(57)【要約】造血幹細胞（ＨＳＣ）、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別し、かつ／または単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための方法および組成物。さらに、ＨＳＣまたは遺伝的に修飾されたＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣおよび／または遺伝的に修飾されたＨＳＣを使用して、血液学的もしくは遺伝的な障害を有する患者、心血管障害を有する患者、創傷から回復中の患者、または化学療法もしくは放射線曝露から回復中の患者を処置するための方法および組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を識別かつ単離するために使用され得る抗体を生成するための方法であって、
２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に結合し、
ヒトＨＳＣを識別することができる
抗体について、抗体集団をスクリーニングするステップを含む、方法。
【請求項２】
前記抗体集団が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＨＳＣに対して産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記識別されたＨＳＣが、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造が、シアリルＩ、シアリルｉ、シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、およびＮ−アセチルシアリルラクトースアミンから選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造が、シアリルラクトースである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３上の２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、３’ＳＬ−ＣＤ１３３に特異的に結合し、ノイラミニダーゼで処理した３’ＳＬ−ＣＤ１３３には結合しない、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルによって機能的に決定される通り、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣを単離するために使用することができる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏモデルが、亜致死的または致死的に照射されたマウスへの、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣの移植である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、ＣＤ１３３およびヒト−フコシダーゼで処理したＣＤ１３３に結合するか、またはそれらとの結合が増強しているが、ノイラミニダーゼで処理したＣＤ１３３には結合しない、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏモデルが、亜致死的または致死的に照射されたマウスへの、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣの移植である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＳＣが、骨髄、動員末梢血、および臍帯血から選択される少なくとも１つの供給源から得られる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＣが、ＦＡＣＳ選別、免疫磁気ビーズ、およびアフィニティーマトリックスから選択される少なくとも１つの方法によって得られる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３が、ヒトＨＳＣまたはヒト造血前駆細胞から単離される、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗体を使用して単離された、ＨＳＣ集団。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗体を使用して、ＨＳＣを単離するステップと、
前記単離されたＨＳＣを遺伝的に修飾するステップと
によって生成された、遺伝的に修飾されたＨＳＣ集団。
【請求項１７】
前記細胞が、骨髄、末梢血、白血球除去生成物、臍帯血、またはそれらの組合せから単離される、請求項１５または１６に記載の細胞集団。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の集団から分化した、リンパ系列の細胞集団。
【請求項１９】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の集団から分化した、赤血球系列の細胞集団。
【請求項２０】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の集団から分化した、内皮前駆細胞集団。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された、単離されたマウスモノクローナル抗体。
【請求項２２】
血液学的疾患を処置し、血液学的障害を処置し、血液学的状態を処置し、心血管障害を処置し、創傷を処置し、化学療法から救済し、かつ／または高線量放射線から対象を救済する方法であって、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞集団を投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞集団を使用して、造血発生を再構築する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って生成された抗体を使用して、疾患、障害、または状態を診断する方法。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って生成された抗体を使用して、ＨＳＣを精製する方法。
【請求項２６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って生成された抗体を使用して、リンパ腫を処置する方法。
【請求項２７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って生成された抗体を使用して、疾患、障害、または状態をモニタリングする方法。
【請求項２８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って生成された抗体を使用して、疾患、障害、または状態の処置をモニタリングする方法。
【請求項２９】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞を使用して、進行性濾胞性リンパ腫を処置する方法。
【請求項３０】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞を使用して、小児の血液学的疾患を処置する方法。
【請求項３１】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞を使用して、血液学的障害を処置する方法。
【請求項３２】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞を使用して、心血管障害を処置する方法。
【請求項３３】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞を使用して、創傷治癒を促進する方法。
【請求項３４】
前記疾患が、急性骨髄性白血病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の細胞を使用して、遺伝的疾患、障害、または状態を処置する方法。
【請求項３６】
血液学的疾患、障害、または状態を有する患者を処置する方法であって、
ドナーから細胞集団を得るステップと、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗体を使用して、前記細胞集団におけるＨＳＣを識別するステップと、
前記識別されたＨＳＣまたは前記識別されたＨＳＣから導出された細胞を、前記患者に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項３７】
化学療法または放射線曝露から回復中の患者を処置する方法であって、
ドナーから細胞集団を得るステップと、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗体を使用して、前記細胞集団におけるＨＳＣを識別するステップと、
前記識別されたＨＳＣまたは前記識別されたＨＳＣから導出された細胞を、化学療法または放射線曝露から回復中の患者に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
創傷を受けている患者の創傷治癒を促進する方法であって、
ドナーから細胞集団を得るステップと、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗体を使用して、前記細胞集団におけるＨＳＣを識別するステップと、
前記識別されたＨＳＣまたは前記識別されたＨＳＣから導出された細胞を、化学療法または放射線曝露から回復中の患者に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
遺伝的疾患、障害、または状態を有する患者を処置する方法であって、
ドナーから細胞集団を得るステップと、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗体を使用して、前記細胞集団におけるＨＳＣを識別するステップと、
前記識別されたＨＳＣを、遺伝的に修飾するステップと、
前記遺伝的に修飾されたＨＳＣまたは前記遺伝的に修飾されたＨＳＣから導出された細胞を、前記患者に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項４０】
前記ドナーが、前記患者である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ドナーが、前記患者ではない、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月３日に出願された米国仮出願番号第６２／２５０，４２４号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本開示は、全体として、生化学、分子生物学、細胞生物学、および再生医療の分野に関する。本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための方法および組成物を提供する。本開示はさらに、造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを使用して、血液学的疾患、障害もしくは状態を有する患者、または化学療法もしくは放射線治療から回復中の患者を処置するための方法および組成物を提供する。本開示はさらに、心血管障害の処置においてＨＳＣを使用するための方法および組成物を提供する。本開示はさらに、創傷の処置において、および創傷治癒の促進のために、ＨＳＣを使用するための方法および組成物を提供する。本開示はさらに、遺伝子治療においてＨＳＣを使用するための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
以下は、単に背景情報としてのみ提供され、論じられている任意の主題または言及されている任意の参考文献が、本開示に先行する技術であることを承認するものと解釈されるべきではない。本明細書で言及されているあらゆる刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が、参照によって具体的にかつ個々に組み込まれると示されるのと同じ程度まで、参照によって組み込まれる。
【０００４】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生涯にわたりすべての血液細胞系列を自己再生し、作製する能力を有する、単一細胞である。ＨＳＣは、自家および同種の両方の造血細胞移植を使用する造血再構築の成功において、重要な役割を演じている。参照によって本明細書に組み込まれるWeissman  IL、Shizuru  JA（２００８年）The  origins  of  the  identification  and  isolation  of  hematopoietic  stem  cells、and  their  capability  to  induce  donor-specific  transplantation  tolerance  and  treat  autoimmune  diseases、Blood  １１２巻（９号）：３５４３〜５３頁。造血細胞移植は、血液学的疾患、障害、または状態（例えば、サラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、骨髄腫）の処置、ならびに化学療法および高線量放射線からの救済において有望な治療手法である。造血細胞移植の潜在的な欠点は、再構築の様々な潜在的可能性を有するＨＳＣおよび他の非ＨＳＣを含む造血細胞の混合物を含有するということである。これによって、手順による合併症および副作用が生じるおそれがある。例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣは、患者の潜在的に疾患の可能性がある他の細胞からは単離することができないので、普通、自家造血細胞移植は処置選択肢にならない。その代わりに、同種提供物が使用される。同種細胞を使用することによって、患者は、患者自身の自家提供物由来の疾患状態の細胞を患者の系に再導入することを回避することができるが、移植片対宿主病などの合併症の危険性がある。同種提供物でも、患者の健康な血液細胞集団を再構築する可能性が最も高い細胞だけを識別し、移植することによって、合併症を低減することができる。したがって、造血細胞移植などの処置において使用するためのＨＳＣ、特に再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離する必要がある。
【０００５】
遺伝的に修飾されたＨＳＣも、遺伝的疾患、障害、または状態、特に血液学的な遺伝的疾患、障害、または状態の処置において有望な治療手法を提供することができる。ＨＳＣは、ユニークな特徴（例えば、数々の細胞に自己再生し、分化する能力）を有しているので、遺伝的固定を患者に導入するための理想的な候補となっている。遺伝子治療では、遺伝的疾患、障害、または状態に罹患している患者から得られた細胞は、治療遺伝子（単数または複数）を挿入するための公知の技術を使用して、遺伝的に修飾される（宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、または外部エピソームもしくはプラスミドとして組み込まれる）。治療遺伝子によって、例えば、細胞にタンパク質を発現させるか、タンパク質の発現を妨害させるか、または遺伝的変異を修正させることができる。遺伝子治療の一般的な方法では、ＤＮＡなどの高分子をゲノムに挿入し、それによって変異遺伝子またはそうでなければ機能不全遺伝子を、機能的治療遺伝子で置き換えるベクターが使用されることを伴う。次に、遺伝的修飾を伴う細胞を、患者に移植して戻すことができ、その遺伝的に修飾された細胞は、治療遺伝子（単数または複数）を発現し、それによって疾患、障害、または状態を処置することができる。このような遺伝子治療の有効性は、遺伝的に修飾された細胞がどの程度原始的であるかに関係する。現在の方法の欠点は、多くの細胞の急速に分裂する性質および短寿命に関係する場合があり、それによって、遺伝子治療は長期的な利益を達成できなくなり、かつ／または患者は複数の処置を受けざるを得なくなる。
【０００６】
ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣは、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に分化することができる。いくつかの研究では、ＥＰＣは、新血管新生および再内皮化を促進し、それらが、心血管障害の治癒および創傷の回復に相関すると報告されている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるKrankel,  N.ら、「'Endothelial  progenitor  cells'  as  a  therapeutic  strategy  in  cardiovascular  disease」、Curr.  Vasc.  Pharmacol.、２０１２年１月、第１０巻（１号）：１０７〜２４頁を参照されたい。ＨＳＣから導出されたＥＰＣは、例えば、心血管障害の処置もしくは創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）のために患者に投与することができ、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＥＰＣに分化させるために患者に投与することができる。ＨＳＣから導出されたＥＰＣは、例えば、馴化血清を患者に投与できるように、血清または他の培地を馴化するために使用することもできる。しかし前述の通り、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでＨＳＣの再構築能力を直接的に試験することなくＥＰＣを得るために、ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別するやり方は、まだ知られていない。
【０００７】
ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣは、治療結果をもたらし、かつ／またはより好ましい（より速く、より長く継続する、より強力な）治療結果をもたらす可能性がより高いので、遺伝子治療のより良好な候補となっている。したがって、遺伝子治療において使用するためのＨＳＣ、特に再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離する必要がある。ＨＳＣは、骨髄、動員末梢血、および臍帯血を含めた様々な供給源から単離することができる。細胞ミックスからＨＳＣ集団を識別かつ単離するプロセスでは、ＣＤ３４などのＨＳＣに特異的なマーカーの使用、および制限用量の候補ＨＳＣを用いて、致死的に照射されたマウスを救済するなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを伴うことができる。しかし、血液細胞株を再構築するＨＳＣの能力は変わり、ＨＳＣに特異的なマーカーは、ＨＳＣだけを識別するが、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣの亜集団を識別することができない。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでＨＳＣの再構築能力を直接的に試験することなく、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別するやり方は、まだ知られていない。
【０００８】
さらに、これまでは、あらゆるＨＳＣがＣＤ３４マーカーを発現すると考えられた。しかし、ある特定のＨＳＣは、ＣＤ３４を発現しないという証拠がある。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるNakauchi  Hirmitsu、Hematopoietic  stem  cells:  Are  they  CD34-positive  or  CD34-negative、Nature  medicine  ４巻：１００９〜１０１０頁（１９９８年）。したがって、ＣＤ３４陰性ＨＳＣを識別する必要がある。
【０００９】
臨床目的のために潜在的に可能なＨＳＣを完全に開拓する試みは、ＨＳＣを特異的に有効に単離し、増殖させるマーカーに関する知識が限られていることによって阻まれてきた。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイなしに再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別する方法は、これまで知られていなかった。
以下は、これらの必要性の１つまたは複数に対処する手段として提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Weissman  IL、Shizuru  JA（２００８年）The  origins  of  the  identification  and  isolation  of  hematopoietic  stem  cells、and  their  capability  to  induce  donor-specific  transplantation  tolerance  and  treat  autoimmune  diseases、Blood  １１２巻（９号）：３５４３〜５３頁
【非特許文献２】Krankel,  N.ら、「'Endothelial  progenitor  cells'  as  a  therapeutic  strategy  in  cardiovascular  disease」、Curr.  Vasc.  Pharmacol.、２０１２年１月、第１０巻（１号）：１０７〜２４頁
【非特許文献３】Nakauchi  Hirmitsu、Hematopoietic  stem  cells:  Are  they  CD34-positive  or  CD34-negative、Nature  medicine  ４巻：１００９〜１０１０頁（１９９８年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ＨＳＣを検出し、単離する助けにするために、これらの細胞表面における新しいマーカーを識別した。これらのマーカーは、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ、シアリルｉ、シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン）を含む。これらの構造は、初期原始造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣの表面に、例えば、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３などに存在する。これらの構造は、主に幹細胞上に発現し、前駆細胞上でフコシル化される。
【００１２】
本開示によれば、初期原始造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための方法および組成物が提供される。ある場合には、抗体は、本明細書で識別される新しいマーカーの１つまたは複数に結合する。このような方法によって単離された細胞、およびこのような方法によって産生された抗体の両方のための、再生医療におけるいくつかの適用も提供される。
【００１３】
一実施形態では、本明細書に開示される技術は、初期原始ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを検出し、単離するための診断抗体および治療抗体を速やかに開発するための新しい戦略、ならびにサラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含めた血液の疾患、障害または状態の移植による処置を提供する。一実施形態では、ＨＳＣまたは抗体は、進行性濾胞性リンパ腫を処置するために使用される。別の実施形態では、ＨＳＣまたは抗体は、小児の血液学的疾患を処置するために使用される。一実施形態では、ＨＳＣまたは抗体は、成人の血液学的疾患を処置するために使用される。別の実施形態では、ＨＳＣまたは抗体は、急性骨髄性白血病を処置するために使用される。一実施形態では、ＨＳＣは、患者とは異なるドナーに由来する（すなわち、同種提供）。一実施形態では、ＨＳＣのドナーと患者は、同じ人物である（すなわち、自家提供）。
【００１４】
一実施形態では、本明細書に開示される技術は、初期原始ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを検出し、単離するための診断抗体および治療抗体を速やかに開発するための新しい戦略、ならびにＨＳＣ、ＨＳＣから導出されたＥＰＣ、またはＨＳＣから導出されたＥＰＣによって馴化された培地を投与することによる、心血管疾患の処置または創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）を提供する。一実施形態では、ＨＳＣは、患者とは異なるドナーに由来する（すなわち、同種提供）。一実施形態では、ＨＳＣのドナーと患者は、同じ人物である（すなわち、自家提供）。
【００１５】
一実施形態では、本明細書に開示される技術は、初期原始ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを検出し、単離するための診断抗体および治療抗体の速やかな開発のため、遺伝的修飾のため、ならびに遺伝的に修飾されたＨＳＣを移植することによる、遺伝的疾患、障害または状態、例えば、血液学的遺伝的疾患、障害または状態の処置のための、新しい戦略を提供する。一実施形態では、遺伝的に修飾されたＨＳＣは、血液の疾患または障害、例えば鎌状赤血球、サラセミア、または重症複合免疫不全を処置するために使用される。
【００１６】
一実施形態では、再構築の高い潜在的可能性を有する初期原始造血幹細胞を識別かつ単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための新規な手法が提供され、この方法は、動物をＨＳＣで免疫付与し、次に２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ、シアリルｉ、シアリルラクトースシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン）に結合する抗体の存在または生成について、それらの動物またはそれらの動物の細胞を選択することを含む。一部の実施形態では、動物は、ＣＤ３４陽性のＨＳＣで免疫付与される。別の実施形態では、抗体は、ＣＤ１３３表面上の２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ、シアリルｉ、シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン）への結合について選択される。
【００１７】
別の実施形態では、この方法は、ＨＳＣから単離されたＣＤ１３３で動物を免疫付与し、次に２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、シアリルラクトース）に結合する抗体の存在または生成について、それらの動物またはそれらの動物の細胞を選択することを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１３３は、ＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）ＨＳＣに由来する。別の実施形態では、抗体は、ＣＤ１３３表面上の２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、シアリルラクトース）への結合について選択される。
【００１８】
一実施形態では、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、シアリルラクトース）に結合する抗体をスクリーニングすることができる抗体パネルを作製または提供することができる任意の他の方法（例えば、ファージディスプレイ）は、抗体供給源として使用することができる。
【００１９】
一実施形態では、免疫動物は、マウス、ラット、ウサギ、または別の哺乳動物である。他の実施形態では、このような抗体は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号および同第００／３７５０４号に記載されている通り、非ヒト遺伝子導入動物において産生することができる。
【００２０】
一実施形態では、抗体は、特異的抗原に対して実質的に均質な抗体集団である、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＭＡｂは、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるKohlerら（１９７５年）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ausubelら（１９８７〜１９９９年）；Harlowら（１９８８年）；およびColliganら（１９９３年）を参照されたい。本明細書で想定されるｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびそれらの任意のサブクラスを含めた、任意の免疫グロブリンクラスのものであってよい。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。高力価のｍＡｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ生成によって得ることができ、この場合、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を生成するために、個々のハイブリドーマ由来の細胞が、プリスチン（pristine）で刺激したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射される。例えば、アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのＭＡｂは、このような腹水から、または培養上清から、カラムクロマトグラフィー方法または当業者に周知の任意の他の方法を使用して精製することができる。
【００２１】
一実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、異なる動物種から導出された異なる部分を有する分子、例えばマウスｍＡｂから導出された可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である。実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）に由来する可変領域フレームワーク残基、および実質的にマウス抗体（ドナー抗体と呼ばれる）に由来する相補性決定領域を有する抗体も、ヒト化抗体と呼ばれる。キメラ抗体は、主に、例えば適用における免疫原性を低減し、生成収率を増大するために使用され、この場合、マウスｍＡｂの方が、ハイブリドーマからの収率が高いが、ヒトにおける免疫原性の方が高く、したがって、ヒト／マウスキメラｍＡｂが使用される。それらの生成のためのキメラ抗体および方法は、当技術分野で公知である（例えば、Betterら、１９８８年、Cabillyら、１９８４年、Harlowら、１９８８年、Liuら、１９８７年；Morrisonら、１９８４年；Boulianneら、１９８４年；Neubergerら、１９８５年；Sahaganら、１９８６年；Sunら、１９８７年；Cabillyら、欧州特許出願第１２５０２３号、同第１７１４９６号、同第１７３４９４号、同第１８４１８７号、同第１７３４９４号、ＰＣＴ国際公開第８６／０１５３３号、同第９７／０２６７１号、同第９０／０７８６１号、同第９２／２２６５３号および米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，２２５，５３９号を参照されたい）。
【００２２】
一実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト重鎖および軽鎖両方の定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、例えば、マウスモノクローナル抗体であり得る親抗体の、かなりの割合の結合特性を保持している。本明細書に記載されるヒト化抗体は、人間の介入によって生成される。したがって、本明細書に記載されるヒト化抗体は、天然に生じることが期待されない。一実施形態では、ヒト化抗体は、当技術分野で周知の技術、例えばRoland  KontermannおよびStefan  Dubel編、Antibody  Engineering、第２版、およびこの文献に引用されている参考文献に記載されている技術によって調製される。
【００２３】
一実施形態では、造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための細胞集団が提供される。一実施形態では、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、シアリルラクトース）に結合する組換え抗体を生成するためにＨＳＣが使用される。一実施形態では、組換え抗体は、ＣＤ１３３表面上の２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、シアリルラクトース）に結合する。
【００２４】
一実施形態では、本明細書に記載の方法の１つに従って生成された抗体は、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、シアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、シアリルラクトース）に対して特異性を有する。一実施形態では、本明細書に記載の方法の１つに従って生成された抗体は、３’シアリルラクトサミニル化ＣＤ１３３に結合し、ノイラミニダーゼで処理した３’シアリリルラクトサミニル化ＣＤ１３３には結合しない。一実施形態では、抗体は、ＣＤ１３３およびヒト−フコシダーゼで処理したＣＤ１３３に結合し、ノイラミニダーゼで処理したＣＤ１３３には結合しない。
【００２５】
一実施形態では、幹細胞を生成するための方法であって、造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを単離し、次にそれらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させるステップを含む方法が提供される。
【００２６】
一実施形態では、遺伝的に修飾された幹細胞を生成するための方法であって、造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを単離し、ＨＳＣを遺伝的に修飾し、次に遺伝的に修飾されたＨＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させるステップを含む方法が提供される。
【００２７】
一実施形態では、本開示の方法の１つに従って識別されたＨＳＣ、本開示の方法の１つに従ってＨＳＣから導出された幹細胞、および／または本開示の方法の１つに従ってＨＳＣから繁殖させた、部分的もしくは完全に分化した細胞を含む組成物が提供される。一実施形態では、ＨＳＣから繁殖させたＥＰＣを含む組成物が提供される。一実施形態では、ＨＳＣから繁殖させたＥＰＣによって馴化された培地を含む組成物が提供される。
【００２８】
一実施形態では、本開示の方法の１つに従って識別され、遺伝子治療で使用するために遺伝的に修飾されたＨＳＣ、本開示の方法の１つに従って遺伝的に修飾されたＨＳＣから導出された、遺伝的に修飾された幹細胞、および／または本開示の方法の１つに従って遺伝的に修飾されたＨＳＣから繁殖させた、部分的もしくは完全に分化した遺伝的に修飾された細胞を含む組成物が提供される。
【００２９】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って識別されたＨＳＣ、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞、および／または本開示の方法の１つに従ってＨＳＣから繁殖させた、部分的もしくは完全に分化した細胞は、血液学的疾患、障害または状態（例えば、サラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、骨髄腫）の処置、ならびに化学療法および高線量放射線からの救済を含めた、様々な病状および状態の処置のための治療戦略で直接的に使用することができる。一実施形態では、ＨＳＣは、心血管障害の処置のための治療戦略で直接的に使用することができる。一実施形態では、ＨＳＣは、創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）のための治療戦略で直接的に使用することができる。一実施形態では、ＨＳＣから繁殖させたＥＰＣは、心血管障害の処置のための治療戦略で直接的に使用することができる。一実施形態では、ＨＳＣから繁殖させたＥＰＣは、創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）のための治療戦略で直接的に使用することができる。一実施形態では、ＨＳＣから繁殖させたＥＰＣは、心血管障害の処置、創傷の処置、または創傷治癒の促進のための治療戦略で使用され得る培地を馴化するために使用することができる。
【００３０】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って識別され、遺伝的に修飾されたＨＳＣ、本開示の方法の１つに従って生成された遺伝的に修飾された幹細胞、および／または本開示の方法の１つに従って遺伝的に修飾されたＨＳＣから繁殖させた、部分的もしくは完全に分化した遺伝的に修飾された細胞は、遺伝的疾患、障害または状態（例えば、鎌状赤血球、サラセミア、または重症複合免疫不全）の処置を含めた、様々な病状および状態の処置のための治療戦略で直接的に使用することができる。
【００３１】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞は、所望の系列の細胞に部分的または完全に分化することができ、そうして分化した細胞は、血液学的疾患、障害または状態（例えば、サラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、骨髄腫）の処置、ならびに化学療法および高線量放射線からの救済を含めた、様々な病状および状態の処置のための治療戦略で使用することができる。別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞は、心血管障害の処置、創傷の処置、または創傷治癒の促進のための治療戦略で使用され得るＥＰＣに、部分的または完全に分化することができる。
【００３２】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された遺伝的に修飾された幹細胞は、所望の系列の遺伝的に修飾された細胞に部分的または完全に分化することができ、そうして分化した細胞は、遺伝的疾患、障害または状態（例えば、鎌状赤血球、サラセミア、または重症複合免疫不全）の処置を含めた、様々な病状および状態の処置のための治療戦略で使用することができる。
【００３３】
本開示のさらなる目的および利点は、以下の説明において部分的に記載され、以下の説明から部分的に明らかとなるか、または本開示の実施によって知ることができる。本開示の目的および利点のいくつかは、特に添付の特許請求の範囲に記載される要素および組合せを用いることによって実現され、得られる。
【００３４】
先の概要および以下の詳細な説明の両方は、単に例示的かつ説明的なものであり、特許請求される本開示を制限するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】図１ａは、シアリルＩ（大文字Ｉ）の化学構造を示す。
【００３６】
【図１ｂ】図１ｂは、シアリルｉ（小文字ｉ）の化学構造を示す。
【００３７】
【図２ａ】図２ａは、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミンの化学構造を示す。
【００３８】
【図２ｂ】図２ｂは、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースの化学構造を示す。
【００３９】
【図２ｃ】図２ｃは、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースの化学構造を示す。
【００４０】
【図３】図３は、シアリルラクトースの化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
ここで、本開示の本発明の実施形態（例示的な実施形態）について詳細に言及し、その例を、添付の図に示す。可能な限り、同じまたは類似の部分を指すために、図を通して同一参照番号が使用される。
【００４２】
本明細書で使用される略語は、一般に、化学技術および生物学技術におけるそれらの従来の意味を有する。
【００４３】
「抗体（単数）」、「抗体（複数）」、「ａｂ」または「免疫グロブリン」という用語は、最も広範な意味で交換可能に使用され、所望の生物活性を示す限り、それらには、単離された、工学的に操作された、化学的に合成された、または組み換えられた抗体（例えば、全長または無傷モノクローナル抗体）を含めたモノクローナル抗体、および抗体断片も含まれる。一実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体に関する。
【００４４】
抗体分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つまたは４つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、超可変性領域、より保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）、および古典的補体系の第１構成成分（Ｃｌｑ）を含めた、宿主組織または因子との免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００４５】
本開示による抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗体の標的に結合する能力を保持している任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すことを企図する。一実施形態では、標的は、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ、図１ａ参照）、シアリルｉ（小文字ｉ、図１ｂ参照）、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン（図２ａ参照）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（図２ｂ参照）、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（図２ｃ参照）、およびシアリルラクトース（図３参照）から選択される。ある特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって生成される。さらなる実施形態では、結合フラグメントは、無傷抗体の酵素的または化学的な開裂によって生成される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」という用語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指し、すなわち集団の個々の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する可能な変異を除いて、同一である。典型的に、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一エピトープを対象とする。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマによって生成することができる。モノクローナル抗体は、組換えであってよく、すなわちタンパク質工学によって生成することもできる。モノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。さらに、様々な決定因子またはエピトープを対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープを対象とする。本開示は、細胞から精製によって単離されたもしくは得られた抗体、または遺伝的組換えもしくは化学合成によって得られた抗体に関する。
【００４７】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤によって結合することができ、さらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成するために動物において使用することができる分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有することができる。抗原の例として、ＣＤ１３３分子の表面上の２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造（例えば、３’ＳＬ−ＣＤ１３３）、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ、図１ａ参照）、シアリルｉ（小文字ｉ、図１ｂ参照）、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン（図２ａ参照）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（図２ｂ参照）、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（図２ｃ参照）、およびシアリルラクトース（図３参照）が挙げられる。
【００４８】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、例えばポリペプチド決定因子などの任意の決定因子を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基が含まれ、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有することができる。エピトープは、抗体によって結合している抗原の領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合するとされる。一実施形態では、抗体は、解離定数が、約１μＭまたはそれ未満である場合、例えば解離定数が約１００ｎＭまたはそれ未満である場合など、例えば解離定数が約１ｎＭまたはそれ未満である場合など、さらに例えば解離定数が約１００ｐＭまたはそれ未満である場合などに、抗原に特異的に結合するとされる。本明細書で使用される「特異的」および「特異的結合」という用語は、交換可能であり、所定の抗原、例えば、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ、図１ａ参照）、シアリルｉ（小文字ｉ、図１ｂ参照）、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン（図２ａ参照）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（図２ｂ参照）、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（図２ｃ参照）、およびシアリルラクトース（図３参照）に結合している抗体を指す。典型的に、抗体は、１０−６Ｍまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、または任意の他の特異的ポリペプチド）に結合するために、そのＫＤの少なくとも２分の１未満のＫＤで、所定の抗原に結合する。「抗原認識抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。
【００４９】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、特定の特殊機能を有する細胞型（すなわち、高分化した細胞、例えば赤血球およびマクロファージ）を含めた他の細胞型に分化することができる細胞を指す。幹細胞は、それらの供給源（成人／体細胞性幹細胞、胚性幹細胞）に従って、またはそれらの効力（全能性、多能性（pluripotent）、複能性（multipotent）および単能性）に従って定義することができる。
【００５０】
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、リンパ系細胞および骨髄細胞を含む赤血球および白血球細胞を含めたいくつかのタイプの血液細胞のいずれかに自己再生し、分化する能力を有する動物細胞、例えば哺乳動物（ヒトを含む）細胞を指す。ＨＳＣは、ＥＰＣに分化することもできる。ＨＳＣには、ｉｎ  ｖｉｖｏで長期間にわたる潜在的な生着可能性を有する造血細胞が含まれ得る。長期間にわたる潜在的な生着可能性（例えば、長期造血幹細胞）は、動物モデルまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して決定することができる。候補ヒト造血幹細胞集団の長期間にわたる潜在的な生着可能性のための動物モデルには、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデル（Kyoizumiら（１９９２年）Blood  ７９巻：１７０４頁；Murrayら、（１９９５年）Blood  ８５巻（２号）３６８〜３７８頁）および子宮内ヒツジモデル（Zanjaniら、（１９９２年）J.  Clin.  Invest.  ８９巻：１１７９頁）が含まれる。ヒト造血発生の動物モデルの総説については、Srourら、（１９９２年）J.  Hematother.  １巻：１４３〜１５３頁およびその文献に引用されている参考文献を参照されたい。幹細胞のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、５〜８週間後の間質共培養において生成されたクローン形成細胞の数の限界希釈分析に基づく、長期間培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）アッセイである（Sutherlandら（１９９０年）Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  ８７巻：３５８４〜３５８８頁）。ＬＴＣＩＣアッセイは、一般に使用される別の幹細胞アッセイ、敷石状（cobblestone）領域を形成する細胞（ＣＡＦＣ）アッセイ、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの長期間にわたる潜在的な生着可能性と相関することが示されている（Breemsら（１９９４年）Leukemia  ８巻：１０９５頁）。造血幹細胞の総説およびデータベースについては、Montrone  C、Kokkaliaris  KD、Loeffler  D、Lechner  M、Kastenmuller  G、Schroeder  T、Ruepp  A.  HSC-explorer:  a  curated  database  for  hematopoietic  stem  cells.  PLoS  One.  ２０１３年７月３０日；８巻（７号）：ｅ７０３４８頁.  doi:  10.1371/journal.pone.0070348.  Print  ２０１３年を参照されたい。
【００５１】
本明細書で使用される「再構築の高い潜在的可能性を有する造血幹細胞」または「再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣ」という用語は、（１）ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団よりも自己再生することができる可能性が高く、（２）ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団よりも自己再生能が高く（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団と比較して、より急速に、より効率的に、より数多く、および／またはより長期にわたって自己再生することができる）、（３）ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団と比較して、赤血球および白血球細胞を含めたいくつかのタイプの血液細胞のいずれかに分化することができる可能性がより高く、（４）ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団と比較して、赤血球および白血球細胞を含めたいくつかのタイプの血液細胞のいずれかへの分化能がより高く（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団と比較して、より数多くのタイプの血液細胞に分化することができ、好ましい比の血液細胞のタイプに分化することができ、かつ／またはより急速に、より効率的に、より数多く、および／もしくはより長期にわたって分化することができる）、（５）ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期間にわたる生着可能性が高く、（６）ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期間にわたる生着能が高く（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団と比較して、より急速に生着することができ、より数多くのタイプの宿主において生着することができ、より数多くの宿主位置において生着することができ、より長期間にわたって生着することができ、かつ／または宿主拒絶反応および／もしくは合併症をあまり伴わずに生着することができる）、（７）以下の実施例５により詳細に説明される通り、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウスにおいて生着すると、マウスのＣＤ４５＋細胞が、少なくとも１０％のキメラ現象を示し、（８）以下の実施例５により詳細に説明される通り、一次および二次ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウスレシピエントにおいて生着すると、細胞が、一次レシピエントにおいて１２週間またはそれよりも長く経過した後に初めて著しい生着を示すが、二次レシピエントにおいて多系列の再構築を示し、ならびに／あるいは（９）それ以外では、動物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ幹細胞アッセイ、例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウスを使用して潜在的な生着可能性を試験するアッセイにおいて、ＣＤ３４＋ＨＳＣの母集団よりも優れている動物細胞、例えば哺乳動物（ヒトを含む）細胞を指す。これらの細胞は、本明細書に開示される方法によって動物から得られ、少なくとも非天然環境に存在することが理由で、天然に存在するＨＳＣ集団とは異なっている。天然に存在するＨＳＣ集団と比較したこれらの差異には、異なるマーカー、より長い寿命、異なる潜在的分化可能性、および／または富化が含まれ得る。
【００５２】
本明細書で使用される「増殖」には、細胞数の任意の増大が含まれる。増殖には、例えば、培養を開始するために使用された細胞集団に存在するＨＳＣの数を上回って、造血幹細胞の数が増大することが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される「単能性（unipotent）」という用語は、１つの細胞型だけを生成することができるが、自己再生の特性を有しており、それによって非幹細胞とは区別される細胞を指す。
【００５４】
本明細書で使用される「複能性（multipotent）」という用語は、「前駆細胞」という用語と同義に使用され、いくつかの異なる高分化細胞型のいずれか１つを生じることができる細胞を指す。これらの異なる細胞型は、通常、密接に関係している（例えば、赤血球、白血球細胞および血小板などの血液細胞）。例えば、間葉系幹細胞（骨髄間質細胞としても公知である）は、複能性細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞、およびβ−膵島細胞を形成することができる。
【００５５】
本明細書で使用される「多能性（pluripotent）」という用語は、生物のいくつかまたは多くの細胞型を生じるが、すべてを生じるわけではない細胞を指す。多能性幹細胞は、成熟生物の体内の任意の細胞型に分化することができるが、それらが導出された細胞に脱分化できなくするように再プログラムされてはいない。理解される通り、「複能性」前駆細胞（例えば、神経幹細胞）は、多能性幹細胞が分化するよりも狭い、潜在的な分化可能性を有する。
【００５６】
本明細書で使用される「全能性（totipotent）」という用語は、受精卵母細胞、ならびに受精卵細胞の最初の数回の分化によって生成された細胞（例えば、発生の２細胞期および４細胞期における胚）を指す。全能性細胞は、特定の種の任意の細胞型に分化する能力を有する。例えば、単一の全能性幹細胞は、完全な動物を生じることができ、同様に特定の種（例えば、ヒト）に見出される無数の細胞型のいずれかを生じることができる。
【００５７】
「ＣＤ３４」という用語は、ヒト骨髄、血液、および胎児肝から導出されたある特定の造血幹細胞および前駆細胞上に選択的に発現した、造血幹細胞抗原を指す。Yinら、Blood  ９０巻：５００２〜５０１２頁（１９９７年）；Miaglia,  S.ら、Blood  ９０巻：５０１３〜２１頁（１９９７年）。ＣＤ３４を発現する細胞は、ＣＤ３４＋と呼ばれる。間質細胞は、ＣＤ３４を発現せず、したがってＣＤ３４−と呼ばれる。ヒト血液から単離されたＣＤ３４＋細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞に分化することもできる。Yehら、Circulation  １０８巻：２０７０〜７３頁（２００３年）を参照されたい。ＣＤ３４＋細胞は、骨髄から導出された有核細胞のおよそ１％であり、ＣＤ３４抗原は、未成熟内皮細胞先駆体によっても発現され、成熟内皮細胞は、ＣＤ３４＋を発現しない。Peichev,  M.ら、Blood  ９５巻：９５２〜５８頁（２００年）。成人の骨髄から導出されたＣＤ３４＋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）の大部分、いくつかのコロニー形成単位混合物（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）および原始赤血球前駆細胞の小集団（バースト形成単位、赤血球またはＢＦＵ−Ｅ）を生じる。Yehら、Circulation  １０８巻：２０７０〜７３頁（２００３年）。またＣＤ３４＋細胞は、低頻度ではあるが、新しい心筋に分化するか、または心筋の発生に寄与する潜在可能性を有することができる。
【００５８】
造血細胞は、抗ＣＤ３４抗体を使用して、ＣＤ３４＋幹細胞のために富化することができる。例えば、骨髄単核細胞からＣＤ３４＋細胞の高度に精製された、生存可能な集団を単離するために、免疫磁気ビーズ分離を使用する技術が開発されている。例えば、米国特許第５，５３６，４７５号、同第５，０３５，９９４号、同第５，１３０，１４４号、および同第４，９６５，２０５号を参照されたい。
【００５９】
しかし、証拠が増えることによって、すべての造血幹細胞がＣＤ３４を発現するわけではないことが示されている。例えば、Nakauchi  Hirmitsu、Hematopoietic  stem  cells:  Are  they  CD34-positive  or  CD34-negative、Nature  medicine  ４巻：１００９〜１０１０頁（１９９８年）。
【００６０】
造血幹細胞を含む出発細胞集団は、想定された使用に応じて、当業者によって選択される。骨髄、末梢血、新生児臍帯血、胎盤または他の供給源、例えば肝臓、例えば胎児肝を含めた、造血幹細胞を含む様々な細胞供給源が、当技術分野において説明されている。
【００６１】
ＨＳＣのさらなる富化は、ＣＤ３８−でもあるＣＤ３４＋細胞を選択することによって達成することができる。このような富化は、それに限定されるものではないが、望ましくない細胞集団へのＣＤ３８特異的抗体の結合に基づく選択を含めた、細胞の負の選択について刊行されているか、かつ／または商業的な方法論に従って行うことができる。代替の望ましくない細胞集団は、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ５６、ＣＤ９７および／またはＣＤ２３５に対する抗体を使用して、幹細胞プールから除去することができる。
【００６２】
「ＣＤ１３３」という用語は、あるクラスの新規なペンタスパン膜タンパク質の中で、ヒトおよびマウスの両方において最初に識別されるものであるタンパク質プロミニン−１を指し、元々、原始造血幹細胞および神経幹細胞のマーカーとして分類された。現在は、造血幹細胞のマーカーとしてのＣＤ１３３の実用性が、研究によって確認されている。ＣＤ１３３に対する抗体は、当技術分野で広く利用可能である。
【００６３】
ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離する方法
【００６４】
一実施形態では、本開示は、ヒト造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離するために使用され得る抗体を生成するための方法であって、
造血幹細胞に対して産生された抗体集団から、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に結合し、
ヒトＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離することができる
抗体をスクリーニングするステップを含む方法を提供する。
【００６５】
一実施形態では、抗体集団を産生するために使用される造血幹細胞は、ＣＤ３４＋である。一実施形態では、抗体集団を産生するために使用される造血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−である。一実施形態では、抗体集団を産生するために使用される造血幹細胞は、ＣＤ３４−である。
【００６６】
一実施形態では、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造は、シアリルＩ（大文字Ｉ、図１ａ参照）、シアリルｉ（小文字ｉ、図１ｂ参照）、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン（図２ａ参照）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（図２ｂ参照）、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（図２ｃ参照）、およびシアリルラクトース（図３参照）から選択される。
【００６７】
一実施形態では、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造は、シアリルラクトース（図３参照）である。
【００６８】
一実施形態では、抗体は、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３上に発現するかまたは存在する、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に結合する。
【００６９】
一実施形態では、抗体は、３’ＳＬ−ＣＤ１３３に特異的に結合する。
【００７０】
一実施形態では、抗体は、３’ＳＬ−ＣＤ１３３に特異的に結合し、ノイラミニダーゼで処理した３’ＳＬ−ＣＤ１３３には結合しない。
【００７１】
一実施形態では、抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルによって機能的に決定される通り、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣを単離するために使用することができる。
【００７２】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルでは、試験細胞集団を、照射されたマウス（例えば、ＮＯＧマウスとしても公知のＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウス）に移植し、次に、それらの試験細胞集団の長期間にわたる潜在的な再増殖可能性を評価することを伴う。
【００７３】
一実施形態では、抗体は、ＣＤ１３３およびヒト−フコシダーゼで処理したＣＤ１３３に結合するか、またはそれらとの結合が増強しているが、ノイラミニダーゼで処理したＣＤ１３３には結合しない。一実施形態では、この抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルによって機能的に決定される通り、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣを単離するために使用することができる。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルでは、試験細胞集団を、照射されたマウス（例えば、ＮＯＧマウスとしても公知のＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウス）に移植し、次に、それらの試験細胞集団の長期間にわたる潜在的な再増殖可能性を評価することを伴う。
【００７４】
一実施形態では、造血幹細胞は、骨髄から単離することができる。一実施形態では、これらの細胞は、末梢血から単離することができる。一実施形態では、これらの細胞は、白血球除去生成物から単離することができる。一実施形態では、これらの細胞は、臍帯血から単離することができる。一実施形態では、これらの細胞は、供給源の組合せから単離することができる。
【００７５】
一実施形態では、造血幹細胞は、ＦＡＣＳ選別、免疫磁気ビーズ、および／またはアフィニティーマトリックスによって単離することができる。
【００７６】
一実施形態では、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３は、ＨＳＣから単離される。一実施形態では、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３は、ＣＤ３４＋ＨＳＣから単離される。一実施形態では、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＨＳＣから単離される。
【００７７】
本開示は、再構築の高い潜在的可能性を有する初期原始造血幹細胞を識別かつ単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための方法および組成物に関する。このような方法によって単離された細胞およびこのような方法によって産生された抗体の両方の、再生医療適用におけるいくつかの使用も提供される。
【００７８】
一実施形態では、本明細書に開示される技術は、造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを検出し、単離するための診断抗体および治療抗体を速やかに開発するための、新しい戦略を提供する。一実施形態では、本明細書に開示される技術は、血液学的疾患および慢性疾病、例えば白血病、リンパ腫、および骨髄腫の処置、心血管障害の処置、または創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）のための、新しい戦略を提供する。一実施形態では、ＨＳＣ、ＨＳＣから導出された細胞、または抗体は、進行性濾胞性リンパ腫を処置するために使用される。別の実施形態では、ＨＳＣ、ＨＳＣから導出された細胞、または抗体は、小児の血液学的疾患を処置するために使用される。一実施形態では、ＨＳＣ、ＨＳＣから導出された細胞、または抗体は、成人の血液学的疾患を処置するために使用される。別の実施形態では、ＨＳＣ、ＨＳＣから導出された細胞、または抗体は、急性骨髄性白血病を処置するために使用される。一実施形態では、ＨＳＣ、ＨＳＣから導出されたＥＰＣを含めたＨＳＣから導出された細胞、ＨＳＣから導出されたＥＰＣによって馴化された培地、または抗体は、心血管障害を処置するために使用される。一実施形態では、ＨＳＣ、ＨＳＣから導出されたＥＰＣ、ＨＳＣから導出されたＥＰＣによって馴化された培地、または抗体は、創傷を処置し、かつ／または創傷治癒を促進するために使用される。一実施形態では、ＨＳＣは、増殖および繁殖の前に、ならびに／または処置に使用する前に、遺伝的に修飾される。
【００７９】
一実施形態では、本開示は、造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを識別かつ単離するために使用され得る抗体に関する。一実施形態では、抗体は、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ、図１ａ参照）、シアリルｉ（小文字ｉ、図１ｂ）、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン（図２ａ参照）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（図２ｂ参照）、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（図２ｃ参照）、およびシアリルラクトース（図３参照）に特異的である。
【００８０】
一実施形態では、造血幹細胞を識別かつ単離するために使用され得る抗体を発見し、生成するための細胞集団が提供される。一実施形態では、抗体を生成するために使用される細胞集団は、再構築の高い潜在的可能性を有する造血幹細胞を含む。
【００８１】
一実施形態では、本開示は、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ、図１ａ参照）、シアリルｉ（小文字ｉ、図１ｂ参照）、Ｎ−アセチルシアリルラクトースアミン（図２ａ参照）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（図２ｂ参照）、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（図２ｃ参照）、およびシアリルラクトース（図３参照）に特異的な抗体であって、マウスにＣＤ３４＋、ＣＤ３８−ＨＳＣを注射し、得られた抗体を、マルチウェルプレート上にコーティングされた２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、およびシアリルラクトースに結合する抗体についてスクリーニングするステップを含む方法によって生成される抗体を提供する。
【００８２】
本開示のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature  ２５６巻：４９５頁による標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含めた様々な技術によって生成することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順を使用することができ、または例えばＢ−リンパ球のウイルス性もしくは発癌性の形質転換を含めた、モノクローナル抗体を生成するための他の技術を用いることができる。
【００８３】
当業者は、ヒトＩｇ遺伝子座の大きい断片を用いて、マウス抗体生成におけるマウス株の欠損を工学的に操作することができ、したがって、このようなマウスは、マウス抗体がない状態でヒト抗体を生成する。大きいヒトＩｇ断片は、膨大な可変的な遺伝子多様性、ならびに抗体生成および発現の妥当な調節を保存することができる。抗体の多様化および選択に関するマウス機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を活用することによって、これらのマウス株において再生成されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含めた目的の任意の抗原に対する高アフィニティー抗体をもたらす。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的なヒトＭＡｂを生成し、選択することができる。
【００８４】
代替の実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現させることができる。これらの実施形態では、適切な哺乳動物宿主細胞を形質変換するために、特定の抗体をコードする配列を使用することができる。これらの実施形態によれば、形質転換は、例えば、ウイルス（またはウイルスベクター）にポリヌクレオチドをパッケージングすること、および宿主細胞にウイルス（またはベクター）を形質導入することを含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法を使用するか、または当技術分野で公知のトランスフェクション手順によって達成することができる。このような手順は、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号によって例示されている。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に応じて変わり得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当技術分野で周知であり、それには、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（単数または複数）の被包、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが含まれるが、それらに限定されない。
【００８５】
一実施形態では、本開示は、３’−シアル酸付加されたラクトースに結合することができる抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、ヒト造血幹細胞の表面上の３’−シアル酸付加されたラクトースに結合することができる。
【００８６】
別の実施形態では、本開示は、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３上に発現するかまたは存在する、２−３シアル酸付加された（sialyated）ラクト−ネオラクト型構造に特異的に結合することができる抗体を提供する。一実施形態では、このＣＤ１３３は、ＨＳＣから単離される。一実施形態では、ＣＤ１３３は、再構築の高い潜在的可能性を有する造血幹細胞から単離される。
【００８７】
ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３上に発現した２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に特異的に結合することができるハイブリドーマ／抗体のスクリーニングは、当業者に利用可能な複数の技術のいずれかによって達成することができる。一実施形態では、スクリーニング方法は、アフィニティーマトリックス上に固定された抗ＣＤ１３３抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、ヒト造血幹細胞および前駆細胞から抽出されたＣＤ１３３分子を精製することを含む。別の実施形態では、次に、２−３シアル酸付加されたラクト構造を発現するＣＤ１３３の特異的なグリコフォームは、アフィニティーマトリックス上に固定されたＭＡＡレクチン（Ｍａａｋｉａ  ａｍｅｎｕｒｉｓ）を使用するレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって、これらのＣＤ１３３分子からさらに精製される。ＭＡＡレクチンは、２−３シアル酸付加されたラクト構造に結合する。
【００８８】
一実施形態では、ＣＤ１３３の精製された特異的なグリコフォーム（例えば、３’シアル酸付加されたラクト／ネオラクト構造−ＣＤ１３３、または３’ＳＬ−ＣＤ１３３）は、マイクロタイタープレートのウェル中でコーティングされる。一実施形態では、３’ＳＬ−ＣＤ１３３でコーティングされたウェルの半分は、ノイラミニダーゼで処理される。ノイラミニダーゼは、スクリーニングされる望ましい抗体に結合するエピトープ上の末端シアル酸残基を切断する。次に、３’ＳＬ−ＣＤ１３３に特異的に結合し、ノイラミニダーゼで処理した３’ＳＬ−ＣＤ１３３には結合しないそれらの抗体は、精製および／またはクローン化される。
【００８９】
一実施形態では、次に、３’ＳＬ−ＣＤ１３３に特異的に結合し、ノイラミニダーゼで処理した３’ＳＬ−ＣＤ１３３には結合しない抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルによって機能的に決定される通り、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを単離するそれらの能力について試験される。
【００９０】
別の実施形態では、精製されたＣＤ１３３は、マイクロタイタープレートのウェル中でコーティングされる。ＣＤ１３３でコーティングされたウェルの半分は、ヒトフコシダーゼで処理される。フコシダーゼは、ＣＤ１３３上の望ましくないより分化した炭水化物構造（シアリルＬｅｘ）上にあるルイスフコースを除去する。次に、ハイブリドーマは、ＣＤ１３３およびヒト−フコシダーゼで処理したＣＤ１３３に結合するか、またはそれらの結合が増強されているが、ノイラミニダーゼで処理したＣＤ１３３には結合しないそれらの能力について選択される。一実施形態では、次に、これらの抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルによって機能的に決定される通り、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを単離するそれらの能力について試験することができる。
【００９１】
一実施形態では、本開示は、ヒト造血幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣに関する。本開示は、治療における潜在的な使用可能性のために、このような細胞を単離する方法を提供する。
【００９２】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞を含む組成物が提供される。
【００９３】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞は、血液学的疾患、障害または状態（例えば、サラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、骨髄腫）を含めた様々な病状および状態の処置のための治療戦略で直接的に使用することができる。
【００９４】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞は、遺伝的疾患、障害または状態、例えば血液学的な遺伝的疾患、障害または状態（例えば、鎌状赤血球、サラセミア、または重症複合免疫不全）を含めた様々な病状および状態を処置するための遺伝子治療戦略で使用する前に、遺伝的に修飾することができる。
【００９５】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された幹細胞は、所望の系列の細胞に部分的または完全に分化することができ、それらの細胞は、血液学的疾患、障害  状態（例えば、サラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、骨髄腫）、心血管障害、または創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）を含めた様々な病状および状態の処置のための治療戦略で使用することができる。一実施形態では、細胞または抗体は、進行性濾胞性リンパ腫を処置するために使用される。別の実施形態では、細胞または抗体は、小児の血液学的疾患を処置するために使用される。一実施形態では、細胞または抗体は、成人の血液学的疾患を処置するために使用される。別の実施形態では、細胞または抗体は、急性骨髄性白血病を処置するために使用される。
【００９６】
別の実施形態では、本開示の方法の１つに従って生成された遺伝的に修飾された幹細胞は、所望の系列の遺伝的に修飾された細胞に部分的または完全に分化することができ、それらの遺伝的に修飾された細胞は、様々な病状および状態、例えば血液学的な遺伝的疾患、障害または状態（例えば、鎌状赤血球、サラセミア、または重症複合免疫不全）の処置のための治療戦略で使用することができる。
【００９７】
一実施形態では、初期原始ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣは、心血管障害の処置または創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）のために使用される。一実施形態では、ＥＰＣは、心血管障害の処置もしくは創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）に使用するために、または心血管障害の処置もしくは創傷の処置（例えば、創傷治癒の促進）に使用するための培地を馴化させるために、ＨＳＣから繁殖させることができる。
【００９８】
本明細書に記載される実施に従って遺伝的に修飾されたＨＳＣの培養を含めた、ＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏ培養に適した培養培地は、例えば米国特許第６，０３０，８３６号、およびJ.  Hartshornら、「Ex  Vivo  Expansion  of  Hematopoietic  Stem  Cells  Using  Defined  Culture  Media」、Cell  Technology  for  Cell  Products、第ＩＩＩ章、２２１〜２２４頁に開示されている通り、当技術分野で周知である。このような培養培地には、容易に商業的に利用可能な周知のＬ−グルタミンを含む高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれるが、それに限定されない。培地には、組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｒｈｂＦＧＦ）を補充することができ、培地は、血清、例えばヒト血清、および抗生物質を含有する。細胞培養物は、培養流体のｐＨを維持するために、ＣＯ２雰囲気中、例えば５％〜１２％に維持され、湿気のある雰囲気中、３７℃でインキュベートされる。化学的に定義付けられた適切な無血清培地は、米国特許出願第０８／４６４，５９９号および国際公開第９６／３９４８７号に記載されており、「完全培地」は、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。化学的に定義付けられた培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ  Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ならびにマイトジェンを補充された、最小必須培地、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）を含む。これらの培地は、分化なしに細胞成長を刺激する。本明細書で使用される場合、マイトジェンは、細胞の細胞分裂を刺激する薬剤を指す。このような薬剤は、細胞に、有糸分裂を誘発する細胞分裂を始めるように働きかける、化学的な、通常はいくつかの形態のタンパク質であり得る。培養培地の他の例として、ＲＰＭＩ  １６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ  Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ならびにマイトジェンを補充された、最小必須培地、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）を含む、化学的に定義付けられた培地も適している。ＨＳＣは、実施例６に記載される方法に従って増殖させることもできる。
【００９９】
本開示の抗体および細胞の投与経路（純粋な抗体／細胞、標識された抗体／細胞、毒素に融合した抗体等であろうとなかろうと）は、公知の方法に従う。
【０１００】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着または浸透を修正し、維持し、または保存するための製剤化材料を含有することができる。このような実施形態では、適切な製剤化材料には、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；単糖；二糖；ならびに他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トリメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal））；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；浸透圧増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール  ソルビトール）；送達ビヒクル；賦形剤；添加剤および／または薬学的アジュバントが含まれるが、それらに限定されない。Remington's  Pharmaceutical  Sciences、１８版（A.  R.  Gennaro.編）、１９９０年、Mack  Publishing  Companyを参照されたい。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体および／または細胞を含む適切な医薬組成物は、例えば、所期の投与経路、送達型式および所望の投与量に応じて、当業者によって決定される。例えば、上記Remington's  Pharmaceutical  Sciencesを参照されたい。ある特定の実施形態では、このような組成物は、本開示の抗体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすことができる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、医薬組成物における主なビヒクルまたは担体は、水性または非水性のいずれかの性質であり得る。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、非経口投与のための組成物によく見られる他の材料を場合によって補充された、注射用の水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得る。血清アルブミンと混合された中性緩衝食塩水または生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。一部の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含むことができる。本開示のある特定の実施形態では、組成物は、保存のために、所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤化薬剤と混合することによって、凍結乾燥させたケーキまたは水溶液の形態で調製することができる（上記Remington's  Pharmaceutical  Sciences）。さらに、ある特定の実施形態では、生成物は、スクロースなどの適正な添加剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０１０３】
本開示の医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。この組成物は、吸入のため、または消化管を介する送達、例えば経口送達のために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技術の範囲内である。
【０１０４】
製剤の構成成分は、投与部位に許容される濃度で存在することができる。ある特定の実施形態では、緩衝液は、組成物を、生理的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ、典型的に約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
【０１０５】
非経口投与が企図される場合、本開示で使用するための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクルに所望の抗体および／または細胞を含む、発熱物質を含まない非経口で許容される水溶液の形態で提供することができる。非経口注射に適したビヒクルの一例は、抗体を適切に保存された無菌等張溶液として製剤化する無菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製物は、所望の分子を、デポー注射によって送達され得る生成物を制御放出または持続放出することができる薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームと共に製剤化することを含むことができる。ある特定の実施形態では、循環における期間の持続を促進する効果を有するヒアルロン酸を使用することもできる。ある特定の実施形態では、所望の抗体および／または細胞を導入するために、植込み型送達デバイスを使用することができる。
【０１０６】
本開示の医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。これらの実施形態では、抗体は、吸入のための乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、抗体吸入溶液は、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に製剤化することもできる。ある特定の実施形態では、溶液は、ネブライザーで投与することができる。したがって、肺への投与および製剤化方法は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載している、参照によって組み込まれる国際公開第９４／２００６９号にさらに記載されている。
【０１０７】
製剤が経口投与され得ることも企図される。この方式で投与される抗体は、固体剤形、例えば錠剤およびカプセル剤の配合において習慣的に使用される担体を用いて、またはそれなしに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、カプセル剤は、胃腸管の地点において、バイオアベイラビリティが最大化され、全身循環前の分解が最小限に抑えられるときに、製剤の活性部分を放出するように設計することができる。抗体の吸収を容易にするための追加の薬剤が含まれ得る。賦形剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤を用いることもできる。
【０１０８】
本開示のいくつかの医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性の添加剤と混合された、有効量の本明細書に記載される抗体の１つまたは複数を含む。錠剤を無菌水、または別の適正なビヒクルに溶解させることによって、溶液を、単位用量形態で調製することができる。適切な添加剤には、不活性賦形剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースもしくはリン酸カルシウム、または結合剤、例えばデンプン、ゼラチンもしくはアカシア、または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクが含まれるが、それらに限定されない。
【０１０９】
持続送達または制御送達製剤を含む製剤を含めたさらなる医薬組成物は、当業者に明らかとなろう。様々な他の持続送達または制御送達手段を製剤化するための技術、例えばリポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射も、当業者に公知である。例えば、医薬組成物を送達するための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載している、国際公開第９３／１５７２２号を参照されたい。持続放出調製物は、成型品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の、半透明ポリマーマトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願第０５８４８１号に開示されている通り）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Sidmanら、１９８３年、Biopolymers  ２２巻：５４７〜５５６頁）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Langerら、１９８１年、J.  Biomed.  Mater.  Res.  １５巻：１６７〜２７７頁およびLanger、１９８２年、Chem.  Tech.  １２巻：９８〜１０５頁）、エチレン酢酸ビニル（上記Langerら）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願第１３３，９８８号）を含むことができる。持続放出組成物は、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームを含むこともできる。例えば、Eppsteinら、１９８５年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８２巻：３６８８〜３６９２頁；欧州特許出願第０３６，６７６号、同第０８８，０４６号、および同第１４３，９４９号を参照されたい。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は、典型的に、無菌調製物として提供される。滅菌は、無菌濾過膜を介して濾過することによって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに、この方法を使用して滅菌を実施することができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１１１】
医薬組成物を製剤化したら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または無水のもしくは凍結乾燥させた粉末として、無菌バイアルで保存することができる。このような製剤は、すぐに使用できる形態、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥形態）のいずれかで保存することができる。使用するのに適した医薬組成物には、本発明の抗体および／または細胞の１つまたは複数が、それらの所期の目的を達成するのに有効な量で含有されている組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、疾患の症状を防止、軽減もしくは寛解させるか、または処置を受ける対象の生存期間を延長するのに有効な、抗体および／または細胞の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、当業者の技術の範囲に十分に含まれる。治療上有効な投与量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ方法を使用することによって決定することができる。
【０１１２】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＨＳＣをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出するために利用することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出は、本明細書に記載される抗体を標識し、標識された抗体を対象に投与し、次に対象を画像化することによって達成される。本開示による画像診断に有用な標識の例は、放射標識、例えばＩ１２３、Ｉ１３１、Ｉ１１１、Ｔｃ９９ｍ、Ｐ３２、Ｉ１２５、Ｈ３、Ｃ１４、およびＲｈ１８８、蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミン、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）走査装置によって検出可能な陽電子放出同位体、化学発光物（chemiluminescer）、例えばルシフェリン、および酵素的マーカー、例えばペルオキシダーゼまたはホスファターゼである。短距離放射線放出体、例えば短距離検出器プローブ、例えば経直腸プローブによって検出可能な同位体を用いることもできる。抗体は、当技術分野で公知の技術を使用して、このような試薬を用いて標識することができる。例えば、抗体の放射標識に関する技術に関して参照によって本明細書に組み込まれる、WenselおよびMeares、Radioimmunoimaging  and  Radioimmunotherapy、Elsevier、N.Y.（１９８３年）を参照されたい。また、参照によって本明細書に組み込まれるD.  Colcherら、「Use  of  Monoclonal  Antibodies  as  Radiopharmaceuticals  for  the  Localization  of  Human  Carcinoma  Xenografts  in  Athymic  Mice」、Meth.  Enzymol.  １２１巻：８０２〜８１６頁（１９８６年）も参照されたい。
【０１１３】
本開示に従って放射標識された抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断試験のために使用することができる。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドの比活性は、放射性標識の半減期、同位体純度、および標識が生物学的作用物質に組み込まれる方法に応じて決まる。イムノアッセイ試験では、比活性が高いほど、一般に感度が良好である。抗体を放射性同位体で標識するための手順は、一般に当技術分野で公知である。
【０１１４】
放射標識抗体は、患者に投与することができ、そこで放射標識抗体は、抗体が反応する抗原を担持するＨＳＣに局在化され、公知の技術、例えば放射性核種（radionuclear）走査を使用して、例えば、ガンマカメラまたは放出断層撮影法を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで検出または「画像化」される。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるA.  R.  Bradwellら、「Developments  in  Antibody  Imaging」、Monoclonal  Antibodies  for  Cancer  Detection  and  Therapy、R.  W.  Baldwinら（編）、６５〜８５頁（Academic  Press  １９８５年）を参照されたい。あるいは、陽電子放出横断断層撮影法走査装置、例えばブルックヘブン国立研究所にある、放射標識が陽電子を放出する（例えば、Ｃ１１、Ｆ１８、Ｏ１５、およびＮ１３）、指定のＰｅｔ  ＶＩを使用することができる。
【０１１５】
フルオロフォアおよび発色団で標識された生物学的作用物質は、当技術分野で公知の標準部分から調製することができる。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、その蛍光部分は、３１０ｎｍを超える、例えば４００ｎｍを超える波長において実質的に吸収するように選択されるべきである。様々な適切な蛍光剤および発色団は、参照によって本明細書に組み込まれるStryer、Science、１６２巻：５２６頁（１９６８年）およびBrand,  L.ら、Annual  Review  of  Biochemistry、４１巻：８４３〜８６８頁（１９７２年）に記載されている。抗体は、従来の手順、例えば参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号に開示されている手順によって、蛍光性発色団基で標識することができる。
【０１１６】
本開示による別の実施形態では、処置し、治療的処置の進行および／または有効性をモニタリングするための方法が提供される。
【０１１７】
本明細書に記載される治療方法のそれぞれの一実施形態では、対象は、最初に、ＨＳＣの増大または補充の必要性について診断される。本明細書に記載される治療方法のそれぞれの一実施形態では、対象は、血液細胞を増大する必要性がある。別の実施形態では、対象は、血液学的疾患、障害または状態（例えば、サラセミア、鎌状赤血球病、白血病、リンパ腫、骨髄腫等）から選択される疾患を有する。一実施形態では、細胞または抗体は、進行性濾胞性リンパ腫を処置するために使用される。別の実施形態では、細胞または抗体は、小児の血液学的疾患を処置するために使用される。一実施形態では、細胞または抗体は、成人の血液学的疾患を処置するために使用される。別の実施形態では、細胞または抗体は、急性骨髄性白血病を処置するために使用される。
【０１１８】
本明細書に記載される治療方法のそれぞれの一実施形態では、対象は、最初に、心血管障害、および／またはＨＳＣもしくはＥＰＣの必要性について診断され、細胞または抗体は、心血管障害を処置するために使用される。別の実施形態では、対象は、創傷を受けており、細胞または抗体は、創傷を処置する（例えば、創傷治癒を促進する）ために使用される。別の実施形態では、ＨＳＣから繁殖させた細胞を使用して、心血管障害を処置するか、または創傷を処置する（例えば、創傷治癒を促進する）ために使用される培地を馴化する。
【０１１９】
本明細書に記載される治療方法のそれぞれの一実施形態では、対象は、最初に、遺伝的疾患、障害もしくは状態、および／または遺伝的に修飾されたＨＳＣの必要性について診断される。一実施形態では、遺伝的に修飾されたＨＳＣは、血液の疾患または障害、例えば鎌状赤血球、サラセミア、および重症複合免疫不全を処置するために使用される。
【０１２０】
本明細書の一実施形態では、再構築の高い潜在的可能性を有するヒトＨＳＣ集団を移植するための方法が記載される。本明細書の一実施形態では、再構築の高い潜在的可能性を有するヒトＨＳＣから導出された細胞の集団を移植するための方法が記載される。本明細書の一実施形態では、再構築の高い潜在的可能性を有する遺伝的に修飾されたヒト造血幹細胞の集団を移植するための方法が記載される。
【０１２１】
本明細書に開示されるある特定の方法は、ＨＳＣのパーセンテージまたは数が多い方が、薬物を発見するため、またはヒト造血幹細胞移植における生着のため、例えば、細胞除去（cytoablative）治療後の患者を救済するための臨床研究において望ましい、任意の状況に適用できる。例えば、骨髄移植では、レシピエントに植え込まれるＨＳＣの数またはパーセンテージが高いほど、レシピエントにおけるドナーＨＳＣの生着パーセンテージが高いことが公知である。
【０１２２】
本明細書に開示されるある特定の方法は、遺伝的に修飾されたＨＳＣが、薬物を発見するため、またはヒト造血幹細胞移植における生着のため、例えば遺伝子治療のための臨床研究において望ましい、任意の状況に適用できる。
【０１２３】
本明細書の一実施形態では、ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを含む、単離された細胞集団、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が記載される。
【０１２４】
本明細書の一実施形態では、ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣから繁殖させた細胞を含む、単離された細胞集団、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が記載される。
【０１２５】
本明細書の一実施形態では、遺伝的に修飾された造血性幹細胞、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを含む、単離された細胞集団、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が記載される。
【０１２６】
具体的な実施形態に応じて、本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、ＨＳＣの増殖／自己再生／長期間培養開始コロニー形成能、またはこのような増殖から産生された細胞を刺激するか、または促進する薬剤を含むことができる。したがって、このような組成物を投与するための製剤は、具体的な実施形態に応じて決まる。増殖を促進する薬剤は、例えば、その薬剤に適した任意の経路によって投与することができる。投与経路には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下経路が含まれるが、それらに限定されない。投与経路には、例えば創傷部位への直接的な投与も含まれ得る。
【０１２７】
骨髄から循環へのＨＳＣの動員を増大するための方法が存在するが、本明細書に開示される方法を、その動員方法と組み合わせて使用すると、収集する前にドナーの循環ＨＳＣおよび骨髄におけるＨＳＣの量を増大することができる。さらに、本明細書に開示される方法は、細胞をドナーから収集した後、その細胞をレシピエントに移植する前にＨＳＣの量を増大するために使用することができる。ドナーから収集されたＨＳＣは、最初にｅｘ  ｖｉｖｏで培養され、本明細書に開示される方法によって培養で増殖される。ＨＳＣの数が所望の量に達したら、培養したＨＳＣを収集し、レシピエントに植え込むことができる。
【０１２８】
一実施形態では、ＨＳＣは、対象から単離され、任意選択で数を増大するために培養され、収集され、同じ対象に移植して戻され、すなわち自家細胞移植される。一実施形態では、ＨＳＣは、対象から単離され、遺伝的に修飾され、任意選択で数を増大するために培養され、収集され、同じ対象に移植して戻され、すなわち自家細胞移植される。
【０１２９】
別の実施形態では、ＨＳＣは、レシピエント対象と一致するＨＬＡ−タイプのドナーから単離され、ここでドナーとレシピエントは、２つの別個の個体である。これは、同種移植である。ドナー−レシピエントの抗原タイプの一致は、当技術分野で周知である。ＨＬＡ−タイプには、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−Ｄが含まれる。典型的に、これらは、移植に必要な細胞表面抗原の一致の最小数を表す。
【０１３０】
一実施形態では、ＨＳＣまたは遺伝的に修飾されたＨＳＣを含む、単離された細胞集団は、移植の前に凍結保存される。
【０１３１】
移植方法は、ドナーまたはレシピエントの性質によって制限されない。一部の実施形態では、ドナーおよびレシピエントは、共にヒトである。移植レシピエントは、ドナーと完全にまたは部分的に同種であり得る。移植は、自家であってもよい。移植レシピエントまたはドナーは、５歳未満、１〜１０歳、５〜１５歳、１０〜２０歳、１５〜２５歳、２０〜３０歳、２５〜３５歳、３０〜４０歳、３５〜４５歳、４０〜５０歳、４５〜５５歳、５０〜６０歳、５５〜６５歳、６０〜７０歳、または７０歳もしくはそれよりも高年齢であってよい。
【０１３２】
別の実施形態では、処置を受ける対象は、移植の補助物として、亜致死的または致死的線量の放射線を受けている（例えば、照射されている）。
【０１３３】
本開示の他の実施形態は、本明細書に開示される本開示の明細書および実施を考慮することによって当業者に明らかとなろう。
【０１３４】
ＨＳＣ、例えば、再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣは、診療所において数々の使い方がある。総説については、例えば、Weissman  IL、Shizuru  JA、The  origins  of  the  identification  and  isolation  of  hematopoietic  stem  cells,  and  their  capability  to  induce  donor-specific  transplantation  tolerance  and  treat  autoimmune  diseases、Blood、２００８年１１月１日、１１２巻（９号）：３５４３〜５３頁を参照されたい。
【０１３５】
ヒト治療における幹細胞移植の数々の具体的な使用例は、当技術分野に見出すことができる。例えば、Hematopoietic  Stem  Cell  Transplantation、Anthony  D.  Ho、Rainer  Haas、およびRichard  E.  Champlin編、Marcel  Dekker  Inc.  ２００年；Schrauder  A、von  Stackelberg  A、Schrappe  M、Cornish  J、Peters  C、ALL-BFM  Study  Group、EBMT  PD  WP、I-BFM  Study  Group、Allogeneic  hematopoietic  SCT  in  children  with  ALL:  current  concepts  of  ongoing  prospective  SCT  trials、Bone  Marrow  Transplant、２００８年６月、４１巻  付録２号：Ｓ７１〜４頁；Copelan  EA、Hematopoietic  stem-cell  transplantation、N  Engl  J  Med、２００６年４月２７日、３５４巻（１７号）：１８１３〜２６頁；Kim  SW、Hematopoietic  stem  cell  transplantation  for  follicular  lymphoma:  optimal  timing  and  indication、J  Clin  Exp  Hematop、２０１４年、５４巻（１号）：３９〜４７頁；Choi  SW、Reddy  P、Current  and  emerging  strategies  for  the  prevention  of  graft-versus-host  disease、Nat  Rev  Clin  Oncol、２０１４年９月、１１巻、５３６〜４７頁；Rambaldi  A、Biagi  E、Bonini  C、Biondi  A、Introna  M、Cell  based  strategies  to  manage  leukemia  relapse:  efficacy  and  feasibility  of  immunotherapy  approaches、Leukemia、２９巻：１〜１０頁、２０１４年７月８日、doi:  10.1038/leu.2014.189.  [印刷前の電子出版]；Kekre  N、Antin  JH、Hematopoietic  stem  cell  transplantation  donor  sources  in  the  21st  century:  choosing  the  ideal  donor  when  a  perfect  match  doesn't  exist、Blood、２０１４年７月１７日、１２４巻（３号）、３３４〜３４３頁；およびTsirigotis  P、Shimoni  A、Nagler  A、The  expanding  horizon  of  immunotherapy  in  the  treatment  of  malignant  disorders:  Allogeneic  hematopoietic  stem  cell  transplantation  and  beyond、Ann  Med、２０１４年、４６巻（６号）、３８４〜３９６頁を参照されたい。
【０１３６】
投与経路、体重当たりの移植細胞数、レシピエントの移植前処置および移植後処置、ならびにＨＳＣまたは再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣの投与速度および投与頻度は、常法を使用して当業者によって決定され得る。一実施形態では、投与方法は、静脈内注入である。輸血／移植される細胞の数は、性別、年齢、体重、疾患または障害のタイプ、疾患または障害の段階、細胞集団における所望の細胞のパーセンテージ（例えば、細胞集団の純度）、および治療上の利益を得るのに必要な細胞数などの因子が考慮される。本明細書に記載される方法と共に、様々な補助的処置を使用することができる。一態様では、補助的処置には、中でも、抗真菌剤、抗菌剤、および抗ウイルス剤が含まれる。
【０１３７】
前述の通り、治療効果を達成するのに必要な細胞の量は、特定の目的に合った従来の手順に従って、経験的に決定される。一般に、治療目的で細胞を投与するために、細胞は、薬理学的に有効な用量で与えられる。「薬理学的に有効な量」または「薬理学的に有効な用量」とは、所望の生理的効果をもたらすのに十分な量、または例えば対象の生着もしくは生存のために所望の結果を達成することができる量である。治療上の利益は、改善が実現されるかどうかにかかわらず、基礎疾患または障害の進行を停止または緩徐することも含む。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１）
免疫付与のためのヒトＣＤ３４＋、ＣＤ３８−ＨＳＣの単離
陽性免疫磁気選択を使用して収集したヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を、Ｌｏｎｚａまたは任意の他の商業的供給源から得ることができる。この細胞は、例えば、骨髄、末梢血、白血球除去生成物、および／または臍帯血から導出することができる。一例では、低密度骨髄単核細胞（１．０７７ｇ／ｍＬ未満）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅで分離する。ＣＤ３４＋細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏ  Ｉｎｃ（ワシントン州ボセル（Bothel））製の商業的に利用可能な細胞分離系キットを使用して富化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％ＢＳＡで２回洗浄し、２×１０８個の細胞／ｍＬの濃度まで１％ＢＳＡに再懸濁させ、ビオチン化抗ＣＤ３４  ＩｇＭモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）（１２．８）と共に室温で２５分間インキュベートする。細胞を、１％ＢＳＡで洗浄して非結合抗体を除去し、次に、５％ＢＳＡに２×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、アビジンカラムに搭載する。吸着されたＣＤ３４＋細胞を、ゲル床を手作業で圧搾することによって放出させ、２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭに再懸濁させ、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、フロリダ州ハイアリア）で計数する。
【０１３９】
あるいは、単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）密度遠心分離を使用してヒト骨髄から単離する。次に、単核画分を、小型磁気作動型細胞選別機系（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を使用してＣＤ３４＋細胞のために予め富化し、それによって８５％〜９０％純粋なＣＤ３４＋集団を得る。次に、得られた細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ３４（ＨＰＣＡ２−ＦＩＴＣ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ３８（Ｌｅｕ  １７−ＰＥ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と共にインキュベートし、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＿細胞を、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、９９％よりも高い純度まで単離する。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、高いＣＤ３４抗原発現、およびアイソタイプ対照の最大ＰＥ蛍光の半分に満たないＣＤ３８蛍光を伴うものとして得られる。
【０１４０】
（実施例２）
ＣＤ１３３表面上の２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、およびシアリルラクトースに対する抗体を作製するためのＣＤ１３３の単離
ヒト造血幹細胞および前駆細胞からのＣＤ１３３の単離および精製は、当業者に公知のいくつかの方法のいずれかによって行うことができる。一例では、ＣＤ１３３＋−細胞（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン製の抗ＣＤ１３３でコーティングされた磁気ビーズ／Ｄｉａｍｏｎｄ  ＣＤ１３３単離キットを使用して単離された）（２×１０９個）を、ＰＢＳで洗浄し、抽出緩衝液で溶解する。細胞を、室温で５分間にわたって間欠的にボルテックスし、次に氷上で２０分間静置する。細胞核およびデブリを、４℃において１０，００ｇで１０分間遠心分離によって除去する。溶菌液／上清を、０．２μｍフィルタを介して濾過した後、洗浄緩衝液（０．１２５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．０１％ＮａＮ３、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％Ｂｒｉｊ）で平衡化した０．５ｍＬの抗ＣＤ１３３アフィニティーカラム上に搭載する。次に、カラムを洗浄緩衝液で十分に洗浄し、ＣＤ１３３抗原を、５０ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ１１．５、０．１％Ｂｒｉｊ、および０．０１％ＮａＮ３で溶出する。ＨＣｌを用いてｐＨを中性に調整する。残った汚染タンパク質の除去は、洗浄緩衝液で平衡化した床体積３００μｌのＤＥＡＥカラム上に抗原溶離液を通過させることを含む追加のクロマトグラフィー、および第２のアフィニティークロマトグラフィーステップによって、行うことができる。溶出されたＣＤ１３３抗原の純度および識別は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって確認することができる。
【０１４１】
（実施例３）
２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、およびシアリルラクトースに対する抗体の作製
一例では、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、およびシアリルラクトースに対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を作製するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ  ０．０３ｍＬ、ｐＨ７．４中５×１０５個のＣＤ３４＋、ＣＤ３８−ＨＳＣで、ｓ．ｃ．（例えば、足蹠）により週２回、少なくとも３回免疫付与する。最初の免疫付与は、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、米国メリーランド州セントルイス）が存在する状態で行う。不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を、その後の免疫付与のために添加する。さらに、細胞を、１：１００の植物性血球凝集素（ＰＨＡ）と共に１０分間インキュベートした後、注射することができる。融合の３日前に、免疫マウスを、５×１０５個のＣＤ３４＋、ＣＤ３８−ＨＳＣで追加免疫する。およそ２１日目に、脾細胞およびリンパ球を、それぞれ脾臓を灌流させ、近位リンパ節を切り刻むことによって免疫マウスから調製し、収集し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、米国メリーランド州ロックビル）に融合させる。融合プロトコールは、KohlerおよびMilstein（Nature、２５６巻：４９５〜４９７頁、１９７５年）に記載されている通りであってよい。
【０１４２】
次に、融合細胞を、ＨＡＴ選択に付す。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片を調製するために、例えば、「抗体」マニュアル（HarlowおよびLane、Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Cold  Spring  Harbor  NY、７２６頁、１９８８年）に記載されている技術を参照することが可能である。融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングする。一次スクリーニングのために、ハイブリドーマの上清を、２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造、例えばシアリルＩ（大文字Ｉ）、シアリルｉ（小文字ｉ）、およびシアリルラクトースの１つに対して生じたＭａｂの分泌について、ＥＬＩＳＡによって評価する。一例では、上清を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にコンジュゲートした３’シアル酸付加されたラクトースに結合するが、ＨＡＳ単独には結合しないものについて評価する。この試験の陽性反応体（reactor）を、増幅させ、クローン化し、一組のハイブリドーマを回収し、精製し、ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３上に発現した２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に特異的に結合するその能力についてスクリーニングする。各実験で、アイソタイプ対照を使用する（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｍ９０３５１ＭＧ）。
【０１４３】
（実施例４）
ヒト幹細胞マーカーＣＤ１３３上に発現した２−３シアル酸付加されたラクト−ネオラクト型構造に特異的に結合することができるハイブリドーマの選択
９６ウェルプレートの各ウェルを、ＰＢＳ（例えば、１μｇ／ｍＬ、５０μＬ）中ＣＤ１３３（ヒト造血幹細胞および前駆細胞から抽出される）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートする。次に、選択される抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を、別々のウェルに添加し、３７℃でさらに１時間インキュベートする。次に、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、標識二次抗マウス抗体（例えば、様々なアイソタイプのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体）と共に３７℃で１時間インキュベートする。このインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合した抗体を、二次抗体標識に従って可視化する（例えば、ＨＲＰのための発色基質としてｏ−フェニレンジアミンを用いる比色アッセイを使用し、吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して４９２ｎｍで読み取る）。
【０１４４】
２−３シアル酸付加されたラクト構造を発現するＣＤ１３３の特異的なグリコフォームは、レクチンアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｍａａｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）レクチンを使用して精製することができる。ＭＡＡレクチンクロマトグラフィーゲルは、商業的供給源（例えば、ＥＹｌａｂｓ）から得ることができる。ゲルを、小型カラム（例えば、プラスチックミニカラム）に注ぎ、ゲル体積の１０倍の緩衝液で洗浄する。ヒト造血幹細胞および前駆細胞から抽出したＣＤ１３３を、カラムに適用し、非結合材料を、緩衝液を用いてカラムから洗浄する。次に、結合した材料を、選択緩衝液中、適正な炭水化物、例えば２−３シアリルラクト−ネオラクト型構造を用いて溶出する。
【０１４５】
所望の抗体のいくつかは、３’シアル酸付加された−ＣＤ１３３（３’ＳＬ−ＣＤ１３３）に結合するが、ノイラミニダーゼで処理した３’ＳＬ−ＣＤ１３３には結合しない。このような抗体は、十分に確立された機能的ｉｎ  ｖｉｖｏモデルのいずれかを使用して、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣを単離するために試験することができる。
【０１４６】
他の場合には、所望の抗体は、ＣＤ１３３（コーティングされたウェル）およびヒトフコシダーゼで処理したＣＤ１３３（コーティングされたウェル）に結合するが、ノイラミニダーゼで処理したＣＤ１３３には結合しない。このような抗体は、十分に確立された機能的ｉｎ  ｖｉｖｏモデルのいずれかを使用して、再構築の高い潜在的可能性を有する原始ＨＳＣを単離するために試験することができる。
【０１４７】
（実施例５）
再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣを単離することができるハイブリドーマ／抗体のスクリーニング
単離された造血細胞集団の自己再生能力および再構築の潜在的可能性をアッセイするためのツールとして働く、当業者に公知のいくつかの方法が存在する。このような方法の１つは、試験細胞集団を、照射されたマウス（例えば、ＮＯＧマウスとしても公知のＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウス）に移植し、次に、それらの試験細胞集団の長期間にわたる潜在的な再増殖可能性を評価することを伴う。例えば、Majeti  R、Park  CY、およびWeissman  IL（２００７年）Identification  of  a  Hierarchy  of  Multipotent  Hematopoietic  Progenitors  in  Human  Cord  Blood、Cell  Stem  Cell、１巻（６号）：６３５〜６４５頁およびWang,  J.C.、Lapidot,  T.、Cashman,  J.D.、Doedens,  M.、Addy,  L、Sutherland,  D.R.、Nayar,  R.、Laraya,  P.、Minden,  M.、Keating,  A.、Eaves,  A.C.、Eaves,  C.J.、およびDick,  J.E.（１９９８年）High  level  engraftment  of  NOD/SCID  mice  by  primitive  normal  and  leukemic  hematopoietic  cells  from  patients  with  chronic  myeloid  leukemia  in  chronic  phase、Blood  ９１巻、２４０６〜２４１４頁を参照されたい。
【０１４８】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から得ることができる。新生仔および成体マウスを、移植前に、当技術分野で十分に説明されているＧａｍｍａ  Ｃｅｌｌ  ４０セシウム源を使用して、それぞれ１００ラッドまたは２７０ラッドで最長２４時間にわたって亜致死的に照射する。次に、再構築の潜在的可能性について試験されるヒト細胞（例えば、前述の通りに調製した抗（２−３シアル酸付加されたラクト構造）抗体に結合するＨＳＣ）の単離集団を、生後最初の４８時間以内に、心臓内もしくは顔面静脈注射によって新生仔に移植するか、または尾静脈注射によって成体（月齢２〜４カ月）マウスに移植する。二次移植は、一次レシピエントマウスの大腿骨および脛骨由来の５×１０６個の骨髄細胞を、３〜５匹の致死的に照射されたＮＯＧマウスのそれぞれに移植することによって実施することができる。二次レシピエントマウス由来の末梢血細胞を、移植の１カ月後、２カ月後、３カ月後、４カ月後、および５カ月後に分析する。
【０１４９】
試験細胞をＮＯＧマウスに注射した後の様々な時点において（例えば１２週〜３０週）、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させ、血液、骨髄（脛骨、大腿骨）、脾臓、リンパ節、および胸腺を回収する。次に、これらの組織を、ドナーのキメラ現象および白血球サブセットについて、当技術分野で周知の方法を使用してフローサイトメトリー分析に付す。例えば、骨髄を、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに懸濁させる。骨髄細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５およびＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ４５で染色し、また、ヒト白血球サブセットを、以下のＰＥコンジュゲート抗体、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ４１、およびＣＤ５６の１つで染色する。赤血球を、抗マウスＴＥＲ１１９−ＦＩＴＣおよび抗ヒトグリコホリンＡ（ＧＰＡ）−ＰＥ（ＣＤ２３５ａ）で染色し、赤血球サブセットを、ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびＣＤ７１−ＰＥで染色する。すべての抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入することができる。あるいは、抗ヒト抗体、例えばＰＢコンジュゲートＣＤ４５、ＨＩ３０；ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０コンジュゲートＣＤ３、Ｓ４．１；ＡＰＣコンジュゲートＣＤ１９、ＳＪ２５−Ｃ１；ＰＥコンジュゲートＣＤ１３、ＴＫ１（Ｃａｌｔａｇ）；ＰＥコンジュゲートＣＤ３３、Ｐ６７．６、ＰＥコンジュゲートＧＰＡ、ＧＡ−Ｒ２、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ４１ａ、ＨＩＰ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、系列分析を行うことができる。マウスの白血球および赤色細胞を、それぞれ、Ａｌｅｘａ４８８またはＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ４５．１、クローンＡ２０．１．７、およびＰＥ−Ｃｙ５またはＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートＴｅｒ１１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の発現に基づいて識別する。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓを含めた様々な販売業者が、系列分化マーカーの数々のパネルを提供している。
【０１５０】
キメラ現象、またはヒト白血球再構築のレベルを、末梢血から、以下の通り算出することができる。
キメラ現象＝％ＣＤ４５＋ヒト細胞／（％ＣＤ４５＋ヒト細胞＋％ＣＤ４５＋マウス細胞）
【０１５１】
これらの方法を使用すると、再構築の高い潜在的可能性を有する、識別されたＨＳＣは、（１）少なくとも１０％のキメラ現象を示すか、または（２）一次レシピエントにおいて１２週間もしくはそれよりも長く経過して初めて著しい生着を示すが、二次レシピエントにおいて多系列の再構築を示す。
【０１５２】
（実施例６）
再構築の高い潜在的可能性を有するＨＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏ増殖および分化
再構築の高い潜在的可能性を有する初期原始ＨＳＣを含むＨＳＣは、様々な方法によってｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。得られる細胞が所望の遺伝的修飾を含有するように、増殖前に、ＨＳＣを遺伝的に修飾することができる。商業的に利用可能な増殖培地およびプロトコールの例として、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＳＴＥＭＧＥＮＩＸ  ＨＳＣ  ＧＥＭ／Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（商標）培地（ＳＩＧＭＡ）、およびＰｒｏｍｏＣｅｌｌのＤＸＦ培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ）が挙げられる。他の増殖方法は、当技術分野で周知である。例えば、Walasek、MA、van  Os  R、およびde  Haan  G（２０１２年）Hematopoietic  stem  cell  expansion:  challenges  and  opportunities;  Ann  N  Y、Acad  Sci.  ２０１２年８月、１２６６巻：１３８〜５０頁；およびRodriguez-Pardo  VMおよびVernot  JP、Mesenchymal  stem  cells  promote  a  primitive  phenotype  CD34+c-kit+  in  human  cord  blood-derived  hematopoietic  stem  cells  during  ex  vivo  expansion、Cell  Mol  Biol  Lett、２０１３年３月、１８巻（１号）：１１〜３３頁を参照されたい。
【０１５３】
ＨＳＣは、様々な系列に分化することができる。総説については、例えば、Seita  J.およびWeissman  I.L.（２０１０年）Hematopoietic  Stem  Cell:  Self-renewal  versus  Differentiation、Wiley  Interdiscip  Rev  Syst  Biol  Med、２巻（６号）：６４０〜６５３頁を参照されたい。これらの系列のいくつかは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化することができる。例えば、ＢＭ由来のＨＳＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球性細胞を得るための方法が導出されている。Magga  J、Savchenko  E、Malm  T、Rolova  T、Pollari  E、Valonen  P、Lehtonen  S、Jantunen  E、Aarnio  J、Lehenkari  P、Koistinaho  M、Muona  A、Koistinaho  J、Production  of  monocytic  cells  from  bone  marrow  stem  cells:  therapeutic  usage  in  Alzheimer's  disease、J  Cell  Mol  Med、２０１２年５月、１６巻（５号）：１０６０〜７３頁。さらに、幹細胞は、骨、軟骨、および肺のための持続性先駆細胞を提供する方式で培養することができる。Pereira,  R.F.ら、Cultured  adherent  cells  from  marrow  can  serve  as  long-lasting  precursor  cells  for  bone,  cartilage,  and  lung  in  irradiated  mice、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、USA  ９２巻、４８５７〜４８６１頁（１９９５年）。このような培養は、遺伝的に修飾された幹細胞を用いて実施することもできる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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