(57)【要約】脳脊髄液の漏出を処置するための方法および材料が本明細書中に記載される。脳脊髄液の漏出を処置するための１つの方法は、脳脊髄液の漏出の標的区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することによって脳脊髄液の漏出を閉鎖することを含み、自己集合性ペプチドは７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、自己集合性ペプチド溶液は生理的条件下でヒドロゲルを形成する。本発明は、例えば、脳脊髄液の漏出を閉鎖するための方法であって、脳脊髄液の漏出の標的区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することを含み、該自己集合性ペプチドが７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、該自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより該脳脊髄液の漏出を閉鎖する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳脊髄液の漏出を閉鎖するための方法であって、脳脊髄液の漏出の標的区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することを含み、該自己集合性ペプチドが７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、該自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより該脳脊髄液の漏出を閉鎖する、方法。
【請求項２】
脳脊髄液の漏出を処置するための方法であって、該脳脊髄液の漏出に関連する硬膜の区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することを含み、該自己集合性ペプチドが７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、該自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより該脳脊髄液の漏出を処置する、方法。
【請求項３】
前記標的区域が、脳脊髄液の漏出に関連する硬膜の区域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロゲルが脳脊髄液の漏出を軽減する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロゲルが脳脊髄液の漏出を実質的に予防する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記自己集合性ペプチドが、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れる約１２個から約１６個のアミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記自己集合性ペプチドが、ＲＡＤＡ、ＩＥＩＫ、ＴＴＴＴ、ＡＴＡＴ、ＴＶＴＶ、ＡＳＡＳ、ＳＳＳＳ、ＶＶＶＴＴＴＴ、およびこれらの組合せから選択される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記自己集合性ペプチドが、（ＲＡＤＡ）４、（ＩＥＩＫ）３Ｉ、および（ＫＬＤＬ）３から選択される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記自己集合性ペプチドが、前記溶液の約０．１から約１０ｗ／ｖ％または前記溶液の約０．１から約３．５ｗ／ｖ％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己集合性ペプチドが、前記溶液の約１、約２．５、または約３ｗ／ｖ％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記有効量が、前記脳脊髄液の漏出の部位の１ｃｍ２あたりおよそ０．１ｍＬから１ｃｍ２あたりおよそ５ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効量が、前記脳脊髄液の漏出の部位の１ｃｍ２あたりおよそ１ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドロゲルが、脳脊髄液が漏出している開口部に前記自己集合性ペプチド溶液を投与する前に形成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルが、脳脊髄液が漏出している開口部に前記自己集合性ペプチド溶液を投与した後に形成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液が生物活性剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液が細胞および／または薬物を実質的に含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己集合性ペプチド溶液がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記脳脊髄液の漏出がヒトの脳脊髄液の漏出である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
脳脊髄液の漏出を閉鎖するための有効量の自己集合性ペプチド溶液の使用であって、該自己集合性ペプチドが約７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、該自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより該脳脊髄液の漏出を閉鎖する、使用。
【請求項２０】
脳脊髄液の漏出を処置するための有効量の自己集合性ペプチド溶液の使用であって、該自己集合性ペプチドが約７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、該自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより脳脊髄液の漏出の部位を処置する、使用。
【請求項２１】
前記部位が、脳脊髄液の漏出に関連する硬膜の区域を含む、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ヒドロゲルが脳脊髄液の漏出を軽減する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記ヒドロゲルが脳脊髄液の漏出を実質的に予防する、請求項１９〜２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記自己集合性ペプチドが、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れる約１２個から約１６個のアミノ酸を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記自己集合性ペプチドが、ＲＡＤＡ、ＩＥＩＫ、ＴＴＴＴ、ＡＴＡＴ、ＴＶＴＶ、ＡＳＡＳ、ＳＳＳＳ、ＶＶＶＴＴＴＴ、およびこれらの組合せから選択される配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記自己集合性ペプチドが、（ＲＡＤＡ）４、（ＩＥＩＫ）３Ｉ、および（ＫＬＤＬ）３から選択される配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記自己集合性ペプチドが、前記溶液の約０．１から約１０ｗ／ｖ％または前記溶液の約０．１から約３．５ｗ／ｖ％である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記自己集合性ペプチドが、前記溶液の約１、約２．５、または約３ｗ／ｖ％である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記有効量が、脳脊髄液の漏出の部位の１ｃｍ２あたりおよそ０．１ｍＬから１ｃｍ２あたりおよそ５ｍＬである、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記有効量が、脳脊髄液の漏出の部位の１ｃｍ２あたりおよそ１ｍＬである、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記ヒドロゲルが、脳脊髄液の漏出の部位に前記自己集合性ペプチド溶液を投与する前に形成される、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記ヒドロゲルが、脳脊髄液の漏出の部位に前記自己集合性ペプチド溶液を投与した後に形成される、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記溶液が生物活性剤をさらに含む、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記溶液が細胞および／または薬物を実質的に含まない、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記自己集合性ペプチド溶液がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記脳脊髄液の漏出がヒトの脳脊髄液の漏出である、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、医療、研究、および産業上の用途において使用され得る材料および方法に関する。より具体的には、本開示は、脳脊髄液の漏出の閉鎖のために使用され得る材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳脊髄液の漏出は、硬膜における穴または裂傷により脳脊髄液が漏出できるようになったときに起こる。脳脊髄液の漏出は、脳脊髄および脊柱の手術の間に起こり得る。血液がその液とともに漏出することが多い。脳脊髄液の漏出は、術後の検査の際によく観察される。それは細菌性髄膜炎などの重篤な合併症を引き起こし得る。
【０００３】
脳脊髄液の漏出を処置するための従来の材料としては、延伸ポリテトラフルオルエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）シート、フィブリン糊、およびコラーゲンが挙げられる。しかしながら、脳脊髄液の漏出を処置するための既存の材料は、不十分な効力および／または望ましくない合併症を有し得る。ｅ−ＰＴＦＥシートの使用では、ｅＰＴＦＥシートと硬膜との間の薄い空間から脳脊髄液が漏出し得る。フィブリン糊およびコラーゲンの適用の間に神経は物理的に圧迫され得る。閉鎖のために硬膜外血液パッチが使用され得るが、それは血液注射および痛みを伴う神経炎に起因する術後癒着などの合併症を引き起こし得る。
【０００４】
したがって、脳脊髄液の漏出に対する改善された処置の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ある特定の両親媒性ペプチド溶液が、驚くべきことにかつ有利なことに、脳脊髄液の漏出を処置するために使用できるという発見に少なくとも部分的に基づく。
【０００６】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出を閉鎖するための方法であって、脳脊髄液の漏出の標的区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することを含み、自己集合性ペプチドが７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより脳脊髄液の漏出を閉鎖する、方法を提供する。
【０００７】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出を処置するための方法であって、脳脊髄液の漏出に関連する硬膜の区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することを含み、自己集合性ペプチドが７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより脳脊髄液の漏出を処置する、方法を提供する。
【０００８】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出を閉鎖するための有効量の自己集合性ペプチド溶液の使用であって、自己集合性ペプチドが約７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより脳脊髄液の漏出を閉鎖する、使用を提供する。脳脊髄液の漏出を閉鎖することは、脳脊髄液が漏出している通路に栓をすること、その通路を妨げること、脳脊髄液が漏出している開口部または穴を閉じること、塞ぐこと、囲いをすること、または封鎖することであり得る。
【０００９】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出を処置するための有効量の自己集合性ペプチド溶液の使用であって、自己集合性ペプチドが約７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成し、それにより脳脊髄液の漏出の部位を処置する、使用を提供する。
【００１０】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出を閉鎖するための方法であって、脳脊髄液の漏出に関連する標的区域に送達デバイスを導入すること、閉鎖が所望される標的区域に送達デバイスの端部を配置すること、標的区域の生理的条件下でヒドロゲルを形成して閉鎖を促進するために有効量で、および有効な濃度で約７アミノ酸から３２アミノ酸を含む自己集合性ペプチドを含む溶液を、送達デバイスを通じて標的区域に投与すること、および標的区域から送達デバイスを取り除くことを含む、方法を提供する。
【００１１】
様々な態様では、本発明は、生理的条件下でヒドロゲルを形成して脳脊髄液の漏出の閉鎖を促進するために使用するための、有効量で、および有効な濃度で約７アミノ酸から３２アミノ酸を含む自己集合性ペプチドを含む組成物を提供する。
【００１２】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出の閉鎖を促進するためのキットであって、生理的条件下でヒドロゲルを形成して閉鎖を促進するために有効量で約７アミノ酸から約３２アミノ酸を含む自己集合性ペプチド、および脳脊髄液の漏出に関連する標的区域に自己集合性ペプチドを投与するための指示を含む、キットを提供する。
【００１３】
様々な態様では、本発明は、脳脊髄液の漏出の閉鎖を容易にする方法であって、生理的条件下で脳脊髄液の漏出に関連する標的区域にヒドロゲルを形成して閉鎖を促進するために有効量で、および有効な濃度で約７アミノ酸から約３２アミノ酸を含む自己集合性ペプチドを含む溶液を提供すること、および標的区域に配置された送達デバイスを通じた溶液の導入を通じて標的区域に溶液を投与するための指示を提供することを含む、方法を提供する。
【００１４】
様々な態様では、本発明は、複数の自己集合性ペプチドから本質的になる肉眼的スキャフォールドであって、自己集合性ペプチドのそれぞれが、脳脊髄液の漏出に関連する標的区域内に配置されて閉鎖を促進することができる有効量で約７アミノ酸から約３２アミノ酸を含む、肉眼的スキャフォールドを提供する。
【００１５】
当業者によって理解されるように、上記態様のいずれかを下記の特徴のいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００１６】
様々な実施形態では、標的区域は、脳脊髄液の漏出に関連する硬膜の区域を含む。
【００１７】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳脊髄液の漏出を軽減する。
【００１８】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳脊髄液の漏出を実質的に予防する。
【００１９】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチドは、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れる約１２個から約１６個のアミノ酸を含む。
【００２０】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチドは、ＲＡＤＡ、ＩＥＩＫ、ＴＴＴＴ、ＡＴＡＴ、ＴＶＴＶ、ＡＳＡＳ、ＳＳＳＳ、ＶＶＶＴＴＴＴ、およびこれらの組合せから選択される配列を含む。
【００２１】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチドは、（ＲＡＤＡ）４、（ＩＥＩＫ）３Ｉ、および（ＫＬＤＬ）３から選択される配列を含む。
【００２２】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチドは、溶液の約０．１から約１０ｗ／ｖ％または溶液の約０．１から約３．５ｗ／ｖ％である。
【００２３】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチドは、溶液の約１、約２．５、または約３ｗ／ｖ％である。
【００２４】
様々な実施形態では、有効量は、脳脊髄液の漏出の部位の１ｃｍ２あたりおよそ０．１ｍＬから１ｃｍ２あたりおよそ５ｍＬである。
【００２５】
様々な実施形態では、有効量は、脳脊髄液の漏出の部位の１ｃｍ２あたりおよそ１ｍＬである。
【００２６】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳脊髄液が漏出している開口部に自己集合性ペプチド溶液を投与する前に形成される。
【００２７】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳脊髄液が漏出している開口部に自己集合性ペプチド溶液を投与した後に形成される。
【００２８】
様々な実施形態では、溶液は生物活性剤をさらに含む。
【００２９】
様々な実施形態では、溶液は細胞および／または薬物を実質的に含まない。
【００３０】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチド溶液はｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。
【００３１】
様々な実施形態では、脳脊髄液の漏出はヒトの脳脊髄液の漏出である。
【００３２】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳脊髄液の漏出の部位に自己集合性ペプチド溶液を投与する前に形成される。
【００３３】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳脊髄液の漏出の部位に自己集合性ペプチド溶液を投与した後に形成される。
【００３４】
様々な実施形態では、溶液は水溶液であり、水溶液中のペプチド濃度は約０．１重量／体積（ｗ／ｖ）パーセントから約３ｗ／ｖパーセントである。
【００３５】
様々な実施形態では、方法は、送達デバイスを導入する前、および／または標的区域から送達デバイスを取り除いた後に、標的区域を可視化することをさらに含む。
【００３６】
様々な実施形態では、方法は、送達デバイスを取り除いた後に標的区域をモニタリングすることをさらに含む。
【００３７】
様々な実施形態では、有効量は、標的区域の１ｃｍ２あたりおよそ１ｍＬである。
【００３８】
様々な実施形態では、方法は、自己集合性ペプチドを含む溶液を調製することをさらに含む。
【００３９】
様々な実施形態では、自己集合性ペプチドは、（ＲＡＤＡ）４、（ＩＥＩＫ）３Ｉ、および（ＫＬＤＬ）３からなる群から選択される。
【００４０】
様々な実施形態では、標的部位は、脳脊髄または脊柱の手術部位に関連する。
【００４１】
様々な実施形態では、ヒドロゲルは、脳または脊髄からの脳脊髄液の漏出を閉鎖し、かつ／または脳または脊髄の髄膜の再生を速める。
【００４２】
様々な実施形態では、組成物は、脳脊髄液の漏出の閉鎖を促進するために使用される。
【００４３】
本技術のこれらおよびその他の利点は、以下の記載を参照したときに明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、ある特定の両親媒性ペプチド溶液が、驚くべきことにかつ有利なことに、脳脊髄液の漏出を処置するために使用できるという発見に少なくとも部分的に基づく。
【００４５】
様々な態様および実施形態では、本発明は、脳脊髄液の漏出を処置するための方法および材料を提供する。脳脊髄液の漏出を処置することは、脳脊髄液が漏出している開口部を閉鎖することを含み得る。脳脊髄液が漏出している開口部は、硬膜における穴または裂傷であり得る。一部の実施形態では、脳脊髄液の漏出を処置することは、脳脊髄液の漏出を軽減または実質的に予防することをもたらし得る。
【００４６】
様々な態様および実施形態では、本発明は、脳脊髄液の漏出を閉鎖する（例えば、脳脊髄液が漏出している開口部を遮断する）ための方法および材料を提供する。方法は、脳脊髄液の漏出の標的区域に有効量の自己集合性ペプチド溶液を投与することを含み、自己集合性ペプチドが約７アミノ酸から３２アミノ酸の間の長さであり、自己集合性ペプチド溶液が生理的条件下でヒドロゲルを形成する。一部の実施形態では、脳脊髄液の漏出を閉鎖することは、脳脊髄液の漏出を軽減または実質的に予防することをもたらし得る。脳脊髄液の漏出を閉鎖することは、脳脊髄液が漏出している通路に栓をすること、その通路を妨げること、脳脊髄液が漏出している開口部または穴を閉じること、塞ぐこと、囲いをすること、または封鎖することであり得る。
【００４７】
１つまたは複数の実施形態によれば、自己集合性ペプチドのヒドロゲルは、脳脊髄液の漏出の閉鎖を容易にし得る。止血剤としてのその効力は実証されている。ヒドロゲルは、そのような閉鎖のための既存の医療用デバイスと等しいまたはそれよりも高い脳脊髄液の漏出の閉鎖効力を呈し得る。血液の存在およびｐＨレベルは、因子であり得る。自己集合性ペプチドのヒドロゲルは、脳および／または脊髄からの脳脊髄液の漏出を閉鎖し得る。自己集合性ペプチドのヒドロゲルは、脳および／または脊髄の髄膜の再生を速め得る。
【００４８】
方法および材料は、脳脊髄液の漏出の処置を含み得る。処置は、部分的または完全なものであり得る。材料および方法は、所定のまたは所望の標的区域への自己集合性ペプチド、または自己集合性ペプチドを含む溶液、または自己集合性ペプチドを含む組成物の投与、適用、または注射を含み得る。
【００４９】
自己組織化または自己集合の間に、ペプチドはナノファイバーを形成し得る。自己組織化または自己集合は、溶液中のペプチドのゲル化を引き起こし得る。ゲル化は、ヒドロゲルを提供し得る、またはヒドロゲルを形成させ得る。ペプチドは、生理的ｐＨレベルの下、溶液中で自発的にベータシートを形成し得る。ペプチドは、生理的条件下および／または陽イオンの存在下、溶液中で自発的にベータシートを形成し得る。
【００５０】
本発明の様々な特徴を以下に順次論じる。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「被験体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物、例えば、脊椎動物、大型動物、および霊長目動物を含むことを意図する。ある特定の実施形態では、被験体は哺乳動物被験体であり、特定の実施形態では、被験体はヒト被験体である。ヒトでの用途が明らかに予見されるが、例えば非ヒト動物での獣医学的用途もまた本明細書中で想定される。本発明の「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば非哺乳動物（例えばニワトリといった鳥類、両生類、爬虫類など）、および哺乳動物、例えば非ヒト霊長目動物、飼育動物、および農業に有用な動物（例えば、中でもヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラット）が含まれる。
【００５２】
「自己集合性ペプチド」という用語は、自己集合性モチーフを含むペプチドを指し得る。自己集合性ペプチドは、肉眼的な膜またはナノ構造が挙げられるが、これらに限定されない構造に自己集合できるペプチドである。例えば、自己集合性ペプチドは、ベータシート構造を誘導する特定条件の存在下、水溶液中でベータシート構造を呈し得る。これらの特定条件は、自己集合性ペプチド溶液のｐＨを調整することを含み得る。調整は、自己集合性ペプチド溶液のｐＨの増加または減少であり得る。ｐＨの増加は、生理的ｐＨへのｐＨの増加であり得る。特定条件はまた、一価の陽イオンなどの陽イオンを自己集合性ペプチド溶液に加えることを含み得る。特定条件は、脳または脊髄に関する条件を含み得る。自己集合性ペプチドは、組成物、ペプチド溶液、ペプチド粉末、ヒドロゲル、またはスキャフォールドと称され得る、またはこれらの一部分であり得る。自己集合性ペプチドは、ペプチド溶液、組成物、ヒドロゲル、膜、スキャフォールドの形態で、またはその他の形態で標的区域に投与され得る。
【００５３】
「ヒドロゲル」という用語は、ポリマーおよび高パーセンテージの水（例えば、少なくとも９０％の水）から構成される材料を指し得る。
【００５４】
自己集合性ペプチドは、両親媒性の自己集合性ペプチドであり得る。「両親媒性」とは、ペプチドが疎水性部分および親水性部分を含むことを意味する。一部の実施形態では、両親媒性ペプチドは、交互に現れる疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を含み得る、それらから本質的になり得る、またはそれらからなり得る。交互に現れるとは、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れる、一続きの３つまたはそれよりも多くのアミノ酸を含むことを意味し、ペプチド配列中に含まれるありとあらゆるアミノ酸が疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れるものである必要はない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、両親媒性である第１の部分および両親媒性ではない第２の部分を含み得る。
【００５５】
自己集合性ペプチドは、本明細書中で「ペプチド」または「自己集合性オリゴペプチド」とも称されるが、これは自己集合性ペプチド溶液、組成物、ヒドロゲル、膜、スキャフォールドの形態で、またはその他の形態で、所定のまたは所望の標的区域に投与され得る。ヒドロゲルは、本開示を通じて膜またはスキャフォールドとも称され得る。
【００５６】
所定のまたは所望の標的区域は、脳脊髄の漏出（cerebrospinal  leakage）の位置にあるかまたはその近くにあり得る。所定のまたは所望の標的区域は、外科的手技または非意図的もしくは意図的な外傷の部位、またはこれらを経験したものであり得るその他の区域に基づいて確立され得る。ある特定の実施形態では、所定のまたは所望の標的区域は、脳脊髄液の漏出に関連する硬膜の区域を含み得る。
【００５７】
自己集合性ペプチド溶液は、自己集合性ペプチド水溶液であり得る。自己集合性ペプチドは、実質的に細胞フリーまたは細胞を含まない溶液で投与、適用、または注射され得る。ある特定の実施形態では、自己集合性ペプチドは、細胞フリーまたは細胞を含まない溶液で投与、適用、または注射され得る。
【００５８】
自己集合性ペプチドはまた、実質的に薬物フリーまたは薬物を含まない溶液で投与、適用、または注射され得る。ある特定の実施形態では、自己集合性ペプチドは、薬物フリーまたは薬物を含まない溶液で投与、適用、または注射され得る。ある特定の他の実施形態では、自己集合性ペプチドは、実質的に細胞フリーかつ実質的に薬物フリーの溶液で投与、適用、または注射され得る。またさらなるある特定の他の実施形態では、自己集合性ペプチドは、細胞フリーかつ薬物フリーの溶液で投与、適用、または注射され得る。
【００５９】
自己集合性ペプチド溶液は、自己集合性ペプチドを含み得る、自己集合性ペプチドからなり得る、または自己集合性ペプチドから本質的になり得る。自己集合性ペプチドは、改変または未改変の形態であり得る。改変とは、溶液中に単独で提供されたときに自己集合しない１つまたは複数のアミノ酸を含む１つまたは複数のドメインを自己集合性ペプチドが有し得ることを意味する。未改変とは、ペプチドの自己集合を提供するドメイン以外のいかなるその他のドメインも自己集合性ペプチドが有しなくてよいことを意味する。すなわち、未改変ペプチドは、ベータシート、またはヒドロゲルなどの肉眼的構造に自己集合し得る交互に現れる疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸からなる。
【００６０】
自己集合性ペプチドは、少なくとも約７アミノ酸、約７から３２アミノ酸の間、または約１２から１６アミノ酸の間のものであり得る。少なくとも約７アミノ酸を含まない、少なくとも約７アミノ酸からならない、または少なくとも約７アミノ酸から本質的にならないその他のペプチドが、本開示によって想定され得る。自己集合性ペプチドは、約６から約２００アミノ酸残基から構成され得る。ある特定の実施形態では、約８から約３２残基が自己集合性ペプチドにおいて使用され得るが、他の実施形態では、自己集合性ペプチドは、約７から約１７残基を有し得る。ある特定のその他の例では、自己集合性ペプチドは、少なくとも８アミノ酸、少なくとも約１２アミノ酸、または少なくとも約１６アミノ酸のペプチドであり得る。
【００６１】
材料および方法は、所定のまたは所望の標的に自己集合性ペプチドを投与することを含み得る。ペプチドは、ヒドロゲルとして投与され得るか、または投与されてヒドロゲルを形成し得る。ヒドロゲルは、水中に分散するコロイド状ゲルを指し得る用語である。ヒドロゲルはまた、本開示を通じて膜またはスキャフォールドとも称され得る。システムおよび方法はまた、ペプチド水溶液などの溶液として、所定のまたは所望の標的に自己集合性ペプチドを適用することを含み得る。
【００６２】
「投与する」という用語は、追加の構成成分と共にまたは追加の構成成分を伴わずに、単独の形態、水溶液などの溶液による形態、または組成物、ヒドロゲル、もしくはスキャフォールドによる形態を非限定的に含む様々な形態の１つまたは複数において、自己集合性ペプチドを適用し、導入し、または注射することを非限定的に含むことを意図する。
【００６３】
方法は、被験体の所定のまたは所望の標的区域にまたはその近くに送達デバイスを導入することを含み得る。方法は、注射器、チューブ、ピペット、カテーテル、カテーテル注射器、またはその他の針に基づくデバイスのうちの少なくとも１つを含む送達デバイスを被験体の所定のまたは所望の標的区域に導入することを含み得る。自己集合性ペプチドは、注射器、チューブ、ピペット、カテーテル、カテーテル注射器、またはその他の針に基づくデバイスによって、被験体の所定のまたは所望の標的区域に投与され得る。注射針のゲージは、注射器からの組成物、溶液、ヒドロゲル、または液体の十分な流れを標的区域に提供するように選択され得る。一部の実施形態では、これは、投与されている組成物、ペプチド溶液、またはヒドロゲル中の自己集合性ペプチドの量、ペプチド溶液の、組成物中の、またはヒドロゲル中の濃度、およびペプチド溶液、組成物、またはヒドロゲルの粘度のうちの少なくとも１つに基づき得る。送達デバイスは、従来式のデバイスであり得るか、または、特定の標的区域への到達、特定の投与レジメンの達成、目標の特定の体積、量、または濃度の送達、および標的区域への正確な送達のうちの少なくとも１つを達成するように設計され得る。
【００６４】
脳脊髄液の漏出を閉鎖する方法は、被験体内に送達デバイスを導入すること、および所定のまたは標的区域（脳脊髄液の漏出が起こっている場所にあるまたはその近くにある脳または脊椎（spine）の部分など）に送達デバイスの端部を配置することを含み得る。自己集合性ペプチドは、少なくとも所望される標的区域へと送達デバイスによって投与され得る。送達デバイスの使用は、ペプチドのより選択的な投与を提供して、標的区域へのより正確な送達を提供し得る。ペプチドの選択的な投与は、成功裡の、かつ所望の位置に正確に配置されるような、ペプチド溶液、組成物、またはヒドロゲルの、強化され、かつより標的化された送達を可能とし得る。選択的な投与は、注射器またはその他の送達デバイスの使用に対して、配置、および処置の有効性が著しく改善された、強化および標的化された送達を提供し得る。本開示のシステム、方法、およびキットにおいて使用され得る送達デバイスとしては、注射器、チューブ、針、ピペット、その他の針に基づくデバイス、またはカテーテルを挙げることができる。
【００６５】
送達デバイスの使用は、送達デバイスを所定の場所（position）にガイドするために使用されるガイドワイヤ、あるいは送達デバイスの正しい配置、ならびに標的区域および／または標的区域への経路の可視化を可能とし得る内視鏡などの付属のデバイスの使用を含み得る。内視鏡は、光およびカメラまたは被験体の身体の像を見ることを可能にするその他の可視化デバイスのうちの少なくとも１つを含み得るチューブであり得る。ガイドワイヤまたは内視鏡は、例えば皮膚の切開によって被験体中に導入され得る。内視鏡は、標的区域へ送達デバイスを導入する前に標的区域に導入され得る。
【００６６】
注射器、チューブ、針、ピペット、その他の針に基づくデバイス、または内視鏡などの送達デバイスの使用は、標的区域がある開口部の直径またはサイズの決定を必要とし得るため、注射器、チューブ、針、ピペット、シリンジカテーテル、その他の針型デバイス、カテーテル、または内視鏡の少なくとも一部分は、標的区域にペプチド、ペプチド溶液、組成物、またはヒドロゲルを投与するために開口部へと入り得る。
【００６７】
ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されてｉｎ  ｖｉｖｏの所望の位置に投与され得る。ある特定の例では、この位置は標的区域であり得る。その他の例では、この位置は、区域の上流、下流、または区域の実質的に近くであり得る。ヒドロゲルが所望される区域へのヒドロゲルの移動を可能とすることが所望され得る。あるいは、別の手技は、ヒドロゲルが所望される区域にヒドロゲルを配置し得る。所望の位置または標的区域は、被験体における脳脊髄液の漏出のところまたはその近くにおいて閉鎖の提供または促進が所望される区域の少なくとも一部分であり得る。
【００６８】
本開示のある特定の態様では、ヒドロゲルはｉｎ  ｖｉｖｏで形成され得る。自己集合性ペプチドを含む水溶液などの溶液は、被験体のｉｎ  ｖｉｖｏの位置または区域に挿入されて被験体における脳脊髄液の漏出の閉鎖を促進または提供し得る。ある特定の例では、ヒドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏの１つの位置で形成されて、被験体における脳脊髄液の漏出の閉鎖の促進または提供が所望される区域へ移動を可能とし得る。あるいは、別の手技は、被験体における脳脊髄液の漏出の閉鎖の促進または提供が所望される区域にヒドロゲルを配置し得る。本開示のペプチドは、粉末、溶液、ゲルなどの形態であり得る。自己集合性ペプチドは溶液のｐＨおよび塩濃度の変化に応答してゲル化するので、適用または投与の際の被験体との接触によりゲル化する液体として流通され得る。
【００６９】
ある特定の環境では、ペプチド溶液は、脆いヒドロゲルであり得、その結果として、本明細書中に記載するような送達デバイスによって投与され得る。
【００７０】
一部の実施形態によれば、自己集合性ペプチドは、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れる両親媒性であり得る。
【００７１】
１つまたは複数の実施形態によれば、被験体は、被験体における脳脊髄液の漏出の閉鎖の促進または提供の必要性を決定するために評価され得る。評価が完了したら、被験体に投与するためのペプチド溶液が調製され得る。
【００７２】
一部の実施形態では、生物活性剤が、本開示の材料および方法と共に使用され得る。生物活性剤は、被験体内または実験室環境において何らかの活性、制御、モジュレーション、または状態もしくはその他の活性の調整を付与し得る、ペプチド、ＤＮＡ配列、化学化合物、または無機もしくは有機化合物などの化合物を含み得る。生物活性剤は、そのような活性を提供するために別の構成成分と相互作用し得る。生物活性剤は、本明細書中の一部の実施形態によれば薬物と称され得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の生物活性剤は、ペプチドシステムの外に徐放され得る。例えば、１つまたは複数の生物活性剤は、ヒドロゲルから徐放され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の試験は、生物活性剤のこの徐放を実証している。生物活性剤は、被験体への投与前にペプチド溶液に加えられ得るか、または溶液とは別々に被験体に投与され得る。１つまたは複数の生物活性剤は、システム内に封入され得、例えば、ヒドロゲル、溶液、またはナノファイバー中に封入され得る。
【００７３】
自己集合性ペプチドは、生理的ｐＨおよび／または一価の陽イオンなどの陽イオン、または被験体の脳脊髄領域に適用され得るその他の条件の存在下、水溶液中でベータシート構造を呈し得る。
【００７４】
ペプチドは、水溶液中で一般に安定であり得、生理的条件、生理的ｐＨ、または生理的レベルの塩に曝露されたときに、大きい、肉眼的構造、スキャフォールド、またはマトリックスに自己集合し得る。ヒドロゲルが形成されたら、それは分解し得ないか、またはある期間後に分解もしくは生物分解し得る。分解速度は、アミノ酸配列およびその周囲の条件のうちの少なくとも１つに少なくとも部分的に基づき得る。
【００７５】
「肉眼的」とは、１０倍またはそれ未満の倍率の下で目に見えるほど十分に大きな寸法を有することを意味する。好ましい実施形態では、肉眼的構造は、裸眼で見えるものである。肉眼的構造は、透明であり得、また、二次元または三次元であり得る。通常、各次元は、少なくとも１０μｍの大きさである。ある特定の実施形態では、少なくとも２つの次元は、少なくとも１００μｍ、または少なくとも１０００μｍの大きさである。頻繁には、少なくとも２つの次元は、少なくとも１〜１０ｍｍの大きさ、１０〜１００ｍｍの大きさ、またはそれよりも大きい。ある特定の実施形態では、フィラメントの大きさは、約１０ナノメートル（ｎｍ）から約２０ｎｍであり得る。フィラメント間の距離は約５０ｎｍから約８０ｎｍであり得る。本開示の自己集合性ペプチドは、約５ｎｍの長さを有し得る。本開示の自己集合性ペプチドは、約１０ｎｍから約２０ｎｍの範囲のナノファイバーの直径、および約５ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均孔径を有し得る。ある特定の実施形態では、ナノファイバーの直径、孔径、およびナノファイバーの密度は、使用されるペプチド溶液の濃度、およびペプチド溶液の体積などの使用されるペプチド溶液の量のうちの少なくとも１つによって調節され得る。そのため、閉鎖を十分に提供するための所望のナノファイバーの直径、孔径、および密度のうちの少なくとも１つを提供するために、溶液中のペプチドの特定の濃度およびペプチド溶液の特定の量のうちの少なくとも１つが選択され得る。
【００７６】
「生理的条件」は、特定の生物体、細胞系、または被験体にとって自然に起こり得、それは人工的な実験室条件とは対照的であり得る。条件は、１つもしくは複数の特定の特性または１つもしくは複数の範囲の特性などの１つまたは複数の特性を含み得る。例えば、生理的条件は、温度または温度範囲、ｐＨまたはｐＨ範囲、圧力または圧力範囲、ならびに特定の化合物、塩、および他の構成成分の１つまたは複数の濃度を含み得る。例えば、一部の例では、生理的条件は、約２０から約４０℃の範囲の温度を含み得る。一部の例では、大気圧は約１ａｔｍであり得る。ｐＨは、生理的ｐＨの範囲内であり得る。例えば、ｐＨは約６から約８の範囲内であり得る。生理的条件は、膜またはヒドロゲルの形成を誘発し得る一価の金属陽イオンなどの陽イオンを含み得る。これらは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含み得る。生理的条件は、約１ｍＭから約２０ｍＭの間のグルコース濃度、スクロース濃度、またはその他の糖濃度も含み得る。
【００７７】
ペプチドは、相補的かつ構造適合的（structurally  compatible）でもあり得る。相補的とは、ペプチドの親水性側鎖間に形成されるイオン化対（ionized  pair）および／または水素結合を通じて相互作用する、それらのペプチドの能力を指し、構造適合的とは、相補的ペプチドのペプチド骨格間に一定の距離を維持する、それらの相補的ペプチドの能力を指す。これらの特性を有するペプチドは、二次構造レベルでベータシートならびに三次構造レベルで絡み合ったフィラメントの形成および安定化を生じる分子間相互作用に参加する。
【００７８】
上記の特性によって特徴付けられるペプチドの同種混合物および異種混合物の両方は、安定した肉眼的な膜、フィラメント、およびヒドロゲルを形成し得る。自己相補的および自己適合的なペプチドは、同種混合物において膜、フィラメント、およびヒドロゲルを形成し得る。同種の溶液中で膜、フィラメント、およびヒドロゲルを形成し得ないものなどの、互いに相補的かつ／または構造適合的な異種ペプチドもまた、肉眼的な膜、フィラメント、およびヒドロゲルに自己集合し得る。
【００７９】
膜、フィラメント、およびヒドロゲルは、非細胞毒性であり得る。本開示のヒドロゲルは、被験体において消化および代謝され得る。ヒドロゲルは、３０日またはそれ未満で生物分解され得る。それらは単純な組成を有し、透過性で、大量生産が容易かつ比較的安価である。膜およびフィラメント、ヒドロゲル、またはスキャフォールドはまた、滅菌条件下で生産および貯蔵され得る。膜形成のための最適な長さは、アミノ酸の組成、溶液条件、および標的部位の条件のうちの少なくとも１つに対して様々であり得る。
【００８０】
自己集合性または両親媒性ペプチドのアミノ酸は、ｄ−アミノ酸、ｌ−アミノ酸、またはこれらの組合せから選択され得る。疎水性アミノ酸としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＧｌｙを挙げることができる。親水性アミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ）、酸性アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、または水素結合を形成するアミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）であり得る。酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸は、ペプチド上でクラスター化され得る。末端残基のカルボキシル基およびアミノ基は、保護されていてもよいし、保護されていなくてもよい。膜またはヒドロゲルは、自己相補的かつ自己適合的ペプチドの同種混合物中で、または互いに相補的かつ構造適合的なペプチドの異種混合物中で形成され得る。上記基準を満たすペプチドは、本明細書中に記載する好適な条件下で肉眼的な膜に自己集合し得る。
【００８１】
ペプチドは、ＲＡＤＡ、ＩＥＩＫ、ＴＴＴＴ、ＡＴＡＴ、ＴＶＴＶ、ＡＳＡＳ、ＳＳＳＳ、ＶＶＶＴＴＴＴ、およびこれらの組合せからなる群から選択される配列を含み得る、またはこれから本質的になり得る。その他のペプチド配列が想定され、本開示の範囲内である。ある特定の実施形態では、ペプチドは、アルギニン、アラニン、およびアスパラギン酸の反復配列を含み得る、またはこれから本質的になり得る。
【００８２】
本開示のペプチドは、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、およびアラニン（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ（ＲＡＤＡ））の反復配列を有するペプチドを含み得、そのようなペプチド配列は、（ＲＡＤＡ）ｐ（ここで、ｐ＝２〜５０）と表され得る。
【００８３】
その他のペプチド配列は、イソロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、およびリシン（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ＩＥＩＫ））の反復配列を有する自己集合性ペプチドによって表され得、そのようなペプチド配列は、（ＩＥＩＫ）ｐ（ここで、ｐ＝２〜５０）と表される。その他のペプチド配列は、イソロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、およびリシン（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ＩＥＩＫ））の反復配列を有する自己集合性ペプチドによって表され得、そのようなペプチド配列は、（ＩＥＩＫ）ｐＩ（ここで、ｐ＝２〜５０）と表される。
【００８４】
その他のペプチド配列は、リシン、ロイシン、アスパラギン酸、およびロイシン（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ＫＬＤＬ））の反復配列を有する自己集合性ペプチドによって表され得、そのようなペプチド配列は、（ＫＬＤＬ）ｐ（ここで、ｐ＝２〜５０）と表される。その他のペプチド配列は、リシン、ロイシン、およびアスパラギン酸（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＫＬＤ））の反復配列を有する自己集合性ペプチドによって表され得、そのようなペプチド配列は、（ＫＬＤ）ｐ（ここで、ｐ＝２〜５０）と表される。本発明による自己集合性ペプチドの具体例として、配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ（ＲＡＤＡ）４を有する自己集合性ペプチドＲＡＤＡ１６、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（ＩＥＩＫ）３Ｉを有する自己集合性ペプチドＩＥＩＫ１３、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（ＩＥＩＫ）４Ｉを有する自己集合性ペプチドＩＥＩＫ１７、または配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ＫＬＤＬ）３を有する自己集合性ペプチドＫＬＤＬ１２があり得る。
【００８５】
両親媒性配列、長さ、相補性、および構造適合性の基準は、ペプチドの異種混合物に当てはまる。例えば、２つの異なるペプチドを使用して膜を形成し得る：ペプチドＡ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＶＲＶＲＶＤＶＤＶＲＶＲＶＤＶＤ）は親水性残基としてＡｒｇおよびＡｓｐを有し、ペプチドＢ、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ  ＡＤＡＤＡＫＡＫＡＤＡＤＡＫＡＫはＬｙｓおよびＡｓｐを有する。ペプチドＡおよびペプチドＢは相補的であり、ＡのＡｒｇはＢのＡｓｐとイオン化対を形成することができ、ＡのＡｓｐはＢのＬｙｓとイオン化対を形成することができる。よって、ペプチドＡとペプチドＢの異種混合物において、膜が恐らく形成されるが、それはペプチドＡまたはペプチドＢのいずれかから同種的に構成される。
【００８６】
膜およびヒドロゲルは、ペプチドが互いに相補的かつ構造適合的であれば、それぞれ単独では膜を形成しないペプチドの異種混合物からも形成され得る。例えば、（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ）４（ＫＡＫＡ）４と（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）４（ＥＡＥＡ）４の混合物または（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ）４（ＫＡＫＡ）４と（Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ）４（ＡＤＡＤ）４の混合物は、膜を形成することが期待されるが、これらのペプチドのいずれも、相補性がないことから単独では膜を形成しない。
【００８７】
完全には相補的または構造適合的でないペプチドは、核酸のハイブリダイゼーションにおけるミスマッチの塩基対と類似のミスマッチを含有すると考えることができる。ミスマッチを含有するペプチドは、ミスマッチの対の破壊的な力よりもペプチド間相互作用の全体的安定性が優位であれば、膜を形成することができる。機能的に、そのようなペプチドも相補的または構造適合的であると考えることができる。例えば、ミスマッチのアミノ酸対は、両側にある数個の完全にマッチした対によって囲まれていれば、許容され得る。
【００８８】
本明細書中に開示するペプチド配列のそれぞれは、記載するアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、およびこれからなるペプチドを提供し得る。
【００８９】
本開示は、本明細書中に記載するペプチドを含む、これから本質的になる、またはこれからなる溶液、ヒドロゲル、およびスキャフォールドのための材料、方法、およびキットを提供する。
【００９０】
１重量／体積（ｗ／ｖ）パーセントの水性（水）溶液および２．５ｗ／ｖパーセントの（ＲＡＤＡ）４は、３−Ｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．による製品ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌとして利用できる。
【００９１】
ある特定のペプチドは、細胞接着リガンドＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）に類似する配列を含有し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞成長を支持するためのこれらのペプチドの適合性は、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫ（ＥＡＫ１６））、ＲＡＤ１６、ＲＡＤＡ１６のホモポリマーシート、およびＲＡＤ１６およびＥＡＫ１６のヘテロポリマーへ様々な培養初代細胞および形質転換細胞を導入することによって試験された。ＲＡＤに基づくペプチドは、ＲＧＤへのこの配列の類似性から、特に興味深いものであり得る。ＲＡＤ配列は、細胞外マトリックスタンパク質テネイシン中に存在する高親和性リガンドであり、インテグリン受容体によって認識される。ＥＡＫ１６ペプチドおよび本明細書中に開示するその他のペプチドは、酵母タンパク質ズオチン（zuotin）の一領域に由来するものであった。
【００９２】
同種または異種混合物において膜、ヒドロゲル、またはスキャフォールドを形成し得るペプチドの一覧を表１に列挙する。
【表１−１】
2019508181.tif 000002
【表１−２】
2019508181.tif 000003
【表１−３】
2019508181.tif 000004
【表１−４】
2019508181.tif 000005
【００９３】
いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、ペプチドの自己集合は、ペプチドを構成するアミノ酸によるペプチド分子間の水素結合および疎水性結合に帰せられ得ると考えられる。
【００９４】
本明細書中で使用する場合、「有効量」または「治療有効量」は、被験体において脳脊髄液の漏出を処置するために有効なペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルの量を指す。ある特定の実施形態では、そのような「有効量」または「治療有効量」は、被験体への単回または複数回の投与（適用または注射）で、そのような処置なしで期待されるものにまさって、障害を有する被験体を処置し、または治癒させ、緩和し、軽減し、または改善するのに有効なペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルの量を指し得る。これは、ペプチド溶液またはヒドロゲル中のペプチドの特定の濃度またはそれの濃度の範囲、および追加的または代替的に、ペプチド溶液またはヒドロゲルの特定の体積またはそれの体積の範囲を含み得る。容易にする方法は、有効量および有効な濃度のうちの少なくとも１つを調製するための指示を提供することを含み得る。
【００９５】
ＲＡＤＡ１６などの本開示の自己集合性ペプチドは、識別可能な生理学的または生物学的に活性のモチーフまたは配列を欠くペプチド配列であり得、したがって本来の細胞機能を損なわないものであり得る。生理学的に活性のモチーフは、転写などの多数の細胞内の現象を調節し得、そして生理学的に活性のモチーフの存在は、そのモチーフを認識する酵素による細胞質内タンパク質または細胞表面タンパク質のリン酸化をもたらし得る。生理学的に活性のモチーフがペプチド組織閉鎖剤中に存在する場合、様々な機能を有するタンパク質の転写が活性化または抑制され得る。本開示の自己集合性ペプチドは、そのような生理学的に活性のモチーフを欠くものであり得、したがってこの危険性を持たない。
【００９６】
膜形成のために最適な長さは、アミノ酸組成によって様々であり得る。本開示のペプチドによって想定される安定化因子は、相補的ペプチドによりペプチド骨格間の一定距離を維持することである。対形成のときに一定距離を維持することができるペプチドは、本明細書中で構造適合的と称される。ペプチド間の距離は、各イオン化対または水素結合対について、対の各アミノ酸の側鎖上の非分岐原子の数を合計することによって算出できる。例えば、リシンは５つ、グルタミン酸は４つの非分岐原子をその側鎖上にそれぞれ有する。
【００９７】
投与量、例えば、投与（例えば適用または注射）される体積または濃度は、ペプチドの形態（例えば、ペプチド溶液の、ヒドロゲルの、または凍結乾燥形態などの乾燥形態）および利用される投与経路に応じて様々であり得る。正確な処方、投与経路、体積、および濃度は、被験体の状態を考慮して、およびペプチド溶液、ヒドロゲル、またはその他の形態のペプチドが投与される特定の標的区域または位置を考慮して、選択され得る。本明細書中に記載するものよりも少ないまたは多い用量が使用され得るまたは必要とされ得る。任意の特定の被験体に対する具体的な投与量および処置レジメンは、様々な要因に依存し得、要因としては、用いられる特定の１または複数のペプチド、処置されている区域の寸法、所望の標的区域に配置され得る生じるヒドロゲルの所望の厚さ、および処置時間の長さを挙げることができる。具体的な投与量および処置レジメンに影響し得るその他の要因としては、年齢、体重、全身の健康状態、性別、投与時間、分解速度、疾患、状態、または症状の重篤度および経過、ならびに治療医の判断が挙げられる。ある特定の実施形態では、ペプチド溶液は、単回用量で投与され得る。他の実施形態では、ペプチド溶液は、２回以上の用量で、または複数回用量で投与され得る。ペプチド溶液は、少なくとも２回用量で投与され得る。
【００９８】
ペプチド溶液の有効量および有効な濃度は、脳脊髄液の漏出の閉鎖を少なくとも部分的に促進または提供するように選択され得る。一部の実施形態では、有効量および有効な濃度のうちの少なくとも１つは、標的区域の寸法または直径に部分的に基づき得る。他の実施形態では、有効量および有効な濃度のうちの少なくとも１つは、標的区域におけるまたはその近くにおける１つまたは複数の流体の流量に部分的に基づく。
【００９９】
さらに他の実施形態では、有効量および有効な濃度のうちの少なくとも１つは、標的区域の寸法または直径、および標的区域におけるまたはその近くにおける１つまたは複数の流体の流量のうちの少なくとも１つに部分的に基づき得る。
【０１００】
有効量は、約０．１ミリリットル（ｍＬ）から約１００ｍＬのペプチド溶液の体積を含み得る。有効量は、約０．１ｍＬから約１０ｍＬのペプチド溶液の体積を含み得る。ある特定の実施形態では、有効量は約０．５ｍＬであり得る。他の実施形態では、有効量は約１．０ｍＬであり得る。さらに他の実施形態では、有効量は約１．５ｍＬであり得る。またさらに他の実施形態では、有効量は約２．０ｍＬであり得る。一部の他の実施形態では、有効量は約３．０ｍＬであり得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、有効量は標的区域の１ｃｍ２あたりおよそ０．１ｍＬから１ｃｍ２あたりおよそ５ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、有効量は標的区域の１ｃｍ２あたりおよそ１ｍＬであり得る。この有効量は、２．５重量／体積パーセントなど、本開示のペプチド溶液の濃度に関して使用され得る。
【０１０２】
有効な濃度は、本明細書中に記載するように、脳脊髄液の漏出の閉鎖を提供し得る量であり得る。標的区域の寸法または直径、および標的区域におけるまたはその近くにおける１つまたは複数の流体の流量のうちの少なくとも１つなどの、標的部位におけるまたはその近くにおける様々な特性は、有効な濃度の選択または決定に寄与し得る。
【０１０３】
有効な濃度は、約０．１重量／体積（ｗ／ｖ）パーセントから約１０ｗ／ｖパーセントの範囲内溶液中のペプチド濃度を含み得る。有効な濃度は、約０．１ｗ／ｖパーセントから約３．５ｗ／ｖパーセントの範囲の溶液中のペプチド濃度を含み得る。ある特定の実施形態では、有効な濃度は約１ｗ／ｖパーセントであり得る。他の実施形態では、有効な濃度は約２．５ｗ／ｖパーセントであり得る。さらに他の実施形態では、有効な濃度は約３．０ｗ／ｖパーセントであり得る。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、より高いペプチド濃度を有するペプチド溶液は、しかるべき場所に留まり、有効な脳脊髄液の漏出の閉鎖を提供する能力を有するより有効なヒドロゲルを提供し得る。ペプチド溶液の送達の目的のために、より高い濃度のペプチド溶液は、粘性が高過ぎて、有効かつ選択的な溶液の投与ができないものであり得る。十分に高い濃度が選択されない場合、ヒドロゲルは所望の期間にわたって標的区域で有効となり得ない可能性がある。
【０１０５】
有効な濃度は、特定の直径もしくはゲージのカテーテルまたは針を使用する注射またはその他の手段によって投与され得る溶液を提供するように選択され得る。
【０１０６】
本開示の方法は、本明細書中に記載する治療有効量のペプチド、組成物、ペプチド溶液、膜、フィラメント、およびヒドロゲルの単回ならびに複数回の投与を想定する。本明細書中に記載するペプチドは、被験体の状態の性質、重篤度、および程度に応じて、定期的な間隔で投与され得る。一部の実施形態では、ペプチド、組成物、ペプチド溶液、膜、フィラメント、またはヒドロゲルは、単回投与で投与され得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載するペプチド、組成物、ペプチド溶液、またはヒドロゲルは、複数回投与で投与される。一部の実施形態では、治療有効量のペプチド、組成物、ペプチド溶液、膜、フィラメント、またはヒドロゲルは、定期的な間隔で繰返し投与され得る。選択される定期的な間隔は、投与される溶液の初期ペプチド濃度、投与される量、および形成されるヒドロゲルの分解速度のうちのいずれか１つまたは複数に基づき得る。例えば、最初の投与後、例えば、１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、または８週間後に後続の投与が為され得る。後続の投与は、最初の投与と同じペプチド濃度および体積を有する溶液の投与を含み得るか、または、より低いもしくは高いペプチド濃度および体積の溶液の投与を含み得る。ペプチド溶液の適切な後続の投与の選択は、標的区域および標的区域周囲の区域を画像化すること、および被験体の状態に基づいて必要性を確認することに基づき得る。所定の間隔は、各後続の投与について同じであってもよいし、異なっていてもよい。一部の実施形態では、ペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルは、被験体の生涯にわたって被験体内で少なくとも部分的な脳脊髄液の漏出の閉鎖を維持するために、所定の間隔で長期にわたって投与され得る。所定の間隔は、各後続の投与について同じであってもよいし、異なっていてもよい。これは、以前の投与により形成されたヒドロゲルが部分的または完全に崩壊または分解したかどうかに依存し得る。後続の投与は、最初の投与と同じペプチド濃度および体積を有する溶液の投与を含み得るか、または、より低いもしくは高いペプチド濃度および体積の溶液の投与を含み得る。ペプチド溶液の適切な後続の投与の選択は、標的区域および標的区域周囲の区域を画像化すること、および被験体の状態に基づいて必要性を確認することに基づき得る。
【０１０７】
ペプチドは、化学合成することもできるし、または天然および組換えの供給源から精製することもできる。化学合成されたペプチドの使用は、別の動物の細胞外マトリックスに由来する未確認の構成成分などの未確認の構成成分をペプチド溶液が含まないようにし得る。したがって、この特性は、従来の組織由来生体用材料と比べて、ウイルス感染の危険性などの感染の懸念を取り除き得る。これは、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの感染症などの感染の懸念を取り除いて、ペプチドを医療使用のために高度に安全なものにし得る。
【０１０８】
ペプチドの初期濃度は、形成される膜、ヒドロゲル、またはスキャフォールドの大きさおよび厚さにおける因子であり得る。一般に、ペプチド濃度が高くなるほど、膜またはヒドロゲル形成の程度がより大きくなる。より高い初期ペプチド濃度（約１０ｍｇ／ｍｌ）（約１．０ｗ／ｖパーセント）で形成されるヒドロゲルまたはスキャフォールドは、より厚くなり得、よってより強くなる可能性がある。
【０１０９】
膜、ヒドロゲル、またはスキャフォールドの形成は、数分のオーダーの、非常に迅速なものであり得る。膜またはヒドロゲルの形成は、非可逆的なものであり得る。ある特定の実施形態では、形成は可逆的なものであり得、他の実施形態では、形成は非可逆的なものであり得る。ヒドロゲルは、標的区域に投与されると瞬時に形成され得る。ヒドロゲルの形成は、投与の約１〜２分以内に起こり得る。その他の例では、ヒドロゲルの形成は、投与の約３〜４分以内に起こり得る。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルを形成するのに要する時間は、ペプチド溶液の濃度、適用されるペプチド溶液の体積、および適用または注射する区域の状態（例えば、適用する区域の一価の金属陽イオン濃度、区域のｐＨ、および区域におけるまたはその近くにおける１つまたは複数の流体の存在）のうちの１つまたは複数に少なくとも部分的に基づき得る。プロセスは、１２未満または１２に等しいｐＨ、および温度によって影響されないものであり得る。膜またはヒドロゲルは、１〜９９℃の範囲の温度で形成され得る。
【０１１０】
ヒドロゲルは、本開示の方法およびキットを使用して所望する効果を提供するのに十分な期間にわたって、標的区域の所定の場所にとどまり得る。本開示の方法およびキットを使用して所望する効果は、脳または脊髄におけるまたはその近くにおける外科的手技が行われた区域を処置するため、またはその区域の治癒を助けるためのものであり得る。例えば、本開示の方法およびキットを使用して所望する効果は、脳または脊髄の手術が行われる区域を処置するため、またはその区域の治癒を助けるためのものであり得る。
【０１１１】
膜またはヒドロゲルが所望の区域に留まり得る期間は、約１０分であり得る。ある特定の例では、それは約３５分間、所望の区域に留まり得る。ある特定のさらなる例では、それは１日または複数の日数の間、１週またはそれより多くの週まで、所望の区域に留まり得る。他の例では、それは３０日間またはそれよりも後まで、所望の区域に留まり得る。それは無期限に所望の区域に留まり得る。その他の例では、それは、自然に分解するかまたは意図的に取り除かれるまで、より長い期間、所望の区域に留まり得る。ヒドロゲルがある期間にわたって自然に分解する場合、同じまたは異なる位置へのヒドロゲルのその後の適用または注射が行われ得る。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、自己集合性ペプチドは、自己集合性ペプチドの強化された有効性を提供し得るか、または別の作用、処置、治療を提供し得るか、または他の方法で被験体の１つもしくは複数の構成成分と相互作用し得る、１つまたは複数の構成成分を用いて調製され得る。例えば、１つまたは複数の生物学的または生理学的に活性のアミノ酸配列またはモチーフを含む追加のペプチドが、自己集合性ペプチドと一緒に、構成成分の１つとして含まれ得る。他の構成成分としては、薬物などの生物学的に活性の化合物、または被験体に対して何らかの利益を提供し得るその他の処置を挙げることができる。例えば、がんを処置する薬物または抗がん薬物は、自己集合性ペプチドと共に投与され得るか、または別々に投与され得る。
【０１１３】
ペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルは、被験体を処置するため、または溶血、炎症、および感染を予防するための小分子薬物を含み得る。小分子薬物は、グルコース、サッカロース、精製サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストラン（destran）、ヨウ素、塩化リゾチーム、ジメチルイソプロピルアズレン（dimethylisoprpylazulene）、トレチノイントコフェリル、ポビドンヨード、アルプロスタジルアルファデクス、アニスアルコール、サリチル酸イソアミル、α，α−ジメチルフェニルエチルアルコール、バクダノール、ヘリオナール、スルファジアジン銀（sulfazin  silver）、ブクラデシンナトリウム、アルプロスタジルアルファデクス、硫酸ゲンタマイシン、テトラサイクリン塩酸塩、フシジン酸ナトリウム、ムピロシンカルシウム水和物、および安息香酸イソアミルからなる群から選択され得る。その他の小分子薬物が想定され得る。タンパク質ベースの薬物は、投与される構成成分として含まれ得、また、エリスロポエチン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、合成ヘモグロビン、およびインスリンを含み得る。
【０１１４】
迅速なまたは即時のヒドロゲルの形成からペプチド溶液を保護するための構成成分が含まれ得る。これは、経時的に分解して標的区域へのペプチド溶液の時間調節放出（controlled  time  release）を可能とすることにより、所望の所定の期間にわたってヒドロゲルを形成し得る、封入された送達システムを含み得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。
【０１１５】
組織閉鎖効果を減少させることなく溶液の浸透圧を低張から等張に改善することによって生物学的安全性を増加させるために、糖が自己集合性ペプチド溶液に加えられ得る。ある特定の例では、糖は、スクロースまたはグルコースであり得る。
【０１１６】
本明細書中に記載する構成成分のいずれかは、ペプチド溶液中に含まれ得るか、またはペプチド溶液とは別に投与され得る。さらに、本明細書中に提供する方法および容易にする方法のいずれかは、１または複数の関係者によって行われ得る。
【０１１７】
本開示のペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルは、キット中に提供され得る。被験体の標的区域に溶液を投与するための指示もまた、キット中に提供され得る。ペプチド溶液は、ヒドロゲルを形成して脳脊髄液の漏出の閉鎖を少なくとも部分的に促進または提供するために有効量で、および有効な濃度で少なくとも約７アミノ酸を含む自己集合性ペプチドを含み得る。ペプチド溶液は、ヒドロゲルを形成して脳脊髄液の漏出の閉鎖を少なくとも部分的に促進または提供するために有効量で、および有効な濃度で約７アミノ酸から約３２アミノ酸を含む自己集合性ペプチドを含み得る。溶液を投与するための指示は、例えば、本明細書中に記載する投与経路によって、ある用量、体積、もしくは濃度、または投与スケジュールで、本明細書中で提供するペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルを投与するための方法を含み得る。ペプチドは、両親媒性であり得、ペプチドの少なくとも一部分は、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸とが交互に現れ得る。
【０１１８】
キットは、情報資料も含み得る。情報資料は、本明細書中に記載する方法に関する、説明的な、指示的な、マーケティングの、またはその他の資料であり得る。一実施形態では、情報資料は、本明細書中に開示するペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルの生産、ペプチド、組成物、ペプチド溶液、またはヒドロゲルの物理的特性、濃度、体積、大きさ、寸法、有効期限、およびバッチ、または生産場所に関する情報を含み得る。
【０１１９】
キットは、所望の区域へのペプチドまたはペプチド溶液の投与を可能とするためのデバイスまたは材料も任意選択で含み得る。例えば、注射器、ピペット、カテーテル、またはその他の針に基づくデバイスがキット中に含まれ得る。追加的または代替的に、キットは、ガイドワイヤ、内視鏡、または標的区域へのペプチド溶液の選択的な投与を提供するためのその他の付属器材を含み得る。
【０１２０】
キットは、追加的または代替的に、ペプチド溶液、ヒドロゲル、またはスキャフォールドの配置を助け得る構成成分などの、その他の構成成分または成分を含み得る。十分な量または体積のペプチド溶液をスクロース溶液（これはキットと共に提供されてもよいし、そうでなくてもよい）と組み合わせるための指示がキット中に提供され得る。標的区域に有効な濃度の溶液を投与するためにペプチド溶液を希釈するための指示が提供され得る。指示は、希釈剤または溶媒でのペプチド溶液の希釈を記載し得る。希釈剤または溶媒は水であり得る。標的区域への溶液の有効な濃度および溶液の有効量のうちの少なくとも１つを決定するための指示がさらに提供され得る。これは、本明細書中で論じる様々なパラメーターに基づき得、また、標的区域にある病変または創傷の直径を含み得る。
【０１２１】
その他の構成成分または成分が、ペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルと同一または異なる組成物または容器において、キット中に含まれ得る。１つまたは複数の構成成分は、自己集合性ペプチドの強化された有効性を提供し得るか、または別の作用、処置、治療を提供し得るか、または他の方法で被験体の１つまたは複数の構成成分と相互作用し得る構成成分を含み得る。例えば、１つまたは複数の生物学的または生理学的に活性の配列またはモチーフを含む追加のペプチドが、自己集合性ペプチドと一緒に構成成分の１つとして含まれ得る。その他の構成要素は、薬物などの生物学的に活性の化合物、または被験体に対して何らかの利益を提供し得るその他の処置を含み得る。例えば、がんを処置する薬物または抗がん薬物は、自己集合性ペプチドと共に投与され得るか、または別々に投与され得る。ペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルは、本明細書中に開示するように、被験体を処置するため、または溶血、炎症、および感染を予防するための小分子薬物を含み得る。スクロース溶液などの糖溶液がキットと共に提供され得る。スクロース溶液は、２０％スクロース溶液であり得る。
【０１２２】
本明細書中に開示する他の構成成分もまた、キット中に含まれ得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、キットの構成成分は、例えば、ゴムまたはシリコーンのふた（例えば、ポリブタジエンまたはポリイソプレンのふた）を有する、密封したバイアル中に貯蔵される。一部の実施形態では、キットの構成成分は、不活性条件下（例えば、窒素下またはアルゴンなどの別の不活性ガス下）で貯蔵される。一部の実施形態では、キットの構成成分は、無水条件下（例えば、乾燥剤と共に）で貯蔵される。一部の実施形態では、キットの構成成分は、アンバーバイアルなどの遮光容器中に貯蔵される。
【０１２４】
キットの一部分としてまたはキットとは別に、注射器またはピペットは、本明細書中に開示するペプチド、ペプチド溶液、またはヒドロゲルで予め充填され得る。その他のデバイスを使用してまたは使用せずに注射器またはピペットに自己集合性ペプチド溶液を供給し、その他のデバイスを使用してまたは使用せずに注射器またはピペットを通じて標的区域にそれを投与するための指示を使用者に与える方法が提供される。その他のデバイスは、例えば、ガイドワイヤを有するまたは有しないカテーテルを含み得る。
【０１２５】
本開示の一部の実施形態では、自己集合性ペプチドは、体液の漏出を抑制するための、ステントまたはカテーテルなどのデバイスまたは器具に対するコーティングとして使用され得る。自己集合性ペプチドはまた、ガーゼまたは包帯などの支持物、あるいは、被験体への処置効果を提供し得る、または標的区域内に適用され得るライニングに組み込まれ得るまたは固定され得る。自己集合性ペプチドはまた、使用のためにスポンジに吸収され得る。
【０１２６】
膜は、細胞単層の培養にも有用であり得る。細胞は、不均一の、荷電表面への粘着を好む。タンパク質膜の荷電残基およびコンホメーションは、細胞の粘着および移動を促進する。ペプチド膜に線維芽細胞成長因子などの成長因子を加えることで、接着、細胞成長、および神経突起伸長がさらに改善され得る。
【０１２７】
ペプチド溶液は酸性ｐＨで液体であり得るが、ペプチドは、中性または生理的ｐＨレベルへの溶液のｐＨレベルの調整によって、自己組織化または自己集合を経験し得る。溶液は、水性または非水性であり得る。
【０１２８】
上記の記載は、実例を挙げるものであり、限定的なものではない。本開示を吟味することにより、本技術の多くの変形が当業者に明らかとなる。したがって、本技術の範囲は、上記の実施形態を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を参照して、そしてそれと共に均等物の範囲全体を以って、決定されるべきである。
【配列表】
2019508181000001.app
【国際調査報告】
2019508181.tif 000006
2019508181.tif 000007
2019508181.tif 000008
2019508181.tif 000009