(57)【要約】本発明は、高等霊長類動物の分泌型タンパク質ｓＤＳＳ１を提供する。ｓＤＳＳ１タンパク質は、非酵素的条件において、酸化タンパク質と結合してポリマーを形成する、又は、Ａβポリペプチドと結合してＡβオリゴマーの形成を低減することができる。また、酸化タンパク質、Ａβオリゴマー、アミリンオリゴマー及びグリコシル化タンパク質によって引き起こされる細胞毒性をブロックすることができる。当該タンパク質は、酸化タンパク質、糖化タンパク質、Ａβタンパク質の蓄積、アミリンタンパク質の蓄積、又は、同様の特性を有する他の病原性タンパク質の過度な産生又は蓄積によって誘発された疾患の予防及び治療に用いられ得る。
2019513023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１であって、ヒトを含む類人猿亜目の動物に存在し、ヒト天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されることを特徴とする新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１。
【請求項２】
前記類人猿亜目の動物は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、キタホオジロテナガザル、ゴールデンモンキー、アカゲザル、ヒヒ、アンゴラコロブス、スーティーマンガベイ、ドリル、及びブタオザルをさらに含み、チンパンジーの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示され、ボノボの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示され、ゴリラの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示され、オランウータンの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示され、キタホオジロテナガザルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示され、ゴールデンモンキーの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示され、アカゲザルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示され、ヒヒの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示され、アンゴラコロブスの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示され、スーティーマンガベイの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示され、ドリルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示され、ブタオザルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示されることを特徴とする請求項１に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１。
【請求項３】
前記天然タンパク質ｓＤＳＳ１は、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列及びＣ末端３１位のアミノ酸配列に分けられ、ヒトｓＤＳＳ１タンパク質のＮ末端５８位のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示され、ヒトｓＤＳＳ１タンパク質のＣ末端３１位のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示され、２つの配列の特徴として、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列は、３つ以上の連続的に配列された酸性アミノ酸配列を含み、連続的に配列された各酸性アミノ酸配列断片が含有する酸性アミノ酸の数は、１０個以下であり、連続的に配列された異なる酸性アミノ酸配列間の間隔の長さは、４個のアミノ酸を超えず、このような各間隔には、少なくとも１つの疎水性アミノ酸が存在し、ｐＨ値が４．５以下であり、Ｎ末端５８位のアミノ酸からなる配列中の酸性アミノ酸の数は１０個以上であり、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列に基づいた５８番目のアミノ酸以降のＣ末端アミノ酸配列は、全体的に疎水性傾向を有し、Ｃ末端３１位のアミノ酸からなるアミノ酸配列中の疎水性アミノ酸の数は１０以上であり、
アミノ酸の分類は以下のように定義されており、
アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、システイン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシンは、疎水性アミノ酸であり、
スレオニン、グリシン、セリン、ヒスチジン、グルタミンは、中性アミノ酸であり、
グルタミン酸、アスパラギン酸、プロリン、アスパラギンは、酸性アミノ酸であり、
アルギニン、リシンは、塩基性アミノ酸であることを特徴とする請求項２に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１。
【請求項４】
類人猿亜目の動物のｓＤＳＳ１タンパク質に含まれているＣ末端アミノ酸の式は、
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31
X1は中性アミノ酸、X2は疎水性アミノ酸、X3及びX4のそれぞれは疎水性アミノ酸、X5は疎水性アミノ酸、X6は疎水性アミノ酸、X7は疎水性アミノ酸、X8は疎水性アミノ酸、X9は疎水性アミノ酸、X10は酸性アミノ酸、X11は中性アミノ酸、 X12は疎水性アミノ酸、X13は疎水性アミノ酸、X14は中性アミノ酸、X15は疎水性アミノ酸、X16は疎水性アミノ酸、X17は疎水性アミノ酸、X18は疎水性アミノ酸、X19は塩基性アミノ酸、X20は酸性アミノ酸、X21は塩基性アミノ酸、X22は中性アミノ酸、X23は塩基性アミノ酸、X24は疎水性アミノ酸、X25は疎水性アミノ酸、X26は中性アミノ酸、X27は疎水性アミノ酸、X28は疎水性アミノ酸、X29は疎水性アミノ酸、X30は疎水性アミノ酸、X31は疎水性アミノ酸であり、
Ｃ末端３１位のアミノ酸配列には、４０％以上の相同アミノ酸配列が存在し、当該配列は、ポリペプチド内のヒトｓＤＳＳ１蛋白質のＣ末端アミノ酸配列との性質及び発揮する機能が同一又は類似であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１のＮ末端５８位のアミノ酸配列及びＣ末端３１位のアミノ酸配列に基づいて構築された１種類のポリペプチド配列であって、
１）当該ポリペプチド配列は、Ｎ末端５８位のアミノ酸によって構成された配列が４０％以上の類似性を有し、Ｃ末端アミノ酸配列が４０％以上類似するタンパク質を有し、当該タンパク質は、ヒト天然タンパク質との性質及び機能が同一又は類似であり、或いは、
２）ヒト天然タンパク質内のポリペプチド配列のＮ末端５８位のアミノ酸によって構成された配列、若しくは、４０％以上の類似配列に基づいてＣ末端又はＮ末端で他のアミノ酸配列を融合させ、融合に用いられるアミノ酸配列は、ヒト天然タンパク質内のＣ末端３１位のアミノ酸配列と同一又は類似性質を実現し、且つ同一又は類似機能を発揮することができ、修飾後のタンパク質は、ヒト天然タンパク質ｓＤＳＳ１と同一又は類似機能を発揮することができるタンパク質であり、或いは、
３）請求項４に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１内のＣ末端ポリペプチド配列を用いて、他の天然又は非天然ポリペプチド配列を融合させて得られたタンパク質であることを特徴とするポリペプチド配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１の完全配列又は部分配列と請求項５に記載のポリペプチド配列とを含むことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項７】
当該タンパク質自体、担体タンパク質、抗体又は他の任意のアミノ酸配列と結合することによって形成されたタンパク質複合体であることを特徴とする請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１の完全配列又は部分配列と、請求項５に記載のポリペプチド配列と、請求項６及び７のいずれか１項に記載の融合タンパク質との一部又は全部の複合を含むことを特徴とする複合体。
【請求項９】
ポリペプチド／タンパク質と薬学的に適用可能な薬物担体との結合によって形成された複合体であることを特徴とする請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記担体は、マイクロスフェア／マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、磁性粒子、及びゲルのうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列をコードすることができることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列を発現することを特徴とする細胞。
【請求項１４】
任意の哺乳動物の幹細胞、前駆細胞又は成体細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記哺乳動物は、ヒト、オランウータン、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、イヌ、ウサギ、ネコ、ラット又はマウスであることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は、初代培養由来の幹細胞、母細胞から分化して得られた多能性若しくは単能性幹細胞を含むことを特徴とする請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列をコードしたヌクレオチド配列を生物体に導入し、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列を発現することを特徴とする発現系。
【請求項１８】
真核生物発現プラスミドベクタ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス科、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、及び他の実行可能な遺伝子編集技術を含むことを特徴とする請求項１７に記載の発現系。
【請求項１９】
前記生物体は、ヒト、オランウータン、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、イヌ、ウサギ、ネコ、ラット、マウス、ニワトリ、アヒル又はガチョウであることを特徴とする請求項１７に記載の発現系。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列を主な標的とし、投与後、有機体内の請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列の発現レベルに影響することができることを特徴とする薬物。
【請求項２１】
化学小分子薬物、タンパク質／ポリペプチド薬物、又は、核酸薬物、ナノ薬物であることを特徴とする請求項２０に記載の薬物。
【請求項２２】
前記核酸薬物は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三本鎖ＤＮＡ及びリボザイムの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項２１に記載の薬物。
【請求項２３】
Ｓ１、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質若しくは請求項５に記載のポリペプチド配列をコードしたヌクレオチド配列をプラスミドに挿入し、且つ細菌又は酵母細胞に導入する、又は、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質若しくは請求項５に記載のポリペプチド配列をコード可能なヌクレオチド配列を昆虫細胞、哺乳動物細胞のゲノム内に挿入する発現ベクタの構築ステップと、
Ｓ２、Ｓ１に記載の形質転換細菌、酵母菌、昆虫細胞又は哺乳動物の細胞に対して拡大培養を行い、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質若しくは請求項５に記載のポリペプチド配列を含む培養液又は細胞溶解物を回収するタンパク質発現ステップと、
Ｓ３、Ｓ２で得られた培養液又は細胞溶解物を、粗ろ過及び精製を経てタンパク質を得るというタンパク質精製ステップとを含むことを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２４】
化学合成技術を用いて請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２５】
インビトロリボソーム発現系を用いて請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリペプチド配列を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５に記載のポリペプチド配列、請求項６又は７に記載の融合タンパク質、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の複合体、請求項１１又は１２に記載のヌクレオチド配列、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の細胞、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の発現系、及び請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の薬物の疾患診断、予防及び治療における使用。
【請求項２７】
前記疾患は、病原性タンパク質／ポリペプチドの過度な産生又は蓄積によって引き起こされた疾患であることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記病原性タンパク質／ポリペプチドは、酸化、グリコシル化されたタンパク質産物、アミロイド前駆体タンパク質及びその切断産物、膵島アミロイドポリペプチド及びその切断産物、並びに、酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アミロイド、膵島アミロイドポリペプチドに類似する特徴を具備する他の病原性タンパク質／ポリペプチドであることを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記疾患診断は、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質の全部又は一部のアミノ酸配列の発現レベル、ｍＲＮＡレベル、及び遺伝子コピー数の１つ又は複数を測定することを含むことを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記予防は、遺伝子改変、核酸導入、薬物注入／投与、細胞移植、及び組織移植のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項３１】
前記治療は、遺伝子改変、核酸導入、薬物注入／投与、細胞移植、及び組織移植のうちの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新型天然タンパク質及びその使用に関する。当該タンパク質は、ジャンクタンパク質の過度な産生又は過度な蓄積によって引き起こされた疾患の予防及び治療に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
正常な生理活動において、有機体は、酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質及び一部の異常切断タンパク質（ポリペプチド）を含む、大量のジャンクタンパク質を産生する。有機体は、正常な生理機能を維持するためにジャンクタンパク質を除去するための様々なメカニズムを保持しているが、老化又は疾患は、ジャンクタンパク質の過度な産生又は有機体のジャンクタンパク質に対する除去能力の低下をもたらし、これにより、ジャンクタンパク質の大量の蓄積が引き起こされる。細胞内又は細胞外におけるジャンクタンパク質の異常蓄積は、一連の疾患をもたらすメインメカニズムである。典型的な疾患は、慢性腎臓病、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、ハンチントン病、糖尿病合併症等[1-5]を含む。循環系における酸化タンパク質、糖化タンパク質、又は他のジャンクタンパク質の蓄積は、有機体老化の重要な原因の１つでもある[6-7]。研究により、血清におけるタンパク質過酸化物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＡＯＰＰ）は、腎細胞を損傷する、慢性腎臓病の主な病因メカニズムである。血清内のＡＯＰＰは、膵島β細胞のプログラム細胞死をも誘導することが証明されている[3,8]。アミロイドβ仮説では、Ａβタンパク質の組織内での不均衡な産生及び除去によってもたらした毒性タンパク質がプログレッシブに蓄積され、これによって引き起こされたシナプス機能障害及びニューロン死は、ＡＤの主な原因であると認められている[9]。アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）タンパク質は、一部の糖尿病患者の膵島組織において異常凝集が発生するだけでなく、脳組織のプラークにも存在し、糖尿病や神経変性疾患の進行と密接に関連している[10,11]。これらの研究結果に基づいて、一部の疾患モデル上において、例えば、抗体[12]、ポリペプチド薬物[13]又は小分子薬物[14]を用いてＡＤモデル動物におけるＡβ凝集又は産生を阻止することにより、神経組織におけるプラークの形成を減少させ、動物の認知レベルを高めることができる。これらの結果は、薬物によってこれらの病原性タンパク質の産生、凝集を抑制し、又は、病原性タンパク質の排除を促進して、病原性タンパク質の蓄積を減少させることは、これらの疾患を予防又は治療する重要な方法であることを示している。
【０００３】
以前の研究では、細胞内で酸化ストレスが生じると、ＤＳＳ１（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｓｐｌｉｔ  ｓｐｌｉｔ  ｈａｎｄ／ｓｐｌｉｔ  ｆｏｏｔ  １）タンパク質は、真核生物に高度に保存された小さなタンパク質として、酵素反応及びＡＴＰ消費の条件において酸化タンパク質に共有結合修飾され得る。このような修飾は、酸化タンパク質の細胞内での分解を媒介することが明らかになった[15]。ＤＳＳ１遺伝子ノックアウトは細胞死をもたらす。ＤＳＳ１タンパク質を高発現する細胞は、酸化ストレス又は抗腫瘍薬物によって誘発されたアポトーシスに対して顕著な抵抗性を示している[16]。これらの結果により、ＤＳＳ１タンパク質は、細胞が酸化タンパク質を除去するプロセスにおいて重要な役割を果たし、細胞の生存には非常に重要であることが明らかになっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dobson CM (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem Sci 24:329-332。
【非特許文献２】Liang M, Wang J, Xie C, Yang Y, Tian JW, Xue YM, Hou FF (2014) Increased plasma advanced oxidation protein products is an early marker of endothelial dysfunction in type 2 diabetes patients without albuminuria 2. J Diabetes 6(5):417-26。
【非特許文献３】Cao W, Hou FF, Nie J (2014) AOPPs and the progression of kidney disease. Kidney Int Suppl(2011) 4(1):102-106。
【非特許文献４】Sadigh-Eteghad S, Sabermarouf B, Majdi A, Talebi M, Farhoudi M, Mahmoudi J (2015) Amyloid-beta: a crucial factor in Alzheimer's disease. Med Princ Pract 24(1):1-10。
【非特許文献５】Choe YJ, Park SH, Hassemer T, Ko（ウムラウト）rner R, Vincenz-Donnelly L, Hayer-Hartl M, Hartl FU (2016) Failure of RQC machinery causes protein aggregation and proteotoxic stress. Nature 531(7593):191-5。
【非特許文献６】Ott C, Grune T (2014) Protein oxidation and proteolytic signalling in aging. Curr Pharm Des 20(18):3040-51。
【非特許文献７】Simm A, Mu（ウムラウト）ller B, Nass N, Hofmann B, Bushnaq H, Silber RE, Bartling B (2015) Protein glycation - Between tissue aging and protection. Exp Gerontol 68:71-5。
【非特許文献８】Liang M, Li A, Lou A, Zhang X, Chen Y, Yang L, Li Y, Yang S, Hou FF (2017) Advanced oxidation protein products promote NADPH oxidase-dependent β-cell destruction and dysfunction through the Bcl-2/Bax apoptotic pathway. Lab Invest 24. [Epub ahead of print]。
【非特許文献９】Zhao LN, Long H, Mu Y, Chew LY (2012) The toxicity of amyloid β oligomers. Int J Mol Sci 13(6):7303-27。
【非特許文献１０】Ferna（アキュート・アクセント）ndez MS (2014) Human IAPP amyloidogenic properties and pancreatic β-cell death. Cell Calcium 56(5):416-27。
【非特許文献１１】Lim YA, Rhein V, Baysang G, Meier F, Poljak A, Raftery MJ, Guilhaus M, Ittner LM, Eckert A, Go（ウムラウト）tz J (2010) Abeta and human amylin share a common toxicity pathway via mitochondrial dysfunction. Proteomics 10 (8): 1621-33。
【非特許文献１２】Winblad B, Andreasen N, Minthon L, Floesser A, Imbert G, Dumortier T, Maguire RP, Blennow K, Lundmark J, Staufenbiel M, Orgogozo JM, Graf A (2012) Safety, tolerability, and antibody response of active Aβ immunotherapy with CAD106 in patients with Alzheimer's disease: randomised, double-blind, placebo-controlled, first-in-human study. Lancet Neurol 11(7):597-604。
【非特許文献１３】Chang L, Cui W, Yang Y, Xu S, Zhou W, Fu H, Hu S, Mak S, Hu J, Wang Q, Ma VP, Choi TC, Ma ED, Tao L, Pang Y, Rowan MJ, Anwyl R, Han Y, Wang Q (2015) Protection against β-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering β-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Sci Rep 5:10256。
【非特許文献１４】Kim HY, Kim HV, Jo S, Lee CJ, Choi SY, Kim DJ, Kim Y (2015) EPPS rescues hippocampus-dependent cognitive deficits in APP/PS1 mice by disaggregation of amyloid-β oligomers and plaques. Nat Commun 6:8997。
【非特許文献１５】Zhang Y, Chang FM, Huang J, Junco JJ, Maffi SK, Pridgen HI, Catano G, Dang H, Ding X, Yang F, Kim DJ, Slaga TJ, He R, Wei SJ (2014) DSSylation, a novel protein modification targets proteins induced by oxidative stress, and facilitates their degradation in cells. Protein Cell 5(2):124-40。
【非特許文献１６】Rezano A, Kuwahara K, Yamamoto-Ibusuki M, Kitabatake M, Moolthiya P, Phimsen S, Suda T, Tone S, Yamamoto Y, Iwase H, Sakaguchi N (2013) Breast cancers with high DSS1 expression that potentially maintains BRCA2 stability have poor prognosis in the relapse-free survival. BMC Cancer 13:562。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近の研究では、我々（発明者）は、サブタイプ高等霊長類（類人猿亜科）のゲノム内に分泌型ＤＳＳ１タンパク質（ｓｅｃｒｅｔａｒｙＤＳＳ１；ｓＤＳＳ１）と命名された新しいサブタイプのＤＳＳ１タンパク質が存在することを発見した。ｓＤＳＳ１は、初めて発見されたＤＳＳ１蛋白質のサブタイプであり、配列、性質及び機能においてＤＳＳ１と非常に類似しているが、血液及び脳脊髄液内に分泌され得るため、性質がより活発であり、エネルギーを消費する酵素反応によることなく、血清又は緩衝液内の酸化タンパク質と凝集体を形成し、又は、Ａβタンパク質と結合してＡβオリゴマーの形成を抑制することができる。培地へのｓＤＳＳ１タンパク質の添加は、酸化タンパク質、Ａβオリゴマー、アミリンオリゴマー、及びグリコシル化タンパク質によって誘発した細胞毒性をブロックし、細胞生存率を保護することができる。従って、我々は、この新型タンパク質ｓＤＳＳ１が、酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、Ａβ、アミリン、及び同様の特性を有する他の病原性タンパク質によって誘発した疾患を予防及び治療するための薬物としてのポテンシャルがあると結論付けた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１種類の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１であって、ヒトを含む類人猿亜目の動物には、天然タンパク質ｓＤＳＳ１が存在する。ここで、ヒト天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される。
【０００７】
好ましくは、前記類人猿亜目の動物は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、キタホオジロテナガザル、ゴールデンモンキー、アカゲザル、ヒヒ、アンゴラコロブス、スーティーマンガベイ、ドリル、及びブタオザルをさらに含む。ここで、チンパンジーの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示され、ボノボの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示され、ゴリラの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示され、オランウータンの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示され、キタホオジロテナガザルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示され、ゴールデンモンキーの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示され、アカゲザルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示され、ヒヒの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示され、アンゴラコロブスの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示され、スーティーマンガベイの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示され、ドリルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示され、ブタオザルの天然タンパク質ｓＤＳＳ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示される。
【０００８】
好ましくは、前記天然タンパク質ｓＤＳＳ１は、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列及びＣ末端３１位のアミノ酸配列に分けられる。ここで、ヒトｓＤＳＳ１タンパク質のＮ末端５８位のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示され、ヒトｓＤＳＳ１タンパク質のＣ末端３１位のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示される。２つの配列の特徴として、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列は、３つ以上の連続的に配列された酸性アミノ酸配列を含み、連続的に配列された各酸性アミノ酸配列断片が含有する酸性アミノ酸の数は、１０個以下である。連続的に配列された異なる酸性アミノ酸配列間の間隔の長さは、４個のアミノ酸を超えず、このような各間隔には、少なくとも１つの疎水性アミノ酸が存在し、ｐＨ値が４．５以下であり、Ｎ末端５８位のアミノ酸からなる配列中の酸性アミノ酸の数は１０個以上である。Ｎ末端５８位のアミノ酸配列に基づいた５８番目のアミノ酸以降のＣ末端アミノ酸配列は、全体的に疎水性傾向を有し、Ｃ末端３１位のアミノ酸からなるアミノ酸配列中の疎水性アミノ酸の数は１０以上である。
【０００９】
アミノ酸の分類は以下のように定義される。
アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、システイン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシンは、疎水性アミノ酸である。
スレオニン、グリシン、セリン、ヒスチジン、グルタミンは、中性アミノ酸である。
グルタミン酸、アスパラギン酸、プロリン、アスパラギンは、酸性アミノ酸である。
アルギニン、リシンは、塩基性アミノ酸である。
【００１０】
好ましくは、類人猿亜目の動物のｓＤＳＳ１タンパク質に含まれているＣ末端アミノ酸の式は、下記の通りである。
【００１１】
[式１]
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31
【００１２】
X1は中性アミノ酸、X2は疎水性アミノ酸、X3及びX4のそれぞれは疎水性アミノ酸、X5は疎水性アミノ酸、X6は疎水性アミノ酸、X7は疎水性アミノ酸、X8は疎水性アミノ酸、X9は疎水性アミノ酸、X10は酸性アミノ酸、X11は中性アミノ酸、 X12は疎水性アミノ酸、X13は疎水性アミノ酸、X14は中性アミノ酸、X15は疎水性アミノ酸、X16は疎水性アミノ酸、X17は疎水性アミノ酸、X18は疎水性アミノ酸、X19は塩基性アミノ酸、X20は酸性アミノ酸、X21は塩基性アミノ酸、X22は中性アミノ酸、X23は塩基性アミノ酸、X24は疎水性アミノ酸、X25は疎水性アミノ酸、X26は中性アミノ酸、X27は疎水性アミノ酸、X28は疎水性アミノ酸、X29は疎水性アミノ酸、X30は疎水性アミノ酸、X31は疎水性アミノ酸である。
【００１３】
Ｃ末端３１位のアミノ酸配列には、４０％以上の相同アミノ酸配列が存在し、当該配列は、ポリペプチド内のヒトｓＤＳＳ１蛋白質のＣ末端アミノ酸配列との性質及び発揮する機能が同一又は類似である。
【００１４】
上記の解決手段に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１のＮ末端５８位のアミノ酸配列及びＣ末端３１位のアミノ酸配列に基づいて構築された１種類のポリペプチド配列は、以下の通りである。
【００１５】
１）当該ポリペプチド配列は、Ｎ末端５８位のアミノ酸によって構成された配列が４０％以上の類似性を有し、Ｃ末端アミノ酸配列が４０％以上類似するタンパク質を有する。当該タンパク質は、ヒト天然タンパク質との性質及び機能が同一又は類似である。或いは、
２）ヒト天然タンパク質内のポリペプチド配列のＮ末端５８位のアミノ酸によって構成された配列、若しくは、４０％以上の類似配列に基づいてＣ末端又はＮ末端で他のアミノ酸配列を融合させる。融合に用いられるアミノ酸配列は、ヒト天然タンパク質内のＣ末端３１位のアミノ酸配列と同一又は類似性質を実現し、且つ同一又は類似機能を発揮することができる。修飾後のタンパク質は、ヒト天然タンパク質ｓＤＳＳ１と同一又は類似機能を発揮することができるタンパク質である。或いは、
３）上記の解決手段に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１内のＣ末端ポリペプチド配列を用いて、他の天然又は非天然ポリペプチド配列を融合させて得られたタンパク質である。
【００１６】
１種類の融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、上記の解決手段に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１の完全配列又は部分配列と上記の解決手段に記載のポリペプチド配列とを含む。
【００１７】
好ましくは、前記融合タンパク質は、当該タンパク質自体、担体タンパク質、抗体又は他の任意のアミノ酸配列と結合することによって形成されたタンパク質複合体である。
【００１８】
１種類の複合体であって、前記複合体は、上記の解決手段に記載の新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１の完全配列又は部分配列と、上記の解決手段に記載のポリペプチド配列と、上記の解決手段に記載の融合タンパク質内の一部又は全部の複合体とを含む。
【００１９】
好ましくは、前記複合体は、ポリペプチド／タンパク質と薬学的に適用可能な薬物担体との結合によって形成された複合体である。
【００２０】
好ましくは、前記担体は、マイクロスフェア／マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、磁性粒子、及びゲルのうちの１つ又は複数を含む。
【００２１】
１種類のヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列は、上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列をコードすることができる。
【００２２】
好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。
【００２３】
１種類の細胞であって、前記細胞は、上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列を発現する。
【００２４】
好ましくは、前記細胞は、任意の哺乳動物の幹細胞、前駆細胞又は成体細胞である。
【００２５】
好ましくは、前記哺乳動物は、ヒト、オランウータン、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、イヌ、ウサギ、ネコ、ラット又はマウスである。
【００２６】
好ましくは、前記細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は初代培養由来の幹細胞、母細胞から分化して得られた多能性若しくは単能性幹細胞を含む。
【００２７】
１種類の発現系であって、前記発現系は、上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列をコードしたヌクレオチド配列を生物体に導入し、生物体において上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列を発現する。
【００２８】
好ましくは、前記発現系は、真核生物発現プラスミドベクタ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス科、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、及び他の実行可能な遺伝子編集技術を含む。
【００２９】
好ましくは、前記生物体は、ヒト、オランウータン、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、イヌ、ウサギ、ネコ、ラット、マウス、ニワトリ、アヒル又はガチョウである。
【００３０】
１種類の薬物であって、前記薬物は、上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列を主な標的とし、投与後、有機体内の上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列の発現レベルに影響することができる。
【００３１】
好ましくは、前記薬剤は、化学小分子薬物、タンパク質／ポリペプチド薬物又は核酸薬物、ナノ薬物である。
【００３２】
好ましくは、前記核酸薬物は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三本鎖ＤＮＡ及びリボザイムの１つ又は複数を含む。
【００３３】
タンパク質の生産方法であって、前記方法は、以下のステップを含む。
【００３４】
Ｓ１、発現ベクタの構築：上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列をコード可能なヌクレオチド配列をプラスミドに挿入し、且つ細菌又は酵母細胞に導入するか、上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列をコード可能なヌクレオチド配列を昆虫細胞、哺乳動物細胞のゲノム内に挿入する。
【００３５】
Ｓ２、タンパク質発現：Ｓ１に記載の形質転換細菌、酵母菌、昆虫細胞又は哺乳動物の細胞に対して拡大培養を行い、上記の解決手段に記載のタンパク質若しくは上記の解決手段に記載のポリペプチド配列を含む培養液又は細胞溶解物を回収する。
【００３６】
Ｓ３、タンパク質精製：Ｓ２で得られた培養液又は細胞溶解物を、粗ろ過及び精製を経てタンパク質を得る。
【００３７】
タンパク質の生産方法であって、化学合成技術を用いて上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列を生産する。
【００３８】
タンパク質の生産方法であって、インビトロリボソーム発現系を用いて上記の解決手段に記載のタンパク質又は上記の解決手段に記載のポリペプチド配列を生産する。
【００３９】
上記の解決手段に記載のタンパク質、ポリペプチド配列、融合タンパク質、複合体、ヌクレオチド配列、細胞、発現系及び薬物は、疾患診断、予防及び治療に用いられる。
【００４０】
好ましくは、前記疾患は、病原性タンパク質／ポリペプチドの過度な産生又は蓄積によって引き起こされた疾患をいう。
【００４１】
好ましくは、前記病原性タンパク質／ポリペプチドは、酸化、グリコシル化されたタンパク質産物、アミロイド前駆体タンパク質及びその切断産物、膵島アミロイドポリペプチド及びその切断産物、並びに、酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アミロイド、膵島アミロイドポリペプチドと同様の特徴を具備する他の病原性タンパク質／ポリペプチドである。
【００４２】
好ましくは、前記疾患診断は、上記の解決手段に記載のタンパク質の全部又は一部のアミノ酸配列の発現レベル、ｍＲＮＡレベル、及び遺伝子コピー数の１つ又は複数を測定することを含む。
【００４３】
好ましくは、前記予防は、遺伝子改変、核酸導入、薬物注入／投与、細胞移植、及び組織移植のうちの１つ又は複数を含む。
【００４４】
好ましくは、前記治療は、遺伝子改変、核酸導入、薬物注入／投与、細胞移植、及び組織移植のうちの１つ又は複数を含む。
【発明の効果】
【００４５】
本発明の特徴及び／又は有益な効果は以下の通りである。
【００４６】
１、本発明に係る新型天然タンパク質ｓＤＳＳ１において、典型的なヒトｓＤＳＳ１タンパク質ポリペプチド配列は、
MSEKKQPVDLGLLEEDDEFEEFPAEDWAGLDEDEDAHVWEDNWDDDNVEDDFSNQLRATVLLMILVCETPYGCYVLHQKGRMCSAFLCC（SEQ ID NO：１参照）である。バイオインフォマティクス解析により、当該タンパク質は、類人猿亜科動物が有する天然タンパク質であることが判明された。
【００４７】
２、本発明のバイオインフォマティクス解析及び細胞実験検証によれば、ポリペプチドｓＤＳＳ１のＣ末端３１位のアミノ酸配列は、シグナルペプチドであり、これらは、当該タンパク質の性質及び分泌特性において重要な役割を果たしている。Ｃ末端３１位のアミノ酸配列は、
TVLLMILVCETPYGCYVLHQKGRMCSAFLCC（SEQ ID NO：２参照）である。
【００４８】
３、本発明に係るｓＤＳＳ１タンパク質は、酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、Ａβタンパク質、アミリンタンパク質に結合し且つこれらの毒性タンパク質の凝集によって誘発された細胞毒性をブロックすることができるため、これらの毒性タンパク質及び同様の特徴を有する他の病原性タンパク質の過度な産生又は過度な蓄積によって引き起こされた疾患を治療するという大きな可能性を有する。
【００４９】
４、本発明に係るｓＤＳＳ１タンパク質は、大腸菌の発酵により生産される。ｓＤＳＳ１タンパク質をコードしたヌクレオチド配列をｐＥＴ１５１Ｄプラスミドに導入し、ｓＤＳＳ１の発現と同時に、そのＮ末端に、精製及びウェスタンブロッティングのための６−ｈｉｓタグ及びＶ５タグが融合した。タンパク質を大腸菌で発現させ、ニッケル−ＮＴＡゲルカラムを用いて予備精製し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてゲル精製する。Ｈｉｓ−Ｖ５−ｓＤＳＳ１タンパク質を含む、切り出されたゲルバンドを、転写バッファを含む透析バッグに入れ、電界駆動によって、タンパク質をゲルから転写させ、透析バッグに回収する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、タンパク質の純度が生物学的実験に使用できるレベルまで達することを分析する。
【００５０】
５、本発明において、ｓＤＳＳ１タンパク質が、血清内の酸化タンパク質及び緩衝液内の酸化タンパク質と結合して凝集体を形成する、又は、Ａβタンパク質と結合することによりＡβオリゴマーの形成が減少することは、分子実験によって立証されている。
【００５１】
６、本発明において、ｓＤＳＳ１タンパク質が、培地内の酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、Ａβオリゴマー、及びアミリンオリゴマーによって誘発された細胞毒性を効果的にブロックし、細胞生存率を維持し得ることが証明されている。
【００５２】
要約すれば、本発明に係る新型天然ｓＤＳＳ１タンパク質において、ｓＤＳＳ１タンパク質の生物学的特性及び活性は、バイオインフォマティクス、分子生物学、細胞生物学という３つのレベルの研究によって証明されている。ｓＤＳＳ１タンパク質は、培地内の酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、Ａβオリゴマー、及びアミリンオリゴマーによって誘発された細胞毒性を効果的に低減し、細胞生存率を維持することができる。ｓＤＳＳ１タンパク質は、高等霊長類動物自身に有するタンパク質であるため、臨床使用の際に免疫応答という問題を回避することができる。従って、本発明は、酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、Ａβタンパク質、アミリンポリペプチド及び、同様の特徴を有する他の病原性タンパク質の過度な産生又は過度な蓄積によって引き起こされた関連疾患を予防及び治療するための新型候補薬物を提供することにより、生物医学における大きな使用見込みを有する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
以下、図面とともに本発明について詳述する。以下の説明は、本発明を明白且つ完全にするためであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【００５４】
【図１Ａ】ｓＤＳＳ１遺伝子は、ＤＳＳ１遺伝子の新規サブタイプである。ヒトＤＳＳ１遺伝子ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００６３０４．１，５０９ｂｐ）とヒトｓＤＳＳ１遺伝子ｃＤＮＡ（ＡＫ３０９２４１．１，１１９５ｂｐ）との比較によって、両者が重複領域を有することが示されている。重複領域の塩基配列は、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列をコード可能であることが解析されている。
【図１Ｂ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ２．１ソフトウェアを用いて１３種のサル目のｓＤＳＳ１タンパク質のアミノ酸配列を比較した結果、ｓＤＳＳ１タンパク質のアミノ酸配列は、高度に保存されており、Ｎ末端５８位のアミノ酸配列は完全同一であり、Ｃ末端３１位のアミノ酸配列は、僅かな部位に点突然変異が生じている。
【図２Ａ】２９３Ｔ細胞にプラスミドをトランスフェクトし、２４ｈ後にＧＦＰタンパク質の分布を観察する。対照細胞（ＧＦＰ）内の緑色蛍光は明瞭で明るく、溶液内のバックグラウンドは暗い。ｓＤＳＳ１とＧＦＰとのキレートタンパク質（ｓＤＳＳ１−ＧＦＰ）、又は、ｓＤＳＳ１タンパク質のＣ末端３１位のアミノ酸配列とＧＦＰとのキレートタンパク質（ｓＤＳＳ１−ｃ−ＧＦＰ）の培養液には顕著な緑色蛍光シグナルが観察され、一方、細胞内の蛍光は拡散し、強度が減少した。これは、ＧＦＰタンパク質がｓＤＳＳ１タンパク質又はｓＤＳＳ１タンパク質のＣ末端配列の分泌とともに細胞の外まで取り出されたことを示している。
【図２Ｂ】ドットイムノブロッティング法を用いてトランスフェクトされた細胞培養培地を検出した結果、ｓＤＳＳ１−ＧＦＰ及びｓＤＳＳ１−ｃ−ＧＦＰ群培地においてはＧＦＰシグナルが検出され、ブランク（ｂｌａｎｋ）対照群及びＧＦＰ対照群においては顕著なシグナルが検出されていないことが示され、これにより、ｓＤＳＳ１タンパク質は分泌タンパク質であるが、Ｃ末端３１個のアミノ酸配列はシグナルペプチドであることが証明されている。
【図３Ａ】ｓＤＳＳ１タンパク質Ｃ末端のポリペプチド配列特異的抗体（抗原配列：ｓＤＳＳ１タンパク質Ｃ末端の３１位のアミノ酸配列）を用いて、ヒト血清（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ）又はヒト脳脊髄液（ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ，  ＣＳＦ）試料内においてｓＤＳＳ１シグナルを検出することができる。Ｈｕｍａｎ  ＣＳＦ試料は、高齢者に由来し、ａ血清試料は、激しい運動をした後の若者の血液に由来し、ｂ、ｃ、ｄ血清試料は、休息状態を保っている若者の血液に由来する。
【図３Ｂ】ＰＣＲ法を利用するにより、ヒト脳星状膠芽腫（Ｕ−８７  ＭＧ）においてｓＤＳＳ１遺伝子特異的ｍＲＮＡ配列（増幅産物が２９３ｂｐ）を検出することができ、ＤＳＳ１遺伝子が対照（増幅産物が２３８ｂｐで）として用いられる。
【図４Ａ】〜
【図４Ｂ】クマシーブリリアントブルー染色は、ｓＤＳＳ１タンパク質の生産及び精製過程における目的タンパク質の含有量を示す。
【図４Ａ】陽性大腸菌のクローン菌株を選択して拡大培養し、ＩＰＴＧ添加後、ｓＤＳＳ１タンパク質の発現が誘導され、誘導されていない細胞における目的タンパク質の発現量は極めて低い。
【図４Ｂ】ニッケル−ＮＴＡゲルカラムによる予備精製後の熱分解濃縮物及び精製後の目的タンパク質含有量を検出する。ａチャネルは精製ｓＤＳＳ１タンパク質を示し、ｂチャネルは予備精製の細胞溶解液を示している。
【図５Ａ】〜
【図５Ｄ】生化学実験及び細胞実験により、ｓＤＳＳ１タンパク質は、酸化タンパク質と結合し、酸化タンパク質の毒性をブロック可能であることが証明されている。
【図５Ａ】０．７２μｇの精製されたｓＤＳＳ１タンパク質を様々な比率の血清タンパク質と混合させたあとインキュベートし、Ｖ５融合タンパク質（Ｖ５−ＨＲＰ）を用いてｓＤＳＳ１タンパク質を検出した結果、ｓＤＳＳ１タンパク質及び血清の酸化タンパク質が大分子のタンパク質複合体を形成したことが示されている。
【図５Ｂ】タンパク質過酸化物（ＡＯＰＰ、２００μｇ／ｍＬ）を、様々な濃度の精製ｓＤＳＳ１タンパク質とともに４℃で一晩インキュベートし、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後クマシーブリリアントブルー染色で示す。ｓＤＳＳ１タンパク質とＡＯＰＰとが大分子の複合体を形成することができ、複合体含有量は、ｓＤＳＳ１タンパク質の濃度の増加にしたがって増加する。
【図５Ｃ】１０％酸化された血清を培地に添加して細胞増殖を大幅に低下させた。ｓＤＳＳ１タンパク質は、培地内において酸化された血清によってもたらした細胞毒性をブロックすることができる。
【図５Ｄ】１００μｇ／ｍＬのＡＯＰＰタンパク質を無血清培地に添加して細胞生存率を低下させた。等濃度のｓＤＳＳ１タンパク質を添加することで細胞生存率を回復させることができる。１００μｇ／ｍＬのＢＳＡは、対照群に用いられる。データについては、ｔ−ｔｅｓｔ検定両側検定を用いて分析し、分散分析（ＡＮＯＶＥ）によって検証した。＊＊、ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図６Ａ】〜
【図６Ｅ】ｓＤＳＳ１タンパク質は、Ａβオリゴマーの形成を減少させ、Ａβオリゴマーによって誘発された細胞毒性及びアポトーシスを減少させる。
【図６Ａ】様々な比率のｓＤＳＳ１タンパク質と１０μｇのＡβタンパク質とを混合させたあとインキュベートし、Ａβ抗体によって検出された結果、ｓＤＳＳ１タンパク質とＡβとが、共有結合した高分子量のタンパク質複合体を形成し、このような結合は、細胞毒性を有するＡβオリゴマーの形成を減少させ得ることが示されている。
【図６Ｂ】Ｖ５融合タンパク質（Ｖ５−ＨＲＰ）を用いてｓＤＳＳ１タンパク質を検出した結果、ｓＤＳＳ１タンパク質とＡβとがタンパク質複合体を形成していることが示された。
【図６Ｃ】Ａβオリゴマーを培地に添加することで細胞毒性をもたらし、それにより、細胞生存率を低下させた。ｓＤＳＳ１タンパク質は、Ａβオリゴマーによる細胞毒性を完全にブロックすることができる。
【図６Ｄ】アポトーシス実験の結果、ｓＤＳＳ１タンパク質を培養液内に投入することにより、Ａβオリゴマーによって引き起こされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の早期アポトーシス及び後期アポトーシスを顕著に低下させ、それにより、細胞に対する毒性タンパク質の影響を低減する。
【図６Ｅ】ｓＤＳＳ１タンパク質は、Ａβオリゴマーの、マウス神経幹細胞（ＮＳＣｓ）に対する毒性をもブロックすることができる。データについては、ｔ−ｔｅｓｔ検定両側検定を用いて分析し、分散分析によって検証した。＊＊、ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図７】培地にアミリンオリゴマーを添加することにより、細胞毒性が誘発され細胞生存率が低下する。ｓＤＳＳ１タンパク質の添加は、細胞生存率を回復させ、細胞生存を促進することができる。データについては、ｔ−ｔｅｓｔ検定両側検定を用いて分析し、分散分析によって検証した。＊＊、ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図８】４００μｇ／ｍＬのグリコシル化タンパク質による細胞生存率の低下は、ｓＤＳＳ１タンパク質によって回復することができる。回復効果は、ｓＤＳＳ１タンパク質濃度の増加（１００μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ）にしたがってより強くなる。４００μｇ／ｍＬのＢＳＡタンパクを対照群に用いた。データについては、ｔ−ｔｅｓｔ検定両側検定を用いて分析し、分散分析によって検証した。  ＊＊、ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図９Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの側脳室（Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）におけるウイルス注射の操作方法及びウイルス注射部位を示す概略図である。
【図９Ｂ】アデノウイルスを５ヶ月齢の早期老化マウスであるＳＡＭＰ８マウスの大脳の側脳室に注射（左右半球のそれぞれに１μＬのウイルス液）した後、示された動物の生存状況について連続的に観察した。結果により、時間の経過につれて、ｓＤＳＳ１タンパク質を発現したアデノウイルスを注射したマウスの術後生存率は、ＧＦＰタンパク質を発現した対照マウス率よりも明らかに高いことが示されている。データは、分散分析によって分析される。＊＊，ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下の内容は、実例とともに本発明における好ましい解決手段を説明且つ検証するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の全ての範囲は、特許請求の範囲における限定に基づくものである。
【００５６】
以下の実施例において使用された実験方法は、特に明記しない限り、すべてが従来の実験方法である。
【００５７】
以下の実施例におけるｓＤＳＳ１タンパク質は、自身で生産し、且つ濃度が生物学的実験のレベルに達することを検証する。他の材料及び試薬は、商業的手段によって得ることができる。
【００５８】
＜実施例１＞
ｓＤＳＳ１タンパク質は、サル目が有する分泌型タンパク質である。
【００５９】
バイオインフォマティクス分析ツール
国立生物工学情報センター(National Center of Biotechnology Information，NCBI)ゲノムデータベース、Nucleotide blast tool（NCBI）、Align sequences nucleotide blast tool（NCBI）、Translate tool (SIB Bioinformatics Resource Portal）、Clustal X2.1：Multiple Sequence Alignment (EMBL-EBI)、SecretomeP 2.0（CBS prediction service）、WoLF PSORT II。
【００６０】
生物実験法
１、細胞培養：２９３Ｔ細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から購入し、細胞を、９０％の基本培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司  Ｃ＃１２５０００６２）及び１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  公司Ｃ＃１０１００−１４７）を含む細胞培養培地において、細胞培養インキュベータ（温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）で培養した。２日間ごとに１回継代した。
【００６１】
２、細胞のトランスフェクション：１ウェルあたり３×１０5の２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート内に播種し、１．５ｍＬの細胞培養培地を添加し、細胞接着の１２時間後にプラスミドをトランスフェクトし始めた。真核発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｃ−Ｆｌａｇを用いた。挿入されたｓＤＳＳ１タンパク質を発現した塩基配列については、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示されている。２５００ｎｇのプラスミドを７５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司Ｃ＃３１９８５０６２）で希釈且つ均等に混合し、１０μＬのトランスフェクション試薬Ｌｉｐ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司Ｃ＃１２５６６０１４）を７５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍで希釈且つ均等に混合し、希釈されたプラスミド溶液を希釈されたトランスフェクション試薬に滴下し、均等に混合した後常温で５分間インキュベートした。６ウェルプレート内の細胞培養培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、インキュベートしたトランスフェクション作業溶液で交換した。細胞をインキュベータ内で培養し続け、２４〜４８時間の間に細胞内の蛍光タンパク質の発現を観察した。
【００６２】
３、ドットイムノブロッティング実験：ＰＶＤＦ膜をメタノールで活性化した後乾燥させ、対照培地及び異なるトランスフェクト細胞培地を膜に滴下した。膜が乾燥した後、ＰＶＤＦ膜に対して１％ＢＳＡブロッキング、一次抗体（Rabbit-anti-GFP）（Cell signal technologyechnology公司C#2956）でのインキュベーション、及び、二次抗体（Goat-anti-rabbit HRP抗体）（中杉金橋，ZDR-5403）でのインキュベーションを順次に完成させた。膜をPBSTで３回洗浄し、発光液（中杉金橋、ZLI-9017）で現像し、且つストリップをＸ線フィルムで露光した。
【００６３】
結果の分析
我々は、ヒトゲノム内のｓｈｆｍ１遺伝子のバイオインフォマティクスを解析した際に、この遺伝子が複数の転写産物を有することを見出した（ＮＣＢＩデータベースにおけるｓｈｆｍ１遺伝子情報を参照、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７９７９）。ＤＳＳ１タンパク質配列を共通にコードする１本のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００６３０４．１，５０９ｂｐ）のほか、より長い１本のｍＲＮＡ配列（ＡＫ３０９２４１．１，１１９５ｂｐ）も存在する。短いｍＲＮＡ配列及び長いｍＲＮＡ配列は、わずか２５６ｂｐの反復配列を有する（図１Ａ）。核酸配列解析を経て、翻訳ツール（Ｔｒａｎｓｌａｔｅ  ｔｏｏｌ）を使用することで、反復配列がＤＳＳ１タンパク質Ｎ末端の５８位のアミノ酸配列をコードできることが明らかになった。長いｍＲＮＡ配列は、８９位のアミノ酸ポリペプチド配列をコードする。ポリペプチド配列の比較から、長いｍＲＮＡによってコードされたポリペプチド配列及びＤＳＳ１ポリペプチド配列は、Ｎ末端の５８位のアミノ酸の重複領域を有するほか、３１位のアミノ酸変異領域を有することがわかる。我々は、この新しいポリペプチドを分泌型ＤＳＳ１タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ＤＳＳ１、ｓＤＳＳ１）と命名した。ポリペプチド配列は以下の通りである。
【００６４】
ＤＳＳ１  （Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）：
MSEKKQPVDLGLLEEDDEFEEFPAEDWAGLDEDEDAHVWEDNWDDDNVEDDFSNQLRAELEKHGYKMETS（SEQ ID NO：４参照）
【００６５】
ｓ−ＤＳＳ１  （Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）：
MSEKKQPVDLGLLEEDDEFEEFPAEDWAGLDEDEDAHVWEDNWDDDNVEDDFSNQLRATVLLMILVCETPYGCYVLHQKGRMCSAFLCC（SEQ ID NO：１参照）
【００６６】
表１に示すように、我々は、ＮＣＢＩデータベースにおけるシーケンシングされたサル目ゲノム及び他のモデル動物ゲノムについてのスクリーニングにより、類人猿亜目動物のゲノムにのみ、類似の長いｍＲＮＡ配列が存在することを見出し、且つヒトｓＤＳＳ１タンパク質と類似するポリペプチド配列を得た。これらのポリペプチド配列を比較した結果、ｓＤＳＳ１タンパク質配列は、高度に保存されており、Ｎ末端５９位のアミノ酸配列は完全同一であり、Ｃ末端他のアミノ酸配列は、僅かな点突然変異が生じていることが示された（図１Ｂ）。
【００６７】
【表１】
2019513023.tif 000003
【００６８】
２つの分泌タンパク質分析予測ソフトウェアＷｏｌｆ  ＰＳＯＲＴ及びＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ  ２．０を用いて、ｓＤＳＳ１タンパク質のアミノ酸配列を分析し、予測の結果により、ｓＤＳＳ１タンパク質は、細胞外に局在し、同定された多くの分泌型タンパク質と同様に、１種の分泌タンパク質であることが予測された。ここで、Ｗｏｌｆ  ＰＳＯＲＴソフトウェアの分析結果によれば、ｓＤＳＳ１タンパク質のシグナルペプチド切断部位（Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）は、アミノ酸５８〜５９の間に位置する。
【００６９】
【表２】
2019513023.tif 000004
【００７０】
バイオインフォマティクスの分析結果に基づいて、当該タンパク質の全配列又はＣ末端３１位のアミノ酸配列（アミノ酸５８の後の３１位のアミノ酸配列）と、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＧＦＰ）とをそれぞれ連結し、且つ２９３Ｔ細胞に発現（ｓＤＳＳ１−ＧＦＰ，ｓＤＳＳ１−ｃ−ＧＦＰ）させた結果、溶液内において緑色蛍光が現れ、バックグラウンドは発光し、細胞内の蛍光はぼやけて暗かった。一方、対照群（ＧＦＰ）の溶液には蛍光がなく、バックグラウンドは暗く、細胞内の蛍光は明瞭で明るかった（図２Ａ）。ドットイムノブロッティング法を用いてトランスフェクトされた細胞培養培地を検出した結果、ｓＤＳＳ１−ＧＦＰ及びｓＤＳＳ１−ｃ−ＧＦＰ群の細胞培養培地においてはＧＦＰシグナルが検出され、対照群（ＧＦＰ）においてはシグナルが検出されていない（図２Ｂ）。これらの結果をまとめると、ｓＤＳＳ１タンパク質は、細胞内で合成され且つ細胞外に分泌され得る１種の分泌タンパク質であり、ｓＤＳＳ１タンパク質のＣ末端３１位のアミノ酸配列はシグナルペプチドとしての機能を果たした。
【００７１】
＜実施例２＞
ｓＤＳＳ１タンパク質は、１種の天然タンパク質
【００７２】
１、ヒト血清及び脳脊髄液サンプル処理  新鮮なヒト全血を採取し、室温で１０〜２０分間放置した後、３５００ｇで３０分間遠心分離し、上清をヒト血清として採取した。１００ｍＭの２−メルカプトエタノールを血清に添加し、均等に混合した後１０分間沸騰水浴で処理し、冷却後、１２０００ｇで１０分間高速遠心分離を行い、上清と１／５容量の５ｘローディングバッファーとを混合した。病院で新鮮な脳脊髄液を取得して、それを輸送用の氷箱に入れ、同日に処理した。新鮮な脳脊髄液と５ｘローディングバッファー（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）とを直接混合した後、ローディングのために直接サンプリングした。
【００７３】
２、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験  調製した１５μＬのローディングサンプルをウェルに添加し、４〜１２％のプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司Ｃ＃ＮＰ０３２１ＢＯＸ）でタンパク質を単離した後、ＰＶＤＦ膜にイムノブロッティングした。膜を一次抗体（Ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｓＤＳＳ１）（抗原配列：ｓＤＳＳ１タンパク質のＣ末端３１位のアミノ酸配列）でインキュベートし、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、二次抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ抗体）でインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、完了後発光液で現像し、且つストリップをＸ線フィルムで露光した。
【００７４】
３、細胞培養  ヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７−ＭＧ細胞）をＡＴＣＣから購入し、細胞を、９０％の基本培地ＤＭＥＭ及び１０％のウシ胎児血清ＦＢＳを含む完全細胞培養培地内において、細胞培養インキュベータ（温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）で培養した。２日間ごとに１回継代した。
【００７５】
４、ＰＣＲ実験  Ｕ８７−ＭＧ細胞を回収した後、１つの全ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、５１３０４）を用いて細胞溶解液から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡサンプルに対して、１Ｕ／μＬＤＮａｓｅ  Ｉを用いて室温で１５分間処理を続けて残留されたゲノムＤＮＡを除去した。得られたＲＮＡサンプルのすべてを、ｃＤＮＡ合成試薬キット（全式金生物技術（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）有限公司、ＡＴ３０１）を用いてｃＤＮＡに変換合成して、後続のＰＣＲ実験のためのテンプレート試料として使用した。ＰＣＲ反応について、１０μＬのＰＣＲプレミックス試薬（ＰＣＲ  Ｔａｑ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）（Ｏｍｅｇａ  ｂｉｏ−ｔｅｋ，ＴＱ２２００）、０．５μＬのｃＤＮＡテンプレート（３．５μｇ／ｍＬ）、０．５μＬのプライマー、及び９μＬの超純水を含む２０μＬの反応系を採用し、混合した後ＰＣＲ反応を開始した。ＤＳＳ１  ｃＤＮＡプライマー：フォワードプライマー：ＧＣＡＧＡＣＡＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＡＧＡＧ，リバースプライマー：ＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣ；ｓＤＳＳ１  ｃＤＮＡプライマー：フォワードプライマー：ＧＣＡＧＡＣＡＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＡＧＡＧ，リバースプライマー：ＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＴＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧ。ＰＣＲ反応プログラム９４℃で１０分間、４０回サイクル反応を開始：９４℃  １０ｓ、６２℃  ２０ｓ、７２℃  ２０ｓを含み、循環の完了後７２℃で１０分間継続し、その後、４℃で保存し且つ３％のアガロースゲル（０．０５％  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，  ４４７２９０３））電気泳動を用いてＰＣＲ産物内のＤＮＡ含有量を検出した。
【００７６】
結果の分析
ｓＤＳＳ１特異的抗体を用いて、ヒト脳脊髄液又は血清内においてｓＤＳＳ１タンパク質のシグナルを検出することができる。異なる個体からの血清サンプルは、異なるシグナルパターンを示し、運動後の個々の血清内のｓＤＳＳ１シグナルは、静止状態より明らかに高い（図３Ａ）。Ｕ８７−ＭＧ細胞において、ｓＤＳＳ１遺伝子のｍＲＮＡシグナルを検出することができる。ＰＣＲ増幅産物の遺伝子シーケンシング結果は、データベースにおける配列と完全一致する（図３Ｂ）。これらの結果は、ｓＤＳＳ１タンパク質が、ヒト脳脊髄液及び血清内に存在する１種の天然タンパク質であることを示している。
【００７７】
＜実施例３＞
ｓＤＳＳ１タンパク質の少量調製
【００７８】
実験方法
１、ｓＤＳＳ１蛋白調製：ヒトｓＤＳＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド断片の全遺伝子合成（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を参照）をｐＥＴ１５１Ｄ内のＨｉｓｘ６−Ｖ５タグの後ろに挿入した。次に、プラスミドを発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）内に移した。大腸菌においてＨｉｓｘ６−Ｖ５−ｓＤＳＳ１タンパク質を融合発現し、ニッケル−ＮＴＡゲルカラムを用いて予備精製し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてゲル精製した。Ｈｉｓ−Ｖ５−ｓＤＳＳ１タンパク質を含む、切り出されたゲルバンドを、転写バッファを含む透析バッグに入れ、電界駆動によって、タンパク質をゲルから転写させ、透析バッグに回収する。タンパク質を約５００マイクロリットルまで濃縮し、４度のＰＢＳ溶液において４回（毎回２００ミリリットル）透析した。
【００７９】
２、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動  精製されたｓＤＳＳ１タンパク質又は細菌溶解液タンパク質と、５ｘローディングバッファーとを混合した後、沸騰水浴で１０分間処理し、１２０００ｇで１０分間遠心分離し、分析のための上清を採取した。タンパク質を４〜１２％のプレキャストゲルで単離した後、ゲルブロックをクマシーブリリアントブルー染料で１時間染色し、次に、脱色液を用いて室温で一晩脱色した。脱色完後、ゲルブロック上のストリップを観察し且つ撮影して保存した。
【００８０】
結果の分析
大腸菌株の陽性クローンを選択し、拡大培養し、細菌増殖の対数期においてＩＰＴＧを用いて目的タンパク質を発現するように細菌細胞を刺激した。細胞を溶解し、目的タンパク質の発現レベルを検出した結果、ＩＰＴＧ刺激後、細菌細胞によって発現されるｓＤＳＳ１タンパク質のレベルが顕著に向上し、タンパク質ストリップがゲルマップ上にはっきり見られたことが示された（図４Ａ）。細菌溶解液をニッケル−ＮＴＡゲルカラムで予備精製した後、濃縮液内の目的タンパク質が大きく濃縮され（ｂチャネル）、雑多なタンパク質の含有量が減少した。精製し続けると、純度が極めて高く、その後の生物学的実験に用いられ得るｓＤＳＳ１タンパク質（ａチャネル）を得ることができた（図４Ｂ）。精製後のｓＤＳＳ１タンパク質をＢＣＡタンパク質により定量し、最終濃度が０．７２ｍｇ／ｍｌであり、予備として４度で保存した。
【００８１】
＜実施例４＞
ｓＤＳＳ１タンパク質と酸化タンパク質との反応、及び酸化タンパク質の細胞毒性のブロック
【００８２】
実験方法
１、酸化された血清とｓＤＳＳ１タンパク質との反応  新鮮なヒト血液を３５００ｇで３０分間遠心分離し、その後の実験のために上層の血清を採取した。実験において、１０μＬのｓＤＳＳ１タンパク質溶液（０．７２ｍｇ／ｍＬ）を、１０、２０、５０、１００マイクロリットルの酸化血清とそれぞれ混合した。ｓＤＳＳ１と血清タンパク質との質量比は約１：１００、１：２００、１：５００、１：１０００であった。また、２０μＭ  Ｆｅｎｔｏｎ試薬（ＦｅＳＯ４及びＨ２Ｏ２を１：１の質量比で混合）を添加して、均等に混合した後暗所の４℃で一晩インキュベートした。翌日、各反応におけるＨｉｓ−Ｖ５−ｓＤＳＳ１を、１０マイクロリットルのＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズで単離した。反応液と磁気ビーズとを４度で２時間混合し、磁気ビーズを磁気ラックでチューブの壁面に吸着させた後、液体を吸引し、１ｍｌのＰＢＳＴを添加し、チューブを磁気ラックから取り外し、振動及び洗浄を繰り返した後、磁気ラックで磁気ビーズを吸着させ、ＰＢＳＴを吸引した。このように４回繰り返し、最後に、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０マイクロリットルのＴＢＳでタンパク質を溶離した。溶離液を等容量の２ｘ  ＳＤＳ溶液に加え、１００℃で１０分間処理し、１２０００ｇで１０分間遠心分離し、検出のための上清を採取した。上清液と５Ｘローディングバッファーとを混合し、１００℃で１０分間加熱処理し、調製した試料をタンパク質のイムノブロッティング実験に使用した。
【００８３】
２、ウシ胎児血清の酸化及びタンパク質過酸化物の調製  １０ｍＬのウシ胎児血清を１０ｍＭ  ＮａＣｌＯで１時間処理し、酸化された血清を、３０００Ｄａの透析バッグを用いてＰＢＳ溶液内で２４時間連続的に透析した。透析中に８時間ごとに液を１回交換し、参加した酸化剤を完全に除去するために、処理終了後の血清溶液内に１ｍＭのビタミンＣ（Ｖｃ）を加えた。ＢＣＡタンパク質定量法でタンパク質濃度を検出した。２つの方法を用いて酸化タンパク質の含有量を検出した。クロラミンＴ法で酸化血清内のダブルチロシン値が７５．３１μＭ／ｍｇのタンパク質（未処理血清が１５．０５ｍｇ／ｍｇのタンパク質）を測定し、ジニトロフェニルヒドラジン法でカルボニル基の含有量が１６．３３ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質（未処理血清が１３．６８ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質）を測定した。
【００８４】
最初に、１０ｍｇの血清アルブミンを１６０ｍＭ  ＮａＣｌＯで１時間処理し、酸化タンパク質を、３０００Ｄａの透析バッグを用いてＰＢＳ溶液内で２４時間透析し続けた。透析中に８時間ごとに液を１回交換した。まず、処理終了後のタンパク質過酸化物（ＡＯＰＰ）を、ＢＣＡタンパク質定量法を用いてタンパク質濃度を測定した。クロラミンＴ法でＡＯＰＰサンプル内のダブルチロシン値が５４．２１μｍｏｌ／ｍｇのタンパク質（未処理のＢＳＡが１４．５５μｍｏｌ／ｍｇのタンパク質）を測定し、ジニトロフェニルヒドラジン法でカルボニル基の含有量が１０４２．５７ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質（未処理のＢＳＡが１０．２６ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質）を測定した。
【００８５】
３、タンパク質過酸化物とｓＤＳＳ１タンパク質との反応  ３０μｇのＡＯＰＰタンパク質（２００μｇ／ｍＬ）を１５０μＬの反応系に加え、また、１５μｇ（１００μｇ／ｍＬ）、３０μｇ（２００μｇ／ｍＬ）、６０μｇ（４００μｇ／ｍＬ）のｓＤＳＳ１タンパク質をそれぞれ添加し、無菌ＰＢＳ溶液で余分な容量を補充した。溶液を均等に混合し、４℃の環境において一晩反応させた。反応終了後のサンプル内に、５ｘローディングバッファーを添加し、１００℃で１０分間の加熱処理を行い、処理したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルー染色でストリップを示した。
【００８６】
４、タンパク質イムノブロッティング実験  反応終了後のタンパク質混合物と５ｘローディングバッファー（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）とを混合し、沸騰水浴で１０分間加熱し、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析に使用した。具体的な方法は前述の内容と同じである。使用した抗体は、Ｖ５−ＨＲＰ抗体（１：５０００希釈）であった。
【００８７】
５、細胞株培養  ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を、１０％のウシ胎児血清を補充した基本培地ＤＭＥＭで増殖させた。細胞を２日間ごとに１回継代した。
【００８８】
６、細胞生存率測定  酸化血清の細胞毒性に対するｓＤＳＳ１タンパク質の効果を検出するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１ウェルあたり２００μＬの完全培地に１０4細胞で９６ウェルプレート内に播種した。。１２時間後、完全培地を、０．５％のＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ（１ウェルあたり２００μＬ）に変更した。２４時間処理を継続した後、ＤＭＥＭ溶液を、１０％の酸化血清及び２０μｇ／ｍＬのｓＤＳＳ１タンパク質の１０％の酸化血清を含む培地に変更した。１ウェルあたり２００μＬであった。４８時間処理を継続した後、９６ウェルプレート内の古い培地を廃棄した。希釈した１００μＬのＣＣＫ−８作業溶液（１：２０で希釈）（同仁化学、ＣＫ０４）を各ウェルに添加して、細胞生存率の変化を測定した。対照群に用いるため、等濃度のＢＳＡ群を添加した。
【００８９】
ＡＯＰＰによって引き起こされた細胞毒性に対するｓＤＳＳ１タンパク質の保護効果を検出するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１ウェルあたり２×１０4細胞で９６ウェルプレート内に播種した。接着の１２時間後に、培地を、０．５％のＢＳＡを含有する無血清培地に変更した。２４時間処理を継続した後、１００μｇ／ｍＬのＡＯＰＰタンパク質を有する無血清培地で置き換えたとともに、１００μｇ／ｍＬのｓＤＳＳ１タンパク質を処置群に添加した。１ウェルあたり２００μＬであった。９６ウェルプレートにおいて４８時間処理を継続した後、ＣＣＫ−８試薬キットを用いて細胞生存率の変化を測定した。
【００９０】
結果の分析
血清内には、主に血清アルブミンである大量のタンパク質が含まれている。フェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）試薬の作用下で、血清内のタンパク質が酸化され、酸化生成物は、ｓＤＳＳ１と反応して複合体を形成することができる。対照群では、明らかなタンパク質凝集を伴わないｓＤＳＳ１タンパク質モノマーが見られた。実実験群では、血清との共同インキュベーションにより多数の高分子量タンパク質複合体が形成され、これらの複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することができない（図５Ａ）。結果により、ｓＤＳＳ１タンパク質が血清内の酸化タンパク質と結合できることが示された。細胞毒性実験では、対照血清と比較すれば、１０％の酸化タンパク質の添加により、細胞増殖及び細胞生存率が明らかに抑制された。培地内に２０μｇ／ｍＬのｓＤＳＳ１タンパク質が含まれれば、酸化タンパク質の細胞毒性を回復することができる（図５Ｂ）。
【００９１】
ｓＤＳＳ１とＡＯＰＰタンパク質とを混合し続けると、ｓＤＳＳ１とＡＯＰＰタンパク質とが結合して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離できない複合体を形成することが分かる。反応系内のｓＤＳＳ１タンパク質の濃度が増加するにつれて、複合体の数も明らかに増加した（図５Ｃ）。細胞実験において、ＡＯＰＰは、細胞に対して明らかな細胞毒性をもたらし、細胞生存率を低下させたが、等濃度のｓＤＳＳ１は、ＡＯＰＰの細胞毒性を完全にブロックすることができた（図５Ｄ）。上記の結果により、ｓＤＳＳ１は、酸化血清又はＡＯＰＰの細胞毒性の影響から細胞を保護することができる。
【００９２】
また、ｓＤＳＳ１タンパク質は、酸化タンパク質反応を有し、両方のタンパク質が酸化タンパク質と緊密に結合することができると結論された。この結合力は、高濃度のＳＤＳに対する耐性を有し、これを共有結合相互作用であると考えられる。相違点として、ＤＳＳ１と酸化タンパク質とが結合する過程においてＡＴＰアーゼの助けを必要とすることであった［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２０１４］。一方、我々の証拠は、ｓＤＳＳ１と酸化タンパク質との密接な結合には、ＡＴＰの添加を必要としない。すなわち、ＡＴＰアーゼの関与を必要としないことを示している。ＤＳＳ１とｓＤＳＳ１とのアミノ酸配列を比較すれば、２つのタンパク質の１〜５８位のアミノ酸配列は、完全一致しているが、ＤＳＳ１の５９〜７０位のアミノ酸配列とｓＤＳＳ１の５９〜８９位のアミノ酸配列とは、全く異なることがわかる。従って、ＤＳＳ１かｓＤＳＳ１と、酸化タンパク質との緊密な結合の特性は、共有アミノ酸配列からの寄与に由来するべきであり、つまり、最初の５８のアミノ酸配列であると推測した。ｓＤＳＳ１は、ＤＳＳ１の特性と異なる。即ち、酸化タンパク質と緊密に結合するのにＡＴＰアーゼ媒介に依存しない特性は、ｓＤＳＳ１の独特なアミノ酸配列に由来し、つまり、５９〜８９位のＣ末端アミノ酸配列に由来することある。要するに、ＡＴＰアーゼ媒介に依存しなくても酸化タンパク質と緊密な結合が生じるというｓＤＳＳ１の特性は、最初の５８個のアミノ酸配列と最後の３１個のアミノ酸配列との有機的な組合せに由来する。
【００９３】
＜実施例５＞
ｓＤＳＳ１タンパク質による、Ａβオリゴマーの形成の低減、及び、Ａβオリゴマーの細胞毒性の低減
【００９４】
実験方法
１、細胞株培養  ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を、１０％ウシ胎児血清を補充した基本培地基ＤＭＥＭで増殖させた。細胞を２日間ごとに１回継代した。
【００９５】
２、神経幹細胞培養  神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＮＳＣ）は、Ｐ２マウスの脳組織に由来し、初代浮遊培養による神経幹細胞を、２継代を経た後毒性検出実験に用いた。神経幹細胞を幹細胞培養培地で培養した。ここで、８８％のＤＭＥＭ／Ｆ１２の基本培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃ＃１２５００−０６２）、１０％の増殖添加剤（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ＃０５７０１）、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃ＃Ｖ９００９３３）、１０ｎｇ／ｍＬヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｃ＃Ｈ３１４９）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃ＃１１１０４６１６００１）、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃ＃３５４０１０）を含む。
【００９６】
３、ＡβとｓＤＳＳ１タンパク質との反応  Ａβタンパク質（Ｈｕｍａｎ、１〜４２）凍結乾燥粉末は、蘇州強耀生物科学技術有限公司により提供されたものである。２ｍｇのＡβ凍結乾燥粉末を２０μＬのＤＭＳＯに溶解し、引き続きＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬまで引き続き希釈した。−２０度で冷凍保存した。反応系において、まず、３００μＬのＰＢＳ溶液内に１０μｇのＡβ及びｓＤＳＳ１タンパク質を１：１、１：５、１：１０のモル質量比で添加して混合し、その後４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション完了後の反応物に、５Χローディングバッファーを添加し、タンパク質イムノブロッティングの分析に用いるために１００℃で１０分間処理した。
【００９７】
４、Ａβタンパク質前処理  Ａβについて、基本培地（ｐＨ７．２）を用いてＡβストック溶液を１０００μｇ／ｍＬまで希釈し、Ａβ希釈液を４℃で２４時間インキュベートした後に形成されたオリゴマーを細胞実験に用いた。その後の実験におけるＡβの濃度は、依然としてインキュベーション前のタンパク質の濃度にしたがってマークした。
【００９８】
５、タンパク質イムノブロッティングの実験  処理完了後の反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析に引き続き使用した。具体的な方法は、前述の内容と同じである。用いた抗体は、Ｖ５−ＨＲＰ抗体（１：５０００で希釈）、Ａβ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９８８８）、及び二次抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ抗体）であった。
【００９９】
６、細胞活性測定  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１ウェルあたり２ｘ１０4細胞で９６ウェルプレート内に播種し、接着の１２時間後に、古い培地を、０．５％のＢＳＡを含有する無血清培地に変更し、２４時間処理を継続した。その後、古い培地を廃棄し、Ａβ又は、Ａβ及びｓＤＳＳ１タンパク質を含むＤＭＥＭ溶液に変更した。細胞について４８時間処理を継続した後、ＣＣＫ−８試薬キットを用いて細胞生存率のレベルを測定した。
【０１００】
７、アポトーシス検出  アポトーシス検出キットは、東仁化学科学技術（上海）有限公司（ＡＤ１０）から購入したものである。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１ウェルあたり３ｘ１０5細胞で６ウェルプレート内に播種した。接着の１２時間後に、古い培地を、０．５％のＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ溶液に変更し、２４時間処理を継続した後、Ａβ又は、Ａβ及びｓＤＳＳタンパク質を含む溶液に変更した。４８時間処理を継続した後、アポトーシス検出キットを用いてアポトーシスのレベルを測定した。すべての溶液及び細胞を集め、遠心分離によって上清を廃棄した。細胞を４００μＬのアポトーシス検出キットによって供給された染色緩衝液を用いて細胞を再浮遊させ、後続の検出のために、１８５μＬの細胞浮遊液を吸引した。細胞浮遊液に５μＬのアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色液を加えて均等に混合し、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。１０μＬのＰＩ染料を添加し続け、均等に混合した後フローサイトメーターでアポトーシスのレベルを測定した。
【０１０１】
まず、神経幹細胞を６ウェルプレート内で単層培養した。ウェルプレートを最初に０．０２５％のラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）で少なくとも２時間処理した後、予備として無菌ＰＢＳで６回洗浄した。神経幹細胞を単細胞化した後、１ウェルあたり３ｘ１０5にしたがって６ウェルプレート内に播種し、細胞接着の２４ｈ後に後続の実験に用いた。
結果の分析
【０１０２】
インキュベーションを経て、Ａβタンパク質が明らかに凝集し、１０〜２０ＫＤの間で異なるサイズのタンパク質凝集体が形成された。文献の報告によれば、これらのＡβオリゴマーは、Ａβによって誘発された細胞毒性の主な供給源である。ｓＤＳＳ１タンパク質を添加してＡβと共同インキュベートした後、ｓＤＳＳ１タンパク質は、Ａβタンパク質と凝集して大分子量の複合体（分子量が２０ＫＤを超える）を形成し、１０−２０ＫＤの間に形成されたオリゴマーは、明らかに減少した（図６Ａ）。ｓＤＳＳ１タンパク質の濃度が増加するにつれて、Ａβオリゴマーの産生は、明らかに抑制された。ｓＤＳＳ１タンパク質シグナルを検出する際に、複合体がｓＤＳＳ１タンパク質とＡβとの反応によって形成されたものであり（図６Ｂ）、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥによって開裂できないことが確認された。
【０１０３】
ｓＤＳＳ１タンパク質の、Ａβ誘発細胞毒性に対するブロック効果を引き続き検出した。細胞生存率アッセイにおいて、前処理されたＡβオリゴマーの添加後に、細胞生存率は顕著に低下した。ｓＤＳＳ１タンパク質を培養液に添加した後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞生存率は顕著に回復し、且つ細胞生存率は対照群より高かった（図６Ｃ）。アポトーシス検出実験において、Ａβオリゴマーを培養液に添加した後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞又は神経幹細胞を誘導した細胞がアポトーシスした。培養液にｓＤＳＳ１タンパク質を添加すると、細胞の早期アポトーシスと後期アポトーシスとのレベルは、顕著に低下する（図６Ｄ、図６Ｅ）。上記の結果に基づいて、ｓＤＳＳ１タンパク質は、Ａβタンパク質と結合することにより、Ａβオリゴマーの形成を減少させ、それによって、Ａβタンパク質によって誘発された細胞毒性を緩和することができる。
【０１０４】
＜実施例６＞
ｓＤＳＳ１タンパク質による、アミリンオリゴマーの細胞毒性の低減
【０１０５】
実験方法
１、細胞株培養  ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を、１０％ウシ胎児血清を補充した基本培地基ＤＭＥＭで増殖させた。細胞を２日間ごとに１回継代した。
【０１０６】
２、アミリンタンパク質の前処理  アミリンタンパク質（Ｈｕｍａｎ）の凍結乾燥粉末は、蘇州強耀生物科学技術有限公司により提供されたものである。２ｍｇのアミリン凍結乾燥粉末を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）で２ｍｇ／ｍＬまで溶解し、−２０度で冷凍保存した。基本培地（ｐＨ７．２）でアミリンストック溶液を１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、アミリン希釈液を４℃で４８時間インキュベートした後に形成されたオリゴマーを細胞実験に用いた。後続の実験におけるアミリンの濃度は、依然としてインキュベーション前のタンパク質の濃度にしたがってマークした。
【０１０７】
３、細胞活性測定  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１ウェルあたり２ｘ１０4細胞で９６ウェルプレート内に播種し、接着の１２時間後に、古い培地を、０．５％のＢＳＡを含有する無血清培地に変更し、２４時間処理を継続した。古い培地を廃棄した後、アミリン又は、アミリン及びｓＤＳＳ１タンパク質を含むＤＭＥＭ溶液に変更した。細胞について４８時間処理を継続した後、ＣＣＫ−８試薬キットを用いて細胞生存率のレベルを測定した。
【０１０８】
結果の分析
細胞培養液にインキュベートされた１０μＭのアミリンタンパク質を添加することにより、顕著な細胞毒性をもたらすことができ、さらに、ｓＤＳＳ１タンパク質を添加することにより、アミリンオリゴマーによる細胞毒性をブロックすることができ、ひいては細胞生存率が対照群よりも高い（図７）。これは、ｓＤＳＳ１タンパク質がアミリンタンパク質の細胞毒性を効果的にブロックできることを示している。
【０１０９】
＜実施例７＞
ｓＤＳＳ１タンパク質による、グリコシル化タンパク質の細胞毒性の低減
【０１１０】
実験方法
１、細胞株培養  ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を、１０％ウシ胎児血清を補充した基本培地基ＤＭＥＭで増殖させた。細胞を２日間ごとに１回継代した。
【０１１１】
２、グリコシル化タンパク質の調製  １０ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンと２．５Ｍのリボースとを混合した後、３７℃で７日間インキュベーションを続けた。インキュベーション終了後、３０００Ｄａの透析バッグを用いてＰＢＳ内で２４時間透析し、８時間毎に１回溶液を交換した。グリコシル化タンパク質の調製完了後、ＢＣＡタンパク質を定量し、サンプルを予備として−８０℃で保存した。
【０１１２】
３、細胞活性測定  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１ウェルあたり２ｘ１０4細胞で９６ウェルプレート内に播種し、接着の１２時間後に、古い培地を、０．５％のＢＳＡを含有する無血清培地に変更し、２４時間処理を継続した。古い培地を廃棄した後、グリコシル化タンパク質又は、グリコシル化タンパク質及び様々な濃度を有するｓＤＳＳ１タンパク質を含むＤＭＥＭ溶液に変更した。対照群に用いるため、等濃度のＢＳＡ群を添加した。細胞について４８時間処理を継続した後、ＣＣＫ−８試薬キットを用いて細胞生存率のレベルを測定した。
【０１１３】
結果の分析
細胞培養液に４００μｇ／ｍＬのグリコシル化タンパク質を添加することにより、顕著な細胞毒性をもたらすことができ、さらに、ｓＤＳＳ１タンパク質を添加することにより、グリコシル化タンパク質による細胞毒性をブロックすることができる。ひいてはｓＤＳＳ１タンパク質の濃度が増加するにつれて、細胞生存率が対照群よりも高く（図８）、これは、ｓＤＳＳ１タンパク質がグリコシル化タンパク質の細胞毒性を効果的にブロックできることを示している。
【０１１４】
＜実施例８＞
ｓＤＳＳ１タンパク質による、早期老化型マウスのＳＡＭＰ術後の生存期間の延長
【０１１５】
実験方法
１．動物飼育  早期老化型ＳＡＭＰ８マウス（５ヵ月齢、雄）を、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入した。動物を、南方モデル動物センターの清潔な実験動物飼育センターに飼育している。動物に十分な無菌水及び標準マウスの繁殖飼料を提供し、明暗の交互の光照射を１２ｈ／１２ｈで与え、毎月敷材及びリスケージを定期的に交換し、毎日動物の生存状況を確認した。
【０１１６】
２、アデノウイルス合成  ｓＤＳＳ１タンパク質を発現するアデノウイルスについては、我々（発明者）が塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を参照）を提供し、アデノウイルスの構築及び合成については、賽業（広州）生物科学技術有限公司によって完成した。アデノウイルスのプロモータ領域及び転写領域における配列は、ユビキチンタンパク質のプロモータ配列を含む、ｐＡＶ［Ｅｘｐ］−ＵＢＣ＞ＥＧＦＰ：Ｔ２Ａ：ＯＲＦ＿３６３ｂｐから構成されている。測定により、ウイルス力価が１０１０  ＰＦＵ／ｍＬを超えることを判明した。感染したＵ８７−ＭＧ細胞及びマウスの神経芽腫細胞（Ｎ２ａ）の検証により、アデノウイルスは、細胞に効率的に感染し、且つｓＤＳＳ１タンパク質を発現することができることが確認された。ＧＦＰタンパク質を発現するアデノウイルス（ｐＡＶ［Ｅｘｐ］−ＵＢＣ＞ＥＧＦＰ）を対照として用いた。
【０１１７】
３、脳定位固定注射  早期老化型ＳＡＭＰ８マウス（６ヶ月齢、雄）に、８００ｍｇ／ｋｇ体重となるように腹腔内に２０％のウレタン（生理食塩水に溶解し、０．２２μｍのフィルタを介して濾過、不純物の除、及び滅菌）を注射して麻酔した。マウスを麻酔した後、頭蓋骨を水平に保つために、マウス脳定位固定装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、５１５００）に固定した。頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させ、ブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）を座標の開始点とし、側脳室領域（０．５８ｍｍ、１．２５ｍｍ、１．７５ｍｍ）を決め、歯科用ドリルでマーキング箇所に穴を開けた。２μＬのウイルス液を微量注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ６００−２．５μＬ、針直径０．２ｍｍ）で吸引し、同じ座標値にしたがって側脳室領域を再配置した。指示された座標値にしたがって針を側脳室領域に素早く挿し進み、ウイルス液を平均２００ｎＬ／ｍｉｎで、合計１０００ｎＬゆっくり注射した。注射完了後、針を完全に脳組織から引き出すまで、針を０．２５ｍｍ抜くごとに３分間待つことにした。他方の側脳室領域を再配置し、針挿入、注射および針引出の手順を完了させ、１μＬのウイルス液を注入した。注射完了のマウスに対して、まず、１００Ｕ／ｍＬのアンピシリン／ストレプトマイシンで頭蓋骨及び周辺組織を拭き、次に、皮膚を縫合糸で縫合した。マウスの腹腔内に１５０μＬの抗生物質を注射し、意識を回復するまで、マウスを腹部が上方に向くようにリスケージに置いた。
【０１１８】
結果の分析
概略図には、マウス側脳室のウイルス注射部位の基本操作及びアデノウイルスの注射部位が示されている（図９Ａ）。ここで、ｓＤＳＳ１発現アデノウイルスの注射を受けたマウスは、２つのバッチで合計１０匹であった。ＧＦＰ発現アデノウイルスマウスの注射を受けたマウスは、２つのバッチで合計１４匹であった。アデノウイルスの注射後１ヶ月以内に、対照群の３匹のマウスが死亡し、実験群の１匹のマウスが死亡した。８ヵ月以内に、対照群のマウスが次々と死亡したが、実験群においては１匹の死亡のみが死亡した（図９Ｂ）。上記の結果をまとめると、ｓＤＳＳ１タンパク質を発現するアデノウイルスＳＡＭＰ８を注射したマウスの術後生存期間は、対照ウイルスのみを注射したマウスより遥かに長く、ＡＮＯＶＡ分析により、両者には大きな差（Ｐ−ｖａｌｕｅ＜  ０．０１）が示された。
【０１１９】
上記に記載の一連の詳細な説明は、本発明の実施可能な実施例についての具体的な説明だけであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。本発明の精神から逸脱せずになされた等価実施例又は変更のすべては、本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
【図１Ａ】
2019513023.tif 000005
【図１Ｂ】
2019513023.tif 000006
【図２Ａ】
2019513023.tif 000007
【図２Ｂ】
2019513023.tif 000008
【図３Ａ】
2019513023.tif 000009
【図３Ｂ】
2019513023.tif 000010
【図４Ａ】
2019513023.tif 000011
【図４Ｂ】
2019513023.tif 000012
【図５Ａ】
2019513023.tif 000013
【図５Ｂ】
2019513023.tif 000014
【図５Ｃ】
2019513023.tif 000015
【図５Ｄ】
2019513023.tif 000016
【図６Ａ】
2019513023.tif 000017
【図６Ｂ】
2019513023.tif 000018
【図６Ｃ】
2019513023.tif 000019
【図６Ｄ】
2019513023.tif 000020
【図６Ｅ】
2019513023.tif 000021
【図７】
2019513023.tif 000022
【図８】
2019513023.tif 000023
【図９Ａ】
2019513023.tif 000024
【図９Ｂ】
2019513023.tif 000025
【配列表】
2019513023000001.xml
【国際調査報告】
2019513023.tif 000041
2019513023.tif 000042
2019513023.tif 000043
2019513023.tif 000044
2019513023.tif 000045
2019513023.tif 000046
2019513023.tif 000047
2019513023.tif 000048