(57)【要約】  本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドに関し、この変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、９２位、１００位、または２３５位のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号１を基準に定義され、この変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する。本発明の変異体ポリペプチドは、ステビオールもしくはステビオール配糖体の産生のために組換え宿主で使用することができる。【選択図】なし
2019532655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドであって、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、
９２位、１００位、または２３５位
のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号１を基準に定義され、前記変異体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する、変異体ポリペプチド。
【請求項２】
前記改変された特性が、改変されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性である、請求項１に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項３】
前記参照ポリペプチドが、配列番号１または配列番号１７のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、請求項１または２に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項４】
天然に存在しないポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１で定義された置換以外のさらなる置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１または配列番号１７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１８〜３３のいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
適切な発現宿主においてゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの発現を誘導することができる１つまたは複数の制御配列に機能的に連結されている、請求項８に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物、例えば発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載の核酸構築物を含む組換え宿主、例えばステビオールもしくはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主。
【請求項１１】
ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド；および
カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の組換え宿主。
【請求項１２】
ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の組換え宿主。
【請求項１３】
（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ２活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチド；および
（ｉｖ）ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチド；
のうちの１つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１４】
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のうちの１つに属する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１５】
前記宿主のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を産生する能力が上方制御されている、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換え宿主を適切な発酵培地中で発酵させる工程、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収する工程を含む、前記ステビオールまたは前記ステビオール配糖体を調製するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［分野］
本開示は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。本開示はまた、核酸を含む核酸構築物、および核酸または核酸構築物を含む発現ベクターに関する。さらに、本開示は、核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主に関する。本開示はまた、組換え宿主を発酵させることを含むステビオールまたはステビオール配糖体の調製のためのプロセス、そのようなプロセスによって得られる発酵ブロス、およびそのプロセスによって得られる、または発酵ブロスから得られるステビオール配糖体に関する。加えて、本開示は、２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物、およびステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料に関する。さらに、本開示は、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法、およびゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドの生産方法に関する。
【０００２】
［背景］
多年生植物、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔ）の葉には、ステビオール配糖体として知られている非常に甘い化合物が大量に蓄積されている。これらの化合物の生物学的機能は不明であるが、それらは、代替の強力な甘味料として商業的意味を有する。
【０００３】
これらの甘いステビオール配糖体は、多くの強力な甘味料の機能特性および知覚特性よりも優れていると思われる機能特性および知覚特性を有する。さらに、研究により、ステビオシドがＩＩ型糖尿病患者の血糖値を下げることができ、そして中等度の高血圧患者の血圧を下げることができることが示唆されている。
【０００４】
ステビオール配糖体は、ステビアの葉に蓄積し、それらは葉の乾燥重量の１０〜２０％を占め得る。ステビオシドおよびレバウジオシドＡは、熱安定性、かつｐＨ安定性であり、炭酸飲料での使用に適しており、他の多くの食品にも使用することができる。ステビオシドは、スクロースよりも１１０〜２７０倍甘く、レバウジオシドＡは、スクロースよりも１５０〜３２０倍甘い。さらに、レバウジオシドＤは、ステビアの葉に蓄積する強力なジテルペン配糖体甘味料でもある。レバウジオシドＤは、スクロースの約２００倍甘い可能性がある。レバウジオシドＭは、さらに強力なジテルペン配糖体甘味料である。レバウジオシドＭは、特定のステビア品種の葉に微量で存在するが、優れた味覚プロファイルを有することが示唆されている。
【０００５】
ステビオール配糖体は、従来、ステビア植物から抽出されてきた。ステビア植物では、ジベレリン酸（ＧＡ）生合成の中間体である（−）−カウレン酸が、四環式ジテルペンステビオールに変換され、次いで多段階グリコシル化経路を経て様々なステビオール配糖体を形成する。しかしながら、収量は、変動し、農業および環境条件によって影響を受ける可能性がある。また、ステビア栽培は、かなりの土地面積、収穫前の長い時間、多大な労働力、ならびに配糖体の抽出および精製のための追加費用を必要とする。
【０００６】
ごく最近になって、発酵プロセスを用いたステビオール配糖体の生産に関心が集まってきている。国際公開第２０１３／１１０６７３号パンフレットおよび同第２０１５／００７７４８号パンフレットに、少なくともステビオール配糖体レバウジオシドＡおよびレバウジオシドＤを生産するために使用できる微生物が記載されている。
【０００７】
より多量のステビオール配糖体を産生することができ、かつ／または追加もしくは新規のステビオール配糖体および／もしくはより多量の特定のステビオール配糖体および／もしくは所望の割合の異なるステビオール配糖体を有するステビオール配糖体の混合物を産生できるようにするためには、そのような微生物のさらなる改良が望ましい。
【０００８】
［概要］
本開示は、変異体ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの同定に基づく。これらの変異体は、ステビオールおよび／または１つまたは複数のステビオール配糖体の生成に適した組換え宿主の作製に使用することができる。
【０００９】
そのような組換え宿主は、非変異体ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを発現する組換え宿主と比較して、より大量のステビオール配糖体を産生し得る。より多量のステビオール配糖体の産生により、ステビオール配糖体の回収がより容易になり得る。あるいは、またはさらに、より高い収量を得ることができる。
【００１０】
したがって、本開示は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドに関し、この変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される配列（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの野生型ＧＧＳ配列）を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に：
９２位、１００位、または２３５位
のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号１を基準に定義され、ここで、この変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する。
【００１１】
本開示はまた、以下に関する：
−配列番号３、５、７、９、１１、１３、または１５のいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチド；
−本明細書に開示される変異体ポリペプチドをコードする配列を含む核酸；
−適切な発現宿主においてゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの発現を誘導することができる１つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本明細書に開示される核酸を含む核酸構築物；
−本明細書に開示される核酸または核酸構築物を含む発現ベクター；
−本明細書に開示される核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主；
−本明細書で開示されるような組換え宿主を適当な発酵培地中で発酵させること、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収することを含む、ステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセス；
−本明細書に開示されるステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロス；
−本明細書に開示されるステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示のステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られるステビオール配糖体；
−本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物；
−本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られるステビオール配糖体を含む食品、飼料、または飲料、あるいは本明細書に開示される組成物を含む食品、飼料、または飲料；
−第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法であって：
前記第１のステビオール配糖体を本明細書に開示される組換え宿主、そのような組換え宿主由来の無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来の酵素調製物と接触させる工程；
それにより、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法；ならびに
−ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの産生に適した条件下で、本明細書に開示される宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを回収する工程を含む、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ステビオール配糖体の生合成をもたらす潜在的経路の概略図を示す。
【００１３】
［配列表の説明］
配列の説明を表１に示す。
【００１４】
【表１】
2019532655.tif 000003
【００１５】
［詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は包含的に解釈されるべきである。すなわち、これらの語は、文脈が許す限り、具体的に列挙されていない他の要素または整数の包含の可能性を伝えることを意図している。
【００１６】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、１つまたは少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味し得る。
【００１７】
本明細書では、「レバウジオシド」を「レブ」と短縮することがある。つまり、例えば、レバウジオシドＡとレブＡは、同じ分子を指すものとする。
【００１８】
本開示は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する新規のポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドを発現する組換え宿主、すなわちそのようなポリペプチドをコードする組換え配列を含む宿主細胞は、ステビオール配糖体の産生のために使用することができる。所与の組換え宿主のステビオール配糖体を産生する能力は、非組換え形態の宿主の特性であり得るか、あるいは１つまたは複数の組換え核酸配列（すなわち、ステビオール配糖体の産生をもたらす酵素をコードする）の導入の結果であり得る。本明細書に開示される組換え宿主は、非組換え宿主またはゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドを発現することができる組換え宿主と比較して、ステビオール配糖体の産生を増加させることができる。
【００１９】
したがって、本開示によると、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドが提供される。
【００２０】
本開示による変異体ポリペプチドは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する。ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性）は、当業者に周知の用語である。
【００２１】
本開示の目的のために、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（またはシンテターゼ）活性を有するポリペプチドは、典型的には、ファルネシル二リン酸およびイソペンテニル二リン酸からのＧＧＰＰの合成を触媒するポリペプチドである。
【００２２】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性は、ＧＧＰＰシンターゼ活性、ＧＧＰＰシンテターゼ活性、ＧＧＰＰＳ活性、ＧＧＰＳ活性、ＧＧＳ活性、ＧＧＳ１活性、ＧＧＰＳ１活性、またはＧＧＰＰＳ１活性とも呼ばれることがある。
【００２３】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性はまた、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）のｃａｒＧ遺伝子の産物の活性に関して定義することができる。ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）のｃａｒＧ遺伝子の産物は、以下のうちの１つ以上を触媒することができる：
−ジメチルアリル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸＝二リン酸塩＋ゲラニル二リン酸；
−ゲラニル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸＝二リン酸塩＋（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸；または
−（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸＝二リン酸塩＋ゲラニルゲラニル二リン酸。
【００２４】
これらの触媒活性のいずれを使用して、本開示のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを定義することができる。
【００２５】
したがって、本開示の目的のために、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、ゲラニルゲラニルピロリン酸の形成を触媒するかまたは部分的に触媒することができるポリペプチドであり得る。
【００２６】
本明細書に開示される変異体ポリペプチドは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して、改変されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する。
【００２７】
そのような変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して低い特異的ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有し得る。
【００２８】
そのような変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して高い特異的ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有し得る。
【００２９】
本開示による変異体ポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドであり得る。
【００３０】
本明細書において、本開示の変異体ポリペプチドは、「ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体」、「ＧＧＰＳ」、または「ＧＧＳ」、「ＧＧＰＳ変異体」、「ＧＧＳ変異体」、「変異体ポリペプチド」、または「ＧＧＰＳポリペプチド」、または「ＧＧＳポリペプチド」などと呼ばれることがある。
【００３１】
本明細書に開示されるゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドの変異体であり得、この変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、９２位、１００位、または２３５位のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号１を基準に定義される。
【００３２】
本明細書に開示されるＧＧＰＳ変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に示されるように１つまたは複数の置換を有する変異体）は、配列番号１のＧＧＰＳなどの参照ＧＧＰＳポリペプチドと少なくとも約６０％、７０％、８０％の同一性、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも約８５％の同一性、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも約９０％の同一性、参照ポリペプチドと少なくとも約９５％の同一性、参照ポリペプチドと少なくとも約９８％の同一性、または参照ポリペプチドと少なくとも約９９％の同一性を有し得る。そのような変異体は、典型的には、９２位、１００位、または２３５位に対応する位置から選択される１つまたは複数の置換または置換のセットを有し、これらの位置は、配列番号１を基準に定義される。
【００３３】
本明細書に開示されるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、９２位、１００位、または２３５位のうちの１つまたは複数に置換を有する、配列番号１に示されるポリペプチドの変異体であり得る。
【００３４】
参照ＧＧＰＳにおける、本明細書で定義される位置のうちの１つに対応するアミノ酸位置は、記載されたアミノ酸位置のいずれかと多重（タンパク質）配列アラインメントで整列する位置であり得る。
【００３５】
したがって、本明細書に開示されるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、８９位、９７位、または２２５位のうちの１つまたは複数に置換を有する、配列番号１７に示されるポリペプチドの変異体であり得る。
【００３６】
本発明者らは、驚くべきことに、９２位、１００位、または２３５位の１つまたは複数に置換を有する本明細書に開示される変異体ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞が、ステビオール配糖体を産生させるための方法に使用された場合、参照ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と比較して著しく高い力価のステビオール配糖体およびＫＡ−配糖体を産生することを見出した。
【００３７】
本開示による置換が起こり得る３つの位置のうち２つ、すなわち配列番号１を基準に定義される９２位および１００位はそれぞれ、αヘリックス上のヒンジ点（９２位）およびαヘリックス内（１００位）に位置すると予想され、これらの位置はそれぞれ、タンパク質ホモ二量体の界面相に位置すると予想される。系統解析は、グリシン９２に相同な位置が高度に保存されていることを示した。理論に拘束されることなく、本発明者らは、観察された驚くべき結果は、厳密に保存されたグリシン９２の、例えばグルタミン酸への変異が、タンパク質構造および潜在的に二量体相互作用に影響を及ぼす可能性があるという事実によるであろうと考えている。系統発生において、Ａ１００と相同な位置ではアミノ酸の変異はほとんど観察されていないが、バリンのようなより大きな疎水性残基へのアミノ酸の変異は観察されていない。理論に拘束されることなく、本発明者らは、実施例において観察された驚くべき結果が、Ａｌａ１００Ｖａｌ変異が二量体の界面相に影響を及ぼし、かつ活性部位、および基質結合ポケットの一部である隣接するαヘリックスとの立体相互作用による触媒作用に影響を及ぼす可能性があるという事実によるであろうと考えている。
【００３８】
突然変異が起こり得る第３の位置、すなわち２３５位は、先に記載された２つの位置から離れている、タンパク質−タンパク質相互作用に関与しないαヘリックスに位置している可能性がある。系統解析は、セリンがＳｅｒ２３５と相同な位置に存在するが、この位置ではアラニンが最も優勢なアミノ酸であることを示した。
【００３９】
本開示のＧＧＰＳ変異体は、典型的にはＧＧＰＳ活性を保持するであろう。すなわち、本開示によるＧＧＰＳ変異体は、参照ポリペプチドと比較して改変された活性を有するにもかかわらず、典型的には上記の反応を触媒することができるであろう。
【００４０】
適切な参照ポリペプチドは、配列番号１（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））のアミノ酸配列、配列番号１７（ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））のアミノ酸配列、またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＧＰＳのアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。
【００４１】
好ましくは、本開示によるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、典型的にはそれが由来する参照ポリペプチドと比較して、典型的には比活性および／または基質特異性に関して改善された特性を示すであろう。そのような改善された特性は、典型的には、例えば（組換え宿主においてＧＧＰＳを発現させることによる）ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の生産方法において変異体が以下に示すように使用されたのであれば関連する特性であろう。
【００４２】
したがって、本開示によるＧＧＰＳ変異体は、（参照ポリペプチドを発現するステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主と比較して）ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主における前記ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生を典型的に増加させることができる変異体である。すなわち、宿主細胞における本開示によるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドの過剰発現は、典型的には、参照ポリペプチド（例えば、配列番号１または配列番号１７のＧＧＰＳ）を過剰発現する宿主細胞と比較して、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生の増加をもたらす。
【００４３】
参照ＧＧＰＳと比較して改善された特性を示すＧＧＰＳ変異体は、典型的には、例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産方法においてＧＧＰＳ変異体が本明細書に示される用途により適するような、関連する特性、例えば比活性の測定可能な減少または増加を示す変異体である。
【００４４】
ＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入、ならびに／あるいは参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の切断を有するアミノ酸配列を含む。ＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、本明細書に記載の１つまたは複数の置換を含み得る。
【００４５】
例えば本明細書に記載されるようなＧＧＰＳ活性を有する変異体ポリペプチドであって、配列番号１に示される配列を含むＧＧＰＳに整列された場合に、９２位、１００位、または２３５位のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、前記位置が、配列番号１を基準に定義され、この変異体は、ＧＧＰＳ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する。
【００４６】
したがって、前記位置のうちの１つまたは複数に存在するアミノ酸は、参照配列中のその位置に現れるものとは異なるアミノ酸で置換されるであろう（位置は、配列番号１を基準に定義される）。
【００４７】
本開示による変異体ＧＧＰＳは、上記の置換のうちの１つを含み得る。しかしながら、変異体ポリペプチドは、９２位、１００位、または２３５位における置換の任意の組み合わせ、例えば前記位置における２つの置換またはすべての置換を含み得、前記位置は、配列番号１に示されるような適切な参照配列を基準に定義される。
【００４８】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される９２位に置換を含み得る。置換は、Ｇｌｕ残基、Ａｓｐ残基、Ａｓｎ残基、Ｇｌｎ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＧｌｕ残基がこの位置にあるようにすることができる。
【００４９】
したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるＧＧＰＳ活性を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の、Ｇｌｕ残基、Ａｓｐ残基、Ａｓｎ残基、Ｇｌｎ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＧｌｕ残基での置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号１を基準に定義され、この変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する。
【００５０】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される１００位に置換を含み得る。この置換は、Ｖａｌ残基、Ｇｌｙ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基、Ｉｌｅ残基、Ｌｅｕ残基、好ましくはＶａｌ残基がこの位置にあるようにすることができる。
【００５１】
したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるＧＧＰＳ活性を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、Ｖａｌ残基、Ｇｌｙ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基、Ｉｌｅ残基、Ｌｅｕ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＶａｌ残基での、１００位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号１を基準に定義され、この変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して、１つまたは複数の改変された特性を有する。
【００５２】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される２３５位に置換を含み得る。この置換は、Ａｓｎ残基、Ａｌａ残基、Ｇｌｙ残基、Ｇｌｎ残基、Ｖａｌ残基、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基、好ましくはＡｓｎ残基がこの位置であるようにすることができる。
【００５３】
したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるＧＧＰＳ活性を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、Ａｓｎ残基、Ａｌａ残基、Ｇｌｙ残基、Ｇｌｎ残基、Ｖａｌ残基、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくは、Ａｓｎ残基での、２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号１を基準に定義され、この変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する。
【００５４】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される９２位および１００位に置換を含み得る。この置換は、Ｇｌｕ残基およびＶａｌ残基がそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、この置換は、ＧｌｕとＧｌｙ、またはＧｌｕとＰｈｅ、またはＧｌｕとＴｙｒ、またはＧｌｕとＩｌｅ、またはＧｌｕとＬｅｕがそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、配列番号１を基準に定義される９２位および１００位の置換は、ＡｓｐとＶａｌがそれぞれこれらの位置にあるか、またはＡｓｐとＧｌｙ、またはＡｓｐとＰｈｅ、またはＡｓｐとＴｙｒ、またはＡｓｐとＩｌｅ、またはＡｓｐとＬｅｕ、またはＡｓｎとＶａｌ、またはＡｓｎとＧｌｙ、またはＡｓｎとＰｈｅ、またはＡｓｎとＴｙｒ、またはＡｓｎとＩｌｅ、またはＡｓｎとＬｅｕ、またはＧｌｎとＶａｌ、またはＧｌｎとＧｌｙ、またはＧｌｎとＰｈｅ、またはＧｌｎとＴｙｒ、またはＧｌｎとＩｌｅ、またはＧｌｎとＬｅｕがこれらの位置にあるようにすることができる。
【００５５】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される９２位および２３５位に置換を含み得る。この置換は、Ｇｌｕ残基およびＡｓｎ残基がそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、この置換は、ＧｌｕとＡｌａ、またはＧｌｕとＧｌｙ、またはＧｌｕとＧｌｎ、またはＧｌｕとＶａｌ、またはＧｌｕとＡｓｐ、またはＧｌｕとＧｌｕ、またはＧｌｕとＰｈｅ、またはＧｌｕとＴｙｒがそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、配列番号１を基準に定義される９２位および２３５位の置換は、ＡｓｐとＡｓｎ、またはＡｓｐとＡｌａ、またはＡｓｐとＧｌｙ、またはＡｓｐとＧｌｎ、またはＡｓｐとＶａｌ、またはＡｓｐとＡｓｐ、またはＡｓｐとＧｌｕ、またはＡｓｐとＰｈｅ、またはＡｓｐとＴｙｒ、またはＡｓｎとＡｓｎ、またはＡｓｎとＡｌａ、またはＡｓｎとＧｌｙ、またはＡｓｎとＧｌｎ、またはＡｓｎとＶａｌ、またはＡｓｎとＡｓｐ、またはＡｓｎとＧｌｕ、またはＡｓｎとＰｈｅ、またはＡｓｎとＴｙｒ、またはＧｌｎとＡｓｎ、またはＧｌｎとＡｌａ、またはＧｌｎとＧｌｙ、またはＧｌｎとＧｌｎ、またはＧｌｎとＶａｌ、またはＧｌｎとＡｓｐ、またはＧｌｎとＧｌｕ、またはＧｌｎとＰｈｅ、またはＧｌｎとＴｙｒがこれらの位置にあるようにすることができる。
【００５６】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される１００位および２３５位に置換を含み得る。この置換は、Ｖａｌ残基およびＡｓｎ残基がそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、この置換は、ＶａｌとＡｌａ、またはＶａｌとＧｌｙ、またはＶａｌとＧｌｎ、またはＶａｌとＶａｌ、またはＶａｌとＡｓｐ、またはＶａｌとＧｌｕ、またはＶａｌとＰｈｅ、またはＶａｌとＴｙｒがそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、この置換は、ＧｌｙとＡｓｎ、またはＧｌｙとＡｌａ、またはＧｌｙとＧｌｙ、またはＧｌｙとＧｌｎ、またはＧｌｙとＶａｌ、またはＧｌｙとＡｓｐ、またはＧｌｙとＧｌｕ、またはＧｌｙとＰｈｅ、またはＧｌｙとＴｙｒがそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。他の実施形態では、配列番号１を基準に定義される１００位および２３５位における置換は、ＰｈｅとＡｓｎ、またはＰｈｅとＡｌａ、またはＰｈｅとＧｌｙ、またはＰｈｅとＧｌｎ、またはＰｈｅとＶａｌ、またはＰｈｅとＡｓｐ、またはＰｈｅとＧｌｕ、またはＰｈｅとＰｈｅ、またはＰｈｅとＴｙｒ、またはＴｙｒとＡｓｎ、またはＴｙｒとＡｌａ、またはＴｙｒとＧｌｙ、またはＴｙｒとＧｌｎ、またはＴｙｒとＶａｌ、またはＴｙｒとＡｓｐ、またはＴｙｒとＧｌｕ、またはＴｙｒとＰｈｅ、またはＴｙｒとＴｙｒ、またはＩｌｅとＡｓｎ、またはＩｌｅとＡｌａ、またはＩｌｅとＧｌｙ、またはＩｌｅとＧｌｎ、またはＩｌｅとＶａｌ、またはＩｌｅとＡｓｐ、またはＩｌｅとＧｌｕ、またはＩｌｅとＰｈｅ、またはＩｌｅとＴｙｒ、またはＬｅｕとＡｓｎ、またはＬｅｕとＡｌａ、またはＬｅｕとＧｌｙ、またはＬｅｕとＧｌｎ、またはＬｅｕとＶａｌ、またはＬｅｕとＡｓｐ、またはＬｅｕとＧｌｕ、またはＬｅｕとＰｈｅ、またはＬｅｕとＴｙｒがこれらの位置にあるようにすることができる。
【００５７】
変異体ＧＧＰＳは、配列番号１を基準に定義される９２位、１００位、および２３５位に置換を含み得る。この置換は、Ｇｌｕ残基、Ｖａｌ残基、およびＡｓｎ残基がそれぞれこれらの位置にあるようにすることができる。本開示の実施形態によると、配列番号１を基準に定義される９２位、１００位、および２３５位における、本開示によるポリペプチド変異体それぞれに見ることができる置換の組み合わせは、以下に示される通りである：
それぞれ、２３５位におけるＮ、Ａ；Ｇ、Ｑ；Ｖ；Ｄ、Ｅ；Ｆ；もしくはＹのうちの１つ１つとそれぞれ組み合わせられた、９２Ｅ＋１００Ｖ、もしくは９２Ｅ＋１００Ｇ、もしくは９２Ｅ＋１００Ｆ、もしくは９２Ｅ＋１００Ｙ、もしくは９２Ｅ＋１００Ｉ、もしくは９２Ｅ＋１００Ｌ、もしくは９２Ｄ＋１００Ｖ、もしくは９２Ｄ＋１００Ｇ、もしくは９２Ｄ＋１００Ｆ、もしくは９２Ｄ＋１００Ｙ、もしくは９２Ｄ＋１００Ｉ、もしくは９２Ｄ＋１００Ｌ、もしくは９２Ｎ＋１００Ｖ、もしくは９２Ｎ＋１００Ｇ、もしくは９２Ｎ＋１００Ｆ、もしくは９２Ｎ＋１００Ｙ、もしくは９２Ｎ＋１００Ｉ、もしくは９２Ｎ＋１００Ｌ、もしくは９２Ｑ＋１００Ｖ、もしくは９２Ｑ＋１００Ｇ、もしくは９２Ｑ＋１００Ｆ、もしくは９２Ｑ＋１００Ｙ、もしくは９２Ｑ＋１００Ｉ、もしくは９２Ｑ＋１００Ｌのうちの１つ１つ；または
それぞれ、１００位におけるＶ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ｌの１つ１つとそれぞれ組み合わせられた、９２Ｅ＋２３５Ｎ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ａ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｇ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｑ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｖ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｄ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｅ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｆ、もしくは９２Ｅ＋２３５Ｙ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｎ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ａ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｇ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｑ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｖ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｄ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｅ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｆ、もしくは９２Ｄ＋２３５Ｙ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｎ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ａ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｇ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｑ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｖ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｄ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｅ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｆ、もしくは９２Ｎ＋２３５Ｙ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｎ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ａ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｇ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｑ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｖ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｄ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｅ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｆ、もしくは９２Ｑ＋２３５Ｙの１つ１つ；または
それぞれ、９２位におけるＥ、Ｄ、Ｎ、もしくはＱの１つ１つとそれぞれ組み合わせられた、１００Ｖ＋２３５Ｎ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ａ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｇ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｑ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｖ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｄ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｅ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｆ、もしくは１００Ｖ＋２３５Ｙ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｎ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ａ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｇ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｑ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｖ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｄ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｅ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｆ、もしくは１００Ｇ＋２３５Ｙ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｎ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ａ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｇ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｑ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｖ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｄ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｅ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｆ、もしくは１００Ｆ＋２３５Ｙ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｎ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ａ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｇ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｑ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｖ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｄ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｅ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｆ、もしくは１００Ｙ＋２３５Ｙ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｎ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ａ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｇ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｑ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｖ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｄ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｅ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｆ、もしくは１００Ｉ＋２３５Ｙ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｎ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ａ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｇ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｑ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｖ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｄ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｅ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｆ、もしくは１００Ｌ＋２３５Ｙの１つ１つ。
【００５８】
本開示のＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、その配列の８９位、９７位、または２２５位のうちの１つまたは複数に置換を有する、配列番号１７に示されるポリペプチドの変異体であり得る。したがって、本開示の変異体は以下を含み得る：８９位および９７位の置換；８９位および２２５位の置換；９７位および２２５位の置換；または８９位、９７位、２２５位の置換。好ましい置換は、８９位のＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ、好ましくはＧｌｕ、９７位のＶａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕ、好ましくはＶａｌ、および２２５位のＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ、好ましくはＡｓｎのうちの１つまたは複数である。
【００５９】
本開示の変異体ポリペプチドは、上で定義された３つの位置以外のさらなる置換、例えば、１つまたは複数のさらなる置換、付加、または欠失を含み得る。
【００６０】
本開示の変異体は、この種の異なる種類の改変の組み合わせを含み得る。変異体は、１つ、２つ、３つ、４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、またはそれ以上のそのような改変（すべて同じ種類の改変であってもよいし、または異なる種類の改変であってもよい）を含み得る。典型的には、さらなる改変は置換であり得る。
【００６１】
そのようなさらなる改変は、上で言及されたヒンジ領域および／またはαヘリックス領域で起こり得る。
【００６２】
本開示の変異体ポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、または１８〜３３に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００６３】
本開示の宿主細胞は、本開示の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異体をコードする核酸を含み得る。そのような変異体は同じでも異なっていてもよい。宿主細胞は、配列番号１のＧＧＰＳをコードする核酸、および本開示の１つまたは複数の変異体をコードする核酸を含み得る。すなわち、宿主細胞は、配列番号１のＧＧＰＳをコードする核酸、および本開示の１つまたは複数の変異体をコードする核酸を含み得、これらはそれぞれ、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のコピーに存在し得る。
【００６４】
変異体ポリペプチドは、典型的には、参照ポリペプチドと比較して改変されたＧＧＰＳ活性を有するであろう。典型的には、改変された活性は、組換え宿主におけるステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生に関して定義することができる。
【００６５】
改変された活性は、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号１７の参照ポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、変異体ＧＧＰＳが宿主細胞において過剰発現される場合のステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生の増加に関して定義することができる。
【００６６】
改変された活性は、２つのステビオール配糖体の産生比の変化に関して定義することができ、参照ポリペプチド、例えば、配列番号１または配列番号１７の参照ポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、変異体ＧＧＰＳが宿主細胞において過剰発現される場合、例えばレバウジオシドＡ：レバウジオシドＭの比率が増加し得る、あるいはレバウジオシドＭ：レバウジオシドＡの比率が増加し得る。
【００６７】
変異体ＧＧＰＳは、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、またはそれ以上の産生レベルを増加させ得る可能性がある。産生レベルは、ｇ／Ｌまたはｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）で表すことができるため、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生レベルの増加は、ｇ／Ｌまたはｍｏｌ／Ｌでの高い生産レベルによってはっきりと分かるであろう。
【００６８】
「ポリペプチド」という語は、本明細書では、約７個を超えるアミノ酸残基を含む鎖に対して使用される。本明細書のすべてのポリペプチド配列は、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に書かれる。本明細書で使用されるアミノ酸の一文字コードは当技術分野で一般的に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に見ることができる。
【００６９】
本明細書に開示されるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、実質的に単離された形態などの単離された形態であり得る。「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質のことである。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製された組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されたと見なされる。本開示によるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法によって組換え細胞の培養物から回収および精製することができる。
【００７０】
本開示のＧＧＰＳ変異体ポリペプチドは、化学合成手順の生成物、ならびに、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む原核宿主または真核宿主からの組換え技術によって産生される産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に応じて、本開示のポリペプチドは、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本開示のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基も含み得る。
【００７１】
本開示はまた、本開示によるＧＧＰＳポリペプチド変異体の生物学的に活性な断片を特徴とする。そのような断片は、「本開示によるＧＧＰＳ変異体」という用語に包含されると見なされる。
【００７２】
ＧＧＰＳポリペプチド変異体の生物学的に活性な断片は、完全長タンパク質より少ないアミノ酸を含むが対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示す、本明細書に開示される変異体タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはこのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な断片は、本明細書に開示される変異体タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本開示によるＧＧＰＳ変異体の生物学的に活性な断片は、例えば、１０、２５、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製することができ、かつ本開示によるポリペプチドの天然の形態の１つまたは複数の生物学的活性について評価することができる。
【００７３】
典型的には、本明細書に開示されるＧＧＰＳ変異体のタンパク質断片は、本明細書で定義される１つまたは複数の置換を含むであろう。
【００７４】
本開示はまた、上記の生物学的に活性な断片をコードする核酸断片を特徴とする（これらの生物学的に活性な断片はそれ自体が本開示の変異体である）。
【００７５】
本開示は、本明細書に開示されるＧＧＰＳ変異体ポリペプチド（およびその生物学的に活性な断片）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、本明細書中に開示されるＧＧＰＳポリペプチド変異体の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。典型的には、そのようなドメインは、本明細書に記載されている１つまたは複数の置換を含むであろう。
【００７６】
本明細書に開示される核酸分子は、本明細書に提供される配列情報と組み合わせて使用される、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて作製することができる。例えば、標準的な合成技術を用いて、必要とされる核酸分子を、ＰＣＲによって作製するか、または新規に合成することができる。そのような合成プロセスは、典型的には自動化プロセスであろう。
【００７７】
本明細書に開示される核酸は、参照ＧＧＰＳをコードする核酸と比較して、１つまたは複数の欠失、すなわちギャップを含み得る。そのような欠失／ギャップは、適切なオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発法を用いて生成することもできる。そのような欠失を生じさせるための技術は当業者に周知である。
【００７８】
さらに、本開示によるヌクレオチド配列に対応するか、またはそれとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて調製することができる。
【００７９】
また、相補的な核酸およびアンチセンス核酸も本開示に含まれる。別のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列にハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができるように他のヌクレオチド配列に十分に相補的な核酸分子である。
【００８０】
本開示の一態様は、本発明の変異体ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片もしくはドメインをコードする単離された核酸分子、ならびに本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子、および本開示の核酸分子の調製などのための、核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用に適した、そのような核酸分子の断片に関する。
【００８１】
「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接しているコード配列（５’末端のコード配列および３’末端のコード配列）の両方と直接隣接していないＤＮＡまたはＲＮＡである。したがって、一実施形態では、単離された核酸は、コード配列に直接隣接している５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部またはすべてを含む。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス、あるいは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているか、または他の配列とは独立に別の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。この用語はまた、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地（組換えＤＮＡ技術によって作製された場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成された場合）を実質的に含まない追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として天然に存在しない、かつ天然の状態でも見出されないであろう核酸断片である。
【００８２】
本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば、変更された塩基対形成能力または高いヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製することができる。
【００８３】
本開示はまた、本開示による変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびそれに機能的に連結された、宿主細胞中でこのポリヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列を含む核酸構築物にも関する。核酸構築物は、変異体ポリペプチドの発現を達成するために、発現ベクターなどのベクターおよび／または宿主細胞に組み込むことができる。
【００８４】
「核酸構築物」という用語は、本明細書では、天然に存在する遺伝子から単離された、またはより典型的には、天然には存在しないように組み合わせられて並置された核酸のセグメントを含むように改変された、一本鎖または二本鎖の核酸分子と呼ばれる。用語、核酸構築物は、コード配列の発現に必要な制御配列のすべてを含む場合、用語「発現カセット」と同義であり、前記制御配列は、前記コード配列に機能的に連結されている。
【００８５】
本明細書で使用される「機能的に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素（またはコード配列または核酸配列）の連結を指す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「機能的に連結されて」いる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている。
【００８６】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および当業者に公知の任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に識別される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生制御下で活性であるプロモーターである。
【００８７】
変異体ＧＧＰＳポリペプチドなどの酵素、または本明細書に開示される組換え宿主細胞に導入される任意の他の酵素のような酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列に固有ではない、すなわち、それが機能的に連結されているヌクレオチド配列（コード配列）に対して異種であるプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、宿主細胞に対して相同、すなわち内因性である。
【００８８】
この文脈における適切なプロモーターには、構成的および誘導性の天然プロモーターならびに遺伝子的に操作されたプロモーターの両方が含まれ、それらは当業者に周知である。宿主細胞における適切なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、およびＡＯＸ１であり得る。他の適切なプロモーターには、ＰＤＣ、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、およびＴＤＨが含まれる。
【００８９】
通常は、酵素をコードするヌクレオチド配列はターミネーターを含む。宿主細胞において機能的であるいずれのターミネーターも、本開示で使用することができる。好ましいターミネーターは、宿主細胞の天然遺伝子から得られる。適切なターミネーター配列は、当技術分野で周知である。好ましくは、そのようなターミネーターは、本明細書に開示される宿主細胞におけるナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ）を防止する変異と組み合わせられる（例えば、Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２を参照）。
【００９０】
本開示はさらに、本開示によるポリヌクレオチドまたは本開示による核酸構築物を含む（すなわち、本明細書に開示される変異体ＧＧＰＳポリペプチドをコードする配列を含む）ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【００９１】
ＧＧＰＳの発現および／または翻訳を容易にするために、ＧＧＰＳをコードする核酸配列を、ＧＧＰＳをコードする遺伝子がインビトロでの発現および／または翻訳のための適切な制御配列に機能的に連結されるように発現ベクターに、または本明細書に開示される宿主細胞に含めることができる。発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に便利に供することができ、かつＧＧＰＳ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される細胞とベクターとの適合性によって決まる。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであり得る。ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは独立している染色体外の実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。真菌起源の宿主細胞での使用を意図している場合、適切なエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μもしくはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）、またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）に基づいてもよい。
【００９２】
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製される発現ベクターであり得る。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体中に無作為にまたは所定の標的遺伝子座に組み込まれ得る。本開示の好ましい実施形態では、組込みクローニングベクターは、クローニングベクターの宿主細胞のゲノム中の所定の遺伝子座への組込みを標的とするための、この所定の標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ断片を含む。標的組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方の末端、好ましくは両方の末端が標的遺伝子座に相同な配列に隣接するように行われる。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも０．１ｋｂ、少なくとも０．２ｋｂ、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、またはそれ以上である。宿主細胞のゲノムへの標的組込み、すなわち所定の標的遺伝子座への組込みの効率は、宿主細胞の増強された相同組換え能力によって高められる。
【００９３】
標的遺伝子座と相同であるクローニングベクター中の相同フランキングＤＮＡ配列は、高度に発現された遺伝子座から得ることができる、すなわちそれらは、宿主細胞中で高い発現レベルが可能である遺伝子から得られることを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、本明細書では、例えば誘導条件下で、そのｍＲＮＡが全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成することができる遺伝子、あるいは、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成することができる、または分泌遺伝子産物の場合には、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌され得る遺伝子として定義される。より典型的には、標的遺伝子座は、遺伝子間位置であり得るため、遺伝子は中断されない。そのような遺伝子座はまた、高い発現レベルを提供し得る。したがって、クローニングベクター中の相同フランキングＤＮＡ配列は、遺伝子間標的遺伝子座と相同であり得る。
【００９４】
核酸構築物または発現ベクターは、本明細書に開示される宿主細胞中で、インビボで構築され、任意選択により、単一工程で細胞のゲノムに組み込むことができる（例えば、国際公開第２０１３／０７６２８０号パンフレットを参照）。
【００９５】
本明細書に開示される核酸構築物または発現ベクターの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入して、核酸構築物内に含まれる核酸配列によってコードされるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドの産生（過剰発現）を増加させることができる。これは、好ましくは、そのゲノムに２コピー以上の核酸を組み込むことによって、より好ましくは、上で定義したように定義された遺伝子座への核酸の組込みを標的化することによって行うことができる。
【００９６】
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを当業者は理解されよう。本開示の発現ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば、配列番号１のＧＧＰＳ変異体、例えば機能的等価物または断片、または１つ以上のそのような変異体を含む融合タンパク質）を産生させることができる。
【００９７】
本明細書に開示される核酸構築物およびベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるＧＧＰＳ変異体ポリペプチドの発現用に設計することができる。
【００９８】
本明細書に開示される核酸構築物および／または発現ベクターを、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当業者に周知の宿主細胞に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための当技術分野で承認されている様々な技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、および他の実験マニュアルに見ることができる。
【００９９】
「機能的等価物」および「機能的変異体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本開示による機能的等価物は、本明細書で定義されるＧＧＰＳ変異体の特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離された核酸断片である。したがって、機能的等価物は、生物学的に活性な断片も包含し、そして、それら自体が本開示の用語「ＧＧＰＳ変異体」に包含される。
【０１００】
好ましくは、本開示の機能的等価物は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換を含む。しかしながら、機能的等価物は、上記の置換に加えて１つまたは複数の改変を含み得る。
【０１０１】
機能的核酸等価物は、典型的には、サイレント変異、またはコードされたＧＧＰＳ変異体ポリペプチドの生物学的機能を変更しない変異を含み得る。したがって、本開示は、特定の生物学的活性、すなわちＧＧＰＳ活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む変異体ＧＧＰＳタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【０１０２】
ＧＧＰＳ変異体タンパク質のそのような機能的等価物は、それらが由来する親ＧＧＰＳ変異体配列とはアミノ酸配列が異なるが、その少なくとも１つの生物学的活性をなお保持する、好ましくは、少なくともＧＧＰＳ活性を保持する。当業者は、本開示によるヌクレオチド配列に変異によって変化を導入し、それにより、そのようなタンパク質の機能を実質的に変更することなく、得られるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることを理解されよう。
【０１０３】
一実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、親ＧＧＰＳ変異体または参照アミノ酸配列（例えば、配列番号１または配列番号１７に示される）に対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
したがって、本開示によるＧＧＰＳ変異体の機能的等価物は、好ましくは、親ＧＧＰＳ変異体アミノ酸配列または参照ポリペプチド配列（例えば、配列番号１または配列番号１７に示され、典型的には、親ＧＧＰＳポリペプチドの少なくとも１つの機能的活性も保持する）に対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、９８％、約９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１０５】
ＧＧＰＳ活性を有する本開示の変異体ポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５、または配列番号１８〜３３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１０６】
本開示の変異体ポリペプチドは、表２に定義される配列または表２に定義される置換パターン（位置に関しては、正確でなくても同じアミノ酸置換である）を有し得る。
【０１０７】
本明細書に開示される変異体ＧＧＰＳポリペプチドは、例えば、適切な参照ポリペプチドの変異体、例えば置換変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。候補変異体は、宿主細胞で発現された場合、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生を（参照ポリペプチドを発現する対応する宿主細胞と比較して）増加させるそれらの能力に基づいてスクリーニングすることができる。
【０１０８】
本明細書に開示される核酸の断片は、機能的なポリペプチドをコードしない配列を含み得るか、またはそれからなり得る。そのような核酸は、ＰＣＲ反応用のプローブまたはプライマーとして機能し得る。
【０１０９】
機能的なポリペプチドをコードするかまたは非機能的なポリペプチドをコードするかにかかわらず、本開示による核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用することができる。ＧＧＰＳ活性を有するポリペプチドをコードしない本開示の核酸分子の使用は、とりわけ、（１）Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されている、ＧＧＰＳコード遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中期染色体スプレッドへのインサイチューハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；（２）特定の組織および／または細胞におけるＧＧＰＳ  ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析；および（３）所与の生物学的（例えば、組織）試料中のプローブまたはプライマーにハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用することができるそのようなプローブおよびプライマー、を含む。
【０１１０】
所与の参照ＧＧＰＳ酵素の変異体は、以下の標準的手順によって得ることができる：
−変異誘発（エラーを起こしやすい、ドープされたオリゴ、スパイクされたオリゴ）または変異体の合成
−例えばＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における形質転換
−形質転換体の培養、形質転換体の選択
−例えばＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現
−例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産に基づく一次スクリーニング
−（例えば、変更された補因子特異性に関して）改善された変異体の同定。
【０１１１】
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＧＰＳポリペプチド変異体を作製する方法に関し、この方法は、以下を含む：
（ａ）参照ＧＧＰＳポリペプチド（すなわち鋳型または出発ポリペプチド）を選択する工程；
（ｂ）９２位、１００位、または２３５位
のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が配列番号１を基準に定義される、工程；
（ｃ）任意選択による、（ｂ）で定義される１つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程；
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）から得られる変異体を調製する工程；
（ｅ）例えば実施例に記載されているように、変異体の特性を決定する工程；および
（ｆ）参照ＧＧＰＳポリペプチドと比較して変更された特性を有する変異体を選択する工程。
【０１１２】
本明細書に開示されるＧＧＰＳポリペプチド変異体を作製する方法における好ましい実施形態では、参照ＧＧＰＳポリペプチドは配列番号１に示される配列を有する。
【０１１３】
より好ましくは、本開示による方法の工程（ｂ）において、９２位、１００位、または２３５位のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、前記位置が配列番号１を基準に定義される。参照ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも約８０％の相同性を有し得る。
【０１１４】
別の実施形態では、本開示は、本開示の核酸、核酸構築物、またはベクターを含む宿主細胞、例えば形質転換宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。本開示による「宿主細胞」または「組換え細胞」は、典型的には、組換えＤＮＡ技術によって本開示による核酸、すなわち本開示のＧＧＰＳをコードする核酸が導入された細胞（または祖先にこの核酸が導入された細胞）である。本開示の文脈において、本開示による「宿主細胞」または前記宿主細胞の親は、あらゆる種類の宿主細胞であり得る。
【０１１５】
したがって、本明細書中に開示される宿主細胞は、本開示の１つまたは複数の変異体ポリペプチドをコードする組換え核酸を含み得る。
【０１１６】
宿主細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。したがって、原核細胞および真核細胞の両方、例えば細菌、真菌、酵母などが含まれ、特に好ましいのは、酵母由来の細胞、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）である。宿主細胞には、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および脈絡叢細胞株などの哺乳動物細胞株も含まれる。
【０１１７】
したがって、本開示は、ＧＧＰＳを産生させるための方法を提供し、この方法は、ＧＧＰＳの産生に適した条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、ＧＧＰＳを回収する工程を含む。典型的には、宿主細胞は、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる。
【０１１８】
本開示による組換え宿主は、本明細書に記載される任意のポリペプチドを含み得る。典型的には、本開示による組換え宿主は、ステビオール配糖体を産生することができる。典型的には、前記組換え宿主は、ステビオール配糖体などのグリコシル化ジテルペンを産生することができる。例えば、本開示による組換え宿主は、例えば、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−１９−ジシド（ｄｉｓｉｄｅ）、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭのうちの１つまたは複数を産生することが可能であり得る。
【０１１９】
本開示による組換え宿主は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）活性を有する１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る。
【０１２０】
本開示の目的のために、ＵＧＴ活性を有するポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４）活性を有するポリペプチドであり、すなわち活性化ヌクレオチド糖（「グリコシルドナー」としても知られる）から通常はアルコールであるグリコシル受容体分子への単糖単位の転移のための触媒として作用し得る。ＵＧＴのためのグリコシルドナーは、典型的には、ヌクレオチド糖ウリジン二リン酸グルコース（ウラシル二リン酸グルコース、ＵＤＰグルコース）である。
【０１２１】
そのような追加のＵＧＴは、所望のステビオール配糖体を生成するように選択することができる。ステビオール配糖体形成の概略図は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）６１：４７−６２、およびＭｏｈａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６８（２０１１）１１３６−１１４１に示されている。さらに、図１は、ステビオール配糖体形成の概略図を示す。
【０１２２】
したがって、本開示による組換え宿主は、以下のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る：
（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ２活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチド。
【０１２３】
本開示での使用に適した組換え酵母は、ステビオールへのＣ−１３−グルコースの付加を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオールがステビオールモノシドに変換される反応を触媒することができるＵＧＴを含み得る。
【０１２４】
本開示の方法での使用に適したそのような組換え酵母は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ＵＧＴ８５Ｃ２によって示される活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオールをステビオールモノシドに変換する能力をその酵母に付与する。
【０１２５】
ＵＧＴ８５Ｃ２活性は、ステビオールの１３−ＯＨへのグルコース単位の転移である。したがって、適切なＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−０−グルコシド１３−ＯＨトランスフェラーゼとして機能し得る。機能的ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドはまた、ステビオールおよびステビオール−１９−Ｏ−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書でＵＧＴ１配列と呼ばれることがある。
【０１２６】
本開示での使用に適した組換え酵母は、ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２７】
ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドは、グルコース部分を受容体分子ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させる、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼ（ステビオール−１３−モノグルコシド１，２−グルコシラーゼとも呼ばれる）として機能するポリペプチドである。典型的には、適切なＵＧＴ２ポリペプチドはまた、グルコース部分を受容体分子ルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させるウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとしても機能する。
【０１２８】
ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドはまた、ステビオール−１３−０−グルコシドおよびルブソシド以外のステビオール配糖体基質を利用する反応を触媒することもでき、例えば、機能的ＵＧＴ２ポリペプチドは、基質としてステビオシドを利用して、グルコース部分を１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’に転移させてレバウジオシドＥを生成し得る。機能的ＵＧＴ２ポリペプチドはまた、基質としてレバウジオシドＡを利用して、グルコース部分を１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’に転移させてレバウジオシドＤを生成し得る。しかしながら、機能的ＵＧＴ２ポリペプチドは、典型的にはＣ−１３位に１，３−結合グルコースを有するステビオール化合物にグルコース部分を転移しない、すなわちステビオール１，３−ビオシドおよび１，３−ステビオシドへのグルコース部分の転移が典型的には起きない。
【０１２９】
ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドはまた、ウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから糖部分を転移し得る。例えば、ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホＤ−キシロシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼとして作用し、キシロース部分を受容体分子ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させる。別の例として、ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホ−Ｌ−ラムノシル：ステビオール−１３−０−グルコシドトランスフェラーゼとして作用することができ、ラムノース部分を受容体分子ステビオールの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させる。
【０１３０】
本開示による方法での使用に適した組換え酵母は、Ｃ−１９−グルコースのステビオールビオシドへの付加を触媒することができるＵＧＴ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え酵母は、ステビオールビオシドがステビオシドに変換される反応を触媒することができるＵＧＴを含み得る。したがって、そのような組換え酵母は、ステビオールビオシドをステビオシドに変換することが可能であり得る。そのようなヌクレオチド配列の発現は、少なくともステビオシドを産生する能力を組換え酵母に付与し得る。
【０１３１】
したがって、本開示による方法で使用するのに適した組換え酵母は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ＵＧＴ７４Ｇ１によって示される活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオールビオシドをステビオシドに変換する能力を細胞に付与する。
【０１３２】
適切なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、グルコース単位をステビオールの１３−ＯＨまたは１９−ＣＯＯＨに転移させることが可能であり得る。適切なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能し得る。機能的ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドはまた、ステビオールおよびステビオール−１３−Ｏ−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するか、またはウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから糖部分を転移させるグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書ではＵＧＴ３配列と呼ばれることがある。
【０１３３】
本開示による方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオシドのＣ−１３位でグルコースのＣ−３’のグルコシル化を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示による方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオシドがレバウジオシドＡに変換される反応を触媒することができるＵＧＴを含み得る。したがって、そのような組換え酵母は、ステビオシドをレバウジオシドＡに変換することが可能であり得る。そのようなヌクレオチド配列の発現は、少なくともレバウジオシドＡを産生する能力を酵母に付与し得る。
【０１３４】
したがって、本発明の方法での使用に適した組換え酵母はまた、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ＵＧＴ７６Ｇ１によって示される活性をするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオシドをレバウジオシドＡに変換する能力をその酵母に付与する。
【０１３５】
適切なＵＧＴ７６Ｇ１は、受容体分子ステビオール１，２グリコシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’にグルコース部分を付加する。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、例えば、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−０−１，２グルコシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−０−グルコース、１３−０−１，２ビオシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する。機能的ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドはまた、グルコース以外の糖を含むステビオール配糖体基質、例えばステビオールラムノシドおよびステビオールキシロシドを利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書ではＵＧＴ４配列と呼ばれることがある。あるいは、またはさらに、ＵＧＴ４は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能であり得る。
【０１３６】
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、典型的には、ＵＧＴ１活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、ＵＧＴ２活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、ＵＧＴ３活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、およびＵＧＴ４活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。これらの核酸配列のうちの１つまたは複数は組換え体であり得る。所与の核酸は、上記の活性のうちの１つまたは複数を有するポリペプチドをコードし得る。例えば、核酸は、上記の活性のうちの２つ、３つ、または４つを有するポリペプチドをコードし得る。好ましくは、本開示の方法に使用するための組換え酵母は、ＵＧＴ１、ＵＧＴ２、およびＵＧＴ３、およびＵＧＴ４活性を含む。適切なＵＧＴ１、ＵＧＴ２、ＵＧＴ３、およびＵＧＴ４の配列は、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの表１に示されている。
【０１３７】
本開示の組換え宿主は、いずれか１つのＵＧＴ活性、例えばＵＧＴ１、２、３、または４活性を有するポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。本開示の組換え宿主が、任意の１つのＵＧＴ活性を有するポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含む場合、それらの核酸配列は、同じであっても異なっていてもよく、かつ／または同じポリペプチドをコードしてもよいし、もしくは異なるポリペプチドをコードしてもよい。特に、本開示の組換え宿主は、２つの異なるＵＧＴ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。
【０１３８】
本開示による組換え宿主は、以下のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含み得る：
ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド；および
カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【０１３９】
本開示の目的のために、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ（ＥＣ５．５．１．１３）を有するポリペプチドは、以下の化学反応を触媒することができる：
【化１】
2019532655.tif 000004
【０１４０】
この酵素は、１つの基質、ゲラニルゲラニルピロリン酸、および１つの生成物、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸を有する。この酵素は、ジベレリン生合成に関与している。この酵素は、イソメラーゼのファミリー、特に分子内リアーゼのクラスに属する。この酵素クラスの系統名は、ｅｎｔ−コパリル−二リン酸リアーゼ（非環化）である。一般に使用されている他の名称は、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼＡ、およびｅｎｔ−カウレンシンテターゼＡを有することを含む。
【０１４１】
ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号１、３、５、７、１７、１９、５９、６１、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５９、１６０、１８２、または１８４に示される配列を含み得る。
【０１４２】
本開示の目的のために、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性（ＥＣ４．２．３．１９）を有するポリペプチドは、化学反応を触媒することができるポリペプチドである：
【化２】
2019532655.tif 000005
【０１４３】
したがって、この酵素は、１つの基質、ｅｎｔ−コパリル二リン酸、ならびに２つの生成物、ｅｎｔ−カウレンおよび二リン酸塩を有する。
【０１４４】
この酵素は、リアーゼのファミリー、特にリン酸に作用する炭素−酸素リアーゼのファミリーに属する。この酵素クラスの系統名は、ｅｎｔ−コパリル二リン酸二リン酸リアーゼ（環化、ｅｎｔ−カウレン形成）である。一般に使用されている他の名称には、ｅｎｔ−カウレンシンターゼＢ、ｅｎｔ−カウレンシンテターゼＢ、ｅｎｔ−コパリル二リン酸二リン酸リアーゼ、および（環化）が含まれる。この酵素は、ジテルペノイド生合成に関与している。
【０１４５】
ｅｎｔ−カウレンシンターゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、６３、６５、１４３、１４４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１８３、または１８４に示される配列を含み得る。
【０１４６】
ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼはまた、同じタンパク質分子に関連した異なるｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有し得る。ｅｎｔ−カウレンシンターゼによって触媒される反応は、ジベレリンへの生合成経路における次の過程である。２つのタイプの酵素活性は異なっており、タンパク質のｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を抑制するための部位特異的変異誘発は、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸の蓄積をもたらす。
【０１４７】
したがって、本開示の組換え宿主細胞で使用される単一ヌクレオチド配列は、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性およびｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし得る。あるいは、２つの活性は、２つの異なる別個のヌクレオチド配列をコードし得る。
【０１４８】
本開示の目的のために、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．１４．１３．７８）を有するポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレンの４−メチル基の３回の連続的酸化を触媒して、カウレン酸を得ることができるポリペプチドである。そのような活性は、典型的にはチトクロームＰ４５０の存在を必要とする。
【０１４９】
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号２１、２３、２５、６７、８５、１４５、１６１、１６２、１６３、１８０、または１８６に示される配列を含み得る。
【０１５０】
本開示の目的のために、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性（ＥＣ１．１４．１３）を有するポリペプチドは、ＮＡＤＰＨおよびＯ２を用いたステビオール（ｅｎｔ−カウル−１６−エン−１３−オール−１９−酸）の生成を触媒することができるポリペプチドである。そのような活性はまた、ｅｎｔ−ｋａ  １３−ヒドロキシラーゼ活性とも呼ばれることがある。
【０１５１】
カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号２７、２９、３１、３３、６９、８９、９１、９３、９５、９７、１４６、１６４、１６５、１６６、１６７、または１８５に示される配列を含み得る。
【０１５２】
本開示の組換え宿主は、ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え宿主は、ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することが可能であり得る。本開示の目的のために、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０レダクターゼ活性（ＥＣ１．６．２．４；ＮＡＤＰＨ：フェリヘムタンパク質オキシドレダクターゼ（ｆｅｒｒｉｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ＮＡＤＰＨ：ヘムタンパク質オキシドレダクターゼ（ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を有するポリペプチド、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、ＰＯＲ、ＣＰＲ、ＣＹＰＯＲとしても知られる）は、典型的には、ＦＡＤおよびＦＭＮ含有酵素ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＰＯＲ；ＥＣ１．６．２．４）から真核細胞のミクロソーム中のチトクロームＰ４５０への電子移動を可能にする膜結合酵素であるポリペプチドである。
【０１５３】
本開示の組換え宿主細胞では、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を産生する宿主細胞の能力を、（本開示の１つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の使用以外によって）上方制御することができる。本開示の文脈では、上方制御されるとは、組換え宿主細胞が同等の非組換え宿主細胞よりも多くのＧＧＰＰを産生することを意味する。
【０１５４】
したがって、本開示の組換え宿主は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むことができ、それにより、このヌクレオチド配列が、微生物の形質転換時に高レベルのＧＧＰＰを産生する能力を微生物に付与する。したがって、本開示による組換え宿主は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（本開示のＧＧＰＳとは異なる）のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る。
【０１５５】
したがって、本開示の組換え宿主は、以下のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を含み得る：
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチド；
ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ活性を有するポリペプチド：
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
【０１５６】
本明細書で定義される宿主または宿主細胞は、遺伝子操作に適した生物であり、かつ標的産物の工業生産に有用な細胞密度で培養することができるものである。適切な宿主は、微生物、例えば発酵装置内に維持され得る微生物であり得る。宿主細胞は、天然に見られる宿主細胞、または遺伝子操作もしくは古典的な変異誘発後の親宿主細胞に由来する宿主細胞であり得る。
【０１５７】
本明細書で使用される組換え宿主は、本明細書で定義される変異体ＧＧＳをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列で遺伝子改変された、または形質転換／トランスフェクトされた組換え宿主である。１つまたは複数のそのようなヌクレオチド配列の存在は、ステビオールまたはステビオール配糖体、特に１つまたは複数のステビオール配糖体を産生する微生物の能力を変更する。非組換え宿主、すなわち、形質転換／トランスフェクトまたは遺伝子改変されていない宿主は、典型的には、細胞がステビオール配糖体を産生することを可能にする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含まない。したがって、非組換え宿主は、典型的にはステビオール配糖体を天然に産生しない宿主であるが、ステビオールまたはステビオール配糖体を天然に産生し、かつ本開示に従って改変されている（したがってジテルペン配糖体を産生するように改変された能力を有する）宿主は、本開示による組換え宿主と見なされる。
【０１５８】
特に、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ、およびカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ、ＵＧＴ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（本開示のＧＧＰＳとは異なる）、およびＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼからなる群から選択される酵素が宿主に固有であること、ならびにこれらの酵素をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列による形質転換が、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生する能力を宿主細胞に付与するために必ずしも存在しなくてもよいことが可能であり得る。本開示による宿主は、ＧＧＰＰを天然に（すなわち、その非組換え形態で）産生することができる組換え宿主であり得る。
【０１５９】
宿主微生物によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生のさらなる改善は、古典的な菌株の改良によって達成することができる。
【０１６０】
宿主細胞は、原核生物、古細菌、または真核生物の宿主細胞であり得る。
【０１６１】
原核宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌宿主細胞であり得る。真核宿主細胞は、限定されるものではないが、酵母、真菌、アメーバ、藻類、動物、昆虫の宿主細胞であり得る。
【０１６２】
真核宿主細胞は、真菌宿主細胞であり得る。「真菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の亜門のすべての種を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。したがって、真菌という用語は、とりわけ、糸状菌および酵母を含む。
【０１６３】
「糸状菌」は、本明細書では、（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、前出により定義される）真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の亜門のすべての糸状形態を含む真核微生物として定義される。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖類からなる菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は絶対好気性である。糸状菌株には、限定されるものではないが、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポーテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロシェテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア（Ｒａｓｍｓｏｎｉａ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株が含まれる。宿主細胞として役割を果たすことができる好ましい糸状菌の菌株は、種アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ラサムソニア・エマーソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（以前はタラロミセス・エマーソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）として知られていた）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌａ）に属��る。形質転換細胞および非形質転換細胞の発酵特性を比較するための参照宿主細胞には、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ１２０．４９、ＣＢＳ５１３．８８、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ１６８６８、ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８〜１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＡＦ２９３（ＣＢＳ１０１３５５）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５、ＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１、ＡＴＣＣ５６７６５、ＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ラクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６、およびこれらすべての菌株の誘導株が含まれる。糸状菌宿主細胞として特に好ましいのは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８およびその誘導株である。
【０１６４】
真核宿主細胞は、酵母細胞であり得る。好ましい酵母宿主細胞は、属：サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．バヤナス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｓ．パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ））、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．レヴカウフィ（Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ））、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）（例えば、Ｉ．オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）と分類されていた））、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）から選択することができる。
【０１６５】
原核宿主細胞は、細菌宿主細胞であり得る。細菌宿主細胞は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌であり得る。細菌の例としては、限定されるものではないが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンティス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュラン（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ））、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、キサントバクタ―（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、菌株ＤＨ１ＯＢ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５−α、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２、およびｃｃｄＡ−ｏｖｅｒ（例えば、米国特許出願第０９／５１８，１８８号明細書）））、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ））、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ティフィリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ））に属する細菌が挙げられる。細菌にはまた、限定されるものではないが、光合成細菌（例えば、緑色非硫黄細菌（例えば、クロロフレクサス（Ｃｈｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）細菌（例えば、Ｃ．オーランティアカス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ））、クロロネマ（Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ）（例えば、Ｃ．ギガテウム（Ｃ．ｇｉｇａｔｅｕｍ）））、緑色硫黄細菌（例えば、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）細菌（例えば、Ｃ．リミコーラ（Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａ））、ペロディクション（Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ）（例えば、Ｐ．ルテオルム（Ｐ．ｌｕｔｅｏｌｕｍ））、紅色硫黄細菌（例えば、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）（例えば、Ｃ．オケニイ（Ｃ．ｏｋｅｎｉｉ）））、および紅色非硫黄細菌（例えば、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）（例えば、Ｒ．ルブルム（Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ））、光合成細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｒ．カプスラタス（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ））、およびロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）細菌（例えば、Ｒ．バネリイ（Ｒ．ｖａｎｅｌｌｉｉ））が含まれる。
【０１６６】
宿主細胞は、非微生物由来の宿主細胞であり得る。そのような細胞の例としては、限定されるものではないが、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）（例えば、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）、およびトリコプルサ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ）（例えば、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞）；鳥細胞；両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）細胞）；爬虫類細胞；および哺乳動物細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ細胞、Ｐｅｒ−Ｃ６細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、およびＨｅＬａ細胞）が挙げられる。
【０１６７】
本開示は、以下の工程を含む、本開示のポリペプチドを産生させるための方法をさらに提供する：
（ａ）宿主細胞によるポリペプチドの産生を促進する条件下で本開示の組換え宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、
（ｂ）ポリペプチドを回収する工程。
【０１６８】
本開示による組換え宿主は、当技術分野で公知の任意の適切な炭素源上で増殖することができ、そしてそれをステビオール配糖体、例えばステビオール配糖体に変換することができる。組換え宿主は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、スクロース、グルコース、ラクトース、またはグリセロールを直接変換可能であり得る。したがって、好ましい宿主は、セルロースのグルコースモノマーへの変換、およびヘミセルロースのキシロースおよびアラビノースモノマーへの変換に必要なセルラーゼ（エンドセルラーゼおよびエキソセルラーゼ）およびヘミセルラーゼ（例えば、エンド−およびエキソ−キシラナーゼ、アラビナーゼ）、ならびにペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に変換することができるペクチナーゼ、またはデンプンをグルコースモノマーに変換することができるアミラーゼなどの酵素を発現する。好ましくは、宿主は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、ラクトース、およびグリセロールからなる群から選択される炭素源を変換することができる。宿主細胞は、例えば、国際公開第０３／０６２４３０号パンフレット、同第０６／００９４３４号パンフレット、欧州特許第１４９９７０８Ｂ１号明細書、国際公開第２００６０９６１３０号パンフレット、または同第０４／０９９３８１号パンフレットに記載されているような真核宿主細胞であり得る。
【０１６９】
したがって、さらなる態様では、本開示は、ステビオール配糖体を調製するためのプロセスも提供し、このプロセスは、適切な発酵培地中で少なくとも１つのステビオール配糖体を産生することができる本開示の組換え宿主を発酵させる工程、および任意選択による、ステビオール配糖体を回収する工程を含む。
【０１７０】
ステビオール配糖体は、例えば、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、ｒｅｂＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭであり得る。
【０１７１】
ステビオール配糖体の産生のためのプロセスで使用される発酵培地は、特定の宿主細胞の増殖を可能にする任意の適切な発酵培地であり得る。発酵培地の必須要素は、当業者に公知であり、選択された宿主細胞に適合させることができる。
【０１７２】
好ましくは、発酵培地は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、グルコース、スクロース、ラクトース、脂肪酸、トリグリセリド、およびグリセロールからなる群から選択される炭素源を含む。好ましくは、発酵培地はまた、尿素などの窒素源、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、もしくはリン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩も含む。
【０１７３】
本開示による発酵プロセスは、バッチ式、流加式、または連続式で行うことができる。別個の加水分解および発酵（ＳＨＦ）プロセスまたは同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスもまた適用することができる。これらの発酵プロセス方式の組み合わせもまた、最適な生産性のために可能であり得る。ＳＳＦプロセスは、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、またはペクチンが発酵プロセスにおいて炭素源として使用される場合、特に魅力的であり得、このプロセスでは、基質を加水分解するためにセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはペクチナーゼなどの加水分解酵素を添加することが必要であり得る。
【０１７４】
ステビオール配糖体の調製のためのプロセスで使用される組換え宿主は、本明細書で上記定義された任意の適切な組換え宿主であり得る。ほとんどの真核細胞は、増殖のために無菌条件を必要とせず、かつバクテリオファージ感染に対して非感受性であるため、本開示による組換え真核宿主をこのプロセスで使用することは有利であり得る。さらに、真核宿主細胞は、細菌汚染を防止するために低ｐＨで増殖させることができる。
【０１７５】
本開示による組換え宿主は、通性嫌気性微生物であり得る。通性嫌気性組換え宿主は、好気的に高い細胞濃度まで増殖させることができる。次いで、この嫌気性相は、高い細胞密度で実施することができ、このことが、実質的に必要とされる発酵量を減少させ、そして好気性微生物による汚染のリスクを最小限にすることができる。
【０１７６】
本開示によるステビオール配糖体の産生のための発酵プロセスは、好気性発酵プロセスでも嫌気性発酵プロセスでもよい。
【０１７７】
嫌気性発酵プロセスは、本明細書では、酸素の非存在下、または実質的に酸素が消費されずに、好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、または１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満の消費で行われ、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスとして定義することができる。本開示による発酵プロセスはまた、最初に好気的条件下で、続いて嫌気的条件下で行うこともできる。
【０１７８】
発酵プロセスはまた、酸素制限、または微好気的条件下で行うこともできる。あるいは、発酵プロセスは、最初に好気的条件下で行い、続いて酸素制限条件下で行うことができる。酸素制限発酵プロセスは、酸素の気体から液体への移動によって酸素の消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入ガス流の量および組成、ならびに使用される発酵装置の実際の混合／物質移動特性によって決定される。
【０１７９】
本開示によるプロセスでのステビオール配糖体の産生は、宿主細胞の増殖期の間、定常（定常状態）期の間、または両期の間に起こり得る。発酵工程を異なる温度で行うことが可能であり得る。
【０１８０】
ステビオール配糖体の産生のためのプロセスは、組換え宿主にとって最適な温度で行うことができる。最適増殖温度は、各形質転換組換え宿主ごとに異なり得、そして当業者に公知である。最小の感染感受性および最低の冷却費用の下で、非無菌条件下で生物を効率的に成長させるための最適温度は、野生型生物にとって最適温度よりも高い可能性がある。あるいは、このプロセスは、組換え宿主の増殖には最適ではない温度で行うことができる。
【０１８１】
本開示によるステビオール配糖体の産生のためのプロセスは、任意の適切なｐＨ値で行うことができる。組換え宿主が酵母である場合、発酵培地中のｐＨは、好ましくは６未満、好ましくは５．５未満、好ましくは５未満、好ましくは４．５未満、好ましくは４未満、好ましくはｐＨ３．５未満、またはｐＨ３．０未満、またはｐＨ２．５未満、好ましくはｐＨ２超の値を有する。これらの低いｐＨ値で発酵を行うことの利点は、発酵培地中の汚染細菌の増殖を防止できることである。
【０１８２】
このようなプロセスは、工業的規模で行うことができる。そのようなプロセスの産物は、例えば、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭの１つまたは複数などの、１つまたは複数のステビオール配糖体である。
【０１８３】
発酵培地からのステビオール配糖体の回収は、当技術分野で公知の方法、例えば蒸留、真空抽出、溶媒抽出、または蒸発によって行うことができる。
【０１８４】
本開示によるステビオール配糖体の産生のためのプロセスでは、５ｍｇ／ｌ超の発酵ブロス、好ましくは１０ｍｇ／ｌ超、好ましくは２０ｍｇ／ｌ超、好ましくは３０ｍｇ／ｌ超の発酵ブロス、好ましくは４０ｍｇ／ｌ超、より好ましくは５０ｍｇ／ｌ超、好ましくは６０ｍｇ／ｌ超、好ましくは７０超、好ましくは８０ｍｇ／ｌ超、好ましくは１００ｍｇ／ｌ超、好ましくは１ｇ／ｌ超、好ましくは５ｇ／ｌ超、好ましくは１０ｇ／ｌ超の濃度を達成することが可能であり得るが、通常は７０ｇ／ｌ未満である。
【０１８５】
本開示は、ステビオール配糖体の調製のための本開示のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロスをさらに提供する。
【０１８６】
１つまたは複数のステビオール配糖体が微生物内で発現される事象では、そのような細胞は、それらを放出するように処理する必要があり得る。優先的には、少なくとも１つのステビオール配糖体、例えばｒｅｂＡ、ｒｅｂＤ、またはｒｅｂＭが細胞外で産生される。
【０１８７】
本開示によるブロスは、本開示のポリペプチドの代わりに参照ポリペプチドが発現される組換え宿主から産生されるブロスと比較して多い、少なくとも１つのステビオール配糖体、例えばｒｅｂＡ、ｒｅｂＤ、またはｒｅｂＭを含み得る。
【０１８８】
ブロスは、総ブロスとして、すなわち本開示の宿主細胞を含むとして定義してもよいし、または本開示の宿主細胞から一旦分離された液相、例えば上清に関して定義してもよい。
【０１８９】
本開示によるブロスは、参照ポリペプチドが本開示のポリペプチドの代わりに発現される組換え宿主から産生されるブロスと比較して少ない、少なくとも１つの非ステビオール配糖体、例えば、１つまたは複数のカウレン酸配糖体を含み得る。
【０１９０】
本開示はまた、ステビオール配糖体の調製のための本開示によるプロセスによって得られるか、または本開示の発酵ブロスから得ることができるステビオール配糖体を提供する。そのようなステビオール配糖体は、天然に存在しないステビオール配糖体、すなわち植物中で産生されないステビオール配糖体であり得る。
【０１９１】
また、ステビオール配糖体の調製のための本開示のプロセスによって得ることができるか、または本開示の発酵ブロスから得ることができる２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物も提供される。そのような組成物では、ステビオール配糖体のうちの１つまたは複数は、天然に存在しないステビオール配糖体、すなわち植物中で産生されないステビオール配糖体であり得る。
【０１９２】
さらに、本開示は、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：
−前記第１のステビオール配糖体を本開示の組換え宿主、そのような組換え宿主から得られる無細胞抽出物、またはそれらのいずれか由来の酵素調製物と接触させる工程；
−それにより、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換する工程。
【０１９３】
そのような方法では、第２のステビオール配糖体は、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭであり得る。
【０１９４】
そのような方法では、第１のステビオール配糖体は、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、ルブソシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、または１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステルであり、第２のグリコシル化ジテルペンは、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＤであり得る。
【０１９５】
すなわち、本開示は、生物変換または生体内変換の方法に関する。
【０１９６】
本開示による発酵プロセスによって産生されるステビオール配糖体または組成物は、そのような化合物に公知の任意の用途で使用することができる。特に、それらのステビオール配糖体または組成物は、例えば食品または飲料に甘味料として使用することができる。したがって、本開示にしたがって、本開示のステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料が提供される。
【０１９７】
例えば、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ソフトドリンク、卓上甘味料、チューインガム、ヨーグルトなどの乳製品（例えば、プレーンヨーグルト）、ケーキ、シリアルもしくはシリアルベースの食品、栄養補助食品、医薬品、食用ゲル、菓子製品、化粧品、練り歯磨き、または他の口腔用組成物などに配合することができる。さらに、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食品、および人間の消費専用の他の製品のためだけではなく、改善された特性を有する動物の飼料および餌のための甘味料として使用することができる。
【０１９８】
したがって、本開示は、とりわけ、本開示のプロセスにしたがって調製されたステビオール配糖体を含む食品、飼料、または飲料を提供する。
【０１９９】
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造中に、混合、混練、溶解、酸洗い、浸透、浸出、散水、噴霧、注入、および他の方法などの従来の方法を使用することができる。
【０２００】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、乾燥形態または液体形態で使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、食品の加熱処理の前後に添加することができる。甘味料の量は、使用目的によって異なる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて添加することができる。
【０２０１】
本開示の方法にしたがって製造される化合物は、１つまたは複数のさらなるノンカロリー甘味料またはカロリー甘味料と混合することができる。そのような混合は、風味または時間的プロファイルまたは安定性を改善するために使用することができる。広範囲のノンカロリー甘味料およびカロリー甘味料の両方が、ステビオール配糖体または本開示の組成物と混合するのに適し得る。例えば、モグロシド、モナチン、アスパルテーム、アセスルファム塩、シクラメート、スクラロース、サッカリン塩、またはエリトリトールなどのノンカロリー甘味料。ステビオール配糖体または本開示の組成物と混合するのに適したカロリー甘味料には、糖アルコールおよび炭水化物、例えばスクロース、グルコース、フルクトース、およびＨＦＣＳが含まれる。グリシン、アラニン、またはセリンなどの甘味アミノ酸も使用することができる。
【０２０２】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、天然甘味抑制剤などの甘味抑制剤と組み合わせて使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、アミノ酸またはその塩などの旨味増強剤と組み合わせてもよい。
【０２０３】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ポリオールまたは糖アルコール、炭水化物、生理活性物質、または機能性成分（例えば、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化剤、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、植物ステロールまたはスタノール（フィトステロールおよびフィトスタノール）、ポリオール、プレバイオティック、プロバイオティック、フィトエストロゲン、大豆タンパク質、硫化物／チオール、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ミネラル、および／または心血管、コレステロール低下、もしくは抗炎症などの健康上の利点に基づいて分類される物質と組み合わせることができる。
【０２０４】
ステビオール配糖体を含む組成物または本開示の組成物は、香味剤、芳香成分、ヌクレオチド、有機酸、有機酸塩、無機酸、苦味化合物、タンパク質もしくはタンパク質加水分解物、界面活性剤、フラボノイド、収斂性化合物、ビタミン、食物繊維、抗酸化剤、脂肪酸、および／または塩を含み得る。
【０２０５】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ゼロカロリー、低カロリー、または糖尿病用飲料、および改善された味覚特性を有する食品を製造するための高強度甘味料として適用することができる。また、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食品、医薬品、および砂糖が使用できないその他の製品にも使用できる。
【０２０６】
さらに、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食料、および人間の消費専用の他の製品のためだけではなく、改善された特性を有する動物の飼料および餌のための甘味料としても使用することができる。
【０２０７】
ステビオール配糖体または本開示の組成物を甘味化合物として使用できる製品の例は、ウォッカ、ワイン、ビール、酒、日本酒などのアルコール飲料；天然ジュース、清涼飲料、炭酸ソフトドリンク、ダイエット飲料、ゼロカロリー飲料、低カロリー飲料および食品、ヨーグルト飲料、即席ジュース、インスタントコーヒー、インスタント飲料の粉末タイプ、缶詰製品、シロップ、発酵大豆ペースト、醤油、酢、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、インスタントブイヨン、粉末醤油、粉末酢、ビスケット類、煎餅、クラッカー、パン、チョコレート、キャラメル、キャンディ、チューインガム、ゼリー、プリン、保存加工された果物および野菜、生クリーム、ジャム、マーマレード、フラワーペースト、粉ミルク、アイスクリーム、シャーベット、野菜や果物の瓶詰め、缶詰されたゆで豆、肉および食品の甘煮、野菜農産物、シーフード、ハム、ソーセージ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉ペースト、魚のフライ、乾燥シーフード、冷凍食品、保存加工された海藻、保存加工された肉、タバコ、医薬品、ならびにその他多くの製品であり得る。原則として、ステビオール配糖体または本開示の組成物は無制限の用途を有し得る。
【０２０８】
甘味組成物は、飲料を含み、飲料の非限定的な例としては、非炭酸飲料および炭酸飲料、例えば、コーラ、ジンジャーエール、ルートビア、サイダー、フルーツ風味のソフトドリンク（例えば、レモンライムまたはオレンジのようなシトラス風味のソフトドリンク）、および粉末ソフトドリンクなど；果物または野菜から生産されたフルーツジュース、絞り汁などを含むフルーツジュース、果物の粒子を含むフルーツジュース、フルーツ飲料、フルーツジュース飲料、フルーツジュースを含む飲料、フルーツフレーバーの飲料、野菜ジュース、野菜を含むジュース、および果物や野菜を含むミックスジュース；スポーツ飲料、エネルギー飲料、ニアウォーター、および同様の飲料（例えば、天然または合成風味剤を含む水）；茶または好みのタイプの飲料、例えば、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、およびウーロン茶など；乳成分含有飲料、例えば、ミルク飲料、乳成分含有コーヒー、カフェオレ、ミルクティー、フルーツミルク飲料、飲料ヨーグルト、または乳酸菌飲料など；ならびに乳製品が挙げられる。
【０２０９】
一般に、甘味組成物中に存在する甘味料の量は、甘味組成物の特定の種類およびその所望の甘味に応じて大幅に異なる。当業者は、甘味組成物に入れるための適切な甘味料の量を容易に見きわめることができる。
【０２１０】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、乾燥形態または液体形態で使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、食品の加熱処理の前後に添加することができる。甘味料の量は、使用目的によって異なる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて添加することができる。
【０２１１】
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造中に、混合、混練、溶解、酸洗い、浸透、浸出、散水、噴霧、注入、および他の方法などの従来の方法を使用することができる。
【０２１２】
したがって、本開示の組成物は、成分の均一で一様なまたは均一な混合物を提供する、当業者に公知の任意の方法によって生産することができる。これらの方法としては、乾式混合、噴霧乾燥、凝集、湿式造粒、圧縮、および共結晶化などが挙げられる。
【０２１３】
固体形態では、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、小袋、パケット、大きなバッグまたは箱、立方体、錠剤、ミスト、または溶解可能なストリップを含む、甘味を付けるべき食料品への送達に適した任意の形態で消費者に提供することができる。本組成物は、単位用量としてまたはバルク形態で送達することができる。
【０２１４】
液体甘味料系ならびに液体、半流動体、ペースト、およびクリームの形態の好都合の範囲の組成物のために、上記の甘味料製品のいずれかを含む任意の組み合わせまたは上記生産された製品の組み合わせを携行する、またはディスペンスする、または保存する、または輸送するのに便利な、任意の形状または形態の適切な包装材料を使用する適切な包装が発明されるものとする。
【０２１５】
本組成物は、種々の増量剤、機能性成分、着色剤、香料を含み得る。
【０２１６】
「配列相同性」または「配列同一性」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本開示の目的のために、本明細書では、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の配列相同性または配列同一性のパーセンテージを決定するために、最適な比較目的でこれらの配列が整列されると定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップを導入することができる。そのようなアラインメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。あるいは、アラインメントは、より短い長さにわたって、例えば約２０、約５０、約１００、またはそれ以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって行ってもよい。配列同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列間の完全な一致のパーセンテージである。
【０２１７】
２つの配列間の配列の比較および配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。当業者は、２つの配列を整列させ、そして２つの配列間の同一性を決定するための何種類かのコンピュータープログラムが利用可能であるという事実を承知しているであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間のパーセント配列同一性は、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方をアルゴリズムによって整列させることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本開示の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（ｖｅｒｓｉｏｎ２．８．０  ｏｒ  ｈｉｇｈｅｒ，ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２を置換マトリックスに使用する。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬを使用する。使用される任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティーおよび０．５のギャップ伸長ペナルティーである。当業者は、すべてのこれらの異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用するときに２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性が有意に変化しないことを理解するであろう。
【０２１８】
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、クエリー配列と本開示の配列との間の配列同一性のパーセンテージは、以下のように計算される：両方の配列において同一のアミノ酸または同一のヌクレオチドを示すアライメントにおける対応する位置の数を、アラインメントのギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除す。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力に「最長同一性」としてラベル付けされる。
【０２１９】
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公共のデータベースに対して検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップ挿入アライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／にある国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。
【０２２０】
［本開示による実施形態：］
１．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドの変異体のような、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドであって、配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、９２位、１００位、または２３５位のいずれかのアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの改変、好ましくは少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号１を基準に定義され、この変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する、変異体ポリペプチド。
【０２２１】
２．改変された特性が、改変されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性である、実施形態１に記載の変異体ポリペプチド。
【０２２２】
３．参照ポリペプチドが、配列番号１または配列番号１７のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、実施形態１または２に記載の変異体ポリペプチド。
【０２２３】
４．配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の、Ｇｌｕ残基、Ａｓｐ残基、Ａｓｎ残基、Ｇｌｎ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＧｌｕ残基での置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置が配列番号１を基準に定義され、該変異体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチド。
【０２２４】
５．配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、１００位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の、Ｖａｌ残基、Ｇｌｙ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基、Ｉｌｅ残基、Ｌｅｕ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＶａｌ残基での置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置が配列番号１を基準に定義され、該変異体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチド。
【０２２５】
６．配列番号１に示される配列を含むゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼと整列された場合に、２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の、Ａｓｎ残基、Ａｌａ残基、Ｇｌｙ残基、Ｇｌｎ残基、Ｖａｌ残基、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基、Ｐｈｅ残基、Ｔｙｒ残基から選択されるアミノ酸残基、好ましくはＡｓｎ残基での置換を含むアミノ酸配列を含み、前記位置が配列番号１を基準に定義され、該変異体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチド。
【０２２６】
７．天然に存在しないポリペプチドである、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチド。
【０２２７】
８．実施形態１で定義された置換以外のさらなる置換を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチド。
【０２２８】
９．配列番号１または配列番号１７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチド。
【０２２９】
１０．配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１８〜３３のいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチド。
【０２３０】
１１．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有する変異体ポリペプチドであって、以下の反応：
−ジメチルアリル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸＝二リン酸塩＋ゲラニル二リン酸；
−ゲラニル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸＝二リン酸塩＋（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸；
−（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸＝二リン酸塩＋ゲラニルゲラニル二リン酸
のうちの１つまたは複数を触媒する、変異体ポリペプチド。
【０２３１】
１２．実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【０２３２】
１３．適切な発現宿主においてゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの発現を誘導することができる１つまたは複数の制御配列に機能的に連結されている、実施形態１２に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【０２３３】
１４．実施形態１２に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態１３に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【０２３４】
１５．実施形態１２に記載のポリヌクレオチド、実施形態１３に記載の核酸構築物、または実施形態１４に記載の発現ベクターを含む組換え宿主。
【０２３５】
１６．ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる、実施形態１５に記載の組換え宿主。
【０２３６】
１７．ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド；および
カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含む、実施形態１５または１６に記載の組換え宿主。
【０２３７】
１８．ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む、実施形態１５〜１７のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２３８】
１９．（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ２活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチド；および
（ｉｖ）ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチド
のうちの１つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、実施形態１５〜１８のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２３９】
２０．宿主がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のうちの１つに属する、実施形態１５〜１９のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２４０】
２１．組換え宿主がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）細胞、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である、実施形態２０に記載の組換え宿主。
【０２４１】
２２．宿主のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を産生する能力が上方制御されている、実施形態１５〜２１のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２４２】
２３．ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチド；
ファルネシル−ピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；または任意選択による、
実施形態１〜７のいずれか１つに記載の変異体ポリペプチドとは異なる、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を含む、実施形態１５〜２２のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２４３】
２４．実施形態１５〜２３のいずれか１つに記載の組換え宿主を適切な発酵培地中で発酵させる工程、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収する工程を含む、ステビオールまたはステビオール配糖体を調製するためのプロセス。
【０２４４】
２５．工業的規模で行われる、ステビオール配糖体の調製のための実施形態２４に記載のプロセス。
【０２４５】
２６．実施形態２４または２５に記載のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロス。
【０２４６】
２７．実施形態２４または２５に記載のプロセスによって得られるか、または実施形態２６に記載の発酵ブロスから得られるステビオール配糖体。
【０２４７】
２８．実施形態２４または２５に記載のプロセスによって得られるか、または実施形態２６に記載の発酵ブロスから得られる２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物。
【０２４８】
２９．実施形態２７に記載のステビオール配糖体または実施形態２８に記載の組成物を含む食品、飼料、または飲料。
【０２４９】
３０．第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法であって：
−前記第１のステビオール配糖体を実施形態１５〜２３のいずれか１つに記載の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物に接触させる工程；
−それにより、該第１のステビオール配糖体を該第２のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法。
【０２５０】
３１．第２のステビオール配糖体が：ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭである、実施形態３０に記載の方法。
【０２５１】
３２．第１のグリコシル化ジテルペンが、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、ルブソシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、または１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステルであり、第２のグリコシル化ジテルペンが、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＤである、実施形態３１に記載の方法。
【０２５２】
３３．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの生産に適した条件下で実施形態１５に記載の宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを回収する工程を含む、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを生産するための方法。
【０２５３】
３４．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のＧＧＰＳポリペプチド変異体を作製するための方法であって：
（ａ）参照ＧＧＰＳポリペプチドを選択する工程；
（ｂ）９２位、１００位、または２３５位のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が、配列番号１を基準に定義される、工程；
（ｃ）任意選択による、（ｂ）で定義されるように１つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程；
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）から得られる変異体を調製する工程；
（ｅ）例えば実施例に記載される変異体の特性を決定する工程；および
（ｆ）参照ＧＧＰＳポリペプチドと比較して変更された特性を有する変異体を選択する工程を含む、方法。
【０２５４】
３５．参照ＧＧＰＳポリペプチドが配列番号１に示される配列を有する、実施形態３４に記載の方法。
【０２５５】
先行技術として与えられる特許文献または他の資料への本明細書での言及は、その文献または資料が既知であること、またはそれらに含まれる情報が任意の特許請求の範囲の優先日現在の一般的な知識の一部であることの承認と見なされるべきではない。
【０２５６】
本明細書に記載の各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５７】
本開示は、以下の実施例によってさらに説明される。
【０２５８】
［実施例］
［概要］
宿主細胞における酵素の過剰発現などの標準的な遺伝学的技術、ならびに宿主細胞のさらなる遺伝子改変は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）に記載されているような当技術分野において公知の方法である。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変の方法は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、同第９９／６０１０２号パンフレット、および同第００／３７６７１号パンフレットから知られている。
【０２５９】
［実施例１：ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ酵素］
ＧＧＳの遺伝子変異体（以下の表２を参照）を合成構築物として注文した。これらを、ＩＩ型制限酵素を使用することによって強力な構成的プロモーター、ＧＧＳ遺伝子、およびターミネーターを含む発現カセットに構築した。同様に、発現カセットをＨＹＧ用に構築した（ハイグロマイシンに対する耐性をコードする）。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における相同組換えを可能にする組込みフランク（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｌａｎｋ）も構築した。これらの組込みフランクは、５’ＩＮＴ３および３’ＩＮＴ３と呼ばれる。異なる部分は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における相同組換えによる構築を可能にする５０ｂｐの相同配列を含む。これらの部分を、２つの５０ｂｐの相同配列も含む線状ｐＲＳ４１７であるデスティネーションベクターと共にＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換した。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で構築されると、発現経路は、３’ＩＮＴ３、ＧＧＳ発現カセット、ＨＹＧ発現カセット、５’ＩＮＴ３からなる。
【０２６０】
【表２】
2019532655.tif 000006
【０２６１】
すべてのＧＧＳ  ＯＲＦは、希少コドンを除去することによってヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現に最適化した。
【０２６２】
発現経路を含むプラスミドをＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離し、この発現経路をＰＣＲ増幅した。精製したＰＣＲ産物をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＭＬ１５１８６に形質転換した。ＭＬ１５１８６もまた、ＨＹＧ発現カセットのみで形質転換した。ＭＬ１５１８６株は、ステビオール配糖体およびカウレン酸（ＫＡ）−配糖体を産生するためのすべての要素を既に有している。この菌株の構築は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５８８８２号明細書（国際公開第２０１６／１７００４５  Ａ１号パンフレットとして公開されている）に記載されている。
【０２６３】
［実施例２：グリコシル化カウレン酸およびステビオール配糖体の生産］
異なるＧＧＳ変異体およびＨＹＧのみ（対照として）で形質転換したＭＬ１５１８６を、ハイグロマイシンを含有するＹＰｈＤプレートに蒔いた。単一コロニー単離物を得て、生産試験を行った：前培養として、グルコースを含む２００μｌのＹＥＰに、ハイグロマイシンを含有するＹＥＰｈ−Ｄ寒天プレートからのコロニー材料を接種した。１つのＧＧＳ変異体につき９個の複製培養物を使用し、ＨＹＧ対照には４６個を使用した。前培養物を、Ｉｎｆｏｒｓインキュベーター内で３０℃、７５０ｒｐｍ、および湿度８０％で４８時間インキュベートした。４０μｌの前培養物を使用して、炭素源としてのグルコースを含む２．５ｍｌのミネラル培地に接種した。これらの生産培養物を、Ｉｎｆｏｒｓインキュベーター内で３０℃、５００ｒｐｍ、湿度８０％で１２０時間インキュベートした。生産培養物を、２７５０×ｇでの１０分間の遠心分離によりペレット化した。遠心分離後、上清を移し、３３％アセトニトリルで希釈し、ステビオール配糖体および関連生成物についてＬＣ／ＭＳを用いて分析した。主な生成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ステビオサイド、ルブソシド、ステビオール−１９−ＭＳ、および（モノ−、ジ−、およびトリ−）グリコシル化カウレン酸であった。各ＧＧＳ設計についての生産レベル（モル基準）の合計を正規化し、表３に列挙した。
【０２６４】
【表３】
2019532655.tif 000007
【０２６５】
本発明者らは、ＧＧＳ変異体０００２〜０００８を発現した形質転換体（配列番号３、５、７、９、１１、１３、および１５）が、対照（ＨＹＧのみおよびＧＧＳ野生型、配列番号１）と比較して著しく高い力価のステビオール配糖体およびＫＡ−配糖体を産生することを見出した。すべてのＧＧＳ変異体（配列番号３、５、７、９、１１、１３、および１５）は、野生型（配列番号１）と比較して著しく良好であり、０．０００５未満の誤発見率であった。
【０２６６】
結論として、本発明者らは、野生型ＧＧＳ（配列番号１）の別のコピーを単に追加しても生産は改善されないが、変異体（配列番号３、５、７、９、１１、１３、および１５）の１つを加えると、ステビオール配糖体およびＫＡ−配糖体の産生が著しく改善されることを見出した。
【図１】
2019532655.tif 000008
【配列表】
2019532655000001.app
【国際調査報告】
2019532655.tif 000009
2019532655.tif 000010
2019532655.tif 000011