA Biology, Volume 12, Issue 8, 2015）は、ＺＣＣＨＣ１１のための数多の小分子インヒビターを同定した。本開示に従って使用されてもよいＴＵＴａｓｅインヒビターは、限定せずに、SCH 202676臭化水素酸塩、Tyrphostin 47、FPA 124、エブセレン、オーロチオグルコース水和物、IPA-3、またはこれらの組み合わせであってもよい。本明細書に記載される小分子ＴＵＴａｓｅインヒビターのすべては、市販されており、例として、Sigma-AldrichまたはTocris Bioscienceから市販されている。
【００６６】
いくつかの態様において、「ＴＵＴａｓｅインヒビター」は、ＴＵＴａｓｅの発現を低減させる剤である。かかる剤は、核酸インヒビターであってもよい。ＴＵＴａｓｅの核酸インヒビターは、例えば、これらに限定されないが、ＲＮＡ干渉誘導分子（ＲＮＡｉ）、例えば、これらに限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびこれらの修飾されたバージョンであり、ここでＲＮＡ干渉分子は、ＺＣＣＨＣ１１またはＺＣＣＨＣ６などのＴＵＴａｓｅの遺伝子発現をサイレンシングする。いくつかの態様において、核酸インヒビターは、アンチセンスオリゴ核酸、または核酸類似体、例えば、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補性(pseudo-complementary)ＰＮＡ（ｐｃ−ＰＮＡ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）等である。代わりの態様において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、および核酸類似体、例えばＰＮＡ、ｐｃＰＮＡおよびＬＮＡである。
【００６７】
核酸は、一本鎖または二本本鎖であり得、および関心のあるタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ等を含む群から選択され得る。かかる核酸配列は、例えば、これらに限定されないが、転写リプレッサー、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性(small inhibitory)核酸配列、例えば、これらに限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等である。一般に、ＲＮＡ干渉剤を送達する方法が当該技術分野において周知であるとおり、ＲＮＡ干渉テクノロジーは、当該技術分野において周知である。例として、米国特許公報第2010/0221226号を参照。
【００６８】
本明細書に使用されるとき、遺伝子サイレンシング、またはＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）の活性に関してサイレンシングされる遺伝子は、標的遺伝子について、ｍｉＲＮＡまたはＲＮＡの干渉分子が存在しない細胞において見出されたｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％までの細胞中ｍＲＮＡレベルの減少を指す。好ましい一態様において、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％まで減少される。
【００６９】
本明細書に使用されるとき、用語「ＲＮＡｉ」は、これらに限定されないが、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡ、および人工マイクロＲＮＡを包含する、いずれのタイプの干渉するＲＮＡをも指す。実例として、それは、ｓｉＲＮＡとして予め同定された配列を、そのＲＮＡの下流プロセシングの機序にかかわらず、包含する（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらすin vivoプロセシングの特定の方法を有すると考えられているものの、かかる配列は、本明細書に記載の配列が隣接するという状況下のベクター中へ組み込まれ得る。）
【００７０】
本明細書に使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指すが、その二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子と同じ細胞において存在するかまたは発現されたとき、遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有し、例えばここで、標的遺伝子は、Ｌｉｎ２８Ａによって動員されたＴＵＴａｓｅ（例として、Ｚｃｃｈｃ１１またはＺｃｃｈｃ６）である。二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡは、相補鎖によって形成され得る。
【００７１】
一態様において、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成し得る核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長の標的遺伝子、またはこの部分配列に対応し得る。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも約１５〜５０ヌクレオチド長であり（例として、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、約１５〜５０ヌクレオチド長であり）、および二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５〜５０塩基対長であり、好ましくは約１９〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長、例として、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
【００７２】
本明細書に使用されるとき、「ｓｈＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（またステムループとも呼ばれる）は、ｓｉＲＮＡの１タイプである。一態様において、これらのｓｈＲＮＡは、短い、例として、約１９〜約２５ヌクレオチドの、アンチセンス鎖から構成され、続いて約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖がある。代わりに、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造に先行し得、およびアンチセンス鎖が、後に続き得る。
【００７３】
ステムループ構造は、主に一本鎖ヌクレオチド（ループ部分）の領域によって片側に結び付けられる二本鎖（ステム部分）を形成することが知られているかまたは予想されるヌクレオチドの領域を包含する二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」および「ホールドバック(fold-back)」構造もまた、ステムループ構造を指すために、本明細書に使用される。かかる構造は、当該技術分野において周知であり、およびその用語は、当該技術分野において知られているその意味で一貫して使用される。ステムループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り、本開示の実践にとって決定的なものではない。当該技術分野において知られるとおり、二次構造は、正確な塩基対形成(base-pairing)を要求しない。よって、ステムは、１以上の塩基ミスマッチを包含してもよい。
【００７４】
代わりに、塩基対形成は、正確であってもよい、すなわち、いずれのミスマッチも包含しない。いくつかの実例において、前駆体マイクロＲＮＡ分子は、１以上のステムループ構造を包含してもよい。複数のステムループ構造は、例えば、核酸リンカーなどのリンカーを通して、またはマイクロＲＮＡ隣接配列または他の分子またはこれらのある組み合わせによって、相互に結び付けられていてもよい。ステムループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、二次構造が存在する限り、決定的なものではない。当該技術分野において知られるとおり、二次構造は、正確な塩基対形成を要求しない。よって、ステムは、１以上の塩基ミスマッチを包含してもよい。代わりに、塩基対形成は、いずれのミスマッチも包含しなくてもよい。
【００７５】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをベースとした、哺乳動物の遺伝子を乱すことにおける使用のための遺伝子編集テクノロジーは、当該技術分野において、広範に記載されてきた。Ｃａｓ９ヌクレアーゼに、乱されることになっている遺伝子を標的にさせるために、「単鎖ガイド(single-guide)ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」または「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子へ導くために使用されてもよい。いくつかの態様において、本開示のＴＵＴａｓｅインヒビターは、活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに、切断されることになっている遺伝子（例として、ＺＣＣＨＣ６またはＺＣＣＨＣ１１）を標的にさせるｓｇＲＮＡとを共発現するベクターであってもよい。
【００７６】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、例えば、
本明細書に同定される遺伝子産物（単数または複数）の核酸および／またはタンパク質、およびまだ同定されていないものを不活性化するよう機能する、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、中和抗体、抗体部分、断片、類似体、変異体または誘導体、ペプチド、タンパク質、模倣ペプチド(peptide-mimetic)、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ホルモン、小分子、核酸、核酸類似体、炭水化物、またはこの類似体、誘導体または変異体であり得る。タンパク質および／またはペプチドインヒビターまたはこれらの部分は、例えば、突然変異タンパク質、治療用タンパク質および組み換えタンパク質であり得る。
【００７７】
タンパク質およびペプチドインヒビターはまた、例えば：突然変異のタンパク質、遺伝的に修飾されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組み換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質、およびこれらの断片（単数または複数）も包含し得る。いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅインヒビターは、抗ＺＣＣＨＣ６抗体または抗ＺＣＣＨＣ１１抗体、またはこれらの抗体断片である。本明細書に使用される抗体断片は、少なくとも、抗原結合のために要求される断片を有する。抗体断片は、当業者に知られている。
【００７８】
本開示のＴＵＴａｓｅインヒビターは、がん細胞において、ｍＲＮＡのウリジル化を予防し、および順に、それらの代謝回転を阻害してもよい。例えば、本開示の図６Ａ〜６Ｆにおいて実証されるとおり、ｍＲＮＡのウリジル化は、それらの代謝回転をがん細胞において増強する。図６Ｄは、ＺＣＣＨＣ６のｓｉＲＮＡの枯渇が、ＺＣＣＨＣ６を発現する細胞と比較して、ゲノム全体のｍＲＮＡの半減期の増大に繋がったことを示す。
【００７９】
本明細書にさらに提供されるのは、ＴＵＴａｓｅ（例として、ＺＣＣＨＣ６および／またはＺＣＣＨＣ１１）の枯渇が、多様ながん細胞タイプにおいて、成長を損なうことを示すデータ（図４Ａ〜４Ｇ）である。用語「ｍＲＮＡの半減期」は、具体的なｍＲＮＡ集団が、５０％分解されるのにかかる時間(the amount time)を指す。ｍＲＮＡ半減期は、種々のタイプのｍＲＮＡの安定性に関する情報を提供する。典型的には、より長い半減期は、あるｍＲＮＡがより安定していることを指し示す。３’ウリジル化は、ｍＲＮＡの分解を増強し、よって半減期を減少させる。逆に、ＴＵＴａｓｅ活性が阻害され、かつウリジル化がないとき、ｍＲＮＡの半減期は増大する。
【００８０】
ＴＵＴａｓｅの活性が、ｍＲＮＡの代謝回転に関連することから、それらは、撹乱されたＲＮＡの代謝という状況下において、重要な役割を果たすことがある。「ＲＮＡ代謝」は、本明細書に使用されるとき、リボ核酸（ＲＮＡ）分子の合成、折り畳み(folding)／アンフォールディング(unfolding)、修飾、プロセシングおよび分解を包含する、ＲＮＡ分子のライフサイクルにおけるいずれの事象をも指す。これらプロセスのいずれに対する乱れは、ＲＮＡ代謝サイクルの乱れに繋がることがある。例えば、ヌクレオシド合成の阻害は、ＲＮＡ分子の構成単位(the building blocks)を利用不能にさせることによって、ＲＮＡ合成における乱れをもたらすであろう。
【００８１】
ヌクレオシド合成を阻害し、およびそれによって、細胞において利用可能なヌクレオチド（５−フルオロウラシルおよびヒドロキシウレア）のプールを限定することが知られている小分子剤は、本開示において、ＴＵＴａｓｅ（例として、ＺＣＣＨＣ６）の枯渇した細胞に対する阻害効果が、対応する野生型細胞より著しく強いことが示されている（図５Ａ〜５Ｂ）。このことは、細胞が、ＴＵＴａｓｅが枯渇されたとき、ＲＮＡ代謝を乱す剤に対して敏感になることを指し示している。
【００８２】
その結果、がんを処置するための本開示の医薬組成物は、治療に有効な量のＲＮＡ代謝を乱す剤をさらに含んでもよい。ＲＮＡ代謝を乱す剤は、ＤＮＡ／ＲＮＡの損傷を引き起こす剤（例として、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド）、またはヌクレオチド合成を阻害し、それによって、細胞において利用可能なヌクレオチドのプールを限定する剤（例として、５−ＦＵおよびヒドロキシウレア）であってもよい。いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、ヌクレオチドの合成および代謝を阻害する剤である。
【００８３】
いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬である。いくつかの態様において、プリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、５’フルオロピリミジンである。いくつかの態様において、５’フルオロピリミジンは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フトラフル、またはウラシルテガフール（ＵＦＴ）である。いくつかの態様において、５’フルオロピリミジンは、５−ＦＵである。本開示に従って使用されてもよい他のプリンおよびピリミジン代謝拮抗薬は、限定せずに、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、フルダラビン、デシタビン、ネララビン、クロファラビン、ビダーザ、カペシタビン、ゲムシタビン、ペントスタチン、フロクスウリジン、シタラビン、および６−チオグアニンを包含する。
【００８４】
いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、５−ＦＵである。５−ＦＵは、数十年間、化学治療剤としてがんの処置において広く使用されてきた。５−ＦＵは、がん細胞における本質的な生物発生プロセスを阻害することによって、またはＤＮＡおよびＲＮＡなどの高分子中へ組み込まれ、およびそれらの正常な機能を阻害することによって機能する、「代謝拮抗薬」と名付けられた薬物の類に属する。ヌクレオチド合成を阻害する剤のすべてが、ＴＵＴａｓｅの枯渇と組み合わせて使用されたとき、がんの成長を低減することにおいて、５−ＦＵと同じ効果を有さないことは、注目に値する。例えば、図５Ａ〜５Ｂに示されるとおり、ヌクレオチド合成を阻害する別の剤、ヒドロキシウレアは、ＴＵＴａｓｅの枯渇と組み合わせて使用されるとき、ＴＵＴａｓｅが単独で枯渇された細胞と比較して、がん細胞の成長をさらに低減させることはなかった。これは、ヌクレオシドの合成を乱す種々の剤が、異なる作用機序を有することを示唆している可能性がある。
【００８５】
いくつかの態様において、ＲＮＡ代謝を乱す剤は、葉酸代謝拮抗薬である。「葉酸代謝拮抗薬」は、本明細書に使用されるとき、葉酸（ビタミンＢ９）の作用にアンタゴナイズする（すなわち、ブロックする）薬物を指す。身体における葉酸の第一機能は、セリン、メチオニン、チミジンおよびプリンの生合成に関与する様々なメチルトランスフェラーゼに対する補因子としてである。結果として、葉酸代謝拮抗薬は、細胞分裂、ＤＮＡ／ＲＮＡの合成および修復、およびタンパク質合成を阻害する。本開示に従って使用されてもよい好適なな葉酸代謝拮抗薬は、限定せずに、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、およびZD9331を包含する。
【００８６】
ＴＵＴａｓｅの枯渇によって誘導されるＲＮＡ代謝の撹乱は、タンパク質代謝の撹乱にさらに繋がることがある。用語「タンパク質代謝」は、本明細書に使用されるとき、タンパク質およびアミノ酸の合成、およびタンパク質（および他の巨大分子）の異化作用による崩壊の原因となる様々な生化学プロセスを指す。いくつかの態様において、タンパク質代謝における乱れは、タンパク質代謝回転における乱れである。用語「タンパク質代謝回転」は、タンパク質合成とタンパク質分解との間のバランスを指す。合成が分解を上回ることは、除脂肪組織(lean tissues)を構築する同化作用状態を指し示し、分解が合成を上回ることは、除脂肪組織を燃焼する異化作用状態を指し示す。よって、タンパク質合成速度、および／またはタンパク質分解速度における撹乱は、タンパク質の代謝回転を乱し得る。
【００８７】
本明細書に提供されるのは、ＴＵＴａｓｅの枯渇が、転写速度の３０％の低減に繋がったこと、およびＴＵＴａｓｅの枯渇した細胞が、タンパク質代謝回転の乱れに対して敏感になることを示すデータである（図１６）。よって、がんを処置するための本開示の医薬組成物は、タンパク質代謝を乱す剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、タンパク質代謝回転を阻害する。
【００８８】
プロテアソームは、すべての真核生物および古細菌の内部にある、およびいくつかの細菌における、タンパク質複合体である。プロテアソームの主な機能は、ペプチド結合を壊す化学反応であるタンパク質分解によって、不要なまたは損傷したタンパク質を分解することである。真菌生物において、プロテアソームは、核および細胞質に位置する。プロテアソームは、真核細胞において、タンパク質分解に関与する最も重要な機構である。プロテアソームの阻害は、タンパク質分解を、その上タンパク質代謝回転を、効果的に阻害する。よって、本開示のタンパク質代謝回転を乱す剤は、プロテアソームインヒビターであってもよい。
【００８９】
数多のプロテアソームインヒビターが、当該技術分野において記載されており、がん処置において使用されてきた。これは、プロテアソームを機能しなくさせるときの細胞が耐えるストレスに起因する。本開示に従って使用されてもよいプロテアソームインヒビターは、限定せずに、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ONX-0912）、デランゾミブ(CEP-18770)、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガラート、エポキソミシン、ＭＧ１３２ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチラート、およびこれらの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。
【００９０】
いくつかの態様において、タンパク質代謝を乱す剤は、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲ経路を阻害する剤である。ｍＴＯＲタンパク質は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）関連キナーゼファミリーに属し、および進化を通じて保存されている、２８９ｋＤａのセリン−スレオニンキナーゼである。ｍＴＯＲは、少なくとも２つの別個の多タンパク質複合体である、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）の核となる（Guertin and Sabatini, 2007によって概説された）。ｍＴＯＲＣ１は、様々な下流のエフェクターを通して、細胞の成長に要求されるタンパク質合成を正に制御する。
【００９１】
ｍＴＯＲＣ１は、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）結合タンパク質１（４Ｅ−ＢＰ１）およびｐ７０リボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）を、リン酸化することによって、タンパク質合成を促進する。４Ｂ−ＢＰＩのリン酸化は、ｅＩＦ４Ｅの４Ｅ−ＢＰ１へのその結合を防止し、ｅＩＦ４Ｅが、キャップ依存性の翻訳を促進することを可能にする（Richer and Sonenberg,2005によって概説された）。ｍＴＯＲＣ１によるＳ６Ｋ１活性の刺激は、ｍＲＮＡの生物発生、キャップ依存性の翻訳および伸長、およびS6K1 aly/REF-like target（ＳＫＡＲ）、programmed cell death 4（ＰＤＣＤ４）、真核生物伸長因子２キナーゼ（ｅＥＦ２Ｋ）、およびリボソームのタンパク質Ｓ６などの、多くのタンパク質の活性の調節を通したリボソームタンパク質の翻訳における増大に繋がる（Ma and Blenis, 2009によりレビューされた）。
【００９２】
ｍＴＯＲＣ１の活性化はまた、リボソームＲＮＡの転写を、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）および転写開始因子ＩＡ（ＴＩＦ−ＩＡ）を伴うプロセスを通して刺激することによって、リボソームの生物発生を促進することも示されてきた（Mayer et al.,2004）。対照的に、ｍＴＯＲＣ１の阻害は、タンパク質合成を阻害し、およびタンパク質代謝を乱す。
【００９３】
よって、本開示のタンパク質代謝を乱す剤は、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターであってもよい。いくつかの態様において、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターは、ラパマイシンまたはラパログである。本開示に従って使用されてもよい好適なラパログは、限定せずに、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムス、およびそれらの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、ＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターは、ＡＴＰ競合性ｍＴＯＲキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、ＡＴＰ競合性ｍＴＯＲキナーゼインヒビターは、Torin１またはTorin2である。いずれのＰＩＫ３／ｍＴＯＲインヒビターも、本開示に従って使用されてもよい。
【００９４】
本開示の医薬組成物は、ＴＵＴａｓｅインヒビター、およびＲＮＡ代謝を乱す剤を含む組成物、ＴＵＴａｓｅインヒビターおよびタンパク質代謝を乱す剤を含む組成物、およびＴＵＴａｓｅインヒビター、ＲＮＡ代謝を乱す剤、およびタンパク質代謝を乱す剤を含む組成物を網羅する。
【００９５】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含んでもよい。本明細書に採用される句「薬学的に許容し得る」は、それらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すが、これらは、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、過敏、アレルギー応答、または他の問題または合併症なく、合理的な利益／リスク比に釣り合って、人間および動物に接触する使用に好適である。句「薬学的に許容し得る担体」は、対象の剤を、ある臓器または身体のある一部から、別の臓器または身体の別の一部まで運搬または輸送することに関与する、、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と相溶であるという意味において「許容し得え」なければならない。
【００９６】
本開示の方法および医薬組成物は、がんの処置を、これを必要とする対象において行うために使用される。本明細書に開示の方法を使用して処置されてもよいがんのタイプは、限定せずに、新生物、悪性腫瘍、転移を、またはがん性と考えられるであろような無制御な細胞の成長によって特徴付けられるいずれの疾患または障害をも、包含する。
【００９７】
がんは、原発性または転移性のがんであってもよい。がんは、これらに限定されないが、胆道がん；膀胱がん；神経膠芽腫および髄芽腫を包含する脳がん；乳がん(breast cancer)；子宮頸がん；絨毛がん；結腸がん；子宮内膜がん；食道がん；胃がん;急性リンパ性および骨髄性白血病を包含する血液腫瘍(hematological neoplasms)；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病、および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を包含する上皮内新生物；肝臓がん；肺がん；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を包含するリンパ種；神経芽細胞腫；扁平上皮細胞癌を包含する口腔(oral)がん；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞に由来するものを包含する卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；直腸がん；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫を包含する肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫;メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞がん、および扁平上皮細胞がんを包含する皮膚がん；精上皮腫、非精上皮腫、奇形腫、絨毛癌などの胚性腫瘍を包含する精巣がん；間質性腫瘍および生殖細胞腫瘍；甲状腺癌および髄様癌を包含する甲状腺がん；および腺がんおよびウィルムス腫瘍を包含する腎がん、を包含する。一般的に直面するがんは、乳、前立腺、肺、卵巣、結腸直腸、および脳のがんを包含する。いくつかの態様において、がん細胞は、転移性である。いくつかの態様において、がんは、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂを、発現しない。
【００９８】
その最も広い意味において、用語「処置」または「処置すること（ための）」は、治療的および予防的な処置の両方を指す。処置を必要とする対象が、がんを有する場合、そのとき「状態を処置すること」は、がんに関連する１つ以上の症状またはがんの重症度を、緩和すること、低減すること、または排除すること、またはがんのさらなる進行を予防することを指す。処置を必要とする対象が、がんを有するリスクのあるものである場合、そのとき対象を処置することは、対象ががんを有するリスクを低減すること、または対象ががんの発症を予防することを指す。
【００９９】
対象は、これらに限定されないが、齧歯動物、例として、ラットまたはマウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、および霊長目の動物、例として、サルを包含する、ヒトまたは脊椎動物または哺乳動物を意味する。本開示の方法は、処置を、これを必要とする対象に行うことに有用である。これを必要とする対象は、がんを発症するリスクを有する対象（すなわち、遺伝子試験を介して）、またはがんを有する対象であり得る。
【０１００】
本開示に従って使用されてもよい治療用の化合物または剤、例として、ＴＵＴａｓｅインヒビターおよび／またはタンパク質／ＲＮＡ代謝を乱す剤は、対象へ直接投与されてもよく、または送達デバイスまたはビヒクルと連携して投与されてもよい。治療用化合物を表面まで送達するための、送達ビヒクルまたは送達デバイスは、記載されてきた。本開示の治療用化合物は、単独で（例として、生理食塩水または緩衝液中）、または当該技術分野において知られているいずれの送達ビヒクル（単数または複数）を使用して、投与されてもよい。
【０１０１】
本開示の用語「治療的に有効な量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。例えば、本開示に関連する、治療的に有効な量のＴＵＴａｓｅインヒビターは、１つ以上のがんの症状を緩和するのに十分なその量であってもよい。本明細書に提供される教示と組み合わされて、効能、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、および好ましい投与モードなどの、様々な活性化合物および重み係数(weighing factors)中から選ぶことによって、実質的な毒性を引き起こさないが、それでも具体的な対象を処置するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的処置のレジメンが、計画され得る。
【０１０２】
いずれの具体的な適用にも有効な量は、処置されている疾患または状態、投与される具体的な治療用化合物、対象のサイズ、または疾患または状態の重症度などの因子に極めて依存して変動し得る。当業者は、本開示に関連する具体的な治療用化合物の有効量を、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定し得る。
【０１０３】
いくつかの態様において、ＴＵＴａｓｅの少なくとも１つのインヒビターを含む、本明細書に開示のとおりの剤および医薬組成物は、例として、腫瘍サイズを低減すること、腫瘍の成長速度を遅くすること、腫瘍の細胞増殖を低減すること、がん細胞死を促進すること、血管新生を阻害すること、転移を阻害すること、またはさもなければ、必ずしもがんを根絶することなく臨床状態を全面的に改善すること、という有益な効果を提供するのに治療的に有効な投薬量で投与され得る。
【０１０４】
用語「腫瘍サイズを低減する」は、本明細書に使用されるとき、対象が本開示の方法および組成物を使用して処置される前と比較して、腫瘍サイズにおける減少を指す。いくつかの態様において、腫瘍サイズは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％まで、低減される。いくつかの態様において、腫瘍サイズは、１００％まで低減される、すなわち腫瘍は、消滅する。いくつかの態様において、腫瘍は、その当初のサイズの８０％以下、７０％以下、６０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、または０．１％以下まで、低減される。
【０１０５】
いくつかの態様において、本開示の組成物および方法は、対象へ投与されるとき、がんの転移を予防する。用語「転移」は、原発性腫瘍が、ある臓器または身体のある部分から、これとは直接連絡されていない別のところへ広がることを指す。「原発性腫瘍」は、腫瘍の進行が始まり進むことで、がん性の塊を産出した解剖学的部位にて成長している腫瘍を指す。
【０１０６】
ほとんどのがんは、それらの原発部位にて発生するが、このとき、身体の他の部分へも広がり続ける、すなわち、転移する。これらのさらなる腫瘍は、２次腫瘍である。転移は、細胞増殖、血管新生、細胞接着、遊走、および周辺組織中への浸潤を包含する、いくつかの相互連絡プロセスに由来する。用語「転移を予防する」は、原発の、直接連絡されていない身体の他の部分へ広がるプロセスが、阻害されること、または２次腫瘍の発生が、予防されることを意味する。
【０１０７】
本明細書に記載される化合物の、送達のための対象用量は、典型的には、１投与につき約０．１μｇから１０ｍｇまでに及び、これは、適用に応じて、毎日、毎週、または毎月、およびその間のいずれか他の時間(amount of time)に与えられ得る。いくつかの態様において、単回用量は、決定的な地固めまたは再地固め期間に投与される。これらの目的のための用量は、１投与につき約１０μｇから５ｍｇまで、および最も典型的には、２〜４回の投与で間隔を空けて、例えば、数日または数週間またはそれ以上離して、約１００μｇから１ｍｇまで、に及んでもよい。しかしながら、いくつかの態様において、これらの目的のための非経口用量は、上に記載の典型的な用量より５〜１０，０００倍高い範囲で使用されてもよい。
【０１０８】
いくつかの態様において、本開示の化合物は、約１と１０ｍｇ／[哺乳動物の体重の１ｋｇ]との間の投薬量にて投与される。他の態様において、本開示の化合物は、約０．００１と１ｍｇ／[哺乳動物の体重の１ｋｇ]との間の投薬量にて投与される。さらに他の態様において、本開示の化合物は、約１０〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／[哺乳動物の体重の１ｋｇ]の間の投薬量、またはその中のいずれか個々の投薬量にて投与される。
【０１０９】
本開示の製剤は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、および任意に他の治療用成分をルーチン的に含有してもよい薬学的に許容し得る溶液において投与される。
【０１１０】
治療における使用のため、本開示に関連する治療用化合物の有効量は、治療剤または治療用化合物を所望の表面、例として粘膜へ送達する、がんへ注射する、全身送達する等のいずれのモードによっても、対象へ投与され得る。本開示の医薬組成物を投与することは、当業者に知られているいずれの手段によっても、達成されてもよい。好ましい投与のルートは、これらに限定されないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、経眼(ocular)、経膣(vaginal)、経直腸(rectal)および脳室内を包含する。
【０１１１】
経口投与のために、本開示の治療用化合物は、活性化合物（単数または複数）を、当該技術分野において周知の薬学的に許容し得る担体とともに組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。かかる担体は、処置されるべき対象による経口摂取のために、本開示の化合物を、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤として得られ、任意に、結果として生じる混合物を細かく砕くこと、およびその顆粒の混合物を、所望ならば好適な助剤を加えた後に、処理することで、錠剤または糖衣錠のコアが得られ得る。
【０１１２】
好適な賦形剤は、とりわけ、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦のデンプン、米のデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの、セルロース調製物である。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられてもよい。任意に、経口製剤はまた、生理食塩水または緩衝剤、すなわち、内部の酸の状態を中和するためにＥＤＴＡにおいても製剤化されてもよく、またはいずれの担体もなく投与されてもよい。
【０１１３】
またとくに企図されるのは、上の構成要素（単数）または構成要素（複数）の経口剤形でもある。構成要素（単数）または構成要素（複数）は、誘導体の経口送達が、効果的になるように、化学的に修飾されてもよい。一般に、企図される化学的修飾は、構成要素の分子自体に対する少なくとも１つの部分の付着であるが、ここで該部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流の中への取り込みを許容する。また所望されるのは、構成要素（単数）または構成要素（複数）の全体的な安定性の増大も、および身体における循環時間の増大もある。
【０１１４】
かかる部分の例は、以下：ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピリエングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリプロリンを包含する（Abuchowski and Davis,1981,"Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as drugs、Hocenberg and Roberts, eds.,Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189)。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン、およびポリ−１，３，６−チオキソカンである。医薬用途にとって好ましいのは、上に指し示されるとおり、ポリエチレングリコール部分である。
【０１１５】
放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であってもよい。当業者は、胃においては溶解しないであろうが、しかし十二指腸において、または腸の他のどこかで、材料を放出するであろう、利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、治療剤の保護または胃環境を超えての（腸における、などの）生物学的に活性な材料の放出のいずれかによって、胃環境の有害効果を避けるであろう。
【０１１６】
胃液への(gastric)完全耐性を確保にするため、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコーティングが好ましい。腸溶性コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート（ＨＰＭＣＰ）、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリ酢酸ビニルフタラート（ＰＶＡＰ）、Eudragit L30D、Aquateric、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Eudragit L、Eudragit S、およびシェラックである。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用されてもよい。
【０１１７】
コーティング、またはコーティングの混合物もまた、錠剤上に使用し得るが、これらは、胃に対する保護を意図したものではない。これは、糖コーティング、または錠剤をより簡単に飲み込めるようにするコーティングを包含し得る。カプセルは、乾燥治療薬、すなわち粉末の送達のためのハードシェル(a hard shell)（ゼラチンなど）からなっていてもよく；液体形形のために、ソフトゼラチンシェル(a soft gelatin shell)が使用されてもよい。オブラート(cachets)のシェル材料は、厚いデンプンまたは他の可食性の紙であることもあり得るだろう。丸剤、トローチ、成形錠剤または湿製錠剤のために、湿潤集結(moist massing)技術が、使用され得る。
【０１１８】
治療薬は、粒子のサイズ約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態の、微細な多微粒子(fine multi particulates)として、製剤中に包含され得る。カプセル投与のための材料の製剤はまた、粉末、軽く圧縮された詰め物としても、または錠剤としてでさえも、あり得るだろう。治療薬は、圧縮によって調製され得るだろう。
【０１１９】
着色料および香味剤は、すべて包含されていてもよい。例えば、治療剤は、製剤化され（リポソームまたはミクロスフェアカプセル化によって、など）、および次いで、着色料および香味剤を含有する冷蔵飲料などの可食製品内に、さらに含有されてもよい。
【０１２０】
治療薬の体積を、不活性材料で希釈しても、増大してもよい。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、加工デキストラン(modified dextrans)およびデンプンを包含し得るだろう。ある無機塩はまた、カルシウム三リン酸(calcium triphosphate)、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを包含する充填剤としても使用されてもよい。市販されているいくつかの希釈剤は、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellである。
【０１２１】
崩壊剤は、治療薬を固体剤形にした製剤中に包含されてもよい。崩壊剤として使用される材料は、これらに限定されないが、デンプンをベースとした市販の崩壊剤、Explotabを包含する、デンプン、を包含する。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然海綿およびベントナイトは、すべて使用されてもよい。崩壊剤の別の形態は、不溶性カチオン交換樹脂である。粉末状のゴムは、崩壊剤として、および結合剤として使用されてもよく、およびこれらは、寒天、カラヤ、またはトラガカントなどの粉末状のゴムを包含し得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩はまた、崩壊剤としても有用である。
【０１２２】
結合剤は、治療剤を一緒に保持し、硬い錠剤を形成するために使用されてもよく、およびアカシア、トラガント、デンプン、およびゼラチンなどの天然産物からの材料を包含してもよい。他は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を包含する。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも、治療薬を粒状にするために、アルコール溶液中で使用され得るだろう。
【０１２３】
減摩性の剤は、製剤化プロセスの間、接着するのを防止するために、治療薬の製剤に包含されてもよい。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用されてもよく、およびこれらは、これらに限定されないが：そのマグネシウムおよびカルシウム塩を包含するステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスを包含し得る。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000などの、可溶性潤滑剤もまた、使用されてもよい。
【０１２４】
製剤化の間、薬物の流動特性を改善し得、かつ圧縮の間の再配置を補助するための滑剤は、加えられてもよい。滑剤は、デンプン、タルク、焼成シリカ、および水和ケイアルミン酸塩(hydrated silicoaluminate)を包含してもよい。
【０１２５】
水性環境中への治療薬の溶解を補助するために、界面活性剤が、湿潤剤として加えられてもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン性洗剤を、包含してもよい。カチオン性洗剤も使用されてもよく、および塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを包含し得るだろう。界面活性剤として製剤に包含され得るだろう潜在的な非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアラート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、または種々の比率の混合物としてのいずれかで、治療剤の製剤に存在し得るだろう。
【０１２６】
経口で使用され得る医薬製剤は、ゼラチンから作られた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンと可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）とから作られた密閉軟カプセル(soft, sealed capsules)を包含する。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤と混和された活性成分を含有し得る。軟カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解されても、または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与のために製剤化されたミクロスフェアもまた、使用されてもよい。かかるミクロスフェアは、当該技術分野において十分に定義されている。経口投与のための全製剤は、かかる投与に好適な投薬量でなければならない。
【０１２７】
口腔(buccal)投与のために、組成物は、従来の様式において製剤化された錠剤またはトローチの形態を採ってもよい。
【０１２８】
吸入による投与のために、本開示に従う使用のための化合物は、好適な噴射剤(propellant)（例として、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス）の使用により、加圧パックまたは噴霧器から提供されるエアロゾルスプレーの形態で、好都合に送達されてもよい。加圧エアロゾルのケースにおいて、投薬量単位は、一定量(a metered amount)を送達するバルブを提供することによって決定されてもよい。吸入器または注入器における使用のための、例としてゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物と好適な粉末ベース（ラクトースまたはデンプンなどの）との粉末ミックスを含有して、製剤化されてもよい。
【０１２９】
また本明細書に企図されるのは、本開示の治療用化合物の経肺(pulmonary)送達である。治療剤は、哺乳動物の肺へ、吸入されながら送達され、および肺の上皮内層を越えて血流へ通り抜ける。吸入分子の他の報告は、Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565 569；Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135 144（酢酸ロイプロリド）；Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143 146（エンドセリン１）；Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206 212（ａ１アンチトリプシン）；Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146（ａ１−プロテイナーゼ）；Oswein et al., 1990, "Aerosolization of proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,（組み換えヒト成長ホルモン）；Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482 3488（インターフェロンｇおよび腫瘍壊死因子アルファ）およびPlatz et al., 米国特許第5,284,656号（顆粒球コロニー刺激因子）を包含する。全身的な効果のための薬物の経肺送達のための方法および組成物は、１９９５年９月１９日にWongらへ発行された米国特許第5,451,569号において記載される。
【０１３０】
本開示の実践における使用のために企図されるのは、これらに限定されないが噴霧器、定量吸入器および粉末吸入器を包含する、治療薬品の経肺送達のために考案された広範囲の機械デバイスであり、それらのすべては、当業者に精通されている。
【０１３１】
本開示の実践に好適な市販のデバイスのいくつかの具体例は、Mallinckrodt Inc., St. Louis, Missouriによって製造されるUltravent噴霧器；Marquest Medical Products, Englewood, Coloradoによって製造されるAcorn II噴霧器；Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolinaによって製造されるVentolin定量吸入器吸入器；およびFisons Corp., Bedford, Massachusettsによって製造されるSp吸入器粉末吸入器粉末吸入器である。
【０１３２】
すべてのかかるデバイスは、治療剤の分配に好適な製剤の使用を要求する。典型的には、各製剤は、採用されるデバイスのタイプに特有であり、および、常用の希釈剤および／または治療に有用な担体に加えて、適切な噴射材料(propellant material)の使用を伴ってもよい。また、リポソーム、ミクロカプセルまたはミクロスフェア、封入複合体、または他のタイプの担体の使用も、企図される。化学的に修飾された治療剤はまた、化学的修飾のタイプ、または採用されるデバイスのタイプに依存して、種々の製剤においても調製されてもよい。
【０１３３】
噴霧器（ジェットまたは超音波のいずれか）との使用に好適な製剤は、典型的には、水に溶解された治療剤を、溶液１ｍＬにつき生物学的に活性な化合物の約０．１〜２５ｍｇの濃度にて含むであろう。製剤はまた、緩衝剤および単糖（例として、浸透圧の安定化および調節のため）をも包含してもよい。噴霧器の製剤はまた、エアロゾルを形成することにおいて溶液の噴霧化によって引き起こされる化合物の表面誘起凝集(surface induced aggregation)を低減または防止するために、界面活性剤をも含有してもよい。
【０１３４】
定量吸入器デバイスとの使用のための製剤は、一般に、界面活性剤の補助により、噴射剤中に懸濁された治療剤を含有する微粉(a finely divided powder)を含むだろう。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２テトラフルオロエタンを包含する）、またはこれらの組み合わせなどの、この目的のために採用されるいずれの従来の材料であってもよい。好適な界面活性剤は、ソルビタントリオラートおよび大豆レシチンを包含する。オレイン酸はまた、界面活性剤としても有用であってもよい。
【０１３５】
粉末吸入器デバイスから分配するための製剤は、治療剤を含有する乾燥微粉を含むだろう。および前記製剤はまた、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤をも、デバイスからの粉末の分散を容易にする量、例として、製剤の５０〜９０重量％で、包含してもよい。治療剤は、最も有利には、末梢の肺への最も有効な送達のために、１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの平均粒子サイズの微粒子形態で調製されるべきである。
【０１３６】
本開示の医薬組成物の鼻腔内送達もまた、企図される。鼻腔内送達は、本開示の医薬組成物の血流への移動を、治療薬品を鼻へ投与した直後に、前記薬品が肺において沈着せずに、できるようにする。鼻腔送達のための製剤は、デキストランまたはシクロデキストランをもつものを包含する。
【０１３７】
鼻腔投与のための、有用なデバイスは、一定量のスプレーヤー(sprayer)が付着された、小さく、硬いボトルである。一態様において、一定量は、本開示溶液の医薬組成物を、規定体積のチャンバー中へ引き込みむことによって送達されるが、そのチャンバーは、チャンバー中の液体が圧縮されたときにスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するよう形作られた(dimentioned)開口部(an aperture)を有する。チャンバーは、圧縮されることで本開示の医薬組成物を投与する。特定の態様において、チャンバーは、ピストンの配置である。かかるデバイスは、市販されている。
【０１３８】
代わりに、スクイーズされたときに(when squeezed)スプレーを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化するよう形作られた、開口部または開孔部(opening)をもつプラスチック製のスクイーズボトル(a plastic squeeze bottle)が使用される。開孔部は通常、ボトルの上部に見出され、および上部は一般に、エアロゾル製剤の効果的な投与のために鼻道(the nasal passages)に部分的にフィットするように先細りになっている。好ましくは、鼻腔吸入器は、薬物の計量された用量の投与のために、定量のエアロゾル製剤を提供するだろう。
【０１３９】
剤は、全身的にそれらを送達することが所望されるとき、注射による、例として、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、単位剤形で、例として、アンプルで、または複数回用量容器で、加えられた防腐剤とともに提供されてもよい。組成物は、油性または水性のビヒクル中、懸濁液、溶液、または乳剤などの形態を採ってもよく、および懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの配合剤(formulatory agents)を含有してもよい。
【０１４０】
非経口投与のための医薬製剤は、水に可溶な形態の活性化合物の水性溶液を包含する。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射懸濁液として、調製されてもよい。好適な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、または、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増大する物質を含有していてもよい。
任意に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または化合物の可溶性を増大させることで高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための剤をも含有してもよい。
【０１４１】
代わりに、活性化合物は、使用前に、好適なビヒクル、例として、滅菌パイロジェンフリー水とともに構成するための粉末形態であってもよい。
先に記載された製剤に加えて、化合物はまた、デポー調製物としても製剤化されてもよい。かかる長時間作用する製剤は、好適なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容し得る油における乳剤として）またはイオン交換樹脂で、または難溶性の誘導体として、例えば、難溶性の塩として、製剤化されてもよい。
【０１４２】
医薬組成物はまた、好適な固体またはゲル相の担体または賦形剤をも含んでもよい。かかる担体または賦形剤の例は、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを、包含する。
【０１４３】
好適な液体または固体の医薬製剤の形態は、例えば、吸入のための水性溶液または生理食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されるか、エンコクリエートされるか(encochleated)、微細金粒子(microscopic gold particles)上にコーティングされるか、リポソーム中に含有されるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚中への移植のためのペレットであるか、または鋭器(a sharp object)上へ乾燥させられる（皮膚に傷がつけられることで皮膚中へ入るように(to be scratched into the skin)）。
【０１４４】
医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、乳剤、懸濁液、クリーム、点眼剤、または、活性化合物が遅延放出する調製物をも包含するが、その調製物において、賦形剤および添加物、および／または、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味料、甘味料または可溶化剤などの助剤は、上に記載されるとおり、習慣的に使用される。医薬組成物は、様々な薬物の送達システムにおける使用に好適である。薬物送達のための方法の簡潔な概説には、Langer,Science 249:1527-1533,1990を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
本開示の治療用化合物および任意に他の治療薬は、それ自体が（ニートで(neat)）投与されてもよく、または、薬学的に許容し得る塩の形態で投与されてもよい。医薬において使用されるとき、塩は、薬学的に許容し得るべきであるが、薬学的に許容し得ない塩は、これらの薬学的に許容し得る塩を調製するために好都合に使用されてもよい。かかる塩は、これらに限定されないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されたものを包含する。また、かかる塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などの、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
【０１４６】
好適な緩衝剤は、以下：酢酸および塩（１〜２％ ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ ｗ／ｖ）；およびリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を包含する。好適な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ ｗ／ｖ）を包含する。
【０１４７】
本開示の医薬組成物は、有効量の本開示の治療用化合物を含有するが、前記化合物は、任意に、薬学的に許容し得る担体に包含される。薬学的に許容し得る担体という用語は、１種以上の相溶性の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適なカプセル化物質を意味する。担体という用語は、天然または合成の有機成分または無機成分を示すが、活性成分は、これらと組み合わされてその適用を容易にする。医薬組成物の構成要素はまた、所望の薬学的な効率を実質的に損なうであろう相互作用がない様式において、本開示の化合物と、および互いに、混蔵されることも可能である。
【０１４８】
治療剤は、血液脳関門を越えて治療剤を送達することが可能である製剤を使用して、脳へ送達されてもよい。脳へ治療薬を送達することに対する１つの障害は、脳の生理学および構造である。血液脳関門は、単層の内皮細胞で裏打ちされた特殊な毛細血管から構成される。細胞間の領域は、タイトジャンクションで密閉されており、そのため血液から脳へ唯一のアクセスは、内皮細胞を通してである。関門は、親油性分子などのある物質のみを通すことを許容し、および他の有害な化合物および病原体を入らせないようにする。よって、親油性の担体は、非親油性の化合物を脳へ送達するのに有用である。
【０１４９】
実例として、ＤＨＡは、ヒト脳中に天然に存在する脂肪酸であるが、これらに対し共有結合する薬物を、脳へ送達するのに有用であることが見出されている（米国特許6407137において記載されたものなど）。米国特許5,525,727は、薬物種の脳への特異的かつ持続的送達のための、ジヒドロピリジンピリジニウム塩担体の酸化還元システムを記載する。米国特許5,618,803は、ホスホナート誘導体での標的化された薬物の送達を記載する。米国特許7119074は、血液脳関門を越えて化合物を送達するための、ＰＥＧ−オリゴマー／ポリマーへ接合された治療用化合物の両親性のプロドラックを記載する。他は、当業者に知られている。
【０１５０】
本開示の治療剤は、がんを処置するための他の治療薬とともに送達されてもよい。
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例として、電気穿孔、リポフェクション）のための標準技術が、使用される。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に遂行されるとおりに、または本明細書に記載されるとおりに、実施される。前述の技術および手順は一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、および本明細書に引用され、その全体において議論される様々な一般のおよびより具体的な参考文献において記載されるとおりに、実施される。
【０１５１】
本明細書に記載される、分析化学、有機合成化学、および医薬品化学および薬化学に関して利用される命名法、および実験法および実験技術(the laboratory procedures and techniques)は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学的合成、化学的分析、医薬製剤、製剤、および患者の送達および処置のための標準技術が使用される。
【０１５２】
以下の例は、本開示の実践の特定の実例を説明するために提供されるものであって、本開示の範囲を限定する意図はない。当業者には明らかだろうが、本開示は、様々な組成物および方法における適用を見出すであろう。
【０１５３】
さらに詳述せずとも、当業者は、上の記載に基づき、本開示を最大限に利用し得る。したがって、以下の特定の態様は、単なる説明として解釈されるべきであって、本開示の残りの部分を限定するものとしては決して解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に参照される目的または主題のための参照により組み込まれる。
【０１５４】
例
例１．ウリジル化に媒介されるｍＲＮＡ代謝回転は、発がんを促進し、がん細胞の成長をサポートする
発がんにおけるＴＵＴａｓｅｓ、ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１の役割の研究：予備データ
２つの脊椎動物ＬＩＮ２８相同体、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８ＡおよびＬＩＮ２８Ｂがあるが、しかしそれらの機械的および機能的な関係性は、不明である。当初提案されたモデルに従うと、ＬＩＮ２８ＡおよびＬＩＮ２８Ｂは、ＬＩＮ２８Ｂが、ｌｅｔ−７抑制について別個の機序を有するが、これによって、ＬＩＮ２８Ａは、ＺＣＣＨＣ６／ＴＵＴ７または代わりのＴＵＴａｓｅであるＺＣＣＨＣ１１／ＴＵＴ４を介して、ｐｒｅ−ｌｅｔ−７のウリジル化を要求するものである一方、ＬＩＮ２８Ｂは、ｐｒｉ−ｌｅｔ−７を核小体中に隔離する、［１〜３］。よって、神経芽腫細胞において、タンパク質−タンパク質相互作用分析を通して、ＺＣＣＨＣ６が、ＬＩＮ２８Ｂのパートナーであることを同定したのは、驚くべきことであった（図９Ａ〜９Ｃ）。
【０１５５】
細胞下分画の後に続くウェスタンブロットはさらに、ＬＩＮ２８ＢおよびＺＣＣＨＣ６が、細胞質において共局存することを指し示した。これによって、核小体をベースとした相互作用の可能性が除外された（図９Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＬＩＮ２８ＢおよびＺＣＣＨＣ６が、in vivoで相互作用することを示し、およびＺＣＣＨＣ６が、ＬＩＮ２８Ｂに媒介される様式において、ｐｒｅ−ｌｅｔ−７をウリジル化し得ることを示唆した。このことは実際に、近年の刊行物［４］において確認された。
【０１５６】
ＺＣＣＨＣ６がｌｅｔ−７を調節するかどうかを決定するため、ｓｉＲＮＡノックダウンを、上の実験において使用されたものを包含する、３種のＬＩＮ２８Ｂ発現細胞株において実施した。驚くべきことに、ＺＣＣＨＣ６のノックダウンは、成熟ｌｅｔ−７レベルに対しては効果を有さず、少数のｌｅｔ−７種のレベルにおいて軽度な低減に繋がっただけであったのに対し、ＬＩＮ２８ノックダウンは、予想されたｌｅｔ−７抑制解除を引き起こした（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＺＣＣＨＣ１１が、ＺＣＣＨＣ６と重複して作用することで、潜在的にその喪失を補っていることから［３］、ＺＣＣＨＣ１１のノックダウンもまた、個々に、またはＺＣＣＨＣ６と組み合わせて、実施した。単一のノックダウンが、個々のｌｅｔ−７のレベルにおいて軽度の増大に繋がった一方、その応答は、ｌｅｔ−７の種または細胞タイプを越えて一貫しておらず、およびダブルノックダウンは、目に見えるほどの効果は一切有さなかった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＺＣＣＨＣ６およびＺＣＣＨＣ１１が、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂと連携して、ｌｅｔ−７を普遍的には調節していないことを指し示す。
【０１５７】
ＬＩＮ２８Ａ／Ｂの他の主要な標的が、ｍＲＮＡであるから、ＴＵＴａｓｅが、ｍＲＮＡを、テンプレート化されないウリジル化を介して調節するかどうかを調査した。少数の先駆的研究は、わずかなｍＲＮＡ標的に対する３’ウリジル化の役割−大抵はそれらの崩壊の調節における−を報告した［５〜７］−そのため、ｍＲＮＡウリジル化が、発がんにおける潜在的な役割をもつ広汎性の遺伝子制御機序であってもよいことが推測された。その仮説を検討したところ、Kimらは、ＺＣＣＨＣ６／１１によるｍＲＮＡウリジル化が、ｍＲＮＡの崩壊を全体的に調節することを報告した［８、９］。このことは、このモデルをサポートし、およびこの機序が発がんにおける役割を果たすかどうかという疑問をさらに強調する。
【０１５８】
ＺＣＣＨＣ６／１１は、厳選した正常組織および多様なタイプのがんにおいて発現される
上の疑問を検討するため、ＺＣＣＨＣ６／１１の発現を、正常な状況と悪性の状況との範囲にわたってプロファイルした。最初に、ウェスタンブロット分析を、１４種の正常なヒト組織の一団に対して実施したが、これは、ＴＵＴａｓｅ−とりわけＺＣＣＨＣ６−が、成人組織の一部においてのみ発現されることを指し示した（図１Ａ）。公然と入手可能なＲＮＡ−ｓｅｑデータは、類似のｍＲＮＡの発現パターンを明らかにした（図１Ｂ）。注目すべきことに、これらＴＵＴａｓｅは、予測される複数のアイソフォームを有するが、それらのうち最大のもの（ＺＣＣＨＣ６については１７１ｋＤ、およびＺＣＣＨＣ１１については１８５ｋＤ）は、触媒的に活性であり、ひいては機能的であることが知られている［６］。それ故、本分析は、これらのアイソフォームに着目した。
【０１５９】
第二に、ＲＮＡ−ｓｅｑデータを、別個の複数のタイプのがんを含むヒト患者試料から得たが、これによって、多様ながんにわたる約３０％の腫瘍が、高レベルのＺＣＣＨＣ６／１１を発現することが明らかになった（図２Ａ）。６種の異なるがんタイプを代表する３０種のがん細胞株の一団を集め、およびウェスタンブロットを介して分析した。際立ったことに、細胞株の大多数は、ＺＣＣＨＣ６および／またはＺＣＣＨＣ１１を発現したが、そのほとんどは、正常の線維芽細胞と比べて、はるかに高発現レベルを呈した（図２Ｂ）。
【０１６０】
正常組織およびがん発現のデータの共通集合は、ＺＣＣＨＣ６／１１を、具体的にはがんの状況において、高レベルにて発現するように見えるいくつかの腫瘍タイプ（例として、大腸、肺、肝臓）を指摘した。このことは、これらのがんが、ＴＵＴａｓｅを選択的に上方調節し得ることを指し示している。興味深いことに、入手可能なゲノムデータの調査によって、ＺＣＣＨＣ６／１１に関連する低頻度の突然変異、欠失および増幅が明らかとなった。このことは、転写過剰発現が、遺伝子変化(genetic alterations)よりむしろ、ＴＵＴａｓｅの発現、およびおそらく機能に影響を及ぼすことを示唆していた（図１１Ａ〜１１Ｂ）。注目すべきことに、ＺＣＣＨＣ６／１１の発現は、ＬＩＮ２８Ａ／Ｂ発現との相関はなかった。このことは、ＴＵＴａｓｅの、ＬＩＮ２８に非依存的な役割を指摘していた（図１〜２）。
【０１６１】
ＴＵＴａｓｅの過剰発現は、発がん性形質転換を促進する
ＴＵＴａｓｅの過剰発現が、発がん性形質転換を促進し得るかどうかを決定するため、コロニー形成アッセイを、軟寒天において実施した。野生型ＺＣＣＨＣ６の過剰発現によって、コロニー数がおよそ４倍の増加に繋がったが、この増加は、突然変異体ＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）の軽度発現の効果に匹敵した。このことは、ＴＵＴａｓｅの過剰発現単独で、発がん性形質転換を誘導するのに十分であり得ると示唆した（図３Ａ〜３Ｃ）。重要なことに、２つの決定的なアスパルギン酸残基をアラニンへ突然変異することは（ＤＡＤＡ）、ＺＣＣＨＣ６を触媒的に不活性な状態にするが、そのコロニー形成能を大幅に抑止した。このことはさらに、その形質転換機能がほとんど、その酵素活性に依存するということを指し示していた（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１６２】
ＴＵＴａｓｅの過剰発現が、ＲＡＳおよびＭＹＣなどの古典的ながん遺伝子の形質転換能を増強し得るかどうかを、次に調査した。野生型、またはＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）またはＭＹＣをもつ触媒が欠損した（ＤＡＤＡ）ＺＣＣＨＣ６を共過剰発現した。これによって、とくに野生型ＴＵＴａｓｅのケースにおいて、増強されたコロニー形成に繋がった（図３Ｄ〜３Ｅ）。全体的に見て、これらのデータは、ＴＵＴａｓｅの過剰発現が、発がん性形質転換を誘導するのに十分であり得ること、およびこれが、確立されたがん遺伝子とさらに協同し得ることを示唆する。
【０１６３】
ＴＵＴａｓｅの枯渇は、多様ながん細胞タイプにおける成長を損なう
次に、ＴＵＴａｓｅの発現が、確立されたがん細胞の急速な成長に要求されるかどうかを決定した。この目標に向けて、ｓｉＲＮＡベースのＺＣＣＨＣ６／１１ノックダウンを、６種の別個のがんタイプを代表する１９種の異なるがん細胞株の一団において実施した。細胞株のうち６種−または約３分の１−は、ＴＵＴａｓｅの枯渇に際し、損なわれた成長を示した（図４Ａ）。それらは、異なるタイプのがんを代表するが、このことは、ＴＵＴａｓｅに対する依存性が、定義されたクラスのがんとは関連しないが、むしろ多様ながんタイプを越えて一部の腫瘍のより普遍的な特色と関連することを示唆する（図４Ｂ）。
【０１６４】
加えて、ＴＵＴａｓｅの依存性とＬＩＮ２８Ａ／Ｂ発現との間には相関関係はなかった。このことは、ＺＣＣＨＣ６／１１に、ＬＩＮ２８に非依存的な新規役割があることを指し示す。ノックダウンのデータを立証するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９に基づくストラテジーを採用し、ＴＵＴａｓｅに依存する代表的な細胞株において、ＺＣＣＨＣ６／１１を遺伝的にノックアウトした。予想されるとおり、ノックアウトは、ｓｉＲＮＡベースの効果を反映して、細胞の成長が損なわれたという結果となった。このことは、観察された表現型の妥当性を確認した（図１０Ａ〜１０Ｂ）。
【０１６５】
次いで、腫瘍形成アッセイにおけるＴＵＴａｓｅ枯渇の影響を査定した。ＺＣＣＨＣ６には依存的であるが、ＺＣＣＨＣ１１には依存的ではない、ＨＣＴ１１６結腸がん細胞を使用すると（図１１Ａ〜１１Ｂ）、低減されたフォーカス形成が、接着培養において観察され、および低減されたコロニー形成能が、ＺＣＣＨＣ６ノックアウトの際、軟寒天において観察された（図４Ｃ〜４Ｄ）。これらのデータは、ＴＵＴａｓｅが、クローン形成密度(clonal density)条件かつ足場非依存的条件の下、がん細胞の成長をサポートし、これが腫瘍形成能の代用として働くことを示唆する。
【０１６６】
in vivoでの腫瘍形成特性に対処するため、皮下異種移植アッセイを、免疫不完全（Ｒａｇ２−／−ｇｃ−／−）マウスにおいて実施した。これは、ＺＣＣＨＣ６ノックアウト vs. 対照の腫瘍おいて、成長が、より一層大きい度合で損なうことを示した（図４Ｅ〜４Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＴＵＴａｓｅが、in vitroおよびin vivoでのがん細胞の成長および腫瘍形成能をサポートすることを示唆する。
【０１６７】
ＴＵＴａｓｅの喪失は、がん細胞をＲＮＡ代謝の乱れに対して敏感にする
観察された表現型を前提として、がん細胞をＴＵＴａｓｅの喪失に対して特異的に敏感にする条件があるかどうかを調査した。とりわけ、ＴＵＴａｓｅが、ＲＮＡ代謝回転に関連していたことから［９］、それらが、撹乱されたＲＮＡ代謝という状況下で、特に重要な役割を果たし得ると推測した。この仮説に対処するため、ＤＮＡ／ＲＮＡ損傷を引き起こし、ひいてはＲＮＡの質を損なう小分子剤（ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド）、ならびにヌクレオチド合成を阻害し、それによって、細胞における利用可能なヌクレオチドのプールを限定する同剤（５−フルオロウラシルおよびヒドロキシウレア）［１０］を選択し、および野生型と、ＺＣＣＨＣ６ノックアウトのＨＣＴ１１６細胞とを、漸増濃度の各剤で処置した（図５Ａ）。
【０１６８】
試験された薬物のうち、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のみが、用量依存的な応答差を生じ、ノックアウト細胞に対して、再現性の良いより強い効果を有した（図５Ｂ）。第二の細胞株、Ｈ１２９９における類似の分析によって、類似する結果に繋がった。これらのデータは、ＴＵＴａｓｅの喪失が、がん細胞を、５−ＦＵに対しては敏感にするが、ＤＮＡ／ＲＮＡ損傷剤に対しては敏感にしないことを指し示す。このことは、ＴＵＴａｓｅの機能が、損傷したＲＮＡ分子のクリアランスよりむしろ正常なＲＮＡ代謝回転の間に、ヌクレオチドの流れを維持することにとりわけ関係し得ることを示唆する。興味深いことに、ヒドロキシウレアは、ヌクレオチド代謝にもまた影響を与えるが、５−ＦＵの結果を反映しなかった（図５Ｂ）。５−ＦＵは、ＲＮＡエキソソーム複合体を標的にすることが具体的に示されたが［１１］、このことは、実験におけるヒドロキシウレアから、その特異的な活性を説明することができる。全体的に見て、これらの結果は、ＴＵＴａｓｅの喪失が、細胞をＲＮＡ代謝の乱れに対して敏感にすることを実証する。このことは、ＴＵＴａｓｅの機能にとりわけ関係のある条件を強調し、およびその根底にある分子作用機序に指摘する。
【０１６９】
ＴＵＴａｓｅsは、ｍＲＮＡをウリジル化し、それらの代謝回転をがん細胞において増強する
次に、表現型の分子基盤を解明した。ＴＵＴａｓｅが、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの両方を調節することが示されたため［１、３、９、１２〜１４］、表現型が、それらのｍＲＮＡに指向される活性に起因するかどうかを、最初に調査した。細胞増殖アッセイを、野生型ＤＩＣＥＲを発現するか、または低形質ＤＩＣＥＲアレル（ＤＩＣＥＲＥｘ５）についてホモ接合体であり、ひいては成熟ｍｉＲＮＡに欠けている、一対の同質遺伝子ＨＣＴ１１６細胞株を使用して、実施した[１５]。際立ったことに、ＺＣＣＨＣ６ノックダウンした際に成長が損なわれる点は、２つの細胞株の間で同一であったが、このことは、ＺＣＣＨＣ６の効果が、ｍｉＲＮＡに非依存的であること、およびそれらが、細胞の成長の調節において、そのｍＲＮＡ特異的な活性に強く関与することを示唆する（図１１Ａ〜１１Ｂ）。
【０１７０】
ｍＲＮＡベースのＴＵＴａｓｅ活性を査定するため、３’ｍＲＮＡターミノム(terminome)のゲノム全体研究のための、近年開発されたＴＡＩＬ−ｓｅｑ方法を使用した（図１４Ａ）［８］。プロトコルステップのほとんどを最適化した後、ＨｅＬａ細胞における試験的なＴＡＩＬ−ｓｅｑ分析を、最適化されたプロトコルを４回別々に反復して使用し、実施した。
ＨｅＬａ細胞は、公然のＴＡＩＬ−ｓｅｑデータが、この細胞タイプから得られたことから、これらの試験的な実行(pilot runs)のために使用し［８］、よって、適合したプロトコルが、公開されたものと比較して、どのように作動するかの直接的な査定を可能にした。全体的に見て、データは、現在までに公開された分析［８、９］に酷似しており、本実験における、ＴＡＩＬ−ｓｅｑプロトコルを立証した（図１２Ｂ〜１２Ｄ）。
【０１７１】
次いで、ＴＡＩＬ−ｓｅｑを、ＺＣＣＨＣ６枯渇の後に、ＨＣＴ１１６細胞へ適用した。ＺＣＣＨＣ６の分子機能と一貫して、ｍＲＮＡウリジル化が、ノックダウン 対 対照の条件において全体的に低減した。このことは、ＺＣＣＨＣ６が、これらの細胞において、ｍＲＮＡをウリジル化することを指し示した（図６Ａ）。減少したウリジル化が、ｍＲＮＡレベルに影響を与えるかどうかを調査するため、類似のノックダウン実験を実施し、その後、大きなＲＮＡ（＞２００ｎｔ）の分画に対するＲＮＡ−ｓｅｑを続けた。興味深いことに、ｍＲＮＡのレベルは、ほとんど変化しなかったが、このことは、ＴＵＴａｓｅ枯渇が、定常状態のｍＲＮＡレベルに対し、限定された効果しか有さないことを示唆した（図６Ｂ）。
【０１７２】
注目すべきことに、代わりの２つのライブラリ調製ストラテジーであるポリＡ選択とｒＲＮＡ枯渇（RiboZero）とを、より一般的に使用されるポリＡ選択プロトコルにおいて、好ましくウリジル化された短いポリＡテールに対する潜在的な偏りを回避するために、使用した。両ストラテジーによって、本質的に同じ結果が生じたが、ｍＲＮＡレベルにおいて大幅な変化がない理由から、転写の偏りを除外した（図６Ｂ）。定常状態ｍＲＮＡの測定からは、ｍＲＮＡ代謝回転に対する効果が容易に突き止められ得ないこと、およびウリジル化が、ｍＲＮＡ半減期と負に相関することから（図６Ｃ）、ｍＲＮＡ半減期の測定を、ＲＮＡ−ｓｅｑとカップリングされたアンチノマイシンＤ追跡を使用して、ＺＣＣＨＣ６枯渇の後に実施した。
【０１７３】
この分析によって、ＺＣＣＨＣ６ノックダウン vs. 対照細胞におけるｍＲＮＡ半減期のゲノム全体の増加が明らかになった。このことは、ＺＣＣＨＣ６が、急速なｍＲＮＡ崩壊およびこれによる代謝回転の全体の維持のために要求されることを指し示した（図６Ｄ）。代表的な転写物の半減期測定を、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、さらに立証した（図６Ｅ）。最後に、選択された非コード低分子ＲＮＡ(short non-coding RNAs）（ｓｎｃＲＮＡｓ）の半減期測定を、同じ実験条件下で実施したが、これによって、ＺＣＣＨＣ６ノックダウンと対照の細胞との間に相違は示されなかった（図６Ｅ）。少なくともこの状況下において、これらの結果はさらに、機能的に関係するＴＵＴａｓｅの標的として、ｓｎｃＲＮＡｓよりむしろｍＲＮＡ（または他のポリＡ ＲＮＡ）を、ＤＩＣＥＲＥｘ５のデータ（図１３Ａ〜１３Ｂ）と一緒に指摘する。全体的に見て、これらの発見は、ＴＵＴａｓｅが、ｍＲＮＡをウリジル化し、およびそれらの代謝回転をがん細胞において増強することを実証する。
【０１７４】
腫瘍形成におけるＴＵＴａｓｅの役割のin vivo査定
in vivoでの発がんにおけるＴＵＴａｓｅの役割を探究するため、Ｚｃｃｈｃ６／Ｔｕｔ７およびＺｃｃｈｃ１１／Ｔｕｔ４の条件付きノックアウトマウスを得て、およびがん（結腸およびウィリムス）の確立されたモデルになるように繁殖した。結腸がんのマウスモデルである、ＡｐｃＭｉｎ、ＡｐｃＭｉｎ＋Ｌｉｎ２８ａ、およびＡｐｃＭｉｎ＋ＬＩＮ２８Ｂからの組織試料のウェスタンブロット分析が、正常粘膜と比べ、腫瘍においてより高いＺｃｃｈｃ６レベルを明らかにしたことから、結腸がんを、最初に調査した（図７Ａ）。
【０１７５】
加えて、ヒト結腸直腸腫瘍からの組織溶解物の分析によって、相当数のケースにおいて（分析された試料の５／１１）、ＺＣＣＨＣ６／１１の類似する再活性が示された（図７Ｂ）。それ故、腸に特異的なVillinCreを採用することによる、ＡｐｃＭｉｎに推進される腫瘍形成に対するＴＵＴａｓｅ喪失の影響を査定するための遺伝子ストラテジーを考案して、組織に制限されるＺｃｃｈｃ６／１１ダブルノックアウトを産出した（図７Ｃ）。最後に、ＴＵＴａｓｅの過剰発現が、in vivoでの腫瘍形成を促進し得るかどうかを調査するため、ドキシサイクリン誘導性のＺＣＣＨＣ６（ｉＺ６）およびＺＣＣＨＣ１１（ｉＺ１１）ｍＥＳＣを生成し、およびＺＣＣＨＣ６／１１の過剰発現が成功したかを、個々のクローンにおけるｑＲＴ−ＰＣＲを介して立証したが、前記クローンは、追加の検証後にマウス生成のために使用し得るものである（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０１７６】
ＴＵＴａｓｅの喪失は、タンパク質代謝回転に対して下流影響を有する
ＴＵＴａｓｅが、ｍＲＮＡ代謝回転に影響を及ぼすと仮定すると、それらは、タンパク質代謝回転に対する下流効果を有し得るともまた推測した。この仮説に対処するため、ＴＵＴａｓｅノックダウン 対 対照ＨＣＴ１１６細胞における全体の翻訳の速度を、ＯＰ−ピューロマイシン方法を使用して測定した[２３]。ＴＵＴａｓｅの枯渇は、翻訳速度においておよそ３０％の低減に繋がったが、このことは、ＴＵＴａｓｅに媒介されるｍＲＮＡ代謝回転の調節が、タンパク質合成とカップリングしていることを示唆した（図１６）。
【０１７７】
加えて、我々は、野生型およびＴＵＴａｓｅノックアウトのＨＣＴ１１６細胞を、漸増する濃度のボルテゾミブ（プロテアソーム、ひいてはタンパク質崩壊のインヒビター）で処置した（図１６）。細胞生存率に対する効果は、ＴＵＴａｓｅノックアウト細胞においてより強かったが、このことは、ＴＵＴａｓｅ喪失が、がん細胞をタンパク質代謝回転の乱れに対して敏感にすることを指し示した。まとめると、これらのデータは、ＴＵＴａｓｅのｍＲＮＡ代謝回転に対する効果が、タンパク質代謝回転に対して下流影響を有することを示唆する。
【０１７８】
参考文献
【表１】
2019517552.tif 000002
【０１７９】
【表２】
2019517552.tif 000003
【０１８０】
【表３】
2019517552.tif 000004
【０１８１】
他の態様
本明細書に開示される特色のすべては、いずれの組み合わせにおいても、組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特色は、同じ、同等の、または類似の目的に適う、代わりの特色によって置き換えられてもよい。よって、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各特色は、包括的な一連の同等または類似の特色の一例でしかない。
【０１８２】
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確かめ得、およびそれらの精神および範囲から逸脱することなく、本開示に様々な変更および改変を施すことで、これを様々な用途および条件に適合させ得る。よって、他の態様もまた、クレーム内にある。
【０１８３】
均等物および範囲
いくつかの発明に関する態様が、本明細書に記載および説明されているものの、当業者は、様々な他の手段および／または構造物を、その機能を実施するために、および／または本明細書に記載の結果および／または１以上の利点を得るために、容易に想定するであろうし、ならびに、かかる変動および／または改変の各々は、本明細書に記載の発明に関する態様の範囲内であると見なされる。より広く、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および形状が、例示であることを意図されていること、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または形状が、本発明の教示が使用される特定の適用（単数）または適用（複数）に依存するであろうこと、を容易に解するであろう。
【０１８４】
当業者は、ルーチンな実験法を使用するだけで、本明細書に記載の特定の発明に関する態様との多くの均等物を認識するかまたは確かめることができるであろう。したがって、前述の態様が、ほんの一例として提示されていること、ならびに、添付のクレームとそれらとの均等物の範囲内で、発明に関する態様が、具体的に記載およびクレームされるとおり以外に実践されてもよいことは、理解されるべきである。本開示の発明に関する態様は、本明細書に記載の個々の特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられる。加えて、２以上のかかる特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法のいずれの組み合わせも、かかる特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に一貫性がないものではない場合、本開示の発明に関する範囲内に包含される。
【０１８５】
すべての定義は、本明細書に定義されかつ使用されるとおり、辞書的定義、参照により組み込まれる文献中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を超えて支配するものと理解されるべきである。
本明細書に開示のすべての参考文献、特許および特許出願は、引用される各々の主題に関して、参照により組み込まれるが、それらは、いくつかのケースにおいて、文献全体を網羅してもよい。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書に使用されるとおり、明細書およびクレーム中、明らかにそれとは反対に指し示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解されるべきである。
【０１８６】
句「および／または」は、本明細書に使用されるとおり、明細書およびクレーム中、要素の「いずれかまたは両方」（すなわち、あるケースにおいては接続的に存在し、またあるケースにおいては離接的に存在する要素）がそのように結合することを意味するものと理解されるべきである。「および／または」で挙げられた複数の要素は、同じやり方で、すなわち、要素のうち「１以上」がそのように結合するように、解釈されるべきである。他の要素は任意に、「および／または」節によって具体的に同定される要素以外に、具体的に同定されるそれらの要素に関するか否かにかかわらず、存在していてもよい。よって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「を含む(comprising)」などのオープンエンドな言語と連携して使用されるとき、一態様において、Ａのみ（任意に、Ｂ以外の要素を包含する）；別の態様において、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を包含する）；もう１つの態様において、ＡとＢとの両方（任意に、他の要素を包含する）；等を指し得る。
【０１８７】
本明細書に使用されるとき、明細書において、およびクレームにおいて、「または」は、上に定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、数多のまたはリストの要素（および任意に、非列挙の追加項目）のうち、少なくとも１つを包含するが、それらのうち１つより多くもまた包含すると当然捉えられるであろう。「のうち１つのみ」または「のうち正確に１つ」などの、明らかにそれとは反対に指し示されない用語のみ、あるいは、クレーム中に使用されるとき、「からなる(consisting of)」は、数多のまたはリストの要素のうち、正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般に、本明細書に使用されるとき、用語「または」は、「いずれか」、「のうち１つ」、「のうち１つのみ」、または「のうち正確に１つ」などの排他性の用語によって先行されるとき、唯一の選択肢（すなわち、「一方または他方ではあるが、両方ではない」）を指し示すと当然捉えられるしかないであろう。「本質的にからなる」は、クレーム中に使用されるとき、特許法の分野において使用されるとおりの通常のその意味を当然有するであろう。
【０１８８】
本明細書に使用されるとき、明細書中およびクレーム中、句「少なくとも１つ」は、１以上の要素のリストに関して、要素のリストにおける要素のいずれか１以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびいかなる要素のうち少なくとも１つを包含する必要はなく、かつ要素のリストにおける要素のいずれの組み合わせも排除しないものと理解されるべきである。この定義はまた、要素が任意に、句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内に具体的に同定された要素以外に、具体的に同定されたそれらの要素に関するか否かにかからわず、存在してもよいことも許容する。よって、非限定例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢのうち少なくとも１つ」）は、一態様において、Ｂは存在しない、少なくとも１つの（任意に、１つより多くの、を包含する）Ａ（および任意に、Ｂ以外の要素を包含する）；別の態様において、Ａは存在しない、少なくとも１つの（任意に、１つより多くの、を包含する）Ｂ（および任意に、Ａ以外の要素を包含する）；もう１つの態様において、少なくとも１つの（任意に、１つより多くの、を包含する）Ａ、および、少なくとも１つの（任意に、１つより多くの、を包含する）Ｂ（および任意に、他の要素を包含する）；等を指し得る。
【０１８９】
明らかにそれとは反対に指し示されない限り、１より多くのステップまたは行為を包含する本明細書にクレームされるいずれの方法においても、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が挙げられている順序に限定される必要はないこともまた理解されるべきである。
【０１９０】
クレーム中、ならびに上の明細書中、「を含む」、「を包含する」、「を運搬する」、「を有する」、「を含有する」、「を伴う」、「を保持する」、「から構成される」等のすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、包含するがそれらに限定されないものと意味すると理解されるべきである。United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に明記されるとおり、移行句「からなる」および「本質的にからなる」のみ、夫々クローズドまたはセミクローズド(semi-closed)の移行句であろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−３Ｃ】
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【図３Ｄ−３Ｅ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図４Ｅ−４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ−６Ｆ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１４Ｃ−１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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