(57)【要約】  本発明は、ヒト臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物を提供する。冷凍保存組成物は、（ａ）アミノ酸、（ｂ）ビタミン、（ｃ）無機塩、並びに（ｄ）ＤＭＳＯ、ショ糖、マンニトール、及びラクトビオン酸を含み得る。本発明はまた、本組成物及びヒト臍帯組織由来細胞を含むキット、並びに本組成物を利用する細胞の冷凍保存方法も提供する。
2019503181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物であって、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、
Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、
塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、
塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩と、
ＤＭＳＯ、ラクトビオン酸、グルタチオン、デキストロース、ショ糖、及びマンニトールと、を含む、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、
少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約２６２．８ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約６５．７９ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約２９．７ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約１８．９ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約４２．７５  ５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、少なくとも約７．２ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び４１．８５ｍｇ／ＬのＬ−バリンと、
少なくとも約０．１８ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約１．８ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々と、
少なくとも約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０の塩化ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５６．２５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、少なくとも約３．２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、少なくとも約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、少なくとも約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び少なくとも約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）と、
約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約８５５ｍｇ／Ｌのデキストロース、少なくとも約４１５ｍｇ／Ｌのグルタチオンと、少なくとも約３０８１ｍｇ／Ｌのショ糖及び少なくとも約１６３９ｍｇ／Ｌのマンニトールと、を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物であって、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、
Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、
塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、
ＤＭＳＯ、デキストロース、ショ糖、及びマンニトールと、を含む、組成物。
【請求項４】
前記組成物が、
少なくとも約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び少なくとも約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリンと、
少なくとも約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々と、
少なくとも約３６０ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、少なくとも約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及び少なくとも約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏと、
約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース、少なくとも約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び少なくとも約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールと、を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、ラクトビオン酸、グルタチオン、並びに、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩を含まない、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物であって、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、
Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、
塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、
塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩と、
約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、約１２，０００〜約２０，０００ｍｇ／Ｌのラクトビオン酸、約３２９〜約４９５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、デキストロース、約２４６０〜約３６９５ｍｇ／Ｌのショ糖、及び約１３１０〜約１９６７ｍｇ／Ｌのマンニトールと、を含む、組成物。
【請求項７】
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記臍帯組織由来細胞が、以下の特性：
酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、
ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、
ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びに
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物及び臍帯組織由来細胞を含むキットであって、前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、キット。
【請求項１０】
請求項３に記載の組成物及び臍帯組織由来細胞を含むキットであって、前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、キット。
【請求項１１】
請求項６に記載の組成物及び臍帯組織由来細胞を含むキットであって、前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、キット。
【請求項１２】
前記臍帯組織由来細胞が、以下の特性：
酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、
ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、
ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びに
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
請求項１に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の前記開始温度を約１５分間維持することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
請求項２に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【請求項１６】
前記臍帯組織由来細胞が、以下の特性：
酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、
ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、
ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びに
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
請求項３に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の前記開始温度を約１５分間維持することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
請求項６に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【請求項２０】
前記方法が、前記冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の前記開始温度を約１５分間維持することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、約−４５．０℃の前記製剤の凝固点付近で発熱反応を生じ、前記方法が、前記冷凍保存組成物を、約−４５．０℃の温度で、−２５．０℃／分の速度で、前記組成物が約−５０．０℃の温度に到達するまで冷却することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許仮出願第６２／２７８，７８０号（２０１６年１月１４日出願）に対する優先権を主張し、この内容は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の冷凍保存に有用な組成物、及びこれらの組成物を利用するｈＵＴＣを冷凍保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
同種細胞療法製品のために、ドナーから細胞又は組織を得て、これは患者に投与する前に更に操作される。非相同細胞療法製品の製造プロセスに、典型的に、細胞を解凍及び増殖するステップと、細胞を濃縮し、細胞の製造中に使用される血清及びトリプシンなどの望ましくない不純物を除去するステップと、細胞を最終的な製剤緩衝液に構成し、細胞又は製品を冷凍保存するステップとを含む。一旦臨床現場において、冷凍保存された製品を解凍し、レシピエントに投与する。製品は、レシピエントに投与する前及び投与中、冷凍保存製剤のままである。
【０００４】
冷凍保存は、零下に冷却することによって細胞又は組織全体を保存するプロセスである。これらの低温で、細胞死を引き起こす生化学反応を含む任意の生物学的活性が効果的に停止される。しかしながら、冷凍保存は、凍結した細胞に損傷を引き起こすことが知られているため、細胞の生存に影響する。冷凍保存中の細胞生存性は、解凍後の細胞の回復及び残存性によって測定される。冷凍保存中の細胞残存は、例えば、冷凍保存製剤、冷凍サイクル、及び手順、並びに解凍手順などの可変的なプロセスの影響を顕著に受ける可能性がある。加えて、冷凍保存中に細胞に損傷を引き起こし得る現象は主に、凍結段階中に生じ、溶液効果、細胞外氷生成、脱水、及び細胞内氷生成を含むが、これらに限定されない。この損傷を回避するために、保存される細胞に対して一意に設計される冷凍保護剤溶液が使用される。このような冷凍保護剤の使用は、冷却又は解凍プロセス中の凍結による損傷から細胞を保護する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、高い細胞残存性を支持及び維持し、かつ解凍中に製品の完全性を保存することができる、製品を送達するビヒクルとしても使用される、最終的な冷凍保存製剤を提供することが重要である。製剤は、レシピエントへの投与に安全である必要もある。更に、冷凍保存製剤は、長期間にわたって製品の安定性を支持しなければならない。
【０００６】
必要なのは、機能性及び治療上の有用性を維持するヒト臍帯組織由来細胞の冷凍保存に有用な組成物である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態は、（１）Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸、（２）Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミン、（３）塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩、並びに（４）ＤＭＳＯ、デキストロース，無水，ＵＳＰ、ショ糖、及びマンニトールを含む臍帯組織由来細胞の冷凍保存に適した組成物である。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本組成物は、（１）約３７．８〜約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、約２６２．８〜約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、約１３．５〜約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、約４７．１６〜約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約４７．１６〜約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、約６５．７９〜約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、約１３．５〜約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、約２９．７〜約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約１８．９〜約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、約４２．７５〜約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、約７．２〜約１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び約４１．８５〜約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリン、（２）約０．１８〜約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに約１．８〜約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々、（３）約３６０〜約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５〜約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０〜約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及び約５６．２５〜約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、並びに約５〜約１０％のＤＭＳＯ、約８５５ｍｇ／Ｌ〜約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース、約３０８１〜約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び約１６３９〜約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。
【０００９】
本組成物は、ラクトビオン酸、グルタチオン、並びに塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩を更に含み得る。よって、一実施形態では、本組成物は、（１）少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約２６２．８ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約６５．７９ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約２９．７ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約１８．９ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約４２．７５  ５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、少なくとも約７．２ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び４１．８５ｍｇ／ＬのＬ−バリン、（２）少なくとも約０．１８ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約１．８ｍｇ／Ｌの、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々、（３）少なくとも約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０の塩化ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５６．２５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、少なくとも約３．２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、少なくとも約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、少なくとも約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び少なくとも約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、並びに（４）約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約８５５ｍｇ／Ｌのデキストロース，無水，ＵＳＰ、少なくとも約４１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、少なくとも約３０８１ｍｇ／Ｌのショ糖、及び少なくとも約１６３９ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。
【００１０】
別の実施形態では、本組成物は、ラクトビオン酸、グルタチオン、並びに塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩を含まない。この実施形態では、本組成物は、（１）少なくとも約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び少なくとも約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリン、（２）少なくとも約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々、（３）少なくとも約３６０ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、少なくとも約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及び少なくとも約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、並びに（４）約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース，無水，ＵＳＰ、少なくとも約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び少なくとも約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。
【００１１】
本組成物は、臍帯組織由来細胞を含むキット、及びヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法において使用され得る。
【００１２】
一実施形態では、臍帯組織由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。別の実施形態では、臍帯組織由来細胞は、以下の特性：酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びにＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、臍帯組織由来細胞及び製剤を含む冷凍保存組成物を提供するステップ、冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から約−１．０℃／分の速度で、組成物が約−４５．０℃／分の温度に到達するまで冷却するステップ、及び冷凍保存組成物を、組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却するステップの連続ステップを含むヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法である。任意追加的に、本方法は、冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の開始温度を約１５分間維持することを更に含む。
【００１４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
上記の発明の概要、並びに以降の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面は本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない点は理解されるべきである。
【図１】解凍後の室温での細胞残存率を示す。
【図２】解凍時の細胞回復率を示す。
【図３】解凍後の細胞生存率を示す。示されるデータは、染色としてトリパンブルーを使用するＣＥＤＥＸデータに基づくものである。
【図４】解凍後の生細胞密度を示す。
【図５】市販の冷凍保存液（ＣＳ１０）を含有する冷凍保存製剤のＩＶ注入後のラットにおける浮腫及び肢発赤を示す。図５は、左側に対照ラット、及び右側に足に浮腫及び発赤を有する、ＣＳ１０を含有する製剤で処置されたラットを示す（実施例２を参照されたい）。
【図６Ａ】解凍後の複数の製剤におけるｈＵＴＣの生存率を示す。細胞を解凍し、アリコートを抜き取り、生存率を経時的にＧｕａｖａ（登録商標）Ｖｉａｃｏｕｎｔ（登録商標）で測定した。サンプルをトリプリケートで測定し、結果を平均±ＳＥＭとしてプロットした。図６は、表３−１に概説されるサンプルについての結果を示す。図６ＡはサンプルＡ〜Ｅの結果を示す。図６ＢはサンプルＡ及びＦ〜Ｉの結果を示す。
【図６Ｂ】解凍後の複数の製剤におけるｈＵＴＣの生存率を示す。細胞を解凍し、アリコートを抜き取り、生存率を経時的にＧｕａｖａ（登録商標）Ｖｉａｃｏｕｎｔ（登録商標）で測定した。サンプルをトリプリケートで測定し、結果を平均±ＳＥＭとしてプロットした。図６は、表３−１に概説されるサンプルについての結果を示す。図６ＡはサンプルＡ〜Ｅの結果を示す。図６ＢはサンプルＡ及びＦ〜Ｉの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の例示的実施形態の詳細な説明において、本明細書の一部をなす添付図面が参照されている。これらの実施形態は、当業者が本発明を実践できるように十分に詳細に説明されており、本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなく、他の実施形態を用いることができること、及び論理構造的、機械的、電気的、及び化学的変更がなされ得ることが理解されよう。当業者が本明細書に記載される実施形態を実践することを可能にするために必要でない詳細な説明を避けるために、当業者に周知の特定の情報の説明が省略されている場合がある。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈されるべきではない。
【００１７】
本発明は、ヒト臍帯組織細胞（ｈＵＴＣ）を冷凍保存するために使用することができる冷凍保存の組成物及び凍結プロファイルを開示する。更に、本発明は、ｈＵＴＣ由来の細胞療法製品を凍結するための冷凍保存製剤の組成物を開示する。開示される製剤／組成物（複数可）は、動物試験に基づいて投与に安全であり、解凍後に高い細胞生存率を維持し、かつ冷凍保存中に高い細胞残存を維持する。これらの組成物は、最適に、（ａ）図像的及び浸透圧バランス、並びにアシドーシスを維持する、（ｂ）細胞膨潤を防止する、並びに（ｃ）フリーラジカル蓄積を制御する。
【００１８】
本発明は、同種細胞療法ｈＵＴＣを冷凍保存するための製剤を記載する。これらの冷凍保存製剤は、冷凍保存ステップ中、高いｈＵＴＣ残存を維持する。更に、製品を送達するためのビヒクルとして使用される製剤は、動物モデルに基づいて任意の有害効果を示さない。加えて、冷凍保存製剤は、製剤が患者への投与に好適であるように、短期間、解凍した製品（即ち、ｈＵＴＣ）の完全性を維持する。
【００１９】
多くの冷凍保存製剤は、細胞内環境と細胞外環境との間の浸透圧バランスを維持するために、５％〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。ＤＭＳＯは、冷凍保存中の細胞内氷生成も阻害する。グリセロール、エチレングリコール、デキストラン、及びヒドロキシセルロースなどの他の化学物質、又はジサッカライド、ショ糖、マルトース、及びトレハロースは、ＤＭＳＯと組み合わせたとき、細胞生存率を高める。本出願に開示される冷凍保存組成物は、凍結中の浸透圧バランスを維持するために、ＤＭＳＯ、マンニトール、ショ糖、及びラクトビオン酸の独特な平衡混合物を含有する。加えて、本組成物は、細胞に栄養を供給するアミノ酸、ビタミン、及び微量金属を含有する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、ｈＵＴＣの高い残存率を維持し、かつ最大約１０ｍＬ／ｋｇの投与容量でのＩＶ投与後、及びラットの総ＣＳＦ容量の約２５〜３３％（３００〜４００μＬ）である１００μＬの容量でのＣＳＦへの注射後に良好に忍容される冷凍保存製剤／組成物を開示する。
【００２１】
本明細書及び請求項を通して様々な用語が使用される。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【００２２】
一実施形態では、本発明で使用される細胞は、一般的に、分娩後細胞又は分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）と称される。これらの細胞は、より具体的には、「臍由来細胞」、又は「臍帯由来細胞」（ＵＤＣ）、又は「臍帯組織由来細胞」（ＵＴＣ）、又は「ヒト臍帯組織由来細胞」（ｈＵＴＣ）である。更には、これらの細胞は、幹細胞又は前駆細胞として説明することができ、後者の用語は広義で使用される。「由来する」という用語は、その細胞が、それらの生物学的起源から得られ、インビトロで、成長するか、ないしは別の方法で操作されている（例えば、成長培地中で培養されて、その集団を増殖させ、かつ／又は細胞株を産生する）ことを示すために使用される。臍幹細胞のインビトロ操作、及び本発明の臍由来細胞の独特な特徴が、以下で詳細に説明される。
【００２３】
「幹細胞」は、単一細胞の、自己複製する能力、並びに自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞を含めた子孫細胞を産生するために分化する能力の双方によって定義される、未分化細胞である。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能細胞に分化するその能力によって、並びに、移植後に複数の胚葉組織を生じさせる能力、及び胚盤胞内への注射後に、全部ではないが実質的に殆どの組織に寄与する能力によっても、特徴付けられる。
【００２４】
幹細胞は、その発生能に応じて、（１）全能性、（２）多分化能性、（３）複能性、（４）少能性、及び（５）単能性に分類される。全能細胞は、全ての胚細胞型及び胚体外細胞型を生じさせることが可能である。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。「多分化能性」細胞には、細胞系統のサブセットで、特定の組織、臓器、又は生理系内の全てを生じさせることが可能であるものが含まれる。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血球限定の少能性前駆細胞、並びに血液の正常成分である全ての細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる。「少能性」細胞は、多分化能性幹細胞より制限された細胞系統サブセットを生じさせることができる。単能細胞は、単一の細胞系統（例えば、精子形生幹細胞など）を生じさせることができる。
【００２５】
幹細胞はまた、それらの幹細胞を得ることができる供給源に基づいても分類される。成体幹細胞は、全般的には、複数の分化細胞型を含む組織内に見出される、多分化能性の未分化細胞である。成体幹細胞は、自己複製することができる。通常の状況下では、成体幹細胞はまた、その細胞が起源とする組織の、特殊化した細胞型、また恐らくは他の組織型を産生するように、分化することもできる。胚幹細胞は、胚盤胞期の胚の内部細胞塊からの、多能性細胞である。胎生幹細胞は、胎児組織又は胎膜を起源とする幹細胞である。分娩後幹細胞は、出産後に入手可能な胚体外組織、すなわち、臍帯を実質的に起源とする、多分化能性若しくは多能性の細胞である。これらの細胞は、迅速な増殖、及び多くの細胞系統への分化に関する潜在能力を含めた、多能性幹細胞に固有の特徴を保有することが見出されている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られる幹細胞のような）又は非血液由来（例えば、臍帯及び胎盤の非血液組織から得られるような）であり得る。
【００２６】
様々な用語が、培養中の細胞を説明するために使用される。「細胞培養物」とは、一般的に、生体から取得され、制御条件下で成長する（「培養中」又は「培養される」）細胞を指す。「初代細胞培養物」は、最初の継代培養の前に、生物（複数可）から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養物である。細胞は、細胞の成長及び／又は分裂を促進する条件下で、成長培地内に置かれると培養中で「増殖」して、より大きな細胞集団を形成する。細胞を培養中に増殖させる場合、細胞増殖の速度は、その細胞の数が倍加するために必要な時間量によって測定される場合がある。これは「倍加時間」と呼ばれる。
【００２７】
「細胞株」という用語は、一般的に、初代細胞培養物の１つ又は２つ以上の継代培養によって形成される細胞集団を指す。継代培養の各一巡は、１継代と称される。細胞が継代培養される場合、細胞が「継代」されたと称する。特定の細胞集団、又は細胞株は、継代された回数によって言及されるか、又は特徴付けられる場合がある。例えば、１０回継代されている培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と称することができる。初代培養物、即ち、組織から細胞を単離した後の最初の培養物は、Ｐ０と表される。最初の継代培養後には、それらの細胞は、二次培養物（Ｐ１又は継代数１）として説明される。２回目の継代培養後には、それらの細胞は、三次培養物（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者には、継代期間中には多くの集団倍加が存在し得、したがって、培養物の集団倍加の数は継代の数よりも大きいということが理解されるであろう。継代間の期間における細胞の増殖（即ち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、成長条件、及び継代間の時間を含むが、これらに限定されない、多くの因子に依存する。
【００２８】
「分化」は、特殊化されていない（「拘束されていない」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化した」細胞は、細胞の系統内で、より特殊化された（「拘束された」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用されたときの用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ、通常の環境下で、異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞の系統内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の「系統」は、その細胞の遺伝性、即ち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。
【００２９】
広義では、「前駆細胞」とは、それ自身よりも分化した後代を産生する能力を有し、かつ、前駆体のプールを補充する能力も保持する細胞である。その定義によれば、幹細胞自体もまた、より直接的な、最終分化細胞への前駆体であるため、前駆細胞である。以下でより詳細に説明されるように、本発明の細胞に言及する場合、この広い意味での前駆細胞の定義を使用することができる。より狭義には、前駆細胞は、分化経路での中間体である細胞として定義される場合が多く、即ち、前駆細胞は、幹細胞から生じるものであり、成熟細胞型又は細胞型のサブセットを産生する際の中間体である。この型の前駆細胞は、全般的には、自己複製が不可能である。したがって、本明細書でこの型の細胞が言及される場合には、その細胞は「非複製前駆細胞」、又は「中間的前駆体若しくは中間的前駆細胞」と称される。
【００３０】
一般的に、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖、及び／又は成熟を促進するか、あるいは細胞の活性の増大を刺激する物質として定義される。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「標準成長条件」という用語は、５％のＣＯ２を含み、相対湿度が約１００％に維持された標準大気中において、３７℃で細胞を培養することを指す。前述の条件は、培養に関して有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するために当該技術分野において利用可能な選択肢を認識する当業者によって、変更することが可能である点を理解されたい。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「単離する」という用語は、一般に、その自然環境から分離されている細胞を指す。この用語は、自然環境からの全体的な物理的分離、例えば、ドナー動物からの除去を含む。好ましい実施形態では、単離された細胞は組織内に存在しない。即ち、細胞は、その細胞が通常は接触している近隣細胞から分離又は解離されている。好ましくは、細胞は細胞懸濁液として投与される。本明細書で使用するとき、「細胞懸濁液」という語句は、培地に接触していて、かつ、例えば、組織片を穏やかな粉砕にかけることによって、解離されている細胞を含む。
【００３３】
「足場依存性細胞」は、組織培養において複製するために、表面、例えば、組織培養フラスコ表面又はマイクロキャリア粒子表面に付着させる必要がある哺乳類細胞を含む細胞である。
【００３４】
本明細書において、量、時間の長さなどの測定可能な値を指して使用するところの「約」なる用語は、具体的に示された値からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味するが、このような変動は、開示される方法を実施するうえで適切なものである。
【００３５】
Ｉ．冷凍保存のための組成物
本発明の一態様は、ヒト臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物を目的とする。本発明の組成物は、投与に適しており、解凍後に高い生存率を維持し、冷凍保存中に高い細胞残存を維持するように製剤化されているという点で独特である。よって、細胞は、組成物中で冷凍保存されてもよく、組成物は、解凍後に対象に投与され得る。本組成物はまた、細胞の膨潤を防止し、フリーラジカルの蓄積を制御し、アシドーシス、並びに図像的及び浸透圧バランスを維持する。
【００３６】
本発明の一実施形態では、冷凍保存組成物は、選択アミノ酸、ビタミン、無機塩、及び他の成分を含む。他の成分のうちの１つ又は２つ以上が冷凍保護剤として作用してもよい。
【００３７】
Ａ．アミノ酸
一実施形態では、本組成物は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸を含む。
【００３８】
別の実施形態では、本組成物は、約３７．８〜約７５．６ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３７．８ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニンを含む。更に別の実施形態では、本組成物は、約２６２．８〜約５２５．６ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２６２．８ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミンを含む。別の実施形態では、本組成物は、約１３．５〜約２７ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１３．５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２７ｍｇ／Ｌのグリシンを含む。別の実施形態では、本組成物は、約４７．１６〜約９４．２３ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４７．１６、あるいは少なくとも約９４．３２のＬ−イソロイシン及びＬ−ロイシンを含む。別の実施形態では、本組成物は、約６７．７９〜約１３１．５８ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約６７．７９ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジンを含む。更に別の実施形態では、本組成物は、約１３．５〜約２７ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１３．５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニンを含む。更に別の実施形態では、本組成物は、約２９．７〜約５９．４ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２９．７ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約５９．４ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを含む。代替的な実施形態では、本組成物は、約１８．９〜約３７．８ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１８．９、あるいは少なくとも約３７．８ｍｇ／Ｌのセリンを含む。一実施形態では、本組成物は、約４２．７５〜約８５．５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４２．７５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニンを含む。代替的な実施形態では、本組成物は、約７．２〜約１４．４ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約７．２ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファンを含む。更に別の実施形態では、本組成物は、約４１．８５〜約８３．７ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４１．８５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含む。
【００３９】
一実施形態では、本組成物は、約３７．８〜約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、約２６２．８〜約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、約１３．５〜約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、約４７．１６〜約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約４７．１６〜約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、約６５．７９〜約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、約１３．５〜約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、約２９．７〜約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約１８．９〜約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、約４２．７５〜約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、約７．２〜約１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び約４１．８５〜約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含む。
【００４０】
別の実施形態では、本組成物は、約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、約２６２．８ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、約６５．７９ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、約２９．７ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約１８．９ｍｇ／ＬのＬ−セリン、約４２．７５  ５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、約７．２ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び４１．８５ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含む。
【００４１】
更に別の実施形態では、本組成物は、約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリンを含む。
【００４２】
Ｂ．ビタミン
別の実施形態では、本組成物は、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、チアミンＨＣｌ、及びリボフラビンのビタミンを更に含む。
【００４３】
一実施形態では、本組成物は、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、及びチアミンのビタミンのうちの１つ又は２つ以上、好ましくはその各々を約１．８〜約３．６ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１．８ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３．６ｍｇ／Ｌ含む。一実施形態では、本組成物は、約０．１８〜約０．３６ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約０．１８ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビンを含む。
【００４４】
一実施形態では、本組成物は、約０．１８〜約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに約１．８〜約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々を含む。
【００４５】
別の実施形態では、本組成物は、約０．１８ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに約１．８ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々を含む。
【００４６】
代替的な実施形態では、本組成物は、約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々を含む。
【００４７】
Ｃ．無機塩
更に別の代替的な実施形態では、本組成物は、塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩を更に含む。一実施形態では、本組成物は、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を更に含む。別の実施形態では、冷凍保存組成物は、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を含まない。
【００４８】
別の実施形態では、本組成物は、約３６０〜約４３２ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３６０ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４３２の塩化カリウム，ＵＳＰを含む。別の実施形態では、本組成物は、約２５６５〜約３３３０ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２５６５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰを含む。一実施形態では、本組成物は、約２８８０〜約５７６０ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２８８０ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰを含む。別の実施形態では、本組成物は、約５６．２５〜約１１２．５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約５６．２５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏを含む。ある特定の実施形態では、本組成物は、（ａ）少なくとも約３．２ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、（ｂ）少なくとも約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、（ｃ）少なくとも約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び（ｄ）少なくとも約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。
【００４９】
代替的な実施形態では、本組成物は、約３６０〜約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５〜約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０〜約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及び約５６．２５〜約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏを含む。
【００５０】
一実施形態では、本組成物は、約３６０ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及び約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏを含む。好ましくは、この冷凍保存組成物は、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を含まない。
【００５１】
別の実施形態では、本組成物は、約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０の塩化ナトリウム，ＵＳＰ、約５６．２５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、約３２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を含む。
【００５２】
代替的な実施形態では、本組成物は、約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム、約２５６５  ０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０の塩化ナトリウム、約５６．２５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、約３．２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を含む。
【００５３】
Ｄ．他の成分
別の実施形態では、本組成物は、ＤＭＳＯ、デキストロース，無水，ＵＳＰ、ショ糖、及びマンニトールを更に含む。更に別の実施形態では、本組成物は、ラクトビオン酸及びグルタチオンを更に含む。
【００５４】
理論に拘束されることなく、本発明のある特定の実施形態では、ラクトビオン酸、ショ糖、マンニトール、グルタチオン、及び／又はＤＭＳＯは、冷凍保護剤として作用し得る。
【００５５】
本組成物は、約５％〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み得る。ある特定の実施形態では、本組成物は、５％、７％、又は１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。
【００５６】
一実施形態では、本組成物は、約８５５ｍｇ／Ｌ〜約９００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約８５５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース，無水，ＵＳＰを含む。別の実施形態では、本組成物は、約３０８１〜約６１６０ｍｇ／Ｌ、あるいは約２４６０〜約３６９５ｍｇ／Ｌあるいは少なくとも約２３００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２４００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４９００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３０８１ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約６１６０ｍｇ／Ｌ、あるいは約２４６０ｍｇ／Ｌ、あるいは約４，９００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約７４００ｍｇ／Ｌ、あるいは約５，４００〜約８，４００ｍｇ／Ｌのショ糖を含む。代替的な実施形態では、本組成物は、約１３１０〜約１９６７ｍｇ／Ｌ、あるいは約２６２０〜約３９４０ｍｇ／Ｌ、あるいは約１３１０〜約３９４０、あるいは少なくとも約１６３９ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約３２４０ｍｇ／Ｌ、あるいは約１６３９ｍｇ／Ｌ、あるいは約約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。別の実施形態では、本組成物は、約１２，０００〜約２０，０００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１６，０００ｍｇ／Ｌ、あるいは約１６１２３ｍｇ／Ｌ、あるいは約１２，０００ｍｇ／Ｌ、あるいは約１６，０００ｍｇ／Ｌ、あるいは１９，０００ｍｇ／Ｌのラクトビオン酸を含む。更に別の実施形態では、本組成物は、約４１５〜約５００ｍｇ／Ｌ、あるいは約３２９〜約４９５ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４１５ｍｇ／Ｌ、あるいは約４１５ｍｇ／Ｌ、あるいは約３２９ｍｇ／Ｌ、あるいは約４９５ｍｇ／Ｌのグルタチオンを含む。
【００５７】
一実施形態では、本組成物は、約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース，無水，ＵＳＰ、約４９３２〜約７１００ｍｇ／Ｌ、あるいは約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び約２６２０〜約３９４０ｍｇ／Ｌ、あるいは約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。好ましくは、本組成物のこの実施態様は、ラクトビオン酸及びグルタチオンを含まない（即ち、不含）。
【００５８】
別の実施形態では、本組成物は、約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約８５５ｍｇ／Ｌのデキストロース，無水，ＵＳＰ、約２４６０〜約３７００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約２４６０ｍｇ／Ｌのショ糖、約１３１０〜約２０００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１６３９ｍｇ／Ｌ、あるいは約１６３９ｍｇ／Ｌのマンニトール、約１２，０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約１６，０００ｍｇ／Ｌ、あるいは約１６，０００ｍｇ／Ｌのラクトビオン酸、及び約３００〜約５００ｍｇ／Ｌ、あるいは少なくとも約４１５ｍｇ／Ｌ、あるいは約４１５ｍｇ／Ｌのグルタチオンを含む。
【００５９】
Ｅ．更なる実施形態
本発明の一実施形態は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミンＨＣｌのビタミンと、塩化カリウム（ＵＳＰ）、重炭酸ナトリウム（ＵＳＰ）、塩化ナトリウム（ＵＳＰ）、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、ＤＭＳＯ、デキストロース（無水ＵＳＰ）、ショ糖、及びマンニトールとを含む臍帯組織由来細胞の冷凍保存に適した組成物である。
【００６０】
一実施形態では、本組成物は、約３７．８〜約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、約２６２．８〜約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、約１３．５〜約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、約４７．１６〜約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約４７．１６〜約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、約６５．７９〜約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、約１３．５〜約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、約２９．７〜約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約１８．９〜約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、約４２．７５〜約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、約７．２〜約１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び約４１．８５〜約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリン、約０．１８〜約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに約１．８〜約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々、約３６０〜約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム（ＵＳＰ）、約２５６５〜約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＵＳＰ）、約２８８０〜約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＵＳＰ）、及び約５６．２５〜約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、並びに約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、約８５５ｍｇ／Ｌ〜約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース、約３０８１〜約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び約１６３９〜約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。
【００６１】
本発明の一実施形態では、本組成物は更に、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩を含まない。更に別の実施形態では、本組成物は、ラクトビオン酸及びグルタチオンも含まない。代替的な実施形態では、本組成物は、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、ラクトビオン酸、及びグルタチオンを含まない。したがって、一実施形態では、本組成物は、少なくとも約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び少なくとも約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々、少なくとも約３６０ｍｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、少なくとも約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム、及び少なくとも約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム一塩基性，Ｈ２Ｏ、並びに約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース（無水ＵＳＰ）、少なくとも約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び少なくとも約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩と、ＤＭＳＯ、デストロース（無水ＵＳＰ）、ショ糖、マンニトール、ラクトビオン酸、及びグルタチオンとを含む臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物である。
【００６３】
一実施形態では、本組成物は、少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約２６２．８ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約６５．７９ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約２９．７ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約１８．９ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約４２．７５  ５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、少なくとも約７．２ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び４１．８５ｍｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．１８ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約１．８ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々、少なくとも約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０の塩化ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５６．２５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、少なくとも約３．２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、少なくとも約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、少なくとも約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び少なくとも約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、並びに約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約８５５ｍｇ／Ｌのデキストロース（無水ＵＳＰ）、少なくとも約４１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、少なくとも約３０８１ｍｇ／Ｌのショ糖、及び少なくとも約１６３９ｍｇ／Ｌのマンニトールを含む。
【００６４】
本発明の組成物の他の実施形態を、下の表に示す。表に列記されている各成分の量に関して、その量は、単に近似値である。所定値の±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、尚もより好ましくは±０．１％の変動もこれらの実施形態において包含される。
【００６５】
【表１】
2019503181.tif 000003
【００６６】
上記の実施形態Ａ及びＢに関して、ラクトビオン酸、グルタチオン、ＤＭＳＯ、デキストロース，無水，ＵＳＰ、ショ糖、及びマンニトールの量は、組成物の使用に応じて変化し得る。ＤＭＳＯの量は、約５％〜約１０％  ｖ／ｖの範囲であり得る。一実施形態では、実施形態Ａは、３．２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）を含む。実施形態Ａに関して、ラクトビオン酸、ショ糖、マンニトール、及びグルタチオンの量は変化してもよく、表１−８に列記されるこれらの成分の量を含む。同様に、実施形態Ｂに関して、ショ糖及びマンニトールの量も変化し、表１−７に記載されるこれらの成分の量を含む。
【００６７】
ＩＩ．冷凍保存方法
本発明の別の態様は、本発明の冷凍保存組成物を利用してヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法である。
【００６８】
広くは、冷凍保存方法は、臍帯組織由来細胞を提供するステップと、本発明の冷凍保存組成物中に細胞を配置するステップと、細胞の所望の冷凍保存温度に到達するために、それらの細胞を所望の期間冷却するステップとを含む。好ましくは、所望の冷凍保存温度は−１２０℃である。
【００６９】
一実施形態では、本方法は、ｈＵＴＣを冷凍保存組成物中に配置し、組成物が４℃の開始温度に到達することを可能にすることを含む。細胞を含む組成物が開始温度に到達したら、それらは約１５分間その温度に維持される。約１５分間この温度に維持した後、細胞を、細胞組成物が約−３．０℃の温度に到達するまで、約−１．０℃／分の速度で冷却する。代替的な実施形態では、本方法は、細胞組成物を、約４℃の開始温度から約−１．０℃／分の速度で、細胞組成物が約−３．０℃／分の温度に到達するまで冷却することを含む。細胞組成物が約−３．０℃の温度になったら、組成物を、約−２５．０℃／分の速度で、細胞組成物が約−５０．０℃の温度に到達するまで更に冷却する。細胞組成物が約−５０．０℃の温度になったら、組成物を、約−１０．０℃／分の速度で、細胞組成物が約−２０．０℃の温度に到達するまで加熱する。細胞組成物が約−２０．０℃の温度になったら、組成物を、約−１．０℃／分の速度で、細胞組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで再び冷却する。次に、組成物が約−４５．０℃の温度になったら、組成物を、約−１０．０℃／分の速度で、細胞組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却する。
【００７０】
一実施形態では、本方法は、ｈＵＴＣを冷凍保存組成物中に配置し、組成物が４℃の開始温度に到達することを可能にすることを含む。次に、細胞を、１℃／分の速度で、４℃〜−４５℃で冷却する。次に、組成物が約−４５．０℃の温度になったら、組成物を、細胞組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却する。
【００７１】
細胞が貯蔵温度にあるとき、それらは、例えば、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、又は２４ヶ月などの所望の期間貯蔵され得る。好ましくは、細胞は、使用するまで液体窒素（例えば、液体窒素冷凍機など）に貯蔵される。
【００７２】
ＩＩＩ．培養培地及び無血清栄養液を含むキット
本発明の別の実施形態は、臍帯組織由来細胞を冷凍保存するためのキットである。一実施形態では、キットは、本発明の組成物を含む。キットは、細胞、及び冷凍保存のための指示書を更に含み得る。別の実施形態では、キットは、本発明の組成物中で冷凍保存されたｈＵＴＣ及びｈＵＴＣを使用するための指示書を含む。一実施形態では、組成物中に冷凍保存されたｈＵＴＣは、静脈内（ＩＶ）注入用に製剤化され得る。
【００７３】
ＩＶ．ヒト臍帯組織由来細胞（ＨＵＴＣ）
上述のように、冷凍保存のための組成物、キット、及び方法は、単離されたヒト臍帯組織由来細胞（「ｈＵＴＣ」又は「ＵＴＣ」）を冷凍保存するために使用され得る。本発明の冷凍保存組成物、キット、及び方法での使用に好適なＵＴＣ及びＵＴＣの集団は、本明細書において以下に詳述すると共に、米国特許第７，５１０，８７３号及び同第７，５２４，４８９号にも詳述されている。
【００７４】
Ａ．臍帯組織由来細胞の分離及び成長
本明細書で説明される方法によれば、哺乳類の臍帯は、満期産若しくは早期産のいずれかの終了時に、又はその直後に、例えば、出産後の娩出後に回収される。この分娩後組織は、出産場所から、実験室へと、フラスコ、ビーカー、培養皿、又は袋などの滅菌容器に入れて移送することができる。容器は、溶液又は培地を含み得、それらの溶液又は培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ダルベッコ最小必須培地としても知られる）若しくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの塩溶液、又はウィスコンシン大学液若しくはペルフルオロ化合物溶液などの、移植に使用される器官の移送のために使用される任意の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、１つ若しくは２つ以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を、培地又は緩衝液に添加することができる。分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすぐことができる。この組織は、ＵＴＣの抽出の前に、約４〜１０℃に保つことが好ましい。この組織は、ＵＴＣの抽出の前に凍結させないことが、更により好ましい。
【００７５】
ＵＴＣの単離は、好ましくは、無菌環境内で実施される。臍帯は、当該技術分野において既知の手段によって、胎盤から分離することができる。あるいは、臍帯及び胎盤は、分離することなく使用される。血液及び残滓は、ＵＴＣの単離前に、分娩後組織から除去することが好ましい。例えば、この分娩後組織は、緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水を含むがこれに限定されない）で洗浄することができる。この洗浄緩衝液はまた、１つ若しくは２つ以上の抗真菌剤及び／又は抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンを含むがこれらに限定されない）も含み得る。
【００７６】
臍帯又はその断片若しくは切片を含む分娩後組織は、機械的な力（細断力又は剪断力）によって脱凝集される。現時点で好ましい実施形態では、この単離手順はまた、酵素消化プロセスも利用する。多くの酵素が、培養中の成長を促進するための、複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に関して有用であることは、当該技術分野において既知である。消化酵素は、弱い消化性（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、及び中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から、強い消化性（例えば、パパイン及びトリプシン）まで様々であり、市販されている。本明細書に適合する酵素の非網羅的なリストとしては、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼなど）、及びデオキシリボヌクレアーゼが挙げられる。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘液溶解活性から選択される酵素活性が、現時点で好ましい。例えば、コラゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離するために有用であることが既知である。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞凝集を最小限に抑えることができる。好ましい方法は、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼで、又はコラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼで、酵素処置することを伴う。特定の実施形態において、コラゲナーゼと中性プロテアーゼディスパーゼの混合物が、この分離する段階に使用される。より具体的な実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の少なくとも１つのコラゲナーゼ、並びにプロテアーゼ活性のディスパーゼ、及びサーモリシンのいずれかの存在下での消化を採用する。更に他の実施形態では、コラゲナーゼとディスパーゼ両方の酵素活性での消化を採用する。また、コラゲナーゼ活性及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含む方法も利用される。様々な組織源から細胞を単離するための、そのような多くの酵素処理が、当該技術分野において既知であることが、当業者には理解されるであろう。例えば、商標名ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）として販売されている組織解離用酵素配合物が、当該方法での使用に好適である。その他の酵素源が既知であり、当業者はまた、そのような酵素を、それらの天然源から直接取得することもできる。当業者は、更に、本発明の細胞を単離する際の有用性に関して、新たな、又は追加的な酵素若しくは酵素の組み合わせを評価するための設備を十分に備えている。好ましい酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、又は２時間以上の長さである。他の好ましい実施形態では、組織は、この解離する段階の酵素処理の間、３７℃でインキュベートされる。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態において、分娩後組織は、例えば、胎盤の新生児、新生児／母体、及び母体の態様などの、様々な組織の態様を含む切片へと分離される。次いで、分離された切片は、本明細書で説明される方法に従って、機械的解離及び／又は酵素的解離によって解離される。新生児系統又は母体系統の細胞は、当該技術分野において既知の任意の手段によって、例えば、Ｙ染色体に関する、核型分析又は原位置ハイブリダイゼーションによって、特定することができる。
【００７８】
分離された細胞、又はＵＴＣが由来する臍組織は、細胞培養を開始又は播種するのに使用することができる。細胞外マトリックス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（ネイティブ、変性、又は架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスタンパク質によりコーティングしていない又はコーティングした組織培養用滅菌容器に単離細胞を移入する。本明細書で開示する培養培地に加えて、ＵＴＣは、細胞の成長を維持することのできる任意の培養培地で培養することができ、これには例えば、ＤＭＥＭ（高又は低グルコース）、アドバンストＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ  ２０１、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、及び商標名ＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥ（Ｍｅｄｉａｔｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ．）として販売されている無血清／無媒体培地などが挙げられるが、これらに限定されない。培養培地は、例えば、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ又は２−ＭＥ）；１つ又は２つ以上の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；並びに、単独又は組み合わせのいずれかでの、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を制御するための１つ又は２つ以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を含む１つ又は２つ以上の成分で補充されてもよい。培養培地は、実施例で定義される成長培地を含んでもよい。
【００７９】
細胞は、細胞成長を可能にする密度で、培養容器中に播種される。好ましい実施形態では、細胞は、空気中約０〜約５容量％のＣＯ２で培養される。いくつかの好ましい実施形態では、細胞は、空気中約２〜約２５％のＯ２で、好ましくは、空気中約５〜約２０％のＯ２で培養される。細胞は、好ましくは、約２５〜約４０℃の温度で培養され、より好ましくは、３７℃で培養される。細胞は、好ましくは、インキュベーター内で培養される。培養容器内の培地は、静的状態とするか、又は例えばバイオリアクターを使用して攪拌することができる。ＵＴＣを、好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）成長させる。「低酸化ストレス」とは、フリーラジカルが培養した細胞に損傷を与えないか、又は損傷が最低限に抑えられる条件を指す。
【００８０】
最も適切な細胞培地、培地調製、及び細胞培養技術の選択方法は、当該技術分野において周知であり、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ及びＨｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），１９９１，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎを含む様々な出典に説明されており、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
単離された細胞又は組織断片を、十分な期間にわたって培養した後に、分娩後組織からの遊走、若しくは細胞分裂のいずれか、又は双方の結果として、ＵＴＣが増殖することとなる。本発明のいくつかの実施形態では、ＵＴＣは、継代され、又は、最初に使用されたものと同じタイプ、若しくは異なるタイプの新鮮培地を収容する、別個の培養容器に取り出され、その細胞の集団は、有糸分裂的に増殖することができる。本発明の細胞は、継代数０と老化との間の任意の時点で使用することができる。この細胞は、好ましくは、約３回〜約２５回継代され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代され、好ましくは、１０回又は１１回継代される。クローニング及び／又はサブクローニングを実行することにより、細胞のクローン集団が単離されていることを確認することができる。
【００８２】
特定の実施形態では、分娩後組織に存在する異なる細胞型が、亜集団に分画され、これらの亜集団からＵＴＣを単離することができる。分画又は選択は、分娩後組織をその成分細胞へと解離する酵素処理が挙げられるがこれに限定されない、細胞分離のための標準的技術を使用し、それに続いて、形態学的マーカー及び／又は生化学的マーカーに基づく選択；所望される細胞の選択的成長（正の選択）、不要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば大豆凝集素を使用するような、混合集団中での示差的な細胞凝集能（differential cell agglutinability）に基づく分離；凍結−解凍処理法；混合集団における細胞の示差的な接着特性；ろ過；従来型及びゾーン遠心分離；遠心エルトリエーション（対向流（counter-streaming）遠心分離）；単位重力分離；向流分布；電気泳動；及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられるがこれらに限定されない、特定の細胞型をクローニング及び選択することによって達成することができる。クローン選択及び細胞分離技術の概説に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９４，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００８３】
培養培地は、例えば、必要に応じて、例えばピペットで、皿から培地を慎重に吸引して、新鮮培地を補充することによって変更される。インキュベーションは、十分な数又は密度の細胞が皿内に蓄積するまで継続される。標準的技術を使用して、又はセルスクレーパーを使用して、元の外移植組織の切片を取り出し、残余の細胞をトリプシン処理することができる。トリプシン処理の後、細胞を収集して、新鮮培地に取り出し、上記のようにインキュベートする。いくつかの実施形態において、培地は、トリプシン処理の約２４時間後に、少なくとも１回交換して、あらゆる浮遊細胞を除去する。培養物に残存する細胞が、ＵＴＣであると考えられる。
【００８４】
とりわけ本発明の組成物を利用して、ＵＴＣを冷凍保存することができる。したがって、自家移入に関する（母又は子のいずれかに関する）ＵＴＣは、子供の誕生後に適切な分娩後組織から誘導して、次いで、それらのＵＴＣが後に移植に必要とされる事象で利用可能となるように、凍結保存することができる。
【００８５】
Ｂ．臍帯組織由来細胞の特性
ＵＴＣは、例えば、成長特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば、正常な核型；母性又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学及び／若しくは免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出のため）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び従来のＰＣＲ））、タンパク質配列、タンパク質分泌（例えば、プラズマ凝固アッセイ又はＰＤＣ−馴化培地の分析によって、例えば、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の尺度として）、並びに／又は当該技術分野において既知の他の方法によって特徴付けられ得る。
【００８６】
臍組織由来の好適なＵＴＣの例は、２００４年６月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０）に寄託されており、以下のＡＴＣＣアクセッション番号が割り当てられている：（１）菌株表示ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ；（２）菌株表示ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。
【００８７】
様々な実施形態では、ＵＴＣは、以下の成長特性のうちの１つ又は２つ以上を有する：（１）培養中に成長するためにＬ−バリンを必要とする、（２）約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含有する大気中での成長が可能である；（３）老化に到達する前に、培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力を有する；及び（４）コーティングされた、若しくはコーティングされていない組織培養容器上に付着して増殖し、このコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む。
【００８８】
特定の実施形態では、ＵＴＣは、その細胞が継代される際に維持される、正常核型を有する。核型分析に関する方法は、当業者に利用可能であり、既知である。
【００８９】
他の実施形態において、ＵＴＣは、（１）組織因子、ビメンチン、及びα平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生；（２）フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生を含む、特定のタンパク質の産生によって特徴付けることができる。他の実施形態では、ＵＴＣは、フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生の欠如によって、特徴付けることができる。組織因子、ビメンチン、及びα平滑筋アクチンのうちの少なくとも２つを産生する細胞が、特に好ましい。タンパク質組織因子、ビメンチン、及びα平滑筋アクチンの３つ全てを産生するような細胞が、より好ましい。
【００９０】
他の実施形態では、ＵＴＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫（melonoma）成長刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、及び腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質３のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に関して増加する遺伝子発現によって特徴付けることができる。
【００９１】
更に他の実施形態では、ＵＴＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、低身長感受性ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、α  Ｂ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２（disheveled associated activator of morphogenesis 2）；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステインリッチドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体、α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α  １；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；ヘファエスチン；インテグリン、β  ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様成長因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮想タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮想タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；並びにシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子に関して低減した遺伝子発現によって特徴付けることができる。
【００９２】
他の実施形態では、ＵＴＣは、培養されたとき、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ  ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌によって特徴付けることができる。加えて、ＵＴＣは、ＥＬＩＳＡにより検出されるような、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１Ａ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如によって特徴付けることができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＵＴＣは、血液を実質的に含まない臍帯組織由来であり、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、成長のためにＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素で成長することができ、かつ、培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む、コーティングされた又はコーティングされていない組織培養容器上での付着及び増殖、ビメンチン及びα平滑筋アクチンの産生、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生、並びに線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコードする遺伝子に関して増加する遺伝子発現の特性のうちの少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、そのようなＵＴＣは、ＣＤ４５及びＣＤ１１７を産生しない。
【００９４】
好ましい実施形態では、その細胞は、上記の成長特性、タンパク質／表面マーカーの産生特性、遺伝子発現特性、又は物質分泌特性のうちの２つ又は３つ以上を含む。これらの特性のうちの３つ、４つ、５つ又はそれ以上を含む細胞が、より好ましい。それらの特性のうちの６つ、７つ、又は８つ又はそれ以上を含むＵＴＣが、更により好ましい。上記の特性の全てを有する細胞が、現時点では更により好ましい。
【００９５】
いくつかの態様で本発明と共に使用するために、現時点で好ましい細胞は、とりわけ、上述の特性を有する分娩後細胞であり、より具体的には、それらの細胞が、正常核型を有し、継代で正常核型を維持するものであり、更には、それらの細胞が、マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現し、それらの細胞が、列記されたマーカーに対応する、免疫学的に検出可能なタンパク質を産生するものである。前述に加えて、フローサイトメトリーによって検出されるような、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかに対応するタンパク質も産生しないような細胞が、更により好ましい。
【００９６】
一実施形態では、ＵＴＣは、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。これらＵＴＣは、任意追加的に、酸化された低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／若しくは顆粒球走化性タンパク質を発現する、並びに／又はＣＤ３１若しくはＣＤ３４を発現しない、並びに／又はヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加する、並びに／又はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現する。
【００９７】
別の実施形態では、ＵＴＣは、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１３及びＣＤ９０を発現し、ＣＤ３４及びＣＤ１１７を発現しない。任意追加的に、これらの細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。更に別の実施形態では、細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ４４、及びＣＤ４３も発現する。代替的な実施形態では、細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ３１も発現しない。これらのＵＴＣは、任意追加的に、（ｉ）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／若しくは顆粒球走化性タンパク質を発現し、並びに／又は（ｉｉ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加する。
【００９８】
別の実施形態では、ＵＴＣは、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１３、ＣＤ９０、及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない。任意追加的に、これらの細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼも発現しない。一実施形態では、細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ４４、及びＣＤ４３も発現する。代替的な実施形態では、細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ３１も発現しない。これらのＵＴＣは、任意追加的に、（ｉ）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／若しくは顆粒球走化性タンパク質を発現し、並びに／又は（ｉｉ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加する。
【００９９】
代替的な実施形態では、ＵＴＣは、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、かつ以下の特性：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現すること、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ１１７を発現しないこと、並びに（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しないことを有する。代替的な実施形態では、ＵＴＣは、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、かつ以下の特性：（１）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現すること、（２）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ１１７を発現しないこと、（３）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しないこと、（４）酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／若しくは顆粒球走化性タンパク質を発現すること、並びに（４）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、若しくは腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していることを有する。
【０１００】
一実施形態では、ｈＵＴＣは、細胞集団として提供され、これらは同質であり得る。いくつかの実施形態において、細胞集団は、異種であり得る。本発明の異種細胞集団は、本発明のＵＴＣを少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％含み得る。本発明の異種細胞集団は、幹細胞、又は筋芽細胞若しくは他の筋肉前駆細胞、血管芽細胞若しくは血管前駆細胞などの他の前駆細胞を更に含み得るか、あるいは、完全に分化した骨格筋細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、又は血管内皮細胞を更に含み得る。いくつかの実施形態において、集団は、実質的に均質であり、即ち、実質的にＵＴＣのみ（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上のＵＴＣ）を含む。本発明の均質な細胞集団は、臍由来細胞からなる。臍由来細胞の均質な集団は、好ましくは、母体系統の細胞を含まない。細胞集団の均質性は、当該技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、又は既知の方法によるクローン増殖によって達成することができる。均質なＵＴＣ集団は、分娩後由来細胞のクローン細胞系を含み得る。
【０１０１】
更なる説明を行わずとも、当業者であれば、上記の説明及び以下の例示的な実施例を利用することで、本発明を行い及び使用し、特許請求される方法を実施することが可能であるものと考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであって、本開示の残りの記載をいかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１）
凍結培地の比較
臨床現場で使用するために、ヒト臍組織細胞（ｈＵＴＣ）は、冷凍保存及び細胞解凍ステップの間、高い細胞残存率を支持することができる培地製剤中で冷凍保存される必要がある。この実施例では、本発明の冷凍保存組成物の２つの実施形態間の比較を開示し、これらの組成物が冷凍保存及び細胞解凍ステップの間、高い細胞残存率を支持することができることを示す。表１−１は、この実施例で使用された組成物の配合を示す。
【０１０３】
【表２】
2019503181.tif 000004
【０１０４】
材料及び方法
細胞培養
ｈＵＴＣを、マイクロキャリアビーズ上で、バイオリアクター内で増殖した。ビーズを回収し、沈降させ、酵素消化によりｈＵＴＣをビーズから解離させた。解離した細胞を濃縮し、１０×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で最終的な冷凍保存製剤に製剤化した。異なる製剤における細胞のアリコートを抜き取り、表１−２に列記される凍結プロファイルを使用して、速度制御された冷凍機（ＧＤＫＲＹＯ  ７５０  ＰＬＵＳ−Ｆ−１１５）を使用して冷凍保存するための冷凍保存バイアル又は冷凍保存袋に移した。細胞を凍結させた後、液体窒素冷凍機に移し、使用するまで貯蔵した。
【０１０５】
表１−２に示される凍結プロファイルは、１℃／分で、４℃〜−４５℃でのサンプルの連続的な温度低下のチャンバ条件を記載する。凍結プロファイルは、溶液の結晶化が温度上昇を刺激する細胞溶液の凝固点付近で、かかる連続的な低下を示す必要がある。この温度上昇は細胞の生存率に影響し得る。このリスクは、−２５℃／分〜−５０℃の低温凍結チャンバ内のプログラムの急激な温度低下による過冷却及び後続の潜熱を最小限に抑えることによって低減される。下の表１−２は、チャンバプローブからの温度読み取り値を示し、これらの温度は、サンプルプローブ（最終凍結培地中に浸漬された）とは異なる。サンプルプローブは、これらの温度変化を受けない。
【０１０６】
【表３】
2019503181.tif 000005
【０１０７】
バイアル解凍
バイアルを液体窒素貯蔵冷凍機から取り出した後、試験のために実験室に輸送するためにドライアイス中に浸漬した。バイアルを、３７℃の予熱した水浴中で約２〜３分間急速に解凍した。１ｍｌの解凍した細胞懸濁液を遠心管に移し、９ｍｌの予備加温した成長培地（ＤＭＥＭ＋１５％  ＦＢＳ（ｖ／ｖ））を細胞計数のために添加した。１ｍｌの細胞懸濁液を取り出し、細胞計数のためにＣｅｄｅｘサンプルカップに配置した。次に、Ｃｅｄｅｘ細胞係数を行った。使用した方法はトリパンブルー排除である。ＶＣＤを使用して、生細胞数及び細胞生存率を評価した。
【０１０８】
結果
生細胞密度及び生存率
表１−３及び１−４に要約される結果は、液体窒素冷凍機中で最大２４ヶ月貯蔵したバイアルの解凍直後、有意な生細胞密度及びｈＵＴＣの生存率差異がなかったことを示す。
【０１０９】
【表４】
2019503181.tif 000006
【０１１０】
【表５】
2019503181.tif 000007
【０１１１】
解凍後の室温での細胞残存率
Ｇｕａｖａ（登録商標）上のＶｉａＣｏｕｎｔ（登録商標）を使用して、０（Ｔ０）、１（Ｔ１）、２（Ｔ２）、３（Ｔ３）、及び４（Ｔ４）時間の時間での解凍時の異なる時間での２つの製剤を評価した。製剤「Ｉ（改変）」中で凍結されたｈＵＴＣは、室温で４時間後、製剤Ｂ中で凍結された細胞よりも高い生細胞数を維持した。結果を表１−５及び図１に要約する。表１−５において、サンプルＩＤは、使用された製剤を指す（製剤Ｂ又は「Ｉ（改変）」）。
【０１１２】
【表６】
2019503181.tif 000008
【０１１３】
細胞回復率
Ｔフラスコ内での解凍時の細胞回復率は、製剤「Ｂ」及び「Ｉ（改変、低Ｃａ）」中で袋内で凍結された細胞から評価された。細胞を、Ｔ−７５フラスコに５０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。解凍後の細胞回復率を試験するために、８５％  ＤＭＥＭ＋１５％  ＦＢＳ（ｖ／ｖ）の成長培地を使用した。毎日、細胞を、ＴｒｙｐＬＥを用いてＴフラスコ表面から分離させ、ＣＥＤＥＸで計数した。
【０１１４】
図２及び表１−６は、細胞回復率の結果を示す。良好な回復傾向は、製剤Ｂと比較して、製剤のＩ（改変、低Ｃａ）中で凍結された細胞から観察された。
【０１１５】
【表７】
2019503181.tif 000009
【０１１６】
製剤の堅牢性
製剤「Ｂ」及び「Ｉ（改変、低Ｃａ）」中の主な選択された成分の作用は、冷凍保存中のｈＵＴＣの高いＶＣＤ及び生存率を維持するこれらの冷凍保存製剤の堅牢性を評価するために検討された。主な冷凍保護剤の濃度は、細胞冷凍保存に対する冷凍保護剤の作用を評価するために試験された（下の表１−７及び表１−８を参照されたい）。液体窒素蒸気相中に貯蔵されたｈＵＴＣは、解凍直後（Ｔ０）及び解凍２時間後（Ｔ２）の細胞生存率（下の表１−９及び図３を参照されたい）及び生細胞密度（下の表１−１０及び図４を参照されたい）を測定するために、標準操作手順を使用して解凍された。この実験からの結果は、製剤Ｂ及びＩが細胞生存性を維持することを確認した。生細胞密度は、試験された製剤に関して２時間維持された。表１−７、１−９、及び１−１０において、製剤Ｂ−１〜Ｂ−５は、ショ糖及びマンニトールの量が変化することを除いて、表１−１に列記される製剤Ｂの組成を有する。更に、表１−８〜１−１０において、製剤Ｉ−１〜Ｉ−１０は、ラクトビオン酸、ショ糖、マンニトール、及びグルタチオンの量が変化することを除いて、表１−１に列記される製剤改変Ｉの組成を有する。
【０１１７】
【表８】
2019503181.tif 000010
【０１１８】
【表９】
2019503181.tif 000011
【０１１９】
【表１０】
2019503181.tif 000012
【０１２０】
【表１１】
2019503181.tif 000013
【０１２１】
（実施例２）
毒性試験における冷凍保存製剤の安全性
緒言
「解凍及び注入」冷凍保存製剤は、細胞治療製品をレシピエントに送達するためのビヒクルとして使用することができる。解凍及び注入製剤の使用は、遠心分離、洗浄、及び細胞計数ステップを排除することによって、臨床現場における細胞の処理を減少させる。細胞療法製品の直接送達のためのビヒクルとして使用される冷凍保存製剤に関して、特定の投与経路に対する安全性を特徴付け、潜在的な有害効果を特定するために、毒性試験を行う必要がある。
【０１２２】
したがって、ラットにおける毒性試験が行われ、この試験では、冷凍保存溶液が、可能性のある細胞ビヒクルとして評価され、静脈内（ＩＶ）注入、又はクモ膜下（ＩＴ）及び大槽内（ＩＣＭ）経路を介する脳脊髄液への注射のいずれかにより投与された。
【０１２３】
浮腫及び肢発赤が、市販の冷凍保存液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０）を含有する冷凍保存製剤のＩＶ注入後のラットにおいて観察された。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０は、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する冷凍保存培地である。図５は、左側に対照ラット、及び右側に足に浮腫及び発赤を有する、ＣＳ１０を含有する製剤で処置されたラットを示す。一般的に使用される冷凍保存溶液成分の試験により、デキストランが肢に浮腫及び発赤を引き起こすと特定された。
【０１２４】
Ａ．ＩＶ注入後の冷凍保存組成物、及びｈＵＴＣを含有する冷凍保存組成物の非臨床安全性評価
この試験の目的は、（ｉ）冷凍保存組成物改変Ｉ（上記に開示される）、及び（ｉｉ）様々な量のヒト臍帯由来組織細胞（ｈＵＴＣ）が添加された冷凍保存組成物改変Ｉの静脈内毒性を評価することであった。
【０１２５】
８０匹の雄及び８０匹の雌の対照：ＣＤ（ＳＤ）ラットを、下の試験設計表に示されるように、１群当たりの性別当たり１６匹のラットの、５つの投与群（群Ｉ〜Ｖ）に無作為に割り当てた。追加の１８匹の雄及び１８匹の雌ラット（群ＩＩＩ〜Ｖに性別当たり６匹）を割り当て、試験の細胞曝露部分を確認した。試験品（改変Ｉ中のｈＵＴＣ）の懸濁液、生理食塩水対照、又はビヒクル（改変Ｉ）を、０（生理食塩水）、０（ビヒクル）、３×１０６細胞、１０×１０６細胞、及び３０×１０６の用量で、ＩＶ注入を介して１回投与した。投与容量は、０．１ｍＬ／分の注入速度で、群Ｉ、ＩＩ、及びＶに対しては３ｍＬ、群ＩＩＩに対して０．３ｍＬ、及び群ＩＶに対しては１ｍＬであった。試験設計を、下の表２−１に要約する。表２−１に関して、ビヒクルは改変Ｉである（上記の実施例１に開示される）。
【０１２６】
【表１２】
2019503181.tif 000014
【０１２７】
毒性試験設計
ビヒクル＋ｈＵＴＣ組成物は、１０×１０６細胞／ｍＬの公称濃度で冷凍保存された細胞を解凍し、細胞を、４０μｍ細胞フィルターを介してろ過することにより調製された。ろ過前及びろ過後に、細胞計数及び生存率を判定した。投与前にビヒクル及（改変Ｉ）及び細胞を室温に温め、４５分以内に使用した。
【０１２８】
ラットの生存率を毎日２回チェックする。臨床観測は、投与前、投与中、及び投与後、並びに投与期間後の間毎日記録された。用量投与日、並びに検死の前日及び検死日を含む投与後期間中少なくとも週に１回、体重を記録した。飼料消費量値を、少なくとも週に１回、及び検死の前日に記録した。用量投与前及び２８日目の安楽死の１週間以内に、全ラットに関して、獣医学眼科医により眼科検査を行った。
【０１２９】
予定された検死日に、各ラット（絶食）から安楽死直後に全血サンプルを下大静脈から回収し、血液学的評価、臨床生化学的評価、及び免疫応答評価のために処理した。検死前に全ラットから、評価のために尿サンプルを回収した。個々の器官の重量は、脳、肝臓、心臓、肺、左側の腎臓、及び脾臓、並びに組織病理学及びヒト細胞特異的ＰＣＲのための組織サンプルに関して記録された。
【０１３０】
試験の細胞曝露部分に割り当てられた全ラットは、用量投与１時間後又は２４時間後に安楽死され、肉眼検死が行われた。ヒト細胞特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の無菌技術を使用して、脳、肝臓、心臓、肺、腎臓、生殖腺（卵巣及び精巣）、及び脾臓の器官を回収した。
【０１３１】
細胞計数及び生存率は、解凍した細胞のバイアルをプールした後、投与製剤が解凍した細胞製剤を４０ミクロンフィルターを通してろ過することにより調製された後、及びＩＶ注入が完了した後に判定された。ろ過された投与製剤の平均細胞生存率は、投与中は変化せず、注入前及び注入完了後の両方で８９％であった。平均投与後細胞濃度は、投与前細胞濃度の８１％であった。
【０１３２】
結果：
３．０ｍＬの一定容量のビヒクル（改変Ｉ）のＩＶ注入、又は３０×１０６  ｈＵＴＣと同じ高用量での改変Ｉ（「ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣ）のｈＵＴＣのＩＶ注入による死亡は生じなかった。試験全体を通して、雄又は雌のラットにおいて、改変Ｉ又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの投与に関連する有害な臨床観測はなかった。
【０１３３】
全ての目視観測は、眼科検査において正常に見えた。改変Ｉ又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する、体重、体重増加、又は飼料消費量値の変化はなかった。
【０１３４】
血液学、臨床化学パラメータ、又は尿検査パラメータにおいて、生理食塩水対照、ビヒクル対照、及び改変Ｉ又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣ処置群間で、毒物学的に有意な差異はなかった。
【０１３５】
検死で、器官重量に対する改変Ｉ又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する巨視的な観測又は作用はなかった。雄及び雌のラットに関する最終体重及び器官重量、並びに脳及び最終体重対器官重量の比率は、一般的に、投与群の間で比較可能であった。改変Ｉ又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの投与に起因する組織病理学所見はなかった。
【０１３６】
ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣ処置群からの雄及び雌のラットからの全血清サンプルは、改変Ｉに対する血清抗体を含有した。生理食塩水及び改変Ｉ（ビヒクル）注射群からの血清サンプルは、検出可能なレベルの抗ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣ血清抗体を有さなかった。したがって、ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣは、雄及び雌のラットにおいて血清抗体応答を誘導し、この異種（ラットへのヒト細胞）モデルにおいて免疫原性と考えられる。
【０１３７】
ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣへの曝露は、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析の結果に基づいて確認された。大部分のビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣは、ＩＶ注入後すぐに肺において検出され、少なくとも２４時間残存した。肝臓、脾臓、及び心臓において１時間で検出されたビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣは、２４時間までに迅速にクリアされた。雄と雌のラット間でビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの数及び存続における差異は検出することができなかった。
【０１３８】
要約すると、３０×１０６細胞と同じ高用量でのビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣのＩＶ注入、又は３．０ｍＬの一定用量でのビヒクル（改変Ｉ）のＩＶ注入は、雄及び雌のラットにより十分に忍容され、死亡又は有害な臨床観測を生じなかった。目視での、又は体重、体重増加、若しくは飼料消費量に対する有害な眼科効果はなかった。尿検査、血液学、又は臨床化学パラメータにおいて、ビヒクル（改変Ｉ）又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する変化は観察されなかった。ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣは、主に、投与後最大２４時間、肺において見られた。この一過性の曝露は、ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに対する抗体を誘導するのに十分であった。検死で特定されたビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣ又はビヒクル（改変Ｉ）に関連する肉眼的病変はなかった。最終体重、器官重量、又は器官重量対最終体重若しくは脳重量の比率に対するビヒクル（改変Ｉ）又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの有害効果はなかった。
【０１３９】
Ｂ．ＩＣＭ注射後の冷凍保存組成物の非臨床安全性評価
この試験の目的は、４週間の観測期間中に、潜在的な遅延毒性を特定し、有害効果の可能性の存続及び／又は可逆性を特徴付けるために、ラットにおける大槽内への単一注入後のビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの潜在的な毒性を評価することであった。スプラーグドーリーラット（１５／性別／群）に、１×１０６又は３×１０６細胞の公称用量のビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣを投与し、対照ラットに、０．９％生理食塩水又はビヒクル（改変Ｉ）のいずれかを投与した。ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣ及びビヒクルの投与に関連する潜在的な急性効果、並びに分解能それぞれを特定するために、試験日（「ＳＤ」）の４日目及び２９日目に、検死が行われた。ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣへの曝露を確認し、潜在的な存続を評価するために、追加（サテライト）動物がこの試験に含まれた。
【０１４０】
ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣのバイアルを解凍し、ろ過せずに使用した。低用量で、投与製剤は、希釈せずに使用されたか、又は細胞濃度が１０±３×１０６の仕様を超えたときにビヒクル（改変Ｉ）中に希釈されたかのいずれかであった。投与に関して、高用量細胞を、遠心分離により濃縮し、元の容量の３分の１よりわずかに少ない改変Ｉに再懸濁した。細胞計数及び生存率が濃縮後に判定され、次いで、容量が、改変Ｉの添加により３０×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度に調整された。投与製剤の平均細胞生存率は、投与前は８９％であり、投与後は７８％であった。試験設計はＩＣＭに詳述される。試験設計を、下の表２−２に要約する。
【０１４１】
【表１３】
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【０１４２】
高用量のビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣで頭蓋皮膚病変からの分泌発生率がより高いことを除き、臨床徴候において、ビヒクル（改変）又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する死亡又は変化はなかった。体重パラメータ、飼料消費量、神経行動機能観測バッテリー評価、眼科検査、血液学、臨床化学、又は尿検査パラメータにおいて、ビヒクル（改変Ｉ）又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する変化はなかった。
【０１４３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析は、投与終了時に得た脳脊髄液サンプルにおいて、ヒト細胞の存在及びビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣへの曝露を確認した。試験日（ＳＤ）の４日目に、脳、並びに脊髄の頸部、胸部、腰部領域において、ヒト細胞が検出された。最大数の細胞が脳において発見されたが、投与された用量の３％未満が脳及び脊髄で検出され、血液中では細胞は検出されなかった。試験日（ＳＤ）の２９日目に得た血液、脳、又は脊髄組織サンプルにおいて、ヒト細胞は検出することができなかった。
【０１４４】
ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣは、両用量レベルでビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣを投与されたラットにおいて、ＳＤ  ２９日目にビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに対する抗体応答の存在を明らかにした血清分析の結果に基づいて免疫原性であった。全ての試験前血清サンプル、並びに試験日（ＳＤ）４日目及び２９日目の生理食塩水及びビヒクル対照（改変Ｉ処置）動物から得たサンプルは、改変Ｉに対する血清抗体を含有しなかった。
【０１４５】
死後、検死でのビヒクル（改変Ｉ）又はビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する器官重量変化又は肉眼的病変はなかった。しかしながら、組織病理学は、ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの両方の公称用量で、脳及び脊髄（頸部、胸部及び腰部）の髄膜においてビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに関連する所見を明らかにした。試験日（ＳＤ）４日目及び２９日目に安楽死させたラットにおいて認められた顕微鏡所見は、小血管の周囲に見られた、髄膜における単核球の存在又は蓄積を特徴とする、わずかな髄膜炎症性浸潤物と記載された。髄膜肥厚の病巣領域も認められた。
【０１４６】
要約すると、ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣの大槽内への単一注射は、死亡率、毒性の臨床徴候、又は臨床病態パラメータ若しくは神経行動評価に対する有害効果に関連しなかった。ビヒクル（改変Ｉ）＋ｈＵＴＣに対する抗体が発達し、単核細胞の持続的炎症性浸潤が髄膜において観察され、髄膜肥厚の病巣領域が≧１×１０６細胞の用量で観察された。免疫抗体応答及び髄膜観測は、ラットによる異種ヒト細胞に対する体液性及び細胞応答を表し得る。
【０１４７】
（実施例３）
低減されたＤＭＳＯ  ＦＢＣ／ＤＭＥＭ−ｌｉｔｅ
解凍された細胞懸濁液の直接投与は、全身投与を含む多くの用途に適している。証拠は、１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯを含有する製剤が冷凍保存中及び解凍後の細胞の生存性を支持することを示した。ＤＭＳＯは重要な冷凍保護剤であり、治療適応症において細胞及び組織の多くの冷凍保存用途に使用されてきた。ｈＵＴＣの生存性及び活性を支持する製剤が定義された。この製剤は、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの濃度を有する比較的高密度のｈＵＴＣ（１ミリリットル当たり１０００万）を含有し、高用量の細胞の静脈内投与が可能であり、かつ虚血性脳傷害からの損傷の軽減に有効であることが証明された。
【０１４８】
１０％  ＤＭＳＯ製剤は、細胞が静脈内投与されるものを含む多くの用途のための細胞投与に適している。しかしながら、一部の用途では、ＣＮＳ内などのいくつかの生物学的区画に細胞を投与するときに、ＤＭＳＯの量を低減することがより望ましい場合がある。いくつかの区画は、ＤＭＳＯに対してより感受性であり得るか、又はＤＭＳＯの拡散を制限し得る独特の構造及び性質を有し、その結果、それらの領域の組織が、ある有害反応を誘導し得るＤＭＳＯのレベルに曝露される可能性がある。
【０１４９】
分離した又はより小さい区画への投与を必要とし得る追加の適応症に対するｈＵＴＣの使用を見越して、より低いＤＭＳＯ濃度の冷凍保存製剤（例えば、上記の実施例１に開示される改変Ｉ系製剤）が冷凍保存を通してｈＵＴＣの生存性及び回復、並びに解凍後の安定性を支持するかを判定するために、一連のインビトロ試験が行われた。様々なレベルのＤＭＳＯ及び細胞濃度の一連の溶液において細胞を試験した。
【０１５０】
方法
ｈＵＴＣを、マイクロキャリアビーズ上で、バイオリアクター内で増殖した。マイクロキャリアビーズを沈降させることにより回収し、ｈＵＴＣを酵素消化によりビーズから解離させた。解離した細胞を遠心分離により回収し、生理食塩水で洗浄した。下の表３−１に概説されるように、細胞を合計９つの製剤に分配した。これらの懸濁液のアリコートを抜き取り、冷凍保存のために１ｍＬのバイアルに移した。サンプルを室温で約６０分間貯蔵し、その後、速度制御された冷凍機で凍結した。次に、凍結したサンプルを液体窒素デュワーに移し、貯蔵した。
【０１５１】
表３−１は、この試験において評価された冷凍保存製剤を示す。製剤は、ＦＢＣ／ＤＭＥＭ−ｌｉｔｅ製剤に基づき、その後、適切な濃度でＤＭＳＯが添加された。溶液は、最初の列に文字で表された。
【０１５２】
【表１４】
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【０１５３】
サンプルバイアルを貯蔵庫から取り出し、水浴中で迅速に解凍した。アリコートを取り出し、回復及び生存性がＧｕａｖａ（登録商標）Ｖｉａｃｏｕｎｔ（登録商標）及び計器により判定された。バイアルを室温で維持し、追加のアリコートを１５〜２０分間隔で取り出し、回復及び生存性がＧｕａｖａ（登録商標）計器で測定された。アリコートを取り出した時間を記録し、回復及び生存性の値を経時的にプロットした。
【０１５４】
生存性及び回復の結果は、製剤が冷凍保存を通して細胞生存性を支持し、解凍後の生存性を維持したことを示す。結果を図６に示す。結果は、全ての製剤が均等にｈＵＴＣの生存性を支持しなかったことを示す。１０％、７％、及び５％  ＤＭＳＯを含有した溶液に製剤化された細胞の生存性は類似した。最も低い生存性は、２％  ＤＭＳＯで観察された。これらの結果は、冷凍保護剤としてのＤＭＳＯの重要性を示す。
【０１５５】
（実施例４）
細胞の単離
臍細胞の単離。臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得た。それらの組織は、正常分娩後に得られたものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残渣を除去するために、この帯をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ  ０．２５μｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で洗浄した。次いで、それらの組織を、１５０ｃｍ２の組織培養プレート内で、５０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ−低グルコース又はＤＭＥＭ−高グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、組織が微細なパルプ状へと細断されるまで、機械的に解離させた。細断した組織を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した（チューブ１本当たり組織約５グラム）。
【０１５６】
次に、ＤＭＥＭ−低グルコース培地又はＤＭＥＭ−高グルコース培地（それぞれペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ  ０．２５μｇ／ｍｌを含む）のいずれか、及び消化酵素にて、細胞を消化した。いくつかの実験では、コラゲナーゼ及びディスパーゼの酵素混合物を使用した（「Ｃ：Ｄ」）（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５００Ｕ／ｍｌ、及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０Ｕ／ｍｌ）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコース中、Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ５００Ｕ／ｍｌディスパーゼ５０Ｕ／ｍｌ、及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）５Ｕ／ｍｌ）。これらの組織、培地、及び消化酵素を入れたコニカルチューブを、２２５ｒｐｍの軌道振盪器（Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ）内で、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１５７】
消化の後、１５０×ｇで５分間、組織を遠心分離して、上清を吸引した。ペレットを、２０ｍｌの成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ；規定のウシ胎児血清、ロット番号ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及びアンホテリシンＢ  ０．２５μｇ／ｍｌ（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから））中に再懸濁させた。細胞懸濁液を７０μｍのナイロン製ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮセルストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通してろ過した。成長培地を含む、追加の５ｍＬの洗液を、ろ過器に通過させた。次いで、細胞懸濁液を、４０μｍのナイロン製セルストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通過させ、続いて、追加の５ｍＬの成長培地ですすいだ。
【０１５８】
この濾液を、成長培地（総容積５０ｍｌ）中に再懸濁させ、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ｍｌの新鮮成長培地中に、細胞を再懸濁させた。このプロセスを、更に２回繰り返した。
【０１５９】
最終的な遠心分離の後に、上清を吸引して、５ｍｌの新鮮成長培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー染色を使用して、生存細胞の数を判定した。次いで、標準条件下で、細胞を培養した。
【０１６０】
臍帯組織から単離した細胞を、成長培地中、ゼラチンコーティングされたＴ−７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に、５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。２日後、消費した培地及び未付着の細胞を、フラスコから吸引した。ＰＢＳで付着細胞を３回洗浄して、残渣及び血液由来細胞を除去した。次いで、細胞に、成長培地を補充して、コンフルエンスまで成長させ（継代数０から約１０日）、継代数１とした。その後の継代（継代数１から継代数２へ、など）の際には、細胞は、４、５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に到達した。これらの後続の継代に関しては、細胞を５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞を、３７℃、二酸化炭素５％、かつ、加湿した培養器内で成長させた。
【０１６１】
いくつかの実験では、細胞は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、及びヒアルロニダーゼ（５Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）による消化後、ＤＭＥＭ−低グルコース培地において、分娩後組織から単離された。組織の消化及び細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化に関する説明と同様であったが、Ｃ：Ｄ又はＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥを使用する組織の消化は、分娩後組織から、容易に増殖する細胞集団の単離をもたらした。
【０１６２】
種々の酵素の組み合わせを使用して、臍帯から細胞を単離するための手順を比較した。消化に関して比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、及びｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれた。これらの異なる酵素消化条件を利用して、細胞単離の差異を観察した（表４−１を参照されたい）。
【０１６３】
種々の手法によって臍帯から細胞のプールを単離するために、他の試みを行った。一例では、臍帯を薄切りにして、成長培地で洗浄し、血餅及びゼラチン状物質を取り除いた。血液、ゼラチン状物質、及び成長培地の混合物を回収して１５０×ｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁し、ゼラチンコーティングされたフラスコ上の成長培地中に播種した。これらの実験から、容易に増殖する細胞集団が単離された。
【０１６４】
細胞はまた、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離されている。単離プロトコルは、Ｈｏらの国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２９９７１号に記載されるものを使用した。臍帯血（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ）のサンプル（それぞれ５０ｍｌ及び１０．５ｍｌ）は、溶解用緩衝液（フィルター殺菌済み１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ミリモルの重炭酸カリウム、ｐＨ７．２に緩衝された０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（全成分はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから））と混合された。１：２０の、臍帯血と溶解緩衝液との比率で、細胞を溶解させた。得られた細胞懸濁液を、５秒間ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を、遠心分離した（２００×ｇで１０分間）。細胞ペレットを、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）、４ｍＭグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する完全最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）中に再懸濁させた。再懸濁した細胞を、遠心分離して（２００×ｇで１０分間）、上清を吸引し、完全培地中で細胞ペレットを洗浄した。Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＮＹ））、Ｔ７５ラミニンコーティングフラスコ、又はＴ１７５フィブロネクチンコーティングフラスコ（双方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）内に、細胞を直接播種した。
【０１６５】
細胞集団が異なる条件下で単離され、単離直後に様々な条件下で増殖することが可能か否かを判定するために、上記の手順に従って、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を有する成長培地中、又は有さない成長培地中で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合わせを使用して、細胞を消化させた。全細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下において成長させた。全ての試験条件下で、細胞は、継代数０〜１の間において、良好に付着して増殖した（表４−２）。条件５〜８及び条件１３〜１６の細胞は、播種の後、継代数４まで良好に増殖することが実証され、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。
【０１６６】
Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせが、単離後の、最良の細胞収量をもたらし、他の条件よりも、多くの世代にわたって培養中に増殖する細胞を生じさせた（表４−１）。コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼを単独で使用しても、増殖可能な細胞集団は得られなかった。この結果が、試験したコラゲナーゼに特異的なものであるか否かを判定する試みは、行わなかった。
【０１６７】
【表１５】
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【０１６８】
細胞は、酵素消化及び成長に関して試験した全ての条件下で、継代数０〜１の間に、良好に付着して増殖した（表４−２）。実験条件５〜８及び実験条件１３〜１６の細胞は、播種の後、継代数４まで良好に増殖し、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。全細胞は、更なる分析のために凍結保存された。
【０１６９】
【表１６】
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【０１７０】
有核細胞が付着し、急速に増殖した。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって分析したところ、酵素消化によって得られた細胞と同様であった。
【０１７１】
これらの調製物は、赤血球及び血小板を含有するものであった。最初の３週間は、有核細胞が付着及び分裂することはなかった。播種の３週間後に、培地を交換したが、細胞の付着及び成長は観察されなかった。
【０１７２】
酵素併用コラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）及びヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を破壊する粘液溶解酵素）を効果的に使用して、臍組織から細胞集団を単離することができた。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの配合物であるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用することができる。コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ  Ｕ／ｇ）及びサーモリシン（１７１４カゼインＵ／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３もまた、細胞を単離するために、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック上の成長増殖培地中で培養した場合、多数回の継代にわたって、容易に増殖した。
【０１７３】
細胞はまた、臍帯内の残留血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着及び成長する、この組織から洗い流された血餅中の細胞の存在は、解剖プロセス中に細胞が遊離することによるものである可能性がある。
【０１７４】
（実施例５）
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いずれの汚染細胞型も含まない。細胞治療に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数（４６個）の染色体を有していなければならない。同種であり、かつ、非臍組織起源の細胞を含まない、臍由来細胞株を同定するために、細胞サンプルの核型を分析した。
【０１７５】
新生男児の分娩後組織由来のＵＴＣを、成長培地中で培養した。新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）との識別が可能となるように、新生男児由来の分娩後組織（Ｘ，Ｙ）が選択された。細胞を、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内の成長培地中に、５，０００細胞／平方センチメートルで播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞を収容するＴ２５フラスコは、首部分まで成長培地で充填した。臨床細胞遺伝学研究所に、急送便でサンプルを配送した（研究所間の推定輸送時間は、１時間である）。染色体分析は、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪに所在するＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより行われた。細胞は、染色体が最も良好に可視化される、分裂中期の間に分析された。計数した分裂中期の２０個の細胞のうち、５個の細胞を、正常な同種核型数（２）に関して分析した。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が同定されると、更なる分裂中期細胞を計数して、分析した。
【０１７６】
染色体分析に送られた全細胞サンプルは、細胞遺伝学研究所のスタッフによって、正常外見を呈していると解釈された。分析された１６の細胞株のうちの３つは、新生児起源及び母体起源の両方に由来する細胞の存在を示す、異種表現型（ＸＸ及びＸＹ）を呈した（表５−１）。各細胞サンプルは、均質であると特徴付けられた。（表５−１）。
【０１７７】
【表１７】
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【０１７８】
染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究所により解釈されると、核型が正常である臍由来ＵＴＣを同定した。核型分析はまた、同種核型により判断される、母体細胞を含まない細胞株も同定した。
【０１７９】
（実施例６）
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質又は「マーカー」の特性評価を用いて、細胞株の同一性を判定することができる。この発現の一貫性は、複数のドナーから、並びに種々の処理及び培養条件に曝された細胞において、判定することができる。臍から単離された分娩後細胞株を、フローサイトメトリーによって特徴付けることにより、これらの細胞株の同定に関するプロファイルが提供された。
【０１８０】
プラズマ処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内で、細胞をコンフルエンスまで成長培地中で培養した。２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、室温で２０分間インキュベートすることによって、これらのフラスコの成長表面をゼラチンでコーティングした。
【０１８１】
フラスコの付着細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＭＯ）中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）により分離された。細胞を採取して遠心分離し、１×１０７／ｍＬの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳに再懸濁した。製造業者の仕様書に従って、１００μｌの細胞懸濁液に、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を添加し、その混合物を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合抗体を除去した。５００μｌのＰＢＳ中に、細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）計器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して行った。
【０１８２】
表６−１に示される細胞表面マーカーに対する抗体を使用した。
【０１８３】
【表１８】
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【０１８４】
臍由来細胞を、継代数８、１５、及び２０で分析した。
【０１８５】
ドナー間の差異を比較するため、異なるドナーからの臍帯組織由来細胞を互いに比較した。また、ゼラチンコーティングされたフラスコ上で培養した臍由来細胞を、コーティングされていないフラスコ上で培養した臍由来細胞と比較した。
【０１８６】
細胞の単離及び調製に関して使用される、４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、及び４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを用いる処理によって、分娩後組織由来の細胞を比較した。
【０１８７】
フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０における臍帯由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、このことは、ＩｇＧ対照と比較しての蛍光の増大によって示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
【０１８８】
フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された臍帯由来細胞のそれぞれは、ＩｇＧ対照と比較しての蛍光値の増大に反映される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生について陽性を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
【０１８９】
ゼラチンコーティングされたフラスコ及びゼラチンコーティングされていないフラスコ上で増殖して、フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に関して陽性であり、ＩｇＧ対照と比較して増加した蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
【０１９０】
フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞の分析により、これらの細胞株の同一性が実証された。これらの臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であった。この同一性は、ドナー、継代数、培養容器の表面コーティング、消化酵素、及び胎盤の層を含む変数が変動しても、一貫していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均及び範囲には、ある程度の変動が観察されたが、全ての試験条件下での、全ての陽性曲線は正常であり、発現した蛍光値は、ＩｇＧ対照よりも大きく、それゆえ、これらの細胞が、マーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。
【０１９１】
（実施例７）
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞分析
オリゴヌクレオオチドアレイを使用して、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、繊維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析により、分娩後由来細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関する固有の分子マーカーが同定された。
【０１９２】
分娩後組織由来細胞。ヒト臍帯及び胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）より、患者の同意を得て、正常な満期分娩から得た。組織を受け取り、Ｃ：Ｄ：Ｈの混合物による消化後、実施例５に記述されるとおり、細胞を単離した。細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック製組織培養フラスコ上の成長培地中で培養した。この培養物を、５％のＣＯ２を使用して、３７℃でインキュベートした。
【０１９３】
線維芽細胞。ヒト皮膚線維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ、ロット番号９Ｆ０８４４）及びＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入した。双方の株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチック上で成長させた。
【０１９４】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）。ｈＭＳＣは、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ．、ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、及び２Ｆ１６５７）から購入し、製造業者の仕様書に従い、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。細胞を、５％のＣＯ２を使用して、３７℃で、標準的な組織培養プラスチック上で成長させた。
【０１９５】
ヒト腸骨稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）。ヒト腸骨稜の骨髄は、患者の同意を得て、ＮＤＲＩより受け取った。この骨髄を、Ｈｏら（国際公開第０３／０２５１４９号）によって概説される方法に従って処理した。この骨髄を、溶解緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、骨髄１部対溶解緩衝液２０部の比率で混合した。細胞懸濁液をボルテックスし、周囲温度で２分間インキュベートし、５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び４ｍＭグルタミンを補充した最小の必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた。これらの細胞を、再び遠心分離して、新鮮培地中に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルーブルー排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、生存単核細胞を計数した。単核細胞を、５×１０４細胞／ｃｍ２で、プラスチック製細胞培養フラスコ内に播種した。細胞を、標準大気Ｏ２又は５％  Ｏ２のいずれかで、５％のＣＯ２を使用して、３７℃でインキュベートした。培地を交換することなく、細胞を５日間培養した。５日間の培養の後、培地及び非付着細胞を除去した。付着細胞は、培養物中に維持された。
【０１９６】
活発に成長する細胞培養物を、低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、細胞スクレーパによってフラスコから除去した。細胞を、３００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去して、細胞を新しいＰＢＳ中に再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを直ちに凍結させて−８０℃で貯蔵した。細胞ｍＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡに転写した。次に、ｃＤＮＡをｃＲＮＡに転写して、ビオチンで標識した。ビオチン標識済みｃＲＮＡについて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション及びデータ収集は、製造業者の仕様書に従って実施した。「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピュータソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５１１６〜５１２１）を使用して、データ分析を行った。分析ソフトウェアのライセンスは、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙを通じて入手可能であり、詳細情報は、Ｄｅｐ’ｔ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＰｒｏｆｅｓｓｏｒ  ＴｉｂｓｈｉｒａｎｉのウェブサイトのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上から入手可能である。
【０１９７】
１４の異なる細胞集団を、この試験において分析した。これらの細胞を、継代情報、培養基質、及び培養培地と共に、表７−１に列記する。細胞株については、解析時の継代、細胞成長基質、及び成長培地と共に識別コードを列記した。
【０１９８】
【表１９】
2019503181.tif 000021
【０１９９】
データは、上述したＳＡＭソフトウェアによる主成分分析で評価した。分析により、試験対象の細胞において、異なる相対量で発現した２９０の遺伝子が明らかとなった。この分析により、集団間の相対比較がもたらされた。
【０２００】
表７−２は、細胞対の比較のために計算された、ユークリッド距離を示す。これらのユークリッド距離は、細胞型間で示差的に発現した２９０の遺伝子に基づく、細胞の比較に基づいたものであった。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現間で類似性と反比例している。ユークリッド距離は、細胞の種類ごとに異なる発現をした２９０の遺伝子を使用して、各種類の細胞について計算した。細胞間の類似性は、ユークリッド距離に反比例している。
【０２０１】
【表２０】
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【０２０２】
表７−３、表７−４、及び表７−５は、胎盤由来細胞内で増加した遺伝子の発現（表７−３）、臍帯由来細胞内で増加した遺伝子の発現（表７−４）、並びに臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞内で減少した遺伝子の発現（表７−５）を示す。
【０２０３】
【表２１】
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【０２０４】
【表２２】
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【０２０５】
【表２３−１】
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【０２０６】
【表２３−２】
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【０２０７】
表７−６、表７−７、及び表７−８は、ヒト線維芽細胞（表７−６）、ＩＣＢＭ細胞（表７−７）、及びＭＳＣ（表７−８）内で増加した遺伝子の発現を示す。
【０２０８】
【表２４】
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【０２０９】
【表２５】
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【０２１０】
【表２６】
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【０２１１】
本実施例は、臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞の分子の特性評価を提供するために実行された。この解析は、３つの異なる臍帯及び３つの異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。この試験はまた、皮膚繊維芽細胞の２つの異なる株、間葉系幹細胞の３つの株、及び腸骨稜骨髄細胞の３つの株も含んだ。これらの細胞により発現されｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブを含むＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにおいて、２２，０００の遺伝子について分析された。
【０２１２】
分析により、これら５つの異なる細胞型には、２９０の遺伝子の転写産物が異なる量で存在していることが明らかとなった。これらの遺伝子には、胎盤由来細胞内で特異的に増加した１０の遺伝子、及び臍帯由来細胞内で特異的に増加した７の遺伝子が含まれる。５４の遺伝子が、胎盤由来細胞及び臍帯組織由来細胞において、特異的に低い発現レベルを有することが分かった。
【０２１３】
（実施例８）
細胞表現型の免疫組織化学的特性評価
ヒト臍帯組織内に見出される細胞の表現型を、免疫組織化学的検査によって分析した。
【０２１４】
ヒト臍帯組織を採取し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに４℃で一晩浸漬固定した。次のエピトープに対する抗体を使用して（表８−１を参照されたい）、免疫組織化学を行った：ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０、ウサギに対して産生、Ｓｉｇｍａ、又は１：３００、マウスに対して産生、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、α平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。加えて、次のマーカーを試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。固定された検体を外科用メスを使用してトリミングし、エタノールを含有するドライアイス浴上の、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）内に配置した。次いで、凍結ブロックを、一般的クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片（厚さ１０μｍ）とし、染色のためにスライドガラス上に載置した。
【０２１５】
以前に行われた試験に類似した免疫組織化学を実施した。（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００３；１８４：８１６〜８２９）。組織の切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、１時間曝した。目的のエピトープが細胞表面（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）上に位置している場合には、エピトープの損失を防ぐために、この手順の全ての工程で、Ｔｒｉｔｏｎを省略した。更に、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、Ｎｏｇｏ−Ａ）に対して産生された場合には、手順全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で４時間にわたって、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、及び／又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）若しくはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にブロッキング剤を含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭ  ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
【０２１６】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって表された。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、階層モンタージュを準備した。
【０２１７】
【表２７】
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【０２１８】
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４マーカーは、臍帯内部に見出される細胞のサブセットで発現した（データは示していない）。具体的には、ｖＷＦ及びＣＤ３４の発現は、臍帯内部に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は、最内層（内腔側）に存在した。ビメンチンの発現は、臍帯のマトリックス及び血管の全域に見られた。ＳＭＡは、動脈並びに静脈の、マトリックス及び外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８及びデスミンは、血管内部のみに観察され、デスミンは、中層及び外層に限定された。
【０２１９】
これらのマーカーのいずれも、臍帯内部では観察されなかった（データ示さず）。
【０２２０】
ビメンチン、デスミン、α平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、ヴォン・ヴィレブランド因子、及びＣＤ  ３４は、ヒト臍帯内部の細胞内で発現する。ビメンチン及びα平滑筋アクチンのみが発現されることを示すインビトロ特徴付け試験に基づいて、データは、臍帯由来細胞を単離する本プロセスが細胞の亜集団を採取するものであること、又は単離した細胞がマーカーの発現を変化させてビメンチン及びα平滑筋アクチンを発現することを示唆している。
【０２２１】
（実施例９）
栄養因子の分泌
選択された栄養因子のＵＴＣからの分泌を測定した。血管新生活性を有する因子、例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，１９９７；２１２：２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０００；９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３；１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２００４；７７：８１２〜８）、マトリックスメタロプロテアーゼ１の組織阻害物質（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ストロマ由来因子１α（ＳＤＦ−１α）、神経栄養／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００３；２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング成長因子β２（ＴＧＦβ２））、又はケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）、単球化学誘引物質−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）、Ｉ３０９；胸腺及び活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、及び（ＩＬ−８）が選択された。
【０２２２】
臍帯由来の細胞、並びにヒト新生児包皮由来のヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ上の成長培地において培養した。継代数１１で、細胞を凍結保存し、液体窒素中で保存した。細胞の解凍後、それらの細胞に成長培地を添加し、その後、１５ｍＬ遠心管に移して、１５０×ｇで５分間、それらの細胞を遠心分離した。４ｍＬの成長培地中に、細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を計数した。細胞を、それぞれ１５ｍｌの成長培地を含有するＴ７５フラスコ内に５，０００細胞／ｃｍ２で播種し、２４時間培養した。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ））に変えて、８時間培養した。インキュベーションの終了時に、１４，０００×ｇで５分間遠心分離して無血清馴化培地を回収し、−２０℃で保存した。
【０２２３】
各フラスコ内の細胞数を推算するため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して分離した。８ｍｌの成長培地の添加によって、トリプシン活性を抑制した。これらの細胞を、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの成長培地中に、細胞を再懸濁させた。細胞数は、血球計数器によって推算した。
【０２２４】
細胞を、５％  ＣＯ２及び大気酸素下で、３７℃で成長させた。各細胞サンプルによって産生された、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−β２の量を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｎ．）によって判定した。全てのアッセイは、製造業者の説明書に従って行われた。提示された値は、１ｍｌごと、細胞１００万個ごとのピクトグラムである（ｎ＝２、ｓｅｍ）。
【０２２５】
ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、及び血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）を、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔプロテオームアレイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を使用して測定した。このプロテオームアレイは、ウェル当たり２〜１６のタンパク質を定量測定するための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各ウェル内に、２×２、３×３、又は４×４パターンの、４〜１６の異なる捕捉抗体をスポットすることによって産生される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後に、プレート全体を画像化して、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された、化学発光シグナルを捕捉する。各スポット内で生成されるシグナルの量は、元の標準又はサンプル中の、標的タンパク質の量に比例する。
【０２２６】
ＭＣＰ−１及びＩＬ−６は、臍由来ＰＰＤＣ及び皮膚繊維芽細胞によって分泌された（表９−１）。ＳＤＦ−１α及びＧＣＰ−２は、線維芽細胞によって分泌された。ＧＣＰ−２及びＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣによって分泌された。ＴＧＦ−β２は、いずれの細胞型においても、ＥＬＩＳＡによって検出されなかった。
【０２２７】
【表２８】
2019503181.tif 000031
【０２２８】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣから分泌された（表９−２及び表９−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、又はＰＤＧＦｂｂは検出されなかった。
【０２２９】
【表２９】
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【０２３０】
【表３０】
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【０２３１】
臍由来細胞は、多数の栄養因子を分泌した。ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、及びＩＬ−８などの、これらの栄養因子のうちの一部は、血管新生において重要な役割を果たす。ＢＤＮＦ及びＩＬ−６などの他の栄養因子は、神経再生又は保護に重要な役割を果たす。
【０２３２】
（実施例１０）
テロメラーゼ活性の分析
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する（Ｌｉｕ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９９；９６：５１４７〜５１５２）。テロメラーゼは、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の２つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写によって決定される。ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡに関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、それゆえ、細胞のテロメラーゼ活性を判定するための容認された方法である。
【０２３３】
細胞単離
リアルタイムＰＣＲ実験を実施して、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生を評価した。ヒト臍帯組織由来細胞は、上記実施例及び米国特許第７，５１０，８７３号に記載の実施例に従って調製した。全般的には、正常な分娩後の、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。次いで、その組織を、培養培地中、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、３７℃でインキュベートした。ヒト臍帯組織由来細胞は、‘０１２号特許出願の実施例に記載の方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び正常真皮線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット番号９Ｆ０８４４）をＣａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から得た。多能性ヒト精巣胎児癌（奇形腫）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２  ｃｌ．Ｄｌ）（Ｐｌａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００６；２４（３）：５３１〜５４６を参照されたい）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）から購入し、米国特許第７，５１０，８７３号に記載される方法に従って培養した。
【０２３４】
総ＲＮＡの隔離
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。ＲＮＡを、５０μｌのＤＥＰＣ処理済み水で溶出し、−８０℃で貯蔵した。ランダムヘキサマーと、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）とを使用し、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＲＮＡを逆転写した。サンプルを、−２０℃で保存した。
【０２３５】
リアルタイムＰＣＲ
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても既知）を、製造業者の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼに関してアッセイするために、広く使用される。簡潔には、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）及びヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）を、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを使用して、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータを、製造業者の仕様書に従って分析した。
【０２３６】
ヒト臍由来細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、及び間葉系幹細胞を、ｈＴｅｒｔ及び１８Ｓ  ＲＮＡに関して分析した。表１０−１に示されるように、ｈＴｅｒｔ、よってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞内では検出されなかった。
【０２３７】
【表３１】
2019503181.tif 000034
【０２３８】
ヒト臍帯組織由来細胞（単離株０２２８０３、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）及びｎＴｅｒａ−２細胞を分析し、結果は、ヒト臍帯組織由来細胞の２つのロットはテロメラーゼの発現を示さなかったが、一方で、テラトーマ細胞株は、高レベルで発現することが明らかとなった（表１０−２）。
【０２３９】
【表３２】
2019503181.tif 000035
【０２４０】
したがって、本発明のヒト臍組織由来細胞は、テロメラーゼを発現しないということを、結論付けることができる。
【０２４１】
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される全ての参照文献、特許及び特許出願は、それらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
【０２４２】
〔実施の態様〕
（１）  臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物であって、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、
Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、
塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、
塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩と、
ＤＭＳＯ、ラクトビオン酸、グルタチオン、デキストロース、ショ糖、及びマンニトールと、を含む、組成物。
（２）  前記組成物が、
少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約２６２．８ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約４７．１６ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約６５．７９ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約１３．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約２９．７ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約１８．９ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約４２．７５  ５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、少なくとも約７．２ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び４１．８５ｍｇ／ＬのＬ−バリンと、
少なくとも約０．１８ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約１．８ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々と、
少なくとも約４３２ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、約２５６５ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、約２８８０の塩化ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５６．２５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏ、少なくとも約３．２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、少なくとも約４５８ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、少なくとも約２２５ｍｇ／Ｌの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び少なくとも約６１２ｍｇ／Ｌの一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）と、
約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約８５５ｍｇ／Ｌのデキストロース、少なくとも約４１５ｍｇ／Ｌのグルタチオンと、少なくとも約３０８１ｍｇ／Ｌのショ糖及び少なくとも約１６３９ｍｇ／Ｌのマンニトールと、を含む、実施態様１に記載の組成物。
（３）  臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物であって、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、
Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、
塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、
ＤＭＳＯ、デキストロース、ショ糖、及びマンニトールと、を含む、組成物。
（４）  前記組成物が、
少なくとも約７５．６ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約５２５．６ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−グリシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約９４．３２ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約１３１．５８ｍｇ／ＬのＬ−リジン，ＨＣｌ、少なくとも約２７ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約５９．４ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約３７．８ｍｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約８５．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、１４．４ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、及び少なくとも約８３．７ｍｇ／ＬのＬ−バリンと、
少なくとも約０．３６ｍｇ／Ｌのリボフラビン、並びに少なくとも約３．６ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、及びチアミンのビタミン各々と、
少なくとも約３６０ｍｇ／Ｌの塩化カリウム，ＵＳＰ、少なくとも約３３３０ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、少なくとも約５７６０ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及び少なくとも約１１２．５ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏと、
約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、少なくとも約９００ｍｇ／Ｌのデキストロース、少なくとも約６１６０ｍｇ／Ｌのショ糖、及び少なくとも約３２４０ｍｇ／Ｌのマンニトールと、を含む、実施態様３に記載の組成物。
（５）  前記組成物が、ラクトビオン酸、グルタチオン、並びに、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩を含まない、実施態様３に記載の組成物。
【０２４３】
（６）  臍帯組織由来細胞の冷凍保存のための組成物であって、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン，ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンのアミノ酸と、
Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン，ＨＣｌ、リボフラビン、及びチアミン，ＨＣｌのビタミンと、
塩化カリウム，ＵＳＰ、重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ、塩化ナトリウム，ＵＳＰ、及びリン酸ナトリウム，一塩基性，Ｈ２Ｏの無機塩と、
塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、及び一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の無機塩と、
約５〜約１０％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、約１２，０００〜約２０，０００ｍｇ／Ｌのラクトビオン酸、約３２９〜約４９５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、デキストロース、約２４６０〜約３６９５ｍｇ／Ｌのショ糖、及び約１３１０〜約１９６７ｍｇ／Ｌのマンニトールと、を含む、組成物。
（７）  前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、実施態様１に記載の組成物。
（８）  前記臍帯組織由来細胞が、以下の特性：
酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、
ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、
ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びに
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施態様７に記載の組成物。
（９）  実施態様１に記載の組成物及び臍帯組織由来細胞を含むキットであって、前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、キット。
（１０）  実施態様３に記載の組成物及び臍帯組織由来細胞を含むキットであって、前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、キット。
【０２４４】
（１１）  実施態様６に記載の組成物及び臍帯組織由来細胞を含むキットであって、前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、キット。
（１２）  前記臍帯組織由来細胞が、以下の特性：
酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、
ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、
ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びに
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施態様１１に記載のキット。
（１３）  ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
実施態様１に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
（１４）  前記方法が、前記冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の前記開始温度を約１５分間維持することを更に含む、実施態様１３に記載の方法。
（１５）  ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
実施態様２に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【０２４５】
（１６）  前記臍帯組織由来細胞が、以下の特性：
酸化低比重リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現すること、
ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと、
ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること、並びに
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０を発現すること、のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
実施態様３に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
（１８）  前記方法が、前記冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の前記開始温度を約１５分間維持することを更に含む、実施態様１７に記載の方法。
（１９）  ヒト臍帯組織由来細胞を冷凍保存する方法であって、
実施態様６に記載の冷凍保存のための組成物及び臍帯組織由来細胞を含む製剤を提供することと、
前記冷凍保存組成物を、約４℃の開始温度から−１．０℃／分の速度で、前記組成物が約−４５．０℃の温度に到達するまで冷却することと、
前記冷凍保存組成物を、前記組成物が約−１２０．０℃の貯蔵温度に到達するまで更に冷却することと、を含み、
前記臍帯組織由来細胞が、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、培養下で自己再生及び増殖が可能であり、分化の可能性を有し、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生がなく、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない、方法。
（２０）  前記方法が、前記冷凍保存組成物を約４℃の開始温度まで冷却し、かつ／又は約４℃の前記開始温度を約１５分間維持することを更に含む、実施態様１９に記載の方法。
【０２４６】
（２１）  前記組成物が、約−４５．０℃の前記製剤の凝固点付近で発熱反応を生じ、前記方法が、前記冷凍保存組成物を、約−４５．０℃の温度で、−２５．０℃／分の速度で、前記組成物が約−５０．０℃の温度に到達するまで冷却することを更に含む、実施態様１９に記載の方法。
【図１】
2019503181.tif 000036
【図２】
2019503181.tif 000037
【図３】
2019503181.tif 000038
【図４】
2019503181.tif 000039
【図５】
2019503181.tif 000040
【図６Ａ】
2019503181.tif 000041
【図６Ｂ】
2019503181.tif 000042
【国際調査報告】
2019503181.tif 000043
2019503181.tif 000044