(57)【要約】本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断に使用されるオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントに関する。本発明は、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化を予後判定及び／又は診断する方法であって、ｉ）哺乳動物の個体の体液のサンプル、好ましくはヒトの血清サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント（単数又は複数）を測定する工程と、ｉｉ）健常な個体の体液、好ましくは血清中のレベルに対するオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はそのフラグメント（複数の場合もある）のレベルの低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示すものであると判断する工程と、を含む、方法に更に関する。本発明はまた、哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断に使用される、オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナー、並びに該免疫学的結合パートナーを含むキットを提供する。
2019513223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断における使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【請求項２】
健常な個体に対する体液中の前記オステオモジュリンタンパク質又はそのフラグメントの発現の低下又は濃度の低下が骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示す、請求項１に記載の使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【請求項３】
尿、分泌物、間質液、血液、滑液、血清、髄液、及びリンパ液からなる群から選択される体液、好ましくは血清中にて、前記発現の低下又は濃度の低下を測定する、請求項２に記載の使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【請求項４】
全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、
オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置１〜４２１で、又はアミノ酸位置２１〜４２１で表されるタンパク質であり、
前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【請求項５】
全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、
オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置１〜４２１で、又はアミノ酸位置２１〜４２１で表されるタンパク質であり、
前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【請求項６】
請求項４のａ）、ｃ）及びｅ）に記載のフラグメント、並びに請求項５のａ）、ｃ）及びｅ）に記載のフラグメントが、ＯＭＤ−（１４８〜１６２）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【請求項７】
請求項４のｂ）、請求項４のｄ）及び請求項４のｆ）に記載のフラグメント、並びに請求項５のｂ）、請求項５のｄ）及び請求項５のｆ）に記載のフラグメントが、ＯＭＤ−（２６１〜２７６）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【請求項８】
骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化を予後判定及び／又は診断する方法であって、
ｉ）哺乳動物の個体の体液のサンプル、好ましくはヒトの血清サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントを測定する工程と、
ｉｉ）健常な個体の体液、好ましくは血清中のレベルに対するオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はそのフラグメントのレベルの低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示すものであると判断する工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
哺乳動物の個体、好ましくはヒトの個体において骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の治療の治療効果を判定又は確認又は診断する方法であって、
ｉ）治療中、又は治療後の前記個体の体液のサンプル、好ましくは血清サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントを測定する工程と、
ｉｉ）下記の（１）〜（３）：
（１）工程ｉ）で得られた前記サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質若しくはそのフラグメントの正常レベル、又は、
（２）前記治療前の前記個体の体液のサンプル、好ましくは血清サンプル中のレベルに対する工程ｉ）で得られた前記サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質若しくはそのフラグメントのレベルの上昇、又は、
（３）健常な個体の体液のサンプル、好ましくは血清サンプル中のレベルに対する工程ｉ）で得られた前記サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質若しくはそのフラグメントのレベルの上昇、
のいずれか１つが、前記個体における骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の治療の治療効果を示すものであると判断する工程と、
を含む、方法。
【請求項１０】
全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、
工程ｉ）で測定されるオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置１〜４２１で、又はアミノ酸位置２１〜４２１で表されるタンパク質であり、
工程ｉ）で測定される前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、
工程ｉ）で測定されるオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置１〜４２１で、又はアミノ酸位置２１〜４２１で表されるタンパク質であり、
工程ｉ）で測定される前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０のａ）、請求項１０のｃ）及び請求項１０のｅ）に記載のフラグメント、若しくは請求項１１のａ）、請求項１１のｃ）及び請求項１１のｅ）に記載のフラグメントが、ＯＭＤ−（１４８〜１６２）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、及び／又は請求項１０のｂ）、請求項１０のｄ）及び請求項１０のｆ）に記載のフラグメント、若しくは請求項１１のｂ）、請求項１１のｄ）及び請求項１１のｆ）に記載のフラグメントが、ＯＭＤ−（２６１〜２７６）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２つのオステオモジュリンフラグメント種、すなわち請求項１０のａ）、請求項１０のｃ）及び請求項１０のｅ）、又は請求項１１のａ）、請求項１１のｃ）及び請求項１１のｅ）のいずれか１つ、並びに請求項１０のｂ）、請求項１０のｄ）及び請求項１０のｆ）、又は請求項１１のｂ）、請求項１１のｄ）及び請求項１１のｆ）のいずれか１つを測定する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
オステオモジュリンタンパク質のフラグメントであって、全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、オステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【請求項１５】
オステオモジュリンタンパク質のフラグメントであって、全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、オステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【請求項１６】
哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断に使用される、オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナー。
【請求項１７】
オステオモジュリンフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナーであって、全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、免疫学的結合パートナー。
【請求項１８】
オステオモジュリンフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナーであって、全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、前記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、免疫学的結合パートナー。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の免疫学的結合パートナーを含むキットであって、前記免疫学的結合パートナーが好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、及び他の抗原特異的抗体フラグメントからなる群から選択される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨関節炎（osteoarthritis：変形性関節症）及び／又は軟骨下骨の硬化を診断又は予後判定する方法、並びに骨関節炎のバイオマーカーとしてのオステオモジュリン及びそのフラグメント、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨関節炎（ＯＡ）は、最も一般的な関節症であり、老年集団における関節痛及び身体障害の主な原因である。骨関節炎の病因は、多因子（すなわち、年齢、肥満、関節損傷、遺伝的素因）であり、その病態生理過程にて関節全体が冒される。関節軟骨の破壊、軟骨下骨の硬化、並びに骨棘の形成、滑膜炎症、並びに靭帯及び半月板の損傷が、ＯＡの主な特徴を構成するものである。
【０００３】
ＯＡに対する治療方針（management strategies）を見出すことの他に、疾患の進行の予後判定、診断、及び監視を助けることができ、新たな治療介入の有効性を評価する手段（tools）を特定することも課題である。これらの手段は、分子レベルでの初期事象を特定し、新規の又は既存の治療法の有効性を客観的に評価するのに十分に精密かつ高感度である必要がある。可溶性バイオマーカーは、これらの手段に含まれると考えられる。
【０００４】
これまで、骨関節炎に使用されてきたのは、軟骨由来のバイオマーカーだけである。ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌ２−１、Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２、Ｃ２Ｃ、ＰＩＩＮＰ、ＣＴＸＩＩ）、アグリカン（ＭＭＰ若しくはＡＤＡＭＴＳによって生成されるネオエピトープ、ケラタン硫酸、又はＣＳ８４６）、ＣＯＭＰ、又はフィブリン−３に由来するフラグメントが主に使用されている。
【０００５】
さらに、この病状を的確に予後判定及び／又は診断することが可能な単一の特異的マーカーは現在存在していない。そのため、この病状の異なる性状を反映する異なるマーカーの組合せを用いなければならないのが現状である。実際、ＯＡは、危険因子、進行プロファイル、共存症、徴候、及び症状によって定められる異なる臨床表現型を伴う多因子症候群（heterogeneous syndrome）である。現在、骨関節炎診断法で使用されているのは、軟骨由来のバイオマーカーだけである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の技術的課題は、骨関節炎の病状を的確に予後判定及び診断するための新たなマーカー、単一の特異的マーカー、及び方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の研究を進める中で、本発明者らは、骨関節炎（ＯＡ）での硬化性の軟骨下の骨芽細胞では、オステオモジュリンがあまり発現されず、またあまり分泌されないことを発見した。さらに、本発明者らは、ＯＡ患者の体液、特に血清中にオステオモジュリンのフラグメントを見出し、またそのオステオモジュリンフラグメントの血清濃度が健常な個体のものと比べて低いことを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、以下の（１）〜（１４）を提供する。
【０００９】
（１）哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断における使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【００１０】
（２）健常な個体に対する体液中の上記オステオモジュリンタンパク質又はそのフラグメント（複数の場合もある）の発現の低下又は濃度の低下が骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示す、（１）による使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【００１１】
（３）尿、分泌物、間質液、血液、滑液、血清、髄液、及びリンパ液からなる群から選択される体液、好ましくは血清中にて、上記発現の低下又は濃度の低下を測定する、（２）による使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。健常な個体に対する上記オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はそのフラグメント（複数の場合もある）の体液レベルの低下、特に血清レベルの低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示す。
【００１２】
（４）全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、
オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置１〜４２１で、又はアミノ酸位置２１〜４２１で表されるタンパク質であり、
上記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれか１つによる使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント。
【００１３】
（５）好ましいオステオモジュリンフラグメントは、ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、又は、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
である。
【００１４】
（６）（４）のａ）、ｃ）及びｅ）によるフラグメント、又は（５）のａ）によるフラグメントが、ＯＭＤ−（１４８〜１６２）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、（１）〜（５）のいずれか１つによる使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【００１５】
（７）（４）のｂ）、ｄ）及びｆ）によるフラグメント、又は（５）のａ）によるフラグメントが、ＯＭＤ−（２６１〜２７６）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、（１）〜（５）のいずれか１つによる使用のためのオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【００１６】
（８）骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化を予後判定及び／又は診断する方法であって、
ｉ）哺乳動物の個体の体液のサンプル、好ましくはヒトの血清サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント（単数又は複数）を測定する工程と、
ｉｉ）健常な個体の体液、好ましくは血清中のレベルに対するオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はそのフラグメント（複数の場合もある）のレベルの低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示すものであると判断する工程と、
を含む、方法。
【００１７】
（９）哺乳動物の個体、好ましくはヒトの個体において骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の治療の治療効果を判定又は確認又は診断する方法であって、
ｉ）治療中、又は治療後の上記個体の体液のサンプル、好ましくは血清サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント（単数又は複数）を測定する工程と、
ｉｉ）下記の（１）〜（３）：
（１）工程ｉ）で得られた上記サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質若しくはそのフラグメント（複数の場合もある）の正常レベル、又は、
（２）上記治療前の上記個体の体液のサンプル、好ましくは血清サンプル中のレベルに対する工程ｉ）で得られた上記サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質若しくはそのフラグメント（複数の場合もある）のレベルの上昇、又は、
（３）健常な個体の体液のサンプル、好ましくは血清サンプル中のレベルに対する工程ｉ）で得られた上記サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質若しくはそのフラグメント（複数の場合もある）のレベルの上昇、
のいずれか１つが、上記個体における骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の治療の治療効果を示すものであると判断する工程と、
を含む、方法。
【００１８】
（１０）全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、
工程ｉ）で測定されるオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質が、配列番号１のアミノ酸位置１〜４２１で、又はアミノ酸位置２１〜４２１で表されるタンパク質であり、
工程ｉ）で測定される上記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、（８）又は（９）による方法。
【００１９】
（１１）工程ｉ）で測定される好ましいフラグメントは、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、又は、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
である。
【００２０】
（８）〜（１１）のいずれか１つによる好ましい方法では、工程ｉ）において体液レベル、好ましくは血清レベルを測定するために、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、及び他の抗原特異的抗体フラグメントからなる群から選択される免疫学的結合パートナーが使用される。
【００２１】
（１２）（１０）のａ）、ｃ）及びｅ）によるフラグメント、若しくは（１１）のａ）によるフラグメントが、ＯＭＤ−（１４８〜１６２）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、及び／又は（１０）のｂ）、ｄ）及びｆ）によるフラグメント、若しくは（１１）のｂ）によるフラグメントが、ＯＭＤ−（２６１〜２７６）に対する免疫学的結合パートナーによって特異的に結合される、（１０）又は（１１）による方法。
【００２２】
（１３）少なくとも２つのオステオモジュリンフラグメント種、すなわち（１０）のａ）、ｃ）及びｅ）、又は（１１）のａ）のいずれか１つ、並びに（１０）のｂ）、ｄ）及び（ｆ）、又は（１１）のｂ）のいずれか１つを測定する、（１０）又は（１１）による方法。
【００２３】
（１４）オステオモジュリンタンパク質のフラグメントであって、全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、上記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、オステオモジュリンタンパク質のフラグメント。
【００２４】
（１５）好ましいフラグメントは、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、又は、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
である。
【００２５】
（１６）哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断に使用される、オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナー。
【００２６】
（１７）オステオモジュリンフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナーであって、全長オステオモジュリンタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しており、上記フラグメントが、ａ）〜ｆ）：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）、
からなる群から選択される、免疫学的結合パートナー。
【００２７】
（１８）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置１３１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２２３で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、又は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２３６〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜２９６で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
である好ましいフラグメントに特異的に結合する免疫学的結合パートナー。
【００２８】
（１７）又は（１８）による免疫学的結合パートナーの好ましい実施の形態では、免疫学的結合パートナーは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、及び他の抗原特異的抗体フラグメントからなる群から選択される。
【００２９】
（１９）請求項１６又は１８のいずれか１つによる免疫学的結合パートナーを含むキットであって、上記免疫学的結合パートナーが好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、及び他の抗原特異的抗体フラグメントからなる群から選択される、キット。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＯＡの予後を判定する、及び／又はＯＡの病状を的確に診断することが可能な単一の特異的マーカーとしてのオステオモジュリン及びそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断に使用されるオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリンタンパク質のフラグメントを提供する。特に、哺乳動物、好ましくはヒトの個体の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断のマーカーとしてオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリンタンパク質のフラグメント（複数の場合もある）を使用して、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化を予後判定及び／又は診断する方法が提供される。特に、オステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメントは、健常な個体に対する体液中の上記オステオモジュリンタンパク質又はそのフラグメント（複数の場合もある）の発現の低下又は濃度の低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示すように、上記予後判定及び／又は診断に使用される。更に好ましい実施の形態では、尿、分泌物、間質液、血液、滑液、血清、髄液、及びリンパ液からなる群から選択される体液、より好ましくは血清中にて、発現の低下又は濃度の低下を測定する。
【００３１】
本発明による方法は、ｉ）哺乳動物の個体の体液のサンプル、好ましくはヒトの血清サンプル中のオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質のフラグメント（単数又は複数）を測定することと、ｉｉ）健常な個体の体液レベル、好ましくは血清レベルに対するオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又はそのフラグメント（複数の場合もある）のレベルの低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の発症を示すものであると判断することとを含む。
【００３２】
オステオモジュリンは、小ロイシンリッチリピートタンパク質ファミリーの細胞外基質ケラタン硫酸プロテオグリカン成員である。予てより、オステオモジュリンは骨特異的であると考えられてきたが、最近になって、関節軟骨細胞及び関節唇由来の線維軟骨細胞のような他の関節組織でもオステオモジュリンの発現が観察されている。オステオモジュリンの生体活性については殆ど知られていない。オステオモジュリンは、バイオミネラリゼーション（biomineralization：生体内鉱質形成）過程に関与し得るものであり、アルファ（Ｖ）ベータ（３）−インテグリンを介した骨芽細胞の結合において機能を果たす。オステオモジュリンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて関節軟骨細胞によるアグリカン発現を刺激することが可能である。ホモ・サピエンス（Homo sapiens）の成熟型のオステオモジュリンは、配列番号１のアミノ酸配列２１〜４２１で表される。本出願の配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列には、アミノ酸位置１〜２０も含まれる。成熟型のタンパク質の分子量は４９．５ｋＤａであるが、グリコシル化パターンを踏まえると、およそ６０ｋＤａ〜８５ｋＤａと推定される。ＣＯＯＨ末端のペプチドが骨ヒドロキシアパタイトに結合する。
【００３３】
本発明の研究の中で、本発明者らは、プロテオミクス技法を用いることで、軟骨下の初代骨芽細胞のセクレトームに由来する新たな可能性のある可溶性バイオマーカーとしてオステオモジュリン及びそのフラグメントを同定した。本発明者らは、ＯＡ中の硬化性の軟骨下の骨芽細胞では、オステオモジュリンがあまり発現されず、またあまり分泌されないことを見出した。さらに、オステオモジュリンのフラグメントがヒト血清中で見出された。オステオモジュリンフラグメントの血清濃度は、健常な個体のものよりも顕著に低いことが見出された。
【００３４】
得られたデータ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果から、オステオモジュリンを、骨関節炎、又は軟骨下骨が変化した骨関節炎患者のサブセットの潜在的バイオマーカーであるとみなすことができることが示唆される。血清中のオステオモジュリン又はオステオモジュリンフラグメントのレベルの定量によって疾患の特定状態が示され、それを骨関節炎及び／又は他の加齢に伴う疾患の診断及び予後判定、更には骨関節炎及び／又は加齢に伴う疾患の治療の有効性の監視に用いることができる。
【００３５】
哺乳動物の個体における骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化を予後判定及び／又は診断する本発明の方法、並びに骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の治療の治療効果を判定又は確認又は診断する方法では、哺乳動物の骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断のマーカーとしてオステオモジュリン（ＯＭＤ）タンパク質又は好ましくはオステオモジュリンタンパク質のフラグメント（複数の場合もある）を利用する。これらのフラグメントは、ａ）〜ｆ）からなる群から選択される：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１〜１４８で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置１６２〜２３５で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸位置２２４〜２６１で異なるＮ末端アミノ酸残基を有するとともに、アミノ酸位置２７６〜４２１で異なるＣ末端アミノ酸残基を有するオステオモジュリンフラグメント、    
ｃ）ＯＭＤ−（１３１〜２２３）（ＯＭＤ１  １３１−ＫＩＤＹＧＶＦＡＫＬＰＮＬＬＱＬＨＬＥＨＮＮＬＥＥＦＰＦＰＬＰＫＳＬＥＲＬＬＬＧＹＮＥＩＳＫＬＱＴＮＡＭＤＧＬＶＮＬＴＭＬＤＬＣＹＮＹＬＨＤＳＬＬＫＤＫＩＦＡＫＭＥＫＬＭＱＬＮＬＣＳＮＲ−２２３（配列番号２））、
ｄ）ＯＭＤ−（２３６〜２９６）（ＯＭＤ２  ２３６−ＭＹＬＳＬＥＮＮＳＩＳＳＩＰＥＫＹＦＤＫＬＰＫＬＨＴＬＲＭＳＨＮＫＬＱＤＩＰＹＮＩＦＮＬＰＮＩＶＥＬＳＶＧＨＮＫＬＫＱＡＦ−２９６（配列番号３））、
ｅ）ＯＭＤ−（１４８〜１６２）（ＯＭＤ１ａ  １４８−ＬＥＨＮＮＬＥＥＦＰＦＰＬＰＫ−１６２（配列番号４））、及び、
ｆ）ＯＭＤ−（２６１〜２７６）（ＯＭＤ２ａ  ２６１−ＬＲＭＳＨＮＫＬＱＤＩＰＹＮＩ−２７６（配列番号５））。
【００３６】
血清ＯＭＤ１、ＯＭＤ２、ＯＭＤ１ａ、及びＯＭＤ２ａ、好ましくはＯＭＤ１及びＯＭＤ２の定量は、ＯＡの診断及び抗ＯＡ療法の経過観察にも用いることができる。さらに、ＯＡが異なる臨床表現型を伴う多因子症候群であることから、オステオモジュリンフラグメントは、患者の疾患の認識を深めるとともに、個別化医療を行うための情報を与えるために、他のＯＡバイオマーカーと併用することができる。加えて、ＯＭＤ１、ＯＭＤ２、ＯＭＤ１ａ及びＯＭＤ２ａ、好ましくはＯＭＤ１及びＯＭＤ２は、硬化性の軟骨下の前骨芽細胞及び骨芽細胞のマーカーとしても使用することができる。
【００３７】
ＯＡが軟骨損傷に先んじて起こるか、又は軟骨損傷に続いて起こるかは未だはっきりしていないが、軟骨下骨の硬化は、ＯＡの病態生理における重要な特徴である。軟骨下骨の硬化は、局所骨吸収及び弱く石灰化した類骨物質の集積を特徴とする。軟骨下骨の硬化は、軟骨下骨の機械的性質を変えるだけでなく、軟骨代謝に対して活性のある生化学因子を放出することによっても、軟骨分解に関係している疑いがある。本発明者らによってこれまでに、軟骨下のＯＡ骨から単離された骨芽細胞が、変化した表現型を発現することが明らかとなっている。より正確には、軟骨病変直下にある肥厚化（硬化性（ＳＣ）と呼ばれる）軟骨下骨に由来する骨芽細胞がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性の上昇を示し、非肥厚化隣接域（非硬化域（ＮＳＣ）と呼ばれる）に由来する骨芽細胞よりも高いレベルのＩＬ−６、ＩＬ−８、ＰＧＥ２、ＴＧＦ−β１及びＩ型コラーゲンを発現することが明らかとなった。本発明の研究の中で、このｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いることで、ＮＳＣ骨芽細胞とＳＣ骨芽細胞とのセクレトームを比較した。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】非硬化性細胞又は硬化性細胞における前骨芽細胞又は成熟骨芽細胞によるオステオモジュリン遺伝子の発現を示す図である。ｍＲＮＡのコピー数を対応するＨＰＲＴ  ｍＲＮＡのコピー数に対して正規化し、結果は、異なるドナーに由来する骨生検材料を用いて行った５回の独立実験の平均±ＳＥＭである。各実験では、各実験条件を２連で行った。平均値の比較を対応のあるｔ検定によって行った。結果から、硬化性骨芽細胞では非硬化骨芽細胞よりもオステオモジュリンの発現が少ないことが示された。
【図２】オステオモジュリン全体に対するヤギポリクローナル抗血清を使用したオステオモジュリンのウェスタンブロッティング検出を示す図である。ｒｈＯＭＤ：ヒト組み換えオステオモジュリン（陽性対照）、ＤＭＥＭ：濃度調整をしていない培養上清（陰性対照）、ＮＳＣ：非硬化性骨芽細胞の上清、ＳＣ：硬化性骨芽細胞の上清、ｓ５９、ｓ６７、ｓ６２：３人の健常な患者の血清。
【図３】ＯＭＤ１ペプチドフラグメント及びＯＭＤ２ペプチドフラグメントに対する抗体を使用したＥＬＩＳＡ試験の結果を示す図である。この図は、非硬化性及び硬化性の前骨芽細胞及び骨芽細胞の培養上清におけるＯＭＤ１濃度及びＯＭＤ２濃度を示している。このＥＬＩＳＡ試験を用いることで、骨芽細胞の培養上清中にオステオモジュリンフラグメントが検出され、更に非硬化性セクレトームに対する硬化性セクレトームにおけるＯＭＤ１及びＯＭＤ２の低減が確認された。
【図４】ヒト血清中のＯＭＤ１及びＯＭＤ２のレベルの分析結果を示す図である。３３人の健常患者及び２４人のＯＡ患者にて定量を行った。健常集団において、１１人が２０歳〜３０歳であり、１２人が３１歳〜４５歳であり、１０人が４６歳〜６５歳であった。ＯＡ集団における年齢範囲は、４４歳〜８３歳であった。ＯＭＤ１及びＯＭＤ２がどちらも、健常患者に対してＯＡで有意に低かった。
【図５】モルモットのＯＡ自然発症モデルの血清中のＯＭＤ１及びＯＭＤ２の定量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本明細書で使用される「オステオモジュリンタンパク質」、すなわち「ＯＭＤ」は、配列番号１のアミノ酸配列１〜４２１で表されるホモ・サピエンスオステオモジュリンを指す。好ましい実施形態では、「オステオモジュリンタンパク質」、すなわち「ＯＭＤ」、特に骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化の予後判定及び／又は診断に用いられる「オステオモジュリンタンパク質」、すなわち「ＯＭＤ」は、配列番号１のアミノ酸配列２１〜４２１で表されるホモ・サピエンスの成熟型のオステオモジュリンを指す。
【００４０】
「サンプル」は、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドを含む、又は含むことが疑われる、生物から得られる任意の生体サンプル、特に体液を意図するものである。示されるように、生体サンプルとしては、ポリペプチド及び／又はペプチドを含む体液、並びにポリペプチド及び／又はペプチドを発現することが見出されている他の組織源が挙げられる。生物から組織生検材料及び体液を得る方法は当該技術分野において既知である。尿、分泌物、間質液、血液、滑液、血清、髄液、及びリンパ液等の体液由来のサンプルが特に好ましく、血清が最も好ましい。
【００４１】
「免疫学的結合パートナー」又は「抗体」という用語は、同義に用いられるとともに、最も広い意味で用いられ、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、及び所望の生物学的若しくは免疫学的活性を示す抗体フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、又は配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５に示されるポリペプチド及びペプチドに特異的に結合する他の抗原特異的抗体フラグメントを特に包含するものである。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と区別なく用いられる。
【００４２】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、場合により微量に存在し得る自然発生突然変異の場合を除き、集団に含まれる個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物に比して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の抗体を混入させずに合成することができるという利点がある。「モノクローナル」という修飾句は、何らかの特定の方法で抗体を作製することを要求するものとはみなされない。例えば、本発明に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製してもよく、又は細菌、真核性の動物若しくは植物の細胞における組換えＤＮＡ法を用いて作製してもよく、又はファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【００４３】
本明細書ではモノクローナル抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、又は相同である一方で、該鎖の残りが、別の種由来の、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、又は相同である「キメラ」抗体だけでなく、所望の生体活性を示す限りにおいて、かかる抗体のフラグメントも含まれる。本明細書で対象となるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメインの抗原結合配列と、ヒトの定常領域配列とを含む「霊長類化（primatized）」抗体が含まれる。
【００４４】
「インタクト」抗体は、抗原結合部位と、ＣＬと、少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とを含むものである。
【００４５】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子；並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００４６】
抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、残る「Ｆｃ」フラグメント（易結晶化能を反映した名称である）とが生じる。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とともに、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価であり、すなわち単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理によって、二価の抗原結合活性を有するジスルフィド結合したＦａｂフラグメント２つに概ね対応するが、抗原を架橋することが依然可能である、単一で大型のＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む数残基を更に有することが、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数の場合もある）に遊離チオール基が付されているＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々、ヒンジシステインが間に存在するＦａｂ’フラグメント対として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【００４７】
Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって結合された両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決まり、この領域は或る特定種の細胞に認められるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても一部認識される。
【００４８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位と抗原結合部位とを含む最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、強固に非共有結合的に結び付いた、１つが重鎖可変領域ドメインであり、１つが軽鎖可変領域ドメインであるダイマーからなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性をもたらす、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖それぞれから３ループ）が出る。しかしながら、単一可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも親和性が低いが、抗原を認識し、結合することができる。
【００４９】
「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略され、単一ポリペプチド鎖へと連結したＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、このリンカーによって、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能となる。
【００５０】
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内対合ではなく、鎖間対合が達成され、二価フラグメント、すなわち２つの抗原結合部位を有するフラグメントがもたらされるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の短リンカー（約５残基〜１０残基）を用いてｓＦｖフラグメントを構築することにより作製される小抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「クロスオーバー（crossover）」ｓＦｖフラグメントのヘテロダイマーである。
【００５１】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、齧歯類）抗体は、非ヒト抗体由来の最小配列を含むキメラ抗体である。殆どの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基を、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種の超可変領域の残基（ドナー抗体）に置き換えたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を対応する非ヒト残基に置き換えることもある。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に認められない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体性能を更に改善するために行われる。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通例２つの可変ドメインを実質的に全て含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、更に任意に免疫グロブリン、通例ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。
【００５２】
対象の抗原、例えば配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチド「に結合する」抗体又は他の有機分子は、該抗体又は他の有機分子が、抗原を発現する細胞、組織及び／又は体液中の診断剤として有用であり、他のタンパク質と大きく交差反応しないように、十分な親和性を持って抗原と結合するものである。かかる実施形態では、抗体又は他の有機分子と、「非標的」タンパク質との結合の程度は、放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）にて判定する場合、抗体又は他の有機分子とその特定の標的タンパク質との結合の約１０％未満である。抗体又は他の有機分子と標的分子との結合について、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的な結合」又は「に特異的に結合する」又は「に対して特異的な」という用語は、非特異的な相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的な結合は、例えば、概して類似の構造であるが、結合活性を有しない分子である対照分子の結合に対して分子の結合を判定することによって測定することができる。例えば、特異的な結合は、標的と類似の対照分子、例えば過剰な非標識化標的との競合作用によって判定することができる。この場合、標識化標的とプローブとの結合が過剰な非標識化標的によって競合阻害される場合に、特異的な結合が示される。本明細書で用いられる、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープ「への特異的な結合」又は「に特異的に結合する」又は「に対して特異的な」という用語は、例えば、標的に対するＫｄが、少なくとも約１０−４Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−９Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−１０Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−１１Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−１２Ｍ、又はそれ以上である分子によって示すことができる。一実施形態では、「特異的な結合」という用語は、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープへの実質的な結合なく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに分子が結合する結合を指す。
【００５３】
本明細書で用いる場合、「標識」という語は、「標識化された」抗体、オリゴペプチド、又は他の有機分子が生じるように、抗体、オリゴペプチド、又は他の有機分子と直接又は間接的に共役する検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、自身が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学変化を触媒するものであってもよい。
【００５４】
「ウェスタンブロット」、「ウェスタンイムノブロット」、「イムノブロット」及び「ウェスタン」という用語は、メンブレン支持体上に固定されているタンパク質（複数の場合もある）、ポリペプチド、又はペプチドの免疫学的分析を指す。タンパク質を初めにポリアクリルアミドゲル電気泳動（すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分割することで、タンパク質を分離し、続いてゲルからニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン等の固体支持体へとタンパク質を転写する。次いで、固定されたタンパク質を対象の抗原に対する反応性を有する抗体に曝す。抗体（すなわち、一次抗体）の結合は、一次抗体へと特異的に結合する二次抗体の使用により検出される。二次抗体は、色の付いた反応生成物の生成により抗原−抗体複合体の可視化が可能であるか、又は発光性酵素反応を触媒する酵素に共役するもの（例えば、ＥＣＬ試薬、Amersham社）であるのが通例である。
【００５５】
本明細書で用いる「ＥＬＩＳＡ」という用語は、酵素結合免疫吸着法（すなわちＥＩＡ）を指す。多くのＥＬＩＳＡ法及び用途が当該技術分野で知られており、多くの文献（例えば、Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)," in Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al. [eds.], pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. [1998]、Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1988]、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York [1994]を参照されたい）で記載されている。加えて、商業的に利用可能なＥＬＩＳＡ試験システムが多く存在する。
【００５６】
ＥＬＩＳＡ法の１つが、サンプル中の抗原（例えば、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチド）を検出する「直接ＥＬＩＳＡ」である。直接ＥＬＩＳＡの一実施形態では、抗原を含有するサンプルを、固体（すなわち、静止又は固定）支持体（例えば、マイクロタイタープレートウェル）に曝す。サンプル中の抗原が静止相に固定され、抗原に特異的な酵素共役抗体を用いて直接検出される。
【００５７】
代替的な実施形態では、抗原に特異的な抗体をサンプルにて検出する。この実施形態では、抗体（例えば、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドに特異的な抗体）を含有するサンプルを、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートウェル）に固定する。続いて、精製抗原及び抗原に特異的な酵素共役抗体を用いて、抗原特異的抗体を検出する。
【００５８】
別の代替的な実施形態では、「間接ＥＬＩＳＡ」が用いられる。一実施形態では、直接ＥＬＩＳＡと同様に、抗原（又は抗体）を固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートウェル）に固定するが、初めに抗原特異的抗体（又は抗原）を添加した後、当業者に既知の様々な製造業者から入手可能である、「種特異的な」抗体としても知られている、抗原に特異的に結合する抗体に特異的な検出抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体）を添加することにより間接的に検出される。
【００５９】
他の実施形態では、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」が用いられる。ここで、固体支持体に固定され、対象の抗原に結合することが可能である抗体（すなわち、捕捉抗体）を介して、抗原（例えば、試験サンプルに含まれる抗原）を固体支持体（例えば、マイクロタイタープレート）上に固定する。好適な捕捉抗体を固定相に貼り付けた後、サンプルをマイクロタイタープレートウェルに加え、続いて洗浄を行う。対象の抗原がサンプルに存在する場合、該抗原は、支持体上に存在する捕捉抗体に結合する。幾つかの実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗原が、抗原に対する酵素共役抗体を用いることで直接検出される「直接サンドイッチ」ＥＬＩＳＡである。代替的には、他の実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗原特異的な抗体に結合する別の酵素共役抗体によって後に検出される、抗原に対する抗体を用いることで、抗体−抗原−抗体−抗体複合体を形成することにより、捕捉抗原を間接的に検出する「間接サンドイッチ」ＥＬＩＳＡである。次いで、三次抗体を検出するのに好適なレポーター試薬を加える。代替的には、幾つかの実施形態では、抗原−抗体複合体を検出するために、必要に応じて任意数の更なる抗体を加える。幾つかの好ましい実施形態では、これらの更なる抗体は、可視化及び／又は定量が可能となるように標識化又はタグ付けされる。
【００６０】
本明細書で用いられる「捕捉抗体」という用語は、抗原の検出前に、サンプル中の抗原に結合する（すなわち抗原を補足する）、サンドイッチＥＬＩＳＡに使用される抗体を指す。例えば、幾つかの実施形態では、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドに対するポリクローナル抗体が、マイクロタイタープレートウェルに固定される場合の捕捉抗体として働く。この捕捉抗体が、ウェルに加えられるサンプルに存在するポリペプチド及び／又はペプチドに結合する。本発明の一実施形態では、アビジン被覆固体支持体とともに、ビオチン化捕捉抗体が本発明で使用される。次いで、抗原−抗体複合体に結合し、それを検出するのに別の抗体（すなわち、検出抗体）が使用され、要するに抗体−抗原−抗体で構成される「サンドイッチ」が形成される（すなわち、サンドイッチＥＬＩＳＡ）。
【００６１】
本明細書で用いられる「検出抗体」は、可視化又は定量の手段、通例、好適な基質を添加した後に色の付いた又は蛍光反応生成物を通例生じる共役酵素部分を保有する抗体である。ＥＬＩＳＡにおいて検出抗体とともに一般的に使用される共役酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。幾つかの実施形態では、検出抗体は、対象の抗原に対するものであり、他の実施形態では、検出抗体は、対象の抗原に対するものではない。幾つかの実施形態では、検出抗体は抗種（anti-species）抗体である。代替的には、検出抗体は、ビオチン、蛍光マーカー、若しくは放射性同位元素等の標識にて調製され、この標識を用いて検出及び／又は定量される。
【００６２】
本明細書で用いられる「レポーター試薬」、「レポーター分子」、「検出基質」及び「検出試薬」という用語は、抗原に結合する抗体の検出及び／又は定量を可能にする試薬について用いられる。例えば、幾つかの実施形態では、レポーター試薬は、抗体へと共役している酵素に対する発色基質である。抗体−酵素コンジュゲートへと好適な基質を加えることで、発色又は蛍光シグナルの発生が（例えば、対象の抗原への共役抗体の結合の後に）起こる。他のレポーター試薬としては、放射性化合物が挙げられるが、これに限定されない。この定義には、検出システムの一部としてのビオチン及びアビジン系の化合物（例えば、ニュートラアビジン及びストレプトアビジンが挙げられるが、これらに限定されない）の使用も含まれる。
【００６３】
本明細書で用いられる「シグナル」という用語は、反応が起こっていることを示す任意の検出可能なプロセス、例えば抗体の抗原への結合について一般的に用いられる。放射能、蛍光性又は発光性の生成物／試薬の形態のシグナルが全て、本発明にて使用されることが企図される。本発明の様々な実施形態では、シグナルは定性的に評価され、代替的な実施形態では、シグナルは定量的に評価される。
【００６４】
本明細書で用いられる「増幅試薬（amplifier）」という用語は、ＥＬＩＳＡ等の検出法においてシグナルを増強するシステム（例えば、ＥＬＩＳＡに使用されるアルカリホスファターゼ増幅システム）について用いられる。
【００６５】
ポリペプチドを検出する方法
配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５のポリペプチド又はペプチドについて、任意の有効な方法に従って検出、可視化、判定、定量等を行うことができる。有用な方法としては、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、組織学的検査、電子顕微鏡検査、光学顕微鏡検査、ｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ、免疫沈降法、ウェスタンブロット等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
イムノアッセイは、液体中又は支持体上で行うことができる。例えば、サンプル（例えば、血液、尿、組織、体液、好ましくは血清）を、ニトロセルロース、又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定することができる他の固体支持体等の固相支持体又は担体に接触させ、その上に固定することができる。次いで、支持体を好適なバッファーで洗浄した後、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５のポリペプチド又はペプチドを特異的に認識する検出可能に標識された抗体で処理することができる。続いて、固相支持体を再度バッファーで洗浄し、結合していない抗体を除去することができる。その後、固相支持体上に結合した標識の量を従来の手段によって検出することができる。
【００６７】
骨及び／又は軟骨障害、例えば骨関節炎の診断
本発明は、好ましくは血清サンプルにて測定される、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドの発現及び／又は濃度の低下に基づき、哺乳動物において骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化等の骨及び／又は軟骨障害を予後判定及び／又は診断する方法も提供する。本発明は、かかる障害と相関される有益な臨床マーカーを提供する。
【００６８】
かかる方法は、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドが、正常サンプルに比べて試験サンプルにて低発現されているか判定することを含む。配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５のポリペプチドは、本出願の実施例に示されるように、ヒト骨において選択的に発現される。患者由来のサンプルにおける配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドの存在の低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化を示す。アッセイは、例えば、ウェスタンブロットアッセイ又はＥＬＩＳＡ等の定量アッセイによって、或る特定のタンパク質のレベル（既知の正常対照と比べたレベル）を測定する任意の標準法を用いて行う。例えば、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドに特異的な抗体を用いる標準的な競合ＥＬＩＳＡ方式を用いて、ポリペプチドのレベルを定量する。代替的には、捕捉抗体として一次抗体、及び検出抗体として配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５から選択されるポリペプチド又はペプチドに特異的な二次抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡが用いられる。
【００６９】
一実施形態では、この方法は、（ａ）骨及び／又は軟骨障害の疑いがある患者から試験サンプルを得ることと、（ｂ）配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドをアッセイすることにより、配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドの発現レベルを検出することと、（ｃ）上記レベルと健常な対照のレベルとを比較することとを含み、対照における配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドの発現レベルに対する配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号２〜配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドの発現レベルの低下が、骨関節炎及び／又は軟骨下骨の硬化等の骨及び／又は軟骨障害の陽性結果を示す。
【００７０】
本発明を下記実施例にてより詳細に説明するが、本実施例は何ら限定的なものとは理解されない。
【実施例】
【００７１】
実施例１：軟骨下の骨芽細胞の細胞培養
膝関節置換術を受けた１０人のＯＡ男性から脛骨の軟骨下の骨プレートを得た。患者の年齢は４２歳〜８３歳の範囲であった。骨梁及び関節軟骨を慎重に取り除いた後、ＯＡ軟骨下骨を解剖し、非硬化（ＮＳＣ）域とＳＣ域とを分けた。厚さが２ｍｍを超え、剥離した、又は線維化（fibrillated）軟骨で覆われた軟骨下骨域のみをＳＣ骨とした。また、最大厚さが１ｍｍの軟骨下骨域のみをＮＳＣ骨とした。次いで、外植片から増生することで、ＳＣ又はＮＳＣ軟骨下骨由来の骨芽細胞を得た。同時に、初代細胞をトリプシン処理により回収し、１２ウェルプレート（１２ウェルのコンパニオンプレート、Ｆａｌｃｏｎ、BD Biosciences社）に播種して（５００００細胞／ｃｍ２）、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ中で３日間、増殖させた。この段階の細胞は前骨芽細胞（アルカリホスファターゼ活性なし）と考えられた。前骨芽細胞は、直接、又は１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２％  Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇ、血清代替物、１０−８Ｍ  １，２５−（ＯＨ）２−ビタミンＤ３（Sigma-Aldrich社、ベルギー）、２ｍＭ  グルタミン、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸及び２０μｇ／ｍｌ  プロリンを含むＤＭＥＭで構成される分化培地内で更に１４日間、維持することにより成熟骨芽細胞へと分化して使用した。この分化期間の終わりに、細胞は、オステオカルシン及びアルカリホスファターゼの産生を特徴とする骨芽細胞／骨細胞の表現型を発現し、β−グリセロリン酸の存在下にて基質を石灰化することが可能であった。
【００７２】
実験のために、前骨芽細胞又は成熟骨芽細胞をリンスした後、ＢＳＡ／ＦＢＳ不含培地にて７２時間、培養した。使用する栄養培地は、１％  ＩＴＳ（Lonza社、ベルギー）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、２ｍＭ  グルタミン（Lonza社、ベルギー）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Sigma-Aldrich社、ベルギー）、２０μｇ／ｍｌ  プロリン（Invitrogen社、ベルギー）が添加されたＤＭＥＭとした。ＩＴＳは、１ｍｌに、０．６２５ｍｇのインスリン、０．６２５ｍｇのトランスフェリン、０．６２５μｇの亜セレン酸を含む予混細胞増殖システムである。これらの調整された７２時間上清を用いて、セクレトーム分析を行った。
【００７３】
実施例２：プロテオミクス分析
骨関節炎の骨芽細胞セクレトームのプロテオミクス分析を、ｎａｎｏＵＰＬＣ−Ｓｙｎａｐｔ  ＨＤＭＳ  Ｇ２システム（Waters社）での差次定量及び相対無標識分析を用いて行った。１人の患者を用いて、検証試験を行ってから、ＮＳＣセクレトームとＳＣセクレトームとを適合させた他の５人の患者を分析した。
【００７４】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定
サンプルを、還元し、アルキル化／還元し、メンブレンカットオフ値が３ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（Millipore社）を用いて濃縮した。次いで、サンプルのタンパク質含量を、ＲＣＤＣキット（Biorad社）を用いて定量した。各サンプルにつき１５μｇのアリコートを、還元し、アルキル化／還元し、メンブレンカットオフ値が３ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（Millipore社）を用いて濃縮した後、２Ｄ−Ｃｌｅａｎ  ｕｐキット（GE社）を製造業者の推奨に従って適用し、質量分析に適合しない不純物を除いた。洗浄工程後のタンパク質ペレットを更に、５０ｍＭ  重炭酸アンモニウムに再可溶化した（resolubilized）。サンプルを、トリプシンを含む溶液中で消化した（８０％  ＡＣＮ中、トリプシン／総タンパク質比（Ｗ／Ｗ）（１／５０）にて３７℃で１６時間、１／１００比にて３７℃で３時間）。ギ酸の添加により、反応を停止させた。サンプルを高速真空下にて蒸発乾固した。サンプルを０．１％  ギ酸水溶液に再溶解させた後、各サンプルにつき３．５μｇのタンパク質消化物に相当するアリコートを、製造業者の推奨に従って、Ｚｉｐ−Ｔｉｐ  Ｃ１８  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙを使用して精製した。サンプルを高速真空下にて蒸発乾固した。
【００７５】
ペプチドは、１００ｍＭ  ギ酸アンモニウム中、３．０μｇで調整して、ＡＤＨ中、体積当たり１５０ｆｍｏｌをＭＰＤＳミックス標準（Waters社）のために注入した。ＭＰＤＳミックス１又はミックス２をサンプル間で異なる比率で混ぜた内部標準により、２Ｄ−ＵＰＬＣ分離全体の技術的検証、更なるイオン移動度分離によるＭＳ−ＭＳＥデータ収集、ＰＬＧＳ同定プロセス、及び更には相対定量分析が可能になる。ＡＤＨは、ＭＰＤＳ１／ＭＰＤＳ２＝１の比率で存在する。
【００７６】
ｎａｎｏＵＰＬＣ−Ｓｙｎａｐｔ（商標）  ＨＤＭＳ（商標）  Ｇ２システム（Waters社）での差次定量及び相対無標識分析
この方法の原理は、複合サンプルのトリプシンペプチド消化物を定量的に比較することであり、異なる市販内部標準を混ぜることで、相対的定量が可能となる。高効率イオン移動度（ＩＭＳ）及び飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）と、Waters社により開発された統計ソフトウェアとを合わせたこの質量分析計の高い感度、分解能、及び質量精度により、比較対象の元のペプチドミックスに存在するペプチド及びタンパク質の信頼性のある同定が可能となる。
【００７７】
Ｓｙｎａｐｔ（商標）  ＨＤＭＳ（商標）  Ｇ２質量分析計では、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）が用いられ、分析されるペプチドに対して、高分解能及び高い質量精度（１０ｐｐｍ内）を伴う高感度検出（下限およそ０．１ｆｍｏｌ〜１ｆｍｏｌのタンパク質）が可能である。全てのペプチドをフラグメント化し（ＭＳＥ）、データベース検索を行い、フラグメント化された親ペプチドそれぞれで測定された精密質量へと相関させることで、ペプチドの配列及び同一性を得た。
【００７８】
ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  ＳＥＲＶＥＲ  ｖｓ２．５による統計分析は、ペプチド及びタンパク質の同定と、異なる存在比で比較される両サンプルに存在する幾つかのタンパク質消化物で構成される第２の内部標準の同時分析に基づく相対的定量とを含むものであった。この無標識定量法のリニアダイナミックレンジは、およそ３桁〜４桁であった。
【００７９】
ＰＬＧＳ分析
タンパク質同定は、スパイク（spikes）として用いられるタンパク質配列及び内部標準：ＭＰＤＳミックスを手動で加えるＵＮＩＰＲＯＴ  Ｓｕｓ  Ｃｒｏｆａから抽出したデータベースを用いて行った。
【００８０】
ＰＬＧＳスコアは、タンパク質同定についての信頼度と相関する確率的スコアである。したがって、高い値のＰＬＧＳスコアは、ＭＳ及びＭＳＥによって、高い質及び量の情報が観察されたことと相関する。このスコアは、データベース検索後のタンパク質に帰するものである。このデータベース検索は、偽陽性タンパク質同定のリスクを評価するために元のデータベースから再計算されたランダム化データベースでの検索も含む。同定のためには、異なるペプチドは同定されるタンパク質当たり少なくとも２つが最小と考えられ、偽陽性率を確認するために、これはできる限り小さくするべきである（ＰＬＧＳデータベース検索に用いられる設定のために、偽陽性率は最大で４％となる）。
【００８１】
この結果から、オステオモジュリンは、硬化性セクレトームよりも非硬化性セクレトームで豊富に存在することが分かる。上述のように、骨関節炎の骨芽細胞セクレトームのプロテオミクス分析を、ｎａｎｏＵＰＬＣ−Ｓｙｎａｐｔ  ＨＤＭＳ  Ｇ２システム（Waters社）での差次定量及び相対無標識分析を用いて行うことで、非硬化性骨芽細胞と硬化性骨芽細胞との間のタンパク質産生に差があることを発見した。６人の患者を用いたこのプロテオミクス分析にて、オステオモジュリンタンパク質の産生は、４人の患者では非硬化性骨芽細胞と比べて硬化性骨芽細胞において６０％低下しており（ｐ＜０．００１）、他の２人の患者では硬化性骨芽細胞セクレトームにおいて検出不能であることが見出された。
【００８２】
加えて、オステオモジュリンの異なるペプチドフラグメント（フラグメントＡ〜Ｈ）をプロテオミクス分析にて見出し、ヒトの体液、すなわち滑液、尿、血漿由来のデータに適合させた。オステオモジュリンのフラグメント及びフラグメントが見出された試験サンプルを下記表１にまとめる。
【００８３】
【表１】
2019513223.tif 000003
【００８４】
実施例３：骨芽細胞におけるオステオモジュリンの発現。定量的リアルタイムＲＴ  ＰＣＲによる測定
骨芽細胞におけるオステオモジュリンの発現を示すために、オステオモジュリンのｍＲＮＡレベルを５人の患者で分析した。１×１０６個の細胞由来のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキットのトータルＲＮＡ単離システム（Qiagen社、ベルギー）により単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＳＹＢＲプレミックスＥｘ  Ｔａｑ（Takara社、ベルギー）を用いて行った。ＰＣＲテンプレート源は、３ｎｇのファーストストランド（first-strand）ｃＤＮＡ又は精製ＤＮＡ標準のいずれかとした。下記のプライマー配列を用いて、所望のｃＤＮＡを増幅した：ＨＰＲＴフォワード５’−ＴＧＴＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＧ−３’（配列番号６）及びリバース５’−ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号７）、オステオモジュリン（ＯＭＤ）フォワード５’−ＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴ−３’（配列番号８）及びリバース５’−ＧＧＧＴＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号９）。ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を内部標準として使用し、ＯＭＤとＨＰＲＴとの比を算出した。５人の患者を分析したが、そのうちの４人はプロテオミクス分析に用いた以外のものである。
【００８５】
結果から、非硬化性骨芽細胞よりも硬化性骨芽細胞でオステオモジュリンの発現が低いことが分かった。オステオモジュリンのｍＲＮＡレベルを５人の患者で分析した。結果として、非硬化性前骨芽細胞と硬化性前骨芽細胞とで０．５７±０．１９倍（図１、ｐ＝０．０３０６）及び非硬化性成熟骨芽細胞と硬化性成熟骨芽細胞とで０．６６±０．２７倍（図１、ｐ＝０．０２４１）が観察された。図１には、非硬化性細胞又は硬化性細胞における前骨芽細胞又は成熟骨芽細胞によるオステオモジュリン遺伝子の発現が示されている。ｍＲＮＡのコピー数を対応するＨＰＲＴ  ｍＲＮＡのコピー数に対して正規化し、結果は、異なるドナーに由来する骨生検材料を用いて行った５回の独立実験の平均±ＳＥＭである。各実験では、各実験条件を２連で行った。平均値の比較を対応のあるｔ検定によって行った。
【００８６】
実施例４：ウェスタンブロッティングによるヒト血清中でのオステオモジュリン及びオステオモジュリンフラグメントの存在の検出
オステオモジュリン又はオステオモジュリンフラグメントがヒト血清中に存在し、バイオマーカーとして標的とすることができるというこの仮説を評価するために、ヒト血清サンプルを、３人の健常な患者及び骨芽細胞の培養上清においてオステオモジュリンタンパク質全体に対するヤギポリクローナル抗血清（R&D systems社）を用いるウェスタンブロットによって分析した。
【００８７】
６人の健常者及び６人の重度のＯＡ罹患者という１２人の男性の血清をウェスタンブロッティング実験に使用した。実験前に、ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐキット（Sigma社）を用いて血清のＩｇＧ及びアルブミンを枯渇させた。このプロセスの間に、血清を、およそ３．３倍希釈した。軟骨下の骨芽細胞の上清を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３ｋＤａ  ２ｍｌカラム（Millipore社）を用いて２０倍濃縮した。枯渇血清（１５μｌ）又は骨芽細胞を濃縮した上清（６μｌ＝６μｇの総タンパク質）を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（９％）によって分画し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを、Roche社ブロッキング試薬を用いて４℃で一晩、ブロッキングした。次いで、メンブレンを、オステオモジュリンタンパク質全体に対する親和性精製したビオチン化ヤギポリクローナル抗血清（ＢＡＦ２８８４、R&D systems社）を０．５％のRoche社のブロッキング試薬で１：２００希釈したものとともに４℃で一晩インキュベートした。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１：２５００希釈）を検出に使用した（Roche社）。この反応は、Ｌｕｍｉｎａｔａ  ｃｌａｓｓｉｃｏウェスタンブロッティング基質（Millipore社）、及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００（Amersham社）による取込みを用いることで明らかとなった。
【００８８】
ヒト血清中のオステオモジュリン及び存在し得る（possible）オステオモジュリンフラグメントの存在を検出するためのウェスタンブロッティングの結果を図２（レーンｓ５９、ｓ６７、ｓ６２）に示す。骨芽細胞の培養上清において、分泌されたオステオモジュリンがおよそ７０ｋＤａ及び７５ｋＤａの２つの主要バンドに現れたが、おそらくはグルコシル化の変差のために、６５ｋＤａ〜１２０ｋＤａでパターンが変動していた。オステオモジュリンバンドは、硬化性（ＳＣ）骨芽細胞よりも非硬化性（ＮＳＣ）骨芽細胞でより強く現れた（図２、レーンＮＳＣ及びＳＣ）。ヒト血清サンプルにおいて、オステオモジュリンタンパク質の主要形態（約５４ｋＤａで検出）が観察された。約４２ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３０ｋＤａ（図２の矢印を参照されたい）にて微小形態も観察され、これは、タンパク質のフラグメントが循環血清中に存在していたことを示していた（図２、レーンｓ５９、ｓ６７、ｓ６２）。
【００８９】
図２に、オステオモジュリンのウェスタンブロッティング検出の結果を示す。示される各種レーンは下記のとおりである：ｒｈＯＭＤ：ヒト組換えオステオモジュリン（陽性対照）、ＤＭＥＭ：濃度調整をしていない培養上清（陰性対照）、ＮＳＣ：非硬化性骨芽細胞の上清、ＳＣ：硬化性骨芽細胞の上清、ｓ５９、ｓ６７、ｓ６２：３人の健常な患者の血清。
【００９０】
実施例５：オステオモジュリンの２つのフラグメントを標的とするＥＬＩＳＡの開発
実施例２及び実施例４にて得られた結果、並びにデータマイニングから、本発明者らは、オステオモジュリンが幾つかのペプチドに切断された後に、これらのペプチドが血清に到達すると推測した。ＭＭＰの予測切断部位、体液のプロテオミクス研究、及びＣ末端の７０残基が骨組織に残り、ヒドロキシアパタイトに連結することを考慮して、下記の２種のポリペプチドを生成し、骨関節炎の潜在的バイオマーカーとして確認した：ＯＭＤ１  １３１−ＫＩＤＹＧＶＦＡＫＬＰＮＬＬＱＬＨＬＥＨＮＮＬＥＥＦＰＦＰＬＰＫＳＬＥＲＬＬＬＧＹＮＥＩＳＫＬＱＴＮＡＭＤＧＬＶＮＬＴＭＬＤＬＣＹＮＹＬＨＤＳＬＬＫＤＫＩＦＡＫＭＥＫＬＭＱＬＮＬＣＳＮＲ−２２３（配列番号２）、及びＯＭＤ２  ２３６−ＭＹＬＳＬＥＮＮＳＩＳＳＩＰＥＫＹＦＤＫＬＰＫＬＨＴＬＲＭＳＨＮＫＬＱＤＩＰＹＮＩＦＮＬＰＮＩＶＥＬＳＶＧＨＮＫＬＫＱＡＦ−２９６（配列番号３）。
【００９１】
ＯＭＤ１及びＯＭＤ２に対する抗血清の作製
オステオモジュリンフラグメントを血清中に見出すことができ、該フラグメントがバイオマーカーとしての役割を果たし得るという仮説を検証するために、ＢａｌｂＣマウスに、それぞれオステオモジュリンの２種のペプチド：ＯＭＤ１ａ（１４８−ＬＥＨＮＮＬＥＥＦＰＦＰＬＰＫ−１６２；配列番号４）及びＯＭＤ２ａ（２６１−ＬＲＭＳＨＮＫＬＱＤＩＰＹＮＩ−２７６；配列番号５）−ＫＬＨ結合ペプチドに対する免疫を付与した。得られた２種の異なる抗血清は、これらの配列に特異的であり、Ｌｕｍｉｃａｎタンパク質に含まれる６０％相同性の（homolog）ペプチドとは交差反応を示さなかった。さらに、ＯＭＤ２に対する抗血清は、オステオモジュリンの配列２６８〜２９０とは交差反応しなかった。スクリーニングを、ビオチン化ペプチドを用いて、ＫＬＨ結合にシステインを添加せずに、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート上に固定して行った。競合ＥＬＩＳＡを、競合因子として非ビオチン化ペプチド及び非結合ペプチドを用いて行った。標準曲線濃度は、５２０ｎＭ〜８ｎＭを含むものである。Ｆｃγフラグメント特異的なペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch社）を二次抗体（１：１００００希釈）として使用した。ヒト血清希釈物は、Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（D-Tek社、ベルギー）の１：２〜１：８希釈の標準曲線と平行することが分かった。アッセイを、ヒトの血清では１：３希釈、及びモルモットの血清では１：５希釈にて行った。培養上清は希釈せずにアッセイした。
【００９２】
実施例６：オステオモジュリンフラグメントの検出にヒト血清を用いるＥＬＩＳＡ
実施例５で調製したＯＭＤ１及びＯＭＤ２に対するポリクローナル抗体を、ヒト血清中に存在し得るオステオモジュリンフラグメントをＥＬＩＳＡによって検出するのに用いた。ヒト血清では、３３人の健常患者及び２４人のＯＡ患者にてＯＭＤ１及びＯＭＤ２を定量した。健常集団において、１１人が２０歳〜３０歳であり、１２人が３１歳〜４５歳であり、１０人が４６歳〜６５歳であった。結果を図４にまとめる。ＯＡ集団における年齢範囲は、４４歳〜８３歳であった。ＯＭＤ１及びＯＭＤ２がどちらも、健常患者に対してＯＡで有意に低かった（それぞれ、ｐ＝０．０１３７及び０．００１３、図４）。レベルは、男女間で有意差がなかった。ＯＭＤ１レベルは、健常な患者では年齢について有意差がなかったが、ＯＭＤ２レベルは、３１歳〜４５歳群及び４６歳〜６５歳群に比べて若い２０歳〜３０歳の患者で低かった。
【００９３】
実施例７：オステオモジュリンフラグメントの検出に骨芽細胞の培養上清を用いるＥＬＩＳＡ
さらに、実施例５で調製したＯＭＤ１及びＯＭＤ２に対するポリクローナル抗体を骨芽細胞の培養上清に存在し得るオステオモジュリンフラグメントを検出するのに用いて、ＥＬＩＳＡを行った。これらのＥＬＩＳＡ試験では、骨芽細胞の培養上清におけるフラグメントを検出し、非硬化性セクレトームに対する硬化性セクレトームでのＯＭＤ１及びＯＭＤ２の減少も確認した。結果を図３にまとめる。この図には、非硬化性又は硬化性の前骨芽細胞及び骨芽細胞の培養上清におけるＯＭＤ１及びＯＭＤ２濃度が示されている。異なるドナーに由来する骨生検材料を用いて行った２つの独立実験の２つの培養物からの平均±ＳＤ。各実験では、各実験条件を３連で行った。平均値の比較を対応のあるｔ検定によって行った。
【００９４】
実施例８：モルモットのＯＡ自然発症モデル
さらに、ＯＭＤ１及びＯＭＤ２を、モルモットのＯＡ自然発症モデルにて評価した。このモデルにおいて、モルモットはＯＡを発症し、３５週齢にて、動物がＯＡＲＳＩ組織学的スコアを用いて定量可能な重度のＯＡ病変を呈した。１５匹の動物を対照群に用い、１５匹の動物を、３１週間、効力のある（potential）抗ＯＡ治療にて治療した。動物の組織学的ＯＡスコアの有意な低下の他に、血清中のＯＭＤ１及びＯＭＤ２レベルの増加傾向が観察された。結果を図５にまとめる。この図には、ＯＡのモルモット血清中のＯＭＤ１及びＯＭＤ２の定量（ｎＭ単位）が示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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