(57)【要約】  Ｔ細胞およびＮＫ細胞活性を刺激し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞活性の阻害を抑制する様々な制御分子を感染細胞に提供する組み換えウイルスおよびウイルス核酸が企図される。最も好ましくは、ウイルスおよびウイルス核酸は、ヒト癌関連配列および特に、複数の癌関連抗原、癌特異的な抗原および／または患者および腫瘍特異的なネオアンチゲンをコードする配列をさらに含む。特に好ましい制御分子としては、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）、ＣＤ１１（ＬＦＡ−１）およびＣＴＬＡ−４の阻害剤が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の遺伝子をコードする組み換え配列部分を含み、前記組み換え配列部分が、前記複数の遺伝子の発現を可能にするために制御配列に操作可能にカップリングされるウイルスゲノム
を含む組み換え核酸ベクターであって；
前記複数の遺伝子が、免疫チェックポイント受容体に対する４個の別個の刺激型分子および阻害性リガンドをコードし；
前記ウイルスゲノムが、前記ウイルスゲノムによりコードされるウイルスの免疫原性を低下させるために少なくとも１個の突然変異または欠失タンパク質コード配列を有する、
組み換え核酸ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記４個の別個の刺激型分子のうち少なくとも１個が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）からなる群から選択される、組み換え核酸ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記４個の別個の刺激型分子のうち少なくとも２個が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）からなる群から選択される、組み換え核酸ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記４個の別個の刺激型分子のうち少なくとも３個が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）からなる群から選択される、組み換え核酸ベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記４個の別個の刺激型分子が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）である、組み換え核酸ベクター。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記免疫チェックポイント受容体がＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１であり、場合によっては前記阻害性リガンドが、細胞膜に前記リガンドを係留する膜貫通ドメインを含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記組み換え配列部分が、ヒト癌関連配列をさらに含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ヒト癌関連配列が、前記組み換え核酸ベクターの宿主となる細胞の細胞質区画へと、癌関連配列によりコードされる遺伝子産物を優先的に向ける輸送配列をさらに含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ヒト癌関連配列が、前記組み換え核酸ベクターの宿主となる細胞のリソソームまたはエンドソーム区画へと、前記癌関連配列によりコードされる遺伝子産物を優先的に向ける輸送配列をさらに含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ヒト癌関連配列が、癌関連抗原、癌特異的抗原および患者および腫瘍特異的なネオアンチゲンからなる群から選択されるタンパク質をコードする、組み換え核酸ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ウイルスがアデノウイルスである、組み換え核酸ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記少なくとも１個の突然変異または欠失タンパク質コード配列が、Ｅ１、Ｅ２ｂおよびＥ３からなる群から選択される、組み換え核酸ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ウイルスが複製欠損型である、組み換え核酸ベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記免疫チェックポイント受容体がＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１であり、場合によっては前記阻害性リガンドが、細胞膜に前記リガンドを係留する膜貫通ドメインを含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項１５】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記組み換え配列部分が、ヒト癌関連配列をさらに含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ヒト癌関連配列が、前記組み換え核酸ベクターの宿主となる細胞の細胞質区画へと、前記癌関連配列によりコードされる遺伝子産物を優先的に向ける輸送配列をさらに含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ヒト癌関連配列が、前記組み換え核酸ベクターの宿主となる細胞のリソソームまたはエンドソーム区画へと、前記癌関連配列によりコードされる遺伝子産物を優先的に向ける輸送配列をさらに含む、組み換え核酸ベクター。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ヒト癌関連配列が、癌関連抗原、癌特異的抗原および患者および腫瘍特異的なネオアンチゲンからなる群から選択されるタンパク質をコードする、組み換え核酸ベクター。
【請求項１９】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ウイルスがアデノウイルスである、組み換え核酸ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記少なくとも１個の突然変異または欠失タンパク質コード配列がＥ１、Ｅ２ｂおよびＥ３からなる群から選択される、組み換え核酸ベクター。
【請求項２１】
請求項１に記載の組み換え核酸ベクターであって、前記ウイルスが複製欠損型である、組み換え核酸ベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の組み換え核酸ベクターを含む、ウイルス。
【請求項２３】
請求項２２に記載のウイルスであって、前記Ｅ２ｂ遺伝子を欠く組み換え欠損型アデノウイルスである、ウイルス。
【請求項２４】
請求項２３に記載のウイルスであって、前記４個の別個の刺激型分子が、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）であり、前記免疫チェックポイント受容体がＣＴＬＡ−４であり、前記組み換え配列部分がヒト癌関連配列をさらに含む、ウイルス。
【請求項２５】
請求項１４〜２１の何れか１項に記載の組み換え核酸ベクターを含む、ウイルス。
【請求項２６】
請求項２５に記載のウイルスであって、Ｅ２ｂ遺伝子を欠く組み換え欠損型アデノウイルスである、ウイルス。
【請求項２７】
請求項２６に記載のウイルスであって、前記４個の別個の刺激型分子がＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）であり、前記免疫チェックポイント受容体がＣＴＬＡ−４であり、前記組み換え配列部分がヒト癌関連配列をさらに含む、ウイルス。
【請求項２８】
抗原提示細胞に感染させて、それにより前記抗原提示細胞と接触するＴ細胞においてＴ細胞活性化を刺激するための、請求項２２〜２４の何れか１項に記載のウイルスの使用。
【請求項２９】
請求項２８に記載の使用であって、皮膚層で前記抗原提示細胞に感染させる、使用。
【請求項３０】
免疫反応の刺激を必要とする哺乳動物において免疫反応を刺激する方法であって、前記免疫反応を刺激するのに有効なプロトコール下で請求項２２〜２４の何れか１項に記載のウイルスを投与する段階を含む、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記投与する段階が、皮下または真皮下注射により行われる、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記哺乳動物に対して低用量化学療法または低用量放射線療法を施行することをさらに含む、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記低用量化学療法または低用量放射線療法が規則的に施行される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年３月１８日提出の米国特許仮出願第６２／３１０５５１号明細書に対する優先権および２０１６年３月２５日提出の米国特許仮出願第６２／３１３５９６号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、組み換え核酸ベクター、特に少なくとも二重機能を有する細胞遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の説明には、本発明を理解することにおいて有用であり得る情報が含まれる。本明細書中で提供される情報は何れも、ここで主張される発明に対する先行技術またはこれに関連するものであること、または具体的または明確に参照される何れの刊行物も先行技術であることを受け入れるものではない。
【０００４】
本明細書中の刊行物および特許出願は全て、それぞれの個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示される場合と同程度まで、参照により組み込まれる。組み込まれる参考文献中の用語の定義または使用が、本明細書中で提供されるその用語の定義と一致しないかまたは対立する場合、本明細書中で提供される用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。
【０００５】
癌に対する免疫療法における最近の進歩は、処置の転帰に顕著な改善をもたらした。例えば、分子レベルで癌細胞の特徴を調べる能力が向上したことによって、より標的化された処置が可能になった。標的の中でもとりわけ、免疫療法は、遺伝子操作されている免疫応答性細胞を癌に向けるための試みにおいて、癌関連抗原（例えばＣＥＡ−１）、癌特異的な抗原（例えばＨＥＲ２）または患者および腫瘍特異的なネオエピトープを使用している。
【０００６】
しかし、免疫応答性細胞の活性を調整することにおける経験の増加によって、治療的に有効な免疫反応を生じさせるために必要とされる制御過程の多大な複雑性が明らかとなってきた。例えば、癌関連抗原のタイプに依存して、いくつかの抗原は、患者のＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ系により提示されないかまたは不十分にしか提示されない。別の例において、腫瘍は、癌細胞に対して細胞毒性がある細胞の活性を下方制御する微小環境を生じさせることが多い。さらに、ロバストな免疫反応を促進するために同時刺激型シグナルが必要とされることが多いが、必ずしも存在するとは限らず、または十分な量で存在するとも限らない。したがって、遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ）の産生が比較的単純であることが多い一方で、インビボでのそれらの有効性は、容易に相殺されない因子により低下することが多い。困難であることの中でもとりわけ、適正な抗原提示、活性化およびシグナル抑制の低下は、適正な免疫反応を妨害することが多い。
【０００７】
Ｔ細胞の有効な刺激は、多くのタンパク質のよく統制されたアセンブリを含む耐久性のある免疫シナプスの形成を必要とすると考えられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５（５４２５）：２２１−２２７；Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５（５５５９）：１５３９−１５４２）。免疫シナプスの形成を模倣するための試みにおいて、米国特許出願第２００８／０３１７７２４号明細書中に記載のように、Ｔ細胞を刺激するための様々なシグナル伝達分子を、スペーシング、分布およびパターンに関して予め方向づけられた方式で担体に固定した。注目すべきことに、発明者らは、このような系におけるＴ細胞活性化が、ＣＤ２８およびＴ細胞受容体の特異的な空間的配置を必要としたことを観察した。しかし、様々な他の因子および抗原提示細胞とＴ細胞との間の細胞−細胞相互作用は存在せず、したがって、シグナル伝達および活性化はインビボで有効となり得ない。
【０００８】
Ｔ細胞活性化のさらなる既知の方法において、細胞における分泌型抗原および選択される同時刺激型分子の同時発現が国際公開第２０１６／１２７０１５号パンフレットで報告された。しかし、同時刺激型分子は分泌型融合タンパク質だったので、および抗原も分泌され、特異的なＨＬＡ型と一致しなかったので、同時刺激型分子の背景において、適正な抗原提示は確実なものとはならなかったと思われた。
【０００９】
ポックスウイルスベクターからのある種の同時刺激型分子（Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）および癌または腫瘍関連抗原の発現によって、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞が活性化されたが、Ｂ７−１のみを発現する同等の系と比較してアポトーシスを増加させることができなかったことが報告された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）Ｖｏｌ  ５９，５８００−５８０７；Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ（２０１６），Ｖｏｌ  ４，１９）。これらの系における抗原はＣＥＡであり、異なるＨＬＡ型によって全てのＣＥＡ断片が等しく提示されるものではないことに留意すべきである。さらに、ＣＥＡは正常な非癌細胞でも発現されるので、自己免疫反応の可能性が除外され得ない。さらに、これらの研究で使用されるウイルスは免疫原性であったので、単回投与しかできなかった。
【００１０】
また別のアプローチにおいて、アゴニスト抗ＯＸ４０  ｍＡｂとともにＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、Ｔ細胞分化およびチェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４の全身性の抗体介在性遮断を増強することによって抗腫瘍免疫を促進した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ（２０１４）Ｖｏｌ  ２（２）：１４２−１５３）。特に、併用抗ＯＸ４０／抗ＣＴＬＡ−４免疫療法は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞依存性に、腫瘍退縮および腫瘍担持宿主の生存を顕著に促進した。しかし、全身性抗ＣＴＬＡ−４免疫療法は、サイトカインストームのリスク向上と関連付けられている。同様のアプローチにおいて、交差提示する樹状細胞に対する腫瘍関連抗原を標的とするワクチン接種を抗ＯＸ４０／抗ＣＴＬＡ−４免疫療法と組み合わせた（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１６）４：３１）。残念ながら、期待できる結果が実際に達成された一方で、防御的免疫反応の発生には、多くの患者において（例えば化学療法および／または放射線療法の繰り返しゆえに）もはや利用できなくなっている、実質的にインタクトな免疫系が必要である。
【００１１】
さらに、ウイルスビヒクルを用いて送達される多くの癌ワクチンは、ウイルスベクターに対する宿主反応ゆえに、抗原性カーゴに対する免疫反応の誘発において無効である傾向があり、それ自体、腫瘍に対する免疫反応を生じさせるために設計される癌エピトープを生成させるためにＤＮＡペイロードを送達するための機会を減少させることが多い。その結果として、ウイルスワクチンの投与は一般に単回の試行に限定される。さらに、組み換えＤＮＡは転写され、翻訳されるので、生じる産物は、ＭＨＣ−Ｉ系を介した免疫反応を支持する傾向がある。しかし、有効な免疫療法は、ロバストなＴ細胞およびＮＫ細胞反応も必要とし、これは一般にＭＨＣ−ＩＩ系により活性化される「Ｉ型」ＣＤ４＋Ｔ細胞により刺激される。
【００１２】
したがって、多くの方法および組成物が抗腫瘍免疫反応を生じさせることが当技術分野で知られているにもかかわらず、それらの全てまたは殆ど全てに１つ以上の欠点がある。それゆえ、癌の免疫療法に対する組成物および方法の改善が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の主題は、組み換え（好ましくは複製欠損型および非免疫原性）ウイルスまたは組み換えウイルス核酸が複数の刺激型分子、免疫チェックポイント受容体の阻害剤および１つ以上のヒト癌関連配列をコードし、それによって、必要とする者へのウイルスの投与時に耐久性があり、治療的に有効な免疫反応の誘発に役立つ組成物および方法を対象とする。最も一般的には、ウイルスは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞と相互作用する樹状細胞に感染させて、ロバストな免疫反応を生じさせ、免疫記憶を生成させるために患者に投与される。免疫療法に対する標的としてネオエピトープのみを使用することに加えて、免疫抑制の刺激因子および／または阻害剤の二重モード投与（および特に組み換え発現および注射を介するもの）は、このような治療法の有効性をまたさらに促進すると考えられる。
【００１４】
本発明の主題の一態様において、発明者らは、複数の遺伝子をコードする組み換え配列部分を含むウイルスゲノムの少なくとも一部を含む組み換え核酸ベクターであって、この組み換え配列部分が、複数の遺伝子の発現を可能とするように制御配列に操作可能にカップリングされている組み換え核酸ベクターを企図する。最も一般的には、この複数の遺伝子は、免疫チェックポイント受容体に対する４個の別個の刺激型分子および少なくとも１個（好ましくは膜に係留）阻害性リガンドをコードし、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムによりコードされるウイルスの免疫原性を低下させるように少なくとも１個の突然変異または欠失タンパク質コード配列を有する。
【００１５】
４個の別個の刺激型分子に関して、一般に、刺激型分子がＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）のうち少なくとも１個または少なくとも２個または少なくとも３個または全てを含むことが好ましい。好ましい免疫チェックポイント受容体はＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１を含み、一般に阻害性リガンドが、細胞膜にリガンドを係留する少なくとも１個の膜貫通ドメインを含むことが企図される。さらに、一般に組み換え配列部分が１つ以上のヒト癌関連配列（例えば癌関連抗原、癌特異的な抗原および患者および腫瘍特異的なネオアンチゲン）をさらに含むことが好ましい。望ましい場合、ヒト癌関連配列は、癌関連配列によりコードされる遺伝子産物を組み換え核酸ベクターの宿主となる細胞の細胞質区画またはリソソームもしくはエンドソーム区画へと優先的に向ける輸送配列をさらに含む。さらに、ウイルスが複製欠損型および／またはアデノウイルスであること、および突然変異または欠失タンパク質コード配列がアデノウイルス５型のＥ１、Ｅ２ｂおよび／またはＥ３であることが好ましい。
【００１６】
したがって、発明者らは、上記で提示されるような組み換え核酸ベクターを含むウイルスも企図する。最も好ましくは、ウイルスは、Ｅ２ｂ遺伝子を欠く組み換え欠損型アデノウイルスであり、別個の刺激型分子はＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）のうち１つ以上であり、免疫チェックポイント受容体はＣＴＬＡ−４であり、組み換え配列部分はヒト癌関連配列をさらに含む。
【００１７】
このような組み換え核酸およびウイルスは、抗原提示細胞に感染し、それによって抗原提示細胞と接触するＴ細胞においてＴ細胞活性化を刺激すると特に考えられる。したがって、発明者らは、免疫反応を刺激するのに有効なプロトコール下で（例えば皮下または真皮下注射により）ウイルスを投与する段階を含む、哺乳動物において免疫反応を刺激する方法も企図する。望ましい場合、このような方法は、哺乳動物に対して、好ましくは規則的に低用量化学療法または低用量放射線療法を施行することをさらに含む。
【００１８】
次の、好ましい実施形態の詳細な記述から、本発明の主題の様々な目的、特性、態様および長所がより明らかになろう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明者らは、複数の（同時）刺激型分子をコードする組み換え核酸および抗原提示細胞の細胞膜に好ましくは係留される免疫チェックポイント受容体の少なくとも１つの阻害剤を含むウイルスベクターおよび最も好ましくはアデノウイルスベクターを使用して、免疫療法組成物が調製され得ることを発見した。さらに、このような組み換えウイルスまたはウイルスベクターは、癌関連配列によりコードされるタンパク質を提示する細胞に対する免疫反応を刺激するための１つ以上のヒト癌関連配列をさらに含む。したがって、組み換えタンパク質を発現する抗原提示細胞は、抗原特異的なＴ細胞活性化に対する十分な相互作用を促進する刺激型因子および抗阻害因子の両方との関連において抗原を提示する。
【００２０】
ウイルスは非免疫原性であり（すなわち、ウイルスに対する防御免疫反応を誘発することなく、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回またはさらに多数回投与し得る）、複製欠損型であり、患者に皮下または真皮下投与し、それにより樹状細胞に優先的に感染させることがまたさらに好ましい。ある特に好ましい例において、ウイルスベクターは、免疫原性を低下させ、ペイロード能を向上させるためにＥ１、Ｅ２ｂおよびＥ３ウイルス遺伝子を欠いている組み換えアデノウイルスである。このような修飾ウイルスゲノムに導入されるのは、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）、活性化因子分子ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１／ＢＢ２）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）および免疫チェックポイント受容体ＣＴＬＡ−４に対する阻害剤（例えば、ｓｃＦｖ、場合によっては膜貫通ドメインを伴う）である同時刺激型分子を適切な調節エレメント（一般的には構成的に活性のあるプロモーター）下でコードする１つ以上の発現カセットである。また、刺激型分子および阻害性リガンドとともに同時発現される複数の癌関連配列も組み換え核酸中にコードされる。必要ではないが、一般的には、適切な輸送配列の使用によって、癌関連配列のうち少なくともいくつかがＭＨＣ−Ｉプロセシング経路および／またはＭＨＣ−ＩＩプロセシング経路へと向けられることが好ましい。
【００２１】
したがって、当然ではあるが、本明細書中で提供されるウイルス（またはウイルスベクター）の設計は、癌関連配列に対して強力で耐久性のある免疫反応を惹起することに対する複数の利点を提供する。最初に、および組み換えウイルスでの樹状細胞の感染時に、癌関連配列が発現され、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ提示経路を用いて提示され、これにより、適切に活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を生じさせる確率が上昇し、同様にして、適正な抗体産生および適切なＴおよびＢ細胞記憶の確率が上昇すると考えられる。さらに、癌関連配列が様々な同時刺激型分子とともに（および最も好ましくはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４およびＣＤ１１とともに）優先的および協調的に発現される場合、このような感染細胞によるＴ細胞活性化が促進されるが、これは、これらの細胞が同時刺激型分子と一緒にＭＨＣ結合エピトープを提示するからである。さらに、このような感染細胞は活性化時にＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞におけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１に対する阻害性リガンド（一般的には膜結合型）も発現するので、このような感染細胞により、可能性のある阻害性シグナル伝達が低下する。
【００２２】
別の視点から見ると、当然ではあるが、本明細書中で企図されるウイルスおよびウイルスベクターコンストラクトは、提示される癌関連配列の観点から、活性化の最適化をもたらし、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の阻害を抑制し、これにより、癌関連配列を提示する癌細胞に対するロバストで治療的に有効な免疫反応が生じると考えられる。このような長所は、樹状細胞の感染を増加させ、同様にして、エピトープ特異的な方式で免疫コンピーテント細胞および特にＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化するためにウイルスが皮下または真皮下投与される場合に特に有利である。
【００２３】
しかし、当然ではあるが、適切なウイルスベクター（およびそのウイルス核酸ベクターを伴う）は、上記のようにアデノウイルスに限定される必要はなく、認識されるはずであるが、ベクターの特定の選択は本発明の主題にとって重要ではない。したがって、適切なウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどが挙げられる。しかし、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、ウイルスが複製欠損型および非免疫原性ウイルスであることがさらに好ましく、これは、一般的には選択されるウイルスタンパク質（例えばアデノウイルスに対するＥ１、Ｅ３タンパク質）の標的化された欠失により遂行される。このような所望の特性は、Ｅ２ｂ遺伝子機能を欠失させることによってさらに促進され得る。
【００２４】
ウイルスが複製欠損型である場合、認識されるはずであるが、欠損機能（例えばポリメラーゼ遺伝子）を提供する細胞株を用いてウイルス培養物を調製し得る。例えば、最近報告されているように、遺伝子改変ヒト２９３細胞を用いて組み換えウイルスの比較的高いタイターを達成し得る（例えばＪ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｆｅｂ；７２（２）：９２６−９３３）。適切なウイルスコンストラクトのさらに特に好ましい態様は、米国特許第６０８３７５０号明細書、同第６０６３６２２号明細書、同第６０５７１５８号明細書、同第６４５１５９６号明細書、同第７８２０４４１号明細書、同第８２９８５４９号明細書および同第８６３７３１３号明細書に記載されている。最も一般的には、および既に上で対処しているように、ウイルス感染細胞からの発現に対する所望の核酸配列は、当技術分野で周知の適切な制御エレメントの調節下にある。ウイルスゲノムまたはウイルスベクターの修飾は一般に当技術分野で周知である標準的手順に従う（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｍａｕｒｏ  Ｇｉａｃｃａ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，Ｎｏｖ  １，２０１０．またはＡ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｒｏｌａｎｄ  Ｈｅｒｚｏｇ（Ｐｈ．Ｄ．），Ｓｅｒｇｅｉ  Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ；Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２０１０．またはＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｂｙ  Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７を参照）。
【００２５】
刺激分子に関して、一般に、同時刺激型分子ならびに他の刺激分子、ならびにそれらの対応する変異タンパク質、短縮およびキメラ形態が本明細書中での使用に適切とみなされることが企図される。例えば特に適切な同時刺激型分子としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬが挙げられるが、一方で作用機序があまり明確ではない（またはあまり理解されていない）他の刺激型分子としては、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ３およびＳＬＡＭファミリーのメンバーが挙げられる。しかし、癌関連配列と発現を協調させるのに特に好ましい分子としては、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）が挙げられる。企図される刺激型分子に対する配列は当技術分野で公知であり、配列（ＲＮＡならびにｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ）の全てが本明細書中での使用に適切とみなされる。
【００２６】
同様に、Ｔ細胞活性化について知られているいくつかの阻害性シグナル経路があり、Ｔ細胞活性化の阻害を低下させる全ての化合物が本明細書中で企図される。例えば、ペプチド分子は、ＰＤ−１、ＰＤ１Ｈ、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＣＤ１６０に結合するかまたはそうでなければこれらを通じてシグナル伝達を阻害することが企図される。このような結合または他の阻害は、適切なアンタゴニスト性リガンドまたは結合断片（例えばｓｃＦｖ）の発現および分泌によって惹起され得、および／またはこれには発現および膜結合提示が介在し得る。したがって、企図される阻害性リガンドは、ペプチドリガンドに融合される膜貫通ドメインも含み得る。当技術分野で公知の多くの膜貫通ドメインがあり、それらは全て、本明細書中での使用に適切であるとみなされ、これには、１個のアルファヘリックス、複数のアルファヘリックス、アルファ／ベータバレルを有するものなどが含まれる。例えば、企図される膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えばＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲまたはＰＡＧ／Ｃｂｐの膜貫通領域を含み得、含む（ｃａｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）。融合タンパク質が所望される場合、組み換えキメラ遺伝子が、膜貫通領域をコードする第１の部分を有し、この第１の部分が阻害性タンパク質をコードする第２の部分とインフレームでクローニングされることが企図される。
【００２７】
当然ではあるが、チェックポイント阻害を妨害／下方制御する上述の刺激型遺伝子および阻害性タンパク質をコードする遺伝子は全て当技術分野で周知であり、これらの遺伝子、アイソフォームおよび変異体の配列情報は様々な公開リソースから検索され得、これには、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑなどでアクセス可能な配列データベースが含まれる。さらに、上記の代表的な刺激分子が好ましくはヒトにおいて発現される場合の全長型で発現される一方で、修飾および非ヒト型も、このような型がＴ細胞を刺激または活性化することに役立つ限り、適切とみなされる。したがって、変異タンパク質、短縮型およびキメラ型が本明細書中で明確に企図される。
【００２８】
癌関連配列に関して、当然ではあるが、癌関連であり、癌のタイプに特異的である何らかのエピトープまたは患者に特異的なネオエピトープは、特にエピトープが発現される場合（好ましくは上記健常対照）および発現されるエピトープがまたＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ複合体の個々の結合モチーフに結合することが証明されるかまたは予想される場合、本明細書中での使用に適切である。
【００２９】
例えば、腫瘍生検（またはリンパ生検または転移性部位の生検）および対応する正常組織（すなわち同じ患者からの非疾患組織）の全ゲノム分析によって、そのように得られるオミクス情報の同調的な比較を介して、第１の段階において患者腫瘍からネオエピトープが同定され得る。次いで、このように同定されたネオエピトープは、ネオエピトープの抗原提示の可能性を上昇させるために、患者のＨＬＡ型に対する一致についてさらにフィルタリングされ得る。最も好ましくはおよび以下でさらに論じるように、このようなマッチングはイン・シリコで行われ得る。最も一般的には、患者に特異的なエピトープは患者に特有であるが、少なくとも一部のケースでは、腫瘍型特異的なネオエピトープ（例えばＨｅｒ−２、ＰＳＡ、ブラキュリ）または癌関連ネオエピトープ（例えばＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＹＰＢ１）も含む。したがって、当然ではあるが、アデノウイルス核酸コンストラクト（または他の送達のための核酸コンストラクト）は、少なくとも１つの患者に特異的なネオエピトープをコードし、より一般的には少なくとも２つまたは３つ以上のネオエピトープおよび／または腫瘍型特異的なネオエピトープおよび／または癌関連ネオエピトープをコードする組み換えセグメントを含む。所望のネオエピトープ数が組み換え核酸に対するウイルスの能力よりも大きい場合、複数および別個の組み換えウイルスを介して複数および別個のネオエピトープが送達され得る。
【００３０】
１つ以上のネオエピトープを同定するために患者からオミクス情報を得る段階に関して、標準的な組織処理プロトコールおよび配列決定プロトコールに従い、患者生検試料からオミクスデータを得ることが企図される。本発明の主題に限定されないが、一般的に、データが患者対応腫瘍データ（例えば腫瘍対同じ患者の正常）であることおよびデータ方式がＳＡＭ、ＢＡＭ、ＧＡＲまたはＶＣＦ方式であることが好ましい。しかし、非対応または対応対他の参照物（例えば前の同じ患者の正常または前の同じ患者の腫瘍またはホモスタティスティクス（ｈｏｍｏ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｕｓ））も本明細書中での使用に適切とみなされる。したがって、オミクスデータは、「新鮮な」オミクスデータまたは以前の手順（またはさらに異なる患者）から得られたオミクスデータであり得る。
【００３１】
参照配列（例えば対応する正常）の性質にかかわらず、複数のエピトープを計算するために、参照配列が使用されることが一般に好ましい。最も一般的には、エピトープは、２〜５０個のアミノ酸、より一般的には５〜３０個のアミノ酸および最も一般的には９〜１５個のアミノ酸長を有し、変化したアミノ酸が好ましくは中央に位置するかまたはそうでなければＭＨＣへのその結合を向上させるように置かれるように計算される。例えばエピトープをＭＨＣ−Ｉ複合体により提示させようとする場合、典型的なエピトープ長は約８〜１１個のアミノ酸であり、一方、ＭＨＣ−ＩＩ複合体を介した提示のための典型的なエピトープ長は約１３〜１７アミノ酸である。以下でより詳細にさらに記載するように、このように計算されたエピトープおよびネオエピトープを、患者特異的なＨＬＡ型（ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ）に対するそれらの親和性についてイン・シリコで分析することがまたさらに好ましい。当然ではあるが、このようなネオエピトープに対するＨＬＡ親和性の知識は、価値のある情報の少なくとも２つの項目を提供する：（ａ）免疫療法に適切なエピトープの欠失が認識され、したがって欠失エピトープを標的としないように免疫療法が調整され得ることおよび（ｂ）免疫療法に適切なネオエピトープの生成が認識され、したがってネオエピトープを標的とするように免疫療法が調整され得ること。
【００３２】
さらに、および以下でさらに記載するように、当然ではあるが、ネオエピトープの選択は、ネオエピトープの発現レベルおよび細胞内の位置を調べることによってもさらに導かれる。例えば、ネオエピトープが発現されないかまたは対応正常と比べて弱くしか発現されない場合（例えば、同じかまたは対応正常発現の２０％より低い）、ネオエピトープは適切なネオエピトープの選択から削除され得る。同様に、ネオエピトープが核タンパク質として同定される場合、適切なネオエピトープの選択からネオエピトープが削除され得る。一方で、ネオエピトープに対する陽性選択は、ネオエピトープの細胞外または膜貫通の存在および／または対応正常と比較して少なくとも５０％の発現レベルを一部必要とし得る。当技術分野で公知の多くの方式で発現レベルを測定し得るが、適切な方式としては、ｑＰＣＲ、ｑＬＣＲおよび他の定量的ハイブリッド形成技術が挙げられる。
【００３３】
何らかの多くの分析的方法によってゲノム分析が行われ得ることが一般に企図されるが、特に好ましい分析的方法としては、腫瘍および対応正常試料の両方のＷＧＳ（全ゲノ配列決定）およびエクソーム配列決定が挙げられる。同様に、配列データの計算分析が多くの方式で行われ得る。しかし最も好ましい方法において、ＢＡＭファイルおよびＢＡＭサーバーを用いて、例えば米国特許出願第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書および同第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書で開示されるように、腫瘍および正常試料の位置誘導型の同調的アライメントによって、分析がイン・シリコで行われる。
【００３４】
次に、同定された患者ＨＬＡ型に対して、このように同定され選択されるネオエピトープをさらにイン・シリコでフィルタリングし得る。このようなＨＬＡマッチングは、有核細胞のＭＨＣ−Ｉ複合体および特異的な抗原提示細胞のＭＨＣ−ＩＩ複合体へのネオエピトープの強力な結合を確実にすると考えられる。両抗原提示系を標的化することによって、特に、免疫系の細胞性および液性の両部門を含む、治療的に有効で耐久性のある免疫反応が生じると考えられる。ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩの両方に対するＨＬＡ決定は、当技術分野で周知のウェット化学における様々な方法を使用して行われ得、これらの方法は全て、本明細書中での使用に適切とみなされる。しかし、特に好ましい方法において、ＨＬＡ型は、以下でより詳細に示されるように、既知および／または一般的なＨＬＡ型の殆どまたは全てを含有する参照配列を使用してイン・シリコでオミクスデータから予測することもできる。手短に言うと、患者のＨＬＡ型を（ウェット化学またはイン・シリコでの決定を使用して）確認し、ＨＬＡ型に対する構造解を計算するか、またはデータベースから得て、次いでこれをイン・シリコでドッキングモデルとして使用して、ＨＬＡ構造解に対するネオエピトープの結合親和性を決定する。結合親和性の決定に対する適切な系としては、ＮｅｔＭＨＣプラットフォーム（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８  Ｊｕｌ  １；３６（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５０９−Ｗ５１２参照）、ＨＬＡＭａｔｃｈｍａｋｅｒ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｎｅｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌ参照）およびＩＥＤＢ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵＲＬ  ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／参照）が挙げられる。次に、既に決定されているＨＬＡ型に対して高親和性（例えばＭＨＣ−Ｉに対して１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満；ＭＨＣ−Ｉに対して５００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満）であるネオエピトープを選択する。最大親和性の計算において、ネオエピトープに対する修飾は、ＨＬＡ型へのウイルス発現ネオエピトープの結合をさらに増加させるためにＮおよび／またはＣ末端修飾をエピトープに付加することによって実行され得る。したがって、ネオエピトープは、特定のＨＬＡ型とより良好に一致することが同定されるか、またはより良好に一致するようにさらに修飾される場合はネイティブであり得る。ＨＬＡ一致ネオエピトープのさらなる態様および考察は、本明細書中に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００２８０４４号明細書で開示される。
【００３５】
このように同定され、発現されるネオエピトープを所望のＭＨＣ系に送ることに関して、当然ではあるが、ＭＨＣ−Ｉ提示ペプチドは、一般的には小胞体を通じたプロテアソームプロセシングおよび送達を介して細胞質から生じる。したがって、ＭＨＣ−Ｉ提示を対象としたエピトープの発現は一般に、以下でより詳細にさらに論じるように、細胞質に向けられる。一方で、ＭＨＣ−ＩＩ提示ペプチドは一般的には、細胞膜への送達前に、酸性プロテアーゼ（例えばレグマイン、カテプシンＬおよびカテプシンＳ）による分解およびプロセシングを介してエンドソームおよびリソソーム区画から生じる。したがって、ＭＨＣ−ＩＩ提示を対象としたエピトープの発現は一般に、また以下でより詳細にさらに論じるように、エンドソームおよびリソソーム区画に向けられる。
【００３６】
最も好ましい態様において、エンドソームおよびリソソーム区画への輸送のために、または細胞質空間での保持のために、シグナルペプチドが使用され得る。例えば、プレ配列を標的とするエンドソームおよびリソソーム区画にペプチドを輸出しようとする場合、内部の標的化ペプチドを使用し得る。標的化ペプチドのプレ配列は好ましくはＮ末端に付加され、６〜１３６個の塩基性および疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソーム標的化の場合、標的化配列はＣ末端にあり得る。他のシグナル（例えばシグナルパッチ）を使用し得、これには、ペプチド配列において分離される配列エレメントが含まれ得、正しいペプチド折り畳み時に機能的になる。さらに、糖鎖付加のようなタンパク質修飾は標的化を誘導し得る。
【００３７】
適切な標的化シグナルの中でもとりわけ、発明者らは、ペルオキシソーム標的化シグナル１（ＰＴＳ１）、Ｃ末端トリペプチドおよびペルオキシソーム標的化シグナル２（ＰＴＳ２）を企図し、これはＮ末端付近に位置するノナペプチドである。さらにエンドソームおよびリソソームへのタンパク質の局在化にはまた、タンパク質の細胞質ドメイン内のシグナルも介在し得、一般的には短い直鎖状配列を含む。一部のシグナルは、チロシンベース局在化シグナルと呼ばれ、ＮＰＸＹまたは
【数１】
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コンセンサスモチーフに一致する。ジロイシンベースシグナルとして知られる他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフと適合する。これらのシグナルは全て、膜の細胞質側と周辺で連結するタンパク質コートの構成要素により認識される。
【数２】
2019508044.tif 000003
および［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］シグナルは、アダプタータンパク質（ＡＰ）複合体ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３およびＡＰ−４により特徴的な優れた特異性で認識され、一方でＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして知られるアダプターの別のファミリーにより認識される。またＦＹＶＥドメインが付加され得、これは、液胞型タンパク質局在およびエンドソーム機能と関連付けられている。またさらなる態様において、ヒトＣＤ１テール配列を使用してエンドソーム区画を標的とすることもできる（例えばＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２，５２２−５３１参照）。
【００３８】
細胞質区画への輸送またはそこでの保持は、１つ以上の特異的な配列エレメントを必ずしも必要とし得ない。しかし、少なくともいくつかの態様において、膜アンカータンパク質または膜アンカータンパク質の膜アンカードメインを含め、ＮまたはＣ末端細胞質保持シグナルが付加され得る。例えば、膜アンカータンパク質としては、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、シナプトプレビン（ｓｙｎａｐｔｏｐｒｅｖｉｎ）、シナプトタグミン、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼおよびＮＯＴＣＨが挙げられる。したがって、当然ではあるが、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩを介した優先的なまたはさらに特異的な提示を達成するために、ペプチドを特異的な細胞区画に向け得る。
【００３９】
さらに、またはあるいは、これもまた当然ではあるが、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩにより複合体化されることなく、ネオエピトープが抗体認識のために細胞の表面でまたは表面上で提示されるように、細胞での発現のために組み換え核酸により１つ以上のネオエピトープがコードされ得る。このようなアプローチは、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ標的化提示と組み合わせて、またはあまり好ましくはないが単独でも行われ得る。異なる角度から見ると、当然ではあるが、このようなネオエピトープを含む目的は、単独で、または、タンパク質の標的セットに対する免疫反応を増強するために古典的なＭＨＣ提示ペプチドエピトープと組み合わせて作用し得る抗体を作製することである（しかし、その患者特異的なエピトープが様々なＭＨＣＩまたはＩＩ区画に追いやられる一方で、同じ突然変異タンパク質が原理上は表面で発現され得る）。このような表面提示は、ペプチドエピトープが膜貫通配列に融合されるキメラタンパク質を用いて行われ、適切な膜貫通配列には、上記で論じるものが含まれる。ネオエピトープの差次的提示に関連するさらなる態様および企図については、本明細書中で参照により組み込まれる共同所有係属米国仮特許出願第６２／４６６８４６号明細書で開示される。
【００４０】
さらに当然ではあるが、免疫チェックポイント受容体に対する刺激型および阻害性リガンドが同じプロモーターの調節下で発現され得、および／または個々のまたは共通のプロモーターエレメントを有する。同様に、ヒト癌関連配列の発現も、制御分子の発現と同時に起こることが好ましく、したがって、最も好ましくは同じ調節（または同じ独立プロモーター配列）下にある。
【００４１】
例えば、組み換え遺伝子は全て、構成的な強力なプロモーター（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧＧプロモーター）から発現されることが一般に好ましいが、様々な誘導型プロモーターも本明細書中での使用のために適切とみなされる。例えば、企図される誘導型プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導型プロモーター、ミクソウイルス耐性１（Ｍｘ１）プロモーターなどが挙げられる。また他の例において、および特に抗原提示細胞が腫瘍微小環境にあると予想される場合、誘導型プロモーターとしては、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−８に感受性がある、低酸素およびプロモーターに感受性があるものが挙げられる（例えばＴＲＡＦ、ＪＮＫ、Ｅｒｋまたは他の個々のエレメントプロモーターを介する）。さらに、個々の組み換え遺伝子とともに天然に見いだされるプロモーターも企図される。
【００４２】
最も一般的には、必ずしも必要ではないが、全ての組み換え遺伝子は、同じプロモーターから同時発現されるので、例えば内部リボソーム進入（ＩＲＥＳ）部位とともに単一の転写産物を生成させるか、または１つ以上の個々のプロモーターから個々の単一の遺伝子転写産物として、もしくはタンデムミニ遺伝子として、または発現に適切な何らかの他の配置で転写され得る。またさらなる企図される態様において、当然ではあるが、組み換え核酸は、刺激型分子をコードし得、免疫チェックポイント受容体に対する阻害性リガンドは、個々の既知のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に基づき得る（およびそれ自体はイントロンを持たない）か、または人工的なイントロンを有し得るか、またはゲノム配列に基づき得る（およびそれ自体は連結されるスプライシング部位とともにイントロンおよびエクソンを持つ）。したがって、企図される組み換え核酸からの転写産物は、同時刺激型分子および他のタンパク質の協調発現を可能にするために、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）または２Ａ配列（切断可能な２Ａ様ペプチド配列）を含むことが企図される。
【００４３】
これも留意すべきこととして、組み換え核酸はＤＮＡワクチンとして投与され得るが、一般に、組み換え核酸がウイルスゲノムの一部であることが好ましい。次に、遺伝子治療において周知であるように、このように遺伝子改変されたウイルスを使用し得る。したがって、組み換えウイルスに関して、組み換えウイルスを作製する全ての既知の方式が本明細書中での使用に適切とみなされることが企図されるが、特に好ましいウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどを含め、治療において既に確立されているものである。適切な選択肢の中でもとりわけ、アデノウイルスが特に好ましい。
【００４４】
さらに、ウイルスが複製欠損型および非免疫原性ウイルスであることがさらに一般に好ましく、これは、一般的には選択ウイルスタンパク質（例えばＥ１、Ｅ３タンパク質）の標的化された欠失により完遂される。このような所望の特性はＥ２ｂ遺伝子機能を欠失させることによりさらに促進され得、最近報告されているように、遺伝子改変ヒト２９３細胞を使用して、組み換えウイルスの高タイターが達成され得る（例えばＪ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｆｅｂ；７２（２）：９２６−９３３）。最も一般的には、所望の核酸配列（ウイルス感染細胞からの発現のため）は当技術分野で周知の適切な制御エレメントの調節下にある。
【００４５】
次に、このように作製された組み換えウイルスを、１０４〜１０１１個のウイルス粒子／投与単位のウイルスタイターで、一般的には滅菌注射用組成物として処方される医薬組成物中で治療用ワクチンとして個々にまたは組み合わせて使用し得る。しかし、代替的処方物も本明細書中での使用に適切とみなされ、全ての既知の投与経路および方式が本明細書中で企図される。本明細書中で使用される場合、医薬組成物または薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物または薬物の直接および間接両投与を指し、医薬組成物または薬物の直接投与は一般的には医療専門家（例えば医師、看護師など）により行われ、間接投与には、医薬組成物または薬物を直接投与のために医療専門家に提供するかまたは医療専門家にとって利用可能にする段階が含まれる（例えば注射、点滴、経口送達、局所送達などを介する）。最も好ましくは、皮下または真皮下注射を介して組み換えウイルスを投与する。しかし、他の企図される態様において、投与は静脈内注射でもあり得る。あるいは、またはさらに、インビトロで感染した患者の細胞から抗原提示細胞を単離し得るかまたは増殖させ得、次いで患者に注入し得る。したがって、当然ではあるが、企図される系および方法は、高度に個別化された癌の処置のための完全な薬物探索系（例えば薬物探索、処置プロトコール、検証など）とみなされ得る。
【００４６】
さらに、Ｔ細胞上での可能性のある阻害性作用を低下させるための免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫刺激型化合物との同時投与によって、ウイルスベクターの予防的または治療的投与が完遂され得ることが企図される。例えば、特に好ましいチェックポイント阻害剤としては、一般的には同じプロトコール下および一般的に処方されるような投与量で、現在利用可能な阻害剤（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ）が挙げられる。プラスミド／ウイルスＤＮＡ上に含まれることを通じて、阻害性リガンド／生物製剤を遺伝子により送達することによってチェックポイント阻害が完遂され得ることも企図される。同様に、遺伝子改変ＮＫ細胞は、本明細書中で企図される組み換えウイルスの投与と同時に、または投与前または投与後に患者に投与され得る。
【００４７】
本明細書中で企図される改変ウイルスの投与と組み合わせられるまたさらなる追加的な処置としては、ウイルスベクター内でコードされ得るかまたはタンパク質薬として個別に投与され得るインターロイキン型刺激型分子が挙げられる。例えば、適切な刺激型化合物としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などが挙げられ、ＩＬ−１５のＮ７２Ｄ突然変異型またはＩＬ−１５スーパーアゴニスト（例えばＡＬＴ８０３）が特に好ましい。さらに、抗体依存性細胞介在細胞毒性を向上させるために治療的に有効な抗体を投与することにより処置が支援され得る。このような抗体は、細胞および患者特異的なネオエピトープ（例えば上記のように同定されるもの）、癌特異的抗原（例えばＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２など）および／または癌関連抗原（例えば標的化ＭＵＣ５ＡＣ変異体（例えばエンシツキシマブ）、ＣＥＡＣＡＭ変異体など）を標的とし得る。
【００４８】
したがって、代表的な方法において、皮下または真皮下注射を介して好ましくは標的樹状細胞に組み換え核酸を投与し得ることが企図され、一方で、ウイルスにより誘導される負荷に対して局所および／または全身性に免疫反応向上を促進するために刺激型および／または抗阻害組成物を個別に注射し得る（例えば好ましくは腫瘍内注射または皮下もしくは真皮下注射を介する）。例えば、刺激型組成物は、好ましくはＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２１を含み、特に好ましいＩＬ−１５組成物としては、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（例えばＮ７２Ｄ突然変異体、これはＩＬ−２ＲβγへのＩＬ−１５の結合を促進）が挙げられ、好ましい抗阻害組成物としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））が挙げられる。必ずしも必要ではないが、最も一般的には、刺激型および／または抗阻害組成物は、承認されているかまたは一般に使用される投与量でまたはそれ以下で投与され、本発明の主題のいくつかの態様において、投与は低用量投与計画（例えば標準的、承認または推奨用量の８０〜９５％、６０〜８５％、４０〜６０％、２０〜４０％または１〜２０％）となろう。
【００４９】
したがって、異なる角度から見ると、当然ではあるが、企図される系および方法は、一般的にはＨＬＡ結合ネオエピトープの提示を刺激するために組み換え核酸を介して（例えばウイルスベクターを介して）送達される患者および癌特異的な構成要素を含み、このネオエピトープは、同時刺激型分子および免疫チェックポイント阻害剤の少なくとも１つとの関連で提示される。言うまでもなく、これもまた認識されるはずであるが、適切な核酸ベクターには細菌ベクター、酵母ベクターおよび酵母人工染色体ならびにウイルスベクターも含まれ得る。さらに、企図される系および方法は、ネオエピトープを産生し、提示する（感染）細胞に対する免疫反応の局所および／または全身性刺激を提供することによって免疫反応促進を刺激するために、ネオエピトープに関して独立に投与される免疫刺激要素も含む。したがって、企図される組成物および方法は、ネオエピトープ関連刺激／阻害の低下を介してＴ細胞活性化を直接刺激するだけではなく、刺激型および／または抗阻害組成物の局所および／または全身性投与を介してネオエピトープに対する免疫反応を間接的に刺激する（例えばさらなる免疫刺激サイトカインの放出を惹起するため）。
【００５０】
ストレスシグナルの過剰発現または転写を惹起するために、低用量化学療法で、好ましくは規則的に、および／または低用量放射線療法で、患者が処置され得ることも企図される。例えば、このような処置が、タンパク質発現、細胞分裂および細胞周期の少なくとも１つに影響を与えること、好ましくはアポトーシスを誘導するため、またはストレス関連遺伝子（および特にＮＫＧ２Ｄリガンド）の発現を少なくとも誘導するかもしくは上昇させるために有効であることが一般に好ましい。したがって、企図される一態様において、このような処置は、１つ以上の化学療法剤を使用した低用量処置を含む。最も一般的には、低用量処置は、化学療法剤に対する、ＬＤ５０またはＩＣ５０の、７０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下である曝露にある。さらに有利である場合、このような低用量投与計画は、例えば米国特許第７７５８８９１号明細書、同第７７７１７５１号明細書、同第７７８０９８４号明細書、同第７９８１４４５号明細書および同第８０３４３７５号明細書に記載のように規則的に行われ得る。
【００５１】
このような低用量投与計画で使用される特定の薬物に関して、全ての化学療法剤が適切とみなされることが企図される。適切な薬物の中でもとりわけ、キナーゼ阻害剤、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、代謝拮抗薬、細胞分裂阻害薬および細胞毒性薬が全て本明細書中で企図される。しかし、特に好ましい薬剤としては、腫瘍の成長または発生を推進する経路の構成要素を妨害または阻害することが同定されているものが挙げられる。例えば国際公開第２０１１／１３９３４５号パンフレットおよび同第２０１３／０６２５０５号パンフレットに記載のように、オミクスデータにおける経路分析を使用して、適切な薬物を同定し得る。中でも注目すべきは、腫瘍細胞においてストレス関連遺伝子のこのように達成された発現の結果、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４および／またはＮＫＰ４６リガンドの表面提示が起こり、次に腫瘍細胞を特異的に破壊するためにＮＫ細胞を活性化することである。したがって、当然ではあるが、ストレス関連タンパク質を発現させ、提示させるために腫瘍細胞においてトリガーとして低用量化学療法を使用し得、次にＮＫ細胞活性化および／またはＮＫ細胞介在性腫瘍細胞死滅を惹起する。さらに、ＮＫ細胞介在性の死滅は、細胞内腫瘍特異的な抗原の放出と関連し、これは、免疫反応をさらに促進すると考えられる。
【００５２】
本明細書中の記載で使用される場合、および続く特許請求の範囲全体を通じて、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、文脈から別段の明確な指示がない限り、複数の言及を含む。また、本明細書中の記載で使用される場合、「ｉｎ」の意味は、文脈から別段の明確な指示がない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。本明細書中で使用される場合および文脈からの別段の指示がない限り、「にカップリングされる（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ）」という語は、直接的カップリング（互いにカップリングされる２つのエレメントが互いに接触する）および間接的カップリング（少なくとも１つのさらなるエレメントが２つのエレメント間に位置する）の両方を含むものとする。したがって、「にカップリングされる（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ）」および「とカップリングされる（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ）」という用語は、同意語として使用する。本明細書中のある一定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例または代表を表す語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良好に明らかにするものであって、主張される本発明の範囲への限定をもたらすものではない。明細書中には、本発明の実施に必須の何らかの主張されない要素を示すものとして解釈されるべき語はない。
【００５３】
当業者にとって当然ではあるが、本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく、既に記載されるもの以外の多くのさらなる改変が可能である。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除き、限定されるべきものではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈と一致する最も広い可能な方式で解釈すべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、構成要素または段階に言及する場合、非排他的に解釈すべきであり、言及される要素、構成要素または段階が存在し得るかまたは利用され得るかまたは明確に言及していない他の要素、構成要素または段階と組み合わせられ得ることを示す。本明細書および特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・およびＮからなる群から選択されるあるもののうち少なくとも１つを指す場合、例えばＡ＋ＮまたはＢ＋Ｎなどではなく、群から要素を１個のみ必要とするように、文章を解釈すべきである。
【国際調査報告】
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