(57)【要約】  本発明は、強化されたアゴニスト活性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法に関する。
2019532025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、前記突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、前記抗体。
【請求項２】
前記Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号６３、６４、６５、６６又は６７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
第２の突然変異を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ２における前記Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１における前記Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ４における前記Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ＴＮＦＲファミリーの前記受容体が、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を前記抗体に導入して、前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、前記遺伝子操作を受けた抗体を前記被験体に投与することとを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記抗体が、第２の突然変異を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ２における前記Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１における前記Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ４における前記Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体が癌を有する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が固形腫瘍である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固形腫瘍が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーが、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）である、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに十分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を前記被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記抗体が、第２の突然変異を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＮＦＲファミリーの前記受容体が、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）又はＧＩＴＲ（配列番号２３）である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、癌の治療における使用について、前記突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、前記抗体。
【請求項３１】
前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、前記癌の治療において使用するための請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
癌を治療するための医薬品の製造における、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体の使用。
【請求項３３】
前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される配列表を含み、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。２０１７年７月３１日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルは、ファイル名がＪＢＩ５０９５ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１６８キロバイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、強化されたアゴニスト活性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗腫瘍免疫効果を賦活するモノクローナル抗体は、癌治療法の重要な分類として台頭しつつある。これらの多くは、免疫賦活性腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーに対するものである。最近の研究によって、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性及び治療活性が、Ｆｃを介したＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への架橋に依存していることが示された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１０３０〜４；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６２：９４１〜８）。Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＢは、スカフォールドとして作用して、下流の細胞内シグナル伝達を活性化するための必要条件である受容体のクラスタリングを促進する抗体の多量体化を促進する（Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：３７１６〜２５）。
【０００４】
抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の抗腫瘍活性を更に最適化するためのアプローチでは、そのＦｃγＲＩＩＢ会合を改善するために抗体のＦｃ領域を遺伝子操作してきた。置換Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒは、ＦｃγＲＩＩＢ会合を選択的に強化することが報告されている（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３；Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）。ＦｃγＲＩＩＢ会合の最適化は実行可能なアプローチであるが、このような遺伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性は、局所腫瘍微小環境におけるＦｃγＲ発現細胞の密度に依存するので、このような抗体の有効性が多少制限されることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、更なる最適化された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、当該突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【０００７】
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物も提供する。
【０００８】
また、本発明は、被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、遺伝子操作を受けた抗体を被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、被験体における癌を治療する方法であって、癌を治療するのに十分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、癌の治療における使用について、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００１１】
また、本発明は、癌を治療するための医薬品の製造における、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性が架橋依存性であることを示す。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイにおいて架橋剤であるプロテインＧビーズの存在下でのみシグナル伝達を誘導した。プロテインＧビーズの存在下又は非存在下において漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０リガンド又はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１を、ＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞及びＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下にある分泌型アルカリホスファターゼ（secreted embryonic alkaline phosphatase、ＳＥＡＰ）リポーター遺伝子と共にインキュベートした。ＳＥＡＰリポーター遺伝子の発現を反映する６５０ｎｍにおけるＯＤを、試験剤の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として提示する。
【図１Ｂ】Ｒａｊｉ細胞と共培養しても、天然ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有するＳＦ２抗体のアゴニスト活性を有意に強化することはできないことを示す。Ｒａｊｉ細胞と共培養して又は共培養せずに、漸増濃度（１０から１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞と共にインキュベートし、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＮＦ−κＢリポーターアッセイによってそのアゴニスト活性を評価した。１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって駆動されたものに対する活性パーセントとして正規化された抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を、試験抗体の濃度に対してプロットした（データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝１４）として提示した）。
【図２Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、野生型ＩｇＧ１（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と比べてＦｃγＲＩＩＢに対する結合が強化されたことを示す。ＦｃγＲＩＩＢを発現しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２と共にインキュベートし、抗体の結合をフローサイトメトリーを用いて評価した。平均蛍光シグナルを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として提示する。
【図２Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、野生型ＩｇＧ１（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と比べてＦｃγＲＩＩＡに対する結合が強化されたが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は同等の結合を有していた。ＦｃγＲＩＩＡを発現しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２と共にインキュベートし、抗体の結合をフローサイトメトリーを用いて評価した。平均蛍光シグナルを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として提示する。
【図２Ｃ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、野生型ＩｇＧ１（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と比べてＦｃγＲＩに対する結合が減少したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは同等の結合を有していた。ＦｃγＲＩを発現しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２と共にインキュベートし、抗体の結合をフローサイトメトリーを用いて評価した。平均蛍光シグナルを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として提示する。
【図２Ｄ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合が消失したことを示す。ＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２と共にインキュベートし、抗体の結合をフローサイトメトリーを用いて評価した。平均蛍光シグナルを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として提示する。
【図３Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、野生型ＩｇＧ１（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と比べてＦｃγＲＩＩＢ受容体を発現しているＲａｊｉ細胞に対する結合が強化されたことを示す。漸増濃度（３ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２を、フローサイトメトリーアッセイによってＲａｊｉ細胞に対する結合について評価した。平均蛍光シグナルを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として提示する。
【図３Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２のＲａｊｉ細胞に対する結合がＦｃγＲＩＩＢ依存性であることを示す。Ｒａｊｉ細胞を５μｇ／ｍＬの抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６で前処理し、１μｇ／ｍＬの抗体のＲａｊｉ細胞への結合をフローサイトメトリーによって評価した。指定のとおり２Ｂ６抗体によってプレブロックした又はしなかった結合の平均蛍光シグナルを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として棒グラフで提示する。
【図３Ｃ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆのアゴニスト活性がＲａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢによる抗体架橋に依存することを示す。一部のアッセイでは共培養の開始前に５μｇ／ｍＬの抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６抗体と共にプレインキュベートしたＲａｊｉ細胞と共培養するか又はせずに、漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆを、ＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）と共にインキュベートした。ｙ軸は、１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって媒介される活性パーセントとして正規化された抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を示す。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）として提示する。
【図３Ｄ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２のアゴニスト活性がＲａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢによる抗体架橋に依存することを示す。一部のアッセイでは共培養の開始前に５μｇ／ｍＬの抗ＦｃγＲＩＩＢ（２Ｂ６）抗体と共にプレインキュベートしたＲａｊｉ細胞と共培養するか又はせずに、漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２を、ＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）と共にインキュベートした。ｙ軸は、１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって媒介される活性パーセントとして正規化された抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を示す。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）として提示する。
【図４Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、ＡＤＣＣが消失させたことを示す。漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１を、エフェクター細胞と共培養した、ＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞と共にインキュベートし、ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイを実施した。ＡＤＣＣ活性の活性倍数（抗体を添加しなかった対照サンプルに対する）を試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）として提示する。
【図４Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、ＡＤＣＰ活性を保持することを示す。漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１を、分化したマクロファージと共培養した、ＯＸ４０を安定的に発現しているＧＦＰ陽性ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞と共にインキュベートし、ＧＦＰ陽性標的細胞の貪食をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。ＡＤＣＰ活性を反映する、排除されたＧＦＰ陽性細胞のパーセントを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）として提示する。
【図４Ｃ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は分化したマクロファージに対する結合が減少したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは野生型抗体（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と同様のレベルでマクロファージに結合することを示す。漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体を分化したマクロファージと共にインキュベートし、その結合をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。平均蛍光シグナルを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として提示する。
【図４Ｄ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦはＣＤＣを媒介しないことを示す。漸増濃度（１０から１０，０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体を、ウサギ補体の存在下でＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞と共にインキュベートした。溶解した細胞のサイトゾルから放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase、ＬＤＨ）活性を測定することによってＣＤＣ活性を定量し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって溶解したものに対する細胞傷害パーセントとして表した（データを平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝７）として提示する）。
【図５】ＯＸ４０発現細胞の表面上における抗体の多量体化の程度の指標である、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０ＹについてのＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）ＰＰＩアッセイから得られた、補正された生物発光共鳴エネルギー転移（bioluminescence resonance energy transfer、ＢＲＥＴ）比を示す。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１−ｎ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ−ｎ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ−ｎ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ−ｎ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ−ｎは、Ｃ末端Ｎａｎｏｌｕｃ配列とインフレームである構造物である。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１−ｈ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ−ｈ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ−ｈ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ−ｈ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ−ｈは、Ｃ末端Ｈａｌｏｔａｇ配列とインフレームである構造物である。漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）ドナー抗体及びＨａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）アクセプター抗体の両方を、ＯＸ４０細胞を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞に適用し、ＮａｎｏＢＲＥＴ  ＰＰＩアッセイを実施した。補正された平均ＢＲＥＴ比を試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧２）として提示する。
【図６Ａ】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイにおいてＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比べて、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙのアゴニスト活性が強化されたことを示す。漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ抗体を、ＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞に適用し、ＳＥＡＰ分泌を測定した。１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって駆動されたものに対する活性パーセントとしてアゴニスト活性を正規化し、試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧９）として提示する。
【図６Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲとＲａｊｉ細胞との架橋は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイにおいて抗体のアゴニスト活性を更に増強することを示す。抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６によるＲａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢのプレブロックによって増強は抑制された。１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって駆動されたものに対する活性パーセントとしてアゴニスト活性を正規化し、試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として提示する。
【図６Ｃ】単独の又はＲａｊｉ細胞の存在下で架橋したＦｃ受容体に対する結合においてサイレント（無変化：silent）であるＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイにおいてアゴニスト活性を有しないことを示す。１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって駆動されたものに対する活性パーセントとしてアゴニスト活性を正規化し、試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として提示する。
【図６Ｄ】Ｅ３４５Ｒ突然変異が、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイにおいてＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａのアゴニスト活性をレスキューしたことを示す。しかし、Ｒａｊｉ細胞との架橋がそのアゴニスト活性を更に増強することはできなかった。１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって駆動されたものに対する活性パーセントとしてアゴニスト活性を正規化し、試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として提示する。
【図７Ａ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは野生型抗体（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と比べて強化されたＡＤＣＣを有し、ＦｃサイレントＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ抗体はＡＤＣＣを抑制したことを示す。漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒを、エフェクター細胞と共培養した、ＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞と共にインキュベートし、ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイを実施した。抗体を含まないサンプルと比べたＡＤＣＣの活性化倍数を試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧４）として提示する。
【図７Ｂ】ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは野生型ＩｇＧ１（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１）と同等のＡＤＣＰを有し、Ｅ３４５Ｒはエフェクターサイレント抗体（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ）においてＡＤＣＰをレスキューすることを示す。漸増濃度（１ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１／ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ抗体を、分化したマクロファージと共に、ＯＸ４０を安定的に発現しているＧＦＰ陽性ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞と共にインキュベートし、ＧＦＰ陽性標的細胞の貪食をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。ＡＤＣＰ活性を反映する、排除されたＧＦＰ陽性細胞のパーセントを試験抗体の濃度に対してプロットした。データを平均±ＳＥＭ（ｎ≧９）として提示する。
【図７Ｃ】Ｅ３４５Ｒ突然変異によって、ＯＸ２０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲのＣＤＣ活性は強化されたが、エフェクターサイレントＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒに対する効果はなかったことを示す。漸増濃度（１０から１０，０００ｎｇ／ｍＬ）のＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ抗体を、ウサギ補体の存在下でＯＸ４０を安定的に発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞と共にインキュベートした。溶解した細胞のサイトゾルから放出されたＬＤＨ活性を測定することによってＣＤＣ活性を定量し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって溶解したものに対する細胞傷害パーセントとして表した（データを平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝６）として提示する）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。
【００１４】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
【００１６】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【００１７】
「抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体」又は「抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する抗体を指す。
【００１８】
「ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー」には、ＴＮＦＲの自然発生変異体をはじめとする、表１に示す受容体などのＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体が含まれる。ＴＮＦＲは、典型的には、Ｉ型膜貫通タンパク質として発現し、その細胞外ドメインに１〜６個のシステインリッチドメインを含有する。シグナル伝達は、ＴＮＦＲ三量体として生じる。各ＴＮＦＲごとに１つのアイソフォームのアミノ酸配列を表１に示す。ＴＮＦＲのリガンドも表１に示す。
【００１９】
【表１】
2019532025.tif 000003
【００２０】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」とは、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー又は当該特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに対して、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、結合についての平衡解離定数（ＫＤ）が約１×１０−８Ｍ以下、例えば約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下又は約１×１０−１２Ｍ以下であるときに「特異的に結合し、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合については、そのＫＤの少なくとも１００分の１のＫＤで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー又は当該特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに特異的に結合する抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する。
【００２１】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構造を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本の重鎖（heavy chains、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chains、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３のドメインで構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
【００２２】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する相補性決定領域（Complementarity Determining Regions、ＣＤＲ）は配列多様性に基づく（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１３２：２１１〜５０；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する「超可変性領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋによって定義されているとおり、構造が超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１〜１７）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準化付番及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応関係については、（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５〜７７に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【００２３】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４へと更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【００２４】
「抗体フラグメント」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２、及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保持する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体フラグメントとしては、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖフラグメント、並びに１つのＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。合成リンカーを介してＶＨドメイン及びＶＬドメインを互いに連結して様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成することが可能であり、その場合、ＶＨ／ＶＬドメインは、分子内で対形成してもよく、又はＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構造物によって発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価抗原結合部位又はダイアボディを形成してもよい。これらは、例えば、国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
【００２５】
「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からＣ末端リシンを除去するなどの可能な周知の変化、あるいはメチオニンの酸化又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなどのアミノ酸の翻訳後修飾による変化を除いて、各重鎖及び各軽鎖のアミノ酸組成が単一である抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原エピトープに結合する二重特異性のモノクローナル抗体を除き、典型的には１つの抗原エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二価抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
【００２６】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又は抗体フラグメントを指す（例えば、例えばＯＸ−４０に特異的に結合する単離された抗体は、ＯＸ−４０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。「単離された抗体」は、純度が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の抗体など、高純度に単離された抗体を包含する。
【００２７】
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換を含んでいてもよく、その結果、当該フレームワークが、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでない場合もある。
【００２８】
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指し、ヒト被験体に投与されたときに免疫応答が最小限に抑えられるように最適化される。抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
【００２９】
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系の代表的なものには、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウス又はラットなどといったヒト以外の遺伝子導入動物を含む。「ヒト抗体」は、抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために用いられる系間の違い、体細胞突然変異の導入、あるいはフレームワーク若しくは抗原結合部位又はこれら両方への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子と比べてアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６）に記載されているヒトフレームワーク配列解析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えば（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されている、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
【００３０】
ヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ファージディスプレイ組み込み合成ＣＤＲ及び／又は合成フレームワークなどの系を用いて作製することもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発に供して抗体特性を改善した結果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
【００３１】
抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【００３２】
「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及びその他のタンパク質を指す。
【００３３】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的には、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖などの部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体の「エピトープ」は、エピトープを同定するために使用される方法論に依存する。
【００３４】
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えばＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得るか、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
【００３５】
「多重特異性」とは、２つ以上の異なる抗原又は同じ抗原内の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を指す。
【００３６】
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して、例えば、細胞、ウイルス、動物、植物などの生物系及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
【００３７】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、合成ポリヌクレオチドの典型例である。
【００３９】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。これら変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発癌物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／癌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、及びｅｘ  ｖｉｖｏにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４年））。
【００４１】
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【００４２】
「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が指定された数存在することを指す。そのため、「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」なる用語はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。
【００４３】
「アゴニスト」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの少なくとも１つの生物活性を誘導する抗体であって、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの天然リガンドによって誘導されるものに結合する抗体を指す。例示的なアゴニスト活性としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生の誘導、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）におけるＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現の増加によって評価されるＤＣ分化の誘導、Ｂ細胞増殖の増加又はＢ細胞におけるＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現の増加によって評価されるＢ細胞の活性化、抗原に既に曝露された患者から単離されたＰＢＭＣによるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生によって評価される抗原特異的Ｔ細胞リコール応答の誘導、並びにＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導が挙げられる。アゴニスト活性（例えば、アゴニズム）は、架橋依存性である場合もあり、抗体架橋に依存しない場合もある。
【００４４】
「強化されたアゴニスト活性」又は「強化されたアゴニズム」とは、ＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体によって誘導される産生によってアゴニスト活性が測定されるとき、親野生型抗体と比べて遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニズムが改善されたことを指す。遺伝子操作を受けた抗体は、架橋依存的又は架橋非依存的に１μｇ／ｍＬの抗体濃度の野生型親抗体と比べて少なくとも２０％高いレベルでＳＥＡＰ産生を誘導するとき、「強化されたアゴニスト活性」を有する。
【００４５】
「架橋」とは、ＦｃγＲ、例えば、シス型又はトランス型のＦｃγＲＩＩｂに結合する抗体によって誘導され、その結果、ＴＮＦＲの抗体によって誘導される多量体化及びＴＮＦＲアゴニスト活性の誘導が生じる、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを発現している細胞における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の高次多量体化を指す。架橋は、本明細書に記載されるとおり、架橋剤としての抗ヒトＦ（ａｂ’）２、又はＲａｊｉ細胞などのＦｃγＲＩＩｂを発現している細胞を使用することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができる。
【００４６】
「抗体架橋に依存しないアゴニスト活性」とは、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＢを発現しているＲａｊｉ細胞の非存在下において、溶液中で本明細書の実施例３に記載のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）リポーターアッセイにおいてＳＥＡＰの産生を抗体が誘導することを意味する。
【００４７】
「被験体」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」には、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物などのすべての脊椎動物が含まれる。
【００４８】
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のとおりＥＵインデックスに従う。
【００４９】
表２に示すとおり、従来の１文字及び３文字アミノ酸コードが本明細書で使用される。
【００５０】
【表２】
2019532025.tif 000004
【００５１】
組成物
本発明は、抗体エフェクター機能のアイソタイプ依存性調節に加えて強化されたアゴニスト活性を示す、改善された特性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、表面細胞において抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を多量体化する置換が、架橋に依存せずに当該抗体のアゴニスト活性を強化するという知見に基づいている。
【００５２】
本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、所望により、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｓ４４０Ｙ突然変異、又はＥ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を更に含み（残基の付番はＥＵインデックスに従う）、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００５３】
また、本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００５４】
Ｅ３４５Ｒ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
【００５５】
Ｅ４３０Ｇ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
【００５６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
【００５７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
【００５８】
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００５９】
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ４３０Ｇ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ４３０Ｇ突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００６０】
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００６１】
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ＦｃγＲ抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有する。したがって、ＦｃγＲ架橋に依存しないアゴニスト活性を有する本発明の抗体は、そのアゴニスト活性について、腫瘍微小環境においてＦｃγＲを発現している細胞のバイオアベイラビリティ及び密度に依存せず、十分なＦｃγＲ細胞浸潤を欠く環境においてＴＮＦＲシグナル伝達を誘導することができる。
【００６３】
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、天然リガンドよりも低いアゴニズムのレベルを示し得るので、改善された安全性プロファイルを提供することができる。
【００６４】
「親抗体」とは、本発明の遺伝子操作を受けた抗体を産生するために使用される抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を指す。
【００６５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を媒介する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（antibody-dependent cell phagocytosis、ＡＤＣＰ）を媒介する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ４３５Ｒ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用することができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異を更に含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更に含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞由来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【００９３】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【００９４】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療において使用するのに好適である。
【００９５】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において使用するのに好適である。
【００９６】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使用するのに好適である。
【００９７】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
【００９８】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣの治療において使用するのに好適である。
【００９９】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１００】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌腫（renal cell carcinoma、ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌腫又は腎乳頭状細胞癌腫）、又はその転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０１０１】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において使用するのに好適である。
【０１０２】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（nasopharyngeal carcinoma、ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０１０３】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療において使用するのに好適である。
【０１０４】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１０５】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０１０６】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において使用するのに好適である。
【０１０７】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０１０８】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０１０９】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１０】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１１】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０１１２】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０１１３】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１４】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１５】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１６】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１７】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療において使用するのに好適である。
【０１１８】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療において使用するのに好適である。
【０１１９】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸癌の治療において使用するのに好適である。
【０１２０】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ４３０Ｇ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用することができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異を更に含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更に含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞由来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【０１４９】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【０１５０】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【０１５１】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療において使用するのに好適である。
【０１５２】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において使用するのに好適である。
【０１５３】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１５４】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０１５５】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣの治療において使用するのに好適である。
【０１５６】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１５７】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌腫又は腎乳頭状細胞癌腫）、又はその転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０１５８】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において使用するのに好適である。
【０１５９】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０１６０】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６１】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６２】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６３】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６４】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６５】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６６】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６７】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０１６８】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０１６９】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０１７０】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使用するのに好適である。
【０１７１】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において使用するのに好適である。
【０１７２】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使用するのに好適である。
【０１７３】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において使用するのに好適である。
【０１７４】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療において使用するのに好適である。
【０１７５】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療において使用するのに好適である。
【０１７６】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸癌の治療において使用するのに好適である。
【０１７７】
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用することができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置である。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異を更に含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更に含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞由来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【０２０６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【０２０７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【０２０８】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療において使用するのに好適である。
【０２０９】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において使用するのに好適である。
【０２１０】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２１１】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０２１２】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣの治療において使用するのに好適である。
【０２１３】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２１４】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌又は腎乳頭状細胞癌）、又はその転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０２１５】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において使用するのに好適である。
【０２１６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０２１７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療において使用するのに好適である。
【０２１８】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２１９】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２０】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２１】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２２】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２３】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２４】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２５】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０２２６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０２２７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２８】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において使用するのに好適である。
【０２２９】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使用するのに好適である。
【０２３０】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において使用するのに好適である。
【０２３１】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療において使用するのに好適である。
【０２３２】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療において使用するのに好適である。
【０２３３】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸癌の治療において使用するのに好適である。
【０２３４】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用することができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異を更に含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更に含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ−２９３細胞由来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
【０２６３】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【０２６４】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適である。
【０２６５】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療において使用するのに好適である。
【０２６６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において使用するのに好適である。
【０２６７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２６８】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０２６９】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣの治療において使用するのに好適である。
【０２７０】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２７１】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌又は腎乳頭状細胞癌）、又はその転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０２７２】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において使用するのに好適である。
【０２７３】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
【０２７４】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療において使用するのに好適である。
【０２７５】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２７６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０２７７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において使用するのに好適である。
【０２７８】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好適である。
【０２７９】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８０】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８１】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８２】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０２８３】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫の治療において使用するのに好適である。
【０２８４】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８５】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８６】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８７】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８８】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療において使用するのに好適である。
【０２８９】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療において使用するのに好適である。
【０２９０】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸の治療において使用するのに好適である。
【０２９１】
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療において使用するのに好適である。
【０２９２】
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、エフェクター細胞で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した、抗体被膜標的細胞と、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に依存して、細胞死を誘導する機序である。例えば、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。ＴＮＦＲ発現細胞などの抗体被膜標的細胞の死滅は、膜孔形成タンパク質及びプロテアーゼの分泌を通じたエフェクター細胞の活性により生じる。本発明の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、抗体を免疫エフェクター細胞と組み合わせてＴＮＦＲ発現細胞に添加してよく、当該免疫エフェクター細胞は抗原抗体複合体によって活性化され、その結果、標的細胞の細胞溶解が生じ得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。そのようなアッセイの代表的なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。例示的な標的細胞としては、Ｔｒｅｇなどの内因的に又は組み換えでＴＮＦＲを発現する細胞が挙げられる。例示的なアッセイでは、標的細胞は、１標的細胞に対して５０エフェクター細胞の比で使用される。標的細胞を、３７℃で２０分間ＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で予標識し、２回洗浄し、ＤＭＥＭ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に再懸濁させる。標的（１×１０４細胞）及びエフェクター細胞（０．５×１０６細胞）を合わせ、１００μＬの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加する。試験抗体を含むか又は含まない、更なる１００μＬを添加する。プレートを２００ｇで３分間遠心分離し、３７℃で２時間インキュベートし、次いで、２００ｇで３分間再び遠心分離する。１ウェル当たり合計２０μＬの上清を除去し、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ  Ｅｕｒｏｐｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって細胞溶解を測定する。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。あるいは、受容体の活性化が本明細書に記載されるルシフェラーゼリポーターの発現を引き起こすリポーター遺伝子アッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩＡの活性化を評価することによってＡＤＣＣ活性を評価することができる。
【０２９３】
「抗体依存性細胞貪食」（「ＡＤＣＰ」）とは、例えばマクロファージ又は樹状細胞などの貪食細胞による取り込みにより、抗体被覆標的細胞を排除する機序を指す。ＡＤＣＰは、エフェクター細胞として単球由来マクロファージを用い、ＧＦＰ又は別の標識分子を発現するように遺伝子操作された標的細胞として、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２１３（商標））、又はＴＮＦＲを発現しているＢ細胞性白血病若しくはリンパ腫若しくは腫瘍の細胞を用いて評価され得る。エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加し又は添加せずに、標的細胞と共に４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体を用いて同定され得、貪食の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。
【０２９４】
本発明の抗体のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、又は補体への当該抗体の結合を強化する抗体Ｆｃに更なる突然変異を導入することによって更に強化され得る。
【０２９５】
活性化Ｆｃγに対する本発明の抗体の結合を増加させるため及び／又は抗体のエフェクター機能を強化するために変異させることができるＦｃの位置は、例えば米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許公開第２０１５／０２５９４３４号、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６０４、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：４００５〜１０、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：８８８２〜９０、Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：２５１７〜２７及びＤｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３に記載されているものであり、２３６、２３９、２４３、２５６、２９０、２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０位を含む（残基の付番はＥＵインデックスに従う）。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な突然変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌ突然変異である。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加した抗体が生じる例示的な突然変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけるＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異である。
【０２９６】
本発明の抗体のＣＤＣを強化するために突然変異させることができるＦｃの位置は、例えば国際公開第２０１４／１０８１９８号、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５７１〜５及びＭｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ  ２：１８１〜９に記載されているものであり、２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な突然変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔ突然変異である。ＣＤＣが増加した抗体が生じる例示的な突然変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異である。
【０２９７】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、標的に結合した抗体のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化し、次に、当該補体成分が補体カスケードを活性化して標的細胞を死に至らしめる、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせて、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＡＤＣＣを容易にする。ＴＮＦＲ発現細胞のＣＤＣは、例えば、ＲＰＭＩ−Ｂ（１％  ＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）でＤａｕｄｉ細胞をプレーティングし、０〜１００μｇ／ｍＬの最終的な濃度になるように５０μＬの試験抗体をウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定できる。溶解した細胞の割合（％）は、標準の方法を使用して、ＦＡＣＳアッセイ内のヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
【０２９８】
本発明の抗体のＡＤＣＣを誘導する能力は、当該抗体のオリゴ糖成分を遺伝子操作することによっても強化することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ−グリコシル化され、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に結合した二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ活性を変更することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合によって抗体のＡＤＣＣを増強する。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高度に脱フコシル化された抗体の発現を成功させることが報告されている様々な方法、例えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４：２４９〜６５）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜４０）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ  ２：４０５〜１５）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜７３）、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１〜８）、又はβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジα−マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシンとの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：５０３２〜６；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３：８５１〜６１；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９９：６５２〜６５）などを使用して実現され得る。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
【０３００】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｇ２３６Ａ突然変異、Ｓ２３９Ｄ突然変異、Ｆ２４３Ｌ突然変異、Ｔ２５６Ａ突然変異、Ｋ２９０Ａ突然変異、Ｒ２９２Ｐ突然変異、Ｓ２９８Ａ突然変異、Ｙ３００Ｌ突然変異、Ｖ３０５Ｌ突然変異、Ｋ３２６Ａ突然変異、Ａ３３０Ｋ突然変異、Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ａ３３９Ｔ突然変異、Ｐ３９６Ｌ突然変異、Ｓ２６７Ｅ突然変異、Ｈ２６８Ｆ突然変異、Ｓ３２４Ｔ突然変異、Ｋ３２６Ａ突然変異、Ｋ３２６Ｗ突然変異、Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｅ４３０Ｓ突然変異、Ｅ４３０Ｆ突然変異及びＥ４３０Ｔ突然変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ突然変異、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ突然変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ突然変異及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
【０３０２】
本発明の抗体のＡＤＣＣを誘導する能力は、当該抗体のオリゴ糖成分を遺伝子操作することによって強化することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ−グリコシル化され、大部分のグリカンは、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に結合した二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ活性を変更することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合によって抗体のＡＤＣＣを増強する。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、約０％〜約１５％、例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。
【０３０５】
「フコース含量」とは、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、全糖構造に関するフコース含有構造の割合である。これらは、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているとおり、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理されたサンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ構造及び高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに結合したままにさせる、Ｅｎｄｏ  Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素を用いた消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ）による、ｍＡｂの成分ペプチドへの消化、並びにそれに続くＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＣ）による分離、検出、及び定量化、あるいは５）Ａｓｎ２９７でＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた酵素による特異的脱グリコシル化による、ｍＡｂオリゴ糖のｍＡｂタンパク質からの分離、により特徴付けられ、定量化され得る。放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実験的質量を理論的質量と比較することによるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ  Ｃ）によるシアル化度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ  Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリー電気泳動−レーザ誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化によって、グリカン構造の精密な特性評価を可能にする様々な補助的技術によって分離及び同定することができる。
【０３０６】
「低フコース」又は「低フコース含量」とは、抗体が約０％〜１５％のフコース含量を有することを指す。
【０３０７】
「正常なフコース」又は「正常なフコース含量」とは、抗体が約５０％を超える、典型的には、約６０％、７０％、８０％を超える、又は８５％を超えるフコース含量を有することを指す。
【０３０８】
エフェクター機能が望ましくない場合、本発明の抗体を更に遺伝子操作して、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する当該抗体の結合を減少させる及び／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは抗体依存性細胞媒介性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低下させる少なくとも１つの突然変異を当該抗体Ｆｃに導入してもよい。
【０３０９】
活性化ＦｃγＲに対する抗体の結合を減少させ、続いて、エフェクター機能を低下させるために突然変異させることができるＦｃの位置は、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６０４、国際公開第２０１１／０６６５０１号、米国特許第６，７３７，０５６号及び同第５，６２４，８２１号、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６〜２６、Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７〜４３、Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：４０３〜１１、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８：５６３〜７１、Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１２５６〜６４、Ｇｈｅｖａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：２９２９〜３８、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ，１：５７２〜９に記載されているものであり、２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１及び３６５位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる例示的な突然変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４におけるＫ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ突然変異である。ＡＤＣＣを低減するために行うことができる例示的な組み合わせ突然変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４におけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７〜２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１〜４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４  Ｆｃドメインを使用してもよい。
【０３１０】
ＩｇＧ４の安定性を強化するために、ＩｇＧ４抗体にＳ２２８Ｐ突然変異を施してよい。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｋ２１４Ｔ突然変異、Ｅ２３３Ｐ突然変異、Ｌ２３４Ｖ突然変異、Ｌ２３４Ａ突然変異、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ突然変異、Ｆ２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異、Ｇ２３７Ａ突然変異、Ｐ２３８Ａ突然変異、Ｐ２３８Ｓ突然変異、Ｄ２６５Ａ突然変異、Ｓ２６７Ｅ突然変異、Ｈ２６８Ａ突然変異、Ｈ２６８Ｑ突然変異、Ｑ２６８Ａ突然変異、Ｎ２９７Ａ突然変異、Ａ３２７Ｑ突然変異、Ｐ３２９Ａ突然変異、Ｄ２７０Ａ突然変異、Ｑ２９５Ａ突然変異、Ｖ３０９Ｌ突然変異、Ａ３２７Ｓ突然変異、Ｌ３２８Ｆ突然変異、Ａ３３０Ｓ突然変異及びＰ３３１Ｓ突然変異からなる群から選択される第２の突然変異を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３１２】
更なるＦｃ突然変異、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２３５１４〜２４，Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：１５７〜９，Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：６２１３〜６，Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６〜５６，Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６０４，Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９〜６９，Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３５：８６〜９４，Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１２８３〜８，Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０：３２６９〜７７  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２８１９〜２５に記載されており、２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５位を含むものを導入することによって、本発明の抗体を更に遺伝子操作して抗体の半減期を調節することもできる。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な突然変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ及びＨ４３５Ｒ突然変異である。抗体の半減期を延長するために行うことができる例示的な単独又は組み合わせの突然変異は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ突然変異である。抗体の半減期を短縮するために行うことができる例示的な単独又は組み合わせの突然変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒ突然変異である。
【０３１３】
保存的修飾を更に含む本発明の抗体も本発明の範囲内である。
【０３１４】
「保存的修飾」とは、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に大きく影響する又はこれを変えることのないアミノ酸の修飾のことを指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的置換は、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング突然変異誘発について既に記載されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ  ６４３：５５〜６７；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３５：１〜２４）、ポリペプチド中の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）などの既知の方法によって行うことができる。あるいは、変異体のライブラリーは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）、又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコード化するＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
【０３１５】
本発明の抗体を、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの非自然発生的な共有結合修飾などのプロセスによって翻訳後修飾され得る。こうした修飾はｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る。例えば、本発明の抗体にポリエチレングリコールを融合させる（ＰＥＧ化）することによって薬物動態のプロファイルを向上させることができる。融合は当業者に既知の技術によって行われ得る。治療用抗体をＰＥＧと接合させると、機能に干渉することなく薬力学的動態が強化されることが示されている（Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６〜１９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １６：７６１〜７０；Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９〜１８）。
【０３１６】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するために修飾され得る本発明の抗体は、本発明の範囲内である。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合に影響するタンパク質／タンパク質界面相互作用、（３）極性残基及び帯電残基の埋没、（４）極性残基及び帯電残基のＨ結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布を含む多くの要因によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：９８９〜１０１０）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、抗体の安定性に対する該残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つには、示差走査熱量計法（ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔｍ）を高くするというものがある。一般に、タンパク質のＴｍはその安定性と相関しており、溶液中でのアンフォールディング及び変性のし易さ、並びに当該タンパク質がアンフォールディングする傾向に依存する分解プロセスとは逆相関している（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１３：３６〜４６）。多数の研究で、ＤＳＣによって熱安定性として測定された処方の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定された物理的安定性との間に相関が見出されている（Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４０：１５５〜６８；Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：２００〜８；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８：２００３；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：１３５３〜６１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜８９）。配合物の研究により、ＦａｂのＴｍは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。
【０３１７】
Ｃ末端リシン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって注入された抗体から除去され得る（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８：４０４〜１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ−Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。抗体のＣＴＬ含量は、公知の方法を用いて測定することができる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約４０％〜約７０％、約５５％〜約７０％又は約６０％のＣ末端リシン含量を有する。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、約０％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のＣ末端リシン含量を有する。
【０３２０】
本発明の抗体を生成する方法
Ｆｃドメインが遺伝子操作を受けた本発明の抗体は、テンプレートとして野生型のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４配列を使用し、標準的なクローニング及び発現技術を用いて生成することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、抗体Ｆｃに突然変異を導入することができ、本明細書に記載される方法を用いてＦｃγＲへの抗体結合、アゴニスト活性、又は他の所望の特性に対する効果を評価することができる。
【０３２１】
抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ｄｅ  ｎｏｖｏ生成することができる。
【０３２２】
例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット又はサルなどを、ヒトＴＮＦＲ又はＴＮＦＲの細胞外ドメインで免疫し、続いて、標準的な方法を使用して、免疫した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原の親和性などの所望の特性を有する抗体の生成についてスクリーニングする。
【０３２３】
様々な宿主動物を使用して、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を産生することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、抗ヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外の動物において作製された抗体を、様々な技術を使用してヒト化して、よりヒトに近い配列を生成することもできる。
【０３２４】
ヒトアクセプターフレームワークの選別を含む例示的なヒト化技術は公知であり、ＣＤＲグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９〜９８）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）を含む。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくは標準構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づいて選択され得るヒトフレームワークに親抗体のＣＤＲを移植する。
【０３２５】
ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰突然変異）、又は任意のＣＤＲに変異を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
【０３２６】
ゲノム中にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有する遺伝子導入動物、例えば、マウス又はラットは、標的タンパク質に対するヒト抗体を生成するために使用することができ、例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３〜２１；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：４８３〜９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５〜９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３〜６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５〜５１；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１４６〜５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１２３６〜４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：４５５〜８に記載されている。このような動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組み換えを用いて、導入染色体（transchromosome）を用いて、又はミニ遺伝子を用いて、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を該動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供するべく取り組んでいる可能性がある。
【０３２７】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン又はその一部、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は対合していない若しくは対合している抗体可変領域などを発現するようにファージが遺伝子操作されたファージディスプレイライブラリーから選択され得る（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４：６７〜８４；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：３０９〜１４；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：６１５７〜６２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１〜９７）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されているバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリーから単離され得る。当該ライブラリーを、ヒト及び／又はカニクイザルＴＮＦＲに対するファージの結合についてスクリーニングし、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長ＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。
【０３２８】
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは細胞全体又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、抗原は、該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内でｄｅ  ｎｏｖｏ形成されてもよい。
【０３２９】
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のＶＨ／ＶＬ領域は、既存の抗ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体抗体から得ることもできる。
【０３３０】
米国特許第８１３３９８３号、同第７９６０５１５号、米国特許出願公開第２０１３／０２８０２７５号、国際公開第２０１３／０２８２３１号及び米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗ＯＸ４０抗体のＶＨ及びＶＬの領域を使用して本発明の抗体を遺伝子操作することができる。更に、抗ＯＸ４０抗体のＶＨ／ＶＬ領域ＭＥＤＩ−６４６９、ＢＭＳ−９８６１７８、ＭＯＸＲ−０９１６、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−０５６２、ＰＦ−０４５１８６００又はＧＳＫ−３１７４９９８を使用してもよい。本発明の遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体を生成するために使用することができる更なる例示的なＶＨ及びＶＬの領域は、以下のとおりである：
【０３３１】
配列番号５１（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗体ＳＦ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０３３２】
配列番号５２（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗体ＳＦ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０３３３】
配列番号５３（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている１２Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０３３４】
配列番号５４（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている１２Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０３３５】
配列番号５５（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている２０Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＳＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＮＹＹＧＳＳＬＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３３６】
配列番号５６（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている２０Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０３３７】
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬの領域は、それぞれ、米国特許第７，２８８，２５１号（抗体２１．４．１）及び米国特許第８，３０３，９５５号に記載されているＣＰ−８７０，８９３及びヒト化Ｓ２Ｃ６、並びに国際公開第２００１／０５６６０３号、同第２００１／０８３７５５号、同第２０１３／０３４９０４号及び同第２０１４／０７０９３４号に記載されている抗ＣＤ４０抗体のものである。本発明の遺伝子操作を受けた抗ＣＤ４０抗体を生成するために使用することができる更なる例示的なＶＨ及びＶＬの領域は、以下である：
【０３３８】
配列番号５７（Ｍ９抗体のＶＨ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＩＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＮＩＹＹＲＧＤＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＦＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３３９】
配列番号５８（Ｍ９抗体のＶＬ）
ＱＳＡＬＴＱＰＰＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＶＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＮＮＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０３４０】
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨ及びＶＬの領域は、米国特許第７，８１２，１３５号、同第８，５９１，８８６号、及び同第７，６１８，６３２号、又は国際公開第２０１１／０２８６８３号、同第２０１３／０３９９５４号、同第２００５／００７１９０号及び同第２００７／１３３８２２号に記載されているものである。
【０３４１】
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＣＤ２７抗体のＶＨ及びＶＬの領域は、米国特許第９１６９３２５号及び米国特許出願公開第２０１３０１８３３１６号に記載されているものである。
【０３４２】
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＣＤ１３７抗体のＶＨ及びＶＬの領域は、米国特許第７２８８６３８号、同第８７１６４５２号及び同第８８２１８６７号に記載されているものである。
【０３４３】
完全長二重特異性抗体に遺伝子操作された本発明の抗体も本発明の範囲内である。
【０３４４】
「完全長抗体」とは、２本の完全長抗体重鎖と２本の完全長抗体軽鎖とを有する抗体を指す。完全長抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。完全長抗体重鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＬ及びＣＬからなる。完全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにＣ末端リシン（Ｋ）を欠いていてもよい。
【０３４５】
完全長二重特異性抗体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無細胞環境において又は共発現を使用して、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に好都合になるように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。「Ｆａｂアーム」又は「半分子」とは、抗原に特異的に結合する一対の重鎖−軽鎖を意味する。
【０３４６】
Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られる生成物は、それぞれ異なるエピトープ、すなわち、ＴＮＦＲにおけるエピトープ及び第２の抗原におけるエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【０３４７】
「ホモ二量体化」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を指す。「ホモ二量体」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を指す。
【０３４８】
「ヘテロ二量体化」とは、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を指す。
【０３４９】
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（electrostatically-matched）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）を使用して二重特異性フォーマットに遺伝子操作することができる。
【０３５０】
Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅストラテジ（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照）では、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸をＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において突然変異させて、ヘテロ二量体形成を促進することができる。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用によりヘテロ二量体が形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。
【０３５１】
ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術では、「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」ストラテジを利用してＦａｂアーム交換を促進することに加えて、半アームのうちの１つが、得られる二重特異性抗体の軽鎖を確実に正しく対合させるために交換されたＣＨ１及びＣＬドメインを有する（例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照）。
【０３５２】
他のクロスオーバーストラテジを使用して、一方のアーム又は両方のアームのいずれかにおいて、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖との間若しくは重鎖内で可変ドメイン若しくは定常ドメイン、又は両方のドメインを交換することによって、完全長二重特異性抗体を生成することができる。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第２００９／０８０２５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２００９／０８０２５２号に記載されるＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣＬ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
【０３５３】
他のストラテジ、例えば、あるＣＨ３表面における正に帯電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に帯電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進を使用して二重特異性抗体を生成することができ、これは、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ  Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）により促進されてもよい。
【０３５４】
ＬＵＺ−Ｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。この技術では、（Ｗｒａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７：４３３３１〜９）に記載されているように、ロイシンジッパーをＣＨ３ドメインのＣ末端に付加して、精製後に除去される親ｍＡｂからヘテロ二量体アセンブリを駆動する。
【０３５５】
ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許第２００７／０２８７１７０号に記載されるように、ヘテロ二量体化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ残基を有する。
【０３５６】
二重特異性抗体は、国際特許出願公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法（ＤｕｏＢｏｄｙ技術）に従って、２つの一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な突然変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下で２つの親一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されてもよい。この方法においては、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合の異性化を受けるのに十分な還元条件下においてともにインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換によって二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン及びベータ−メルカプトエタノールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
【０３５７】
抗体のドメイン及び付番は周知である。「非対称」とは、抗体の２本の別個の重鎖の２つのＣＨ３ドメインにおける非同一の置換を指す。ＩｇＧ１  ＣＨ３領域は、典型的には、ＩｇＧ１における残基３４１〜４４６からなる（残基の付番はＥＵインデックスに従う）。
【０３５８】
本発明の抗体は、様々な周知の抗体形態に設計されてもよい。
【０３５９】
医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の抗体は、薬学的に許容できる担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容できる補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１〜１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０３６０】
本発明の抗体を治療的に使用するための投与方法は、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子の、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに入れられた製剤を使用する非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；又は当該技術分野において周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【０３６１】
本発明の抗体は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になどの任意の好適な経路によって被験体に投与することができる。静脈内注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、若しくは２４０分間にわたって、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２時間にわたって行ってよい。
【０３６２】
被験体に投与される用量は、治療されている疾患を軽減するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分（「治療的に有効な量」）であり、時に、０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、若しくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、若しくは約２４ｍｇ／ｋｇ、又は例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／ｋｇであり得るが、更に多量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０３６３】
例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの固定単位用量を与えてもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２の用量を与えてもよい。通常、１〜８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。
【０３６４】
本発明の抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月後に、又はそれ以上後に繰り返すことができる。治療コースの繰り返しも可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であってもよいし、又は異なる用量であってもよい。例えば、本明細書に記載される本発明の抗体は、静脈内注入によって、８週間にわたって１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、更に１６週間にわたって２週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、４週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与してよい。
【０３６５】
例えば、本発明の方法における抗体は、単回投与、又は２４、１２、８、６、４若しくは２時間ごとの分割投与、又はこれらの任意の組み合わせを使用して、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当たり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、あるいはこれらの任意の組み合わせで提供され得る。
【０３６６】
また、本発明の方法における抗体は、癌の発現リスクを低下させる、癌の進行における事象の発生の開始を遅延させる、及び／又は癌が寛解したときの再発リスクを低下させるために予防的に投与されてもよい。
【０３６７】
本発明の抗体を、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体に溶解させてもよい。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
【０３６８】
方法及び使用
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、診断上の有用性、並びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて培養中の細胞に、又はがん及び感染性疾患などの様々な障害を治療、予防及び／若しくは診断するために被験体に投与してよい。
【０３６９】
また、本発明は、被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのアゴニスト活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、当該アゴニスト活性を強化するのに十分な時間、当該遺伝子操作を受けた抗体を当該被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
【０３７０】
また、本発明は、被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのアゴニスト活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、当該遺伝子操作を受けた抗体を当該被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
【０３７１】
また、本発明は、被験体における癌を治療する方法であって、当該癌を治療するのに十分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含むＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する抗体を当該被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
【０３７２】
また、本発明は、被験体における癌を治療する方法であって、当該癌を治療するのに十分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体を当該被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
【０３７３】
本発明の方法では、当該抗体はＡＤＣＣを媒介する。
【０３７４】
本発明の方法では、当該抗体はＡＤＣＰを媒介する。
【０３７５】
本発明の方法では、当該抗体は、抗体架橋に依存しない抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのアゴニスト活性を強化する。
【０３７６】
本発明の方法では、当該抗体は、所望により、ＡＤＣＣを低減する第２の突然変異を更に含む。
【０３７７】
本発明の方法では、当該被験体はウイルス感染を有する。
【０３７８】
本発明の方法では、当該被験体は癌を有する。
【０３７９】
本発明の方法では、当該癌は固形腫瘍である。
【０３８０】
本発明の方法では、当該固形腫瘍は、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌又は癌の転移巣である。
【０３８１】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）である。
【０３８２】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲは、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）である。
【０３８３】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＯＸ４０（配列番号４）である。
【０３８４】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＣＤ２７（配列番号８）である。
【０３８５】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＣＤ４０（配列番号５）である。
【０３８６】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＣＤ１３７（配列番号１０）である。
【０３８７】
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＧＩＴＲ（配列番号２３）である。
【０３８８】
ＴＮＦＲ１／２／ＴＮＦ−α、ＣＤ７０／ＣＤ２７／ＣＤ２７、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬを含むＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー及びそのリガンドの多くは、癌治療の標的として示されており（Ｂｒｅｍｅｒ，Ｈｉｎｄａｗｉ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＩＳＲＮ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ３７１８５４，２５  ｐａｇｅｓ；Ｓａｎｍａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ）、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを標的とするいくつかのアゴニスト抗体、例えば、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ−４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７抗体が、様々な固形腫瘍並びに非ホジキンリンパ腫及びＢ細胞悪性腫瘍などのヘム悪性腫瘍のために臨床開発されている。所望によりエフェクター機能と合わせて、強化されたアゴニスト活性の観点で改善された特性を有する抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７及び他の本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、固形腫瘍を含む様々な癌の治療において治療的に有効であろう。
【０３８９】
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の各実施形態を、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
【０３９０】
実施例１：抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を改善するためのＦｃ遺伝子操作アプローチ
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する免疫賦活性受容体に対するアゴニスト抗体は、癌の免疫療法の有望な薬剤候補として台頭しつつある。アゴニスト活性及び／又はエフェクター機能を強化することによって抗ＴＮＦＲ抗体の抗腫瘍活性を増強できるいくつかのＦｃ遺伝子操作アプローチが最近見出された。
【０３９１】
抗腫瘍免疫を賦活するモノクローナル抗体は、癌治療法の重要な分類として台頭しつつある（Ｍｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０〜９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：２２７〜４２）。免疫チェックポイント受容体を標的とする抗体であるＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１は、進行黒色腫、肺癌の単剤療法として承認されており、他の種類のヒト癌の治療について評価されている。阻害経路を標的とすることに加えて、Ｔ細胞及び抗原提示細胞上の免疫賦活性受容体に対するアゴニスト抗体も抗腫瘍免疫を賦活することができ、癌免疫療法の臨床開発の有望な領域として台頭しつつある（Ｓｃｈａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：７）。
【０３９２】
多くの免疫賦活性受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属している。これらのうち、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ及びＧＩＴＲは、エフェクターＴ細胞及びそのリガンドで発現し、アゴニスト抗体はこれら受容体を活性化してＴ細胞の増殖及び活性化を刺激することができる（Ｋａｎａｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：７３０６〜１４；Ｇｒａｍａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：６５１０〜７；Ｐｏｌｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５０：７７１〜８１；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３７）。ＣＤ４０は抗原提示細胞で発現し、この受容体の活性化が、活性化Ｔ細胞に対する腫瘍抗原のより効果的な提示を促進する（Ｍａｎｇｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：１１１５〜２６）。これらＴＮＦ受容体に対する治療用抗体のアゴニスト活性がその抗腫瘍活性にとって重要であることを多くのエビデンスが示している（Ｍａｎｇｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：１１１５〜２６；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１：４１７４〜８３；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９：１０１〜１３）。他方、いくつかのＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えば、ＯＸ４０及びＧＩＴＲは、腫瘍免疫を負に調節する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において発現が増加した。いくつかの研究で、抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体が、抗体のエフェクター機能によって腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の選択的除去を促進し得ることが明らかになっている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０：１６８５〜９３；Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９２：４７５〜８０）。制御性Ｔ細胞のこのような抗体媒介性死滅は、治療用抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性について、抗体媒介性エフェクターＴ細胞の活性化よりも重要であり得る。
【０３９３】
蓄積されつつあるエビデンスでは、免疫調節性抗体は、そのアゴニスト活性及びエフェクター機能のために様々な種類のＦｃ受容体と会合することが示された。下流のシグナル伝達経路を活性化するためには、ＴＮＦＲの三量化が必要である。しかし、１つの抗体分子は、一般的に、十分なＴＮＦ受容体をクラスタリングするのに十分ではなく、その代わり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける受容体活性化には抗体の架橋が必要である（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：３１１２〜２１．Ｒｅｃｅｎｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＦｃγＲＩＩＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ＴＮＦＲ  ｔａｒｇｅｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＣＤ４０（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１０３０〜４；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６２：９４１〜８），ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５（ＤＲ５）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９：１０１〜１３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９：１０９６６〜７１）ａｎｄ  ＣＤ９５（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：５６２〜８）。ＩｇＧ  ＦｃのＦｃγＲＩＩＢ受容体への架橋によって、１よりも多くの抗体分子を多量体化することができ、続いて、シグナル伝達経路を活性化するために十分なＴＮＦＲのクラスタリングを促進することができる。他方、抗体のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、様々な活性化Ｆｃγ受容体との相互作用に依存している。腫瘍内制御性Ｔ細胞を選択的に除去することによって活性化Ｆｃγ受容体が免疫調節性抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性に寄与することが、マウスにおける研究によって明らかになった（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０：１６８５〜９３；（Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９２：４７５〜８０）．Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｈａｖｅ  ｐｏｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｘｃｅｐｔ  ＦｃγＲＩ（Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：９４〜１０８）。
【０３９４】
免疫賦活性ＴＮＦ受容体に対するアゴニスト抗体の抗腫瘍活性を最適化するために、１つのアプローチは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を遺伝子操作してそのＦｃγ受容体の会合、特に、ＴＮＦ受容体抗体のアゴニズムを媒介するＦｃγＲＩＩＢ受容体との会合を改善することである。これに関して、Ｃｈｕらは、ＦｃγＲＩＩＢ結合親和性が強化されたＩｇＧ１  ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異について記載している（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３。このような突然変異を有するように遺伝子操作を受けた抗ＣＤ１９抗体は、初代ヒトＢ細胞のＢ細胞受容体媒介性活性化の阻害を改善することが示された。しかし、更なる研究によって、このようなＦｃ変異体が活性化ＦｃγＲＩＩＡ受容体のＲ１３１アロタイプへの結合も強化することが明らかになった（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８。近年、Ｍｉｍｏｔｏらは、ＦｃγＲＩＩＡ受容体のＨ１３１アロタイプ又はＲ１３１アロタイプへの結合増加を伴わずにＦｃγＲＩＩＢ会合が選択的に強化された、Ｖ１２突然変異と総称されるＩｇＧ１  Ｆｃにおける６つの突然変異のセットを報告した（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８。遺伝子操作を受けたＶ１２突然変異を有する抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ会合に依存してはるかに強化されたアゴニスト活性を示した。
【０３９５】
ＦｃγＲＩＩＢ会合の最適化は実行可能なアプローチであるが、このような遺伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性は、局所腫瘍微小環境におけるＦｃγ受容体の発現に大きく依存し、このような抗体の有効性は解剖学的作用部位に限定されることがある。Ｆｃγ受容体の会合に依存しない免疫賦活性抗体のアゴニズムを増強する試みにおいて、ヒトＩｇＧ２が、ＣＤ４０、４−１ＢＢ及びＣＤ２８受容体について、免疫賦活性抗体に超アゴニスト活性を付与し得ることがＷｈｉｔｅらによって最近報告された（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２７：１３８〜４８）。この活性は、ＩｇＧ２サブタイプのヒンジ領域におけるジスルフィド結合の独特な構造によって付与され、ＦｃγＲＩＩＢ会合には依存しない。他方、ＦｃγＲＩＩＢに対する架橋の目的が受容体を活性化するためにアゴニスト抗体のクラスタリングを増加させることのみである場合、本発明者らは、抗体の多量体化を促進し得るこれらＦｃ突然変異が、ＦｃγＲＩＩＢを架橋させる必要なくＴＮＦ受容体への抗体のアゴニズムを強化し得ると仮定した。Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、選択的Ｆｃ突然変異が、細胞表面の標的に結合した際にＩｇＧ抗体の六量体の形成を促進し得ると報告した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３）。このようなＩｇＧ六量体は補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）を大きく活性化できることが報告されているが、本発明者らは、別の出願で、ＴＮＦ受容体を認識するオリゴマー化抗体が受容体のクラスタリングを促進することによってこのような受容体を活性化できると請求している。
【０３９６】
この研究は、抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムの強化に対する様々なＦｃ遺伝子操作アプローチの評価について説明している。更に、遺伝子操作を受けた抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰエフェクター機能に対するＦｃ突然変異の効果についても評価された。このような研究は、抗腫瘍活性が改善されたＯＸ４０及び他のＴＮＦ受容体に対する遺伝子操作を受けた抗体の設計の指針に役立ち得る。
【０３９７】
実施例２：材料及び方法
抗ＯＸ４０抗体のＦｃ遺伝子操作
抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２のＶＨ及びＶＬの領域（ＶＨ：配列番号５１、ＶＬ：配列番号５２）をヒト野生型ＩｇＧ１又はＩｇＧ２にクローニングし、選択置換でＦｃを遺伝子操作して、抗体のアゴニスト活性及びエフェクター機能に対する当該置換の効果を評価した。生成された抗体及びそのＦｃ置換の名称を表３に示す。
【０３９８】
【表３】
2019532025.tif 000005
【０３９９】
配列番号６３  Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０４００】
配列番号６４  Ｅ４３０Ｇ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０４０１】
配列番号６５  Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０４０２】
配列番号６６  Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴＱＫＹＬＳＬＳＰＧＫ
【０４０３】
配列番号６７  Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＩｇＧ２ｓｉｇｍａ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０４０４】
抗体の発現及び精製
抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードしているプラスミドを、トランスフェクションキットの説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って１：３（ＨＣ：ＬＣ）のモル比でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後に細胞をスピンダウンし、上清を０．２μｍのフィルタに通した。Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、抗体発現の力価を定量した。キットの説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってプレパックドプロテインＡスピンカラムを使用して抗体の精製を実施した。精製された抗体を透析によってＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）にバッファ交換し、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によってタンパク質濃度を求めた。還元されたサンプル及び還元されていないサンプルの高性能サイズ排除クロマトグラフィ（high-performance size-exclusion chromatography、ＨＰ−ＳＥＣ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、分子の品質及び完全性を評価した。
【０４０５】
ＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ
抗ＯＸ４０  ＳＦ２抗体の軽鎖のコーディング配列を、それぞれ、Ｃ末端Ｎａｎｏｌｕｃ及びＨａｌｏｔａｇ配列とインフレームになるようにｐＮＬＦ−Ｃ及びｐＨＴＣ  ｈａｌｏｔａｇベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。Ｎａｎｏｌｕｃ又はＨａｌｏｔａｇが軽鎖のＣ末端に結合しているＦｃが遺伝子操作を受けたＳＦ２を発現させるために、これら軽鎖をＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ抗体の重鎖と対合させた。標準的なプロテインＡスピンカラムを使用して、これら修飾された抗体を精製した。
【０４０６】
ＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって細胞表面における抗体の多量体化について調べるために、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに０．２５×１０５個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を播種し、３７℃で一晩培養した。次の日、５０μＬのアッセイ培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地、フェノールレッド無し＋４％  ＦＢＳ）中、等濃度のＮａｎｏｌｕｃタグ付抗体（ドナー）及びＨａｌｏｔａｇタグ付抗体（アクセプター）を細胞に適用した。５０μＬのアッセイ培地で１：１０００希釈されたＨａｌｏｔａｇ  ６１８リガンドを実験ウェルに添加し、アッセイ培地でＤＭＳＯを１：１０００希釈することによってリガンド無しの対照ウェルも設定した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞をアッセイ培地で２回洗浄し、１００μＬのアッセイ培地に再懸濁した。ＦＢＳを含まないアッセイ培地で１：２００希釈した２５μＬのＮａｎｏ−Ｇｌｏ基質を各ウェルに添加した。３０秒間振盪した後、ドナーの発光（４６０ｎｍ）及びアクセプターの発光（６１８ｎｍ）をＥｎｖｉｓｉｏｎによって測定した。ミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）による生のＮａｎｏＢＲＥＴ比の値をＲａｗＢＲＥＴ＝６１８ｎｍＥｍ／４６０ｎｍＥｍ×１０００として算出した。ドナーが寄与するバックグラウンド又は蛍光漏れ（bleed through）を計算に入れるために、ミリＢＲＥＴ単位による補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比の値をＣｏｒｒｅｃｔｅｄＢＲＥＴ＝ＲａｗＢＲＥＴ実験サンプル−ＲａｗＢＲＥＴリガンド無し対照サンプルとして算出し、これは、タンパク質−タンパク質相互作用に起因する生物発光タンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー転移を反映している。
【０４０７】
フローサイトメトリー染色
ヒトＦｃγＲＩ（ＮＭ＿０００５６６）（配列番号５９）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＮＭ＿０２１６４２）（配列番号６０）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＮＭ＿００４００１）（配列番号６１）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＮＭ＿０００５６９）（配列番号６２）（Ｏｒｉｇｅｎｅ）をコードしているｃＤＮＡを発現するプラスミドを、Ｅｘｐｉｆｅｃｔｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリーアッセイを実施した。トランスフェクトされたＦｃ受容体の発現を確認するために、その特異的抗体、ＦｃγＲＩについては１０．１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦｃγＲＩＩＡについてはＩＶ．３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦｃγＲＩＩＢについては２Ｂ６（インハウスで調製）（Ｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２１：３９２〜４０４、及びＦｃγＲＩＩＩＡについては３Ｇ８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、陽性対照としてフローサイトメトリー染色において使用した。抗ＯＸ４０抗体のＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合を試験するためにＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−８６）も使用した。
【０４０８】
９６ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０５個の細胞を播種し、ＢＳＡ染色バッファ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中において４℃で３０分間ブロックした。細胞を、氷上において４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベートした。ＢＳＡ染色バッファで２回洗浄した後、Ｒ−ＰＥで標識された抗ヒト又は抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に細胞を４℃で４５分間インキュベートした。細胞を染色バッファで２回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７  ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬの染色バッファ中に再懸濁させた。それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使用して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを検出した。生細胞をＤＲＡＱ７排除でゲートし、収集された少なくとも１０，０００生細胞事象について幾何平均蛍光シグナルを求めた。解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用した。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって非線形回帰分析を行い、ＥＣ５０値を算出した。
【０４０９】
配列番号５９
ＭＷＦＬＴＴＬＬＬＷＶＰＶＤＧＱＶＤＴＴＫＡＶＩＴＬＱＰＰＷＶＳＶＦＱＥＥＴＶＴＬＨＣＥＶＬＨＬＰＧＳＳＳＴＱＷＦＬＮＧＴＡＴＱＴＳＴＰＳＹＲＩＴＳＡＳＶＮＤＳＧＥＹＲＣＱＲＧＬＳＧＲＳＤＰＩＱＬＥＩＨＲＧＷＬＬＬＱＶＳＳＲＶＦＴＥＧＥＰＬＡＬＲＣＨＡＷＫＤＫＬＶＹＮＶＬＹＹＲＮＧＫＡＦＫＦＦＨＷＮＳＮＬＴＩＬＫＴＮＩＳＨＮＧＴＹＨＣＳＧＭＧＫＨＲＹＴＳＡＧＩＳＶＴＶＫＥＬＦＰＡＰＶＬＮＡＳＶＴＳＰＬＬＥＧＮＬＶＴＬＳＣＥＴＫＬＬＬＱＲＰＧＬＱＬＹＦＳＦＹＭＧＳＫＴＬＲＧＲＮＴＳＳＥＹＱＩＬＴＡＲＲＥＤＳＧＬＹＷＣＥＡＡＴＥＤＧＮＶＬＫＲＳＰＥＬＥＬＱＶＬＧＬＱＬＰＴＰＶＷＦＨＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩＲＫＥＬＫＲＫＫＫＷＤＬＥＩＳＬＤＳＧＨＥＫＫＶＩＳＳＬＱＥＤＲＨＬＥＥＥＬＫＣＱＥＱＫＥＥＱＬＱＥＧＶＨＲＫＥＰＱＧＡＴ
【０４１０】
配列番号６０
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
【０４１１】
配列番号６１
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡＮＰＴＮＰＤＥＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ
【０４１２】
配列番号６２
ＭＡＥＧＴＬＷＱＩＬＣＶＳＳＤＡＱＰＱＴＦＥＧＶＫＧＡＤＰＰＴＬＰＰＧＳＦＬＰＧＰＶＬＷＷＧＳＬＡＲＬＱＴＥＫＳＤＥＶＳＲＫＧＮＷＷＶＴＥＭＧＧＧＡＧＥＲＬＦＴＳＳＣＬＶＧＬＶＰＬＧＬＲＩＳＬＶＴＣＰＬＱＣＧＩＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＦＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ
【０４１３】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＮＦκＢリポーターアッセイ
ＮＦ−κＢ誘導性プロモーター（ＩＦＮ−βミニマルプロモーター）の制御下で分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）受容体遺伝子を発現するように遺伝子操作を受けたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１細胞にＯＸ４０発現プラスミド（ｐＵＮＯ１−ｈＯＸ４０）をトランスフェクトすることによって、ヒトＯＸ４０を発現する安定なＨＥＫ−Ｂｌｕｅリポーター細胞株（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０）を樹立した。リポーターアッセイでは、２００μＬの培養培地に再懸濁させた１×１０５個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注し、ＯＸ４０リガンド又は抗ＯＸ４０抗体を添加した。架橋の効果を試験するために、１μＬのプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）、又は１×１０５個のＲａｊｉ細胞を同じアッセイウェルに添加した。３７℃で一晩インキュベートした後、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ検出キット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して誘導された分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーター遺伝子の発現を定量することによって、抗体のアゴニスト活性を評価した。簡潔に述べると、４０μＬの細胞培養上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ試薬と混合し、適切な青色を発色するまで３７℃でインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して６５０ｎｍにおけるＯＤを測定した。抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を、１μｇ／ｍＬ  ＯＸ４０リガンドによって誘導されたものに対する活性パーセントとして正規化した。
【０４１４】
ＡＤＣＣアッセイ
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって指示されているとおり、ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイによって抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。簡潔に述べると、一晩９６ウェルプレートにプレーティングした１ウェルあたり２５，０００個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の活性化によってルシフェラーゼリポーターが発現する遺伝子操作を受けたエフェクター細胞と混合した。抗ＯＸ４０抗体を細胞に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加し、ルシフェラーゼシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎによって定量した。抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を、試験抗体を添加しなかったものに対するルシフェラーゼシグナルの活性化の倍数として表した。
【０４１５】
ＡＤＣＰアッセイ
Ｔｕｒｂｏ  ＧＦＰ形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に感染させることによって、ＧＦＰを発現するＯＸ４０標的細胞株を樹立した。安定なＧＦＰ発現細胞をピューロマイシンで選抜した。ＣＤ１６が枯渇していないネガティブヒト単球濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＢＭＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ）からヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球を単離した。１０％  ＦＢＳを含有するＸ−ＶＩＶＯ−１０培地（Ｌｏｎｚａ）に単離された単球をプレーティングし、７日間にわたって２５ｎｇ／ｍＬのマクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加することによって単球からマクロファージを分化させた。分化の最後の２４時間、ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。ＡＤＣＰアッセイでは、１×１０５細胞／ウェルの分化したマクロファージを、９６ウェルＵ底プレートにおける２００μＬの培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ）中０．２５×１０５細胞／ウェルのＧＦＰ発現ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞と混合した（４：１比）。試験抗体を添加し、３７℃のインキュベータ内で２４時間プレートをインキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を剥離し、ＢＳＡ染色バッファに再懸濁させた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合している抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でマクロファージを染色した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）を使用して、フローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞及びＡｌｅｘａ６４７陽性マクロファージを同定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いてデータを解析し、以下の式を用いてＧＦＰ蛍光の減少を測定することによって、ＡＤＣＰ媒介性細胞死滅を求めた：死滅した標的細胞の割合＝（（最低濃度の抗体によるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−細胞の割合）−（試験濃度の抗体によるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−細胞の割合））／（最低濃度の抗体によるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−細胞の割合）×１００。
【０４１６】
ＣＤＣアッセイ
補体媒介性細胞死滅アッセイによって抗ＯＸ４０抗体のＣＤＣ活性を評価した。簡潔に述べると、１×１０５個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を６．７％（ｖ／ｖ）ウサギ補体（Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）及び試験抗体と共に１時間インキュベートした。製造業者の指示書（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って、溶解したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞のサイトゾルから上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼの活性を細胞傷害検出キットによって測定した。補体媒介性細胞傷害を、０．６７％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって溶解したものに対する細胞傷害のパーセントとして表した。
【０４１７】
実施例３．抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムを評価するためのＮＦκＢリポーターアッセイの確立
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＯＸ４０は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）に結合することによって核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）シグナル伝達経路を活性化する。ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性に対するＦｃ遺伝子操作の寄与について調べるために、ＮＦκＢ誘導性プロモーター下で安定的にヒトＯＸ４０及びＳＥＡＰを発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）リポーター細胞株を樹立した。ＯＸ４０リガンドは、ＳＥＡＰリポーター遺伝子を発現させるトランスフェクトされたＯＸ４０受容体を用量依存的に活性化した（図１Ａ）。次いで、このリポーターアッセイによって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体をそのアゴニスト活性について評価した。抗体は単独でわずかにアゴニスト活性を示したが、プロテインＧビーズに固定化されたＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、用量依存的に、１０００ｎｇ／ｍＬではＯＸ４０リガンドよりも高いレベルまでリポーター遺伝子の発現を刺激することができ（図１Ａ）、これは、アゴニスト活性に抗体架橋が必要であることを示す。
【０４１８】
最近の研究では、ＦｃγＲＩＩＢにより架橋活性がもたらされ、ＴＮＦ受容体抗体のアゴニスト活性を促進できることが明らかになった（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １１：３３４３〜４）。ＦｃγＲＩＩＢが主に発現するヒトＢリンパ芽球Ｒａｊｉ細胞と共にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を共培養することによって、リポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＢの架橋効果を評価した（Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０８：２３８４〜９１）。しかし、Ｒａｊｉ細胞と共培養しても天然ＩｇＧ１を有するＳＦ２抗体のアゴニスト活性を有意に強化することはできなかった（図１Ｂ）。
【０４１９】
実施例４．Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体の特性評価
抗体ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ突然変異（本明細書ではＶ１２突然変異と称する）は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する当該抗体の結合を強化することが判明している。抗ＯＸ４０抗体におけるこのような突然変異の効果を評価するために、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ二重突然変異（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）及びＶ１２突然変異（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２）を有するＩｇＧ１として抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２をクローニングした。
【０４２０】
ＦｃγＲへの結合
一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現している様々なＦｃγＲに対する遺伝子操作を受けた抗体の結合を、フローサイトメトリーによって評価した。ＦｃγＲＩＩＢについて、天然ＩｇＧ１を有するＯＸ４０ＳＦ２抗体の結合は少ないが、遺伝子操作を受けたＦｃ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の増大を伴う抗ＯＸ４０抗体を強く助長し、ＥＣ５０（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆについては４５９ｎｇ／ｍＬ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２については５０２ｎｇ／ｍＬ）は２Ｂ６（４３１ｎｇ／ｍＬ）と同等であり、抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１よりもはるかに高く、ＦｃγＲＩＩＢを優先的に認識する（図２Ａ）。同様のフローサイトメトリーアッセイを実施して、一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現しているＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１アロタイプに対する、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の結合を評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様にＦｃγＲＩＩＡに対して少ない結合を示したが、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異は、２０倍効力が高いＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（ＥＣ５０：２１６ｎｇ／ｍＬ）に対するより強力な結合を促進する（図２Ｂ）。このデータは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異がいずれもＦｃγＲＩＩＢ結合の強化を促進するが、Ｖ１２突然変異の効果がより特異的であるという以前の知見と一致している。
【０４２１】
ＦｃγＲＩでは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は高い親和性を示し、ＥＣ５０は３２６ｎｇ／ｍＬであった（図２Ｃ）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様の結合特性を示したが、Ｖ１２突然変異は、ＦｃγＲＩに対するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体の結合を有意に抑制する。フローサイトメトリーアッセイによって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の結合も評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、ＥＣ５０は７４４ｎｇ／ｍＬでＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を示したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合活性を示さなかった（図２Ｄ）。
【０４２２】
アゴニズム
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の増大を伴うＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体を助長するので、これら強化された結合によって抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムが増加し得るかどうかをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＮＦκＢリポーターアッセイによって評価した。まず、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＲａｊｉ細胞への結合をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。ＦｃγＲＩＩＢ受容体でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図２Ａ）と比べて効力は低かったが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、Ｒａｊｉ細胞に対して用量依存的結合を示し、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は示さなかった（図３Ａ）。Ｒａｊｉ細胞に対する結合がＦｃγＲＩＩＢによって媒介されることを確認するために、Ｒａｊｉ細胞を５μｇ／ｍＬの２Ｂ６抗体で前処理した後、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＲａｊｉ細胞に対する結合を評価した。２Ｂ６抗体によるＲａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢのプレブロックはＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２のＲａｊｉ細胞への結合を有意に抑制することが観察された（図３Ｂ）。
【０４２３】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイでは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２も、Ｒａｊｉ細胞の非存在下において有意なアゴニスト活性を示さなかった。しかし、Ｒａｊｉ細胞とＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を共培養すると、これら遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体は劇的に増加したアゴニズムを示し、１０００ｎｇ／ｍＬにおける効力は同濃度のＯＸ４０リガンドと比べて２倍超高かった（図３Ｃ及び図３Ｄ）。更に、Ｒａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢをプレブロックするために２Ｂ６抗体を添加したとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体については、アゴニズムのＲａｊｉ細胞依存性強化が有意に抑制され（図３Ｃ及び図３Ｄ）、これは、遺伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性がＦｃγＲＩＩＢ架橋によって媒介されたことを示す。
【０４２４】
Ｆｃのエフェクター機能
エフェクター細胞における生物発光リポーター遺伝子の発現がＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性ＡＤＣＣの活性化を反映するリポーターバイオアッセイによって、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞とＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているエフェクター細胞とを共培養したとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１はリポーター遺伝子の発現を用量依存的に活性化した。しかし、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２もリポーター遺伝子の発現を誘導せず（図４Ａ）、これは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異がＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を抑制したことを示す。この結果は、遺伝子操作を受けた抗体におけるＦｃγＲＩＩＩＡへの結合活性の喪失と一致する（図２Ｄ）。
【０４２５】
単離された単球から分化したマクロファージによるＧＦＰを発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の貪食を評価するアッセイにおいて、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体の抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性についても調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、マクロファージによるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞の死滅を用量依存的に媒介した。Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異もＶ１２突然変異も、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を有意に変化させなかった（図４Ｂ）。遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の分化したマクロファージへの結合をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体と同様のマクロファージへの結合親和性を有していたが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体は、ＡＤＣＰアッセイでは活性があったものの、マクロファージに対する結合は有意に減少した（図４Ｃ）。
【０４２６】
ウサギ補体の存在下におけるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の溶解を評価するアッセイにおいて、抗体媒介性ＣＤＣについて調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、１０，０００ｎｇ／ｍＬ以下でＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞に対する有意なＣＤＣ活性を引き起こさなかった。同様に、Ｖ１２突然変異もＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異も、天然ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する抗体よりも高いＣＤＣ活性を促進しなかった（図４Ｄ）。
【０４２７】
実施例５．Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ突然変異を単独で又は組み合わせて有する抗ＯＸ４０抗体の特性評価
Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、細胞表面抗原に結合したときにＩｇＧ１抗体の六量体化を誘導し、抗体のエフェクター機能ＡＤＣＣ及びＣＤＣを強化するＦｃ突然変異のセット（Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ）を同定した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３）。このような多量体化抗体が、受容体を活性化するための必要条件であるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの凝集を促進することによって抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体のアゴニズムを強化し得ると仮定した。
【０４２８】
仮説を検証するために、抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２のＩｇＧ１に対して単独のＥ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ突然変異、又は当該突然変異の組み合わせで遺伝子操作を行い、表３に示す得られた抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙを特性評価した。
【０４２９】
抗体の多量体化
ＳＥＣ分析によって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ抗体が、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１のように溶液中でモノマーとして存在することが明らかになった。しかし、ＳＥＣ分析によって、三重変異抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙのピークが約９００ｋＤａであることが明らかになり、これは、その抗体の六量体の存在を示す。この所見は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異が溶液相において容易に六量体の形成を促進するという報告された知見と一致する（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３。
【０４３０】
遺伝子操作を受けた抗体が、細胞表面における抗原に結合したときに多量体化するかどうかを評価するために、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）タンパク質−タンパク質相互作用（protein-protein interaction、ＰＰＩ）アッセイを実施した。このアッセイは、生物発光タンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー転移を測定することによってタンパク質−タンパク質相互作用を検出する、近接度に基づくアッセイである。生成された抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙを、それぞれ、ドナー及びアクセプターとして抗体軽鎖のＣ末端に結合しているＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ又は蛍光標識されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）のいずれかを有するように更に遺伝子操作した。タグ付き抗体は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＮＦκＢリポーターアッセイにおいて対応するタグの付いていない抗体と同等の機能活性を示した（データ不図示）。ドナー及びアクセプター抗体をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に適用することによってＮａｎｏＢＲＥＴ  ＰＰＩアッセイを実施し、算出され補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比は多量体化抗体の会合を反映する。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体はバックグラウンドの補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比を示したが、ＩｇＧの六量体化を促進する突然変異を有するＳＦ２抗体は、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度にわたってはるかに高い補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比を示した（図５）。補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比の値によって反映される細胞表面における抗体会合の程度は、以下の順序であった：ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１。この結果は、会合の程度が異なるにもかかわらず、野生型ＩｇＧ１を除く全ての抗体が細胞表面で多量体化したことを示した。
【０４３１】
遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムの改善はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存しない
抗体のアゴニスト活性に対するＥ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ置換の効果を評価するために、遺伝子操作を受けた抗体をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイで特性評価した。生成された抗体は全てアゴニスト活性を示した。抗体は最も高い多量体化度を有さなかったが（図５）、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、ＯＸ４０リガンドの活性と比べて最も改善されたアゴニスト活性を示した（図６Ａ）。
【０４３２】
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇは、最も低いアゴニスト活性の改善を示したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲとＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇとの間のアゴニズムの程度を示した（図６Ａ）。
【０４３３】
Ｅ３４５は、ＩｇＧサブタイプの中で保存されている残基である。また、サイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａＦｃを有する抗ＯＸ４０抗体においてもＥ３４５Ｒ突然変異の遺伝子操作を行い、その結果、抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒが得られた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイによって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはわずかしかアゴニスト活性を有しないが（図６Ｃ）、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒは用量依存的にアゴニズムを示す（図６Ｄ）ことが明らかになった。これは、Ｅ３４５Ｒ突然変異が複数のＩｇＧサブタイプにわたってアゴニズムの強化を促進し得ることを示した。
【０４３４】
ＦｃγＲＩＩＢ架橋は、ＩｇＧサブタイプに依存してＥ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムを更に増強する
Ｅ３４５Ｒ突然変異はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｓｉｇｍａのＦｃを有する抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムを促進し得るが、それでもなお、Ｒａｊｉ細胞と共培養したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に遺伝子操作を受けた抗体を適用したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイによって、ＦｃγＲＩＩＢ架橋の効果について調べた。Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ抗体のアゴニズムを更に増強することができ、Ｒａｊｉ細胞と共培養しない場合と比べて試験濃度全体にわたって活性が２倍を超えて増加する（図６Ｂ）ことが観察された。Ｒａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢ受容体をプレブロックするために２Ｂ６抗体を添加したとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲのアゴニズムのＲａｊｉ細胞媒介性増強は完全に阻害され、アゴニスト活性はＲａｊｉ細胞と共培養しない場合と同様のレベルまで低下したが、これはアゴニズムの増強がＦｃγＲＩＩＢ架橋によって駆動されることを示す。
【０４３５】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するか又は有しないＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体のアゴニズムに対するＦｃγＲＩＩＢ架橋を評価するために、同様のアッセイを設定した。Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ又はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ抗体のいずれにおいてもアゴニスト活性を増強できないことが見出された（図６Ｃ及び図６Ｄ）。このデータは、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムのＲａｊｉ細胞によって媒介される増強がＩｇＧサブタイプに依存しており、ＩｇＧ１  Ｆｃに対しては効果があるが、サイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａ  Ｆｃに対しては効果がないことを示した。
【０４３６】
Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のエフェクター機能
ＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイによって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。Ｅ３４５Ｒ突然変異は、抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣを改善した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比べてＡＤＣＣを改善した（図７Ａ）。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはＡＤＣＣ活性を示さず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａへのＥ３４５Ｒ突然変異の導入はＡＤＣＣに対して効果を有しなかった。
【０４３７】
分化したマクロファージによるＧＦＰを発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の貪食によって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＰ活性についても調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、マクロファージによるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞の死滅を用量依存的に媒介したが、Ｅ３４５Ｒ突然変異の導入はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性をわずかに強化しただけであった（図７Ｂ）。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはＡＤＣＰ活性を有していなかったが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａへのＥ３４５Ｒ突然変異の導入はＡＤＣＰを改善した（図７Ｂ）。
【０４３８】
ウサギ補体の存在下におけるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の溶解を評価するアッセイにおいて、抗体媒介性ＣＤＣについて調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体はＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞に対する有意なＣＤＣ活性を媒介しなかったが、Ｅ３４５Ｒ突然変異は、ＣＤＣ活性の増加を伴うＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体を用量依存的に助長した。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体はこのアッセイにおいてＣＤＣ活性を有しておらず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体におけるＥ３４５Ｒ突然変異は、そのＣＤＣ活性におけるサイレンシングを変化させなかった（図７Ｃ）。
【０４３９】
考察
免疫賦活性ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに対するアゴニスト抗体は、癌治療法のための有望な薬剤として台頭しつつある。最近のＦｃを遺伝子操作する試みは、置換Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２をＦｃに導入することによって抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体のＦｃγＲＩＩＢとの会合を最適化することを介してそのアゴニスト活性を強化することによって、当該抗体をその抗腫瘍免疫について最適化することに向けられている（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６〜３３；Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）。
【０４４０】
本明細書において抗ＯＸ４０抗体に適用したとき、報告されたＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＲａｊｉ細胞のいずれかで発現したＦｃγＲＩＩＢに対する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の結合を強化し、架橋依存的にアゴニスト活性を強化した。アゴニズムの程度は、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異のいずれについても同等であった。ＯＸ４０抗体におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を強化すると同時にＦｃγＲＩＩＩＡへの抗体結合を阻害したが、これは、Ｍｉｍｏｔｏによって報告された結果と一致している（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８。結果として、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣを完全に阻害したが、このＡＤＣＣは、ＮＫ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＩＡによって大部分が媒介される。
【０４４１】
ＣＤ２０などの腫瘍関連抗原に対する抗体の六量体化を誘導する突然変異（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０〜３（Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ４４０Ｙ）が抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を誘導することも本明細書において見出された。しかし、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異について報告されたものとは対照的に、改善されたアゴニスト活性はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存していなかった。Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、及びＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ二重突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体は溶液中でモノマーとして存在するが、当該抗体は細胞表面におけるＯＸ４０に結合すると多量体化した。多量体化した抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ発現細胞の非存在下において強化されたアゴニスト活性を示したが、これは恐らく細胞上におけるＯＸ４０のクラスタリングの増加が促進されたことによるものである。二重Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及び三重Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異によって、単一突然変異のみと比べてより高次の抗体多量体化が生じたが、単一のＥ３４５Ｒ突然変異から最高のアゴニスト活性を有する抗体が得られた。何らかの特定の理論に束縛されるものではないが、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するオリゴマー化した抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を有する抗体よりもＯＸ４０受容体のクラスタリングの促進についてより好ましい構造を有すると考えられる。
【０４４２】
Ｅ３４５Ｒ突然変異はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにアゴニズムを強化したが、ＦｃγＲＩＩＢ発現細胞の存在がＥ３４５Ｒ突然変異を有する抗体のアゴニズムを更に強化することが見出された。このアゴニズムの更なる増強は、遺伝子操作を受けた抗体とＲａｊｉ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢとの相互作用に依存していたが、その理由は、ＦｃγＲとの結合においてサイレントであるＩｇＧｓｉｇｍａ抗体ではアゴニズムの増強がみられず、Ｒａｊｉ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢをプレブロックすることによってアゴニズムが抑制されたためである。多量体化抗体はモノマーの抗体と比べてＦｃγ受容体に対してより高い親和性を有することが報告されている（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ  １：４９１〜５０４）。実際、本明細書に提示される結果は、溶液中で部分的に六量体形態であるＯＸ４０ＳＦ２Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙが、溶液中でモノマーとして存在するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ抗体と比べて、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢに対してはるかに強力な結合を有することを示す（データ不図示）。細胞表面におけるＯＸ４０に結合しているオリゴマー化ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、Ｒａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢに対する結合を増加させ得、次に、抗体の多量体化を更に安定化し、アゴニズムの増強をもたらす受容体のクラスタリングを促進すると仮定する。
【０４４３】
抗ＯＸ４０抗体に導入されたＥ３４５Ｒ突然変異は、抗体のＡＤＣＣ活性の効力を強化した。この効果は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができるＩｇＧ１における遺伝子操作を受けた抗体に特異的であったが、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合しないＩｇＧ２ｓｉｇｍａにおける抗体に対しては特異的ではなかった。これら所見は、ＩｇＧ１抗体のＥ３４５Ｒ媒介性ＡＤＣＣ活性の強化が、細胞表面におけるＯＸ４０を認識した際のＦｃγＲＩＩＩＡとオリゴマー化抗体との結合増加を介したものである可能性が高いことを示唆していた。
【０４４４】
天然ＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗ＯＸ４０抗体に対して、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＶ１２突然変異もＡＤＣＰに有意な影響を与えなかった。これは、貪食を媒介するマクロファージで発現している主なＦｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＡに対する結合を強化することが報告された（Ｍｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９〜９８）Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異については予想外であり得る。しかし、ＦｃγＲＩＩＡに加えて、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡを含むいくつかのＦｃ受容体は、標的細胞のＩｇＧ抗体によって媒介される貪食に寄与する（Ｉｎｄｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６：４３８９〜９９）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のＦｃγＲＩに対する結合効力を示したが、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合は抑制した。更に、強化されたＦｃγＲＩＩＡ結合の程度は、高親和性ＦｃγＲＩ受容体に対する結合と全く同等のレベルであった。その結果、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のマクロファージに対する結合効力を示し、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１に比べてＡＤＣＰ活性の強化は示さなかった。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合が減少し、ＦｃγＲＩＩＡに対する結合効力は変化しなかったが、これによって、マクロファージに対する結合の有意な減少を説明することができる。それにもかかわらず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のＡＤＣＰ活性を示した。この矛盾の理由は未知である。同様に、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体についてＡＤＣＰ活性の有意な増加は観察されなかったが、このような突然変異は、遺伝子操作を受けた抗体のＡＤＣＣ活性を有意に強化した。興味深いことに、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはＡＤＣＰ活性を有していなかったが、Ｅ３４５Ｒ突然変異は、サイレントＦｃを有するこの抗体に対して有意なＡＤＣＰ活性を付与した。
【０４４５】
本研究において評価されたいくつかのＦｃ遺伝子操作アプローチはそれぞれ、同時に遺伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性を強化し、エフェクター機能を調節することにおいて独特の特性を与える。ＡＤＣＣの要件に依存して、様々な遺伝子操作アプローチは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに結合する治療用抗体に対して想定され得る。例えば、ＣＤ４０及びＣＤ２７に結合する抗体は、細胞枯渇のリスクを最小化するために、改善されたアゴニスト活性ではあるが最小のＡＤＣＣから利点を享受し得る。したがって、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ若しくはＶ１２、又はＩｇＧ２ｓｉｇｍａにおけるＥ３４５Ｒを使用して、改善されたＣＤ４０及びＣＤ２７抗体を生成し得る。対照的に、例えば制御性Ｔ細胞を除去するためにＡＤＣＣ活性が望ましいとき、ＩｇＧ１におけるＥ３４５Ｒ突然変異を使用することができる。例えば、ＯＸ４０又はＧＩＴＲに結合する抗体は、改善されたアゴニスト活性及び強化されたＡＤＣＣの利点を享受し得る。
【０４４６】
別の検討事項は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に対する依存性がアゴニズムの強化にとって望ましいかどうかである。Ｅ３４５Ｒ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにアゴニズムの増加を促進することができ、これにより、局所微小環境におけるＦｃγＲの発現レベルに関係なく規定の治療活性を有する抗体を備えておくことができ、特に、ＦｃγＲ低発現細胞が浸潤している癌の種類について有利である。しかし、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存しないことで、アゴニズムが非特異的に賦活されることがあり、これによって望ましくないオフターゲット効果が生じる場合がある。このような場合、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ又はＶ１２突然変異を使用され得る。異なるＦｃ受容体に対する結合活性の変化、免疫原性、ＰＫプロファイル、及び遺伝子操作を受けた抗体の開発可能性を含む他の要因も、最適な遺伝子操作アプローチの選択において考慮しなければならない。
【図１Ａ】
2019532025.tif 000006
【図１Ｂ】
2019532025.tif 000007
【図２Ａ】
2019532025.tif 000008
【図２Ｂ】
2019532025.tif 000009
【図２Ｃ】
2019532025.tif 000010
【図２Ｄ】
2019532025.tif 000011
【図３Ａ】
2019532025.tif 000012
【図３Ｂ】
2019532025.tif 000013
【図３Ｃ】
2019532025.tif 000014
【図３Ｄ】
2019532025.tif 000015
【図４Ａ】
2019532025.tif 000016
【図４Ｂ】
2019532025.tif 000017
【図４Ｃ】
2019532025.tif 000018
【図４Ｄ】
2019532025.tif 000019
【図５】
2019532025.tif 000020
【図６Ａ】
2019532025.tif 000021
【図６Ｂ】
2019532025.tif 000022
【図６Ｃ】
2019532025.tif 000023
【図６Ｄ】
2019532025.tif 000024
【図７Ａ】
2019532025.tif 000025
【図７Ｂ】
2019532025.tif 000026
【図７Ｃ】
2019532025.tif 000027
【配列表】
2019532025000001.app
【国際調査報告】
2019532025.tif 000028
2019532025.tif 000029
2019532025.tif 000030