(57)【要約】  目的物質（例えば、バニリン等のアルデヒド）の製造法について記載する。Gordonia CAR遺伝子、Novosphingobium CAR遺伝子、またはCoccomyxa CAR遺伝子等の特定のカルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR）遺伝子を有するように改変された目的物質生産能を有する微生物を利用して、炭素源または目的物質前駆体から目的物質を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質の製造方法であって、
目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記目的物質が、アルデヒドであり、
前記微生物が、アルデヒドオキシドレダクターゼ遺伝子を有するように改変されており、
前記アルデヒドオキシドレダクターゼ遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法：
（ａ）配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記製造が、炭素源を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記製造が、前記微生物を利用して前記目的物質の前駆体を該目的物質に変換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変換が、前記微生物の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、前記目的物質を該反応液中に生成蓄積させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記菌体が、下記からなる群より選択される、請求項５に記載の方法：
−  前記微生物の培養液に含まれる菌体；
−  該培養液から回収された菌体；
−  該培養液の処理物に含まれる菌体；
−  該回収された菌体の処理物に含まれる菌体；
−  それらの組み合わせ。
【請求項７】
前記前駆体が、プロトカテク酸、バニリン酸、安息香酸、Ｌ−フェニルアラニン、桂皮酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
さらに、前記目的物質を培地または反応液から回収することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌、コリネ型細菌、または酵母である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記目的物質が、芳香族アルデヒドである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的物質が、バニリン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される芳香族アルデヒドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、さらに、前記目的物質の生合成に関与する酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的物質の生合成に関与する酵素が、前記目的物質の前駆体から該目的物質への変換を触媒できる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的物質の生合成に関与する酵素が、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、３−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物が、さらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が、さらに、前記目的物質以外の物質の取り込み系の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記取り込み系が、バニリン酸取り込み系、プロトカテク酸取り込み系、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物が、さらに、前記目的物質の生産の際に副生物の生産に関与する酵素の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的物質の生産の際に副生物の生産に関与する酵素が、バニリン酸デメチラーゼ、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた目的物質（例えば、バニリン（vanillin）等のアルデヒド）の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バニリンは、バニラの香りの主要な成分であり、香料として飲食品や香水等に配合して使用されている。バニリンは、主に、天然物からの抽出または化学合成により製造されている。
【０００３】
また、生物工学的手法による、例えば、各種微生物と、オイゲノール（eugenol）、イソオイゲノール（isoeugenol）、フェルラ酸（ferulic acid）、グルコース、バニリン酸、ヤシガラ（coconut husk）等を原料とする、バニリンの製造が試みられている（非特許文献１）。生物工学的手法としては、他にも、バニリンを配糖体として製造する方法（特許文献１および２）、バニリンシンターゼ（vanillin synthase）を使用してフェルラ酸からバニリンを製造する方法（特許文献３）、Escherichia coliの発酵によりバニリン酸を製造し、次いで酵素的にバニリン酸をバニリンに変換する方法（特許文献４）がある。
【０００４】
バニリンは、プロトカテク酸を中間体として生成し得る。具体的には、プロトカテク酸は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase；OMT）またはアルデヒドオキシドレダクターゼ（aldehyde oxidoreductase）（カルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR））の作用により、それぞれ、バニリン酸（vanillic acid）またはプロトカテクアルデヒド（protocatechualdehyde）へと変換され得る。バニリン酸またはプロトカテクアルデヒドは、それぞれ、CARまたはOMTの作用により、バニリンへと変換され得る。加えて、イソバニリン（isovanillin）が、プロトカテク酸を中間体として副生物として生成し得る。具体的には、プロトカテク酸は、OMTの作用によりイソバニリン酸（isovanillic acid）へと変換され得る。イソバニリン酸は、CARの作用によりイソバニリンへと変換され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2013/022881
【特許文献２】WO2004/111254
【特許文献３】JP2015-535181
【特許文献４】US6372461
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kaur B. and Chakraborty D., Biotechnological and molecular approaches for vanillin production: a review. Appl Biochem Biotechnol. 2013 Feb;169(4):1353-72.
【発明の概要】
【０００７】
精製工程において、或るアルデヒド（例えば、バニリン）を他のアルデヒド（例えば、プロトカテクアルデヒドやイソバニリン）と分離することは困難である。よって、バニリンの選択的生成は、例えば、精製コストの削減に有用であり得る。しかし、バニリンの選択的生成に適したCARはこれまでに報告されていない。
【０００８】
本発明の或る側面は、目的物質（例えば、バニリン等のアルデヒド）の生産を向上させ
る新規な技術、例えば、目的物質の選択的生成に有用な技術、を開示し、以て効率的な目的物質の製造法を提供することである。
【０００９】
本明細書には、Gordonia effusa、Novosphingobium malaysiense、またはCoccomyxa subellipsoideaのカルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR）遺伝子を発現できる微生物を用いることにより、微生物の目的物質（例えば、バニリン等のアルデヒド）を生産する能力が顕著に向上し得ることが記載されている。
【００１０】
本発明の或る側面は、目的物質の製造方法であって、
目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、アルデヒドオキシドレダクターゼ遺伝子を有するように改変されており、
前記アルデヒドオキシドレダクターゼ遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法を提供することである：
（ａ）配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
発明のさらなる側面は、前記製造が、炭素源を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、前記方法を提供することである。
【００１２】
発明のさらなる側面は、前記製造が、前記微生物を利用して前記目的物質の前駆体を該目的物質に変換することを含む、前記方法を提供することである。
【００１３】
発明のさらなる側面は、前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、前記方法を提供することである。
【００１４】
発明のさらなる側面は、前記変換が、前記微生物の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、前記目的物質を該反応液中に生成蓄積させることを含む、前記方法を提供することである。
【００１５】
発明のさらなる側面は、下記からなる群より選択される、前記方法を提供することである：
−  前記微生物の培養液に含まれる菌体；
−  該培養液から回収された菌体；
−  該培養液の処理物に含まれる菌体；
−  該回収された菌体の処理物に含まれる菌体；
−  それらの組み合わせ。
【００１６】
発明のさらなる側面は、前記前駆体が、プロトカテク酸、バニリン酸、安息香酸、Ｌ−フェニルアラニン、桂皮酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質である、前記方法を提供することである。
【００１７】
発明のさらなる側面は、さらに、前記目的物質を培地または反応液から回収することを
含む、前記方法を提供することである。
【００１８】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌、コリネ型細菌、または酵母である、前記方法を提供することである。
【００１９】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌である、前記方法を提供することである。
【００２０】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、前記方法を提供することである。
【００２１】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌である、前記方法を提供することである。
【００２２】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、前記方法を提供することである。
【００２３】
発明のさらなる側面は、前記目的物質が、芳香族アルデヒドである、前記方法を提供することである。
【００２４】
発明のさらなる側面は、前記目的物質が、バニリン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される芳香族アルデヒドである、前記方法を提供することである。
【００２５】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、さらに、前記目的物質の生合成に関与する酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、前記方法を提供することである。
【００２６】
発明のさらなる側面は、前記目的物質の生合成に関与する酵素が、前記目的物質の前駆体から該目的物質への変換を触媒できる、前記方法を提供することである。
【００２７】
発明のさらなる側面は、前記目的物質の生合成に関与する酵素が、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、３−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記方法を提供することである。
【００２８】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、さらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、前記方法を提供することである。
【００２９】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、さらに、前記目的物質以外の物質の取り込み系の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、前記方法を提供することである。
【００３０】
発明のさらなる側面は、前記取り込み系が、バニリン酸取り込み系、プロトカテク酸取り込み系、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記方法を提供することである。
【００３１】
発明のさらなる側面は、前記微生物が、さらに、前記目的物質の生産の際に副生物の生
産に関与する酵素の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記方法を提供することである。
【００３２】
発明のさらなる側面は、前記目的物質の生産の際に副生物の生産に関与する酵素が、バニリン酸デメチラーゼ、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記方法を提供することである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
＜１＞本発明の微生物
本明細書に記載の微生物は、特定のカルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR）遺伝子（例えば、Gordonia CAR遺伝子、Novosphingobium CAR遺伝子、またはCoccomyxa CAR遺伝子）を有する（すなわち、保持する）ように改変された、目的物質を生産する能力を有する微生物である。目的物質を生産する能力を、「目的物質生産能」ともいう。
【００３５】
＜１−１＞目的物質生産能を有する微生物
「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を生産することができる微生物を意味してよい。
【００３６】
「目的物質生産能を有する微生物」とは、同微生物が発酵法に用いられる場合にあっては、目的物質を発酵により生産することができる微生物を意味してよい。すなわち、「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を炭素源から生産することができる微生物を意味してよい。「目的物質生産能を有する微生物」とは、具体的には、培地（例えば、炭素源を含有する培地）で培養したときに、目的物質を生産し、回収できる程度に培地中に蓄積することができる微生物を意味してよい。
【００３７】
「目的物質生産能を有する微生物」とは、同微生物が生物変換法に用いられる場合にあっては、目的物質を生物変換により生産することができる微生物を意味してよい。すなわち、「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を該目的物質の前駆体から生産することができる微生物を意味してよい。「目的物質生産能を有する微生物」とは、具体的には、培地（例えば、目的物質の前駆体を含有する培地）で培養したときに、目的物質を生産し、回収できる程度に培地中に蓄積することができる微生物を意味してよい。また、「目的物質生産能を有する微生物」とは、具体的には、反応液中で目的物質の前駆体に作用させたときに、目的物質を生産し、回収できる程度に反応液中に蓄積することができる微生物を意味してよい。
【００３８】
目的物質生産能を有する微生物は、非改変株よりも多い量の目的物質を培地または反応液に蓄積することができる微生物であってよい。非改変株を、「非改変微生物の株」ともいう。「非改変株」とは、特定のCAR遺伝子を有するように改変されていない対照株を意味してよい。非改変株としては、特定のCAR遺伝子に代えて、特定のCAR遺伝子以外のCAR遺伝子、例えば、Nocardia brasiliensisのCAR遺伝子、を有する株が挙げられる。また、目的物質生産能を有する微生物は、0.01 g/L以上、0.05 g/L以上、または0.09 g/L以上の量の目的物質を培地または反応液に蓄積することができる微生物であってよい。
【００３９】
「目的物質」とは、アルデヒドを意味してよい。アルデヒドとしては、芳香族アルデヒドが挙げられる。芳香族アルデヒドとしては、バニリン（vanillin）、ベンズアルデヒド（benzaldehyde）、シンナムアルデヒド（cinnamaldehyde）が挙げられる。微生物は、１
種の目的物質を生産する能力を有していてもよく、２種またはそれ以上の目的物質を生産する能力を有していてもよい。また、微生物は、１種の目的物質前駆体から目的物質を生成する能力を有していてもよく、２種またはそれ以上の目的物質前駆体から目的物質を生成する能力を有していてもよい。
【００４０】
本明細書に記載の微生物を構築するために用いられる親株は特に制限されない。微生物としては、細菌や酵母が挙げられる。
【００４１】
細菌としては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。
【００４２】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００４３】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００４４】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００４５】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614
）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター属細菌やエルビニア属細菌には、パントエア属に再分類されたものもある（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345(1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345(1989)）。パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も包含されてよい。
【００４６】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００４７】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。
【００４８】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００４９】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００５０】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００５１】
酵母は出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。酵母は、一倍体の酵母であってもよく、二倍体またはそれ以上の倍数性の酵母であってもよい。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属、ピチア・シフェリイ（Pichia ciferrii）、ピチア・シドウィオラム（Pichia sydowiorum）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属（ウィッカーハモマイセス（Wickerhamomyces）属ともいう）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。
【００５２】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所P.O.
Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００５３】
微生物は、本来的に目的物質生産能を有するものであってもよく、目的物質生産能を有するように改変されたものであってもよい。目的物質生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物に目的物質生産能を付与することにより、または、上記のような微生物の目的物質生産能を増強することにより、取得できる。
【００５４】
以下、目的物質生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するような目的物質生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
目的物質は、目的物質の生合成に関与する酵素の作用により生成し得る。そのような酵素を、「目的物質生合成酵素」ともいう。よって、微生物は、目的物質生合成酵素を有していてよい。言い換えると、微生物は、目的物質生合成酵素をコードする遺伝子を有していてよい。そのような遺伝子を、「目的物質生合成遺伝子」ともいう。微生物は、本来的に目的物質生合成遺伝子を有するものであってもよく、目的物質生合成遺伝子が導入されたものであってもよい。遺伝子を導入する手法については本明細書に記載する。
【００５６】
また、目的物質生合成酵素の活性の増大により、微生物の目的物質生産能を向上させることができる。すなわち、目的物質生産能を付与又は増強するための方法としては、目的物質生合成酵素の活性を増大させる方法が挙げられる。すなわち、微生物は、目的物質生合成酵素の活性が増大するように改変されてよい。１種の目的物質生合成酵素の活性が増大してもよく、２種またはそれ以上の目的物質生合成酵素の活性が増大してもよい。タンパク質（酵素等）の活性を増大させる手法については本明細書に記載する。タンパク質（酵素等）の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大させることができる。
【００５７】
目的物質は、例えば、炭素源および／または該目的物質の前駆体から、生成し得る。よって、目的物質生合成酵素としては、例えば、炭素源および／または前駆体の目的物質への変換を触媒する酵素が挙げられる。例えば、３−デヒドロシキミ酸（3-dehydroshikimic acid）は、シキミ酸経路の一部によって生産され得る。当該シキミ酸経路の一部は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate synthase；DAHP synthase）、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）、および３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）により触媒されるステップを含んでいてよい。３−デヒドロシキミ酸は、３−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ（3-dehydroshikimate dehydratase；DHSD）の作用によりプロトカテク酸（protocatechuic acid）へと変換され得る。プロトカテク酸は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase；OMT）またはアルデヒドオキシドレダクターゼ（aldehyde oxidoreductase）（カルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR））の作用により、それぞれ、バニリン酸（vanillic
acid）またはプロトカテクアルデヒド（protocatechualdehyde）へと変換され得る。バニリン酸またはプロトカテクアルデヒドは、それぞれ、CARまたはOMTの作用により、バニリンへと変換され得る。また、ベンズアルデヒドおよびシンナムアルデヒドは、例えば、CARの作用により、それぞれ、安息香酸（benzoic acid）および桂皮酸（cinnamic acid）から生成し得る。すなわち、目的物質生合成酵素として、具体的には、例えば、DAHP synthase、3-dehydroquinate synthase、3-dehydroquinate dehydratase、DHSD、OMT、CARが挙げられる。特に、特定のCARの使用は、バニリン酸を中間体とするバニリンの生産に効果的であり得る。よって、バニリン生産およびそれに関連する事項は、バニリンが部分的または完全にバニリン酸を中間体として生成することを前提として記載する。
【００５８】
「３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate synthase；DAHP synthase）」とは、Ｄ−エリトロース４−リン酸とホスホエノールピルビン酸をＤ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸（DAHP）とリン酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 2.5.1.54）。DAHP synthaseをコードする遺伝子を、「DAHP synthase遺伝子」ともいう。DAHP synthaseとしては、aroF、aroG、aroH遺伝子にそれぞれコードされるAroF、A
roG、AroHタンパク質が挙げられる。これらの内、AroGが主要なDAHP synthaseとして機能し得る。AroF、AroG、AroHタンパク質等のDAHP synthaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。DAHP synthaseとして、具体的には、E. coliのAroF、AroG、AroHタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のaroG遺伝子の塩基配列を配列番号１に、同遺伝子がコードするAroGタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００５９】
DAHP synthase活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、Ｄ−エリトロース４−リン酸とホスホエノールピルビン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的なDAHPの生成を測定することにより、測定できる。
【００６０】
「３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）」とは、DAHPを脱リン酸化して３−デヒドロキナ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 4.2.3.4）。3-dehydroquinate synthaseをコードする遺伝子を、「3-dehydroquinate synthase遺伝子」ともいう。3-dehydroquinate synthaseとしては、aroB遺伝子にコードされるAroBタンパク質が挙げられる。AroBタンパク質等の3-dehydroquinate synthaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。3-dehydroquinate synthaseとして、具体的には、E. coliのAroBタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のaroB遺伝子の塩基配列を配列番号３に、同遺伝子がコードするAroBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００６１】
3-dehydroquinate synthase活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、DAHP）とインキュベートし、酵素および基質依存的な３−デヒドロキナ酸の生成を測定することにより、測定できる。
【００６２】
「３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）」とは、３−デヒドロキナ酸を脱水して３−デヒドロシキミ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 4.2.1.10）。3-dehydroquinate dehydrataseをコードする遺伝子を、「3-dehydroquinate dehydratase遺伝子」ともいう。3-dehydroquinate dehydrataseとしては、aroD遺伝子にコードされるAroDタンパク質が挙げられる。AroDタンパク質等の3-dehydroquinate dehydrataseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。3-dehydroquinate dehydrataseとして、具体的には、E. coliのAroDタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のaroD遺伝子の塩基配列を配列番号５に、同遺伝子がコードするAroDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００６３】
3-dehydroquinate dehydratase活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、３−デヒドロキナ酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な３−デヒドロシキミ酸の生成を測定することにより、測定できる。
【００６４】
「３−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ（3-dehydroshikimate dehydratase；DHSD）」とは、３−デヒドロシキミ酸を脱水してプロトカテク酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 4.2.1.118）。DHSDをコードする遺伝子を、「DHSD遺伝子」ともいう。DHSDとしては、asbF遺伝子にコードされるAsbFタンパク質が挙げられる。AsbFタンパク質等のDHSDとしては、Bacillus thuringiensis、Neurospora crassa、Podospora pauciseta等の各種生物のものが挙げられる。Bacillus thuringiensis BMB171株のasbF遺伝子の塩基配列を配列番号７に、同遺伝子がコードするAsbFタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００６５】
DHSD活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、３−デヒドロシキミ酸）とインキュベー
トし、酵素および基質依存的なプロトカテク酸の生成を測定することにより、測定できる。
【００６６】
シキミ酸経路の酵素（DAHP synthase、3-dehydroquinate synthase、3-dehydroquinate
dehydratase等）をコードする遺伝子の発現は、tyrR遺伝子にコードされるチロシンリプレッサーTyrRにより抑制される。よって、シキミ酸経路の酵素の活性は、チロシンリプレッサーTyrRの活性を低下させることによっても、増大させることができる。E. coli K-12
MG1655株のtyrR遺伝子の塩基配列を配列番号９に、同遺伝子がコードするTyrRタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００６７】
「Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase；OMT）」とは、プロトカテク酸をメチル化してバニリン酸を生成する反応（すなわち、プロトカテク酸のメタ位の水酸基のメチル化）を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 2.1.1.68等）。同活性を、「OMT活性」ともいう。OMTをコードする遺伝子を、「OMT遺伝子」ともいう。OMTは、さらに、メチル基供与体の存在下でプロトカテクアルデヒドをメチル化してバニリンを生成する反応（すなわち、プロトカテクアルデヒドのメタ位の水酸基のメチル化）を触媒してもよい。OMTは、通常はプロトカテク酸とプロトカテクアルデヒドの両方を使用してよいが、それには限られない。メチル基供与体としては、Ｓ−アデノシルメチオニン（SAM）が挙げられる。OMTとしては、各種生物のOMT、例えば、Homo sapiens（Hs）のOMT（GenBank Accession No. NP_000745, NP_009294）、Arabidopsis thalianaのOMT（GenBank Accession No. NP_200227, NP_00929４）、Fragaria x ananassaのOMT（GenBank Accession No. AAF28353）、その他WO2013/022881A1に例示されている哺乳動物、植物、微生物の各種OMTが挙げられる。Homo sapiensのOMT遺伝子には４つの転写バリアントおよび２種のOMTアイソフォームが知られている。それら４つの転写バリアント（transcript variant 1-4；GenBank Accession No. NM_000754.3, NM_001135161.1, NM_001135162.1, NM_007310.2）の塩基配列を配列番号１１〜１４に、長いOMTアイソフォーム（MB-COMT；GenBank Accession No. NP_000745.1）のアミノ酸配列を配列番号１５に、短いOMTアイソフォーム（S-COMT；GenBank Accession No. NP_009294.1）のアミノ酸配列を配列番号１６に、それぞれ示す。配列番号１６は、配列番号１５のＮ末端５０アミノ酸残基を欠くアミノ酸配列に相当する。
【００６８】
また、OMTは、副反応として、プロトカテク酸および／またはプロトカテクアルデヒドをメチル化してイソバニリン酸および／またはイソバニリンを生成する反応（すなわちパラ位の水酸基のメチル化）を触媒し得る。OMTは、メタ位の水酸基のメチル化を選択的に触媒してよい。「メタ位の水酸基のメチル化を選択的に触媒する」とは、プロトカテク酸からバニリン酸を選択的に生成すること、および／または、プロトカテクアルデヒドからバニリンを選択的に生成することを意味してよい。「プロトカテク酸からバニリン酸を選択的に生成する」とは、OMTをプロトカテク酸に作用させた際に、例えば、モル比で、イソバニリン酸の３倍以上、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、または３０倍以上のバニリン酸を生成することを意味してよい。また、「プロトカテクアルデヒドからバニリン酸を選択的に生成する」とは、OMTをプロトカテクアルデヒドに作用させた際に、例えば、モル比で、イソバニリンの３倍以上、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、または３０倍以上のバニリンを生成することを意味してよい。メタ位の水酸基のメチル化を選択的に触媒するOMTとしては、本明細書に記載の「特定の変異」を有するOMTが挙げられる。
【００６９】
「特定の変異」を有するOMTを、「変異型OMT」ともいう。また、変異型OMTをコードする遺伝子を、「変異型OMT遺伝子」ともいう。
【００７０】
「特定の変異」を有さないOMTを、「野生型OMT」ともいう。また、野生型OMTをコード
する遺伝子を、「野生型OMT遺伝子」ともいう。なお、「野生型」とは、「野生型」のOMTを「変異型」のOMTと区別するための便宜上の記載であり、天然に得られるものには限定されず、「特定の変異」を有さないあらゆるOMTを包含してよい。野生型OMTとしては、例えば、上記例示したOMTが挙げられる。また、上記例示したOMTの保存的バリアントは、「特定の変異」を有さない限り、いずれも野生型OMTとみなし得る。
【００７１】
「特定の変異」としては、WO2013/022881A1に記載の変異型OMTが有する変異が挙げられる。すなわち、「特定の変異」としては、野生型OMTの198位のロイシン残基（L198）が、ロイシン残基よりも疎水性インデックス（hydropathy index）が低いアミノ酸残基に置換される変異や、野生型OMTの199位のグルタミン酸残基（E199）が、pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基（amino acid residue having either a neutral
or positive side-chain charge at pH 7.4）に置換される変異が挙げられる。変異型OMTは、これらの変異のいずれか一方を有していてもよく、両方を有していてもよい。
【００７２】
「ロイシン残基よりも疎水性インデックス（hydropathy index）が低いアミノ酸残基」としては、Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyrが挙げられる。「ロイシン残基よりも疎水性インデックス（hydropathy index）が低いアミノ酸残基」としては、Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr等のアミノ酸残基が好ましく、Tyrがさらに好ましい。
【００７３】
「pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基」としては、Ala, Arg,
Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valが挙げられる。「pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基」としては、AlaまたはGlnが特に好ましい。
【００７４】
任意の野生型OMTにおける「L198」および「E199」とは、それぞれ、「配列番号１６に示すアミノ酸配列の198位のロイシン残基に相当するアミノ酸残基」および「配列番号１６に示すアミノ酸配列の199位のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基」を意味してよい。これらのアミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列において、Ｘ位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した、または挿入された場合、元のＸ位のアミノ酸残基は、それぞれ、Ｎ末端から数えてＸ−１番目またはＸ＋１番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号１６に示すアミノ酸配列のＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。また、「L198」および「E199」は、それぞれ、通常はロイシン残基およびグルタミン酸残基であるが、そうでなくてもよい。すなわち、「特定の変異」には、「L198」および「E199」がそれぞれロイシン残基およびグルタミン酸残基でない場合に、当該アミノ酸残基を上述した変異後のアミノ酸残基に置換する変異も包含されてよい。
【００７５】
任意のOMTのアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「L198」または「E199」であるかは、当該任意のOMTのアミノ酸配列と配列番号１６に示すアミノ酸配列とのアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et
al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【００７６】
変異型OMT遺伝子は、例えば、野生型OMT遺伝子を、コードされるOMTが「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変の元になる野生型OMT遺伝子は、例えば、野生型OMT遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により
、取得できる。また、変異型OMT遺伝子は、野生型OMT遺伝子を介さずに取得することもできる。変異型OMT遺伝子は、例えば、化学合成により直接取得してもよい。取得した変異型OMT遺伝子は、そのまま、あるいはさらに改変して利用してよい。
【００７７】
遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel,
T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
【００７８】
OMT活性等の、メタ位の水酸基をメチル化する活性は、例えば、SAMの存在下で酵素を基質（すなわち、プロトカテク酸またはプロトカテクアルデヒド）とインキュベートし、酵素および基質依存的なプロダクト（すなわち、バニリン酸またはバニリン）の生成を測定することにより、測定できる（WO2013/022881A1）。また、同様の条件下でのバイプロダクト（すなわち、イソバニリン酸またはイソバニリン）の生成を測定し、プロダクトの生成と比較することにより、OMTがプロダクトを選択的に生成するかどうかを決定できる。
【００７９】
carboxylic acid reductase（CAR）については、「特定のcarboxylic acid reductase遺伝子の導入」において後述する。
【００８０】
CARは、ホスホパンテテイニル化されることにより活性型酵素となり得る（J. Biol. Chem. 2007, Vol. 282, No.1, p478-485）。よって、タンパク質のホスホパンテテイニル化を触媒する酵素（「ホスホパンテテイニル化酵素」ともいう）の活性を増大させることにより、CARの活性を増大させることができる。すなわち、目的物質生産能を付与又は増強するための方法としては、ホスホパンテテイニル化酵素の活性を増大させる方法が挙げられる。すなわち、微生物は、ホスホパンテテイニル化酵素の活性が増大するように改変されていてよい。ホスホパンテテイニル化酵素としては、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase；PPT）が挙げられる。
【００８１】
「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase；PPT）」とは、ホスホパンテテイニル基供与体の存在下でCARをホスホパンテテイニル化する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい。同活性を、「PPT活性」ともいう。PPTをコードする遺伝子を、「PPT遺伝子」ともいう。ホスホパンテテイニル基供与体としては、補酵素A（CoA）が挙げられる。PPTとしては、entD遺伝子にコードされるEntDタンパク質が挙げられる。EntDタンパク質等のPPTとしては、各種生物のものが挙げられる。PPTとして、具体的には、E. coliのEntDタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のentD遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、同遺伝子がコードするEntDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に、それぞれ示す。また、PPTとして、具体的には、Nocardia brasiliensisのPPT、Nocardia farcinica IFM10152のPPT（J. Biol. Chem. 2007, Vol. 282, No.1, pp.478-485）、Corynebacterium glutamicumのPPT（App. Env. Microbiol. 2009, Vol.75, No.9, pp.2765-2774）も挙げられる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032株のPPT遺伝子の塩基配列を配列番号２３に、同遺伝子がコードするPPTのアミノ酸配列を配列番号２４に、それぞれ示す。
【００８２】
PPT活性は、例えば、CoAの存在下で酵素をCARとインキュベートし、CAR活性の増強を指標として測定することができる（J. Biol. Chem. 2007, Vol.282, No.1, pp.478-485）。
【００８３】
また、上述したように、ベンズアルデヒドおよびシンナムアルデヒドは、例えば、それぞれ、安息香酸および桂皮酸から生成し得る。すなわち、目的物質生合成酵素としては、
例えば、安息香酸生合成酵素や桂皮酸生合成酵素も挙げられる。具体的には、桂皮酸は、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（phenylalanine ammonia lyase；PAL；EC
4.3.1.24）の作用によりＬ−フェニルアラニンから生成し得る。すなわち、桂皮酸生合成酵素としては、例えば、Ｌ−フェニルアラニン生合成酵素やPALが挙げられる。Ｌ−フェニルアラニン生合成酵素としては、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase；aroF, aroG, aroH）、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase；aroB）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase；aroD）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（shikimate dehydrogenase；aroE）、シキミ酸キナーゼ（shikimate kinase；aroK, aroL）、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase；aroA）、コリスミ酸シンターゼ（chorismate synthase；aroC）等の芳香族アミノ酸に共通の生合成酵素や、コリスミ酸ムターゼ（chorismate mutase；tyrA）、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（prephenate dehydrogenase；tyrA）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（tyrosine amino transferase；tyrB）が挙げられる。コリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、二機能酵素としてtyrA遺伝子にコードされてよい。
【００８４】
また、目的物質生産能を付与又は増強するための方法としては、目的物質以外の物質（例えば、目的物質の生産中に中間体として生成する物質や、目的物質の前駆体として利用される物質）の取り込み系の活性を増大させる方法が挙げられる。すなわち、微生物は、そのような取り込み系の活性が増大するように改変されていてよい。「物質の取り込み系」とは、物質を細胞外から細胞内へ取り込む機能を有するタンパク質を意味してよい。同活性を、「物質の取り込み活性」ともいう。そのような取り込み系をコードする遺伝子を、「取り込み系遺伝子」ともいう。そのような取り込み系としては、バニリン酸取り込み系やプロトカテク酸取り込み系が挙げられる。バニリン酸取り込み系としては、vanK遺伝子にコードされるVanKタンパク質が挙げられる（M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865）。C. glutamicum ATCC 13869株のvanK遺伝子（NCgl2302）の塩基配列を配列番号２５に、同遺伝子がコードするVanKタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２６に、それぞれ示す。プロトカテク酸取り込み系としては、pcaK遺伝子にコードされるPcaKタンパク質が挙げられる（M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865）。C. glutamicum ATCC 13869株のpcaK遺伝子（NCgl1031）の塩基配列を配列番号２７に、同遺伝子がコードするPcaKタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に、それぞれ示す。
【００８５】
物質の取り込み活性は、例えば、公知の手法（M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865）により測定することができる。
【００８６】
また、目的物質生産能を付与又は増強するための方法としては、目的物質以外の物質の副生に関与する酵素の活性を低下させる方法が挙げられる。そのような目的物質以外の物質を、「副生物」ともいう。そのような酵素を、「副生物生成酵素」ともいう。「副生物生成酵素」とは、具体的には、目的物質の生産の際に副生物の生産に関与する酵素を意味してよい。副生物生成酵素としては、例えば、目的物質の資化に関与する酵素や、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の物質を生成する反応を触媒する酵素が挙げられる。タンパク質（酵素等）の活性を低下させる手法については本明細書に記載する。タンパク質（酵素等）の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。例えば、コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている（Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65）。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、バニリンからプロトカテク酸への変換を触媒する酵素や、プロトカテク酸のさらなる代謝を触媒する酵素が挙げられる。そのような酵素としては、バニリン酸デメチラ
ーゼ（vanillate demethylase）、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ（protocatechuate 3,4-dioxygenase）、およびプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼによる反応産物をスクシニルCoAとアセチルCoAまでさらに分解する各種酵素（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, Vol.95, p77-89）が挙げられる。また、バニリン等のアルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase）の作用により、バニリルアルコール等の対応するアルコールへと変換され得る（Kunjapur AM. et al., J. Am. Chem. Soc., 2014, Vol.136, p11644-11654.; Hansen EH. et al., App. Env. Microbiol., 2009, Vol.75, p2765-2774.）。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、alcohol dehydrogenase（ADH）も挙げられる。また、バニリン生合成経路の中間体である３−デヒドロシキミ酸は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（shikimate dehydrogenase）の作用によりシキミ酸へと変換され得る。すなわち、バニリン生産における副生物生成酵素として、具体的には、shikimate dehydrogenaseも挙げられる。
【００８７】
「バニリン酸デメチラーゼ（vanillate demethylase）」とは、バニリン酸を脱メチル化してプロトカテク酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい。同活性を、「バニリン酸デメチラーゼ活性」ともいう。バニリン酸デメチラーゼをコードする遺伝子を、「バニリン酸デメチラーゼ遺伝子」ともいう。バニリン酸デメチラーゼとしては、vanAB遺伝子にコードされるVanABタンパク質が挙げられる（Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65）。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれ、バニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。バニリン酸デメチラーゼ活性を低下させる場合、例えば、vanAB遺伝子の両方を破壊等してもよく、片方のみを破壊等してもよい。C. glutamicum ATCC 13869株のvanAB遺伝子の塩基配列を配列番号２９と３１に、同遺伝子がコードするVanABタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３０と６０３２に、それぞれ示す。なお、vanAB遺伝子は、通常、vanK遺伝子とvanABKオペロンを構成している。よって、バニリン酸デメチラーゼ活性を低下させるためにvanABKオペロンをまとめて破壊等（例えば、欠損）してもよい。その場合、改めて宿主にvanK遺伝子を導入してもよい。例えば、菌体外に存在するバニリン酸を利用する場合であって、vanABKオペロンをまとめて破壊等（例えば、欠損）した場合は、改めてvanK遺伝子を導入するのが好ましい。
【００８８】
バニリン酸デメチラーゼ活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、バニリン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的なプロトカテク酸の生成を測定することにより、測定できる（J Bacteriol, 2001, Vol.183, p3276-3281）。
【００８９】
「プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ」とは、プロトカテク酸を酸化してβ−カルボキシルcis,cis-ムコン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい。同活性を、「プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ活性」ともいう。プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を、「プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子」ともいう。プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼとしては、pcaGH遺伝子にコードされるPcaGHタンパク質が挙げられる（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, Vol.95, p77-89）。pcaG遺伝子およびpcaH遺伝子は、それぞれ、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼのαサブユニットおよびβサブユニットをコードする。プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ活性を低下させる場合、例えば、pcaGH遺伝子の両方を破壊等してもよく、片方のみを破壊等してもよい。C. glutamicum ATCC 13032株のpcaGH遺伝子の塩基配列を配列番号３３と３５に、同遺伝子がコードするPcaGHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３４と３６に、それぞれ示す。
【００９０】
プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、プロトカテク酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な酸素消費を測定することにより、測定できる（Meth. Enz., 1970, Vol.17A, p526-529）。
【００９１】
「アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase；ADH）」とは、電子供与体の存在下でアルデヒドを還元してアルコールを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.71等）。同活性を、「ADH活性」ともいう。ADHをコードする遺伝子を、「ADH遺伝子」ともいう。ADHの基質となるアルデヒドとしては、本明細書に記載の方法における目的物質として例示されたアルデヒド、例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド等の芳香族アルデヒド、が挙げられる。すなわち、「ADH活性」の定義において言及されるアルデヒドとアルコールの組み合わせとしては、芳香族アルデヒドとそれに対応する芳香族アルコールの組み合わせ、例えば、バニリンとバニリルアルコール（vanillyl alcohol）の組み合わせ、ベンズアルデヒドとベンジルアルコール（benzyl alcohol）の組み合わせ、シンナムアルデヒドとシンナミルアルコール（cinnamyl alcohol）の組み合わせ、が挙げられる。芳香族アルデヒド、バニリン、ベンズアルデヒド、またはシンナムアルデヒドを利用するADHを、それぞれ、「芳香族アルコールデヒドロゲナーゼ（aromatic alcohol dehydrogenase）」、「バニリルアルコールデヒドロゲナーゼ（vanillyl alcohol dehydrogenase）」、「ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（benzyl alcohol dehydrogenase）」、または「シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（cinnamyl alcohol dehydrogenase）」ともいう。また、芳香族アルデヒド、バニリン、ベンズアルデヒド、またはシンナムアルデヒドを基質とするADH活性を、それぞれ、「aromatic alcohol dehydrogenase活性」、「vanillyl alcohol dehydrogenase活性」、「benzyl alcohol dehydrogenase活性」、または「cinnamyl alcohol dehydrogenase活性」ともいう。ADHは、１種のアルコールを利用してもよく、２種またはそれ以上のアルコールを利用してもよい。電子供与体としては、NADHやNADPHが挙げられる。
【００９２】
ADHとしては、yqhD遺伝子、NCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子、NCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子にそれぞれコードされるYqhDタンパク質、NCgl0324タンパク質、NCgl0313タンパク質、NCgl2709タンパク質、NCgl0219タンパク質、NCgl2382タンパク質が挙げられる。yqhD遺伝子は、例えば、E. coli等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌に見出され得る。NCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子、NCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子は、例えば、C. glutamicum等のコリネ型細菌に見出され得る。E. coli K-12 MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列を配列番号３７に、同遺伝子がコードするYqhDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。C. glutamicum ATCC 13869株のNCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子の塩基配列を配列番号３９、４１、４３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４０、４２、４４に、それぞれ示す。また、C. glutamicum ATCC 13032株のNCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子の塩基配列を配列番号４５、４７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４６、４８に、それぞれ示す。
【００９３】
１種のADHの活性を低下させてもよく、２種またはそれ以上のADHの活性を低下させてもよい。例えば、１種またはそれ以上のADH（例えば、NCgl0324タンパク質、NCgl2709タンパク質、およびNCgl0313タンパク質等の全てのADH）の活性を低下させてよい。また、少なくとも、NCgl0324タンパク質およびNCgl2709タンパク質の一方または両方の活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、少なくともNCgl0324タンパク質の活性を低下させてもよく、さらにNCgl2709タンパク質の活性を低下させてもよい。あるいは、少なくともNCgl2709タンパク質の活性を低下させてもよく、さらにNCgl0324タンパク質の活性を低下させてもよい。ADHと目的物質の組み合わせは、コリネ型細菌においてADHの活性を低下させることにより目的物質の生産が増大する限り、特に制限されない。例えば、少なくとも目的物質として生産されるアルデヒドを利用するADHの活性を低下させてよい。すなわち、例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド等の芳香族アルデヒドの生産のためには、それぞれ、vanillyl alcohol dehydrogenase、benzyl alcohol dehydrogenase
、cinnamyl alcohol dehydrogenase等のaromatic alcohol dehydrogenaseの活性を低下させてよい。具体的には、例えば、バニリンを生産する場合、YqhDタンパク質の活性を低下させてよい。また、具体的には、例えば、バニリンを生産する場合、NCgl0324タンパク質およびNCgl0313タンパク質の一方または両方の活性を低下させてもよく、少なくともNCgl0324タンパク質の活性を低下させてもよい。また、具体的には、ベンズアルデヒドを生産する場合、NCgl0324タンパク質およびNCgl2709タンパク質の一方または両方の活性を低下させてもよい。また、具体的には、シンナムアルデヒドを生産する場合、NCgl0324タンパク質およびNCgl2709タンパク質の一方または両方の活性を低下させてもよい。YqhDタンパク質は、vanillyl alcohol dehydrogenase活性を有していてよい。NCgl0324タンパク質は、vanillyl alcohol dehydrogenase活性、benzyl alcohol dehydrogenase活性、およびcinnamyl alcohol dehydrogenase活性の全てを有していてよい。NCgl2709タンパク質は、benzyl alcohol dehydrogenase活性およびcinnamyl alcohol dehydrogenase活性の両方を有していてよい。
【００９４】
ADH活性は、例えば、NADPHまたはNADHの存在下で酵素を基質（すなわち、バニリン等のアルデヒド）とインキュベートし、酵素および基質依存的なNADPHまたはNADHの酸化を測定することにより、測定できる。ADH活性は、少なくとも１つの適切な条件下、例えば、NADPHまたはNADH等の適切な電位供与体の存在下、で検出されればよい。
【００９５】
「シキミ酸デヒドロゲナーゼ（shikimate dehydrogenase）」とは、電子供与体の存在下で３−デヒドロシキミ酸を還元してシキミ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 1.1.1.25）。同活性を、「shikimate dehydrogenase活性」ともいう。shikimate dehydrogenaseをコードする遺伝子を、「shikimate dehydrogenase遺伝子」ともいう。電子供与体としては、NADHやNADPHが挙げられる。shikimate dehydrogenaseとしては、aroE遺伝子にコードされるAroEタンパク質が挙げられる。E. coli K-12
MG1655のaroE遺伝子の塩基配列を配列番号４９に、同遺伝子がコードするAroEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５０に示す。
【００９６】
shikimate dehydrogenase活性は、例えば、NADHまたはNADPHの存在下で酵素を基質（すなわち、３−デヒドロシキミ酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的なNADHまたはNADPHの酸化を測定することにより、測定できる。
【００９７】
改変された活性を有するタンパク質は、目的物質が生産される生合成経路の種類、および微生物が本来的に有するタンパク質の種類や活性に応じて適宜選択できる。例えば、バニリンをプロトカテク酸からの生物変換法により製造する場合は、OMT、CAR、PPT、およびプロトカテク酸取り込み系等の１種またはそれ以上のタンパク質の活性を増大させるのが好ましい場合がある。また、バニリンをバニリン酸からの生物変換法により製造する場合は、CAR、PPT、およびバニリン酸取り込み系等の１種またはそれ以上のタンパク質の活性を増大させるのが好ましい場合がある。本明細書に記載の微生物は特定のCAR遺伝子を有するように改変されているため、少なくともCAR活性が増強されてよい。
【００９８】
目的物質生産能を有する微生物の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、例えば、上記例示した又はその他公知の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、目的物質生産能を有する微生物の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質（例えば、上記例示した又はその他公知の塩基配列およびアミノ酸配列を有する遺伝子およびタンパク質）の保存的バリアントであってもよい。具体的には、例えば、目的物質生産能を有する微生物の育種に使用される遺伝子は、元の機能（すなわち、酵素活性やトランスポーター活性等）が維持されている限り、上記例示したアミノ酸配列や公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸
配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、後述するCAR遺伝子およびCARの保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【００９９】
＜１−２＞特定のcarboxylic acid reductase遺伝子の導入
本明細書に記載の微生物は、特定のカルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR）遺伝子を有するように改変されている。CAR遺伝子を有する微生物を、「CARを有する微生物」ともいう。特定のCAR遺伝子を有するように微生物を改変することによって、同微生物の目的物質生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物を用いた目的物質の生産を増大させることができる。すなわち、微生物について、非改変株と比較して、目的物質生産能の向上および目的物質の生産の増大が得られる。目的物質の生産の増大は、目的物質の生産の絶対的な程度（例えば、絶対量や絶対収率）の増大であってもよく、副生物に対する目的物質の生産の相対的な程度（例えば、相対量や相対収率）の増大であってもよい。副生物としては、例えば、バニリン生産について、プロトカテクアルデヒドやイソバニリンが挙げられる。精製工程において、或るアルデヒド（例えば、バニリン）を他のアルデヒド（例えば、プロトカテクアルデヒドやイソバニリン）と分離することは困難であり得る。よって、バニリン等の目的物質の生産の増大により、例えば、精製コストが削減され得る。
【０１００】
微生物は、目的物質生産能を有する微生物を、特定のCAR遺伝子を有するように改変することにより取得できる。また、微生物は、特定のCAR遺伝子を有するように微生物を改変した後に、目的物質生産能を付与または増強することによっても取得できる。なお、微生物は、特定のCAR遺伝子を有するようになる改変により、あるいは特定のCAR遺伝子を有するようになる改変と目的物質生産能を付与または増強するための他の改変との組み合わせにより、目的物質生産能を獲得したものであってもよい。微生物を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【０１０１】
「アルデヒドオキシドレダクターゼ（aldehyde oxidoreductase）（カルボン酸レダクターゼ（carboxylic acid reductase；CAR））」とは、電子供与体とATPの存在下でカルボン酸を還元して対応するアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 1.2.99.6等）。同活性を、「CAR活性」ともいう。CARをコードする遺伝子を、「CAR遺伝子」ともいう。CARとしては、本明細書に記載の方法において目的物質として生産されるアルデヒドに対応するカルボン酸を少なくとも使用するものが用いられる。すなわち、CARの産物として生成するアルデヒドとしては、本明細書に記載の方法における目的物質として例示されたアルデヒド、例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド等の芳香族アルデヒド、が挙げられる。すなわち、「CAR活性」の定義において言及されるカルボン酸とアルデヒドの組み合わせとしては、芳香族カルボン酸とそれに対応する芳香族アルデヒドの組み合わせ、例えば、バニリン酸とバニリンの組み合わせ、安息香酸とベンズアルデヒドの組み合わせ、桂皮酸とシンナムアルデヒドの組み合わせ、が挙げられる。言い換えると、例えば、バニリンの生産に用いられるCARの「CAR活性」とは、バニリン酸を還元してバニリンを生成する反応を触媒する活性を意味してよい。芳香族カルボン酸を使用するCARを、「芳香族アルデヒドオキシドレダクターゼ（aromatic aldehyde oxidoreductase）（芳香族カルボン酸レダクターゼ（aromatic carboxylic acid reductase；ACAR））」ともいう。また、芳香族カルボン酸が基質となる場合のCAR活性を、「ACAR活性」ともいう。特定のCARは、ACAR活性を有していてよい。CARは、１種のカルボン酸を使用してもよく、２種またはそれ以上のカルボン酸を使用してもよい。電子供与体としては、NADHやNADPHが挙げられる。
【０１０２】
CARは、さらに、電子供与体とATPの存在下でプロトカテク酸および／またはイソバニリン酸を還元してプロトカテクアルデヒドおよび／またはイソバニリンを生成する反応を触
媒してもよい。CARは、バニリンの生成を選択的に触媒してよい。「バニリンの生成を選択的に触媒する」とは、CARをバニリン酸に作用させた際に、例えば、モル比で、プロトカテクアルデヒド（プロトカテク酸を基質とすること以外はバニリン生成と同様の条件下で生成するもの）およびイソバニリン（イソバニリン酸を基質とすること以外はバニリン生成と同様の条件下で生成するもの）のそれぞれまたはいずれかの１．１倍以上、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、または３０倍以上のバニリンを生成することを意味してよい。
【０１０３】
CAR活性は、例えば、ATPおよびNADPHの存在下で酵素を基質（例えば、バニリン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的なNADPHの酸化を測定することにより、測定できる（J. Biol. Chem. 2007, Vol. 282, No.1, p478-485に記載の手法を改変）。また、プロトカテク酸またはイソバニリン酸を基質とすること以外は同様の条件下でのプロトカテクアルデヒドまたはイソバニリンの生成を測定し、バニリンの生成と比較することにより、CARがバニリンの生成を選択的に触媒するかどうかを決定できる。特定のCARは、少なくとも１つの適切な条件下で測定されるCAR活性を有していればよい。なお、本願で言及される他の全てのタンパク質についても、少なくとも１つの適切な条件下で測定される各活性を有していればよい。
【０１０４】
「特定のCAR遺伝子」とは、特定のCARをコードする遺伝子を意味してよい。特定のCAR遺伝子としては、Gordonia CAR遺伝子、Novosphingobium CAR遺伝子、Coccomyxa CAR遺伝子が挙げられる。特定のCARとしては、Gordonia CAR、Novosphingobium CAR、Coccomyxa CARが挙げられる。「Gordonia CAR遺伝子」とは、Gordonia CARをコードする遺伝子を意味してよい。「Gordonia CAR」とは、Gordonia属細菌に見出されるCARおよび特定の範囲のそのバリエーション（例えば、保存的バリアント）を総称してよい。「Novosphingobium CAR遺伝子」とは、Novosphingobium CARをコードする遺伝子を意味してよい。「Novosphingobium CAR」とは、Novosphingobium属細菌に見出されるCARおよび特定の範囲のそのバリエーション（例えば、保存的バリアント）を総称してよい。「Coccomyxa CAR遺伝子」とは、Coccomyxa CARをコードする遺伝子を意味してよい。「Coccomyxa CAR」とは、Coccomyxa属藻類に見出されるCARおよび特定の範囲のそのバリエーション（例えば、保存的バリアント）を総称してよい。
【０１０５】
Gordonia属細菌としては、Gordonia effusaが挙げられる。すなわち、Gordonia CAR遺伝子およびGordonia CARとしては、Gordonia effusaのCAR遺伝子およびCARが挙げられる。Gordonia effusaのCAR遺伝子の塩基配列を配列番号１７に、同遺伝子がコードするCARのアミノ酸配列を配列番号１８に示す。Novosphingobium属細菌としては、Novosphingobium malaysienseが挙げられる。すなわち、Novosphingobium CAR遺伝子およびNovosphingobium CARとしては、Novosphingobium malaysienseのCAR遺伝子およびCARが挙げられる。Novosphingobium malaysienseのCAR遺伝子の塩基配列を配列番号７８に、同遺伝子がコードするCARのアミノ酸配列を配列番号７９に示す。Coccomyxa属藻類としては、Coccomyxa subellipsoideaが挙げられる。すなわち、Coccomyxa CAR遺伝子およびCoccomyxa CARとしては、Coccomyxa subellipsoideaのCAR遺伝子およびCARが挙げられる。Coccomyxa subellipsoidea C-169のCAR遺伝子（cDNA）の塩基配列を配列番号８２に、同遺伝子がコードするCARのアミノ酸配列を配列番号８３に示す。すなわち、特定のCAR遺伝子は、例えば、配列番号１７、７８、または８２に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、特定のCARは、例えば、配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「遺伝子またはタンパク質が塩基配列またはアミノ酸配列を有する」という表現は、特記しない限り、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列またはアミノ酸配列を含むことを意味してよく、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列またはアミノ酸配列からなる場合も包含してよい。
【０１０６】
特定のCAR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したCAR遺伝子（例えば、配列番号１７、７８、または８２に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、特定のCARは、元の機能が維持されている限り、上記例示したCAR（例えば、配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。すなわち、特定のCAR遺伝子および特定のCARとしては、そのような保存的バリアントも挙げられる。そのような保存的バリアントは、Gordonia属細菌、Novosphingobium属細菌、またはCoccomyxa属藻類に見出されてもよく、見出されなくてもよい。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した遺伝子やタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【０１０７】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば、活性や性質）に対応する機能（例えば、活性や性質）を有することを意味してよい。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることを意味してよい。すなわち、CAR遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがCARをコードすることを意味してよい。また、CARについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがCAR活性を有することを意味してよい。
【０１０８】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【０１０９】
特定のCAR遺伝子のホモログまたは特定のCARのホモログは、例えば、上記例示したCAR遺伝子の塩基配列または上記例示したCARのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、特定のCAR遺伝子のホモログは、例えば、Gordonia属細菌、Novosphingobium属細菌、またはCoccomyxa属藻類等の生物の染色体を鋳型にして、上記例示したCAR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【０１１０】
特定のCAR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号１８、７９、または８３に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお、上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個であってよい。
【０１１１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の元の機能が維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置
換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【０１１２】
また、特定のCAR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、または99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）とは、「同一性」（identity）を意味する。
【０１１３】
また、特定のCAR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号１７、７８、または８２に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、例えばDNA、であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味してよい。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、または99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【０１１４】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１１５】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので特定のCAR遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、特定のCAR遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示したCAR遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、特定のCAR遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドン最適化された特定のCAR遺伝子としては、E. coliのコドン使用に応じてコドン最適化されている、配列番号７７、８１、または８５に示す塩基配列を有するCAR遺伝子が挙げられる。
【０１１６】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【０１１７】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（すなわち、アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol.
Biol. 24:307-331によく記載されている。
【０１１８】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLASTを、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【０１１９】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【０１２０】
なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、目的物質生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【０１２１】
特定のCAR遺伝子を微生物に導入することにより、同遺伝子を有するように微生物を改変することができる。
【０１２２】
特定のCAR遺伝子を微生物に導入する手法は特に制限されない。特定のCAR遺伝子は、使用可能に微生物により保持されていればよい。微生物は、１コピーの特定のCAR遺伝子を有していてもよく、２コピーまたはそれ以上の特定のCAR遺伝子を有していてもよい。微生物は、１種の特定のCAR遺伝子を有していてもよく、２種またはそれ以上の特定のCAR遺伝子を有していてもよい。特定のCAR遺伝子は、「タンパク質の活性を増大させる手法」において後述する遺伝子の導入と同様にして微生物に導入することができる。
【０１２３】
微生物は、特定のCAR遺伝子以外のCAR遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。
【０１２４】
＜１−３＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法（遺伝子を導入する手法も含む）について記載する。
【０１２５】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大
することを意味してよい。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株に対して増大していることを意味してよい。「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味してよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各微生物種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、微生物の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち微生物が属する種の基準株）と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、E. coli K-12 MG1655株と比較して増大してもよい。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（mRNA量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【０１２６】
タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【０１２７】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（mRNA量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
【０１２８】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【０１２９】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Mill
er, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【０１３０】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【０１３１】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであってよい。また、形質転換体を選択するために、好ましくは、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有する。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF DNA（タカラバイオ）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（WO2007/046389）；pVS7（WO2013/069634）；pVC7（特開平9-070291）が挙げられる。
【０１３２】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、宿主により発現可能に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターを意味してよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する
遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するようなより強力なプロモーターを利用してもよい。
【０１３３】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【０１３４】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【０１３５】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が使用可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する」とは、例えば、２またはそれ以上のタンパク質（例えば、酵素）をそれぞれコードする遺伝子を導入すること、単一のタンパク質複合体（例えば、酵素複合体）を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入すること、およびそれらの組み合わせを包含してよい。
【０１３６】
導入される遺伝子は、宿主で機能できるタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
【０１３７】
なお、タンパク質が複数のサブユニットを有する複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それらのサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構
成する各サブユニットは、複合体が標的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０１３８】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称であってよい。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【０１３９】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味してよい。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌で機能するより強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０１４０】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、mRNAの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味してよい。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene,
1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０１４１】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺
伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０１４２】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０１４３】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１４４】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（desensitization to feedback inhibition）も包含されてよい。すなわち、タンパク質が代謝物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が脱感作された変異型タンパク質をコードする遺伝子を宿主に保持させることにより、タンパク質の活性を増大させることができる。なお、「フィードバック阻害の脱感作」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含されてよい。また、「フィードバック阻害が脱感作されている」（すなわちフィードバック阻害が低減又は解除されている）ことを「フィードバック阻害に耐性」ともいう。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０１４５】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., 1977. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。
【０１４６】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１４７】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０１４８】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Sambrook, J., et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１４９】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１５０】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、特定のCAR遺伝子の導入に加えて、任意のタンパク質（例えば、目的物質生合成酵素、ホスホパンテテイニル化酵素、および物質の取り込み系）の活性増強や、任意の遺伝子（例えば、それら任意のタンパク質をコードする遺伝子）の発現増強に利用できる。
【０１５１】
＜１−３＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について記載する。
【０１５２】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味してよい。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して減少していることを意味してよい。「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味してよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各微生物種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、微生物の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち微生物が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、E. coli K-12 MG1655株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含されてよい。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（mRNA量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含されてよい。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含されてよい。タ
ンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１５３】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して減少することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（mRNA量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含されてよい。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１５４】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、１塩基以上、２塩基以上、または３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味してよい。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０１５５】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味してよい。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（例えば、活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合も包含されてよい。
【０１５６】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失を意味してよい。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化し得る。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域
全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
【０１５７】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１〜２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０１５８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化し得る。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０１５９】
遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失を意味する。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることを意味してよく、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含されてよい。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。アミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
【０１６０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子が挿入された遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は
、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０１６１】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０１６２】
上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１６３】
なお、タンパク質が複数のサブユニットを有する複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それらのサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それらのアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０１６４】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１６５】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１６６】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１６７】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１６８】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の
塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１６９】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質（例えば、副生物生成酵素）の活性低下や、任意の遺伝子（例えば、それら任意のタンパク質をコードする遺伝子）の発現低下に利用できる。
【０１７０】
＜２＞本発明の方法
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の微生物を利用して目的物質を製造する方法である。
【０１７１】
＜２−１＞発酵法
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物の発酵により製造することができる。すなわち、本明細書に記載の方法の一態様は、微生物の発酵により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「発酵法」ともいう。また、微生物の発酵により目的物質を製造する工程を、「発酵工程」ともいう。
【０１７２】
発酵工程は、本明細書に記載の微生物を培養することにより実施できる。具体的には、発酵工程において、目的物質は、炭素源から製造することができる。すなわち、発酵工程は、例えば、微生物を培地（例えば、炭素源を含有する培地）で培養し、目的物質を該培地中に生成蓄積する工程であってよい。すなわち、発酵法は、微生物を培地（例えば、炭素源を含有する培地）で培養し、目的物質を該培地中に生成蓄積することにより、目的物質を製造する方法であってよい。また、言い換えると、発酵工程は、例えば、微生物を利用して炭素源から目的物質を製造する工程であってよい。
【０１７３】
使用する培地は、微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌や酵母等の微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分等の培地成分を必要に応じて含有してよい。培地成分の種類や濃度は、使用する微生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１７４】
炭素源は、微生物が資化でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉の加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、クエン酸、コハク酸、グルコン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。なお、炭素源としては、特に、植物由来原料を用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、精製物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の５炭糖、グルコース等の６炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して５炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して６炭糖を生成させてもよい。また、キシロースは、例えば、微生物にグルコース等の６炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、６炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１７５】
培地中の炭素源の濃度は、微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地中の炭素源の濃度は、例えば、目的物質の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くしてよい。培地中の炭素源の初発濃度は、例えば、通常5〜30w/v%、または10〜20w/v%であってよい。また、適宜、炭素源を培地に追加で供給してもよい。例えば、発酵の進行に伴う炭素源の減少または枯渇に応じて、炭素源を培地に追加で供給してもよい。最終的に目的物質が生産される限り炭素源は一時的に枯渇してもよいが、培養は、炭素源が枯渇しないように、あるいは炭素源が枯渇した状態が継続しないように、実施するのが好ましい場合がある。
【０１７６】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１７７】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１７８】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０１７９】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１８０】
また、生育にアミノ酸等の栄養素を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、そのような栄養素を培地に補填するのが好ましい。また、目的物質の生産に利用される成分を培地に補填してもよい。そのような成分として、具体的には、例えば、メチル基供与体（例えば、SAM）やそれらの前駆体（例えば、メチオニン）が挙げられる。
【０１８１】
培養条件は、微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌や酵母等の微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する微生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１８２】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、例えば、微生物を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、微生物を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。目的物質は、少なくとも本培養の期間に生産されればよい。培養開始時に培地に含有される微生物の量は特に制限されない。例えば、OD660＝4〜100の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して0.1質量％〜100質量％、または1質量％〜50質量％、添加してよい。
【０１８３】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（例えば、発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、種培養と本培養の培養形態は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよく、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０１８４】
炭素源等の各種成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。すなわち、培養の過程において、炭素源等の各種成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、培地に追加で供給してもよい。これらの成分は、いずれも、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
【０１８５】
培養は、例えば、好気条件で実施してよい。「好気条件」とは、培地中の溶存酸素濃度が、0.33ppm以上、または1.5ppm以上である条件を意味してよい。酸素濃度は、具体的には、例えば、飽和酸素濃度に対し、1〜50％、または5％程度に制御されてよい。培養は、例えば、通気培養または振盪培養で行うことができる。培地のpHは、例えば、pH 3〜10、またはpH 4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20〜45℃、または25℃〜37℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間〜120時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは微生物の活性がなくなるまで、継続してもよい。
【０１８６】
このような条件下で微生物を培養することにより、培地中に目的物質が蓄積する。
【０１８７】
目的物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。これらの手法は、培地中に存在する各種成分の濃度を決定するためにも用いることができる。
【０１８８】
生成した目的物質は、適宜回収することができる。すなわち、発酵法は、さらに、目的物質を回収する工程を含んでいてよい。同工程を、「回収工程」ともいう。回収工程は、培養液から、具体的には培地から、目的物質を回収する工程であってよい。目的物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、抽出法、蒸留法、および晶析法が挙げられる。目的物質は、具体的には、酢酸エチル等の有機溶媒での抽出により、または蒸気蒸留により、回収することができる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０１８９】
また、目的物質が培地中に析出する場合は、例えば、遠心分離または濾過により回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を
晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０１９０】
尚、回収される目的物質は、目的物質以外に、例えば、微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。回収された目的物質の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【０１９１】
＜２−２＞生物変換法
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物を利用した生物変換により製造することもできる。すなわち、本明細書に記載の方法の別の態様は、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「生物変換法」ともいう。また、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する工程を、「生物変換工程」ともいう。
【０１９２】
具体的には、生物変換工程において、目的物質は、該目的物質の前駆体から製造することができる。より具体的には、生物変換工程において、目的物質は、微生物を利用して該目的物質の前駆体を該目的物質に変換することにより製造することができる。すなわち、生物変換工程は、微生物を利用して目的物質の前駆体を該目的物質に変換する工程であってよい。
【０１９３】
目的物質の前駆体を、単に、「前駆体」ともいう。前駆体としては、目的物質への変換に特定のCARにより触媒されるステップが含まれる物質が挙げられる。前駆体として、具体的には、目的物質の生合成経路における中間体（例えば、目的物質生合成酵素の記載に関連して言及したもの）であって、目的物質への変換に特定のCARにより触媒されるステップが含まれるものが挙げられる。前駆体として、より具体的には、例えば、プロトカテク酸、バニリン酸、安息香酸、Ｌ−フェニルアラニン、桂皮酸が挙げられる。プロトカテク酸およびバニリン酸は、いずれも、例えば、バニリンを生産するための前駆体として用いてよい。安息香酸は、例えば、ベンズアルデヒドを生産するための前駆体として用いてよい。Ｌ−フェニルアラニンおよび桂皮酸は、いずれも、例えば、シンナムアルデヒドを生産するための前駆体として用いてよい。前駆体としては、１種の前駆体を用いてもよく、２種またはそれ以上の前駆体を組み合わせて用いてもよい。前駆体が塩の形態を取り得る化合物である場合、前駆体は、フリー体として用いてもよく、塩として用いてもよく、それらの混合物として用いてもよい。すなわち、「前駆体」とは、特記しない限り、フリー体の前駆体、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。前駆体の塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
【０１９４】
前駆体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。すなわち、生物変換法は、さらに、前駆体を製造する工程を含んでいてもよい。前駆体の製造方法は特に制限されず、例えば、公知の方法を利用できる。前駆体は、例えば、化学合成法、酵素法、生物変換法、発酵法、抽出法、またはそれらの組み合わせにより製造することができる。すなわち、例えば、目的物質の前駆体は、そのさらなる前駆体から該目的物質の前駆体への変換反応を触媒する酵素（「前駆体生成酵素」ともいう）を利用して、そのようなさらなる前駆体から製造することができる。また、例えば、目的物質の前駆体は、前駆体生産能を有する微生物を利用して、炭素源から、あるいはそのようなさらなる前駆体から、製造することができる。「前駆体生産能を有する微生物」とは、目的物質の前駆体を、炭素源から、またはそのようなさらなる前駆体から、生成することができる微生物を意味してよい。例えば、酵素法または生物変換法によるプロトカテク酸の製造法としては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KS-0180を用いてパラクレゾ
ールをプロトカテク酸に変換する方法（特開平7-75589号公報）、NADH依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを用いてパラヒドロキシ安息香酸をプロトカテク酸に変換する方法（特開平5-244941号公報）、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関与する遺伝子が導入された形質転換体をテレフタル酸が添加された培地で培養することによりプロトカテク酸を製造する方法（特開2007-104942号公報）、プロトカテク酸生産能を有し且つプロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物を用いてプロトカテク酸をその前駆体から製造する方法（特開2010-207094号公報）が挙げられる。また、発酵法によるプロトカテク酸の製造法としては、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する細菌を用いて酢酸を炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法（特開昭50-89592号公報）や、３−ジヒドロシキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されたエシェリヒア（Escherichia）属またはクレブシエラ（Klebsiella）属に属する細菌を用いてグルコースを炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法（米国特許第5,272,073号明細書）が挙げられる。また、バニリン酸は、プロトカテク酸を前駆体として、OMTを利用した酵素法またはOMTを有する微生物を利用した生物変換法により（J. Am. CHm. Soc., 1998, Vol.120）、またはフェルラ酸を前駆体として、Pseudomonas sp. AV10株を利用した生物変換法により（J. App. Microbiol., 2013, Vol.116, p903-910）、製造することができる。製造された前駆体は、そのまま、あるいは、適宜、濃縮、希釈、乾燥、溶解、分画、抽出、精製等の処理に供してから、生物変換法に利用できる。すなわち、前駆体としては、例えば、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、前駆体を含有する素材を用いてもよい。前駆体を含有する素材は、微生物が前駆体を利用できる限り特に制限されない。前駆体を含有する素材として、具体的には、例えば、前駆体生産能を有する微生物を培養して得られた培養液、該培養液から分離した培養上清、それらの濃縮物（例えば、濃縮液）や乾燥物等の処理物が挙げられる。
【０１９５】
一態様において、生物変換工程は、本明細書に記載の微生物を培養することにより実施できる。この態様を、「生物変換法の第１の態様」ともいう。すなわち、生物変換工程は、例えば、目的物質の前駆体を含有する培地で微生物を培養し、該前駆体を目的物質に変換する工程であってよい。生物変換工程は、具体的には、目的物質の前駆体を含有する培地で微生物を培養し、目的物質を該培地中に生成蓄積する工程であってもよい。
【０１９６】
使用する培地は、目的物質の前駆体を含有し、微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培養条件は、微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。生物変換法の第１の態様における培養については、同態様においては培地が目的物質の前駆体を含有すること以外は、発酵法における培養についての記載（例えば、培地や培養条件についての記載）を準用できる。
【０１９７】
前駆体は、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間にのみ培地に含有されていてもよい。すなわち、「前駆体を含有する培地で微生物を培養する」とは、前駆体が培養の全期間において培地に含有されていることを要しない。例えば、前駆体は、培養開始時から培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。前駆体が培養開始時に培地に含有されていない場合は、培養開始後に培地に前駆体を添加する。添加のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、微生物が十分に生育してから培地に前駆体を添加してもよい。また、いずれの場合にも、適宜、培地に前駆体を添加してよい。例えば、目的物質の生成の際に起こる前駆体の減少または枯渇に応じて培地に前駆体を添加してもよい。前駆体を培地に供給する手段は特に制限されない。例えば、前駆体を含有する流加培地を培地に流加することにより、前駆体を培地に供給することができる。また、例えば、本明細書に記載の微生物と前駆体生産能を有する微生物を共培養することにより、前駆体生産能を有する微生物に前駆体を培地中に生成させ、以て前駆体を培地に供給することもできる。これらの供給手段は、適宜組み合わせて利用してもよい。培地中の前駆体濃度は、微生物が前駆体を目的物質の原料として利用できる限り
、特に制限されない。培地中の前駆体濃度は、フリー体の重量に換算して、例えば、0.1 g/L以上、1 g/L以上、2 g/L以上、5 g/L以上、10 g/L以上、または15 g/L以上であってもよく、200 g/L以下、100 g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。前駆体は、培養の全期間において上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。前駆体は、例えば、培養開始時に上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、培養開始後に上記例示した濃度となるように培地に添加されてもよい。培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、目的物質は、少なくとも本培養の期間に生産されればよい。よって、前駆体は、少なくとも本培養の期間に、すなわち本培養の全期間または本培養の一部の期間に、培地に含有されていればよい。すなわち、前駆体は、種培養の期間には培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。このような場合、培養についての記載（例えば、「培養期間（培養の期間）」や「培養開始」）は、本培養についてのものとして読み替えることができる。
【０１９８】
別の態様において、生物変換工程は、本明細書に記載の微生物の菌体を利用することにより実施できる。この態様を、「生物変換法の第２の態様」ともいう。すなわち、生物変換工程は、例えば、微生物の菌体を利用して反応液中の目的物質の前駆体を目的物質に変換する工程であってよい。生物変換工程は、具体的には、微生物の菌体を反応液中の目的物質の前駆体に作用させ、目的物質を該反応液中に生成蓄積する工程であってもよい。そのような菌体を利用して実施する生物変換工程を、「変換反応」ともいう。
【０１９９】
微生物の菌体は、微生物を培養することにより得られる。菌体を取得するための培養法は、微生物が増殖できる限り、特に制限されない。菌体を取得するための培養時には、前駆体は、培地に含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。また、菌体を取得するための培養時には、目的物質は、培地に生産されてもよく、されなくてもよい。生物変換法の第２の態様における菌体を取得するための培養については、発酵法における培養についての記載（例えば、培地や培養条件についての記載）を準用できる。
【０２００】
菌体は、培養液（具体的には培地）に含まれたまま変換反応に用いてもよく、培養液（具体的には培地）から回収して変換反応に用いてもよい。また、菌体は、適宜処理を行ってから変換反応に用いてもよい。すなわち、菌体としては、菌体を含有する培養液、該培養液から回収した菌体、それらの処理物が挙げられる。言い換えると、菌体としては、微生物の培養液に含まれる菌体、該培養液から回収した菌体、それらの処理物に含まれる菌体が挙げられる。処理物としては、菌体（例えば、菌体を含有する培養液または該培養液から回収した菌体）を処理に供したものが挙げられる。これらの態様の菌体は、適宜組み合わせて利用してもよい。
【０２０１】
菌体を培養液から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。そのような手法としては、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過が挙げられる。また、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。これらの手法は、適宜組み合わせて利用してもよい。回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
【０２０２】
菌体の処理としては、例えば、希釈、濃縮、アクリルアミドやカラギーナン等の担体への固定化処理、凍結融解処理、膜の透過性を高める処理が挙げられる。膜の透過性は、例えば、界面活性剤または有機溶媒を利用して高めることができる。これらの処理は、適宜組み合わせて利用してもよい。
【０２０３】
変換反応に用いられる菌体は、目的物質生産能を有していれば特に制限されない。菌体は、代謝活性が維持されているのが好ましい。「代謝活性が維持されている」とは、菌体
が炭素源を資化して目的物質の製造に必要な物質を生成または再生する能力を有していることを意味してよい。そのような物質としては、ATP、NADHやNADP等の電子供与体、SAM等のメチル基供与体が挙げられる。菌体は、生育する能力を有していてもよく、有していなくてもよい。
【０２０４】
変換反応は、適切な反応液中で実施することができる。変換反応は、具体的には、菌体と前駆体とを適切な反応液中で共存させることにより実施することができる。変換反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、例えば、反応容器内の反応液中で、微生物の菌体と前駆体とを混合することにより、変換反応を実施できる。変換反応は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。カラム式の場合は、例えば、固定化菌体を充填したカラムに前駆体を含有する反応液を通液することにより、変換反応を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
【０２０５】
反応液は、前駆体に加えて、前駆体以外の成分を必要に応じて含有してよい。前駆体以外の成分としては、ATP、NADHやNADPH等の電子供与体、SAM等のメチル基供与体、金属イオン、緩衝剤、界面活性剤、有機溶媒、炭素源、リン酸源、その他各種培地成分が挙げられる。すなわち、例えば、前駆体を含有する培地を反応液として用いてもよい。すなわち、生物変換法の第２の態様における反応液については、生物変換法の第１の態様における培地についての記載を準用できる。反応液に含有される成分の種類や濃度は、前駆体の種類や、菌体の形態等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０２０６】
変換反応の条件（溶存酸素濃度、反応液のpH、反応温度、反応時間、各種成分の濃度等）は、目的物質が生成する限り特に制限されない。変換反応は、例えば、静止菌体等の微生物菌体を利用した物質変換に用いられる通常の条件で行うことができる。変換反応の条件は、使用する微生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。変換反応は、例えば、好気条件で実施してよい。「好気条件」とは、反応液中の溶存酸素濃度が、0.33ppm以上、または1.5ppm以上である条件を意味してよい。酸素濃度は、具体的には、例えば、飽和酸素濃度に対し、1〜50％、または5％程度に制御されてよい。反応液のpHは、例えば、通常6.0〜10.0、または6.5〜9.0であってよい。反応温度は、例えば、通常15〜50℃、15〜45℃、または20〜40℃であってよい。反応時間は、例えば、5分〜200時間であってよい。カラム法の場合、反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。また、変換反応は、例えば、細菌や酵母等の微生物の培養に用いられる通常の条件等の培養条件で行うこともできる。変換反応においては、菌体は、生育してもよく、しなくてもよい。すなわち、生物変換法の第２の態様における変換反応については、同態様においては菌体が生育してもしなくてもよいこと以外は、生物変換法の第１の態様における培養についての記載を準用できる。そのような場合、菌体を取得するための培養条件と、変換反応の条件は、同一であってもよく、なくてもよい。反応液中の前駆体の濃度は、フリー体の重量に換算して、例えば、0.1 g/L以上、1 g/L以上、2 g/L以上、5 g/L以上、10 g/L以上、または15 g/L以上であってもよく、200 g/L以下、100 g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応液中の菌体の濃度は、例えば、600nmにおける光学密度（OD）に換算して、1以上であってもよく、300以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【０２０７】
変換反応の過程において、菌体、前駆体、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、反応液に追加で供給してもよい。例えば、目的物質の生成に伴う前駆体の減少または枯渇に応じて反応液に前駆体を追加で供給してもよい。これらの成分は、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。
【０２０８】
前駆体等の各種成分を反応液に供給する手段は特に制限されない。これらの成分は、いずれも、反応液に直接添加することにより、反応液に供給することができる。また、例えば、本明細書に記載の微生物と前駆体生産能を有する微生物を共培養することにより、前駆体生産能を有する微生物に前駆体を反応液中に生成させ、以て前駆体を反応液に添加することもできる。また、例えば、ATP、電子供与体、メチル基供与体等の成分は、いずれも、反応液中で生成または再生されてもよく、微生物の菌体内で生成または再生されてもよく、異菌体間共役により生成または再生されてもよい。例えば、微生物の菌体において代謝活性が維持されている場合、炭素源を利用して微生物の菌体内でATP、電子供与体、メチル基供与体等の成分を生成または再生することができる。また、ATPを生成または再生する方法としては、例えば、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法（Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997)）、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法（Yamamoto, S et al., Biosci.
Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005)）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（C. Aug’e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29：789-790 (1988)）、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988)）が挙げられる。
【０２０９】
また、反応条件は、変換反応の開始から終了まで均一であってもよく、変換反応の過程において変化してもよい。「反応条件が変換反応の過程において変化する」ことには、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することも包含されてよい。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で変換反応を実施する場合に、反応温度や菌体密度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることを意味してよい。
【０２１０】
このようにして生物変換工程を実施することにより、目的物質を含有する培養液（または培地）または反応液が得られる。目的物質が生成したことの確認や目的物質の回収は、いずれも、上述した発酵法と同様に実施することができる。すなわち、生物変換法は、さらに、回収工程（例えば、培養液（または培地）または反応液から目的物質を回収する工程）を含んでいてよい。尚、回収される目的物質は、目的物質以外に、例えば、微生物菌体、培地成分、反応液成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。回収された目的物質の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【実施例】
【０２１１】
以下、本発明を非限定的な実施例によりさらに具体的に説明する。
【０２１２】
本実施例では、Corynebacterium glutamicum 2256株（ATCC 13869）を親株として、各種CAR遺伝子を有する株を構築し、構築した株を用いてバニリンを生産した。
【０２１３】
＜１＞バニリン酸デメチラーゼ遺伝子を欠損した株（FKS0165株）の構築
コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている（Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65）。バニリン酸からプロトカテク酸への変換反応は、バニリン酸デメチラーゼにより触媒される。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれバニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。vanK遺伝子は、バニリン酸取り込み系をコードし、vanAB遺伝子とvanABKオペロンを構成している（M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865）。よって、まず、vanABKオペロンを欠損させることにより、C.
glutamicum 2256株からバニリンやバニリン酸等の目的物質の資化に利用できる株（FKS0165株）を構築した。手順を以下に示す。
【０２１４】
＜１−１＞vanABK遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔvanABK56の構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号５１および５２の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号５３および５４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号５２および５３は一部が相補的な配列となっている。次にvanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびvanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit（Clontech）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター（WO2007/046389）に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔvanABK56と命名した。
【０２１５】
＜１−２＞FKS0165株の構築
上記で得られたpBS4SΔvanABK56はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔvanABK56を電気パルス法にてC. glutamicum 2256株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地（グルコース 5 g/L、Polypeptone 10
g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 15 g/L、NaOHでpH7.5に調整）に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔvanABK56が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のvanABK遺伝子群と欠損型のvanABK遺伝子群の両方を有する。
【０２１６】
該1回組換え株をCM-Dex液体培地（寒天を含有しないこと以外はCM-Dex寒天培地と同一組成）で一夜培養し、培養液をS10寒天培地（スクロース 100 g/L、ポリペプトン 10 g/L、酵母エキス 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・4-5H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆蛋白加水分解液1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 20 g/L、NaOHを用いてpH7.5に調整：オートクレーブ120℃20分）に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をCM-Dex寒天培地上で純化した。純化した株よりゲノムDNAを調製し、配列番号５５および５６の合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによってvanABK遺伝子の欠損を確認し、該株をFKS0165株とした。
【０２１７】
＜２＞アルコールデヒドロゲナーゼホモログ遺伝子を欠損した株（FKFC14株）の構築
次いで、Corynebacterium glutamicum FKS0165株を親株として、アルコールデヒドロゲナーゼホモログ遺伝子であるNCgl0324遺伝子（adhC）、NCgl0313遺伝子（adhE）、NCgl2709遺伝子（adhA）を欠損した株（FKFC14株）を以下の手順で構築した。
【０２１８】
＜２−１＞FKFC5株（FKS0165ΔNCgl0324株）の構築
＜２−１−１＞NCgl0324遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhCの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号５７および５８の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号５９および６０の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物
を得た。配列番号５８および５９は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit（Clontech）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター（WO2007/046389）に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhCと命名した。
【０２１９】
＜２−１−２＞FKFC5株（FKS0165ΔNCgl0324株）の構築
上記で得られたpBS4SΔ2256adhCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhCを電気パルス法にてC. glutamicum FKS0165株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhCが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0324遺伝子と欠損型のNCgl0324遺伝子の両方を有する。
【０２２０】
該1回組換え株をCM-Dex液体培地で一夜培養し、培地をS10寒天培地に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をCM-Dex寒天培地上で純化した。純化した株よりゲノムDNAを調製し、配列番号６１および６２の合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによってNCgl0324遺伝子の欠損を確認し、該株をFKFC5株とした。
【０２２１】
＜２−２＞FKFC11株（2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313株）の構築
＜２−２−１＞NCgl0313遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhEの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号６３および６４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号６５および６６の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号６４および６５は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit（Clontech）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター（WO2007/046389）に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhEと命名した。
【０２２２】
＜２−２−２＞FKFC11株（2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313株）の構築
上記で得られたpBS4SΔ2256adhEはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhEを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC5株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhEが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0313遺伝子と欠損
型のNCgl0313遺伝子の両方を有する。
【０２２３】
該1回組換え株をCM-Dex液体培地で一夜培養し、培地をS10寒天培地に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をCM-Dex寒天培地上で純化した。純化した株よりゲノムDNAを調製し、配列番号６７および６８の合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによってNCgl0313遺伝子の欠損を確認し、該株をFKFC11株とした。
【０２２４】
＜２−３＞FKFC14株（2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709株）の構築
＜２−３−１＞NCgl2709遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhAの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号６９および７０の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号７１および７２の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号７０および７１は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit（Clontech）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhAと命名した。
【０２２５】
＜２−３−２＞FKFC14株（2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709株）の構築
上記で得られたpBS4SΔ2256adhAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhAを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC11株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhAが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl2709遺伝子と欠損型のNCgl2709遺伝子の両方を有する。
【０２２６】
該1回組換え株をCM-Dex液体培地で一夜培養し、培地をS10寒天培地に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をCM-Dex寒天培地上で純化した。純化した株よりゲノムDNAを調製し、配列番号７３および７４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによってNCgl2709遺伝子の欠損を確認し、該株をFKFC14株とした。
【０２２７】
＜３＞バニリン生産株の構築
＜３−１＞CAR遺伝子とPPT遺伝子の共発現用プラスミドの構築
Nocardia brasiliensisのCAR遺伝子（Nb_ACAR）とE. coliのPPT遺伝子（entD）の共発現用プラスミドpVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD、Gordonia effusaのCAR遺伝子（Ge_ACAR）とE. coliのPPT遺伝子（entD）の共発現用プラスミドpVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD、Novosphingobium malaysienseのCAR遺伝子（Nm_ACAR）とE. coliのPPT遺伝子（entD）の共発現用プラスミドpVK9::Ptuf*-Nm_ACAR-entD、およびCoccomyxa subellipsoidea C-169のCAR遺伝子（Cs2_ACAR）とE. coliのPPT遺伝子（entD）の共発現用プラスミドpVK9::Ptuf*-Cs2_ACAR-entDを、以下の手順で構築した。PPTは、CARにホスホパンテテイニル基を付与することにより、CARを活性化する。CAR遺伝子は、E. coliのコドン使用に応じてコドン最適化
して使用した。これらの遺伝子は、pVK9ベクター（WO2007/046389）にクローニングした。pVK9ベクターは、コリネ型細菌とEscherichia coliのシャトルベクターである。
【０２２８】
pVK9ベクターをBamHIとPstIで処理し、Tuf*プロモーター、SD配列、Nb_ACAR（コドン最適化したもの）、SD配列、およびE. coliのentD遺伝子が順に連結されてなる人工オペロンを含むDNA断片を挿入することにより、プラスミドpVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entDを得た。このプラスミド中の挿入DNA断片を含む部位の塩基配列を配列番号１９に示す（挿入DNA断片は16〜4621位に相当する）。
【０２２９】
pVK9ベクターをBamHIとPstIで処理し、Tuf*プロモーター、SD配列、Ge_ACAR（コドン最適化したもの）、SD配列、およびE. coliのentD遺伝子が順に連結されてなる人工オペロンを含むDNA断片を挿入することにより、プラスミドpVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entDを得た。このプラスミド中の挿入DNA断片を含む部位の塩基配列を配列番号２０に示す（挿入DNA断片は16〜4517位に相当する）。また、Ge_ACAR（コドン最適化したもの）の塩基配列を配列番号７７に示す。
【０２３０】
pVK9ベクターをBamHIとPstIで処理し、Tuf*プロモーター、SD配列、Nm_ACAR（コドン最適化したもの）、SD配列、およびE. coliのentD遺伝子が順に連結されてなる人工オペロンを含むDNA断片を挿入することにより、プラスミドpVK9::Ptuf*-Nm_ACAR-entDを得た。このプラスミド中の挿入DNA断片を含む部位の塩基配列を配列番号８０に示す（挿入DNA断片は16〜4528位に相当する）。また、Nm_ACAR（コドン最適化したもの）の塩基配列を配列番号８１に示す。
【０２３１】
pVK9ベクターをBamHIとPstIで処理し、Tuf*プロモーター、SD配列、Cs2_ACAR（コドン最適化したもの）、SD配列、およびE. coliのentD遺伝子が順に連結されてなる人工オペロンを含むDNA断片を挿入することにより、プラスミドpVK9::Ptuf*-Cs2_ACAR-entDを得た。このプラスミド中の挿入DNA断片を含む部位の塩基配列を配列番号８４に示す（挿入DNA断片は16〜4702位に相当する）。また、Cs2_ACAR（コドン最適化したもの）の塩基配列を配列番号８５に示す。
【０２３２】
＜３−２＞vanK遺伝子の発現プラスミドpVS7::Plac-vanKの構築
vanK遺伝子は、バニリン酸取り込み系をコードする。そこで、バニリン酸の取り込みを向上させるため、C. glutamicum 2256株のvanK遺伝子の発現プラスミドpVS7::Plac-vanKを、以下の手順で構築した。
【０２３３】
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号７５および７６の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanK遺伝子のORFとSD配列を含むPCR産物を得た。次に、In Fusion HD cloning kit（Clontech）を用いて、PCR産物を、BamHIとPstIで処理をしたpVS7ベクター（WO2013/069634）に挿入した。pVS7ベクターは、コリネ型細菌とEscherichia coliのシャトルベクターである。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびスペクチノマイシン50μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVS7::Plac-vanKと命名した。このプラスミドにおいて、vanK遺伝子は、pVS7ベクター由来のlacプロモーターから発現する。
【０２３４】
＜３−３＞バニリン生産株の構築
プラスミドpVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD、pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD、pVK9::Ptuf*-Nm_ACAR-entD、またはpVK9::Ptuf*-Cs2_ACAR-entDと、プラスミドpVS7::Plac-vanKを、電気パ
ルス法にてC. glutamicum FKFC14株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLとスペクチノマイシン50μg/mLを含有するCM-Dex SGFC寒天培地（グルコース 2.5 g/L、フルクトース 2.5 g/L、Polypeptone 10 g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、コハク酸2ナトリウム6水和物 2 g/L、グルコン酸ナトリウム 4 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、biotin
10 μg/L、寒天15 g/L、NaOHでpH7.5に調整）に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株を同寒天培地にて純化し、それぞれ、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD pVS7-vanK、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nm_ACAR-entD pVS7-vanK、およびFKFC14/pVK9::Ptuf*-Cs2_ACAR-entD pVS7-vanKと命名した。これらの株を、それぞれ、CM-Dex SGFC培地（寒天を含有しないこと以外はCM-Dex SGFC寒天培地と同一の組成）4 mLを含む試験管に接種し、31.5℃で約16時間振とう培養を行った。得られた培養液0.9 mLを50%グリセロール水溶液0.6 mLと混合してグリセロールストックとし、-80℃で保存した。
【０２３５】
＜４＞C. glutamicumバニリン生産株によるバニリン生産とプロトカテクアルデヒド生産の比較
構築したバニリン生産株のグリセロールストック20μLを、それぞれ、CM-Dex SGFC寒天培地に塗布し、前培養として31.5℃で20時間培養した。得られた菌体を滅菌生理食塩水に懸濁した。菌体懸濁液の光学密度（OD）を測定し、600 nmでのODが83になるように生理食塩水で菌体懸濁液を希釈した。希釈した菌体懸濁液1.5 mLを、カナマイシン25μg/mLとスペクチノマイシン50μg/mLを含有するバニリン生産培地（バニリン酸42.9 g/L、グルコース 85.7 g/L、Polypeptone 10 g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O
0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物
1.2 g/L、biotin 10 μg/L、KOHでpH7.4に調整後、CaCO38.6 g/L（180℃で3時間乾熱滅菌したもの）と混合）またはカナマイシン25μg/mLとスペクチノマイシン50μg/mLを含有するプロトカテクアルデヒド生産培地（プロトカテク酸42.9 g/L、グルコース 85.7 g/L、Polypeptone 10 g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、biotin 10 μg/L、KOHでpH7.4に調整後、CaCO38.6 g/L（180℃で3時間乾熱滅菌したもの）と混合）3.5 mLを含む試験管に接種し、30℃で21時間振とう培養を行った。
【０２３６】
培養開始時と終了時に、培地中のグルコースの濃度をバイオテックアナライザーAS-310（サクラエスアイ（株））により分析した。また、培地中のバニリン酸、バニリン、プロトカテク酸、およびプロトカテクアルデヒドの濃度を超高速液体クロマトグラフNEXERA X2システム（SHIMADZU）により下記の条件で分析した。
【０２３７】
UPLC分析条件
カラム：KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex) 
オーブン温度: 40 ℃ 
移動相（A）：0.1% トリフルオロ酢酸
移動相（B）：0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %)：(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速：1.5 mL/min
【０２３８】
結果を表１〜３に示す。
【０２３９】
FKFC14/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK株におけるV/P ratio（すなわち、プロトカテクアルデヒド生産量に対するバニリン生産量の比率）は、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD pVS7-vanK株の約1.4倍であった（表１）。したがって、Ge_ACARはバニリン生産に有用であると判断した。
【０２４０】
FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD pVS7-vanKは9.6 g/Lの濃度でプロトカテクアルデヒドを生産したのに対し、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nm_ACAR-entD pVS7-vanK株はプロトカテクアルデヒドを生産しなかった（表２）。したがって、Nm_ACARはバニリン生産に有用であると判断した。
【０２４１】
FKFC14/pVK9::Ptuf*-Cs2_ACAR-entD pVS7-vanK株におけるV/P ratio（すなわち、プロトカテクアルデヒド生産量に対するバニリン生産量の比率）は、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD pVS7-vanK株の約1.6倍であった（表３）。したがって、Cs2_ACARはバニリン生産に有用であると判断した。
【０２４２】
【表１】
2019536450.tif 000002
【０２４３】
【表２】
2019536450.tif 000003
【０２４４】
【表３】
2019536450.tif 000004
【０２４５】
＜５＞C. glutamicumバニリン生産株によるバニリン生産とイソバニリン生産の比較
構築したバニリン生産株のグリセロールストック20μLを、それぞれ、CM-Dex SGFC寒天培地に塗布し、前培養として31.5℃で20時間培養した。得られた菌体を滅菌生理食塩水に懸濁した。菌体懸濁液の光学密度（OD）を測定し、600 nmでのODが83になるように生理食塩水で菌体懸濁液を希釈した。希釈した菌体懸濁液1.5 mLを、カナマイシン25μg/mLとスペクチノマイシン50μg/mLを含有するバニリン生産培地（バニリン酸42.9 g/L、グルコース 85.7 g/L、Polypeptone 10 g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O
0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物
1.2 g/L、biotin 10 μg/L、KOHでpH7.4に調整後、CaCO38.6 g/L（180℃で3時間乾熱滅菌したもの）と混合）またはカナマイシン25μg/mLとスペクチノマイシン50μg/mLを含有するイソバニリン生産培地（イソバニリン酸42.9 g/L、グルコース 85.7 g/L、Polypepto
ne 10 g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、biotin 10 μg/L、KOHでpH7.4に調整後、CaCO38.6 g/L（180℃で3時間乾熱滅菌したもの）と混合）3.5
mLを含む試験管に接種し、30℃で21時間振とう培養を行った。
【０２４６】
培養開始時と終了時に、培地中のグルコースの濃度をバイオテックアナライザーAS-310（サクラエスアイ（株））により分析した。また、培地中のバニリン酸、バニリン、イソバニリン酸、およびイソバニリンの濃度を超高速液体クロマトグラフNEXERA X2システム（SHIMADZU）により下記の条件で分析した。
【０２４７】
UPLC分析条件
カラム：KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex) 
オーブン温度: 40 ℃ 
移動相（A）：0.1% トリフルオロ酢酸
移動相（B）：0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %)：(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速：1.5 mL/min
【０２４８】
結果を表４〜５に示す。
【０２４９】
FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD pVS7-vanKは9.3 g/Lの濃度でイソバニリンを生産したのに対し、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nm_ACAR-entD pVS7-vanK株ではイソバニリン生産は認められなかった（表４）。したがって、Nm_ACARはバニリン生産に有用であると判断した。
【０２５０】
FKFC14/pVK9::Ptuf*-Cs2_ACAR-entD pVS7-vanK株におけるV/iV ratio（すなわち、イソバニリン生産量に対するバニリン生産量の比率）は、FKFC14/pVK9::Ptuf*-Nb_ACAR-entD pVS7-vanK株の約1.2倍であった（表５）。したがって、Cs2_ACARはバニリン生産に有用であると判断した。
【０２５１】
【表４】
2019536450.tif 000005
【０２５２】
【表５】
2019536450.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０２５３】
本発明によれば、微生物の目的物質（例えば、バニリン等のアルデヒド）を生産する能力を向上させることができ、目的物質を効率よく製造することができる。
【０２５４】
＜配列表の説明＞
配列番号１：Escherichia coli MG1655のaroG遺伝子の塩基配列
配列番号２：Escherichia coli MG1655のAroGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Escherichia coli MG1655のaroB遺伝子の塩基配列
配列番号４：Escherichia coli MG1655のAroBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Escherichia coli MG1655のaroD遺伝子の塩基配列
配列番号６：Escherichia coli MG1655のAroDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：Bacillus thuringiensis BMB171のasbF遺伝子の塩基配列
配列番号８：Bacillus thuringiensis BMB171のAsbFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：Escherichia coli MG1655のtyrR遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Escherichia coli MG1655のTyrRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１〜１４：Homo sapiensのOMT遺伝子の転写バリアント１〜４の塩基配列
配列番号１５：Homo sapiensのOMTアイソフォーム（MB-COMT）のアミノ酸配列
配列番号１６：Homo sapiensのOMTアイソフォーム（S-COMT）のアミノ酸配列
配列番号１７：Gordonia effusaのCAR遺伝子の塩基配列
配列番号１８：Gordonia effusaのCARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：Nocardia brasiliensisのCAR遺伝子（コドン最適化したもの）とEscherichia coliのentD遺伝子を含むDNA断片の塩基配列
配列番号２０：Gordonia effusaのCAR遺伝子（コドン最適化したもの）とEscherichia coliのentD遺伝子を含むDNA断片の塩基配列
配列番号２１：Escherichia coli MG1655のentD遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Escherichia coli MG1655のEntDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPT遺伝子の塩基配列
配列番号２４：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPTタンパク質のアミノ酸配列配列番号２５：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanK遺伝子の塩基配列配列番号２６：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpcaK遺伝子の塩基配列配列番号２８：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPcaKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanA遺伝子の塩基配列配列番号３０：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanB遺伝子の塩基配列配列番号３２：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaG遺伝子の塩基配列
配列番号３４：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３５：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaH遺伝子の塩基配列
配列番号３６：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７：Escherichia coli MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列
配列番号３８：Escherichia coli MG1655のYqhDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３９：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324遺伝子の塩基配列
配列番号４０：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313遺伝子の塩基配列
配列番号４２：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709遺伝子の塩基配列
配列番号４４：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219遺伝子の塩基配列
配列番号４６：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382遺伝子の塩基配列
配列番号４８：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４９：Escherichia coli MG1655のaroE遺伝子の塩基配列
配列番号５０：Escherichia coli MG1655のAroEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５１〜７６：プライマー
配列番号７７：E. coliのコドン使用に応じてコドン最適化したGordonia effusaのCAR遺伝子の塩基配列
配列番号７８：Novosphingobium malaysienseのCAR遺伝子の塩基配列
配列番号７９：Novosphingobium malaysienseのCARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８０：Novosphingobium malaysienseのCAR遺伝子（コドン最適化したもの）とEscherichia coliのentD遺伝子を含むDNA断片の塩基配列
配列番号８１：E. coliのコドン使用に応じてコドン最適化したNovosphingobium malaysienseのCAR遺伝子の塩基配列
配列番号８２：Coccomyxa subellipsoidea C-169のCAR遺伝子（cDNA）の塩基配列
配列番号８３：Coccomyxa subellipsoidea C-169のCARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８４：Coccomyxa subellipsoideaのCAR遺伝子（コドン最適化したもの）とEscherichia coliのentD遺伝子を含むDNA断片の塩基配列
配列番号８５：E. coliのコドン使用に応じてコドン最適化したCoccomyxa subellipsoideaのCAR遺伝子の塩基配列
【国際調査報告】
2019536450.tif 000007
2019536450.tif 000008
2019536450.tif 000009