(57)【要約】  孔付プレート（１１）が、プレート本体（１２）と、このプレート本体（１２）の上側にある少なくとも１つの凹部（１４）とを有する。前記少なくとも１つの凹部（１４）には上方が開放したリングチャネル（１５）が形成されており、該リングチャネルの内周部は閉じた周回壁（１６）によって画定されている。前記周回壁（１６）の水平外周部は、下方から上方に向かって当該周回壁（１６）の上縁部（２２）まで縮小している。前記上縁部（２２）における前記周回壁（１６）の水平外周部の内側では、少なくとも２つの保持要素（２４）が上に向かって前記周回壁（１６）の前記上縁部（２２）に続いている。少なくとも２つの保持要素（２４）は、水平の自由間隔（２８）を互いに有し、前記少なくとも２つの保持要素（２４）の少なくとも１つは、水平方向に弾性に前記プレート本体（１２）に支持されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレート本体（１２）と、該プレート本体（１２）の上側（１３）に少なくとも１つの凹部（１４）とを備える孔付プレート（１１）であって、
前記少なくとも１つの凹部（１４）には上方が開放したリングチャネル（１５）が形成されており、該リングチャネルの内周部は閉じた周回壁（１６）によって画定されている、孔付プレートにおいて、
前記周回壁（１６）の水平外周部は、下方から上方に向かって当該周回壁（１６）の上縁部（２２）まで縮小し、
前記上縁部（２２）における前記周回壁（１６）の水平外周部の内側では、少なくとも２つの保持要素（２４）が上に向かって前記周回壁（１６）の前記上縁部（２２）に続いており、
前記少なくとも２つの保持要素（２４）は、水平の自由間隔（２８）を互いに有し、
前記少なくとも２つの保持要素（２４）の少なくとも１つは、水平方向に弾性に前記プレート本体（１２）に支持されている、ことを特徴とする孔付プレート。
【請求項２】
前記少なくとも２つの保持要素（２４）の各々は、前記少なくとも１つの凹部（１４）内で前記プレート本体（１２）に支持されている、ことを特徴とする請求項１に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項３】
前記保持要素（２４）の少なくとも１つまたは各保持要素（２４）は、垂直方向（３１）に沿って伸長する保持フィンガ（２１）のそれぞれ一部である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項４】
前記周回壁（１６）は、上方が開放した有底孔（２０）の少なくとも１つの上側部分を取り囲み、前記有底孔の底部（３３）において前記または各保持フィンガ（２１）は前記プレート本体（１２）に支承されている、請求項３に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項５】
前記または各保持フィンガ（２１）は、前記底部プレート（３４）と一体的に構成されており、前記底部プレートは、前記有底孔（２０）の基部（３３）に力結合して支承されている、ことを特徴とする請求項４に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項６】
前記または各保持フィンガ（２１）は、撓み弾性である、ことを特徴とする請求項３から５のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項７】
前記少なくとも２つの保持要素（２４）は２つの保持フィンガ（２１）に、１ｍＮの水平方向の力が少なくとも２つの保持要素（２４）の間で、前記２つの保持フィンガ（２１）の自由端部（４４）の相対的な水平方向のたわみを、２０から１，０００μｍまたは５０から５００μｍの範囲で引き起こし、および／または前記保持フィンガ（２１）の静止間隔の１から５０％または１０から３０％の範囲で引き起こすように互いに弾性に支持されている、ことを特徴とする請求項３から６のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項８】
前記または各保持フィンガ（２１）は、０．５から３．０ｍｍ、または０．７５から２．０ｍｍの範囲の直径を有し、および／または前記または各保持フィンガ（２１）は、前記有底孔（２０）の基部（３３）から当該保持フィンガに形成された保持要素（２４）まで５から１０ｍｍの長さ、および／または保持フィンガの自由端部（４４）まで１０から２０ｍｍの全長を有する、ことを特徴とする請求項３から７のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項９】
前記または各保持フィンガ（２１）の指先領域（３６）は、前記保持要素（２４）を越えて上方に伸長している、ことを特徴とする請求項３から８のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１０】
前記または各保持フィンガ（２１）の材料（３５）は、０．５から５０ＭＰａ、または１から１０ＭＰａの範囲の弾性係数を有する、ことを特徴とする請求項３から９のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１１】
前記または各保持フィンガ（２１）は、前記プレート本体（１２）の上側（１３）の下方に終端する、ことを特徴とする請求項３から１０の一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１２】
前記または各保持フィンガ（２１）は、前記プレート本体（１２）に対して光学的にコントラストのある材料（３５）から、および／または蛍光材料から作製されている、ことを特徴とする請求項３から１１のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの保持要素（２４）は２つの保持フィンガ（２１）に形成されており、当該２つの保持フィンガは、それぞれ前記保持要素まで伸長する少なくとも１つの導電性部分領域を有し、前記少なくとも２つの保持フィンガ（２１）の前記導電性部分領域は、プレート本体（１２）の下方から電気的に接触接続可能である、ことを特徴とする請求項３から１２のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１４】
前記または各保持フィンガ（２１）は、前記保持要素（２４）の領域に水平の湾入部または膨張部（２３，５１）を有する、ことを特徴とする請求項３から１３のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１５】
前記周回壁（１６）の水平外周部は、互いに平行の２つの直線部分（２６）と、当該２つの直線部分（２６）を互いに接続する半円弧（２７）の２つの端部から組み合わされている、ことを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１６】
前記直線部分（２６）の間隔および／または前記半円弧の半径は下方から上方に向かって減少する、ことを特徴とする請求項１５に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１７】
前記周回壁（１６）の傾斜角（３０）は、垂直方向（３１）に対して１５°から６５°、または３５゜から５５゜である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１８】
前記リングチャネル（１５）の外周部は、壁（１７，１８）によって周回して画定されており、前記外周部は、垂直方向（３１）に対して外に向かって１５°から６５°、または３５゜から５５゜の範囲の傾斜角（３２）を少なくとも部分的に有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項１９】
前記リングチャネル（１５）は、５０から１，５００μｌ、または１００から２５０μｌの容積を有する、ことを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項２０】
前記少なくとも２つの保持要素（２４）の水平間隔（２８）の方向で、前記少なくとも１つの凹部（１４）の外周部に電極のないスペース（２５）が２つ形成されている、ことを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項２１】
前記リングチャネル（１５）の基部と前記周回壁（１６）の上縁部（２２）は水平に延在しており、前記少なくとも１つの凹部（１４）は、その開口部を除いて、前記プレート本体（１２）の上側で閉鎖されている、ことを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの凹部（１４）は、生体適合性のある材料によって完全に覆われており、および／または前記周回壁（１６）は、滑らかな、および／または疎水性の材料から作製されている、ことを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項２３】
前記孔付プレート（１１）内には複数の凹部（１４）が２つの水平方向に並んで配置されている、請求項１から２２のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）。
【請求項２４】
結合組織細胞およびさらなる細胞の懸濁液（３８）が前記リングチャネル（１５）に入れられ、前記凹部（１４）が保持要素（２４）の上まで培養液（４２）により満たされ、前記保持要素（２４）ないし各保持要素（２４）、またはこれに上方に続く指先領域（３６）の上方自由端部（４４）の運動がカメラ（４５）により検出される、ことを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の孔付プレート（１１）の使用。
【請求項２５】
前記指先領域（３６）の上方自由端部（４４）は、培養液（４２）を越えて突き出ている、ことを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記さらなる細胞は、筋肉細胞、心筋細胞または骨格筋細胞から選択される、ことを特徴とする請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記懸濁液は、さらにヒドロゲルを含む、ことを特徴とする請求項２４から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
振幅が可変の電圧が、保持要素（２４）において電極の間に、および／または培養液（４２）に印加される、ことを特徴とする請求項２４から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記培養液（４２）は、前記または各保持フィンガ（２１）が培養液（４２）に対して光学的に際立つように前記または各保持フィンガ（２１）に色的に整合されている、ことを特徴とする請求項２４から２８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレート本体と、このプレート本体の上側に少なくとも１つの凹部とを備える孔付プレートに関するものであり、凹部には上方が開放したリングチャネルが形成されており、このリングチャネルの内周部は周回壁によって画定されている。
【０００２】
とりわけ本発明は、いわゆる組織工学により作製された人工的な組織、例えば心筋組織および骨格筋組織並びに結合組織からなるリングを作製および研究するための、複数のそのような凹部を備える孔付プレートに関するものである。ここで概念「リング」とは、それぞれの組織が閉じた環またはループを形成するが、これらの環またはループが特別の幾何的形状を有する必要はなく、円である必要は全くないものと理解すべきである。
【０００３】
さらに本発明は、とりわけ人工的な心筋組織および骨格筋組織からなるリングの作製および研究の枠内における、そのような孔付プレートの使用に関する。
【０００４】
しかし基本的に孔付プレートおよびその使用は、他の細胞ないし混合細胞からなるリング、例えば結合組織の細胞または神経、肝細胞のような器官細胞からなるリング、または例えば電気レオロジーまたは磁気レオロジー重合体のような他の物質からなるリングの作製および研究のためにも使用することができる。
【０００５】
概念「孔付プレート」は、本明細書全体および特許請求の範囲において制限として理解すべきではない。したがって孔付プレートは、基本的に、少なくとも１つの凹部が孔付シャーレの少なくとも１つの凹部に対して規定されているような特徴を有する限り、少なくとも１つの凹部を備える培養シャーレも含む。
【背景技術】
【０００６】
１つの凹部を備える培養シャーレであって、この凹部に疎水性材料からなる中央シリンダの装着によってリングチャネルが形成され、このリングチャネルの内周部がシリンダの外周部によって画定されている培養シャーレは、独国特許出願公開第１０００３５２１号明細書から公知である。ヒドロゲルと心筋細胞の特別な懸濁液がリングチャネルに入れられると、シリンダを取り囲むリングの形に人工的な心筋組織が形成される。
【０００７】
国際特許出願公開第２００７／０５４２８６号によればこのリングは、シリンダから取り外し、互いに平行に配置された２つの保持フィンガ、いわゆるストレッチャの上に配置することができ、ストレッチャはそれらの間隔方向に互いに弾性に支持されている。このストレッチャ上で、人工心筋組織からなるリングが培養液中で成熟し、典型的には心拍周波数で周期的な収縮を自動的に開始する。
【０００８】
中央に垂直に配向されたシリンダを備える公知の培養シャーレでは、人工骨格筋組織を、ヒドロゲルと骨格筋細胞の特別の懸濁液を充填することにより生成することができる。ここで発生する人工骨格筋組織からなるリングは、成熟のために同様にストレッチ上で培養液中に配置される。しかしリングはリズミカルな収縮を示さず、そのために電気的に刺激される。
【０００９】
中央に垂直に配向されたシリンダを備える公知の培養シャーレでは、人工結合組織を、ヒドロゲルと結合組織細胞の特別の懸濁液を充填することにより作製することができる。ここで発生する人工結合組織からなるリングは、成熟のために同様にストレッチ上で培養液中に配置される。しかしリングにはリズミカルに収縮する能力がなく、ストレッチャを組織の緊張に依存して緊張性に引張する。人工組織からなるリングを中央シリンダから培養シャーレの凹部に移し替えることは面倒であり、簡単には自動化できない。人工組織からなるリングを大量に研究することが、有意義には可能でない。
【００１０】
国際公開第２０１４／１５４７０４号から、人工心筋組織の収縮特性の測定装置が公知である。そのためにヒドロゲルと水中の心筋細胞の懸濁液が培養シャーレに取り込まれる。懸濁液へは、実質的に垂直に配向された２つの保持フィンガの、互いに離れるように外に向かって折り曲げられた下方端部が浸漬される。これに続き適切な条件下で、重合化されたヒドロゲルがその中に埋め込まれた心筋細胞と共に懸濁液から堆積し、これにより保持フィンガの自由端部を互いに接続する骨状の構造体が形成される。この装置により、構造体が孔付プレートの凹部から取り除かれ、別の孔付プレートの凹部の培養液に移し替えられる。この構造物の収縮運動が圧電変換器によって検出される。保持フィンガはこの圧電変換器を介してこの装置の土台に支承されている。この装置およびその使用は面倒であり、障害に脆弱であり、したがって種々異なる周辺条件の下で多数の組織構造を大量に検査するのには、有意義に使用することができない。
【００１１】
国際公開第２０１４／１５４７０４号から公知の装置に類似する、圧電変換器を備えない装置が、Ａ．Ｈａｎｓｅｓｎら著の、Development of a Screening platform based on engineered heart tissue, Circulation Research, (米), AHA Journals, 2010年7月, Vol.107, p.35-44から公知である。ここでは保持フィンガが装置の土台に弾性に支持されており、保持フィンガを接続する骨状の構造体の収縮運動は、保持フィンガに生じる運動をカメラによって光学的に観察することにより検出される。具体的には、保持フィンガの互いに対向する垂直表面の間隔の変化が観察される。前もって孔付プレートの複数の孔（これらの孔の水平断面は構造体の所望の形状に整合されている）の中には、複数の構造体が一対の保持フィンガの下方端部の間にそれぞれ同時に形成され、この装置により、培養液が満たされたさらなる孔付プレートの孔に移し替えられる。
【００１２】
国際公開第２０１５／０６１９０７号から、人工筋肉組織からなるそれぞれ１つのストランドを作製するための複数の孔を備える孔付プレートが公知である。孔付プレートの各凹部には、孔付プレートのプレート本体に固定されたフレームエレメントが配置されており、これらのフレームエレメントはそれぞれのストランドに埋め込むために設けられている。ストランドの収縮の際に、その中に埋め込まれたフレームエレメントが運動する。ストランドの収縮は、フレームエレメントに配置された一対の電極によって励起することができる。公知の孔付プレートでは、例えば治療薬および毒物などの種々の物質がストランドの収縮に及ぼす作用が検査される。公知の孔付プレートの場合、埋め込まれたフレームエレメントが組織ストランドの特性に影響する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】独国特許出願公開第１０００３５２１号明細書
【特許文献２】国際公開第２００７／０５４２８６号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１５４７０４号
【特許文献４】国際公開第２０１５／０６１９０７号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ａ．Ｈａｎｓｅｓｎら、Development of a Screening platform based on engineered heart tissue, Circulation Research, (米), AHA Journals, 2010年7月, Vol.107, p.35-44
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の基礎とする課題は、大きなコストを掛けずに、人工心筋および人工骨格筋、並びに他の組織種からなる多数のリングにおいて大量の検査を、平行して自動的に実施することのできる孔付プレートおよびその使用法を開示することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のこの課題は、請求項１の特徴を備える孔付プレート、および請求項２４の特徴を備える孔付プレートの使用法によって解決される。孔付プレートおよび本発明の使用の好ましい実施形態は従属請求項に規定されている。
【００１７】
プレート本体と、プレート本体の上側に少なくとも１つの凹部とを備え、少なくとも１つの凹部には上方が開放したリングチャネルが形成されており、リングチャネルの内周部は閉じた周回壁によって画定されている本発明の孔付プレートでは、周回壁の水平外周部が、下方から上方に向かって周回壁の上縁部まで縮小しており、上縁部における周回壁の水平外周部の内側では、少なくとも２つの保持要素が上に向かって周回壁の上縁部に続いている。ここで少なくとも２つの保持要素は、水平方向に自由間隔を互いに有し、少なくとも２つの保持要素の少なくとも１つは、水平方向に弾性にプレート本体に支持されている。
【００１８】
ここで称呼「リングチャネル」は、このリングチャネルが特別の形状、とりわけ称呼されたチャネルの円形、またはチャネルをその内周部において画定する閉じた周回壁の形状を必要としないものと理解すべきである。むしろこの称呼は、連続的に閉じた任意のチャネルも網羅する。ここでリングチャネルの断面は、その内周部にわたって一定とすることができる。しかしこれは必須ではない。
【００１９】
本発明の孔付プレートの少なくとも１つの凹部のリングチャネルに、結合組織細胞、例えば線維芽細胞と、さらなる細胞、例えば心筋細胞の懸濁液が入れられ、この懸濁液がさらにヒドロゲルを有することができ、懸濁液から周回壁に当接するリングが形成される場合、このリングは、上方に向かって縮小するリングの外周部によって自動的に上方に移動する。上方へのリングのこの移動の速度は、リングが周回壁に当接するリングの応力、リングチャネルの基部を越える高さへの、壁の水平外周部の誘導、およびリングと周回壁との間の静止摩擦に依存する。上方へのリングの移動は、リングが壁の上縁部を越え、上部で壁に続く保持要素に入り込むまで継続する。これら少なくとも２つの保持要素はリングを受け入れる。これらのうちの少なくとも１つが水平方向に弾性にプレート本体に支持されていることにより、保持要素は互いに弾性に支持され、リングに対してストレッチャの機能を果たす。したがって本発明の孔付プレートを使用すれば、リングチャネル内に形成され、リングチャネルの内周部を形成する周回壁に当接するリングを壁から取り外し、ストレッチャに移し替える必要がなくなる。この移し替えは、上方に向かって縮小する周回壁の外周部により、リングの収縮によってむしろ自動的に行われる。さらに周回壁の水平外周部は、たとえ好ましいものであっても継続的でもなく厳密に単調でもなく、上方に向かって縮小する。
【００２０】
新規の孔付プレートでは、保持要素は基本的に、孔付プレートの本体に対して可動のさらなる部分に支持することができる。しかし好ましくは、少なくとも２つの保持要素の各々は、少なくとも１つの凹部においてプレート本体に支持されている。これにより孔付プレートは、全体として単純な構造を有する。孔付プレートの使用に際しても単純化が生じる。なぜなら、孔付プレートの凹部に形成されたリングを、その検査のために凹部から取り出す必要がないからである。むしろそれぞれのリングの検査は、同じ凹部において、周回壁の上縁部の上方の保持要素で行われる。
【００２１】
したがって本発明の孔付プレートのこの実施形態では、プレート本体に弾性に支持される保持要素は、少なくともこのような保持フィンガの一部である。保持フィンガに基づき、それぞれの保持要素は単純なやり方で柔らかく弾性に支持される。このことは、それぞれの保持フィンガが弾性に変形可能である場合にも、保持フィンガが形状的には剛性であるが、しかし弾性に支承されている場合にも当てはまる。両方の場合とも、それぞれの保持要素の支持の柔軟性は、保持要素とプレート本体における保持要素の接続点との間の保持フィンガの長さと共に上昇する。
【００２２】
それぞれの保持フィンガをプレート本体に簡単に接続し、それでも保持要素と適用との間に所定の長さを実現するために、周回壁は上方が開放した有底孔の少なくとも上側部分を取り囲むことができ、有底孔の基部において保持フィンガはプレート本体に支承されている。したがって有底孔の長さは、保持要素とプレート本体における保持要素の接続点との間の保持フィンガの長さに相当する。有底孔は保持フィンガの出口において上方が開放しており、凹部の一部であるが、リングチャネルの一部ではない。
【００２３】
それぞれの保持フィンガは、有底孔の基部に、例えば物質的に結合、すなわち化学的に結合することができる。しかしこのことは、保持フィンガが、有底孔の基部においてプレート本体に直接成形されるか、または問題なしに接着されることを前提とする。
【００２４】
本発明の孔付プレートの一実施形態では、前記または各保持フィンガは底部プレートと一体的に構成されており、底部プレートは有底孔の基部に力結合によって支承されている。さらに有底孔は下方に向かって円錐形に延びることができ、底部プレートは弾性の材料から僅かに大きく形成し、有底孔に押し込むことができる。しかし底部プレートを有底孔の基部に力結合して保持するためには、有底孔に達する水性流体に対して大きな表面張力を有する好ましい材料の組み合わせだけで十分であり得る。保持要素の所望の弾性の支持が達成される限り、有底孔は底部プレートによって、または保持フィンガのための他の取付体によっても、十分に、それどころか完全に塞ぐことができる。
【００２５】
すでに示したように、前記または各保持フィンガは、撓み弾性とすることができる。このことは、保持フィンガが付加的に、撓み弾性の材料からなる上記底部プレートにより構成されており、したがってプレート本体にも弾性に支承されていることを排除するものではない。択一的に、前記または各保持フィンガ自体の材料は撓み弾性ではないが、前記または各保持フィンガの撓み弾性を達成するために、底部プレートだけを撓み弾性の材料から構成することができる。
【００２６】
少なくとも２つの保持要素の弾性支持に互いに作用する弾性であって発生する全ての弾性は、１ｍＮの水平方向の力が２つの所属の保持フィンガにおける少なくとも２つの保持要素の間で、無負荷の保持フィンガの静止間隔の１から５０％だけの、２つの保持フィンガの自由端部の水平方向の相対的なたわみを引き起こすか、または例えば人工心筋組織からなるリングを作製および検査するための孔付プレートの場合は、１０から３０％のたわみを引き起こすように互いに整合することができる。同時にまたは択一的に、１ｍＮの水平方向の力は、２つの所属の保持フィンガにおける少なくとも２つの保持要素の間で、２つの保持フィンガの自由端部の水平方向の相対的なたわみを、２０から１，０００μｍまたは５０から５００μｍの範囲で引き起こすことができる。たわみは、前記範囲において任意の値をとるのではなく、力と共に増大し、または１ｍＮの水平方向の力の場合、保持フィンガの弾性とそれらの接続点により規定される値をとることが理解される。
【００２７】
そのために必要な保持フィンガの弾性は、例えば、前記または各保持フィンガが０．５から３ｍｍの直径、より特別には０．７５から２ｍｍの直径を有することにより、および／または前記ないし各保持フィンガが、有底孔の基部からこの基部に形成されている保持要素まで５から１０ｍｍの長さを有することにより、および／または１０から２０ｍｍの全長を有することにより達成される。保持フィンガの全長は、保持フィンガの相対的なたわみが、保持フィンガに形成された保持要素の領域において保持要素を越えて上方に突き出る指先領域ｔにより拡大できる場合には重要な役割を果たさない。保持要素の間隔をｙμｍだけ変化させるｘｍＮの力は、例えば指先領域の上方自由端部の間隔を２ｙμｍだけ変化することができ、したがって指先領域の上方自由端部間の間隔を容易に検出することができる。さらに前記または各保持フィンガは、その全長に基づき、凹部を満たす培養液から突き出ることができ、その向きを特に容易に光学的に検出することができる。
【００２８】
前記または各弾性の保持フィンガを作製するための材料として、とりわけ、弾性係数が０．５から５０ＭＰａの範囲、またはより特別には１から１０ＭＰａの範囲、すなわち約５ＭＰａの材料を使用することができる。ここでも、前記範囲は公差範囲ではなく、材料はこの範囲内で可及的に一定の弾性係数を有することが当てはまる。
【００２９】
前記または各保持フィンガの自由端部が、保持フィンガに形成された保持要素を越えて突き出ている場合でも、保持フィンガは好ましくはプレート本体の上側の下方で終端する。これにより保持フィンガが、例えば本発明の孔付プレートの積み重ね、または本発明の孔付プレートのその他の取り扱いによって損傷する恐れが低減される。
【００３０】
好ましくは前記または各保持フィンガは、プレート本体よりも光学的にコントラストのある材料から作製される。これにより例えば、プレート本体は、白色、他の明るいまたは透明な材料から形成されており、一方、前記または各保持フィンガは、黒色、他の暗いおよび／または不透明な材料から形成されていることが意味される。この場合、保持フィンガは、通常、凹部に取り込まれた培養液に対しても良好に際立つ。前記または各保持フィンガは、択一的にまたは付加的に、プレート本体とは異なり蛍光材料から作製することもでき、これにより蛍光材料に対する励起光による照明の際に光学的コントラストを引き起こす。
【００３１】
本発明の孔付プレートの一実施形態では、保持要素の少なくとも２つが保持フィンガに形成されており、これら保持フィンガはそれぞれ、保持要素に伸長する少なくとも１つの導電性部分領域を有し、少なくとも２つの保持フィンガの導電性部分領域は、プレート本体の下側から電気的に接触接続可能である。この電気的な接触接続可能性を利用して、保持要素に当接するリングを電気的に励起または刺激することができる。このことは、心筋組織または骨格筋組織のような人工筋肉組織からなるリングまたは人工神経組織からなるリングに対しても、電気レオロジー材料からなるリングに対しても当てはまる。
【００３２】
本発明の孔付プレートの別の一実施形態では、保持要素の１つは組織との少なくとも１つの接触点において導電性であり、これにより電極を形成する。この保持要素は、プレート本体に弾性に支持された少なくとも１つの保持要素とすることができるが、必須ではない。対向電極が凹部の他の箇所に設けられており、したがって対向電極は満たされた培養液と接触する。保持要素に形成された電極と対向電極は、凹部の外から電気的に接触接続することができる。
【００３３】
それぞれの保持要素を形成するために、前記または各保持フィンガは、上方に向かってリングチャネルをその周囲で画定する周回壁に続く水平の湾入部またはその上にある膨張部を有することができる。この湾入部または膨張部によりそれぞれのリングは、これが周回壁から取り外される時に位置が保持される。しかしこのような湾入部または膨張部は、幾何学的に規定された保持要素を形成するためには必ずしも必要ないことが判明した。それぞれのリングは、周回壁から取り外された後、各保持フィンガ上の自分の位置を周回壁の上縁部の直ぐ上で、保持フィンガが上方に滑らかに経過している場合でも維持する。
【００３４】
周回壁の水平外周部は、とりわけ互いに平行の２つの直線部分と、２つの直線部分の端部を互いに接続する２つの半円弧とから組み合わせることができる。そこから、直線部分に対して平行に延びるリングが得られ、このリングは、２つの保持要素の間で緊張されるように適合されている。これらの保持要素は、周回壁の上縁部の上方で、水平外周部の半円弧内の上方に相応に配置すべきである。
【００３５】
本発明の孔付プレートのこの実施形態では、直線部分の間隔も半円弧の半径も、下方から上方に向かって減少し、したがって壁はどこにおいても垂直方向に対して傾斜角を有する。この傾斜角は、１５°から６５°の間、またはより特別には３５゜から５５°の間、すなわち約４５°とすることができる。ここでこの傾斜角は、周回壁の外周部全体にわたって同じである必要はない。例えば傾斜角は直線部分の領域においては、半円弧の領域におけるよりも大きくすることができる。なぜならそこでは、形成されるリングの応力、および対応して壁の傾斜により上方に指向される力が比較的に大きくてもよいからである。
【００３６】
リングチャネルはその外周部において周回壁によって画定することができ、周回壁は少なくとも一部分において、垂直に対して外に向かい１５°から６５°の範囲、またはより特別には３５°から５５°の範囲、すなわち約４５°の傾斜角を有することができる。かくて懸濁液を穏やかにリングチャネルに注ぐための注入面が形成される。
【００３７】
リングチャネルは５０から１，５００μｌまたはより特別には１００から２５０μｌの容積を有することができる。リングチャネルのこの寸法は、内周が６から２０ｍｍのリングを形成するのによく適する。
【００３８】
電界によりリングの材料を電気的に刺激するために、少なくとも２つの保持要素の水平の間隔の方向に、少なくとも１つの凹部の外周部に電極のないスペースを２つ形成することができる。ここで電極は上方から凹部に浸漬することができ、凹部は典型的には孔付プレートの構成部分ではない。磁界によってリングの材料を刺激するために、孔付プレート全体を１つのリングコイルに、または２つのリングコイルの間に取り入れることができる。
【００３９】
リングチャネルの基部と周回壁の上縁部は、本発明の孔付プレートでは規則的に水平に延在し、少なくとも１つの凹部は、その開口部を除いて、プレート本体の上側で閉じている。
【００４０】
本発明の孔付プレートを人工組織の作製および検査に使用すべき場合、少なくとも１つの凹部は生体適合性のある材料によって完全に覆われるべきであり、そのためにプレート本体とこれに装着された保持フィンガは全体的に生体適合性のある材料から形成することができる。リングが生体適合性のある材料から形成されない場合であっても、リングチャネルの内周部を画定する周回壁が疎水性の材料から形成されていることが好ましい。さらにこれらの材料が滑らかであると有利である。すなわち表面粗度が小さいと有利である。これにより周回壁とリングとの間の静止摩擦が低減される。
【００４１】
複数のリングを作製し、大量の検査を行うために、複数の凹部を備える本発明の孔付プレートを、互いに直交する２つの水平方向に設けることができる。
【００４２】
本発明の孔付プレートの本発明による使用では、結合組織細胞とさらなる細胞の懸濁液がリングチャネルに入れられる。凹部は、周回壁の上縁部の上まで、好ましくは保持要素の上まで培養液により満たされる。組織が成熟すると、組織の応力が増大し、組織は周回壁を上方に、保持要素により保持されるまで上昇する。
そして、心筋組織の場合は自発性に、骨格筋組織の場合は例えば電気刺激により誘発することのできるリングの発生する収縮が、弾性に支持された少なくとも１つの保持要素ないし各保持要素の、またはこれに上方に続く指先領域の上方自由端部の運動に基づき、カメラにより検出される。
【００４３】
懸濁液は、とりわけヒドロゲルと筋肉細胞、特に心筋細胞または骨格筋細胞の水性懸濁液とすることができる。
【００４４】
さらなる細胞は、肝細胞または神経、すなわち神経細胞とすることもできる。
【００４５】
凹部に培養液を満たすことは、所定の待機時間後に行うことができる。この待機時間は、培養液の添加の際にヒドロゲル成分のウォッシュアウトが回避されるように選択される。
【００４６】
凹部には保持要素の上まで培養液を満たすことができる。ここで前記または各保持フィンガの上方自由端部は培養液を越えて突き出ることができ、これによりカメラによる前記または各保持フィンガの上方自由端部の運動の検出を容易にする。基本的に培養液は、カメラにより観察される自由端部も覆うことができる。
【００４７】
人工骨格筋組織を電気的に刺激するためだけではなく、人工心筋組織または電気レオロジー材料も電気的に刺激するために、振幅可変の電圧を、例えば個々の電圧パルスまたはユニポーラないしバイポーラ矩形電圧の形で保持フィンガの導電性部分領域の間に、または本発明の孔付プレートの電極のないスペースにある電極の間に印加することができ、一方、前記または各保持フィンガの上方自由端部の運動がカメラにより検出される。具体的には、検出された運動を懸濁液の組成と、および／または電圧の周波数および振幅と、および／または培養液の組成及び温度と、および／または培養液への添加物等と相関させることができる。例えば培養液には、薬理学的または毒物学的な種々の活性物質または作用物質を添加することができ、どのような活性物質または作用物質において、あるいは活性物質または作用物質のどのような濃度において、例えば収縮への定量化可能な作用を、偏向、自発性拍動周波数、基本電圧、収斂ないし弛緩の速度を基準にして識別可能であるかを検査することができる。
【００４８】
人工組織の電気刺激は、例えば組織の成熟を促進し、または所期のように影響を与えるために、カメラによる観察なしでも行うことができる。
【００４９】
凹部に取り込まれる培養液が有色の場合、凹部は好ましくは前記または各保持フィンガに色的に整合され、前記または各保持フィンガが培養液に対して光学的に際立つようにする。例えば培養液はｐH指示薬に基づいて有色であってよい。培養液を前記または各保持フィンガに色的に整合することは、特定の色の培養液のために、前記または各保持フィンガに、これに対してコントラストのある色を付与することができることを含むことが理解される。
【００５０】
本発明の有利な改善形態は、従属請求項、明細書および図面から得られる。明細書に述べた特徴の利点および複数の特徴の組み合わせの利点は、単なる例であり、択一的にまたは累積的に作用することができ、これらの利点は本発明の実施形態により必然的に達成されなければならないものではない。これにより添付された特許請求の範囲の対象が変更されることなく、元の出願書類および特許の開示内容に関して以下のことが当てはまる。さらなる特徴は、図面、とりわけ図示の幾何形状および複数の構成部材の相互の相対的寸法並びにそれらの相対的配置および作用接続から理解される。本発明の種々の実施形態の特徴の組み合わせ、または種々の請求項の特徴の組み合わせも同様に、請求項の選択された引用関係から異なっていても可能であり、ここにおいて発案される。このことは、別個の図面に示された特徴、または図面の説明において述べられる特徴にも当てはまる。これらの特徴も種々の請求項の特徴と組み合わせることもできる。同様に特許請求の範囲に挙げられた特徴は、本発明のさらなる実施形態のために省略することができる。
【００５１】
特許請求の範囲および明細書に述べられた特徴は、それらの数に関して、当該数または述べられた数よりも大きい数が、明示的に副詞「少なくとも」の使用を必要とせずとも存在すると理解すべきである。したがって例えば一エレメントについて述べる場合、これはちょうど１つのエレメント、２つのエレメントまたはそれ以上のエレメントが存在することであると理解される。これらの特徴は、他の特徴によって補充することができ、またはそれぞれの結果物が発生するただ１つの特徴であってもよい。
【００５２】
特許請求の範囲に含まれる参照符号は、特許請求の範囲により保護される対象の範囲を制限するものではない。参照符号は、特許請求の範囲を容易に理解するためにだけ用いられる。
【００５３】
以下、図面に示された好ましい実施例に基づき、本発明をさらに詳細に説明し、記述する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】複数の凹部を備える本発明の孔付プレートの上側を上方からの平面図に示す。
【図２】図１の孔付プレートの凹部の１つを斜視図に示す。
【図３】図２の凹部の垂直縦断面図である。
【図４】図２の凹部の垂直横断面図である。
【図５】本発明の孔付プレートを本発明により使用する際の、図２の凹部の別の実施形態の垂直縦断面図である。
【図６】本発明の方法のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
図１に示した孔付プレート１１は本体１２を有し、本体は基本的に孔付プレート１１の平坦な上側１３を形成する。上側１３には複数の凹部１４が形成されており、これらの凹部はそれぞれ水平方向に矩形の全体寸法を有する。凹部１４は、８行Ａ〜Ｈと６列１〜６に配置されている。各凹部１４の基部にはリングチャネル１５が形成されており、リングチャネルの内周部は周回壁１６によって画定されている。その外周部においてリングチャネル１５は、周回して区分ごとに長手壁１７と、区分ごとに壁１８とによって画定されており、前記長手壁はそれぞれの凹部の長辺が画定し、前記壁は上方に向かって横壁１９に移行し、横壁はそれぞれの凹部１４の短辺を画定する。周回壁１６の内側に各凹部１４には有底孔２０が形成されており、有底孔から２つの保持フィンガ２１が上方に突き出ている。周回壁の水平外周部、すなわち対応して各凹部１４の基部におけるリングチャネル１５は、互い平行に延在する２つの直線部分２６と、これら直線部分２６の自由端部を互いに接続する２つの半円弧２７とから組み合わされている。有底孔２０は、それぞれの凹部１４の長手方向において水平に伸長し、直線部分を越えて半円弧まで延びている。保持フィンガ２１は、長手に伸長した有底孔２０の両端部において実質的に垂直に配向されており、水平の自由間隔２８を置いて互いに配置されている。
【００５６】
図２は、孔付プレート１１の凹部１４の１つを斜視図に示す。ここでは凹部１４の内側への視線を開放するために凹部の長手壁１７が取り除かれている。これにより、周回壁１６の上縁部２２の上方には、保持要素２４を形成するために保持フィンガ２１に湾入部２３が設けられていることが分かる。さらに凹部１４の短辺には壁１９の前方に、電極のないスペース２５が保持要素２４の高さで開放されている。図２から、周回壁１６の水平外周部は下方から上方に向かって縮小し、保持要素２４は周回壁１６の上縁部２２に、保持フィンガ２１の自由間隔２８を除いて、周回壁１６が上方に継続するように接していることが分かる。電極のないスペースの横には、外に向かって傾斜したリングチャネル１５の外壁１８が領域的に登り坂になっており、したがって進入面２９を形成し、この進入面を介してリングチャネル１５にコントルールしながら充填することができる。
【００５７】
図３の縦断面図および図４の横断面図では、垂直方向３１に対する周回壁１６の傾斜角３０が強調されており、この傾斜角はここではそれぞれ４５°であるが、基本的にそれより増減しても良い。垂直方向３１に対する壁１８の傾斜角３２も、ここでは同様に４５゜であるが、増減してもよい。保持フィンガ２１の有底孔２０の基部３３での固定は底部プレート３４を介して行われる。この底部プレートは、保持フィンガ２１と一体的に弾性材料３５から形成されている。底部プレート３４は、有底孔２０に力的に結合して装着することができる。そのためには、底部プレート３４を有底孔２０の基部３３に保持し、保持フィンガ２１の既定の基本配向を凹部１４内で生じさせるためには、表面張力を互いに整合させるだけでしばしば十分である。保持フィンガ２１は、成形工具から容易に取り外しできるようにするため、上方に向かって軽く先き細にすることができる。対応して凹部１４の自由断面も、有底孔２０の内部の全ての箇所において上方に向かって軽く拡張しており、これにより成形工具からの本体１２の離型が容易になる。保持フィンガ２１の指先領域３６は上方に向かって、これに形成された保持要素２４を越えて突き出ているが、しかしプレート本体１２の上側１３の下方で終端している。
【００５８】
図５は凹部１４に基づき、そして図６はブロック図に基づき、本発明の孔付プレート１１の本発明による使用を示す。第１のステップ３７でリングチャネル１５に、例えばヒドロゲルと水溶液中の心筋細胞の懸濁液３８が満たされる。ステップ４１では、ヒドロゲルが心臓細胞と、理想的には３０分から数時間の待機時間内に硬化する。次に凹部１４にはステップ４７で、レベル４３まで培養液４２を満たすことができる。培養液４２中には、典型的には２４から７２時間以内に人工心筋組織４０からなるリング３９が形成される。リング３９は収縮し、周回壁１６を登るように移動する。培養液のレベル４３は、リングが周回壁１６の上縁部２２を乗り越え、保持フィンガ２１にある保持要素２４に当接する場合でも、リング３９が培養液中に完全に留まるように選択される。保持要素２４は、その上端部に保持フィンガ２１の水平の膨張部５１を有する。膨張部は、保持フィンガ２１を介して互いに弾性に支持されており、これに当接するリング３９に対するストレッチャとして作用する。リング３９が人工心筋組織から形成されている場合、リング３９は自律的に周期的収縮を開始する。この収縮の周波数は、ステップ４９で外部電界により、または例えば個別の電圧パルスの形態、またはユニポーラないしバイポーラ矩形電圧の形態の可変振幅電圧よるリング３９の直接電気刺激によって設定することができる。リング３９が例えば人工心筋組織から形成されている場合、または電気レオロジー材料から形成されている場合、収縮はもっぱら電界だけにより、または直接印加される電圧により引き起こされる。
【００５９】
いずれの場合でもステップ４８で、カメラ４５による自由端部４４の観察によって収縮が検出可能な場合、カメラの焦点面４６は自由端部４４をちょうど鮮明に結像するように配置される。そしてカメラ４５により、自由間隔２８の変化が時間経過および大きさに関して量的に検出される。カメラ４５による自由端部４４の運動の観察に対して光学的に好ましい状況は、培養液４２のレベルが保持フィンガ２１の指先領域３６の自由端部４４の下方にあることによって得られる。培養液４２から突き出る自由端部４４は、カメラの画像において、これが培養液４２により覆われている場合よりも比較的に高いコントラストに生じさせる。このことは本発明の孔付プレート１１を本発明により使用する場合、基本的に可能である。
【００６０】
図６は、電圧を印加するステップ４９と、これに平行して行われる、カメラ４５により保持フィンガ２１を観察するステップ４８を示す。培養液４２を凹部１４に添加するステップ４７の際、またはその後に、さらなる任意選択のステップ５０を行うことができ、このステップでは培養液４２に作用物質が添加される。このステップ５０はステップ４８と４９の前、または最中に行うことができ、ステップ４９は任意選択である。このようにしてこの作用物質の人工心筋組織４０に対する作用を検査することができ、例えば保持フィンガ２１の自由間隔２８の動的な変化として測定される収縮がどのように変化するかについて検査することができる。
【００６１】
図５では、２つの保持フィンガ２１が底部プレートによって互いに接続されておらず、個別に物質的に結合して有底孔２０の基部３３に取り付けられている。これは例えば孔付プレートを３Ｄプリンタでプリンティングする際、または保持フィンガを孔付プレートと接着ないし融合する際に行うことができる。
【符号の説明】
【００６２】
Ａ〜Ｈ  行
１〜６  列
１１  孔付プレート
１２  プレート本体
１３  上側
１４  凹部
１５  リングチャネル
１６  周回壁
１７  長手壁
１８  壁
１９  横壁
２０  有底孔
２１  保持フィンガ
２２  上縁部
２３  湾入部
２４  保持要素
２５  電極のないスペース
２６  直線部分
２７  半円弧
２８  自由間隔
２９  進入面
３０  傾斜角
３１  垂直方向
３２  傾斜角
３３  有底孔の基部
３４  底部プレート
３５  材料
３６  指先領域
３７  ステップ
３８  懸濁液
３９  リング
４０  人工心筋
４１  ステップ
４２  培養液
４３  レベル
４４  自由端部
４５  カメラ
４６  焦点面
４７  ステップ
４８  ステップ
４９  ステップ
５０  ステップ
５１  膨張部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019517277.tif 000008
【国際調査報告】
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2019517277.tif 000010
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