(57)【要約】本発明は、細胞選別のためのスクリーニングチップに関し、前記スクリーニングチップは、対向する第１および第２の表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部は、波長λ１でのレーザー照射により気化可能なラマン不活性コーティング材料でコーティングされ、前記基板は波長λ１のレーザー光線に対して透明である。本発明のさらなる態様では、スクリーニングチップを用いた細胞選別方法およびスクリーニングチップを用いた細胞選別装置が提供される。
2019508038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞選別のためのスクリーニングチップであり、前記スクリーニングチップは、対向する第１および第２の表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部は、波長λ１でのレーザー照射により気化可能なラマン不活性コーティング材料でコーティングされ、前記基板は波長λ１のレーザー光線に対して透明である、スクリーニングチップ。
【請求項２】
前記ラマン不活性コーティング材料に隣接する細胞保持層をさらに含み、前記細胞保持層は、前記ラマン不活性コーティング材料の少なくとも一部が露出している少なくとも１つのウェルを含む、請求項１に記載のスクリーニングチップ。
【請求項３】
前記細胞保持層が複数のウェルを含む、請求項２に記載のスクリーニングチップ。
【請求項４】
前記λ１が約５３２ｎｍまたは約１０６４ｎｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニングチップ。
【請求項５】
前記ラマン不活性コーティング材料が、アルミニウム、チタン、金、銀、ニッケル、銅、白金、パラジウム、およびロジウム、それらの混合物、それらの酸化物、それらの酸化物の混合物、グラファイト、グラフェン、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ＴｉＯ２、およびそれらの混合物および複合物から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニングチップ。
【請求項６】
前記ラマン不活性コーティング材料が１００ｎｍ以下の厚さを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニングチップ。
【請求項７】
前記ラマン不活性コーティング材料は、約２５ｎｍの厚さを有するアルミニウムまたはＰＥＮとアルミニウムとの複合体であり、前記ＰＥＮは、前記基板の前記第１の表面に隣接する層を形成し、前記アルミニウムはＰＥＮ層に隣接して厚さ２５ｎｍの層を形成し、前記ＰＥＮ層によって前記基板の前記第１の表面から分離されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニングチップ。
【請求項８】
細胞選別方法であり：
（ｉ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のスクリーニングチップを用意するステップであって、さらに前記スクリーニングチップに複数の細胞を含め；
（ｉｉ）前記細胞に波長λ２のレーザー光線を照射し、この照射された細胞からのラマン散乱を検出するステップと；
（ｉｉｉ）前記ラマン散乱に基づいて標的領域を特定するステップであって、前記標的領域は、ラマン不活性コーティング材料でコーティングされた第１の表面の領域であり、それに隣接して配置された少なくとも１つの細胞を有し；
（ｉｖ）前記波長λ１のレーザー光線が前記スクリーニングチップの前記基板の前記第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面まで前記基板を透過して前記標的領域内の前記ラマン不活性コーティング材料を選択的に照射するように、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー照射を照射するステップであって、このレーザー照射によって前記標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させ、それに隣接して配置された少なくとも１つの細胞を射出させ；そして
（ｖ）少なくとも１つの射出された細胞を収集チップ上に収集するステップと、
を含む、細胞選別方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｉｉ）において、前記波長λ２のレーザー光線が、前記スクリーニングチップの基板を通過することなく前記細胞に入射する、請求項８に記載の細胞選別方法。
【請求項１０】
前記スクリーニングチップはｘｙ平面を画定し、前記波長λ１の光線は、前記ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射し、前記波長λ２の光線は、前記ｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射する、請求項８または請求項９に記載の細胞選別方法。
【請求項１１】
前記スクリーニングチップはｘｙ平面を画定し、前記波長λ１の光線は、前記ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射し、前記波長λ２の光線は、前記ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射する、請求項８または請求項９に記載の細胞選別方法。
【請求項１２】
前記スクリーニングチップを前記ステップ（ｉｉ）と前記ステップ（ｉｖ）の間で反転させる、請求項１１に記載の細胞選別方法。
【請求項１３】
前記収集チップをステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間で配置する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の細胞選別方法。
【請求項１４】
前記λ２が、約２３０ｎｍ〜約３９０ｎｍの範囲の紫外放射線、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の可視放射線、または約７５０ｎｍから約１２００ｎｍの範囲の近赤外放射線である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の細胞選別方法。
【請求項１５】
前記λ１が、５３２ｎｍまたは１０６４ｎｍである、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の細胞選別方法。
【請求項１６】
前記波長λ２のレーザー光線がパルスであり、前記波長λ１のレーザー光線が連続波である、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の細胞選別方法。
【請求項１７】
細胞選別装置であり：
請求項１〜７のいずれか１項に記載のスクリーニングチップと、
前記スクリーニングチップに前記波長λ２のレーザー光線を照射する照射部と；
前記スクリーニングチップ上の細胞試料からのラマン散乱を検出する検出部と；
前記波長λ１のレーザー光線が前記スクリーニングチップの前記基板の第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面まで前記基板を透過してその標的領域内のラマン不活性コーティング材料を選択的に照射し、この照射により、前記標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させるように、前記波長λ１のレーザー光線を前記スクリーニングチップに照射する照射部と；
を含む、細胞選別装置。
【請求項１８】
前記スクリーニングチップに前記波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部と、ラマン散乱を検出する前記検出部とが、共焦点ラマン顕微鏡の構成要素である、請求項１７に記載の細胞選別装置。
【請求項１９】
前記スクリーニングチップに前記波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、前記波長λ１のレーザー光線が、前記スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに前記波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、前記波長λ２のレーザー光線が、前記スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射するように配置される、請求項１７または請求項１８に記載の細胞選別装置。
【請求項２０】
前記スクリーニングチップに前記波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、前記波長λ１のレーザー光線が、前記スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに前記波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、前記波長λ２のレーザー光線が、前記スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置から前記スクリーニングチップに入射するように配置される、請求項１７または請求項１８に記載の細胞選別装置。
【請求項２１】
前記サンプリングチップのｘｙ座標および／または前記スクリーニングチップに前記波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部のｘｙ座標および／または前記スクリーニングチップに前記波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部のｘｙ座標を記録するためのソフトウェアがロードされたコンピュータをさらに備える、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の細胞選別装置。
【請求項２２】
前記サンプリングチップと、前記スクリーニングチップに前記波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部および／または前記スクリーニングチップに前記波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部とが、前記コンピュータによる指示を受けて、前記スクリーニングチップおよび／または２つの前記照射部を互いに対して移動させるための駆動手段に接続されている、請求項２１に記載の細胞選別装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞選別のためのスクリーニングチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
単細胞生物学は、生命の基本的な構築ブロックである細胞を理解するための新しい機会を提供する生物学の新興分野である。典型的な生化学的および生理学的方法は、細胞の群に対して実施されるため、細胞の集合にわたって平均化された情報を提供する。これらのような方法はそれ故、個々の細胞の詳細な生理機能、細胞−細胞相互作用、および細胞集団内の異種性に関するきわめて重要な情報を失う危険性がある。微生物学者は、自然界の微生物の大部分が現在は上手く培養できないため、単一細胞に特に関心がある。培養することができる細胞であっても、それらの正常な生物学的状況においてこれらを研究することは依然として有利である。従って、単一細胞の研究のための新規かつ改良された方法を開発することが望ましい。
【０００３】
興味深い特性を有する単一細胞の同定および単離は、しばしば、蛍光活性化細胞選別（Fluorescence-Activated Cell Sorting；ＦＡＣＳ）に基づく技術を用いて達成される。しかし、ＦＡＣＳ技術では、細胞を溶液中に懸濁させ、細胞の蛍光に従ってソートするために、小さなノズルを１つずつ通過させなければならない。しかし、ＦＡＣＳには２つの大きな制限がある。第１に、細胞懸濁液には、細胞選別ノズルをブロックする大きな粒子または破片がないことが必要である。これは、例えば、ＦＡＣＳが土壌試料または複雑な組織試料を分析するために使用できないことを意味する。第２に、ＦＡＣＳは、細胞が均質な溶液中に懸濁されることを必要とするが、それは任意の構造的または空間的な情報を失わせ、それ故に、個々の細胞（例えば、細胞−細胞、細菌−組織、または細胞−基質相互作用）間に存在し得る相互作用の如何なる理解も妨げる。
【０００４】
単一細胞ラマン分光法（Single-Cell Raman Spectroscopy；ＳＣＲＳ）は、最近注目されている方法である。ラマン分光法は、細胞の生化学的組成物、例えばその核酸、タンパク質、炭水化物および／または脂質組成物の特徴である化学的「フィンガープリント」を提供する。すべてではないにしても、多くの複雑な有機分子は少なくとも１つのラマン活性モードを有するため、標識化合物を導入する必要なく、自然な状態で生きている細胞内の生体分子に基づいてラマンスペクトルを得ることができる。これにより、特定の特性を有する個々の細胞の迅速かつ確実な検出が可能になる。例えば、ＳＣＲＳは、細胞組成物の調査、特定の表現型（例えば細菌株）の同定、または細胞成分の濃度および分布の変化をモニタリングすることによって生理学的状態の同定にさえも使用することができる。（例えば、１３Ｃまたは１５Ｎを用いて）同位体標識した細胞は、そのような同位体標識が生体分子に組み込まれたときに生じるラマンスペクトル線の小さいながらも検出可能なシフト（転位、転移）に起因して代謝経路を調べるために使用することができる。
【０００５】
単細胞生物学の研究をさらに進めるために、例えば、興味深い特性を有する細胞をさらなる研究のために培養することができ、または単一細胞の“オミクス”解析、例えば、ゲノミクス（例えば、ゲノムシーケンシング）、トランスクリプトミクス、プロテオミクスおよびメタボロミクスなどの分析を実施することができるようにするには、対象となる細胞を同定するためだけでなく、それらを単離するための方法も必要である。この分野における多くの研究は、最近、一般に“ＲＡＣＳ”（Raman Activated Cell Sorting；ラマン活性化細胞選別）として知られている、ラマン分光法による特徴付け後の細胞の選別技術に焦点を当てている。これまでに文献に記載されている最も一般的なＲＡＣＳ技術は、ラマン特性決定後に細胞を選別するために、マイクロ流体技術または光ピンセットを使用する。しかし、このような技術にはいくつかの欠点がある。マイクロ流体細胞選別および光ピンセットは、細胞を液体中に懸濁させる必要があるが、このことが組織試料、固体粒子、バイオフィルムなどの細胞へのこれらの技術の適用を妨げている。さらに、マイクロ流体工学に基づく細胞操作技術は、汚染または閉塞を起こしやすい、複雑なマイクロ流体チップを必要とし、処理能力が比較的低い。光ピンセットを用いた細胞の光学トラッピングは、処理能力を制限するゆっくりとした繊細な操作であり、さらに、必要とされる強力なレーザー光線に長期間さらすと細胞損傷をもたらすことがある。さらに、ラマンスペクトル線は当然非常に弱いので、細胞選別が行われる前にラマンスペクトルを取得するために長い捕捉時間が必要であり、ＲＡＣＳ技術の潜在的な処理能力をさらに制限している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載のラマン活性化細胞射出（Raman Activated Cell Ejection；ＲＡＣＥ）技術が、迅速で、対象となる細胞の同定において非侵襲的で、高処理能力で、そして非侵襲性、非有害、高品質および同定された細胞の正確な単離のための方法を提供できることを見出した。
【０００７】
特に、本明細書に記載されたスクリーニングチップの使用は、効率的かつ効果的なＲＡＣＥ技術を提供するために、ラマン分光法による細胞探査とレーザー誘起前方転写（laser induced forward transfer；ＬＩＦＴ）を用いた細胞選別の統合を可能にすることにおいて特別な利点を提供することが分かった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の一態様は、細胞選別のためのスクリーニングチップを提供するものであり、前記スクリーニングチップは、対向する第１および第２の表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部は、波長λ１でのレーザー照射により気化可能なラマン不活性コーティング材料でコーティングされ、前記基板は波長λ１のレーザー光線に対して透明である。
【０００９】
前記スクリーニングチップは、本明細書に記載の分光学的方法および／または細胞選別方法および技術によって研究される試料のための運搬体として機能する。この点で前記スクリーニングチップは、顕微鏡スライドに類似するもの、すなわち研究中の試料のための取付台とみなすことができる。
【００１０】
好ましい実施形態では、前記基板の前記第１の表面と前記第２の表面の両方が実質的に平ら（例えば、平面）である。このような実施形態では、前記基板の前記第１の表面および前記第２の表面は互いに実質的に平行（例えば、平行）であってもよい。そのため、前記基板の前記第１の表面と前記第２の表面との間の間隔がチップ上の任意の点で実質的に一定である。
【００１１】
好ましい実施形態では、前記チップは細胞保持層をさらに含む。前記細胞保持層は、前記細胞保持層と基板との間に前記ラマン不活性コーティング材料が位置するように、前記ラマン不活性コーティング材料に隣接して配置される。前記細胞保持層は、細胞試料を内部に留めておくのに適した少なくとも１つのウェルを有する。ラマン不活性コーティング材料の一部は、細胞試料がラマン不活性コーティング材料と接触するように、前記ウェルの底部で露出している。好ましくは、前記細胞保持層は複数のそのようなウェルを含む。従って、前記ウェルは、前記細胞保持層内の穴とみなすことができ、これは、使用時に、前記細胞保持層が、ウェルの体積よりも小さい体積の細胞試料の少なくとも１つを留める（保持する）ことを可能にしている。
【００１２】
前記細胞保持層は、不活性な材料、すなわち、細胞に対して非毒性であり、典型的な生物学的／生理学的ｐＨ範囲で緩衝液などの水性溶媒に溶解しないかまたは反応しない物質から作られることが好ましい。前記細胞保持層は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層などのポリマー層が好適である。
【００１３】
細胞試料は、少なくとも１つの生物細胞（単細胞生物など、例えば細菌）を含み、また、複数の細胞（例えば、２つ以上の細胞の単細胞生物、複数の異なる単細胞生物、多細胞生物、または組織試料）を含んでいてもよい。所望により、細胞試料は、水または緩衝水溶液などの適切な液体溶媒中にある１つまたは複数の細胞の懸濁液として提供することができる。特に好ましくは、細胞試料は、少なくとも１つの生細胞を含む。
【００１４】
他の実施形態では、１つまたは複数のウェルは、基板自体が少なくとも１つの細胞試料を留めておくことができるように、基板に直接形成される。このような実施形態では、第１の表面は、ウェル間の領域において実質的に平ら（例えば、平面）であり、第２の表面は、実質的に平ら（例えば、平面）であることが好ましい。好ましくは、第１の表面の平面領域は、第２の表面に対して実質的に平行（例えば、平行）である。従って、このような実施形態では、ウェルは、すべて基板の第１の表面と第２の表面との間の間隔が明らかに小さくされた形状の領域となる（換言すれば、第１の表面と第２の表面との間の間隔は、製造公差または他の避けられない欠陥のためにいずれの表面の平坦性の自然発生的な変化よりも大きく変更する）。任意のそのような実施形態において、チップの全体的な厚さに関する言及は、第１の表面と第２の表面との間の最も広い間隔を指すものとして理解されるべきである。従って、このような実施形態では、ウェルは、使用時に、ウェルの容積よりも小さい容積を有する試料を留めるように作用するチップの基板の第１の表面における局所的なくぼみとみなすことができる。
【００１５】
ウェルが細胞保持層内または基板内に存在する場合、これらは、試料の局在的な留め置きに適していれば、任意の形状を有することができる。ある実施形態において、基板の第１および第２の表面によって画定される平面に平行な軸に沿って見た場合、ウェルは、実質的に正方形、長方形、半球形、放物線形、中央の頂部が切り取られた放物線形（centrally-truncated parabolic）（すなわち、実質的に放物線状の壁が平坦な底部と結合している）、周囲が切り取られた放物面（peripherally-truncated paraboloid）（すなわち、実質的に平行な壁が放物線状の底部と結合している）、三角形、または台形断面を有していてもよい。ある実施形態において、基板の第１および第２の表面によって画定される平面に垂直な軸に沿って見た場合、ウェルは、実質的に円形、卵形、八角形、七角形、六角形、五角形、四角形（例えば、長方形、正方形、または偏菱形）、または三角断面を有していてもよい。基板の第１および第２の表面およびそれに垂直な平面によって画定される平面におけるこのような断面の幾何学的に許容される任意の組み合わせがさらに考えられる。複数のウェルが存在する場合、すべてのウェルの形状は互いに実質的に同じ（例えば同一）であってもよいし、複数の異なる形状のウェルが存在してもよい。複数のウェルが存在する場合、ウェルは、規則的な反復パターンで細胞保持層または基板内に配置されてもよく、または互いにランダムに配置されてもよい。好ましくは、すべてのウェルの形状は実質的に同じ（例えば同一）である。好ましくは、ウェルは、互いに対して規則的な反復パターンで配置される。特に好ましくは、ウェルは互いに規則的な反復パターンで配置され、形状が実質的に同じ（例えば同一）である。好ましくは、複数のウェルが存在する場合、それらの容積は実質的に同じ（例えば同一）である。
【００１６】
ウェルの存在は、研究される試料が個々のつながっていない細胞の集合体（例えば、細菌などの単細胞生物の集合体）を含む場合に特に望ましいことがある。しかし、ウェルはまた、多細胞生物または組織試料がウェル内に収容され得るならば、多細胞生物または組織試料の研究のために使用されてもよい。
【００１７】
ある実施形態において、スクリーニングチップはウェルがなくてもよく、またはウェルを一つ含んでいてもよい。このような実施形態は、研究される試料が大きな多細胞生物または組織試料である場合に特に望ましい場合がある。しかしながら、個々のつながっていない細胞（例えば、細菌などの単細胞生物）を含む試料は、ウェルがないかまたはウェルを一つ含むスクリーニングチップを用いて研究を行ってもよい。
【００１８】
前記一つのウェルまたは複数のウェルは、少なくとも０．２μｌの容量を有することが好ましいが、これは液体試料の取扱いがこの容量以下では困難になるためである。好ましくは、前記一つのウェルまたは複数のウェルは、少なくとも０．２〜０．５μｌの容量を有する。ある実施形態において、前記一つのウェルまたは複数のウェルは、少なくとも１μｌ、例えば２μｌの容量を有することが好ましい。ある実施形態において、前記一つのウェルまたは複数のウェルは、約１０μｌ以下の容量を有することが好ましい。ウェルは、基板に平行な面において、例えば、一辺または直径の長さが約０．５〜約３ｍｍ（例えば、約１ｍｍ、約１．５ｍｍまたは約２ｍｍ）の寸法を有することが好適である。ウェルは、約０．１〜約１ｍｍの深さ（例えば、約０．５ｍｍ）を有することが好適である。好ましいウェルは、基板の第１および第２の表面によって画定される平面に垂直な軸に沿って見たときに円形の断面を有するとともに、基板の第１および第２の表面によって画定される平面に平行な軸に沿って見たときに長方形の断面を有し、前記円形の断面の直径が約１ｍｍであり、前記長方形の断面が約０．５ｍｍの深さを有するウェルである。
【００１９】
基板の第１の表面の少なくとも一部分は、波長λ１でのレーザー照射によって気化され得るラマン不活性コーティング材料でコーティングされている。
【００２０】
電磁放射線のラマン散乱は、光子の非弾性散乱に与えられた名称である。典型的には、これは、ラマン活性モードを有する分子と相互作用する１０００万光子ごとに約１つ発生する。非弾性散乱は散乱光子のエネルギー（従って振動数）の変化をもたらし、それによって、元々の入射光子よりもエネルギーが高く（振動数が高く、従って波長がより短くなる）なったり−これは、反ストークスラマン散乱と呼ばれている−または、元々の入射光子よりもエネルギーが低く（周波数がより低く、従って波長がより長くなる）なったりすることがある−これは、ストークスラマン散乱と呼ばれている。電磁放射線のラマン散乱は、典型的には、光子と、分子の回転、振動および／または回転振動モードとの間の相互作用の結果として生じる。いくつかの回転／振動／回転振動モードは、ラマン散乱を生じさせることができる方法で光子と相互作用することができず、これらのモードはラマン不活性モードと呼ばれている。ラマン散乱を生じさせることができるような方法で光子と相互作用することができる回転、振動または回転振動モードは、ラマン活性モードと呼ぶことができる。
【００２１】
本明細書で使用されるラマン不活性コーティング材料は、ラマン活性モードを有さない元素および／または化合物を含む、または好ましくは本質的にそれらからなる材料であってもよい。例えば、単原子または金属状態で存在する元素の大部分はラマン不活性であり、従って、ラマン不活性コーティング材料は、そのような元素を含んでもよく、または本質的にそれらの元素からなるものでよい。ラマン不活性コーティング材料での使用に適した好ましいラマン不活性元素の例は、アルミニウム（Ａｌ）である。
【００２２】
ラマン不活性コーティング材料は、ラマン活性モードを有する元素および／または化合物を含んでもよいが、そのような元素および／または化合物の存在から生じるラマン散乱は、存在するいかなるラマン活性試料から生じるラマン散乱と比較しても無視できる程度である。
【００２３】
一実施形態では、ラマン不活性コーティング材料は、ラマン不活性層とラマン活性層とを含む複合体であってもよい。そのような実施形態では、ラマン活性層は、ラマン不活性層がラマン活性層によって基板から離れるように、基板と接触させるべきである。これにより、チップが使用されているときに、（例えば、基板内のウェル内または細胞保持層内のウェル内の）提供される任意の細胞試料が、ラマン活性層ではなく、ラマン不活性層に接触する。例えば、ラマン不活性コーティング材料は、基板と接触するポリマー層と、ポリマー層と接触する金属層とを含んでいてもよい。そのような実施形態の一例は、基板の第１の表面と接触するポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）層またはポリエチレンテレフタレート層と、ＰＥＮまたはポリエチレンテレフタレート層と接触するアルミニウム層とを含む。本明細書に記載された他のラマン不活性金属、例えば、Ａｕ、Ｔｉ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、それらの混合物、それらの酸化物、それらの酸化物の混合物および／または金属と酸化物の混合物を、アルミニウムの代わりに使用してもよい。ポリマー層（例えば、ＰＥＮまたはポリエチレンテレフタレート）は、波長λ１の照射に対して透明であり、金属（例えばＡｌ）層の気化を妨げなければ、任意の厚さを有していてもよい。例えば、約５ｎｍ〜約１０ｍｍの厚さを有するポリマー（例えば、ＰＥＮ）層を使用してもよい。ある実施形態において、その厚さは、約５０〜約１００ｎｍ、例えば約７５ｎｍとしてもよい。金属または金属酸化物層の厚さは、波長λ１の照射で照射されたときに気化することができるのであれば、本明細書に記載の任意の適切な厚さであってもよく、例えば、厚さは約５ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲、例えば２５ｎｍとしてもよい。
【００２４】
好ましくは、ラマン不活性コーティング材料は、使用時に５未満の信号対雑音比を提供する。
【００２５】
本発明のスクリーニングチップにおける使用に適したラマン不活性コーティング材料の例としては、金属および金属酸化物、特にアルミニウム、チタン、金、銀、ニッケル、銅、白金、パラジウム、およびロジウム、それらの混合物、それらの酸化物、それらの酸化物の混合物、および／またはそのような金属と金属酸化物との混合物が含まれる。これらの金属のうち、銅および銀は、それらの潜在的な細胞傷害効果のために避けることが好ましい。アルミニウムが特に適していることが分かっている。他の適切な材料としては、グラファイト、グラフェン、またはポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリエチレンテレフタレートおよび／またはポリエステルなどのポリマーを含んでもよい。多くのポリマーはラマン活性モードを有するので、ラマン活性ポリマーがコーティング材料として使用される場合、これは、それ自体がラマン不活性材料、例えば上述の金属の１つでコーティングされるべきである。そうすることによって、ラマン不活性コーティング材料は、基板の第１の表面と接しているポリマー層と、前記ポリマー層と前記基板の第１の表面との間の接触点から反対側のポリマー層と接しており、ラマン不活性である第２層と、を含む複合材料となる。このようなラマン活性ポリマーは、本明細書に記載されたレーザー照射で容易に気化可能である場合に使用され得るが、それらのラマン活性が細胞試料からのラマンスペクトルの取得を妨げないことを確実にすることが重要である。
【００２６】
従って、本明細書に記載されるラマン散乱法および装置は、表面増強ラマン散乱に依存した細胞選別技術を改良するために従来用いられた多くの方法とは異なる。表面増強ラマン散乱は、基板と、吸着され、吸収された試料との間、さもなければ試料からの光のラマン散乱の強度を増加させる基板と接触することによる良く理解されていない相互作用に依存する。このような技術は、ラマン散乱の強度の劇的な増加をもたらすことができ、従って、得られたラマンスペクトルの信号対雑音比の良好な改善につながるが、それらはしばしば、比較的厚いコーティング材料の層が存在することを必要とする。厚い層の存在はラマンシグナルの増強に有利である。従って、対象となる細胞の同定をより容易にするが、このような層は一般的に容易に気化できず、従って細胞射出技術には適用性が限られるという欠点を有する。
【００２７】
ラマン不活性であることに加えて、本発明のスクリーニングチップにおけるコーティング層は、レーザー照射によって容易に気化可能とすべきである。特に、コーティング層は、各パルスが１ナノ秒（ｎｓ）から１秒（ｓ）の間、例えば０．１ｓ〜１ｓのパルス照射時間を有するパルスレーザー照射によって気化可能とすべきである。典型的には、パルス照射時間は長くてもせいぜい５００ｍｓであり、好ましくは１００ｍｓ以下、例えば５０ｍｓ以下、１ｍｓ以下、１μｓ以下、５００ｎｓ以下、１００ｎｓ以下、または１０ｎｓ以下、例えば１〜１０ｎｓである。また、コーティング層は、１０ｍＪ／ｃｍ２以下、例えば３．５ｍＪ／ｃｍ２以下のエネルギー密度を有する各パルスでのパルスレーザー照射によって気化可能とすべきである。また、コーティング層は、各パルスが１００ｐＪから３μＪの間の全エネルギーを有するパルスレーザー照射によって気化可能とすべきである。本明細書に記載されたレーザーパルス照射時間、エネルギー密度およびパルスエネルギーは、コーティング層上に位置する細胞試料の損傷または破壊のリスクを最小にするために好ましい。
【００２８】
原理的には、レーザーからコーティング層に気化させるのに十分なエネルギーが伝達されるのであれば、コーティング層の気化には任意のレーザー波長λ１を使用することができる。例えば、２００ｎｍから１６００ｎｍ（例えば、３５０〜１４００ｎｍ、例えば２００〜１２００ｎｍ、例えば３５０〜９００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、５００〜１１００ｎｍ、または７００〜１１００ｎｍなど）の任意の波長を用いてもよい。５３２ｎｍまたは１０６４ｎｍでの照射は、これらの波長がコーティング層上に位置する細胞に与える損傷を最小限にすることが分かっているので特に好ましい。
【００２９】
コーティング層は、コーティング層の照射領域が完全に気化するようにレーザー照射を吸収するのに適した厚さであるべきであり、それによって、基板の第１の表面から離れる方向（例えば、実質的に垂直）に飛びだす軌跡でコーティング層の上に配置された任意の試料を射出させる熱衝撃波が生成される。薄すぎる層は、その上に入射するレーザーエネルギーのすべてを吸収する前に気化する可能性があり、過剰なレーザーエネルギーから任意の細胞試料に対して損傷を与える危険にさらす可能性がある。厚すぎる層は完全にまたは少しも気化しない可能性があり、ごくわずかな試料射出、または射出された細胞の有効な捕捉を可能にするには不十分な速度での射出をもたらす。あまりにも厚い層の使用は、例えば過度の加熱のために細胞の完全性の喪失（例えば、細胞壁の破裂）を招く可能性があるので、射出中に細胞の完全性が維持されるような層の厚さを選択すべきである。適切な層の厚さは、任意のレーザー照射の波長、出力および持続時間だけでなく、コーティング層の性質によって左右される。従って、コーティング層の厚さに関する特定の制限を予め規定することは困難である。当業者は、コーティング材料の性質、使用される任意のレーザー照射の波長、出力および持続時間、射出される試料の性質および任意の射出された試料によって達成される必要がある所望の速度および距離を考慮して適切な層厚を選択してもよい。しかしながら、典型的には、コーティング層は多くて１００ｎｍ、例えば８０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、または１５ｎｍ以下の厚さとする。好ましくは、コーティング層は薄くても１０ｎｍである。従って、一実施形態では、コーティング層は、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、例えば２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍまたは５０ｎｍ〜６０ｎｍの厚さとしてもよい。好ましいコーティング層は、薄くても１５ｎｍ、厚くても３５ｎｍ、好ましくは２５ｎｍ以下の厚さを有するアルミニウムである。そのような層は、約０．１ｓまでの持続時間および約３．５ｍＪ／ｃｍ２までのエネルギー密度の５３２ｎｍのレーザーパルスを使用して適切に気化され得る。
【００３０】
スクリーニングチップの基板は、波長λ１のレーザー光線に対して透明であるべきである。上記説明で、「透明」とは、透過した放射線がラマン不活性コーティング材料を気化させて細胞を射出させることができる波長λ１の十分な照射を基板が伝達できること、すなわち、基板が細胞の射出が起こらない程度にレーザービームを減衰させないことを意味する。好ましくは、基板は、波長λ１の照射に関して０．１以下の光学密度を有するべきである。波長λ１は、コーティング材料の性質、射出される試料の性質、所望の射出速度および距離などによって変更するので、基板材料に関して予め規定することは困難である。当業者は、必要に応じて適切な基板材料を選択することができる。しかしながら、ある波長範囲の全体にわたって許容可能なレベルの透明性を示す典型的な基板材料としては、ガラス（例えば、石英ガラス）または透明ポリマー材料が挙げられる。
【００３１】
適切な波長、出力および照射時間のレーザーエネルギーの照射により、照射領域内のコーティング材料が気化し、その上に位置する任意の試料（例えば、細胞）を熱衝撃波および／または気化の際に発生するガスの膨張によって基板の第１の表面から離れる方向に推進させる。これは射出と呼ばれている。このようにして、試料を射出することにより、射出された試料を元の環境から単離することができる。従って、例えば、元の試料が、対象となる特定の特徴を有する幾つかの細胞（例えば、特定の生体分子、または細菌の特定の表現型を発現する細胞）およびその特徴を欠く他の細胞を含む細胞集団を含む場合、対象の特徴を有する細胞（好ましくは生細胞）を選択的に射出するために細胞の射出を行うことができる。
【００３２】
射出された試料のさらなる研究を容易にするため、射出された試料が収集されることが望ましい。従って、一実施形態では、スクリーニングチップから射出された細胞を捕捉するために形成された収集チップが備えられている。前記スクリーニングチップの基板の第１の表面から離れる方向に飛んでいく前記スクリーニングチップから射出された細胞が、前記収集チップの前記実質的に平坦な第１の表面に突き当たるように、前記スクリーニングチップの基板の第１の表面に対して離間して配置された実質的に平坦な第１の表面を有する基板を収集チップは含んでいてもよい。あるいは、収集チップは、ウェル（試料収集ウェルとも呼ばれる）を除けば実質的に平坦な第１の表面を有する基板を含んでいてもよい。そのようなウェルは、スクリーニングチップに関連して先に記載したウェルに類似していてもよく、従って、スクリーニングチップのウェルに関する望ましい断面形状に関する前述の議論は、収集チップにおいて任意のウェルの形状に等しく適用される。
【００３３】
ある実施形態において、収集チップの少なくとも一部（例えば、実質的に平坦な第１の表面の少なくとも一部、または少なくとも１つの試料収集ウェルの底部の少なくとも一部）が、収集チップに当たる任意の射出された細胞の接着を促進する材料でコーティングされていてもよい。
【００３４】
一実施形態では、収集チップは、第１および第２の表面を有する実質的に平坦な基板を含み、さらに、第１の表面と接触する細胞保持層を含む。細胞保持層は、細胞試料を留めておくのに適した少なくとも１つのウェルを有する。従って、ウェルは、細胞保持層内の穴とみなすことができ、この穴によって、使用時に、細胞保持層が、ウェルの体積よりも小さい体積の細胞試料の少なくとも１つを穴の中に留めること（保持すること）を可能にしている。
【００３５】
収集チップの細胞保持層は、不活性な材料、すなわち、細胞に対して非毒性であり、典型的な生物学的／生理学的ｐＨ範囲で緩衝液などの水性溶媒に溶解しないかまたは反応しない物質から作られることが好ましい。細胞保持層は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層などのポリマー層が好適である。
【００３６】
使用時には、収集チップ（一つのウェルまたは複数のウェルが含まれている）における前記ウェルは、ウェルの開口端がスクリーニングチップに向けられるように向きを合わせるべきである。そうすることによって、スクリーニングチップから収集チップに向けて細胞が飛んで、収集チップのウェルの中に入ることができる。このことは、収集チップの基板の第１の表面がスクリーニングチップの基板の第１の表面の方に向くように、収集チップを配置することによって具現できる。スクリーニングチップおよび収集チップの両方が少なくとも１つのウェルまたは複数のウェルを含む場合、スクリーニングチップのウェルおよび収集チップのウェルが互いに（例えば、同軸上または共線上にあるように）位置が合っていることが望ましく、このようにすることによって、スクリーニングチップのウェルから射出された細胞が収集チップの相補的なウェルの中に移動する確率が最大になる。このような実施形態では、収集チップのウェルは、細胞がスクリーニングチップから一定の範囲の軌道にわたって射出され得るという事実を説明するために、収集チップによって画定される平面に垂直な軸に沿って見たとき、スクリーニングチップのウェルより体積が大きく、および／またはスクリーニングチップのウェルよりも断面積が大きいことがより望ましい。例えば、収集チップのウェルは、適切には、スクリーニングチップのウェルの対応する面積の約４倍（例えば、約３．５倍、約３倍または約２倍）である収集チップの平面の面積を有していてもよい。収集チップのウェルはまた、適切には、スクリーニングチップのウェルの深さの約８倍（例えば、約７倍、約６倍、約５倍、または約４倍）の深さを有していてもよい。いくつかの実施形態では、収集チップのウェルは、収集チップの平面内に第１の寸法を有する第１の部分と、収集チップの平面内に第２の寸法を有する第２の部分とを有することができ、前記第２の寸法が前記第１の寸法よりも小さく、前記第２の部分の深さが前記第１の部分の深さ未満である。使用時には、そのようなウェルは、収集チップに向かって飛んでいくスクリーニングチップから射出された細胞が、収集チップのウェルの第２の部分に当たる前に収集チップのウェルの第１の部分に当たる方向に向いている。一実施形態では、収集チップは、直径約３．５ｍｍの収集チップの平面内に円形断面を有する第１の部分と、直径約２ｍｍの収集チップの平面内に円形断面を有する第２の部分と、を有するウェルを有し、前記第１の部分は約３ｍｍの深さを有し、前記第２の部分は約０．５ｍｍの深さを有する。
【００３７】
収集チップおよびスクリーニングチップの両方がウェルを有する場合、収集チップおよびスクリーニングチップは、互いに間隔をおいて配置することができる。ある実施形態において、収集チップとスクリーニングチップとは互いに離間した関係にあり、収集チップ、スクリーニングチップおよび壁が一緒になって囲まれた空間を画定するように壁によって接続されている。一実施形態では、スクリーニングチップは細胞保持層を含み、収集チップもまた細胞保持層を含み、そして、スクリーニングチップのウェルと収集チップのウェルとの位置が合うようにスクリーニングチップの細胞保持層を収集チップの細胞保持層と接触させる。
【００３８】
あるいは、収集チップおよびスクリーニングチップは、スクリーニングチップおよび収集チップの平面部分が互いに直接接触し、収集チップのウェルがスクリーニングチップのウェルに直接重なるように配置してもよい。
【００３９】
スクリーニングチップがウェルまたは複数のウェルを含む場合、ウェルまたは複数のウェルは、液体試料の取り扱いがこの体積以下では困難になるので、少なくとも０．２μｌの体積を有することが好ましい。好ましくは、ウェルまたは複数のウェルはそれぞれ少なくとも０．２〜０．５μｌの体積を有する。ある実施形態において、ウェルまたは複数のウェルは、好ましくは、少なくとも約１μｌ、例えば２μｌの容量を有する。ある実施形態において、ウェルまたは複数のウェルは、好ましくは約１０μｌ以下、例えば、約６μｌ以下、例えば、０．２〜６μｌまたは０．５〜６μｌの体積を有する。ウェルは、収集チップの平面内に約０．５〜約３ｍｍ（例えば、約１ｍｍ、約１．５ｍｍまたは約２ｍｍ）の寸法、例えば、一辺または直径の長さである長さを有することが適切である。ウェルは、約０．１〜約５ｍｍ（例えば、約０．５〜約３．５ｍｍ）の全深さを有することが適切である。ウェルが第１の部分および第２の部分を含む場合、ウェルの全深さは第１および第２の部分の累積深さである。
【００４０】
収集チップによって収集された、射出された細胞がＤＮＡ増幅のために使用されることを意図している場合、収集チップ中の最大ウェル体積は約１０μｌであることが特に好ましい。収集された細胞が細胞培養に使用されることを意図している場合、原理的にはウェルの体積に上限はないが、ウェルは製造の容易さのために本明細書に記載されるような寸法を有することが好ましい。いずれにせよ、適切なウェルの寸法および体積は、とりわけ、研究される細胞試料の性質および対象となる細胞試料中の細胞の密度およびサイズに左右される。理想的には、収集チップのウェルは、１ウェルあたり１０３〜１０５個の細胞を集められることが可能であるべきである。それによって存在する任意のウェルの寸法および体積は、研究される細胞の性質によって異ならせることができる。当業者であれば、検討中の細胞に応じて適切なウェルサイズおよび体積を選択することができる。
【００４１】
原理的には、本発明の方法、チップおよび装置を用いて任意のタイプの生物細胞を研究することができる。本発明の方法、チップおよび装置を用いて適切に研究され得る細胞の例としては、昆虫、植物、哺乳動物（例えば、ヒト）および微生物（例えば、藻類のまたは細菌の（グラム陽性およびグラム陰性細菌を含む））細胞を含む任意の真核細胞または原核細胞、例えば、酵母の細胞、赤血球細胞（red blood cells）（赤血球（erythrocytes）、例えば、ヒト赤血球（human erythrocytes））、白血球細胞（white blood cells）（白血球（leukocytes））、例えば、ヒト白血球（human leukocytes））、幹細胞、がん細胞、土壌細菌および／または光合成細菌のような細菌；リゾビウム属（Rhizobium spp.）；バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、シュードモナス属（Pseudomonas spp.）、アシネトバクター属（Acinetobacter spp.）；シアノバクテリア属（Cyanobacteria spp.）；ナンノクロロプシス属（Nannochloropsis sp.）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus spp.）、グロイオバクター属（Gloeobacter spp.）、ロドバクター属（Rhodobacter spp.）ペロモナス属（Pelomonas spp.）、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium spp.）、ハロモナス属（Halomonas spp.）、シゲラ属（Shigella spp.）；およびヒト病原性細菌（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Staphylococcus saprophyticus）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス属（Bacillus spp.）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・コーニィ（Staphylococcus cohnii）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、および／またはシュードモーナス・エールジノーサ（Pseudomonas aeruginosa)）などを含むが、これらに限定されない。
【００４２】
ある実施形態において、収集チップのウェルは、収集された細胞の付着を促進するために液体培地を含ませてもよい。液体培地の性質は、検討中の細胞の性質および任意の意図されたさらなる研究（例えば、細胞培養またはＤＮＡ増幅）によって異なる。例えば、ＤＮＡ増幅研究の場合、収集チップは、水、細胞溶解緩衝液、または水性Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液を適切に含ませてもよい。細胞培養の研究のためには、収集チップは、水、ＰＢＳ緩衝溶液または栄養溶液を適切に含ませてもよい。他の適切な溶液は、細胞生物学の通常の原理に関して有している当業者の共通の一般知識の範囲内である。
【００４３】
従って、さらなる局面において、本発明は、細胞選別方法を提供し、前記方法は：
（ｉ）対向する第１および第２の表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部が、波長λ１でのレーザー照射によって気化され得るラマン不活性コーティング材料でコーティングされるスクリーニングチップを用意するステップであって、前記基板は、波長λ１でのレーザー照射に対して透明であり；さらに前記スクリーニングチップは複数の細胞を含む；
（ｉｉ）前記細胞に波長λ２のレーザー光線を照射し、この照射された細胞からのラマン散乱を検出するステップと；
（ｉｉｉ）前記ラマン散乱に基づいて標的領域を特定するステップであって、前記標的領域は、前記コーティング材料でコーティングされた第１の表面の領域であり、それに隣接して配置された少なくとも１つの細胞を有し；
（ｉｖ）前記波長λ１のレーザー光線が前記基板の前記第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面に前記基板を透過して前記標的領域内の前記コーティング材料を選択的に照射するように、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー照射を照射するステップであって、それによって前記標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させ、それに隣接して配置された少なくとも１つの細胞を射出させ；そして
（ｖ）少なくとも１つの射出された細胞を収集チップ上に収集するステップと、
を含む。
【００４４】
スクリーニングチップは、複数の細胞を含む。これら複数の細胞は、スクリーニングチップに直接付着させたり、またはスクリーニングチップの表面上および／またはスクリーニングチップのウェル内の液体培地中で、例えば、緩衝液などの水性溶媒に懸濁させて提供したりしてもよい。少なくとも１つの細胞は、ラマン不活性コーティング材料に隣接して配置されるべきである。上記説明中の「隣接する」とは、少なくとも１つの細胞がコーティング材料と直接接触する（例えば、付着する）ことを意味し得るものであり、または、例えば、少なくとも１つの細胞が液体培地中に懸濁されたり、液体培地それ自体がコーティング材料と接触したりしている場合には、間接接触することもまた意味し得るものである。しかしながら、少なくとも１つの細胞が、標的領域におけるコーティング材料の気化が、スクリーニングチップからの少なくとも１つの細胞の射出を引き起こすことができるように配置することが重要である。
【００４５】
スクリーニングチップから射出された細胞は、本明細書に記載の収集チップである収集チップによって収集される。
【００４６】
波長λ２のレーザー光線は、対象となる細胞内の生体分子におけるラマン活性モードからの検出可能なラマン散乱を促す任意の適切な波長とすることができる。選択される的確な波長は、研究中の細胞の性質および細胞選別が複数の細胞のそれぞれを識別するために使用しようとする生体分子の性質によって異なる。しかしながら、λ２として使用するのに適した波長の典型的な例としては：
約２３０ｎｍ〜約３９０ｎｍの範囲の紫外放射線、例えば、２４４ｎｍ、２５７ｎｍ、３２５ｎｍ、３６４ｎｍ、
約４００ｎｍから約７００ｎｍの範囲の可視放射線、例えば、４５７ｎｍ、４７３ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、５３２ｎｍ、６３３ｎｍ、６６０ｎｍ、
約７５０ｎｍ〜約１２００ｎｍの範囲の「近赤外」放射線、例えば、７８５ｎｍ、８３０ｎｍ、９８０ｎｍ、１０６４ｎｍであるが、これらに限定されない。
【００４７】
選択された波長λ２は、研究対象の細胞および生体分子の性質だけでなく、所望の感度（ラマン散乱強度はλ２−４に比例する）および所望の空間分解能（より短い波長がより良好な回折限界空間分解能を有する）によっても左右される。
【００４８】
一実施形態において、波長λ２は、波長λ１とは異なる（すなわち、より長い、またはより短い）。
【００４９】
一実施形態において、波長λ２は波長λ１と同じである。
【００５０】
原理的に、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップ上のコーティング材料を気化させることができる場合（例えば、λ２＝λ１の場合）、波長λ２での任意の照射の持続時間および／またはエネルギー密度がそのような気化を生じさせるには不十分であること、すなわち、本明細書に記載の波長λ２での照射後にコーティングが実質的に無傷であることを確実にすることが重要である。
【００５１】
好ましくは、λ２での照射は、連続波照射であり、λ１での照射はパルス照射によるものである。
【００５２】
λ２での照射は、照射された細胞からのラマン散乱光の捕捉を可能にするのに十分な時間継続するべきである。
【００５３】
λ２での照射は、例えば、スクリーニングチップ上の別個の点（例えば、個々の細胞または個々のウェル）を連続して照射することによって、または、スクリーニングチップ全体をレーザー点で連続的に走査することによって、または、複数の細胞および／またはウェルを同時に照射するためにスクリーニングチップ全体をレーザー線で走査することによって、または、スクリーニングチップの全面に同時に照射することによって、任意の適切なパターンで行ってもよい。
【００５４】
λ２での照射が別個のステップで行われる場合（例えば、連続した別々の点での照射によって）または連続走査（例えば、レーザー点またはレーザー線の走査）によって行われる場合、これは、レーザー光線源に対してスクリーニングチップを動かすことによって、および／または、スクリーニングチップに対してレーザー光線源を移動させることによって行ってもよい。
【００５５】
照射された細胞からのラマン散乱の検出は、任意の従来のラマン散乱検出手段を用いて行ってもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態において、例えば２つ以上のラマン活性モードを検出することによって、検出精度を向上させるために、２つ以上の波長λ２のレーザー光線の照射から生じるラマン散乱を検出することが望ましい場合がある。
【００５７】
細胞選別の機能を果たすためには、検出されたラマン散乱は、対象の特徴を有する細胞をその特徴を持たない細胞から区別するのに適している。可能性のある対象の特徴は広範囲であり、特定の種または表現型の同定；特定の生理学的状態の識別；または特定の生体分子の存在の同定を含むが、これらに限定されない。種、表現型または生理学的状態を区別するためにラマン散乱が使用される場合、これは、ラマン散乱の存在または非存在がその特定の種、表現型または生理学的状態に特徴的であり、または、ラマン散乱の強度によって種、表現型または生理学的状態の特徴付けを可能になるように変化するラマン散乱プロファイルの存在または非存在の検出によって行うことができる。任意の細胞のラマンシグネチャーがその生化学的組成物の特徴であるので、そのような表現型、種または生理学的状態のためのバイオマーカーとして振る舞う分子の特徴であるラマン散乱プロファイルの存在、非存在または強度に基づいて、表現型、種または際理学的状態を区別することが可能である。
【００５８】
本発明の細胞選別方法で検出されるラマン散乱は、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）、ヌクレオチド（例えば、グアニン）、多環芳香族化合物（例えば、ナフタレン）、グルコース、セルロース、ステロイド化合物、エルゴステロール、シトクロムＣ、チミン、カロテノイド、オプシン（例えば、ロドプシンまたはプロテオロドプシン）、脂肪酸、ポリリン酸塩、グリコーゲン、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、クロロフィル、ジピコリン酸カルシウム（ＣａＤＰＡ）、ポリスルフィド、八硫黄（シクロオクタサルファ）、でんぷん、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）またはアデニンを含む広範な生体分子のいずれかから生じ得るが、これらに限定されない。シトクロムＣは、真核細胞のミトコンドリアに豊富に存在し、ラマン共鳴（ＲＲ）散乱のために５３２ｎｍのレーザーにより励起されると、７４７ｃｍ−１、１１２８ｃｍ−１、１３１１ｃｍ−１および１５８３ｃｍ−１でいくつかの強くて固有のラマンスペクトルを有する。さらに、光合成細菌のカロテノイドもまた、５３２ｎｍの励起波長でＲＲに起因する３つの非常に強い特徴的なバンドを示す。ｖ１バンドは、メチル振動モード（methyl rocking mode）であり、ｖ２およびｖ３バンドは、共役Ｃ＝Ｃ結合の異なる長さおよびＣ−Ｃ結合の伸張モード（stretching modes）により異なる。
【００５９】
５３２ｎｍでの励起時に微生物細胞で観察され得る典型的なラマン活性バンドの範囲を表１に列挙する。安定同位体プロービング（ＳＩＰ）と組み合わせると、そのようなバンドで観察されるシフトは、そのような細胞の生理機能および代謝に関する情報を明らかにするために用いることができる。従って、特定の同位体の取り込み時にこのようなラマンバンドで観察されるシフトも表１に示している。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
ラマン散乱の検出に続いて、標的領域が特定される。標的領域は、気化可能なコーティング材料でコーティングされ、かつそれに隣接して配置された少なくとも１つの細胞を有するスクリーニングチップの基板の第１の表面上の領域である。標的領域は、細胞またはその上に位置する細胞のラマンシグネチャーに基づいて特定されるはずであり：標的領域内の少なくとも１つの細胞は、対象の特性を示すラマンシグネチャーを有する細胞であるはずである。標的領域内の気化可能なコーティング材料の少なくとも一部に波長λ１のレーザー光線を照射することにより、標的領域内のコーティング材料を気化させることができ、それにより、スクリーニングチップから離れる方向、好ましくは収集チップに向かう方向に標的領域から１つまたは複数の細胞を飛び出させる。
【００６２】
標的領域は、典型的には、スクリーニングチップの平面に垂直な軸に沿って見たときに、断面が実質的に円形であり、約１μｍ〜約２μｍの直径を有していてもよい。しかしながら、標的領域内のコーティング材料が気化するときに、標的領域内に存在するコーティング材料がスクリーニングチップから離れて配置された細胞を射出するのに十分な量備えられているならば、標的領域は、所望により、その上に位置する任意の細胞よりも断面積がより小さくてもよく、また、所望により、その上に位置する任意の細胞または細胞集団よりも断面積が大きくてもよい。
【００６３】
多細胞生物またはいくつかの隣接する細胞の選択（採取）を組織試料または細胞培養物から単離することが望ましい実施形態では、例えば、標的領域は、前記多細胞生物または細胞集団をその周囲から選択的に単離するのに適したサイズおよび形状としてもよい。適切な試料の単離を成すために、当業者に知られているビーム成形技術を使用してもよく、例えば形状制御可能な焦点スポットアレイを使用して複数の細胞を射出することができる。リング状レーザービームを用いて、複数の細胞を単離することができるリング状の標的領域を画定するために使用してもよく、または、例えば、単一の大細胞を射出するためにさえ使用してもよい。適切なビーム成形技術の例が、Laser Beam Shaping Applications（Fred M. Dickey、Todd E. Lizotte、Scott C. Holswade、David L. Shealy CRC Press、2005)およびBeam Shaping for Advanced Laser Materials Processing（Keiji Fuse、Laser Technik Journal 12、p19-22、2015）に記載されている。ある好ましい実施形態では、適応ビーム成形技術、例えば、What spatial light modulators can do for optical microscopy（C. Maurer et al., Laser and Photonics Reviews 5, p81-101, 2011）に記載されている、顕微鏡対物系（microscope objective system）による適応ビーム成形を使用することができ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
波長λ１のレーザー光線による標的領域内のコーティング材料の照射は、選択的であるべきであり、すなわち、λ１のレーザー光線は、標的領域の外側のコーティング材料の任意の部分に直接照射すべきではない。これは、対象の特徴を有する細胞ではない細胞をスクリーニングチップから射出する確率を最小限に抑える。
【００６５】
２つ以上の標的領域が特定され、続いて波長λ１で照射して細胞を射出してもよい。例えば、スクリーニングチップが複数のウェルを有し、各ウェルが少なくとも１つの細胞を含み、ラマン散乱が、複数のそのようなウェルが少なくとも１つの対象となる細胞を含むことを示す場合、対象となる細胞を含む各ウェルに対応して標的領域を画定してもよい。このようにして、対象となる複数の細胞を射出して収集してもよい。
【００６６】
波長λ１のレーザー光線を細胞に直接照射することを避けるために（さもなければ細胞の損傷または破壊を引き起こす可能性がある）、波長λ１のレーザー光線がスクリーニングチップの基板の第２の表面に入射し、そして、第２の表面から第１の表面までの基板を透過し、ここでコーティング材料に入射するように、波長λ１の光線によるスクリーニングチップの照射は行われなければならない。これにより、細胞の射出が正しい方向に行われることを確実にするだけでなく、直接照射すると細胞に損傷を与える可能性のある波長λ１の光線による細胞への照射をも回避する。
【００６７】
波長λ２のレーザー光線による細胞の照射は、原理的には、ラマン散乱を生じさせ、十分なラマン散乱光が標的領域の特定を可能とするため収集できるように、任意の方向から細胞に入射する波長λ２の光線で行うことができる。従って、一実施形態において、波長λ２のレーザー光線は、波長λ２のレーザー光線がコーティング材料上に位置する細胞に直接照射するような進行方向を有することができる。
【００６８】
別の実施形態において、波長λ２のレーザー光線は、波長λ２のレーザー光線がスクリーニングチップの基板の第２の表面に入射し、そして、第２の表面から第１の表面へと基板を透過し、さらにその後、細胞に照射するためにコーティング材料を透過するような進行方向を有することができる。従って、この別の実施形態において、スクリーニングチップの基板およびラマン不活性コーティング材料は、波長λ２のレーザー光線に対して透明であることが要求される。上記の説明中、「透明」とは、基板およびコーティング材料が、細胞の照射またはラマン散乱の検出を妨げる程度まで波長λ２のレーザビームを減衰させないことを意味する。この透明であるということが、基材およびコーティング材料の材料の選択に課す制約のために、そのような実施形態はλ２＝λ１でなければあまり好ましくない。
【００６９】
従って、波長λ１およびλ２の光線の進行方向およびスクリーニングチップに対するレーザー光源の配置によって、細胞選別方法の２つの基本的な変形例（Ａ）および（Ｂ）が想定され得る：
（Ａ）細胞選別方法であり、
（ｉ）対向する第１および第２の表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部は波長λ１でのレーザー照射によって気化され得るラマン不活性コーティングでコーティングされたスクリーニングチップを準備するステップであって、前記基板は波長λ１でのレーザー照射に対して透明であり；さらに前記スクリーニングチップに複数の細胞を含め；
（ｉｉ）前記細胞に波長λ２のレーザー光線を照射し、前記照射された細胞からのラマン散乱を検出するステップであって、前記波長λ２のレーザー光線は、前記基板を通過することなく前記細胞に入射させ；
（ｉｉｉ）前記ラマン散乱に基づいて標的領域を特定するステップであって、前記標的領域は、前記コーティング材料でコーティングされた第１の表面の領域であり、それに隣接して位置する少なくとも１つの細胞を有し；
（ｉｖ）前記波長λ１のレーザー光線が前記基板の前記第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面に前記基板を透過して前記標的領域内の前記コーティング材料を選択的に照射するように、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射するステップであって、それによって前記標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させ、それに隣接して位置する少なくとも１つの細胞を射出させ；そして、
（ｖ）収集チップ上の少なくとも１つの射出された細胞を収集するステップと；を含み、
および、
（Ｂ）細胞選別方法であり、
（ｉ）対向する第１および第２の表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部は波長λ１でのレーザー照射によって気化され得るラマン不活性コーティングでコーティングされたスクリーニングチップを用意するステップであって、前記基板は波長λ１でのレーザー照射に対して透明であり；さらに前記スクリーニングチップに複数の細胞を含め；
（ｉｉ）前記細胞に波長λ２のレーザー光線を照射し、前記照射された細胞からのラマン散乱を検出するステップであり、前記波長λ２のレーザー光線は前記基板の第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面に前記基板を透過して前記標的領域内の前記コーティング材料を選択的に照射し、それによって前記標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させ、それに隣接して位置する少なくとも１つの細胞を射出させ；
（ｉｉｉ）前記ラマン散乱に基づいて標的領域を特定するステップであって、前記標的領域は、前記コーティング材料でコーティングされた第１の表面の領域であり、それに隣接して位置する少なくとも１つの細胞を有し；
（ｉｖ）前記波長λ１のレーザー光線が前記基板の前記第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面までの前記基板を透過して前記標的領域内の前記コーティング材料を選択的に照射するように、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射するステップであって、それによって前記標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させ、それに隣接して位置する少なくとも１つの細胞を射出させ；そして、
（ｖ）収集チップ上の少なくとも１つの射出された細胞を収集するステップと；を含む。
【００７０】
基板が波長λ１と波長λ２の両方の光線に対して透明である基板を必要とし、さらに、ラマン散乱の生成と検出を可能にするために波長λ２の光線に対して十分に透明なラマン不活性コーティングが必要であるので、変形例（Ｂ）はあまり好ましくない。これは、ラマン不活性コーティング材料とその厚さの選択を著しく制限するとともに、検出され得る任意のラマンシグナルの強度と品質を低下させる場合がある。
【００７１】
従って、変形例（Ａ）は強く好まれ、これは２つの基本態様（Ａ１）および（Ａ２）で実行することができる。態様（Ａ１）では、スクリーニングチップはｘｙ平面を画定し、波長λ１の光線は、ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射し、波長λ２の光線は、ｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射する。態様（Ａ２）では、スクリーニングチップはｘｙ平面を画定し、波長λ１の光線は、ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射し、波長λ２の光線は、ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射する。
【００７２】
ｘｙ平面と正と負のｚ座標が互いに画定されているので、態様（Ａ１）は、波長λ１の光線がｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射し、また、波長λ２の光線が、ｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射すると等価的に説明することができる。同様に、態様（Ａ２）は、波長λ１の光線がｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射し、また、波長λ２の光線が、ｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射すると等価的に説明することができる。しかし、態様（Ａ１）では、波長λ２の光線および波長λ１の光線が、逆符号を有するｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するのに対し、態様（Ａ２）では、波長λ２の光線および波長λ１の光線は、同じ符号を有するｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射することが重要である。
【００７３】
スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面は、床または加工物の表面に対して実質的に平行（例えば、平行）とすることができ、従って、正および負のｚ方向は、それぞれ「上」および「下」、または「下」および「上」に実質的に対応する（対応する）。しかし、これは本質的ではなく、本明細書に記載された方法は、原則として、床、加工物の表面または他の「実世界」の基準点に対して任意の空間的定位を有するスクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面で実行することができる。
【００７４】
従って、態様（Ａ２）において、波長λ２の光線が基板を通過しないという要件と、波長λ１の光線が基板を通過するという要件とが、波長λ１の光線と波長λ２の光線の両方がｚ軸に沿った同じ方向からスクリーニングチップに入射するという事実と両立できることを保証するために、スクリーニングチップは、ステップ（ｉｉ）と（ｉｖ）との間で反転する（「裏返す」）必要がある。態様（Ａ１）では、スクリーニングチップを裏返す必要性は、波長λ１の光線および波長λ２の光線がｚ軸に沿って反対方向からスクリーニングチップに入射するという事実により回避される。
【００７５】
態様（Ａ１）は、スクリーニングチップの操作を少なくすることができるため、細胞選別方法の自動化が容易になるので好ましい。態様（Ａ２）では、スクリーニングチップを反転させるための処置の必要性は、全体的なプロセスを遅くするだけでなく、効果的な細胞の射出を妨げる位置合わせ誤差をもたらすことにつながる可能性がある。スクリーニングチップを裏返した後（その後、波長λ１のレーザー光線で標的領域を選択的に照射する）は、スクリーニングチップを裏返さない場合よりも標的領域を再度発見することがより困難となり得る。スクリーニングチップを裏返す必要がある場合、これは、いくつかの実施形態では、裏返した後の標的領域を視覚的に特定できるように、より薄いラマン不活性コーティング層（例えば、２５ｎｍ以下の厚さのＡｌ層）の使用も必要とする可能性がある。これらの理由から、態様（Ａ２）はあまり好ましくない。
【００７６】
飛ばした（射出した）一つの細胞または複数の細胞を収集した後、その飛ばした細胞を培養し、および／または当業者に公知の方法に従って全ゲノム増幅および／またはＤＮＡ配列決定などのさらなる研究に供してもよい。望ましくは、このような方法は、細胞分解または汚染の危険性を最小限に抑えるために収集チップ上で実施してもよい。全ゲノム増幅および／またはＤＮＡ配列決定が意図される場合、回収チップは滅菌されており、如何なるＤＮＡまたはＲＮＡも（単離された細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ以外のもの）、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅも含まないものでなければならない。
【００７７】
飛ばした細胞が収集チップ上に収集されるためには、収集チップは時間ステップ（ｉｖ）が実施されるまで存在しなければならない。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、収集チップが所定の収集位置に配置された状態で実施される。別の実施形態において、収集チップは、ステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｖ）との間、すなわち、ステップ（ｉｉ）の後であるが、ステップ（ｉｖ）の前に、例えば、ステップ（ｉｉ）の後またはステップ（ｉｉｉ）の後に配置される。従って、そのような実施形態では、本発明の細胞選別方法は、収集チップを配置するステップ（ｉｉ（ａ））またはステップ（ｉｉｉ（ａ））をさらに含む。
【００７８】
本発明の方法の変形例（Ａ）（態様（Ａ１）および（Ａ２）を含む）において、ステップ（ｉｉ）が収集チップを既に所定の収集位置に配置した状態で行っているのであれば、これは、収集チップ基板の材料が、波長λ２の光線を細胞に透過させ、ラマン散乱を検出できるように、波長λ２の光線に対して透明であるように選択されなければならないことを意味する。従って、好ましくは、本発明の方法の変形例（Ａ）（態様（Ａ１）および（Ａ２）を含む）において、ステップ（ｉｉ）は、収集チップを収集位置に配置しない状態で行い、代わりにステップ（ｉｖ）の前、すなわちステップ（ｉｉ（ａ））またはステップ（ｉｉｉ（ａ））で収集チップが配置される。これにより、収集チップの基板の材料のより広い選択が可能になり、潜在的には全体のプロセスが減速するという犠牲を払わなければならないが、ステップ（ｉｉ）におけるラマン散乱の検出に干渉する可能性のあるソースを排除できる。
【００７９】
変形例（Ａ２）では、ステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間で、例えばステップ（ｉｉ）の後またはステップ（ｉｉｉ）の後に、スクリーニングチップを「裏返しする」（反転させる）ことが必要である。ステップ（ｉｉ）が収集チップを所定の収集位置に配置した状態で行われる場合、収集チップもまた、スクリーニングチップと共に反転する必要がある。収集チップがステップ（ｉｉ（ａ））またはステップ（ｉｉｉ（ａ））で配置される場合、収集チップの配置はスクリーニングチップを反転させる前または後のいずれで行ってもよい。ステップ（ｉｉ（ａ））またはステップ（ｉｉｉ（ａ））がスクリーニングチップを反転させる前に行われるのであれば、収集チップはその後でスクリーニングチップとともに反転する必要がある。
【００８０】
本発明の方法の変形例（Ｂ）は、ステップ（ｉｉ）に間に合うように細胞収集チップが所定の収集位置に配置した状態で行ってもよく、またはステップ（ｉｉ（ａ））またはステップ（ｉｉｉ（ａ））で細胞収集チップを配置して行ってもよい。本発明の方法の変形例（Ｂ）では、波長λ２の光線は、任意の点で収集チップを通過する必要がないので、変形例（Ｂ）は、収集チップの基板の材料が波長λ２の光線に対して透明であることを必要とすることなく、細胞収集チップを所定の収集位置に配置した状態で行うことができる。
【００８１】
従って、本発明の更なる態様では、細胞選別装置が提供され、前記装置は：
スクリーニングチップを含み、前記スクリーニングチップは、対向する第１および第２表面を有する基板を含み、前記第１の表面の少なくとも一部は波長λ１でのレーザー照射によって気化可能であるラマン不活性コーティング材料でコーティングされており、また、前記基板は波長λ１でのレーザー照射に対して透明であり；
前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する照射部と；
前記スクリーニングチップ上の試料からのラマン散乱を検出する検出部と；
前記波長λ１のレーザー光線が前記基板の第２の表面に入射し、前記第２の表面から前記第１の表面に前記基板を透過してその標的領域内の前記コーティング材料を選択的に照射し、それにより、標的領域内のコーティング材料の少なくとも一部を気化させるように、前記波長λ１のレーザー光線を前記スクリーニングチップに照射する照射部と、を含む。
【００８２】
スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線を発生するレーザー源と、任意に、前記レーザー源からのレーザービームを所望のサイズ、形状および方向に集光、整形および／または誘導するための少なくとも１つの対物レンズ（例えば、レンズおよび／またはミラー）と、を含む。スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、便宜的に、「λ２照射部」と呼ぶこともできる。
【００８３】
スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線を発生するレーザー源と、任意に、前記レーザー源からのレーザービームを所望のサイズ、形状および方向に集光、整形および／または誘導するための少なくとも１つの対物レンズ（例えば、レンズおよび／またはミラー）と、を含む。スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、便宜的に、「λ１照射部」と呼ぶこともできる。
【００８４】
試料からのラマン散乱を検出する前記検出部は、例えば、散乱光をスペクトル成分に分解することができる回折または分散型分光計であってよく、ラマンスペクトル指標（Raman spectral signature）を識別するために、波長または周波数に応じて１つ以上のスペクトル成分の強度を検出することができる。
【００８５】
ある実施形態において、スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部と、ラマン散乱を検出する前記検出部とは、共焦点ラマン顕微鏡のような従来のラマン顕微鏡の構成要素であってもよい。
【００８６】
ある実施形態において、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部と、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部とは、同一の照射部であってもよい。
【００８７】
ある実施形態において、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置されてもよい。
【００８８】
ある実施形態において、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置されてもよい。
【００８９】
ある実施形態において、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置されてもよい。
【００９０】
ある実施形態において、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置されてもよい。
【００９１】
従って、前記照射部の配置は、細胞選別装置が、本発明の細胞選別方法の変形例（Ａ）の態様（Ａ１）；変形例（Ａ）の態様（Ａ２）；または変形例（Ｂ）のいずれを行うかによって変更することができる。
【００９２】
細胞選別装置が変形例（Ａ）の態様（Ａ１）を行うように構成されている場合、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置される。あるいは、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置される。
【００９３】
細胞選別装置が変形例（Ａ）の態様（Ａ２）を行うように構成されている場合、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置される。あるいは、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置される。
【００９４】
細胞選別装置が変形例（Ｂ）を行うように構成されている場合、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置される。あるいは、前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ１のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置され、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部は、波長λ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように配置される。
【００９５】
従って、本発明の方法の変形例（Ａ２）を実施するための装置は、本発明の方法の変形例（Ｂ）を実施するための装置の照射部と同じ配置とすることができる。従って、変形例（Ａ２）を実施するための装置と変形例（Ｂ）を実施するための装置との間の違いは、いずれかの方法の変形を行うのに適したスクリーニングチップおよび／または収集チップの性質にあるだけである。あるいは、変形例（Ｂ）および変形例（Ａ２）を実施するために使用されるスクリーニングチップおよび／または収集チップは同一とすることができ（上記のλ１およびλ２に関する透明性の必要要件を満たすことを条件として）、装置は実質的に同一（例えば、同一）とすることができる。そのような実施形態において、変形例（Ａ２）と変形例（Ｂ）との間の違いは、方法の変形例（Ａ２）を実施しながらスクリーニングチップを反転させている（裏返している）のに対して、変形例（Ｂ）は如何なるスクリーニングチップの反転も省略していることから生じる。
【００９６】
スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部と、スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部とは、
（ｉ）両方の波長λ１およびλ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して正のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように、
または、
（ｉｉ）両方の波長λ１およびλ２のレーザー光線が、スクリーニングチップによって画定されるｘｙ平面に対して負のｚ座標を有する位置からスクリーニングチップに入射するように、のいずれかに構成され、
さらにまた、ある実施形態において、スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部と、スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部とは、同一の照射部とすることができ、または、それらは共通の対物レンズ（例えば、両方の照射部に共通のレンズまたはミラー）を共有する別個の照射部とすることができる。
【００９７】
ある実施形態において、スクリーニングチップと、前記スクリーニングチップに波長λ２のレーザー光線を照射する前記照射部および／または前記スクリーニングチップに波長λ１のレーザー光線を照射する前記照射部は、互いに相対的に移動可能とすることができる。特に、スクリーニングチップおよび／または一方あるいは両方の照射部は、チップ上の所望の位置が、λ１照射部および／またはλ２照射部から照射されるレーザー光線と合致するように持ってくることができるように、チップによって画定されるｘｙ平面内で、またはチップによって画定されるｘｙ平面と平行な面で移動させることができる。所望により、スクリーニングチップおよび／または一方または両方の照射部は、λ１および／またはλ２の光線の焦点および／またはビーム形状を最適化するために、チップによって画定されるｘｙ平面に垂直なｚ方向に直線移動可能にすることができる。ある実施形態において、スクリーニングチップは、ｘｙ直線移動ステージまたはｘｙｚ直線移動ステージ上に搭載される。好ましくは、そのようなｘｙ直線移動ステージまたはｘｙｚ直線移動ステージは、約０．１μｍ／ステップ以下の最小ステップサイズを有するべきである。ある実施形態において、直線移動ステージは、モータまたはサーボなどの機械的移動手段に接続される。ある実施形態において、直線移動ステージは手動で移動可能である。
【００９８】
本発明の細胞選別方法を実施するには、少なくとも１つの標的領域を特定して選択的に照射する必要がある。いくつかの実施形態では、目視で標的領域の位置を見つけて、手動でこの標的領域に波長λ１の光線のレーザー源の位置を合わせることが可能であるが、これは常に実現可能であるとは限らず、必要とするターゲッティング精度を達成するための比較的遅くて不正確な方法であってもよい。標的領域を識別し、これに波長λ１の光線をこれに選択的に照射するためには、標的領域の位置を見つけることができるように座標系を設定することが好ましい。これは、例えば、本明細書に記載の変形例（Ａ）の態様（Ａ２）により細胞選択方法を実施しながらスクリーニングチップが裏返しされる場合、および／または複数の標的領域がスクリーニングチップ上の異なる位置で特定される（例えば、それぞれの標的領域が対象となる単一の細胞に対応する）場合に、特に重要である。
【００９９】
スクリーニングチップがｘｙ平面を画定する場合、例えば、座標系を確立することができる。その際、スクリーニングチップ上の任意の点を点（０，０）として画定してもよい。そうすると、スクリーニングチップの平面内の任意の点（細胞および／またはウェルなど）が画定した（０，０）に関するｘｙ座標を有する。点（０，０）は、必要に応じて、基準マークまたは特定のウェルまたは特定の細胞などの容易に識別可能な特徴であってもよいが、それは顕著な特徴のない単なる任意の場所であってもよい。
【０１００】
従って、好ましくは、本発明の細胞選別装置は、サンプリングチップのｘｙ座標および／またはサンプリングチップに対するλ１照射部および／またはλ２照射部のｘｙ座標を記録するためのソフトウェアがロードされたコンピュータをさらに備える。この実施形態では、サンプリングチップ、ｘｙまたはｘｙｚ直線移動ステージ、および／またはλ１照射部および／またはλ２照射部は、好ましくは、ｘｙ座標を定義し、前記ｘｙ座標に関する情報をコンピュータに送信する位置記録手段に接続される。特に好ましくは、ｘｙ直線移動ステージまたはｘｙｚ直線移動ステージおよび／またはλ１照射部および／またはλ２照射部は、ｘｙ直線移動ステージまたはｘｙｚ直線移動ステージおよび／またはλ１照射部および／またはλ２照射部をコンピュータから指示を受けると所望のｘｙ座標に移動させるための駆動手段（例えば、押し込み手段、モータまたはサーボ）と接続されている。例えば、点（０，０）がｘｙ平面に画定されると、コンピュータソフトウェアは、対象となる細胞が検出されたことを示すラマン散乱が存在する位置に対応するサンプリングチップまたはλ２照射部のｘｙ座標を記録することができる。さらに、コンピュータから指示を受けると、サンプリングチップを移動させてλ１照射部にそのｘｙ座標を位置合わせすることができ、またはλ１照射部を移動させてそのｘｙ座標にλ１照射部を位置合わせすることができる。このようにして、コンピュータソフトウェアは、標的領域が波長λ１のレーザー光線で選択的に照射されることを確実にするために標的領域を識別し、その後、標的領域をλ１照射部と位置合わせするステップを少なくとも一部自動化する。
【０１０１】
サンプリングチップとλ１照射部および／またはλ２照射部の位置合わせを自動化するため、必要に応じて、ｘｙ座標を記録するためにＬａｂｓｐｅｃ６（ホリバサイエンティフィック社製）などの市販のソフトウェアを使用してもよい。
【０１０２】
本発明の方法における使用に適した細胞選別方法、装置およびスクリーニングチップは、対象となる細胞の同定ひいては標的領域の特定のためラマン分光法の使用に基づいて本明細書に記載されているが、原理的には、対象となる細胞の同定のために他の方法を用いてもよい。例えば、対象となる細胞が特に視覚的に特徴的（例えば、形状、大きさ、色、または拡大レンズを通して見た場合に目に見える他の物理的特徴によって）である場合、対象となる細胞を同定するためラマン分光法の代わりに光学顕微鏡法を用いてもよい。そのような場合、スクリーニングチップのコーティング材料はラマン不活性である必要はなく、原理的には、スクリーニングチップから対象となる細胞を飛びださせるために、波長λ１のレーザー光線によって気化され得る任意のコーティング材料を使用してもよい。あるいは、対象となる細胞が蛍光色素分子を有する場合（これらが天然に存在する蛍光色素分子として存在するか、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いた蛍光標識によって存在するかに関わりなく）、対象となる細胞の同定のためラマン分析法の代わりに蛍光測定を用いてもよい。そのような場合、スクリーニングチップのコーティング材料は、ラマン不活性である必要はないが、波長λ２のレーザー照射のもとで蛍光を発するべきではなく、そのような実施形態におけるλ２は、対象となる一つの細胞または複数の細胞における蛍光を励起する波長になるように選択される。非蛍光コーティング材料はまた、スクリーニングチップから対象となる細胞を射出させるために、波長λ１のレーザー光線によって気化可能であるべきである。
【０１０３】
添付の図面を参照して、１つ以上の非限定的な実施例を説明する：
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】（ａ）は、本明細書に記載のスクリーニングチップの一例を示している。第１の層（基板）は、λ１に対して透明な任意の材料、例えばガラスであってもよい。第２の層（コーティング）は、λ１によって気化することができるものであり、例えば、２５ｎｍのアルミニウムである。コーティングは、より多くの機能性を提供するために複数の層、例えば、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）の層の上にＡｌを含むこともできる。第３の層、例えば、ＰＤＭＳは、ウェル、例えば、ウェル層／細胞保持層／試料層を導入するために存在していてもよい。一つのウェルが図示されているが、チップは複数のウェルを含んでいてもよい。（ｂ）は、本明細書に記載の収集チップの一例を示している。基板はガラスであってもよい。第２の層、例えば、ＰＤＭＳは、ウェル、例えば、ウェル層／細胞保持層／試料層を導入するために存在していてもよい。一つのウェルが図示されているが、チップは複数のウェルを含んでいてもよい。
【図２】収集チップ（Ａ、ＢおよびＣ）の代替デザインの例を示している。
【図３】スクリーニングチップと収集チップを組み合わせた一例を示している。右側の図はスクリーニングチップ（下）と収集チップ（上）の直径と深さの例を示している。
【図４】スクリーニングステップの一例を図示しており、（ａ）は上からの図であり、（ｂ）は下からの図である。
【図５】細胞射出の一例を図示している。スクリーニングチップおよび収集チップは、それらのウェル層を介して取り付けられて示されている。５３２ｎｍのパルスレーザーが図示されているが、他の波長が使用されてもよい。パルスレーザーがラマン取得スクリーニングステップで使用されるのと同じ対物レンズを通過する場合、チップは射出／収集ステップのために裏返すことができる。
【図６】２つの対物レンズを用いた（ａ）細胞同定プロセス、（ｂ）細胞射出プロセスのＲＡＣＥシステムの動作原理の一例を図示している。ラマン分光計は、（ａ）の細胞を同定するために使用される。細胞が同定されると、それらは（ｂ）において射出される準備が整う。この構成は２つの独立した対物レンズを使用するため、プロセス中にチップを裏返す必要はない。
【図７】（ａ）ＲＡＣＥアドオンモジュールの光学レイアウト；（ｂ）プッシャー付チップホルダーの設計の一例を図示している。ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３は回転ミラー、ＲＬは中継レンズ、ＢＥはビーム拡大器である。これらは、本発明における使用のために既存の分光計を適合させるために使用される。
【図８】ラマン活性化単一細胞射出の代表的な説明を図示している。（Ａ）ＲＡＣＥチップ上の細胞の顕微鏡画像である。（Ｂ）連続レーザーは単一細胞ラマンスペクトルを取得するために使用される。（Ｃ）１つの単一細胞（上部トレース）および２５ｎｍのアルミニウムコーティングのバックグラウンド（下部トレース）のスペクトルである。（Ｄ）ＲＡＣＥチップを裏返し、標的細胞をパルスレーザーにより収集器に射出する。
【図９】パルスレーザーを印加する前後の海水試料を保持するＲＡＣＥチップ（上段横列）および収集器（下段横列）の顕微鏡画像を示している。（Ａ）パルスレーザーは細胞のない位置に焦点を合わせた。（Ｂ）パルスレーザーは細胞に焦点を合わせた。
【図１０Ａ】紅海の試料におけるいくつかの典型的な細菌の単一細胞ラマンスペクトルである（トレース（上から下に）：蛍光性を示す細胞；未知の化合物を含有する細胞；ＰＨＢを含有する細胞；典型的な細菌細胞）。
【図１０Ｂ】射出された細胞の４つの群のラマンスペクトルである。各群は、同じカロテノイドスペクトル（トレース（上から下に）：シアノバクテリア属Ｇ６１０−８（Cyanobacteria spp G610-8）；シゲラ属（赤痢菌属）Ｓ７０９−６（Shigella spp S709-6）；ペロモナス属Ｐ６１０−５（Pelomonas spp P610-5）；ペロモナス属Ｐ７０９−１１（Pelomonas spp P709-11））を有する３〜８個の細胞を含む。
【図１０Ｃ】射出された個々の細胞の３つの群のラマンスペクトルである（トレース（上から下に）：ペロモナス属Ｐ７２８−５（Pelomonas spp P728-5）；ブラディリゾビウム属Ｂ７２８−３（Bradyrhizobium spp B728-3）；ハロモナス属Ｈ８０８−５（Halomonas spp H808-5））。カロテノイドｖ１、ｖ２およびｖ３バンドの位置がラベルされている。
【図１１】細菌のカロテノイド合成経路に関し、紅海の水から同定された遺伝子を示している。射出された細胞に存在するタンパク質には下線が引かれている。ＩＤＩ：イソペンテニル二リン酸異性化酵素（isopentenyl diphosphate isomerase）（またはＩＰＩ、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素（isopentenlypyrophosphate isomerase））；ＩｓｐＡ：ファルネシル二リン酸合成酵素（farnesyl diphosphate synthase）；ＣｒｔＥ：ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase）；ＣｒｔＢ：フィトエン合成酵素（phytoene synthase）；ＣｒｔＩ：フィトエン不飽和化酵素（脱水素酵素）（phytoene desaturase (dehydrogenase)）；ＣｒｔＣ：ヒドロキシニューロスポレン合成酵素（hydroxyneurosporene synthase）；ＣｒｔＤ：メトキシニューロスポレン脱水素酵素（methoxyneurosporene dehydrogenase）；ＣｒｔＦ：ヒドロキシニューロスポレンメトキシ化酵素（hydroxyneurosporene-O-methyltransferase）；ＣｒｔＹ：リコペン環化酵素（lycopene cyclase）；ＣｒｔＺ：カロテン水酸化酵素（carotene hydroxylase）；ＰＭＤ：ホスホメバロン酸脱炭酸酵素（phosphomevalonate decarboxylase）。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明の非限定的な代表的な実施形態では、緑色レーザーを用いた市販の分光器（図６（ａ）参照）によって対象となる細胞を同定する。その後、ＤＮＡ増幅のため、第２の対物レンズを用いて底からパルス緑色レーザーにより標的細胞を射出させる必要がある（図６（ｂ））。これは、本明細書に記載の方法（Ａ）の変形例（Ａ１）による方法に相当する。既存の分光器を使用してＲＡＣＥを具現するために、ＲＡＣＥアドオンモジュールが開発されている。光学セットアップを図７（ａ）に示す。ＲＡＣＥモジュールの入力部に向けて緑色レーザーを偏向させるため、４５度回転ミラー（ＴＭ１）が分光器の対物レンズタレットに取り付けられている。ＲＡＣＳアドオン内では、模造の正立顕微鏡（dummy upright microscope）が、第２の４５度回転ミラー（ＴＭ２）、対物レンズタレット、対物レンズ（対物レンズ１）およびチップホルダーを使用して機能する。特定のシステム、例えば、無限遠補正光学系では、対物レンズとチューブレンズの間の距離を変更することができる。分光器の対物レンズ後焦点面とＲＡＣＥアドオンの対物レンズ後焦点面を共役させるために、リレーレンズ（ＲＬ）をＴＭ１とＴＭ２の間で使用することができる。チップホルダー（図６（ｂ））は、試料スライドを指定された位置に配置するプッシュ方式で設計することができる。この設計は、試料スライド上の標的細胞に対して繰り返し可能な位置合わせを提供することができる。このスライドホルダーは、既存の分光器の電動スキャニングステージに取り付けることができ、または別体の電動スキャニングステージに取り付けることもできる。緑色パルスレーザーは、底部から標的細胞を射出するために使用される。ビーム拡大器（ＢＥ）はパルスレーザーの後に用いられ、射出対物レンズ（対物レンズ２）の背面開口部を満たすようにビームサイズを完全な開口数（ＮＡ）の適用を達成するまで拡大する。これは、細胞を単離するためのレーザー誘起前方転写（ＬＩＦＴ）を生じさせる。射出対物レンズまたは高ＮＡレンズに向けて直立にビームを偏向するため、４５度回転ミラー（ＴＭ３）が用いられている。上記のように、前記ＲＡＣＥモジュールは、単一細胞の単離およびその後の単一細胞ゲノミクスを達成するため、改変された一般的な顕微鏡（例えば、形態に基づいて細胞を選別する）および蛍光顕微鏡（例えば、蛍光標識細胞に基づいて細胞を選別する）に適用することもできる。
【０１０６】
上記の説明は、非限定的な例に関するものであることが理解され、また、種々の変更および改変が本開示の範囲から逸脱することなく、示された配置から創作することができ、それらは添付の特許請求の範囲に記載されたものである。
【実施例】
【０１０７】
本開示は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される：
【０１０８】
実施例１−チップの作製
Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ａｌ、ＡｕおよびＡｇを含む薄層コーティング材料の様々な厚さを有するスライドをウェルセンズバイオテック社（Wellsens Biotech；北京、中国）から試験用に購入した。透明性を確保するため、金属層コーティングは１００ｎｍ未満であった。
【０１０９】
単一細胞ゲノミクス用に設計されたサンプリングおよび収集ＲＡＣＥチップの例を図３に示す。収集ＲＡＣＥチップを作製するために、２つの同心円をなすウェルからなる多層ＰＤＭＳを作製した。ＰＤＭＳ層（厚さ３ｍｍ）は、容器中のシラン処理されたウェハ上に１０：１（ｗ／ｗ）の割合のＰＤＭＳ溶剤と硬化剤（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、ダウ・コーニング社）との混合物を注ぎ、続いて６５℃で一晩硬化させることによって作製した。次いで、ＰＤＭＳ層の中に小さなウェル（直径３．５ｍｍ）を打刻した（図３）。第２のＰＤＭＳ層（厚さ０．５ｍｍ）は、ＰＤＭＳプレポリマーをシラン処理したウェハ上で２００ｒｐｍで３０秒間回転させ、その後６５℃で１時間硬化させることによって作製した（図３）。２つのＰＤＭＳ層を酸素プラズマ処理を用いて一緒に結合させ、次に厚さ０．５ｍｍのＰＤＭＳ層に２ｍｍの直径の穴を３．５ｍｍの穴に同心円状となるように打ち抜いた（図３）。結果として得られたＰＤＭＳウェルブロックは、酸素プラズマ処理を用いてカバースリップ上に不可逆的に結合した。サンプリングＲＡＣＥチップを作製するために、薄層コーティングスライド上に、直径１ｍｍのウェルを有する単層で０．５ｍｍ厚のＰＤＭＳウェルを同様の方法で製造した（図３）。
【０１１０】
ＲＡＣＥを具現するために、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＯＬ（ポリエステル）、ＴｉＯ２／Ｔｉ（７５ｎｍ）、インジウムスズ酸化物（１０ｎｍ）、Ａｕ（１０ｎｍ）、Ａｌ（１０ｎｍ、２５ｎｍ、５０ｎｍおよび１００ｎｍ）を含む各種コーティング材を検討した。５３２ｎｍのパルスレーザー（０．９５ナノ秒半値全幅（０．９５  ｎｓ  ＦＷＨＭ）、Ｅｍａｘ＝４．３μＪ、反復率＝０．１〜１６．６ｋＨｚ）は、薄いＰＥＮ、ＰＥＴ、ＰＯＬ、ＴｉＯ２／Ｔｉ（７５ｎｍ）、Ａｕ（１０ｎｍ）およびＡｌ（１０ｎｍおよび２５ｎｍ）を被覆したスライド上で単一細胞の射出を達成することが分かった。２５ｎｍの厚さのＡｌが、最小のラマンバックグラウンドシグナルで良好な品質のＳＣＲＳになるという結果になった（図８Ｃ）。
【０１１１】
本明細書で論じるように、この実施例および図３に具体的に示されているものを超えて、他の層の厚さおよび穴の直径とすることも可能である。
【０１１２】
実施例２−ラマンバックグラウンドの評価
低ラマンバックグラウンドは、ラマンスペクトルの重要な要素である。この実験は、ＲＡＣＥアドオンモジュール（例えば、図７に示すもの）が余分なラマンバックグラウンドを生じさせるか否かをチェックするために用いられた。２枚のＴｈｏｒｌａｂｓ８０ｍｍレンズ（ＡＣ２５４−０８０−Ａ）を中継レンズとして使用したバックグラウンドデータが記録された。このバックグラウンドシグナルは、試料が取り付けられておらず、４０倍の対物レンズの後の黒色のシートのみであるので、反射およびレンズ材料の両者からのものであった。ラマンバックグラウンドがレンズ材料からのものであるかどうかを調べるために、エドモンドレンズで同じ実験を試み、同様の結果が得られた。中継レンズを取り除くと、バックグラウンドシグナルはほとんど見られなかった（中継レンズで９００のピークカウントであるのと比較してピークで１００カウントだけであった）。５３２ｎｍ励起のラマンバックグラウンドシグナルによれば、２つのピークシグナルが５８０ｎｍおよび６１０ｎｍにある。これらの２つのピークはレーザー自体から確認することができる。ラマン分光計からの全出力と５秒の捕捉時間が使用されたため、このラマンバックグラウンドは依然として許容範囲にあり、分光器内のレンズと発光フィルターの選択を通じて改善することが可能である。
【０１１３】
実施例３−射出レーザー出力およびビームサイズ
５３２ｎｍのパルスレーザー（ＣｒｙＬａｓ  ＤＰＳＳ  ２０μＪ＠１ｋＨｚ、１．３ナノ秒パルス幅（１．３ｎｓ  ｐｕｌｓｅ  ｗｉｄｔｈ））を用いて、スクリーニングチップの底から標的細胞を射出させた。このレーザーを用いてレーザー誘起前方転写（ＬＩＦＴ）を生じさせる最小出力は２００ｐＪであり、このレーザーを用いて許容可能なスポットの範囲でＬＩＦＴを生じさせる最大出力は２μＪであった。
【０１１４】
実施例４−細胞射出
２μＪ＠１ｋＨｚのレーザー出力を印加して、図７に示す構成を用いて細胞を５００μｍ垂直に射出させた。射出プロセスを実施するために、４０ｘ／０．４ＮＡ対物レンズが使用された。オリンパス社製ＬＭＰＬＦＬＮ  ５０Ｘ／０．５ＮＡと比較して、同様の結果が得られた。この実験は、このＲＡＣＥモジュールが単一細胞の射出に使用できることを証明している。
【０１１５】
実施例５−スクリーニング−共焦点ラマンマイクロ分光法およびスペクトル処理
使用したすべての化学薬品は、特に明記しない限り、シグマ−アルドリッチ社（ドーセット州、英国）から購入した。ｐ１８ＧＦＰを含む大腸菌ＪＭ１０９（プロメガ社、英国）を、１００μｇ／Ｌアンピシリンを添加したＬＢ液体培地中で３７℃でインキュベートした。
【０１１６】
ラマンマイクロ分光法で分析する前に、濃縮された紅海の水の試料（イスラエルのエイラートにある海洋科学大学共同利用研究所（Inter-University Institute for Marine Sciences（ＩＵＩ）の桟橋から採取）中の細胞を脱イオン水で洗浄した。各細胞懸濁液（１μｌ）を図３のＲＡＣＥチップに設計されたミニウェル内に載せ、ラマン分析の前に空気乾燥させた。
【０１１７】
連続した５３２ｎｍレーザーを用いたラマンマイクロ分光法により細胞を調べた（図８Ｂ）。ＳＣＲＳを細胞の表現型を識別するための選別基準として使用し、標的細胞の位置を記録した（図８Ｃ）。
【０１１８】
一体型顕微鏡（ＢＸ４１、オリンポス社）を備えた共焦点ラマン顕微鏡（ＬａｂＲＡＭ  ＨＲ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、ホリバサイエンティフィック社、ロンドン、英国）を用いてラマンスペクトルを取得した。５０倍の拡大乾式対物レンズ（ＭＰＬＦＬＮ、ＮＡ  ０．８、オリンポス社、エセックス州、英国）を使用して観察し、単一細胞からラマンシグナルを取得した。レーザービームの位置をソフトウェアＬａｂｓｐｅｃ６（ホリバサイエンティフィック社、ロンドン、英国）によって較正し、マークした。細胞は、一体型カラーカメラおよび電動ＸＹＺステージ（０．１μｍステップ）によって視覚化された。ラマン散乱は、５３２ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｖｅｎｔｕｓ、レーザーカンタム社、マンチェスター、英国）で励起した。回折格子６００ ｌ／ｍｍをラマン測定に使用した結果、約１ｃｍ−１のスペクトル分解能と１０１９のデータポイントが得られた。単一細胞のレーザー出力は約０．５ｍＷであった。検出器は、−７０℃の空冷式電荷結合素子検出器（アンドール社、ベルファスト、英国）であった。このシステムは、１００μｍの共焦点ピンホール径で実行され、〜１μｍの空間分解能が得られるようにした。ＬａｂＳｐｅｃ６ソフトウェアを使用してラマンシステムを制御し、ラマンスペクトルを取得した。単一細胞を測定するためのラマンスペクトルの捕捉時間は５秒であった。紅海の試料からそれぞれ測定された細胞の空間的位置をＬａｂｓｐｅｃ６（ラマン分光計のオペレーティングソフトウェア）で記録し、その後の単一細胞射出のために細胞を同定するために使用した。
【０１１９】
Ｌａｂｓｐｅｃ６はスペクトルが得られる各スポットの座標を記録する。スライド上の参照点が見つけられ、Ｌａｂｓｐｅｃ６で（０，０）に設定されるため、測定されたすべての細胞は、（０，０）に対する座標を有することになる。サンプリングステージの正確な動きを記録できる他のソフトウェアも使用することができる。例えば、実験条件（０．１μｍ／ステップ）を満たす最小のステップサイズを有する任意のＸＹＺ直線移動ステージを用いて、細胞の位置を特定することができる。プログラマブルソフトウェアを使用してステージを駆動し、対応する位置を記録する。あるいは、細胞は、単に細胞の画像を撮り、次いで、その画像から細胞を見つけることによって位置を特定することができる。
【０１２０】
このように、ＳＣＲＳが細胞の表現型プロファイル（この場合、細胞中のカロテノイドの存在）を識別するための基準として用いられ、標的細胞の位置が記録される（図８Ｃ）。
【０１２１】
実施例６−収集−ラマンマイクロ分光器への単一細胞射出の統合
実施例５のスクリーニングステップの後、ＲＡＣＥサンプリングチップを裏返し、対象となる単一細胞を５３２ｎｍパルスレーザーを用いて射出し、ＲＡＣＥ収集チップ（すなわち、本発明による収集チップ、図８Ｄおよび図３）で収集した。この研究では、パルスレーザーを導くために連続的な５３２ｎｍレーザー光路が使用されたので、Ａｌで被覆されたスライド（スクリーニングチップ）は細胞射出のためにスライドを裏返した後に位置の特定および視覚化を可能とするため５３２ｎｍに対して透明とした（図８Ｄ）。しかし、図６に示すような設計では、サンプリングチップの下にパルスレーザを配置しているので、この透明性を必要としない。
【０１２２】
５３２ｎｍのパルスレーザー（アルファラス有限会社、ゲッティンゲン、独国）を共焦点ラマン顕微鏡に統合し、ミラーとフィルターを変更せずにＳＣＲＳ測定用の同じ連続レーザー（５３２ｎｍ）光路と対物レンズを共有した（図８）。ピーク出力は１．１ｋＷであり、従来のＵＶマイクロダイセクションレーザーより約２等級低かった。露光試験では、このＬａｂＲＡＭ  ＨＲ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎラマン顕微鏡で、５３２ｎｍパルスレーザーが実際にミラーとエッジフィルターにダメージを与えないことが示された。
【０１２３】
すべての装置および作業面を１０％（ｖ／ｖ）の家庭用漂白剤（ドメスト、英国）で拭いた。すべての消耗品をオートクレーブし、ＵＶ滅菌済みの層流キャビネット内でＵＶ電球（２５４ｎｍ）に１時間暴露した。試薬を慎重に滅菌した。
【０１２４】
１μｌの溶解緩衝液（５００μｌのＳＣＧ等級水および４５．５μｌの１Ｍ  ＤＴＴを緩衝液ＤＬＢ（単一細胞キット、キアゲン社、英国）に添加し、ＵＶ滅菌済みエッペンドルフチューブに等分した）および１μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液およびＤＭＳＯ：Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８）緩衝液およびＤＭＳＯを０．２μｍフィルターでろ過し、ＵＶ滅菌済みエッペンドルフチューブに等分した）を収集チップ上の各ウェル内に添加し、次いでこれをＲＡＣＥスクリーニングチップに取り付けた。あるいは、細胞を回収した後に液体を添加することができる。封入されたチップは、ＲＡＣＥチップを下に向けてラマン顕微鏡のステージに移した。標的細胞はそれらの座標によって位置決めされ、ラマンスペクトル取得中に得られた明視野像を比較することによって確認された。レーザースポットは、標的細胞の下のコーティング層に手動で位置合わせした。あるいは、これは、目標座標を入力してステージを移動させ、さらに自動画像調整を行うソフトウェアを使用して自動化することができる。標的細胞は、５３２ｎｍパルスレーザーを０．１秒照射して、コーティング層の気化によって射出され、細胞は収集器中で収集された。１２ウェルのＲＡＣＥチップについては、少なくとも２つの対照ウェルもセットアップされた：１つは陰性対照であり、無細胞のままとし、１つは陽性対照であり、細胞懸濁液を全ゲノム増幅（ＷＧＡ）前に添加した。
【０１２５】
ＲＡＣＥサンプリングチップ上の２５ｎｍのアルミニウム（Ａｌ）コーティングは、最小のラマンバックグラウンドを与えたことが分かった（図８Ｃ）。薄いコーティングは、５３２ｎｍパルスレーザーのエネルギーを吸収し、その上に置かれた単一細胞を射出することができた（図９）。図９は、Ａｌ（２５ｎｍ）のコーティング材料が、レーザー射出後にコーティングスライド上に〜１．５μｍの跡を残して除去されたことを示している。ブランク対照の射出後、観察可能なＡｌ材料は収集チップに到達せず、これはＡｌが完全に気化したことを示唆している。図９Ｂは、単一細胞がＲＡＣＥ収集チップによって正確に単離され、収集されたことを示している。
【０１２６】
実施例７−全ゲノム増幅オンチップ
封入されたチップを注意深く層流チャンバに移し、２つのチップを分離した。０．５μｌの細胞懸濁液を陽性対照ウェルに添加し、次いで滅菌カバースリップを収集チップの上に置いた。細胞溶解は、３回の凍結融解サイクル、続いてサーモサイクラー（Ｃ１０００、バイオ・ラッド社、英国）中で６５℃で１０分間加熱して行った。１μｌの停止液を添加して溶解緩衝液を中和した後、１２μｌの反応マスターミックスを各ウェルに添加した（反応緩衝液は、１ｘＲｅｐｌｉｐｈｉ２９反応緩衝液（エピセントレ社、米国）、５０μＭランダムヘキサマー、５％ＤＭＳＯ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）を含み、ＵＶ滅菌済みエッペンドルフチューブに等分した）。次いで、収集チップをカバースリップで覆い、ホットリッド（hot lid）を活性化して３０℃でサーモサイクラー内に保持し、７０℃に設定した。８時間のインキュベーション後、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを６５℃で１０分間加熱することによって失活させた。ＭＤＡ生成物を滅菌した２００μｌのＰＣＲチューブに移して保存した。
【０１２７】
実施例８−ラマン共鳴スペクトルに基づく紅海試料からのカロテノイド含有細菌の選別
エイラートの表層海水からの３２７８個の単一細胞のＳＣＲＳを得て分析したところ、分析した細胞の３１．４％が蛍光性を示し、細胞の６８．６％が選別のために識別可能なＳＣＲＳを有していた。図１０Ａは、典型的な細菌細胞、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）および未知の化合物を含有する蛍光性を示す個々の細胞を含む試料からのＳＣＲＳの例を示す。ＳＣＲＳは細胞の生化学的表現型を反映するので、ＳＣＲＳのラマンバンドをバイオマーカーとしてこれに基づいて細胞を選別することができる。例えば、典型的な細胞のＳＣＲＳ（図１０Ａ）である１００５ｃｍ−１のベンゼン環呼吸バンド（例えば、フェニルアラニン）はシャープで区別可能であり、それは細胞と細胞の１３Ｃ−基質の代謝活性とを関連付けるために使用することができる１３Ｃが取り込まれるとシフトする。ＰＨＢを含有する細胞は、８３９ｃｍ−１、１０５８ｃｍ−１、１４０３ｃｍ−１および１１２３ｃｍ−１（図１０Ａ）で識別可能なラマンバイオマーカーを与え、これはＰＨＢ含有細胞を選別するために使用することができる。
【０１２８】
カロテノイドの特徴的なｖ１、ｖ２およびｖ３ラマンバンドを選別基準として使用した。ｖ１バンドは、メチル振動モード（methyl rocking mode）であり、ｖ２およびｖ３バンドは、共役Ｃ＝Ｃ結合の異なる長さおよびＣ−Ｃ結合の伸張モード（stretching modes）により異なる。ラマンスペクトル分解能は約１ｃｍ−１であるので、ｖ１、ｖ２およびｖ３の位置の変化は、細胞内に存在するカロテノイドの異なる構造を示す（図３Ｂおよび図３Ｃ）。ＳＣＲＳによると、７４４個（２２．７％）の細胞はカロテノイドを含んでいた（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。それらのＳＣＲＳに基づいて、４群のカロテノイド含有細胞が各群において３〜８個の細胞で単離され（図１０Ｂ）、ｖ１、ｖ２、ｖ３の位置は各群内で全く同じであった。３個の単一細胞も個々に単離された（図１０Ｃ）。まとめると、これらの７個の選別された試料は、５つの異なる型に分けることができた（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。選別された細胞の光学画像は、細胞が０．３〜１μｍのサイズで小さいことを示した。
【０１２９】
想定される汚染の推定度は、異なるアミノ酸配列を有する普遍的なマーカー遺伝子の複数のコピーに基づくと、すべての場合において比較的低かった。しかしながら、配列分析は、すべての場合において２０％未満の低いゲノムカバレッジを示し、これはｐｈｉ２９ポリメラーゼのＵＶ処理に起因する可能性がある。
【０１３０】
カロテノイド生合成経路に直接関与する回収遺伝子を図１１に示す。具体的には、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ）およびゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｉｓｐＡ）は、無色の基質ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の生成に関与しており、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）は赤色色素リコペンが合成される原因である（図１１）。カロテノイド合成に直接関連する遺伝子がＨ８０８−５には見つからなかったが（おそらくゲノムカバレッジが低いため）、この試料はカロテノイド化合物を基質とする２種類の推定上のｓｈｃ（スクアレン−ホペン環化酵素）遺伝子を含んでいた。これらの結果は、選別された細胞はそのＳＣＲＳによればカロテノイドが含まれているはずなので、ＲＡＣＥ法は有効である。
【０１３１】
従って、本発明の方法は、カロテノイドに特徴的なＳＣＲＳに基づいて紅海試料から個々の細胞を正確に単離することが示されている。
【０１３２】
上記の実施例は、単一細胞ゲノミクスと結びつけられたラマン活性化細胞選別を説明している。ＲＡＣＥ技術は、紅海試料に適用されている７つの群のカロテノイド含有細胞を選別し、その後のゲノム解析を実施した。ＲＡＣＥチップの設計により、高価で専用の「スーパークリーン」施設を利用することなく、標準的な研究室の条件下で単一細胞ゲノミクスを実行することができる。
【０１３３】
本発明のＲＡＣＥチップ（例えば、図３）は、単一細胞の単離およびＤＮＡ増幅オンチップを実施するための密封環境を作り出し、外部環境から細胞またはＤＮＡ汚染を有意に防止する。対象となる細胞は直接単離され、収集ウェル内に用意された緩衝液の中に射出され、細胞の移動を必要とせずに、オンチップで単一細胞のＤＮＡ増幅を可能にする。先進的なマイクロ流体デバイスを使用することにより、チップはオンチップで細胞培養、ＰＣＲ、さらにはＤＮＡシークエンシングを行うことができる。単一細胞ゲノミクス、オンチップ細胞培養、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡシークエンシング（または本明細書中に記載される任意の他の方法）において本明細書に記載のチップ、方法、コーティングまたは装置の使用は、この開示のさらなる態様を形成する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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