(57)【要約】  製剤なしに効率的かつ特異的な組織分布、細胞取り込み、最小免疫応答およびオフターゲット効果を示す分岐オリゴヌクレオチドが本明細書において提供される。
2019503394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の核酸を含む分岐オリゴヌクレオチド化合物であって、これら核酸がリンカー、スペーサーおよび分岐点から選択される１以上の部分により互いに結合している、化合物。
【請求項２】
２個、３個、４個、６個または８個の核酸を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
各核酸が一本鎖であり、５’末端および３’末端を有し、各核酸が独立して、５’末端または３’末端でリンカー、スペーサーおよび分岐点に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
各一本鎖核酸が、独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
各核酸が１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
各核酸が化学修飾ヌクレオチドから成る、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
各核酸が二本鎖であり、それぞれが５’末端および３’末端を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、化学修飾ヌクレオチドから成る、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が交互に２’−メトキシヌクレオチドおよび２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
センス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端から１位および２位でヌクレオチドがホスホロチオエート結合により隣接するヌクレオチドに結合する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
各二本鎖核酸が独立して、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端で結合している、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
アンチセンス鎖が、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含み、標的に対する相補性を有する、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
３’末端から１〜６位または３’末端から１〜７位でヌクレオチドがホスホロチオエート結合により隣接するヌクレオチドに結合する、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
化合物が分岐オリゴヌクレオチド化合物の末端５’位に結合した疎水性部分をさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
疎水性部分がアルキル、アルケニルもしくはアリール部分、ビタミンもしくはコレステロール誘導体、脂溶性アミノ酸またはそれらの組合せを含む、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
各リンカーが独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子が場合により窒素原子で置換されていてよく、ヒドロキシル置換基を有していてよく、またはオキソ置換基を有していてよい；
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
式(Ｉ)：
【化１】
2019503394.tif 000031
〔式中、
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、
式(Ｉ)は場合により１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳをさらに含み；
Ｂはそれぞれ独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓはそれぞれ独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
Ｎはそれぞれが１以上の化学的修飾を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡであり；そして
ｎは２、３、４、５、６、７または８である〕
の化合物。
【請求項１９】
式(Ｉ−１)〜(Ｉ−９)：
【表１】
2019503394.tif 000032
から選択される構造を有する、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
アンチセンス鎖が、
【化２】
2019503394.tif 000033
から成る群から選択される５’末端基Ｒを含む、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
式(ＩＩ)：
【化３】
2019503394.tif 000034
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびそれらの化学修飾誘導体から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびそれらの化学修飾誘導体から選択され；
−はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして
---はそれぞれ、個々に塩基対相互作用またはミスマッチを表す〕
の構造を有する、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２２】
式(ＩＩ)：
【化４】
2019503394.tif 000035
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｘはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、ヌクレオチド２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
式(ＩＶ)：
【化５】
2019503394.tif 000036
〔式中、
Ａは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むアデノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル修飾を含むアデノシンであり；
Ｇは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むグアノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル修飾を含むグアノシンであり；
Ｕは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むウリジンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル修飾を含むウリジンであり；
Ｃは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むシチジンであり；そして
Ｃは２’−Ｏ−メチル修飾を含むシチジンである〕
の構造を有する、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
式(Ｖ)：
【化６】
2019503394.tif 000037
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
−はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして
---はそれぞれ、個々に塩基対相互作用またはミスマッチを表す〕
の構造を有する、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２５】
式(ＶＩ)：
【化７】
2019503394.tif 000038
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｘはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
式(ＶＩＩ)：
【化８】
2019503394.tif 000039
〔式中、
Ａは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むアデノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル修飾を含むアデノシンであり；
Ｇは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むグアノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル修飾を含むグアノシンであり；
Ｕは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むウリジンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル修飾を含むウリジンであり；
Ｃは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むシチジンであり；そして
Ｃは２’−Ｏ−メチル修飾を含むシチジンであり；
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
ＬがＬ１：
【化９】
2019503394.tif 000040
の構造を有する、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
ＲがＲ３であり、ｎが２である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
ＬがＬ２：
【化１０】
2019503394.tif 000041
の構造を有する、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
ＲがＲ３であり、ｎが２である、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
式(ＶＩＩＩ)：
【化１１】
2019503394.tif 000042
〔式中、
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート 、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、
ここで、式(ＶＩＩＩ)は場合により１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳをさらに含んでよく；ここで、
Ｂはそれぞれ独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓはそれぞれ独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
各ｃＮＡは独立して、１以上の化学修飾を含むキャリア核酸であり；そして
ｎは２、３、４、５、６、７または８である〕
の構造を有する治療用核酸のための送達系。
【請求項３２】
式(ＶＩＩＩ−１)〜(ＶＩＩＩ−９)：
【表２】
2019503394.tif 000043
から選択される構造を有する、請求項３１に記載の送達系。
【請求項３３】
各ｃＮＡが独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の送達系。
【請求項３４】
各ｃＮＡが独立して、化学修飾ヌクレオチドから成る、請求項３１に記載の送達系。
【請求項３５】
ｎ個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含み、ここで各ＮＡが少なくとも１つのｃＮＡとハイブリッド形成している、請求項３１に記載の送達系。
【請求項３６】
各ＮＡが独立して、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の送達系。
【請求項３７】
各ＮＡが独立して、１６〜２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の送達系。
【請求項３８】
各ＮＡが少なくとも２個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む、請求項３５に記載の送達系。
【請求項３９】
オーバーハングのヌクレオチドがホスホロチオエート結合により結合している、請求項３５に記載の送達系。
【請求項４０】
各ＮＡが独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマーまたはガイドＲＮＡから成る群から選択される、請求項３５に記載の送達系。
【請求項４１】
各ＮＡが同一である、請求項３５に記載の送達系。
【請求項４２】
各ＮＡが同一でない、請求項３５に記載の送達系。
【請求項４３】
請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の構造を有する、請求項３５に記載の送達系。
【請求項４４】
送達の標的が脳、肝臓、皮膚、腎臓、脾臓、膵臓、結腸、脂肪、肺、筋肉および胸腺から選択される、請求項３１に記載の送達系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は国立衛生研究所により授与された助成金番号１  Ｒ０１  ＧＭ１０８８０３−０２の下の政府支援によりかつＣＨＤＩ財団からの助成金により行った。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は２０１６年１月３１日に出願された米国特許仮出願番号第６２／２８９，２６８号および２０１６年４月１日に出願された第６２／３１７，１１３号の優先権を主張するものである。前記出願の内容は、全ての目的のために、参照により本明細書に包含させる。
【０００３】
技術分野
本発明は予想外に高い有効性、取り込みおよび組織分布を達成するためにデザインされた新規分岐オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
治療用オリゴヌクレオチドは、遺伝子機能の阻害を含む種々の用途について単純かつ有効な手段である。このような阻害の例はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)である。しかしながら、一般的な治療戦略としてのＲＮＡｉの有望性は、小さなＲＮＡを広範囲の組織に送達する能力に左右される。現在、小さな治療ＲＮＡは肝臓にしか有効に送達できない。最小限の免疫応答およびオフターゲット効果、製剤なしでの効率的な細胞取り込みならびに効率的かつ特異的な組織分布を示す、自己送達ｓｉＲＮＡおよび一般的な治療用オリゴヌクレオチドが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
従って、本発明は分布、インビボ有効性および安全性において予想外の改善を示す分岐オリゴヌクレオチド(「本発明の化合物」)を提供する。
【０００６】
第一の態様において、２以上の核酸を含む分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供され、これら核酸はリンカー、スペーサーおよび分岐点から選択される１以上の部分により互いに結合されている。
【０００７】
ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは２個、３個、４個、６個または８個の核酸を含む。
【０００８】
分岐オリゴヌクレオチドの実施態様において、各核酸は一本鎖であり、５’末端および３’末端を有し、各核酸は独立して、リンカー、スペーサーまたは分岐点と５’末端または３’末端で結合する。
【０００９】
ある実施態様において、各一本鎖核酸は独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、アンチセンス鎖は少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含み、標的への相補性を有する。
【００１０】
ある実施態様において、各核酸は１以上の化学修飾ヌクレオチドを有する。ある実施態様において、各核酸は化学修飾ヌクレオチドから成る。
【００１１】
分岐オリゴヌクレオチドの実施態様において、各核酸は二本鎖であり、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、５’末端および３’末端を有する。ある実施態様において、各二本鎖核酸は独立して、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点と結合する。
【００１２】
ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、化学修飾ヌクレオチドから成る。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖はともに、交互の２’−メトキシ−ヌクレオチドおよび２’−フルオロ−ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、センスおよびアンチセンス鎖の５’末端から１位および２位のヌクレオチドはホスホロチオエート結合により隣接するヌクレオチドに結合する。ある実施態様において、３’末端から１〜６位、または３’末端から１〜７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により隣接するヌクレオチドに結合する。
【００１３】
ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは疎水性部分をさらに含む。特定の実施態様において、疎水性部分は分岐オリゴヌクレオチド化合物の１以上の末端５’位に結合する。疎水性部分は１以上の５’ホスフェート部分に含まれ得る。特定の実施態様において、疎水性部分はアルキルまたはアルケニル部分(例えば、アルキルもしくはアルケニル鎖または飽和もしくは不飽和脂肪酸残基)、ビタミンまたはコレステロール誘導体、芳香族部分(例えば、フェニルまたはナフチル）、脂溶性アミノ酸またはそれらの組合せを含む。疎水性部分の特定の実施態様および疎水的に修飾された分岐オリゴヌクレオチド化合物の合成戦略は図４４に示される。
【００１４】
分岐オリゴヌクレオチドの実施態様において、各リンカーは独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は場合により窒素原子で置換されていてよいか、ヒドロキシル置換基を有するか、またはオキソ置換基を有する。
【００１５】
第二の態様において、式(Ｉ)：
【化１】
2019503394.tif 000003
〔式中、
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、
式(Ｉ)は場合により１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳをさらに含んでよく；
Ｂはそれぞれ独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓはそれぞれ独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
Ｎはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡ二本鎖であり、これらセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して１以上の化学修飾を含み；
ｎは２、３、４、５、６、７または８である〕
の化合物が本明細書において提供される。
【００１６】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は表１の式(Ｉ−１)〜(Ｉ−９)から選択される構造を有する。
【表１】
2019503394.tif 000004
【００１７】
ある実施態様において、各アンチセンス鎖は独立して、表２の群から選択される５’末端基Ｒを含む。
【表２】
2019503394.tif 000005
【００１８】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＩＩ)：
【化２】
2019503394.tif 000006
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
−はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして
---はそれぞれ、個々に塩基対相互作用またはミスマッチを表す〕
の構造を有する。
【００１９】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＩＩＩ)：
【化３】
2019503394.tif 000007
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｘはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する。
【００２０】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＩＶ)：
【化４】
2019503394.tif 000008
〔式中、
Ａは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むアデノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル修飾を含むアデノシンであり；
Ｇは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むグアノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル修飾を含むグアノシンであり；
Ｕは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むウリジンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル修飾を含むウリジンであり；
Ｃは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むシチジンであり；そして
Ｃは２’−Ｏ−メチル修飾を含むシチジンである〕
の構造を有する。
【００２１】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｖ)：
【化５】
2019503394.tif 000009
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
−はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；
---はそれぞれ、個々に塩基対相互作用またはミスマッチを表す〕
の構造を有する。
【００２２】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＶＩ)：
【化６】
2019503394.tif 000010
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｘはそれぞれ、独立して２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する。
【００２３】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＶＩＩ)：
【化７】
2019503394.tif 000011
〔式中、
Ａは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むアデノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル修飾を含むアデノシンであり；
Ｇは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むグアノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル修飾を含むグアノシンであり；
Ｕは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むウリジンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル修飾を含むウリジンであり；
Ｃは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むシチジンであり；
Ｃは２’−Ｏ−メチル修飾を含むシチジンであり；
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する。
【００２４】
式(Ｉ)の化合物の実施態様において、ＬはＬ１：
【化８】
2019503394.tif 000012
の構造を有する。Ｌ１の実施態様において、ＲはＲ３であり、ｎは２である。
【００２５】
式(Ｉ)の化合物の実施態様において、ＬはＬ２：
【化９】
2019503394.tif 000013
の構造を有する。Ｌ２の実施態様において、ＲはＲ３であり、ｎは２である。
【００２６】
第三の態様において、式(ＶＩＩＩ)：
【化１０】
2019503394.tif 000014
〔式中、
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、
ここで、式(ＶＩＩＩ)は場合により１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳをさらに含んでよく；ここで
Ｂはそれぞれ独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓはそれぞれ独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
各ｃＮＡは独立して、１以上の化学修飾を含むキャリア核酸であり；そして
ｎは２、３、４、５、６、７または８である〕
の構造を有する治療用核酸のための送達系が本明細書で提供される。
【００２７】
ある実施態様において、表３の式(ＶＩＩＩ−１)〜(ＶＩＩＩ−９)から選択される構造を有する。
【表３】
2019503394.tif 000015
【００２８】
ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物(例えば、式(ＶＩＩＩ−１)〜(ＶＩＩＩ−９)を含む)、各ｃＮＡは独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ｃＮＡは独立して、化学修飾ヌクレオチドから成る。
【００２９】
ある実施態様において、送達系はさらにｎ個の治療用核酸(ＮＡ)を含み、各ＮＡは少なくとも１つのｃＮＡとハイブリッド形成する。
【００３０】
ある実施態様において、各ＮＡは独立して、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ＮＡは独立して、少なくとも１６〜２０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ＮＡは少なくとも２個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。ある実施態様において、オーバーハングのヌクレオチドはホスホロチオエート結合により結合する。
【００３１】
ある実施態様において、各ＮＡは独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマーまたはガイドＲＮＡから成る群から選択される。ある実施態様において、各ＮＡは同一である。ある実施態様において、各ＮＡは同一ではない。
【００３２】
ある実施態様において、ｎ個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む送達系は本明細書に記載される式(Ｉ)、(ＩＩ)、(ＩＩＩ)、(ＩＶ)、(Ｖ)、(ＶＩ)、(ＶＩＩ)およびそれらの実施態様から選択される構造を有する。
【００３３】
送達系の実施態様において、送達の標的は脳、肝臓、皮膚、腎臓、脾臓、膵臓、結腸、脂肪、肺、筋肉および胸腺からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ジ−ｈｓｉＲＮＡの構造を示す。黒色 − ２’−Ｏ−メチル、灰色 − ２’−フルオロ、赤線 − ホスホロチオエート結合、リンカー − テトラエチレングリコール。ジ−ｈｓｉＲＮＡはセンス鎖の３’末端でリンカーにより結合した２つの非対称ｓｉＲＮＡである。より長いアンチセンス鎖とのハイブリッド形成により、組織分布、細胞取り込みおよび有用性に不可欠な、突出した完全ホスホロチオエート化一本鎖領域が形成される。提示された構造は４つのモノマーのｔｅｇリンカーを利用する。リンカーの化学的特性は有効性に影響を与えることなく変更できる。それは長さ、化学組成(全て炭素)、飽和または化学標的リガンドの付加により調節できる。
【図２】ジ−分岐ｓｉＲＮＡの化学合成、精製およびＱＣを示す。
【図３】図２に示された方法により製造された化合物のＨＰＬＣおよびＱＣを示す。３つの主生成物が質量スペクトルにより、ＴＥＧ(テトラエチレングリコール)リンカーを有するセンス鎖、ジ−分岐オリゴおよびＶｉｔ−Ｄ(カルシフェロール)コンジュゲートとして特定された。全ての生成物は独立に、ＨＰＬＣにより精製し、インビボで試験した。ジ−分岐オリゴは唯一、分岐構造が組織保持および分布に不可欠であることを示す前例のない組織分布および有効性により特徴付けられる。
【図４】ジ−分岐オリゴヌクレオチドの質量を確認する質量スペクトルを示す。観測された１１６８３の質量は、３’末端によりＴＥＧリンカーによって結合した２つのセンス鎖に対応する。
【図５】別の化学経路を用いた分岐オリゴヌクレオチドの合成を示す。
【図６】アミダイト、スペーサーおよび分岐部分の例を示す。
【図７】分岐オリゴヌクレオチドのモチーフを示す。二重らせんはオリゴヌクレオチドを示す。種々のリンカー、スペーサーおよび分岐点の組合せにより多様な分岐ｈｓｉＲＮＡ構造が生じる。
【図８】構造的に多様な分岐オリゴヌクレオチドを示す。
【図９】４つの一本鎖ホスホロチオエート領域を有する本発明の非対称化合物を示す。
【００３５】
【図１０】インビトロ有効性データを示す。(Ａ)ＨｅＬａ細胞を、示された濃度で７２時間、(ＲＮＡｉＭａｘを用いて)ジ−分岐オリゴでトランスフェクトした。(Ｂ)一次皮質マウスニューロンを、示された濃度で１週間、ジ−分岐オリゴで処理した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０を用いてｍＲＮＡを測定した。データをハウスキーピング遺伝子に対して標準化し(ＰＰＩＢ)、未処理細胞の％としてグラフ化した。(Ｃ)ＨｅＬａ細胞を、示された濃度で１週間、(製剤せずに)受動的にジ−ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトした。
【図１１】線条体内注射後４８時間のジ−ｓｉＲＮＡまたはＴＥＧの脳分布を示す。２ｎｍｏｌｓの(Ａ)ジ−分岐オリゴ(４ｎｍｏｌの対応するアンチセンス鎖)または(Ｂ)ＴＥＧ−オリゴのみの線条体内注射。コンジュゲートあたりＮ＝２のマウス。４８時間後に脳を回収しＤａｐｉ(核、青)で染色した。赤−オリゴ。(Ａ)においては脳の左側が明るい赤色に見えるが、(Ｂ)においては脳の左側が微かに赤色に見えるのみである。
【図１２】ジ−ｓｉＲＮＡの単回注射が注入部位の同側および反対側の両方で検出されることを示す。
【図１３】マウス脳におけるジ−ｈｓｉＲＮＡの広範な分布および有効性。(Ａ)単回ＩＳ注射(２５μｇ)７日後の大脳皮質および線条体の両方における健常者のＨｔｔ  ｍＲＮＡ  サイレンシング、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ(登録商標)。(Ｂ)注射７日後の組織におけるｈｓｉＲＮＡ蓄積量(ＰＮＡアッセイ)。
【図１４】ジ−ｈｓｉＲＮＡのボーラス髄腔内注射後の脊髄への広範な分布および有効性を示す。３ｎｍｏｌのジ−分岐オリゴ(６ｎｍｏｌの対応するアンチセンスＨＴＴ鎖)の腰部における髄腔内注射。(Ａ)脊髄の全領域における健常者のＨｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシング、７日、ｎ＝６。動物は注射７日後に屠殺した。脊髄の頸部、胸部および腰静脈領域から採取した組織パンチ。Ｃｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０を用いてｍＲＮＡを定量した。ハウスキーピング遺伝子、ＨＰＲＴおよび移植片に対してａＣＳＦ対照の割合としてデータを標準化した。ａＣＳＦ−人工ＣＳＦ。(Ｂ)７５μｇのＣｙ３−Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡ、Ｃｙ−ジ−ｈｓｉＲＮＡを動物に腰静脈ＩＴ注射した。Ｃｈｏｌ−ｈｓｉＲＮＡｓは脊髄の外側から内側までの急勾配の拡散を示す。ジ−ｈｓｉＲＮＡ脊髄全体(全領域)への広範な分布を示す。ライカ１０ｘ(２０ミリバール)。髄腔内注射４８時間後脊髄の頸部領域におけるジ−分岐オリゴの画像。赤色＝オリゴ、青色＝Ｄａｐｉ。(Ｃ)髄腔内注射４８時間後の肝臓におけるジ−分岐オリゴの画像。赤色＝オリゴ、青色＝Ｄａｐｉ。
【００３６】
【図１５】本発明の分岐オリゴヌクレオチドを示す。(Ａ)３つのオリゴヌクレオチドをアニールすることにより形成される分岐オリゴヌクレオチド。より長い結合オリゴヌクレオチドは修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡまたはＵＮＡの形態で開裂可能な領域を含み得る；(Ｂ)先に記載されたリンカーまたはスペーサーへの３’および５’結合を有する非対称分岐オリゴヌクレオチド。これはセンス鎖またはアンチセンス鎖またはそれらの組合せの３’および５’末端が利用され得る；(Ｃ)３つの別々の鎖で作製された分岐オリゴヌクレオチド。長二重センス鎖は３’ホスホルアミダイトおよび５’ホスホルアミダイトを用いて合成され、３’−３’隣接または５’−５’隣接末端を可能にする。
【図１６】コンジュゲートした生物活性部分を有する本発明の分岐オリゴヌクレオチドを示す。
【図１７】ホスホロチオエート含有量と立体選択性の関係を示す。
【図１８】疎水性部分の例を示す。
【図１９】ヌクレオチド間結合の例を示す。
【図２０】ヌクレオチド間骨格結合の例を示す。
【図２１】糖修飾体の例を示す。
【図２２】ジ−ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡを示す。(Ａ)ＶｉｔＤ−ＦＭ−ｈｓｉＲＮＡ合成から生成した４つの副生成物の化学組成および元の化学合成の粗逆相ＨＰＬＣ分析。(Ｂ)脂質がｈｓｉＲＮＡ送達を媒介した後のＨｅＬａ細胞における副生成物の有効性。細胞を７２時間処理した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キット(Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社)を用いてｍＲＮＡを測定した。ハウスキーピング遺伝子  ＨＰＲＴに対してデータを標準化し、未処理対照の割合として表す。(Ｃ)各ｈｓｉＲＮＡ副生成物の単回、片側線条体内注射(２５μｇ)。注射４８時間後に撮影した画像。
【図２３Ａ−Ｂ】ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３は線条体内注射後に肝臓または腎臓においてサイレンシングを効率的に誘発しないことを示す。図２３Ａは、陰性対照(ａＣＳＦ)と比較したジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の線条体内注射１週間後の肝臓におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡ発現を示す散布ドットプロットを示す。図２３Ｂは、陰性対照(ａＣＳＦ)と比較したジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３線条体内注射１週間後の腎臓におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡ発現を示す散布ドットプロットを示す。
【図２４Ａ−Ｂ】線条体内注射後に線条体および大脳皮質の両方において、ジ−ＨＴＴが効率的にＨＴＴ遺伝子発現をサイレンシングすることおよびジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３はジ−ＨＴＴ(非標識)よりわずかに有効であることを示す。図２４Ａはジ−ＨＴＴ、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３または２つの陰性対照(ａＣＳＦまたはジ−ＮＴＣ)の線条体内注射１週間後の線条体におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡ発現を示す散布ドットプロットを示す。図２４Ｂはジ−ＨＴＴ、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３または２つの陰性対照(ａＣＳＦまたはジ−ＮＴＣ)の線条体内注射１週間後の大脳皮質におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡ発現を示す散布ドットプロットを示す。
【図２５】線条体および大脳皮質におけるジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３量を測定する散布ドットプロットを示す。プロットは線条体内注射の２週間後にも多量のジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３が検出可能であることを示す。
【００３７】
【図２６Ａ−Ｂ】ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３が線条体内注射２週間後に線条体および大脳皮質の両方において効果的にＨＴＴ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現をサイレンシングすることを示す。図２６Ａは線条体内注射２週間後の線条体および大脳皮質におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡ量を測定する散布ドットプロットを示す。図２６Ｂは線条体内注射２週間後の線条体および大脳皮質におけるＨｔｔタンパク質量を測定する散布ドットプロットを示す。
【図２７Ａ−Ｂ】線条体内注射２週間後に、高用量ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３処置はインビボで高い毒性をもたらさないが、インビボで顕著な神経膠症をもたらすことを示す。図２７Ａはジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３またはａＣＳＦを注射した２週間後の線条体および大脳皮質におけるＤＡＲＰＰ３２シグナルを測定する散布ドットプロットを示す。図２７Ｂはジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３またはａＣＳＦを注射した２週間後の線条体および大脳皮質におけるＧＦＡＰタンパク質量を測定する散布ドットプロットを示す。
【図２８】ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の髄腔内注射が脊髄全体に強く均一な分布をもたらすことを示す蛍光イメージングを示す。
【図２９】図２８Ｂの合成蛍光画像を示す(脊髄の拡大)。青色 − 核、赤色 − ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３。ＸＸＸ
【図３０Ａ−Ｃ】脳室内注射４８時間後のジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の広範な分布を示す。図３０Ａは線条体、大脳皮質および小脳の部分の蛍光画像を示す。図３０Ｂは対照(ａＣＳＦ)またはジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３を注射した脳全体の明視野画像を示す。図３０Ｃはジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３注射４８時間後の脳全体の蛍光画像を示す。
【図３１】脳室内注射２週間後、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３が多数の脳領域に蓄積することを示す。散布ドットプロットは脳の多数の領域におけるジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の量を示す。
【図３２】図３２Ａは、陰性対照注射(ａＣＳＦ)と比較して、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３は脳室内注射２週間後に脳の複数の領域においてＨｔｔ遺伝子サイレンシングを誘導することを示す。散布ドットプロットは脳の複数の領域におけるＨｔｔ  ｍＲＮＡ量を測定する。図３２Ｂは、陰性対照注射(ａＣＳＦ)と比較して、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３は脳室内注射２週間後に脳の複数の領域においてＨｔｔサイレンシングを誘導することを示す。散布ドットプロットは脳の複数の領域におけるＨｔｔタンパク質量を測定する。
【図３３】高用量の脳室内注射がインビボで軽度毒性を引き起こすことを示す。散布ドットプロットはａＣＳＦのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３注射後に脳の複数の領域におけるＤＡＲＰＰ３２シグナルを測定する。
【図３４】高用量の脳室内注射がインビボで顕著な神経膠症をもたらすことを示す。散布ドットプロットはａＣＳＦのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３注射後に脳の複数の領域におけるＤＡＲＰＰ３２シグナルを測定する。
【００３８】
【図３５】静脈注射後、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３が多数の臓器に分布することを示す。蛍光イメージはジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３または陰性対照(ＰＢＳ)の注射後の、心臓、腎臓、副腎および脾臓におけるジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３量を示す。
【図３６】静脈注射後の多数の臓器におけるジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の蓄積を示す。散布ドットプロットは複数の組織におけるジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の量を示す。
【図３７】ｈｓｉＲＮＡおよび完全に代謝された(ＦＭ)ｈｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図３８Ａ−Ｂ】ｈｓｉＲＮＡｓの完全な代謝安定化が、ｈｓｉＲＮＡＨＴＴまたはＦＭ−ｈｓｉＲＮＡＨＴＴの線条体内注射後により効果的な遺伝子サイレンシングをもたらすことを示す。図３８Ａは線条体内注射後１２日までのＨＴＴ  ｍＲＮＡ量を測定する散布ドットプロットを示す。図３８Ｂは線条体内注射後２８日までのＨＴＴ  ｍＲＮＡ量を測定する散布ドットプロットを示す。
【図３９】一本鎖完全修飾オリゴヌクレオチドの化学的多様性を示す。一本鎖オリゴヌクレオチドはギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯまたはＰＮＡからなり得る。
【図４０】ＴＥＧホスホルアミデート リンカーを有するジ−ＨＴＴを示す。
【図４１】ＴＥＧジホスフェートリンカーを有するジ−ＨＴＴを示す。
【図４２】２個のオリゴヌクレオチド分岐または４個のオリゴヌクレオチド分岐のいずれかを有するジ−ＨＴＴの変形を示す。
【図４３】２個のオリゴヌクレオチド分岐およびリンカーに結合したＲ２を有する構造のジ−ＨＴＴの別の変形を示す。
【図４４】分岐オリゴヌクレオチド構造への疎水性部分の導入のための第一の戦略を示す。
【図４５】分岐オリゴヌクレオチド構造への疎水性部分の導入のための第二の戦略を示す。
【図４６】分岐オリゴヌクレオチド構造への疎水性部分の導入のための第三の戦略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明は分布、インビボ有効性および安全性において予想外の改善を示す分岐オリゴヌクレオチド(「本発明の化合物」)を提供する。本明細書に記載の分岐オリゴヌクレオチドは脳の多数の領域多数の他の臓器に効率的かつ安定に小さなＲＮＡを送達し、コンジュゲートしていない小さなＲＮＡを用いては以前には示されていない、前例のない送達の有効性を示す。
【００４０】
本明細書に記載の組成物は治療標的遺伝子の強力なサイレンシングを促進するための効率的な、安定なｓｉＲＮＡの送達を可能にする。当該組成物は多数の治療困難な疾患に対する治療可能性を示し、かつＲＮＡ療法の使用における存在する課題を克服する。
【００４１】
第一の態様において、リンカー、スペーサーおよび分岐点から選択される１以上の部分により互いに結合した２以上の核酸を含む分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供される。
【００４２】
本明細書中の種々の態様および実施態様において、本発明の化合物である分岐オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施態様において、本発明の化合物はリンカーにより結合した２〜８個のオリゴヌクレオチドを有する。リンカーは疎水性であり得る。特定の実施態様において、本発明の化合物は２〜３個のオリゴヌクレオチドを有する。ある実施態様において、これらオリゴヌクレオチドは独立して、十分な化学的安定性を有する(例えば、構成塩基の少なくとも４０％が化学修飾される)。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは完全な化学的安定性を有する(すなわち、全ての構成塩基が化学修飾される)。いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、それぞれ独立して２〜２０個のヌクレオチドを有する１以上の一本鎖ホスホロチオエート化テイルを含む。特定の実施態様において、各一本鎖テイルは８〜１０個のヌクレオチドを有する。
【００４３】
特定の実施態様において、本発明の化合物は３つの特性、(１)分岐構造、(２)代謝安定化および(３)ホスホロチオエートリンカーを含む一本鎖テイルの存在により特徴付けられる。特定の実施態様において、本発明の化合物は２つまたは３つの分岐を有する。分岐構造の増加した全体のサイズは取り込みの増加を促進する。また、活性の特定の理論に縛られることなく、多数の(例えば、２つまたは３つの)隣接する分岐は、それぞれの分岐が協調的に動くことを可能にし、従って内面化、トラフィッキングおよび遊離の速度を劇的に上昇させる。
【００４４】
本発明の分岐オリゴヌクレオチドの完全な代謝安定化は予想外に高いインビボ有効性をもたらす。不安定化された分岐ｓｉＲＮＡはインビボ有効性が不足する。一本鎖テイルの存在には分岐オリゴヌクレオチドの活性のために必要である。ホスホルアミデート官能基はジ−分岐オリゴの機能に重要である。
【００４５】
特定の実施態様において、本発明の化合物は以下の特性：(１)例えば、３’および５’末端の数が等しくない２以上の分岐オリゴヌクレオチド；(２)例えば、４０％以上、最適には１００％化学修飾されている、実質的に化学的に安定化されたオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＮＡおよび場合によりＤＮＡが存在しない)；および(３)少なくとも３個、最適には５〜２０個のホスホロチオエート結合を含むホスホロチオエート化された一本鎖オリゴヌクレオチドにより特徴付けられる。
【００４６】
本発明の化合物は種々の構造的に多様な実施形態で提供される。図７に示すように、例えば、いくつかの実施態様において、分岐点で結合したオリゴヌクレオチドは一本鎖であり、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ギャップマー、ミックスマー、ＳＳＯ、ＰＭＯまたはＰＮＡから成る。これらの一本鎖はそれらの３’または５’末端で結合し得る。ｓｉＲＮＡと一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せもまた、二重機能のために使用され得る。別の実施態様において、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯおよびＰＮＡに対して相補的な短いオリゴヌクレオチドは、これらの活性な一本鎖オリゴヌクレオチドを運搬し、分布および細胞内面化を促進するために使用される。短い二本鎖領域は分岐構造の細胞への内面化後の急速な解離について低い融点(Ｔｍ  約３７℃)を有する。
【００４７】
図１６に示すように、本発明のジ−ｓｉＲＮＡ化合物は化学的に多様なコンジュゲートを含み得る。コンジュゲートされた生物活性リガンドは細胞特異性を向上させるためおよび膜結合、内面化および血清タンパク質結合を促進するために使用され得る。コンジュゲートに使用される生物活性部分の例は、ＤＨＡｇ２、ＤＨＡ、ＧａｌＮＡｃおよびコレステロールを含む。これらの部分はリンカーまたはスペーサーによりジ−ｓｉＲＮＡ結合し得るか、または他の遊離ｓｉＲＮＡ末端に結合した追加のリンカーまたはスペーサーにより追加され得る。
【００４８】
分岐構造の存在は、個々の化学組成物の非分岐化合物と比較して、脳における組織保持のレベルを１００倍改善し、これは細胞保持および分布の新しいメカニズムを示唆する。本発明の化合物は脊髄および脳の分布を予想外に均一にする。さらに、本発明の化合物は種々の組織への効率的な全身送達および極めて高いレベルの組織蓄積を予想外に示す。
【００４９】
本発明の化合物はＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチング、ＰＭＯ、ＰＮＡを含む種々の治療オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、本発明の化合物はコンジュゲートされた疎水性部分をさらに含み、インビボおよびインビトロで予想外のサイレンシングおよび有効性を示す。
【００５０】
分岐オリゴヌクレオチド構造の非限定的な実施態様を図１、７〜９、１５〜１７および４０〜４５に示す。リンカー、スペーサーおよび分岐点の非限定的な例を図６に示す。
【００５１】
可変核酸
ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは２個、３個、４個、６個または８個の核酸を含む。ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチド２個の核酸を含む。別の実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは３個の核酸を含む。別の実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは４個の核酸を含む。別の実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは６個の核酸を含む。別の実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは８個の核酸を含む。別の実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは５個の核酸を含む。別の実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは７個の核酸を含む。
【００５２】
分岐オリゴヌクレオチドの実施態様において、各核酸は一本鎖であり、５’末端および３’末端を有し、各核酸は独立して、５’末端または３’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。ある実施態様において、各核酸は３’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。別の実施態様において、各核酸は５’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。ある実施態様において、各核酸リンカーに結合する。別の実施態様において、各核酸スペーサーに結合する。別の実施態様において、各核酸分岐点に結合する。
【００５３】
ある実施態様において、各一本鎖核酸は独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、核酸は少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含み、標的に対して相補性を有する。特定の実施態様において、相補性は＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％である。ある実施態様において、核酸は標的に対して完全な相補性を有する。
【００５４】
分岐オリゴヌクレオチドの実施態様において、各核酸は二本鎖であり、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、５’末端および３’末端を有する。ある実施態様において、各二本鎖核酸は独立して、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。ある実施態様において、各核酸はセンス鎖の３’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点と結合する。ある実施態様において、各核酸はアンチセンス鎖の３’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。別の実施態様において、各核酸はセンス鎖の５’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。別の実施態様において、各核酸はアンチセンス鎖の５’末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合する。ある実施態様において、各核酸はリンカーに結合する。別の実施態様において、各核酸はスペーサーに結合する。別の実施態様において、各核酸は分岐点に結合する。
【００５５】
ある実施態様において、各二本鎖核酸は独立して、少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、アンチセンス鎖は少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含み、標的に対する相補性を有する。特定の実施態様において、相補性は＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％である。ある実施態様において、アンチセンス鎖は標的に対して完全な相補性を有する。
【００５６】
修飾ヌクレオチド
ある実施態様において、各核酸は１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各核酸は化学修飾ヌクレオチドから成る。特定の実施態様において、各核酸の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００５７】
ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、化学修飾ヌクレオチドから成る。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖はともに、別の２’−メトキシ−ヌクレオチドおよび２’−フルオロ−ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端から１位および２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により、隣接するヌクレオチドに結合する。ある実施態様において、３’末端から１〜６位、または３’末端から１〜７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により、隣接するヌクレオチドに結合する。他の実施態様において、少なくとも５個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により、隣接するヌクレオチドに結合する。
【００５８】
分岐オリゴヌクレオチドの実施態様において、各リンカーは独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、ここでリンカーの任意の炭素または酸素は場合により窒素原子で置換されていてよいか、ヒドロキシ官能基を有するか、またはオキソ置換基を有する。ある実施態様において、各リンカーはエチレングリコール鎖である。別の実施態様において、各リンカーはアルキル鎖である。別の実施態様において、各リンカーはペプチドである。別の実施態様において、各リンカーはＲＮＡである。別の実施態様において、各リンカーはＤＮＡである。別の実施態様において、各リンカーはホスフェートである。別の実施態様において、各リンカーはホスホネートである。別の実施態様において、各リンカーはホスホルアミデートである。別の実施態様において、各リンカーはエステルである。別の実施態様において、各リンカーはアミドである。別の実施態様において、各リンカーはトリアゾールである。別の実施態様において、各リンカーは図７の式から選択される構造である。
【００５９】
式(Ｉ)の化合物
第二の態様において、式(Ｉ)：
【化１１】
2019503394.tif 000016
〔式中、
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、
式(Ｉ)は場合により１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳをさらに含み；
Ｂはそれぞれ独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓはそれぞれ独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
Ｎはそれぞれが１以上の化学的修飾を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡであり；そして
ｎは２、３、４、５、６、７または８である〕
の化合物が提供される。
【００６０】
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は表１の式(Ｉ−１)〜(Ｉ−９)から選択される構造を有する。
【表４】
2019503394.tif 000017
【００６１】
ある実施態様において，式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−１)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−２)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−３)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−４)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−５)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−６)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−７)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−８)である。別の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ−９)である。
【００６２】
式(Ｉ)の化合物の実施態様において、各リンカーは独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、ここで、リンカーの任意の炭素または酸素は場合により窒素原子により置換されていてよいか、ヒドロキシル置換基を有するか、またはオキソ置換基を有する。式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、各リンカーはエチレングリコール鎖である。別の実施態様において、各リンカーはアルキル鎖である。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはペプチドである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはＲＮＡである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはＤＮＡである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはホスフェートである。別の実施態様において、各リンカーはホスホネートである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはホスホルアミデートである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはエステルである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはアミドである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーはトリアゾールである。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、各リンカーは図７の式から選択される構造である。
【００６３】
式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、Ｂは多価有機種である。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、Ｂは多価有機種の誘導体である。式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、Ｂはトリオールまたはテトラオール誘導体である。別の実施態様において、Ｂはトリ−またはテトラカルボン酸誘導体。別の実施態様において、Ｂはアミン誘導体である。別の実施態様において、Ｂはトリ−またはテトラ−アミン誘導体である。別の実施態様において、Ｂはアミノ酸誘導体である。式(Ｉ)の化合物の別の実施態様において、Ｂは図６の式から選択される。
【００６４】
多価有機種は炭素および３以上の原子価(すなわち、上で定義されるＳ、ＬまたはＮのような部分を有する結合点)を含む部分である。多価有機種の非限定的な例は、トリオール(例えば、グリセロール、フロログルシノールなど)、テトラオール(例えば、リボース、ペンタエリスリトール、１，２，３，５−テトラヒドロキシベンゼンなど)、トリカルボン酸(例えば、コハク酸、１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸、トリメシン酸など)、テトラカルボン酸(例えば、エチレンジアミン四酢酸、ピロメリット酸など)、三級アミン(例えば、トリプロパルギルアミン、トリエタノールアミンなど)、トリアミン(例えば、ジエチレントリアミンなど)、テトラミンおよびヒドロキシル、チオール、アミノおよび／またはカルボキシル部分(例えば、リシン、セリン、システインなどのようなアミノ酸)の組合せを含む種を含む。
【００６５】
式(Ｉ)の化合物の実施態様において、各核酸は１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。式(Ｉ)の化合物の実施態様において、各核酸は化学修飾ヌクレオチドから成る。式(Ｉ)の化合物の特定の実施態様において、各核酸の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００６６】
ある実施態様において、各アンチセンス鎖は独立して、表２の群から選択される５’末端基Ｒを含む。
【表５】
2019503394.tif 000018
【００６７】
ある実施態様において、ＲはＲ１である。別の実施態様において、ＲはＲ２である。別の実施態様において、ＲはＲ３である。別の実施態様において、ＲはＲ４である。別の実施態様において、ＲはＲ５である。別の実施態様において、ＲはＲ６である。別の実施態様において、ＲはＲ７である。別の実施態様において、ＲはＲ８である。
【００６８】
式(ＩＩ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＩＩ)：
【化１２】
2019503394.tif 000019
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびそれらの化学修飾誘導体から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびそれらの化学修飾誘導体から選択され；
−はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして
---はそれぞれ、個々に塩基対相互作用またはミスマッチを表す〕
の構造を有する。
【００６９】
特定の実施態様において、式(ＩＩ)の構造はミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(ＩＩ)の構造は１つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＩＩ)の化合物は２つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＩＩ)の化合物は３つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＩＩ)の化合物は４つのミスマッチを含む。ある実施態様において、各核酸は化学修飾ヌクレオチドから成る。
【００７０】
特定の実施態様において、式(ＩＩ)の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾ヌクレオチドである。他の実施態様において、式(ＩＩ)の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾ヌクレオチドである。
【００７１】
式(ＩＩＩ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＩＩＩ)：
【化１３】
2019503394.tif 000020
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｘはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する。
【００７２】
ある実施態様において、Ｘは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。ある実施態様において、Ｘは２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。ある実施態様において、Ｙは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。ある実施態様において、Ｙは２’−Ｏ−メチル修飾されたアデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。
【００７３】
特定の実施態様において、式(ＩＩＩ)の構造はミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(ＩＩＩ)の構造は１つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＩＩＩ)の構造は２つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＩＩＩ)の化合物３つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＩＩＩ)の化合物４つのミスマッチを含む。
【００７４】
式(ＩＶ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＩＶ)：
【化１４】
2019503394.tif 000021
〔式中、
Ａは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むアデノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル修飾を含むアデノシンであり；
Ｇは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むグアノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル修飾を含むグアノシンであり；
Ｕは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むウリジンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル修飾を含むウリジンであり；
Ｃは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むシチジンであり；そして
Ｃは２’−Ｏ−メチル修飾を含むシチジンである〕
の構造を有する。
【００７５】
式(Ｖ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｖ)：
【化１５】
2019503394.tif 000022
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびそれらの化学修飾誘導体から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびそれらの化学修飾誘導体から選択され；
−はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして
---はそれぞれ、個々に塩基対相互作用またはミスマッチを表す〕
の構造を有する。
【００７６】
特定の実施態様において、式(Ｖ)の構造はミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(Ｖ)の構造は１つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(Ｖ)の化合物は２つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(Ｖ)の化合物は３つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(Ｖ)の化合物は４つのミスマッチを含む。ある実施態様において、各核酸は化学修飾ヌクレオチドから成る。
【００７７】
特定の実施態様において、式(ＩＩ)の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾ヌクレオチドである。他の実施態様において、式(ＩＩ)の構造のＸの＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾ヌクレオチドである。
【００７８】
式(ＶＩ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＶＩ)：
【化１６】
2019503394.tif 000023
〔式中、
Ｘはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｘはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドであり；
Ｙはそれぞれ、独立して２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する。
(ＶＩ)
【００７９】
特定の実施態様において、Ｘは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。ある実施態様においてＸは２’−Ｏ−メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。ある実施態様において、Ｙは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。ある実施態様において、Ｙは２’−Ｏ−メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンから成る群から選択される。
【００８０】
特定の実施態様において、式(ＶＩ)の構造はミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(ＶＩ)の構造は１つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＶＩ)の化合物は２つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＶＩ)の化合物は３つのミスマッチを含む。別の実施態様において、式(ＶＩ)の化合物は４つのミスマッチを含む。
【００８１】
式(ＶＩＩ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(ＶＩＩ)：
【化１７】
2019503394.tif 000024
〔式中、
Ａは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むアデノシンであり；
Ａは２’−Ｏ−メチル修飾を含むアデノシンであり；
Ｇは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むグアノシンであり；
Ｇは２’−Ｏ−メチル修飾を含むグアノシンであり；
Ｕは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むウリジンであり；
Ｕは２’−Ｏ−メチル修飾を含むウリジンであり；
Ｃは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むシチジンであり；そして
Ｃは２’−Ｏ−メチル修飾を含むシチジンであり；
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そして
Ｙはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドである〕
の構造を有する。
【００８２】
可変リンカー
式(Ｉ)の化合物の実施態様において、ＬはＬ１：
【化１８】
2019503394.tif 000025
の構造を有する。Ｌ１の実施態様において、ＲはＲ３であり、ｎは２である。
【００８３】
式(ＩＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ１の構造を有する。式(ＩＩＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ１の構造を有する。式(ＩＶ)の構造の実施態様において、ＬはＬ１の構造を有する。式(Ｖ)の構造の実施態様において、ＬはＬ１の構造を有する。式(ＶＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ１の構造を有する。式(ＶＩＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ１の構造を有する。
【００８４】
式(Ｉ)の化合物の実施態様において、ＬはＬ２：
【化１９】
2019503394.tif 000026
の構造を有する。Ｌ２の実施態様において、ＲはＲ３であり、ｎは２である。
【００８５】
式(ＩＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ２の構造を有する。式(ＩＩＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ２の構造を有する。式(ＩＶ)の構造の実施態様において、ＬはＬ２の構造を有する。式(Ｖ)の構造の実施態様において、ＬはＬ２の構造を有する。式(ＶＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ２の構造を有する。式(ＶＩＩ)の構造の実施態様において、ＬはＬ２の構造を有する。
【００８６】
送達系
第三の態様において、式(ＶＩＩＩ)：
【化２０】
2019503394.tif 000027
〔式中、
Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され、
ここで、式(ＶＩＩＩ)は場合により１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳをさらに含んでよく；ここで
Ｂはそれぞれ独立して、多価有機種またはその誘導体であり；
Ｓはそれぞれ独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびそれらの組合せから選択され；
各ｃＮＡは独立して、１以上の化学修飾を含むキャリア核酸であり；そして
ｎは２、３、４、５、６、７または８である〕
の構造を有する治療用核酸のための送達系が本明細書で提供される。
【００８７】
送達系のある実施態様において、Ｌはエチレングリコール鎖である。送達系の別の実施態様において、Ｌはアルキル鎖である。送達系の別の実施態様において、Ｌはペプチドである。送達系の別の実施態様において、ＬはＲＮＡである。送達系の別の実施態様において、ＬはＤＮＡである。送達系の別の実施態様において、Ｌはホスフェートである。送達系の別の実施態様において、Ｌはホスホネートである。送達系の別の実施態様において、Ｌはホスホルアミデートである。送達系の別の実施態様において、Ｌはエステルである。送達系の別の実施態様において、Ｌはアミドである。送達系の別の実施態様において、Ｌはトリアゾールである。
【００８８】
送達系のある実施態様において、Ｓはエチレングリコール鎖である。別の実施態様において、Ｓはアルキル鎖である。送達系の別の実施態様において、Ｓはペプチドである。別の実施態様において、ＳはＲＮＡである。送達系の別の実施態様において、ＳはＤＮＡである。送達系の別の実施態様において、Ｓはホスフェートである。送達系の別の実施態様において、Ｓはホスホネートである。送達系の別の実施態様において、Ｓはホスホルアミデートである。送達系の別の実施態様において、Ｓはエステルである。別の実施態様において、Ｓはアミドである。別の実施態様において、Ｓはトリアゾールである。
【００８９】
送達系のある実施態様において、ｎは２である。送達系の別の実施態様において、ｎは３である。送達系の別の実施態様において、ｎは４である。送達系の別の実施態様において、ｎは５である。送達系の別の実施態様において、ｎは６である。送達系の別の実施態様において、ｎは７である。送達系の別の実施態様において、ｎは８である。
【００９０】
特定の実施態様において、各ｃＮＡは＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００９１】
ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は表３の式(ＶＩＩＩ−１)〜(ＶＩＩＩ−９)から選択される構造を有する。
【表６】
2019503394.tif 000028
【００９２】
ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−１)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−２)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−３)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−４)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−５)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−６)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−７)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−８)の構造である。ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物は式(ＶＩＩＩ−９)の構造である。
【００９３】
ある実施態様において、式(ＶＩＩＩ)の化合物(例えば、式(ＶＩＩＩ−１)〜(ＶＩＩＩ−９)を含む)、各ｃＮＡは独立して、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ｃＮＡは独立して、化学修飾ヌクレオチドから成る。
【００９４】
ある実施態様において、送達系はさらにｎ個の治療用核酸(ＮＡ)を含み、ここで各ＮＡは少なくとも１個のｃＮＡにハイブリダイズしている。ある実施態様において、送達系は２個のＮＡから成る。別の実施態様において、送達系は３個のＮＡから成る。別の実施態様において、送達系は４個のＮＡから成る。別の実施態様において、送達系は５個のＮＡから成る。別の実施態様において、送達系は６個のＮＡから成る。別の実施態様において、送達系は７個のＮＡから成る。別の実施態様において、送達系は８個のＮＡから成る。
【００９５】
ある実施態様において、各ＮＡは独立して、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ＮＡは独立して、１６〜２０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ＮＡは独立して、１６個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、１７個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、１８個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、１９個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、２０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００９６】
ある実施態様において、各ＮＡは少なくとも２個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施態様において、各ＮＡは少なくとも３個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施態様において、各ＮＡは少なくとも４個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施態様において、各ＮＡは少なくとも５個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。別の実施態様において、各ＮＡは少なくとも６個のヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。ある実施態様において、オーバーハングのヌクレオチドはホスホロチオエート結合により結合する。
【００９７】
ある実施態様において、各ＮＡは独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、ｍｉＲＮＡｓ、ギャップマー、ミックスマーまたはガイドＲＮＡから成る群から選択される。ある実施態様において、各ＮＡは独立してＤＮＡである。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、ｓｉＲＮＡである。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、アンタゴｍｉＲである。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、ｍｉＲＮＡである。別の実施態様において、各ＮＡは独立してギャップマーである。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、ミックスマーである。別の実施態様において、各ＮＡは独立して、ガイドＲＮＡである。ある実施態様において、各ＮＡは同一である。ある実施態様において、各ＮＡは同一でない。
【００９８】
ある実施態様において、ｎ個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む送達系は式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は２個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を含む。別の実施態様において、送達系は３個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は４個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は５個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は６個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は７個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は８個の治療用核酸(ＮＡ)をさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)および本明細書に記載のその実施態様から選択される構造を有する。
【００９９】
ある実施態様において、送達系は、ＲがＲ３であり、ｎが２である構造Ｌ１またはＬ２のリンカーをさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)から選択される構造を有する。別の実施態様において、送達系は、ＲがＲ３であり、ｎが２である構造Ｌ１のリンカーをさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)から選択される構造を有する。別の実施態様において、送達系は、ＲがＲ３であり、ｎが２である構造Ｌ２のリンカーをさらに含む式(Ｉ)、式(ＩＩ)、式(ＩＩＩ)、式(ＩＶ)、式(Ｖ)、式(ＶＩ)、式(ＶＩＩ)から選択される構造を有する。
【０１００】
送達系の実施態様において、送達の標的は脳、肝臓、皮膚、腎臓、脾臓、膵臓、結腸、脂肪、肺、筋肉および胸腺から成る群から選択される。ある実施態様において、送達の標的は脳である。別の実施態様において、送達の標的は脳の線条体である。別の実施態様において、送達の標的は脳の大脳皮質である。別の実施態様において、送達の標的は脳の線条体である。ある実施態様において、送達の標的は肝臓である。ある実施態様において、送達の標的は皮膚である。ある実施態様において、送達の標的は腎臓である。ある実施態様において、送達の標的は脾臓である。ある実施態様において、送達の標的は膵臓である。ある実施態様において、送達の標的は結腸である。ある実施態様において、送達の標的は脂肪である。ある実施態様において、送達の標的は肺である。ある実施態様において、送達の標的は筋肉である。ある実施態様において、送達の標的は胸腺である。ある実施態様において、送達の標的は脊髄である。
【０１０１】
本発明において記載される方法は、本明細書に開示される特定の方法および実験条件に限定されず、従って、方法および条件は変わってよいと解されるべきである。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施態様のみを表すことを目的とし、限定することを意図しない。
【０１０２】
さらに、特に示されない限り、本明細書に記載の実験は当分野の技術範囲である従来の分子および細胞生物学的ならびに免疫学的技術を使用する。このような技術は当業者に既知であり、文献において詳細に説明される。例えば、全ての補遺を含むAusubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1987-2008)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) by MR Green and J. Sambrook and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)を参照。
【０１０３】
定義
本明細書において特に定義しない限り、ここで使用される科学的および技術的用語は当業者により一般的に理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧性がある場合、本明細書において提供される定義はあらゆる辞書または外的定義の上に立つ。文脈から他の解釈が必要でない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。「含む」ならびに「含まれる」のような他の形態の使用は、限定的ではない。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「核酸」とは、それぞれリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの鎖から成るＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「治療用核酸」とは、疾患に関連するｍＲＮＡと部分的なまたは完全な相補性を有し、疾患に関連するｍＲＮＡと相互作用し、ｍＲＮＡ発現のサイレンシングを介在する核酸分子(例えば、リボ核酸)をいう。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「キャリア核酸」とは、治療用核酸と相補性を有し、治療用核酸とハイブリッド形成する核酸分子(例えば、リボ核酸)をいう。
【０１０７】
本明細書で使用される用語「３’末端」とは、リボース環の３’炭素に非修飾ヒドロキシル基を含む核酸の末端をいう。
【０１０８】
本明細書で使用される用語「５’末端」とは、リボース環の５’炭素に結合したホスフェート基を含む核酸の末端をいう。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「ヌクレオシド」とは、ヘテロ環式塩基およびその糖から成る分子をいう。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの３’または５’糖ヒドロキシル基にホスフェート基を有するヌクレオシドをいう。
【０１１１】
本明細書で使用される用語「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)経路を誘発する小分子干渉二本鎖ＲＮＡをいう。ｓｉＲＮＡ分子は多様な長さであってよく(一般には１８〜３０塩基対)、それらの標的ｍＲＮＡに対する種々の程度の相補性を含み得る。用語「ｓｉＲＮＡ」は２個の別々の二本鎖ならびに二本鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を含む。
【０１１２】
本明細書で使用される用語「アンチセンス鎖」とは、標的遺伝子に対してある程度の相補性を含む二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖をいう。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「センス鎖」とは、アンチセンス鎖に対する相補性を含む二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖をいう。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「化学修飾ヌクレオチド」もしくは「ヌクレオチドアナログ」または「改変ヌクレオチド」もしくは「修飾ヌクレオチド」とは、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む非標準ヌクレオチドをいう。例示的なヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドの特定の化学的特性を変化させるが、その意図した機能を果たすためのヌクレオチドの能力を維持できるように、任意の位置で修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例は、Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載のような５位、例えば５−(２−アミノ)プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど；６位、例えば６−(２−アミノ)プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンの８位、例えば８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどを含む。ヌクレオチドアナログはまた、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−修飾(例えば、アルキルされた、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンまたは当分野で知られる他のもの)ヌクレオチド；および他のヘテロ環修飾ヌクレオチドアナログを含む。
【０１１５】
ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分の修飾を含んでよい。例えば２’ＯＨ−基はＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲまたはＯＲから選択される得基により置換されていてよく、ここでＲは置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能性のある修飾は米国特許第５，８５８，９８８号および第６，２９１，４３８号に記載されている修飾を含む。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「代謝的に安定化された」とは、２’−ヒドロキシル基から２’−Ｏ−メチル基に化学修飾されたリボヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をいう。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「ホスホロチオエート」とは、硫黄を有するホスフェート基の１以上の酸素原子を置換することにより修飾されたヌクレオチドのホスフェート基をいう。
【０１１８】
本明細書で使用される用語「エチレングリコール鎖」とは、式((ＣＨ２ＯＨ)２)を有する炭素鎖をいう。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「アルキル鎖」とは、非環式不飽和炭化水素鎖をいう。本発明に関連して「アルキル鎖」は、限定されないが、直鎖、分岐鎖および環式不飽和炭化水素を含む。
【０１２０】
本明細書で使用される用語「アミド」とは、アミノカルボニル官能基に結合したアルキルまたは芳香族基をいう。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「ヌクレオシド間」および「ヌクレオチド間」とはそれぞれ、ヌクレオシド間およびヌクレオチド間の結合をいう。
【０１２２】
本明細書で使用される用語「トリアゾール」とは、位置が変化して複数の異性体をもたらし得る２個の炭素および３個の窒素の５員環を有する、式(Ｃ２Ｈ３Ｎ３)を有するヘテロ環化合物をいう。
【０１２３】
本明細書で使用される用語「末端基」とは、炭素鎖または核酸末端の基をいう。
【０１２４】
本明細書で使用される用語「脂溶性アミノ酸」とは、疎水性部分(例えば、アルキル鎖または芳香族環)を含むアミノ酸をいう。
【０１２５】
本明細書で使用される用語「アンタゴｍｉＲ」とは、ｍｉＲＮＡ活性阻害剤として機能し得る核酸をいう。
【０１２６】
本明細書で使用される用語「ギャップマー」とは、ＲＮａｓｅ  Ｈ開裂を誘導するのに十分な長さのデオキシヌクレオチドモノマーの中心ブロックを含むキメラアンチセンス核酸をいう。デオキシヌクレオチドブロックはリボヌクレオチドモノマーまたは修飾を含むリボヌクレオチドモノマーと隣接する。
【０１２７】
本明細書で使用される用語「ミックスマー」とは、ロックド核酸(ＬＮＡ)とＤＮＡの混合物を含む核酸をいう。
【０１２８】
本明細書で使用される用語「ガイドＲＮＡ」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編成系において使用されるような、プロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)配列に隣接したまたは１塩基上流のゲノムにおける特定の配列に相補性を有する核酸をいう。
【０１２９】
本明細書で使用される用語「送達標的」とは、分岐オリゴヌクレオチド組成物を送達することが望まれる身体の臓器または部分をいう。
【０１３０】
本明細書で使用される用語「ジ−ｓｉＲＮＡ」とは、分岐オリゴヌクレオチド構造を含み、治療用核酸としてｓｉＲＮＡ分子を含む本発明の分子をいう。
【０１３１】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」とは、アミンおよびカルボキシル官能基ならびにアミノ酸に特異的な側鎖(Ｒ)を含む分子をいう。ある実施態様において、アミノ酸は式：
【化２１】
2019503394.tif 000029
の構造を有する。
【０１３２】
別の実施態様において、「アミノ酸」は式：
【化２２】
2019503394.tif 000030
の構造を有するペプチドまたはタンパク質の構成成分残基を示し得る。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、アミノ酸はタンパク質原性アミノ酸の群から選択される。他の実施態様において、アミノ酸はＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸である。他の実施態様において、アミノ酸は合成アミノ酸(例えば、β−アミノ酸)である。
【０１３４】
本明細書に記載の特定のヌクレオチド間結合(例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート)は、生理学的ｐＨで−１の形式電荷を含み、前記形式電荷はカチオン性部分、例えばナトリウムもしくはカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムもしくはマグネシウムのようなアルカリ土類金属またはアンモニウムもしくはグアニジニウムイオンにより相殺されると解される。
【０１３５】
ヌクレオチドのホスフェート基もまた、硫黄(例えば、ホスホロチオエート)を有するホスフェート基の１以上の酸素原子を置換することにより、または例えばEckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25、Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85および米国特許出願番号第5,684,143号に記載されるように、ヌクレオチドがその意図する機能を果たすことを可能にする他の置換をすることにより修飾され得る。上で参照される修飾のいくつか(例えば、ホスフェート基修飾)は、好ましくは、例えば前記アナログを含むポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでの加水分解の速度を低下させる。
【０１３６】
送達および分布
別の態様において、核酸が選択的に送達されるように本明細書に記載の分岐オリゴヌクレオチドを患者に投与することを含む、本明細書に記載の核酸を選択的に患者の臓器へ送達する方法が提供される。ある実施態様において、臓器は肝臓である。別の実施態様において、臓器は腎臓である。別の実施態様において、臓器は脾臓である。別の実施態様において、臓器は心臓である。別の実施態様において、臓器は脳である。別の実施態様において、核酸。
【０１３７】
本明細書に記載の組成物は、代謝的に安定なオリゴヌクレオチド(例えば、ｓｉＲＮＡ)の単純で、効果的な、非毒性の送達を促進し、インビボで一定範囲の組織において治療標的の強力なサイレンシングを促進する。
【０１３８】
図１１に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡは、線条体内注射後、マウス脳の注射された半球全体に分布する。一本鎖非コンジュゲートｓｉＲＮＡは一次ニューロンにおけるｍＲＮＡをサイレンシングすることができ、ジ−ｓｉＲＮＡ構造は修飾オリゴヌクレオチドの増強された組織分布および組織保持に不可欠である。コレステロールのような他のコンジュゲートは保持されるが、注射部位から急勾配で拡散して離れることが示される。２つの一本鎖ホスホロチオエートテイルのわずかな疎水性は、組織保持を支援する一方で、脳の注射された同側半球全体への広範かつ均一な分布もまた可能にする。
【０１３９】
図１２に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡの単回注射は注射部位の同側および対側の両方で検出され、これは拡散が注射された半球に限られず、正中線を越えて注射されていない側でも起こっていることを示す。脳室内を含む他の注射方法は、わずか一回の注射で両側分布も促すことができる。
【０１４０】
ジ−ｓｉＲＮＡは、脳に線条体内注射されたとき、極めて独特な細胞分布を示す。蛍光標識したジ−ｓｉＲＮＡは大脳皮質においてニューロンに優先的に局在化するように見える。この選択的特徴はこれらの化合物に特異的であり、コレステロールのような細胞型嗜好性を示さない他のｓｉＲＮＡコンジュゲートにはあてはまらない。
【０１４１】
ジ−ｓｉＲＮＡは線条体における線維路への局在化を示すが、大脳皮質のニューロン細胞体内に存在する。大脳皮質への移動は拡散であり得るか、または線条体線維路による逆行性輸送であり得る。逆行性輸送が一部重要であるという理論は大脳皮質のいくつかの領域が十分なニューロン侵入を示すが、隣接領域のニューロンはジ−ｓｉＲＮＡ取り込みを全く示さないという事実により支持される。
【０１４２】
ジ−ｓｉＲＮＡの治療的に適切な単回脳注射は、脳全体へのジ−ｓｉＲＮＡの広範な分布をもたらす。図３１〜３２に示す分布量は先行技術において前例がなく、ジ−ｓｉＲＮＡの有望な治療送達系であることを示す。
【０１４３】
単回静脈注射後、ジ−ｓｉＲＮＡは全身への広範な分布を示す。図３７に示すように、多量のジ−ｓｉＲＮＡがマウスの肝臓、皮膚、脳、腎臓、脾臓、膵臓、結腸、脂肪、肺、筋肉および胸腺において検出された。静脈注射後にジ−ｓｉＲＮＡが脳に存在するという発見はまた、ジ−ｓｉＲＮＡ構造が効率的に血液−脳関門を通過することを示す。
【０１４４】
サイレンシング
いくつかの実施態様において、本発明の化合物は脳における単回注射において、毒性の兆候なく、インビボで約９０％の線条体サイレンシングおよび約６５％の皮質サイレンシングを促進する。いくつかの実施態様において、本発明の化合物は、髄腔内注射で脊髄の全領域にわたって約６０％のサイレンシングを示す。
【０１４５】
ジ−ｓｉＲＮＡの単回注射はマウス脳の線条体および大脳皮質の両方において強いサイレンシングを誘発する。この有効性レベルは非コンジュゲートｓｉＲＮＡについて以前に示されていない。ジ−ｓｉＲＮＡは視覚的に線条体内の線維路に取り込まれるように見えるが、観察された有効性は線条体ニューロンがジ−ｓｉＲＮＡを多量に内面化することを明確に示す。実験において、２ｎｍｏｌのジ−ｓｉＲＮＡ(４ｎｍｏｌの対応するアンチセンスＨＴＴ鎖)を線条体内注射した。注射７日後、動物を屠殺した。線条体および大脳皮質から３００μｍの脳切片から採取した組織パンチで回収した。種々脳領域、肝臓および腎臓に存在するジ−ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は、該鎖とハイブリッド形成させるためのＣｙ３ラベル相補的ＰＮＡおよび組織１ｍｇあたりのオリゴのｎｇ量を定量するためのＨＰＬＣを使用して定量された。
【０１４６】
図１０に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡはＨｅＬａ細胞における脂質介在トランスフェクション後に単一の二本鎖と比較して同等の有効性を示し、これはＲＩＳＣ導入が２つの二本鎖ｓｉＲＮＡをリンカーにつなぐことによって妨害されないことを示す。ジ−ｓｉＲＮトランスフェクトなしではＨｅＬａ細胞において有効ではないが、一次皮質ニューロンでは、１つのホスホロチエートテイルで少なくとも６０％サイレンシングを誘発するのに十分であり、これはホスホロチエート化が製剤なしでｓｉＲＮＡを一次ニューロンへ送達するための有効な方法であることを示す。
【０１４７】
図１３に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡの単回投与はマウス脳の線条体および大脳皮質の両方において強いサイレンシングを誘発する。Ｃｙ３標識ジ−分岐オリゴを含む錐体ニューロンの６３Ｘ画像は、ジ−ｓｉＲＮＡが視覚的に線条体における繊維路に取り込まれるように見えるが、明確に観察された有効性は線条体ニューロンがジ−ｓｉＲＮＡを多量に吸収していることを示す。
【０１４８】
図１４に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡは髄腔内注射後に脊髄全体に強く均一なサイレンシングを示す。脊髄の腰部領域におけるジ−ｓｉＲＮＡ単回注射は頸部、胸部および腰部領域で同程度ｍＲＮＡをサイレンシングし、均一かつ長い範囲の分布を示す。
【０１４９】
図２４に示すように、Ｃｙ３標識ジ−ｓｉＲＮＡはマウス脳の線条体および大脳皮質の両方において強いサイレンシングを誘発する。ｍＲＮＡ発現レベルは分岐オリゴヌクレオチド組成物へのＣｙ３の付加が非標識ジ−ｓｉＲＮＡと比較してサイレンシングを強化することを示す。
【０１５０】
図２３〜２４に示すように、単回線条体内注射はマウス脳の大脳皮質および線条体の両方でサイレンシングをもたらしたが、肝臓または腎臓において顕著なサイレンシングをもたらさなかった。これは分岐オリゴヌクレオチドが目的の臓器を特異的に標的化できることを示す。
【０１５１】
図２６に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡの単回注射はマウス脳の線条体および大脳皮質の両方において、注射後２週間強いサイレンシングを維持し続ける。ジ−ｓｉＲＮＡは少なくとも２週間インビボで安定かつ有効である。
【０１５２】
図３３および３４に示すように、治療的に適切なジ−ｓｉＲＮＡの単回注射は脳の複数の領域で顕著なサイレンシングを誘導する。これは治療的に適切な単回注射後の脳における広範なｓｉＲＮＡサイレンシングの最初の例である。これらの結果はジ−ｓｉＲＮＡがＲＮＡ治療に効果的な選択肢であることを示す。
【０１５３】
修飾ＲＮＡサイレンシング剤
本発明の特定の態様において、上記の本発明のＲＮＡサイレンシング剤(またはそのいずれかの一部)はその剤の活性がさらに改善されるように修飾され得る。例えば、上記のＲＮＡサイレンシング剤は下記の修飾のいずれかで修飾される。修飾は一部で標的識別の更なる強化、剤の安定性の強化(例えば分解の阻止)、細胞取り込みの促進、標的有効性の強化、結合(例えば標的への)における有効性の改善、剤に対する患者の耐性の改善および／または毒性の低減に役立ち得る。
【０１５４】
１)標的識別を強化するための修飾
特定の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は単一ヌクレオチド標的識別を強化するために不安定化したヌクレオチドで置換され得る(参照により本明細書に包含させる２００７年１月２５日に出願された米国特許出願番号第１１／６９８，６８９号および２００６年１月２５日米国仮出願番号第６０／７６２，２２５号を参照)。このような修飾は標的ｍＲＮＡ(例えば機能獲得変異ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性に顕著に影響を与えることなく、非標的ｍＲＮＡ(例えば野生型ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性を無効にするのに十分であり得る。
【０１５５】
好ましい実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、そのアンチセンス鎖における少なくとも１つのユニバーサルヌクレオチドの導入により修飾される。ユニバーサルヌクレオチドは４つの標準ヌクレオチド塩基(例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ)のいずれかと無差別に塩基対を形成できる塩基部分を含む。ユニバーサルヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤および標的ｍＲＮＡのガイド鎖により形成される二本鎖の安定性に比較的与える影響が小さいため、好ましい。例示的なユニバーサルヌクレオチドは、デオキシイノシン(例えば２’−デオキシイノシン)、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−アザ−２’−デオキシイノシン、ＰＮＡ−イノシン、ノルホリノ−イノシン、ＬＮＡ−イノシン、ホスホルアミデート−イノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−イノシンおよび２’−ＯＭｅ−イノシンから成る群から選択されるイノシン塩基部分またはイノシンアナログ塩基部分を有するヌクレオチドから選択される。特定の好ましい実施態様において、ユニバーサルヌクレオチドはイノシン残基またはその天然に存在するアナログである。
【０１５６】
特定の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性を決定するヌクレオチド(すなわち、疾患関連多型を認識するヌクレオチド)から５ヌクレオチド以内に少なくとも１つの不安定化ヌクレオチドを導入することにより修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性を決定するヌクレオチドから５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内の位置で導入され得る。例示的な実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性を決定するヌクレオチドから３ヌクレオチドの位置で(すなわち、不安定化ヌクレオチドと特異性を決定するヌクレオチドの間に２つの不安定化ヌクレオチドが存在するように)導入される。二本鎖または鎖の一部(例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ)を有するＲＮＡサイレンシング剤において、不安定化ヌクレオチドは特異性を決定するヌクレオチドを含まない鎖または鎖の一部に導入され得る。好ましい実施態様において、不安定化ヌクレオチドは特異性を決定するヌクレオチドを含む同一の鎖または鎖の一部に導入される。
【０１５７】
２)有効性および特異性を強化するための修飾
特定の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は改変されて、非対称デザインルールにより介在ＲＮＡｉにおいて強化された有効性および特異性を容易にすることがある(米国特許番号第８，３０９，７０４号、第７，７５０，１４４号、第８，３０４，５３０号、第８，３２９，８９２号および第８，３０９，７０５号参照)。このような改変はｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖(例えば、本発明の方法を用いてデザインされたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから製造されたｓｉＲＮＡ)のセンス鎖に有利なＲＩＳＣへの導入を容易にし、従って、標的の開裂およびサイレンシングの有効性を増加させ、改善する。好ましくはＲＮＡサイレンシング剤の非対称性を、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端(ＡＳ３’)とセンス鎖５’末端(Ｓ５’)の結合強度または塩基対強度と比較すると、前記ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端(ＡＳ５’)とセンス鎖３’末端(Ｓ３’)の塩基対強度を低下させることにより強化させる。
【０１５８】
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一またはアンチセンス鎖の５’末端と３’センス鎖部分の３’末端の間のＧ：Ｃ塩基対が第一またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端の間のＧ：Ｃ塩基対より少なくなるように強化され得る。別の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一またはアンチセンス鎖の５’末端と３’センス鎖部分の３’末端の間に少なくとも１つのミスマッチ塩基が存在するように強化され得る。好ましくは、ミスマッチ塩基はＧ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕから成る群から選択される。別の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、少なくとも１つの揺らぎ塩基対、例えば、第一またはアンチセンス鎖の５’末端と３’センス鎖部分の３’末端の間にＧ：Ｕが存在するように強化され得る。別の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、稀少ヌクレオチド、例えば、イノシン(Ｉ)を含む塩基対が少なくとも１つ存在するように強化され得る。好ましくは、塩基対はＩ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃから成る群から選択される。さらに別の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、修飾ヌクレオチドを含む塩基対が少なくとも１つ存在するように強化され得る。好ましい実施態様において、修飾ヌクレオチドは２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇおよび２，６−ジアミノ−Ａから成る群から選択される。
【０１５９】
３)向上した安定性を有するＲＮＡサイレンシング剤
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は細胞培養のための血清または生育培地における安定性を改善するために修飾され得る。安定性を強化するために、３’−残基は分解に対して安定化され得て、例えば、それらはプリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドから成るように選択され得る。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾アナログへの置換、例えば、ウリジンの２’−デオキシチミジンへの置換は許容され、ＲＮＡ干渉の効率に影響を与えない。
【０１６０】
好ましい態様において、本発明は対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比較してインビボ安定性が強化されるように修飾ヌクレオチドで内部ヌクレオチドを置換することにより修飾される第一鎖および第二鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤に関する。本明細書に定義するように、「内部」ヌクレオチドは核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外のいずれかの位置で生じるヌクレオチドである。内部ヌクレオチドは一本鎖分子内または二重鎖もしくは二本鎖分子の一鎖内に存在し得る。ある実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は少なくとも１つの内部ヌクレオチドの置換により修飾される。別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。さらに別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は全ての内部ヌクレオチドの置換により修飾される。
【０１６１】
本発明の好ましい実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは標的特異的サイレンシング活性、例えば、ＲＮＡｉ介在活性または翻訳抑制活性が実質的に影響を受けない位置、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端の領域に位置し得る。特に、末端は修飾ヌクレオチドアナログを取り込むことで安定化され得る。
【０１６２】
例示的なヌクレオチドアナログは糖修飾および／または主鎖修飾リボヌクレオチドを含む(すなわち、ホスフェート−糖主鎖に対する修飾を含む)。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は修飾されて少なくとも１つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含み得る。例示的な主鎖修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに結合するホスホエステル基は修飾された基、例えば、ホスホチオエート基により置換される。例示的な糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’ＯＨ基はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮ(ＲはＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである)から選択される基により置換される。
【０１６３】
具体的な実施態様において、修飾は２’−フルオロ、２’−アミノおよび／または２’−チオ修飾である。特に好ましい修飾は２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジンおよび／または５−アミノ−アリル−ウリジンを含む。特定の実施態様において、２’−フルオロリボヌクレオチドは全てウリジンおよびシチジンである。さらなる例示的な修飾は５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジンおよび５−フルオロ−ウリジンを含む。２’−デオキシ−ヌクレオチドおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドは、本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用され得る。さらなる修飾残基はデオキシ−脱塩基、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン、プソイドウリジン、プリン  リボヌクレオシドおよびリバビリンを含む。特に好ましい実施態様において、２’部分は結合部分が２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドであるようなメチル基である。
【０１６４】
例示的な実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はロックド核酸(ＬＮＡ)を含む。ＬＮＡはヌクレアーゼ活性に耐性(極めて安定)であり、ｍＲＮＡについて一ヌクレオチド識別を備える糖修飾ヌクレオチドを含む(Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81)。これらの分子は２’−デオキシ−２’’−フルオロウリジンのような可能性のある修飾を含む２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸を含む。さらに、ＬＮＡは糖部分を３’−エンド配置に拘束することによりオリゴヌクレオチドの特異性を増大させ、それによって塩基対合のためのヌクレオチドを予め編成し、オリゴヌクレオチドの融点を１塩基あたり１０℃まで上昇させる。
【０１６５】
別の例示的な実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖−ホスフェート部分が、ヌクレアーゼ消化に対して耐性が高く、改善された分子への結合特異性を付与するポリアミド主鎖を形成することができる中性２−アミノエチルグリシン部分で置換された修飾ヌクレオチドを含む(Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500)。
【０１６６】
核酸修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの非天然核酸塩基を含むクレオチドもまた、好ましい。塩基はアデノシンデアミナーゼの活性をブロックするために修飾され得る。例示的な修飾核酸塩基は、限定されないが、５位で修飾されたウリジンおよび／またはシチジン、例えば、５−(２−アミノ)プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザアデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを含む。上の修飾は組み合わせてよいことに留意するべきである。
【０１６７】
他の実施態様において、架橋結合はＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を変化させるために、例えば体内での半減期を増大させるために使用され得る。従って、本発明は架橋した２つの核酸の相補鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含む。本発明はまた、他の部分(例えば、ペプチドのような非核酸部分)、有機化合物(例えば、染料)など)にコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤を含む。この方法でｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することは、対応するｓｉＲＮＡと比較して細胞取り込みを改善し得るか、または得られるｓｉＲＮＡ誘導体の細胞標的化活性を強化し、対応するｓｉＲＮＡと比較して細胞内のｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用であるか、またはｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
【０１６８】
他の例示的な修飾は、(ａ)２’修飾、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖、特にセンス鎖のＵの２’ＯＭｅ部分の提供、または３’オーバーハング、例えば、３’末端(３’末端とは分子の３’原子または最も多くの３’部分を意味し、例えば、文脈により示される最も多くの３’Ｐまたは２’位)の２’ＯＭｅ部分の提供；(ｂ)主鎖の修飾、例えば、ホスフェート主鎖のＯをＳで置換することによる修飾、例えば、ＵまたはＡまたはその両方、特にアンチセンス鎖におけるホスホロチオエート修飾、例えば、ＰのＳによる置換の提供；(ｃ)ＵのＣ５アミノリンカーによる置換；(ｄ)ＡのＧによる置換(配列変化はアンチセンス鎖ではなくセンス鎖に位置するのが望ましい)；および(ｄ)２’位、６’位、７’位または８’位での修飾を含む。例示的な実施態様は、１以上のこれらの修飾がアンチセンス鎖ではなくセンス鎖に存在する実施態様、またはアンチセンス鎖がこのような修飾をほとんど有さない実施態様である。さらなる他の例示的な修飾は３’オーバーハング、例えば、３’末端におけるメチル化されたＰの使用；２’修飾の組合せ、例えば、２’ＯＭｅ部分および主鎖の修飾、例えば、ＰをＳで置換することによる修飾の提供、例えば、ホスホロチオエート修飾の提供，または３’オーバーハング、例えば、３’末端におけるメチル化されたＰの使用；３’アルキルを有する修飾；３’オーバーハング、例えば、３’末端に塩基ではないピロリドンを有する修飾；ナプロキセン、イブプロフェンまたは３’末端で分解を示す他の部分を有する修飾を含む。
【０１６９】
４)細胞取り込みを強化するための修飾
他の実施態様において、本発明の化合物は、例えば、標的細胞(例えば、神経細胞)による細胞取り込みを強化するために化学部分で修飾される。従って、本発明は他の部分(例えば、ペプチドのような非核酸部分)、有機化合物(例えば、染料)など)にコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲートは当分野で知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (ポリアルキルシアノアクリレート(ＰＡＣＡ)ナノパーティクルに導入された核酸について記載)；Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (ナノパーティクルに結合した核酸について記載)；Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994) (挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノパーティクルに結合した核酸について記載)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (ナノパーティクルに結合した核酸について記載)の方法を用いることで達成され得る。
【０１７０】
特定の実施態様において、本発明の化合物は脂溶性部分にコンジュゲートされる。ある実施態様において、脂溶性部分はカチオン性基を含むリガンドである。別の実施態様において、脂溶性部分はｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に結合する。例示的な実施態様において、脂溶性部分はｓｉＲＮＡのセンス鎖の一方の末端に結合する。別の例示的な実施態様において、脂溶性部分はセンス鎖の３’末端に結合する。特定の実施態様において、脂溶性部分はコレステロール、ビタミンＤ、ＤＨＡ、ＤＨＡｇ２、ＥＰＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸またはカチオン性染料(例えば、Ｃｙ３)から成る群から選択される。
【０１７１】
５)結合したリガンド
他の物質が本発明の化合物に結合され得る。例えば、安定性、標的核酸とのハイブリッド形成熱力学、特定の組織または細胞型に対する標的化、またはエンドサイトーシス依存または非依存機構による細胞透過性を改善するためのＲＮＡサイレンシング剤に結合したリガンド。リガンドおよび関連する修飾体はまた、配列特異性を増大させ、結果としてオフサイト標的化を減少させ得る。結合したリガンドは１以上の挿入剤として機能できる修飾された塩基または糖を含み得る。これらは好ましくは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的鎖のバルジのような挿入領域に存在する。挿入剤は芳香族、例えば、多環式芳香族性またはヘテロ環式芳香族性化合物であり得る。多環式挿入剤はスタッキング能力を有し得て、２つ、３つ、または４つの縮合した環の形を含み得る。本明細書に記載のユニバーサル塩基は、リガンドに含まれ得る。ある実施態様において、リガンドは標的核酸の開裂により標的遺伝子阻害に貢献する開裂基を含み得る。開裂基は例えば、ブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２，またはブレオマイシン−Ｂ２)、ピレン、フェナントロリン(例えば、Ｏ−フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド)または金属イオンであり得る。金属イオンキレート基は、例えば、Ｌｕ(ＩＩＩ)またはＥＵ(ＩＩＩ)マクロ環式錯体、Ｚｎ(ＩＩ)２，９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ(ＩＩ)ターピリジンまたはアクリジンを含み得て、Ｌｕ(ＩＩＩ)のような遊離金属イオンによりバルジ部分で標的ＲＮＡの選択的開裂を促進し得る。いくつかの実施態様において、ペプチドリガンドは標的ＲＮＡの開裂を促進するためにＲＮＡサイレンシング剤、例えば、バルジ領域で結合され得る。例えば、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン(サイクラム)は標的ＲＮＡ開裂を促進するためにペプチド(例えば、アミノ酸誘導体による)にコンジュゲートされ得る。結合されたリガンドは、アミノグリコシドリガンドであり得て、これはＲＮＡサイレンシング剤に改善したハイブリッド形成特性または改善した配列特異性をもたらす例示的なアミノグリコシドはグリコシル化されたポリリシン、ガラクトシル化されたポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡおよびアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート(例えばネオ−Ｎ−アクリジン、ネオ−Ｓ−アクリジン、ネオ−Ｃ−アクリジン、トブラ−Ｎ−アクリジンおよびカナＡ−Ｎ−アクリジン)を含む。アクリジンアナログの使用は配列特異性を増大させ得る。例えば、ネオマイシンＢはＤＮＡと比較するとＲＮＡに対して高い親和性を有するが、配列特異性が低い。アクリジンアナログ、ネオ−５−アクリジンはＨＩＶ  Ｒｅｖ応答配列(ＲＲＥ)に対する増大した親和性を有する。いくつかの実施態様において、アミノグリコシドリガンドのグアニジンアナログ(グアニジノグリコシド)は、ＲＮＡサイレンシング剤に結合される。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸のアミン基はグアニジン基と交換される。グアニジンアナログの結合はＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性を強化し得る。結合したリガンドは、オリゴヌクレオチド剤の��胞取り込みを強化し得るポリアルギニンペプチド、ペプトイドまたはペプチド模倣体であり得る。
【０１７２】
例示的なリガンドは、間にあるつながりにより、好ましくは共有結合的に、直接的または間接的にリガンド−コンジュゲート担体にカップリングされ得る。例示的な実施態様において、リガンドは間にあるつながりにより担体に結合される。例示的な実施態様において、リガンドは取り込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、標的化または寿命を変化させる。例示的な実施態様において、リガンドはこのようなリガンドを有さない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞または臓器コンパートメント、組織、臓器または身体の領域に対して強化されたアフィニティーを提供する。
【０１７３】
例示的なリガンドは、輸送、ハイブリッド形成および特異性特性を改善し得て、得られる天然もしくは修飾ＲＮＡサイレンシング剤または本明細書に記載のモノマーの任意の組合せおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性もまた改善し得る。リガンドは一般に、治療的修飾、例えば取り込みを強化するための修飾；例えば分布をモニタリングするための診断化合物またはレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性付与部分；および天然もしくは非天然核酸塩基を含む。一般的な例は、脂溶性物質、脂質、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘコゲニン、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導化リトコール酸)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサル)、炭化水素、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的化分子、ポリカチオン性物質、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣体を含む。リガンドは天然に存在する物質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)；アミノ酸または脂質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸のような合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸のような組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリリシン(ＰＬＬ)、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ(Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２−エチルアクリル酸)、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例はポリエチレンイミン、ポリリシン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリンポリアミンの四級塩またはアルファ−へリックスペプチドを含む。
【０１７４】
リガンドはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体を含み得て、これは腎細胞のような特定の細胞に結合する。標的化基はチオトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性タンパク質Ａ、ムチン炭化水素、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化されたポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例は、染料、挿入剤(例えばアクリジンおよび置換アクリジン)、クロスリンカー(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、ポリ環式芳香族性炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン)、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ (例えばＥＤＴＡ)、脂溶性分子、例えば、コレステロール(およびそのチオアナログ)、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール(例えば、エステル(例えばモノ、ビスまたはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０脂肪酸)およびそれらのエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル；例えば、１，３−ビス−Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、１，３−ビス−Ｏ(オクタデシル)グリセロール)、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネノール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸(例えば、ジステアリン酸グリセリル)、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰであり得る。
【０１７５】
リガンドはタンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コ−リガンドに対して特異的な親和性を有する分子または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞または骨細胞のような特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。それらは脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノースまたは多価フコースのような非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポポリサッカライド、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化剤またはＮＦ−κＢ活性化剤であり得る。
【０１７６】
リガンドは基質、例えば、細胞の骨格を破壊することによって、例えば細胞のミクロチューブ、ミクロフィラメントおよび／またはフィラメントを破壊することによってＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増大させることができる薬物であり得る。薬物は例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノライド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。リガンドは、例えば炎症性応答を活性化することにより、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増大させ得る。このような効果を有する例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)、インターロイキン−１βまたはγインターフェロンを含む。ある態様において、リガンドは脂質または脂質に基づく分子である。このような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは標的組織、例えば身体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子もまた、リガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質に基づくリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、(ｂ)標的化または標的細胞または細胞膜への輸送を増大させることが可能であり、および／または(ｃ)血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調製するために使用できる。脂質に基づくリガンドは調節、例えば標的組織へのコンジュゲートの結合の制御に使用され得る。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓に対して標的化され難く、従って体内から排出され難い。ＨＳＡに強く結合しない脂質または脂質に基づくリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用され得る。好ましい実施態様において、脂質に基づくリガンドはＨＳＡに結合する。脂質に基づくリガンドは、好ましくは非腎臓組織に分布されるように十分な親和性を伴ってＨＳＡに結合し得る。しかしながら、親和性はＨＳＡ−リガンド結合が不可逆であるほど強くないことが好ましい。別の好ましい実施態様において、脂質に基づくリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布されるようにＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しない。腎細胞を標的化する他の部分もまた、脂質に基づくリガンドの代わりにまたは脂質に基づくリガンドに加えて使用され得る。
【０１７７】
別の態様において、リガンドは部分、例えば標的細胞、例えば増殖細胞により取り込まれるビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性型、例えば癌細胞の、望ましくない細胞増殖により特徴付けられる障害を処置するために特に有用である。例示的なビタミンはビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。他の例示的なビタミンはＢビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサルまたは癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素を含む。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)もまた、含まれる。
【０１７８】
別の態様において、リガンドは細胞浸透剤、好ましくはらせん型の細胞浸透剤である。好ましくは、該剤は両親媒性である。例示的な剤はｔａｔまたはアンテナペディアのようなペプチドである。該剤がペプチドならば、ペプチド模倣体、逆転異性体、非ペプチド、擬似ペプチドもしくは擬似ペプチドならびにＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん型の剤は、好ましくはα−ヘリックス剤であり、好ましくは脂溶性および粗油性相を有する。
【０１７９】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも称される)は天然ペプチドに類似する特定の三次元構造に折り重なることができる分子である。オリゴヌクレオチド剤へのペプチドおよびペプチド模倣体の結合は、例えば細胞認識および吸収を強化することによりＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態的分布に影響を与える。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅから成る)であり得る。ペプチド部分はデンドリマーペプチド、構造規制ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分はＬ−ペプチドまたはＤ−ペプチドであり得る。別の代替法において、ペプチド部分は疎水性膜転位配列(ＭＴＳ)を含み得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリまたは１ビーズ１化合物(ＯＢＯＣ)コンビナトリアルライブラリから特定されたペプチドのようなＤＮＡの無作為な配列によりエンコードされ得る(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991)。例示的な実施態様において、取り込まれたモノマー単位によりＲＮＡサイレンシング剤に結合したペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(ＲＧＤ)−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体のような細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は約５アミノ酸から４０アミノ酸までの長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性またはまたは直接的コンホーメーション特性を増大させるための構造的修飾を有し得る。以下に記載のいずれかの構造的修飾が利用され得る。
【実施例】
【０１８０】
実施例１
ジ−ＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの化学的合成
インビトロおよびインビボ有効性評価において使用されるジ−ｓｉＲＮＡを以下のように合成した。図２に示すように、トリエチレングリコールをアクリロニトリルと反応させ、保護されたアミン官能基を導入した。その後分岐点をトシル化したソルケタールとして加え、ニトリルを還元してカーバメートリンカーによりビタミンＤ(カルシフェロール)にその後結合した一級アミンを得た。ケタールをその後加水分解し、一級ヒドロキシルでジメトキシトリチル(ＤＭＴｒ)保護基で選択的に保護されたｃｉｓ−ジオールを遊離させ、無水コハク酸でスクシニル化した。得られた部分を固体支持体に結合させ、その後固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護を行い、３つの生成物；ＶｉｔＤ、キャッピングされたリンカー、およびジ−ｓｉＲＮＡを得た。合成の生成物をその後実施例４に記載のようにして分析した。
【０１８１】
実施例２
代替合成ルート１
図５に示すように、モノホスホアミデートリンカーアプローチは以下の工程を含む：モノアジドテトラエチレングリコールがトシル化されたソルケタールとして負荷された分岐点を有する。ケタールがその後除去されて、一級ヒドロキシルでジメトキシトリチル(ＤＭＴｒ)保護基で選択的に保護されたｃｉｓ−ジオールを遊離し、トリフェニルホスフィンにより一級アミンに還元され、これは直ちにモノメトキシトリチル(ＭＭＴｒ)保護基で保護される。残りのヒドロキシルを無水コハク酸を用いてスクシニル化し、固体支持体(ＬＣＡＡ  ＣＰＧ)と結合させる。オリゴヌクレオチド合成および脱保護により１つの主生成物、ホスフェートおよびホスホアミデート結合をを有するジ−ｓｉＲＮＡを得る。この例は、ホスフェートおよびホスホアミデートリンカーのみを製造するための合成の代替および直接的経路を強調する。
【０１８２】
実施例３
代替合成ルート２
ジホスフェート含有部分を製造するために、第二の代替合成アプローチを開発した。図５に示すように、ジホスホエートリンカーアプローチは以下の段階を含む：：ソルケタール修飾テトラエチレングリコールから出発して、ケタールを除去し、２つの一級ヒドロキシルをジメトキシトリチル(ＤＭＴｒ)で選択的に保護する。残りのヒドロキシルｗｐシリル保護した１−ブロモエタノールで伸長する。ＴＢＤＭＳを除去し、スクシニル化し、固体支持体に結合させる。その後固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護に続き、ジ−ｓｉＲＮＡジホスフェート含有リンカーを製造する。
【０１８３】
実施例４
ジ−ｓｉＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの化学合成の品質管理。
ＨＰＬＣ
ジ−ｓｉＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの化学合成の品質を評価するために、分析ＨＰＬＣを使用して合成した生成物を同定して定量した。３つの主生成物：トリエチレングリコール(ＴＥＧ)リンカーでキャッピングされたｓｉＲＮＡセンス鎖、ジ−ｓｉＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｓｉＲＮＡセンス鎖を同定した(図３)。各生成物をＨＰＬＣにより単離し、後の実験に使用した。合成した３つの主生成物の化学構造を図３に示す。ＨＰＬＣ条件：５−８０％  Ｂ(１５分)、緩衝液Ａ(０．１Ｍ  ＴＥＡＡ＋５％  ＡＣＮ)、緩衝液Ｂ(１００％  ＡＣＮ)。
【０１８４】
質量スペクトル
質量スペクトルによりさらなる品質制御を行い、ジ−ｓｉＲＮＡ錯体の性質を確認した。生成物は、ＴＥＧリンカーにより３’末端で結合したｓｉＲＮＡの２つのセンス鎖に対応する１１６８３  ｍ／ｚの質量を有することが観察された(図４)。この特定の例において、ｓｉＲＮＡセンス鎖はハンチンチン遺伝子(Ｈｔｔ)を標的化するようにデザインされた。実施例１で説明される化学合成の方法はハンチンチン遺伝子を標的化するジ−分岐ｓｉＲＮＡ錯体の望ましい生成物の製造に成功した。ＬＣ−ＭＳ条件：０−１００％  Ｂ(７分間)、０．６ｍＬ／分。緩衝液Ａ(２５ｍＭ  ＨＦＩＰ、２０％  ＭｅＯＨ中に１５ｍＭ  ＤＢＡ)、緩衝液Ｂ(２０％の緩衝液Ａ中のＭｅＯＨ)。
【０１８５】
実施例５
ジ−ｓｉＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの化学合成の副生成物の有効性および細胞取り込み
ジ−ｓｉＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの化学合成でＨＰＬＣ単離したそれぞれの副生成物のＨｔｔ遺伝子サイレンシング有効性を評価するために、ＨｅＬａ細胞を脂質介在トランスフェクションにより各単離化合物で処理した。ハンチンチンｍＲＮＡ発現はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０により評価し、ハウスキーピング遺伝子(ＰＰＩＢ)に対して標準化した。全ての４つの副生成物は、トランスフェクト７２時間後に顕著なＨｔｔ遺伝子サイレンシングをもたらした(図２２)。蛍光標識した各副生成物を線条体内注射によりマウスに送達し、蛍光イメージングによる取り込みを測定することにより、細胞取り込みをインビボで試験した。ジ−ｓｉＲＮＡ生成物は他の３つの副生成物と比較して、注射されたマウスの半球において劇的な増大された取り込みを示した(図２２)。化学合成反応から生じた４つの副生成物について、ジ−ｓｉＲＮＡはインビボで効果的な遺伝子サイレンシンおよび高い細胞取り込み量の両方を示した。
【０１８６】
実施例６
ジ−分岐ｓｉＲＮＡ構造のインビトロ有効性
ジ−分岐ｓｉＲＮＡ(ジ−ｓｉＲＮＡ)のインビトロ有効性を決定するために、脂質介在送達系を用いてＨｔｔを標的化するジ−ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞はＲＮＡｉＭａｘを用いて種々の濃度で分岐オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクト７２時間後にＨＴＴ  ｍＲＮＡ発現を測定した。ＨｅＬａ細胞(図１０)における単一の二本鎖ｓｉＲＮＡから生じた効果と同様に、ジ−ｓｉＲＮＡはＨＴＴ遺伝子の顕著なサイレンシングをもたらした。
【０１８７】
脂質を介して送達されない一次皮質ニューロンにおける細胞取り込みおよび遺伝子サイレンシングの有効性を決定するために、種々の濃度で一週間、細胞をＨｔｔ−ジ−ｓｉＲＮＡで受動的に処理した。ＨＴＴ  ｍＲＮＡ発現を測定し、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢに対して標準化した。図１０に示すように、ジ−ｓｉＲＮＡ構造はＨｔｔ遺伝子の顕著なサイレンシングをもたらし、ジ−分岐ｓｉＲＮＡ構造が脂質形成なしに効率的にニューロンへ送達されることを示した。これはｓｉＲＮＡ錯体のジ−分岐構造がＲＩＳＣ導入および既知の効果的なｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングを妨げないことを示す。
【０１８８】
実施例７
ジ−ｓｉＲＮＡおよびビタミンＤコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの投与方法
インビボでのニューロンにおける分岐オリゴヌクレオチドの送達および活性の有効性を評価するために、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３を線条体内(ＩＳ)注射によりマウスに送達した。ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３は脳の注射された半球全体に局在化し、蓄積したが、単一の分岐ＨＴＴ−ｓｉＲＮＡ(トリエチレングリコールコンジュゲートｓｉＲＮＡ(ＴＥＧ−ｓｉＲＮＡ))は脳の注射された半球全体において極めて低い蓄積を示した(図１１)。Ｈｔｔ−ジ−ｓｉＲＮＡの単回ＩＳ注射は、注射１週間後に顕著な遺伝子サイレンシングをもたらし(図１３)、遺伝子サイレンシングのレベルは注射後２週間維持された(図２６)。さらなる実験により、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の単回ＩＳ注射は、注射２週間後に顕著な毒性をもたらさないことが示された(図２７Ａ)。Ｈｔｔ−ジ−ｓｉＲＮＡは顕著な神経膠症をもたらしたが(図２７Ｂ)、これはニューロンにおいてＨｔｔ遺伝子がサイレンシングされたときに想定される。さらに、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３はＩＳ注射２週間後に肝臓または腎臓に蓄積せず(図１３)また、Ｈｔｔ  ｍＲＮＡはＩＳ注射後、肝臓または腎臓において顕著にサイレンシングされない(図２３)。ＴＥＧ−ｓｉＲＮＡのみと比較したとき、ジ−ｓｉＲＮＡの二重分岐構造は分布およびニューロン取り込みを改善し；従って大きさおよび／またはｓｉＲＮＡ錯体の構造が有効性に重要である。Ｈｔｔ−ジ−ｓｉＲＮＡのＩＳ注射は、脳に局在化し続ける顕著かつ安定なＨｔｔの減少をもたらし、この有効性のレベルは非コンジュゲートｓｉＲＮＡについては一度も示されていない。
【０１８９】
実施例８
他の投与経路１
脊髄における送達の有効性および分岐オリゴヌクレオチドの活性を評価するために、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３を脊髄の腰部領域に髄腔内(ＩＴ)注射によりマウスに送達した。図１４および２８〜２９に示すように、注射１週間後、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３は脊髄に蓄積する。ＩＴ注射はまた、頸部、胸部および脊髄の腰部領域において顕著なＨｔｔ  ｍＲＮＡサイレンシングをもたらした(図１４)。ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３のＩＴ注射は脊髄において顕著な遺伝子サイレンシングを成功裏にもたらした。
【０１９０】
実施例９
他の投与経路２
臨床的に関連する実験において、脳全体の分岐オリゴヌクレオチドの送達および活性の有効性を評価するために、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３を脳室内(ＩＣＶ)注射によりマウスに送達した。注射２日後および２週間後の両方で、ジ−ｓｉＲＮＡは脳全体に蓄積した(図３０−３１)。ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３のＩＣＶはまた、注射２週間後にＨｔｔ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を顕著にサイレンシングした(図３２)。さらなる実験により、ＩＣＶ送達は注射２週間後に顕著な毒性をもたらさないことが示された(図３３)。しかしながら、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３のＩＣＶ注射は脳の多数の領域で神経膠症をもたらし、これはＨｔｔ遺伝子のサイレンシングによる結果であると想定される(図３４)。ＩＣＶ注射は血液脳関門を避けるためにジ−ｓｉＲＮＡを脳脊髄液(ＣＳＦ)に直接的に投与し、この注射は脳の疾患を処置するために使用される。
【０１９１】
ＩＣＶ注射が神経疾患について治療的に関連する注射であるように、この結果は分岐オリゴヌクレオチドの治療可能性に重要である、ＩＣＶ投与後の分岐オリゴヌクレオチドの有効性および安定性は、本明細書に記載の発明がハンチントン病を含む種々の処置が困難な神経疾患に治療として使用され得ることを示す。
【０１９２】
実施例１０
他の投与経路３
全身にわたるジ−ｓｉＲＮＡの送達および活性の有効性を評価するために、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３を静脈内(ＩＶ)注射によりマウスに投与した。マウスはに２０ｍｇ／ｋｇのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３を２日連続で注射し(合計４０ｍｇ／ｋｇ)、最後の注射から２４時間後に屠殺した。図３５−３６に示すように、ＩＶ送達後、ジ−ｓｉＲＮＡは多くの臓器(肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、肺、脂肪、筋肉、胸腺、結腸および皮膚を含む)に蓄積した。ジ−ｓｉＲＮＡは脳にもまた蓄積し、これは治療用ｓｉＲＮＡを使用した予測不可能な結果であるジ−ｓｉＲＮＡの血液−脳関門を通過する能力を示す。ＩＶ注射は、ジ−ｓｉＲＮＡ構造は、全身の広範な種々の細胞型において効果的かつ機能的であることを示す。
【０１９３】
実施例１１
毒性および神経膠症の決定
毒性
上昇したＤＡＲＰＰ３２はニューロンの死滅を示すため(Jin, H., et al. DARPP-32 to quantify intracerebral hemorrhage-induced neuronal death in basal ganglia. Transl Stroke Res. 4(1): 130-134. 2013)、ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３の注射後の脳における毒性レベルを評価するために、脳組織においてＤＡＲＰＰ３２のタンパク質量を評価した。ＩＳまたはＩＣＶ注射により、２ｎｍｏｌのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３(４ｎｍｏｌの対応するアンチセンスＨＴＴ鎖)でマウスを処置した。注射１４日後に動物を屠殺し、組織パンチを脳の種々の領域に由来する３００μｍの脳切片から採取した。ＤＡＲＰＰ３２タンパク質を免疫ブロットにより定量した。人工脳脊髄液(ａＣＳＦ)を陰性対照として使用した。高用量ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３ＩＳ注射もＩＣＶ注射も顕著な毒性をもたらさなかった(図２７および３３)。
【０１９４】
神経膠症
ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３注射後の脳における神経膠症のレベルを評価するために、高用量のジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３後にＧＦＡＰタンパク質レベルを評価した。ＩＳまたはＩＣＶ注射により２ｎｍｏｌのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３(４ｎｍｏｌの対応するアンチセンスＨＴＴ鎖)でマウスを処置した。注射１４日後にマウスを屠殺し、組織パンチを脳の種々の領域に由来する３００μｍの脳切片から採取した。ＧＦＡＰタンパク質を免疫ブロットにより定量した。人工脳脊髄液(ａＣＳＦ)を陰性対照として使用した。高用量ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３のＩＳおよびＩＣＶ注射の両方が、顕著な神経膠腫をもたらした(図２７および３４)が、しかしながら、神経膠腫の誘発はハンチンチン遺伝子のほぼ完全なサイレンシングによる結果であると考えられる。
【０１９５】
実施例１２
ジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３インビボ有効性の決定
分布および蓄積
インビボでの分岐オリゴヌクレオチドの分布の有効性を決定するために、実施例７〜１０に記載されるようにＩＳ、ＩＣＶ、髄腔内またはＩＶ注射によりジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３でマウスを処置した。全ての実施例において、２ｎｍｏｌのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３(４ｎｍｏｌの対応するアンチセンスＨＴＴ鎖)を注射し、センス鎖とハイブリッド形成するためのＣｙ３−標識ペプチド核酸(ＰＮＡ)を用いて蓄積を定量した。組織１ｍｇあたりのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３のｎｇを定量するために、その後ＨＰＬＣ分析を使用した。人工脳脊髄液(ａＣＳＦ)を陰性対照として用いた。
【０１９６】
蛍光イメージング実験において、脳切片をジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３(赤)の蓄積を検出するためにＣｙ３チャネルを使用して造影されるＤＡＰＩ(青)で染色した。
【０１９７】
サイレンシング
インビボでの分岐オリゴヌクレオチドのサイレンシングの有効性を決定するために、実施例７〜１０において上で記載したようにマウスをＩＳ、ＩＣＶ、髄腔内またはＩＶ注射によりジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３で処置した。全ての実施例において、Coles, A. et al., A High-Throughput Method for Direct Detection of Therapeutic Oligonucleotide-Induced Gene Silencing In Vivo. Nucl Acid Ther. 26 (2), 86-92, 2015に記載のように、２ｎｍｏｌのジ−ＨＴＴ−Ｃｙ３(４ｎｍｏｌの対応するアンチセンスＨＴＴ鎖)を注射し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０を用いてＨｔｔ  ｍＲＮＡのサイレンシングを定量した。データをハウスキーピング対照、ＨＰＲＴに対して標準化し、人工脳脊髄液(ａＣＳＦ)を陰性対照として使用した。
【０１９８】
実施例１３
分岐オリゴヌクレオチド構造における疎水性部分の取り込み：戦略１
ある態様において、非保護ヒドロキシル基(またはアミン)を有する、２−シアノエトキシ−ビス(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(または他の適切なホスフィチル化試薬)でホスフィチル化された短鎖の疎水性アルキレンまたはアルカン(Ｈｙ)は、対応する脂溶性ホスホロアミダイトを製造するために使用される。これらの脂溶性ホスホロアミダイトは従来のオリゴヌクレオチド合成条件を用いて、分岐オリゴヌクレオチドの末端位置に付加され得る。この戦略は図４４に示される。
【０１９９】
実施例１４
分岐オリゴヌクレオチド構造における疎水性部分の組み込み：戦略２
別の例において、２−シアノエトキシ−ビス(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(または任意の他の適切なホスフィチル化試薬)を用いてホスフィチル化され得る正電荷を有するまたは有さない保護されていないヒドロキシル基(またはアミン)を有する短い／小さい芳香族性平面分子(Ｈｙ)は、対応する芳香族性疎水性ホスホルアミダイトを製造するために使用される。芳香族性部分は正電荷を有する。これらの脂溶性ホスホルアミダイトは、従来のオリゴヌクレオチド合成条件を用いて分岐オリゴヌクレオチドの末端位置に加えることができる。この戦略は図４５に示される。
【０２００】
実施例１５
分岐オリゴヌクレオチド構造における疎水性部分の組み込み：戦略３
生物学的に関連する疎水性部分を導入するために、短い脂溶性ペプチドを固体支持体上または溶液中(後者を本明細書に記載)で連続ペプチド合成により製造した。あらゆる正電荷はオリゴヌクレオチドの全体の正味電荷を減少させ、従って、疎水性を増大させるために、短い(１〜１０)アミノ酸鎖は正に荷電したまたは極性アミノ酸部分もまた含み得る。適切な長さのペプチドが製造されると、疎水性を増大させ、遊離のアミンをマスクするためにそれは無水酢酸または別の短鎖脂肪酸でキャッピングされるべきである。カルボニル保護基をその後除去し、遊離のヒドロキシル(またはアミン)のホスフィチル化を可能にするカップリングされた３−アミノプロパン−１−オールを得る。このアミノ酸ホスホルアミダイトはその後、従来のオリゴヌクレオチド合成条件を用いて分岐オリゴヌクレオチドの末端５’位に加えることができる。この戦略は図４６に示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2019503394.tif 000053
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ−Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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