(57)【要約】  ナノダイヤモンド粒子、及び、検体の検出及び定量のためのナノダイヤモンド粒子といった関連する装置及び方法が、一般的に述べられる。ある実施形態において、該装置は、複数のナノダイヤモンド粒子、及び該ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の化学種を含む。ある実施形態において、該複数のナノダイヤモンド粒子は、検体を含む疑いのあるサンプルに曝露され得る。ある場合において、検体は、該サンプル中における検体の存在が検出され得るように、該化学種と結合し得る。ある実施形態において、この本文で述べられる、装置、システム、及び方法は、例えば、診断目的で被験者より得られたサンプル中における検体の検出に有益である。ある場合において、この本文で述べられる、該システム、装置、及び方法は、病気又は体調の診断、予防、処置、及び／又は管理に有益であり得る。例となる実施形態において、この本文で述べられる、そのようなシステム、装置、及び装置は、被験者及び／又は該被験者から得られるサンプル中におけるウィルス（例えば、エボラ）の存在の検出及び／又は定量に有益であり得る。
2019533005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤が、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドと化学的に結合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む、診断薬。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ディスインテグリンである、請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
前記薬剤が、前記ナノダイヤモンド粒子本来の性質の結果として、蛍光性である、請求項１に記載の診断薬。
【請求項４】
前記試薬が、電磁気源により励起された際、検出可能な電磁気的シグナルを放出する、請求項１に記載の診断薬。
【請求項５】
前記蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び前記ポリペプチドが、共有結合している、請求項１に記載の診断薬。
【請求項６】
血栓塞栓事象の診断又は予後診断の方法であって、該方法が、
血栓塞栓事象を罹患していた又はそのリスクにある疑いがある被験者に、請求項１に記載の診断薬を診断に効的な量、投与する工程、
該診断薬が十分な時間、血栓部位（複数有り）に局在化させる工程、及び
該診断薬の蛍光放出を検出することで該診断薬を検出する工程
を含む方法。
【請求項７】
活性血小板の検出方法である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象者の血栓又は血栓の形成の検出方法である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
血栓の検出についての診断方法における使用のための、分配、運搬、及び／又は貯蔵に適した詰め合わせの形の、請求項１に記載の診断薬
を含むキット。
【請求項１０】
前記診断薬の分配、運搬、及び／又は貯蔵に適した材料をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
詰め合わせの組み合わせで、１つ以上の、対象者への前記診断薬の投与のための試薬又は装置をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
前記診断薬へ励起エネルギーを放出する装置をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記励起エネルギーを放出する装置が、前記診断薬由来の放出応答を検出するための検出器をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記装置が、手持ち式装置である、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
サンプル注入口、
該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、
該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、及び
該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域
を含む、流体装置。
【請求項１６】
前記検出領域と流体的に連通している制御領域であって、該制御領域が、該制御領域と結合した複数の第３の化学種をさらに含む、請求項１５に記載の流体装置。
【請求項１７】
複数の第１の化学種及び複数の第２の化学種が、各々、検体と結合するよう配置されている、請求項１５に記載の流体装置。
【請求項１８】
前記第３の化学種が、前記第１の化学種と結合することが可能である、請求項１６に記載の流体装置。
【請求項１９】
前記蛍光性ナノダイヤモンド粒子が、２５０ｎｍより大きい又は等しい及び１０００ｎｍより小さい又は等しい波長の放出を有する、先行するいずれかの請求項に記載の流体装置。
【請求項２０】
前記制御領域と流体的に連通している吸収領域をさらに含む、先行するいずれかの請求項に記載の流体装置。
【請求項２１】
請求項１５に記載の２つ以上の流体装置を含むシステム。
【請求項２２】
前記流体装置が、ラテラルフローアッセイ装置である、先行するいずれかの請求項に記載の流体装置。
【請求項２３】
サンプル注入口、
該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、
該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、
該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域、及び
該検出領域で蛍光放出を定量するよう配置されている検出器
を含む、システム。
【請求項２４】
サンプル注入口、
該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、
該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、
該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域、及び
該検出領域で赤外シグナルを定量するよう配置されている検出器
を含む、システム。
【請求項２５】
検体を含む疑いのあるサンプルを流体装置の流体チャネルへ導入すること、
該検体が存在する場合、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種の少なくとも一部分と結合するよう、該サンプルを複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に曝露すること、
該検体と結合していないすべての蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び化学種を除くこと、及び
該検体と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を定量すること、
を含む方法。
【請求項２６】
サンプル中に存在する検体の量が、蛍光放出の強度が関係している、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
特定の検体を含む疑いを有する被験者に、化学種が、存在する場合、該検体と結合し得るよう、化学種と結合した複数のナノダイヤモンド粒子を投与する工程、及び
存在する場合、該検体と結合した化学種を含む、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を検出する工程
を含む方法。
【請求項２８】
蛍光放出の強度の定量を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
蛍光放出を検出することが、被験者における血栓の存在を示唆する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
蛍光放出を検出することが、被験者におけるウイルスの存在を示唆する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学種が、エボラウィルスと結合することが可能である、先行する請求項のいずれかに記載の流体装置、システム、又は方法。
【請求項３２】
前記ディスインテグリンが、ビチスタチンである、請求項１に記載の診断薬。
【請求項３３】
前記化学種が、ディスインテグリンである、請求項１５に記載の流体装置。
【請求項３４】
ヒト又はヒト以外の動物における血栓塞栓事象の検出のための診断薬であって、該薬剤が、ディスインテグリンビチスタチン（Ｂｔ）と化学的に結合している、蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む、診断薬。
【請求項３５】
前記薬剤が、前記ダイヤモンド粒子の本来的な性質の結果として蛍光性である、請求項３４に記載の診断薬。
【請求項３６】
電磁気源により励起された際、前記薬剤が、検出可能な電磁気的シグナルを放出する、請求項３４に記載の診断薬。
【請求項３７】
前記蛍光性ナノダイヤモンド粒子、及び前記Ｂｔが共有結合している、請求項３４に記載の診断薬。
【請求項３８】
血栓塞栓事象の診断又は予後診断のための方法であって、該方法が、
血栓塞栓事象を罹患していた又はその疑いのある被験者へ請求項３４に記載の診断薬を診断的に効果のある量で投与する工程、
該診断薬を十分な時間、血栓の場所（複数有り）に局在化させる工程、及び
該診断薬の蛍光放出を検出することで診断薬を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
血小板の検出方法である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
被験者における血栓又は血栓の形成を検出する方法である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
血栓の検出のための診断法における使用のための分配、運搬、及び／又は貯蔵に適した詰め合わせの形の請求項３４に記載の診断薬を含む、キット。
【請求項４２】
前記診断薬の分配、運搬、及び／又は貯蔵に適した材料をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
詰め合わせの組み合わせで、被験者への前記診断薬の投与のための１つ以上の試薬又は装置をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記診断薬に対し、励起エネルギーを放出する装置を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４５】
励起エネルギーを放出する前記装置が、前記診断薬からの放出応答を検出する検出器をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４６】
前記装置が手持ち式装置である、請求項４４又は４５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
検体の検出及び／又は定量のためのナノダイヤモンド粒子といった、ナノダイヤモンド粒子及び関連する装置及び方法が、一般的に述べられる。さらに、本発明は、医学及び獣医学的診断及び処置の分野に関する。より具体的には、本発明は、血小板及び血栓の検出に特有の診断薬、ツール、及びシステムに関する。さらに、本発明は、種々の病気及び外傷性条件における体内の出血部位の検出に関する。
【０００２】
本出願は、米国特許法第１１９条の下、２０１６年９月６日に出願された、『ヒト及び動物用薬における血栓の診断及び処置のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子（Ｆ−ＮＤＰ）のエンジニアリング及び有用性』という表題の米国特許仮出願第６２／３８３，０６５７号、及び２０１７年６月１９日に出願された、『ナノダイヤモンド粒子及び関連する装置及び方法』という表題の米国特許仮出願第６２／５２２，０３６号に対する優先権を主張し、それらはすべての目的に関し、参照によりこの本文にそのまま組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
脳卒中及び心臓発作といった心臓血管の病気は、先進国において主たる致死の原因である。脳卒中及び心臓発作に由来する死は、専ら、脳及び心臓血管に形成された血栓（ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｓ）（ｔｈｒｏｍｂｉ）又は離れた血管（例えば、末梢静脈システム、心房付随物）中に形成された血栓と関連する血栓塞栓事象（ＴＥＥ）の結果である。致命的なＴＥＥ（例えば、アテローム性動脈硬化血管病）に寄与するいくつかの因子がよく知られているが、ＴＥＥの前兆として未だ入念に検査が行われていない因子はもちろんのこと、特定の評価における明確な『診断及び予後診断ギャップ』、及び既知のリスク因子を有する個人に『全血栓負荷』が存在する。相変わらず、脳卒中又は心臓発作につながる血流閉塞の結果の臨床的説明では、ＴＥＥの原因を捜索する医学的調査が正確に要求される。そうした調査は大部分、血管造影法、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ及び超音波といった、病院ベースのイメージング試験である。現在の技術は、脳卒中及び心臓発作の時宜にかなった、上手な管理にとって重要であるが、いくつかの重要な限定する要因が対処されるべきである。第１に、一般の人々、特に心臓血管のリスクを有している年配の人々は、しばしば血管中の血栓を評価する病院ベースの技術の利用が限られている。第２に、病院においてさえも、これらのイメージング技術の利用は、試験及び専門家による評価と関連した、ある時間的要求を有する。事件の発生から処置ウィンドウが３〜４．５時間に限られている脳卒中の場合において、しばしば処置のための重要なウィンドウを失う程度にまで、多くの時間が、血栓溶解処置に関する患者の適格性を確立するのに費やされる。
【０００４】
他方の端において、心房微細化（慢性、再発性）といった心臓不整脈の診断がなされると、心室において血栓が未知であっても、ＴＥＥのリスクにより抗凝固剤での長期的な処置が命じられる。ＴＥＥリスクの主要な診断ギャップを提示する例がほとんどなく、それらは早期の診断及び予防的尺度がないためにしばしば致命的な結果となる。容易かつ広く利用でき、手頃な料金の、外来治療での全身の血栓負荷又はＴＥＥリスクの早期の評価が必要とされている。
【０００５】
さらに、ラテラルフローアッセイといった免疫クロマトグラフィーアッセイが、一般的に、サンプル中の抗原といった検体の存在又は非存在を検出するのに使用される。しかしながら、そのような分析法は、一般的に、自動化処理、正確な定量法を欠いており、ある場合においては、主観的解釈が要求される可能性があり、偽陽性及び／又は偽陰性という結果につながる。
【０００６】
したがって、改善された装置及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
ナノダイヤモンド粒子、及び検体の検出及び／又は定量のためのナノダイヤモンド粒子（例えば、蛍光性ナノダイヤモンド粒子）のような関連する装置及び方法が、一般的に述べられる。本発明の主題は、ある場合において、相互に関連する製品、特定の問題に対する代替解決策、及び／又は１つ以上のシステム及び／又は物品の複数の異なる使用を含む。
【０００８】
１つの態様において、診断薬が提供される。ある実施形態において、該診断薬は、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドと化学的に結合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む。
【０００９】
別の態様において、流体装置が提供される。ある実施形態において、該流体装置は、サンプル注入口、該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域、及び該検出領域と流体的に連通している制御領域であって、該制御領域と結合した複数の第３の化学種を含む制御領域を含む。
【００１０】
さらに別の態様において、システムが提供される。ある実施形態において、該システムは、サンプル注入口、該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域、及び該検出領域で蛍光放出を定量するよう配置された検出器を含む。
【００１１】
ある実施形態において、該システムは、サンプル注入口、該注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、該複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域、及び該検出領域で赤外シグナルを定量するよう配置されている検出器を含む。
【００１２】
さらに別の態様において、方法が提供される。ある実施形態において、該方法は、流体装置の流体チャネルへ検体を含む疑いのあるサンプルを導入すること、該サンプルを、検体が存在した場合、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種の少なくとも一部と結合するよう、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に曝露すること、該検体と結合していないいかなる蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び化学種を除くこと、及び該検体と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を定量すること、を含む。
【００１３】
ある実施形態において、該方法は、特定の検体を含む疑いのある被験者（例えば、ヒト、ほ乳類）に、検体が存在した場合、化学種が検体と結合し得るよう、化学種と結合した複数のナノダイヤモンド粒子を投与する工程、及び、存在した場合、検体と結合した化学種を含む複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出を検出する工程を含む。
【００１４】
本発明の他の利点及び新規特徴は、添付の図と併せて考慮した際、以降の本発明の種々の限定されない実施形態の詳細な説明より明らかとなる。本明細書及び参照により組み入れられる文書が、競合する及び／又は矛盾する開示を含む場合には、本明細書が支配するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の限定されない実施形態は、添付の図を参照して、実施例により示されることとなるが、それらは概要的なもので、基準に描かれることは意図していない。図において、示されているのと同一又はほぼ同一の各要素は、典型的には、単独の数字で表される。明確のため、図ごとに要素ごとにラベルしてはおらず、本発明の各実施形態の要素ごとにも、当業者に発明を理解させるために図が必要ない箇所においては、示していない。図において、
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態の１つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施形態の１つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施形態の１つのセットによる、検体の検出のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施形態の１つのセットによる、検体を含む疑いのあるサンプルの導入する上での、検体の検出のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施形態の１つのセットによる、検体を含む疑いのあるサンプルの導入した上後の、検体の検出のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含むシステムの略図である。
【図３】図３は、実施形態の１つのセットによる、ヒトＩｇＧのような化学種で機能化された、例となる蛍光性ナノダイヤモンド粒子の略図である。
【図４】図４は、実施形態の１つのセットによる、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器を含む、例となるシステムの写真である。
【図５】図５は、実施形態の１つのセットによる、種々の濃度での蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合したヒトＩｇＧの検出の、対対照（牛血清アルブミン（ＢＳＡ））の、半ＥＬＩＳＡのプロットである。
【図６】図６は、実施形態の１つのセットによる、頸動脈血栓中、ビチスタチンで機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子の定量の、対ラット中の対照血管の、プロットである。
【図７Ａ】図７Ａは、実施形態の１つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子が導入された発生した血栓を伴うラット（複数）由来の頸動脈の、走査型共焦点顕微鏡画像を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施形態の１つのセットによる、蛍光性ナノダイヤモンド粒子が導入された発生した血栓を伴うラット由来の頸動脈の、走査型共焦点顕微鏡画像を示す。
【図８】図８は、実施形態の１つのセットによる、頸動脈中に発生した血栓近傍の大腿動脈に組織的に注入した蛍光性ナノダイヤモンド粒子で処置した、又は処置していない、血栓の組織懸濁液の画像を示す。
【図９】図９は、例となる実施形態において使用したＮＤＰ−Ｆｓの蛍光を最適化する、励起対放出波長の２次元的スクリーニングを示す蛍光スクリーニングの結果である。図は、ＮＤＰ−Ｆｓのための最大の蛍光の最適化を示す。ヒートマップは、励起対放出波長の全スペクトルにおける蛍光スクリーニングの結果を表す。実験は、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して行った。ＮＤＰ−ＦｓをＰＢＳ中、懸濁液として９６ウェルプレート（０．３ｍｇ／０．１ｍｌ）上に適用した。ブランク、又は負の対照は、ＰＢＳ単独で使用して確立した。
【図１０】図１０は、『半ＥＬＩＳＡアッセイ』におけるＮＤＰ−Ｆｓ上でのＢｔの検出を示す折れ線グラフである。ＮＤＰｓは、Ｂｔ又はＢＳＡと結合しており，Ｘ軸に示されているようにＮＤＰ−Ｆｓ１ｍｇの当たりの濃度で使用した。３つの複製において、０．２ｍｇの各ＮＤＰサンプルを半ＥＬＩＳＡに使用した。実験は、培養の間の緩やかな回転とともに９６ウェルプレート（Ｕ型底）上で行った。ＮＤＰｓは、Ｂｔに対して第１抗体を加える前に１０％ヤギ血清でブロックした。ＮＤＰサンプルは、３７°Ｃで１時間、抗Ｂｔ抗体で培養し、プレートは、室温での遠心分離（１，０００ｘｇ）により、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ヤギ抗ウサギＩｇＧＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ。）を１：２０００に希釈して加え、前記のように１時間、培養した。最終洗浄を前記のように行い、基質（ｐＮＰＰ）をＡＰに加えた。３０分間発色させ、ＮＤＰサンプルを遠心分離した。上澄みを９６ウェルプレートに移し、４０５ｎｍ波長の下、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った。エラーバーは、半ＥＬＩＳＡ法に適用した、３つの独立したサンプル由来の標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図１１】図１１は、半ＥＬＩＳＡでの、純粋なインテグリンとＮＤＰｓとの相互作用を示す、折れ線グラフである。実験は、Ｕ型底９６ウェルプレートを使用して行った。プレート  を５％ＢＳＡで一晩ブロックし、一方ＮＤＰｓは、プレート上で適用する前に、３７℃で１時間の培養することにより、３％ＢＳＡでブロックした。ブロックしたＮＤＰｓをウェルに加え（ウェル当たり０．２ｍｇ）、プレートを室温で遠心分離した（１０，０００ｘｇ）。指示濃度で血小板フィブリノゲン受容体（ＰＦＲ）を０．１ｍＬの、生理学的濃度でＣａ２＋（ＣａＣｌ２として）及びＭｇ２＋（ＭｇＣｌ２として）を含むＨａｎｋｓの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に各ウェルに対し加え、３７℃で１時間培養した。ＮＤＰｓは、室温でのプレートの遠心分離（１，０００ｘｇ）により３回洗浄し、フィブリノゲン受容体に対し、第１ポリクローナル抗体を加えた（２μｇ／ｍｌ）。３７°Ｃで１時間、培養を行い、サンプルを前記のように３回洗浄した。ヤギ抗ウサギＩｇＧＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ。）を１：３０００に希釈し、加えて前記同様１時間培養した。最終的な洗浄を前記のように行い、基質（ｐＮＰＰ）をＡＰに加えた。３０分間発色させ、プレート上のＮＤＰサンプルを室温で遠心分離（１０，０００ｘｇ）し、ＮＤＰをペレットとして集めた。上澄みを平底９６ウェル（０．１ｍｌ）プレートに移し、４０５ｎｍ波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った。
【図１２】図１２は、固定したＰＦＲに対する、ＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔ及びＮＤＰ−ＢＳＡの接着を示す、折れ線グラフである。ＰＦＲは、ＰＢＳ中、４°Ｃで一晩培養して９６ウェルプレート上に固定した。プレート及びＮＤＰｓは、３％ＢＳＡでブロックした。１ｍｇのタンパク質（Ｂｔ又はＢＳＡ）と結合したＮＤＰｓを実験に使用した。ＮＤＰｓ（３００ｍｇ）をウェルに加えた。カルシウム及びマグネシウムを生理学的濃度で含むＨＢＳＳ緩衝液中で、３７°Ｃで１時間、培養を行った。結合していないＮＤＰｓを真空吸引とともに、同一の緩衝液を使用して、６回集中的に洗浄した。最後に、ＨＢＳＳ（１００μｌ）をウェルに加え、４８５ｎｍ（励起）及び５３０（放出）波長で、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光を読み取った。
【図１３】図１３は、固定したフィブリノゲン受容体に対する、ＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔ及びＮＤＰ−ＢＳＡの接着の定量を示す、折れ線グラフである。フィブリノゲン受容体は、４°Ｃで一晩培養し、８ウェルガラスチャンバースライド上に固定した。ウェルを３％ＢＳＡでブロックし、前にまた３％ＢＳＡでブロックしたＮＤＰｓを、カルシウム及びマグネシウムを生理学的濃度で含むＨＢＳＳに加えた（２００ｍｌ当たりウェル当たり５０ｍｇ）。接着プロシージャを、図１２当たりに行った。最終工程において、スライドを据え付けの緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）で調製した。画像は、油レンズを使用して蛍光顕微鏡（４００×）の下、解析した。ＮＤＰｓの数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した。エラーバーは、各濃度のフィブリノゲン受容体に対して撮られた３つの独立した画像に対するＳＤを表す。
【図１４】図１４は、固定したＰＦＲに接着したＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔの代表的な画像を表す。ＰＦＲ（指示濃度）を８ウェルチャンバースライド上に固定し、図１３に示すように実験を行った。凡例において、バーは２０μｍを表す。
【図１５】図１５は、外頸動脈注入を経由して、ＦＮＤＰで処置した後の頸動脈血栓のＩＶＩＳ及び共焦点顕微鏡で撮られた蛍光画像の写真を示す。図１５Ａは、頸動脈分岐部領域の露光の後、ＩＶＩＳイメージングを経由して、可視処理した後の頸動脈血栓の蛍光を示す、ｉｎ  ｓｉｔｕでの頸動脈分岐部領域画像を示す。図１５Ｂ及び１５Ｃは、血栓におけるＦＮＤＰの蓄積を示唆する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの頸動脈分岐部から発散される蛍光の高拡大画像である。図１５Ｄは、頸動脈分岐部での血栓局所化に相当する蛍光を示す１つの枝を表す、ｅｘ  ｖｉｖｏでの頸動脈分岐部の蛍光を示す。図１５Ｅ及び１５Ｆは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８３で撮影した共焦点画像であり、ＦＮＤＰ蛍光は、５４３ｎｍの励起、６５５−７５５ｎｍの放出で検出されることを示す。
【図１６】図１６は、ＦＮＤＰで静脈を処置した後、ＩＶＩＳ及び共焦点顕微鏡で撮影された頸動脈血栓の蛍光画像を示す。図１６Ａは、生理食塩水で処置した対照由来のｅｘ  ｖｉｖｏでの蛍光画像を示す。図１６Ｂは、血栓を有する枝に局所化した蛍光を示すＩＶ  ＦＮＤＰで処置した動物由来の頸動脈のｅｘ  ｖｉｖｏでの蛍光画像を示す。図１６Ｃ−Ｆは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８３で撮影した共焦点画像を示す。図１６Ｇは、生理食塩水で処置した対照と比較して、外頸動脈を経由して又は静脈に局所的に処置された動物由来の頸動脈血栓溶解物中に存在するＦＮＤＰｓの数を示す、グラフである。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｂは、トロンビン（１Ｕ／ｍｌ）によるラットの血液血漿由来の血栓の生成に関する、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ相互作用の特異性の蛍光顕微鏡検査を示す。図１７Ａは、蛍光顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１解析により得られる、血漿血栓の１００倍拡大の下での画像を示す。図１７Ｂは、ＩＶＩＳ  ５０  イメージングシステムにおいて得られた血漿血栓の画像を示す。測定に使用された波長：励起  Ｃｙ５．５ＢｋＧ（５８０−６１０ｎｍ）、放出  Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。バックグラウンドの控除について：励起  ＧＦＰ（４４５−４９０ｎｍ）、放出  Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。露光時間：１分である。矢印は血栓の局所化を指す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｂは、ラット（検死）の皮下に移植された、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔで満たした血管の画像を示す。図１８Ａは、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ（４ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ（対照）で満たした移植したガラスキャピラリーの画像を示す。露光時間は、５秒間であった。図１８Ｂは、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔで満たしたラットの大動脈の画像を示す。ラットの大動脈は、安楽死させた雌のラットから切断し，ＰＢＳで洗浄して凝固した血液の残りを除き、ＰＢＳ中、３００μlのＦ−ＮＤＰ−Ｂｔ懸濁液（２ｍｇ／ｍｌ）で満たした。  図１８Ｃは、トロンビン誘起ＰＲＰ血栓におけるＦ−ＮＤＰ−Ｂｔ、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ＋ロトラフィバン（ｌｔ）、及びＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡに関する平均蛍光強度のプロットを示す。  図１８Ｄは、ＩＶＩＳ由来の図１８Ｃにおける血栓の例となる画像を示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｃは、プロテナーゼ−活性受容体４（ＰＡＲ４  ＡＰ、図１９Ａ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、図１９Ｂ）、及びアラキドン酸（ＡＡ、図１９Ｃ）についての平均最高血小板凝集＋／−標準偏差回帰直線に関する、ビチスタチン（すなわち、プローブ）で機能化された、７００ｎｍ直径の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を有する及び有さない、用量反応曲線を示す。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｃは、種々の濃度での、血小板個数と結びついた７００ｎｍ及び２００ｎｍ直径のプローブのボックスプロットを示す。図２０Ａは、全血小板のパーセンテージを示し、図２０Ｂは、ＣＤ６２＋ｖｅ血小板のパーセンテージを示し、及び図２０Ｃは、種々の濃度での７００ｎｍ及び２００ｎｍプローブと結合したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ＋ｖｅ血小板のパーセンテージを示す。示されているデータは、平均（＋）であり、ボックス内の線は中間を表し、ボックスの上端及び下端は、７５番目の及び２５番目のパーセンタイルを表し、及び上部及び下部のひげは９５番目の及び５番目のパーセンタイルを表す。
【図２１】図２１は、刺激対刺激なしの血小板個数についての、７００ｎｍ直径のプローブと結合した血小板のパーセンテージのプロットを示す。示されているデータは、３５０ｍｃｇ／ｍＬのプローブの濃度での、刺激対刺激なし血小板における、プローブと結合した全血小板の平均のパーセンテージ（＋／−標準偏差）である。
【図２２】図２２は、刺激対刺激なしの血小板個数についての、２００ｎｍ直径のプローブと結合した血小板のパーセンテージのプロットを示す。示されているデータは、３５０ｍｃｇ／ｍＬのプローブ濃度での、刺激対刺激なしの血小板における、プローブと結合した全血小板の平均のパーセンテージ（＋／−標準偏差）である。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｄは、細胞及び血小板の非シミュレート及びシミュレートの個数についてのフローサイトメトリーの点プロットを示す。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｄは、細胞及び血小板の非シミュレート及びシミュレートの個数についてのフローサイトメトリーの点プロットを示す。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｂは、殺菌前後のＦ−ＮＤＰｓについての体積対サイズ（図２５Ａ）及び蛍光強度対サイズ（図２５Ｂ）のプロットを示す。
【図２６】図２６Ａ−２６Ｃは、懸濁液中のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）及びＦ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）のＮＩＲ蛍光強度の比較を示す。（図２６Ａ）Ｆ−ＮＤＰ懸濁液は、蛍光のため、励起及び放出の範囲で蛍光プレートリーダーにおいてスキャンした。蛍光は、ブランクのウェルを差し引き、ｌｏｇ１０処理をすることで標準化されている。（図２６Ｂ）キャピラリーは、ＰＢＳ中、指示密度のＦ−ＮＤＰで満たし、５秒の露光を使用して、ＩＶＩＳイメージングにより解析した。挿絵は、キャピラリーの代表画像を示す。平均蛍光はプロットで表されている。（図２６Ｃ）露光時間の関数として異なるＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）濃度に関する蛍光強度の比較。エラーバーは、３〜５の独立した実験のＳＤを表す。＊Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）及びＦ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）間の差（Ｐ＜０．０１）
【図２７】図２７Ａ−２７Ｄは、ＩＶＩＳにおいての異なる露光時間下での、異なるサイズのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）の蛍光強度の比較を示す。左のペインは、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）の代表的な画像であり、プロットされた濃度で表される。粒子のサイズは、（上から）：各々、１００、７００、及び１０，０００ｎｍである。エラーバーは、３つの独立した実験に関してのＳＤを示す。
【図２８】図２８Ａ−２８Ｈは、異なる生体バリアを通じてのＦ−ＮＤＰ  ＮＩＲ蛍光の検出能の、ＩＶＩＳを使用する、比較を示す（図２８Ａ）。Ｆ−ＮＤＰ、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）（４ｍｇ／ｍｌ）、又はＰＢＳで満たしたキャピラリー（ＮＶ）（４ｍｇ／ｍｌ）は、安楽死させたラットの腹部の皮膚パッチのもとに置いた。キャピラリーの位置を矢印で示す（図２８Ｂ）。２ｍｍ（側面）から５．９ｍｍ（中央）に及ぶラットの大腿四頭筋筋肉覆われたＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）で満たしたキャピラリー。（図２８Ｃ）Ｆ−ＮＤＰ（４ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで満たしたキャピラリー（４ｍｇ／ｍｌ）を豚の腋の下の静脈に挿した。（図２８Ｄ）Ｆ−ＮＤＰ（４ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで満たしたキャピラリーを副真皮がない豚の皮膚（２．５ｍｍ）で覆った。（図２８Ｅ）副真皮がない２．５ｍｍの豚の皮膚を通しての、異なる濃度のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）の蛍光強度。（図２８Ｆ）Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）（２ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで満たし及び真皮及び副真皮を含む８ｍｍの豚の皮膚で覆われた豚の腋の下の静脈（図２８Ｇ）Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）（２０ｍｇ／ｍｌ）、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）（２０ｍｇ／ｍｌ）及びＰＢＳ（同一体積）で満たされ、厚さが増加した脂肪組織（挿し絵に示されている）を含む豚の皮膚で覆われたキャピラリー。（図２８Ｈ）表面から１１．８９ｍｍ下の動脈を示す、ヒト頸動脈の代表的な超音波。
【図２９】図２９Ａ−２９Ｎは、外頸動脈を経由してのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの注入を示す。頸動脈血栓はｉｎ  ｓｉｔｕで画像化され、さらに直接的なイメージング及び解析のために動物から分離される。（図２９Ａ−２９Ｆ）２秒の露光で、５８０−６１０ｎｍの励起及び６９５−７７０ｎｍの放出通過域を使用して、全動物イメージングのために設計されたＩＶＩＳスキャナーで記録された画像。自動蛍光は、４４５−４９０ｎｍでの励起に基づき、差し引いた（図２９Ａ、図２９Ｂ）複製動物の処理後の、ＩＶＩＳによる、頸動脈血栓のｉｎ  ｓｉｔｕでの蛍光イメージング（切断による首粒子の分離後）スケールバー＝１ｃｍ。（図２９Ｃ−２９Ｆ）Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ処理（図２９Ｃ，図２９Ｄ）又は展色剤対照で処理（図２９Ｅ，図２９Ｆ）した後の、分離した頸動脈のＥｘ−ｖｉｖｏでの蛍光。スケールバー＝１ｍｍ。（図２９Ｇ−２９Ｊ）共焦点画像の山はＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ  １０００で撮影した。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ蛍光が、５４３ｎｍの励起及び６５５−７５５ｎｍの放出で検出された。バックグラウンドの蛍光は、５５５−６２５ｎｍの放出を伴う、同一の励起から集め、及びフォアグラウンドから差し引いた。スケールバー＝１ｍｍ。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ処理（図２９Ｇ、図２９Ｈ）又は生理食塩水処理（図２９Ｉ、図２９Ｊ）した後の頸動脈の蛍光。（図２９Ｋ）未処理の対側の動脈と比較する、ＦｅＣｌ３で発生させた血栓頸動脈のＩｎ  ｓｉｔｕでの画像。（図２９Ｌ−２９Ｎ）ＲＩＰＡ溶解緩衝液で溶解させた血栓及び複製物をともに合わせ、溶解物を形成させる。一定量の溶解物をカバーガラス上に落とし（１０μＬ）、２０倍対象物で撮影した。スケールバー＝１００ ｍ。（図２９Ｋ）多くのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔが視認できる。（図２９Ｌ）低用量（１ｍｇ）でのＩＶ処置の後、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔが、血栓形成部分での溶解物中においてが見つかる。（図２９Ｎ）生理食塩水対照においては、ほとんどまったく蛍光性粒子は検出されない。
【図３０】図３０Ａ−３０Ｓは、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの静脈注入を示す。（図３０Ａ−３０Ｊ）蛍光画像は、２秒の露光で、５８０−６１０ｎｍ励起及び６９５−７７０ｎｍ放出通過域を使用して、全動物イメージングのために設計されたＩＶＩＳスキャンで行った。自動蛍光は４４５−４９０ｎｍでの励起に基づき、差し引いた。（図３０Ａ−３０Ｃ）３連の複製動物を処理した後の、頸動脈血栓の蛍光を示す全体画像は、動脈の露光の後、ＩＶＩＳイメージングを経由して見ることができる。スケールバー＝１ｃｍ。（図３０Ｄ−３０Ｉ）Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ処理（図３０Ｄ−３０Ｆ）又は生理食塩水処理（図３０Ｇ−３０Ｉ）した後のＥｘ−ｖｉｖｏでの頸動脈の蛍光。スケールバー＝１ｍｍ。（図３０Ｊ−３０Ｏ）Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ  １０００で撮影された共焦点画像の山。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ蛍光は、５４３ｎｍの励起及び６５５−７５５ｎｍの放出で検出される。スケールバー＝１ｍｍ。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ処理（図３０Ｊ−３０Ｌ）又は生理食塩水処理（図３０Ｍ−３０Ｏ）した後の頸動脈の蛍光。（図３０Ｐ）可溶化した頸動脈由来の溶解物を画像化し、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔを血球計で計数する。対側の未処理の対照を、挿入図に表す。スケールバー＝１００μｍ（図３０Ｑ）血球計により計数される、対側の対照と比較する、血栓側の頸動脈分岐部当たり検出される−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの総数。（図３０Ｒ、図３０Ｓ）処理済み及び対側の未処理の頸動脈分岐部のＩＶＩＳ（図３０Ｄ−３０Ｉ）及びＬＳＣＭ（図３０Ｊ−３０Ｏ）イメージングを経由してのバックグラウンドを差し引いた後の明るさ。エラーバーは、標準偏差を表す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１対対照（ｔ−ｔｅｓｔによる）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ナノダイヤモンド粒子、及び検体の検出及び／又は定量のためのナノダイヤモンド粒子といった関連する装置及び方法について、一般的に述べる。ある実施形態において、本発明は、動物血栓塞栓事象（ＴＥＥ）のリスクという点で、ヒト及びヒト以外の動物のいずれも含む被験者のリスク評価のための診断薬及び方法を提供する。ＴＥＥとは、脳卒中及び心臓発作由来の心臓血管の死の主たる要因である。本発明の診断薬及び方法により、非放射線（例えば、Ｘ線）、非ＭＲＩ、及び非超音波技術を使用して、血管内の血栓の全身負荷の評価、及び血栓形成の一般的な好発部位での発生期の血栓の検出が可能となる。本技術は、一般的に、速い及び手頃な料金の外来環境での使用に適した、非侵襲的な遠隔ベースでの蛍光性記録システムを含む。本発明は、複数の革新的科学的及び工学的ブレークスルーを含む。
【００１７】
本発明は、少なくとも一部分においては、化学種（例えば、ディスインテグリンビチスタチン（Ｂｔ）といったポリペプチド、ＩｇＧ及び／又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）といった免疫グロブリン）に機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子（ＮＤＰ−Ｆ）は、活性血小板フィブリノゲン受容体（ＰＦＲ）に熱心に結合する能力が備わり得るという認識に基づいている。例えば、この本文で示されるデータにより、うまいＢｔのＮＤＰ−Ｆへの結合、及びＢｔ生物活性の保持が示される。本発明を達成するのに使用された方法、試薬、及びｄｅ  ｎｏｖｏプロトコルは、他の人に前に報告されてきた発明者には知られていない。
【００１８】
ある実施形態において、前記装置は、ナノダイヤモンド粒子と結合した複数のナノダイヤモンド粒子及び化学種（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド）を含む。ある実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子は、検体を含む疑いのあるサンプルに曝露され得る。ある場合において、サンプル中の検体の存在が検出され得るよう、化学種と結合し得る。ある実施形態において、この本文で述べられる、装置、システム、及び方法は、例えば、診断目的で、被験者より得られるサンプル中の検体の検出に有用である。ある場合において、この本文で述べられるシステム、装置、及び方法は、病気又は体調の診断、予防、処置及び／又は管理に有用であり得る。例となる実施形態において、そのようなこの本文で述べられるシステム、装置、及び方法は、被験者中の及び／又は被験者から得られるサンプル中のウィルス（例えば、エボラ）の存在の検出及び／又は定量に有用であり得る。
【００１９】
好都合なことに、被験者からのサンプル中の検体（例えば、ウィルス、バクテリア、毒、環境汚染物質、など）を定量するための従来のシステムと比較して、この本文で述べられるシステム及び方法は、サンプル中に存在する検体の量の定量を含み得る。
【００２０】
本発明は、脳卒中及び心臓発作を超えて、多くの医療救急及び生命を脅かす条件に適用可能であり得る、広範なスケールのＴＥＥリスクの調査をまた可能とする。本技術は、ＴＥＥについてのリスクにあると疑われる個人に使用可能であるだけでなく、プライマリヘルスケアオフィスアセスメントの一部として、年１回のマンモグラフィー、脂肪テスト、又は身体検査で使用することも可能である．例えば、ある実施形態において、本発明は、蛍光放射をモニターし、非常に手頃な料金で、最小限侵襲的（安全な用量のナノ粒子の単独での注入のみ要求）で、及び、外来環境で、ＥＣＧモニタリングと同様、訓練された救急医療技術者又はプライマリケア医師によって行われ、解釈され得ることが期待される。
【００２１】
本発明の１つの一般的な態様は、被験者中の血栓の検出のための造影剤である。該薬剤は、例となる実施形態において、３つの要素から成り、次の通りである。：ｉ）ａ蛍光性ナノダイヤモンド粒子（ＮＤＰ−Ｆ）、ｉｉ）−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、又は−Ｃ＝Ｏ部位といった、ＮＤＰ−Ｆを機能化する配位子、及びｉｉｉ）配位子に取り付けられたタンパク質。該３要素は、ともに任意の順序で及び任意の化学結合のタイプで結合することが可能であるが、典型的には、述べた順序で共有結合している。造影剤の目的は、該薬剤とヒト又はヒト以外の動物の体内の個別の生物学的ターゲットとを明確に結合することである。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、活性血小板の検出のための診断方法である。ある場合において、該診断方法は、大部分、ポリペプチド（例えば、ビチスタチン、ＢＳＡ、ヒトＩｇＧ）といった化学種の、特定の抗原（例えば、ＰＦＲ）に高い親和性をもって及び／又は熱心に、結合する能力に基づく。ある実施形態において、該ポリペプチド（例えば、ビチスタチン）は、前記ＮＤＰ−Ｆを、例えば、活性血小板及び血栓形成部位に絞るように配置されている。ある実施形態において、ＮＤＰ−Ｆの蛍光により、血栓又は多重血栓の位置及びサイズの非侵襲的、及び比較的無害なイメージングが可能となる。ある実施形態において、該診断方法は、定量的であり、他の実施形態においては、半定量的又は定量的である。ある実施形態において、該方法は、ｉ）１つ以上の血栓部位を有する又は潜在的に有する疑いのある被験者に、本発明の診断薬を検出可能な量で投与する工程、ｉｉ）該診断薬を血栓の部位（複数有り）に十分な時間局在化させる工程、及びｉｉｉ）適切な電磁気的刺激での励起の後、蛍光放出（例えば、手持ち式装置由来の放出といった、励起光）を検出することで該診断薬を検出する工程、を含む。ある実施形態において、工程ｉｉｉ）での励起の活動は、蛍光タグが、被験者の体内で、生来蛍光性である場合には、省略することが可能であると解される。投与の工程は、造影剤の被験者の全血流への導入ということになる、何らかの活動であり得る。それゆえ、例えば及び制限なしで、静脈注射又は注入経由であり得る。
【００２３】
さらにさらに、及びすぐ上で述べられている方法に従って、本発明は、被験者中の血栓又は血栓形成の検出方法を含む。前記方法に関し、この方法は、血栓、血栓形成、血小板活性化、又はアテローム性血管硬化班又は炎症といった、血栓形成に関するリスクを形成する病変域を検出又はイメージングする方法とみなされ得る。該方法工程は、前記のとおりである。例えば、ある実施形態において、被験者中の血栓は、少なくとも一部の血栓と結合し得る化学種（例えば、ビチスタチンといったポリペプチド）で機能化された複数のナノダイヤモンド粒子を投与により検出され得る。
【００２４】
当業者であればすぐにわかるように、本発明の診断及びイメージング方法は、非天然生物活性物質を被験者の体内に導入するため、生物学的事象に関するデータの収集にもっぱら関連しないが、その代わりに被験者の体に対しての物理的及び生理学的変化に関連する。例えば、自然発生的でない造影剤を被験者の血流へ物理的に導入することで、血流の性質が変化する。さらに、造影剤が活性血小板に結合することで、活性血小板と相互作用する体の自然の力が変化し、血栓が滝のように流れる。本発明の造影剤を投与する上での他の物理的及び生理学的変化は、熟練した職人にとっては明らかであろう。
【００２５】
本発明は、また本発明の方法を実行するキットを含む。広く言えば、本発明によるキットは、本発明の方法においての使用のための分配、運搬、及び／又は貯蔵に適切な、詰め合わせの形の本発明の造影剤を含む。従来の方式では、該詰め合わせは、段ボール又はプラスチックボックスなど、金属容器など、又はホイルポーチ又は同様のものといった、しかしこれらに限定されない適切な材料から成る。ある実施形態において、該キットは、容器に単独の投与に十分な造影剤を含み、一方、他の実施形態において、該キットは、２つ以上の投与のために十分な造影剤を含む。キットが、２つ以上の投与ために十分な造影剤を含む実施形態において、造影剤は、多重使用のための単一の容器又は２つ以上の容器に提供されることが可能であり、各々は、単一使用のために十分な造影剤を含む。ある場合において、単一使用及び多重使用の容器の組み合わせが、キット内に含まれ得る。ある実施形態において、キット（キットにどれくらい多くの造影剤の容器が提供されるかにかかわらず）は、１つ以上の試薬又は被験者へ造影剤を投与するための装置の詰め合わせの組み合わせで提供され得る。そういうものとして、及び無制限に、本発明のキットは、詰め合わせの形で、消毒剤（例えば、エタノール消毒綿又はパッド、又はヨウ素消毒綿又はパッド）、１つ以上のシリンジ、シリンジと接続するのに適合した１つ以上の針、及び／又は１つ以上のガーゼ片及び／又は縫合及び投与部位の回復を促す接着剤を伴う造影剤を含み得る。
【００２６】
ある実施形態においてポリペプチド又はポリヌクレオチドといった化学種と結合した複数のナノダイヤモンド粒子（例えばＮＤＰ−Ｆ）は、検体を含む疑いのあるサンプルに導入され得る。ある実施形態において、該ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドは、存在する場合、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドが検体と結合するように選択され得る。
【００２７】
ある実施形態において、検体がサンプル中に存在する場合、該検体、化学種、及び／又はナノダイヤモンド粒子は、検体の存在が検出され得るよう、結合され得る。ある場合において、該検体の検出は、前記ナノダイヤモンド粒子による放出（例えば、蛍光放出、近赤外放出）の定量を含む。ある実施形態において、放出の定量は、相対強度の定量、及び／又は放出波長の定量を含む。理論に縛られることを望むことなしに、ある場合において、放出の強度は、サンプル中に存在する検体の量に比例的（例えば、直接的に比例的、指数関数的に比例的、対数的に比例的）であり得る。
【００２８】
ある実施形態において、複数の（蛍光性）ナノダイヤモンド粒子を被験者に投与する。ある実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子は、経口的に、直腸に、経膣的に、経鼻的に、又は尿道に、被験者に投与され得る。ある場合において、複数のナノダイヤモンド粒子は、外科的に投与され（例えば、移植）及び／又は注射され得る（例えば、全身循環に、眼球内に、脊柱システムに、例えば、シリンジ経由で）。
【００２９】
他の例となる実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子（例えば、該ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種を含む複数のナノダイヤモンド粒子）が、被験者に投与され得る（例えば、被験者中に存在することが疑われる検体の検出目的で）。例えば、ある場合において、化学種を含む複数のナノダイヤモンド粒子は、被験者に投与され、ナノダイヤモンド粒子の放出（例えば、蛍光放出、近赤外放出）を検出した上で、被験者中の検体の存在を示す。ある場合において、該検体は、ナノダイヤモンド粒子と結合することが可能な、（血液）血栓の少なくとも一部であり得る。ある実施形態において、蛍光放出及び／又は近赤外放出を計測及び／又は検出するよう配置されている検出装置は、検体が存在する場合、放出が検出され、及び／又は定量されるよう、被験者に（例えば、皮膚の上又は皮膚近く、被験者内部の場所で）適用され得る。
【００３０】
すでに述べたように、この本文で述べられる方法、装置、及びシステムは、サンプル中に存在する検体の量の決定及び／又は定量に有用であり得る。ある実施形態において、該サンプルは流体である。ある実施形態において、該サンプルは全血である。ある実施形態において、該サンプルは、全血、血漿、尿、唾液、汗、及び／又は他の生体流体といった題材から得られる。そのようなサンプルを収集するための方法は、公知技術において知られている。ある実施形態において、該サンプルは、流体装置（例えば、複数のナノダイヤモンド粒子を含む容器を含む、流体装置）に導入される。
【００３１】
ある実施形態において、前記サンプルは（例えば、サンプル中に存在する検体の量の決定及び／又は定量に先立ち）希釈され得る。例えば、ある実施形態において、緩衝溶液が、サンプルが希釈されるよう、流体装置へサンプルを導入する前、間、及び／又は後に、複数のナノダイヤモンド粒子を含む流体装置に添加され得る。ある実施形態において、該緩衝溶液は、流体装置の１つ以上の構成要素と流体的に連通している容器に含まれる。サンプルは、複数のナノダイヤモンド粒子のサンプルへの導入に先立ち、又は間に、緩衝溶液に希釈され得る。ある実施形態において、サンプル中の検体は、次のいかなる方法段階なしに、容易に決定することが可能である。ある場合において、該検体は、被験者中に存在し、及びナノダイヤモンド粒子が、すでに述べたように、被験者に投与され得る。
【００３２】
『ナノダイヤモンド粒子』という用語は、一般的に、１マイクロメータより小さい平均断面寸法を有するダイヤモンド粒子を指す（例えば、９００ナノメータより小さいか等しい、８００ナノメータより小さいか等しい、７００ナノメータより小さいか等しい、６００ナノメータより小さいか等しい、５００ナノメータより小さいか等しい、４００ナノメータより小さいか等しい、３００ナノメータより小さいか等しい、２００ナノメータより小さいか等しい、１００ナノメータより小さいか等しい、９０ナノメータより小さいか等しい、８０ナノメータより小さいか等しい、７０ナノメータより小さいか等しい、６０ナノメータより小さいか等しい、５０ナノメータより小さいか等しい、４０ナノメータより小さいか等しい、３０ナノメータより小さいか等しい、２０ナノメータより小さいか等しい、又は１０ナノメータより小さいか等しい）。ある場合において、ナノダイヤモンド粒子は、５ナノメータより大きいか等しい、１０ナノメータより大きいか等しい、２０ナノメータより大きいか等しい、３０ナノメータより大きいか等しい、４０ナノメータより大きいか等しい、５０ナノメータより大きいか等しい、６０ナノメータより大きいか等しい、７０ナノメータより大きいか等しい、８０ナノメータより大きいか等しい、９０ナノメータより大きいか等しい、１００ナノメータより大きいか等しい、２００ナノメータより大きいか等しい、３００ナノメータより大きいか等しい、４００ナノメータより大きいか等しい、５００ナノメータより大きいか等しい、６００ナノメータより大きいか等しい、７００ナノメータより大きいか等しい、８００ナノメータより大きいか等しい、又は９００ナノメータより大きいか等しい、平均断面寸法を有し得る。前記参照した範囲の組み合わせがまた可能である（例えば、１マイクロメータより小さい及び５ナノメータより大きいか等しい、７００ナノメータより小さいか等しい及び１００ナノメータより大きいか等しい）。他の範囲がまた可能である。当業者は、本明細書の教示に基づくナノダイヤモンドの平均断面寸法を決定するための適切な方法を選択することができよう。
【００３３】
理論に縛られることを望むことなしに、ある場合において、この本文で述べられるナノダイヤモンド粒子は、自動蛍光性であり得る（ナノダイヤモンド粒子は、例えば、電磁気的放射線の吸収の後、蛍光を放出する）。ある場合において、ナノダイヤモンド粒子は、１つ以上の原子型欠陥（例えば、窒素−空孔（ＮＶ）中心といった点欠陥、窒素−空孔−窒素（ＮＶＮ）欠陥といった点欠陥、それらの組み合わせ）を含んでいてよく、それが検出され、及び／又は定量され得る、近赤外蛍光及び／又はフォトルミネッセンスという結果になる。他の欠陥もまた可能である（例えば、Ｓｉ−空孔欠陥）。ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、適用した電磁気的放射線に反応して蛍光を発する。
【００３４】
例えば、ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、（例えば、第１の波長を有する電磁気的放射線を適用することで）検出可能な放出（例えば、第１の波長とは異なる、第２の波長を有する電磁気的放射線）を放出するよう、励起され得る。実施形態の具体的なセットにおいて、検体がサンプル中に存在する場合、検体は、ナノダイヤモンド粒子からの放出が、検出及び／又は定量され得るよう、ナノダイヤモンド粒子と結合する（例えば、ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種と結合する）。ある場合において、被験者中のナノダイヤモンド粒子の放出の検出は、ナノダイヤモンド粒子が、疑いある検体と結合していることを示唆し得る。あるそうした場合において、該放出が、定量され得る（例えば、被験者中に存在する検体の相対的な量を決定するために）。
【００３５】
実施形態の別のセットにおいて、検体を含む疑いのあるサンプルは、存在する場合、検体が、ナノダイヤモンド粒子と（例えば、ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に）結合するよう、流体装置、及び流体装置内の検出領域に添加され得る。あるそうした実施形態において、放出の存在は、サンプル中の検体の存在を示唆する。ある場合において、放出の強度及び／又は波長が、定量され得る。
【００３６】
この本文で述べられているように、ある実施形態において、前記システム、装置、及び方法は、複数のナノダイヤモンド粒子と結合した、複数のナノダイヤモンド粒子及び化学種を含む。好都合なことに、この本文で述べられる装置及び方法は、ある実施形態において、さらなるろ過又は分離工程を必要とすることなく全血から検体を分析することが可能であり得、あるすでに存在する検体の定量方法と比較して、比較的高い感度を有し得る。
【００３７】
図１Ａに示すように、ある実施形態において、装置１００は、化学種１２０と結合した複数のナノダイヤモンド粒子１１０を含む（例えば、存在する場合、検体と結合し得る化学種）。ある実施形態において、該ナノダイヤモンド粒子は、ナノダイヤモンド粒子の機能化を経由して化学種と結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（例えば、結合（ｂｏｕｎｄ））している。例えば、ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、イオン結合、共有結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、などといった結合の形成を経由して、化学種と結合している。共有結合は、例えば、炭素−炭素、炭素−酸素、酸素−ケイ素、硫黄−硫黄、リン−窒素、炭素−窒素、金属−酸素、又は他の共有結合であり得る。水素結合は、例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、チオール、及び／又は同様の官能基間であり得る。例えば、化学種は、官能基、チオール、アルデヒド、エステル、カルボン酸、ヒドロキシル、など、といった官能基を含んでいてよく、該官能基はナノダイヤモンド粒子と結合を形成する。ある場合において、化学種は、電子豊富又は電子不足部位であってよく、ナノダイヤモンド粒子及び化学種間の相互作用は、静電相互作用を含み得る。
【００３８】
例えば、機能化されたナノダイヤモンド粒子及び化学種を架橋剤の存在下、反応させることで、前記化学種は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、又は−Ｃ＝Ｏ官能基を含む、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、又は−Ｃ＝Ｏ官能基を含む機能化されたナノダイヤモンド粒子と結合し得る。適切な架橋剤の限定されない例は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）といったカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル及びヒドロメチルホスフィンといったアミン反応性化合物、マレイミド、ピリジルジスルフィド、及びヨードアセチルといったスルフヒドリル反応性化合物、ヒドラジド及びアルコキシアミンといったアルデヒド反応性化合物、及びアリールアジド及びジアジリジンといった光反応性架橋剤を含む。他の架橋剤もまた可能である。当業者は、選択した化学種のタイプ及び本明細書の教示に基づき、適切な架橋剤を選択することができよう。
【００３９】
ある実施形態において、前記化学種は、標的の検体と結合し得る。ある場合において、化学種は、サンプル中の他の生体又は非生体（化学）分子（例えば、検体上に存在する生体又は化学分子）と結合することが可能な生体又は非生体（化学）の基を含み得る。例えば、化学種は、チオール、アルデヒド、エステル、カルボン酸、ヒドロキシル、アミン、ポリエチレングリコールなどといった官能基を含んでいてよく、該官能基は検体と結合を形成する。ある場合において、化学種は、検体及び化学種間での相互作用が、静電相互作用を含む、電子豊富な又は電子不足な部位であり得る。
【００４０】
ある実施形態において、前記化学種及び検体は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモン、などを含む生体分子の対間の結合事象を経由して相互作用する。具体的な例は、抗体／ペプチド対、抗体／抗原対、抗体フラグメント／抗原対、抗体／抗原フラグメント対、抗体フラグメント／抗原フラグメント対、抗体／ハプテン対、酵素／基質対、酵素／阻害剤対、酵素／共同因子対、タンパク質／基質対、核酸／核酸対、タンパク質／核酸対、ペプチド／ペプチド対、タンパク質／タンパク質対、タンパク質／受容体対、小分子／タンパク質対、グルタチオン／ＧＳＴ対、抗ＧＦＰ／ＧＦＰ融合タンパク質対、Ｍｙｃ／Ｍａｘ対、マルトース／タンパク質対結合しているマルトース、炭水化物／タンパク質対、炭水化物誘導体／タンパク質対、タグ／金属／キレートと結合している金属、ペプチドタグ／金属イオン−金属キレート対、ペプチド／ＮＴ対、レクチン／炭水化物対、受容体／ホルモン対、受容体／作動体又は対、相補的核酸／核酸対、配位子／細胞表面受容体対、ウィルス／配位子対、タンパク質Ａ／抗体対、タンパク質Ｇ／抗体対、タンパク質Ｌ／抗体対、Ｆｃ受容体／抗体対、ビオチン／アビジン対、ビオチン／ストレプトアビジン対、ドラッグ／ターゲット対、ジンクフィンガー／核酸対、小分子／ペプチド対、小分子／タンパク質対、小分子／ターゲット対、マルトース／ＭＢＰ（タンパク質と結合しているマルトース）といった炭水化物／タンパク質対、小分子／ターゲット対、及び金属イオン／キレート剤対を含む。具体的な限定されない化学種の例は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含む。他の化学種及び結合対がまた可能である。例となる実施形態において、化学種は、抗体（例えば、標的検体に対する抗体）である。
【００４１】
例となる実施形態において、前記化学種及び検体は、抗体／抗原対結合事象を経由して相互作用する。
【００４２】
他の例となる実施形態において、前記化学種及び検体は、タンパク質／受容体対結合事象経由して相互作用する。例えば、化学種は、ディスインテグリン（例えば、ビチスタチン）といったタンパク質を含んでいてよく、検体は、フィブリノゲン受容体といった受容体分子を含み得る。
【００４３】
ある実施形態において、前記化学種及び検体は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモン、又は同種のものを含む生体分子の対間での結合事象を経由して相互作用する。
【００４４】
ある実施形態において、前記化学種は、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチド、及び配位子から成る群から選択される。例となる実施形態において、化学種は、タンパク質、抗体、及び／又は抗原といったポリペプチドである。例えば、ある実施形態において、該抗体は、Ｉｇ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又は同種のものといった免疫グロブリンである。他の例となる実施形態において、化学種は、ＤＮ又はＲＮＡといった（ポリ）ヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）である。さらに他の例となる実施形態において、化学種は、アルボラブリン、アップラジン、バーブーリン、バトロキソスタチン、ビチスタチン、オブツスタチン、チスタチン（ｓｃｈｉｓｔｔｉｎ）、エチスタチン、エレガンチン、エリスチコフィン、フラボリジン、ハリシン、キストリン、モジャスチン、ルビスタチン、テルゲミニン、サルモシン又はトリフラビンといったディスインテグリンである。ある実施形態において、化学種は、血清アルブミン（例えば、牛血清アルブミン）といったタンパク質を含み得る。
【００４５】
化学種（例えば、ビチスタチン）で機能化された適切なナノダイヤモンド粒子の例は、２０１６年９月６日に出願され、『ヒト及び動物用薬における血栓の診断及び処置のための蛍光性ナノダイヤモンド粒子（Ｆ−ＮＤＰ）の工学及び有用性』という表題の、米国特許仮出願第６２／３８３，０６５７号においてより詳細に議論されており、参照によりこの本文にそのまま組み入れられる。他の機能化の方法が、また可能である。
【００４６】
検出され及び／又は定量され得る検体の限定されない例は、生体化合物、ドラッグ、超分子、塩、電解質、酵素、核酸（例えば、（ポリ）ヌクレオチド）、炭水化物、（ポリ）ペプチド、タンパク質、脂質、リン酸塩、スルホン酸塩、ウィルス、病原体、細菌、真菌、酸化剤、還元剤、毒、界面活性剤、及びそれらの組み合わせを含む。
【００４７】
例となる実施形態のセットにおいて、前記検体はウィルスである（例えば、エボラ、マールブルグ、ブンディブギョ、スーダン、フニン、ラッサ熱ウイルス、ＭＥＲＳ、天然痘、ジカ熱、百日咳、風疹、はしか）。ある実施形態において、検体は細菌毒である（例えば、炭疽菌）。ある実施形態において、検体は、特定の寄生虫及び／又は真菌と関連した生物学的エンティティである。好都合なことに、この本文で述べられるシステム及び方法は、エボラといったウィルスの検出及び／又は定量に有用であり得る。
【００４８】
さらに別の例となる実施形態のセットにおいて、前記検体は、受容体分子である（例えば、フィブリノゲン受容体）。好都合なことに、この本文で述べられるシステム及び方法は、血栓の検出に有用であり得る。
【００４９】
ある場合において、前記検体は、特定の病気又は状態の標識／抗原を含み得る。例えば、ある場合において、検体は、血栓、外傷性脳負傷、骨の病気（例えば、骨粗しょう症、変形性関節症）、炎症及び／又は（自動）免疫病（例えば、クローン病、乾癬）潰瘍、心虚血及び脳卒中、アテローム性動脈硬化、筋肉の病気、アルツハイマー／パーキンソン、腫瘍及び腫瘍転移ガン、又は他のものと関連した標識／抗原であり得る。例えば、この本文で述べられるシステム及び方法は、血栓、外傷性脳負傷、炎症及び／又は（自動）免疫病（例えば、クローン病、乾癬）、潰瘍、心虚血及び脳卒中、アテローム性動脈硬化、筋肉の病気、アルツハイマー／パーキンソン、腫瘍及び腫瘍転移ガン、又は他のものの被験者における検出及び／又は診断に有用であり得る。
【００５０】
ある実施形態において、複数のナノダイヤモンド粒子及び該ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種が存在し（例えば、容器中に）及び／又は流体装置に導入される。例えば、図１Ｂに示すように、流体装置１０２は、サンプル注入口１３０及びサンプル注入口１３０と流体的に連通している容器１４０を含む。ある実施形態において、容器１４０は、複数の（蛍光性）ナノダイヤモンド粒子１１０（及びナノダイヤモンド粒子１１０と結合した化学種１２０）を含む。
【００５１】
ある実施形態において、サンプルは、サンプルが容器に流れ及びサンプルが複数のナノダイヤモンド粒子及び化学種と相互作用するよう、サンプル注入口に導入され得る。ある実施形態において、検体は、サンプル中に存在する場合、化学種と結合する。
【００５２】
ある場合において，検出領域１５０は、容器１４０の下流に置かれ、及び／又は、容器１４０と流体的に連通している。
【００５３】
ある実施形態において、検出器１６０は、検出領域１５０の近傍に置かれる。検出器は、ある場合において、検出領域で放出（例えば、放出の強度、放出の波長）を定量するよう、配置され得る。ある場合において、該放出は、蛍光性及び／又は近赤外であり得る。例えば、検体は、存在する場合、化学種と結合し得る。あるそうした場合、検体は、検出領域と結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（例えば、結合（ｂｏｕｎｄ））した、第２の化学種（例えば、抗体）と結合し得る。ある実施形態において、該第２の化学種及び第１の化学種と結合した（ナノダイヤモンド粒子と結合した）検体は、ナノダイヤモンド粒子の放出を測定（例えば、検出器を経由して）することにより、検出及び／又は定量され得る。
【００５４】
ある実施形態において、検出器は、検体及び／又は血栓を含む疑いのある被験者の領域の近傍に置かれ得る。例えば、化学種で機能化された複数の（蛍光性）ナノダイヤモンド粒子は、被験者に投与されてよく、該検出器は、検体及び／又は血栓と結合した任意のナノダイヤモンド粒子が検出（例えば、ナノダイヤモンド粒子の放出を経由して）され得るよう、被験者の近傍に置かれ得る。
【００５５】
任意の適切な検出器が、この本文で述べられている装置及び方法とともに使用され得る。例えば、ある実施形態において、該検出器は光学検出器（例えば、蛍光検出器、可視光及び／又はＵＶ検出器、近赤外検出器、顕微鏡）であり得る。
【００５６】
ある実施形態において、前記放出は、蛍光放出である。ある実施形態において、放出の波長は、２５０ｎｍより大きいか等しい、３００ｎｍより大きいか等しい、３５０ｎｍより大きいか等しい、４００ｎｍより大きいか等しい、４５０ｎｍより大きいか等しい、５００ｎｍより大きいか等しい、５５０ｎｍより大きいか等しい、６００ｎｍより大きいか等しい、又は６５０ｎｍより大きいか等しい。ある実施形態において、放出の波長は、７００ｎｍより小さいか等しい、６５０ｎｍより小さいか等しい、６００ｎｍより小さいか等しい、５５０ｎｍより小さいか等しい、５００ｎｍより小さいか等しい、４５０ｎｍより小さいか等しい、４００ｎｍより小さいか等しい、３５０ｎｍより小さいか等しい、又は３００ｎｍより小さいか等しい。前記参照した範囲の組み合わせが、また可能である（例えば、２５０ｎｍより大きいか等しい及び７００ｎｍより小さいか等しい）。他の範囲がまた可能である。
【００５７】
ある実施形態において、前記放出は、近赤外放出である。ある実施形態において、放出の波長は、７００ｎｍより大きいか等しい、７５０ｎｍより大きいか等しい、８００ｎｍより大きいか等しい、８５０ｎｍより大きいか等しい、９００ｎｍより大きいか等しい、又は９５０ｎｍより大きいか等しい。ある実施形態において、放出の波長は、１０００ｎｍより小さいか等しい、９５０ｎｍより小さいか等しい、９００ｎｍより小さいか等しい、８５０ｎｍより小さいか等しい、８００ｎｍより小さいか等しい、又は７５０ｎｍより小さいか等しい。前記参照した範囲の組み合わせが、また可能である（例えば、７００ｎｍより大きい及び１０００ｎｍより小さいか等しい）。他の範囲がまた可能である。
【００５８】
ある実施形態において、前記ナノダイヤモンド粒子は、特定の波長を有する電磁気的放射線による励起で蛍光及び／又は近赤外放出を放出し得る。例えば、ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、２５０ｎｍより大きいか等しい、３００ｎｍより大きいか等しい、３５０ｎｍより大きいか等しい、４００ｎｍより大きいか等しい、４５０ｎｍより大きいか等しい、５００ｎｍより大きいか等しい、５５０ｎｍより大きいか等しい、６００ｎｍより大きいか等しい、６５０ｎｍより大きいか等しい、７００ｎｍより大きいか等しい、７５０ｎｍより大きいか等しい、８００ｎｍより大きいか等しい、８５０ｎｍより大きいか等しい、９００ｎｍより大きいか等しい、又は９５０ｎｍより大きいか等しい波長を有する電磁気的放射線に（例えば、ナノダイヤモンド粒子が、前記参照した範囲の１つにおいて、蛍光放出及び／又は近赤外放出を放出するよう）曝露され得る。ある実施形態において、ナノダイヤモンド粒子は、１０００ｎｍより小さいか等しい、９５０ｎｍより小さいか等しい、９００ｎｍより小さいか等しい、８５０ｎｍより小さいか等しい、８００ｎｍより小さいか等しい、又は７５０ｎｍより小さいか等しい、７００ｎｍより小さいか等しい、６５０ｎｍより小さいか等しい、６００ｎｍより小さいか等しい、５５０ｎｍより小さいか等しい、５００ｎｍより小さいか等しい、４５０ｎｍより小さいか等しい、４００ｎｍより小さいか等しい、３５０ｎｍより小さいか等しい、又は３００ｎｍより小さいか等しい波長を有する電磁気的放射線に曝露され得る。前記参照した範囲の組み合わせがまた可能である（例えば、２５０ｎｍより大きいか等しい及び１０００ｎｍより小さいか等しい、５５０ｎｍより大きいか等しい及び６５０ｎｍより小さいか等しい）。他の範囲がまた可能である。
【００５９】
この本文での記述の多くが、（蛍光性）ナノダイヤモンド粒子の文脈にあるが、当業者は、本明細書の教示に基づき、他の粒子もまた可能であると理解するであろう。例えば、ある実施形態において、前記装置は、前記参照した範囲の１つにおける放出を有する、化学種（例えば、１つ以上の標的となる検体と結合することが可能な化学種）と結合した、ナノ粒子（例えば、シリカナノ粒子、サファイヤナノ粒子、ガーネットナノ粒子、ルビーナノ粒子）といった粒子を含み得る。ある場合において、粒子は、自動蛍光性であり得る。他の場合において、粒子は、蛍光性分子で機能化（例えば、結合）され得る。
【００６０】
ある実施形態において、前記流体装置（例えば、サンプル注入口及び複数のナノダイヤモンド粒子及びナノダイヤモンド粒子と結合した化学種を含む容器を含む）は、ラテラルフローアッセイの構成（例えば、ラテラルフロー装置において）を含む。当業者は、本明細書の教示に基づき、複数のナノダイヤモンド粒子及びナノダイヤモンド粒子に結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（例えば、結合（ｂｏｕｎｄ））した化学種をラテラルフローアッセイ装置に組み込む方法を理解するであろう。例えば、図２Ａに概略的に示すように、例となる実施形態において、システム２００は、ラテラルフローアッセイの構成を含む。ある実施形態において、システム２００は、第１の化学種と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子２２０を含む容器２１０を含む。容器２１０の下流には、ある実施形態においては、第２の化学種（例えば、標的検体に対する第１の抗体）を含む第２の容器２３０、及び第３の化学種（例えば、標的検体に対する抗体と結合することが可能な第２の抗体）を含む第３の容器２４０がある。ある実施形態において、第１の化学種及び第２の化学種は、同一である。
【００６１】
いま図２Ｂについて述べると、検体２５０を含む疑いのあるサンプルは、システム２００に導入され得る（例えば、サンプルが流れ及び容器２１０と相互作用するよう）。ある実施形態において、検体２５０の少なくとも一部は、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子２２０上で化学種と結合する。図２Ｃに示すように、検体２５０を含む疑いのあるサンプルがシステムに沿って流れるにつれ、検体２５０の少なくとも一部（例えば、今、化学種及び／又は複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子２２０と結合している）は、容器２３０中で第２の化学種と結合する。ある場合において、検体と結合していない複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子２２０の少なくとも一部は容器２４０（例えば、そこでは第３の化学種が、第１の化学種と結合することが可能である）で捕捉され得る。
【００６２】
ある場合において、この本文での装置及びシステムは、多重式であり得るすなわち、ある実施形態において、該装置は複数のナノダイヤモンド粒子を含む２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、又は５つ以上の流体成分及び／又は容器を含み得る。あるそうした実施形態において、１つより多くの検体が、サンプル中に存在する場合、単一の装置において検出され得る。ある実施形態において、１つ以上の検体が、複数のナノダイヤモンド粒子を含む複数の流体成分及び／又は容器を含む装置において検出され得る。
【００６３】
例となる実施形態において、検体を含む疑いのあるサンプルは、検体が存在する場合、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した少なくとも一部の化学種と結合するよう、サンプルを複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した化学種に曝露しながら、流体装置の流路に導入され得る。ある実施形態において、検体と結合していない任意の蛍光性ナノダイヤモンド粒子及び化学種は除かれ、検体と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光放出が定量され得る。この本文で述べられているように、ある場合において、サンプル中に存在する検体の量は、蛍光放出の強度に関連し得る。
【００６４】
他の例となる実施形態において、システムは、サンプル注入口、該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、及び該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域を含む。ある場合において、該検出器は、検出領域で蛍光放出を定量するよう配置されていてよく、及び／又は検出領域で赤外シグナルを検出するよう配置されていてよい。
【００６５】
さらに他の例となる実施形態において、流体装置は、サンプル注入口、該サンプル注入口と流体的に連通している容器であって、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む容器、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した複数の第１の化学種、及び該容器と流体的に連通している検出領域であって、該検出領域と結合した複数の第２の化学種を含む検出領域を含む。ある実施形態において、流体装置は、さらに検出領域と流体的に連通している制御領域であって、該制御領域と結合した複数の第３の化学種を含む制御領域を含む。あるそうした実施形態において、第３の化学種は、第１の化学種及び／又は第２の化学種と同一又は異なるものであり得る。例えば、複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子と結合した第１の化学種は、第１の抗体（例えば、標的検体と選択的に結合することが可能な）であり得、第２の化学種は、第１の抗体、又は第１の抗体（例えば、標的検体と選択的に結合することが可能な）とは異なる第２の抗体であり得、及び第３の化学種は、第１の抗体に対する抗抗体であり得る。前記制御領域は、放出が存在する場合、前記システムは適切に作動しているという示唆を提供する（例えば、複数のナノダイヤモンド粒子が適切に機能し、サンプル中に導入されている）。
【００６６】
ある実施形態において、前記流体装置は吸収剤を含む。ある実施形態において、吸収材を含む吸収領域は、検出領域及び／又は制御領域の下流に置かれ、及び検出領域及び／又は制御領域と流体的に連通している。ある場合において、吸収材は流体装置の１つ以上の成分（例えば、容器、検出領域）と結合している。ある場合において、吸収材は、少なくとも部分的に流体装置内でサンプルの流れ（例えば、ウィッキング）を駆動する。他の実施形態において、毛細管現象により、少なくとも部分的に流体装置内でサンプルの流れが引き起こされる。
【００６７】
適切な吸収材の限定されない例は、固体材料、孔質材料、粒子、粉末、及びゲルを含む。ある実施形態において、吸収材は、建材、セルロース、コットン、及び／又はポリマーを含み得る。当業者は、本明細書の教示に基づき、適切な吸収材を選択することができるであろう。
【００６８】
他の例となる実施形態において、この本文で述べられる方法は、特定の検体を有する（例えば、血流中に存在する）疑いがある被験者に、化学種が、存在する場合、検体と結合し得るよう、化学種と結合した複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子を投与する工程、及び、存在する場合、検体と結合した化学種を含む複数の蛍光性ナノダイヤモンド粒子の蛍光及び／又は近赤外放出を検出する工程を含む。ある場合において、蛍光放出の検出は、被験者中に血栓が存在することを示唆する。ある実施形態において、蛍光放出の検出は、被験者中にウィルス（例えば、エボラ、マールブルグ、ブンディブギョ、スーダン、フニン、ラッサ熱、ＭＥＲＳ、など）が存在することを示唆する。
【００６９】
明らかであるが、ある実施形態において、本発明は、またヒト又はヒト以外の動物における血栓事象の検出又はイメージングのための診断薬を提供し、該薬剤は、ディスインテグリンビチスタチン(Ｂｔ)と化学的に結合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子を含む。ある実施形態において、蛍光性ナノダイヤモンド粒子及びBtは、共有結合している。診断薬は、ナノダイヤモンド粒子に元来備わった性質の結果として、蛍光性であり得る。ある実施形態において、診断薬は、電磁気的源で励起された際、検出可能な電磁気的シグナルを放出する。
【００７０】
さらなる例となる実施形態は、血栓塞栓事象の診断又は予後診断のための方法に関する。これらの実施形態において、該方法は、血栓塞栓事象を罹患していた、又はそのリスクにある疑いのある被験者に、本発明の診断薬を診断的に十分な量、投与する工程、該診断薬を血栓部位（複数有り）に十分な時間局在化させる工程、及び該診断薬の蛍光放出を検出することで該診断薬を検出する工程を含む。該方法は、活性血小板の検出の方法、及び／又は被験者中の血栓又は血栓形成の検出の方法として実行することが可能である。
【００７１】
本発明の他の例となる実施形態は、キットに関する。該キットは、診断方法（例えば、血栓の検出のための診断方法）における分配、運搬、及び／又は貯蔵に適切な詰め合わせの形で本発明の診断薬を含み得る。詰め合わせの形は、診断薬の分配、運搬、及び／又は貯蔵に適切な材料を含み得る。ある実施形態において、キットは、詰め合わせの組み合わせで、被験者に本発明の診断薬を投与するための１つ以上の試薬又は装置をさらに含む。キットは、診断薬のために励起エネルギーを放出する装置を含むことがまた可能であり、好ましくは診断薬からの放出反応の検出のための検出器をさらに含む。具体的な例となる実施形態において、該装置（例えば、励起エネルギーを放出する装置、放出反応の検出のための検出器）は、手持ち式装置である。
【００７２】
本発明の範囲又は精神から離れることなく、種々の改変及び変形が、本発明の実践においてなすことができることは、当業者にとっては、明らかであろう。本明細書の考慮及び本発明の実践から、本発明の他の実施形態は、当業者にとっては明らかであろう。本明細書及び実施例は、例としてだけみなされることを意図しており、本発明の真の範囲及び精神は、以降の請求項により示される。
【００７３】
『被験者』又は『患者』とは、例えば、病気又は体調を受け得るほ乳類のような任意のほ乳類（例えば、ヒト）を指す。被験者又は患者の例は、ヒト、ヒト以外の霊長類、牛、馬、豚、ヒツジ、ヤギ、イヌ、猫又はネズミ、ラット、ハムスター、又はモルモットといったげっ歯類を含む。一般的に、本発明は、ヒトの使用のためのものである。患者は、ある病気又は体調と診断された被験者であり得、又はそうでなければ病気又は体調を有していると知らされ得る。ある実施形態において、患者は、病気又は体調と診断され、又は病気又は体調を助長しているリスクにあると知らされ得る。他の実施形態において、患者は、例えば、種々の臨床的因要素及び／又は他のデータに基づき、病気又は体調を有している又は助長していると疑われ得る。ある場合において、患者は、患者から得られるサンプル中の検体（例えば、ウィルス、抗原、抗体）の検出及び／又は定量の後に、具体的な病気又は体調を有している又は助長していると診断され得る。ある実施形態において、被験者は、例えば、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の投与で、健康的利益を示し得る。
【００７４】
この本文で使用されているように、『流体』は、その通常の意味で与えられ、すなわち液体又は気体である。流体は決まった形を維持することができず、観測可能な時間枠の間、流れて据え置かれる容器を満たすこととなる。それゆえ、流体は、流れを許容する任意の適切な粘度を有し得る。２つ以上の流体が存在す場合には、各流体は、当業者により、原則的に何らかの流体（液体、気体、など）の間で独立して選択され得る。
【００７５】
以降の実施例は、本発明のある実施形態を示すことを意図しているものであるが、本発明のすべての範囲を説明するものではない。
【実施例１】
【００７６】
次の実施例は、例となる、化学種(例えば,抗ヒト IgG-APに結合するための)を有する機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子を示す. 
【００７７】
図３は、カルボン酸基で機能化された、及び化学種（例えば、ビチスタチン）と結合した、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の複合化を示す。そのような機能化されたＦ−ＮＤＰｓは、例えば、外部スキャナー（例えば、ＵＶ及び／又はＮＩＲ放出のための検出器）を使用して、血栓の存在をイメージ化し及び検出するのに使用することができる。
【実施例２】
【００７８】
次の実施例は、ラテラルフローアッセイ構成といった例となるシステムへの蛍光性ナノダイヤモンド粒子の組み込みを示す。
【００７９】
図４は、３つの例となるシステム（システム４００、システム４１０、及びシステム４２０）を載せたものを示す。各々は、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の容器（各システム中、点線として示す）を伴い、ニトロセルロース基材上に置かれている。システム４００へ水を導入し、システム４１０へ１％ＴＷＥＥＮ２０を伴う水を導入し、及びシステム４２０へ１％ＴＷＥＥＮ２０を伴う１０ｍＭリン酸ナトリウム塩を導入した上で、各装置の基材に沿って、蛍光性ナノダイヤモンド粒子の流れを観測した（各々システム４０２、システム４１２、及びシステム４２２）。
【実施例３】
【００８０】
次の実施例は、検体（例えば、抗ヒトＩｇＧ）の検出のための化学種（例えば、ヒトＩｇＧ）と複合化した蛍光性ナノダイヤモンド粒子（Ｆ−ＮＤＰ）の使用を示す。
【００８１】
図５は、Ｆ−ＮＤＰＮＶと結合したヒトＩｇＧの検出（７００ｎｍ）についての半ＥＬＩＳＡのプロットを示す。Ｆ−ＮＤＰは、ヒトＩｇＧ、又はＢＳＡ（対照）と結合しており、１ｍｇのＦ−ＮＤＰ当たり、示されている濃度で使用した。０．２ｍｇの各Ｆ−ＮＤＰ−ＩｇＧ又はＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡサンプルを半ＥＬＩＳＡに使用し、Ｕ型底９６ウェルプレート上で行った。プレートは、ＰＢＳＴ中、３％ＢＳＡで一晩ブロックした。Ｆ−ＮＤＰ−ＩｇＧは、３７℃で１時間、培養することで、ＰＢＳＴ中、３％ＢＳＡでブロックした。ブロッキング剤は室温で遠心分離（１，０００ｘｇ）することで除き、ＰＢＳＴで２回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＡＰ−複合体（ＳｉｇｍａＩｎｃ．）を１：５０００に希釈して加え、前記のように１時間培養した。最終的な洗浄を前記のように行い、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩基質（ｐＮＰＰ）を塩基性ホスファターゼ（ＡＰ）に加えた。３０分間発色させ、プレート上のＮＤＰサンプルを遠心分離した。上澄みを平底９６ウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍの波長の下、読み取った。エラーバーは、同一のサンプル由来の半ＥＬＩＳＡにおける４つの繰り返しを表す。
【実施例４】
【００８２】
次の実施例は、血栓の検出のための、化学種（例えば、ビチスタチン（Ｂｔ））で機能化されたＦ−ＮＤＰｓの使用を示す。図６は、発生した血栓を伴うラット中での頸動脈におけるＦ−ＮＤＰ−Ｂｔの蓄積数を示す。発生した血栓を伴う又は伴わない（対照）頸動脈は、実験の最後にラットから切除した。血管は、１２Ｎ  ＨＣｌで、１ｍｌ当たり１００ｍｇの比で、６０℃で一晩培養することにより可溶化した。得られた溶液を水で１０倍に希釈し、室温で１４，０００ｒｐｍを使用して遠心分離し、同一の体積の水に再懸濁させた。Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔは、蛍光顕微鏡を備えた血球計を使用して計数した（４０ｘ対象物、ＴＲＩＴＣ波長）。示した数は、全蓄積粒子を示す。エラーバーは、３匹のラット由来の標準偏差を表す（血栓値＝２．８±０．３８ｘ１０７、対照値＝６．６±４．７ｘ１０５）
【００８３】
図７Ａは、発生した血栓を伴うラット由来の頸動脈の走査型共焦点顕微鏡（ＳＣＭ）画像である。血栓の発生は、塩化鉄を使用して行った。Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ懸濁液を血栓近傍に局所的に注入した。ラットを安楽死させ、血栓を伴う頸動脈を切除した。イメージングは、ＳＣＭを使用して行った。測定に使用した波長：励起Ｃｙ５．５ＢｋＧ（５８０−６１０ｎｍ）、放出Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。バックグラウンドの控除のために：励起ＧＦＰ（４４５−４９０ｎｍ）、放出Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。Ｆ−ＮＤＰ−ＢｉのＮＩＲ検出は、白矢印で示す。
【００８４】
図７Ｂは、発生した血栓を伴うラット由来の頸動脈の走査型共焦点顕微鏡画像を示す。血栓の発生は、塩化鉄を使用して行った。Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ懸濁液は、全身的に動物の尾に注入した。ラットを安楽死させ、血栓を伴う頸動脈を切除した。イメージングは、ＳＣＭを使用して行った。測定に使用した波長：励起Ｃｙ５．５ＢｋＧ（５８０−６１０ｎｍ）、放出Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。バックグラウンドの控除のために：励起ＧＦＰ（４４５−４９０ｎｍ）、放出Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。ＮＩＲ検出は、白矢印で示す。
【００８５】
図８は、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔで処理した又は処理していない、頸動脈中に発生した血栓近傍（局所的に）の大腿動脈に全身的に注入した、血栓の組織懸濁液の画像を示す。血栓の組織は、１００ｍｌに対し１つの静脈の比で、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ベース）の存在下、手動で均一にした。溶解物の懸濁液をガラススライド上に適用し、直ぐに顕微鏡下で分析した。倍率１００倍。
【実施例５】
【００８６】
次の実施例は、ポリペプチド（例えば、ビチスタチン（Ｂｔ））でのＦ−ＮＤＰ（すなわち、ＮＤＰ−Ｆ）の機能化及び１つ以上の検体及び／又は血栓の検出を示す。
【００８７】
カルボキシル機能化されたＮＤＰ−Ｆへタンパク質／ペプチドを結合させる方法論は、この本文で述べられる。結合したタンパク質／ペプチドの生体活動を担う活動領域の保存は、挑戦的なままであり、一般的に試行錯誤努力とみられる。本発明の主な革新は、改変ＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔ剤の精製したＰＦＲへの濃度依存結合の提示である。Ｂｔの選択は、ビトロネクチン（ａｖｂ３）及びフィブロネクチン（ａ５ｂ１）についての受容体といった他のＲＧＤ依存インテグリンとの無視できる相互作用と併せた、ＢｔのＰＦＲへの高い選択性／特異性に基づいている。血栓イメージングのためにＢｔを使用する本戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血栓をマップするＴｃ９９−ビチスタチンの有用性を示すことを目的とした過去の研究とは著しく異なる。本イメージング戦略は、ＮＤＰ−Ｆを励起することで放出される本来備わる近赤外（ＮＩＲ）蛍光に基づいており、それにより他のイメージング技術に必要とされる高放射活性曝露を除く。Ｂｔ（又は他のポリペプチド）のナノ粒子への結合は、その生体標的部位でのＢｔの寿命の延長に有益であろうことがまた想定される。
【００８８】
カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子（ＮＤＰ−Ｆ又はＦＮＤＰ）は、Ａｄａｍａｓ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から購入した。サイズ分布分析により、ＮＤＰの直径のピークは７３４．５（±２２３．６、ＳＤ）ｎｍであることが明らかとなった。ＮＤＰｓについての蛍光の最適化は、励起対放出波長の２Ｄスクリーニングで行った（図９）。ＮＤＰｓについての２つの最適な蛍光領域を確立したが、それは医療的イメージングでの適用に有用であるはずである。（図９の丸）。詳細なスクリーニングにより、２つの最適な励起対放出波長の相関が明らかとなった：４８０ｎｍ対５２０ｎｍ、及び５６５ｎｍ対７００ｎｍである。第１の相関は、典型的な緑色蛍光を示すが、第２のものは、ＮＩＲ放出を伴う長ストークスシフトと同定される。該ＮＩＲ放出は、検出ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出に非常に有用であり、というのも、それはヒト及びヒト以外の動物の非侵襲的イメージング環境（例えば、水、ヘモグロビン、オキシヘモグロビン、メラニン）に存在する要素の自動蛍光の光学的治療的ウィンドウにあるためである。
【００８９】
前記ＮＤＰ−Ｆｓは、光退色に対して耐性があることがみつかっている。ＮＤＰｓを含むスライドを強い蛍光に曝しても５時間の時点において、その蛍光の強度に変化は見られない（データは示していない）。
【００９０】
ビチスタチンは、一般的にヘビ毒に由来し、タンパク質のディスインテグリン属に属する。ビチスタチンは、放射性のタグを使用して、深い静脈血栓（ＤＶＴ）の潜在的な検出試薬として以前に調査が行われている。このＲＧＤ−ディスインテグリンは、キストリン及びバーブーリンといった、他のヘビ毒ディスインテグリンと比較した際、ＤＶＴの検出のための所望のパラメータを示した。それゆえ、このフィブリノゲン受容体結合配位子は、静脈循環（静脈血栓）中に存在する血栓中の活性血小板（又はそれら集積体）の目的で、ＮＤＰ−Ｆｓへ結合させるために選択した。
【００９１】
ビチスタチンは、一般的に８３−アミノ酸ポリペプチドであり，元々はＢｉｔｉｓ  ａｒｉｅｔａｎｔｓの毒から単離されたものである。この天然のポリペプチドは、他のヘビ毒ディスインテグリンの精製のために研究室で開発された方法論を使用することで、同一のヘビ毒から精製される（Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｃｅｚａｒｙら．  『ＥＣ３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ  ｖｅｎｏｍ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  α４及びα５  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｉｎ  ａｎ  ＲＧＤ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．』  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４．１８  （１９９９）：  １２４６８−１２４７３．、参照によりこの本文に組み入れられる）。簡潔に言えば、この方法は、Ｃ１８カラムの適用を伴う逆相ＨＰＬＣ、及びタンパク質溶離剤として、アセトニトリルの線形勾配、の２つの工程を含む。得られたＢｔの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでテストし、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ青色染色による標準タンパク質ゲル上のバンドのデジタル処理により定量した。Ｂｔの含有量は、最終的なタンパク質配合において、９８％を超えるものと見積もった。この配合をＮＤＰに結合するためにＰＢＳ中につり下げた。
【００９２】
Ｂｔの活性部位が特定され、ＲＧＤモチーフを含むことがみつかった。それは、αＩＩｂβ３、αｖβ３、及びα５β１といった、あるインテグリンへ結合している配位子に重要である。Ｂｔは、ＰＦＲ、αＩＩｂβ３インテグリンにのみ結合することが示されたとった点でかなり選択的であり、それはもっぱら循環血小板上で発現される。ＲＧＤシーケンス中のアスパラギン酸は、組み替えタンパク質の部位特異的な突然変異生成、及びフィブリノゲン受容体に結合しているディスインテグリンに最も重要なアミノ酸として、短ペプチド合成に認識された。本発明者は、Ｂｔを取り付けたアミン基で機能化されたＮＤＰｓと結合することは、アスパラギン酸の側鎖中に存在するカルボキシル基の関与により、ディスインテグリンの活性に影響を与え得るとの仮説を立てた。それゆえ、カルボキシル基で機能化されたＮＤＰｓを、ＢｔをＮＤＰｓ表面上に取り付けるのに選択した。
【００９３】
ＮＤＰｓ上に存在するカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基をＢｔ上に存在するＮＨ２基へ結合することは、以前に開発された（Ｇｒａｂａｒｅｋ及びＧｅｒｇｅｌｙ、１９９０）標準的な手順を使用して行った。この方法は、クロスリンカーである１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の適用に基づいており、それはカルボキシル基を活性して、アミノ基と素早く反応し、アミド結合を形成するＯ−アシルイソウレア中間体を形成させることでカルボキシル基を活性化させる。Ｏ−アシルイソウレアは、一般的に、迅速な加水分解を受ける。それゆえ、結合の効率を増加させるために、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を反応混合物に加えて、アミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルを生成させた。
【００９４】
ＢＳＡを同時に対照のＮＤＰと結合した。
【００９５】
例となる適切な結合手順の詳細な説明は、次の通りである:
【００９６】
２つのＮＤＰのサンプル、０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、１．８ｍｌ中、各々２ｍｇを含むもの、を調製した。サンプルＡは、１ｍｇＮＤＰｓ当たり１ｍｇＢのＢｔを含んだ。サンプルＢは、１ｍｇＮＤＰｓ当たり１ｍｇＢＳＡを含み、対照とした。
【００９７】
各サンプルに対し、０．７２ｍｇのＥＤＣを加え、該混合物を室温（およそ２１°Ｃ〜２５°Ｃ）で、１５分間穏やかな回転とともに培養した。培養の後、２．５μｌの２−メルカプトエタノールを（２０ｍＭの最終濃度を与えるために）加え、ＥＤＣを失活させ、カルボキシル基活性化を停止した。
【００９８】
前記活性したＮＤＰｓを１．５ｍＬ遠心分離管に移し、室温で５分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した。ＮＤＰペレットを１ｍＬのＰＢＳで２度線洗浄し、結合緩衝液（ＰＢＳ）中につり下げた。１ｍＬのＰＢＳ中、１ミリグラムのＢｔ又はＢＳＡのいずれかを含むものを各サンプル管に加えた。サンプル管は、穏やか回転ともに室温で２時間培養した。１Ｍヒドロキシルアミン−ＨＣｌ（５ｍＬのＰＢＳ中、３５０ｍｇ）１０μを失活のため、各サンプル管に加えた（ヒドロキシルアミン−ＨＣｌの最終的な濃度は、およそ１０ｍＭであるべきである）。
【００９９】
前記サンプル管を室温で５分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した。上澄みは、結合効率をチェックするタンパク質濃度を決定するためにとっておいた。ＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔ粒子は、毎回１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。洗浄した粒子を大量のＰＢＳ中につり下げ、１ｍｇ／ｍｌの濃度を達成した。
【０１００】
結合効率を、ＮＤＰｓの表面上のＢｔ（ＮＤＰ−Ｂｔ）の免疫検出を使用して、評価した。本明細書中における参照の簡便のため、該検出方法を、半ＥＬＩＳＡと呼ぶ。広く言えば、Ｂｔに対するポリクローナル抗体を、精製したそのままのポリペプチドを抗原として使用して、ラビット中で商業的に発現させた（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．）。Ｂｔの飽和濃度を１ｍｇＮＤＰｓ当たり１ｍｇで見積もった。３つの独立した実験に由来する代表的なプロットを、図１０に示す。
【０１０１】
結合効率を決定するための、例となる適切なアッセイは、次の通りである:
【０１０２】
Ｕ型底を有する、前にＰＢＳ中、５％ＢＳＡで４℃で一晩培養してブロックした９６ウェルプレートを使用し、２００μｌのＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔ又はＮＤＰ−Ｆ−ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬのＮＤＰ）を、各々、個別のウェルに適用した。該プレートを１，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した。上澄みを除き、プレートをボルテックスで穏やかに振とうし、ＮＤＰ−Ｆのペレットを分散、再懸濁させた。
【０１０３】
ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％−２０）中、２００μｌの１０％ヤギ血清を加え、ピペットの先から熱心に吸引、放出することで、数度混合した。該混合物を３７°Ｃで１時間ゆっくりと撹拌することで培養した。混合物を前記のように遠心分離し、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。各遠心分離の後、ペレットをボルテックスで分散させた。最終的な洗浄の後、１００μｌの抗ビチスタチン（ＰＢＳＴ中、５μｇ／ｍｌ）をウェルに加え、室温で１時間培養した。プレートを前記のようにＰＢＳＴで３回洗浄した。各ペレットに対し、１００μｌの、ＰＢＳＴ中、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａから）１：２０００希釈液をウェルに加え、該混合物を３７°Ｃで１時間培養した。混合物は１０分間１，０００ｘｇで遠心分離し、ペレットは前記のようにＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１０４】
１５０μｌのＡＰ基質ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａから）を加え、室温で穏やかに撹拌して、およそ３０分間発色させた（黄色の強度が見えるようになるまで）。反応は、１００μｌの３Ｍ  ＮａＯＨを加えることでブロックした（この工程は、任意選択的である）。プレートを遠心分離し、１００μｌの上澄みを９６ウェルプレート（平底）に移した。上澄みの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍで測定した。
【０１０５】
血小板、αＩＩｂβ３インテグリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．）から精製したＰＦＲを使用して、ＮＤＰ−Ｂｔの活性をテストした。２つのタイプのアッセイを、溶解性ＰＦＲのＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔへの結合、及びＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔの表面（プラスチック又はガラス）上へ固定されたフィブリノゲン受容体への接着を含む、ＮＤＰ−Ｂｔ上でのディスインテグリンの存在を確認するために、適用した。溶解性ＰＦＲの結合は、この本文で機能的半ＥＬＩＳＡと称される、機能的『サンドイッチ』ＥＬＩＳＡに基づき、決定した。この場合において、αＩＩβインテグリンサブユニット（ＳａｎｔａＣｒｕｚＩｎｃ．より購入）に対するポリクローナル抗体を使用して、ＮＤＰ−Ｂｔと結合したαＩＩｂβ３インテグリンの免疫検出を行った。
【０１０６】
フィブリノゲン受容体のＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔへの結合を検出するための、機能的半ＥＬＩＳＡのための例となる適切な手順は、次の通りである。
【０１０７】
Ｕ型底を有し、前にＰＢＳ中、５％ＢＳＡで４℃で一晩培養してブロックした９６ウェルプレートを使用し、２００μｌのＮＤＰ−Ｆ−Ｂｔ又はＮＤＰ−Ｆ−ＢＳＡ懸濁液（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬＮＤＰ）を、各々、個別のウェルに適用した。プレートは、１，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した。上澄みを除き、プレートをボルテックスで穏やかに振とうさせ、ＮＤＰ−Ｆのペレットを分散させた。２００μｌの３％ＢＳＡ  ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％−２０）を加え、組成物をピペットの先から熱心に吸引、及び放出することで、２、３回混合した。該混合物を３７°Ｃで１時間、穏やかに撹拌とともに培養した。代わりに、９６ウェルプレート上での適用の前に、ブロッキング工程はサンプル管中で行われ得る。混合物を前記のように遠心分離し、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。各遠心分離の後、ペレットはボルテックスで分散させた。
【０１０８】
フィブリノゲン受容体を所望の濃度（すなわち、用量−反応を発生させるのに必要とされる量）で加えた、図１１を参照されたい（生理学的濃度のＣａ２＋及びＭｇ２＋を含む、２００μｌのＨＢＳＳ中、３７°Ｃで１時間培養。プレートを前記のようにＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、ＰＢＳＴ中、１００μｌの抗フィブリノゲン受容体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．より２μｇ／ｍｌ）ポリクローナル抗体をウェルに加え、室温で１時間培養した。プレートを前記のようにＰＢＳＴで３回洗浄した。ペレットに対し、ＰＢＳＴ中、１００μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａから）１：３０００希釈液をウェルに加え、３７°Ｃで１時間培養した。混合物を１，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した、ペレットを前記のようにＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１０９】
１５０μｌのＡＰ基質ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａから）を加え、穏やかな撹拌とともに、およそ３０分間発色させた。反応は、１００μｌの３Ｍ  ＮａＯＨを加えることでブロックした（この工程は、任意選択的である）。プレートを遠心分離し、１００μｌの上澄みを９６ウェルプレート（平底）に移した。上澄みの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍで測定した。
【０１１０】
図１１からわかるように、ＰＦＲは、用量依存の方式において、ＮＤＰ−Ｂｔと結合し、一方、対照ＮＤＰ−ＢＳＡは、このアッセイにおいては活性でなかった。
【０１１１】
固定したフィブリノゲン受容体に対するＮＤＰ−Ｂｔの接着を、取り付けたＮＤＰｓの蛍光の概算に基づく、２つの形式で行った。初めに、インテグリンを９６ウェルプレート上に固定し、接着したＮＤＰｓを蛍光プレートリーダーを使用して検出した。得られた結果では、固定した精製した受容体の濃度の増加に対し、ＮＤＰ−Ｂの接着が線形的進歩を示した（図１２）。ＮＤＰ−Ｂｔの接着を、また蛍光顕微鏡でモニターした。接着したＮＤＰｓの数は、コンピュータソフトウェアを使用して定量した（図１３）。接着したＮＤＰ−Ｂｔの代表画像を図１４に示す。
【０１１２】
ＦＮＤＰの効果をさらに特定するために、外頸動脈注入を経由してＦＮＤＰで処理した後の頸動脈血栓の蛍光画像を、ＩＶＩＳ及び共焦点顕微鏡により撮影した。結果を図１５に示す。２つの独立した実験において、ＦｅＣｌ３の適用の３〜５分の後、外頸動脈を経由してＦＮＤＰの注入を開始し、１５分間を超えて続けた。（ＦｅＣｌ３注入の終了の５分過ぎ）。ＦＮＤＰ溶液は、５ｍｇ／ｍＬのＦＮＤＰが懸濁した（溶液のボルテックスの後）、１．５ｍＬのＰＢＳから成っていた。この注入経路は、周辺器官による粒子の、起こり得る『ファーストパス』除外を回避するために選択した。ＦＮＤＰ注入の完了に続き、ラットを安楽死させ、ＩＶＩＳ及び／又は蛍光顕微鏡法によるイメージングを行った。図１５Ａ−Ｄは、２秒の露光で５８０−６１０ｎｍ励起及び６９５−７７０ｎｍ放出通過域を使用した、全動物イメージングのために設計されたＩＶＩＳスキャナーで行った蛍光のイメージングを示す。自動蛍光は、４４５−４９０ｎｍでの励起に基づき、差し引いた。図１５Ａは、頸動脈分岐部領域を露光した後の、ＩＶＩＳイメージングを経由して可視可処理した後の、頸動脈血栓の蛍光を示す、ｉｎ  ｓｉｔｕでの頸動脈分岐部領域画像を示す。図１５Ｂ及び１５Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの頸動脈分岐部由来の蛍光発散の高拡大画像であり、血栓中のＦＮＤＰの蓄積を示唆する。図１５Ｄは、頸動脈分岐部内での血栓の位置に相当する、蛍光を示す１つの枝を表す、ｅｘ  ｖｉｖｏでの頸動脈分岐部の蛍光の写真である。図１５Ｅ及び１５Ｆは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８３で撮影した、蛍光が５４３ｎｍの励起、及び６５５−７５５ｎｍの放出で検出される、ＦＮＤＰの共焦点画像である。バックグラウンドの蛍光は、５５５−６２５ｎｍの放出を伴う、同一の励起から集め、自動蛍光を軽減するためにフォアグラウンドから差し引いた。図１５Ｅは、４倍に拡大したｅｘ  ｖｉｖｏでの頸動脈の蛍光を示す。図１５Ｆは、ＲＩＰＡ溶解緩衝液で流した後、ＦＮＤＰで処理した頸動脈を示し、複製物はともにして溶解物を形成させた。溶解物をカバーガラス上に堆積させ、２０倍に拡大してイメージ化した。血小板周りに種々の凝集体サイズで多くのＦＮＤＰが視認できる。
【０１１３】
図１６は、ＦＮＤＰで静脈を処理した後の、ＩＶＩＳ及び共焦点顕微鏡で撮影した頸動脈血栓の蛍光画像を示す。塩化鉄で血栓を形成させた後、尾の静脈又は大腿動脈を経由した静脈注入による、生理食塩水対照での処理又はＦＮＤＰでの処理を３匹のラットに行った。ＦＮＤＰは、１ｍｇ／ｍＬのＦＮＤＰを含む１ｍＬの溶液で、ＰＢＳ中の懸濁液として注入した（１０分を超えて）。頸動脈はイメージングのために動物から除き、イメージングまでの保存のため、７０％変性エタノール中に置いておいた。ＦＮＤＰは、血栓形成部位に顕著に確認された。ＦＮＤＰは、静脈注入に続いて得た３つの各標本中に確認されたが、３つの標本は、溶解物の調査のため、１つのものとして、ともに処理した。図１６Ａ及び１６Ｂは、行ったように、２秒の露光で５８０−６１０ｎｍ励起及び６９５−７７０ｎｍ放出通過域を使用した、全動物イメージングのために設計されたＩＶＩＳスキャナーでの蛍光のイメージングを示す。自動蛍光は、４４５−４９０ｎｍでの励起に基づき、差し引いた。図８Ａは、生理食塩水処理対照由来のｅｘ  ｖｉｖｏでの頸動脈の蛍光画像を示す。自動蛍光は、完全に除くことはできなかったが、対照標本に沿って均一に分散させた。図１６Ｂは、ＩＶ  ＦＮＤＰ処理した動物由来のｅｘ  ｖｉｖｏでの頸動脈の蛍光画像を示し、血栓を伴う枝に局在化した蛍光を示す。図１６Ｃ−１６Ｆは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８３で撮影した共焦点画像を示す。図は、ＦＮＤＰ蛍光が、５４３ｎｍの励起及び６５５−７５５ｎｍの放出で検出されたことを示す。バックグラウンドの蛍光は、５５５−６２５ｎｍの放出を伴う、同一の励起から集め、自動蛍光を軽減するために、フォアグラウンドから差し引いた。図１６Ｃ及び１６Ｄは、各々、生理食塩水処理した及びＦＮＤＰ処理した動物の４倍拡大した、ｅｘ  ｖｉｖｏでの頸動脈の蛍光を示す。自動蛍光は、完全には除くことはできなかったが、対照標本に沿って均一に分散しており、一方蛍光は、ＩＶ処理した動物において、血栓を伴う枝に局在化していた（パネル１６Ｅ及び１６Ｆを参照されたい。）。処理した頸動脈をＲＩＰＡ溶解緩衝液で流し、複製物は、ともにして溶解物を形成させた。溶解物をカバーガラス上に堆積させ、２０倍に拡大してイメージ化した。視覚的調査のためのコントラストを増加させるため、画像は、画像Ｊ中で不明瞭なマスクとともに処理した。
【０１１４】
図１６Ｅは、生理食塩水処理した対照は、検出可能な蛍光を示さなかったことを示す。図１６Ｆは、処理したサンプル中、蛍光スポットとして頻繁に現れることを示す。図１６Ｇは、外頸動脈又は静脈を経由して局所的に処理した動物由来の頸動脈血栓溶解物中に存在するＦＮＤＰｓの数の、生理食塩水処理した対照との比較を示すグラフを表す。ＦＮＤＰｓは、画像Ｊ中での閾値化した後、複製画像において数えた。
【０１１５】
図１７は、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ及びＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡで処置した後のラット血液血漿血栓の画像を表す。ラットの血液を心臓穿刺により集め、室温で２０分間１００ｘｇで遠心分離して、血小板豊富な血漿（ＰＲＰ）を得た。血栓は、トロンビン（１Ｕ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１５分間培養することで発生させた。形成させた血栓を、カルシウム及びマグネシウムを含むＨＢＳＳでデカンテーションすることで３回洗浄し、スライスした。血栓片はカルシウム及びマグネシウムを含むＨＢＳＳ中、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ及びＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡ（５０μｇ／ｍｌ）の懸濁液で３７℃で６０分間で培養し、前記のように同一の緩衝液で３回洗浄し、イメージングのためにガラススライド上に適用した。蛍光顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１解析より得られた、１００倍に拡大した、血漿血栓の画像を図１７Ａに示す。ＩＶＩＳ  ５０イメージングシステムを使用して得られた血漿血栓の画像を図１７Ｂに示す。測定に使用した波長：励起  Ｃｙ５.５ＢｋＧ（５８０−６１０ｎｍ）、放出  Ｃｙ５.５（６９５−７７０ｎｍ）。バックグラウンドの控除のために：励起  ＧＦＰ（４４５−４９０ｎｍ）、放出  Ｃｙ５.５（６９５−７７０ｎｍ）。露光時間：１分。図１７Ｂの矢印は、血栓の局所化を指す。
【０１１６】
図１７は、トロンビン（１Ｕ／ｍｌ）により、ラット血液血漿から発生した血栓を伴うＦ−ＮＤＰ−Ｂｔの相互作用の特異性を示す。蛍光顕微鏡（図１７Ａ）で血栓を解析すると、高程度でＦ−ＮＤＰ−Ｂｔが血栓表面上に蓄積してはいるものの、この蓄積は均一に分散されていないことが明らかとなった。蛍光顕微鏡イメージングにより、高い緑色蛍光強度を伴う領域が確認されたが（黒色及び白色画像中、明点で表される）、それは活性血小板の濃縮域を示唆し得る。蛍光ライブイメージングシステム（ＩＶＩＳ  ５０）は、またＦ−ＮＤＰ−Ｂｔの血漿血栓への結合を示す（図１７Ｂ）。しかしながら、このシステムにおいて、近赤外（ＮＩＲ）検出は、図９に示すように行われた最適化に基づき、セットアップした。表面（Ｆ−ＮＤＰ−ＢＳＡ）に結合したＢＳＡを含む対照ナノ粒子は、両イメージングアッセイにおいて、無視できる程度で血栓と相互作用した。近赤外によるＦ−ＮＤＰ−Ｂｔの検出により、生きた器官でのイメージングのための、機能的に活性なＦ−ＮＤＰ−Ｂｔの有用性が示唆された。というのも、放出波長が『光学』的治療的ウィンドウ（６００−１３００ｎｍ）に局在化しているためである。
【０１１７】
それゆえ、その仮説の実証のために、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔの検出をラットモデル中で行った。結果を図１８に示す。観察野の皮膚領域を、移植のためにカミソリにより準備した。外科用メスで切開し、死んだラットの皮下に血管を挿入した。死んだラットをＩＶＩＳ  ５０イメージングシステムに置き、ＮＩＲスペクトルの下、蛍光測定を行った。測定に使用した波長：励起  Ｃｙ５．５ＢｋＧ（５８０−６１０ｎｍ）、放出  Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。バックグラウンドの控除のために：励起  ＧＦＰ（４４５−４９０ｎｍ）、放出  Ｃｙ５．５（６９５−７７０ｎｍ）。
【０１１８】
Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ（４ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ（対照）で満たした、移植したガラスキャピラリーの代表画像を図１８Ａに示す。露光時間は５秒であった。図１０Ｂは、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔで満たしたラットの大動脈の画像を示す。ラットの大動脈は、安楽死させた雌のラットから切除して、ＰＢＳで洗浄して凝固血液の残りを除き、ＰＢＳ中、３００μｌのＦ−ＮＤＰ−Ｂｔ懸濁液（２ｍｇ／ｍｌ）で満たした。大動脈は縫合糸の結び目で両端に固定した。露光時間は１分であった。図１８Ａは、ラットの皮下に実験的に移植されたＦ−ＮＤＰ−ＢｔのＮＩＲイメージングを示す。皮下移植の前に、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔの懸濁液をガラスキャピラリーに注入し、切開したラットの大動脈に注入した（図１８Ｂ）。明確な画像により、ラットにおける人工（キャピラリー）及び自然（大動脈）血管のいずもの正確な位置確認が示された。
【０１１９】
最後に、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔの、先に形成されたＰＲＰ血栓中の活性血小板上に存在するフィブリノゲン受容体との相互作用の特異性を調査した（図１８Ｃ−１８Ｄ）。２つの別々の実験において、血栓を、各々、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔで１５又は６０分間培養した。血栓は、トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）により、ラットＰＲＰより発生させ、Ｌｔ（４．６７μｍｏｌ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔ（２５０μｇ／ｍＬ）で培養した。（図１８Ｃ）ＩＶＩＳイメージングをＧＦＰフィルター（励起  ４４５−４９０ｎｍ、放出  ５１５−５７５ｎｍ）を使用して行った。血栓をＦ−ＮＤＰ−Ｂｉｔで１５分間（上のパネル）又は６０分間（下のパネル）培養した。蛍光強度をＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．３．１ソフトウェアを使用して評価した。バー上の挿入は、ＩＶＩＳ由来の血栓の各画像を表す。（図１８Ｄ）血栓の相コントラスト及び蛍光顕微鏡画像（１００倍）。Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔの蓄積領域は、黄色で囲ってある。培養期間にかかわらず、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔの結合は、常に非特異的対照粒子（Ｆ−ＮＤＰ−ＢＳＡ）のそれよりも４〜５倍高かった。さらに、ロトラフィバン（ｌｔ）での血栓の前培養は、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔの結合を対照Ｆ−ＮＤＰ−ＢＳＡの程度にまで減少させた。
【０１２０】
ビチスタチンを２工程の逆相ＨＰＬＣを使用して、Ｂｉｔｉｓ  ａｒｉｅｎｔａｎｓ  （Ｌａｔｏｘａｎ  Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ，  Ｖａｌｅｎｃｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）の毒から精製した。カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で化学的に表面機能化されたＦ−ＮＤＰは、Ａｄａｍａｓ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ．  ＮＣ，ＵＳＡ）から購入した。２種類のＦ−ＮＤＰを使用した：７００ｎｍでのＮ−Ｖ−Ｎ色中心（Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ））に基づく緑色蛍光性Ｆ−ＮＤＰ（２ｘ１０８粒子／ｍｇ）及び１００ｎｍでのＮ−Ｖ（Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ））色中心に基づく赤色蛍光性（５ｘ１０１１粒子／ｍｇ）、７００ｎｍ（２ｘ１０８粒子／ｍｇ）、及び１０，０００ｎｍ（５ｘ１０５粒子／ｍｇ）。イソフルランは、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ（Ｂ３４Ｃ１６Ａ  Ｄｕｂｌｉｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）から購入した。７０％変性エチルアルコール及びＰＥ−１０管は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入した。絹の縫合糸は、Ｒｏｂｏｚ  ＳＵＴ−１５−１、Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）から購入した。パラフィルム及びＦｅＣｌ３は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）から購入した。
【０１２１】
ビチスタチンは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）を使用して、ヘテロ二官能性クロスリンカーとして、すべての型のＦ−ＮＤＰと結合させた。種々の機能化されたナノダイヤモンド粒子（Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔ）上での結合効率及びビチスタチン活性の保存は半ＥＬＩＳＡ法を使用して検証した。
【実施例６】
【０１２２】
次の実施例は、血小板及び好ましくはヒト由来の活性血小板と結合する機能化された蛍光性ナノダイヤモンド粒子（例えば、（Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ））の使用を示す。データは、また粒子が、実質的に血小板凝集に関与しないことを示す。
【０１２３】
例えば、図１９Ａ−１９Ｃは、プローブ（すなわち、Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔ）を伴う又は伴わない血小板の凝集についての用量反応曲線を示し、プロテイナーゼ−活性受容体４（ＰＡＲ４  ＡＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、及びアラキドン酸（ＡＡ）の濃度の関数として決定される。
【０１２４】
図２０Ａ−２０Ｃは、７００ｎｍ又は２００ｎｍの平均粒子直径を有するＦ−ＮＤＰ−Ｂｔプローブの、異なる濃度での種々の血小板個数と結合する能力を示す。図２１−２２２は、刺激あり対刺激なし血小板個数におけるプローブ（直径７００ｎｍ又は２００ｎｍ）の結合の差を示す。
【０１２５】
Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｔプローブを使用した、刺激あり及び刺激なし血小板のフローサイトメトリーデータを図２３Ａ−２３Ｄ及び図２４Ａ−２４Ｄに示す。
【実施例７】
【０１２６】
次の実施例は、血液及び／又は生体組織におけるＦ−ＮＤＰ−（ＮＶ）の抽出、単離、及び／又は定量の例となる方法を示す。
【０１２７】
１．この本文で述べる結合手順を、無菌状態（例えば、実施例８を参照されたい）で使用して、Ｆ−ＮＤＰ−ＢＳＡ  ＮＶ７００ｎｍを調製した。動物投与のために最終濃度５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中、調製した。
【０１２８】
２．４用量の１ｍＬ（ＰＢＳ中、５ｍｇ／ｍＬ）のＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡを１被験者（例えば、動物）当たりに注入した。血液（ＴＢＤ）は、異なる時間間隔で３．８％クエン酸ナトリウム（１：９の比で）に集められ得る。対照グループは、同等の体積の生理食塩水を注入され得る。ＰＢＳ−注入動物由来の血液は、同一の方法で集められ、処置したサンプルは処理される。手順の最後に、およそ１０ｍＬの血液が集められ得る。
【０１２９】
３．Ｆ−ＮＤＰ−ＢＳＡを含む血液は、ＳｐｅｅｄＶａｃシステム（ＳＣ１１０Ａ  Ｐｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ）を４、６８０ｘｇで使用して凍結乾燥され得る。対照動物は、標準曲線の作成に使用され得る。標準曲線は、既知量のＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡを血液と混合することで作成され得る。８連続希釈法が最も高い、２ｍｇ／ｍＬ粒子密度から出発して作製され得る。
【０１３０】
４．実験途中で集められた乾燥質量の血液を含む粒子は、血液の体積（およそ１ｍｌ）と同一の体積で１２Ｎ  ＨＣｌに溶解され得る。可溶化が６０℃で一晩培養することにより行われ得る。
【０１３１】
５．上澄みは、遠心分離（室温で５分間、１７，０００ｘｇ）により除かれてよく、ペレットは元の体積（例えば、水１ｍｌ）と同一の体積に再懸濁させてよい。遠心分離は、洗浄のため１度繰り返されることとなる。この点で、粒子は少量の水を使用し濃縮され、感度を向上させ得る。例えば、最終的な水の体積は、例えば、Ｆ−ＮＤＰの検出感度が２倍に増加することとなるよう、凍結乾燥のために使用した血液の体積の２倍より小さいものであり得る。
【０１３２】
６．調査したサンプルのＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡの懸濁液及び標準曲線は、９６ウェルプレート（ウェル当たり１００マイクロリットル）に適用されてよく、プレートは、ＮＩＲ波長（励起５７０ｎｍ、放出６７０ｎｍ）を使用してＴｅｃａｎに読まれ得る。同時に、ｍｌ当たりの粒子の数は、蛍光顕微鏡下、計数しながら、例えば、ＴＲＩＣＩ波長及び４００倍拡大でＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１を使用しながら、使い捨て血球計（ＩｎｃｙｔｏＩｎｃ．，Ｃｈｅｏｎａｎ−ｓｉ，Ｋｏｒｅａ）により確立され得る。調査したサンプルにおけるＦ−ＮＤＰ−ＢＳＡの量は、標準曲線から差し引かれ得る。
【実施例８】
【０１３３】
次の実施例は、Ｆ−ＮＤＰｓの殺菌及び／又は凍結乾燥のための例となる方法を示す。
【０１３４】
１．Ｆ−ＮＤＰｓを７０％エタノール中につり下げ、『Ｓｐｅｃｉ  Ｍｉｘ  Ｔｅｓｔ  ＴｕｂｅＲｏｃｋｅｒ』（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ  ＵＳＡ）上での穏やかな撹拌を使用して、室温で１５分間培養した（２３＋／−２０Ｃ）。Ｆ−ＮＤＰｓの密度は、およそ０．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１３５】
２．Ｆ−ＮＤＰｓの懸濁液は遠心分離され得る（例えば、室温で５分、１７，０００ｘｇ）。上澄み（エタノール）真空吸引、水又は緩衝液（例えば、ＰＢＳ又はＭＥＳ）につり下げられたペレットで除かれてよく、洗浄目的で同一の速度条件の下、再度遠心分離され得る。
【０１３６】
３．Ｆ−ＮＤＰｓを所望の密度（例えば１ｍｇ／ｍｌ）で水又は作業緩衝液（例えば、ＭＥＳは、タンパク質と結合している場合、行われることとなる）につり下げた。
【０１３７】
４．Ｆ−ＮＤＰｓの凍結乾燥は、ＳＰｅｅｄＶａｃシステム（ＳＣ１１０Ａ  Ｐｌｕｓ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ，  ａｎｄ  Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）を使用して行われ得る。例えば、ポリプロピレン管５ｍＬ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｉｎｃ．，  Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又は１．５ｍＬ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を凍結乾燥のために使用した。このシステムは、一般的に、低い乾燥速度を与える外気温度での作動するために、セットアップされた濃縮器とともに作動する。例えば、４３ｏＣ−６５ｏＣ温度の範囲での高い乾燥速度及び作業の適用は、Ｆ−ＮＤＰに取り付けられた、あるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドに有害であり得る。濃縮器は、４，６８０ｘｇの最大力を与える８，５００ｒｐｍの最大速度で使用され得る。真空ポンプ（ｍｏｄｅｌ  ＶＬＰ１２０，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ）は、最終全圧１．５ｘ１０−３Ｔｏｒｒを与えるガスバラスト制御『閉鎖』位置のためにセットアップされ得る。冷却蒸気トラップ（ｍｏｄｅｌ  ＲＶＴ４００，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ）は、およそ作業温度−５０℃を与える４リットルのチャンバー容量とともに使用され得る。
【０１３８】
凍結乾燥は、要求される目的に応じて、水又は緩衝液懸濁液から行われ得る（例えば、ＰＢＳは、血管系における血栓塞栓事象といった診断的アプローチのためのｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に使用され得る）。Ｆ−ＮＤＰの再構成は、無菌の純水を使用して所望の体積まで行われ得る。管及びチップといったすべての材料を含むすべての手順が、無菌状態で行われ得る。
【０１３９】
４．サイズ分布の上で、エタノール殺菌及び  凍結乾燥の効果の測定が、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，  Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を使用して行われ得る。Ｆ−ＮＤＰｓの作業密度は１０ｍｇ／ｍｌと見積もられた。図２５Ａ−２５Ｂは、殺菌前後アッセイされた粒子  サイズ  分布（Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＰＳＤ）についての同一のＦ−ＮＤＰｓの高いオーバーラップを示す。
【実施例９】
【０１４０】
次の実施例は、対外近赤外（ＮＩＲ）イメージングを使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管血栓を検出するビチスタチンと共有結合的に複合した蛍光性ナノダイヤモンド粒子  （Ｆ−ＮＤＰ）（Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔ）の能力を示す。具体的には、Ｆ−ＮＤＰの蛍光特性を色中心（ＮＶ対ＮＶＮ）及びサイズ（１００−１０，０００ｎｍ）と比較した。最適なＮＩＲ蛍光及び生体組織（ラットの皮膚、豚の腋の下の静脈及び皮膚）にを跨いだ組織透過性が、７００ｎｍの平均直径を有するＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）について得られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生体内イメージング（ＩＶＩＳ）により、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）を搭載したガラスキャピラリーは、６ｍｍのラット赤色筋肉バリア及び１２ｍｍの豚の皮膚を跨いで検出され得ることが明らかとなり、隣接皮膚の表面からのヒト頸動脈分岐部の平均垂直距離（１４ｍｍ）である。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、実現可能性がＦｅＣｌ３生成閉塞性血栓Ｉ頸動脈分岐部のラットモデルにおいて示された。外頸動脈（ＥＣＡ）又は大腿動脈（Ｎ＝３）を経由して、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ（３又は１５ｍｇ／Ｋｇ）を全身的に注入した後、血栓中における粒子の存在が、ＩＶＩＳを経由してｉｎ  ｓｉｔｕで、及び、共焦点イメージングを経由して、ｅｘ  ｖｉｖｏで、いずれにおいても確認された。血管血栓中のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）の存在を、組織可溶化の後、血栓から抽出された蛍光粒子を直接計えることでさらに確認した。データにより、おそらく血栓内の活性血小板と結合しているＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔにより、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔは、血管血栓と結合していることが示唆された。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔは、追加の体外装置によりモニターされるＮＩＲエネルギーを使用する、血管血栓を確認するための非侵襲的基板技術として機能するものと考えられる。
【０１４１】
材料
ビチスタチンは、すでに述べたように、２工程の逆相ＨＰＬＣを使用して、Ｂｉｔｉｓａｒｉｅｎｔａｎｓ（Ｌａｔｏｘａｎ  Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ，  Ｖａｌｅｎｃｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）の毒から精製した。カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で化学的に表面機能化されたＦ−ＮＤＰは、Ａｄａｍａｓ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ．  ＮＣ，  ＵＳＡ）から購入した。２種類のＦ−ＮＤＰを使用した：７００ｎｍでのＮ−Ｖ−Ｎ色中心（Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ））に基づく、緑色蛍光Ｆ−ＮＤＰ（２ｘ１０８粒子／ｍｇ）及び１００ｎｍ（５ｘ１０１１粒子／ｍｇ）、７００ｎｍ（２ｘ１０８粒子／ｍｇ）、及び１０，０００ｎｍ（５ｘ１０５粒子／ｍｇ）でのＮ−Ｖ（Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ））色中心に基づく赤色蛍光。イソフルランは、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ（Ｂ３４Ｃ１６Ａ  Ｄｕｂｌｉｎ，  ＯＨ，  ＵＳＡ）から購入した。７０％変性エチルアルコール及びＰＥ−１０管は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ，  ＵＳＡ）から購入した。５−０絹の縫合糸は、Ｒｏｂｏｚ  ＳＵＴ−１５−１、Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）から購入した。パラフィルム及びＦｅＣｌ３は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）から購入した。
【０１４２】
ビチスタチンのＦ−ＮＤＰへの結合
ビチスタチンは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）を使用して、ヘテロ二官能性クロスリンカーとして、すべての型のＦ−ＮＤＰと結合させた。種々の機能化されたナノダイヤモンド粒子（Ｆ−ＮＤＰ−Ｂｉｔ）上での結合効率及びビチスタチン活性の保存は半ＥＬＩＳＡ法を使用して検証した。
【０１４３】
Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）及びＦ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）のＮＩＲ放出の同定
Ｆ−ＮＤＰの近赤外蛍光プロフィルを、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ  ＡＧ，  Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，  ＣＨ）を使用して同定した。純水（ＤＩ）中につり下げた１００μｌの３ｍｇ／ｍＬの７００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）又はＦ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）を９６−ウェルポリスチレンに載せた。蛍光を２３０ｎｍから８５０ｎｍの励起、及び２９０ｎｍから８５０ｎｍからの放出で、２０ｎｍの間隔で、すべてのウェルについてスキャンした（図１Ａ）。データは、Ｍａｔｌａｂ  ２０１５ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）で処理した。バックグラウンドの蛍光は、Ｆ−ＮＤＰを伴わない空のウェルから差し引き、得られた正味の蛍光値は、視覚化のためにＬｏｇ１０変換した。
【０１４４】
ガラスキャピラリー（４０ｍｍ長、１ｍｍ内径、（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を０．０６から４ｍｇ／ｍｌの濃度で（１．８−１２０μｇ全粒子質量）、Ｆ−ＮＤＰの懸濁液と同等の体積（３０マイクロリットル）で満たし、各端をｐｌａｓｔｉｃｉｎｅ（Ｈａｓｂｒｏ，  Ｐａｗｔｕｃｋｅｔ，  ＲＩ，  ＵＳＡ）で封入した。キャピラリー中の種々の懸濁液のＮＩＲ蛍光強度は、前記のように、検出された所望のＮＩＲ放出プロフィルと適合されたこれらのフィルターとして、「Ｃｙ５．５ＢｋＧ」（５８０−６１０ｎｍ）にセットされた励起フィルター、及び「Ｃｙ５．５」（６９５−７７０ｎｍ）にセットされた放射フィルターを使用する、ＩＶＩＳ  ５０イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ａｋｒｏｎ  ＯＨ）を使用して、分析した。イメージングは、４にセットされた「ビニング」及び１０ｃｍ視野で、２から４０秒の露光時間で、完遂した。生体バリア（ラット及び豚の皮膚及びラット筋肉）を通してイメージングするために、自動蛍光は、前記のように、ブルーシフトした励起「ＧＦＰ」（４４５−４９０ｎｍ）及び同一の放射フィルター「Ｃｙ５．５」（６９５−７７０ｎｍ）で、同様のイメージング環境でイメージ化し、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）の大きなストークスシフトを補償するＩＶＩＳ  ５０プロトコルから修正されるように、フォアグラウンドを差し引いた。１２この修正は、単純化されたスペクトル非混合のために使用した：対照チャネル及びブルーシフトした励起チャネル間の自動蛍光の比は、対照組織において定義される。同一の比を、試験標本中のブルーシフトした励起チャネルに基づく対照チャネル由来の自動蛍光を差し引くために使用した。これは、検出されているフルオロフォアはブルーシフトした波長で最小の励起を有するという仮定のもとに作動する。Ｆ−ＮＤＰ由来の近赤外蛍光放出の組織透過性を評価するために、キャピラリーを切除したラットの大腿四頭筋筋肉（２−５．９ｍｍ厚）で覆った、又は豚の皮膚（地方の肉屋から得られる豚の肩から離された）で覆った、剃った腹部のラットの皮膚（安楽死させたラットより得られた）の下に置いた。
【０１４５】
ラット中での頸動脈血栓の発生及びＦ−ＮＤＰ注入
ＦｅＣｌ３誘起血管血栓モデルの技術的手順は、一般的に当該技術分野において既知である。この特有の作業に使用される具体的な改変は、下記に簡潔に要約される。すべての動物は、ｔｈｅ  ＵＳ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔのガイドラインに従って行い、及びＳＵＮＹ州南部医療センターのｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ＆  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されている。要するに：成人した雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、  ３５０Ｇｍ＋／−１０％体重）、に４％イソフルランを使用して麻酔し（ＩＦ、導入、チャンバーで）、手順を通して、調節された１−２％ＩＦ（メンテナンス）が続く。ラットをあおむけのままにし、清潔な道具を使用して外科手術を受けさせ、双眼鏡で助けた。左の頸動脈を切除し、分岐部領域で曝した。５−０外科用の絹の縫合糸を総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）、及び内頸動脈（ＩＣＡ）下でラップした。ＰＥ−１０のキャニューラを、調査のために、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔが局所的に注入されているＥＣＡに挿した。キャニューラを、また調査のために、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔが静脈に（ＩＶ）注入されている左の大腿動脈に挿した。ＩＣＡ茎を５０％ＦｅＣｌ３に浸したパラフィルムにラップし、１０分間静置した。ＩＣＡ上にパラフィルムを２〜３分間置いておいた後、ＰＢＳ中、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ懸濁液の注入を、ＥＣＡ（１ｍＬ中、Ｎ＝２、１５ｍｇ／Ｋｇ）を経由して、又は大腿動脈（Ｎ＝６）を経由して、低用量で（１ｍＬＰＢＳ中、Ｎ＝３、３ｍｇ／Ｋｇ）、又は高用量で（３ｍＬＰＢＳ中、Ｎ＝３、４５ｍｇ／Ｋｇ）を開始した。すべての注入は、１０分間を上回ったところで完結した。対照ラットには、比較可能な体積及び期間で、展色剤を注入した。
【０１４６】
Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ注入後の組織固定
粒子注入の完結に続き、５％ＩＦを使用して、麻酔を増やして、深い眠りにつかせた。低大動脈を速やかに分離し、切って血液を流させた。組織を固定し、７０％変性エタノール１０ｍＬでかん流することで残りの血液を除いた。両側の頸動脈分岐部領域の切除は、全身イメージング（ＩＶＩＳ）の後に完了した。血管をさらなるｅｘ  ｖｉｖｏでのＮＩＲ蛍光評価のために７０％変性エタノールにつり下げた。
【０１４７】
ＩＶＩＳによるＩｎ  ｓｉｔｕでの及びｅｘ  ｖｉｖｏでのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）蛍光のイメージング
簡潔に言えば、ＮＩＲ蛍光を、前記のように、２秒の露光、４にセットされた「ビニング」、及び７ｃｍ視野で、５８０−６１０ｎｍ励起及び６９５−７７０ｎｍ放出透過域を使用して、検出した。自動蛍光は、他のものと同様のイメージング条件の下、４４５−４９０ｎｍでの励起に基づき、差し引いた。頸動脈は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの画像を明確に視覚化させることが可能となるイメージングの前に、露光した。ｉｎ  ｓｉｔｕでのイメージングに続き、頸動脈分岐部を動物から除き、ｉｎ  ｓｉｔｕでのイメージングに使用したものと同じイメージングパラメータを使用する、ｅｘ  ｖｉｖｏでのイメージングのためにガラスプレート上に置いた。各動脈について、自動蛍光が補償される画像の平均蛍光強度を画像Ｊを使用して計算した（ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）。
【０１４８】
蛍光顕微鏡によるＥｘ  ｖｉｖｏでのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）のイメージング
血栓ベアリング又は対側血管から抽出した、頸動脈分岐部領域全体の全体画像を４倍対象物を使用して、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）で評価した。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）から放出されるＮＩＲ蛍光は、５４３ｎｍの励起及び６５５−７５５ｎｍの放出で検出された。共焦点の山は、血管全体が焦点となるよう、最大強度プロジェクションを使用して組み合わせた。各動脈におけるＦ−ＮＤＰの平均蛍光強度は、画像Ｊを使用して、ローカルバックグラウンドを差し引いた後に計算した。
【０１４９】
血管血栓からのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）の分離
Ｆ−ＮＤＰをＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．  Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）中に１００ｍｇ／ｍｌで均一化することで、抽出した頸動脈から分離した。一定量（１０マイクロリットル）の溶解物懸濁液を顕微鏡スライドに適用し、前記のように、２０倍対象物の下、ＬＳＣＭで分析した。
【０１５０】
大腿部の動脈を経由して高用量でＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）で処理した動物においては、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）は、血管断片を有する血栓を１２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）に１００ｍｇ／ｍｌで、６０℃で一晩溶解させることで抽出して、頸動脈から分離した。溶液を遠心分離し（室温で１０分間、１４，０００ｘｇ）、ペレットを純水で１度洗浄した。不溶性のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔを含むペレットは、最初の質量／体積比を維持する間、ＤＩ−水に再懸濁させた。一定量の懸濁液を、４０倍対象物での逆蛍光顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１）で計測する粒子のために標準化してある、血球計（ＩｎｃｙｔｏＩｎｃ．，  Ｃｈｅｏｎａｎ−ｓｉ，  Ｋｏｒｅａ）に適用した。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの画像を、ＴＲＩＴＣフィルターキューブを使用して、計数のために各観察野から撮影した。可溶化した組織全体について、粒子数を計算した。
【０１５１】
統計分析
別段言及しない限り、本実施例における各実験は、３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）にて、独立して、３回行った。概略データは排除していない。データは、平均±ＳＤで表す。統計分析は、（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）  １２  ＳＰＳＳ，  Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して、スチューデントのｔ検定により行った。Ｐ＜０．０５は、重要とみなした。
【０１５２】
結果
Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）及びＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）蛍光プロフィル測定のＮＩＲ蛍光強度の比較により、Ｎ−Ｖ及びＮ−Ｖ−Ｎ粒子、いずれにおいても、ＮＩＲ蛍光が明らかとなった。しかしながら、ＮＩＲ領域においての蛍光は、Ｎ−Ｖ粒子においてのものより２０倍強かった（図２６Ａ）。この実験により、また５７０ｎｍでのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）のピーク励起及び６７０ｎｍでのピーク放出が、明らかとなった。このピーク励起及び放出プロフィルを使用して、Ｆ−ＮＤＰｓのＮＩＲ放出を、用量反応方式で、ＩＶＩＳにおいて比較した（図２６Ｂ、図２６Ｃ）。キャピラリー調査により、同一の励起条件下では、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）のＮＩＲ放出は、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）のそれよりも、およそ大きさの順でより効果的であることが明らかとなった（図２６Ｂ）。
【０１５３】
Ｆ−ＮＤＰの蛍光特性は、粒子のサイズで異なり得る。ｍＬのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）当たり同じ質量のＮＩＲ放出を、３つの異なるサイズの粒子について比較した（図２７Ａ−２７Ｄ）。最も小さい蛍光強度は、最も小さい粒子（１００ｎｍ）に観測され、最も大きい蛍光放出は、７００ｎｍＦ−ＮＤＰに観測された。蛍光は、露光時間に伴い、線形に増え、高露光時間でも退色は明らかとならなかった。７００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）粒子由来の蛍光は、検出器を２０秒未満以内に飽和させたが、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）粒子由来の蛍光がはっきりと示されるのには、より長い露光時間を必要とした。同一の獲得時間で、７００ｎｍ及び１０，０００ｎｍのＮＩＲ放出が増加しなかったことは注目に値する。実際、０．５ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌでは、１０，０００ｎｍ粒子の放出は、７００ｎｍ粒子のそれよりも著しく低いものであった（ｐ＜０．０１、図２７Ａ）。われわれは、ＩＶＩＳにおいてイメージ化されるように、生体バリアを透過する、Ｆ−ＮＤＰのＮ−Ｖ及びＮ−Ｖ−Ｎ種の同等のサイズ（７００ｎｍ）のＦ−ＮＤＰ粒子から放射される近赤外蛍光の能力をテストした（図２８Ａ−２８Ｈ）。４ｍｇ／ｍＬのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）粒子で満たしたキャピラリーは、ラットの皮膚（図２８Ａ）又は大腿四頭筋筋肉（図２８Ｂ）並びに豚の腋の下の静脈（図２８Ｃ）及び２．５ｍｍの脱脂した豚の皮膚（図２８Ｄ）を通してイメージ化することができた一方、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）で満たしたキャピラリー粒子は、これらの状況における任意の、同様のイメージングパラメータでも、視覚化することはできなかった。シグナルが十分な厚さの組織を透過しなかったため、ＮＩＲ蛍光は、１〜４ｍｇ／ｍＬ（３０−１２０マイクログラム総量）の濃度で、２．５ｍｍの脱脂した豚の皮膚を通して、モニターした（図２８Ｅ）。２ｍｇ／ｍＬのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）粒子、１ｍＬを載せた豚の腋の下の静脈は、８ｍｍの豚の皮膚を通して、視覚化することができた（図２８Ｆ）。透過能の最終試験として、厚さ９〜１４ｍｍで異なる、十分な厚さの豚の皮膚の角のある片を、２０ｍｇ／ｍＬ（６００μｇ総量）のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）を含むキャピラリーの頂部へ横たわらせた。Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）由来の検出可能なシグナルは、厚さ１２ｍｍまでの豚の皮膚を通して、記録された。対照的に、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）の同等の条件では、光放出は検出されなかった（図２８Ｇ）。注目に値するのは、ヒト頸動脈の超音波イメージングにより得られたデータであり、そこでは皮膚表面からの頸動脈分岐部の距離は、皮膚表面の下、１４ｍｍと見積もられた。これらの発見は、この領域における血栓上に、安全に、比較可能な粒子質量が堆積し得る場合には、この領域における血栓を検出する、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）の翻訳の見込みを示す（図２８Ｈ）。
【０１５４】
Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔを使用した、ラットモデルにおける血栓の検出
図２６Ａ−２８Ｈの結果は、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）（７００ｎｍ）が、試験した粒子のうち最も明るいものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングのための有用なＦ−ＮＤＰ種であり得ることを示す。それゆえ、すべての次のｉｎ  ｖｉｖｏでの調査は、ラットの頸動脈分岐部において発生した血栓の検出のためにＢｉｔと結合した、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）で実行した。血栓形成及びＥＣＡを経由したＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔでの処理の後、頸動脈をｉｎ  ｓｉｔｕでイメージ化し、イメージング及び解析のために動物から除いた。ＥＣＡを経由してのＦ−ＮＤＰの注入により、病変部位への粒子の曝露が最適化され、潜在的に分配、摂取、除外の交絡係数を回避する。ＩＶＩＳスキャナーにおいての蛍光のイメージングにより、曝露した動脈中の血栓の位置に相当する血管枝において、ｉｎ  ｓｉｔｕでの強い蛍光が示される（図２９Ａ、図２９Ｂ）。処理した及び未処理の動物由来の頸動脈分岐部を除いた後、強い蛍光シグナルが、ＦｅＣｌ３処理した動脈において検出される（図２９Ｃ、図２９Ｄ対図２９Ｅ、図２９Ｆ）。これをさらに、血栓及び堆積した粒子のコロケーションを確認する、共焦点イメージングにより、正当性を検証した（図２９Ｇ、図２９Ｈ対図２９Ｉ、図２９Ｊ）。最終的な検証法として、粒子をプールした溶解物（２病変）中においてイメージ化したところ、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）処理した動物においては、展色剤で処理した動物において、それらがないものと比較して、多くの蛍光性粒子が示された（図２９Ｋ）。ＥＣＡを経由してのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの直接投与の実現可能性の最初の証明に続き、低（３ｍｇ／Ｋｇ）及び高（１５ｍｇ／ｋｇ）用量のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔを大腿動脈を経由して、動物に全身的に注入した。低用量で処理した動物から得られた結果については、結論が出なかった。というのも、シグナルが、展色剤のみで処理した対照動物から分離した頸動脈分岐部から検出される蛍光レベルを一貫して上回らなかったためである。これにもかかわらず、プールした溶解物（３病変）では、Ｆ−ＮＤＰ粒子が血栓中で動かなくなっていることを示し、一方蛍光と関連した粒子は、展色剤で処理した動物からは検出できなかった（図２９Ｌ）。
【０１５５】
Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの高用量のＩＶ注入の後、血栓と関連した蛍光が、すべての処理した動物においてｉｎ  ｓｉｔｕで示された（図３０Ａ−３０Ｃ）。ＦｅＣｌ３で発生させた病変を伴う動脈及び対側対照は、切除し、ＩＶＩＳ及び共焦点顕微鏡により独立にイメージ化した。処理した動脈において、強い蛍光シグナルが、ＩＶＩＳ（図３０Ｄ−３０Ｆ対図３０Ｇ−３０Ｉ）及び共焦点イメージング（図３０Ｊ−３０Ｌ対図３０Ｍ−３０Ｏ）のいずれにおいても観測された。対照動脈のそれに対する明るさの違いは、ｐ＜０．０５で統計的に有意であった（図３０Ｒ、図３０Ｓ）。頸動脈を溶解することで集められた溶解物は、また病変動脈中に残る多くの蛍光性粒子を示し、対側対照動脈においては、少ないが一定した粒子を示した（図３０Ｐ）。この差は、ｐ＜０．０１で、統計的に非常に有意であった（図３０Ｑ）。
【０１５６】
前記実施例の２つの目的は、１）それらのＮＩＲ放出パラメータの点で、２種のＦ−ＮＤＰ（Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）及びＦ−ＮＤＰ（ＮＶＮ））の同定、及び２）ヒトＮＩＲ血管病理イメージングにおける透過アプリケーションに要求される距離を超えて、生体組織を十中八九透過する十分なエネルギーを放出する、Ｆ−ＮＤＰ種の同定、である。ヒトにおいてのより長いスケール（分間）のイメージング法の見込みを考慮すると、Ｆ−ＮＤＰの選択において考えなければならない重要なものは、ＮＩＲ放出の安定性／持続性を含む。ナノ粒子は、一般的に、直径が増加するにつれ、毒性が低下する傾向を有する。具体的には、ナノダイヤモンドは、直径の増加とともに（１００ｎｍまで試験済）毒性の低減（例えばナノチューブと比較して）を示し、本調査に使用した７００ｎｍのＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）は、安全であり得ることを示す。４５ｍｇ／ｋｇで７００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）での予備調査では、静脈ポートを経由して注入されたラットにおいての致死率又は死亡率は示されておらず、重量及び神経行動学的試験のために、５日間まで評価されている。
【０１５７】
第１の目的は、４つの独立した変数に沿って、各Ｆ−ＮＤＰの放射属性を体系的に調査することであった。すなわち、ａ）原子操作（Ｎ−Ｖ、Ｎ−Ｖ−Ｎ）により生じる蛍光スペクトル及び明るさ、ｂ）粒子全質量の放射強度との関係、ｃ）粒子直径の放射強度との関係、及びｄ）速度及びＮＩＲ獲得度合いの速度論である。これらの変数は、ＩＶＩＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、Ｎ−Ｖ及びＮ−Ｖ−Ｎ種間に「ｈｅａｄ  ｔｏ  ｈｅａｄ」で用いられており、その感度及びその非侵襲性のため、ＮＩＲ光検出能のそのような比較にすべて十分に適しているとみなされる。図２６Ａ−２７Ｄに示されるデータにより、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）種が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生体組織を通してのＮＩＲ蛍光透過に有用である見込みが示される。例えば、本実施例において、７００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）は、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶＮ）よりも１０−６０倍高いＮＩＲ放出強度を示す。注意すべきは、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）由来のＮＩＲ放出は、直接粒子サイズとは相関しておらず、７００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）で最大化される。一定の粒子質量の搭載では、７００ｎｍ粒子は、ＩＶＩＳイメージにおいて、４倍明るく、一貫して及びすべてのテストした獲得期間でそうであった、１０，０００ｎｍ粒子由来のＮＩＲ蛍光放出は、ｅ７００ｎｍ粒子よりも弱かった（図２）。１０，０００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）は、ＩＶ注入に有用でありそうにないが、１０，０００ｎｍ粒子は、同等の質量条件粒子の下では、明るさは、直径と相関しないが、固有の直径範囲まで最大化し得ることを示した。
【０１５８】
Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）について示した物性（図２６Ａ−２７Ｄ）と等しく、図２８Ａ−２８Ｈにおけるデータは、さらにＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの血管血栓のイメージングを助けるポテンシャルを支持する。図３は、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）から放出されたＮＩＲ蛍光の組織透過性が試験された、いくつかの条件を示す。ヒトの皮膚に類似するものとして使用された、豚の皮膚を通してＮＩＲにより検出可能な最大距離は、１２ｍｍであった（図２８Ｇ）。図２８Ｈは、ＩＣＡ、ＥＣＡ及びＣＣＡについて注釈が付けられた、標準的なヒト頸動脈分岐部の超音波記録を表す。図２８Ｈにおける線状の点線のバーは、首表面からの垂直距離からの、ヒト頸動脈分岐部の１１．８９ｍｍの深さを示す。皮上に直接置かれた同様の手持ち式装置の使用に対して、ヒトの首及びモニターされる検体からのＩＶＩＳカメラの距離と比較すると、豚の肩の厚い表皮を考えると、血栓容器である頸動脈分岐部のＮＩＲ蛍光イメージングは、達成可能な診断機会の内にあると推測される。さらに、図２８Ｈ中に記録されているＮＩＲ蛍光は、およそ６７０ｕｇの７００ｎｍＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）粒子から発生した源を表す。この領域においてヒト血栓にタグ付けされた同一量の粒子により、ＮＩＲ蛍光イメージングによる血栓検出が可能となる。図３０Ｑ中の結果は、最小限の０．７％の注入用量が対象病変中に捕捉され（用量にして、２ｘ１０８粒子／ｍｇ）、ヒトにおいて、同様の放出プロフィルに到達するのに必要とされる用量は、およそ１００ｍｇ（１．４ｍｇ／ｋｇ）であることを示唆している。ラットにおける予備調査においては、４５ｍｇ／ｋｇと同程度の用量は、５日間、何らの有害事象が記録されることもなく、耐性良好であった（データは示していない）。
【０１５９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの調査を、ビチスタチンと共有結合的に結合したＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔで行った。手順は、安定なアミドを結合を与えるＤＣ媒介共有結合性ヘテロ二官能性結合を使用しており、生体システムにおいて回復力のあるものである。これらＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔを、確立された分岐部部位での頸動脈血栓法を受けた、安楽死させたラットに対して、全身的に投与した。パイロットの翻訳調査においては、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔは、初めにＥＣＡを経由して（「高用量」、１５ｍｇ／Ｋｇ）又は大腿部の動脈を経由して（「低用量」、３ｍｇ／Ｋｇ）投与した。この実験デザインは、薬物動態（学）及び粒子分配の動力学が未知のために選択した。それゆえ、起こり得る、第１経路排泄又は組織分配を経由しての粒子量の大量減少を回避するために（潜在的「偽陰性」という結果）、ＥＣＡを経由しての注入は、標的とした領域における血栓への、粒子の最大曝露を確める。血液中におけるＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔ固有の共局在化を評価し、確かめるために、３つの独立した方法を配備した。すなわち、ａ）ＩＶＩＳ全身イメージング（図２９Ａ、図２９Ｂ）、ｂ）血栓を運ぶ抽出血管のＬＳＣＭ（図２９Ｃ、図２９Ｄ）及びｃ）全有機物質の可溶化の後、血栓を有する血管から抽出した粒子の直接的な計数（図２９Ｌ）である。ＥＣＡを経由しての高用量のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉの注入によるＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）の凝集は、３つの方法すべてにより容易に検出される。しかしながら、大腿動脈を経由しての低用量（３ｍｇ／Ｋｇ）のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔの注入では、ＩＶＩＳ又はＬＳＣＭで放出を検出することに成功しなかった（図４Ｅ−Ｆ）。少ない量の粒子を血栓抽出物中で数えたが（図２９Ｍ）、この非常に少量のものが、具体的に凝集血栓であるか、『栄養血管』を経由して、血管壁に載せられたものであるか、又は両方であるかについては定かでない。しかしながら、粒子が実際に血栓を標的としていたとしても、低用量のＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔでは、ＩＶＩＳ又はＬＳＣＭにより検出可能な、信頼できる放出は生み出さなかった。次にＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）−Ｂｉｔを静脈に高用量で（１５ｍｇ／Ｋｇ、Ｎ＝３）投与した。図３０Ａ−３０Ｃに示すように、試験したすべての３つの動物は、また分離した血管の蛍光（図３０Ｄ−３０Ｉ）において、ＬＳＣＭ（図３０Ｊ−３０Ｏ）による検閲の下、明確にみえるほど、頸動脈分岐部域から発せられる（ＩＶＩＳ）強い蛍光シグナル放出を示した。粒子は、また可溶化された血栓を有する血管中に大量に存在した（図３０Ｐ）。図３０Ｑ−３０Ｓは、血栓を有する血管対照対側中での固い粒子の沈殿物の定量分析を示す。
【０１６０】
本実施例におけるまとめとして、本調査で配備されたＦ−ＮＤＰ（ＮＶ）が、ラット頸動脈分岐部モデル中に形成された血栓といった、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血栓と結合し得る証拠を示した。ここで概念実証は、３つの独立した測定、又は抽出した血栓から分離した蛍光粒子の直接計数を含む、ｉｎ  ｓｉｔｕでの血栓形成で検出されたＮＩＲ蛍光放出に基づく。データにより、血管病変（例えば、頸動脈分岐部における血栓）に存在するに相当する距離を超えて、Ｆ−ＮＤＰ（ＮＶ）から放出されるＮＩＲ蛍光イメージングを検出する可能性が示される。うまく臨床的実践にまで変換されれば、外来的環境において行われる、この最小限侵襲的な方法により、抗血栓塞栓剤の早期開始といった、予防的測定が強化され得る。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態が、この本文で述べられ、図示されてきた一方で、当業者は、機能の実行、及び／又は結果及び／又はこの本文で述べられている１つ以上の利益を得るために、直ちに種々の他の手段及び／又は構成を想像することとなるが、各そのような変形及び／又は改変は、本発明の範囲内にあるものとみなされる。より一般的には、当業者は、この本文で述べられている、すべてのパラメータ、寸法、物品、及び配置が例となることを意味しており、実際のパラメータ、寸法、物品、及び／又は配置は、具体的な適用又は本発明の教示が使用されるアプリケーションに依存することとなることが、すぐにわかるであろう。当業者は、ただルーティンにすぎない実験を使用して、この本文で述べられている、具体的な実施形態と等価な多くのものを認識することとなり、又は確かめることが可能となる。それゆえ、前記実施形態は、実施例を経由してのみ示され、添付の請求項及びそれらと等価のものの範囲内において、具体的に述べられ、請求されているもの以外に、本発明は実行され得る、と解される。本発明は、この本文で述べられている、各個々の特徴、システム、物品、材料、及び／又は方法に向けられている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、及び／又は方法の２つ以上の任意の組み合わせが、そのような特徴、システム、物品、材料、及び／又は方法が相互に矛盾していないのであれば、本発明の範囲に含まれる。
【０１６２】
ここで明細書及び請求項に使用されているように、不定冠詞『ａ』及び『ａｎ，』は、明確に反対に指示されていない限り、『ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ（少なくとも１つ）』を意味すると解されるべきである。
【０１６３】
『ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）』という表現は、この本文で明細書において及び請求項において使用されているように、非常に共同した、すなわち、ある場合において、共同的に存在しており、他の場合において、選言的に存在している、要素の『ｅｉｔｈｅｒ  ｏｒ  ｂｏｔｈ（どちらか一方又は両方）』を意味するものと解すべきである。明確に反対に示されていない限り、具体的に特定される要素と関連があろうがなかろうが、『ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）』節により具体的に特定される要素以外の他の要素が、要すれば、存在し得る。それゆえ、限定されない例として、『ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）』といった制約のない言語と併せて使用される際、『Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ，（Ａ及び／又はＢ、）』への参照は、１つの実施形態において、Ｂを伴わない（要すればＢ以外の要素を含む）Ａ、他の実施形態において、Ａを伴わない（要すればＡ以外の要素を含む）Ｂ、さらに他の実施形態においては、Ａ及びＢいずれも（要すれば他の要素を含む）、などを参照することが可能である。
【０１６４】
この本文で明細書において、請求項において使用されているように、『ｏｒ（又は）』は、上で定義されているように、『ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）』と同一の意味を有すると解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分けた際に、『ｏｒ（又は）』又は『ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）』は、包含的であると、すなわち、少なくとも１つであるが、また１つより多くの、多くのリストの要素の、及び要すれば、さらなるリスト化されていない項目の包含であると、解釈されるべきである。『ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ（のうちの１つのみ）』又は『ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ，（のうちのちょうどひとつ、）』又は、請求項において使用される際、『ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ，（から成る）』といった、明確に反対に示されている表現のみが、要素の多くのリストのちょうど１つの包含を参照することとなる。一般的には、この本文で使用されているように、『ｏｒ（又は）』という表現のみを、『ｅｉｔｈｅｒ，（どちらか一方、）』『ｏｎｅ  ｏｆ，（のうちの１つ、）』『ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ，（のうちの１つのみ、）』又は『ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ（のうちのちょうど１つ）』といった排他の表現が先行する際、排他的代替（すなわち、『ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ（一方又は他方であるが、どちらともではない）』）を示すものとして、解釈するものとする。『Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ，（本質的に含む）』は、請求項において使用する際には、特許法の分野で使用されているように、通常の意味を持つものとする。
【０１６５】
この本文で明細書において、請求項において使用されているように、１つ以上の要素のリストに関して『ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ，（少なくとも１つ）』という表現は、要素のリスト中の任意の１つ以上から選択されるが、要素のリストに具体的にリスト化された、各及びすべての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト内の要素のいかなる組み合わせも排除しない、少なくとも１つの要素を意味するものと解すべきである。この定義により、具体的に特定される要素と関連があろうがなかろうが、『ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ（少なくとも１つの）』という表現が参照する要素のリスト内に、具体的に特定される要素以外の要素が、要すれば存在し得ることが、また可能となる。それゆえ、限定されない例として、『ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ）』（又は、等価に、『ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ｏｒ  Ｂ（Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ），』又は、等価に『ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ（Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ）』）は、１つの実施形態において、少なくとも１つ、要すれば１つより多く含む、Ｂが存在しない（及び要すればＢ以外の要素を含む）、Ａ、他の実施形態において、少なくとも１つ、要すれば１つより多く含む、Ａが存在しない（及び要すればＡ以外の要素を含む）、Ｂ、さらに別の実施形態において、少なくとも１つ、要すれば１つより多く含む、Ａ、及び少なくとも１つ、要すれば１つより多く含む、Ｂ（及び要すれば他の要素を含む）など、を指し得る。
【０１６６】
請求項において、並びに前記明細書において、『ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ，（含む）』『ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，（含む）』『ｃａｒｒｙｉｎｇ，（運ぶ）』『ｈａｖｉｎｇ，（有する）』『ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，（含む）』『ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ，（含む）』『ｈｏｌｄｉｎｇ，（有する）』など、といった、すべての移行句は、限定されないものと解することが可能で、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味すると解することが可能である。移行句『ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（から成る）』及び『ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的にから成る）』の移行句のみを、各々、閉じた又は半分閉じた移行句とし、米国特許庁特許審査手順のセクション２１１１．０３に記載されている。
【図１Ａ】
2019533005.tif 000003
【図１Ｂ】
2019533005.tif 000004
【図２Ａ】
2019533005.tif 000005
【図２Ｂ】
2019533005.tif 000006
【図２Ｃ】
2019533005.tif 000007
【図３】
2019533005.tif 000008
【図４】
2019533005.tif 000009
【図５】
2019533005.tif 000010
【図６】
2019533005.tif 000011
【図７Ａ】
2019533005.tif 000012
【図７Ｂ】
2019533005.tif 000013
【図８】
2019533005.tif 000014
【図９】
2019533005.tif 000015
【図１０】
2019533005.tif 000016
【図１１】
2019533005.tif 000017
【図１２】
2019533005.tif 000018
【図１３】
2019533005.tif 000019
【図１４】
2019533005.tif 000020
【図１５】
2019533005.tif 000021
【図１６】
2019533005.tif 000022
【図１７Ａ】
2019533005.tif 000023
【図１７Ｂ】
2019533005.tif 000024
【図１８Ａ】
2019533005.tif 000025
【図１８Ｂ】
2019533005.tif 000026
【図１８】
2019533005.tif 000027
【図１９】
2019533005.tif 000028
【図２０】
2019533005.tif 000029
【図２１】
2019533005.tif 000030
【図２２】
2019533005.tif 000031
【図２３】
2019533005.tif 000032
【図２４】
2019533005.tif 000033
【図２５】
2019533005.tif 000034
【図２６】
2019533005.tif 000035
【図２７】
2019533005.tif 000036
【図２８】
2019533005.tif 000037
【図２９】
2019533005.tif 000038
【図３０】
2019533005.tif 000039
【国際調査報告】
2019533005.tif 000040
2019533005.tif 000041