(57)【要約】本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法、及び不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法に関する。組成物もまた開示される。前記組成物は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法であって、
膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、前記膵β細胞の集団を二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
エクスビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接触が、前記ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及び前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の両方を含む組成物を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触が、前記集団における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約５％増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記接触が、前記集団における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約７％増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤が、ハルミン、ＩＮＤＹ、ロイセチン、５−ヨードツベルシジン（５−ＩＴ）、及びＧＮＦ４８７７からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体結合の阻害剤、アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合の阻害剤、及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）／ＢＭＰ受容体結合の阻害剤からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＬＹ３６４９４７及びＧＷ７８８３８８からなる群より選択される、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体結合の阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＳＢ４３１５４２及びＡｌｋ５阻害剤ＩＩからなる群より選択される、アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合の阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触が、ハルミン及びＬＹ３６４９４７を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触が、ハルミン及びＬＤＮ１９３１８９を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記膵β細胞が、初代ヒト膵β細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触が、β細胞死またはＤＮＡ損傷を誘発しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触が、β細胞の分化を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触が、グルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法であって、
不十分なレベルのインスリン分泌について前記対象を治療するために、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の治療を必要とする前記対象に、前記対象における膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記対象が、Ｉ型糖尿病について治療される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、ＩＩ型糖尿病について治療される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与が、経口で、経皮で、非経口で、皮下に、静脈内に、筋肉内に、または腹腔内に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、哺乳動物対象である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、ヒト対象である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記投与が、前記対象における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約５％増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与が、前記対象における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約７％増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、前記対象の膵β細胞におけるグルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤が、ハルミン、ＩＮＤＹ、ロイセチン、５−ヨードツベルシジン（５−ＩＴ）、及びＧＮＦ４７７からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体結合の阻害剤、アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合の阻害剤、及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）／ＢＭＰ受容体結合の阻害剤からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＬＹ３６４９４７及びＧＷ７８８３８８からなる群より選択される、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体結合の阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＳＢ４３１５４２及びＡｌｋ５阻害剤ＩＩからなる群より選択される、アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合の阻害剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与が、前記ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及び前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の両方を含む組成物を投与することによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与が、ハルミン及びＬＹ３６４９４７を用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記接触が、ハルミン及びＬＤＮ１９３１８９を用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）阻害剤と、
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と
を含む、組成物。
【請求項３６】
担体をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記担体が、薬学的に許容される担体である、請求項３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／４１３，０７１号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本明細書に開示されるのは、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるための方法、低下したまたは不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法、及びそのような方法を行うための組成物である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
β細胞量の減少は、糖尿病の主な原因である。１型糖尿病（「Ｔ１Ｄ」）では、患者のβ細胞量は、その患者の免疫系が自分のβ細胞を攻撃して破壊するために減少され、これは、その人を生存のために外因的に投与されたインスリンに依存するような状態にする。２型糖尿病（「Ｔ２Ｄ」）と診断された人々にとって、β細胞量は、その疾患の発症前に比較的低くなる傾向があり、β細胞量の減少は、インスリン抵抗性によって引き起こされるグルコース毒性のために、前記疾患の発症後に加速される。したがって、β細胞の増殖の誘導は、Ｔ１Ｄを有する人々においてβ細胞量を正常に、また、Ｔ２Ｄを有する人々においてβ細胞量を正常より上に回復させるために望ましいであろう。
【０００４】
本発明者らは、以前に、酵素である二重特異性チロシン調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）の小分子阻害剤を用いて、ヒトβ細胞の増殖を誘導した。ハルミン、ＩＮＤＹ、ＧＮＦ４８７７、及び５−ヨードツベリシジン（５−ＩＴ）は、１日当たり１．５％〜３％の範囲でヒトβ細胞の増殖を誘導する。この増殖率は、生命の最初の年の間に起こる、ヒトβ細胞における最も高い増殖率と一致し、これは、かなりのβ細胞の増殖が起こるヒト発生の唯一の段階である。
【０００５】
残念なことに、ヒトβ細胞の増殖率が１．５％〜３％であるのは、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄの患者を治療するための実用的な治療にとって明らかに不十分である。本発明者らは、治療上合理的な期間内に、β細胞量を増加させるためには、β細胞の増殖率は、これまで達成できなかった１日あたりの率である、少なくとも１日当たり約５％である必要があると仮定する。
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様において、本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。この方法は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、膵β細胞の集団を、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法に関する。この方法は、不十分なレベルのインスリン分泌について対象を治療するために、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の治療を必要とする対象に、対象における膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することを含む。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む組成物に関する。
【０００９】
本発明は、残存する膵β細胞の再生を誘導するために、小分子薬の使用を通じて、インスリン分泌の低下または欠乏レベル（例えば、メタボリックシンドローム、Ｔ１Ｄ、及びＴ２Ｄ）に関連する状態の治療のための代替戦略を提供し、それによって、適切なインスリン分泌を回復させる（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.,“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１：２０１−２１２（２０１５）;Ｃｏｚａｒ−Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ−４  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１４９−５９（２００４）;Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｔｌａｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４５０−５９（２０１３）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｎｕｃｌｅａｒ  ＴｒａｆｆｉｃＫｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４６０−７０（２０１３）;及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.,“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。本願の実施例（下記）は、ＤＹＲＫ１Ａ及びＴＧＦβＳＦシグナル伝達の薬理学的または遺伝的な阻害の組み合わせが、ヒトβ細胞の増殖の著しいかつ以前には達成不可能な「率」を誘発することを実証している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ハルミン及びＴＧＦβＳＦ阻害剤の併用治療によるヒトβ細胞の増殖の誘導を示す。図１Ａは、ハルミン単独、及び様々なＴＧＦβＳＦリガンド阻害剤の効果を示し、それらのうちのいくつかは、ＴＧＦβ受容体に対して特異的であり、他のものは、アクチビン、インヒビン、及びＢＭＰ受容体に対して特異的である。以前に報告されたように（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.,“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  ａｎｄ  ＧＳＫ３Ｂ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ.６：８３７２（２０１５）；Ｄｉｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１６６０−７１（２０１６）；Ａａｍｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ,”ＡＪＰ  Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．３１１：Ｅ８５９−６８（２０１６）；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｎｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ,”Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２４：６１６−２６（２０１６））、ハルミンは、正常ヒトβ細胞の約２％においてＫｉ６７標識を誘導し、ＴＧＦβＳＦ阻害剤は、わずかなＫｉ６７標識しかもたらさない。しかしながら、ハルミンと組み合わせたすべてのＴＧＦβＳＦ阻害剤は、β細胞におけるＫｉ６７標識化の著しい増加を誘導する。大きなエラーバーは、死体由来のヒト膵島において一般的に観察される健康状態及び他の特徴の多様性を反映するが、いくつかのヒト成人ヒト膵島調製物において、１５〜２０％ものインスリン陽性細胞において、Ｋｉ６７が観察され得ることを示す。各バーは、４〜１０セットのヒト膵島における実験を表し、エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。＊は、対照に対してｐ．０．０５を示し、＊＊は、ハルミン単独処理に対してｐ＜０．０５を示す。
【図１Ｂ】ハルミン及びＴＧＦβＳＦ阻害剤の併用治療によるヒトβ細胞の増殖の誘導を示す。図１Ｂは、インスリン及びＫｉ６７について免疫標識された、ＤＭＳＯ（上）またはハルミン−ＬＹ３６４９４７の組み合わせ（下）で処理されたヒト膵島の例を示し、これまでにない増殖率を明らかにしている。いくつかのβ細胞では、細胞分裂が進行中であることを示すＫｉ６７陽性の核の二重構造が観察され得る。
【図２】図２Ａ〜図２Ｇは、他のハルミン類似体との併用療法による増殖の誘導、ＢｒｄＵ及びＰＨＨ３を用いた確認、及び相乗的な相互作用の証明を示す。図２Ａ〜図２Ｂは、Ｋｉ６７で標識されたヒトβ細胞標識において、他の２つのハルミン類似体であるＩＮＤＹ（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.,“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））（図２Ａ）及びロイセチン−４１（図２Ｂ）（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｈｔｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ.,“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｌｅｕｃｅｔｔｉｎｅｓ，ａ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｐｏｎｇｅ  Ａｌｋａｌｏｉｄ  Ｌｅｕｃｅｔｔａｍｉｎｅ  Ｂ,”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５：９３１２−３０（２０１２））の効果を示す。図２Ｃは、ＴＧＦβ受容体阻害剤である、ＬＹ３６４９４７の漸増用量と共に、固定した最大用量のハルミン（１０μＭ）（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.,“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））の用量反応曲線を示す。ハルミン及びＬＹ３６４９４７の併用効果は、いずれかの化合物単独の最大用量の効果をはるかに上回り、併用治療の相乗効果の証拠を提供する。図２Ｄ〜図２Ｆは、ＢｒｄＵ（図２Ｄ〜図２Ｅ）及びリン酸化ヒストン−３（「ＰＨＨ３」）（図２Ｆ〜図２Ｇ）を用いて、ヒト膵島に対する、ハルミン及びＬＹ３６４９４７の単独または組み合わせの効果を示す。ＰＨＨ３は、細胞周期のすべての時期を捉えるＫｉ６７及びＢｒｄＵと比較して、細胞周期のＧ２Ｍ期のみを捉えるので、ＰＨＨ３に対する標識指数は、Ｋｉ６７及びＢｒｄＵよりも低いことに留意されたい。すべての実験において、バーは、３〜１０個のヒト膵島調製物を表し、エラーバーは、平均値±ＳＥＭを表す。＊は、対照に対してｐ．０．０５を示し、＊＊は、ハルミン単独処理に対してｐ＜０．０５を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｅは、ヒト膵島の非β細胞における増殖、及びβ細胞の生存に対する、ハルミン−ＴＧＦβＳＦの組み合わせの効果を示す。図３Ａは、ＤＭＳＯ（ビヒクル）、または１０μＭのハルミン及び５μＭのＬＹ３６４９４７で処理した、４つの異なる組のヒト膵島におけるアルファ細胞（ＧＣＧ）、デルタ細胞（ＳＴＳ）、ＰＰ細胞（ＰＰ）、及び管（ＣＫ１９）細胞におけるＫｉ６７免疫標識の定量化を示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊は、スチューデントのＴ検定によって決定されるｐ＜０.０５を示す。図３Ｂは、ヒト膵島の非β膵島細胞におけるＫｉ６７標識の例を示す蛍光顕微鏡画像である。示されるように、細胞をＫｉ６７、グルカゴン（「ＧＣＧ」）、ソマトスタチン（「ＳＴＳ」）、膵臓ポリペプチド（「ＰＰ」）、及び／または乳管細胞マーカーＣＫ１９で免疫標識する。図３Ｃ〜図３Ｄは、分散させ、プレーティングし、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）ハルミン（１０μＭ）＋ＬＹ３６４９４７（５μＭ）で９６時間処理し、次いで、ＴＵＮＥＬ標識を用いて細胞死について試験した、ヒト膵島の蛍光顕微鏡画像（図３Ｃ）及び棒グラフ（図３Ｄ）を示す。対照の膵島において、時折、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞と非β細胞があるが、これらは、ハルミン−ＬＹ３６４９４７の組み合わせで治療した膵島ではまれである。図３Ｅは、４人の異なるドナー由来の２，０００個のβ細胞におけるＴＵＮＥＬ標識の定量化を示す。β細胞死は、薬物処理されたβ細胞において増加せず、統計学的有意性を達成しなかったが、対照よりも低いようである。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｆは、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害の組み合わせがβ細胞転写因子を増加させることを示す。Ａ〜Ｂは、全ヒト膵島における重要なβ細胞転写因子（図４Ａ）及びβ細胞分化のマーカー（図４Ｂ）に対する、４日間のハルミン及びハルミン−ＬＹ３６４９４７の併用治療の効果を示す。５つのヒト膵島製剤を表し、エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。＊＊は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理に対してｐ＜０．０５を示す。図４Ｃは、分散処理されたヒトβ細胞上の免疫細胞化学を示し、併用治療は、特にβ細胞においてＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを増加させることを示し、３つの異なるヒト膵島ドナー調製物における実験を表す。図４Ｄは、ビヒクル、ハルミン、ＬＹ３６４９４７、またはハルミン−ＬＹ３６４９４７の組み合わせの存在下において、８人の異なるドナー由来の膵島における低グルコース及び高グルコースに応答したインスリン分泌を示す。エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。＊は、高グルコース対低グルコースについて、ｐ＜０．０５を示す。図４Ｅ〜図４Ｆは、Ｔ２Ｄを有する４人のドナー由来の膵島におけるβ細胞Ｋｉ６７免疫標識（図４Ｅ）及び重要なβ細胞転写因子及び分化マーカーに対するハルミン、ＬＹ３６４９４７、ＧＷ７８８３８８、またはＡＬＫ５阻害剤の効果を示す（図４Ｆ）。エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。＊は、ｐ＜０．０５を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｇは、ＤＹＲＫ１Ａ及びＳＭＡＤシグナル伝達についての要件を示す。図５Ａは、対照、ハルミン処理、ＬＹ３６４９４７処理、ＡＬＫ５阻害剤処理、または併用治療された全ヒト膵島の免疫ブロットを示す。（同じ抗体によって検出される）ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は変化しなかったが、ｐ−ＳＭＡＤ３は、ハルミンによって減少し、さらに、ＬＹ３６４９４７またはＡＬＫ５阻害剤及びその組み合わせによって減少した。ＳＭＡＤ１、５及び９も一般的な抗体によって検出され、ハルミンと薬物の組み合わせによって減少される。免疫ブロットは、３人の異なるドナー由来のヒト膵島における別々の実験を代表するものである。図５Ｂは、ハルミン処理をしたヒト膵島におけるＫｉ６７免疫標識に対する、ＬａｃＺを発現する対照アデノウイルス、ならびにＳＭＡＤ２、３及び４（それぞれ１５０ｍｏｉ）をサイレンシングするアデノウイルスの効果を示す。図５Ｃは、β細胞増殖単独及びハルミンとの組み合わせにおいて、アデノウイルスＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の過剰発現（１００ｍｏｉ）の効果を示す。図５Ｄは、Ｋｉ６７免疫標識に対するヒトβ細胞におけるＳＭＡＤ７サイレンシングの分裂促進作用の例である。図５Ｅは、ハルミン−ＬＹ３６４９４７の組み合わせで処理したヒト膵島における増殖に対するアデノウイルスＤＹＲＫ１Ａ過剰発現またはＣｒｅを発現する対照アデノウイルス（Ａｄ．Ｃｒｅ）の効果を示す。図５Ｆは、ハルミン及びＬＹ３６４９４７で処理したヒト膵島におけるＫｉ６７免疫標識に対するＡｄ．Ｃｒｅ及びＡｄ．ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現ウイルスの例を示す。図５Ｇは、ＴＧＦβＳＦ阻害剤ＧＷ７８８３８８またはＬＹ３６４９４７と組み合わせたＤＹＲＫ１Ａのアデノウイルスサイレンシングの効果を示す。Ａｄ.ｓｈＬａｃＺは、Ａｄ.ｓｈＤＹＲＫ１Ａに対するｓｈ−アデノウイルスを示す。バーは、４〜５個のヒト膵島調製物を表し、エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、対照に対してｐ．０．０５を示し、＊＊は、アデノウイルスＳＭＡＤ７単独処理に対してｐ＜０．０５を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｇは、ハルミン、ＬＹ３６４９４７、ＡＬＫ５阻害剤、及びハルミンとＬＹ３６４９４７の組み合わせに応答した細胞周期分子の変化を示す。図６Ａは、ｑＰＣＲを用いて評価した、細胞周期活性化因子の全ヒト膵島における遺伝子発現についてビヒクル（ＤＭＳＯ０．１％）、ハルミン（１０μＭ）、ＬＹ３６４９４７（５μＭ）、またはハルミンとＬＹ３６４９４７との組み合わせに対する効果を示す。図６Ｂは、細胞周期阻害剤についての比較可能な結果を示す。図６Ｃは、ハルミン、ＬＹ３６４９４７、またはハルミンとＬＹ３６４９４７との組み合わせで処理したヒト膵島におけるｐ１５ＩＮＫ２ｂ、ｐ１６ＩＮＫ２ａ、ｐ５７ＫＩＰ、及びｐ２１ＣＩＰの免疫ブロットを示す。図６Ｄ〜図６Ｅは、ｑＰＣＲを使用して評価した、ヒト膵島におけるＣＤＫＮ１Ａ（図６Ｄ）及びＣＤＫＮ１Ｃ（図６Ｅ）の発現に対する、ＳＭＡＤ２、３、４のサイレンシングまたはＳＭＡＤ６及び／または７の過剰発現の効果を示す。図６Ｆは、ハルミン１０μＭの存在下または非存在下において、ヒトβ細胞におけるＫｉ６７免疫標識に対するＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃのサイレンシングの効果を示す。図６Ｇは、ハルミンとＬＹ３６４９４７との組み合わせによって誘導される増殖に対して、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、及びＣＤＫＮ２Ｂの過剰発現の効果を示す。すべての実験は、５つのヒト膵島調製物を表し、エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、対照に対してｐ．０．０５を示し、＊＊は、対照に対してｐ＜０．０５を示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｆは、ヒト膵島におけるＳＭＡＤ及びＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーと、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子座との直接相互作用を示す。図７Ａ〜図７Ｂは、ｈｇ１９ＵＣＳＣゲノムブラウザ由来のヒトＣＤＫＮ１Ａ（図７Ａ）及びＣＤＫＮ１Ｃ（図７Ｂ）遺伝子座の概略図であり、ＣｈＩＰに使用したプライマー対を小さい黒い四角で、遺伝子体を下の青で、また、エンハンサー及びプロモーターをそれぞれオレンジと黒で示す。図７Ｃ〜図７Ｄは、ＣｈＩＰが、対照（白いバー）及びハルミン−ＬＹ３６４９４７で処理した（黒いバー）ヒト膵島をもたらし、ｘ軸に沿ってＣＤＫＮ１Ａ（図７Ｃ）及びＣＤＫＮ１Ｃ（図７Ｄ）に対応するプライマー対を有することを示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。各実験は、ヒト膵島の最低３セットの平均を表す。図７Ｅ〜図７Ｆは、基本条件下（図７Ｅ）及びハルミン−ＬＹ３６４９４７処理後（図７Ｆ）でのＳＭＡＤ及びＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーの相互作用を示す概略図であり、ハルミンとＬＹ３６４９４７治療との組み合わせが、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子座へのＳＭＡＤ−Ｔｒｉｔｈｏｒａｘの結合を著しく変化させ、ほとんどの場合に破壊することを示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、ヒトβ細胞の増殖に対するＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達及びハルミンＴＧＦβスーパーファミリーの作用のモデルである。図８Ａは、標準ＴＧＦβパラダイムにおいて、リン酸化してそれによりいわゆる受容体ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ２及び３、及び１、５、８/９）を活性化するマルチサブユニット受容体に、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、ミオスタチン、ＧＤＦ１１、及び骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）などのリガンドが結合する。次いで、これらは、一般的なＳＭＡＤであるＳＭＡＤ４とヘテロマー化することができ、前記ＳＭＡＤ４ヘテロマーは、とりわけクロマチン修飾及びＤＮＡをメチル化したＴｒｉｔｈｏｒａｘ複合体に組み込まれ、それによって、複数の遺伝子ファミリーの発現に影響を与える核に移行する。出典：全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｙｅｒ，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＧＦｂ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２１：４４１−４４８（２０１０）。図８Ｂは、相乗的機構であって、それを介してハルミン及びＴＧＦβＳＦ経路阻害剤が協調してヒトβ細胞の増殖を増強する相乗的機構の簡略図を示す。ＤＹＲＫ１Ａに作用するハルミンは、主に、サイクリン、ＣＤＫ、及び関連する細胞周期活性化剤を活性化する。並行して、ＴＦβＳＦ経路阻害剤は、ｐ２１ＣＩＰをコードするＣＤＫＮ１Ａ、ｐ５７ＫＩＰをコードするＣＤＫＮ１Ｃ、及びｐ１５ＩＮＫ４をコードするＣＤＫＮ２Ｂを含む細胞周期阻害剤の活性化を軽減する。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、インビボでのマウス及びヒトβ細胞の増殖に対するハルミン−ＴＧＦβＳＦ１の組み合わせの有効性を示す。図９Ａに示すように、３ヶ月齢の雄のＣ５７ＢＬ６Ｎマウスに、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ハルミン、ＧＷ７８８３８８、またはハルミンとＧＷ７８８３８８の組み合わせを７日間、示した用量で腹腔内投与し、その後、マウスを屠殺し、膵臓を採取し、固定し、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２１：３８３−３８８（２０１５）に記載されているようにして、インスリンａｂｄ  Ｋｉ６７から免疫標識した。図９Ｂは、１人のヒトドナー由来の５００個の成体ヒト死体膵島をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜に移植し、１週間生着させた実験を示す。７日目に、治療は、７日間、図９Ａと全く同じように開始された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるための方法、低下したまたは不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法、及びそのような方法を実施するための組成物に関する。
【００１２】
本発明の１つの態様は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。この方法は、膵β細胞の集団において、細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、膵β細胞の集団を二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることを含む。
【００１３】
この方法は、エクスビボまたはインビボで実施され得る。エクスビボで実施される場合、膵β細胞の集団は、１つの実施形態によれば、膵臓からβ細胞を得て、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞において、インビトロまたはエクスビボ培養に適した液体培地中で細胞を培養することによって提供され得る。例えば、限定されるものではないが、適切で非限定的な培地は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＲＰＭＩ１６４０のような市販の利用可能な培地に基づき得る。
【００１４】
必要に応じて、細胞が膵β細胞の表現型を有するかどうかを決定するための方法は、当技術分野において公知であり、限定されるものではないが、前記細胞をグルコースと共にインキュベートすること、及び前記細胞におけるインスリン発現が増加または誘導されるかどうかを試験することを含む。他の方法は、β細胞特異的転写因子が発現されるかどうかを試験すること、ＲＮＡ定量的ＰＣＲの助けを借りてβ細胞特異的遺伝子産物を検出すること、糖尿病マウスにおける候補細胞の移植、ならびに前記移植後のその後の生理学的応答の試験及び電子顕微鏡で細胞を分析することを含む。
【００１５】
１つの実施形態によれば、前記方法は、エクスビボで行われ、培養された膵β細胞を、培養された膵β細胞の集団において細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。
【００１６】
別の実施形態によれば、前記方法は、インビボで行われ、対象、例えば、ヒト対象における膵β細胞の集団を、対象の膵β細胞における細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することにより、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。
【００１７】
膵β細胞の集団をＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることは、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及び／またはＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の一方または両方を含む組成物を用いて、順次または同時に行われ得る。
【００１８】
ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤は、当技術分野において公知であり、限定されるものではないが、以下の表１に記載のものが挙げられる。
【００１９】
（表１）ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤
2019531753.tif 000002
2019531753.tif 000003
＊その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるＤＹＲＫ１Ａ阻害剤は、ＤＹＲＫ１Ａの小分子阻害剤であり得る。特定の実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるＤＹＲＫ１Ａ阻害剤は、ハルミン、ＩＮＤＹ、ロイセチン、５−ヨードツベルシジン（「５−ＩＴ」）、及びＧＮＦ４８７７から選択される。
【００２１】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤には、ＢＭＰファミリーの受容体、アクチビン及びインヒビン受容体、ならびに関連受容体の小分子及び他の（例えば、中和モノクロ−ナル抗体、合成／組換えペプチド阻害剤、及びｓｉＲＮＡ）阻害剤が含まれる。
【００２２】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤もまた、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、Ａ−８３−０１、デコリン、可溶性ＴＧＦ−β受容体、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＡＰ−１２００９、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＧＡＳＴ−１、ＧＤＦ８プロペプチド、ＭＹＯ−０２９、Ｎｏｇｇｉｎ、コルディン、Ｃｅｒ／Ｄａｎ、エクトジン、及びスクレロスチン（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｓｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ,”Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６（１１）：１２５５−６１（２００６）を参照のこと）を含む。
【００２３】
ＴＧＦ−βシグナル伝達の他の阻害剤は、限定されるものではないが、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５ナフチリジン、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノイル）］−１Ｈ−ピラゾール、３−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（４−キノリル）−１−フェニルチオカルバモイル−１Ｈ−ピラゾール、ＳＢ−４３１５４２、ＳＭ１６、ＳＢ−５０５１２４、及び２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ）（全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２９８，８２５号を参照のこと）を含む。
【００２４】
ＴＧＦ−βシグナル伝達のさらなる型の阻害剤としては、例えば、ＧＤＦ８及びＧＤＦ１１の阻害剤が挙げられる（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０００/０４３７８１及び米国特許第６,３６８,５９７号を参照のこと）。
【００２５】
ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：９９９−１００１（２００２）；Ｓａｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：３９５３−３９５６（２００３）；Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：４４９４−４５０６（２００４）；Ｔｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６：７９１−８００（２００５)；Ｖａｌｄｉｍａｒｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ.，ＡＰＭＩＳ  １１３：７７３−３８９（２００５）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ７３：７０５−７１５（２００８）；Ｙｉｎｇｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．３：１０１１−１０２２（２００４）；Ｂｙｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：７４４−７５２（２００４）；Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：５３１−５３６（２００３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００２／０９４８３３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００４／０２６８６５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００４／０６７５３０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００９／０３２６６７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００４／０１３１３５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００３／０９７６３９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００７／０４８８５７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００７／０１８８１８号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００６／０１８９６７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００５／０３９５７０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０００／０３１１３５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  １９９９／０５８１２８号；米国特許第６，５０９，３１８号；米国特許第６，０９０，３８３号；米国特許第６，４１９，９２８号；米国特許第９，９２７，７３８号；米国特許第７，２２３，７６６号；米国特許第６，４７６，０３１号；米国特許第６，４１９，９２８号；米国特許第７，０３０，１２５号；米国特許第６，９４３，１９１号；米国特許出願公開第２００５／０２４５５２０号；米国特許出願公開第２００４／０１４７５７４号；米国特許出願公開第２００７／００６６６３２号；米国特許出願公開第２００３／００２８９０５号；米国特許出願公開第２００５／００３２８３５号；米国特許出願公開第２００８／０１０８６５６号；米国特許出願公開第２００４／０１５７８１号；米国特許出願公開第２００４／０２０４４３１号；米国特許出願公開第２００６／０００３９２９号；米国特許出願公開第２００７／０１５５７２２号；米国特許出願公開第２００４／０１３８１８８号；及び米国特許出願公開第２００９／００３６３８２号に記載されている。
【００２６】
ＴＧＦ−βシグナル伝達の例示的な阻害剤は、限定されるものではないが、ＡＰ−１２００９（ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、レルデリムマブ（ＣＡＴ１５２、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型に対する抗体）、ＧＣ−１００８（ヒトＴＧＦ−βの全アイソフォームに対する抗体）、ＩＤ１１（マウスＴＧＦ−βの全アイソフォームに対する抗体）、可溶性ＴＧＦ−β、可溶性ＴＧＦ−βレセプターＩＩ型、ジヒドロピロロイミダゾール類似体（例えば、ＳＫＦ−１０４３６５）、トリアリールイミダゾール類似体（例えば、ＳＢ−２０２６２０（４−（４−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−イミダゾール２−イル）安息香酸））、及びＳＢ−２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）、ＲＬ−００６１４２５、１，５−ナフチリジンアミノチアゾール、及びピラゾール誘導体（例えば、４−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−５−（１，５−ナフチリジン−２−イル）−１，３−チアゾール−２−アミン、及び２−［３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン）、ＳＢ−４３１５４２（４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド）、ＧＷ７８８３８８（４−（４−（３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−イル）−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド、デコリン、レフティ１、レフティ２、フォリスタチン、ノギン、コルディン、ケルベロス、グレムリン、インヒビン、ＢＩＯ（６−ブロモ−インジルビン−３'−オキシム）、Ｓｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７）、及びシスタチンＣを含む。
【００２７】
ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤はまた、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型を阻害する分子も含む。ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤は、限定されるものではないが、可溶性ＴＧＦ−β受容体Ｉ型、ＡＰ−１１０１４（ＴＧＦ−β受容体Ｉ型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、メテリムマブ（ＣＡＴ１５２、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型抗体）、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６（３−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−２−（６−メチルピリジン−２−イル）−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ５７３６３６（Ｎ−（（５−ブロモ−２−チエニル）スルホニル）−２，４−ジクロロベンズアミド）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジル）アミノ］プテリジン）、ＳＤ−０９３、ＫＩ２６８９、ＳＭ１６、ＦＫＢＰ１２タンパク質、及び３−（４−（２−（６−メチルピリジン−２−イル）Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）キノリン−７−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミンを含む。
【００２８】
ＴＧＦ−β受容体Ｉ型の阻害剤は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｙｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ,Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：１０７−１１１（２００４）；Ｓａｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３５８１−３５８４（２００４）；Ｓａｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：３９５３−３９５６（２００３）；Ｂｙｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：７４４−７５２（２００４）；Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：４４９４−４５０６（２００４）；Ｙｉｎｇｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．３：１０１１−１０２２（２００４）；Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：５３１−５３６（２００３）；Ｔｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６：７９１−８００（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００４／０２６８７１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００４／０２１９８９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００４／０２６３０７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０００／０１２４９７号；米国特許第５，７３１，４２４号；米国特許第５，７３１，１４４号；米国特許第７，１５１，１６９号；米国特許出願公開第２００４／０００３８８５６号、米国特許出願公開第２００５／０２４５５０８号に記載されている。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、受容体、及び／または下流シグナル伝達分子（例えば、ＳＭＡＤ）、または核標的（例えば、クロマチン修飾複合体及び転写因子）を妨害する化合物を含む。図１Ａ〜１Ｂを参照のこと。
【００３０】
１つの実施形態において、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、例えば、ＴＧＦβリガンドを中和する抗血清であり得る。
【００３１】
別の実施形態において、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体結合の阻害剤、アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合の阻害剤、及び骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）／ＢＭＰ受容体結合の阻害剤からなる群より選択される。
【００３２】
具体的な実施形態において、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ３６４９４７及びＧＷ７８８３８８からなる群より選択されるＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体結合の阻害剤である。
【００３３】
別の特定の実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ４３１５４２及びＡｌｋ５阻害剤ＩＩからなる群より選択される、アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合の阻害剤である。アクチビンまたはインヒビン／アクチビン受容体結合のさらなる例示的な阻害剤は、ＳＢ−５０５１２４、ＢＹＭ３８８、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、フォリスタチンドメイン（すなわち、Ｆｓ２、Ｆｓ１２、Ｆｓ１２３）、Ａ−８３−０１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＧＷ７８８３８８、ＢＡＭＢＩ、及びＳｏｔａｔｅｒｃｅｐｔからなる群から選択され得る（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｙｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ.，“ＳＢ−５０５１２４  ｉｓ  ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＡＬＫ４，ＡＬＫ５，ａｎｄ  ＡＬＫ７,”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５（３）：７４４−５２（２００４）；Ｌａｃｈ−Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆａ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｔｙｐｅ  II  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｔｒｏｐｈｙ,”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３４（４）：６０６−１８（２０１４）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３（８）：２０２４−３３（２００４）；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ,”ＥＭＢＯ  Ｊ．２５（５）：１０３５−４５（２００６）；Ｔｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｔｈｅ  ＡＬＫ−５  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ａ−８３−０１  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ,”Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６（１１）：７９０−８００（２００５）；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｈｕｍａｎ  ＢＡＭＢＩ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｍａｄ７  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ,”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（４４）：３００９７−１０４（２００９）；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ５  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ,”Ａｍ．���．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９８（５）：Ｈ１４１５−２５（２０１０）；及びＧｏｋｏｆｆｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａｃｔｉｖｉｎ  ａｎｄ  ＧＤＦ１１  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｉｎ  Ｆｅｅｄｂａｃｋ  Ｃｏｎｔｒｏl  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆａｔｅ,”Ｄｅｖｅｌｏｐ．１３８（１９）：４１３１−４２（２０１１）を参照のこと）。
【００３４】
別の特定の実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ＢＭＰ／ＢＭＰ受容体結合の阻害剤である。ＢＭＰ／ＢＭＰ受容体結合の例示的な阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。さらなる例示的なＢＭＰ阻害剤は、ノギン、スクレロスチン、コルディン、ＣＴＧＦ、フォリスタチン、グレムリン、インヒビン、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１２８５４、ＤＭ３１８９、ＢＭＰ−３、及びＢＡＭＢＩからなる群から選択され得る（全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０１８６９１  Ａ１号、及びＭｏｈｅｄａｓ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ＡＬＫ２−Ｂｉａｓｅｄ  ＢＭＰ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,”ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８（６）：１２９１−３０２（２０１３）；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｈｕｍａｎ  ＢＡＭＢＩ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｍａｄ７  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ,”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（４４）：３００９７−１０４（２００９）を参照のこと）。
【００３５】
別の実施形態によれば、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤はＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤である。例示的なＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤は、限定されるものではないが、ＳＭＡＤ３  ｓｉＲＮＡ、ＳＭＡＤ２／３  ｓｉＲＮＡ、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２４７４、Ｓｍａｄ３の特異的阻害剤（ＳＩＳ３）、ＨＳｃ０２５、及びＳＢ５２５３３４からなる群から選択され得る（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ａ  Ｐｉｖｏｔａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ−３  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｅｔａ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ,”ＢＢＡ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７８３（９）：１６０５−１２（２００８）；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｍａｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ,”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６０（１１）：３４６５−７５（２００９）;及びＲａｍｄａｓ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｍｉＲ−２９,”Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８３（６）：１８８５−９６（２０１３）を参照のこと）。
【００３６】
さらなる例示的なＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤は、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１００、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＭＡＤ結合ペプチドアプタマ−（例えば、Ｔｒｘ−ＦｏｘＨ１、Ｔｒｘ−Ｌｅ１、Ｔｒｘ−ＣＢＰ、Ｔｒｘ−ＳＡＲＡ）、ピルフェニドン、及びＬＤＮ１９３１８９を含む（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ.，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１００  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｍａｄ,”Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０（１８）：３９１１−１９（２０１６）；Ｂｏｅｒｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ  ａｎｄ  ＬＤＮ−１９３１８９  Ｉｎｈｉｂｉｔ  ＢＭＰ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｍａｄ，ｐ３８  ａｎｄ  Ａｋｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ２Ｃ１２  Ｃｅｌｌｓ,”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４２（１１）：１８０２−７（２０１０）；Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｓｍａｄ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ＦｏｘＨ１，Ｌｅｆ１  ａｎｄ  ＣＢＰ,”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：３８６４−７４（２００５）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ１−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｍａｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｒｘ−ＳＡＲＡ,”Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：３８１９−３１（２００６）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｏｒａｌ  Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＧＦ−β  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  Ｍｏｄｅｌ,”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１７：５７−６７（２０１６）；及びＣｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.，“ＢＭＰ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｂａｌａｎｃｅｓ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ＳＭＡＤ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐ３８ＭＡＰＫ  ａｎｄ  ＮＯＴＣＨ  Ｐａｔｈｗａｙｓ,”Ｂｌｏｏｄ  １２４（３）：３９３−４０２（２０１４）を参照のこと）。
【００３７】
別の特定の実施形態において、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ複合体の阻害剤である。例示的なＴｒｉｔｈｏｒａｘ複合体阻害剤は、限定されるものではないが、ＷＤＲ５−０１０３、ＭＩ−１、ＭＩ−２、ＭＩ−２−２、ＭＬＳ００１１７１９７１−０１、ＭＬ２２７、ＭＣＰ−１、ＲＢＢ５  ｓｉＲＮＡ、及びＭＬＬ１  ｓｉＲＮＡを含む（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｅｎｉｓｔｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＬＬ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＷＤＲ５,”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４４９（１）：１５１−９（２０１３）；Ｃｉｅｒｐｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｎｉｎ−ＭＬＬ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ,”Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６（４）：４４７−６２（２０１４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＤＰＹ３０  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ,”ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  １０（７）：ｅ０１３１８６３（２０１５）；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｓ  β  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３（１１）：４８４９−４８５８（２０１３）を参照のこと）。
【００３８】
別の実施形態において、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ポリコーム抑制複合体２（「ＰＲＣ２」）の阻害剤または活性化剤である。例示的なＰＲＣ２阻害剤には、ＧＳＫ９２６、ＥＰＺ００５６８７、ＧＳＫ１２６、ＧＳＫ３４３、Ｅ１１、ＵＮＣ１９９９、ＥＰＺ６４３８、コンステレーション化合物３、ＥＺＨ２  ｓｉＲＮＡ、及び３−デアザネプラノシンＡが含まれる（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，Ｃｅｌｌ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＥＺＨ２,”ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：１０９１−６（２０１２）；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＥＺＨ２  ａｎｄ  ＰＲＣ２  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ,”Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４３：６９８−７１２（２０１５）；Ｋｎｕｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＥＺＨ２  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｈ３Ｋ２７  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｋｉｌｌｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ,”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８９０−６（２０１２）；Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｚｈ２  ｂｙ  ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：２１３６０−６５（２０１２）；ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ.，“ＥＺＨ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＥＺＨ２−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  ４９２：１０８−１２（２０１２）；Ｎａｓｖｅｓｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｅｓ  ａｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＥＺＨ２,”ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：３７８−８３（２０１４）；Ｂｒｏｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ２  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．７：１１３８４（２０１６）；Ｆｉｓｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｐｌｅｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｚｅｓｔｅ  ２  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ２  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃｅｌｌｓ,”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５（１２）：３０９６−１０４（２００６）；及びＦｉｓｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎ���ｆｅｒａｓｅ  ＥＺＨ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ３−Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  ＡＭＬ  Ｃｅｌｌｓ,”Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７３３−４３（２００９）を参照のこと）。１つの実施形態において、ＰＲＣ２の活性化は、ＰＲＣメンバー、例えば、ＥＺＨ２（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｚｈ２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌ  Ｉｎｋ４ａ／ＡＲｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，“Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２３（８）：９７５−９８５（２００９）及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））、ＢＭＩ１（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｂｍｉ−１  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ  Ｌｏｃｕｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２３（８）：９０６−９１１（２００９））、及びＹＹ１（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））の遺伝的過剰発現によって達成される。
【００３９】
別の実施形態では、接触は、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤ハルミン及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤ＬＹ３６４９４７と行われる。あるいは、接触は、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤ハルミン及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤ＬＤＮ１９３１８９と行われる。
【００４０】
１つの実施形態によれば、「膵β細胞」は、初代ヒト膵β細胞である。初代ヒト膵β細胞は、死体の細胞であってもよい。１つの実施形態において、「膵β細胞」は、幹細胞由来である（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０１７５３６３号及び米国特許第９，３９４，５２３号を参照のこと）。
【００４１】
本発明のこの方法及び他の方法を実施する１つの実施形態において、接触は、β細胞死またはＤＮＡ損傷を誘導しない。
【００４２】
さらに、接触は、β細胞の分化を誘導し、また、グルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させ得る。β細胞の脱分化は、β細胞がグルコースを感知することまたはインスリンを分泌することができないことに寄与することが知られている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｌｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  β  Ｃｅｌｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ,”Ｃｅｌｌ  １５０：１２２３−３４（２０１２）及びＣｉｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１０１：１０４４−５４（２０１６））。したがって、１つの実施形態において、接触は、β細胞の分化を誘導する。
【００４３】
別の実施形態において、前記方法は、細胞の生存を増強するために実施される。例えば、前記方法は、未処理の細胞集団と比較して、処理された細胞集団の細胞の生存を増強するために実施され得る。あるいは、前記方法は、未処理の細胞集団と比較して、処理された細胞集団の細胞死またはアポトーシスを減少させるために実施され得る。
【００４４】
別の態様において、本発明は、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法に関する。この方法は、不十分なレベルのインスリン分泌に対して対象を治療するために、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の治療を必要とする対象に、前記対象の膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することを含む。
【００４５】
本明細書では、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態とは、不十分なインスリン分泌に関連する状態を有する対象が高血糖になるように対象が血中の正常なグルコースレベルを維持するのに必要とされる血漿インスリンレベルよりも、低い血漿インスリンレベルを産生する状態のことを意味する。このような状態において、罹患した対象の膵β細胞は、血中の正常または適切な濃度のグルコース（すなわち、正常血糖）の存在を維持するのには不十分なレベルのインスリンを分泌する。
【００４６】
１つの実施形態において、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の１つは、インスリン抵抗性である。インスリン抵抗性は、対象の細胞がインスリンの血糖低下作用に対してそれほど敏感でなくなる状態である。筋肉細胞及び脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、グルコース取り込み（したがって、グリコーゲン及びトリグリセリドとしてのグルコースの局所的な貯蔵）を減少させるが、肝細胞におけるインスリン抵抗性は、グリコーゲン合成及び貯蔵の減少、ならびにグルコース産生及び血中への放出の抑制の失敗をもたらす。インスリン抵抗性は、通常、インスリンのグルコース低下作用の減少のことをいう。しかしながら、インスリンの他の機能もまた影響を受ける可能性がある。例えば、脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、脂質についてのインスリンの通常の効果を減少させ、そして循環する脂質の摂取の減少及び貯蔵されたトリグリセリドの加水分解の増加をもたらす。これらの細胞内に貯蔵された脂質の動員の増加は、血漿中の遊離脂肪酸を上昇させる。血中脂肪酸濃度の上昇、筋肉内グルコース取り込みの低下、及び肝臓内グルコース産生の増加はすべて、血中グルコースレベルの上昇に寄与する。インスリン抵抗性が存在する場合、より多くのインスリンが膵臓から分泌される必要がある。この代償的増加が起こらなければ、血糖濃度が上昇し、Ｔ２Ｄが起こる。
【００４７】
別の実施形態によれば、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の１つは、糖尿病である。糖尿病は、２つの広い種類の疾患、すなわちＩ型（「Ｔ１Ｄ」または「１型」）及びＩＩ型（「Ｔ２Ｄ」または「２型」）に分類することができる。用語「糖尿病」はまた、本明細書では、Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、ステロイド性糖尿病、及びいくつかの形態の単遺伝子性糖尿病を含む、患者が高い血糖値を有する一群の代謝疾患のことをいう。
【００４８】
別の実施形態において、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態は、メタボリックシンドロームである。メタボリックシンドロームは、一般に、ＩＩ型糖尿病及びアテローム性動脈硬化性血管疾患の発症リスクの増加に関連する異常の群を定義するために使用される。関連する状態及び症状には、限定されるものではないが、空腹時高血糖（ＩＩ型糖尿病または空腹時血糖障害、耐糖能障害、またはインスリン抵抗性）、高血圧、主に腰の周りの脂肪沈着を伴う太りすぎを意味する中枢性肥満（内臓、男性型、またはリンゴ型の肥満としても知られる）、ＨＤＬコレステロールの減少及びトリグリセリドの上昇を含む。
【００４９】
不十分なレベルのインスリン分泌と関連し得る他の状態には、限定されるものではないが、高尿酸血症、非アルコール性脂肪肝疾患に進行する脂肪肝（特に、同時肥満症）、多嚢胞性卵巣症候群（女性）、及び黒色表皮腫を含む。
【００５０】
関連障害もまた本発明のこの態様にしたって治療され得、そのような障害は、限定されるものではないが、正常範囲外の血中または血漿グルコースレベルに関連する任意の疾患、好ましくは高血糖症を含む。したがって、用語「関連障害」は、耐糖能異常（「ＩＧＴ」）、空腹時血糖異常（「ＩＦＧ」）、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、食後高血糖、及び過体重／肥満を含む。そのような関連障害はまた、異常な血中及び／または血漿インスリンレベルによっても特徴付けられ得る。
【００５１】
別の実施形態によれば、本発明のこの方法は、β細胞不全に関連する症状を有する対象を治療するために実施される。そのような状態は、限定されるものではないが、膵炎、嚢胞性線維症、膵切除術、及びグルココルチコイド治療を含む。
【００５２】
本発明のこの方法を実施する際に、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、対象における膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態に対して対象を治療するために投与される。
【００５３】
１つの実施形態によれば、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、対象における膵β細胞量を増加させるために投与され、それにより対象におけるインスリン分泌レベルが増加する。
【００５４】
１つの実施形態によれば、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、別々の医薬組成物、またはＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の両方を含む単一の医薬組成物として製剤化される。１つの実施形態によれば、このような医薬組成物（複数可）は、治療有効量のＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及び／またはＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む。
【００５５】
したがって、１つの実施形態によれば、本発明のこの方法は、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の組み合わせまたは併用療法または併用治療を施すことによって実施され得る。用語「組み合わせ」または「併用療法」または「併用治療」は、少なくとも２つの化合物を対象に同時投与して生物学的効果、この場合は、相乗効果を引き起こす治療を意味する。併用療法では、少なくとも２つの薬物は、一緒にまたは別々に、同時にまたは順次に投与され得る。下記の実施例に記載されるように、対象の状態を改善するために、薬物が対象において相乗効果を生じる限り、同時投与は必要とされない。また、少なくとも２つの薬物は、異なる経路及びプロトコルを通して投与され得る。結果として、それらは一緒に製剤化され得るが、組み合わせの薬物もまた別々に製剤化され得る。
【００５６】
本発明のこの方法を実施する際に、対象への化合物の投与は、治療上有効な量の化合物（複数可）（すなわち、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤）を含む医薬組成物の投与を含み得、これは、対象における述べられた状態及び／または障害を治療するのに有効な化合物の量を意味する。このような量は一般に、当業者の知識の範囲内にある多くの要因にしたがって変わる。これらは、限定されるものではないが、特定の対象、ならびにその年齢、体重、身長、一般的な健康状態、及び病歴（使用される特定の化合物、ならびにそれが製剤化されている担体、及びそれに対して選択された投与経路、治療の長さまたは期間、及び治療されている状態の性質と重症度）を含む。
【００５７】
投与は、典型的には、本明細書に記載の化合物（すなわち、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤）の剤形を意味する薬学的に許容される剤形の投与を含み、例えば、錠剤、糖衣錠、散剤、エリキシル剤、シロップ剤、懸濁剤を含む液体製剤、スプレー剤、吸入剤錠剤、ロゼンジ剤、乳剤、液剤、顆粒剤、カプセル剤、及び坐剤、ならびにリポソーム製剤を含む注射用の液体製剤を含む。技術及び製剤は、一般に、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ.，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ.，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに見出され得る。
【００５８】
本発明のこの方法を実施する際に、薬物（すなわち、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤）は、任意の適切な量で任意の適切な担体物質中に含まれてもよい。薬物は、組成物の全重量の９９重量％までの量で存在してもよい。前記組成物は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与）、直腸投与、皮膚投与、経鼻投与、経膣投与、吸入投与、皮膚投与（パッチ投与）、または眼投与経路に適した剤形で提供され得る。したがって、前記組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター剤、ドレンチ剤、浸透圧送達装置、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、スプレー、またはエアロゾルの形態であり得る。
【００５９】
医薬組成物は、従来の製薬実務にしたがって製剤化され得る（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ.），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００６０】
本発明による医薬組成物は、投与後実質的に即時に、または投与後の任意の所定の時間もしくは期間に活性薬物を放出するように製剤化され得る。
【００６１】
制御放出製剤には、（ｉ）長期間にわたって、実質的に一定濃度の薬物（複数可）を体内に作り出す製剤、（ｉｉ）所定の遅延時間の後、長期間にわたって、実質的に一定の濃度の薬物（複数可）を体内に作り出す製剤、（ｉｉｉ）活性薬物物質の血漿レベルの変動に関連する付随的な望ましくない副作用は最小に、体内で比較的一定の有効薬物レベルを維持することによって、所定の期間中薬物（複数可）作用を持続する製剤、（ｉｖ）例えば、罹患した組織または臓器に隣接してまたはその中に、制御された放出組成物を空間的に配置することによって、薬物（複数可）作用を局在化させる製剤、及び（ｖ）特定の標的細胞型に薬物を送達するために、担体または化学誘導体を使用することによって、薬物（複数可）作用を標的とする製剤を含む。
【００６２】
徐放性製剤の形態での薬物の投与は、薬物が（ｉ）狭い治療指数（すなわち、有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と、治療効果をもたらす血漿濃度との差が小さいこと；一般に、治療指数（「ＴＩ」）は、半致死量（ＬＤ５０） 対 半有効量（ＥＤ５０）の比として定義される）、（ｉｉ）胃腸管における狭い吸収ウィンドウ、または（ｉｉｉ）治療レベルで血漿レベルを維持するために、１日の間に頻繁な投薬が必要とされるような非常に短い生物学的半減期を有する場合に、特に好ましい。
【００６３】
放出速度が問題の薬物の代謝速度を上回る制御放出を得るために、多くの戦略のいずれかが追求され得る。制御放出は、例えば、様々な種類の制御放出組成物及びコーティングを含む、様々な製剤パラメータ及び成分を適切に選択することによって得られ得る。したがって、前記薬物は、適切な賦形剤と共に、投与時に薬物を制御された方法で放出する医薬組成物（単一または複数の単位の錠剤またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、及びリポソーム）に製剤化される。
【００６４】
したがって、本発明のこの態様による投与は、経口で、局所に、経皮で、非経口で、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内注入で、腔内または膀胱内注入で、眼内に、動脈内に、病変内に、または粘膜への塗布で行われ得る。化合物は、単独でまたは適切な医薬担体と一緒に投与され得、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤または乳剤などの固体または液体形態であり得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び下等動物の細胞と接触して使用するのに適していることを意味し、それは合理的な利益／リスク比に相応である。
【００６６】
対象は、哺乳動物対象であり得る。１つの実施形態において、対象は、ヒト対象である。適切なヒト対象は、限定されるものではないが、インスリン欠乏症を有する小児、成人、及び高齢の対象を含む。
【００６７】
他の実施形態において、対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ウマ、マウス、イヌ、ウサギなどであり得る。
【００６８】
１つの実施形態において、投与ステップは、対象における増殖性膵β細胞の数を、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上増加させ得る。
【００６９】
別の実施形態では、投与ステップは、対象中の増殖性β細胞の数を、１日当たり少なくとも約１％、約２％、約３％、またはそれ以上増加させ得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、投与は、対象の膵β細胞におけるグルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させる。
【００７１】
本発明のこの態様及び他の態様の１つの実施形態において、化合物（すなわち、上記のＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤）の指定は、化合物自体、ならびにその任意の薬学的に許容される塩、水和物、異性体、ラセミ体、エステル、またはエーテルを示すことを意味する。化合物の指定は、それ自体具体的に指定されている化合物、ならびにその任意の薬学的に許容される塩を指定することを意味する。
【００７２】
本発明の文脈内では、「治療する」とは、予防的または治療的な処置を意味する。治療という用語は、特に、矯正、変化率の減少、またはグルコース恒常性障害の減少を意味する。血中グルコースレベルは、一日を通して変動する。血糖値は、通常朝、一日の最初の食事の前に低めであり、及び食事の後に数時間上昇する。したがって、治療という用語は、正常なグルコースレベルに達するために、対象の状態及び時間帯に応じて、血糖レベルを増減することによる血糖レベルの制御を含む。治療という用語は、より具体的には、糖尿病または関連障害を有する対象における血糖値の一時的または持続的な低下を含む。用語「治療」または「治療すること」はまた、（例えば、膵β細胞による）インスリン放出の改善を意味する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、語句「血糖値の制御」とは、異常値（すなわち、正常なグルコース恒常性を有する対応する対象に対して、既知の基準値、中央値、または平均値より下または上である値）を有する対象における、血中または血漿中グルコースレベルの正常化または調節のことをいう。
【００７４】
本発明の別の態様は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（「ＤＹＲＫ１Ａ」）阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む組成物に関する。
【００７５】
ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子β（「ＴＧＦβ」）スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、上記に記載されている。
【００７６】
１つの実施形態において、前記組成物は、担体を含む。前記担体は、上記のように薬学的に許容される担体であり得る。
【実施例】
【００７７】
実施例１〜６の材料及び方法
化学物質：  薬物源は、以下の通りであった：ＩＮＤＹ（４９９７、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢｒｄＵ基質（ＲＰＮ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ハルミン（２８６０４４、Ｓｉｇｍａ）、ロイセチン−４１（Ａｄｉｐｏｇｅｎ、ＡＧ−ＭＲ−Ｃ００２３−Ｍ００５）、ＬＹ３６４９４７（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ２８０５）、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、４４６８５９−３３−２）、ＧＷ７８８３８８（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ２７５０）、Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ、２９３９）、ＳＢ４３１５４２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ１０６７）、Ｋ０２２８８（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ７３５９）、ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ  ２６１８）。
【００７８】
ヒト膵島：  正常及び２型糖尿病の成人の死体膵臓ドナー由来の膵島は、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫ支援統合膵島分布プログラム及びアルバータ糖尿病研究所から入手した。実施した実験に応じて、膵島をインタクトの膵島として使用するか、または最初にＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてカバーガラス上に分散させた。
【００７９】
ヒトβ細胞のＦＡＣＳソーティング（表２）：  ヒト膵島を分散させ、前述の通り、β細胞をアデノウイルスで標識した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。簡単に説明すると、収集する７２時間前に、両方とも明るい緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の上流にある、ＲＩＰ１プロモーターの４３８塩基に連結した１７７塩基のｈＣＭＶ  ＩＥ−１プロモーターＣｌａＩ−ＳｐｅＩフラグメントを含むＲＩＰ１−ｍｉｎｉＣＭＶ構築物によって駆動されるアデノウイルスを用いて、分散したヒト膵島細胞を蛍光活性化サイトメトリーソーティング（ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ）のために形質導入した。選別された細胞をインスリンで免疫標識することによって、ｑＲＴ−ＰＣＲによって及びＲＮＡｓｅｑによって、β細胞画分が９２％を超える純度であることを確認した。
【００８０】
アデノウイルス及び形質導入：  アデノウイルスを前述の通り調製した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｔｌａｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４５０−５９（２０１３）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４６０−７０（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７）；及びＣｏｚａｒ−Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ−４  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１４９−５９（２００４））。特に明記しない限り、すべての形質導入は、１５０ｍｏｉを用いて１時間行い、研究は、７２時間後に行った。Ａｄ.ＤＹＲＫ１Ａ及びＡｄ.ｓｈＤＹＲＫ１Ａの配列及び検証は、以前に報告されている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。ヒトＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ７をコードするアデノウイルスは、Ｈａｒｖａｒｄ  ＰｌａｓｍＩＤデータベースから入手したＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７をコードするｃＤＮＡを用いて、記載のように調製した。ＳＭＡＤ２、３、及び４をサイレンシングするために使用されるアデノウイルスは、表２に示される配列を使用した。
【００８１】
（表２）アデノウイルス配列
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【００８２】
ｑＰＣＲ：  ＲＮＡを単離し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを前述の通り実施した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。分散した膵島における遺伝子発現を、ＡＢＩ  ７５００システムで実施したリアルタイムＰＣＲによって解析した。プライマーは、以前に報告されている通りである（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。
【００８３】
ＲＮＡ配列決定：  ＦＡＣＳで精製したβ細胞からのＲＮＡ（表３）を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて直ちに調製した。
【００８４】
（表３）ＦＡＣＳでソーティングしたヒトβ細胞におけるＴＧＦβスーパーファミリーメンバー及び受容体のＲＮＡｓｅｑプロファイリング（ＲＮＡｓｅｑ、ＦＰＫＭ）
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【００８５】
各実験のＦＡＣＳからのＲＮＡ収量は、３００〜５００ｎｇであり、ＲＮＡ完全性数は、９．５〜１０．０であり、選別されたβ細胞由来のポリＡ＋  ｍＲＮＡをオリゴｄＴ磁気ビーズで精製した。次いで、β細胞由来のポリＡ＋  ＲＮＡを９４℃で二価カチオンの存在下で断片化した。断片化したＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡの末端を平滑化した後、３'末端をアデニル化した。最後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ提供のユニバーサルアダプターをｃＤＮＡ断片に連結した。ＡｍｐＰｕｒｅビーズを用いて、アダプター連結ＤＮＡをサイズ選択して、平均２５０ｂｐのインサートサイズを得て、１５サイクルのＰＣＲによって増幅した。次いで、ＡｍｐＰｕｒｅビーズを用いてＰＣＲ  ＤＮＡを精製し、最終的なｓｅｑライブラリーのシークエンシングの準備を整えた。ｓｅｑライブラリーのインサートサイズ及びＤＮＡ濃度は、それぞれＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ及びＱｕｂｉｔで測定した。１０個のバーコード化されたＲＮＡ配列ライブラリーのプールを、適切な濃度で、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルの８レーンのうちの２つに載せ、ブリッジ増幅して、約２５００万〜３５００万の生クラスターを得た。次いで、前記フローセル上のＤＮＡリードを、１００ｂｐペアエンドレシピを用いて、ＨｉＳＥｑ  ２０００上で配列決定した。ＲＮＡが全膵島においてより豊富であったためＲｉｂｏｚｅｒｏ濃縮ＲＮＡを用いたことを除いて、ハルミン、１０μｇ/ｍｌ、プラス０．１％ＤＭＳＯ中に希釈されたＬＹ３６４９４７、またはビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）単独で処理した全ヒト膵島（表４）について、同様のプロトコルを用いた。
【００８６】
（表４）選択されたＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対するヒト膵島のハルミン処理の効果（ＲＮＡｓｅｑ、ＦＰＫＭ）
2019531753.tif 000006
【００８７】
免疫細胞化学及び抗血清：  免疫細胞化学を４％パラホルムアルデヒド固定（１５分）で行い、記載されているように、Ａｃｃｕｔａｓｅ分散ヒト膵島をカバースリップ上にプレートした（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｔｌａｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４５０−５９（２０１３）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１/Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４６０−７０（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７）；及びＣｏｚａｒ−Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ−４  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１４９−５９（２００４））。一次抗血清は、ＢｒｄＵ（ａｂ６３２６、Ａｂｃａｍ）、Ｋｉ６７（ＲＭ−９１０６−ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及びＭＩＢ１、ＤＡＫＯ）、ｐ−ヒストン−３（０６−５７０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、インスリン（Ａ０５６４、ＤＡＫＯ）、ｐ−γＨ２ＡＸ（ＭＡ１−２０２２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＮＫＸ６．１（Ｆ５５Ａ１０−ｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）、ＰＤＸ１（０７−６９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＭＡＦＡ（Ａｂ２６４０５、Ａｂｃａｍ）、Ｇｌｕｃａｇｏｎ（２７６０ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（Ｓｃ−２０９９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（Ａ０６１９、ＤＡＫＯ）及びＣＫ１９（Ａｂ５２６２５、Ａｂｃａｍ）であった。種特異的マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ａ−１１０２９、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ａ−１１００７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ラビットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ａ１１０３７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはモルモットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ａ−１１０７３、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）二次抗血清を適切に選択した。ＴＵＮＥＬ標識化を記載されているように行った（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｔｌａｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４５０−５９（２０１３）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４６０−７０（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７）；及びＣｏｚａｒ−Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ−４  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１４９−５９（２００４））。
【００８８】
イムノブロット：  イムノブロットを、以前に詳細に記載されているように、全ヒト膵島で実施した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｓｕｂｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７：１５８４−９４（２００８）；Ｋａｓｓｅｍ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｃｙ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１３２５−１３３３（２０００）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１：２０１−２１２（２０１５）；及びＦｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｔｌａｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４５０−５９（２０１３））。用いた一次抗血清は、ＳＭＡＤ２／３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８６８５ｐ）、ｐ−ＳＭＡＤ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２９０３）、ＳＭＡＤ４（Ｓｃ−７９６６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＳＭＡＤ１／５／９（ａｂ６６７３７、Ａｂｃａｍ）、ｐ１５ＩＮＫ４（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３０３４）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ（Ｓｃ−４６８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐ２１ＣＩＰ（５５６４３０、ＢＤ）、ｐ５７ＣＩＰ２（２５５７ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＧＡＰＤＨ（Ｓｃ―２５７７８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）であった。
【００８９】
グルコースで刺激されたインスリン分泌：  ＧＳＩＳを、前述の通り実施した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｔｌａｓ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４５０−５９（２０１３）；Ｆｉａｓｃｈｉ−Ｔａｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｇ１／Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：２４６０−７０（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７）；及びＣｏｚａｒ−Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ−４  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１４９−５９（２００４））。簡単に説明すると、全ヒト膵島を低グルコース（２．８ｍＭ）または高グルコース（１６．８ｍＭ）中で３０分間培養し、培地を採取してインスリン（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）についてアッセイした。結果は、低グルコース濃度と比較した高グルコース中の培地インスリン濃度の倍率変化として表される。
【００９０】
クロマチン免疫沈降アッセイ：  ＣｈＩＰは、前述の通り製造元のプロトコルにしたがって、ＥＺ−ＣｈＩＰキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。ヒトの死体の膵島は、前述の通り分散された。示された各図について、最低３つの別々の膵島調製物を使用した。ＳＭＡＤ２／３、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、及びＭＥＮ１の各免疫沈降について、実験当たり２×１０６細胞を回収した。免疫沈降したＤＮＡをＡＢＩ  ７５００リアルタイム定量的ＰＣＲ検出システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量した。以下の抗体を用いた：抗ＳＭＡＤ２／３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃８６８５）、抗ＳＭＡＤ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＦ２０９７）、抗ＫＤＭ６Ａ（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ８４１９０）、及び抗ＭＥＮ１（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ.  ＃Ａ３００−１０５Ａ）。データは、インプットコントロールに対して正規化されたＣｈＩＰ読み取り値、及び濃縮倍率をそれぞれのＩｇＧで割ったものとして示されている。エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。ＣＤＫＮ１Ｃのためのプライマーセットは、前述の通りである（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。ＣＤＫＮ１Ａのプライマーセットは、表５に示す通りであった。
【００９１】
（表５）ＣＤＫＮ１Ａプライマー
2019531753.tif 000007
【００９２】
マウス膵臓の研究：  雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１２週齢）に、７日間毎日腹腔内注射によって、ビヒクル（食塩水）、１０ｍｇ  ｋｇ−１のハルミンＨＣｌ、３０ｍｇ  ｋｇ−１のＧＷ７８８３８８、またはハルミンとＧＷ７８８３８８の組み合わせを投与した。マウスを７日目に屠殺し、膵臓を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋し、切片にした。以前に報告されたように、切片をＫｉ−６７及びインスリンについて染色した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。膵臓当たり最低２，０００個のβ細胞が計数された。研究者に対して、グループの割り当ては盲検化された。
【００９３】
ヒト膵島移植の研究：  成人ヒト膵臓臓器提供者由来の５００個のヒト膵島等価物を、以下に詳細に記載されるように、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎被膜下に移植した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。マウスを７日間回復させ、次いで、ビヒクル（食塩水）、１０ｍｇ  ｋｇ−１のハルミンＨＣｌ、３０ｍｇ  ｋｇ−１のＧＷ７８８３８８、またはハルミンとＧＷ７８８３８８の組み合わせで、７日間毎日腹腔内注射した。マウスを７日目に屠殺し、腎臓移植片を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋し、切片にした。以前に報告されたように、切片をＫｉ−６７及びインスリンについて染色した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））。
【００９４】
統計：  統計は、図面の簡単な説明に記載されているように、スチューデントの対応のない両側ｔ検定を用いて、または一元配置分散分析によって行った。０．０５未満のＰ値は、有意とみなした。
【００９５】
実施例１  ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤とＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせは、前例のない相乗的なヒトβ細胞増殖を誘導する
表２にまとめた、ＦＡＣＳでソーティングしたヒトβ細胞からの遺伝子発現プロファイル（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌl  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））は、ＴＧＦβＳＦのメンバーの存在量の点で注目に値した。さらに、ヒト膵島のハルミン治療は、ＴＧＦβＳＦメンバーに顕著な変化をもたらした（表３）。ヒトインスリノーマ細胞増殖におけるＳＭＡＤシグナル伝達の卓越性からのこれらの観察からの推論（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））及び他の者によって記載されたＴＧＦβシグナル伝達阻害の有益な効果（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，“ＦＳＴＬ３  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＴＧＦｂｅｔａ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｆａｔ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ.”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：１３４８−５３（２００７）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｙｅｒ，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＧＦｂ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２１：４４１−４４８（２０１０）；Ｅｌ−Ｇｏｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６３：２２４−３６（２０１４）；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｅｔａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ,”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５７：１３４８−５６（２０１６）；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｍ２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ７,”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１：Ｅ１２１１−２０（２０１４）；Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ７  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：ｅ３９���２００６）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｓ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４８４９−５８（２０１３）；及びＤｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６））、多数のヒト死体膵島調製物におけるヒトβ細胞増殖に対する広範囲の薬理学的ＴＧＦβＳＦ阻害剤の効果を調べた（図１Ａ〜１Ｂ）。ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）は、効果がなく、インスリン陽性細胞のＫｉ６７標識を用いて評価したところ、ハルミンは、その通常の２％標識指数を示した。以前に報告されたように、広範囲のＴＧＦβ受容体、ＢＭＰ受容体、及びアクチビン受容体の阻害剤は、ヒトβ細胞増殖にほとんど影響を及ぼさなかった（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６））。対照的に、ＴＧＦβ、アクチビン、またはＢＭＰ受容体を標的とするかどうかにかかわらず、試験されたすべてのＴＧＦβＳＦ受容体阻害剤は、ハルミンと組み合わせて使用される場合、ヒトβ細胞におけるＫｉ６７標識指数の劇的な増加を誘導した。増殖率（標識指数）は、平均５〜８％の範囲であった。しかしながら、大きなエラーバーは、時折ヒト膵島調製物にみられるさらに高い増殖率を反映しており、時には、１５〜２０％もの高いＫｉ６７標識指数を達成する。
【００９６】
有益な効果は、ハルミンに限定されなかったが、ＩＮＤＹ及びロイセチン−４１を含む追加のＤＹＲＫ１Ａ阻害剤にまで及んだ（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｈｔｏｕｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｏ−Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｌｅｕｃｅｔｔｉｎｅｓ，ａ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｐｏｎｇｅ  Ａｌｋａｌｏｉｄ  Ｌｅｕｃｅｔｔａｍｉｎｅ  Ｂ,”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５：９３１２−３０（２０１２））（図２Ａ〜図２Ｂ）。さらに、用量反応試験において、前記組み合わせは、薬理学的相乗作用についての正式な基準を満たした（図２Ｃ）。さらに、注目すべき相乗効果は、２つの追加の増殖測定：ＢｒｄＵ取り込み及びリン酸化−ヒストン−３免疫標識で観察することができた（図２Ｄ〜２Ｇ）。
【００９７】
前記組み合わせの分裂促進効果は、β細胞に特異的であることは観察されなかった：増殖は、アルファ、デルタ、ＰＰ、及び管細胞においても観察された（図３Ａ〜３Ｂ）。ＴＵＮＥＬアッセイ及びγＨ２ＡＸ免疫標識によってそれぞれ評価したところ、β細胞死またはＤＮＡ損傷に関して有害作用は観察されなかった（図３Ｃ〜３Ｅ）。
【００９８】
実施例２−ハルミン−ＴＧＦβＳＦの組み合わせは、正常及び２型糖尿病膵島におけるヒトβ細胞分化のマーカーを増強する
分裂促進経路の活性化がβ細胞の脱分化をもたらし得ることを懸念して、β細胞分化の一連のマーカーの遺伝子発現を調べた（図４Ａ〜４Ｂ）。ハルミン単独について観察されたように（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせは、脱分化を誘導することができなかっただけでなく、その逆も起こった：ＩＮＳ（インスリン）、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＭＡＦＢ、ＳＬＣ２Ａ２、及びＰＣＳＫ１などの重要なβ細胞マーカーの遺伝子発現（図４Ａ〜４Ｂ）は、ｑＰＣＲによりすべての膵島について評価したところ、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤併用治療ですべて増加した。ＩＳＬ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＮｅｕｒｏＤ、ＮＫＸ２．２、及びＰＣＳＫ２の遺伝子発現は、すべて基準値と同じままであった（図４Ａ〜４Ｂ）。ＰＡＸ４だけ減少したが、その意義は不明である。これらの結果は、分散ヒト膵島調製物における免疫細胞化学によって確認し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡがすべてヒトβ細胞において特異的に増加したことを明らかにした（図４Ｃ）。これらの観察と一致して、グルコースで刺激されたインスリン分泌は正常であり、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせで処理されたヒト膵島においては強調されたかもしれない（図４Ｄ）。
【００９９】
β細胞の脱分化は、マウス及びＴ２Ｄを有する人々由来の膵島で起こるので（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｌｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ,”Ｃｅｌｌ  １５０：１２２３−３４（２０１２）、及びＣｉｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１０１：１０４４−５４（２０１６））、ＩＩ型糖尿病のドナー由来の膵島における増殖を次に調べた（図４Ｅ）。注目すべきことに、ハルミン単独は、非糖尿病の膵島ドナーにおいて観察されたのと同程度に、Ｋｉ６７免疫標識を増加させ、さらに、３つの異なるＴＧＦβＳＦ阻害剤と組み合わせたハルミンは、正常な膵島で観察されたものに匹敵するＫｉ６７標識の相乗的増加をもたらした（図１Ａ〜Ｂ及び図２Ａ〜Ｇ）。同様に驚くべきことに、複数のハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせは、重要なβ細胞マーカーであるＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡの発現の顕著な増加をもたらした。これは、ヒトＴ２Ｄ膵島インスリン遺伝子発現の有意な増加と関連していた（図４Ｆ）。
【０１００】
実施例３−併用効果は、ＳＭＡＤ及びＤＹＲＫ１Ａシグナル伝達を必要とする
ＴＧＦβＳＦリガンドは、ＳＭＡＤシグナル伝達に影響を及ぼすが、他のシグナル伝達経路も動員し得る（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｙｅｒ，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＧＦｂ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２１：４４１−４４８（２０１０）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：Ｐａｒｔ  ３,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：１８７２−８５（２０１５）；Ｍａｃｉａｓ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｍａｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．４０：２９６−３０８（２０１５）；及びＧａａｒｅｎｓｔｒｏｏｍ  ＆  Ｈｉｌｌ，“ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：Ｈｏｗ  Ｓｍａｄｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ,”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０７−１１８（２０１４））。ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせがＳＭＡＤシグナル伝達に影響を与えるかどうかを確かめるために、ヒト膵島をハルミン単独または２つのＴＧＦβＳＦ阻害剤であるＬＹまたはＡＬＫ５と組み合わせてインキュベートした（図５Ａ）。ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせは、ＳＭＡＤ２／３の存在量を変えることなく、ＳＭＡＤ３リン酸化の減少をもたらし、また、全ＳＭＡＤ１／５／９の劇的な減少をもたらした（抗血清は、これら３つのＳＭＡＤを区別できないことに注意）。おそらく最も興味深いことに、ハルミンだけでリン酸化ＳＭＡＤ３の減少、及び全ＳＭＡＤ１／５／９の減少をもたらした。ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせによって誘導される増殖において、ＳＭＡＤシグナル伝達の必要性を調べるために、Ｒ−ＳＭＡＤ２、３及び４を、ハルミンで処理したヒト膵島においてアデノウイルスでサイレンシングさせ（図５Ｂ〜５Ｃ）、これらの３つのＲ−ＳＭＡＤをサイレンシングすることは、ハルミンで誘導したヒトβ細胞の増殖をさらに増強することを観察した。逆に、Ｉ−ＳＭＡＤ６及び７を過剰発現させてもそれ自体では増殖に影響を及ぼさなかったが、ハルミンで誘導した増殖は著しく増強された。これらの結果をまとめると、３つの重要なポイントが明らかになる。第一に、ハルミンと組み合わせて投与した場合に、ＴＧＦβＳＦ阻害剤によって生じる増殖は、すべてがＳＭＡＤシグナル伝達を介して、または大部分がＳＭＡＤシグナル伝達を介して媒介され、Ｒ−ＳＭＡＤのサイレンシングまたはＩ−ＳＭＡＤＳの過剰発現は、併用において、ＴＧＦβＳＦ阻害剤の代わりになり得る。第二に、ハルミン自体は、ＳＭＡＤシグナル伝達において、これまで認識されていない阻害効果を有する。第三に、複数のＳＭＡＤファミリー（すなわち、標準的ＴＧＦβ受容体関連ＳＭＡＤ２、３及び４、ならびに標準的ＢＭＰ受容体関連ＳＭＡＤ１、５、及び８／９の両方が、ハル���ンを介した増殖を調節することができる。
【０１０１】
ハルミン類似体は、それらの分裂促進効果のすべてとまではいかなくても、その大部分をＤＹＲＫ１Ａの阻害を介して誘導する（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  ａｎｄ  ＧＳＫ３Ｂ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．６：８３７２（２０１５）；及びＤｉｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１６６０−７１（２０１６））。ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせに由来する相乗的な増殖におけるＤＹＲＫ１Ａについて、推定要件を探るために、ＤＹＲＫ１Ａ単独のまたはＴＧＦβＳＦ阻害と組み合わせた、アデノウイルスの過剰な発現及びサイレンシングを使用した（図５Ｅ〜５Ｇ）。これらの実験は、ＤＹＲＫ１Ａの過剰発現がハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせの増殖効果を阻止することができ、逆に、ＤＹＲＫ１Ａの喪失がＴＧＦβ阻害剤のＧＷ及びＬＹによって誘導される増殖を著しく強調することを明らかにする。まとめると、図５Ａ〜５Ｇの結果は、ヒトβ細胞増殖に対するハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせの強調された効果の、全部ではないにしても大多数が、ＤＹＲＫ１Ａ及びＳＭＡＤシグナル伝達の両方の複合的な中断に起因することを示している。それらはまた、ハルミンがＲ−ＳＭＡＤシグナル伝達を減少させるために、予期せぬ直接的または間接的な影響を及ぼし得ることを明らかにしている。
【０１０２】
実施例４−ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の相乗効果は、サイクリン／ＣＤＫ及びＣＤＫ阻害剤に対する補完的効果を反映する
ハルミン及びハルミン−ＴＧＦβ阻害剤（及びＤＹＲＫ１Ａ及びＳＭＡＤそれぞれ）は、細胞周期活性化剤及び細胞周期阻害剤を介した細胞周期進入を最終的に調整しなければならないという理由から、細胞周期活性化剤及び阻害剤の遺伝子発現は、ビヒクル、ハルミン、ＴＧＦβ阻害剤、またはハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせで処理した全膵島において調べた（図６Ａ〜６Ｂ）。前述の通り、ハルミン単独（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５））は、多数の細胞周期活性化因子（例えば、ＣＤＫ１、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＥ２及びＣＤＣ２５Ａ）の発現を誘導した。対照的に、ＴＧＦβ阻害単独では、ほとんど効果がなかった。特に、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせは、これらまたは他のサイクリンまたはｃｄｋのさらなる活性化を誘導せず、前記ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせは、ハルミン単独と同等であった。
【０１０３】
一方、細胞周期阻害剤は、異なる挙動をした（図６Ｂ〜６Ｃ）。ＣＤＫＮ１Ｃ（ｐ５７ＫＩＰ２をコードする）が約５０％減少したことを除けば、ハルミン単独では、細胞周期阻害剤の発現に中程度で限定的な影響しか及ぼさなかった。ＴＧＦβ阻害は、ＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＩＮＫ４ｂをコードする）、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＣＩＰをコードする）、及びＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７ＫＩＰ２の発現を低下させた。驚くべきことに、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせは、３つの重要な細胞周期阻害剤であるＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａ、及びＣＤＫＮ１Ｃの著しい減少を誘導した。
【０１０４】
ＴＧＦβ阻害に応答したＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、及びＣＤＫＮ２Ｂの減少の根底にある機序を探るために、Ｒ−ＳＭＡＤ２、３及び４のアデノウイルスを用いたサイレンシング、またはＩ−ＳＭＡＤ６及び７の過剰発現の、ヒト膵島におけるＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ及びＣＤＫＮ２Ｂの発現に対する影響を調べた。Ｒ−ＳＭＡＤをサイレンシングするかまたはＩ−ＳＭＡＤを過剰発現させると、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃの発現は減少した（図６Ｄ〜６Ｅ）が、ＣＤＫＮ２Ｂの発現にはほとんど効果がなかった。ＣＤＫＮ１Ａ及び／またはＣＤＫＮ１Ｃの減少が、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせにおけるＴＧＦβＳＦ阻害の相乗効果の根底にあり得るかどうかを決定するために、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃは、単独でまたはハルミン治療と組み合わせて、ヒト膵島においてサイレンシングされた（図６Ｆ）。以前に報告されたように（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７）、及びＡｖｒａｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐ５７Ｋｉｐ２  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：６７０−６７４（２０１４））、ＣＤＫＮ１Ｃのサイレンシングは、ヒトβ細胞増殖のわずかな増加をもたらし、ＣＤＫＮ１Ａのサイレンシングは効果がなかった。対照的に、ハルミンの存在下では、ＣＤＫＮ１ＡまたはＣＤＫＮ１Ｃのいずれかまたは両方のサイレンシングは、強力なヒトβ細胞の増殖をもたらした。最後に、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ及びＣＤＫＮ２Ｂがヒトβ細胞において細胞周期阻害剤として本当に機能するかどうかを決定するために、これらは、ハルミン及びＴＧＦβ阻害剤ＬＹ３６４９４７で処理されたヒト膵島において過剰発現された。各細胞周期阻害剤は、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤で処理されたヒトβ細胞における増殖を劇的に減少させて、「速度」をゼロに近づけた。
【０１０５】
まとめると、これらの観察結果は、増殖に対するハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせの相乗効果のメカニズムを示唆し、ハルミンは、ＤＫＲＫ１Ａ阻害及び核ＮＦＡＴ保持を介して（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｈｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦＡＴ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｅs  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：３４５−３４９（２００６）；Ｇｏｏｄｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｓ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦａＴ,”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２３：２１−３４（２０１２）；及びＤｅｍｏｚａｙ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｓｕｐｓｔｒａｔｅ−２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａ２＋−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ＮＦＡＴ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  β−Ｃｅｌｌｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０：２８９２−２９０２（２０１１））、主に細胞周期遺伝子を相補的に活性化し、ＳＭＡＤシグナル伝達の減弱を介するＴＧＦβ阻害は、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａ、及びＣＤＫＮ１Ｃの発現を減少させ、これらはそれぞれヒトβ細胞において細胞周期阻害剤として通常機能する。ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａ、及びＣＤＫＮ１ＣにおけるこのＴＧＦβ阻害剤を介した減少は、サイクリン及びＣＤＫにおけるハルミン誘導性の、ＤＹＲＫ１Ａ−ＮＦａＴを介した増加を補完し、ハルミン処理またはＴＧＦβ阻害単独による場合よりも大きな細胞周期活性化を可能にする。
【０１０６】
実施例５−細胞周期阻害剤に対するＲ−ＳＭＡＤ及びＴｒｉｔｈｏｒａｘ複合体の直接効果
Ｒ−ＳＭＡＤは、遺伝子をトランス活性化または抑制し得、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘメンバーを含む複合体においてそうする可能性があり（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｓ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４８４９−５８（２０１３）；Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：Ｐａｒｔ  ３,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：１８７２−８５（２０１５）；Ｍａｃｉａｓ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｍａｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．４０：２９６−３０８（２０１５）；及びＧａａｒｅｎｓｔｒｏｏｍ  ＆  Ｈｉｌｌ，“ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：Ｈｏｗ  Ｓｍａｄｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ,”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０７−１１８（２０１４））、どちらもヒトインスリノーマにおけるβ細胞増殖に関与している（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。したがって、Ｒ−ＳＭＡＤＳ  ２、３、及び/または４が、ヒト膵島においてＣＤＫＮ１Ａ及び/またはＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子の調節領域と関連するかどうかを次に調べた（図７Ａ〜７Ｆ）。実際、ＳＭＡＤ２／３及び４は、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃのプロモーター及びエンハンサー領域と会合し（図７Ｃの黒いバー）、これらの会合は、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせでの処理によって減少する。注目すべきことに、ＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーであるＭＥＮ１及びＨ３Ｋ４メチラーゼもまた、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃの両方のこれらの同じ領域に結合することが観察され、この会合はまた、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤処理によって劇的に減少した。最後に、Ｈ３Ｋ２７デメチラーゼ、ＫＤＭ６Ａはまた、ＦＡＣＳでソーティングされたヒトβ細胞におけるＣＤＫＮ１Ｃプロモーターに特異的に結合するＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーである（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。ＫＤＭ６Ａは、ヒト膵島のＣＤＫＮ１Ａプロモーター上でＭＥＮ１と共局在し、この会合は、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤処理によって減少する（図７Ｃ）。逆説的に、ＭＥＮ１の結果とは対照的に、ＫＤＭ６Ａは、ヒト膵島のＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子座と関連しているが、この関連は、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤治療では減少するよりむしろ増強されるように思われる。まとめると、これらの観察は、Ｒ−ＳＭＡＤ、ＭＥＮ１、及びＫＤＭ６Ａが実際にヒトβ細胞のＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃの調節領域に直接結合し、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘメンバーによっても占められる遺伝子座で、そうであることを明らかにしている。重要なことに、これらの関連は、ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤治療によって妨害される。これらの観察は、これらの遺伝子座でのＴｒｉｔｈｏｒａｘを介したオープンクロマチン状態と協調したＴＧＦβＳＦを介したＳＭＡＤシグナル伝達の影響下で、ＳＭＡＤ−Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ相互作用が基礎的状況下で、β細胞においてＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃの発現を維持するモデルを示唆する（図７Ｅ〜７Ｆ）。ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤処理により、これらの複合体は、解離し、ＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃ遺伝子座におけるＳＭＡＤトランス活性化クロマチン圧縮の喪失を可能にする。
【０１０７】
実施例６−ハルミン−ＴＧＦβ阻害剤処理は、インビボでマウス及びヒトβ細胞の増殖を増強する
インビボでハルミン及びＴＧＦβ阻害剤の効果を評価するために、Ｃ５７ＢＬ６Ｎマウスにビヒクル（ＤＭＳＯ）、ハルミン、ＧＷ７８８３８８、またはハルミンとＧＷ７８８３８８の組み合わせを７日間腹腔内投与し、屠殺し、そしてインスリン及びＫｉ６７について評価した。図９Ａは、ハルミン及びＴＧＦβ阻害剤ＧＷ７８８３８８の両方がβ細胞の増殖を誘導したのに対し、ハルミン及びＧＷ７８８３８８の組み合わせは相加的であったことを示す。次に、ヒトの死体の膵島をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植した。図９Ｂは、β細胞の増殖の対照の率は、成人ヒトβ細胞に典型的なものよりも高い（すなわち、０．１〜０．２％超）ものの、ハルミンはこの率を増加させ、ＧＷ７８８３８８は効果がなく、前記ハルミン−ＧＷ７８８３８８の組み合わせは、インビボでのヒト膵島に相乗効果を及ぼしたことを示す。
【０１０８】
実施例１〜６の考察
実施例１〜６は、様々な新規の、予期しない、そして重要な観察を提供する。第一に、それらは、２つのクラスの分子、つまりＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤と合わせたＤＹＲＫ１Ａ阻害剤の新規な組み合わせについて記載しており、これは、成熟した成人のヒトβ細胞において一日平均５〜８％の増殖「率」を確実に誘導することを意味し、これは、以前にはいかなるクラスの治療用分子でも観察されていなかった。これらの率は、生後１年での通常の生理的膵β細胞の複製を上回る（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｉｓ  Ｓｅｔ  Ｅａｒｌｙ  ｉｎ  Ｌｉｆｅ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９７：３１９７−３２０６（２０１２）；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｓｕｂｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７：１５８４−９４（２００８）；及びＫａｓｓｅｍ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｃｙ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１３２５−１３３３（２０００））。第二に、上記の実施例は、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせが相乗的に挙動してヒトβ細胞の増殖を促進し、この相乗作用についての新規なメカニズム及びモデルを提供することを実証する（図８Ａ）。第三に、上記の実施例は、ヒト増殖に対する有益な効果が、部分的には、クロマチン修飾、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘファミリーのエピジェネティック調節酵素の活性の調節により達成され、ＫＤＭ６Ａ及びおそらく追加のメンバーに対するＴｒｉｔｈｏｒａｘβ細胞調節の関与を拡大する（図８Ｂ）。第四に、上記の実施例は、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせによって生じたβ細胞増殖がβ細胞脱分化と関連しておらず、むしろ維持または増加したβ細胞分化を促進することを実証している。第五に、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせの有益な効果は、Ｔ２Ｄ患者のβ細胞にも及ぶ。第六に、上記の例は、ロイセチン−４１（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｈｔｏｕｈ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｏ−Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｌｅｕｃｅｔｔｉｎｅｓ，ａ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｐｏｎｇｅ  Ａｌｋａｌｏｉｄ  Ｌｅｕｃｅｔｔａｍｉｎｅ  Ｂ,”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５：９３１２−３０（２０１２））を、ヒトβ細胞増殖を活性化することができる小分子ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤の名前が増え続けているリストに加える。第七に、２つの異なるインビボモデルを用いた増殖の誘導が確認された。第八に、この観察は、ＴＧＦβのアクチビン、インヒビン、ＢＭＰ、及び関連分子のような局所的に産生された内因性ＴＧＦβＳＦアゴニストが成人ヒトβ細胞における増殖の抑制において重要な役割を果たすこと、また、この阻害経路は治療目的のために操作され得ることを示唆する。最後に、ＤＹＲＫ１Ａは、依然としてハルミン及び他のＤＹＲＫ１Ａ阻害剤の中心的な標的であるが、上記の例は、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤もまた部分的にＳＭＡＤ経路を介して作用し得ることを示唆する。
【０１０９】
ハルミン、５−ＩＴ、ＩＮＤＹ、ＧＮＦ４８７７などのＤＹＲＫ１Ａ阻害剤は、ヒトβ細胞において複製を誘導することが示されている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  ａｎｄ  ＧＳＫ３Ｂ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．６：８３７２，ＤＯＩ：１０−１０３８／ｎｃｏｍｍ９３７２  Ｏｃｔｏｂｅｒ（２０１５）；Ｄｉｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１６６０−７１（２０１６）；Ａａｍｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ,”ＡＪＰ  Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．３１１：Ｅ８５９−６８（２０１６）；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ,”Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２４：６１６−２６（２０１６））が、一般に、増殖「率」または標識指数は低く、１．５〜３％／日の範囲である。したがって、ＤＹＲＫ１Ａ阻害が誘導したβ細胞の増殖は、重要な進歩であるが、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄにおける治療用ヒトβ細胞の増殖に必要とされるものとして、より高い増殖速度が想定され得る。ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤−ＴＧＦβ阻害剤の組み合わせで得られた５〜８％の範囲の平均「率」（図１Ａ〜Ｂ及び図２Ａ〜Ｇ）は、この点に関して注目に値する。
【０１１０】
ＴＧＦβ阻害剤及びＳＭＡＤ阻害は、げっ歯類の膵島における増殖の活性化因子としてよく知られている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，“ＦＳＴＬ３  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＴＧＦｂｅｔａ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｆａｔ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ.”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：１３４８−５３（２００７）；Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｓｃｈｎｅｙｅｒ，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＧＦｂ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２１：４４１−４４８（２０１０）；Ｅｌ−Ｇｏｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６３：２２４−３６（２０１４）；Ｘｉａｏ  ｅt  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｅｔａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ,”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５７：１３４８−５６（２０１６）；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｍ２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ７,”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.１１１：Ｅ１２１１−２０（２０１４）；Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ７  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅs  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：ｅ３９（２００６）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｓ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４８４９−５８（２０１３）；Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６）；及びＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｏｎ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｏｎｏｒｓ,”Ｉｓｌｅｔｓ  ６：５−６（２０１４））。例えば、内因性アクチビン阻害剤、フォリスタチン様３のノックアウトは、マウスの遺伝的モデルにおけるβ細胞の拡大をもたらす（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，“ＦＳＴＬ３  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＴＧＦｂｅｔａ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｆａｔ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ.”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔl．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：１３４８−５３（２００７））。他の者は、Ｉ−ＳＭＡＤ、ＳＭＡＤ７の自発的または誘導的なアップレギュレーションが、マウスにおけるβ細胞の増殖及び拡大に関連していることを報告している（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌ−Ｇｏｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６３：２２４−３６（２０１４）及びＳｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ７  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：ｅ３９（２００６））。さらに他の者は、マウス膵β細胞における増殖を活性化するために、小分子ＴＧＦβ受容体阻害剤を使用した（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌ−Ｇｏｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６３：２２４−３６（２０１４）及びＳｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ７  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：ｅ３９（２００６））。しかしながら、成人のヒト膵島で検査した場合、ＴＧＦβＳＦ阻害剤に反応したβ細胞の増殖は、中程度または無視できる程度であり（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６））、ここで結果が確認された（図１Ａ）。
【０１１１】
本発明の主な進歩は、ＤＹＲＫ１Ａ及びＳＭＡＤ経路の両方の異常が明白であるヒトインスリノーマデータマイニングに由来する概念である、ハルミンと組み合わせてＴＧＦβ阻害剤を使用することであった（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。さらに、上記の実施例は、ハルミンの存在下で、ＴＧＦβ、アクチビン、及びＢＭＰ受容体を含むＴＧＦβスーパーファミリー受容体の様々なクラスのいずれかを阻害することが、すべてβ細胞の増殖を可能にするのに有効であることを示す。以前に報告されたように（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｓｃｈｎｅｙｅｒ，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＧＦβ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ,”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２１：４４１−４４８（２０１０））、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー及びＳＭＡＤシグナル伝達経路は、ヒトの膵島に豊富に存在する。これらは集合的に、おそらく、他の者によって示唆されているように、脱分化から保護するために、ヒトβ細胞の増殖を抑制する抑制性調節経路を構成すると推測される（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌ−Ｇｏｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｓｍａｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６３：２２４−３６（２０１4)及びＳｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ７  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：ｅ３９（２００６））。
【０１１２】
ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤／ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせは、単に相加的ではなく、明らかに相乗的であることが今や見出された（図１Ａ〜Ｂ及び図２Ａ〜Ｇ）。ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤は、サイクリンやｃｄｋなどの細胞周期活性化剤を優先的に活性化するようであるが、ＴＧＦβＳＦ阻害剤は、細胞周期阻害剤、特に、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、及びＣＤＫＮ２Ｂの効果を優先的に抑制するようであり、少なくともＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃについては、ＳＭＡＤシグナル伝達及びＴｒｉｔｈｏｒａｘクロマチンリモデリングによって介されると思われる（図８Ｂ）。ＣＤＫＮ２Ｂ及びＣＤＫＮ２Ａの関与は可能であるが、それらは、ｐ１４ＡＲＦ、ＡＮＲＩＬなどのさらなる細胞周期調節因子をコードする共通の遺伝子座から生じるために、実証することがより困難である。これらの問題、及びこの遺伝子座の異常にＧＣに富む性質は、この遺伝子座の個々のメンバーの選択的なサイレンシングを困難にする。
【０１１３】
β細胞増殖の制御におけるエピジェネティック修飾遺伝子のＴｒｉｔｈｏｒａｘファミリーの関与は予想外ではなく、標準的なＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーであるＭＥＮ１は、多発性内分泌腫瘍１型症候群を有する人々から位置的にクローニングされ（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ−Ｔｙｐｅ  １,”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：４０４−４０７（１９９７））、これには、インスリノーマ、及びＭＥＮ１が含まれ、その他のＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーは、動物モデル及び細胞株において、β細胞の増殖及び量を調節することが示されている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｅｖｅｌｏｐｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ,”ＰＮＡＳ  ９８：１１１８−２３（２００１）；Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｏｆ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ＭＥＮ１：Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ,”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：６０７５−６０８５（２００３）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“ＰＤＧＦ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ａｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：３４９−５５（２０１１）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｚｈ２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２３：９７５−９８５（２００９）；及びＫａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｍｅｎｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐ２７ｋｉｐ１  ａｎｄ  ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ,”ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０２：１４６５９−６４（２００５））。さらに、ＭＥＮ１及びＭＬＬなどの他のＴｒｉｔｈｏｒａｘメンバーも、げっ歯類のβ細胞増殖及び細胞周期阻害剤に対するＣｈＩＰに関与していることが示されている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｓ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４８４９−５８（２０１３）及びＤｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６））。さらに、別のＴｒｉｔｈｏｒａ���メンバーであるＫＤＭ６Ａは、時折ヒトインスリノーマにおいて不活性化され、ヒトβ細胞において、ＫＤＭ６Ａをサイレンシングまたは薬理学的に阻害し、細胞周期阻害剤ＣＤＫＮ１Ｃの発現を遮断することが最近示された（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。本発明は、ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤／ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせが、ＭＥＮ１及びＫＤＭ６ＡのＣＤＫＮ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ｃプロモーター及びエンハンサーへの正常な結合を破壊し、ヒトβ細胞における重要な細胞周期阻害剤ＣＤＫＮ１ＣのＴｒｉｔｈｏｒａｘ調節の直接の証明を初めて提供することを示すことによって、これらの観察を拡張する。ＴＧＦβＳＦ及びＳＭＡＤの標的は、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘメンバーに限定されず、おそらくポリコーム抑制複合体（ＰＲＣ）のメンバーのような他のエピジェネティック修飾遺伝子を含むと予測される。確かに、ＥＺＨ２やＢＭＩ１などの正規のＰＲＣメンバーは、げっ歯類のβ細胞増殖の年齢に関連した修飾因子としてよく知られており（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“ＰＤＧＦ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ａｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：３４９−５５（２０１１）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｚｈ２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ,”Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２３：９７５−９８５（２００９）；及びＫａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｍｅｎｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐ２７ｋｉｐ１  ａｎｄ  ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ,”ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０２：１４６５９−６４（２００５））、多くの遺伝子に対するＴｒｉｔｈｏｒａｘ作用に結合しそれに対抗する（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｓ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４８４９−５８（２０１３）及びＤｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−Ｂｅｔａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１２０８−１８（２０１６））。さらに、ヒトインスリノーマにおけるＰＲＣ突然変異及び誤発現の繰り返し��証拠があり（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））、ＣＤＫＮ１Ｃサイレンシングと組み合わせたＥＺＨ２の過剰発現は、ヒトβ細胞の増殖を促進することが報告されている（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７６７（２０１７））。
【０１１４】
ＩＩ型糖尿病は、マウス及びヒトβ細胞において、より原始的で機能性の低いインスリン枯渇神経内分泌細胞型への脱分化と関連している（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｌｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ,”Ｃｅｌｌ  １５０：１２２３−３４（２０１２）及びＣｉｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ,”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１０１：１０４４−５４（２０１６））。ハルミンの場合と同様に、ハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせは、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＭＡＦＢ、ＳＬＣ２Ａ２、及びＰＣＳＫ２を含む、ヒトβ細胞の同一性、分化及び成熟のいくつかの重要なマーカーを増加させる。マウスβ細胞で実証されているように、これは、部分的には、結果として生じるＮＦａＴ核転座を伴うＤＹＲＫ１Ａ阻害、及びこのクラスの遺伝子を促進するための結合に関連すると推定されるが、実験的には確認されていない（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦＡＴ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：３４５−３４９（２００６）及びＧｏｏｄｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｓ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦａＴ,”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２３：２１−３４（２０１２））。治療的見地から、従来の知識は、β細胞の増殖を駆動する事象が必然的にβ細胞の脱分化及び機能不全をもたらすことを示唆しているため、この分化の誘導は、重要であり、意外なままである。増殖の誘導にもかかわらず、分化した分子表現型及びグルコースで刺激されたインスリン分泌がインタクトのままであるという事実（図４Ａ〜Ｆ）は有望である。Ｔ２Ｄ膵島においてβ細胞の増殖を促進し、分化マーカーを増強するというハルミン−ＴＧＦβＳＦ阻害剤の組み合わせの能力は、どちらも驚くべきことでもあり、歓迎すべきことでもある。それは、Ｔ２Ｄを有する患者の治療に有望である。
【０１１５】
ハルミン及び関連化合物は、主にＤＹＲＫ１Ａの阻害を介して、増殖を促進するように主に作用することは明らかであると思われるが（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，“Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｈａｒｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：３８３−３８８（２０１５）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  ａｎｄ  ＧＳＫ３Ｂ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．６：８３７２，ＤＯＩ：１０−１０３８／ｎｃｏｍｍ９３７２  Ｏｃｔｏｂｅｒ（２０１５）；及びＤｉｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ.，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＹＲＫ１Ａ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ,”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６５：１６６０−７１（２０１６））、ハルミンがＳＭＡＤ  １、５、８／９と同様にリン酸化ＳＭＡＤ３を減少させることを観察したことは驚くべきことであった。これは、ＤＹＲＫ１Ａに対するその効果に加えて、ハルミン及び他のＤＹＲＫ１Ａ阻害剤が、まだ解明されていない方法でＳＭＡＤシグナル伝達と相互作用する可能性があることを示唆する。
【０１１６】
本明細書において好ましい実施形態を詳細に図示し説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更、追加、置換などを行うことができることは当業者には明らかであり、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲で定義されているように、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【図１Ａ】
2019531753.tif 000008
【図１Ｂ】
2019531753.tif 000009
【図２Ａ】
2019531753.tif 000010
【図２Ｂ】
2019531753.tif 000011
【図２Ｃ】
2019531753.tif 000012
【図２Ｄ】
2019531753.tif 000013
【図２Ｅ】
2019531753.tif 000014
【図２Ｆ】
2019531753.tif 000015
【図２Ｇ】
2019531753.tif 000016
【図３Ａ】
2019531753.tif 000017
【図３Ｂ】
2019531753.tif 000018
【図３Ｃ】
2019531753.tif 000019
【図３Ｄ】
2019531753.tif 000020
【図３Ｅ】
2019531753.tif 000021
【図４Ａ】
2019531753.tif 000022
【図４Ｂ】
2019531753.tif 000023
【図４Ｃ】
2019531753.tif 000024
【図４Ｄ】
2019531753.tif 000025
【図４Ｅ】
2019531753.tif 000026
【図４Ｆ】
2019531753.tif 000027
【図５Ａ】
2019531753.tif 000028
【図５Ｂ】
2019531753.tif 000029
【図５Ｃ】
2019531753.tif 000030
【図５Ｄ】
2019531753.tif 000031
【図５Ｅ】
2019531753.tif 000032
【図５Ｆ】
2019531753.tif 000033
【図５Ｇ】
2019531753.tif 000034
【図６Ａ】
2019531753.tif 000035
【図６Ｂ】
2019531753.tif 000036
【図６Ｃ】
2019531753.tif 000037
【図６Ｄ】
2019531753.tif 000038
【図６Ｅ】
2019531753.tif 000039
【図６Ｆ】
2019531753.tif 000040
【図６Ｇ】
2019531753.tif 000041
【図７Ａ】
2019531753.tif 000042
【図７Ｂ】
2019531753.tif 000043
【図７Ｃ】
2019531753.tif 000044
【図７Ｄ】
2019531753.tif 000045
【図７Ｅ】
2019531753.tif 000046
【図７Ｆ】
2019531753.tif 000047
【図８Ａ】
2019531753.tif 000048
【図８Ｂ】
2019531753.tif 000049
【図９】
2019531753.tif 000050
【配列表】
2019531753000001.app
【国際調査報告】
2019531753.tif 000051
2019531753.tif 000052