(57)【要約】化学的および／または生物学的分析を行うためのモジュール方式の構成要素（カセット）および／または微小流体チャネルを有するカートリッジを含む流体システムが、提供される。本明細書で記載されるシステムは、いくつかの実施形態において、フレーム、そのフレームへと挿入され得る１またはこれより多くのカセット、および流体を移動するためのチャネルシステムを含むカートリッジを含む。ある種の実施形態において、その１またはこれより多くのカセットは、流体（例えば、貯蔵された試薬、サンプル）を含むおよび／または受容するように構成された１もしくはこれより多くのレザバまたは容器を含む。いくつかの場合には、その貯蔵された試薬は、１またはこれより多くのリオスフェアを含み得る。
2019536434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カートリッジであって、該カートリッジは、
共通微小流体チャネル；
サンプルチャネルに接続されたサンプル入り口；
第１の容器チャネルに接続された第１の容器；
第２の容器チャネルに接続された第２の容器；
第１のバルブ；および
第２のバルブ、
を含み；
ここで該共通チャネル、サンプルチャネル、第１の容器チャネルおよび第２の容器チャネルの各々は、該第１のバルブから延び、そして
ここで該共通微小流体チャネルは、該第１のバルブと該第２のバルブとの間に位置づけられる、
カートリッジ。
【請求項２】
カートリッジであって、該カートリッジは、
容器の第１のセット；
第１のバルブ；
該容器の第１のセットに接続された容器チャネルの第１のセットであって、ここで該容器チャネルの第１のセットからのチャネルの各々は、該第１のバルブに接続される容器チャネルの第１のセット；
容器チャネルの第２のセット；および
該容器チャネルの第１のセットと該容器チャネルの第２のセットとの間に位置づけられた共通微小流体チャネル、
を含む、カートリッジ。
【請求項３】
前記カートリッジは、第１のカセットを収容するように構成かつ配列された第１の開口部、および第２のカセットを収容する第２の開口部を含むフレームをさらに含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４】
前記共通微小流体チャネルは、前記フレームに隣接しかつ一体ではないチャネルシステムの一部である、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５】
前記カートリッジは、前記第１の容器または容器の第１のセットのうちの少なくとも一方に含まれる貯蔵された液体試薬をさらに含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６】
前記貯蔵された液体試薬を含む前記容器は、該貯蔵された液体試薬の蒸発を低減または防止するために密閉される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項７】
前記カートリッジは、貯蔵された実質的に乾燥した試薬をさらに含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項８】
前記貯蔵された試薬は、第１のＰＣＲ反応を行うための試薬を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項９】
前記カートリッジは、温度制御され得るふたとインターフェイス接続する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１０】
前記ふたは、前記容器を覆う、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１１】
前記ふたは、前記容器の頂部を形成する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１２】
加熱されたふたは、半透明または透明である、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１３】
加熱されたふたは、光学測定が該加熱されたふたを通って行われることを可能にするように構成される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１４】
前記カートリッジは、温度制御デバイスと伝達状態にある、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１５】
前記温度制御デバイスは、第１の温度を第１のカセットに、および第２の温度を第２のカセットに適用するように構成される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１６】
前記温度制御デバイスは、１またはこれより多くのサーマルパッド、熱電構成要素、および／またはサーミスタを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１７】
前記カートリッジは、前記カセットを該カートリッジに挿入した際に、該カセットの１またはこれより多くの部分を穿刺するように構築かつ配列された１またはこれより多くの穿刺構成要素を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１８】
前記第１のカセットおよび／または第２のカセットは、容器のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１９】
前記カートリッジは、第３のカセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２０】
前記第１のカセットは、前記フレームの第１の開口部に位置づけられるように構成される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２１】
前記第２のカセットは、前記フレームの第２の開口部に位置づけられるように構成される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２２】
前記第３のカセットは、容器のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２３】
前記容器のセットにおける容器は、前記カートリッジに挿入する前には、互いと流体伝達状態にない、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２４】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、その中に貯蔵された試薬を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２５】
前記カセットのうちの少なくとも１つは密閉され、該カセットの中の前記容器のうちの少なくとも一部は、その中に貯蔵された試薬を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２６】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、その中に貯蔵された第１の試薬およびその中に貯蔵された第２の試薬を含み、該第１のおよび第２の試薬は、該カセットを該カートリッジへと挿入する前には、互いと流体伝達状態にない、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２７】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、該カセットを前記カートリッジへと挿入する前には、前記チャネルシステムと流体伝達状態にない、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２８】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、その中に貯蔵された第１の試薬および／または第２の試薬が前記チャネルシステムのうちの少なくとも１つのチャネルと流体伝達状態にあるように、前記カートリッジの中に位置づけられる、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項２９】
前記カセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器のセットは、リオスフェアのセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３０】
前記容器のうちの少なくとも１つは、単一のリオスフェアを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３１】
前記容器のうちの少なくとも１つは、２またはこれより多くのリオスフェアを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３２】
前記カセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器のセットは、プライマーのセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３３】
前記カセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器のセットは、緩衝剤、洗浄試薬、および／またはアルコールを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３４】
前記カセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器のセットは、加熱されるように構築かつ配列される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３５】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、微小流体チャネルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３６】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、詰め替え可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３７】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、前記フレームおよび／または前記カートリッジに不可逆的に取り付けられる、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３８】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、少なくとも約０．１ｍＬでかつ２５ｍＬ以下の全作業体積を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項３９】
前記カセットのうちの少なくとも１つは、廃棄物カセットである、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４０】
前記廃棄物カセットは、少なくとも１ｍＬでかつ３０ｍＬ以下の体積を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４１】
前記カートリッジは、貯蔵されたリオスフェアを含む容器の第１のセットを含む第１のカセット、貯蔵されたリオスフェアを含む容器の第２の第１のセットを含む第２のカセットを含み、ここで該第１のおよび第２のカセットは、互いと流体伝達状態にない、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４２】
前記第１のおよび第２のカセットは、独立して加熱されるように構築かつ配列される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４３】
前記第１のカセットは、第１のＰＣＲ反応を行うために構築かつ配列され、前記第２のカセットは、該第１のＰＣＲ反応とは独立した第２のＰＣＲ反応を行うために構築かつ配列される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４４】
前記カートリッジは、チャネルシステムを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４５】
前記チャネルシステムは、第１のＰＣＲ反応を行うためのチャネルの第１のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４６】
前記チャネルシステムは、第２のＰＣＲ反応を行うためのチャネルの第２のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４７】
チャネルの前記第１のおよび第２のセットは、少なくとも１つのバルブによって分離される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４８】
前記共通チャネルは、蛇行チャネルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項４９】
前記第１の容器チャネルの内部体積は、前記第２の容器チャネルの内部体積より小さい、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５０】
前記容器チャネルの第１のセットおよび／または容器チャネルの第２のセットは、少なくとも２つ、４つ、６つ、８つ、もしくは１０のチャネル、および／または２０、１５、１０、もしくは５つ以下のチャネルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５１】
前記共通チャネルは、少なくとも２μＬおよび／または２００μＬ以下の体積を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５２】
前記チャネルシステムは、前記容器チャネルの第２のセットに接続された容器の第２のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５３】
前記チャネルシステムは、第２のバルブを含み、前記容器チャネルの第２のセットからのチャネルの各々は、該第２のバルブに接続される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５４】
前記共通微小流体チャネル、前記第１の容器チャネル、および／または前記第２の容器チャネルは、約５０ミクロン以上および／または１ｍｍ以下の最大の断面寸法を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５５】
各容器は、少なくとも約１μＬおよび／または２００μＬ以下の体積を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５６】
前記容器の第１のセットおよび／または容器の第２のセットは、少なくとも２つ、４つ、６つ、８つ、もしくは１０の容器および／または２０、１５、１０、もしくは５つ以下の容器を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５７】
少なくとも１つの容器は、テーパー状の断面形状を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５８】
少なくとも１つの容器は、形状が円錐状である、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５９】
前記フレームおよび／またはカートリッジは、キャリアプレートと直接接触状態にある、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６０】
前記キャリアプレートは、前記フレームおよび／またはカートリッジを含むユーザーなしで、該フレームおよび／またはカートリッジの移動を促進するように構成される、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６１】
前記フレームは、１またはこれより多くのサンプルを受容するように構成された１またはこれより多くのサンプルウェルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６２】
前記１またはこれより多くのサンプルウェルは、前記チャネルシステムと流体伝達状態にある、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６３】
前記フレームは、１またはこれより多くの出力ウェルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６４】
前記１またはこれより多くの出力ウェルは、前記チャネルシステムと流体伝達状態にある、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６５】
前記フレームは、廃棄物カセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６６】
前記第１のバルブおよび／または第２のバルブは、ロータリーバルブである、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６７】
前記第１のバルブおよび／または第２のバルブは、前記共通微小流体チャネルと別のチャネルとの間の流体の流れを促進するように構成された高くした特徴を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６８】
前記バルブは、密閉物を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６９】
前記チャネルシステムは、廃棄物容器に接続された廃棄物チャネルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項７０】
方法であって、該方法は、
第１の方向に、共通微小流体チャネルにおいて第１の流体を流す工程；
該共通微小流体チャネルにおいて該第１の流体のうちの少なくとも一部を、第２の方向に流す工程であって、ここで該第２の方向は、該第１の方向の反対である工程；
該第１の流体のうちの少なくとも一部を第１の容器チャネルを介して第１の容器へと流す工程；
該第１の流体のうちの少なくとも一部を、該第１の容器から該共通微小流体チャネルへと流す工程；および
該第１の流体のうちの少なくとも一部を、該共通チャネルから第２の容器チャネルを介して第２の容器へと流す工程、
を包含する方法。
【請求項７１】
方法であって、該方法は、
共通微小流体チャネルにおいて第１の流体を流す工程；
該第１の流体のうちの一部を第１の容器へと流す工程；
該第１の流体のうちの一部を廃棄物容器へと流す工程；
化学的および／または生物学的反応を該第１の容器において行って、第２の流体を形成する工程；
該第２の流体のうちの一部を該第１の容器から該共通微小流体チャネルへと流す工程；ならびに
該第２の流体のうちの一部を該廃棄物容器へと流す工程、
を包含する方法。
【請求項７２】
方法であって、該方法は、
第１の流体を共通微小流体チャネルへと流す工程；
該共通微小流体チャネルが第１の容器チャネルと流体伝達状態にあるように、バルブを始動する工程；
該第１の流体のうちの少なくとも一部を該第１の容器チャネルへと流す工程；
第２の流体を該共通微小流体チャネルへと導入する工程であって、ここで該第２の流体は、該第１の流体と非混和性である工程；
該第２の流体のうちの少なくとも一部を、該共通微小流体チャネルから該第１の容器チャネルへと流す工程；および
該第２が該第１の容器チャネルにおいて流れる間に、該第１の流体の制御された体積を、該第１の容器チャネルに接続された第１の容器へと流す工程、
を包含する方法。
【請求項７３】
前記カートリッジは、チャネルシステムを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記チャネルシステムは、第１のＰＣＲ反応を行うために、チャネルの第１のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記チャネルシステムは、第２のＰＣＲ反応を行うために、チャネルの第２のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記チャネルの第１のおよび第２のセットは、少なくとも１つのバルブによって分離される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記共通チャネルは、蛇行チャネルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１の容器チャネルの内部体積は、前記第２の容器チャネルの内部体積より小さい、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記容器チャネルの第１のセットおよび／または容器チャネルの第２のセットは、少なくとも２つ、４つ、６つ、８つ、もしくは１０のチャネルおよび／または２０、１５、１０、もしくは５つ以下のチャネルを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記共通チャネルは、少なくとも２μＬおよび／または２００μＬ以下の体積を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記チャネルシステムは、前記容器チャネルの第２のセットに接続された容器の第２のセットを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記チャネルシステムは、第２のバルブを含み、前記容器チャネルの第２のセットからのチャネルの各々は、該第２のバルブに接続される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記共通微小流体チャネル、前記第１の容器チャネル、および／または前記第２の容器チャネルは、約５０ミクロン以上および／または１ｍｍ以下の最大の断面寸法を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の容器に入れる際に、前記流体は、第１の試薬に曝される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２の容器に入れる際に、前記流体は、第２の試薬に曝される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記流体中に存在するサンプルおよび／または反応物は、前記第１の試薬と反応する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記流体中に存在する前記サンプルおよび／または前記反応物は、前記第２の試薬と反応する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１の流体を流す工程は、前記共通微小流体チャネルが第１の容器チャネルと流体伝達状態にあるように、バルブを始動する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１の流体を流す工程は、前記第２の流体のうちの少なくとも一部が前記容器チャネルに入るように、前記共通微小流体チャネルに第２の圧力を適用する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記容器チャネルおよび／または前記容器の経路に接続された容器中に存在する前記流体の体積は、前記共通微小流体チャネルに適用される前記第１のおよび／または第２の圧力によって制御される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記共通チャネルおよび容器チャネルの各々は、前記バルブから延びる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の流体のうちの少なくとも一部を流す工程は、前記共通微小流体チャネルが前記第１の容器チャネルと流体伝達状態にあるように、バルブ／前記バルブを始動する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の流体のうちの少なくとも一部を前記第１の容器チャネルを介して前記第１の容器へと流す工程は、前記共通微小流体チャネルへと第１の圧力を適用する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１の流体のうちの少なくとも一部を、前記第１の容器から前記共通微小流体チャネルへと流す工程は、該共通微小流体チャネルへと第２の圧力を適用する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１の流体のうちの少なくとも一部を、前記共通チャネルから前記第２の容器チャネルを介して前記第２の容器へと流す工程は、前記共通微小流体チャネルが該第２の容器チャネルと流体伝達状態にあるように、前記バルブを始動する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１の流体のうちの少なくとも一部を、前記共通チャネルから前記第２の容器チャネルを介して前記第２の容器へと流す工程は、前記微小流体チャネルに第３の圧力を適用する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記第２の流体のうちの少なくとも一部を流す工程は、前記微小流体チャネルに圧力を適用する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
圧力（前記第１の圧力、前記第２の圧力、および／または前記第３の圧力）は、陽圧である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
圧力（前記第１の圧力、前記第２の圧力、および／または前記第３の圧力）は、陰圧または減圧である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記第２の流体のうちの少なくとも一部を流す工程は、前記共通微小流体チャネルが前記第１の容器チャネルと流体伝達状態にあるように、前記バルブを始動する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第２の流体のうちの少なくとも一部を前記共通微小流体チャネルから前記第１の容器チャネルへと流す工程は、前記第２の流体が前記第１の容器へと入ることから防止する工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第２の流体を前記共通微小流体チャネルへと導入する工程は、前記第２の流体を、前記バルブから延びかつ該共通微小流体チャネルと流体伝達状態にあるサンプルチャネルに接続されたサンプル入り口を通じて流す工程を包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記制御された体積は、１００μＬ以下、８０μＬ以下、６０μＬ以下、４０μＬ以下、２０μＬ以下、１０μＬ以下、５μＬ以下、または２μＬ以下の体積を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１の流体は、液体サンプルである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の流体は、試薬である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第２の流体は、ガスである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ガスは、空気である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第２の流体は、試薬である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第２の流体は、液体サンプルである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第２の流体は、水または緩衝剤である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国仮特許出願第６２／３９８，８４１号、第６２／３９９，１５２号、第６２／３９９，１５７号、第６２／３９９，１８４号、第６２／３９９，１９５号、第６２／３９９，２０５号、第６２／３９９，２１１号および第６２／３９９，２１９号（これらそれぞれは、２０１６年９月２３日に出願された）の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張し、２０１７年９月１５日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２４号（２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３３９号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する）、および２０１７年９月１５日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２７号（２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３４７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する）の米国特許法第１２０条および第３６５条（ｃ）項に基づく優先権を主張し、これらそれぞれの内容は、参照によって本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は一般に、分子（例えば、核酸）の自動化処理のためのシステムおよび関連方法に関する。本発明はまた、一般に、流体システムおよび関連方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
核酸を処理するための多くのアプローチが開発されてきた。このような方法はしばしば、複数の酵素工程、精製工程、および調製工程を含んだ。これらの工程は、汚染、システム上のユーザーエラー、およびプロセスバイアスと関連するエラーを含め、困難かつ間違えやすくする。結果として、このようなプロセスを信頼性高くかつ再現可能に実行することは、特に、そのプロセスが商業的に、例えば、多重またはハイスループットの状況で行われている場合には、しばしば困難である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本発明は一般に、核酸を処理するためのシステムおよび関連方法に関する。いくつかの実施形態において、上記システムは、核酸の自動化処理（自動化核酸ライブラリー調製を含む）を促進するカセットおよび／または微小流体チャネルを含むカートリッジを含む。いくつかの実施形態において、システムおよび関連方法は、次世代シーケンシングおよび／または他の下流の分析技術のための物質を生成する核酸の自動化処理のために提供される。本発明はまた一般に、流体システムおよび関連方法に関する。
【０００５】
実施形態のうちの１セットにおいて、一連のカートリッジが提供される。一実施形態において、カートリッジは、第１のカセットを収容するように構築かつ配列される第１の開口部および第２のカセットを収容する第２の開口部を含むフレーム；ならびに上記フレームに隣接しかつ一体でないチャネルシステムであって、ここで上記チャネルシステムは、少なくとも１つの微小流体チャネルを含むチャネルシステムを含み、ここで上記カセットは、上記第１のおよび／または第２のカセットの上記フレームへの挿入の際に、それぞれ、上記第１のカセットと上記チャネルシステムのうちの少なくとも１つのチャネルとの間、ならびに／または上記第２のカセットと上記チャネルシステムのうちの少なくとも１つのチャネルとの間の流体伝達を可能にするように構成される。
【０００６】
別の実施形態において、カートリッジは、第１のカセットを収容するように構築かつ配列された第１の開口部および第２のカセットを収容する第２の開口部を含むフレーム；上記フレームに隣接するチャネルシステムであって、ここで上記チャネルシステムは、少なくとも１つの微小流体チャネルを含むチャネルシステム；ならびに容器の第１のセットであって、ここで上記容器の第１のセットのうちの少なくとも一部は、上記容器の中に配置された少なくとも１つのリオスフェアを含む容器の第１のセットを含み、ここで上記カートリッジは、少なくとも１つの容器と上記チャネルシステムのうちの少なくとも１つの微小流体チャネルとの間での流体伝達を可能にするように構成される。
【０００７】
別の実施形態において、カートリッジは、第１の開口部および第２の開口部を含むフレーム；上記フレームに隣接するチャネルシステムであって、ここで上記チャネルシステムは、少なくとも１つの微小流体チャネルを含むチャネルシステム；上記フレームの第１の開口部に位置づけられるように構成された第１のカセットであって、ここで上記第１のカセットは、容器の第１のセットを含む第１のカセット；上記フレームの第２の開口部に位置づけられるように構成された第２のカセットであって、ここで上記第２のカセットは、容器の第２のセットを含む第２のカセット；ならびに上記第１のカセットの容器の第１のセットのうちの少なくとも１つに含まれる貯蔵された液体試薬であって、ここで上記貯蔵された液体試薬を含む容器は、上記貯蔵された液体試薬の蒸発を低減または防止するために密閉される貯蔵された液体試薬を含む。
【０００８】
別の実施形態において、カートリッジは、チャネルシステムであって、ここで上記チャネルシステムは、少なくとも１つの微小流体チャネルを含むチャネルシステム；容器の第１のセットを含む第１のカセット；上記容器の第１のセットに含まれる第１のＰＣＲ反応を行うための貯蔵された試薬の第１のセット；容器の第２のセットを含む第２のカセット；ならびに上記容器の第２のセットに含まれる第２のＰＣＲ反応を行うための貯蔵された試薬の第２のセットを含み、ここで上記カートリッジは、上記第１のおよび第２のＰＣＲ反応を並行して行い、それぞれ、上記第１のおよび／または第２のＰＣＲ反応を行う間に、上記チャネルシステムと上記第１のおよび第２のカセットのうちの少なくとも一方との間での流体伝達を可能にするように、構築かつ配列される。
【０００９】
別の実施形態において、カートリッジは、共通微小流体チャネル；サンプルチャネルに接続されたサンプル入り口；第１の容器チャネルに接続された第１の容器；第２の容器チャネルに接続された第２の容器；第１のバルブ；および第２のバルブを含み、ここで上記共通チャネル、サンプルチャネル、第１の容器チャネルおよび第２の容器チャネルの各々は、上記第１のバルブから延び、上記共通微小流体チャネルは、上記第１のバルブと上記第２のバルブとの間に位置づけられる。
【００１０】
別の実施形態において、カートリッジは、容器の第１のセット；第１のバルブ；上記容器の第１のセットに接続された容器チャネルの第１のセットであって、ここで上記容器チャネルの第１のセットからのチャネルの各々は、上記第１のバルブに接続される容器チャネルの第１のセット；容器チャネルの第２のセット；ならびに上記容器チャネルの第１のセットと上記容器チャネルの第２のセットとの間に位置づけられた共通微小流体チャネルを含む。
【００１１】
実施形態のうちの別のセットにおいて、一連の方法が提供される。一実施形態において、方法は、第１の方向に、共通微小流体チャネルの中の第１の流体を流す工程；上記共通微小流体チャネルの中の上記第１の流体のうちの少なくとも一部を、第２の方向に流す工程であって、ここで上記第２の方向は、上記第１の方向の反対である工程；上記第１の流体のうちの少なくとも一部を第１の容器チャネルを介して第１の容器へと流す工程；上記第１の流体のうちの少なくとも一部を上記第１の容器から上記共通微小流体チャネルへと流す工程；および上記第１の流体のうちの少なくとも一部を上記共通チャネルから第２の容器チャネルを介して第２の容器へと流す工程を包含する。
【００１２】
一実施形態において、方法は、共通微小流体チャネルの中の第１の流体を流す工程；上記第１の流体のうちの一部を第１の容器に流す工程；上記第１の流体のうちの一部を廃棄物容器へと流す工程；化学的および／または生物学的反応を上記第１の容器の中で行って、第２の流体を形成する工程；上記第２の流体のうちの一部を上記第１の容器から上記共通微小流体チャネルへと流す工程；ならびに上記第２の流体の一部を上記廃棄物容器へと流す工程を包含する。
【００１３】
一実施形態において、方法は、第１の流体を共通微小流体チャネルへと流す工程；上記共通微小流体チャネルが第１の容器チャネルと流体伝達状態にあるように、バルブを始動する工程；上記第１の流体のうちの少なくとも一部を上記第１の容器チャネルへと流す工程；第２の流体を上記共通微小流体チャネルへと導入する工程であって、ここで上記第２の流体は、上記第１の流体と非混和性である工程；上記第２の流体のうちの少なくとも一部を上記共通微小流体チャネルから上記第１の容器チャネルへと流す工程；および上記第１の容器チャネルの中で上記第２の流体が流れる間、上記第１の流体の制御された体積を上記第１の容器チャネルに接続された第１の容器へと流す工程を包含する。
【００１４】
本発明の他の利点および新規な特徴は、添付の図面とともに考慮される場合に、本発明の種々の非限定的実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。本明細書および参考として援用される文献が矛盾するおよび／または一致しない開示を含む場合には、本明細書が優先するものとする。
【００１５】
本発明の非限定的実施形態は、添付の図面を参照して例示によって記載される。図面は、模式図であり、一定の縮尺で描かれることは意図されない。図面において、図示される各同一のまたはほぼ同一の構成要素は、代表的には、ひとつの数字によって表される。明瞭にする目的で、あらゆる構成要素があらゆる図においても表示されているわけではなく、当業者に本発明を理解させるために図示が必要でない場合には、本発明の各実施形態のあらゆる構成要素が示されるわけではない。図面において：
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、核酸ライブラリー調製ワークフローの模式図である。
【００１７】
【図２Ａ】図２Ａは、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの図である。
【００１８】
【図２Ｂ】図２Ｂは、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの内部構成要素を示す図である。
【００１９】
【図３】図３は、微小流体カートリッジベイアセンブリの透視図である。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａは、微小流体カートリッジキャリアアセンブリの上面図である。
【００２１】
【図４Ｂ】図４Ｂは、の微小流体カートリッジ透視図である。
【００２２】
【図５】図５は、微小流体カートリッジの分解組み立て図である。
【００２３】
【図６Ａ】図６Ａは、カートリッジへと挿入されつつあるモジュールの側面図である。
【００２４】
【図６Ｂ】図６Ｂは、カートリッジへと挿入されたモジュールの側面図である。
【００２５】
【図６Ｃ】図６Ｃは、カートリッジへと挿入されつつある２つのモジュールの側面図である。
【００２６】
【図７】図７は、一連の容器を含むモジュールの側面図である。
【００２７】
【図８】図８は、リオスフェアを含む一連の容器を含むモジュールの側面図である。
【００２８】
【図９】図９は、共通微小流体チャネル、一連の容器、および一連の容器チャネルを含むチャネルシステムの上面図である。
【００２９】
【図１０】図１０は、流体チャネルに接続されたロータリーバルブを含むチャネルシステムの上面図である。
【００３０】
【図１１】図１１は、容器および他の構成要素に接続された一連の流体チャネルを含むチャネルシステムの上面図である。
【００３１】
【図１２】図１２は、ロータリーバルブに向かって流れる流体を含むチャネルシステムの上面図である。
【００３２】
【図１３】図１３は、共通微小流体チャネルの中を流れている流体を含む、図１２に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００３３】
【図１４】図１４は、第１の容器の中の流体を含む、図１２に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００３４】
【図１５】図１５は、共通微小流体チャネルの中を流れる流体を含む、図１２に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００３５】
【図１６】図１６は、第２の容器の中の流体を含む、図１２に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００３６】
【図１７】図１７は、共通微小流体チャネルの中の流体を示すチャネルシステムの上面図である。
【００３７】
【図１８】図１８は、共通微小流体チャネルから第１の容器チャネルへと移動されつつある流体を示す、図１７に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００３８】
【図１９】図１９は、共通微小流体チャネルの中で流体を分割するために使用されている非混和性流体を示す、図１７に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００３９】
【図２０】図２０は、その分割された流体のうちの一部を第１の容器に向かって押し進めるために使用されている非混和性流体を示す、図１７に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００４０】
【図２１】図２１は、第１の容器の中のその分割された流体を示す、図１７に示されるチャネルシステムの上面図である。
【００４１】
【図２２】図２２は、微小流体カートリッジの層を示す透視図である。
【００４２】
【図２３】図２３は、微小流体カートリッジの層を示す別の透視図である。
【００４３】
【図２４−１】図２４は、微小流体カートリッジの種々の層を示す透視図である。
【図２４−２】図２４は、微小流体カートリッジの種々の層を示す透視図である。
【００４４】
【図２５】図２５は、種々のバルブを含むチャネルシステムの上面図である。
【００４５】
【図２６】図２６は、種々のバルブを含むチャネルシステムの別の上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
核酸を処理するためのモジュール方式の構成要素（カセット）および／または微小流体チャネルを有するカートリッジを含むシステムが一般に提供される。いくつかの実施形態において、システムおよび関連方法が、次世代シーケンシングおよび／または他の下流分析技術のための材料を生成するための核酸の自動化処理のために提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるシステムは、フレーム、上記フレームへと挿入され得る１つまたはこれより多くのカセット、および流体を移動させるためのチャネルシステムを含むカートリッジを含む。ある種の実施形態において、その１つまたはこれより多くのカセットは、流体（例えば、貯蔵された試薬、サンプル）を含むおよび／または受容するように構成された１つもしくはこれより多くのレザバまたは容器を含む。いくつかの場合には、その貯蔵された試薬は、１つまたはこれより多くのリオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）を含み得る。本明細書で記載されるシステムおよび方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含め、核酸処理のための反応を含む化学的および／または生物学的反応を行うために有用であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、図１に示されるように核酸を処理するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、図１に示される核酸調製法（これは、本明細書でより詳細に記載される）は、多重様式で行われ得、複数の異なる（例えば、８までの異なる）サンプルが自動化様式で並行して処理される。このようなシステムおよび方法は、実験、臨床（例えば、病院）、または研究の状況の範囲内で実行され得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）サンプル調製（例えば、ライブラリーサンプル調製）のために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、サンプル品質制御のために使用され得る。図２Ａおよび２Ｂは、多数の使い捨てカセット、プライマーカセット、およびバルク流体カセットを利用する実験用ベンチトップ機器として働く例示的システム２００を示す。いくつかの実施形態において、このシステムは、標準的な実験作業台上での使用に適している。
【００４８】
いくつかの実施形態において、システムは、タッチスクリーンインターフェイスを有し得る（例えば、タッチスクリーンインターフェイス２０２を含む図２Ａの例示的システムに記載されるとおり）。いくつかの実施形態において、そのインターフェイスは、１つまたはこれより多くのカートリッジベイの各々の状態を、「完了予定時間（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」、「現在のプロセス工程（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｔｅｐ）」、または他のインジケーターとともに表示する。いくつかの実施形態において、ログファイルまたはレポートは、その１つまたはこれより多くのカートリッジの各々に関して作られ得る。いくつかの実施形態において、そのログファイルまたはレポートは、上記機器上で記憶され得る。いくつかの実施形態において、テキストファイルまたは出力が、その機器から、例えば、処理されているカートリッジの日付範囲に関して、または特定のシリアルナンバーを有するカートリッジに関して、送信され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、１つまたはこれより多くの核酸調製カートリッジを受容し得る１つまたはこれより多くのカートリッジベイ（２つのカートリッジベイ２１０を含む図２Ｂの例示的システムに記載されるとおり、例えば、２つ）を含み得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジベイの上の空間は、光学モジュール２２６（および／またはバーコードスキャナー、例えば、２−Ｄバーコードスキャナー）を各カートリッジベイのふた２２８（例えば、加熱されたふた）の上に移動させるＸＹポジショナー２２４のために確保される。いくつかの実施形態において、そのシステムは、光学モジュール２２６およびＸＹポジショナー２２４を駆動する電子モジュール２２２を含む。いくつかの実施形態において、ＸＹポジショナー２２４は、光学モジュール２２６が容器の中の物質（例えば、発蛍光団）を励起し得るかつその発せられた蛍光を集め得るように、その光学モジュール２２６を位置づける。いくつかの実施形態において、これは、各容器の上にふた（例えば、加熱されたふた）に配置された孔を通じて起こる。いくつかの実施形態において、バーコードスキャナーは、適切なカートリッジおよびプライマーカセットが、そのシステムの中に挿入されていることを確認する。いくつかの実施形態において、光学モジュール２２６は、必要な場合には、サンプルの処理の間に、例えば、増幅された核酸のレベルを検出するために核酸の増幅の間に、各カートリッジベイにおける各カートリッジからの光シグナルを集める。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるシステムは、そのシステム内の構成要素の温度調節を補助する要素（例えば、１つまたはこれより多くのファンまたはファンアセンブリ（例えば、図２Ｂに示されるファンアセンブリ２２０）を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのカートリッジベイは、核酸調製カートリッジを、任意の組み合わせで処理し得る。いくつかの実施形態において、各カートリッジベイは、例えば、操作者によって、またはロボットアセンブリによって、装填される。図３は、微小流体カートリッジベイアセンブリ３００の例示的図面を示す。いくつかの実施形態において、カートリッジは、そのカートリッジをキャリアプレート３７０の中に配置して、キャリアプレートアセンブリ３０４を形成することによって、ベイが開いた位置にある場合にそのベイに装填される。そのキャリアプレートは、それ自体、いくつかの実施形態において、そのカートリッジベイから外され得る独立型構成要素である。このカートリッジベイは、その機器に対して既知の位置においてカートリッジを保持する。いくつかの実施形態において、ふた３２８（例えば、加熱されたふた）は、１つもしくはこれより多くの容器の中で起こる処理および／または反応のモニタリングを促進するために、１つまたはこれより多くの孔３３０を含む。いくつかの実施形態において、新たなカートリッジをその機器上に装填する前に、プライマーカセットは、そのカートリッジの中に設置され得る。いくつかの実施形態において、そのプライマーカセットは、そのカートリッジとは別個にパッケージされる。いくつかの実施形態において、プライマーカセットは、カートリッジの中に配置され得る。いくつかの実施形態において、プライマーカセットおよびカートリッジの両方が識別され、その結果、これらの両方をその機器上に配置すると、その機器がこれらの両方を読み取り（例えば、バーコードスキャナーを使用して）、そのカセットと関連するプロトコルを開始することを可能にする。
【００５１】
いくつかの実施形態において、キャリアをその機器の中に設置する前に、バルク試薬がそのキャリアの中に装填され得る。いくつかの実施形態において、ユーザーまたはロボットアセンブリは、その試薬が装填されるか、およびそれらをどこに装填するかに関して、その機器または遠隔サンプル装填ステーション上のインターフェイスによって知らされ得る。いくつかの実施形態において、プライマーカセットを有するカートリッジを機器の中に装填した後、ユーザーは、ある種の反応条件（例えば、ＰＣＲサイクルの数）および／またはカートリッジ上で実行されるサンプルの量を選択するという選択肢を有する。いくつかの実施形態において、各カートリッジは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのサンプルという収容力を有し得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、ＲＮＡを処理するように構成され得る。しかし、いくつかの実施形態において、そのシステムは、ＤＮＡを処理するように構成され得る。いくつかの実施形態において、種々の核酸が、そのシステム内で連続してまたは並行して処理され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジは、遺伝子融合アッセイを自動化様式で行うために、例えば、ＡＬＫ、ＲＥＴ、またはＲＯＳ１における遺伝的質の変化を検出するために使用され得る。このようなアッセイは、本明細書において、ならびに米国特許出願公開番号ＵＳ  ２０１３／０３０３４６１（これは、２０１３年１１月１４日に公開された）および米国特許出願公開番号２０１５／０２０１１０５０（これは、２０１３年７月２０日に公開された）において開示される（これらの各々の内容は、それらの全体において本明細書に参考として援用される）。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、自動化様式で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＸｇｅｎプロトコルまたは他の類似の核酸処理プロトコルを処理し得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、カートリッジおよびカセットは、特定のプロトコルを行うために必要とされる試薬の全てを有する。いくつかの実施形態において、キャリアがカートリッジベイへと一旦装填されると、そのベイへのアクセスドアが閉じられ、必要に応じて、ふた（例えば、加熱されたふた）が自動的に降ろされ得る。いくつかの実施形態において、そのふた（例えば、その加熱されたふた）を降ろすと、そのカートリッジの中の１つまたはこれより多くの温度制御された容器のセットの各々に合うヒータージャケットのアレイ上へとそのカートリッジが押し下げられる（または配置される）。いくつかの実施形態において、これは、引き出しアセンブリの中に垂直に、そのカートリッジを既知の位置に配置する。いくつかの実施形態において、ふたを降ろすと、そのカートリッジは、そのカートリッジに存在するロータリーバルブが、そのカートリッジ中のバルブの回転位置を制御する、対応する駆動部とかみ合い得る位置へと押し下げられる。いくつかの実施形態において、自動制御構成要素は、そのロータリーバルブがそれらの駆動部と適切にかみ合うことを担保するために提供される。
【００５４】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、カートリッジに（例えば、カセットの容器内に）存在する核酸サンプルは、リオスフェアと混合される。いくつかの実施形態において、そのリオスフェアは、そのサンプルに付着する発蛍光団を含む。いくつかの実施形態において、分子の（例えば、合成ＤＮＡの）既知の量を含むリオスフェアには、「参照物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」もまた存在する。いくつかの実施形態において、「参照物質」に付着されるのは、そのサンプルの発蛍光団とは異なる波長の光を発する別の発蛍光団である。いくつかの実施形態において、使用される発蛍光団は、インターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）またはレポーター／クエンチャー化学現象（例えば、ＴａｑＭａｎなど）を介して、そのサンプルまたは「参照物質」に付着され得る。いくつかの実施形態において、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）サイクリングの間に、その２つの発蛍光団の蛍光はモニターされ、次いで、比較ＣＴ法によってそのサンプル中の核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）の量を決定するために使用される。
【００５５】
有利なことには、本明細書で記載されるある種のシステムは、行われる特異的反応および／または工程の調整を可能にし得るモジュール方式の構成要素（例えば、カセット）を含み得る。いくつかの実施形態において、特定のタイプの反応を行うためのある種のカセットは、そのカートリッジの中に含まれる。例えば、ＰＣＲ反応の多数の工程を行うための種々の試薬とともにリオスフェアを含む容器を含むカセットは、そのカートリッジ中に存在し得る。フレームまたはカートリッジは、そのカートリッジの中で行われる特定の反応（または反応のセット）のための特定の流体および／または試薬を含む１つもしくはこれより多くのカセットを挿入するために、ユーザー用の空の領域をさらに含み得る。例えば、ユーザーは、特定の緩衝剤、試薬、アルコール、および／またはプライマーを含む１つもしくはこれより多くのカセットを、フレームまたはカートリッジの中へと挿入し得る。あるいは、ユーザーは、流体および／または試薬の異なるセットを含むカセットの異なるセットを、異なる反応および／または実験を行うためのフレームまたはカセットの空の領域へと挿入し得る。そのカセットがフレームまたはカートリッジへと挿入された後、それらは、反応／分析を行うために、流体を移動させるためのチャネルシステムと流体接続を形成し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、異なるカセットをカートリッジへと挿入することによって、多数の分析が同時にまたは連続的に行われ得る。例えば、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、有利なことには、システムを開けるまたはカートリッジを変更する必要性なしに、２つまたはこれより多くのサンプルを分析する能力を提供し得る。例えば、いくつかの場合には、１つまたはこれより多くのサンプルでの１つまたはこれより多くの反応は、並行して行われ得る（例えば、２つまたはこれより多くのＰＣＲ反応を並行して行う）。このようなモジュール方式および融通性は、多数のサンプルの分析を可能にし得、その分析の各々は、単一の流体システム内の１またはいくつかの反応工程を必要とし得る。よって、多数の複雑な反応および分析が、本明細書で記載されるシステムおよび方法を使用して行われ得る。
【００５７】
ある種の既存の流体システムおよび方法とは異なり、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、再使用可能（例えば、再使用可能キャリアプレート）または使い捨て可能（例えば、カセットおよび種々の流体構成要素を含む消耗構成要素）であり得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されるシステムは、類似の反応および実験を行うためのある種の既存の流体システムと比較して、比較的小さな設置面積を占め得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、そのカセットおよび／またはカートリッジは、１つまたはこれより多くのサンプルで特定の反応または分析（または反応もしくは分析のセット）を行うために必要とされる貯蔵された流体および／または試薬を含む。カセットの例としては、試薬カセット、プライマーカセット、緩衝剤カセット、廃棄物カセット、サンプルカセット、および出力カセットが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なモジュールまたはカセットが使用され得る。このようなカセットは、それら試薬を使用する前にその貯蔵された試薬の汚染または喪失を防止または排除する様式で構成され得る。他の利点は、以下でより詳細に記載される。
【００５９】
一実施形態において、図４Ａおよび４Ｂに例証として示されるように、カートリッジ４００は、フレーム４１０ならびにカセット４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、および４４０を含む。いくつかの実施形態において、これらカセットの各々は、チャネルシステムと流体伝達状態にあり得る（例えば、そのカセットの下に位置づけられる（示されない））。いくつかの実施形態において、カセット４２８（例えば、試薬カセット）、４３０（例えば、試薬カセット）、および４３２（例えば、試薬カセット）のうちの少なくとも１つは、そのカセットがそのチャネルシステムと流体伝達状態にあるように、ユーザーによってフレーム４１０へと挿入され得る。例えば、いくつかの実施形態において、カセット４２８、４３０、および４３２のうちの１つは、反応緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝剤）を含む試薬カセットである。ある種の実施形態において、カセット４２８、４３０および／または４３２は、反応または反応のセットのための１つもしくはこれより多くの試薬および／または反応容器を含み得る。いくつかの実施形態において、モジュール４４０は、複数のサンプルウェルおよび／または出力ウェル（例えば、１つまたはこれより多くのサンプルを受容するように構成されたサンプルウェル）を含む。いくつかの場合には、カセット４２０、４２２、４２４、および４２６は、１つもしくはこれより多くの貯蔵された試薬または反応物（例えば、リオスフェア）を含み得る。例えば、カセット４２０、４２２、４２４、および４２６の各々は、別個の反応を行うために貯蔵された試薬または反応物の異なるセットを含み得る。例えば、カセット４２０は、第１のＰＣＲ反応を行うための第１の試薬セットを含み得、カセット４２２は、第２のＰＣＲ反応を行うための第２の試薬セットを含み得る。その第１のおよび第２の反応は、同時に（例えば、並行して）または連続的に行われ得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、図４Ａに例証として示されるように、キャリアプレートアセンブリ４８０は、キャリアプレート４７０ならびにモジュール４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０を含むさらなるカセットを含む。例示的な実施形態において、カセット４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０は各々、１つもしくはこれより多くの貯蔵された試薬を含み得、そして／または１つもしくはこれより多くの流体を受容するように構成および配列され得る（例えば、モジュール４５８は、反応廃棄物流体を集めるように構成された廃棄物モジュールであり得る）。いくつかの実施形態において、カセット４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０のうちの１つもしくはこれより多くが、詰め替え可能であり得る。
【００６１】
図５は、実施形態の１セットに従う例示的なカートリッジ５００の分解組み立て図である。カートリッジ５００は、プライマーカセット５１０およびプライマーカセット５１５を含み、これらカセットは、フレーム５２０の中の１つまたはこれより多くの開口部へと挿入され得る。カートリッジ５００は、フレーム５２０に隣接しかつ一体化していないチャネルシステムを含む流体層アセンブリ５４０をさらに含む。いくつかの実施形態において、カセット５３２のセット（例えば、１つもしくはこれより多くのプライマーカセット、緩衝剤カセット、試薬カセット、および／または廃棄物カセットを含み、各々必要に応じて、１つまたはこれより多くの容器を含む）、反応カセット５３４のセット（これは、反応容器を含む）、入力／出力カセット５３３（これは、サンプル入力容器５３６および出力容器５３８を含む）は、フレーム５２０の中の１つまたはこれより多くの開口部へと挿入され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジ５００は、バルブプレート５５０を含む。いくつかの実施形態において、バルブプレート５５０は、フレーム５２０へと接続し（例えば、かちっとはまり）、流体層アセンブリ５４０ならびにカセット５３２、５３３および５３４をフレーム５２０の中で適所に保持する。ある種の実施形態において、カートリッジ５００は、バルブ５６０（本明細書で記載されるとおり）、および複数の密閉物５６５を含む。いくつかの場合には、フレーム５２０および／または１つもしくはこれより多くのモジュールは、カバー５７０、５７２、および／または５７４によって覆われ得る。
【００６２】
微小流体システムおよび方法
上記で注記されるように、化学的および／または生物学的分析を行うためのモジュール方式の構成要素（カセット）および／または微小流体チャネルを有するカートリッジを含む流体システムが、提供される。本明細書で記載されるシステムは、いくつかの実施形態において、フレーム、そのフレームに挿入され得る１またはこれより多くのカセット、および流体を移動させるためのチャネルシステムを含むカートリッジを含む。ある種の実施形態において、その１またはこれより多くのカセットは、流体（例えば、貯蔵された試薬、サンプル）を含むおよび／または受容するように構成された１またはこれより多くのレザバまたは容器を含む。いくつかの場合には、その貯蔵された試薬は、１またはこれより多くのリオスフェアを含み得る。本明細書で記載されるシステムおよび方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、実験、臨床（例えば、病院）、または研究の状況内で行われるもの）を含む化学的および／または生物学的反応を行うために有用であり得る。
【００６３】
有利なことには、本明細書で記載されるある種のシステムは、行われる特異的反応および／または工程の調整を可能にし得るモジュール方式の構成要素（例えば、カセット）を含み得る。いくつかの実施形態において、特定のタイプの反応を行うためのある種のカセットは、製造業者によってそのカートリッジの中に含まれる。例えば、ＰＣＲ反応の多数の工程を行うための種々の試薬とともにリオスフェアを含む容器を含むカセットは、そのカートリッジ中に存在し得る。そのフレームまたはカートリッジは、そのカートリッジの中で行われる特定の反応（または反応のセット）のための特定の流体および／または試薬を含む１つもしくはこれより多くのカセットを挿入するために、ユーザー用の空の領域をさらに含み得る。例えば、ユーザーは、特定の緩衝剤、試薬、アルコール、および／またはプライマーを含む１つもしくはこれより多くのカセットを、そのフレームまたはカートリッジへと挿入し得る。あるいは、ユーザーは、流体および／または試薬の異なるセットを含むカセットの異なるセットを、異なる反応および／または実験を行うためのフレームまたはカセットの空の領域へと挿入し得る。そのカセットがそのフレームまたはカートリッジへと挿入された後、それらは、反応／分析を行うために、流体を移動させるためのチャネルシステムと流体接続を形成し得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、異なるカセットをカートリッジへと挿入することによって、多数の分析が同時にまたは連続して行われ得る。例えば、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、有利なことには、システムを開けるまたはカートリッジを変更する必要性なしに、２つまたはこれより多くのサンプルを分析する能力を提供し得る。例えば、いくつかの場合には、１つまたはこれより多くのサンプルでの１つまたはこれより多くの反応は、並行して行われ得る（例えば、２つまたはこれより多くのＰＣＲ反応を並行して行う）。このようなモジュール方式および融通性は、多数のサンプルの分析を可能にし得、その分析の各々は、単一の流体システム内の１またはいくつかの反応工程を必要とし得る。よって、多数の複雑な反応および分析が、本明細書で記載されるシステムおよび方法を使用して行われ得る。
【００６５】
ある種の既存の流体システムおよび方法とは異なり、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、再使用可能（例えば、再使用可能キャリアプレート）または使い捨て可能（例えば、カセットおよび種々の流体構成要素を含む消耗構成要素）であり得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されるシステムは、類似の反応および実験を行うためのある種の既存の流体システムと比較して、比較的小さな設置面積を占め得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、そのカセットおよび／またはカートリッジは、１つまたはこれより多くのサンプルで特定の反応または分析（または反応もしくは分析のセット）を行うために必要とされる貯蔵された流体および／または試薬を含む。カセットの例としては、試薬カセット、プライマーカセット、緩衝剤カセット、廃棄物カセット、サンプルカセット、および出力カセットが挙げられるが、これらに限定されない。このようなカセットは、それら試薬を使用する前にその貯蔵された試薬の汚染または喪失を防止または排除する様式で構成され得る。他の利点は、本明細書でより詳細に記載される。
【００６７】
本明細書で記載される場合、カートリッジは、１またはこれより多くのカセットを挿入するためのフレームまたは支持構造、およびカセット内の流体構成要素（例えば、容器、レザバ）に流体接続され得るチャネルシステムを含み得る。いくつかの実施形態において、そのチャネルシステムは、そのフレームに隣接しかつ一体でない。すなわち、ある種の実施形態において、そのフレームは、その中に形成されるチャネルシステムのチャネルを含まない。いくつかのこのような実施形態において、そのチャネルシステムは、そのフレームから独立して形成され、そのフレームに隣接して（例えば、直接隣接して）位置する。例えば、図６Ａに図示されるように、カートリッジ１１００は、フレーム１１１０およびフレーム１１１０に隣接して位置しかつ一体でないチャネルシステム１１３０を含む。いくつかの実施形態において、チャネルシステム１１３０は、少なくとも１つの流体（例えば、微小流体）チャネル１１３５を含む。チャネルシステムおよび流体チャネルは、以下でより詳細に記載される。いくつかの実施形態において、そのフレームおよび／またはカートリッジは、キャリアプレートと直接接触状態にある。そのキャリアプレートは、ある種の実施形態において、カートリッジの移動および／または分析デバイスもしくは機器へのそのカートリッジの適切な挿入を促進するように構成され得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、そのフレームは、少なくとも１つの開口部を含む。例えば、図６Ａを再び参照すると、フレーム１１１０は、開口部１１１２を含む。その開口部は、カセットを収容するように構築かつ配列され得る。例えば、いくつかの実施形態において、カートリッジ１１２０は、開口部１１１２へと挿入され得る（例えば、へと位置づけられ得る）。いくつかの実施形態において、カートリッジ１１２０は、容器１１４０を含む。以下でより詳細に記載されるように、モジュールは、特定の反応もしくは分析のための１もしくはこれより多くの流体および／もしくは試薬を含み得るか、または特定の反応もしくは分析のための１またはこれより多くの流体および／もしくは試薬を受容するように構成され得る（例えば、廃棄物カートリッジ、試薬カートリッジ、プライマーカートリッジ、緩衝剤カートリッジ、サンプルカートリッジ、出力カートリッジ）。いくつかの場合には、その１またはこれより多くの流体および／または試薬は、そのカートリッジのうちの１またはこれより多くの容器に（例えば、貯蔵の間に、使用の間に）存在し得る。そのカートリッジは、いくつかの場合には、そのカートリッジまたはフレームへとユーザーによって挿入され得る。そのカートリッジは、そのフレームの開口部がそのカートリッジとそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのチャネル、ポート、または他の流体構成要素）との間の流体伝達を可能にするように構成され得る。
【００６９】
ここで図６Ｂを参照すると、カートリッジ１１００は、フレーム１１１０、チャネルシステム１１３０、およびカートリッジ１１２０がチャネルシステム１１３０に隣接するようにフレーム１１１０に挿入されるカートリッジ１１２０を含む。いくつかの実施形態において、カートリッジ１１２０は、チャネルシステム１１３０（例えば、流体チャネル１１３５）と流体伝達状態にある（例えば、カートリッジ１１２０の容器１１４０は、流体チャネル１１３５と流体伝達状態にあり得る）。
【００７０】
例えば、いくつかの実施形態において、そのカートリッジは、そのユーザーがそのカートリッジを使用する（例えば、そのカートリッジ内で反応を行う）際に、そのカートリッジに既に存在し得る。ある種の実施形態において、そのカートリッジは、そのカートリッジの製作の際および／またはその製作の間に、そのカートリッジの中に存在し得る（例えば、そのカートリッジは、その製造業者によってそのフレーム／カートリッジへと挿入され得る）。いくつかの場合には、そのカートリッジは、そのカートリッジへと物理的に接続され得る。例えば、いくつかのこのような実施形態において、そのカートリッジは、接着剤（例えば、エポキシ）、機械的機構（例えば、溝、ラッチ）、摩擦を介して、または当該分野で公知の他の手段によって、そのチャネルシステムの表面に接続され得かつその表面との接触を維持するように構成され得る。そのカートリッジへのカートリッジモジュールの接続は、製造業者によっておよび／またはいくつかの場合には、そのユーザーによって行われ得る。
【００７１】
ある種の実施形態において、フレームは、２またはこれより多くの開口部を含み、各々、カートリッジを受容するように構成される。ここで図６Ｃを参照すると、カートリッジ１１０２は、チャネルシステム１１３０に隣接するフレーム１１１０を含む。いくつかの実施形態において、フレーム１１１０は、２またはこれより多くの開口部（例えば、第１の開口部１１１４および第２の開口部１１１６）を含む。ある種の実施形態において、第１のカセットは、その第１の開口部へと挿入され得、第２のカセットは、その第２の開口部へと挿入され得る。例えば、図示されるように、第１のカセット１１２２は、第１の開口部１１１４へと挿入され得、そして／または第２のカセット１１２４は、第２の開口部１１２４へと挿入され得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、カセット１１２２および／またはカセット１１２４は、１またはこれより多くの流体（例えば、緩衝剤）および／または試薬を含むか、またはこれらを含むように構成される。例えば、ある種の実施形態において、その流体および／または試薬は、容器１１４２および／または１１４４内に含まれ得る。さらなる容器（これは、１またはこれより多くの流体および／または試薬を必要に応じて含む）は、そのカセットの中に存在し得る（示さず）。いくつかの実施形態において、その流体および／または試薬は、そのカセットが開口部１１１４および／または１１１６へと挿入された後に、そのカートリッジおよび／またはチャネルシステムへと導入される。例えば、本明細書で記載される場合、そのカセットに存在する流体および／または試薬は、そのチャネルシステムへと（例えば、そのチャネルシステムにおける流体チャネルを介して）移動され得る。
【００７３】
別の実施形態において、その流体および／または試薬は、そのカセットの流体構成要素へと導入される。例えば、いくつかの場合には、１またはこれより多くの流体および／または試薬は、そのチャネルシステムからそのカセットへと移動され得る。例えば、そのチャネルシステムの中の流体および／または試薬は、第１の反応が起こり得る第１のカセットへと移動され得る（例えば、流体チャネル１１３９／１１３７の中の流体および／または試薬は、そのカートリッジへと挿入されたカセット１１２２／１１２４へと移動され得る）。実施形態のうちの１つの特定のセットにおいて、その得られた流体は、そのチャネルシステムへと（例えば、カセット１１２２／１１２４から流体チャネル１１３９／１１３７へと）戻され得る。ある種の実施形態において、その得られた流体は、第２の反応が起こり得る第２のカセットへと（例えば、カセット１１２４の容器１１４４の中に）移動され得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジは、複数の反応がそのカセットの内／中で起こるように構成かつ配列された複数の開口部および／またはカセットを含み得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、そのフレームは、１またはこれより多くのカセットを受容するように構成された少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１６、または少なくとも２０の開口部を含む。ある種の実施形態において、そのフレームは、１またはこれより多くのモジュールを受容するように構成された２４以下、２０以下、１６以下、１２以下、１０以下、８以下、６以下、５以下、４以下、または３以下の開口部を含む。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、少なくとも２つで２４以下の開口部）。他の範囲も可能である。いくつかのこのような実施形態において、そのカートリッジは、その第１のおよび／または第２のカセットをそのフレームへと挿入する際に、それぞれ、その第１のカセットとそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのうちの少なくとも１つのチャネル）および／またはその第２のカセットとそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのうちのその少なくとも１つのチャネル）との間の流体伝達を可能にするように構成され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、そのカートリッジは、第３のカセットおよび／または第４のカセットとそのチャネルシステムとの間の流体伝達を可能にするように構成される。さらなるカセットも可能であり、以下で詳細に記載される。
【００７６】
本明細書で記載される場合、いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのカセットは、特定の反応または分析のための試薬を含み得る。例えば、そのカートリッジおよび／またはそのフレームに挿入および／または固定される１またはこれより多くのカセットは、例えば、特定の反応または分析をそのカートリッジ上で行うために、そのカセットの中に１または一連の貯蔵された試薬を含み得る。ある種の実施形態において、１またはこれより多くのカセットは、特定の反応または分析のための流体（例えば、緩衝剤）を含み得る。いくつかの場合には、そのカセットは、特定の反応が起こる領域（例えば、容器）を含み得る。よって、カセットの異なる構成が、そのカートリッジで行われる特定の反応および／またはプロセスを調整するために使用され得る。
【００７７】
本明細書で記載される場合、そのカートリッジは、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカセットとそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのチャネル）との間の流体伝達を可能にするように構成される。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのカセットは、少なくとも１つのカセットがそのチャネルシステムと流体伝達状態にあるように、カートリッジおよび／またはフレームへと挿入またはその内部に配列される。ある種の実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つ（またはそのカセットのうちの流体構成要素）は、そのカセットをそのカートリッジへと（例えば、そのフレームの開口部へと）挿入する前には、そのチャネルシステムと流体伝達状態にないが、そのモジュールとそのチャネルシステムとの間の流体伝達は、そのカセットをそのカートリッジへと挿入する際にまたは挿入した後に起こり得る。例えば、図６Ｂを再び参照すると、カセット１１２０は、フレーム１１１０へと挿入する際にまたは挿入した後に、チャネルシステム１１３０と流体伝達状態になり得る。
【００７８】
いくつかの場合には、１またはこれより多くのカセットは、その中に試薬（例えば、貯蔵された試薬）を含み得る。例えば、そのカセットは、１またはこれより多くの試薬（例えば、貯蔵された試薬）を中に含み得る流体構成要素（例えば、レザバ、容器，および／またはチャネル（例えば、微小流体チャネル））を含み得る。２またはこれより多くのカセットは、所望の反応に依存して種々の試薬（例えば、第１の反応を行うための第１の試薬および第２の反応を行うための第２の試薬）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、第１のカセットは、第１の反応（例えば、第１のＰＣＲ反応）を行うために構築かつ配列され、第２のカセットは、その第１の反応とは独立した第２の反応（例えば、第２のＰＣＲ反応）を行うために構築かつ配列される。
【００７９】
いくつかの場合には、その１またはこれより多くのカセットは、密閉され得る。例えば、いくつかの実施形態において、そのカセットは、そのカセットをそのフレームに挿入する前には、流体がそのカセットから（例えば、漏れることによって、蒸発によって）実質的に逃げないように、その流体を含み得る。有利なことには、そのカセットを密閉することは、貯蔵された液体試薬の蒸発および／または試薬の汚染を低減または防止し得る。いくつかの実施形態において、そのフレームまたはカートリッジは、そのカセットをそのフレームまたはカートリッジへと挿入する際に、そのカセットのうちの１またはこれより多くの部分を穿刺するように構築かつ配列された１またはこれより多くの穿刺構成要素を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、そのカセットをそのフレームの開口部に挿入する際に、その穿刺構成要素（例えば、そのカセットが挿入されつつある開口部内に位置するまたは隣接する）は、そのカセット内に含まれる試薬がそのチャネルシステムと流体伝達状態にあるように、そのカセットを穿刺する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つは、そのモジュールをそのカートリッジへと挿入される前には互いと流体伝達状態にない、そのカセットの中に貯蔵された２またはこれより多くの試薬を含む。例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカセットは、その中に貯蔵された第１の試薬およびその中に貯蔵された第２の試薬を含み、ここでその第１のおよび第２の試薬は、そのカセットをそのカートリッジへと挿入する前には互いと流体伝達状態にない。ある種の実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つは、その中に貯蔵された第１の試薬および／または第２の試薬がそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのうちの少なくとも１つのチャネル）と流体伝達状態にあるように、そのカートリッジの中に挿入または固定される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つは、少なくとも０．１ｍＬおよび／または２５ｍＬ以下の全作業体積を有する。ある種の実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つは、少なくとも０．１ｍＬ、少なくとも０．２ｍＬ、少なくとも０．５ｍＬ、少なくとも約１ｍＬ、少なくとも約２ｍＬ、少なくとも約５ｍＬ、少なくとも約１０ｍＬ、少なくとも約１５ｍＬ、または少なくとも約２０ｍＬの全作業体積を有する。いくつかの実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つは、２５ｍＬ以下、２０ｍＬ以下、１５ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、５ｍＬ以下、２ｍＬ以下、１ｍＬ以下、０．５ｍＬ以下、０．２ｍＬ以下の全作業体積を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、少なくとも０．１ｍＬでかつ２５ｍＬ以下）。他の範囲も可能である。
【００８２】
いくつかの場合には、そのモジュールのうちの少なくとも１つは、詰め替え可能であり得る。例えば、少なくとも１つのモジュールは、反応を（例えば、その中に貯蔵された試薬とサンプルとの間で）行うために使用され得、そのモジュールは、その第１の反応が完了した後に新たな試薬で詰め替えられ得る。いくつかのこのような実施形態において、その少なくとも１つのモジュールは、２またはこれより多くの反応を行うために使用され得る。他の実施形態において、モジュールは、詰め替え可能でない。
【００８３】
いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのモジュールは、１またはこれより多くのサンプルウェル（すなわち、サンプルモジュール）を含む。例えば、ある種の実施形態において、１またはこれより多くのサンプルウェルを含むモジュールは、そのカートリッジに固定され得、そのチャネルシステムと流体伝達状態にあり得る。いくつかのこのような実施形態において、ユーザーは、１またはこれより多くのサンプルをその１またはこれより多くのサンプルウェルへと（例えば、ピペッティングを介して）挿入し得る。そのサンプルは、反応または分析を行うために、そのチャネルシステムに、および１またはこれより多くのレザバまたは容器に移動され得る。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのサンプルウェルを含む各モジュールは、少なくとも約５μＬ（例えば、少なくとも約１０μＬ、少なくとも約２０μＬ、少なくとも約３０μＬ、少なくとも約４０μＬ、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約８０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約２００μＬ）および／または５００μＬ以下（例えば、４００μＬ以下、３００μＬ以下、２００μＬ以下、１００μＬ以下、８０μＬ以下、６０μＬ以下、４０μＬ以下、２０μＬ以下）の総体積を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。
【００８４】
ある種の実施形態において、１またはこれより多くのモジュールは、１またはこれより多くの出力ウェル（すなわち、出力モジュール）を含む。例えば、いくつかの場合には、そのカートリッジは、１またはこれより多くのサンプルがそのカートリッジの中に存在する（または導入される）１またはこれより多くの試薬と反応し、その反応の生成物がその出力ウェルに移動されるように、構成かつ配列され得る。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの出力ウェルを含む各モジュールは、少なくとも約５μＬ（例えば、少なくとも約１０μＬ、少なくとも約２０μＬ、少なくとも約３０μＬ、少なくとも約４０μＬ、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約８０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約２００μＬ）および／または５００μＬ以下（例えば、４００μＬ以下、３００μＬ以下、２００μＬ以下、１００μＬ以下、８０μＬ以下、６０μＬ以下、４０μＬ以下、２０μＬ以下）の総体積を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのモジュールは、１またはこれより多くの廃棄物モジュールを含む。例えば、いくつかの実施形態において、副生成物および／または未使用の試薬は、その１またはこれより多くの廃棄物モジュールに対する作動の間に、そのチャネルシステムから移動され得る。いくつかの実施形態において、その廃棄物モジュールは、少なくとも０．１ｍＬおよび／または５ｍＬ以下の体積を有する。ある種の実施形態において、その廃棄物モジュールは、少なくとも０．１ｍＬ、少なくとも０．２ｍＬ、少なくとも０．５ｍＬ、少なくとも約１ｍＬ、少なくとも約２ｍＬ、少なくとも約３ｍＬ、少なくとも約４ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態において、その廃棄物モジュールは、５ｍＬ以下、２ｍＬ以下、１ｍＬ以下、０．５ｍＬ以下、０．２ｍＬ以下の体積を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。（例えば、少なくとも０．１ｍＬでかつ３ｍＬ以下）。他の範囲も可能である。
【００８６】
いくつかの場合には、１またはこれより多くのモジュールは、反応がそのモジュール内で起こり得るように、流体を受容するように構成される。例えば、いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのモジュールは、反応物およびサンプルがその１またはこれより多くのモジュール内で反応するように、その反応物およびサンプルを受容し得る。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのモジュールは、試薬（すなわち、試薬モジュール）、プライマー（すなわち、プライマーモジュール）、または緩衝剤（すなわち、緩衝剤モジュール）を含む。例えば、いくつかの場合には、その反応物モジュールは、以下でより詳細に記載されるように、１またはこれより多くのリオスフェアを含む。反応物、試薬、プライマー、および緩衝剤はまた、以下でより詳細に記載される。
【００８７】
ある種の実施形態において、カートリッジは、種々のタイプのカセットの組み合わせを含み得る。いくつかのモジュールは、そのユーザーによって挿入され得、他のモジュールは、そのカートリッジに固定され得る（例えば、そのフレームに固定され得る）。いくつかの実施形態において、カートリッジは、モジュールを受容するように構成された、１もしくはこれより多くの、２もしくはこれより多くの、３もしくはこれより多くの、４もしくはこれより多くの、５もしくはこれより多くの、６もしくはこれより多くの、８もしくはこれより多くの、１０もしくはこれより多くの、１２もしくはこれより多くの、１６もしくはこれより多くの、または２０もしくはこれより多くのモジュールおよび／または開口部を含む。いくつかの場合には、そのカートリッジは、１もしくはこれより多くのサンプルモジュール、１もしくはこれより多くの出力モジュール、１もしくはこれより多くの廃棄物モジュール、１もしくはこれより多くの挿入可能なモジュール、および／または１もしくはこれより多くの、貯蔵された試薬を含む固定されたモジュールの組み合わせを含み得る。
【００８８】
上記で注記されるように、一実施形態において、図４Ａおよび４Ｂに図示されるように、カートリッジ４００は、フレーム４１０、ならびにカセット４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、および４４０を含む。いくつかの実施形態において、これらのカセットの各々は、チャネルシステムと流体伝達状態にあり得る（例えば、そのカセットの下に位置づけられ得る（示さず））。いくつかの実施形態において、カセット４２８（例えば、試薬カセット）、４３０（例えば、試薬カセット）、および４３２（例えば、試薬カセット）のうちの少なくとも１つは、そのカセットがそのチャネルシステムと流体伝達状態にあるように、そのユーザーによってフレーム４１０へと挿入され得る。例えば、いくつかの実施形態において、カセット４２８、４３０、および４３２のうちの１つは、反応緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝剤）を含む試薬カセットである。ある種の実施形態において、カセット４２８、４３０および／または４３２は、反応もしくは反応のセットのために、１またはこれより多くの試薬および／または反応容器を含み得る。いくつかの実施形態において、モジュール４４０は、複数のサンプルウェルおよび／または出力ウェル（例えば、１またはこれより多くのサンプルを受容するように構成されたサンプルウェル）を含む。いくつかの場合には、カセット４２０、４２２、４２４、および４２６は、１もしくはこれより多くの貯蔵された試薬または反応物（例えば、リオスフェア）を含み得る。例えば、カセット４２０、４２２、４２４、および４２６の各々は、別個の反応を行うために、貯蔵された試薬または反応物の種々のセットを含み得る。例えば、カセット４２０は、第１のＰＣＲ反応を行うための試薬の第１のセットを含み得、カセット４２２は、第２のＰＣＲ反応を行うための試薬の第２のセットを含み得る。その第１のおよび第２の反応は、同時に（例えば、並行して）または連続して行われ得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、図４Ａに図示されるように、キャリアプレートアセンブリ４８０は、キャリアプレート４７０ならびにモジュール４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０を含むさらなるカセットを含む。例示的な実施形態において、カセット４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０は各々、１またはこれより多くの貯蔵された試薬を含み得、そして／または１もしくはこれより多くの流体を受容するように構成かつ配列され得る（例えば、モジュール４５８は、反応廃棄物流体を集めるように構成された廃棄物モジュールであり得る）。いくつかの実施形態において、カセット４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０のうちの１またはこれより多くは、詰め替え可能であり得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカセットは、１またはこれより多くのレザバを含む。いくつかの場合には、そのレザバは、流体および／または試薬を含めるために使用され得る容器である。本明細書中の記載のうちの大部分は容器に関するが、当業者は、レザバの他のタイプがまた可能である（導管、チャネル、マイクロチャネル、腔、カプセル、ピット、孔などが挙げられるが、これらに限定されない）ことを、本明細書の教示に基づいて理解する。
【００９１】
ある種の実施形態において、少なくとも１つのカセットは、容器のセットを含む。図７に図示されるように、カセット１３２０は、容器１３４２、１３４４、および１３４６を含む容器のセット１３４０を含む。カートリッジまたはキャリアプレートは、いくつかの場合には、１またはこれより多くのこのようなカセットを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、第１のカセットは、容器の第１のセットを含み、第２のカセットは、容器の第２のセットを含む。ある種の実施形態において、第３のカセットは、容器の第３のセットを含み得る。容器のさらなるセットも可能である。いくつかの実施形態において、容器の少なくとも１セットは、少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、少なくとも１０、または少なくとも１５の容器を含む。ある種の実施形態において、容器の少なくとも１セットは、２０以下の容器、１５以下の容器、１０以下の容器、８つ以下の容器、６つ以下の容器、または４つ以下の容器を含む。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、少なくとも２つで４つ以下の容器）。他の範囲も可能である。
【００９２】
本明細書で記載される場合、カートリッジは、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの容器とそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのチャネル）との間の流体伝達を可能にするように構成される。図６Ｂを再び参照すると。、カートリッジ１１００は、フレーム１１１０、流体チャネル１１３５を含むチャネルシステム１１３０、および容器１１４０が流体チャネル１１３５と流体伝達状態にあるようにフレーム１１１０に位置づけられた容器１１４０を含むカセット１１２０を含む。いくつかの実施形態において、流体伝達は、モジュールの中のその容器の各々とそのチャネルシステムとの間で（例えば、実質的に同時に）起こる（例えば、モジュールの中の各容器は、そのチャネルシステムの容器チャネルと流体伝達状態にあり得る）。
【００９３】
いくつかの場合には、少なくとも１つの容器は、その中に試薬（例えば、貯蔵された試薬）を含み得る。２またはこれより多くの容器は、望ましい反応に依存して種々の試薬（例えば、第１の反応を行うための第１の試薬および第２の反応を行うための第２の試薬）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、第１の容器は、第１の反応（例えば、ＰＣＲ反応のうちの第１の部分）を行うために構築かつ配列され、第２の容器は、第１の反応とは独立した第２の反応（例えば、ＰＣＲ反応のうちの第２の部分）を行うために構築かつ配列される。その２つまたはこれより多くの容器は、流体がその容器の各々の間で移動され得るように、そのチャネルシステムと流体伝達状態にあり得る。例えば、第１の反応が（例えば、サンプル構成要素とその第１の容器内に位置づけられた第１の試薬との間で）第１の容器の中で起こった後に、その反応生成物は、その第１の容器からそのチャネルシステムを戻りかつその第２の容器へと、第２の反応を（例えば、その反応生成物と第２の試薬との間で）行うために移動され得る。同じプロセスが、種々の反応（例えば、連続的な反応）を行うために、種々の容器へと流体を移動させるために使用され得る。
【００９４】
いくつかの場合には、その１またはこれより多くの容器は、密閉され得る（例えば、適切なホイル、膜、カバーなどを使用して）。例えば、いくつかの実施形態において、その容器は、そのカセットをそのカートリッジに挿入する前に、その流体がその容器から（例えば、漏れることによって、蒸発によって）実質的に逃げないように、流体を含み得る。有利なことには、その容器を密閉することは、貯蔵された液体試薬の蒸発を低減または防止し得る。
【００９５】
いくつかの実施形態において、そのカートリッジ（またはフレーム）は、その容器をそのフレームに挿入する際に、その容器のうちの１またはこれより多くの部分を穿刺するよう構築かつ配列された１またはこれより多くの穿刺構成要素を含む。いくつかのこのような実施形態において、その容器をそのカートリッジまたはフレームの開口部に挿入する際に、その穿刺構成要素（例えば、その容器を含むカセットが挿入されている開口部内にまたは隣接して位置する）は、その容器および／またはその容器内に含まれる試薬がそのチャネルシステムと流体伝達状態にあるように、その容器を穿刺する。いくつかの実施形態において、カートリッジは、一連の穿刺構成要素を含み、各穿刺構成要素は、容器の密閉物を穿刺するように整列される。穿刺構成要素は、任意の適切な形態（例えば、斜角になった前縁（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）を有するプローブのような）にあり得る。
【００９６】
ある種の実施形態において、（例えば、カセットの）容器のセットの中の容器は、それらをそのカートリッジへと挿入する前には（例えば、その容器のセットを含むカセットをそのカートリッジおよび／またはそのフレームの開口部へと挿入する前には）、互いと流体伝達状態にない。いくつかの実施形態において、容器のセットは、その中に貯蔵された２またはこれより多くの試薬を含むが、その容器を含むカセットをそのカートリッジに挿入する前には互いと流体伝達状態にない。例えば、いくつかの実施形態において、容器のセットは、そのセット中の第１の容器に貯蔵された第１の試薬およびそのセット中の第２の容器に貯蔵された第２の試薬を含み、ここでその第１のおよび第２の試薬（ならびに／またはその第１のおよび第２の容器）は、その容器のセットを含むカセットをそのカートリッジに挿入する前には、互いと流体伝達状態にない。ある種の実施形態において、その容器のセットは、その中に貯蔵された第１の試薬および／または第２の試薬がそのチャネルシステム（例えば、そのチャネルシステムのうちの少なくとも１つのチャネル）と流体伝達にあるように、そのカートリッジに挿入または固定される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの容器は、流体（例えば、サンプルを含む流体、反応流体、廃棄物流体など）を受容するように、例えば、そのチャネルシステムからの流体を受容するように構成され得る。ある種の実施形態において、反応は、容器の中で行われ得る。例えば、その容器は、第１の試薬（例えば、第１の貯蔵された試薬）を含み得、その第１の試薬は、流体と反応されて、第２の流体を形成する。いくつかの場合には、その反応は、化学的および／または生物学的反応であり得る。
【００９８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの容器は、流体（例えば、サンプルを含む流体、反応流体など）を送達するように、例えば、そのチャネルシステムへと流体を送達するように構成され得る。いくつかの場合には、その容器のうちの少なくとも１つは、詰め替え可能であり得る。例えば、少なくとも１つの容器は、反応を（例えば、その中に貯蔵された試薬とサンプルとの間で）行うために使用され得、その容器は、その第１の反応が完了した後に、新たな試薬で詰め替えられ得る。いくつかのこのような実施形態において、その少なくとも１つの容器は、２またはこれより多くの反応を行うために使用され得る。
【００９９】
ある種の実施形態において、その容器のうちの少なくとも１つは、少なくとも約１μＬの体積（例えば、少なくとも約５μＬ、少なくとも約１０μＬ、少なくとも約２０μＬ、少なくとも約３０μＬ、少なくとも約４０μＬ、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約８０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約２００μＬの体積）および／または５００μＬ以下（例えば、４００μＬ以下、３００μＬ以下、２００μＬ以下、１００μＬ以下、８０μＬ以下、６０μＬ以下、４０μＬ以下、２０μＬ以下）の体積を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。その体積は、その容器の側壁および容器のカバー（存在するのであれば）によって取り囲まれる体積によって定義され得る。
【０１００】
容器は、任意の適切な形状を有し得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの容器は、円錐形状を有する。ある種の実施形態において、少なくとも１つの容器は、テーパー状の断面形状を有する。本明細書で記載される場合、その容器は、任意の適切な形状を有し得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの容器は、円錐形状を有する。ある種の実施形態において、少なくとも１つの容器は、その側壁によって規定されるテーパー状の断面形状を有する。そのテーパー状の形状は、図６Ａに示される容器１１４０のもののように、実質的に円錐状であってもよいし、ある程度の弯曲を含んでいてもよい（例えば、その側壁は、図６Ａに示される透視図から直線的ではなくむしろ弯曲していてもよい／弯曲しているようである）。その円錐状またはテーパー状の形状の頂端は、その容器への入り口として近似され得る。その容器は、その頂端とその表面（例えば、側壁）との間で形成される角度として定義されるテーパー角を有し得る。いくつかの実施形態において、その容器のテーパー角は、少なくとも５°、少なくとも１０°、少なくとも２０°、少なくとも３０°、少なくとも４０°、少なくとも４５°、少なくとも５０°、少なくとも６０°、または少なくとも７０°であり得る。いくつかの実施形態において、その容器のテーパー角は、８０°以下、７０°以下、６０°以下、５０°以下、４５°以下、４０°以下、３０°以下、２０°以下、または１０°以下であり得る。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、少なくとも２０°でかつ４５°以下）。他の範囲も可能である。
【０１０１】
その容器の形状は、その容器にリッジ（ｌｅｄｇｅ）がない（すなわち、リッジなし）ようにされ得る；このような構成は、混合を促進し得るおよび／またはその容器の中の残渣の存在を低減し得る。その容器の形状は、その容器に（例えば、上に、下に）隣接して位置づけられた検出機器（例えば、光学機器）の使用を促進し得、その結果、例えば、その容器内の表面部分および／または流体部分が、種々の目的（例えば、計測、光化学、およびプロセス制御が挙げられる）のために使用される光の適切な分布を受容する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、その容器は、その容器の中で反応を行うために、ある種の内部圧力に耐えるように構成される。例えば、その容器は、少なくとも１ｐｓｉ、少なくとも１．５ｐｓｉ、少なくとも２ｐｓｉ、少なくとも２．５ｐｓｉ、少なくとも３ｐｓｉ、または少なくとも３．５ｐｓｉの圧力に耐えるように構成され得る。その容器の中の圧力は、４ｐｓｉ以下、３ｐｓｉ以下、または２ｐｓｉ以下であり得る。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、少なくとも１ｐｓｉで４ｐｓｉ以下）。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。本明細書で記載されるカートリッジを使用するための方法は、１またはこれより多くの容器の中で上記の圧力のうちの１またはこれより多くにおいて反応を行うことを包含し得る。
【０１０３】
温度制御デバイス
いくつかの実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器のうちの少なくとも１セットは、加熱（または冷却）されるように構築かつ配列される。２またはこれより多くのカセットを含む実施形態において、第１のおよび第２のカセット（または容器の第１のおよび第２のセット）は、独立して加熱される（または冷却される）ように構築かつ配列され得る。例えば、いくつかの実施形態において、温度制御デバイスは、第１の温度を第１のカセットに、および第２の温度を第２のモジュールに（例えば、同時にまたは連続して）適用するように構成される。いくつかの実施形態において、カセットの中に存在する個々の容器は、独立して加熱または冷却されるように配列され得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジは、温度制御デバイスを含み得るかまたはそのデバイスとインターフェイス接続し得る。ある種の実施形態において、そのカートリッジは、温度制御デバイスと伝達状態にあり得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジは、温度制御され得るふた（例えば、加熱されたふた）とインターフェイス接続し得る。例えば、いくつかの実施形態において、そのカセットは、温度制御デバイスを含むふたとインターフェイス接続し得る。いくつかの実施形態において、そのふたは、少なくとも１つの容器を覆う。ある種の実施形態において、そのふた（例えば、温度制御されたふた）は、容器の頂部を形成する。温度制御され得るふたは、いくつかの場合には、半透明または透明であり得る。有利なことには、その温度制御可能なふたは、光学測定がそのふたを通って行われることを可能にするように構成され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、カセットのふたは、レーザー切断されたアクリル樹脂または射出成形されたアクリル樹脂（例えば、Ａｃｒｙｌｉｔｅ  Ｈ１５）から構築され得る。しかし、いくつかの実施形態において、そのふたは、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、オレフィンポリマー、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｙｅｎｅ）、またはポリスチレンから構築され得る。いくつかの実施形態において、その加熱されたふたは、アルミニウムから機械加工され、内部にフレキシブル抵抗性ヒーター（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  ｈｅａｔｅｒ）およびサーマルフィードバックを有する。いくつかの実施形態において、その温度制御デバイスは、１またはこれより多くのサーマルパッド、熱電構成要素、および／またはサーミスタを含む。当業者は、本明細書の教示に基づいて適切な温度制御デバイスを選択し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、温度制御は、熱電クーラー（ＴＥＣ、ペルチエヒートポンプ、またはソリッドステートクーラー（ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ  ｃｏｏｌｅｒ）としても公知）を使用して達成される。いくつかの実施形態において、温度フィードバックは、サーミスタ、測温抵抗体（ＲＴＤ）、および熱電対（タイプＫ）を使用することによって集められる。いくつかの実施形態において、その加熱されたふたにおける加熱要素は、フレキシブル抵抗性ヒーターであり、加熱し得るに過ぎず冷却はできない。
【０１０６】
貯蔵された試薬
本明細書で記載される場合、いくつかの実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器（または容器のセット）は、試薬（例えば、貯蔵された試薬）を含む。ある種の実施形態において、その貯蔵された試薬は、反応を行うために使用され得、いくつかの場合には、それは反応物であり得る。いくつかの実施形態において、その貯蔵された試薬は、ＰＣＲ反応を行うためのものであり得る。いくつかの実施形態において、以下の手順（またはその反応工程）のうちの１またはこれより多くが、容器の中で行われ得る：  ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＲＴ／ｃＤＮＡ合成、ライゲーション、末端修復／末端ポリッシング（Ｅｎｄ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）（リン酸化、Ａテール付加、末端切断）、制限酵素消化、ヌクレアーゼ切断、プライマーアニーリング、ＢＥＲ（塩基除去修復）、およびＤＮＡ変性。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、その貯蔵された試薬は、貯蔵された液体試薬である。いくつかの実施形態において、その貯蔵された液体試薬としては、プライマー、緩衝剤、洗浄試薬，および／またはアルコール（例えば、イソプロパノール、エタノール、メタノール）が挙げられる。いくつかの実施形態において、そのプライマーは、ＰＣＲプライマー、ランダムヘキサマー、ＲＴ特異的プライマー、または改変されたプライマー（例えば、ビオチン標識プライマー、リン酸化プライマー、ホスホロチオエート結合プライマー、ロック核酸プライマー（ＬＮＡ）、または発蛍光団標識プライマー）である。いくつかの実施形態において、その緩衝剤は、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ホスフェート緩衝剤、ＴＥ緩衝剤、ＴＢＥ緩衝剤、溶解緩衝剤、抽出緩衝剤、ＰＣＲ緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤または洗浄緩衝剤である。いくつかの実施形態において、その洗浄試薬は、水、エタノール、イソプロパノール、トリスまたは界面活性剤溶液である。いくつかの実施形態において、貯蔵された試薬は、以下をさらに含み得る：ＰＥＧ、Ｔｒｉｓ、ベタイン、グリセロール非含有酵素、ｄＮＴＰ、塩、緩衝剤、改変されたオリゴヌクレオチドなど。
【０１０８】
ある種の実施形態において、その貯蔵された試薬は、貯蔵された乾燥試薬である。いくつかの実施形態において、その乾燥試薬は、オリゴヌクレオチド、プライマー、合成テンプレートコントロール、蛍光標識プローブ、蛍光色素、緩衝剤、マスターミックスまたは酵素である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、そのカセットのうちの少なくとも１つおよび／または容器（または容器のセット）は、１またはこれより多くの貯蔵されたリオスフェアを含む。すなわち、ある種の実施形態において、その貯蔵された試薬は、貯蔵されたリオスフェアである。例えば、一実施形態において、少なくとも１つのカセットおよび／または少なくとも１つの容器は、単一のリオスフェアを含む。別の実施形態において、少なくとも１つのカセットおよび／または少なくとも１つの容器は、２またはこれより多くのリオスフェア（例えば、２もしくはこれより多く、３もしくはこれより多く、または４もしくはこれより多くのリオスフェア）を含む。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのカセットおよび／または少なくとも１つの容器は、リオスフェアのセットを含む。いくつかの実施形態において、その容器のセットのうちの少なくとも一部は、その中に配置された少なくとも１つのリオスフェアを含む。例えば、図８に図示されるように、カセット１３２０は、容器のセット１３４０を含み、各容器はリオスフェアを含む（例えば、リオスフェア１３５２を含む容器１３４２、リオスフェア１３５４を含む容器１３４４、および／またはリオスフェア１３５６を含む容器１３４６）。
【０１１０】
各容器の中の単一のリオスフェアが図８に示されるが、当業者は、１、または２もしくはこれより多くのリオスフェアが、他の実施形態において各容器の中に存在し得ることを本明細書に基づいて理解する。ある種の実施形態において、２またはこれより多くのカセットは、リオスフェアのセットを含む（例えば、図４Ａおよび４Ｂにおけるカセット２２０、２２２、２２４，および／または２２６のうちの１またはこれより多くは、リオスフェアのセットを含み得る）。いくつかの実施形態において、カートリッジは、貯蔵されたリオスフェアを含む容器の第１のセットを含む第１のカセット、および貯蔵されたリオスフェアを含む容器の第２のセットを含む第２のモジュールを含む。いくつかのこのような実施形態において、その第１のおよび第２のカセットは、（例えば、そのカセットをそのカートリッジ／フレームの中に挿入する前、もしくはその後、および／または貯蔵の間に）互いと流体伝達状態にない。上記で記載されるように、いくつかの実施形態において、貯蔵された試薬（例えば、液体試薬）を含む容器は、その貯蔵された試薬の蒸発を低減もしくは防止するために、および／またはその貯蔵された試薬の汚染を低減もしくは防止するために、密閉される。
【０１１１】
例示的な実施形態において、カートリッジは、容器の第１のセットを含む第１のカセット、容器の第２のセットを含む第２のカセット、その容器の第１のセットの中に含まれる、第１の反応（例えば、第１のＰＣＲ反応）を行うための貯蔵された試薬の第１のセット、およびその容器の第２のセットの中に含まれる、第２の反応（例えば、第２のＰＣＲ反応）を行うための貯蔵された試薬の第２のセットを含む。いくつかのこのような実施形態において、上記で記載されるように、そのカートリッジは、第１のおよび第２の反応が並行して行われることを可能にするように構築かつ配列され得る。ある種の実施形態において、そのカートリッジは、その第１のおよび／または第２の反応の間に、それぞれ、そのチャネルシステムとその第１のおよび第２のカセットのうちの少なくとも一方との間の流体伝達を可能にするように構築かつ配列され得る。以下でより詳細に記載されるように、そのチャネルシステムは、チャネルの第１のおよび第２のセットを含み得る。そのチャネルの第１のセットは、その容器の第１のセットを含む第１のカセットと流体伝達状態にあり得、そのチャネルの第２のセットは、その容器の第２のセットを含む第２のカセットと流体伝達状態にあり得る。そのチャネルの第１のおよび第２のセットは、１またはこれより多くのバルブを介して互いと流体伝達状態にあり得る。いくつかの実施形態において、リオスフェアは、市販の供給源から（例えば、Ｂｉｏｌｙｐｈ  ＬＬＣから）得られる。いくつかの実施形態において、リオスフェアサイズは、０．３ｃｍ〜１ｃｍの直径の範囲にある。
【０１１２】
任意の適切な材料または材料の組み合わせは、そのシステムの構成要素（例えば、モジュール、フレーム、カセット）を形成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、剛性のサーモポリマー（ｔｈｅｒｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）が使用される。そのサーモポリマーは、任意の適切な方法（例えば、射出成形）によって処理され得る。材料の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（スチレン−ｃｏ−アクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリ（ジメチルシロキサン）、ＰＶＣ、ＰＴＦＥ、ＰＥＴ、または２もしくはこれより多くのこのようなポリマーのブレンド）、接着剤、金属（ニッケル、銅、ステンレス鋼、バルク金属ガラス、または他の金属もしくは合金が挙げられる）、またはセラミック（ガラス、石英、シリカ、アルミナ、ジルコニア、炭化タングステン、炭化ケイ素、または非金属材料（例えば、グラファイト、ケイ素など）が挙げられる）。他の材料も可能である。
【０１１３】
そのシステムの構成要素（例えば、モジュール、フレーム、カセット）は、任意の適切な構成を有し得る。いくつかの実施形態において、そのフレームは、少なくとも５インチ、少なくとも６インチ、少なくとも７インチ、少なくとも８インチ、少なくとも９インチ、少なくとも１０インチ、少なくとも１２インチ、または少なくとも２０インチ；および／または２０インチ以下、１５インチ以下、１０インチ以下、または５インチ以下の断面寸法（例えば、幅、高さ）を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。
【０１１４】
本明細書で記載される場合、いくつかの実施形態において、カートリッジは、チャネルシステムを含む。図６Ａ〜６Ｃを再び参照すると、カートリッジ１１００は、フレーム１１１０に隣接しかつ一体でないチャネルシステム１１３０を含む。ある種の実施形態において、そのチャネルシステムは、少なくとも１つの微小流体チャネル（例えば、図６Ａ〜６Ｂにおける流体チャネル１１３５、図６Ｃにおける流体チャネル１１３７および１１３９）を含む。いくつかの場合には、１またはこれより多くの微小流体チャネルは、共通微小流体チャネルであり得る。用語「共通微小流体チャネル（ｃｏｍｍｏｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ）」とは、本明細書で使用される場合、一般に、１またはこれより多くの副次的チャネル（例えば、１またはこれより多くの容器チャネル）と関連する（例えば、その副次的チャネルと流体伝達状態に、これに取り付けられた）微小流体チャネルに言及し、この共通微小流体チャネルにおいて、流体は、共通チャネルからその副次的チャネルへと移動され得る。いくつかの実施形態において、その共通微小流体チャネルは、バルブを介してその副次的チャネルに接続される。例えば、バルブは、共通微小流体チャネルと第１のチャネル（例えば、容器に接続された第１の容器チャネル）との間の流体伝達を可能にし得、そのバルブの切り替えの際に、その共通微小流体チャネルと第２のチャネル（例えば、容器に接続された第２の容器チャネル）との間の流体伝達を可能にし得る。ある種の実施形態において、１またはこれより多くの流体構成要素（例えば、バルブ、接合部）は、その共通微小流体チャネルに、および／または以下でより詳細に記載されるとおりの１より多くの共通微小流体チャネルに、流体接続され得る。本明細書中の記載のうちの大部分は、微小流体チャネルに関するが、当業者は、他の流体導管（例えば、チャネル、導管、キャピラリー）も使用され得ることを本明細書の教示に基づいて理解する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、チャネルシステムは、共通微小流体チャネル、１またはこれより多くのバルブ、および１もしくはこれより多くの容器または容器のセットを含む。いくつかの場合には、各容器は、容器チャネルに接続され得る。例えば、図９に図示されるように、いくつかの実施形態において、チャネルシステム１４００は、共通微小流体チャネル１４１５、第１の容器１４２０および第２の容器１４３０を含む。第１の容器１４２０は、第１の容器チャネル１４２５に接続（例えば、流体接続）され得、第２の容器１４３０は、第２の容器チャネル１４３５に接続され得る。いくつかの実施形態において、そのチャネルシステムは、１つ、２つ、４つ、６つ、８つ、または１０もしくはこれより多くの（および／または２０、１５、１０、５、もしくは４以下の）共通微小流体チャネル、容器の１つ、２つ、４つ、６つ、８つ、または１０もしくはこれより多くの（および／または２０、１５、１０、５、もしくは４以下の）セット、および／または各容器に接続された容器チャネルを含み得る。容器の各セットは、本明細書で記載されるとおりの種々のカセットに位置づけられ得る。ある種の実施形態において、容器の各セットは、１つ、２つ、４つ、６つ、８つ、または１０もしくはこれより多くの（および／または２０、１５、１０、５、もしくは４以下の）容器を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、容器チャネルの第１のセットおよび／または容器チャネルの第２のセットは、少なくとも２つ、４つ、６つ、８つ、もしくは１０の容器チャネルおよび／または２０、１５、１０、もしくは５以下の容器チャネルを含む。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、各共通微小流体チャネルは、バルブを介して容器または容器のセットに接続され得る。すなわち、いくつかの実施形態において、各共通微小流体チャネルおよび／または各容器チャネルは、バルブから延び得る。例えば、図９を再び参照すると、いくつかの実施形態において、共通微小流体チャネル１４１５、第１の容器チャネル１４２５、および第２の容器チャネル１４３５は、バルブ１４１０（例えば、ロータリーバルブ）から延びる。いくつかの実施形態において、１つ、２つ、４つ、６つ、８つ、または１０もしくはこれより多くの容器チャネルおよび１またはこれより多くの副次的チャネル（例えば、チャネル１４５５（例えば、１またはこれより多くのサンプルチャネル、１またはこれより多くの廃棄物チャネル、１またはこれより多くの入り口チャネルなど））は、そのバルブから延び得る。いくつかの実施形態において、そのバルブは、その共通微小流体チャネルおよびその第１の容器チャネル、その共通微小流体チャネルおよびその第２の容器チャネル、またはその第１の容器チャネルおよびその第２の容器チャネルが、互いと流体伝達状態にあるように、作動され（例えば、切り替えられ、回転され）得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、２またはこれより多くの共通微小流体チャネルは、そのバルブから延びる。例えば、図１０に図示されるように、いくつかの実施形態において、チャネルシステム１４０２は、バルブ１４１２、バルブ１４１２に接続された共通微小流体チャネル１４１５および１４１７、ならびに入り口チャネル１４４５を含む。副次的チャネル（例えば、容器チャネル）および／または容器は、共通微小流体チャネルの各々に（直接的にまたは間接的に）接続され得る（示さず）。いくつかのこのような実施形態において、バルブ１４１２は、入り口チャネル１４４５と共通微小流体チャネル１４１５（しかし共通微小流体チャネル１４１７ではない）との間の流体伝達を可能にし得、そのバルブ１４１２を切り替える際に、そのバルブは、入り口チャネル１４４５と共通微小流体チャネル１４１７（しかし共通微小流体チャネル１４１５ではない）との間の流体伝達を可能にし得る。いくつかの実施形態において、共通微小流体チャネル１４１５は、第１のカセット（例えば、容器の第１のセットを含む）に流体接続され、共通微小流体チャネル１４１７は、第２のカセット（例えば、容器の第２のセットを含む）に接続される。よって、その入り口チャネルは、その共通微小流体チャネルを介して、下流の末端において、１またはこれより多くのカセット（または１もしくはこれより多くのカセットの１もしくはこれより多くの容器）に流体接続され得る。別の例では、ユーザーは、カセットを本明細書で記載されるとおりのカートリッジに挿入し得、挿入の際に、そのカセットは、上流において、そしてそのカセットの中に存在する流体が、そのバルブを介して、１またはこれより多くの共通微小流体チャネルへと方向付けられ得るように、その入り口チャネルと流体伝達状態になる。
【０１１８】
実施形態のうちの１セットにおいて、図１１に図示されるように、チャネルシステム１４０４は、チャネルの第１のセット１４０６およびチャネルの第２のセット１４０８を含む。そのチャネルの第１のセットは、反応の第１のセット（例えば、第１のＰＣＲ反応）を行うために使用され得、そのチャネルの第２のセットは、反応の第２のセット（例えば、第２のＰＣＲ反応）を行うために使用され得る。そのチャネルの第１のセット１４０６は、容器の第１のセット１４４０に接続された容器チャネルの第１のセット１４２２を含み得る；そしてそのチャネルの第２のセット１４０８は、容器の第２のセット１４４２に接続された容器チャネルの第２のセット１４２７を含み得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、容器の第１のセット１４４０は、複数の容器（およびその容器に接続された容器チャネル）を含み、各容器チャネルは、バルブ１４１０から延びる。バルブ１４１０は、共通微小流体チャネル１４１５に接続され得、このチャネルは、チャネルシステム１４０６に試薬／流体を導入する、および／またはチャネルシステム１４０６から試薬／流体を除去するために使用され得る。ある種の実施形態において、容器の第２のセット１４４２は、複数の容器（およびその容器に接続された容器チャネル）を含み、各容器は、バルブ１４１４から延びる。バルブ１４１４は、共通微小流体チャネル１４１７に接続され得、このチャネルは、チャネルシステム１４０８に試薬／流体を導入する、および／またはチャネルシステム１４０８から試薬／流体を除去するために使用され得る。
【０１２０】
本明細書で記載される場合、その容器は、挿入されるカセットの一部であり得るか、またはそうでなければカートリッジの一部であり得る。例えば、実施形態のうちの１セットにおいて、図１１に示される容器の第１のセット１４４０（例えば、容器１４２０および１４３０）は、図６Ｃに示されるとおりのカセット１１２２の一部であり得、容器の第２のセット１４４２は、図６Ｃに示されるとおりのカセット１１２４の一部であり得る。チャネルシステム１１３０（図６Ｃ）は、図１１のチャネルシステム１４０４を含み得る。例えば、チャネル１１３９（図６Ｃ）は、容器チャネル１４２２（図１１）のうちの１つであり得、チャネル１１３７（図６Ｃ）は、容器チャネル１４２７（図１１）のうちの１つであり得る。他の構成も可能である。
【０１２１】
チャネルおよびバルブの種々の構成が、本明細書で記載されるチャネルシステムにおいて可能であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、チャネルシステムは、バルブ１４１２、ならびにバルブ１４１２から延びる共通微小流体チャネル１４１５および１４１７を含む。図１１に図示されるように、その容器チャネルの第１のおよび第２のセットは、少なくとも１つのバルブによって、および／または少なくとも１つの共通微小流体チャネルによって、互いから分離され得る。すなわち、いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの共通微小流体チャネルは、容器チャネルの第１のセットと容器チャネルの第２のセットとの間に位置づけられ得る。ある種の実施形態において、共通微小流体チャネルは、第１のバルブと第２のバルブとの間に位置づけられ得る。例えば、共通微小流体チャネル１４１５は、図１１に、バルブ１４１２とバルブ１４１０との間に位置づけられるとして図示される。ある種の実施形態において、共通微小流体チャネル１４１７は、バルブ１４１２とバルブ１４１４との間に位置づけられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、そのチャネルシステムは、１またはこれより多くの反応（例えば、第１のＰＣＲ反応、第２のＰＣＲ反応など）を行うための１またはこれより多くのチャネル（またはチャネルのセット）を含む。例えば、図１１を再び参照すると、いくつかの実施形態において、その容器の第１のセット１４４０に接続された容器チャネルの第１のセット１４２２を含むそのチャネルの第１のセット１４０６は、第１の反応を行うために構成され、その容器の第２のセット１４４２に接続された容器チャネルの第２のセット１４２７を含むそのチャネルの第２のセット１４０８は、第２の反応を行うために構成される。その第１のおよび第２の反応は、並行して、または連続して行われ得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、そのチャネルシステムは、副次的チャネル（例えば、廃棄物容器に接続された廃棄物チャネル、サンプルウェルに接続されたサンプル入り口チャネル、および／または出力ウェルに接続された出力チャネル）を含む。図１１を再び参照すると、いくつかの実施形態において、バルブ１４１０は、サンプル入り口チャネル１４５５、出力チャネル１４６０、および／または廃棄物チャネル１４６２に接続され得る。そのサンプル入り口チャネルは、１またはこれより多くのサンプルウェルに（例えば、サンプルカセット１４９０の一部として、サンプル入り口チャネル１４５５と流体伝達状態にある）接続され得る。その出力チャネルは、１またはこれより多くの出力ウェルに（例えば、出力カセット１４９５の一部として、出力チャネル１４６０と流体伝達状態にある）に接続され得る。その廃棄物チャネルは、１またはこれより多くの廃棄物ウェル（例えば、廃棄物カセットの一部として（示さず））に接続され得る。ある種の実施形態において、バルブ１４１４は、サンプル入り口チャネル１４５７、出力チャネル１４６５、および／または廃棄物チャネル１４６７に接続され得る。そのサンプル入り口チャネルは、１またはこれより多くのサンプルウェル（例えば、サンプルカセットの一部として（示さず））に接続され得る。その出力チャネルは、１またはこれより多くの出力ウェル（例えば、その出力カセットの一部として（示さず））に接続され得る。その廃棄物チャネルは、１またはこれより多くの廃棄物ウェル（例えば、廃棄物カセットの一部として（示さず））に接続され得る。ある種の実施形態において、バルブ１４１２は、１またはこれより多くの流体／試薬をそのチャネルシステムに移動し得る１またはこれより多くの流体入り口チャネル（例えば、流体入り口チャネル１４４５および１４４７）に接続される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、そのチャネルシステムの１またはこれより多くのバルブは、ロータリーバルブである。ある種の実施形態において、そのチャネルシステムの１またはこれより多くのバルブは、その共通微小流体チャネルと別のチャネルとの間の流体の流れを促進するように構成された高くした特徴を含む。いくつかの場合には、そのチャネルシステムの１またはこれより多くのバルブは、密閉物を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、そのバルブは、その共通微小流体チャネルおよび１つの副次的チャネルと流体伝達状態にあるように構築かつ配列される。例えば、そのバルブは、その共通微小流体チャネルがそのバルブを始動する際に所望のチャネルと流体伝達状態にあり得るように始動され得る。
【０１２６】
概して、本明細書で記載されるチャネルシステムまたはその一部は、流体の方向および／または体積を制御するために使用され得る。本明細書で記載される方法は、例えば、制御された体積で、２もしくはこれより多くの試薬および／または流体を混合および／または反応させるために有用であり得る。いくつかの場合には、少なくとも１つの容器は、その中に試薬（例えば、貯蔵された試薬）を含み得る。２またはこれより多くの容器は、所望の反応に依存して種々の試薬（例えば、第１の反応を行うための第１の試薬および第２の反応を行うための第２の試薬）を含み得る。その２またはこれより多くの容器は、流体がその容器の各々の間で移動され得るように、そのチャネルシステムと流体伝達状態にあり得る。いくつかの実施形態において、混合および／または反応の順序は、制御され得る（例えば、流体の流れを制御するおよび／または交替させることによって）。
【０１２７】
いくつかの場合には、その第１の容器に移動される流体のうちの少なくとも一部は、その第１の容器の中に存在する第１の貯蔵された試薬に曝され得る（例えば、その試薬と反応され得る）。いくつかの実施形態において、その得られた流体（例えば、その反応した流体）は、第１の容器から第２の容器へと移動され得る。ある種の実施形態において、その第２の容器に入った際に、その流体は、その第２の試薬に曝される（例えば、その試薬と反応される）。いくつかの実施形態において、その流体の中に存在するサンプルおよび／または反応物は、その第１の試薬および／またはその第２の試薬と反応する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、容器間のその流体の移動は、（例えば、その共通微小流体チャネルと１またはこれより多くの容器チャネルとの間に配置されたバルブを始動することによって）制御され得る。例えば、ある種の実施形態において、その共通微小流体チャネルは、その流体の移動（例えば、その流体の流れの方向）を促進するために利用され得る。いくつかのこのような実施形態において、その反応した（例えば、その第１の貯蔵された試薬と反応した後の）流体のうちの少なくとも一部は、その第１の容器からその共通微小流体チャネルへと移動され得、その後、その流体のうちの一部がその第２の容器の中に存在する第２の貯蔵された試薬と反応し得るように、その第２の容器へと移動され得る。いくつかの実施形態において、一連の反応（例えば、ＰＣＲ反応工程）は、その共通微小流体チャネルと２またはこれより多くの容器との間で流体を流すことによって連続して行われ得る。いくつかのこのような実施形態において、そのバルブは、そのサンプル入り口チャネル、その第１の容器、および／またはその第２の容器の間の流体のうちの少なくとも一部の移動／流れを促進するために、その共通微小流体チャネルが、そのサンプル入り口チャネル、その第１の容器チャネル、またはその第２の容器チャネルと流体伝達状態にあるように始動され得る。このプロセスは、図１２〜２１に図示され、これらは一般的に、種々の流体の流れの構成においてチャネルシステム１４００を示す。
【０１２９】
例えば、いくつかの実施形態において、図１２に図示されるように、流体１４７０Ａ（例えば、サンプル）は、そのチャネルシステムへと、サンプル入り口チャネル１４５５（例えば、サンプルカセット１４９０に接続されかつこれと流体伝達状態にある）を介して導入され得る。その流体は、図１２において矢印によって示される方向に流され得る。いくつかの場合には、流体１４７０Ａは、ユーザーによって、サンプル入り口チャネル１４５５に接続されたサンプルウェルへと提供または導入され得る。その流体は、その流体をサンプル入り口チャネル１４５５からバルブ１４１０（共通微小流体チャネルと容器のセットとの間に位置づけられ、その共通微小流体チャネルおよびそのサンプル入り口チャネルが互いと流体伝達状態にあるように始動される）を通って流すことによって、共通微小流体チャネル１４１５に移動され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、図１３に図示されるように、共通微小流体チャネル１４５５の中に存在する流体のうちの少なくとも一部は、バルブ１４１０を通って、第１の容器チャネル１４２５を介して第１の容器１４２０へと移動され（例えば、流され）得る。第１の容器１４２０は、第１の反応（例えば、ＰＣＲ反応の第１の部分、化学的および／または生物学的反応）を収容または行うために構築かつ配列され得る。いくつかのこのような実施形態において、バルブ１４１０は、その共通微小流体チャネル１４５５および第１の容器チャネル１４２５が、流体１４７０Ａの第１の容器１４２０への移動を可能にするために互いと流体伝達状態にあるように始動され得る（図１３）。いくつかの実施形態において、第１の反応は、第１の容器１４２０の中で（例えば、サンプル構成要素とその第１の容器内に位置づけられた第１の試薬との間で）起こり得る。その第１の反応がその第１の容器の中で起こった後に、その反応生成物は、その第１の容器チャネルに戻り、その後、そのバルブを介して共通微小流体チャネルへと移動され得る。例えば、いくつかの実施形態において、図１４に図示されるように、流体１４７０Ｂ（例えば、その流体は、いまやその反応生成物を含む）は、共通微小流体チャネル１４１５へと容器１４２０から移動され得る。いくつかの実施形態において、その流体は、特定の方向に流され得る。例えば、いくつかの場合には、その流体は、第１の方向（例えば、図１３における矢印によって示されるとおりのバルブに向かうその微小流体チャネル（例えば、共通微小流体チャネル）における第１の方向）に流され得る。ある種の実施形態において、その流体は、その第１の方向とは反対の第２の方向（例えば、そのバルブから離れるその微小流体チャネルにおける（例えば、共通微小流体チャネルにおける）第２の方向）に流され得る。いくつかの実施形態において、その流体を（例えば、そのバルブを始動する前後に）反対の方向に流すと、その共通微小流体チャネルと２またはこれより多くの容器チャネルとの間のその流体の移動が促進される。
【０１３１】
ある種の実施形態において、その反応生成物（例えば、図１５において反応生成物を含む流体１４７０Ｂ）は、その第２の容器チャネルを介してその第２の容器に移動され得る。その第２の容器は、例えば、その第１の反応とは独立した第２の反応（例えば、ＰＣＲ反応の第２の部分）を行うために構築かつ配列され得る。図１５に図示されるように、いくつかのこのような実施形態において、バルブ１４１５は、共通微小流体チャネル１４１５および第２の容器チャネル１４３５が互いと流体伝達状態にあるように始動され得、そして流体１４７０Ｂは、共通微小流体チャネル１４１５からバルブ１４１５を介して第２の容器１４３０へと、そして第２の容器チャネル１４３５へと移動され得る（図１６）。ある種の実施形態において、第２の反応は、第２の容器１４３０の中で（例えば、サンプル構成要素とその第２の容器内に位置づけられた第２の試薬との間で）起こり得る。その第２の反応の後に、その反応生成物（例えば、流体１４７０Ｃの中に存在する）は、第２の容器１４３０から第２の容器チャネル１４３５へと、そしてバルブ１４１０を介して共通微小流体チャネル１４１５へと戻り、移動され得る。その同じプロセスが、種々の反応（例えば、連続的な反応）を行うために種々の容器へと流体を移動するために使用され得る。有利なことには、多くの反応および混合工程は、本明細書で記載されるとおりの共通微小流体チャネルおよび容器のセットの使用を通じて促進され得る。
【０１３２】
流体は、任意の適切な時間量にわたって（例えば、３０分まで、１時間まで、２時間まで、３時間まで、４時間まで、５時間まで、６時間までまたはこれより長く）１またはこれより多くの容器および／またはその共通微小流体チャネルの中に残り得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、その流体のうちの少なくとも一部（例えば、反応の反応生成物、または２もしくはこれより多くの連続的な反応の反応生成物）は、出力チャネル（例えば、収集および／または分析のために）および／または廃棄物チャネルに移動され得る。例えば、いくつかの実施形態において、その流体のうちの少なくとも一部は、その共通微小流体チャネルに移動され得、その後、その出力チャネル（例えば、１またはこれより多くの出力ウェルに接続された出力チャネル）に移動され得る。いくつかの実施形態において、その共通微小流体チャネルの中に存在する流体のうちの少なくとも一部は、その出力チャネルまたは廃棄物チャネル（例えば、廃棄物カセットに接続された廃棄物チャネル）へと移動され得る。ある種の実施形態において、その共通微小流体チャネルの中に残っている流体のうちの実質的にすべてが、その出力チャネルおよび／またはその廃棄物チャネルへと移動される。ある種の実施形態において、その第１のおよび／または第２の容器へと移動されないその共通微小流体チャネルの中に存在する流体のうちの少なくとも一部は、廃棄物チャネルへと流され得る。
【０１３４】
ある種の実施形態において、混合および／または反応される流体の量（例えば、体積）は、制御され得る。いくつかの場合には、流体の特定の体積を容器に（例えば、反応物および／またはサンプルとの制御された反応を促進するために）添加することは、望ましいことであり得る。いくつかの実施形態において、その流体の特定の体積は、容器および／またはその共通微小流体チャネル内で単離され得る。有利なことには、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、容器および／またはチャネルへと既知の／所定の体積の流体の移動を促進し得る。例えば、少なくとも１マイクロリットル、少なくとも２マイクロリットル、少なくとも５マイクロリットル、または少なくとも１０マイクロリットルは、その第１の容器とその共通微小流体チャネルとの間で移動され得る。有利なことには、反応物および／またはサンプルの望ましい体積は、１またはこれより多くの流体と、本明細書で記載される方法を介して、特定の反応工程が正確に行われ得るように、反応され得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、第２の流体（例えば、その第１の流体と非混和性の流体）は、その共通微小流体チャネルと１またはこれより多くの容器チャネルとの間の第１の流体の特定の体積を方向付ける（例えば、押し出す）ために利用され得る。例示的な実施形態において、図１７に示されるように、（第１の）流体１４７０は、共通微小流体チャネル１４１５内に配置される。流体１４７０のうちの少なくとも一部は、第１の容器チャネル１４２５および共通微小流体チャネル１４１５が流体伝達状態にあるように、そのバルブ１４１０を始動することによって第１の容器１４２０へと移動され得る。図１８に示されるように、流体１４７０のうちの少なくとも一部は、第１の容器チャネル１４２５のうちの少なくとも一部へと移動され得る。いくつかのこのような実施形態において、第１の容器チャネル１４２５のうちの少なくとも一部へと移動された流体１４７０の一部の体積は、選択され得る。例えば、共通微小流体チャネル１４１５と流体伝達状態にあるポンプ（例えば、シリンジポンプ）は、流体１４７０の既知の体積が第１の容器チャネル１４２５内に配置されるように始動され得る。図１１を再び参照すると、ある種の実施形態において、そのポンプは、入り口チャネル１４４７に流体接続され得、バルブ１４１２は、入り口チャネル１４４７および共通微小流体チャネル１４１５が流体伝達状態にあるように始動され得る。
【０１３６】
図１８を再び参照すると、第２の流体１４８０は、サンプル入り口チャネル１４５５に提供され得る。図１９に示されるように、第２の流体１４８０は、サンプル入り口チャネル１４５５および共通微小流体チャネル１４１５が流体伝達状態にあるようにバルブ１４１０を始動することによって、共通微小流体チャネルに移動され得る（例えば、流体１４７０をさらにその共通微小流体チャネルへと効果的に置き換える）。第２の流体１４８０は、第１の方向（図１９において矢印によって示されるとおり）に流され得る。いくつかの実施形態において、この第２の流体は、その第１の流体１４７０を少なくとも部分（例えば、図１９に図示されるとおりの部分１４７０Ａおよび１４７０Ｂ）へと分割し得る。その流体部分は、少なくともその第２の流体（これは、場合によっては、その第１の流体と非混和性であり得る）によって分離される流体プラグ（例えば、第１の流体プラグおよび第２の流体プラグ）の形態にあり得る。
【０１３７】
ここで図２０を参照すると、バルブ１４１０は、共通微小流体チャネル１４１５および第１の容器チャネル１４２５が流体伝達状態にあるように始動され得る。第２の流体１４８０のうちの少なくとも一部は、流体１４７０Ａが置き換えられるように、第１の容器チャネル１４２５に向かって移動され得る（図２０の矢印によって示されるとおりのその第１の方向とは反対の第２の方向に流され得る）。いくつかのこのような実施形態において、流体１４７０Ａの所望の体積が、第２の流体１４８０によって第１の容器１４２０へと移動される（例えば、図２１に示されるとおり）。いくつかの実施形態において、その第２の流体のうちの少なくとも一部はまた、その第１の容器へと導入される。しかし、他の実施形態において、本質的にはその第２の流体のいずれも、その容器へと導入されない。
【０１３８】
上記の説明のうちの大部分は、その共通微小流体チャネルとその第１の容器チャネルとの間の流体の所望の体積を移動させることに関するが、当業者は、一連の工程（例えば、上記で記載されるもの）が、その共通微小流体チャネルと１もしくはこれより多くの容器、１もしくはこれより多くの容器チャネル、１もしくはこれより多くの出力チャネル、および／または１もしくはこれより多くの廃棄物チャネルとの間の流体の所望の体積の移動を促進するために利用され得ることを、本明細書の教示に基づいて理解する。例えば、いくつかの実施形態において、その第１の容器に移動された流体の第１の体積、およびその第２の容器に移動された、その第１の体積とは異なる流体の第２の体積を有することは、望ましいことであり得る。いくつかのこのような実施形態において、上記で記載される工程は、流体体積のこのような移動を促進するために利用され得る。
【０１３９】
いくつかの場合には、上記の第２の流体は、その第１の流体（例えば、水性流体）と非混和性である（例えば、その第２の流体は、空気である）。いくつかの実施形態において、その第２の流体は、その第１の流体を特定の方向（例えば、その共通微小流体チャネルにおける方向）に、および／またはチャネルもしくは他の構成要素（例えば、その共通微小流体チャネル、容器チャネル、出力チャネル、廃棄物チャネル）へと押し出すために使用され得る。ある種の実施形態において、その第２の流体は、流体を別個に（例えば、流体プラグとして）維持するために使用され得る。例えば、いくつかの場合には、その第２の流体は、チャネルの中に存在し、２つの流体部分（例えば、第１の流体および第３の流体）の間に配置され得る。いくつかのこのような実施形態において、その第１の流体およびその第３の流体は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【０１４０】
上記のように、その第２の流体は、いくつかの実施形態において、その第１の流体の制御された体積の流れを促進する。いくつかの実施形態において、その制御された体積は、少なくとも約５μＬ（例えば、少なくとも約１０μＬ、少なくとも約２０μＬ、少なくとも約３０μＬ、少なくとも約４０μＬ、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約８０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約２００μＬ）および／または５００μＬ以下（例えば、４００μＬ以下、３００μＬ以下、２００μＬ以下、１００μＬ以下、８０μＬ以下、６０μＬ以下、４０μＬ以下、２０μＬ以下、１０μＬ以下、５μＬ以下、２μＬ以下）の体積を有する。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である。他の体積も可能である。
【０１４１】
一般に、１またはこれより多くの容器チャネルおよびその共通微小流体チャネルの内部体積は既知であり得、そして特定の体積の流体を分割するために使用され得る。例えば、いくつかのこのような実施形態において、流体が配置される特定のチャネルの寸法（例えば、長さ、断面寸法）は、そのチャネル内に配置される流体の体積を決定するために利用され得る。例証となる例として、特定の実施形態において、その第１の容器チャネルは、２マイクロリットルの内部体積を有し得る。このような実施形態において、１マイクロリットルの流体がその第１の容器に添加されることが所望される場合、圧力は、その流体がその第１の容器チャネルへと中間点で配置されるように、その共通微小流体チャネル（その第１の容器チャネルと流体伝達状態にある）に適用され得る。そのバルブは、上記のように始動され得、そして第２の流体（例えば、空気のようなその第１の流体と非混和性の流体）は、その共通微小流体チャネルへと導入され得、その第１の流体のうちの１μＬがその第２の流体によって置き換えられ、その第１の容器へと移動されるように、その第１の容器チャネルへと再度方向付けられ得る。いくつかのこのような実施形態において、その第２の流体のうちの少なくとも一部は、その第１の容器へと移動され得る。しかし、ある種の実施形態において、実質的にその第２の流体はいずれも、その第１の容器へと移動されない（例えば、第１の流体がその第１の容器に移動されるが、実質的にはその第２の流体のいずれもその第１の容器に移動されないように、圧力がその共通微小流体チャネルに適用される）。
【０１４２】
流体は、微小流体チャネル（例えば、共通微小流体チャネル、容器チャネル、など）、容器、またはカセットへと、任意の適切な構成要素（例えば、ポンプ、シリンジ、加圧式容器、または任意の他の圧力源）を使用して、移動され（例えば、輸送し、流され、置き換えられ）得る。あるいは、流体は、真空または減圧をそのチャネルまたはデバイスの下流の側に適用することによって、その微小流体チャネル、容器、またはカセットへと引っ張られ得る。真空は、そのチャネルまたはデバイスの上流に存在するより低い圧力条件を提供し得る任意の供給源によって提供され得る。このような供給源としては、真空ポンプ、ベンチュリ、シリンジおよび空気を抜いた容器が挙げられ得る。しかし、ある種の実施形態において、本明細書で記載される方法が、キャピラリーの流れ、バルブの使用、または圧力および／もしくは流速を変動させる他の外部制御を使用することによって、その微小流体デバイスの入り口および出口にわたって変化する圧力低下とともに行われ得ることは、理解されるである。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、その流体（例えば、その第１の流体、その第２の流体）またはその流体のうちの少なくとも一部を流すことは、第１の流体のうちの少なくとも一部がその容器チャネルに入るように、圧力をその共通微小流体チャネルに適用することを包含する。ある種の実施形態において、その流体を流すことは、第１の流体のうちの少なくとも一部がその容器チャネルから（またはその容器チャネルへと）その容器へと（またはその容器から）移動されるように、圧力をその共通微小流体チャネルに適用することを包含する。いくつかの実施形態において、その圧力は陽圧である。ある種の実施形態において、その圧力は、陰圧または減圧である。ある種の実施形態において、その容器チャネルおよび／またはその容器経路に接続された容器に存在するその流体の体積は、その共通微小流体チャネルに適用される圧力によって制御される。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、上記のように、そのバルブは、種々のチャネルの間の（例えば、その第１の容器チャネルとその共通微小流体チャネルとの間の、その第１の容器チャネルとその廃棄物チャネルとの間の、そのサンプル入り口とその微小流体チャネルとの間の、など）その流体からの移動を方向付け得る。いくつかの実施形態において、その流体（例えば、その第１の流体、その第２の流体）のうちの少なくとも一部を流すことは、その共通微小流体チャネルがその容器チャネル（例えば、その第１の容器チャネル、その第２の容器チャネル）と流体伝達状態にあるように、バルブ／そのバルブを始動することを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、その第１の流体は、液体サンプル、試薬、水、緩衝剤などであり得る。ある種の実施形態において、その第２の流体は、液体サンプル、試薬、水、緩衝剤などであり得る。いくつかの場合には、その第２の流体は、その第１の流体と非混和性であり得る。いくつかのこのような実施形態において、その第２の流体は、ガス（例えば、空気、窒素）であり得る。いくつかの実施形態において、流体は、以下から選択され得る：ミネラルオイル、シリコーンオイル、エタノール、トリス、水、ＰＥＧ溶液、発蛍光団、フルオロカーボンまたはフルオロシリコンベースの化合物、例えば、ペルフルオロ。
【０１４６】
ある種の実施形態において、そのチャネルシステムのうちの１またはこれより多くのチャネルは、特定の平均断面寸法を有する。そのチャネルの「断面寸法」（例えば、直径）は、流体の流れの方向に対して垂直に測定される。いくつかの実施形態において、そのチャネルの平均または最大の断面寸法は、約２ｍｍ以下、約１ｍｍ以下、約８００ミクロン以下、約６００ミクロン以下、約５００ミクロン以下、約４００ミクロン以下、または約３００ミクロン以下である。ある種の実施形態において、そのチャネルの平均または最大の断面寸法は、約５０ミクロン以上、約１００ミクロン以上、約１５０ミクロン以上、約２００ミクロン以上、約２５０ミクロン以上、約３００ミクロン以上、約４００ミクロン以上、約５００ミクロン以上、約６００ミクロン以上、約８００ミクロン以上、または約１ｍｍ以上である。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、約２５０ミクロン〜約２ｍｍの間、約４００ミクロン〜約１ｍｍの間、約３００ミクロン〜約６００ミクロンの間）。他の範囲も可能である。いくつかの場合には、１つより多くのチャネルまたはキャピラリーが使用され得る。「微小流体チャネル」とは、１ｍｍ未満の平均断面寸法を有するチャネルをいう。
【０１４７】
そのチャネルシステムの１またはこれより多くの微小流体チャネルは、任意の適切な内部体積を有し得る。いくつかの実施形態において、そのチャネル（例えば、微小流体チャネル、共通チャネル、容器チャネル）の内部体積は、少なくとも０．１マイクロリットル、少なくとも０．５マイクロリットル、少なくとも１マイクロリットル、少なくとも２マイクロリットル、少なくとも５マイクロリットル、少なくとも７マイクロリットル、少なくとも１０マイクロリットル、少なくとも１２マイクロリットル、少なくとも１５マイクロリットル、少なくとも２０マイクロリットル、少なくとも３０マイクロリットル、または少なくとも５０マイクロリットルであり得る。ある種の実施形態において、その微小流体チャネルの内部体積は、２００マイクロリットル以下、１５０マイクロリットル以下、１００マイクロリットル以下、８０マイクロリットル以下、７０マイクロリットル以下、５０マイクロリットル以下、２５マイクロリットル以下、１０マイクロリットル以下、または５マイクロリットル以下であり得る。上記で参照した範囲の組み合わせも可能である（例えば、１マイクロリットル〜１０マイクロリットルの間）。他の範囲も可能である。いくつかの実施形態において、その第１の容器チャネルの内部体積は、その第２の容器チャネルの内部体積より小さい。
【０１４８】
そのチャネルシステムの１またはこれより多くのチャネル（例えば、微小流体チャネル）は、任意の適切な断面形状（円形、卵形、三角形、不規則、不等辺四角形、四角形または矩形など）を有し得る。微小流体チャネルはまた、少なくとも２：１、より代表的には少なくとも３：１、５：１、もしくは１０：１またはこれより大きなアスペクト比（平均断面寸法に対する長さ）を有し得る。そのチャネル内の流体（例えば、サンプル）は、そのチャネルを部分的にまたは完全に満たし得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、その１またはこれより多くのチャネル（例えば、微小流体チャネル）は、特定の構成を有し得る。ある種の実施形態において、１またはこれより多くの微小流体チャネルのうちの少なくとも一部は、流体の流れの方向において実質的に直線状であり得る。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの微小流体チャネルのうちの実質的に全てが、流体の流れの方向において実質的に直線状であり得る。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの微小流体チャネル（例えば、共通微小流体チャネル）のうちの少なくとも一部は、弯曲していてもよいし、曲がっていてもよいし、蛇行していてもよいし、千鳥状であってもよいし、ジグザグ状であってもよいし、らせん状であってもよいし、これらの組み合わせであってもよい。有利なことには、非直線状の微小流体チャネル（例えば、蛇行共通チャネル）の使用は、直線状の微小流体チャネルと比較して、流体の流れの平均方向において測定されるカートリッジの単位長あたりのチャネルの体積の増大した保持を可能にする。
【０１５０】
本明細書で記載されるチャネルシステムまたはその一部（例えば、バルブ、微小流体チャネル）は、任意の適切な材料から製作され得る。材料の非限定的な例としては、ポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（スチレン−ｃｏ−アクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリ（ジメチルシロキサン）、ＰＶＣ、ＰＴＦＥ、ＰＥＴ、または２もしくはこれより多くのこのようなポリマーのブレンド）、接着剤、または金属（ニッケル、銅、ステンレス鋼、バルク金属ガラス、または他の金属もしくは合金が挙げられる）、あるいはセラミック（ガラス、石英、シリカ、アルミナ、ジルコニア、炭化タングステン、炭化ケイ素、または非金属材料（例えば、グラファイト、ケイ素など）が挙げられる）が挙げられる。いくつかの実施形態において、感圧性接着剤（例えば、アクリル樹脂およびシリコーン接着剤）が使用される。場合によっては、熱硬化性接着剤がまた、使用され得る。ある種の実施形態において、そのチャネルは、そのチャネルを基材へと射出成形し、そしてその基材を頂部樹脂層でキャップ形成することによって作られ得、その頂部樹脂層は、感圧性接着剤、熱硬化性接着剤、レーザー溶接、超音波ボンディング、またはそのキャップ形成層をそのチャネル付近の基材へと密閉し、密閉物を形成する任意の他のボンディング法によって固定される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、そのチャネルシステムまたはその一部は、複数の層（例えば、交互になっているポリマー層および接着剤層）によって形成され、これらの層は、その中に微小流体チャネルを形成する。例示的な実施形態において、図２２〜２３に示されるように、カセット１６００は、容器のセット（例えば、容器１６２０および容器１６２２）およびチャネルシステム１６１０を含み、そのチャネルシステムは、複数の交互になっているポリマー層および接着剤層をアセンブリすることによって製作され、各層は、アセンブリされる場合に複数のチャネルを形成するパターンを含む。カートリッジ１６００は、フレーム１６３０を含み得、カセット１６４０および１６４５は、そのフレーム内の開口部へと挿入され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジ１６００は、チャネルシステム１６１０の共通微小流体チャネルと流体伝達状態にあるように構築かつ配列された１またはこれより多くのバルブ（例えば、バルブ１６５０）を含む。実施形態のうちの１セットにおいて、そのアセンブリは、感圧性接着剤層およびポリエステル樹脂層の交互になっている層を含む。例えば、図２３に関する場合によっては、濃い方の層が接着剤層であり、明るい方の層が樹脂である。その感圧性接着剤は、プレスの中でそれら層を一緒に圧縮し、結合が起こる数秒間待機することによって硬化され得る。熱硬化性接着剤が使用される場合、熱および圧力は、その接着剤を硬化させるために使用され得る。いくつかの実施形態において、その複数の層は、図２４に示される層１〜１０に示されるとおりである。
【０１５２】
微小流体チャネルを形成するための他の方法は、当該分野で公知であり、例えば、微細加工、成形、鋳造、化学エッチング、フォトリソグラフィー、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１５３】
増幅（ＡＭＰ）方法
本明細書で記載されるのは、既知の標的ヌクレオチド配列に連続したヌクレオチド配列を決定するための方法である。その方法は、本明細書で開示されるシステムを使用して自動化様式で実行され得る。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に（例えば、「ショットガン（ｓｈｏｔｇｕｎ）」シーケンシング）、またはプライマーをデザインするために使用される２つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの１つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する（例えば、シーケンシングする）ことを可能にする。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、例えば、自動化様式で、次世代シーケンシング技術を使用して特定のヌクレオチド配列を決定する前に、その特定のヌクレオチド配列を富化するための方法を実行するように構成され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むサンプルを富化することに関し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸を、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｂ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を、第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｃ）工程（ｂ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｄ）そのＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジの中の微小流体チャネルおよびバルブは、反応物質／流体をカートリッジの中で１つの容器から別の容器へと移動させることを促進して、自動化様式で反応を進めることを可能にする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ溶液は、次世代シーケンシング技術を使用して、第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでその後シーケンシングされ得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムを使用して処理されるサンプルは、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡを含むサンプルは、工程（ａ）の前にフラグメント化工程を包含する。いくつかの実施形態において、各ライゲーションおよび増幅工程は、必要に応じて、その後の精製工程（例えば、工程（ａ）と工程（ｂ）との間にサンプル精製、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間にサンプル精製、ならびに／または工程（ｃ）の後にサンプル精製）を含み得る。例えば、ゲノムＤＮＡを含むサンプルを富化するための方法は、（ａ）ゲノムＤＮＡのフラグメント化；（ｂ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸をユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｃ）ライゲーション後のサンプル精製；（ｄ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｅ）増幅後のサンプル精製；（ｆ）工程（ｄ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｇ）増幅後のサンプル精製；ならびに（ｈ）その精製されたＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、その方法の工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジの中の微小流体チャネルおよびバルブは、反応物質／流体を、カートリッジの中で１つの容器から別の容器へと自動化様式で移動させることを促進する。その精製されたサンプルは、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでその後シーケンシングされ得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、図１の例示的なワークフローに示されるように、核酸を処理するために使用され得る。核酸サンプル１２０が提供される。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、ＤＮＡ（例えば、２本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）および／または２本鎖のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）１０２）を含む。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、核酸末端修復および／またはｄＡテール付加を含む工程１０２に供される。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、アダプターライゲーションを含む工程１０４に供される。いくつかの実施形態において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプター１２２は、その核酸サンプル中の１つまたはこれより多くの核酸にライゲーションされる。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、平滑末端ライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、付着末端ライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、オーバーハングライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、ＴＡライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのｄＡテール付加工程１０２は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプターにおけるオーバーハングに相補的な核酸サンプル中のオーバーハングを生成するために行われる（例えば、ＴＡライゲーション）。いくつかの実施形態において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプターは、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプターが隣接する核酸１２４を生成するために、その核酸サンプルにおいて１つまたはこれより多くの核酸の両末端にライゲーションされる。いくつかの実施形態において、最初の増幅ラウンドは、アダプタープライマー１３０および第１の標的特異的プライマー１３２を使用して行われる。いくつかの実施形態において、その増幅されたサンプルは、アダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマー１３４を使用して第２の増幅ラウンドに供される。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、バーコード、インデックス、アダプター配列、またはシーケンシングプライマー部位を含み得るハイブリダイゼーション配列（例えば、共通配列）に対して５’側にさらなる配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、その第２の標的特異的プライマー（１３４によって示されるとおり）の共通配列とハイブリダイズするさらなるプライマーによってさらに接触される。いくつかの実施形態において、第２の増幅ラウンドは、核酸シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング法）に適切な核酸１２６を生成する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２４（これは、２０１７年９月１５日に出願され、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３３９号の優先権を主張する）およびＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２７（これは、２０１７年９月１５日に出願され、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３４７号の優先権を主張する）（核酸ライブラリー調製に関するこれらの各々の内容全体は、参考として援用される）に記載されるように、核酸を処理するために使用され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムを使用して処理されるサンプルは、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、以下を包含する方法によってＲＮＡを処理するために有用であり得る：（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子と、ランダムプライマーの集団とを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズしたランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物と最初の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供する工程；（ｆ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸をユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｇ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を、第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｈ）工程（ｇ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｉ）ｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ溶液は、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンスされ得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、各ライゲーションおよび増幅工程は、必要に応じて、その後のサンプル精製工程（例えば、工程（ｆ）と工程（ｇ）との間にサンプル精製工程、工程（ｇ）と工程（ｈ）との間にサンプル精製工程、および／または工程（ｈ）の後にサンプル精製）を含み得る。例えば、ＲＮＡを含むサンプルを富化するための方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子とランダムプライマーの集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズしたランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物と最初の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供する工程；（ｆ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸をユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｇ）ライゲーション後のサンプル精製；（ｈ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｉ）増幅後のサンプル精製；（ｊ）工程（ｈ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｋ）増幅後のサンプル精製；ならびに（ｌ）その精製されたｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。その精製されたサンプルは、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンスされ得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、例えば、自動化様式で、未知のヌクレオチド配列の隣接領域から下流に既知の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（例えば、未知の配列を含む５’領域および既知の配列を含む３’領域を含むヌクレオチド配列）を富化するための方法を実行するように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、以下の工程を包含する：（ａ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子と最初の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物とテール付加ランダムプライマーの集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズしたテール付加ランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その標的核酸分子の一部およびそのテール付加ランダムプライマー配列を第１のテールプライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｆ）工程（ｅ）で得られたアンプリコンの一部を第２のテールプライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｇ）そのｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。そのｃＤＮＡ溶液は、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団は、第１のシーケンシングプライマーと同一の５’核酸配列および約６〜約１２個のランダムヌクレオチドを含む３’核酸配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、その第１の標的特異的プライマーは、その標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列に、アニーリング温度で特異的にアニールし得る核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、工程（ｅ）から生じるアンプリコンによって含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部に特異的にアニールし得る核酸配列を含む３’部分、および第２のシーケンシングプライマーに同一の核酸配列を含む５’部分を含み、その第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーに関してネスト化され得る。いくつかの実施形態において、その第１のテールプライマーは、テール付加ランダムプライマーと同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２のテールプライマーは、その第１のシーケンシングプライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第１のテールプライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、例えば、自動化様式で、未知のヌクレオチド配列の隣接領域から上流にある既知の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（例えば、既知の配列を含む５’領域および未知の配列を含む３’領域を含むヌクレオチド配列）を富化するための方法を実行するように構成され得る。いくつかの実施形態において、その方法は、以下を包含する：（ａ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子とテール付加ランダムプライマーの集団とを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズしたテール付加ランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物と最初の標的特異的プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その標的核酸分子の一部およびそのテール付加ランダムプライマー配列を、第１のテールプライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｆ）工程（ｅ）から得られたアンプリコンの一部を第２のテールプライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｇ）そのｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。そのｃＤＮＡ溶液は、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団は、第１のシーケンシングプライマーと同一の５’核酸配列および約６〜約１２のランダムヌクレオチドを含む３’核酸配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、その第１の標的特異的プライマーは、その標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列にアニーリング温度で特異的にアニールし得る核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、工程（ｃ）から得られたアンプリコンによって含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部に特異的にアニールし得る核酸配列を含む３’部分および第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む５’部分を含み、その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その第１のテールプライマーは、テール付加ランダムプライマーと同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２のテールプライマーは、その第１のシーケンシングプライマーの一部と同一の核酸配列を含み、その第１のテールプライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、そのサンプルとＲＮａｓｅとをその最初の標的特異的プライマーの伸長後に接触させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、そのテール付加ランダムプライマーは、ヘアピンループ構造を形成し得る。いくつかの実施形態において、その最初の標的特異的プライマーおよびその第１の標的特異的プライマーは、同一である。いくつかの実施形態において、そのテール付加ランダムプライマーは、第１のシーケンシングプライマーと同一の５’核酸配列と６〜１２個のランダムヌクレオチドを含む３’核酸配列との間に６〜１２個のランダムヌクレオチドを含むバーコード部分をさらに含む。
【０１６２】
ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプター
本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプター（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔａｉｌ−ａｄａｐｔｅｒ）」とは、２本の鎖（ブロッキング鎖および増幅鎖）から構成され、第１のライゲーション可能な二重鎖末端（ｄｕｐｌｅｘ  ｅｎｄ）および第２の不対末端を含む核酸分子をいう。そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターのブロッキング鎖は、５’二重鎖部分を含む。その増幅鎖は、不対５’部分、３’二重鎖部分、３’Ｔオーバーハング、ならびに第１のおよび第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む。そのブロッキング鎖および増幅鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、３’Ｔオーバーハングを含む第１のライゲーション可能な二重鎖末端を形成し、その二重鎖部分は、ライゲーション温度において二重鎖形態を保持するために十分な長さである。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む増幅鎖の一部は、少なくとも部分的に、その増幅鎖の５’不対部分によって含まれ得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターは、二重鎖部分および不対部分を含み得、ここでその不対部分は、その増幅鎖の５’部分のみを含む、すなわち、そのブロッキング鎖の全体は、二重鎖部分である。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターは、「Ｙ」形状を有し得る、すなわち、その不対部分は、ブロッキング鎖および増幅鎖の両方の部分を含み得、これらの鎖は不対である。そのブロッキング鎖の不対部分は、その増幅鎖の不対部分より短くてもよいし、長くてもよいし、長さが等しくてもよい。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖の不対部分は、その増幅鎖の不対部分より短い可能性がある。Ｙ形状のユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターは、そのブロッキング鎖の不対部分がＰＣＲレジメンの間の３’伸長に左右されないという利点を有する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分に実質的に相補的でない３’不対部分をさらに含み得る；そしてここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーのうちのいずれにも実質的に相補的でないか、または実質的に同一でない。いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分にアニーリング温度で特異的にアニールしない３’不対部分をさらに含み得る；そしてここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーまたはその相補体のうちのいずれにも、アニーリング温度で特異的にアニールしない。
【０１６７】
第１の増幅工程
本明細書で使用される場合、用語「第１の標的特異的プライマー（ｆｉｒｓｔ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、適したアニーリング条件下で標的核酸に特徴的な鎖を有する核酸テンプレートに特異的にアニールし得る核酸配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドに言及する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、プライマー（例えば、標的特異的プライマー）は、５’タグ配列部分を含み得る。いくつかの実施形態において、反応中に存在する多数のプライマー（例えば、全ての第１の標的特異的プライマー）は、同一の５’タグ配列部分を含み得る。いくつかの実施形態において、多重ＰＣＲ反応において、種々のプライマー種が、互いとオフターゲット様式で相互作用し得、プライマー伸長およびその後にＤＮＡポリメラーゼによる増幅をもたらす。このような実施形態において、これらプライマーダイマーは、短い傾向にあり、それらの効率的増幅は、反応を追い越して優位を占め得、所望の標的配列の不十分な増幅を生じ得る。よって、いくつかの実施形態において、プライマーに（例えば、標的特異的プライマー上に）５’タグ配列を含めることは、両方の鎖上に同じ相補的テールを含むプライマーダイマーの形成を生じ得る。いくつかの実施形態において、その後の増幅サイクルにおいて、このようなプライマーダイマーは、１本鎖ＤＮＡプライマーダイマーへと変性し、各々は、５’タグによって導入されるそれらの２つの末端上に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、これらの１本鎖ＤＮＡプライマーダイマーにアニールするプライマーの代わりに、分子内ヘアピン（フライパンの柄様の構造）形成は、別個の分子上の新たなプライマーとの分子間相互作用の代わりに、同じプライマーダイマー分子上の相補的タグの近位のアクセスしやすさに起因して起こり得る。よって、いくつかの実施形態において、これらのプライマーダイマーは、不十分にしか増幅されない可能性があり、その結果、プライマーは、増幅のためのダイマーによって指数関数的に消費されない；むしろそのタグ化プライマーは、標的配列の所望の特異的増幅のために高いかつ十分な濃度で残り得る。いくつかの実施形態において、プライマーダイマーの蓄積は、多重増幅の状況で望ましくない可能性がある。なぜならそれらは、その反応の中で他の試薬と競合し、消費するからである。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、５’タグ配列は、ＧＣリッチ配列であり得る。いくつかの実施形態において、５’タグ配列は、少なくとも５０％  ＧＣ含量、少なくとも５５％  ＧＣ含量、少なくとも６０％  ＧＣ含量、少なくとも６５％  ＧＣ含量、少なくとも７０％  ＧＣ含量、少なくとも７５％  ＧＣ含量、少なくとも８０％  ＧＣ含量、またはより高いＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、タグ配列は、少なくとも６０％  ＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、タグ配列は、少なくとも６５％  ＧＣ含量を含み得る。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、用語「第１のアダプタープライマー（ｆｉｒｓｔ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、第１のシーケンシングプライマーの５’部分と同一の核酸配列を含む核酸分子に言及する。従って、第１のテール−アダプタープライマーが増幅鎖（相補鎖とは対照的に）の配列のうちの少なくとも一部と同一であるので、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプター自体の任意の部分に特異的にアニールできない。
【０１７１】
第１の増幅工程の第１のＰＣＲ増幅サイクルにおいて、その第１の標的特異的プライマーは、既知の標的ヌクレオチド配列を含む任意の核酸のテンプレート鎖に特異的にアニールし得る。その第１の標的特異的プライマーがデザインされた配向に依存して、その既知の標的ヌクレオチド配列の上流または下流にある配列は、そのテンプレート鎖に相補的な鎖として合成される。ＰＣＲの伸長相の間に、そのテンプレート鎖の５’末端がライゲーションされたユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターにおいて終了する場合、その新たに合成された生成物鎖の３’末端は、その第１のテール−アダプタープライマーに相補的な配列を含む。その後のＰＣＲ増幅サイクルでは、その第１の標的特異的プライマーおよびその第１のテール−アダプタープライマーの両方が、その標的核酸配列の適切な鎖に特異的にアニールし得、その既知のヌクレオチド標的配列とそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとの間の配列が、増幅され得る（すなわち、コピーされ得る）。
【０１７２】
第２の増幅工程
本明細書で使用される場合、用語「第２の標的特異的プライマー（ｓｅｃｏｎｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、先立つ増幅工程から生じるアンプリコンによって含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部に特異的にアニールし得る核酸配列を含む３’部分、および第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む５’部分を含む１本鎖オリゴヌクレオチドに言及する。その第２の標的特異的プライマーは、その第２の標的特異的プライマーの共通配列とハイブリダイズするさらなるプライマー（例えば、３’シーケンシングアダプター／インデックス配列を有するプライマー）によってさらに接触され得る。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、バーコード、インデックス、アダプター配列、またはシーケンシングプライマー部位を含み得るハイブリダイゼーション配列の５’側にさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、包括的シーケンシングアダプター／インデクスプライマーである。その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーに関して、少なくとも３ヌクレオチド、例えば、３もしくはこれより多くの、４もしくはこれより多くの、５もしくはこれより多くの、６もしくはこれより多くの、７もしくはこれより多くの、８もしくはこれより多くの、９もしくはこれより多くの、１０もしくはこれより多くの、または１５もしくはこれより多くのヌクレオチドがネスト化される。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、反応に存在するその第２の標的特異的プライマーのうちの全ては、同じ５’部分を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーの５’部分は、本明細書中上記の第１の標的特異的プライマーの５’タグに関して記載されるように、プライマーダイマーを抑制するように働き得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２の標的特異的プライマーは、その標的核酸の同じ鎖に実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０個の特有の塩基、例えば、２０個もしくはこれより多くの特有の塩基、２５個もしくはこれより多くの特有の塩基、３０個もしくはこれより多くの特有の塩基、３５個もしくはこれより多くの特有の塩基、４０個もしくはこれより多くの特有の塩基、または５０個もしくはこれより多くの特有の塩基を含み得る。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも３０個の特有の塩基を含み得る。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、用語「第２のアダプタープライマー（ｓｅｃｏｎｄ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、その第１のシーケンシングプライマーの一部と同一の核酸配列を含む核酸分子に言及し、その第１のアダプタープライマーに関してネスト化される。従って、その第２のテール−アダプタープライマーは、増幅鎖（相補鎖とは対照的に）の配列の少なくとも一部と同一であるので、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプター自体のいかなる部分にも特異的にアニールできない。いくつかの実施形態において、その第２のアダプタープライマーは、その第１のシーケンシングプライマーと同一である。
【０１７６】
その第２のアダプタープライマーは、第１のアダプタープライマーに関してネスト化されるはずである、すなわち、その第１のアダプタープライマーは、第２のアダプタープライマーによって含まれずかつその第２のアダプタープライマーによって含まれる増幅鎖と同一の配列のうちのいずれとも異なる、その増幅プライマーの５’末端の近位に位置するその増幅鎖に同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２のアダプタープライマーは、少なくとも３個のヌクレオチド、例えば、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、またはこれより多くがネスト化される。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、その第１のアダプタープライマーは、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖の約２０個の最も５’側の塩基と同一の核酸配列を含み得、その第２のアダプタープライマーは、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖の約３０個の塩基と同一の核酸配列と、その増幅鎖の５’末端の３’側にある少なくとも３個のヌクレオチドである５’塩基とを含み得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ネスト化されたプライマーセットが使用され得る。いくつかの実施形態において、ネスト化されたアダプタープライマーの使用は、増幅可能である（例えば、ブリッジＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲの間に）が、ある種の技術を使用して効率的にシーケンシングできない最終アンプリコンを生成する可能性を排除する。いくつかの実施形態において、半ネスト化されたプライマーセットが使用され得る。
【０１７９】
サンプル精製工程
いくつかの実施形態において、標的核酸および／またはその増幅生成物は、１つの方法のうちの任意の適切な工程の前および／または後で、酵素、プライマー、または緩衝剤構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ））クリーンアップを含み得る。ＳＰＲＩクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  −  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（カタログ番号Ａ６３８８０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；  Ｂｒｅａ，  ＣＡ））。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしなかったプライマーは、適切な方法（例えば、精製、消化など）を使用して核酸調製物から除去され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）は、調製物からプライマーを除去するために使用される。いくつかの実施形態において、このようなヌクレアーゼは、プライマー消化後に熱不活性化される。そのヌクレアーゼが一旦不活性化されると、プライマーのさらなるセットが、さらなる増幅反応を行うために、他の適切な構成要素（例えば、酵素、緩衝剤）と一緒に添加され得る。
【０１８１】
シーケンシング
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法（例えば、サンガーシーケンシング法）で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法／プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる：大規模並行シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；４５４パイロシーケンシング（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ，  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）；ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）；ＤＮＡナノボールシーケンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およびその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である（例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら，「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００８，  ｖｏｌ．  ２６，  Ｎｏ．  １０，  １１３５−１１４５；Ｍａｒｄｉｓ，  「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００７，  ｖｏｌ．  ２４，  Ｎｏ．  ３，  ｐｐ．  １３３−１４１；  Ｓｕら，  「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ，  ２０１１，  １１（３）：３３３−４３；Ｚｈａｎｇら，  「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ」，  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２０１１，  ３８（３）：９５−１０９；（Ｎｙｒｅｎ，  Ｐ．ら  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０８：  １７１７５（１９９３）；  Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｃｕｒｒ  ���ｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １６：５４５−５２（２００６）；  Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｌ．ら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ  １３：５６９−７７（２００８）；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，２７９，５６３号；米国特許第７，２２６，７２０号；米国特許第７，２２０，５４９号；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国公開番号２００６／０２５２０７７；同２００７／００７０３４９；および同２００７００７０３４９を参照のこと；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、そのシーケンシング工程は、第１のおよび第２のシーケンシングプライマーの使用に依拠する。いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２のシーケンシングプライマーは、本明細書で記載されるとおりの次世代シーケンシング法と適合性であるように選択される。
【０１８３】
シーケンシングリードをゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列の既知の配列データベースに整列させるための方法は、当該分野で周知であり、ソフトウェアは、このプロセスのために市販される。いくつかの実施形態において、それらの全体において、野生型配列データベースにマッピングされないリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成または大きなインデル変異であり得る。いくつかの実施形態において、ゲノム中の多数の位置にマッピングされる配列を含むリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成であり得る。
【０１８４】
ＡＭＰプライマー
いくつかの実施形態において、プライマーの４タイプ（第１のおよび第２の標的特異的プライマー、ならびに第１のおよび第２のアダプタープライマー）を、これらが、約６１〜７２℃、例えば、約６１〜６９℃、約６３〜６９℃、約６３〜６７℃、約６４〜６６℃のアニーリング温度において、これらの相補的配列に特異的にアニールするように、デザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが７２℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが７０℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが６８℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが約６５℃のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクリングすることによって）変更して、プライマーアニーリングを促進するように構成される。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６１〜７２℃、例えば、約６１〜６９℃、約６３〜６９℃、約６３〜６７℃、約６４〜６６℃の温度で特異的にアニールする。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６５℃の温度で、ＰＣＲ緩衝剤中で特異的にアニールする。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるプライマーおよび／またはアダプターは、改変された塩基を含むことができない（例えば、そのプライマーおよび／またはアダプターは、ブロッキング３’アミンを含むことができない）。
【０１８７】
核酸伸長、増幅、およびＰＣＲ
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、１つまたはこれより多くのハイブリダイズしたテール付加ランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのテール付加ランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、既知の標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、既知の標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅レジメンを包含し得る（１つまたはこれより多くの増幅サイクルを包含する）。本明細書で記載される方法の増幅工程は、各々ＰＣＲ増幅レジメンを、すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクルすることによって）変更して、種々のＰＣＲ工程、例えば、融解、アニーリング、伸長などを促進するように構成される。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、自動化様式で増幅レジメンを実行するように構成される。本明細書で使用される場合、用語「増幅レジメン（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」とは、目的の核酸を特異的に増幅する（その存在量を増大させる）プロセスをいう。いくつかの実施形態において、指数関数的増幅は、以前のポリメラーゼ伸長の生成物が連続する伸長ラウンドにわたってテンプレートとして働く場合に起こる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うＰＣＲ増幅レジメンは、少なくとも１回、およびいくつかの場合には、少なくとも５回またはこれより多くの反復サイクルを含み得る。いくつかの実施形態において、各反復サイクルは、１）鎖分離（例えば、熱変性）；２）テンプレート分子へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリング；および３）そのアニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長という工程を含み得る。これらの工程の各々に関与する任意の適切な条件および時間が使用され得ることは、認識されるである。いくつかの実施形態において、選択される条件および時間は、長さ、配列の内容、融解温度、二次構造特徴、または反応において使用される核酸テンプレートおよび／もしくはプライマーに関する他の因子に依存し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う増幅レジメンは、サーマルサイクラー（そのうちの多くは市販されている）で行われる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、核酸伸長反応は、核酸ポリメラーゼの使用を包含する。本明細書で使用される場合、語句「核酸ポリメラーゼ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、ヌクレオシド三リン酸のテンプレート依存性重合を触媒して、テンプレート核酸配列に相補的なプライマー伸長生成物を形成する酵素をいう。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニールしたプライマーの３’末端における合成を開始し、そのテンプレートの５’末端に向かう方向で進む。多くの核酸ポリメラーゼは、当該分野で公知であり、市販されている。核酸ポリメラーゼのうちの１グループは、熱安定性である。すなわち、それらは、相補的な核酸のアニールした鎖を変性させるために十分な温度（例えば、９４℃、または時にはより高い）に供された後に機能を保持する。増幅のためのプロトコルの非限定的な例は、以下の条件下でポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｔａｑ、ＶｅｒａＳｅｑ）を使用することを包含する：９８℃で３０秒間、続いて、以下を含む１４〜２２回のサイクル（９８℃で１０秒間での融解、続いて、６８℃で３０秒間のアニーリング、続いて、７２℃で３分間の伸長、続いて、４℃での反応の保持）。しかし、他の適切な反応条件が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アニーリング／伸長温度は、塩濃度における差異を考慮するために調節され得る（例えば、より高い塩濃度に対して３℃高い）。いくつかの実施形態において、例えば、９８℃から６５℃への傾斜率を（例えば、１℃／秒、０．５℃／秒、０．２８℃／秒、０．１℃／秒またはよりゆっくりと）遅らせることは、より多重化したサンプル中でプライマー性能および適用範囲の均一性を改善する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクルさせ、制御された上昇率または下降率を有することによって）変更して、増幅を促進するように構成される。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、その酵素がテンプレート依存性伸長を行う条件下で使用される。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＶｅｒａＳｅｑ  ＵＬｔｒａポリメラーゼ、ＶｅｒａＳｅｑ  ＨＦ  ２．０ポリメラーゼ、ＥｎｚＳｃｒｉｐｔ、または別の適切なポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素ではない。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、伸長反応は、相補的なＤＮＡ分子を生成するために、ＲＮＡに対して行われる逆転写を包含する（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、マウスのモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、または別の適切な逆転写酵素である。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、核酸増幅反応は、反応混合物の加熱を概して要する鎖分離工程を包含するサイクルを要する。本明細書で使用される場合、用語「鎖分離（ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」または「鎖を分離する（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｎｄ）」とは、相補的な２本鎖分子が、オリゴヌクレオチドプライマーにアニールするために利用可能な２本の単一の鎖へと分離されるようにする核酸サンプルの処理を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う鎖分離は、核酸サンプルをその融解点（Ｔｍ）を上回って加熱することによって達成される。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼに適した反応調製物における核酸分子を含むサンプルに関しては、９４℃への加熱は、鎖分離を達成するために十分である。いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１種またはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１種の緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、およびキャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）を含む。適切な緩衝剤の非限定的な例は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．１％
ＢＳＡを含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、核酸増幅は、標的核酸に特徴的な鎖を有する核酸テンプレートにプライマーをアニールさせることを包含する。いくつかの実施形態において、標的核酸の鎖は、テンプレート核酸として働き得る。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、用語「アニールする（ａｎｎｅａｌ）とは、２つの核酸の間での１つまたはこれより多くの相補的塩基対の形成をいう。いくつかの実施形態において、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は、２つの相補的または実質的に相補的な核酸鎖が一緒にハイブリダイズすることを要する。いくつかの実施形態において、伸長反応の状況では、アニーリングは、テンプレート依存性ポリメラーゼ酵素のプライマー伸長基質が形成されるように、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを要する。いくつかの実施形態において、アニーリング（例えば、プライマーと核酸テンプレートとの間）の条件は、プライマーの長さおよび配列に基づいて変動し得る。いくつかの実施形態において、アニーリングの条件は、プライマーのＴｍ（例えば、計算されたＴｍ）に基づく。いくつかの実施形態において、伸長レジメンのアニーリング工程は、鎖分離工程後の温度を、プライマーのＴｍ（例えば、計算されたＴｍ）に基づく温度へと、このようなアニーリングを可能にするために十分な時間にわたって低下させることを要する。いくつかの実施形態において、Ｔｍは、多くのアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．  Ｃｏｌｏｒａｄｏ）プライマーデザインソフトウェアおよびＶＥＮＴＲＯ  ＮＴＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）プライマーデザインソフトウェアおよびインターネット上で入手可能なプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３、Ｏｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ、およびＮｅｔＰｒｉｍｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ；  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ；およびワールドワイドウェブ上で（例えば、ａｔ  ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ／Ｈｅｌｐ／ｘｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ．ｈｔｍｌにおいて）無料で入手可能なものが挙げられる）のうちのいずれかを使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、プライマーのＴｍは、以下の式を使用して計算され得る（これは、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒソフトウェアによって使用され、Ｆｒｉｅｉｒ，ら  ＰＮＡＳ  １９８６  ８３：９３７３−９３７７（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）により詳細に記載される）
Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃ／４））＋１６．６  ｌｏｇ（［Ｋ＋］／（１＋０．７［Ｋ＋］））−２７３．１５
ここで：ΔＨは，ヘリックス形成のエンタルピーであり；ΔＳは、ヘリックス形成のエントロピーであり；Ｒは、モル気体定数（１．９８７ｃａｌ／℃×ｍｏｌ）であり；Ｃは、核酸濃度であり；そして［Ｋ＋］は、塩濃度である。大部分の増幅レジメンに関して、アニーリング温度は、推定Ｔｍより約５℃低いように選択されるが、例えば、推定Ｔｍより５℃より大きく低い温度（例えば、６℃低い、８℃低い、１０℃低い、またはより低い）であり得るように、Ｔｍにより近く、Ｔｍを上回る温度（例えば、推定Ｔｍより１℃〜５℃の間または低い、推定Ｔｍより１℃〜５℃の間高い）が使用され得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度がＴｍに近いほど、アニーリングはより特異的になる。いくつかの実施形態において、伸長反応の間（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、反応の体積に基づいて決定される（例えば、体積が大きいほど、より長い時間を要する）。いくつかの実施形態において、伸長反応の間に（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、プライマーおよびテンプレート濃度に基づいて決定される（例えば、テンプレートに対するプライマーの相対的濃度が高いほど、より低い相対的濃度より、より短い時間を要する）。いくつかの実施形態において、体積および相対的プライマー／テンプレート濃度に依存して、伸長反応における（例えば、増幅レジメンの状況内での）プライマーアニーリング工程は、１秒〜５分、１０秒〜２分、または３０秒〜２分の範囲内であり得る。本明細書で使用される場合、「実質的にアニールする（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｎｎｅａｌ）」とは、相補的塩基対が、ＰＣＲ増幅レジメンの状況において使用される場合に、特異的に増幅された生成物の検出可能なレベルを生じるために十分である２つの核酸の間で形成する程度に言及する。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ伸長（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」とは、核酸ポリメラーゼによる、核酸テンプレートにアニールされるプライマーの３’末端への少なくとも１個の相補的ヌクレオチドのテンプレート依存性付加をいう。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、例えば、テンプレートの全長に相当するヌクレオチドまでおよびそれを含む１個より多くのヌクレオチドを付加する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長の条件は、少なくとも部分的に、使用されるポリメラーゼが何であるかに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長に使用されるテンプレートは、その酵素の既知の活性特性に基づく。アニーリング温度がその酵素の至適温度を下回るいくつかの実施形態において、より低い伸長温度を使用することは、許容可能であり得る。いくつかの実施形態において、酵素は、それらの至適伸長温度より下で少なくとも部分的活性を保持し得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長（例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよびその改変体のような熱安定性ポリメラーゼで行われる）は、６５℃〜７５℃または６８℃〜７２℃で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＰＣＲ増幅レジメンの各サイクルにおいて核酸テンプレートにアニールされるプライマーのポリメラーゼ伸長を要する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、比較的強い鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態において、強い鎖置換を有するポリメラーゼは、融合物（例えば、５’融合物）を検出する目的で核酸を調製するために有用である。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、プライマー伸長は、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件下で行われる。本明細書で使用される場合、用語「伸長生成物が生成されるようにアニールしたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｅｒｍｉｔ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｎｅａｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｃｈ  ｔｈａｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）」とは、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する条件のセット（例えば、温度、塩および補因子濃度、ｐＨ、ならびに酵素濃度）をいう。いくつかの実施形態において、このような条件は、少なくとも部分的に、使用されている核酸ポリメラーゼに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、適切な反応調製物中でプライマー伸長反応を行い得る。いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１つまたはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１つの緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、キャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）、および１つまたはこれより多くのＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの各々が１０〜２００μＭ）を含む。条件の非限定的なセットは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する７２℃において５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、および０．１％  ＢＳＡである。いくつかの実施形態において、開始および伸長の条件は、適切な緩衝剤中に、１種、２種、３種または４種の種々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰから選択される）および重合誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、「緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）」とは、溶媒（例えば、水性溶媒）に加えて、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす適切な補因子および試薬を含み得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、自動化様式で、多数の核酸増幅サイクルを実行するように構成される。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、５回まで、１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、またはこれより多くのラウンド（サイクル）の増幅を要する。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、長さが５サイクル〜２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅工程は、長さが１０サイクル〜２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、各増幅工程は、長さが１２サイクル〜１６サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７０℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７２℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６５℃であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６１〜約７２℃であり得る。
【０１９８】
種々の実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、本明細書で記載されるプライマーのタイプのうちの１つまたはこれより多くを用いてＰＣＲ増幅レジメンを行うことに関する。本明細書で使用される場合、「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、核酸テンプレートに特異的にアニーリングし、テンプレート依存性ポリメラーゼの基質として働く３’末端を提供して、そのテンプレートに相補的な伸長生成物を生成し得るオリゴヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態において、プライマーは、プライマーおよびその相補体がアニールして２つの鎖を形成し得るようにする１本鎖である。本明細書に記載される方法および組成物に従うプライマーは、長さが３００ヌクレオチド以下であり、例えば、３００以下、または２５０、または２００、または１５０、または１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、またはこれより少ない、または２０もしくはこれより少ない、または１５もしくはこれより少ないが、長さが少なくとも６ヌクレオチドであるハイブリダイゼーション配列（例えば、核酸テンプレートとアニールする配列）を含み得る。いくつかの実施形態において、プライマーのハイブリダイゼーション配列は、長さが６〜５０ヌクレオチド、長さが６〜３５ヌクレオチド、長さが６〜２０ヌクレオチド、長さが１０〜２５ヌクレオチドであり得る。
【０１９９】
任意の適切な方法が、オリゴヌクレオチドおよびプライマーを合成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、市販の供給源は、本明細書で記載される方法および組成物における使用のためのプライマーを提供するために適したオリゴヌクレオチド合成サービス（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ）からの特注のＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏ）を提供する。
【０２００】
ＤＮＡ剪断／フラグメント化
本明細書で使用される核酸（例えば、シーケンシングの前）は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）から市販されるＡＦＡＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、核酸が、例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る、例えば、カートリッジ内に嵌められているカセット内に１つまたはこれより多くの容器を有し得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物（例えば、伸長生成物、増幅生成物）は、剪断も酵素消化もされない。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、標的核酸がＲＮＡである場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。
【０２０３】
標的核酸
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、目的の核酸分子（例えば、分析される核酸）をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列）および決定される隣接するヌクレオチド配列（これは、未知の配列といわれ得る）の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２本鎖である。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、１本鎖である。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）であり得る。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ゲノムＤＮＡによって含まれ得る。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡによって含まれ得る。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ｃＤＮＡによって含まれ得る。本明細書で記載される方法における使用に適したシーケンシング法のうちの多くは、数十から数百のヌクレオチド塩基の至適リード長でのシーケンシング実行を提供する（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、２００〜４００ｂｐのリード長を生成し得る）。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、この至適リード長より実質的に長い核酸分子によって含まれ得る。第２の増幅工程から生じる増幅された核酸部分が特定のシーケンシング技術における使用のための適切な長さのものであるために、その既知の標的ヌクレオチド配列とユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターがライゲーションされ得る標的核酸の末端との間の平均距離は、選択された技術の至適リード長に可能な限り近いである。例えば、所定のシーケンシング技術の至適リード長が２００ｂｐである場合、本明細書で記載される方法に従って増幅される核酸分子は、約４００ｂｐまたはこれより短い平均長を有するである。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）から市販されるＡＦＡＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡによって含まれる標的核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、その標的核酸がＲＮＡによって含まれる場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって；およびその核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、遺伝子再編成によって含まれ得る。本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適合される。なぜならその遺伝子再編成の半分のみが何であるかが、先に決定されなければならないからである（すなわち、遺伝子特異的プライマーによって標的化される遺伝子再編成の半分）。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、発がん遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、用語「既知の標的ヌクレオチド配列（ｋｎｏｗｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、その配列（例えば、その核酸が何であるかおよびその核酸のヌクレオチド塩基の順序）が既知である標的核酸の一部をいう。例えば、いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、既知であるかまたはその核酸の隣接する未知の配列のインターロゲーションより先に決定された核酸のヌクレオチド配列である。既知の標的ヌクレオチド配列は、任意の適切な長さであり得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５００個もしくはこれより多くのヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０〜１００個のヌクレオチド、１０〜５００個のヌクレオチド、１０〜１０００個のヌクレオチド、１００〜５００個のヌクレオチド、１００〜１０００個のヌクレオチド、５００〜１０００個のヌクレオチド、５００〜５０００個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、方法は、核酸の連続する（または隣接する）部分の配列を決定するために、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、用語「に連続するヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｔｏ）」とは、別のヌクレオチド配列（例えば、既知のヌクレオチド配列）の直ぐ上流または下流にある核酸分子（例えば、標的核酸）のヌクレオチド配列に言及する。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、例えば、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、７５０ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、５００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、４００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、３００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、２００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、１００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列を含む。サンプルが既知の標的ヌクレオチド配列を含む種々の標的核酸（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列が、そのゲノムに、または別個の同一でない染色体上に何度も出現する細胞）を含むいくつかの実施形態において、その既知の標的ヌクレオチド配列「に連続するヌクレオチド配列」を含む多数の配列が存在し得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列（またはそのヌクレオチド配列）を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａ（ｏｒ  ｔｈｅ）  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、核酸のヌクレオチド塩基が何であるかおよびその相対的位置を決定することに言及する。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、既知の標的核酸は、遺伝子再編成から生じる融合配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適している。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成の１つの部分が何であるかは、先に既知であり（例えば、遺伝子特異的プライマーによって標的化される遺伝子再編成の一部）、他の部分の配列は、本明細書で開示される方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子を要し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。
【０２１１】
サンプル
いくつかの実施形態において、標的核酸は、適切なサンプル（例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど）中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および／または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは、遺伝子変化（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）と関連する疾患（例えば、がんまたは遺伝性疾患）の処置の必要性のある被験体から得られ得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子に存在する。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、サンプルは、がんの処置の必要性のある被験体から得られる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍細胞の集団、例えば、少なくとも１個の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍生検物（非処理の生検組織物または処理生検組織物（例えば、ホルマリン固定および／またはパラフィン包埋した生検組織）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは、新たに集められる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において使用される前に貯蔵される。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、非処理サンプルである。本明細書で使用される場合、「非処理サンプル（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、溶液中での希釈および／または懸濁を除いて、いかなる事前のサンプル事前処理をも有しなかった生物学的サンプルをいう。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られ、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に保存または処理される。非限定的な例によれば、サンプルは、パラフィンワックス中に包埋され得るか、冷蔵され得るか、または凍結され得る。凍結サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物に従って、核酸の存在を決定する前に融解され得る。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｅｄ）サンプルであり得る。サンプルを処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ための例示的な方法としては、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、加熱、凍結および融解、保存剤（例えば、抗凝固剤またはヌクレアーゼインヒビター）との接触、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、化学的および／または生物学的試薬で処理され得る。化学的および／または生物学的試薬は、処理および／または貯蔵の間に、サンプルの安定性またはそのサンプルによって含まれる核酸を保護および／または維持するために使用され得る。さらに、または代わりに、化学的および／または生物学的試薬は、そのサンプルの他の構成要素から核酸を放出するために使用され得る。非限定的な例によれば、血液サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に、抗凝固剤で処理され得る。核酸分析のためのサンプルの処理、保存、または処理に適切な方法およびプロセスは、本明細書で開示される方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、清澄にした流体サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、その清澄にされる流体サンプルを含む上清の低速遠心分離（例えば、３，０００×ｇまたはこれより小さい）および収集によって清澄にされ得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する核酸は、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に単離され得るか、富化され得るか、または精製され得る。サンプルから核酸を単離、富化、または精製するために適した方法は、使用され得る。例えば、ゲノムＤＮＡを種々のサンプルタイプから単離するためのキットは、市販されている（例えば、カタログ番号５１１０４、５１３０４、５６５０４、および５６４０４；  Ｑｉａｇｅｎ；  Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，  ＭＤ）。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、標的核酸のシーケンシングの前に、標的核酸を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、富化される標的核酸の一方の末端の配列は、シーケンシングの前には知られていない。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、次世代シーケンシング技術を使用してヌクレオチド配列を決定する前に、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法は、ハイブリダイゼーション富化を含まない。
【０２１６】
標的遺伝子（ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ）および治療適用
本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および／またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常（例えば、ＳＮＰ、挿入、欠失、および／または遺伝子再編成）を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および／または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。
【０２１７】
がんのある種の処置は、ある種の発がん遺伝子を含む腫瘍に対して特に有効である。例えば、所定の融合発がん遺伝子の作用または発現を標的化する処置薬剤は、その融合発がん遺伝子を含む腫瘍に対して有効であり得るが、その融合発がん遺伝子を欠く腫瘍に対しては有効でない。本明細書で記載される方法は、発がん遺伝子状態（例えば、変異、ＳＮＰ、および／または再編成）を明らかにする特定の配列の決定を促進し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、隣接する領域の配列が既知である場合に、特定の配列の決定をさらに可能にし得る。例えば、本明細書で記載される方法は、精密な位置および／または再編成パートナーが、本明細書で記載される方法が行われる前に既知ではない既知の遺伝子（例えば、発がん遺伝子）を要する遺伝子再編成の存在および何であるかを決定し得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、被験体は、肺がんの処置の必要性がある。いくつかの実施形態において、例えば、そのサンプルが、肺がんの処置の必要性のある被験体から得られる場合、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。よって、いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む融合物を生じる。ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む遺伝子再編成の非限定的な例は、例えば、以下に記載される：Ｓｏｄａら  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  ４４８５６１−６：  Ｒｉｋｏｖａら  Ｃｅｌｌ  ２００７  １３１：１１９０−１２０３；  Ｋｏｈｎｏら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  １８：３７５−７；  Ｔａｋｏｕｃｈｉら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  １８：３７８−８１；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。しかし、再編成に関与する第２の遺伝子の遺伝子再編成の精密な位置および何であるかが予め既知でなくてもよいことは、認識されるである。よって、本明細書で記載される方法において、このような再編成の存在および何であるかは、遺伝子再編成に関与する第２の遺伝子の再編成の位置または何であるかを知る必要なしに検出され得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＡＬＫの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＡＬＫインヒビター；クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６）；ＡＰ２６１１３；ＬＤＫ３７８；３−３９；ＡＦ８０２；ＩＰＩ−５０４；ＡＳＰ３０２６；ＡＰ−２６１１３；Ｘ−３９６；ＧＳＫ−１８３８７０５Ａ；ＣＨ５４２４８０２；ＡＬＫキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジンインヒビター（例えば、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６（例えば、Ｇａｌｋｉｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２００７，  １０４：２７０−２７５；  Ｚｏｕら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００７，  ６７：４４０８−４４１７；  Ｈａｌｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｆ１０００  Ｍｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１１  ３：２１；  Ｓａｋａｍｏｔｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１１  １９：６７９−６９０；およびＷＯ  ０４／０７９３２６で開示される分子を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＡＬＫインヒビターは、ＡＬＫまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＡＬＫまたはその一部の発現および／または活性を低減する例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「未分化リンパ腫キナーゼ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｋｉｎａｓｅ）」または「ＡＬＫ」とは、代表的には野生型形態におけるニューロン調節に関与する膜貫通チロシンキナーゼ（ｔｙＲＯＳ１ｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をいう。ＡＬＫ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２３８の下で註釈されるとおり）。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＯＳ１の遺伝子再編成の存在は、腫瘍がＲＯＳ１インヒビターおよび上記で記載されるとおりのＡＬＫインヒビター（例えば、ククリゾチニブ）からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る。ＲＯＳ１インヒビターは、ＲＯＳ１またはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＯＳ１またはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「ｃ−ｒｏｓ発癌遺伝子１（ｃ−ｒｏｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １）」または「ＲＯＳ１」（当該分野ではｒｏｓ−１ともいわれる）は、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓサブファミリーの膜貫通チロシンキナーゼに言及し、これは、ＰＴＰＮ６と相互作用する。ＲＯＳ１遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６０９８の下で註釈されるとおり）。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＥＴの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＲＥＴインヒビター；ＤＰ−２４９０、ＤＰ−３６３６、ＳＵ５４１６；ＢＡＹ  ４３−９００６、ＢＡＹ  ７３−４５０６（レゴラフェニブ）、ＺＤ６４７４、ＮＶＰ−ＡＳＴ４８７、ソラフェニブ、ＲＰＩ−１、ＸＬ１８４、バンデタニブ、スニチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ゲフィチニブ、およびウィザフェリンＡ（例えば、Ｓａｍａｄｉら，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２０１０  １４８：１２２８−３６；  Ｃｕｃｃｕｒｕら，  ＪＮＣＩ  ２００４  １３：１００６−１０１４；  Ａｋｅｎｏ−Ｓｔｕａｒｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  ６７：６９５６；  Ｇｒａｚｍａら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０  ２８：１５ｓ  ５５５９；  Ｍｏｌｏｇｎｉら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００６  ３７：１９９−２１２；  Ｃａｌｍｏｍａｇｎｏら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＮＣＩ  ２００６  ９８：３２６−３３４；  Ｍｏｌｏｇｎｉ，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１１  １８：１６２−１７５；ならびにＷＯ  ０６／０３４８３３で開示される化合物；米国特許公開２０１１／０２０１５９８および米国特許第８，０６７，４３４号で開示される化合物を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＲＥＴインヒビターは、ＲＥＴまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＥＴまたはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合、「トランスフェクションの間に再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「ＲＥＴ」とは、神経堤発生に関与し、グリア細胞由来神経栄養因子ファミリーシグナル伝達分子を認識するカドヘリンスーパーファミリーのレセプターチロシンキナーゼをいう。ＲＥＴ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５９７９の下で註釈されるとおり）。
【０２２３】
本明細書で記載される方法の適用のさらなる非限定的な例としては、造血悪性腫瘍マーカーおよびその一団の検出（例えば、リンパ腫および白血病においてゲノム再編成を検出するものが挙げられる）、肉腫関連ゲノム再編成およびその一団の検出；ならびにリンパ腫検査のためのＩＧＨ／ＴＣＲ遺伝子再編成およびその一団の検出が挙げられる。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、がんを有するまたはがんを有すると診断された被験体を、がんの処置で処置することに関する。がんを有する被験体は、がんを診断するための現在の方法を使用して医師によって同定され得る。例えば、肺がんの状態を特徴付けかつ診断を補助する、肺がんの症状および／または合併症は、当該分野で周知であり、呼吸の虚弱（ｗｅａｋ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、鎖骨上リンパ節腫脹、肺の異常音、胸部を軽くたたいた場合の濁音（ｄｕｌｌｎｅｓｓ）および胸痛が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、肺がんの診断を補助し得る検査としては、ｘ線、高レベルのある種の物質（例えば、カルシウム）に関する血液検査、ＣＴスキャン、および腫瘍生検が挙げられるが、これらに限定されない。肺がんの家族歴、または肺がんのリスク因子への曝露（例えば、喫煙または煙および／もしくは空気汚染への曝露）はまた、被験体が肺がんを有するようであるか否かを決定するか、または肺がんの診断を行うことを補助し得る。
【０２２５】
がんとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：癌腫（腺がん、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、白血病、扁平細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、膠芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、脳のがん（膠芽腫および髄芽腫が挙げられる）が挙げられる）；乳がん、子宮頚がん、絨毛がん；結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮内膜がん；食道がん、胃がん；種々のタイプの頭頚部がん、上皮内新生物（ボーエン病およびパジェット病が挙げられる）；血液新生物（急性リンパ性白血病および骨髄性白血病が挙げられる）；カポジ肉腫、ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、リンパ腫（ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫が挙げられる）；肝臓がん（例えば、肝臓癌腫および肝細胞がん）、メル血細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫；神経芽腫；口腔がん（扁平上皮がんが挙げられる）；卵巣がん（上皮細胞に由来するものが挙げられる）、肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫（ｆｉｂＲＯＳ１ａｒｃｏｍａ）、および骨肉腫が挙げられる）；膵臓がん；皮膚がん（黒色腫、間質細胞、胚細胞および間葉系細胞が挙げられる）；前立腺がん（ｐＲＯＳ１ｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん；外陰部がん（ｖｕｌｖａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎がん（腺癌を含む）；精巣がん（胚細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛がん）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられる）；甲状腺がん（甲状腺腺がんおよび髄様がんを含む）；食道がん、唾液腺がん、およびウィルムス腫瘍。いくつかの実施形態において、そのがんは、肺がんであり得る。
【０２２６】
多重方法
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、１つまたはこれより多くの反応容器において１より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの１つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約２〜１，０００個の間の異なる標的配列を１つの反応において検出することを指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、２〜１，０００の間の任意の範囲、例えば、５〜５００個、２５〜１，０００個、または１０〜１００個などの間の異なる標的配列を１つの反応において検出することに言及する。ＰＣＲに当てはまる場合の用語「多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」とは、同じＰＣＲ反応において少なくとも２個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、サンプル中の標的核酸、またはサンプルの別個の部分は、複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）で増幅され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの反応混合物中に存在し得る。例えば、多数の増幅生成物は、同じ反応混合物中で生成され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１のおよび第２の標的特異的プライマーの複数のセット）は、別個の遺伝子によって含まれる既知の標的配列に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの遺伝子によって含まれる既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１の標的特異的プライマー）は、同一の５’タグ配列部分を含み得る。
【０２２８】
本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つのシーケンシング反応またはシーケンシング実行において多数のサンプル中の１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、多数のサンプルは、異なる起源のもの、例えば、異なる組織および／または異なる被験体に由来するものであり得る。このような実施形態において、プライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、バーコード部分をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、特有のバーコード部分を有するプライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、各サンプルに添加され得、その中の核酸にライゲーションされ得る；そのサンプルはその後、プールされ得る。このような実施形態において、増幅生成物の各得られたシーケンシングリードは、増幅生成物が由来するテンプレート核酸を含むサンプルを同定するバーコードを含む。
【０２２９】
分子バーコード
いくつかの実施形態において、プライマーは、識別子配列（例えば、バーコード、インデックス）、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｒｄ１）、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシング技術のためのＰ５およびＰ７配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング技術と適合性のＰ１およびＡである。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「分子バーコード（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ）」、「分子バーコードタグ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｔａｇ）」および「インデックス（ｉｎｄｅｘ）」は、交換可能に使用され得、そして一般に、識別子（例えば、その核酸の供給源識別子、位置識別子、日付もしくは時間識別子（例えば、サンプリングまたは処理の日付もしくは時間）、または他の識別子のような）として有用である核酸のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、このような分子バーコードまたはインデックス配列は、核酸の集団に存在する核酸の異なる局面を同定するために有用である。いくつかの実施形態において、分子バーコードまたはインデックス配列は、標的核酸の供給源または位置識別子を提供し得る。例えば、分子バーコードまたはインデックス配列は、核酸が得られる患者を同定するように働き得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードまたはインデックス配列は、１つの反応（例えば、１つのフローセルで行われる）での多数の異なるサンプルのシーケンシングを可能にする。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、個々のシーケンシング反応を検出する目的で配列イメージャーを配向するために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードまたはインデックス配列は、長さが２〜２５ヌクレオチド、長さが２〜１５ヌクレオチド、長さが２〜１０ヌクレオチド、長さが２〜６ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、バーコードまたはインデックスは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団が、本明細書で記載される方法に従って使用される場合、多数の区別可能な増幅生成物は、増幅後に存在し得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーは、サンプルの核酸分子全体を通じて種々の位置においてハイブリダイズするので、標的特異的プライマーのセットは、１回より多くのハイブリダイゼーション事象によって作られる伸長生成物をハイブリダイズ（および増幅）し得る。例えば、１つのテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第１の距離（例えば、１００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、別のテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第２の距離（例えば、２００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、それによって、２つの増幅生成物（例えば、約１００ｂｐを含む第１の増幅生成物および約２００ｂｐを含む第２の増幅生成物）を生じ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物は各々、次世代シーケンシング技術を使用してシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物のシーケンシングは、増幅またはシーケンシングプロセスの間に導入される配列エラーを検出するために互いと比較され得る多数の重なり合う配列リードを提供することから有利である。いくつかの実施形態において、個々の増幅生成物が整列され得、それらが特定の塩基において存在する配列の中で異なる場合、ＰＣＲおよび／またはシーケンシングのアーチファクトまたはエラーが存在し得る。
【０２３２】
コンピューターおよび制御装置
本明細書で提供されるシステムは、いくつかの構成要素（センサー、環境制御システム（例えば、ヒーター、ファン）、ロボット（例えば、ＸＹポジショナー）などが挙げられる）を含み、これらは、コンピューター、プロセッサー、マイクロコントローラーまたは他のコントローラーの指示で一緒に作動し得る。その構成要素としては、例えば、ＸＹポジショナー、液体取り扱いデバイス、微小流体ポンプ、リニアアクチュエーター、バルブドライバー、ドア作動システム、光学アセンブリ、バーコードスキャナー、画像化または検出デバイス、タッチスクリーンインターフェイスなどが挙げられ得る。
【０２３３】
いくつかの場合には、作動（例えば、中で提供されるかまたはともにインターフェイス接続するシステムおよび／または構成要素の作動制御）は、ハードウェア、ソフトウェアまたはこれらの組み合わせを使用して実行され得る。ソフトウェアで実行される場合、ソフトウェアコードは、単一の構成要素において提供されようと、多数の構成要素の中で割り振られようと、任意の適切なプロセッサーまたはプロセッサーの集まり上で実行され得る。このようなプロセッサーは、集積回路として、集積回路構成要素の中の１つまたはこれより多くのプロセッサーで実行され得る。プロセッサーは、任意の適切な形式で回路を使用して実行され得る。
【０２３４】
コンピューターは、多くの形態のうちのいずれか（例えば、ラックマウント式コンピューター、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、またはタブレットコンピューター）において具現化され得る。さらに、コンピューターは、コンピューターとしては概して見做されないが、適切な処理能力を有するデバイス（パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、スマートフォンまたは任意の他の適切なポータブル、モバイルまたは固定の電子デバイス（システム自体を含む）が挙げられる）の中に埋め込まれ得る。
【０２３５】
いくつかの場合には、コンピューターは、１つまたはこれより多くの入力および出力デバイスを有し得る。これらのデバイスは、とりわけ、ユーザーインターフェイスを提示するために使用され得る。ユーザーインターフェイスを提供するために使用され得る出力デバイスの例としては、出力の視覚的提示のためのプリンターまたはディスプレイスクリーン、および出力の可聴式提示のためのスピーカーまたは他の音声生成デバイスが挙げられる。ユーザーインターフェイスのために使用され得る入力デバイスの例としては、キーボード、およびポインティングデバイス（例えば、マウス、タッチパッド、およびディジタイザータブレット（ｄｉｇｉｔｉｚｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ））が挙げられる。他の例では、コンピューターは、音声認識を通じて、または他の可聴式形式において、視覚的なジェスチャーを通じて、触覚入力（例えば、振動、触知できるおよび／または他の力を含む）を通じて、またはこれらの任意の組み合わせを通じて、入力情報を受容し得る。
【０２３６】
１つまたはこれより多くのコンピューターは、任意の適切な形式で１つまたはこれより多くのネットワーク（ローカルエリアネットワークまたはワイドエリアネットワーク（例えば、エンタープライズネットワークまたはインターネット）として含まれる）によって相互接続され得る。このようなネットワークは、任意の適切な技術に基づき得、任意の適切なプロトコルに従って作動し得、そして無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバーネットワークを含み得る。
【０２３７】
本明細書で概説される種々の方法またはプロセスは、種々のオペレーティングシステムまたはプラットフォームのうちのいずれか１つを使用する１つまたはこれより多くのプロセッサー上で実行可能なソフトウェアとしてコードされ得る。このようなソフトウェアは、多くの適切なプログラミング言語および／またはプログラミングもしくはスクリプトツールのうちのいずれかを使用して書かれ得、機械言語コードまたはフレームワークもしくは仮想マシン上で実行される実行可能な中間コードとしてコンパイルされ得る。
【０２３８】
本明細書で提供される方法またはプロセスを制御するための１つまたはこれより多くのアルゴリズムは、１つまたはこれより多くのコンピューターまたは他のプロセッサー上で実行される場合に、本明細書で記載される種々の方法またはプロセスを実行する方法を行う１つまたはこれより多くのプログラムで符号化される読み取り可能な記憶媒体（または多数の読み取り可能な媒体）（例えば、コンピューターメモリ、１つまたはこれより多くのフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、光学ディスク、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイにある回路構成もしくは他の半導体デバイス、または他の触知可能な記憶媒体）として具現化され得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、コンピューター読み取り可能な記憶媒体は、一過性でない形態でコンピューター実行可能な指示を提供するために十分な時間にわたって情報を保持し得る。このようなコンピューター読み取り可能な記憶媒体は、その中に記憶されたプログラムが本明細書で記載される方法またはプロセスの種々の局面を実行するために、１つまたはこれより多くの異なるコンピューターまたは他のプロセッサー上にロードされ得るように可搬性であり得る。本明細書で使用される場合、用語「コンピューター読み取り可能な記憶媒体（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｒｅａｄａｂｌｅ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」は、製造品（例えば、製造物品）または機械であると考えられ得るコンピューター読み取り可能な媒体のみを包含する。代わりにまたはさらに、本明細書で記載される方法またはプロセスは、コンピューター読み取り可能な記憶媒体以外のコンピューター読み取り可能な媒体（例えば、伝播シグナル）として具現化され得る。
【０２４０】
用語「プログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）」または「ソフトウェア（ｓｏｆｔｗａｒｅ）」とは、コンピューターまたは他のプロセッサーをプログラムして、本明細書で記載される方法またはプロセスの種々の局面を実行するために使用され得る実行可能なコードまたは指示のセットのいずれかのタイプを指すために、包括的な意味において本明細書で使用される。さらに、この実施形態の一局面によれば、実行される場合に、本明細書で記載される方法またはプロセスを行う１つまたはこれより多くのプログラムは、１つのコンピューターまたはプロセッサー上にある必要はないが、種々の手順または作動を実行するために、多くの異なるコンピューターまたはプロセッサーの中で、モジュラー様式で割り振られていてもよいことは、認識されるである。
【０２４１】
実行可能な指示は、１つまたはこれより多くのコンピューターまたは他のデバイスによって実行される多くの形態（例えば、プログラムモジュール）で存在し得る。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを行うかまたは特定の抽象データ型を実行する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。代表的には、そのプログラムモジュールの機能性は、種々の実施形態において望ましい場合、組み合わされ得るかまたは割り振られ得る。
【０２４２】
また、データ構造は、任意の適切な形態でコンピューター読み取り可能な媒体に記憶され得る。データ記憶の非限定的な例としては、構造化、非構造化、ローカライズされた、割り振られた、短期間および／または長期間の記憶が挙げられる。データを伝達するために使用され得るプロトコルの非限定的な例としては、所有権によって保護されたおよび／または業界標準プロトコル（例えば、ＨＴＴＰ、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、ＪＳＯＮ、ＳＱＬ、ウェブサービス、テキスト、スプレッドシートなど、またはこれらの任意の組み合わせ）が挙げられる。例証を単純化するために、データ構造は、そのデータ構造における位置を通じて関連するフィールドを有することが示され得る。このような関連性は、そのフィールドに関する記憶を、そのフィールド間の関連性を伝えるコンピューター読み取り可能な媒体における位置とともに割り当てることによって、同様に達成され得る。しかし、任意の適切な機構は、データ構造のフィールドにおける情報間の関係性を確立するために使用され得る（ポインター、タグ、またはデータ要素間の関係性を確立する他の機構の使用を通じるものを含む）。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、そのシステムの作動に関する情報（例えば、温度、画像化または光学的情報）、蛍光シグナル、構成要素の位置（例えば、加熱されたふたの位置、ロータリーバルブの位置）、液体取り扱い状態、バーコード状態、ベイアクセスドアの位置、またはこれらの任意の組み合わせ）は、そのシステムと関連した（例えば、そのシステム内に位置した）１つまたはこれより多くのセンサーまたはリーダーから得られ得、プロセス（例えば、自動化ライブラリー調製プロセス）の間の状態についての情報を提供するためにコンピューター読み取り可能な媒体の中に記憶され得る。いくつかの実施形態において、その読み取り可能な媒体は、データベースを含む。いくつかの実施形態において、上記データベースは、１つのシステムから（例えば、１つまたはこれより多くのベイから）のデータを含む。いくつかの実施形態において、上記データベースは、複数のシステムからのデータを含む。いくつかの実施形態において、データは、これを改竄防止にする様式で記憶される。いくつかの実施形態において、そのシステムによって生成される全てのデータは、記憶される。いくつかの実施形態において、データの部分セットが記憶される。
【実施例】
【０２４４】
以下の実施例は、本発明のある種の局面を含め、本明細書で記載されるある種の実施形態を例証することが意図されるが、本発明の全範囲を例示するのではない。
【０２４５】
実施例１
以下の実施例は、サンプル流体がチャネルシステムの容器に移動されるように、そのチャネルシステムの作動を示す。
【０２４６】
例示的なチャネルシステム１７００は、図２５〜２６に示される。
１）第１の共通微小流体チャネル１７５０および第２の共通微小流体チャネル１７６０が流体伝達状態にあるように、バルブ１７１０を始動する。
２）第２の共通微小流体チャネル１７６０およびシリンジポンプ１７８０が流体伝達状態にあるように、バルブ１７２０を始動する。
３）必要に応じて、第１の共通微小流体チャネル１７５０および入り口チャネル１７７０が流体伝達状態にあるように、バルブ１７３０を始動する。
４）必要に応じて、工程３が行われる場合、空気が第１の共通微小流体チャネル１７５０へと引き込まれるように、シリンジポンプ１７８０で吸引する。
５）第１の共通微小流体チャネル１７５０およびサンプルウェル１７９０が流体伝達状態にあるように、第１のバルブ１７３０を始動する
６）サンプルウェル１７９０中のサンプル流体が第１の共通微小流体チャネル１７５０に引き込まれるように、シリンジポンプ１７８０で吸引する。
７）第１の共通微小流体チャネル１７５０および容器１７９５が流体伝達状態にあるように、バルブ１７３０を始動する。
８）シリンジポンプを作動することによって、サンプル流体を容器へと分与する。
【０２４７】
実施例２
以下の実施例は、バルク流体がチャネルシステムの容器へと移動されるように、そのチャネルシステムの作動を示す。
【０２４８】
例示的なチャネルシステム１７００は、図２５〜２６に示される。
１）第２の共通微小流体チャネル１７６０および微小流体チャネル１７４２が流体伝達状態にあるように、バルブ１７１０を始動する。
２）微小流体チャネル１７４２およびバルク流体容器１７４５が流体伝達状態にあるように、バルブ１７４０を始動する。
３）バルク流体容器１７４５からのバルク流体を第２の共通微小流体チャネル１７６０へと引き込むように、シリンジポンプ１７８０で吸引する。
４）第１の共通微小流体チャネル１７５０および第２の微小流体チャネル１７６０が流体伝達状態にあるように、バルブ１７１０を始動する。
５）第１の共通微小流体チャネル１７５０および廃棄物チャネル１７７５が流体伝達状態にあるように、バルブ１７３０を始動する。
６）第２の共通微小流体チャネル１７６０の中のバルク流体が第１の共通微小流体チャネル１７５０へと吸引され、そのバルク流体の前縁が廃棄物チャネル１７７５に入る（例えば、そのバルク流体でない任意の流体がその廃棄物チャネルへと引き込まれるように）、シリンジポンプ１７８０で吸引する。
７）必要に応じて、第１の共通微小流体チャネル１７５０および入り口チャネル１７７０が流体伝達状態にあるようにバルブ１７３０を始動し、空気が第１の共通微小流体チャネル１７５０へと引き込まれるように、シリンジポンプ１７８０で吸引する。
８）第１の共通微小流体チャネル１７５０および容器１７９５が流体伝達状態にあるように、バルブ１７３０を始動する。
９）シリンジポンプを作動することによって、バルク流体を容器へと分与する。
【０２４９】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および／または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるである。本発明は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法に関する。さらに、２つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法が相互に矛盾しなければ、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５０】
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そうでないことが明確に示されなければ、「少なくとも１」を意味することが理解されるである。
【０２５１】
語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ  ｏｒ  ｂｏｔｈ）」、すなわち、いくつかの場合には結合的に存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味することが理解されるである。他の要素は、必要に応じて、そうでないことが明確に示されなければ、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、その「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような制約のない文言とともに使用される場合、一実施形態において、ＢなしのＡ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態において、ＡなしのＢ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態においてＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）；などに言及し得る。
【０２５２】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるである。例えば、リストの中で項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１（しかし１より多くを含む）、そして必要に応じて、さらなる列挙されない項目をも包含すると解釈されるものとする。そうでないことが明確に示される用語のみ、例えば、「のうちの１のみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」もしくは「のうちの正確に１（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または請求項において使用される場合に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、排他的な用語（例えば、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「のうちの１（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「のうちの１のみ」、または「のうちの正確に１」が先行する時に排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」を示すと解釈されるに過ぎないものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。
【０２５３】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、１つまたはこれより多くの要素のリストへの言及において語句「少なくとも１（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）とは、要素のリスト中にある要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１を必ずしも含むわけではなく、要素のリスト中にある要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、要素のリスト（これに対して文言「少なくとも１」が言及する）内で具体的に識別される要素以外の要素が必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例としては、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」（または、等しくは、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」、または、等しくは、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ）」は、一実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）ＡであってＢは存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂであって、Ａは存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ａ、および少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂ（および必要に応じて、他の要素を含む）；などに言及し得る。
【０２５４】
請求項において、上記の明細書においても同様に、全ての移行句（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」などは、制約がないこと、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されないことを意味すると理解されるである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、米国特許審査基準２１１１．０３節に示されるように、それぞれ、制約のあるまたは半制約の移行句であるものとする。
【０２５５】
例えば、１つもしくはこれより多くの物品、構造、力、フィールド、流れ、方向／軌跡、および／もしくはこれらの部分構成要素および／もしくはこれらの組み合わせならびに／またはこのような用語による特徴付けに従う上記で列挙されない任意の他の触知可能なまたは触知不能な要素のあるいはこれらの間の形状、配向、アラインメント、および／または幾何的関係性に関して本明細書で使用される場合の任意の用語は、別段定義されるかまたは示されることがなければ、このような用語の数理的定義への絶対的適合を要しないと理解されるものとするが、むしろ、このような主題に最も近く関連する当業者によって理解されるように特徴づけられるような主題に関して考えられる程度まで、このような用語の数理的定義への適合を示すと理解されるものとする。形状、配向、および／または幾何的関連性に関するこのような用語の例としては、以下を記載する用語が挙げられるが、これらに限定されない：形状（例えば、丸い、四角の、環状の／環、矩形の／矩形、三角形の／三角形、円筒状の／円筒、楕円状の／楕円、（ｎ）角形の／（ｎ）角形など）；角度配向（例えば、垂直の、直交の、平行の、鉛直の、水平の、共線の、など）；輪郭および／または軌跡（例えば、平面／平面状、同一平面上、半球状（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、半球状（ｓｅｍｉ−ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、直線／直線状、双曲線の、放物線の、平らな、弯曲した、まっすぐな、弓状の、正弦波の、接線／接線のなど）；方向（例えば、北、南、東、西など）；表面および／またはバルク物質特性および／または空間／時間分解および／または分布（例えば、滑らかな、反射性の、透明な、透き通った、不透明な、剛性の、不浸透性の、均一な（に）、不活性な、非湿潤性の（ｎｏｎ−ｗｅｔｔａｂｌｅ）、不溶性の、固定した、不変の、一定の、均質な、など）；ならびに関連分野の当業者に明らかな多くの他のもの。一例として、「四角」であると本明細書で記載される製作された物品は、このような物品が、完全に平面のまたは直線状でありかつ正確に９０度の角度で横断する面または側面を有することは要求されない（実際に、このような物品は、数理的抽象化として存在し得るに過ぎない）が、むしろ、このような物品の形状は、「四角の」（数理的に定義されるとおり）を、代表的には、当業者によって理解されるかまたは具体的に記載されるとおりの記載される製作技術のために達成可能でありかつ達成される程度に近いと解釈されるである。別の例として、「整列され（ａｌｉｇｎｅｄ）」る本明細書で記載される２つまたはこれより多くの製作された物品は、このような物品が完璧に整列される面または側面を有することは要求されない（実際に、このような物品は、数理的抽象化として存在し得るに過ぎない）が、むしろ、このような物品の配置は、「整列される」（数理的に定義されるとおり）を、代表的には、当業者によって理解されるかまたは具体的に記載されるとおりの記載される製作技術のために達成可能でありかつ達成される程度に近いと解釈されるである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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