(57)【要約】  本開示は、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析の方法、または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析とも呼ばれ得る方法によって、ホルマリン固定されている生体試料においてＭｅｔタンパク質を直接定量化する上で特に有利な、特異ペプチド、および肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔ）タンパク質由来の前記ペプチドのイオン化特性を提供する。また、Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）変異タンパク質の存在を検出する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料における肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔ）タンパク質のレベルを測定する方法であって、
質量分析を用いて前記ヒト生体試料から調製されたタンパク質消化物における第一および第二のＭｅｔフラグメントペプチドの量を検出および定量化する工程であって、前記第一のＭｅｔフラグメントペプチドが配列番号１であり、前記第二のＭｅｔフラグメントペプチドが配列番号３である前記工程、ならびに
前記試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを算出する工程
を含んでなり、
ここで、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである、方法。
【請求項２】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量を検出および／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織が腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの定量化が、ある生体試料における前記第一および第二のＭｅｔフラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料における同じＭｅｔフラグメントペプチドの量とを比較することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの定量化が、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量を判定することを含んでなり、ここで、生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドが、同じ各アミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較され、かつ、前記内部標準ペプチドが同位体標識されたペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質消化物における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量の検出および／または定量化が、修飾または非修飾Ｍｅｔタンパク質の存在および対象における癌との関連性を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量または前記Ｍｅｔタンパク質のレベルの前記検出および／もしくは定量化の結果を、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量または前記Ｍｅｔタンパク質のレベルの前記検出および／もしくは定量化の結果を癌の診断病期／グレード／状態と相関させることを、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を多重形式で検出および／または定量化することと組み合わせて、癌の診断病期／グレード／状態に関する追加情報を提供する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料を採取した患者に対して治療的有効量の治療薬を投与することをさらに含んでなり、ここで、治療薬および／または治療薬の投与量が、前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量またはＭｅｔタンパク質のレベルに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
治療薬が、Ｍｅｔタンパク質に結合するおよび／またはその生物活性を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号２の配列を有するＭｅｔフラグメントペプチドを検出および定量化することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料におけるＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）変異タンパク質の存在または非存在を検出する方法であって、質量分析を用いて前記ヒト生体試料から調製されるタンパク質消化物におけるＭｅｔフラグメントペプチドの存在または非存在を検出することを含んでなり、ここで、前記Ｍｅｔフラグメントペプチドが配列番号２である、方法。
【請求項１５】
配列番号１の配列を有する第一のＭｅｔフラグメントペプチドおよび配列番号３の配列を有する第二のＭｅｔフラグメントペプチドの量を検出および定量化することにより、ホルマリン固定組織の前記試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを検出および定量化すること、ならびに前記試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを算出することをさらに含んでなり、
ここで、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量を検出および／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織が腫瘍から得られるものである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの定量化が、ある生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料における同じＭｅｔフラグメントペプチドの量とを比較することを含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの定量化が、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量を判定することを含んでなり、ここで、生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドが、同じ各アミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較され、かつ、前記内部標準ペプチドが同位体標識されたペプチドである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質消化物における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量および／またはＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）の存在の検出および／または定量化が、Ｍｅｔタンパク質および／またはＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質の存在ならびに対象における癌との関連性を示すものである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量、または前記Ｍｅｔタンパク質および／もしくは前記Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質のレベルの前記検出および／または定量化の結果を、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量、または前記Ｍｅｔタンパク質および／もしくは前記Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質のレベルの前記検出および／または定量化の結果を癌の診断病期／グレード／状態と相関させることを、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を多重形式で検出および／または定量化することと組み合わせて、癌の診断病期／グレード／状態に関する追加情報を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料を採取した患者に対して治療的有効量の治療薬を投与することをさらに含んでなり、ここで、前記治療薬および／または前記治療薬の投与量が前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量またはＭｅｔタンパク質のレベルに基づく、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療薬が、Ｍｅｔタンパク質に結合するおよび／またはその生物活性を阻害する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療薬が、クリゾチニブ、チバンチニブ、カボザンチニブおよびフォレチニブからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１６年６月７日に出願された米国仮出願第６２／３４６，５６２号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の仮出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
緒言
肝細胞増殖因子受容体タンパク質（本明細書ではＭｅｔと呼び、科学文献ではＨＧＦ／ＳＦ受容体、癌原遺伝子ｃ−Ｍｅｔ、ｃＭｅｔ、分散因子受容体およびチロシンプロテインキナーゼＭｅｔとも呼ばれる）のアミノ酸配列に由来する３つの特異ペプチドを用いた、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを説明する。本アッセイは、組織、有利にはホルマリン固定組織における特異型のＭｅｔタンパク質の発現を判定する。より具体的には、本アッセイは、組織中に発現しているＭｅｔタンパク質において、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメインが存在するか否かを判定する。この特定のバージョンのＭｅｔタンパク質はＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）と呼ばれ、全非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の約４％に出現し、正確なＭＥＴ  ＲＮＡスプライシングを制御するゲノムの領域における１つまたは複数の変異から生じるものであり、これらの１つ以上の変異の存在が、ＲＮＡプロセシング中にエクソン１４のスキッピング事象をもたらし、そしてＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質を生じさせる。ＭＥＴエクソン１４が損失すると、Ｍｅｔの安定性が向上し、ＨＧＦ刺激時のシグナル伝達が延長し、その結果、癌細胞の増殖および分裂が亢進する。
【０００３】
質量分析に基づく選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイとも呼ばれることがあり、本明細書ではＳＲＭ／ＭＲＭと呼ぶ）には、この３つの特異ペプチド各々に対するペプチド配列および断片化／遷移イオンが用いられる。このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、Ｍｅｔタンパク質の発現および完全性を評価するため、具体的には、発現Ｍｅｔタンパク質におけるＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメインの存在または非存在を検出するために用いることができる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定された癌患者組織などの患者組織試料から得た細胞から調製された複雑なタンパク質ライセート試料において、３つの特異ペプチドを直接検出および測定することができる。
【０００４】
患者から得たホルマリン固定腫瘍組織内に存在する腫瘍細胞におけるＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質の発現を検出できれば、患者に対して、Ｍｅｔタンパク質のリン酸化機能を特異的に阻害するクリゾチニブ、チバンチニブ、カボザンチニブおよびフォレチニブなどのＭｅｔ阻害剤を用いた治療を提示することによって、癌治療の決定を知らせることができる。
【発明の概要】
【０００５】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料における肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔ）タンパク質のレベルを測定する方法が提供される。前記方法は、質量分析を用いてヒト生体試料から調製されたプロテアーゼ消化物などのタンパク質消化物における第一および第二のＭｅｔフラグメントペプチドの量を検出および定量化することを含む。前記第一のＭｅｔフラグメントペプチドは配列番号１であり、前記第二のＭｅｔフラグメントペプチドは配列番号３である。前記方法は、配列番号２の配列を有するＭｅｔフラグメントペプチドを検出および定量化することをさらに含んでもよい。これらの量は、試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを算出するために用いられ、前記レベルは相対または絶対レベルである。
【０００６】
また、ホルマリン固定組織のヒト生体試料におけるＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）変異タンパク質の存在または非存在を検出する方法も提供される。前記方法は、質量分析を用いてヒト生体試料から調製されたプロテアーゼ消化物などのタンパク質消化物におけるＭｅｔフラグメントペプチドの存在または非存在を検出することを含み、前記Ｍｅｔフラグメントペプチドは配列番号２である。これらの方法は、配列番号１の配列を有する第一のＭｅｔフラグメントペプチドおよび配列番号３の配列を有する第二のＭｅｔフラグメントペプチドの量を検出および定量化することによって、ホルマリン固定組織の試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを検出および定量化すること、ならびに前記試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを算出することをさらに含んでもよく、前記レベルは相対レベルまたは絶対レベルである。
【０００７】
上記の方法に用いる試料は、パラフィン包埋組織であってもよく、腫瘍由来であってもよい。前記タンパク質消化物は、前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量を検出および／または定量化する前に、分画してもよい。
【０００８】
前記Ｍｅｔフラグメントペプチドは、ある生体試料における前記第一および第二のＭｅｔフラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料における同じＭｅｔフラグメントペプチドの量とを比較することによって、定量化してもよい。別の実施態様では、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量を判定することにより、前記Ｍｅｔフラグメントペプチドを定量化してもよく、生体試料における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドは、同じ各アミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較され、内部標準ペプチドは同位体標識されたペプチドである。
【０００９】
タンパク質消化物における前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量および／またはＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）の存在の検出および／または定量化は、修飾または非修飾Ｍｅｔタンパク質の存在および対象における癌との関連性を示すために用いてもよい。Ｍｅｔフラグメントペプチドの量、またはＭｅｔタンパク質のレベル、および／もしくはＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）の存在の検出および／または定量化の結果は、癌の診断病期／グレード／状態と相関させてもよい。この相関は、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を多重形式で検出および／または定量化することと組み合わせて、癌の病期診断／グレード／状態に関する追加情報を提供してもよい。
【００１０】
上記の方法は、患者に対して治療的有効量の治療薬を投与することをさらに含んでなってもよく、治療薬および／または治療薬の投与量は、前記Ｍｅｔフラグメントペプチドの量またはＭｅｔタンパク質のレベルおよび／もしくはＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）の存在に基づく。有利には、前記治療薬はＭｅｔタンパク質に結合する、および／または生物活性を阻害する。前記治療薬は、例えば、クリゾチニブ、チバンチニブ、カボザンチニブもしくはフォレチニブまたはその組み合わせであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、再現性のある質量分析ピークの可視化によって、３つのペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）が陽性に検出され、通常バージョンのＭｅｔタンパク質における３つの全ペプチドの存在が示されていることを示す。これは、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるＭｅｔタンパク質ドメインの陽性の検出および定量化を示す。この図はまた、Ｈ５９６およびＨｓ７４６Ｔ細胞株における配列番号２に対する陽性の質量分析ピークの視覚的検出がないこと（検出限界未満）も示しており、その結果、これらの細胞株におけるＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメインを含まないＭｅｔタンパク質の発現、およびＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質の発現を検出できる能力がさらに示されている。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本明細書で説明するアッセイは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法を用いてヒトＭｅｔタンパク質の３つの異なるペプチドの存在を検出する。第一のペプチドはＭｅｔタンパク質の細胞外ドメイン内に存在し、第二および第三のペプチドはＭｅｔタンパク質の細胞内ドメイン内に存在する。第二のペプチドは、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４（アミノ酸９６３〜１０１０）によりコードされるＭｅｔタンパク質セグメントのフラグメントである。発現Ｍｅｔタンパク質におけるこれら３つのペプチドの存在は、同一試料内で互いに関連しているものと判定される。このアッセイは、Ｍｅｔタンパク質の発現レベルとＭｅｔタンパク質の発現型の完全性の双方を分析するために用いることができる―ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４（アミノ酸９６３〜１０１０）によりコードされる細胞内ドメインの全長Ｍｅｔタンパク質内の存在（または非存在）を判定できるのと同様に、発現Ｍｅｔタンパク質の細胞外および細胞内ドメインの存在を判定することができる。
【００１３】
ＳＲＭ／ＭＲＭ法は、生体試料における特異ペプチドの独特のシグネチャーピークを検出し、そのピーク面積を同じ生体試料に添加された内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、特異ペプチドを検出および定量化する。一つの実施態様では、各内部標準は、３つのＭｅｔペプチドのうちの１つの合成バージョンであり、全く同じアミノ酸配列を有するが、１つ以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む。各同位体標識された内部標準は、質量分析により分析されたとき、天然Ｍｅｔペプチドのシグネチャーピークとは異なり、比較ピークとして用いることができる予測可能なかつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを生成するように合成される。内部標準を既知量で生体試料由来のタンパク質調製物に添加し、質量分析により分析する場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較され、この数値比較からは、生体試料由来の元のタンパク質調製物に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかが示される。特異Ｍｅｔペプチドの検出および定量化は、試料あたりに分析されたタンパク質の量に従って表示される。ＳＲＭ／ＭＲＭによるペプチドの検出および定量化は、単一の試料において多数のＭｅｔペプチドに対して同時に実施できるため、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでは３つの全Ｍｅｔペプチドの分析が可能となる。
【００１４】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来組織において直接癌の診断を補助するため、およびその患者の治療に用いるのにどの治療薬が最も有利となるかの判定を補助するために使用することができる。部分的もしくは全体的な腫瘍の治療的切除などの手術、または疑われる疾患の存在もしくは非存在を判定するために実施される生検処置のいずれかを通じて患者から除去される癌組織は、Ｍｅｔおよび／またはその他のタンパク質がその患者組織に存在するか否か、ならびにどの型のタンパク質がその患者組織に存在するかを判定するために分析される。さらに、１つまたは複数のタンパク質の発現レベルを判定することもできる。タンパク質レベルならびに／または種々の型およびアイソフォームのタンパク質（例えば、Ｍｅｔエクソン１４欠失タンパク質）のアッセイを用いて、治療戦略を知らせることもできる。ひとたび癌のＭｅｔタンパク質の発現特性が判定されると、その情報は、医師に対して、どの治療薬（化学的および生物学的）が患者を助ける可能性が最も高くなるかについて知らせるものとなる。Ｍｅｔタンパク質アッセイから得られる情報を潜在的な治療薬と適合させると、Ｍｅｔタンパク質がＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメインを含む可能性があるまたは含まない可能性がある患者において、癌を治療するための個別化医療アプローチを知らせる助けとなる。
【００１５】
原則的に、例えば、特異性が既知のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化することにより調製されたＭｅｔタンパク質に由来するいずれの予測されるペプチドも、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて試料中のＭｅｔタンパク質の発現を検出するための代替レポーターとして用いることができる。しかし、実際には、Ｍｅｔタンパク質の分析に用いることができるペプチドまたは複数のペプチド（ある場合は）の同一性は、全く予測不可能である。このことは、特にホルマリン固定組織に当てはまり、ホルマリン固定組織では、タンパク質架橋のために予測不能性がさらに増加する。
【００１６】
米国特許第７，４７３，５３２号に記載の液体組織プロトコルの使用など、種々の手段により、Ｍｅｔフラグメントペプチドを含む適切な組織消化物を生成してもよい。液体組織プロトコルおよび試薬は、組織／生体試料におけるタンパク質のタンパク質消化によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から、質量分析に適切なペプチド試料を産生することができる。液体組織プロトコルでは、組織／生体試料を緩衝液中で長時間（例えば、約８０℃〜約１００℃で約１０分〜約４時間）加熱し、タンパク質架橋を逆転または遊離させる。用いる緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗浄剤を含む緩衝液）である。加熱処理後、組織／生体試料を１つ以上のプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、ペプシンおよびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃが挙げられるが、これらに限定されない）で、前記生体試料の組織および細胞構造を破壊する、ならびに前記試料を液化するのに十分な時間（例えば、３７℃〜６５℃の温度で３０分〜２４時間）処理する。加熱およびタンパク質分解の結果、液体で可溶性の希釈可能な生体分子ライセートが得られる。
【００１７】
癌患者組織から最も広く有利に得られる組織型は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界的に圧倒的に最も一般的な癌組織試料の保存方法であり、標準的な病理学の実践において受け入れられている慣習である。ホルムアルデヒド水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、ホルムアルデヒド（約４０容積％または３７質量％）の飽和水溶液からなり、酸化および重合度を制限するために、少量の安定剤、通常はメタノールを含む。組織を保存する最も一般的な方法は、組織全体を含水ホルムアルデヒド（通常、１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に長時間（８時間〜４８時間）浸漬した後、固定された組織全体をパラフィンろうに包埋し、室温で長時間保存する。よって、ホルマリン固定癌組織を分析する分子分析法は、癌患者組織を分析するための最も受け入れられている、最もよく用いられている方法である。
【００１８】
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで使用されるＭｅｔペプチド（表１および２に示すアミノ酸配列を有する）は、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製された複雑な液体組織ライセート内の全タンパク質をプロテアーゼ消化することによって、Ｍｅｔタンパク質から得たものであった。特に明記しない限り、各例におけるプロテアーゼはトリプシンであった。次に、液体組織ライセートを質量分析により分析し、Ｍｅｔタンパク質に由来するどのペプチド（ある場合）が、（ａ）Ｍｅｔタンパク質の発現および（ｂ）ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４に由来するコードドメインが発現Ｍｅｔタンパク質に存在するか否かを判定するための質量分析により、効率的および再現性よく検出および分析できたかを判定した。
【００１９】
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを定義するための質量分析に用いる３つの特異ペプチドの同定は、（１）発現Ｍｅｔタンパク質内の細胞外、細胞内およびエクソン１４タンパク質ドメインを検出できる能力；（２）液体組織ライセートの質量分析において、Ｍｅｔタンパク質のこれら３つのドメインに由来するどの１つまたは複数のペプチドがイオン化するかの実験的判定；ならびに（３）液体組織ライセートの調製に用いるプロトコルおよび実験条件をペプチドが乗り越えられる能力、に基づいている。
【００２０】
本明細書で説明するアッセイは、腫瘍細胞に発現したとき、腫瘍細胞に対しＭｅｔタンパク質阻害剤分子による処理を受けやすくするＭｅｔタンパク質の変異体の存在または非存在を検出する。ＮＳＣＬＣにおけるＭＥＴエクソン１４の周囲のおよびＭＥＴエクソン１４に関与するスプライスドナーまたはアクセプター部位に認められるＭＥＴ遺伝子のまれな変異／欠失は、ＭＥＴエクソン１４欠失（ＭＥＴｅｘ１４）変異として知られる。腫瘍細胞のゲノムに存在する場合、これらの変異／欠失は、不完全なＭｅｔメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）スプライシングをもたらし、そして、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４のタンパク質コード領域を含まない不完全なＭｅｔタンパク質が生じる。２００３年に両小細胞肺癌で最初に報告され、次に２００５年に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）で報告された、これらのスプライス部位の変異／欠失の意義は２００６年に実証され、スプライスドナーおよびアクセプター部位における多点変異および欠失の結果として、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４が最終的な成熟ＭＥＴ  ｍＲＮＡから切り出される。エクソン１４によりコードされるタンパク質の一部は、Ｍｅｔをユビキチン介在性分解の標的とするユビキチンリガーゼＣＢＬを効率的に動員するために必要である。具体的には、ＣＢＬは、ユビキチンがチロシン残基に結合しているチロシン残基１００３（Ｙ１００３）を標的とし、Ｍｅｔタンパク質のリソソーム分解をもたらす。それゆえ、ＭＥＴエクソン１４によりコードされるタンパク質領域の「スキッピング」は、さほど効率的には分解されないＭｅｔタンパク質を生じさせ、その結果、Ｍｅｔタンパク質の相対的に過剰な発現をもたらし、Ｍｅｔの活性化（リン酸化）およびその後の腫瘍形成が著明に亢進する。
【００２１】
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクトでは、腺癌におけるＭＥＴｅｘ１４の発生率は約３〜４％であると推定している。近年、ＭＥＴｅｘ１４変異を含む癌は、クリゾチニブ、チバンチニブ、カボザンチニブおよびフォレチニブなどのＭｅｔチロシンキナーゼ阻害剤のクラスを用いた阻害によって治療が「可能」であり、その結果、そのようなＭＥＴエクソン１４の変化を有するＮＳＣＬＣ患者において臨床的有用性がもたらされることが見出されている。
【００２２】
Ｍｅｔタンパク質の細胞外、細胞内およびエクソン１４コードドメインの存在を検出することにより、Ｍｅｔタンパク質の発現を分析する本明細書で説明するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに用いられる３つのＭｅｔトリプシンペプチドを、表１に記載する。配列番号１はＭｅｔ細胞外ドメインに存在し、配列番号２は、Ｍｅｔタンパク質の細胞内ドメインに存在し、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるドメイン内に認められ、配列番号３はＭｅｔ細胞内ドメインに存在する。表１に記載のＭｅｔトリプシンペプチドは、乳癌、結腸癌および肺癌などの複数の種類の癌から調製された液体組織ライセートにおいて、効率的および再現性よく検出される。また、それらの各ペプチドは、ホルマリン固定組織から調製された液体組織ライセートにおけるＭｅｔタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに効率的に用いられる。よって、これらの各ペプチドは、いずれの生体試料または体内のいずれの器官部位に由来するいずれのホルマリン固定組織からの液体組織ライセートに対しても、Ｍｅｔタンパク質の本明細書で説明するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施するのに適しており、それにより、３つの全ペプチドを１回の質量分析アッセイで同時に分析できる。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本明細書で説明するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイなどのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施する際に考慮する点としては、ペプチドの分析に用い得る機器の種類が挙げられる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、三連四重極またはイオントラップ／三連四重極複合型などのいずれの種類の質量分析計に対しても開発および実施し得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も有利な機器プラットフォームは、現在は三連四重極型機器プラットフォームであると考えられている。この種の質量分析計は、１つの細胞内に含まれる全タンパク質に由来する数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質ライセート内にある単一の分離された標的ペプチドを分析するのに、現在最も適切な機器である。
【００２５】
Ｍｅｔタンパク質に由来する３つの各ペプチドに対してＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率的に実施するために、分析におけるペプチド配列に加え、情報を利用することが望ましい。その追加情報は、アッセイを効率的に実施できるように、特異標的ペプチドの正確かつ集中した分析を実施するために、質量分析計（例えば、三連四重極型質量分析計）の指導および指示に用いられ得る。一般に標的ペプチドに関する、および特にこれらの３つの特異Ｍｅｔペプチドに関するこの追加情報は、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオンおよび各遷移イオンのイオン型のうち１つ以上を含み得る。３つの全ＭｅｔペプチドのＭｅｔタンパク質に対して本明細書で説明するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施するために用いる追加のペプチド情報を、表２に示す。
【００２６】
【表２】
2019517677.tif 000003
【００２７】
ホルマリン固定患者由来組織の分析に基づいた、組織中のＭｅｔタンパク質レベルおよびＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるＭｅｔタンパク質ドメインの存在／非存在の評価は、各特定の患者に関する診断、予後および治療に関連する情報を提供し得る。一つの実施態様では、本明細書で説明するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、生体試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを測定する方法であって、質量分析を用いて前記生体試料から調製されたタンパク質消化物における２つの特定のＭｅｔフラグメントペプチド（配列番号１および配列番号３）の量を検出および定量化すること、ならびに前記試料におけるＭｅｔタンパク質のレベルを算出することを含んでなり、レベルが相対レベルまたは絶対レベルである方法を提供する。第二の実施態様では、本明細書で説明するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメイン内に存在する特異Ｍｅｔフラグメントペプチド（配列番号２）を検出することを含む。３つの全Ｍｅｔフラグメントペプチドは、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較（生体試料中の配列番号１、配列番号２および配列番号３のＭｅｔフラグメントペプチドの各々を、それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３と同じアミノ酸配列を有する３つの内部標準ペプチドと比較する）によって、生体試料において検出および定量化され得る。一部の実施態様では、内部標準は同位体標識された内部標準ペプチドであり、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含んでなる。
【実施例】
【００２８】
以下に説明する方法は、（１）Ｍｅｔタンパク質に対する本明細書で説明する質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに用いることができるＭｅｔタンパク質由来の候補ペプチドの同定、（２）Ｍｅｔタンパク質由来の本明細書で説明する各ペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）に対する個々のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発、ならびに（３）最適な癌療法の選択肢を知らせるために、Ｍｅｔタンパク質の発現ならびにＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメインの存在または非存在を判定するための、液体組織ライセートにおける各ペプチドを同時に検出および定量化する単一のマルチプレックスＳＲＭ／ＭＲＭの開発、のために用いた。
【００２９】
本アッセイの実験的証明を表３および図１に示す。表３は、３つの異なるホルマリン固定ヒト細胞株から調製された３つの液体組織ライセートにおける本明細書で説明する３つの全ペプチドの３回にわたる検出および定量的ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を示し、結果はａｍｏｌ／ｕｇ（分析した総タンパク質量）の単位で示す。第一の細胞株Ｈ２２６は、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４ドメインを含む通常型のＭｅｔタンパク質を発現することで知られる。通常バージョンのＭｅｔタンパク質を発現するこの細胞株のＳＲＭ／ＭＲＭ分析では、３つの全ペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）が検出および定量化され、配列番号１＝６９４．５０ａｍｏｌ／ｕｇ、配列番号２＝１１０１ａｍｏｌ／ｕｇ、配列番号３＝８７７ａｍｏｌ／ｕｇであった。図１に示すように、３つの全ペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）は、再現性のある質量分析ピークの可視化によって陽性に検出されたため、通常バージョンのＭｅｔタンパク質における３つの全ペプチドの存在が示された。このことは、ＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるＭｅｔタンパク質ドメインが陽性に検出および定量化されたことを示す。
【００３０】
この実験的証明における他の２つの細胞株、Ｈ５９６およびＨｓ７４６Ｔは、Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）バージョンのＭｅｔタンパク質の発現をもたらすＭＥＴ遺伝子のエクソン１４のスプライスジャンクション周囲の変異を含むことで知られる。表３は、Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）バージョンのＭｅｔタンパク質を発現することで知られるこれらの細胞株の双方におけるこれら３つのペプチドのうち２つのみ（配列番号１および配列番号３）が検出および定量化されたことを示す。結果からは、配列番号１はＨ５９６において４９３．５３ａｍｏｌ／ｕｇで検出および定量化されたが、配列番号３はＨ５９６において６３６．３３ａｍｏｌ／ｕｇで検出および定量化されたことが示されている。同様に、配列番号１はＨｓ７４６Ｔにおいて３２８８．６７ａｍｏｌ／ｕｇで検出および定量化されたが、配列番号３はＨｓ７４６Ｔにおいて４０６３．１７ａｍｏｌ／ｕｇで検出および定量化された。図１は、質量分析ピークの可視化によって、これらの細胞株においてこれらのペプチドが陽性に検出されたことを示している。
【００３１】
しかし、配列番号２はＨ５９６およびＨｓ７４６Ｔの細胞株では検出されず、定量化できなかったことから、Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質の発現が示され、ホルマリン固定細胞由来の液体組織ライセートにおけるこの型のＭｅｔタンパク質を本アッセイが検出できる能力が示された。図１は、Ｈ５９６およびＨｓ７４６Ｔの細胞株における配列番号２に対する陽性の質量分析ピークの視覚的検出がなかったこと（検出限界未満）を示しており、これらの細胞株においてＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるタンパク質ドメインを含まないＭｅｔタンパク質が発現していること、およびＭｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質の発現を検出できる能力がさらに示されている。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
アッセイ法
１．  Ｍｅｔタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定
ａ．  １つまたは複数のプロテアーゼプロテアーゼ（この特定の例では、トリプシン）を用いたホルマリン固定生体試料由来の液体組織タンパク質ライセートを用いて、タンパク質を消化した。
b.  液体組織ライセート中の全タンパク質フラグメントをイオントラップタンデム型質量分析計で分析し、Ｍｅｔタンパク質由来の全フラグメントペプチドを同定した（個々のフラグメントペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのペプチド修飾を含まない）。
ｃ．  ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に用いる好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複雑な液体組織タンパク質ライセートにおいて質量分析により直接同定されたペプチドであった。
【００３４】
２．  Ｍｅｔタンパク質由来のフラグメントペプチドに対する質量分析アッセイ
ａ．  ３つの個々のフラグメントペプチドに対する三連四重極型質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ
ｉ．  細胞外ドメインに存在する１つのペプチド、およびＭｅｔタンパク質の細胞内ドメイン内に存在する２つのペプチドに対するアッセイを開発した。さらにここで、液体組織ライセートにおいて同定されたＭＥＴ遺伝子のエクソン１４によりコードされるＭｅｔタンパク質の一部の中に存在する細胞内ドメインペプチドのうち１つを、Ｍｅｔタンパク質由来のペプチドに適用する。
ｉｉ．  液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび／または逆相高速液体クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない最適なクロマトグラフィー条件に対して、各フラグメントペプチドの最適な保持時間を判定した。
ｉｉｉ．  ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のｍ／ｚ値、各ペプチドのｍ／ｚ遷移イオンおよび各フラグメントペプチドの各遷移イオンのイオン型を判定した。
ｉｖ．  次に、三連四重極型質量分析計で、上記の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からの情報を用いて、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施した。ここで、各ペプチドは、三連四重極型質量分析計で実施された独特のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを正確に規定する特徴的かつ独特なＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する。
【００３５】
ｂ．  Ｍｅｔタンパク質のフラグメントペプチドの量が、独特のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の関数として検出されるようにＳＲＭ／ＭＲＭ分析を実施し、特定のタンパク質ライセートにおけるタンパク質の相対量および絶対量の双方が示された。
i.  相対的定量化は、以下によって達成することができる。
１．  あるホルマリン固定生体試料由来の液体組織ライセートにおいて検出された特定のＭｅｔペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以降のホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第二、第三、第四またはそれ以降の液体組織ライセートにおける同じＭｅｔフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、Ｍｅｔタンパク質の存在の増加または減少を判定する。
２．  あるホルマリン固定生体試料由来の液体組織ライセートにおいて検出された特定のＭｅｔペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、異なる別の生体源由来の他の試料における他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから得られたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、Ｍｅｔタンパク質の増加または減少を判定する。ここで、ペプチドフラグメントに対する２試料間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の比較を、各試料中の分析したタンパク質の量に対して正規化する。
３．  Ｍｅｔタンパク質のレベルの変化を、種々の細胞条件下で発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに対して正規化するために、特定のＭｅｔペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、ホルマリン固定生体試料由来の同じ液体組織ライセート内の異なるタンパク質に由来する他のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、Ｍｅｔタンパク質の存在の増加または減少を判定する。
【００３６】
ｉｉ．  特定のペプチドの絶対的定量化は、個々の生体試料におけるＭｅｔタンパク質由来の特定のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、生体試料由来のタンパク質ライセートに添加したフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、達成した。
１．  前記内部標準は、調査中のＭｅｔタンパク質に由来するフラグメントペプチドの標識合成バージョンである。この標準を既知量の試料に添加し、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積は、生体試料中のフラグメントペプチド内部標準および天然フラグメントペプチドの双方に対して別々に判定することができ、その後、両ピーク面積を比較する。
２．  これを、選択した３つの全Ｍｅｔフラグメントペプチドに適用した。
【００３７】
３．  癌の診断および治療のためのフラグメントペプチドの検出および定量化
ａ．  Ｍｅｔタンパク質の３つの全フラグメントペプチドの相対的および／または絶対的定量化を実施し、Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）の発現と患者腫瘍組織における癌の状態との相関が認められることが示された。
ｂ．  Ｍｅｔ（Ｅｘ１４ｄｅｌ）タンパク質の発現と異なる治療戦略から得られる臨床成績との相関を示すことができ、この相関は、すでにこの分野において実証されているか、患者コホートとそれらの患者の組織との間の相関研究を通じて将来実証され得る。本アッセイ法は、最適な治療戦略の判定に用いることができる。
【図１−１】
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【図１−２】
2019517677.tif 000006
【配列表】
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