(57)【要約】  本発明は、エンドソーマルGタンパク質共役受容体様ニューロキニン-1受容体に対するモジュレーター部分、リンカー及び細胞膜にトリパータイト化合物をアンカーするために好適なリピッドアンカーを含む、トリパータイト化合物に関する。本発明はまた、該トリパータイト化合物を含むプロドラッグ及び医薬組成物、並びにエンドソーマルGタンパク質共役受容体シグナル伝達様NK1Rシグナル伝達によって媒介される、疾患又は病気の治療のためのトリパータイト化合物の使用に関する。【選択図】なし0【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングする、式 (I)のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩であって、
【化１】
2019503356.tif 000077
前記式中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)シグナル伝達をターゲティングする、式 (I)のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩であって、
【化２】
2019503356.tif 000078
前記式中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であって、Lは、式 (IVa)によって表され、
【化３】
2019503356.tif 000079
前記式中、
Zは、リピッドアンカー（LA）に対するリンカーの結合基であり；Zは以下：
a1) C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-；又は
b1) 隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸；該アミノ酸は、その側鎖官能基を介して、リピッドアンカーに結合する；
によって定義され、
Yは、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)のモジュレーターである、モジュレーターXに対するリンカーの結合基Lであり、
a2) Yは、共有結合、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-若しくは-C(O)S-によって定義され；又は
b2) 隣接するアミド基とまとめられる場合、Yは以下：
a. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるαアミノ酸；該αアミノ酸は、任意選択で、前記αアミノ酸の少なくとも１の側鎖官能基を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；或いは
b. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を含む、β、γ若しくはδアミノ酸；前記β、γ若しくはδアミノ酸は、任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも１を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；或いは
c. α、β、γ若しくはδアミノ酸から形成されるペプチドであって、該ペプチドはアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を有する、少なくとも１のα、β、γ若しくはδアミノ酸を含み；又はそれらの組合せであって、前記ペプチドは、任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも１を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し； 
によって定義され、
mは1若しくは2であり；
nは1〜20であり；
pは1〜8であり；及び
Xは式 (Va)若しくは式(Vb)によって定義される構造X＝M-R1-によって定義される、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)のモジュレーターであって、Mは、R1を介して、リンカーLのYに共有結合し：
【化４】
2019503356.tif 000080
前記式中、
R1は-F1-R2’-F2-によって定義され：
-  MはF1を介して、R2’に共有結合し(M-F1-R2’-)、及び
-  R2’はF2を介して、リンカーLのYに更に共有結合し(M-F1-R2’-F2-Y-)、及び
-  F1とF2は互いに独立して、R2’に対する共有結合を有し；
R2’は以下：
a3) 共有結合、
b3) 任意選択で、置換基として、5〜7員の芳香族若しくは非芳香族複素環基を有し、任意選択で、炭素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される1〜4のヘテロ原子を更に含み、並びに任意選択で、1若しくは2のオキソを置換基として更に有する、直鎖状又は分枝状のC1-4アルキル基、
c3) 任意選択で、炭素原子以外に、1若しくは2の窒素原子を更に含み、並びに任意選択で、オキソ、直鎖状又は分枝状のC1-6アルキル、フェニル、直鎖状又は分枝状のC1-6アルキル-カルボニル及びC1-6アルキル-カルボニルアミノからなる群から選択される1〜3の置換基を有する、5〜7員の非芳香族複素環基、
d3) 任意選択で、以下：
(i) 炭素原子以外に1〜4の窒素原子を含み、及び任意選択で、1若しくは2のオキソを置換基として有する、5〜7員の芳香族若しくは非芳香族複素環基、
(ii) (i)C1-6アルキル-カルボニルアミノ基、
(iii) モノ-若しくはジ-C1-6アルキルアミノ基、並びに
(iv) C1-6アルコキシ基；
からなる群から選択される置換基(複数可)を有する直鎖状又は分枝状のC1-6アルキル基、
e3) 直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルコキシ基、
f3) 任意選択で、C1-6アルキル-カルボニルアミノ基、C1-6アルコキシ-カルボニルアミノ基及びアミノ基からなる群から選択される1若しくは2置換基を有する、C3-8シクロアルキル基、
g3) カルバモイル基、
h3) 直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルコキシ-カルボニル基、
i3) C1-6アルキル-カルバモイル基；或いはそれらの組合せ；
によって定義され、
F1は、共有結合、或いは以下：
-C(=O)-、
-C(=O)-O-、
-C(=O)-N(R4’)、及び
-S(=O)2-N(R4’)-；R4’は水素原子、又は直鎖状若しくは分枝状のC1〜C12アルキルである；
からなる官能基のリストから選択される部分によって定義され、
F2は、以下：
-C(=O)-、
-C(=O)-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2)n-C(=O)-      （n = 1〜12）、
-C(=O)-(CH2)n-            （n = 1〜12）、
-C(=O)-O-(CH2)n-C(=O)-    （n = 1〜12）、及び
-C(=O)-O-(CH2)n-          （n = 1〜12）；
からなる官能基のリストから選択される部分によって定義され、
Mは、以下の置換基：
R2は、水素原子、任意選択で、ハロゲン化されている直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルキル基であり；
R3とR3’は、互いに独立して、水素原子若しくはメチルであり、又はR3とR3’は、任意選択で、それらに結合した炭素原子と一緒になって環を形成するよう互いに結合し；
R4は、塩素原子、メチル若しくはトリフルオロメチルであり；
R5は、塩素原子、メチル若しくはトリフルオロメチルであり；
及び式：
【化５】
2019503356.tif 000081
によって表される官能基は、任意選択で、置換基(複数可)を有する芳香族基であり；
によって定義され、
p＝0、1若しくは2；
q＝1若しくは2；
である、請求項１に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項３】
リピッドアンカーが、4℃で非イオン性界面活性剤に不溶性である脂質膜に分配される、請求項１又は２に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項４】
LAが、任意選択で、式(IIaa)、又は任意選択で、式 (IIa)若しくは式(IIIa)：
【化６】
2019503356.tif 000082
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ基で置換され；
R2a、R3a、R3b、R4b、R4c、R5、R6、R7a、R7b、R8a；R8b、R9a、R9b、R10、R11a、R11b、R12a、R12b、R13、R14、R15a、R15b、R16a、R16bは、独立して、H若しくはC1-3アルキル；ヒドロキシル、アルコキシ、若しくはアミノであり；又は
任意選択で、R3aR3b及び／若しくはR4b R4c、及び／若しくはR7a R7b、及び／若しくはR8aR8b、及び／若しくはR9a R9b、及び／若しくはR11a R11b、及び／若しくはR12aR12b、及び／若しくはR15a R15b、及び／若しくはR16a R16bは、一緒になって=O (酸素に対する二重結合)を与え；R4aはCH2、O、NH若しくはS；並びに
【化７】
2019503356.tif 000083
は、単結合若しくは二重結合を表し；
によって表される、細胞膜に前記化合物の挿入を促進するリピッドアンカーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項５】
エンドソーマルNK1Rのモジュレーターが、式 (VI)又は式 (Vb)に記載の少なくとも１の化合物から選択され、
【化８】
2019503356.tif 000084
前記式中、
R2は、水素原子、メチル若しくはシクロプロピルであり；
R3は、水素原子若しくはCH3であり；
R4及びR5は、トリフルオロメチルであり；並びに
【化９】
2019503356.tif 000085
によって表される基であり、該基は、以下の式によって表される基であり、
【化１０】
2019503356.tif 000086
前記式中、
R6は、水素原子、メチル、エチル若しくはイソプロピルであり；
R7は、水素原子、メチル若しくは塩素原子；及び
R8は、水素原子、フッ素原子、塩素原子若しくはメチル；又は
3-メチルチオフェン-2-イルである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項６】
部分構造：
【化１１】
2019503356.tif 000087
が
【化１２】
2019503356.tif 000088
であるか、又はR3が水素原子であり、及びR3’が水素原子である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項７】
-F2-によって、リンカーLに共有結合する、部分-R2’-F1-Mは、以下の構造において示され：
【化１３】
2019503356.tif 000089
前記式中、R3は水素又は-CH3である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項８】
-F2-によって、リンカーLに共有結合する、以下の構造において示される部分-R2’-F1-Mは、以下の構造によって定義され：
【化１４】
2019503356.tif 000090
前記式中、R3は水素若しくは-CH3である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項９】
-F2-によって、リンカーLに共有結合する、以下の構造において示される部分-R2’-F1-Mは、以下の構造によって定義され：
【化１５】
2019503356.tif 000091
請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１０】
Yによって、リンカーLに共有結合する、以下の構造において示される部分-F2-R2’-F1-Mは、以下：
【化１６】
2019503356.tif 000092
【化１７】
2019503356.tif 000093
前記式中、R3は水素原子若しくはCH3である、
の化合物のリストから選択され、及びそれらの組合せである、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１１】
Yによって、リンカーLに共有結合する、以下の構造において示される部分-F2-R2’-F1-Mは、以下：
【化１８】
2019503356.tif 000094
【化１９】
2019503356.tif 000095
の化合物のリストから選択される、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１２】
以下の構造：
【化２０】
2019503356.tif 000096
【化２１】
2019503356.tif 000097
前記式中、R3は水素原子若しくは-CH3である、
からなる化合物のリストから選択される、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物Ｘ−Ｌ−ＬＡ又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物のプロドラッグ。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物、又はそのプロドラッグを含む医薬組成物。
【請求項１５】
タキキニン受容体アンタゴニストとして使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療のための、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
下部尿路疾患、胃腸疾患又は中枢神経系の疾患の予防又は治療における使用のための、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
過活動膀胱、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、嘔吐、吐き気、うつ病、不安神経症、不安、全般性不安障害（ＧＡＤ）、骨盤内臓痛又は間質性膀胱炎の予防又は治療のための、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
化学療法誘発性悪心・嘔吐（ＣＩＮＶ）、周期性嘔吐症候群、術後の悪心・嘔吐、情動性及び嗜癖性障害（うつ病及び不安を含む）、全般性不安障害（ＧＡＤ）、炎症性腸疾患を含む胃腸障害、過敏性腸症候群、胃不全麻痺及び機能性ディスペプシア、関節炎を含む慢性炎症性障害、ＣＯＰＤ及び喘息を含む呼吸器疾患、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛及び内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス及び細菌感染並びに増殖性障害（がん）、並びにそれらの組合せのリストから選択されるエンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気が、体性痛又は内臓痛である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気が、慢性的な疾患又は病気である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物。
【請求項２３】
治療有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩を、少なくとも1の医薬的に許容される担体又は希釈剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項２４】
以下の式：
【化２２】
2019503356.tif 000098
のエンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングするトリパータイト化合物。
【請求項２５】
式(Ie)のエンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングするトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩であって：
【化２３】
2019503356.tif 000099
前記式中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターであり；
該リピッドアンカーが、4℃で非イオン性界面活性剤に不溶性である脂質膜に分配される、
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２６】
式(Ia)のエンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングするトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩であって：
【化２４】
2019503356.tif 000100
前記式中、
LAは、細胞膜への前記化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり、式 (IIa)又は(IIIa)によって表され：
【化２５】
2019503356.tif 000101
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH若しくはC1-3アルキルであり；
R4aは、C、O、NH若しくはSであり；
【化２６】
2019503356.tif 000102
は、単結合若しくは二重結合を表し；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー基であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである、
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２７】
式(Ib)のエンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングするトリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩であって：
【化２７】
2019503356.tif 000103
前記式中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり、式 (IIa)又は(IIIa)によって表され:
【化２８】
2019503356.tif 000104
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH若しくはC1-3アルキルであり；
R4aは、C、O、NH若しくはSであり；
【化２９】
2019503356.tif 000105
は、単結合若しくは二重結合を表し；
Lは、式 (IVa)によって表され：
【化３０】
2019503356.tif 000106
前記式中、
Zは、リンカーとリピッドアンカーとの間の結合基であり、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり；又は
Zは、隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸であり；該アミノ酸は、側鎖官能基を介して該リピッドアンカーに結合し；
Yは、該リンカーとエンドソーマルGPCRのモジュレーターとの間の結合基であり、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-若しくは-C(O)S-であり-；又は
Yは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるアミノ酸であり；該アミノ酸は、その側鎖官能基を介して該エンドソーマルGPCRのモジュレーターに結合し；
mは1若しくは2であり；
nは1〜20であり；
pは1〜8であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである、
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２８】
エンドソーマルGPCRのモジュレーターが、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物。
【請求項２９】
エンドソーマルGPCRのモジュレーターが、CGRP受容体のモジュレーターである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のトリパータイト化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トリパータイト化合物及びそれらの使用、並びに特にエンドサイトーシスされた（endocytosed）Gタンパク質共役受容体に対するモジュレーターとして作用するトリパータイト化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Gタンパク質共役受容体 (GPCR)は、殆んどの病態生理学的プロセスに関与する、細胞表面受容体 (約850メンバー)の最大のファミリーであり、治療薬の約30%の標的である(Audet, M. & Bouvier, M. Nat Chem Biol 2008, 4, 397-403)。細胞表面GPCRは、細胞外リガンドと相互作用し、ヘテロ三量体のGタンパク質と共役し、セカンドメッセンジャーの形成、増殖因子受容体のトランス活性化、及びイオンチャネルの調節を含む、細胞膜に起源するシグナル伝達経路をトリガーする。
【０００３】
最近まで、GPCRの活性化、それに続く下流のシグナル伝達及びシグナルの終結は、専ら細胞膜において起こると広く想定されていた。細胞膜シグナル伝達は、リガンドが結合した受容体の活性構造に対して選択的であるGPCRキナーゼによる、受容体のリン酸化を介して、活性化の数分以内に終結する。次いで、リン酸化された受容体は、受容体とGタンパク質との間の共役を立体的に阻害するβ-アレスチン(βarr)に結合し、それゆえアゴニストが媒介するGタンパク質の活性化が終結する。更に、βarrは、ダイナミン依存的及びクラスリン依存的なエンドサイトーシスを介して、リガンドが結合した受容体を、細胞表面から早期エンドソームへの輸送を促進する。一旦エンドサイトーシスされたら、リガンド及びリン酸基はGPCRから除かれ、受容体は、急速に細胞膜に再分配されるか、又は分解のためのリソソームに輸送されるかのいずれかである。
【０００４】
しかしながら、最近、多様なGPCRが従来のパラダイムに必ずしも従うとは限らないということが発見されている。研究によって、リガンドの結合及び受容体の活性化に続き、幾つかの細胞表面GPCRが、ヘテロ三量体のGタンパク質シグナル伝達が長期間維持される、早期エンドソームに内在化し再分配されることが見出されている。従って、GPCRがリサイクル又は分解経路に輸送される（トラフィッキング）、単なる通路（conduit）として作用するというよりむしろ、エンドソームはシグナル伝達の重要な部位であり得る(Murphy, J. E.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17615-17622)。幾つかのGPCRは、エンドソームからのGαs依存性シグナルを誘発するが (Calebiro, D.ら、PLoS Biol 2009, 7, e1000172；Irannejad, R.ら、Nature 2013, 495, 534-538)、GPCR及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼをエンドソームに補充することによって、βarrはエンドソーマルGPCRシグナル伝達を媒介し得る (Murphy, J. E.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106、17615-17622；DeFea, K. A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 11086-11091；DeFea, K. A.ら、J Cell Biol 2000, 148, 1267-1281)。
【０００５】
βarrは、細胞膜及びエンドソーム膜において、様々なシグナル伝達タンパク質を活性化した受容体に補充し、シグナル伝達の必須なメディエーターである。MAPKカスケード [ERK、c-Junアミノ末端キナーゼ(JNK)、p38]は最も徹底的に調べられたβarr依存性シグナル伝達経路である。βarrがシグナル伝達において積極的に参加する最初の証拠は、βarrのドミナントネガティブ変異体がERK1/2のβ2AR誘導性の活性化を阻害したという発見であった(Daaka Yら、J Biol Chem 1998, 273, 685-688)。その後、βarrはβ2ARをc-Srcにつなぎ、ERK1/2の活性化を媒介することが見出された (Lutterall L. M.ら、Science 1999, 283, 655-661)。同様に、βarrは、ニューロキニン-1受容体(NK1R)、プロテアーゼ活性化受容体2 (PAR2)、アンギオテンシンII 1A型受容体 (AT1AR)及びバソプレッシンV2受容体 (V2R)を含む、他のGPCRによるERK1/2シグナル伝達に関与する。これらの発見によって、βarrは、活性化したGPCRをMAPKシグナル伝達複合体とつなぐ足場であるとの見方が導かれた。それにより、βarrは細胞膜でのGタンパク質依存性シグナル伝達とは異なる、GPCRシグナル伝達の第2波を媒介する。
【０００６】
従って、エンドサイトーシスされたGPCRをモジュレートすることは、この大きい受容体ファミリーに関連する、膨大な数の疾患や病気を治療する新しい方法を有利に提供し得る。
【発明の概要】
【０００７】
発明の要約
エンドソーマルGPCRシグナル伝達のモジュレーションにとって好適である、新規のトリパータイト化合物が提供される。本発明のトリパータイト化合物は、これらの受容体によって媒介される疾患及び病気の治療及び予防の新規の方法を提供し得る。
【０００８】
従って、本発明の一態様においては、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングする、式 (I)のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【０００９】
【化１】
2019503356.tif 000002
【００１０】
前記式（I）中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである。
【００１１】
本発明の好ましい一実施形態においては、式 (I)のエンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)シグナル伝達をターゲティングするトリパータイト化合物、又はそれらの医薬的に許容される塩を提供する。
【００１２】
【化２】
2019503356.tif 000003
【００１３】
前記式（I）中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり、Lは、式 (IVa)によって表される。
【００１４】
【化３】
2019503356.tif 000004
【００１５】
前記式（IVa）中、
Zは、リピッドアンカーLAに対する、リンカーの結合基であり；Zは、以下：
a1) C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル−、-C2-C10アルキニル−、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-；又は
b1) 隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸であり；該アミノ酸がその側鎖官能基を介してリピッドアンカーに結合する
により定義され；及び
Yは、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)のモジュレーターである、モジュレーターXに対するリンカーの結合基であり、
a2) Yは、共有結合、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-若しくは-C(O)S-によって定義され；又は
b2) Yは、隣接するアミド基とまとめられる場合、以下：
a. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるαアミノ酸；該αアミノ酸は任意選択で、前記αアミノ酸の少なくとも１の側鎖官能基を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合する；又は
b. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を含むβ、γ若しくはδアミノ酸；ここで、前記β、γ若しくはδアミノ酸は任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも１を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合する；又は
c. α、β、γ若しくはδアミノ酸から形成されるペプチドであって、該ペプチドが、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンにおいてもまた見出される側鎖官能基を有する、少なくとも１のα、β、γ若しくはδアミノ酸を含み；又はそれらの組合せであり、前記ペプチドが任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも１を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合する；
によって定義され、
mは1若しくは2であり；
nは1〜20であり；
pは1〜8であり；及び
Xは、式 (Va)若しくは式(Vb)、任意選択で、式 (V)（Mは、R1を介して、リンカーLのYに共有結合する）によって定義される、構造X=M-R1-によって定義される、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)のモジュレーターであり：
【００１６】
【化４】
2019503356.tif 000005
【００１７】
前記式中、
R1は、-F1-R2’-F2-によって定義され：
-  Mは、F1を介してR2’に共有結合し (M-F1-R2’-)、及び
-  R2’は、F2を介して、リンカーLのYに更に共有結合し (M-F1-R2’-F2-Y-)、及び
-  F1とF2は、互いに独立してR2’に対して共有結合を有し；
R2’は以下：
a3)共有結合、
b3)任意選択で、置換基として5〜7員の芳香族若しくは非芳香族複素環基を有し、任意選択で、炭素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される1〜4のヘテロ原子を更に含み、並びに任意選択で、置換基として1若しくは2のオキソを有する、直鎖状又は分枝状のC1-4アルキル基、
c3)任意選択で、炭素原子以外に、1若しくは2の窒素原子を更に含み、並びに任意選択で、オキソ、直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルキル、フェニル、直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルキル-カルボニル及びC1-6アルキル-カルボニルアミノからなる群から選択される、1〜3の置換基を有する、5〜7員の非芳香族複素環基、
d3)任意選択で、以下：
(i)  炭素原子以外に、1〜4の窒素原子を含み、及び任意選択で、置換基として1若しくは2のオキソを有する、5〜7員の芳香族若しくは非芳香族複素環基
(ii)  (i)C1-6アルキル-カルボニルアミノ基、
(iii)  モノ-若しくはジ-C1-6アルキルアミノ基、並びに
(iv)  C1-6アルコキシ基
からなる群から選択される、置換基(複数可)を有する、直鎖状又は分枝状のC1-6アルキル基；
e3)直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルコキシ基、
f3)任意選択で、C1-6アルキル-カルボニルアミノ基、C1-6アルコキシ-カルボニルアミノ基及びアミノ基からなる群から選択される、1若しくは2置換基を有する、C3-8シクロアルキル基、
g3)カルバモイル基、
h3)直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルコキシ-カルボニル基、
i3)C1-6アルキル-カルバモイル基；或いはそれらの組合せ；
によって定義され；
F1は、共有結合によって定義されるか、又は以下：
-C(=O)-、
-C(=O)-O-、
-C(=O)-N(R4’)、及び
-S(=O)2-N(R4’)-；R4’は、水素原子、又は直鎖状若しくは分枝状のC1〜C12アルキルである；
からなる官能基のリストから選択される部分（moiety）によって定義され；
F2は、以下：
-C(=O)-、
-C(=O)-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2)n-C(=O)-      （n=1〜12）、
-C(=O)-(CH2)n-            （n=1〜12）、
-C(=O)-O-(CH2)n-C(=O)-    （n=1〜12）、及び
-C(=O)-O-(CH2)n-          （n=1〜12）
からなる官能基のリストから選択される部分によって定義され；
Mは、以下の置換基：
R2は、水素原子、直鎖状若しくは分枝状のC1-6アルキル基であり、任意選択で、ハロゲン化され；
R3とR3’は、互いに独立して、水素原子若しくはメチルであり、又はR3とR3’は、任意選択で、それに結合した炭素原子と一緒になって環を形成するように互いに結合し；
R4は、塩素原子、メチル若しくはトリフルオロメチルであり；
R5は、塩素原子、メチル若しくはトリフルオロメチルであり；
並びに式：
【００１８】
【化６】
2019503356.tif 000006
【００１９】
によって表される官能基が、芳香族基であり、任意選択で、置換基(複数可)を有し；
によって定義され；
p = 0、1若しくは2であり；
q = 1若しくは2である。
【００２０】
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、リピッドアンカーは、4℃で非イオン性界面活性剤に不溶性である脂質膜に分配される。
【００２１】
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、LAは、リピッドアンカーであり、任意選択で、細胞膜への化合物の挿入を促進し、式(IIaa)、任意選択で、式 (IIa)又は式 (IIIa)によって表される。
【００２２】
【化７】
2019503356.tif 000007
【００２３】
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ基で置換され；
R2a、R3a、R3b、R4b、R4c、R5、R6、R7a、R7b、R8a；R8b、R9a、R9b、R10、R11a、R11b、R12a、R12b、R13、R14、R15a、R15b、R16a、R16bは、独立して、H若しくはC1-3アルキル；ヒドロキシル、アルコキシ若しくはアミノ；又は、
任意選択で、R3a R3b及び／若しくはR4b R4c、及び／若しくはR7aR7b、及び／若しくはR8a R8b、及び／若しくはR9a R9b、及び／若しくはR11aR11b、及び／若しくはR12a R12b、及び／若しくはR15a R15b、及び／若しくはR16aR16bは、一緒になって=O (酸素に対する二重結合)を与え；R4aはCH2、O、NH若しくはSであり；並びに
【００２４】
【化８】
2019503356.tif 000008
【００２５】
は単結合若しくは二重結合を表す。
【００２６】
トリパータイト化合物又はそれらの医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターは、式 (VI)若しくは式 (Vb)に記載の、少なくとも1の化合物から選択される。
【００２７】
【化９】
2019503356.tif 000009
【００２８】
前記式中、
R2は、メチル若しくはシクロプロピルであり；
R3は、水素原子若しくはCH3であり；
R4とR5は、トリフルオロメチルであり；及び
【００２９】
【化１０】
2019503356.tif 000010
によって表される官能基であり、以下の式によって表される官能基であり、
【化１１】
2019503356.tif 000011
【００３０】
前記式中、
R6は、水素原子、メチル、エチル若しくはイソプロピルであり；
R7は、水素原子、メチル若しくは塩素原子；及び
R8は、水素原子、フッ素原子、塩素原子若しくはメチル；又は
3-メチルチオフェン-2-イルである。
【００３１】
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、該部分構造：
【００３２】
【化１２】
2019503356.tif 000012
【００３３】
は、
【００３４】
【化１３】
2019503356.tif 000013
【００３５】
であるか又はR3は水素原子であり、及びR3’は水素原子である。
【００３６】
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、以下の構造に示されるように、-F2-によって、リンカーLに共有結合する、部分-R2’-F1-Mは、以下の通りである。
【００３７】
【化１４】
2019503356.tif 000014
【００３８】
前記式中、
R3は水素若しくは-CH3であり；R4は水素若しくはフッ素である。
【００３９】
トリパータイト化合物又はその医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、以下の構造に示されるように、-F2-によって、リンカーLに共有結合する、部分-R2’-F1-Mは以下の通りである。
【００４０】
【化１５】
2019503356.tif 000015
【００４１】
トリパータイト化合物又はそれらの医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、以下の構造に示されるように、Yによって、リンカーLに共有結合する、部分-F2-R2’-F1-Mは、以下：
【００４２】
【化１６】
2019503356.tif 000016
【００４３】
【化１７】
2019503356.tif 000017
【００４４】
前記式中、
R3は水素原子又はCH3であり；R4は水素又はフッ素である
からなる化合物のリストから選択される、及びそれらの組合せである。
【００４５】
トリパータイト化合物又はそれらの医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、以下の構造に示されるように、Yによって、リンカーLに共有結合する、部分-F2-R2’-F1-Mは、以下：
【００４６】
【化１８】
2019503356.tif 000018
【００４７】
【化１９】
2019503356.tif 000019
【００４８】
からなる化合物のリストから選択される、及びそれらの組合せである。
【００４９】
トリパータイト化合物又はそれらの医薬的に許容される塩の別の好ましい実施形態においては、以下:
【００５０】
【化２０】
2019503356.tif 000020
【００５１】
【化２１】
2019503356.tif 000021
【００５２】
前記式中、
R3は水素原子又は-CH3である
の構造からなる化合物のリストから選択される。
【００５３】
本発明の別の態様においては、トリパータイト化合物のプロドラッグが提供される。
【００５４】
本発明の別の態様においては、トリパータイト化合物又はそのプロドラッグを含む医薬組成物が提供される。
【００５５】
別の好ましい実施形態においては、医薬組成物は、タキキニン受容体アンタゴニストとしての使用のためのものである。
【００５６】
別の好ましい実施形態においては、医薬組成物は、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療のために提供される。
【００５７】
別の好ましい実施形態においては、医薬組成物は、下部尿路疾患、胃腸疾患又は中枢神経系疾患の予防又は治療における使用のために提供される。
【００５８】
別の好ましい実施形態においては、医薬組成物は、過活動膀胱、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、嘔吐、吐き気、うつ病、不安神経症、不安、全般性不安障害（GAD）、骨盤内臓痛又は間質性膀胱炎の予防又は治療のために提供される。
【００５９】
別の好ましい実施形態においては、医薬組成物は、化学療法誘発性悪心・嘔吐（CINV）、周期性嘔吐症候群、術後の悪心・嘔吐、情動性及び嗜癖性障害（うつ病及び不安を含む）、全般性不安障害（GAD）、炎症性腸疾患を含む胃腸障害、過敏性腸症候群、胃不全麻痺及び機能性ディスペプシア（functional dyspepsia）、関節炎を含む慢性炎症性障害、COPD及び喘息を含む呼吸器疾患、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛及び内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス及び細菌感染並びに増殖性障害（がん）、並びにそれらの組合せのリストから選択されるエンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療に提供される。
【００６０】
別の好ましい実施形態においては、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気は、体性痛又は内臓痛である。
【００６１】
別の好ましい実施形態においては、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気は、慢性的な疾患又は病気である。
【００６２】
本発明の別の態様においては、トリパータイト化合物はエンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療において使用される。
【００６３】
本発明の別の態様においては、医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、治療有効量のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を、少なくとも1の医薬的に許容される担体若しくは希釈剤と共に含む。
【００６４】
本発明の別の態様においては、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングする、以下の式のトリパータイト化合物が提供される。
【００６５】
【化２２】
2019503356.tif 000022
【００６６】
本発明の別の態様は、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングする、式（Ie）のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【００６７】
【化２３】
2019503356.tif 000023
【００６８】
前記式中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターであり；
該リピッドアンカーは、4℃で非イオン性界面活性剤に不溶性である脂質膜に分配される。
【００６９】
別の態様においては、本発明は、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングする、式 (Ia)のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【００７０】
【化２４】
2019503356.tif 000024
【００７１】
前記式中、
LAは、式(IIa)又は(IIIa)によって表される、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーである。
【００７２】
【化２５】
2019503356.tif 000025
【００７３】
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH若しくはC1-3アルキルであり；
R4aは、C、O、NH若しくはSであり；
【００７４】
【化２６】
2019503356.tif 000026
【００７５】
は、単結合若しくは二重結合を表し；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー基であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである。
【００７６】
別の態様においては、本発明は、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をターゲティングする、式(Ib)のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【００７７】
【化２７】
2019503356.tif 000027
【００７８】
前記式中、
LAは、式(IIa)又は(IIIa)によって表される、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーである。
【００７９】
【化２８】
2019503356.tif 000028
【００８０】
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH若しくはC1-3アルキルであり；
R4aは、C、O、NH若しくはSであり；
【００８１】
【化２９】
2019503356.tif 000029
【００８２】
は、単結合若しくは二重結合を表し；
Lは、式(IVa)によって表される。
【００８３】
【化３０】
2019503356.tif 000030
【００８４】
前記式中、
Zは、リンカーとリピッドアンカーとの間の結合基であり、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり；又は
Zは、隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸であり；該アミノ酸は、側鎖官能基を介して該リピッドアンカーに結合し；
Yは、該リンカーとエンドソーマルGPCRのモジュレーターとの間の結合基であり、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-若しくは-C(O)S-であり；又は
Yは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるアミノ酸であり；該アミノ酸は、その側鎖官能基を介してエンドソーマルGPCRのモジュレーターに結合し；
mは1若しくは2であり；
nは1〜20であり；
pは1〜8であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである。
【００８５】
本発明の別の態様は、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をモジュレートする方法であって、エンドソーマルGCPRを、本明細書において定義される式 (Ie)のトリパータイト化合物と接触させることを含む、方法を提供する。
【００８６】
本発明の別の態様においては、それを必要とする対象において、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をモジュレートする方法であって、有効量の本明細書において定義される式(Ie)のトリパータイト化合物を、該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８７】
本発明の別の態様は、エンドソーマル物質P (SP)又はニューロキニン1受容体(NK1R)シグナル伝達によって媒介される疾患又は病気を治療する方法であって、有効量の本明細書において定義される式 (Ie)のトリパータイト化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８８】
本発明の更なる態様においては、エンドソーマルCGRPシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気を治療する方法であって、有効量の本明細書において定義される式 (Ie)の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００８９】
本発明のこれらの及び他の態様は、添付の実施例及び請求項に関連して、以下の詳細な説明を読むことにより、当業者により明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１：様々な部分及び該部分間の連結パターンを示す、本発明のトリパータイト化合物の模式図。
【図２】図２：トリパータイト化合物である化合物Aを調製するための合成手順。
【図３】図３：トリパータイト化合物である化合物Bを調製するための合成手順。
【図４】図４：これらのモジュレーターを、-Y-を介して、リンカーにカップリングする前に、コアモジュレーター部分である化合物C-1及び化合物C-2を調製するための合成手順。
【図５】図５：NK1R細胞内トラフィッキングの図（Graphical representations）。A. NK1R-RLuc8、β-arr1/2-YFP、KRas-Venus又はRab5a-Venus間の近接のBRET分析。B〜C. NK1R-RLuc8と、β-arr1-YFP (B)又はβ-arr2-YFP (C)との間における、HEK293細胞内におけるSP誘導性BRET。D〜F. NK1R-RLuc8と、KRas-Venus (D、E)又はRab5a-Venus (D、F)との間における、HEK293細胞内におけるSP誘導性BRET。E、Fは、エンドサイトーシス阻害剤の影響を示す。*P<0.05、***P<0.001。3回の反復観察、実験はn>3。
【図６】図６：NK1R 細胞内シグナル伝達の図（A、C、E）。核内で活性化したERK (NucEKAR)、細胞質内で活性化したPKC (CytoCKAR)及び細胞質内のcAMP (CytoEpac2)の検出のためのFRETバイオセンサー。核ERK (B、G、H)、細胞質PKC (D)及び細胞質cAMP (F)のためのバイオセンサーを用いての、NK1R発現HEK293細胞内におけるSP誘導性FRET。エンドサイトーシス阻害剤の影響を示す。B、D、E、G、Hは、曲線下面積(AUC)を示す。ビヒクルに対するSP、**P<0.01、***P<0.001；Dy4、PS2、ダイナミンK44E、ダイナミンsiRNA、又はクラスリンsiRNAを用いた場合のSPに対するSP対照、^^P<0.01、^^^P<0.001。n=30〜170細胞。
【図７】図７：Gタンパク質依存性NK1Rシグナル伝達の図。A〜D. NK1R-RLuc8及びKRas-Venus (A)、NK1R-RLuc8及びRab5a-Venus (B)、Gαq-RLuc8及びGγ2-Venus (C)、並びにGαq-RLuc8及びRab5a-Venus (D)の間の、HEK293細胞内における15分後のSP誘導性BRET。ベースラインに対して、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。3回の反復観察、実験はn>3。E〜G. 核ERK (E)、細胞質PKC (F)及び細胞質cAMP (G)についての、NK1R発現HEK293細胞内におけるSP誘導性FRET。ビヒクルに対するSP、***P<0.001；阻害剤を用いた場合のSPに対するSP対照、^^^P<0.001。n=35〜67細胞。
【図８】図８：脊髄ニューロンにおけるSP誘発性NK1Rエンドサイトーシス及び興奮性の図。A. ラット脊髄切片の後角ラミナIニューロンにおける、SP刺激性NK1R-IRエンドサイトーシスに対するエンドサイトーシス阻害剤の影響。結果は、ラット脊髄ニューロンにおける細胞膜NK1R-IRに対する細胞質の比を示す。****P<0.0001、処理毎に、n=6ニューロン。Veh、ビヒクル。B〜D. ラット脊髄ニューロンのSP誘発性の発火に対するエンドサイトーシス阻害剤の影響。Bは代表的なトレースを示す。Cは、2分での反応に対して標準化した発火率を示す(P>0.05)。Dは、最後の活動電位に対する反応期間で、発火時間を示す。処理毎に、n=7細胞、17ラット、*P<0.05、**P<0.01。
【図９】図９：脊髄ニューロンにおけるNK1Rエンドサイトーシス及びERKシグナル伝達の（of of）図。ビヒクル(Veh)又はカプサイシン (Cap)の足底内 (i.pl.)注射の30分前に、ビヒクル、Dy4、Dy4（不活性）、PS2又はPS2（不活性）を、ラットの髄腔内 (i.t.)に注射した。Aは、細胞膜NK1R-IRに対する細胞質の割合を示し、Bは、NeuN-IRニューロンに対するpERK-IRの割合を示す。LI、LIIは、ラミナI、II。スケールは、A、10μm；C、25μm。**P<0.01、***P<0.001。n=3ラット；NK1R、状態毎に6細胞の分析、状態毎に6フィールドのp-ERK分析。
【図１０】図１０：マウスにおける機械的痛覚過敏、炎症性浮腫及び運動協調の図。A〜D. 左脚に対して、カプサイシン (Cap)又はビヒクル(Veh)を足底内に注射する30分前に、ビヒクル又はエンドサイトーシス阻害剤を髄腔内に注射した。A、Bは、注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を示す。Cは、注射を受けた左脚の浮腫反応を示す。D. ローターロッドの落下までの時間を測定する30分前に、ビヒクル又はエンドサイトーシス阻害剤を髄腔内に注射した。E〜H. 左脚に対して、カプサイシンを足底内に注射する24〜48時間前に、ダイナミン-1 (E、F)、βarr1＋2 (G、H)に対するsiRNA又は対照siRNAを、髄腔内に注射した。E、Gは、ウェスタンブロットによって決定したダイナミン-1 (E)、及びRT-PCRによって決定したβarr1＋2 (G)の後角におけるノックダウンを示す。F、Hは、注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を示す。I. 左脚に対して、カプサイシン又はビヒクルを足底内に注射する30分前に、ビヒクル又はU0126を髄腔内に注射した。注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を測定した。J、K. ホルマリン (Form)を足底内に注射する30分前に、ビヒクル又はエンドサイトーシス阻害剤を髄腔内に注射した。生体防御行動を60分間、測定した。Jは、反応のキネティックすを示す。Kは、第一段階及び第二段階（phases）の期間中の反応を示す。L. ビヒクル又はエンドサイトーシス阻害剤を髄腔内に注射する36時間前に、左脚に対してCFAを注射した。注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を測定した。Veh/Cap、対照siRNAi、veh/Form又はCFA/Vehと比較して、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。(n)マウス数。
【図１１】図１１：トリパータイト・プローブを使用した、エンドソーマルNK1Rのターゲティングの図。A. Cy5、スパンタイド又はL-733,060（カーゴ（cargo））を有するトリパータイト・プローブの構造。B. HEK293細胞における、Cy5-エチルエステル又はCy5-コレスタノール (Cy5-Chol)の取り込み(30分、37℃)。アスタリスク、細胞外；矢じり、細胞膜；矢印、エンドソーム。スケール、10μm。C. HEK293細胞における核ERKのSP活性化。プレインキュベーション：スパンタイド (Span)、化合物1又はSR140,333 (SR)を用いて、細胞を30分間プレインキュベートし、次いで（阻害剤の存在下）SPを用いて直ぐに刺激した。パルスインキュベーション：スパンタイド、化合物1又はSR140,333を用いて、細胞を30分間パルスインキュベートし、洗浄し、洗浄の240分後にSPを用いて刺激した。結果は、20分超の曲線下面積（AUC）を示す。ビヒクル(Veh)に対するSP、**P<0.01、***P<0.001；スパンタイド、スパンタイド-コレスタノール又はSR140,333を用いたSPに対する、ビヒクルを用いたSP、^^^P<0.001。n=31〜83細胞。
【図１２】図１２：トリパータイト・プローブを使用した、脊髄ニューロンにおけるエンドソーマルNK1Rのターゲティングの図。A〜C.ラット脊髄ニューロンのSP誘発性の発火。Aは、代表的なトレースを示す。Bは、2分での反応に対して標準化した発火率を示す（イベント数／2分：化合物1、196.6±81.6；スパンタイド、242.6±95.9；P>0.05）。Cは、最後の活動電位に対する反応期間で、発火時間を示す。処理毎に、n=7細胞、18ラット、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。D、E. 左脚に対してカプサイシン (Cap)を足底内に注射する、3時間前（D）又は30分後（E）に、ビヒクル (Veh)、Cy5-コレスタノール(Cy5-Chol)、スパンタイド (Span)又は化合物1を、マウスの髄腔内に注射した。注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を示す。F、G. ホルマリン (Form)を足底内に注射する30分前に、ビヒクル、SR140,333 (SR)、スパンタイド又は化合物1を、マウスの髄腔内に注射した。生体防御行動を、60分間測定した。Fは、反応キネティックスを示し、Gは、第一段階及び第二段階の期間中の反応を示す。H、I. ビヒクル、SR140,333 (SR)、スパンタイド又は化合物1を髄腔内に注射する36時間前に、マウスの左脚に対してCFAを注射した。CFAの36〜39時間 (H)又は39〜42時間(I)後に、マウスの異なる群において、注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を測定した。J. 左脚に対して、カプサイシンを足底内に注射する3時間前に、ビヒクル (Veh)、L-733,060 (L733)又は化合物4を、マウスの髄腔内に注射した。注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を示す。Cy5-コレスタノール又はビヒクルに対して、**P<0.01、****P<0.0001。(n)、マウス数。
【図１３】図１３：マウスにおけるCGRP媒介性機械的痛覚過敏の図。A、B. 左脚に対してカプサイシン (Cap)を足底内に注射する3時間前に、ビヒクル (Veh)、オルセゲパント (Olceg)、化合物4又はフリーのCGRP8-37を、髄腔内に注射した。Aは、注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を示し、Bは、注射を受けていない右脚のvon Frey逃避反応を示す。C、D. 左脚に対してホルマリンを足底内に注射する3時間前に、ビヒクル、オルセゲパント、化合物4又はフリーのCGRP8-37を、髄腔内に注射した。生体防御行動を、60分間測定した。Cは、反応キネティックスを示し、Dは第一段階及び第二段階の期間中の反応を示す。E. ビヒクル、化合物4又はフリーのCGRP8-37を髄腔内に注射する36時間前に、完全フロイントアジュバント (CFA)をマウスの左脚に注射した。完全フロイントアジュバントの39〜42時間後、注射を受けた左脚のvon Frey逃避反応を測定した。ビヒクルに対して、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。(n)、マウス数。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
発明の詳細な説明
活性化時に、エンドソームに確実にトラフィックする（traffics）典型的なGPCRとして、物質P (SP)ニューロキニン1受容体 (NK1R)を研究することによって、エンドソーマルGPCRが、脊髄ニューロンにおける興奮及び侵害受容伝達の根底にある、持続シグナルを運搬するということが、現在示されている。これらの発見は、エンドソームにおけるGPCRのターゲティングが、最適な薬理学的介入に必要であることを示唆する。エンドソームが、病態生理学的に重要なプロセスの根底にある、区分化されたGPCRシグナル伝達のためのプラットフォームであるという概念は、受容体シグナル特異性及び治療ターゲティングのために意義がある。エンドソーマル・トラフィッキングによって、同じGタンパク質及びβarrを活性化する様々な受容体が、どのように反応を特異的に調節し得るかを、説明し得る細胞内区分化におけるシグナルを、GPCRが、生成することを可能にする。エンドソームに対するGPCRモジュレーターの運搬によって、有効性及び選択性の向上した疾患関連プロセスの根底にある、シグナルのターゲティングが可能となり得る。
【００９２】
カベオラに局在するGPCRエンドセリンB型 (ETBR)をターゲティングすることによって、効果的な抗腫瘍治療を提供し得ることが既に示唆されている (WO2005/097199を参照)。ETBRは、血管収縮、細胞の発達、分化及び有糸分裂誘発に対する多様な生理効果を媒介することが示されている (Yamaguch, T.ら、Eur. J. Biochem 2003, 270, 1816-1827)。エンドソームとは異なり、カベオラは細胞膜内に形成された、小さいフラスコ状又はカップ状の窪みであり、エンドソームとは異なり、カベオラはクラスリンで覆われていない。
【００９３】
今回、エンドソーマルGPCRをターゲティングすることによって、エンドソーマルGPCRシグナル伝達によって媒介される、疾患及び病気の治療及び予防の新規な方法を提供することが、初めて発見されている。
【００９４】
一実施形態においては、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をモジュレートするための、式 (I)に記載のトリパータイト化合物が提供される。
【００９５】
別の実施形態においては、本発明は、エンドソーマルGPCRシグナル伝達をモジュレートする方法であって、有効量の本明細書において定義される式 (Ie)の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００９６】
本明細書において用いられる場合、用語「トリパータイト化合物」は、リンカー基に共有結合したエンドソーマルGPCRモジュレーターを含む化合物を指し、リピッドアンカーに共有結合する該リンカー基は、細胞膜の脂質二重層に対して、究極には早期エンドソームの膜に対して、式 (I)又は(Ie)の化合物をアンカーできるようにする。
【００９７】
本明細書において用いられる場合、用語「リピッドアンカー(LA)」は、脂質膜に分配することができ、それにより脂質膜に式 (I)の化合物をアンカーすることができる部分を意味する。脂質膜への分配は、細胞外腔若しくは小胞内腔から直接起こり得る、又は脂質二重層から横方向に（laterally）起こり得る。
【００９８】
好ましい一実施形態においては、リピッドアンカーは、脂質膜に分配するその能力によって特徴付けることができ、それにより、前記脂質膜は4℃での非イオン性界面活性剤中での不溶性によって特徴付けられる。
【００９９】
好適なリピッドアンカーの例としては、コレステロール、コレスタノール、スフィンゴ脂質、GPIアンカー又は飽和脂肪酸誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。多くのそのようなリピッドアンカーは、当該技術分野において、例えば、その全体が参照により本明細書に取り込まれるWO2005/097199において、記載されている。
【０１００】
一実施形態においては、リピッドアンカーは、式 (IIa)又は(IIIa)から選択される部分である。
【０１０１】
【化３１】
2019503356.tif 000031
【０１０２】
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH又はC1-3アルキルであり；
R4aは、-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-NH(CH2)aOPO3--、-NH(CH2)aSO2CF2-、-NH(CH2)aSO2NH-、-NHCONH-、-NHC(O)O-、-NHCH(CONH2)(CH2)bC(O)O-、-NHCH(COOH)(CH2)bC(O)O-、-NHCH(CONH2)(CH2)bCONH-、-NHCH(COOH)(CH2)bCONH-、-NHCH(CONH)(CH2)4NH((CO)CH2O)e-又は-NHCH(COOH)(CH2)4NH((CO)CH2O)e-であり；
aは2〜3の整数であり；
bは1〜2の整数であり；
eは0〜1の整数であり；並びに
【０１０３】
【化３２】
2019503356.tif 000032
【０１０４】
は、単結合又は二重結合を表す。
【０１０５】
他の実施形態においては、リピッドアンカーは、式 (VIa)、(VIIa)、(VIIIa)又は(IXa)から選択される部分である。
【０１０６】
【化３３】
2019503356.tif 000033
【０１０７】
前記式中、
R4aは、上記の通りであり；
【０１０８】
【化３４】
2019503356.tif 000034
【０１０９】
は、単結合又は二重結合を表し；
【０１１０】
【化３５】
2019503356.tif 000035
【０１１１】
は、単結合、二重結合又は三重結合を表し；
各々において出現する（each occurrence of）R5aは、独立して、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-又は-NHS(O2)-であり；
各々において出現するR6aは、独立して、C14-30アルキル基であり、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子によって置換され；
各々において出現するR7aは、独立して、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲン又はOであり、但し、R7aが、NH2、NHCH3、OH、H又はハロゲンである場合、
【０１１２】
【化３６】
2019503356.tif 000036
【０１１３】
は、単結合であり、R7aが、Oである場合、
【０１１４】
【化３７】
2019503356.tif 000037
【０１１５】
は、二重結合であり；
各々において出現するR8aは、独立して、H、OHであるか、又は
【０１１６】
【化３８】
2019503356.tif 000038
【０１１７】
が、三重結合を表す場合、存在せず；
R9aは、C10-30アルキル基であり、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子によって置換され；並びに
各々において出現するR10aは、独立して、C24-40アルキレン基、C24-40アルケニレン基又はC24-40アルキニレン基、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子によって置換される。
【０１１８】
更なる実施形態においては、リピッドアンカーは式 (Xa)又は(XIa)から選択される部分である。
【０１１９】
【化３９】
2019503356.tif 000039
【０１２０】
前記式中、
【０１２１】
【化４０】
2019503356.tif 000040
【０１２２】
は、単結合又は二重結合を表し；
【０１２３】
【化４１】
2019503356.tif 000041
【０１２４】
は、単結合、二重結合又は三重結合を表し；
各々において出現するR13aは、独立して、-O-又は-CO(CH2)a(CO)bO-であり、aは1〜3の整数であり、bは0〜1の整数であり；
R14aは、-O-又は-OC(O)-であり；
各々において出現するR15aは、独立して、C16-30アルキル基から選択され、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子で置換され；
R16aは、-PO3-CH2-、-SO3CH2-、-CH2-、-CO2CH2-又は直接結合であり；
R17aは、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-又は-NHS(O2)-であり；
R18aは、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲン又はOであり；
R19aは、C16-30アルキル基であり、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子で置換され；並びに
各R20aは、C(O)C13-25アルキル基、任意選択で、以下の式の基で置換される。
【０１２５】
【化４２】
2019503356.tif 000042
【０１２６】
前記式中、
【０１２７】
【化４３】
2019503356.tif 000043
【０１２８】
は、単結合又は二重結合であり；
R21aは、-PO3-CH2-、-SO3CH2-、-CH2-、-CO2CH2-又は直接結合であり；
R22aは、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-又は-NHS(O2)-であり；
R23aは、-O-又は-OC(O)-であり;
各々において出現するR24aは、独立して、C16-30アルキル基から選択され、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子で置換され；
R25aは、-CO(CH2)a(CO)bO-又は-CO(CH2)a(CO)bNH-であり、aは1〜3の整数であり、bは0〜1の整数であり；並びに
R26aは、C4-20アルキル基であり、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子で置換される。
【０１２９】
更なる実施形態においては、リピッドアンカーは、式 (XIIa)、(XIIIa)、(XIVa)又は(XVa)から選択される部分である。
【０１３０】
【化４４】
2019503356.tif 000044
【０１３１】
前記式中、
各々において出現するR27aは、独立して、-NH-、-O-、-NH(CH2)cOPO3--、-NH(CH2)cSO2NH-、-NHCONH-、-NHC(O)O-、-CO(CH2)b(CO)aNH-、-CO(CH2)b(CO)aO-、-CO(CH2)bS-、-CO(CH2)bOPO3--、-CO(CH2)bSO2NH-、-CO(CH2)bNHCONH-、-CO(CH2)bOCONH-、-CO(CH2)bOSO3-又は-CO(CH2)bNHC(O)O-から選択され、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、cは2〜3の整数であり;
各々において出現するR28aは、独立して、-CH2-又は-O-であり；
各々において出現するR29aは、独立して、H又はC16-30アルキル基から選択され、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子によって置換され；
各々において出現するR31aは、独立して、H又はC1-15アルキル基から選択され、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子によって置換され、又はC1-15アルコキシ基は、任意選択で、フッ素、任意選択で、1〜4のフッ素原子によって置換され；並びに
nは1〜2の整数である。
【０１３２】
本明細書において用いられる場合、用語「リンカー」は、エンドソーマルGPCRのモジュレーターをリピッドアンカーに連結する化合物の部分に関連する。該リンカーは、リガンド結合部位でエンドソーマルGPCRのモジュレーターと競合しないよう、選択されるべきであることが理解される。また、該リンカーは、脂質膜に分配されるべきでない。
【０１３３】
リピッドアンカーがエンドソーム膜内にアンカーされる場合、該リンカー基は、任意選択で、エンドソーマルGPCRのモジュレーターが受容体と相互作用できるようにするために、1 nm〜50 nmの間の長さでなければならない。
【０１３４】
一実施形態においては、該リンカー基は、1以上のポリエチレングリコール単位を含む。別の実施形態においては、該リンカー又は該リンカーのサブユニットは、どちらの官能基の機能にも干渉することなく、エンドソーマルGPCRのモジュレーターとリピッドアンカーとの間の十分な距離を提供する、アミノ酸残基、誘導体化若しくは官能化したアミノ酸残基、ポリエーテル、尿素、カルバミン酸塩、スルホンアミド又は他のサブユニットであり得ることが想定される。
【０１３５】
一実施形態においては、該リンカーは、式 (IVa)の部分によって表される。
【０１３６】
【化４５】
2019503356.tif 000045
【０１３７】
前記式中、
Zは、リピッドアンカーに対するリンカーの結合基であり、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり；又は
Zは、隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸であり；該アミノ酸は、側鎖官能基を介して該リピッドアンカーに結合し；
Yは、該リンカーとエンドソーマルGPCRのモジュレーターとの間の結合基であり、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-若しくは-C(O)S-であり；又は
Yは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるアミノ酸であり；該アミノ酸は、その側鎖官能基を介してエンドソーマルGPCRのモジュレーターに結合し；又は
Yは、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)のモジュレーターである、モジュレーターXに対する、リンカーの結合基であり、ここで
a2) Yは、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-若しくは-C(O)S-によって定義され；又は
b2) 隣接するアミド基とまとめられる場合、Yは、以下：
a. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるαアミノ酸；該αアミノ酸は、任意選択で、前記αアミノ酸の少なくとも1の側鎖官能基を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；或いは
b. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を含む、β、γ若しくはδアミノ酸；前記β、γ若しくはδアミノ酸は、任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも1を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；或いは
c. α、β、γ若しくはδアミノ酸から形成されるペプチドであって、該ペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を有する、少なくとも1のα、β、γ若しくはδアミノ酸を含み；又はそれらの組合せであって、前記ペプチドは、任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも1を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；
によって定義され、
mは1若しくは2であり；
nは1〜20であり；及び
pは1〜8である。
【０１３８】
別の実施形態においては、リンカーは、式 (XXa)の部分によって表される。
【０１３９】
【化４６】
2019503356.tif 000046
【０１４０】
前記式中、
各々において出現するR11aは、独立して、天然で生じた、誘導体化又は官能化したアミノ酸残基の任意の側鎖であり；
mは3〜80の整数であり；及び
nは0〜1の整数である。
【０１４１】
他の実施形態においては、リンカーは式 (XXIa)の部分によって表される。
【０１４２】
【化４７】
2019503356.tif 000047
【０１４３】
前記式中、
mは0〜40の整数であり；
nは0〜1の整数であり；
各々において出現するoは、独立して、1〜5の整数であり；
各々において出現するR11aは、独立して、天然で生じた、誘導体化若しくは官能化したアミノ酸残基の任意の側鎖であり；及び
SO2末端はリピッドアンカーに結合し、N末端はエンドソーマルGPCRのモジュレーターに結合する。
【０１４４】
別の実施形態においては、リンカーは式 (XXIIa)の部分によって表される。
【０１４５】
【化４８】
2019503356.tif 000048
【０１４６】
前記式中、
mは0〜40の整数であり；
nは0〜1の整数であり；
各々において出現するoは、独立して、1〜5の整数であり；
各R12aは、独立して、NH若しくはOであり；
各々において出現するR11aは、独立して、天然で生じた、誘導体化若しくは官能化したアミノ酸残基の任意の側鎖であり；及び
C(O)末端はリピッドアンカーに結合し、R12a末端はエンドソーマルGPCRのモジュレーターに結合する。
【０１４７】
多くの好適なリンカー部分は、その全体が参照により本明細書に取り込まれるWO2005/097199に記載されている。
【０１４８】
本明細書において用いられる場合、用語「エンドソーマルGPCRのモジュレーター」は、エンドソームにエンドサイトーシスされるGタンパク質共役受容体のアゴニスト、及びアンタゴニスト又は阻害剤を指す。
【０１４９】
一実施形態においては、GPCRモジュレーターは、受容体のアゴニストである。別の実施形態においては、GPCRモジュレーターは、アンタゴニスト又は阻害剤である。
【０１５０】
GPCRモジュレーターは、有機分子、ポリペプチド配列、ホルモン、タンパク質フラグメント又はこれらのいずれかの誘導体を含む、任意の形態であり得るが、それらに限定されない。
【０１５１】
特に、GPCRモジュレーターは、任意選択で、有機分子であるか、又は代替的若しくは追加的に、ホルモン、或いはこれらの誘導体である。
【０１５２】
本明細書において用いられる場合、用語「エンドソーマルGPCRシグナル伝達」は、エンドソーム、任意選択で、早期エンドソームに取り込まれている活性化したGタンパク質共役受容体によって伝達されたシグナルを指す。
【０１５３】
一実施形態においては、エンドソーマルGPCRシグナル伝達は、受容体が早期エンドソームに取り込まれる場合に、細胞膜で最初に伝達され、維持されるシグナル伝達である。
【０１５４】
別の実施形態においては、エンドソーマルGPCRシグナル伝達は、受容体エンドサイトーシスを必要とする、及び／又はエンドソーム膜に対して選択的に起こるシグナル伝達、例えば、β-アレスチン媒介性シグナル伝達である。βarrは、細胞表面で、アゴニストが占有し、Gタンパク質共役受容体キナーゼ (GRK)によってリン酸化されたGPCRと相互作用し、ダイナミン依存的及びクラスリン依存的なエンドサイトーシスを介して、細胞表面から早期エンドソームに、リガンドが結合した受容体の輸送を促進すると考えられる。本経路は、細胞膜でのGタンパク質依存的なシグナル伝達とは異なる、第二シリーズのエンドソーマルGPCRシグナル伝達を媒介し得ることが、最近発見されている。本機構の重要性は、GPCRがβarrと相互作用するアフィニティーに依存し、それはGRKによるGPCRのリン酸化の程度に依存して変化すると考えられる。「クラスA」GPCR (例えば、β2AR、α1bAR)は、殆んどリン酸化部位を持たず、細胞膜の殆んどで、βarr2に対するより高いアフィニティーで、一時的にβarr1及びβarr2と相互作用する。「クラスB」GPCR (例えば、AT1AR、NK1R)は、複数の部位でリン酸化され、細胞膜及びエンドソーム膜で、長い時間、高いアフィニティーで、βarr1及び2の両方と相互作用する。「クラスC」GPCR (例えば、ブラジキニンB2受容体)は、βarrと共にエンドソーム内に内在化し、その後、アゴニストが除かれた際には、βarrが急速に解離する。
【０１５５】
βarr誘導性MAPKシグナル伝達の程度は、βarrに対する受容体のアフィニティーに依存し、それは受容体の構造及び該受容体をリン酸化する7つの哺乳動物のGRKに依存すると考えられる。したがって、AT1AR及びV2Rの活性化は、α1bAR及びβ2ARの活性化よりも大きい、βarr結合ERK1/2のリン酸化を引き起こす。このことは、本経路による、クラスB受容体のシグナルはより強い（more robustly）ことを示唆する。クラスBのGPCRとしては、セクレチン受容体、VPAC1受容体、VPAC2受容体、PAC1受容体、グルカゴン受容体、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)受容体、グルカゴン関連ペプチド1 (GLP-1)受容体、グルカゴン関連ペプチド2 (GLP-2)受容体、胃抑制ポリペプチド (GIP)受容体、コルチコトロピン放出因子1 (CRF1)受容体、コルチコトロピン放出因子2 (CRF2)受容体、副甲状腺ホルモン1 (PTH1)受容体、副甲状腺ホルモン2 (PTH2)受容体、カルシトニン受容体様受容体、カルシトニン受容体、アンギオテンシンII受容体1型、バソプレッシン受容体 2、カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP)受容体、ニューロキニン1受容体 (NK1R)、及びプロテアーゼ活性化型受容体2 (PAR2)が挙げられる。
【０１５６】
本発明の幾つかの好ましい実施形態においては、一般式 (I)又は(Ie)を参照し、1以上の以下の実施形態を適用する。
a) LAは、コレステロール、コレスタノール、スフィンゴ脂質、GPIアンカー又は飽和脂肪酸誘導体から選択されるリピッドアンカーである。
b) LAは、式 (IIa)、(IIIa)、(VIIa)、(VIIIa)、(IXa)、(Xa)、(XIa)、(XIIa)、(XIIIa)及び(IXa)の部分から選択されるリピッドアンカーである。
c) LAは、式 (IIa)又は(IIIa)の部分から選択されるリピッドアンカーである。
d) Lは、1以上のサブユニットを含むリンカー部分であって、ポリエチレングリコール単位、アミノ酸残基、誘導体化若しくは官能化したアミノ酸残基、ポリエーテル、尿素、カルバミン酸塩及び／又はスルホンアミドを含む。
e) Lは、式 (IVa)、(XXa)、(XXIa)又は(XXIIa)によって表されるリンカー部分である。
f) Lは、式 (IVa)によって表されるリンカー部分である。
g) Xは、エンドソーマルGPCRのアゴニスト、任意選択で、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体のアゴニストである。
h) Xは、エンドソーマルGPCRのアンタゴニスト、任意選択で、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体のアンタゴニストである。
【０１５７】
好ましい実施形態においては、LAは、式 (IIa)又は(IIIa)によって表されるリピッドアンカーである。
【０１５８】
従って、一実施形態においては、本発明は、式 (Ia)によって表される、式 (I)のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１５９】
【化４９】
2019503356.tif 000049
【０１６０】
前記式中、
LAは、式 (IIa)又は(IIIa)によって表される、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーである。
【０１６１】
【化５０】
2019503356.tif 000050
【０１６２】
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH若しくはC1-3アルキルであり；
R4aは、C、O、NH若しくはSであり；及び
【０１６３】
【化５１】
2019503356.tif 000051
【０１６４】
は、単結合若しくは二重結合を表し；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー基であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターであり、任意選択で、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体である。
【０１６５】
別の好ましい実施形態においては、LAは、式 (IIa)又は(IIIa)によって表されるリピッドアンカーであり、Lは式 (IVa)によって表されるリンカーである。
【０１６６】
従って、別の実施形態においては、本発明は、式 (Ib)によって表される式 (I)のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１６７】
【化５２】
2019503356.tif 000052
【０１６８】
前記式中、
LAは、式 (IIa)又は(IIIa)によって表される、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーである。
【０１６９】
【化５３】
2019503356.tif 000053
【０１７０】
前記式中、
R1aは、任意選択で、C1-12アルキル基で置換され；
R2aとR3aは、独立してH若しくはC1-3アルキルであり；
R4aは、C、O、NH若しくはSであり；
【０１７１】
【化５４】
2019503356.tif 000054
【０１７２】
は、単結合若しくは二重結合を表し；
Lは、式 (IVa)によって表されるリンカーである。
【０１７３】
【化５５】
2019503356.tif 000055
【０１７４】
前記式中、
Zは、リンカーとリピッドアンカーとの間の結合基であり、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり；或いは
Zは、隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸であり；該アミノ酸は、側鎖官能基を介して該リピッドアンカーに結合し；
Yは、該リンカーとエンドソーマルGPCRのモジュレーターとの間の結合基であり、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-若しくは-C(O)S-であり；或いは
Yは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるアミノ酸であり；該アミノ酸は、その側鎖官能基を介して該エンドソーマルGPCRのモジュレーターに結合し；或いは
Zは、リピッドアンカーLAに対するリンカーの結合基であり；Zは以下：
a1) C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-若しくは-C2-C10アルキニルC(O)-；又は
b1) 隣接するアミンと一緒になって、任意選択で、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるC末端がアミド化されたアミノ酸であり；該アミノ酸が、その側鎖官能基を介してリピッドアンカーに結合し；
によって定義され、並びに
Yは、エンドソーマル・ニューロキニン-1受容体 (NK1R)のモジュレーターである、モジュレーターXに対する、リンカーの結合基であり、
a2) Yは、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)O-、-O-C(O)-、-NH-C(O)-若しくは-C(O)S-によって定義され；或いは
b2) 隣接するアミド基とまとめられる場合、Yは、以下：
a. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン若しくはスレオニンから選択されるαアミノ酸；該αアミノ酸は、任意選択で、前記αアミノ酸の少なくとも1の側鎖官能基を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；又は
b. アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン又はスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を含む、β、γ又はδアミノ酸；前記β、γ又はδアミノ酸は、任意選択で、前記側鎖官能基の少なくとも1を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；又は
c. α、β、γ又はδアミノ酸から形成されるペプチドであって、該ペプチドが、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリン又はスレオニンにおいても見出される側鎖官能基を有する、少なくとも1のα、β、γ又はδアミノ酸を含み；又はそれらの組合せであって、前記ペプチドが、任意選択で、少なくとも1の前記側鎖官能基を介して、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターに結合し；
によって定義され、
mは1若しくは2であり；
nは1〜20であり；
pは1〜8であり；及び
Xは、エンドソーマルGPCRのモジュレーターである。
【０１７５】
好ましい実施形態においては、Xは、エンドソーマルNK1受容体のモジュレーターである。
【０１７６】
物質P(SP)ニューロキニン1受容体(NK1R)は疼痛と炎症を媒介する (Steinhoff, M. S.ら、Physiol Rev 2014, 94, 265-301)。細胞膜NK1Rシグナル伝達のアンタゴニストを用いた前臨床試験によって、神経学的な及び炎症性の障害におけるその関与が支持されるが、これらのアンタゴニストは慢性疾患に対しては治療効果がない。NK1Rは、脊髄における疼痛伝達部位 (Marvizon, J. C.ら、J Neurosci 1997, 17, 8129-8136)及び血管系における炎症部位 (Bowden, J. J.ら、Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 8964-8968)で、エンドソームに、急速に及び完全に、再分布し、慢性的な疼痛と炎症を有する患者において内在化すると考えられる(Jarcho, J. M.ら、Pain, 2013)。
【０１７７】
驚くべきことに、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達が、ニューロンの活性化と痛覚過敏の根底にある細胞内シグナルを生成することが見出されている。一時的な受容体の潜在的なバニロイド1アゴニストであるカプサイシンを含む、痛みを伴う炎症性刺激は、後角ラミナI、IIにおける一次感覚性侵害受容器からのSPの放出を刺激する。そこでは、SPが、脊髄ニューロンにおいて、NK1Rエンドサイトーシスを刺激する。恐らく化合物の代謝とクリアランスのために、NK1Rアンタゴニスト・スパンタイドは、カプサイシン誘発性の痛覚過敏を改善することができないことが見出された。しかしながら、同じNK1Rアンタゴニストが本発明のトリパータイト化合物に取り込まれた場合、痛覚過敏が120分超で抑制された。このことは、エンドソームにおけるNK1Rの拮抗作用は、疼痛に対する効果的な治療であることを示唆する。
【０１７８】
うつ病及び気分障害、不安障害、物質中毒関連障害、アルコール関連障害、睡眠障害、摂食障害、自閉症スペクトラム障害、注意欠陥／多動性障害パーソナリティ障害、並びにがんを含む幅広い多様な障害の治療及び予防において、SP媒介性NK1R活性化の調節が関与している。NK1Rのモジュレーターはまた、炎症、アレルギー性障害、神経学的障害、嘔吐、疼痛及びがんの治療及び予防のために有用であり得る。
【０１７９】
一実施形態においては、本発明は、式 (Ic)によって表される式 (I)のトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１８０】
【化５６】
2019503356.tif 000056
【０１８１】
前記式中、
LAは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり；及び
Xは、エンドソーマルNK1Rのモジュレーターであり；
本発明の好ましい実施形態においては、該リピッドアンカーは、4℃で非イオン性界面活性剤に不溶性である脂質膜に分配される。
【０１８２】
好ましい実施形態においては、式 (Ic)の化合物又はその医薬的に許容される以下の塩から選択される。
【０１８３】
【化５７】
2019503356.tif 000057
【０１８４】
互いに連結されたX、L、LA、Y、Z、YとZの間のスペーサー、M、F1、F2、R1及びR2’を含む、本発明のトリパータイト化合物の個々の部分が、図1において模式的に記載されている。
【０１８５】
従って、モジュレーターXは部分M及びR1から形成され、R1は、部分F1、R2’及びF2を含む。部分F1は、MをR2’に共有結合させるために使用され、F2はR2’をYに共有結合させるために使用され、YはリンカーLの一部である。
【０１８６】
部分F1及びF2は、特定の置換パターンに限定されることなく、R2’に共有結合する。R2’での、F1及びF2の結合パターンは、F1、F2及びR2’に存在する官能基の効能によってのみ限定される。
【０１８７】
好ましいモジュレーター部分又はその医薬的に許容される塩は、以下の構造によって示される。
【０１８８】
-F2-によって、リンカーLに共有結合する部分-R2’-F1-Mは、以下の構造において示される。この定義の下においては、部分-R2’-F1-Mは、更に記載された構造において示されるのみであるF2を含まない。
【０１８９】
【化５８】
2019503356.tif 000058
【０１９０】
前記式中、R3は水素又は-CH3であり；R4は水素又はフッ素である。
【０１９１】
-F2-によって、リンカーLに共有結合する部分-R2’-F1-Mは、以下の構造において示される。この定義の下においては、部分-R2’-F1-Mは、更に記載された構造において示されるのみであるF2を含まない。
【０１９２】
【化５９】
2019503356.tif 000059
【０１９３】
Yによって、リンカーLに共有結合する、以下の7つの部分-F2-R2’-F1-M、及びそれらの組合せ、又はその医薬的に許容される塩は、以下の構造において示される（この定義の下においては、部分-F2-R2’-F1-Mは、更に記載された3つの構造において示されるのみであるYを含まない）。
【０１９４】
【化６０】
2019503356.tif 000060
【０１９５】
【化６１】
2019503356.tif 000061
【０１９６】
前記式中、R3は水素原子又はCH3であり；R4は水素原子又はフッ素である。
【０１９７】
Yによって、リンカーLに共有結合する、以下の7つの部分-F2-R2’-F1-M、及びそれらの組合せ、又はその医薬的に許容される塩は、以下の構造において示される（この定義の下においては、部分-F2-R2’-F1-Mは、更に記載された3つの構造において示されるのみであるYを含まない）。
【０１９８】
【化６２】
2019503356.tif 000062
【０１９９】
【化６３】
2019503356.tif 000063
【０２００】
トリパータイト化合物X-L-LA、又はその医薬的に許容される塩は、以下の構造を有する。
【０２０１】
【化６４】
2019503356.tif 000064
【０２０２】
【化６５】
2019503356.tif 000065
【０２０３】
前記式中、R3は水素原子又は-CH3である。
【０２０４】
一実施形態においては、本発明は、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気を治療する方法であって、有効量の本明細書において定義される式 (Ic)の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２０５】
別の実施形態においては、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療のための医薬の製造における、本明細書において定義される式 (Ic)の化合物の使用を提供する。
【０２０６】
別の実施形態においては、本発明は、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療のためのトリパータイト化合物の使用を提供する。
【０２０７】
更なる実施形態においては、本発明は、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療における使用のための、本明細書において定義される式 (Ic)の化合物を提供する。
【０２０８】
好ましい実施形態においては、エンドソーマルNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は病気は、化学療法誘発性悪心・嘔吐（CINV）、周期性嘔吐症候群、術後の悪心・嘔吐、情動性及び嗜癖性障害（うつ病及び不安を含む）、全般性不安障害 (GAD)、炎症性腸疾患を含む胃腸障害、過敏性腸症候群、胃不全麻痺及び機能性ディスペプシア（functional dyspepsia）、COPD及び喘息を含む呼吸器疾患、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛及び内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス及び細菌感染、並びに増殖性障害 (がん)から選択される。
【０２０９】
本発明の文脈内では、用語「疼痛」としては、慢性的な炎症性の疼痛 (例えば、関節リウマチ、変形性関節症、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎及び若年性関節炎に関連する疼痛)；筋骨格の疼痛、下背及び首の疼痛、捻挫及び緊張、神経因性疼痛、交感神経依存性疼痛、筋炎、がん及び線維筋痛に関連する疼痛、片頭痛に関連する疼痛、群発性及び慢性日常性頭痛に関連する疼痛、インフルエンザ又は他のウイルス感染、例えば風邪等に関連する疼痛、リウマチ熱、例えば非潰瘍性消化不良等の機能性腸傷害に関連する疼痛、非心臓胸部疼痛及び過敏性腸症候群、心筋虚血に関連する疼痛、術後の疼痛、頭痛、歯痛、月経困難症、神経痛、線維筋痛症候群、複合性局所疼痛症候群 (CRPS I型及びII型)、神経因性疼痛症候群 (糖尿病性ニューロパチー、化学療法誘発性神経因性疼痛、坐骨神経痛、非特異的な腰部の疼痛、多発性硬化症の疼痛、HIVに関連するニューロパチー、ヘルペス後の神経痛、三叉神経痛を含む)、並びに物理的外傷、切断、がん、毒素又は慢性的な炎症性の状態に起因する疼痛、が挙げられる。好ましい実施形態においては、疼痛は体性痛又は内臓痛である。
【０２１０】
別の好ましい実施形態においては、エンドソーマルGPCRのモジュレーターはエンドソーマルCGRP受容体の阻害剤である。
【０２１１】
神経ペプチドである、カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP)は、三叉神経節の多形一次感覚ニューロンによって、末梢及び中枢神経系の両方で、広く発現する。背脊髄中におけるCGRPの放出は、侵害受容伝達と関連しており、血管周囲神経終末からのCGRPの放出は、神経原性血管拡張及び肥満細胞からの炎症性メディエーターの放出を引き起こす (Benemei, S.ら、Curr. Opin. Pharmacol. 2009, 9(1) , 9-14；Durham P. L. N. Engl, J. Med. 2004, 350, 1073-1074)。CGRPは、疼痛の伝達及び炎症に寄与し、片頭痛の病態生理に不可欠な役割を果たすと考えられる (Durham, P. L. Headache、2006, 46, S3-S8)。CGRPはまた、疼痛、並びに変形性関節症及び関節リウマチを含む関節炎に関連する炎症に寄与すると考えられる (Walsh, D. A.ら、Br. J. Clin. Pharmacol., 2015, 80(5), 965-978)。
【０２１２】
CGRP受容体 (CGRP-R)は、カルシトニン受容体様受容体 (CLR、GPCR)及び受容体活性調節タンパク質-1 (RAMP1)の、2つのサブユニットからなる。CLR及びRAMP1の共発現及び二量体化によって、CGRPに対して高いアフィニティーを有するCGRP-Rが生成する (Russell, F. A.ら、Physiological Reviews, 2014, 94, 1099-1142)。CGRPの結合及び受容体の活性化は、CLRのリン酸化及び安定な複合体としてのCGRP-Rの内在化に繋がることが示されている (Hilairet, S.ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, 42182-42190)。内在化は、ダイナミン及びβ-アレスチンの両方に依存することが見出された。このことは、CLR、RAMP1及びβ-アレスチン間での三量複合体の形成によって、クラスリン被覆ピット（chathin-coated pit）媒介性のエンドサイトーシスが起こることを示している。
【０２１３】
選択的なCGRP-Rアンタゴニストである、テルカゲパント（Telcagepant）を用いた初期の研究によって、2時間後の疼痛緩和という主要評価項目で、中程度から重度の片頭痛発作の効果的な治療をもたらす、化合物の投与による有望な結果を示した(Ho, T. W.ら、Neurology, 2008, 70(16)1304-1312)。テルカゲパントはまた、24時間を超える維持された疼痛の緩和、及び、例えば光恐怖症、音声恐怖症及び悪心等の片頭痛関連症状の緩和のための効果的な治療として有望であることが示された。しかしながら、テルカゲパントが、肝臓肝酵素であるアラニントランスアミナーゼのレベルを、患者にとって許容できないレベルにまで有意に上昇させることが見出されたために、化合物の第IIa相臨床試験が中止した。
【０２１４】
CGRP-Rとして特定された別のアンタゴニストは、CGRP8-37である。ヒトにおいては、CGRPは、α-CGRP及びβ-CGRPの2つの形態で存在する。これらの形態は、別の遺伝子に由来し、3アミノ酸に関して異なるが、同様の生物学的機能を示す (Durham, P. L and Vause, C. V. CNS Drugs, 2010, 24(7), 539-548)。神経ペプチドα-CGRPにおける37アミノ酸の結合性研究によって、N末端の最初の7アミノ酸が受容体の活性化のために必須であることが明らかにされている。SAR研究によって、残りの18アミノ酸 (CGRP8-37)が受容体認識及びドッキングのために重要であることが示されている。しかしながら、この配列は、受容体の活性化に関与しないことが見出された。この発見によって、CGRP-R阻害剤として、CGRP8-37を使用することに繋がった。
【０２１５】
一実施形態においては、本発明は、式 (Id)によって表される式 (I)の化合物、又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【０２１６】
【化６６】
2019503356.tif 000066
【０２１７】
前記式中、
Aは、細胞膜への化合物の挿入を促進するリピッドアンカーであり；
Lは、1 nm〜50 nmの長さのリンカー部分であり；及び
Xは、エンドソーマル CGRP-Rのモジュレーターであり；
本発明の好ましい実施形態においては、リピッドアンカーは4℃で非イオン性界面活性剤に不溶性である脂質膜に分配される。
【０２１８】
一実施形態においては、XはCGRP-Rアンタゴニストのオルセゲパントである。
【０２１９】
別の実施形態においては、XはCGRP-RアンタゴニストCGRP8-37であり、式 (Id)の化合物又はその医薬的に許容される塩は化合物4によって表される。
【０２２０】
【化６７】
2019503356.tif 000067
【０２２１】
一実施形態においては、本発明は、エンドソーマルCGRP受容体シグナル伝達によって媒介される疾患又は病気を治療するための方法であって、有効量の本明細書において定義される式 (Id)の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２２２】
別の実施形態においては、本発明は、エンドソーマルCGRP受容体シグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療のための医薬の製造における、本明細書において定義される式 (Id)の化合物の使用を提供する。
【０２２３】
更なる実施形態においては、本発明は、エンドソーマルCGRP受容体シグナル伝達によって媒介される疾患又は病気の治療における使用のための、本明細書において定義される式 (Id)の化合物を提供する。
【０２２４】
一実施形態においては、エンドソーマルCGRP受容体シグナル伝達によって媒介される疾患又は病気は、片頭痛及び疼痛を含む片頭痛と関連する症状、光恐怖症、音声恐怖症、悪心及び嘔吐、感覚障害、体性痛及び内臓痛を含む疼痛、群発性及び慢性日常性頭痛に関連する疼痛、COPD及び喘息を含む呼吸器疾患、炎症性腸疾患を含む胃腸障害、過敏性腸症候群、胃不全麻痺及び機能性ディスペプシア（functional dyspepsia）、並びに変形性関節症及び関節リウマチを含む慢性的な炎症性の障害である。
【０２２５】
好ましい実施形態においては、エンドソーマルCGRP受容体シグナル伝達によって媒介される疾患又は病気は、片頭痛及びそれに関連する症状である。
【０２２６】
本発明の化合物を合成するための一般的な戦略は、調製の間に保護基を添加し除去した場合に適用される通常の操作を用いた固相ペプチド化学、並びに合成有機化学の確立された方法に依存する。図1は、最終的なトリパータイト化合物を形成するための、様々な部分及びそれらの結合パターンについて更に理解するための助けとなる一方で、重要な合成工程は、図2〜4に記載されている。
【０２２７】
コレステリルグリコール酸、3-コレステリルアミン及びコレステリルグリシンの合成は、文献に記載されている (Hussey, S. L.ら、J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12712-12713；Hussey, S. L.ら、Org. Lett. 2002, 4, 415-418；Martin, S. E.ら、Bioconjugate Chem. 2003, 14, 67-74)。ステロイド構造の3位で、アミド、スルホンアミド、尿素又はカルバメート官能基を有する、式 (IIIa)のリピッドアンカーは、3-コレステリルアミン（3-cholesterylaιnine）から調製され得、例えば、3-コレステリルアミンはDMAPの存在下で、無水コハク酸と反応し得、対応するスクシニル置換された化合物を提供する。対応するスルホンアミドは、クロロスルホニル酢酸との3-コレステリルアミンの反応によって取得し得、文献中に記載されるように調製し得る (Hinman, R. L. and Locatell, L. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 5655-5658)。対応する尿素又はカルバメートは、文献の手順に従って、対応するイソシアネートを介して調製され得る (Knolker, H.-J. T.ら、Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 2497；Knolker, H.-J.ら、Synlett 1996, 502；Knolker, H.-J. and. Braxmeier, T. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 5861)。ステロイド構造の3位で、ホスフェート又はカルボキシメチル化ホスフェートを有する化合物 (IIIa)の中間体は、文献中に記載されるように調製し得る (Golebriewski, Keyes, Cushman, Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 1637-1648；Cusinato, Habelerら、J. Lipid Res. 1998, 39, 1844-1851；Himber, Missanoら、J. Lipid Res. 1995, 36, 1567-1585)。ステロイド構造の3位でチオールを有する式 (IIIa)のリピッドアンカーは、文献中に記載されるように調製し得 (J. G. Parkes, J. G.ら、Biochim. Biophys. Acta 1982, 691, 24-29)、対応するカルボキシメチル化チオールは、対応するアミン及びアルコールについて記載されるように、簡易なアルキル化によって得ることができる。ステロイド構造の3位で、ジフルオロメチレンスルホン誘導体を有する式 (IIIa)のリピッドアンカーは、文献中に記載されるように調製し得る (Lapiene, J.ら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 151-155)。式 (IIIa)のリピッドアンカーの17位での様々な側鎖の導入は、デヒドロイソアンドロステロン又はプレグネノロンから開始する文献のプロトコールの使用によって達成し得る (Bergmann, E. D.ら、J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 1239-1243、及びその参考文献)。コレスタンから誘導した式 (IIIa)のリピッドアンカーは、文献のプロトコール、例えば、様々な遷移金属触媒の存在下での水素化を使用して、5,6-二重結合の還元によってコレステロールから誘導した、対応する前駆体から獲得することができる。
【０２２８】
3位で酸素誘導置換基を有する式 (IIa)のリピッドアンカーは、エストロンから開始する式 (IIIa)のリピッドアンカーについて記載されるように、同様の様式で調製される。3位で窒素誘導置換を有する式 (IIa)のリピッドアンカーは、3-アミノエストロンから開始する式 (IIIa)のリピッドアンカーについて記載されるように、同様の様式で調製し得、文献中に記載されるように調製し得る (Zhang, X. and Sui, Z. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3071-3073；Woo, L. W. L.ら、Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88)。3位で硫黄誘導置換基を有する式 (IIa)のリピッドアンカーは、3-チオエストロンから開始する式 (IIIa)のリピッドアンカーについて記載されるように、同様の様式で調製し得、文献中に記載されるように調製し得る (Woo, L. W. L.ら、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88)。エストロン構造の17位での様々な側鎖の導入は、文献中に記載されるように、Wittigアプローチによって、続けて、得られた二重結合を水素化することによって達成し得る (Peters, R. H.ら、J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26)。側鎖内での更なる操作 (例えば、二重結合の構築、シクロアルキル修飾)は、標準的なプロトコール(Suzukiカップリング等)によって達成し得る。
【０２２９】
異なる炭化水素基を有するセラミド、デヒドロセラミド及びジヒドロセラミドのクラスに属する式(VIa)のリピッドアンカーは、文献中に概説されるように得ることができる (A. H. Merrill, Jr. , Y. A. Hannun (編), Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999； Koskinen, P. M and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075)。特に、スフィンゴシン塩基は、スフィンゴシン主鎖の1位で酸素誘導置換を有する全ての式 (VIa)のリピッドアンカーについて、重要な中間体として使用され得る。対応するアミノ誘導体は、スルホン酸塩の置換によって得ることができ、公知のプロトコールに従って、アルコールから調製し得る。1-アミノ又は1-ヒドロキシ誘導体のアルキル化及びアシル化は、それぞれブロモ酢酸及び無水コハク酸を用いた反応によって達成し得る。チオアセチル化誘導体は、メルカプト酢酸を用いたスルホン酸塩の置換によって調製し得る。文献中に記載されるように、リン酸塩誘導体及び硫酸塩誘導体を得ることができる(A. H. Merrill, Jr., YA A. Hannun (編)、Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999；Koskinen, P. M. and Koskinen, A. M. P. Synthesis1998, 1075)。アシル化、スルホニル化、尿素及びカルバメート形成は、標準的な手順によって達成し得る。R5aはアミノ又はアミノ誘導官能基である、式 (VIa)のリピッドアンカーは、スフィンゴシン塩基から開始して調製し得、Koskinenによって公表されたように、標準的なプロトコールを使用して入手することができる (Koskinen, P. M. and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075)。対応する2-酸素を置換したスフィンゴ脂質は、Yamanoiによって公表された戦略によって、得ることができる (Yamanoi, T.ら、Chem. Lett. 1989, 335)。両方のR8aはヒドロキシ基を表す、式 (VIa)のリピッドアンカーは、公知のプロトコールを使用して、対応するアルケンのビスヒドロキシル化によって得ることができる。対応するモノヒドロキシ誘導体は、文献中に記載されるように調製し得る (Howell, A. R. and Ndakala, A. J. Curr. Org. Chem. 2002, 6, 365-391)。式 (VIa)のリピッドアンカーにおける置換基R6a及びR9aの修飾は、様々な概説論文において概説されるプロトコール及び戦略によって、達成し得る (Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154；Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280)。
【０２３０】
式 (VIIa)のリピッドアンカーは、文献中に記載されるプロトコール (Muller, S.ら、J. Prakt. Chem. 2000, 342, 779)によって、及び式 (VIIa)のリピッドアンカーの調製について記載するプロトコールとの組合せによって得ることができる。
【０２３１】
R4a及びR5aが酸素誘導置換基である、式 (VIIIa)のリピッドアンカーは、Fraser-Reidによって概説されるように、市販されている(R)-(-)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノールから開始して調製し得る (Schlueter, U. Lu, J. and Fraser-Reid, B. Org. Lett. 2003, 5, 255-257)。式 (VIIIa)の化合物において置換基 R6aの変更は、様々な概説論文において概説されるプロトコール及び戦略によって達成し得る (Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154；Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280)。R4a及びR5aが窒素誘導置換基である、式 (VIIIa)のリピッドアンカーは、対応するスルホン酸塩の求核置換及び上記で概説されるように更なる修飾によって、対応する酸素置換システムから開始するか、又は文献中に記載されるように得ることができる1,2,3-トリアミノプロパンから開始するかのいずれかによって、得ることができる (Henrick, K.ら、J Chem. Soc. Dalton Trans. 1982, 225-227)。
【０２３２】
式 (IXa)のリピッドアンカーは、式 (VIIa)のリピッドアンカーと同様の方法で得ることができ、又は代替的に式 (VIIIa)のリピッドアンカーのω-エテニル化中間体の閉環メタセシスによって得ることができる。
【０２３３】
式 (Xa)及び(XIa)のリピッドアンカーは、文献中に記載される合成戦略によって得ることができ(Xue, J. and Guo, Z. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2015-2018；Xue, J. and Guo, Z. J. Am. Chem. Soc. 2003, 16334-16339；Xue, J.ら、J. Org. Chem. 2003, 68, 4020-4029；Shao, N., Xue, J. and Guo, Z. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1569-1573)、式 (VIa)及び(VIIIa)のリピッドアンカーの調製のために上記で記載した方法との組合せによって得ることができる。
【０２３４】
式 (XIIa)、(XIIIa)及び(XIVa)のリピッドアンカーは、文献中に記載される合成戦略に従った全合成によって得ることができる (Knolker, H.-J. Chem. Soc. Rev.1999, 28, 151-157；Knolker, H.-J. and Reddy, K. R. Chem. Rev. 2002, 102, 4303-4427；Knolker, H.-J. and Knoll, J. Chem. Commun. 2003, 1170-1171；Knolker, H.-J. Curr. Org. Synthesis 2004, 1)。
【０２３５】
式 (XVa)のリピッドアンカーは、6-メトキシ-5-メチルインドールを提供するための、4-メトキシ-3-メチルベンズアルデヒドから開始するNenitzescu型インドール合成によって調製し得る。エーテル開裂、トリフラート形成及びSonogashiraカップリングによって、対応する6-アルキニル置換5-メチルインドールが導かれる。Nilsmeierのホルミル化及びそれに続くニトロメタンの添加によって、全体的な水素化を受ける、3-ニトロビニル置換インドール誘導体が産生され、結果として、6-アルキル置換5-メチルトリプタミンが形成される。スクシニル無水物を使用したアミノ基のアシル化によって、該調製は完了する。
【０２３６】
本発明のペプチドの合成においては、公知の固相又は液相技術、例えば固体支持体（典型的には、レジン）に対して、N末端又はC末端のカップリングに続けて、直鎖状ペプチドを段階的に合成する等、を使用し得る。側鎖を含むアミノ酸残基の保護のための保護基化学物質は、当該分野において周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts、Protecting Groups in Organic Synthesis (第3版、John Wiley & Sons, Inc, 1999)において見出し得る。
【０２３７】
本明細書に記載された化合物の調製方法は、当業者に明白であり、a)ホスホリル頭部基(単数又は複数可)又はリピッドアンカーの頭部基と同等なものと、エンドソーマルGPCRのモジュレーターの結合部位及び／若しくは相互作用部位との間の距離を定義すること；b)(a)で定義した距離に跨ることができるリンカーを選択すること；並びにc)(b)で選択したリンカーによって、該リピッドアンカーと、エンドソーマルGPCRのモジュレーターとを結合することとを含む。
【０２３８】
そのような方法に対応する実施例が本明細書において特定され、添付の実施例において記載される。当業者は、特定の又は潜在的なエンドソーマルGPCRのモジュレーターの関連する結合部位又は相互作用部位を推定する位置にあり、従って、ホスホリル頭部基(単数若しくは複数可)又はリピッドアンカーの頭部基と同等なものと、エンドソーマルGPCRのモジュレーターの結合部位及び／又は相互作用部位との間の距離を決定する。そのような方法は、分子モデリング、in vitro及び／又は分子相互作用若しくは結合アッセイ (例えば、酵母2又は3ハイブリッド法、ペプチドスポッティング、オーバーレイアッセイ、ファージディスプレイ、バクテリアルディスプレイ、リボソームディスプレイ)、原子間力顕微鏡、並びに分光法及びX線結晶学を含むが、それらに限定されない。更に、例えば部位特異的変異導入等の方法を、特定のエンドソーマルGPCRのモジュレータ又は候補のエンドソーマルGPCRのモジュレーターの推定された相互作用部位、及びそれに対応する標的を検証するために使用し得る。
【０２３９】
上記で説明したように、エンドソーマルGPCRのモジュレーターは、エンドソーム内で起こる生物学的プロセスに関与する分子であり、Gタンパク質共役受容体によって媒介される。
【０２４０】
当業者であれば、当該分野において公知であるリンカーの選択を含む、リンカーを選択すること、並びに例えば分子モデリング及び対応する合成、又は当該分野において公知である更なる方法による、新規のリンカーの生成及び使用について理解する。工程b)に関する用語「またがる（spanning）」は、リピッドアンカーがエンドソームの脂質層の部分を形成する場合、受容体の正確な部位でエンドソーマルGPCRのモジュレーターを位置させるよう選択されたリンカーの長さを指す。
【０２４１】
当業者であれば、本明細書に記載された個別の部分と同様に、特定のトリパータイト化合物の脂溶性を推測、検証及び／又は評価することが、容易である立場にある。エンドソーマルGPCRのターゲティングを決定するための、対応するテストアッセイが、実施例において本明細書に提供される。
【０２４２】
当業者であれば、リピッドアンカーがエンドソーム膜にアンカーされる場合、リンカー部分の目的は、エンドソーマルGPCRのモジュレーターが受容体と相互作用することができるように、リピッドアンカーをエンドソーマルGPCRのモジュレーターに接続することであると理解する。該リピッドアンカー及びリンカーは、該2つが共有結合することができるような官能基を含む。リピッドアンカーの官能基の種類は、決して限定されるものでなく、例えば、リンカーとアミド結合を形成するアミン基、又はリンカーとエーテル結合若しくはエステル結合を形成する（that forms and ether or ester bond with the linker）ヒドロキシル基若しくはカルボン酸基が挙げられ得る。
【０２４３】
同様に、当業者であれば、エンドソーマルGPCRと接続するリンカーの末端での官能基の選択は、選択したエンドソーマルGPCRのモジュレーター上の任意の利用可能な官能基によって、主に影響されることを理解する。例えば、エンドソーマルGPCRがフリーのアミン基又はカルボン酸基を含む場合、リンカーの官能基が、アミド結合を形成するように、相補的なカルボン酸又はアミンを含むことが想定される。
【０２４４】
本発明の化合物は、1以上の立体異性体(例えば、ジアステレオマー)中に存在し得ることが理解される。本発明は、単離された（例えば、エナンチオマー単離において）か、又は組み合わされたか（ラセミ混合物及びジアステレオマー混合物を含む）のいずれかの、これらの立体異性体の全てを含む。
【０２４５】
本発明は、独立してL体及びD体から選択されるアミノ酸の使用を含む、L体及びD体の両方におけるアミノ酸の使用、例えばペプチドが、2のアラニン残基を含み、各アラニン残基が同じか、又は反対の絶対立体化学を有し得ること、を期待する。特に明記しない限り、アミノ酸はL立体配置をとる。
【０２４６】
それゆえ、本発明はまた、アミノ酸残基の非対称中心との関連で、実質的に純粋な立体異性体を有する、化合物と関連する。例えば、該化合物は、約90%（de）よりも高く、例えば約95%〜97%（de）であり、又は99％（de）よりも高い純度を有し、ラセミ混合物を含む、それらの混合物も同様である。そのようなジアステレオマーは、例えばキラル中間体を使用した非対称合成によって調製し得、又は混合物は、従来法、例えば、クロマトグラフィーによって、若しくは分割剤の使用によって分割し得る。
【０２４７】
本発明の化合物が精製を必要とする場合、クロマトグラフィー技術、例えば高速液体クロマトグラフィー (HPLC)及び逆相HPLC等を使用し得る。化合物については、マススペクトロメトリー及び／又は他の好適な方法によってその性質を調べ得る。
【０２４８】
化合物が、(例えば、生理学的なpHで)プロトン化又は脱プロトン化され得る、1以上の官能基を含む場合、該化合物は、医薬的に許容される塩として調製及び／又は単離し得る。該化合物は特定のpHで両イオン性であり得ることが理解される。本明細書で用いられる場合、「医薬的に許容される塩」という表現は、特定の化合物の塩を指し、該塩は医薬品として投与するために好適である。そのような塩は、例えば、それぞれアミン基又はカルボン酸基と、酸又は塩基との反応によって、形成し得る。
【０２４９】
医薬的に許容される酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製し得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。有機酸の例としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。
【０２５０】
医薬的に許容される塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製し得る。無機塩基に由来する対応する対イオンとしては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N-アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン及びN-エチルピペリジンを含む、第1級、第2級、第3級アミン、天然で生じた置換アミンを含む置換アミン並びに環状アミンが挙げられる。
【０２５１】
酸／塩基付加塩は、対応するフリーの酸／塩基形態よりも、水性溶媒中において高い溶解性を有する傾向がある。
【０２５２】
本発明はまた、治療有効量の本明細書中前記において定義したトリパータイト化合物、又はその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物と共に、少なくとも1の医薬的に許容される担体又は希釈剤を提供する。
【０２５３】
用語「組成物」は、（他の担体あり又はなしの）有効成分が担体によって囲まれるカプセルを与えるように、担体としての封入材料と共に、有効成分の製剤を含むことを意図する。
【０２５４】
本明細書中前記において記載した化合物、又はその医薬的に許容される塩が、対象に投与される唯一の有効成分であっても良いが、該化合物と共に他の有効成分(複数可)を投与することは本発明の範囲内である。1以上の実施形態においては、2以上の本発明の化合物の組合せが対象に投与されることが想定される。該化合物（複数可）はまた、組合せで1以上の追加の治療剤と共に投与され得ることが想定される。該組合せによっては、他の有効成分（複数可）と、本明細書中前記において記載された化合物（複数可）とを、別々に、順番に又は同時に投与し得る。該組合せは、医薬組成物の形態において提供され得る。
【０２５５】
本明細書において使用される場合、用語「組合せ」は、上記にて定義した組合せのパートナーが、依存的に若しくは独立して、又は識別された量の組合せのパートナーとの異なる固定された組合せ、即ち、同時に若しくは異なる時点での使用によって投薬され得る場合、組成物又は部品のキット（kit of parts）を指す。次いで、組合せのパートナーは、例えば、同時に又は時系列的にずらして（即ち、異なる時点で）、部品のキットの任意の部品（any part of the kit of parts）について、等しい又は異なる時間間隔で、投与し得る。例えば、患者の年齢、性別、体重等のために、異なるニーズがあり得る、治療されるべき患者亜集団のニーズ又は一人の患者のニーズに対処するために、該組合せにおける、投与される組合せのパートナーの総量の比は変動し得る。
【０２５６】
当業者によって容易に理解されるように、投与経路及び医薬的に許容される担体の性質は、状態の性質及び治療される哺乳動物に依存する。特定の担体又は送達系、及び投与経路の選択は、当業者によって容易に決定され得ると考えられる。活性な化合物を含む任意の製剤の調製においては、その工程において該化合物の活性が破壊されず、該化合物が破壊されることなく作用する部位に到達することができることを確実にするために、注意を払わなければならない。幾つかの状況によっては、例えば、マイクロカプセル化等の当該分野において公知な方法によって、該化合物を保護する必要がある場合がある。同様に、該化合物がその作用部位に到達するように、投与経路を選択しなければならない。
【０２５７】
当業者は、従来のアプローチを使用して、本発明の化合物の適切な製剤を容易に決定し得る。好ましいpHの範囲及び好適な賦形剤、例えば抗酸化剤を特定することは、当該技術分野において日常的に行われる。バッファー系は、所望の範囲のpHを提供するために日常的に使用され、例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、コハク酸等のカルボン酸バッファーが挙げられる。例えばBHT又はビタミンE等のフェノール系化合物、例えばメチオニン又は亜硫酸塩等の還元剤、及び例えばEDTA等の金属キレート剤を含む、そのような製剤のために、多様な抗酸化剤が利用できる。
【０２５８】
本明細書中前記において記載された化合物、又はその医薬的に許容される塩は、静脈内、髄腔内、及び大脳内又は硬膜外送達に好適なものを含む、非経口投与形態に調製し得る。注射用途に好適な医薬形態としては、無菌の注射用溶液又は分散液、及び無菌の注射用溶液の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。それらは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、還元又は酸化、及び例えば細菌又は真菌等の微生物の汚染作用を防ぎ得る。
【０２５９】
注射用溶液又は分散液のための溶媒又は分散媒体は、該活性な化合物のための従来の溶媒又は担体系のいずれかを含み得、例えば、水、エタノール、ポリオール (例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの好適な混合物、並びに植物油を含み得る。適切な流動性は、例えば、例えばレシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合においては必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持し得る。微生物の作用の抑制は、必要に応じて、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含によって、もたらされ得る。多くの場合において、浸透圧を調節するための剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを包含することが好ましい。任意選択で、注射用の製剤は、血液と等張である。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物中の吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。注射可能な用途に好適な医薬形態は、静脈内、筋肉内、大脳内、髄腔内、硬膜外の注射又は注入を含む、任意の適切な経路によって送達され得る。
【０２６０】
無菌の注射用溶液は、必要に応じて、様々な他の成分、例えば上記で列挙したもの等を含む適切な溶媒中に、必要な量、本発明の化合物を取り込み、続けて濾過滅菌することによって、調製される。一般的に、分散液は、上記で列挙したものから、基本的な分散媒体及び必要な他の成分を含む無菌のビヒクルに、様々な滅菌された有効成分を取り込むことによって調製される。無菌の注射用溶液の調製用の無菌の粉末の場合においては、調製の好ましい方法は、有効成分及び任意の追加的な所望の成分の、前もって濾過滅菌した溶液の吸引乾燥又は凍結乾燥である。
【０２６１】
他の医薬形態としては、本発明の経口製剤及び経腸製剤が挙げられ、該活性化合物は、不活性な希釈剤又は同化可能な食用の担体を用いて製剤化しても良く、又はハードシェル若しくはソフトシェルのゼラチンカプセル中に封入しても良く、又は錠剤に圧縮しても良く、又は食事の食物中に直接取り込んでも良い。経口治療投与のためには、活性な化合物を賦形剤と共に取り込んでも良く、摂取可能な錠剤、頬側又は舌下の錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用しても良い。そのような治療に有用な組成物中の活性な化合物の量は、好適な用量が得られる程度である。
【０２６２】
錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤等はまた、以下に一覧で記載された構成要素：例えばガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤；例えばリン酸二カルシウム等の賦形剤；例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；及び例えばスクロース、ラクトース又はサッカリン等の甘味剤を添加しても良く、又は例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、若しくはチェリー香料等の香味剤を含んでも良い。投薬単位の形態がカプセルである場合、上記の型の材料に加えて、液体の担体を含んでも良い。様々な他の材料が、コーティングとしてか、又はそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変するために、存在しても良い。例えば、錠剤、丸薬又はカプセル剤は、シェラック、砂糖又はその両方を用いてコートしても良い。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性な化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、並びに例えばチェリー又はオレンジの香料等の香味剤を含んでも良い。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、医薬的に純粋であり、実質的に使用される量で非毒性でなければならない。更に、本発明の化合物は、腸の特定の領域に対して、活性のあるペプチドの特異的な送達を可能にするものを含む、徐放性調製物及び製剤に取り込んでも良い。
【０２６３】
液体製剤はまた、胃又は食道管を介して、経腸的に投与されても良い。経腸製剤は、例えば乳化基剤又は水溶性基剤等の適切な基剤と混合することによって、坐剤の形態で調製しても良い。その必要はないが、本発明の化合物を局所、鼻腔内、膣内、眼内等に投与することもできる。
【０２６４】
医薬的に許容されるビヒクル及び／又は希釈剤としては、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張な吸収遅延剤等が挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体又は剤が有効成分と混合できない場合を除いて、治療組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な有効成分はまた、組成物に取り込み得る。
【０２６５】
容易な投与及び投薬量の均一化のためには、組成物を投薬単位形態に製剤化することは特に利点がある。本明細書で用いられる場合、投薬単位形態は、治療される哺乳動物対象にとって単位用量として適した、物理的に分離した単位を指す；所定量の活性材料を含む各単位は、必要な医薬的に許容されるビヒクルと関連して、所望の治療効果を生成するよう計算される。本発明の新規な投薬単位形態のために、本明細書は、(a)活性材料及び得られる特定の治療効果の独特な特徴、並びに(b)本明細書に詳細に開示されているように、身体の健康が損なわれる、疾患状態を有する生きている対象において、疾患の治療のために活性材料を配合することの当該技術分野に内在する限界、によって記載され、それらに直接依存する。
【０２６６】
上述したように、投薬単位形態中において、好適な医薬的に許容されるビヒクルと共に、簡便で効果的な投与のために、主な有効成分が治療有効量、配合され得る。単位投薬形態は、例えば、0.25μg〜約2000 mgの範囲の量で、主な活性化合物を含み得る。割合で表せば、活性化合物は、担体1mL中に約0.25μg〜約2000mg存在し得る。補助的な有効成分を含む組成物の場合、投薬量は、通常の投薬量及び前記成分の投与様式を参照することによって決定される。
【０２６７】
本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、所望の投薬治療法に従って投与される場合、所望の治療活性を提供する化合物の量を指す。投薬は、1回、又は数分若しくは数時間の間隔で、又はこれらの期間のいずれか1つに連続して、行われても良い。好適な投薬量は、1投薬につき、体重1kg当たり約0.1 ng〜体重1kg当たり1 gの範囲内であっても良い。典型的な投薬量は、1投薬につき、体重1kg当たり1μg〜1 gの範囲であり、例えば1投薬につき、体重1kg当たり1 mg〜1 gの範囲等である。一実施形態においては、投薬量は、1投薬につき、体重1kg当たり1 mg〜500 mgの範囲であっても良い。別の実施形態においては、投薬量は、1投薬につき、体重1kg当たり1 mg〜250 mgの範囲であっても良い。また別の実施形態においては、投薬量は、1投薬につき、体重1kg当たり1 mg〜100 mgの範囲、例えば1投薬につき、体重当たり50 mgまで等である。
【０２６８】
本明細書で用いられる場合、用語「治療」及び「治療する」は、動物、任意選択で、ヒトのような哺乳動物における状態又は疾患の任意の治療をカバーし、エンドソーマルGPCRシグナル伝達によって媒介される、任意の疾患又は病気を治療することを含む。本明細書で用いられる場合、用語「予防」及び「予防する」は、動物、任意選択で、ヒトのような哺乳動物における状態又は疾患の予防（prevention）又は予防（prophylaxis）をカバーし、エンドソーマルGPCRシグナル伝達によって媒介される、疾患又は病気の予防を含む。
【０２６９】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈上別途必要な場合を除き、単語「含む（comprise）」、及び例えば「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」等の変形は、記載された整数若しくは整数のグループ又はステップを含むが、任意の他の整数又は整数のグループを除外するものではないことを暗示するものとして理解する。
【０２７０】
本明細書中における、任意の先行文献 (若しくはそれに由来する情報)、又は公知である任意の事項の参照は、先行文献 (若しくはそれに由来する情報)又は公知の事項が、本明細書が関連する努力の技術分野における共通の一般知識の一部を形成する、同意（acknowledgment）又は承認（admission）、或いは示唆の任意の形態として、捉えられるものでなく、そのように捉えられるべきでない。
【０２７１】
本発明を以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０２７２】
実施例１:トリパータイト化合物の調製手順
以下の実施例は、本発明の代表的なものであり、例示的な本発明の化合物を調製するための詳細な方法を提供する。
本発明のトリパータイト化合物は、以下の実験手順によって、調製されている。
【０２７３】
【化６８】
2019503356.tif 000068
【０２７４】
NH2-PEG12-Asp(OChol)レジン。スペーサー脂質コンジュゲートの合成は、NovaSyn（登録商標）TGR Rレジン (NovaBiochemから購入、0.18 mmol/gをロード)上で、標準的なFmoc化学物質を用いて、マニュアルでのペプチド合成によって調製した。ジクロロメタン(DCM)中で、ジイソプロピルエチルアミン (DIPEA、3等量)を使用した、in situでの活性化を用いて、Fmoc-Asp(OChol)-OH (1.5等量)と(1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)(トリ-1-ピロリジニル) ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP、2等量)とを、3時間カップリングした。Fmocの脱保護は、N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)中、20%ピペリジンを使用して行った。DCM中で、PyBOP (2等量)及びDIPEA (3等量)を用いて、Fmoc-PEG12-OH (2等量)をレジン結合NH2-Asp(OChol)にカップリングした。Fmocの脱保護は、N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)中、20%ピペリジンを使用して行った。最後の脱保護に続いて、NK1Rアンタゴニストを、レジン上で、スペーサー脂質コンジュゲートにカップリングした。
【０２７５】
【化６９】
2019503356.tif 000069
【０２７６】
化合物B。DCM (15 mL)中の(3S,4S)-N-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)-3-(4-フルオロ-2-メチルフェニル)-N-メチルピペリジン-4-カルボキサミド (500 mg、1.0 mmol)を、DIPEA (3.47 mL、2.0 mmol)に添加し、続けてエチルクロロオキソアセテート (1.67 mL、1.5 mmol)を添加し、室温で1時間、撹拌した。その混合物をDCMで希釈し、飽和重炭酸塩で洗浄し、次いで1N HClで洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮して残留物を得、次の工程で直接使用した。
【０２７７】
残留物をMeOH (5 mL)中で溶解し、0.5M LiOH (4 mL、2 mmol)を添加し、室温で2時間、撹拌した。その混合物を、1N HClとDCMとの間で分配した。有機層を乾燥し (MgSO4)、濾過し、濃縮して残留物を得、シリカゲルクロマトグラフィーによって残留物を精製し(DCM：MeOH、95：5〜80：20)、不定形の泡状物質として、2-((3S,4S)-4-((3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)(メチル)カルバモイル)-3-(4-フルオロ-2-メチルフェニル)ピペリジン-1-イル)-2-オキソ酢酸を得た (432 mg、79%)。
【０２７８】
【化７０】
2019503356.tif 000070
【０２７９】
DMF中、PyBOP (10等量)、DIPEA (10等量)及びHOBt (10等量)を用いて、2-((3S,4S)-4-((3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)(メチル)カルバモイル)-3-(4-フルオロ-2-メチルフェニル)ピペリジン-1-イル)-2-オキソ酢酸 (レジンロードに比べて、10等量)を、レジン結合NH2-PEG12-Asp(OChol)レジン (250 mg)に、終夜カップリングした。次いで、95%トリフルオロ酢酸を使用して、該コンストラクトを、レジンから切り出し、シリカゲル・クロマトグラフィーによって精製し(DCM：MeOH、98：2〜80：20)、粘着性の油状物質としてトリパータイト・プローブ化合物Bを得た (34.8 mg)。
【０２８０】
【化７１】
2019503356.tif 000071
【０２８１】
化合物C-1。DMF(1.5 mL)中の(3S,4S)-N-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)-3-(4-フルオロ-2-メチルフェニル)-N-メチルピペリジン-4-カルボキサミド (50 mg、0.1 mmol)を、オキサミド酸 (17 mg、0.2 mmol)に添加し、PyBOP (104 mg、0.2 mmol)を続け、最後にDIPEA (34μL、0.2 mmol)を続け、室温で終夜撹拌した。該混合物を、EtOAcで希釈し、飽和重炭酸塩で洗浄し、次いで1N HClで洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮して残留物を得、0.1％TFA/H2O及び0.1％TFA/CANを溶媒として用いた逆相での高速液体クロマトグラフィーによって精製し(HPLC)(Phenomenex Luna C8カラム、Lane Cove、Australia)、不定形の固体として2-((3S,4S)-4-((3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)(メチル)カルバモイル)-3-(4-フルオロ-2-メチルフェニル)ピペリジン-1-イル)-2-オキソ酢酸を得た(47 mg、88%)。
【０２８２】
【化７２】
2019503356.tif 000072
【０２８３】
化合物C-3。tert-ブチル(3S,4S)-4-((3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)(メチル)カルバモイル)-3-(o-トリル)ピペリジン-1-カルボキシレート(200 mg、0.36 mmol)は、ジオキサン (6 mL)中で、4M HClを用いて、室温で4時間、脱保護したBocであった。混合液を濃縮し、EtOAcを用いて粉砕し、固形とした(170 mg、96%)。DMF (3 mL)中で、DIPEA (158μL、0.909 mmol)を使用した、in situでの3時間の活性化によって、脱Boc材料 (150 mg、0.303 mmol)を、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]-ピリジニウム 3-オキサイドヘキサフルオロホスフェート (HATU)H(127 mg、0.334 mmol)を用いて、N-Bocイソニペコチン酸 (76 mg、0.334 mmol)にカップリングした。該混合物をEtOAcで希釈し、重炭酸塩を含む水で洗浄し、最終的に塩水で洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮して残留物を得、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し (EtOAc：石油エーテル、50：50〜100：0)、ジオキサン (6 mL)中4M HClを用いて直ぐに脱保護したBocであった、無色透明なレジン (205 mg)を得た。3時間後の濃縮によって、脱保護された中間体4が残渣に得た(180 mg、98%)。DIPEA (112μL、0.644 mmol)を用いてin situで3時間活性化したDCM (3 mL)中で、(3S,4S)-N-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)-N-メチル-1-(ピペリジン-4-カルボニル)-3-(o-トリル)ピペリジン-4-カルボキサミド (130 mg、0.215 mmol)を、無水コハク酸(24 mg、0.236 mmol)にカップリングした。該混合物を、DCMで希釈し、1N HClで洗浄し、次いで塩水で洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮して、不定形の泡として、化合物C-3、4-(4-((3S,4S)-4-((3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)(メチル)カルバモイル)-3-(o-トリル)ピペリジン-1-カルボニル)ピペリジン-1-イル)-4-オキソブタン酸(157 mg)を得た。
【０２８４】
【化７３】
2019503356.tif 000073
【０２８５】
化合物C-2。(3S,4S)-N-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)-N-メチル-1-(ピペリジン-4-カルボニル)-3-(o-トリル)ピペリジン-4-カルボキサミド (50 mg、0.083 mmol)をDMF (2 mL)中に溶解し、この混合物に、グリコール酸 (7 mg、0.091 mmol)、HATU (35 mg、0.091 mmol)、続けてDIPEA (43μL、0.248 mmol)を添加し、室温で2時間撹拌した。該混合物をエーテルで希釈し、水で洗浄し、次いで1N HClで洗浄した。有機層を乾燥し (MgSO4)、濾過し、濃縮して残留物を得、シリカゲルクロマトグラフィー(MeOH：EtOAc、10：90)によって精製し、半透明な（clear opaque）レジン (36 mg)を得た。該レジンを石油エーテルで粉砕し、不定形の固体として、化合物C-2、(3S,4S)-N-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)-1-(1-(2-ヒドロキシアセチル)ピペリジン-4-カルボニル)-N-メチル-3-(o-トリル)ピペリジン-4-カルボキサミド (26 mg、50%)を得た。
【０２８６】
【化７４】
2019503356.tif 000074
【０２８７】
A．酸化合物C-3、4-(4-((3S,4S)-4-((3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジル)(メチル)カルバモイル)-3-(o-トリル)ピペリジン-1-カルボニル)ピペリジン-1-イル)-4-オキソブタン酸 (130 mg)を、DCM中において、PyBOP (2等量)及びDIPEA (3等量)を用いて、終夜、レジン結合NH2-PEG12-Asp(OChol)レジンにカップリングした。次いで、95％トリフルオロ酢酸を使用して、該コンストラクトをレジンから切り出し、溶媒として0.1％TFA/H2O及び0.1％TFA/CANを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC)(Phenomenex Luna C8カラム、Lane Cove、Australia)によって精製し、粘着性の油状物質としてトリパータイト・プローブ化合物A(30.2 mg)を得た。
【０２８８】
以下の化合物は、同じ化学物質を使用することにより、及び表示したNK1アンタゴニストから開始することにより、作製し得る。
【０２８９】
【化７５】
2019503356.tif 000075
【０２９０】
【化７６】
2019503356.tif 000076
【０２９１】
Et3N (554μL、4.0 mmol)を使用して、室温で終夜、in situで活性化したDMF (10 mL)中において、中間体D-1 (1.0 g、1.94 mmol)を、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]-ピリジニウム 3-オキサイド・ヘキサフルオロホスフェート (779 mg、2.05 mmol)を用いて、N-Boc-イソニペコチン酸 (459 mg、2.0 mmol)にカップリングした。該混合物を、水を用いてゆっくり希釈して、pptを得、2時間撹拌し、次いで濾過した。濾過した固形物を大量の水を用いて洗浄し、乾燥し、オフ・ホワイトの固形(1.43 g)を得、ジオキサン (10 mL)中4M HClを用いて直ぐにBoc脱保護した。3時間の濃縮によって、不定形の固体として、脱保護された中間体D-2(1.28 g、99%)を得た。
【０２９２】
Et3N (63μL、0.453 mmol)を使用して、室温で終夜、in situで活性化したDCM (5 mL)中において、中間体D-2 (100 mg、0.151 mmol)を無水コハク酸 (15 mg、0.151 mmol))にカップリングした。該混合物を、DCMを用いて希釈し、1N HClを用いて洗浄し、次いで塩水を用いて洗浄した。有機層を乾燥し (MgSO4)、濾過し、濃縮し、無色透明なレジンとして、中間体D-3 (119 mg)を得た。
【０２９３】
酸D-3 (119 mg)を、DCM:DMF (1：1)中において、2時間、PyBOP (2等量)及びDIPEA (6等量)を用いて、レジン結合NH2-PEG12-Asp(OChol)レジン（300 mg）にカップリングした。次いで、該コンストラクトを、95：5 TFA：TIPSを使用してレジンから切り出し、残渣（esidue）にまで濃縮し、DCM中で取り上げ、重炭酸塩を用いて洗浄し、乾燥し (MgSO4)、濾過し、濃縮して残留物を得 (118 mg)、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し (MeOH：EtOAc：Et2NH 10：90：1)、無色透明な粘着性の油状物質として化合物 D(68 mg、69%)を得た。
HRMS：計算されたm/z；C89H137Cl2F6N7O20[M + H]+ 1809.9306、[M+ 2 H]2+ 905.4689；観測された：[M + H]+ 1809.9361、[M+ 2 H]2+ 905.4735。
【０２９４】
実施例2：エンドソーマルNK1Rの治療ターゲティング
エンドソーマルNK1Rシグナル伝達は、ニューロン活性化及び痛覚過敏の根底にある細胞内シグナルを生成する。一時的な受容体潜在的なバニロイド1アゴニストである、カプサイシンを含む、痛みを伴うプロ炎症性の刺激は、後角ラミナI、IIにおける一次感覚性侵害受容器からの物質P (SP)放出を刺激し、そこではSPが、脊髄ニューロンにおいてNK1Rエンドサイトーシスを刺激する。
【０２９５】
本発明に基づくトリパータイト・プローブは、本発明のトリパータイト化合物に加えて、脂質コレスタノール又は又はエチルエステル (陰性対照、膜アンカーなし)、ポリエチレングリコールリンカー及び蛍光色素シアニン5 (Cy5)を含んで、合成し得る。
【０２９６】
最初の実験アプローチにおいては、エンドソーマルNK1Rに対してトリパータイト化合物をターゲティングすることは、以下のように研究し得る。
【０２９７】
HEK293細胞を用いたインキュベーション後、Cy5-コレスタノールは5分で細胞膜に挿入され、プローブの50％超が内在化するであろう30〜60分でエンドソームにおいて検出し得る一方で、Cy5-エチルエステルは細胞外液中に残る。4時間後、Cy5-コレスタノールは、細胞膜から、NK1R-GFPを含むRab5a陽性早期エンドソームに再分配される。
【０２９８】
FRETアッセイは、以下のように、エンドソームにおいて、NK1Rを標的化する、トリパータイト・プローブの能力を定量的に評価するために使用し得る。
【０２９９】
細胞外N末端Snap-Tag（登録商標）を用いて、HEK293細胞を、1ウェル当たり50ngのNK1Rでトランスフェクトする。48時間後、光安定性蛍光基質であるSNAP-SurfaceTM549 (New England Biolabs)を用いて標識する(1μM、30分、37℃、0.5％BSAを含む、DMEM中)。細胞を洗浄し、DMEM中で30分間回収し、物質P (SP)を用いて刺激し(10 nM、30分、37℃)、NK1Rエンドサイトーシスを誘発する。Cy5-コレスタノールを用いて細胞をインキュベートする(200 nM、37℃)。Cy5-コレスタノール添加の前及び後に、570〜620nm（SNAP-549ドナー）及び670〜750nm（Cy5 FRET及びCy5アクセプター）でのアルゴン（514nm）/HeNe（633nm）レーザー及び発光による順次励起を使用して、SNAP-549/Cy5感作性発光FRETを共焦点顕微鏡法によって分析する。対照としては、トランスフェクトしていないHEK293細胞 (アクセプターのみ)、及びCy5-コレスタノールで処理していないHEK293細胞 (ドナーのみ)が挙げられる。記載されるようにFRETを分析し、対照に対する相対的な発光比で表す(F/F0)。
【０３００】
細胞外N末端Snap-Tagを有するNK1Rは、HEK293細胞内で発現し得、細胞表面NK1Rは膜非透過性のSNAP-SurfaceTM 549光安定性蛍光基質で標識される。SP (10 nM、30分)は、全ての検出可能なSNAP-549のエンドソームへの転座を誘発する。Cy5-コレスタノールを添加後に、SNAP-549-NK1R及びCy5-コレスタノールFRETは検出し得、75分間超で増加した。次いで、FRETの細胞内起源の分析によって、シグナルの殆んどが細胞内であることを確認することができ、それによりエンドソーマルNK1Rと関連するプローブであることが証明される。
【０３０１】
本発明のトリパータイト化合物を用いて細胞を、例えば、30分間、プレインキュベートし、次いで、SPを用いて直ぐにチャレンジした（challenged）場合、好適なアンタゴニストは、核及び細胞質ERKの活性化をブロックすることが示され、このことは細胞表面NK1Rの効果的な拮抗作用を示す。それに対して、細胞を30分間、アンタゴニストを用いてパルスインキュベートし、洗浄し、次いで4時間後にSPを用いて刺激した場合、トリパータイト化合物単独では核ERKを阻害し、アンタゴニストのいずれも細胞質ERKを阻害しない。本発明のトリパータイト化合物は、内在的β2-アドレナリン受容体によって媒介される、核ERKのイソプレナリン誘導性の活性化に影響しない。
【０３０２】
従って、そのようなアプローチによって、コレスタノールに対する連結が、プローブをNK1R陽性早期エンドソームに送達し、パルスインキュベーション後に、本発明のトリパータイト化合物が、細胞表面NK1Rでなく、エンドソーマルの持続的で選択的な拮抗作用を引き起こすことができるということが示され得る。
【０３０３】
第二の実験アプローチにおいては、エンドソーマルNK1Rの拮抗作用が、脊髄ニューロンの持続的SP誘導性興奮をブロックするかを評価するために、ラット脊髄の切片は、本発明のトリパータイト化合物を用いてインキュベートし得る。
【０３０４】
60分間のインキュベーション後、脊髄切片を洗浄し、アンタゴニスト-フリーの培地中で60分間インキュベートし、次いでSPを用いてチャレンジした。前もってビヒクル又はスパンタイドで処理した切片においては、SPは、SP除去後も維持される、活発な活動電位の放電を引き起こす。トリパータイト化合物は、最初の興奮を抑制しないが、SP除去後も維持される活動電位の放電を抑制する。従って、エンドソーマルを標的とし、膜にアンカーされたNK1Rアンタゴニストは、脊髄ニューロンの持続的なSP誘導性活性化を効果的にブロックし、長く続く鎮痛を引き起こす。
【０３０５】
エンドソーマルNK1Rの拮抗作用がまた侵害受容をブロックするかを、更に評価するために、Cy5-コレスタノール、スパンタイド又は本発明のトリパータイト化合物の髄腔内注射をマウスに対して行い得る。3時間後、カプサイシンを脚に注射する。スパンタイド又はCy5-コレスタノールは阻害しないが、本発明のトリパータイト（tripartide）化合物はカプサイシン誘発性の痛覚過敏を顕著に阻害する。
【０３０６】
カプサイシンの後、30分で投与される場合、髄腔内のスパンタイドは小さく一時的な鎮痛効果を有する一方で、トリパータイト化合物は、遅延した、持続的で実質的な抑制鎮痛を引き起こす。Cy5-コレスタノールは、6時間後、ラミナI〜IIIニューロン中において検出され、このことは効果的なプローブ送達を示唆する。足底内にホルマリンを注射する3時間前に、髄腔内に注射された場合、トリパータイト化合物は、スパンタイドよりも効果的に、生体防御行動の両方の段階を顕著に阻害する。足底内にCFAを注射する36時間後に、髄腔内に注射された場合、トリパータイト化合物は4時間後に、鎮痛作用を示し、鎮痛が6時間超で持続する一方で、スパンタイドの鎮痛作用は小さく一時的である。
【０３０７】
エンドソーマル・ターゲティングの一般的な有用性を評価するために、小分子NK1RアンタゴニストL733-0660をまた、ポリエチレングリコールリンカーを介して、コレスタノールに連結することによって試験し得る。足底内にカプサイシンを注射する3時間前に、髄腔内に注射された場合、この複合体は、4時間超で持続された鎮痛を示す一方で、L-733,060の効果は小さく一時的であるのみである。
【０３０８】
従って、エンドソーマルを標的とし、膜にアンカーされたNK1Rアンタゴニストは、脊髄ニューロンの持続的なSP誘導性活性化を効果的にブロックし、長く続く鎮痛を引き起こす。マウスに対して髄腔内に注射後、スパンタイド及びトリパータイト化合物は同様に、4時間超で、ヒトCSF内で安定であるが、スパンタイドは広く代謝される一方で、トリパータイト化合物は安定である。エンドソーマル・ターゲティング及び保持（retention）は、in vivoでの安定性に貢献し得る。
【０３０９】
上記研究は、以下の技術の使用によってもなし得る。
氷冷したスクロースベースの人工CSF (sACSF)(mM：100 スクロース、63 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、1.2 MgCl2、25 グルコース、25 NaHCO3；95％O2／5％CO2)中において、ラット脊髄の腰椎領域から、ビブラトームを使用して、側矢状の切片 (340〜400μm)を調製する。切片を、N-メチル-D-グルカミン (NMDG)ベースの回収ACSF (rACSF)(mM：93 NMDG、93 HCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 グルコース、5 アスコルビン酸Na、2 チオウレア、3 ピルビン酸Na、10 MgSO4、0.5 CaCl2；95％O2／5％CO2、15分、34℃)に移す。切片を、10μM MK-801を含む通常ACSF (mM：125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、1.2 MgCl2、2.5 CaCl2、25 グルコース、11 NaHCO3；95％O2／5％CO2)に移し(45分、34℃)、次いで室温で維持する。
【０３１０】
ラット脊髄の切片をレコーディングチャンバーに移し、通常ACSFを用いて表面かん流する (2 ml／分、36℃)。位置、サイズ及びラミナIに限定される樹状突起を有する紡錘形に基づいて、ラミナIにおける、大きく（電気容量≧20 pF）、推定されるNK1R陽性ニューロンを特定するために、Dodtコントラスト光学系を使用する。記録の前に10分間、切片をDy4又はDy4（不活性）(共に30μM、0.03％DMSO)を用いてプレインキュベートするか、又は60分間、本発明のトリパータイト（tripartide）化合物及びスパンタイド(0.01％DMSO中、共に1μM) を用いてプレインキュベートし、洗浄し、記録前に、更に60分間、アンタゴニスト-フリーのACSF中でインキュベートする。PS2は、電気生理学に必要とされる低濃度のDMSO中では溶解しない。大きく、NK1R陽性で、推定された侵害受容性のラミナIニューロンを、記載されるように (Imlach, W. L.,ら、Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428)、視覚的に特定する。セルアタッチ（cell-attached）設定(Multiclamp 700B、Molecular Devices、Sunnyvale、CA)中で、10 kHzでサンプリングし、高域の1 Hzでフィルタリングして、自発電流を記録し、Axograph X、V 1.4.4 (Axograph)を使用して、容量的に結合した（capacitatively coupled）活動電位事象を分析する。パッチ電極(2.5-3.5MΩの抵抗)は、ホールセル（whole-cell）設定中におけるその後の活動電位特性の記録を容易にするために、KMESベースの内部溶液 (mM：105 KMES、20 NaCl、5 HEPES、10 BAPTA、1.5 MgCl2、4 MgATP、0.4 NaGTP、0.1％ビオシチン；285〜295 mosmol.l-1)を含まなければならない。活動電位特性に対するシナプス前の影響を最小にするために、CNQX (6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン)(10μM；AMPA/カイニン酸受容体アンタゴニスト)、ピクロトキシン (100μM；GABAA受容体アンタゴニスト)、ストリキニーネ (0.5μM；グリシン及びアセチルコリン受容体アンタゴニスト)、並びにAP5 ((2R)-アミノ-5-ホスホノ吉草酸；(2R)-アミノ-5-ホスホノペンタノエート)(100μM；NMDA受容体アンタゴニスト)の存在下で記録をしなければならない。次いで、切片を、SP (1μM)を用いた2分間の表面かん流によってチャレンジする。記録は10 kHzでサンプリングし、高域の1 Hzでフィルターし、発火率を2分間隔のビン（bins）において測定する。各セルアタッチ記録の終末に、通常の活動電位発火の保持を確認するために、電流クランプモード（current-clamp mode）でホールセル記録を行う。生きているニューロンが含まれることを確認するために、閾値を超える50 mV以上である活動電位強度を細胞が有する場合、分析中のデータのみを含める。細胞をビオシチンで満たし、免疫蛍光によってNK1R発現を確認するために切片を処理する。各細胞についての発火率を、群間で有意に異ならない、2分の時点での反応に対して標準化する。最後の活動電位に対する応答の期間で、発火時間を決定する。シナプス伝達を評価するために、対照条件下、又はDy4若しくはDy4（不活性）に曝露後にホールセル設定の記録を行う；記載されるように（Imlach, W. L.ら、Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428）、双極の刺激電極を後根進入部に配置し、電気的誘発性の興奮性シナプス後電流を記録する。NK1Rエンドサイトーシスを更に評価するために、SP（1μM）を用いて脊髄切片(400μm)をインキュベートし(5分)、PFA中で固定し(4時間、室温)、凍結保護し、NK1Rの位置を見出せるように処理する。
【０３１１】
実験前の、連続した2日に、マウスを実験装置及び環境に対して、1〜2時間順化させる。機械的な痛覚過敏は、段階的な太さのvon Freyフィラメントを用いて、後ろ脚の足底面の刺激に対して脚を逃避することによって評価する。試験の前の日に、各動物についてベースラインを確立するために、von Freyスコアを3回反復で測定する。脚の浮腫を評価するために、治療の前と後で、デジタルキャリパーを使用して後ろ脚の厚さを計測する。足底内注射については、マウスを鎮静化する(5%イソフルラン)。カプサイシン (5μg)、完全フロイントアジュバント (CFA、2 mg/ml)又はビヒクル (カプサイシン、20％エタノール、10％Tween 80、70％生理食塩水；CFA、生理食塩水)を、左の後ろ脚の足底面に皮下注射する (10μl)。von Freyスコア (左及び右脚)、並びに脚の厚さ (左脚)を、カプサイシンの後であって、CFAの注射後36〜40時間で、30〜240分間計測する。結果は、注射前の数値の％で表す。生体防御行動を評価するために、マウスを鎮静化し、ホルマリン (4％、10μl)を左の後ろ脚の足底面に皮下注射する。マウスをPerspexコンテナ内に置き、60分間、生体防御行動 (注射した脚を縮める、舐める、噛む)を記録する。防御イベントの総数を、急性段階(I、0〜10分)及び強直段階(II、10〜60分)に分ける。実験の終わりに、ラットについて記載されるように、マウスをPBS及びPFAを用いて経心灌流し、脊髄を回収し、NK1Rの位置を見出すために、免疫蛍光によって処理した。調査者には、テスト剤について知らせない。
【０３１２】
髄腔内注射は、意識のあるマウスに行う(5μl、L3/L4)。カプサイシン若しくはホルマリンを足底内に注射する30分前に、又はCFAの36時間後に、Dy4、Dy4（不活性）、PS2、PS2（不活性）(すべて50μM)、SR-140333 (15μM)、SM-19712 (8 mM)、U0126 (100μM)、又はビヒクル (1％DMSO/生理食塩水)を注射する。カプサイシンを足底内に注射する3時間前若しくは30分後、ホルマリンの3時間前、又はCFAの36時間後に、スパンタイド (50μM)、トリパータイト化合物 (50μM)、L-733,060 (100 nM)又はCy5-コレスタノール (10μM)を、髄腔内に注射する。
【０３１３】
実施例3：一般式 (Ie)の化合物の調製方法
以下の実施例は、本発明の代表的なものであり、例示的な本発明の化合物を調製するための詳細な方法を提供する。
【０３１４】
一般的な実験の詳細：
SPPSのためのFmoc-PAL-PEG-PSレジンをApplied Biosciencesから取得した。PEGアミノ酸(Fmoc-PEG3-OH及びFmoc-PEG4-OH)をPolypeptide Group (France)から取得した。Fmoc-Asp(OChol)-OH及びFmoc-Asp(OEt)-OHは、標準的な化学（側鎖のエステル化、それにC末端の酸脱保護を続ける）を使用して、市販されているFmoc-Asp-Ot-Buから合成した。全ての他のFmocアミノ酸 (好適な保護基を有する)は、Chem-Impex又はAuspepから取得した。カップリング剤 (HBTU、HCTU)及び溶媒は、受け取ったままで使用した。
【０３１５】
Phenomenex Luna C8 (2)3μm分析用 (100Å、100×2 mm)を備えたShimadzu LCMS-2020 スペクトロメーターを使用して、それぞれ0.05％TFA/H2O及び0.05％TFA/ACNからなるバッファーA及びBの混合液を用いて溶出させて、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー (LC-MS)データを得た。大規模な予備精製用のPhenomenex Luna C8 (2)10μmカラム (10Å、50×21.2 mm)及び小規模な予備精製用のPhenomenex Luna C8 (2)5μmカラム (100Å、250×10 mm)を使用して、溶媒ポンプ、システムコントローラー及びUV吸収検出器からなる、Waters Prep LCシステムを使用して、準備的な高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を行った。全ての分離においては、それぞれ0.1％TFA/H2O及び0.1％TFA/ACNからなるバッファーA及びBを溶媒として使用した。
【０３１６】
一般的な SPPS法：
脱保護混合液としてDMF中の20％v/v ピペリジン及び活性化混合液としてDMF中の7％v/v DIPEAを使用して、標準的な方法によって、Rainin PS3装置を使用して、自動化SPPSを行った。カップリング剤としてのHCTU (3等量)と共に、Fmoc保護アミノ酸 (レジンロードに比べて、3等量)をバイアル中でプレミックスし、50分の標準的なカップリング時間を使用した。
【０３１７】
250mLの丸底フラスコ内に収納し得る、5 mL濾過カラム中で、手動によるSPPSを行い、標準的なロータリーエバポレーター上で撹拌した。N-Fmoc脱保護のために、DMF(2 mL)中の20％v/v ピペリジンをレジンに添加し、該混合液を15分間撹拌した。次いで、該脱保護混合液を濾過によって回収し、該レジンをDMFを用いて洗浄した(5×2 mL)。完全な脱保護がなされるように、この方法を合計3回繰り返した。最後の機会では、DMF (5×2 mL)、MeOH (5×2 mL)及びCH2Cl2(5×2 mL)を用いて、レジンを洗浄した。アミノ酸カップリングのために、DMF (2 mL)中、適切なアミノ酸 (3等量)、HBTU又はHCTU (3等量)、及びDIPEA (3.5等量)の溶液を脱保護したレジンに添加し、完全な脱保護がなされるように、該混合液を15〜20時間撹拌した。次いで、カップリング混合液を濾過によって除き、レジンをDMF (5×2 mL)、MeOH (5×2 mL)及びCH2Cl2 (5×2 mL)を用いて洗浄し、減圧下で乾燥した。
【０３１８】
レジン上でのペプチドの組み立てが完了した後、該レジンを時々撹拌しながら、TFA/TIPS/H2O (3 mL)の95：2.5：2.5 v/v混合液に2〜3時間曝露することによって、固体支持体からの切り出しを達成した。側鎖保護基を有するアミノ酸を含む合成のために、望ましくない副反応を防止する代わりに、TFA/TIPS/H2O/EDTの92.5：2.5：2.5：2.5 v/v混合液を使用した。次いで、該レジンを濾過し、N2流下で該TFA溶液を濃縮し、粗ペプチドを得た。
【０３１９】
例示された化合物の合成
化合物1
保護された直鎖状のペプチドDArg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-DTrp-Phe-DTrp-Leu-Leu-NH2(スパンタイドI)を、N-脱保護したFmoc-PAL-PEG-PSレジンを用いて開始し、上記のように自動化SPPSによって合成した(278 mg、0.18 mmol/g、50.0μmol)。最後のN-脱保護工程の後、材料部分をレジンから切り出し、完全な側鎖の脱保護がなされるように、0.1％TFAを含むACN/H2Oの1：1混合液に懸濁した粗残渣を得た。半予備的なHPLC (20〜90%のバッファーB、35分超)によって、この粗産物を精製することによって、スパンタイドIを得て、マススペクトロメトリー（C75H110N20O13[M + 2H+]についての計算されたm/z：749.5；観測された：m/z 749.4）によって確認した。
【０３２０】
次に、N-脱保護レジン結合化合物(375 mg、50.0μmol)の一部を、5 mL濾過カラムに移し、それぞれFmoc-PEG4-OH、Fmoc-PEG3-OH、Fmoc-PEG4-OH及びFmoc-Asp(OChol)-OHを用いた手動のSPPSに供した。最後のN-脱保護工程に続けて、該レジンを、2時間連続的な撹拌を行いつつ、DMF (1.5 mL)中のDIPEA (100μL)及び無水酢酸 (1.5 mL)の溶液に曝露することによって、ペプチドのN末端を、キャッピングした。次いで、該レジンを通常の方法で洗浄し、レジンから該ペプチドを切り出して粗産物を得た。予備的HPLC (50〜100%のバッファーB、35分超)による精製によって、化合物1 (5.5 mg)を得た。
化合物1は、マススペクトロメトリー（C139H223N24O31[M + 3H+]についての計算されたm/z：908.9；観測された：m/z 908.2；C139H223N24O31[M + 2H+]についての計算されたm/z：1362.7；観測された：m/z 1361.8）によって確認した。
【０３２１】
化合物2
上記のように手動SPPSによって、0.025 mmolのスケール（147 mgのレジン）で、Fmoc-PAL-PEG-PSレジン (Life Technologiesから入手の0.17 mmol/gをロード)を用いて開始し、合成を行った。それぞれFmoc-Asp(OChol)-OH、Fmoc-PEG4-OH、Fmoc-PEG3-OH及びFmoc-PEG4-OHを使用して、カップリング／脱保護のサイクルを合計4回繰り返した。
【０３２２】
最後のN-脱保護工程の後、TNBSテストによって陽性の結果を示した時点である45分間、コンスタントに撹拌しつつ、レジン結合ペプチド (85.7 mg、12.5μmol、完全な変換を前提とする)の半分を、DMF (3 mL)中、3モル等量の8-ブロモオクタン酸、3モル等量のHCTU及び5モル等量のDIPEAとカップリングした。次いで、該カップリング溶液を濾去し、DMF、MeOH及びDCM (各5×5 mL)を用いて該レジンを洗浄し、吸引下で乾燥した。最後に、ブロモで終端したレジン結合化合物を、3日間にわたって、ヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウム (TBAI、0.5モル等量)及びDIPEA (5モル等量)の溶液中、NK1Rアンタゴニスト L-733,060・HCl (0.8モル等量)と反応した。次いで、カップリング溶液を濾去、該レジンをDMF、MeOH及びDCM (各5×5 mL)を用いて洗浄し、吸引下で乾燥した。2mLのTFA/TIPS/H2O (95：2.5：2.5)の混合液を使用して、1.5時間掛けて、生成物をレジンから切り出し、その後、レジンを濾過し、2 mLのTFAを用いて洗浄し、窒素流下で溶媒を除去した。次いで、粗残渣をmilli-Q水 (1 mL)及びアセトニトリル(0.5 mL)の混合液中で取り出し、RP-HPLC精製に供した。ESI-MS分析によって、正確な分子量を有するものとして、化合物2を確認した：C90H144F6N6O19[M + 2H]2+についての計算されたm/z：864.53；観測された：m/z 864.70。
【０３２３】
化合物3
上記の通り、N-脱保護したFmoc-PAL-PEG-PSレジンから開始して、自動化したSPPSによって、NK1RアゴニストGR73632 [Ava-Phe-Phe-Pro-N-MeLeu-Met-NH2]を調製した。最後のN-脱保護後、所望のアゴニストペプチドを得るために、TFA溶液(95：2.5：2.5 TFA：TIPS：H2O)を使用して、レジンから材料の一部を切り出した。生成物を、マススペクトロメトリー：m/z 766.4（calcd for C40H59N7O6S [M + H+] m/z 766.4）によって確認した。
【０３２４】
化合物3は、レジン結合GR73632の一部に由来した。アミノ酸として、Fmoc-PEG4-OH、Fmoc-PEG3-OH、Fmoc-PEG4-OH及びFmoc-Asp(OChol)-OHを使用した、手動のSPPSに、N-脱保護GR73632レジンを供した。最後の脱保護に続けて、DMF中で、2時間、DIPEA及びAc2Oに曝露することによって、ペプチドのN末端をキャッピングした。上記のように、コンストラクトをレジンから切り出し、HPLCを繰り返すことによって精製した。化合物3：m/z 996.6（calcd for C104H173N11O24S [M + 2H+] m/z 996.1）。
【０３２５】
化合物4
上記で説明したように、手動のSPPSによって、保護された直鎖状ペプチド VTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-NH2 (CGRP8-37)の合成を行った。合成は、0.18 mmolのスケール (1 gのレジン)で、NovaSyn（登録商標）TGRRレジン (0.18 mmol/gをロード)を用いて開始した。レジン (100 mg)上で完成したCGRP8-37ペプチドの一部分を切り出し、濾過し、2 mLの切り出し溶液を用いて洗浄し、窒素流下で溶媒を除去した。粗ペプチドをRP-HPLC精製に供し、7 mgの収量で、不定形の白色固体としてCGRP8-37を得た。ESI-MS分析によって、正確な分子量を有するものとして、化合物を確認した。計算されたm/z (モノアイソトピック)；C139H230N44O38[M + 2H]2+ 1563.83、[M+ 3H]3+1042.89、[M + 4H]4+ 782.42、[M + 5H]5+ 626.14；観測された：[M + 2H]2+1563.85、[M+ 3H]3+ 1043.00、[M + 4H]4+ 782.55、[M + 5H]5+626.30。
【０３２６】
レジン (100 mg；100 mgのペプチド結合レジンについて0.018 mmolと推定される)上で、完成したCGRP8-37ペプチドの一部を、それぞれN-Fmoc-Peg12-酸及びFmoc-Asp(OCholestanol)-OHを用いて、順次脱保護し、カップリングした。次いで、DIPEA (6モル等量)を使用して、20分間活性化したDMF中において、レジン結合化合物を、無水酢酸(3モル等量)を用いて処理した。次いで、2 mLのTFA/TES/H2O (95：2.5：2.5)の混合液を使用して、3時間掛けて、化合物を切り出し、同時に保護基を除去した。milli-Q水中において、粗化合物を取り出し、RP-HPLC精製に供し、1.3 mgの収量で、不定形の白色粉末として化合物4を得た。ESI-MS分析によって、正確な分子量を有するものとして、化合物を確認した。
化合物4、計算されたm/z (モノアイソトピック)：C199H336N46O55[M+ 3H]3+ 1418.84、[M + 4H]4+1064.38、[M + 5H]5+ 851.71、[M+ 6H]6+ 709.92；観測された：[M+ 3H]3+1418.85、[M + 4H]4+ 1064.45、[M + 5H]5+ 851.80、[M+ 6H]6+710.05。
【０３２７】
実施例4：NK1Rエンドソーマル・トラフィッキング
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を使用して、HEK293細胞における、GPCRトラフィッキング (βarr)の鍵調節因子、並びに血漿(Kras)及び早期エンドソーマル膜（Rab5a)の滞留タンパク質に対する、NK1Rの近接を定量的に評価した(図1A)。物質P (SP、1、10nM)は、NK1R-RLuc8及びβarr1-YFP及びβarr2-YFP間のBRETを刺激した (図1B、C)。SPは、NK1Rエンドサイトーシスと一致して、NK1R-RLuc8/KRas-Venus BRETを低減し、付随してNK1R-RLuc8/Rab5a-Venus BRETを増大した(図1D)。ダイナミン阻害剤Dyngo 4a (Dy4)、クラスリン阻害剤PitStop 2 (PS2)及びドミナントネガティブダイナミンK44Eの発現の全てが、NK1R-RLuc8/KRas-Venus BRETにおける減少及びNK1R-RLuc8/Rab5a-Venus BRETにおける増加をブロックしたので(図1E、F)、エンドサイトーシスはダイナミン及びクラスリンに依存的であった。不活性型Dy4 (Dy4（inact）)、不活性型PS2 (PS2（inact）)及び野生型 (WT)ダイナミンは、効果が無かった。ダイナミンK44Eは、NK1R-RLuc8/βarr1-YFP及びβarr2-YFP BRETを増大した。このことは、エンドサイトーシスが、NK1R/βarrの解離を開始することを示唆している。
【０３２８】
HEK-NK1R細胞におけるAlexa568-SPのトラフィッキングを研究することによって、NK1Rの場所を突き止めた。ビヒクル処理細胞 (Veh)においては、Alexa568-SPは、4℃で細胞膜受容体に結合し、37℃で30分後に、エンドソームに完全に再分配した。不活性の対照では引き起こさなかったが、Dy4及びPS2は、細胞膜近くの小胞中においてAlexa568-SPの滞留を引き起こした（データ非表示）。従って、SPは、βarrとのNK1Rの会合を促進し、NK1Rのクラスリン及びダイナミン依存的なエンドサイトーシスを誘導する。
【０３２９】
実施例5：NK1Rエンドソーマル・シグナル伝達
NK1Rトラフィッキングとシグナル伝達との間の関連性を研究するために、NK1R及びForster共鳴エネルギー移動 (FRET)バイオセンサーは、細胞質内で (CytoEKAR)又は核内で活性化したERK (NucEKAR、図2A)、細胞膜で (pmCKAR)又は細胞質内で活性化したPKC (CytoCKAR、図2C)、並びにHEK293細胞内で発現した細胞膜で (pmEpac2)又は細胞質内でのcAMP (CytoEpac2、図2E)、を標的として検出した。SP (1 nM)は、急速かつ一時的に、細胞質ERKを活性化し (非表示)、核ERKの遅延し、かつ持続した活性化を引き起こした(図2B)。SPは、細胞膜PKC活性（非表示）に影響しなかったが、細胞質PKC活性においては、急速かつ持続した増加を引き起こした(図2D)。SPは、一時的に、細胞膜cAMPを増大させ（非表示）、細胞質cAMPにおける持続した増大を引き起こした(図2F)。不活性対照は無効にしなかったが、PS2及びDy4は、核ERK (図2B)、細胞質PKC (図2D)及び細胞質cAMP (図2F)のSP刺激を無効にした。PS2及びDy4は、細胞質ERK又は細胞膜cAMPのSP活性化を抑制しなかったが、両方の反応が維持されるようにした。PS2及びDy4は、細胞膜PKC活性を増幅した。ダイナミンWTは、核ERKのSP活性化を拡大した一方で、ダイナミンK44Eは核ERKの活性化を無効にした(図2G)。ダイナミンK44Eは、細胞質ERKの活性化をブロックしなかったが、維持させるようにする反応を引き起こした。ダイナミン及びクラスリンsiRNAは発現を阻害し、核ERKのSP活性化を抑制した (図2H)。従って、クラスリン及びダイナミン依存的なNK1Rエンドサイトーシスが核ERKの活性化に必要とされ、それはまたβarrに依存し、細胞質PKC及びcAMPの活性化にも必要である。
【０３３０】
GPCRを介したPKC及びcAMPシグナル伝達は、ヘテロ三量体のGタンパク質に依存し、HEK293細胞のエンドソーム中においてGタンパク質を活性化するためのSPの能力を試験した。Rab5a及びGγ2に対する、NK1R及びGαqの近接を決定するために、BRETを使用した。SP (0.1〜10 nM)は、NK1R-RLuc8/KRas−Venus BRETを低減し、NK1R-RLuc8/Rab5a-Venus BRETにおける増加を映し出していた (図3A、B)。SPはGαq-RLuc8/Gγ2-Venus BRETを低減し、それは15分間維持され(図3C)、15分でGαq-RLuc8/Rab5a-Venus BRETを増大させた(図3D)。HEK-NK1R細胞の細胞膜で又はエンドソーム中で、GαqがNK1Rと共在化するかを決定するために、免疫蛍光法及び超解像顕微鏡法を使用した。4℃でのSP (10 nM)を用いたインキュベーション後、NK1R免疫反応性(NK1R-IR)及びGαq-IRは、細胞膜で共在化した。洗浄し、37℃で15分間温めた後、NK1R-IR及びGαq-IRは、早期エンドソーマル抗原1 (EEA1)と共在化した（データ非表示）。従って、SPは、その解離によって、このGタンパク質複合体を活性化し、エンドソームにGαqを補充する。
【０３３１】
βarr及びPKCにも依存し、表皮成長因子受容体トランス活性化から独立している、核ERKのSP活性化を、Gαq阻害剤UBO-QICは抑制した(図3E)。Gαq、PLC及びCa2+依存的PKC経路の活性化と一致して、UBO-QIC、PLC阻害剤U73122及びCa2+キレート剤EGTAは、細胞質PKCの活性化を抑制した (図3F)。Gαs阻害剤NF449は抑制しなかったが、UBO-QIC、PKC阻害剤GF109203X及びEGTAは、細胞質cAMPのSP生成を抑制した (図3G)、このことはcAMPの生成における、Gαqが媒介する、Ca2+依存性PKCの活性化と関係する。UBO-QICは、NK1Rエンドサイトーシスに影響しなかった。これらの結果は、活性化したNK1R及びGαqはエンドソームに移動し、そこでGαqが核ERK及び細胞質PKC及びcAMPを生成することを示唆する。
【０３３２】
実施例6：NK1Rエンドサイトーシス及び脊髄ニューロンの活性化
カプサイシン (一時的な受容体潜在的なバニロイド1アゴニスト)を含む、痛みを伴うプロ炎症性の刺激は、後角ラミナI、IIにおける一次感覚性侵害受容器からのSP放出を引き起こし、そこでSPは脊髄ニューロン10,11におけるNK1Rエンドサイトーシスを刺激する。SPは、脊髄ニューロンの持続的なNK1R依存性の興奮を引き起こす20。
NK1Rエンドソーマル・シグナル伝達がこの維持された活性化を媒介するかを評価するために、ラット脊髄の切片において、後角のラミナIにおけるNK1R陽性ニューロンから、セルアタッチ・パッチクランプレコーディングを作製した。SP (1μM、5分)は、Dy4によって抑制されたNK1Rエンドサイトーシスを刺激した (図4A)。SP (1μM、2分)は、洗い流した後も維持された、活動電位の急速な発火を引き起こした (図4B、C、D)。Dy4（不活性）では起こらなかったが、Dy4は、最初の興奮には影響しなかったが、SP除去後も維持した、持続的な活動電位の放電を抑制し(図6B、C、D)、NK1Rエンドサイトーシスを阻害した。これらの発見は、持続的なニューロンの興奮における、NK1Rエンドサイトーシスについての役割をサポートする。
Dy4は、ラット脊髄の切片における、グルタミン性の一次求心性シナプス伝達又はシナプスの疲弊に影響しなかった（非表示）。PS2及びDy4は、マウス背脊髄のセグメントからのSP-IR及びCGRP-IRの基礎的な又はカプサイシン刺激性の放出に影響しなかった。
【０３３３】
実施例7：NK1Rエンドサイトーシス及び痛みの伝達
in vivoでのNK1Rエンドサイトーシスにおけるダイナミン及びクラスリンの関与を決定するために、ビヒクル (Veh)、Dy4、Dy4（不活性）、PS2又はPS2（不活性）を用いて、Sprague-Dawleyラット (雄性、3〜8週)の髄腔内 (L3/L4)に注射した。ビヒクル又はカプサイシンの足底内注射を、30分後に左の後ろ脚に行った。NK1Rの位置を見出すために、10分後に、脊髄を回収した。対照(髄腔内、足底内ビヒクル)においては、NK1R-IRは、殆んどがラミナIニューロンの神経細胞体及び神経突起の細胞膜にあった (神経細胞体の細胞膜の0.5μｍ以内に、総NK1R-IRの80.7±1.6%)。カプサイシンは、NK1Rエンドサイトーシスを刺激した (細胞膜に、NK1R-IRの42.1±5.6%、対照に対してP<0.001；図4A)。Dy4（不活性）又はPS2（不活性）は阻害しなかったが、Dy4又はPS2は、カプサイシン刺激性NK1Rエンドサイトーシスを阻害した (％膜：Dy4 59.6±0.2、Dy4（不活性） 49.9±0.8、P<0.001；PS2 69.0±1.1、PS2（不活性） 51.9±1.3、P<0.05；図4A)。
【０３３４】
痛みを伴う末梢刺激は、受容体エンドサイトーシスと同時に起こり、痛覚過敏に貢献する、NK1R発現脊髄ニューロンにおけるERKを活性化する。足底内のカプサイシンは、後角ラミナIニューロンにおけるERKリン酸化を刺激した(図5B)。不活性類似体は抑制しなかったが、Dy4又はPS2は、脊髄ERKのカプサイシン誘発性の活性化を抑制した。従って、カプサイシンは、in vivoにおいて、脊髄ニューロンにおける、クラスリン及びダイナミン依存的なNK1Rエンドサイトーシス及びERK活性化を刺激する。
【０３３５】
NK1R、クラスリン及びダイナミンの重要性を評価するために、ビヒクル、NK1RアンタゴニストSR140,333、Dy4、Dy4（不活性）、PS2又はPS2（不活性）を用いて、マウス (C57BL/6、雄性、6〜10週)の髄腔内 (L3/L4)に注射した。30分後、ビヒクル又はカプサイシンの足底内注射を、左の後ろ脚に行った。von Freyフィラメントを用いて、左及び右脚の足底面を刺激することによって、機械的な痛覚過敏を測定し、キャリパーを用いて左脚の厚さを測定することによって、炎症性の浮腫を評価した。ビヒクル (髄腔内)処理したマウスにおいては、カプサイシンは左脚の機械的痛覚過敏及び浮腫を引き起こした。Dy4（不活性）及びPS2（不活性）は阻害しなかったが、SR140,333、Dy4及びPS2は、痛覚過敏を阻害した (図6A、B)。浮腫が影響を受けなかったことによって、脊髄におけるそれらの局所的な作用が確認された(図6C)。Dy4及びPS2は、注射していない右の後ろ脚の脚の逃避反応、又はローターロッドでの滞留時間に影響しなかった。このことは、正常な運動行動を示唆する(図5D)。ダイナミン-1 siRNAの髄腔内注射によって、脊髄ダイナミン-1レベルが低減し、24時間及び48時間でのカプサイシン誘発性の痛覚過敏が阻害された (図6E、F)。髄腔内のβarr1＋2 siRNAによって、βarr1及び2の脊髄でのレベルが低減し、また36時間でのカプサイシン誘発性の痛覚過敏が阻害された(図5G〜H)。siRNAは、注射していない右の後ろ脚の脚の逃避反応に影響しなかった（非表示）。髄腔内のMEK阻害剤U0126は、カプサイシン誘発性の痛覚過敏を阻害した (図6I)。NK1Rリサイクル及び再感作を抑制するエンドセリン変換酵素-1の阻害剤である、髄腔内のSM-19712は、痛覚過敏に対する影響がなかった。このことは、エンドサイトーシス阻害剤の鎮痛作用が、阻害された再感作によるものではないことを示唆する。髄腔内のDy4及びPS2は、ホルマリンを足底内に注射することによって誘発された、マウスにおける生体防御行動の両方の段階を阻害した(図6J、K)。完全フロイントアジュバント (CFA)の足底内注射は、髄腔内のDy4及びPS2によって、1〜5時間以内に部分的に逆転したマウスにおける、維持された機械的痛覚過敏を引き起こした(図6L)。足底内のカプサイシン、ホルマリン及びCFAは、いずれも、髄腔内のDy4によって阻害されたマウス後角のニューロンにおけるNK1Rエンドサイトーシスを誘発した（データ非表示）。
【０３３６】
これらの結果は、ダイナミン、クラスリン、βarr及びMEK阻害剤が鎮痛剤であったので、NK1Rエンドサイトーシス及び結果として起こるERKの活性化が痛覚過敏に貢献するという仮説と一致するものである。エンドサイトーシス阻害剤の鎮痛作用は、影響を受けなかった、神経ペプチド放出、シナプス伝達又は運動協調性が乱されたことによるものである可能性は低い。
【０３３７】
実施例8：エンドソーマルNK1Rの治療ターゲティング
エンドソーマルNK1Rが、ニューロンの活性化及び持続的な痛覚過敏の根底にある区分化されたシグナルを生成するという発見は、エンドソームにおけるNK1Rの拮抗作用が疼痛に対する効果的な治療を得得ることを示唆していた。このアプローチの有用性を探索するために、本発明の化合物に加えて、脂質コレスタノール又はエチルエステル (対照、膜アンカーなし)、ポリエチレングリコールリンカー及び蛍光色素Cyanine 5 (Cy5)を含むトリパータイト・プローブを合成した。HEK293細胞を用いてインキュベーション後、細胞膜に5分でCy5-コレスタノールを挿入し、プローブの50%超が内在化する時間である30〜60分で、エンドソームにおいて検出された一方で、Cy5-エチルエステルは細胞外液中に残った(図7B)。4時間後、Cy5-コレスタノールは、細胞膜から、NK1R-GFPを含むRab5a陽性早期エンドソームに再分配された。
【０３３８】
エンドソームにおけるNK1Rをターゲティングするトリパータイト・プローブの能力を定量的に評価するために、FRETを使用した。細胞外N末端Snap-Tagを有するNK1RをHEK293細胞内で発現させ、膜非浸透のSNAP-SurfaceTM 549光安定性蛍光基質を用いて、細胞表面NK1Rを標識した。SP (10 nM、30分)は、全ての検出可能なSNAP-549のエンドソームに対する移動を誘発した。Cy5-コレスタノールを添加してから5分以内に、SNAP-549-NK1R及びCy5-コレスタノールFRETが検出され、75分超の間増加した（データ非表示）。FRETの細胞内起源の分析によって、エンドソーマルNK1Rと関連するプローブと一致して、シグナルの75%超が細胞内であることが確認された。
【０３３９】
化合物1は、HEK-NK1R細胞における、SP (3 nM、EC80)刺激性Ca2+シグナル伝達と拮抗し (pIC50スパンタイドI：8.23±0.21；化合物1：8.44±0.29)、それゆえアンタゴニスト活性を保持する。トリパータイト・プローブが細胞膜から枯渇し、4時間後にエンドソーム再分配されたので、NK1Rエンドソーマルシグナル伝達に影響を及ぼす化合物1及びスパンタイドの能力を、HEK293と共にプレインキュベートした4時間後と比べた。化合物1、スパンタイド又はSR140333を用いて、細胞を30分間プレインキュベートし、次いで直ぐにSPを用いてチャレンジした場合、全てのアンタゴニストは、核及び細胞質ERKの活性化をブロックした(図7C)。このことは、細胞表面NK1Rと効果的に拮抗する作用を示している。それに対して、アンタゴニストを用いて、細胞を30分間パルスインキュベートし、洗浄し、次いで4時間後にSPを用いて刺激した場合、化合物1のみが核ERKを阻害し、アンタゴニストのいずれもが細胞質ERKを阻害しなかった。化合物1は、内在的β2-アドレナリン受容体によって媒介される、イソプレナリン誘導性の核ERKの活性化に影響しなかった（非表示）。従って、コレスタノールに共役させることによって、NK1R陽性の早期エンドソームにプローブを送達し、パルスインキュベーション後に、化合物1が、細胞表面NK1Rでなくエンドソーマルの持続的で選択的な拮抗作用を引き起こす。
【０３４０】
次に、エンドソーマルNK1Rの拮抗作用が、脊髄ニューロンの持続的なSP誘導性興奮をブロックするかを評価するために、化合物1又はスパンタイドを用いて、ラット脊髄の切片をインキュベートした。60分間のインキュベーション後、脊髄切片を洗浄し、アンタゴニスト-フリーの培地中で60分間インキュベートし、次いでSPを用いてチャレンジした。ビヒクル又はスパンタイドで前もって処理した切片においては、SPは、SP除去後も維持された活発な活動電位の放電を引き起こした(図8A〜C)。化合物1は、最初の興奮を抑制しなかったが、SP除去後も維持された活動電位の放電を抑制した。従って、エンドソーマルを標的とし、膜にアンカーされたNK1Rアンタゴニストは効果的に脊髄ニューロンの持続的なSP誘導性活性化をブロックし、長く続く鎮痛を引き起こす。
【０３４１】
エンドソーマルNK1Rの拮抗作用が侵害受容をブロックするかを評価するために、Cy5-コレスタノール、スパンタイド又は化合物1を、マウスの髄腔内に注射した。3時間後、カプサイシンを脚に注射した。スパンタイド又はCy5-コレスタノールは阻害しなかったが、化合物1は、120分超で、カプサイシン誘発性の痛覚過敏を顕著に阻害した(図8D)。カプサイシン投与後、30分で、髄腔内のスパンタイドは、小さく、一時的な (1時間)鎮痛効果を有していた一方で、化合物1は、遅延し(3時間)、持続的で(6時間超)、実質的な(50％超の阻害)鎮痛を引き起こした (図8E)。6時間後、ラミナI〜IIIニューロンにおいて、Cy5-コレスタノールが検出されたことは、効果的にプローブが送達されたことを示唆する（非表示）。足底内にホルマリンを注射する3時間前に、髄腔内に注射した場合、化合物1は、スパンタイド又はSR140333よりも効果的に、生体防御行動の両方の段階を顕著に阻害した(図8F、G)。足底内にCFAを注射した36時間後に、髄腔内に注射した場合、化合物1は4時間後も鎮痛剤であり、6時間超で鎮痛が持続した一方で、SR140333及びスパンタイドの鎮痛作用は、小さく一時的であった (図8H、I)。
【０３４２】
エンドソーマル・ターゲティングの一般的な有用性を評価するために、ポリエチレングリコール・リンカーを介して、小分子NK1RアンタゴニストL733-0660をコレスタノールに結合した(化合物2)。足底内にカプサイシンを注射する3時間前に髄腔内に注射した場合、化合物2は、4時間超で持続的な鎮痛を示した一方で、L-733,060の効果は小さく一時的であった (図8J)。
従って、エンドソーマルを標的とし、膜にアンカーされたNK1Rアンタゴニストは、効果的に脊髄ニューロンの持続的なSP誘導性の活性化をブロックし、長く続く鎮痛を引き起こす。スパンタイド及び化合物1は、同様に4時間超で、ヒトCSF内で安定であるが、マウスの髄腔内に注射した後、スパンタイドは広く代謝される一方で、化合物1は安定していた（非表示）。エンドソーマル・ターゲティング及び保持は、スパンタイド-コレスタノールのin vivoでの安定性に貢献し得る。
【０３４３】
実施例9：CLRシグナル伝達及び痛みの伝達
CGRP及びSPは、共に一時感覚ニューロンから放出され得、疼痛及び神経性の炎症を誘発する。CGRPが、CLRのβarr依存性エンドサイトーシスを刺激することが示されているという事実を考慮して、エンドソームからのCLRシグナルに関する調査を行った。CGRP (1 nM)は、CLRエンドサイトーシスと一致して、CLR-RLuc8/KRas-Venus BRETを低減し、CLR-RLuc8/Rab5a-Venus BRETを増大することが見出された（非表示）。PS2及びダイナミンK44Eは、これらの効果を阻害した。CGRPは、核及び細胞質ERKを刺激した。Dy4及びダイナミンK44Eは、核の活性化を抑制したが、細胞質ERKは抑制しなかった。CLRアンタゴニストCGRP8-37を含む化合物4は、HEK-CLR/RAMP1細胞において、CGRP刺激性のCa2+シグナル伝達と効果的に拮抗することが見出された。HEK293細胞を用いて、30分間プレインキュベーション後、CGRP8-37及び化合物4の両方が、核及び細胞質ERKのCGRP刺激性の活性化を阻害した（データ非表示）。アンタゴニストを用いて、細胞を30分間パルスインキュベートし、洗浄し、次いで4時間後にCGRPを用いて刺激した場合、化合物4のみが核ERKを強力に阻害し、いずれのアンタゴニストも細胞質ERKを強力に阻害しなかった。
【０３４４】
マウスの髄腔内に注射した場合、化合物4及び小分子CLRアンタゴニストのオルセゲパントは同様に、CGRP8-37よりも完全に、カプサイシン誘発性の機械的痛覚過敏を阻害し、ホルマリン誘発性の生体防御行動の両方の段階を阻害した(図9)。処置は、注射を受けていない足の脚の逃避に影響しなかった(図9B)。CGRP8-37は逆転しなかったが、化合物4はCFA誘導性の痛覚過敏を逆転した (図9E)。化合物4はまた、ホルマリン誘発性の防御行動を阻害した(図9C、D)。
これらの結果は、エンドソーマルCLRシグナル伝達が、脊髄ニューロンの興奮及び疼痛の伝達を調節することを示唆する。
【０３４５】
実施例１0：エンドソーマルNK1Rの活性化
GR73632 [Ava-Phe-Phe-Pro-N-MeLeu-Met-NH2]は、エンドセリン変換酵素1による切断に対して感受性が無いニューロキニン1受容体アゴニストである (Hagan R.M.ら、Neuropeptides 1991, 19, 127-35)。可撓性のPEGリンカーを介して、GR73632をコレスタノール (化合物3)又はエチルエステル (GR73632-エチルエステル)に結合した。次いで、NK1Rを発現するHEK293細胞におけるこれらの化合物の影響を調べた。
【０３４６】
カルシウム移動アッセイによって、フリーのアゴニスト(logEC50＝−9.03)と比較した場合に、GR73632-エチルエステル (logEC50＝−7.28)及び化合物3 (logEC50＝−6.80)の効力における約100倍の低下が明らかになった。生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)アッセイは、GR73632と比較して、化合物3が、βarrの補充を誘導しないことを示す。これらのデータは、化合物3が細胞膜ニューロキニン1受容体をバイパスすることを示唆する。
【０３４７】
細胞外シグナル関連キナーゼ (ERK)活性化の時空間的な描写のための、細胞質及び核をターゲティングする細胞外制御キナーゼ活性レポーター (EKAR)バイオセンサー(Harvey C.D.ら、PNAS 2008, 105, 19264-9)を使用して、Forster共鳴エネルギー移動(FRET)アッセイを行った。20分超で画像化したFRETアッセイにおける予備データは、フリーのGR73632アゴニストが、持続的な細胞質及び核ERKリン酸化を刺激した一方で、GR73632-エチルエステルに応答したERKリン酸化が観察されなかったことを示した。化合物3は、持続的な核ERKリン酸化を刺激するが、細胞質ERKを刺激しない。
これらの結果は、化合物3がエンドソーマルNK1Rの選択的アゴニストであることを示す。
【０３４８】
実施例１1：生物学的方法
Alexa568-SP
DMF (500μl)中において、SP (1.48μmol)及びトリエチルアミン(2.9μmol)を用いて、AlexaFluor568 NHSエステル (Invitrogen、Carlsbad、CA；6.3μmol)をインキュベートした (15時間、室温)。逆相HPLCによってAlexa568-SPを精製した。マススペクトロメトリー：m/z 1012.8（calcd for C96H127N19O24S3 [M + 2H+] m/z 1012.9）によって、生成物を確認した。
【０３４９】
cDNA
BRETプローブ、NK1R-RLuc8、KRas-Venus、Rab5a-Venus、βarr1-YFP、βarr2-YFP、Gαq-RLuc8及びGγ2-Venusは記載されている(Kocan, M.ら、Frontiers in Endocrinology, 2010, 1, 12；Lan, T. H.ら、Traffic, 2012, 13, 1450-1456)。CytoEKAR及びNucEKAR及びCytoCKAR及びpmCKARは、Addgene由来であった (それぞれプラスミド18680、18681、14870、14862)。CytoEpac2-campsはM Lohse (Wurzburg大学)から入手し、pmEpac2-campsはD Cooper (Cambridge大学)から入手した。GFP-ダイナミン及びGFP-ダイナミンK44Eは、記載されている(Schmidlin, F.ら、J. Biol Chem, 2001, 276, 25427-25437)。細胞外N末端Snap-Tag（登録商標）を付したヒトNK1RをCisbioから入手した。完全長及びトランケートδ312ラットHA-NK1Rは、記載されている (Dery, O., Defea, K. A. & Bunnett, N. W., American Journal of Physiology, 2001, 280, C1097-1106)。PCRによって終止コドンを除去し、pcDNA3.1-RLuc8ベクターにサブクローニングすることによって、RLuc8を融合したこれらのコンストラクトを生成した。HA-CLR及びMyc-RAMP1は、記載されている (Cottrell, G. S.ら、J Biol. Chem., 2007, 282, 12260-12271)。CLR-RLucは、M. Bouvier (Montreal大学)から入手した。
【０３５０】
細胞株、トランスフェクション
N末端HA11エピトープを有するラットNK1Rを安定して発現するHEK293細胞は、記載されている (Roosterman, D.ら、P.N.A.S., 2007, 104, 11838-11843)。ポリエチレンイミン(Polysciences)又はFuGene (Promega)を使用して、HEK293細胞を一時的にトランスフェクトした。5％FBSを補充したDulbecco改変Eagle培地 (DMEM)中で、細胞を増殖させた(37℃、5％CO2)。
【０３５１】
BRET
以下のcDNAを用いてHEK293細胞をトランスフェクトした：1μg NK1R-RLuc8若しくは1μg CLR-RLuc8 + 1μg Myc-RAMP1 + 4μg KRas-Venus、4μg Rab5a-Venus、4μg βarr1-YFP、又は4μg βarr2-YFP；或いは、1μg NK1R + 0.5μg Gαq-RLuc8 + 1μg Gβ1 + 4μg Gγ2-Venus；或いは、1μg NK1R + 0.5μg Gαq-RLuc8 + 1μg Gβ1 + 1μg Gγ2 + 4μg Rab5a-Venus。48時間後、Hank平衡塩類溶液(HBSS)中で37℃で細胞を平衡化し、RLuc基質のセレンテラジンhを用いてインキュベートした(5μM、15分)。SP (0.1〜10 nM)又はビヒクル (dH2O)を用いてチャレンジする前及び後に、マイクロプレートリーダーLUMIstar Omega (BMG LabTech)を使用して、BRET比を決定した。
【０３５２】
区分化されたシグナル伝達のFRETバイオセンサー
1ウェル当たり55 ngのN末端HA.11エピトープタグを有するラットNK1R (HA-NK1R)又はCLR plus RAMP1、及び1ウェル当たり40 ngのFRETバイオセンサーを用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。血清制限（0.5％FBS終夜）後、トランスフェクションの48時間後に、FRETを評価した。クラスリン又はダイナミンsiRNAを使用した実験のために、1ウェル当たり55 ngのラットHA-NK1R、1ウェル当たり40 ngのFRETバイオセンサー、及び1ウェル当たり25 nMの混合クラスリン又はダイナミンON-TARGETplus SMARTプールsiRNA (GE Dharmacon)を用いて、細胞をトランスフェクトした。血清制限(0.5％FBS終夜)後、トランスフェクションの72時間後に、FRETを評価した。HBSS中、37℃で細胞を平衡化し、GE Healthcare INCell 2000 Analyzerを使用して、FRETを分析した。GFP/RFP発光比分析のために、FITCフィルター (490/20)を使用して、細胞を順次励起し、dsRed (605/52)及びFITC (525/36)フィルターを使用して発光を測定し、FITC/dsRedフィルター・ペア (Quad4)のためにポリクロニック（polychronic）に最適化した。CFP/YFP発光比分析のために、CFPフィルター (430/24)を使用して、細胞を順次励起し、YFP (535/30)及びCFP (470/24)フィルターを使用して発光を測定し、CFP/YFPフィルター・ペア (Quad3)のためにポリクロニック（polychronic）に最適化した。細胞を1分毎に画像化したことにより、1分毎に14ウェルの画像取り込みが可能となる。ベースラインとなる発光比の画像を4分間キャプチャした。SP (1 nM)、GGRP (1 nM)又はビヒクルのEC50濃度で、細胞をチャレンジし、画像を20分間キャプチャした。次いで、陽性対照 (ERKに対しては、200 nMホルボール 12,13-ジブチレート；PKCに対しては、200 nMホルボール 12,13-ジブチレートとホスファターゼ阻害剤カクテル；cAMPに対しては、10μMフォルスコリン、100μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、100 nM PGE1)を使用して、10分間、細胞を刺激し、最大となる増加を生成し、陽性の発光比の画像を4分間キャプチャした。記載したようにデータを分析し、各細胞について、ベースラインに対する相対的な発光比(F/F0)で表した。陽性対照を用いて刺激後の、F/F0において10%超で変化した細胞を、分析のために選択した。
【０３５３】
エンドソーマルNK1RターゲティングのFRETアッセイ
1ウェル当たり50ngの細胞外N末端Snap-Tag（登録商標）を有するNK1Rを用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。48時間後、SNAP-SurfaceTM 549光安定性蛍光基質 (New England Biolabs)を用いて、細胞表面NK1Rを標識した(0.5％BSAを含むDMEM中、1μM、30分、37℃)。細胞を洗浄し、DMEM中において、30分間掛けて回収し、SPを用いて刺激し(10 nM、30分、37℃)、NK1Rエンドサイトーシスを誘導した。Cy5-コレスタノールを用いて細胞をインキュベートした(200 nM、37℃)。Cy5-コレスタノールの添加の前及び後に、Argon (514 nm)／HeNe (633 nm)レーザーを用いた順次の興奮、並びに570〜620 nm (SNAP-549ドナー)及び670〜750 nm (Cy5 FRET及びCy5アクセプター)での発光を使用して、共焦点顕微鏡法によって、SNAP-549／Cy5感作性発光FRETを分析した。対照は、トランスフェクトしていないHEK293細胞 (アクセプターのみ)及びCy5-コレスタノールで処理していないHEK293細胞 (ドナーのみ)を含んでいた。記載されるようにFRETを分析し、対照に対する相対的な発光比(F/F0)で表した。
【０３５４】
Ca2+アッセイ
記載されるように (Jensen, D. D.ら、J Biol Chem, 2014, 289, 20283-20294)、[Ca2+]iを測定した。Fura2-AM (2μM)を用いて、HA-NK1又はHA-CLR/Myc-RAMP1を一時的に発現するHEK293細胞をロードした。スパンタイド、化合物1、L-733,060、化合物2、CGRP8-37又は化合物4のアンタゴニスト能力を比較するために、アンタゴニストを用いて30分間プレインキュベートし、次いでSP (3 nM、EC80)又はCGRP (10 nM、EC80)を用いてチャレンジした。
【０３５５】
ELISA
HA-NK1R又はHA-NK1Rδ312を用いて、一時的にトランスフェクトしたHEK293細胞をPFA中で固定した (30分)。トータルでの発現の分析のために、固定後に、TBS中の0.5％NP-40を使用して細胞を透過処理した (30分)。ブロッキングバッファー(1％スキムミルク粉末、0.1M NaHCO3)中で、細胞をインキュベートし（4時間、室温)、次いで抗HA (1：5,000、Sigma)を用いてインキュベートした（終夜、4℃)。細胞を洗浄し、抗マウス・セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗体を用いてインキュベートした (1：2,000、2時間、室温)。細胞を洗浄し、SIGMAFAST OPD基質 (SigmaAldrich)を使用して染色した。EnVisionプレートリーダー (PerkinElmer Life Sciences)を使用して、490 nmでの吸収を測定した。pcDNA3を用いてトランスフェクトしたHEK293細胞、又は未処理の細胞に対して、値を標準化した。
【０３５６】
細胞株におけるNK1Rトラフィッキング
HEK-NK1R細胞を、ポリ-D-リジンでコートしたガラス製チャンバースライド又はカバースリップ上にプレーティングし、48時間培養した。蛍光SPの取り込みを試験するために、Alexa568-SPを含むHBSS中で、細胞をインキュベートし (100 nM、20分、4℃)、洗浄し、37℃で30分間インキュベートし、4％パラホルムアルデヒド、100 mM PBS pH 7.4中で固定した (PFA、20分、4℃)。共焦点顕微鏡法によって、細胞を調べた。NK1R及びGαqのトラフィッキングを試験するために、SP (100 nM)又はビヒクルを含むHBSS中で細胞をインキュベートし（15分）、固定した。PBS、0.2％サポニン、3％通常ヤギ血清中で細胞をブロックした (1時間、室温)。一次抗体：ラット抗HA (1：1,000；Roche)、ウサギ抗Gαq (1：2,000、C-19；Santa Cruz Biotechnology)、マウス抗EEA1 (1：100、610457；BD Biosciences)中で細胞をインキュベートした(終夜、4℃)。細胞を洗浄し、ロバ抗ラットAlexa488 (1：500)、ロバ抗ウサギAlexa568 (1：1,000)及びロバ抗マウスAlexa647 (1：1,000)(Life Technologies又はJackson ImmunoResearch)を用いてインキュベートした(1時間、室温)。超解像顕微鏡法によって、細胞を調べた。
【０３５７】
Cy5トリパータイト・プローブの取り込み
HEK293細胞を、ポリ-D-リジンでコートしたガラス製カバースリップ上にプレーティングした。CellLight（登録商標）Rab5a-RFP (Life Technologies)を用いて細胞を感染させ、又はラットNK1R-GFPを用いて細胞をトランスフェクトした。24時間後、細胞を、HBSS中で平衡化し、共焦点顕微鏡法によって37℃で画像化し、Cy5-コレスタノール又はCy5-エチルエステル (1.5μM)を用いてインキュベートした。NK1R-GFPを発現する細胞を、SP (10 nM)を用いてインキュベートした。
【０３５８】
動物
動物実験委員会は全ての研究について承認した。ラット(Sprague-Dawley、雄性、3〜8週)及びマウス (C57BL/6、雄性、6〜10週)は、Monash Animal Research Platform、Animal Resources Centre（Western Australia）及びHarlan Laboratoriesから得た。動物は、12時間の明／暗サイクルで、温度調節された環境で、餌料及び水を自由に摂取できるようにして維持した。過量の麻酔薬投与によって動物を屠殺し、開胸した。
【０３５９】
脊髄切片
氷冷したスクロースベースの人工CSF (sACSF)(mM：100 スクロース、63 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、1.2 MgCl2、25 グルコース、25 NaHCO3；95％O2／5％CO2)中のラット脊髄の腰椎領域から、ビブラトームを使用して、側矢状の切片 (340〜400μm)を調製した。切片を、N-メチル-D-グルカミン (NMDG)ベースの回収ACSF (rACSF)(mM：93 NMDG、93 HCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 グルコース、5 アスコルビン酸Na、2 チオウレア、3 ピルビン酸Na、10 MgSO4、0.5 CaCl2；95％O2／5％CO2)に移した（15分、34℃）。切片を、10μM MK-801を含む通常ACSF (mM：125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、1.2 MgCl2、2.5 CaCl2、25 グルコース、11 NaHCO3；95％O2／5％CO2)に移し(45分、34℃)、次いで室温で維持した。
【０３６０】
電気生理学
ラット脊髄の切片を、レコーディングチャンバーに移し、通常ACSFを用いて表面かん流した(2 ml／分、36℃)。Dodtコントラスト光学系を使用して、大きさ（キャパシタンス≧20 pF）、位置に基づいてラミナI内の推定NK1R陽性ニューロン、サイズ及びラミナIに限定された樹状突起を有する紡錘形を特定した。記録前に、Dy4又はDy4（不活性）(共に30μM、0.03％DMSO)を使用して、切片を10分間プレインキュベートし、化合物1、スパンタイド、化合物4又はCGRP8-37(全て、0.01％DMSO中、1μM)を用いて、60分間プレインキュベートし、洗浄し、アンタゴニスト-フリーのACSF中で、記録前に更に60分間、インキュベートした。電気生理学のために必要な低濃度のDMSO中において、PS2は可溶でなかった。記載されるように (Imlach, W. L.ら、Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428)、大きさ、NK1R陽性、推定された侵害受容性ラミナIニューロンを視覚的に特定した。セルアタッチ設定(Multiclamp 700B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中で、10 kHzでサンプリングし、高域の1 Hzでフィルタリングして、自発電流を記録し、Axograph X、V 1.4.4 (Axograph)を使用して、容量的に結合した（capacitatively coupled）活動電位事象を分析した。パッチ電極(2.5〜3.5MΩの抵抗)は、ホールセル設定中におけるその後の活動電位特性の記録を容易にするために、KMESベースの内部溶液 (mM：105 KMES、20 NaCl、5 HEPES、10 BAPTA、1.5 MgCl2、4 MgATP、0.4 NaGTP、0.1％ビオシチン；285〜295 mosmol.l-1)を含んでいた。活動電位特性に対するシナプス前の影響を最小にするために、CNQX (6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン)(10μM；AMPA/カイニン酸受容体アンタゴニスト)、ピクロトキシン (100μM；GABAA受容体アンタゴニスト)、ストリキニーネ (0.5μM；グリシン及びアセチルコリン受容体アンタゴニスト)、並びにAP5 ((2R)-アミノ-5-ホスホノ吉草酸；(2R)-アミノ-5-ホスホノペンタノエート)(100μM；NMDA受容体アンタゴニスト)の存在下で記録を行った。切片を、SP又はCGRP (1μM)を用いた2分間の表面かん流によってチャレンジした。CGRP及びSP受容体の共発現を確認するために、CGRPで刺激した切片を、実験の終わりにSPを用いてチャレンジした。10 kHzでサンプリングし、高域の1 Hzでフィルタリングして、記録を行い、発火率を2分間隔のビン（bins）で測定した。各セルアタッチ記録の終末に、通常の活動電位発火の保持を確認するために、電流クランプモード（current-clamp mode）でホールセル記録を行った。生きているニューロンが含まれることを確認するために、細胞が閾値を超える50 mV以上である活動電位強度を有した場合、分析中のデータのみを含めた。細胞をビオシチンで満たし、免疫蛍光によってNK1R発現を確認するために切片を処理した。各細胞についての発火率を、群間で有意に異ならなかった、2分の時点での反応に対して標準化した。最後の活動電位に対する応答の期間で、発火時間を決定した。シナプス伝達を評価するために、対照条件下、又はDy4若しくはDy4（不活性）に曝露後にホールセル設定の記録を行った；記載されるように（Imlach, W. L.ら、Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428）、双極の刺激電極を後根進入部に配置し、電気的誘発性の興奮性シナプス後電流を記録した。NK1Rエンドサイトーシスを評価するために、SP（1μM）を用いて脊髄切片 (400μm)をインキュベートし(5分)、PFA中で固定し (4時間、室温)、凍結保護し、NK1Rの位置を見出せるように処理した。
【０３６１】
神経ペプチド放出
マウス背脊髄（頸部、胸部、腰仙骨部が結び付いた）の切片 (0.4 mm)を、0.1％BSA、1μMホスホラミドン及び1μMカプトプリルを含むKrebs溶液 (mM：NaCl 119、NaHCO3 25、KH2PO41.2、MgSO4 1.5、CaCl22.5、KCl 4.7、D-グルコース 11 mM)を用いて、表面かん流した (0.4 ml／分；95％CO2／5％O2、37℃)。Dy4、PS2、不活性類似体 (30μM)又はビヒクル (0.3％DMSO／生理食塩水)を用いて、組織を30分間、表面かん流した。次いで、阻害剤又は対照の存在下で、カプサイシン (0.3μM)を用いて、組織を表面かん流した(10分)。カプサイシン刺激の前、最中及び後に、表面かん流液を回収し(10分回収、4 ml)、SP-IR及びCGRP-IR (Bertin Pharma)について分析した。エンドサイトーシス阻害剤は、免疫アッセイと干渉しなかった。アッセイの検出限界は、SP-IRについては2 pg.ml-1であり、CGRP-IRについては5 pg.ml-1であった。結果は、fmol.g-1／20分で表す。
【０３６２】
ラット脊髄ニューロンにおけるNK1Rエンドサイトーシス
Dy4、Dy4（不活性）、PS2、PS2（不活性）(全て50μM)、又はビヒクル (1％DMSO／生理食塩水)を、意識のあるラットの髄腔内に注射した (10μl、L3/L4)。30分後、ラットを鎮静化し (5％イソフルラン)、一方の後ろ脚の足底面に、カプサイシン (12.5μg)又はビヒクル (20％エタノール、10％Tween 80、70％生理食塩水)を皮下注射した (25μl)。10分後、PBSを用いて、次いで4％PFAを用いて、ラットを経心灌流した。脊髄を回収し、PFA中に浸漬して固定し(2時間、4℃)、凍結保護した (30％スクロース、PBS、24時間、4℃)。脊髄 (T12〜L4)をOCT中に包埋し、PBSを含む48ウェルプレート中に30μm連続冠状切片を切り落とした。10％通常ウマ血清を含むPBS中で、自然に浮かぶ切片をブロッキングした(1時間、室温)。3％通常ウマ血清を含むPBS中、マウス抗NeuN (1：20,000；AbCam)と、ウサギ抗NK1R (1：5,000、＃94168)又はウサギ抗pERK (1：200；Cell SignalingTechnology)のいずれかとを用いて、切片をインキュベートした(48時間、4℃)。切片を洗浄し (PBS中、4×20分)、ロバ抗ウサギAlexa488 (1：8,000)及びロバ抗マウスAlexa568 (1：2,000；Life Technologies)を用いてインキュベートした (1時間、室温)。切片を洗浄し、DAPIを用いてインキュベートし(10μg/ml、5分)、Vectashield (Vector Laboratories)にマウントした。
【０３６３】
マウスの脊髄ニューロンにおける機械的な痛覚過敏、生体防御行動及びNK1Rエンドサイトーシス
実験前の連続した2日に、1〜2時間、マウスを実験装置及び環境に順応させた。段階的な太さのvon Freyフィラメントを用いて、後ろ脚の足底面の刺激に対して脚を逃避することによって、機械的な痛覚過敏を評価した。試験の前の日に、各動物についてのベースラインを確立するために、3回反復でvon Freyスコアを測定した。脚の浮腫を評価するために、処置の前及び後に、デジタルキャリパーを使用して、後ろ脚の厚さを測定した。足底内の注射のために、マウスを鎮静化した(5%イソフルラン)。カプサイシン(5μg)、完全フロイントアジュバント (CFA、2 mg/ml)、又はビヒクル (カプサイシン、20％エタノール、10％Tween 80、70％生理食塩水；CFA、生理食塩水)を、左の後ろ脚の足底面に皮下注射した(10μl)。カプサイシンの後30〜240分、及びCFAの注射後36〜40時間で、von Freyスコア (左及び右脚)、並びに脚の厚さ (左脚)を測定した。結果は、注射前の値の％で表した。生体防御行動の評価のために、マウスを鎮静化し、ホルマリン (4%、10μl)を左の後ろ脚の足底面に皮下注射した。マウスをPerspexコンテナ中に置き、生体防御行動 (注射した脚を縮める、舐める、噛む)を60分間記録した。防御イベントの総数を、急性段階(I、0〜10分)及び強直段階(II、10〜60分)に分けた。実験の終わりに、ラットについて記載したように、マウスをPBS及びPFAを用いて経心灌流し、脊髄を回収し、NK1Rの位置を見出すために、免疫蛍光によって処理した。調査者には、テスト剤について知らせなかった。
【０３６４】
マウスにおける髄腔内注射
髄腔内注射は、意識のあるマウスに対して行った (5μl、L3/L4)。カプサイシン若しくはホルマリンを足底内に注射する30分前に、又はCFA注射後36時間で、Dy4、Dy4（不活性）、PS2、PS2（不活性）(全て50μM)、SR-140333 (15μM)、SM-19712 (8 mM)、U0126 (100μM)、又はビヒクル (1％DMSO／生理食塩水)を、髄腔内に注射した。カプサイシンを足底内に注射する3時間前若しくは注射の30分後、ホルマリン注射の3時間前、又はCFA注射後36時間で、スパンタイド (50μM)、化合物1 (50μM)、L-733,060 (100 nM)、化合物2 (100 nM)、CGRP8-37 (10μM)、化合物4 (10μM)、オルセゲパント (10μM)、又はCy5-コレスタノール (10μM)を、髄腔内に注射した。
【０３６５】
マウスにおける髄腔内siRNA
siRNAを送達するために、カチオン性リポソーム及びアジュバントのアニオン性ポリマー（ポリグルタミン酸塩）を使用した。siRNAターゲティング・マウスダイナミン-1 (5'(S-S)UAA GUG UCA AUC UGG UCU C dTdT 3')若しくは対照siRNA (5'(S-S)CGU ACG CGG AAU ACU UCG AUU dTdT)、又はsiRNAターゲティング・マウスβ-arr1 (センス5' AGC CUU CUG CGC GGA GAA U dTdT 3'、アンチセンス5' dTdT U CGG AAG ACG CGC CUC UUA 5')及びマウスβ-arr2 (センス：5' CCU ACA GGG UCA AGG UGA A dT dT 3'、アンチセンス：5' UUC ACC UUG ACC CUG UAG G dT dT 3')若しくは対照siRNA (センス：5' AAG GCC AGA CGC GAA UUA U dT dT、3' アンチセンス：5' AUA AUU CGC GUC UGG CCU U dT dT 3')(Dharmacon)(50 ng、100 ng/μlのストックのうち0.5μl)を、0.5μlのアジュバント・ポリグルタミン酸塩(0.1μg/μlストック)及び1.5μlの無菌0.15 M NaClと混合した。リポソーム溶液、カチオン性脂質2-{3-[ビス-(3-アミノ-プロピル)-アミノ]-プロピルアミノ}-N-ジテトラデシル・カルバモイルメチル-アセトアミド (DMAPAP)及びL-α-ジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミン (DOPE)(DMAPAP/DOPE、1/1 M：M)(200μMの2.5μl)をsiRNA／アジュバントに添加し、1分間ボルテックスし、インキュベートした (30分、室温)。髄腔内注射によって、siRNAリポプレックス（lipoplexes）を、マウスに投与した (L1〜L4、5μl)。行動試験後 (24〜48時間)、ウェスタンブロッティングによってダイナミン-1発現を分析し、q-PCRによってβ-アレスチン-1及びβ-アレスチン-2発現を分析するために、脊髄 (L1〜L4)を回収した。
【０３６６】
ウェスタンブロッティング
細胞株
HALTプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む、150μlのRIPAバッファー (Thermo Scientific)中で、HEK293細胞を溶解した。サンプルを氷上で超音波処理し、遠心分離し、10％SDS-PAGEによって上清 (20μg、タンパク質)を分画し、PVDF膜にトランスファーした。Odysseyブロッキングバッファー (LI-COR Biosciences)中で、膜をブロッキングし(1時間、室温)、PBS、0.2％Tween-20、50％Odysseyブロッキングバッファー中のヒツジ抗ダイナミン-154(1：1,000)又はウサギ抗クラスリン(1μg/ml、Abcam)抗体を用いてインキュベートした(16時間、4℃)。膜を洗浄し、ロバ抗ヤギ680又はヤギ抗ウサギ680 (1：10,000；LI-COR Biosciences)を用いてインキュベートした(1時間、室温)。膜を洗浄し、LI-COR Odyssey赤外線スキャナを用いて、画像化した。膜を細長く切り、ウサギ抗βアクチン (1：1,000；Cell Signaling Technology、16時間、4℃)を用いて再探索し（re-probed）、洗浄し、ヤギ抗ウサギ800を用いてインキュベートし (1：10,000、1時間、室温、LI-COR)、再度画像化した。ImageJ (NIH)を使用してシグナルを定量化した。
脊髄
脊髄の背側の半分を、HALTプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む、100μlの氷冷したRIPAバッファー (Thermo Scientific)中に置いた。組織をホモジェナイズし、遠心分離し、10％SDS-PAGEによって上清 (20μg、タンパク質)を分離し、PVDF膜にトランスファーした。記載されるように、ダイナミン-1及びβアクチンを検出するために、膜を処理した。
【０３６７】
q-PCR
マウス腰脊髄 (L1〜L4)をRNAlater (Qiagen)中に置き、RNeasy RNA Isolationキット (Qiagen)を使用してトータルRNAを単離した。SuperscriptTM III cDNA合成キット (Invitrogen)を使用して、トータルRNA (500 ng)を逆転写した。陰性の逆転写(rt)対照として、サンプルの1/3に水を添加した。Superscript III Reverse Transcriptaseを使用して、サンプルの残りの2/3は逆転写した。Eppendorf RealPlex Real Time PCRシステムを使用して、cDNAを増幅した。20μlの増幅反応液は、cDNAの鋳型、TaqMan Universal Master Mix、及び以下の遺伝子(カタログ番号)：ARRB2 (Mm00520666_g1)、ARRB1 (Mm00617540_m1)、ACTB (Mm02619580_g1)、Gapdh (hs00363153_m1)の一つのためのTaqMan Gene Expression Assaysを含んでいた。全てのサンプルについて、3回反復で増幅した。以下の式：2ΔCTを使用した、ΔCt法に従って、各転写物の相対的な量(R)を見積もった。Ctは、蛍光の増加が指数関数的である、中間の臨界（mean critical）閾値である。PCR反応の効率が100%であると想定すると、PCRの各サイクルで、単位複製配列の量において2倍の増加に対応する。この想定で、2ΔCTを使用し、相対的な転写物の量を計算した。これらの値は、ハウスキーピング遺伝子（βアクチン及びGAPHD）の平均に対して標準化した。
【０３６８】
ローターロッド
実験前の連続した2日において、3回の試行によってマウスを順応させた。3つの連続する期間、マウスがローターロッドに留まるように訓練した。実験日、ベースラインとなる時間のための3回の試行（カットオフ：120秒）を記録した。Dy4、PS2、不活性類似体(50μM)、又はビヒクルを、髄腔内に注射した (5μl、L3/L4)。30分後、マウスを、最大120秒間、速度を加速させるローターロッド上に置いた。3回の連続した試行において時間を測定し、30、90及び120分で、落下までに留まる時間を決定した。
【０３６９】
共焦点顕微鏡法、画像分析
HCX PL APO 40x (NA 1.30)及びHCX PL APO 63x (NA 1.40)油浸対物レンズ（oil objectives）を使用した、Leica SP8共焦点顕微鏡を使用して、組織及び細胞を観察した。後角ラミナIにおけるNK1R陽性ニューロンのZスタック（Z stacks）を回収した。Imarisソフトウェア (Bitplane)を使用して、Zスタックのビデオ投影を作成した。ImageJを使用して、NK1Rエンドサイトーシス及びpERK発現を定量した。ラミナIニューロンにおけるNK1R内在化を定量するために、NeuN蛍光によってニューロンの神経細胞体の細胞質の境界を定義し、境界の5ピクセル（0.5μm）以内のNK1R蛍光を細胞膜関連受容体で定義した。細胞質に対する細胞膜のNK1R-IR蛍光の割合を、条件毎に6超のラミナIニューロンで決定した。ERK活性化を定量するために、ラミナIにおける総Neu-N陽性ニューロンに対するpERK-IRニューロンの数の割合を、条件毎に6超の視野（対物×40）で決定した。
【０３７０】
本発明の化合物の代謝安定性
脳脊髄液中における安定性を評価するために、スパンタイド又は化合物1 (10μg/ml)をヒト脳脊髄液中でインキュベートし (0〜4時間、37℃)、次いで瞬間凍結した。ACNを使用して、タンパク質を沈殿させた。脊髄中における安定性を評価するために、スパンタイド又は化合物1をマウスの髄腔内に注射した (10μM、5μl、L3/L4)。3時間後、注射部位のいずれかの側の5 mmの脊髄切片を回収し、瞬間凍結した。メタノール (30μl)及びEDTA/KF (60μl、0.1 M EDTA、4 g/l KF)の混合液中で、ガラス棒を用いて組織を破砕し、ボルテックスし、遠心分離して、脂質を除去した。該ペレットから、75％ACN/H2O (100μl)中の0.5％ギ酸を用いてペプチドを抽出した。Waters UPLCと組合せた、Waters Xevo TQ又はTQDトリプル四重極マススペクトロメーターを使用したLC/MSによってアッセイし、分析した。溶媒としてのH2O及びACN中の0.05％ギ酸を用いて、HPLC (Supelco Ascentis Express Peptide ES C18カラム、50×2.1 mm、2.7μm)によって、ペプチドを分離した。校正標準(50〜50,000 ng/ml)との比較によって、ペプチドを定量した。
【０３７１】
統計分析
データを平均±標準誤差で表した。2つの比較のために、StudentのT検定を使用して違いを評価した。多重比較のために、one-way又はtwo-way ANOVAに続けて、Dunnettの多重比較検定 (BRET、疼痛、ローターロッド、ウェスタンブロット)、Tukeyの多重比較検定 (FRET、NK1R内在化、脊髄ニューロン中のERK活性化、シナプス伝達)、Sidakの多重比較検定(脊髄ニューロンの平均発火率)、又はDunnの多重比較検定(脊髄ニューロンの発火反応期間)を使用して、違いを評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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