(57)【要約】  本発明は、遺伝子サイレンシングを媒介するために干渉RNA二重鎖を用いて癌を治療する方法に関する。本発明はまた、干渉RNA二重鎖及びこのような干渉RNA二重鎖をコードするベクターに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、配列番号1〜配列番号104及び配列番号209〜配列番号297から選択される少なくとも1つの配列若しくはその変異体、又は配列番号1〜配列番号104及び配列番号209〜配列番号297から選択される配列に相補的な少なくとも1つの配列若しくはその変異体を標的とするsiNA(低分子干渉核酸)分子。
【請求項２】
siNAが、配列番号4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87及び95〜104から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体を特異的に標的とし、前記分子はLAT1遺伝子の発現を減少させる、請求項1に記載のsiNA分子。
【請求項３】
siNAが、配列番号209、216、225、226、228、235〜238、245、260、264、267、271、272、278、279及び281〜297から選択される少なくとも1つの配列又はそれらの変異体を特異的に標的し、前記分子はASCT2遺伝子の発現を減少させる、請求項1に記載のsiNA分子。
【請求項４】
前記分子が19〜25塩基対の長さである、請求項1から3のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項５】
siNAが、dsRNA、siRNA又はshRNAから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項６】
siNAがsiRNAである、請求項5に記載のsiNA分子。
【請求項７】
siNAが5'及び/又は3'突出部を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項８】
siNAが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のsiNA。
【請求項９】
siNA分子が、センス鎖、及び好ましくはアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号105〜208及び298〜386から選択される配列又はその変異体を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項１０】
センス鎖が、108、110、114、117、126、138、162、165、185、187、191及び199〜208から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体を含み、好ましくは、前記分子はLAT1遺伝子の発現を減少させる、請求項9に記載のsiNA分子。
【請求項１１】
好ましくはセンス鎖が、298、305、314、315、317、324〜327、334、349、353、356、360、361、367、368及び370〜386から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体を含み、好ましくは、前記分子はASCT2遺伝子の発現を減少させる、請求項1から8のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項１２】
センス鎖が、配列番号387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407及び409から選択される配列若しくはその変異体を含み、アンチセンス鎖が、それぞれ配列番号388、390、392、394、306、398、400、402、404、406、408及び410から選択される配列若しくはその変異体を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載の少なくとも1つのsiNA及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌の治療に使用するための請求項1から13のいずれか一項に記載のsiNA分子。
【請求項１５】
前記癌が、膀胱、血液、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、筋肉、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃及び子宮の癌から選択される、請求項14に記載のsiNA分子。
【請求項１６】
癌を治療するための方法であって、それを必要とする患者に請求項1から12のいずれかに一項に記載のsiNA又は請求項13に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
癌が、膀胱、血液、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、転移性、筋肉、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃及び子宮の癌から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
抗癌剤を投与する工程を更に含む、請求項16又は17に記載の方法。
【請求項１９】
癌を治療するための方法であって、それを必要とする患者に請求項1から12のいずれか一項に記載のsiNAを、1つ以上の抗癌剤と組み合わせて投与する工程を含み、好ましくは抗癌剤は抗-抗新生物剤を含む、方法。
【請求項２０】
細胞増殖を減少させるための方法であって、細胞を請求項1から12のいずれか一項に記載のsiNAと接触させる工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項1から12のいずれかに一項に記載のsiNAをコードする核酸配列を含む核酸構築物又はベクター。
【請求項２２】
請求項21に記載の核酸構築物又はベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子サイレンシングを媒介するために干渉RNA二重鎖を使用して癌を治療する方法に関する。本発明はまた、干渉RNA二重鎖及びこのような干渉RNA二重鎖をコードするベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
それらの起源にかかわらず、腫瘍は、それらの特徴的な衰えない成長を支えるために一定量の栄養素の供給を必要とする。実際に、腫瘍細胞は、それら自身の代謝要求に必要とされるよりも多くの栄養素を消費する場合があり(Medinaら、1992年b)、それらの正常な細胞対応物と比較して明確に異なる代謝プロファイルを示す。腫瘍には、血管新生の集合的過程と構成細胞の原形質膜において栄養素トランスポーターを驚異的な量発現することによって、それらの代謝要求を促進するための栄養素が供給される。アミノ酸は、ヌクレオチド、グルタチオン、アミノ糖及びタンパク質合成に使用される細胞窒素の主な供給源である。悪性腫瘍の、貪欲であり、見かけ上無駄なアミノ酸代謝は、とりわけ、癌を有する宿主における負の窒素バランスをもたらす。更に、アミノ酸の炭素骨格は、多くの場合、グルコース及び脂肪酸に加えて、ATP生成のための酸化的燃料源として利用され、また、ステロール及び脂質の生合成に寄与し得る(Baggetto、1992年; Medinaら、1992年a)。正常な細胞又は組織と比較して、癌細胞は、多くの場合、腫瘍に特徴的な好気性解糖に呼応して、選択された代謝経路へのアミノ酸の増強された及び変更されたチャネル形成を示す(Baggetto、1992年)及び(Mazurekら、2003年)。固形腫瘍は、多くの場合、特に新形成及び転移に特徴的な新生無血管期において、血管新生が不十分であり、そのため、それらは、宿主組織と競合するために血漿アミノ酸を抽出するための効率的な機構を持たなければならない(Medinaら、1992年b)。一方、癌は進化の縮図であり、「適者」の細胞は、局所的な微環境への適応を通じて持続する;結果として、成長及び生存の利点を付与する特性を有するアミノ酸トランスポーターが、多くの場合、親組織と比較して増大したレベルで選択され、発現される。
【０００３】
哺乳動物のアミノ酸トランスポーターがクローニング及び単離されるよりも前に、Christensenは、成長及び増殖に必要な高レベルのタンパク質合成を支持するために、特定のアミノ酸トランスポーターを形質転換細胞において上方調節することができることを提唱した(Christensen、1990年)。癌ゲノム解剖学プロジェクト(Cancer Genome Anatomy Project)(CGAP)のウェブサイト(http://cgap.nci.nih.gov)でのヒト発現配列タグ(EST)データベースの検索は、「cDNA Virtual northern」を用いて正常組織及び癌性組織における古典的な中性アミノ酸輸送「システム」A、ASC、L及びNの発現レベルにおいて決定することで、5つのトランスポーターが癌性組織において全体的に有意に増強される一方、LAT1(大型中性アミノ酸トランスポーター1)及びASCT2(ASCアミノ酸トランスポーター2)の2つが際立っていることを明らかにした(Fuchsら、2005年)。ASCT2及びLAT1はともに、それらの発現パターンがほぼ同一である様々な癌性組織において3倍に(集合的に)上方調節される(Fuchs、2005年)。
【０００４】
LAT1は、癌性又は増殖性細胞と長い間関連づけられてきた。全長LAT1が1998年に最初に単離され、特徴付けられたとき、それはラット肝臓では発現されないことが示されたが、ラット肝癌(dRLh-84)及び肝癌腫(FAA-HTC1)細胞株では検出された(Kanai、1998年)。これは、後述するように、ヒト肝臓におけるASCT2の発現パターンと一致する。ヒト細胞株を用いたノーザンブロット分析は、絨毛癌細胞株JEG-3及び乳癌細胞株MDA-A1(Sangら、1995年)、並びに胃印環細胞癌(KATOIII)、肺小細胞癌(RERF-LC-MA)及び悪性黒色腫(G-361)(Kanaiら、1998年)におけるTA1発現を明らかにした。4F2hcとLAT1の両方が、いくつかの白血病細胞株、RERF-LC-MA肺小細胞癌細胞、HeLa子宮頸癌細胞及びT-24膀胱癌細胞において検出された(Yanagidaら、2001年)。T-24細胞を用いた結果は、共焦点免疫蛍光顕微鏡法によって確認され、これは、原形質膜におけるLAT1及び4F2hcの共局在を明らかにした(Kimら、2002年)。LAT1及び4F2hcはまた、KBヒト口腔表皮癌細胞の原形質膜に共局在することが示され(Yoonら、2005年)、免疫組織化学的染色により、正常な口腔粘膜の口腔扁平細胞癌への進行中にそれらの発現が増加することを示しているため(Kimら、2004年b)、これらは口腔扁平上皮発癌に重要であり得る。
【０００５】
Kuhneら(Kuhneら、2007年)は、LAT1及びLAT2遺伝子の遺伝的多型を開示し、このような多型をメルファランの薬物動態に関連づける。Shennanら(Shennanら、2008年)は、LAT1の阻害により、ヒト乳癌細胞の増殖が減少することを開示している。Nawashiroら(Nawashiroら、2006年)は、LAT1がヒト星状細胞腫における潜在的な分子標的であることを開示している。Yamauchiら(Yamauchiら、2009年)及びKimら(Kimら、2008年)は、様々な癌細胞の腫瘍活性を遮断するために、LAT1阻害剤の使用を開示している。LAT1活性を可能にするために4F2hcシャペロンが必要とされることに関連して、リアルタイム定量的RT-PCRは、KB細胞において同様のレベルのLAT1及び4F2hc mRNAを明らかにした(Yoonら、2005年)。これは、LAT1レベルが4F2hcよりも約1.5倍高かったT-24細胞からのデータ(Kimら、2002年)と矛盾し、LAT1 mRNAが4F2hcよりも約4.3倍及び約4.9倍高かったMDA-MB-231及びMCF-7ヒト乳癌細胞の結果(Shennanら、2004年)と矛盾する。(Fuchsら、2005年)によるデータに基づくと、4F2hc mRNAの全体的な存在量は、LAT1の存在量と同程度であるようであるが、タンパク質及びmRNAレベルは、遺伝子発現制御の複数の機構に起因して、必ずしも線形に相関するとは限らないことに留意すべきである。更に、細胞は、疑いもなく両成分のタンパク質レベルを適切に適合させる機構を有し、そのため、4F2hcは重要なLAT1関連機能を律速しない。
【０００６】
結腸癌RCN-9細胞をラットの脾臓に注射した場合、得られた転移性肝腫瘍の大きさは、LAT1発現と直接相関していた(Ohkameら、2001年; Tamaiら、2001年)。したがって、LAT1機能を阻害することは、癌の多数の種類に対する潜在的な治療薬として役立ち得ることが提唱されている(Kanaiら、2001年)。今日までに、LAT1を特異的に標的とする研究はほとんどない。しかしながら、非ヒト肝腫瘍細胞におけるインビトロでのLAT1アンチセンス発現は、5日間にわたり、この期間中のL型輸送における有意な低下がないにもかかわらず、対照と比較して、細胞数、生存率及びS期細胞において中程度であるが統計的に有意な低下をもたらした(Storeyら、2005年)。
【０００７】
4F2hcに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、C6-BU-1ラット神経膠腫細胞におけるNa+非依存性イソロイシン輸送(Broerら、1997年)、及びBeWoヒト細胞栄養芽層細胞におけるロイシン取り込み(Kudoら、2004年)を阻害することが示されているが、細胞成長への影響については報告されていない。抗4F2hc抗体は、種々の腫瘍細胞株の増殖を阻害したが(Yagitaら、1986年)、これらの効果は、LAT1、又は4F2hcの、輸送に関連しない機能に加えて、他の4F2「軽鎖」に対する集合的効果を通して媒介された可能性がある(Feralら、2005年)。インビトロでヌクレオチド1173-1194に対するLAT1-siRNAを用いたT-24細胞におけるLAT1のノックダウンは、L-CSNO取り込みの低下をもたらしたが(Liら、2005年)が、細胞生存が影響を受けたかどうかについては報告されていない。したがって、LAT1の「軽鎖」を癌の成長に結びつける機序的研究はまだ報告されていない。
【０００８】
LAT1遺伝子発現を阻害するためのsiRNAの使用は、いくつかのグループによって開示されている(Kimら、2006年a; Kimら、2006年b; Kanekoら、2007年; Pinhoら、2007年a; Yinら、2008年; Kuhneら、2009年; Nicklinら、2009年; Xiaら、2010年; Liangら、2011年; Mikoら、2011年; Ohkawaら、2011年; Denoyerら、2012年; Hayashiら、2012年; Dickensら、2013年; Hayashiら、2013年; Youlandら、2013年; Gaccioliら、2015年; Habermeierら、2015年; Wongthaiら、2015年; Furugenら、2016年; Poletら、2016年; Strakaら、2016年; Tomblinら、2016年; Weiら、2016年; Xuら、2016年; Liuら、2017年)。
【０００９】
最近になって、LAT1は、以下の表に列挙されている癌のタイプにおける癌予後のマーカーとして示唆されている:
【００１０】
【表１Ａ】
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【００１１】
【表１Ｂ】
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【００１２】
システムASC輸送活性は偏在しており、アラニン、セリン及びシステインを含む小さい中性アミノ酸に対するその優先性によって特徴付けられる。中性アミノ酸トランスポーター(SLC1A4及びSLC1A5)のシステムASCは、溶質輸送体ファミリー-1(SLC1)に属し、これには高親和性グルタミン酸トランスポーターも含まれる。ヒトATB0は、ヒト近位尿細管細胞株HKPTにおいてRT-PCR及び酵素制限分析によって同定され、げっ歯類ASCT2に対応する。2つのASCトランスポーターは、異なる基質選択性を示す。SLC1A4は、ナトリウム依存性アミノ酸トランスポーターASCT1をコードし、これは、立体特異的にL-アラニン、L-セリン、L-スレオニン、及びL-システインを受容する。ASC輸送システムの2番目のアイソフォームであるASCT2は、SLC1A5によってコードされている。腎臓及び腸において、ASCT2は、それぞれ近位尿細管細胞及び腸細胞の刷子縁膜に存在する。典型的なシステムASC基質に加えて、それはまた、より高い親和性でL-グルタミン及びL-アスパラギン、並びにより低い親和性でメチオニン、ロイシン、及びグリシンを受容する。ASCT1とASCT2の両方が、基質アミノ酸のナトリウム依存性必須交換を仲介する(Pinhoら、2007年b)。
【００１３】
最近になって、ASCT2は、以下の表に列挙されている癌の種類における癌の予後のマーカーとして示唆されている。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
ASCT2は結腸直腸腺癌で発現され、患者の生存率は、ASCT2陽性癌細胞の割合の増加とともに低下した。これらの結果は、ASCT2が有意な数の結腸直腸腺癌で発現されていること、及びASCT2発現が進行性の生物学的挙動と関連していることを示している(Witteら、2002年)。ASCT2が、非悪性前立腺と悪性前立腺の両方におけるグルタミン代謝に必要とされるようであることが提唱されている。しかしながら、ASCT2陽性前立腺腺癌は、より進行性の生物学的挙動に関連しているようである。ASCT2は、腫瘍進行に関与しているようである(Liら、2003年; Wangら、2015年)。ASCT2発現は、肺腺癌の転移において決定的な役割を果たしており、手術後の予後不良を予測するための潜在的な分子マーカーである(Shimizuら、2014年)。ASCT2発現はまた、腫瘍細胞成長において重要な役割を果たすことが見出されており、膵臓癌におけるより悪い結果を予測するための有望な病理学的マーカーである(Kairaら、2015年b; Kyoichiら、2015年)。高いASCT2発現はまた、神経芽細胞腫患者の予後不良及び生存率と有意に関連していることが見出されている(Renら、2015年)。更に、他の研究者らは、ASCT2抑制が、グルタミン飢餓単独の効果を超えるアポトーシス促進効果を発揮すること示唆している(Bryanら、2004年; Fuchsら、2004年)。黒色腫におけるASCT2発現の重要性は、グルタミン取り込み、mTORC1シグナル伝達及び細胞増殖を阻害したshRNAノックダウンによって確認された(Wangら、2014年)。
【００１６】
ASCT2遺伝子発現を阻害するためのsiRNAの使用は、いくつかのグループによって開示されている(Wielandら、2005年; Nicklinら、2009年; Okudairaら、2011年; Barelら、2012年; Hassaneinら、2013年; Hassaneinら、2015年; Corbetら、2016年; Strakaら、2016年; Zhouら、2016年; Leeら、2017年)。
【００１７】
RNA干渉(「RNAi」)は、目的の遺伝子(又はコード領域)に対応する二本鎖RNAが生物に導入され、対応するmRNAの分解をもたらす、転写後の遺伝子サイレンシングについて最近発見された機構である。この現象は、元々、シノラブディス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)で発見された(Fireら、1998年)。
【００１８】
アンチセンス技術とは異なり、RNAi現象は、遺伝子発現が回復するまでの複数回の細胞分裂の間持続する。このプロセスは、少なくとも2つのステップで起こる:内因性リボヌクレアーゼは、より長いdsRNAを、「低分子干渉RNA」又はsiRNAと呼ばれるより短い21、22又は23ヌクレオチド長のRNAに切断する(Hannon、2002年)。次に、siRNAセグメントは、標的mRNAの分解を媒介する。RNAiは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様であるが、より効率的な方法で遺伝子機能決定に使用されている。従来の遺伝子ノックアウト技術を用いたDNAレベルではなく、RNAiによるRNAレベルで標的化されたノックアウトを行うことによって、膨大な数の遺伝子を迅速に及び効率的にアッセイすることができる。したがって、RNAiは、遺伝子機能をアッセイするための非常に強力であり、簡単な方法である。
【００１９】
RNAiは、培養哺乳動物細胞において有効であることが示されている。今日までに記載されているほとんどの方法において、RNAiは、マイクロインジェクションにより細胞に二本鎖RNAを導入することによって、又は培養細胞を二本鎖RNAの溶液に浸すことによって、並びにU6、H1若しくはサイトメガロウイルス(「CMV」)プロモーター等の適切なプロモーターの制御下にヘアピン構造のsiRNA発現カセットを保持するプラスミドを細胞にトランスフェクトすることによって行われる(Elbashirら、2001年; Harborthら、2001年; Leeら、2001年; Brummelkampら、2002年; Miyagishiら、2002年; Paddisonら、2002年; Paulら、2002年; Suiら、2002年; Xiaら、2002年; Yuら、2002年)。二本鎖リボ核酸による遺伝子発現の遺伝子特異的な阻害は、一般的に、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,506,559号に記載されている。siRNA技術の例示的な使用は、参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第2003/01090635号、及び公開された米国特許出願第2004/0248174号に更に記載されている。Davis(Davis、2009年)は、ナノ粒子技術を用いたヒトへのsiRNAの標的化送達について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第6,506,559号
【特許文献２】米国特許出願第2004/0248174号
【非特許文献】
【００２１】
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【非特許文献１４７】Biology EoNC (2003年). Whither RNAi ? Nature Cell Biology 5: 489-490.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の目的は、癌を治療又は予防するために、LAT1及び/又はASCT2遺伝子の発現を下方調節するためにRNA干渉技術を使用することである。本発明によって治療又は予防することができる好ましい癌には、膀胱、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、筋肉、卵巣、膵臓、皮膚及び胃の癌が含まれる。本発明の組成物(又は分子)は、低分子干渉核酸分子(siNA)及び関連化合物、例えば、限定されないが、siRNAを含むか又はそれらからなる。本発明は、siNA、例えば、限定されないが、RNA干渉を媒介することができる、低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンタゴミル(antagomir)、及び低分子ヘアピンRNA(shRNA)の組成物及び使用方法を包含する。一実施形態では、本発明のsiNA分子をRISC(RNA誘導性サイレンシング複合体)に組み込むことができる。
【００２３】
本発明の更なる目的は、LAT1遺伝子及び/又はASCT2遺伝子の発現を効率的に下方調節するsiRNA分子を提供することである。
【００２４】
したがって、第1の態様では、本発明は、siNA分子に関し、上記分子は、配列番号1〜配列番号104から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体、及び配列番号209〜配列番号297から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体を特異的に標的とする。代替の実施形態では、本発明は、siNA分子に関し、上記分子は、配列番号1〜配列番号104から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体、及び配列番号209〜配列番号297から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体に相補的な少なくとも1つの配列を特異的に標的とする。一実施態様では、本発明は、単離されたsiNA分子、好ましくは単離されたsiRNA分子に関する。
【００２５】
一実施形態では、siNA分子は、細胞に導入されたときに、(好ましくはヒト)LAT1及び/又はASCT2遺伝子の発現を減少させる。
【００２６】
一実施形態では、siNA分子は、配列番号4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87及び95〜104から選択される少なくとも1つの配列又はその変異体を特異的に標的とする。好ましくは、siNA分子は、配列番号6、22、34、58及び61から選択される配列又はその変異体を標的とする。更により好ましくは、siNAは、配列番号61若しくは58又はその変異体に標的とする。好ましくは、siNA分子は、細胞内に発現されたときに、LAT1遺伝子の発現を減少させる。
【００２７】
代替の実施形態では、siNA分子は、配列番号209、216、225、226、228、235〜238、245、260、264、267、271、272、278、279、及び281〜297から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とする。好ましくは、siNA分子は、配列番号225、237、267又は278から選択される配列又はその変異体を標的とする。更により好ましくは、siNAは、配列番号267若しくは278又はそれらの変異体を標的とする。好ましくは、siNA分子は、細胞内に発現されると、ASCT2遺伝子の発現を減少させる。
【００２８】
更なる実施形態では、siNAは、好ましくは二本鎖RNA分子を含み、そのアンチセンス鎖は、配列番号1〜配列番号104のいずれか、より好ましくは配列番号4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87及び95〜104のいずれか、更により好ましくは配列番号6、22、34、58及び61のいずれか、最も好ましくは配列番号61若しくは58のいずれか、又はいずれかのその変異体に実質的に相補的であり、そのセンス鎖は、センス鎖に相補的なRNA配列を含み、両鎖は、ヌクレオチド間の標準的な塩基対合によってハイブリダイズされる。更なる実施形態では、上記センス鎖は、配列番号105〜208、好ましくは配列番号108、110、114、117、126、138、162、165、185、187、191及び199〜209、より好ましくは配列番号110、126、138、162及び165、最も好ましくは配列番号162若しくは165から選択される配列、又はその変異体を含むか又はそれからなる。対応するアンチセンス鎖は図26に記載されている。好ましくは、siNA分子は、細胞内に発現されると、LAT1遺伝子の発現を減少させる。
【００２９】
代替の実施形態では、siNAは、好ましくは二本鎖RNA分子を含み、そのアンチセンス鎖は、配列番号209〜配列番号297のいずれか、より好ましくは配列番号209、216、225、226、228、235〜238、245、260、264、267、271、272、278、279及び281〜297のいずれか、更により好ましくは配列番号225、237、267若しくは278のいずれか、最も好ましくは配列番号267若しくは278のいずれかに実質的に相補的であり、そのセンス鎖は、センス鎖に相補的なRNA配列を含み、両鎖はヌクレオチド間の標準的な塩基対合によってハイブリダイズされる。更なる実施形態では、上記センス鎖は、配列番号298〜386から選択される配列、好ましくは配列番号298、305、314、315、317、324〜327、334、349、353、356、360、361、367、368及び370〜386から選択される配列、より好ましくは配列番号314、326、36及び367から選択される配列若しくはその変異体、更により好ましくは配列番号356若しくは367から選択される配列又は任意のその変異体を含むか又はそれからなる。対応するアンチセンス鎖は図27に記載されている。好ましくは、siNA分子は、細胞内に発現されると、ASCT2遺伝子の発現を減少させる。
【００３０】
本発明の意味の範囲内で、標的mRNA配列に対して「実質的に相補的」とはまた、上記標的配列に対して「実質的に同一」として理解され得る。当業者に知られている「同一性」は、配列間のヌクレオチドの順序及び同一性を一致させることによって決定される、ヌクレオチド配列間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的mRNA配列に対して、80%、及び80%から100%までの間の相補性、例えば、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は99%の相補性を有するsiRNAのアンチセンス鎖は、実質的に相補的であると考えられ、本発明において使用され得る。相補性の割合は、ワトソン-クリック鎖において、第2の核酸分子中の一組の隣接ヌクレオチドと塩基対を形成することができる、第1の核酸分子中の隣接ヌクレオチドの割合を示す。
【００３１】
例えば、siNA分子が遺伝子の発現を選択的に低下させるか又は阻害する場合、遺伝子は、本発明によるsiNAによって「標的とされる」。本明細書で使用される「選択的に低下させるか又は阻害する」という語句は、LAT1及び/又はASCT2の発現に影響を及ぼすsiNAを包含する。或いは、siNAが、ストリンジェントな条件下で遺伝子転写物、すなわちそのmRNAにハイブリダイズする場合、siNAは遺伝子を標的とする。「ストリンジェントな条件下で」ハイブリダイズすることができるとは、標準的な条件下で、例えば、ハイブリダイゼーションを好まない傾向がある高温及び/又は低塩含有量の下で、標的mRNA領域にアニーリングすることを意味する。適切なプロトコール(0.1×SSC、68℃で2時間を伴う)は、Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, at pages 387-389に記載されている。
【００３２】
本明細書中に引用される核酸配列は、他に示されない限り、5'から3'の方向に記載される。「核酸」という用語は、DNA(アデニン「A」、シトシン「C」、グアニン「G」、チミン「T」)中に又はRNA(アデニン「A」、シトシン「C」、グアニン「G」、ウラシル「U」)中に存在するプリン塩基又はピリミジン塩基を含むDNA若しくはRNA、又はその修飾形態のいずれかを指す。本明細書で提供される干渉RNAは、たとえ「T」塩基がRNA中に天然に存在しないとしても、例えば3'末端に「T」塩基を含み得る。いくつかの場合において、これらの塩基は、リボヌクレオチド鎖中に存在するデオキシリボヌクレオチドを区別するために「dT」として現れる場合がある。
【００３３】
本発明の一実施形態では、siNA分子は40塩基対以下の長さである。好ましくは、siNA分子は19〜25塩基対の長さである。一実施形態では、siNAは、21ヌクレオチドの二本鎖領域を含むか又はそれからなる。好ましくは、siNAはセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。代替の態様において、siNA分子は、19ヌクレオチドの二本鎖領域を含むか又はそれからなる。一実施形態では、siNAは平滑末端を有する。代替の実施形態では、siNAは5'及び/又は3'突出部を有する。好ましくは、突出部は、1〜5ヌクレオチドの間、より好ましくは2ヌクレオチドの突出部である。突出部は、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸であり得る。
【００３４】
一実施形態では、本発明によるsiNA分子は化学修飾を含む。好ましくは、化学修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖又はその両方の上にある。化学修飾の例としては、ホスホロチオエートヌクレオチド連結、2'-Oメチル化、2'-デオキシ-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、5-Cメチルヌクレオチド、逆デオキシ塩基残基の組み込み、若しくはデオキシチミジンヌクレオチドによるウラシルリボースヌクレオチドの置換、又はそれらの組合せが挙げられる。
【００３５】
一実施形態では、5'又は3'突出部は、ジヌクレオチド、好ましくはチミジンジヌクレオチドである。好ましい実施形態では、5'又は3'突出部はデオキシチミジンである。一実施形態では、センス鎖は、少なくとも1つ、好ましくは2つの3'突出部を含む。好ましくは、上記センス鎖は、少なくとも1つ、好ましくは2つの3'デオキシチミジンを含む。代替の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも1つ、好ましくは2つの3'突出部を含む。好ましくは、上記センス鎖は、少なくとも1つ、好ましくは2つの3'デオキシチミジンを含む。更に好ましい実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方は、本明細書に記載される3'突出部を含む。
【００３６】
更なる実施形態では、siNA分子は、好ましくは二本鎖RNA分子を含み、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖は以下又はその変異体から選択される。
【００３７】
センス鎖  アンチセンス鎖
387              388.この配列はまた、本明細書中で配列番号58tと呼ばれる。
389              390.この配列はまた、本明細書中で配列番号58s1と呼ばれる。
391              392.この配列はまた、本明細書中で配列番号58s2と呼ばれる。
393              394.この配列はまた、本明細書中で配列番号61tと呼ばれる。
395              396.この配列はまた、本明細書中で配列番号61s1と呼ばれる。
397              398.この配列はまた、本明細書中で配列番号61s2と呼ばれる。
399              400.この配列はまた、本明細書中で配列番号267tと呼ばれる。
401              402.この配列はまた、本明細書中で配列番号267s1と呼ばれる。
403              404.この配列はまた、本明細書中で配列番号267s2と呼ばれる。
405              406.この配列はまた、本明細書中で配列番号278tと呼ばれる。
407              408.この配列はまた、本明細書中で配列番号278s1と呼ばれる。
409              410.この配列はまた、本明細書中で配列番号278s2と呼ばれる。
【００３８】
本明細書で使用される「変異体」とは、非変異の核酸又はリボ核酸配列に対して、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は少なくとも99%の全配列同一性を有する配列を意味する。
【００３９】
「下方調節する」とは、LAT1及び/又はASCT2の発現が、対照におけるレベルと比較した場合、最大10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又はそれを超えて低下させることを意味する。或いは、本明細書に記載されるsiNA分子は、LAT1及び/又はASCT2の発現を無効にし得る。「無効にする」という用語は、LAT1及び/又はASCT2の発現を検出することができないこと、又は機能的LAT1及び/又はASCT2タンパク質が産生されないことを意味する。例えば、少なくともLAT1及び/又はASCT2発現の発現レベル及び/又はタンパク質レベルの減少は、タンパク質レベル及び/又は核酸レベルの尺度であり得、当業者に公知である任意の技術によって、例えば、限定されないが、任意の形態のゲル電気泳動又はクロマトグラフィー(例えば、HPLC)によって測定することができる。
【００４０】
特に、一部の実施形態では、siNA分子(5'若しくは3'鎖又はその両方)は、少なくとも1つの、好ましくは2つのアラニンヌクレオチドで開始し得る。或いは、標的配列が1つ又は2つのアラニン配列で開始する場合、これらは、siNA分子中に含まれない(標的化されない)可能性がある。
【００４１】
一実施形態では、標的配列は、配列の3'末端に少なくとも1つの、好ましくは2つのアラニンヌクレオチドによって特徴付けられ得、及び/又は標的配列は、配列の5'末端に少なくとも1つの、好ましくは2つのアラニンヌクレオチドを欠失し、及び/又は標的配列は、配列内に2つの連続したアラニンヌクレオチドを欠失している。好ましい実施形態では、本発明のsiNA分子は、それらが上記の性質を有する配列を標的とすることにより特徴付けられる。
【００４２】
一実施形態では、複数のsiNA分子種が使用され、上記複数のsiNA分子は、同じ又は異なるmRNA種に標的とされる。
【００４３】
一実施形態では、siNAは、dsRNA、siRNA又はshRNAから選択される。好ましくは、siNAはsiRNAである。
【００４４】
更なる実施形態では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載されるsiNA分子に関する。一実施形態では、本発明は、LAT1及び/又はASCT2の(健常対象におけるレベルと比較して)発現レベルの増加によって特徴付けられる障害の治療に使用するためのsiNAに関する。
【００４５】
本発明の別の態様では、癌の治療に使用するための、本明細書に記載されるsiNA分子が提供される。
【００４６】
更なる態様では、本発明は、癌治療用の医薬の調製における、本明細書に記載される少なくとも1つのsiNA分子の使用に関する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される少なくとも1つのsiNA分子を、それを必要とする患者又は対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法に関する。
【００４８】
一実施形態では、癌は、膀胱、血液、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、筋肉、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃及び子宮の癌から選択される。
【００４９】
本発明の別の態様では、本明細書に記載される少なくとも1つのsiNA分子、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００５０】
本発明の更なる態様では、細胞へのアミノ酸の取り込みを阻害する方法、好ましくはインビトロでの方法が提供され、この方法は、細胞に本明細書において定義されるsiNAを投与する工程を含む。好ましくは、アミノ酸取り込みは、ナトリウム非依存性ロイシン取り込みである。或いは、アミノ酸取り込みは、ナトリウム依存性アラニン取り込みである。一実施形態では、アミノ酸取り込みは、対照におけるレベルと比較した場合、最大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくは90%、又はそれを超えて阻害される。
【００５１】
本発明の更なる態様では、細胞増殖を低下させる方法が提供され、この方法は、本明細書に記載される少なくとも1つのsiNAを細胞に投与する工程を含む。一実施形態では、上記細胞増殖の低下は、対照におけるレベルと比較した場合、最大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくは90%、又はそれを超え得る。
【００５２】
本発明のなお更なる態様では、好ましくは患者において、腫瘍体積を減少させる方法が提供され、この方法は、本明細書に記載される少なくとも1つのsiNAを投与する工程を含む。一実施形態では、上記腫瘍体積の低下は、対照におけるレベルと比較した場合、最大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくは90%、又はそれを超え得る。
【００５３】
一実施形態では、上記の方法のうち、少なくとも1つのLAT-1 siNA又は少なくとも1つのASCT2 siNAが投与される。代替の実施形態では、少なくとも1つのLAT-1 siNA及び少なくとも1つのASCT2 siNAが投与される。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、当該技術分野において公知である1つ以上の抗癌剤と組み合わせて本発明のsiNAで細胞を処理することを含む、癌細胞増殖を減少させる方法に関し、抗癌剤は、抗新生物剤、より好ましくは細胞傷害性抗新生物剤、最も好ましくは5-フルオロウラシル(5-FU)、シスプラチン(Cisp)及び/又はオキサリプラチン(Oxa)を含む。
【００５５】
本発明はまた、当該技術分野において公知である1つ以上の抗癌剤と組み合わせて本発明のsiNAを、好ましくはそれを必要としている患者に投与する工程を含む、癌を治療する方法に関し、好ましくは抗癌剤は、抗新生物剤、より好ましくは細胞傷害性抗新生物剤、最も好ましくは5-フルオロウラシル(5-FU)、シスプラチン(Cisp)及び/又はオキサリプラチン(Oxa)を含む。発明は更に、本発明のsiNA及び1つ以上の抗癌剤を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、治療薬と組み合わせて本発明のsiNAを投与する工程を含む、患者に施される抗癌治療の有効性を高める方法に関する。siNA又は抗癌剤のいずれかの単独での投与の有効性と比較した場合、有効性における上記増加は、最大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくは90%、又はそれを超え得る。
【００５７】
好ましい実施形態では、上記siNAは、配列番号58又は配列番号61(例えば、siNAは、それぞれ配列番号162又は165から選択される配列を含むセンス鎖を含む)又はその変異体を標的とする。更なる代替の実施形態では、上記siNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の配列は配列番号387又はその変異体であり、アンチセンス鎖の配列は配列番号388又はその変異体である。或いは、上記siNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の配列は配列番号393又はその変異体であり、アンチセンス鎖の配列は配列番号394又はその変異体である。
【００５８】
代替の実施形態では、上記siNAは、配列番号267若しくは278又はそれらの変異体を標的とする(例えば、siNAは、配列番号356又は367から選択される配列を含むセンス鎖を含む)。更なる代替の実施形態では、上記siNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の配列は配列番号399又はその変異体であり、アンチセンス鎖の配列は配列番号400又はその変異体である。或いは、上記siNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖の配列は配列番号405又はその変異体であり、及びアンチセンス鎖の配列は配列番号406又はその変異体である。
【００５９】
一実施形態では、抗癌剤は、siNAの投与の前に、同時に、又は後に投与される。
【００６０】
「対照」とは、本明細書において、本明細書中に記載されるように、siNAを投与されていない細胞若しくは患者、又はビヒクルを投与されている細胞のいずれかを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、癌治療のための新規な戦略として、LAT1遺伝子及び/若しくはASCT2遺伝子をノックダウン又はその発現を又は阻害することにより、LAT1遺伝子及び/又はASCT2遺伝子を標的とする方法に関する。特に、本発明の第1の態様によれば、癌を治療又は予防するための薬剤の製造における、LAT1遺伝子及び/又はASCT2遺伝子発現を阻害するためのsiRNAの使用が提供され、siRNAは、センスLAT1又はASCT2核酸及びアンチセンスLAT1又はASCT2核酸を含む。本発明はまた、癌を治療又は予防するための薬剤の製造における、LAT1及びASCT2遺伝子発現を阻害するためのsiRNAをコードするベクターの使用を提供する。
【００６２】
本発明の第2の態様によれば、LAT1及び/又はASCT2遺伝子発現を阻害する有効量のsiRNAを個体に投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法が提供され、siRNAは、センスLAT1又はASCT2核酸及びアンチセンスLAT1又はASCT2核酸を含む。本発明はまた、LAT1及びASCT2遺伝子発現を阻害するsiRNAをコードする有効量のベクターを個体に投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法を提供する。
【００６３】
システムL Na+非依存性中性アミノ酸トランスポーターのアイソフォームであるLAT1トランスポーターの過剰発現は、様々な形態の癌における非常に一般的な所見である。本発明は、LAT1に選択的な低分子干渉RNA(siRNA)が癌の治療に有効であるという驚くべき発見に基づいている。特に、膀胱、血液、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、転移性、筋肉、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃及び子宮の癌である。
【００６４】
siRNA若しくはsiRNAをコードするベクター、又はsiRNA若しくはsiRNAをコードするベクターを含む薬剤は、経腸投与(例えば、経口、直腸内及び鼻腔内)、非経口投与(例えば、血管内投与、組織周囲及び組織内投与、皮下注射又は沈着、皮下注入眼内投与及び腫瘍部位又はその近傍への直接投与)によって個体に投与され得る。
【００６５】
本発明の第3の態様によれば、細胞を、本明細書に記載されるLAT1及び/又はASCT2遺伝子発現を阻害するsiNAと接触させる工程を含む、細胞におけるLAT1遺伝子及び/又はASCT2遺伝子の発現を阻害するインビトロでの方法が提供される。一実施形態では、上記siRNAは、センスLAT1及び/又はASCT2核酸、並びにアンチセンスLAT1及び/又はASCT2核酸を含み、センスLAT1又はASCT2核酸は、LAT1又はAST2のmRNA内に含有される標的配列と実質的に同一であり、アンチセンスLAT1又はASCT2核酸は、センスLAT1又はASCT2核酸に相補的である。本発明はまた、細胞を、LAT1及び/又はASCT2遺伝子発現を阻害するsiRNAをコードするベクターと接触させる工程を含む、細胞におけるLAT1及び/又はASCT2遺伝子の発現を阻害するインビトロでの方法を提供し、上記siRNAは、センスLAT1及び/又はASCT2核酸、並びにアンチセンスLAT1及び/又はASCT2核酸を含み、センスLAT1又はASC2核酸は、LAT1又はASC2のmRNA内に含有される標的配列と実質的に同一であり、アンチセンスLAT1又はASCT2核酸は、センスLAT1又はASCT2核酸に相補的である。
【００６６】
遺伝子の発現は、LAT1及び/又はASCT2遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を細胞内に導入することによって阻害され得る。
【００６７】
本発明で使用されるsiRNAは、LAT1又はASCT2 mRNAのRNAi媒介分解を引き起こし、そのため、LAT1又はASCT2遺伝子のタンパク質産物が産生されないか又は減少した量で産生されると考えられる。本発明で使用されるsiRNAは、例えば、細胞の悪性形質転換の結果として、LAT1及び/又はASCT2の発現が上方調節されている細胞における遺伝子発現を変化させるために使用することができる。細胞におけるLAT1又はASCT mRNA転写物へのsiRNAの結合は、細胞によるLAT1及びASCT2産生の減少をもたらす。
【００６８】
「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を意味するために使用される。DNAが、RNAが転写される鋳型であるものを含む、siRNAを細胞内に導入する標準的な技術が使用される。LAT1又はASCT2遺伝子発現を阻害するsiRNAは、センスLAT1又はASCT2核酸配列及びアンチセンスLAT1又はASCT2核酸配列を含む。siRNAは、単一の転写物が、標的遺伝子由来のセンス配列と相補的アンチセンス配列の両方を、例えばヘアピンの形態で有するように構築され得る。
【００６９】
siRNAは、標的mRNA、すなわちLAT1 mRNA又はASCT2 mRNAを標的とする短い二本鎖RNAを含むことが好ましい。siRNAは、標準的なワトソン-クリック型塩基対合相互作用(以下、「塩基対合」)によって共にアニーリングしたセンスRNA鎖及び相補的アンチセンスRNA鎖を含む。センス鎖は、LAT1 mRNA又はASCT2 mRNA内に含有される標的配列と実質的に同一である核酸配列を含む。
【００７０】
「センス/アンチセンス配列」及び「センス/アンチセンス鎖」という用語は、標的LAT1及びASCT2のmRNA配列と実質的に同一であるか(センス)、又は標的LAT1及びASCT2のmRNA配列に実質的に相補的である(アンチセンス)、本発明のsiRNAの一部を指すために、本明細書で交換可能に用いられる。
【００７１】
本明細書で使用するとき、標的mRNA内に含有される標的配列と「実質的に同一」である核酸配列は、標的配列と同一であるか、又は標的配列と1つ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列である。好ましくは、実質的に同一である配列は、標的配列と同一であるか、又は1つ、2つ若しくは3つのヌクレオチド、より好ましくは1つ若しくは2つのヌクレオチド、最も好ましくは1つのヌクレオチドだけ標的配列と異なる。標的配列と実質的に同一である核酸配列を含むセンス鎖は、このようなセンス鎖を含むsiRNAが、標的配列を含有するmRNAのRNAi媒介性分解を誘導することにより特徴付けられる。例えば、本発明のsiRNAは、標的mRNAのRNAi媒介性分解がsiRNAによって誘導される限り、1つ、2つ、3つ又はそれを超えるヌクレオチドだけ標的配列と異なる核酸配列を含むセンス鎖を含むことができる。
【００７２】
siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、2つの相補的な一本鎖RNA分子を含み得るか、又は2つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合している単一分子を含み得る。すなわち、センス領域及びアンチセンス領域は、リンカー分子を介して共有結合により接続することができる。リンカー分子は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。siRNAはまた、1つ以上のリボヌクレオチド塩基の改変、置換又は修飾を含有し得る。例えば、本発明のsiRNAは、1個以上、好ましくは0、1、2又は3個のデオキシリボヌクレオチド塩基を含有するように改変、置換又は修飾され得る。好ましくは、siRNAは、いかなるデオキシリボヌクレオチド塩基も含有しない。
【００７３】
siRNAは、部分的に精製されたRNA、実質的に純粋なRNA、合成RNA、又は組換え生成されたRNA、並びに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は改変によって、天然に存在するRNAとは異なる改変RNAを含み得る。このような改変は、siRNAの末端(単数又は複数)若しくはsiRNAの1つ以上の内部ヌクレオチド等への非ヌクレオチド材料の付加;siRNAをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾(例えば、2'-置換されたリボヌクレオチドの使用又は糖-リン酸骨格の修飾);又はsiRNA中の1個以上、好ましくは0、1、2若しくは3個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換を含み得る。
【００７４】
siRNAの核酸塩基、糖及びリン酸エステル骨格の改変を含む多種多様な化学修飾によって、分解を遅延又は回避することができる。これらの化学的に修飾されたsiRNAの全ては、修飾がsiRNAの特定の領域に存在せず、限られた程度で含まれるという条件で、依然としてsiRNA媒介性遺伝子サイレンシングを誘導することができる。一般的に、骨格修飾は、結合親和性の僅かな喪失を引き起こすが、ヌクレアーゼ耐性を提供する。ホスホロチオエート(PS)又はボラノホスフェート(BS)修飾されたsiRNAは、実質的なヌクレアーゼ耐性を有する。siRNA二重鎖によるサイレンシングはまた、いくつかのタイプの2'-糖修飾、2'-H、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル、2'-フルオロ(2'-F)、ロックド核酸(LNA)及びエチレン架橋核酸(ENA)と適合性がある。適切な化学修飾は、当業者に周知である。
【００７５】
本発明で使用されるsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であり、センス鎖は、LAT1又はASCT2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、アンチセンス鎖は、上記センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列を含み、上記センス鎖と上記アンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして、上記二本鎖分子を形成し、上記二本鎖分子は、LAT1及びASCT2遺伝子を発現する細胞に導入した場合、上記遺伝子の発現を阻害する。以下に更に示されるように、上記LAT1標的配列は、配列番号4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87、及び95〜104からなる群から選択される少なくとも約10個の連続した、より好ましくは15〜21個の、最も好ましくは約19〜21個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。更に下記に示されるように、上記ASCT2標的配列は、配列番号209、216、225、226、228、235〜238、245、260、264、267、271、272、278、279、281〜297からなる群から選択される少なくとも約10個の連続した、より好ましくは15〜21個の、最も好ましくは約19〜21個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００７６】
本発明の一実施形態では、siRNA分子の上記センス鎖及びアンチセンス鎖は、リンカー分子を介して共有結合により接続される。上記リンカー分子は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。好ましくは、リンカーはループ配列である。ループ配列は、好ましくは3〜23ヌクレオチドの長さである。適切なループ配列は、http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html 及び(Jacqueら、2002年)に記載されている。好ましいループ配列は、以下を含む:
AUG:(Suiら、2002年)。
CCC、CCACC、又はCCACACC:(Paulら、2002年)。
UUCG:(Leeら、2002年)。
CTCGAG又はAAGCUU:(Biology、2003年)。
UUCAAGAGA:(Yuら、2002年)。
【００７７】
ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC、及びUUCAAGAGAからなる群から選択することができる。好ましくは、ループ配列は、UUCAAGAGA(DNA中の「ttcaagaga」)である。
【００７８】
本発明において使用されるsiRNAは、当業者に公知である多数の技術を用いて得ることができる。例えば、siRNAは、全開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2002/0086356号に記載されているDrosophilaインビトロシステム等の当該技術分野において公知である方法を用いて化学合成するか又は組換えによって製造することができる。siRNAは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイト及び従来のDNA/RNAシンセサイザーを用いて化学的に合成され得る。siRNAは、2つの別々の相補的なRNA分子として、又は2つの相補的な領域を有する単一のRNA分子として合成することができる。合成RNA分子又は合成試薬の供給業者には、Biospring (Frankfurt, Germany)、Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, Colo., USA)、Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)、Glen Research (Sterling, Va., USA)、ChemGenes (Ashland, Mass., USA)及びSigma-Aldrich (St. Louis, MO USA)が含まれる。
【００７９】
siRNAはまた、任意の適切なプロモーターを用いて組換え環状又は線状DNAベクターから発現させることができる。ベクターからsiRNAを発現させるための適切なプロモーターには、例えば、U6又はH1 RNA polIIIプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当該技術分野の範囲内である。ベクターはまた、特定の組織中又は特定の細胞内環境中でのsiRNAの発現のための誘導性又は調節可能プロモーターを含み得る。
【００８０】
ベクターから発現されたsiRNAは、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離させ得るか、又は細胞内で発現させ得る。ベクターは、例えば、インビボにおいて細胞内でsiRNAを発現させることによって、インビボで細胞にsiRNAを送達するために使用することができる。siRNAは、2つの別々の相補的なRNA分子として、又は2つの相補的な領域を有する単一のRNA分子として、ベクターから発現させることができる。siRNAを発現するのに適したベクターの選択、siRNAを発現させるための核酸配列をベクターに挿入する方法、及び目的の細胞にベクターを送達する方法は、当業者に周知である。
【００８１】
siRNAはまた、インビボにおいて細胞内でベクターから発現させることができる。本明細書で使用するとき、「ベクター」という用語は、所望の核酸を送達するために使用される任意の核酸ベース及び/又はウイルスベースの技術を意味する。プラスミド、コスミド、場合により縮合剤で縮合された裸のDNA、及びウイルスベクターを含む、発現されるべきsiRNA分子(単数又は複数)のコード配列を受容することができる任意のベクターを使用することができる。適切なウイルスベクターには、アデノウイルス(AV);アデノ随伴ウイルス(AAV);レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(LV)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス);ヘルペスウイルス等の由来のベクターが含まれる。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質若しくは他のウイルス由来の他の表面抗原を用いてベクターを偽型化することによって、又は必要に応じて異なるウイルスキャプシドタンパク質を置換することによって修飾することができる。ベクターがレンチウイルスベクターである場合、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス又はモコラウイルス由来の表面タンパク質で偽型化される。
【００８２】
ベクターは、例えば、LAT1又はASCT2標的配列を発現ベクターにクローニングして、両方の鎖の(DNA分子の転写による)発現を可能にする様式で、作動可能に連結された調節配列がLAT1又はASCT2配列に隣接するようにする(Leeら、2002年)。LAT1 mRNA又はASCT2 mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子は、第1のプロモーター(例えば、クローン化DNAのプロモーター配列3')によって転写され、LAT1 mRNA又はASCT2 mRNAに対してセンス鎖であるRNA分子は、第2のプロモーター(例えば、クローン化DNAのプロモーター配列5')によって転写される。センス鎖及びアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイズして、LAT1遺伝子又はASCT2遺伝子をサイレンシングするためのsiRNA構築物を生成する。或いは、2つのベクターを利用して、siRNA構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖を作製する。クローン化LAT1又はASCT2は、二次構造、例えばヘアピンを有する構築物をコードし得、単一の転写物は、標的遺伝子由来のセンス配列と相補的なアンチセンス配列の両方を有する。二次構造を有する構築物をコードするこのような転写物は、好ましくは、上記センス鎖及び上記アンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列(ループ配列)を含む。
【００８３】
siRNAは、好ましくは単離されている。本明細書で使用するとき、「単離された」とは、ヒトの介入によって合成され、又は天然状態から改変若しくは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物において天然に存在するsiRNAは「単離されていない」が、合成siRNA、又はその天然状態の共存材料から部分的に若しくは完全に分離されているsiRNAは「単離されている」。単離されたsiRNAは、実質的に精製された形態で存在し得るか、又は例えばsiRNAが送達された細胞等の非天然の環境に存在し得る。例として、天然のプロセスによって細胞内で産生されるが、「単離された」前駆体分子から産生されるsiRNAはそれ自体で「単離された」分子である。したがって、単離されたdsRNAを標的細胞に導入することができ、それはダイサータンパク質(又はその等価物)によって単離されたsiRNAにプロセシングされる。
【００８４】
本明細書で使用するとき、「阻害する」とは、LAT1若しくはASCT2遺伝子発現産物の活性又はLAT1若しくはASCT2遺伝子発現産物のレベルが、本発明のsiRNA分子の非存在下で観察されるものより減少することを意味する。siRNA分子による阻害は、好ましくは、RNAi反応を媒介することができない不活性分子又は弱毒化分子の存在下で観察されるレベルより有意に低い。siRNA分子による遺伝子発現の阻害は、好ましくは、siRNA分子の非存在下よりもその存在下において有意に大きい。好ましくは、siRNAは、LAT1又はASCT2遺伝子発現のレベルを少なくとも10%、より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも75%阻害する。
【００８５】
好ましくは、siRNA分子は、LAT1又はASCT2遺伝子を含有する細胞の成長が阻害されるように、LAT1又はASCT2遺伝子の発現を阻害する。細胞成長を阻害するとは、処理された細胞が、未処理の細胞よりも低い速度で増殖するか又は生存率が低下することを意味する。細胞成長は、当該技術分野において公知である増殖アッセイによって測定される。
【００８６】
本明細書で使用するとき、「単離された核酸」は、その元の環境(例えば、天然に存在する場合は天然の環境)から取り出された核酸であり、したがって、その天然状態から合成的に改変された核酸である。本発明において、単離された核酸には、DNA、RNA、及びそれらの誘導体が含まれる。単離された核酸がRNA又はその誘導体である場合、塩基「t」は、ヌクレオチド配列中の「u」で置き換えられるべきである。
【００８７】
本明細書で使用するとき、「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソン-クリック又はフーグスティーン型塩基対合体を指し、「結合」という用語は、2つのポリペプチド若しくは化合物又は関連ポリペプチド若しくは化合物又はそれらの組合せ間の物理的又は化学的相互作用を意味する。
【００８８】
本明細書で使用するとき、「高度に保存された配列領域」という語句は、標的遺伝子中の1つ以上の領域のヌクレオチド配列が、一世代から他の世代で又は1つの生物系から他の生物系で有意に変化しないことを意味する。
【００８９】
本明細書で使用するとき、「相補性」又は「相補的」という用語は、伝統的なワトソン-クリック型又は他の非伝統的な種類の相互作用のいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。本発明に関して、siRNA分子とその相補的な配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばRNAi活性を進行させるのに十分である。例えば、siRNA分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の間の相補性の程度は、siRNAのアンチセンス鎖と標的RNA配列の間の相補性の程度と同じであるか又は異なっていてもよい。
【００９０】
相補性パーセントは、第2の核酸配列(例えば、10のうち、5、6、7、8、9、10は50%、60%、70%、80%、90%、及び100%相補性である)と水素結合を(例えば、ワトソン-クリック型塩基対合)を形成することができる核酸分子中の隣接残基の割合を示す。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての隣接残基が第2の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することを意味する。好ましくは、「相補性」又は「相補的」という用語は、第1の核酸配列の少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の残基が第2の核酸配列と水素結合を形成できることを意味する。
【００９１】
相補的な核酸配列は、適切な条件下でハイブリダイズして、ミスマッチがほとんどないか(1つ若しくは2つ)か又は全く含有しない安定な二重鎖を形成する。更に、siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖ヌクレオチド又はヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい実施形態では、このような二本鎖は、10のマッチごとに1以下のミスマッチを含有する。特に好ましい実施形態では、二重鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は完全に相補的であり、すなわち二本鎖はミスマッチを含有しない。
【００９２】
本明細書で使用するとき、「細胞」という用語は、その通常の生物学的意味を用いて定義される。細胞は、生物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコ等の哺乳動物に存在することができる。細胞は、真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)であり得る。細胞は、体細胞性又は生殖細胞系起源、全能性又は多能性、分裂性又は非分裂性であり得る。細胞はまた、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来し得るか又はそれを含み得る。好ましくは、細胞は、膀胱、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、筋肉、卵巣、膵臓、皮膚又は胃の癌細胞である。
【００９３】
本明細書で使用するとき、「RNA」という用語は、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β-D-リボフラノース部分の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、単離されたRNA、例えば、部分的に精製されたRNA、実質的に純粋なRNA、合成RNA、又は組換え生成されたRNA、並びに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は改変によって、天然に存在するRNAとは異なる改変RNAを含む。このような改変は、siRNAの末端(単数又は複数)に、又は内部的に、例えばこのRNAの1つ以上のヌクレオチドに、非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド等の非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの改変されたRNAは、天然に存在するRNAの類似体と呼ぶことができる。好ましくは、「RNA」という用語は、リボヌクレオチド残基のみからなる。
【００９４】
本明細書で使用するとき、「生物」という用語とは、少なくとも1つの細胞で構成された任意の生きている実在物を指す。生物(living ortanism)は、例えば、単一の真核細胞のように単純なものであってもよく、又はヒトを含む哺乳動物のように複雑なものであってもよい。
【００９５】
本明細書で使用するとき、「対象」という用語は、外植細胞のドナー若しくはレシピエントである生物又は細胞それ自体を意味する。「対象」はまた、本発明の核酸分子を投与することができる生物を指す。対象は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシである。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００９６】
本明細書で使用するとき、「生物学的試料」という用語は、ポリヌクレオチドを含有する任意の試料を指す。試料は、組織又は細胞試料、又はポリヌクレオチドを含有する体液(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血(amniotic cord blood)、尿、膣液及び精液)であり得る。試料は、生物全体又はその細胞、組織若しくは構成部分のサブセット、又はそれらの画分若しくは部分から調製されたホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物若しくは組織培養物であり得る。最後に、試料は、生物、又は生物の細胞が増殖している栄養ブロス又はゲル等の培地であってもよく、試料はポリヌクレオチドを含有する。
【００９７】
本発明は、癌細胞成長の阻害を引き起こすLAT1及び/又はACST2遺伝子発現を阻害する方法に関する。特に、本発明は、LAT1及び/又はASCT2 siRNAを癌性細胞集団に適用する工程を含む、上記癌性細胞集団の成長を阻害する方法を提供する。癌細胞成長は、細胞をLAT1及び/又はASCT2 siRNAの組成物と接触させることによって阻害される。LAT1及びASCT2は、膀胱、脳、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、筋肉、卵巣、膵臓、皮膚及び胃の癌等の腫瘍において過剰発現されるアミノ酸トランスポータータンパク質である。LAT1又はASCT2を発現している細胞の成長は、LAT1又はASCT2 siRNAによって抑制することができる。細胞をトランスフェクション促進剤と更に接触させて、細胞にsiRNA又はsiRNAをコードするベクターの送達を増強させ得る。本発明の特定の方法に応じて、細胞は、インビトロ、インビボ又はエクスビボで提供され得る。
【００９８】
ヒトLAT1遺伝子(GenBank登録番号NM_003486)に関する配列情報は、NCBI Entrezヌクレオチドデータベースから抽出された。最大104個のmRNAセグメントが同定された。ヒトASCT2遺伝子(GenBank登録番号NM_001145144)に関する配列情報は、NCBI Entrezヌクレオチドデータベースから抽出された。最大89個のmRNAセグメントが同定された。標的細胞における遺伝子発現を阻害する能力を有する二本鎖RNAを設計する方法は公知である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6，506，559号、及びElbashirら、2001年を参照されたい。
【００９９】
siRNA標的部位の選択は、以下のように実施することができる。
1．転写物のATG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、各AA及び3'隣接19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschalらは、5'及び3'の非翻訳領域(UTR)及び開始コドン近傍(75塩基以内)の領域にsiRNAの設計に対して推奨した。これは、これらが調節タンパク質の結合部位が豊富になる可能性があるためである。UTR結合タンパク質及び/又は翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2．潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から除外する。本発明者らは、BLASTの使用を示唆する。これは、NCBIサーバでwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/に見出すことができる。
3．合成に適格な標的配列(すなわち、55%を超えるGC含量を有する配列)を選択する。
【０１００】
本発明の一態様では、センス核酸の長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在するLAT1転写物と同じ長さであり得る。好ましくは、センス核酸は75、50、又は25ヌクレオチド未満の長さである。センス核酸が少なくとも19ヌクレオチドを含むことが更に好ましい。最も好ましくは、センス核酸は19〜25ヌクレオチドの長さである。哺乳動物細胞においてLAT1発現を阻害する本発明のLAT1 siRNAセンス核酸の例には、LAT1遺伝子の以下の標的配列のうちのいずれか1つを含むオリゴヌクレオチドが含まれる:ヌクレオチド145〜165(配列番号4)、217〜237(配列番号6)、466〜486(配列番号10)、628〜648(配列番号13)、796〜816(配列番号22)、1243〜1263(配列番号34)、525〜545(配列番号58)、624〜644(配列番号61)、1245〜1265(配列番号81)、1316〜1336(配列番号83)、1410〜1430(配列番号87)、147〜165(配列番号95)、219〜237(配列番号96)、468〜486(配列番号97)、630〜648(配列番号98)、798〜816(配列番号99)、1247〜1263(配列番号100)、527〜545(配列番号101)、1247〜1265(配列番号102)、1318〜1336(配列番号103)、1412〜1430(配列番号104)。
【０１０１】
二本鎖RNAの一方の鎖に関する配列を示す104個の配列が、LAT-1について生成された。これらは、以下のヌクレオチド配列を含んでいた。
【０１０２】
【表３Ａ】
2019517819.tif 000006
【０１０３】
【表３Ｂ】
2019517819.tif 000007
【０１０４】
【表３Ｃ】
2019517819.tif 000008
【０１０５】
LAT1遺伝子特異性は、NCBI BlastNデータベースを検索することによって確認された。siRNAを化学合成した。
【０１０６】
42個の精製されたsiRNA二重鎖の全てをリポフェクタミンと複合化させ、無血清培地中で12時間、細胞に添加した。その後、細胞を血清補足培地で72〜96時間培養し、これを実験の24時間前に無血清培地と交換した。スクランブルネガティブsiRNA二重鎖を対照として使用した。
【０１０７】
LAT1-siRNAは、単一の標的LAT1遺伝子配列に指向される。或いは、siRNAは、複数の標的LAT1遺伝子配列に指向される。例えば、組成物は、2、3、4、5個、又はそれを超えるLAT1標的配列に対して指向されたLAT1-siRNAを含有する。LAT1標的配列とは、LAT1遺伝子の一部と同一であるヌクレオチド配列を意味する。標的配列は、ヒトLAT1遺伝子の5'非翻訳(UT)領域、オープンリーディングフレーム(ORF)又は3'非翻訳領域を含むことができる。或いは、siRNAは、LAT1遺伝子発現の上流又は下流の調節因子に相補的な核酸配列である。上流及び下流の調節因子の例には、LAT1遺伝子プロモーターに結合する転写因子、LAT1ポリペプチドと相互作用するキナーゼ又はホスファターゼ、LAT1プロモーター、又はエンハンサー(enhance)が含まれる。
【０１０８】
mRNAを標的とするためにハイブリダイズするLAT1-siRNAは、通常、一本鎖のmRNA転写物と会合することによってLAT1遺伝子にコードされるLAT1ポリペプチド産物の産生を減少又は阻害し、それによって翻訳、したがってタンパク質の発現を妨げる。LAT1-siRNAの産生のための例示的な核酸配列には、標的配列として、ヌクレオチド145〜165(配列番号4)、217〜237(配列番号6)、466〜486(配列番号10)、628〜648(配列番号13)、796〜816(配列番号22)、1243〜1263(配列番号34)、525〜545(配列番号58)、624〜644(配列番号61)、1245〜1265(配列番号81)、1316〜1336(配列番号83)、1410〜1430(配列番号87)、147〜165(配列番号95)、219〜237(配列番号96)、468〜486(配列番号97)、630〜648(配列番号98)、798〜816(配列番号99)、1247〜1263(配列番号100)、527〜545(配列番号101)、1247〜1265(配列番号102)、1318〜1336(配列番号103)、1412〜1430(配列番号104)の配列が含まれる。更なる実施形態では、siRNAの阻害活性を増強させるために、ヌクレオチド「u」を標的配列のアンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。好ましくは、少なくとも2、より好ましくは2〜10、最も好ましくは2〜5uが付加される。付加されたuは、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。
【０１０９】
LAT1-siRNAは、mRNA転写物に結合することができる形態で細胞内に直接導入することができる。或いは、LAT1-siRNAをコードするベクターを細胞内に導入することができる。
【０１１０】
任意のヌクレオチド配列からなるループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列の間に配置することができる。したがって、本発明はまた、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有するsiRNAを提供し、式中、[A]は、LAT1遺伝子の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列である。好ましくは、[A]は、ヌクレオチド145〜165(配列番号4)、217〜237(配列番号6)、466〜486(配列番号10)、628〜648(配列番号13)、796〜816(配列番号22)、1243〜1263(配列番号34)、525〜545(配列番号58)、624〜644(配列番号61)、1245〜1265(配列番号81)、1316〜1336(配列番号83)、1410〜1430(配列番号87)、147〜165(配列番号95)、219〜237(配列番号96)、468〜486(配列番号97)、630〜648(配列番号98)、798〜816(配列番号99)、1247〜1263(配列番号100)、527〜545(配列番号101)、1247〜1265(配列番号102)、1318〜1336(配列番号103)、1412〜1430(配列番号104)からなる群から選択される配列である;[B]は、3〜23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列である;[A']は、[A]の相補的な配列からなるリボヌクレオチド配列である。領域[A]は[A']とハイブリダイズし、次に、領域[B]からなるループが形成される。ループ配列は、好ましくは3〜23ヌクレオチドの長さであり得る。適切なループ配列は、http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.htmlに記載されている。更に、23ヌクレオチドからなるループ配列はまた、活性なsiRNAを提供する(Jacqueら、2002年)。好ましいループ配列は、以下を含む:
AUG:(Suiら、2002年)。
CCC、CCACC、又はCCACACC:(Paulら、2002年)。
UUCG:(Leeら、2002年)。
CTCGAG又はAAGCUU:(Biology、2003年)。
UUCAAGAGA:(Yuら、2002年)。
【０１１１】
ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC、及びUUCAAGAGAからなる群より選択することができる。好ましくは、ループ配列は、UUCAAGAGA(DNA中の「ttcaagaga」)である。
【０１１２】
本発明の更なる態様では、センス核酸の長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在するASCT2転写物と同じ長さであり得る。好ましくは、センス核酸は75、50、又は25ヌクレオチド未満の長さである。センス核酸が少なくとも19ヌクレオチドを含むことが更に好ましい。最も好ましくは、センス核酸は19〜25ヌクレオチドの長さである。哺乳動物細胞においてASCT2発現を阻害する本発明のASCT2 siRNAセンス核酸の例には、ASCT2遺伝子の以下の標的配列のうちのいずれか1つを含むオリゴヌクレオチドが含まれる:ヌクレオチド300〜320(配列番号209)、452〜472(配列番号216)、773〜793(配列番号225)、776〜796(配列番号226)、830〜850(配列番号228)、1122〜1142(配列番号235)、1123〜1143(配列番号236)、1124〜1144(配列番号237)、1150〜1170(配列番号238)、769〜789(配列番号260)、994〜1014(配列番号264)、1066〜1086(配列番号267)、1131〜1151(配列番号271)、1154〜1174(配列番号272)、1264〜1284(配列番号278)、1268〜1288(配列番号279)、302〜320(配列番号281)、454〜472(配列番号282)、775〜793(配列番号283)、778〜796(配列番号284)、832〜850(配列番号285)、1124〜1142(配列番号286)、1125〜1143(配列番号287)、1126〜1144(配列番号288)、1152〜1170(配列番号289)、771〜789(配列番号291)、996〜1014(配列番号292)、1068〜1086(配列番号293)、1133〜1151(配列番号294)、1156〜1174(配列番号295)、1266〜1284(配列番号296)、1270〜1288(配列番号297)。
【０１１３】
二本鎖RNAの一方の鎖に関する配列を示す89個の配列が、ASCT2について生成された。これらは、以下のヌクレオチド配列を含んでいた。
【０１１４】
【表４Ａ】
2019517819.tif 000009
【０１１５】
【表４Ｂ】
2019517819.tif 000010
【０１１６】
【表４Ｃ】
2019517819.tif 000011
【０１１７】
ASCT2遺伝子特異性は、NCBI BlastNデータベースを検索することによって確認された。siRNAを化学合成した。
【０１１８】
42個の精製されたsiRNA二重鎖の全てをリポフェクタミンと複合化させ、無血清培地中で12時間、細胞に添加した。その後、細胞を血清補足培地で72〜96時間培養し、これを実験の24時間前に無血清培地と交換した。スクランブルネガティブsiRNA二重鎖を対照として使用した。
【０１１９】
ASCT2-siRNAは、単一の標的ASCT2遺伝子配列に指向される。或いは、siRNAは、複数の標的ASCT2遺伝子配列に指向される。例えば、組成物は、2、3、4、5個、又はそれを超えるASCT2標的配列に対して指向されたASCT2-siRNAを含有する。ASCT2標的配列とは、ASCT2遺伝子の一部と同一であるヌクレオチド配列を意味する。標的配列は、ヒトASCT2遺伝子の5'非翻訳(UT)領域、オープンリーディングフレーム(ORF)又は3'非翻訳領域を含むことができる。或いは、siRNAは、ASCT2遺伝子発現の上流又は下流の調節因子に相補的な核酸配列である。上流及び下流の調節因子の例には、ASCT2遺伝子プロモーターに結合する転写因子、ASCT2ポリペプチドと相互作用するキナーゼ又はホスファターゼ、ASCT2プロモーター、又はエンハンサー(enhance)が含まれる。
【０１２０】
mRNAを標的とするためにハイブリダイズするASCT2-siRNAは、通常、一本鎖のmRNA転写物と会合することによってASCT2遺伝子にコードされるASCT2ポリペプチド産物の産生を減少又は阻害し、それによって翻訳、したがってタンパク質の発現を妨げる。ASCT2-siRNAの産生のための例示的な核酸配列には、標的配列として、ヌクレオチド300〜320(配列番号209)、452〜472(配列番号216)、773〜793(配列番号225)、776〜796(配列番号226)、830〜850(配列番号228)、1122〜1142(配列番号235)、1123〜1143(配列番号236)、1124〜1144(配列番号237)、1150〜1170(配列番号238)、769〜789(配列番号260)、994〜1014(配列番号264)、1066〜1086(配列番号267)、1131〜1151(配列番号271)、1154〜1174(配列番号272)、1264〜1284(配列番号278)、1268〜1288(配列番号279)、302〜320(配列番号281)、454〜472(配列番号282)、775〜793(配列番号283)、778〜796(配列番号284)、832〜850(配列番号285)、1124〜1142(配列番号286)、1125〜1143(配列番号287)、1126〜1144(配列番号288)、1152〜1170(配列番号289)、771〜789(配列番号291)、996〜1014(配列番号292)、1068〜1086(配列番号293)、1133〜1151(配列番号294)、1156〜1174(配列番号295)、1266〜1284(配列番号296)、1270〜1288(配列番号297)の配列が含まれる。更に、siRNAの阻害活性を増強させるために、ヌクレオチド「u」を標的配列のアンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。好ましくは、少なくとも2、より好ましくは2〜10、最も好ましくは2〜5uが付加される。付加されたuは、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。
【０１２１】
ASCT2-siRNAは、mRNA転写物に結合することができる形態で細胞内に直接導入することができる。或いは、ASCT2-siRNAをコードするベクターを細胞内に導入することができる。
【０１２２】
任意のヌクレオチド配列からなるループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列の間に配置することができる。したがって、本発明はまた、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有するsiRNAを提供し、式中、[A]は、ASCT2遺伝子の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列である。好ましくは、[A]は、ヌクレオチド300〜320(配列番号209)、452〜472(配列番号216)、773〜793(配列番号225)、776〜796(配列番号226)、830〜850(配列番号228)、1122〜1142(配列番号235)、1123〜1143(配列番号236)、1124〜1144(配列番号237)、1150〜1170(配列番号238)、769〜789(配列番号260)、994〜1014(配列番号264)、1066〜1086(配列番号267)、1131〜1151(配列番号271)、1154〜1174(配列番号272)、1264〜1284(配列番号278)、1268〜1288(配列番号279)、302〜320(配列番号281)、454〜472(配列番号282)、775〜793(配列番号283)、778〜796(配列番号284)、832〜850(配列番号285)、1124〜1142(配列番号286)、1125〜1143(配列番号287)、1126〜1144(配列番号288)、1152〜1170(配列番号289)、771〜789(配列番号291)、996〜1014(配列番号292)、1068〜1086(配列番号293)、1133〜1151(配列番号294)、1156〜1174(配列番号295)、1266〜1284(配列番号296)、1270〜1288(配列番号297)からなる群から選択される配列である;
[B]は、3〜23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列である;[A']は、[A]の相補的な配列からなるリボヌクレオチド配列である。領域[A]は[A']とハイブリダイズし、次に、領域[B]からなるループが形成される。ループ配列は、好ましくは3〜23ヌクレオチドの長さであり得る。適切なループ配列は、http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.htmlに記載されている。更に、23ヌクレオチドからなるループ配列はまた、活性なsiRNAを提供する(Jacqueら、2002年)。好ましいループ配列は、以下を含む:
AUG:(Suiら、2002年)。
CCC、CCACC、又はCCACACC:(Paulら、2002年)。
UUCG:(Leeら、2002年)。
CTCGAG又はAAGCUU:(Biology、2003年)。
UUCAAGAGA:(Yuら、2002年)。
【０１２３】
ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC、及びUUCAAGAGAからなる群から選択することができる。好ましくは、ループ配列は、UUCAAGAGA(DNA中の「ttcaagaga」)である。
【０１２４】
本発明者らは、驚くべきことに、LAT1遺伝子又はASCT2遺伝子の特定の標的配列に対して標的とされたsiRNAが、それぞれナトリウム非依存性[14C]-L-ロイシン取り込み又はナトリウム依存性[14C]-L-アラニン取り込み、LAT1若しくはASCT2発現、細胞成長、及びLAT1又はASCT2トランスポーターを過剰発現している腫瘍の成長の阻害に特に効果的であることを見出した。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態では、本発明で使用されるLAT1 siRNAのセンス鎖は、配列番号6、配列番号22、配列番号34、配列番号58及び配列番号61を含む群から選択される配列を含むか又はそれからなる。siRNAはまた、対応するアンチセンス鎖を含む。このようなsiRNAの使用は、ナトリウム非依存性の[14C]-L-ロイシン輸送を阻害するのに特に効果的であることを見出した。更なる実施形態では、LAT1 siRNAのセンス鎖は、配列番号110、126、138、162及び165を含む群から選択される少なくとも1つの配列を含むか又はそれからなる。
【０１２６】
本発明の別の態様によれば、センスLAT1核酸及びアンチセンスLAT1核酸を含むsiRNAが提供され、このセンスLAT1核酸は、LAT1 mRNA内に含有される標的配列と実質的に同一であり、アンチセンスLAT1核酸は、センスLAT1核酸に相補的である。センス核酸及びアンチセンス核酸は互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。
【０１２７】
本発明のsiRNA分子は、上記遺伝子を発現している細胞内に導入した場合、LAT1遺伝子の発現を阻害するという性質を有する。
【０１２８】
本発明のsiRNA分子は、LAT1遺伝子を発現している細胞内に導入した場合、細胞成長を阻害するという性質を有する。
【０１２９】
本発明のsiRNA分子は、LAT1遺伝子を発現している腫瘍内に導入した場合、腫瘍成長を阻害するという性質を有する。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態では、本発明で使用されるASCT2 siRNAのセンス鎖は、配列番号225、配列番号237、配列番号267及び配列番号278を含む群から選択される配列を含むか又はそれからなる。siRNAはまた、対応するアンチセンス鎖を含む。このようなsiRNAの使用は、ナトリウム非依存性の[14C]-L-ロイシン輸送を阻害するのに特に効果的であることが判明している。更なる実施形態では、LAT1 siRNAのセンス鎖は、314、326、356及び367を含む群から選択される少なくとも1つの配列を含むか又はそれからなる。
【０１３１】
本発明の別の態様によれば、センスASCT2核酸及びアンチセンスASCT2核酸を含むsiRNAが提供され、このセンスASCT2核酸は、ASCT2 mRNA内に含有される標的配列と実質的に同一であり、アンチセンスASCT2核酸は、センスASCT2核酸に相補的である。センス核酸及びアンチセンス核酸は互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。
【０１３２】
本発明のsiRNA分子は、ASCT2遺伝子を発現している細胞内に導入した場合、上記遺伝子の発現を阻害するという性質を有する。
【０１３３】
本発明のsiRNA分子は、ASCT2遺伝子を発現している細胞内に導入した場合、細胞成長を阻害するという性質を有する。
【０１３４】
本発明のsiRNA分子は、ASCT2遺伝子を発現している腫瘍内に導入した場合、腫瘍増成長を阻害するという性質を有する。
【０１３５】
組み合わせたとき、本発明のsiRNA-LAT1及びsiRNA-ASCT2は、LAT1及びASCT2遺伝子を発現している細胞内に導入した場合、該遺伝子の発現を阻害するという性質を有する。
【０１３６】
組み合わせたとき、本発明のsiRNA-LAT1及びsiRNA-ASCT2分子は、LAT1及びASCT2遺伝子を発現している細胞内に導入した場合、細胞成長を阻害するという性質を有する。
【０１３７】
組み合わせたとき、本発明のsiRNA-LAT1及びsiRNA-ASCT2分子は、LAT1 ASCT2遺伝子を発現している腫瘍内に導入した場合、腫瘍成長を阻害するという性質を有する。
【０１３８】
本発明の別の態様は、本発明の第4の態様によるsiRNAをコードする核酸配列及びベクター、並びに、例えば本発明の方法において有用なそれらを含む組成物に関する。本発明の組成物は、トランスフェクション増強剤を更に含み得る。核酸配列は、誘導性又は調節性プロモーターに作動可能に連結され得る。適切なベクターは上記で考察されている。好ましくは、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【０１３９】
本発明の組成物は、癌を治療するための医薬品を更に含み得、この医薬品はsiRNAとは異なる。好ましくは、医薬品は、アバレリクス、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン(cispatlin)、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エルロチニブ、4'-エピドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、フロキシリジン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プレドニゾン、プロカルバジン、リツキシマブ、サトラプラチン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、6-チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トリプトレリン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレビンからなる群から選択される。
【０１４０】
非ウイルス送達siRNAシステムは、核酸トランスフェクション試薬の作製を伴う。核酸トランスフェクション試薬は2つの基本的性質を有する。第一に、それらは核酸カーゴと何らかの方法で相互作用しなければならない。ほとんどの場合、これは静電気力を伴い、それによって核酸複合体の形成が可能になる。複合体の形成は、核酸及びトランスフェクション試薬が細胞膜に同時に提示されることを確実にする。複合体は、送達試薬の性質に基づいて、3つのクラス:リポプレックス;ポリプレックス;及びリポポリプレックスに分類することができる。リポプレックスは、アニオン性核酸とカチオン性脂質との相互作用によって形成され、ポリプレックスは、カチオン性ポリマーとの相互作用によって形成される。リポポリプレックス試薬は、カチオン性脂質及びポリマーの作用を組み合わせて、核酸を送達することができる。カチオン性脂質のいくつかの製剤へのヒストン、ポリ-L-リジン及びプロタミンの添加は、脂質又はポリマー単独のいずれよりも高い送達レベルをもたらす。組み合わせた製剤はまた、毒性が低い場合がある。この目的に最も関連する生体適合性システムは、特に核酸の物理化学に従って設計された非ウイルス性生分解性ナノカプセルである。それらは、生分解性ポリマーエンベロープによって囲まれた水性コアを有し、生分解性ポリマーエンベロープはサイトゾルへのsiRNAの保護及び輸送を提供し、siRNAがインビボで効率的に機能することを可能にする。
【０１４１】
本発明はまた、本発明の第4の態様によるsiRNA又は本発明のベクターを含有する細胞を提供する。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。細胞が単離された細胞であることが更に好ましい。
【０１４２】
前述の開示は、本発明を製造及び使用する方法並びにその最良の形態を含む本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供する一方で、以下の実施例は、更に当業者が本発明を実施することができ、その完全な説明を提供することができるように提供される。しかしながら、当業者は、これらの実施例の仕様が本発明を限定するものとして読まれるべきではなく、その範囲が本開示に添付された特許請求の範囲及びその均等物から理解されるべきであることを認識する。本開示を考慮して、本発明の様々な更なる態様及び実施形態は当業者には明らかである。
【０１４３】
配列データベース識別子への言及を含む、本明細書中で言及された全ての書類は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に明記しない限り、配列データベース識別子を参照する場合、バージョン番号は1である。
【０１４４】
「及び/又は」は、本明細書で使用される場合、2つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示として、他のものを伴って又は伴わずに解釈されるべきである。例えば、「A及び/又はB」は、あたかもそれぞれが本明細書において個別に記載されているかのように、(i)A、(ii)B、及び(iii)A及びB、のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきものである。
【０１４５】
文脈が他に指示しない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明のいかなる特定の態様及び実施形態にも限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。本発明は、以下の非制限的な実施例において更に説明される。
【０１４６】
以下の実施例は、本発明を更に詳細に説明するものであるが、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ヒト肝癌SK-HEP-1細胞、ヒト膀胱癌T24細胞、ヒト線維肉腫HT-1080細胞、及びヒト結腸がんHTC-116細胞中のLAT1タンパク質及びASCT2タンパク質のウェスタンブロットによる相対的存在量を示す図である(GAPDHとの比較)。
【図２】ヒト肝癌SK-HEP-1細胞、ヒト膀胱癌T24細胞、ヒト線維肉腫HT-1080細胞、及びヒト結腸がんHTC-116細胞中のLAT1 mRNA及びASCT2 mRNAのRT-PCRによる相対的存在量を示す図である(GAPDHとの比較)。
【図３】LAT1経由の14C-L-ロイシンの輸送(非標識L-ロイシンに対して感受性)、及びASCT2経由の14C-L-アラニンの輸送(非標識L-アラニンに対して感受性)を示す図である。対応する対照値とは有意に異なる(****p<0.001)。
【図４】24時間の時点で、トランスフェクティング剤として0.5%リポフェクトアミン2000を使用して、(A)ヌクレオチド配列番号6、22、34、58、及び61に対する10nMのsiRNA-LAT1で24時間処置した肝癌SK-HEP-1細胞中のLAT1 mRNAの相対的存在量、並びに(B)ヌクレオチド配列番号225、237、267、及び278に対する10nMのsiRNA-ASCT2で6時間処置した肝癌SK-HEP-1細胞中のASCT2 mRNAの、ヒトがん細胞(SK-HEP-1)中のASCT2 mRNAレベルに基づく相対的存在量を示す図である。対応する対照値(* p<0.01)、及び配列番号34に対応する数値(#p<0.05)とは有意に異なる。
【図５】24時間(A及びB)又は48時間(C及びD)の時点でトランスフェクティング剤として0.4%リポフェクトアミン2000を使用して、ヌクレオチド配列番号6、22、34、58、61に対する10nMの抗LAT1(siRNA-LAT1)(A及びC)で、並びにヌクレオチド配列番号225、237、267、及び278に対する10nMのsiRNA-ASCT2で6時間処置した肝癌SK-HEP-1細胞中への、初期の取り込み速度(1分間)における[14C]-L-ロイシン(0.25μM)(A及びC)、及び[14C]-L-アラニン(0.25μM)(B及びD)の取り込みを示す図である。対応する対照値(*p<0.01)、配列番号34に対応する数値(#p<0.05)、及び配列番号267に対応する数値($ p<0.05)とは有意に異なる。
【図６】ヌクレオチド配列番号58、58t、58s1、58s2、61、61t、61s1、及び61s2に対する5'DNAセンス、5'センスsiRNA、及び3'アンチセンスsiRNA-LAT1を示す図である。
【図７】ヌクレオチド配列番号267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1、及び278s2に対する5'DNAセンス、5'センスsiRNA、及び3'アンチセンスsiRNA-ASCT2を示す図である。
【図８】48時間の時点で、トランスフェクティング剤として0.4%リポフェクトアミン2000を使用して、ヌクレオチド配列番号58、58t、61、61tに対する5nMの抗LAT1、及び1つの市販siRNA(QIAGEN社よりSI31011000)、ヌクレオチド配列番号267、267t、278、278tに対する5nMのsiRNA-ASCT2及び1つの市販siRNA (QIAGEN社よりSI00097930)で6時間処置したヒト線維肉腫HT-1080細胞中への、初期の取り込み速度(1分間)における[14C]-L-ロイシン(0.25μM)(A)、及び[14C]-L-アラニン(0.25μM)(B)の取り込みを示す図である。対応する対照値(*p<0.01)、及び配列番号267tに対応する数値($ p<0.05)とは有意に異なる。
【図９】24時間(A及びB)又は72時間(C及びD)の時点で、トランスフェクティング剤として0.5%リポフェクトアミン2000を使用して、ヌクレオチド配列番号58、61、58t、及び61tに対する5又は25nMのsiRNA-LAT1で6時間処置したヒト結腸がんHTC-116細胞内のLAT1 mRNA(A及びC)、及びASCT2 mRNA(B及びD)の相対的存在量、並びにヌクレオチド配列番号267、278、267t、及び278tに対する5又は25nMのsiRNA-ASCT2で6時間処置したヒト結腸がんHTC-116細胞内のASCT2 mRNAの相対的存在量を示す図である。対応する対照値とは有意に異なる(*p<0.01)。
【図１０】(A)ヌクレオチド配列番号58tに対する5、25、及び45nMのsiRNA-LAT1により、(B)72時間の時点で、トランスフェクティング剤として0.5%リポフェクトアミン2000(登録商標)、リポフェクトアミンRNAiMAX(登録商標)、又はInjectin(登録商標)を使用して6時間処置したヒト結腸がんHTC-116細胞中のLAT1 mRNAの相対的存在量を示す図である。対応する対照値(**p<0.01、***p<0.02; ****p<0.001)、及びInjectin(登録商標)の対応する数値(#p<0.05)とは有意に異なる。
【図１１】72時間曝露後に、トランスフェクティング剤であるリポフェクトアミン2000(登録商標)又はInjectin(登録商標)がヒト結腸がんHTC-116細胞密度に与える効果を示す図である。対応する対照値とは有意に異なる(**p<0.01、***p<0.02)。
【図１２】siRNA: Injectin(登録商標)複合体について行った、複合体の容積が(A) 20μL、及び(B) 80μLのときのアガロースゲル電気泳動によるsiRNA複合体形成分析を示す図である。パネルAでは、siRNA: Injectin(登録商標)複合体の電気泳動により、siRNA: Injectin(登録商標)の比が1:1であり、かつ複合混合物中のInjectin(登録商標)の割合が0.9%よりも高いとき、siRNAは完全に複合体化することが明らかとなった。パネルBでは、siRNA: Injectin(登録商標)の比を1:1に維持しても、複合混合物中のInjectin(登録商標)の量が0.2%に等しい又はそれ未満であるとき、siRNA複合体形成は有効でないことを示す図である。
【図１３】トランスフェクティング剤としてInjectin(登録商標)(0.075%及び0.1%)、又はリポフェクトアミン2000(登録商標)(0.25%)を使用して72時間曝露したときに、陰性対照であるsiRNA市販(QIAGEN社より)配列NC-SI03650318及びNC-SI03650325が、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。
【図１４】トランスフェクティング剤として0.1%のInjectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに、(A)ヌクレオチド配列番号6、22、34、58、58t、58s1、58s2、61、61t、61s1、61s2に対するsiRNA-LAT1、及び3つの市販siRNA(QIAGEN社、Thermofisher Scientific社、及びSigma-Aldrich社より、それぞれSI31011000、HSS112005、及びSASI_Hs01_00103513)、並びに(B)ヌクレオチド配列番号225、237、267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1、278s2に対するsiRNA-ASCT2、及び1つの市販siRNA(QIAGEN社よりSI00097930)のそれぞれが、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。パネルAでは、数値は、対応する対照値(*p<0.01)、配列番号34に対応する数値(#p<0.05)、及び配列番号58に対応する数値($ p<0.05)とは有意に異なる。パネルBでは、数値は、対応する対照値(*p<0.01)、配列番号267に対応する数値(#p<0.05)、及び配列番号278に対応する数値($ p<0.05)とは有意に異なる。
【図１５】トランスフェクティング剤として濃度を漸増させた(0.037%〜0.15%)Injectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに、ヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1、並びにヌクレオチド配列番号267t及び278tに対するsiRNA-ASCT2が、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。対応する対照値(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.02; ****p<0.001)、及びInjectin(登録商標)の対応する数値(#p<0.05)とは有意に異なる。
【図１６】トランスフェクティング剤として0.25%リポフェクトアミン2000を使用して72時間曝露したときに、濃度漸増法を使用した5-フルオルウラシル(fluoruracil)(5-FU; 3及び10μM)、シスプラチン(Cisp; 3及び10μM)、及びオキサリプラチン(Oxa; 1及び3μM)の単独使用、又はヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1(5及び25nM)との併用が、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。対応する対照値(#p<0.05、####p<0.001)及び抗新生物細胞傷害性剤5-FU、Cisp、又はOxaの対応する数値(*p<0.05 **p<0.01、***p<0.02、****p<0.001)とは有意に異なる。
【図１７】トランスフェクティング剤として0.037% Injectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに、5-フルオルウラシル(5-FU; 10μM)単独使用、又は配列番号58t及び61tに対する抗LAT1(25nM)との併用が、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。対応する対照値(####p<0.001)、及び抗新生物細胞傷害性剤5-FUの対応する数値(**p<0.01、****p<0.001)とは有意に異なる。
【図１８】トランスフェクティング剤としてInjectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに、配列番号58t及び61tに対する抗LAT1(25nM)、及び配列番号267t及び278tに対する抗ASCT2単独使用又は併用が、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。対応する対照値とは有意に異なる(*p<0.05 **p<0.01、***p<0.02、****p<0.001)。
【図１９】トランスフェクティング剤として0.17%リポフェクトアミン2000(登録商標)、又は0.1% Injectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに、配列番号58、58t、58s1、61、61t、61s1に対する抗LAT1、及び2つの市販siRNA (QIAGEN社及びThermofisher Scientific社より、それぞれSI31011000及びHSS112005)が、(A)LAT1 mRNAの相対的存在量、及び(B)ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。対応する対照値(*p<0.01)、配列番号58に対応する数値(#p<0.05)、及び配列番号61に対応する数値($ p<0.05)とは有意に異なる。
【図２０】トランスフェクティング剤として0.17%リポフェクトアミン2000(登録商標)、又は0.1% Injectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに、配列番号267、267t、267s1、278、278t、278s1に対する抗ASCT2、及び1つの市販siRNA(QIAGEN社よりSI00097930)が、(A)ASCT2 mRNAの相対的存在量、及び(B)ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に与える効果を示す図である。対応する対照値(*p<0.01)、配列番号267に対応する数値(#p<0.05)、及び配列番号278に対応する数値($ p<0.05)とは有意に異なる。
【図２１】ヒト結腸がんHTC-116細胞を皮下注射した免疫欠損マウスにおいて開発された異種移植腫瘍モデル内のLAT1タンパク質及びASCT2タンパク質の代表的なウェスタンブロットを示す図である。
【図２２】ヒト結腸がんHTC-116細胞を皮下注射した免疫欠損マウスにおいて開発された異種移植腫瘍モデル内の、RT-PCRによるLAT1 mRNA及びASCT2 mRNAの相対的存在量(GAPDHとの比較)、並びにウェスタンブロットによるLAT1タンパク質及びASCT2タンパク質の相対的存在量(GAPDHとの比較)を示す図である。
【図２３】ヒト結腸がんHTC-116細胞を皮下注射し、並びにビヒクル(Injectin(登録商標))、又は配列番号58tに対する抗LAT1(10μg)及び配列番号278tに対する抗ASCT2(10μg)の腫瘍内注射(50μL)で1日おきに処置した免疫欠損マウスにおいて開発された異種移植腫瘍モデル内の相対的な腫瘍容積を示す図である。配列番号58t及び配列番号278tにより誘導された相対的腫瘍容積の低下は、統計的に有意であり、P値はそれぞれ0.0018及び0.0051であった。
【図２４】LAT1の好ましい標的配列の表を示す図である。
【図２５】ASCT2の好ましい標的配列の表を示す図である。
【図２６】LAT1標的配列及びsiRNAの表を示す図である。
【図２７】ASCT2標的配列及びsiRNAの表を示す図である。
【０１４８】
材料及び方法
細胞培養
SK-HEP-1、T24、HT-1080、及びHCT-116細胞株を、37℃、5% CO2の加湿された雰囲気内で維持した。SK-HEP-1細胞を、20%ウシ胎仔血清(FBS)(Gibco社、英国)、100U/mLペニシリンG、0.25μg/mLアンホテリシンB、100μg/mLストレプトマイシン(Gibco社、英国)、25mM重炭酸ナトリウム(メルク社、ドイツ)、及び25mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)(Sigma社、St. Louis、MO)が補充されたRPMI-1640 (Sigma社、St. Louis、MO)内で増殖させた。T24及びHT-1080細胞を、10% FBS(Gibco社、英国)、100U/mLペニシリンG、0.25μg/mLアンホテリシンB、100μg/mLストレプトマイシン(Gibco社、英国)、25mM重炭酸ナトリウム(メルク社、ドイツ)、及び25mM HEPES(Sigma社、St. Louis、MO)が補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)-高グルコース(Sigma社、St. Louis、MO)、及びDMEM-低グルコース(Sigma社、St. Louis、MO)内でそれぞれ増殖させた。HCT-116細胞を、10% FBS(Gibco社、英国)、100U/mLペニシリンG、0.25μg/mLアンホテリシンB、100μg/mLストレプトマイシン(Gibco社、英国)、25mM重炭酸ナトリウム(メルク社、ドイツ)、及び25mM HEPES(Sigma社、St. Louis、MO)が補充されたMcCoy's 5A(Sigma社、St. Louis、MO)内で増殖させた。全ての細胞株について、培地を2日毎に変更し、そして初回播種後3〜4日間で細胞はコンフルエンスに達した。継代培養では、0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(Sigma社、St. Louis、MO)を用いて細胞を剥離し、1:15又は1:20に分割し、そして21cm2増殖エリア(Sarstedt社、ドイツ)内で継代培養した。
【０１４９】
LAT1及びASCT2タンパク質の発現
細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回すすぎ、そしてプロテアーゼ阻害剤を含有する100μLのRIPA溶解バッファー(154mM NaCl、65.2mM TRIZMA塩基、1mM EDTA、1% NP-40(IGEPAL)、6mMデオキシコール酸ナトリウム): 1mM PMSF、1μg/mLロイペプチン、及び1μg/mLアプロチニン;及びホスファターゼ阻害剤: 1mM Na3VO4及び1mM NaFを用いてインキュベートした。細胞を削り取り、そして短時間超音波処理した。等しい量の総タンパク質(30μg)を10% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして20%メタノールを含有するトリス-グリシン転写バッファー中で、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した。トランスブロットシートを、5%脱脂粉乳を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)中で60分間ブロックし、次に下記の抗体と共に4℃、一晩インキュベートした:ウサギ抗LAT1(1:1000; Cell Signalling社);ウサギ抗ASCT2(1:1000; Cell Signalling社);又は2.5%脱脂粉乳を含むTBS-ツイーン20(0.1% vol/vol)で希釈されたマウスモノクロナール抗GAPDH(1:20,000; Santa Cruz Biotechnology Inc.社)。免疫ブロットをその後洗浄し、そして蛍光標識されたヤギ抗ウサギ二次抗体(1:20,000; IRDye(商標)800、Rockland社)、又は蛍光標識されたヤギ抗マウス二次抗体(1:20,000; AlexaFluor 680、Molecular Probes社)と共に、室温(RT)及び遮光で60分間インキュベートした。膜を洗浄し、そしてOdyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences社)を用いた700nm及び800nmの両波長スキャニングにより画像化した。
【０１５０】
LAT1及びASCT2遺伝子の発現
全RNAを単離し、そしてSV Total RNA Isolation System(Promega社、米国)を使用して、製造業者の指示に従って精製した。RNAの品質及び濃度を、NanoDrop ND1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific社、米国)で確認し、そしてRNAの完全性及びゲノムDNA汚染をアガロースゲル電気泳動により評価した。全RNA(1μg)を、Maxima Scientific First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific社、米国)を使用して、指示に従って、RT-qPCR用としてcDNAに変換した。下記のプロトコールを使用した:第1ステップ、25℃で10分間;第2ステップ、50℃で15分間;第3ステップ、85℃で5分間。StepOnePlus instrument(Applied Biosystems社、米国)においてMaxima SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo Scientific社、米国)を使用するqPCR分析ではcDNAを使用した。LAT1及びASCT2について、並びに内在性対照遺伝子GAPDHについてQuantiTect Primer Assayを使用した(Quiagen社、ドイツ)。qPCR反応を、96ウェルPCRプレート(Sarstedt社、ドイツ)内で以下の通り実施した: 95℃で10分間、1サイクル、その後に95℃で15秒間及び60℃で60秒間、40 PCRサイクル。増幅の特異性を実証するために、qPCRの直後に融解曲線を作成した。テンプレートを含まない対照を、標的遺伝子毎に常に評価した。定量サイクル(Cq)値は、StepOnePlus 2.3ソフトウェアにより自動的に生成し、また標的遺伝子の比は、内在性対照遺伝子GAPDHと比較して表した。リアルタイムPCR効率は90%〜110%の間であることが判明した。
【０１５１】
LAT1活性
細胞を、24ウェルプレート(Sarstedt社、ドイツ)に蒔き、そしてコンフルエンスに達するまで増殖させた。実験当日、細胞培養培地を吸い取り、そして細胞をハンクス培地(NaCl 140mM、KCl 5mM、MgSO4・7H2O 0.8mM、K2HPO4 0.33mM、KH2PO4 0.44mM、MgCl2・6H2O 1mM、CaCl2 0.025mM、トリス-HCl 9.75mM、pH7.4)内で15分間プレインキュベートした。取り込みを、3mM未標識L-ロイシンが存在する及び存在しない0.25μM [14C]-L-ロイシンを含むハンクス培地の添加により開始した。プレインキュベーション及びインキュベーション期間中、細胞を連続的に振盪させ、そして37℃に維持した。パスツールピペットに接続した真空ポンプによる取り込み溶液の迅速除去、その後のハンクス培地による迅速洗浄によって、取り込みを1分後に終了した。その後、細胞を0.1% vol/volトリトンX-100(5mMトリス-HCl、pH7.4に溶解)中で可溶化し、そして放射能を液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
【０１５２】
ASCT2活性
細胞を、24ウェルプレート(Sarstedt社、ドイツ)に蒔き、そしてコンフルエンスに達するまで増殖させた。実験当日、細胞培養培地を吸い取り、そして細胞をハンクス培地(ChCl 140mM、KCl 5mM、MgSO4・7H2O 0.8mM、K2HPO4 0.33mM、KH2PO4 0.44mM、MgCl2・6H2O 1mM、CaCl2 0.025mM、トリス-HCl 9.75mM、pH 7.4)内で15分間プレインキュベートした。取り込みを、3mM未標識L-アラニンが存在する及び存在しない0.25μM[14C]-L-アラニンを含むハンクス培地の添加により開始した。プレインキュベーション及びインキュベーション期間中、細胞を連続的に振盪させ、そして37℃に維持した。パスツールピペットに接続した真空ポンプによる取り込み溶液の迅速除去、その後のハンクス培地による迅速洗浄によって、取り込みを1分後に終了した。その後、細胞を0.1% vol/volトリトンX-100(5mMトリス-HCl、pH7.4に溶解)中で可溶化し、そして放射能を液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
【０１５３】
LAT1遺伝子のサイレンシング
細胞を、24ウェル(Sarstedt社、ドイツ)、又は6ウェルプレート(Sarstedt社、ドイツ)、又は壁面が黒色で底部が透明な96ウェルプレート(BD Biosciences社、米国)に蒔き、そして通常の成長条件下で24時間インキュベートした。LAT1に対するsiRNA及びトランスフェクション剤を所望の濃度に希釈し、そしてトランスフェクション剤製造業者の指示に従って混合した。siRNA-複合体形成のために、混合物を室温で20分間インキュベートし、その後、それに細胞を添加し、そして37℃、5% CO2でインキュベートした。インキュベーション期間後、血清及び抗生物質を復活させ、そして細胞を通常条件において、LAT1活性又はLAT1発現の評価(免疫ブロッティング及びRT-qPCR)まで、所望の期間、更にインキュベートした。
【０１５４】
ASCT2遺伝子サイレンシング
細胞を、24ウェル(Sarstedt社、ドイツ)、又は6ウェルプレート(Sarstedt社、ドイツ)、又は壁面が黒色で底部が透明な96ウェルプレート(BD Biosciences社、米国)に蒔き、そして通常の成長条件下で24時間インキュベートした。ASCT2に対するsiRNA及びトランスフェクション剤を所望の濃度に稀釈し、そしてトランスフェクション剤製造業者の指示に従って混合した。siRNA-複合体形成のために、混合物を室温で20分間インキュベートし、その後、それに細胞を添加し、そして37℃、5% CO2でインキュベートした。インキュベーション期間後、血清及び抗生物質を復活させ、そして細胞を通常条件において、ASCT2活性又はASCT2発現の評価(免疫ブロッティング及びRT-qPCR)まで、所望の期間、更にインキュベートした。
【０１５５】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖を、カルセイン-AM(Thermo Fisher Scientific社、米国)を使用して測定した。膜透過性のカルセイン-AMは非蛍光色素であり、それが取り込まれ、そして細胞内エステラーゼにより膜不透過性カルセインに変換されると、緑色蛍光を発する。細胞を壁面が黒色で底部が透明な96ウェルプレート(BD Biosciences社、米国)に蒔き、そして通常の成長条件下で24時間インキュベートした。細胞を、試験品と共に37℃、5% CO2でインキュベートした。インキュベーション期間後、血清及び抗生物質を復活させ、そして細胞を通常条件において、72時間更にインキュベートした。試験物質又はビヒクルにより処置した後、細胞をハンクス培地で2回洗浄し、そして2μMカルセイン-AMを含むハンクス培地と共に、37℃で30分間負荷した。マイクロプレート分光蛍光光度計(Gemini EM、Molecular Devices社)において、485nm励起波長及び530nm発光波長で蛍光を測定した。1ウェル当たり9回の連続した蛍光測定を実施して、ウェルの全エリア内の蛍光読み取りを可能にし、次に1ウェル当たりの平均蛍光を計算するための検討対象とした。カルセインの最低染色(カルセインmin)を決定するために、カルセイン-AMを添加する30分前に8ウェルをエタノールで処理した。[(カルセイン試料)/(カルセイン対照)]×100として細胞数の割合を計算する。
【０１５６】
動物及び腫瘍移植
ヒト結腸がんHTC-116細胞を組織培養中で増殖させ、マウス1匹当たり107個の細胞をメスのNMRI nu/nuマウスの後部側腹部内に注射した。腫瘍が発現し、そして腫瘍容積がランダム化の基準に達したら、治療を、1日1回の腫瘤内注射で1日おきに開始する。ビヒクル処置群を対照として試験に含めた。Charles River社のメス免疫不全NMRI nu/nuマウスを使用した。4〜6週齢の動物を入手し、少なくとも1週間の隔離後に移植用として使用する。全ての動物への介入は、欧州指令番号86/609、及び「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」、7th edition, 1996, Institute for Laboratory Animal Research (ILAR)、Washington, DCの規則に基づき実施した。明らかに健康な動物のみを選択して、試験手順に組み入れた。実験期間中、少なくとも1日1回、動物をモニタリングした。各ケージを、動物の起源、性別、及び入手日を示す記録カードで表示した。腫瘍移植期間中又は用量探索実験の開始時に、動物の番号付けを行った。
【０１５７】
腫瘍容積を、ランダム化の当日(0日目)、次に1週間に2回、ノギスを用いた2次元測定により測定した。腫瘍容積を、下式に従って計算した:
腫瘍容積[mm3] = a [mm]×b2 [mm2]×0.5
式中、理想的な楕円体を呈する腫瘍の、「a」は最大径、及び「b」は直角方向の直径である。
【０１５８】
下式に示すように、X日目の各腫瘍の絶対容積[mm3](Tx)を、ランダム化当日、すなわち0日目の同一の腫瘍の絶対容積(T0)で割り算し、それを100倍することにより、X日目の個々の腫瘍の相対的容積(RTVx)を計算した:
【０１５９】
【数１】
2019517819.tif 000012
【０１６０】
RTVは、以下のように、増殖の特徴付け及び化合物の活性評定で使用した:
【０１６１】
【表５】
2019517819.tif 000013
【０１６２】
RTVの群メジアン及び範囲(或いは、幾何平均±SEM)を、所定の日に生存した動物の腫瘍のみを考慮して計算した(メジアンについて)。群メジアン(幾何平均)RTVを、腫瘍成長曲線を作図するのに、及び処置を評価するのに使用した。
【０１６３】
下式に示すように、特定日の腫瘍阻害(T/Cx)を、試験群のメジアンRTVと対照群のメジアンRTVから、それを100倍して計算した:
【０１６４】
【数２】
2019517819.tif 000014
【０１６５】
実験期間中に特定の群について記録された最適/最低/最良のT/C[%]値は、各処置の最大抗腫瘍活性を表し、また以下のように評定される:
【０１６６】
【表６】
2019517819.tif 000015
【０１６７】
腫瘍容積2倍/4倍増加時間(DT/QT)は、メジアンRTVが初期の腫瘍容積の200%/400%に達するのに群が要する時間(日数)として定義される。成長遅延は、試験群及び各対照群について、その腫瘍容積が2倍に増加する時間と4倍に増加する時間の間の日数の差異として定義される。
【０１６８】
非ウイルス性送達siRNAシステム
1. siRNA-LAT1治療薬剤を担持するリポソームは、標的細胞膜を通過してカーゴを送達する能力を有する。多数の脂質が、siRNAの送達で使用されるリポソームの合成に利用可能である。siRNA-LAT1と複合体形成可能な中性脂質として、DOPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン)、卵のPC(ホスファチジルコリン)、DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン)、及びDPPE(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)を挙げることができる。
【０１６９】
2. siRNA-LAT1と複合体形成可能なカチオン性脂質として、DOTAP(1,2-ジオレイ(dioley)-3-トリメチルアンモニウムプロパン)、CDAN(N(1)-コレステリルオキシカルボニル-3,7-ジアザノナン-1,9-ジアミン)/DOPE、DC-Chol(3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール)/DOPE、DOTAP/DOPE、カチオン性脂質RPR209120(2-(3-[ビス-(3-アミノ-プロピル)-アミノ]-プロピルアミノ)-N-ジテトラデシルカルバモイルメチルアセトアミド)を挙げることができる。ガラクトシル化(Gal-C4-Chol/DOPE)リポソーム/siRNA-LAT1複合体もまた、遺伝子サイレンシングを誘導することができる。
【０１７０】
3.カチオン性ポリマーも、siRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2の送達で使用可能である。これらの物質をアニオン性のsiRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2と組み合わせると、siRNA-LAT1-ポリマー複合体又はsiRNA-ASCT2-ポリマー複合体が形成され、複合体のカチオン性部分を介して負に荷電した細胞表面と相互作用することができる。利用可能なポリマーの中でも、ポリエチレンイミン(PEI)は、負に荷電したsiRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2に強く結合する能力を有する。生分解性ポリマー、例えば、ポリ(L-リジン)(PLL)等は、PEIよりも毒性が低く、また生体適合性が高いことが公知である。PLLの誘導体であるポリ[α-(4-アミノブチル)-L-グリコール酸]は、オリジナルのPLLポリマーよりも高いトランスフェクション効率、及び低い免疫原性及び細胞傷害性を示し、siRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2と共に使用可能である。
【０１７１】
4.カチオン化ゼラチンミクロスフェアは、油中水型エマルジョン状態でゼラチンを化学的に架橋することにより調製され得る。カチオン化ゼラチンミクロスフェア内を、siRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2発現プラスミドDNAで満たすために、siRNA-LAT1発現プラスミドDNAを含有するPBSを凍結乾燥カチオン化ゼラチンミクロスフェア上に滴下し、次に4℃で24時間保つことができる。
【０１７２】
5.キトサンとトリポリリン酸(TPP)との修飾されたイオンゲル化に基づき、ナノ粒子を製造することができる。異なる2タイプのキトサン(キトサン塩酸塩及びグルタミン酸塩)、及び2つの異なる分子量を有する各タイプが使用可能である。ナノ粒子は、一定のマグネット撹拌下、室温で、TPP水溶液をキトサン溶液に添加すれば自然に取得され得る。粒子は、次に室温でインキュベートした後、使用又は更に分析することができる。ナノ粒子を遠心分離により収集する。上清を廃棄し、そしてナノ粒子を濾過済みの蒸留水中で再懸濁する。siRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2とキトサン-TPPナノ粒子との会合(キトサン-TPP-siRNA-LAT1又はキトサン-TPP-siRNA-ASCT2)では、2回蒸留水中のsiRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2をTPP溶液に添加した後に、これをキトサン溶液に一定のマグネット撹拌下、室温で滴状添加する。粒子を次に室温でインキュベートした後に、使用又は更に分析する。
【０１７３】
6.キトサン(114kDa)を酢酸ナトリウムバッファーに溶解して、0.2〜1mg/mlの範囲の作業溶液を得た。20マイクロリッターのsiRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2(20〜250μmの範囲)を、1mlの濾過済みのキトサンに撹拌しながら添加し、そして1時間放置した。特定比N:P (キトサンアミノ基/RNAリン酸基のモル比として定義される)を計算するにあたり、RNAについてリン酸塩1分子当たり325Daの質量、及びキトサン(84%脱アセチル化)について167.88の質量電荷比(mass per charge)を使用した。
【０１７４】
7.siRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2は、安定な核酸脂質粒子(SNALP)内にカプセル化可能であり、また静脈内注射により投与可能である。SNALP製剤には、脂質3-N-[(ω-メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシ-プロピルアミン(PEG-DMA)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパノン(DLinDMA)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、及びコレステロールが含まれた。
【０１７５】
8. siRNA-LAT1又はsiRNA-ASCT2は、Injectin In Vivo SiRNa Delivery Reagent (BioCellChallenge SAS社、Toulon、フランス)内にカプセル化可能であり、また静脈内注射により投与可能である。注射用製剤には下記の混合物が含まれた: 10μgのsiRNAを含むグルコース含有バッファー10μL、無菌のRNaseを含まない水40μL、Injectin試薬10μL。混合物は、上下にピペット吸引することにより混合し、そして室温で15分間インキュベートした後に注射すべきである。
【実施例１】
【０１７６】
ヒトがん細胞におけるLAT1及びASCT2の免疫ブロッティング
LAT1タンパク質及びASCT2タンパク質の存在を、LAT1及びASCT2に対して生じた抗体を使用する免疫ブロッティングによって試験した。図1に示すように、LAT1及びASCT2に対して生じた抗体は、全てのがん細胞株においてLAT1及びASCT2の存在を認識した。
【実施例２】
【０１７７】
ヒトがん細胞におけるLAT1及びASCT2遺伝子の発現
LAT1 mRNA及びASCT2 mRNAの存在を、ASCT2に対するプライマーを使用してリアルタイムPCRにより試験した。図2に示すように、ハウスキーピング遺伝子GADPHと比較したLAT1及びASCT2の遺伝子発現が、全てのがん細胞株において判明した。
【実施例３】
【０１７８】
[14C]-L-ロイシン及び[14C]-L-アラニンの取り込み
図3A〜図3Dに示すように、上皮癌腫細胞内への初期の取り込み速度(1分)におけるナトリウム非依存性[14C]-L-ロイシン(0.25mM)の取り込みは、3mM非標識L-ロイシンにより有意に(P<0.001)低下した。図3E〜図3Hに示すように、上皮癌腫細胞内への初期の取り込み速度(1分)におけるナトリウム依存性[14C]-L-アラニン(0.25mM)の取り込みは、3mM非標識L-アラニンにより有意に(P<0.01)低下した。
【実施例４】
【０１７９】
ヒトがん細胞におけるLAT1及びASCT2遺伝子の発現
図4Aに示すように、ヌクレオチド配列番号6、22、34、58、及び61に対するsiRNA-LAT1 (例えば、配列番号110、126、138、162、及び165をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、24時間における肝癌SK-HEP-1細胞内LAT1 mRNAの相対的存在量が減少した。ヌクレオチド配列番号58に対するsiRNA-LAT1の効果は、配列番号34を有するヌクレオチドよりも有意に大きかった(p<0.05)。図4Bに示すように、ヌクレオチド配列番号225、237、267、及び278に対するsiRNA-ASCT2 (例えば、配列番号314、326、356、及び367を含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、24時間における肝癌SK-HEP-1細胞内ASCT2 mRNAの相対的存在量が減少した。ヌクレオチド配列番号278に対するsiRNA-ASCT2の効果は、配列番号267を有するヌクレオチドよりも有意に大きかった(p<0.05)。
【実施例５】
【０１８０】
[14C]-L-ロイシン及び[14C]-L-アラニンの取り込み
図5A及び図5Cに示すように、ヌクレオチド配列番号6、22、34、58、及び61に対するsiRNA-LAT1(例えば、配列番号110、126、138、162、及び165をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、24時間及び48時間において、初期の取り込み速度(1分)における肝癌SK-HEP-1細胞内への[14C]-L-ロイシン(0.25mM)の取り込みが減少した。ヌクレオチド配列番号58に対するsiRNA-LAT1効果は、配列番号34を有するヌクレオチドよりも有意に大きかった(p<0.05)。図5B及び図5Dに示すように、ヌクレオチド配列番号225、237、267、及び278に対するsiRNA-ASCT2(例えば、配列番号314、326、356、及び367を含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、24時間及び48時間において、初期の取り込み速度(1分)における肝癌SK-HEP-1細胞内への[14C]-L-ロイシン(0.25mM)の取り込みが、24時間について減少した。
【実施例６】
【０１８１】
siRNA-LAT1及びsiRNA-ASCT2の修飾
ヌクレオチド配列番号58及び61に対するsiRNA-LAT1(例えば、配列番号162及び165をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)を図6に示す。(ヌクレオチド配列番号58、58t、58s1、58s2、61、61t、61s1、及び61s2に対する5' DNAセンス、5'センスsiRNA、及び3'アンチセンスsiRNA-LAT1)。ヌクレオチド配列番号267及び278に対するsiRNA-ASCT2(例えば、配列番号356及び367をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)を図7に示す。ヌクレオチド配列番号267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1、及び278s2に対する5' DNAセンス、5'センスsiRNA、及び3'アンチセンスsiRNA-ASCT2。
【実施例７】
【０１８２】
[14C]-L-ロイシン及び[14C]-L-アラニンの取り込み
図8Aに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号58、61、58t、61tに対するsiRNA-LAT1、及び市販のSI31011000で細胞を6時間処置すると、48時間において、初期の取り込み速度(1分)における線維肉腫HT-1080細胞内への[14C]-L-ロイシン(0.25mM)の取り込みが減少した。図8Bに示すように、ヌクレオチド配列番号267、278、267t、及び278tに対するsiRNA-ASCT2(例えば、配列番号356、367を含む又はそれらからなるsiRNA、或いはセンス鎖として配列番号399及びアンチセンス鎖として配列番号400、又はセンス鎖として配列番号405及びアンチセンス鎖として配列番号406をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)、及び市販のSI00097930で細胞を6時間処置すると、48時間において、初期の取り込み速度(1分)における線維肉腫HT-1080細胞内への[14C]-L-アラニン(0.25mM)の取り込みが減少した。ヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2の効果は、配列番号267tを有するヌクレオチドよりも有意に大きかった(p<0.05)。
【実施例８】
【０１８３】
ヒトがん細胞におけるLAT1及びASCT2遺伝子の発現
図9A及び図9Cに示すように、ヌクレオチド配列番号58、61、58t、及び61tに対するsiRNA-LAT1(例えば、siRNA配列番号162、165を含む又はそれらからなる、或いはセンス鎖として配列番号387及びアンチセンス鎖として配列番号388、又はセンス鎖として配列番号393及びアンチセンス鎖として配列番号394をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、24時間又は48時間において、ヒト結腸がんHTC-116細胞内LAT1 mRNAの相対的存在量が減少した。図9B及び図9Cに示すように、ヌクレオチド配列番号267、278、267t、及び278tに対するsiRNA-ASCT2(例えば、配列番号356、367を含む又はそれらからなるsiRNA、或いはセンス鎖として配列番号399及びアンチセンス鎖として配列番号400、又はセンス鎖として配列番号405及びアンチセンス鎖として配列番号406をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、24時間又は48時間において、ヒト結腸がんHTC-116細胞内ASCT2 mRNAの相対的存在量が減少した。
【実施例９】
【０１８４】
ヒトがん細胞におけるLAT1遺伝子の発現
図10A及び図10Bに示すように、ヌクレオチド配列58tに対するsiRNA-LAT1(例えば、センス鎖として配列番号387及びアンチセンス鎖として配列番号388を含む又はそれらからなるsiRNA)で細胞を6時間処置すると、トランスフェクティング剤として0.5%リポフェクトアミン2000(登録商標)、リポフェクトアミンRNAiMAX(登録商標)、又はInjectin(登録商標)を使用したとき、72時間において、ヒト結腸がんHTC-116細胞内LAT1 mRNAの相対的存在量が濃度に依存して減少した。
【実施例１０】
【０１８５】
ヒト結腸がんHTC-116細胞の細胞増殖、トランスフェクション剤、及び陰性対照
図11Aに示すように、0.5%のリポフェクトアミン2000(登録商標)を72時間用いてヒト結腸がんHTC-116細胞を6時間処置しても、細胞増殖に影響を及ぼさなかった。対照的に、図11Bに示すように、Injectin(登録商標)を用いてヒト結腸がんHTC-116細胞を処置すると、0.1%、0.113、及び0.115%のとき、72時間において細胞増殖に対して統計的に有意な影響を確かに及ぼした。Injectinは、脂質に基づくsiRNAトランスフェクション剤である。製造指示書では、Injectin試薬の容積が総複合混合物の20%に対応する場合、Injectin(登録商標)試薬1μL当たりsiRNA 1μg(1:1の比)での使用を推奨する。In vivoアッセイでは、siRNA:Injectin(登録商標)複合体を、生産者の勧告通りに調製した。In vitroアッセイでは、使用したsiRNA濃度は小規模スケール化され、したがってInjectin(登録商標)の総siRNA:Injectin(登録商標)複合混合物に占める割合を20%に維持することは不可能であった。そのような理由から、siRNA複合体形成の有効性及びsiRNA:Injectin(登録商標)トランスフェクション効率を、複合混合物中におけるパーセントが異なるInjectin(登録商標)を使用して評価した。siRNA:Injectin(登録商標)複合体の電気泳動より、siRNA:Injectin(登録商標)の比が1:1であり、かつ複合混合物内のInjectin(登録商標)の割合が0.9%よりも高いとき、siRNAは完全に複合体形成することが明らかになった(図12A)。しかし、siRNA:Injectin(登録商標)の比が1:1に維持されても、複合混合物中のInjectin(登録商標)の量が0.2%に等しい又はそれ未満のとき、siRNAの複合体形成は有効ではない(図12B)。このデータは、複合体内のInjectin(登録商標)の割合が0.2%未満のとき、Injectin(登録商標) 1μL当たりsiRNA 1μgの推奨比はもはや有効でないことを示唆している。したがって、より効率的なsiRNA:Injectin(登録商標)複合体を得るためには、siRNA 1μg当たりのInjectin(登録商標)の量を増やす必要がある。同様に、siRNAトランスフェクション混合物中のInjectin(登録商標)の量が増加するほど、siRNA:Injectin(登録商標)複合体のトランスフェクションの有効性が増強されることから明らかなように、複合混合物中のInjectin(登録商標)の量を増やせば、siRNA配列が細胞増殖に及ぼす効果が増強する(図15)。図13に示すように、トランスフェクティング剤としてInjectin(登録商標)(0.075及び0.1%)、又はリポフェクトアミン2000(0.25%)を使用して72時間曝露したとき、陰性対照である市販siRNA(QIAGEN社より)配列NC-SI03650318及びNC-SI03650325がヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に及ぼす影響は有意ではなかった。
【実施例１１】
【０１８６】
ヒト結腸がんHTC-116細胞の細胞増殖
図14Aに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号6、22、34、58、58t、58s1、58s2、61、61t、61s1、61s2に対するsiRNA-LAT1、及び3つの市販siRNA(QIAGEN社、Thermofisher Scientific社、及びSigma-Aldrich社より、それぞれSI31011000、HSS112005、及びSASI_Hs01_00103513)で細胞を6時間処置すると、トランスフェクティング薬剤として0.1% Injectin(登録商標)を使用して72時間曝露したときに細胞増殖が減少した。ヌクレオチド配列番号58に対するsiRNA-LAT1が及ぼす効果は、配列番号34を有するヌクレオチドよりも有意に大きく(p<0.05)、またヌクレオチド配列番号58s1及び58s2に対するsiRNA-LATが及ぼす効果は、配列番号58を有するヌクレオチドよりも有意に大きかった(p<0.05)。図14Bに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1、278s2に対するsiRNA-ASCT、及び1つの市販siRNA(QIAGEN社よりSI00097930)で細胞を6時間処置すると、トランスフェクティング剤として0.1% Injectin(登録商標)を使用して72時間曝露したとき、細胞増殖が減少した。ヌクレオチド配列番号267t及び267s2に対するsiRNA-ASCT2が及ぼす効果は、配列番号267を有するヌクレオチドよりも有意に大きく(p<0.05)、またヌクレオチド配列番号278s1及び278s2に対するsiRNA-ASCT2が及ぼす効果は、配列番号278を有するヌクレオチドよりも有意に大きかった(p<0.05)。
【０１８７】
図15Aに示すように、ヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1(例えば、センス鎖として配列番号387及びアンチセンス鎖として配列番号388を含む又はそれらからなるsiRNA)で、並びに図15B及び図15Cに示すように、ヌクレオチド配列番号267t及び278tに対するsiRNA-ASCT2(例えば、センス鎖として配列番号399及びアンチセンス鎖として配列番号400、又はセンス鎖として配列番号405及びアンチセンス鎖として配列番号406をそれぞれ含む又はそれらからなるsiRNA)で、それぞれ細胞を6時間処置すると、72時間曝露したときに細胞増殖が減少したが、siRNA:Injectin(登録商標)複合体内のInjectin(登録商標)濃度が高いほどより多く減少した。これは、ヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1、及びヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2について特に明白であった。
【実施例１２】
【０１８８】
細胞傷害性抗新生物剤存在下でのヒト結腸がんHTC-116細胞の細胞増殖
図16に示すように、細胞傷害性抗新生物剤5-フルオルウラシル(5-FU; 3及び10μM)、シスプラチン(Cisp; 3及び10μM)、及びオキサリプラチン(Oxa; 1及び3μM)を単独使用して72時間曝露したときに、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に及ぼす効果は、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1と組み合わせると濃度に依存していずれも有意に増強した。図17Aに示すように、細胞傷害性抗新生物剤5-フルオルウラシル(5-FU; 10μM)を単独使用して72時間曝露したときに、ヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に及ぼす効果は、本明細書で定義するヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1により増強したが、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号61tに対するsiRNA-LAT1によっては増強しなかった。同様に、図17Bに示すように、細胞傷害性抗新生物剤5-フルオルウラシル(5-FU; 10μM)と、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2による効果の増強は、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号267tに対するsiRNA-ASCT2による効果の増強よりも顕著であった。
【実施例１３】
【０１８９】
抗LAT1 siRNA及び抗ASCT2 siRNA存在下でのヒト結腸がんHTC-116細胞の細胞増殖
図18Aに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1により、72時間曝露時のヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖は有意に減少したが、その減少は、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2により、非有効条件(0.037% Injectin(登録商標))においても増強した。同様に、図18Bに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1により、72時間曝露時のヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖に対して有意な効果がもたらされるが、その効果は、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号267tに対するsiRNA-ASCT2により、非有効条件(0.037% Injectin(登録商標))においても増強した。
【実施例１４】
【０１９０】
抗LAT1 siRNA及び抗ASCT2 siRNA存在下でのLAT1及びASCT2遺伝子の発現及びヒト結腸がんHTC-116細胞の細胞増殖
図19Aに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号58、58t、58s1、61、61t、61s1に対するsiRNA-LAT1、及び2つの市販siRNA(QIAGEN社及びThermofisher Scientific社より、それぞれSI31011000及びHSS112005)で細胞を6時間処置すると、ヒト結腸がんHTC-116細胞内のLAT1 mRNAの相対的存在量は有意に減少したが、この減少は、ヌクレオチド配列番号58t及び58s1に対するsiRNA-LAT1で明白であった。図19Bに示すように、本明細書に記載するようなヌクレオチド配列番号58、58t、58s1、61、61t、61s1に対するsiRNA-LAT1、及び2つの市販siRNA(QIAGEN社及びThermofisher Scientific社より、それぞれSI31011000及びHSS112005)で細胞を6時間処置すると、72時間においてヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖は有意に減少したが、この減少は、ヌクレオチド配列番号58、58t、及び58s1に対するsiRNA-LAT1で明白であった。
【０１９１】
図20Aに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号267、267t、2678s1、278、278t、278s1に対するsiRNA-ASCT2、及び1つの市販siRNA(QIAGEN社よりSI00097930)で細胞を6時間処置すると、ヒト結腸がんHTC-116細胞内のASCT2 mRNA相対的存在量は有意に減少したが、この減少は、ヌクレオチド配列番号267t及び278tに対するsiRNA-LAT1で明白であった。図20Bに示すように、本明細書に記載するヌクレオチド配列番号267、267t、2678s1、278、278t、278s1に対するsiRNA-ASCT2、及び1つの市販siRNA(QIAGEN社よりSI00097930)で細胞を6時間処置すると、72時間におけるヒト結腸がんHTC-116細胞の増殖は有意に減少したが、この減少は、ヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2で明白であった。
【実施例１５】
【０１９２】
異種移植腫瘍モデルにおけるLAT1及びASCT2免疫ブロッティング
LAT1タンパク質及びASCT2タンパク質の存在を、LAT1及びASCT2に対して生じた抗体を使用する免疫ブロッティングによって試験した。図21に示すように、LAT1及びASCT2に対して生じた抗体は、ヒト結腸がんHTC-116細胞に由来する両腫瘍(T1及びT2)内のLAT1及びASCT2の存在を認識した。
【実施例１６】
【０１９３】
ヒトがん細胞におけるLAT1及びASCT2遺伝子の発現
LAT1 mRNA及びASCT2 mRNAの存在を、LAT1及びASCT2に対するプライマーを使用して、リアルタイムPCRにより試験した。図22に示すように、LAT1及びASCT2遺伝子の発現が、ハウスキーピング遺伝子GADPHとの比較において、ヒト結腸がんHTC-116細胞に由来する両腫瘍(T1及びT2)において見出された。
【実施例１７】
【０１９４】
腫瘍の成長
図23に示すのは、ヒト結腸がんHTC-116細胞を皮下注射し、そしてビヒクル(Injectin(登録商標))、又は本明細書に記載するヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1(10μg)、及びヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2(10μg)の腫瘍内注射(50μL)で一日おきに処置した、免疫欠損マウスで開発された異種移植腫瘍モデル内の相対的な腫瘍容積である。ヌクレオチド配列番号58tに対するsiRNA-LAT1(10μg)、及びヌクレオチド配列番号278tに対するsiRNA-ASCT2による相対的腫瘍容積の低下は統計的に有意であり、P値はそれぞれ0.0018及び0.0051であった。
【０１９５】
結論
LAT1及び/又はASCT2トランスポーターを発現するがん細胞を、siRNA-LAT1及び/又はsiRNA-ASCT2で処置すれば、LAT1タンパク質及び/又はASCT2タンパク質の減少、並びに[14C]-L-ロイシン取り込み及び[14C]-L-アラニン取り込みの減少を引き起こし、それに細胞増殖の減少が伴う。siRNA-LAT1及び/又はsiRNA-ASCT2により細胞生存率及びがん細胞増殖の減少が誘導され、それにヒト結腸がんHTC-116細胞のヌードマウス皮下腫瘍において証明されたように、アポトーシス、並びに腫瘍成長及び転移能力の低下が伴う。本発明の追加の態様は、当業者にとって明白である又は本発明の実践から学習され得る。
【０１９６】
本発明の目的及び長所は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段及び組合せによって実現及び達成され得る。
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019517819.tif 000032
【図８】
2019517819.tif 000033
【図９】
2019517819.tif 000034
【図１０】
2019517819.tif 000035
【図１１】
2019517819.tif 000036
【図１２】
2019517819.tif 000037
【図１３】
2019517819.tif 000038
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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