(57)【要約】  本開示は、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を処置するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬標的化ＰＡＢＰＮ１、これを含む組成物、およびＯＰＭＤに罹患したまたはその素因がある個体を処置するためのその使用に関する。
2019513395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むＲＮＡであって、前記ＲＮＡ転写物の前記領域が配列番号１〜３のいずれか１つに記載されるものである、ＲＮＡ。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、配列番号４、６または８に記載の配列から選択される配列を含む一本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
前記ＲＮＡが、以下からなる群から選択される二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項３に記載のＲＮＡ：
配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号４に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；
配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号６に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；ならびに
配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号８に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡが、以下からなる群から選択される、請求項３または請求項４に記載のＲＮＡ：
配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号５に記載のエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；
配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号７に記載のエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；および
配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号９に記載のエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、以下からなる群から選択される短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項３に記載のＲＮＡ：
配列番号１０に記載のエフェクター配列、および配列番号１０に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；
配列番号１２に記載のエフェクター配列、および配列番号１２に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
配列番号１４に記載のエフェクター配列、および配列番号１４に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【請求項７】
前記ｓｈＲＮＡが、以下からなる群から選択される、請求項６に記載のＲＮＡ：
配列番号１０に記載のエフェクター配列、および配列番号１１に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；
配列番号１２に記載のエフェクター配列、および配列番号１３に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
配列番号１４に記載のエフェクター配列、および配列番号１５に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【請求項８】
前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列を含む、請求項６または７に記載のＲＮＡ。
【請求項９】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号１６〜２１のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
【請求項１０】
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＲＮＡ；および
（ｂ）以下から選択される少なくとも１つのＲＮＡ：
（ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ；または
（ｉｉ）眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むＲＮＡ；
を含み、（ａ）の前記ＲＮＡと（ｂ）の前記ＲＮＡとが異なるエフェクター配列を含む、複数のＲＮＡ。
【請求項１１】
（ａ）配列番号１に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第１のＲＮＡ；
（ｂ）配列番号２に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第２のＲＮＡ；および
（ｃ）配列番号３に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第３のＲＮＡ
を含む、請求項１０に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１２】
（ａ）前記第１のＲＮＡが、配列番号４に記載の配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であり；
（ｂ）前記第２のＲＮＡが、配列番号６に記載の配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であり；
（ｃ）前記第３のＲＮＡが、配列番号８に記載の配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子である、
請求項１１に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１３】
（ａ）前記第１のＲＮＡが、配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号４に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含む二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり；
（ｂ）前記第２のＲＮＡが、配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号６に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡであり；
（ｃ）前記第３のＲＮＡが、配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号８に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡである、
請求項１１に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１４】
（ａ）前記第１のｄｓＲＮＡが、配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号５に記載のエフェクター相補配列、を含み；
（ｂ）前記第２のｄｓＲＮＡが、配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号７に記載のエフェクター相補配列、を含み；
（ｃ）前記第３のｄｓＲＮＡが、配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号９に記載のエフェクター相補配列、を含む、
請求項１３に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１５】
（ａ）前記第１のＲＮＡが、配列番号１０に記載のエフェクター配列、および配列番号１０に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含む短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり；
（ｂ）前記第２のＲＮＡが、配列番号１２に記載のエフェクター配列、および配列番号１２に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡであり；
（ｃ）前記第３のＲＮＡが、配列番号１４に記載のエフェクター配列、および配列番号１４に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡである、
請求項１１に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１６】
（ａ）前記第１のｓｈＲＮＡが、配列番号１０に記載のエフェクター配列、および配列番号１１に記載のエフェクター相補配列、を含み；
（ｂ）前記第２のｓｈＲＮＡが、配列番号１２に記載のエフェクター配列、および配列番号１３に記載のエフェクター相補配列、を含み；
（ｃ）前記第３のｓｈＲＮＡが、配列番号１４に記載のエフェクター配列、および配列番号１５に記載のエフェクター相補配列、を含む、
請求項１５に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１７】
前記ｓｈＲＮＡがそれぞれ前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列を含む、請求項１６に記載の複数のＲＮＡ。
【請求項１８】
前記ＲＮＡが短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１または６〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）構築物。
【請求項１９】
前記複数のＲＮＡがそれぞれ短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１０、１１または１５〜１７のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）構築物。
【請求項２０】
前記または各ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、
前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするＤＮＡ配列；および
３’末端にターミネーター配列
を含む、請求項１８または請求項１９に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２１】
前記ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１６〜２１のいずれか１つに記載の配列からなる群から選択される、請求項１８または２０に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１６または１７に記載の第１のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号１８または１９に記載の前記第２のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列；および
（ｃ）配列番号２０または２１に記載の前記第３のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列
を含む、請求項１９または２０に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２３】
ｓｈＲＮＡ配列をコードする前記または各ＤＮＡ配列の上流にＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２４】
前記ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターが、Ｕ６およびＨ１プロモーターから選択される、請求項２３に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２５】
（ａ）前記第１のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、前記第１のｓｈＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡ配列の上流にＵ６−１プロモーターを含み；
（ｂ）前記第２のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、前記第２のｓｈＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡ配列の上流にＵ６−９プロモーターを含み；
（ｃ）前記第３のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、前記第３のｓｈＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡ配列の上流にＨ１プロモーターを含む、
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２６】
配列番号２２または２３に記載の配列を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む、組成物。
【請求項２８】
前記ｄｄＲＮＡｉ構築物が発現ベクター内に含まれる、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
３つのＤＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）構築物を含む組成物であって、前記組成物が、
（ａ）以下を含む短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第１のｄｄＲＮＡｉ構築物：
（ｉ）配列番号１に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）前記エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列；
（ｂ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第２のｄｄＲＮＡｉ構築物：
（ｉ）配列番号２に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）前記エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列；および
（ｃ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第３のｄｄＲＮＡｉ構築物：
（ｉ）配列番号３に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）前記エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列
を含む、組成物。
【請求項３０】
（ａ）前記第１のｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ＤＮＡ配列によってコードされる前記ｓｈＲＮＡが以下：
（ｉ）配列番号１０に記載のエフェクター配列；および
（ｉｉ）配列番号１１に記載のエフェクター相補配列
を含み；
（ｂ）前記第２のｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ＤＮＡ配列によってコードされる前記ｓｈＲＮＡが以下：
（ｉ）配列番号１２に記載のエフェクター配列；および
（ｉｉ）配列番号１３に記載のエフェクター相補配列
を含み；
（ｃ）前記第３のｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ＤＮＡ配列によってコードされる前記ｓｈＲＮＡが以下：
（ｉ）配列番号１４に記載のエフェクター配列；および
（ｉｉ）配列番号１５に記載のエフェクター相補配列
を含む、
請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
各ｓｈＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡ配列が、
前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするＤＮＡ配列；および
前記ｓｈＲＮＡの３’末端のターミネーター配列
を含む、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）前記第１のｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ＤＮＡ配列によってコードされる前記ｓｈＲＮＡが、配列番号１６または１７に記載の配列を含み；
（ｂ）前記第２のｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ＤＮＡ配列によってコードされる前記ｓｈＲＮＡが、配列番号１８または１９に記載の配列を含み；
（ｃ）前記第３のｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ＤＮＡ配列によってコードされる前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２０または２１に記載の配列を含む、
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
各ｄｄＲＮＡｉ構築物が、前記ｓｈＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ配列の上流にＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
各ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターが、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ｄｄＲＮＡｉ構築物のそれぞれが、発現ベクター内に含まれる、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡまたは請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の複数のＲＮＡを含む組成物。
【請求項３６】
前記複数のＲＮＡによって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ｓｈＲＮＡによって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質が、配列番号２５に記載の配列を含む、請求項３６または請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が配列番号２４に記載のものである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が、発現ベクター内に含まれる、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ｄｄＲＮＡｉ構築物および前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が同じ発現ベクター内に含まれる、請求項２７に付加される場合、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ｄｄＲＮＡｉ構築物および前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が異なる発現ベクター内に含まれる、請求項２７に付加される場合、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
各ｄｄＲＮＡｉ構築物が異なる発現ベクター内に含まれ、前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が前記発現ベクターの少なくとも１つに含まれる、請求項２９に付加される場合、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ｄｄＲＮＡｉ構築物および前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸がそれぞれ異なる発現ベクター内に含まれる、請求項２９に付加される場合、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記または各発現ベクターがプラスミドである、請求項２８、３４または４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記または各発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、請求項２８、３４または４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記または各発現ベクターがカチオン性ＤＮＡ結合ポリマーと複合体化されている、請求項２８、３４または４０〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記カチオン性ＤＮＡ結合ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２７〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
対象における眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害する方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ、または請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ、または請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、または請求項２７〜４９のいずれか一項に記載の組成物、を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を、それに罹患している対象において処置する方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ、または請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ、または請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、または請求項２７〜４９のいずれか一項に記載の組成物、を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を、それに罹患している対象において処置する方法であって、前記方法が、対象に、
（ａ）ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの：（ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ；（ｉｉ）請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ；（ｉｉｉ）請求項１８〜３８のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクター；および（ｉｖ）請求項２８、３４または４０〜４９のいずれか一項に記載の組成物；ならびに
（ｂ）（ａ）において前記薬剤により発現される前記ｓｈＲＮＡで標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター
を投与することを含む、方法。
【請求項５３】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が配列番号２４に記載されるものである、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）の前記薬剤および（ｂ）の前記発現ベクターが一緒に、同時にまたは連続的に、対象に投与される、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
（ａ）ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの：（ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ；（ｉｉ）請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ；（ｉｉｉ）請求項１８〜３８のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクター；および（ｉｖ）請求項２８、３４または４０〜４９のいずれか一項に記載の組成物；ならびに
（ｂ）（ａ）において前記薬剤により発現される前記ｓｈＲＮＡで標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター
を含むキット。
【請求項５７】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記核酸が配列番号２４に記載されるものである、請求項５６または５７に記載のキット。
【請求項５９】
請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法に従ってＯＰＭＤを処置するために使用される場合、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年４月１４日出願の米国特許仮出願第６２／３２２，７４５号の優先権を主張し、その全内容を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
本開示は、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を処置するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬、これを含む組成物、およびＯＰＭＤに罹患したまたはその素因がある個体を処置するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＯＰＭＤは、常染色体優性遺伝性、遅進行性、遅発性の変性筋肉障害である。この疾患は、主に進行性の眼瞼の垂れ（眼瞼下垂）および嚥下困難（嚥下障害）を特徴とする。咽頭筋および下咽頭筋は、ＯＰＭＤにおける特異的な標的である。近位四肢の衰弱は、疾患進行の後期に続く傾向がある。この疾患を引き起こす突然変異は、ポリ（Ａ）結合タンパク質核１（ＰＡＢＰＮ１）遺伝子のコード領域における（ＧＣＮ）ｎトリヌクレオチド反復の異常な伸長である。この伸長は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質のＮ末端におけるポリアラニントラクトの伸長を導く：正常タンパク質中には１０個のアラニンが存在し、突然変異型（ｅｘｐＰＡＢＰＮ１）では１１〜１８個のアラニンに伸長する。疾患の主な病理学的特徴は、ｅｘｐＰＡＢＰＮ１の核内凝集体である。伸長したＰＡＢＰＮ１のミスフォールディングは、罹患細胞の核内に不溶性高分子線維凝集体の蓄積を生じる。ＰＡＢＰＮ１は凝集しやすいタンパク質であり、ＯＰＭＤ中の突然変異アラニン伸長ＰＡＢＰＮ１は野生型正常タンパク質よりも高い凝集速度を有する。しかし、ＯＰＭＤの核内凝集体が病理学的機能を有するのか、細胞の防御機構の結果として保護的役割を果たすのかは依然として不明である。
【０００４】
薬理学的またはその他の処置は現在ＯＰＭＤには利用できない。対症的外科的介入は中程度から重度の罹患した個体における眼瞼下垂を部分的に矯正し、嚥下を改善することができる。例えば、輪状咽頭筋切開術は、現在、これらの患者の嚥下を改善するために利用できる唯一の可能な処置である。しかし、これは、嚥下困難や窒息の後に死に至ることが多い、咽頭筋系の進行性劣化を矯正するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＯＰＭＤを処置するための治療薬が、それに罹患している患者および／またはＯＰＭＤがその素因がある患者において、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、部分的に、ＯＰＭＤの処置のための治療薬が現在存在しないという本発明者の認識に基づく。したがって、本開示は、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするＲＮＡｉ試薬を提供する。本発明者らは、これらのＲＮＡｉ試薬が、これがなければＯＰＭＤの原因である突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質、すなわち伸長ポリアラニントラクトを含むそのようなＰＡＢＰＮ１タンパク質に翻訳されるであろう転写変異体を含む、ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ転写物の転写後抑制に有効であることを示した。例えば、本開示の例示的ＲＮＡｉ試薬は、ＯＰＭＤのインビトロおよびインビボモデルの両方においてＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害または低下させることが示された。さらに、本開示は、本開示のＲＮＡｉ試薬（以下、「ＰＡＢＰＮ１置換試薬」）によって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現のための試薬を提供する。本発明者らは、本開示のＲＮＡｉ試薬と併用して投与される場合、ＰＡＢＰＮ１置換試薬は、ＲＮＡｉ試薬に耐性があり、機能的である転写物を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現することができることを示した。本発明者らによるこれらの知見は、ＯＰＭＤの処置において治療用途を有し得る試薬を提供する。
【０００７】
したがって、本開示は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むＲＮＡを提供し、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号１〜３のいずれか１つに記載される。好ましくは、エフェクター配列は、３０ヌクレオチド長よりも短い。例えば、好適なエフェクター配列は、１７〜２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【０００８】
エフェクター配列は、このエフェクター配列が実質的に相補的である配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列に対する６塩基対のミスマッチを含み得る。別の例では、エフェクター配列は、このエフェクター配列が実質的に相補的である配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列に対する５塩基対のミスマッチを含み得る。別の例では、エフェクター配列は、このエフェクター配列が実質的に相補的である配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列に対する４塩基対のミスマッチを含み得る。別の例では、エフェクター配列は、このエフェクター配列が実質的に相補的である配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列に対する３塩基対のミスマッチを含む。別の例では、エフェクター配列は、このエフェクター配列が実質的に相補的である配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列に対する２塩基対のミスマッチを含む。別の例では、エフェクター配列は、このエフェクター配列が実質的に相補的である配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列に対する１塩基対のミスマッチを含む。さらに別の例では、エフェクター配列は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列内の等価長の領域と１００％相補的である。
【０００９】
本開示のＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。例えば、一本鎖ＲＮＡは、以下からなる群から選択され得る：
エフェクター配列が配列番号５に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含むＲＮＡ；
エフェクター配列が配列番号７に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含むＲＮＡ；および
エフェクター配列が配列番号９に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含むＲＮＡ。
【００１０】
例えば、一本鎖ＲＮＡは、配列番号４、６または８に記載の配列から選択されるエフェクター配列を含み得る。
【００１１】
別の例では、ＲＮＡは、エフェクター配列に実質的に相補的なエフェクター相補配列をさらに含み得る。
【００１２】
例えば、本開示のＲＮＡは、以下からなる群から選択され得る：
（ｉ）エフェクター配列が配列番号５に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列、および（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的である配列を含むエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ；
（ｉ）エフェクター配列が配列番号７に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列、および（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的である配列を含むエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ；ならびに
（ｉ）エフェクター配列が配列番号９に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列、および（ｉｉ）エフェクター配列に実質的に相補的である配列を含むエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ。
【００１３】
別の例では、本開示のＲＮＡは、以下からなる群から選択され得る：
配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ；
配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ；ならびに
配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ。
【００１４】
例えば、本開示のＲＮＡのエフェクター相補配列は、同族のエフェクターおよびエフェクター相補配列が二本鎖を形成することができる限りにおいて、対応するエフェクター配列に対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのミスマッチを含み得る。
【００１５】
別の例では、本開示のＲＮＡは、以下からなる群から選択される：
配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号５に記載のエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ；
配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号７に記載のエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ；ならびに
配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号９に記載のエフェクター相補配列、を含むＲＮＡ。
【００１６】
したがって、本開示のＲＮＡは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の二本鎖または二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の形態で提供され得ることが理解されよう。
【００１７】
あるいは、本開示のＲＮＡは、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形態で提供され得る。ｓｈＲＮＡとして提供される場合、本開示のＲＮＡは、エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するループ配列を含み得る。好適なループ配列は、当技術分野で公知のものから選択され得る。例えば、本開示によるｓｈＲＮＡは、本明細書に記載されるエフェクター補体配列とエフェクター相補体配列との間のステムループ配列との任意の組み合わせを含み得る。
【００１８】
一例では、本開示のＲＮＡは、以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号１０に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むｓｈＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１２に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉ）配列番号１４に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【００１９】
一例では、本開示のＲＮＡは、以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号１０に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１１に記載のエフェクター相補配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むｓｈＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１２に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１３に記載のエフェクター相補配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉ）配列番号１４に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１５に記載のエフェクター相補配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【００２０】
例えば、本開示によるｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２１のいずれか１つに記載の配列を含み得る。
【００２１】
本開示によるＲＮＡが、ＯＰＭＤを処置するための他の治療剤と組み合わせ得るか、またはそれと併用され得ることは、当業者に理解されよう。したがって、本開示は、ＯＰＭＤを処置するための１つ以上の他の薬剤と組み合わせて、本明細書に記載のＲＮＡを提供する。一例では、以下を含む複数のＲＮＡが提供される：
（ａ）本明細書に記載の少なくとも１つのＲＮＡ；および
（ｂ）以下から選択される少なくとも１つのＲＮＡ：
（ｉ）本明細書に記載のＲＮＡ；または
（ｉｉ）ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むＲＮＡ；
ここで、（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含む。
【００２２】
一例では、（ｂ）のＲＮＡは、本明細書に記載のＲＮＡである。
【００２３】
一例では、本開示の複数のＲＮＡは、以下から選択される少なくとも２つのＲＮＡを含む：
（ａ）本明細書に記載の、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第１のＲＮＡ；
（ｂ）本明細書に記載の、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第２のＲＮＡ；および
（ｃ）本明細書に記載の、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第３のＲＮＡ。
【００２４】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つまたはそれぞれは、本明細書に記載のｓｓＲＮＡから選択されるｓｓＲＮＡである。例えば、本開示の複数のＲＮＡは、以下からなる群から選択される少なくとも２つのｓｓＲＮＡを含み得る：
（ａ）配列番号４に記載のエフェクター配列を含む第１のＲＮＡ；
（ｂ）配列番号６に記載のエフェクター配列を含む第２のＲＮＡ；および
（ｃ）配列番号８に記載のエフェクター配列を含む第３のＲＮＡ；
【００２５】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つまたはそれぞれは、本明細書に記載のｄｓＲＮＡから選択されるｄｓＲＮＡである。例えば、本開示の複数のＲＮＡは、以下からなる群から選択される少なくとも２つのｄｓＲＮＡを含み得る：
（ａ）配列番号４に記載のエフェクター配列、および配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号５に記載の配列、を含む第１のＲＮＡ；
（ｂ）配列番号６に記載のエフェクター配列、および配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号７に記載の配列、を含む第２のＲＮＡ；ならびに
（ｃ）配列番号８に記載のエフェクター配列、および配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号９に記載の配列、を含む第３のＲＮＡ。
【００２６】
別の例において、本明細書に記載の複数のＲＮＡ中の少なくとも１つまたはそれぞれのＲＮＡは、ｓｈＲＮＡの形態で存在し得る。本明細書に記載されるように、複数のｓｈＲＮＡはそれぞれ、ｓｈＲＮＡが単一の連続配列を形成するように、対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列を含む。例えば、本開示の複数のｓｈＲＮＡは、以下からなる群から選択される少なくとも２つのＲＮＡを含み得る：
（ａ）（ｉ）配列番号１０に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号１１に記載の配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含む第１のＲＮＡ；
（ｂ）（ｉ）配列番号１２に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号１３に記載の配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含む第２のＲＮＡ；ならびに
（ｃ）（ｉ）配列番号１４に記載のエフェクター配列、（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号１５に記載の配列、および（ｉｉｉ）エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含む第３のＲＮＡ。
【００２７】
本明細書に記載されるように、本開示の複数のＲＮＡは、本明細書に記載の第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含み得る。別の例において、本開示の複数のＲＮＡは、本明細書に記載の第１のＲＮＡおよび第３のＲＮＡを含む。別の例において、本開示の複数のＲＮＡは、本明細書に記載の第２のＲＮＡおよび第３のＲＮＡを含む。さらに別の例において、本開示の複数のＲＮＡは、本明細書に記載の第１のＲＮＡ、第２のＲＮＡおよび第３のＲＮＡを含む。
【００２８】
本開示による複数のＲＮＡは、２つのＲＮＡまたは３つのＲＮＡまたは４つのＲＮＡまたは５つのＲＮＡまたは６つのＲＮＡまたは７つのＲＮＡまたは８つのＲＮＡまたは９つのＲＮＡまたは１０のＲＮＡなどの１０までのＲＮＡを含み得る。一例では、複数のＲＮＡは、本明細書に記載のＲＮＡのうち２つを含む。別の例では、複数のＲＮＡは、本明細書に記載のＲＮＡのうち３つを含む。
【００２９】
複数のｓｈＲＮＡが提供される本開示の一例によると、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【００３０】
複数のｓｈＲＮＡが提供される本開示の一例によると、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【００３１】
複数のｓｈＲＮＡが提供される本開示の一例によると、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【００３２】
複数のｓｈＲＮＡが提供される本開示の一例によると、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【００３３】
一例では、本明細書に記載の複数のＲＮＡは、単一の組成物として一緒に提供されてもよい。
【００３４】
一例では、本明細書に記載の複数のＲＮＡは、複数の組成物として提供されてもよい。例えば、複数のＲＮＡのそれぞれを別々に提供してもよい。あるいは、複数のＲＮＡの少なくとも１つを別個に提供し、複数のうちの２つ以上を組成物中に一緒に提供してもよい。
【００３５】
本開示のＲＮＡまたはそのそれぞれは、核酸から転写され得るＤＮＡ指向性ＲＮＡ（ｄｄＲＮＡ）であり得る。したがって、本開示はまた、本開示のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含むＤＮＡ依存性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）構築物を提供し、例えば、ＲＮＡは、本明細書に記載のｓｈＲＮＡである。
【００３６】
ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。例えば、本開示のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１６〜２１のいずれか１つに記載の配列からなる群から選択され得る。一例では、本開示のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列はまた、３’末端にターミネーター配列を含み得る。
【００３７】
別の例において、本開示は、複数のｓｈＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示の複数のＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含む核酸を含み得、例えば、ＲＮＡはそれぞれ、本明細書に記載のｓｈＲＮＡである。
【００３８】
一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下からなる群より選択される少なくとも２つの核酸を含み得る：
（ａ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第１の核酸：
（ｉ）配列番号１に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列；
（ｂ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第２の核酸；
（ｉ）配列番号２に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列；および
（ｃ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第３の核酸；
（ｉ）配列番号３に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列。
【００３９】
一例では、第１の核酸内に含まれるＤＮＡ配列は、配列番号１０に記載のエフェクター配列および配列番号１１に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡ配列をコードする。
【００４０】
一例では、第２の核酸内に含まれるＤＮＡ配列は、配列番号１２に記載のエフェクター配列および配列番号１３に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡ配列をコードする。
【００４１】
一例では、第３の核酸内に含まれるＤＮＡ配列は、配列番号１４に記載のエフェクター配列および配列番号１５に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡ配列をコードする。
【００４２】
本明細書に記載のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むそれぞれの核酸は、同族のエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。
【００４３】
一例では、第１の核酸は、配列番号１６または１７に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４４】
一例では、第２の核酸は、配列番号１８または１９に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４５】
一例では、第３の核酸は、配列番号２０または２１に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４６】
本明細書に記載のｓｈＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含むことができる。
【００４７】
それぞれの核酸はまた、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端にターミネーター配列を含み得る。
【００４８】
一例では、複数のＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第１の核酸および本明細書に記載の第２の核酸を含む。一例では、複数のＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第１の核酸および本明細書に記載の第３の核酸を含む。一例では、複数のＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第２の核酸および本明細書に記載の第３の核酸を含む。一例では、複数のＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第１の核酸、本明細書に記載の第２の核酸、および本明細書に記載の第３の核酸を含む。
【００４９】
本開示の３つのｓｈＲＮＡを発現することができる例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
配列番号１６に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第１の核酸；
１８に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第２の核酸；
配列番号２０に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第３の核酸。
【００５０】
本明細書に記載のｓｈＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含み得る。
【００５１】
一例では、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のｓｈＲＮＡをコードする核酸またはそのそれぞれに機能し得るように連結された単一のプロモーターを含む。
【００５２】
別の例では、本開示のｓｈＲＮＡをコードする核酸はそれぞれ、別個のプロモーターに機能し得るように連結される。例えば、プロモーターは、ｓｈＲＮＡをコードするそれぞれのＤＮＡ配列の上流に位置する。複数のプロモーターを含むｄｄＲＮＡｉ構築物において、プロモーターは同一でも異なっていてもよい。例示的なプロモーターは、Ｕ６およびＨ１プロモーターなどの、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである。
【００５３】
本開示の３つのｓｈＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物の例によると、ｄｄＲＮＡｉ構築物は以下を含み得る：
（ａ）配列番号１６に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第１の核酸の上流のＵ６−１プロモーター；
（ｂ）配列番号１８に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第２の核酸の上流のＵ６−９プロモーター；および
（ｃ）配列番号２０に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む第３の核酸の上流のＨ１プロモーター。
【００５４】
一例では、本開示の３つのｓｈＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号２２に記載の配列を含む。一例では、本開示の３つのｓｈＲＮＡを発現することができるｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号２３に記載の配列を含む。
【００５５】
さらに別の例では、本開示は、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の少なくとも１つのｓｈＲＮＡを発現することができる。複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下からなる群から選択される少なくとも２つのｄｄＲＮＡｉ構築物を含み得る：
（ａ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む第１のｄｄＲＮＡｉ構築物：
（ｉ）配列番号１に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列；
（ｂ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む第２のｄｄＲＮＡｉ構築物：
（ｉ）配列番号２に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列；および
（ｃ）以下を含むｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む第３のｄｄＲＮＡｉ構築物：
（ｉ）配列番号３に記載のＰＡＢＰＮ１配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列；および
（ｉｉ）エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列。
【００５６】
一例では、第１のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１０に記載のエフェクター配列、および配列番号１１に記載のエフェクター相補配列、をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む。
【００５７】
一例では、第２のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１２に記載のエフェクター配列、および配列番号１３に記載のエフェクター相補配列、をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む。
【００５８】
一例では、第３のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１４に記載のエフェクター配列、および配列番号１５に記載のエフェクター相補配列、をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む。
【００５９】
複数のｄｄＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおいて、それぞれのｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、それぞれのエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。
【００６０】
一例では、第１のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１６または１７に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む。
【００６１】
一例では、第２のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１８または１９に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む。
【００６２】
一例では、第３のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号２０または２１に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む。
【００６３】
ｄｄＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおいて、核酸またはそのそれぞれはまた、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端にターミネーター配列を含み得る。
【００６４】
ｄｄＲＮＡｉ構築物から発現したｓｈＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えば、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含み得る。
【００６５】
一例では、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第１のｄｄＲＮＡｉ構築物および本明細書に記載の第２のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。一例では、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第１のｄｄＲＮＡｉ構築物および本明細書に記載の第３のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。一例では、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第２のｄｄＲＮＡｉ構築物および本明細書に記載の第３のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。一例では、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の第１のｄｄＲＮＡｉ構築物、本明細書に記載の第２のｄｄＲＮＡｉ構築物、および本明細書に記載の第３のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。
【００６６】
例示的な複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
配列番号１６に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む第１のｄｄＲＮＡｉ構築物；
配列番号１８に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む第２のｄｄＲＮＡｉ構築物；および
配列番号２０に記載のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む第３のｄｄＲＮＡｉ構築物。
【００６７】
複数のｄｄＲＮＡｉ構築物中のｄｄＲＮＡｉ構築物はそれぞれ、本開示のｓｈＲＮＡをコードする核酸またはそのそれぞれに機能し得るように連結されたプロモーターを含み得る。
【００６８】
複数のｄｄＲＮＡｉ構築物の１つ以上が１つより多いｓｈＲＮＡを発現することができる例によると、ｓｈＲＮＡをコードする核酸はそれぞれ別個のプロモーターに機能し得るように連結されていてもよい。例えば、プロモーターは、ｓｈＲＮＡをコードするそれぞれのＤＮＡ配列の上流に位置する。複数のプロモーターを含むｄｄＲＮＡｉ構築物において、プロモーターは同一でも異なっていてもよい。例示的なプロモーターは、Ｕ６およびＨ１プロモーターなどの、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである。
【００６９】
本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物またはそのそれぞれは、発現ベクター内に含まれ得る。
【００７０】
複数のｄｄＲＮＡｉ構築物が存在する例によると、ｄｄＲＮＡｉを含む複数の発現ベクターが提供され得る。一例では、複数の発現ベクターのうちの１つ以上は、本明細書に開示される複数のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。別の例では、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物はそれぞれ、別個の発現ベクター内に含まれる。この段落における前述の任意の方法において、複数の発現ベクターは、本開示に従って集合的に複数のｓｈＲＮＡを発現し得る。
【００７１】
本開示はまた、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクターおよび／または複数の発現ベクターを含む組成物を提供する。一例では、組成物はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含み得る。
【００７２】
一例では、本開示の組成物は、組成物中にｄｄＲＮＡｉ構築物によってコードされたｓｈＲＮＡまたはそのそれぞれ、によって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸をさらに含む。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質、例えば配列番号２５に記載の配列を有するものである。
【００７３】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、そこから転写されたｍＲＮＡが組成物中のｄｄＲＮＡｉ構築物によってコードされるｓｈＲＮＡまたはそのそれぞれ、によって標的化されないようにコドン最適化される。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、配列番号２４に記載の配列を含む。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまた、５’末端にコザック配列を含み得る。
【００７４】
本明細書に開示される機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、発現ベクター内に含まれる。
【００７５】
ｄｄＲＮＡｉ構築物またはそのそれぞれが単一の発現ベクター内に含まれる例によると、ｄｄＲＮＡｉ構築物および機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、同じ発現ベクター内に含まれ得る。あるいは、ｄｄＲＮＡｉ構築物（単数および複数）および機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、異なる発現ベクター内に含まれてもよい。
【００７６】
本開示の複数のｄｄＲＮＡｉ構築物が複数の発現ベクター内に含まれる例によると、それぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は異なる発現ベクター内に含まれ得、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、ｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクターの少なくとも１つの内に含まれ得る。
【００７７】
一例では、発現ベクターまたはそのそれぞれは、プラスミドまたはミニサークルである。
【００７８】
一例では、プラスミドもしくはそのそれぞれまたはミニサークルまたは発現ベクターまたはｄｄＲＮＡｉ構築物は、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマー、例えばポリエチレンイミンと複合体化される。
【００７９】
別の例では、発現ベクターまたはそのそれぞれは、ウイルスベクターである。例えば、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）およびレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群より選択される。
【００８０】
本開示は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の野生型ｍＲＮＡ転写物を標的とするものとして本明細書に記載される、ＲＮＡの１つまたは複数（例えば、ｓｈＲＮＡ）によって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸も提供する。一例では、本開示の核酸によってコードされる機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質の同一のアミノ酸配列、例えば配列番号２５に記載の配列を有し得る。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする本開示の核酸は、そこから転写されたｍＲＮＡが、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の野生型ｍＲＮＡ転写物を標的とするものとして本明細書に記載される１つ以上のＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡによって標的化されないように、コドン最適化されてもよい。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、配列番号２４に記載の配列を含む。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまた、５’末端にコザック配列を含み得る。本明細書に開示される機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、発現ベクター内に含まれ得る。発現ベクターは、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の文脈において本明細書に上記されるような任意の発現ベクターであり得る。本明細書で上記したように、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターはまた、本開示の１つ以上のｄｄＲＮＡｉ構築物を含み得る。
【００８１】
本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物と組み合わせて、またはすでにそれを用いた処置を受けている対象において、ＯＰＭＤを処置するのに有用であり得る。
【００８２】
本開示はまた、対象においてＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、対象に、本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物を投与することを含む。
【００８３】
本開示はまた、ＯＰＭＤをそれに罹患している対象において処置する方法を提供し、この方法は、対象に、本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物を投与することを含む。ＯＰＭＤを処置する方法は、本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を対象に投与することをさらに含み得る。
【００８４】
本開示はまた、ＯＰＭＤをそれに罹患している対象において処置する方法を提供し、この方法は、以前に本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物を投与されていた対象に、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を投与することを含む。本開示はまた、ＯＰＭＤをそれに罹患している対象において処置する方法を提供し、この方法は、対象に、以下を投与することを含む：
（ａ）ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの：（ｉ）本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物；ならびに
（ｂ）（ａ）において薬剤で標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
【００８５】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号２５に記載の配列を含む。
【００８６】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、そこから転写されたｍＲＮＡがＲＮＡｉを介して作用する（ａ）の薬剤によって標的化されないようにコドン最適化される。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、配列番号２４に記載の配列を含む。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまた、５’末端にコザック配列を含み得る。
【００８７】
１つの例において、（ａ）の薬剤および（ｂ）の発現ベクターは、一緒に対象に投与される。一例では、（ａ）の薬剤および（ｂ）の発現ベクターは、別々にしかし同時に対象に投与される。一例では、（ａ）の薬剤および（ｂ）の発現ベクターは、連続的に対象に投与される。
【００８８】
本開示はまた、以下を含むキットを提供する：
（ａ）ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの：（ｉ）本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物；ならびに
（ｂ）（ａ）において薬剤で標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
【００８９】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質、例えば配列番号２５に記載の配列を有するものである。
【００９０】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、そこから転写されたｍＲＮＡがＲＮＡｉを介して作用する（ａ）の薬剤によって標的化されないようにコドン最適化される。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、配列番号２４に記載の配列を含む。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまた、５’末端にコザック配列を含み得る。
【００９１】
一例では、キットは、本開示の方法における使用のための説明書をさらに含む。
【００９２】
本開示はまた、対象におけるＯＰＭＤを処置または予防するための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物の使用を提供する。
【００９３】
本開示はまた、対象におけるＯＰＭＤを処置または予防するための医薬の調製における、本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸の使用を提供する。この例によるＯＰＭＤの処置は、本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物から選択されるＲＮＡｉを介して作用する薬剤と組み合わせて対象に医薬を投与することを含み得、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡｉを介して作用する薬剤によって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する。別の例によると、ＯＰＭＤの処置は、本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物から選択されるＲＮＡｉを介して作用する薬剤をすでに投与されている対象に医薬を投与することを含み得、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡｉを介して作用する薬剤によって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する。
【００９４】
本開示はまた、対象におけるＯＰＭＤを処置または予防するための医薬の調製における、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターの使用を提供し、ここで医薬は本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物から選択されるＲＮＡｉを介して作用する薬剤を含み、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、薬剤によって標的化されていないｍＲＮＡ転写物を有する。
【００９５】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号２５に記載の配列を有する。
【００９６】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、そこから転写されたｍＲＮＡが薬剤によって標的化されないようにコドン最適化される。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、配列番号２４に記載の配列を含む。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまた、５’末端にコザック配列を含み得る。
【００９７】
前述の例のそれぞれにおいて、処置される対象は、ＯＰＭＤに罹患していてもよく、または遺伝的にＯＰＭＤに対する素因を有していてもよい。
【００９８】
本開示はまた、治療における使用のための本明細書に記載のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクター、組成物および／またはキットを提供する。例えば、ＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクター、組成物および／またはキットは、対象および／または本明細書に開示される方法においてＯＰＭＤを処置するために使用され得る。
【００９９】
本開示はまた、治療において使用するための本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を提供する。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、対象におけるＯＰＭＤの処置および／または本明細書に開示される方法において使用され得る。
【０１００】
本明細書に記載の任意の例によるＯＰＭＤの処置は、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質、すなわち、伸長したポリアラニントラクトを有するＰＡＢＰＮ１タンパク質の、対象における発現の減少または阻害の１つ以上を含み得る。あるいは、またはさらに、本明細書に記載の任意の例によるＯＰＭＤの処置は、本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を用いた対象におけるＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換を含み得る。例えば、置換ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列を含み得る。一例では、処置は、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を減少させまたは阻害し、対象において通常の長さのポリアラニン残基を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を置換する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】候補ｄｓＲＮＡ配列（ｄｓＲＮＡ１、ｄｓＲＮＡ２およびｄｓＲＮＡ３）をトランスフェクションした後の健常な（ＬＨＣＮＭ２）またはＯＰＭＤに感染した（ＫＭＯＰ６／４）ヒト筋芽細胞におけるヒトＰＡＢＰＮ１の発現レベルを示す。
【図２】ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡに対する単一およびトリシストロンｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶプラスミドによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＡＢＰＮ１ノックダウン効率を示す。ＰＡＢＰＮ１発現は、ＧＡＰＤＨ発現と比較して表された（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図３Ａ】（Ａ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（Ｂ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、（Ｃ）ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧまたは（Ｄ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現したＧＡＰＤＨタンパク質に対するＰＡＢＰＮ１タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。
【図３Ｂ】左から右へ、（ｉ）トランスフェクトされていない対照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｉｉ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｉｉｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｉｖ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５およびｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｖ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５およびｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｖｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｖｉｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔおよびｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｖｉｉｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔおよびｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｉｘ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｘ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および（ｘｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中の、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＡＢＰＮ１発現に対して正規化された平均ＰＡＢＰＮ１発現を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図３Ｃ】左から右へ、（ｉ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（ｉｉ）ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（ｉｉｉ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣおよびｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（ｉｖ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、（ｖ）ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、または（ｖｉ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現したＧＡＰＤＨタンパク質と比較した、Ｍｙｃタグ付きＰＡＢＰＮ１タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。
【図４Ａ】対照Ｈ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞および（Ａ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（Ｂ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇまたは（Ｃ）ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇでトランスフェクトしたＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞におけるＧＡＰＤＨタンパク質に対するＰＡＢＰＮ１タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。
【図４Ｂ】は、（Ｂ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、（Ｄ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３、（Ａ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、または（Ｃ）ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇでトランスフェクトしたＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞におけるＭｙｃタグ付きＰＡＢＰＮ１タンパク質のＧＡＰＤＨタンパク質に対するレベルを示すウェスタンブロットである。
【図４Ｃ】は、（ｉ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣ、（ｉｉ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（ｉｉｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、および（ｉｖ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣでトランスフェクトしたＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞におけるＧＡＰＤＨ発現（パーセンテージで表される）に対するＭｙｃタグ付きコドン最適化ＰＡＢＰＮ１発現の平均レベルを示す。
【図４Ｄ】（Ａ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（Ｃ）ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、（Ｂ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、または（Ｄ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇでトランスフェクトしたＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞におけるＧＡＰＤＨタンパク質と比較した、ＦＬＡＧタグ付き突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質（伸長ポリアラニントラクトを含む）のレベルを示すウェスタンブロットである。
【図４Ｅ】左から右へ、（Ａ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、（Ｂ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、（Ｃ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、または（Ｄ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇでトランスフェクトしたＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞におけるＧＡＰＤＨ発現（パーセンテージで表される）と比較した、ＦＬＡＧタグ付き突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質（伸長ポリアラニントラクトを含む）の平均レベルを示す。
【図５】（ｉ）生理食塩水で処置したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で処置したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、から摘出された前脛骨（ＴＡ）筋の（Ａ）質量、（Ｂ）特定力、および（Ｃ）最大等張力を示す。全ての筋肉測定は、注射後１８週間で行った。
【図６Ａ】（ｉ）生理食塩水で処置したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で処置したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、からの前脛骨（ＴＡ）筋におけるビンクリンタンパク質発現に対するＰＡＢＰＮ１タンパク質発現の平均レベルを示すウェスタンブロットである。
【図６Ｂ】図６Ａのウェスタンブロットのデンシオメトリック分析によって決定される、（ｉ）生理食塩水で処置したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で処置したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、からの前脛骨（ＴＡ）筋におけるＰＡＢＰＮ１タンパク質発現のレベルを示す。
【図６Ｃ】（ｉ）生理食塩水で処置したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で処置したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、からの前脛骨（ＴＡ）筋におけるビンクリンタンパク質発現に対するＭＹＣタンパク質発現の平均レベルを示すウェスタンブロットである。このウェスタンブロットは、ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣ単独またはｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇと組み合わせて処置した全ての筋肉でｍｙｃエピトープが検出されることを示す。矢印は正しい分子量で検出されたバンドを示す。
【図６Ｄ】ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣを単独で、またはｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇと組み合わせて注射後１８週のＡ１７マウスからの前脛骨（ＴＡ）筋で、図６（Ｃ）のウェスタンブロットのデンシオメトリック分析によって検出されたＭｙｃタグのレベルを示す。このグラフは、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣの両方を注射した筋肉で同時発現させた場合、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇはｏｐｔＰＡＢＰＮ１タンパク質量に影響しないことを示す。
【図７Ａ】（ｉ）生理食塩水で処置したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で処置したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、からの前脛骨（ＴＡ）筋の切片におけるＰＡＢＰＮ１の免疫蛍光組織化学およびラミニン検出を示す。切片を１Ｍ  ＫＣｌで前処理して、組織から全ての可溶性ＰＡＢＰＮ１を捨てた。ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇの処置した筋肉において、ＰＡＢＰＮ１陽性核内封入体（ＩＮＩ）の数が有意に減少する。全ての筋肉切片を注射後１８週間に採取した。
【図７Ｂ】（ｉ）生理食塩水で処置したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で処置したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７からの前脛骨（ＴＡ）筋の切片におけるＩＮＩ（パーセンテージで表される）を含有する核のレベルを示す。このグラフは、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、またはｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣのいずれかを用いた処置が、生理食塩水を注射したＡ１７筋肉に比べて、ＩＮＩ量をそれぞれ約１０％および５％へ減少させることを示す（ＣＮＦ＝３５％）（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｄｏｃ検定による一元Ａｎｏｖａ検定＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図８Ａ】（ｉ）生理食塩水を注射したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水を注射したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、から摘出した前脛骨（ＴＡ）筋のＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色切片の画像を示す。これらの画像は、Ａ１７筋肉における内因性ＰＡＢＰＮ１の枯渇が中心核形成線維の量を増加させる一方で、ｓｓＡＡＶ９−ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣの同時注射は、生理食塩水を注射したＡ１７筋肉で観察されるものと同じレベルまで中心核を有する線維の量を保存したことを示し、これは、コドン最適化ｈＰＡＢＰＮ１の同時発現が、筋肉変性を防止することを示す。全ての筋肉切片を注射後１８週間に採取した。
【図８Ｂ】（ｉ）生理食塩水を注射したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水を注射したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、から摘出した前脛骨（ＴＡ）筋の切片におけるコラーゲンＶＩの免疫染色の代表的な画像を提供する。全ての筋肉切片を注射後１８週間に採取した。
【図８Ｃ】（ｉ）生理食塩水を注射したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水を注射したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、から摘出した前脛骨（ＴＡ）筋の切片に対する中心核形成（ＣＮ）線維のパーセンテージを示す全ての筋肉切片を注射後１８週間に採取した。
【図８Ｄ】（ｉ）生理食塩水を注射したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水を注射したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、から摘出した前脛骨（ＴＡ）筋の切片におけるコラーゲンＶＩ陽性領域のパーセンテージを示す。このグラフは、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置した筋肉における線維症の有意な減少を示す。
【図８Ｅ】グループあたりの平均筋線維サイズを示し、ｓｓＡＡＶ９−ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣ単独またはｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇと併用して処置した筋肉の筋線維は、生理食塩水で処置した筋肉の筋線維よりも大きいことを示す（平均±ＳＥＭ  ｎ＝５〜８、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｄｏｃ検定を用いた一元Ａｎｏｖａ検定、またはカイ二乗分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない）。
【図８Ｆ】（ｉ）生理食塩水を注射したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水を注射したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇで処置したＡ１７、（ｉｖ）ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、および（ｖ）ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣで処置したＡ１７、から摘出した前脛骨（ＴＡ）筋切片の筋線維断面積（ＣＳＡ）分布を示す。カイ二乗分析による異なる群の比較は、生理食塩水のみを投与した動物と比較して、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ単独で、およびｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣと組み合わせて処置した筋肉の筋線維分布の変化を示す。
【０１０２】
配列表の一覧
配列番号１：ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ領域１と称されるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号２：ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ領域２と称されるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号３：ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ領域３と称されるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号４：それぞれｓｓＲＮＡ１およびｄｓＲＮＡ１と称される、ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５：ｄｓＲＮＡ１と称されるｄｓＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６：それぞれｓｓＲＮＡ２およびｄｓＲＮＡ２と称される、ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号７：ｄｓＲＮＡ２と称されるｄｓＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号８：それぞれｓｓＲＮＡ３およびｄｓＲＮＡ３と称される、ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号９：ｄｓＲＮＡ３と称されるｄｓＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１０：ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１１：ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１２：ｓｈＲＮＡ３およびｓｈＲＮＡ４と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１３：ｓｈＲＮＡ３およびｓｈＲＮＡ４と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１４：ｓｈＲＮＡ５およびｓｈＲＮＡ６と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１５：ｓｈＲＮＡ５およびｓｈＲＮＡ６と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１６：ｓｈＲＮＡ１と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号１７：ｓｈＲＮＡ２と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号１８：ｓｈＲＮＡ３と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号１９：ｓｈＲＮＡ４と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号２０：ｓｈＲＮＡ５と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号２１：ｓｈＲＮＡ６と称されるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号２２：ＯＰＭＤトリプル構築物短のＤＮＡ配列。
配列番号２３：ＯＰＭＤトリプル構築物長のＤＮＡ配列。
配列番号２４：ヒトコドン最適化ＰＡＢＰＮ１  ｃＤＮＡ配列のＤＮＡ配列。
配列番号２５：コドン最適化ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号２６：ヒトコドン最適化ＰＡＢＰＮ１  ｃＤＮＡ配列のＤＮＡ配列（Ｍｙｃ−タグを有する）。
配列番号２７：コドン最適化ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列（Ｍｙｃ−タグを有する）。
配列番号２８：突然変異型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のｃＤＮＡ配列（ＦＬＡＧタグを有する）。
配列番号２９：突然変異型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列（ＦＬＡＧタグを有する）。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
一般
本明細書を通じて、別段の記載がない限り、または文脈上他の意味を必要としない限り、単一のステップ、特性、組成物、ステップ群または特性群または複数組成物への言及は、１つおよび複数（すなわち、１つ以上）のそのようなステップ、特性、組成物、ステップ群または特性群または複数組成物を包含するものとする。
【０１０４】
当業者は本開示が具体的に記載されたもの以外の変形および改変が可能であることを理解するであろう。本開示はそのような全ての変形および改変を含むことを理解されたい。本開示はまた、個別にまたは集合的に、本明細書で言及または指示されるステップ、特徴、組成物および化合物の全て、および前記ステップまたは特徴の任意のおよび全ての組み合わせまたは任意の２つ以上を含む。
【０１０５】
本開示は、例示のみを目的とすることを意図した本明細書に記載の特定の例によって範囲が限定されるものではない。機能的に同等な製品、組成物および方法は、明らかに本開示の範囲内にある。
【０１０６】
本明細書の本開示のいずれの例も、他に特に記載のない限り、本開示のいずれの他の例についても準用するものとする。
【０１０７】
他に特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学において）。
【０１０８】
他に示さない限り、本開示において利用される組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。このような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ１および２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ１−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、およびＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全てのアップデートを含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全てのアップデートを含む）などを出典とする文献を通じて記載および説明される。
【０１０９】
本明細書を通して、文脈が他の意味を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載のステップもしくは要素もしくは整数またはステップもしくは要素もしくは整数の群を含むことを意味すると理解されるが、他のいずれのステップもしくは要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を除外するものではない。
【０１１０】
用語「および／または」、例えば「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」を意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に支持するために用いられるものとする。
【０１１１】
定義
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二重鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生されたＲＮＡなど）、ならびに、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、置換および／または変性による、天然に存在するＲＮＡとは異なる変性ＲＮＡ、を含む。そのような改変は、ＲＮＡの末端に、または内部的に、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおいて、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。本開示のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類縁体または天然に存在するＲＮＡの類縁体と称され得る。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡｉ試薬」は、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」を誘発することができるＲＮＡを指す。
【０１１３】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、一般に、細胞の細胞質中の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子および一本鎖短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）分子によって開始される遺伝子発現のＲＮＡ依存性サイレンシングを指す。ｄｓＲＮＡ分子またはｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、標的核酸配列の転写産物を減少または阻害し、それによって遺伝子をサイレンシングする。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、二本鎖構造を有し、互いに類似の長さのエフェクター配列およびエフェクター相補配列を含むＲＮＡ分子を指す。エフェクター配列およびエフェクター相補配列は、単一のＲＮＡ鎖または別個のＲＮＡ鎖に存在し得る。「エフェクター配列」（しばしば「ガイド鎖」と称される）は、この場合、ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ転写物の領域である標的配列と実質的に相補的である。「エフェクター配列」は、「アンチセンス配列」とも称され得る。「エフェクター相補配列」は、エフェクター配列にアニールして二本鎖を形成できるように、エフェクター配列に対して十分に相補的である。これに関して、エフェクター相補配列は、標的配列の領域と実質的に相同となる。当業者に明らかであるように、「エフェクター相補配列」という用語は、「エフェクター配列の相補体」またはセンス配列またはパッセンジャー鎖配列とも呼ばれ得る。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「二本鎖」は、２つの相補的または実質的に相補的な核酸（例えば、ＲＮＡ）、または、ワトソン−クリック塩基対形成または相補的または実質的に相補的なヌクレオチド配列間の安定な二本鎖を可能にする他の方法によって、互いに塩基対を形成する一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ）の２つの相補的または実質的に相補的な領域、を指す。二本鎖領域内では、１００％の相補性は要求されず、実質的相補性が許容されることは当業者に理解されよう。実質的相補性は、６９％以上の相補性を含み得る。例えば、１９塩基対（すなわち、１８塩基対および１つのミスマッチ）からなる二本鎖領域における単一のミスマッチは、９４．７％の相補性をもたらし、二本鎖領域を実質的に相補的にする。別の例では、１９塩基対（すなわち、１７塩基対および２つのミスマッチ）からなる二本鎖領域における２つのミスマッチは、８９．５％の相補性をもたらし、二本鎖領域を実質的に相補的にする。さらに別の例では、１９塩基対（すなわち、１６塩基対および３つのミスマッチ）からなる二本鎖領域における３つのミスマッチは、８４．２％の相補性をもたらし、二本鎖領域を実質的に相補的にする、などである。
【０１１６】
ｄｓＲＮＡは、ステムループと呼ばれる少なくとも２つのヌクレオチド配列によって連結されたエフェクター配列およびエフェクター相補配列からなる二本鎖領域を有する、ヘアピンまたはステムループ構造として提供され得る。ｄｓＲＮＡがヘアピンまたはステムループ構造として提供される場合、それは「ヘアピンＲＮＡ」または「ショートヘアピンＲＮＡｉ剤」または「ｓｈＲＮＡ」と称され得る。ヘアピンまたはステムループ構造において提供されるか、またはそれに生じる他のｄｓＲＮＡ分子には、一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）および前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が含まれる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ  ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成する一次ｍｉＲＮＡ転写物の領域を認識および放出する酵素ＤｒｏｓｈａおよびＰａｓｈａの作用によって、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから天然に産生され得る。あるいは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物は、天然のステムループ構造を人工／組換えステムループ構造で置換するように操作することができる。この場合、ＤｒｏｓｈａおよびＰａｓｈａは人工ｓｈＲＮＡを認識および放出する。このアプローチを用いて生産されたｄｓＲＮＡ分子は、「ｓｈｍｉＲＮＡ」、「ｓｈｍｉＲ」または「マイクロＲＮＡフレームワークｓｈＲＮＡ」として知られている。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「一本鎖短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｓ−ｓｉＲＮＡ」、「一本鎖ＲＮＡ」、「ｓｓＲＮＡ」または同様の用語は、一本鎖構造を有し、エフェクター配列を含むＲＮＡ分子を指す。本明細書においてｄｓＲＮＡ分子について記載されているように、「エフェクター配列」（しばしば「アンチセンス配列」または「ガイド鎖」と称される）は、この場合、ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ転写物の領域である標的配列と実質的に相補的である。しかし、二本鎖構造を有するＲＮＡｉ試薬とは異なり、ｓｓＲＮＡはエフェクター相補配列を含まない。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、配列に関する「相補的」という用語は、グアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対を形成し、アデニン（Ａ）がウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のいずれかと対を形成する、ワトソン−クリック塩基対形成による配列の相補体を指す。配列は、別の配列の全長に相補的であってもよく、または別の配列の特定の部分または長さに相補的であってもよい。当業者は、ＵがＲＮＡ中に存在し得、ＴがＤＮＡ中に存在し得ることを認識するであろう。したがって、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列のいずれかの中のＡは、ＲＮＡ配列のＵまたはＤＮＡ配列のＴと対になっていてもよい。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に相補的」は、核酸配列間、例えばエフェクター配列とエフェクター相補配列の間、またはエフェクター配列と標的配列との間で、安定した特異的結合が起こるような十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される。核酸の配列は、その標的または相補体の配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解される。この用語は、オーバーハングを例外として、別の配列に相補的な配列を包含する。いくつかの場合において、配列は、１〜２個のミスマッチを例外として、他の配列に相補的である。いくつかの場合において、配列は１つのミスマッチを除いて相補的である。いくつかの場合において、配列は２つのミスマッチを除いて相補的である。他の場合には、配列は３つのミスマッチを除いて相補的である。さらに他の場合には、配列は４つのミスマッチを除いて相補的である。
【０１２０】
本開示のＲＮＡの文脈において使用される用語「コードした」または「をコードする」は、ＲＮＡがＤＮＡ鋳型から転写され得ることを意味すると理解されるべきである。したがって、本開示のＲＮＡをコードする（ｅｎｃｏｄｅ）またはコードする（ｃｏｄｅ  ｆｏｒ）核酸は、それぞれのＲＮＡの転写のための鋳型として働くＤＮＡ配列を含む。
【０１２１】
用語「ＤＮＡ依存性ＲＮＡｉ構築物」または「ｄｄＲＮＡｉ構築物」は、転写されると、ＲＮＡｉを誘発するＲＮＡ分子を産生する、ＤＮＡ配列を含む核酸を指す。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、少なくとも２個のヌクレオチドのステムループ、すなわちｓｈＲＮＡ、により連結された二本鎖領域を有するヘアピン構造に自己アニーリングすることができる単一のＲＮＡとして、または複数のｓｈＲＮＡを有する単一のＲＮＡとして、またはそれぞれ単一のｓｈＲＮＡとして折りたたむことができる複数のＲＮＡ転写物として、転写される核酸を含み得る。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、発現ベクター、すなわち、「ｄｄＲＮＡｉ発現構築物」、例えばプロモーターに機能し得るように連結されたものの中にあってもよい。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「機能し得るように連結された」または「機能し得る連結」（または同様のもの）は、コード核酸配列が、調節配列、例えばプロモーターに、コード配列の発現を容易にする様式で連結または関連していることを意味する。調節配列には、当技術分野で認識され、コード配列の発現を導くように選択される、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントが含まれる。
【０１２３】
「ベクター」は、核酸を細胞に導入するための媒体を意味すると理解される。ベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、細菌、およびウイルスまたは細菌源に由来するビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。「プラスミド」は、環状の二重鎖ＤＮＡ分子である。本開示に従って使用するための有用なタイプのベクターはウイルスベクターであり、異種ＤＮＡ配列が、１つ以上のウイルス遺伝子またはその一部を欠失させるように改変され得るウイルスゲノムに挿入される。特定のベクターは、宿主細胞において自律的複製ができる（例えば、宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞のゲノムに安定に組み込むことができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込むことなく、染色体外の状態で存続する。本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、本開示のＲＮＡ分子を発現することができるベクターを意味すると理解される。
【０１２４】
「機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質」は、野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質の機能的特性、例えば、ｍＲＮＡポリアデニル化部位および／または哺乳動物細胞におけるイントロンスプライシングを制御する能力、を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を意味すると理解されるものとする。したがって、「機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質」は、対象において発現または存在する場合にＯＰＭＤの原因ではないＰＡＢＰＮ１タンパク質であると理解される。一例では、本明細書における「機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質」への言及は、ヒト野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質への言及である。ヒト野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質の配列は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４６３４に記載されている。したがって、機能的ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４６３４に記載のヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のインビボでの機能的特性を有し得る。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、用語「処置すること」、「処置する」または「処置」およびその変形は、臨床病理の経過において処置される個体または細胞の自然経過を変更するように設計された臨床介入を指す。処置の望ましい効果には、疾患の進行速度の低下、疾患の状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれる。ＯＰＭＤの処置には、対象におけるＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を減少させるかまたは阻害すること、および／または正常長のポリアラニン残基を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を対象において発現させることが含まれることとなる。好ましくは、ＯＰＭＤの処置には、対象におけるＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を減少させるかまたは阻害すること、および正常長のポリアラニン残基を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を対象において発現させることが含まれる。例えば、上記処置成果の１つ以上が達成された場合、個体は成功裏に「処置」される。
【０１２６】
「治療有効量」は、少なくとも、ＯＰＭＤの１つ以上の症状、（例えば、対象における眼瞼下垂症、嚥下障害および筋肉衰弱を含むがこれに限定されない）における測定可能な改善などの、ＯＰＭＤ病態の測定可能な改善を生じるのに必要な最小濃度または量である。本明細書の治療有効量は、患者の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉもしくは発現構築物の能力、ならびに／または対象における機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現する発現ベクターの能力などの因子によって変化し得る。治療有効量はまた、ＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターの任意の毒性または有害な効果が、単独で、または対象における機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現の治療的に有益な効果と組み合わせて考慮して、ＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターの治療上有益な効果よりも大きく、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害、抑制または減少させる量である。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「対照」または「患者」は、ＯＰＭＤに罹患しているか、または遺伝的に素因がある、すなわち、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１遺伝子変異体を有するヒトまたは非ヒト動物であり得る。「非ヒト動物」は、霊長類、家畜（例えばヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ）、コンパニオン動物（例えばイヌやネコなどのペット）、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ゼブラフィッシュ）、芸などをする動物（例えば競走馬、ラクダ、グレイハウンド）または飼育下の野生動物であってもよい。一例では、対象または患者は哺乳動物である。一例では、対象または患者はヒトである。
【０１２８】
「減少した発現」、「発現の減少」または同様の用語は、標的遺伝子、例えばＰＡＢＰＮ１遺伝子からの、タンパク質および／またはｍＲＮＡ産物の不在またはそのレベルの観察可能な減少を指す。この減少は絶対的である必要はないが、本開示のＲＮＡによって生じるＲＮＡｉの結果として検出可能なまたは観察可能な変化に十分な部分的減少であり得る。この減少は、ＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターを欠く細胞と比較して、標的核酸からのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質産物のレベルの減少を決定することによって測定することができ、これは１％、５％または１０％であってもよく、または絶対的、すなわち１００％阻害であってもよい。減少の影響は、外的特性、すなわち細胞または生物の定量的および／または定性的表現型の検査によって決定し得、また、本開示のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターの投与後の細胞または生物におけるｅｘｐＰＡＢＰＮ１の核内凝集体の量の存在または変化の検出を含み得る。
【０１２９】
ＲＮＡｉの薬剤
一例では、本開示はＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡｉを誘発できるものを提供し、ここで、ＲＮＡは、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含み、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号１〜３のいずれか１つに記載される。好ましくは、本開示のＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満のエフェクター配列を含む。例えば、好適なエフェクター配列は、１７〜２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【０１３０】
一例では、エフェクター配列は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的であり、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号１に記載される。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する６つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する５つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１３１】
一例では、エフェクター配列は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的であり、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号２に記載される。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する６つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する５つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１３２】
一例では、エフェクター配列は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的であり、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号３に記載される。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する６つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する５つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する４つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する３つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する２つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的であり得、それに対する１つのミスマッチ塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１３３】
一例では、本開示のＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。
【０１３４】
本開示によるｓｓＲＮＡは、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含んでもよく、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号１〜３のいずれか１つに記載される。例えば、本開示のｓｓＲＮＡは、配列番号４、６または８に記載の配列と実質的に同一の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含み得る。
【０１３５】
一例では、本開示のｓｓＲＮＡは、配列番号４に記載の配列と実質的に同一の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する６塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する５塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する４塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する３塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する２塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する１塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号４に記載の配列と１００％同一であり得る。
【０１３６】
一例では、本開示のｓｓＲＮＡは、配列番号６に記載の配列と実質的に同一の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する６塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する５塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する４塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する３塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する２塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する１塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号６に記載の配列と１００％同一であり得る。
【０１３７】
一例では、本開示のｓｓＲＮＡは、配列番号８に記載の配列と実質的に同一の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する６塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する５塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する４塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する３塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する２塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と実質的に同一であり得、それに対して変動する１塩基を含み得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号８に記載の配列と１００％同一であり得る。
【０１３８】
一例では、ＲＮＡｉを誘発することができる本開示のＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。本開示によるｄｓＲＮＡは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、エフェクター配列は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的な少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含み、ＲＮＡ転写物の領域は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される。
【０１３９】
本開示による例示的なｄｓＲＮＡは、表３の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列、すなわち、配列番号５、７および９と実質的に相補的なエフェクター配列を含む。
【０１４０】
一例では、本開示は、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｄｓＲＮＡを提供する。例えば、エフェクター配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号５に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１４１】
一例では、本開示は、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｄｓＲＮＡを提供する。例えば、エフェクター配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号７に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号７に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１４２】
一例では、本開示は、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｄｓＲＮＡを提供する。例えば、エフェクター配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号９に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号９に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１４３】
本開示のｄｓＲＮＡが１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのミスマッチ（本明細書に記載）を例外として、表３の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列に実質的に相補的なエフェクター配列を含む場合、エフェクター配列は、依然として表３の対応するエフェクター相補配列と二本鎖を形成することができる。
【０１４４】
一例では、本開示は、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含むｄｓＲＮＡを提供し、エフェクター配列は、表３の「エフェクター」と表示された列に記載の配列、すなわち配列番号４、６および８から選択される配列であり、ｄｓＲＮＡのエフェクター相補配列は、そのエフェクター配列と実質的に相補的である。例えば、ＲＮＡのエフェクター相補配列は、同族のエフェクター配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのミスマッチを含み得るが、依然としてそれと二本鎖を形成することができる。
【０１４５】
一例では、ｄｓＲＮＡは、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載のエフェクター配列およびそれと実質的に相補的であるエフェクター相補配列を含み得る。例えば、エフェクター相補配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、配列番号４に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１４６】
一例では、ｄｓＲＮＡは、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載のエフェクター配列およびそれと実質的に相補的であるエフェクター相補配列を含み得る。例えば、エフェクター相補配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号６に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、配列番号６に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１４７】
一例では、ｄｓＲＮＡは、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載のエフェクター配列およびそれと実質的に相補的であるエフェクター相補配列を含み得る。例えば、エフェクター相補配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号８に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、配列番号８に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１４８】
本開示による例示的なｄｓＲＮＡは、表３の「エフェクター」および「エフェクター相補体」とそれぞれ表示された列に記載の対応するエフェクターおよびエフェクター相補配列を含む。一例では、ｄｓＲＮＡの対応するエフェクターおよびエフェクター相補配列は、二本鎖形成（例えばワトソン−クリック塩基対形成によって）された別個の核酸として提供され得る。
【０１４９】
ｄｓＲＮＡである本開示の例示的なＲＮＡは、配列番号４に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号５に記載の配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【０１５０】
ｄｓＲＮＡである本開示の例示的なＲＮＡは、配列番号６に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号７に記載の配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【０１５１】
ｄｓＲＮＡである本開示の例示的なＲＮＡは、配列番号８に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号９に記載の配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【０１５２】
ＲＮＡｉを誘発することができる本開示のＲＮＡはまた、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として提供され得る。本開示のこの実施例によるｓｈＲＮＡは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、エフェクター配列は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的な少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含み、ＲＮＡ転写物の領域は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載される。
【０１５３】
本開示による例示的なｓｈＲＮＡは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、エフェクター配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列、すなわち、配列番号１１、１３および１５に、実質的に相補的である。
【０１５４】
一例では、本開示は、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡを提供する。例えば、エフェクター配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号１１に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１１に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１５５】
一例では、本開示は、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡを提供する。例えば、エフェクター配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号１３に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１３に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１５６】
一例では、本開示は、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡを提供する。例えば、エフェクター配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号１５に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター配列は、配列番号１５に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１５７】
本開示のｓｈＲＮＡが１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのミスマッチ（本明細書に記載）を例外として、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列に実質的に相補的なエフェクター配列を含む場合、エフェクター配列は、依然として表４の対応するエフェクター相補配列と二本鎖領域を形成することができる。
【０１５８】
別の例において、本開示は、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを提供し、エフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列、すなわち配列番号１０、１２および１４から選択される配列であり、ｓｈＲＮＡのエフェクター相補配列は、そのエフェクター配列と実質的に相補的である。例えば、ｓｈＲＮＡのエフェクター相補配列は、同族のエフェクター配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのミスマッチを含み得るが、依然としてそれと二本鎖を形成することができる。
【０１５９】
一例では、ｓｈＲＮＡは、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載のエフェクター配列およびそれと実質的に相補的であるエフェクター相補配列を含み得る。例えば、エフェクター相補配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号１０に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、配列番号１０に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１６０】
一例では、ｓｈＲＮＡは、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載のエフェクター配列およびそれと実質的に相補的であるエフェクター相補配列を含み得る。例えば、エフェクター相補配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号１２に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、配列番号１２に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１６１】
一例では、ｓｈＲＮＡは、１、２、３、４、５または６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載のエフェクター配列およびそれと実質的に相補的であるエフェクター相補配列を含み得る。例えば、エフェクター相補配列は、６塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、５塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、４塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、３塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、２塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、１塩基のミスマッチを例外として、配列番号１４に記載の配列と実質的に相補的であり得る。例えば、エフェクター相補配列は、配列番号１４に記載の配列と１００％相補的であり得る。
【０１６２】
本開示のＲＮＡがｓｈＲＮＡとして提供される場合、それぞれのＲＮＡが単一の連続配列を形成するように、ステムループ配列は、対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に配置される。ステムループ配列は、エフェクター配列とエフェクター相補配列とが互いにアニールする、すなわち、ワトソン−クリック塩基対形成によって二本鎖領域を形成できるのに十分な長さである。好適なステムループ配列は、例えば、当技術分野で公知のものから選択され得る。
【０１６３】
本開示による例示的なｓｈＲＮＡは、表４の「エフェクター」および「エフェクター相補体」とそれぞれ表示された列に記載の対応するエフェクターおよびエフェクター相補配列を含む。そのような例示的なｓｈＲＮＡは、表５に記載の配列を含み得、任意に本明細書に記載のように改変される。
【０１６４】
ｓｈＲＮＡである本開示の例示的なＲＮＡは、配列番号１０に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列からなるエフェクター相補配列を含む。この実施例によるｓｈＲＮＡは、配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。あるいは、この実施例によるｓｈＲＮＡは、配列番号１７に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０１６５】
ｓｈＲＮＡである本開示の例示的なＲＮＡは、配列番号１２に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列からなるエフェクター相補配列を含む。この実施例によるｓｈＲＮＡは、配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。あるいは、この実施例によるｓｈＲＮＡは、配列番号１９に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０１６６】
ｓｈＲＮＡである本開示の例示的なＲＮＡは、配列番号１４に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列からなるエフェクター相補配列を含む。この実施例によるｓｈＲＮＡは、配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。あるいは、この実施例によるｓｈＲＮＡは、配列番号２１に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０１６７】
本明細書に記載のｓｈＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含み得る。
【０１６８】
本開示はまた、複数のＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡｉを誘発できるものを提供し、ここで、それぞれのＲＮＡは、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含み、複数のうちの少なくとも１つのＲＮＡは、本明細書に記載の配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むＲＮＡである。好ましくは、複数のＲＮＡはそれぞれ、長さが３０ヌクレオチド未満のエフェクター配列を含む。例えば、好適なエフェクター配列は、１７〜２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【０１６９】
配列番号１〜３のいずれか１つに記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含む例示的なＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含む）を説明したが、これらは本開示の実施例に準用できるものとする。
【０１７０】
本開示による複数のＲＮＡは、本明細書に記載の２つのＲＮＡを含み得る。別の例では、本開示による複数のＲＮＡは、本明細書に記載の３つのＲＮＡを含み得る。
【０１７１】
したがって、本開示による複数のＲＮＡは、表１に記載のＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域に実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドを有するエフェクター配列を含む、本明細書に記載の１つ以上のＲＮＡを含み得る。
【０１７２】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７３】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７４】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７５】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり、複数のＲＮＡの別のエフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７６】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり、複数のＲＮＡの別のエフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７７】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり、複数のＲＮＡの別のエフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７８】
一例では、複数のＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、配列番号１に記載の配列と実質的に相補的であり、複数のＲＮＡの別のエフェクター配列は、配列番号２に記載の配列と実質的に相補的であり、複数のＲＮＡのさらに別のエフェクター配列は、配列番号３に記載の配列と実質的に相補的である。
【０１７９】
配列番号１〜３のうちの１つに記載の配列と実質的に相補的である少なくとも１７の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む例示的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｓｈｍｉＲＮＡを含む）が本明細書に記載される。
【０１８０】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター配列」と表示された列に記載のエフェクター配列と実質的に同一であるエフェクター配列をそれぞれ含む、ｓｓＲＮＡである複数のＲＮＡを提供する。
【０１８１】
本開示の例示的な複数のｓｓＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号６に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ。
【０１８２】
本開示の例示的な複数のｓｓＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ。
【０１８３】
本開示の例示的な複数のｓｓＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号６に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ。
【０１８４】
本開示の例示的な複数のｓｓＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号６に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ；および
（ｉｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むｓｓＲＮＡ。
【０１８５】
一例では、本開示は、それぞれがエフェクター配列およびエフェクター相補配列を含む、ｄｓＲＮＡである複数のＲＮＡを提供し、それぞれのＲＮＡのエフェクター配列は、表３の「エフェクター配列」と表示された列に記載のエフェクター配列と実質的に同一である。例えば、それぞれのｄｓＲＮＡのエフェクター配列は、表３の「エフェクター」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。同族のエフェクター相補配列は、表３の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０１８６】
表３の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｄｓＲＮＡを本明細書に記載する。
【０１８７】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号６に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号７に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むｄｓＲＮＡ。
【０１８８】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号９に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むｄｓＲＮＡ。
【０１８９】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号６に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号７に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号９に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むｄｓＲＮＡ。
【０１９０】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号６に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号７に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｄｓＲＮＡ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号８に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号９に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むｄｓＲＮＡ。
【０１９１】
別の例では、本開示の複数のＲＮＡが複数のｓｈＲＮＡとして提供され、それぞれのｓｈＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的である。例えば、それぞれのｓｈＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。同族のエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０１９２】
表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈＲＮＡを本明細書に記載する。
【０１９３】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０１９４】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０１９５】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０１９６】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０１９７】
本明細書に記載されるように、複数のｓｈＲＮＡはそれぞれ、ｓｈＲＮＡが単一の連続配列を形成するように、対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列を含む。例示的なｓｈＲＮＡは、本明細書、例えば表５に記載される。
【０１９８】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０１９９】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２００】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２０１】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２０２】
本明細書に記載のｓｈＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含み得る。
【０２０３】
別の例では、本開示の複数のＲＮＡが複数のｓｈｍｉＲＮＡとして提供され、それぞれのｓｈｍｉＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的である。例えば、それぞれのｓｈｍｉＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。同族のエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０２０４】
表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲＮＡを本明細書に記載する。
【０２０５】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２０６】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２０７】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２０８】
本開示の例示的な複数のＲＮＡは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２０９】
本明細書に記載されるように、複数のｓｈｍｉＲＮＡはそれぞれ、ｓｈｍｉＲＮＡが単一の連続配列を形成するように、対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列を含む。例示的なｓｈｍｉＲＮＡは、本明細書、例えば表５に記載される。
【０２１０】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２１１】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２１２】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２１３】
一例では、本開示は複数のＲＮＡを提供し、複数のＲＮＡは、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ；および
（ｉｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡ。
【０２１４】
本明細書に記載のｓｈｍｉＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｍｉｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含み得る。
【０２１５】
一例によると、本明細書に記載の複数のＲＮＡは、単一の組成物として一緒に提供されてもよい。
【０２１６】
別の例によると、本明細書に記載の複数のＲＮＡは、複数の組成物として提供されてもよい。例えば、複数のＲＮＡのそれぞれを別々に提供してもよい。あるいは、複数のＲＮＡの少なくとも１つを別個に提供し、複数のうちの２つ以上を組成物中に一緒に提供してもよい。
【０２１７】
本開示のＲＮＡまたは複数のＲＮＡは、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ指向性ＲＮＡ（ｄｄＲＮＡ）のいずれかを含み得る。合成ＲＮＡは、典型的なオリゴヌクレオチド合成などの当技術分野で公知の方法によって製造され、ｓｉＲＮＡ剤の半減期および／もしくは有効性を増加させる、ならびに／またはより堅牢な送達製剤を可能にする、化学的改変を組み込み得る。オリゴヌクレオチドの多くの化学的改変は公知であり、当技術分野において十分に記載されている。
【０２１８】
一例では、本開示のＲＮＡの実質的に全てのヌクレオチドが改変される。別の例では、本開示のＲＮＡの全てのヌクレオチドが改変される。「実質的に全てのヌクレオチドが改変された」本開示のＲＮＡは、大部分が改変されているが完全には改変されておらず、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つ以下の非改変ヌクレオチドを含み得る。
【０２１９】
一例では、本開示のＲＮＡは、二本鎖の一方または両方の鎖の３’末端、５’末端、または両端に、１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含む。オーバーハング領域は、１〜６ヌクレオチド長、例えば２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖より長いこと、または同じ長さの２つの鎖が互い違いになることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、または標的化される遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。第１および第２の鎖はまた、例えばヘアピンを形成するためのさらなる塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、結合され得る。
【０２２０】
一例では、ＲＮＡのオーバーハング領域のヌクレオチドは、それぞれ独立して改変または未改変ヌクレオチドであり、２’−糖改変、例えば２−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、デオキシ−チミン（ｄＴ）、２’’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、ｄＴｄＴはいずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、または標的化される遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。
【０２２１】
ＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖における５’−または３’−オーバーハングはリン酸化され得る。いくつかの例では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、２つのヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。
【０２２２】
一例では、本開示のＲＮＡは、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ＲＮＡの干渉活性を強化し得る単一のオーバーハングのみを含む。例えば、一本鎖オーバーハングは、エフェクター配列の３’末端に、あるいはエフェクター相補配列の３’末端に配置される。一例では、ＲＮＡはまた、エフェクター相補配列の５’末端（またはエフェクター配列の３’末端）またはその逆に位置する平滑末端を含む。
【０２２３】
改変としては、例えば、末端改変、例えば５’末端改変（リン酸化、コンジュゲーション、逆位連結）もしくは３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位連結など）；塩基改変、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは対形成相手のレパートリーが広い塩基での置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または結合塩基；糖改変（例えば、２’位または４’位）または糖の置換；および／またはホスホジエステル連結の改変または置換を含む骨格改変が挙げられる。本開示において有用なＲＮＡの特定の例には、改変された骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが含まれるが、これに限定されるものではない。改変骨格を有するＲＮＡには、とりわけ、骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的のために、そして時に当技術分野で参照されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない改変ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなし得る。いくつかの例では、改変ＲＮＡはそのヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２４】
リン原子を含まない改変ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結によって形成された骨格を有する。これらには、モルフォリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；およびその他の混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有するものが含まれる。これらのオリゴヌクレオシドの例示的な形態を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２５】
他の例において、本開示のＲＮＡは、ヌクレオチド単位が新規な基で置換されたＲＮＡ模倣物（例えば骨格）である、またはそれを含む。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２２６】
改変ＲＮＡはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。本明細書において特徴付けられるＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、２’位に以下のうちの１つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの一つを２’位に含むことができ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニル。例示的な好適な改変は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ１）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である。
【０２２７】
本開示のＲＮＡは、核酸塩基（しばしば当技術分野において単に「塩基」と称される）の改変または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「未改変」核酸塩基または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、デオキシ−チミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよび他のアデニンやグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルおよび他のアデニンやグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。
【０２２８】
本開示のＲＮＡはまた、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように改変し得る。ロックド核酸は、改変されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’および４’炭素を連結する余分の架橋を含む。この構造は、効果的に３’−ｅｎｄｏ立体構造のリボースを「ロック」する。ロックド核酸のｓｉＲＮＡへの添加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７）。
【０２２９】
ＲＮＡ末端を安定化させ得る改変は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−Ｏ−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３’’−ホスファート、逆位塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この改変の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見出すことができる。
【０２３０】
一例では、本開示のＲＮＡは化学的に合成される。オリゴヌクレオチド（例えば、特定の改変オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドがない部分）は当技術分野で公知のプロトコルを用いて、例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９、国際公開第９９／５４４５９号パンフレット、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎの米国特許第６，００１，３１１号明細書に記載のもののようなプロトコルを用いて合成される。オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端にジメトキシトリチル、３’末端にホスホラミダイトなどの一般的な核酸保護およびカップリング基を利用する。
【０２３１】
改変を有しないＲＮＡは、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），  Ｊ．  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３に記載の手順を用いて合成される。これらの合成は、本開示の特定のＲＮＡに使用することができる、５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホラミダイトなどの一般的な核酸保護およびカップリング基を利用する。
【０２３２】
特定の実施例において、本開示のＲＮＡは、米国特許第６，９９５，２５９号明細書、米国特許第６，６８６，４６３号明細書、米国特許第６，６７３，９１８号明細書、米国特許第６，６４９，７５１号明細書、および／または米国特許第６，９８９，４４２号明細書に記載の方法に従って合成、脱保護および分析される。
【０２３３】
別の例では、本開示のＲＮＡは、例えばライゲーション（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３または国際公開第９３／２３５６９号パンフレット）、または合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションによって、別個の成分として合成される。
【０２３４】
ｄｄＲＮＡｉ
ｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡである本開示のＲＮＡは、核酸から転写され得る。したがって、一例では、本開示は、本開示のＲＮＡをコードする核酸を提供する。
【０２３５】
一例では、核酸はＤＮＡである。
【０２３６】
別の例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードする核酸を提供する。
【０２３７】
別の例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードする複数の核酸を提供する。例えば、複数の核酸はそれぞれ、本明細書に記載の単一のＲＮＡをコードし得る。別の例では、１つ以上の核酸が複数のＲＮＡをコードする、例えば複数の核酸が本開示の２つ以上のＲＮＡをコードし、複数の別の核酸が本開示の１つ以上のＲＮＡをコードする。
【０２３８】
一例では、本明細書に記載の複数の核酸は、例えば単一の組成物中に、一緒に提供される。
【０２３９】
別の例において、本明細書に記載の複数の核酸は、複数の成分、例えば複数の組成物として提供される。例えば、複数の核酸のそれぞれを別個に提供してもよい。あるいは、本開示の少なくとも３つの核酸が提供される例では、核酸の少なくとも１つは別個に提供され、複数のうちの２つ以上が一緒に提供され得る。
【０２４０】
いくつかの例では、本開示の核酸は、例えばＲＮＡの転写を促進するための１つ以上のさらなる要素を含む。例えば、核酸は、本開示のＲＮＡをコードする配列に機能し得るように連結されたプロモーターを含み得る。他の要素、例えば転写ターミネーターは、当技術分野で公知であり、および／または本明細書に記載される。
【０２４１】
一例では、核酸はＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）構築物である。
【０２４２】
一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能し得るように連結された本開示のＲＮＡをコードする配列を含む。
【０２４３】
一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のエフェクター配列およびエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書に記載のように、本開示のＲＮＡは、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むエフェクター配列を含み、このＲＮＡ転写物の領域は配列番号１〜３のいずれか１つに記載される。例示的なエフェクター配列およびエフェクター相補配列を表４に示す。
【０２４４】
例えば、配列は、プロモーター、例えばＵ６またはＨ１、に機能し得るように連結されていてもよい。一例では、両方の配列が同じプロモーターに機能し得るように連結されていてもよい。一例では、両方の配列は異なるプロモーターに機能し得るように連結されていてもよい。
【０２４５】
一例では、本開示は、エフェクター配列をコードする配列およびエフェクター相補配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、エフェクター配列は、表４の「エフェクター相補配列」と表示された列に記載されるエフェクター相補配列と実質的に相補的である。例えば、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補体配列と実質的に相補的なエフェクター配列は、表４の対応するエフェクター相補配列と二本鎖を形成する場合、０個、１つ、２つ、３つまたは４つのミスマッチを含み得る。
【０２４６】
一例では、本開示は、４塩基のミスマッチを例外として、表４の「エフェクター相補配列」と表示された列に記載される配列と実質的に相補的であるエフェクター配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。
【０２４７】
一例では、本開示は、３塩基のミスマッチを例外として、表４の「エフェクター相補配列」と表示された列に記載される配列と実質的に相補的であるエフェクター配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。
【０２４８】
一例では、本開示は、２塩基のミスマッチを例外として、表４の「エフェクター相補配列」と表示された列に記載される配列と実質的に相補的であるエフェクター配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。
【０２４９】
一例では、本開示は、１塩基のミスマッチを例外として、表４の「エフェクター相補配列」と表示された列に記載される配列と実質的に相補的であるエフェクター配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。
【０２５０】
一例では、本開示は、エフェクター配列およびエフェクター相補配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、エフェクター配列は、表４の「エフェクター相補配列」と表示された列に記載される配列と１００％相補的である。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｄｄＲＮＡｉ構築物によってコードされるエフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【０２５１】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、表４に記載される対応するエフェクターおよびエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【０２５２】
一例において、本開示は、エフェクター配列をコードする配列およびエフェクター相補配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、エフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列からなる。一例では、エフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列からなる。
【０２５３】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１０に記載の配列からなるエフェクター配列をコードする配列、および配列番号１１に記載の配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【０２５４】
本開示の別の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１２に記載の配列からなるエフェクター配列をコードする配列、および配列番号１３に記載の配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【０２５５】
本開示のさらに別の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１４に記載の配列からなるエフェクター配列をコードする配列、および配列番号１５に記載の配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【０２５６】
別の例において、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするか、または本開示のＲＮＡをコードする配列およびＲＮＡｉを誘発することができる少なくとも１つの他のＲＮＡを含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。
【０２５７】
一例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれのＲＮＡはエフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、少なくとも１つの（またはそれぞれの）ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列と実質的に相補的である。表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列に「実質的に相補的」であるエフェクター配列を含む本開示の例示的なＲＮＡは、記載されており、本開示のこの例について準用されるものとする。しかし、一例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれのＲＮＡはエフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、少なくとも１つの（またはそれぞれの）ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列からなる。一例では、少なくとも１つの（またはそれぞれの）ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列からなる。
【０２５８】
一例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれＲＮＡｉを誘発することができ、ここで：
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列からなり（一例では、それぞれのＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列からなる）；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、ＲＮＡのエフェクター配列は、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的な少なくとも１７の連続したヌクレオチドの配列からなる。
【０２５９】
例えば、（ｉｉ）の少なくとも１つのＲＮＡは、（ｉ）のＲＮＡと異なっていてもよいが、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列からなる（一例では、それぞれのＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示されたカラムに記載の配列からなる）。
【０２６０】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列からなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列；ならびに
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列。
【０２６１】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列。
【０２６２】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列。
【０２６３】
本開示の別の例示的なｄｄＲＮＡｉは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むＲＮＡをコードする配列。
【０２６４】
本明細書に記載されるように、本開示のｓｈＲＮＡおよび／またはｓｈｍｉＲＮＡは、それぞれのＲＮＡが単一の連続配列を形成するように、対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列を含む。したがって、本開示のｄｄＲＮＡｉは、それぞれ対応するエフェクター配列をコードする配列とエフェクター相補配列をコードする配列との間に位置するステムループをコードする配列を含み得る。
【０２６５】
一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能し得るように連結された本開示のｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーター、に機能し得るように連結された表５に記載の配列を含むか、またはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０２６６】
例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１６または１７に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含み得る。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１７に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０２６７】
例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１８または１９に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含み得る。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号１９に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０２６８】
例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号２０または２１に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含み得る。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号２１に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０２６９】
本開示はまた、少なくとも１つの本発明のｓｈＲＮＡを含む複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。
【０２７０】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれのｓｈＲＮＡは、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも１７の連続したヌクレオチドの配列を含むか、またはそれからなる、エフェクター配列を含み、少なくとも１つのｓｈＲＮＡは、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含む。表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的である例示的なエフェクター配列が記載されており、本開示のこの例について準用されるものとする。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物によってコードされる複数のｓｈＲＮＡの少なくとも１つのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列を含み得るか、またはそれからなり得る（例えば、同族のエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含み得るか、またはそれからなり得る）。
【０２７１】
別の例において、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれのｓｈＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載のエフェクター配列を含むか、またはそれからなる。それぞれのｓｈＲＮＡの同族のエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈＲＮＡを本明細書に記載する。
【０２７２】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができ、この複数は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０２７３】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができ、この複数は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０２７４】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができ、この複数は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０２７５】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができ、この複数は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡ。
【０２７６】
本開示の例示的なｓｈＲＮＡを表５に記載する。したがって、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、表５に記載の複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含み得る。
【０２７７】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２７８】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２７９】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２８０】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、以下を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）配列番号１６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
（ｉｉ）配列番号１８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；および
（ｉｉｉ）配列番号２０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ。
【０２８１】
本開示はまた、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、配列番号１６に記載の配列または本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡを含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡを含む。
【０２８２】
本開示はまた、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、配列番号１８に記載の配列または本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡを含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡを含む。
【０２８３】
本開示はまた、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、この複数は、配列番号２０に記載の配列または本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡを含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡを含む。
【０２８４】
別の例において、本開示は、プロモーターに機能し得るように連結されたｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。例えば、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーター、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーター、に機能し得るように連結された表５に記載の配列を含むか、またはそれからなるｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含む。エフェクターおよびエフェクター相補配列の例示的な組み合わせは、本開示のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物の文脈で記載されており、ｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を記載するこの例について準用されるものとする。
【０２８５】
上記のように、ｄｄＲＮＡｉ構築物は一般に、プロモーターに機能し得るように連結された本開示のＲＮＡ（例えば、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡ）をコードする配列を含む。例えば、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター、に機能し得るように連結され得る。あるいは、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーター、例えば、ＵｂＣ、ＣＭＶまたはＰＧＫプロモーター、に機能し得るように連結され得る。ｄｄＲＮＡｉ構築物が複数のｓｈＲＮＡをコードする場合、複数のｓｈＲＮＡのうちの１つをコードする配列はそれぞれ、プロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーターに機能し得るように連結され得る。あるいは、ｄｄＲＮＡｉ構築物が複数のｓｈＲＮＡをコードする場合、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列のそれぞれは、同じプロモーターに機能し得るように連結され得る。例えば、ＰｏｌＩＩプロモーター、例えば、ＵｂＣ、ＣＭＶまたはＰＧＫプロモーターは、複数のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含むより長い構築物の発現を駆動するのに特に有用であり得る。
【０２８６】
しばしば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ベクター、例えば、プラスミドまたはミニプラスミドまたはウイルスベクター内にある。
【０２８７】
一例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物中の本開示の複数のＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡ）をコードする配列は、同じプロモーターに機能し得るように連結される。例えば、構築物は、本開示の異なるｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列に機能し得るように連結されたそれぞれのコピーを有する同じプロモーターの複数のコピーを含み得る。
【０２８８】
別の例において、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列に機能し得るように連結されたそれぞれのプロモーターは異なっている。例えば、本開示の３つのｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物において、それぞれのｓｈＲＮＡをコードする３つの配列は、それぞれ異なるプロモーターに機能し得るように連結される。同様に、本開示の３つのｓｈｍｉＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物において、それぞれのｓｈｍｉＲＮＡをコードする３つの配列は、それぞれ異なるプロモーターに機能し得るように連結される。
【０２８９】
さらなる例において、３つ以上のｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物において、ｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする２つの（またはそれより多い）配列は同じプロモーターに連結され、ＲＮＡをコードする１つの（またはそれより多い）配列は、異なるプロモーターに連結される。
【０２９０】
一例では、プロモーターは構成的プロモーターである。用語「構成的」とは、プロモーターに関して言及される場合、プロモーターが、特異的な刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）の非存在下で機能し得るように連結された核酸配列の転写を導くことができることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織中のコード配列の発現を導くことができる。本開示のＲＮＡを転写するために使用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって制御される、ユビキチン、ＣＭＶ、β−アクチン、ヒストンＨ４、ＥＦ−１αまたはｐｇｋ遺伝子のプロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩによって制御されるプロモーターエレメントを含む。
【０２９１】
一例では、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｕ１、β−アクチンまたはハイブリッドＰｏｌＩＩプロモーターなどのＰｏｌＩＩプロモーターが使用される。他の好適なＰｏｌＩＩプロモーターは当技術分野で公知であり、本開示のこの実施例に従って使用され得る。例えば、酵素ＤｒｏｓｈａおよびＰａｓｈａの作用によって１つ以上のｓｈｍｉＲＮＡにプロセシングされるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを発現する本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物において、ＰｏｌＩＩプロモーター系が好ましいものであり得る。ＰｏｌＩＩプロモーター系はまた、単一プロモーターの制御下で複数のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする配列を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物において好ましいものであり得る。組織特異性が所望される場合には、ＰｏｌＩＩプロモーター系も好ましいものであり得る。
【０２９２】
別の例では、Ｕ６プロモーター（Ｕ６−１、Ｕ６−８、Ｕ６−９）、Ｈ１プロモーター、７ＳＬプロモーター、ヒトＹプロモーター（ｈＹ１、ｈＹ３、ｈＹ４（例えば、Ｍａｒａｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２（１５）：３０４５−５２参照）およびｈＹ５（Ｍａｒａｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４（１８）：３５５２−５９参照）、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、ヒトｔＲＮＡプロモーター、または５ｓリボソームＲＮＡプロモーターなどの、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって制御されるプロモーターが用いられる。ＰｏｌＩＩＩプロモーターは、ｓｈＲＮＡを発現する本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物において好ましくあり得る。
【０２９３】
本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物における使用に好適なプロモーターは、米国特許第８，００８，４６８号明細書および米国特許第８，１２９，５１０号明細書に記載されている。
【０２９４】
一例では、プロモーターはＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである。例えば、プロモーターはＵ６プロモーターである。別の例では、プロモーターはＨ１プロモーターである。
【０２９５】
構築物中のプロモーターがＵ６プロモーターである場合、それはＵ６−１プロモーター、Ｕ６−８プロモーターまたはＵ６−９プロモーターであり得る（例えば、Ｄｏｍｉｔｒｏｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３１：２３４４−２３５２参照）。例えば、構築物中のプロモーターは、Ｕ６−１プロモーターである。例えば、構築物中のプロモーターは、Ｕ６−８プロモーターである。例えば、構築物中のプロモーターは、Ｕ６−９プロモーターである。
【０２９６】
本開示の複数のｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物の場合、ｓｈＲＮＡの少なくとも１つをコードする配列はＵ６プロモーターに機能し得るように連結され、少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列は、Ｈ１プロモーターに機能し得るように連結される。
【０２９７】
本開示の３つのｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物の場合、ｓｈＲＮＡの２つをコードする配列はそれぞれＵ６プロモーターに機能し得るように連結され、ＲＮＡの他方をコードする配列はＨ１プロモーターに機能し得るように連結される。例えば、５’から３’の方向で考えた場合、第１および第２の配列はそれぞれＵ６プロモーターに機能し得るように連結され、第３の配列はＨ１プロモーターに機能し得るように連結される。例えば、５’から３’の方向で考えた場合、第１の配列はＵ６−１プロモーターに機能し得るように連結され、第２の配列はＵ６−９プロモーターに機能し得るように連結され、第３の配列はＨ１プロモーターに機能し得るように連結される。
【０２９８】
別の例では、２つのＲＮＡをコードする配列はそれぞれＨ１プロモーターに機能し得るように連結され、他方のＲＮＡの他方をコードする配列はＵ６プロモーターに機能し得るように連結される。
【０２９９】
いくつかの例では、可変強度のプロモーターが使用される。例えば、２つ以上の強力なプロモーター（ＰｏｌＩＩＩ型プロモーターなど）の使用は、例えば、転写に必要な利用可能なヌクレオチドまたは他の細胞成分のプールを枯渇させることによって、細胞に負荷し得る。さらに、またはあるいは、いくつかの強力なプロモーターの使用は、細胞中のＲＮＡｉ剤の毒性レベルの発現を生じ得る。したがって、いくつかの例において、複数プロモーターｄｄＲＮＡｉ構築物中の１つ以上のプロモーターは、構築物中の他のプロモーターよりも弱いか、または構築物中の全てのプロモーターはｓｈＲＮＡを最大速度未満で発現し得る。プロモーターは、様々な分子技術を使用して、またはその他、例えば、様々な調節要素の改変を介して、より弱いレベルまたはより強いレベルの転写を達成するために改変され得る。転写の減少を達成する１つの手段は、プロモーター活性を制御することが知られているプロモーター内の配列要素を改変することである。例えば、近位配列エレメント（ＰＳＥ）は、ヒトＵ６プロモーターの活性に影響を及ぼすことが知られている（例えば、Ｄｏｍｉｔｒｏｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３１：２３４４−２３５２参照）。ヒトＵ６−１、Ｕ６−８またはＵ６−９プロモーターなどの強力なプロモーターに存在するＰＳＥエレメントを、ヒトＵ６−７プロモーターなどの弱いプロモーター由来のエレメントで置換すると、ハイブリッドＵ６−１、Ｕ６−８またはＵ６−９プロモーターの活性が低下する。
【０３００】
本開示のいくつかの例において有用なプロモーターは、組織特異的または細胞特異的であり得る。プロモーターについて用いられる「組織特異的」という用語は、異なる種類の組織（例えば肝臓）では同じ目的ヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しないのに対し、特定の種類の組織（例えば目または筋肉の組織）に目的とする核酸の選択的な転写を導くことができるプロモーターを指す。プロモーターについて用いられる「細胞特異的」という用語は、同じ組織内の異なる細胞では同じ目的ヌクレオチド配列の発現が相対的に存在しないのに対し、特定の種類の細胞において目的の核酸の選択的な転写を導くことができるプロモーターを指す。
【０３０１】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡの発現を増加させるための１つ以上のエンハンサーをさらに含み得る。本開示の実施例における使用に適切なエンハンサーには、ＣＭＶエンハンサー（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３１（１７）：ｅ１００）、および当業者に公知の他のエンハンサーが含まれる。
【０３０２】
さらなる例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲＮＡをコードする核酸に連結された転写ターミネーターを含み得る。複数のｓｈＲＮＡまたは複数のｓｈｍｉＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物の場合、各核酸に連結されたターミネーターは同一であっても異なっていてもよい。一例では、ターミネーターは、例えば、１つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下でｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物の場合など、４つ以上または５つ以上または６つ以上のＴ残基の連続ストレッチである。
【０３０３】
異なるプロモーターが使用されるいくつかの例では、ターミネーターは異なる場合があり、ターミネーターが由来する遺伝子由来のプロモーターに適合する。そのようなターミネーターには、ＳＶ４０ポリＡ、ＡｄＶ  ＶＡ１遺伝子、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、およびヒトｔ−ＲＮＡのターミネーターが含まれる。さらに、一般にＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーターおよびターミネーターで行われるように、プロモーターおよびターミネーターを混合して適合させてもよい。
【０３０４】
一例では、複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物中の配列／ターミネーター成分をコードするそれぞれのプロモーター／ＲＮＡ中のプロモーターおよびターミネーターは、成分間のＤＮＡ組換え事象の可能性を減少させるため、全て異なっている。
【０３０５】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、Ｕ６プロモーターに機能し得るように連結され、少なくとも４つのチミジン残基、例えば４つまたは５つまたは６つのチミジン残基、を含むターミネーターに連結された、本開示のｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。任意に、ｓｈＲＮＡをコードする配列はまた、単一のグアニンを含む転写開始因子に連結されていてもよい。
【０３０６】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーター、に機能し得るように連結された表５に記載の配列からなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、例えば少なくとも４つのチミジン残基（４つまたは５つまたは６つのチミジン残基など）を含む、ターミネーターに連結される。
【０３０７】
１つの例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０３０８】
別の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０３０９】
別の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【０３１０】
別の例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：（ｉ）プロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーター、に機能し得るように連結された表５に記載の配列を含むか、またはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列、および（ｉｉ）プロモーターに機能し得るように連結された本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡをコードする配列。一例では、（ｉ）の配列は、ターミネーター（例えば、少なくとも５つの連続したチミジン残基を含むもの）に連結されている。一例では、（ｉ）の配列は、ターミネーター（例えば、少なくとも５つのチミジン残基を含むもの）に連結されている。一例では、（ｉ）および（ｉｉ）の配列は、それぞれ、ターミネーター（例えば、少なくとも５つのチミジン残基を含むもの）に連結されている。
【０３１１】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および（ｉｉ）プロモーターおよび少なくとも４つのチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１２】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および９つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および（ｉｉ）プロモーターおよび少なくとも４つのチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１３】
一例では、本開示は、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：（ｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および（ｉｉ）プロモーターおよび少なくとも４つのチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された本開示の少なくとも１つの他のｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１４】
本開示はまた、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１５】
本開示はまた、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および
（ｉｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１６】
本開示はまた、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および
（ｉｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１７】
本開示はまた、複数のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、このｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；および
（ｉｉｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列。
【０３１８】
別の例では、本開示は、ｓｈＲＮＡをそれぞれコードする複数のｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物の少なくとも１つは、本開示のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物である。本開示の例示的なｓｈＲＮＡは記載されており、この例に準用されるものとする。
【０３１９】
一例では、本開示は、それぞれがｓｈＲＮＡをコードする配列を含む複数のｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物の少なくとも１つは、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物である。表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的である例示的なエフェクター配列が記載されており、本開示のこの例について準用されるものとする。例えば、少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉ構築物によってコードされるｓｈＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載の配列を含み得る、またはそれからなり得る（少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉ構築物によってコードされるｓｈＲＮＡの同族のエフェクター相補配列は、例えば、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含み得る、またはそれからなり得る）。
【０３２０】
別の例では、本開示は、それぞれがｓｈＲＮＡをコードする配列を含む複数のｄｄＲＮＡｉ構築物を提供し、それぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、表４の「エフェクター」と表示された列に記載のエフェクター配列を含むか、またはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。それぞれのｓｈＲＮＡの同族のエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列を含むかまたはそれからなり得る。複数のｄｄＲＮＡｉ構築物中の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、表４の「エフェクター相補体」と表示された列に記載のエフェクター相補配列と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことが本明細書に記載される。
【０３２１】
本開示の例示的な複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；ならびに
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３２２】
本開示の例示的な複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３２３】
本開示の例示的な複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；ならびに
（ｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３２４】
本開示の例示的な複数のｄｄＲＮＡｉ構築物は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；
（ｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１４に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号１５に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３２５】
本明細書に記載の例によると、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物の少なくとも１つは、表５に記載のｓｈＲＮＡをコードする配列を含み得る。表５に記載のｓｈＲＮＡをコードする配列は、プロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーターに機能し得るように連結されていてもよい。表５に記載のｓｈＲＮＡはそれぞれ、任意に、例えばＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写終結の結果として、ｓｈＲＮＡの３’末端に２つの連続したウラシル（ＵＵ）をさらに含み得る。
【０３２６】
一例では、本開示は、それぞれが本開示のｓｈＲＮＡをコードする配列を含む、２つ以上のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む複数のｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。例えば、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物はそれぞれ、プロモーター、例えばＵ６またはＨ１プロモーター、に機能し得るように連結された表５に記載のｓｈＲＮＡをコードする配列を含み得る。
【０３２７】
一例では、複数のｄｄＲＮＡ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；および
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；
【０３２８】
一例では、複数のｄｄＲＮＡ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；および
（ｉｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３２９】
一例では、複数のｄｄＲＮＡ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；および
（ｉｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３３０】
一例では、複数のｄｄＲＮＡ構築物は、以下を含む：
（ｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１６に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−９プロモーター）および６つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号１８に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物；および
（ｉｉｉ）Ｈ１プロモーターおよび５つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号２０に記載の配列を含むまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉ構築物。
【０３３１】
さらに、ｄｄＲＮＡｉ構築物またはそのそれぞれは、プロモーター、ｓｈＲＮＡコード配列および／またはターミネーターエレメントが容易に除去または置換されるように、戦略的に配置された１つ以上の多重クローニング部位および／またはユニークな制限部位を含み得る。ｄｄＲＮＡｉ構築物またはそのそれぞれは、戦略的に配置された制限部位および／または相補的な粘着末端を用いて、より小さいオリゴヌクレオチド成分から組み立て得る。本開示による１つのアプローチの基本ベクターは、全ての部位がユニークである多重リンカーを有するプラスミドを含む（これは絶対必要条件ではないが）。続いて、それぞれのプロモーターはその定められた固有の部位の間に挿入され、その結果、１つ以上のプロモーターを有する塩基カセットが得られ、その全ては可変性の配向を有し得る。続いて、再度、アニールしたプライマー対を個別のプロモーターそれぞれの下流のユニークな部位に挿入して、単一、二重または複数の発現カセット構築物を得る。インサートは、例えば、単一、二重または複数の発現カセット挿入物に隣接する２つのユニークな制限酵素部位（同一または異なるもの）を使用するＡＶＶ骨格である。
【０３３２】
構築物またはそのそれぞれの生成は、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製およびＤＮＡシーケンシングの標準的技法を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の好適な遺伝子操作技法により達成することができる。構築物またはそのそれぞれがウイルス構築物である場合、構築物は、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物をウイルス粒子にパッケージングするために必要な配列および／またはｄｄＲＮＡｉ構築物を標的細胞ゲノムに組み込むことを可能にする配列を含む。いくつかの例では、ウイルス構築物またはそのそれぞれは、ウイルスの複製および増殖を可能にする遺伝子をさらに含むが、このような遺伝子はｔｒａｎｓで供給される。さらに、ウイルス構築物カムまたはそのそれぞれは、天然型に組み込まれた、または改変された任意の公知の生物のゲノム由来の遺伝子または遺伝子配列を含む。例えば、ウイルス構築物は、細菌中の構築物の複製に有用な配列を含み得る。
【０３３３】
構築物またはそのそれぞれはまた、さらなる遺伝子エレメントを含み得る。構築物に含まれ得るエレメントのタイプは、決して限定されず、当業者によって選択され得る。例えば、さらなる遺伝子エレメントは、ＧＦＰまたはＲＦＰなど蛍光マーカータンパク質の１つ以上の遺伝子などのレポーター遺伝子；ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、もしくは分泌型胚性アルカリホスファターゼなどの簡単にアッセイできる酵素；またはホルモンもしくはサイトカインなどの免疫アッセイが容易にできるタンパク質を含む。
【０３３４】
本開示の実施形態における使用がされ得る他の遺伝子エレメントは、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコディック（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｄｉｃ）ホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼなどの選択的増殖優位性を細胞に与えるタンパク質をコードするもの、薬物耐性、あるいは栄養要求株にはない生合成能力を提供するタンパク質をコードする遺伝子を含む。レポーター遺伝子が構築物またはそのそれぞれと共に含まれる場合、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が含まれ得る。一例では、さらなる遺伝子エレメントは、独立したプロモーター／エンハンサーと機能し得るように連結され、それによって制御される。さらに、細菌または細胞培養物中の構築物の増殖につき好適な複製起点を用いてもよい。複製起点の配列は、一般に、ｄｄＲＮＡｉ構築物および他の遺伝子配列から分離されている。そのような複製起点は当技術分野で公知であり、ｐＵＣ、ＣｏｌＥ１、２−ミクロンまたはＳＶ４０複製起点を含む。
【０３３５】
発現構築物
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、発現構築物内に含まれる。
【０３３６】
一例では、発現構築物は発現ベクターである。
【０３３７】
一例では、発現ベクターは、例えば当技術分野で公知のものなどの、プラスミドである。一例では、好適なプラスミド発現ベクターは、ｐＡＡＶベクター、例えば、自己相補性ｐＡＡＶ（ｐｓｃＡＡＶ）プラスミドベクターまたは一本鎖ｐＡＡＶ（ｐｓｓＡＡＶ）プラスミドベクターである。本明細書に記載されるように、プラスミドは、例えば、本開示の１つ以上のＲＮＡの発現を駆動するために、１つ以上のＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターを含み得る。発現ベクターに含めるのに好適なＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターは、本明細書に記載されている。
【０３３８】
一例では、発現ベクターはミニサークルＤＮＡである。ミニサークルＤＮＡは、米国特許出願公開第２００４／０２１４３２９号に記載される。ミニサークルＤＮＡは、核酸転写物が持続的に高水準であるために有用である。環状ベクターは、発現−サイレンシング細菌配列を欠いていることを特徴とする。例えば、ミニサークルベクターは、複製起点を欠き、細菌プラスミド、例えばβ−ラクタマーゼ、ｔｅｔ等に一般的に見られる薬剤選択マーカーを欠いている点で、細菌プラスミドベクターとは異なる。結果として、ミニサークルＤＮＡはサイズが小さくなり、より効率的な送達が可能になる。
【０３３９】
一例では、発現ベクターはウイルスベクターである。
【０３４０】
本開示のｄｄＲＮＡｉを送達するために、任意の適切なウイルスに基づくウイルスベクターを用いてもよい。さらに、ハイブリッドウィルス系が有用であり得る。ウイルス送達系の選択は、送達の標的となる組織、系の形質導入効率、病原性、免疫学的および毒性の懸念などの種々のパラメータに依存する。
【０３４１】
遺伝子治療で一般的に使用されるウイルス系のクラスは、そのゲノムが宿主細胞クロマチンに組み込まれるか（レトロウイルスおよびレンチウイルス）、染色体外エピソームとして細胞核内に優勢的に残るか（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスおよびヘルペスウイルス）によって、２つのグループに分類することができる。一例では、本開示のウイルスベクターは、宿主細胞のクロマチンに組み込まれる。別の例では、本開示のウイルスベクターは、染色体外エピソームとして宿主細胞の核内に存続する。
【０３４２】
一例では、ウイルスベクターはパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリー由来である。パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）は、約５０００ヌクレオチド長のゲノムを有する小さな一本鎖、非エンベロープＤＮＡウイルスのファミリーである。ファミリーのメンバーには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が含まれる。一例では、本開示のウイルスベクターはＡＡＶである。ＡＡＶは、生産的感染サイクルを開始し維持するために、一般に別のウイルス（典型的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染を必要とする依存性パルボウイルスである。そのようなヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、レセプター媒介性の結合および内在化によって標的細胞に感染または形質導入する能力を依然として有し、非分裂細胞および分裂細胞の両方の核に浸透する。子孫ウイルスは、ヘルパーウイルスの非存在下ではＡＡＶ感染から産生されないため、形質導入の程度は、ウイルスに感染した初期細胞にのみ制限される。この特徴から、ＡＡＶは本開示の望ましいベクターとなる。さらに、レトロウイルス、アデノウイルスおよび単純ヘルペスウイルスとは異なり、ＡＡＶはヒトの病原性および毒性を欠いているようである（Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ．４２４：２５１）。ゲノムは通常２つの遺伝子のみをコードするため、送達ビヒクルとして、ＡＡＶが４．５一本鎖キロ塩基（ｋｂ）のパッケージング容量によって制限されることは驚くべきことではない。しかしながら、このサイズ制限は、置換遺伝子治療のために送達され得る遺伝子を制限し得るが、ｓｈＲＮＡなどのより短い配列のパッケージングおよび発現に悪影響を及ぼさない。
【０３４３】
一例では、ウイルスベクターはアデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターである。アデノウイルスは、２６〜４８ｋｂｐの線形ゲノムを有する中程度のサイズの二重鎖、非エンベロープＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、レセプター媒介性の結合および内在化によって標的細胞への侵入を得、非分裂細胞および分裂細胞の両方の核に浸透する。アデノウイルスは、生存および複製につき宿主細胞に大きく依存しており、宿主の複製機構を用いて脊椎動物細胞の核内で複製することができる。
【０３４４】
本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に有用な別のウイルス送達系は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスに基づく系である。レトロウイルスは、２つのユニークな特性を特徴とする一本鎖ＲＮＡ動物ウイルスを含む。第１に、レトロウイルスのゲノムは二倍体であり、ＲＮＡの２つのコピーからなる。第２に、このＲＮＡは、ビリオン関連酵素逆転写酵素によって二重鎖ＤＮＡに転写される。次いで、この二重鎖ＤＮＡまたはプロウイルスは宿主ゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムの安定に組み込まれた成分として、親細胞から子孫細胞へと引き継がれ得る。
【０３４５】
いくつかの例では、ウイルスベクターはレンチウイルスである。レンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルスグリコプロテイン（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｅａｔｉｔｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＶＳＶ−Ｇ）とシュードタイプ化されることが多く、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヒツジの脳炎（ビスナ）や肺炎の原因となるｖｉｓａｎ−ｍａｅｄｉ；ウマの自己免疫性溶血性貧血や脳症の原因となるウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコの免疫不全の原因となるネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシのリンパ節腫やリンパ球増加症の原因となるウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；および非ヒト霊長類で免疫不全や脳症の原因となるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来している。ＨＩＶに基づくベクターは、一般に、親ゲノムの５％未満を保持し、ゲノムの２５％未満がパッケージング構築物に組み込まれ、複製能を有する複製可能なＨＩＶの生成の可能性を最小にする。バイオセーフティは、ベクターの動員に必要とされるパッケージングシグナルの転写を排除し、下流の長鎖末端反復配列中の調節エレメントの欠失を含む自己不活性化ベクターの開発によってさらに増加した。レンチウイルスベクターの使用の主な利点の１つは、遺伝子導入が、形質導入された細胞の細胞分裂後でさえも、ほとんどの組織または細胞型において持続的であることである。
【０３４６】
本開示のＲＮＡを発現するために使用されるレンチウイルス系の構築物は、レンチウイルスの５’および３’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）由来の配列を含む。一例では、ウイルス構築物は、レンチウイルスからの不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲは、当技術分野で公知の任意の方法によって自己不活性化され得る。例えば、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１およびＮＦ−カッパＢ部位の欠失を含む。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスは不活性化５’ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、任意の種由来の任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列であってもよい。レンチウイルス系の構築物はまた、ＭＭＬＶもしくはＭＳＣＶ、ＲＳＶまたは哺乳動物遺伝子の配列を組み込んでもよい。さらに、レンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルス構築物中のプロモーター配列で置換され得る。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルス力価を増加させ得る。エンハンサー配列も含まれ得る。
【０３４７】
当業者に知られている他のウイルス系または非ウイルス系も、目的とする細胞に本発明のｄｄＲＮＡｉまたは核酸を送達するのに使用することができ、これは遺伝子欠失アデノウイルス−トランスポゾンベクター（Ｙａｎｔ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９９９−１００４参照）；シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルス由来の系（Ｐｅｒｒｉ，ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９８０２−９８０７参照）；ニューカッスル病ウイルスまたはセンダイウイルス由来の系を含むが、これに限定されるものではない。
【０３４８】
本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物の試験
細胞培養モデル
ＯＰＭＤの細胞培養モデルとして有用な細胞系の例は、正常Ａｌａ１０−ヒトＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ（Ａｌａ１０）または突然変異型Ａｌａ１７−ｈｕｍａｎＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ（Ａｌａ１７）（後者はＯＰＭＤの特徴である）を発現するベクターでトランスフェクトした実施例３に記載のＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、米国）である。
【０３４９】
ＯＰＭＤのための細胞培養モデルとして有用な細胞株の別の例は、正常Ａｌａ１０−ヒトＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ（Ａｌａ１０）または突然変異型Ａｌａ１７−ヒトＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ（Ａｌａ１７）のいずれかを発現するように安定にトランスフェクトされた初代マウス筋芽細胞（ＩＭ２）細胞株である。突然変異型Ａｌａ１７−ヒトＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ（Ａｌａ１７）を安定に発現する例示的なＩＭ２由来細胞株は、実施例３に記載のＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞株である。Ｈ２ｋＢ−Ｄ７ｅ細胞系は、Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７９（４）：１９８８−２０００にも記載されている。
【０３５０】
ＯＰＭＤの細胞培養モデルに好適な他の細胞株は、Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２３４１-２３５１、Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７：１２２６３−１２２６９、およびＡｂｕ−Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：２６０９-２６２３に記載のものなど、当技術分野で公知である。
【０３５１】
本明細書に例示されるように、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物の活性は、ＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物を細胞に投与し、続いてＰＡＢＰＮ１遺伝子によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定することによって決定される。例えば、細胞内ＰＡＢＰＮ１遺伝子発現は、ＰＡＢＰＮ１に特異的な１つ以上のプローブまたはプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、またはストリンジェントな条件下でのインサイツハイブリダイゼーションのいずれか１つ以上によってアッセイすることができる。細胞外ＰＡＢＰＮ１はまた、ＰＡＢＰＮ１  ＤＮＡに特異的な１つ以上のプローブまたはプライマーを用いるＰＣＲまたはＰＡＢＰＮ１タンパク質のＥＬＩＳＡのいずれかによってアッセイすることができる。
【０３５２】
ＰＡＢＰＮ１発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲまたは半定量的ＰＣＲ技術において使用され得るポリヌクレオチドは公知であり、市販されている（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。しかし、ＰＣＲ系の検出方法に有用なポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法および／またはソフトウェアを用いてＰＡＢＰＮ１つき利用可能な配列情報に基づいて設計され得る。一例では、ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡの存在または非存在は、当技術分野で公知の標準的な方法を用いてＲＴ−ＰＣＲを用いて検出することができる。一例では、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドまたはタンパク質の存在または非存在または相対量は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または当技術分野で利用可能な他の標準的な定量的または半定量的技術、またはこのような技術の組み合わせのうちのいずれか１つ以上を用いて検出され得る。ＰＡＢＰＮ１の抗体認識に依存する技術が企図され、例えば実施例３〜５に、記載されている。一例では、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの存在または非存在または相対量は、例えばＩｓｏｎｏｓｔｉｃ（商標）アッセイ（Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用して、捕捉したＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの電気泳動分解と組み合わせたＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの抗体捕捉を含む技術で検出してもよい。抗体は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質について市販されている。
【０３５３】
トランスフェクションまたは形質導入の効率および試料回収における差異を標準化するための様々な手段は、当技術分野で公知である。
【０３５４】
本開示のＲＮＡの非存在下でのＰＡＢＰＮ１によってコードされるｍＲＮＡ発現もしくはタンパク質のレベルまたはＰＡＢＰＮ１タンパク質の核内凝集体の量と比較して、ＰＡＢＰＮ１によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を減少させるか、またはＰＡＢＰＮ１タンパク質の核内凝集体の存在を減少させる本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物は、内因性ＰＡＢＰＮ１の発現を低下させ、内在性ＰＡＢＰＮ１の一部または全部を、本明細書に記載のＯＰＭＤの原因ではないＰＡＢＰＮ１タンパク質で置換することによって、ＯＰＭＤを処置するなどの治療用途に有用であると考えられる。
【０３５５】
動物モデル
ＯＰＭＤの研究に利用可能ないくつかの小型動物モデルがあり、その例は、Ｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌｏｇｉｃａ，２４（２）：８４−８８およびＣｈａｒｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎｅｌｉｇ（２０１３）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０：ｅ１０３−１０７に記載されている。例示的な動物モデルは、本明細書の実施例４および５に記載の、ならびに以前にＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：６７２-６７７およびＴｒｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１１）：２１９１−２２０７に記載されている、Ａ１７．１トランスジェニックマウスモデルである。
【０３５６】
前述の動物モデルのいずれかを使用して、ＰＡＢＰＮ１遺伝子によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質のノックダウン、減少または発現阻害に対する本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物の有効性を決定することができる。
【０３５７】
細胞内および細胞外ＰＡＢＰＮ１遺伝子発現をアッセイするための方法は、細胞モデルに関して本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されるものとする。
【０３５８】
機能性ＰＡＢＰＮ１の置換剤
一例では、本開示は、例えば細胞または動物に対する、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換剤を提供する。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、ＯＰＭＤの原因ではなく、本開示のＲＮＡによって標的化されるｍＲＮＡ転写物によってコードもされない。
【０３５９】
一例では、細胞または動物に対する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換剤は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡなど）である。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はコドン最適化されていてもよく、例えば、野生型ＰＡＢＰＮ１核酸に対して１つ以上の縮重塩基またはゆらぎ塩基を含むが同一アミノ酸をコードし、その結果、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする、対応するｍＲＮＡ配列は、本開示のＲＮＡによって認識されない。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、本開示のＲＮＡによって標的化される領域内の野生型ＰＡＢＰＮ１核酸と比較して、１つ以上の縮重塩基またはゆらぎ塩基を含み得る。一例では、１つ以上の縮重塩基またはゆらぎ塩基は、本開示のＲＮＡのシード領域内に存在する。
【０３６０】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、その対応するｍＲＮＡ配列が本開示のＲＮＡによって認識されないようにコドン最適化される。例えば、コドン最適化核酸配列によってコードされる機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、すなわち野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列を含み得る。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質、例えば配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質、の置換剤は、配列番号２４に記載の配列を含む核酸である。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまた、コザック配列を含み得る。
【０３６１】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、エピトープタグ、例えばＭｙｃ−タグに付加されるか、またはこれを含む。例えば、Ｍｙｃ−タグを含む機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み得る。この例によると、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換剤は、配列番号２６に記載の配列を含む核酸であってもよい。
【０３６２】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現に好適なプロモーターに機能し得るように連結されている。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸との使用に好適な例示的なプロモーターの１つは、ＳｐＣ５１２プロモーターである。しかし、当技術分野で公知の任意の適切なプロモーターを使用してもよい。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と共に使用するための他の好適なプロモーターは、米国特許出願公開第２０１１／０２１２５２９Ａ１号明細書に記載されている。
【０３６３】
本明細書に記載されるように、本開示のいくつかの例において有用なプロモーターは、組織特異的または細胞特異的であり得る。
【０３６４】
一例では、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質およびその対応するｍＲＮＡ転写物の発現を増加させるための１つ以上のエンハンサーをさらに含み得る。本開示のこの例における使用に適したエンハンサーは、当業者に公知となる。
【０３６５】
機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、発現ベクター内に含まれ得る。例示的な発現ベクターは、本開示のＲＮＡおよびｄｄＲＮＡｉ構築物の文脈において記載されており、この実施例に準用されるものとする。
【０３６６】
したがって、一例では、細胞または動物に対する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換剤は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターであり得る。例えば、本開示の発現ベクターは、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸、例えば配列番号２４に記載の配列、およびその発現のためのプロモーター、例えばＳｐＣ５１２プロモーターを含み得る。一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸はまた、コザック配列を含み得る。したがって、本開示の発現ベクターは、その５’末端にコザック配列を有する配列番号２４に記載の配列を含み得る。
【０３６７】
一例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質、例えば配列番号２５に記載の配列を有するもの、の置換剤は、配列番号２４に記載の配列を含むかまたはそれからなるコドン最適化核酸である。一例では、コドン最適化核酸はさらにコザック配列を含む。したがって、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換剤は、その５’末端にコザック配列を含む配列番号２４に記載の配列を含むか、またはそれからなる核酸であってもよい。
【０３６８】
一例では、本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、プラスミド発現ベクター内に含まれ得る。好適なプラスミド発現ベクターは本明細書に記載されており、当技術分野で公知となる。一例では、好適なプラスミド発現ベクターは、ｐＡＡＶベクター、例えば、ｐｓｃＡＡＶプラスミドベクターまたはｐｓｓＡＡＶプラスミドベクターである。
【０３６９】
一例では、発現ベクターはミニサークルＤＮＡである。ミニサークルＤＮＡベクターは本明細書に記載される。
【０３７０】
一例では、発現ベクターはウイルスベクターである。例えば、任意の適切なウイルスに基づくウイルスベクターは、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を送達するために使用され得る。さらに、ハイブリッドウィルス系が有用であり得る。ウイルス送達系の選択は、送達の標的となる組織、系の形質導入効率、病原性、免疫学的および毒性の懸念などの種々のパラメータに依存する。
【０３７１】
細胞または動物への遺伝物質の送達のための例示的なウイルス系は、本開示のＲＮＡおよびｄｄＲＮＡｉ構築物の文脈で記載されており、この例に準用されるものとする。
【０３７２】
一例では、ウイルスベクターはＡＡＶである。
【０３７３】
一例では、ウイルスベクターはＡｄＶベクターである。
【０３７４】
一例では、ウイルスベクターはレンチウイルスである。
【０３７５】
当業者に公知の他のウイルス系または非ウイルス系を、目的とする細胞に本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を送達するのに使用してもよく、これは遺伝子欠失アデノウイルス−トランスポゾンベクター（Ｙａｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９９９−１００４参照）；シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルス由来の系（Ｐｅｒｒｉ，  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９８０２−０７参照）；ニューカッスル病ウイルスまたはセンダイウイルス由来の系を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３７６】
本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸が本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物と共に提供される例によると、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、ｄｄＲＮＡｉ構築物と同じ発現ベクター内に含まれ得る。
【０３７７】
本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸および本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物が一緒に提供される別の例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸およびｄｄＲＮＡｉ構築物は、異なる発現ベクター内に含まれ得る。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質およびｄｄＲＮＡｉ構築物をコードするコドン最適化核酸が異なる発現ベクター内に含まれる場合、それぞれの発現ベクターは、同じタイプのベクターであってもよいし、異なるタイプのベクターであってもよい。
【０３７８】
機能性ＰＡＢＰＮ１の試験
細胞培養モデル
例示的なＯＰＭＤの細胞培養モデルが本明細書に記載され、実施例３に記載される。このようなＯＰＭＤの細胞培養モデルは、内因性ＰＡＢＰＮ１を標的とする本開示の１つ以上のＲＮＡの存在下で、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を置換する本開示の薬剤の能力を評価するために使用され得る。
【０３７９】
ＰＡＢＰＮ１タンパク質の存在または非存在または相対量を検出する例示的な方法も記載されており、この例に準用する。例えば、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の存在または非存在または相対量は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または当技術分野で利用可能な他の標準的な定量的または半定量的技術、またはこのような技術の組み合わせのうちのいずれか１つ以上を用いて検出され得る。ＰＡＢＰＮ１の抗体認識に依存する技術が企図され、本明細書に記載される（実施例３など）。突然変異型および機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、市販の適切な抗体を用いて突然変異型および機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の差別的検出を容易にするために、適切なタンパク質タグ、例えば、ｍｙｃタグまたはフラグタグと共に発現され得る。例えば、突然変異型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質は、ＦＬＡＧタグを伴って発現し、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含み得る。このようにして、本開示のＲＮＡおよび本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の置換薬による細胞のトランスフェクションまたは形質導入後の細胞において、突然変異型および機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の両方の有無または相対量が独立して検出され得る。
【０３８０】
一例では、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの存在または非存在または相対量は、例えばＩｓｏｎｏｓｔｉｃ（商標）アッセイ（Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用して、捕捉したＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの電気泳動分解と組み合わせたＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの抗体捕捉を含む技術で検出してもよい。抗体は、ＰＡＢＰＮ１タンパク質について市販されている。
【０３８１】
本開示のＲＮＡの存在下で（すなわち、本明細書に記載のＲＮＡｉ試薬の存在下で）ＯＰＭＤの原因ではないＰＡＢＰＮ１タンパク質を細胞内で発現する本開示の薬剤は、ＯＰＭＤの処置に有用であると考えられる。
【０３８２】
動物モデル
ＯＰＭＤを研究するための例示的な動物モデルが記載されている。ＯＰＭＤを研究するための例示的な動物モデルも、実施例４および５に記載される。
【０３８３】
前述の動物モデルのいずれかを使用して、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物の存在下、インビボで機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を置換する本開示の薬剤の有効性を決定することができる。
【０３８４】
細胞内および細胞外ＰＡＢＰＮ１発現をアッセイするための方法は、細胞モデルに関して本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されるものとする。
【０３８５】
一例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物の存在下、インビボで機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を置換する本開示の薬剤の有効性を決定するために、実施例５に記載の組織学的および形態学的分析が用いられ得る。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をインビボで置換するための本開示の薬剤の有効性を決定するために使用され得るさらなるアッセイは、Ｔｒｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１１）：２１９１−２２０７に記載される。
【０３８６】
組成物および担体
いくつかの例において、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターは、組成物中に提供される。いくつかの例では、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、組成物中に提供される。いくつかの例において、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターは、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と共に組成物中に提供される。
【０３８７】
本明細書に記載されるように、発現ベクターは、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を単独で、または本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸と組み合わせて含み得る。したがって、本明細書の発現ベクターおよび／またはそれを含む組成物への言及は、以下を包含するものと考えられる：（ｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物またはそれを含む組成物、を含む発現ベクター；（ｉｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物および本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸もしくはそれを含む組成物、を含む発現ベクター；または（ｉｉｉ）本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸またはそれを含む組成物、を含む発現ベクター。
【０３８８】
一例によると、本開示の組成物は、（ｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクター、および（ｉｉ）本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターを含み得る。
【０３８９】
あるいは、本開示の組成物は、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物および本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターを含み得る。
【０３９０】
さらに別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクターを１つの組成物中に提供してもよく、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターを、例えば一緒にパッケージ化された、別の組成物中に提供してもよい。
【０３９１】
本開示の組成物はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体または希釈剤を含み得る。例えば、組成物は、投与後の対象の筋肉への本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターの送達に好適な担体を含み得る。
【０３９２】
いくつかの例において、担体は、脂質系担体、カチオン性脂質、またはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子またはそれらの混合物である。
【０３９３】
いくつかの例では、担体は、カチオン性ポリマー−核酸複合体が形成されるような生分解性ポリマー系担体である。例えば、担体は、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターを筋細胞に送達するのに好適なカチオン性ポリマー微粒子であってもよい。細胞への送達組成物のためのカチオン性ポリマーの使用は、Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５：４５７−４６２に記載されているように、当技術分野で公知であり、この内容は参照として本明細書に援用する。例示的なカチオンポリマー系の担体は、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマー、例えばポリエチレンイミンである。本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターとの複合体化および送達に好適な他のカチオン性ポリマーには、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマーおよびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）が含まれる。これらは、当技術分野で公知であり、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｉｎｋ，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１：１０−１２、国際公開第２００３／０９７１０７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０４１６１７号パンフレットに記載され、その全内容は参照として本明細書に援用する。このような担体製剤は、非経口皮下注射、静脈内注射および吸入を含む様々な送達経路用に開発されている。
【０３９４】
さらなる例では、担体は、シクロデキストリンポリマー−核酸複合体のようなシクロデキストリン系の担体である。
【０３９５】
さらなる例では、担体は、カチオン性ペプチド−核酸複合体などのタンパク質系の担体である。
【０３９６】
別の例では、担体は脂質ナノ粒子である。例示的なナノ粒子は、例えば米国特許７５１４０９９号明細書に記載される。
【０３９７】
いくつかの例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現構築物は、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ（例えば４０／４８／２／１０の比率）、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ（例えば４０／４８／２／１０の比率）、またはカチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ（例えば６０／３８／２の比率）を含む脂質ナノ粒子組成物と一緒に製剤化される。いくつかの例では、カチオン性脂質は、ＤＭＡ中のＯｃｔｙｌ  ＣＬ、ＤＭＡ中のＤＬ、Ｌ−２７８、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、またはＭＣ３である。
【０３９８】
別の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現構築物は、国際公開第２０１０／０２１８６５号パンフレット；国際公開第２０１０／０８０７２４号パンフレット；国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット；国際公開第２０１０／１０５２０９号パンフレットまたは国際公開第２０１１／０２２４６０号パンフレットに記載のカチオン性脂質処方物のいずれかと共に製剤化される。
【０３９９】
別の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現構築物は、例えばＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現構築物の送達を容易にするために、別の化合物にコンジュゲートまたは複合体化される。そのようなコンジュゲートの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００８／０１５２６６１号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１６２２６０号明細書に記載されている（例えば、ＣＤＭ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐｉｐ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−ＰＥＧ、ＣＤＭ−ＮＡＧなど）。
【０４００】
別の例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現ベクターに共有結合される。結合したＰＥＧは、任意の分子量、例えば、約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）であり得る。
【０４０１】
さらに他の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターは、例えば、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット；国際公開第９６／１０３９０号パンフレット；または国際公開第９６／１０３９２号パンフレットに開示されているものなどの、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、または血中滞留型リポソームまたはステルスリポソーム）を含む担体と一緒に製剤化される。
【０４０２】
いくつかの例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターは、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−ｔｒｉ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などの、ポリエチレンイミンまたはその誘導体と一緒に製剤化または複合体化することもできる。
【０４０３】
他の例において、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターは、米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号明細書に記載されているものなどの膜破壊剤と複合体化される。
【０４０４】
他の担体には、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４または国際公開０３／４６１８５号パンフレット参照）、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第２００２１３０４３０号明細書参照）が含まれる。
【０４０５】
組成物は、望ましくは、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターの生物学的安定性を増加させる物質、ならびに／または筋肉細胞に選択的に局在化および／もしくは浸透する組成物の能力を増加させる物質を含む。本開示の治療用組成物は、投与の様式および経路、ならびに標準的な薬学的実務に基づいて選択される、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）で投与され得る。当業者は、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターを含む医薬組成物を容易に製剤化することができる。いくつかの場合には、等張剤が使用される。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含み得る。いくつかの場合には、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの場合において、血管収縮剤が製剤に添加される。本開示による組成物は、滅菌され、発熱性物質を含まないように提供される。好適な薬学的担体、および医薬製剤に用いられる薬学的に必要な物質は、本分野の標準的な参照資料であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（旧Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、およびＵＳＰ／ＮＦに記載される。
【０４０６】
医薬組成物の量、濃度、および製剤、ならびに用量レジメンは、炎症反応などの毒性を最小化しながら細胞送達を最大化するよう、個別調整することができ、例えば、所望により、活性成分が低濃度となる比較的大きな体積（５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌまたはそれ以上）、およびコルチコステロイドなどの抗炎症性化合物の含有を利用してもよい。
【０４０７】
本開示の組成物は、任意の好適な経路による投与のために製剤化され得る。例えば、投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口ならびに経皮または吸入または座薬が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的な投与経路には、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、経口、腹腔内、皮内、動脈内および皮下注射が含まれる。一例では、本開示の組成物は、ＩＭ投与のために製剤化される。そのような組成物は、医薬用途に有用であり、非経口投与用の、例えば、ＩＭ、静脈内（静脈内注入を含む）、ＳＣおよび腹腔内投与用の、好適な滅菌非発熱性ビヒクル、例えば注射用緩衝食塩水中で容易に製剤され得る。ＩＭ、ＩＶ注射または注入などのいくつかの投与経路は、本開示のＰＡＢＰＮ１をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物および／またはコドン最適化核酸の筋肉組織への効率的送達およびトランスフェクション、ならびにＲＮＡおよび／またはその中のコドン最適化核酸の発現を達成し得る。
【０４０８】
処置方法
一例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物は、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質を含む内因性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を対象において阻害するために使用され得る。
【０４０９】
一例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物は、ＯＰＭＤを処置するために、これに罹患している対象において使用され得る。同様に、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物は、ＯＰＭＤの１つ以上の症状の、それに罹患しているまたはその素因がある対象における発症または進行を予防するために使用され得る。
【０４１０】
上記の例それぞれにおいて、本開示の発現ベクターおよび／または組成物は、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物および本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸の両方を含み得る。したがって、発現ベクターまたは組成物の投与は、（ｉ）ＯＰＭＤの原因である拡大ポリアラニン管を含むＰＡＢＰＮ１タンパク質を含む内因性ＰＡＢＰＮ１の発現の阻害、減少またはノックダウン、および（ｉｉ）内在性ＰＡＢＰＮ１の発現を阻害、減少またはノックダウンするＲＮＡによって標的化されていない機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現の提供、に有効であり得る。したがって、本開示の組成物は、それが投与される細胞または動物において、ＰＡＢＰＮ１タンパク質機能、例えば、ＲＮＡの転写後プロセシングを阻害する。
【０４１１】
別の例では、ＯＰＭＤの処置は、対象に、（ｉ）ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤、および（ｉｉ）本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸またはそれを含む組成物、を含む発現ベクター、を別個に投与することを含み得る。本明細書に記載されるように、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤は、本開示のものを含むＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物であり得る。対象には、成分（ｉ）および（ｉｉ）を一緒に、同時にまたは連続的に投与し得る。
【０４１２】
例えば、ＯＰＭＤの処置は、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を対象に投与することを含み得、ここで、対象は、ＯＰＭＤの原因であるがコドン最適化核酸の発現を阻害しないＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１つ以上の薬剤が予め投与されている。例えば、対象は、本開示のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数のｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび／または組成物を予め投与されていてもよい。
【０４１３】
上記のように、投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口ならびに経皮または吸入または座薬が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的な投与経路には、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、経口、腹腔内、皮内、動脈内および皮下注射が含まれる。ＩＭ、ＩＶ注射または注入などのいくつかの投与経路は、本開示のＰＡＢＰＮ１をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物および／またはコドン最適化核酸の筋肉組織への効率的送達およびトランスフェクション、ならびにＲＮＡおよび／またはその中のコドン最適化核酸の発現を達成し得る。
【０４１４】
当業者は、ルーチン的実験によって、ＯＰＭＤに罹患している対象を処置するために必要とされるであろう本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物の有効な非毒性量を決定することができるであろう。任意の特定の患者の治療有効量レベルは、医学において周知の他の関連因子と共に、使用される組成物；患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食事；投与時間；投与経路；本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物の隔離速度；処置の持続時間、を含む様々な因子に依存する。
【０４１５】
本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物の、ＯＰＭＤの原因であるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を減少させまたは阻害し、ＰＡＢＰＮ１の機能を回復させるのに十分な量でＯＰＭＤの原因ではない機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現する効果は、処置された対象における筋肉収縮特性および／または嚥下困難を評価することによって決定され得る。嚥下能力および筋肉収縮特性を試験するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、嚥下障害は、ビデオ蛍光透視法、ＵＧＩ内視鏡検査または食道圧マノメータ検査およびインピーダンス試験を用いて評価してもよい。ＯＰＭＤの臨床的特徴を評価するための他の方法は、Ｒｕｅｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ，．（２００５）Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｗｅｅｋｌｙ，１３５：５７４−５８６に記載されている。
【０４１６】
キット
本開示はまた、キットにおける本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物を提供する。キットは、容器を含み得る。キットは、典型的には、その投与のための説明書と共に、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物を含む。いくつかの例では、キットは、１つより多い本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現ベクターまたは組成物を含む。一例では、キットは、以下を含む：（ｉ）第１のキット構成要素として、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターまたは組成物、および（ｉｉ）第２のキット構成要素として、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターまたはそれを含む組成物。第１および第２のキットの構成要素は、キットに一緒にパッケージ化されてもよい。
【０４１７】
【表１】
2019513395.tif 000003
【０４１８】
【表２】
2019513395.tif 000004
【０４１９】
【表３】
2019513395.tif 000005
【０４２０】
【表４】
2019513395.tif 000006
【０４２１】
【表５】
2019513395.tif 000007
【実施例】
【０４２２】
実施例１−ＰＡＢＰＮ１を標的とするｄｓＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの設計
公に入手可能なｓｉＲＮＡ設計アルゴリズム（Ａｍｂｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＯｒｉｇｅｎｅおよびＭＷＧを含む）を用いて、ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ配列からｄｄＲＮＡｉ構築物の設計のために潜在的標的を表す配列を同定した。ヒト、ウシおよびマウスにおいて、保存された配列を選択した。ｓｉＲＮＡを合成し、これらにつきインビトロで試験し、ｄｄＲＮＡｉ構築物への変換のために３つの活性ｓｉＲＮＡを選択した。二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の設計の標的として選択された領域に対応するｍＲＮＡ転写物を表１に示す。
【０４２３】
表１に記載の標的領域に実質的に相補的なエフェクター配列を含むｄｓＲＮＡを設計し、検証した（表３）。ヒトＰＡＢＰＮ１をダウンレギュレートするためのｓｉＲＮＡ配列のスクリーニングは、内因性ヒトＰＡＢＰＮ１が構成的に発現されるＨｅＬａ細胞で行われた。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。簡潔には、トランスフェクションの日に、１２ウェルプレート中の培地を、抗生物質を含まない４００μｌの無血清培地および１００μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｓｉＲＮＡ複合体で置換した。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｓｉＲＮＡ複合体１００μｌ中、Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）７μｌ中のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３μｌおよびＯｐｔｉ−Ｍｅｍ８７μｌ中の６０ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを一緒に混合し、最終容量を１００μｌとした。混合物を室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクションの４時間後、各ウェルに３０％ＦＢＳを含む２５０μｌの培地を添加した。最終ｓｉＲＮＡ濃度は８０ｎＭであった。トランスフェクションの４８時間後にＲＮＡ抽出を行った。表１に記載の標的領域に対して試験した全てのｓｉＲＮＡ配列は、ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＢＰＮ１の実質的なノックダウンを示した。試験したｓｉＲＮＡのうち、異なる有効度を示す３つの配列（表３のｄｓＲＮＡ１、２および３）。これらは、健康な個体またはＯＰＭＤに罹患した個体からのヒト筋芽細胞においても評価された。簡潔には、健常な個体またはＯＰＭＤに感染した個体由来のヒト筋芽細胞を、上記の方法に従ってｄｓＲＮＡ１、ｄｓＲＮＡ２またはｄｓＲＮＡ３でトランスフェクトした。次いで、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、それぞれのｄｓＲＮＡについて有意なレベルのノックダウンを示した（図１）。
【０４２４】
表１に記載の標的領域と実質的に相補的なエフェクター配列を含むｄｓＲＮＡ１〜３に対応するｓｈＲＮＡを設計した。これを表４に示す。エフェクター配列、ステムループ配列およびエフェクター相補配列（５’−３’配向）をそれぞれ含む、表４のｓｈＲＮＡの完全配列を、表５に示す。
【０４２５】
実施例２−ＰＡＢＰＮ１を標的とするｓｈＲＮＡを発現する自己相補性ＡＡＶ系プラスミド構築物およびウイルスの生成
ＰＡＢＰＮ１を標的とするｓｈＲＮＡの１つまたは３つを発現する自己相補性アデノ随伴ウイルス２型（ｓｃＡＡＶ２）プラスミドを、ＰＡＢＰＮ１を標的とするｓｈＲＮＡの１つまたは３つをｃＡＡＶ２骨格にサブクローニングすることによって生成した。
【０４２６】
簡潔には、Ｈ１プロモーターの制御下でｓｈＲＮＡ５（配列番号２０）をコードするＤＮＡを含む単一のｓｈＲＮＡ構築物をｐＡＡＶ２ベクター骨格（ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５）にクローニングした。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６１、Ｕ６９およびＨ１の制御下で、ｓｈＲＮＡ１（配列番号１６）、ｓｈＲＮＡ３（配列番号１８）およびｓｈＲＮＡ５（配列番号２０）をコードするＤＮＡを含む２つの三重ｓｈＲＮＡ構築物も産生され、それぞれｐＡＡＶ２ベクターの骨格にクローニングされた。これらの三重構築物は、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔ（配列番号２２）およびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ（配列番号２３）であった。両方の変異体は記載したトリシストロンｓｈＲＮＡ構築物を含んでいたが、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇにおける構築物はまた、ＡＡＶパッケージングに最適なインサートサイズを作り出すためのスタッファーＤＮＡ配列を含んでいた。同様に、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子（ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ）に対しｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶウイルスプラスミドを対照として使用するために構築した。
【０４２７】
さらに２つのプラスミドを産生し、１つは、７つのアラニン伸長を含むＦＬＡＧタグ付き突然変異型ヒトＰＡＢＰＮ１をコードし（ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ；配列番号２７）、他方は、ＭＹＣタグを有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１をコードするコドン最適化配列を含んでいた（ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣ；配列番号２６）。
【０４２８】
ＡＡＶベクターはそれぞれ、ＡＡＶ８キャプシドにおけるシュードタイプ化によって産生された。
【０４２９】
次いで、組換えシュードタイプＡＡＶベクターストックを生成した。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地中のローラーボトル中で培養し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。この例に記載のｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡウイルスプラスミドおよびｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒｃａｐ８プラスミド（ｐＤＰ８ｒ）またはｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒｃａｐ９プラスミド（ｐＤＰ９ｒｓ）のそれぞれを、製造者の説明書に従ってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化させた。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔまたはｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｐＤＰ８ｒ（またはｐＤＰ９ｒｓ）の１つを用いて二重トランスフェクションを行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間培養した後、細胞を溶解し、それぞれのウイルスプラスミドのｓｃＡＡＶ  ｓｈＲＮＡ発現粒子をイオジキサノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ステップ勾配超遠心分離で精製した。ベクターゲノムの数は、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）によって定量した。
【０４３０】
ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔ、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣと称されるウイルスプラスミドについて、対応するｓｃＡＡＶ８ウイルス調製物は、それぞれｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡ５、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔ、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ、ｓｃＡＡＶ８−ＨＢＶｐｏｌ、ｓｓＡＡＶ８  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧおよびｓｓＡＡＶ９−Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣと称された。
【０４３１】
実施例３−インビトロでのＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシング
この実施例は、インビトロでＰＡＢＰＮ１の発現をノックダウンするための、実施例２において産生されたＰＡＢＰＮ１  ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡプラスミドの能力を実証する。
【０４３２】
細胞
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグルタミン（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｙｅｏｖｉｌ、ＵＫ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＵＳＡ）を増殖させた。
【０４３３】
温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原（ｔｓＡ５８）導入遺伝子で不死化し、Ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈ２ｋＢ−ＩＭ２（親細胞株）、Ｈ２ｋＢ−ＷＴＡ（ヒト野生型ＰＡＢＰＮ１をコードする）およびＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅ（７アラニン伸長ＰＡＢＰＮ１をコードする）から誘導された、初代マウス筋芽細胞（クローンＩＭ２）は、Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ＬｏｎｄｏｎのＭｉｃｈａｅｌ  Ａｎｔｏｎｉｏｕ博士によって提供された。ＩＭ２細胞を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミンを含み、２０％ＦＢＳ、０．５％ニワトリ胚抽出物、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミンおよび２０Ｕ／ｍｌインターフェロン−γを添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。
【０４３４】
処置
簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３ｘ１０５細胞／ウェルで播種し、翌日、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔまたはｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ（４μｇ／ウェル）のうち１つで、突然変異型ｈＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ（ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧ）（４μｇ／ウェル）（配列番号２７）またはコドン最適化ＰＡＢＰＮ１（ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣ）（４μｇ／ウェル）（配列番号２６）を発現するＡＡＶプラスミドを伴いまたは伴わず、トランスフェクションした。対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子（４μｇ／ウェル）に対しｓｈＲＮＡを発現するｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌプラスミドでトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗生物質の非存在下、ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳ中、３３℃で４８時間インキュベートし、その後、細胞を回収し、ウェスタンブロッティングによる分析のために細胞溶解物を産生した。
【０４３５】
同様に、Ｈ２ｋＢ−Ｄ７ｅマウス筋芽細胞（１０６細胞／ウェル）を、突然変異型ｈＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧまたはＯｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣを発現するＡＡＶプラスミド（１μｇ／ウェル）を伴いまたは伴わず、ｐＡＡＶ−ＨＢＶｐｏｌ、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔまたはｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇによるヌクレオフェクションにより、トランスフェクトした。次いで、Ｈ２ｋＢ−Ｄ７ｅマウス筋芽細胞を、抗生物質の非存在下、ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳ中、３３℃で４８時間インキュベートし、次いで、ＤＭＥＭ／５％ウマ血清中でさらに７２時間インキュベートすることによって分化に切り替えた。トランスフェクションの５日後、筋管を採取し、ウェスタンブロッティングによる分析のために細胞溶解物を作製した。
【０４３６】
ウェスタンブロット分析
ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で細胞をホモジナイズすることにより細胞溶解物を調製した（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【０４３７】
タンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、０．１Ｍ  ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％ミルク中でのインキュベーションによりブロックしたニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ニトロセルロース膜をハウスキーピング対照としてＰＡＢＰＮ１（ａｂｃａｍ、１／１０，０００）およびヒトＧＡＰＤＨ（ａｂｃａｍ、１／１０，０００）またはマウスＧＡＰＤＨ（ａｂｃａｍ、１／２５００）に対して得た一次抗体で染色した。
【０４３８】
ｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧベクターよって発現した伸長突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質、およびｐＡＡＶ  ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣベクターによって発現したコドン最適化ＰＡＢＰＮ１タンパク質を検出するため、ニトロセルロース膜を抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、１／１０，０００）および抗ｃＭＹＣ抗体（Ａｂｃａｍ、１／１０，０００）でそれぞれ染色した。
【０４３９】
ニトロセルロース膜をさらにＨＲＰ結合抗ウサギおよび抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ、それぞれ１／２０００および１／１０００）と共にインキュベートした。免疫反応性バンドは、増強化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出し、膜をＥＣＬ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に暴露することによって視覚化した。
【０４４０】
ＩｍａｇｅＪを用いたＧＡＰＤＨに対するＰＡＢＰＮ１の全ノックダウンの定量を図２に示す。図２から明らかであるように、単一ｓｈＲＮＡベクター（ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５）、トリシストロン短鎖ベクター（ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔ）およびトリシトロン（ｔｒｉｃｉｔｒｏｎｉｃ）長鎖ベクター（ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ）を用いて、平均で４０％、９０％および９５％のＰＡＢＰＮ１発現ノックダウン達成された。ＰＡＢＰＮ１遺伝子内の同じ標的に対して導かれる配列組成の類似性に起因して、短鎖（約１Ｋｂのインサートサイズ）および長鎖（約１．５ｋｂのインサートサイズ）トリシストロンｓｈＲＮＡ構築物は、同程度のＰＡＢＰＮ１ノックダウンを生じた。この点に関して、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ構築物へのスタッファー配列の付加は、ＰＡＢＰＮ１ノックダウン効率に悪影響を及ぼさず、むしろわずかに高いノックダウンを生じた。
【０４４１】
単一のｓｈＲＮＡベクター（ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ５）および両方のトリシストロンベクター（ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｓｈｏｒｔおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ）は、突然変異型ＰＡＢＰＮ１を発現しているｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧと同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、野生型および突然変異型ＰＡＢＰＮ１をノックダウンすることができたが、全体的ノックダウンは、単一のｓｈＲＮＡ構築物の場合よりも三重ｓｈＲＮＡ構築物の場合の方が、統計的に有意であった。一方、突然変異型ＰＡＢＰＮ１を発現するｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧベクターおよびＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を標的とするｐＡＡＶ−ＨＢＶ−ｐｏｌ対照ベクターを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では、ノックダウンは観察されなかった（図３ａおよび３ｂ）。
【０４４２】
さらに、伸長突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現するｐＡＡＶ  ｍｕｔ−ＰＡＢＰＮ１−ＦＬＡＧベクターで同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と比較して、コドン最適化ＰＡＢＰＮ１を発現するｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣベクターで同時トランスフェクトした細胞は、良好なレベルのＰＡＢＰＮ１タンパク質を示した。これらのデータは、コドン最適化ＰＡＢＰＮ１タンパク質が、単一およびトリシストロンｓｈＲＮＡ構築物によって発現されるｓｈＲＮＡによる分解に対し耐性を有することを実証する（図３ａおよび３ｂ）。この観察を確認するために、ｃＭＹＣ抗体を用いて、ｃＭＹＣペプチドタグを含むコドン最適化ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を検出した（図３ｃ）。
【０４４３】
同様の結果が、（ｉ）ｐＡＡＶ−ＨＢＶ−ｐｏｌ対照ベクター、（ｉｉ）コドン最適化ＰＡＢＰＮ１を発現するｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣベクター、（ｉｉｉ）ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇベクター、または（ｉｖ）ｐＡＡＶ  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ＭＹＣベクターおよびｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇベクター、のいずれかでトランスフェクトされたＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅマウスの筋芽細胞において得られた。図４ａ〜４ｅから明らかなように、ｐＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇベクターは、分化したＨ２ｋＢ−Ｄ７ｅマウス筋芽細胞によって発現される突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質をノックダウンすることができた一方、コドン最適化ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、トリシストロンｓｈＲＮＡ構築物によって発現されるｓｈＲＮＡによる分解に対して耐性を有していた。
【０４４４】
全てのデータは、平均値±平均値の標準誤差として提示される。全ての統計解析はスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて行った。差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１または＊＊＊Ｐ＜０．００１で有意であると判断された。
【０４４５】
これらのデータに基づいて、ｐＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇの構築物をウイルス産生およびさらなる評価のために採取した。
【０４４６】
実施例４−内在性ＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシングおよびインビボでのコドン最適化ＰＡＢＰＮ１による置換
この実施例は、実施例２で産生したｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ組換えウイルスがインビボで内因性ＰＡＢＰＮ１の発現をノックダウンする能力およびそのコドン最適化ヒトＰＡＢＰＮ１での置換を実証する。突然変異型ＰＡＢＰＮ１のノックダウンおよび遺伝子の非突然変異形態による置換の生理学的結果も実証される。
【０４４７】
処置
Ａ１７．１トランスジェニックマウスは以前に記載されている（Ｄａｖｉｅｓ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｔｒｏｌｌｅｔ，Ａｎｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。Ａ１７．１マウスおよびＷＴ  ＦｖＢ対照は、ヘテロ接合キャリア株Ａ１７．１（Ｄａｖｉｅｓ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）をＦｖＢバックグラウンドマウスと交配することによって生成した。ウシＰＡＢＰＮ１について、生後４週間でマウスの遺伝子型を決定し、最小疾患設備（Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｌｌｏｗａｙ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ）で飼料および水を自由に与えて飼育した。
【０４４８】
簡潔には、１０〜１２週齢のＡ１７マウスを、以下の処置グループ１〜４（処置グループ当たりｎ＝５）に入れた。また１０〜１２週齢のＷＴ  ＦｖＢマウスを健常対照として使用し、グループ５（ｎ＝５）に入れた。全てのマウスを２〜４％イソフルランで麻酔し、以下のように処置した：
グループ１（Ａ１７）：両方のＴＡ筋に２．５Ｅ＋１０個のｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇのウイルス粒子を含む生理食塩水のＩＭ注射による単回５０μｌのボーラス。
グループ２（Ａ１７）：両方のＴＡ筋に１．３Ｅ＋１１個のｓｓＡＡＶ９−Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１のウイルス粒子（コドン最適化ｈＰＡＢＰＮ１を発現する）を含む生理食塩水のＩＭ注射による単回５０μｌのボーラス。
グループ３（Ａ１７）：両方のＴＡ筋に２．５Ｅ＋１０個のｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇのウイルス粒子および１．３Ｅ＋１１個のｓｓＡＡＶ９−Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１ウイルス粒子を含む生理食塩水のＩＭ注射による単回５０μｌのボーラス。
グループ４（Ａ１７）：生理食塩水のみの５０μｌのボーラス。
グループ５（ＦｖＢ）：生理食塩水のみの５０μｌのボーラス。
【０４４９】
筋収縮特性
以前にＴｒｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１１）：２１９１−２２０７に記載された方法論を使用して、注射後１８週に、最大等張力および特定力を含むＴＡ筋収縮特性の測定を行った。これらのデータを図４に示す。
【０４５０】
次いで、マウスを麻酔薬の過剰投与により屠殺し、その後、ＴＡ筋を腱から腱まで切除し、秤量し、さらなる組織学的および分子的分析のために液体窒素冷却イソペンタン中で急速凍結した。
【０４５１】
ＰＡＢＰＮ１  ｍＲＮＡ発現
製造者の説明書に従いＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、骨格筋試料から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料は、ＮＤ−１０００ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量した。製造者の説明書に従い、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡ（筋肉生検については５０〜２５０ｎｇ、細胞ペレットについては１〜３μｇ）を逆転写した。ＳＹＢＲ緑色混合緩衝液（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎＩ  Ｍａｓｔｅｒ）を使用して、合計９ｕｌの反応容量で、ｃＤＮＡを定量ＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応は、次のように行った：９５℃で８分、続いて：９５℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で１５秒を５０サイクル。ＰＣＲ産物の特異性は、以下のプログラムを用いて融解曲線分析によってチェックした：９７℃まで０．１１℃／秒で６５℃上昇。
【０４５２】
それぞれのｍＲＮＡの発現レベルは、マウスＲＰＬＰ０  ｍＲＮＡ（大きなリボソームタンパク質、サブユニットＰ０）の発現レベルに対して正規化された。発現レベルは、△△Ｃｔ法に従って算出した。
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマーの配列は以下の通りである：
ＰＡＢＰＮ１−ＦＷＤ  ５’−ＴＧＡＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣ−３’
ＰＡＢＰＮ１−ＲＥＶ  ５’−ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣ−３’
ＲＰＬＰ０−ＦＷＤ  ５’−ＧＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＴＴＣＧＧ−３’
ＰＲＬＰ０−ＲＥＶ  ５’−ＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣ−３’
【０４５３】
免疫組織化学
ＰＡＢＰＮ１タンパク質の核内凝集体の存在を検出するために、マウスから切除したＴＡ筋（１０μｍ）の切片に対して免疫組織化学を行った。簡潔には、ＴＡ筋の切片を、１Ｍ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ６．９）中で１時間インキュベートして、可溶性タンパク質を除去した。次いで、切片を０．１Ｍ  ＰＢＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００中の１％正常ヤギ血清でブロックし、抗ＰＡＢＰＮ１一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、同じ緩衝液で１：２００に希釈した。次いで、切片をラミニン用抗体と共に１時間室温でさらにインキュベートし、次いで二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、ヘキストで切片を染色し、核を可視化した。
【０４５４】
組織学的および形態学的分析
ＴＡ筋の横断連続凍結切片（１０μｍ）に染色を行った。ＴＡ筋は、筋肉の長さに沿って１０〜１２の異なる間隔で切断され、最大断面積（ＣＳＡ）が決定された。組織形態の評価および線維症および結合組織の視覚化のために、筋肉の横断切片を、蛍光灯下でのさらなる検査のためにＨ＆ＥおよびコラーゲンＶＩでそれぞれ染色した。中心核生成を評価するために、各セクションで５つの無作為領域を評価した。画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、独国）を用いて視覚化し、ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ｆｘ；Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、米国）を用いてデジタル化し、ＭｅｔａＶｉｅｗ画像解析システム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、米国）を用いて分析した。これらの領域の線維の総数を計数し、中心核形成した線維の数を線維の総数のパーセンテージとして表した（図５）。
【０４５５】
ウェスタンブロット分析
次いで、組織についてウェスタンブロット分析を行い、ＰＡＢＰＮ１を検出した。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いたＲＩＰＡ溶液（ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＨＥＰＥＳ  ０．０５Ｍ、ＮＰ−４０  １％、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＳＤＳ  ０．１０％、ＥＤＴＡ  ０．０１Ｍ）中の組織をホモジナイズすることによって筋肉溶解物を調製した。タンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、０．１Ｍ  ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％ミルク中でのインキュベーションによりブロックしたニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ニトロセルロース膜をハウスキーピング対照としてＰＡＢＰＮ１（ａｂｃａｍ、１／１０，０００）またはマウスビンクリン（Ｓｉｇｍａ、１／１０，０００）に対して得た一次抗体で染色した。ニトロセルロース膜をさらにＨＲＰ結合抗ウサギおよび抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ、それぞれ１／２０００および１／１０００）と共にインキュベートした。免疫反応性バンドは、増強化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出し、膜をＥＣＬ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に暴露することによって視覚化した。
【０４５６】
全てのデータは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として提示される（コホートサイズは実験ごとに記載）。全ての統計分析はスチューデントｔ検定を用いて行った。差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１または＊＊＊Ｐ＜０．００１で有意であると判断された。
【０４５７】
結果
筋肉量（図５Ｂ）は４ヶ月の処置期間にわたって回復しなかったが、（ｉ）内因性ＰＡＢＰＮ１を標的とする３つのｓｈＲＮＡを発現するｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇのウイルス粒子、および（ｉｉ）ｓｈＲＮＡによって標的化されていない置換コドン最適化ヒトＰＡＢＮ１を発現するｓｓＡＡＶ８  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１ウイルス粒子、を投与したグループ３のマウスにつき、全筋力（図５Ａ）が改善され、特定の筋力（図５Ｃ）が正常化されたことが示された（図５）。
【０４５８】
図６に示されるウエスタンブロットデータから明らかなように、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇのみ、およびｓｓＡＡＶ９  ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃと組み合わせて投与したＡ１７マウスは、生理食塩水のみを投与したマウスに比べて突然変異型ＰＡＢＰＮ１タンパク質レベルの有意な低下が示され、ｓｃＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇウイルス粒子のインビボで内因性突然変異ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害する能力を実証した。さらに、ｓｓＡＡＶ９−ｏｐｔＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃ、またはｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９−ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃの組み合わせで処置したマウスにおいて、Ｍｙｃタグが同等に発現された。
【０４５９】
定量的ＰＣＲによりこれらの結果が確認され、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇは、生理食塩水のみを投与したマウスと比較して、ＰＡＢＰＮ１発現において８０％のノックダウンを生じたこと、およびｓＡＡＶ９  ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃと組み合わせて投与したｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇは、生理食塩水のみを投与したマウスと比較して、ＰＡＢＰＮ１発現において９０％のノックダウンを生じたことが示された。
【０４６０】
組織学的および分子的分析は、内在性ＰＡＢＰＮ１のサイレンシングが、核内凝集体をほぼ破壊し（図７Ａ−Ｂ）、中心核形成線維の増加した量によって示されるように筋変性を誘導する（図８Ａ、Ｃ）ことを示した。この点に関して、Ａ１７マウスの筋核の３５％に核内凝集体が検出されたが、ＦｖＢマウスの筋核は事実上凝集体を含有していなかった。ｏｐｔＰＡＢＰＮ１の発現は、Ａ１７マウスの筋肉における不溶性凝集体の形成を改変しなかったが、ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇでの処理は、筋核含有凝集体の量を１０％に減少させた。ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇを、ｓｓＡＡＶ９−ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃ発現コドン最適化ＰＡＢＰＮ１と同時投与した場合、筋核含有凝集体の量はわずか５％に減少した。しかし、筋肉変性は、コドン最適化ヒトＰＡＢＰＮ１の同時発現によって逆転することが示された。
【０４６１】
ｓｃＡＡＶ８−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇおよびｓｓＡＡＶ９  ｏｐｔ  ｈＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃの組み合わせで処置したＡ１７マウスからの筋肉において、生理食塩水を投与したＡ１７マウスからの筋肉と比較して、線維性組織の有意な減少が観察された（図８Ｂ、Ｄ）。最後に、筋線維断面積（ＣＳＡ）の分析は、ｓｃＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇのみの注射は筋線維ＣＳＡを改変しないが、ｓｓＡＡＶ９  Ｏｐｔ−ｈＰＡＢＰＮ１−ｍｙｃ単独またはｓｃＡＡＶ−ｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇとの併用での処置は顕著に筋線維ＣＳＡを増加させた（図８Ｅ〜Ｆ）。
【０４６２】
まとめると、これらのデータは、ＡＡＶによって送達されたｓｈＲＮＡｘ３−ｌｏｎｇ構築物がインビボでＰＡＢＰＮ１を効率的にダウンレギュレーションし、核内凝集体の形成を大幅に減少させることを示している。重要なことに、配列最適化されたＰＡＢＰＮ１がインビボでｒＡＡＶによって発現され得、分解に抵抗性を有し筋機能を回復させる転写物を産生することも示されている。まとめると、これらのインビボデータは、抑制および置換療法がＯＰＭＤの筋機能を回復させるのに有効であることを示している。
【図１】
2019513395.tif 000008
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
2019513395.tif 000016
【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
2019513395.tif 000019
【図８−１】
2019513395.tif 000020
【図８−２】
2019513395.tif 000021
【図８−３】
2019513395.tif 000022
【配列表】
2019513395000001.app
【国際調査報告】
2019513395.tif 000023
2019513395.tif 000024